(57)【要約】  本発明は、水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）に結合し、そして、ＶＺＶ感染を中和する新規抗体配列を提供する。新規配列は、ＶＺＶ感染の医療管理のために、具体的には、ウイルスを検出するために、あるいは、ＶＺＶ感染の予防的処置又は治療的処置に使用される医薬組成物を調製するために使用される。
2010517557.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んで成るタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んで成る、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質が、配列番号７と少なくとも９０％の同一性を有する配列をさらに含んで成る、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質が、抗体、抗体フラグメント、生理活性ペプチド、又は融合タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記抗体フラグメントが、可変重鎖／軽鎖ヘテロ二量体であるか、又は一本鎖可変フラグメントである、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質が、水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）に結合し、そして、中和する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項８】
前記核酸が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の核酸を含んで成るベクター。
【請求項１０】
請求項７又は８に記載の核酸を含んで成る組み換えファージ、原核生物宿主細胞、又は真核生物宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を製造するための、請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸、あるいは、請求項１０に記載の組み換えファージ又は宿主細胞の使用方法。
【請求項１２】
ＶＺＶ感染又はＶＺＶ関連疾患を検出、治療、抑制、予防、及び／又は改善するための組成物の調製のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質の使用方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を含んで成る治療用組成物、予防用組成物、又は診断用組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、眼又は局所に投与される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
異なるＶＺＶ中和抗体、ＶＺＶ中和抗体フラグメント、免疫グロブリン静注調製物、ステロイド、及び／又は抗ウイルス化合物をさらに含んで成る、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスに特異的な生物学的活性を有する、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーから単離された新規抗体配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
ファージ・ディスプレイ技術は、ポリペプチド（抗体フラグメント、生理活性ペプチド、酵素等）をクローニング、選択、及び設計するために、細菌細胞（例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞）に感染する（Ｍ１３などの）線状ファージのゲノムの小さな寸法と順応性を利用する。前記ポリペプチドは、線状ファージ表面上に発現され、そして、標的とそれらの相互作用により生じる生物学的機能を発揮する。
【０００３】
論文（Ｂｒａｄｂｕｒｙ  Ａ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｓ  Ｊ，２００４；Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，２００４；Ｃｏｎｒａｄ  Ｕ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌｅｒ  Ｊ，２００５；Ｈｕｓｔ  Ｍ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ  Ｓ，２００５）及び書籍（“Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ｖｏｌ．２６６，ｅｄ．Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ  Ｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，２００４；“Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｅｄ．Ｂｕｒｔｏｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）で概説されるように、いくつかのクローニング及び発現ストラテジー、ベクター、ライブラリー、ファージの伝播方法、及びスクリーニング・アッセイが、様々な適用のために開発された。
【０００４】
ファージ・ディスプレイ・ライブラリーは、組み換えファージの集団で作られており、それぞれがタンパク質配列のレパートリーの１つの要素を提示している。特異的なタンパク質を発現するファージは、繰り返される親和性ベースの、及び／又は機能ベースの選択過程（「パンニング」）によってライブラリーから単離される。例えば、タンパク質は、精製抗原に対するそれら親和性、又は生物学的アッセイ法における活性に基づいて単離及び特徴づけされ得る、（一般的にＦａｂｓと名付けられる）可変重鎖／軽鎖ヘテロ二量体、又は一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の形態の抗体フラグメントである。
【０００５】
具体的には、前記結合特性に関係する関連生物学的活性を伴うこともある、病原菌及び生物学的標的に対する高い親和性と特異性を有する抗体フラグメントを同定するためのスクリーニング過程が開発された。実際には、（受動免疫療法又は受動血清療法と名付けられた）治療方法全体が、ヒト又はヒト以外の治療標的に向けられた抗体及び抗体フラグメントの抗原結合特性の上に成り立っている（Ｄｕｎｒｎａｎ  Ｐ  ａｎｄ  Ｎｅｓｉｎ  Ｍ，２００３；Ｋｅｌｌｅｒ  Ｍ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｈｍ  Ｅ，２０００）。受動免疫療法は、病原性抗原（例えば、毒素、ヒト・タンパク質、ウイルス、又は寄生生物）に対して規定の結合特異性を有する治療抗体を含んで成る医薬組成物の個体への投与から成る。
【０００６】
受動免疫療法は、臨床診療に取り入れられ、（感染症、免疫媒介疾患、及び癌を含めた）様々な疾患を治療する機会が急速に増大した。このアプローチは、免疫系が標的とされた分子を妨げる、及び／又は排除するのに必要とされる量、及び／又は特異性を有する抗体を産生することができない患者において特に有効である（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ  Ｌ，２００５；Ｌａｆｆｌｙ  Ｅ  ａｎｄ  Ｓｏｄｏｙｅｒ  Ｒ，２００５）。
【０００７】
治療抗体を使用して標的とされ得る病原性抗原の中で、ヒト細胞に感染するウイルスは、特別な重要性を持つ。このような抗体の投与で、患者におけるウイルス増殖を妨げることができ、そして、集団におけるウイルス感染の大発生を阻む可能性がある。あるいは、前記抗体は、通常、免疫が保たれている人の健康に重大な、及び／又は永続的な影響を及ぼさないものを含めた感染症に対してより一層感受性が高くなる、程度の差はあれ長期間、免疫系が弱まっている患者（例えば、免疫抑制された人、高齢者、又は移植を受けた人）に投与され得る。
【０００８】
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ、水痘）は、免疫障害を持つ人にとってそのような命にかかわる可能性のある感染の原因となるウイルスの１種である。ＶＺＶは、少なくとも７０個の異なったオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦｓ）をコードするアルファ・ヘルペスウイルスであって、その大部分が単純ヘルペスウイルスと近縁関係にある（Ｍｏｒｉ  Ｉ  ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  Ｙ，２００５）。ＶＺＶは、皮膚病変又は呼吸器分泌物中の感染性ウイルスとの直接接触によってヒト集団内で伝播され、皮膚とＴ細胞に対して特異的親和性を示す。第一次ＶＺＶ感染は、リンパ球に向けられ、それに続いて、細胞関連ウイルス血症、臓器内でのウイルス複製、そして、第二次ウイルス血症に起因する広汎性皮膚疹が起こる。ＶＺＶ感染は、ビリオンの放出、又は細胞間伝播によって拡散することが可能であり、知覚神経節内への潜伏を確立する（Ａｒｖｉｎ  Ａ，１９９６；Ｑｕｉｎｌｉｖａｎ  Ｍ  ａｎｄ  Ｂｒｅｕｅｒ  Ｊ，２００６）。
【０００９】
通例、１回のＶＺＶ侵襲又はワクチン接種が、一生にわたる保護をもたらす。しかしながら、ＶＺＶには、ウイルスが先天的な免疫応答、及び後天的に得た免疫応答の両方を回避することを可能にする固有の特性がある。ワクチン接種後の検出可能な細胞性免疫にもかかわらず、ＶＺＶ特異的抗体が失われる場合もあるので、ＶＺＶの再感染又は再活性化がさらに可能である（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００１０】
感染及びワクチン接種に対する免疫応答の機構と効力は、ヒト及び動物モデルにおいて（Ｍａｐｌｅ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｍａｔｓｕｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋｕｔｉｎｏｖａ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ，２００１；Ｍａｓｓａｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｈａｕｍｏｎｔ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｈａｓｎｉｅ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）又は試験管内培養系において（Ｆｉｎｎｅｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ａｎｄｒｅｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５ａ）研究された。ＶＺＶ発症機序と免疫生物学は、トランスジェニック・マウス・モデルにおいて、生体外におけるヒト皮膚又は神経節モデルを使用して研究できる（Ｂａｉｋｅｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｋｕ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｔａｙｌｏｒ  Ｓ  ａｎｄ  Ｍｏｆｆａｔ  Ｊ，２００５；Ｚｅｒｂｏｎｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。このように、細胞型特異的ＶＺＶアポトーシス活性（Ｈｏｏｄ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、及びＶＺＶ感染の細胞性／ウイルス性伝達物質（Ｂｅｒａｒｄｕｃｃｉ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｃｈｅｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｌｉ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｈａｍｂｌｅｔｏｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）が同定された。
【００１１】
弱毒化生水痘ワクチン（Ｏｋａ／Ｍｅｒｃｋ菌株）が入手可能であり、その安全と有効性を鑑みて、上記ワクチンが日常的な幼児期予防接種と成人に推奨される（Ｏｘｍａｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ａｒｖｉｎ  Ａ，１９９６）。ＶＺＶワクチン接種が先進工業国において幅広く定着し、且つ、短期間／中期間、すべての形態の水痘（特に重症疾患）を低減するのに非常に効果的であるにもかかわらず、集団において潜在型又は進化した野生型ウイルスのプールが継続的な脅威になっている（Ｈａｍｂｌｅｔｏｎ  Ｓ  ａｎｄ  Ｇｅｒｓｈｏｎ  Ａ，２００５）。
【００１２】
ＶＺＶ菌株は、ＶＺＶ転写産物の特異的な遺伝子変異（Ｇｒｏｓｅ  Ｃ，２００６）、及び３種類の大きく異なる遺伝子型（Ｎｏｒｂｅｒｇ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）と関連する。遺伝的変異は、予防接種されたヒト宿主の中に検出された皮疹を形成するＶＺＶ遺伝子型に関連した（Ｑｕｉｎｌｉｖａｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。そのうえ、ＶＺＶ免疫のレベルは、異なったヒト集団において、例えば、欧州地域の中で、大きく異なる（Ｎａｒｄｏｎｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００１３】
帯状ヘルペス（帯状疱疹）は、臨床診療において、特に加齢に伴って低下した細胞性免疫の結果として高齢者において、別の年齢分布においてはＶＺＶ再活性化の危険因子に起因して、そして、癌、免疫抑制治療、又はステロイド療法による随伴性免疫不全と共に、いまだに頻繁に観察されている。帯状ヘルペスの合併症は、神経学的合併症（ヘルペス後神経痛、脳血管炎、脳炎、無菌性髄膜炎、脳神経麻痺、又は髄膜脳炎）、目に関する合併症（眼帯状ヘルペス、ブドウ膜炎、網膜の壊死、視神経炎、又は角膜炎）、あるいは、内臓合併症（肝炎、肺炎、心筋炎）である。帯状ヘルペスの危険因子は、さらによく理解されるようになってきているが、それらの数の増加、並びに知覚神経節及び眼表面へのＶＺＶ持続性は、成人における、より広範囲のワクチン接種、及びより効果的な抗ＶＺＶ治療の必要性を示唆している（Ｄｗｏｒｋｉｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｊ，２００７；Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ  Ｔ，２００４）。
