(57)【要約】本発明は、FXR媒介性の疾患または状態の治療のための、式中、R1が水素またはアルキル基であり；R2が水素、またはハロゲン、ニトロ、アルキルオキシ、アミノもしくはカルボキシ基であり；YがCH2、酸素または硫黄であり；nが1〜4の整数である、式 (I) の化合物、ならびにその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体に関する。2010517931.tif 000013
2010517931.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式 (I) の化合物、ならびにその薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体：
2010517931.tif 000012
式中、
R1は水素、またはアルキル基であり；
R2は水素、またはハロゲン、ニトロ、アルキルオキシ、アミノもしくはカルボキシ基であり；
YはCH2、酸素または硫黄であり；かつ
nは1〜4の整数である。
【請求項２】
R1およびR2が水素であり、Yは酸素であり、かつnが1である、式 (I) の化合物。
【請求項３】
FXR媒介性の疾患または状態を患う哺乳動物に、請求項1または2記載の化合物の治療的有効量を投与する段階を含む、哺乳動物におけるFXR媒介性の疾患または状態の予防または治療のための方法。
【請求項４】
FXR媒介性の疾患または状態が、肝疾患もしくは状態、胃腸疾患もしくは状態、腎臓疾患もしくは状態、循環器疾患もしくは状態、ならびに代謝疾患もしくは状態からなる群より選択される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
肝疾患または状態が、原発性胆汁性肝硬変（PBC）、原発性硬化性胆管炎（PSC）、薬物誘発性胆汁うっ滞、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞、非経口的栄養補給に関連した胆汁うっ滞（PNAC）、細菌異常増殖もしくは敗血症に関連した胆汁うっ滞、自己免疫性肝炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝（NAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、移植片対宿主病、移植肝再生、先天性肝線維症、総胆管結石症、肉芽腫性肝疾患、肝内もしくは肝外の悪性疾患、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、ウィルソン病、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、ならびにα1-アンチトリプシン欠損症からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
胃腸疾患または状態が、炎症性腸疾患（IBD）、過敏性腸症候群（IBS）、細菌異常増殖、吸収不良、放射線照射後の大腸炎、および顕微鏡的大腸炎からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項７】
腎臓疾患または状態が、糖尿病性腎症、巣状分節状糸球体硬化症（FSGS）、高血圧性腎硬化症、慢性糸球体腎炎、慢性移植糸球体症、慢性間質性腎炎、および腎多嚢胞病からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項８】
循環器疾患または状態が、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、脂質異常症、高コレステロール血症、および高トリグリセリド血症からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項９】
代謝疾患または状態が、インスリン抵抗性、糖尿病、および肥満からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項１０】
請求項1または2記載の化合物、ならびに薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む医薬製剤。
【請求項１１】
放射性同位元素標識された、請求項1または2記載の化合物。
【請求項１２】
トリチウム化された、請求項11記載の化合物。
【請求項１３】
FXR媒介性の疾患または状態の予防または治療用の薬学的組成物の調製のための、請求項1または2記載の化合物の使用。
【請求項１４】
肝疾患もしくは状態、胃腸疾患もしくは状態、腎臓疾患もしくは状態、循環器疾患もしくは状態、ならびに代謝疾患もしくは状態からなる群より選択される、FXR媒介性の疾患または状態の予防または治療用の薬学的組成物の調製のための、請求項1または2記載の化合物の使用。
【請求項１５】
