(57)【要約】  本発明は、トランスフェクションベクターとして使用するための直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を合成及び調製する方法、並びに該方法を用いて得られた生成物に関する。該方法は、モノマー２−エチル−２−オキサゾリンを乾燥させること、及びポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯＸ）を得るために、以下により該モノマーを重合させることを含む：溶媒としてアセトニトリルを使用すること、乾燥された重合反応開始剤を添加すること、及びそれらを全て混合すること、該得られたＰＥＯＸを蒸発により精製すること、一方で、（ｉ）１Ｈ−ＮＭＲ試験を行うことによる該ＰＥＯＸポリマーの正確な同定、＜１．０％のレベルまでのモノマーの不在の確認、及び＜５．０％のレベルまでの溶媒の不在の確認、並びに（ｉｉ）ゲル浸透クロマトグラフィーを行うことにより、＞２３０００Daの平均分子量（Ｍｗ）及び＜１．５の該ＰＥＯＸの多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）を得るために、メタノール及びジエチルエーテルを用いた少なくとも３回の連続する洗浄／沈殿段階並びに対応する濾過を行うこと、該ＰＥＯＸを加水分解すること。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスフェクションベクターとして使用するための直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を合成及び調製する方法であって、
９９％よりも高い純度の、所定量のモノマー２−エチル−２−オキサゾリンから、該量のモノマーを徹底的に乾燥させる段階、並びに
−  既定量のアセトニトリルを徹底的に乾燥させた後に、該量の乾燥されたモノマーにおける溶媒として該アセトニトリルを使用すること、一方で、既定量の、徹底的に乾燥された重合反応開始剤を添加すること、及びそれら全部を混合すること、
−  該溶媒を除去するために、該得られたＰＥＯＸを蒸発により精製すること、一方で、メタノール及びジエチルエーテルを用いて少なくとも３回の連続する洗浄／沈殿段階及び対応する濾過を行うこと（但し、該乾燥、重合、及び精製の作業は、（ｉ）１Ｈ−ＮＭＲ試験、該ＰＥＯＸポリマーの正しい同定、＜１．０％レベルまでのモノマーの不在の確認、及び＜５．０％レベルまでの溶媒の不在の確認により、並びに（ｉｉ）ゲル浸透クロマトグラフィーを行うことにより、＞２３０００Daの平均分子量（Ｍｗ）及び＜１．５の該ＰＥＯＸの多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）を得るように配列されている）
−  １Ｈ−ＮＭＲ試験を行うことにより、＜５％の量の残留側鎖又はプロピオン酸を有するために、及び単一ピークとして該ＰＥＩを同定するために、十分に効率的に該ＰＥＩを得るために、塩酸を用いて該ＰＥＯＸを加水分解すること
により、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯＸ）を得るために該量のモノマーを重合させる段階を含む方法。
【請求項２】
中間体ＰＥＯＸの平均分子量（Ｍｗ）が４００００Da＜Ｍｗ＜５４０００Daであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
モノマー／開始剤比が約５００であることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
モノマー／開始剤比が４８０であることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
モノマーが、９９．９５％よりも高い純度であることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
開始剤が、モノマーへの添加前にアセトニトリルと混合されることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
重合が、８５℃よりも高い温度で２０時間よりも長い時間行われることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
重合温度が、１０５℃よりも高いことを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
初回の濾過の後に残渣がＭｅＯＨで十分に洗浄されること、及びジエチルエーテルの添加後にポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）が油として溶液から自然に分離され、溶媒全体がデカンテーションされ、真空中での乾燥前に、該洗浄及び分離が少なくとも４回繰り返されることを特徴とする、請求項の１〜８いずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
加水分解する段階が、定期的に、そして少なくとも１日間共沸蒸留により得られた、放出されたプロピオン酸を反応混合物から除去すること、一方で、１Ｈ−ＮＭＲ分光法により反応工程をモニタリングすることを含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
反応工程の最後に得られた残渣が水で希釈され、痕跡量のプロピオン酸を除去するために少なくとも３回蒸発され、次いで該残渣が水に再び溶解され、そして凍結乾燥の前に濾過されることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