【００１４】
ＶＺＶ感染は、ワクチンの使用が妥当でない免疫抑制患者において非常に危険である。実際に、免疫抑制状態にある１人の人の単独のＶＺＶ再活性化又は再感染が、脊髄又は脳動脈を含めたいくつかの組織にＶＺＶが侵入し得るような数人の患者に感染する可能性がある移植病棟において、ＶＺＶは重大な問題である（Ｃｈａｖｅｓ  Ｔｄｏ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｇｉｌｄｅｎ  Ｄ，２００４）。妊娠中、ＶＺＶ感染はまた、子宮内伝播又は新生児期感染によって胎児にも広まり、重大な皮膚病変及び四肢と臓器の発生の異常を伴った、子宮内胎児死亡又は先天性水痘症候群を引き起こす（Ｓｃｈｌｅｉｓｓ  Ｍ，２００３；Ｓａｕｅｒｂｒｅｉ  Ａ  ａｎｄ  Ｗｕｔｚｌｅｒ  Ｐ，２００７）。
【００１５】
いくつかの重要な禁忌（Ａｒｖｉｎ  Ａ，１９９６）があるワクチン接種は別として、抗ウイルス治療が利用可能である（アシクロビア、バラシクロビル、ファムシクロビル、及びブリブジンなど）。しかしながら、薬剤耐性ＶＺＶ菌株の問題に加えて、これらの化合物はまた、例えば、ヒト酵素との相互作用のために、禁忌がある可能性がある（Ａｎｄｒｅｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５ｂ；Ａｂｄｅｌ−Ｈａｑ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。コルチコステロイド又は抗痙攣薬などの他の治療が、追加的な鎮痛を与えるために使用されるが、それらの有害影響特性が、特にヘルペス後神経痛に対する、使用を制限する（Ｔｙｒｉｎｇ  Ｓ，２００７）。これにより、予防のための現在の手段が適用不可能であるか、又はもはや有効性でない場合、代替のアプローチが必要である（Ｈａｍｂｌｅｔｏｎ  Ｓ  ａｎｄ  Ｇｅｒｓｈｏｎ  Ａ，２００５）。ワクチン不全とワクチン誘発免疫の低下を考慮して、現在、二次ワクチン投与が推奨されている（Ｃｈａｖｅｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００１６】
ＶＺＶ感染を早期に同定するために、いくつかの診断検査が、同様の患者集団において、並びにＶＺＶ感染の危険に晒された高齢者又は免疫不全の人において、ＶＺＶ特異的抗体、抗原、又は転写産物を検出するために開発された（Ｈａｍｂｌｅｔｏｎ  Ｓ  ａｎｄ  Ｇｅｒｓｈｏｎ  Ａ，２００５；Ｓｍｉｔｈ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００１７】
ＶＺＶに関連する眼感染（Ｋｅｚｕｋａ，Ｔ．  ２００４）、血管障害（Ｂｕｒｇｏｏｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、又は疫学的研究（Ｔａｌｕｋｄｅｒ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）に関連して血清、脳脊髄液、又は口腔液中で、ＶＺＶ特異的免疫活性が同定された。ＶＺＶ暴露後の予防が提案され、そして、具体的には、感染を予防するために投与され得る有意な抗ＶＺＶ力価を有するヒト抗体の調製物を使用して試験された（Ｋｅｌｌｅｒ  Ｍ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｈｍ  Ｅ，２０００）。特異的な、抗ＶＺＶ抗体の高い力価を有するヒト免疫グロブリンの静脈内注射用調製物が記載された（ＵＳ４７１７５６４；ＣＤＣ，２００６）。単独での、又はＶＺＶ特異的な抗ウイルス剤としての他の化合物と組み合わせたその利用は、移植を受けた患者、妊婦、又は新生児で試験された（Ｈｕａｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，００１；Ｃａｒｂｙ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｋｏｒｅｎ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００１８】
ＶＺＶ−特異的抗原、ＶＺＶ糖タンパク質の変異体、及びそれらの免疫原性エピトープが、異なる抗体調製物、例えば、ヒト血清（ＵＳ６９６０４４２；Ｆｏｗｌｅｒ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｋｊａｒｔａｎｓｄｏｔｔｉｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；ＷＯ９６／０１９００）、ヒト以外のポリクローナル血清（ＵＳ５３０６６３５；ＷＯ９２／０６９８９）など、を使用して説明された。ＶＺＶに対するモノクローナル抗体は、単離され、そして、ヒト起源（ＷＯ８６／０２０９２；ＷＯ９１／１６４４８；ＷＯ９５／０４０８０；ＥＰ１４８６４４；Ｎｅｍｅｃｋｏｖａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｆｏｕｎｇ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｓｕｇａｎｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｉｔｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、又はマウス起源（ＥＰ３２１２４９；Ｖａｆａｉ  Ａ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ  Ｗ，１９９１；Ｍｏｎｔａｌｖｏ  Ｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｅ  Ｃ  １９８６；Ｆｏｒｇｈａｎｉ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｇｒｏｓｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３；Ｌｌｏｙｄ−Ｅｖａｎｓ  Ｐ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍｏｕｒ  Ｊ，２０００；Ｓｈａｎｋａｒ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｇａｒｃｉａ−Ｖａｌｃａｒｃｅｌ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）のトリオーマ又はハイブリドーマを使用して発現された。組み換え、ＶＺＶ結合、及び／又は中和抗体フラグメントが、ファージ・ディスプレイ・ライブラリー中で同定され、そして、一本鎖可変フラグメント（Ｋａｕｓｍａｌｌｙ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｄｒｅｗ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）又はＦａｂｓ（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）として発現された。抗ＶＺＶマウス・モノクローナル抗体は、ヒト化された（ＷＯ  ９５／３１５４６）。
【００１９】
ワクチンと全身的抗ウイルス剤の両方に大幅な改善がもたらされたにもかかわらず、疾患は存続している。療法は、予測不可能なパターンで発症するＶＺＶ合併症の多くを軽減するが、それを解消するわけではない。今もなお、集団におけるＶＺＶの感染及び増殖をより効率的に検出し、そして、阻むことができる新規抗体及び抗体フラグメントの同定及び製造は、この感染症の療法、及び／又は予防のための改善された治療を確立するのに特に重要なことである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、ＶＺＶに結合し、中和する新規抗体配列、並びにＶＺＶ感染又はＶＺＶ関連疾患を検出する、治療する、抑制する、予防する、及び／又は改善するために使用できる新規抗体配列を提供する。
【００２１】
ヒト抗体配列のパネルを組み換えファージ上に提示させ、そして、ＶＺＶ特異的結合活性をファージ・ライブラリーにおいて検出した。２つの抗体フラグメントの重鎖及び軽鎖可変領域をコードし、且つ、ＶＺＶ中和活性を有するＤＮＡ配列を同定し、ＤＤＦ−ＶＺＶ１とＤＤＦ−ＶＺＶ２と命名した。対応するタンパク質配列、及びＶＺＶ特異的な生物学的活性に関与する相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を決定した。
【００２２】
本発明の配列は、組み換えタンパク質を製造するのに適当な技術を使用した、完全な抗体、抗体フラグメント、又はいずれか他の形式の機能タンパク質（具体的には融合タンパク質）の形態で、ＶＺＶ特異的結合及び中和特性を有する組み換えタンパク質を製造するのに使用できる。
【００２３】
ＶＺＶ感染及びＶＺＶ関連疾患の管理において治療上、予防上、及び／又は診断上の有用性を有する組成物が、本発明のタンパク質を使用することで調製できる。このような組成物は、抗ウイルス化合物、及び／又は免疫グロブリン静注（ＩＶＩｇ）調製物に基づく現在のＶＺＶ治療を補うか、又はそれを置き換えるのに使用できる。
【００２４】
単離されたＤＮＡ及びタンパク質配列、ベクター、組み換えファージ、及び宿主細胞、並びに医学方法や用途を含めた本発明のさらなる態様が、以下の説明の中で提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＤＤＦ−ＶＺＶ１が（ＶＺＶ−１）、ＤＤＦ−ＶＺＶ２（ＶＺＶ−２）、又は陰性対照として使用された無関係なヒトＦａｂ（ｅ−１３７）を発現する組み換えファージの調製物に対するＶＺＶ結合活性の特異性。結合活性は、（ＭＲＣ−５細胞について）総タンパク質量抽出物、又は（ウシ血清アルブミン、ＢＳＡについて）精製タンパク質の形態でプレート・コーティングに使用される表示抗原（ｔｈｅ  ｉｎｄｉｃａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）を使用したＥＬＩＳＡにより計測された。
【図２】（Ａ）ＤＤＦ−ＶＺＶ１の重鎖の可変領域のＤＮＡ（小文字）配列とタンパク質（大文字）配列の配列比較（ＤＤＦ−ＶＺＶ１  ＶＨ；配列番号１及び２）。予測されるＣＤＲｓ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３；配列番号３、４、及び５）には下線が引かれている。（Ｂ）ＤＤＦ−ＶＺＶ１の軽鎖の可変領域のＤＮＡ（小文字）配列とタンパク質（大文字）配列の配列比較（ＤＤＦ−ＶＺＶ１  ＶＬ；配列番号６及び７）。予測されるＣＤＲｓ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）には下線が引かれている。
【図３】（Ａ）ＤＤＦ−ＶＺＶ２の重鎖の可変領域のＤＮＡ（小文字）配列とタンパク質（大文字）配列の配列比較（ＤＤＦ−ＶＺＶ２  ＶＨ；配列番号８及び９）。予測されるＣＤＲｓ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３；配列番号１０、１１、及び１２）には下線が引かれている。（Ｂ）ＤＤＦ−ＶＺＶ２の軽鎖の可変領域のＤＮＡ（小文字）配列とタンパク質（大文字）配列の配列比較（ＤＤＦ−ＶＺＶ２  ＶＬ；配列番号１３及び１４）。予測されるＣＤＲｓ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）には下線が引かれている。
【図４】ＤＤＦ−ＶＺＶ１（Ａ）及びＤＤＦ−ＶＺＶ２（Ｂ）で染色した、ＶＺＶ感染ＭＲＣ−５細胞の免疫蛍光。細胞膜が白線で示されており、そして、核膜が白色点線で示されている。未感染細胞においてこれらのＦａｂｓを使用することで染色を得られなかった。
【図５】ファージ・コスト・タンパク質上に提示された、ある程度精製されたヒト組み換え型Ｆａｂｓとして発現された場合のＤＤＦ−ＶＺＶ１（Ａ）及びＤＤＦ−ＶＺＶ２（Ｂ）のＶＺＶ中和活性。プラーク減少の用量‐応答分析は、無関係なヒトＦａｂ（ｅ１３７）の対応する濃度と平行して実施された。パーセンテージ値は、全くＦａｂを含まずにプレインキュベートされたＶＺＶを使用することで得られたデータと比較することによって計算された。
【図６】（Ａ）対応する逆方向プライマー（ｐＤＤ−ＦＬＡＧｈｉｓ逆方向：配列番号１６）と対形成させ、ＳｐｅＩとＮｈｅＩで消化し、そして、ｃｐ３＊配列（ＷＯ  ０７／００７１５４）を置換するためにｐＤＤベクター内にクローンニングした後に、このオリゴヌクレオチドによって連続してコードされるタンパク質タグ（ＦＬＡＧＨｉｓタグ；配列番号１７）の目印を伴ったＦＬＡＧｈｉｓタグ（ｐＤＤ−ＦＬＡＧｈｉｓ順方向：配列番号１５）のための順方向リンカー。（Ｂ）ｐＤＬａｃＩ−ＦＬＡＧｈｉｓベクター内にクローンニングされた抗体フラグメントの重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含むＤＮＡフラグメントの概要地図。ＨＣ配列は、ＰｅｌＢシグナル配列（ＰｅｌＢ）とＦＬＡＧｈｉｓタグ配列（ＦＬＡＧｈｉｓ）の間のフレーム内にクローンニングされている。ＬＣ配列はＰｅｌＢシグナル配列（ＰｅｌＢ）と共にフレーム内にクローンニングされ、そして、その発現はＬａｃＺプロモーター（ＬａｃＺ）によって駆動される。２つの発現ユニットの間で、マーカー遺伝子（ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）；Ｚｅｏ遺伝子）とＬａｃＺプロモーターを制御する遺伝子（Ｌａｃ  Ｉ遺伝子）は、それら自身のプロモーターと共にクローンニングされる。ｃｐ８＊（ｃｐ８＊）をコードする配列は、機能的プロモーターと開始点の不存在下では、転写及び翻訳されない。関連する制限部位、具体的には、ＨＣ（ＳｐｅＩとＸｈｏＩ）、ＬＣ（ＸｂａＩとＳａｃＩ）、及びＬａｃＩ遺伝子（ＳｔｕＩ）をクローニングするために使用されるものを示す。ｐＤＬａｃシステムを使用してＤＤＦ−ＶＺＶ１を発現するための対応するＮｈｅＩ−ＢｇｌＩフラグメントを、配列番号１８として提供する。（Ｃ）ｐＤＬａｃ−ＶＺＶ１−ＦＬＡＧｈｉｓ精製を使用して発現されたＤＤＦ−ＶＺＶ１−ＦＬＡＧｈｉｓのクマシー染色。この図面は、アフィニティー・クロマトグラフィー・カラムから溶出された５つの連続した画分を示している。画分は、一緒に貯留され、濃縮され、そして、さらなる使用のために−２０℃にて保存された。
