(57)【要約】抗凝固剤と組み合わせたか又は組み合わせていない、実質的に活性を有さない、特に抗凝固活性を有さない変異アンチトロンビンの、血液凝固異常と関連するか又はそれに伴う病変の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗凝固剤と組み合わせたか又は組み合わせていない、実質的に活性を有さない、特に抗凝固活性を有さない変異アンチトロンビンの、血液凝固異常と関連するか又はそれに伴う病変の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための使用。
【請求項２】
抗凝固剤と組み合わせた請求項1に記載の変異アンチトロンビンの使用であって、前記抗凝固剤の副作用に起因する出血性障害及び関連する病変の治療又は予防を意図する薬剤の製造のための使用。
【請求項３】
前記変異アンチトロンビンが、前記抗凝固剤に結合し、かつ特にインビボで、血漿アンチトロンビンと前記抗凝固剤との結合をシフトする能力を有する請求項1又は2に記載の使用。
【請求項４】
前記変異アンチトロンビンのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するアンチトロンビン変異体と組み合わせた請求項2又は3に記載の変異アンチトロンビンの使用であって、前記変異アンチトロンビンが、特にインビボで、血漿アンチトロンビンと前記抗凝固剤との結合をシフトする能力と、特にインビボで、前記アンチトロンビン変異体と前記抗凝固剤との結合をシフトする能力とを有する使用。
【請求項５】
前記変異アンチトロンビンが、第Xa因子阻害活性及びトロンビン阻害活性を実質的に喪失している請求項1〜4のいずれか1項に記載の使用。
【請求項６】
所定のイオン強度、特に生理的イオン強度での前記変異アンチトロンビンと前記抗凝固剤との結合に起因する複合体の解離平衡定数(Kd)の値が、血漿アンチトロンビンと前記抗凝固剤との複合体のKdの値と同様であるか又はそれより低い請求項2〜5のいずれか1項に記載の使用。
【請求項７】
所定のイオン強度、特に生理的イオン強度での前記変異アンチトロンビンと前記抗凝固剤との結合に起因する複合体のKdの値が、前記アンチトロンビン変異体と前記抗凝固剤との複合体のKdの値と同様であるか又はそれより低い請求項4〜6のいずれか1項に記載の使用。
【請求項８】
前記抗凝固剤が、ヘパリン、ヘパリン誘導体、特に未分画ヘパリン、低分子量ヘパリン、抗凝固剤ペンタサッカライド(フォンダパリヌックス)及びその誘導体(イドラパリヌックス:SANORG 34006)、並びにヘパリノイド(ダナパロイドナトリウムORG 10172)から選択される請求項1〜7のいずれか1項に記載の使用。
【請求項９】
血液凝固異常に関連するか又はそれに伴う病変が、肺塞栓症、深部静脈血栓症、心筋梗塞、不安定狭心症、卒中、播種性血管内凝固のような動脈又は静脈の血栓性障害、並びにFVIII 欠損(血友病A)、FIX欠損(血友病B)、FVII欠損、FX欠損、FXI欠損、FII欠損、vWF欠損のような出血性障害、これらの凝固因子に対する獲得性抗体、フィブリン溶解異常、血小板異常、播種性血管内凝固、並びにこれらの欠陥又は異常の組み合わせに伴う任意の病変である請求項1〜8のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１０】
前記変異アンチトロンビンが、380位のアミノ酸から400位のアミノ酸までの領域内、特に380位のアミノ酸から397位のアミノ酸までの領域内、特に390位のアミノ酸から394のアミノ酸までの領域内、特に393位に少なくとも1つの変異を含み、前記アミノ酸の番号付けが、配列番号2のアンチトロンビンアミノ酸配列に関し、前記変異が置換、挿入又は欠失である請求項1〜9のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１１】
前記変異アンチトロンビンが、96位、135位、155位又は192位、特に135位のアミノ酸のグリコシル化部位にて少なくとも1つの変異を含む請求項10に記載の使用。
【請求項１２】
前記変異アンチトロンビンが：
-     配列番号4、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換を含み、
-     配列番号6、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入を含み、
-     配列番号8、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸の欠失を含み、及び
-     配列番号10、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸の欠失を含む、
からなる群より選択されるアミノ酸配列である請求項10又は11に記載の使用。
【請求項１３】
前記変異アンチトロンビンが：
-     配列番号14、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換と、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含み、
-     配列番号16、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入と、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含み、
-     配列番号18、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位及び394位のアミノ酸の欠失を含み、