原発性胆汁性肝硬変（PBC）、原発性硬化性胆管炎（PSC）、薬物誘発性胆汁うっ滞、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞、非経口的栄養補給に関連した胆汁うっ滞（PNAC）、細菌異常増殖もしくは敗血症に関連した胆汁うっ滞、自己免疫性肝炎、肝炎、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝（NAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、移植片対宿主病、移植肝再生、先天性肝線維症、総胆管結石症、肉芽腫性肝疾患、肝内もしくは肝外の悪性疾患、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、ウィルソン病、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、ならびにα1-アンチトリプシン欠損症からなる群より選択される、肝疾患または状態の予防または治療用の薬学的組成物の調製のための、請求項1または2記載の化合物の使用。
【請求項１６】
炎症性腸疾患（IBD）、過敏性腸症候群（IBS）、細菌異常増殖、吸収不良、放射線照射後の大腸炎、および顕微鏡的大腸炎からなる群より選択される、胃腸疾患または状態の予防または治療用の薬学的組成物の調製のための、請求項1または2記載の化合物の使用。
【請求項１７】
糖尿病性腎症、巣状分節状糸球体硬化症（FSGS）、高血圧性腎硬化症、慢性糸球体腎炎、慢性移植糸球体症、慢性間質性腎炎、および腎多嚢胞病からなる群より選択される、腎臓疾患または状態の予防または治療用の薬学的組成物の調製のための、請求項1または2記載の化合物の使用。
【請求項１８】
アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、脂質異常症、高コレステロール血症、および高トリグリセリド血症からなる群より選択される、循環器疾患または状態の予防または治療用の薬学的組成物の調製のための、請求項1または2記載の化合物の使用。
【請求項１９】
インスリン抵抗性、糖尿病、および肥満からなる群より選択される、代謝疾患または状態の予防または治療用の薬学的組成物の調製のための、請求項1または2記載の化合物の使用。
【請求項２０】
薬学的に許容される担体および／または希釈剤との混合剤に請求項1または2記載の化合物を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、胆汁うっ滞性障害の治療に用いることができるファルネソイドX受容体（FXR）調節因子、特に、C24カルボキシ基がアミド、カルバミドまたはチオカルバミド基に変換された、胆汁酸誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ファルネソイドX受容体（FXR）は、最初にラットの肝臓のcDNAライブラリー（BM. Forman, et al., Cell 81:687-693 (1995)（非特許文献1））から同定された、オーファン核内受容体であり、昆虫エクジソン受容体と最も密接な関係がある。FXRは、ステロイド、レチノイドおよび甲状腺ホルモンの受容体を含むリガンド活性化転写因子の核内受容体ファミリーに属している（DJ. Mangelsdorf, et al., Cell 83:841-850 (1995)（非特許文献2））。ノーザン分析およびその場分析により、FXRが肝臓、腸、腎臓、および副腎で最も多量に発現することが示されている（BM. Forman, et al., Cell 81:687-693 (1995) （非特許文献1）および W. Seol, et al., Mol. Endocrinnol. 9:72-85 (1995)（非特許文献3））。FXRは、9-cisレチノイン酸受容体（RXR）とのヘテロ二量体としてDNAに結合する。FXR/RXRヘテロ二量体は、逆方向反復として組織化され、単一ヌクレオチドで隔てられた共通AG(G/T)TCAの2つの核内受容体ハーフサイト（half site）から構成される応答配列（response element）（IR-1モチーフ）に、優先的に結合する（BM. Forman, et al., Cell 81:687-693 (1995)（非特許文献1））。初期の報告で、ラットのFXRが、例えばファルネソールおよび幼若ホルモン等のマイクロモル濃度のファルネソイドによって活性化されることが示された（BM. Forman, et al., Cell 81:687-693 (1995)（非特許文献1））。しかしながら、これらの化合物はマウスおよびヒトのFXRを活性化せず、内因性FXRリガンドの性質は不明なままである。数種の天然由来の胆汁酸は、生理学的濃度でFXRに結合し、FXRを活性化する（2000年6月29日公開の国際公開公報第00/37077号（特許文献1））。その中で論じられたように、FXRリガンドとして働く胆汁酸としては、ケノデオキシコール酸（CDCA）、デオキシコール酸（DCA）、リトコール酸（LCA）、ならびにこれらの胆汁酸のタウリンおよびグリシン抱合体が挙げられる。
【０００３】
胆汁酸は、肝臓内で生成され、腸の十二指腸内に分泌されるコレステロール代謝産物であり、ここで、それらは食物中の脂肪およびビタミンの可溶化と吸収における重要な役割を有する。ほとんどの胆汁酸（〜95%）は、続いて回腸内で再吸収され、腸肝循環系を経て肝臓に戻される。肝臓内でのコレステロールの胆汁酸への変換はフィードバック調節下で行われ、胆汁酸は、胆汁酸の生合成における律速段階を触媒する酵素をコードする、チトクロムP450 7a（CYP7a）の転写を下方調節する。正確な機構ははっきりしないままであるが、FXRが胆汁酸によるCYP7a発現の抑制に関与することを示唆するデータがある（DW. Russell, Cell 97:539-542 (1999)（非特許文献4））。回腸内で、胆汁酸は、高い親和性で胆汁酸と結合してそれらの細胞取り込みおよび輸送に関与し得る細胞質タンパク質である、腸内胆汁酸結合タンパク質（IBABP）の発現を誘導する。現在、2つのグループにより、ヒト、ラット、およびマウスのIBABP遺伝子プロモーター（14；17）に保存されたIR-1型応答配列に結合するFXRの活性化を介して、胆汁酸が、IBABP発現に対するそれらの作用を媒介することが実証されている。従って、FXRは、胆汁酸およびコレステロールの恒常性に関与する標的遺伝子の刺激（IBABP）と抑制（CYP7a）の両方に関与している。
