(57)【要約】本発明は、ヒト血漿/血清中に存在する異なる形態のヒトアディポネクチンを測定するための方法に関し、より具体的には、この方法は、アディポネクチンに対する異なるモノクローナル抗体を、ヒトアディポネクチンの異なるドメインに対する異なるポリクローナル抗体と組み合わせて利用するELISAアッセイ法に基づいている。本発明はまた、アディポネクチンの独特なアイソフォーム、ならびにポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含むそれに対する抗体も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アディポネクチンのN末端を対象とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号3を含むアディポネクチンペプチドを用いて産生させた、請求項1記載の抗体。
【請求項３】
配列番号4または配列番号6のアミノ酸21〜36、アミノ酸52〜58、およびアミノ酸91〜99、ならびに配列番号5または配列番号7のアミノ酸25〜33、アミノ酸48〜64、およびアミノ酸97〜104からなる群より選択される、少なくとも2つのCDR配列を含む、請求項1または2記載の抗体。
【請求項４】
配列番号4または配列番号6のアミノ酸21〜36、アミノ酸52〜58、およびアミノ酸91〜99、ならびに配列番号5または配列番号7のアミノ酸25〜33、アミノ酸48〜64、およびアミノ酸97〜104からなる群より選択される、少なくとも3つのCDR配列、より好ましくは少なくとも4つ、さらにより好ましくは少なくとも5つ、最も好ましくは6つのCDR配列を含む、請求項3記載の抗体。
【請求項５】
配列番号4または配列番号6より選択される軽鎖可変領域および配列番号5または配列番号7より選択される重鎖可変領域を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
【請求項６】
配列番号4に示す軽鎖可変領域および配列番号5に示す重鎖可変領域を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の抗体。
【請求項７】
配列番号6に示す軽鎖可変領域および配列番号7に示す重鎖可変領域を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の抗体。
【請求項８】
配列番号4または配列番号6より選択される軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
配列番号5または配列番号7より選択される重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
配列番号16、配列番号17、および配列番号18からなる群より選択される、請求項8または9記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】
患者試料中のアディポネクチンをスクリーニングするためのアッセイ法において少なくとも1つのアディポネクチンモノクローナル抗体および少なくとも1つのアディポネクチンポリクローナル抗体を含む、ヒト対象の糖尿病に対する素因を診断するための方法であって、AUCが0.65またはそれ以上である受診者動作特性曲線(ROC)プロットに対応するアッセイ値が、糖尿病に対する素因を示す、方法。
【請求項１２】
少なくとも1つのモノクローナル抗体が、請求項1〜7のいずれか一項記載の抗体およびmAb A12820より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも1つのモノクローナル抗体がmAbアディポネクチンM1であり、かつ少なくとも1つのポリクローナル抗体が、球状抗体およびN末端抗体からなる群より選択される、請求項11または12記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも1つのモノクローナル抗体がmAbアディポネクチンM24であり、かつ少なくとも1つのポリクローナル抗体が、球状抗体およびC末端抗体からなる群より選択される、請求項11または12記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも1つのモノクローナル抗体がmAb A12820であり、かつ少なくとも1つのポリクローナル抗体が、球状抗体、N末端抗体、およびC末端抗体からなる群より選択される、請求項11または12記載の方法。
【請求項１６】
アッセイ法がELISAである、請求項11〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
AUC値が0.70またはそれ以上である、請求項11〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
ヒト対象の糖尿病に対する素因を診断するための、少なくとも1つのアディポネクチンポリクローナル抗体と組み合わせた請求項1〜7のいずれか一項記載の抗体またはmAb A12820の使用。
【請求項１９】
ポリクローナル抗体が、球状アディポネクチン抗体、N末端アディポネクチン抗体、およびC末端アディポネクチン抗体からなる群より選択される、請求項18記載の使用。
【請求項２０】
配列番号1を含むアディポネクチンペプチドを用いて産生させた、アディポネクチンのN末端を対象とするポリクローナル抗体。
【請求項２１】
配列番号2を含むアディポネクチンペプチドを用いて産生させた、アディポネクチンのC末端を対象とするポリクローナル抗体。
【請求項２２】
配列番号19のアミノ酸107〜244を含むアディポネクチンペプチドを用いて産生させた、アディポネクチンの球状ドメインを対象とするポリクローナル抗体。
【請求項２０】
本明細書において記載した本発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒト血漿/血清中に存在する異なる形態のヒトアディポネクチンを測定するための方法に関し、より具体的には、方法は、アディポネクチンに対する異なるモノクローナル抗体を、ヒトアディポネクチンの異なるドメインに対する異なるポリクローナル抗体と組み合わせて利用するELISAアッセイ法に基づいている。本発明はまた、アディポネクチンの独特なアイソフォーム、ならびにポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含むそれに対する抗体も提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アディポネクチンは、抗炎症活性、アテローム生成抑制活性、メタボリックシンドロームに対する予防活性、およびインスリン抵抗性改善活性を含む様々な活性を有することが最近示された、脂肪細胞特異的タンパク質である。アディポネクチンは、単一遺伝子にコードされて、約30キロダルトンのポリペプチド鎖を生じる。血漿/血清中では、アディポネクチンは、単量体、三量体、六量体、およびそれらの様々な組合せを含む様々な分子形態で存在する。アディポネクチンのどの特定の分子形態がどのタイプの活性を有するかに関する情報は、現在、当技術分野において公知ではない。現行のELISA法は、ヒト血漿/血清中のアディポネクチンレベルを測定するために存在しているが、異なるアディポネクチン形態を正確かつ迅速に測定することは依然として可能ではなく、特定の生理的状態または疾患に対する特定のアディポネクチン形態のレベルの関係を予測する有用なアディポネクチン測定法(measure)もない。例えば、現行のアディポネクチン測定法には、アディポネクチン総量を測定するELISA法が含まれ、アディポネクチンレベルに基づいて生理的状態を容易に予測する手段は提供しない。高分子量のアディポネクチン形態と低分子量のアディポネクチン形態を区別できる速度沈降またはゲルろ過などの他の測定法は、サイズに基づいた複雑な分画方法を含み、ハイスループットなスクリーニング手順に容易には適さない。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、異なるアディポネクチン形態の測定、具体的には、ヒト血漿/血清中のこれらの形態を測定する能力に関する。さらに、本発明はまた、これらの異なる形態のレベルと特定の生理的状態の相関関係を示す能力、および好ましくは、非限定的に糖尿病、具体的にはII型糖尿病を含む疾患を発症するリスクがある個体を診断するための、該異なる形態の相関しているレベルの使用も提供する。アディポネクチンアイソフォームが有意な値を提供し得る他の潜在的な疾患適応症には、メタボリックシンドローム、心血管疾患、炎症性疾患、NASH(Nonalcoholic steatohepatitis)、異脂肪血症、および他の疾患が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０００４】
本発明はまた、アディポネクチンの独特なアイソフォーム、ならびにポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含むそれらに対する抗体も提供する。
【０００５】
本発明はまた、異なるアディポネクチンアイソフォームが存在すること、および本発明のELISA法を用いてそれらを容易に測定できることも実証する。
【０００６】
したがって、これらのアッセイ法の有用性、ならびに同定された新規なアディポネクチン抗体およびその際に利用されるアイソフォームを用いて、疾患の進行、治療に対する応答、治療応答の予測、ならびに疾患、より具体的には糖尿病および心血管疾患の初期形態の診断をモニターすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ヒトアディポネクチンのアミノ酸配列(配列番号19)。ヒトアディポネクチンのアミノ酸配列を示し、シグナルペプチド切断部位および成熟タンパク質の開始点を表示する。潜在的なN-結合型N-グリコシル化の部位を図に示す。
【図２】異なるアディポネクチン分子形態の概略図。アディポネクチンは、単量体、三量体、六量体、ならびにより高次の集合体に及ぶ多数の形態で存在することが示されている。集合体形態のいずれも、異なる高次構造を有し得る。これらの異なる分子形態のアディポネクチンの機能的役割は、まだ解明されないでいる。アディポネクチンの分子状態または生物学的役割のいずれかを改変する、アディポネクチンへの付加的な翻訳後修飾があるかどうかは公知ではない。
【図３】モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を開発するために使用された(エピトープ)様々なアディポネクチンペプチド配列(N末端ペプチド、C末端ペプチド、および球状ペプチド)の概略図。市販のモノクローナル抗体が対象とする特異的部位は、現在のところ公知ではない。
【図４】アディポネクチンアッセイ法形式の概略図。簡単に説明すると、アディポネクチンを対象とするモノクローナル抗体を0.1〜10μg/ウェルの濃度で使用して、マルチウェルプレートをコーティングする。2時間〜2日間のコーティング期間の後、ウェルを緩衝液ですすぎ、アディポネクチンを含む生物学的試料をプレートに添加し、抗体でコーティングしたプレートと数時間インキュベートする。これらのウェルを緩衝液で洗浄し、アディポネクチンの異なるエピトープを対象とするウサギポリクローナル抗体をウェルに添加し、1時間インキュベートする。これらのウェルを緩衝液で洗浄し、発色(developing)抗体である、HRPと結合させたロバ抗ウサギIgGを1時間添加する。これらのウェルを数回洗浄し、TMB基質溶液を一定の時間添加する。リン酸を添加して反応を停止させ、450nmでの光学密度を決定する。試料のOD(optical density)を、検量線を作成するために使用される公知の量のアディポネクチンのODと比較することによって、試料中のアディポネクチンの量を決定する。
【図５】選択的アディポネクチンアッセイ法の概略図。抗体の特定の組合せを用いて、血漿のような生物学的試料中に一般に存在するアディポネクチン混合物内の特定のアディポネクチン形態を検出する。1つはモノクローナル抗体であり2つ目はポリクローナル抗体である2つの抗体によって認識されるアディポネクチンアイソフォームのみが、これらのアッセイ法において認識され、かつ定量される。抗体のある種の組合せが、アディポネクチンの多数の形態を認識できる例もあり得る。このようなアッセイ法の1つの例は、R&D systems社製の市販のアディポネクチンアッセイ法、または多数の形態のアディポネクチン(測定されるアディポネクチンのレベルに基づく。ならびに勾配によって分画された血漿から認識される異なるアイソフォーム)を認識する、本発明者らが開発したアッセイ法のいくつかであり得る。
