(57)【要約】  本発明は、分離された小生存組織粒子を含む組成物、組織粒子の調製方法、及び組織欠損を修復するための組成物を使用する方法を提供する。組織粒子は、細胞及びそれらと関連する細胞外分子から成り、ある実施形態において約１ｍｍ未満に小さくサイズ調整されている。本発明における組織粒子のその他の側面は、生存細胞の割合が高いことである。ある実施形態において、組織粒子は軟骨から調製されており、組成物は接着剤、溶液、及び生物活性剤などの添加剤を含むこともできる。
2010512946.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の分離された生存組織粒子を含む組成物であって、粒子は少なくとも約８０％の生存率及び細胞外タンパク質を有する細胞を含み、夫々の粒子は少なくとも１つの寸法が６０μｍ未満となるようにサイズ調整されている組成物。
【請求項２】
細胞外タンパク質は細胞外マトリックスの成分である請求項１の組成物。
【請求項３】
複数の分離された生存幼若組織粒子を含む組成物であって、粒子は少なくとも約８０％の生存率及び細胞外タンパク質を有する細胞を含み、夫々の粒子は１ｍｍ３未満となるようにサイズ調整されている組成物。
【請求項４】
細胞外タンパク質は細胞外マトリックスの成分である請求項３の組成物。
【請求項５】
粒子は少なくとも１つの寸法が１ｍｍ未満となるようにサイズ調整されている請求項３の組成物。
【請求項６】
組織は自家、同種、又は異種のうちの少なくとも１つである請求項１又は３の組成物。
【請求項７】
組織は、軟骨、骨、靱帯、半月板、腱、筋肉、及びそれらの組合せから成るグループより選択される請求項１又は３の組成物。
【請求項８】
組織は工学的組織を含む請求項７の組成物。
【請求項９】
組織は関節軟骨である請求項１又は３の組成物。
【請求項１０】
関節軟骨は硝子軟骨又は線維軟骨のうちの少なくとも１つを含む請求項９の組成物。
【請求項１１】
接着剤、バッファー、又は生物活性剤のうちの少なくとも１つを含む請求項１又は３の組成物。
【請求項１２】
トロンビンを含む請求項１又は３の組成物。
【請求項１３】
生体適合性組成物を調製する方法であって、
結果的に生じる夫々の粒子が少なくとも１つの寸法が６０μｍ未満となるように、ほぼ平坦な表面に平行に取付けられた少なくとも３つの刃を使用して、分離された生存組織を粒子にサイズ調整することを含み、
組織粒子は、少なくとも約８０％の生存率を有する細胞と、マトリックス内で組織化された細胞外タンパク質とを含む方法。
【請求項１４】
生体適合性組成物を調製する方法であって、
結果的に生じる夫々の粒子が最大で１ｍｍ３となるように、ほぼ平坦な表面に平行に取付けられた少なくとも３つの刃を使用して、分離された生存幼若性非皮膚組織を粒子にサイズ調整することを含み、
組織粒子は、少なくとも約８０％の生存率を有する細胞と、マトリックス内で組織化された細胞外タンパク質とを含む方法。
【請求項１５】
粒子は少なくとも１つの寸法が１ｍｍ未満となるようにサイズ調整される請求項１４の方法。
【請求項１６】
組織は軸シリンダーの顎部に取付けられる請求項１３又は１４の方法。
【請求項１７】
組織を刃に対して押付けることを含む請求項１３又は１４の方法。
【請求項１８】
組織は少なくとも２回サイズ調整される請求項１３又は１４の方法。
【請求項１９】
刃に対する組織の向きを変更することによって、複数の粒子形状をもたらすことができる請求項１３及び１４の方法。
【請求項２０】
組織は自家、同種、又は異種のうちの少なくとも１つである請求項１３又は１４の方法。
【請求項２１】
消化酵素無しで実行される請求項１３又は１４の方法。
【請求項２２】
組織は培養されている請求項１３又は１４の方法。
【請求項２３】
組織は加工されている請求項１３又は１４の方法。
【請求項２４】
哺乳動物における損傷組織の修復方法であって、
損傷組織を修復するのに十分な条件の下で哺乳動物の損傷組織に、生存組織からサイズ調整された複数の分離された生体粒子を導入することを含み、粒子は少なくとも約８０％の生存率を有する細胞とマトリックス内で組織された細胞外タンパク質とを含み、夫々の粒子は６０μｍ未満である方法。
【請求項２５】
哺乳動物における損傷組織の修復の方法であって、
損傷組織を修復するのに十分な条件の下で哺乳動物における損傷組織に、生存幼若性非皮膚組織からサイズ調整された複数の分離された生体粒子を導入することを含み、粒子は少なくとも約８０％の生存率を有する細胞とマトリックス内で組織された細胞外タンパク質とを含み、夫々の粒子は１ｍｍ３未満である方法。
【請求項２６】
粒子は少なくとも１つの寸法が１ｍｍ未満となるようにサイズ調整される請求項２５の方法。
【請求項２７】
組成物を損傷組織に接着することを含む請求項２４又は２５の方法。
【請求項２８】
組成物を損傷組織に接着させるためにトロンビンを加えることを含む請求項２４又は２５の方法。
【請求項２９】
損傷組織の微小破壊が先に行われる請求項２４又は２５の方法。
【請求項３０】
損傷組織は、軟骨、骨、靱帯、半月板、腱、筋肉、及びそれらの組合せから成るグループより選択される請求項２４又は２５の方法。
【請求項３１】
組織は加工された組織を含む請求項３０の方法。
【請求項３２】
組成物における組織及び損傷組織は同一である請求項２４又は２５の方法。
【請求項３３】
