(57)【要約】   本発明は、以下の工程を含む、in vivoでC型肝炎ウイルス（HCV）を増幅する方法に関する：a)ウイルス源の、雌のアエデス・ベクサンス(Aedes vexans)またはアエデス・カスピウス(Aedes caspius)蚊による摂取；b)ウイルスを増幅するのに必要な時間の間、蚊を飼育すること。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
a)ウイルス源の、雌のアエデス・ベクサンス(Aedes vexans)またはアエデス・カスピウス(Aedes caspius)蚊による摂取；
b)ウイルスを増幅するのに必要な時間の間、蚊を飼育すること
を含む、C型肝炎ウイルス（HCV）をin vivoで増幅する方法。
【請求項２】
前記蚊が、野生種から得られたものであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルス源が、赤血球細胞で補足されており、そしてATPで補足されていても良いことを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記蚊によるウイルス源の摂取が、血液の餌を介して行われ、有利には、エンゴルジメント手法を使用して行われることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記エンゴルジメント手法が、ニワトリの皮膚を使用することを特徴とする、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルス源が、血清、有利にはヒト起源であることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルス源が、弱毒化ウイルスからなることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記摂取が、一匹の蚊当り少なくとも1000コピーのウイルスのレベルであることを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記蚊を、15から30日間、有利には約20日間飼育することを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスを、飼育期間の最後に、蚊の組織から回収することを特徴とする、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項1から10のいずれか一項に記載の方法によって得られる、HCVを保有するアエデス(Aedes)に由来する組織。
【請求項１２】
請求項1から10のいずれか一項に記載の方法によって得られる、HCVを保有するアエデス(Aedes)に由来する細胞。
【請求項１３】
AP61またはC6/36型細胞の存在下での請求項12に記載の細胞の培養を含む、in vitroでHCVを産生する細胞を得る方法。
【請求項１４】
請求項13に記載の方法によって得られる、in vitroでHCVを産生する蚊の細胞。
【請求項１５】
特定の抗体の産生ための、または予防もしくは治療対象を用いたワクチンの調製のための、ウイルス粒子の産生のための請求項12または14に記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、C型肝炎ウイルス（HCV）を増幅するための新規のシステムの特定に関する。アエデス(Aedes)属の特定の蚊は、in vivoで効率的にHCVを複製できることが判明した。このことにより、特に、ワクチン学や感染に対する薬剤の開発にとって、前途有望な見通しが提供される。
【背景技術】
【０００２】
C型肝炎ウイルス（HCV）は、慢性的な悪性疾患（例えば、肝硬変または肝細胞ガン）をもたらす、非A型および非B型肝炎の原因として同定された。
【０００３】
HCVは、エンベロープを持った一本鎖RNAウイルスであり、主要な流行性疾患、例えば、最も重要なものだけ言及すると、黄熱病（YF）、デング熱（DEN）およびデング出血熱（DHF）、日本脳炎（JE）、セントルイス脳炎（SLE）、西ナイル熱（WN）およびC型肝炎（HC）の原因となるウイルスを含む、Flaviviridae科のHepacivirus属の一員である。
【０００４】
