(57)【要約】  単球をトランスフェクションするための方法および組成物、ならびに療法目的のためのこれらの使用を記載する。該組成物は、核酸構成要素、リソソーム回避構成要素および貪食されうる消化可能粒子で構成される。好ましくは、単球はマクロファージであり、そして消化可能粒子は天然供給源由来、例えば微生物供給源由来である。より好ましくは、消化可能粒子はザイモサンなどの酵母細胞壁粒子である。組成物自体、または該組成物で前処理した細胞は、すべての遺伝子医学適用、例えば遺伝子治療、遺伝子ワクチン接種、癌治療、ならびに免疫調節および組織修復に有用である。
2010524507.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）核酸構成要素、（ｉｉ）リソソーム回避構成要素、および（ｉｉｉ）貪食されうる消化可能粒子を含む組成物と、単球を接触させる工程を含む、単球性細胞内への指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）進入のための方法。
【請求項２】
貪食されうる消化可能粒子が、天然供給源に由来する、請求項１の方法。
【請求項３】
貪食されうる消化可能粒子が、微生物起源のものである、請求項２の方法。
【請求項４】
貪食されうる消化可能粒子が、酵母細胞壁粒子である、請求項２の方法。
【請求項５】
単球性細胞がマクロファージである、請求項１の方法。
【請求項６】
単球性細胞が樹状細胞である、請求項１の方法。
【請求項７】
核酸がＤＮＡおよびＲＮＡからなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項８】
核酸が発現ベクター中にコードされる、請求項１の方法。
【請求項９】
発現ベクターが核プロモーターを含有する、請求項５の方法。
【請求項１０】
プロモーターが低酸素誘導性プロモーターである、請求項６の方法。
【請求項１１】
核酸がタンパク質またはＲＮＡｉ構築物をコードする、請求項１の方法。
【請求項１２】
タンパク質が抗原である、請求項８の方法。
【請求項１３】
リソソーム回避構成要素が非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性構成要素である、請求項１の方法。
【請求項１４】
ウイルスがアデノウイルスである、請求項１０の方法。
【請求項１５】
ウイルスが非複製性である、請求項１０の方法。
【請求項１６】
リソソーム回避構成要素が生体模倣ポリマーである、請求項１０の方法。
【請求項１７】
消化可能粒子が約０．０５ミクロン〜約５．０μｍの間のサイズを有する、請求項１の方法。
【請求項１８】
消化可能粒子が約１．０ミクロン〜約２．５μｍの間のサイズを有する、請求項１の方法。
【請求項１９】
酵母細胞壁粒子がザイモサンである、請求項４の方法。
【請求項２０】
核酸保護構成要素をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項２１】
構成要素が、プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ヒストン、ヒストン様タンパク質、合成ポリカチオン性ポリマー、およびＲＮＡ配列中に含まれる適切なパッケージング配列を含むレトロウイルスのコア粒子からなる群より選択される、請求項１７の方法。
【請求項２２】
前記核酸およびリソソーム回避構成要素が、抗体付着によって粒子に付着する、請求項１の方法。
【請求項２３】
核酸および前記リソソーム回避構成要素が、（ストレプト）アビジンおよびビオチンの間の相互作用によって粒子に付着する、請求項１の方法。
【請求項２４】
核酸に結合する多重結合性ビヒクルをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項２５】
リソソーム回避構成要素がアデノウイルス・ペントン・タンパク質である、請求項１の方法。
【請求項２６】
構成要素が、薬学的に適切な賦形剤を含む薬学的組成物である、請求項１の方法。
【請求項２７】
核酸が抗原をコードする、請求項２３の方法。
【請求項２８】
（ｉ）核酸構成要素、（ｉｉ）リソソーム回避構成要素、および（ｉｉｉ）貪食されうる消化可能粒子を含む、組成物。
【請求項２９】
貪食されうる消化可能粒子が、天然供給源に由来する、請求項２５の組成物。
【請求項３０】
貪食されうる消化可能粒子が、微生物起源のものである、請求項２５の組成物。
【請求項３１】
貪食されうる消化可能粒子が、酵母細胞壁粒子である、請求項２５の組成物。
【請求項３２】
単球性細胞がマクロファージである、請求項２５の組成物。
【請求項３３】
単球性細胞が樹状細胞である、請求項２５の組成物。
【請求項３４】
核酸がＤＮＡおよびＲＮＡからなる群より選択される、請求項２５の組成物。
【請求項３５】
核酸が発現ベクター中にコードされる、請求項２５の組成物。
【請求項３６】
発現ベクターが核プロモーターを含有する、請求項２９の組成物。
【請求項３７】
プロモーターが低酸素誘導性プロモーターである、請求項３０の組成物。
【請求項３８】
核酸がタンパク質またはＲＮＡｉ構築物をコードする、請求項２５の組成物。
【請求項３９】
タンパク質が抗原である、請求項３２の組成物。
【請求項４０】
リソソーム回避構成要素が非感染性ウイルスまたはウイルスの非感染性構成要素である、請求項２５の組成物。
【請求項４１】
ウイルスがアデノウイルスである、請求項３４の組成物。
【請求項４２】
ウイルスが非複製性である、請求項３４の組成物。
【請求項４３】
リソソーム回避構成要素が生体模倣ポリマーである、請求項３４の組成物。
【請求項４４】
消化可能粒子が約０．０５ミクロン〜約５．０μｍの間のサイズを有する、請求項２５の組成物。
【請求項４５】
消化可能粒子が約１．０ミクロン〜約２．５μｍの間のサイズを有する、請求項２５の組成物。
【請求項４６】
酵母細胞壁粒子がザイモサンである、請求項３１の組成物。
【請求項４７】
核酸保護構成要素をさらに含む、請求項２５の組成物。
【請求項４８】
構成要素が、プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ヒストン、ヒストン様タンパク質、合成ポリカチオン性ポリマー、およびＲＮＡ配列中に含まれる適切なパッケージング配列を含むレトロウイルスのコア粒子からなる群より選択される、請求項４１の組成物。
【請求項４９】
前記核酸およびリソソーム回避構成要素が、抗体付着によって粒子に付着する、請求項２５の方法。
【請求項５０】
核酸および前記リソソーム回避構成要素が、（ストレプト）アビジンおよびビオチンの間の相互作用によって粒子に付着する、請求項２５の方法。
【請求項５１】
核酸に結合する多重結合性ビヒクルをさらに含む、請求項２５の方法。
【請求項５２】
リソソーム回避構成要素がアデノウイルス・ペントン・タンパク質である、請求項２５の方法。
【請求項５３】