組成物における組織及び損傷組織は異なる請求項２４又は２５の方法。
【請求項３４】
組成物は最小限の侵襲処理によって損傷組織へ導入される請求項２４又は２５の方法。
【請求項３５】
幼若軟骨からサイズ調整された複数の分離された生体組織粒子を含む生体適合性移植可能組成物であって、粒子はマトリックス内で少なくとも約８０％の生存率軟骨細胞と軟骨細胞外タンパク質とを含み、夫々の粒子は６０μｍ未満である組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
整形外科的組織欠損などの組織欠損を修復するために様々な材料源からサイズ調整された組織粒子（tissue  particles）の調製及び利用。
【背景技術】
【０００２】
関節軟骨は、圧縮力に対して弾力性のある硝子軟骨から構成されている、薄くて、平坦、低摩擦、滑らかな表面を有している。数ミリの厚みのみでありながら、それは優れた磨耗特性を有する。その機械的及び構造的能力は、それの細胞外マトリックスの完全性に起因し、細胞外マトリックス内において、軟骨細胞はコラーゲン、プロテオグリカン、及び非コラーゲン性タンパク質を含めた構造高分子全体にまばらに分散されている。軟骨細胞は細胞外マトリックスを産生するが、それらは軟骨の湿重量の５％未満しか構成していない。
【０００３】
それらの構成要素の組成及び高度に複雑な相互作用のために、再生及び置換技術は取組みがいのあるものになっている。例えば、高密度細胞外マトリックスの間における直接の血液供給の欠如及びわずかな細胞しか広範囲に分散されないことは、損傷関節軟骨の治癒能力を制限することにつながる。この事は、例えば膝における欠損に対する多岐に渡る治療方法をもたらし、それぞれの方法は様々なレベルの効果を有する。
【０００４】
穿孔、掻爬、微小破壊、及び創面切除などの治療方法は、痛み症状の緩和や機能の向上をもたらす。豊富な血液供給を有する軟骨の下に位置する骨が出血の原因となる場合において、総合してこれらの治療方法は軟骨下骨髄刺激技術と定義される。それらの治療方法の目標は、血液から間充織幹細胞を移動させて、修復組織を合成する軟骨細胞様の細胞に分化させることである。一旦、血管が新生された海綿骨が破壊されると、フィブリン血餅が形成されて多能性細胞はその領域に移動する。適切な機械的及び生物学的合図を受け取った後、これらの細胞は最終的に軟骨特異的プロテオグリカンと同様にＩ型、ＩＩ型及び他の型のコラーゲンを分泌する軟骨細胞様の細胞に分化する。その細胞は線維芽細胞様修復組織を形成し、前記組織は外観及び初回生検において硝子様の性質を有するが、時間と共に大部分は線維軟骨組織であることが組織学的に証明されてきた。線維軟骨は、天然硝子軟骨とは対照的に、比較的コラーゲン線維の乱れた格子であり、それ故同様にわずかな耐久性を有する構造的に弱い組織で欠損を部分的に充填する。
【０００５】
骨膜移植、骨軟骨の自家移植及び同種移植、及び自家軟骨細胞移植などの他の治療方法の選択肢は、痛みの緩和及び機能回復の目的のために、軟骨細胞の欠損を修復するよう使用されてきた。通常、これらの治療方法の効果は時間と共に減少するが、おそらく線維軟骨の形成、修復組織の不適切な発達、不十分な細胞分化、及び／又は周囲の関節軟骨縁に対する不十分な結合によるものであろう。骨軟骨の自家移植及び同種移植などの損傷を受けていない完全な厚さの移植片も同様に、サイズ不適合、免疫学的拒絶、及び骨表面への軟骨の不十分な接着に悩まされるであろう。自家軟骨細胞移植のためには２つの外科手術が必要とされる：軟骨細胞は初めに軟骨の含まれていない領域から採取されて１４日から２１日培養された後、培養された細胞は切開して露出した欠損に注入され、近接した脛骨内側から切除された骨膜弁で覆われる。
【０００６】
組織の成長及び修復、並びに特に軟骨の修復を促進させる様々な方法が提案されており、脱塩されていない関節軟骨を約６０μｍから約５００μｍの断片にすりつぶすこと（grinding）（マリーニン（Malinin）  米国特許出願第２００５０１９６４６０号）；２つの平行刃を用いて、組織を結果的に約０．１から約３ｍｍ３の大きさで、少なくとも１つの生存細胞を含んでいる粒子に刻むこと(mincing)（ビネッテ（Binette）他  米国特許出願第２００４００７８０９０号）；軟組織を、生存要素（細胞）及び／又は生物活性分子と結合する約１から約１００μｍの小片に粉砕すること(pulverizing)（アワド（Awad）他  米国特許出願第２００５０２８８７９６号）；及び、ペースト状に成形することができる約０．０１ｍｍから約１ｍｍの大きさの粒子を形成するためにその後に凍結乾燥される同種移植軟骨を製粉すること（milling）（ゴメス（Gomes）他  米国特許出願第２００４０２１９１８２号）によって得られる組織粒子の利用を含む。組織調製の様々な方法は、また、複数の刃物を備えたローラを用いて約５０μｍから約１５００μｍの皮膚組織片を作成する方法を含めて開示されている（ミシュラ（Mishra）他  米国特許出願第２００４０１７５６９０号）。
【０００７】
移植のための細胞及び／又は組織の生存率は向上されるべきである。例えば、組織粒子を調製するために使用されるホモジナイザは、均一化の後に、約５％の細胞しか生存していないという結果になる。自家軟骨細胞移植のための細胞を作成するためによく使用される酵素消化法は、最初の分離後の細胞生存率が乏しいという結果になる。
【０００８】