【０００４】
欧州特許第1392714号（特許文献2）には、FXR媒介性の疾患または状態の予防または治療用の薬剤の調製に用いることができるFXRアゴニストとして、3α,7β-ジヒドロキシ-6α-エチル-5β-コラン-24-酸（以下、6-エチル-ケノデオキシコール酸、6-EDCAとも称される）、その溶媒和物およびアミノ酸抱合体が開示されている。
【０００５】
欧州特許第1568796号（特許文献3）には、FXRアゴニストとしての6-エチル-ウルソデオキシコール酸（6-EUDCA）誘導体、およびFXR媒介性の疾患または状態の予防または治療におけるそれらの使用が開示されている。
【０００６】
【特許文献１】国際公開公報第00/37077号
【特許文献２】欧州特許第1392714号
【特許文献３】欧州特許第1568796号
【非特許文献１】BM. Forman, et al., Cell 81:687-693 (1995)
【非特許文献２】J. Mangelsdorf, et al., Cell 83:841-850 (1995)
【非特許文献３】W. Seol, et al., Mol. Endocrinnol. 9:72-85 (1995)
【非特許文献４】DW. Russell, Cell 97:539-542 (1999)
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、下記一般式 (I) の化合物、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体を提供する。
2010517931.tif 000003
式中、R1は水素またはアルキル基であり；R2は水素、またはハロゲン、ニトロ、アルキルオキシ、アミノもしくはカルボキシ基であり；Yはメチレン基、酸素または硫黄であり；かつnは1〜4の整数である。
【０００８】
別の局面において、本発明は、R1およびR2が水素であり、Yが酸素であり、かつnが1である式 (I) の化合物（式 Ia）を提供する。
【０００９】
別の局面において、本発明は、FXR媒介性の疾患または状態を患う哺乳動物に、式 (I) または (Ia) の化合物の治療的有効量を投与する段階を含む、哺乳動物におけるFXR媒介性の疾患または状態の予防または治療のための方法を提供する。本発明はまた、FXR媒介性の疾患または状態の予防または治療のための薬剤の調製のための、式 (I) または (Ia) の化合物の使用も提供する。特定の態様において、FXR媒介性の疾患または状態は、肝疾患もしくは状態、胃腸疾患もしくは状態、腎臓疾患もしくは状態、循環器疾患もしくは状態、または代謝疾患もしくは状態である。特定の態様において、肝疾患または状態は、原発性胆汁性肝硬変（PBC）、原発性硬化性胆管炎（PSC）、薬物誘発性胆汁うっ滞、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞、非経口的栄養補給に関連した胆汁うっ滞（PNAC）、細菌異常増殖もしくは敗血症に関連した胆汁うっ滞、自己免疫性肝炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝（NAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、移植片対宿主病、移植肝再生、先天性肝線維症、総胆管結石症、肉芽腫性肝疾患、肝内もしくは肝外の悪性疾患、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、ウィルソン病、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、またはα1-アンチトリプシン欠損症である。特定の態様において、胃腸疾患または状態は、炎症性腸疾患（IBD）（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）、過敏性腸症候群（IBS）、細菌異常増殖、吸収不良、放射線照射後の大腸炎、または顕微鏡的大腸炎である。特定の態様において、腎臓疾患または状態は、糖尿病性腎症、巣状分節状糸球体硬化症（FSGS）、高血圧性腎硬化症、慢性糸球体腎炎、慢性移植糸球体症、慢性間質性腎炎、または腎多嚢胞病である。特定の態様において、循環器疾患または状態は、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、脂質異常症、高コレステロール血症、または高トリグリセリド血症である。特定の態様において、代謝疾患または状態は、インスリン抵抗性、糖尿病、または肥満である。
【００１０】
