(57)【要約】  本発明は、高発現クローンの選択のための抗体産生細胞株のスクリーニング方法を記述する。【選択図】図１
2010517530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．最低１種のＨ鎖遺伝子および場合によっては１種のＬ鎖遺伝子を含んでなる抗体をコードする遺伝子を２種若しくはそれ以上の適する哺乳動物宿主細胞にトランスフェクトする段階；
ｂ．トランスフェクトした宿主細胞を培養する段階；
ｃ．宿主細胞中で該抗体遺伝子によりコードされるｍＲＮＡを定量する段階；および
ｄ．最高のｍＲＮＡ量を有する宿主細胞を選択する段階
を含んでなる、抗体の製造のための細胞株の選択方法。
【請求項２】
細胞あたりのＨ鎖遺伝子のｍＲＮＡコピー数を測定する段階、および指定されるコピー数をもつ細胞を選択する段階をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トランスフェクション段階が、選択可能なマーカー遺伝子のトランスフェクションをさらに含んでなる、請求項１若しくは２に記載の方法。
【請求項４】
選択可能なマーカーがＤＨＦＲ、ＧＰＴ若しくはＧＳである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
培養段階が選択培地中でのサブクローニングを含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
選択した宿主細胞の増殖速度および生産性が選択基準として決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｈ鎖ｍＲＮＡが定量的ＰＣＲを使用して測定される、請求項１ないし６に記載の方法。
【請求項８】
定量的ＰＣＲが、配列番号４〜６に示される配列を有するオリゴヌクレオチドを使用する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｈ鎖ｍＲＮＡが、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭよりなる群から選択されるＨ鎖をコードする、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
抗体遺伝子が、内因性抗体遺伝子プロモーターおよびＣＭＶプロモーターよりなる群から選択されるプロモーターの制御下にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
最も安定なクローンを選択する段階をさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体のような免疫グロブリン遺伝子由来の治療的タンパク質の製造方法に関する。本発明は、治療的タンパク質製造の目的上の高発現宿主細胞株の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物製剤の市場占有率は急速に増大しつつある。１０００種を超える新たな生物製剤製品の開発が世界中で進行中である。生物製剤市場の成長は従って増大された製造能力に対する必要性を高めている。しかしながら、新たな生物学的製造（ｂｉｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）施設の建設は非常に高価であり、小パイロットプラントについて５０００万ドルから商業的施設について５億ドル若しくはそれ以上を超えるまでの範囲にわたる。加えて、規制当局が製造工程の全局面を検証しなければならないため、新たな施設を稼働せしめるためには４年超かかる。
【０００３】
宿主細胞の初期選択は、下流の工程の設計およびバイオリアクター運転回数のような必要とされる装置稼働数にもまた影響する。従って、いずれか１製品の製造の効率は、低下された製造容量若しくは能力の要件および従って全体的な低下された費用になるであろう。これを達成し得る１つの基礎的な方法は、安定な分子をかつ高発現率で産生する宿主細胞株の創製による。
【０００４】
治療的モノクローナル抗体（Ａｂ）を包含する治療的タンパク質の多様な哺乳動物細胞宿主中の発現を増大させるのに数多くの方法が使用されている（非特許文献１；ＧａｎｇｕｌｙとＪｉｎ、２００２およびＴｒｉｌｌ、２００２に総説されている）。これらは、ａ）強力なウイルスプロモーター、例えば、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（Ｄｅａｎｓら、１９８４）若しくは細胞プロモーター、例えば、β−アクチンプロモーター（Ｎｉｗａら、１９９１）の使用；ｂ）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）陰性チャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＰａｇｅとＳｙｄｅｎｈａｍ、１９９１）および骨髄腫細胞株（ＤｏｒａｉとＭｏｏｒｅ、１９８７）双方での増幅可能なマーカーとしてＤＨＦＲ遺伝子を使用するトランスフェクトされた遺伝子の増幅（Ｋａｕｆｍａｎ、１９９０）；ｃ）グルタミン合成酵素選択系の使用（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、１９９２）；ならびにｄ）増幅可能なマーカーが目的の組換えタンパク質に比較してはるかにより低いレベルで発現され、そして従って高程度の遺伝子増幅および発現の影響を受けやすい、２シストロン性ベクターの使用（Ｌｕｃａｓら、１９９６；Ｋａｕｆｍａｎら、１９９１）を包含する。加えて、染色体の発現の「ホットスポット」への目的の遺伝子の標的を定めた組込みの使用（Ａｌｄｒｉｃｈら、２００３およびＫｏｄｕｒｉら、２００１）ならびに発現ベクター中のインスレーター配列および抗抑制エレメントの使用（Ｚａｈｎ−Ｚａｂａｌら、２００１；Ｋｗａｃｋｓら、２００３）が有望な結果を生じたとは言え、治療的タンパク質発現におけるそれらの使用は未だ実現されるべきである。これらおよび多くの他の改良の努力により、約１００ピコグラム／細胞／日の比生産性で治療的タンパク質を発現する細胞株が開発された（ＰａｇｅとＳｙｄｅｎｈａｍ、１９９１）。
【０００５】