組織欠損、及び、特に関節軟骨の欠損を修復するための改善された組成物及び方法が所望される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０１９６４６０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／００７８０９０号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０２８８７９６号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４／０２１９１８２号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００４／０１７５６９０号明細書
【発明の概要】
【００１０】
一実施形態は、細胞と、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）として知られているそれらと関連する細胞外分子（例えば、タンパク質、ポリサッカライド、プロテオグリカン等）とから成る分離された小組織粒子を含む組成物である。いくつかの実施形態において、組織粒子は少なくとも１つの寸法が約６０μｍ未満となるようにサイズ調整されている。他の実施形態において、粒子は少なくとも１つの寸法が約１ｍｍ未満となる。他の実施形態において、体積が約１ｍｍ３未満となるように粒子はサイズ調整されている。いくつかの実施形態において、組織粒子における少なくとも約５０％の細胞は生存している。その他の実施形態において、組織粒子における少なくとも約８０％の細胞は生存している。また、いくつかの実施形態において、組成物は、接着剤、溶液、及び生物活性剤などの添加剤を含んでいてもよい。接着剤の例には、フィブリン接着剤、ティシール（Tisseal）（バクスター  バイオサイエンス，ディアフィールド  イリノイ州（Baxter  BioScience，Deerfield  IL））及びサージセル（Surgicel）（ジョンソン＆ジョンソン，ニューブランズウィック  ニュージャージー州（Johnson&Johnson，New  Brunswick  NJ））が含まれる。生物活性剤の例には、フィブリノゲン、トロンビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ベータ型（TGFβ）を含む形質転換成長因子（ＴＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、及び骨髄穿刺液が含まれる。
【００１１】
他の実施形態は小組織粒子を調製するための方法であって、組織試料は切断装置上に配置され、前記切断装置はある実施形態において少なくとも２つの平行な刃を備え、別の実施形態において少なくとも３つの平行な刃を備える。少なくとも３つの刃を含む実施形態においては、刃の間の間隔は均一であっても変化してもよい。刃同士の間の隙間は粒子の寸法を規定する。一実施形態において、少なくとも１つの刃は湾曲している。他の実施形態において、少なくとも２つの刃は平行ではない。一実施形態において、サイズ調整装置は、平行に取付けられ且つ約６０μｍの幅をもつスペーサによって分離されている３つの刃を備えている。組織試料と切断装置との間の相対的な空間的関係を変更することにより、水平、垂直、前頭面で切断することができる。これらの面の間の角度を変化させることができるため、結果として生じる組織粒子は立方体、三角形、四角形、及び他の多角形を含めた様々な形状にサイズ調整することができる。
【００１２】
他の実施形態は、組織欠損を修復することにおける説明された組成物を用いる方法である。一実施形態において、欠損組織は、軟骨、骨、靱帯、半月板、腱、筋肉、髄核、歯肉、線維輪、骨膜、軟骨膜、筋膜、及び／又は神経周膜である。一実施形態において、関節軟骨における欠損は、該方法が施される。一般的に、その方法は分離されてサイズ調整された組織粒子を組織欠損部位に配置することを含む。欠損部位における組織粒子の保持は小粒子サイズであることによって促進される。ある実施形態において、欠損部位における組織粒子の保持は、微小破壊及び接着剤の使用などの技術によって強化される。
【００１３】
他の実施形態は、例えばインビトロ（in  vitro）実験の一環として、及び／又は培養下で細胞を増殖させるための、細胞培養状況下での本発明における小組織粒子の使用である。
【００１４】
その方法及び組成物は、以下の図及び説明を参照することにより、良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】生細胞のみの染色による粒子の写真である。
【図１Ｂ】死細胞のみの染色による粒子の写真である。
【図２】組織粒子をサイズ調整するための装置を示している。
【図３Ａ】一実施形態の方法における生存細胞の割合を示している。
【図３Ｂ】本発明の一実施形態に対する酵素消化後の生存細胞の割合を示している。
【図４】Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸によって規定される３つの粒子面の配置図を示している。
【図５Ａ】本発明の一実施形態に用いられた豚の膝関節面を示す写真である。
【図５Ｂ】本発明の他の実施形態に用いられた豚の膝関節面を示す写真である。
【図５Ｃ】図５Ａにおける写真の素描である。