別の局面において、本発明は、式 (I) もしくは (Ia) の化合物、ならびに薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む医薬製剤を提供する。本発明はまた、薬学的に許容される担体および／または希釈剤との混合剤中に式 (I) または (Ia) の化合物を含有する薬学的組成物も提供する。
【００１１】
別の局面において、本発明は、式 (I) または (Ia) の放射性同位元素標識化合物を提供する。別の態様において、式 (I) または (Ia) の化合物はトリチウム化されている。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、下記一般式 (I) の化合物、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくはアミノ酸抱合体に関する。
2010517931.tif 000004
式中、
R1は水素、またはアルキル基であり；
R2は水素、またはハロゲン、ニトロ、アルキルオキシ、アミノもしくはカルボキシ基であり；
Yはメチレン基、酸素または硫黄であり；
nは1〜4の整数である。
【００１３】
本願の目的に関して、「アルキル」は、1〜6個の炭素原子を含有する、直鎖状または分岐状アルキル鎖を意味し、「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素より選択されるハロゲン原子を意味する。
【００１４】
本発明による適した薬学的に許容される塩は、当業者により容易に決定され、例えば、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、および亜鉛から作られる金属塩、または、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン、クロルプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（N-メチルグルカミン）、およびプロカインから作られる有機塩等の塩基性塩を含むと考えられる。式 (I) の化合物のこのような塩は、例えば、適当な塩基を式 (I) の化合物と反応させることにより、式 (I) の化合物から、従来技術を用いて調製してもよい。
【００１５】
医薬で用いられる場合、式 (I) の化合物の塩は、薬学的に許容されるべきであるが、それらの対応する遊離塩基または薬学的に許容される塩を調製するために、薬学的に許容されない塩を適宜用いてもよい。
【００１６】
本明細書で用いられる「溶媒和物」という用語は、式 (I) の化合物またはその薬学的に許容される塩、ならびに化学量論的量かもしくは非化学量論的量の溶媒を含有する結晶形態のことである。溶媒の一例としては、水、メタノール、エタノール、または酢酸が挙げられる。以下、式 (I) の化合物への言及は、その特別な形態、塩または溶媒和物が特定されない限り、該化合物の任意の物理的形態のことである。
【００１７】
本明細書で用いられる「アミノ酸抱合体」という用語は、任意の適したアミノ酸との式 (I) の化合物の抱含体のことを言う。好ましくは、このような、式 (I) の化合物の適したアミノ酸抱合体は、胆液または腸液中での完全性の増強という追加の利点を有すると考えられる。適したアミノ酸としては、グリシンおよびタウリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明の化合物は、有機合成の分野で周知の方法により調製することができる。
【００１９】
Yがメチレン基である式 (I) の化合物は、ケノデオキシコール酸 (II) のC24カルボキシ基をアミノ基に変換し、次いで、該アミノ誘導体を下記式 (III) の活性カルボン酸と反応させることにより、調製することができる。
2010517931.tif 000005
式中、Xはカルボキシ活性化基である。
【００２０】
Yが酸素または硫黄である式 (I) の化合物は、ケノデオキシコール酸 (II) のC24カルボキシ基をイソシアナート基に変換し、次いで、該イソシアナート誘導体を下記式 (IV) の適したアルコールまたはチオールと反応させることにより、調製することができる。
2010517931.tif 000006
式中、Yは酸素または硫黄である。
【００２１】
この合成アプローチは、本明細書で以下に簡単に要約されており、かつ、本発明の最も好ましい態様である、R1およびR2が水素であり、Yが酸素であり、かつnが1である、式 (Ia) の化合物に関して、スキーム1に図示されている。Goto, J. et al. Chem. Pharm. Bull. 1979, 27, 1402-1411で報告されたようにして得られる、3α,7α-ジホルミル-ケノデオキシコール酸（CDCA）(V)は、最初に塩化オキサリルで処理し、次いで水性アジ化ナトリウムで処理することにより、塩化アシル中間体を経由して、対応するアシルアジドに変換される。次いで、未精製のアシルアジド混合物を、クルチウス転位により、対応するイソシアナート (VI) に変換する。次いで、中間体(VI)をシンナミルアルコール（またはもう1つの適したアルコール IV）と反応させて3α,7α-二保護-CDCAカルバマート類似体を得、これから、塩基加水分解後に所望の化合物 (Ia) を得た。
（スキーム1）
2010517931.tif 000007
【００２２】