濾過が、０．２０μmから０．２５μmのメッシュ寸法を有する無菌酢酸セルロースメンブレンを通過させて提供されることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
１．０％未満のモノマー、５．０％未満の溶媒の存在、＞２３０００Daの分子量Ｍｗ、１．５未満の多分散性Ｍｗ／Ｍｎを有する中間体生成物（ＰＥＯＸ）の精製により、前記請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法により得られるような、直鎖ＰＥＩ。
【請求項１４】
中間体生成物ＰＥＯＸが、４００００＜Ｍｗ＜５３０００DaのようなＰＥＯＸの分子量Ｍｗを有することを特徴とする、請求項１３記載の直鎖ＰＥＩ。
【請求項１５】
中間体生成物ＰＥＯＸが、約２５０００Daの分子量Ｍｗを有することを特徴とする、請求項１３記載の直鎖ＰＥＩ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスフェクション応用のための直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の製造及び品質管理に関する。
【０００２】
本発明は、また、該製造法で得られた生成物、そしてさらに具体的には、非限定的に核酸に基づく治療を含むインビボ応用のための生成物に関する。
【０００３】
本出願は、以前の米国仮出願第６０／９５２９９３号に関する非仮出願であって、その仮出願の優先権を主張する非仮出願である。
【０００４】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、高いカチオン電荷密度ポテンシャルを有する有機高分子である。ＰＥＩの３個目毎の原子は、プロトン化することのできるアミノ性窒素である。ＰＥＩは、ＤＮＡを捕らえることができ、そして多数のリンカーアミノ基が近接して位置することから、ＰＥＩは、事実上任意のｐＨで実質的な緩衝能を有する。
【０００５】
ＰＥＩ単独は、インビトロ及びインビボの両方でＤＮＡプラスミドを送達するための高度に効率的なベクターである。
【０００６】
ＰＥＩは、ＤＮＡを正荷電粒子に圧縮し、その粒子は、細胞表面で陰イオン性プロテオグリカンと相互作用してエンドサイトーシスによる粒子の侵入を促進することができる。正荷電粒子は、細胞表面で陰イオン性細胞表面プロテオグリカンに付着し、その後自然にエンドサイトーシスされる（Boussif et. al., 1995）。ＰＥＩは、また、「プロトンのスポンジ」として作用する独特の性質を有し、これは、エンドソームｐＨを緩衝し、いったん細胞内に入ったＤＮＡを分解から保護する。プロトンの流入持続は、また、エンドソームの浸透圧膨張及び破裂を誘導し、これはＤＮＡ粒子にとって細胞質への逃避メカニズムをもたらす（Boussif, et . al., 1995; Behr, 1997）。
【０００７】
要するに、ＰＥＩに基づくデリバリーシステムは、ＤＮＡ凝縮／保護及びエンドソーム逃避などの、ウイルスの主要な性質の幾つかを模倣している。
【０００８】
いくつかの製造法がＰＥＩのために存在する。
【０００９】
これは、実際に、該ポリマーが複数の工業分野において長年使用されてきたという事実による。
【００１０】
しかし、トランスフェクション目的に使用される場合に、該ＰＥＩの効率は、多くの場合に良好ではなく、すなわち、細胞への導入に成功するのは、製品の１０％未満である。
【００１１】
特に、高分子量、すなわち＞１００００DaのＰＥＩについて低効率である。
【００１２】
さらに、そのような生成物が医学分野に、さらに詳細には、ＧＭＰ基準などの高い製造基準を有する遺伝子治療のために使用しようとすれば、直ちに、非常に優れた効率及び品質が要求される。
【００１３】
本発明は、この問題を解決することを目的とし、高分子量及び低い多分散性と共に大きな効率（≧５５％）を可能にする。
【００１４】
このために、すでに公知であるものよりも良好なトランスフェクションの効率及び信頼性をより高い品質で、可能にする直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を合成及び調製する改良法を提供することが、本発明の目的である。
【００１５】
好ましい一態様では、その品質は、ＧＭＰ（Good Manufacturing Product）のための標準的なものである。
【００１６】
さらに正確には、本発明は、トランスフェクションベクターとして使用するための直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を合成及び調製する方法を目的とし、該方法は、９９％よりも高い純度の、所定量のモノマー２−エチル−２−オキサゾリンから、該量のモノマーを徹底的に乾燥させる段階、並びに
−  所定量のアセトニトリルの徹底的な乾燥後に、該量の乾燥されたモノマーにおける溶媒として該アセトニトリルを使用すること、一方で、既定量の、徹底的に乾燥された重合反応開始剤を添加すること、及びそれら全部を混合すること、
−  得られた該ＰＥＯＸを蒸発により精製して該溶媒を除去すること、一方で、メタノール及びジエチルエーテルを用いた少なくとも３回の連続する洗浄／沈殿段階及び対応する濾過を行うこと（但し、該乾燥、重合、及び精製の作業は、（ｉ）１Ｈ−ＮＭＲ試験を行うことにより、該ＰＥＯＸポリマーの正確な同定、＜１．０％レベルまでのモノマーの不在の確認、及び＜５．０％レベルまでの溶媒の不在の確認、並びに（ｉｉ）ゲル浸透クロマトグラフィーにより、平均分子量（Ｍｗ）＞２３０００Da及び＜１．５の該ＰＥＯＸの多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）を得るように配列される）、
−  １Ｈ−ＮＭＲ試験を行うことにより、＜５％の残留側鎖又はプロピオン酸の量を有するように、そして単一ピークとしてＰＥＩを同定するために、十分に効率的に該ＰＥＩを得るために該ＰＥＯＸを塩酸で加水分解すること