既存施設を使用してタンパク質製品を製造するための世界的能力を増大するために、現在利用可能であるものよりなお高い生産性をもつ細胞株が開発されることが必要である。こうした細胞株を選択するためのスクリーニング方法は、治療的タンパク質の製造のための高発現細胞株の開発過程を促進させる上で有用であろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｕｒｍら  ２００４  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２、１３９３−１３９８
【発明の概要】
【０００７】
［発明の要約］
本発明の一局面は、最低１種のＨ鎖遺伝子および場合によっては１種のＬ鎖遺伝子を含んでなる抗体をコードする遺伝子を２種若しくはそれ以上の適する哺乳動物宿主細胞にトランスフェクトする段階；トランスフェクトした宿主細胞を培養する段階；宿主細胞中の該抗体遺伝子によりコードされるｍＲＮＡを定量する段階；ならびに最高のｍＲＮＡ量を有する宿主細胞を選択する段階を含んでなる、抗体の産生のための細胞株の選択方法である。
【０００８】
［発明の詳細な記述］
略語
Ａｂ  抗体、ポリクローナル若しくはモノクローナル；ＣＨＯ  チャイニーズハムスター卵巣；ＨＣ  Ｈ鎖；ＬＣ  Ｌ鎖；Ｍａｂ  モノクローナル抗体；ＱＰＣＲ  定量的ＰＣＲ；ＭＭｂ  ミメティボディ（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）；ｃＤＮＡ  相補ＤＮＡ；ｍＲＮＡ  メッセンジャーＲＮＡ；ＧＳ  グルタミン合成酵素；ＭＨＸ  ミコフェノール酸、ヒポキサンチンおよびキサンチン。
【０００９】
定義
「抗体」という用語は、抗体模倣物を制限なしに包含するか、あるいは、抗体、または一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ミメティボディおよびそれらのフラグメントを制限なしに包含するそれらの特定フラグメント若しくは部分の構造および／若しくは機能を模倣する抗体の部分を含んでなる、抗体、それらの消化フラグメント、特定部分およびバリアントを包含することを意図している。機能的フラグメントは目的の標的抗原に結合する抗原結合フラグメントを包含する。例えば、限定されるものでないがＦａｂ（例えば、パパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えば、ペプシン消化および部分還元による）ならびにＦ（ａｂ’）２（例えば、ペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えば、ペプシン若しくはプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分還元および再凝集による）、Ｆｖ若しくはｓｃＦｖ（例えば、分子生物学技術による）フラグメントを挙げることができる、標的抗原若しくはその部分に結合することが可能な抗体フラグメントを、抗体という用語により包含する（例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記を参照されたい）。従って、本明細書で使用されるところの抗体という用語は、抗体全体の改変により製造される若しくは組換えＤＮＡの方法論を使用して新たに合成されるいずれの抗体フラグメントもまた包含する。
【００１０】
「高産生細胞株」、「高生産性」および「優れた産生レベルを有するクローン」若しくは「高発現」クローンにより、ある抗体を発現するように工作された他細胞に匹敵する条件で増殖される場合に、同様に増殖される他細胞より細胞培地中の抗体の比較的より高濃度を生じる、工作された細胞株すなわちトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）若しくはそれらのクローンを意味している。抗体濃度および従って産生量は、いずれかの数の標準的若しくは非標準的方法により測定することができ、そして例えば、単位容量あたりに産生される量として定量的でありうるか、または、例えば、溶液中で産生される抗体複合体の密度として相対的でありかつ例えば、比濁法により若しくはメチルセルロースのような半固形媒体中で測定されることができる。
【００１１】
「増殖速度」は細胞の増殖速度を指す。培養物中で、増殖速度は、培養物中の単位容量あたりの生存細胞の密度を異なる時点で評価することによりモニターしうる。増殖速度が
典型的に最速（すなわち、最高）である場合、該細胞は、酸素、エネルギー、ならびに全部の細胞成分および過程のための基質を包含する栄養素の豊富さにより「対数期」増殖にある。増殖速度は生存細胞数／ｍｌ／日によって表現しうる。増殖速度は、「倍加時間」すなわち単位容量あたりの細胞の数が倍加するのに該培養物がかかる時間としてもまた表現しうる。従って、増殖速度が速くなるほど倍加時間値は小さくなる。
【００１２】
「比生産性」は単位時間あたりに１細胞若しくは特定の数の細胞により産生されるタンパク質産物の量を意味している。比生産性は例えば、μｇ／１０６／日若しくはｐｇ／細胞／日として表現しうる。比生産性は、例えば、生産性の値（培養物容量の単位あたりのタンパク質のｍｇ若しくはμｇ）を生存細胞密度（単位容量あたり細胞）を除算することによってもまた計算しうる。
【００１３】
「安定性」若しくは「安定なクローン」により、単位時間あたりに１細胞若しくは特定の数の細胞により産生されるタンパク質産物の量が継代に際して認識可能に減少しないことを意味している。すなわち、サブクローニングおよびその後の継代に際して、ある細胞株の比生産性が所望の比率で維持される。
【００１４】
説明
安定な高産生細胞株の初期選択の重要性は、生物製剤製造の工程のためのマスター細胞バンク（ＭＣＢ）の開発にとって極めて重要である。臨床研究の間の細胞バンクのいかなる変化も追加の規制文書化および実験を必要とし、それは増大される費用につながりかつ進行中の臨床試験のための物質の供給を大きく遅らせうる。宿主細胞の初期選択は、下流の工程の設計、およびバイオリアクター運転回数のような必要とされる装置稼働数にもまた影響し、そして従って「拡張性（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）」が重要である。
【００１５】