【図６】血漿試料中のアディポネクチンレベルを測定する際の作業の流れの概略図。
【図７】MAB3604ならびに球状ポリクローナル抗体およびN末端ポリクローナル抗体を用いたELISAアッセイ法の検量線。参照アディポネクチン1〜244標準(C末端Hisタグ)を0.0195〜10ng/ウェルで用い、mAb MAB3604を1:5000希釈で用いた、球状ドメインアディポネクチンpAb(図7a)、およびN末端ドメインアディポネクチンpAb(図7b)の場合のELISA検量線の例が提供される。
【図８】mAb A12820および3種の抗アディポネクチンポリクローナル抗体を用いたELISAアッセイ法の検量線。参照用の標準アディポネクチン1-244(C末端Hisタグ)を0.0195〜10ng/ウェルで用いた、アディポネクチン球状ドメインpAb(図8a)、およびN末端ドメインアディポネクチンpAb(図8b)の場合のELISA検量線の例が提供される。図8cは、参照用の標準アディポネクチン16〜247(N末端FLAGタグ)を0.0195〜10ng/ウェルで用いた、C末端ドメインアディポネクチンpAbの場合の検量線の例である。各例において使用されるmAbは、0.5μg/mlのA12820である。
【図９】mAb MAB10651および3種の抗アディポネクチンポリクローナル抗体を用いたELISAアッセイ法の検量線。参照用の標準アディポネクチン1〜244(C末端Hisタグ)を0.0195〜10ng/ウェルで用いた、アディポネクチン球状ドメインpAb(図9a)、およびN末端ドメインpAb(図9b)の場合のELISA検量線の例が提供される。図9cは、参照用の標準アディポネクチン16〜247(N末端FLAGタグ)を用いた、C末端ドメインアディポネクチンpAbの場合の検量線の例である。mAbは、0.25μg/mlのMAB10651である。
【図１０】mAbアディポネクチンM1および3種の抗アディポネクチンポリクローナル抗体を用いたELISAアッセイ法の検量線。参照用の標準アディポネクチン1〜244(C末端Hisタグ)を0.0195〜10ng/ウェルで用いた、アディポネクチン球状ドメインpAb(図10a)、およびN末端ドメインpAb(図10b)の場合のELISA検量線の例が提供される。図10cは、参照用の標準アディポネクチン16〜247(N末端FLAGタグ)を用いた、C末端ドメインアディポネクチンpAbの場合の検量線の例である。mAbは、1μg/mlのアディポネクチンM1である。
【図１１】mAbアディポネクチンM24および3種の抗アディポネクチンポリクローナル抗体を用いたELISAアッセイ法の検量線。参照用の標準アディポネクチン1〜244(C末端Hisタグ)を0.0195〜10ng/ウェルで用いた、アディポネクチン球状ドメインpAb(図11a)、およびN末端ドメインpAb(図11b)の場合のELISA検量線の例が提供される。図11cは、参照用の標準アディポネクチン16〜247(N末端FLAGタグ)を用いた、C末端ドメインアディポネクチンpAbの場合の検量線の例である。mAbは、1μg/mlのアディポネクチンM24である。
【図１２】R&D Systems社製のアディポネクチンキットを用いたELISAアッセイ法の検量線。R&D Systems社製の市販のアディポネクチンELISAキットを用いたELISA検量線の例が提供される。
【図１３】速度沈降による正常ヒト血漿試料の分画、およびMAB3604を用いたELISAによるアディポネクチンアイソフォームの測定。ヒト血漿を速度沈降によって分画し、画分を回収した。画分1は、勾配の上層であり、画分20は、勾配の最下層である。球状ドメインポリクローナル抗体およびN末端ドメインポリクローナル抗体と組み合わせてMAB3604を用いて、アディポネクチンレベルを測定した。モノクローナル抗体MAB3604を希釈率1:5000で捕獲抗体として使用した。各画分の5μlを分析して、アディポネクチンのレベルを決定した。
【図１４】速度沈降による正常ヒト血漿試料の分画、およびmAb A12820を用いたELISAによるアディポネクチンアイソフォームの測定。ヒト血漿を速度沈降によって分画し、画分を回収した。画分1は、勾配の上層であり、画分20は、勾配の最下層である。球状ドメインポリクローナル抗体、N末端ドメインポリクローナル抗体、およびC末端ドメインポリクローナル抗体と組み合わせてmAb A12820を用いて、アディポネクチンレベルを測定した。モノクローナル抗体mAb A12820を0.5μg/mlで捕獲抗体として使用した。各画分の5μlを分析して、アディポネクチンのレベルを決定した。
【図１５】速度沈降による正常ヒト血漿試料の分画、およびMAB10651を用いたELISAによるアディポネクチンアイソフォームの測定。ヒト血漿を速度沈降によって分画し、画分を回収した。画分1は、勾配の上層であり、画分20は、勾配の最下層である。球状ドメインポリクローナル抗体、N末端ドメインポリクローナル抗体、およびC末端ドメインポリクローナル抗体と組み合わせてMAB10651を用いて、アディポネクチンレベルを測定した。モノクローナル抗体MAB10651を0.25μg/mlで捕獲抗体として使用した。各画分の5μlを分析して、アディポネクチンのレベルを決定した。
【図１６】速度沈降による正常ヒト血漿試料の分画、およびmAbアディポネクチンM1を用いたELISAによるアディポネクチンアイソフォームの測定。ヒト血漿を速度沈降によって分画し、画分を回収した。画分1は、勾配の上層であり、画分20は、勾配の最下層である。球状ドメインポリクローナル抗体、N末端ドメインポリクローナル抗体、およびC末端ドメインポリクローナル抗体と組み合わせてmAbアディポネクチンM1を用いて、アディポネクチンレベルを測定した。mAbアディポネクチンM1を1.0μg/mlで捕獲抗体として使用した。各画分の5ulを分析して、アディポネクチンのレベルを決定した。
【図１７】速度沈降による正常ヒト血漿試料の分画、およびmAbアディポネクチンM24を用いたELISAによるアディポネクチンアイソフォームの測定。ヒト血漿を速度沈降によって分画し、画分を回収した。画分1は、勾配の上層であり、画分20は、勾配の最下層である。球状ドメインポリクローナル抗体、N末端ドメインポリクローナル抗体、およびC末端ドメインポリクローナル抗体と組み合わせてmAbアディポネクチンM24を用いて、アディポネクチンレベルを測定した。モノクローナル抗体mAbアディポネクチンM24を1.0μg/mlで捕獲抗体として使用した。各画分の5μlを分析して、アディポネクチンのレベルを決定した。
【図１８】速度沈降による正常ヒト血漿試料の分画、およびR&DアディポネクチンELISAによるアディポネクチンアイソフォームの測定。ヒト血漿を速度沈降によって分画し、画分を回収した。画分1は、勾配の上層であり、画分20は、勾配の最下層である。R&DアディポネクチンELISAを用いてアディポネクチンレベルを測定した。製造業者によって説明されているようにして、アッセイ法を使用した。各画分の5μlを分析して、アディポネクチンのレベルを決定した。
【図１９】球状(図19a)およびN末端(図19b)アディポネクチンポリクローナル抗体と共にMAB3604を用いた、アディポネクチンレベルに関するヒト血漿試料の解析。正常個体、糖尿病個体、耐糖能障害(IGT)個体、空腹時血糖障害(IFG)個体、およびIGTとIFG両方の個体から採取したヒト空腹時血漿試料を、アディポネクチンレベルに関して分析した。分析用の抗体ペアは、球状アディポネクチンポリクローナル抗体またはN末端アディポネクチンポリクローナル抗体と組み合わせたMAB3604であった。アディポネクチンレベル(μg/ml)を空腹時血糖レベル(mg/dL)に対してプロットする。正常な空腹時血糖レベルを有する個体-青色のひし形、IGT個体-ピンク色の四角形、IFG個体-黄色の三角形、IGT+IFG個体-淡青色の十字形、および糖尿病個体-青色のアスタリスク。有意な相関は明らかではない。
【図２０】球状(図20a)、N末端(図20b)、およびC末端(図20c)アディポネクチンポリクローナル抗体と共にmAb A12820を用いた、アディポネクチンレベルに関するヒト血漿試料の解析。正常個体、糖尿病個体、耐糖能障害(IGT)個体、空腹時血糖障害(IFG)個体、およびIGTとIFG両方の個体から採取したヒト空腹時血漿試料を、アディポネクチンレベルに関して分析した。分析用の抗体ペアは、球状アディポネクチンポリクローナル抗体、N末端またはC末端アディポネクチンポリクローナル抗体と組み合わせたmAb A12820であった。アディポネクチンレベル(μg/ml)を空腹時血糖レベル(mg/dL)に対してプロットする。正常な空腹時血糖レベルを有する個体-青色のひし形、IGT個体-ピンク色の四角形、IFG個体-黄色の三角形、IGT+IFG個体-淡青色の十字形、および糖尿病個体-青色のアスタリスク。特にN末端抗体およびC末端抗体の場合に、有意な相関が明らかである。
【図２１】球状(図21a)、N末端(図21b)、およびC末端(図21c)アディポネクチンポリクローナル抗体と共にMAB10651を用いた、アディポネクチンレベルに関するヒト血漿試料の解析。正常個体、糖尿病個体、耐糖能障害(IGT)個体、空腹時血糖障害(IFG)個体、およびIGTとIFG両方の個体から採取したヒト空腹時血漿試料を、アディポネクチンレベルに関して分析した。分析用の抗体ペアは、球状アディポネクチンポリクローナル抗体、N末端またはC末端アディポネクチンポリクローナル抗体と組み合わせたMAB10651であった。アディポネクチンレベル(μg/ml)を空腹時血糖レベル(mg/dL)に対してプロットする。正常な空腹時血糖レベルを有する個体-青色のひし形、IGT個体-ピンク色の四角形、IFG個体-黄色の三角形、IGT+IFG個体-淡青色の十字形、および糖尿病個体-青色のアスタリスク。有意な相関は明らかではない。
【図２２】球状(図22a)、N末端(図22b)、およびC末端(図22c)アディポネクチンポリクローナル抗体と共にmAbアディポネクチンM1を用いた、アディポネクチンレベルに関するヒト血漿試料の解析。正常個体、糖尿病個体、耐糖能障害(IGT)個体、空腹時血糖障害(IFG)個体、およびIGTとIFG両方の個体から採取したヒト空腹時血漿試料を、アディポネクチンレベルに関して分析した。分析用の抗体ペアは、球状アディポネクチンポリクローナル抗体、N末端またはC末端アディポネクチンポリクローナル抗体と組み合わせたmAbアディポネクチンM1であった。アディポネクチンレベル(μg/ml)を空腹時血糖レベル(mg/dL)に対してプロットする。正常な空腹時血糖レベルを有する個体-青色のひし形、IGT個体-ピンク色の四角形、IFG個体-黄色の三角形、IGT+IFG個体-淡青色の十字形、および糖尿病個体-青色のアスタリスク。特に球状抗体およびN末端抗体の場合に、有意な相関が明らかである。
【図２３】球状(図23a)、N末端(図23b)、およびC末端(図23c)アディポネクチンポリクローナル抗体と共にmAbアディポネクチンM24を用いた、アディポネクチンレベルに関するヒト血漿試料の解析。正常個体、糖尿病個体、耐糖能障害(IGT)個体、空腹時血糖障害(IFG)個体、およびIGTとIFG両方の個体から採取したヒト空腹時血漿試料を、アディポネクチンレベルに関して分析した。分析用の抗体ペアは、球状アディポネクチンポリクローナル抗体、N末端またはC末端アディポネクチンポリクローナル抗体と組み合わせたmAbアディポネクチンM24であった。アディポネクチンレベル(μg/ml)を空腹時血糖レベル(mg/dL)に対してプロットする。正常な空腹時血糖レベルを有する個体-青色のひし形、IGT個体-ピンク色の四角形、IFG個体-黄色の三角形、IGT+IFG個体-淡青色の十字形、および糖尿病個体-青色のアスタリスク。特に球状抗体およびN末端抗体の場合に、有意な相関が明らかである。
