(57)【要約】  抗体で処理されている哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１及び／又はＩＧＦ−２の結合を阻害するための抗体の阻害活性を評価するための方法であって、該ＰＢＬのＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルが、該抗体の阻害活性の指標として測定されることを特徴とする、方法。
2010517024.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相免疫アッセイにより試料中のＩＧＦ−１Ｒを測定するための方法であって、該試料が溶解した哺乳類の末梢血リンパ球の調製物（溶解ＰＢＬ試料）であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記哺乳類がヒト又は類人猿であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルが、前記哺乳類に投与されたＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の生体内活性の指標として測定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体で処理された哺乳類におけるＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の生体内活性の評価のための方法であって、前記哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルが前記抗体の生体内活性の指標として測定されることを特徴とする方法。
【請求項５】
前記抗体で処理された哺乳類におけるＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の薬力学的又は薬物動態学的な特性を予測するための方法であって、前記哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルが前記予測の指標として測定されることを特徴とする方法。
【請求項６】
ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体を投与された患者における臨床転帰を予測するため、あるいは治療方針を決定するための方法であって、前記患者の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルを最初に測定し、該タンパク質レベルと次に測定したレベルを比較する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
採血時期が、投与前、投与中及び／又は投与後のいずれかであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルがＥＬＩＳＡにより測定される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
使用される一次抗体及び二次抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに対する異なるエピトープに結合する２つのモノクローナル抗体であるか、あるいはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＩＧＦ−１Ｒに対する三次抗体の生体内活性の評価のための免疫アッセイを製造するためのＩＧＦ−１Ｒに対する一次抗体及び二次抗体の使用であって、ここで哺乳類が前記三次抗体で処理されており、前記哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルが前記三次抗体の生体内活性の指標として測定されることを特徴とする使用。
【請求項１１】
三次抗体で処理された哺乳類におけるＩＧＦ−１Ｒに対する三次抗体の薬力学的又は薬物動態学的な特性を予測するための免疫アッセイの製造のためのＩＧＦ−１Ｒに対する一次抗体及び二次抗体の使用であって、前記哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルが前記予測の指標として測定されることを特徴とする使用。
【請求項１２】
哺乳類における臨床転帰を予測するため、又は治療方針を決定するための免疫アッセイの製造のためのＩＧＦ−１Ｒに対する一次抗体及び二次抗体の使用であって、ここで三次抗体が患者に投与され、前記哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルを最初に測定し、該タンパク質レベルと次に測定したレベルを比較する工程を含むことを特徴とする使用。
【請求項１３】
採血時期が、三次抗体の投与前、投与中及び／又は投与後のいずれかであることを特徴とする、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記免疫アッセイにおいて使用される抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに対する異なるエピトープに結合する２つのモノクローナル抗体であるか、あるいはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に対する抗体の阻害活性の評価方法、かかる抗体の薬力学的又は薬物動態学的な特性を予測する方法、及びかかる抗体が投与される患者の治療方針の臨床転帰を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＣ２．７．１１２、ＣＤ２２１抗原）は、膜貫通タンパク質チロシンキナーゼのファミリーに属する (LeRoith, D., et al., Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163; and Adams, T.E., et al., Cell. MoI. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093)。ＩＧＦ−１Ｒは高い親和性を伴いＩＧＦ−１と結合し、そして生体内において該リガンドに対する生理学的応答を開始する。ＩＧＦ−１ＲはＩＧＦ−２にも結合するが、その親和性は僅かに低いものである。ＩＧＦ−１Ｒの過剰発現は細胞の悪性形質転換を促進し、ＩＧＦ−１Ｒが細胞の悪性転換に関連する証拠も存在するため、癌治療の治療剤の開発のための有用な標的となる(Adams, T. E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093)。インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−１）は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の重要なマイトジェンである。ＩＧＦ−１受容体は２つの架橋性細胞外α鎖とチロシンキナーゼドメインを含有する２つの膜貫通性β鎖から構成されるヘテロ四量体である。これはインスリン受容体（ＩＲ）と高い配列類似性を有し、推定されるリガンド特異的結合部位はα鎖のシステインリッチ領域（ＣＲＲ）に存在するとされている(Adams, T. E., et al., Cell. MoI. Life Sci 57 (2000) 1050-1093)。