【図５Ｄ】図５Ｂにおける写真の素描である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一実施形態において、複数の分離された組織粒子を含む組成物が開示されている。粒子には細胞及びそれらに関連する細胞外分子（例えば、タンパク質、ポリサッカライド、プロテオグリカン等）が含まれており、前記細胞外分子はマトリックスと総称される。他の実施形態において、組織粒子は少なくとも約５０％の細胞が生存している細胞から成る。他の実施形態において、組織粒子は少なくとも約６０％の細胞が生存している細胞から成る。他の実施形態において、組織粒子は少なくとも約６５％の細胞が生存している細胞から成る。他の実施形態において、組織粒子は少なくとも約７０％の細胞が生存している細胞から成る。他の実施形態において、組織粒子は少なくとも約７５％の細胞が生存している細胞から成る。他の実施形態において、組織粒子は少なくとも約８０％の細胞が生存している細胞から成る。細胞の生存率は、細胞が生存しており、且つ１つ又は複数の固有の生物学的機能（例えば、細胞内シグナル伝達、細胞恒常性の維持等）を実行することが可能なことを示しており、また、細胞周期の段階において休眠又は停止している細胞を含む。生存していない細胞は死細胞である。生存細胞の絶対数は、例えば、粒子を調製するために用いられる組織の種類及び／又は粒子サイズによって変化する。組織粒子組成物に生存細胞が存在することは、以下により十分説明されるように、組織欠損の修復における組成物の利用を促進する。例えば、生存細胞は組織再構築、成長、及び／又は修復のために、刺激因子及び／又は合図を提供する。細胞の生存率を測定するための方法は、当業者の間で知られており、促進性の染色剤及び生化学的分析が含まれる。例えば、組織粒子における細胞生存率はライブ／デッド（登録商標）(LIVE/DEAD(R))生存率分析（インビトロジェン，ユージーン  オレゴン州（Invitrogen  Eugene  OR））を用いて測定され、カルセイン（calcein）染色剤は生存細胞内に保持されて緑色の蛍光を発光し、エチジウムホモ二量体（ethidium  homodimer）は損傷した細胞膜から細胞内に入り、核酸と相互作用した時に赤い蛍光を発光する。図１Ａは本発明の一実施形態において、組織粒子内にて赤い蛍光を発光している死細胞を示している。図１Ｂは、本発明の一実施形態において、組織粒子内にて緑色の蛍光を発光している生存細胞を示している。図１Ａ及び１Ｂにおける結果は、小さな組織粒子内への染色剤の十分な取込みを示している。
【００１７】
細胞と共に、組織粒子は、また、しばしば細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と称される細胞外分子を含んでいる。ＥＣＭは哺乳動物の組織内で細胞を取囲んで支持しており、生体分子の３つの主要な分類：（i）コラーゲン及びエラスチンなどの構造タンパク質；（ii）フィブリリン、フィブロネクチン、及びラミニンなどの特定タンパク質、及び（iii）プロテオグリカンから構成されている。プロテオグリカンはグリコサミノグリカン（GAGs）と称される二糖単位の繰り返しの長鎖に結合しているタンパクコアから成り、ＥＣＭの高分子量成分複合体を形成している。ＥＣＭには細胞構成、細胞移動及び成長の誘導、及び構築、を含めた多くの役割がある。これらの役割の重要性は組織によって変化する。例えば、ＥＣＭは、特に軟骨、腱、靱帯、骨、筋肉において、力伝達及び組織構造維持において重要な役割を果たす。粒子におけるＥＣＭの正確な組成は、組織のどこから粒子が採取されたか、及びそれらの任意の処理又は修飾などの要因に起因する。従ってＥＣＭの組成はその組織の種類に対する内因性の組成に依存して変化する。また、組織の種類に基づくＥＣＭ組成における変化に応じて、ＥＣＭは修正可能である。一実施例として、粒子は粒子の組織修復能力を強化するために、ＢＭＰ、ＩＧＦ、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ、骨髄穿刺液などの生物活性タンパク質で処理される。また、粒子はＥＣＭの近接可能性を増加させるために、トリプシン及びヒアルロニダーゼなどのタンパク質及び／又は糖鎖を加水分解する酵素で処理される。
【００１８】
本発明の組成物における組織粒子の大きさは、使用される組織材料源の種類、組織の年齢、及び組成物の意図される後の使用などの要因によって変更可能である。一実施形態において、組織粒子は、粒子の少なくとも一寸法が１ｍｍ未満となるようにサイズ調整されている。他の実施形態において、組織粒子は少なくとも一寸法が６０μｍ未満となるようにサイズ調整されている。他の実施形態において、組織粒子は組織粒子は夫々の辺が約６０μｍ以下のほぼ立方体となるようにサイズ調整されている。他の実施形態において、組織は幼若な材料源に由来し、組織粒子は１ｍｍ３未満の体積である。他の実施形態において、組織粒子は約２×１０−４ｍｍ３の体積である。組織粒子は任意の形状をとることができ、立方体及び細長い断片を含むがこれに制限されない。サイズ調整は組織試料を所望の大きさ及び／又は形状に切断することを指し、さらに以下に説明される。
【００１９】