抗体製造細胞株の生産性を改良するための試みにおいて、われわれは、Ｈ若しくはＬいずれかの鎖のｍＲＮＡ転写物レベルのＡｂ生産性との相関が存在したかどうかを尋ねた（Ｄｏｒａｉら  ２００６．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２５：１−９）。これらのパラメータ間の相関は、より高発現の細胞株が、Ｈおよび／若しくはＬ鎖ｍＲＮＡ転写物レベルを増大させること、または増大されたＨおよび／若しくはＬ鎖ｍＲＮＡ転写物レベルを有する細胞株を選択することにより得ることができることを示唆するとみられる。こうした相関が存在するかどうかを決定するため、多数の組換えモノクローナルＡｂ産生細胞株を検査した。これらの細胞株は、目的のタンパク質を製造するのに適する細胞株を開発するという目的でマウス骨髄腫宿主細胞株への治療的抗体の組換えＨおよびＬ鎖遺伝子のコトランスフェクション後に生成された。全ＲＮＡをこれらの細胞株の指数培養物から調製しそして定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）法を使用してＨおよびＬ鎖ｍＲＮＡコピー数について分析した。同時にこれらの細胞株のＡｂ力価を測定した。該結果は、試験した細胞株の大部分で、実験誤差内で、Ｌ鎖転写物レベルはＨ鎖転写物のものより豊富であり、また、ＨおよびＬ鎖転写物レベルのＡｂ生産性との相関が存在したことを示唆する。しかしながら、この相関はＨ鎖についてとりわけ顕著であった。これらの知見は、これらの遺伝子の転写がおそらく抗体発現経路中の律速段階の１つであることを意味している。
【００１６】
一例（Ｄｏｒａｉ、２００６  上記）において、優性選択マーカーとしてｇｐｔ遺伝子を包含する構築物中に存在する内因性免疫グロビン（ＮＳ０）誘導性宿主細胞株の非分泌型（ｎｏｎ−ｓｅｃｒｅｔｏｒ）への、それらの元の内因性プロモーターの制御下の多様な抗体遺伝子のトランスフェクションから製造した初代トランスフェクトーマで、Ａｂ生産性を検査した（ＭＨＸを使用して）。初代トランスフェクトーマのサブクローンもまた検査した。生産性は、類似の培養条件下で培養した個々の細胞株について約１０μｇ／ｍｌから２００μｇ／ｍｌ超までの範囲にわたった。生産性は対応する免疫グロブリンプロモーターの強度の差違に依存し得る一方、初代トランスフェクトーマの１サブセットをサ
ブクローニングすることは、Ａｂ力価が２ないし７倍高められた細胞株、および生産性が増大しなかったか若しくはわずかにのみ増大した他のクローンを生じた。サブクローンの（それらの初代クローンに比較しての）抗体力価の増大は、Ｈ鎖およびＬ鎖ｍＲＮＡレベルの増大と正に相関したことが発見され；より高発現体は、１０ｎｇのｃＤＮＡあたりおよそ１．０×１０７および１．５×１０７コピーのそれぞれＨおよびＬ鎖を伴った。一般に、Ｌ鎖ｍＲＮＡのレベルは細胞株の大多数でＨ鎖のレベルに比較してより高く、また、それらのレベルの差違はメッセージの差別的安定性によらなかった。振とうフラスコ培養物中で１００ｍｇ／Ｌ超のＡｂを発現する安定細胞株について、Ｌ鎖のコピー数は１０ｎｇのｃＤＮＡあたり１０から２０×１０６コピーまでの範囲にわたった一方、Ｈ鎖のものは１０ｎｇのｃＤＮＡあたり４から１０×１０６コピーまでの範囲にわたった。該知見は、Ｈ鎖ｍＲＮＡがＬ鎖ｍＲＮＡより細胞株の生産性の優れた予測因子であり、また、Ｌ鎖メッセージがＨ鎖メッセージに対し一般に過剰量で存在することを示す。
【００１７】
別の報告（Ｂａｒｎｅｓら  ２００７．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ  ９６（２）：３３７−３４８）において、ＧＳ遺伝子と一緒にＨおよびＬ鎖抗体遺伝子でトランスフェクトしたＮＳ０骨髄腫細胞をこれらの遺伝子の特異的ｍＲＮＡについて分析し、そしてデータを該トランスフェクタントの比生産性と関係づけた。それぞれ別個のＣＭＶプロモーターの制御下の抗ＣＤ３８抗体のＨおよびＬ鎖双方をコードするベクターを用いる電気穿孔法によりトランスフェクトした個別のＮＳ０の培養物の比生産性のデータが報告され、そしてＧＳ遺伝子はＳＶ４０プロモーターの制御下にあった。Ｈ鎖ｍＲＮＡ発現パーセントと比生産性の間の関係の相関係数はＲ２＝０．７７４７であった一方、Ｌ鎖ｍＲＮＡ発現パーセントと比生産性のものはＲ２＝０．４６５９であり、またＧＳ
ｍＲＮＡコピーおよび比生産性についてはＲ２＝０．００８２であった。従って、本研究は、抗体遺伝子が非天然のプロモーターの制御下にある系において、Ｈ鎖ｍＲＮＡコピー数がＬ鎖コピー数若しくは選択マーカーのｍＲＮＡコピー数よりも細胞生産性のより良好な予測因子であることを示す結果を生じた。
【００１８】
この情報を、抗体製造の目的上有用である所望の増殖速度をもつ安定な高発現産生細胞株の予測的同定に使用し得る。加えて、高レベルのＨ鎖および場合によってはＬ鎖転写物をもつ個別の細胞を、例えば、ハイスループットＲＴ−ＰＣＲスクリーニング法により直接選択して、高生産性を伴うＡｂ発現細胞株を大きく短縮された時間枠で生じ得る。
【００１９】
本発明は、適する哺乳動物宿主細胞中への抗体をコードする遺伝子のトランスフェクション後の高産生細胞株の選択方法に関する。本発明の該方法の一態様において、１種若しくはそれ以上の宿主細胞を、抗体Ｈ鎖をコードする遺伝子および抗体Ｌ鎖をコードする遺伝子、ならびに場合によっては選択可能なマーカータンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトし、次いでトランスフェクトした宿主細胞を培養してトランスフェクトーマを形成し、そして該宿主細胞による抗体産生の開始後に、Ｈ鎖をコードするｍＲＮＡを宿主細胞中で定量し、かつ、最高のｍＲＮＡ量を伴う宿主細胞を選択する。
【００２０】
別の態様において、Ｈ鎖ｍＲＮＡコピー数の絶対コピー数を使用して保持のためのトランスフェクトーマを選択する。なお別の態様において、１トランスフェクトーマをサブクローニングし、そして、抗体を産生する培養サブクローン中のＨ鎖ｍＲＮＡを使用して保持のためのクローンを選択する。
【００２１】
従って、Ｈ鎖ｍＲＮＡ定量を使用する高抗体発現細胞株（高産生体）のスクリーニング方法を、多様な哺乳動物宿主細胞株系で使用し得、および、独立に、または他のパラメータ、特徴若しくは選択基準と協調して使用し得る。
【００２２】
宿主細胞および高産生クローンの選択
