(57)【要約】  本発明は、関心のある化合物を生産するための組み換え宿主細胞に関する。本発明はまた、単離された真菌プロモーターＤＮＡ配列と、ＤＮＡコンストラクトと、ベクターと、関心のある化合物をコードするコード配列と作動可能に結合した関係にあるプロモーターを含んでなる真菌宿主細胞とにも関する。本発明はまた、本発明に従ったプロモーターを使用して、関心のある遺伝子を発現し、および／または関心のある化合物を生産する方法にも関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのＤＮＡコンストラクトを含んでなり、各ＤＮＡコンストラクトがプロモーターＤＮＡ配列と作動可能に結合した関係にあるコード配列を含んでなり、少なくとも２つのＤＮＡコンストラクトが少なくとも２つの別々のプロモーターＤＮＡ配列を含んでなり、前記ＤＮＡコンストラクトに含まれるコード配列が関連ポリペプチドをコードする、組み換え宿主細胞。
【請求項２】
少なくとも２つの別々のプロモーターＤＮＡ配列が別々の発現特徴を有する、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項３】
少なくとも２つのプロモーターＤＮＡ配列の少なくとも１つが、
（ａ）配列番号１〜４および１３〜５５からなる組から選択されるヌクレオチド配列と、表１に列挙される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列とを含んでなるＤＮＡ配列、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列とハイブリッド形成できるＤＮＡ配列、
（ｃ）（ａ）のＤＮＡ配列と少なくとも８０％の相同性を共有するＤＮＡ配列、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡ配列のいずれかの変異型、および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡ配列のいずれかの部分配列
からなる群から選択される、請求項１または２に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項４】
真菌細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項５】
アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、シュタケ属（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種である、請求項４に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項６】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）が、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）種である、請求項５に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項７】
コード配列が酵素をコードする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項８】
コード配列が代謝産物の生産に関与する酵素をコードする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項９】
（ａ）少なくとも２つのＤＮＡコンストラクトを提供するステップと、
（ｂ）適切な宿主細胞を提供するステップと、
（ｃ）前記宿主細胞を前記ＤＮＡコンストラクトで形質転換するステップと、
を含んでなり、各ＤＮＡコンストラクトがプロモーターＤＮＡ配列と作動可能に結合した関係にあるコード配列を含んでなり、少なくとも２つのＤＮＡコンストラクトが少なくとも２つの別々のプロモーターＤＮＡ配列を含んでなり、前記ＤＮＡコンストラクトに含まれるコード配列が関連ポリペプチドをコードする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換え細胞を調製する方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）が少なくとも２つの別個の形質転換事象によって実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）少なくとも２つのＤＮＡコンストラクトを提供するステップと、
（ｂ）適切な宿主細胞を提供するステップと、
（ｃ）前記宿主細胞を前記ＤＮＡコンストラクトで形質転換するステップと、
（ｄ）前記宿主細胞をコード配列の発現を実施できる条件下で培養するステップと、
を含んでなり、各ＤＮＡコンストラクトがプロモーターＤＮＡ配列と作動可能に結合した関係にあるコード配列を含んでなり、少なくとも２つのＤＮＡコンストラクトが少なくとも２つの別々のプロモーターＤＮＡ配列を含んでなり、前記ＤＮＡコンストラクトに含まれるコード配列が関連ポリペプチドをコードする、コード配列を発現する方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）が少なくとも２つの別個の形質転換事象によって実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換え宿主をコード配列の発現を実施できる条件下で培養するステップを含んでなる、コード配列を発現する方法。
【請求項１４】
（ａ）少なくとも２つのＤＮＡコンストラクトを含んでなる組み換え宿主細胞をポリペプチドの発現を実施できる条件下で培養するステップと、
（ｂ）場合によりポリペプチドを培養ブロスから回収するステップと、
（ｃ）場合によりポリペプチドを精製するステップと、
を含んでなり、各ＤＮＡコンストラクトがプロモーターＤＮＡ配列と作動可能に結合した関係にあるコード配列を含んでなり、少なくとも２つのＤＮＡコンストラクトが少なくとも２つの別々のプロモーターＤＮＡ配列を含んでなり、前記ＤＮＡコンストラクトに含まれるコード配列が関連ポリペプチドをコードする、ポリペプチドを生産する方法。
【請求項１５】
（ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞をポリペプチドの発現を実施できる条件下で培養するステップと、
（ｂ）場合によりポリペプチドを培養ブロスから回収するステップと、
（ｃ）場合によりポリペプチドを精製するステップと、
を含んでなる、ポリペプチドを生産する方法。
【請求項１６】
（ａ）請求項８に記載の組み換え宿主細胞を代謝産物の生産を実施できる条件下で培養するステップと、
（ｂ）場合により代謝産物を培養ブロスから回収するステップと、
（ｃ）場合により代謝産物を精製するステップと、
を含んでなる、代謝産物を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、関心のある化合物を生産するための組み換え宿主細胞に関する。本発明はまた、単離された真菌プロモーターＤＮＡ配列と、ＤＮＡコンストラクトと、ベクターと、関心のある化合物をコードするコード配列と作動可能に結合した関係にあるプロモーターを含んでなる宿主細胞とにも関する。本発明はまた、本発明に従ったプロモーターを使用して関心のある遺伝子を発現し、および／または関心のある化合物を生産する方法にも関する。
【０００２】
［背景技術］
宿主細胞中での組み換えポリペプチドの生産は、通常その中でポリペプチドをコードするＤＮＡが宿主細胞に適したプロモーターの発現制御下に置かれる発現カセットを構築することで達成される。発現カセットは、プラスミド−またはベクター−媒介形質転換によって宿主細胞中に導入されてもよい。次にポリペプチドの生産は、発現カセットに含有されるプロモーターが適切に機能するのに必要な誘発条件下で、形質転換宿主細胞を培養することにより達成されてもよい。
【０００３】
各宿主細胞において、形質転換により宿主中に導入されたコード配列の発現、およびこのコード配列によってコードされる組み換えポリペプチドの生産は、機能性プロモーターが利用可能であることを要する。例えば真菌宿主細胞などから、多数のプロモーターが宿主細胞中で機能性であることが既に知られている。プロモーターの異種間使用の例がある。アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）のプロモーター（Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡ遺伝子はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ））中で機能性であることが知られている（Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９１年１月；１７（１）：１９〜３３頁．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｇｐｄＡ  ｇｅｎｅ．Ｐｕｎｔ  ＰＪ，Ｚｅｇｅｒｓ  ＮＤ，Ｂｕｓｓｃｈｅｒ  Ｍ，Ｐｏｕｗｅｌｓ  ＰＨ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ＣＡ）。別の例は、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）およびＡ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）中で使用されるＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）β−キシロシダーゼｘｌｎＤプロモーター（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，ｖａｎ  Ｐｅｉｊ，ＮＮＭＥ，オランダ国ワーゲニンゲン農業大学博士号論文，ＩＳＢＮ  ９０−５８０８−１５４−０）、およびＣｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．１９８９年３月；１５（３）：１７７〜８０頁：Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＩＮ，Ｏｌｉｖｅｒ  ＲＰ，Ｐｕｎｔ  ＰＪ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ＣＡ．「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ」で述べられるような、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）、およびクラドスポリウム・フルバム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｌｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）中における大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）β−グルクロニダーゼ遺伝子の発現である。
【０００４】
しかし依然として組み換え発現および関心のある化合物生産の改善に対する必要性がある。例えば真菌宿主細胞中における関心のある化合物生産に付随する既知の問題は、菌糸体の一部のみが化合物の生産に関与することである。これはまた、その中で発現が細胞周期の全相において構成的でない、その他の宿主細胞にも当てはまる。したがって改善された発現および生産システムを提供することが、本発明の目的である。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】組み込み型グルコアミラーゼ発現ベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡのプラスミドマップを図示する。
【図２】多重クローニング部位がある組み込み型グルコアミラーゼ発現ベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−２のプラスミドマップを図示する。
【図３】グルコアミラーゼコード配列と作動可能に結合した関係にある本発明に従ったプロモーターを含有する、組み込み型発現ベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１６のプラスミドマップを図示する。
【図４】全て別々のプロモーターの制御下にあるｇｌａＡコンストラクトを発現するＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）株の培養ブロス中のグルコアミラーゼ活性を図示する。コンストラクトについては表２で述べる。グルコアミラーゼ活性は相対単位で示され、４日目のＷＴ１培養の平均を１００％と設定した。示されるタイプあたり２つの形質転換体を独立して単離し、形質転換体を培養した。
【図５】置換ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＬＡＡのプラスミドマップを図示する。
【図６】プロモーター置換の略図を図示する。
【図７】相同的組換えを通じた組み込みの略図を図示する。
【図８】６日目（上パネル）および１０日目（下パネル）のシュタケ（Ｐ．ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）組み換え株Ｇ１３（Ａ）、Ｓ１（Ｂ）、およびＬ１２−８（Ｃ）のサンドイッチされたコロニーのラッカーゼの空間活性を図示する（株の説明については表４を参照されたい。ラッカーゼ活性は灰色または黒色の着色として検出される。黒矢印はコロニーの縁を示す。
【図９】株ＧＳ８（Ａ）および親Ｇ１４株（Ｂ）のラッカーゼ活性を図示する。ラッカーゼ活性は灰色または黒色の着色として検出される。Ｇ−Ｓ８では、菌糸体の最大部分が分泌に充てられる。
【０００６】
［発明の詳細な説明］
複数の別々のプロモーター配列を含んでなる組み換え宿主細胞に基づく改善された発現系を提供することが、本発明の目的である。これらのプロモーターは、例えば細胞周期の異なる相の間に、または真菌細胞または真菌菌糸体の異なる部分において、別々の活性を示し得る。それらはまた、特定の好都合な基質または化合物によって誘導されてもよい。いくつかの別々の機能性プロモーターはまた、単一宿主中で様々な遺伝子を同時に過剰発現することが想定される際に有利である。スケルチング（特定の転写因子のタイトレーション）を防止するために、例えば発現される各遺伝子毎に１つの特異的プロモーターなどの複数の別々のプロモーターを使用することが好ましい。
【０００７】
したがって本発明は、少なくとも２つのＤＮＡコンストラクトを含んでなる組み換え宿主細胞に関し、各ＤＮＡコンストラクトはプロモーターＤＮＡ配列と作動可能に結合した関係にあるコード配列を含んでなり、少なくとも２つのＤＮＡコンストラクトは少なくとも２つの別々のプロモーターＤＮＡ配列を含んでなり、前記ＤＮＡコンストラクトに含まれるコード配列は関連ポリペプチドをコードする。前記組み換え宿主細胞は、ここで本発明に従った組み換え宿主細胞と称される。本発明に従った組み換え宿主細胞は、有利には少なくとも１つの関心のある化合物の組み換え生産のために使用される。場合により前記２つのＤＮＡコンストラクトは、単一のコンストラクトに含まれる。本発明の態様に従って、組み換え宿主は組み換え技術によって宿主細胞中に導入される少なくとも１つのＤＮＡコンストラクトを含んでなり、すなわちそれに組み換え宿主が由来する親宿主は、関心のある化合物をコードするコード配列を含んでなる天然ＤＮＡコンストラクトを既に含有してもよい。
【０００８】
関心のある化合物は、例えばＲＮＡ、ポリペプチド、代謝産物であってもよく、または宿主細胞全体またはその一部であってもよい（すなわち生物由来資源または例えば生物由来資源抽出物などの加工生物由来資源）。
【０００９】
「別々のプロモーターＤＮＡ配列」という用語は、ここで単一遺伝子から双方が得られたのではないプロモーターＤＮＡ配列と定義される。別々のプロモーターＤＮＡ配列は、本発明に従ったプロモーター配列と称される。本発明に従って、プロモーターＤＮＡ配列はコード配列にとって天然であってもまたは外来性であってもよく、プロモーターＤＮＡ配列は宿主細胞にとって天然であってもまたは外来性であってもよい。
【００１０】
「関連ポリペプチド」という用語は、ここで関心のある単一化合物の生産に関与するポリペプチドを包含すると定義される。１つ以上のポリペプチドが関心のある実際の化合物であってもよく、別のポリペプチドは、場合により例えば関心のあるポリペプチドの転写活性化物質などの制御因子であってもよい。関心のある化合物が代謝産物である場合、関連ポリペプチドは代謝産物の生産に関与する酵素であってもよい。
【００１１】
さもなければ、関連ポリペプチドはかなりの適合率を共有してもよい。本発明の実施態様に従って、関連ポリペプチドは少なくとも５０％の適合率を共有する。より好ましくは、関連ポリペプチドは少なくとも６０％、なおもより好ましくは少なくとも７０％、なおもより好ましくは少なくとも８０％、なおもより好ましくは少なくとも９０％、なおもより好ましくは少なくとも９９％。最も好ましくは、関連ポリペプチドは同一ポリペプチドである。
【００１２】
本発明の目的では、それぞれ２つの核酸配列である２つのポリペプチド間の同一性の程度、すなわち適合率は、好ましくはＴｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ，およびＧｉｂｓｏｎ  ＴＪ（１９９４年）ＣｌｕｓｔａｌＷ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：４６７３〜４６８０頁で定義されるＣｌｕｓｔａｌＷを使用して判定される。
【００１３】
好ましい実施態様に従って、少なくとも２つの別々のプロモーターＤＮＡ配列は別々の発現特徴を有する。
【００１４】
別の好ましい実施態様に従って、少なくとも２つのプロモーターＤＮＡ配列の少なくとも１つは、
（ａ）配列番号１〜４および１３〜５５からなる組から選択されるヌクレオチド配列と、表１に列挙される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列とを含んでなるＤＮＡ配列、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列とハイブリッド形成できるＤＮＡ配列、
（ｃ）（ａ）のＤＮＡ配列と少なくとも８０％の相同性を共有するＤＮＡ配列、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡ配列のいずれかの変異型、および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡ配列のいずれかの部分配列
からなる群から選択され、好ましくは少なくとも２つの別々のプロモーターＤＮＡ配列は、別々の発現特徴を有する。
【００１５】
表１に示される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列は、本発明に従った目的のためのものであり、それぞれの遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）のすぐ上流の１５００ｂｐのヌクレオチド配列と定義される。より好ましい本発明の実施態様に従って、少なくとも２つの別々のプロモーターＤＮＡ配列の少なくとも１つは表１に示される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列から選択され、好ましくは少なくとも２つの別々のプロモーターＤＮＡ配列は別々の発現特徴を有し、すなわち異なる列から選択される（例えば表１のＩ列に列挙される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列と、ＩＩ列に列挙される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列を組み合わせる）。
【００１６】
好ましいプロモーターの組み合わせは、Ａｎ１２ｇ０６９３０またはＡｎ０５ｇ０２１００のプロモーターＤＮＡ配列（例えば（国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットで詳述されるような）最適化された翻訳開始部位がある国際公開第２００６／０９２３９６号パンフレットで言及されるａｍｙＢプロモーター；配列番号１７は最適化された翻訳開始部位があるプロモーターＤＮＡ配列Ａｎ１２ｇ０６９３０を表す）の少なくとも１つと組み合わさったＡｎ０３ｇ０６５５０のプロモーターＤＮＡ配列（例えば配列番号１６で提供される最適化された翻訳開始部位があるｇｌａＡプロモーター）である。
【００１７】
