(57)【要約】  本発明は、三官能性擬ペプチド試薬、特に生物発光試薬、または必要に応じて蛍光バイオコンジュゲートを調製するためのその様々な使用、固体支持体に官能化するための前記試薬およびバイオコンジュゲートの使用、ならびにそうして官能化した固体支持体を問題分子の検出に使用することに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも以下の３つの反応性構造単位Ａ、ＢおよびＣ、すなわち、
（ａ）少なくとも１個のアミド官能基により割り込まれ、２つの末端Ｅ１およびＥ２を有する擬ポリエチレングリコールの親水性鎖から構成され、前記末端Ｅ１は、フリーであり、アミノ基、活性化カルバメート、および活性化エステルから選択される末端単位を含み、前記末端Ｅ２は、カルボニル官能基の一部である末端炭素原子を含み、前記炭素原子は、単位Ｂによって保持されるα−アミン官能基の窒素原子と一緒に形成されるアミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）官能基に含まれる単位Ａ、
（ｂ）ＬもしくはＤ系列のα−アミノ酸およびそのラセミ混合物から選択されるアミノ酸から構成され、前記アミノ酸は、その側鎖に、保護基によって保護された少なくとも１個のオキシアミン官能基、または少なくとも１個のマスクされたアルデヒド官能基を有する単位Ｂ、
（ｃ）ＬもしくはＤ系列のα−アミノ酸およびそのラセミ混合物から選択されるアミノ酸から構成され、前記アミノ酸は、その側鎖に、少なくとも１個のチオール、マレイミド、ヨードアセチル、アジド、真のアルキン、ホスファン、またはシクロオクチン単位を有する単位Ｃ
を含み、前記単位ＢおよびＣは、単位Ｂを構成するα−アミノ酸のカルボニル官能基の一部である炭素原子と、単位Ｃを構成するα−アミノ酸のα−アミン官能基の窒素原子とで形成されるアミド官能基によって連結されていることを特徴とする擬ペプチド三官能性試薬。
【請求項２】
単位Ａの擬ポリエチレングリコール鎖が、以下の式（Ａ−Ｉ）の鎖
【化１】
2010533291.tif 000026
［式中、
Ｒ１は、第一級アミン、活性化カルバメート単位、または活性化エステル単位を表し、
ｍおよびｎは、同一または異なり、２以上１０以下の整数であり、
ｐは、１以上１０以下の整数であり、
矢印は、擬ポリエチレングリコール鎖の末端Ｅ２のアミド官能基を単位ＢまたはＣに連結する共有結合を表す］から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の三官能性試薬。
【請求項３】
擬ポリエチレングリコール鎖が、ｍ＝ｎ＝２であり、ｐ＝１である式（Ａ−Ｉ）の擬ポリエチレングリコール鎖から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の三官能性試薬。
【請求項４】
活性化カルバメート基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、Ｎ−ヒドロキシフタルイミジルカルバメート、Ｎ−ヒドロキシピペリジルカルバメート、ｐ−ニトロフェニルカルバメート、およびペンタフルオロフェニルカルバメートから選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の三官能性試薬。
【請求項５】
活性化カルバメート基がＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートであることを特徴とする、請求項４に記載の三官能性試薬。
【請求項６】
活性化エステル基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、シアノメチルエステル、Ｎ−ヒドロキシフタルイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシピペリジルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ベンゾトリアゾールエステル、ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、およびヒドロキシアザベンゾトリアゾールエステルから選択されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の三官能性試薬。
【請求項７】
活性化エステル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルであることを特徴とする、請求項６に記載の三官能性試薬。
【請求項８】
単位Ｂに使用することのできるα−アミノ酸が、リシン、ホモリシン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、および２，３−ジアミノプロパン酸から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の三官能性試薬。
【請求項９】
単位Ｂのα−アミノ酸がリシンであることを特徴とする、請求項８に記載の三官能性試薬。
【請求項１０】
単位Ｃに使用することのできるα−アミノ酸が、リシン、システイン、ホモリシン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロパン酸、アミノメルカプト酢酸、ホモシステイン、５−メルカプトノルバリン、６−メルカプトノルロイシン、２−アミノ−７−メルカプトヘプタン酸、および２−アミノ−８−メルカプトオクタン酸から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の三官能性試薬。
【請求項１１】
単位Ｃのα−アミノ酸がリシンまたはシステインであることを特徴とする、請求項１０に記載の三官能性試薬。
【請求項１２】
単位Ｂを構成するα−アミノ酸の側鎖のオキシアミン官能基の保護基が、９−フルオレニルメトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、トリクロロエトキシカルボニル、トリメチルシリルエトキシカルボニル、ピリジルジチオエトキシカルボニル、２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル、アゾメチルオキシカルボニル、２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル、アゾメチルオキシカルボニル、２−（トリメチルシリル）エタンスルホニル、およびフタルイミド基から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の三官能性試薬。
【請求項１３】
以下の式（Ｉ）の化合物
【化２】
2010533291.tif 000027
［式中、
Ｒ１、ｍ、ｎおよびｐは、式（Ａ−Ｉ）の単位について請求項２または３で定義したものと同じ意味を有し、
Ｘ１およびＸ２は、同一または異なり、これらが結合している炭素原子と一緒になって、α−アミノ酸の炭化水素ベース鎖を表し、
Ｐｒｏｃは、９−フルオレニルメトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、トリクロロエトキシカルボニル、トリメチルシリルエトキシカルボニル、ピリジルジチオエトキシカルボニル、２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル、アゾメチルオキシカルボニル、２−（トリメチルシリル）エタンスルホニル、およびフタルイミドから選択される保護基であり、
Ｆｏｎｃは、チオール、マレイミド、ヨードアセチル、アジド、真のアルキン、ホスファン、またはシクロオクチン単位である］から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の三官能性試薬。
【請求項１４】
Ｘ１がｎ−ブチル鎖であることを特徴とする、請求項１３に記載の三官能性試薬。
【請求項１５】
Ｘ２がエチル鎖またはｎ−ブチル鎖であることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の三官能性試薬。
【請求項１６】
式（Ｉ）の化合物が以下の式（Ｉ−１）から（Ｉ−６）の化合物から選択されることを特徴とする、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の試薬。
【化３−１】
2010533291.tif 000028
【化３−２】
2010533291.tif 000029
【請求項１７】
バイオコンジュゲートを調製するための、前記請求項のいずれか一項に記載の少なくとも１種の三官能性試薬の使用。
【請求項１８】
単位Ａを構成する擬ポリエチレングリコール鎖のフリー末端に存在する第一級アミン、活性化カルバメート、もしくは活性化エステル単位、および／またはそれぞれその脱保護、その脱マスク後の、単位Ｂによって保持されるオキシアミンもしくはアルデヒド官能基が、問題の生物学的分子によって官能化されている、請求項１から１６のいずれか一項に記載の三官能性試薬からなることを特徴とするバイオコンジュゲート。
【請求項１９】
問題の生物学的分子が、抗体、核酸分子およびその類似物、多糖、タンパク質、ペプチド、放射性核種、毒素、酵素阻害剤、ならびにハプテンから選択されることを特徴とする、請求項１８に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２０】
ｉ）単位Ａを構成する擬ポリエチレングリコール鎖のフリー末端に存在する第一級アミン官能基のみまたは活性化カルバメートもしくは活性化エステル単位のみが生物学的分子によって官能化されている三官能性試薬によって構成されたバイオコンジュゲート、
ｉｉ）単位Ｂの脱保護されたオキシアミンまたは脱マスクされたアルデヒド官能基のみが生物学的分子によって官能化されている三官能性試薬によって構成されたバイオコンジュゲート、および
ｉｉｉ）単位Ａを構成する擬ポリエチレングリコール鎖のフリー末端に存在する第一級アミン官能基または活性化カルバメートもしくは活性化エステル単位と、単位Ｂの脱保護されたオキシアミンまたは脱マスクされたアルデヒド官能基が、互いに同一または異なる生物学的分子によってそれぞれ官能化されている三官能性試薬によって構成された、二つの生物学的分子を含むバイオコンジュゲート
から選択されることを特徴とする、請求項１８または１９に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項２１】
発光試薬調製のための、請求項１から１６のいずれか一項に記載の少なくとも１種の三官能性試薬の使用。
【請求項２２】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の三官能性試薬からなり、脱保護されたオキシアミン官能基もしくは脱マスクされたアルデヒド官能基を介して単位Ｂに、またはチオール官能基、またはマレイミド、ヨードアセチル、真のアルキン、ホスファン、シクロオクチン、そうでなければアジド単位を介して単位Ｃに結合している単一の発光基（Ｌ）を含むことを特徴とする三官能性発光試薬。
【請求項２３】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の三官能性試薬からなり、一方が脱保護されたオキシアミン官能基または脱マスクされたアルデヒド官能基を介して単位Ｂに結合しており、他方がチオール官能基、またはマレイミド、ヨードアセチル、真のアルキン、ホスファン、シクロオクチン、そうでなければアジド単位を介して単位Ｃに結合している２つの発光基を含むことを特徴とする三官能性発光試薬。
【請求項２４】
１つまたは複数の発光基が、ポリメチン鎖を含むフルオロフォア；蛍光シアニン；フルオレセインおよびその誘導体；ローダミンおよびその誘導体；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの形のローダミンの水溶性誘導体；ロドールおよびその誘導体；クマリン誘導体；反応性アミンを含む蛍光色素；二フッ化ジピロメテンホウ素；ピレン由来のフルオロフォア；ジアゾ誘導体；ダンシル誘導体；エオシン；エリスロシン、ならびにスルホローダミン誘導体から選択されることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の三官能性発光試薬。
【請求項２５】
エネルギー移動カセット調製のための、請求項１から１６のいずれか一項に記載の少なくとも１種の三官能性試薬の使用。
【請求項２６】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の三官能性試薬から構成され、前記試薬は、発光基（Ｌ）と、発光基からの発光を受け入れるアクセプター化合物（Ｑ）とを含み、ＬおよびＱは、単位Ｂの脱保護されたオキシアミンまたは脱マスクされたアルデヒド官能基、また単位Ｃのチオール官能基、またはマレイミド、ヨードアセチル、真のアルキン、ホスファン、シクロオクチン、そうでなければアジド単位を介して前記三官能性試薬に個々にかつ無関係に結合していることを特徴とするエネルギー移動カセット。
【請求項２７】
発光基（Ｌ）が、ポリメチン鎖を含むフルオロフォア；蛍光シアニン；フルオレセインおよびその誘導体；ローダミンおよびその誘導体；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの形のローダミンの水溶性誘導体；ロドールおよびその誘導体；クマリン誘導体；反応性アミンを含む蛍光色素；二フッ化ジピロメテンホウ素；ピレン由来のフルオロフォア；ジアゾ誘導体；ダンシル誘導体；エオシン；エリスロシン、ならびにスルホローダミン誘導体から選択されることを特徴とする、請求項２６に記載のカセット。
【請求項２８】
アクセプター化合物（Ｑ）が、請求項２７で列挙した発光基（Ｌ）、アゾ色素のファミリーの非蛍光分子、金粒子、ジアゾ色素、マラカイトグリーン、およびシアニンのファミリーのアクセプター化合物から選択されることを特徴とする、請求項２５または２６に記載のカセット。
【請求項２９】
発光基（Ｌ）とアクセプター化合物（Ｑ）が、以下の（Ｌ／Ｑ）ペア、すなわち、Ｃｙ３／Ｃｙ５、Ｃｙ５／Ｃｙ７、Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、Ｃｙ３／Ｃｙ５Ｑ、Ｃｙ３／ＱＳＹ（登録商標）７、Ｃｙ３／ＱＳＹ（登録商標）９、Ｃｙ５／Ｃｙ７Ｑ、Ｃｙ５／ＱＳＹ（登録商標）２１、Ｃｙ５／Ｃｙ５、Ｃｙ５．５／Ｃｙ５．５、Ｃｙ７／Ｃｙ７、Ｒ６）／Ｃｙ５、Ｒ６Ｇ／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ｒ６Ｇ／ＱＳＹ（登録商標）２１、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２／Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２／ＱＳＹ（登録商標）２１、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５／Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５／ＱＳＹ（登録商標）２１から選択されることを特徴とする、請求項２５から２８のいずれか一項に記載のカセット。
【請求項３０】
少なくとも１つの生物学的分子と少なくとも１つの発光基とを含む混合型バイオコンジュゲートを調製するための、請求項１から１６のいずれか一項に記載の三官能性試薬の使用。
【請求項３１】
少なくとも１つの生物学的分子および少なくとも１つの発光基が結合している、請求項１から１６のいずれか一項に記載の三官能性試薬からなることを特徴とする混合型バイオコンジュゲート。
【請求項３２】
発光基からの発光を受け入れるアクセプター化合物（Ｑ）も含むことを特徴とする、請求項３１に記載の混合型バイオコンジュゲート。
【請求項３３】
ｉ）１または２個の問題の生物学的分子および発光基、または
ｉｉ）１個の問題の生物学的分子および２個の発光基、
ｉｉｉ）１個の問題の生物学的分子、１個の発光基、および発光基からの発光を受け入れる１個のアクセプター化合物（Ｑ）
が結合している三官能性試薬から選択され、
前記生物学的分子、前記発光基、および前記アクセプター化合物（Ｑ）は、単位Ａ、ＢおよびＣの終末端で官能性試薬に結合していることを特徴とする、請求項３１または３２に記載の混合型バイオコンジュゲート。
【請求項３４】
１個または複数のカルボニル含有基または１個または複数のオキシアミン官能基をそれぞれ有する少なくとも１つの表面を含む固体支持体に官能化するための、単位Ｃが発光基によって必要に応じて改変されており、単位Ｂのオキシアミンまたはアルデヒド官能基がそれぞれフリーである、請求項１から１６、１８から２０、２２、２４、３１、および３３のいずれか一項に記載の三官能性試薬またはバイオコンジュゲートの使用。
【請求項３５】
請求項１から１６、１８から２０、２２、２４、３１、および３３のいずれか一項に記載の、１つまたは複数の三官能性試薬、および／または１つまたは複数のバイオコンジュゲートによって共有結合性に官能化されており、前記三官能性試薬およびバイオコンジュゲートは、単位Ｃが発光基によって必要に応じて改変されていることを特徴とする少なくとも１つの表面を含むことを特徴とする固体支持体。
【請求項３６】
少なくとも１つのバイオコンジュゲートによって官能化された少なくとも１つの表面を含み、したがってバイオチップまたはバイオセンサーの構成要素となることを特徴とする、請求項３５に記載の固体支持体。
【請求項３７】
問題分子を検出するための、請求項３５または３６に記載の支持体の使用。
【請求項３８】
機能プロテオミクスを目的とするプローブを調製するための、請求項１から１６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの三官能性試薬の使用。
【請求項３９】