実験項でより詳細に説明するように、化合物 (Ia) を、無細胞アッセイで、およびヒト肝細胞株に対して試験した。この (Ia) は、FXRの活性化において、ケノデオキシコール酸（CDCA）よりおよそ20倍強力であることが証明され、FXR調節遺伝子および胆汁酸輸送体、つまりBSEP（胆汁塩輸出ポンプ）を13倍誘導した。例えばCDCA等の天然のFXRリガンドとは対照的に、化合物 (Ia) は、小ヘテロ二量体パートナー（small heterodimeric partner）（SHP、DNA結合ドメインを欠失した非定型核内受容体）を誘導せず、SREPB-1cおよび脂肪酸合成酵素（FAS）に作用しなかった。従って、本発明の化合物によるFXR活性化は、脂質、コレステロールおよびグルコース代謝に関与する遺伝子に作用せずに、胆汁酸排出に関与する遺伝子の選択的調節を可能にすることが示唆される。それ故、式 (I) の化合物は、胆汁酸輸送体BSEPの選択的調節因子として働き、SHPを誘導せずに肝臓での胆汁酸の流出を増加させる。このため、それらを、FXR媒介性の疾患または状態の予防または治療に用いることができ、該疾患または状態としては、肝疾患もしくは状態（1つまたは複数の胆汁うっ滞、脂肪症、炎症、線維症、および肝硬変を含む）、胃腸疾患もしくは状態、腎臓疾患もしくは状態、循環器疾患もしくは状態、ならびに代謝疾患もしくは状態が挙げられる。式 (I) の化合物を用いて予防または治療され得る、肝疾患または状態としては、原発性胆汁性肝硬変（PBC）、原発性硬化性胆管炎（PSC）、薬物誘発性胆汁うっ滞、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞、非経口的栄養補給に関連した胆汁うっ滞（PNAC）、細菌異常増殖もしくは敗血症に関連した胆汁うっ滞、自己免疫性肝炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝（NAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、移植片対宿主病、移植肝再生、先天性肝線維症、総胆管結石症、肉芽腫性肝疾患、肝内もしくは肝外の悪性疾患、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、ウィルソン病、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、およびα1-アンチトリプシン欠損症が挙げられるが、これらに限定されない。式 (I) の化合物を用いて予防または治療され得る、胃腸疾患または状態としては、炎症性腸疾患（IBD）（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）、過敏性腸症候群（IBS）、細菌異常増殖、吸収不良、放射線照射後の大腸炎、および顕微鏡的大腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。式 (I) の化合物を用いて予防または治療され得る、腎臓疾患または状態としては、糖尿病性腎症、巣状分節状糸球体硬化症（FSGS）、高血圧性腎硬化症、慢性糸球体腎炎、慢性移植糸球体症、慢性間質性腎炎、および腎多嚢胞病が挙げられるが、これらに限定されない。式 (I) の化合物を用いて予防または治療され得る、循環器疾患または状態としては、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、脂質異常症、高コレステロール血症、および高トリグリセリド血症が挙げられるが、これらに限定されない。式 (I) の化合物を用いて予防または治療され得る、代謝疾患または状態としては、インスリン抵抗性、糖尿病、および肥満が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明の方法は、式 (I) の化合物の治療的有効量を投与する段階を含む。本明細書で用いられる、「治療的有効量」という用語は、規定の効果を達成するために十分である式 (I) の化合物の量のことを言う。従って、FXR媒介性の疾患または状態の予防または治療のための方法で用いられる、式 (I) の化合物の治療的有効量は、FXR媒介性の疾患または状態を予防または治療するために十分な量であると考えられる。従って、例えば、胆汁うっ滞性肝疾患の予防法もしくは治療のための、または胆汁流出を増加させるための方法で用いられる、式 (I) の化合物の治療的有効量は、腸管への胆汁流出を増加させるために十分な量であると考えられる。
【００２４】
所望の生物学的効果を達成するために必要とされる、式 (I) の化合物の量は、例えば、意図される使用、投与手段、および受容者等の複数の因子に依存すると考えられ、最終的に医師または獣医師の自由裁量であると考えられる。一般に、FXR媒介性の疾患および状態の治療のための標準的な日用量は、例えば、約0.01 mg/kg〜約100 mg/kgの範囲にあると見込まれ得る。この用量は、単回単位用量として、または複数回分割単位用量として、または持続注入として投与してもよい。
【００２５】
従って、さらなる局面において、本発明は、少なくとも1種の薬学的担体または希釈剤とともに、および／またはこれらとの混合剤中に、活性成分として式 (I) の化合物を含む、薬学的組成物を提供する。これらの薬学的組成物は、前述の疾患もしくは状態の予防法および治療で用いられ得る。
【００２６】
担体は、薬学的に許容される必要があり、組成物中の他の成分に適合性がある、すなわち、悪影響をもたらさない必要がある。担体は、固体または液体であってもよく、好ましくは単位用量製剤、例えば、0.05〜95重量%の活性成分を含有し得る錠剤として処方される。望ましければ、他の生理活性成分も、本発明の薬学的組成物に組み入れてもよい。