免疫グロブリンＨ鎖を含んでなるタンパク質を産生することが可能な宿主細胞は、場合によっては、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、Ａｇ６５３、ＳＰ２／０、ＮＳ０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、またはそれらのいずれかの誘導体、不死化若しくは形質転換細胞から選択される最低１種であり得る。
【００２３】
本発明の方法において、真核生物細胞は骨髄腫細胞である。本発明の方法で有用な骨髄腫細胞株の例は、マウスから得られたＳＰ２／０、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、英国ウィルトシャー州ソールズベリー、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）、およびＡｇ６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）細胞株を包含する。ヒトから得られかつ本発明の方法で有用な骨髄腫細胞株の一例はＵ２６６細胞株（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。Ｃ４６３Ａ骨髄腫細胞株もまた本発明の方法で有用であり、そして既知組成培地中で増殖することが可能なＳＰ２／０由来細胞株の一例である。当業者は他の有用な骨髄腫細胞株を認識するであろう。
【００２４】
本発明の方法において、真核生物細胞は、ＳＰ２／０、Ｃ４６３ＡおよびＣＨＯ細胞よりなる群からもまた選択し得る。これらの細胞型のそれぞれは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に適しかつペプチド鎖を高レベルで発現する能力を有するという共通の特性を有する。
【００２５】
哺乳動物細胞中での組換えタンパク質の製造方法の開発は十分に確立されている。最初に、必要な転写調節エレメントと一緒の組換え遺伝子または抗体若しくは他のヘテロ二量体タンパク質の場合にはＨおよびＬ鎖双方の組換え遺伝子を含んでなるベクターを細胞に移入する。同時にレシピエント細胞に選択の利点を賦与する付加的な遺伝子を移入しうる。リン酸カルシウムトランスフェクション、電気穿孔法、リポフェクションならびに遺伝子銃およびポリマー媒介性遺伝子移入を、トランスフェクトーマを創製するための宿主細胞へのベクターを含んでなる遺伝子の移入に影響を及ぼすのに慣例に使用する。
【００２６】
遺伝子移入後に適用される選択剤の存在下で、選択遺伝子を発現する細胞のみが生き残る。選択のための遺伝子は、一般に、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびグルタミン合成酵素（ＧＳ）のような細胞増殖に決定的に重要な経路で代謝物を産生するのに不可欠な酵素をコードするものである。双方の場合に、選択は適切な代謝物（ＤＨＦＲの場合ヒポキサンチンおよびチミジン、ＧＳの場合グルタミン）の非存在下で起こり、非形質転換細胞の増殖を予防する。別の形態の選択遺伝子は、毒性物質の存在に対し細胞に抵抗性を賦与することができるタンパク質をコードするものである。こうした系の一例は、選択培地がミコフェノール酸、ヒポキサンチンおよびキサンチンを含有しかつマーカー遺伝子がＧＰＴ（グアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ）であるＭＨＸである。一般に、組換えタンパク質の効率的発現のために、生物製剤をコードする遺伝子（１種若しくは複数）および選択遺伝子が同一プラミド上にあるかどうかは重要でない。トランスフェクトーマの限界希釈クローニングの方法によることができる選択後に、生存体を単一細胞として第二の培養容器に移し、そして培養物を増殖させてクローン集団（クローン）を生じる。最終的に個々のクローンを組換えタンパク質発現について評価し、最高産生体をさらなる培養および分析のため保持する。これらの候補から、適切な増殖および生産性の特徴をもつ１細胞株を、方法開発および組換えタンパク質の製造のため選ぶ。その後、生産の必要性により決定される培養方法を確立する。
【００２７】
本発明の記述されるところのいかなる化学選択方法も生き残ったトランスフェクトした宿主細胞すなわちトランスフェクトーマの評価若しくはスクリーニング方法は、細胞の培養、および該トランスフェクトされた遺伝子によりコードされる抗体タンパク質が培地中に分泌される期間に存在する抗体鎖の１種若しくはそれ以上をコードするｍＲＮＡの定量
方法の使用を含んでなる。治療的タンパク質の宿主細胞へのトランスフェクション後に、一組の初代トランスフェクトーマを場合によっては最初にスクリーニングすることができ、そして培地中の分泌された抗体濃度の量（力価）若しくは高生存率のような優れた増殖特性に従って分類しうる。典型的な細胞株開発の努力において、およそ６００〜１０００の初代トランスフェクトーマを抗体力価についてスクリーニングし、そして約５０トランスフェクトーマをそれらのクローンの子孫のさらなる研究のため選択する。例えば、クローンは、２×１０５細胞／ｍｌを播種すること、振とうしながら３７℃で７日間若しくは生存率が１０％以上下落するまでのいずれか早いほうまでインキュベートすることにより、１２５ｍｌ振とうフラスコ中の５０ｍｌ培養物として増殖しうる。その時点で、比濁法、およびＡｂ特異的抗原若しくはウサギ抗ヒトポリクローナル抗体のような結合試薬を使用して、培養液中のＡｂ濃度を測定し得る。比濁計はサンプルの前方光散乱により免疫化学複合体を検出する。
【００２８】
本発明の方法により、抗体鎖ｍＲＮＡスクリーニングをトランスフェクトーマに適用する。本発明の方法のＨ鎖ｍＲＮＡスクリーニングは、抗体を産生しかつ培地中に分泌する細胞中のトランスフェクトされた遺伝子のメッセージ（すなわちＨおよびＬ鎖ｍＲＮＡ）の定量方法である。該方法の一態様において、トランスフェクトされた遺伝子のｍＲＮＡの検出方法は迅速ハイスループット定量的ＰＣＲ法である。本発明の一実施方法において、下で本明細書に提供される実施例に記述されるプロトコルおよび手順をスクリーニングに使用しうる。本発明の方法の一態様において、トランスフェクトされた遺伝子のｍＲＮＡの測定を、全トランスフェクトーマと比較して優れた抗体力価を示すトランスフェクトーマに適用する。
【００２９】