【図７】（Ａ）ｐＤＬａｃ−ＶＺＶ１−ＦＬＡＧｈｉｓ（ＤＤＦ−ＶＺＶ１  ＣＨＴａｇ；配列番号２０）を使用することで発現されるヒトＦａｂ  ＤＤＦ−ＶＺＶ１の重鎖のタンパク質配列。対応するＤＮＡ配列は、配列番号１９として提供される。ｐＤＤベクターを使用することで元々クローンニングされたこの重鎖の可変領域（配列番号２）には下線が引かれている。ＰｅｌＢ配列は、第１アミノ酸と第２６アミノ酸の間に包含されている。第１５５〜２６０アミノ酸は、ヒトＩｇガンマ−１鎖Ｃ領域の第１〜１０６アミノ酸に相当する（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ａｃｅ．Ｎｏ．：Ｐ０１８５７）。第２６２〜２７５アミノ酸は、ＦＬＡＧｈｉｓ配列に相当する。（Ｂ）ｐＤＬａｃ−ＶＺＶ１−ＦＬＡＧｈｉｓ（ＤＤＦ−ＶＺＶ１  ＣＬ；配列番号２２）を使用して発現されるヒトＦａｂ  ＤＤＦ−ＶＺＶ１の軽鎖のタンパク質配列。対応するＤＮＡ配列は、配列番号１９として提供される。ｐＤＤベクターを使用することで元々クローンニングされたこの軽鎖の可変領域（配列番号７）には下線が引かれている。ＰｅｌＢ配列は、第１アミノ酸と第２２アミノ酸の間に包含されている。第１２９〜２３４アミノ酸は、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域の第１〜１０６アミノ酸に相当する（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ａｃｅ．Ｎｏ．：Ｐ０１８３４）。（Ｃ）ｐＤＬａｃ−ＶＺＶ２−ＦＬＡＧｈｉｓ（ＤＤＦ−ＶＺＶ２  ＣＨＴａｇ；配列番号２４）を使用して発現されるヒトＦａｂ  ＤＤＦ−ＶＺＶ２の重鎖のタンパク質配列。対応するＤＮＡ配列は、配列番号２３として提供される。ｐＤＤベクターを使用することで元々クローンニングされたこの重鎖の可変領域（配列番号９）には下線が引かれている。ＰｅｌＢ配列は、第１アミノ酸と第２６アミノ酸の間に包含されている。第１５２〜２５７アミノ酸は、ヒトＩｇガンマ−１鎖Ｃ領域の第１〜１０６アミノ酸に相当する（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ａｃｅ．Ｎｏ．：Ｐ０１８５７）。第２５９〜２７２アミノ酸は、ＦＬＡＧｈｉｓ配列に相当している。（Ｄ）ｐＤＬａｃ−ＶＺＶ２−ＦＬＡＧｈｉｓ（ＤＤＦ−ＶＺＶ２  ＣＬ；配列番号２６）を使用することで発現されるヒトＦａｂ  ＤＤＦ−ＶＺＶ２の軽鎖のタンパク質配列。対応するＤＮＡ配列は、配列番号２５として提供される。ｐＤＤベクターを使用することで元々クローンニングされたこの軽鎖の可変領域（配列番号１４）には下線が引かれている。ＰｅｌＢ配列は、第１アミノ酸と第２２アミノ酸の間に包含されている。第１３５〜２４０アミノ酸は、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域の第１〜１０６アミノ酸に相当する（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ａｃｅ．Ｎｏ．：Ｐ０１８３４）。
【図８】ｐＤＬａｃシステムを使用することで発現され、そして、精製されるヒトＦａｂｓのＤＤＦ−ＶＺＶ１及びＤＤＦ−ＶＺＶ２のＶＺＶ中和活性。（Ａ）各Ｆａｂは示した濃度にて使用され、そして、プラーク減少が計算された。（Ｂ）各Ｆａｂは、単独、又は等量の各Ｆａｂを含んで成るＦａｂ調製物のいずれかで、示した濃度にて使用された。プラーク減少の用量‐応答分析が、同じ系（ｅｌ３７）を使用することで製造された無関係な対応する濃度のヒトＦａｂと平行して実施された。パーセンテージ値は、全くＦａｂを含まずにプレインキュベートされたＶＺＶを使用することで得られたデータ（陰性対照）と比較することによって計算された。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
ｐＤＤファージミド及びＷＯ０７／００７１５４に記載の関連方法は、２つの所定のファージ・コート・タンパク質の一方又はもう一方のいずれかに融合されたタンパク質配列のクローニング、発現、及び選別を可能にする。このアプローチは、表面上に又は組み換えファージにより示差的に発現又は提示されることができ、その結果、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーと異なった効率で選別され得るタンパク質配列識別の選択を可能にする。
【００２７】
この場合、ファージ・ライブラリーは、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリンの可変領域をｐＤＤファージミド内にクローンニングすることによって構築された。ライブラリーは、ＶＺＶタンパク質抽出物に対してパンニングしてより分けられ、それに続いて、選択されたクローンが、実施例に示されているように、ＶＺＶ中和活性があるものを決定するために細胞ベースのアッセイ方法で試験された。
【００２８】
ＤＤＦ−ＶＺＶ１及びＤＤＦ−ＶＺＶ２と名付けた、２つの最も有望なクローンをコードするＤＮＡ配列が決定され、次に、細菌発現のために適切なベクター内にクローンニングされた。これらのＦａｂｓのＶＺＶ中和活性は、ＶＺＶ感染の試験管内モデルを使用して、細菌細胞培養物から精製した組み換えファージの表面上の融合タンパク質としても、アフィニティー精製した組み換えヒトＦａｂｓとしても試験された。
【００２９】
本発明は、ＶＺＶに結合し、中和できる新規タンパク質配列を提供し、それには、ＦａｂｓのＤＤＦ−ＶＺＶ１又はＤＤＦ−ＶＺＶ２により識別される特異的なＣＤＲ（相補性決定領域）が含まれる。具体的には、本発明の各ＨＣＤＲ３ｓ（重鎖可変領域のＣＤＲ３）（配列番号５及び配列番号１２）は、それぞれ、ＤＤＦ−ＶＺＶ１及びＤＤＦ−ＶＺＶ２の抗原結合部分を特徴とする。
【００３０】
ＨＣＤＲ３の抗体は、抗原に結合し、その結果、生物学的活性（例えば、実施例に示されているように、ＶＺＶに結合し、そして、中和する）を発揮することができる、そのような抗体の抗原結合部分を特徴とすると考えられる。抗体の数個又はすべてのＣＤＲが、完全な抗原結合表面を得るのに通常必要とされるにもかかわらず、ＨＣＤＲ３は、配列に関してだけではなく、長さに関しても抗体の間で最も高い相違を示すＣＤＲである。実際、ＨＣＤＲ３の配列と長さの多様性は、大部分の抗体に対する特異性を測定するための基本となる（Ｘｕ  Ｊ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ  Ｍ，２０００；Ｂａｒｒｉｏｓ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．２００４；Ｂｏｎｄ  Ｇｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００３１】
前記ＨＣＤＲ３が同定されたのと同じＦａｂからの他のＣＤＲと組み合わせて又は組み合わせずに、ＶＺＶ結合部分として本発明の特異的なＨＣＤＲ３を含むタンパク質が、抗体タンパク質フレームワーク内に作り出される（Ｋｎａｐｐｉｋ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＣＤＲの組み合わせは、抗体構造と無関係なタンパク質フレームワーク内であっても、元の結合活性を乱すことなく、元の結合特性を持ち続ける非常に短いタンパク質の状態に互いに連結され得る（Ｌａｄｎｅｒ  Ｒ，２００７；Ｋｉｓｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００３２】
１つの態様において、本発明は、Ｆａｂ  ＤＤＦ−ＶＺＶ１のＨＣＤＲ３と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んで成るタンパク質を提供する。ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２（配列番号３及び配列番号４；図２Ａ）と共に、このＨＣＤＲ３は、ＤＤＦ−ＶＺＶ１  Ｆａｂの重鎖の可変領域（ＤＤＦ−ＶＺＶ１  ＶＨ；配列番号２）内に含まれる。このＦａｂを形成する軽鎖の可変領域（ＤＤＦ−ＶＺＶ１  ＶＬ：配列番号７）、そのうえ、その特異的なＬＣＤＲｓ（軽鎖可変領域のＣＤＲｓ）が決定された（図２Ｂ）。
【００３３】
他の態様において、本発明は、Ｆａｂ  ＤＤＦ−ＶＺＶ２のＨＣＤＲ３と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んで成るタンパク質を提供する。ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２（配列番号１０及び配列番号１１；図３Ａ）と共に、このＨＣＤＲ３は、ＤＤＦ−ＶＺＶ２の重鎖の可変領域（ＤＤＦ−ＶＺＶ２  ＶＨ；配列番号９）内に含まれる。このＦａｂ（ＤＤＦ−ＶＺＶ１  ＶＬ；配列番号１４）を形成する軽鎖の可変領域、そのうえ、その特異的なＬＣＤＲｓが決定された（Ｆｉｇ．３Ｂ）。
【００３４】
本発明のタンパク質がＤＤＦ−ＶＺＶ１の配列に基づいているなら、それらは、配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んで成るべきである。特に、それらは、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んで成るべきである。より特に、前記タンパク質はまた、配列３及び配列番号４から成る群から選択される１つ以上の配列も含むべきである。
【００３５】
あるいは、本発明のタンパク質が、ＤＤＦ−ＶＺＶ２の配列に基づいているなら、それらは、配列番号１２に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んで成るべきである。特に、それらは、配列番号９に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んで成るべきである。より特に、前記タンパク質はまた、配列番号１０及び配列番号１１から成る群から選択される１つ以上の配列も含むべきである。
【００３６】
本発明のさらなる態様は、両Ｆａｂｓの重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列であり、具体的には、ＤＤＦ−ＶＺＶ１（重鎖については配列番号１；軽鎖については配列番号６）及びＤＤＦ−ＶＺＶ２（重鎖については配列番号８；軽鎖については配列番号１３）の可変領域についてクローンニングされ、そして、決定された本来のＤＮＡ配列と少なくとも９０％の同一性を有するものである。これらのＤＮＡ配列（又は、図２及び３から容易に決定され得る単離されたＨＣＤＲｓ及びＬＣＤＲｓをコードするものなどの選択された部分）は、それらがＶＺＶ結合及び中和特性をもたらす組み換え抗体（例えば、完全抗体、親和性成熟抗体、ＣＤＲグラフト抗体、又はフラグメント）又は融合タンパク質の公知の形式の１つでそれらを発現するために他のベクター内に移されてもよい。
【００３７】
同一性のレベルがどこに示されるとしても、この同一性のレベルは、本発明の関連配列の完全長で測定されるべきである。
【００３８】
ＤＤＦ−ＶＺＶ１又はＤＤＦ−ＶＺＶ２（又は単離されたＨＣＤＲｓやＬＣＤＲｓなどの選択された部分）のいずれかを形成する重鎖及び軽鎖の可変領域は、特定のアイソタイプを持つ抗体の中に、特に、完全なヒト組み換え抗体の中に包含されることができる。この抗体は、２本の軽鎖及び２本の重鎖によって形成された四量複合体の天然の立体構造で、軽鎖及び重鎖可変領域としてＤＤＦ−ＶＺＶ１又はＤＤＦ−ＶＺＶ２のいずれかのＶＬ及びＶＨ配列を含んで成ることができる。完全なヒト抗体が望ましいとき、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ定常領域から成る群から選択される重鎖定常領域をさらに含んで成るべきである。例えば、ＩｇＧイソタイプは、ほとんどすべての承認された治療抗体の抗体形式である（Ｌａｆｆｌｙ  Ｅ  ａｎｄ  Ｓｏｄｏｙｅｒ  Ｒ，２００５）。しかしながら、ヒトＩｇＧ１から単離された抗原結合部分は、ヒトＩｇＡ配列に移されることができ、そして、得られた組み換え抗体が、ＨＩＶ感染を抑制することができる抗体で最近示されたように、本来のＩｇＧ１の活性を維持した（Ｍａｎｔｉｓ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００３９】
あるいは、ＤＤＦ−ＶＺＶ１又はＤＤＦ−ＶＺＶ２（又は単離されたＨＣＤＲｓやＬＣＤＲｓなどの選択された部分）のいずれかを形成する重鎖及び軽鎖の可変領域は、Ｓｃｆｖ（一本鎖可変フラグメント）、Ｆａｂ（可変重鎖／軽鎖ヘテロ二量体）、二重特異性抗体、ペプタボディ（ｐｅｐｔａｂｏｄｙ）、ＶＨＨ（重鎖抗体の可変ドメイン）、単離された重鎖若しくは軽鎖、二重特異性抗体、及び非臨床／臨床適用のためのその他の遺伝子操作抗体変異体（Ｊａｉｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｌａｆｆｌｙ  Ｅ  ａｎｄ  Ｓｏｄｏｙｅｒ  Ｒ，２００５）などの異なった名称で文献に記載される機能的抗体フラグメントに関するあらゆる他のタンパク質形式に含まれるかもしれない。ＤＤＦ−ＶＺＶ１又はＤＤＦ−ＶＺＶ２の組み換え変異体は、タグ付与したＦａｂｓの形態でｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓと呼ばれるｐＤＤ適合発現ベクターを使用することで製造された（図６Ｂは関連ＤＮＡフラグメントの概要地図に関し；配列番号１８はＤＤＦ−ＶＺＶ１を製造するために作り出されたこのようなフラグメントのＤＮＡ配列の例に関する）。ＤＤＦ−ＶＺＶ１及びＤＤＦ−ＶＺＶ２のタグ付与バージョンを含んでいるｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓベースのベクターが作り出され、そして、ＤＤＦ−ＶＺＶ１  ＨＣｔａｇを製造するためにＤＤＦ−ＶＺＶ１  ＬＣ（配列番号１９〜２２、図７Ａ及びＢ）と共に、そして、ＤＤＦ−ＶＺＶ２  ＨＣｔａｇを製造するためにＤＤＦ−ＶＺＶ２  ＬＣ（配列番号２３〜２６；図７Ｃ及びＤ）と共に使用された。
【００４０】
追加抗体及び抗体フラグメントは、シャフリング軽鎖の過程を通してＤＤＦ−ＶＺＶ１又はＤＤＦ−ＶＺＶ２のいずれかの配列を使用することで作り出される。実際に、いくつかの異なった抗体が作り出され、そして、例えば、一般的なファージ・ディスプレイ技術、又はＷＯ  ０７／００７１５４に記載の技術を使用して、ＶＬ配列に関するライブラリーと組み合わせた１本重鎖可変ドメインＶＨ（ＤＤＦ−ＶＺＶ１又はＤＤＦ−ＶＺＶ２のいずれか一方など）を使用することで特異的な生物学的活性について試験され得る。このアプローチは、親和性、安定性、特異性、及び／又は組み換え体の製造に関して改善された特性を有するＶＨ／ＶＬ組み合わせの決定を可能できる（Ｏｈｌｉｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｒｏｊａｓ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。
【００４１】
そのうえ、特に（より良い薬物動態学的プロフィール、又は抗原に対するより高い親和性などの）臨床適用に関して、改善された特徴を有する抗体にするために特定の位置で抗体を修飾できることが知られている。これらの変更は、ＣＤＲｓ、及び／又はＤＤＦ−ＶＺＶ１又はＤＤＦ−ＶＺＶ２のいずれかのフレームワークに加えられる。配列は、親和性成熟及びその他の方法を利用して行われる抗体の合理的設計のための専用技術のいずれかを適用することによって決定できる（Ｋｉｍ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｊａｉｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００４２】