薬学的に適切な賦形剤を含む、薬学的組成物である、請求項２５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願に対するクロス−リファレンス
本出願は、本明細書にその全体が援用される、２００７年４月２５日出願の米国仮出願第６０／９０７，９７７号および２００７年６月４日出願の米国仮出願第６０／９２４，８６８号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、単球をトランスフェクションするための方法およびその療法的使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
単球性細胞は、免疫応答において中心的な役割を果たす。これらは、マクロファージおよび樹状細胞、すなわち体の主な抗原提示細胞に成熟する。さらに、腫瘍が増殖するにつれて、腫瘍は、血管形成プロセスの一部として、単球性細胞を腫瘍に引き寄せるマクロファージ誘因ケモカインを産生する。したがって、単球性細胞が特異的に標的化された場合、その単球性細胞を用いて、療法的遺伝子産物を腫瘍細胞に送達するか、あるいは優れた抗原提示特性を通じて、療法的または予防的免疫応答を生成することも可能である。
【０００４】
単球由来細胞は、通常、外来の（ｆｏｒｅｉｇｎ）非自己構造、典型的には微生物を探し求めて、体をパトロールする。単球性細胞は、微生物を貪食し、微生物は次いで、リソソーム中で、より小さい抗原性部分に消化される。生じた抗原は、細胞性免疫系および体液性免疫系に提示するため、表面に循環して戻される。
【０００５】
マクロファージは単球性細胞から生じる組織内の細胞である。これらは病原体に対する宿主中の非特異的および特異的防御の両方において、重要な役割を果たすため、特に興味深い。最近、マクロファージがまた、宿主における支持的再構築機能も有することが見出されてきている。例えばＳｃｈｗａｒｔｚら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，  ２３：３６０−３７０，  ２００６）は、活性化マクロファージを局所的に移植すると、損傷を受けた脊髄の機能回復が促進されることを立証している。中枢神経系（ＣＮＳ）傷害に対する最初のミクログリア応答は、ＣＮＳがこれを許容する容量を超えていると考えられる。したがって、活性化マクロファージの局所注射によるなどの免疫に基づく介入は、急性脊髄傷害（ＳＣＩ）後の神経学的損傷を最小限にすることが証明されている。
【０００６】
本明細書に特に援用されるＷａｇｎｅｒらに対する米国特許第６，８７５，６１２号は、療法的遺伝子産物の腫瘍細胞への送達のための、単球性細胞内へのビーズベクターの指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）進入を記載する。しかし、’６１２特許は、ザイモサンなどの酵母細胞壁粒子を使用して、単球性起源の細胞内へ核酸の進入を導くことを記載しない。
【０００７】
ザイモサンは、酵母細胞壁の不溶性多糖構成要素である。先の刊行物は、ザイモサンの（ｉ）サイトカインまたは炎症促進性サイトカインの放出の誘導、（ｉｉ）タンパク質リン酸化およびイノシトールリン酸形成の誘導、（ｉｉｉ）アラキドン酸の動員、（ｉｖ）補体第二経路（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ）の活性化；および（ｖ）マクロファージ活性化におけるサイクリンＤ２の役割を示唆する、サイクリンＤ２レベルの上昇における関与を明らかにした（Ｍｉｙａｓａｔｏら，  Ｉｎｔ．  Ａｒｃｈ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０４：２４−２６，  １９９４）。例えば、ザイモサン粒子は、Ｔｏｌｌ様受容体、例えばＴＬＲ２およびＴＬＲ６、ならびにβ−グルカンに結合する受容体であり、そしてマクロファージ貪食に重要であるデクチン−１を通じて、マクロファージにおいて炎症性シグナルを誘導可能である。ザイモサンはまた、マクロファージにおけるＴＮＦ−α産生およびＮＦ−κＢ活性化などの炎症性応答の誘導にも関与する（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ９：１７６−１８０，  ２００３；  Ｓａｔｏら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７１：４１７−４２５，  ２００３；  Ｄｉｌｌｏｎら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１６：９１６−９２８，  ２００６）。
【０００８】
本発明者らは、驚くべきことに、マクロファージが、消化不能粒子または強磁性体ビーズなどの非天然供給源から作製された粒子を含む組成物よりも、酵母細胞壁粒子などの消化可能粒子に付着した核酸構成要素を含む組成物の貪食をよりよく許容しうることを発見した。したがって、本発明は、遺伝子送達のためにマクロファージを用いる先行技術の戦略に勝る改善である。「よりよい許容」は、代謝および生存性を検出する多様なアッセイによって、定量化可能である。例えば、粒子状ベクター取り込み後のマクロファージ生存および活力を、テトラゾリウム色素（ＭＴＴ染色）で監視可能であり、そしてトリパンブルー排除アッセイで細胞死を評価する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，８７５，６１２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｃｈｗａｒｔｚら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，  ２３：３６０−３７０，  ２００６）
【非特許文献２】Ｍｉｙａｓａｔｏら，  Ｉｎｔ．  Ａｒｃｈ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０４：２４−２６，  １９９４
【非特許文献３】Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ９：１７６−１８０，  ２００３
【非特許文献４】Ｓａｔｏら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７１：４１７−４２５，  ２００３
【非特許文献５】Ｄｉｌｌｏｎら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１６：９１６−９２８，  ２００６
【発明の概要】
【００１１】
第一の側面において、本発明は、単球内への指向性進入のための組成物を提供する。該組成物は、（ｉ）核酸構成要素、（ｉｉ）リソソーム回避構成要素、および（ｉｉｉ）貪食されうる消化可能粒子を含む。１つの態様において、核酸構成要素は、タンパク質をコードする核酸を含有する、ウイルスの非複製性および／または非感染性型を含有する。ウイルスの非複製性および／または非感染性型は、リソソーム回避構成要素として作用可能であり、そしてしたがって、第二のさらなるリソソーム回避構成要素は選択自由である。