トランスフェクトされた抗体遺伝子のｍＲＮＡによるトランスフェクトーマおよびそれらの子孫のスクリーニング方法を記述したので、治療的抗体製造に適する工作された宿主細胞株の適する１クローンを開発するために消費されなければならない努力、工数、実時間およびバイオリアクター空間と一緒に、バイオリアクター中の試験されるべき候補クローン株の数が、大きく低下されることができることが明らかであろう。
【００３０】
抗体
抗体クラス（アイソタイプとしてもまた知られる）はＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧである）。抗体は、２本の同一のＬ鎖および２本の同一のＨ鎖から構成される約１５０，０００ダルトンの基本的なヘテロ四量体糖タンパク質を含んでなる特化した免疫グロブリン分子である。ＩｇＧクラスの抗体は２本のＨ鎖および２本のＬ鎖を含んでなる。各鎖は定常領域（Ｃ）および可変領域（Ｖ）を有する。各鎖は一連のドメインに組織化されている。Ｌ鎖はＣＬ領域およびＶＬ領域に対応する２ドメインを有する。Ｈ鎖は４ドメインすなわちＶＨ領域に対応する１個ならびにＣ領域の３ドメイン（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）を有する。各ＨおよびＬ鎖は規則的に間隔を空けられた鎖内ジスルフィド架橋もまた有する。ヒトＩｇＧ抗体中で、Ｌ鎖の定常ドメインはＨ鎖の第一の定常ドメインと並置され、また、Ｌ鎖可変ドメインはＨ鎖の可変ドメインと並置される。特定のアミノ酸残基がＬおよびＨ鎖可変ドメインの間の非共有界面を形成すると考えられる（Ｃｌｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６、６５１−６６、１９８５）；ＮｏｖｏｔｎｙとＨａｂｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２  ４５９２−４５９６（１９８５）。２本のＨ鎖は、ヒンジとして知られるＨ鎖中のドメイン間領域でジスルフィド結合により相互接続されている。加えて、抗体は、配列類似性、とりわけ定常ドメイン中のものにより賦与される生物物理学的および生物学的特性に基づき、サブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４にさらにタイプ分けすなわち分類されうる。
【００３１】
抗体は、限定されるものでないがヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類を
挙げることができるいずれかの哺乳動物若しくはそれらのいずれかの組合せを包含若しくはそれらに由来し得、そして単離されたヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳動物、キメラ、ヒト化および／若しくはＣＤＲ移植抗体、免疫グロブリン、切断生成物、ならびにそれらの他の指定される部分およびバリアントを包含する。抗体は当該技術分野で公知のいくつかの方法で製造し得る。一局面において、抗体はマウスを標的タンパク質、そのバリアント若しくはフラグメントで免疫することにより製造されるハイブリドーマから便宜的に得られる。抗体は従って当該技術分野で公知のハイブリドーマ技術のいずれかを使用して得ることができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８７−２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９４−２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆
Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、（１９９７−２００１）（それぞれ引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる）を参照されたい。目的の抗体のＨおよびＬ鎖をコードする遺伝子をその後、当業者に公知の技術によりハイブリドーマ細胞株から単離し得る。
【００３２】
ｍＲＮＡの定量方法
ＲＮＡ調製物中の特定の配列は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００４．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｂｒｏｗｎら”Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｂｙ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
ａｎｄ  Ｓｌｏｔ  Ｂｌｏｔ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”ＵＮＩＴ  ４．９に記述されるところの、元はＤＮＡのために開発されたもの（サザンブロッティング）に非常に類似の技術を使用するブロッティングおよびハイブリダイゼーション分析により検出し得る。分画したＲＮＡをアガロースゲルからメンブレン支持体に移し（ノーザンブロッティング）；未分画ＲＮＡをスロット若しくはドットブロッティングにより固定する。生じるブロットを、標識ＤＮＡ若しくはＲＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーション分析により研究する。ＲＮＡスロットブロッティングは、ナイロン若しくはニトロセルロースメンブレン上の未分画ＲＮＡの固定を可能にする単純な技術である。ハイブリダイゼーション分析をその後実施して、ブロットしたサンプル中の標的ｍＲＮＡ配列の相対的豊富さを決定する。該技術はＤＮＡドットおよびスロットブロッティング手順に基づき、大きな差違はサンプルを固定前に変性する方法である。
【００３３】
ＲＮアーゼ保護を使用して混合物中の特定のＲＮＡの量を測定し得る。標識一本鎖プローブへのＲＮＡのハイブリダイゼーションは一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化からそれを保護する。保護される領域の大きさはゲル電気泳動により決定し得る。