-     配列番号20、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸の欠失と、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含み、
-     配列番号22、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸の欠失と、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含み、及び
-     配列番号24、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位及び394位のアミノ酸の欠失と、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含む、
からなる群より選択されるアミノ酸配列である請求項10又は11に記載の使用。
【請求項１４】
前記変異アンチトロンビンが、412位のアミノ酸から432位のアミノ酸までの領域内、特に412位のアミノ酸から429位のアミノ酸までの領域内、特に422位のアミノ酸から426位のアミノ酸までの領域内、特に425位に少なくとも1つの変異を含み、前記アミノ酸の番号付けが、配列番号26で表されるシグナルペプチドを含むアンチトロンビンアミノ酸配列に関し、前記変異が置換、挿入又は欠失である請求項1〜9のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１５】
前記変異アンチトロンビンが、128位、167位、187位又は224位、特に167位のアミノ酸のグリコシル化部位にて少なくとも1つの変異をさらに含む請求項14に記載の使用。
【請求項１６】
前記変異アンチトロンビンが：
-     配列番号28、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換を含み、
-     配列番号30、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入を含み、
-     配列番号32、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸の欠失を含み、及び
-     配列番号34、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸の欠失を含む
からなる群より選択されるアミノ酸配列である請求項14又は15に記載の使用。
【請求項１７】
前記変異アンチトロンビンが：
-     配列番号38、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換と、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含み、
-     配列番号40、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入と、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含み、
-     配列番号42、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位及び426位のアミノ酸の欠失を含み、
-     配列番号44、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸の欠失と、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含み、
-     配列番号46、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸の欠失と、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含み、及び
-     配列番号48、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位及び426位のアミノ酸の欠失と、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含む、
からなる群より選択されるアミノ酸配列である請求項14又は15に記載の使用。
【請求項１８】
実質的に活性を有さず、特に抗凝固活性を有さない少なくとも1つの変異アンチトロンビンと、少なくとも1つの化合物、特に抗凝固剤とを含む、前記抗凝固剤の副作用に起因する出血性障害及び関連する病変の予防又は治療における別々又は逐次的な使用のための組み合わせ製品としての製品。
【請求項１９】
前記変異アンチトロンビンが、抗凝固剤と結合し、かつ特にインビボにおいて、血漿アンチトロンビンと前記抗凝固剤との結合をシフトする能力を有する請求項18に記載の製品。
【請求項２０】
前記変異アンチトロンビンが、特にインビボにおいて、血漿アンチトロンビンと前記抗凝固剤との結合をシフトする能力と、特にインビボにおいて、アンチトロンビン変異体と前記抗凝固剤との結合をシフトする能力とを有する請求項18又は19に記載の製品。
【請求項２１】
前記変異アンチトロンビンが、第Xa因子阻害活性及びトロンビン阻害活性を実質的に喪失している請求項18〜20のいずれか1項に記載の製品。
【請求項２２】
所定のイオン強度、特に生理的イオン強度での前記変異アンチトロンビンと前記抗凝固剤との結合に起因する複合体の解離平衡定数(Kd)の値が、血漿アンチトロンビンと前記抗凝固剤との複合体のKdの値と同様であるか又はそれより低い請求項18〜21のいずれか1項に記載の製品。