【００１２】
いくつかの態様において、核酸構成要素は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。１つの態様において、核酸は、抗原または他の療法タンパク質などのタンパク質あるいはＲＮＡｉ構築物をコードしてもよい。別の態様において、核酸構成要素は、ＣＭＶプロモーターまたは低酸素誘導性プロモーターなどの核プロモーターを含有する発現ベクター中にコードされる核酸を含む。さらに別の態様において、核酸は、Ｔ７ベクター系などの細胞質ベクター中にコードされてもよい。
【００１３】
他の態様において、リソソーム回避構成要素は、ウイルスまたはウイルス構成要素、例えばアデノウイルスまたはアデノウイルス・ペントン・タンパク質であってもよい。
特定の態様において、貪食されうる粒子は、消化可能なものであり、そして単球性細胞が典型的に取り込む微生物構造のサイズに近い。１つの態様において、粒子は、約０．０５〜約５．０μｍ、約０．０５〜約２．５μｍ、約０．１〜約２．５μｍ、約１．０〜約２．５μｍ、約１．０〜約２．０μｍ、または約１．０〜約１．５μｍであろう。用語「約」は、この文脈において、＋／−０．２５μｍを指す。好ましくは、粒子は、微生物粒子状構造などの天然供給源に由来する。例えば、貪食されうる粒子は、ザイモサンなどの酵母細胞壁粒子、あるいはグラム陽性細菌由来のベータ・グルカンまたはペプチドグリカンである。しかし、他の貪食されうる適切な粒子には、アガロースおよびイヌリンが含まれる。
【００１４】
いくつかの態様において、組成物は、プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ヒストン、ヒストン様タンパク質、合成ポリカチオン性ポリマー、またはＲＮＡ配列中に含まれる適切なパッケージング配列を含むレトロウイルスのコア・タンパク質などの核酸保護構成要素をさらに含有してもよい。
【００１５】
構成要素は、付着を可能にする任意の手段によって、消化可能粒子に付着していてもよい。１つの態様において、核酸およびリソソーム回避構成要素は、抗体付着によって粒子に付着する。別の態様において、核酸およびリソソーム回避構成要素は、（ストレプト）アビジンおよびビオチンの間の相互作用によって粒子に付着する。さらに別の態様において、核酸は、多重結合性ビヒクルとして働く。
【００１６】
関連する側面において、本発明は、単球をトランスフェクションするための方法を提供する。該方法は、樹状細胞またはマクロファージなどの単球性細胞を、上述の組成物と接触させる工程を含む。
【００１７】
別の側面において、本発明は、樹状細胞またはマクロファージなどの単球と、上述の組成物を接触させることによる、単球性細胞内への生物学的物質の標的化送達法を提供する。
【００１８】
さらに別の側面において、本発明は、上述の組成物を必要とする個人にそれを投与する工程を含む遺伝子治療法であって、核酸構成要素が、抗腫瘍タンパク質などの療法タンパク質をコードする、前記方法を提供する。本発明は、上述の組成物を必要とする個人にそれを投与する工程を含む遺伝子ワクチン接種法であって、核酸が、アレルゲン、ウイルス抗原、細菌抗原または寄生虫由来抗原などの抗原をコードする、前記方法を提供する。本発明はまた、上述の組成物を必要とする個人にそれを投与する工程を含む癌治療法であって、核酸が、抗血管形成因子、免疫調節剤または抗炎症因子などの抗腫瘍遺伝子である、前記方法も提供する。
【００１９】
さらなる側面において、本発明は、上述の組成物を必要とする個人にそれを投与する工程を含む、脊髄修復などの組織修復法一般を提供する。本発明はまた、免疫調節法も提供する。例えば、関節内への直接注射による関節リウマチのような慢性炎症疾患、および自己免疫炎症の他の形を治療することもまた、本発明によって意図される。
【００２０】
上述の方法において、組成物を静脈内投与または皮下投与してもよい。例えば、単球性細胞を粒子コンジュゲート化ウイルス（例えばザイモサン−コンジュゲート化ウイルス）でｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクションし、そして次いで患者に静脈内再注入してもよい。この投与様式は、腫瘍を標的化するのに最も適している可能性もある。あるいは、直接注射または顕微手術技術のいずれかによって、局所的に適用することにより、粒子コンジュゲート化ウイルスを投与してもよい。この投与法は、脊髄修復に、または関節リウマチを治療するのに、最適である可能性もある。当業者は、所定の状態を治療するために、どの投与様式が適しているかを知っているであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合されたＩκβ遺伝子のｓｉＲＮＡを含有するアデノウイルス・ベクターである。
【図２】図２は、ＩκＢのＧＦＰ−ＲＮＡｉ構築物（ＭＢ−ＧＦＰ−ＲＮＡｉおよびＺ−ＧＦＰ−ＲＮＡｉ）を飲み込んだマクロファージの写真である。（Ａ）ビオチン化ＧＦＰ−ＲＮＡｉアデノウイルス・ベクターに付着したストレプトアビジン・コーティング磁気ビーズ（「ＭＢ」）または（Ｂ）ＧＦＰ−ＲＮＡｉアデノウイルス・ベクターに付着したザイモサン（「Ｚ」）粒子。
【図３】図３は、ザイモサン−コンジュゲート化Ａｄベクターでトランスフェクションされたマクロファージの培地の細胞傷害活性を示す。これらの細胞の培地を４８時間後に収集し、濃縮し、そして抗腫瘍活性に関して試験した。これらのデータは、ザイモサン−コンジュゲート化ｓｉＲＮＡベクターによるマクロファージのトランスフェクションおよび活性化が成功したことを立証する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
序論
本発明は、単球性細胞をトランスフェクションするための組成物、およびその関連法を提供する。本発明にしたがった、単球性細胞をトランスフェクションするための組成物は、一般的に、貪食されうる消化可能粒子およびリソソーム回避構成要素に付着した核酸構成要素で構成される。１つの態様において、貪食されうる消化可能粒子は、天然供給源由来の、好ましくは微生物起源の粒子であり、そして最も好ましくは酵母細胞壁粒子である。本発明の組成物はまた、本明細書において、「消化可能粒子含有組成物」とも称される。
【００２３】
１つの態様において、核酸構成要素はまた、リソソーム回避構成要素であってもよい。本発明の組成物は、樹状細胞およびマクロファージなどの単球性起源の細胞を誘引し、これによって、組成物は、遺伝子ワクチン接種、遺伝子治療および癌治療などの遺伝子医学法に非常に有用となる。
【００２４】
単球は、微生物などの粒子状構造を取り込む貪食性免疫細胞である。本発明は、この特性を利用して、微生物のように「見える」支持体上に、ベクターを提供する。
消化可能粒子