【図２４】R&D社のアディポネクチンELISAによる、アディポネクチンレベルに関するヒト血漿試料の解析。正常個体、糖尿病個体、耐糖能障害(IGT)個体、空腹時血糖障害(IFG)個体、およびIGTとIFG両方の個体から採取したヒト空腹時血漿試料を、アディポネクチンレベルに関して分析した。R&D社のアディポネクチンELISAアッセイ法を用いて、アディポネクチンのレベルを決定した。アディポネクチンレベル(μg/ml)を空腹時血糖レベル(mg/dL)に対してプロットする。正常な空腹時血糖レベルを有する個体-青色のひし形、IGT個体-ピンク色の四角形、IFG個体-黄色の三角形、IGT+IFG個体-淡青色の十字形、および糖尿病個体-青色のアスタリスク。有意な相関は明らかではない。
【図２５】M1球状型および空腹時血糖の相関。試料の特徴:N=126のII型糖尿病患者(T2D)およびN=124の正常個体を検査した。この試料においてT2Dに関して使用した診断基準は、空腹時血糖(FBG)>126であった。図25a:アディポネクチンレベルの単位はμg/mlであり、M1球状型である。球状型のオッズ比(OR=0.84、95％信頼区間、0.74〜0.95)は、1より有意に小さく、低レベルのM1球状型がII型糖尿病のリスクと関連していることが示唆された。図25b:ROC曲線は、球状濃度カットオフ値3.0μg/ml、4.0μg/ml、および5.0μg/mlにおける感受性および特異性を示す。FPは、偽陽性を表す。M1球状型の曲線下面積は0.731であった。
【図２６】M1 N末端型および空腹時血糖の相関。試料の特徴:N=126のII型糖尿病患者(T2D)およびN=124の正常個体を検査した。この試料においてT2Dに関して使用した診断基準は、空腹時血糖(FBG)>126であった。図26a:アディポネクチンレベルの単位はμg/mlであり、M1 N末端型である。球状型のオッズ比(OR=0.53、95％信頼区間、0.32〜0.88)は、1より有意に小さく、低レベルのM1 N末端型がII型糖尿病のリスクと関連していることが示唆された。図26b:ROC曲線は、球状濃度カットオフ値3.0μg/ml、4.0μg/ml、および5.0μg/mlにおける感受性および特異性を示す。M1 N末端型の曲線下面積は0.705であった。
【図２７】M24球状型および空腹時血糖の相関。試料の特徴:N=126のII型糖尿病患者(T2D)およびN=124の正常個体を検査した。この試料においてT2Dに関して使用した診断基準は、空腹時血糖(FBG)>126であった。図27a:アディポネクチンレベルの単位はμg/mlであり、M24球状型である。球状型のオッズ比(OR=0.47、95％信頼区間、0.30〜0.72)は、1より有意に小さく、低レベルのM24球状型がII型糖尿病のリスクと関連していることが示唆された。図27b:ROC曲線は、球状濃度カットオフ値3.0μg/ml、4.0μg/ml、および5.0μg/mlにおける感受性および特異性を示す。M24球状型の曲線下面積は0.742であった。
【図２８】M24 C末端型および空腹時血糖の相関。試料の特徴:N=126のII型糖尿病患者(T2D)およびN=124の正常個体を検査した。この試料においてT2Dに関して使用した診断基準は、空腹時血糖(FBG)>126であった。図28a:アディポネクチンレベルの単位はμg/mlであり、M24 C末端型である。C末端型のオッズ比(OR=0.87、95％信頼区間、0.80〜0.92)は、1より有意に小さく、低レベルのM24 C末端型がII型糖尿病のリスクと関連していることが示唆された。図28b:ROC曲線は、球状濃度カットオフ値3.0μg/ml、4.0μg/ml、および5.0μg/mlにおける感受性および特異性を示す。M24 C末端型の曲線下面積は0.740であった。
【図２９】A12820球状型および空腹時血糖の相関。試料の特徴:N=126のII型糖尿病患者(T2D)およびN=124の正常個体を検査した。この試料においてT2Dに関して使用した診断基準は、空腹時血糖(FBG)>126であった。図29a:アディポネクチンレベルの単位はμg/mlであり、A12820球状型である。A12820球状型のオッズ比(OR=0.87、95％信頼区間、0.80〜0.92)は、1より有意に小さく、低レベルのA12820球状型がII型糖尿病のリスクと関連していることが示唆された。図29b:ROC曲線は、球状濃度カットオフ値3.0μg/ml、4.0μg/ml、および5.0μg/mlにおける感受性および特異性を示す。A12820球状型の曲線下面積は0.714であった。
【図３０】A12820 N末端型および空腹時血糖の相関。試料の特徴:N=126のII型糖尿病患者(T2D)およびN=124の正常個体を検査した。この試料においてT2Dに関して使用した診断基準は、空腹時血糖(FBG)>126であった。図30a:アディポネクチンレベルの単位はμg/mlであり、A12820 N末端型である。A12820 N末端型のオッズ比(OR=0.97、95％信頼区間、0.95〜0.99)は、1より有意に小さく、低レベルのA12820 N末端型がII型糖尿病のリスクと関連していることが示唆された。図30b:ROC曲線は、球状濃度カットオフ値3.0μg/ml、4.0μg/ml、および5.0μg/mlにおける感受性および特異性を示す。A12820 N末端型の曲線下面積は0.673であった。
【図３１】A12820 C末端型および空腹時血糖の相関。試料の特徴:N=126のII型糖尿病患者(T2D)およびN=124の正常個体を検査した。この試料においてT2Dに関して使用した診断基準は、空腹時血糖(FBG)>126であった。図31a:アディポネクチンレベルの単位はμg/mlであり、A12820 C末端型である。A12820 C末端型のオッズ比(OR=0.97、95％信頼区間、0.93〜0.99)は、1より有意に小さく、低レベルのA12820 C末端型がII型糖尿病のリスクと関連していることが示唆された。図31b:ROC曲線は、球状濃度カットオフ値3.0μg/ml、4.0μg/ml、および5.0μg/mlにおける感受性および特異性を示す。A12820 C末端型の曲線下面積は0.663であった。
【図３２】M1の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列(配列番号16および17)ならびにアミノ酸配列(配列番号4および5)。アディポネクチンM1ハイブリドーマcDNAの対応する領域をクローン化し、配列決定した。アミノ酸配列は、cDNA配列から導き出した。可変領域のアミノ酸は、抗体の特異的結合領域をコードし、アディポネクチンN末端アミノ酸へのIgG結合の高度な特異性を与える。
【図３３】M24の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列(配列番号18)ならびにアミノ酸配列(配列番号6および7)。アディポネクチンM1ハイブリドーマcDNAの対応する領域をクローン化し、配列決定した。アミノ酸配列は、cDNA配列から導き出した。可変領域のアミノ酸は、抗体の特異的結合領域をコードし、アディポネクチンN末端アミノ酸へのIgG結合の高度な特異性を与える。
【図３４】アディポネクチンハイブリドーマ細胞株M1およびM24に対するIgG重鎖可変領域のアミノ酸配列比較およびCDR割当。
【図３５】アディポネクチンハイブリドーマ細胞株M1およびM24に対するIgG軽鎖可変領域のアミノ酸配列比較およびCDR割当。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
本明細書に引用する参考文献はすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００９】
「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、同義的に使用されることを意図する。これらは、ペプチド結合またはアミド結合を介して相互に連結されている少なくとも2つ(2)またはそれ以上のアミノ酸の鎖を意味し、この鎖は翻訳後修飾(例えば、グリコシル化、アシル化、リン酸化など)とは無関係である。抗体は、具体的には、この定義の範囲内にあることが意図される。本発明のポリペプチドは、各サブユニットが別々のDNA配列にコードされている複数のサブユニットを含んでよい。タンパク質はまた、二量体、三量体、四量体、または様々なより高次の構造物を含む、複数のポリペプチド単位も包含してよい。また、様々なタンパク質が、付加的なタンパク質または構成要素から構成され得るが、本発明者らはそれらの具体的な組成もアイデンティティも知らない。
【００１０】
「アイソフォーム」とは、ヒトまたは動物、血漿、血清、または他の体液中に存在し得る、アディポネクチンのようなタンパク質の異なる分子形態を意味する。アイソフォームはまた、様々な組換法によって作製されてもよく、アディポネクチンを発現する細胞から培地に分泌されて存在し得る。アディポネクチンの場合、アイソフォームは、複数のアディポネクチンサブユニットからなってよく、かつ、様々な翻訳後修飾によって修飾され得る。また、アイソフォームは、一緒になって複合体を形成する他のタンパク質または構成要素からなってよい。
【００１１】
アディポネクチンは、抗炎症活性、アテローム生成抑制活性、メタボリックシンドロームに対する予防活性、およびインスリン抵抗性改善活性を含む様々な活性を有することが最近示された、脂肪細胞特異的タンパク質である。アディポネクチンは、単一遺伝子にコードされ、244個のアミノ酸からなり(配列番号19)、約30キロダルトンのポリペプチド鎖を生じる。成熟したヒトアディポネクチンタンパク質は、アミノ酸19〜244を含む。球状ドメインは、アミノ酸107〜244を含むことが報告されている。血漿/血清中では、アディポネクチンは、単量体、三量体、六量体、およびそれらの様々な組合せを含む様々な分子形態で存在する。アディポネクチンのどの分子形態がどのタイプの活性を有するかに関する情報は、当技術分野において公知ではない。ヒト血漿/血清中のアディポネクチンレベルを測定するための方法は存在しているが、異なるアディポネクチン形態を正確に測定することは依然として可能ではなく、特定の生理的状態または疾患に対する特定のアディポネクチン形態のレベルの関係を予測することも依然として可能ではない。
【００１２】
「組換え」アディポネクチンとは、通常はアディポネクチンを産生しない細胞中で合成されるタンパク質を意味する。この技術は、様々なタイプの研究用に多量のタンパク質を調製するために、当技術分野において一般に使用される。「組換え」アディポネクチンは、大腸菌(E. coli)、酵母、または293細胞もしくはCHO細胞など様々な哺乳動物細胞株において作製することができる。これらの細胞型において作製された組換えアディポネクチンアイソフォームは、ヒト血漿試料中に存在するアディポネクチンアイソフォームと同様でよいか、または顕著に異なってよい。
【００１３】
「N末端」または「N末端の」とは、タンパク質のN末端に最も近いアミノ酸残基を意味する。これらの残基は、タンパク質のアミノ酸残基19で始まり、40個もの付加的なアミノ酸を含んでよい。本発明者らは、アディポネクチンのアミノ酸残基19〜39をN末端配列として利用し、これらに対して抗体を開発した。
【００１４】
「C末端」または「C末端の」とは、タンパク質のC末端に最も近いアミノ酸残基を意味する。これらの残基は、タンパク質のアミノ酸残基244で終了し、タンパク質の末端の前に40個もの付加的なアミノ酸を含んでよい。本発明者らは、アディポネクチンの残基223〜244をC末端配列として利用し、これらに対して抗体を開発した。
【００１５】
抗体ポリペプチド配列に関する「実質的に同一な」という語句は、参照ポリペプチド配列に対して少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは90％、および最も好ましくは95％の配列同一性を示す抗体として解釈されるものとする。核酸配列に関する用語は、参照核酸配列に対して少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％、および最も好ましくは97％の配列同一性を示すヌクレオチド配列として解釈されるものとする。ポリペプチドの場合、比較配列の長さは、一般に、少なくとも25アミノ酸である。核酸の場合、長さは一般に少なくとも75ヌクレオチドである。
【００１６】
