(57)【要約】  細胞アッセイにおいて野生型と比較して活性が上昇し且つ安定性が増しているＣＴＬＡ−４のタンパク質変異体。そのような変異体は、Ｔ細胞応答の減弱化が有益な障害の治療に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（配列番号８）において２カ所以上の以下の位置：１７位、２６位、２８位、２９位、４３位、４６位、４９位、５４位、５９位、６１位、６２位、６６位、７０位、７１位、８１位、８６位、及び９４位に突然変異を有するＣＴＬＡ−４変異体であって、該ＣＴＬＡ−４変異体は、前記位置にヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸（配列番号８）を有するＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して改善された効力及び／又は改善された安定性を有し、改善された効力とは、Ｂ細胞によって活性化されたＴ細胞を用いたＩＬ−２産生アッセイにおいてＩＣ５０が少なくとも２倍低下することであり、改善された安定性とは、１０ｍＭ  ＤＴＴ存在下におけるＢ７−１又はＢ７−２への結合シグナルを、ＤＴＴ非存在下におけるＢ７−１又はＢ７−２への結合シグナルで割り、１００を掛けたものとして計算される残留結合が少なくとも１０％であることである、前記ＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項２】
配列番号８のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＣＴＬＡ−４と比較して改善された効力及び／又は改善された安定性を有する、請求項１に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項３】
ヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（配列番号８）において１カ所以上の以下の位置：２６位、２８位、７１位、及び９４位に突然変異を有する、請求項１又は２に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項４】
前記位置のいずれか１カ所に提供される残基が、以下の表：
【表１】
2010506581.tif 000008
に特定されるものから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項５】
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドに対して１０個以下の置換を有するアミノ酸配列を含み、ここで、親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＣＴＬＡ−４であるか、又は１７位、２６位、２８位、２９位、４３位、４６位、４９位、５４位、５９位、６１位、６２位、６６位、７０位、７１位、８１位、８６位、及び９４位のそれぞれにヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸（配列番号８）を有するその突然変異体若しくは変異体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項６】
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドが、配列番号８のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＣＴＬＡ−４である、請求項５に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項７】
配列番号８のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＣＴＬＡ−４において、以下の突然変異セット：
（ｉ）Ｉ１７Ｓ、Ｓ２６Ｐ、Ｇ２８Ｓ、Ｌ５９Ｓ、Ｓ７１Ｌ、Ｋ９４Ｅ；
（ｉｉ）Ｓ２６Ｐ、Ｍ５４Ｖ、Ｌ５９Ｓ、Ｓ７１Ｆ、Ｋ９４Ｅ；
（ｉｉｉ）Ｉ１７Ｖ、Ｓ２６Ｐ、Ｋ２９Ｎ、Ｌ５９Ｓ、Ｉ６６Ｔ、Ｓ７１Ｆ、Ｍ８６Ｖ、Ｋ９４Ｅ；
（ｉｖ）Ｓ２６Ｐ、Ｌ５９Ｓ、Ｔ７０Ｉ、Ｓ７１Ｆ、Ｍ８６Ｔ、Ｋ９４Ｅ；
（ｖｉｉ）Ｓ２６Ｐ、Ｃ４９Ｗ、Ｌ５９Ｓ、Ｌ６２Ｐ、Ｓ７１Ｆ、Ｑ８１Ｒ、Ｋ９４Ｅ；
（ｖ）Ｉ１７Ｔ、Ｓ２６Ｐ、Ｃ４９Ｙ、Ｌ５９Ｓ、Ｆ６１Ｓ、Ｓ７１Ｆ、Ｋ９４Ｅ；
（ｖｉ）Ｓ２６Ｐ、Ｓ４３Ｇ、Ｔ４６Ｓ、Ｌ５９Ｓ、Ｓ７１Ｆ、Ｑ８１Ｒ、Ｋ９４Ｅ、
から成る群より選択される突然変異セットを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項８】
配列番号１、２、３、４、７、５、及び６から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項９】
効力が改善された、請求項１に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項１０】
ヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（配列番号８）において、１カ所以上の以下の位置：１７位、２６位、２８位、２９位、５４位、５９位、６６位、７０位、７１位、８６位、及び９４位に突然変異を有する、請求項９に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項１１】
１７位、２６位、２８位、２９位、５４位、５９位、６６位、７０位、７１位、８６位、及び９４位のいずれか１カ所に提供される残基が、以下の表：
【表２】
2010506581.tif 000009
に特定されるものから選択される、請求項１０に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項１２】
残基２６はＰであり、残基５９はＳであり、残基７１はＦ又はＬであり、そして残基９４はＥである、請求項１１に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項１３】
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドに対して１０個以下の置換を有するアミノ酸配列を含み、ここで、親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＣＴＬＡ−４であるか、又は１７位、２６位、２８位、２９位、４３位、４６位、４９位、５４位、５９位、６１位、６２位、６６位、７０位、７１位、８１位、８６位、及び９４位のそれぞれにヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸（配列番号８）を有するその突然変異体若しくは変異体である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項１４】
配列番号８のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＣＴＬＡ−４において、以下の突然変異セット：
（１）Ｉ１７Ｓ、Ｓ２６Ｐ、Ｇ２８Ｓ、Ｌ５９Ｓ、Ｓ７１Ｌ、Ｋ９４Ｅ；
（２）Ｓ２６Ｐ、Ｍ５４Ｖ、Ｌ５９Ｓ、Ｓ７１Ｆ、Ｋ９４Ｅ；
（３）Ｉ１７Ｖ、Ｓ２６Ｐ、Ｋ２９Ｎ、Ｌ５９Ｓ、Ｉ６６Ｔ、Ｓ７１Ｆ、Ｍ８６Ｖ、Ｋ９４Ｅ；
（４）Ｓ２６Ｐ、Ｌ５９Ｓ、Ｔ７０Ｉ、Ｓ７１Ｆ、Ｍ８６Ｔ、Ｋ９４Ｅ、
から成る群より選択される突然変異セットを含む、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項１５】
配列番号１、２、３、及び４から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項９〜１４のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項１６】
安定性が改善された、請求項１に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項１７】
ヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（配列番号８）において、１カ所以上の以下の位置：１７位、２６位、４３位、４６位、４９位、５９位、６１位、６２位、７１位、８１位、及び９４位に突然変異を有する、請求項１６に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項１８】
１７位、２６位、４３位、４６位、４９位、５９位、６１位、６２位、７１位、８１位、及び９４位のいずれか１カ所に提供される残基が、以下の表：
【表３】
2010506581.tif 000010
に特定されるものから選択される、請求項１７に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項１９】
残基２６はＰであり、残基５９はＳであり、残基７１はＦであり、そして残基９４はＥである、請求項１８に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項２０】
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドに対して１０個以下の置換を有するアミノ酸配列を含み、ここで、親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＣＴＬＡ−４であるか、又は１７位、２６位、２８位、２９位、４３位、４６位、４９位、５４位、５９位、６１位、６２位、６６位、７０位、７１位、８１位、８６位、及び９４位のそれぞれにヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸（配列番号８）を有するその突然変異体若しくは変異体である、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項２１】
配列番号８のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＣＴＬＡ−４において、以下の突然変異セット：
（７）Ｓ２６Ｐ、Ｃ４９Ｗ、Ｌ５９Ｓ、Ｌ６２Ｐ、Ｓ７１Ｆ、Ｑ８１Ｒ、Ｋ９４Ｅ；
（５）Ｉ１７Ｔ、Ｓ２６Ｐ、Ｃ４９Ｙ、Ｌ５９Ｓ、Ｆ６１Ｓ、Ｓ７１Ｆ、Ｋ９４Ｅ；
（６）Ｓ２６Ｐ、Ｓ４３Ｇ、Ｔ４６Ｓ、Ｌ５９Ｓ、Ｓ７１Ｆ、Ｑ８１Ｒ、Ｋ９４Ｅ、
から成る群より選択される突然変異セットを含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項２２】
配列番号７、５、及び６から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項２３】
可溶性ポリペプチドである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項２４】
更なるポリペプチドに融合した、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体の少なくとも細胞外ドメインを含む融合タンパク質。
【請求項２５】
更なるポリペプチドが免疫グロブリン部分を含む、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体をコードする核酸。
【請求項２７】
請求項２６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体を含む組成物。
【請求項３０】