組織粒子は様々な組織の種類及び組織源から採取することができる。組織は以下に説明されるように、本発明の組成物の移植者に対して自家、同種、又は異種とすることができる。あらゆる組織はおそらく使用に適しており、組織の種類は軟骨、骨、靱帯、半月板、腱、筋肉、髄核、歯肉、線維輪、骨膜、軟骨膜、筋膜、及び／又は神経周膜を含む。一実施形態において、組織は関節軟骨である。他の実施形態において、関節軟骨は硝子軟骨及び／又は繊維軟骨である。
【００２０】
一実施形態において、組織は加工組織（engineeredtissue）である。組織の加工は、通常は有していない特徴を有するように組織の生理機能を変化させること、存在する組織特性を拡大及び／又は縮小させること、及び／又はインビトロで組織を育てることを指す。加工組織は遺伝子組み換えドナーに由来する組織を含んでいてもよい。遺伝子組み換えドナーは、外来性の遺伝物質が組織源のゲノムに組み込まれている動物などの組織源を指す。組み込まれた遺伝物質は内因性でない遺伝子を発現するか、又は内因性遺伝子の発現レベルを変化させる。他の実施形態において、ドナー組織はドナーからの採取の後に遺伝的に改変される。切除の後であって培養より先又は同時の組織の改変の例には、遺伝物質及び／又は生物活性剤の導入によってもたらされる改変が含まれる。遺伝子操作の場合において、組織は当技術分野で周知のように、例えばウイルス及び脂質で仲介される遺伝子導入の様々な方法を用いて遺伝子ベクターで処理されて、内因性又は外因性の遺伝子発現において変化をもたらす。成長因子のような生物活性剤は、培養された組織と共にインキュベートされることで組織生理学における変化をもたらす。加工組織は、また、インビトロで増殖又は成長した組織も指す。インビトロでの組織の成長は、動物宿主外での組織の産生及び／又は増殖を指す。例えば、インビトロで成長した組織は、例えばインキュベート容器内で組織を形成するために細胞が刺激されるなどの組織培養操作に起因している。インビトロで組織を生産するための方法は当業者には周知である。
【００２１】
また、本発明において使用される組織の発生又は成熟の段階は変更可能である。例えば、組織粒子は、胚、胎児、新生児、幼若又は成体の組織に由来している。幼若の組織が使用される場合の実施形態において、ヒトの場合、幼若は１２歳未満であると定義される。更に、組織は粒子へとサイズ調整する前に急速に分離又は培養される。培養された組織試料の場合、組織は組織内の細胞の生存率を保つ環境に維持される。しかしながら、インビトロでの組織培養の結果、いくらかの細胞死が生じる可能性があることは当業者によって同様に理解されている。培養調製中である又は急速分離後のどちらかの組織は、例えば、組織粒子のその後の調製における操作を容易にするサイズとなるようその後のサイズ調整を促進するか、又は、例えば、組織の表面積を拡大し、その結果酸素及び栄養素が細胞へ届きやすくなるよう組織培養における細胞生存率を高めるかどちらかである小さな断片にサイズ調整される。他の実施形態において、組織は培養前に所望の粒子サイズにサイズ調整される。
【００２２】
組成物は、また、追加の成分を含むことができる。一実施形態において、組成物の組織粒子は溶液中で保たれる（maintained）か又はけん濁（suspended）している。溶液は溶液のｐＨを所望の範囲に維持するバッファーであってもよい。例えば、バッファーは組織粒子を、約ｐＨ６．８から約ｐＨ７．５の範囲の溶液中に維持することができる。その他の実施形態において、バッファーはｐＨを約ｐＨ５から約ｐＨ７の範囲に維持する。バッファー及び選択して結果的に生じたバッファーのｐＨの範囲は、組織の種類及びその組織の種類対する特定のｐＨの効果を含めた当業者に周知の因子に依存する。
【００２３】
他の実施形態において、組成物は生物活性剤を含む。生物活性剤は上述したように組織試料の培養による残余物であっても、又は別の機会に組織粒子に加えられてもよい。生物活性剤の例は、成長因子、ホルモン、及び栄養素を含むが、これに限定されない。
【００２４】
また、本発明における組成物は、組織粒子の組織欠損部位への付着を補助する接着剤を含んでいてもよい。接着剤はフィブリンなどの天然生体接着剤であってもよい。トロンビンは可溶性プラズマフィブリノーゲンを、重合してフィブリン血餅を形成するフィブリン分子に変換する。フィブリンは組織欠損部位において組織粒子をカプセル化及び／又は巻込む。しかしながら、本発明における組織粒子はサイズが小さいことによって、粒子が組織欠損部位に本質的に接着することを同様に認識しなければならない。他の実施形態において、組織粒子はそれらが正電荷を帯びるように処理される。組織粒子は粒子をイオン性界面活性剤又は磁場に曝すことを含む様々な処理によって帯電し、結果として粒子上に全体的に正電荷を帯びるようにする。粒子の全体における正電荷は、大部分が負に帯電した組織欠損への粒子の接着を促進する。粒子の組織欠損部位への接着が増加すると、組織欠損の修復に必要な時間が減少する。
【００２５】
