(57)【要約】【課題】芽胞センサーの提供。【解決手段】芽胞（或いは胞子）センサーに関し、該センサーは芽胞結合リガンドと、該センサーの本体上又は本体内に、Ｃａ−ＤＰＡ（カルシウム−ジピコリン酸）には反応するが、発芽誘導剤、即ち、Ｃａ−ＤＰＡとは別の発芽誘導剤、には反応しない物質とを備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
芽胞センサーであって、芽胞結合リガンドと、該センサーの本体上又は本体内に、Ｃａ−ＤＰＡ（カルシウム−ジピコリン酸）には反応するが、発芽誘導剤、即ち、Ｃａ−ＤＰＡとは別の発芽誘導剤、には反応しない物質とを備えるセンサー。
【請求項２】
前記リガンドは固定化された抗体である、請求項１に記載のセンサー。
【請求項３】
前記物質は芽胞を含む、請求項１又は請求項２に記載のセンサー。
【請求項４】
マトリックスと該マトリックス内に記録されたホログラムとを備えるセンサーであって、
前記物質がＣａ−ＤＰＡに反応することによって直接的又は間接的にもたらされる、前記マトリックスの特性変化を観察し得る、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のセンサー。
【請求項５】
サンプル中の芽胞の検出方法であって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のセンサーに前記サンプルを接触させて、それにより前記サンプル中の芽胞を前記リガンドによって捕捉させ、
前記発芽誘導剤を投入し、
前記物質の反応を観察する
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原体センサー、特に芽胞(或いは胞子)センサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
病原微生物を迅速に検出し、かつ同定することは、臨床用途、環境用途、及び生体防御用途における数多くの場面でますます重要になっている。しかしながら、病原微生物を正確に同定しようとすると、そのプロセスに役立つＥＬＩＳＡやＰＣＲといった多くの手法を用いることができるのにもかかわらず、研究室ベースの時間のかかる手順が未だ必要である。残念なことに、ＥＬＩＳＡベース及びＰＣＲベースの手法はいずれも、感度が乏しかったり、サンプル調製が複雑であったり、高度に訓練された人員が必要であったりするなど、多くの短所を伴う。具体的なニーズとしては、主としてバチルス・アンシラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽の原因物質））の検出を目的としてはいるものの、他の対象微生物の検出に拡張できる可能性も有する迅速な診断基盤の開発が望まれている。
【０００３】
望ましいのは、発芽自体を検出することである。発芽に伴う最も初期の事象の一つは、芽胞に蓄積されたＤＰＡ、即ちジピコリン酸の放出である。上記ＤＰＡは、内因性の二価の金属イオン（主としてカルシウム）とキレートを形成している。
【０００４】
ホログラフィックセンサーは公知である。例えば、特許文献１及び２、並びに、スマート  ホログラムズ  リミテッドの名称で発行されている他の公報を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９５／２６４９９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／６３４０８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、捕捉された標的芽胞からのＣａ−ＤＰＡの放出を利用して、適したホログラフィックセンサー又は他のセンサーの近傍で発芽装置の構成要素、典型的には加水分解酵素を活性化するシステムに基づいている。本質的に、この設計によって標的芽胞の発芽反応が変換され、増幅されて、センサーの感度が高まる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第一の態様によれば、芽胞センサーであって、芽胞結合リガンドと、該センサーの本体上又は本体内に、Ｃａ−ＤＰＡには反応するが、発芽誘導剤、即ち、Ｃａ−ＤＰＡとは別の発芽誘導剤、には反応しない物質とを備えるセンサーである。
【０００８】
本発明の第二の態様によれば、サンプル中の芽胞の検出方法であって、
上記のセンサーに上記サンプルを接触させて、それにより上記サンプル中の芽胞を上記リガンドによって捕捉させ、