により、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯＸ）を得るために該量のモノマーを重合させる段階を含む。
【００１７】
「特定の量のモノマー、アセトニトリル又は開始剤を徹底的に乾燥させること」により、使用直前に水１０ppm未満への湿気の減少を得ることと理解されたく、これは、水素化カルシウム上で４８時間乾燥させること、次いで１２９℃を超える温度でモノマーを蒸留及び収集することにより得ることができる。
【００１８】
本発明は、また、非限定的に一つ及び／又は複数の以下の特徴を含む有利な態様を提案する：
−  ＰＥＯＸの平均分子量（Ｍｗ）は４００００Da＜Ｍｗ＜５４０００Daである；
−  モノマー／開始剤比は約５００である（「約」により±５％と理解されたい）；
−  モノマー／開始剤比は４８０である；
−  モノマーは、９９．９５％よりも高い純度である；
−  モノマーに添加する前に開始剤をアセトニトリルと混合する；
−  重合を、８５℃折茂高い温度で２０時間よりも長い時間行う；
−  重合温度は１０５℃以上である；
−  初回の濾過後に、残渣をＭｅＯＨなどの溶媒で十分に洗浄し、ジエチルエーテルの添加後に、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）を油として溶液から自然に分離させ、溶媒全体をデカンテーションし、真空中で乾燥させる前に該洗浄及び分離を少なくとも４回繰り返す；
−  加水分解段階は、共沸蒸留により得られた、放出されたプロピオン酸を、定期的に、そして少なくとも１日間反応混合物から除去すること、一方で、１Ｈ−ＮＭＲ分光法により反応工程をモニタリングすることを含む；
−  反応工程の最後に得られた残渣を水で希釈し、少なくとも３回蒸発させて痕跡量のプロピオン酸を除去し、次いで残渣を水に再び溶解させ、凍結乾燥の前に濾過する；
−  メッシュの寸法が０．２０μm〜０．２５μmの無菌メンブレン、特に無菌細胞アセテートメンブレンを通過させて濾過をもたらす。
【００１９】
しかし、そのような濾過は無菌的ではないことから、追加の費用を伴わず、これは、濾過の無菌性が必要であったであろうとする当業者の一般的な意見とは反対である。
【００２０】
「無菌濾過」により、現行のＵＳＰにより決定された値を少なくとも下回る、全ての生存している細菌及び生存しているエレメントの除去と理解されたい。
【００２１】
本発明は、また、上記方法で得られた直鎖ＰＥＩを提案する。
【００２２】
好都合には、本発明は、中間体ＰＥＯＸが４００００＜分子量Ｍｗ＜５４０００DaなどのＭｗを有することを特徴とする直鎖ＰＥＩを提案する。
【００２３】
他の有利な態様では、ＰＥＯＸの分子量Ｍｗは約２５０００Daである。「約」により±１８００Daと理解されたい。
【００２４】
本発明は、非限定的な実施例として示され、添付の図面を参照する、特定の態様の以下の説明を読むことで、よりよく理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明の第一の態様による直鎖ＰＥＩの製造方法（ＧＭＰ）の概略図を示す。
【図２】図２は、本発明の第二の態様による方法の段階を特徴付ける図である。
【図３】図３は、本発明の態様による方法で得られた結果の種々のグラフを示す。
【図４】図４は、本発明の態様による方法で得られた結果の種々のグラフを示す。
【図５】図５は、本発明の態様による方法で得られた結果の種々のグラフを示す。
【図６】図６は、本発明の態様による方法で得られた結果の種々のグラフを示す。
【図７】図７は、本発明の態様による方法で得られた結果の種々のグラフを示す。
【図８】図８は、本発明の態様による方法で得られた結果の種々のグラフを示す。
【図９】図９は、本発明の態様による方法で得られた結果の種々のグラフを示す。
【図１０】図１０は、本発明の態様による方法で得られた結果の種々のグラフを示す。
【００２６】
（ＧＭＰ品質を有する）本発明記載の方法の第一の態様では、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）は、強い求電子剤としてｐ−トルエンスルホン酸メチルによる重合開始後の２−エチル−２−オキサゾリン（モノマー）のカチオン開環重合により得られる。
【００２７】
オキサゾリン環が形成し（本明細書下記の開環重合の伝播段階参照）、次いで次のモノマーにより結合される。
【００２８】
次いで、リビングポリマーが得られ、重合は、水及び炭酸ナトリウムの添加により終止される。
【００２９】
【化１】
2010535264.tif 000003
【００３０】
重合度は、モノマー/開始剤比により、そして合成収率によりコントロールされる。
【００３１】
モノマー／開始剤比から、理論的数平均分子量（Ｍｎ）を計算することができる。高度にコントロールされた重合は、理論的Ｍｎ付近の決定されたＭｎを有し、低い多分散性指数を有するポリマーを与える。
【００３２】
ＰＥＯＸの分子量が１０００〜１００００Daと予想された場合に、重合の古典的収率は５５〜９５％の範囲であった（Hoogenboom et al., 2003）。収量は、高分子量になるほど減少していった。分子量の決定は、＜１００００Daの低Ｍｎについて１Ｈ−ＮＭＲ分光法又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用することによって達成することができる。
【００３３】
＞１００００Daよりも高い分子量のＰＥＯＸについては、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）が現在使用されており、唯一の有効な方法に相当する。
【００３４】