一実施例において、粒子のサイズに調整された組織を有する組成物の調製方法が開示されている。組織試料は、例えば、外科用メス（scalpel）などの当業者に周知の外科用ツールを用いて、最初に小さい断片に切断されることによって、その後の組織粒子へのサイズ調整を容易にする。一実施例において、組織は最初に約５ｍｍから約１１ｍｍの断片に切断される。他の実施形態において、培養された組織はすでに最初の切断処理を受けており、その後のサイズ調整に対して近いサイズとなっている。図２の図に示されるように（正確な尺度ではないが）、組織１０が適切な最初のサイズであれば、それは軸シリンダの顎部（jaw）１２に取付けられる。軸Ａに沿って軸シリンダが伸長すると、組織１０は顎部の反対側に取付けられた刃１４と接触する。一実施例において、組織はほぼ平坦な表面に平行に取付けられた少なくとも２つの刃と接触する。他の実施形態において、組織はほぼ平坦な表面に平行に取付けられた３つの刃と接触する。他の実施形態において、刃１４はお互いに平行ではなく、また、例えば湾曲した真っ直ぐでない刃を含む。刃１４の形状は、また、刃同士の間にスペーサ１６を含み、前記スペーサの幅は平行な切断部間の所望の寸法に対応する。ある実施形態において、刃１４同士の間のスペーサ１６は同じ大きさであり、その他の実施形態において、スペーサ１６は異なる大きさである。刃は組織の損傷及び／又は喪失を最小限にするために十分に鋭い。
【００２６】
その方法は、外から加えられる消化酵素無しで行うことができる。消化酵素は細胞の解離を促進するが、それらは同様に処理の結果生存する細胞の割合を減少してしまう。図３において、ライブ／デッド（登録商標）生存率分析によって決定されるように、本発明の方法において一実施形態による細胞の生存率は約８５％（図３A）であり、一方でコラゲナーゼによる酵素処理を行った細胞の生存率は、約２５％の生存細胞が得られる（図３B）という結果になった。単一理論には留まらないが、消化酵素は細胞膜成分に損傷を与え、細胞死に寄与していることが考えられる。
【００２７】
刃と組織との間の最初の接触は、例えば、図４に示されるように組織試料のｘ軸面における平行切断となる。異なる実施形態において、組織は刃に対して押圧され、又はその代わりに刃が組織に対して押圧される。他の実施形態において、刃及び組織試料は両方ともお互いに向かって移動する。ある実施形態において、刃は平行ではなく、それ故平行切断とならない。しかしながら、簡素化のために本発明における方法は平行切断を行う平行刃に関して説明されているが、全ての場合において、刃及び結果として生じる切断は平行ではなく、また、例えば湾曲しており真っ直ぐではなくても良い。刃と組織との間の最初の接触の後、試料及び／又は刃は、例えば回転せずに軸Bに沿って平行に移動することで、なお同じ平面で前回の切断と平行に更なる切断を行うことができる。一実施形態において、図２に示すように、刃はデジタルマイクロメータ１８を用いて正確に約１μｍ平行に移動することができる。その後、刃及び／又は組織試料は軸Ａ周りに回転Ｃによって互い相対的に回転し、第２の配向を規定すると共に刃及び組織は再度接触し、図４に示すように例えばｙ軸平面で切断を行う。この第２の配向において、一連の平行切断が行われるように刃及び／又は組織は再度平行に移動する。一実施例において、刃と組織との間の２回目の接触によって組織はほぼ垂直に切断され、最初と２回目の切断との間の角度は約９０°である。しかしながら、最初と２回目の切断との間の角度は約１°から約１７９°の範囲にすることができる。一実施例において、刃及び／又は組織試料は第３の配向に到達するように移動し、図４に示されるように例えば刃はＺ軸平面で組織試料を切断する。第３の配向は図２に示されるようにＤ方向に組織を移動させることにより到達する。一実施例において、第３の配向によって規定される面は、例えばｘ軸又はｙ軸面である第１又は第２のいずれの切断面に対してもほぼ垂直に組織を切断し、その結果、粒子はほぼ立方体（cubicle）となる。しかしながら、第３の切断面と第１又は第２のどちらかの切断面との間の角度は約１°から約１７９°の範囲にすることができる。従って、切断面の間の角度を選択することで、結果的に生じる組織粒子の形状を変えることができる。
【００２８】
刃の間のスペーサの大きさ及び切断部の間の角度を変えることで、様々なサイズの組織粒子を調製することができる。一実施例において、組織は上述した方法を用いて切断され、そこでは３つの刃が組織と接触し、結果的に得られる組織粒子は少なくとも一寸法が６０μｍ未満であるようにサイズ調整される。他の実施形態において、組織は上述した方法を用いて切断され、そこでは３つの刃が組織と接触し、組織は幼若性非皮膚組織源に由来して、結果的に得られる組織粒子は少なくとも一寸法が１ｍｍ未満となるようにサイズ調整される。他の実施形態において、結果的に生じる組織粒子のサイズは１ｍｍ３未満である。その方法は所望の寸法の組織粒子を生産し、また、例えば約８５％以上の高率で生存細胞を維持することができる（図３Ａ参照）。
【００２９】
上述したように、組織粒子を調製するために本発明における方法によって使用される組織源は、自家、同種、異種、培養された、及び加工された組織を含む任意の種類の組織であり且つ任意の成熟段階であるあらゆる材料源から使用可能である。
【００３０】
一実施例において、哺乳動物における損傷した組織の修復方法が開示されている。組織粒子の組成物は、損傷組織を修復するのに十分な条件の下で、損傷組織に又はその近くに導入される。組成物は組織からサイズ調整された複数の組織粒子を含む。更に、上述したように、粒子はマトリックス内で組織化された細胞及び細胞外分子の両方を含む。一実施形態において、損傷組織は関節軟骨である。損傷した関節軟骨の場合、軟骨の損傷は創面切除されることで安定した元の軟骨に戻り、遊離した（loose）又は線維状の軟骨は切除される。一実施例において、関節軟骨の場合、軟骨下骨からの出血が起こるまで軟骨下骨基盤に微小な穴が開けられる。微小破壊は突き錐（awl）を用いて約３ｍｍから約４ｍｍの深さに骨に一連の小さな穴を開けて実施される。若しくは、その部位に熱壊死を起こさないよう配慮して軟骨下骨に穴を開けるのにドリルが使用される。組成物は欠損部位及び／又は隣接部位に適用される。