【００３４】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、１ＤＮＡコピーを逆転写酵素によりＲＮＡから最初に作成し、その後該反応をＰＣＲにかける、ポリメラーゼ連鎖反応の変法である。ＲＮＡを定量するのに使用するため、内部対照を有しなければならない。リボソーム１８Ｓ  ＲＮＡのｍＲＮＡをしばしば内部標準として使用する。
【００３５】
１若しくは複数種のｍＲＮＡの定量は、マイクロアレイ、マクロアレイ、遺伝子チップ、ＳＡＧＥ法（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ＲＴ−ＰＣＲおよびＥＳＴ配列決定のような技術を使用してもまた達成しうる。こ
れらの技術は、一方の、別のものすなわち抗体発現のような単一過程に関係付けるためにその発現レベルが集合的に同定されている遺伝子との既知の関係を有しうる一組の遺伝子のモニタリングにおいて役立ちうるデータを生じる。これらのデータはハイスループット環境でしばしば収集され、個体の状態若しくは処置、組織、または疾患状態、あるいはクローンに独特である個々の発現プロファイルを提供する。該結果の解釈は、データを解析するための多様な技術およびそれらを保存かつ可視化するのに利用可能なコンピュータツールの双方の理解を必要とする（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００３  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｇｒｅｗａｌら”Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｄａｔａ：Ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ”．Ｕｎｉｔ  ７．１）。
【００３６】
「Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ｂＤＮＡシグナル増幅キット」としてＣｈｉｒｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃからもまた入手可能なｂＤＮＡアッセイ（Ｕｒｄｅａら  １９８７．Ｇｅｎｅ  ６１：２５３−２６４；Ｋｅｒｎら  １９９６．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：３１９６−３２０２；Ｃｏｌｌｉｎｓら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２９７９−２９８４）、および核酸捕捉アッセイ（ＮＡＣＡ）（Ｔｓａｉら、２００３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３１（６）：ｅ２５−３１）のような、特定のｍＲＮＡの特定の型の感受性ハイスループット検出方法が記述されている。
【００３７】
本発明の方法で実施されるとおり、工作された細胞株、トランスフェクトーマ若しくはそのクローン中のＨ鎖抗体遺伝子のｍＲＮＡの定量方法は、おそらく、当該技術分野で記述されかつ既知の多様な方法により実施される。本発明の方法は、抗体製造の目的上高産生細胞株であろう細胞を選択するためのＨ鎖抗体遺伝子のｍＲＮＡの使用に関する。
【００３８】
本発明は以下の実施例を参照してさらに記述される。これらの実施例は単に本発明の局面を具体的に説明するためでありかつ本発明の制限として意図していない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＨおよびＬ鎖発現のための発現構築物の図解を示す。すなわちＡ）Ｌ鎖発現ベクター（１２．４ｋｂ）およびＨ鎖発現ベクター（１７．８ｋｂ）。
【図２】Ｓｐ２／０で抗体＃３（Ａ）および抗体＃１（Ｂ）を発現する細胞株の抗体力価とＬおよびＨ鎖転写物のコピー数の間の関係を示す。
【図３】Ｓｐ２／０で抗体＃５（Ａ）および抗体＃７（Ｂ）を発現する細胞株の抗体力価とＬおよびＨ鎖転写物のコピー数の間の関係を示す。
【図４】検査した細胞株の抗体力価とＨ鎖（Ａ）およびＬ鎖（Ｂ）転写物のコピー数の間の関係を示す。大部分の細胞株の力価およびコピー数測定の標準偏差を表２に示す。
【図５】Ａｂ生産性との抗体Ｈ鎖（Ａ）およびＬ鎖のｍＲＮＡ（Ｂ）の間の相関を示す。
【実施例１】
【００４０】
骨髄腫産生細胞株の開発
図１は本研究で使用される産生細胞株の開発に使用したマウス／ヒトキメラＨおよびＬ鎖Ａｂ遺伝子をコードする典型的な発現構築物を示す。キメラＡｂは、ヒトκ  Ｌ鎖およびＩｇＧ１  Ｈ鎖の定常領域の上流にそれぞれマウスＨおよびＬ鎖可変領域を（それらの連続する免疫グロブリンプロモーターと一緒になって）クローン化することにより構築し
た。ＪおよびＣ領域の間に配置されるＨおよびＬ鎖双方のヒト免疫グロブリンエンハンサーを構築物のそれぞれに包含した。ミコフェノール酸耐性マーカー（ｇｐｔ遺伝子）が優性選択マーカーとして双方の構築物中に存在した。
【００４１】
産生細胞株を開発するため、ＨおよびＬ鎖構築物をマウス骨髄腫宿主細胞株Ｓｐ２／０若しくはＣＤ−Ｓｐ２／０（既知組成培地適合Ｓｐ２／０）またはＡｇＸ６５３にコトランスフェクトした。多数のＭＨＸ（（ミコフェノール酸（０．５ｍｇ／Ｌ）、ヒポキサンチン（２．５ｍｇ／Ｌ）およびキサンチン（５０ｍｇ／Ｌ））耐性クローンをＡｂ生産性についてスクリーニングし、そして初代クローン（トランスフェクトーマ）を複数回のサブクローニングに選択した。生成物力価のさらなる改良が達成可能でなかった場合にサブクローニングの過程を終了した。表Ｉは初代トランスフェクトーマおよび本研究で選択したそれらのサブクローンを列挙する。７日振とうフラスコ培養から得た各細胞株のＡｂ力価を表１に包含する。利用可能な場合は産生細胞株開発の過程の間に生成された中間クローンを表２に列挙する。これらの場合に、力価の倍数増大（ｆｏｌｄ−ｉｎｃｒｅａｓｅ）ならびにＨおよびＬ鎖転写物レベルを測定するため選ばれた細胞株が太字である。
【００４２】