【０００３】
当業界においてＩＧＦ−１Ｒに対する抗体は周知であり、試験管内又は生体内においてこれらの抗腫瘍効果が調査されている(Benini, S., et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001) 1790-1797; Scotlandi, K., et al., Cancer Gene Ther. 9 (2002) 296-307; Scotlandi, K., et al., Int. J. Cancer 101 (2002) 11-16; Brunetti, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989) 212-218; Prigent, S.A., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 9970-9977; Li, S.L., et al., Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243- 252; Pessino, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 1236-1243; Surinya, K.H., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 16718-16725; Soos, M.A., et al., J. Biol. Chem., 267 (1992) 12955-12963; Soos, M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 5217-5221; O'Brien, R.M., et al., EMBO J. 6 (1987) 4003-4010; Taylor, R., et al., Biochem. J. 242 (1987) 123-129; Soos, M.A., et al., Biochem. J. 235 (1986) 199-208; Li, S.L., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (1993) 92-98; Delafontaine, P., et al., J. MoI. Cell. Cardiol. 26 (1994) 1659-1673; KuIl, F.C. Jr., et al., J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566; Morgan, D.O., and Roth, R.A., Biochemistry 25 (1986) 1364-1371; Forsayeth, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 3448-3451; Schaefer, E.M., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 13248-13253; Gustafson, T.A., and Rutter, W.J., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667; Hoyne, P.A., et al., FEBS Lett. 469 (2000) 57-60; Tulloch, P.A., et al., J. Struct. Biol. 125 (1999) 11-18; Rohlik, Q.T., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 149 (1987) 276- 281; and Kalebic, T., et al., Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534; Adams, T. E., et al., Cell. MoI. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093; Dricu, A., et al., Glycobiology 9 (1999) 571-579; Kanter-Lewensohn, L., et al., Melanoma Res. 8 (1998) 389-397; Li, S.L., et al., Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252)。またIGF-IRに対する抗体は多くの文献、例えば、Arteaga, C.L., et al., Breast Cancer Res. Treatment 22 (1992) 101-106; 及び Hailey, J., et al., Mol. Cancer Ther. 1 (2002) 1349-1353）に記載されている。
【０００４】
