(57)【要約】  本発明は、少なくとも３．５であるｐＨ活性プロファイルの幅を有するアスパラギナーゼに関する。さらに、本発明は、配列番号２または配列番号４のうちのいずれか１つにしたがった新たに同定されたアスパラギナーゼポリペプチド、およびその変異体、ならびにかかる新規のアスパラギナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列に関する。さらに本発明は、工業的プロセスにおけるこれらの新規のアスパラギナーゼ変異体の使用に関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  配列番号２または配列番号４のいずれか一方に示されている通りのアミノ配列を有するポリペプチド；
ｂ）  ａ）にしたがったポリペプチドと少なくとも８５％の相同性を有するポリペプチド；
ｃ）  ａ）またはｂ）に定義されたポリペプチドから１つ以上のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入によって得ることのできるポリペプチド；または
ｄ）  成熟ポリペプチドをコードする配列番号１または配列番号３のいずれか１つにしたがった核酸配列または少なくとも１００個のヌクレオチドを有するそのサブ配列によってコードされるポリペプチド、
であるアスパラギナーゼ。
【請求項２】
ｂ）、ｃ）またはｄ）にしたがった配列番号２に関するポリペプチドが、２５位のＡｌａ、２８位のＴｈｒ、３０位のＴｙｒ、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１３１位のＳｅｒ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１０位のＡｌａ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２４０位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５２位のＶａｌ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７３位のＧｌｎ、２７９位のＳｅｒ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０７位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１０位のＡｌａ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＬｙｓ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３１９位のＬｅｕ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＴｈｒ、３４５位のＰｈｅ、３５１位のＡｌａ、３６０位のＡｌａ、３６１位のＧｌｕ、３６４位のＧｌｙ、３６５位のＰｈｅ、３６６位のＬｙｓ、３６９位のＡｒｇ、３７０位のＧｌｕ、３７４位のＬｙｓ、３７５位のＶａｌまたは３７７位のＶａｌのうちの１つ以上を含み、前記位置は配列番号２を基準にして定義されている、請求項１に記載のアスパラギナーゼ。
【請求項３】
ｂ）、ｃ）またはｄ）にしたがった配列番号４に関するポリペプチドが、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７９位のＡｓｐ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＴｈｒ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＰｒｏ、３３３位のＧｌｕ、３３６位のＧｌｎ、３４１位のＰｈｅ、３５６位のＡｌａ、３６０位のＧｌｙ、３６２位のＧｌｕ、３６５位のＡｒｇ、３６６位のＧｌｕ、３７０位のＬｙｓ、３７１位のＶａｌ、３７２位のＧｌｙまたは３７３位のＶａｌのうちの１つ以上を含み、前記位置は配列番号４を基準にして定義されている、請求項１に記載のアスパラギナーゼ。
【請求項４】
６〜７の間の最適なｐＨを有しかつ／または同じ条件下で測定された場合に国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレット内で開示されている通りのＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）由来の野生型アスパラギナーゼの比活性に比べて高い５以上というｐＨでの比活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼ。
【請求項５】
少なくとも３．５、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも５ｐＨユニットというｐＨ活性プロファイルの幅を有するアスパラギナーゼ。
【請求項６】
少なくとも３．５、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも５ｐＨユニットというｐＨ活性プロファイルの幅を有するアスパラギナーゼが、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼである、請求項５に記載のアスパラギナーゼ。
【請求項７】
請求項５のアスパラギナーゼをコードする核酸配列。
【請求項８】
ａ）  配列番号２または配列番号４のいずれか１つにしたがったアスパラギナーゼをコードするＤＮＡ配列；
ｂ）  配列番号２または配列番号４のいずれか１つにしたがったポリペプチドと少なくとも８５％の相同性を有するアスパラギナーゼをコードするＤＮＡ配列；
ｃ）  ａ）またはｂ）にしたがったＤＮＡ配列と少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡ配列；
ｄ）  ａ）またはｂ）にしたがったＤＮＡ配列の相補鎖と高いストリンジェンシーでハイブリッド形成するＤＮＡ配列；
ｅ）  少なくとも１００個のヌクレオチドを有するａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）にしたがったＤＮＡ配列のサブ配列；
ｆ）  ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）にしたがったＤＮＡ配列の相補鎖、
を含む核酸配列。
【請求項９】
前記核酸配列によってコードされるポリペプチドが、配列番号２または配列番号４のいずれか１つのアミノ酸配列と比べて１つのアミノ酸の１つまたは複数の切断、および／または少なくとも１つの置換、欠失および／または挿入を有するアミノ酸配列を含む変異体である、請求項８に記載の核酸配列。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の核酸配列である、請求項７に記載の核酸配列。
【請求項１１】
適切な発現宿主の中でアスパラギナーゼの発現を誘導することができる１つ以上の制御配列に作動的に連結された、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクト。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸コンストラクトを含む組換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１４】
アスパラギナーゼの生産を導く条件下で請求項１３に記載の宿主細胞を培養するステップおよびアスパラギナーゼを回収するステップを含む、アスパラギナーゼ生産方法。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の、または請求項１４に記載の方法により得られるアスパラギナーゼを含む組成物。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼまたは請求項１５に記載の組成物の、食品生産における使用。
【請求項１７】
アスパラギン含有原料に基づく熱処理食品の中で形成されるアクリルアミドの量を削減することを目的とした、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼまたは請求項１５に記載の組成物の使用。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の１つ以上のアスパラギナーゼ酵素または請求項１５に記載の組成物を生産プロセス中の前記食品の中間形態に対し添加し、これによって前記食品の前記中間形態の中に存在するアスパラギナーゼレベルを低下させるのに有効な量で加熱ステップに先立ち酵素が添加されることになるステップを含む、少なくとも１つの加熱ステップが関与する食品の生産のためのプロセス。
【請求項１９】
請求項１８に記載のプロセスまたは請求項１６または１７に記載の使用によって得ることのできる食品。
【請求項２０】
腫瘍の治療のための薬剤としての、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼまたは請求項１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、新たに同定されたアスパラギナーゼポリペプチド変異体およびこれらの新規のアスパラギナーゼをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド配列に関する。本発明は、全長機能タンパク質のアミノ酸配列および遺伝子またはアミノ酸配列の機能的等価物を特徴とする。本発明は同様に、工業的プロセスにおけるこれらの変異体タンパク質の使用方法にも関する。本発明の中に同様に含まれるのは、これらのタンパク質および細胞を生産するのに適した本発明にしたがったポリヌクレオチドで形質転換された細胞であり、ここで、本発明にしたがったタンパク質は、その活性および／または発現レベルを増強または削減するべく遺伝的に修飾されている。本発明は同様に、工業的プロセス中でこれらのタンパク質を使用する方法にも関する。
【０００２】
［発明の背景］
近年、数多くの加熱食品中におけるアクリルアミドの発生が公開された（タレケ（Ｔａｒｅｋｅ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、第１３号、５１７〜５２２頁（２０００年））。アクリルアミドは動物およびヒトにとって発ガン性の恐れがあるものとみなされていることから、この発見事実は、結果として世界中の関心事となった。さらなる研究は、一般的なさまざまな焼き物、揚げ物およびオーブン調理食品の中で大量のアクリルアミドを検出可能であることを明らかにし、食品中のアクリルアミドの発生が加熱プロセスの結果であることが実証された。
【０００３】
モットラム（Ｍｏｔｔｒａｍ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第４１９号、４４８頁（２００２年）により、メイラード反応の結果としての還元糖およびアミノ酸からのアクリルアミドの形成経路が提案された。この仮説によると、アクリルアミドはメイラード反応中に形成され得る。焼いたり、ローストしたりする間に、メイラード反応は主として、色、においおよび風味に関与する。メイラードに付随する１つの反応は、アミノ酸のシュトレッカー分解であり、アクリルアミドへの経路が提案された。アクリルアミドの形成は、温度が１２０℃を超えた時点で検出可能となり、最高の形成速度は、１７０℃前後で観察された。アスパラギンおよびグルコースが存在した場合、最高レベルのアクリルアミドを検出でき、一方、グルタミンおよびアスパラギン酸は、微量という結果しかもたらさなかった。
【０００４】
食品と接触するプラスチックから食品内に移動するアクリルアミドについてのＥＵにおける公式の移動限界は、１０ｐｐｂ（１キログラムあたり１０マイクログラム）に設定されている。調理中に形成するアクリルアミドについてはいかなる公式限界もまだ設定されていないが、数多くの製品、特に穀物、パン製品およびジャガイモまたはトウモロコシベースの製品がこの値を超過しているという事実は、懸念を生じさせるものである。
【０００５】
複数の植物原料が実質的レベルのアスパラギンを含有するものとして公知である。ジャガイモ中では、アスパラギンが、主要な遊離アミノ酸であり（合計アミノ酸含有量の４０％に当たる９４０ｍｇ／ｋｇ）、小麦粉中では、アスパラギンが合計遊離アミノ酸プールの１４％に当たる約１６７ｍｇ／ｋｇのレベルで存在している（ベリッツ（Ｂｅｌｉｔｚ）およびグロッシュ（Ｇｒｏｓｃｈ）、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ中、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９年）。アクリルアミドが主として（還元糖と組合わされた）アスパラギンから形成されているという事実によって、揚げ物、オーブン調理またはローストされた植物製品中で高レベルのアクリルアミドの説明がつくかもしれない。したがって、公衆衛生の利益のため、実質的に低いレベルのアクリルアミドしかもたないか、好ましくはアクリルアミドを含まない食品に対する緊急のニーズが存在する。
【０００６】
アクリルアミド含有量を低減させるため、例えば加熱ステップの温度または持続時間といった加工変数を変えること、またはアクリルアミドの形成を化学的または酵素的に防止することまたは形成したアクリルアミドを除去することによるさまざまな解決法が提案されてきた。
【０００７】
複数の特許出願において、アスパラギンのレベルひいては形成されるアクリルアミドの量を減少させるためのアスパラギナーゼの使用が開示された。この目的のための適切なアスパラギナーゼ、例えば国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレット中のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）および国際公開第０４／０３２６４８号パンフレット中のアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）などが、複数の真菌供給源から生成された。
【０００８】
全てのＬ−アスパラギナーゼは同一の化学転化の触媒として作用するが、このことは、それらが同じ利用分野に適していることを意味するわけではない。さまざまな利用分野が、酵素が機能しなければならない条件に関して異なる要求を有する。酵素的転化の速度に影響を及ぼしうる物理的および化学的パラメータは、（化学反応速度にプラスの効果を有するものの酵素の安定性についてはマイナスの効果を有し得る）温度、含水量、ｐＨ、塩濃度、食品マトリクスの構造的完全性、酵素の活性化因子または阻害因子の存在、基質および生成物の濃度などである。
【０００９】
したがって、改善された特性をもつ複数の利用分野向けの改良型アスパラギナーゼに対する継続的なニーズが存在する。
【００１０】
［発明の目的］
本発明の目的は、新規のアスパラギナーゼ変異体ポリペプチドおよびかかる変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。さらなる目的は、かかるアスパラギナーゼ変異体を生産する組換え菌株を提供することにある。同じく融合ポリペプチドは、本発明にしたがったポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作製および使用方法と共に、本発明の一部を成す。
【００１１】
［発明の概要］
本発明は、アスパラギナーゼ活性を有する新規のポリペプチド変異体を提供する。特に、本発明は、配列番号２または配列番号４のいずれか１つに記されているアミノ酸配列を有する変異体アスパラギナーゼ、そしてそれらの少なくとも１つに対して少なくとも８５％の相同性をもつそのさらなる変異体を提供している。典型的には、本発明のこのようなさらなる変異体は、配列番号２または配列番号４のいずれか１つのポリペプチドの機能的等価物である。本明細書では「機能的等価物」という用語は、かかる機能的に等価なポリペプチドが少なくともアスパラギナーゼ活性を有している必要があることを求めるように意図されている。
【００１２】
本発明は同様に、少なくとも３．５、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも５ｐＨユニットというｐＨ活性プロファイルの幅を有するアスパラギナーゼを提供している。本発明に関しては、ｐＨ活性プロファイルの幅は、酵素がその最大活性の５０〜１００％を示す（ｐＨユニットで計算された）ｐＨ範囲の幅である。酵素のｐＨ活性プロファイルの幅は、実施例の中で示されているように計算可能である。少なくとも３．５というｐＨ活性プロファイルの幅をもつアスパラギナーゼは、天然供給源から単離することが可能であり、そうでなければ人工的アスパラギナーゼ酵素でもあり得る。好ましい実施形態においては、少なくとも３．５、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも５ｐＨユニットというｐＨ活性プロファイルの幅をもつアスパラギナーゼは、配列番号２または配列番号４のいずれか１つに記されているアミノ酸配列を有する変異体アスパラギナーゼおよび少なくともそれらの１つに対して少なくとも８５％の相同性を有するそのさらなる変異体にしたがったアスパラギナーゼである。
【００１３】
本発明の一実施形態においては、本発明は、配列番号２または配列番号４に示されている通りのアミノ酸配列を伴うポリペプチドまたは、それらのいずれかの変異体例えば機能的等価物をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供している。
【００１４】
さらなる実施形態においては、本発明は、配列番号２または配列番号４のいずれか１つにしたがったポリペプチドまたはそれらのうちのいずれかの変異体例えば機能的等価物の少なくとも１つの機能的ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、本発明にしたがった新規のポリペプチド変異体についてコードする新規のポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、少なくとも３．５、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも５ｐＨユニットというｐＨ活性プロファイルの幅を有するアスパラギナーゼをコードする核酸配列を提供する。
【００１７】
本発明は同様に、本発明にしたがったポリヌクレオチド配列および本発明にしたがったこのようなポリヌクレオチドを増幅または検出するために使用可能なプライマ、プローブおよびフラグメントを含むベクターにも関する。
【００１８】
さらに好ましい実施形態においては、本発明にしたがったポリヌクレオチド配列が、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの糸状菌といった適切な宿主細胞内でのコードされたアミノ酸の発現に適した少なくとも１つの調節配列と機能的に連結されているベクターが提供されている。本発明は同様に、本発明にしたがったポリヌクレオチドおよびベクターを調製する方法をも提供する。
【００１９】
本発明は同様に、本発明にしたがった変異体（非相同）ポリヌクレオチドを含む組換え産生された宿主細胞にも関する。
【００２０】
別の実施形態においては、本発明は、本発明にしたがった変異体アスパラギナーゼの発現が著しく増大しているかまたは生産されたアスパラギナーゼの活性が増大している組換え宿主細胞を提供する。
【００２１】
別の実施形態においては、本発明は、本発明にしたがったポリヌクレオチドを含み、したがって本発明にしたがった機能的変異体アスパラギナーゼを生産できる組換え生産された宿主細胞、好ましくは本発明にしたがった変異体アスパラギナーゼを過剰発現できる細胞、例えば本発明にしたがったポリヌクレオチドを含むアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）菌株を提供する。
【００２２】
本発明のさらに別の態様においては、精製された変異体ポリペプチドが提供されている。本発明にしたがったポリペプチドは、本発明にしたがったポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む。特に好ましいのは、配列番号２または配列番号４のいずれか１つにしたがった変異体ポリペプチドまたはそれらのいずれかの変異体、例えば機能的等価物である。
【００２３】
本発明にしたがったポリペプチドを含む融合タンパク質も同様に、本発明の範囲内に入る。
【００２４】
本発明は同様に、本発明にしたがった変異体ポリペプチドを製造する方法をも提供する。
【００２５】
本発明は同様に、本明細書中で記述されているようなあらゆる工業的プロセスにおける本発明にしたがった変異体アスパラギナーゼの使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレットの配列番号３の中で開示されている通りのＡ・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）野生型アスパラギナーゼとの配列番号２および配列番号４のアラインメントを示す。
【００２７】
［発明の詳細な説明］
本明細書および随伴する特許請求の範囲全体を通して、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」という用語そして「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」といったような変形形態は、包括的に解釈されるものとする。すなわち、これらの用語は、文脈が許容する場合、具体的に列挙されていないその他の要素または整数の包含の可能性を伝達するように意図されている。
【００２８】
本発明は、配列番号２または配列番号４のいずれか１つに記されている配列を有する変異体アスパラギナーゼ配列およびそのさらなる変異体に関する。
【００２９】
以下に両方のポリペプチド配列についての詳細を記す。