消化可能粒子に好ましいサイズは、単球性細胞が典型的に取り込む微生物構造のサイズに近いものである。１つの態様において、粒子は、約０．０５〜約５．０μｍ、約０．０５〜約２．５μｍ、約０．１〜約２．５μｍ、約１．０〜約２．５μｍ、約１．０〜約２．０μｍ、または約１．０〜約１．５μｍであろう。用語「約」は、この文脈において、＋／−０．２５μｍを指す。好ましくは、消化可能粒子は、微生物起源の粒子などの天然供給源に由来する粒子である。特に好ましい粒子は酵母細胞壁粒子である。１つの態様において、酵母細胞壁粒子はザイモサン粒子である。ザイモサン（ザイモサンＡとも称される）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどの多様な企業から商業的に入手可能である。ザイモサンの粒子サイズは、典型的には約２．０μｍである。
【００２５】
他方で、製造目的のためには、わずかにより大きい粒子が好ましく、これはこれらが互いにくっつく可能性がより低く、そしてしたがってより大きい粒子サイズでは、結合した構成要素から離れるように洗浄するのがより容易であるためである。
【００２６】
消化可能粒子は、形状または材料によって限定されない。一般的に、粒子は、消化可能粒子含有組成物が、樹状細胞およびマクロファージなどの単球によって貪食されることが可能になる、任意の形状、サイズまたは材料のものであってもよい。
【００２７】
驚くべきことに、本発明者らは、貪食された消化可能粒子が、貪食された合成ビーズよりも、マクロファージによりよく許容されるようであることを発見した。実際、図２に示すように、ＡＤ−ＧＦＰベクターに付着したザイモサン粒子を飲み込んだマクロファージは、ビオチン化ＡＤ−ＧＦＰベクターに付着したストレプトアビジン−コーティング磁気ビーズを飲み込んだマクロファージより、より天然の外見を有する。
【００２８】
核酸構成要素
本発明の消化可能粒子は、一般的に、核酸構成要素に付着する。核酸構成要素は、タンパク質またはＲＮＡｉ構築物をコードする核酸を含み、そしてＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡ両方で構成されてもよい。核酸構成要素はまた、核酸を含有するベクターを含んでもよい。構成要素は、典型的には、翻訳および／または転写に必要なシグナルを含有する（すなわち、最終的に、タンパク質またはＲＮＡ産物をコードしてもよい）。
【００２９】
当業者は、核酸によってコードされてもよい多数のタンパク質を直ちに理解するであろう。典型的には、これらは抗原または抗腫瘍タンパク質、例えば抗血管形成タンパク質およびインターロイキンであろう。タンパク質は、マクロファージによって、主に腫瘍のごく近傍に局在するであろう。
【００３０】
ワクチン適用で有用な例示的抗原には、アレルゲン、ウイルス抗原、細菌抗原および寄生虫由来抗原が含まれる。好ましい抗原には、腫瘍関連抗原が含まれ、これらは当業者によく知られている（例えば、癌胎児抗原、前立腺特異的膜抗原、黒色腫抗原、腺癌抗原、白血病抗原、リンパ腫抗原、肉腫抗原、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＲＴ−１、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｐ５３、ｇｐ１００、結腸癌関連抗原、乳癌関連抗原、Ｍｕｃ１、Ｔｒｐ−２、テロメラーゼ、ＰＳＡおよび腎癌関連抗原）。ウイルス抗原もまた好ましい。適切なウイルス抗原には、ＨＩＶ、ＥＢＶおよびヘルペスウイルスが含まれる。１つの態様において、核酸は、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ免疫原性を改善するのに有用な構築物として同定されている、直鎖ｇｐ４１エピトープ挿入物（ＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬ）をコードする（Ｌｉａｎｇら，  Ｖａｃｃｉｎｅ，  １６；１７（２２）：２８６２−７２，  １９９９年７月）。
【００３１】
上に提供するように、核酸は、好ましくは、核酸のタンパク質産物を発現可能な発現ベクター中にコードされる。ベクターは、典型的には、例えば、コード配列に機能可能であるように連結されたプロモーターを含む、制御配列をさらに含む。ベクターは、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細菌または細胞培養系での増殖のための、選択可能マーカー配列をさらに含んでもよい。好ましい発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、そしてまた任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５’隣接非転写配列を含む。ＳＶ４０またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位を用いて、必要な非転写遺伝子要素を提供してもよい。
【００３２】
挿入された標的遺伝子コード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルもまた、必要でありうる。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。核酸構成要素がそれ自体の開始コドンを含み、そして隣接配列が適切な発現ベクター内に挿入されている場合、さらなる翻訳調節シグナルは必要でない可能性もある。しかし、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部しか用いられない場合には、おそらくＡＴＧ開始コドンを含む、外因性翻訳調節シグナルが提供されなければならない。さらに、全標的の翻訳を確実にするために、開始コドンは、所望のコード配列のリーディングフレームと同調していなければならない。
【００３３】
これらの外因性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然および合成両方の多様な起源のものであってもよい。発現効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写終結因子などの包含によって増進可能である（Ｂｉｔｔｎｅｒら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５３：５１６−５４４（１９８７）を参照されたい）。いくつかの適切な発現ベクターが、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（１９８９）中に記載され、該文献の開示は、本明細書に参照として援用される。望ましい場合、発現を増進し、そして適切なタンパク質フォールディングを促進するため、Ｈａｔｆｉｅｌｄら、米国特許第５，０８２，７６７号に説明されるように、配列のコドン背景（ｃｏｄｏｎ  ｃｏｎｔｅｘｔ）およびコドン対形成を最適にしてもよい。
【００３４】