特に、αＩＲ３と称されるＩＧＦ−１Ｒに対するモノクローナル抗体は、ＩＧＦ−１Ｒが介するプロセス及びＩＧＦ−１Ｒが介する疾患、例えば癌の研究において広く使用されている。α−ＩＲ−３は KuIl, F.C, J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566に記載されている。一方、抗腫瘍効果に関してαＩＲ３単独、又は細胞増殖抑制剤、例えばドキソルビシン及びビンクリスチンとの併用における研究及び治療的使用に関してはおよそ１００の刊行物が出版されている。αＩＲ３はＩＧＦ−１のＩＧＦ受容体に対する結合を阻害するが、ＩＧＦ−２のＩＧＦ−１Ｒに対する結合は阻害しないことが知られるマウスモノクローナル抗体である。αＩＲ３は高濃度において腫瘍細胞増殖及びＩＧＦ−１Ｒリン酸化を刺激する(Bergmann, U., et al., Cancer Res. 55 (1995) 2007-2011; Kato, H., et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 2655-2661)。ＩＧＦ−１結合よりも強くＩＧＦ−２のＩＧＦ−１Ｒに対する結合を阻害するほかの抗体も存在する。抗体ならびにこれらの特性及び特徴の先行技術についての概要は、Adams, T. E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093 に記載されている。
【０００５】
先行技術に記載されるほとんどの抗体はマウス起源である。このような抗体は、先行技術において周知であるように、キメラ化又はヒト化等の更なる改変なしではヒトの患者の治療には有用ではない。これらの欠点によって、ヒト患者の治療における治療剤としては明らかにヒト抗体が好ましい。ヒト抗体は当業界において周知である(van Dijk, M.A., and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374)。このような技術に基づき、極めて多様な標的に対するヒト抗体を産生することができる。ＩＧＦ−１Ｒに対するキメラ、ヒト化及びヒト治療用抗体は、ＵＳ２００５／００８４９０６、ＷＯ２００５／０５８９６７、ＷＯ２００６／０１３４７２、ＵＳ２００３／０１６５５０２、ＷＯ２００５／０８２４１５、ＷＯ２００５／０１６９７０、ＷＯ０３／１０６６２１、ＷＯ０４／０８３２４８、ＷＯ２００３／１００００８、ＷＯ２００４／０８７７５６、ＷＯ２００５／００５６３５及びＷＯ２００５／０９４３７６に言及されている。
【０００６】
モノクローナル抗体による標準的な固相免疫アッセイは、固相上に吸着した抗体、抗原、及び酵素に接合した抗原のほかのエピトープに対する抗体（トレーサー抗体）における複合体の形成に関する。したがって、固相−捕捉抗体−抗原−トレーサー抗体のサンドイッチが形成される。このサンドイッチにより触媒される反応において、抗体接合酵素の活性はインキュベーション媒体における抗原濃度に比例する。標準的なサンドイッチ法は捕捉抗体及びとレーサー抗体が抗原の異なるエピトープに結合することから二重抗原ブリッジング免疫アッセイとも称される。
【０００７】
本発明は、インスリン様成長因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に対する抗体の阻害活性の評価方法、かかる抗体の薬力学的又は薬物動態学的な特性を予測する方法、及びかかる抗体が投与された患者の治療方針の臨床転帰を予測する方法に関する。ＩＧＦ−１Ｒの測定のためのアッセイは当業界において周知であるが（例えば、ＷＯ０２／０５３５９６、ＷＯ２００４／０８７７５６及びＷＯ２００５／００５６３５）、試料としてＩＧＦ−１Ｒ過剰発現細胞（３Ｔ３細胞）が使用されており、測定はフローサイトメトリーにより行われる(Cohen, B.D., Clin. Cancer Res. 11 (2005) 2063-2073)。
【０００８】
ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体による患者の治療における薬力学的又は薬物動態学的結果を測定及びモニタリングする必要がある。このような測定及びモニタリングは、例えば、腫瘍バイオプシー中のＩＧＦ−１Ｒ発現レベルを測定するか(Kornprat, P., J. Clin. Path. 59 (2006) 202-206)、あるいはＩＧＦ−１Ｒリン酸化状態を測定することにより行うことができる(Chen, J.W., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284 (2003) e1149-e1155)。また、患者におけるＩＧＦ−１Ｒ減少を測定することも示唆されている(Cohen, B.D., Clin. Cancer Res. 11 (2005) 2063-2073)。フローサイトメトリーによりモニターしたところ、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の血液の生体外処理はヒト末梢血液単核細胞においてＩＧＦ−１Ｒの下方制御をもたらした。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、固相免疫アッセイにより試料中のＩＧＦ−１Ｒを測定するための方法であって、該試料が溶解した哺乳類の末梢血リンパ球の調製物（溶解ＰＢＬ試料）であることを特徴とする方法を含む。このような試料は、さらに「溶解ＰＢＬ試料」又は「溶解ＰＢＬ」として表される。哺乳類は好ましくはヒト又は類人猿（ape)である。
【００１０】
ＰＢＬにおけるＩＧＦ−１Ｒ発現の範囲は２５０〜２，３００分子であるが(Cohen, B.D., Clin. Cancer Res. 11 (2005) 2063-2073)、本発明の固相免疫アッセイによって溶解ＰＢＬにおけるＩＧＦ−１Ｒを測定することが可能となる、という驚くべき知見が得られた。
【００１１】
本発明は、前記ＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルが前記哺乳類に投与されたＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の生体内活性の指標として測定されることを特徴とする方法を含む。
【００１２】
本発明は、前記抗体で処理された哺乳類におけるＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の生体内活性を評価するための方法であって、前記哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルが前記抗体の生体内活性の指標として測定されることを特徴とする方法を含む。
【００１３】
本発明は、前記抗体で処理された哺乳類におけるＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の薬力学的又は薬物動態学的な特性を予測するための方法であって、前記哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルが前記予測の指標として測定されることを特徴とする方法を含む。
