(57)【要約】  二次元色層列または別試料配列像は配列にわたって移動することによるかまたは配列が光に対して移動することにより配列長さを掃射する照射光線を利用し、いずれの場合も全二次元配列を可動構成部品の一方向通過で走査する走査計器で形成される。時間遅延積算を備え付けられたCCDの使用は計器に画質向上画像を形成することを許容する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二次元試料配列の二次元画像を形成する装置であって、前記装置は
幅と長さを有する平面試料領域を規定する試料保持器；
前記試料領域の前記幅にわたる光条を形成する光源；
前記全試料領域を前記光線に暴露するために前記試料保持器の前記長さに沿って前記試料保持器あるいは前記光源いずれかを移動する手段；
CCD撮像機を時間遅延積算様態で含み、前記試料領域が前記光線により照射される前記試料領域からの出現光を集合するように配列される検出器；および
前記移動手段が前記全試料領域を前記光線に暴露するときに当該試料領域画像を集成するように前記検出器で集められるデータについての計算機処理手段を含む、装置。
【請求項２】
前記光源ならびに前記検出器は前記試料保持器の同側にあってそのために上照射を生ずる、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記光源ならびに前記検出器は前記試料保持器の両側にあってそのために徹照を生ずる、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記光源は直線配列LEDである、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記直線配列LEDは干渉帯域通過濾光器を結合される、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記光源は光線として投射されるレーザー光源である、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
さらに複数の異波長光源間の選択手段を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
複数の異波長光源間の前記選択手段は帯域通過濾光器を活用する、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記検出器はさらに蛍光放射を複数の放射波長帯で光学濾波器の使用により集める手段を含み、データの前記計算機処理手段は各自走査が一の前記複数の波長帯で集光する複数の走査で得られるデータを重ねて整列する手段を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
さらに前記光源と前記試料保持器の間に配列され、前記光線の長さに沿った光の均一性を改良する帯域重なり制御濾波器を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記移動手段は前記光源が定置存続する間に前記試料保持器を移動させる、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記移動手段は前記試料保持器が定置存続する間に前記光源を移動させる、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記計算機処理手段は（i）前記試料領域の全フレーム化学発光画像を前記光源による前記試料領域照射なく集成することか（ii）前記移動手段が前記全試料領域を前記光線に暴露するときに当該試料領域画像を化学発光による他に集成することかを選択する手段を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
二次元試料配列の二次元画像を形成する方法であって、前記方法は
（a）前記試料配列を長さ及び幅を有する平面試料領域上に（i）前記試料領域を含む表面を有する試料保持器、（ii）前記試料領域の幅にわたる光条を形成する光源、及び（iii）前記試料領域が前記光線により照射されるときに前記試料領域から出現光を集合するように配列されるCCD撮像機を含む検出器からなる装置において配置し；
（b）前記試料保持器あるいは前記光源いずれかを前記試料保持器の前記長さに平行軸線に沿って移動し、前記全試料領域を前記光線に暴露し；および
（c）前記検出器により集められるデータを処理して前記試料配列の二次元画像を集成することを含む、方法。
【請求項１５】