Flavivirusesは、非常に異なる疫学的な方法で、媒介昆虫によって感染する。幾つかの病気は、典型的には、ヒトであり（または霊長類に関連し）、決して動物に影響を及ぼさないのに対して（例えば、DENおよびDHF）、他の感染は、むしろ人畜共通感染を示し、多かれ少なかれ偶発的にヒトにも影響を及ぼす（例えば、JE、SLEおよびWN）。最後に、特定のFlavivirusesは、ヒトおよび動物集団の両方において、流行型で広まることができる（YF）。それでも、これらの感染の異なる免疫学的な方法は、共通の要素、例えば、昆虫細胞におけるウイルス増幅を有する。
【０００５】
HCVに関しては、最近確立された感染経路は、血液製剤、薬物中毒、性的な感染および院内感染を介するものである。それでも、今日ヒトにおいて報告されているHCV感染の30から40%については原因が説明されておらず、前記した条件のいずれもが当てはまらない。更にその上、HCV感染の広い流行は、温かく湿気の多い地域、例えば、エジプトや日本の南部において観察されている（JEV）。現在、疾患のこの地理的な分布に関する説明はなされていない。
【０００６】
抗-HCVワクチンに関しては、当該業界における通常の2つの方法に基づく：ワクシニアもしくはAAV（アデノ関連ウイルス）リコンビナント、または、HCVタンパク質のポリペプチド誘導体に基づいて開発された抗-HCVワクチン学をベースにした方法。
【０００７】
ウイルス媒介性C型肝炎に対する対策においては、in vitroでウイルスの高いレベルの増殖を可能とするシステムが存在しないことが、治療および効果的なワクチンの開発を阻害する主な障害となっている。このことは、ヒトでのウイルスの乏しい順応によって説明することができ、ウイルスを、一般的な細胞モデル、例えば、肝細胞ガンラインまたは一次肝細胞においてin vitroで増幅することができなくしている。
【０００８】
この問題を克服するために、分子構築物、特にレプリコンモデルが提案されているが、それらは全て、天然のC粒子とは完全に異なる代替的な形態であるという欠点を有する。
【０００９】
より包括的に、HCVを増幅するのに現在利用することができるモデルを、以下に示す。
感染およびウイルス複製のin vivoモデルは、Bartenschlager et al. (1)によるレビューにおいて記されている。一般的な動物モデルに関しては、HCVに感染しやすい唯一の動物は、血液のウイルスタイターが高いチンパンジー（P. troglodytes）である。他の霊長類（Tupaia belangeri chinensis）も感染できるが、血液のウイルスタイターは、低く断続的である。他の利用できる動物モデルは、ヒトの肝細胞を異種移植したベージュ/ヌード/免疫不全（beige/nude/immunodeficient）マウス（mouse trimera（登録商標））であり、このマウスは、高い血液ウイルスタイターを有するが、その成功はトランス遺伝子の寿命に関連する。
【００１０】
Bartenschlager et al. (1)によるレビューは、また、細胞培養システムの存在も報告している。完全な許容状態のサイクルを可能とする細胞ラインや、一般的な感染後のウイルス粒子の産生は、全く記載されていない(8)。複製を可能とする唯一の効果的なシステムは、Bartenschlager and Lohmann (2)によって開示されている：そのシステムは、クローン化したレプリコンによるHuh-7細胞のトランスフェクション後に、HCVゲノムRNAを複製し、非-構造タンパク質（特にはプロテアーゼ-ヘリカーゼおよびRNAポリメラーゼ）を発現するサブゲノムレプリコンシステムからなる。このシステムは、抗ウイルススクリーニングにおいて使用される。著しい改良が、Wakita et al. (11)によって提供され、その方法においては、レプリコンシステム（HCV-JFH1クローン）が、（Huh-7細胞へのトランスフェクション後に）完全な感染性ウイルス粒子を産生することができる。それにも関わらず、このシステムは、現在のところ、大量の生物由来資源の産生には適さない。
【００１１】