【００１４】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体を投与された患者における臨床転帰を予測するため、あるいは治療方針を決定するための方法であって、前記患者の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルを最初に測定し、該タンパク質レベルと次に測定したレベルを比較する工程を含むことを特徴とする方法を含む。
【００１５】
本発明は、採血時期が、投与前、投与中及び／又は投与後のいずれかであることを特徴とする方法を含む。
【００１６】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルがＥＬＩＳＡにより測定されることを特徴とする方法を含む。
【００１７】
本発明は、ＥＬＩＳＡにおいて使用される一次抗体及び二次抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに対する異なるエピトープに結合する２つのモノクローナル抗体であるか、あるいはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体であることを特徴とする方法を含む。
【００１８】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに対する三次抗体の生体内活性の評価のための免疫アッセイを製造するためのＩＧＦ−１Ｒに対する一次抗体及び二次抗体の使用であって、ここで哺乳類が前記三次抗体で処理されており、前記哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルが前記三次抗体の生体内活性の指標として測定されることを特徴とする使用を含む。
【００１９】
本発明は、三次抗体で処理された哺乳類におけるＩＧＦ−１Ｒに対する三次抗体の薬力学的又は薬物動態学的な特性を予測するための免疫アッセイの製造のためのＩＧＦ−１Ｒに対する一次抗体及び二次抗体の使用であって、前記哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルが前記予測の指標として測定されることを特徴とする使用を含む。
【００２０】
本発明は、哺乳類における臨床転帰を予測するため、又は治療方針を決定するための免疫アッセイの製造のためのＩＧＦ−１Ｒに対する一次抗体及び二次抗体の使用であって、ここで三次抗体が患者に投与され、前記哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルを最初に測定し、該タンパク質レベルと次に測定したレベルを比較する工程を含むことを特徴とする使用を含む。
【００２１】
本発明は、採血時期が、三次抗体の投与前、投与中及び／又は投与後のいずれかであることを特徴とする使用を含む。
【００２２】
本発明は、前記免疫アッセイ、好ましくはＥＬＩＳＡにおいて使用される抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに対する異なるエピトープに結合する２つのモノクローナル抗体であるか、あるいはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体であることを特徴とする使用を含む。
【００２３】
本発明は、哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒを測定するための方法であって、前記ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルが、好ましくは前記哺乳類に投与されたＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の生体内活性の指標として測定されることを特徴とする方法を含む。
【００２４】
本発明は、哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の生体内活性を評価するための方法であって、前記哺乳類が前記抗体で処理されており、前記ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルが、前記抗体の生体内活性の指標として測定されることを特徴とする方法を含む。
【００２５】
本発明は、前記抗体で処理された哺乳類におけるＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の生体内活性を評価するための方法であって、前記処理された哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルを前記抗体の生体内活性の指標として測定することを特徴とする方法を含む。
【００２６】
本発明はさらに、前記抗体で処理された哺乳類におけるＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の薬力学的又は薬物動態学的な特性を予測するための方法であって、前記哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルが前記予測の指標として測定されることを特徴とする方法を含む。
【００２７】
本発明はさらに、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体を投与された患者における臨床転帰を予測するため、あるいは治療方針を決定するための方法であって、前記患者の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルを最初に測定し、該タンパク質レベルと次に測定したレベルを比較する工程を含むことを特徴とする方法を含む。採血時期は、投与前、投与中及び／又は投与後のいずれかである。
【００２８】
これらのすべての方法は哺乳類の外部において行われ、ＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルは試験管内で測定される。
【００２９】