プロモーターには、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウス・メタロチオネイン−Ｉが含まれる。好ましいプロモーターは、標的特異的なもの、すなわち治療のため標的とされる特異的領域において特定の遺伝子の発現を可能にするプロモーターである。例えば、腫瘍細胞を標的化する際に本発明で使用するのに適したプロモーターは、低酸素誘導性プロモーターであろう。
【００３５】
例示的なベクターには、ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。選択可能マーカーには、ＣＡＴ（クロラムフェニコール・トランスフェラーゼ）が含まれる。好ましいベクターにはまた、Ｔ７ベクター系のような細胞質ベクターも含まれる。Ｗａｇｎｅｒら、米国特許第５，５９１，６０１号（１９９７年１月７日）を参照されたい。
【００３６】
リソソーム回避構成要素
核酸構成要素に加えて、酵母細胞壁粒子はまた、一般的に、リソソーム回避構成要素を付着させる。リソソーム回避構成要素の役割は、核酸構成要素がリソソームの過酷な環境を逃れるのを補助することである。本明細書に開示するものとは別に、当業者は、こうした分子の多くの例に気づくであろう。
【００３７】
単球性細胞が巨大抗原を取り込むと、抗原を飲み込む食胞（ファゴソーム）が形成される。次に、単球に含有される特殊化リソソームが、新たに形成されたファゴソームと融合する。融合すると、貪食された巨大抗原は、いくつかの非常に反応性の分子とともに、リソソーム・ヒドロラーゼの濃縮混合物に曝露される。これらの非常に反応性である分子およびリソソーム・ヒドロラーゼは、ファゴソームの内容物を消化する。したがって、粒子にリソソーム回避構成要素を付着させることによって、粒子にやはり付着した核酸は、リソソーム中の物質による消化を逃れ、そして単球細胞質に無傷で（ｉｎｔａｃｔ）進入する。先行技術の系は、この特徴の重要性を認識することができず、そしてしたがって、本発明よりもはるかに低いレベルの発現しか得られなかった。Ｆａｌｏら、ＷＯ  ９７／１１６０５（１９９７）を参照されたい。用語「リソソーム回避構成要素」が、上述の融合リソソーム／ファゴソームを含むことに注目すべきである。
【００３８】
リソソーム回避構成要素は、リソソームを回避するかまたは破壊することが可能な任意の構成要素である。例えば、リソソーム回避構成要素には、タンパク質、炭水化物、脂質、脂肪酸、生体模倣ポリマー、微生物およびそれらの組み合わせが含まれてもよい。用語「タンパク質」は、任意の数のアミノ酸を含むポリマー性分子を含むことが注目される。したがって、当業者であれば、「タンパク質」がペプチドを含み、ペプチドは一般的に「短い」タンパク質であると理解されることを知っている。好ましいリソソーム回避構成要素には、タンパク質、ウイルスまたはウイルスの部分が含まれる。例えば、アデノウイルス・ペントン・タンパク質は、ウイルスがリソソーム／ファゴソームを回避／破壊するのを可能にする周知の複合体である。したがって、損なわれていないアデノウイルスまたは単離されたペントン・タンパク質、またはそれらの部分のいずれか（例えば、Ｂａｌら，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６７：６０７４−８１（２０００））を、リソソーム回避構成要素として利用してもよい。インフルエンザウイルス赤血球凝集素サブユニットＨＡ−２のＮ末端配列由来の融合ペプチド（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）もまた、リソソーム回避構成要素として使用可能である（Ｗａｇｎｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：７９３４−７９３８，  １９９２）。
【００３９】
他の好ましいリソソーム回避構成要素には、関心対象のプラスミドを含有するコンジュゲートのエンドソーム放出の増進によって、細胞トランスフェクション効率を増進することが示されてきている、ポリ（２−プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡｃ）などの生体模倣ポリマーが含まれる（Ｌａｃｋｅｙら，  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ：  Ｔｈｅ  Ｔｈｉｒｄ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．  ３３，  ２０００年５月３１日〜２０００年６月４日，  コロラド州デンバーを参照されたい）。本発明によって想定される他のリソソーム回避構成要素の例が、Ｓｔａｙｔｏｎら  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  １；６５（１−２）：２０３−２０，  ２０００によって論じられる。
【００４０】
核酸保護構成要素
直接または互いへの付着を介してのいずれかで（例えば核酸をコードする組換えアデノウイルス）、消化可能粒子に一般的に付着する上述の構成要素に加えて、粒子に、または粒子に付着した構成要素に、他の構成要素もまた付着させてもよい。例えば、特に核酸構成要素がウイルスまたはその一部と会合していない場合、上述の消化可能粒子含有組成物に、場合によってＤＮＡ保護構成要素を添加してもよい。一般的に、ＤＮＡ保護構成要素は、消化可能粒子に直接付着しないであろう。核酸保護構成要素には、リソソーム破壊前または破壊中に、溶解酵素に短時間曝露される間、消化可能粒子に結合したＤＮＡまたはＲＮＡを消化から保護可能な任意の構成要素が含まれる。好ましい核酸保護構成要素には、プロタミン、ポリアルギニン、ポリリジン、ヒストン、ヒストン様タンパク質、合成ポリカチオン性ポリマー、およびＲＮＡ配列中に含まれる適切なパッケージング配列を含むレトロウイルスのコア・タンパク質が含まれる。
【００４１】
本発明の１つの態様において、消化可能粒子含有組成物は、（ｉ）タンパク質をコードする核酸を含有する、場合によって非複製性および／または非感染性の、組換え型ウイルス、および（ｉｉ）貪食されうる消化可能粒子を含む。ウイルスは、レトロウイルスのようなＲＮＡウイルスであってもよいし、またはアデノウイルスのようなＤＮＡウイルスであってもよい。この態様において、ウイルス自体は、好ましくは、リソソーム破壊されうる。言い換えると、核酸およびリソソーム回避構成要素はどちらもウイルスの不可欠な部分である。あるいは、ウイルスはリソソーム破壊が不能であってもよい。このような場合、もちろん、別個のリソソーム回避構成要素を添加しなければならない。好ましいウイルスには、ＨＩＶ、アデノウイルス、シンドビスウイルス、ならびにそれらのハイブリッドおよび組換え型が含まれる。特に好ましいウイルスは、ＨＩＶ−アデノウイルス・ハイブリッドであり、これは、本質的に組換えアデノウイルスであり、ＨＩＶ抗原を発現するように操作されている。慣用法を用いて、ウイルスを消化可能粒子に直接付着させてもよい。Ｈａｍｍｏｎｄら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５４：３７−４９（１９９９）を参照されたい。