ターゲットタンパク質の検出（もしくは可視化）および／または精製を可能にする基（レポータータグ）と、
前記ターゲットタンパク質によって認識される単位（認識単位）と、
ターゲットタンパク質の活性部位と共に共有結合の確立を可能にする反応性基（反応性基）と
を含む請求項１から１６のいずれか一項に記載の三官能性試薬から構成されることを特徴とする機能プロテオミクス用プローブ。
【請求項４０】
ターゲットタンパク質が酵素であることを特徴とする、請求項３９に記載のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、擬ペプチド三官能性試薬、特に発光試薬または場合により発光バイオコンジュゲートを調製するための、その様々な使用、これらの試薬を固体支持体の官能化のためのバイオコンジュゲート中に使用すること、さらにまた、こうして官能化された固体支持体を問題分子の検出に使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体高分子（核酸、タンパク質、多糖など）に由来するバイオコンジュゲートを活用する多くの適用は、これらのバイオコンジュゲートを第二の分子構造（生体高分子、固体支持体など）に共有結合的に結合させ（可逆的または不可逆的結合）、その分子構造を精密に検出および／または定量化する（光学的検出、放射性検出など）ことができるものである。したがって、その結果でありターゲットである分子構造に含まれるパートナーそれぞれの特徴をあまり大きく損なうことなく、生体高分子を他の（マクロ）分子と効果的に結合させることを可能にするツールを手にすることが不可欠である。
【０００３】
この目的では、多くの二官能性小分子（「二価性架橋試薬」という表現の方がよく知られている）が開発されている。大多数がＰｉｅｒｃｅ社によって販売されている。しかし、興味深いことに、いくつかの学究的な集団が、ますます精巧であり、かつますます複雑なバイオコンジュゲートの生成を可能にする、新規な二官能性試薬の開発に取り組み続けている。
【０００４】
以前から述べられているとおり、２つでなく３つの直交機能（すなわち各機能を、ターゲットであるパートナーと選択的に反応させることができる）を有することが時に不可欠となる。したがって、三官能性試薬の開発が求められる。
【０００５】
このように、様々なタイプの三官能性試薬の使用が、たとえば、Ａｌｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻、６１２６〜６１２７頁およびＳｉｎｚ，Ａ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００５年、第１６巻、１９２１〜１９３１頁の論文にすでに記載されており、そうした三官能性試薬の中でも、特に、Ｐｉｅｒｃｅ社（米国イリノイ州ロックフォード）から入手可能な、タンパク質／タンパク質相互作用の研究のためのＳｕｌｆｏ−ＳＢＥＤ、すなわちスルホスクシンイミジル−２−［６−（ビオチンアミド）−２−（ｐ−アジドベンズイミダゾ）ヘキサノアミド］エチル−１，３’−ジチオプロピオネートが挙げられる。この三官能性試薬は、反応性アミンと光反応性部位から構成される。Ｓｕｌｆｏ−ＳＢＥＤは以下の構造を有する。
【０００６】
【化１】
2010533291.tif 000002
【０００７】
しかし、Ｓｕｌｆｏ−ＳＢＥＤは、その疎水性／親水性の性質を調節することが不可能であり、また特に、第三の官能性単位（すなわちビオチン）が、アビジン（糖タンパク質）またはストレプトアビジンに予め結合させたパートナーとしか強い（擬共有結合性の）相互作用を可能にせず、完全に満足なものではなく、このことがその使用を大いに限定している。
【０００８】
三官能性試薬は、特に国際出願ＷＯ００／０２０５０にもすでに記載されているが、この試薬は、３つの異なるリンカーによって、親和性リガンド、生体分子に関して反応性の基、およびエフェクター薬剤に結合している、トリアミノベンゼン、トリカルボキシベンゼン、ジカルボキシアニリン、およびジアミノ安息香酸から選択される三官能性の中心単位から構成されるバイオコンジュゲートの調製を可能にするものである。しかし、この試薬は、少なくとも２つの同一の化学的官能基（すなわちカルボン酸またはアミン官能基）から構成される三官能性中心単位を有するために、リンカーによって保持される相補的な官能基の選択が制限され、限定的な効果しかもち得ないという弱点を有する。
【０００９】
特に、不均一系の免疫蛍光法による分析物の検出についての他の適用では、三官能性試薬（トライポッド）の使用がすでに提案されており、この試薬は、３つの異なる官能性ポール、すなわち発光基（Ｌ）と、検出しようとする分析物、その類似体または断片から選択される分子（Ｂ）と、最後に、前記三官能性試薬を固体支持体の表面に確実に結合させる官能基とを含む（特に、ＦＲ２８４７９８４の番号で公開されているフランス特許出願およびＶｏｌｌａｎｄ，Ｈ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００５年、第７７巻、１９８６〜１９０４頁の対応する論文を参照されたい）。しかし、これらの試薬は、すべてのタイプの適用で使用することはできない。
【００１０】
これまでより正確な新規な技術の開発には、これまでより精巧なバイオコンジュゲートの作製および使用が必要であるが、現在市場で入手可能な二官能性または三官能性試薬では実現が容易でない（または不可能でさえある）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第００／０２０５０号
【特許文献２】ＦＲ２８４７９８４
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ａｌｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻、６１２６〜６１２７頁
【非特許文献２】Ｓｉｎｚ，Ａ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００５年、第１６巻、１９２１〜１９３１頁
【非特許文献３】Ｖｏｌｌａｎｄ，Ｈ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００５年、第７７巻、１９８６〜１９０４頁
【非特許文献４】Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９６年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．
【非特許文献５】Ｓｉｎｇ，Ｙ．ら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００６年、第４巻、１４１３〜１４１９頁
【非特許文献６】Ｚａｔｓｅｐｉｎ，Ｔ．Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２００５年、第１６巻、４７１〜４８９頁
【非特許文献７】Ｒｅｎｓｅｎ，Ｐ．Ｃ．Ｎ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００４年、第４７巻、５７９８〜５８０８頁
【非特許文献８】Ｄｏｎｄｏｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００５年、第７０巻、５５０８〜５５１８頁
【非特許文献９】Ｄｈａｗａｎ，Ｒ．ら  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２０００年、第１１巻、１４〜２１頁
【非特許文献１０】Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｋ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、２００４年、第１４巻、１１０５〜１１０８頁
【非特許文献１１】Ｒａｃｈｅｌｅ，Ｊ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９６３年、第２８巻、２８９８頁
【非特許文献１２】Ｈａｎ，Ｓ．−Ｙ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２００４年、第６０巻、２４４７〜２４６７頁
【非特許文献１３】Ｃｉｐｏｌｌａ  Ｌ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．ｃｈｅｍ．、２００２年、第１０巻、１６３９〜１６４６頁
【非特許文献１４】Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９７８年、第１００巻、３５８５〜３５９０頁
【非特許文献１５】Ｋｅｌｌｅｒ  Ｏ．ら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９７５年、第５８巻、５３１〜５４１頁
【非特許文献１６】Ｋｎｏｒｒ，Ｒ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９８９年、第３０巻、１９２７〜１９３０頁
【非特許文献１７】Ｋｏｎｉｇ，Ｗ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．、１９７０年、第１０３巻、７８８〜７９８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、これらすべての弱点を克服するため、特に、各官能基の性質を非常に多種多様にすることが可能である新規なファミリーの三官能性試薬を提供して、生体高分子と他の（マクロ）分子との効果的な結合を、その結果でありターゲットである分子構造中に含まれる各パートナーの特徴をあまり大きく損なうことなく実施できるようにするために、本発明者らは、本発明の対象物を開発した。より詳細には、本発明者らは、バイオコンジュゲートを生体高分子や固体支持体などの第二の分子構造に共有結合（可逆的または不可逆的結合）させることを可能にする三官能性試薬を提供することをその目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明の第一の主題は、少なくとも以下の３つの反応性構造単位Ａ、ＢおよびＣ、すなわち、
（ａ）少なくとも１個のアミド官能基により割り込まれ、２つの末端Ｅ１およびＥ２を有する擬ポリエチレングリコールの親水性鎖（擬ＰＥＧ鎖）から構成され、前記末端Ｅ１は、フリーであり、アミノ基（−ＮＨ２）、活性化カルバメート、および活性化エステルから選択される末端単位を含み、前記末端Ｅ２は、カルボニル官能基の一部である末端炭素原子を含み、前記炭素原子は、単位Ｂによって保持されるα−アミン官能基の窒素原子と一緒に形成されるアミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）官能基に含まれる単位Ａ、
（ｂ）ＬもしくはＤ系列のα−アミノ酸およびそのラセミ混合物から選択されるアミノ酸から構成され、前記アミノ酸は、その側鎖に、保護基によって保護された少なくとも１個のオキシアミン官能基、または少なくとも１個のマスクされたアルデヒド官能基を有する単位Ｂ、
（ｃ）ＬもしくはＤ系列のα−アミノ酸およびそのラセミ混合物から選択されるアミノ酸から構成され、前記アミノ酸は、その側鎖に、少なくとも１個のチオール、マレイミド、ヨードアセチル、アジド、真のアルキン、ホスファン、またはシクロオクチン単位を有する単位Ｃ
を含み、前記単位ＢおよびＣは、単位Ｂを構成するα−アミノ酸のカルボニル官能基の一部である炭素原子と、単位Ｃを構成するα−アミノ酸のα−アミン官能基の窒素原子とで形成されるアミド官能基によって連結されていることを特徴とする擬ペプチド三官能性試薬である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
これらの構造の主な独創性は、その側鎖が選択された保護基によって保護されている（天然または改変）アミノ酸と、その長さを容易に調節することができる、官能化された擬ＰＥＧ鎖の組合せにある。これらの試薬の調製の際、いくつかの（保護されたまたは無保護の）化学的官能基の存在が必然的に問題となるとしても（官能基同士の不適合、時期尚早の脱保護、および／または特定の保護基の分解など）、その構造が、３つの別個の構造単位に分けられる（互いに独立して調製され、次いで三官能性試薬製造の最終ステップの際につなぎ合わされる）ために、互いに不適合の化学的単位が同時に存在することが可能な限り制限された、大いに集中的な合成戦略が可能になる。さらに、三官能性試薬の３つの構造単位の１つを改変するだけで、際立った構造上の多様性（幾何学的配置、長さ、物理化学的性質、および特に溶解性などの調節）が得られる。
【００１６】
本発明によれば、表現「擬」ＰＥＧ鎖とは、ＰＥＧ鎖
【００１７】
【化２】
2010533291.tif 000003
【００１８】
と構造が際立って類似しているが、鎖内に１個または複数の官能基（エステル、アミド、カルバメート、尿素など）が存在する点で異なっている鎖を意味すると理解される。
【００１９】
本発明によれば、用語「真の」アルキンとは、三重結合がＲ基で一置換されているアルキン：
【００２０】
【化３】
2010533291.tif 000004
【００２１】
を意味すると理解される。
【００２２】
本発明による三官能性試薬を構成する３つの反応性構造単位では、穏和な条件下（特に、生体高分子が可溶性となる水性媒体中）で完全に化学選択的な反応を実施することが可能になる。
【００２３】
単位Ａを構成する擬ＰＥＧ鎖のフリーの末端Ｅ１に存在する場合もある活性化カルバメートまたは活性化エステル単位は、アミン官能基（一般に脂肪族第一級アミン）などの相補的な反応性単位を有する化合物に関して反応性となる。さらに、その代わりとして単位Ａを構成する擬ＰＥＧ鎖のフリーの末端Ｅ１に存在する場合のある第一級アミン官能基は、活性化カルバメートまたはエステルなどの相補的な単位を有する化合物に関して反応性となる。この末端Ｅ１によって、特に、前記の相補的な反応性官能基を自然にまたはそうでなく含む生物学的なマクロ分子（抗体、核酸または類似物、多糖、タンパク質、ペプチド、放射性核種、毒素、酵素阻害剤、ハプテンなど）の結合が可能になる。
【００２４】
単位Ｂの基は、関わる様々なパートナーの安定性と適合性のある穏和な条件下での必要に応じた活性化後、すなわち、オキシアミン官能基の場合では脱保護の後、またはアルデヒド官能基の場合では脱マスク後、１個または複数のカルボニル含有基（アルデヒドなど）またはその代わりとしてアミノ基を有する化合物または材料に関して反応性となる。そのような化合物の中でも、特に、抗体、核酸または類似物、リポソーム、多糖、タンパク質、ペプチド、活性成分、放射性核種、毒素、フルオロフォア、酵素阻害剤、ハプテンなどのマクロ分子を挙げることができる
単位Ｃを構成するα−アミノ酸の考えられる側鎖置換基として定義されるチオール単位は、マレイミド単位またはヨードアセチル単位を含む化合物または材料に関して反応性である。単位Ｃを構成するα−アミノ酸の考えられる側鎖置換基として定義されるマレイミド単位およびヨードアセチル単位は、チオール官能基またはシステインを有する、その必要に応じた脱保護後の化合物または材料に関して反応性である。最後に、単位Ｃを構成するα−アミノ酸の考えられる側鎖置換基として定義されるアジド単位は、真のアルキン、ホスファン、またはシクロオクチン単位を有する化合物または材料に関して反応性であり、あるいは単位Ｃを構成するα−アミノ酸の考えられる側鎖置換基として定義される真のアルキン、ホスファン、またはシクロオクチン単位は、アジド単位を有する化合物または材料に関して反応性である。この反応部位は、特に、単位Ｃ上に存在するチオール、マレイミド、ヨードアセチル、アジド、真のアルキン、ホスファン、またはシクロオクチン単位に関して反応性である相補的な官能基を有するフルオロフォア基の結合に使用することができる。
【００２５】
本発明の特定の一実施形態によれば、単位Ａの擬ＰＥＧ鎖は、以下の式（Ａ−Ｉ）の鎖から選択される。
【００２６】
【化４】
2010533291.tif 000005
【００２７】
［式中、
−  Ｒ１は、第一級アミン、活性化カルバメート単位、または活性化エステル単位を表し、
−  ｍおよびｎは、同一または異なり、２以上１０以下の整数であり、
−  ｐは、１以上１０以下の整数であり、
−  矢印は、擬ＰＥＧ鎖の末端Ｅ２のアミド官能基を単位ＢまたはＣに連結する共有結合を表す。］
本発明の好ましい一実施形態によれば、擬ＰＥＧ鎖は、ｍ＝ｎ＝２であり、ｐ＝１である、上記式（Ａ−Ｉ）の擬ＰＥＧ鎖から選択される。
【００２８】
単位Ａの擬ＰＥＧ鎖の末端Ｅ１に存在してもよい活性化カルバメート基の中でも、特に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、Ｎ−ヒドロキシフタルイミジルカルバメート、Ｎ−ヒドロキシピペリジルカルバメート、ｐ−ニトロフェニルカルバメート、およびペンタフルオロフェニルカルバメートを挙げることができ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートが格別に好ましい。
【００２９】
単位Ａの擬ＰＥＧ鎖の末端Ｅ１に存在してもよい活性化エステル基の中でも、特に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、シアノメチルエステル、Ｎ−ヒドロキシフタルイミジルエステル、Ｎ−ヒドロキシピペリジルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ベンゾトリアゾールエステル、ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、およびヒドロキシアザベンゾトリアゾールエステルを挙げることができ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルが特に好ましい。