表１に示されるとおり、初代トランスフェクトーマのあいだでＡｂ力価にかなりの差違が存在した。例えば、細胞株Ｃ１８は、類似の培養条件下で１５８．６±１３．７ｍｇ／Ｌを発現した細胞株Ｃ１２８Ｂに比較して１１．３±１．８ｍｇ／Ｌのみ発現した。この差違は、対応する免疫グロブリンプロモーターの強度の差違に部分的に帰すことができる。サブクローニングに際して、Ａｂ力価が２ないし７倍高められた初代トランスフェクトーマの１サブセットが発見された一方、他のクローンはそれらの力価を増大しなかったかもしくはそれらをわずかに増大した（表１）。高Ａｂ力価を伴う初代トランスフェクトーマの力価の増大の欠如は理解可能である（例えば、Ｃ１２８Ｂ、１５８．６±１３．７ｍｇ／Ｌ）一方、非常に低力価を伴うＣ１８のような初代トランスフェクトーマがサブクローニングに際してＡｂ力価の有意の増大を示さなかった（Ｃ６２、２１．０±３．９ｍｇ／Ｌ）理由は明確でない。
【００４３】
【表１】
2010517530.tif 000003
【００４４】
クローン性Ａｂの発現レベルの予測因子を見出すために、様々な抗体発現レベルを伴う３０種の抗体発現細胞株をＨおよびＬ鎖ｍＲＮＡ発現レベルについて分析した。各細胞株を融解し、そして、振とうフラスコ中、５％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）、６ｍＭグルタミンおよびＭＨＸ（全部Ｓｉｇｍａから）を補充したＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＩＭＤＭ＋５％ＦＢＳ）若しくは６ｍＭグルタミンおよびＭＨＸを補充したＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＣＤ−Ｈｙｂ）いずれか中で３継代培養した。およそ１×１０７細胞を指数増殖期に収集し、そしてＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することにより全ＲＮＡを調製した。ＲＮＡを分光測光法により定量し、そしてＬａｂ−ｏｎ  ａ−ｃｈｉｐ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してその質を決定した。２マイクログラムの全ＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびプライマーとしてのオリゴｄＴを使用するｃＤＮＡ製造に使用した。７日振とうフラスコ培養物の抗体力価は、抗ヒトＡｂを検出剤として使用する（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）比濁法（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｒｒａｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）により推定した。
【００４５】
Ｃ１７５Ａ、１７５−５３、１７５−８８およびＣ１７５Ｈ細胞株（全部Ａｂ＃１を発現する）ならびにＣ１６８Ａ、Ｃ１６８Ｄ、Ｃ１６８ＥおよびＣ１６８Ｊ細胞株（全部Ａｂ＃３を発現する）の指数培養物を全ＲＮＡの単離のため収集し、消費済み培地中のＡｂ力価を測定するため７日間のさらなるインキュベーションのためアリコートを保持した。これらのＲＮＡサンプルからのｃＤＮＡを使用してＨおよびＬ鎖転写物のコピー数を決定した。既知濃度のＨおよびＬ鎖発現プラスミドＤＮＡ（図１）を使用して標準曲線を生成した。
【００４６】
抗体＃５を発現するＣ１１６ＡおよびＣ１１６Ｅ細胞株ならびに抗体＃７を発現するＣ
２．３２０およびＣ４６６Ｄ細胞株の指数培養物を全ＲＮＡの単離のため収集し、消費済み培地中のＡｂ力価を測定するため７日間のさらなるインキュベーションのためのアリコートを保持し、そして上述されるとおり処理した。
【００４７】
ＨおよびＬ鎖ｍＲＮＡのコピー数を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７０００装置を使用するＱＰＣＲ法により測定した。プライマーおよびＴａｑｍａｎプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアプログラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してヒトκ定常領域およびヒトγ−１定常領域から設計した。多様なプライマーおよびＴａｑｍａｎプローブの配列を下に示す。
Ｌ鎖プローブ／プライマー：
フォワード：５’ＣＣＴ  ＧＡＣ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＣＡＡ  ＡＧＣ  Ａ（配列番号１）リバース：５’ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＡＴＧ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  Ｔ（配列番号２）
ｑＰＣＲプローブ：５’ＡＣＴ  ＡＣＧ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＡＡＧ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  ＣＣＴ  ＧＣＧ（配列番号３）
Ｈ鎖プローブ／プライマー：
フォワード：５’ＴＧＴ  ＣＣＴ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＡＧＧ  ＡＣＴ  ＣＴＡ  ＣＴＣ（配列番号４）
リバース：５’ＴＧＡ  ＴＴＣ  ＡＣＧ  ＴＴＧ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＴＡＧ  ＧＴ（配列番号５）
ｑＰＣＲプローブ：５’ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＧＴＧ  Ｃ（配列番号６）
【００４８】
いくつかの実験で、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のプライマーおよびプローブの組（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してサンプル間変動を正規化した。ＧＡＰＤＨの蛍光標識はＶＩＣであり、また、ＨおよびＬ鎖プローブについて、それはＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）であった。全部の場合で、蛍光クエンチャー色素はＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）であった。各ＱＰＣＲ反応は、５０μｌの総容量中に１０ナノグラムのｃＤＮＡ、１００ｎＭのｑＰＣＲプライマー、２００ｎＭのフォワードおよびリバースプライマーのそれぞれ、２×ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含有した。ＰＣＲ反応は９０℃で１０分間の初期インキュベーションにより変性し、次いで９０℃で０．１５秒間および６０℃４５秒間インキュベーションした。最後の２段階を４０周期反復した。