その他の好ましいプロモーターの組み合わせは、Ａｎ１６ｇ０１８３０（配列番号１８で提供されるｇｐｄＡプロモーター）のプロモーターＤＮＡ配列、および国際公開第２００５／１００５７３号パンフレットで言及されるプロモーター（例えば配列番号１３、１４、１５、１９または２０で提供されるプロモーター）の少なくとも１つと組み合わさった、Ａｎ０３ｇ０６５５０（例えば配列番号１６で提供される最適化された翻訳開始部位があるｇｌａＡプロモーター）、Ａｎ１２ｇ０６９３０および／またはＡｎ０５ｇ０２１００（例えば国際公開第２００６／０９２３９６号パンフレットで言及されるａｍｙＢプロモーター；配列番号１７は最適化された翻訳開始部位があるプロモーターＤＮＡ配列Ａｎ１２ｇ０６９３０を表す）の一組の遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列の少なくとも１つである。
【００１８】
その他の好ましいプロモーターの組み合わせは、表１のＩＩ欄に列挙される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列の少なくとも１つと組み合わさった、Ａｎ０３ｇ０６５５０（例えば配列番号１６で提供される最適化された翻訳開始部位があるｇｌａＡプロモーター）、Ａｎ１２ｇ０６９３０および／またはＡｎ０５ｇ０２１００（例えば国際公開第２００６／０９２３９６号パンフレットで言及されるａｍｙＢプロモーター；配列番号１７は最適化された翻訳開始部位があるプロモーターＤＮＡ配列Ａｎ１２ｇ０６９３０を表す）、Ａｎ１６ｇ０１８３０（配列番号１８で提供されるｇｐｄＡプロモーター）、国際公開第２００５／１００５７３号パンフレットで言及されるプロモーター（例えば配列番号１３、１４、１５、１９または２０で提供されるプロモーター）の一組の遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列の少なくとも１つである。
【００１９】
【表１】
2010517587.tif 000002
【００２０】
「宿主細胞」という用語は、全ての適切な真核生物および原核生物宿主細胞を包含する。宿主細胞の選択は、大体において関心のある化合物をコードする遺伝子およびその起源に左右される。当業者は適切な宿主細胞をどのように選択するかを知っている。
【００２１】
一実施様態に従って、ポリペプチドを生産するために本発明に従った組み換え宿主細胞を使用する。
【００２２】
別の実施態様に従って、特定の一次または二次代謝産物を生産するために本発明に従った組み換え宿主細胞を使用し、前記代謝産物は（β−ラクタム）抗生物質、ビタミンまたはカロチノイドなどの関心のある化合物である。
【００２３】
「ＤＮＡコンストラクト」という用語は、ここで一本鎖または二本鎖どちらかの核酸分子と定義され、それは天然遺伝子から単離され、またはそれは改変されてさもなければ自然界に存在しない様式で組み合わされ並置された核酸セグメントを含有している。
【００２４】
「コード配列」という用語は、ここでｍＲＮＡに転写された核酸配列と定義され、それは適切な制御配列の制御下に置かれると、ポリペプチドに翻訳される。コード配列の境界は一般にＡＴＧ開始コドンによって定まり、ＡＴＧ開始コドンは通常、ｍＲＮＡの５’末端の読み取り枠の始まり、およびｍＲＮＡの３’末端の読み取り枠のすぐ下流に位置する転写ターミネーター配列である。コード配列としてはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成、合成、および組み換え核酸配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２５】
本発明の文脈で、プロモーターＤＮＡ配列はＤＮＡ配列であり、このプロモーターＤＮＡ配列がコード配列と作動可能に結合した関係にある場合、そのコード配列の発現を制御できる。プロモーターＤＮＡ配列としてはゲノムＤＮＡ、半合成、合成、および組み換え核酸配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２６】
同義的に使用される「プロモーター」または「プロモーター配列」という用語は、ここでＲＮＡポリメラーゼと結合して、ポリメラーゼをコード配列の正しい転写開始部位に誘導し、転写を開始するＤＮＡ配列と定義される。ＲＮＡポリメラーゼは、コード領域の適切なＤＮＡストランドと相補的なメッセンジャーＲＮＡのアセンブリーを効果的に触媒する。「プロモーター」または「プロモーター配列」という用語は、ｍＲＮＡへの転写後の翻訳のための５’非コード領域（プロモーターと翻訳開始の間）、エンハンサーなどのｃｉｓ−作用転写制御要素、および転写因子と相互作用できるその他のヌクレオチド配列もまた含むものと理解される。
【００２７】
「作動可能に結合した関係にある」という用語は、ここでその中で、プロモーターＤＮＡ配列がコード配列によってコードされるポリペプチドの生産を誘導するように、プロモーターＤＮＡ配列がコード配列との相対位置に適切に配置される立体配置と定義される。
【００２８】
「別々の発現特徴」という用語は、ここで同様の条件下でアッセイした際の少なくとも２つのプロモーター間の発現レベルの違いと定義され、その違いは少なくとも１つの場合に起きる。このような場合の例は下に列挙されるが、例示的な目的で示されるものであり、網羅的な一覧と解釈すべきではない。
【００２９】
別々の発現特徴は、細胞分化の結果である発現の違いを含んでなる。細胞分化は発生生物学からの概念であり、それによって細胞が「タイプ」を獲得する過程について述べる。細胞または生物の遺伝物質はほとんど例外なく同じ状態のままであるが、例えば分化中に形態は劇的に変化してもよい。分化は、細胞生理機能、サイズ、形、極性、代謝活性、シグナル応答性などの多数の側面における変化を伴うことができ、または遺伝子発現プロフィールは分化中に全て変化できる。したがって真菌は、菌糸の異なる部分の間（菌糸先端と菌糸先端下部分の間など）、または菌糸体の異なる部分の間（栄養菌糸体の中央と末梢の間、あるいは栄養菌糸体と子実体または分生子柄などの生殖構造の間など）で分化させることができる。
【００３０】
分化は、例えば熟成、生育条件、栄養成分、ストレス（環境条件）、温度、放射線、圧力、形態、光、生育速度、発酵タイプ（バッチ、流加、連続生育条件、液内、表面または固体状態）の結果として生じることができる。栄養成分媒介分化の例は、栄養素キシロースによるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）における転写因子ＸｌｎＲの誘導である。転写因子ＸｌｎＲは、細胞外酵素をコードする様々な遺伝子の転写を誘導する一方で、その他の遺伝子の転写は誘導しない（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｖｉｓｓｅｒ，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６５：４９７〜５２２頁）。
【００３１】
細胞生理機能の多数の側面の変化を伴うかもしれない分化は、その基盤が転写、翻訳、タンパク質発現または酵素活性レベルにあるかもしれない。分化は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質または酵素活性または代謝産物レベルで始まってもよい。分化、ひいては別々の発現特徴は、（潜在的に）分化した細胞の間でＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質または酵素活性または代謝産物レベルを測定し比較することにより同定できる。同定された（代謝、ＲＮＡタンパク質）の違いは、関与する遺伝子と関係があり得る。これらの遺伝子は、別々の発現特徴を有する候補遺伝子である。発現プロフィールおよび可能な別々の発現特徴は、研究中の（潜在的に）分化した細胞の間で遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定することによって調査できる。分化的に発現した遺伝子は、別々の発現特徴があるプロモーターを含有する。分化的に発現した遺伝子は、好ましくは発現レベルが少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、なおもより好ましくは少なくとも５倍、なおもより好ましくは少なくとも１０倍、なおもより好ましくは少なくとも２０倍、なおもより好ましくは少なくとも５０倍、最も好ましくは少なくとも１００倍異なる。好ましくは１つのプロモーターは、同様の条件下でアッセイした際に、高レベルの発現をもたらす別のプロモーターと比較して、検出不能な発現をもたらす。
【００３２】
別々の発現特徴を有するプロモーターＤＮＡ配列の応用では、別々の発現特徴は工業的に適切な条件および工程に関連してもよい。これらの分化条件は、工業的生育および生物由来資源と製品の生産中に生じる、細胞間の空間、時間、環境または栄養的な違いと関係があるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
別々の発現特徴は、細胞の異なる周期相に、または細胞の異なる部分に反映されてもよい。
【００３４】
［組み換え宿主細胞］
本発明に従って、本発明に従った組み換え宿主細胞は、あらゆる適切な真核生物および原核生物宿主細胞であってもよい。
【００３５】
実施態様に従って、組み換え宿主細胞は原核細胞である。原核生物宿主細胞は、本発明の方法で有用なあらゆる原核生物宿主細胞であってもよい。好ましくは原核生物宿主細胞は細菌細胞である。「細菌細胞」という用語は、グラム陰性およびグラム陽性微生物の双方を含む。適切な細菌は、例えばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ））、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）またはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から選択されてもよい。好ましくは細菌細胞は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．プンチス（ｐｕｎｔｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．ハロデュランス（ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｇ．オキシダンス（ｏｘｙｄａｎｓ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＣＢ１５、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ロドバクター・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、シュードモナス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．グルタミカム（ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、およびリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される。
【００３６】
実施態様に従って、組み換え宿主細胞は真核細胞である。真核生物宿主細胞は、本発明の方法で有用なあらゆる真核生物宿主細胞であってもよい。好ましくは真核細胞は哺乳類、昆虫、植物、真菌、または藻類細胞である。好ましい哺乳類細胞としては、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＰｅｒＣ６細胞、およびハイブリドーマが挙げられる。好ましい昆虫細胞としては、例えばＳｆ９およびＳｆ２１細胞およびそれらの誘導体が挙げられる。より好ましくは組み換え宿主細胞は真菌宿主細胞である。真菌宿主細胞は、本発明の方法で有用なあらゆる真菌細胞であってもよい。「真菌」とは、ここでの用法では、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、および接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，第８版，１９９５年，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫで定義される）ならびに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら，前出で言及される）および全ての栄養胞子形成菌（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら，前出）を含む。
【００３７】
好ましい実施態様に従って、真菌宿主細胞は酵母細胞である。「酵母」とは、ここでの用法では、子嚢菌類酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子胞子形成酵母、および不完全菌類（不完全酵母菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する酵母を含む。酵母の分類は将来変わるかもしれないので、本発明の目的では、酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｆ．Ａ．，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｍ．，およびＤａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｒ．Ｒ．編，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，第９号，１９８０年）で述べられるように定義される。
【００３８】
より好ましい実施態様に従って、酵母宿主細胞は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞である。
【００３９】
なおもより好ましい実施態様に従って、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ダイアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クリヴェリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）またはサッカロミセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）細胞である。別のなおもより好ましい実施態様に従って、酵母宿主細胞はクリヴェロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）細胞である。別のなおもより好ましい実施態様に従って、酵母宿主細胞はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞である。
【００４０】
別の好ましい実施態様に従って、真菌宿主細胞は糸状菌細胞である。「糸状菌」は、真正菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら，１９９５年，前出によって定義される）の全ての糸状体を含む。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、およびその他の複合多糖から構成される菌糸体壁によって特徴づけられる。栄養成長は菌糸伸長により、炭素異化作用はほぼ絶対好気性である。対照的に、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母の栄養成長は単細胞葉状体の出芽により、炭素異化作用は発酵性であってもよい。
【００４１】
より好ましい実施態様に従って、糸状菌宿主細胞は、以下の種の細胞であるが、これに限定されるものではない。アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィロバシジウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、シイタケ（Ｓｈｉｉｔａｋｅ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ホウロクタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株。
【００４２】
なおもより好ましい実施態様に従って、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・ツビゲニス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｉｓ）、アスペルギルス・バデンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｖａｄｅｎｓｉｓ）またはコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）細胞である。別のなおもより好ましい実施態様に従って、糸状菌宿主細胞は、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・カルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レティキュラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブシナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、またはフザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）細胞である。別のなおもより好ましい実施態様に従って、糸状菌宿主細胞は、アガリクス・ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｒｏｒｕｓ）、クリソスポリウム・ラクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パルロゼラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、シュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）細胞である。
【００４３】
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ  ５１３．８８、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＡＴＣＣ２０４２３、ＩＦＯ  ４１７７、ＡＴＣＣ  １０１１、ＡＴＣＣ  ９５７６、ＡＴＣＣ  １４４８８−１４４９１、ＡＴＣＣ  １１６０１、ＡＴＣＣ  １２８９２、Ｐ．クリソゲヌム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＣＢＳ  ４５５．９５、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＡＴＣＣ  ３８０６５、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｐ２、アクレモニウム・クリソゲヌム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ  ３６２２５またはＡＴＣＣ  ４８２７２、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ  ２６９２１またはＡＴＣＣ  ５６７６５またはＡＴＣＣ  ２６９２１、ショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）ＡＴＣＣ  １１９０６、クリソスポリウム・ラクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）ＡＴＣＣ  ４４００６、シュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）ＢＲＦＭ  ４４、およびそれらの誘導体などのいくつかの糸状菌株は、米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ  （ＤＳＭ））、オランダ微生物株保存センター（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ  （ＣＢＳ））、Ｂａｎｑｕｅ  ｄｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｆｏｎｇｉｑｕｅｓ  ｄｅ  Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などのいくつかの菌株保存機関において、公的に容易に入手できる。
【００４４】