【００３０】
配列番号２の配列は、国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレット内で開示されているようなアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）から得られた野生型アスパラギナーゼ配列と比べて、以下の置換を含む：Ｔ２５Ａ、Ｅ２８Ｔ、Ｆ３０Ｙ、Ａ３５Ｓ、Ｆ５３Ｌ、Ｄ６３Ｓ、Ｓ６４Ａ、Ｓ６５Ｄ、Ｓ６６Ｎ、Ｓ７４Ａ、Ｖ７７Ｉ、Ｖ７９Ｉ、Ｌ８０Ｑ、Ｓ８１Ｔ、Ｓ８８Ｅ、Ｅ１０６Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｄ１１１Ｓ、Ｉ１１４Ｌ、Ｓ１１７Ａ、Ｋ１１９Ｔ、Ｒ１２２Ｅ、Ｅ１２６Ｄ、Ａ１３１Ｓ、Ｉ１６１Ｖ、Ｓ１６８Ａ、Ｅ１８１Ｑ、Ｔ１８９Ｐ、Ｓ１９０Ａ、Ｍ１９７Ｌ、Ａ２０５Ｖ、Ｙ２０８Ｆ、Ｖ２１０Ａ、Ｔ２１１Ｓ、Ｍ２２４Ｖ、Ｙ２２８Ｎ、Ｅ２３１Ａ、Ｍ２３２Ｉ、Ｉ２３３Ｖ、Ｔ２３６Ｋ、Ｆ２３８Ｙ、Ｆ２４０Ｙ、Ｖ２５０Ｔ、Ａ２５１Ｔ、Ｆ２５２Ｖ、Ｉ２５４Ｖ、Ｔ２５５Ｒ、Ｅ２５９Ｓ、Ｆ２６７Ｙ、Ｅ２７０Ｑ、Ｈ２７３Ｑ、Ｎ２７９Ｓ、Ｓ２８２Ｄ、Ｓ２８３Ｎ、Ｑ２８６Ｋ、Ａ２９３Ｓ、Ｇ２９７Ｓ、Ｔ２９９Ｓ、Ｓ３０１Ｇ、Ｎ３０３Ｓ、Ｅ３０４Ｄ、Ｅ３０７Ｄ、Ｖ３０９Ｉ、Ｉ３１０Ａ、Ｎ３１１Ｓ、Ｒ３１２Ｋ、Ｌ３１３Ｈ、Ｅ３１４Ｓ、Ｖ３１７Ｉ、Ｑ３１９Ｌ、Ｍ３２１Ｔ、Ｖ３２４Ｇ、Ｌ３３０Ｔ、Ｙ３４５Ｆ、Ｓ３５１Ａ、Ｓ３６０Ａ、Ｑ３６１Ｅ、Ｎ３６４Ｇ、Ｉ３６５Ｆ、Ｔ３６６Ｋ、Ａ３６９Ｒ、Ｄ３７０Ｅ、Ｌ３７４Ｋ、Ｇ３７５ＶおよびＤ３７７Ｖ。
【００３１】
国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレット内で開示されている通りのＡ・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）から得られた野生型アスパラギナーゼ配列は、その中で配列番号３（アミノ酸配列）として開示されている。本出願の配列番号２に記されているアスパラギナーゼは、ＡＳＮ００１と仮称される。
【００３２】
配列番号２に記されている配列の変異体、例えば機能的等価物は、２５位のＡｌａ、２８位のＴｈｒ、３０位のＴｙｒ、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１３１位のＳｅｒ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１０位のＡｌａ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２４０位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５２位のＶａｌ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７３位のＧｌｎ、２７９位のＳｅｒ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０７位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１０位のＡｌａ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＬｙｓ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３１９位のＬｅｕ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＴｈｒ、３４５位のＰｈｅ、３５１位のＡｌａ、３６０位のＡｌａ、３６１位のＧｌｕ、３６４位のＧｌｙ、３６５位のＰｈｅ、３６６位のＬｙｓ、３６９位のＡｒｇ、３７０位のＧｌｕ、３７４位のＬｙｓ、３７５位のＶａｌまたは３７７位のＶａｌのうちの１つ以上を含んでいてよく、前記位置は配列番号２を基準にして定義されている。
【００３３】
すなわち、配列番号２に記されている配列の変異体を配列番号２に記されている配列と整列させた場合、その変異体は、次のもののうちの１つ以上を含んでいてよい：
配列番号２中の２５位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号２中の２８位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｈｒ；
配列番号２中の３０位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｙｒ；
配列番号２中の３５位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号２中の５３位に対応する（変異体中の）位置にあるＬｅｕ；
配列番号２中の６３位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号２中の６４位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号２中の６５位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｐ；
配列番号２中の６６位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｎ；
配列番号２中の７４位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号２中の７７位に対応する（変異体中の）位置にあるＩｌｅ；
配列番号２中の７９位に対応する（変異体中の）位置にあるＩｌｅ；
配列番号２中の８０位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｎ；
配列番号２中の８１位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｈｒ；
配列番号２中の８８位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｕ；
配列番号２中の１０６位に対応する（変異体中の）位置にあるＰｒｏ；
配列番号２中の１０８位に対応する（変異体中の）位置にあるＶａｌ；
配列番号２中の１１１位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号２中の１１４位に対応する（変異体中の）位置にあるＬｅｕ；
配列番号２中の１１７位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号２中の１１９位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｈｒ；
配列番号２中の１２２位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｕ；
配列番号２中の１２６位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｐ；
配列番号２中の１３１位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号２中の１６１位に対応する（変異体中の）位置にあるＶａｌ；
配列番号２中の１６８位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号２中の１８１位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｎ；
配列番号２中の１８９位に対応する（変異体中の）位置にあるＰｒｏ；
配列番号２中の１９０位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号２中の１９７位に対応する（変異体中の）位置にあるＬｅｕ；
配列番号２中の２０５位に対応する（変異体中の）位置にあるＶａｌ；
配列番号２中の２０８位に対応する（変異体中の）位置にあるＰｈｅ；
配列番号２中の２１０位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号２中の２１１位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号２中の２２４位に対応する（変異体中の）位置にあるＶａｌ；
配列番号２中の２２８位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｎ；
配列番号２中の２３１位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号２中の２３２位に対応する（変異体中の）位置にあるＩｌｅ；
配列番号２中の２３３位に対応する（変異体中の）位置にあるＶａｌ；
配列番号２中の２３６位に対応する（変異体中の）位置にあるＬｙｓ；
配列番号２中の２３８位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｙｒ；
配列番号２中の２４０位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｙｒ；
配列番号２中の２５０位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｈｒ；
配列番号２中の２５１位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｈｒ；
配列番号２中の２５２位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｈｒ；
配列番号２中の２５４位に対応する（変異体中の）位置にあるＶａｌ；
配列番号２中の２５５位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｒｇ；
配列番号２中の２５９位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号２中の２６７位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｙｒ；
配列番号２中の２７０位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｎ；
配列番号２中の２７３位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｎ；
配列番号２中の２７９位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｐ；
配列番号２中の２８２位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｐ；
配列番号２中の２８３位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｎ；
配列番号２中の２８６位に対応する（変異体中の）位置にあるＬｙｓ；
配列番号２中の２９３位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号２中の２９７位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号２中の２９９位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号２中の３０１位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｙ；
配列番号２中の３０３位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号２中の３０４位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｐ；
配列番号２中の３０７位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｐ；
配列番号２中の３０９位に対応する（変異体中の）位置にあるＩｌｅ；
配列番号２中の３１０位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号２中の３１１位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号２中の３１２位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｈｒ；
配列番号２中の３１３位に対応する（変異体中の）位置にあるＨｉｓ；
配列番号２中の３１４位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号２中の３１７位に対応する（変異体中の）位置にあるＩｌｅ；
配列番号２中の３１９位に対応する（変異体中の）位置にあるＬｅｕ；
配列番号２中の３２１位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｈｒ；
配列番号２中の３２４位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｙ；
配列番号２中の３３０位に対応する（変異体中の）位置にあるＰｒｏ；
配列番号２中の３４５位に対応する（変異体中の）位置にあるＰｈｅ；
配列番号２中の３５１位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号２中の３６０位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号２中の３６１位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｕ；
配列番号２中の３６４位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｙ；
配列番号２中の３６５位に対応する（変異体中の）位置にあるＰｈｅ；
配列番号２中の３６６位に対応する（変異体中の）位置にあるＬｙｓ；
配列番号２中の３６９位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｒｇ；
配列番号２中の３７０位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｕ；
配列番号２中の３７４位に対応する（変異体中の）位置にあるＬｙｓ；
配列番号２中の３７５位に対応する（変異体中の）位置にあるＶａｌ；または
配列番号２中の３７７位に対応する（変異体中の）位置にあるＶａｌ。
【００３４】
本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、２５位のＡｌａ、２８位のＴｈｒ、３０位のＴｙｒ、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１３１位のＳｅｒ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１０位のＡｌａ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２４０位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５２位のＶａｌ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７３位のＧｌｎ、２７９位のＳｅｒ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０７位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１０位のＡｌａ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＬｙｓ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３１９位のＬｅｕ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＴｈｒ、３４５位のＰｈｅ、３５１位のＡｌａ、３６０位のＡｌａ、３６１位のＧｌｕ、３６４位のＧｌｙ、３６５位のＰｈｅ、３６６位のＬｙｓ、３６９位のＡｒｇ、３７０位のＧｌｕ、３７４位のＬｙｓ、３７５位のＶａｌまたは３７７位のＶａｌというアミノ酸のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、例えば少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、例えば少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個または全てを含んでいてよく、前記位置は配列番号２を基準にして定義されている。
【００３５】
したがって、本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、２５位のＡｌａ、２８位のＴｈｒ、３０位のＴｙｒ、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１３１位のＳｅｒ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１０位のＡｌａ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２４０位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５２位のＶａｌ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７３位のＧｌｎ、２７９位のＳｅｒ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０７位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１０位のＡｌａ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＬｙｓ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３１９位のＬｅｕ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＴｈｒ、３４５位のＰｈｅ、３５１位のＡｌａ、３６０位のＡｌａ、３６１位のＧｌｕ、３６４位のＧｌｙ、３６５位のＰｈｅ、３６６位のＬｙｓ、３６９位のＡｒｇ、３７０位のＧｌｕ、３７４位のＬｙｓ、３７５位のＶａｌまたは３７７位のＶａｌのうちの２つ以上のあらゆる組合せを含んでいてよく、前記位置は配列番号２を基準にして定義されている。
【００３６】
好ましくは、本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、２５位のＡｌａ、２８位のＴｈｒ、３０位のＴｙｒ、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１３１位のＳｅｒ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１０位のＡｌａ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２４０位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５２位のＶａｌ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７３位のＧｌｎ、２７９位のＳｅｒ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０７位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１０位のＡｌａ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＬｙｓ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３１９位のＬｅｕ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＴｈｒ、３４５位のＰｈｅ、３５１位のＡｌａ、３６０位のＡｌａ、３６１位のＧｌｕ、３６４位のＧｌｙ、３６５位のＰｈｅ、３６６位のＬｙｓ、３６９位のＡｒｇ、３７０位のＧｌｕ、３７４位のＬｙｓ、３７５位のＶａｌまたは３７７位のＶａｌの全てを含んでいてよく、前記位置は配列番号２を基準にして定義されている。
【００３７】
２５、２８、３０、３５、５３、６３、６４、６５、６６、７４、７７、７９、８０、８１、８８、１０６、１０８、１１１、１１４、１１７、１１９、１２２、１２６、１３１、１６１、１６８、１８１、１８９、１９０、１９７、２０５、２０８、２１０、２１１、２２４、２２８、２３１、２３２、２３３、２３６、２３８、２４０、２５０、２５１、２５２、２５４、２５５、２５９、２６７、２７０、２７３、２７９、２８２、２８３、２８６、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０４、３０７、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１７、３１９、３２１、３２４、３３０、３４５、３５１、３６０、３６１、３６４、３６５、３６６、３６９、３７０、３７４、３７５および３７７位に対応する本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチド内のこれらの位置は、例えばＧＡＰプログラム（このプログラムの詳細については以下を参照のこと）によって発見された最も相同な配列に対するＧＡＰアラインメントなどを用いて配列番号２の配列と変異体ポリペプチドの配列とを整列させることにより同定されてよい。配列番号２内の２５、２８、３０、３５、５３、６３、６４、６５、６６、７４、７７、７９、８０、８１、８８、１０６、１０８、１１１、１１４、１１７、１１９、１２２、１２６、１３１、１６１、１６８、１８１、１８９、１９０、１９７、２０５、２０８、２１０、２１１、２２４、２２８、２３１、２３２、２３３、２３６、２３８、２４０、２５０、２５１、２５２、２５４、２５５、２５９、２６７、２７０、２７３、２７９、２８２、２８３、２８６、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０４、３０７、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１７、３１９、３２１、３２４、３３０、３４５、３５１、３６０、３６１、３６４、３６５、３６６、３６９、３７０、３７４、３７５および３７７位に対応する変異体内の位置はこのようにして同定され得、配列番号２を基準にして定義されるこれらの位置として呼称される。