最後に、異種発現システムが開発されている。これらは、第一に、E1E2ヘテロ二量体エンベロープ糖タンパク質を発現するバキュロウイルスから得られた「ウイルス様粒子（Virus Like Particles(VLP)）」である(4)。最近、バキュロウイルスシステムが、ワクチン対象を用いたチンパンジーを免疫化する実験において、コアタンパク質cDNA+E1E2 gpを含むリコンビナントに基づいて、使用されている。第二に、偽型または偽型粒子（pp）ラブドウイルス（VSV, 6）またはレトロウイルス（HIVもしくはMLV, 3）が得られた。これらの根本的に重要なシステムは、E1E2 gpを介したウイルスの侵入を研究するのに使用されている。これらは、抗-HCVエンベロープ中和抗体を研究するためにのみ使用されており、それ故、ワクチン学における使用に関心を示すものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】FR 2793 258
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
それ故、開示されたシステムの全てが、完全には、満足いくものではなく、効率的にHCVを増幅する新規のモデルを開発する必要性は今だに存在しているようである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この必要性を満たすために、本発明は、以下の段階からなるC型肝炎ウイルス（HCV）を増幅するin vivo方法に関する：
a)ウイルス源の、アエデス(Aedes)属の雌の蚊による摂取；
b)ウイルスを増幅するのに必要な時間の間、蚊を飼育すること。
【００１５】
それ故、第1の工程は、摂取により、ウイルスを蚊へと、可能な最も効率的な方法で入り込ませることからなる。蚊がウイルスを摂取した後、ウイルスは胃へと到達し、胃壁を横断し、血体腔に分散し、様々な器官（例えば、卵巣および唾液腺）に到達し、そこで増殖することができる。結果として、ウイルスは、蚊の更なる子孫へと、または、蚊が刺したヒトへと伝染することができる。
【００１６】
アエデス(Aedes)属の蚊は、双翅目、長角亜目、カ科、ナミカ亜科、Aedini族に属する。雌は、特徴的な短い口肢および羽のようではない触覚
【００１７】
本発明については、アエデス・ベクサンス(Aedes vexans)およびアエデス・カスピウス(Aedes caspius)を使用する。
【００１８】
有利には、これらの種の野生種を、本発明の為に使用する。この方法で使用する集団は、野原から直接入手した原料（卵、幼虫または成虫）からの、これら2つの種が好む生息空間での飼育の結果である。有利には、使用する個体は、F0、F1またはF2世代に属する。
【００１９】
既に言及したように、ウイルス源と蚊との接触は、摂取による。有利には、ウイルス源は、雌の蚊にとって魅力を高めるために、場合によってはATPで補足して（例えば、ヒツジ由来の）赤血球細胞を用いて調製する。
【００２０】
それ故、実際には、摂取は、雌の蚊に取り込まれる血液の摂取の間に生じる。
【００２１】
有利には、摂取は、エンゴルジメント手法(engorgement technique)を使用して実施する。この特に有効な手法は、昆虫学者によって良く知られており、例えば、Fouque et al. (7)に開示されている。原則として、血液の餌は、雌の蚊に、餌を37℃に維持する「エンゴルガー(engorger)」中で提供する。エンゴルガーは、皮膚によって覆われ、皮膚を介して、蚊は、吻を挿入し、餌を取り込む。
【００２２】
この手法の有利な実施態様においては、ニワトリの皮膚を使用する。
【００２３】
本発明によれば、ウイルス源は、「ネイティブ」ウイルス（毒性）を含み、有利には、弱毒化したウイルスを含む。毒性ウイルスを用いて感染を再現し、実験モデルの最初の選択を提供する。より応用に富む方法においては、弱毒化ウイルスは、特に、ワクチンまたは抗体産生について関心が持たれる。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様によれば、ウイルス量は、血清、有利にはヒト起源の血清（例えば、HCV遺伝子1b型によって引き起こされる慢性肝炎を有する対象の血清）に由来する。このような血清の一般的なタイターは、一般的に、約2E6 コピー/mlである。
【００２５】
本発明については、接触は、一匹の蚊当り少なくとも1000コピーのウイルス、有利には、一匹の蚊当り1500コピーのウイルスを用いて行わなければならないことが求まった。
【００２６】
本発明による方法の第2の工程は、一定の期間、蚊を飼育することからなる。蚊は、制御された条件下で、特には温度および湿度に関して制御された条件下で飼育する。飼育期間は、以下の基準に従って求める：