前記光源ならびに前記検出器は前記試料保持器の同側にあってそのために上照射を生ずる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記光源ならびに前記検出器は前記試料保持器の両側にあってそのために徹照を生ずる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記光源は光線として投射されるレーザー光源である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記装置は上照射を生ずるために前記試料保持器の前記検出器同側に第一の光源および徹照を準備するために前記試料保持器の前記検出器向かい側に第二の光源を含み、前記方法は（1）前記上照射で蛍光測定検出、比色測定分析、または蛍光測定及び比色測定検出の両方及び（2）徹照で蛍光測定かまたは濃度測定検出のいずれかまたはどちらも実行することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記光源は直線配列LEDである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記光源は光線として投射されるレーザー光源である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
さらに異なる放射波長帯で光学濾波器の使用により各自走査が実行される複数の走査により集光し、前記複数の走査で得られるデータを重ねて整列することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
（b）は前記光源を定置維持する一方で前記試料保持器を移動することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
（b）は前記試料保持器を定置維持する一方で前記光源を移動することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料配列は燐光物質遮蔽格子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
さらに第一に工程（a）、（b）、および（c）を実行して前記試料配列の前記二次元画像を集成するために最適作業変数を決定し、次に工程（a）、（b）、および（c）をそのように決定された最適作業変数のもとで繰返すことを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
さらに第一に工程（a）、（b）、および（c）を実行して前記試料配列で隣接領域からよりも当該関心領域からの高度放射信号により規定される関心領域を定位し、工程（a）、（b）、ならびに（c）を繰返す一方で前記工程を前記関心領域に限定することを含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は2006年12月21日に提出された米国仮特許出願第60/871369号の利益を主張し、内容はここで引用により完全に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
臨床及び研究調査は生物工学の異なった分野で頻繁に生物混合物試料の構成部分の同定を含み、構成部分は全生物体から核酸断片ならびに蛋白質の範囲におよぶ。混合物の構成種は電気泳動、器量除外クロマトグラフィー、および等電点電気泳動である中でも顕著な多様な分類手順どれによっても識別される。試料は定型的に緩衝水溶液に溶解または懸濁され、分別が実行される媒質はポリアクリルアミドやアガロースゲルのような多孔基質である。行なわれる実験に依存して試料はいずれかゲルに残存するか通例「ブロット」として知られる膜質支持材の表面に移動され、よりたくさんの接近容易性を許容する。分別種は大抵それだけでは検知されないので検出の目的に対して吸光、放射性、発光、もしくは蛍光報告部分のような検知可能部分を会合される。これらの通知部分は選別より前に核種に共有結合されるか選別後に通常親和性染料としてもしくは生物学準拠の特定分子プローブとして適用されるかする。分別される種に通知部分の付随を含む手順はさまざまに「サザン」、「ノーザン」、及び「ウェスタン」ブロット法と称される。
【０００３】
染色質画による分別種としては選別が一次元か二次元いずれかで実行されるか選択候補の検出方法は史的に分別種配列の画像を生成するものであった。そのような画像は在来X線フィルムかまたは写真陰画および印画で記録された。ディジタル式画像化は以来発展され、ディジタル技術が改良され、実験用群集にもっと利用しやすくなったから近年は普及が増した。現在とても通例画像化技法は電荷結合素子（CCDs）の使用に関係するものである。CCDは染色質画配列の像形成に大抵の生物試料検出が発生する可視および近赤外スペクトルの両方でCCD感度のために特に好適合される。
【０００４】
ディジタル画像化計器は通常はCCDカメラを光源と組合せて生物試料を照明し、CCDカメラも光源も周囲光に対して密封される封入物で保持される。設計に依存して計測器は励起光を特定波長帯で放射する光源を含有するか実行し、しかもなお最も適当な濾波器を選択することにより特定通知部分の検出が最適にされることを許す放射濾波器範囲を含むことが可能である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は時間遅延積分読出しの区域CCDカメラ、励起ビームを光線の形態で生ずる光源、及び専用試料領域を有する試料保持材を含み、光源か試料保持材いずれかが直線方向に動く電動構成部品として作動する生物試料向け集積画像化基盤に属する。電動構成部品の移動過程を通して二次元色層列または試料領域上の別試料配列の全領域、もしくは試料配列内で関心の二次元区画は光線に暴露される。