【００３８】
配列番号４の配列は、国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレット内で開示されている通りのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）から得た野生型アスパラギナーゼ配列と比べて、Ａ３５Ｓ、Ｆ５３Ｌ、Ｄ６３Ｓ、Ｓ６４Ａ、Ｓ６５Ｄ、Ｓ６６Ｎ、Ｓ７４Ａ、Ｖ７７Ｉ、Ｖ７９Ｉ、Ｌ８０Ｑ、Ｓ８１Ｔ、Ｓ８８Ｅ、Ｅ１０６Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｄ１１１Ｓ、Ｉ１１４Ｌ、Ｓ１１７Ａ、Ｋ１１９Ｔ、Ｒ１２２Ｅ、Ｅ１２６Ｄ、Ｉ１６１Ｖ、Ｓ１６８Ａ、Ｅ１８１Ｑ、Ｔ１８９Ｐ、Ｓ１９０Ａ、Ｍ１９７Ｌ、Ａ２０５Ｖ、Ｙ２０８Ｆ、Ｔ２１１Ｓ、Ｍ２２４Ｖ、Ｙ２２８Ｎ、Ｅ２３１Ａ、Ｍ２３２Ｉ、Ｉ２３３Ｖ、Ｔ２３６Ｋ、Ｆ２３８Ｙ、Ｖ２５０Ｔ、Ａ２５１Ｔ、Ｉ２５４Ｖ、Ｔ２５５Ｒ、Ｅ２５９Ｓ、Ｆ２６７Ｙ、Ｅ２７０Ｑ、Ｎ２７９Ｄ、Ｓ２８２Ｄ、Ｓ２８３Ｎ、Ｑ２８６Ｋ、Ａ２９３Ｓ、Ｇ２９７Ｓ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ３００Ｓ、Ｓ３０１Ｇ、Ｎ３０３Ｓ、Ｅ３０４Ｄ、Ｖ３０９Ｉ、Ｎ３１１Ｓ、Ｒ３１２Ｔ、Ｌ３１３Ｈ、Ｅ３１４Ｓ、Ｖ３１７Ｉ、Ｍ３２１Ｔ、Ｖ３２４Ｇ、Ｌ３３０Ｐ、Ｖ３３３Ｅ、Ｈ３４０Ｑ、Ｙ３４５Ｆ、Ｓ３６０Ａ、Ｎ３６４Ｇ、Ｔ３６６Ｅ、Ａ３６９Ｒ、Ｄ３７０Ｅ、Ｌ３７４Ｋ、Ｇ３７５Ｖ、Ｔ３７６ＧおよびＤ３７７Ｖという置換を含んでいる。
【００３９】
さらに、配列番号４の配列は、国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレット内で開示されている通りのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）から得た野生型アスパラギナーゼ配列と比べて、４つのアミノ酸欠失を含んでいる。すなわち、本明細書中で開示されている配列番号４は、国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレット中で開示されその中で配列番号３（アミノ酸配列）と呼称されているアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）から得られた野生型アスパラギナーゼ配列内のＤ３３６、Ｔ３３７、Ａ３３８およびＴ３３９に対応するアミノ酸を含んでいない。本出願の配列番号４に記されているアスパラギナーゼはＡＳＮ００２と仮称される。
【００４０】
配列番号４に記されている配列の変異体、例えば機能的等価物は、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７９位のＡｓｐ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位Ｓｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＴｈｒ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＰｒｏ、３３３位のＧｌｕ、３３６位のＧｌｎ、３４１位のＰｈｅ、３５６位のＡｌａ、３６０位のＧｌｙ、３６２位のＧｌｕ、３６５位のＡｒｇ、３６６位のＧｌｕ、３７０位のＬｙｓ、３７１位のＶａｌ、３７２位のＧｌｙまたは３７３位のＶａｌのうちの１つ以上を含んでいてよく、前記位置は配列番号４を基準にして定義されている。
【００４１】
すなわち、配列番号４に記されている配列の変異体を配列番号４に記されている配列と整列させた場合、その変異体は、次のもののうちの１つ以上を含んでいてよい：
配列番号４中の３５位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号４中の５３位に対応する（変異体中の）位置にあるＬｅｕ；
配列番号４中の６３位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号４中の６４位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号４中の６５位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｐ；
配列番号４中の６６位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｎ；
配列番号４中の７４位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号４中の７７位に対応する（変異体中の）位置にあるＩｌｅ；
配列番号４中の７９位に対応する（変異体中の）位置にあるＩｌｅ；
配列番号４中の８０位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｎ；
配列番号４中の８１位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｈｒ；
配列番号４中の８８位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｕ；
配列番号４中の１０６位に対応する（変異体中の）位置にあるＰｒｏ；
配列番号４中の１０８位に対応する（変異体中の）位置にあるＶａｌ；
配列番号４中の１１１位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号４中の１１４位に対応する（変異体中の）位置にあるＬｅｕ；
配列番号４中の１１７位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号４中の１１９位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｈｒ；
配列番号４中の１２２位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｕ；
配列番号４中の１２６位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｐ；
配列番号４中の１６１位に対応する（変異体中の）位置にあるＶａｌ；
配列番号４中の１６８位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号４中の１８１位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｎ；
配列番号４中の１８９位に対応する（変異体中の）位置にあるＰｒｏ；
配列番号４中の１９０位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号４中の１９７位に対応する（変異体中の）位置にあるＬｅｕ；
配列番号４中の２０５位に対応する（変異体中の）位置にあるＶａｌ；
配列番号４中の２０８位に対応する（変異体中の）位置にあるＰｈｅ；
配列番号４中の２１１位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号４中の２２４位に対応する（変異体中の）位置にあるＶａｌ；
配列番号４中の２２８位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｎ；
配列番号４中の２３１位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号４中の２３２位に対応する（変異体中の）位置にあるＩｌｅ；
配列番号４中の２３３位に対応する（変異体中の）位置にあるＶａｌ；
配列番号４中の２３６位に対応する（変異体中の）位置にあるＬｙｓ；
配列番号４中の２３８位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｙｒ；
配列番号４中の２５０位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｈｒ；
配列番号４中の２５１位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｈｒ；
配列番号４中の２５４位に対応する（変異体中の）位置にあるＶａｌ；
配列番号４中の２５５位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｒｇ；
配列番号４中の２５９位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号４中の２６７位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｙｒ；
配列番号４中の２７０位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｎ；
配列番号４中の２７９位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｐ；
配列番号４中の２８２位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｐ；
配列番号４中の２８３位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｎ；
配列番号４中の２８６位に対応する（変異体中の）位置にあるＬｙｓ；
配列番号４中の２９３位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号４中の２９７位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号４中の２９９位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号４中の３００位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号４中の３０１位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｙ；
配列番号４中の３０３位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号４中の３０４位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｓｐ；
配列番号４中の３０９位に対応する（変異体中の）位置にあるＩｌｅ；
配列番号４中の３１１位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号４中の３１２位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｈｒ；
配列番号４中の３１３位に対応する（変異体中の）位置にあるＨｉｓ；
配列番号４中の３１４位に対応する（変異体中の）位置にあるＳｅｒ；
配列番号４中の３１７位に対応する（変異体中の）位置にあるＩｌｅ；
配列番号４中の３２１位に対応する（変異体中の）位置にあるＴｈｒ；
配列番号４中の３２４位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｙ；
配列番号４中の３３０位に対応する（変異体中の）位置にあるＰｒｏ；
配列番号４中の３３３位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｕ；
配列番号４中の３３６位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｎ；
配列番号４中の３４１位に対応する（変異体中の）位置にあるＰｈｅ；
配列番号４中の３５６位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｌａ；
配列番号４中の３６０位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｙ；
配列番号４中の３６２位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｕ；
配列番号４中の３６５位に対応する（変異体中の）位置にあるＡｒｇ；
配列番号４中の３６６位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｕ；
配列番号４中の３７０位に対応する（変異体中の）位置にあるＬｙｓ；
配列番号４中の３７１位に対応する（変異体中の）位置にあるＶａｌ；
配列番号４中の３７２位に対応する（変異体中の）位置にあるＧｌｙ；または
配列番号４中の３７３位に対応する（変異体中の）位置にあるＶａｌ。
【００４２】
本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７９位のＡｓｐ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位Ｓｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＴｈｒ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＰｒｏ、３３３位のＧｌｕ、３３６位のＧｌｎ、３４１位のＰｈｅ、３５６位のＡｌａ、３６０位のＧｌｙ、３６２位のＧｌｕ、３６５位のＡｒｇ、３６６位のＧｌｕ、３７０位のＬｙｓ、３７１位のＶａｌ、３７２位のＧｌｙまたは３７３位のＶａｌというアミノ酸のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、例えば少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、例えば少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個または全てを含んでいてよく、前記位置は配列番号４を基準にして定義されている。
【００４３】
したがって、本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７９位のＡｓｐ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位Ｓｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＴｈｒ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＰｒｏ、３３３位のＧｌｕ、３３６位のＧｌｎ、３４１位のＰｈｅ、３５６位のＡｌａ、３６０位のＧｌｙ、３６２位のＧｌｕ、３６５位のＡｒｇ、３６６位のＧｌｕ、３７０位のＬｙｓ、３７１位のＶａｌ、３７２位のＧｌｙまたは３７３位のＶａｌのうちの２つ以上のあらゆる組合せを含んでいてよく、前記位置は配列番号４を基準にして定義されている。
【００４４】
好ましくは、本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７９位のＡｓｐ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＴｈｒ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＰｒｏ、３３３位のＧｌｕ、３３６位のＧｌｎ、３４１位のＰｈｅ、３５６位のＡｌａ、３６０位のＧｌｙ、３６２位のＧｌｕ、３６５位のＡｒｇ、３６６位のＧｌｕ、３７０位のＬｙｓ、３７１位のＶａｌ、３７２位のＧｌｙおよび３７３位のＶａｌの全てを含んでいてよく、前記位置は配列番号４を基準にして定義されている。
【００４５】
３５、５３、６３、６４、６５、６６、７４、７７、７９、８０、８１、８８、１０６、１０８、１１１、１１４、１１７、１１９、１２２、１２６、１６１、１６８、１８１、１８９、１９０、１９７、２０５、２０８、２１１、２２４、２２８、２３１、２３２、２３３、２３６、２３８、２５０、２５１、２５４、２５５、２５９、２６７、２７０、２７９、２８２、２８３、２８６、２９３、２９７、２９９、３００、３０１、３０３、３０４、３０９、３１１、３１２、３１３、３１４、３１７、３２１、３２４、３３０、３３３、３３６、３４１、３５６、３６０、３６２、３６５、３６６、３７０、３７１、３７２および３７３位に対応する本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチド内のこれらの位置は、例えばＧＡＰプログラム（このプログラムの詳細については以下を参照のこと）によって発見された最も相同な配列に対するＧＡＰアラインメントなどを用いて配列番号４の配列と変異体ポリペプチドの配列とを整列させることにより同定され得る。配列番号４内の３５、５３、６３、６４、６５、６６、７４、７７、７９、８０、８１、８８、１０６、１０８、１１１、１１４、１１７、１１９、１２２、１２６、１６１、１６８、１８１、１８９、１９０、１９７、２０５、２０８、２１１、２２４、２２８、２３１、２３２、２３３、２３６、２３８、２５０、２５１、２５４、２５５、２５９、２６７、２７０、２７９、２８２、２８３、２８６、２９３、２９７、２９９、３００、３０１、３０３、３０４、３０９、３１１、３１２、３１３、３１４、３１７、３２１、３２４、３３０、３３３、３３６、３４１、３５６、３６０、３６２、３６５、３６６、３７０、３７１、３７２および３７３位に対応する変異体内の位置はこのようにして同定され得、配列番号４を基準にして定義されるこれらの位置として呼称される。
【００４６】
さらに、本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチドは典型的には、国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレットの中で開示されているようにアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）から得られた野生型アスパラギナーゼ配列の中のＡｓｐ３３６、Ｔｈｒ３３７、Ａｌａ３３８およびＴｈｒ３３９に対応するアミノ酸のうちの１つ以上、例えば２つ、３つまたは全てを含まない。すなわち本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチドを国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレット内で開示されているアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）から得られた野生型アスパラギナーゼ配列と整列させた場合、それは典型的に、野生型Ａ・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）配列の３３６、３３７、３３８および３３９位に見出されるものに対応するアミノ酸のうちの１つ以上を含まない。
【００４７】
別の実施形態においては、本発明は同様に、少なくとも３．５、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも５ｐＨユニットというｐＨ活性プロファイルの幅を有するアスパラギナーゼをも提供している。好ましい実施形態においては、少なくとも３．５、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも５ｐＨユニットというｐＨ活性プロファイルの幅を有するアスパラギナーゼは、配列番号２または配列番号４のうちのいずれか１つに記されているアミノ酸配列を有する変異体アスパラギナーゼそしてそれらのうちの少なくとも１つに対する少なくとも８５％の相同性を有するそのさらなる変異体にしたがったアスパラギナーゼである。
【００４８】
［ポリヌクレオチド］
以上で記した通り、本発明は、配列番号２（ＡＳＮ００１と仮称）または配列番号４（ＡＳＮ００２と仮称）のいずれか１つにしたがったアミノ酸配列を有する変異体アスパラギナーゼおよびその付加的な変異体、例えば機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを提供する。したがって本発明は、配列番号１または配列番号３のいずれか１つにしたがったポリヌクレオチドおよび付加的な変異体ポリヌクレオチドを提供する
【００４９】
明確さを期して、配列番号１は配列番号２にしたがったポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であり、配列番号３は配列番号４にしたがったポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。
【００５０】
本発明は、本発明にしたがったアスパラギナーゼをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド配列ならびにそのコード配列を提供している。したがって、本発明は、
ａ）  配列番号２または配列番号４のいずれか１つにしたがったアスパラギナーゼをコードするＤＮＡ配列；
ｂ）  配列番号２または配列番号４のいずれか１つにしたがったポリペプチドと少なくとも８５％の相同性を有するアスパラギナーゼをコードするＤＮＡ配列；
ｃ）  ａ）またはｂ）にしたがったＤＮＡ配列と少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡ配列；