- とらわれた状態においては、蚊の種の平均的な寿命よりも短くしなければならない；
- 少なくとも1サイクルの外因性の増幅を蚊において生じさせることができなければならず、好ましくは、最大速度のウイルスの複製を可能としなければならない。
【００２７】
本発明については、増幅は、試験したアエデス(Aedes)に関しては15から30日間の飼育で最適となるようであり、約20日の飼育期間が、有利な平均値である。
【００２８】
ウイルスの回収には、蚊の組織から、特には、ウイルス粒子の形態で、ウイルスを抽出することが必要である。好ましい組織は、卵巣および唾液腺である。
【００２９】
それ故、本発明は、蚊の特定の種においてin vivoで実施する、HCVを増幅する方法を提供し、この方法により、完全に予期できない顕著な効果がもたらされる。
【００３０】
実際には、FR 2793 258およびGermi et al. (9)から、HCVは昆虫細胞においてin vitroで産生できることが知られていたが、不十分な結果を介してであった。
【００３１】
更にその上、アエデス・アエジプティ（Aedes aegypti）、アエデス・アルボピクタス（Aedes albopictus）、アノフェレス・ステフェンシ（Anopheles stephensi）およびクレックス・キンケファシアタス（Culex quinquefasciatus）に属する蚊を用いたin vivoで実施した以前の実験は、ネガティブであることが証明され（10, 5）、その結果は、長い共適合や、ウイルスと媒介する蚊との間の高い特異性の概念と一致した。これらは、本発明の利点を強調するものである。
【００３２】
既に言及したように、本発明による方法は、in vitroでのHCVの大量産生を含む、有望な見通しを有する。
【００３３】
それ故、本発明による方法によって、有利には、HCVキャリアであるアエデス・カスピウス(Aedes caspius)またはアエデス・ベクサンス(Aedes vexans)に由来する組織、特には、卵巣もしくは唾液腺に由来する組織、またはアエデス細胞へアクセスできるようになる。
【００３４】
これらの細胞は、in vitroでのHCVの大量産生に適するので、使用することができる。
【００３５】
他の実施態様においては、本発明は、また、in vitroでHCVを産生する細胞を得る方法に関する。本発明による方法を使用して得られた、HCVを保持するアエデス細胞は、AP61またはC6/36型細胞と共培養する。AP61およびC6/36型細胞は、Germi et al. (9)によって開示されている。これらは、連続的で十分に定義された蚊の細胞ライン、特には、アエデス・シュードスクテラリス（Aedes pseudoscutellaris）に由来する細胞ラインである。共培養する目的は、HCVを、これらの細胞ラインへと移すことである。それ故、本発明は、また、本方法の最後に得られた、in vitroでHCVを産生する蚊の細胞に関する。
【００３６】
HCVのこれらの2つの細胞源は、優れた展望、特には、特異的な抗体の産生または予防用または治療用ワクチンの産生のための新規の種類のウイルス粒子（アエデスに由来する）を産生するという展望をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明および本発明がもたらす利点は、実施態様の以下の例および添付の図によって、例示される。しかしながら、これらの実施例は、制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図1は、総RNAの抽出およびDNAを用いた一般的なRT-PCR後の、エチジウムブロマイドで染色した、HCVを感染させたアエデス・ベクサンス(Aedes vexans)蚊におけるウイルスRNAの検出を表すゲルを示す。バンド1：PCRネガティブコントロール；バンド2：蚊のネガティブコントロール；バンド3、4：0日目；バンド5：14日目；バンド6、7、8；21日目。
【図２】図2は、24日間飼育したアエデス（アエデス・ベクサンス(Aedes vexans)およびアエデス・カスピウス(Aedes caspius)）蚊に由来する総RNAの抽出後のqRT-PCRによるウイルスRNAの検出を示す。標準グラフを、既知のタイターのウイルスRNA抽出物の対数希釈物（120,000コピー/ランから1,200コピー/ラン）から得た（図2A）。図2Bにおいては、ポジティブコントロールを（J0, T+）とし、24日後にHCVを複製したと思われる個体を（J20）とする。また、各サンプルについて、(i)ウイルスRNAを検出した後のサイクル数および(ii)標準グラフに対する最初の濃度も求める。図2Bのグラフは、各サンプルについて、どのようにシグナルの検出が変化するかを示す。