一定の実施形態で装置はまた多重射出濾光器、すべての場合に電動構成部品の動作と含まれるならば適当な濾光器選択は計算機制御ソフトウェアを通じて調整される。光源は光線が試料領域の幅にわたるように構成され、光源であろうが試料保持器であろうが電動構成部品が動くときに光線は試料領域の全長この故に試料配列を掃射する。よってこの発明のシステムにより像を描かれることができる試料配列長に限定はない。この発明による取得画像は多様な検出方法どれでも形成されることができる。そのような方法の例は蛍光、比色測定、化学ルミネセンス、及び濃度測定法である。発明の望ましい実施形態はまた完全二次元画像を定置試料から試料領域反対側に光線の縦掃射に用いられる同一検出器を使用して捕捉する能力を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は本発明の画像化設備の略図である。
【０００７】
【図２】図２は図１の試料保持器の平面図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
この発明を規定する特徴は多様構成で実行が可能であるところが発明は全体として特定実施形態の詳細検討により最もよく理解されるものである。1つのそのような実施形態は添付の図面に示される。
【０００９】
この実施形態で試料はゲル、ブロット、または燐光物質網目スクリーンであることができ、定盤に配置される。図１で定盤は試料皿として働き、左右に（図で示される見方で）正確規制速度で動く試料保持器または載物台11に位置する。励起光は光線13、すなわち載物台の移動方向に垂直であって試料皿の幅にわたるように指向される直線配列の一様もしくは実質的に一様強度光である。
【００１０】
試料載物台11はどの常用直線運動伝動装置によっても移動されることができる。例は親ねじであり、ステッピングモーターによるか符号器を有するＤＣモーターにより駆動され、載物台の位置を運動しているときに検出し、移動量を正確な方法で調整する。載物台自体は滑り子にまたは軸受筒を加えて案内棒に取付けられることができる。伝動装置ならびに載物台取付けのほかの例は当該分野の熟練したものに電動ラックアンドピニオン式伝動装置のように容易にはっきりわかるであろう。光源が載物台よりむしろ移動する発明の実施形態で同形式の直線運動伝動装置は使用可能である。
【００１１】
図２は試料載物台11の上面図であり、載物台表面の試料領域19を示す。光線13は試料領域19の幅に及び、矢印20により示される方向に動いて試料領域の全長を掃射する。
【００１２】
光線は直列のLEDで密接間隔線形配列に形成されることができる。隣接LED間隔は、例えば1 mmか1 mm程度の距離であることが可能である。LEDは使用されるときにLEDによる発射光はレンズにより平行にされ、試料反対側に狭包光として載物台に入射する。LED構成及び配置は明彩大体は均一照明を光線の長さに沿って生ずるように選択される。LEDはまた光線の波長帯が公称は試料通知部分に望まれる励起帯であるようにも選択される。なおまた好ましくは干渉光学帯域通過濾光器は光線と試料の間に配置され、LEDによっても発射されるかもしれないが望まれる励起帯外側である光跡すべてを本質的に取り除く。干渉濾光器は帯域外の光吸収で希望帯の光が通過することを許容する。
【００１３】
蛍光信号、すなわち蛍光標識また染色を生ずる通知部分については一組の励起及び発射波長は一方の標識または染色に最適であることが可能であり、他の組は他方の標識または着色に最適であることが可能である。異なる標識または染色に適応するために計器は異なる励起波長の間の選択ならびに異なる射出濾光器間の選択を許容し、放射を異なる波長で検出する。励起波長の選択を達成する一手段は2つまたはそれ以上の光源を回転タレット14に装備するだけである。このように利用可能にされることができる波長数は広範に変化することができる。図に示される実施形態で4つの異なる光源15，16，17，18は旋回砲塔14に据付けられ、各々が光線を異なる波長で放射し、各々が適当励起帯通過濾光器25，26，27，28と結合される。ほかの実施形態で旋回砲塔は異なる波長の光条を生ずる5つ、6つ、またはそれ以上の光源の収容能力をもつことができる。これらの実施形態はシステムが多色通知部分に加えて試料画像を集成し、これらの画像を後続のデータ解析に重ね合わせることを許容する。異なる波長の光条を生ずる別手段は光源を滑り面に取付けそして滑り面を動かして特別適用の選択波長の光を試料載物台11と相応整列位置に配置するだけである。代替光源はレーザーであり、選択及び構成が当該分野の熟練したものにはっきりわかるものである適性光学素子で光線に形成されることができる。異なる波長で発射する多重レーザーは同様に旋回砲塔に据付けられることができる。それでも当該分野の熟練したものに知られ、光線を生ずるかそれに形成されることができるほかの光源は使用可能である。
【００１４】
旋回砲塔は中空芯で形成されれば冷却液で連続してパージされ、光源により発生される熱を取り除くことができる。例えば空気流は冷却液として働くことができる。かくして旋回砲塔は有効な冷却用放熱器として作用する。
【００１５】