好ましくは、ＰＢＬは、測定方法が行われる前に、通常Ficoll勾配を使用する遠心分離により試料、好ましくは軟膜から単離される。本発明の方法のための試料は、好ましくは１０6〜１０8ＰＢＬ細胞／２５０μｌとして使用される。溶解は、例えばアルキルアリールポリエーテルアルコール、例えばオクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトン（登録商標）Ｘ−１００）又はＣＨＡＰＳ（例えば１％（ｖ／ｖ））の使用により行われる。
【００３０】
本発明はさらに、ＩＧＦ−１Ｒに対する三次抗体の生体内活性の評価のための免疫アッセイを製造するためのＩＧＦ−１Ｒに対する一次抗体及び二次抗体の使用であって、ここで哺乳類が前記三次抗体で処理されており、前記哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルが前記三次抗体の生体内活性の指標として測定されることを特徴とする使用を含む。
【００３１】
本発明はさらに、三次抗体で処理された哺乳類におけるＩＧＦ−１Ｒに対する三次抗体の薬力学的又は薬物動態学的な特性を予測するための免疫アッセイの製造のためのＩＧＦ−１Ｒに対する一次抗体及び二次抗体の使用であって、前記哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルが前記予測の指標として測定されることを特徴とする使用を含む。
【００３２】
本発明はさらに、哺乳類における臨床転帰を予測するため、又は治療方針を決定するための免疫アッセイの製造のためのＩＧＦ−１Ｒに対する一次抗体及び二次抗体の使用であって、ここで三次抗体が患者に投与され、前記哺乳類の溶解ＰＢＬ試料中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルを最初に測定し、該タンパク質レベルと次に測定したレベルを比較する工程を含むことを特徴とする使用を含む。
【００３３】
本発明の測定方法において使用することができる抗体は、異なるエピトープに結合する２つのモノクローナル抗体、又はモノクローナル抗体とポリクローナル抗体である。一次抗体は固定化され、そして二次抗体は検出抗体であり、検出可能な標識を含有する。
【００３４】
本発明に使用することができる抗体は、ヒトＩＧＦ−１Ｒ(EC 2.7.1.112, SwissProt P08069)に結合し、そして好ましくは該受容体のα鎖に結合する。本発明に有用なこのようなモノクローナル抗体は、例えばＷＯ２００４／０８７７５６及びＷＯ２００５／００５６３５に記載されている。このような抗体はまた、三次（治療）抗体としても有用である。
【００３５】
有用なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germanyに寄託した。
【００３６】
【表１】
2010517024.tif 000003
【００３７】
本発明のために使用することができる抗体は、さらに１０-8Ｍ（ＫD）又はそれ以下のＩＧＦ−１Ｒに対する親和性、好ましくは１０-9Ｍ、そしてより好ましくは約１０-10〜１０-13Ｍの親和性により特徴付けられる。
【００３８】
ＩＧＦ−１Ｒタンパク質レベルは、免疫アッセイ、より好ましくはＥＬＩＳＡにより測定され、これにより１つの抗体が固定化される。免疫化は、好ましくは生物学的結合ペア、好ましくはハプテン−抗ハプテン（例えば、ジゴキシゲニン−ジゴキシゲニンに対する抗体）又はビオチン−（ストレプト）アビジンを介して行われる。本発明の好ましい態様において、一次抗体はビオチニル化され、そしてストレプトアビジン（又はほかのアビジン類似体）マトリックス上で固定化される。ビオチニル化又はハプテンカップリングは、該抗体が１０-9Ｍ（ＫD）、そしてより好ましくは約１０-10〜１０-13ＭのＩＧＦ−１Ｒに対する親和性を維持するように行われる。
【００３９】
好ましい哺乳類は、腫瘍治療を必要とするヒト患者、又は生体内動物試験のために処理される非ヒト哺乳類である。
【００４０】
本発明の詳細な説明
用語「抗体」は、抗体の様々な形態を包含し、例えば制限することなく、全ての抗体、抗体フラグメント、ヒト抗体、ヒト化抗体及び遺伝子組み換え抗体を含む。好ましくは、一次抗体及び二次抗体の一方はモノクローナル抗体であり、そして他方は非ヒト動物、例えばウサギ又はヤギに由来するほかのポリクローナル形態である。
【００４１】
「抗体フラグメント」は、完全長の抗体の一部を含み、一般に少なくとも本発明のアッセイに適当かつ有用であるその抗原結合部分又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例はＦａｂ及びＦ（ａｂ）2フラグメントを含む。
【００４２】
本明細書において使用される用語「ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体」又は「ＩＧＦ−１Ｒ抗体」はヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合し、そして好ましくはこれによりほかのタンパク質と検出可能な交差反応を示さない抗体を意味する。
【００４３】
本明細書において使用される用語「ＩＧＦ−１Ｒに対する結合」は、試験管内アッセイ、好ましくは抗体が表面に結合し、そしてＩＧＦ−１Ｒの結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される結合アッセイにおけるＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の結合を意味する。結合は１０-8Ｍ又はそれ以下、好ましくは１０-8Ｍ（ＫD）又はそれ以下、そしてより好ましくは約１０-13〜１０-10Ｍの結合親和性（ＫD）を意味する。
【００４４】
本明細書において使用される用語「ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の生体内活性」は、ＩＧＦ−１Ｒに対して結合し、そしてリガンド結合を阻害するような抗体のための周知の活性を意味する。ＩＧＦ−１Ｒに結合するリガンドの抗体媒介障害は、２つの主なインスリン様成長因子（ＩＧＦ）経路の下流シグナル伝達、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ及びホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ／Ａｋｔを阻害する。その結果、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の細胞分裂及び増殖能力が有意に減少した。さらに、該抗体は腫瘍細胞に対する特異的な結合におけるＩＧＦ−１Ｒ内在化及び低下を誘発し、その結果受容体分子を供する細胞表面中で有意な（少なくとも８０％）の減少をもたらす(例えば、Mitsiades, C.S., Cancer Cell 5 (2004) 221-230; Grimberg, A., Cancer Biology & Therapy 2 (2003) 630-635を参照のこと)。