【００３０】
単位Ｂに使用することのできるα−アミノ酸の中でも、特に、リシン、ホモリシン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸（ＤＡＢＡ）、および２，３−ジアミノプロパン酸を挙げることができる。
【００３１】
このようなα−アミノ酸の中でも、リシンが特に好ましい。
【００３２】
単位Ｃに使用することもできるα−アミノ酸の中でも、特に、リシン、システイン、ホモリシン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸（ＤＡＢＡ）、２，３−ジアミノプロパン酸、アミノメルカプト酢酸、ホモシステイン、５−メルカプトノルバリン、６−メルカプトノルロイシン、２−アミノ−７−メルカプトヘプタン酸、および２−アミノ−８−メルカプトオクタン酸を挙げることができる。
【００３３】
このようなアミノ酸の中でも、リシンおよびシステインが特に好ましい。
【００３４】
単位Ｂを構成するα−アミノ酸の側鎖のオキシアミン官能基用の保護基は、穏和な条件下で不安定な保護基、たとえば、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）、トリメチルシリルエトキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）、ピリジルジチオエトキシカルボニル（Ｐｙｄｅｃ）、２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル（ＮＰＰＯＣ）、アゾメチルオキシカルボニル（Ａｚｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エタンスルホニル（Ｓｅｓ）、およびフタルアミドから選択されることが好ましい。
【００３５】
このような保護基の中でも、Ｆｍｏｃ基およびフタルアミド基が特に好ましい。
【００３６】
本発明の意味の範囲内では、表現「マスクされたアルデヒド官能基」とは、セリン、または１，２−ジオール（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−）、１，２−アミノアルコール、もしくは１，２−ヒドロキシチオール単位を含む任意の有機分子から選択される有機分子中に含まれた任意のアルデヒドまたはケトン官能基を意味すると理解される。このような有機分子の中でも、特に、酒石酸、グリセリン酸、２，３−ジヒドロキシプロパン酸、３，４−ジヒドロキシブタン酸、４，５−ジヒドロキシペンタン酸、および３−アミノ−２−ヒドロキシプロパン酸を挙げることができる。
【００３７】
本発明の意味の範囲内では、表現「穏和な条件」とは、オキシアミン官能基の脱保護またはアルデヒド官能基の脱マスク用の試薬の使用を、周囲温度、かつ中性ｐＨまたはおよそ５から９までの間のｐＨ範囲で実施することを意味すると理解される。
【００３８】
脱保護または脱マスク試薬として、特に、過ヨウ素酸（ＨＩＯ４）、メタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）やメタ過ヨウ素酸カリウム（ＫＩＯ４）などのメタ過ヨウ素酸塩、さらにまた過ヨウ素酸テトラアルキルアンモニウムを挙げることができる。
【００３９】
本発明による三官能性試薬の中でも、特段に、以下の式（Ｉ）の化合物から選択されるものを挙げることができる。
【００４０】
【化５】
2010533291.tif 000006
【００４１】
［式中、
−  Ｒ１、ｍ、ｎおよびｐは、式（Ａ−Ｉ）の単位について上で定義したのと同じ意味を有し、
−  Ｘ１およびＸ２は、同一または異なり、これらが結合している炭素原子と一緒になって、α−アミノ酸の炭化水素ベース鎖を表し、
−  Ｐｒｏｃは、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）、トリメチルシリルエトキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）、ピリジルジチオエトキシカルボニル（Ｐｙｄｅｃ）、２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル（ＮＰＰＯＣ）、アゾメチルオキシカルボニル（Ａｚｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エタンスルホニル（Ｓｅｓ）、およびフタルイミドから選択される保護基であり、
−  Ｆｏｎｃは、チオール、マレイミド、ヨードアセチル、アジド、真のアルキン、ホスファン、またはシクロオクチン単位である。］
本発明の特に好ましい一実施形態によれば、Ｘ１はｎ−ブチル鎖である。
【００４２】
本発明の別の特に好ましい実施形態によれば、Ｘ２はエチル鎖またはｎ−ブチル鎖である。
【００４３】
本発明の特に好ましい一実施形態によれば、上記式（Ｉ）の化合物は、以下の式（Ｉ−１）から（Ｉ−６）の化合物から選択される。
【００４４】
【化６−１】
2010533291.tif 000007
【００４５】
【化６−２】
2010533291.tif 000008
【００４６】
本発明による三官能性試薬は、集中的な合成方法に従って調製することができ、この方法によれば、単位Ａ、ＢおよびＣのそれぞれを個々に調製し、次いでこれらを組み立てて、想定した三官能性試薬とする。このような集中的な合成方法では、当業者によく知られている従来の反応を使用するが、その詳細は、本出願を例示する合成実施例で示す。
【００４７】
その三官能性によって、本発明による上述の試薬は、いくつもの使用および適用を有し得る。
【００４８】
本発明による三官能性試薬は、第一に、バイオコンジュゲートの調製に使用することができる。
【００４９】
したがって、本発明の別の主題は、予め定義した、少なくとも１種の三官能性試薬のバイオコンジュゲートの調製への使用である。
【００５０】
本発明の意味の範囲内では、用語「バイオコンジュゲート」は、前述のような任意の三官能性試薬が、少なくとも１種の問題の生物学的分子に結合したものを意味すると理解される。
【００５１】
１種または複数の問題分子の結合は、酸（もしくはカルバメート）官能基または反応性アミン官能基（一般に脂肪族第一級アミン）を有する生物学的分子に関して反応性である、単位Ａを構成する擬ＰＥＧ鎖のフリー末端に存在する第一級アミン官能基、活性化カルバメート単位、または活性化エステル単位の箇所で実施することができる。
【００５２】
問題の生物学的分子の結合は、オキシアミン官能基の脱保護またはアルデヒド官能基の脱マスク後に、１個または複数のカルボニル含有基（アルデヒドなど）またはオキシアミン基をそれぞれ有する生物学的分子に関して反応性になる単位Ｂで実施することもできる。
【００５３】
したがって、本発明による三官能性試薬によって、同一または異なる１つまたは２つの生物学的分子を結合させることが可能である。
【００５４】
本発明による三官能性試薬に結合させることのできる生物学的分子の中でも、特に、抗体、核酸分子およびその類似物、多糖、タンパク質、ペプチド、放射性核種、毒素、酵素阻害剤、ハプテンなどを挙げることができる。
【００５５】
したがって、本発明の別の主題は、単位Ａを構成する擬ＰＥＧ鎖のフリー末端に存在する第一級アミン、活性化カルバメート、もしくは活性化エステル単位、および／またはそれぞれその脱保護、その脱マスク後の、単位Ｂによって保持されるオキシアミンもしくはアルデヒド官能基が、問題の生物学的分子によって官能化されている、以前に定義した三官能性試薬からなること特徴とするバイオコンジュゲートである。
【００５６】
したがって、本発明によれば、以下の３タイプのバイオコンジュゲート、すなわち、
ｉ）単位Ａを構成する擬ＰＥＧ鎖のフリー末端に存在するアミン官能基のみまたは活性化カルバメートもしくは活性化エステル単位のみが生物学的分子によって官能化されている三官能性試薬によって構成されたバイオコンジュゲート、
ｉｉ）単位Ｂの脱保護されたオキシアミンまたは脱マスクされたアルデヒド官能基のみが生物学的分子によって官能化されている三官能性試薬によって構成されたバイオコンジュゲート、および
ｉｉｉ）単位Ａを構成する擬ＰＥＧ鎖のフリー末端に存在する第一級アミン官能基、活性化カルバメート単位、または活性化エステル単位と、単位Ｂの脱保護されたオキシアミンまたは脱マスクされたアルデヒド官能基が、それぞれ生物学的分子によって官能化されている三官能性試薬によって構成された、２つの生物学的分子を含むバイオコンジュゲートを有することが可能であり；後者の場合、バイオコンジュゲートは、互いに同一でも異なっていてもよい２つの生物学的分子を含む。同一であるが、２種の異なるマーカーによって修飾されている２種の生物学的分子は、特に問題になる場合がある。
【００５７】
このようなバイオコンジュゲートの調製は、本発明による三官能性試薬を、結合しようとする生物学的分子または問題分子と反応させることにより、従来法で実施することができ、その際は、たとえば以下のもの、すなわち、
−  活性化カルバメートまたは活性化エステルとアミン官能基（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９６年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）または
−  オキシアミン官能基とカルボニル含有基（Ｓｉｎｇ，Ｙ．ら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００６年、第４巻、１４１３〜１４１９頁、またはＺａｔｓｅｐｉｎ，Ｔ．Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２００５年、第１６巻、４７１〜４８９頁）
を反応させる従来技術のよく知られた方法を使用する。
【００５８】
本発明による三官能性試薬は、発光試薬、特に蛍光試薬の調製に使用することもできる。
【００５９】
したがって、本発明の別の主題は、少なくとも１種の以前に定義した三官能性試薬を、発光試薬、特に蛍光試薬の調製に使用することである。
【００６０】
この場合では、発光基（Ｌ）のグラフトを、
ｉ）単位Ｃによって保持されるチオール、マレイミド、ヨードアセチル、アジド、真のアルキン、ホスファン、またはシクロオクチン単位を、前記発光基によって自然にまたはそうでなく保持されている相補的なマレイミドもしくはヨードアセチル官能基（単位Ｃがチオール官能基を含む場合）、チオール官能基（単位Ｃがマレイミドもしくはヨードアセチル単位を含む場合）、または真のアルキン、ホスファン、もしくはシクロオクチン官能基（単位Ｃがアジド官能基を含む場合）、そうでなければアジド官能基（単位Ｃが真のアルキン、ホスファン、もしくはシクロオクチン官能基を含む場合）と反応させること、
および／または
ｉｉ）単位Ｂの脱保護されたオキシアミンまたは脱マスクされたアルデヒド官能基を、アルデヒドもしくはケトン官能基などのカルボニル含有官能基を有する発光基、またはオキシアミン官能基それぞれを有する発光基と反応させるステップ
によって実施することができる。
【００６１】
このような２つの例では、必要に応じて、発光基を予め官能性化してから、反応させたい官能基に相補的な単位と反応させることが必要なこともある。
【００６２】
このような発光試薬の調製は、当業者に知られている反応に従って従来法で実施することができる。
【００６３】
したがって、
ｉ）脱保護されたオキシアミン官能基もしくは脱マスクされたアルデヒド官能基によって単位Ｂに、あるいはチオール官能基、またはマレイミド、ヨードアセチル、真のアルキン、ホスファン、シクロオクチン、そうでなければアジド単位によって単位Ｃに結合している単一の発光基、
ｉｉ）一方が、脱保護されたオキシアミン官能基または脱マスクされたアルデヒド官能基によって単位Ｂに結合しており、他方が、チオール官能基、またはマレイミド、ヨードアセチル、真のアルキン、ホスファン、シクロオクチン、そうでなければアジド単位によって単位Ｃに結合している２つの発光基
を含む発光試薬を得ることが可能である。
【００６４】
このような三官能性発光試薬は、本発明の別の主題となる。
【００６５】
本発明に従って使用することができる１つまたは複数の発光基の性質は、発光基が、チオールもしくはカルボニル含有官能基、またはそうでなければマレイミド、ヨードアセチル、真のアルキン、ホスファン、シクロオクチン、そうでなければアジド単位を自然に含むか、またはこれらによって官能性化されている限り、重要でない。
【００６６】
本発明によれば、表現「発光基」とは、所与の波長でまたは所与の化合物によって励起されたとき、光子を放射することができる任意の物質、たとえばフルオロフォア、または希土類元素を意味すると理解される。
【００６７】
本発明に従って使用することができる（フルオロフォアを含めた）発光基の中でも、特に、ポリメチン鎖（すなわちポリエン鎖）を含むフルオロフォア；蛍光シアニン、たとえば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社によってＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７の参照記号で販売されているもの；フルオレセイン（フルオレセインナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｔｅ））およびその誘導体、たとえばイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）や６−カルボキシフルオレセイン（６−Ｆａｍ）；ローダミンおよびその誘導体、たとえばイソチオシアン酸テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの形のローダミンの水溶性誘導体、たとえば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によってＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）の商品名で販売されている製品、たとえばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）製品４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０−Ｘ、６３３、６４７、６６０、６８０、７００、７５０、および７９０；ロドールおよびその誘導体；７−アミノクマリンなどのクマリン誘導体；９−アミノアクリジンおよび９−アクリジンカルボン酸；反応性アミンを含む蛍光色素、たとえば６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサン酸（ＡＭＣＡ）のスクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）の商品名で販売されている二フッ化ジピロメテンホウ素、たとえば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．社（米国）によって販売されているＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＲ−Ｂｒ２、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ならびにＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０（励起波長／放射波長（ｎｍ））、５５８／５６７、５６４／５７０、５７６／５８９、５８１／５９１、６３０／６５０および６５０／６６５；ピレン由来のフルオロフォア、たとえばＣａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ色素（たとえばＴｒｉｌｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって販売されている）；ＤＡＢＣＹＬ（登録商標）などのジアゾ誘導体；ＥＤＡＮＳ（登録商標）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、ＢＥ）などのダンシル誘導体；エオシン；エリスロシンならびにスルホローダミン誘導体、たとえば、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄの名称でも知られているスルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １０１  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を挙げることができる。
【００６８】
本発明による三官能性試薬は、発光試薬、特に発光基からの発光を受け入れる「アクセプター化合物」（Ｑ）を含む蛍光試薬の調製に使用することもできる。この場合では、こうした試薬は、特にＤＮＡ配列決定に使用することのできるエネルギー移動カセット（またはＦＲＥＴカセット）として一般に知られているものの構成要素となる。
【００６９】
したがって、本発明の別の主題は、少なくとも１種の以前に定義した三官能性試薬をエネルギー移動カセットの調製に使用することである。
【００７０】
この場合では、発光基が、単位Ｂの脱保護されたオキシアミンまたは脱マスクされたアルデヒド官能基に、あるいは単位Ｃのチオール官能基、またはマレイミド、ヨードアセチル、真のアルキン、ホスファン、シクロオクチン、そうでなければアジド単位を介してグラフト化され、アクセプター化合物（Ｑ）が、単位Ｃのチオール官能基、またはマレイミド、ヨードアセチル、真のアルキン、ホスファン、シクロオクチン、そうでなければアジド単位を介して、あるいは単位Ｂの脱保護されたオキシアミンまたは脱マスクされたアルデヒド官能基にそれぞれグラフト化される。
【００７１】