場合により糸状菌宿主細胞は、野性型細胞と比較して高められた小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を含んでなり、関心のある化合物の生産能が強化される。ＵＰＲは、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７０Ａ１号明細書および／または米国特許出願公開第２００１／００３４０４５Ａ１号明細書および／または国際公開第０１／７２７８３Ａ２号パンフレットで述べられる技術によって高められてもよい。より具体的には、高いＵＰＲを有する宿主細胞を得るために、ＨＡＣ１および／またはＩＲＥ１および／またはＰＴＣ２のタンパク質レベルが調節される。
【００４５】
高いＵＰＲの代案として、またはそれと組み合わせて、糸状菌宿主細胞は、国際公開第２００５／１２３７６３号パンフレットで述べられるようなＥＲと細胞質間のｓｅｃ６１転移チャネルの特定の一方向性変異を含んでなってもよい。このような変異は、表現型を与え、そこでは新規に合成されたポリペプチドがｓｅｃ６１を通じてＥＲに入ることができるが、この一方向性変異体では、ｓｅｃ６１を通じた逆向性の輸送は損なわれる。
【００４６】
関心のある化合物の生産能を増強するために、高いＵＰＲおよび／またはｓｅｃ６１転移チャネルの一方向性変異の代案として、またはそれらと組み合わせて、糸状菌宿主細胞を遺伝子改変し、野性型細胞と比較して、より低いプロテアーゼ発現および／またはプロテアーゼ分泌を示す表現型を得る。このような表現型は、プロテアーゼ発現の転写調節因子の欠失および／または改変および／または不活性化によって得てもよい。このような転写調節因子は例えばｐｒｔＴである。ｐｒｔＴの調節によるプロテアーゼ発現低下は、好ましくは米国特許出願公開第２００４／０１９１８６４Ａ１号明細書、国際公開第２００６／０４３１２号パンフレット、および国際公開第２００７／０６２９３６号パンフレットで述べられる技術によって実施される。
【００４７】
関心のある化合物の生産収率を高めるために、高いＵＰＲおよび／またはおよび／またはｓｅｃ６１転移チャネルの一方向性変異、より低いプロテアーゼ発現および／またはプロテアーゼ分泌を示す表現型の代案として、またはそれらと組み合わせて、糸状菌宿主細胞はシュウ酸塩欠損表現型を示す。シュウ酸塩欠損表現型は、好ましくはここで参照によって援用する国際公開第２００４／０７００２２号パンフレットで述べられる技術によって得られる。
【００４８】
高いＵＰＲおよび／またはおよび／またはｓｅｃ６１転移チャネルの一方向性変異、より低いプロテアーゼ発現および／またはプロテアーゼ分泌を示す表現型および／またはシュウ酸塩欠乏症の代案として、またはそれらと組み合わせて、糸状菌宿主細胞は野性型細胞と比較して異なる表現型の組み合わせを示して、関心のある化合物の生産収率を高める。これらの違いとしては、グルコアミラーゼおよび／または中性α−アミラーゼＡおよび／または中性α−アミラーゼＢ、プロテアーゼ、およびシュウ酸加水分解酵素の低下した発現が挙げられるが、これに限定されるものではない。糸状菌宿主細胞によって示される前記表現型の違いは、米国特許公開第２００４／０１９１８６４Ａ１号明細書で述べられる技術に従って、遺伝子改変によって得られてもよい。
【００４９】
［プロモーターＤＮＡ配列］
プロモーター活性は好ましくは、プロモーターと作動可能に結合した関係にあるコード配列によってコードされるタンパク質濃度を測定して判定される。代案としてはプロモーター活性は、プロモーターと作動可能に結合した関係にあるコード配列によってコードされる、タンパク質の酵素活性を測定して判定される。最も好ましくはプロモーター活性（およびその強度）は、ｌａｃＺレポーター遺伝子のコード配列の発現を測定して判定される（Ｌｕｏ（Ｇｅｎｅ  １６３（１９９５年）１２７〜１３１頁）。別の好ましい方法に従って、プロモーター活性はコード配列として緑色蛍光タンパク質を使用して判定される（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９９年３月；１４５（第３部）：７２９〜３４頁．Ｓａｎｔｅｒｒｅ  Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ  ＡＬ，Ｅｖｅｎ  Ｓ，Ｍｕｌｌｅｒ  Ｃ，Ｐｕｎｔ  ＰＪ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ＣＡ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｊ．Ｓｔｕｄｙ）。
【００５０】
さらにプロモーター活性は、プロモーター支配下で発生した転写物のｍＲＮＡレベルを測定して判定できる。ｍＲＮＡレベルは、例えばノーザンブロット法またはリアルタイム定量的ＰＣＲによって測定できる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。
【００５１】
本発明の態様に従って、本発明に従ったプロモーターＤＮＡ配列は、配列番号１〜４および１３〜５５からなる組から選択されるヌクレオチド配列と、表１に列挙される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列とを含んでなるＤＮＡ配列とハイブリッド形成できるＤＮＡ配列である。好ましい実施態様に従って、本発明に従ったプロモーターＤＮＡ配列は、配列番号１〜４および１３〜５５からなる組から選択されるヌクレオチド配列と、表１に列挙される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列とを含んでなるＤＮＡ配列である。本発明は、プロモーター活性を維持して、非常に低いストリンジェンシー条件、好ましくは低ストリンジェンシー条件、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件、より好ましくは中程度〜高ストリンジェンシー条件、なおもより好ましくは高ストリンジェンシー条件、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、
（ｉ）配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列と、表１に列挙される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列とのヌクレオチド１〜１５００、好ましくはヌクレオチド１００〜１４９０、より好ましくは２００〜１４８０、なおもより好ましくは３００〜１４７０、なおもより好ましくは３５０〜１４５０、最も好ましくは３６０〜１４００と対応する、
（ｉｉ）（ｉ）の部分配列である、または
（ｉｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）の相補鎖である
核酸プローブとハイブリダイズする、（単離された）プロモーターＤＮＡ配列を包含する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出）。
【００５２】
配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列と、表１に列挙される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列との部分配列は、少なくとも１００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、なおもより好ましくは少なくとも４００ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドであってもよい。ハイブリダイゼーション条件は、説明でさらに詳しく定義する。
【００５３】
当該技術分野でよく知られている方法に従って、配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列、表１に列挙される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列の核酸配列、またはその部分配列を使用して核酸プローブをデザインし、異なる属または種の株からのＤＮＡプロモーターを同定してクローニングしてもよい。特にこのようなプローブは、対応する遺伝子を同定して単離するために、サザンブロット法手順に従って、関心のある属または種のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために使用できる。このようなプローブは配列全体よりかなり短くてもよいが、長さは少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、およびより好ましくは少なくとも３５ヌクレオチドあるべきである。さらにこのようなプローブを使用して、ＰＣＲによってＤＮＡプロモーターを増幅できる。より長いプローブもまた使用できる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブが使用できる。プローブは、対応する遺伝子を検出するために、（例えば３２Ｐ、３３Ｐ  ３Ｈ、３５Ｓ、ビオチン、またはアビジンまたは蛍光性マーカーで）典型的に標識される。このようなプローブは本発明に包含される。
【００５４】
したがって上述のプローブとハイブリダイズしてポリペプチドをコードするＤＮＡについて、このようなその他の生物から調製されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーンしてもよい。このようなその他の生物からのゲノムＤＮＡまたはその他のＤＮＡは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動法またはその他の分離技術によって、分離してもよい。ライブラリーからのＤＮＡまたは独立したＤＮＡをニトロセルロースまたはその他の適切な担体材料上に転移して、固定してもよい。配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列、表１に列挙される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列、またはその部分配列との相同性を共有するクローンまたはＤＮＡを同定するために、担体材料をサザンブロット法で使用してもよい。
【００５５】
本発明の目的で、ハイブリダイゼーションは、核酸配列が、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシー条件下で、以下とハイブリダイズすることを示す。配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される核酸配列、その相補鎖、またはその部分配列に対応する標識核酸プローブ、または表１に列挙される遺伝子の１つのプロモーターＤＮＡ配列、相補鎖、またはその部分配列に対応する標識核酸プローブ。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子は、例えばＸ線フィルムを使用して検出される。検出のための蛍光および担体としてのスライドガラスおよび／またはＤＮＡマイクロアレイを使用した技術など、その他のハイブリダイゼーション技術もまた使用できる。ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション検出の例は、ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．２００３年１２月；４（３）：２５９〜６９頁（Ｄａｒａｎ−Ｌａｐｕｊａｄｅ  Ｐ，Ｄａｒａｎ  ＪＭ，Ｋｏｔｔｅｒ  Ｐ，Ｐｅｔｉｔ  Ｔ，Ｐｉｐｅｒ  ＭＤ，Ｐｒｏｎｋ  ＪＴ．「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｔｒａｉｎｓ  Ｓ２８８Ｃ  ａｎｄ  ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」にある。さらにハイブリダイゼーションのためのＰＮＡマイクロアレイの使用については、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３年１０月１；３１（１９）：１１９頁（Ｂｒａｎｄｔ  Ｏ，Ｆｅｌｄｎｅｒ  Ｊ，Ｓｔｅｐｈａｎ  Ａ，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  Ｍ，Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ  Ｍ，Ａｒｌｉｎｇｈａｕｓ  ＨＦ，Ｈｏｈｅｉｓｅｌ  ＪＤ，Ｊａｃｏｂ  Ａ．ＰＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｌａｂｅｌｌｅｄ  ＤＮＡ  ｓａｍｐｌｅｓ）で述べられる。
【００５６】
好ましくは核酸プローブは配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される核酸配列、または表１に列挙される遺伝子の１つのプロモーターＤＮＡ配列である。より好ましくは核酸プローブは、配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列、または表１に列挙される遺伝子の１つのプロモーターＤＮＡ配列のヌクレオチド２０〜１４８０を有する配列であり、より好ましくは配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列、または表１に列挙される遺伝子の１つのプロモーターＤＮＡ配列のヌクレオチド５００〜１４５０、なおもより好ましくはヌクレオチド８００〜１４２０、最も好ましくはヌクレオチド９００〜１４００を有する配列である。別の好ましいプローブは、転写開始部位上流のＤＮＡ配列の一部である。
【００５７】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドある長いプローブでは、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシー条件は、標準サザンブロット法手順に従った、４２℃で５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌの剪断変性サケ精子ＤＮＡ、および非常に低いおよび低いストリンジェンシーでは２５％ホルムアミド、中程度のおよび中程度〜高ストリンジェンシーでは３５％ホルムアミド、または高いおよび非常に高いストリンジェンシーでは５０％ホルムアミドのいずれかの中でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションと定義される。
【００５８】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブについては、好ましくは非常に低いストリンジェンシーでは少なくとも４５℃で、より好ましくは低いストリンジェンシーでは少なくとも５０℃で、より好ましくは中程度のストリンジェンシーでは少なくとも５５℃で、より好ましくは中程度〜高ストリンジェンシーでは少なくとも６０℃で、なおもより好ましくは高いストリンジェンシーでは少なくとも６５℃で、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシーでは少なくとも７０℃で、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを使用して担体材料を最後に１５分間ずつ３回洗浄する。
【００５９】
長さが約１５ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの短いプローブでは、ストリンジェンシー条件は、ＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２年，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ４８：１３９０頁）に従った計算を使用して計算されたＴｍを５℃〜１０℃下回る温度における、標準サザンブロット法手順に従った、０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１×デンハルト液、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭリン酸二水素ナトリウム、０．１ｍＭのＡＴＰ、および１ｍｌあたり０．２ｍｇの酵母ＲＮＡ中でのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄後ハイブリダイゼーションと定義される。
【００６０】
長さが約１５ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの短いプローブについては、担体材料を計算されたＴｍを５℃〜１０℃下回る温度で、０．１％ＳＤＳ添加６×ＳＣＣで１５分間にわたり１回、６×ＳＳＣを使用して１５分間ずつ２回洗浄する。
【００６１】
別の実施態様に従って、配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列、または表１に列挙される遺伝子の１つのプロモーターＤＮＡ配列を最初に使用して、天然遺伝子と、配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列または表１に列挙される遺伝子の１つのプロモーターＤＮＡ配列と作動可能なように結合する前記天然遺伝子のコード配列またはその一部とをクローニングする。これは、先に定義したような配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列、表１に列挙される遺伝子の１つのプロモーターＤＮＡ配列、またはその部分配列のいずれかから開始して、この配列をプローブとして使用して実施できる。プローブは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）または本願明細書で定義されるあらゆるその他の真菌宿主のいずれかである所与の宿主のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリにハイブリダイズされる。ひとたび天然遺伝子またはその一部がクローニングされたら、それ自体をプローブとして引き続き使用し、ここで述べられるようなハイブリダイゼーション実験によって、その他の真菌に由来する天然遺伝子との相同性を共有する遺伝子をクローニングできる。好ましくは遺伝子は、少なくとも５５％の天然遺伝子との相同性、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、なおもより好ましくは少なくとも７５％好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％、なおもより好ましくは約９５％、最も好ましくは約９７％の天然遺伝子との相同性を共有する。天然遺伝子との相同性を共有する遺伝子のコード配列の上流の配列は、本発明に包含されるプロモーターである。
【００６２】
代案としては、先に定義されたような配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列、またはその部分配列、または表１に列挙される遺伝子配列、またその部分配列を使用して、例えばここで述べられるような配列比較またはＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用してゲノムデータベースを検索して、天然遺伝子の配列と、本発明に従ったプロモーターと作動可能なように結合するコード配列またはその一部とを同定できる。この得られた配列を引き続いて使用して、本願明細書で定義されるようなあらゆるその他の真菌宿主中のオルソログまたは相同遺伝子を同定できる。同定されたオルソログまたは相同遺伝子のコード配列の上流の配列は、本発明に包含されるプロモーターである。
【００６３】
さらに別の実施態様に従って、本発明に従ったプロモーターＤＮＡ配列は、配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列、または表１に列挙される遺伝子の１つのプロモーターＤＮＡ配列と少なくとも８０％の相同性（同一性）を共有する（単離された）ＤＮＡ配列である。好ましくはＤＮＡ配列は、配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列、または表１に列挙される遺伝子の１つのプロモーターＤＮＡ配列と少なくとも好ましくは約８５％、より好ましくは約９０％、なおもより好ましくは約９５％、最も好ましくは約９７％の相同性を共有する。
【００６４】
本発明の目的で、「相同性」および「同一性」という用語は同義的に使用される。
【００６５】
２つの核酸配列間の相同性（同一性）の程度は、好ましくはＢＬＡＳＴプログラムによって判定される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、配列比較の感受性および速度を定める。ＢＬＡＳＴプログラムは、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５頁（１９８９年）を参照されたい）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および双方のストランドの比較をデフォルトとして使用する。