【００２７】
可能な製剤としては、経口投与、舌下投与、口腔内投与、非経口投与（例えば、皮下、筋肉内、または静脈内）、直腸内投与、経皮投与を含む局所投与、鼻腔内投与、および吸入投与のために適した製剤が挙げられる。特定の患者への最も適した投与手段は、治療する疾患もしくは状態の性質および重症度、または用いる治療法の性質、ならびに活性化合物の性質に依存すると考えられるが、可能であれば、FXR媒介性の疾患および状態の予防および治療には、経口投与が好ましい。
【００２８】
経口投与に適した製剤は、所定量の活性化合物をそれぞれ含有する別々の単位、例えば、錠剤、カプセル剤、カシェ剤、舐剤等として；散剤もしくは顆粒剤として；水性もしくは非水性液体の液剤または懸濁剤として；または水中油型もしくは油中水型乳剤として提供され得る。
【００２９】
舌下または口腔内投与に適した製剤としては、活性化合物、および通常、例えば、糖およびアルビアゴムもしくはトラガカントゴム等の香味基剤を含む舐剤、ならびに例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖アルビアゴム（sucrose acacia）等の不活性な基剤に活性化合物を含むトローチ剤が挙げられる。
【００３０】
非経口投与に適した製剤は、一般に、所定濃度の活性化合物を含有する無菌水溶液を含み、該溶液は、対象とする受容者の血液と等張であることが好ましい。非経口投与に適したさらなる製剤としては、例えば、界面活性剤およびシクロデキストリン等の生理学的に適した共溶媒および／または錯化剤を含有する製剤が挙げられる。水中油型乳剤も、非経口製剤に適した製剤である。このような液剤は、静脈内投与することが好ましいが、また、それらを皮下または筋肉内注射により投与してもよい。
【００３１】
直腸投与に適した製剤は、好ましくは、坐剤の基剤を形成する1種またはそれ以上の固体担体、例えば、ココアバターに活性成分を含む、単位用量の坐剤として提供される。
【００３２】
局所適用または鼻腔内適用に適した製剤としては、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、パスタ剤、ゲル剤、スプレー剤、エアゾール剤、および油剤が挙げられる。このような製剤に適した担体としては、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール類、アルコール類、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００３３】
本発明の製剤は、任意の適した方法により、一般に、活性化合物を液体もしくは微粉砕した固体担体、またはその両方と、必要な割合で均質にかつ完全に混合し、次いで必要に応じて、得られた混合物を所望の形状に成形することにより、調製され得る。
【００３４】
例えば、錠剤は、活性成分の粉末または顆粒と、例えば結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、または表面活性分散剤等の1種またはそれ以上の任意の成分とを含む均質混合物を圧縮することにより、または粉末活性成分と不活性な液状希釈剤との均質混合物を成型することにより調製され得る。
【００３５】
吸入による投与に適した製剤としては、様々な種類の定量加圧型エアゾール、噴霧器、または吹き入れ器を用いて発生させ得る、微粒子ダストまたはミストが挙げられる。
【００３６】
口を経由する肺投与では、気管支樹へ確実に送達されるように、粉末または液滴の粒径は、一般に0.5〜10μm、好ましくは1〜5μmの範囲である。経鼻投与では、鼻腔で確実に保持されるように、10〜500μmの範囲にある粒径が好ましい。
【００３７】
定量吸入器は、一般に液化噴射剤中に活性成分の懸濁剤または液剤を含有する、加圧型エアゾールディスペンサーである。
【００３８】
使用中、これらの装置は、一般に10〜150μlの定量を送達するように適合させたバルブを通して製剤を放出し、活性成分を含有する微粒子噴霧を生成する。適した噴射剤としては、ある特定のクロロフルオロカーボン化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、およびそれらの混合物が挙げられる。製剤は、1種またはそれ以上の、例えばエタノールといった共溶媒、例えばオレイン酸またはトリオレイン酸ソルビタン等の界面活性剤、抗酸化剤、および適した香味剤をさらに含有してもよい。
【００３９】
噴霧器は、狭いベンチュリ・オリフィスを通して一般に空気もしくは酸素である圧縮ガスを加速させることによって、または超音波攪拌によって、活性成分の液剤または懸濁剤を、治療用エアゾールミストに変換する、市販の装置である。噴霧器での使用に適した製剤は、液体担体中の活性成分からなり、製剤の最大40% w/wまで、好ましくは20% w/w未満の活性成分を含む。該担体は、一般に水または希アルコール水溶液であり、好ましくは、例えば塩化ナトリウムを添加することにより体液と等張にされる。任意の添加剤としては、製剤が無菌で調製されない場合、例えばヒドロキシ安息香酸メチルといった保存剤、抗酸化剤、香味剤、揮発性油、緩衝剤、および界面活性剤が挙げられる。
【００４０】