したがって、本発明の別の主題は、以前に定義した三官能性試薬から構成され、前記試薬は、発光基（Ｌ）と、発光基からの発光を受け入れるアクセプター化合物（Ｑ）とを含み、ＬおよびＱは、単位Ｂの脱保護されたオキシアミンまたは脱マスクされたアルデヒド官能基を介して、また単位Ｃのチオール官能基、またはマレイミド、ヨードアセチル、真のアルキン、ホスファン、シクロオクチン、そうでなければアジド単位を介して、個々にかつ無関係に前記三官能性試薬に結合していることを特徴とするエネルギー移動カセットである。
【００７２】
このような２つの例では、必要に応じて、アクセプター化合物（Ｑ）を予め官能性化してから、反応させたい官能基と相補的な単位と反応させることが必要なこともある。
【００７３】
このようなエネルギー移動カセット中に使用することのできる発光基（Ｌ）は、特に、前述した発光基（Ｌ）、および本発明による三官能性発光試薬の調製に使用することのできる発光基（Ｌ）から選択されるものでよい。
【００７４】
本発明によれば、表現「アクセプター化合物」（Ｑ）とは、特定の条件下で発光基（Ｌ）からの発光の弱化または消失を可能にする任意の分子を意味すると理解される。様々な性質のこの化合物は、特に、化合物（発光または発光でない、たとえば蛍光タンパク質など）、重元素、またはナノ粒子でよい。
【００７５】
そのようなアクセプター化合物（Ｑ）の中でも、特に、Ｌ基について上述したものなどの蛍光化合物、特にローダミンおよびその誘導体、たとえばテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、色素のＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、およびＱＳＹ（登録商標）２１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）；それに加えてアゾ染料ファミリーの非蛍光分子、たとえば、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（ＢＨＱ）の商品名で販売されている化合物、たとえばＢＨＱ−０、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；商品名Ｎａｎｏｇｏｌｄ  Ｐａｒｔｉｃｕｌｅｓ（登録商標）（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）で販売されている直径が１．５ｎｍのものなどの金粒子；ジアゾ染料、たとえば、商品名Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＱＳＹ（登録商標）３５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で販売されている製品；市販品のＥｌｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）；マラカイトグリーン；ならびにシアニンのファミリーのアクセプター化合物（「消光剤」）、たとえば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社によってＣｙ５ＱまたはＣｙ７Ｑの商品名で販売されている化合物を挙げることができる。
【００７６】
このようなエネルギー移動カセットの特に有利な一実施形態によれば、発光基（Ｌ）とアクセプター化合物（Ｑ）は、以下の（Ｌ／Ｑ）ペア、すなわち、Ｃｙ３／Ｃｙ５、Ｃｙ５／Ｃｙ７、Ｃｙ５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、Ｃｙ３／Ｃｙ５Ｑ、Ｃｙ３／ＱＳＹ（登録商標）７、Ｃｙ３／ＱＳＹ（登録商標）９、Ｃｙ５／Ｃｙ７Ｑ、Ｃｙ５／ＱＳＹ（登録商標）２１、Ｃｙ５／Ｃｙ５、Ｃｙ５．５／Ｃｙ５．５、Ｃｙ７／Ｃｙ７、Ｒ６）／Ｃｙ５、Ｒ６Ｇ／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ｒ６Ｇ／ＱＳＹ（登録商標）２１、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２／Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２／ＱＳＹ（登録商標）２１、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５／Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５／ＱＳＹ（登録商標）２１から選択される。
【００７７】
本発明の別の特定の実施形態によれば、三官能性試薬は、少なくとも１つの生物学的分子と少なくとも１つの発光基とを含む混合型バイオコンジュゲートの調製に使用することができる。
【００７８】
したがって、本発明の別の主題は、少なくとも１つの生物学的分子および少なくとも１つの発光基が結合している以前に定義した三官能性試薬からなることを特徴とする混合型バイオコンジュゲートである。さらに、このような混合型バイオコンジュゲートは、発光基（Ｌ）からの発光を受け入れるアクセプター化合物（Ｑ）も含んでよい。
【００７９】
したがって、このような混合型バイオコンジュゲートは、
ｉ）１または２個の問題の生物学的分子および発光基、または
ｉｉ）１個の問題の生物学的分子および２個の発光基、
ｉｉｉ）１個の問題の生物学的分子、１個の発光基、および発光基からの発光を受け入れる１個のアクセプター化合物（Ｑ）
が結合している三官能性試薬から選択され、
前記生物学的分子、前記発光基、および前記アクセプター化合物（Ｑ）は、上述のような単位Ａ、ＢおよびＣの終末端で官能性試薬に結合している。
【００８０】
単位Ｃが発光基によって改変されているかまたは改変されておらず、単位Ｂのオキシアミンまたはアルデヒド官能基がそれぞれフリーである（すなわち、問題の生物学的分子、蛍光基、またはアクセプター化合物によって官能化されていない）、本発明による三官能性試薬およびバイオコンジュゲートは、１個または複数のカルボニル含有基、特に１個または複数のアルデヒドもしくはケトン官能基、または１個または複数のオキシアミン官能基をそれぞれ有する少なくとも１つの表面を含む固体支持体の官能化に使用することができる。
【００８１】
したがって、本発明の別の主題は、１つまたは複数の三官能性試薬および／または１つまたは複数のバイオコンジュゲートによって共有結合性に官能化された少なくとも１つの表面を含み、前記三官能性試薬およびバイオコンジュゲートは、単位Ｃが発光基によって、以前に定義したとおりに必要に応じて修飾されていることを特徴とする固体支持体である。
【００８２】
本発明によれば、固体支持体の性質は、固体支持体が、自然にまたは化学修飾後に、１個または複数のカルボニル含有基、特に１個または複数のアルデヒドもしくはケトン官能基、または１個または複数の第一級アミン官能基をそれぞれ有する少なくとも１つの表面を含み、前記基または官能基が、三官能性試薬またはバイオコンジュゲートの単位Ｂの脱保護されたオキシアミン官能基または脱マスクされたアルデヒド官能基とそれぞれ反応し得る限り、重要でない。
【００８３】
そのような支持体の中でも、特に、ガラス、プラスチック、および金属を挙げることができる。
【００８４】
本発明の特定の一実施形態によれば、固体支持体は、少なくとも１つのバイオコンジュゲートによって官能化された少なくとも１つの表面を含み、したがってバイオチップ、たとえば核酸チップ、タンパク質チップ、多糖チップ、またはペプチドチップ、そうでなければバイオセンサー、たとえばイムノセンサーの構成要素となる。
【００８５】
このような支持体は、
−  本発明による少なくとも１つの三官能性試薬または少なくとも１つのバイオコンジュゲートの単位Ｂ上に存在する、保護されたオキシアミン官能基の脱保護またはマスクされたアルデヒド官能基の脱マスクをそれぞれ実施して、脱保護されたオキシアミン、脱マスクされたアルデヒド官能基をそれぞれ有する三官能性試薬またはバイオコンジュゲートを得るステップと、
−  脱保護されたオキシアミンまたは脱マスクされたアルデヒド官能基をそれぞれ有する前記試薬または前記バイオコンジュゲートを、その少なくとも１つの表面が１個または複数のカルボニル含有基、第一級アミン基をそれぞれ有する固体支持体と接触させることにより、オキシム結合を形成し、前記オキシム結合によって、前記試薬または前記バイオコンジュゲートを支持体表面に共有結合性に結合させるステップと
を含む方法に従って調製することができる。
【００８６】
このような支持体は特に、問題分子の検出、特に液体培地中の分析物の検出に使用することができる。
【００８７】
別の実施形態によれば、本発明の別の主題は、少なくとも１種の前述のような三官能性試薬を、機能プロテオミクスを目的としたプローブの調製に使用することである。
【００８８】
したがって、本発明の別の主題は、
−  ターゲットタンパク質の検出（もしくは可視化）および／または精製を可能にする基（レポータータグ）と、
−  前記ターゲットタンパク質によって認識される単位（認識単位）と、
−  ターゲットタンパク質の活性部位と共に共有結合の確立を可能にする反応性基（反応性基）と
を含む三官能性試薬から構成されていることを特徴とする機能プロテオミクス用プローブである。
【００８９】
本発明によれば、表現「前記ターゲットタンパク質によって認識される単位」とは、ターゲットタンパク質の任意のリガンドまたはそれが酵素であるときは任意の基質（たとえばペプチド配列）を意味すると理解される。
【００９０】
本発明の好ましい一実施形態によれば、ターゲットタンパク質は酵素である。
【００９１】
機能プロテオミクス用のこのようなプローブの第一の実施形態によれば、ターゲットタンパク質が酵素であるとき、酵素によって認識される単位と、その酵素の活性部位との共有結合を可能にする反応性基は、同じ存在物に属し（たとえば、医薬品化学で使用される不可逆的阻害剤および／または自殺基質がその例である）、したがって本発明による擬ペプチド三官能性試薬の同じ単位によって保持される。この場合では、前記三官能性試薬の他の２つの単位を使用して、検出を可能にする基（たとえば、フルオロフォア）、および精製を容易にする基（ビオチン、ポリヒスチジンタグなど）に結合させることができる。この実施形態によれば、３種の存在物は、本発明による擬ペプチド三官能性試薬の任意の単位に無関係に結合させることができる。
【００９２】
機能プロテオミクス用のこのようなプローブの第二の実施形態によれば、ターゲットタンパク質が酵素であるとき、酵素によって認識される単位と反応性基は、同じ存在物に属さず、したがって本発明による擬ペプチド三官能性試薬の２つの異なる単位によって保持される。この場合では、これらを互いに最も近い２つの単位（ＢおよびＣ）に結合させて、反応性基の反応が、ターゲットとされる（活性）部位で確実に起こるようにすることが好ましい。したがって、本発明による擬ペプチド三官能性試薬の最後の単位は、検出および／または精製を可能にする基の結合に使用される。
【００９３】
前述の条項のほかに、本発明は、以下の記述から明らかになる他の条項も含み、それによって本発明による三官能性試薬を合成する実施例に言及する。
【実施例１】
【００９４】
本発明による三官能性試薬の調製
この実施例に記載するのは、本発明による三官能性試薬（Ｉ−１）の合成であり、以下の式（Ｉ−１）に対応する。
【００９５】
【化７】
2010533291.tif 000009
【００９６】
［式中、
−  単位Ａは、第一級アミン官能基を有する化合物に関して反応性である活性化カルバメート単位を有する擬ＰＥＧタイプのリンカーであり、
−  単位Ｂは、その側鎖上に、Ｆｍｏｃ基によって保護されたオキシアミン官能基を有するリシンであり、オキシアミン官能基は、アルデヒド官能基を有する表面に関して反応性であり、
−  単位Ｃは、その側鎖上に、チオール官能基を有する化合物に関して反応性であるマレイミド単位を有するリシンである。］
化合物（Ｉ−１）の合成戦略は、正しく保護された３種の前駆体（Ａ−１）、（Ｂ−１）および（Ｃ−１）を別々に調製し、次いでこれらを結合反応によって組み立てて、本発明による上記式（Ｉ−１）の三官能性試薬を得ることにある。
【００９７】
１）前駆体（Ａ−１）：Ｂｏｃ−ＰＥＧタイプのリンカーアームの合成
【００９８】
【化８】
2010533291.tif 000010
【００９９】
前駆体（Ａ−１）は、４個のエチレングリコール単位と、さらに（Ｂ−１）単位、（Ｃ−１）単位、および第一級アミン官能基との後続の結合を可能にするカルボン酸官能基とを有する親水性リンカーであり、「活性化カルバメート」に変換する最後のステップまで保護しておくことが不可欠である。この前駆体は、２分子の８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸を組み合わせることにより得られ、前記分子は、Ｒｅｎｓｅｎ，Ｐ．Ｃ．Ｎ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００４年、第４７巻、５７９８〜５８０８頁；Ｄｏｎｄｏｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００５年、第７０巻、５５０８〜５５１８頁、またはＤｈａｗａｎ，Ｒ．ら  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２０００年、第１１巻、１４〜２１頁に記載の方法に従って調製された。次いで、このアミノ酸は、たとえばＮａｋａｔａｎｉ，Ｋ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、２００４年、第１４巻、１１０５〜１１０８頁、またはＲａｃｈｅｌｅ，Ｊ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９６３年、第２８巻、２８９８頁に記載の方法に従って、２種の保護された誘導体（Ｎ−Ｂｏｃ（６）およびメチルエステル（７）誘導体）に変換するが、これを、たとえばＨａｎ，Ｓ．−Ｙ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２００４年、第６０巻、２４４７〜２４６７頁に記載の方法に従ってつなぎ合わせることができ、けん化後に、所望の前駆体（Ａ−１）を得た。
【０１００】
ａ）第１ステップ：２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エタノール（３）の合成
【０１０１】
【化９】
2010533291.tif 000011
【０１０２】
アジ化ナトリウム（０．７ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）およびヨウ化ナトリウム（０．１４ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）の無水エタノール懸濁液に、１．２９ｍＬ（８．９ｍｍｏｌ）の２−（２−（２−クロロエトキシ）エトキシ）エタノールを加えた。得られる黄色の混合物を、アルゴン雰囲気中で５日間加熱還流した。ジクロロメタン／メタノール（９：１、ｖ／ｖ）溶媒混合物を使用する薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（ＭｅｒｃｋによってＤＣ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４の参照記号で販売されている供給品）を用いて、反応が完了したことを確認した。次いで、混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）５４５で濾過してナトリウム塩を除去し、次いで蒸発させた。得られる油性の残渣を約１０ｍＬのジクロロメタンに溶解させ、次いで温度４℃で１時間保存した。脱脂綿で濾過し、濃縮した後、所望の化合物（３）を無色の油状物の形で得た（定量的収率）。
1H NMR分析(300 MHz, CDCl3): δ = 2.63 (t, J = 6.0 Hz, 1H, OH), 3.43 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 3.61-3.77 (m, 10H).
【０１０３】
ｂ）第２ステップ：２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）酢酸（４）の合成
【０１０４】
【化１０】
2010533291.tif 000012
【０１０５】
前述のステップで上記のように得た化合物（３）１．５６ｇ（８．９ｍｍｏｌ）を９０ｍＬのアセトンに溶解させ、得られる溶液を温度４℃に冷却した。次いで、（たとえば、２６．７２ｇのＣｒＯ３を２３ｍＬの濃硫酸に溶解させ、次いで体積が１００ｍＬになるまで水を加えることにより）新たに調製した３ＭのＪｏｎｅｓ試薬８．９ｍＬを滴下し（緑色の沈殿が直ちに生成した）、次いで、得られる反応混合物を周囲温度で１時間撹拌した。前述のステップのように、ＴＬＣを使用して反応が完了したかを点検し、約４ｍＬのプロパン−２オールを加えて反応を停止した。１５分後、１００ｍＬのアセトンを加え、Ｃｒ（ＩＩＩ）塩の緑色の沈殿をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）５４５での濾過によって除去した。次いで濾液を蒸発乾燥した。得られる油性残渣を、勾配をかけたジクロロメタン中メタノール（０→５％）を移動相として使用する、シリカゲル（５０ｇ）カラムでのクロマトグラフィーによって精製した。１．５３ｇ（８．１ｍｍｏｌ）の化合物（４）を黄色の油状物（収率９１％）の形で得た。
1H NMR分析(300 MHz, CDCl3): δ = 3.43 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 3.66-3.80 (m, 6H), 4.19 (s, 2H).
13C NMR分析(75.5 MHz, CDCl3): δ = 50.7; 68.6; 70.2; 70.6; 71.4; 174.2.