【００６６】
本発明のさらに別の実施態様に従って、プロモーターＤＮＡ配列は、配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列、または表１に列挙される遺伝子の１つのプロモーターＤＮＡ配列の変異型である。
【００６７】
「変異型」または「変異型プロモーター」という用語は、ここで親プロモーターの１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入を含んでなるヌクレオチド配列を有するプロモーターと定義され、変異型プロモーターは対応する親プロモーターよりも高いまたは低いプロモーター活性を有する。「変異型プロモーター」という用語は、天然変異型と、古典的変異誘発、部位特異的変異誘発、およびＤＮＡシャフリングなどの当該技術分野でよく知られている方法を使用して得られた生体外で作り出された変異型とを包含する。変異型プロモーターは１つ以上の変異を有してもよい。各変異はヌクレオチドの独立した置換、欠失、および／または挿入である。
【００６８】
好ましい実施態様に従って、変異型プロモーターは、最初に同定されたプロモーター配列（例えば配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列、または表１に列挙される遺伝子の１つのプロモーターＤＮＡ配列）と比較して、少なくとも１つの修飾調節部位を有するプロモーターである。このような調節部位はその全体を除去でき、または上で説明したように特異的に変異できる。したがってこのようなプロモーター変異体の調節は修飾されて、例えばもはやグルコースによって誘発されなくなる。このようなプロモーター変異体およびこれらを得るための技術の例については、欧州特許第６７３  ４２９号明細書または国際公開第９４／０４６７３号パンフレットで述べられる。
【００６９】
プロモーター変異体は、対立遺伝子変異体であってもよい。対立遺伝子変異型とは、同一染色体の遺伝子座を占有する遺伝子の２つ以上の代案の形態のどちらかを指す。対立遺伝子変異は変異を通じて自然に起き、集団内に多形性をもたらすかもしれない。変異型プロモーターは、（ａ）ＤＮＡを非常に低い、低い、中程度、中程度に高い、高い、または非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列または表１に列挙される遺伝子の１つのプロモーターＤＮＡ配列、（ｉｉ）（ｉ）の部分配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）の相補鎖とハイブリダイズし、（ｂ）ＤＮＡから変異型プロモーターを単離して得てもよい。ストリンジェンシーおよび洗浄条件は、ここで定義されるとおりである。
【００７０】
さらに別の実施態様に従って、プロモーターは、配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列または表１に列挙される遺伝子の１つのプロモーターＤＮＡ配列の部分配列であり、前記部分配列は依然としてプロモーター活性を有する。部分配列は、好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２００ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約３００ヌクレオチドを含有する。
【００７１】
別の好ましい実施態様に従って、部分配列は、配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列または表１に列挙される遺伝子の１つのプロモーターＤＮＡ配列に包含される核酸配列であり、５’および／または３’末端からの１つ以上のヌクレオチドが欠失しており、前記核酸配列は依然としてプロモーター活性を有する。
【００７２】
別の好ましい実施態様に従って、プロモーター部分配列は、「トリミング」されたプロモーター配列、すなわち翻訳開始点および／または転写開始点の上流にある配列断片である。プロモーターをトリミングして機能的に分析する例については、Ｇｅｎｅ．１９９４年８月５；１４５（２）：１７９〜８７頁：ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｐｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ．Ｖｅｒｄｏｅｓ  ＪＣ，Ｐｕｎｔ  ＰＪ，Ｓｔｏｕｔｈａｍｅｒ  ＡＨ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ＣＡ）で述べられる。
【００７３】
本発明に従ったプロモーターは、特異的制限部位を導入して、プロモーター配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを容易にする目的のために、その配列にリンカーが備わっていてもよいプロモーターであることができる。
【００７４】
特に断りのない限り、ここでＤＮＡ分子を配列決定して判定される全てのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定装置を使用して判定された。したがってこの自動化されたアプローチによって判定されたあらゆるＤＮＡ配列について当該技術分野で知られているように、ここで判定されたあらゆるヌクレオチド配列はいくつかの誤りを含有してもよい。自動化によって判定されたヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と、典型的に少なくとも約９０％同一、より典型的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該技術分野でよく知られている手動ＤＮＡ配列決定方法をはじめとするその他のアプローチによって、さらに正確に判定できる。
【００７５】
当業者はこのような誤って同定された塩基を同定でき、このような誤りをどのように修正するかを知っている。
【００７６】
したがってここで提供されるような配列情報が誤って同定された塩基の包含を必要とすると、狭く解釈すべきではない。ここで開示される特定の配列を容易に使用して、例えば糸状菌、特にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）から元のＤＮＡ配列を単離して、さらなる配列分析の対象にでき、それによって配列決定の誤りが同定される。
【００７７】
本発明は、それが関与するプロモーターの生物学的機能を変更しない変異を含有する、機能性プロモーター同等物を典型的に包含する。「機能性同等物」という用語は、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）ＤＮＡ配列のオルソログもまた包含する。Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）ＤＮＡ配列のオルソログは、その他の株または種から単離でき、同様のまたは同一の生物学的活性を有するＤＮＡ配列である。
【００７８】
本発明のプロモーター配列は、あらゆる属の微生物から得られてもよい。本発明の目的で、特定の起源に関連して使用される「から得られる」という用語は、ポリペプチドが起源によって、またはその中に起源からの遺伝子が挿入されている細胞によって、生成されることを意味するものとする。
【００７９】
本発明の実施態様に従って、プロモーター配列は原核生物源から、好ましくは、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ））、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）またはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種から得られる。より好ましくは、プロモーター配列は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．プンチス（ｐｕｎｔｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．ハロデュランス（ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｇ．オキシダンス（ｏｘｙｄａｎｓ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＣＢ１５、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ロドバクター・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、シュードモナス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．グルタミカム（ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）またはリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）から得られる。
【００８０】
別の実施態様に従って、プロモーター配列は真菌源から、好ましくはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株などの酵母株、より好ましくはサッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ダイアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クリヴェリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）またはサッカロミセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）株から得られる。別のより好ましい実施態様に従って、プロモーター配列はクリヴェロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）株から得られる。別のより好ましい実施態様に従って、プロモーター配列はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株から得られる。
【００８１】
さらに別の実施態様に従って、プロモーター配列は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィロバシジウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ファネロカエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株などの糸状菌株から、より好ましくはアガリクス・ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・ツビゲニス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｉｓ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・バデンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｖａｄｅｎｓｉｓ）、クリソスポリウム・ラクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パルロゼラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、シュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）、チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔ��ｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）株から得られる。
【００８２】
さらに別の好ましい実施態様に従って、プロモーター配列は、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・カルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブシナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、またはフザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）株から得られる。
【００８３】
前述の種について、本発明はそれらの知られている種名にかかわらず、完全および不完全世代と、例えば無性世代などのその他の分類学的同等物を包含するものと理解される。当業者は、適切な同等物のアイデンティティを容易に認識するであろう。これらの種の株は、米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などのいくつかの菌株保存機関において、公的に容易に入手できる。
【００８４】
さらに本発明に従ったプロモーター配列は、上述のプローブを使用して、自然界（例えば土壌、堆肥、水など）から単離された微生物をはじめとするその他の起源から同定され、得られてもよい。自然の生息環境から微生物を単離する技術については、当該技術分野でよく知られている。次に別の微生物のゲノムＤＮＡライブラリーを同様にスクリーニングして、核酸配列を得てもよい。ひとたびプロモーターをコードする核酸配列がプローブで検出されたら、当業者に知られている技術を使用して、配列を単離またはクローニングしてもよい（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，前出を参照されたい）。
【００８５】
本発明では、プロモーターＤＮＡ配列はまた、本発明の１つ以上のプロモーターの一部；本発明のプロモーターの一部と、例えば１つのプロモーターのリーダー配列およびその他のプロモーターからの転写開始部位などの別の既知のプロモーターの一部；または本発明の１つ以上のプロモーターの一部と、その他の１つ以上のプロモーターの一部を含んでなるハイブリッドプロモーターであってもよい。その他のプロモーターは、変異型、トランケート型、およびハイブリッドプロモーターをはじめとする、選択された真菌宿主細胞中で転写活性を示すあらゆるプロモーター配列であってもよく、宿主細胞と相同的または異種性のどちらかである、細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られてもよい。その他のプロモーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然であってもまたは外来性であってもよく、細胞にとって天然または外来性であってもよい。
【００８６】
好ましい実施態様に従って、同定されたプロモーターの重要な制御部分配列をその他の「基本的」プロモーターに融合させ、それらのプロモーター活性を増強することができる（例えばＭｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９４年５月；１２（３）：４７９〜９０頁．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｘｙｌａｎａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｘｌｎＡ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ．ｄｅ  Ｇｒａａｆｆ  ＬＨ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ  ＨＣ，ｖａｎ  Ｏｏｙｅｎ  ＡＪ，Ｖｉｓｓｅｒ  Ｊで述べられるように）。
【００８７】
本発明のプロモーターとのハイブリッドプロモーターの構築において有用なその他のプロモーターのその他の例としては、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）酸安定α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）ｇｐｄＡ、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）グルコースオキシダーゼｇｏｘＣ、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性プロテアーゼ、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、およびフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼおよびコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、およびそれらの変異型、トランケート型、およびハイブリッドプロモーターの遺伝子から得られたプロモーターが挙げられる。酵母宿主細胞に有用なその他のプロモーターについては、Ｒｏｍａｎｏｓｅｔら，１９９２年，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３〜４８８頁で述べられる。
【００８８】
本発明では、プロモーターＤＮＡ配列は「タンデムプロモーター」であっても、またはそうでなくてもよい。「タンデムプロモーター」は、そのそれぞれがコード配列と作動可能に結合した関係にあってコード配列のｍＲＮＡへの転写を仲介する、２つ以上のプロモーター配列とここで定義される。
【００８９】
タンデムプロモーターは、本発明の２つ以上のプロモーターを含んでなる。または代案としては本発明の１つ以上のプロモーターと、ハイブリッドプロモーター構築に有用な上で例示されるものなどの１つ以上のその他の既知のプロモーターとを含んでなる。タンデムプロモーターの２つ以上のプロモーター配列が、核酸配列の転写を同時に促進してもよい。代案としては、タンデムプロモーターの１つ以上のプロモーター配列は、細胞の異なる生育段階で、または菌糸体の形態学的に異なる部分で、核酸配列の転写を促進してもよい。
【００９０】
本発明では、プロモーターは、関心のある化合物をコードするコード配列、および／または真菌宿主細胞にとって外来性であってもよい。たとえ野生型プロモーターがコード配列または真菌宿主細胞にとって天然であっても、本発明の変異型、ハイブリッド、またはタンデムプロモーターは、関心のある化合物をコードするコード配列にとって外来性であると理解される。
【００９１】
本発明の変異型、ハイブリッド、またはタンデムプロモーターは、変異型、ハイブリッドまたはタンデムプロモーターが由来する親プロモーターの少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約１００％、なおもより好ましくは少なくとも約２００％、最も好ましくは少なくとも約３００％、最も好ましくは少なくとも約４００％のプロモーター活性を有する。
【００９２】
［コード配列］
本発明では、本発明に従ったＤＮＡコンストラクト中のコード配列は、ポリペプチドをコードしてもよい。ポリペプチドは、関心のある生物学的活性を有するあらゆるポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、本発明に従った宿主細胞と相同的または異種性であってもよい。好ましくはポリペプチドは酵素である。
【００９３】
「ポリペプチド」という用語は、ここで特定の長さのコードされた生成物を指すことは意味せず、したがってペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を包含する。
【００９４】
株は遺伝子またはポリペプチドを実際に含有するので、「相同的な遺伝子」または「相同的なポリペプチド」という用語は、ここでその変異型を含めた同一種に属する株から得られる遺伝子またはポリペプチドと定義される。好ましくは供与および受容株は同一である。変異体または断片がそれに由来する遺伝子またはポリペプチドが、相同的な遺伝子またはポリペプチドであれば、遺伝子またはポリペプチドの断片および変異体もまた、相同的と見なされる。また制御配列とコード配列の非天然の組み合わせは、コード配列が相同的でありさえすれば相同的と見なされる。当然、異種という用語は、ここで供与および受容株が、その同一種または変異型に属さない、遺伝子またはポリペプチドを指す。
【００９５】