【請求項２３】
所定のイオン強度、特に生理的イオン強度での前記変異アンチトロンビンと前記抗凝固剤との結合に起因する複合体のKdの値が、前記アンチトロンビン変異体と前記抗凝固剤との複合体のKdの値と同様であるか又はそれより低い請求項20〜22のいずれか1項に記載の製品。
【請求項２４】
前記抗凝固剤が、ヘパリン、ヘパリン誘導体、特に未分画ヘパリン、低分子量ヘパリン、抗凝固剤ペンタサッカライド(フォンダパリヌックス)及びその誘導体(イドラパリヌックス:SANORG 34006)、並びにヘパリノイド(ダナパロイドナトリウムORG 10172)から選択される請求項18〜23のいずれか1項に記載の製品。
【請求項２５】
血液凝固異常が、肺塞栓症、深部静脈血栓症、心筋梗塞、不安定狭心症、卒中、播種性血管内凝固のような動脈又は静脈の血栓性障害、並びにFVIII 欠損(血友病A)、FIX欠損(血友病B)、FVII欠損、FX欠損、FXI欠損、FII欠損、vWF欠損のような出血性障害、これらの凝固因子に対する獲得性抗体、フィブリン溶解異常、血小板異常、播種性血管内凝固、並びにこれらの欠陥又は異常の組み合わせに伴う任意の病変である請求項18〜24のいずれか1項に記載の製品。
【請求項２６】
前記変異アンチトロンビンが：
-     配列番号4、
-     配列番号6、
-     配列番号8及び
-     配列番号10
からなる群より選択されるアミノ酸配列である請求項18〜25のいずれか1項に記載の製品。
【請求項２７】
前記変異アンチトロンビンが：
-     配列番号14、
-     配列番号16、
-     配列番号18、
-     配列番号20、
-     配列番号22及び
-     配列番号24
からなる群より選択されるアミノ酸配列である請求項18〜25のいずれか1項に記載の製品。
【請求項２８】
前記変異アンチトロンビンが：
-     配列番号28、
-     配列番号30、
-     配列番号32及び
-     配列番号34
からなる群より選択される請求項18〜25のいずれか1項に記載の製品。
【請求項２９】
前記変異アンチトロンビンが：
-     配列番号38、
-     配列番号40、
-     配列番号42、
-     配列番号44、
-     配列番号46及び
-     配列番号48
からなる群より選択される請求項18〜25のいずれか1項に記載の製品。
【請求項３０】
抗凝固剤なしでの、実質的に活性を有さない、特に抗凝固活性を有さない変異アンチトロンビンの、血液凝固異常と関連するか又はそれに伴う病変の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための使用。
【請求項３１】
配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内で、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間にアミノ酸挿入を少なくとも含有する、特にプロリン(Pro)の挿入を含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号6で表される変異アンチトロンビン。
【請求項３２】
配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内で、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間にアミノ酸挿入を少なくとも含有する、特にプロリン(Pro)の挿入を含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号30で表される変異アンチトロンビン。
【請求項３３】
配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内で、393位のアミノ酸のアミノ酸欠失を少なくとも含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号8で表される変異アンチトロンビン。
【請求項３４】
配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内で、425位のアミノ酸のアミノ酸欠失を少なくとも含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号32で表される変異アンチトロンビン。
【請求項３５】
配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内で、394位のアミノ酸のアミノ酸欠失を少なくとも含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号10で表される変異アンチトロンビン。
【請求項３６】
配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内で、426位のアミノ酸のアミノ酸欠失を少なくとも含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号34で表される変異アンチトロンビン。
【請求項３７】
少なくとも2つの変異：
-     第1変異は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内での、393位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換であり、第2変異は、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号14で表され、