新しい生理活性ペプチドを開発するための抗体ベースのストラテジーはまた、Ｌ−アミノ酸、及び／又はＤ−アミノ酸を含むＣＤＲ誘導ペプチド合成の実現可能性を示した。これらの分子は、より適切な薬理学的特性を伴った、本来の活性の比活性を維持する（Ｌｅｖｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｗｉｊｋｈｕｉｓｅｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。そのため、本発明のＨＣＤＲ３のそれぞれ、並びにそれらと高度に類似した配列、それらを含む融合タンパク質、そして、（例えば、Ｄ−アミノ酸を含むか、又はレトロ‐インベルソ型立体構造にある）それらに由来する合成ペプチドが、ＶＺＶ結合タンパク質として使用及び試験され得る。
【００４３】
本発明のタンパク質は、ＶＺＶに結合し、そして、中和する、抗体、抗体フラグメント、生理活性ペプチド、又は融合タンパク質として提供される。これらの代替タンパク質は、ＤＤＦ−ＶＺＶ１及びＤＤＦ−ＶＺＶ２  Ｆａｂｓについて測定されるそのような特性を強化しないにしても、維持するべきである。融合タンパク質の場合には、異種タンパク質配列は、その正しい発現と生物学的活性に影響することなく、ＶＺＶ特異的部分（例えば、抗体フラグメントの特異的ＨＣＤＲ３又は可変領域）に対してＮ又はＣ末端位置に位置し得る。
【００４４】
用語「異種タンパク質」は、ＶＺＶ特異的部分（例えば、抗体フラグメント）に対してＮ又はＣ末端位置に、タンパク質配列が天然には存在していないことを示す。このタンパク質配列をコードするＤＮＡ配列は、一般的に組み換えＤＮＡ技術によって融合され、そして、少なくとも５つのアミノ酸をコードする配列を含んで成る。存在しているこの異種配列は、一般的にＶＺＶ特異的融合タンパク質に追加特性を与えるために選ばれている。このような追加特性の例には、検出若しくは精製のためのより優れた手段、追加の結合部分若しくは生物学的リガンド、又は融合タンパク質の翻訳後修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、若しくはタンパク質内部分解性開裂）が含まれる。
【００４５】
あるいは（又は１つ以上の異種タンパク質配列への融合に加えて）、本発明のタンパク質の活性は、治療薬、安定化剤、又は診断薬などの異なった化合物との結合によって改善することができる。これらの作用物質の例は、化学リンカー又は重合体を使用して結合され得る検出可能な標識（例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、毒素、金属原子、コロイド状金属、化学発光化合物、生物発光化合物、又は酵素）である。本発明のタンパク質のＶＺＶ特異的生物学的活性は、診断上の又は治療上の適用において代謝、及び／又は安定性を変える重合体のような化合物との融合によって改善される。治療活性は、別の抗ウイルス・タンパク質、あるいは、細胞の代謝、及び／又は活性を変えるタンパク質などの別の治療用タンパク質との融合によって改善される。
【００４６】
タンパク質部分、リガンド、及び適切なリンカーの選択及び設計方法、並びに融合タンパク質の構築、精製、検出、及び使用のための方法及びストラテジーは、文献（ニルソンら、１９９７；「キメラ遺伝子と雑種タンパク質の適用」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  Ｖｏｌ．３２６−３２８、アカデミックプレス社、２０００；ＷＯ０１／７７１３７）内に提供されており、且つ、臨床検査室及び研究室で一般的に利用可能である。例えば、融合タンパク質は、融合タンパク質の生体内、及び／又は試験管内における識別、又はその精製を容易にできる（ポリヒスチジン、ＦＬＡＧ、ｃ−Ｍｙｃ、若しくはＨＡタグなどのタグを含めた）商業的な抗体によって認識される配列を含む。他のタンパク質配列は、（緑色蛍光タンパク質の場合のように）直接蛍光分析によって、又は（例えば、タンパク分解部位を使用した）特異的基質又は酵素によって容易に識別できる。
【００４７】
ＶＺＶ特異的抗体、抗体フラグメント、及び融合タンパク質の安定性は、ファージ・コート・タンパク質（単離されたか若しくは組み換えファージ内に含まれているｃｐ３又はｃｐ８）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などの周知の担体タンパク質との融合により改善される。
【００４８】
本発明のタンパク質はまた、ＶＺＶエンベロープに対する中和抗原を特徴づけするためにも使用できる。実際、ＤＤＦ−ＶＺＶ１及びＤＤＦ−ＶＺＶ２は、最初、ＥＬＩＳＡによる、ＶＺＶ感染細胞株から得られた細胞抽出物へのそれらの特異的結合のためにクローンニングされ（図１）、そして、ＶＺＶ感染を中和するそれらの能力はまた、ＶＺＶ基準菌株を使用した試験管内における中和アッセイによって測定された（図５及び８）。その結果、本発明のタンパク質は、ＤＤＦ−ＶＺＶ１又はＤＤＦ−ＶＺＶ２と競合する（例えば、完全な抗体、Ｆａｂｓ及び他の抗体フラグメント、生理活性ペプチド、又は融合タンパク質の形態の）他のＶＺＶ結合タンパク質を規定するのに使用できる。このような競争タンパク質は、任意に、本来のＤＤＦ−ＶＺＶ１又はＤＤＦ−ＶＺＶ２配列において確認されたものと一部又は完全に異なったＨＣＤＲｓ及びＬＣＤＲｓと共に、先に規定されたＨＣＤＲ３配列のいずれかを単に含む。
【００４９】
（本発明の抗体、抗体フラグメント、生理活性ペプチド、又は融合タンパク質に関して）そのような競合タンパク質は、実施例又は文献に記載の関連アッセイによって測定される、本発明のタンパク質と競合するそれらの能力、それから、ＶＺＶ感染を中和するそれらの能力を実証することによってスクリーニングされ、そして、単離され得る。本発明の背景は、類似活性を測定するための異なるアプローチに関するいくつかの基準を提供する。具体的には、本発明の抗体、抗体フラグメント、及び他のタンパク質は、抗体フラグメント（Ｋａｕｓｍａｌｌｙ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｄｒｅｗ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、マウス若しくはヒト・モノクローナル抗体（Ｇｒｏｓｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３；Ｍｏｎｔａｌｖｏ  Ｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｅ  Ｃ，１９８６；Ｓｕｇａｎｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｆｏｒｇｈａｎｉ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｌｌｏｙｄ−Ｅｖａｎｓ  Ｐ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍｏｕｒ  Ｊ，２０００）、並びにヒト以外／ヒト血清（Ｆｏｗｌｅｒ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｈａｕｍｏｎｔ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｇａｒｃｉａ−Ｖａｌｃａｒｃｅｌ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）についてＶＺＶ特異的生物学的活性及びエピトープを特徴づけるために使用されるアッセイにより試験され得る。
【００５０】
免疫蛍光研究（図４）は、他の抗体及び抗体フラグメントについてこれまでに示されたように、ＤＤＦ−ＶＺＶ１とＤＤＦ−ＶＺＶ２が異なったＶＺＶ抗原を認識することを示した（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｗｕ  Ｌ  ａｎｄ  Ｆｏｒｇｈａｎｉ  Ｂ，１９９７；Ｇｒｏｓｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。文献は、ＶＺＶ抗原と各Ｆａｂによって認識される特異的エピトープが測定でき、且つ、過去に測定したものと比較できることを使用した技術に関するいくつかの例を提供する。例えば、ＶＺＶタンパク質、及び関連する切断変異体若しくは合成ペプチドを使用したＥＬＩＳＡ、免疫沈降反応、又はウエスタン・ブロットを、使用して、関連エピトープを同定した（Ｋｒａｈ  Ｄ，１９９６，Ｓａｕｅｒｂｒｅｉ  Ａ  ａｎｄ  Ｗｕｔｚｌｅｒ  Ｐ，２００６）。具体的には、前記エピトープは、糖タンパク質Ｅ又は糖タンパク質Ｂ（Ｆｏｗｌｅｒ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｈａｕｍｏｎｔ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｇａｒｃｉａ−Ｖａｌｃａｒｃｅｌ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｋｊａｒｔａｎｓｄｏｔｔｉｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、及び糖タンパク質Ｌ：糖タンパク質Ｈ複合体（Ｆｏｒｇｈａｎｉ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）内で同定された。
【００５１】
本発明のタンパク質のＶＺＶ関連の予防上、診断上、及び治療学上の使用についてのより詳しい特徴づけとバリデーションは、その次に、本発明の背景にまとめられているとおり、ＶＺＶ発症機序と免疫生物学を研究するための文献に開示されている試験管内又は生体内におけるアッセイ（組織若しくは細胞ベースのアッセイ、齧歯動物において確立された病態モデル）の１つ以上を使用することで実施できる（Ｆｏｒｇｈａｎｉ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４：  Ｖａｆａｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｆｏｒｇｈａｎｉ，１９９７；Ｆｏｗｌｅｒ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ，，１９９５；Ｍａｐｌｅ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｍａｔｓｕｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋｕｔｉｎｏｖａ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｍａｓｓａｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｈａｕｍｏｎｔ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｇｒｏｓｅ  Ｃ，２００６；Ｂａｉｋｅｒ  ２００４；Ｋｕ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｔａｙｌｏｒ  Ｓ  ａｎｄ  Ｍｏｆｆａｔ  Ｌ，２００５；Ｚｅｒｂｏｎｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００５２】
本発明のさらなる目的は、先に規定された抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質、又は単離ＣＤＲのいずれかをコードする核酸である。実施例は、具体的には、ＤＤＦ−ＶＺＶ１又はＤＤＦ２−ＶＺＶ２重鎖及び軽鎖の完全な可変領域をコードする配列を提供する（配列番号１、６、８、及び１３）。前記核酸は、配列番号１、配列番号６、配列番号８、及び／又は配列番号１３と少なくとも９０％の同一性を有していなければならない。前記配列、具体的には、特異的なＣＤＲｓ（図２と３を参照のこと）に関連するそれらの中の配列は、例えば、発現ベクター内のプロモーターに作動できるように連結されるか、若しくはｐＤＤベースのファージミド内にクローンニングされて、ベクター及びＤＮＡ発現カセット内に、並びにいずれか他のファージミド内に含まれ得る。これにより、（実施例に示されているように）本発明のタンパク質を発現するファージミド・ベクターを含んで成る組み換えファージは、ＶＺＶ感染の検出手段、及び／又は中和手段として使用され得る。
【００５３】
完全ヒト抗体が望ましい場合には、発現ベクターは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ定常領域から成る群から選択される重鎖の定常領域をさらに含んで成るはずである。着目の重鎖及び軽鎖の関連可変領域をコードする核酸配列は、それらが適切な調節配列（例えば、プロモーター、転写ターミネータ）に作動できるように連結される、１つのベクター又は異なったベクターの発現カセット内に適切にクローンニングされるべきである。発現カセットは、所望のタンパク質のための単シストロン性若しくは２シストロン性の転写産物の発現を駆動できるプロモーター、（必要であれば）リボソーム結合部位、開始／終止コドン、及びリーダー／分泌配列を含むはずである。
【００５４】
ＶＺＶに結合し、そして、中和できると先に規定された本発明の抗体、抗体フラグメント、ＨＣＤＲｓ、融合タンパク質、及びいずれか他の化合物は、適切な宿主細胞を形質転換するためのそのようなベクター、及び組み換えタンパク質としてのそれらの発現を可能にする十分に確立された技術を使用して製造され得る。これらの調製物は、ＶＺＶ関連の予防上、診断上、及び治療上の使用に関するより詳細な特徴づけとバリデーションを実施するのに十分な量の組み換えタンパク質（マイクログラムからミリグラムの範囲）を提供するべきである。
【００５５】
本発明の配列がクローンニングされ、そして、対応する組み換えファージの手段によって特徴づけされたｐＤＤベースのファージミドは、本来のＦａｂｓ、又はそれらから得られたタンパク質配列が（ｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓ系を用いて実施例で示されているように）宿主細胞内で組み換えタンパク質として適切に発現されるベクター内に（一部又は全体として）移され得るＤＮＡ配列を含む。ベクターは、構成的に活性であるか又は誘導性であるように選択された転写開始／終止調節配列の制御下、原核生物又は真核生物宿主細胞において組み換えタンパク質の発現を可能にするべきである。
【００５６】
本発明の核酸を含んで成る宿主細胞は、原核生物又は真核生物宿主細胞であり、所望の組み換えタンパク質の分泌を可能にすべきである。そして、このような細胞が実質的に豊富になった細胞株は、単離されて、安定細胞株をもたらす。前記のタンパク質の製造方法には、タンパク質の発現に好適な条件下、それらのコード配列を含んで成る発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、そして、その宿主細胞培養物からタンパク質を回収するステップが含まれる。
【００５７】
これらの核酸、組み換えファージ、及び宿主細胞は、一般的な組み換えＤＮＡ技術を適用することによって本発明のタンパク質を製造するのに使用できる。簡単に言えば、所望のＤＮＡ配列は、制限酵素でファージミドを消化することによって、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）の鋳型として本来のファージミドを使用し、及び重鎖及び軽鎖の完全な可変領域若しくは（ＨＣＤＲ３などの）それらの一部分だけを特異的に増幅するためのＰＣＲプライマーを使用して増幅することによって抽出できる。