上記発芽誘導剤を投入し、
上記物質の反応を観察する
ことを含む方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｃａ−ＤＰＡにより活性化された、酵素が結合しているホログラフィックセンサーの略図である。
【図２】３７℃、ｐＨ７．４で、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び５ｍＭ  ＣａＣｌ２中に最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるように平衡化させたＳＳＡＰホログラムに、Ｃａ２＋−ＤＰＡにより活性化されたＧＰＲｓを添加した後、活性ＧＰＲｓがＳＡＳＰベースのホログラムの回折強度に与える影響を示すグラフである。
【図３】Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＱＭ  Ｂ１５５１の「受容体を持たない」芽胞の発芽反応のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に本発明を例示として説明する。この例は、図１に示した、本発明を具体化したセンサーの略図のみを参照とした例である。
【００１１】
このセンサー設計の原理を説明するために、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＫＭの休眠芽胞から抽出した低分子量酸可溶性タンパク質（ＳＡＳＰ）を含むホログラフィックセンサーを作製した。この低分子ペプチドは、休眠している間は芽胞ＤＰＡを保護しているが、発芽の際に急速に分解され、タンパク質のデノボ合成に供されるアミノ酸源となる。ＳＡＳＰ加水分解に関与する酵素である発芽プロテアーゼ（ＧＰＲ）はＣａ−ＤＰＡにより活性化されることが知られている。従って、組み換え型発芽プロテアーゼ（ＧＰＲ）を作製し、ＳＡＳＰホログラムとともに培養した。図２によれば、Ｃａ−ＤＰＡ（５０ｍＭ）の添加時に、上記酵素が活性化され、ホログラムを変性させる。一方、ＧＰＲ存在下かつＣａ−ＤＰＡ非存在下で培養されたホログラムは安定なままである。
【００１２】
本発明への一つのアプローチは、組み換え型のＣｗｌＪ、即ち、Ｃａ−ＤＰＡにより活性化されるコルテックス溶解酵素を用いて、さらに、ペプチドグリカン含有ホログラム上の当該酵素の活性が持続することを利用することである。別のアプローチとしては、例えば、精製された組み換え酵素の安定性／活性に関連した問題がある場合には、（組み換え型の成分とは対照的に）無傷芽胞を増幅ベクターとして使用することもできる。一例として、外因性Ｃａ−ＤＰＡに反応した場合にのみ、芽胞殻（スポアコート）に存在するコルテックス溶解酵素ＣｗｌＪの活性化を介し発芽することができる、遺伝子操作された「受容体を持たない（レセプターレスの）」バチルス・メガテリウム芽胞の使用が挙げられる。これらの芽胞は、例えば約３０ｍＭ程度の濃度のＣａ−ＤＰＡに反応して発芽する。バチルス・メガテリウム  ＣｗｌＪの構造遺伝子をクローン化し、該遺伝子を過剰発現する構成体を作製して、上記システムの感度を高めてもよい。そのようなベクター増幅芽胞をＲＮＴＡ二価金属イオン感受性ポリマーと一体化させて、内蔵（ビルトイン）型のシグナル増幅手段を設けることができる。
【００１３】
抗体上に固定化された芽胞は発芽能力を保持していることが分かった。基本的に、失活させた芽胞懸濁液に対して産生された多クローン性抗血清の精製物を、アミノシラン化された顕微鏡用スライドガラス上に固定化した。上記スライドガラスの抗体で覆われた領域に、芽胞の５０μｌアリコート（１ｍｌ当たりに含まれる芽胞数：１０４〜１０８）を加え、１時間結合させた。後で、結合時間を１０分に短縮したが、結合性は特に減少しなかった。洗浄して、抗体で標識付けした表面に芽胞がうまく結合したのを確認した後、１ｍＭ  Ｌ−アラニンを含有するＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ）５０μｌを添加して、発芽を誘導した。顕微鏡写真によれば、発芽反応を特徴付ける、芽胞の明相から暗相への位相の変化が見られ、固定化によって発芽が妨げられてはいないことが分かった。引き続き芽胞懸濁液を用いて検討したところ、芽胞密度は発芽反応速度には影響を及ぼさないようであった。このことは、捕捉された芽胞の数が少なくても、高密度で捕捉された場合と同様な速度で発芽することを意味している。これらを総合的に考察すると、抗体によってホログラフィックマトリックスの近傍に固定化された芽胞は通常の発芽反応速度を示すことがこの検討から示唆される。このように、発芽誘導剤を添加して発芽を誘導する際、芽胞密度（最終的な器機の設計における重要なパラメーターである）に左右されない。