【図３】図3は、28日間飼育したクレックス（クレックス・ピピエンス(Culex pipiens)）蚊に由来する総RNAの抽出後のqRT-PCRによるウイルスRNAの検出を示す。標準グラフを、既知のタイターのウイルスRNA抽出物の対数希釈物（800,000コピー/ランから8,000コピー/ラン）から得た（図3A）。また、各サンプルについて、(i)ウイルスRNAを検出した後のサイクル数および(ii)標準グラフに対する最初の濃度も求める。図3Bのグラフは、各サンプルについて、どのようにシグナルの検出が変化するかを示す。
【実施例】
【００３９】
[I-実験による感染]
（1.試験した種の飼育）
試験した個体は、クレックス・ピピエンス(Culex pipiens)種についてはマルセイユの市街地の野原において、そして、アエデス・ベクサンス(Aedes vexans)およびアエデス・カスピウス(Aedes caspius)種についてはCamargueのTour du Valat特別保留地において採取した蚊（卵、幼虫または成虫）から飼育した昆虫に由来する。昆虫は、Salon de ProvenceのDomaine du MerleのENSAM(Ecole Nationale Superieure d'Arts et Metiers)において飼育した。飼育は、一般的な昆虫飼育所で行い、標準的な飼育に適合させた。幼虫は、ビール酵母および魚肉を与え、成虫は、スクロース溶液を与えた。クレックスおよびアエデスの餌の血液は、洗浄したヒツジの赤血球細胞から構成される（洗浄は、血液成分からの妨害を除外するために実施した）。
【００４０】
（2.蚊の安全な研究室（レベル2+）への導入）
1日目に、雌の蚊をグループに分け、各ボックスに湿らせた脱脂綿を備えたエンゴルジメントボックス(engorgement box)に入れ、安全な研究室へと導入した。蚊は、制御された温度および湿度（T=25℃±2, RH 80%±10）に保った。
【００４１】
（3.HCVのL2+研究室への導入）
0日目に、HCVを含むウイルス溶液（2E6 コピー/mlの、慢性肝炎の患者の血清）を、特定の運送人によって、蚊を飼育しているL2+へと移した。ウイルス溶液は、Molecular and Structural Virology Laboratory of the Grenoble Faculty of Medicineによって提供された。ウイルス溶液は、L2+急速冷凍機内で、-80℃で保持した。
【００４２】
（4.感染した血液溶液の調製）
0日目に、非感染の洗浄した赤血球細胞（ヒツジの血液）およびウイルス溶液を、蚊を感染するのに十分なタイターを得るような方法で混合した（〜1500コピー/蚊）。ATPを加え、血液を、蚊がより好むようにし、雌の願望を増大させた。それぞれの蚊は、一回の血液の餌当り3から5μl摂取した。
【００４３】
（5.雌のグループの感染）
0日目に、37℃に温めた感染血液を含むエンゴルガー(engorger)を、24時間グルコースを与えなかった雌に提示した。エンゴルガー(engorger)を、各ボックスに置き、血液の餌を摂取するために約4時間静置した。並行して、血液を含まないエンゴルガー(engorger)を、ネガティブコントロールの雌に提示した。エンゴルジメント(engorgement)の期間の最後に、雌を、mouth aspiratorを使用して回収し、気体クロロホルムを用いて麻酔し、単対物双眼顕微鏡を用いて分類分けした。血液で満腹にさせた蚊は、ケージに戻した。雌が卵を産むのに適した箇所が、各金属ケージの左側にあった（雌のアエデス(Aedes)については水の入れ物、雌のクレックス(Culex)については湿った土）。この日から、満腹にさせた雌を含む金属ケージは、蚊を殺すまで、開かず、または取り扱わなかった。
【００４４】
（6.雌のグループの維持）
雌のグループを、少なくとも70％の制御された湿度で、約28℃の一定の温度に保った。毎日、金属ケージ中で、10％のグルコース溶液を浸した脱脂綿を使用して、雌に餌を与えた。産卵場所は、洗浄瓶を使用してケージを介して湿らせた。