医薬的に許容可能な賦形剤を含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ヒト又は動物の身体の治療方法に用いるための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項３２】
関節リウマチ、多発性硬化症、及び／又は全身性エリテマトーデスの治療に用いるための、請求項３１に記載のＣＴＬＡ−４変異体。
【請求項３３】
関節リウマチ、多発性硬化症、及び／又は全身性エリテマトーデスの治療に用いるための医薬の製造における、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体の使用。
【請求項３４】
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して効力及び／又は安定性が改善されたＣＴＬＡ−４変異体の作製方法であって：
コードする核酸からの発現により、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（配列番号８）における２カ所以上の以下の位置：１７位、２６位、２８位、２９位、４３位、４６位、４９位、５４位、５９位、６１位、６２位、６６位、７０位、７１位、８１位、８６位、及び９４位に親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して突然変異を有するＣＴＬＡ−４変異体を作製し；そして
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して改善された効力及び／又は安定性に関してＣＴＬＡ−４変異体を試験する、
ことを含む、前記方法。
【請求項３５】
試験前にＣＴＬＡ−４変異体を単離する工程を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して効力及び／又は安定性が改善されたＣＴＬＡ−４変異体の同定方法又は入手方法であって：
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドをコードする核酸を突然変異させて、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（配列番号８）における２カ所以上の以下の位置：１７位、２６位、２８位、２９位、４３位、４６位、４９位、５４位、５９位、６１位、６２位、６６位、７０位、７１位、８１位、８６位、及び９４位に変更されたアミノ酸配列を有する１種以上のＣＴＬＡ−４変異体をコードする配列を有する１種以上の核酸を準備し；
核酸を発現させてＣＴＬＡ−４変異体を産生し；
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して改善された効力及び／又は安定性に関し、産生されたＣＴＬＡ−４変異体を試験する、
ことを含む、前記方法。
【請求項３７】
変更されたアミノ酸配列を有するＣＴＬＡ−４変異体のライブラリー又は多様集団を作製し、試験する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して効力が改善されたＣＴＬＡ−４変異体の作製方法であって：
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドの１以上のＣＤＲループの構造及び／又は方向に影響を及ぼす２カ所以上のバーニア位置を同定し；そして
２カ所以上のバーニア位置に、親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較してＣＴＬＡ−４変異体のＢ７分子への結合能を高める突然変異を提供する、
ことを含む、前記方法。
【請求項３９】
２カ所以上のバーニア位置が、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（配列番号８）における以下の位置：２６位、２８位、７１位、及び９４位から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドが、配列番号８のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＣＴＬＡ−４である、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドが、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４の突然変異体又は変異体であり、親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号８と異なる、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列を有するベラタセプトのアミノ酸配列を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
それを必要とする個体へ、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＣＴＬＡ−４変異体を投与することを含む、治療方法。
【請求項４４】
治療が、関節リウマチ、多発性硬化症、及び／又は全身性エリテマトーデスの治療である、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞アッセイにおいて野生型と比較して活性が上昇し且つ安定性が増しているＣＴＬＡ−４のタンパク質変異体に関するものである。そのような変異体は、Ｔ細胞応答の減弱化が有益な障害の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞活性の調節は、抗原特異的且つ共刺激性のシグナルに依存している。最も重要なＴ細胞共刺激シグナルの１つは、ＣＤ２８−ＣＤ８０／８６経路を介在している。ＣＤ２８は大部分のＴ細胞上に存在し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に存在するＣＤ８０（Ｂ７−１）及びＣＤ８６（Ｂ７−２）に結合する。ＣＤ２８とＢ７分子との連結は、Ｔ細胞活性化シグナルを提供する。細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）−４（ＣＤ１５２）は、活性型Ｔ細胞上で上方調節され、また、Ｂ７分子と相互作用してＣＤ２８活性化経路を遮断し、Ｔ細胞応答を減弱化する負のシグナルを提供する。
【０００３】
ＣＴＬＡ−４はＣＤ２８と相同性があり、その遺伝子はＣＤ２８遺伝子と同一染色体バンドにマップされる。ＣＴＬＡ−４は、マウス細胞障害性Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーのディファレンシャルスクリーニングによって同定された（非特許文献１）。ヒトＣＴＬＡ−４は、Ｄａｒｉａｖａｃｈら（非特許文献２）によって最初にクローニングされた。発現は細胞外ドメインとＦｃドメインとの可溶性遺伝子融合体を用いて最初に報告され、この融合タンパク質はＴリンパ球とＢリンパ球との細胞内相互作用に依存したｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫応答の強力な阻害剤であることが示された（非特許文献３）。ＣＴＬＡ−４細胞外ドメインの構造は、免疫グロブリン可変ドメインに特徴的である。ヒトＣＴＬＡ−４前駆体配列は、スイスプロット主要受託番号：Ｐ１６４１０によって特定されている。
【０００４】
ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞応答の負の調節に重要であると考えられる（非特許文献４）。ＣＴＬＡ−４の封鎖は阻害シグナルを取り除くことがわかっており、一方、ＣＴＬＡ−４の凝集はＴ細胞応答を下方調節する阻害シグナルを提供することがわかっている（非特許文献５）。Ｂ７分子はＣＤ２８よりもＣＴＬＡ−４に対して高親和性があり（非特許文献３）、Ｂ７−１及びＢ７−２はＣＴＬＡ−４分子の異なる領域に結合し、ＣＴＬＡ−４に対する結合動態が異なることがわかっている（非特許文献６）。
【０００５】
Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４共刺激経路の重要性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで及びいくつかのｉｎ  ｖｉｖｏモデル系で実証されている。この共刺激経路の封鎖により、マウス及びヒトの系において抗原特異的寛容を発生させる（非特許文献７〜非特許文献１１）。反対に、Ｂ７陰性マウス腫瘍細胞によるＢ７の発現は、腫瘍の攻撃に対する腫瘍拒絶及び長期防御を伴うＴ細胞介在性特異的免疫を誘導する（非特許文献１２〜非特許文献１４）。したがって、共刺激経路の操作は、ヒトにおいて免疫応答を刺激又は抑制するための大きな可能性を提供する。
【０００６】
ＣＴＬＡ−４の活性化は、例えば、Ｔ細胞へ負のシグナルを伝達する。ＣＴＬＡ−４の連結は、ＩＬ−２産生を阻害し、細胞周期の停止を誘導することができる（非特許文献１５）。更に、ＣＴＬＡ−４欠損マウスは、リンパ球増殖性疾患を発症する（非特許文献１６；非特許文献４）。抗体によるＣＴＬＡ−４の封鎖は阻害シグナルを除去することができるが、ＣＴＬＡ−４と抗体との凝集は阻害シグナルを伝達する。
【０００７】
ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（アバタセプト、オレンシア）は、ＩｇＧ１のＦｃに融合したＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインであり、得られる可溶性タンパク質は分子量およそ９２ｋＤａの２量体である。これは、ブリストル・マイヤーズ  スクイブ社（ＢＭＳ）によって関節リウマチ（ＲＡ）に対して開発されたものであり、ＲＡ、多発性硬化症（ＭＳ）、及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含めた各種免疫障害を治療する可能性を有している。アバタセプトはそのＣＤＲ３様ドメイン中にアミノ酸のヘキサペプチドモチーフＭＹＰＰＰＹを含有し、このモチーフはＣＤ２８とＣＴＬＡ−４とのあいだで共有されており、Ｂ７リガンドへの結合に必要である。このモチーフの最初のチロシン（Ｙ）をアラニン（Ａ）に突然変異させることにより、ＣＤ８０への結合を廃するが、ＣＤ８６への結合も低下させ、一方、フェニルアラニン（Ｆ）への置換はＣＤ８０に対する完全な親和性保持を可能にし、ＣＤ８６への結合を完全に喪失する（非特許文献１７）。ＣＤＲ３様領域及びＣＤＲ１様領域における残基もアバタセプトとそのリガンドとの相互作用に重要である。したがって、１０４位のロイシン（Ｌ）の代わりにグルタミン酸（Ｅ）を、２９位のアラニン（Ａ）の代わりにチロシン（Ｙ）を有する突然変異分子は、アバタセプトよりも、ＣＤ８０（Ｂ７−１）に対しておよそ２倍大きい結合親和性を、ＣＤ８６（Ｂ７−２）に対しておよそ４倍大きい結合親和性を発揮する。この化合物ＬＥＡ−２９Ｙ（ベラタセプト）は、ＢＭＳによって移植のための免疫抑制剤として開発されたものである（非特許文献１８）。
【０００８】
ＣＴＬＡ−４を切り離すリーダー配列は、文献にも公共のデータベースにも規定されていない。したがって、少なくとも２種の異なる番号付けシステムが可能である。ＣＴＬＡ−４配列は、とりわけＡｌａを１位から（特許文献１）又はＭｅｔを１位から開始することができる（非特許文献１８）。例えば、上で参照した番号付けは、ベラタセプトに関してＭｅｔを１位に特定する。文脈が他に明確に指示しない限り、本明細書において用いる番号付けシステムは、１位がＡｌａ、２位がＭｅｔのものである。