「同一性」または「相同性」という用語は、比較される対応する配列の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを意味すると解釈されるものとする。比較は、これらの配列をアラインし、必要であればギャップを導入して配列全体に対する最大の同一性パーセントを実現した後に行い、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない。N末端またはC末端の伸張も挿入も、同一性または相同性を減少させるものとして解釈されないものとする。アライメントのための方法およびコンピュータープログラムは、当技術分野において周知である。配列同一性は、配列解析ソフトウェア(例えば、Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, Wis. 53705)を用いて測定することができる。このソフトウェアは、様々な置換、欠失、および他の修飾に対して相同性の程度を割り当てることによって、類似した配列をマッチさせる。
【００１７】
本明細書において使用される「インスリン感受性」という用語は、グルコースを利用する身体能力の尺度を意味する。この尺度は、インスリンがグルコース取込みを刺激する能力に依存する。空腹時血糖、空腹時インスリン、経口グルコース負荷試験、グルコースクランプ、またはインスリンクランプを含む、この目的のために使用できる様々な尺度がある。これらの尺度はすべて、このタイプの解析のためにルーチン的に使用することができる。
【００１８】
本明細書において使用される「抗原」という用語は、免疫応答を刺激し、かつその抗原と特異的に反応する抗体を作製するために使用できる物質を意味する。これらの抗体は、起源がポリクローナルまたはモノクローナルでよい。ポリクローナル抗体は、多数のB細胞から産生され、かつ特定の抗原を対象とする抗体分子のグループである。ポリクローナル抗体では、あるタンパク質またはペプチドの異なるエピトープまたは配列を認識する抗体分子の混合物がある。モノクローナル抗体は、単一のB細胞から産生され、かつタンパク質またはペプチドなどの抗原を特異的に対象とする、単一の独特な抗体分子である。
【００１９】
本明細書において使用される「ELISAアッセイ法」という用語は、酵素結合免疫吸着測定法を意味する。このアッセイ法は、タンパク質、ペプチド、および低分子を含む様々な実体のレベルを測定するためにルーチン的に使用される。とりわけ、リン酸化、アシル化、GlcNアシル化(glcnacylation)などの翻訳後修飾以外のタンパク質の異なる分子形態を伝統的なELISAアッセイ法によって同定できることは、一般的ではない。伝統的なELISA法では、同じサブユニットから構成された異なる分子実体を測定することができない。
【００２０】
発明の詳細な説明
第1の目的において、本発明は、アディポネクチンのN末端を対象とするモノクローナル抗体に関する。
【００２１】
好ましい態様において、配列番号3を含むアディポネクチンペプチドを用いて、抗体を産生させた。
【００２２】
さらに好ましい態様において、抗体は、配列番号4または配列番号6のアミノ酸21〜36、アミノ酸52〜58、およびアミノ酸91〜99、ならびに配列番号5または配列番号7のアミノ酸25〜33、アミノ酸48〜64、およびアミノ酸97〜104からなる群より選択される少なくとも2つのCDR配列を含む。
【００２３】
さらに好ましい態様において、抗体は、配列番号4または配列番号6のアミノ酸21〜36、アミノ酸52〜58、およびアミノ酸91〜99、ならびに配列番号5または配列番号7のアミノ酸25〜33、アミノ酸48〜64、およびアミノ酸97〜104からなる群より選択される、少なくとも3つのCDR配列、より好ましくは少なくとも4つ、さらにより好ましくは少なくとも5つ、最も好ましくは6つのCDR配列を含む。
【００２４】
別の好ましい態様において、抗体は、配列番号4または配列番号6より選択される軽鎖可変領域および配列番号5または配列番号7より選択される重鎖可変領域を含む。
【００２５】
さらなる好ましい態様において、抗体は、配列番号4に示す軽鎖可変領域および配列番号5に示す重鎖可変領域を含む。
【００２６】
別の好ましい態様において、抗体は、配列番号6に示す軽鎖可変領域および配列番号7に示す重鎖可変領域を含む。
【００２７】
第2の目的において、本発明は、配列番号4または配列番号6より選択される軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド配列、および配列番号5または配列番号7より選択される重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００２８】
好ましい態様において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号16、配列番号17、および配列番号18からなる群より選択される。
【００２９】
第3の目的において、本発明は、ヒト対象の糖尿病に対する素因を診断するための方法であって、患者試料中のアディポネクチンをスクリーニングするためのアッセイ法において少なくとも1つのアディポネクチンモノクローナル抗体および少なくとも1つのアディポネクチンポリクローナル抗体を含み、AUCが0.65またはそれ以上である受診者動作特性曲線(ROC)プロットに対応するアッセイ値が、糖尿病に対する素因を示す方法に関する。
【００３０】
本発明の方法の好ましい態様において、少なくとも1つのモノクローナル抗体は、本発明の抗体および/またはmAb A12820より選択される。
【００３１】
本発明の方法のさらに好ましい態様において、少なくとも1つのモノクローナル抗体はM1であり、少なくとも1つのポリクローナル抗体は、球状抗体およびN末端抗体からなる群より選択される。
【００３２】
本発明の方法のさらに好ましい態様において、少なくとも1つのモノクローナル抗体は、mAbアディポネクチンM24であり、少なくとも1つのポリクローナル抗体は、球状抗体およびC末端抗体からなる群より選択される。
【００３３】
本発明の方法のさらに好ましい態様において、少なくとも1つのモノクローナル抗体はmAb A12820であり、少なくとも1つのポリクローナル抗体は、球状抗体、N末端抗体、およびC末端抗体からなる群より選択される。
【００３４】
さらに好ましい態様において、アッセイ法はELISAである。
【００３５】
本発明の方法のさらに好ましい態様において、AUC値は、0.70またはそれ以上である。
【００３６】
本発明の方法のさらに好ましい態様において、患者試料は、血漿または血清である。
【００３７】
第4の目的において、本発明は、ヒト対象の糖尿病に対する素因を診断するための、少なくとも1つのアディポネクチンポリクローナル抗体と組み合わせた本発明の抗体および/またはmAb A12820の使用に関する。
【００３８】
好ましい態様において、ポリクローナル抗体は、球状アディポネクチン抗体、N末端アディポネクチン抗体、およびC末端アディポネクチン抗体からなる群より選択される。
【００３９】
さらなる目的において、本発明は、配列番号1を含むアディポネクチンペプチドを用いて産生させた、アディポネクチンのN末端を対象とするポリクローナル抗体を提供する。
【００４０】
さらに別の目的において、本発明は、配列番号2を含むアディポネクチンペプチドを用いて産生させた、アディポネクチンのC末端を対象とするポリクローナル抗体に関する。
【００４１】
別の目的において、本発明は、配列番号19のアミノ酸107〜244を含むアディポネクチンペプチドを用いて産生させた、アディポネクチンの球状ドメインを対象とするポリクローナル抗体に関する。
【００４２】
本発明は、ヒト血漿/血清中に存在する異なる形態のヒトアディポネクチンを測定するための方法に関し、より具体的には、方法は、アディポネクチンに対する異なるモノクローナル抗体を、ヒトアディポネクチンの異なるドメインに対する異なるポリクローナル抗体と組み合わせて利用するELISAアッセイ法に基づいている。
【００４３】
異なる組合せのモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を組み合わせてELISAアッセイ法を構成する場合、異なるELISA形式により、アディポネクチンの異なる分子形態を測定することができる。さらに、これらの異なる分子形態のアディポネクチンの一部は、異なる生理的状態と相関関係がある。異なるアディポネクチン分子形態のレベルは、インスリン感受性もしくは空腹時血糖、または心血管疾患、脂肪症、炎症、ならびに他の疾患など他の生理的状態と相関し得る。
【００４４】
本発明はまた、アディポネクチンの独特なアイソフォーム、ならびにポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含むそれに対する抗体も提供する。
【００４５】
本発明の方法は、単純で、信頼性が高く、かつ再現性があり、糖尿病表現型に対して有意な程度の相関関係を示すいくつかの形態(M1球状、M1 N末端、M24球状、M24 C末端、A12820球状、A12820 N末端、A12820 C末端)を含む、異なるアディポネクチンアイソフォームを識別することができる。さらに、本発明は、低分子量または高分子量のアディポネクチンアイソフォームを単に測定するだけである以前の方法が、II型糖尿病の形態を有する個体を特定する識別力を提供するには十分ではないことを実証する。本発明のアッセイ法はまた、心血管疾患、メタボリックシンドローム、炎症、異脂肪血症、およびNASHなどの他の疾患へのアディポネクチンアイソフォームの関連をさらに明確にするためにも使用することができる。本発明の方法はまた、疾患の進行、治療に対する応答、治療応答の予測、ならびに疾患の初期形態の診断をモニターするためにも使用することができる。
【００４６】
したがって、これらのアッセイ法の有用性、および同定された新規なアディポネクチン抗体およびアイソフォームを用いて、疾患の進行、治療に対する応答、治療応答の予測、ならびに疾患の初期形態の診断をモニターすることができる。
【００４７】
抗体の開発および特徴付け
ヒトアディポネクチンの球状ドメイン、N末端ドメイン、およびC末端ドメインに対するポリクローナル抗体を開発した。これらのポリクローナル抗体は、ウェスタンブロット、および血漿、血清などの体液中に存在する異なる形態のアディポネクチンに関するELISAの開発において、使用することができる。これらのポリクローナル抗体はウサギにおいて産生させ、手順は、Pocono Rabbit Farm & Laboratory Inc, Canadensis, PA.の標準プロトコールに従って実施した。標準プロトコールは、抗原注射、追加免疫、および放血のために使用した。プロテインGアガロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、抗体を血清から精製した。球状ドメインの抗原は、アミノ酸残基107〜244をコードする組換えアディポネクチンタンパク質であった。タンパク質は大腸菌において産生させ、標準的な精製技術によって精製した。N末端ペプチド抗原は、N末端配列
2010515668.tif 000002
を有する。C末端ペプチド抗原は、配列
2010515668.tif 000003
を有する。
【００４８】
ヒトアディポネクチンN末端に対する新規なモノクローナル抗体(M1 配列番号4および配列番号5、それぞれ軽鎖可変領域および重鎖可変領域、ならびにM24 配列番号6および配列番号7、それぞれ軽鎖可変領域および重鎖可変領域)を、N末端配列
2010515668.tif 000004
を用いて作製した。これらの抗体は、Antibody Solutions社、Mountain View, CA 94043によってマウスにおいて作製された。Antibody Solutions社は、免疫化(PolyExpress社所有の抗原に対する抗体応答のプロトコール)、ハイブリドーマライブラリーの作製(免疫細胞の最終追加免疫、骨髄腫細胞との融合、および凍結保存)、ならびにモノクローナル培養物(フローサイトメトリー細胞選別を用いたモノクローナル培養物の調製)のために、彼らの標準プロトコール(当技術分野において周知である技術)を使用した。
【００４９】