-     第1変異は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内での、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入であり、第2変異は、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号16で表され、
-     第1変異は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内での、393位のアミノ酸の欠失であり、第2変異は、394位のアミノ酸の欠失であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号18で表され、
-     第1変異は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内での、393位のアミノ酸の欠失であり、第2変異は、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号20で表され、
-     第1変異は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内での、394位のアミノ酸の欠失であり、第2変異は、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号22で表され、又は
-     第1変異は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内での、393位のアミノ酸の欠失であり、第2変異は、394位のアミノ酸の欠失であり、第3変異は、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号24で表される
を含有する変異アンチトロンビン。
【請求項３８】
少なくとも2つの変異：
-     第1変異は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内での、425位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換であり、第2変異は、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号38で表され、
-     第1変異は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内での、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入であり、第2変異は、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号40で表され、
-     第1変異は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内での、425位のアミノ酸の欠失であり、第2変異は、426位のアミノ酸の欠失であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号42で表され、
-     第1変異は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内での、425位のアミノ酸の欠失であり、第2変異は、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号44で表され、
-     第1変異は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内での、426位のアミノ酸の欠失であり、第2変異は、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号46で表され、又は
-     第1変異は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内での、425位のアミノ酸の欠失であり、第2変異は、426位のアミノ酸の欠失であり、第3変異は、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号48で表される
を含有する変異アンチトロンビン。
【請求項３９】
請求項31〜38のいずれか1項で規定される変異アンチトロンビンをコードする、特に配列番号5、7、9、13、15、17、19、21、23、29、31、33、37、39、41、43、47からなる群より選択されるヌクレオチド配列。
【請求項４０】
有効成分として、請求項31〜38のいずれか1項で規定される変異アンチトロンビン、特に配列番号6、8、10、14、16、18、21、22、24、30、32、34、38、40、42、44、46、48の変異アンチトロンビンを、医薬的に許容されるビヒクルと組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項４１】
有効成分として、配列番号4、12、28又は36の変異アンチトロンビンを、医薬的に許容されるビヒクルと組み合わせて含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固異常を治療又は予防するための変異アンチトロンビンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンチトロンビンは、血液の流動性の維持において必須の役割を演じる。血液凝固は、一連のセリンプロテアーゼにより媒介される。アンチトロンビンは、第VIIa因子、第IXa因子、第Xa因子、第XIa因子、第XIIa因子及び第IIa因子(トロンビン)の強力な阻害物質である。