【００５８】
次に、前記ＤＮＡフラグメントは、オックスフォード大学出版より刊行された「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」というシリーズの中のいくつかのタイトル（“ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”，１９９５；“ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ４：  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”，１９９６；“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，１９９９；“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，２００１）を含めた、組み換えタンパク質をどのようにクローンニングし、そして、製造するかに関する多くの書籍と総説に記載のとおり、原核生物又は真核生物宿主細胞内でのさらなる一時変異、及び／又は発現のためにより適切なベクターに移されてもよい。
【００５９】
真核生物宿主（例えば、酵母、昆虫、又は哺乳動物細胞）に関して、宿主の性質によって、異なった転写及び翻訳調節配列を用いることができる。それらは、調節シグナルが、発現レベルが高い特定の遺伝子に関連するアデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、シミアンウイルス、又は同様のものなどのウイルス由来である。例は、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーターなどである。一過性の（構成的）の抑制及び活性化を可能にし、その結果、修飾遺伝子発現を可能にする転写開始調節シグナルが選択できる。さらなるクローニング・ステップの間、抗体又は融合タンパク質をコードする配列は、例えば、特定のベクター及び宿主細胞を使用して組み換えタンパク質をクローンニングし、そして、発現するためのコドン使用及び制限部位が最も適当であるＤＮＡ配列を選択するためのソフトウェアを使用することで、決定され得るＤＮＡレベルにおいてのみ、又はＤＮＡ及びタンパク質レベルの両方における特異的修飾のために、他のベクター内に適合させ、そして、再クローニングし得る（Ｒｏｄｉ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ，，２００２；Ｇｒｏｔｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｃａｒｔｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。タンパク質配列もまた、（Ｓｃｆｖ、Ｆａｂ、完全ヒト抗体などの）所望の抗体形式、又は１つ以上の内部アミノ酸の挿入、置換、又は除去と関連して追加され得る。
【００６０】
これらの技術もまた、抗体の治療学的特性のさらなる構造的及び機能的な特徴づけ及び最適化のために（Ｋｉｍ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、あるいは、それらの安定した生体内デリバリーを可能にするベクターを製造するために使用され得る（Ｆａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。例えば、組み換え抗体もまた、可変領域に融合される特異的なＦｃ領域を選択することによって（Ｆｕｒｅｂｒｉｎｇ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ  Ｔ，２００７）、組み換え一本鎖抗体フラグメントを製造することによって（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、安定化ペプチド配列を融合することによって（ＷＯ０１／４９７１３）、又は化学的に修飾した残基に放射性化学物質又は重合体を追加することによって（Ｃｈａｐｍａｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、構造、及び／又は活性レベルで修飾され得る。
【００６１】
いったん好適なエピソマー、又は非相同若しくは相同の組み込み型ベクター（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）内に挿入された、ディスプレイ及び選択されたタンパク質配列をコードするＤＮＡ配列は、（形質転換、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ダイレクト・マイクロインジェクションなどの）好適な手段のいずれかによって適切な宿主細胞内に導入されて、それらを形質転換することができる。特定のプラスミド又はウイルス・ベクターを選択する場合に考慮される重要な要因は：ベクターを含まない宿主細胞の中からベクターを含む宿主細胞を認識し、そして、選択することの容易さ；特定の宿主体内で所望されるベクターのコピー数；そして、異なる種の宿主細胞間のベクターである「シャトル」にそれが望ましいかどうかである。
【００６２】
導入されたＤＮＡによって安定に形質転換された細胞は、発現ベクターを含む宿主細胞の選別を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによっても選択され得る。前記マーカーはまた、栄養要求性宿主に対して光合成栄養、殺生物剤抵抗性、例えば、抗生物質、若しくは銅などの重金属、又は同様のもの、に対する抵抗性も与え、そして、必要性であれば、切断可能であるか又は抑制される。選択マーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ遺伝子配列に直接連結され得るか、又は同時トランスフェクションによって同じ細胞内に挿入され得る。追加の転写制御要素もまた、最適な発現に必要である。
【００６３】
宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれかである。原核生物宿主細胞の中で、好ましいものは、Ｂ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）とＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。真核生物宿主細胞の中で、好ましいものは、酵母、（バキュロウイルス・ベースの発現系を使用した）昆虫細胞、又は哺乳動物細胞、例えば、ヒト、サル、マウス、（バキュロウイルス・ベースの発現系を使用した）昆虫、及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などである。なぜならば、哺乳動物細胞が、正しい折りたたみ、又は正しい部位でのグリコシル化の特定の形態を含めた、タンパク質分子に対する翻訳後修飾を提供するからである。また、酵母細胞もグリコシル化を含めた翻訳後ペプチド修飾を行う。酵母において所望のタンパク質の製造に利用できる強力なプロモーター配列と高いプラスミド・コピー数を利用する、多くの組み換えＤＮＡストラテジーが存在する。酵母は、クローンニングされた哺乳動物遺伝子産物、及びリーダー配列を担持している分泌ペプチド（すなわち、プレ‐ペプチド）の中のリーダー配列を認識する。
【００６４】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野で公知であり、そして、それには、これだけに制限されることなく、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓（ＣＯＳ）細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞、及びヒト肝細胞癌（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）細胞、及びその他の多くの細胞株を含めたアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の不死化細胞株が含まれる。バキュロウイルス系において、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料は、（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって商品化されている）キット形態で市販されている。
【００６５】
長期間にわたる、高収率産生の組み換えポリペプチドの、安定的な発現が好まれる。例えば、着目のポリペプチドを安定して発現する細胞株は、同じか、又は別のベクター上にウイルス複製開始点、及び／又は内因性発現要素、並びに選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを使用することで形質転換される。ベクターの導入に続いて、細胞を、強化培地中で１〜２日間、増殖させ、その後、それらを選択培地に切り換える。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、その存在が導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖と回復を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞型に適切な組織培養技術を使用することで増殖する。そして、このような細胞が実質的に豊富になった細胞株は、単離されて、安定な細胞株を提供し得る。宿主細胞は、組み換えタンパク質の発現レベルに基づいてさらに選択される。
【００６６】
ファージ・ディスプレイ技術を使用して単離される免疫グロブリン可変鎖（具体的には、ヒト免疫グロブリン可変鎖）の場合、重要な変更は、選択されたＦａｂ又はｓｃＦＶの、好ましいアイソタイプ及び定常領域を持つ完全な免疫グロブリン・タンパク質への転換である。こういう種類の変更は、例えば、ファージ・ディスプレイ・ライブラリー由来の単鎖Ｆｖ又はＦａｂｓから構築されたすべてのアイソタイプの完全なヒト・モノクローナル抗体を製造し、そして、哺乳動物又は昆虫細胞内で発現することを可能にする。文献に広く記載のとおり（Ｐｅｒｓｉｃ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｇｕｔｔｉｅｒｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ベクターは、所望のアイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧガンマ）の定常（Ｆｃ）領域に対するこの配列の融合を可能にする発現抗体のために特異的に設計される。抗体又は融合タンパク質は、一過性に又は安定に形質転換された細胞として高レベルの発現を可能にする原核生物細胞（例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  Ｈ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ  Ｋ，２００５；Ｖｅｎｔｕｒｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、植物細胞（Ｍａ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、又は真核生物細胞において組み換えタンパク質として発現される（Ｄｉｎｎｉｓ  Ｄ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｄ，２００５）。これは、具体的には、抗体の特徴づけが、より困難なアッセイ、及び／又は生体内アッセイを使用して実施されなければならない場合に必要であるだろう。
【００６７】
文献は、記事及び書籍の章で概説されるとおり、原核生物宿主細胞において、Ｆａｂとしてタンパク質を、又は抗体フラグメントと同様の形式を発現するための異なったストラテジーを提供する（“Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ｖｏｌ．２６６，ｅｄ．Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ  Ｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，２００４；“Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｅｄ．Ｂｕｒｔｏｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ｃｏｒｉｓｄｅｏ  Ｓ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ  Ｂ，２００４；Ｂｅｎｈａｒ  Ｉ，２００１）。
【００６８】
タンパク質、特に抗体が真核生物宿主細胞（具体的には、哺乳動物細胞株）において発現されるとき、異なったベクター及び発現系が、トランスフェクト細胞株の安定したプールを作り出すように設計される（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔ  ｅｔ  ａｈ，２００３；Ｂｉａｎｃｈｉ  Ａ  ａｎｄ  ＭｃＧｒｅｗ  Ｊ，２００３）。組み換え抗体の高レベルの、最適化された、安定した発現は、細胞培養条件の最適化によっても（Ｇｍｎｂｅｒｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｙｏｏｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、そして、より高いレベルの抗体産生及び分泌を有するクローンを選択するか又は設計することによって（Ｂｏｈｍ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｂｕｔｌｅｒ  Ｍ，２００５）達成された（Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００６９】