【０１０６】
ｃ）第３ステップ：２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）酢酸（５）の合成
【化１１】
2010533291.tif 000013
【０１０７】
前述のステップで上記のように得た１．５３ｇ（８．２ｍｍｏｌ）の化合物（４）と２．５ｍＬ（６６．５ｍｍｏｌ）のギ酸の混合物を１５０ｍＬのエタノールに溶解させ、次いで、得られた溶液を温度４℃に冷却した。１０％のＰｄを含有する０．３２ｇのパラジウム／炭（Ｐｄ／Ｃ）をこの溶液に加え、得られる反応混合物を水素雰囲気中にて周囲温度で１２時間撹拌した。次いで、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）／メタノール（ＭｅＯＨ）の８：２（ｖ／ｖ）混合物を使用する以外は前述のステップのように、ＴＬＣによって反応が完了したことを確認し、次いで混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）５４５で濾過して、Ｐｄ／Ｃを除去した。次いで、濾液を、油性残渣が得られるまで蒸発乾燥し、それを真空中で乾燥させて、所望の化合物（５）を黄色の油状物の形で得た（定量的収率）。
【０１０８】
ｄ）第４ステップ：２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）酢酸メチルエステル（６）の合成
【０１０９】
【化１２】
2010533291.tif 000014
【０１１０】
前述のステップで上記のように得た化合物（５）０．４８ｇ（２．９２ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの２，２−ジメトキシプロパン懸濁液に投入し、次いで２．９２ｍＬの濃塩酸（３７％ＨＣｌ）を加えた。得られる反応混合物を周囲温度で１時間撹拌し続けた。次いで、８０：２０：２（ｖ／ｖ／ｖ）のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／トリエチルアミンの混合物を使用するＴＬＣによって反応が完了したことを確認し、次いで混合物を蒸発乾燥した。次いで、得られる油性の残渣を、各回１０ｍＬの浸透水（ｏｓｍｏｓｅｄ  ｗａｔｅｒ）を加えながらの４回の連続的な凍結乾燥操作にかけて、所望の生成物を黄色の油状物の形で最終的に得た（定量的収率）。
1H NMR分析(300 MHz, CD3CN + 5% D2O): δ = 3.08 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.56-3.76 (m, 11H), 4.13 (s, 2H).
【０１１１】
ｅ）第５ステップ：２−（２−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノエトキシ）エトキシ）酢酸（７）の合成
【０１１２】
【化１３】
2010533291.tif 000015
【０１１３】
ステップｃ）で上記のように得た化合物（５）０．７８ｇ（３．７５ｍｍｏｌ）を１２ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）／Ｈ２Ｏ（２：１、ｖ／ｖ）混合物に溶解させた。次いで、新たに調製した２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液５ｍＬを加え、得られた溶液を４℃に冷却した。次いで、０．８９ｇ（４．１２ｍｍｏｌ）の二炭酸ジ−ｔブチルを加え、反応混合物を周囲温度で１時間撹拌し続けた。次いで、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（７：３、ｖ／ｖ）混合物を使用するＴＬＣによって、反応が完了したことを確認した。次いで、１Ｍの硫酸水素カリウム（ＫＨＳＯ４）水溶液２５ｍＬを加えて、反応混合物を酸性化した。次いで、この溶液を５０ｍＬの酢酸エチル３ロットで抽出した。有機相を硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、次いで蒸発乾燥した。得られる油性の残渣を、勾配をかけたＣＨ２Ｃｌ２中メタノール（０→６％）を移動相として使用する、シリカゲル（４０ｇ）カラムでのクロマトグラフィーによって精製した。０．５０ｇ（１．８７ｍｍｏｌ）の化合物（７）を無色の油状物の形で得た（収率５０％）。
1H NMR分析(300 MHz, CDCl3): δ = 1.44 (s, 9H), 3.34 (bm, 2H), 3.50-3.77 (m, 6H), 4.17 (s, 2H), 4.97 (bs, 1H, NH).
【０１１４】
ｆ）第５ステップ：前駆体（Ａ−１）の合成
前述のステップで上記のように得た０．１５ｇ（０．８３ｍｍｏｌ）の化合物（７）およびステップｄ）で上記のように得た化合物（６）０．２３ｇ（０．８７ｍｍｏｌ）を、８ｍＬの無水アセトニトリルに溶解させた。次に、０．４４ｍＬ（２．５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）および０．３７ｇ（０．８３ｍｍｏｌ）のベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ−オキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）を加え、次いで、反応混合物をアルゴン雰囲気中にて周囲温度で終夜撹拌し続けた。次いで、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（８：２、ｖ／ｖ）混合物を使用するＴＬＣによって反応が完了したことを確認し、次いで反応混合物を蒸発乾燥した。次いで、得られる残渣を７５ｍＬの酢酸エチルに溶かし、５０ｍＬの１０％クエン酸水溶液、５０ｍＬの炭酸水素ナトリウム飽和溶液（ＮａＨＣＯ３）、および５０ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液で順次洗浄して、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾燥した。次いで、橙色の油性残渣を５ｍＬのＭｅＯＨに溶解させ、溶液を４℃に冷却した。次いで、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液０．８３ｍＬを加え、反応混合物を周囲温度で３０分間撹拌し続けた。次いで、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（７：３、ｖ／ｖ）混合物を使用するＴＬＣによって、反応が完了したことを確認した。次いで、１ＭのＫＨＳＯ４水溶液約１ｍＬを加えて、反応混合物を酸性化した。次いで、溶液を加熱せずに蒸発乾燥し、得られる残渣を、勾配をかけたＣＨ２Ｃｌ２中メタノール（０〜５０％）を移動相として使用するシリカゲル（３０ｇ）カラムでのクロマトグラフィーによって精製した。このように、無色の油状物の形のリンカー（Ａ−１）の前駆体０．１７ｇ（０．４２ｍｍｏｌ）を収率８０％で得た。
1H NMR分析(300 MHz, CDCl3); δ = 1.43 (s, 9 H), 3.30 (bm, 2H), 3.47-3.66 (m, 14H), 4.01 (s, 2H), 4.04 (s, 2H), 5.16 (bs, 1H, NH), 7.34 (bs, 1H, NH).
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3); δ = 28.8 (3C); 38.9; 70.3 (3C); 70.5 (3C); 71.1 (3C); 79.8; 156.5; 171.6; 175.0.
MS (ESI, ポジティブモード) m/z: 431.27 (M+Na)+, 453.27 (M-H+2Na)+.
MS (ESI, ネガティブモード) m/z: 407.47 (M-H)- C17H32N2O9の計算値 408.45
【０１１５】
２）前駆体（Ｂ−１）の合成
【０１１６】
【化１４】
2010533291.tif 000016
【０１１７】
前駆体（Ｂ−１）は、Ｓｃｈｏｔｔｅｎ−Ｂａｕｍａｎｎ条件下で市販のアミノオキシ酢酸と９−フルオレニルメタノールクロロホルメートを反応させることにより予め調製したアミノオキシ酢酸のＮ−Ｆｍｏｃ保護された誘導体（８）から出発して、２ステップで合成した（Ｃｉｐｏｌｌａ  Ｌ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．ｃｈｅｍ．、２００２年、第１０巻、１６３９〜１６４６頁）。
【０１１８】
ａ）第１予備ステップ：９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノオキシ酢酸（８）の合成
【０１１９】
【化１５】
2010533291.tif 000017
【０１２０】
０．５ｇ（４．６ｍｍｏｌ）のカルボキシメトキシアミンヘミクロロヒドリドを、１．２ｇのＮａ２ＣＯ３を含有する２０ｍＬの水溶液に溶解させ、次いで得られる溶液を４℃に冷却した。次いで、１．３１ｇ（５．０ｍｍｏｌ）のクロロギ酸９−フルオレニルメチルを含有する１０ｍＬの無水ジオキサンを反応媒体に滴下し、次いで周囲温度で終夜撹拌し続けた。反応混合物を濃縮し、約５ｍＬの５％塩酸水溶液を加えてｐＨ４〜５に酸性化し、生成物を溶液中に沈殿させた。これを濾過によって回収し、２０ｍＬの蒸留水で１回、次いで２０ｍＬのペンタンで１回洗浄した。残りの水を凍結乾燥によって除去して、１．０５ｇ（３．４ｍｍｏｌ）の化合物（８）を未精製の形で得た。勾配をかけたジクロロメタン中メタノール（０〜５０％）を移動相として使用するシリカゲル（３０ｇ）カラムでのクロマトグラフィーによって精製した後、０．６４ｇ（２．０ｍｍｏｌ）の化合物（８）を白色の泡沫の形で得た（収率４３％）。
1H NMR分析(300 MHz, CD3OD): δ = 4.22-4.27 (m, 3H), 4.44 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.29-7.42 (m, 4H), 7.64 (d, J = 7.5 Hz, 2H), (d, J = 7.5 Hz, 2H).
【０１２１】
ｂ）第２予備ステップ：Ｎα−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−リシン（１０）の合成
【０１２２】
【化１６】
2010533291.tif 000018
【０１２３】
１．０ｇ（２．６３ｍｍｏｌ）のＮα−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｎε−（ベンジルオキシカルボニル））−Ｌ−リシン（市販品）を５０ｍＬの酢酸エチルに溶解させ、次いで溶液を４℃に冷却した。次に、１０％のＰｄを含有する０．１ｇのＰｄ／Ｃを加え、次いで得られる反応混合物を水素雰囲気中にて周囲温度で２１時間撹拌し続けた。ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ８５：１５、ｖ／ｖ）によって反応が完了したことを確認し、次いで反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）５４５で濾過して、Ｐｄ／Ｃを除去した。化合物（１０）の酢酸エチルへの溶解性が低いために、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）５４５を５０ｍｌのメタノール２ロットで洗浄して、化合物（１０）を回収した。濾液を蒸発乾燥し、得られた油性残渣を真空中で乾燥させて、白色泡沫の形の化合物（１０）０．４１ｇ（１．６７ｍｍｏｌ）を収率６４％で得た。
【０１２４】
ｃ）第１ステップ：９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノオキシ酢酸スクシンイミジルエステル（９）の合成
【０１２５】
【化１７】
2010533291.tif 000019
【０１２６】
ステップａ）で上記のように得た化合物（８）０．５６０ｇ（１．８０ｍｍｏｌ）を１５ｍＬの酢酸エチル／ジオキサン（２：１、ｖ／ｖ）混合物に溶解させ、次いで溶液を温度４℃に冷却した。０．２２５ｇ（１．９５ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび０．４０４ｇのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）をこの溶液に順次加え、得られる反応媒体をアルゴン雰囲気中にて周囲温度で終夜撹拌し続けた。化合物（８）が対応するＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（９）に変換されたことを、アセトニトリルおよび０．１％（ｖ／ｖ、ｐＨ２）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液（０．１％のＴＦＡ水溶液８０％に、３５分毎にアセトニトリル２０→９０％の線形勾配をかける）を溶離液として流量１．０ｍＬ／分で使用する、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｃ１８カラム（５μｍ、寸法４．６×１５０ｍｍ）での逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって確認した。２１０ｎｍおよび２５４ｎｍで二重検出ＵＶ分析を実施した。次いで、化合物（９）（ｔＲ＝２０．７２分）を精製せずに直ちに以下の結合反応で使用した。
【０１２７】
ｄ）第２ステップ：Ｎα−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｎα−（９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノオキシアセチル）−Ｌ−リシン（Ｂ−１）の合成
Ｎα−Ｂｏｃ−Ｌ−リシン（１０）（０．４１ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を６ｍＬの無水ＤＭＦ／ＮＭＰ（５：１、ｖ／ｖ）混合物に懸濁させた懸濁液に、ＤＩＥＡ（０．２９ｍＬ、１．６７ｍｍｏｌ）および前述のステップで上記のように得た未精製のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液（９）を順次加えた。得られる反応媒体を周囲温度で３０分間撹拌した。次いで、ＤＩＥＡ水溶液（５ｍＬ中０．１５ｍＬ）を加え、得られる溶液を周囲温度で９０分間撹拌した。反応をＲＰ−ＨＰＬＣ（前述のステップで化合物（９）の分析について上記のように使用したものと同一のシステム）によってモニターした。５％のＨＣｌ水溶液（約３ｍＬ）を加えて、反応混合物をｐＨ５〜６に酸性化し、次いで蒸発乾燥した。こうして得た残渣を５０ｍＬの酢酸エチルに溶かし、不溶性の固体残渣（ＤＣＵの沈殿）をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）５４５での濾過によって除去した。濾液を１０％クエン酸水溶液３０ｍＬで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで蒸発乾燥した。こうして得た油性の黄色残渣を、勾配をかけたジクロロメタン中ＭｅＯＨ（０〜６％）を移動相として使用する、シリカゲル（４５ｇ）カラムでのクロマトグラフィーによって精製した。白色泡沫の形の化合物（Ｂ−１）３１０ｍｇ（０．５７ｍｍｏｌ）を収率３４％で得た。
1H NMR分析(300 MHz, CD3CN): δ = 1.37-1.83 (m, 15H), 3.18 (q, J = 6.4 Hz, J = 12.6 Hz, 2H), 4.00 (m, 1H, α-CH), 4.04 (s, 2H), 4.26 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.61 (bd, J = 7.5 Hz, 1H, NH), 7.31-7.44 (m, 4H), 7.51 (bs, 1H, NH), 7.63 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.83 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.9 (bs, 1H, NH).
13C NMR分析(75.5 MHz, CD3CN): δ = 23.5; 28.5 (3C); 29.5; 31.6; 38.9; 47.7; 54.2; 68.0; 76.3; 79.8; 120.9 (2C); 126.0 (2C); 128.1 (2C); 128.7 (2C), 142.1 (2C); 144.6 (2C); 156.7; 158.9; 169.3; 174.5.
MS (Maldi-TOF, ポジティブモード) m/z: 564.5709 (M+Na)+, 580.5535 (M+K)+, C28H35N3O8の計算値 541.61.
【０１２８】
３）前駆体（Ｃ−１）の合成
この合成を以下のスキーム１に示す。
【０１２９】
【化１８】
2010533291.tif 000020
【０１３０】
スキーム１に示すように、前駆体（Ｃ−１）は、Ｎα−Ｂｏｃ−Ｎα−Ｚ−Ｌ−リシン（１１）（この化合物において、Ｚはベンジルオキシカルボニル基を表す）から出発して、４ステップで合成した。まず、たとえばＨｏｆｍａｎｎ，Ｋ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９７８年、第１００巻、３５８５〜３５９０頁に記載の方法に従って直ちに生成した混合無水物上でアンモニアを反応させて、カルボン酸官能基をカルボキサミド（１２）に変換した。次に、Ｋｅｌｌｅｒ  Ｏ．ら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９７５年、第５８巻、５３１〜５４１頁に記載の方法に従って、Ｚ基によって保護されたε−ＮＨ２官能基を接触水素化によって遊離させて（１３）、グリシンとＮ−（メチルオキシカルボニル）マレイミドとの反応によって予め調製したグリシンのマレイミド誘導体（１４）を結合できるようにした。次いで、シリカゲルでのクロマトグラフィーによって、マレイミド誘導体（１５）を収率５１％で単離した。最後に、トリフルオロ酢酸での処理によってＮ末端を脱保護して、前駆体（Ｃ−１）を得た。
【０１３１】
ａ）第１ステップ：Ｎα−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｎε−（ベンジルオキシカルボニル））−Ｌ−リシンカルボキシアミド（１２））の合成
１．０ｇ（２．６３ｍｍｏｌ）のＮα−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎε−ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リシン（１１）を１８ｍＬの無水酢酸エチルに溶解させ、溶液を、ドライアイス（固体ＣＯ２）とエチレングリコールから構成された浴で−１５℃に冷却した。次いで、０．２９ｍＬ（２．６３ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）および０．３４ｍＬ（２．６３ｍｍｏｌ）のクロロギ酸イソブチルを加え、得られる反応媒体をアルゴン雰囲気中にて−１５℃で１０分間撹拌し続けた。次に、この混合物に１．３ｍＬのアンモニア水（５０％、ｖ／ｖ）を加え、反応混合物を温度０℃で１時間撹拌し続けた。かさ高い白色の沈殿を直ちに生成し、これを濾過によって回収し、２５ｍＬの蒸留水、次いで２５ｍＬのペンタンで洗浄した。残留する水を凍結乾燥によって除去して、０．７０５ｇ（１．８６ｍｍｏｌ）の化合物（１２）を得た。さらに濾液を２０ｍＬの酢酸エチルに溶かし、２０ｍＬの蒸留水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾燥した。得られた白色固体を２５ｍＬのペンタン２ロットで洗浄し、真空中で乾燥させた。追加の量の化合物（１２）（０．２５ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）がこうして得られた。全収率は９５％であった。
1H NMR分析(300 MHz, CD3CN): δ = 1.31-7.78 (m, 15H), 3.10 (q, J = 6.4 Hz, J = 12.9 Hz, 1H), 3.92 (m, 1H,α-CH), 5.06 (s, 2H, CH2-Bn), 5.53 (bs, 1H, NH), 5.66 (bs, 1H, NH), 5.71 (bs, 1H, NH), 6.31 (bs, 1H, NH), 7.30-7.42 (m, 5H).