【００４５】
（7.雌の処理）
回収の日には、蚊を、金属ケージを冷却して殺した。その後、蚊を1.5mlのチューブに入れ、ラベルし、PCR前のRNA抽出段階まで、急速冷凍機に入れた。ウイルスを含まない血液で満腹にしたネガティブコントロールも殺した。0日目に殺し、-80℃の急速冷凍機に入れた蚊のグループを、エンゴルジメント(engorgement)、ウイルスRNAの抽出および増幅のD0ポジティブコントロールとした。
【００４６】
[II-ウイルスRNAの検出]
（8.感染した器官からのRNAの抽出）
蚊の組織からのHCVウイルスRNAの抽出は、フードを被せた状態で、Rocheによって販売されている「High Pure RNA Tissue Kit」を使用して実施した。
【００４７】
（9.ウイルスRNAの増幅）
使用したプライマーおよびプローブ（qPCR用）は、ウイルスゲノムの非-コード5'末端の保存領域を増幅するようにデザインした。ヌクレオチド-289と-269との間に位置するセンスプライマー2CH (5'-AAC TAC TGT CTT CAC GCA GAA-3')（配列番号1）およびヌクレオチド-70と-90との間に位置するアンチセンスプライマー1TS (5'GCG ACC CAA CAC TAC TCG GCT-3')（配列番号2）を使用した。qPCR用で使用したプローブは、ヌクレオチド-137と-119との間に位置するTM416 (5'-6Fam-AAC CCG CTC AAT GCC TGG A-Tamra-3')（配列番号3）であった。
【００４８】
一般的なRT-PCRおよびqRT-PCR用の反応混合物の組成を、以下の表に要約する：
【００４９】
【表１】
2010513425.tif 000002
【００５０】
RT-PCRは、以下の条件下で実施した：逆転写を30分間50℃で行い、その後、逆転写酵素を不活性化する工程（15分間95℃）に続き、伸長工程（1分間63℃）と変性工程（30秒間90℃）とを交互に行う45回のPCRサイクルを行った。
【００５１】
[結果]
最初の一連の実験により、21日間飼育したアエデス・ベクサンス(Aedes vexans)におけるウイルスRNAの存在を明らかにした。結果を図1に示す。図1では、21日目に検出可能な量のウイルスが示されている。
【００５２】
次の一連の実験は、並行して、クレックス・ピピエンス(Culex pipiens)（図3）、アエデス・ベクサンス(Aedes vexans)およびアエデス・カスピウス(Aedes caspius)（図2）において実施した。アエデス(Aedes)について以前の実験で得られた結果が確認された。24日間飼育した後のウイルスを含む血液で満腹にさせた蚊から抽出した総RNAのリアルタイムRT-PCRを使用した分析により、HCV遺伝子型1bに由来するウイルスRNAの存在が明確に示され、一方で、ネガティブコントロールの個体では完全に存在しなかった（図2）。
【００５３】
これらの実験により、以下のことが示された：
A. 蚊に存在するウイルスRNAを検出することは可能であり、このことにより、完全な蚊から総RNAの抽出工程およびウイルスゲノムのリアルタイムRT-PCRによる増幅が確認された（図2のグラフ14、15および16）。
B. ウイルスRNAは、28日目まで飼育したクレックス(Culex)属の個体には完全に存在しなかった（図3）。
C. 最後に、28日目まで飼育したクレックス(Culex)蚊においてはこのRNAが完全に存在していないことから（図3のグラフ6から17）、検出されたRNAが残余のRNAであるということはなく、ネガティブコントロールにおける検出可能なウイルスRNAが存在しないという観点から、単にコンタミネーションの結果であるということも除外することができる。
【００５４】
[参考文献]
2010513425.tif 000003
【図１】
2010513425.tif 000004
【図２】
2010513425.tif 000005
【図３】
2010513425.tif 000006
【配列表】
2010513425000001.app
【国際調査報告】
2010513425.tif 000007
2010513425.tif 000008
2010513425.tif 000009
2010513425.tif 000010
2010513425.tif 000011
2010513425.tif 000012