吹き入れによる投与に適した製剤としては、吹き入れ器を用いて送達されるか、または鼻から吸い込んで鼻腔中に取り入れられる、微粉砕した粉末が挙げられる。吹き入れ器では、粉末は一般にゼラチンまたはプラスチックで作られたカプセルまたはカートリッジに含有されており、これらはインサイチューで穴をあけられるかまたは開けられ、粉末は、吸入した際に装置を通して吸い込まれた空気により、または手動ポンプを用いて、送達される。吹き入れ器で使用される粉末は、活性成分単独、または、活性成分と、例えば乳糖等の適した粉末希釈剤と、任意の界面活性剤とを含む粉末ブレンドからなる。活性成分は、一般に製剤の0.1〜100 w/wを構成する。
【００４１】
具体的に上述した成分に加えて、本発明の製剤は、課題となる製剤の種類を考慮して、製薬学分野で当業者に公知の他の薬剤を含んでもよい。例えば、経口投与に適した製剤は、香味剤を含んでもよく、鼻腔内投与に適した製剤は香料を含んでもよい。
【００４２】
それゆえ、本発明のさらなる局面によれば、FXR媒介性の疾患または状態の予防または治療のための薬剤の調製における式 (I) の化合物の使用が提供される。
【００４３】
本発明の方法は、概して哺乳動物の治療に、特にヒトの治療に有用である。
【００４４】
本発明は以降、下記の実験項においてより詳細に説明される。
【００４５】
実施例
化学
融点は、Buchi 535型電熱装置を用いて測定し、補正は行わなかった。NMRスペクトルは、Bruker AC 200 MHzまたは400 MHZの分光計を用いて取得し、化学シフトは、100万分の1（ppm）で報告した。以下のように略号を用いた：s, シングレット；bs, ブロードシングレット；d, ダブレット；dd, ダブルダブレット；m, マルチプレット。比旋光度は、Jasco Dip-360型デジタル旋光度計で記録した。フラッシュカラムクロマトグラフィは、Merckのシリカゲル60（0.040〜0.063 mm）を用いて遂行した。TLCは、シリカゲル60 F-254（Merck）でプレコート済みのTLCプレートで行った。スポットは、リンモリブデン酸エステル試薬（5% EtOH溶液）で染色して温めることにより可視化した。全ての反応は、窒素雰囲気下で行った。
【００４６】
3α,7α-ジホルミルオキシ-5β-コラン-24-酸 (V) の合成
CDCA (II)（15.0 g, 38.27 mmol）を83 mlのテトラヒドロフランに溶解し、18滴の70% HClO4 で処理した。次いで、ギ酸（50 ml）を40分間かけて滴下し、得られた混合物を54℃で8時間反応させた。次いで、混合物を真空下で濃縮し、残渣を水に取り込ませた。白色の沈殿を濾過して、水で数回洗浄し、5℃で20分間、水中で粉末化して、高真空下で乾燥させ、純粋な化合物 (V) を16.5 g（36.83 mmol, 96%）得た。
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【００４７】
化合物 (VI) の合成
3α,7α-ジホルミルオキシ-5β-コラン-24-酸 (V)（6.0 g, 13.37 mmol）を塩化オキサリル（7.0 ml）で処理し、窒素雰囲気下、35℃で3時間反応させた。塩化オキサリルを蒸発により除去して対応する酸塩化物を得、これを乾燥アセトン（50 ml）に溶解した。この溶液に、NaN3（5.2 g, 80.25 mmol）の水溶液（25 ml）を0〜5℃で添加し、得られた反応混合物を同じ温度でさらに3時間攪拌した。溶媒を除去し、残渣を冷水（100 ml）に注ぎ入れ、ジエチルエーテル（3×100 ml）で抽出した。併せた有機相を無水Na2SO4で乾燥させ、濃縮して対応するアシルアジド（IR：2134 および 2267 cm-1）を得た。次いで、得られたアシルアジド中間体を乾燥トルエン（60 ml）中で5時間還流させた。混合物を真空下で濃縮し、5.1 gのイソシアナート誘導体3（11.37 mmol, 85%, IR：2271 cm-1）を得た。これを精製せずに次の工程で用いた。
【００４８】
23-N-カルバシンナミルオキシ-3α,7α-ジヒドロキシ-5β-ノルコラニルアミン (Ia) の合成
イソシアナート (VI)（5.0 g, 11.25 mmol）を乾燥トルエン（25 ml）に溶解し、次いで、窒素雰囲気下、90℃でシンナミルアルコール（1.2 eq.）と反応させた。反応の終点をTLCで確認した。次に反応混合物を水（50 ml）に注ぎ入れ、有機相を分離して、水相を酢酸エチル（3×25 ml）で抽出した。併せた有機相を食塩水で洗浄し、乾燥させ（Na2SO4）、濾過して、真空下で濃縮した。次いで、未精製の23-N-カルボキシ-3α,7α-ジホルミルオキシ-5β-ノルコラニルアミン誘導体を、室温で、終夜、K2CO3の飽和メタノール溶液（25 ml）で処理した。溶媒を蒸発させた後、残渣を水（35 ml）に溶解し、2N HClで酸性にして、ジクロロメタン（3×25 ml）で抽出した。併せた有機抽出物を無水Na2SO4で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して、ジクロロメタン／メタノールの混合物を溶出液として用いたシリカゲルフラッシュクロマトグラフィにより精製し、所望の化合物 (Ia) を良好な収率（72%）で得た。
mp：79〜84℃ 
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【００４９】
生物活性