【０１３２】
ｂ）第２ステップ：Ｎα−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−リシンカルボキシアミド（１３）の合成
前述のステップで上記のように得た０．９５ｇ（２．５ｍｍｏｌ）の化合物（１２）を５０ｍＬの酢酸エチル／エタノール（４：１、ｖ／ｖ）混合物に溶解させ、溶液を４℃に冷却した。１０％のＰｄを含有する０．１ｇのＰｄ／Ｃを加え、得られる反応混合物をアルゴン雰囲気中にて周囲温度で３時間撹拌し続けた。ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ９：１、ｖ／ｖ）によって、反応が完了したことを確認し、次いで混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）５４５で濾過してＰｄ／Ｃを除去した。次いで濾液を蒸発乾燥して油性残渣を得、次いでこれを真空中で蒸発させて、所望の化合物（１３）を白色固体の形で得た（定量的収率）。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ = 1.40-1.80 (m, 15H), 2.70 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 4.03 (q, J = 4.9 Hz, J = 12.1 Hz, 1H, α-CH).
【０１３３】
ｃ）追加ステップ：Ｎ−マレオイル−Ｌ−グリシン（１４）の合成
ｉ）予備ステップ：Ｎ−（メチルオキシカルボニル）マレイミドの調製
１ｇ（１０．３ｍｍｏｌ）のマレイミドを２０ｍＬの無水酢酸エチルに溶解させ、次いで溶液を４℃に冷却した。次いで、１．１３ｍＬのＮＭＭ（１０．３ｍｍｏｌ）および０．８０ｍＬ（１０．３ｍｍｏｌ）のクロロギ酸メチルを加え、次いで、得られる反応混合物を周囲温度で１時間撹拌し続けた。ＮＭＭ．ＨＣｌのかさ高い白色沈殿が直ちに生成し、これを濾過によって除去し、約２０ｍＬの酢酸エチルで洗浄した。濾液を３０ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾燥した。得られる油性残渣を真空中で乾燥させて、Ｎ−（メチルオキシカルボニル）マレイミドを紫褐色の固体の形で得た（１．１６ｇ、７．５ｍｍｏｌ、収率７３％）。
【０１３４】
ｉｉ）Ｎ−マレオイル−Ｌ−グリシン（１４）の調製
０．５ｇのグリシン（６．７ｍｍｏｌ）をＮａＨＣＯ３の水溶液（３２ｍＬ中２．８ｇ）に溶解させ、次いで溶液を０℃に冷却した（ＮａＣｌ／氷浴）。次いで、上記ステップｉ）で得たＮ−（メチルオキシカルボニル）マレイミド１．０４ｇ（６．７ｍｍｏｌ）を加え、得られる反応混合物を温度０℃で２０分間激しく混合した。次に、６０ｍＬの蒸留水を加え、得られる水溶液を周囲温度で終夜放置した。次いで、Ｈ２ＳＯ４を加えて反応混合物をｐＨ６に酸性化し、次いで部分的に蒸発させた。次いで、追加量のＨ２ＳＯ４を加えて、ｐＨを１〜２とし、次いで、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）を使用して水溶液を抽出させた。有機相をＮａＣｌ飽和水溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾燥した。得られる油性残渣を、ＣＨＣｌ３／ＡｃＯＨ（９５：５、ｖ／ｖ）の混合物を移動相として使用するシリカゲル（２５ｇ）カラムでのクロマトグラフィーによって精製した。最後に、ＡｃＯＨの痕跡量を凍結乾燥によって除去した。次いで、Ｎ−マレオイル−Ｌ−グリシン（１４）を無色固体の形で得た（０．６１ｇ、３．６ｍｍｏｌ、収率５４％）。次いで、この化合物（１４）を、以下で記載する第３ステップで直ちに使用した。
1H NMR分析(300 MHz, アセトン-d6): δ= 4.29 (s, 2H, CH2-Gly), 7.02 (s, 2H, CH-Mal).
13C NMR分析(75.5 MHz, アセトン-d6): δ = 39.6, 136.3 (2C), 169.8 (2C), 171.7 (1C).
【０１３５】
ｄ）第３ステップ：Ｎα−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｎε−（Ｎ−マレオイル−Ｌ−グリシル）−Ｌ−リシンカルボキシアミド（１５）の合成
事前に得た０．２９ｇ（１．７３ｍｍｏｌ）のＮ−マレオイル−Ｌ−グリシン（１４）を５ｍＬの無水ＣＨ３ＣＮに溶解させた。Ｎα−Ｂｏｃ−Ｌ−リシン−ＮＨ２（１１）（０．５５ｇ、２．２４ｍｍｏｌ）を５ｍＬの無水ＤＭＦに溶かした溶液を加え、得られる溶液を４℃に冷却した。０．２３ｇ（１．７３ｍｍｏｌ）のヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（ＨＯＢｔ）および０．３９ｇ（１．９０ｍｍｏｌ）のＤＣＣを加えた。得られる反応混合物をアルゴン雰囲気中にて周囲温度で終夜撹拌し続けた。ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ８：２、ｖ／ｖ）によって、反応が完了したことを確認し、混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）５４５で濾過して、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）の白色沈殿を除去した。次いで濾液を蒸発乾燥し、次いで真空中で乾燥させて、ＤＭＦを除去した。次いで、得られる残渣を５０ｍＬの酢酸エチルに溶かし、３０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３、３０ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾燥した。得られる残渣を、勾配をかけたジクロロメタン中メタノール（０〜１５％）を移動相として使用するシリカゲル（３０ｇ）カラムでのクロマトグラフィーによって精製して、白色固体の形の０．３５ｇ（０．８８ｍｍｏｌ）の所望の化合物（１５）を収率５１％で得た。
IR分析(KBr) νmax 835, 1063, 1166, 1256, 1432, 1525, 1555, 1665 (ブロード), 1710 (ブロード), 2926, 3218, 3342 (ブロード), 3416 cm-1.
1H NMR分析(300 MHz, CD3CN): δ = 1.29-1.78 (m, 15H), 3.15 (q, J = 6.4 Hz, J = 13.0 Hz, 1H), 3.88-3.95 (m, 1H, α-CH), 4.05 (s, 2H), 5.52 (bs, 1H, NH), 5.72 (bs, 1H, NH), 6.34 (bs, 1H, NH), 6.62 (bs, 1H, NH), 6.85 (s, 2H).
13C NMR分析(75.5 MHz, CD3CN): δ = 24.1, 29.0 (3C), 30.1, 33.0, 40.1, 41.4, 55.7, 80.2, 136.1 (2C), 157.1, 167.8, 172.1, 176.0.
【０１３６】
ｅ）第４ステップ：Ｎε−（Ｎ−マレオイル−Ｌ−グリシル）−Ｌ−リシンカルボキサミド（前駆体Ｃ−１）の合成
０．３３ｇ（０．８３ｍｍｏｌ）のＮα−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｎε−（Ｎ−マレオイル−Ｌ−グリシル）−Ｌ−リシンカルボキサミド（１５）を７ｍＬのＴＦＡ／Ｈ２Ｏ混合物（９５：５、ｖ／ｖ）に溶解させ、次いで溶液を周囲温度で９０分間放置した。次いで、ＴＦＡを蒸発させ、生成物をエーテルで沈殿させ、エーテルで洗浄し、凍結乾燥した。前駆体（Ｃ−１）の未精製ＴＦＡ塩を、Ｃ１８グラフト化シリカカラムでの逆相フラッシュクロマトグラフィー（２０ｇ、ＴＦＡの０．１％水溶液で溶出）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、所望の前駆体（Ｃ−１）９１ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ、収率２７％）を白色固体の形で得た。
1H NMR分析(300 MHz, D2O): δ = 1.33-1.42 (m, 2H), 1.49-1.59 (m, 2H), 1.83-1.90 (m, 2H), 3.21 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.98 (t, J = 6.8 Hz, 1H, α-CH), 4.22 (s, 2H), 6.92 (s, 2H).
【０１３７】
４）本発明による非蛍光官能性試薬（Ｉ−１）の合成：
前駆体（Ａ−１）、（Ｂ−１）および（Ｃ−１）の組立て
三官能性化合物（Ｉ−１）を、前述のステップで上記のように調製した前駆体（Ａ−１）、（Ｂ−１）および（Ｃ−１）から５ステップで合成した。
【０１３８】
以下のスキーム２に化合物（Ｉ−１）の合成プロトコルを要約する（主な３ステップのみ）。
【０１３９】
【化１９】
2010533291.tif 000021
【０１４０】
前駆体（Ｂ−１）と（Ｃ−１）のカップリングは、たとえばＫｎｏｒｒ，Ｒ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９８９年、第３０巻、１９２７〜１９３０頁の論文に記載の方法に従って、前駆体（Ｂ−１）をヒドロキシスクシンイミドエステルの形で予備活性化した後に実施した。次いで、その活性化エステルを前駆体（Ｃ−１）と反応させて、カップリング生成物（１６）を得、これをシリカゲルでのクロマトグラフィーによって収率３２％で単離した。次に、ＴＦＡでの処理によって、Ｂｏｃ基を除去し、そうして前駆体（Ｂ−１−Ｃ−１）を得ることが可能になった。前駆体（Ａ−１）と前駆体（Ｂ−１−Ｃ−１）の最終のカップリングは、ＢＯＰをカップリング試薬として使用して実施した。まだ保護された形の所望の生成物を、シリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製した。トリフルオロ酢酸での処理によって脱保護した後、トリエチルアミンの存在下、無水ＤＭＦ中にてＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）で処理することにより、Ｎ末端を活性化カルバメートに変換した。擬ペプチドから式（Ｉ−１）の化合物への完全な変換は、３０分が経過する頃に認められた。次いで、所望の式（Ｉ−１）の化合物を、Ｃ１８グラフト化シリカカラムでの逆相フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【０１４１】
ａ）第１ステップ：Ｎα−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｎε−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノオキシアセチル）−Ｌ−リシン−Ｎε−マレオイル−Ｌ−リシンカルボキサミド（１６）の合成
ステップ２）ｄ）で上記のように得た前駆体（Ｂ−１）０．２ｇ（０．３６ｍｍｏｌ）を２ｍＬの無水アセトニトリルに溶解させた。次に、６７．４μｌ（０．３８ｍｍｏｌ）のＤＩＥＡおよび１１６ｍｇ（０．３８ｍｍｏｌ）のＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）を加え、反応混合物をアルゴン雰囲気中にて周囲温度で４５分間撹拌し続けた。前駆体（Ｂ−１）のそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルへの変換を、ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、８５：１５、ｖ／ｖ）によって確認した。次いで、ステップ３ｅ）で上記のように得た９１ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）のＮα−（Ｎ−マレオイル−Ｌ−グリシル）−Ｌ−リシン−カルボキサミド（前駆体Ｃ−１）および４０μｌ（０．２３ｍｍｏｌ）のＤＩＥＡを３ｍＬの無水ＣＨ３ＣＮ／ＤＭＦ混合物（２：１、ｖ／ｖ）に溶かした溶液を滴下し、得られる反応混合物をアルゴン雰囲気中にて周囲温度で１時間撹拌し続けた。ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、８５：１５、ｖ／ｖ）によって、反応が完了したことを確認し、次いで混合物を真空中で蒸発させてＤＭＦを除去した。こうして得た油性残渣を、勾配をかけたジクロロメタン中ＭｅＯＨ（０〜１０％）を移動相として使用するシリカゲル（２５ｇ）カラムでのクロマトグラフィーによって精製した。こうして、白色泡沫の形の化合物（１６）６０ｍｇ（０．０７５ｍｍｏｌ）を収率３２％で得た。
1H NMR分析(300 MHz, CDCl3): δ = 1.25-1.91 (m, 21H), 3.07-3.29 (m, 4H), 4.08-4.42 (m, 7H, 2 × α-CH, CH-Fmoc, 2 × CH2), 4.48 (d, J = 6.8 Hz, 2H, CH2-Fmoc), 5.61 (bd, J = 6.4 Hz, 1H, NH), 6.04 (bs, 1H, NH), 6.74 (s, 2H), 6.81 (bs, 1H, NH), 6.91 (bs, 1H, NH), 7.27-7.42 (m, 4H), 7.57 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 9.2 (bs, 1H, NH).
MS (MALDI-TOF, ポジティブモード) m/z 706.6896 ((M-Boc)+H)+808.7330 (M+H)+, 828.7064 (M+Na)+, C40H51N7O11の計算値 805.89.
【０１４２】
ｂ）第２ステップ：Ｎε−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノオキシアセチル）−Ｌ−リシン−Ｎε−マレオイル−Ｌ−グリシル）−Ｌ−リシンカルボキサミド（Ｂ−１−Ｃ−１）の合成
前述のステップで上記のように得た６０ｍｇ（０．０７５ｍｍｏｌ）の化合物（１６）を２ｍＬのジクロロメタンに溶解させ、溶液を４℃に冷却した。３０６μｌ（４．１２ｍｍｏｌ）のＴＦＡを滴下し、得られる反応混合物を周囲温度で９０分間撹拌し続けた。ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、８５：１５、ｖ／ｖ）によって、反応が完了したことを確認し、次いで混合物を蒸発乾燥した。こうして得た油性残渣を、５ｍＬのＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ混合物（１：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、次いで凍結乾燥して、５８ｍｇ（０．０７１ｍｍｏｌ）の化合物（Ｂ−１−Ｃ−１）を白色粉末（収率９４％）の形で得た。
MS (MALDI-TOF, ポジティブモード) m/z 706.6488 (M+H)+, C35H43N7O9の計算値707.77.