「異種のポリペプチド」という用語は、ここで真菌細胞に天然でないポリペプチド、修飾されて天然配列が改変された天然ポリペプチド、または組み換えＤＮＡ技術による真菌細胞操作の結果として発現が定量的に変更されている天然ポリペプチドと定義される。例えば天然ポリペプチドは、例えばコード配列を本発明のプロモーター制御下においてポリペプチドの発現を増強すること、シグナル配列の使用によって細胞外の関心のある天然ポリペプチドの輸送を促進すること、および常態では細胞によって生成されるポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増大させることで、組み換え的に生成されてもよい。
【００９６】
本発明の好ましい態様に従って、ポリペプチドはペプチドホルモンまたはその変異型、酵素、または細胞内タンパク質である。
【００９７】
細胞内ポリペプチドは、分泌過程に関与するタンパク質、折りたたみ過程に関与するタンパク質、ペプチドアミノ酸輸送体、グリコシル化因子、受容体またはその一部、抗体またはその一部、またはレポータータンパク質であってもよい。好ましくは細胞内タンパク質は、シャペロンまたは転写因子である。この例については、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８年１０月；５０（４）：４４７〜５４頁（「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｂｉｐＡ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｂｌａｃｋ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ．Ｐｕｎｔ  ＰＪ，ｖａｎ  Ｇｅｍｅｒｅｎ  ＩＡ，Ｄｒｉｎｔ−Ｋｕｉｊｖｅｎｈｏｖｅｎ  Ｊ，Ｈｅｓｓｉｎｇ  ＪＧ，ｖａｎ  Ｍｕｉｊｌｗｉｊｋ−Ｈａｒｔｅｖｅｌｄ  ＧＭ，Ｂｅｉｊｅｒｓｂｅｒｇｅｎ  Ａ，Ｖｅｒｒｉｐｓ  ＣＴ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ＣＡ）で述べられる。シャペロンまたは転写因子などであるこのコード配列が、タンパク質生産における制限因子であることが知られていれば、これを使用して、例えばタンパク質生産株としての宿主細胞の効率を改善できる。別の好ましい細胞内ポリペプチドは、アマドリアーゼ、カタラーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、リノール酸イソメラーゼ、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＡＣＰ還元酵素、トリコテシン３−Ｏ−アセチル基転移酵素、アルコールデヒドロゲナーゼ、カルニチンラセミ化酵素、Ｄ−マンデル酸デヒドロゲナーゼ、エノイルＣｏＡヒドラターゼ、フルクトシルアミン酸素オキシド還元酵素、２−ヒドロキシヘプタ−２，４−ジエン−１，７−二酸イソメラーゼ、ＮＡＤＰ−依存リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、オキシド還元酵素、キノン還元酵素などの細胞内酵素である。その他の細胞内酵素は、セラミダーゼ、エポキシド加水分解酵素、アミノペプチダーゼ、アシラーゼ、アルドラーゼ、ヒドロキシラーゼ、アミノペプチダーゼである。
【００９８】
本発明の別の好ましい態様に従って、ポリペプチドは細胞外に分泌される。好ましくは細胞外ポリペプチドは酵素である。細胞外酵素の例は、エンドグルカナーゼ、β−グルカナーゼ、セロビオ加水分解酵素またはβ−グルコシダーゼなどのセルラーゼと、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチン酸リアーゼ、エンド−ポリガラクツロナーゼ、エキソポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、アラバナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アラビノキシラン加水分解酵素、ガラクツロナーゼ、リアーゼなどのヘミセルラーゼまたはペクチン分解酵素と、デンプン分解酵素と、フィターゼなどのホスファターゼと、リパーゼなどのエステラーゼと、プロテアーゼ、ペプチダーゼなどのタンパク質分解酵素と、オキシダーゼなどのオキシド還元酵素と、基転移酵素と、またはイソメラーゼと、リグニナーゼなどのペルオキシダーゼである。
【００９９】
本発明に従ったＤＮＡコンストラクトに含まれるコード配列はまた、有機酸、カロチノイド、（β−ラクタム）抗生物質、およびビタミンなどの一次または二次代謝産物の合成に関与する酵素をコードしてもよい。このような代謝産物は、本発明に従った生物学的化合物と見なしてもよい。
【０１００】
関心のあるポリペプチドをコードするコード配列は、あらゆる原核生物、真核生物、またはその他の起源から得られてもよい。好ましくはそれに付随するコード配列およびプロモーターは宿主細胞に相同的であり、自己クローンである組み換え宿主細胞をもたらす。
【０１０１】
本発明の実施態様に従って、本発明に従ったＤＮＡコンストラクト中のコード配列は、例えば国際公開第２００６０７７２５８号パンフレットで述べられるような、最適化されたターミネーター配列を含んでなる変異型の最適化された配列であってもよい。
【０１０２】
コード配列は、部分的合成核酸配列または合成核酸配列全体であってもよい。コード配列は、好ましくは、参照によって本願明細書に援用する国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットおよび／または国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットで述べられる方法に従って、そのコドン使用について最適化されてもよい。国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットは、コドンペア最適化に対処する。コドンペア最適化は、特にポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の改善された発現、および／またはコードされたポリペプチドの改善された生産を得るのに使用されるコドンペアである、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、それらのコドン使用に関して修正される方法である。コドンペアは、コード配列中の引き続くトリプレット（コドン）の２つの組と定義される。
【０１０３】
代案としてはコード配列は、アンチセンスＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）コンストラクトの発現をコードしてもよい。アンチセンス−ＲＮＡの発現例は、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００年２月；６６（２）：７７５〜８２頁（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｏｌｄａｓｅ，ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ａ，ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ．Ｎｇｉａｍ  Ｃ，Ｊｅｅｎｅｓ  ＤＪ，Ｐｕｎｔ  ＰＪ，Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ＣＡ，Ａｒｃｈｅｒ  ＤＢ）または（Ｚｒｅｎｎｅｒ  Ｒ，Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ  Ｌ，Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ  Ｕ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔａｔｏ  ｕｒｉｄｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ．Ｐｌａｎｔａ．（１９９３年）；１９０（２）：２４７〜５２頁）に示される。遺伝子発現の部分的、ほぼ完全、または完全な不活性化は、例えば代謝経路の望まれない側枝を制御する遺伝子を不活性化して、例えば（β−ラクタム）抗生物質またはカロチノイドなどの特定の二次代謝産物の生産を増大させるのに有用である。完全な不活性化はまた、有毒なまたは望まれない化合物の生産を低下させるのにも有用である（ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）中のクリソゲニン；アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中のアフラトキシン：ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ＫＤら，：ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９６３年）３３：３７５〜８３頁）。完全な不活性化はまた、発酵過程および下流処理が改善されるように、生物の形態学を改変するのにも有用である。
【０１０４】
本発明の別の実施態様は、真菌細胞の大規模な代謝再プログラミングまたはエンジニアリングに関する。完全に新しい経路の導入および／または望まれない経路の修正は、タンパク質または代謝産物などの特定化合物の生産に特異的に適応した細胞を提供するであろう。
【０１０５】
本発明の方法で、コード配列がポリペプチドをコードする場合、前記ポリペプチドはまた、その中で別のポリペプチドがポリペプチドまたはその断片のＮ−末端またはＣ−末端に融合した、融合またはハイブリッドポリペプチドを含んでもよい。融合ポリペプチドは、あるポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一部）と、別のポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一部）とを融合させて生成される。融合ポリペプチドを生成する技術については当該技術分野で知られており、ポリペプチドをコードするコード配列がインフレームになり、融合ポリペプチドの発現が同一プロモーターおよびターミネーターに制御されるように、配列をライゲートすることが含まれる。ハイブリッドポリペプチドは、１つ以上が真菌細胞にとって異種性であってもよい、少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られた、部分的または完全なポリペプチド配列の組み合わせを含んでなってもよい。
【０１０６】
［制御配列］
本発明のＤＮＡコンストラクトは、制御配列に適合する条件下で適切な宿主細胞中でのコード配列の発現を誘導するプロモーターＤＮＡ配列に加えて、１つ以上の制御配列を含んでなってもよい。発現は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌をはじめとするが、これに限定されるものではない、ポリペプチドの生産に関与するあらゆるステップを含むものと理解される。１つ以上の制御配列は、コード配列にとってまたは宿主にとって天然であってもよい。代案としては、宿主細胞中のコード配列の発現を改善するために、コード配列にとって外来性である１つ以上の制御配列によって、１つ以上の制御配列を置換してもよい。
【０１０７】
「制御配列」という用語は、ここで本発明に従ったプロモーターをはじめとする、コード配列発現に必要なまたは有利な全ての構成要素を含むものと定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然または外来性であってもよい。このような制御配列としては、リーダーと、例えば国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットで述べられるような最適コザックまたは翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋ，１９９１年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７〜１９８７０頁）と、ポリアデニル化配列と、プロペプチド配列と、シグナルペプチド配列と、上流活性化配列と、変異型、断片、およびハイブリッドをはじめとする本発明に従ったプロモーターと、それに由来するタンデムプロモーターと、転写ターミネーターが挙げられるが、これに限定されるものではない。少なくとも制御配列は、転写および翻訳停止シグナルおよび本発明に従ったプロモーター（の一部）を含む。制御配列には、特定制限部位を導入する目的のためにリンカーが備わっていてもよく、コード配列のコード領域がある制御配列のライゲーションを容易にする。
【０１０８】
制御配列は、適切な転写ターミネーター配列、すなわち宿主細胞によって認識され転写を終結する配列であってもよい。ターミネーター配列は、コード配列の３’末端と作動可能に結合した関係にある。本発明では、選択された宿主細胞中で機能性のあらゆるターミネーターを使用してもよい。
【０１０９】
糸状菌宿主細胞に好ましいターミネーターは、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）アンスラニル酸シンターゼ、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、ｔｒｐＣ遺伝子、およびフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ遺伝子から得られる。
【０１１０】
酵母宿主細胞に好ましいターミネーターは、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）チトクロームＣ（ＣＹＣ１）、およびサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞に有用なその他のターミネーターについてはＲｏｍａｎｏｓら，１９９２年，前出で述べられる。
【０１１１】
制御配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの５’非翻訳領域であってもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端と作動可能に結合した関係にある。本発明では、選択された宿主細胞中で機能性のあらゆるリーダー配列を使用してもよい。
【０１１２】
糸状菌宿主細胞に好ましいリーダーは、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼ、およびＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡの遺伝子から得られる。
【０１１３】
酵母宿主細胞に適切なリーダーは、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子、およびサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１１４】
制御配列はまた、核酸配列の３’末端と配列作動可能に結合した関係にある配列であるポリアデニル化配列であってもよく、それは転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして、宿主細胞によって認識される。本発明では、選択された宿主細胞中で機能性のあらゆるポリアデニル化配列を使用してもよい。
【０１１５】
糸状菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）アンスラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ、およびＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼの遺伝子から得られる。
【０１１６】
酵母宿主細胞に有用なポリアデニル化配列については、ＧｕｏおよびＳｈｅｒｍａｎ，１９９５年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：５９８３〜５９９０頁で述べられる。
【０１１７】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に結合しているアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路内に誘導する、シグナルペプチドコード領域であってもよい。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み枠内で自然に結合する、シグナルペプチドコード領域を固有に含有してもよい。代案としてはコード配列の５’末端は、コード配列にとって外来性であるシグナルペプチドコード領域を含有してもよい。外来性シグナルペプチドコード領域は、コード配列がシグナルペプチドコード領域を自然に含有しない場合に必要かもしれない。代案としてはポリペプチド分泌を増強するために、外来性シグナルペプチドコード領域で天然のシグナルペプチドコード領域を単に置き換えてもよい。しかし本発明では、発現されたポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路内に誘導する、あらゆるシグナルペプチドコード領域を使用してもよい。
【０１１８】
糸状菌宿主細胞に適切なシグナルペプチドコード領域の例は、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、Ａ．フィカム（ｆｉｃｕｕｍ）フィターゼ、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）エンドキシラナーゼ、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、およびフミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。
【０１１９】
酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼの遺伝子から得られる。その他の有用なシグナルペプチドコード領域については、Ｒｏｍａｎｏｓｅｔら，１９９２年，前出で述べられる。
【０１２０】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に配置されたアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であってもよい。得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（または場合によっては酵素原）として知られている。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって、成熟活性ポリペプチドに変換できる。プロペプチドコード領域は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性プロテアーゼ（ａｐｒＥ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、およびＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）エンドキシラナーゼ（ｅｎｄｏ１）の遺伝子から得られてもよい。
【０１２１】
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の双方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣に配置され、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の隣に配置される。
【０１２２】
遺伝子増幅を可能にする制御配列を付加することもまた、望ましいかもしれない。制御配列の例は真核細胞系にあり、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、および重金属によって増幅されるメタロチオネイン遺伝子である。
【０１２３】
ｃｒｅＡ結合部位の除去（先に欧州特許第６７３  ４２９号明細書で述べられたような炭素異化産物抑制）、（ｐＨおよび窒素調節のための）ｐａｃＣおよびａｒｅＡの変化が、重要であり得る。
【０１２４】
［発現ベクター］
本発明はまた、ＤＮＡコンストラクト（本発明に従ったプロモーターＤＮＡ配列と作動可能に結合した関係にあるコード配列を含んでなる）を含んでなる、組み換え発現ベクターにも関する。場合により、本発明の少なくとも２つのＤＮＡコンストラクト（プロモーターＤＮＡ配列と作動可能に結合した関係にあるコード配列を含んでなる）は単一ＤＮＡコンストラクトに含まれ、その単一ＤＮＡコンストラクトは組み換え発現ベクターに含まれる。
【０１２５】
好ましくは本発明の少なくとも１つのＤＮＡコンストラクト（プロモーターＤＮＡ配列と作動可能に結合した関係にあるコード配列を含んでなる）は、ベクター上に存在する。ベクターは、染色体の組み込み体として、および／または自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入される。