【０００９】
更なるＣＴＬＡ−４産物がＣＴＬＡ−４免疫グロブリン融合タンパク質の形態で存在する（特許文献２；レプリゲン社）。このＣＴＬＡ−４−Ｃγ４産物は、可溶性型ＣＴＬＡ−４を作製するために免疫グロブリンの一部に融合させた天然ＣＴＬＡ−４で構成される遺伝子操作された融合タンパク質である。ヒンジ領域並びにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン定常領域は、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、付加、又は欠失によって修飾され、補体活性化又はＦｃ受容体相互作用を軽減させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，４３４，１３１号明細書
【特許文献２】米国特許第６，７５０，３３４号明細書
【特許文献３】国際公開第９２／０１０４７号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｒｕｎｅｔら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：２６７−２７０
【非特許文献２】Ｄａｒｉａｖａｃｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８、１８（１２）：１９０１−５
【非特許文献３】Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９１、１７４：５６１−５６９
【非特許文献４】Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：９８５
【非特許文献５】Ａｌｌｉｓｏｎ及びＫｒｕｍｍｅｌ、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：９３２
【非特許文献６】Ｌｉｎｓｌｅｙら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：７９３
【非特許文献７】Ｈａｒｄｉｎｇら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：６０７−６０９
【非特許文献８】Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：７８９−７９２
【非特許文献９】Ｔｕｒｋａら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１１１０２−１１１０５
【非特許文献１０】Ｇｉｍｍｉら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６５８６−６５９０
【非特許文献１１】Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１７５３−１７６３
【非特許文献１２】Ｃｈｅｎら、１９９２、Ｃｅｌｌ  ７１：１０９３−１１０２
【非特許文献１３】Ｔｏｗｎｓｅｎｄ及びＡｌｌｉｓｏｎ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：３６８−３７０
【非特許文献１４】Ｂａｓｋａｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：５６８７−５６９０
【非特許文献１５】Ｋｒｕｍｍｅｌ及びＡｌｌｉｓｏｎ、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １８３：２５３３
【非特許文献１６】Ｔｉｖｏｌら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：５４１
【非特許文献１７】Ｈａｒｒｉｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７、１８５：１７７−１８２
【非特許文献１８】Ｌａｒｓｅｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００５、５：４４３−４５３
【非特許文献１９】『分子クローニング：実験室マニュアル』：第３版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、２００１、コールドスプリングハーバー研究所出版
【非特許文献２０】『分子生物学の最新プロトコール』、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２
【非特許文献２１】Ｌｏｗｅ  Ｄ及びＪｅｒｍｕｔｕｓ  Ｌ、２００４、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５１７−２７
【非特許文献２２】Ｈａｎｅｓら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０００、３２８：４０４
【非特許文献２３】Ｓｔａｍｐｅｒら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：６０８−６１１
【非特許文献２４】Ｄｕｐｒａｔら、２００４、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔ．２：１１１−１３６
【非特許文献２５】Ｆｏｏｔｅ及びＷｉｎｔｅｒ、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９
【非特許文献２６】Ｐｅａｃｈら、１９９４、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８０：２０４９−２０５８
【非特許文献２７】Ｍａｒｔｉｎ及びＴｈｏｒｎｔｏｎ、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２６３：８００−８１５
【非特許文献２８】Ｊｅｒｍｕｔｕｓら、２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、効力及び／又は安定性が増加したＣＴＬＡ−４の変異体、並びにそのような分子の作製方法を提供するものである。これらの変異体は、治療的処置及びＣＴＬＡ−４由来産物の製剤に関し、有効性を増大させる。例えば、より強力なＣＴＬＡ−４変異体は、有効用量を減少させるであろう。より安定なＣＴＬＡ−４変異体は、静脈内注入よりもむしろ皮下投薬用の製剤を可能にし、患者の利便性を改善するであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
適宜設計された選択技術及び細胞アッセイを利用することによって、本発明者らは、野生型ＣＴＬＡ−４と比較して効力又は安定性が増加したＣＴＬＡ−４タンパク質変異体を開発した。更に、Ｂ７−１分子と相互作用するＣＴＬＡ−４変異体のモデリングにより、効力に影響を及ぼす主要な残基位置の同定を可能にした。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１００，０００細胞／ウェル）及びＲａｊｉ細胞（１００，０００細胞／ウェル）からのＩＬ−２産生の、ＣＴＬＡ−４野生型（ＷＴ）及び変異体による阻害を示す。
【００１５】
【表１】
2010506581.tif 000002
【図２】図２は、Ｂ７−２を抗Ｂ７−２抗体でブロックすることにより、ＷＴ及び変異体とＢ７−１受容体との相互作用のみを可能にするＢ７−１の相互作用を測定するアッセイにおける、ＷＴ及び変異体の相対効力を示す。バー１〜３は、それぞれ２ｎＭ、１ｎＭ、及び０．５ｎＭのＷＴ  ＣＴＬＡ−４を示す。バー４〜６は、それぞれ２ｎＭ、１ｎＭ、及び０．５ｎＭの変異体Ａ０６を示す。バー７〜９は、それぞれ２ｎＭ、１ｎＭ、及び０．５ｎＭの変異体Ｂ０６を示す。バー１０〜１２は、それぞれ２ｎＭ、１ｎＭ、及び０．５ｎＭ変異体Ｃ０６を示す。バー１３〜１５は、それぞれ２ｎＭ、１ｎＭ、及び０．５ｎＭの変異体Ｄ０６を示す。
【図３】図３は、Ｂ７−１を抗Ｂ７−１抗体でブロックすることにより、ＷＴ及び変異体とＢ７−２受容体との相互作用のみを可能にするＢ７−２の相互作用を測定するアッセイにおける、ＷＴ及び変異体の相対的効力を示す。バー１〜３は、それぞれ２ｎＭ、１ｎＭ、及び０．５ｎＭのＷＴ  ＣＴＬＡ−４を示す。バー４〜６は、それぞれ２ｎＭ、１ｎＭ、及び０．５ｎＭの変異体Ａ０６を示す。バー７〜９は、それぞれ２ｎＭ、１ｎＭ、及び０．５ｎＭの変異体Ｂ０６を示す。バー１０〜１２は、それぞれ２ｎＭ、１ｎＭ、及び０．５ｎＭの変異体Ｃ０６を示す。バー１３〜１５は、それぞれ２ｎＭ、１ｎＭ、及び０．５ｎＭの変異体Ｄ０６を示す。
【図４】図４は、Ｂ７−１と相互作用するＣＴＬＡ−４変異体Ｄ０６の相同性モデルを示す。Ｂ７−１の画像は中間色のグレーであり、残基Ａｒｇ９７は中間色のグレーの球体として強調されている。ＣＴＬＡ−４及び変異体のリボンは薄いグレーで示されている。変異体Ｄ０６中の変異残基は黒い球体（Ｐｒｏ２６、Ｌｅｕ７１、及びＧｌｕ９４）及び濃いグレーの球体（Ｓｅｒ１７、Ｓｅｒ２８、及びＳｅｒ５９）として強調され、太字で標識されている。ＣＴＬＡ−４の１つの残基（Ｌｙｓ９４）は薄いグレーの球体として示されている。
【図５】図５は、ＣＴＬＡ−４変異体Ｄ０６のアミノ酸配列及びＶ様ドメイン抗体バーニア残基に関するＩＭＧＴ  ＩｇＳＦ番号付けのアラインメントを示す。ＣＴＬＡ−４における変異は黒四角に白文字で強調されている。バーニア残基は黒四角に白文字のＶで強調されている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明による好ましいＣＴＬＡ−４変異体は、本明細書において同定されるような突然変異セットを含む。本明細書において同定される位置の番号付けシステムは、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４配列に適用すると、１位がＡｌａであり、２位がＭｅｔであり、配列番号８に示すようなものとなるシステムである。ヒト野生型ＣＴＬＡ−４配列を参照することにより、この番号付けシステムを、本発明のＣＴＬＡ−４変異体及びベラタセプトなどの公知のＣＴＬＡ−４変異体を含めた他のＣＴＬＡ−４ポリペプチドに適用することができる。
【００１７】
したがって、第１の側面では、本発明は、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（配列番号８）において２カ所以上の以下の位置：１７位、２６位、２８位、２９位、４３位、４６位、４９位、５４位、５９位、６１位、６２位、６６位、７０位、７１位、８１位、８６位、及び９４位に突然変異を有するＣＴＬＡ−４変異体を提供するものであり、ＣＴＬＡ−４変異体は、前記位置にヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸（配列番号８）を有するＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して改善された効力及び／又は改善された安定性を有し、改善された効力とは、Ｂ細胞によって活性化されたＴ細胞を用いたＩＬ−２産生アッセイにおいてＩＣ５０が少なくとも２倍低下することであり、改善された安定性とは、１０ｍＭ  ＤＴＴ存在下におけるＢ７−１又はＢ７−２への結合シグナルを、ＤＴＴ非存在下におけるＢ７−１又はＢ７−２への結合シグナルで割り、１００を掛けたものとして計算される残留結合が少なくとも１０％であることである。
【００１８】