【００４２】
ウイルス感染は、本発明において、ヌクレオチド構成要素が単球の細胞質に到達するのに必須ではないため、ウイルスはまた、複製／感染不全であってもよい。本発明によって想定される複製／感染不全アデノウイルスを産生するための１つの方法は、ウイルス線維タンパク質を改変することである。例えば、線維タンパク質が特異的突然変異によって操作されて、線維タンパク質が抗体と結合可能であるが、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）細胞受容体とは結合不能であるウイルスを、本発明で用いてもよい。
【００４３】
本発明によって想定される複製／感染不全ウイルスを産生するための別の方法は、感染性の原因であるウイルス構成要素の変性を意図的に引き起こすことである。例えば、アデノウイルスの場合、ウイルス調製中に、線維タンパク質を破壊してもよいし；ＨＩＶに関しては、これはエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質であってもよい。本発明によって想定される複製／感染不全レトロウイルスを産生するための方法は、レトロウイルス・コア粒子のみが残るように、レトロウイルス外膜を除去する工程を必要とする。上述のように調製された複製／感染不全ウイルスを酵母細胞壁粒子に付着させる場合、上述のようなＲＮＡ保護構成要素もまた、粒子に付着させてもよい。
【００４４】
いくつかの療法的態様において、標的細胞の染色体内にベクターが安定して組み込まれることが有益である。例えば、安定な組込みを達成するための１つの様式は、アデノウイルス・ハイブリッドの使用を通じる。こうしたアデノウイルス・ハイブリッドは、例えば、療法的または抗原性の核酸またはタンパク質およびレトロウイルス・インテグラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ構成要素に隣接してレトロウイルスの５’および３’末端反復（ＬＴＲ）配列を所持するアデノウイルス・ベクターを含む（Ｚｈｅｎｇら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １８：１７６−１８０，  ２０００を参照されたい）。他の態様において、一過性発現が好ましく、そしてシンドビスウイルスのような細胞質ウイルス（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｖｉｒｕｓ）を使用してもよい。こうした場合、リソソーム回避構成要素がウイルス上に天然に存在しない場合、これを添加する。例えば、シンドビスまたは他のこうしたウイルスの場合、この目的のため、アデノウイルス・ペントン・タンパク質のすべてまたは一部を発現するように操作してもよい。
【００４５】
粒子に構成要素を付着させるための方法
上に論じるベクター粒子コンジュゲートへの構成要素の付着は、任意の手段によって達成される。上述のように、多様な「構成要素」には、核酸、リソソーム回避構成要素が含まれ、これらはどちらもウイルス中に存在してもよい。付着のための好ましい方法には、抗体付着、ビオチン−（ストレプト）アビジン相互作用および化学的架橋が含まれる。化学的に付着した抗体、（ストレプト）アビジンまたは他の選択的付着部位を用いて、ベクター粒子コンジュゲートを調製してもよい。
【００４６】
抗体付着は、任意の抗体相互作用を通じて起こってもよい。抗体には、限定されるわけではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化抗体またはキメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含む一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生される断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、エピトープ結合性断片、および上述のいずれかのヒト化型が含まれる。
【００４７】
一般的に、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに所望の抗体を産生可能なハイブリドーマを調製するための技術が当該技術分野において周知である（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  オランダ・アムステルダム（１９８４）；  Ｓｔ．  Ｇｒｏｔｈら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：１−２１（１９８０）；  ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；  Ｃｏｌｅら，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．（１９８５）中，  ｐｐ．  ７７−９６）。
【００４８】
本発明によって含まれる抗体付着の一例は、消化可能粒子含有組成物に化学的に固定された単一抗体を含む。抗体は、粒子に付着させるべき構成要素に特異的である。あるいは、２つの抗体を用いてもよい。この場合、消化可能粒子に付着した一つの抗体は、第二の抗体に特異的であり、そして第二の抗体は、消化可能粒子に付着させる構成要素に特異的である。したがって、構成要素特異的抗体は構成要素に結合し、そしてその抗体は次に、粒子に結合した抗体に結合される。例えば、ヤギまたはウサギ抗マウス抗体を粒子に結合させ、そしてマウスモノクローナル抗体を用いて、特定の構成要素に結合させてもよい。
【００４９】
抗体付着の別の例において、プロテインＡまたは抗体に対するアフィニティーを持つ任意の類似の分子を使用する。この例では、消化可能粒子を、抗体に結合したプロテインＡでコーティングし、これは次いで、粒子に付着する構成要素に結合される。
【００５０】
ビオチン−（ストレプト）アビジン相互作用を通じて付着を達成してもよく、例えばアビジンを消化可能粒子に付着させ、そして付着させようとする構成要素にビオチンを付着させることによって達成してもよい。当業者に知られる慣用的手段によって化学的架橋を達成してもよい。
【００５１】
別の付着機構は、多重結合性ビヒクルとして働く核酸を含む。異なる核酸配列に特異的に結合するように、合成グリッパー・タンパク質核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチドを設計する。ＰＮＡは、デオキシリボースリン酸骨格ではなく、ペプチド骨格を持つ、ポリ核酸類似体である。これらを、消化可能粒子に直接付着させるか、または好適な付着のために誘導体化して、それによって核酸付着の配列特異的手段を提供してもよい。各グリッパー・オリゴヌクレオチドを誘導体化するか、あるいは異なるリガンドまたは分子に付着させて、そして異なる核酸配列に結合するよう設計してもよい。ＰＮＡはフーグスティーン塩基対形成相互作用を通じてＤＮＡと相互作用し、そして安定なＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡ三重鎖クランプが形成されると考えられる（Ｚｅｌｐｈａｔｉら  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ２８：３０４−３１６，  ２０００）。