本発明の手順は、高度にコントロールされた重合を用いて１００００Daを超える高分子量直鎖ポリエチレンイミンを生成させるプロセスの説明に関する。約５００のモノマー／開始剤比で始まる重合が、９０％よりも高い収率で得られ、ＧＰＣ測定により、そして決定された多分散性指数が低いことにより示されるように、狭い分子量分布を有する高分子量直鎖ＰＥＩを製造させることができる。
【００３５】
高度にコントロールされた重合は、出発物質（モノマー、開始剤）及び溶媒（アセトニトリル）の量が完全に定義されコントロールされた場合に専ら得られる。
【００３６】
試薬は、米国企業Aldrich製であり、以下の規格で得られた：
−  ２−エチル−２−オキサゾリン、参照番号１３，７４５−６、純度規格＞９９％、ＧＣ分析により決定された純度９９．５〜９９．７％、水分含量について規格なし；
−  ｐ−トルエンスルホン酸メチル、参照番号１５８９９２、純度規格＞９８％、ＧＣ分析により決定された純度９９．９％。
【００３７】
アセトニトリルは、イタリア企業Carlo Erba製であり、参照番号００６３７１６、ＨＰＬＣ等級、純度規格９９．９％及び水分含量＜０．０３％。
【００３８】
重合の収率に影響している最も重要なパラメーターの一つは、開始及び伝播（propagation）段階の間の水の存在であることが見出された。
【００３９】
この理由から、使用される容器は入念に乾燥させ、合成を開始するまでアルゴン下で保管する。
【００４０】
痕跡量の水の存在が重合収率を減少させうると推測したため、出発モノマー及びアセトニトリルの両方を蒸留する必要性もまた比較した（表１参照）。
【００４１】
モノマー及びアセトニトリルを水素化カルシウムで乾燥させ、次いで使用前にアルゴン下で蒸留することにより精製した。
【００４２】
アセトニトリルは、使用前に蒸留により精製した。
【００４３】
結果から、２−エチル−２−オキサゾリン及びアセトニトリルの両方の蒸留が、≧９０％のＰＥＯＸの生成収率を得るために必要であることが明らかに示された。
【００４４】
加えて、高レベルの再現性が示される。これらの条件で、そして開始剤に対するモノマーの比５００を使用して、ＰＥＯＸポリマーは、同じ範囲、５１．８６２＋／−１．６４４に分子量及び１．１５＋／−０．０３の平均Ｍｗ／Ｍｎを有する。
【００４５】
蒸留されていない試薬又は溶媒の使用は、一貫しない分子量を生じる。
【００４６】
【表１】
2010535264.tif 000004
【００４７】
Ｍｗ及びＭｗ／Ｍｎ（多分散性指数）をゲル浸透クロマトグラフィーにより得た。
【００４８】
直鎖ＰＥＩの分析証明書（ＧＭＰ）は、例えば本明細書下記の表２に提供される。
【００４９】
生成物  直鎖ポリエチレンイミン
式（正味）（Ｃ２Ｈ５Ｎ）ｎ×（ＨＣｌ）ｍ：
【００５０】
【表２】
2010535264.tif 000005
【００５１】
Ｃｆｕ：コロニー形成単位；ＲＬＵ：相対光単位；ＥＵ：エンドトキシン単位；最大：〜を超えない
【００５２】
トランスフェクションアッセイ
トランスフェクションの前日に、２４ウェルの組織培養プレートのウェル１個あたり５×１０４個のＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）を、１mlのＭＥＭ完全培地（１０％ウシ胎児血清、重炭酸ナトリウム、２mM glutamax（商標）、２００U/mlペニシリン及び２００μg/mlストレプトマイシンを補充されたアール塩類を有するイーグルＭＥＭ培地)に入れて蒔く。トランスフェクションの当日に、インビボ−直鎖ＰＥＩ  ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ複合体を調製する。一つのウェルについて、１μgのＤＮＡ（ｐＣＭＶＬｕｃプラスミド、１mg/ml、ルシフェラーゼ遺伝子をコード)を、マイクロチューブ（１．５ml）に入れた５０μlの１５０mM ＮａＣｌに添加し、次いでVortexで混合する。インビボ−直鎖ＰＥＩ試料又は陽性対照を５０μlの１５０mM ＮａＣｌ（条件については表を参照）に添加し、この溶液をVortexで混合する。インビボ−直鎖ＰＥＩ試料の溶液（予め水で７．５mMに希釈）、又は直鎖ＰＥＩ陽性対照（７．５mM）、又は５０μlの１５０mM ＮａＣｌ溶液（ＤＮＡ単独の条件）を一度にＤＮＡ溶液に添加し、次いでvortexで１０秒間混合する。この溶液（１００μl）を室温で３０分間インキュベーションしてから、それをウェルに添加する。静かにかき混ぜて均一化した後で、５％ＣＯ２を含む加湿空気雰囲気中で３７℃で２４時間インキュベーションする。
【００５３】
【表３】
2010535264.tif 000006
【００５４】
トランスフェクションの翌日、ルシフェラーゼアッセイを行う。細胞培養液を除去し、各ウェルを１mlのＰＢＳで洗浄する。ＰＢＳを除去後に、１００μlの溶解緩衝液（Luciferase Cell Culture Lysis buffer（５×）, Promega）を添加し、プレートを室温で３０分間インキュベーションする。溶解液を１．５mlマイクロチューブに収集し、１４，０００rpmで５分間遠心分離する。ルミノメーター（LB 960 CENTRO, Berthold Technologies）用９６ウェルプレートのウェル１個あたり２μlの上清を添加し、５０μlのルシフェリン基質（Promega）の自動添加後に、１秒間にわたり積分した発光（ＲＬＵ、相対光単位）を測定する。次いで、結果をＲＬＵ／ウェルで表す。ＲＬＵ／ウェルの平均±ＳＤ（ｎ＝６）を計算する。
【００５５】
図１に関してこの方法を以下にさらに詳細に説明する。
【００５６】
原材料１（モノマー並びに他の溶媒及び試薬）を２で適切に定性し、その原材料から段階３の重合が提供され、中間生成物ＰＥＯＸが得られる（４）が、それを５で適切に同定し、段階６でその質量を決定する。