以下により詳細に記載するように、本発明による特定のＣＴＬＡ−４変異体は、Ｂ７−１及びＢ７−２へ結合することが示されており、Ｔ細胞活性化を測定するアッセイにおいて高い効力を有する。ＣＴＬＡ−４変異体は、リガンドＢ７−１及びＢ７−２をブロックし、それにより、Ｂ７−１及びＢ７−２からの更なる活性化シグナルを妨げ、ＩＬ−２産生を低下させる。
【００１９】
薬物の効力は、効果を生ずるのに必要とされる量で表される薬物活性の大きさである。典型的には、変異体の滴定を細胞アッセイで比較し、ＩＣ５０値を報告する。機能性アッセイでは、ＩＣ５０は、生物学的反応を最大値の５０％まで低下させる結合部の濃度である。ＩＣ５０は、最大生物学的反応の％を結合部濃度のｌｏｇ関数としてプロットし、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）などのソフトウェアプログラムを用いてデータにシグモイド関数を適応し、ＩＣ５０値を生ずることにより計算することができる。ＩＣ５０値が低いほど薬物はより強力である。
【００２０】
ＣＴＬＡ−４変異体は、前記位置にヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸（配列番号８）を有するＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して、ＩＬ−２産生を阻害することに多くを必要とされないほど効力が増加しているものとして記載することができる。これは、報告したＩＣ５０値にも反映されている。好ましいＣＴＬＡ−４変異体は、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号８）と比較して効力が増加している。
【００２１】
ＣＴＬＡ−４のＢ７−１及びＢ７−２への結合はＩＬ−２産生を減弱化させるため、ＣＴＬＡ−４変異体の結合は、例えばＩＬ−２産生を介して測定することができる。好適なアッセイは、産生されたＩＬ−２量を、例えばＥＬＩＳＡによって検出することを含むことができる。
【００２２】
ＩＬ−２産生量の低下は、部分的でも全体的でもあり得る。特定の態様では、試験した濃度においてＩＬ−２産生を少なくとも５０％、７５％、又は８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、又は９５％まで低下させるＣＴＬＡ−４変異体が提供される。ＣＴＬＡ−４変異体の効力は、熟練した者に公知の及び／又は本明細書に記載若しくは参照するような１以上のアッセイを用いて決定又は測定することができる。
【００２３】
効力が改善された本発明のＣＴＬＡ−４変異体は、Ｂ細胞によって活性化されたＴ細胞を用いるＩＬ−２産生のアッセイにおいて、前記位置にヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸（配列番号８）を有するＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して、ＩＣ５０が少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、最も好ましくは少なくとも２０倍低下し得る。好適なアッセイを本明細書に更に記載する。
【００２４】
安定性は、一般に、分子が折り畳まれて活性状態のままにある傾向として定義することができる。天然分子は、代謝、しばしば早い代謝が体内における内因性作用メカニズムの主要な特徴であるため、通常安定性が限られている。
【００２５】
通常、折り畳まれた天然構造にある安定なタンパク質は、プロテアーゼ又は他のメカニズムによって分解されることができない。通常、タンパク質が体内から排泄されるのは、安定状態からの２つの主要な離脱経路によるものである。これら２つはアンフォールディング及び凝集である。これらは通常連係している。アンフォールディングは、折り畳まれた活性分子をほとんど折り畳まれていない状態に戻す経路である。凝集は誤った折り畳みの結果であり、分子が不可逆的に非活性状態になる。アンフォールディング及び凝集はともにタンパク質分解又は他の消化に対するタンパク質の感受性を顕著に増加させる。本発明において、本発明者らは、得られる実体がより安定となるようにＣＴＬＡ−４のフォールディング及びアンフォールディング経路を修飾した。
【００２６】
本発明の更なる側面によれば、前記位置にヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸（配列番号８）を有するＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して安定性が改善されたＣＴＬＡ−４変異体が提供される。好ましいＣＴＬＡ−４変異体は、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号８）と比較して安定性が増加している。
【００２７】
本発明の状況において採用する安定性の程度は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で測定されるような、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、例えば１０ｍＭ  ＤＴＴ存在下におけるＣＴＬＡ−４変異体のＢ７−１又はＢ７−２への結合能と、同一ラジオイムノアッセイでＤＴＴ非存在下におけるＣＴＬＡ−４変異体のＢ７−１又はＢ７−２への結合能との比として表すことができる。ＤＴＴ非存在下及び存在下におけるＣＴＬＡ−４変異体のＢ７−１への相対結合の比較は、安定性の指標を提供する。結合を％値として測定する場合、％値が大きいほどＣＴＬＡ−４変異体の安定性が大きい。
【００２８】
前記位置にヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸（配列番号８）を有するＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して、本発明のＣＴＬＡ−４変異体は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、又は４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、又は８０％のそのような％値を有することができる。本発明のＣＴＬＡ−４変異体は、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号８）と比較してそのような％値を有することが好ましい。
【００２９】
安定性が改善された変異体は、以下に記載の実験において同定される。例えば、ＤＴＴ存在下及び非存在下におけるＢ７−１結合によって決定される％値を野生型ＣＴＬＡ−４（０％）及び３種の変異体（１１％〜７５％の範囲）に関して提供する表１を参照されたい。
【００３０】
安定性が改善された変異体は、一般に、下流のプロセシングにおいてより高い発現及びより高い収率を提供し、商品原価を改善する。更に、安定性が改善されたＣＴＬＡ−４変異体は保存期間を改善する。より長い保存期間は商品原価にも影響を及ぼすため有益である。
【００３１】
安定性が改善されたＣＴＬＡ−４変異体は、より長い半減期から生ずる、増加した有効性を体内で有することができる。更に、安定性が改善されたＣＴＬＡ−４変異体は、凝集の減少により、皮下投与などの投与経路により適しているかもしれない。これは有効性を増加させるだけでなく、中和抗体又は結合抗体が生ずる危険性を低下させる。
【００３２】
本発明によるＣＴＬＡ−４変異体は、親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して１以上の追加の変化を含有することができる。親は、野生型若しくは天然タンパク質であるか、又は１個以上の野生型とは異なるアミノ酸配列を含有する突然変異体若しくは変異体であり得る。野生型と比較して特性が修飾された、ＣＴＬＡ−４タンパク質の多くの異なる突然変異体及び変異体が（天然に生ずる突然変異体及び人工的に作製された変異体ともに）公知である。１以上のこれらの特性は、本発明によるＣＴＬＡ−４変異体において保持されるか又は提供されることができる。本発明にしたがい更に変化させることができる好ましいＣＴＬＡ−４変異体は、ベラタセプトである（非特許文献１８）。例えば本発明によるＣＴＬＡ−４変異体は、１カ所以上の前記位置に突然変異を有するベラタセプトの変異体を含むことできる。ベラタセプトの配列を配列番号９として以下に提示する。
【００３３】
本発明によって提供される好ましい変異体には、前記位置のいずれか１カ所に提供される残基が、以下の表：
【００３４】
【表２】
2010506581.tif 000003
に特定されるものから選択されるいずれかが含まれる。
【００３５】
本発明によって提供される好ましい変異体には、２６位に提供される残基がＹ以外であり、及び／又は２８位に提供される残基がＬ以外であり、及び／又は２９位に提供される残基がＦ以外であるいずれかが含まれる。したがって、本発明による好ましい変異体は、突然変異Ｓ２６Ｙ、Ｇ２８Ｌ、及び／又はＫ２９Ｆ以外のものを有することができる。本発明によって提供される好ましい変異体には、１７位、２６位、２８位、２９位、４３位、４６位、４９位、５４位、５９位、６１位、６２位、６６位、７０位、７１位、８１位、８６位、及び／又は９４位のいずれかに提供される残基が、ＣＤ２８に由来する残基に対応する残基以外であるいずれかが含まれる。
【００３６】
本発明のＣＴＬＡ−４変異体は、親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドに対して１０個以下、好ましくは５個、６個、７個、又は８個の置換を有する配列を含むことができる。親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＣＴＬＡ−４であるか、又はベラタセプトのようなその突然変異体若しくは変異体であり得る。親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、１７位、２６位、２８位、２９位、４３位、４６位、４９位、５４位、５９位、６１位、６２位、６６位、７０位、７１位、８１位、８６位、及び９４位のそれぞれにヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸（配列番号８）を有する、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４の突然変異体若しくは変異体であり得る。
【００３７】
したがって、本発明のＣＴＬＡ−４変異体は、親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドに対して個々の数の置換を有することができ、それにより、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４又はベラタセプトのような親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して改善された効力及び／又は安定性を有する。
【００３８】
より好ましくは、本発明のＣＴＬＡ−４変異体は、以下の突然変異セット：
【００３９】
【表３】
2010506581.tif 000004
から成る群より選択される置換を含む。
【００４０】
本発明にしたがう更に好ましいＣＴＬＡ−４変異体は、配列番号１、２、３、４、５、６、及び７から選択されるアミノ酸配列を有する。
効力が改善された本発明のＣＴＬＡ−４変異体は、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（配列番号８）において１カ所以上の以下の位置：１７位、２６位、２８位、２９位、５４位、５９位、６６位、７０位、７１位、８６位、及び９４位に突然変異を有することができる。