【０００３】
過剰の凝固を防ぐことにおけるアンチトロンビンの生理的重要性は、アンチトロンビンのレベルが遺伝的又は後天的な欠陥により減少している個体の研究により明らかにされている。このような人々は、自発的血栓症の傾向があり、播種性血管内凝固、心筋梗塞、脳血管発作及び肺塞栓症の危険性を伴う傾向がある。
【０００４】
抗凝固剤(ヘパリン、ペンタサッカライドフォンダパリヌックス(Fondaparinux) Arixtra (登録商標)及びペンタサッカライド誘導体)の治療による投与が、血餅の形成及び血液中に存在する血餅の拡大を妨げ、よって、静脈血栓塞栓症の臨床上の予防及び管理に有用であることが公知である。
【０００５】
アンチトロンビンの抗凝固効果は、ヘパリン及び誘導体、特にペンタサッカライドにより増強され、これは阻害物質-プロテアーゼ複合体形成の速度を大きく増大させる。
ヘパリン分子の構造中の、高い親和性でアンチトロンビンに結合でき、アンチトロンビンの活性コンホメーション変化を誘導できる特定のペンタサッカライド部分のおかげで、ヘパリン分子のフラクションのみが上記の観点で機能的である。
【０００６】
アンチトロンビン、及び上記のペンタサッカライドと複合体を形成したアンチトロンビンの結晶構造により、阻害物質のアロステリック部位に結合しているペンタサッカライドが、阻害物質表面上の反応性プロテイナーゼ結合ループにコンホメーション変化を伝達し、これがプロテイナーゼにループが近づくことを増強することが明らかになる(Skinner, R., Abrahams, J-P., Whisstock, J.C., Lesk, A. M., Carrell, R. W.,及びWardell, M. R. (1997) J. Mol. Biol. 266 601〜609; Jin, L., Abrahams, J. P., Skinner, R., Petitou, M., Pike, R. N.,及びCarrell, R. W., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 94, 14683〜14688)。
【０００７】
ヘパリン又はペンタサッカライドは、内科／外科の患者での種々の血栓の疾患、不安定狭心症及び血栓症予防(prophylaxy)の処置、体外循環補助又は透析装置に関連する血栓症の管理、心筋梗塞の治療(種々の血栓溶解剤を主に又は付属的に用いる)のためのようないくつかの臨床的な使用において抗凝固剤として用いられる。
しかし、ヘパリンの使用は、望ましくない合併症、特に出血に導き得る。いくつかの場合において、これは、投与されたヘパリンの投与量が適切でないことを原因とし、このことは、ヘパリンを臨床的にうまく用いることの制限をもたらすかもしれない。
【０００８】
ヘパリンの中和に利用可能な唯一の解毒剤(antidote)は、プロタミンである。しかし、プロタミンはペンタサッカライドを中和できず(Giangrande PL. フォンダパリヌックス (Arixtra):新しい抗凝固剤(Fondaparinux (Arixtra): a new anticoagulant.) Int J Clin Pract 2002; 56: 615〜617)、種々の副作用(過量投与の場合のプロタミンの抗凝固活性に関連した血行動態不安定、アナフィラキシーショック及び出血の危険性)を伴い、特にプロタミンの重要な用量の投与が出血を増加させることが知られている。
【０００９】
今日、ヘパリン及びヘパリンのペンタサッカライドのための完全に適切な解毒剤は見出されておらず、より具体的には、凝固の分野ではインビトロ試験はインビボでの影響を予測するには決して充分でないことを承知の上で、インビボで効果的な適切な解毒剤は記載されていない。
【００１０】
例えば、文献(Krupinskiら、「レーザ誘発血栓症のラットモデルにおける3つのトロンビン阻害物質の抗血栓効果」("Antithrombotic effects of three thrombin inhibitors in a rat model of laser-induced thrombosis") Haemostasis 1989; 19 (2): 74〜82)には、ヒルジン、NAPAP及びアルジディピン(argidipine)がインビトロでは異ならないが、エクスビボではヒルジンの抗凝固効果が最も重要であることが示されている。
別の文献(Yamashitaら、「ラット腸間膜微細血管でHe-Neレーザにより誘発された血栓に対するヒルジン配列P551及びP532に基づく有効な二官能性トロンビン阻害物質の抗血栓効果」("The antithrombotic effect of potent bifunctional thrombin inhibitors based on hirudin sequence, P551 and P532, on He-Ne Laser induced thrombosis in rat mesenteric microvessels") Thrombosis Research 90 (1998) 199〜206)は、「トロンビンと阻害物質とのインビボ相互作用は、インビトロのものと異なる」ことを示唆している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的の1つは、ヘパリン及びペンタサッカライドの安全で適切な解毒剤を提供することである。