【００５７】
次いで、酸性加水分解７を提供して直鎖ＰＥＩを得て（８）、それを９で適切に同定し、トランスフェクション用試料に関して試験する（トランスフェクションアッセイ１０）。
【００５８】
外観１１、燃焼残渣１２、重金属の存在１３、残留有機化合物の存在１４、不純物プロファイル１５、エンドトキシンアッセイ１６及び最終的に生物学的負荷（微生物限界＝微生物の量（cfu/g）の決定のためのアッセイ）１７を提供し、その後及び／又はその間に、凍結乾燥１８の最終段階を行う。
【００５９】
したがって、凍結乾燥形態の最終生成物１９を得てから、最終段階の充填２０を行う。
【００６０】
簡潔には、最終段階の充填は、インビボ−直鎖ＰＥＩ原体溶液の調製により開始する。原体粉末を秤量し、水に溶解させて１５０mMの窒素終濃度を得る。磁気撹拌装置を使用して混合速度２００rpmでこの溶液を約１時間混合し、次いで２〜８℃で２４時間放置する。クラスＡ条件の室内でこの溶液を濾過する。濾過のために、無菌専用ガラス容器に一列に並べて入れた使い捨て無菌シリコーンチューブ及び２×Sartobran Pフィルター（０．４５μm／０．２２μm）を使用する。最初のフィルターの完全性を試験した後で、フィルターを通過させて無菌ガラス容器にＰＥＩ溶液をゆっくりと濾過する。この段階の後で、生物学的負荷試験のために試料を採取する。濾過後に、層流空気流下でDIN 2Rバイアルへの充填及びゴム栓の挿入を行う。次いで、バイアルを１３mmアルミシールでキャップをする。キャップ工程の完了後にバイアルを−２０℃で保存する。試料を採取し、大きな欠損がないか点検する。
【００６１】
エンドトキシン及び無菌アッセイのために他の（ランダム化された）試料を採取する。出荷までバイアルを−２０℃で保存する。
【００６２】
第二の態様では、インビボ−直鎖ＰＥＩの製造及び管理を次の四つの主段階で行う（図２参照）：
１）オキサゾリンからポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯＸ）への重合；
２）ＰＥＯＸの精製；
３）ＰＥＯＸからポリエチレンイミン（直鎖ＰＥＩ）への変換；
４）及び直鎖ＰＥＩの精製。
【００６３】
さらに正確には、製造及び管理段階を、図２を参照して本明細書下記に説明する。
【００６４】
非常に純粋なモノマーから出発する。
段階１：この方法は、２１で開始する。段階１の重合（２２）を最初に提供する。
【００６５】
【化２】
2010535264.tif 000007
【００６６】
段階２は、アセトニトリル中でのポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）の精製（２３）に関する。
【００６７】
該精製の間に、以下の段階を行う：
−  モノマーを除去するためのエーテルを用いたポリマー物質の沈殿（２４）；
−  メタノール及びエーテルを用いた、洗浄物の３サイクル洗浄（２５）；
−  溶媒を除去するための蒸発（２６）；
−  工程内品質管理による管理（２７）：すなわち、ポリマーを同定するための１Ｈ−ＮＭＲ、モノマーの欠如を確認するための１Ｈ−ＮＭＲ、溶媒の不在（＜１．０％）を確認するための１Ｈ−ＮＭＲ。
【００６８】
次いで、ポリ（オキサゾリン）（ＰＥＯＸ）の精製された沈殿が得られる。
【００６９】
段階３〜４。ＰＥＯＸから直鎖ＰＥＩへの変換（２８）及びポリマーの精製（２９）。
ポリ（オキサゾリン）（ＰＥＯＸ）の精製された沈殿を得るためにさらに正確には、以下の段階が提供される。
−  ３０〜３７％  水性ＨＣｌへの添加；
−  水を用いたＣＨ３−ＣＨ２−ＣＯＯＨの共沸蒸留（３１）；
−  ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＯＯＨを得るための塩酸の添加（３２）。
【００７０】
この段階で、水溶液中にＨＣｌと共に精製直鎖ポリエチレンイミンが得られる（３３）。
【００７１】
次いで、以下の段階が提供される。
−  過剰のＨＣｌの除去を伴う水の蒸発（３４）（これにより、滅菌水に可溶化された直鎖ＰＥＩ、ＨＣｌを得ることができる（３５））、次いで；
−  直鎖ＰＥＩ、ＨＣｌ粉末を提供するための凍結乾燥（３６）。
【００７２】
次いで、ＰＥＩを再加湿し、水性インビボ直鎖ＰＥＩ（１５０mM窒素）を得て（３７）から、濾過する（３８）。
【００７３】
次いで、最終原体のインビボ直鎖ＰＥＩ品質試験（３９及び４０）を、換言すればトランスフェクションに使用されるＰＥＩを送達する前に、提供する：
−  インビボ直鎖ＰＥＩの１Ｈ−ＮＭＲ同一性及び純度；
−  １Ｈ−ＮＭＲ−残留側鎖又はプロピオン酸；
−  インビボ直鎖ＰＥＩのゲル浸透−多分散性；
−  ＨｅＬａ細胞のトランスフェクション−生物学的活性；
−  エンドトキシンレベル。
【００７４】
インビボ直鎖ＰＥＩの上記製造を以下にさらに詳細に解説する。
【００７５】
最初の段階２２において、アセトニトリル中での二つの出発物質２−エチル−２−オキサゾリン及びパラトルエンスルホン酸メチルからのカチオン重合によりポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯＸ）が得られる。
【００７６】
第二段階２３は、ポリマー、ＰＥＯＸを沈殿させるための、そしてモノマー、溶媒及び未反応の試薬を除去するための、メタノールの（ポリマーを洗浄する能力における）等価物中での、すなわちこの例ではクロロホルム中での、そしてエーテルを用いた、複数回の洗浄（２５）で開始する。
【００７７】
この中間体化合物に関して高低内品質試験２７を完了する。
【００７８】
これらの試験（工程内試験、表３参照）はＰＥＯＸポリマーを同定するための核磁気共鳴（ＮＭＲ）、モノマーの不在を確認するためのＮＭＲ、及び溶媒の＜１．０％レベルまでの不在を確認するためのＮＭＲである（手順ＣＱ−１００１）。