【００４１】
好ましくは、効力が改善されたＣＴＬＡ−４変異体は、１７位、２６位、２８位、２９位、５４位、５９位、６６位、７０位、７１位、８６位、及び９４位のいずれか１カ所に提供される、以下の表：
【００４２】
【表４】
2010506581.tif 000005
に特定されるものから選択される残基を有する。
【００４３】
残基２６がＰであり、残基５９がＳであり、残基７１がＦ又はＬであり、そして残基９４がＥであるＣＴＬＡ−４変異体は、配列番号８のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＣＴＬＡ−４より、Ｂ７−１及びＢ７−２に対して大きい効力を発揮する傾向があった。したがって、本発明のＣＴＬＡ−４タンパク質変異体は、残基２６がＰであり、残基５９がＳであり、残基７１がＦ又はＬであり、そして残基９４がＥであるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００４４】
本発明にしたがい改善された効力を示す更に好ましいＣＴＬＡ−４変異体は、配列番号１、２、３、及び４から選択されるアミノ酸配列を有する。
安定性が改善された本発明のＣＴＬＡ−４変異体は、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（配列番号８）において１カ所以上の以下の位置：１７位、２６位、４３位、４６位、４９位、５９位、６１位、６２位、７１位、８１位、及び９４位に突然変異を有することができる。
【００４５】
好ましくは、安定性が改善されたＣＴＬＡ−４変異体は、１７位、２６位、４３位、４６位、４９位、５９位、６１位、６２位、７１位、８１位、及び９４位のいずれか１カ所に提供される、以下の表：
【００４６】
【表５】
2010506581.tif 000006
に特定されるものから選択される残基を有する。
【００４７】
残基２６がＰであり、残基５９がＳであり、残基７１がＦであり、そして残基９４がＥであるＣＴＬＡ−４変異体は、本明細書において更に記載するように、より大きい安定性を発揮する傾向があった。したがって、本発明のＣＴＬＡ−４タンパク質変異体は、残基２６がＰであり、残基５９がＳであり、残基７１がＦであり、そして残基９４がＥであるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００４８】
本発明にしたがい改善された安定性を示す更に好ましいＣＴＬＡ−４変異体は、配列番号５、６、及び７から選択されるアミノ酸配列を有する。
好ましいＣＴＬＡ−４変異体は、ＣＴＬＡ−４の１以上のＣＤＲループの構造及び／又は方向に影響を及ぼす位置に１個以上の（例えば１個、２個、３個、４個、５個、１０個、又はそれより多い）突然変異を有することができる。そのような突然変異には、アミノ酸置換を含めることができる。
【００４９】
ＣＴＬＡ−４の１以上のＣＤＲループの構造及び／又は方向に影響を及ぼす位置における突然変異は、ＣＴＬＡ−４とＢ７分子とのあいだの結合相互作用を変更し、それにより、ＣＴＬＡ−４変異体の効力をヒト野生型ＣＴＬＡ−４と比較して変更、特に改善すると考えられる。特に好ましいのは、ＣＴＬＡ−４の１以上のＣＤＲループの構造及び／又は方向に影響を及ぼす位置における突然変異が、Ｂ７分子との適合性を改善するためのＣＤＲ３ループの変更；エネルギー的に好ましくない側鎖の除去；及びＣＴＬＡ−４とＢ７分子とのあいだの全体的な電荷相補性増加から選択されるメカニズムによって、少なくとも部分的に、効力を改善するものである変異体である。
【００５０】
１以上のＣＤＲループの構造及び／又は方向に影響を及ぼす位置は、バーニア位置として同定される位置であり得る。ＣＴＬＡ−４におけるバーニア位置及びバーニア位置の同定方法を本明細書に更に記載する。
【００５１】
好ましいＣＴＬＡ−４変異体は、野生型ヒトＣＴＬＡ−４と比較して、図５に示すバーニア位置に２個以上のアミノ酸置換を有する。図５のアラインメントを参照してわかるように、バーニア残基は、ＣＴＬＡ−４のヒト野生型アミノ酸配列（配列番号８）の以下の位置；ＩＭＧＴ  ＩｇＳＦ番号付けシステムによる対応位置番号を括弧内に示す：３（３）、１７（１８）、２６（２８）、２７（２９）、２８（３０）、２９（３１）、４７（５２）、４８（５３）、４９（５４）、６７（７６）、６９（７８）、７１（８０）、７６（８７）、９４（１０５）、９５（１０６）、１０６（１１８）に推定される。好ましいＣＴＬＡ−４変異体は、以下の：２６（２８）、２８（３０）、７１（８０）、及び９４（１０５）から選択されるバーニア位置に１個以上のアミノ酸置換を有する。以下の実施例５で更に説明するように、これら４カ所のバーニア位置は、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４と比較して効力が改善されたＣＴＬＡ−４変異体において突然変異した位置でもあった。特に好ましいＣＴＬＡ−４変異体は、Ｓ２６Ｐ、Ｇ２８Ｓ、Ｓ７１Ｌ、及びＫ９４Ｅから成る群より選択される１個以上のアミノ酸置換を有する。
【００５２】
ＣＴＬＡ−４の１以上のＣＤＲループの構造及び／又は方向に影響を及ぼす位置に突然変異を有する変異体は、本明細書に記載の突然変異を含めた１個以上の追加の突然変異を更に含む。
【００５３】
本明細書に開示の突然変異セット群のそれぞれは、特定された突然変異セット群から成る突然変異セットを有するＣＴＬＡ−４変異体内に含まれることができる。これら突然変異セット群のそれぞれは、特定された突然変異セット及び１個以上の追加の突然変異、特に本明細書に開示の１個以上の突然変異を好ましい突然変異として含むＣＴＬＡ−４変異体内に含まれることができる。
【００５４】
本発明によるポリペプチドは、例えばコードする核酸からの発現による産生後、（例えば抗体を用いて）単離し及び／又は精製することができる（これに関しては以下を参照されたい）。したがって、ポリペプチドは、汚染物質を全く含まないか実質的に含まずに提供することができる。ポリペプチドは、他のポリペプチドを含まないか実質的に全く含まずに提供することができる。単離及び／又は精製されたポリペプチドは、少なくとも１種の追加成分を含めることができる組成物、例えば医薬的に許容可能な賦形剤、ビヒクル、又は担体を含めた医薬組成物の製剤に用いることができる。本発明によるポリペプチドを含めた組成物は、以下で考察するように予防的処置及び／又は治療的処置に用いることができる。
【００５５】
本発明によるポリペプチドを作製する簡便な方法は、発現系における核酸の使用により、それをコードする核酸を発現させることである。したがって、本発明は、（開示のような）ポリペプチドの作製方法も包含するものであり、前記方法には、ポリペプチドをコードする核酸（一般に本発明による核酸）からの発現が含まれる。これは、ポリペプチドの発現を引き起こすか又は可能にする適切な条件下、培養物内でそのようなベクターを含有する宿主細胞を増殖させることによって簡便に達成することができる。ポリペプチドは、網状赤血球溶血液などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で発現させることもできる。
【００５６】
各種の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング系及び発現系は周知である。好適宿主細胞には、細菌、哺乳動物及び酵母などの真核細胞、及びバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野において利用可能な哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎細胞、ＣＯＳ細胞、及び他の多くのものが含まれる。一般的に好ましい細菌宿主は大腸菌である。プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び必要に応じて他の配列を含めた適切な調節配列を含有する好適なベクターを選択し、又は構築することができる。ベクターは、必要に応じてプラスミド、ウイルス、例えばファージ又はファージミドであり得る。更に詳細については、例えば非特許文献１９を参照されたい。核酸操作、例えば、核酸構築体の調製、突然変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入、及び遺伝子発現、並びにタンパク質解析に関する多くの公知技術及びプロトコールは、非特許文献２０に詳細に記載されている。
【００５７】
本発明のポリペプチドをコードする核酸は、本発明の更なる側面として提供される。
一般に、本発明による核酸は単離型及び／又は精製型の単離物として提供され、汚染物質を全く含まないか実質的に含まない。核酸は、全体的に又は部分的に合成物であっても、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡを含んでいてもよい。
【００５８】
核酸は複製可能ベクターの一部として提供することができ、また、本発明によって提供されるのは、本発明のＣＴＬＡ−４変異体をコードする核酸を含めたベクター、特にコードされたポリペプチドを適切な条件下で発現できる発現ベクター、及びそのようなベクター又は核酸を含有する宿主細胞である。このような状況における発現ベクターは、目的ポリペプチドをコードする核酸、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系、例えば網状赤血球溶血液において、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏ発現系、例えばＣＯＳ細胞若しくはＣＨＯ細胞などの真核細胞又は大腸菌などの原核細胞においてポリペプチドを発現させるための適切な調節配列を含めた核酸分子である。
【００５９】
本発明の更なる側面は、本明細書に開示のような核酸を含有する宿主細胞を提供するものである。本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば染色体）に組み込むことができる。組み込みは、標準技術にしたがってゲノムとの組換えを促進する配列を含めることにより促進させることができる。核酸は、細胞内の染色体外ベクター上に存在することができる。
【００６０】
更なる側面は、核酸を宿主細胞へ導入することを含めた方法を提供するものである。導入は、（特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ導入に関して）一般に、限定されるものではないが「形質転換」又は「トランスフェクション」と称するものであり得るが、利用可能な技術のいずれかを用いることができる。真核細胞では、好適技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション、リポソーム介在トランスフェクション、及びレトロウイルス又は他のウイルス、例えばワクシニアウイルス若しくは昆虫細胞であればバキュロウイルスを用いた形質導入を含めることができる。細菌細胞では、好適技術には、リン酸カルシウム形質転換法、エレクトロポレーション、及びバクテリオファージを用いたトランスフェクションを含めることができる。
【００６１】
当該技術分野において周知のように、目的核酸含有クローンを同定する上で、抗生物質耐性遺伝子又は感受性遺伝子などのマーカー遺伝子を用いることができる。