次いで、この化合物を精製せずに以下のステップで使用した。
【０１４３】
ｃ）第３ステップ：完全に保護された形の三官能性試薬（Ｉ−１）の合成
前述のステップで上記のように得た５８ｍｇ（０．０７１ｍｍｏｌ）の化合物（Ｂ−１−Ｃ−１）、およびステップ１）ｆ）で事前に得た３２ｍｇ（０．０７７ｍｍｏｌ）の前駆体（Ａ−１）を、２ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解させた。次に、２５．９μｌ（０．１５ｍｍｏｌ）のＤＩＥＡおよび３４．４ｍｇ（０．０７７ｍｍｏｌ）のＢＯＰを加え、反応混合物をアルゴン雰囲気中にて周囲温度で３０分間撹拌し続けた。ＲＰ−ＨＰＬＣ（システムＢ、すなわち、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｃ１８カラム（５μｍ、寸法４．６×１５０ｍｍ）を使用し、アセトニトリルおよび０．１％（ｖ／ｖ、ｐＨ２）のＴＦＡ水溶液を溶離液として、８０％のＴＦＡを含有するこの混合物を５分間、次いで、２０〜９０％の範囲の線形勾配のＣＨ３ＣＮを３５分間かけて流量１．０ｍＬ／分で通過させることによるもの。２１０ｎｍおよび２５４ｎｍで二重検出ＵＶ分析を実施した）によって、反応が完了したことを確認し、次いで追加量の前駆体（Ａ−１）（１４．４ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１８．５μｌ、０．１０ｍｍｏｌ）、およびＢＯＰ（１５．６ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）を加えた。周囲温度で９０分間混合した後、反応混合物を２５ｍＬのジクロロメタンに溶解させた。得られる有機相を２５ｍＬの１０％クエン酸および２５ｍＬのブラインで順次洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾燥した。こうして得た油性残渣を、勾配をかけたジクロロメタン中メタノール（０〜１５％）を移動相として使用するシリカゲル（１０ｇ）カラムでのクロマトグラフィーによって精製して、黄色の泡沫の形の完全に保護された式（Ｉ−１）の化合物２４ｍｇ（０．０２２ｍｍｏｌ）を収率３１％で得た。
【０１４４】
ｄ）第４ステップ：完全に保護された式（Ｉ−１）の化合物のＴＦＡ塩の合成
完全に保護された形の、前述のステップで上記のように得た２４ｍｇ（０．０２２ｍｍｏｌ）の式（Ｉ−１）の化合物を１ｍＬのジクロロメタンに溶解させた。次いで、８１μｌ（１．０８ｍｍｏｌ）のＴＦＡを滴下し、次いで、得られる反応混合物を周囲温度で１時間撹拌し続けた。ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、８５：１５、ｖ／ｖ）によって、反応が完了したことを確認し、次いで混合物を蒸発乾燥した。完全に保護された形の式（Ｉ−１）の化合物の未精製のＴＦＡ塩を、勾配をかけた０．１％のＴＦＡ水溶液中ＣＨ３ＣＮ（０〜２３％）を移動相として使用する、Ｃ１８グラフト化シリカカラム（５ｇ）での逆相フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、式（Ｉ−１）の完全に保護された三官能性試薬のＴＦＡ塩１２ｍｇ（０．０１１ｍｍｏｌ）を白色泡沫の形で得た。
【０１４５】
ｅ）第５ステップ：式（Ｉ−１）の三官能性試薬の合成
前述のステップで上記のように得た完全に保護された形の式（Ｉ−１）の三官能性試薬のＴＦＡ塩１２ｍｇ（０．０１１ｍｍｏｌ）を２００μｌの無水ＤＭＦに溶解させた。次に、１．５μｌ（０．０１１ｍｍｏｌ）のＴＥＡ、およびＤＳＣ試薬（４．１５ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）を１００μｌの無水ＤＭＦに溶かした溶液を加えた。次いで、反応混合物を周囲温度で１時間撹拌し続けた。ステップ４）ｂ）で上述したシステムＢを使用するＲＰ−ＨＰＬＣによって、反応が完了したことを確認した。次いで、混合物を０．１％のＴＦＡ水溶液５ｍＬに溶かし、勾配をかけた０．１％ＴＦＡ水溶液中ＣＨ３ＣＮ（０〜５０％）を移動相として使用するＣ１８グラフト化シリカカラム（５ｇ）での逆相フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、所望の式（Ｉ−１）の三官能性試薬６．７０ｍｇ（０．００５９ｍｍｏｌ）を白色粉末の形で得た。
MS (MALDI-TOF, ポジティブモード) m/z: 996.6590 ((M-NHS カルバメート)+H)+, 1159.5921 (M+Na)+, 1175.5654 (M+K)+, C52H68N10O19の計算値 1137.18.
【実施例２】
【０１４６】
本発明による擬ペプチド三官能性試薬（Ｉ−２）の合成
この実施例には、本発明による、次式に相当する擬ペプチド三官能性試薬（Ｉ−２）の合成を記載する。
【０１４７】
【化２０】
2010533291.tif 000022
【０１４８】
この実施例では、フルオロフォアの結合に持ちこたえる必要のあるアミノ酸（前駆体Ｃ）の性質によって、実施例１）で上記のように以前に合成した式（Ｉ−１）の試薬とは異なる三官能性試薬の合成を例示する。この実施例では、マレイミドまたはヨードアセチル単位によって予め官能性化したフルオロフォアと反応させるために、その側鎖のチオール官能基がＳ−エチル（ＳＥｔ）基を使用してジスルフィドの形で保護されているシステインを使用することも可能であることを示している。
【０１４９】
これを行うために、前駆体（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を別々に調製し、次いでこれらを組み立てることからなる、集中的な合成戦略を実施例１）のように使用した。前駆体（Ａ）として、上記実施例１）で合成した前駆体（Ａ−１）を使用した。前駆体（Ｂ）として、式（Ｂ−１）の前駆体は、実施例１）の前駆体（Ｂ−１）の合成に使用したものと実質的に異なり、またそれより改良されている経路に従って合成した。最後に、前駆体（Ｃ−２）の合成は、市販のＢｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＥｔ）−ＯＨから出発して実施した。
【０１５０】
１）前駆体（Ｂ−１）：Ｎα−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｎε−（９−フルオレニルオキシカルボキシルアミノオキシアセチル）−Ｌ−リシンの合成
前駆体（Ｂ−１）は、実施例１）、ステップ２）ａ）のとおりに予め調製した、アミノオキシ酢酸のＮ−Ｆｍｏｃ保護された誘導体（８）から合成した。
【０１５１】
０．２３０ｇ（０．７３ｍｍｏｌ）の化合物（８）を９ｍＬのＣＨ３ＣＮ／ＤＭＦ混合物（１：１、ｖ／ｖ）に溶解させた。次に、１１９ｍｇ（０．８８ｍｍｏｌ）のヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物および１８２ｍｇ（０．８８ｍｍｏｌ）のＤＣＣを加え、次いで反応混合物をアルゴン雰囲気中にて周囲温度で２時間撹拌し続けた。次いで、実施例１のステップ２）、ｂ）で上記のように得た１８０ｍｇ（０．７３１ｍｏｌ）のＮα−Ｂｏｃ−Ｌ−リシン（１０）を２ｍＬの無水ＤＭＦに溶かした溶液を加え、反応混合物をアルゴン雰囲気中にて周囲温度で撹拌し続けた。反応をＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、８０：２０、ｖ／ｖ）によってモニターした。２時間撹拌した後、混合物を蒸発乾燥した。こうして得た残渣を５０ｍＬの酢酸エチルに溶かし、１０％のクエン酸水溶液５０ｍＬ、蒸留水２５ｍＬで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、最後に、勾配をかけたジクロロメタン中酢酸エチル（０〜８０％）を移動相として使用するシリカゲル（２０ｇ）カラムでのクロマトグラフィーによって精製した。白色泡沫の形の化合物（Ｂ−１）２９６ｍｇ（０．３６ｍｍｏｌ）を収率５０％で得た。
1H NMR分析(300 MHz, CD3CN): δ = 1.37-1.83 (m, 15H), 3.18 (q, J = 6.4 Hz, J = 12.6 Hz, 2H), 4.00 (m, 1H, α-CH), 4.04 (s, 2H), 4.26 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 5.61 (bd, J = 7.5 Hz, 1H, NH), 7.31-7.44 (m, 4H), 7.51 (bs, 1H, NH), 7.63 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.83 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.9 (bs, 1H, NH).
13C NMR分析(75.5 MHz, CD3CH): δ = 23.5; 28.5 (3C); 29.5; 31.6; 38.9; 47.7; 54.2; 68.0; 76.3; 79.8; 120.9 (2C); 126.0 (2C); 128.1 (2C); 128.7 (2C), 142.1 (2C); 144.6 (2C); 156.7; 158.9; 169.3; 174.5.
MS (MALDI-TOF, ポジティブモード) m/z: 564.5709 (M+Na)+, 580.5535 (M+K)+, C28H35N3O8の計算値 541.61.
【０１５２】
２）前駆体（Ｃ−２）の合成
【０１５３】
【化２１】
2010533291.tif 000023
【０１５４】
前駆体（Ｃ−２）は、Ｎ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｓ−（Ｓ−エチル）システイン（１９）から、以下のスキーム３に従って２ステップで合成した。
【０１５５】
【化２２】
2010533291.tif 000024
【０１５６】
このスキームに従い、第１ステップでは、化合物（１９）のカルボン酸官能基を、アンモニア水と、たとえばＨｏｆｍａｎｎ，Ｋ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９７８年、第１００巻、３５８５〜３５９０頁に記載の方法に従って直ちに生成した混合無水物との反応によって、カルボキサミド（２０）に変換した。次に、化合物（２０）のＮ末端を、トリフルオロ酢酸での処理によって脱保護して、前駆体（Ｃ−２）を得た。
【０１５７】
ａ）第１ステップ：Ｎ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｓ−（Ｓ−エチル）システインカルボキサミド（６）の合成
５００ｍｇ（１．０８ｍｍｏｌ）のＮ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｓ−（Ｓ−エチル）システイン（１９）を１５ｍＬの酢酸エチルに溶解させ、溶液をドライアイスとエチレングリコールの浴で−１５℃に冷却した。次いで、０．１１９ｍＬ（１．０８ｍｍｏｌ）のＮＭＭおよび０．１４０ｍｇ（１．０８ｍｍｏｌ）のクロロギ酸イソブチルを加え、反応混合物をアルゴン雰囲気中にて−１５℃で１０分間撹拌し続けた。次に、この無水溶液に、１５％のアンモニアを含有する水溶液（０．３８ｍＬ、３．２４ｍｍｏｌ）を加え、次いで反応混合物を温度４℃で３０分間撹拌し続けた。次いで、混合物を蒸発乾燥し、残渣を３０ｍＬの酢酸エチルに溶かし、次いで２０ｍＬの水で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで蒸発乾燥した。白色固体の形の化合物（２０）を定量的収率で得た。
1H NMR分析(300 MHz, CDCl3): δ = 1.24-1.29 (t, J = 6.8 Hz, 3H, CH3(SEt)), 1.39 (s, 9H, tBu), 2.63-2.70 (q, J = 7.1 Hz, 2H, CH2(SEt)), 2.99-3.01 (d, J = 6.0 Hz, 2H, CH2, β), 4.36-4.39 (m, 1H, CH α), 5.25-5.28 (d, J = 9.0 Hz, 1H, NH), 5.63 (bs, 1H, NH), 6.31 (bs, 1H, NH).
13C NMR分析(75.5 MHz, CDCl3): δ = 13.8 (CH3(SEt)), 27.8 (tBu), 32.0 (CH2(SEt)), 39.9 (CH2β), 53.0 (CH α), 80.1 (Cq tBu), 155.1 (Cq), 172.6 (Cq).
MS (MALDI-TOF, ポジティブモード) m/z = 303.13 (M+Na)+, C16H20N2O3S2-Naの計算値 303.41.
【０１５８】
ｂ）第２ステップ：前駆体（Ｃ−２）：Ｓ−（Ｓ−エチル）システインカルボキサミドの合成
前述のステップで上記のように得た化合物（２０）を、１４ｍＬのＴＦＡ／Ｈ２Ｏ混合物（９５：５、ｖ／ｖ）に、０℃から周囲温度の間の温度で１時間かけて撹拌しながらゆっくりと溶解させた。ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ９０：１０、ｖ／ｖ）によって、反応が完了したことを確認し、次いで反応混合物を蒸発乾燥した。次いで、最小量の浸透水を加え、得られる水溶液を凍結乾燥して、黄色がかった粉末の形の前駆体（Ｃ−２）を収率８９％で得た。
1H NMR分析(300 MHz, D2O): δ = 1.26-1.31 (t, J = 7.1 Hz, 3H, CH3(SEt)), 1.39 (s, 9H), 2.72-2.80 (q, J = 7.1 Hz, 2H, CH2(SEt)), 3.25-3.26 (d, J = 6.0 Hz, 2H, CH2β), 4.30-4.35 (m, 1H, CH α).
13C NMR分析(75.5 MHz, D2O): δ = 13.8 (CH3(SEt)), 30.1 (CH2(SEt)), 38.3 (CH2β), 52.2 (CH α), 170.8 (Cq).
MS (MALDI-TOF, ポジティブモード) m/z = 180.00 (M+Na)+, C5H12N2OS2.Naの計算値 180.29.
【０１５９】
３）式（Ｉ−２）の三官能性試薬の合成
試薬（Ｉ−２）は、以下のスキーム４に従って予め合成した前駆体（Ａ−１）、（Ｂ−１）および（Ｃ−２）から３ステップで合成した。
【０１６０】
【化２３】
2010533291.tif 000025
【０１６１】
前駆体（Ｂ−１）と（Ｃ−２）のカップリングは、たとえばＫｏｎｉｇ，Ｗ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．、１９７０年、第１０３巻、７８８〜７９８頁の論文に記載の方法に従って、前駆体（Ｂ−１）をヒドロキシベンゾトリアゾールエステルの形で予備活性化した後に実施した。次いで、その活性化エステルを前駆体（Ｃ−１）と反応させて、カップリング生成物（２１）を得た。含まれるアミンはＴＦＡ塩の形であるので、塩基（ＤＩＥＡ）を加えることが必要であった。中間体化合物（Ｂ−１−Ｃ−２）をシリカゲルでのクロマトグラフィーによって収率６１％で精製した。Ｎ−Ｂｏｃ三官能性試薬（２２）のＮ末端をＴＦＡで脱保護し、次いで、ＴＥＡの存在下、無水ＤＭＦ中でＤＳＣを使用する処理によって活性化カルバメートに変換した。
【０１６２】
ａ）第１ステップ：Ｎα−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｎε−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノオキシアセチル）−Ｌ−リシン−Ｓ−（Ｓ−エチル）−Ｌ−システインカルボキサミド（２１）の合成
ステップ１）の終わりで上記のように得た化合物（Ｂ−１）０．１９６ｇ（０．３６ｍｍｏｌ）を３ｍＬの無水ＣＨ３ＣＮ／ＤＭＦ混合物（２：１、ｖ／ｖ）に溶解させた。次いで、５８．４ｍｇ（０．４３ｍｍｏｌ）のヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物および８９．１ｍｇ（０．４３ｍｍｏｌ）のＤＣＣを加え、得られる反応混合物をアルゴン雰囲気中にて周囲温度で２時間撹拌し続けた。次に、化合物（Ｃ−２）１０６ｍｇ（０．３６ｍｍｏｌ）を含有するＤＭＦ溶液１ｍＬを加え、反応混合物をアルゴン雰囲気中にて周囲温度で撹拌し続けた。２時間経過する頃に、３１μｌ（０．１８ｍｍｏｌ）のＤＩＥＡを加えた。さらに２時間経過する頃に、３１μｌ（０．１８ｍｍｏｌ）のＤＩＥＡをさらに加えた。さらに２時間経過後、もう一度、３１μｌ（０．１８ｍｍｏｌ）のＤＩＥＡを加え、４４．９ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）のＤＣＣを加えた。反応媒体を含有するフラスコを温度−２０℃で終夜保存した。翌日、追加量のＤＩＥＡ（３１μｌ、０．１８ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（４４．９ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後、反応が完了したと判断し、反応混合物を蒸発乾燥した。得られる残渣を２５ｍＬの酢酸エチルに溶かし、２５ｍＬの１０％クエン酸水溶液、２５ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３、および２５ｍＬの蒸留水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、勾配をかけたジクロロメタン中ＭｅＯＨ（０〜１０％）を移動相として使用するシリカゲル（２０ｇ）カラムでのクロマトグラフィーによって精製した。白色泡沫の形の化合物（２１）２２２ｍｇ（０．３１ｍｍｏｌ）を収率８８％で得た。
1H NMR分析(300 MHz, CDCl3): δ = 1.26-1.31 (t, 3H, J = 7.1 Hz, CH3(SEt)Cys), 1.42 (s, 9H, tBu), 1.51-1.92 (m, 6H, CH2, β,δ, γ Lys), 2.65-2.72 (q, 2H, J = 7.5 Hz, CH2(SEt)Cys), 3.08-3.10 (d, 2H, J = 6 Hz, CH2 β Cys), 3.26-3.33 (m, 2H, CH2 ε Lys), 4.04-4.06 (t, J = 6.0 Hz, 1H, CH α Lys), 4.20-4.25 (t, J = 7.2 Hz, 1H, CH Fmoc), 4.33 (s, 2H), 4.49-4.51 (d, 1H, J = 6.4 Hz, CH2 Fmoc), 4.71-4.78 (q, J = 6.4 Hz, 1H, CH α Cys), 7.26-7.78 (m, 8H, CH Fmoc).