本発明の目的の1つは、ヘパリン及びペンタサッカライドを中和でき、使用が簡単で副作用を回避できるヘパリン及びペンタサッカライドの適切な解毒剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このことは、適切な変異アンチトロンビンを用いることにより達成される。
より具体的には、本発明は、抗凝固剤と組み合わせたか又は組み合わせていない(possibly in association with)、実質的に活性を有さない、特に抗凝固活性を有さない変異アンチトロンビンの、血液凝固異常と関連するか又はそれに伴う病変の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】全長アンチトロンビンcDNAを有するシャトルベクターの調製。
【図２】AT発現ベクターの特徴決定。
【図３】細胞培養培地中の組換えATの分泌についてのクローンのスクリーニング。
【図４】組換えアンチトロンビンの完全性及び純度。
【図５】飽和ペンタサッカライド濃度での血漿アンチトロンビン又は変異アンチトロンビンの抗第Xa因子活性。
【図６】不連続アッセイにおける変異アンチトロンビンの抗第Xa因子活性。
【図７】ATは、ペンタサッカライド結合について血漿ATと競合できる。
【図８】ATは、HUVEC表面でインキュベートされたときに、ペンタサッカライド結合について血漿ATと競合できる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
用語「変異アンチトロンビン」とは、そのアミノ酸配列内に1つ又は複数のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を少なくとも含むヒトアンチトロンビンのことである。
上記の変異アンチトロンビンは、実験部Iに記載される方法に従って調製できる。
ヒトアンチトロンビン配列は、Olds R.J., Lane D.A., Chowdhury V., De Stefano V., Leone G.及びThein S.L.「アンチトロンビン遺伝子の完全ヌクレオチド配列:血栓形成傾向を引き起こす相同組換えの証明」("Complete nucleotide sequence of the antithrombin gene: evidence for homologous recombination causing thrombophilia") Biochemistry. 32 (16), 4216〜4224 (1993)に記載されている。
本発明のヒトアンチトロンビン配列は、ホモ・サピエンス(Homo sapiens)セルピンペプチダーゼ阻害剤、クレードC (アンチトロンビン)、メンバー1 (SERPINC1)、mRNAである。アクセッションNM 000488、バージョンNM 000488.2、GI:50541941。
【００１５】
上記のDNA配列(シグナルペプチドを含む)について記載する文献は多くあるが、これらは、アンチトロンビンの特性を通常は変更しないアンチトロンビンの多くの天然の多型のために、絶対的に同一ではない。
アンチトロンビンのヒトアミノ配列は、2つの形を示す：シグナルペプチドを含まない「短形」(配列番号2)と、シグナルペプチドを含む「長形」(配列番号26)である。
シグナルペプチドは、32アミノ酸を含み、アンチトロンビンの分泌に必要である。これは、アンチトロンビンのプロセシングの間に除去され、血漿アンチトロンビンは「短形」として循環する。
【００１６】
よって、本発明において、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22及び24で表される変異アンチトロンビンアミノ酸配列は、シグナルペプチドを含まず、配列番号26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46及び48で表される変異アンチトロンビンアミノ酸配列は、シグナルペプチドを含む。
本発明の変異アンチトロンビンは、抗凝固剤とともに、又は抗凝固剤なしで用い得る。
【００１７】
本明細書で用いる場合、用語「変異アンチトロンビン」は、以下のとおりである：
- 本発明の変異アンチトロンビンは抗凝固活性を有さず、グリコサミノグリカン結合について血漿アンチトロンビンとインビボで競合できる点で、当該技術において既知のアンチトロンビン変異体とは異なる変異アンチトロンビン、さらに、
- 本発明の変異アンチトロンビンを抗凝固剤とともに用いる場合、変異アンチトロンビンは、上記の特性に加えて、抗凝固剤への結合について血漿アンチトロンビンとインビボで競合する特性を有する。
【００１８】
本発明の変異アンチトロンビンは、血漿アンチトロンビンとインビボにおいて競合でき、血液の過剰の流動性を予防又は治療するために用い得ることが、驚くべきことに見出された。
さらに、驚くべきことに、上記の変異アンチトロンビンは、抗凝固剤への結合について血漿アンチトロンビンと競合でき、抗凝固剤とともに変異アンチトロンビンを治療上投与することは、望ましくない合併症、特に該抗凝固剤の副作用に起因する出血を防ぐことが、驚くべきことに見出された。
【００１９】
「実質的に活性を有さない変異アンチトロンビン」との表現は、凝固を阻害するその能力を失った変異アンチトロンビンのことをいう。
抗凝固活性がないことを決定する試験の例は、本出願の実験部II a)に記載されている。
【００２０】
表現「抗凝固剤」とは、凝固を妨げ、血栓障害のための医薬品としてインビボで用い得る物質のことをいう。
本明細書で用いる場合、「血液凝固異常と関連するか又はそれに伴う病変」との表現は、血液の組成、血管壁の質及び／又は血液の流れの性質の異常により引き起こされる凝固過剰又は凝固欠損のことをいう。
【００２１】