【０１２６】
組み換え発現ベクターは、好都合には組み換えＤＮＡ手順の対象になることができ、コード配列の発現をもたらすことができる、あらゆるベクター（例えばプラスミドまたはウィルス）であってもよい。ベクターの選択は、典型的にその中にベクターが導入される宿主細胞と、ベクターとの適合性に左右されるであろう。ベクターは、線状プラスミドまたは閉環状プラスミドであってもよい。当業者は当該技術分野の一般知識を使用して、適切で都合よいベクターをどのように選択するかを知っている。
【０１２７】
ベクターは、自己複製ベクター、すなわち例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体など、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体の複製と関わりを持たないベクターであってもよい。自律複製のために、ベクターは複製起点を含んでなって、ベクターが件の宿主細胞中で自律的に複製できるようにしてもよい。酵母宿主細胞で使用される複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組み合わせ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組み合わせである。複製起点は、宿主細胞中でその機能を温度感受性にする変異を有するものであってもよい（例えばＥｈｒｌｉｃｈ，１９７８年，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ７５：１４３３頁を参照されたい）。糸状菌中で自律的に維持されるクローニングベクターの例は、ＡＭＡ１−配列を含んでなるクローニングベクターである。ＡＭＡ１はＡ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）から単離された６．０ｋｂのゲノムＤＮＡ断片であり、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中で自律的維持ができる（例えばＡｌｅｋｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ（１９９７年），Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．２１：３７３〜３９７頁を参照されたい）。
【０１２８】
代案としてはベクターは、宿主細胞中に導入されるとゲノムに組み込まれ、それを中に組み込んだ染色体と共に複製されるものであってもよい。このような組み込み系の例については、欧州特許第０３５７１２７Ｂ１号明細書で述べられる。さらに宿主細胞のゲノム中に導入される全ＤＮＡ、またはトランスポゾンを共に含有する単一ベクターまたはプラスミド、または２つ以上のベクターまたはプラスミドを使用してもよい。
【０１２９】
本発明のベクターは、好ましくは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする１つ以上の選択可能なマーカーを含有する。宿主は、選択マーカーを含んでなる少なくとも２つのベクターで同時形質転換されてもよい。選択可能なマーカーは、その生成物が、殺生剤またはウィルス性抵抗性、重金属抵抗性、栄養要求株への原栄養性などを提供する遺伝子である。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。糸状菌宿主細胞で使用するための選択可能なマーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイル基転移酵素）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチル基転移酵素）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンリン酸転移酵素）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニル基転移酵素）、ｔｒｐＣ（アンスラニル酸シンターゼ）、ならびにそれらの同等物が挙げられるが、これに限定されるものではない。例えばフレオマイシン、ハイグロマイシンＢまたはＧ４１８などに対する抵抗性を与えるマーカーもまた使用できる。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞で使用するために好ましいのは、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子、およびストレプトミセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子である。ａｍｄＳマーカー遺伝子は、好ましくは、欧州特許第６３５  ５７４号明細書または国際公開第９７／０６２６号パンフレットで述べられる技術を応用して使用され、それによって同一選択マーカー遺伝子を使用して再形質転換できる、選択マーカー非含有組み換え宿主細胞を開発できるようになる。好ましい選択マーカー遺伝子は、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡプロモーター（欧州特許第６３５  ５７４号明細書）と融合したＡ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳコード配列である。その他の糸状菌からのＡｍｄＳ遺伝子もまた、使用してもよい（国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）。
【０１３０】
相同的または非相同的組換えによるゲノム中へのベクターの安定した組み込みのために、ベクターは、宿主細胞ゲノム中への組み込みのために、プロモーター配列および／またはポリペプチドまたはあらゆるその他のベクター要素をコードするコード配列に依存してもよい。代案としてはベクターは、宿主細胞ゲノム中への相同的組換えによる組み込みを誘導するために、追加的な核酸配列を含有してもよい。追加的核酸配列は、ベクターが染色体中の正確な位置で宿主細胞ゲノム中に組み込まれるようにする。正確な位置における組み込みの可能性を高めるために、組み込み要素は、対応する標的配列との高い同一性割合を有して相同的組換えの確率を高める、好ましくは十分な数の、好ましくは少なくとも３０ｂｐ、好ましくは少なくとも５０ｂｐ、好ましくは少なくとも０．１ｋｂ、なおも好ましくは少なくとも０．２ｋｂ、より好ましくは少なくとも０．５ｋｂ、なおもより好ましくは少なくとも１ｋｂ、最も好ましくは少なくとも２ｋｂの核酸を含有すべきである。好ましくは宿主細胞ゲノム中への標的を定めた組み込み、すなわち所定の標的遺伝子座への組み込みの効率は、宿主細胞の強化された相同的組換え能力によって増大する。このような細胞表現型は、好ましくは国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットで述べられるように、欠損ｋｕ７０遺伝子を伴う。国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットは、標的を定めた組み込み効率の増大を含んでなる、糸状菌細胞を得る好ましい方法を開示する。組み込み要素は、宿主細胞ゲノム中の標的配列と相同的なあらゆる配列であってもよい。さらに組み込み要素は、非コード化またはコード化核酸配列であってもよい。標的を定めた組み込みを促進するために、クローニングベクターは好ましくは、宿主細胞の形質転換に先だって直鎖化される。直鎖化は好ましくは、クローニングベクターの少なくとも一端、好ましくは両端が、標的遺伝子座と相同的な配列で挟まれるように実施される。
【０１３１】
好ましくは、標的遺伝子座に相同的なクローニングベクター中の組み込み要素は、高度に発現される遺伝子座に由来し、すなわちそれらは、真菌宿主細胞中において高レベル発現能力がある遺伝子に由来する。高レベル発現能力がある遺伝子、すなわち高度に発現される遺伝子は、ここで例えば誘導条件下で、そのｍＲＮＡが総細胞ｍＲＮＡの少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）を構成できる遺伝子、または代案としては、その遺伝子産物が総細胞タンパク質の少なくとも１％（ｗ／ｗ）を構成でき、あるいは分泌される遺伝子産物の場合は、少なくとも０．１ｇ／ｌのレベルで分泌できる、遺伝子と定義される（欧州特許第３５７  １２７Ｂ１号明細書で述べられるように）。いくつかの好ましい高度発現真菌遺伝子の例は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からのアミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、グリセルアルデヒド−リン酸デヒドロゲナーゼまたはセロビオ加水分解酵素遺伝子である。これらの目的でより好ましい高度発現遺伝子は、好ましくはＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子であるグルコアミラーゼ遺伝子、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡ遺伝子、配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列の遺伝子座または表１に列挙される遺伝子の遺伝子座、配列番号１３〜５５の組から選択される配列のＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）遺伝子座または表１に列挙される遺伝子のＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）遺伝子座、またはトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオ加水分解酵素遺伝子である。
【０１３２】
代案としてはベクターは、非相同的組換えによって宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよい。
【０１３３】
ポリペプチドをコードする核酸配列を１コピーよりも多く宿主細胞に挿入して、遺伝子産物の生産を増大させてもよい。これは好ましくは、ＤＮＡ配列のコピーをそのゲノムに組み込むことで、より好ましくは、例えばグルコアミラーゼ遺伝子座または配列番号１〜４および１３〜５５の組から選択される配列の遺伝子座または表１に列挙される遺伝子の遺伝子座などの高度発現遺伝子座をＤＮＡ配列組み込みの標的とすることで、実施できる。代案としてはこれは、核酸配列がある増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を含めることで実施でき、適切な選択可能作用剤の存在下で細胞を培養することで、選択可能マーカー遺伝子の増幅されたコピー、ひいては核酸配列の追加的コピーを含有する細胞を選択できる。過剰発現するＤＮＡ配列のコピー数をなおもより増加させるためには、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットで述べられるような遺伝子変換の技術を使用できる。
【０１３４】
上述の要素をライゲートして、本発明の組み換え発現ベクターを構築するのに使用される手順については、当業者によく知られている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，前出を参照されたい）。
【０１３５】
［形質転換］
細胞中への発現ベクターまたは核酸コンストラクトの導入は、一般に知られている技術を使用して実施される。それはそれ自体公知の様式におけるプロトプラスト形成、プロトプラスト形質転換、および細胞壁再生からなる処理を伴ってもよい。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞の形質転換のための適切な手順については、欧州特許第２３８  ０２３号明細書、およびＹｅｌｔｏｎら，１９８４年，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８１：１４７０〜１４７４頁で述べられる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を使用した、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびその他の糸状菌宿主細胞の形質転換のための適切な手順については、例えばＮａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８年９月；１６（９）：８３９〜４２頁．正誤表：Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９８年１１月；１６（１１）：１０７４頁．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ．ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ＭＪ，Ｂｕｎｄｏｃｋ  Ｐ，Ｈｏｏｙｋａａｓ  ＰＪ，Ｂｅｉｊｅｒｓｂｅｒｇｅｎ  ＡＧ．Ｕｎｉｌｅｖｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓで述べられる。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を形質転換する適切な方法については、Ｍａｌａｒｄｉｅｒら，１９８９年，Ｇｅｎｅ  ７８：１４７１５６または国際公開第９６／００７８７号パンフレットで述べられる。Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｐｌａｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｇｕｓ，Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｆ．ｓｐ．ｈｏｒｄｅｉ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ＳＫ，Ｋｎｕｄｓｅｎ  Ｓ，Ｇｉｅｓｅ  Ｈ．Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．１９９５年１２月；  ２９（１）：１００〜２頁で述べられるような遺伝子銃形質転換を使用した方法などのその他の方法も応用できる。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．およびＳｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，編，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１９４巻，１８２〜１８７頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏら，１９８３年，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １５３：１６３頁；およびＨｉｎｎｅｎら，１９７８年，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ７５：１９２０頁で述べられる手順を使用して形質転換してもよい。
【０１３６】
本発明は、
（ａ）少なくとも２つのＤＮＡコンストラクトを提供するステップと、
（ｂ）適切な宿主細胞を提供するステップと、
（ｃ）前記宿主細胞を前記ＤＮＡコンストラクトで形質転換するステップと、
を含んでなり、各ＤＮＡコンストラクトがプロモーターＤＮＡ配列と作動可能に結合した関係にあるコード配列を含んでなり、少なくとも２つのＤＮＡコンストラクトが少なくとも２つの別々のプロモーターＤＮＡ配列を含んでなり、前記ＤＮＡコンストラクトに含まれるコード配列が関連ポリペプチドをコードする、本発明に従った組み換え宿主細胞を調製する方法にさらに関する。
【０１３７】
場合により、前記２つのＤＮＡコンストラクトは単一コンストラクトに含まれる。場合により、少なくとも１つのＤＮＡコンストラクトはベクター上に存在する。
【０１３８】
好ましい実施態様に従って、形質転換ステップは少なくとも２つの別個の形質転換事象によって実施される。形質転換事象は、ここで親宿主細胞中へのＤＮＡコンストラクトの導入、および親細胞の形質転換された子孫の単離による形質転換手順と定義される。
【０１３９】
［発現］
本発明は、適切な宿主細胞中でコード配列を発現する方法にさらに関する。本方法は、
（ａ）少なくとも２つのＤＮＡコンストラクトを提供するステップと、
（ｂ）適切な宿主細胞を提供するステップと、
（ｃ）前記宿主細胞を前記ＤＮＡコンストラクトで形質転換するステップと、
（ｄ）前記宿主細胞をコード配列の発現を実施できる条件下で培養するステップと、
を含んでなり、各ＤＮＡコンストラクトがプロモーターＤＮＡ配列と作動可能に結合した関係にあるコード配列を含んでなり、少なくとも２つのＤＮＡコンストラクトが少なくとも２つの別々のプロモーターＤＮＡ配列を含んでなり、前記ＤＮＡコンストラクトに含まれるコード配列が関連ポリペプチドをコードする。
【０１４０】
場合により、前記２つのＤＮＡコンストラクトは単一コンストラクトに含まれる。場合により、少なくとも１つのＤＮＡコンストラクトはベクター上に存在する。
【０１４１】
好ましい実施態様に従って、形質転換ステップは少なくとも２つの別個の形質転換事象によって実施される。
【０１４２】
本発明は、本発明に従った組み換え宿主細胞をコード配列の発現を実施できる条件下で培養することで、コード配列を発現する方法にさらに関する。
【０１４３】
［生産］
本発明は、
（ａ）本発明に従った組み換え宿主細胞をポリペプチドの発現を実施できる条件下で培養するステップと、
（ｂ）場合によりポリペプチドを培養ブロスから回収するステップと、
（ｃ）場合によりポリペプチドを精製するステップと、
を含んでなる、ポリペプチドを生産する方法にさらに関する。
【０１４４】
本発明はまた、
（ａ）本発明に従った組み換え宿主細胞を代謝産物の生産を実施できる条件下で培養するステップと、
（ｂ）場合により代謝産物を培養ブロスから回収するステップと、
（ｃ）場合により代謝産物を精製するステップと、
を含んでなる、代謝産物を生産する方法にも関する。
【０１４５】
本発明の生産方法において、細胞は、当該技術分野で知られている技術を使用して、ポリペプチドまたは代謝産物の生産に適した栄養培地で培養される。本発明の限定を意図しない培養法の例は、液内発酵、固体上の表面発酵、および液体基質上の表面発酵である。例えば細胞は、適切な培地中で、コード配列が発現できおよび／またはポリペプチドが単離できるようにする条件下で実施される、実験室または工業酵槽内の振盪フラスコ培養、小規模または大規模発酵（連続、バッチ、流加、または固体発酵をはじめとする）によって培養してもよい。培養は、当該技術分野で知られている手順を使用して、炭素および窒素源および無機塩を含んでなる適切な栄養培地中で行われる。適切な培地は販売元から入手でき、または（例えば米国微生物系統保存機関のカタログで）公開される組成に従って調製してもよい。ポリペプチドまたは代謝産物が栄養培地中に分泌される場合、ポリペプチドまたは代謝産物は、培地から直接回収できる。ポリペプチドまたは代謝産物が分泌されない場合、それは細胞溶解産物から回収できる。
【０１４６】
ポリペプチドは、当該技術分野で知られている、ポリペプチドに対して特異的な技術を使用して検出されてもよい。これらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成、または酵素基質の消失を含んでもよい。
【０１４７】
得られたポリペプチドまたは代謝産物は、当該技術分野で知られている方法によって回収してもよい。例えばポリペプチドまたは代謝産物を遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿をはじめとするが、これに限定されるものではない従来の手順によって、栄養培地から回収してもよい。
【０１４８】
ポリペプチドは、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動手順（例えば分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出をはじめとするが、これに限定されるものではない当該技術分野で知られている多様な手順によって精製してもよい（例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ，編，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年を参照されたい）。
【０１４９】
［発現の調節］