【００７９】
ゲル浸透アッセイ（ＣＱ−１００２）は、ＰＥＯＸの多分散性を保証し、平均分子量を決定する。
【００８０】
第三の段階２８は、３７％水性塩酸を用いた酸性加水分解を使用したプロピオネート側鎖の切断によるＰ、ＥＯＸから直鎖ＰＥＩへの変換である（３０）。直鎖ＰＥＩの精製は、水中での共沸蒸留（３１）によりプロピオン酸を除去することによって達成される。水及び過剰の塩酸の蒸発（３４）後に、直鎖ＰＥＩを滅菌水に１５０mMアミンの濃度に再懸濁し（段階３７）、０．２２μmセルロースメンブレンを通過させて原体容器に濾過する（３８）。
【００８１】
インビボ−直鎖ＰＥＩの同定及び純度は、試験３９、４０の主にＮＭＲ試験により確認する（表３のＣＱ−１００３参照）。
【００８２】
これらの試験は、また、側鎖の完全な除去を確実にし、任意の残留プロピオン酸を検出する。
【００８３】
次いで、トランスフェクションアッセイを使用して、インビボ−直鎖ＰＥＩの生物学的活性を測定する（ＣＱ−１００４）。
【００８４】
最後に、エンドトキシンアッセイ（ＣＱ−１００５）を使用して、エンドトキシンレベルを測定する。
【００８５】
本明細書においてさらに詳細に記載された本発明の態様によると、インビボ−直鎖ＰＥＩの生成全体にわたるバッチ生成手順が続く。
【００８６】
特に、装置、構成要素、条件及び手順が作業者のイニシャルと日付と共に記録され、一方で、手順文書に準じて、資格のある技術スタッフにより工程内及び最終原体生成物試験が行われる（再度、本明細書表３参照）。全ての試験は、どの結果が記録されるかの可の規格を有する。
【００８７】
【表４】
2010535264.tif 000008
【００８８】
次いで、顧客への各バッチのインビボ−直鎖ＰＥＩの発送を認可する前に、品質保証者がバッチ生産記録及び分析証明書の再評価及び承認に責任があることを念頭に置いて、本発明の第一の態様で先に示したように、各バッチの生成物について規格及び試験結果を有する分析証明書を用意する。
【００８９】
反応スキーム：
【００９０】
【化３】
2010535264.tif 000009
【００９１】
提供された、異なる実施例において、そのような作業を行うために以下の出発物質及び試薬を使用する。
【００９２】
２−エチル−２−オキサゾリン、≧９９％：
【００９３】
モノマーは、非常に純粋、すなわち純度≧９９％でなければならない。ここでもまた、モノマーは、米国企業Aldrichから得ることができ、蒸留により例えば９９．９８％の純度まで改良することができよう（図３及び４参照）。
【００９４】
ｐ−トルエンスルホン酸メチルは、高純度、すなわち９８％である。
【００９５】
開始剤は、例えばそして好ましくは、ここでもまた高純度の、すなわち≧９５％、例えば９８％を有するｐ−トルエンスルホン酸メチルである。
【００９６】
酸は、好都合には塩酸、ここでもまた、そして例えばイタリア企業Flukaから購入された、酸性度３７％の酸である。
【００９７】
その他：
アセトニトリルはＨＰＬＣ等級であり、溶媒メタノール及びエーテルは欧州薬局方等級であった。工程助剤である水素化カルシウム及び炭酸ナトリウムはFlukaから購入した。
【００９８】
さらに正確には、そして本実施例において、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯＸ）の第一合成段階は以下の通りである。
【００９９】
反応：
【０１００】
【化４】
2010535264.tif 000010
【０１０１】
合成：
重合開始剤としてｐ−トルエンスルホン酸メチルを使用して２−エチル−２−オキサゾリンから開始してポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）を合成する。アルゴン下の火炎乾燥反応フラスコ中で反応を実施する。溶媒としてアセトニトリルを使用し、反応温度は８５℃である。
【０１０２】
８５℃で２４時間後に、反応混合物を室温に冷却し、水でクエンチし、炭酸ナトリウムを添加する。結果として生じた懸濁液を８５℃で追加的に２４時間加熱する。室温に冷却し、続いて濾過（Duran D2ガラスフリット）して、固体を除き、フィルターケーキをメタノールで洗浄し、溶媒を蒸発させる。
【０１０３】
残渣をメタノールに溶解させ、もう一度濾過する（ガラス繊維、Whatman B）。オイルポンプで溶媒を蒸発させる。もう一度、残渣をメタノールに溶解させ、次いでジエチルエーテルの添加により沈殿させる。続いて、溶媒を除去する（オイルポンプによる真空）。２回目の沈殿を行い、次いでＰＥＯＸを一定重量になるまで乾燥させる。
【０１０４】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、５％未満の溶媒及び１％未満のオキサゾリンモノマーを示さなければならない。
【０１０５】
ＰＥＯＸ及びＰＥＩの実現の実施例を以下に記載するが、その一つ（バッチ１及び３）は、本発明の段階の全てを含むわけではなく（すなわち、アセトニトリルにおける蒸留を含まない）、不満足な結果を有し、一つ（バッチ２及び４）は、本発明の全ての段階を含み、満足させる結果を有する。
【０１０６】
【表５】
2010535264.tif 000011
【０１０７】
成果と分析結果:
バッチ番号１:
合成及び作業は上記プロトコールに準じた。
収量：４０．９５ｇ（８１．９％）（すなわち低すぎる）
１Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル：公知の不純物（プロトン化形態、１．７８ppm）及びジエチルエーテルのシグナルが検出される。これらのシグナルに加えて、３．７２ppmにシグナルを有する少量の未知不純物が検出される（図５）。
【０１０８】
【表６】
2010535264.tif 000012