ＶＺＶに結合し、中和できると先に規定した抗体、抗体フラグメント、生理活性ペプチド、融合タンパク質、及びあらゆるその他タンパク質は、細胞培養物又は合成調製物からの非組み換え／組み換えタンパク質のいずれかの分離を可能にする十分に確立された技術、すなわち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動、又は同様のものを含めた従来手順のいずれかを使用して精製され得る。抗体精製の方法は、カラム内に含まれる固定されたゲルマトリックス（Ｎｉｓｎｅｖｉｔｃｈ  Ｍ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅｒ  Ｍ，２００１；Ｈｕｓｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｈｏｒｅｎｓｔｅｉｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、具体的には、プロテインＡ若しくはプロテインＧなどの基質、又は合成基質に対する抗体の一般的な親和性によるもの（Ｖｅｒｄｏｌｉｖａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｒｏｑｕｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、並びに抗原又はエピトープ・ベースのアフィニティー・クロマトグラフィ（Ｍｕｒｒａｙ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｊｅｎｓｅｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）を活用できる。洗浄の後に、タンパク質は、ｐＨ又はイオン強度の変化によってゲルから溶出される。あるいは、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）が使用できる。溶出は、タンパク質精製のために一般的に用いられる水‐アセトニトリル・ベースの溶媒を使用することで行われ得る。
【００７０】
ＶＺＶに結合し、中和できると先に規定された抗体、抗体フラグメント、生理活性ペプチド、融合タンパク質、及びあらゆるその他の化合物が、ＶＺＶ感染を検出、治療、抑制、予防、及び／又は改善するために使用できる。この目的のために、前記化合物が、ＶＺＶ感染及びＶＺＶ関連疾患の医療管理のための診断用、治療用、又は予防用の組成物を調製するのに使用できる。
【００７１】
これらの組成物は、ヒトＤＤＦ−ＶＺＶ１及びＤＤＦ−ＶＺＶ２の配列と活性に基づいて先に規定された抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質、ＣＤＲ、及びあらゆるその他の化合物を含んで成る。前記組成物は、異なるＶＺＶ中和抗体若しくは抗体フラグメント、免疫グロブリン静注（ＩＶＩｇ）調製物、ステロイド、及び／又は抗ウイルス化合物をさらに含んで成る。異なるＶＺＶ中和抗体又は抗体フラグメントは、既に文献に記載されているものなどの異なるエピトープを特徴とするべきである。実際、文献には、ウイルス又はヒト標的に向けられた２種類以上の抗体が医薬組成物中で組み合わせられた場合に、得られた組成物が単なる相加効果ではなく、特定の相乗効果による改善された治療効果を有することができる多くの例が示されている（Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ  Ｔ，２００７）。
【００７２】
医薬組成物は、任意に、いずれかの医薬として許容されるビヒクル又は担体を含んで成る。これらの組成物は、ワクチン、免疫調節免疫グロブリン静注製剤、ステロイド、又は抗ウイルス化合物などのあらゆる追加の治療薬又は予防薬をさらに含んで成る（又はそれらと一緒に投与できる）。文献は、ＶＺＶ複製に作用し、且つ、単独又は免疫グロブリン静注調製物と組み合わせて、ヒトで既に試験されている前記化合物に関するいくつかの例を提供する（Ｈｕａｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｃａｒｂｙ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｋｏｒｅｎ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。そのうえ、最近の文献は、前記医薬組成物の頻度、及び／又は投薬量を低減する機会を与える、ヒト・モノクローナル抗体が免疫グロブリン静注調製物、ステロイド、及び／又は抗ウイルス化合物などの現在の治療を補う（可能であれば、置き換える）ために使用され得ることを示唆している（Ｂａｙｒｙ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００７３】
先に規定されたタンパク質（例えば、抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質、生理活性ペプチド）及び核酸のいずれかを含んで成る組成物は、ＶＺＶに関連した診断上、治療上、又は予防上の目的がある人に投与され得る。これらの組成物は、ＶＺＶビリオンをターゲッティングすることによって、治療された患者のウイルスの増殖を抑制できる、及び集団内でのウイルス感染の大発生を妨げる可能性のある治療用化合物（具体的には、治療抗体若しくは治療抗体フラグメント）を提供するＶＺＶ特異的な受動免疫のための手段として投与され得る。
【００７４】
特定の使用に依存して、組成物は、より長い又はより短い期間、（ＶＺＶに感染しているか、又は入院、免疫抑制薬若しくは化学療法剤治療、又はＶＺＶに感染した人との接触のためＶＺＶの危険性があると考えられるあらゆる幼児、妊婦、高齢者、又はその他の人である）ヒト対象に化合物を提供するべきである。この目的のために、組成物は、噴霧装置、吸入器によって、又は点眼薬として、非生分解性／生分解性基質物質中、あるいは、マイクロビーズなどの粒状薬物デリバリー・システムを使用して、様々な経路：筋肉内、静脈内、皮下、局所、粘膜を通じて、単回又は複数回の投薬量で、及び／又は適切なデバイスを使用して投与され得る。
【００７５】
具体的には、組成物は、皮膚及び眼におけるＶＺＶの存在を考慮すると、有用なアプローチである局所的投与及び眼内投与を可能にする（Ａｒｖｉｎ  Ａ，１９９６；Ｑｕｉｎｌｉｖａｎ  Ｍ  ａｎｄ  Ｂｒｅｕｅｒ  Ｊ，２００６；Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ  Ｔ，２００４）。そのうえ、抗体及び抗体フラグメントは、角膜に対して局所的に適用された場合に有効である（Ｂｒｅｒｅｔｏｎ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｎｗａｎｅｇｂｏ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００７６】
医薬組成物は、第二次ウイルス血症に関連する皮膚疹におけるウイルスの存在を考慮すると、化合物が、特に局所投与に関して、十分な期間その活性を発揮することを可能にする治療的又は予防的に有効量の化合物を対象に対して提供すべきである。望ましい効果は、ＶＺＶ感染、再活性化、及び／又は再感染を制御することによって、並びにＶＺＶ感染の臨床徴候の少なくともいくつかを低減することによって、患者の体質を改善することである。例えば、前記組成物は、投与経路、投与される投薬量の数、及びその人の体質によって、約０．００５〜約５０ｍｇ／ｋｇ／体重の有効量にて投与されるべきである。
【００７７】
診断用途のある組成物の場合、化合物は、生物学的サンプル中のウイルスを検出するための臨床検査室及び研究室において一般的に確立された技術（例えば、ＥＬＩＳＡ又はその他の血清学的なアッセイ）を使用して、又は生体内で対象に投与された場合には、投与後少なくとも１、２、５、１０、２４時間、又はそれより長い時間、検出されるべきである。ＶＺＶの検出は、免疫応答性宿主及び免疫不全宿主の両方から成る危険性のある集団における慢性又は急性ＶＺＶ感染を観察するために確立された公知の手段及び手順と置換して又は合わせて、本発明のタンパク質を使用して実施され得る。
【００７８】
本発明のタンパク質はまた、ＶＺＶ感染、並びにＶＺＶ関連疾患を検出、治療、抑制、予防、及び／又は改善するための組成物の調製にも使用できる。これらの疾患は、ＶＺＶ感染の合併症から生じる可能性がある（Ｄｗｏｒｋｉｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｊ，２００７）。
【００７９】
背景技術に示されているとおり、ヘルペス後神経痛の症例のように、劇的、且つ、衰弱させる効果を持つ可能性がある神経学的、眼性、又は臓器を冒す効果を持っている数多くの帯状ヘルペスの帯状ヘルペス合併症が存在する（Ｏｘｍａｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ  Ｔ，２００４）。そのうえ、ＶＺＶの再活性化及び関連する合併症はまた、癌患者（Ｓａｎｄｈｅｒｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）又は炎症性膠原病に罹患している患者、そして、通常、コルチコステロイドなどの免疫抑制治療、又は化学療法及びその他の抗体ベースの免疫抑制レジメン下にある患者においても見られた。
【００８０】
ＶＺＶ又はＶＺＶ関連疾患の治療、予防、又は診断方法は、先に規定されたタンパク質又は核酸の投与を含んで成る。前記方法は、異なるＶＺＶ中和抗体若しくは抗体フラグメント、免疫グロブリン静注（ＩＶＩｇ）調製物、ステロイド、及び／又は抗ウイルス化合物の投与をさらに含んで成る。
【００８１】
臨床開発及び使用は、抗体の薬物動態学及び薬力学の特徴づけ（Ｌｏｂｏ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、前臨床的及び臨床的安全性データ（Ｔａｂｒｉｚｉ  Ｍ  ａｎｄ  Ｒｉｓｋｏｓ  Ｌ，２００７）、並びに治療学用組み換え抗体の商業的な製造規模の製剤と分析的特徴づけのための公的な要件の順守（Ｈａｒｒｉｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）に基づくべきである。
【００８２】
どのような形であっても本発明を制限すると解釈されるべきでない以下の実施例によって、本発明は説明されるだろう。
【実施例】
【００８３】
実施例１：ＥＬＩＳＡによるヒトＦａｂｓ結合ＶＺＶタンパク質抽出物の発現と選別
材料と方法
ライブラリー構築
ヒトＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡを、文献に従ってＶＺＶ血清陽性個体から得られたリンパ球から入手した（Ｂｕｒｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；“Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｂｕｒｔｏｎ  ＤＲ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）。ファージ・ライブラリーを、ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ０７／００７１５４に記載の技術に従ってｐＤＤベクターと適合するクローニング・カセットを使用することで構築し、そして、Ｆａｂｓを、ライブラリーの中の組み換えファージ表面上に発現させた。
【００８４】
ｐＤＤベースのＦａｂライブラリーのパンニング、そして、陽性クローンの配列決定によるヒトＦａｂｓの選別を、文献に記載されたとおり実施した（Ｂｕｒｉｏｎｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。
【００８５】
特異的なＦａｂｓのＣＤＲｓを、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）によって提供された予測及び配列比較と、ヨーロッパ生物情報科学研究所によって提供されるもの及びＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｆａｓｔａ３３／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を使用して検索可能なものなどのヒト抗体のタンパク質配列を含む他のデータベースを比較することによって規定した。
【００８６】
培養ヒト細胞からのタンパク質抽出物の調製
ＶＺＶ分離及び増殖のために一般的に使用されるヒト胎児肺繊維芽細胞株である細胞株ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ受入番号ＣＣＬ−１７１）を、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーのパンニングのため、及びＥＬＩＳＡによりＦａｂｓを試験するために、ＶＺＶに特異的な物質の調製に使用した。ＭＲＣ−５細胞を、１０％の不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、５０μｇ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含む変法イーグル培地中で維持する。
【００８７】
細胞（ＶＺＶ感染又は未感染ＭＲＣ−５）を、掻き取り、そして、２５０ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０；１５０ｍＭのＮａＣｌ；０．０２％のアジ化ナトリウム；０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ）中に再懸濁し、氷上で２０分間インキューベートし、次に、４℃、１２０００ｒｐｍにて２分間遠心分離した。得られた上清のタンパク質濃度を、ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、二重反復試験で測定した。未知試料のタンパク質濃度を、測定し、そして、既知濃度（０ｍｇ／ｍｌ＝ブランク〜２．０００ｍｇ／ｍｌ＝最高値）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の段階希釈を基準にして報告した。すべてのサンプルの吸収度を、５４０ｎｍにセットした分光光度計を用いて計測した。
【００８８】
タンパク質抽出物を使用したパンニングとＥＬＩＳＡ
タンパク質コーティングを、以下の抗原：ＶＺＶ（ＥＬＬＥＮ菌株；ＡＴＣＣ受入番号ＶＲ−５８６）を感染させたＭＲＣ−５ヒト線維芽細胞の細胞溶解物；インフルエンザ・ウイルス抗原（Ｖｉｒｉｏｎ  Ｌｔｄ．）の市販調製物；未感染ＭＲＣ−５の細胞溶解物；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して、９６ウェル・プレート上に実施した。各サンプルを、炭酸バッファーで希釈し（１ウェルあたり２５□ｌの終量中に１００ナノグラムの総タンパク質）、そして、そのプレートを４℃にて一晩インキューベートした。蒸留水で洗浄した後、そのプレートを、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中、３７℃にて１時間のインキュベーションによってブロッキングした。
【００８９】
ＥＬＩＳＡを、文献中に開示されているプロトコールを使用し、以下のＦａｂｓ：ＤＤＦ−ＶＺＶ１、ＤＤＦ−ＶＺＶ２、及び調製された無関係なＦａｂであるｅ１３７、を含む４０□ｌの未希釈サンプルを使用して実施した（Ｂｕｇｌｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。前記Ｆａｂｓを、二重反復試験のウェル内で試験した。各Ｆａｂとの３７℃にて１時間のインキュベーション、そして、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、４０μｌのヤギ抗ヒトＦａｂを含むＰＢＳでの５回の洗浄の後に、ペルオキシダーゼ・コンジュゲート（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ａ０２９３）を、加え、そして、３７℃にて１時間インキューベートした。前述のとおりプレート洗浄を繰り返し、そして、４０μｌの基質（ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ；Ｐｉｅｒｃｅ）を各ウェルに加えることによって、酵素反応を進めた。ＥＬＩＳＡ反応を、３７℃にて１５分間進めた。酵素活性を、停止溶液（Ｈ２ＳＯ４）を加えることによって停止させ、そして、吸収度を、４５０ナノメートルにセットした分光光度計を用いて計測した。