【００４５】
末梢血単核細胞／リンパ球は先行技術に従い軟膜から単離した。例えばRees, G. and Gough R., J. Med. Lab. Tech. 25 (1968) 117-118 and Figdor, C, et al., J. Immunol. Methods 55 (1982) 221-229を参照のこと。
【００４６】
ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の免疫学的測定は、好ましくは捕捉抗体（一次抗体）及び検出可能な標識に接合したトレーサー抗体（二次抗体）を含む二重抗原ブリッジング免疫アッセイにより生じる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、抗原の異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体（一次及び二次抗体）を使用して、あるいは１種類のモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体及び１種類のポリクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体により、抗原の濃度を測定することにより特徴付けられる。このサンドイッチＥＬＩＳＡの手順は通常３段階からなる。例えば、第１段階において、抗原含有試料を一次モノクローナル／ポリクローナル抗体が吸着している測定プレート上に注ぐ；該試料中のＩＧＦ−１Ｒを一次抗体に結合させる。第２段階において、該試料中の抗原以外の物質を洗浄剤で洗浄する。その後第３段階において、レポーター分子、例えば酵素又はラジオアイソトープで標識した二次抗体の溶液をプレートに注ぎ；標識された抗体が一次抗体と結合しているＩＧＦ−１Ｒと結合し、そして標識が検出される。ＥＬＩＳＡ法は当業界で周知であり、例えばHildebrand R.L., Rapid diagnosis in infectious disease, Rytel, M.W. (ed.), Boca Raton (1979) pp. 71-88に概説される。
【００４７】
好ましくは、抗体のその接合パートナーに対する接合は、抗体のアミノ酸バックボーンのＮ−末端及び／又はε−アミノ基（リジン）、異なるリジンのε−アミノ基、カルボキシ−、スルフィドリル−、ヒドロキシ−、及び／又はフェノール性官能基、及び／又は抗体の炭化水素構造の糖アルコール基を介する化学結合により行われる。
【００４８】
好ましくは、一次抗体は、特異的な結合ペアを介して固定化される。このような結合ペア（一次成分／二次成分）は、例えばストレプトアビジン又はアビジン／ビオチン、抗体／抗原（例えば、Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, Inc. (1996)を参照のこと)、レクチン／多糖、ステロイド／ステロイド結合タンパク質、ホルモン／ホルモン受容体、酵素／基質、ＩｇＧ／タンパク質Ａ及び／又はＧ等である。好ましくは、一次抗体はビオチンに接合し、そして固定化は固定化アビジン又はストレプトアビジンを介して行われる。
【００４９】
あるいは、一次抗体は受動吸着により固相に接合される。受動吸着は、例えばButler, J. E., Solid Phases in Immunoassay, In: Immunoassay, Diamandis, E.P., and Christopoulos, T.K. (eds.), Academic Press, Inc., San Diego, California (1996), pp. 205-225に記載される。
【００５０】
本発明の好ましい態様において、二次抗体は検出可能な標識に接合する。好ましくは、特異的な結合ペアを介して接合される。このような結合ペア（一次成分／二次成分）は、例えばストレプトアビジン又はアビジン／ビオチン、抗体／抗原（例えば、Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press, Inc. (1996)を参照のこと)、レクチン／多糖、ステロイド／ステロイド結合タンパク質、ホルモン／ホルモン受容体、酵素／基質、ＩｇＧ／タンパク質Ａ及び／又はＧ等である。好ましくは、二次抗体は、ジゴキシゲニン及びジゴキシゲニンに対する抗体を介して検出可能な標識に接合される。あるいは、二次抗体は電気化学発光標識、例えばルテニウムビスピリジル錯体に接合される。
【００５１】
モノクローナル抗体は、タンパク質として複数の反応性側鎖を含有する。このような抗体の反応性化学基は、例えばアミノ基（リジン、α−アミノ基）、チオール基（シスチン、システイン、及びメチオニン）、カルボン酸基（アスパラギン酸、グルタミン酸）、及び糖−アルコール基である。
【００５２】
本発明の免疫アッセイのための固体支持体は、先行技術において広く記載されている(例えば、Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23を参照のこと)。
【００５３】
異なる免疫アッセイの原理は、例えば Hage, D. S., in Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R. Lu, B., et al., in Analyst. 121 (1996) 29R-32Rにおいて記載されており、免疫アッセイに使用するための抗体の配向された固定化が報告される。アビジン−ビオチン−媒介免疫アッセイは、例えばWilchek, M., and Bayer, E.A., Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469において報告される。
【００５４】
モノクローナル抗体及びこれらの定常領域は、タンパク質として、結合パートナー、例えば表面、タンパク質、ポリマー、例えばPEG、セルロース又はポリスチロール、酵素又は結合ペアのメンバーに結合するための複数の反応性側鎖を含有する。抗体の化学反応基は、例えばアミノ基（リジン、α−アミノ基）、チオール基（シスチン、システイン、及びメチオニン）、カルボン酸基（アスパラギン酸、グルタミン酸）、及び糖−アルコール基である。このような方法は、例えばAslam, M. and Dent, A., Bioconjuation, MacMillan Reference Ltd. (1999), pp. 50-100において記載される。