化合物 (Ia) がFXR調節遺伝子を調節するかどうかを実証するために、最初にケノデオキシコール酸（CDCA）と比較して試験を行った。CDCAは、ファルネソイドX受容体（FXR；NR1H4）の内因性リガンドとして機能する、一次胆汁酸である。最初にFXR活性に関する化合物 (Ia) の生物活性を蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）技術を用いた、インビトロアッセイで試験した。無細胞アッセイであるこの技術は、Pellicciari R., et al. J Med Chem. 2002 15; 45: 3569-72に記載されている。FREを用いる無細胞アッセイにおいて、FXRに対する共活性化因子であるScr-1の動員（recruitment）は、天然のFXRリガンドCDCAに対して必要とされる濃度よりも、ほとんど20倍少ない化合物 (Ia) の濃度で起こる。
【００５０】
（表１）FRETでのヒトFXRに関する化合物 (Ia) の活性
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1 CDCA = 100%とした場合の、FXRに対するSRC1ペプチドの相対的動員。
全てのデータは、n = 4での平均値±標準誤差である。
【００５１】
化合物 (Ia) がFXR調節遺伝子を調節するかどうかを、ヒト肝細胞の細胞株（HepG2）を用いた細胞アッセイでも評価した。HepG2細胞株を用いた細胞トランスフェクションアッセイにおいて、化合物 (Ia) は強力なFXRリガンドであることが証明された。HepG2細胞を1μMの化合物 (Ia) に暴露するとFXRをトランス活性化する。FXR遺伝子、またはルシフェラーゼ遺伝子の上流域にクローニングした他の核内受容体を運ぶウイルス構築物でトランスフェクトした肝細胞を用いた他の実験において、マウス、ラット、およびヒトの肝細胞において、化合物 (Ia) が選択的FXRリガンドとして機能することが見出された。これらの方法の詳細な説明は、以下の参考文献、Fiorucci S., et al. Gastroenterology 2004で見つけることができる。
【００５２】
HepG2細胞における化合物 (Ia) によるFXR標的遺伝子発現の制御
化合物 (Ia) がFXR調節因子であり、かつ特異な活性を示すかどうかを証明するために、ヒトHepG2細胞を、化合物 (Ia)、CDCA（天然のFXRリガンド）、およびその6-エチル誘導体であり、強力なFXRリガンドである6-ECDCAに暴露した。次いで、これらのリガンドのFXR応答遺伝子への作用を、定量的逆転写-PCR（qRT-PCR）により調べた。これらいずれのリガンドに暴露しても、つまりCDCAおよびその6-ECDCA誘導体にHepG2細胞を暴露しても、直接的な細胞毒性は観測されなかったが、FXR調節遺伝子であるSHPを2〜3倍誘導した。一方、化合物 (Ia) がFXRリガンド（前記参照）であるという事実にもかかわらず、SHPの発現を促進しなかった。試験した全てのFXRリガンド、すなわちCDCA、6-ECDCAおよび化合物 (Ia) はCYP7α1に対して同じ作用を示した（全ての薬剤がCYP7α1 mRNA の発現を60〜70%減少させた）。さらに、化合物 (Ia) への暴露はBSEP mRNAの発現を強く誘導した（約13倍の誘導）。この作用は、他のFXRリガンドよりも、化合物 (Ia) で有意により顕著であった。さらに、他のリガンドと同様に、化合物 (Ia) への暴露は、SREPB-1cおよびFAS mRNAの発現に対して同様の阻害活性をもたらした。総合すれば、これらのデータは、化合物 (Ia) が強力なFXRリガンドとして機能するFXR調節因子であり、かつFXR調節遺伝子を予想外に変化させて、SHPを誘導せずに胆汁酸輸送体（例えばBSEP）を有意に誘導することを示唆する。さらに、化合物 (Ia) は、コレステロールからの胆汁酸合成に決定的に関与する遺伝子であるCYP7α1の発現を抑える。これらのFXR標的遺伝子の調節は、化合物 (Ia) が遺伝子選択的FXRリガンドであり、該FXRリガンドがSHPの発現を妨害せずに肝細胞からの胆汁酸分泌を増加させながら、古典経路を介して胆汁酸生合成を阻害し得ることを証明している。これらのFXRリガンドの薬理活性が限られていることからこの作用は望ましく、一般にSHPの誘導に関連する代謝活性化を予防し得る。
【００５３】
これらの実験の結果を表2にまとめ、かつ図1に図示する。
【００５４】
（表２）化合物 (Ia) におけるインビトロ薬理研究
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【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】選択的遺伝子への化合物 Ia の作用を示す。ヒト肝細胞の細胞株HepG2をこれらの研究のために使用した。細胞を10μMのCDCA、6-ECDCAおよび化合物 (Ia)に18時間暴露し、CYP7A1、SHP、BSEP、SREPB-1CおよびFASの発現をqRT-PCRにより測定した。図は、同じパターンを示す4つの実験報告のうち、1つの結果を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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