【００９０】
ＥＬＩＳＡ及び中和アッセイのためのＦａｂ調製
プロトコールは、ｐＤＤ、又はｐＧｅｍ変異体などの他のファージミドを使用した文献に記載のものと同様であった（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９；Ｂｕｒｉｏｎｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｂｕｒｉｏｎｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；ＷＯ  ０７／００７１５４）。
【００９１】
簡単に言えば、ライブラリーの個々のＥ．コリ・クローンを、抗生物質を含む２００ｍｌのＳｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ；３．５％のバクト−トリプトン、２％の酵母抽出物、０．５％のＮａＣｌ）培地中で培養し、ＩＰＴＧを補い、集菌し、そして、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。制御パルスを用いて４℃にて超音波処理することによって、溶解を細胞膜周辺腔に限定した。周辺質抽出物中のＦａｂｓを、ＪＡ−１０ローターによる４℃、１２，０００ｒｐｍにて４５分間の超遠心分離によってある程度精製した。生成物を、濾過し、そして、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルタを用いて１０回濃縮した。
【００９２】
ある程度精製したＦａｂｓの濃度を、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ［Ｆ（ａｂ’）２］（Ｐｉｅｒｃｅ；カタログ番号３１１３２）を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって周辺質抽出物中で測定し、それを、９６ウェル・プレート（Ｃｏｓｔａｒ；カタログ番号３６９０）の表面上に結合させた。３７℃にて１時間のインキュベーションの後に、プレートを、脱イオン水で６回洗浄し、そして、３％のＢＳＡを含む１７０μｌ／ウェルのＰＢＳを使用してブロッキングした。３７°にて１時間のさらなるインキュベーションの後に、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中、それぞれのＦａｂ、又は既知濃度の対照ヒトＦａｂ（Ｃａｐｐｅｌ；カタログ番号６００１−０１００）の一連の３倍希釈物５０μｌを、各ウェルに加え、そして、３７℃にて１時間インキューベートした。次に、プレートを、ＴＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で６回洗浄した。次に、５０μｌのアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗ヒト抗体（Ｐｉｅｒｃｅ；カタログ番号３１３１２）を加え、そして、３７℃にて１時間インキューベートすることによって、抗体結合を測定した。プレート洗浄を、前述のとおりＴＰＢＳを用いて繰り返し、そして、１００μｌのｐ−ニトロフェニル・リン酸二ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに加えた。ＥＬＩＳＡ反応を６０分間進め、そして、結果を対照ヒトＦａｂに対してプロットした。
【００９３】
結果
組み換えファージに関するライブラリーを、ｐＤＤ技術（ＷＯ  ０７／００７１５４）によって作り出し、そして、ＶＺＶの臨床分離株を感染させたヒト線維芽細胞の細胞株から得られたタンパク質抽出物に対してパンニングした。５ラウンドのパンニングもまた、ＶＺＶに感染していない同じ細胞株からの対照タンパク質抽出物を使用することで、同じライブラリーを用いて平行して実施した。
【００９４】
第３ラウンドまでに、対照タンパク質抽出物に対してパンニングしたサンプルのファージ力価は１０４未満であり、その一方で、第３ラウンドにおいてＶＺＶ抽出物に対してパンニングしたサンプルのファージ力価は１０４より高く、第５ラウンドのときに１０５に達した。この値は、Ｆａｂｓ結合ＶＺＶ抗原をその表面上に発現する組み換えファージ内でのライブラリーの連続的な濃縮を実証している。
【００９５】
第５ラウンドのパンニング後に得られた２６０個を超えるクローンを、ＥＬＩＳＡにより個別に試験し、そして、それらの中の８６個を陽性と確認した。選択されるクローンにおけるＨＣＤＲ３のＰＣＲと配列分析では、ヒトＦａｂｓを特徴とする２個の重鎖を同定し、ここで、ＤＤＦ−ＶＺＶ１及びＤＤＦ−ＶＺＶ２と名付けた。ＤＤＦ−ＶＺＶ１又はＤＤＦ−ＶＺＶ２を発現する組み換えファージの反応性を、ＶＺＶ特異タンパク質抽出物に対して、並びに無関係な抗原（未感染細胞、ウシ血清アルブミン）に対して試験し、ＥＬＩＳＡフォーマットによりそれらの強い結合活性を確認した（図１）。結合の特異性もまた、選択されたＦａｂｓが全く有意な親和性を示さなかったインフルエンザ・ウイルス抗原を使用して確認した。
【００９６】
これらのＦａｂｓの完全な重鎖及び軽鎖可変領域のＤＮＡ配列を、ＤＤＦ−ＶＺＶ１及びＤＤＦ−ＶＺＶ２について、対応するＣＤＲｓと共に測定した（図２及び３）。また、タンパク質発現用のＥ．コリ・ベースのシステムを使用して、さらなるアッセイに十分な量の組み換えタンパク質を得るために、これらのＦａｂｓを他のベクター内に再クローニングした。
【００９７】
実施例２：ＶＺＶ感染細胞培養において試験したＤＤＦ−ＶＺＶ１とＤＤＦ−ＶＺＶ２の特性
材料と方法
ＶＺＶ特異的ヒトＦａｂｓの中和アッセイ
プラーク減少アッセイを、３７℃にて７２時間のインキュベーション後にコンフルエントな単層が通常形成される条件下でプレート内に植菌された１０４〜１０５個のＭＲＣ−５細胞を使用してＣｏｓｔａｒの２４ウェル・プレート内で実施した。使用されるＶＺＶウイルス株は、臨床分離株であった。
【００９８】
Ｆａｂｓを、実施例１に示したようにある程度精製し、そして、維持培地中に懸濁された等量のＶＺＶ無細胞ストック（ＥＬＬＥＮ菌株；感染多重度０．０１）と、様々な濃度（０．０１、０．１、１、１０、及び５０μｇ／ｍｌ）で混合した。対照を、Ｆａｂｓの不存在下（ブランク対照）、又はヒトＣ型肝炎ウイルスに特異的な無関係なＦａｂ（ｅ１３７；Ｂｕｇｌｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）の存在下、等量の維持培地とウイルスから構成した。
【００９９】
３７℃にて１時間のインキュベーション後に、２５０μｌのウイルス・フラグメントＦａｂ混合物又は対照混合物を、培地を取り除いたウェル内に（二重反復試験の状態に）植菌した。プレートを、３７℃にて２時間インキューベートして、未中和ウイルスを吸着させた。接種材料を取り除き、そして、１．５ｍｌの維持培地を加えた。細胞培養条件下、１週間のインキュベーション後に、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、エタノールを用いて室温にて１０分間固定し、そして、１％のクリスタル・バイオレット溶液で１０分間染色した。プレートを、蒸留水によって３回洗浄し、そして、溶解プラークをカウントした。それぞれのＦａｂの中和能力を、単一溶解プラークをカウントし、対照サンプルと比較したウイルス・プラーク・カウントの減少のパーセンテージについて計算することによって測定した。
【０１００】
それぞれのＦａｂの中和能力を、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって単一蛍光発光細胞をカウントし、そして、対照サンプルと比較してＶＺＶ陽性細胞数の減少のパーセンテージを計算することによって測定した。
【０１０１】
免疫蛍光分析
ＭＲＣ−５細胞を、無菌のガラス・カバーガラスを含むＣｏｓｔａｒの２４ウェル・プレート内で培養した。細胞培養が（通常、３７℃にて７日間のインキュベーション後に形成する）単層としてコンフルエントになったときに、以下のとおり、細胞にウイルス‐Ｆａｂ混合物又は対照混合物を感染させた。培地を取り除き、そして、細胞単層に、３７℃にて１時間のインキュベーションの間、指示濃度の半精製Ｆａｂｓと共にプレインキュベートしたＶＺＶ  Ｅｌｌｅｎ基準菌株を使用して高い感染多重度にて感染させた（２５０μｌ／ウェル；感染多重度０．１〜１）。対照を、Ｆａｂｓの不存在下（ブランク対照）、又はヒトＣ型肝炎ウイルス（ｅ８）に特異的な無関係なＦａｂの存在下、等量の維持培地とウイルスから構成した。前記プレートを３７℃にて２時間インキューベートし、未中和ウイルスを吸着させた。接種材料は取り除き、そして、２％のＦＢＳを含む１．５ｍｌのＭＥＭをそれぞれのウェルに入れた。
【０１０２】
免疫蛍光アッセイを、ＶＺＶ感染の７２時間後に実施した。培地を取り除いた後に、細胞単層を、ＰＢＳで１回洗浄し、そして、冷メタノール‐アセトン溶液（１：２の比率；−２０℃にて保存）中、室温にて１０分間固定した。固定細胞を、一次抗体としてのＤＤＦ−ＶＺＶ１又はＤＤＦ−ＶＺＶ２の調製物と共に湿潤大気中、３７℃にて３０分間インキューベートし、ＰＢＳで洗浄し、そして最後に、抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ特異的ＦＩＴＣ‐コンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）と共に湿潤大気中、３７℃にて３０分間インキューベートした。対照として、細胞を、製造業者の取扱説明書に従って使用される市販の抗ＶＺＶ抗体（Ａｒｇｅｎｅ；カタログ番号１１−０１７）と共に、二次ＦＩＴＣ標識抗体だけを使用することで調製した。
【０１０３】
さらに、サイトメガロウイルスを感染させたＭＲＣ−５細胞を、一次抗体としてＤＤＦ−ＶＺＶ１又はＤＤＦ−ＶＺＶ２の同じ調製物を使用して試験した。スライドを、エバンスブルーによって対比染色し、グリセロール・バッファーで封入し、そして最後に、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって観察した。
【０１０４】
結果
ＤＤＦ−ＶＺＶ１とＤＤＦ−ＶＺＶ２の両方に関する中和及び結合活性のさらなる分析を、ある程度精製したＦａｂｓの調製物を使用して実施した。
免疫蛍光では、感染細胞において核染色を示す市販のマウス・モノクローナル抗体と比較して、ＤＤＦ−ＶＺＶ１は、ＶＺＶビリオンが組み立てられる核（周辺）領域においてＶＺＶ感染細胞をより強く染色する。ＤＤＦ−ＶＺＶ２は、細胞質領域においてＶＺＶ感染細胞をより強く染色する（図４）。一次抗体の不存在下において、あるいは、感染させなかった、又はサイトメガロウイルスを感染させたＭＲＣ−５細胞に対するＤＤＦ−ＶＺＶ１及びＤＤＦ−ＶＺＶ２の使用において、染色は観察されなかった。これらのデータはまた、一時的に培養し、その後、免疫蛍光で観察した、ＶＺＶに感染している人の皮膚から得られた細胞に対して実施した免疫蛍光によっても確認された。
【０１０５】
プラーク減少に関するデータは、ＶＺＶとプレインキュベートした場合に、ＤＤＦ−ＶＺＶ１及びＤＤＦ−ＶＺＶ２が強力な中和活性を与えられることを示している。実際、対照（Ｆａｂを伴わない、又は無関係なＦａｂを伴ったＶＺＶ）と比較すると、これらのＦａｂｓの添加は、用量依存的様式でのプラーク形成の減少を引き起こす（図５）。
【０１０６】
実施例３：ｐＤＤ適合発現ベクターを使用したＤＤＦ−ＶＺＶ１及びＤＤＦ−ＶＺＶ２の製造とバリデーション
材料と方法
ｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓベクターの設計と構築
ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎｅ）遺伝子がマーカー遺伝子として使用されるＤＤｂカセット（ＷＯ０７／００７１５４）を含むｐＤＤベクターを、ｃｐ３＊配列を含んでいるＳｐｅＩ−ＮｈｅＩフラグメントを、２つのタグと終止コドンを含んでいるＮｈｅＩ−ＳｐｅＩ合成リンカーで置換することによって修飾した。前述のリンカーを、２つのオリゴヌクレオチド（配列番号１５及び１６）をアニーリングすることによって作り出した。得られた二本鎖ＤＮＡ分子を、ＳｐｅＩとＮｈｅＩで消化し、そして、対応する線状化ｐＤＤベクター内へのクローニング・ステップに備えた。２つのタグ配列のインフレーム挿入を確認するために、最終的なベクターを、制限分析と配列分析によって特徴づけした。ＬａｃＩ遺伝子を、ｐＥＴ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）という市販のプラスミドからＰＣＲ増幅し、そして次に、ゼオシン遺伝子と、ＦＬＡＧｈｉｓタグに融合されるべきタンパク質の発現を駆動するＬａｃＺプロモーターの間のＳｔｕＩ部位に挿入した。
【０１０７】
ＰＣＲ反応を、ＤＮＡ鋳型（２０〜３０ｎｇ）、市販のＰＣＲバッファー（１×；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、プライマー（０．２μＭ）、ｄＮＴＰ（０．２５ｍＭ）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．２５単位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び水（５０μｌの終量まで）を含む混合物を使用して実施した。その反応を、サーマル・サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により、以下のとおり実施した：９４℃にて５分間、そして、９４℃にて３０秒、５０〜５５℃にて３０秒間、７２℃にて１分間を３０サイクル。部位特異的突然変異誘発ＰＣＲ法を、Ｐｆｕ融合Ｔａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、先に説明したのと同じ増幅条件で実施した。制限酵素を用いたＤＮＡの消化を、製造業者の取扱説明書（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に従って実施した。バクテリオファージＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を、適切なベクター内への調製したＤＮＡフラグメントの連結反応に使用した。ベクター：挿入ＤＮＡのモル比は１：３であり、そして、ＤＮＡの総濃度は約５０ｎｇであった。連結反応を、以下のとおり２０μｌ中で実施した：ＤＮＡ（５０ｎｇ）、連結反応バッファー（１×）、１０ｍＭのＡＴＰ（１μｌ）、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（４単位）、及び水（２０μｌまで）。Ｔ４連結反応を、１５℃にて一晩実施した。ＴＧ１又はＸＬ−１  Ｂｌｕｅエシェリキア・コリ・コンピテント細胞を、ＣａＣｌ２プロトコールを使用して調製し、そして、ｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓベクターを含む連結反応混合物で形質転換した。