導入後、例えば宿主細胞（細胞は形質転換細胞の子孫である可能性が高いが、実際に形質転換された細胞を含んでいてもよい）を遺伝子発現条件下で培養することによって、核酸からの発現を引き起こすか又は可能にすることができ、それによりコードされたポリペプチドが産生される。ポリペプチドが適切なシグナルリーダーペプチドとカップリングして発現される場合、細胞から培地へ分泌され得る。発現による産生後、ポリペプチドは、宿主細胞及び／又は培地から単離し及び／又は精製することができ、場合によっては、その後、要望通り、例えば、１種以上の医薬的に許容可能な賦形剤、ビヒクル、又は担体（例えば以下を参照されたい）を含めた医薬組成物のように、１種以上の追加成分を含んでいてもよい組成物の製剤に用いることができる。
【００６２】
それぞれ及び全ての本明細書に開示の変異体は、コードしている核酸、そのような核酸を含むベクター、そのようなベクターを含む宿主細胞、変異体を含む組成物、ヒト又は動物の身体の治療方法に使用するための本発明の変異体、関節リウマチ、多発性硬化症、及び／又は全身性エリテマトーデスを治療するための医薬の製造における変異体の使用、変異体及び他の組成物の作製方法、本明細書に開示のような方法及び使用がそうであるように、本発明の側面を表す。
【００６３】
さらに、親タンパク質と比較して又は野生型若しくは天然タンパク質と比較して２個以上の追加の変化を含有する本発明によるＣＴＬＡ−４変異体は、１個以上の突然変異の相乗的組み合わせに起因する増加した効力又は安定性を示すことができる。
【００６４】
発現によるＣＴＬＡ−４変異体の産生後、その活性、例えばそのＢ７−１又はＢ７−２への結合能を日常的に試験することができる。
本発明の更なる側面によれば、親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して効力及び／又は安定性が改善されたＣＴＬＡ−４変異体の作製方法が提供され、前記方法は：
コードする核酸からの発現により、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（配列番号８）における２カ所以上の以下の位置：１７位、２６位、２８位、２９位、４３位、４６位、４９位、５４位、５９位、６１位、６２位、６６位、７０位、７１位、８１位、８６位、及び９４位に親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して突然変異を有するＣＴＬＡ−４変異体を作製し；そして
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して改善された効力及び／又は安定性に関してＣＴＬＡ−４変異体を試験する、
ことを含む。
【００６５】
ＣＴＬＡ−４変異体は、本明細書に開示の突然変異セットを１個以上の追加の突然変異とともに含有することができる。そのような追加の突然変異は、保存的置換を含むことができる。「保存的置換」とは、第１のアミノ酸残基を第２の異なるアミノ酸残基に置換することを意味し、ここで、第１及び第２のアミノ酸残基は類似の生物物理学的特徴を有する側鎖を有する。類似の生物物理学的特徴には、疎水性、電荷、極性、又は水素結合を提供又は受容する能力が含まれる。保存的置換の例には、セリンをスレオニン又はトリプトファンへ、グルタミンをアスパラギンへ、リジンをアルギニンへ、アラニンをバリンへ、アスパラギン酸をグルタミン酸へ、バリンをイソロイシンへ、アスパラギンをセリンへ変化させることが含まれる。
【００６６】
そのような方法は、場合により、ＣＴＬＡ−４変異体を単離及び／又は精製することを、その産生後で試験前に含めることができる。
本方法を実施する者は、親又は出発ＣＴＬＡ−４ポリペプチドのアミノ酸配列を変更することによって、例えば考察されるような１個以上のアミノ酸の置換及び／又は挿入によって、ＣＴＬＡ−４変異体を準備する先行工程を更に実施することができる。各種の異なるＣＴＬＡ−４変異体を準備し、例えば、さまざまなＣＴＬＡ−４変異体から本発明にしたがって所望される特性を有する１種以上のＣＴＬＡ−４変異体を同定するために、所望の活性について試験することができる。通常、ＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列の変更は、ＣＴＬＡ−４をコードする核酸のコード配列を変更することによってなされるであろう。１個以上のヌクレオチドを変更して、１個以上のコドン及びこれによりコードされたアミノ酸を変更することができる。本明細書のいずれかに記載のように、そして当該技術分野に熟練した者に明らかなように、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドのコード配列及びこれによりコードされたアミノ酸配列を変化させるために、突然変異誘発のための好適技術、特に定方向突然変異誘発又は部位特異的突然変異誘発を使用することができる。
【００６７】
本発明の更なる側面は、親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して効力及び／又は安定性が改善されたＣＴＬＡ−４変異体の同定方法又は入手方法を提供するものであり、前記方法は：
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドをコードする核酸を突然変異させて、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（配列番号８）における２カ所以上の以下の位置：１７位、２６位、２８位、２９位、４３位、４６位、４９位、５４位、５９位、６１位、６２位、６６位、７０位、７１位、８１位、８６位、及び９４位に変更されたアミノ酸配列を有する１種以上のＣＴＬＡ−４変異体をコードする配列を有する１種以上の核酸を準備し；
核酸を発現させてＣＴＬＡ−４変異体を産生し；
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して改善された効力及び／又は安定性に関し、産生されたＣＴＬＡ−４変異体を試験する、
ことを含む。
【００６８】
ＣＴＬＡ−４変異体のライブラリー又は多様集団を作製し、所望の能力に関して試験することができる。
突然変異を受けるＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、本明細書に開示の突然変異セットを含むことができ、配列番号１、２、３、４、５、６、及び７から選択されるアミノ酸配列を有することができる。突然変異を受けるＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号８及び９から選択されるアミノ酸配列を有することができる。
【００６９】
ライブラリー又は多様集団からの選択は、ファージディスプレイ及び／又はリボソームディスプレイなどのディスプレイシステムを使用することができる（概説として、非特許文献２１；特許文献３を参照されたい）。安定性が改善された変異体の選択は、例えば本明細書に開示のように、変異体をＤＴＴ存在下及び非存在下で作製する場合の結合又は他の活性指標の比較を含むことができる。
【００７０】
所望の特性を有する１種以上のＣＴＬＡ−４変異体を同定し又は選択することができる。
本発明のＣＴＬＡ−４変異体を同定し又は入手した後、単離型及び／又は精製型で提供することができ、要望通りに使用することができ、そして医薬的に許容可能な賦形剤又は担体などの少なくとも１種の追加成分を含む組成物に製剤化することができる。ＣＴＬＡ−４変異体をコードする核酸を用いて、その後の使用ための変異体を作製することができる。上述のとおり、そのような核酸は例えば最初に提供されたライブラリー又は多様集団から単離することができ、そしてそこからＣＴＬＡ−４変異体を作製し、同定した。
【００７１】
本発明の更なる側面によれば、親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して効力が改善されたＣＴＬＡ−４変異体の作製方法が提供され、前記方法は：
親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドの１以上のＣＤＲループの構造及び／又は方向に影響を及ぼす２カ所以上のバーニア位置を同定し；そして
２カ所以上のバーニア位置に、親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較してＣＴＬＡ−４変異体のＢ７分子への結合能を高める突然変異を提供する、
ことを含む。バーニア位置は、好ましくは、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（配列番号８）における以下の位置：２６位、２８位、７１位、及び９４位から選択することができる。親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を有するヒト野生型ＣＴＬＡ−４であるか、又はその突然変異体若しくは変異体であり得る。親ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは配列番号９のアミノ酸配列を有していてもよい。
【００７２】
本発明によるＣＴＬＡ−４変異体は、対象のヒト又は動物の身体、好ましくはヒトの診断方法又は治療方法に用いることができる。
したがって、治療方法は、提供されるようなＣＴＬＡ−４変異体の投与を含むことができ、医薬組成物はそのようなＣＴＬＡ−４変異体を含み、そして投与用医薬の製造におけるそのようなＣＴＬＡ−４変異体の使用、例えば医薬又は医薬組成物の作製方法における使用は、ＣＴＬＡ−４変異体を医薬的に許容可能な賦形剤とともに製剤化することを含む。
【００７３】
ＣＴＬＡ−４変異体を用いて治療的恩恵を提供し得る臨床的適応には、関節リウマチ、多発性硬化症、及び全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患、並びに移植が含まれる。
【００７４】
ＣＴＬＡ−４変異体は、好ましくは個体に恩恵を示すのに十分な「予防的有効量」又は「治療的有効量」（場合により、予防は療法と見なされ得るが）で投与することにより、個体に与えることができる。実際の投与量、並びに投与速度及び経時的投与は、処置されるものの性質及び重篤度に依存するであろう。処置の処方、例えば投薬量の決定などは、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内である。
【００７５】
組成物は、単独投与しても、処置すべき状態に応じて同時に又は連続的に他の処置と組み合わせてもよい。
本発明による医薬組成物、及び本発明にしたがった使用のための医薬組成物には、活性成分に加えて、医薬的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、又は当該技術分野に熟練した者に周知の他の物質を含めることができる。そのような物質は、非毒性で活性成分の有効性を妨げないものである必要がある。担体又は他の物質の厳密な性質は投与経路に依存するであろう。それは好適経路であり得るが、最もありそうなのは注射（針を使用するもの又は使用しないもの）、特に皮下注射である。他の好ましい投与経路には、吸入による投与又は経鼻投与が含まれる。
【００７６】
静脈内、皮下、又は筋肉内注射の場合、活性物質は、発熱物質を含まず、好適なｐＨ、等張性、及び安定性を有する、非経口的に許容可能な水溶液の形態であろう。当該技術分野において関連技術を有する者は、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、又は乳酸加リンゲル液などの等張ビヒクルを用いて好適な溶液を十分に調製可能である。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／又は他の添加物を含めることができる。