【００３１】
また、一実施例において、損傷組織の修復の方法は本発明における組成物を損傷組織に接着することを含む。もしその方法が微小破壊と共に実施された場合、図５Ａ及び５Ｃに示されるように出血している骨の接着特性によって組織粒子を適所に固定する。特に、出血している骨によって生じる血餅は、欠損近くの表面に粒子を維持する生物学的接着剤としての機能を果たす。また、組織粒子が小さなサイズであることによって、図５Ｂ及び５Ｄに示されるように、粒子はおそらく表面張力により自然に欠損に留まる。本発明における組成物は、また、フィブリン、ヒアルロン酸、フィブリン接着剤、フィブリン血餅、コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、ゼラチン−レゾルシン−ホルマリン接着剤、マッセル（mussel）を基礎とした接着剤、ジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）を基礎とした接着剤、キトサン、トランスグルタミナーゼ、ポリ（アミノ酸）を基礎とした接着剤、セルロースを基礎とした接着剤、多糖を基礎とした接着剤、合成アクリレートを基礎とした接着剤、多血小板血漿（PRP）、貧血小板血漿（PPP），ＰＲＰの血餅、ＰＰＰの血餅、マトリゲル（登録商標）（MATRIGEL(R)）、（ビーディー  バイオサイエンス，サンノゼ  カリフォルニア州（BD  Bioscience，San  Jose  CA））、モノステアロイル・グリセロール・コスクシネート（MGSA）、モノステアロイル・グリセロール・コスクシネート／ポリエチレングリコール（MGSA／PEG）コポリマー、ラミニン、エラスチン、プロテオグリカン、及びそれらの組合せなどの接着剤を含ことができる。
【００３２】
一実施例において、本発明の組成物における組織粒子は、上述したように組織欠損への静電付着を促進する正味電荷を粒子が提示すよう処理される。また、フラップ（flaps）などの当業者に周知の他の技術も粒子を欠損部位に維持するために使用可能である。
【００３３】
一実施例において、その方法は、例えば関節鏡検査などの最小限の侵襲的治療を用いて行われる。最小限の侵襲的治療によってわずかな切開で済むため、従来のより侵襲的な治療よりも痛みが少なくなり、患者の入院期間が短くなり、及び回復時間が早くなる。また、関節鏡検査などの最小限の侵襲的治療の使用は、軟組織線維症などの術後の合併症の恐れを減少する一助となる。
【００３４】
一実施例において、損傷組織は、軟骨、骨、靱帯、半月板、腱、及び／又はその他の筋肉などの整形外科に関する組織である。他の実施形態において、損傷した組織は、髄核、歯肉、線維輪、骨膜、軟骨膜、筋膜、及び／又は神経周膜である。一実施例において、損傷組織及び本発明の組成物のための材料源として使用される組織は、例えば関節軟骨などの同じ種類の組織である。他の実施形態において、損傷組織及び本発明の組成物のための材料源として使用される組織は、自家、同種、異種、培養された、加工された組織を含み、及び任意の成熟段階である異なる種類の組織である。
【００３５】
一実施例は、生存幼若軟骨由来の組織からサイズ調整された複数の生物学的組織粒子を含む生体適合性のある移植可能な組成物を開示している。粒子は少なくとも約８０％の生存率を有する軟骨細胞及び軟骨細胞外のタンパク質から成り、夫々の粒子は６０μｍ未満であり、組成物は哺乳動物に移植可能である。
【００３６】
一実施例において、粒子軟骨組成物は、軟骨形成（chondrogenesis）を刺激することによる軟骨再生のために調製されて使用される。関節軟骨は、例えば耳、鼻、顎関節、及び肋骨縁などの硝子軟骨が存在する他の部位からと同様、大腿遠位、脛骨近位端、臼蓋窩、大腿骨頭、及び／又は橈骨頭などの関節の関節面から採取される。軟骨は例えば外科用メス、骨鉗子、又は他の外科用器具を用いて切除される。一実施例において、軟骨は、骨を取除かずに軟骨下骨まで切除される。関節軟骨は関節硝子軟骨及び／又は線維軟骨を含み、同種及び／又は異種の軟骨を有する。
【００３７】
以下の実施例によって本発明における更なる実施形態を説明する。
【実施例】
【００３８】
軟骨組織粒子は、細胞生存率及び軟骨欠損修復における評価のために判定された。全ての工程は、動物組織を使用するための関連規則を順守して行われた。豚の膝関節は地元の食肉処理場から得られた。膝関節は外科用メスによって切開され、関節丘の耐荷重領域の関節軟骨が露出された。直径７．５ｍｍのコアリングリーマ（coring  reamer）を使用して、骨軟骨栓（osteochondral  plug）が得られた。
【００３９】
骨軟骨栓は、切断装置の顎部（図２）に取付けられて、一連の切断が３つの複合刃を使用して行われ、生存小組織粒子が得られた。
【００４０】