【００５５】
用語「固相」は、非液体物質であり、そしてポリマー、金属（常磁性粒子、強磁性粒子）、ガラス、及びセラミックから作成される粒子（微粒子及びビーズを含む）；ゲル物質、例えばシリカ、アルミナ、及びポリマーゲル；ポリマー、金属、ガラス及び／又はセラミックから作成できるキャピラリー；ゼオライト及びほかの多孔性物質；電極；マイクロタイタープレート；固体ストリップ；及びキュベット、チューブ又はほかのスペクトロメーター試料容器を含む。アッセイの固相要素は、該アッセイが接触される内部固相表面と区別され、「固相」はその表面上に少なくとも１つの部分を含有し、これは二次抗体と相互作用することを意図する。固相は、固定要素、例えばチューブ、ストリップ、キュベット又はマイクロタイタープレートであってよく、あるいは非固定要素、例えばビーズ、及び微粒子であってよい。微粒子はまた、均一なアッセイフォーマットのための固相として使用することができる。タンパク質とほかの物質との非共有結合又は共有結合のいずれかを許容する多様な微粒子を使用することができる。このような粒子は、ポリマー粒子、例えばポリスチレン及びポリ（メチルメタクリレート）；金粒子、例えば金ナノ粒子及び金コロイド；及びセラミック粒子、例えばシリカ、ガラス、金属酸化物粒子を含む。例えば参考により本明細書に組み込まれる、Martin, C.R., et al., Anal. Chem. 70 (1998) 322A-327Aを参照のこと。
【００５６】
色原体（蛍光性又は発光性群及び色素）、酵素、ＮＭＲ−活性群又は金属粒子、ハプテン、例えばジゴキシゲニンは検出可能な標識の例である。該検出可能な標識はまた光活性化可能な架橋基、例えばアジド又はアジリン基である。電気化学発光により検出することができる金属錯体はまた、好ましくはシグナル放射基であり、特に、ルテニウム錯体、例えばルテニウム（ビスピリジル）32+が好ましい。適当なルテニウム標識基は、例えばＥＰ０５８０９７９、ＷＯ９０／０５３０１、ＷＯ９０／１１５１１及びＷＯ９２／１４１３８に記載される。
【００５７】
以下の実施例及び図面は、付属の特許請求の範囲に記載される真の範囲である、本発明の理解を助けるために提供される。本発明の精神から離れることなく記載される手順において改変できることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】１〜５に標識した５つの独立した実験において同じ試料のレベルが測定された。同じ色は同一の試料を示す。標準偏差は１１〜１４％の範囲であった。
【図２】カニクイザルから単離した新しい末梢白血球（出発個体数）を、これらのＩＧＦ−１Ｒ濃度について試験し、そして細胞の一晩培養（未処理）と抗体１８で処理した細胞の一晩培養（処理）とを比較した。左のパネルにおいて、１ｍｇあたりの任意単位をプロットする。
【実施例】
【００５９】
例１
ＰＢＬ単離及び溶解
ａ）ヒトＰＢＬの単離
２００μｌのリクエミン（Liquemine）(Roche Diagnostics GmbH, DE)を１６０ｍｌのＲＰＭＩ／ヘペス(ＲＰＭＩ中１０ｍＭのヘペス緩衝液）中に添加した。０．５ｌの血液からの末梢血細胞（「バフィーコート」）を該溶液に再懸濁した。血液細胞タイプの分離は５０ｍｌのGREINER Leucosepチューブ中で行った(Article No. 7.227.290)。バフィーコートからのＰＢＬの単離のために６本のチューブを使用した。該チューブを調製するために１５ｍｌのリンパ球選択培地 (LSM, ICN No. 50494)を各チューブに移し、そして該チューブを１０００×ｇで３０秒間遠心分離した。３９ｍｌの血液懸濁液をＬＳＭ溶液の上部において層を形成させ、そして１０００×ｇにおいて１８℃で１０分間遠心分離した。ＰＢＬは上部に白色のバンドとして直接的に現れ、１０ｍｌピペットで回収し、そして４本の５０ｍｌチューブに移した。その後、該チューブを５０ｍｌのＲＰＭＩ／ヘペスで満たし、そして２５０×ｇにおいて１８℃で１０分間遠心分離した。上清を捨て、そして細胞を少量のＲＰＭＩ／ヘペス中に再懸濁した。全ての細胞を単一の５０ｍｌチューブ中に集め、そしてＲＰＭＩ／ヘペスで再度洗浄した。上清を捨て、そして混入した赤血球を溶解するために細胞を１０ｍｌの予め温めたＡＬＴ中に再懸濁した。ＡＬＴは３００ｍｌの溶液Ａ（０．１６Ｍ  ＮＨ4Ｃｌ）と１００ｍｌの溶液Ｂ（０．１６Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６５）と混合し、ｐＨを７．２に調節し、そして濾過（０．２２μｍ）により溶液を滅菌することにより調製した。ＡＬＴ中の細胞懸濁液を３７℃で３分間インキュベーションした後、チューブをＲＰＭＩ／ヘペスで５０ｍｌに満たし、そして該細胞を２５０×ｇで５分間遠心分離した。該細胞をＲＰＭＩ／ヘペスで２回再度洗浄し、そして５０ｍｌのＲＰＭＩ／ヘペス中に再懸濁した。最後に、該細胞を集計した。新たに調製した細胞に代えて、場合により凍結させたＰＢＬもまた使用することができた。凍結のために、細胞は１０００万細胞／ｍｌの密度において凍結培地（熱不活性化ヒト血清中の１０％ＤＭＳＯ）中に再懸濁した。懸濁液をゆっくりと−８０℃に冷却する。解凍のために、細胞を素早く解凍し、その後培地の段階的な添加によって、攪拌することなくゆっくりと希釈した。
【００６０】
ｂ）カニクイザルＰＢＬの単離
血液(２４ｍｌ，３ｍｌ  ８匹の異なる類人猿に各々由来する)を、ヘパリンを含有するバキュテナー中に回収した。５６ｍｌのＰＢＳを添加し、そして懸濁液はＬＳＭ(ICN No. 50494)のクッションの上部に層を形成した。チューブを１０００×ｇで１０分間回転させた。ＰＢＬを除去し、そしてＰＢＳ中で２回洗浄し、そして集計した。
【００６１】
ｃ）ＰＢＬ処置
ウェルあたり２００万〜１０００万の細胞を、６ウェル細胞培養プレートにおいて２ｍｌの培地（１０％ＦＣＳを伴うＲＰＭＩ）中で播種した。対照は未処理のままにした。最終濃度が１００ｎｍになるようにＩＧＦ−１Ｒ（２．０ｍｇ／ｍｌ）に対する抗体をウェルの半分まで添加した。該細胞を５％のＣＯ2と共に３７℃で一晩インキュベートした。対照として細胞のアリコットを遠心分子し、さらなる分析のための細胞培養工程の前に凍結させた。