13C NMR分析(75.5 MHz, CDCl3): δ = 14.2 (CH3(SEt) Cys), 22.3 (CH2γ, Lys) 28.6 (CH2δLys), 30.1 (CH2 (SEt) Cys), 32.4 (CH2 β Lys), 38.0 (CH2β Cys), 39.3 (CH2ε Lys), 46.7 (CH Fmoc), 52.3 (CH α Cys), 52.2 (CH α Lys), 68.0 (CH2 Fmoc), 76.1 (CH2), 80.8 (Cq tBu), 120.3 (Cq Fmoc), 125.1 (Cq Fmoc), 127.4 (Cq Fmoc), 128.1 (Cq Fmoc), 141.4 (Cq), 143.3 (Cq), 156.4 (Cq), 158.6 (Cq), 169.0 (Cq), 172.6 (Cq), 172.8 (Cq).
RP-HPLC (システムB): tR = 22.3分, 純度84% 
MS分析(MALDI-TOF, ポジティブモード) m/z = 726.77 (M+Na)+, 742.74 (M+K)+ C33H45O8S2-.Naの計算値 726.88.
【０１６３】
ｂ）第２ステップ：カップリング生成物（Ｂ−１−Ｃ−２）：Ｎε−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノオキシアセチル）−Ｌ−リシン−Ｓ−（Ｓ−エチル）−Ｌ−システインカルボキサミドの合成
前述のステップで上記のように得た化合物（２１）１９１ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）を７ｍＬのジクロロメタンに溶解させ、溶液を４℃に冷却した。次いで１．２ｍＬ（１６．６ｍｍｏｌ）のＴＦＡを滴下し、得られる反応混合物を周囲温度で９０分間撹拌し続けた。ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、８０：２０、ｖ／ｖ）によって、反応が完了したことを確認し、次いで反応混合物を蒸発乾燥した。こうして得た油性残渣を蒸留水に溶解させ、凍結乾燥した。白色粉末の形のカップリング生成物（Ｂ−１−Ｃ−２）１９９ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）を定量的収率で得た。次いで、この化合物をさらに精製することなく以下のステップで使用した。
1H NMR分析(300 MHz, CD3OD): δ = 1.26-1.28 (t, 3H, J = 3.8 Hz, CH3(SEt)Cys), 1.40-1.56 (m, 4H, CH2, β, γ Lys), 1.83-1.90 (m, 2H, CH2δLys), 2.67-2.74 (q, 2H, J = 7.2 Hz, CH2(SEt) Cys), 2.93-2.96 (d, 2H, J = 9.4 Hz, CH2 β Cys), 3.20-3.28 (m, 2H, CH2 ε Lys), 3.84-3.88 (t, J = 6.0 Hz, 1H, (H α Lys), 4.23 (s, 3H, CH Fmoc, CH2), 4.46-4.48 (d, 2H, J = 6.4 Hz, Ch2 Fmoc), 4.63-4.68 (q, J = 4.9 Hz, 1H, CH α Cys), 7.26-7.78 (m, 8H, CH Fmoc), 8.32 (bs, 1H, NH).
13C NMR分析(75.5 MHz, CD3OD): δ = 14.7 (CH3(SEt) Cys), 22.3 (CH2γ, Lys) 30.7 (CH2δLys), 32.2 (CH2(SEt) Cys), 33.2 (CH2 β Lys), 39.5 (CH2 β Cys), 41.0 (CH2 ε Lys), 48.2 (CH Fmoc), 53.9 (CH α Cys), 54.2 (CH α Lys), 68.6 (CH2 Fmoc), 76.5 (CH2), 121.0 (CH Fmoc), 126.0 (CH Fmoc), 128.2 (CH Fmoc), 129.0 (CH Fmoc), 142.7-174.3 (Cq).
RP-HPLC (システムB): tR = 16.5分, 純度74%.
MS (MALDI-TOF, ポジティブモード) m/z = 604.70 (M+H)+, 626.68 (M+Na)+, 642.66 (M+K)+, C28H37N5O6S2の計算値 603.76.
【０１６４】
ｃ）第３ステップ：Ｂｏｃ保護された三官能性試薬（２２）の合成
実施例１で予め調製した前駆体（Ａ−１）７８ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ）を２ｍＬの無水ＣＨ３ＣＮに溶解させた。次いで、３１ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）のヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物および４７．３ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）のＤＣＣを加え、得られる反応混合物をアルゴン雰囲気中にて周囲温度で２時間撹拌し続けた。次に、前述のステップで上記のように得た化合物（Ｂ−１−Ｃ−２）１３６．４ｍｇ（０．１９ｍｍｏｌ）を加え、次いで反応混合物をアルゴン雰囲気中にて周囲温度で２時間撹拌し続けた。反応混合物を含有する丸底フラスコを温度−２０℃で終夜保存した。翌日、３２μｌ（０．１９ｍｍｏｌ）のＤＩＥＡを加えた。反応をＲＰ−ＨＰＬＣ（システムＢ）によってモニターした。３時間経過する頃に、追加量のＤＣＣ（１２ｍｇ、５８μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１６μｌ、９５μｍｏｌ）を加えた。９０分経過する頃に、１６μｌ（９５μｍｏｌ）のＤＩＥＡをさらに加えた。２時間後、１６μｌ（９５μｍｏｌ）のＤＩＥＡをもう一度加えた。２１μｌ（３６０μｍｏｌ）の酢酸を加えて反応を停止し、反応媒体を含有する丸底フラスコを温度−２０℃で終夜保存した。２ｍＬのＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ混合物（２：１、ｖ／ｖ）で希釈した後、所望の化合物（２２）をＲＰ−ＨＰＬＣ（システムＣ、すなわち、Ｖａｒｉａｎ  Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）Ｃ１８カラム（１０μｍ、寸法２１．２×２５０ｍｍ）を使用し、アセトニトリルと浸透水の混合物を溶離液として、９０％の浸透水を５分間、次いで、１０〜４０％の範囲の線形勾配のＣＨ３ＣＮを１５分間かけて、次いで４０％〜７０％のＣＨ３ＣＮを流量２０．０ｍｌ／分で通過させる。２５４ｎｍおよび３０５ｎｍで二重検出ＵＶ分析を実施した）によって精製した。２種の生成物を得、凍結乾燥して、白色粉末の形の２種の異なる三官能性試薬（２２−１）（２２−２）それぞれ３８ｍｇおよび６６ｍｇを全収率６１％で得た。
化合物（２２−１）＝所望の化合物（２２）：ＲＰ−ＨＰＬＣ（システムＢ）：ｔＲ＝２０．８分、純度８６％、６６ｍｇ。
1H NMR分析(300 MHz, CDCl3): δ = 1.25-1.30 (t, 3H, J = 7.1 Hz, CH3(SEt)Cys), 1.43 (s, 9H, tBu), 1.52-1.90 (m, 4H, CH2 γ, δ Lys), 2.32 (bs, 2H, CH2 β Lys), 2.64-2.69 (q, 2H, J = 7.2 Hz, CH2(SEt) Cys), 2.97-3.16 (m, 2H, CH2 β Cys), 3.30 (s, 2H, CH2単位(A-1)), 3.45-3.65 (m, 11H, CH2 ε Lys + 4 × CH2単位(A-1)), 4.0 (s, 3H, CH2単位(A-1) + CH Fmoc), 4.21-4.25 (q, J = 6.8 Hz, 1H, CH α Lys), 4.34 (s, 2H, CH2), 4.44-4.50 (d, 2H, J = 10.0 Hz, CH2 Fmoc), 4.70-4.72 (q, 1H, J = 2.3 Hz CH α Cys), 5.23 (bs, 1H, NH), 6.08 (bs, 1H, NH), 6.9 (bs, 1H, NH), 7.26-7.77 (m, 8H, CH Fmoc).
13C NMR分析(75.5 MHz, CDCl3): δ = 14.4 (CH3(SEt) Cys), 22.6 (CH2γ, Lys) 26.7 (CH2単位(A-1)), 28.5 (tBu), 28.7 (CH2 δ Lys), 31.7 (CH2 (SEt) Cys), 32.5 (CH2 β Lys), 38.6 (CH2単位(A-1)), 38.8 (CH2単位(A-1)), 39.6 (CH2 ε Lys), 40.4 (CH2 β Cys), 47.0 (CH2単位(A-1)), 53.6 (CH α Lys), 68.0 (CH2 Fmoc), 70.0-71.2 (5 × CH2単位(A-1)), 77.5 (CH2単位(A-1)), 77.8 (CH Fmoc), 79.5 (Cq tBu), 120.2 (CH Fmoc), 125.1 (CH Fmoc), 127.3 (CH Fmoc), 128.1 (CH Fmoc), 141.4-173.0 (Cq).
MS (MALDI-TOF, ポジティブモード) m/z = 1016.66 (M+Na)+, C45H67N7O14S2.Naの計算値 1017.20.
Compound (22-2) (所望でないもの): RP-HPLC (システムB): tR = 21.6分, 純度79%, 38 mg.
MS (MALDI-TOF, ポジティブモード) m/z = 871.47 (M+Na)+, C39H56N6O11S2.Naの計算値 871.04.
【０１６５】
ｄ）第４ステップ：化合物（２２−１）の脱保護および式（Ｉ−２）の三官能性試薬の合成
前述のステップで上記のように得た化合物（２２−１）６２ｍｇ（０．０６２ｍｍｏｌ）を３ｍＬのジクロロメタンに溶解させた。溶液を４℃に冷却し、次いで３６８μｌ（４．９６ｍｍｏｌ）のＴＦＡを滴下した。得られる反応混合物を周囲温度で１時間撹拌し続けた。ＲＰ−ＨＰＬＣ（システムＢ）によって、反応が完了したことを確認し、次いで混合物を蒸発乾燥した。次いで最小量の浸透水を加え、得られる溶液を凍結乾燥して、脱保護された形の化合物（２２−１）（ＴＦＡ塩）（白色粉末）８３ｍｇ（０．０８２ｍｍｏｌ）を得た。
【０１６６】
次いで、この化合物をさらに精製することなく以下の反応で使用した。
RP-HPLC (システムB): tR = 16.5分, 純度88%.
MS (MALDI-TOF, ポジティブモード) m/z = 894.64 (M+H)+, C40H59N7O12S2の計算値894.08.
上記のように得た脱保護された化合物（２２−１）のＴＦＡ塩３６ｍｇ（３６．７μｍｏｌ）を５００μｌの無水ＤＭＦに溶解させた。次いで、５μｌ（３６．７μｍｏｌ）のＴＥＡおよびＤＳＣ（２４ｍｇ、９１．７５μｍｏｌ）を２５０μｌの無水ＤＭＦに溶かした溶液を滴下し、反応混合物を周囲温度で９０分間撹拌し続けた。ＲＰ−ＨＰＬＣ（システムＢ）によって、反応が完了したことを確認した。次いで、混合物を０．１％のＴＦＡ水溶液約４ｍＬに溶かし、ＲＰ−ＨＰＬＣ（システムＤ、すなわち、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｃ１８カラム（５μｍ、寸法１０×２５０ｍｍ）を使用し、アセトニトリル／０．１％（ｖ／ｖ、ｐＨ２）ＴＦＡ水溶液の混合物を溶離液として、９０％の０．１％ＴＦＡを含有する混合物を５分間、次いで１０〜４０％の範囲の線形勾配のＣＨ３ＣＮを１５分間かけて、次いで４０％〜７０％のＣＨ３ＣＮを流量５．０ｍＬ／分で通過させる。二重検出ＵＶ分析を２５４ｎｍおよび３０５ｎｍで実施した）によって精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥して、白色の非晶質粉末の形の式（Ｉ−２）の三官能性試薬２５ｍｇ（２４．２μｍｏｌ）を収率７４％で得た。
RP-HPLC (システムB): tR = 18.5分, 純度97%.
1H NMR分析(300 MHz, CDCl3): δ = 1.24-1.27 (t, 3H, J = 7.1 Hz, CH3(SEt)Cys), 1.32-1.90 (m, 6H, CH2 β, γ, δ Lys), 2.63-2.69 (q, 2H, J = 7.1 Hz, CH2(SEt) Cys), 2.81 (s, 4H, 2 × CH2スクシンイミジル), 2.24-3.28 (m, 2H, CH2 β Cys), 3.24-3.69 (m, 11H, 5 × CH2単位(A-1) + CH2 ε Lys), 4.22-4.27 (t, 1H, CH Fmoc), 4.32 (s, 2H, CH2), 4.51-4.53 (d, 2H, J = 6.4 Hz, CH2 Fmoc), 4.58-4.66 (q, J = 7.5 Hz, 1H, CH α Lys), 4.70-4.76 (q, 1H, J = 6.0 Hz CH α Cys), 6.17 (bs, 1H, NH), 6.83 (s, 1H, NH), 7.27-7.83 (m, 8H, CH Fmoc), 9.2 (bs, 1H, NH).
MS (MALDI-TOF, ポジティブモード) m/z = 1035.17 (M+H)+, 1057.71 (M+Na)+, 1073.68 (M+K)+, C45H62N8O16S2の計算値 1035.69 (M+H)+.
次いで、式（Ｉ−２）の三官能性試薬を任意の蛍光リガンドによって官能化すると、対応する三官能性蛍光試薬を得ることができる。
【国際調査報告】
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