組織粒子は細胞生存率を決定するために、ライブ／デッド（登録商標）染色を使用して染色された。ライブ／デッド（登録商標）染色は膜透過性カルセイン  エイエム（CALCEIN  AM）と膜非透過性エチジウムホモ二量体−１（ethidium  homodimer-1）とを使用する。カルセイン  エイエムは生存細胞において内因性エステラーゼによって開裂されることで細胞質内緑色蛍光を発し、膜非透過性エチジウムホモ二量体−１は、例えば死細胞などの膜損傷細胞の核酸を赤色蛍光で標識する。染色されたスライドの写真はNIH画像化ソフトウェアを用いて分析され、全体及び生存細胞の数が算出された。酵素消化法のために、軟骨は関節面か削り取られてペトリ皿に収集された。組織の重量は記録された。軟骨組織ブロックは、目に見える断片がなくなるまで約１２−１６時間にわたって０．１５％のII型コラゲナーゼによって１：１０の質量：体積比で消化された。細胞−コラゲナーゼ溶液はフィルター濾過されてリン酸緩衝生理食塩水によって洗浄された。分離された細胞は数えられて、生存率はライブ／デッド（登録商標）染色を使用して決定された。生存細胞の数は組織重量によって標準化されて、図３Ａに示されるように、組織の既定のユニットにおける細胞の絶対数の割合として示された。対を成すｔ−テスト（paired  t-test）統計分析はシグマ  スタット（Sigma  Stat）２．０ソフトウェアを用いて実行された。
【００４１】
組織粒子は規則的な形状を有することが結果から示された。粒子の大多数は５０μｍから２４０μｍであった。ライブ／デッド（登録商標）染色実験は粒子のサイズに起因して染色剤の良好な組織浸透を示した。約１０％から約１５％のわずかな割合の組織は切断工程の間に失われたが、組織粒子における細胞生存率は、消化法によって得られた生存細胞の割合よりも非常に高かった（図３Ａ及び３Ｂの比較）。関節面に蒔かれた組織粒子は、条件が維持されている限り無期限に重力に対抗して表面に付着して残っており（図５Ｂ）、軟骨下骨を圧迫して出血を起こすことで微小破壊がシミュレートされると、接着力は増加した（図５Ａ）。
【００４２】
上記の結果より、小生存組織粒子は自家材料源から得られることが示された。また、結果から粒子内部の細胞生存率は８５％よりも高いままであることが示された。
【００４３】
説明された実施形態及び実施例は単なる例示であり、いかなる方法においても制限されるものではないことが理解される。従って、これらの実施形態に対する様々な変更、修正又は代替は、本発明の精神及び以下の請求の範囲から逸脱することなく実行され、又は採用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年8月4日(2009.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の分離された生存組織粒子を含む組成物であって、粒子は少なくとも約８０％の生存率及び細胞と関連する細胞外タンパク質を有する細胞を含み、夫々の粒子は少なくとも１つの寸法が６０μｍ未満となるようにサイズ調整されている組成物。
【請求項２】
細胞外タンパク質は細胞外マトリックスの成分である請求項１の組成物。
【請求項３】
細胞外タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブリン、フィブロネクチン、及びラミニンから成るグループより選択される請求項２の組成物。
【請求項４】
粒子は、軟骨、骨、靱帯、半月板、腱、筋肉、及びそれらの組合せから成るグループより選択される組織を含む請求項１から３のいずれかの組成物。
【請求項５】
粒子は工学的組織を含む請求項１から４のいずれかの組成物。
【請求項６】
粒子は幼若組織を含む請求項１から５のいずれかの組成物。
【請求項７】
粒子は関節軟骨を含む請求項１から６のいずれかの組成物。
【請求項８】
関節軟骨は硝子軟骨又は線維軟骨のうちの少なくとも１つを含む請求項１から７のいずれかの組成物。
【請求項９】
接着剤、バッファー、又は生物活性剤のうちの少なくとも１つを含む請求項１から８のいずれかの組成物。
【請求項１０】
接着剤は、フィブリン、ヒアルロン酸、フィブリン接着剤、フィブリン血餅、コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、ゼラチン−レゾルシン−ホルマリン接着剤、マッセル（mussel）を基礎とした接着剤、ジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）を基礎とした接着剤、キトサン、トランスグルタミナーゼ、ポリ（アミノ酸）を基礎とした接着剤、セルロースを基礎とした接着剤、多糖を基礎とした接着剤、合成アクリレートを基礎とした接着剤、多血小板血漿（PRP）、貧血小板血漿（PPP），ＰＲＰの血餅、ＰＰＰの血餅、モノステアロイルグリセロールコ−スクシネート（MGSA）、モノステアロイルグリセロールコ−スクシネート／ポリエチレングリコール（MGSA／PEG）コポリマー、ラミニン、エラスチン、プロテオグリカン、及びそれらの組合せから成るグループより選択される請求項９の組成物。
【請求項１１】
生物活性剤は、成長因子、ホルモン、栄養素、ＢＭＰ、ＩＧＦ、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ及び骨髄穿刺液から成るグループより選択される請求項９の組成物。
【請求項１２】
トロンビンを含む請求項１から１１のいずれかの組成物。
【国際調査報告】
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