使用したプロトコールは、ハイブリドーマ細胞の作製、増殖、および特徴付けの標準的なプロトコールであり、以下の一般的な手順の方法に従った。(Oi. V. T.およびL. A. Herzenberg. 1979. Selected Methods in Cellular Immunology.  B. B. MishellおよびS .M. Shiigi編、Freeman, San Francisco, 351頁、Reik, L. M., S. L. Maines. D. E. Ryan, W.Levin, S.Bandiera.およびP.E.Thomas. 1987. A simple. non-chromatographic purification procedure for monoclonal antibodies. J. Immunol. Methods 100:123、該参考文献は、参照により本明細書に組み入れられる)。ハイブリドーマ上清の一次スクリーニングは、96ウェルプレート上にコーティングされたN末端ペプチドを用いて、ハイブリドーマ上清中のIgGの反応性を検出することであった。二次的なアッセイ法は、血漿からのヒトアディポネクチンの捕獲、続いて、ELISA形式を用いたヒトアディポネクチンに対するポリクローナル抗体との反応(reactivity)を含んだ。ヒトアディポネクチンを捕獲することができるモノクローナル抗体を有用とみなし、続いて、ELISA解析およびウェスタンブロット解析によってさらに特徴付けた。
【００５０】
ELISAアッセイ法の開発
ヒトアディポネクチンのレベルを測定するためのELISAアッセイ法は、アディポネクチンを対象とする特異的なモノクローナル抗体を用いて異なるアディポネクチンアイソフォームを捕獲し、次いで、異なるアディポネクチンエピトープを認識する異なるポリクローナル抗体を用いて、捕獲されたアディポネクチンアイソフォームをさらに同定する能力に依拠する。したがって、これらのアッセイ法の構成は、抗体ペア(モノクローナル抗体に加えてポリクローナル抗体)が独特なアディポネクチンアイソフォームと特異的に相互作用する能力に依存している、異なるアディポネクチンアイソフォームを特異的に認識する能力を提供する。本発明者らは、5種の異なるモノクローナル抗体(MAB3604(Chemicon International)、A12820 (611645) (BD Biosciences)、MAB10651 (R&D Systems, Inc)、N-ADIP-M1(Roche)、およびN-ADIP-M24(Roche))を、3種の異なるポリクローナル抗体(N末端、C末端、および球状)と一緒に、この解析において使用した。したがって、本発明者らは、15種の異なるアッセイ法を開発し、15種の異なるアディポネクチンアイソフォーム(M1球状、M1 N末端、M1 C末端、M24球状、M24 C末端、M24 N末端、A12820球状、A12820 N末端、A12820 C末端、MAB10651球状、MAB10651 N末端、MAB10651 C末端、MAB3604球状、MAB3604 N末端)を潜在的に同定する潜在能力を有する。MAB3604 C末端の組合せは、シグナルを生じなかった。付加的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いることによって、さらに多数の潜在的なアディポネクチンアイソフォームを同定することが可能である。
【００５１】
ウサギポリクローナル抗体を作製するための手順
精製したN末端アディポネクチンペプチドまたはC末端アディポネクチンペプチドを、システイン残基を介して、KLH 1mgに対してペプチド1mgの比でKLHに結合させた(複合ペプチド)。完全フロイントアジュバント(CFA)に溶かした100〜200μgの複合ペプチドをウサギに皮内注射した。14日後、不完全フロイントアジュバント(IFA)に溶かした50〜100μgの複合ペプチドを皮内注射した。14日後、不完全フロイントアジュバント(IFA)に溶かした50〜100ugの複合ペプチドを皮内注射した。14日後にウサギから採血して、分析のために血清を得た。その後、30日毎に複合ペプチド25〜50μgを皮下注射してウサギを免疫化し、次いで、免疫化後14日目に採血した。血清を採取し、次いで、後述するようにしてIgGを精製し、アッセイ法開発において使用した。(pAb作製に関する参考文献:Lui, F. T., Sinnecker, M., Hamaoka, J.およびKatz, D. (1979) Biochemistry 18,690-697。これは、当業者によって標準的に使用される多くのプロトコールのうちの1つである)。使用した抗原は、N末端アディポネクチンペプチド、C末端アディポネクチンペプチド、および大腸菌において作製した、アミノ酸107〜244に及ぶ組換え球状アディポネクチンであった。
【００５２】
上記の手順により、「抗体の特徴付けおよび開発」のセクションにおいて上記に考察したように、本発明者らがN末端抗体、C末端抗体、および球状抗体と呼ぶ3種の異なるポリクローナル抗体が産生された。これらの各ポリクローナル抗体を、異なるモノクローナル抗体と一緒に使用して、異なるアディポネクチンアイソフォームを認識する独特なELISAアッセイ法を作成した。
【００５３】
モノクローナル抗体を作製するための手順
免疫化プロトコールおよびmAb作製
CFAに溶かした複合体N末端ペプチド50μgをBALB/c雌マウスに腹腔内注射して免疫化し、次いで、5週間後に、CFAに溶かした複合体N末端ペプチド50μgを腹腔内注射して追加免疫した。6週間後、PBSに溶かした複合体N末端ペプチド50ugを腹腔内注射し、続いて、48時間後に全く同様にして追加免疫した。この最後の追加免疫後2日目に、脾臓を摘出し、細かく切断して細胞懸濁液にし、以前に説明されているようにして(19)、HAT感受性マウス骨髄腫細胞Sp2/0と融合させた。当業者によって一般に使用される多くの同様の手順がある。HAT培地(HB101培地(Irvine Scientific, Irvine, CA)、7％ FBS、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1×HAT、および10％ハイブリドーマクローニング因子(HCF; IGEN, Rockville, MD))中でハイブリドーマを選択した(Kenney et al, Biotechnology, 13: 787, 1995)。10〜14日後に増殖を示すウェルから得た上清分取物(50ul)を、ELISAによって抗アディポネクチンN末端抗体に関してスクリーニングした。96ウェルプレートの底にN末端ペプチドをコーティングし、ハイブリドーマ上清との反応性に関してスクリーニングした。N末端ペプチドと反応するハイブリドーマをELISAによってさらにスクリーニングして、ヒト血漿中に存在する天然のアディポネクチンとそれらが相互作用し得るかどうかを決定した。HAT培地中での限界希釈によって、関心対象のハイブリドーマをクローン化した(Kenney et al, Biotechnology, 13: 787, 1995)。
【００５４】
プリスタンで抗原刺激したBALB/cマウスにクローン化したハイブリドーマを注射することによって(1〜2×106細胞/マウス、腹腔内)、腹水を産生させた。以前に説明されているように、カプリル酸沈殿および硫酸アンモニウム沈殿の組合せによって、加熱不活化した腹水からmAbを精製した。また、大規模な培養とそれに続くIgGを精製するためのプロテインGクロマトグラフィーによって、mAbを作製した。
【００５５】
任意で、かつ好ましくは、これらのプロトコールのさらなる向上は、アッセイ法において使用される抗体の順序を逆にすることを含む。例えば、ポリクローナル抗体を、異なるアディポネクチンアイソフォームを捕獲するために使用し、次いで、異なるアディポネクチンエピトープを認識する異なるモノクローナル抗体を用いて、捕獲したアディポネクチンアイソフォームをさらに同定することができる。
【００５６】
血漿/血清中および血漿画分中のヒトアディポネクチンの球状ドメイン、N末端ドメイン、およびC末端ドメインの定量は、ELISA形式で測定される。イムノプレートを次のモノクローナル抗体のうち1種でコーティングする:1:5000希釈のMAB3604(Chemicon International)、0.5ug/mlのA12820(611645)(BD Biosciences)、0.25μg/mlのMAB10651(R&D Systems, Inc)、1ug/mlのN-ADIP-M1(Roche)、および1ug/mlのN-ADIP-M24(Roche)。100μgの適切なモノクローナル抗体を有するプレートをプレートシーラーで覆い、4℃で16〜20時間インキュベートする。次いで、プレートをPBS-tween20 0.05％(以降のすべての洗浄に使用する)で3回洗浄する。PBS緩衝液中BSA1％+Tween20 0.05％ 300μlで1時間、プレートをブロックし、3回洗浄した。適切な参照用標準(0.0195〜10ng/ウェル)を最終体積50μlで各プレートに添加し、これを以降のすべてのインキュベーションに使用する。アディポネクチンの球状ドメインおよびN末端ドメインの検出の場合、R&D Systems社製のアディポネクチン(1〜244)(カタログ番号1065、C末端にhisタグ付)を使用する。C末端アディポネクチンの検出の場合、Alexis Biochemicals社製のアディポネクチン(16〜247)(カタログ番号ALX-522-063、N末端にFLAGタグ付)を使用する。血漿/血清または血漿画分を、BSA0.1％+Tween20 0.05％を含むPBS中で希釈し、各プレートに添加する。これらのプレートを、オービタルシェーカー上で21〜23℃にて1時間インキュベートし、次いで4回洗浄する。適切な検出抗体を、BSA0.1％+Tween20 0.05を含むPBS中に溶かして各プレートに添加し、オービタルシェーカー上で21〜23℃にて1時間インキュベートし、続いて4回洗浄する。発色抗体である、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させたロバ抗ウサギを、オービタルシェーカー上で21〜23℃にて1時間添加し、続いて4回洗浄する。結合された、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させた抗体を、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)の存在下で定量する。ウェル当たり50μlのTMB溶液を添加し、プレートシーラーでプレートを覆い、ミニオービタルプレートシェーカー上で振盪しながら、21〜23℃でインキュベートする。適切な時点に50μl/ウェルの0.5Mリン酸を添加して、反応を終結させる。ODを450nmで読み取り、適切な検量線から補間によってアディポネクチンの量を決定する。2未満のOD測定値を与える時点で反応を終結させる。これは、捕獲抗体および検出抗体に依存して、2分〜10分の間である。
【００５７】
分画した血漿試料のスクリーニング
正常なドナー3名に由来する血漿画分を、2mlの薄膜超遠心機用チューブ(Becton Dickinson)中に段階的に注ぎ、4℃で一晩、平衡にさせた10mM HEPES, pH8、125mM NaCl中の5〜20％のスクロース勾配を用いて分画した。 600ulの血漿全体を1:10希釈し、添加し、勾配遠心分離した。試料を上層に重ねた後(10mM HEPES, pH8, 125mM NaClで1:10希釈)、Beckman TL-100卓上超遠心機のTLS55ローター中、55,000rpm、4℃で4時間、勾配を回転させた(Pajvani et al 2004)。試料画分150μlをチューブの上層から取り出し、1〜20のラベルを付けた。画分1は勾配の最上層とし、画分20は勾配の最下層であった。これらの勾配画分を続いて回収し、後述するように、ウェスタン解析またはELISA解析によって解析した。異なる抗体をウェスタン解析のために使用し、これらはモノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれかであった。ELISA解析の場合、捕獲反応物としてのモノクローナル抗体、および発色反応物としての異なるポリクローナル抗体の異なる組合せを用いたELISAによって、アディポネクチンアイソフォームの存在に関して各画分を解析した。また、ポリクローナル抗体が捕獲抗体として使用され、モノクローナル抗体が発色抗体として使用されるように、構成を逆にすることもできる。市販のヒトアディポネクチンELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN)を比較のために使用した。