【００１４】
ＣｗｌＪをその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で活性化させる、即ち、無傷芽胞をセンサー設計に組み込むことにより活性化させることを利用する本発明の好ましいシステムにおいて、（特定の抗体により捕捉された）発芽中の標的芽胞から放出されるＣａ−ＤＰＡは、センサーと結合している芽胞がＣｗｌＪを介して発芽するよう促す。その後、標的芽胞の発芽反応を本質的に変換し増幅するこれらの芽胞から放出されたＣａ−ＤＰＡを、ＲＮＴＡ（又は同様の）ホログラフィックセンサーによって検出することができる。上記芽胞自体は、センサーの近傍に固定化されていてもよいし、ポリマー自体に埋め込まれていてもよい。また、発芽は（本質的に細菌芽胞に特有のものである）Ｃａ−ＤＰＡによってのみ引き起こされ、遊離のＣａ２＋イオンには引き起こされないので、さらなる特異性要素がシステムに導入される。上記リガンドの合成方法及びそれらの芽胞検出への適用は、文献：Ｂｈａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２３（２００７）５２０−５２７に記載されており、当該文献の内容を本明細書に引用して援用する。
【００１５】
増幅芽胞を、そのようなセンサーシステムに組み込もうとする場合には、いくつかの基準を満たさなくてはならない。特に、シグナル増幅芽胞は、標的芽胞を発芽させるために使用される発芽誘導栄養剤そのものには反応してはならない。例えばバチルス・アンシラシスは、Ｌ−アラニンとイノシンの混合物に曝露される際、最も効率的に発芽する（アラニンは、大部分のバチルス属に対する主要な発芽誘導剤である）。上記問題は、外因性Ｃａ−ＤＰＡに対する反応があった場合のみ発芽可能である「受容体を持たない（レセプターレスの）」芽胞を遺伝子操作で作ることで回避できる。また、シグナル増幅芽胞は、発芽中の標的芽胞が少量であってもシグナル増幅カスケードが開始されるよう、比較的低い濃度の外因性Ｃａ−ＤＰＡをも十分に感知できるものであるのが望ましい。
【００１６】
バチルス・メガテリウム  ＱＭ  Ｂ１５５１の芽胞は、他の日常的に用いられる実験株（バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）や、バチルス・メガテリウム  ＫＭなど）と比べ、きわめて同調的かつ急速に発芽することが分かった。バチルス・メガテリウム  ＱＭ  Ｂ１５５１の芽胞は、グルコース、各種アミノ酸、及び各種塩といった多くの化合物に反応して発芽する（いわゆる「イオン性」発芽）。推定される発芽誘導剤受容体をコードするＧｅｒＡ型オペロンの一つを変異させた株を構築した。図３に示されるように、この株の芽胞は、今までに試験された発芽誘導剤刺激（アラニンを含む）全てに対し反応する能力を失っていた。
【００１７】
これらの芽胞（ＧＣ４１７株）の構築法は、文献：Ｃｈｒｉｓｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８９，ｎｏ．１２（２００７年６月）４３７５−４３８３に記載されており、当該文献の内容を本明細書に引用して援用する。これらの芽胞は栄養剤の複合混合物に反応してゆっくりと発芽する場合はあるが、単一の引き金（トリガー）化合物には反応しない。よって当該芽胞は本発明において使用するのに好適である。
【００１８】
これらのデータによれば、受容体を持たない変異体は、多くの発芽誘導栄養剤に対し、それらに曝露されても発芽しない。比較のために、グルコースに対する野生型の反応を共に示す。変異芽胞のＡ６００において観察されたわずかな減少は、発芽度合いというよりはむしろ芽胞の凝集によるものである。
【００１９】
ＣｗｌＪ遺伝子の配列は決定されている（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＥＵ０３７９０４）。バチルス・スブチリスとは異なり、ＣｗｌＪ遺伝子は、ＧｅｒＱとの相同部分を有する、バイシストロニックなオペロンに組織化されているようである。
【００２０】