本発明はまた、真菌宿主細胞に内在性である、関心のある化合物をコードするコード配列の発現を変更するための、配列番号１〜４および１３〜５５からなる組から選択されるヌクレオチド配列と、表１に列挙される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列とを含んでなる、ＤＮＡ配列プロモーターを含んでなる核酸コンストラクトにも関する。コンストラクトは、内在性遺伝子の発現を変更するのに必要な最小数の構成要素を含有してもよい。
【０１５０】
好ましい実施態様に従って、核酸コンストラクトは、（ａ）標的配列、（ｂ）配列番号１〜４および１３〜５５の配列からなる組から選択されるヌクレオチド配列と、表１に列挙される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列を含んでなるプロモーターＤＮＡ配列、（ｃ）エクソン、および（ｄ）スプライス供与部位を含有する。細胞への核酸コンストラクトの導入に際して、コンストラクトは相同的組換えによって内在性遺伝子部位で細胞ゲノムに組み込まれる。標的配列は、要素（ｂ）〜（ｄ）が内在性遺伝子と作動可能に結合した関係になるように、要素（ａ）〜（ｄ）の内在性遺伝子中への組み込みを誘導する。
【０１５１】
別の実施態様に従って、核酸コンストラクトは、（ａ）標的配列、（ｂ）配列番号１〜４および１３〜５５の配列、および表１に列挙される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列からなる組から選択されるヌクレオチド配列を含んでなるプロモーターＤＮＡ配列、（ｃ）エクソン、（ｄ）スプライス供与部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライス受容部位を含有し、標的配列は、要素（ｂ）〜（ｆ）が内在性遺伝子と作動可能に結合した関係になるように要素（ａ）〜（ｆ）の組み込みを誘導する。しかしコンストラクトは、選択可能なマーカーなどの追加的構成要素を含有してもよい。使用できる選択可能なマーカーは、ここで先に述べたものである。
【０１５２】
双方の実施態様で、これらの構成要素の導入は、その中で内在性遺伝子の発現が変更される新しい転写単位の生産をもたらす。本質的に新しい転写単位は、コンストラクトと内在性遺伝子を標的とすることで導入された配列の融合産物である。その中で内在性遺伝子が改変される実施態様に従って、遺伝子は活性化される。この実施態様に従って、遺伝子が、対応する親細胞中で顕性であるよりも高レベルで発現するようにする制御配列の挿入を通じて、相同的組換えを使用して、常態では親細胞の内在性遺伝子に付随する調節領域を置換、中断、または無効化する。
【０１５３】
標的配列は、内在性遺伝子内にあり、遺伝子に直接隣接し、上流遺伝子内であり、または上流で内在性遺伝子から少し離れていることができる。１つ以上の標的配列が使用できる。例えば環状プラスミドまたはＤＮＡ断片が好ましくは単一標的配列を用いるのに対し、線状プラスミドまたはＤＮＡ断片は好ましくは２つの標的配列を用いる。
【０１５４】
コンストラクトは、内在性遺伝子の１つ以上のエクソンをさらに含有する。エクソンはＤＮＡ配列と定義され、それはＲＮＡ中にコピーされて、エクソン配列が内在性遺伝子のコード領域と共にインフレームであるように成熟ｍＲＮＡ分子中に存在する。エクソンは場合により、１つ以上のアミノ酸をコードし、および／またはアミノ酸を部分的にコードする、ＤＮＡを含有できる。代案としてはエクソンは、５’非コード領域に相当するＤＮＡを含有する。外来性エクソンまたはエクソン群が、１つ以上のアミノ酸および／またはアミノ酸の一部をコードする場合、核酸コンストラクトは、転写およびスプライシングに際して、第２のエクソンに由来するｍＲＮＡの部分の適切な読み枠が変化しないよう、読み枠が内在性遺伝子のコード領域と共にインフレームにあるようにデザインされる。コンストラクトのスプライス供与部位は、エクソンと別のエクソンとのスプライシングを誘導する。典型的に、第１のエクソンは第２のエクソンの５’の位置にあり、スプライス供与部位は第１のエクソンと重なってその３’側に隣接し、第２のエクソンの５’側に隣接するスプライス受容部位を認識する。スプライス供与部位と同様に、スプライス受容部位は、エクソンと別のエクソンとのスプライシングを誘導する配列である。スプライス供与部位と連動して、スプライシング装置はスプライス受容部位を使用して、イントロン除去をもたらす。
【０１５５】
ＤＮＡ配列の発現を変更する好ましいストラテジーは、特定のＤＮＡ配列の欠失および／または本発明に従ったプロモーターなどの修飾プロモーターＤＮＡ配列による、特定のＤＮＡ配列の内在性プロモーター配列の置換を含んでなる。欠失および置換は、好ましくは欧州特許第０  ３５７  １２７号明細書で述べられる遺伝子置換技術によって実施される。遺伝子および／またはプロモーター配列の特定の欠失は、好ましくは欧州特許第６３５  ５７４号明細書で述べられるように、ａｍｄＳ遺伝子を選択マーカー遺伝子として使用して実施される。欧州特許第６３５  ５７４号明細書で述べられるように、フルオロアセタミドの対抗選択の手段によって得られる株は選択マーカーを含まず、さらなる遺伝子改変のために使用できる。
【０１５６】
代案として、またはその他の言及される技術と組み合わせて、Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（２０００年）Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ，Ｍ−Ｋ．，Ｇｈｉｃｏ，Ｊ−Ｍ．ａｎｄ  ｄ’Ｅｎｆｅｒｔ  Ｃ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２８巻，第２２号で述べられるように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのコスミドの生体内遺伝子組み換えに基づく技術が使用できる。この技術は、例えばＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）のようなその他の糸状菌に応用される。
【０１５７】
ここで示される特定の実施態様は、本発明のいくつかの態様の例示であることが意図されるので、ここで述べられ特許請求される本発明は、これらの実施態様によって範囲を限定されるものではない。本発明のあらゆる同等の実施態様および／または好ましい態様の組み合わせは、本発明の範囲内であることが意図される。実際、ここで示され述べられるものに加えて、本発明の様々な改変は、当業者にとっては前述の説明から明らかになるであろう。このような改変もまた添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。矛盾点がある場合、定義を含めた本開示が優先するものとする。
【０１５８】
［実施例］
［実験情報］
［株］
ＷＴ  １：このＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）株は野生型株として使用される。この株は寄託番号ＣＢＳ  ５１３．８８の下にＣＢＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに寄託された。
【０１５９】
ＷＴ  ２：このＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）株は、グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）をコードする遺伝子の欠失を含んでなるＷＴ  １株である。ＷＴ  ２は、欧州特許第０  ６３５  ５７４  Ｂ１号明細書で述べられるような「ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥ」アプローチを使用して構築された。この特許では、ＣＢＳ  ５１３．８８のゲノム中のｇｌａＡ特異的ＤＮＡ配列をどのようにして消去するのかが詳細に述べられる。手順はＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ  ＦＲＥＥΔｇｌａＡ組み換えＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ  ５１３．８８株をもたらし、それは最終的に外来性ＤＮＡ配列を全く有さなかった。
【０１６０】
ＢＦＲＭ  ４４：このシュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）株は実施例９で使用され、寄託番号ＢＲＦＭ  ４４の下に、Ｂａｎｑｕｅ  ｄｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｆｏｎｇｉｑｕｅｓ  ｄｅ  Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｍａｒｓｅｉｉｌｅ，Ｆｒａｎｃｅから入手できる。
【０１６１】
［グルコアミラーゼ活性アッセイ］
グルコアミラーゼ活性は、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットで述べられるようにして、シグマ（Ｓｉｇｍａ）からのｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシドを使用して判定された。
【０１６２】
［実施例１：コード配列と作動可能に結合した関係にある本発明に従ったプロモーターを含んでなるＤＮＡコンストラクトの構築］
本実施例は、本発明に従ったプロモーターの制御下における発現コンストラクトの構築について述べる。ここで使用されるコード配列またはレポーターコンストラクトは、Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ  ５１３．８８グルコアミラーゼ酵素をコードするｇｌａＡ遺伝子である。グルコアミラーゼをレポーター酵素として使用して、本発明に従ったプロモーターの活性を測定できる。
【０１６３】
［１．１  組み込み型グルコアミラーゼ発現ベクター（ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ）の説明］
Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）からのグルコアミラーゼプロモーターおよびグルコアミラーゼコード化遺伝子ｇｌａＡを国際公開第９９／３２６１７号パンフレットで述べられている発現ベクターｐＧＢＴＯＰ−８にクローンした。既知の原理、および通例のクローニング技術に従ってクローニングを実施して、プラスミドｐＧＢＴＯＰＧＬＡを得た（図１参照）。本質的にこの発現ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクター中の３’および３’’ｇｌａＡ標的部位で挟まれた、グルコアミラーゼプロモーター、コード配列、およびターミネーター領域を含んでなる。
【０１６４】
［１．２  多重クローニング部位ＭＣＳによる組み込み型グルコアミラーゼ発現ベクター（ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−２）の構築］
当業者に知られているＰＣＲ法により（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出）、１ｎｇのｐＧＢＴＯＰＧＬＡをテンプレートとして使用して、ｇｌａＡコード配列の一部を含有して、ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位に挟まれるＰＣＲ断片を作り出した。この断片をＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩで消化して、ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩ消化ベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡに導入し、ベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−２をもたらす（図２参照）。ＭＣＳと、ｇｌａＡコード配列の一部とを含んでなる導入ＰＣＲ断片の配列を配列分析によって確認した。
【０１６５】
［１．３  本グルコアミラーゼコード配列と作動可能に結合した関係にある本発明に従ったプロモーターによる組み込み型発現ベクター（ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−３）の構築］
以下を使用して、当業者に知られているＰＣＲ法によって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出）、株ＣＢＳ  ５１３．８８のゲノムＤＮＡを配列決定し分析した。
５’−末端にＸｈｏＩ制限部位がある、配列番号１３〜５５の組から選択される配列および表１に列挙される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列のヌクレオチド１〜２０を含有する５’−ＰＣＲプライマー、および
３’−末端にＡｓｃＩ制限部位がある、すぐ上で選択された配列のヌクレオチド１４７７〜１４９７（場合によっては２０００ヌクレオチド前後）を含有する３’−ＰＣＲプライマー、および
テンプレートとしての株ＣＢＳ  ５１３．８８のゲノムＤＮＡ。
適切な制限部位は、ＰＣＲ増幅によって本発明に従ったプロモーターに付着される。配列番号１３〜５５の１つ、または表１に列挙される遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列の１つを含んでなる、およそ１．５〜２ｋｂの得られた断片をＡｓｃＩおよびＸｈｏＩで消化して、ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ消化ベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−２に導入し、例えばベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１６（ベクターの一般レイアウトについては図３を参照されたい）、および例えば表２に列挙されるようなその他のベクターを得た。
【０１６６】
【表２】
2010517587.tif 000003
【０１６７】
本発明に従ったプロモーターを含んでなる導入されたＰＣＲ断片の配列は、配列分析によって確認された。
【０１６８】
［実施例２．ＤＮＡコンストラクトによって形質転換された真菌宿主細胞］
下記の例では、形質転換によって発現コンストラクトが真菌宿主細胞に導入される。
【０１６９】
追加的なｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１、およびｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１６〜−１９ベクターをＷＴ  １に導入し、ｇｌａＡコピー数を増大させるために、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットおよび国際公開第９９／３２６１７号パンフレットで述べられるようにして、形質転換および引き続く形質転換体の選択を実施した。手短に述べると、前述のｐＧＢＴＯＰＧＬＡベクターの線状ＤＮＡを単離して、ｐＧＢＡＡＳ−１と称されるａｍｄＳ選択可能なマーカー遺伝子含有ベクター（欧州特許第６３５５７４Ｂ１号明細書で述べられるようにして構築される）で同時形質転換した。ベクターは、どちらのタイプもＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）宿主株のｇｌａＡ遺伝子座に相同的な２つのＤＮＡドメインを含んでなり、ＷＴ  １におけるｇｌａＡの３’−３’’ターミネーター遺伝子座のターゲティングを誘導する。形質転換体をアセトアミド培地上で選択し、標準の操作手順に従ってコロニーを純化した。胞子をフルオロ−アセトアミド培地上に播種して、ａｍｄＳマーカーを失った株を選択した。生育するコロニーをｇｌａＡ遺伝子座における組み込みおよびコピー数について診断した。ｇｌａＡの追加的コピーがあるｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１、−１６、−１７、−１８、および−１９の形質転換体を選択した。
【０１７０】
代案としては図７に図示されるような環状コンストラクトを使用して、ＷＴ  １のｇｌａＡコード配列でゲノムに組み込むことができる。さらに選択可能マーカー遺伝子、および本発明に従ったプロモーターに制御される関心のある遺伝子は、単一コンストラクト上にあってもよい。このベクターの例および形質転換における使用方法については、国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されている。
【０１７１】
［実施例３．真菌宿主細胞中における本発明に従ったプロモーター制御下での追加的ｇｌａＡ遺伝子の導入］
宿主細胞中で特定遺伝子の発現レベルを変更し増大させるために、本発明に従ったプロモーターに作動可能なように結合するグルコアミラーゼの追加的コピーを特定の宿主細胞に導入できる。この例では、ｇｌａＡコード配列と作動可能なように結合する本発明のプロモーターを真菌宿主細胞中で、内生的に存在するグルコアミラーゼをコードするｇｌａＡ遺伝子の隣に導入する。下記の例では、選択された形質転換体中において、レポーター（グルコアミラーゼ）の活性を測定して本発明のプロモーターの活性を測定する。したがってグルコアミラーゼ活性は培養ブロス中で判定される。
【０１７２】
選択されたＷＴ  １のｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１、１６、−１７、−１８、−１９形質転換体と、ＷＴ  １およびＷＴ  ２株の双方とを使用して、５００ｍｌ邪魔板付き振盪フラスコを使用して、恒温器振盪機内において３４℃および１７０ｒｐｍで、欧州特許第６３５  ５７４Ｂ号明細書で述べられるような１００ｍｌの培地中における振盪フラスコ実験を実施した。４および６日間の発酵後、サンプルを採取して上述のようにグルコアミラーゼ活性を判定した。４または６日間のどちらかの培養後に、選択されたＷＴ  １のｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１、−１６、−１７、−１８、−１９形質転換体中のグルコアミラーゼ活性は、ＷＴ  １と比較して増大した（図４）。意外にもｇｌａＡ以外の別のプロモーターの制御下にある第２のｇｌａＡ遺伝子コピーを導入することは、コピー数に基づいて予期される以上に発現を増大させることが示された（２００％を超える）。また修飾ｇｌａＡまたはａｍｙＢプロモーターを使用して、コピー数に基づいて予期される以上の増大が同定された。
【０１７３】
さらにｐＧＢＴＯＰＧＬＡコンストラクトの複数コピーがある株は、全ベクターに対して少なくとも５コピーまでは、遺伝子コピーあたりの生産が一定であることを示した（データ示さず）。
【０１７４】
［実施例４．本発明に従ったプロモーターを含んでなるプロモーター置換コンストラクトｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＬＡＡの構築］
宿主細胞中の特定遺伝子の発現レベルを変更するために、本発明に従ったプロモーターで前記特定遺伝子の内在性プロモーターを置換できる。この実施例では、真菌宿主細胞中において、本発明に従ったプロモーターで、グルコアミラーゼをコードするｇｌａＡ遺伝子のプロモーターを置換する。実施例４、５、および６は、この過程のいくつかの異なるステップについて述べる。
【０１７５】
公知の原理に従って、グルコアミラーゼプロモーターのための置換ベクターをデザインし、通例のクローニング手順に従って構築した（図５参照）。本質的にｇｌａＡプロモーター置換ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＬＡＡは、予定されるゲノム遺伝子座における相同的組換えを通じて、本発明に従ったプロモーターにより置換される、ｇｌａＡプロモーター配列のおよそ１０００ｂｐの隣接領域を含んでなる。ここで使用される隣接領域（図５参照）は、ｇｌａＡプロモーターの５’上流領域およびｇｌａＡコード配列の一部である。さらに置換ベクターは直列反復配列の間に、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）双方向性ａｍｄＳ選択マーカーを含有する。本実施例で使用される直列反復配列は、ｇｌａＡコード配列の一部である。これらの欠失ベクターの一般デザインについては、以前、欧州特許第６３５５７４Ｂ１号明細書および国際公開第９８／４６７７２号パンフレットで述べられている。
【０１７６】
［実施例５．真菌宿主細胞中における本発明に従ったプロモーターによるｇｌａＡプロモーターの置換］