【００５８】
患者の血漿コレクションのスクリーニング
ヒト血漿試料の採取
男性および女性両方の糖尿病患者および非糖尿病患者を募集した。一晩の絶食後、対象を集め、血液約50mlを採取した。対象の身元は伏せたままにした(インフォームドコンセントのフォームを参照されたい)。対象には、糖尿病患者および糖尿病ではない年齢を一致させた対照が含まれる。
【００５９】
除外基準:症例の対象および対照対象の両方とも、1型糖尿病も糖尿病の二次的な形態(例えば、クッシング病、先端巨大症)も有してはならない。ステロイド治療を受けているか、または炎症性疾患(例えば皮膚筋炎)に罹患している対象は、除外される。余命が1年より短い(研究者の判断)対象もまた、除外される。これらの基準に加えて、対照対象は、以前に2型糖尿病または妊娠糖尿病と診断されたことがあっても、2型糖尿病の家族歴があっても、(前述したような)空腹時血糖障害または耐糖能障害を有してもいけない。
【００６０】
本明細書によって明かされ、本発明のELISA法において利用されるアディポネクチンアイソフォームおよび抗体が、2型糖尿病を含むある種の疾患の原因のより深い理解をもたらすこと、およびこの理解により、より優れた治療措置および予防措置をもたらすはずであることが予想される。
【００６１】
重要な材料およびパラメーター
公知の糖尿病患者である個体において、一晩の絶食後、合計約50mlの血液を採取した。
【００６２】
個体が以前に2型糖尿病と診断されていない場合、または彼らが食事療法を受けた糖尿病患者である場合、一晩の絶食後、合計約50mlの血液を採取した。一部の個体は、75gmの経口グルコース負荷試験を受ける必要があった。この試験は、一晩の絶食(少なくとも10時間)、ならびにグルコース経口投与を基準として0分、30分、および120分時点での血液抜き取りを必要とする。最大で、合計60mlの血液を抜き取った。
【００６３】
血液採取および血漿調製の手順
標準手順に従って、静脈血を患者から採血する。すべての段階はできるだけ速く連続的に実施して、最大限の試料品質を確保し、かつタンパク分解を防止した。
【００６４】
患者当たり、約50mlの血液を採取する(4×10mlバキュテナー)。各バキュテナーを2回反転させて、血液を抗凝固剤と混合し、直ちに氷上に置く(凍結させない)。
【００６５】
採血が終わった後、すべてのバキュテナーを1500×g、4℃で15分間、直ちに遠心分離する。
【００６６】
冷却した(4℃または氷上)バキュテナーを開け、1mlの使い捨てチップピペットを用いて、上清を10ml Falconチューブ(氷上)に移す。上清を約2mm残して、沈降物のキャリーオーバーを防ぐ。
【００６７】
Falconチューブを3000×g、4℃で30分間、遠心分離する。遠心分離ブレーキは、停止されなければならない。
【００６８】
ピペットを用いてFalconチューブ中の血漿上清を回収して、沈降物はすべて後に残した。すべての血漿試料を1つの50ml Falconチューブに移し、穏やかに混合して、確実に試料が均一になるようにした。
【００６９】
これらの試料を液体窒素中でショックフリーズし、-80℃の冷凍器中で保存した。輸送はドライアイス上で行った。
【００７０】
スクリーニング
ヒト血漿試料を解凍し、スクリーニングに備えて96ウェル中に等分した。
【００７１】
Assay Developmentのセクションで説明し、かつ下記に手短に概説するアッセイ法の手順を、図7〜12のアッセイ法の検量線において、および図13〜18の血漿画分に関するアッセイ法において使用した。このアッセイ法形式はまた、疾患状態に対する相関に関してヒト血漿試料コレクション中のアディポネクチンレベルを決定する際にも使用した(図19〜31)。
1)4℃で16〜20時間、PBS 100μlの体積で適切な捕獲抗体をイムノプレートに添加する。
2)吸引し、プレートを3回洗浄する
3)300ulの体積で、21〜23℃で1時間、300μlの体積のBSA 1％+Tween20 0.05％ + PBSでプレートをブロックする。
4)吸引し、プレートを3回洗浄する
5)最終体積50μlのBSA0.1％+Tween20 0.05％+PBSに溶かした希釈物を用いて、各プレートに適切な参照用標準を添加する。
6)最終体積50μlのBSA0.1％+Tween20 0.05％+PBSに溶かした希釈物を用いて、各プレートに血漿/血清を添加する。
7)プレートをオービタルシェーカー上に置き、21〜23℃で1時間、インキュベートする。
8)吸引し、プレートを4回洗浄する
9)最終体積50μlのBSA0.1％+Tween20 0.05％+PBS中に溶かした適切な検出抗体を各プレートに添加し、オービタルシェーカー上に置き、21〜23℃で1時間、インキュベートする
10)吸引し、プレートを4回洗浄する
11)最終体積50μlのBSA 0.1％+Tween20 0.05％+PBSに溶かした発色抗体であるロバ抗ウサギ-HRPを各プレートに添加し、オービタルシェーカー上に置き、21〜23℃で1時間、インキュベートする。
12)吸引し、プレートを4回洗浄する
13)体積50μlのTMB基質溶液をプレートに添加し、オービタルシェーカー上に置き、適切な発色時点まで21〜23℃でインキュベートする
14)体積50μlの0.5Mリン酸を添加して、反応を終結させる
15)ODを450nmで読み取り、検量線から補間によってアディポネクチンの量を決定する。
【００７２】
血漿/血清および血漿画分中の異なるヒトアディポネクチンアイソフォームの定量をELISA形式で測定する。イムノプレートを次のモノクローナル抗体のうち1種でコーティングする:1:5000希釈のMAB3604(Chemicon International)、0.5μg/mlのA12820(611645)(BD Biosciences)、0.25μg/mlのMAB10651(R&D Systems, Inc)、1μg/mlのN-ADIP-M1(Roche)、および1μg/mlのN-ADIP-M24(Roche)。100μlの適切なモノクローナル抗体を有するプレートをプレートシーラーで覆い、4℃で16〜20時間インキュベートする。次いで、プレートをPBS-tween20 0.05％(以降のすべての洗浄に使用する)で3回洗浄する。PBS緩衝液中BSA1％+Tween20 0.05％ 300μlで1時間、プレートをブロックし、3回洗浄した。適切な参照用標準(0.0195〜10ng/ウェル)を最終体積50μlで各プレートに添加し、これを以降のすべてのインキュベーションに使用する。アディポネクチンの球状ドメインおよびN末端ドメインの検出の場合、R&D Systems社製のアディポネクチン(1〜244)(カタログ番号1065、C末端にhisタグ付)を使用する。C末端アディポネクチンの検出の場合、Alexis Biochemicals社製のアディポネクチン(16〜247)(カタログ番号ALX-522-063、N末端にFLAGタグ付)を使用する。血漿/血清または血漿画分を、BSA 0.1％+Tween20 0.05％を含むPBS中で希釈し、各プレートに添加する。これらのプレートを、オービタルシェーカー上で21〜23℃、1時間インキュベートし、次いで4回洗浄する。適切な検出抗体を、BSA0.1％+Tween20 0.05を含むPBS中に溶かして各プレートに添加し、オービタルシェーカー上で21〜23℃にて1時間インキュベートし、続いて4回洗浄する。発色抗体である、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させたロバ抗ウサギを、オービタルシェーカー上で21〜23℃にて1時間添加し、続いて4回洗浄する。結合された、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合させた抗体を、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)の存在下で定量する。ウェル当たり50ulのTMB溶液を添加し、プレートシーラーでプレートを覆い、ミニオービタルプレートシェーカー上で振盪しながら、21〜23℃でインキュベートする。適切な時点に50μl/ウェルの0.5Mリン酸を添加して、反応を終結させる。ODを450nmで読み取り、適切な検量線から補間によってアディポネクチンの量を決定する。2未満のOD測定値を与える時点で反応を終結させる。これは、捕獲抗体および検出抗体ならびにそれらの濃度に依存して、2分〜10分の間である。
【００７３】
アディポネクチンハイブリドーマM1およびM24の可変重鎖および可変軽鎖のcDNAの配列決定
材料および方法
標準手順によってハイブリドーマ細胞を増殖させ、全RNAを抽出した。例えば、「Characterization of a murine monoclonal antibody that mimics heparin-induced thrombocytopenia antibodies」 G. M. Arepally, S. Kamei, K. S. Park, K. Kamei, Z. Q. Li, W. Liu, D. L. Siegel, W. Kisiel, D. B. Cines およびM. Poncz BLOOD (2000年3月1日) 95巻5号 1533〜1540頁、「Efficient amplification and direct sequencing of mouse variable regios from any immunoglobulin family」Thierry Chardes, Sylvie Villard, Gaelle Ferrieres, Marine Piechaczyk, Marine Cerutti, Gerard DevauchelleおよびBernard Pau FEBS Letters 452 (1999) 386〜394頁を参照されたい。
【００７４】
オリゴdTまたは逆PCRオリゴのいずれかをプライマーとして用いて、標準手順によって第1鎖cDNAを合成した。可変重鎖領域および可変軽鎖領域のcDNAを以下の条件を用いてPCR増幅した:
94C/5分
94C/30秒
55C/30秒
72C/90秒
30サイクル
72C/10分
以下のPCRオリゴを使用した:
参照1から:
重鎖フレームワーク1(フォワードプライマー)(配列番号8)
2010515668.tif 000005
重鎖定常(リバースプライマー)(配列番号9)
2010515668.tif 000006
軽鎖フレームワーク1(フォワードプライマー)(配列番号10)
2010515668.tif 000007
軽鎖定常(リバースプライマー)(配列番号11)
2010515668.tif 000008
参照2から:
重鎖フレームワーク1(フォワードプライマー)(配列番号12)
2010515668.tif 000009
重鎖定常(リバースプライマー)(配列番号13)
2010515668.tif 000010
軽鎖フレームワーク1(フォワードプライマー)(配列番号14)
2010515668.tif 000011
軽鎖定常(リバースプライマー)(配列番号15)
2010515668.tif 000012
【００７５】
アガロースゲル電気泳動によって生成物を解析した。軽鎖アンプリコンをゲル単離し、クローニングせずに配列決定した。重鎖アンプリコンをサブクローニングし、クローニングしたプラスミドから配列を決定した。
【００７６】
結果
アッセイ法の開発および標準化
ヒトアディポネクチンに関する様々なアッセイ法を開発した。使用したアッセイ法形式はELISAアッセイ法であった。これは、捕獲抗体としての特異的モノクローナル抗体、適切な標準物質のようなアディポネクチンを含む溶液、またはヒト血漿もしくは血清とそれに続くポリクローナル抗体の添加を利用する(図4および5)。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の各組合せは、異なるアッセイ形式に相当する。ポリクローナル抗体と合わせたモノクローナル抗体の特定の組合せは、特定のアディポネクチンアッセイ法を提供する(図5)。場合によっては、特定の組合せでは、アディポネクチンをまったく測定できないことがあり(例えばMAB3604 C末端の組合せ)、他のものを用いて、異なるレベルのアディポネクチンが測定される。