【００６２】
ｄ）ＰＢＬ溶解
細胞を遠心分離により回収し、そしてＰＢＳ中で２回洗浄した。ペレットを凍結させた。分析の直前に該細胞ペレットを解凍し、そしてボルテックスした２００μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１  ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＥＧＴＡ，１００ｍＭ  ＮａＦ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００，２０％グリセロール）中に再懸濁し、超音波水浴中に２分間入れ、そして遠心分離した。
【００６３】
例２
ＥＬＩＳＡアッセイ
末梢血リンパ球中のＩＧＦ−１受容体を、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロプレート（ＳＡ−ＭＴＰ）中の該受容体のαドメインに対するビオチニル化抗体（抗体１８）により捕捉する。ウサギポリクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体及び抗ウサギ−ＨＲＰ結合抗体により結合したＩＧＦ−１Ｒを検出する。
【００６４】
細胞の全タンパク質量に対するＩＧＦ−１Ｒタンパク質量としてＩＧＦ−１Ｒレベルを測定した。細胞可溶化液を産生し、同じタンパク質濃度に調節し、そしてＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した。該圧制の直線範囲において、４５０ｎｍにおける吸収シグナルは、ＩＧＦ−１Ｒレベルの相対量に対応する。
【００６５】
材料：
−  96-ウェル・ストレプトアビジンコーティングポリスチレンプレート(Nunc)
−  PBST: H2Oで1:10 に希釈した10×PBS−緩衝溶液＋0.2% Tween20
−  BSA
−  PAK <IGF-1Rβ> Ra-C20-IgG (Santa Cruz Biotechnology, #sc-713)
−  PAK <ウサギ> G-IgG-HRP (Cell Signaling #7074)
−  3,3'-5,5'-テトラメチルベンジジン
−  1M H2SO4
−  ビオチニル化 MAK <IGF-1R α> Hu-AK1a-IgG (DSM ACC 2586)
【００６６】
プレートコーティング：
−  3% BSA/PBST 中希釈ビオチニル化抗体 1:200
−  SA-MTPに100 μl/ウェル添加
−  シェーカー上室温で１時間インキュベート
−  200μl PBST/ウェルで洗浄
【００６７】
試料調製：
−  PBSで洗浄後、末梢血リンパ球(PBL, 1 × 107 細胞)を遠心分離により再単離し、そして該細胞ペレットを250 μｌの溶解緩衝液中に溶解する。ELISAアッセイの直線範囲となる溶解物のIGF-1R濃度を保証するために、希釈系列を行う。
【００６８】
アッセイ手順：
−  100 μl/ウェルの試料をアッセイプレートに添加
−  室温で１時間インキュベート
−  200 μlのPBST/ウェルで洗浄
−  3% BSA/PBST中1:1000 の100 μl/ウェルのPAK <IGF-1Rβ> Ra-C20-IgG (Santa Cruz Biotechnology, #sc-713)をプレートに添加
−  室温で１時間インキュベート
−  200 μlのPBST/ウェルで洗浄
−  3% BSA/PBST中1:5000の100 μl/ウェルのPAK <ウサギ> G-IgG-HRPをプレートに添加
−  室温で１時間インキュベート
−  200 μlのPBST/ウェルで洗浄
−  100 μl/ウェルの3,3'-5,5'-テトラメチルベンジジンをアッセイプレートに添加
−  室温で0.5 時間インキュベート
−  250 μl/ウェルの1M H2SO4で反応を停止
−  450 nm で吸光度を測定
【００６９】
純粋な組み換えタンパク質の不存在下において、１：１００の希釈の陽性対照により得られたＥＬＩＳＡシグナルを任意単位「Ｕ」として定義した。試料の異なる希釈を測定し、そして少なくとも２つの値の平均値を計算した。
【００７０】
ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体で処理したＰＢＬ培養液中のＩＧＦ−１Ｒレベルにおける変化の測定：
２０人のドナー由来のＰＢＬを抗体１８の存在下及び不存在下において培養した。９つのサンプルは凍結ストックに由来し、１１のサンプルは新たに調製した細胞で測定した。ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の処理から２４時間後、ＩＧＦ−１Ｒレベルの下方制御を測定する。全ての細胞培養液中、抗体処理においてＩＧＦ−１Ｒのレベルは未処理細胞と比較して低下した。処理後のＩＧＦ−１Ｒのレベルは対照培養液中で検出したレベルの０〜６２％のレベル範囲だった。したがって、該受容体の下方制御は治療抗体によるシグナル伝達カスケードの下方制御の一般現象であるように見える。受容体発現のベースライン値はドナー間で強く変化し、したがって「閾値」レベルは確立することができず、そして該レベルの経時変化は各患者についての処理期間を通してベースライン対照としての処理前の値を含み、測定しなければならないものと考えられる。２０ドナー中１９ドナーでは、細胞培養前のレベルは細胞培養後（処理なし）のレベルよりも低かった。しかしながら、２０ドナー中１７ドナーでは、これらのレベルは治療抗体で処理後の細胞培養液中で測定したものよりも依然高かった。
【００７１】
２つの細胞調製物について、異なる濃度のｈｕＭａｂ  ＩＧＦ−１Ｒにより、ＩＧＦ−１Ｒレベルの低下が試験された。低濃度においてさらに低いレベルのＩＧＦ−１Ｒが検出された（図１及び２）。
【００７２】
アッセイが前臨床試験におけるカニクイザルに適用できることを確認するために、治療抗体の有無において類人猿ＰＢＬのインキュベーションを行った。ヒト試料のように、カニクイザルリンパ球においてＩＧＦ−１Ｒ濃度の下方制御が検出された。受容体レベルの下方制御の割合はヒトにおいて検出されるものと比較可能であった。
【図１】
2010517024.tif 000004
【図２】
2010517024.tif 000005
【国際調査報告】
2010517024.tif 000006
2010517024.tif 000007
2010517024.tif 000008