ＮｏｔＩ−消化欠失ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＬＡＡの線状ＤＮＡを単離して使用し、ＷＴ  １（ＣＢＳ  ５１３．８８）を形質転換した。この線状ＤＮＡはｇｌａＡ遺伝子座でゲノムに組み込むことができ、したがってｇｌａＡプロモーター領域をａｍｄＳと本発明に従ったプロモーターとを含有するコンストラクトで置換する（図６参照）。形質転換体をアセトアミド培地上で選択して、標準の操作手順に従ってコロニーを純化した。ｇｌａＡ遺伝子座における組み込みのために、生育するコロニーをＰＣＲによって診断した。ｇｌａＡプロモーターの欠失は、本発明に従ったプロモーターに特異的なサイズのバンドの増幅、およびｇｌａＡプロモーターに対して特異的なバンドの損失によって検出可能であった。胞子をフルオロ−アセトアミド培地上に播種し、ａｍｄＳマーカーを喪失した株を選択した。候補株をグルコアミラーゼプロモーターの適切な欠失と、本発明に従ったプロモーターによる置換について、サザン分析を使用して試験した。本発明に従ったプロモーターにより置換されたｇｌａＡプロモーターがあり、復元された機能性ｇｌａＡコード配列を有する代表的な株として、ｄＰＧＬＡＡ株を選択した（図６参照）。
【０１７７】
［実施例６．真菌宿主細胞中における、本発明に従った置換プロモーターの制御下にあるｇｌａＡコード配列によってコードされるグルコアミラーゼポリペプチドの生産］
選択されたｄＰＧＬＡＡ株（適切なＷＴ  １のｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＬＡＡ形質転換体、実施例５で単離された）および株ＷＴ  １を使用して、５００ｍｌ邪魔板付き振盪フラスコを使用して、恒温器振盪機内において３４℃および１７０ｒｐｍで、欧州特許第６３５  ５７４Ｂ号明細書で述べられるような１００ｍｌの培地中における振盪フラスコ実験を実施した。４および６日間の発酵後、サンプルを採取してグルコアミラーゼ活性を判定した。選択されたＷＴ  １のｄｐＧＬＡＡ形質転換体中のグルコアミラーゼ活性は、４または６日間どちらかの発酵後にＷＴ  １について測定されたものと比較して変化していた。
【０１７８】
［実施例７．真菌宿主細胞中における本発明に従った複数のプロモーターの制御下にあるｇｌａＡ遺伝子の組み込み］
宿主細胞中で特定遺伝子の発現レベルを変更し増大させるために、本発明に従った様々なプロモーターに作動可能なように結合する特定遺伝子の複数の追加的コピーを特定の宿主細胞に導入できる。この例では、ｇｌａＡコード配列と作動可能なように結合する本発明に従った様々なプロモーターを真菌宿主細胞ＷＴ  ２に導入できる。実施例７および８は、この過程のいくつかの異なるステップについて述べる。
【０１７９】
ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１、およびｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１６、−１７、および−１８ベクターの組み合わせをＷＴ  ２に導入するために、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットおよび国際公開第９９／３２６１７号パンフレットで述べられるようにして、同時形質転換および引き続く形質転換体の選択を実施した。原則として、前述のｐＧＢＴＯＰＧＬＡベクターのうち２つの線状ＤＮＡを単離して、ｐＧＢＡＡＳ−１と称されるａｍｄＳ選択可能なマーカー遺伝子含有ベクター（欧州特許第６３５５７４Ｂ１号明細書で述べられるようにして構築される）で同時形質転換した。ベクターは、どちらのタイプもＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）宿主株のｇｌａＡ遺伝子座に相同的な２つのＤＮＡドメインを含んでなり、ＷＴ  ２におけるｇｌａＡの３’−３’’ターミネーター遺伝子座のターゲティングを誘導する。形質転換体をアセトアミド培地上で選択し、標準の操作手順に従ってコロニーを純化した。ＰＣＲ技術を使用して同時形質転換体を同定し、ｇｌａＡコピー数およびｇｌａＡ遺伝子座における２つの異なるｐＧＢＴＯＰＧＬＡコンストラクトの組み込みについてコロニーを診断した。２つのｇｌａＡコピーと、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１／１６、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１６／１７、およびｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１７／１８の組み合わせとがある形質転換体を選択した。
【０１８０】
［実施例８．真菌宿主細胞中における本発明の複数のプロモーターの制御下にあるｇｌａＡコード配列によってコードされるグルコアミラーゼポリペプチド生産］
実施例７で単離された、選択されたｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１／１６、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１６／１７およびｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１７／１８株および株ＷＴ  １を使用して、５００ｍｌ邪魔板付き振盪フラスコを使用して、恒温器振盪機内において３４℃および１７０ｒｐｍで、欧州特許第６３５  ５７４Ｂ号明細書で述べられるような１００ｍｌの培地中における振盪フラスコ実験を実施した。４および６日間の発酵後、サンプルを採取してグルコアミラーゼ活性を判定した。選択されたＷＴ  ２のｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１６／１７およびｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１７／１８形質転換体中のグルコアミラーゼ活性は、４または６日間どちらかの発酵後に測定されたｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１／１６形質転換体およびＷＴ  １と比較して増大していた（データ示さず）。これは、複数の非天然プロモーターの制御下にあるｇｌａＡ遺伝子の発現が、ｇｌａＡの発現増大を提供できることを明白に示す。
【０１８１】
［実施例９．シュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）中におけるシュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）ｌｃｃ３−１遺伝子によってコードされるラッカーゼポリペプチドの較差生産］
下で詳細に記載されるように、ＳＣ３プロモーターが駆動するｌｃｃ３−１の発現は、シュタケ（Ｐ．ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）のコロニー周辺におけるラッカーゼの放出をもたらすことが実証された。対照的にＧＰＤプロモーターおよびラッカーゼプロモーターが駆動する発現は、それぞれコロニーの中心および中間におけるラッカーゼの放出をもたらした。
【０１８２】
株ＢＲＦＭ  ４４を２つの発現コンストラクトで形質転換することで、ラッカーゼは、コロニーの周辺および中間（ＳＣ３およびＧＰＤが駆動するｌｃｃ３−１の発現）、周辺および中央（ＳＣ３およびＧＰＤが駆動する発現）、および中間と中央（ラッカーゼプロモーターおよびＧＰＤプロモーターが駆動する発現）で放出された。
【０１８３】
したがって発現コンストラクトの組み合わせを使用することで、菌糸体の複数の部分をラッカーゼの分泌に関与させることができる。この現象は、液体浸透培養中のラッカーゼ活性の増大を伴う。
【０１８４】
［９．１  材料と方法］
［シュタケ（Ｐ．ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）の培養］
一核性ラッカーゼ欠損シュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）株ＢＲＦＭ  ４４（Ｂａｎｑｕｅ  ｄｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｆｏｎｇｉｑｕｅｓ  ｄｅ  Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を１Ｌあたり１０ｇのグルコース、５ｇのペプトン、３ｇの酵母抽出物、および３ｇの麦芽エキスを含有する液体または固体（１．５％寒天）酵母麦芽培地（ＹＭ）中において、３０℃で慣例的に生育させた。ラッカーゼ生産のために、野生型シュタケ（Ｐ．ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）中でのラッカーゼ生産に最適の条件を使用した（Ｌｏｍａｓｃｏｌｏら，２００３年）。１Ｌエルレンマイアーフラスコ中で、濾過滅菌エタノール含有または非含有の２５０ｍｌの最少培地（ＭＭ）中で２５０ｒｐｍ、３０℃で株を生育させた。ＭＭは１Ｌあたり以下を含有した。２０ｇのマルトース、１ｇの酵母抽出物、２．３ｇのＣ４Ｈ４Ｏ６Ｎａ２・２Ｈ２Ｏ、１．８４ｇの（ＮＨ４）２Ｃ４Ｈ４Ｏ６、１．３３ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．１ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＭｇＳＯ４、０．０７ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０４８ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０３６ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＣｕＳＯ４および１ｍｌのビタミン溶液（Ｔａｔｕｍら，１９５０年）。
【０１８５】
［シュタケ（Ｐ．ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）の形質転換］
シュタケ（Ｐ．ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）をＡｌｖｅｓ  ＡＭ，Ｒｅｃｏｒｄ  Ｅ，Ｌｏｍａｓｃｏｌｏ  Ａ，Ｓｃｈｏｌｔｍｅｉｊｅｒ  Ｋ，Ａｓｔｈｅｒ  Ｍ，Ｗｅｓｓｅｌｓ  ＪＧ，ａｎｄ  Ｗｏｓｔｅｎ  ＨＡ．Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｃｃａｓｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ  Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４年１１月；７０（１１）：６３７９〜８４頁で述べられるようにして形質転換した。特に断りのない限り、形質転換手順の全てのステップは３０℃で実施した。ワーリングブレンダー内で、１５日目のコロニー（直径６〜８ｃｍ）を５０ｍｌのＹＭ培地中で１分間均質化した。同一容積の培地を添加した後、ホモジェネートを２００ｒｐｍで２４時間生育させた。この培養物を再度均質化し、ＹＭ中で２回希釈して、２００ｒｐｍで２４時間生育させた。シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からの１ｍｇ  ｍｌ−１のｇｌｕｃａｎｅｘを使用して、菌糸体を０．５ＭのＭｇＳＯ４または０．５Ｍのスクロース中で穏やかに振盪してプロトプラスト化させた。１Ｅ＋７プロトプラストおよび５μｇのプラスミドＤＮＡを氷上で１５分間インキュベートした。１容積のポリエチレングリコール４０００を添加した後、混合物を室温で５分間インキュベートした。プロトプラストを２．５ｍｌの再生培地中で、一晩再生させた（Ｓｐｅｃｈｔら，１９８８年，Ｅｘｐ．Ｍｙｃｏｌ．１２：３５７〜３６６頁）。５μｇ  ｍｌ−１のフレオマイシンおよび１％の低融点アガロースを含有する３容積のＹＭ培地を添加した後、混合物を５μｇ  ｍｌ−１の抗生物質を含有するＹＭ寒天培地上に散布した。抗生物質に加えて５００μｇ  ｍｌ−１のカフェインを培地に添加することで、その中でフレオマイシン抵抗性カセットが既に導入された形質転換体を同一選択カセットで再形質転換した。
【０１８６】
［ラッカーゼ発現ベクターの構築］
スエヒロタケ（Ｓ．ｃｏｍｍｕｎｅ）のＳＣ３およびＧＰＤプロモーターの後ろのシュタケ（Ｐ．ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）からのラッカーゼｌｃｃ３−１遺伝子を発現するために、プライマーＮｃｏＩＰｙｃおよびＢｃｌＩＰｙｃを使用して、ＰＣＲによってそのコード配列を増幅した（表３）。これは、開始コドン中の導入されたＮｃｏＩ部位と、停止コドンにすぐ続くＢｃｌＩ制限部位とがある断片をもたらした。ラッカーゼプロモーターの後のｌｃｃ３−１遺伝子発現するために、プライマーＰｒｏｍｏＮＣＯｆｏｒｗａｒｄおよびＰｒｏｍｏＬＡＣｒｅｖｅｒｓｅを使用してコード配列を増幅し（表３）、５’末端に導入されたＮｃｏＩ部位と、停止コドンにすぐ続くＳｍａＩ部位とがある断片をもたらした。ｌｃｃ３−１の増幅されたコード配列を発現ベクターｐＥＳＣおよびその誘導体ｐＥＧＰおよびｐＥＬＰ中でクローンし、プラスミドｐＥＳＣＬ１、ｐＥＧＰＬ１、ｐＥＬＰＬ１をそれぞれもたらした。プラスミドｐＥＳＣはフレオマイシン抵抗性カセットを含有し（ＳｃｈｕｒｅｎおよびＷｅｓｓｅｌｓ，１９９４年）、その中では内部ＮｃｏＩ部位が欠失している。さらにそれは間にＳＣ３遺伝子の制御配列を含有して、そのコード配列はＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位を使用してクローンできる。ＳＣ３プロモーターが１．２ｋｂのＨｉｎＤＩＩＩ／ＮｃｏＩ断片上に含有される一方、そのターミネーターは４３４ｂｐのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片からなる。プラスミドｐＥＧＰおよびｐＥＬＰはｐＥＳＣの誘導体であり、その中ではＳＣ３プロモーターがＧＰＤのＨｉｎＤＩＩＩ／ＮｃｏＩプロモーター断片（７００ｂｐ）（Ｈａｒｍｓｅｎら，１９９２年）およびラッカーゼ（２．５ｋｂ）によってそれぞれ置換されている。ラッカーゼプロモーターは次のようにして単離された。シュタケ（Ｐ．ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）のＢｇｌＩＩ消化ゲノムＤＮＡを自己ライゲーションによって環状化させ、プライマーＩＮＶＳＥおよびＩＮＶＡＳＥを使用したインバースＰＣＲのためのテンプレートとして使用した（表３）。得られた３．５ｋｂの断片をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＸＬ−ＴＯＰＯにクローンして、プラスミドｐＰＬ１００をもたらした。配列決定は、ｐＰＬ１００が２．５ｋｂのプロモーター領域を含有することを確認した。この領域をプライマーｐｒｏｍｏＬＡＣｆｏｒｗａｒｄおよびｐｒｏｍｏＮＣＯｒｅｖ（表３）を使用して、ＰＣＲによって増幅し、５’および３’末端にＨｉｎＤＩＩＩおよびＮｃｏＩ部位をそれぞれ．導入した。
【０１８７】
【表３】
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【０１８８】
［ラッカーゼ活性定量］
シグマ・アルドリッチからの０．２ｍＭのＡＢＴＳ（２、２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）および０．１ｍＭのＣｕＳＯ４を添加した固体ＹＭ培地上で、シュタケ（Ｐ．ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）株のラッカーゼ活性をモニターした。５０ｍＭのＮａ−Ｋ−酒石酸塩（ｐＨ４．０）の存在下で、４２０ｎｍ（吸光係数３６０００／ｍＭ／ｍ）において、５ｍＭのＡＢＴＳの酸化に続いて、培地上のラッカーゼ活性を定量的に判定した。活性はｎｋａｔ  ｍｌ−１で表現された。１ｎｋａｔは、１秒あたり１ｎｍｏｌのＡＢＴＳの酸化を触媒する酵素量と定義される。アッセイを三連で３０℃で実施した。標準偏差は平均値の１０％を超えなかった。
【０１８９】
［９．２  シュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）中のラッカーゼ生産］
先にＡｌｖｅｓら，前出に従って、シュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）中のラッカーゼ生産が実証された。
【０１９０】
スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）（配列番号１）のラッカーゼプロモーター（配列番号３）の制御下、またはＳＣ３ハイドロフォビン遺伝子（配列番号２）またはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）遺伝子の制御下に置かれた、天然ｌｃｃ３−１ラッカーゼ遺伝子（配列番号４）によって、シュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）のラッカーゼ欠損一核性ＢＲＦＭ  ４４株（Ｂａｎｑｕｅ  ｄｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｆｏｎｇｉｑｕｅｓ  ｄｅ  Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を形質転換した。ＳＣ３が駆動する発現は、液体振盪培養物中で最大で１０７ｎｋａｔ  ｍｌ−１のラッカーゼ活性をもたらした。この値はＧＰＤおよびラッカーゼプロモーターの場合に、それぞれ約１．４〜１．６倍高い（表４）。ｌｃｃ３−１がどちらかのプロモーターの後で発現される場合、ｌｃｃ３−１ｍＲＮＡおよびラッカーゼ活性は、２５ｇ／Ｌエタノールの存在下で大きく増大する（表３）。４０ｇ／Ｌのエタノールの存在下で生育させることにより、ラッカーゼプロモーターまたはＧＰＤの後でｌｃｃ３−１遺伝子を発現する形質転換体中において、ラッカーゼ生産はさらに増大する。この場合、最大の活性はそれぞれ３９００および４６６０ｎｋａｔ  ｍｌ−１であり、１Ｌあたり１および１．２ｇのラッカーゼに相当する。
【０１９１】
【表４】
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【０１９２】
［９．３  シュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）中における較差ラッカーゼ生産］
ＳＣ３、ＧＰＤおよびラッカーゼプロモーターからのラッカーゼ遺伝子ｌｃｃ３−１をそれぞれ発現するコンストラクトｐＥＳＣＬ１、ｐＥＧＰＬ１、ｐＥＬＰＬ１をシュタケ（Ｐ．ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）のラッカーゼ陰性一核相ＢＲＦＭ  ４４に形質転換したＡｌｖｅｓら，２００４年，前出）。酵素によって緑色生成物に転換される基質ＡＢＴＳを培地に添加して、ラッカーゼ産生形質転換体を選択した。空間および時間的ラッカーゼ活性をモニターし、すなわち様々な時間間隔でラッカーゼ活性をモニターし、コロニー中のラッカーゼ活性の局在性を評価した。各コンストラクトの２つの独立した形質転換体を選択して、位置効果を排除した。寒天培地とコロニー間のＰＣ膜の存在は、ＡＢＴＳ含有培地上のラッカーゼの空間および時間活性に影響しなかった。ＧＰＤプロモーター制御下の導入されたラッカーゼ遺伝子があるコロニーは、６日目に始まってコロニー中央のみにラッカーゼ活性を示した（図８）。１０日間の生育後、活性は周辺に拡大して基質分解が増大した。ＳＣ３が駆動する発現は、５日目に始まってコロニー周辺の活性をもたらした。１０日間の生育後、活性は周辺で依然として観察され、分解産物の濃さが増大した。それ自身のプロモーターの制御下にあるラッカーゼ遺伝子で形質転換された株は、コロニーの中間で活性を示した。この活性は４日目に観察された。１０日間の生育後、活性ゾーンはコロニー周辺の延長と同様の程度に外側に広がった。これらの結果から、我々は培地中のラッカーゼの空間および時間活性は、使用プロモーターに依存すると結論した。
【０１９３】
５００μｇ  ｍｌ−１のカフェインと組み合わせたフレオマイシンによる選択を使用して、組み換え株Ｇ１４（ｐＥＧＰＬ１で形質転換された）をｐＥＳＣＬ１で再形質転換した。これは単一形質転換体のゾーンに相当する、コロニーの２つのゾーン中でラッカーゼを分泌する株をもたらした。例えばＧ−Ｓ８株は、コロニーの中央および周辺部分の双方でラッカーゼを放出し（図９）、菌糸体の最大部分が分泌に充てられた。
【０１９４】
４０ｇ／Ｌのエタノールの存在下において液体振盪培養中でラッカーゼ活性を判定した。Ｇ−Ｓ８株はその親株Ｇ１４よりも多いラッカーゼを産生した（表５）。
【０１９５】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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