【００７７】
ELISAの発色を容易にするために、本発明者らは、アディポネクチンのN末端に特異的である新規なモノクローナル抗体を開発した。これらのmAbは、N末端アディポネクチンペプチドと特異的に反応し、また、ELISA、ウェスタンブロット解析、および免疫蛍光法によって決定されるアディポネクチンとも特異的に反応した。これらのmAbをポリクローナル抗体と組み合わせてさらに使用して、ELISAアッセイ法によりヒト血漿中のアディポネクチンのレベルを測定した。
【００７８】
基本的な形式のアッセイ法は、96ウェルプレート上に特異的抗アディポネクチンモノクローナル抗体を固定化することを含んだ(図4および5)。これらの研究で使用した異なる抗アディポネクチンモノクローナル抗体には、A12820、MAB3604、MAB10651、M1、およびM24が含まれた。ELISAアッセイ法の第2の構成要素は、アディポネクチンを対象とするポリクローナル抗体であった。3種の異なるポリクローナル抗体を使用した。これらには、N末端ポリクローナル抗体、C末端ポリクローナル抗体、および球状ポリクローナル抗体が含まれた。これら3種のポリクローナル抗体は、異なるアディポネクチンドメインを認識する。アディポネクチンELISAアッセイ法の様々な段階の概略図を図6に提示する。アディポネクチンの異なるドメインを対象とする異なるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて、付加的なアッセイ法を設定することが可能である。抗体のこのような組合せは、疾患状態と相関関係がある様々なアディポネクチンアイソフォームを識別する特性を有する付加的なアッセイ形式を提供し得る。
【００７９】
商業的供給業者から得た異なる組換えアディポネクチンタンパク質を用いて、異なるアッセイ法形式を標準化した(図7〜12)。したがって、報告されているアディポネクチンの絶対レベルは、各アッセイ法に対して使用した標準物質を基準とした定量化に基づいている。
【００８０】
すべてのアッセイ法によって、独特なアディポネクチンアイソフォームを検出できるとは限らない。したがって、各mAbを3種の各ポリクローナル抗体と組み合わせた場合、ELISAアッセイ法のすべてが、標準アディポネクチンまたはヒト血漿中のアディポネクチンなどのアディポネクチンを測定できるとは限らなかった。場合によっては、モノクローナル抗体と組み合わせたポリクローナル抗体のうち2種のみが、アディポネクチンレベルを測定するのに有用である。他のモノクローナル抗体の場合、ポリクローナル抗体の3種の組合せすべてで、アディポネクチンを検出することができる。本発明者らはまた、抗体組合せによって検出されるアディポネクチンアイソフォームのレベルが、アッセイ法によって有意に変動し得ることも観察した。いくつかの場合では、約0.05μg/mlのアディポネクチンレベルを(M24-N末端pAb)、他の場合では、約15μg/mlのレベルを(M24-C末端pAb)検出することができ、他のものは、約60μg/mlもの高さのレベルを有する(A12820-球状pAb)。
【００８１】
異なるアッセイ法によって認識されたアディポネクチンアイソフォームの特徴付け
異なるアッセイ法を確立した後、本発明者らは、異なるアッセイ法が異なるレベルのアディポネクチンを認識できることに気付いた。次いで、本発明者らは、アッセイ法間の差の性質を決定しようとした。アディポネクチンは、いくつかの異なる分子形態で存在することが報告されているため、本発明者らは、これらのアッセイ法が異なるアディポネクチン分子形態を認識し得るかを判定しようとした(Berg et al, Trends Endocrinol Metab. 2002 Mar;13(2):84-9.; Trujilloおよび Scherer, J Intern Med. 2005 Feb;257(2):167-75に総説がある)。速度勾配沈降は、サイズに基づいて分子を分離する簡単な手段を提供する。速度沈降によるアディポネクチンの分離は、報告されている(Pajvani UB et al (2003). J.Biol. Chem. 278:9073-9085)。サイズに基づいて分子を分離するその他の方法があり、例えば、同様にこの目的のために使用され得るゲルろ過クロマトグラフィーである。
【００８２】
概説したようにして、ヒト血漿試料を速度沈降によって分離し、画分を採取した。アディポネクチンの分布を決定するために、異なるアッセイ法形式を用いて、ELISAによって画分の分取物を測定した。各画分中のアディポネクチンの量を異なるアッセイ法形式を用いて決定し、次いで、速度勾配分画に由来する画分番号に対してプロットした。データを図13〜18に提示する。観察されたパターンから、アディポネクチンレベルがアッセイ法によって異なることが示される。球状pAbまたはN末端pAbと組み合わせたMAB3604は、画分3〜7中に存在する、分子量の小さいアディポネクチンアイソフォームのみを主として認識する(図13)。これに対して、3種すべてのpAbと組み合わせたMAB10651は、画分10〜16中に存在する、分子量の大きいアディポネクチンアイソフォームを主として認識する(図15)。アッセイ法を用いて決定されるアディポネクチンの量は異なり、球状pAbと組み合わせたMAB 10651が最も高いレベルを測定するのに対し、N末端pAbと組み合わせたMAB10651は、最も少量のアディポネクチンを測定する。したがって、これら3種の異なるアッセイ法は、大型のアディポネクチンアイソフォームを主として検出することができるが、検出されるアディポネクチンタンパク質のレベルは異なることから、抗体の異なる組合せによって認識されるアディポネクチン分子にはいくつかの差異があることが示唆される。
【００８３】
mAb A12820を3種の異なるポリクローナル抗体と組み合わせて用いて、分画したヒト血漿試料をアディポネクチンに関して分析した場合、極めて異なるパターンが観察された(図14)。アディポネクチンレベルは、いくつかの異なる画分において存在し、画分5のピークは、分子量の小さいアディポネクチンに対応していた。また、画分7〜17までにアディポネクチンタンパク質の幅広いピークがあり、画分13の近くにピークを有した。3種のアッセイ法すべてにおいて同様のパターンが観察されたが、各アッセイ法によって検出されたアディポネクチンのレベルは異なっていた(図14)。したがって、これら3種の異なるアッセイ法は、異なるアディポネクチンアイソフォームを検出することができ、検出されるアディポネクチンタンパク質のレベルはアッセイ法によって異なることから、抗体の異なる組合せによって認識されるアディポネクチン分子にはいくつかの差異があることが示唆される。
【００８４】
mAbアディポネクチンM1を3種の異なるポリクローナル抗体と組み合わせて用いて、分画したヒト血漿試料をアディポネクチンに関して分析した場合、極めて異なるパターンが観察された(図16)。C末端pAbと組み合わせたmAbアディポネクチンM1が、最も高レベルのアディポネクチンを生じた。この形態によって認識されるアディポネクチンは、画分3〜20に広く分布していた。また、球状pAbおよびN末端pAbと組み合わせたmAbアディポネクチンM1の場合も、検出可能なレベルのアディポネクチンが観察された。これらのレベルはずっと低く、いくつかの異なる画分に渡って分布していると思われた。
【００８５】
mAbアディポネクチンM24を3種の異なるポリクローナル抗体と組み合わせて用いて、分画したヒト血漿試料をアディポネクチンに関して分析した場合、極めて異なるパターンが観察された(図17)。C末端pAbと組み合わせたmAbアディポネクチンM24が、最も高レベルのアディポネクチンを生じた。この形態によって認識されるアディポネクチンは、画分3〜20に広く分布していた。また、球状pAbおよびN末端pAbと組み合わせたmAbアディポネクチンM24の場合も、かろうじて検出可能なレベルのアディポネクチンが観察された。これらのレベルはずっと低く、いくつかの異なる画分に渡って分布していると思われた。
【００８６】
アディポネクチンR&Dアッセイ法を用いて、分画したヒト血漿試料をアディポネクチンに関して分析した(図18)。アディポネクチンは、画分3〜20に分布していることが判明し、2つのピークがあり、1つ目は画分5にあり、2つ目は、画分13中のより豊富なピークであった。観察されたパターンは、他のアディポネクチンアッセイ法とは異なっていた。
【００８７】
速度沈降の結果から、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の異なる組合せは、異なる分子量形態のアディポネクチンを認識することがはっきりと実証される。速度沈降によって決定されるように、アディポネクチンのサイズが異なるだけでなく、検出されるアディポネクチンのレベルもまた、大きく異なっている。したがって、異なる抗体組合せは、異なるアディポネクチン分子形態(アイソフォーム)を特異的に認識する異なるアッセイ法形式に相当する。これらのアッセイ法形式が利用できることにより、アディポネクチンアイソフォームが様々な生理的状態または疾患状態と相関するかどうかを評価する機会が与えられる。
【００８８】
正常血漿試料および糖尿病血漿試料のスクリーニング
各アディポネクチンアイソフォームのレベルを、正常者、糖尿病患者、耐糖能障害、および空腹時血糖障害からなる個体の集団において決定した。空腹時血漿試料を採取し、使用前に-80℃で保存した。次いで、試料分取物を試験して、様々なアディポネクチンアイソフォームのレベルを決定した。異なるELISAアッセイ法形式によって決定したアディポネクチンのレベルを空腹時血糖レベルに対してプロットした。これを図19〜24に示す。空腹時血糖レベルに対するアディポネクチンレベルの分布は、異なるアッセイ法において異なる。統計学的解析を下記に示す(表1に要約する)。アディポネクチンアッセイ法のうちいくつかは、アディポネクチンレベルと空腹時血糖の区別をまったく示さない。これらのアッセイ法には、市販のアディポネクチンR&Dアッセイ法(図24)、MAb3604アッセイ法(図19)、およびMAB10651アッセイ法(図21)が含まれる(表1に要約する)。一方、アディポネクチンmAb M1(図22)、アディポネクチンmAb M24(図23)、およびmAb 12820(図20)を用いるアディポネクチンアッセイ法は、空腹時血糖値に対するアディポネクチンレベルの有意な相関を示す(表1に要約する)。
【００８９】
結果の統計学的解析
様々なアディポネクチン形態が対照をII型糖尿病患者と区別する能力を、SAS 9.1 (SAS Institute, Carey, NC)のロジスティック手順を用いたロジスティック回帰モデルによって検査した。各アディポネクチン形態に対して、別々のモデルを実行した。各モデル群において、状態(すなわち、正常または糖尿病)が結果変数としての機能を果たし、予測変数には、アディポネクチン形態のうち1種が含まれた。年齢、肥満度指数(BMI)、およびインスリンは、各モデルにおいて共変量としての機能を果たした。アディポネクチン形態に対する感受性および特異性を、SAS9.1のfreq手順およびロジスティック手順を用いて算出した。受信者動作特性(ROC)プロットを算出して、3種のポリクローナル形態に関してアディポネクチン濃度の様々なカットオフポイントにおける感受性および特異性の変動を示した。曲線下面積(AUC)を、各ROC曲線の要約した統計量として提供する。AUCは、真の症例(すなわちII型糖尿病)が正常な患者から正確に特定される確率と解釈することができる。例えば、1.0のAUCは、誤分類の無い完全な試験を表すのに対し、AUCが0.5未満のアッセイ法は、ランダムな割付と大差ないと思われる。AUCが0.65およびそれ以上のROCプロット、AUCが0.70およびそれ以上のROCプロットを有するアッセイ法がより好ましく、例えば糖尿病(II型)のような調査される疾患状態に対する素因の指標として有意な相関および予測値を示す。これらの異なるアッセイ法すべての結果を表1に要約する。
【００９０】
（表１）II型糖尿病126名および正常対照124名に基づいた、様々なアディポネクチン形態に関するロジスティック回帰および相関の結果。年齢、肥満度指数(BMI)、およびインスリンレベルに関して補正して、別々の回帰モデルを各形態に対して実行した。空腹時血糖に対するその関係の強さを示すピアソン相関係数を各形態に関して示す。