【００７７】
本発明の更なる側面及び態様は、以下の実施例の記載を含めた本明細書の開示を見れば、当該技術分野に熟練した者に明らかであろう。
本明細書のいずれかに記載の全ての文献は援用される。
【実施例１】
【００７８】
ＣＴＬＡ−４変異体ライブラリーの構築及び改善された効力に対する選択
ライブラリーの構築
ＣＴＬＡ−４  ｃＤＮＡはインビトロジェンから入手した。ＣＴＬＡ−４の二量体化を防ぐため、二量体化界面におけるシステイン１２１をセリンへ突然変異させた。成熟配列をリボソームディスプレイの直鎖状鋳型に再構築し、その後これをライブラリーの作製に用いた。ＤＮＡレベルでは、ｍＲＮＡへの効率的転写のためにＴ７プロモーターを５’端に付加した。ｍＲＮＡレベルでは、構築体に原核リボソーム結合部位（シャイン−ダルガーノ配列）を含有させた。３’端にｇＩＩＩの一部を付加してスペーサーとして作用させた（非特許文献２２）。製造者のプロトコールにしたがい（ＢＤバイオサイエンス）、変異性ＰＣＲを用いて変異体ライブラリーを作製したところ、エラー率は８．１ヌクレオチド突然変異／分子であった。これは、１分子あたり４個の突然変異、及びおよそ２．５×１０１０変異体分子のライブラリーを導入した。
【００７９】
改善された効力に対する選択
非特許文献２２に記載のようにして、ヒトＢ７−１（Ｒ＆Ｄシステムズ、１４０−Ｂ１）及び／又はＢ７−２（Ｒ＆Ｄシステムズ、１４１−Ｂ２）の濃度を低下させながらリボソームディスプレイ親和性に基づいた選択を行った。簡潔に言えば、各選択ラウンドに関し、ライブラリーをＢ７分子とともにインキュベーションし、Ｆｃ融合Ｂ７をプロテインＧコーティング常磁性ビーズ（ダイナル  Ｍ２８０）（登録商標）へカップリングさせ、結合した三次複合体（ｍＲＮＡ−リボソーム−ｓｃＦｖ）を磁気分離により回収し、一方、未結合複合体は洗浄により除去した。次に結合したＣＴＬＡ−４をコードするｍＲＮＡを非特許文献２２に記載のようにしてＲＴ−ＰＣＲにより取り出し、選択のあいだに存在するヒトＢ７の濃度を低下させながら（５ラウンドにわたり５０ｎＭ〜１０ｐＭ）選択プロセスを繰り返した。
【００８０】
選択によるＰＣＲ産物を、ＨＥＫ−２９３細胞で発現させるためにｐＥＵ７．１ベクターへクローニングした。簡潔に言えば、産出物をＰＣＲ増幅させて、５’端にＢｓｓＨＩＩ制限部位及び３’端にＮｏｔＩ制限部位を導入した。産物をゲルで精製し、ＮｏｔＩ及びＢｓｓＨＩＩ（ニューイングランドバイオラブス）にて２重に消化し、ゲルで精製した。消化産物をＮｏｔＩ／ＢｓｓＨＩＩで消化したｐＥＵ７．１へ連結し、大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換した。個々のコロニーを、配列決定及び発現用の調製のために９６ウェルプレートに取った。
【００８１】
第１相の親和性選択後、効力が２〜３倍改善された変異体を同定した。これら変異体のうち５種を、上記のようにして第２ランダム突然変異誘発ライブラリーの鋳型として用いた。第２相においてヒトＢ７の濃度を低下させながら（５ラウンドにわたり５ｎＭ〜７０ｆＭ）ライブラリーを選択し、上記のようにクローニングした。
【実施例２】
【００８２】
ＣＴＬＡ−４変異体の発現
単一細胞アッセイで試験するために、変異体を最初にミディアムスループット形式で発現させた。次に確認アッセイのための材料を提供するために、このうちの当たりを大規模で発現させた。
【００８３】
ＣＴＬＡ−４変異体のミディアムスループット発現及び精製
候補ＣＴＬＡ−４変異体を親野生型及びＬＥＡ２９Ｙ対照と平行して発現させた。トランスフェクションの２日前、ＨＥＫ−ＥＢＮＡ２９３細胞を、１０％ＦＢＳ（インビトロジェン、１０１００−１４７）及び１％非必須アミノ酸（インビトロジェン、１１１４０−０３５）含有Ｄ−ＭＥＭ（インビトロジェン、４１９６６）を用いて２．５×１０５／ウェルの濃度で１２ウェルプレートに蒔き、加湿インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２にて増殖させた。トランスフェクションの直前に使用済み培地を吸引し、１ｍｌ／ウェルの５％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭに交換した。トランスフェクションすべき各ウェルに対し、４μｇのプラスミドＤＮＡをＤ−ＭＥＭ中の５μｇのリポフェクタミン２０００（インビトロジェン、１１６６８−０１９）と混合し、ウェルに加える前に室温で４５分間インキュベーションした。プレートを加湿インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２にて一晩インキュベーションした。次の朝、トランスフェクション培地を吸引し、８ｍＭ  Ｌ−グルタミン（インビトロジェン、２５０３０−０２４）、２％ＨＴサプリメント（インビトロジェン、４１０６５−０１２）、１％Ｏｐｔｉｍａｂ  Ａ（インビトロジェン、１１９０８−０３５）、及び１％Ｏｐｔｉｍａｂ  Ｂ（インビトロジェン、１１９０９−０３３）を含有する１．５ｍｌ／ウェルのＣＤ−ＣＨＯ培地（インビトロジェン、１０７４３−０１１）に交換し、次に加湿インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２にて５日間インキュベーションし、増殖培地中でタンパク質を発現させた。発現後、タンパク質を含有する使用済み培地を１５００×ｇにて５分間の遠心分離によって浄化し、精製するまで４℃で保存した。９６ウェル形式のＭｉｎｉＴｒａｋ（登録商標）液体処理ロボット（パーキンエルマー）にて、ＰｈｙＴｉｐ（登録商標）プロテインＡ親和性カラム（Ｐｈｙｎｅｘｕｓ、ＰＴＰ−９２−２０−０１、樹脂床容量２０μｌ）を用いてマイクロスケールタンパク質精製を行った。浄化した粗上清をＰｈｙＴｉｐ（登録商標）カラムに通した；次にこれを２００μｌのＤ−ＰＢＳ、２００μｌの１４０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、１００μｌの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ３．０）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出させ、１００μｌの２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌで中和した。
【００８４】
ＣＴＬＡ−４変異体の大規模発現及び精製
候補ＣＴＬＡ−４変異体を親野生型及びＬＥＡ２９Ｙ対照と平行して発現させた。トランスフェクションの２日前、ＨＥＫ−ＥＢＮＡ２９３−６Ｅ細胞（Ｄｕｒｏｃｈｅｒらより入手）を０．９９％プルロニック（登録商標）（インビトロジェン、２４０４０−０３２）及び０．０５％ジェネティシン（登録商標）（インビトロジェン、１０１３１）含有フリースタイル２９３培地（インビトロジェン、１２３３８−０１８）中に５×１０５／ｍｌの濃度で蒔き、加湿振盪インキュベーター内で１２０ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２にて増殖させた。トランスフェクションの直前に細胞を１５００×ｇにて遠心分離し、次に新鮮な０．９９％プルロニック（登録商標）及び０．０５％ジェネティシン（登録商標）含有フリースタイル２９３培地に再懸濁させて１×１０６／ｍｌの濃度にした。各ＣＴＬＡ−４変異体に関し、５０ｍｌ容量のこれらの細胞を、フリースタイル２９３培地中にて５０μｇのプラスミドＤＮＡを２００μｇのポリエチレンイミン（ポリサイエンス社、直鎖状２５ｋＤａ、９００２−９８−６）と混合し、室温にて１時間インキュベーションし、５０ｍｌの細胞を含有する２５０ｍｌフラスコに加えることによってトランスフェクションした。培養物を加湿振盪インキュベーター内で１２０ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２にて５日間増殖させ、増殖培地中でタンパク質を発現させた。発現後、タンパク質を含有する使用済み培地を１５００×ｇにて５分間の遠心分離によって浄化し、精製するまで４℃で保存した。ＡＳＰＥＣ  ＸＬ４液体処理ロボット（ギルソン）を用いて精製した。０．５ｍｌ床容量のプロテインＡ樹脂（バイオセプラ、Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｐｅｒ  ＤＦ、２００７８−２８）を親和性カラムに注入し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ８．０）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化した。５０ｍｌの浄化した粗上清サンプルそれぞれを１本のプロテインＡカラムに通し、１５ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ８．０）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、１．１５ｍｌの１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で溶出させ、１００μｌの２Ｍ  Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ１０．０）で中和した。中和した溶出物を、Ｄ−ＰＢＳ（インビトロジェン、１４１９０−０９４）で平衡化したＮＡＰ−１０カラム（ＧＥヘルスケア、１７−０８５４−０１）を用いて１．５ｍｌのＤ−ＰＢＳにバッファー交換した。
【実施例３】
【００８５】
変異体及び野生型ＣＴＬＡ−４の生物活性をＪｕｒｋａｔ（Ｔ細胞）及びＲａｊｉ（Ｂ細胞）の２重細胞アッセイにて評価した
フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）存在下におけるＪｕｒｋａｔ細胞及びＲａｊｉ細胞の共培養によりＩＬ−２を産生させる。ＰＨＡはＪｕｒｋａｔ細胞上のＴＣＲを活性化し、ＣＤ２８を介した更なる必須活性化シグナルがＲａｊｉ細胞上のＢ７−１及びＢ７−２リガンドによって提供される。その後ＩＬ−２をＥＬＩＳＡで検出する。ＩＬ−２産生は、Ｒａｊｉ細胞上のＢ７−１及びＢ７−２へ結合しているＣＴＬＡ−４によって減弱化される。Ｊｕｒｋａｔ細胞はＥＣＡＣから、Ｒａｊｉ細胞はＥＣＣＡＣから入手し、供給されたプロトコールにしたがって維持した。アッセイ培地は１０％ｖ／ｖウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩで構成された。各アッセイの前に、３００×ｇにて５分間の遠心分離によってＪｕｒｋａｔ及びＲａｊｉを沈殿させ、培地を吸引除去し、最終濃度２×１０６／ｍｌとなるように細胞をアッセイ培地に再懸濁させた。ＣＴＬＡ−４変異体（２重）をアッセイ培地で所望の濃度に希釈した。このアッセイでは、変異体及び野生型をＣＴＬＡ−４−Ｆｃ型で試験したため、ＣＴＬＡ−４変異体及びＣＴＬＡ−４ヒト野生型は、１２１位にシステインを有していた。次に５０μｌの再懸濁細胞のそれぞれを、各アッセイポイントへ加え、合計アッセイ容量を２５０μｌ／ウェルとした。アッセイプレートを、５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間インキュベーションした。次に産生されたＩＬ−２を、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ユーロピウム読み出しに変換されているＤｕｏｓｅｔ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号ＤＹ２０２）で検出した。