ｄ）  ａ）またはｂ）にしたがったＤＮＡ配列の相補鎖と高いストリンジェンシーでハイブリッド形成するＤＮＡ配列；
ｅ）  少なくとも１００個のヌクレオチドを有するａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）にしたがったＤＮＡ配列のサブ配列；
ｆ）  ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）にしたがったＤＮＡ配列の相補鎖、
を含む核酸配列に関する。
【００５１】
本発明は同様に、配列番号２または配列番号４のいずれか１つにしたがったポリペプチドの少なくとも１つの機能的ドメインにしたがった単離されたポリヌクレオチドにも関する。以下では、本発明にしたがったポリペプチドについて、このことを詳述する。
【００５２】
典型的には、配列番号２に関しては、かかるドメインは、２５位のＡｌａ、２８位のＴｈｒ、３０位のＴｙｒ、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１３１位のＳｅｒ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１０位のＡｌａ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２４０位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５２位のＶａｌ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７３位のＧｌｎ、２７９位のＳｅｒ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０７位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１０位のＡｌａ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＬｙｓ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３１９位のＬｅｕ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＴｈｒ、３４５位のＰｈｅ、３５１位のＡｌａ、３６０位のＡｌａ、３６１位のＧｌｕ、３６４位のＧｌｙ、３６５位のＰｈｅ、３６６位のＬｙｓ、３６９位のＡｒｇ、３７０位のＧｌｕ、３７４位のＬｙｓ、３７５位のＶａｌまたは３７７位のＶａｌのうちの１つ以上に対応する１つまたは複数のアミノ酸を含み、前記位置は配列番号２を基準にして定義されている。
【００５３】
本発明の一実施形態においては、本発明にしたがった核酸配列はポリペプチドをコードし、ここでポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜３７８の配列に比べてアミノ酸の１つ以上の切断、および／または少なくとも１つの置換、欠失および／または挿入を有するアミノ酸配列を含む変異体である。かかるポリペプチドは典型的には、２５位のＡｌａ、２８位のＴｈｒ、３０位のＴｙｒ、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１３１位のＳｅｒ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１０位のＡｌａ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２４０位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５２位のＶａｌ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７３位のＧｌｎ、２７９位のＳｅｒ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０７位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１０位のＡｌａ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＬｙｓ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３１９位のＬｅｕ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＴｈｒ、３４５位のＰｈｅ、３５１位のＡｌａ、３６０位のＡｌａ、３６１位のＧｌｕ、３６４位のＧｌｙ、３６５位のＰｈｅ、３６６位のＬｙｓ、３６９位のＡｒｇ、３７０位のＧｌｕ、３７４位のＬｙｓ、３７５位のＶａｌまたは３７７位のＶａｌのうちの１つ以上を含み、前記位置は配列番号２を基準にして定義されている。
【００５４】
典型的には、配列番号４に関しては、かかるドメインは、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７９位のＡｓｐ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＴｈｒ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＰｒｏ、３３３位のＧｌｕ、３３６位のＧｌｎ、３４１位のＰｈｅ、３５６位のＡｌａ、３６０位のＧｌｙ、３６２位のＧｌｕ、３６５位のＡｒｇ、３６６位のＧｌｕ、３７０位のＬｙｓ、３７１位のＶａｌ、３７２位のＧｌｙおよび３７３位のＶａｌのうちの１つ以上に対応する１つまたは複数のアミノ酸を含み、前記位置は配列番号４を基準にして定義されている。
【００５５】
本発明の一実施形態においては、本発明にしたがった核酸配列はポリペプチドをコードし、ここでポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１〜３７４の配列と比べてアミノ酸の１つ以上の切断、および／または少なくとも１つの置換、欠失および／または挿入を有するアミノ酸配列を含む変異体である。かかるポリペプチドは典型的には、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７９位のＡｓｐ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＴｈｒ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＰｒｏ、３３３位のＧｌｕ、３３６位のＧｌｎ、３４１位のＰｈｅ、３５６位のＡｌａ、３６０位のＧｌｙ、３６２位のＧｌｕ、３６５位のＡｒｇ、３６６位のＧｌｕ、３７０位のＬｙｓ、３７１位のＶａｌ、３７２位のＧｌｙおよび３７３位のＶａｌのうちの１つ以上を含み、前記位置は配列番号４を基準にして定義されている。
【００５６】
別の実施形態においては、本発明は、少なくとも３．５、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも５ｐＨユニットというｐＨ活性プロファイルの幅を有するアスパラギナーゼをコードする核酸分子を提供する。好ましい実施形態においては、少なくとも３．５というｐＨ活性プロファイルの幅を有するアスパラギナーゼをコードする前記核酸分子は、
ａ）  配列番号２または配列番号４のいずれか１つにしたがったアスパラギナーゼをコードするＤＮＡ配列；
ｂ）  配列番号２または配列番号４のいずれか１つにしたがったポリペプチドと少なくとも８５％の相同性を有するアスパラギナーゼをコードするＤＮＡ配列；
ｃ）  ａ）またはｂ）にしたがったＤＮＡ配列と少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡ配列；
ｄ）  ａ）またはｂ）にしたがったＤＮＡ配列の相補鎖と高いストリンジェンシーでハイブリッド形成するＤＮＡ配列；
ｅ）  少なくとも１００個のヌクレオチドを有するａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）にしたがったＤＮＡ配列のサブ配列；
ｆ）  ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）にしたがったＤＮＡ配列の相補鎖、
を含む核酸配列である。
【００５７】
本明細書中で使用されている「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、例えば野生型アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスパラギナーゼの変異体といったような本明細書で記述されている変異体アスパラギナーゼをコードする読取り枠を含む核酸分子を意味する。遺伝子は、コード配列、非コード配列、イントロンおよび調節配列を含んでいてよい。すなわち、本明細書中で使用されている「遺伝子」とは、本明細書中で定義されている単離した核酸分子を意味してよい。したがって、「遺伝子」という用語は、本発明に関しては、天然に存在する配列のみを意味していない。
【００５８】
本発明の核酸分子は、本明細書で提供されている配列情報と組合せて考慮した場合に当業者にとって周知である標準的な分子生物学技術を用いて生成可能である。
【００５９】
例えば、標準的な合成技術を用いて、必要とされる核酸分子を新たに合成してもよい。かかる合成プロセスは典型的には自動化されたプロセスとなる。かかる技術は当業者にとって周知である。
【００６０】
代替的には、本発明の核酸分子は、例えば野生型核酸分子といった既存の核酸分子の部位特異的突然変異誘発を使用することによって生成されてよい。部位特異的突然変異誘発は、当業者にとって周知である多数の技術を用いて実施され得る。
【００６１】
単なる一例としてここで言及されるこのような方法の１つにおいては、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチド「プライマ」を用いてプラスミド鋳型上でＰＣＲが実施される。プライマは新たに合成されたストランドの末端であることから、鋳型ＤＮＡストランドを結合させる上で第１サイクル中にミスマッチが存在した場合、その第１ラウンドの後、（突然変異を含む）プライマベースのストランドは、当初の鋳型と同等の濃度となる。連続的サイクルの後、それは指数関数的に成長し、２５回の後、８００万：１の領域内で当初の突然変異を受けていないストランドの数を上回り、その結果、突然変異を受けた増幅済みフラグメントのほぼ均質な溶液が得られると思われる。このとき鋳型ＤＮＡは、例えばＤｐｎ１といったような、メチル化されたＤＮＡのみを切断する制限酵素を用いて、酵素消化により除去され得る。アルカリ溶菌法プラスミド調製から誘導され、したがってメチル化されている鋳型は、このステップにおいて破壊されるが、突然変異を受けたプラスミドは、生体外で生成されておりかつその結果としてメチル化されていないことから、保存される。
【００６２】
かかる方法においては、２つ以上の突然変異を、例えば、各々１つ以上のミスマッチを含む１つ以上のオリゴヌクレオチドを用いることによって、単一のＰＣＲ反応の中で核酸分子内に導入してよい。或いは、改変された核酸が逐次的反復的に核酸内に導入されるような形で、各々が１つ以上の突然変異を導入する２つ以上のＰＣＲ反応を実施することによって、核酸分子内に２つ以上の突然変異を導入してもよい。
【００６３】
本発明の核酸は、上述の部位特異的突然変異誘発技術にしたがって適切なミスマッチオリゴヌクレオチドプライマおよび鋳型としてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ或いはまたゲノムＤＮＡを用いて生成可能である。このようにして誘導された核酸分子は、適切なベクターの中にクローニングさせ、ＤＮＡ配列分析により特徴付けすることができる。
【００６４】
本発明の核酸配列は、国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレットの中で開示されているようなアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）から得た野生型アスパラギナーゼ配列の野生型配列および／または配列番号２または配列番号４のいずれか１つに記されている配列に比べて１つ以上の欠失つまりギャップを含み得る。かかる欠失／ギャップは同様に、適切なオリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異誘発を用いても生成され得る。かかる欠失を生成するための技術は、当業者にとって周知である。
【００６５】
さらに、本発明にしたがったヌクレオチド配列に対応するかまたはこれに対してハイブリッド形成可能なオリゴヌクレオチドは、例えば自動化されたＤＮＡ合成装置を用いて、標準的合成技術により調製可能である。
【００６６】
同様に、相補的核酸分子も本発明に含まれる。別のヌクレオチド配列に相補的である核酸分子とは、もう一方のヌクレオチド配列にハイブリッド形成できかくして安定した２重鎖を形成できるようにもう一方のヌクレオチド配列に対する充分な相補性を有する核酸分子である。
【００６７】
本発明の１つの態様は、本発明のポリペプチドまたは生物学的に活性なフラグメントまたはドメインといったようなその機能的等価物をコードする単離核酸分子、ならびに、本発明の核酸分子の調製のためといったような核酸分子の増幅または突然変異のためのＰＣＲプライマとして使用するのに適した本発明のポリペプチドをコードする核酸分子およびかかる核酸分子のフラグメントを同定するためにハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに充分な核酸分子にも関する。
【００６８】
「単離ポリヌクレオチド」または「単離核酸」とは、それが由来する生体の天然に存在するゲノム内ではそれが直接隣接している（１つは５’末端上、１つは３’末端上）コード配列の両方と直接隣接していないＤＮＡまたはＤＮＡである。かくして、一実施形態においては、単離核酸は、コード配列に直接隣接する５’非コーディング（例えばプロモータ）配列の一部または全てを含む。したがってこの用語には、例えば、ベクター内、自己複製プラスミドまたはウイルス内、または原抗生物または真核生物のゲノムＤＮＡ内に取込まれるかまたは、その他の配列とは独立して別々の分子（例えばＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理により生産されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメント）として存在する組換えＤＮＡが含まれる。それにはまた、細胞材料、ウイルス材料または培地（組換えＤＮＡ技術により生産される場合）また化学的前駆体またはその他の化学物質（化学的に合成される場合）を実質的に含まない付加的なポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部分である組換えＤＮＡも含まれる。さらに、「単離核酸フラグメント」というのは、フラグメントとして天然に存在せず天然の状態では発見されないと思われる核酸フラグメントである。
【００６９】
本明細書中で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）およびヌクレオチド類似体を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むように意図されている。核酸分子は、１本鎖または２本鎖であり得るが、好ましくは、２本鎖ＤＮＡである。核酸は、オリゴヌクレオチド類似体または誘導体（例えばイノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド）を用いて合成され得る。かかるオリゴヌクレオチドは、例えば、改変した塩基対合能力または増大したヌクレアーゼ耐性をもつ核酸を調製するために用いることができる。
【００７０】
本発明の別の実施形態は、本発明の核酸分子に対しアンチセンスである単離核酸分子、例えば配列番号１または配列番号３のいずれか１つの中に記された配列を有する核酸分子のコード鎖を提供する。同じく本発明の範囲内に含まれるのは、本明細書中で記述されている核酸分子の相補鎖である。
【００７１】
［同一性および相同性］
「相同性」または「同一性百分率」という用語は、本明細書において同義的に用いられる。本発明においては、ここで、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性百分率を決定するために、最適な比較を目的として配列を整列させることが規定されている（例えば、第２のアミノまたは核酸配列との最適なアラインメントのために第１のアミノ酸または核酸の配列の中にギャップを導入することができる）。このとき対応するアミノ酸またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸またはヌクレオチド残基が比較される。第１の配列内の１つの位置が第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸またはヌクレオチド残基によって占有されている場合には、分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性百分率は、配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／合計位置数（すなわち重複する位置）×１００）。好ましくは、２つの配列は同じ長さである。
【００７２】
配列比較は、比較中の２つの配列の全長にわたってかまたは２つの配列のフラグメント全体にわたって実施されてよい。典型的には、この比較は比較中の２つの配列の全長にわたって実施される。しかしながら、配列同一性は、例えば２０、５０、１００またはそれ以上の隣接アミノ酸残基の一領域にわたって実施することもできる。
【００７３】
当業者であれば、２つの配列の間の相同性を決定するために複数の異なるコンピュータプログラムを利用できるということに気づくであろう。例えば、２つの配列の間の配列の比較および同一性の百分率の決定を、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい実施形態においては、２つのアミノ酸または核酸配列の間の同一性百分率は、１６、１４、１２、１０、８、６または４というギャップ重み（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）および１、２、３、４、５または６という長さ重み（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）、およびＢｌｏｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかを用いて、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／で入手可能な）Ａｃｃｅｌｒｙｓ  ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラム内に取込まれたニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第４８号：４４４〜４５３頁（１９７０年））アルゴリズムを用いて決定される。当業者であれば、これらの異なるバラメータ全てがわずかに異なる結果を生み出すものの、２つの配列の全体的同一性百分率が、異なるアルゴリズムを使用した場合に著しく変わらない、ということを認識するだろう。
【００７４】
本発明のヌクレオチドまたはタンパク質配列は、さらに、例えばその他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定するべく、公開データベースに対する検索を実行するための「問合せ配列」として使用することができる。かかる検索は、アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５号：４０３〜１０頁のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラム（バージョン２．０）を用いて実行可能である。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を実行することができる。比較を目的としてギャップ付きアラインメントを得るためには、ギャップ付きＢＬＡＳＴをアルシュールら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２５号（１７）：３３８９〜３４０２頁に記述されている通りに利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴＰプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム（例えばＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメータを使用することができる。国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のホームページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照のこと。
【００７５】
［ハイブリダイゼーション］
本発明のポリヌクレオチドおよび配列番号１または配列番号３のいずれか１つに記された配列の相補体は、典型的には、バックグラウンドよりも著しく高いレベルでハイブリッド形成することができる。例えば、ｃＤＮＡライブラリ内にはその他のｃＤＮＡが存在するため、バックグラウンドハイブリダイゼーションが発生し得る。本発明のポリヌクレオチドと配列番号１または配列番号３のいずれか１つのコード配列の相補体との間の相互作用により生成されるシグナルレベルは、典型的に、その他のポリヌクレオチドと配列番号１または配列番号３のいずれか１つの配列との間の相互作用の少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍強いものである。相互作用強度は、例えば放射性標識化により測定され得る。