試料により励起の結果として放射される蛍光はカメラ22のCCDチップに光を向けるレンズ21で集められ、光は色層列または別試料配列像を形成する。しかしながら検出器に達する前に放射光は射出濾光器23を通過する。電動濾光器回転盤24は所定の励起光源に適当な濾光器の選択を許容する。濾光器はまたどの散乱励起光も遮断する。
【００１６】
載物台11が走行するときに励起光線13は載物台により支持される試料の上を走行し、CCDカメラ22は放射光画像を形成する。画像化は試料放射から集合光子による画素の電子生成を含む常用手段により達成される。かくして生成された電子はCCDにわたって一の画素列から次列に移動方向に連続的に伝達される。CCDの各画素列の刻時速度は、試料上の所定の点が光線を横に移動すると蛍光はその時点で放射され続け、電子生成を続ける共役変換画素要素に集束するほどに載物台速度に比例し、それに同期される。走行点画像が一の画素列から次のものに転移するときに生成される電子は画素列の間を厳密に同速度で移動される。電子はかくして電荷が記録される前に時間遅延積算として知られる方法で画素配列に蓄積される。このように試料点から集合電子は拡張される。
【００１７】
時間遅延積算の記述は先行技術に見られる。そのような記述を含む文献例である：
【００１８】
スウィードラーら（Sweedler et al.）(The Trustees of the Leland Stanford Junior University)、1992年8月25日発行された米国特許第5141609号明細書。この特許に記述されるシステムは時間遅延積算様態のCCDを包含し、ゲル及び膜のような二次元媒体よりむしろ電気泳動細管を走査するために設計される。
【００１９】
ノールマンら（Nordman et al.）(Applera Corporation) 2005年2月15日発行された米国特許第6856390号明細書。この特許に記述される装置は時間遅延積算様態で毛細管路の液体試料の分析に作動する直線配列の検出器を含む。
【００２０】
イケダ（Ikeda）(Kabushiki Kaisha Toshiba)、2006年7月11日発行された米国特許第7076394号明細書。この特許は反射光か透過光かいずれかを検出するように時間遅延積算感知装置で文書ならびに写真の走査を記述する。
【００２１】
アプレラコーポレーション（Applera Corporation）、国際公開日2003年2月6日の国際公開第03/010524号。この特許出願に記述されるシステムは細管または流路に保持される試料で使用され、同時に試料面積を多重照明波長で照射し、放射信号を時間遅延積算様態の領域検出素子で捕捉することにより作動する。
【００２２】
異なった検出方法は前に言及されるようにこの発明の実施に使用可能だがこの発明は蛍光放射する試料で特に有用であり、典型的励起波長は公称365、405、470、490、530、630、660、及び780 nmである。追加波長はしかしながら365 nm未満放射のUV LEDで生成されるもののようにまた使用可能である。前に言及されるように目下好ましい構成は4つの異なる波長の間で選択を許容するものである。
【００２３】
図に示される実施形態で射出濾光器回転盤24は放射波長に該当する6つの濾光器の収容能力をもつことができる。選定は自動的に実行されることができる。濾光器回転輪は図に示される構成でレンズ21の正面にあるところが回転輪はまたカメラ内にレンズ21およびカメラ22のCCDチップの間に位置することもできる。
【００２４】
前述の記載は蛍光画像化の信号強度を向上する時間遅延積算様態で作動する完全フレーム構造CCDカメラの使用に向けられるところが信号強度の同様の向上は比色画像化でなし遂げられ、化学ルミネセンス画像化と反映画像化の両方を含む。
【００２５】
本発明の選択実施形態で徹照射は上照射よりもむしろ使用される。徹照射は試料載物台より下に位置を定められる光源31により図１で達成される。この光源は上照射光源同様に光線32を生ずるが試料載物台を上から照らすよりもむしろ試料載物台11を下から通過するものである。効果的に徹照法を活用することができる検出様態の一例は吸光測定を使用する濃度測定法である。構成部分が可視スペクトルの光を吸収するクマシー着色（Coomassie-stained）や銀着色ゲルのような非乳白試料はこの種類の検出に適した試料の例である。濃度計測定はこれらの実施形態について白色光源であることができる光源を試料皿下に配置することにより実行される。試料皿はガラスまたは融解シリカのような透明物質であることができる。白色光源の一例は白色LED配列であり；別のものは蛍光白色光である。白色光源の代替はUV光源及び任意の前述波長で光を発射する光源である。濃度測定法実施形態について光源は封入され、供給源からの光は囲いから試料皿にわたってしかもその下に位置調整される細隙を通過し、試料皿の走行方向の横送り方向に向けられる。前述の蛍光実施形態に類似した方式で試料皿は直線方向に正確に規制速度で走行し、吸収されずレンズ視野内にある光はレンズにより集められ、検出素子上に像を造られる。射出濾光器はまた含まれることができる。
【００２６】