ＧｅｒＱは、ＣｗｌＪを芽胞殻層内に局在化させるのに必要である。ＣｗｌＪ及びＧｅｒＱがバチルス・メガテリウムにおいて単一の転写単位として組織化されているという事実は、両遺伝子の過剰発現を単純化し、Ｃａ−ＤＰＡに対する芽胞の感度を向上させる。今までに行われた研究によれば、受容体を持たないバチルス・メガテリウム  ＱＭ  Ｂ１５５１芽胞、及び、野生型のバチルス・メガテリウム  ＱＭ  Ｂ１５５１芽胞の両方において、見掛けのＫｍ（反応速度が最大発芽反応速度の１／２になるＣａ−ＤＰＡの濃度）は約３５ｍＭである。この値は、バチルス・スブチリスにおいて過去に測定されている値と同等である。さらに、バチルス・メガテリウムのＣｗｌＪノックアウト株は外因性Ｃａ−ＤＰＡに反応しても発芽しないことから、Ｃａ−ＤＰＡに誘導された発芽は当該種において上記酵素を介して行われることが分かる。
【００２１】
さらに、バチルス・メガテリウムのＣｗｌＪ／ＧｅｒＱオペロン（上流調節配列を含む）のコピーを有する多コピープラスミドを構築して、野生型細胞及び受容体を持たない細胞に導入した。ＣｗｌＪを過剰に発現するものと考えられる上記プラスミドを有する芽胞は現在調製中であり、外因性Ｃａ−ＤＰＡに対する感受性は今後試験する予定である。また、もう一つ構築した構成体は、適当なＲＮＡポリメラーゼ（ＥシグマＥ）により認識される高コピー数のプロモーターの制御下で、ＣｗｌＪオペロンのコピーを有している。この構成体が染色体に組み込まれると、芽胞は抗生物質（通常、自律的に複製可能なプラスミドが存在し続けるために必要とされる）が存在しない状態でも調製することができ、好ましい方法である。
【００２２】
以下の実施例によって本発明を説明する。
【実施例】
【００２３】
酸破壊（ａｃｉｄ−ｒｕｐｔｕｒｅ）によってＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍの成熟芽胞から抽出されたＳＡＳＰ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｔｉｐｐｅｒ，１９８１）をホルムアルデヒドで架橋して、シラン化スライドガラス上にコートすることで安定なヒドロゲルフィルムを形成した。次にフィルムを、硝酸銀溶液に、次に感光性色素を含む臭化リチウム溶液に順番に浸漬した（Ｂｌｙｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。これをレーザー光に曝露し、従来の現像を行った後、超微細粒（直径：２０ｎｍ未満）の金属銀がポリマーフィルム厚の範囲内で分布している層を有する干渉縞パターンを生成することで、ポリマーフィルムを反射ホログラムに変換する。現像された回折格子に白色光を照射すると、ブラッグの式に準ずる波長を有する特徴的なスペクトルピークが得られる。脱イオン水で十分に水和し、ポリマーを膨潤させると、ＳＡＳＰベースのホログラムは視覚的に認識することができ、主に明るい緑色光を反射した。
【００２４】
より具体的に説明すると、アミノシラン化スライドガラス上で、１％酢酸中に１２％（ｗ／ｖ）ＳＡＳＰを含む溶液の１０μｌアリコートを、ホルムアルデヒド蒸気を富化したチャンバ内において３分間架橋して、小型ＳＡＳＰポリマーフィルム（６×１０ｍｍ）を形成した。フィルムを、Ｂｌｙｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）に概説されている拡散方法を用いて、即ち、０．３Ｍ硝酸銀溶液、及び、０．１％（ｗ／ｖ）ＱＢＳ（１，１−ジエチル−２，２−シアニンヨージド）を含む３％（ｗ／ｖ）臭化リチウム溶液に順次曝露して、ホログラムに変換した。感光性を付与したフィルムを、Ｎｄ／ＹＡＧレーザー２倍波（３５０ｍＪ、５３２ｎｍ、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂ、Ｑｕａｎｔｅｌ社製（フランス））の１０ｎｓパルスに３回曝露し、Ｓａｘｂｙ現像液（Ｓａｘｂｙ，１９９４）に浸漬し、１０％（ｗ／ｖ）チオ硫酸ナトリウム中で定着させた。ホログラムを水中で洗浄し、スポットライト照射下で目視しやすくした。
【００２５】