【００７６】
本明細書において使用される「ハイブリッド形成する」（「ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ」および「ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ」）という用語は、比較すべき配列の少なくとも約２０、例えば少なくとも約５０、例えば少なくとも約１００、例えば少なくとも約２００、より好ましくは少なくとも約３００の隣接ヌクレオチドの領域全体にわたってかまたは全長にわたって決定された場合に互いに少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらに一層好ましくは少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％互いに相同である、例えば少なくとも約９８％互いに相同である、例えば少なくとも約９９％互いに相同であるヌクレオチド配列を典型的に互いにハイブリッド形成された状態にとどまらせるハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を記述するように意図されている。
【００７７】
かかるハイブリダイゼーション条件の好ましい限定的意味のない例は、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーションとそれに続く５５℃、好ましくは６０℃そしてさらに一層好ましくは６５℃での１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。
【００７８】
ストリンジェンシーの高い条件としては、例えば、５×ＳＳＣ／５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液／１．０％のＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションと室温での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄が含まれる。或いは、４２℃で洗浄を行なってもよい。
【００７９】
当業者であれば、ストリンジェントおよび高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件にあてはまるのはどんな条件であるかを知っていると考えられる。かかる条件に関する付加的な指針は、当該技術分野では、例えばサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク；およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、（編）、１９９５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）中で容易に入手可能である。
【００８０】
当然のことながら、ポリＡ配列（例えばｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクト）またはＴ（またはＵ）残基の相補的ストレッチにのみハイブリッド形成するポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補体（例えば事実上全ての２本鎖ｃＤＮＡクローン）を含むあらゆる核酸分子に対しハイブリッド形成することから、本発明の核酸の一部分に特異的にハイブリッド形成するように用いられる本発明のポリヌクレオチドの中には含まれないと思われる。
【００８１】
上述の程度の配列同一性および最小サイズの任意の組合せを用いて、本発明のポリヌクレオチドを定義してよいが、よりストリンジェンシーの高い組合せ（すなわちより大きい長さにわたるより高い配列同一性）が好ましい。
【００８２】
［ベクター］
本発明の別の態様は、例えば配列番号２または配列番号４のいずれか１つのアスパラギナーゼタンパク質またはそれらのうちのいずれかの機能的等価物といった本発明の変異体アスパラギナーゼをコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。
【００８３】
本明細書中で使用する「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味する。１つのベクタータイプは、付加的なＤＮＡセグメントを中にライゲートできる環状２本鎖ＤＮＡループを意味する「プラスミド」である。別のベクタータイプは、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノム内にライゲートされ得る、ウイルスベクターである。一部のベクターは、それが中に導入される宿主細胞内で自己複製する能力をもつ（例えば、細菌複製起点をもつ細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入時点で宿主細胞のゲノム内に組込まれ、かくして宿主ゲノムと共に複製される。さらに、一部のベクターは、それが作動的に連結されている遺伝子の発現を誘導する能力をもつ。かかるベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは多くの場合プラスミドの形をしている。「プラスミド」および「ベクター」という用語は、プラスミドがベクターの最も一般的に用いられる形態であることから、本明細書において同義的に用いることができる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）といったようなその他の発現ベクター形態を含むように意図されている。
【００８４】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内での核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含んでおり、これはすなわち、組換え発現ベクターが、発現させるべき核酸配列に作動的に連結された、発現に用いるべく宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味している。組換え発現ベクターの内部で、「作動的に連結された」という表現は、関心対象のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする要領で（例えば生体外転写／翻訳系内またはベクターが宿主細胞内に導入される場合には宿主細胞内で）、１つまたは複数の調節配列に連結されている、ということを意味するように意図されている。「調節配列」という用語は、プロモータ、エンハンサおよびその他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むように意図されている。かかる調節配列は、例えばゴーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０年）の中で記述されている。調節配列としては、数多くのタイプの宿主細胞内でヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するものおよび一部の宿主細胞内でのみヌクレオチド配列の発現を誘導するもの（例えば組織特異的調節配列）が含まれる。当業者であれば、発現ベクターの設計が形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルといったような要因によって左右され得るということがわかるだろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入されて、本明細書中で記述されているような核酸によりコードされるタンパク質またはペプチドを生産することができる（例えば、配列番号２および配列番号４のいずれか１つにしたがったアスパラギナーゼ変異体またはそれらのうちのいずれかの変異体、例えば機能的等価物またはフラグメント、またはかかる変異体のうちの１つ以上を含む融合タンパク質）。
【００８５】
本発明の組換え発現ベクターは、原核または真核細胞内での本発明の変異体タンパク質の発現用として設計され得る。例えば、本発明の変異体タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）といった細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞または哺乳動物細胞の中で発現可能である。適切な宿主細胞はさらに、ゴーデル、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０年）の中で論述されている。或いは、組換え発現ベクターを、例えばＴ７プロモータ調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、生体外で転写および翻訳することもできる。
【００８６】
本発明において有用である発現ベクターとしては、染色体、エピソームおよびウイルスに由来するベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスに由来するベクター、そしてこれらの組合せに由来するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素に由来するベクター、例えばコスミドおよびファージミドが含まれる。
【００８７】
ＤＮＡインサートは、いくつかの例を挙げると、ファージラムダＰＬプロモータ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモータ、ＳＶ４０早期および後期プロモータそしてレトロウイルスＬＴＲのプロモータといったような適切なプロモータに対して作動的に連結されなくてはならない。その他の適切なプロモータは、当業者にとって周知であろう。具体的な実施形態においては、糸状菌内でアスパラギナーゼの高い発現レベルを誘導することのできるプロモータが好ましい。このようなプロモータは当該技術分野において公知である。発現コンストラクトは、転写開始、終結のための部位そして転写された領域内では、翻訳のためのリボソーム結合部位を含んでいてよい。コンストラクトにより発現される成熟した転写産物のコード部分は、最初に翻訳開始ＡＵＧそして翻訳すべきポリペプチドの末端に適切に位置づけされた終端コドンを含む。
【００８８】
従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して、原核または真核細胞内にベクターＤＮＡを導入することができる。本明細書で使用される「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、形質導入、感染、リポフェクション、カチオン脂質仲介型トランスフェクションまたは電気穿孔を含めた、宿主細胞内に外来性核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための当該技術分野で認知されたさまざまな技術を意味するように意図されている。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、サンブルックら、（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９年）、デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、「Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８６年）およびその他の実験室マニュアルの中に見出すことができる。
【００８９】
哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションのためには、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、わずかな細胞画分だけが外来性ＤＮＡをそのゲノム内に組込み得る。これらの組込み体を同定し選択するために、選択的マーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が一般に、関心対象の遺伝子と共に宿主細胞内に導入される。好ましい選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメタトレキセートといったような薬物に対する耐性を付与するマーカーが含まれる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、本発明の変異体タンパク質をコードするものと同じベクター上で宿主細胞内に導入することができ、そうでなければ別々のベクター上で導入することができる。導入された核酸での安定したトランスフェクションを受けた細胞は、薬物選択によって同定可能である（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を取込んだ細胞は、その他の細胞が死枯する一方で生存し続ける）。
【００９０】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質の発現を誘導する構成的プロモータまたは誘導可能なプロモータを含むベクターと共に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で実施されることが多い。融合ベクターは、その中でコードされるタンパク質、例えば組換えタンパク質のアミノ末端に対し数多くのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的に次の３つの目的に使用される。すなわち１）組換えタンパク質の発現を増大させるため；２）組換えタンパク質の溶解度を増大させるため；そして３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助するため。多くの場合、融合発現ベクター内では、融合タンパク質の精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離することができるように、融合部分と組換えタンパク質の接合部にタンパク質分解切断部位が導入されている。
【００９１】
上述の通り、発現ベクターは好ましくは、選択可能なマーカーを含む。かかるマーカーとしては、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびその他の細菌内での培養のためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性が含まれる。適切な宿主の代表例としては、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセスサルモネラチフリウム（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）および一部のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種；真菌細胞、例えばアスペルギルス種、例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇａｒ）、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）およびＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、例えば酵母、例えばクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、例えばＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）および／またはプッチア（Ｐｕｃｈｉａ）例えばＰ．パストリス（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ）；昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳおよびバウス（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫；および植物細胞が含まれる。上述の宿主細胞のための適切な培地および条件は、当該技術分野において公知である。
【００９２】
細菌中で使用するために好ましいベクターは、例えば、本明細書に参考により援用されている国際公開第Ａ１−２００４／０７４４６８号パンフレット中で開示されている。その他の適切なベクターは、当業者にとって容易に明らかになる。
【００９３】
本発明において使用するのに適した公知の細菌プロモータには、本明細書に参考により援用されている国際公開第Ａ１−２００４／０７４４６８号パンフレット中で開示されているプロモータが含まれる。
【００９４】
高等真核動物による本発明の変異体をコードするＤＮＡの転写は、ベクター内にエンハンサ配列を挿入することによって増大させることができる。エンハンサは、所与の宿主細胞タイプの中でプロモータの転写活性を増大させるように作用する通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性要素である。エンハンサの例としては、ｂｐ１００〜２７０で複製起点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルス早期プロモータエンハンサ、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサ、およびアデノウイルスエンハンサが含まれる。
【００９５】
小胞体内腔内、ペリプラズム空間内または細胞外環境内へ翻訳済みタンパク質を分泌するために、発現されたポリペプチド内に適切な分泌シグナルを取込んでよい。シグナルは、ポリペプチドに対し内因性であり得、そうでなければ、非相同シグナルであってよい。
【００９６】
本発明の変異体は、それが例えば分泌シグナルなどの付加的な非相同機能領域を含み得るような形態で発現されてよい。本発明の変異体は、例えば、精製中または後続する取扱いおよび貯蔵中の宿主細胞内での安定性および持続性を改善するなどの目的でポリペプチドのＮ末端に付加される追加のアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を含んでいてもよい。同様に、例えばヒスチジン残基またはＴ７タグを付加することによって、精製を容易にするために本発明の変異体に対しペプチド部分を添加してもよい。
【００９７】
［本発明に従ったポリペプチド］
本発明は、
ａ）  配列番号２または配列番号４のいずれか一方に示されている通りのアミノ配列を有するポリペプチド；
ｂ）  ａ）にしたがったポリペプチドと少なくとも８５％の相同性を有するポリペプチド；
ｃ）  ａ）またはｂ）に定義されたポリペプチドから１つ以上のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入によって得ることのできるポリペプチド；
ｄ）  成熟ポリペプチドをコードする配列番号１または配列番号３の核酸配列または少なくとも１００個のヌクレオチドを有するそのサブ配列によってコードされるポリペプチド、
であるアスパラギナーゼを提供している。
【００９８】
典型的には、配列番号２に関してｂ）、ｃ）またはｄ）にしたがったポリペプチドは、２５位のＡｌａ、２８位のＴｈｒ、３０位のＴｙｒ、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１３１位のＳｅｒ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１０位のＡｌａ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２４０位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５２位のＶａｌ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７３位のＧｌｎ、２７９位のＳｅｒ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０７位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１０位のＡｌａ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＬｙｓ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３１９位のＬｅｕ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＴｈｒ、３４５位のＰｈｅ、３５１位のＡｌａ、３６０位のＡｌａ、３６１位のＧｌｕ、３６４位のＧｌｙ、３６５位のＰｈｅ、３６６位のＬｙｓ、３６９位のＡｒｇ、３７０位のＧｌｕ、３７４位のＬｙｓ、３７５位のＶａｌまたは３７７位のＶａｌのうちの１つ以上を含み、前記位置は配列番号２を基準にして定義されている。
【００９９】