計器はこの発明に従ってまた光線走査ならびに信号の時間遅延積算の計器能力に加えて化学ルミネセンス放射として検出される試料について領域CCD画像化を実行するように構成されることもできる。「全フレーム」様態で作動するか「全フレーム」画像を取得するとも言われる領域画像化を実行するために載物台は試料皿と共にカメラに関して心合わせされ、試料からの化学ルミネセンス原型画像はCCDの全領域で集合され、それ故に光源による試料照射なしに加工処理される。射出濾光器はこの画像化様態で必要とされないので濾光器回転盤はどの濾光器もない空開口がある位置を有することができ、必要とされるときにCCDに放射光を集束する。同一CCDカメラはかくして移動線様態でも全フレーム様態でも作業者の選定で使用可能である。計器ソフトウェアはそれ自体プログラムされ、使用者に移動線様態か全フレーム様態かどちらかの選択を提供することができる。移動線様態は化学発光ではない画像化試料に通常使用されるものである。
【００２７】
単一計器はかくして移動線様態および全フレーム様態で作動するかの選択ばかりでなく蛍光、比色測定法、化学ルミネセンス、および濃度測定法のような多重画像化基盤の中から選択候補を示すために使用可能である。上照射か徹照射かを選ぶか両方を同時にか連続して実行するように設計される計器もこの発明の範囲内である。単一計器はかくして上照射で蛍光測定法または比色測定法分析および徹照射で蛍光測定法または濃度測定法分析を生ずることができる。
【００２８】
CCDにより集合されるデータの加工処理ならびに光源の選択及び制御のようなほかの計器機能は生物工学実験室で使用されしかも当該分野で知られる常用ソフトウェアを用いて計算機33（図１）により容易に実行される。前に言及されるようにソフトウェアは設備の可動部の機構部分を制御し、可動部をCCDの時間遅延積算と協調させることができる。多重走査は異なる波長で実行されるときに走査画像を重ねて整列するソフトウェアは使用可能であり、単一重ね合わせ画像を形成する。
【００２９】
この発明の装置および方法を利用する別の手段方法は第一に前走査を実行して試料により放射される信号強度の推定値を得ることである。これらの推定値が得られたら試料画像を生成するのに最適になる作動条件は選択されることができる。走査は次に計器整定と共にこれらの最適条件で繰返される。作動条件は試料及び検出器間の運動の相対速度、光源の強度、及び検出器により集められるデータの開始ならびに停止時限を含むことが可能である。最適条件の決定は自動計測により果たされることができる。前走査はまた隣接領域に対して高強度の信号を放射する領域のような関心領域を試料領域内で位置選定するために使用され、次に第二走査を関心領域だけで実行する。
【００３０】
この発明の装置および方法は試料皿の単一二次元試料の画像化、同じく試料列の画像化に有用である。試料載物台11はかくして多数の試料が配置されることができるコンベヤー調帯のような可動循環調帯と交換されることができる。これはたくさんの試料が高処理量で像形成されることを許容し、特に自動化されやすい。変動長さの試料もこのように加工処理されることができる。
【００３１】
前述記載は図に示される構成部分の異なった代替を記述するところがそれでもさらに代替は当該分野で熟練を要するものにはっきりわかるものであり、発明の範囲内である。例えば、帯域重なり制御濾波器は励起経路に介在され、光線の均一性を向上できる。帯域重なり制御濾波器は検出経路に介在され、検出器のレンズゆがみを補償することができ、それによってCCDで集合される光の均一性を改良する。
【００３２】
さらにまた発明に潜在的に関連する開示は下記のものに見られる：
【００３３】
オールダムら（Oldham et al.）、2005年2月17日公表された米国特許出願公開第2005/0036142号明細書。前述アプレラコーポレーション引用書類と同様にこの特許出願は細管または管路で保持された試料に用いるシステムを記述し、同時に試料面積を多重照射波長で照射し、放射信号を時間遅延積算様態の領域検出素子で捕捉することにより作動する。
【００３４】
ブラウンら（Brown et al.）、2003年3月13日公表された米国特許出願公開第2003/0048933号明細書は時間遅延積算を使用する微小配列検査システムを開示する。
【００３５】
マッキーンら（McKean et al.）、1990年10月2日発行された米国特許第4960999号明細書はUV光源が移動ゲルの狭い部分を照射し、ゲルからの放射光は位置が調整できるCCDカメラに同期される走査口を通して集められるシステムを開示する。
【００３６】
これに添付される特許請求の範囲で術語「1つ」または「1つの」は「一以上」を意味すると解釈される。術語「含む」ならびに「含み」および「含んで」のようなその変形は工程または要素列挙に先行するときに後続の工程または要素の追加は選択的であり、除外されないことを意味すると解釈される。すべての特許、特許出願及びこの明細書で引用されるほかの公表された参考資料はこれによって参照により全体としてここに結合される。ここで引用されるどの参考資料及びこの明細書の明示的教授の間で食い違いはどれもこの明細書において教示のために解決される。これは語句の技術理解定義と同一語句のこの明細書で明示的に提供される定義の間の食い違いどれも含む。
【図１】
2010515019.tif 000003
【図２】
2010515019.tif 000004
【国際調査報告】
2010515019.tif 000005