【０１０９】
５００個のモノマーからなるインビボ−直鎖ＰＥＩについて予想されるモル質量は４９，５８１g/molである。以下の装置を使用してＧＰＣにより平均Ｍｗを測定する：ポンプShimadzu LC-10AD（０．５ml/min）、自動インジェクターWISP（Waters）、ガードカラム１本（Shodex OH-pak K3-G、６．０×５０mm）、それに続く連続的に連結したカラム３本（Shodex OH-pak、８．０×３００mm）（１本のカラムは803HQ、１本のカラムは804HQ、１本のカラムは806HQ）、屈折率検出器、示差検出器Waters R410、及び多角度光散乱検出器DAWN F（Wyatt Techn）。試料を流すために使用される溶媒は、０．１Ｍ  ＮａＮＯ３及びＮａＮ３を有する再蒸留水である。乾燥ＰＥＯＸを室温で４時間撹拌しながらＧＰＣ溶媒で４〜６g/ｌに溶解させる。インジェクション前に、試料を０．２２μm  Dynagardフィルターを通過させる濾過に供する。１００μlの４〜６g/l  PEOXをガードカラムに自動インジェクションし、流速０．５ml/minでＧＰＣを実現する。９０°光散乱シグナル及びＲＩシグナル（ｄｎ／ｄｃ）の両方を追跡することにより、ＧＰＣのモニタリングを行う。散乱シグナルとＲＩデータを組み合わせることにより、ポリマーの絶対モル質量をソフトウェアにより計算する（ソフトウェアASTRAを使用）。
【０１１０】
バッチ番号２：
合成及び作業は上記プロトコールに準じた。
収量：４３．７１ｇ（８７．２％）（すなわち適合）
【０１１１】
１Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル：このスペクトルは、ＰＥＯＸに加えて溶媒ジエチルエーテル及びアセトニトリルを示す。追加的に未知の不純物（３．７２ppm）が見出される（図６）。
【０１１２】
【表７】
2010535264.tif 000013
【０１１３】
５００個のモノマーからなるインビボ−直鎖ＰＥＩについて予想されるモル質量は４９５８１g/molである。
【０１１４】
第二段階は、ポリエチレンイミンの合成を行うことからなる（インビボ−直鎖ＰＥＩ）：
反応：
【化５】
2010535264.tif 000014
【０１１５】
合成：
インビボ−直鎖ＰＥＩの合成のために、水において塩酸を用いてアミド結合を加水分解することにより、上記の中間体ＰＥＯＸの側鎖を除去する。この混合物を１２０℃で撹拌する。
【０１１６】
１日後に反応は完了する。１Ｈ−ＮＭＲ分光法により反応の進行をモニタリングする。
【０１１７】
未切断であるのは側鎖の５％以下でなければならない。
【０１１８】
蒸発により塩酸を除去する。残渣を水／塩酸に溶解させ、２回蒸発させて痕跡量のプロピオン酸を除去する。
【０１１９】
次いで、残渣を水に溶解させ、ガラス繊維フィルター（Whatman B）、次いで無菌０．２２μm酢酸セルロースメンブレンを通過させて濾過する。その無色溶液を凍結乾燥させる。
【０１２０】
ＮＭＲ分析は、ポリマーの同一性、低量の残留側鎖及び５％未満の残留プロピオン酸を示さなければならない。
【０１２１】
行ったインビボ−直鎖ＰＥＩの調製の概略は以下の通りである：
【０１２２】
【表８】
2010535264.tif 000015
【０１２３】
バッチ番号３は、バッチ番号１の加水分解後に得られる。
【０１２４】
バッチ番号４は、バッチ番号２の加水分解後に得られる。
【０１２５】
成果及び分析結果：
バッチ番号３：
合成及び作業は上記プロトコールに準じた。
収量：２７．６１g（８７．７％）
１Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル：スペクトルは、インビボ−直鎖ＰＥＩについて単一ピークを示す（図９）。
バッチ番号４：
合成及び作業は上記プロトコールに準じた。
収量：２９．４３ｇ（８７．４％）
１Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル：スペクトルは、インビボ−直鎖ＰＥＩについて単一ピークを示す（図１０）。
【０１２６】
結論
二つのバッチの直鎖ＰＥＩを合成した。１Ｈ−ＮＭＲ−分光方による純度及び第２のバッチの生成物の収量は、最初のバッチに比べて再現性があり、満足のいくものであり、最初のバッチは、本発明の段階の幾つかを採用しなかったことが原因で、満足のいくものではなかった。
【０１２７】
ＰＥＯＸの平均モル質量をＧＰＣにより決定した。この仕様は、非常に高感度であることが示された。バッチ番号１において、鎖長は所望の値を達成しなかった（表５、図７）。
【０１２８】
次に、表８〜１４及び対応する図３〜１０に対応させて以下の結果を提供する。
１．）購入されたモノマー２−エチル−２−オキサゾリン（ＥＨ−１２６８．４−２）のＧＣ（表８及び図３参照）。
２．）蒸留されたモノマー２−エチル−２−オキサゾリン（ＥＨ−１２６８．４−２）のＧＣ（表９及び図４参照）。
３．）バッチ番号１の１Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル（図５参照）。
４．）バッチ番号２の１Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル（図６参照）。
５．）バッチ番号１のＧＰＣ（図７及び表１１参照）。
６．）バッチ番号２のＧＰＣ（図８及び表１２参照）。
７．）バッチ番号３の１Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル（図９参照）。
８．）バッチ番号４の１Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル（図１０参照）。
【０１２９】
１．）購入されたモノマー２−エチル−２−オキサゾリン（ＥＨ−１２６８．４−２）のＧＣ