本発明のポリペプチドは、２５位のＡｌａ、２８位のＴｈｒ、３０位のＴｙｒ、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１３１位のＳｅｒ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１０位のＡｌａ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２４０位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５２位のＶａｌ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７３位のＧｌｎ、２７９位のＳｅｒ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０７位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１０位のＡｌａ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＬｙｓ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３１９位のＬｅｕ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＴｈｒ、３４５位のＰｈｅ、３５１位のＡｌａ、３６０位のＡｌａ、３６１位のＧｌｕ、３６４位のＧｌｙ、３６５位のＰｈｅ、３６６位のＬｙｓ、３６９位のＡｒｇ、３７０位のＧｌｕ、３７４位のＬｙｓ、３７５位のＶａｌおよび３７７位のＶａｌのうちの２つ以上を含んでいてよく、前記位置は配列番号２を基準にして定義されている。より好ましくは、本発明のポリペプチドは、上述の位置にあるこれらのアミノ酸すべてを含んでいてよく、前記位置は配列番号２を基準にして定義されている。
【０１００】
配列番号４に関しては、本発明にしたがったポリペプチドは、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７９位のＡｓｐ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＴｈｒ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＰｒｏ、３３３位のＧｌｕ、３３６位のＧｌｎ、３４１位のＰｈｅ、３５６位のＡｌａ、３６０位のＧｌｙ、３６２位のＧｌｕ、３６５位のＡｒｇ、３６６位のＧｌｕ、３７０位のＬｙｓ、３７１位のＶａｌ、３７２位のＧｌｙまたは３７３位のＶａｌのうちの１つ以上を含んでいてよく、前記位置は配列番号４を基準にして定義されている。
【０１０１】
本発明のポリペプチドは、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７９位のＡｓｐ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＴｈｒ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＰｒｏ、３３３位のＧｌｕ、３３６位のＧｌｎ、３４１位のＰｈｅ、３５６位のＡｌａ、３６０位のＧｌｙ、３６２位のＧｌｕ、３６５位のＡｒｇ、３６６位のＧｌｕ、３７０位のＬｙｓ、３７１位のＶａｌ、３７２位のＧｌｙまたは３７３位のＶａｌのうちの２つ以上を含んでいてよく、前記位置は配列番号４を基準にして定義されている。
【０１０２】
より好ましくは、本発明のポリペプチドは、上述の位置にあるこれらのアミノ酸の全てを含んでいてよく、前記位置は配列番号４を基準にして定義されている。
【０１０３】
別の実施形態においては、本発明は同様に、少なくとも３．５、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも５ｐＨユニットというｐＨ活性プロファイルの幅を有するアスパラギナーゼをも提供している。好ましい実施形態においては、少なくとも３．５というｐＨ活性プロファイルの幅を有するアスパラギナーゼは、
ａ）  配列番号２または配列番号４のいずれか一方に示されている通りのアミノ配列を有するポリペプチド；
ｂ）  ａ）にしたがったポリペプチドと少なくとも８５％の相同性を有するポリペプチド；
ｃ）  ａ）またはｂ）に定義されたポリペプチドから１つ以上のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入によって得ることのできるポリペプチド；または
ｄ）  成熟ポリペプチドをコードする配列番号１または配列番号３の核酸配列または少なくとも１００個のヌクレオチドを有するそのサブ配列によってコードされるポリペプチド、
であるアスパラギナーゼである。
【０１０４】
同様に、上述のポリペプチドの機能的等価物を含むペプチドまたはポリペプチドが本発明の範囲内に含まれる。上述のポリペプチドは「本発明にしたがったポリペプチド」または「本発明にしたがった変異体」という用語の中に集合的に含まれる。
【０１０５】
「ペプチド」および「オリゴペプチド」という用語は、（一般に認知されている通りに）同義語とみなされ、ペプチジルリンケージによってカップリングされた少なくとも２つのアミノ酸の鎖を示すように、文脈により必要とされる通りに同義的に各々の用語を使用することができる。「ポリペプチド」という用語は、本明細書において８個以上のアミノ酸残基を含む鎖について使用されている。本明細書中の全てのオリゴペプチドおよびポリペプチドの式は左から右へ、そしてアミノ末端からカルボキシ末端への方向で記されている。本明細書で用いられているアミノ酸の１文字コードは、当該技術分野において一般に公知であり、サンブルックら、（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９年）の中に見出すことができる。
【０１０６】
「単離」ポリペプチドまたはタンパク質という用語で、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図されている。例えば、宿主細胞内で発現される組換え生産されたポリペプチドおよびタンパク質は、スミスおよびジョンソン（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｇｅｎｅ  ６７：３１〜４０頁（１９８８年）中で開示されている一段階精製方法といったような任意の適切な技術によって実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様、本発明に関しては単離されたものとみなされる。
【０１０７】
本発明にしたがった変異体ポリペプチドは、当該技術分野において公知の方法により組換え細胞培養物から回収され精製可能である。最も好ましくは、イオン交換クロマトグラフィまたは高性能液体クロマトグラフィ（「ＨＰＬＣ」）が精製のために利用される。
【０１０８】
本発明のポリペプチドには、化学合成手順の生成物および、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物の細胞を含めた原核生物または真核生物宿主から組換え技術により生産される生成物が含まれる。組換え生産手順の中で用いられる宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもよいし或いはまたグリコシル化されなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドは同様に、一部のケースでは宿主媒介プロセスの結果として初期修飾メチオニン残基をも含んでいてよい。
【０１０９】
［タンパク質フラグメント］
本発明は同様に、本発明にしたがったポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントをも特徴としている。かかるフラグメントは、「本発明の変異体」という用語の中に包含されるものとみなされる。
【０１１０】
本発明のポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントには、全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含むものの対応する全長タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を示す本発明の変異体タンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列）と充分な同一性を有するかまたはそれに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。典型的には、生物学的活性フラグメントは、本発明の変異体タンパク質の少なくとも１つの活性をもつドメインまたはモチーフを含む。好ましくは、生物学的に活性なフラグメントは少なくともアスパラギナーゼ活性を有する。本発明のタンパク質の生物学的に活性なフラグメントは、例えば長さがアミノ酸１０、２５、５０、１００個またはそれ以上であるポリペプチドであり得る。その上、タンパク質のその他の領域が欠失しているその他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製でき、本発明のポリペプチドの未変性形態の生物学的活性のうちの１つ以上について評価可能である。
【０１１１】
典型的には、配列番号２に関して、本発明のタンパク質フラグメントは、２５位のＡｌａ、２８位のＴｈｒ、３０位のＴｙｒ、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１３１位のＳｅｒ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１０位のＡｌａ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２４０位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５２位のＶａｌ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７３位のＧｌｎ、２７９位のＳｅｒ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０７位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１０位のＡｌａ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＬｙｓ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３１９位のＬｅｕ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＴｈｒ、３４５位のＰｈｅ、３５１位のＡｌａ、３６０位のＡｌａ、３６１位のＧｌｕ、３６４位のＧｌｙ、３６５位のＰｈｅ、３６６位のＬｙｓ、３６９位のＡｒｇ、３７０位のＧｌｕ、３７４位のＬｙｓ、３７５位のＶａｌおよび３７７位のＶａｌのうちの１つ以上を含み、前記位置は配列番号２を基準にして定義されている。
【０１１２】
本発明のタンパク質フラグメントは、２５位のＡｌａ、２８位のＴｈｒ、３０位のＴｙｒ、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１３１位のＳｅｒ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１０位のＡｌａ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２４０位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５２位のＶａｌ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７３位のＧｌｎ、２７９位のＳｅｒ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０７位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１０位のＡｌａ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＬｙｓ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３１９位のＬｅｕ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＴｈｒ、３４５位のＰｈｅ、３５１位のＡｌａ、３６０位のＡｌａ、３６１位のＧｌｕ、３６４位のＧｌｙ、３６５位のＰｈｅ、３６６位のＬｙｓ、３６９位のＡｒｇ、３７０位のＧｌｕ、３７４位のＬｙｓ、３７５位のＶａｌおよび３７７位のＶａｌのうちの２つ以上を含んでいてよく、前記位置は配列番号２を基準にして定義されている。より好ましくは、本発明のタンパク質フラグメントは、上述の位置にあるこれらのアミノ酸すべてを含んでいてよく、前記位置は配列番号２を基準にして定義されている。
【０１１３】
典型的には、配列番号４に関して、本発明のタンパク質フラグメントは、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７９位のＡｓｐ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＴｈｒ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＰｒｏ、３３３位のＧｌｕ、３３６位のＧｌｎ、３４１位のＰｈｅ、３５６位のＡｌａ、３６０位のＧｌｙ、３６２位のＧｌｕ、３６５位のＡｒｇ、３６６位のＧｌｕ、３７０位のＬｙｓ、３７１位のＶａｌ、３７２位のＧｌｙおよび３７３位のＶａｌのうちの１つ以上を含んでいてよく、前記位置は配列番号４を基準にして定義されている。
【０１１４】
本発明のタンパク質フラグメントは、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７９位のＡｓｐ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＴｈｒ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＰｒｏ、３３３位のＧｌｕ、３３６位のＧｌｎ、３４１位のＰｈｅ、３５６位のＡｌａ、３６０位のＧｌｙ、３６２位のＧｌｕ、３６５位のＡｒｇ、３６６位のＧｌｕ、３７０位のＬｙｓ、３７１位のＶａｌ、３７２位のＧｌｙおよび３７３位のＶａｌのうちの２つ以上を含んでいてよく、前記位置は配列番号４を基準にして定義されている。より好ましくは、本発明のタンパク質フラグメントは、上述の位置にあるこれらのアミノ酸の全てを含んでいてよく、前記位置は配列番号４を基準にして定義されている。
【０１１５】
本発明は同様に、（それ自体本発明の変異体である）上述の生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸フラグメントをも特徴としている。
【０１１６】
［融合タンパク質］
本発明の変異体、例えば本発明のタンパク質またはその機能的等価物、例えばその生物学的に活性な部分およびフラグメントは、本発明にしたがっていないポリペプチド（例えば非相同アミノ酸配列）に対し作動的に連結されて、融合タンパク質を形成することができる。これに関連して本発明にしたがっていないポリペプチドというのは、本発明の変異体アスパラギナーゼと実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。
【０１１７】
融合タンパク質中で、本発明の変異体は、本発明のポリペプチドの全長配列または生物学的に活性なフラグメントに対応し得る。好ましい実施形態においては、本発明の融合タンパク質は、少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質中で、「作動的に連結された」という用語は、変異体ポリペプチドおよび本発明にしたがっていないポリペプチドが互いに枠内で融合されていることを表わすように意図されている。本発明にしたがっていないポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０１１８】
例えば、一実施形態においては、融合タンパク質は、ＧＳＴ配列のＣ末端に１つまたは複数の変異体配列が融合されている融合タンパク質である。かかる融合タンパク質は本発明にしたがった組換え変異体の精製を容易にすることができる。別の実施形態では、融合タンパク質はそのＮ末端に非相同性シグナル配列を含む本発明の変異体である。一部の宿主細胞（例えば哺乳動物および酵母宿主細胞）においては、本発明の変異体の発現および／または分泌は、非相同性シグナル配列の使用を通して増大させることが可能である。
【０１１９】
別の実施例においては、バキュロウイルス外皮タンパク質のｇｐ６７分泌配列を、非相同シグナル配列として使用することができる（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、アウスベルら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２年）。真核生物非相同性シグナル配列のその他の例としては、メリチンおよびヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼの分泌配列が含まれる（カリフォルニア州ラホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））。さらに別の例においては、有用な原核生物非相同性シグナル配列には、ｐｈｏＡ分泌シグナル（サンブルックら、上掲書）およびプロテインＡ分泌シグナル（ニュージャージー州ピスカタウェイのファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）；）が含まれる。
【０１２０】
シグナル配列は、本発明の一変異体の分泌および単離を容易にするために使用することができる。シグナル配列の典型的な特徴は、一般に１つ以上の切断事象において分泌中に成熟タンパク質から切断される疎水性アミノ酸のコアにある。かかるシグナルペプチドは、分泌経路を通過するにつれて成熟タンパク質からシグナル配列を切断させることができるようにするプロセッシング部位を含んでいる。シグナル配列は、中に発現ベクターが形質転換される原核細胞宿主からといったような変異体の分泌を導くことができ、このときシグナル配列はその後にまたは同時に切断されてよい。本発明の変異体はこのとき、公知の方法によって細胞外培地から容易に精製されてよい。或いは、シグナル配列は、ＧＳＴドメインといったような精製を容易にする配列を用いて、関心対象の変異体に連結され得る。かくして、例えば、本発明の変異体をコードする配列は、本発明の融合された変異体の精製を容易にする、ペプチドをコードする配列といったようなマーカー配列に融合されてよい。本発明のこの態様の一部の好ましい実施形態においては、マーカー配列は、なかでもその多くが市販されているｐＱＥベクター（キアゲン株式会社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．））の中で提供されているｔａｇといったようなヘキサ−ヒスチジンペプチドである。例えばゲンツ（Ｇｅｎｔｚ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８６号、８２１〜８２４頁（１９８９年）で記述されているように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製を提供する。ＨＡタグは、例えばウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら、Ｃｅｌｌ、第３７号：７６７頁（１９８４年）によって記述されたインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドである。
【０１２１】
本発明の融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により生産されてよい。例えば、異なるポリペプチド配列についてコードするＤＮＡフラグメントは、例えばライゲーションのための平滑末端または付着末端の利用、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な粘着末端の充填、望ましくない接合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理および酵素ライゲーションなどの従来の技術にしたがって枠内で合わせてライゲートされる。別の実施形態においては、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成することができる。或いは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、後にアニールされ再増幅されてキメラ遺伝子配列を生成することのできる２つの連続する遺伝子フラグメントの間の相補的オーバーハングを発生させるアンカープライマーを用いて、実施可能である（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、編、アウスベルら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２年）。その上、すでに融合部分をコードしている数多くの発現ベクターが市販されている（例えばＧＳＴポリペプチド）。融合部分が前記変異体に対し枠内で連結されるような形でこのような発現ベクター内に変異体をコードする核酸をクローニングすることができる。
【０１２２】
［機能的等価物］
本明細書では「機能的等価物」および「機能的変異体」という用語は同義的に使用されている。本発明にしたがった機能的等価物は、本明細書で定義されているアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスパラギナーゼ変異体の特定の機能を示すポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡフラグメントである。本発明にしたがったポリペプチドの機能的等価物は、本明細書で定義されているアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスパラギナーゼ変異体の少なくとも１つの機能を示すポリペプチドである。したがって、機能的等価物は同様に生物学的に活性なフラグメントをも包含し、それ自体本発明の「変異体」という用語内に包含される。
【０１２３】