【００４９】
ＨおよびＬ鎖のコピー数の代替測定方法すなわちＲＮＡアーゼ保護アッセイを、Ａｍｂｉｏｎから購入したキットを使用して、選択した細胞株で実施した。
【００５０】
既知量のＨおよびＬ鎖発現構築物（図１）を使用してそれぞれのコピー数標準曲線を生成した。これらの標準曲線を使用して、各細胞株のＨおよびＬ鎖転写物のコピー数を決定した（表２）。これらの細胞株は単一のＨおよびＬ鎖ｍＲＮＡ種のみを有することが示されている（Ｌｏｏｎｅｙら、１９９２およびＫｎｉｇｈｔら、１９９３）ため、本研究でＱＰＣＲにより測定されるＨ鎖およびＬ鎖ｍＲＮＡのレベルは、完全長Ｈ鎖およびＬ鎖転写物のレベルを正確に反映する。表２に提示されるデータは、サブクローンの（それらの初代クローンと比較した）抗体力価の増大が、Ｈ鎖およびＬ鎖ｍＲＮＡレベルの増大に部分的によったことを示唆し；より高発現体は１０ｎｇのｃＤＮＡあたりそれぞれおよそ１．０×１０７および１．５×１０７コピーのＨおよびＬ鎖を伴った。一般に、Ｌ鎖ｍＲＮＡのレベルは細胞株の大多数でＨ鎖のレベルと比較してより高く、また、それらのレベルの差違はそれらの差別的安定性によらなかった。本研究で試験した全細胞株から生成されるデータは、抗体産生性とのＬおよびＨ鎖転写物レベルの相関が存在したことを示唆し、相関係数はＬ鎖について０．５９およびＨ鎖について０．８１であった。
【００５１】
【表２】
2010517530.tif 000004
【００５２】
要するに、図２および表１は、初代トランスフェクトーマのサブクローニングが、ＨおよびＬ鎖転写物のコピー数の付随する増大を伴いＡｂ生産性の大きな改善に至ったＡｂ発現細胞株の例を示す。例えば、Ａｂ＃３の場合（図２Ａ）、ＨおよびＬ鎖ｍＲＮＡのレベルは、初代トランスフェクトーマおよびそのサブクローンを比較した場合にそれぞれ１．８倍および５．１倍増大した。力価を分析した場合、サブクローンＣ１６８Ｄは初代トランスフェクトーマＣ１６８Ａに比較して約７倍より多いＡｂを産生した。この組の全細胞株で、Ｌ鎖転写物はＨ鎖のものより豊富であった（より高発現細胞株の１種Ｃ１６８Ｅで約６．５倍より豊富）。
【００５３】
Ａｂ＃１の場合（図２Ｂ）、力価は、最終サブクローンＣ１７５Ｈで、初代トランスフェクトーマＣ１７５Ａのものと比較した場合に３．１倍まで増大した一方、Ｈ鎖およびＬ
鎖転写物のレベルはそれぞれ係数２および２．４増大した。Ａｂ＃３産生細胞株について見られるとおり、Ｌ鎖転写物はこの組の全細胞株についてＨ鎖転写物のものより豊富であった（中間細胞株の１種１７５−２で３．１倍までより豊富）。
【００５４】
全細胞株をＡｂ生産性の順序で等級付けする場合（図４および表２）、われわれは、一般にＬ鎖がＨ鎖より有意により豊富であり、かつ、ＨおよびＬ鎖転写物のＡｂ生産性との相関が存在することを見出す。（表２からのデータをプロットする）図５は、Ｌ鎖の相関係数が０．５９である一方、Ｈ鎖のものについてそれが０．８１であることを示す。
【実施例２】
【００５５】
ＨおよびＬ鎖転写物の安定性
細胞株Ｃ１６８Ｊが、Ｈ鎖転写物レベルに対するＬ鎖の最高の比を有したため、それをＨ鎖およびＬ鎖ｍＲＮＡの安定性を比較するための代表的細胞株として選択した。この細胞株を、５μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ）を含有する増殖培地中で４８時間培養した。指定された時点（表２）で５×１０６細胞を取り出してＨおよびＬ鎖転写物の量を測定した。高度に安定な１８Ｓ  ＲＮＡおよびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ（それぞれ６７および２４時間の半減期（Ｌｅｋａｓら、２０００およびＮｗａｇｗｕとＮａｎａ、１９８０））を対照として使用した。ＱＰＣＲによる１８Ｓ  ＲＮＡレベルの推定に使用した試薬はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【００５６】
ＨおよびＬ鎖ｍＲＮＡの差別的レベルがそれらの差別的安定性によるかどうかを決定するため、これら２転写物の半減期を、比較的より安定であることが既知であるハウスキーピング遺伝子転写物ＧＡＰＤＨおよび１８Ｓ  ＲＮＡのものと比較した（Ｌｅｋａｓら、２０００およびＮｗａｇｗｕとＮａｎａ、１９８０）。Ｃ１６８Ｊ細胞株を、新生ｍＲＮＡ合成を阻害するためアクチノマイシンＤの存在および非存在下で４８時間増殖させ、そして指定された時点（表ＩＩＩを参照されたい）で収集した細胞サンプル中の該４転写物のそれぞれのレベルを、実施例１に記述されるところのＱＰＣＲにより測定した。
【００５７】
表３に要約されるとおり、Ｌ鎖転写物の安定性はＨ鎖転写物およびＧＡＰＤＨ転写物のものに類似であることが見出された。これは、Ｃ１６８ＪでのＨ鎖転写物のものに比較してのＬ鎖転写物の豊富さがその差別的安定性の結果によらなかったことを示す。
【００５８】
【表３】
2010517530.tif 000005
【図１】
2010517530.tif 000006
【図２】
2010517530.tif 000007
【図３】
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【図４Ａ】
2010517530.tif 000009
【図４Ｂ】
2010517530.tif 000010
【図５】
2010517530.tif 000011
【配列表】
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【国際調査報告】
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2010517530.tif 000013
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