【０１３０】
【表９】
2010535264.tif 000016
【０１３１】
さらに正確には、Ｏｙに高さ（ＰＡの高さ）及びＯｘに時間（分）を示す図３は、温度４０℃で、ＧＣガスクロマトグラフィーについて観察された、異なるピーク、すなわち二の態様に記載された方法で使用された精製前のモノマーのピーク１（４１）、ピーク２（４２）、２−エチル−２−オキサゾリンのピーク（４３）、ピーク３（４４）及びピーク４（４５）を示す。
【０１３２】
２．）蒸留されたモノマー２−エチル−２−オキサゾリン（ＥＨ−１２６８．４−２）のＧＣ
図４及び表９は、蒸留されたモノマー（段階２２の直前）のＧＣを示す。蒸留のこの特異的段階は、市販の原材料の純度に比べた場合に、モノマーの純度が増加することを示す（表８及び図３）。
【０１３３】
わずか三つのピーク、すなわちピーク１（４６）、ピーク２（４７）及び２−エチル−２−オキサゾリンのピーク（４８）のみが残る。
【０１３４】
【表１０】
2010535264.tif 000017
【０１３５】
３，  ４）バッチ１及び２の１Ｈ−ＮＭＲ−スペクトル
【０１３６】
【表１１】
2010535264.tif 000018
【０１３７】
図５及び６は、それぞれＰＥＯＸバッチ番号２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル及びＰＥＯＸバッチ番号２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【０１３８】
さらに詳細には、得られたピーク５０〜５３及びピーク５５〜５８はＰＥＯＸ［１．０−１．３ppm（３Ｈ，ＣＨ２−ＣＨ３）、２．０−２．５ppm（２Ｈ，ＣＨ２−ＣＨ３）、３．４−３．５ppm（４Ｈ，ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ）］の同定を意味する。ピーク４９及び５４は、溶媒に相当する（ＣＤＣｌ３）。
【０１３９】
５．）バッチ番号１のＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）
【０１４０】
【表１２】
2010535264.tif 000019
【０１４１】
グラフ６０（多角度光散乱検出器ＭＡＬＳからの生データ）及び６１（屈折率検出器ＲＩからの生データ）は、明らかに異なり、満足されない結果について重大な多分散性を示す（軸の単位は、Ｏｘでは体積（ml）であり、ＯＹではシグナル強度の相対尺度である）。
【０１４２】
６．）バッチ番号２のＧＰＣ
【０１４３】
【表１３】
2010535264.tif 000020
【０１４４】
ここで、縁６２（ＭＡＬＳ検出器からの生データ）及び６３（ＲＩ検出器からの生データ）は、本発明に許容されるものとほぼ一致する。
【０１４５】
７，８）最終的に、図９及び図１０に、バッチ番号１及び２のＰＥＯＸを用いてそれぞれ得られたＰＥＩ番号３及び番号４のバッチの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを再現するが、それらは、それぞれピーク６４（４．７２ppm、Ｄ２Ｏ）及び６５（３．４６ppm、ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、ＰＥＩ由来）、及び６６（４．７１ppm、Ｄ２Ｏ）、６７（３．４７ppm、ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ、ＰＥＩ由来）を示す。
【０１４６】
最終的に以下に表１３を提供する、
【０１４７】
【表１４】
2010535264.tif 000021
【０１４８】
この表は、ＰＥＯＸの質量Ｍｗが初期開始剤／モノマー比に依存することを示す。
＊注：この実施例において、最終ＰＥＩは質量＞１００００Da、さらに正確には約１５０００Da（すなわち、３４１８０／９９×４３＝１４８４６Da）を有する。
【０１４９】
高成績のＰＥＯＸ生成（＞８５％）は、理論値に近い質量を有するポリマーを生成させ、本発明の工程は＜１．５の低い多分散性を有する。
【０１５０】
追加の利点及び改変は、当業者に容易に思い浮かぶであろう。したがって、本発明は、そのより広い局面において本明細書に示され記載された特定の詳細、代表的な装置及び例示された実施例に限定されない。
【０１５１】
特に、それは、上記方法で得られた直鎖ＰＥＩに及ぶ。
【０１５２】
【表１５】
2010535264.tif 000022
【０１５３】
本発明による工程の第三の態様を以下に記載する。
【０１５４】
インビボ−直鎖ＰＥＩにおけるこの製造方法は、二段階合成で進行する。
【０１５５】
モノマー（２−エチル−２−オキサゾリン）からポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯＸ）への重合のための第一段階及び該ＰＥＯＸから直鎖ＰＥＩを得るための第二段階。
【図１】
2010535264.tif 000023
【図２】
2010535264.tif 000024
【図３】
2010535264.tif 000025
【図４】
2010535264.tif 000026
【図５】
2010535264.tif 000027
【図６】
2010535264.tif 000028
【図７】
2010535264.tif 000029
【図８】
2010535264.tif 000030
【図９】
2010535264.tif 000031
【図１０】
2010535264.tif 000032
【国際調査報告】
2010535264.tif 000033
2010535264.tif 000034
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