【００５２】
したがって、１つの態様において、１つのグリッパーを使用して、核酸構成要素を粒子に結合させ、そして別のものを用いて、リソソーム回避構成要素を核酸構成要素に結合させる。多数回のこうした反復が可能である。例えば、ビオチンを含む「グリッパー」は、一つの部位で核酸に特異的に結合する配列であってもよい。アビジンでコーティングした粒子への付着は、ビオチン−アビジン相互作用によって起こる。核酸上の別の部位で、リソソーム／ファゴソーム回避構成要素を含む、別の「グリッパー」は、特異的に結合する配列であってもよい。場合によって、ＤＮＡ保護構成要素を含む「グリッパー」は、さらに別の部位で核酸に特異的に結合する配列であってもよい。例示的なグリッパー・オリゴヌクレオチドが先に記載されてきている。
【００５３】
消化可能粒子にウイルスを付着させる場合、これは、表面上に特定のタンパク質を発現するようにウイルスを操作することによってもまた達成可能である。例えば、ＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質をアデノウイルス・ペントン・タンパク質またはその一部で置き換えてもよい。次いで、抗ペントン抗体を介して、組換えウイルスを付着させてもよく、粒子への付着は、例えば、別の抗体またはプロテインＡによって仲介される。この態様において、ペントン・タンパク質はまた、リソソーム回避構成要素としても働くであろう。
【００５４】
製剤
消化可能粒子含有組成物を、例えば局所適用（直接注射または顕微手術技術）、筋内注射または皮下注射による非経口投与用に製剤化してもよい。あるいは、単球性細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで、消化可能粒子含有組成物でトランスフェクションして、そして次いで患者に静脈内再注入してもよい。
【００５５】
注射用製剤を、単位投薬型で、例えばアンプル中または複数用量容器中（ｉｎ  ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ）で、場合によって添加された保存剤を含んで提示してもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁物、溶液またはエマルジョンの形を取ってもよく、そして懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ）を含有してもよい。また、薬学的に許容されうる賦形剤を用いて、消化可能粒子含有組成物を製剤化してもよい。こうした賦形剤は当該技術分野に周知であるが、典型的には生理学的に許容されうる水溶液であろう。生理学的に許容されうる溶液は、本質的に非毒性のものである。好ましい賦形剤は、不活性または増進性のいずれかであろう。
【００５６】
療法
本発明の消化可能粒子含有組成物は、単球を誘引する。したがって、これは、遺伝子ワクチン接種、癌治療および遺伝子治療を含む、単球細胞内に核酸構成要素を選択的に導入する工程を含む任意の適用に有用である。典型的な方法は、単球性細胞を消化可能粒子含有組成物と接触させる工程を必要とする。
【００５７】
消化可能粒子含有組成物を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで単球性細胞と接触させる。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏ法およびｅｘ  ｖｉｖｏ法の両方が意図される。ｉｎ  ｖｉｖｏ法に関しては、消化可能粒子含有組成物は、一般的に、非経口で、通常、静脈内、筋内、皮下または経皮投与される。例えばボーラス注射または連続注入によって投与されてもよい。ｅｘ  ｖｉｖｏ法では、単球性細胞を体の外側で接触させ、そして次いで、接触させた細胞を患者に投与する。また、細胞を非経口的に、典型的には注入によって投与する。
【００５８】
ワクチン接種の分野において、樹状細胞およびマクロファージを含む単球性細胞は、「プロフェッショナル」抗原提示細胞（ＡＰＣ）と見なされ、そしてしたがって、遺伝子ワクチン発現のための理想的な部位である。ＡＰＣ内での抗原の発現が、他の細胞種いずれの内部でこの同じ抗原を発現するよりも、強い細胞性免疫応答を生じるのにはるかにより有効であることが周知である。したがって、本発明の消化可能粒子含有組成物が、ワクチン接種抗原の発現を、「プロフェッショナル」抗原提示細胞（単球細胞）に導く能力は、遺伝子ワクチンの有効性を劇的に増進させる。
【００５９】
本発明は、先行技術のワクチンに勝る実質的な改善を提供し、これは、マクロファージが、磁気ビーズと比較して、貪食された消化可能粒子をより許容するためである。また、消化可能粒子含有組成物を、患者、ならびにマクロファージおよび樹状細胞のような単球性起源の標的細胞内に直接注射してもよい。したがって、消化可能粒子含有組成物は、慣用的ワクチンとちょうど同じように投与可能であり、これは、より低いレベルの技術しか必要とされないため、実質的にコストを減少させる。さらに、投与経路を改変すると、標的化される単球性細胞も改変させうることが意図される。
【００６０】
本発明の組成物を伴う遺伝子ワクチン接種のための典型的な方法には、一般的に皮下または静脈内で、患者に、消化可能粒子含有組成物を投与する工程が含まれる。あるいは、単球性細胞を、本明細書記載の消化可能粒子含有組成物と、ｅｘ  ｖｉｖｏで接触させ、そして次いで、細胞自体を患者に非経口投与してもよい。さらに、接触させた単球性細胞を用いて、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで生成し、これを次いで、患者に投与して、このｅｘ  ｖｉｖｏ法を単離Ｔリンパ球によって修飾してもよい。当業者はこうした戦略をよく知っているであろう。
【００６１】
改善されるワクチン接種戦略に加えて、本発明の消化可能粒子含有組成物を用いた単球性細胞系譜への遺伝子発現の標的化は、癌治療に有効である。本発明に含まれる１つの種類の癌治療は、療法的遺伝子を腫瘍に標的化する工程を含む。腫瘍、原発性腫瘍および転移は、一様に、直径数ミリメートルを超えて増殖し、そして酸素欠乏になるため、これらは、腫瘍生存のために必要ないくつかの事象を誘発するシグナルタンパク質を分泌する。これらの事象には、血管形成を誘導するシグナルの分泌が含まれる。血管形成誘導機構の一部として、低酸素腫瘍は、腫瘍に単球を誘引する機能を持つシグナル伝達ケモカインタンパク質を分泌する。増殖中の腫瘍の部位に誘引された単球は、次いで、マクロファージとなり、そして腫瘍血管形成の誘導を補助する。したがって、療法遺伝子腫瘍標的化の有効な方法は、直接またはｅｘ  ｖｉｖｏ接触させた単球性細胞を通じてのいずれかで、抗腫瘍遺伝子を含む消化可能粒子含有組成物の有効量を癌患者に投与する工程を含む。貪食された消化可能粒子含有組成物を含有する単球細胞は、腫瘍発展部位に誘引され、そして選択的に療法腫瘍遺伝子を腫瘍に送達するはずである。１つの態様において、療法遺伝子は、低酸素誘導性プロモーターの調節下にある。