好ましくは、本発明の配列番号２に関する機能的に等価のポリペプチドは、２５位のＡｌａ、２８位のＴｈｒ、３０位のＴｙｒ、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１３１位のＳｅｒ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１０位のＡｌａ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２４０位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５２位のＶａｌ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７３位のＧｌｎ、２７９位のＳｅｒ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０７位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１０位のＡｌａ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＬｙｓ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３１９位のＬｅｕ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＴｈｒ、３４５位のＰｈｅ、３５１位のＡｌａ、３６０位のＡｌａ、３６１位のＧｌｕ、３６４位のＧｌｙ、３６５位のＰｈｅ、３６６位のＬｙｓ、３６９位のＡｒｇ、３７０位のＧｌｕ、３７４位のＬｙｓ、３７５位のＶａｌまたは３７７位のＶａｌのうちの１つ以上を含み、前記位置は配列番号２を基準にして定義されている。
【０１２４】
したがって、本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、２５位のＡｌａ、２８位のＴｈｒ、３０位のＴｙｒ、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１３１位のＳｅｒ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１０位のＡｌａ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２４０位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５２位のＶａｌ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７３位のＧｌｎ、２７９位のＳｅｒ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０７位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１０位のＡｌａ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＬｙｓ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３１９位のＬｅｕ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＴｈｒ、３４５位のＰｈｅ、３５１位のＡｌａ、３６０位のＡｌａ、３６１位のＧｌｕ、３６４位のＧｌｙ、３６５位のＰｈｅ、３６６位のＬｙｓ、３６９位のＡｒｇ、３７０位のＧｌｕ、３７４位のＬｙｓ、３７５位のＶａｌまたは３７７位のＶａｌのうちの２、３、４、５個、例えば少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、例えば少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個またはすべてを含んでいてよく、前記位置は配列番号２を基準にして定義されている。
【０１２５】
好ましくは、本発明の配列番号４に関する機能的に等価のポリペプチドは、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７９位のＡｓｐ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＴｈｒ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＰｒｏ、３３３位のＧｌｕ、３３６位のＧｌｎ、３４１位のＰｈｅ、３５６位のＡｌａ、３６０位のＧｌｙ、３６２位のＧｌｕ、３６５位のＡｒｇ、３６６位のＧｌｕ、３７０位のＬｙｓ、３７１位のＶａｌ、３７２位のＧｌｙおよび３７３位のＶａｌのうちの１つ以上を含み、前記位置は配列番号４を基準にして定義されている。
【０１２６】
従って本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチドは、３５位のＳｅｒ、５３位のＬｅｕ、６３位のＳｅｒ、６４位のＡｌａ、６５位のＡｓｐ、６６位のＡｓｎ、７４位のＡｌａ、７７位のＩｌｅ、７９位のＩｌｅ、８０位のＧｌｎ、８１位のＴｈｒ、８８位のＧｌｕ、１０６位のＰｒｏ、１０８位のＶａｌ、１１１位のＳｅｒ、１１４位のＬｅｕ、１１７位のＡｌａ、１１９位のＴｈｒ、１２２位のＧｌｕ、１２６位のＡｓｐ、１６１位のＶａｌ、１６８位のＡｌａ、１８１位のＧｌｎ、１８９位のＰｒｏ、１９０位のＡｌａ、１９７位のＬｅｕ、２０５位のＶａｌ、２０８位のＰｈｅ、２１１位のＳｅｒ、２２４位のＶａｌ、２２８位のＡｓｎ、２３１位のＡｌａ、２３２位のＩｌｅ、２３３位のＶａｌ、２３６位のＬｙｓ、２３８位のＴｙｒ、２５０位のＴｈｒ、２５１位のＴｈｒ、２５４位のＶａｌ、２５５位のＡｒｇ、２５９位のＳｅｒ、２６７位のＴｙｒ、２７０位のＧｌｎ、２７９位のＡｓｐ、２８２位のＡｓｐ、２８３位のＡｓｎ、２８６位のＬｙｓ、２９３位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位のＳｅｒ、３０１位のＧｌｙ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＡｓｐ、３０９位のＩｌｅ、３１１位のＳｅｒ、３１２位のＴｈｒ、３１３位のＨｉｓ、３１４位のＳｅｒ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＰｒｏ、３３３位のＧｌｕ、３３６位のＧｌｎ、３４１位のＰｈｅ、３５６位のＡｌａ、３６０位のＧｌｙ、３６２位のＧｌｕ、３６５位のＡｒｇ、３６６位のＧｌｕ、３７０位のＬｙｓ、３７１位のＶａｌ、３７２位のＧｌｙおよび３７３位のＶａｌのうちの２、３、４、５個、例えば少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、例えば少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個またはすべてを含んでいてよく、前記位置は配列番号４を基準にして定義されている。
【０１２７】
機能的タンパク質またはポリペプチド等価物は、配列番号２または配列番号４のいずれか１つの１つ以上のアミノ酸の置換または可欠アミノ酸の置換、挿入または欠失を含んでいてよい。したがって、可欠アミノ酸は、生物学的機能を実質的に改変することなく配列番号２または配列番号４のいずれか１つの中で改変され得る１つの残基である。さらに、本発明にしたがったタンパク質およびその他のアスパラギナーゼの間で保存されたアミノ酸は、改変を受ける確率が低い。
【０１２８】
本発明の機能的変異体を提供するべく、例えば１、２または３個から約１０個、約２０個、約３０個またはそれ以上の置換といったアミノ酸置換を、配列番号２または配列番号４のいずれか１つに対し行なってもよい。
【０１２９】
機能的核酸等価物は典型的には、サイレント突然変異またはコードされたポリペプチドの生物学的機能を改変しない突然変異を含んでいてよい。したがって、本発明は、特定の生物学的活性にとって不可欠でないアミノ酸残基の変更を含む変異体アスパラギナーゼタンパク質をコードする核酸分子を提供する。かかる変異体タンパク質は、アミノ酸配列に関して配列番号２または配列番号４のいずれか１つと異なっており、しかもその少なくとも１つの生物学的活性を保持する。一実施形態においては、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでこのタンパク質は配列番号２または配列番号４のいずれか１つに示されているアミノ酸配列に対する少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％以上の相同性をもつ実質的に相同性のアミノ酸配列を含んでいる。
【０１３０】
配列番号２または配列番号４のいずれか１つにしたがったタンパク質と相同、典型的には実質的に相同である、本発明の変異体をコードする単離された核酸分子は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失または挿入がコードされたタンパク質内に導入されるような形で、本発明にしたがったコードヌクレオチド配列内に１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することによって作り出すことができる。かかる突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介型突然変異誘発といったような標準的技術によって導入されてよい。
【０１３１】
本明細書で定義されているように、「実質的に相同な」という用語は、第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列が共通のドメインを有するような形で第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列と同一または等価の（例えば類似の側鎖を伴う）アミノ酸またはヌクレオチドを充分な数または最少限の数だけ含む第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列を意味する。例えば、約６０％、好ましくは６５％、より好ましくは７０％、さらに一層好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の同一性を有する共通のドメインを含むアミノ酸またはヌクレオチド配列が、本明細書において、充分に同一であると定義される。
【０１３２】
本発明の変異体アスパラギナーゼに対応する、すなわちこれをコードする核酸分子は、本明細書中で開示されているｃＤＮＡを用いて本明細書中で開示されている発明の核酸に対するその相同性に基づいて、単離可能である。
【０１３３】
当業者であれば、本発明にしたがったヌクレオチド配列への突然変異によって変化を取り込みこうして結果として得られたタンパク質の機能を実質的に改変することなくこのタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことができる、ということを認識することだろう。
【０１３４】
本発明の別の態様においては、改良型アスパラギナーゼ変異体タンパク質が提供される。改良型アスパラギナーゼ変異体タンパク質は、例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）に由来するものといったような野生型アスパラギナーゼと比較して少なくとも１つの生物学的活性が改善されているタンパク質である。
【０１３５】
特に、本発明の変異体タンパク質は、国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレットの配列番号３の中で開示されている通りのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のものといったような野生型アスパラギナーゼと比べて所与のｐＨで改善された比活性を有していてよく、そうでなければ、国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレットの配列番号３の中で開示されている通りのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のものといったような野生型アスパラギナーゼと比べて改善されたｐＨ応答を有する、例えばより好アルカリ性または好酸性であってよい。例えば、本発明の変異体タンパク質は、同じ条件で測定された場合、国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレットの配列番号３の中で開示されている通りのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来野生型アスパラギナーゼの比活性と比べて高いものである少なくとも５というｐＨでの比活性を有していてよい。例えば国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレットの配列番号３の中で開示されている通りのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来の野生型アスパラギナーゼは、ｐＨ４〜ｐＨ５の最適ｐＨを有する。本発明の変異体タンパク質は、このような野生型酵素よりもさらに好アルカリ性が高くてよい。すなわち例えばｐＨ６〜ｐＨ７の最適ｐＨを有していてよい。ただし、変異体は野生型アスパラギナーゼよりもさらに好酸性であってよい。
【０１３６】
別の実施形態においては、本発明の変異体タンパク質は、少なくとも３．５、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも５ｐＨユニットというｐＨ活性プロファイルの幅を有していてよい。
【０１３７】
かかるタンパク質は、飽和突然変異誘発などによって本発明のコード配列の全てまたは一部分に沿って無作為に突然変異を導入することによって得てよい。結果としての突然変異体を次に、組換え発現させ生物学的活性についてスクリーニングすることができる。例えば、当該技術は、アスパラギナーゼの酵素活性を測定するための標準的検定を提供し、かくして改良型タンパク質が容易に選択され得る。
【０１３８】
好ましい実施形態においては、本発明のアスパラギナーゼ変異体は、配列番号２または配列番号４のいずれか１つにしたがったアミノ酸配列を有する。別の実施形態においては、本発明の変異体は、配列番号２または配列番号４のいずれか１つにしたがったアミノ酸配列に対し実質的に相同であり、典型的には同様に配列番号２または配列番号４のいずれか１つにしたがったポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を保持し、しかも上述のような突然変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なっていてよい。
【０１３９】
さらなる好ましい実施形態においては、本発明のアスパラギナーゼ変異体は、好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で本発明にしたがった核酸に対しハイブリッド形成することのできる単離された核酸フラグメントによってコードされたアミノ酸配列を有する。
【０１４０】
したがって、本発明のアスパラギナーゼ変異体は、好ましくは、配列番号２または配列番号４のいずれか１つに示されたアミノ酸配列に対し少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性をもつアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２または配列番号４のいずれか１つにしたがったポリペプチドの少なくとも１つの機能的活性を保持するタンパク質である。
【０１４１】
本発明の変異体、例えば本発明にしたがったタンパク質の機能的等価物は、同様に、例えばアスパラギナーゼ活性について本発明の突然変異体例えば切断型突然変異体の組合せライブラリをスクリーニングすることによっても同定可能である。１つの実施形態においては、変異体の変化に富んだライブラリが、核酸レベルでの組合せ突然変異誘発によって生成される。変異体の変化に富んだライブラリは、例えば、縮退した１組の潜在的なタンパク質配列が個々のポリペプチドとしてか或いは１組のより大きな融合タンパク質として（例えばファージディスプレイ向け）発現可能となるような形で遺伝子配列内に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素によりライゲートすることによって生成可能である。縮退したオリゴヌクレオチド配列から本発明のポリペプチドの潜在的変異体のライブラリを生産するために使用できるさまざまな方法が存在する。縮退したオリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該技術分野において公知である（例えばナラング（Ｎａｒａｎｇ）（１９８３年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、第３９号：３頁；イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）ら、（１９８４年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第５３号：３２３頁；イタクラら、（１９８４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１９８号：１０５６頁；アイク（Ｉｋｅ）ら、（１９８３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．第１１号：４７７頁）を参照のこと）。
【０１４２】
さらに、本発明のポリペプチドをコードする配列のフラグメントライブラリは、後続する変異体の選択をスクリーニングするために変化に富んだポリペプチド集団を生成する目的で使用可能である。例えば、ニッキングが１分子あたりおよそ一回しか発生しない条件下でヌクレアーゼと関心対象のコード配列の２本鎖ＰＣＲフラグメントを処理すること、２本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニッキング産物からのセンス／アンチセンス対を含むことのできる２本鎖ＤＮＡを形成するようにＤＮＡを復元すること、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理により再形成された２重鎖から１本鎖部分を除去することそして、結果として得られたフラグメントライブラリを発現ベクター内にライゲートすることによって、コード配列フラグメントのライブラリを生成することができる。この方法によって関心対象のタンパク質のさまざまなサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリを誘導することができる。
【０１４３】
当該技術分野においては、切断の点突然変異によって作られる組合せライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするため、そして選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするための複数の技術が公知である。大きな遺伝子ライブラリをスクリーニングするために最も広く用いられている高スループット解析に適した技術には、典型的に、複製可能な発現ベクター内に遺伝子ライブラリをクローニングすること、結果として得られるベクターライブラリで適切な細胞を形質転換すること、そして、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が所望の活性の検出によって容易になる条件下で、組合せ遺伝子を発現すること、が含まれる。ライブラリ内の機能的突然変異体の頻度を増強する技術である循環アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）をスクリーニング検定と組合せて使用して、本発明のタンパク質の変異体を同定することができる（アルキン（Ａｒｋｉｎ）およびユアバン（Ｙｏｕｒｖａｎ）（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９号：７８１１〜７８１５頁；デルグレーブ（Ｄｅｌｇｒａｖｅ）ら、（１９９３年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第６号（３）：３２７〜３３１頁）。
【０１４４】
本発明にしたがったポリヌクレオチドのフラグメントは同様に、機能的ポリペプチドをコードしないポリヌクレオチドをも含んでいてよい。かかるポリヌクレオチドは、ＰＣＲ反応のためのプローブまたはプライマとして機能し得る。
【０１４５】
本発明にしたがった核酸はそれらが機能的または非機能的ポリペプチドのいずれをコードするかとは無関係に、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマとして使用可能である。アスパラギナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の用途としてはとりわけ、（１）ベルマ（Ｖｅｒｍａ）ら、Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８８年）の中で記述されているようなアスパラギナーゼコード遺伝子の精確な染色体位置を提供するための中期染色体スプレッドに対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えばＦＩＳＨ）；（２）特定の組織および／または細胞内でのアスパラギナーゼｍＲＮＡの発現を検出するためのノーザンブロット分析；および（３）所与の生物学的（例えば組織）試料中でプローブまたはプライマに対しハイブリッド形成可能な核酸の存在を分析するための診断ツールとして使用可能なかかるプローブおよびプライマ。
【０１４６】