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M1ハイブリドーマとM24ハイブリドーマの差を示す
【００９１】
解析に先立って、データを正規性および異常値の存在に関してスクリーニングした。正規性仮定、したがって変換無しに一致したデータを適用した。Grubbの試験を用いて、異常値の存在に関して試験し、p<0.05で有意な異常値であると判定されたデータポイントは解析の前に除いた。
【００９２】
集団試料の特徴は以下のとおりである:N=126のII型糖尿病患者(T2D)およびN=124の正常個体を検査した。この試料においてT2Dに関して使用した診断基準は、空腹時血糖(FBG)>126であった。
【００９３】
M1球状型のロジスティック回帰の結果から、球状型がグループの状態の有意な予測因子であったことが示される(Wald Chi 2乗=7.26; p<0.01)。球状型のオッズ比(OR=0.84、95％信頼区間、0.74〜0.95)は、1より有意に小さく、低レベルのM1球状型がII型糖尿病のリスクと関連していることが示唆された(図25)。図25のROC曲線は、球状濃度カットオフ値3.0μg/ml、4.0μg/ml、および5.0μg/mlにおける感受性および特異性を示す。M1球状型の曲線下面積は0.731であった。
【００９４】
M1 N末端型のロジスティック回帰の結果から、N末端型がグループの状態の有意な予測因子であったことが示される(Wald Chi 2乗=6.01;p<0.01)。球状型のオッズ比(OR=0.53、95％信頼区間、0.32〜0.88)は、1より有意に小さく、低レベルのM1 N末端型がII型糖尿病のリスクと関連していることが示唆された(図26)。図26のROC曲線は、N末端濃度カットオフ値0.8μg/mlおよび1.0μg/mlにおける感受性および特異性を示す。N末端型の曲線下面積は0.705であった。
【００９５】
M24球状型のロジスティック回帰の結果から、球状型がグループの状態の有意な予測因子であったことが示される(Wald Chi2乗=11.9; p<0.0005)。球状型のオッズ比(OR=0.47、95％信頼区間、0.30〜0.72)は、1より有意に小さく、低レベルのM24球状型がII型糖尿病のリスクと関連していることが示唆された(図27)。図27のROC曲線は、球状濃度カットオフ値1.2μg/mlおよび1.5μg/mlにおける感受性および特異性を示す。M1球状型の曲線下面積は0.742であった。
【００９６】
M24 C末端型のロジスティック回帰の結果から、C末端型がグループの状態の有意な予測因子であったことが示される(Wald Chi2乗=15.9; p<0.0001)。C末端型のオッズ比(OR=0.87、95％信頼区間、0.80〜0.92)は、1より有意に小さく、低レベルのM24 C末端型がII型糖尿病のリスクと関連していることが示唆された(図28)。図28のROC曲線は、C末端濃度カットオフ値10.0μg/mlおよび15.0μg/mlにおける感受性および特異性を示す。M24 C末端型の曲線下面積は0.740であった。
【００９７】
A12820球状型のロジスティック回帰の結果から、A12820球状型がグループの状態の有意な予測因子であったことが示される(Wald Chi 2乗=15.9;p<0.0001)。A12820球状型のオッズ比(OR=0.87、95％信頼区間、0.80〜0.92)は、1より有意に小さく、低レベルがII型糖尿病のリスクと関連していることが示唆された(図29)。図29のROC曲線は、A12820球状型濃度カットオフ値3.0μg/ml、4.0μg/ml、および5.0μg/mlにおける感受性および特異性を示す。M1球状型の曲線下面積は0.714であった。
【００９８】
A12820 N末端型のロジスティック回帰の結果から、A12820 N末端型がグループの状態の有意な予測因子であったことが示される(Wald Chi 2乗=5.18;p=0.02)。A12820 N末端型のオッズ比(OR=0.97、95％信頼区間、0.95〜0.99)は、1より有意に小さく、低レベルがII型糖尿病のリスクと関連していることが示唆された(図30)。図30のROC曲線は、A12820 N末端型濃度カットオフ値11.0μg/mlおよび16.0μg/mlにおける感受性および特異性を示す。M1 N末端型の曲線下面積は0.673であった。
【００９９】
A12820 C末端型に関するロジスティック回帰の結果。A12820 C末端型は、グループの状態の有意な予測因子であった(Wald Chi 2乗=4.91;p=0.03)。A12820 C末端型のオッズ比(OR=0.97、95％信頼区間、0.93〜0.99)は、1より有意に小さく、低レベルがII型糖尿病のリスクと関連していることが示唆された(図31)。図31のROC曲線は、A12820 C末端型濃度カットオフ値12.0μg/mlおよび15.0μg/mlにおける感受性および特異性を示す。M1球状型の曲線下面積は0.663であった。
【０１００】
残りのアッセイ法の統計学的解析は表1に要約する。これらは、実施した解析から有意性を示さないようである。
【０１０１】
ハイブリドーマ細胞株M1およびM24のCDRの配列決定
mAbアディポネクチンM1およびM24 IgG cDNAのCDRの配列を決定した。これを図32および33に示す。これら2つのIgGの配列は非常に類似しているが、異なる。これらのIgGタンパク質の両方とも、アミノ酸19〜34
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を含むN末端アディポネクチン領域に結合する。
【０１０２】
考察
アディポネクチンを認識するELISAアッセイ法
アディポネクチンを認識するELISAアッセイ法を開発した。異なるモノクローナル抗体を捕獲抗体として使用し、3種の異なるポリクローナル抗体と組み合わせた。たいていの場合、抗体組合せはアディポネクチンを認識することができたが、一部の組合せはアディポネクチンを検出することができなかった(MAB3604 C末端)。これらのアッセイ法はすべて、組換え型のアディポネクチンを用いることによって標準化することができた。標準化により、血漿のような生物試料中に存在するアディポネクチのレベルを決定するための基本原理が提供された。次いで、ELISAアッセイ法を用いて、アディポネクチンレベルを測定し、アディポネクチン分子形態のサイズ分布を決定し、かつ、特定のアディポネクチンアイソフォームの濃度が特定の生理的状態と相関するかどうかを決定することができた。本発明のアッセイ法は測定する前にいかなる試料前処理も試料の変性も必要としないことに注目することが重要である。したがって、これらのアッセイ法では、天然型のアディポネクチンを測定する。
【０１０３】
異なるアディポネクチン分子形態
異なるアディポネクチン分子形態が様々なELISAアッセイ法によって認識されることを実証するために、速度沈降によってヒト血漿を分画し、異なるELISAアッセイ法を用いて、それらの画分をアディポネクチンレベルに関して分析した。図13〜18において、アディポネクチンレベルの分布が、使用されるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の組合せによって有意に異なることがはっきりと実証される。これらのアッセイ法のいくつかでは、低分子量のアディポネクチン形態しか認識されない(図13、画分4、5、6)。他のアッセイ法では、アディポネクチン高分子量型しか認識されない(図15、画分11〜14)。最後に、これらのアッセイ法のいくつかは、アディポネクチンの高分子量型および低分子量型の両方を認識する(図14、16、17)。これらのアッセイ法は、速度沈降プロファイルによって示されるように、異なるサイズのアディポネクチンを認識するだけでなく(図13〜18)、これらのアッセイ法のうちいくつか(図14、15、16、17)は、異なるレベルのアディポネクチンも認識することから、異なるアッセイ法によって認識されるアディポネクチン分子のタイプには独特の差異があることがさらに示唆される。これらのアッセイ法が異なるアディポネクチン分子量形態を認識することから、個体間のアディポネクチンの差異を評価し、かつアディポネクチン形態のいずれかが疾患状態と相関するかどうかを決定するための強力で単純な手法が提供される。
【０１０４】
アディポネクチン形態のレベルは個体間で異なる
異なるアッセイ法を用いて、異なる個体中のアディポネクチンレベルを決定した場合、観察されるアディポネクチンレベルに有意な差があった。アッセイ法のいくつかでは、アディポネクチンレベルは10〜50倍異なる。これらの結果から、いくつかのアディポネクチンアッセイ法は、ヒト血漿または血清中に存在するアディポネクチンアイソフォームの大半を測定できるものの、他のアッセイ法は、極めて特定のアディポネクチンアイソフォームを測定することが示唆される。例えば、球状ドメインpAbと組み合わせたmAb 12820は、30〜120μg/mlのアディポネクチンを検出する。一方、N末端ポリクローナル抗体と組み合わせたmAbアディポネクチンM24は、0.02〜0.1μg/mlのみを検出する。この差は、ヒト血漿において検出されるアディポネクチンレベルにおいて約1000倍の差に相当する。これらの差は、分画したヒト血漿においてアディポネクチンレベルを決定した図13〜18において明らかである。また、これらの差は、図19〜24でも観察される。これらの差の一部は、表現型に対する相関の点で有意である(表1に要約する)が、他のものは有意ではない。多種多様の疾患状態から血漿試料を特徴付ける能力は、有意な相関関係を提供する。
【０１０５】
ある種のアディポネクチン形態はグルコースレベルと相関関係を示す
異なるアディポネクチンアッセイ法のすべてを用いてヒト血漿試料コレクションをスクリーニングして、グルコースに対する相関関係を調べた。本発明者らは、ある種のアディポネクチンアイソフォームが、グルコースに対して中程度の強さの相関関係を示すことを観察した。グルコースに対して有意な相関関係を示すアッセイ法は、mAbアディポネクチンM1球状およびN末端(図22、25、26)、mAbアディポネクチンM24球状およびC末端(図23、27、28)、mAb A12820球状、N末端、およびC末端(図20、29、30、31)、ならびにMAB1051 N末端およびC末端である(表1に要約する)。R&Dから市販されているアディポネクチンアッセイ法を含む他のアッセイ法のどれも、グルコースに対する有意な関連をまったく示さない。
【０１０６】
ある種のアディポネクチン形態は、糖尿病状態を予測する
低アディポネクチンレベルのmAbアディポネクチンM1球状およびN末端(図25、26)、mAbアディポネクチンM24球状およびC末端(図27、28)、ならびにmAb 12820球状(図29)は、糖尿病の有意な予測因子である(表1に要約する)。この観察結果から、これらのアッセイ法が、どの正常個体が糖尿病になるか、どの個体が個々の糖尿病治療に対して最良の応答を示すか、およびどの個体が糖尿病の最良の予後を示すかを確認するために興味深いことが示唆される。ROCプロットから、特定の形態が、診療所において有用となるのに十分なレベルの特異性および感受性を有することが示される。具体的には、60％またはそれ以上の感受性/特異性のレベルが、診療所において有用であり得る。疾患の進行および治療の成果に対する相関関係を決定するために、さらなる予測値を得るためにこれらのアッセイ法を使用できるかどうかは、長期的な試料の採取に依存する。
【０１０７】
本発明のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、本発明のELISA法、および糖尿病のような特定の疾患状態のアディポネクチン形態/レベルに対する断定的(predicative)/診断的方法を例示する上記の実施例は、本発明の範囲を制限することを意図しない。これらの実施例は、例示のために含まれ、本発明は、本明細書における特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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