ホログラムは、Ｍａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）に記載されるように屋内反射分光計を用いて確認した。ＳＡＳＰベースのホログラフィックマトリックスの変性を、ＧＰＲｓ、即ち、バチルス・メガテリウム  ＧＰＲの変異体を用いて調べた。当該変異体は、Ｃａ−ＤＰＡ２＋に刺激され、不活性なチモーゲンから触媒として活性な酵素へとより速やかに処理できる（Ｉｌｌａｄｅｓ−Ａｇｕｉａｒ  ａｎｄ  Ｓｅｔｌｏｗ，１９９４ｂ）。Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ｇｐｒｓ遺伝子を有するＥ．Ｃｏｌｉ  ＰＳ１９０９細胞のＧＰＲｓ（Ｉｌｌａｄｅｓ−Ａｇｕｉａｒ  ａｎｄ  Ｓｅｔｌｏｗ，１９９４ｂ）の発現及び精製は、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｓａｌａｓ  ａｎｄ  Ｓｅｔｌｏｗ（１９９３）の方法を改変して行った。組み換えＧＰＲｓは、イオン交換クロマトグラフィーにより９５％の同質性にまで精製し、Ｉｌｌａｄｅｓ−Ａｇｕｉａｒ  ａｎｄ  Ｓｅｔｌｏｗ（１９９４ａ）に記載されるようにＣａ２＋−ＤＰＡとともに培養することで触媒活性を有するように処理した。Ｃａ２＋−ＤＰＡで活性化されたＧＰＲｓがＳＡＳＰベースのホログラムの回折特性に与える影響をモニタリングした。開始から１０分過ぎてから、１．５〜２時間の期間にわたって、ピーク強度の一様な低下が観察された。ピークが初期強度の１０〜５０％の範囲内である場合に、ホログラフィックプロファイルが安定化した。元のスペクトルピークは、平衡緩衝液を用いて十分に洗浄しても回復させることができず、このことは、ホログラフィック反応が不可逆的であったことを示している。これは、酵素によってマトリックスが変性したためであり、ホログラフィック縞の完全性が損なわれた結果である。ピーク強度の減少は、ＧＰＲｓによりＳＡＳＰベースのマトリックスが変性するにつれ、溶液に対しホログラフィック縞が変調し、徐々に損なわれることによるものである。また、不活性なＧＰＲｓ（即ち、Ｃａ２＋−ＤＰＡとともに培養する前のもの）がホログラフィック回折特性に与える影響を調べたところ、長期にわたりホログラフィックシグナルに著しい変化がみられないことが分かった。このように観察されたのは、酵素によってホログラフィックマトリックスが変性しなかったためであり、Ｃａ２＋−ＤＰＡに刺激され自己処理される前は、ＧＰＲの触媒活性がないことに合致している（Ｉｌｌａｄｅｓ−Ａｇｕｉａｒ  ａｎｄ  Ｓｅｔｌｏｗ，１９９４ａ）。その後、同一のホログラフィックマトリックスは活性化されたＧＰＲｓにより変性され、センサーの本来の反応性を示した。
【００２６】
参照
Ｂｌｙｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｔｈｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４７，８７−９１．
【００２７】
Ｉｌｌａｄｅｓ−Ａｇｕｉａｒ  ａｎｄ  Ｓｅｔｌｏｗ，１９９４ａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７６，７０３２−７０３７．
【００２８】
Ｉｌｌａｄｅｓ−Ａｇｕｉａｒ  ａｎｄ  Ｓｅｔｌｏｗ，１９９４ｂ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７６，２７８８−２７９５．
【００２９】
Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｔｉｐｐｅｒ，１９８１．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １４６，９７２−９８２．
【００３０】
Ｍａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  １１，１６８−１７４．
【００３１】
Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｓａｌａｓ  ａｎｄ  Ｓｅｔｌｏｗ，１９９３．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７５，２５６８−２５７７．
【００３２】
Ｓａｘｂｙ，１９９４．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈｏｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｌｉｆｆｓ．
【図１】
2010517006.tif 000002
【図２】
2010517006.tif 000003
【図３】
2010517006.tif 000004
【国際調査報告】
2010517006.tif 000005
2010517006.tif 000006
2010517006.tif 000007