【００６２】
別の態様において、抗腫瘍遺伝子は、エンドスタチンまたはアンジオスタチンのような抗血管形成因子をコードする。こうした治療は、単球を抗血管形成因子の送達ビヒクルとして利用するため、非常に有効であると想定される。
【００６３】
さらに別の態様において、抗腫瘍遺伝子は、免疫調節剤または抗炎症因子であってもよい。ＩＬ−２およびＩＬ−１２のような免疫調節剤が想定される。さらに、抗炎症因子は、腫瘍の治療に有用であるだけでなく、関節炎のような慢性炎症性障害の治療にも有用である。抗腫瘍効果のような本発明の抗炎症効果は、特定の組織に単球性細胞がホーミングする能力に頼る。単球が、関節炎におけるような炎症性応答部位に誘引されることは周知である。他の例示的な免疫調節剤および抗炎症剤には、ＧＭ−ＣＳＦおよび可溶性ＴＮＦ−アルファ受容体が含まれる。
【００６４】
本明細書記載の本発明の組成物の別の使用は、慣用的遺伝子治療におけるものである。本発明に関与する遺伝子治療の典型的な方法には、タンパク質をコードする核酸に付着した酵母細胞壁粒子を含有する組成物を患者に、またはその組成物を含有する単球性細胞（マクロファージまたは樹状細胞など）を患者に投与する工程が含まれる。
【００６５】
以下の限定されない実施例は、例示のみのために提供され、そして本発明の限定とは見なされない。本発明の範囲内の多くの明らかなバリエーションがある。
【実施例】
【００６６】
実施例１
本実施例は、粒子状キャリアーにカップリングしたアデノウイルス−ベクターでのマクロファージのトランスフェクションを示す。
【００６７】
１．ストレプトアビジン磁気ビーズへのアデノウイルス・ベクターのカップリング
ＰＢＳ中に懸濁したアデノウイルス（Ａｄ）粒子を、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンでビオチン化し、そしておよそ１０のＡｄ粒子／ビーズの比で、ストレプトアビジン−コンジュゲート化磁気ビーズ（ＭＢ）に２時間添加した。Ａｄ−ＭＢコンジュゲートをＰＢＳで徹底的に洗浄し、そしてさらなる使用のため、４℃で保存した。
【００６８】
２．ザイモサンへのアデノウイルス・ベクターのカップリング
２．１．コンジュゲート化のためのザイモサンの誘導体化
ザイモサン炭水化物基を、メタ過ヨウ素酸ナトリウムによって穏やかに酸化した後、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を添加してアミノ基を導入した。シアノ水素化ホウ素ナトリウムの添加によって、生じたコンジュゲートを安定化した。ＡＤＨ修飾ザイモサンを、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）とさらに反応させて、粒子あたりおよそ１０６の反応性保護スルフヒドリル基を導入し、そしてＰＢＳで徹底的に洗浄し、そしてさらなる使用のため、４℃で保存した。
【００６９】
２．２．ザイモサンへのコンジュゲート化のためのアデノウイルス・ベクターの修飾
Ａｄ粒子をＳＰＤＰと２時間反応させて、保護スルフヒドリル基を導入し、そして続いて、Ｚｅｂａスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）上でのスピン−クロマトグラフィーによって、副産物を反応から取り除いた。
【００７０】
２．３．修飾ザイモサンへのアデノウイルス・ベクターのカップリング
工程２．１で記載した修飾ザイモサン中の保護スルフヒドリル基を、ジチオスレイトールによって３０分間穏やかに還元し、そして徹底的に洗浄して残渣試薬を除去した。続いて、ザイモサン粒子あたりおよそ１０の、２．２に記載するように修飾したＡｄ粒子を添加し、そして一晩反応させて、ザイモサンおよびＡｄ粒子間に安定なジスルフィド結合を形成した。Ａｄ−Ｚ（ザイモサン）コンジュゲートをＰＢＳで徹底的に洗浄し、そしてさらなる使用のため、４℃で保存した。
【００７１】
３．粒子状Ａｄベクターでのマウス腹腔マクロファージのトランスフェクション
チオグリコール酸誘発マウス腹腔マクロファージを、１０５細胞／ウェルの密度で、無血清培地中、９６ウェル培養プレート内に植え付け、３時間接着させ、そして続いて洗浄して非接着細胞を取り除いた。その後、Ａｄ−ＭＢまたはＡｄ−Ｚコンジュゲートを、マクロファージあたりおよそ４粒子（約４０Ａｄ粒子に等しい）の比で添加して、そして３７℃で２４時間インキュベーションした。この期間後、Ａｄベクターによって導入されたＧＦＰ導入遺伝子の発現に関して、蛍光顕微鏡によって、トランスフェクション効率を監視した。
【００７２】
実施例２
本実施例は、アデノウイルスが仲介する遺伝子トランスファーによる、マクロファージ抗腫瘍活性の分泌刺激を示す。
【００７３】
チオグリコール酸誘発マウス腹腔マクロファージを、マクロファージあたりおよそ４のザイモサン粒子（約４０Ａｄ粒子に等しい）の比で、Ａｄ−Ｚ（ザイモサン）ベクターで４８時間トランスフェクションした。その後、培地を収集し、ろ過（０．２２μｍ）によって清澄化し、限外ろ過（カットオフ１０ｋＤａ）によって５０倍濃縮し、そしてＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）に対して透析した。濃縮マクロファージ培養上清の連続希釈を、ＹＡＣ−１マウスリンパ腫細胞と４０時間インキュベーションした。その後、生存腫瘍細胞をＭＴＴで染色し、そしてＨＢＳとインキュベーションした対照に比較して、測光法によって、試料の相対的細胞傷害性を決定した。細胞傷害性をＵ／ｍｌとして示し、１Ｕ／ｍｌは、５０％細胞傷害性を生じる濃度と定義される。未刺激および未トランスフェクションマクロファージ、または細菌リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激したマクロファージの培養上清が、それぞれ、陽性または陰性対照として働いた。結果は、ＩκＢに関する２つの異なるＲＮＡｉ構築物（Ｚ−Ａｄ４０６およびＺ−Ａｄ４０７）の混合物でトランスフェクションした後、腫瘍細胞傷害活性分泌の増進を示し、一方、ＲＮＡｉ構築物を欠く対照Ａｄ−Ｚ−ベクター（Ｚ−ＡｄＧＦＰ）は、マクロファージ腫瘍細胞傷害活性分泌の穏やかな増進しか引き起こさなかった。
【図１】
2010524507.tif 000003
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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