【０１０８】
ＤＤＦ−ＶＺＶ１とＤＤＦ−ＶＺＶ２の重鎖及び軽鎖をコードする配列を、適切な制限部位を使用することでｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓ内にクローンニングした。最終的なベクター（ｐＤＬａｃ−ＶＺＶ１−ＦＬＡＧｈｉｓとｐＤＬａｃ−ＶＺＶ２−ＦＬＡＧｈｉｓ）を、２つの抗体配列のインフレーム挿入を確認するために、制限分析及び配列分析によって特徴づけした。
【０１０９】
ＦＬＡＧｈｉｓタグ付与ＤＤＦ−ＶＺＶ１及びＤＤＦ−ＶＺＶ２の発現、精製、及び検出
Ｅ．コリＸＬ−１  Ｂｌｕｅを、ｐＤＬａｃ−ＶＺＶ１−ＦＬＡＧｈｉｓ、ｐＤＬａｃ−ＶＺＶ２−ＦＬＡＧｈｉｓ、又はｅ５０９を発現するｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓ変異体、対照として使用されるＨＣＶ特異的Ｆａｂ（Ｂｕｇｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）で形質転換した。
【０１１０】
得られた菌株を、細菌培養によるＦａｂｓの製造に使用した。このために、形質転換から得られた単一コロニーを、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、及びゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）（５０μｇ／ｍｌ）を含む１０ｍｌのＳＢ培地中に植菌した。細菌を、３７℃にて１２時間増殖させた。インキュベーション時間の後に、５００μｌのそれらを、同じ抗生物質を補った１００ｍＬのＳＢで希釈し、０．６のＯＤに達するまで６〜８時間増殖させた。イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、１ｍＭの終濃度まで加え、そして、細胞を、ロータリー振盪機により３０℃にてさらに１４時間インキューベートした。細菌を、５０００ｇにて２０分間の遠心分離によって集菌し、１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、そして、凍結‐融解手順（−８０℃及び３７℃にて３ステップ）で溶解させた。細胞破片を、微量遠心管による１５，０００ｇ、室温にて５分間の遠心分離によって取り除いた。
【０１１１】
Ｆａｂ発現を確認するために、上清を、抗Ｆａｂ及び抗Ｈｉｓ抗体検出を用いたウエスタン・ブロット分析に使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、β−メルカプトエタノールを含む又は含まない（還元又は非還元条件）サンプルを添加して作製し、次に、ブロッティングを３５０ｍＡにて２時間実施した；ニトロセルロース紙を、存在するブロッティングを確認するためにＰｏｎｃｅａｕｓ  Ｒｅｄで最初に染色し、次に、それを１０％のミルク／ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ０．１％（ブロッキング溶液）と共に４℃にて一晩撹拌した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ０．１％で１回洗浄した後に、前記ニトロセルロースを、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗Ｆａｂ抗体（Ｓｉｇｍａ）又はＨＲＰコンジュゲート抗Ｈｉｓ−タグ抗体（Ｒｏｃｈｅ）と共に撹拌しながら室温で１時間インキューベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ０．１％で３回洗浄した後に、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、そして、フィルムを、それぞれ３０秒、１、及び５分間現像した。
【０１１２】
抗Ｆａｂを用いて検出したシグナルを、抗Ｈｉｓ  ＨＲＰコンジュゲート検出と比較した。それらの両方が、（浄化した細胞抽出物を非還元条件を使用したゲルに泳動したとき）Ｆａｂフラグメントの天然型に対応する〜６０ｋＤａの主要なバンドを明らかにした。同じサンプルを還元条件を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したとき、抗Ｈｉｓ抗体を使用した場合に、重鎖（〜２５ｋＤａ）だけが存在した。抗Ｆａｂを用いた検出では、タグを付与されていなかったので検出できなかった軽鎖の存在を明らかにした。
【０１１３】
ＦＬＡＧｈｉｓタグ付与ｆａｂｓのより大規模な製造において、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）、及びゼオシン（５０ｕｇ／ｍｌ）を含むスーパー・ブロス（ｓｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈ）の１リットル・アリコートに、特定のｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓベクターで形質転換した細菌コロニー１つを植菌し、ロータリー振盪機内で３７℃にて７時間培養し、示したようにＩＰＴＧで誘導し、そして、３０℃にて一晩培養した。細胞を、遠心分離によって集菌し、２５ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、そして、超音波処理した。細胞破片を、遠心分離（１５，０００ｇにて５０分間）によって除去し、そして、０．２２μｍで濾過した上清をＩＭＡＣによって精製した。標準的なＱｉａｇｅｎ精製プロトコールに従った：ＮｉＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を結合バッファー溶液（リン酸緩衝液、１０ｍＭのイミダゾール）で平衡化し、次に、濾過した上清をその樹脂と混合し（３００μＬの樹脂／１００ｍＬの培養物）、そして、４℃にて１時間撹拌した。この溶液を、４００ｇにて５分間遠心分離して、樹脂に連結したＦａｂフラグメントを回収し、そして、流れ出た物を収集した。その樹脂を、５倍量の結合バッファー１０ｍＭイミダゾールで洗浄して、非特異的結合を除去した。ＨｉｓフラグＦａｂフラグメントを、３倍量の溶出緩衝液（リン酸緩衝液、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール）で溶出した。溶出したアリコートを、ＳＤＳ／１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、そして、クマシー・ブリリアントブルー染色及びウエスタン・ブロットで検出した。
【０１１４】
結果
ＤＤＦ−ＶＺＶ１及びＤＤＦ−ＶＺＶ２の活性を、最初、ある程度精製したＦａｂｓ及び組み換えファージとして試験した。さらなるバリデーションには、このような抗体フラグメントを適切な細菌発現系を使用した精製された組み換えタンパク質の形態で試験する必要がある。
【０１１５】
着目のＦａｂを持つファージミドは、可溶性分子の産生のために好適な発現ベクター、及び／又は適切な菌株（例えば、アンバー非サプレッサー（ａｍｂｅｒ  ｎｏｎ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ））に通常移される。分子クローニングのこのような手間がかかったステップを避ける目的で、より効果的なアプローチは、前記Ｆａｂｓを同定するのに使用した元々のｐＤＤベクター内のものと適合する制限部位を持つ発現ベクターを製造することだろう。そのうえ、タグ配列の存在は、より簡単なＦａｂの精製及び検出を可能にするだろう。
【０１１６】
ｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓと名付けたこのような発現ベクターを、設計し、そして、構築した。それは、ｃｐ３＊のコード配列を、終止コドンが後に続く２つのタンパク質タグ（８つのアミノ酸を含むＦＬＡＧペプチド、及び６−ヒスチジン・タグ）をコードする配列で置換したｐＤＤベクターに基づいている（図６Ａ）。ヒスチジン・タグは、例えば、ＩＭＡＣ（固定金属アフィニティー・クロマトグラフィー）精製システムを使用したアフィニティー・クロマトグラフィーによってＦａｂを精製することを可能にする。ＦＬＡＧタグは、（ＥＬＩＳＡなどの）検出アッセイにおいて非常に有用であるかもしれない。これらの２つのタグがクローンニングされ、そして、組み換えタンパク質に融合されたベクター、おまけに、ＦＬＡＧｈｉｓタグ付与タンパク質を検出又は精製する手段が、文献に記載されていた（Ｐａｇｎｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｋｏｉｖｕｎｅｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｋｏｍａｔｓｕ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０１１７】
最初に同定され、そして、ｐＤＤファージミドを使用して特徴づけられたＦａｂ（又は、いずれかのその他タンパク質配列）は、その後、ｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓベクター内に一方向性にクローンニングされるＤＤカセットを使用することで抽出できる。このように、元々コート・タンパク質に融合していた配列が、ここで、ＦＬＡＧタグ及びポリヒスチジン・タグと共にＣ末端にてフレーム内にクローンニングされる。得られたベクターは、ＤＤカセット内に本来のマーカー遺伝子（例えば、ゼオシン遺伝子）を含み、所望の挿入物を含むベクターの選択を可能にする。ｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓベクター内のＬａｃＺプロモーターを使用して発現されるべきタンパク質の転写を制御するための手段として、ＬａｃＩ遺伝子を本来のＤＤカセット内に挿入した（図６Ｂ）。
【０１１８】
このクローニング・ストラテジーは、２つの利点をもたらした。第１の利点は、起こり得る相同組み換えを回避する、本来のＤＤカセット内の２つのＬａｃＺプロモーター領域の間の空間を増やすことである。第２に、オペレーター領域にそれが結合することによりＬａｃＺプロモーターを遮断して、発現系を下方制御できることが知られているＬａｃＩ遺伝子からのリプレッサー・タンパク質である。そして、誘導は、適切な濃度のＩＰＴＧ、及び／又はグルコースを使用して調整される。誘導により、ＬａｃＺプロモーターの制御下にクローンニングされた配列／ＰｅｌＢシグナル配列の両方が、発現され、そして、ｐｅｌＢ配列が酵素シグナル・ペプチダーゼによってそれに続いて切断されるところの周辺質に向けられる。周辺質内では、適切な酸化条件が、組み換えタンパク質内のジスルフィド結合の形成、及び正しいタンパク質の折り畳みを可能にする（例えば、ヘテロ二量体タンパク質に組み立てられるＦａｂの軽鎖及び重鎖）。アフィニティー・クロマトグラフィーのカラムを溶出し、そして、試験することによって、ＦＬＡＧｈｉｓタグ付与タンパク質を均質にまで精製できる（図６Ｂ）。次に、このタンパク質を、例えば、（Ｓｉｇｍａから入手可能な）市販の抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を使用したウエスタン・ブロット又は免疫蛍光により同定できる。
【０１１９】
このアプローチを使用して、ＤＤＦ−ＶＺＶ１及びＤＤＦ−ＶＺＶ２（図７）の、並びに対照ｆａｂのＦＬＡＧｈｉｓタグ付与バージョンを、製造し、そして、先に記載したアッセイにより試験した。選択したＦａｂｓのこれらの組み換え変異体で、２μｇ／ｍｌ前後のＩＣ５０を示す、ＶＺＶ中和活性に関する本来の観察結果を確認した（図８Ａ）。しかしながら、２つのＦａｂｓが１つの調製物に組み合わせられるとき、この調製物のＶＺＶ中和活性は、同量の単独のＦａｂを含む調製物より優れた結果となった。実際、Ｆａｂ濃度が１〜２μｇ／ｍｌに達するときに、単独のＦａｂを含む調製物がその活性を１０〜１５％増強する場合に、１μｇ／ｍｌのＤＤＦ−ＶＺＶ１と１μｇ／ｍｌのＤＤＦ−ＶＺＶ１を含む調製物は、２μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値を有するはるかに高いＶＺＶ中和活性を有する（図８Ｂ）。この効果は、おそらく、２つのＦａｂｓによって認識される異なるＶＺＶ特異的エピトープのためであり（図４を参照のこと）、ＤＤＦ−ＶＺＶ１とＤＤＦ−ＶＺＶ２（同様の特性を有する２つの抗体又は抗体フラグメント）を含む医薬組成物が、ＶＺＶ感染及びＶＺＶ関連疾患に対してより良好な治療効果又は予防効果をもたらし得ることを示唆している。
【０１２０】
ここに提示した実験的証拠が、ＶＺＶ感染及びＶＺＶ関連疾患に関係する診断上の、治療上の、又は予防上の適用のためのＤＤＦ−ＶＺＶ１及びＤＤＦ−ＶＺＶ２（又はそれらの特異的なＨＣＤＲ３ｓに基づき、且つ、同様の特性を示す代替タンパク質配列）候補化合物をもたらす。
【０１２１】
参考文献
【０１２２】
【化１】
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【０１２３】
【化２】
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【０１２４】
【化３】
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【０１２５】
【化４】
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【０１２６】
【化５】
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【図１】
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【図２Ａ）】
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【図２Ｂ）】
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【図３Ａ）】
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【図３Ｂ）】
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【図４Ａ）】
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【図４Ｂ）】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ）】
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【図７Ｂ）】
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【図７Ｃ）】
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【図７Ｄ）】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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