同様に本発明により包含されているのは、本発明のポリヌクレオチドの機能的等価物を得る方法である。かかる方法は、配列番号２または配列番号４のいずれか１つにしたがったタンパク質配列またはその変異体の全てまたは一部分をコードする単離した核酸を含む標識されたプローブを獲得すること；ライブラリ内の核酸フラグメントに対するプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件の下で標識づけされたプローブで核酸フラグメントライブラリをスクリーニングし、かくして核酸２重鎖を形成すること、および任意の標識された２重鎖の中の核酸フラグメントから全長遺伝子配列を調製して、本発明のポリヌクレオチドに関連する配列を得ることを伴う。
【０１４７】
［宿主細胞］
別の実施形態においては、本発明は、本発明に包含される核酸を含む細胞例えば形質転換された宿主細胞または組換え宿主細胞を特徴とする。「形質転換された細胞」または「組換え細胞」というのは、その中に（またはその先祖の中に）組換えＤＮＡ技術を用いて本発明にしたがった核酸が導入された細胞である。原核細胞および真核細胞の両方、例えば細菌、真菌、酵母などが含まれ、最も好ましいのは、糸状菌、特にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の細胞である。
【０１４８】
挿入された配列の発現を調節するかまたは取込まれた核酸配列によってコードされた産物を特異的な所望の要領で修飾しプロセッシングする宿主細胞を選択することができる。タンパク質産物のかかる修飾（例えばグリコシル化）およびプロセッシング（例えば分割）は、コードされたタンパク質の最適な機能を促進し得る。
【０１４９】
さまざまな宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾について特徴的かつ特異的機序を有する。分子生物学および／または微生物学の当業者にとってなじみのある適切な細胞系統または宿主系を選択して、発現された外来性タンパク質の所望のかつ適正な修飾およびプロセッシングを確保することができる。この目的で、一次転写産物の適切なプロセッシング、グリコシル化および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することが可能である。かかる宿主細胞は、当該技術分野において周知である。
【０１５０】
宿主細胞には同様に、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８および脈絡叢細胞系統といったような哺乳動物細胞系統も含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１５１】
望ましい場合、安定した形でトランスフェクトされた細胞系統が、本発明に従った変異体を生産できる。哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションに適した多数のベクターが、一般に入手可能であり、かかる細胞系統を構築するための方法も同様に、例えばアウスベルら（上掲書）中に記されているように公知である。
【０１５２】
［工業的プロセスにおける本発明の変異体アスパラギナーゼの使用］
本発明は、本発明にしたがったアスパラギナーゼを含む組成物をさらに開示する。この組成物は任意には、その他の成分例えばその他の酵素を含んでいてよい。本発明にしたがったアスパラギナーゼ変異体または前記アスパラギナーゼを含む組成物は、食品の生産において使用可能である。本発明の一実施形態においては、本発明にしたがったアスパラギナーゼ変異体またはこのアスパラギナーゼを含む組成物は、アスパラギン含有原料をベースとする熱処理食品の中で形成されたアクリルアミドの量を削減するために使用可能である。これらは例えば、少なくとも１つの加熱ステップが関与し、この加熱ステップに先立ち前記食品の中間形態で存在するアスパラギナーゼのレベルを削減する上で有効である量で酵素を添加する前記生産プロセス内での前記食品の中間形態への１つ以上のアスパラギナーゼ酵素の添加ステップを含む、食品の生産用プロセスにおいて使用可能である。かかるプロセスは国際公開第０４／０３０４６８号パンフレット内で開示されており、このプロセスおよびその全ての選好性は本明細書に参考により援用されている。同様に、国際公開第０４／０２６０４３号パンフレットには、本発明にしたがったアスパラギナーゼを使用することができると思われる適切なプロセスが記述されている。国際公開第０４／０２６０４３号パンフレット中に開示されているプロセスおよび開示されている全ての選好性は、本明細書に参考により援用されている。
【０１５３】
食品の中間体は、本明細書では、食品の最終的形態が得られまでの生産プロセス中に発生するあらゆる形態として定義づけされている。中間形態は、使用された個々の原料および／またはその混合物および／または添加剤および／または加工助剤との混合物、またはその後加工されたその形態を含んでいてよい。例えば、食品パンの場合、中間形態は、例えば小麦、小麦粉、例えば水、塩、酵母およびパン改良組成物といったその他のパン成分とのその初期混合物、混合パン生地、練上げパン生地、発酵生地および部分焼上げ生地を含む。例えば、いくつかのジャガイモベースの製品については乾燥ポテトフレークまたは顆粒が中間製品であり、トルティーヤチップスについては、コーン・マサが中間製品である。
【０１５４】
食品は、例えばジャガイモ、タバコ、コーヒー、ココア、米、穀物、例えば小麦、ライ麦モロコシ（ｒｙｅ  ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、大麦、ひき割り穀物、ソバおよびオート麦といった植物由来のものである少なくとも１つの原料から作られていてよい。以降、小麦という用語は、例えば、パン小麦、デュラム小麦および／またはスペルト小麦といったコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）属の公知の全ての種を包含するように意図されている。２つ以上の原料または中間体から作られた食品、例えば小麦（小麦粉および／またはデンプン）およびジャガイモの両方を含む食品も、本発明の範囲内に含み入れられる。本発明にしたがったプロセスが適している食品の例としては、あらゆる小麦粉ベースの製品（例えばパン、ペストリー、ケーキ、プレッツェル、ベーグル、ダッチハニーケーキ、クッキー、ジンジャーブレッド、ジンジャーケーキおよびクリスプブレッド）そしてあらゆるジャガイモベースの製品（例えばフレンチフライ、フライドポテト、ポテトチップス、コロッケ）がある。
【０１５５】
以上で列挙した通りの原料は、生産プロセスの加熱ステップ中のアクリルアミド形成に関与している実質的な量のアスパラギンを含有するものとして公知である。或いは、アスパラギンは、例えば食品生産プロセスにおいて添加剤として用いられる酵母エキス、大豆加水分解物、カゼイン加水分解物などといったようなタンパク質加水分解物といったように、原料以外の供給源に由来している可能性もある。好ましい生産プロセスは、小麦粉および／またはその他の穀物由来の粉からのパンおよびその他の焼上げ製品の焼上げである。別の好ましい生産プロセスは、ジャガイモのスライスからのポテトチップスのディープフライである。
【０１５６】
好ましい加熱ステップは、中間食品の少なくとも一部分例えば食品の表面を、アクリルアミド形成が促進される温度、例えば１１０℃以上、１２０℃以上の温度に曝露するステップである。本発明にしたがったプロセス内の加熱ステップは例えば、パンおよびその他のベーカリー製品を焼き上げる場合のようにオーブン内において例えば１８０〜２２０℃の温度で実施されるか、またはポテトチップスの揚げ作業のように油中において例えば１６０〜１９０℃の温度で実施されてよい。
【０１５７】
別の態様においては、本発明は、以上で記述されているような本発明のプロセスによってかまたは食品を生産するべく以上で記述した新規のアスパラギナーゼを使用することによって得ることのできる食品を提供している。これらの食品は、前記加熱ステップ中のアクリルアミドの形成に関与するアミノ酸のレベルを削減するのに有効な量で１つ以上の酵素を添加するステップを含まない生産プロセスによって得ることのできる食品と比べて著しく削減されたアクリルアミドレベルを特徴とする。本発明にしたがったプロセスは、従来のプロセスで得られた食品と比較して、生産された食品のアクリルアミド含有量の好ましくは５０％超、より好ましくは２０％超、さらに一層好ましくは１０％超そして最も好ましくは５％超という減少を得るために使用可能である。
【０１５８】
本発明にしたがったアスパラギナーゼ変異体のための付加的な利用分野は、動物およびヒトにおける腫瘍の治療において利用することである。腫瘍細胞の代謝にはＬ−アスパラギンが必要であり、これはアスパラギナーゼによって迅速に分解され得る。本発明にしたがったアスパラギナーゼは同様に、一部のヒト白血病の治療における補助治療薬としても使用可能である。実験動物およびヒトにおけるアスパラギナーゼの投与は、一部のリンパ腫および白血病の退行を導く。したがって、一実施形態において、本発明は、例えば動物またはヒトの腫瘍の治療例えばリンパ腫または白血病の治療における薬剤として使用するための本発明にしたがったアスパラギナーゼまたは組成物に関する。
【０１５９】
本発明にしたがったアスパラギナーゼ変異体は、都合のよいことに微生物中で生産され得る。上述のプロセスにおいては、組換えＤＮＡ技術によって得られるアスパラギナーゼを使用することが有利である。かかる組換え酵素は、細菌またはウイルスといったような汚染性作用物質を含まないだけでなく細菌毒素またはその他の汚染性酵素活性も含まず、高収量で低コストで生産できるといった数多くの利点を有する。
【０１６０】
本発明について以下で、次の限定的な意味のない実施例によって例示する。
【実施例】
【０１６１】
［材料と方法］
［ｐＨ＝４からｐＨ＝９までの範囲内のｐＨ依存性を測定するためのアスパラギナーゼ検定］
アスパラギナーゼ活性を、基質としてＬ−アスパラギンを用いて測定した。酵素の作用によって遊離されたアンモニア量を、ベルトロー反応にしたがって測定した。既製の試薬フェノールニトロプルシドおよびアルカリ性次亜塩素酸塩をシグマ（Ｓｉｇｍａ）から得た。所望のｐＨの５０ｍＭのピロリン酸ナトリウム緩衝液と５０ｍＭのクエン酸の混合物中の１００ｍＭのＬ−アスパラギン２０００μｌと１００μｌの酵素試料を混合した。３０分間３７℃でインキュベートした後、４００μｌの２５％のトリクロロ酢酸を添加することによって反応を停止させ、その後２５００μｌの水を加えた。インキュベーションの間、他に指示のない限り温度は３７℃に定めた。
【０１６２】
当業者であれば、上述の条件下でのインキュベーションの後、背景よりも著しく高く、それでもなお得られたシグナルが加えられた酵素の量に正比例している範囲内にあるシグナルが得られるような形で、酵素の用量が選択されたということを理解するはずである。好ましくは反応は、ゼロ次反応であった。
【０１６３】
反応を停止した後、１５６μｌの水に４μｌのインキュベーション混合物を添加した。その後、３４μｌのフェノール／ニトロプルシド溶液（シグマＰ６９９４）および３４μｌのアルカリ性次亜塩素酸塩溶液（シグマＡ１７２７）を添加した。３７℃で６７６秒のインキュベーションの後、６００ｎｍで消光を測定した。適切なブランクを含み入れることによって、背景シグナルについて読取り値を補正した。ブランクとして、（ＴＣＡ）不活性化酵素を伴う試料を使用した。例えば、Ｋｏｎｅｌａｂ  Ａｒｅｎａ  ３０（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））といった自動分析装置上で、検定を実施した。標準系列の既知の硫酸アンモニウム濃度との関係において６００ｎｍでの測定された吸光度をプロットすることによって作成された較正線を用いて、活性を決定した。活性は、規定の検定条件下で一分あたり１ミクロモルのアンモニアをＬ−アスパラギンから遊離させるのに必要とされる酵素の量として１ユニットを定義して、ユニット単位で表現された。
【０１６４】
［ｐＨ＝４からｐＨ＝８までの範囲内のｐＨ依存性を測定するためのアスパラギナーゼ検定］
この方法は、所望のｐＨの５０ｍＭのリン酸／クエン酸緩衝液中の１００ｍＭのＬ−アスパラギン２０００μｌと１００μｌの酵素試料を混合したという違いはあるものの、ｐＨ＝４からｐＨ＝９までの範囲についての活性のｐＨ依存性の測定に関する上述の方法と同じ要領で、実施された。
【０１６５】
全ての検定において、アスパラギナーゼ試料の活性をユニット／ｍｌ単位で表わした。
【０１６６】
［実施例１］
［本発明にしたがったアスパラギナーゼの発酵、単離および精製］
本発明のアスパラギナーゼは、国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレットに記述されているように本発明のアスパラギナーゼをコードするＤＮＡ配列を含有する発現プラスミドを構築し、プラスミドでアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）菌株を形質転換させアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）菌株を成長させることによって得られた。
【０１６７】
適正な発現プラスミドを含有するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を成長させた後、４℃で３０分間５０００×ｇで発酵ブロスを遠心分離して無細胞上清を調製した。必要な場合は、上清をそれぞれにＭｉｒａｃｌｏｔｈフィルタ（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）カタログ番号４７５８５５）およびＧＦ／Ａ  Ｗｈａｔｍａｎｎ  Ｇｌａｓｓマイクロファイバフィルタ（１５０ｍｍφ）上でろ過して、あらゆる固体を除去した。あらゆる真菌材料を除去するために、上清を４ＮのＫＯＨでｐＨ＝５に調整し、吸引しながら２μｍの（ボトルトップ）フィルタ上で無菌ろ過することができた。上清を使用まで４℃に貯蔵し、必要な場合は−２０℃で凍結させた。
【０１６８】
不純物が６０％ｗ／ｗを上回った場合には、無細胞上清から始めてアニオンイオン交換クロマトグラフィによりアスパラギナーゼを精製するかまたは、ＰＤ−１０カラム（アマーシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を介してｃｃＵＦ脱塩した。脱塩した材料を、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液ｐＨ５．９６中で平衡化されたＭｏｎｏ−ＱまたはＱ−セファロースカラムに適用した。大規模な洗浄の後、アスパラギナーゼを、０〜１ＭのＮａＣｌ勾配を用いてカラムから溶出させた。
【０１６９】
アスパラギナーゼ活性を含有する上清画分または精製されたアスパラギナーゼ画分（ｍｇタンパク質／ｍｌ単位で決定されたもの）の純度を、分析サイズ排除クロマトグラフィ（ＨＰ−ＳＥＣ：高性能サイズ排除クロマトグラフィ、ＴＳＫｇｅｌ  ３０００ＳＷ−ＸＬ、カラム３００＊７．８ｍｍ；ＭＷ範囲１０〜３００ｋＤａ、１００ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７およびｐＨ５．９６）によって確認した。全ての流量は１ｍｌ／分であった（５ｍｌ／分であったＱ−セファロースカラム上の試料注入は除く）。溶出されたタンパク質の検出を２８０ｎｍで行なった。溶出されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスパラギナーゼの濃度を、１０２４０Ｍ−１・ｃｍ−１のモル消光係数を用いて２８０ｎｍ（Ａ２８０）での消光から計算した（Ａ２８０１ｃｍ，１ｍｇ／ｍｌ＝０．２８、なお式中Ａ２８０１ｃｍ，１ｍｇ／ｍｌは、１ｍｇ／ｍｌという純粋タンパク質濃度でかつ１ｃｍという経路長で測定した２８０ｎｍでの消光である）。Ａ２８０の測定は、Ｕｖｉｋｏｎ  ＸＬ  Ｓｅｃｏｍａｍ分光光度計（オランダ、アップカウデのＢｅｕｎ  ｄｅ  Ｒｏｎｄｅ）の中で実施した。配列番号４に対応するアスパラギナーゼ（ＡＳＮ００２）および配列番号２に対応するアスパラギナーゼ（ＡＳＮ００１）のためには、それぞれ８９６０Ｍ−１・ｃｍ−１（Ａ２８０１ｃｍ，１ｍｇ／ｍｌ＝０．２５）および１１５２０Ｍ−１・ｃｍ−１（Ａ２８０１ｃｍ，１ｍｇ／ｍｌ＝０．３１）を用いた。２８０ｎｍで吸収する不純物の場合には、アスパラギナーゼ濃度は、アスパラギナーゼピークの下の面積と２８０ｎｍで吸収するピークの合計面積の比を測定されたアスパラギナーゼ試料のＡ２８０に乗ずることにより、ＨＰ−ＳＥＣクロマトグラムに基づいて補正された。アスパラギナーゼピークがその他のピークから明らかに離れていない場合には、ピーク面積に代ってピーク高さを取上げた。
【０１７０】
［実施例２］
［本発明にしたがったアスパラギナーゼの性能］
［ｐＨの関数としての比活性］
アスパラギナーゼ変異体の比活性を、無細胞上清を用いて５０ｍＭのリン酸／クエン酸緩衝液中、３７℃でｐＨ＝４、ｐＨ＝５、ｐＨ＝６、ｐＨ＝７、ｐＨ＝８で決定した。ここで酵素比活性は、純粋な酵素ポリペプチド１ｍｇあたりのユニット数で表わした１酵素試料について決定された活性と定義づけされる。したがってアスパラギナーゼ比活性は、純粋アスパラギナーゼ１ｍｇあたりのユニット数で表わした１アスパラギナーゼについて決定された活性である。
【０１７１】
【表１】
2010524448.tif 000002
【０１７２】
アスパラギナーゼの比活性を決定するためには、材料と方法の中で指示されているようにＨＰ−ＳＥＣクロマトグラフィに基づいてあらゆる純度に対して補正を適用して、Ａ２８０測定値から上清中の濃度を導出した。
【０１７３】
野生型との関係において、変異体ＡＳＮ００２およびＡＳＮ００１の最適ｐＨをｐＨ４からｐＨ６までシフトさせた。さらに最適ｐＨは、特にアルカリ範囲内ではるかに広くなった。変異体ＡＳＮ００２およびＡＳＮ００１は、ｐＨ＝４を超える全ての測定値について、野生型に比べ実質的に高い比活性を示す。
【０１７４】
［ｐＨ活性依存性および最適ｐＨ］
無細胞上清を用いてｐＨ＝４からｐＨ＝８までのｐＨ範囲について５０ｍＭのリン酸／クエン酸緩衝液中で、アスパラギナーゼ活性のｐＨ依存性を決定した。１つの変異体について最高の活性が観察されたｐＨは、前記変異体についての最適ｐＨと呼ばれる。表２では、１つの変異体について観察された最大活性は１００％に設定されており、その他のｐＨ値での前記変異体の活性は、前記変異体について観察された最大活性の百分率として示されている。
【０１７５】
【表２】
2010524448.tif 000003
【０１７６】
表２は、最適ｐＨがより高いｐＨへとシフトしたことを示している。さらに、アルカリ性ｐＨにおける活性は、変異体について著しく改善されており、そのためこれらの変異体は、よりアルカリ性の条件下でアスパラギナーゼ活性を必要とする利用分野にとって非常に有用なものとなっている。
【０１７７】
［変異体のｐＨ活性プロファイルの幅］
ＡＳＮ００２とＡＳＮ００１の最も卓越した特徴は、２つのアスパラギナーゼがｐＨ＝４からｐＨ＝９の最も有用なｐＨ範囲内で極めて広いｐＨ活性プロファイルを示すということにあり、これはこれまでのいかなるアスパラギナーゼにおいても見られなかったことである。ｐＨ活性プロファイルの幅を確立するために、クエン酸／ピロリン酸緩衝液を用いて、ｐＨ＝４からｐＨ＝９までについて活性を決定した。ｐＨ活性プロファイルの幅というのは、酵素がその最大活性の５０％〜１００％を示すｐＨユニット単位で計算されたｐＨ範囲の幅である。ｐＨ活性プロファイルの幅は、ｐＨに対して活性をプロットすることによって決定される。酵素がその最大活性の少なくとも５０％を示すｐＨユニット単位で計算されたｐＨ範囲の幅は、前記酵素のｐＨ活性プロファイルの幅を定義する。最大活性の半分のところにｐＨ軸に平行して１本の線を引いた場合、ｐＨ活性プロファイルはこの線と２つのｐＨ値において交差する。２つの交差のｐＨ値、つまりｐＨ活性プロファイルの酸性縁（ａｃｉｄｉｃ  ｌｉｍｂ）について１つそしてアルカリ性縁（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｌｉｍｂ）について１つのｐＨ値が、ｐＨ活性プロファイルの幅を定義づける。中間ｐＨ値において、活性な最大活性の少なくとも５０％である。最大活性は、活性とｐＨの関係をプロットした場合に観察される最高の活性として定義される。最高の活性に対応するｐＨが、前記酵素の最適ｐＨである。
【０１７８】
【表３】
2010524448.tif 000004
【０１７９】
表４は、ｐＨ＝４からｐＨ＝９までのｐＨ範囲について決定された完全ｐＨ−活性の関係を示す。
【０１８０】
【表４】
2010524448.tif 000005
【０１８１】
［変異体の安定性］
所与のｐＨにおける活性とは別に、酵素の性能は、転化の間の熱安定性によって大幅に左右される。より活性な変異体の熱安定性を確認するために、６０℃で活性検定を実施した。１つの検定では、１０分後に酵素反応が停止され、２回目の検定では反応は３０分後に停止された。３０分検定における酵素用量は、１０分検定における用量の３分の１であった。適用された条件下で酵素が安定している場合、観察された活性は類似したものであるはずである。不活性化が発生した場合、より長い検定時間の後に活性が低下することが予想される。結果は表５に示されている。
【０１８２】
【表５】
2010524448.tif 000006
【０１８３】
表５は、変異体の安定性が野生型アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスパラギナーゼに非常に類似していることを表わしている。ｐＨ６、ｐＨ＝７、ｐＨ＝８では、変異体ＡＳＮ００２およびＡＳＮ００１は６０℃で完全に活性であり、３０分のインキュベーションの後に、わずかな活性低下しか示さない。その結果、アスパラギンからアスパラギン酸への転化において増大した活性を完全に活用することができる。特に中性およびアルカリ性領域内の測定されたｐＨ値で、変異体の性能は著しく改善されている。
【図１】
2010524448.tif 000007
【配列表】
2010524448000001.app
【国際調査報告】
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