【００８６】
ＷＴと比較して１０〜２０倍効力が改善された変異体を同定した（図１）。この改善された効力は、おそらくＢ７−１及びＢ７−２リガンドに対する親和性増加によるものである。４種の変異体の配列を配列番号１、２、３、及び４として記録する。
【実施例４】
【００８７】
ＷＴ及び変異体の各Ｂ７受容体に対する相対活性の評価
Ｒａｊｉ細胞はＢ７−１及びＢ７−２を発現する。各Ｂ７受容体に対するＣＴＬＡ−４変異体の効果を評価するために、Ｂ７−１又はＢ７−２を特異的抗体によって選択的にブロックした。４種の変異体及び野生型のＢ７−１受容体及びＢ７−２受容体に対する相対活性を、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞）及びＲａｊｉ細胞（Ｂ細胞）アッセイにおいて、ＰＨＡ存在下、それぞれ抗Ｂ７−２抗体及び抗Ｂ７−１抗体で受容体をブロックすることにより評価した。Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＲａｊｉ細胞は供給されたプロトコールにしたがって維持した。アッセイ培地は１０．０％ｖ／ｖウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩで構成された。各アッセイの前に、３００×ｇにて５分間の遠心分離によってＪｕｒｋａｔ及びＲａｊｉを沈殿させ、培地を吸引除去し、最終濃度２×１０６／ｍｌとなるように細胞をアッセイ培地に再懸濁させた。ＣＴＬＡ−４変異体（３重）をアッセイ培地で所望の濃度に希釈した。このアッセイでは、変異体及び野生型をＣＴＬＡ−４−Ｆｃ型で試験したため、ＣＴＬＡ−４変異体及びＣＴＬＡ−４ヒト野生型は１２１位にシステインを有していた。次に５０μｌの再懸濁細胞のそれぞれを、５ｎＭの抗Ｂ７−１（Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号Ｍａｂ１４０）又は抗Ｂ７−２（Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号Ｍａｂ１４１）とともに各アッセイポイントへ加え、合計アッセイ容量を２５０μｌ／ウェルとした。アッセイプレートを、５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間インキュベーションした。次に産生されたＩＬ−２を、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ユーロピウム読み出しに変換されているＤｕｏｓｅｔ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号ＤＹ２０２）で検出した。
【００８８】
４種の変異体は、野生型と比較して、Ｂ７−１（図２）及びＢ７−２（図３）に対する改善された活性を示した。Ｂ７−１及びＢ７−２に対する変異体の効力を比較すると、Ｂ７−１への結合はより大きな改善を示している。
【実施例５】
【００８９】
Ｂ７−１と相互作用するＣＴＬＡ−４変異体のモデリング
１次アミノ酸配列から、アクセルリスソフトウェア社製ＤＳ  Ｍｏｄｅｌｌｅｒ  １．１（登録商標）を用いてＣＴＬＡ−４変異体構造のモデリングを行った。簡潔に言えば、ヒトＣＴＬＡ−４及びＢ７．１の×線結晶構造１ｉ８Ｌ（非特許文献２３）において変異体ＣＴＬＡ−４の配列をＣＴＬＡ−４の配列と並べることによって、ソフトウェアで相同性モデリングを行った。モデルの可視化はＰＹＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ、２００２）を用いて行った。モデルは、ＣＴＬＡ−４変異体Ｄ０６（配列番号１）とＢ７−１との相互作用を示す図４に描写する。
【００９０】
改善された効力に関する論理的根拠
モデリングＤ０６（配列番号１）は、Ｂ７−１及びＢ７−２の結合に重要であることが知られているＣＤＲ３ループ内の残基位置にほとんど変化がないことを示している。しかしながら、構造モデルにおける突然変異の試験及び他の免疫グロブリンＶ様ドメインとの比較により、有益な突然変異は好適な作用メカニズムを有する証拠を提供している。
【００９１】
９４位における陽荷電Ｌｙｓから負荷電Ｇｌｕへの変化は、Ｂ７−１の陽荷電Ａｒｇの近位にある。理論に拘束されることを望むものではないが、この荷電の変化は、電荷斥力を除去し、Ｄ０６とＢ７−１とのあいだに塩橋を導入することによって、静電相互作用を改善し得ると考えられる。
【００９２】
ＣＴＬＡ−４構造は、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のＶ様ドメインである。ＩｇＳＦ  Ｖ様ドメインに対する標準番号付けスキームが提唱されている（非特許文献２４）。これには、ＣＴＬＡ−４、及びアミノ酸配列におけるアミノ酸の相違が大きいにもかかわらず同一のＩｇ構造の折り畳みを共有する他の抗体が含まれる。この折り畳みは、βターン又はループによって連結され、ジスルフィド結合によって２相に安定化された逆平行β鎖の約１００アミノ酸から成る。抗体及びＣＴＬＡ−４はともに、大部分の標的結合相互作用に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）ループを有する。抗体に関する研究により、ＣＤＲの標的への適合を微調整可能な残基セットが同定されている。これらの残基は「バーニア」残基として公知である（非特許文献２５）。抗体可変領域の３次元構造においてバーニア残基はＣＤＲループの下に層を形成し、ＣＤＲループの構造及び方向に影響を及ぼすことができるため、それらは効果を発揮する。ＣＴＬＡ−４及び抗体バーニア残基をＩｇＳＦ番号付けスキームで並べると（図５）、４個の突然変異がバーニア位置内に生じている。バーニア残基はＰｒｏ２６、Ｓｅｒ２８、Ｌｅｕ７１、及びＧｌｕ９４である。したがって、Ｄ０６における６個の突然変異のうち４個はバーニア位置内にある。この顕著な発見は予想外のものであった。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの有益な突然変異はＣＤＲ３における本質的な側鎖接触を変更しないが、より微妙なアプローチを介して作用し得ると考えられる。これは、Ｂ７分子との適合を改善するためのＣＤＲ３ループの確認の変更、エネルギー的に好ましくない側鎖の除去、又は全体的な電荷相補性増加などの数種のメカニズムを包含し得るであろう。ＣＤＲ３を変更するＣＤＲ１領域の可能性は、非特許文献２６に記載されている。残基Ｐｒｏ２６及びＳｅｒ２８はＣＤＲ１内にあり、バーニア残基でもあるため、ＣＴＬＡ−４とＢ７−１とのあいだの適合を変更する役割を支援する。突然変異Ｓｅｒ５９は、バーニア残基と相同性があるとは同定されなかったが、ループ確認に関与する構造決定残基として記載された他の抗体Ｖ様ドメイン残基セットと一致する（非特許文献２７）。Ｓｅｒ５９はＣＤＲループ２の構造を変更するであろう。
【００９３】
したがって、ＣＴＬＡ−４のＣＤＲループの構造及び方向に影響を及ぼすことができる位置の残基、特にバーニア位置の残基は、ＣＴＬＡ−４変異体の効力に影響すると予想される。
【実施例６】
【００９４】
安定性が改善されたＣＴＬＡ−４変異体の選択
実施例１に記載の第２相ライブラリーを改善された安定性に関して選択した。ＣＴＬＡ−４変異体及びヒト野生型は１２１位にセリンを有しているため単量体型であった。ＤＴＴの存在下及び非存在下にて、非特許文献２８に記載のようにしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳及び選択を実施した。安定性によって選択されたライブラリーをＢ７−１とともにインキュベーションした後、融合タンパク質を捕捉し、磁気分離により結合複合体を回収し、一方、未結合複合体は洗浄により除去した。次に、結合したＣＴＬＡ−４変異体をコードするｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより回収し、選択プロセスを繰り返した。ＤＴＴ濃度を増加させて３ラウンドの選択を行った。
【００９５】
ラウンド３のＰＣＲ産物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現ベクターｐＩＶＥＸ２．３ｄ（ロシュ）へクローニングした。簡潔に言えば、ＮｃｏＩ再増幅プライマー及びＮｏｔＩ再増幅プライマーを用いて産出物をＰＣＲ増幅し、５’端にＮｃｏＩ制限部位を、３’端にストップコドンと、直後にＮｏｔＩ制限部位を導入した。ストップコドンは、タグのない変異体ＣＴＬＡ−４の発現を可能にした。産物をゲルで精製し、ＮｏｔＩ及びＮｃｏＩ（ニューイングランドバイオラブズ）で２重に消化し、ゲルで精製した。消化産物を、ＮｏｔＩ／ＮｃｏＩで消化したｐＩＶＥＸ２．３ｄへ連結し、大腸菌ＴＧ１細胞を形質転換した。スクリーニング及び配列決定のために個々のコロニーを９６ウェルプレートへ取り出した。
【実施例７】
【００９６】
１次安定性ＲＩＡにおける単一ＣＴＬＡ−４変異体のスクリーニング
１次安定性ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）を用い、非特許文献２８に記載のようにしてＣＴＬＡ−４変異体を安定性についてスクリーニングした。簡潔に言えば、各変異体に関し、直鎖状ＤＮＡ鋳型を増幅させ、転写し、ｍＲＮＡをＧ２５セファデックス（登録商標）カラムで精製し、定量した。各変異体に関し、３５Ｓ−標識メチオニン存在下におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を３０℃で３０分間にて２重に設定し、一方は非還元条件、他方は１０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）中とした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び翻訳と同一濃度のＤＴＴを含有するＰＢＳで翻訳を停止させた。翻訳混合物を、Ｂ７−１でコーティングしたプレート上で１時間室温にてインキュベーションした。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有ＰＢＳにて３回、ＰＢＳにて３回洗浄した。残留放射能を０．１Ｍトリエチルアミンで溶出させ、液体シンチレーションカウンターで定量した。変異体の安定性の程度を％残留結合として、即ち、ＤＴＴ存在下における結合シグナルをＤＴＴ非存在下における結合シグナルで割り、１００を掛けて計算した。変異体が安定であるほど、％残留結合は大きい。
【００９７】
４種の変異体を試験し、このうち３種のＣＴＬＡ−４変異体をＷＴよりも安定であると同定した（表１）。
【００９８】
【表６】
2010506581.tif 000007
ＣＴＬＡ−４変異体の配列解析
ラウンド３のＣＴＬＡ−４変異体を配列決定した。３種のより安定な変異体の配列を、配列番号５、６、及び７として以下に記載する。
【図４】
2010506581.tif 000011
【図５】
2010506581.tif 000012
【図１】
2010506581.tif 000013
【図２】
2010506581.tif 000014
【図３】
2010506581.tif 000015
【配列表】
2010506581000001.app
【国際調査報告】
2010506581.tif 000016
2010506581.tif 000017
2010506581.tif 000018
2010506581.tif 000019
2010506581.tif 000020