より具体的には、本発明は、血漿アンチトロンビンの濃度の約0.1倍〜約10倍、特に血漿アンチトロンビンの濃度の約1倍〜約5倍の濃度での変異アンチトロンビンの使用に関する。
血漿アンチトロンビンの濃度は、約150μg/ml〜約350μg/ml、特に約300μg/mlである。
【００２２】
有利な実施形態において、本発明は、抗凝固剤と組み合わせた変異アンチトロンビンの、前記抗凝固剤の副作用に起因する出血障害及び関連する病変の治療又は予防を意図する薬剤の製造のための使用に関する。
多くの臨床状況において、ヘパリンと特にヘパリンのペンタサッカライドは、血栓塞栓事象の予防及び治療に有効であるが、用量の調整が必要である。
投与されるヘパリンの用量が適切でない場合、ヘパリンは重篤な有害影響、特に出血を引き起こし得る。
上記のような変異アンチトロンビンの使用は、特にヘパリン又はペンタサッカライドを中和して、出血を予防及び／又は治療することを可能にする。
【００２３】
「抗凝固剤の副作用に起因する出血障害及び関連する病変」との表現は、出血性合併症のことをいう。出血性副作用は、局所的な血腫から死亡を含む主要な出血事象までの重篤度の範囲にある。
【００２４】
本発明は、抗凝固剤に結合し、かつ特にインビボにおいて、血漿アンチトロンビンと該抗凝固剤との結合をシフトする能力を有する上記の変異アンチトロンビンの使用に関する。
「変異アンチトロンビンが抗凝固剤に結合する能力を有する」との表現は、抗凝固剤へのその結合親和性が、抗凝固剤への血漿アンチトロンビンの結合親和性と同様であるか又はそれより高い変異アンチトロンビンのことをいう。
変異アンチトロンビンと抗凝固剤との間の結合を決定する試験は、例えば、漸増濃度の抗凝固剤の存在下又は非存在下での変異アンチトロンビンの固有蛍光の測定である(Meagher, Beechem, Olson及びGettins JBC 1998, 23283〜232)。
【００２５】
用語「インビボにおいて結合をシフトする」とは、抗凝固剤結合についての血漿アンチトロンビンと変異アンチトロンビンとの競合に相当する。
変異アンチトロンビンによる結合のシフトを決定する試験は、例えば、抗凝固剤を含有する血漿中での血漿アンチトロンビン抗第Xa因子阻害活性の測定である。
この試験は、実験部に記載される(インビトロ実験についてII b、及びインビボ実験についてIII 2)。
【００２６】
実験モデルにおいてインビボにて、血漿アンチトロンビン-抗凝固剤複合体に対する変異アンチトロンビンの影響を調べることが重要である。なぜなら、インビトロ試験は、本発明の変異アンチトロンビンのインビボでの影響を予測するには充分でないからである。
【００２７】
用語「血漿アンチトロンビン」とは、肝臓により生成される内因性糖タンパク質に相当する。アルファ-アンチトロンビンは、血液の血漿中で優勢な形態である。血漿アンチトロンビンの生理的標的プロテアーゼは、固有の凝固系のもの、すなわち第VII因子、(第VIIa因子)、第Xa因子、第IXa因子、第VIIa因子、第XIa因子、第XIIa因子及びトロンビンの活性形である。プロテアーゼ不活性化は、血漿アンチトロンビンとの等モル共有結合複合体中にプロテアーゼを捕捉した結果であり、ここで、プロテアーゼ酵素の活性部位には、その通常の基質が近づくことができない。血漿アンチトロンビンが、ヘパリンに対して高い親和性を有し、トロンビン及び第Xa因子に対する阻害速度は、ヘパリンの存在下で10000倍まで加速できることが知られている。
【００２８】
有利な実施形態において、本発明は、変異アンチトロンビンのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するアンチトロンビン変異体と組み合わせた上記の変異アンチトロンビンの使用であって、該変異アンチトロンビンが、特にインビボにおいて、血漿アンチトロンビンと抗凝固剤との結合をシフトする能力と、特にインビボにおいて、該アンチトロンビン変異体と該抗凝固剤との結合をシフトする能力を有する使用に関する。
【００２９】
用語「アンチトロンビン変異体」とは、増大した抗凝固活性を有し、かつアンチトロンビンの内因性変異体とは異なるアンチトロンビンの全ての変異形のことをいう。
用語「変異アンチトロンビンのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列」とは、本発明の変異アンチトロンビンの配列とアンチトロンビン変異体の配列とを比較したときに、その性質により異なるか、又はその存在若しくは不在が異なる少なくとも1つのアミノ酸があることをいう。
【００３０】
本発明は、第Xa因子阻害活性及びトロンビン(IIa)阻害活性を実質的に喪失した上記の変異アンチトロンビンの使用に関する。
特に、本発明は、血液凝固に関与するセリンプロテアーゼの阻害活性を実質的に喪失した上記の変異アンチトロンビンの使用に関する。
【００３１】
「第Xa因子阻害活性」との表現は、第Xa因子と相互作用し、この酵素を不可逆的に捕捉して不活性化するアンチトロンビンの能力のことをいう。
「トロンビン阻害活性」との表現は、トロンビンと相互作用し、この酵素を不可逆的に捕捉して不活性化するアンチトロンビンの能力のことをいう。
【００３２】
トロンビン阻害活性の喪失を決定する試験は、例えば、トロンビンを、試験される変異アンチトロンビンの過剰量と、ペンタサッカライドの存在下又は非存在下で、所定の濃度の色素産生性基質S2238の存在下でインキュベートする、インビトロで行われるアッセイである。変異アンチトロンビンがトロンビン阻害活性を示す場合、S2238の開裂に起因する405 nmでの吸光度は、時間の関数として一次指数関数に従って増加する。逆の場合において、変異アンチトロンビンがそのトロンビン阻害活性を喪失するか又は阻害物質の非存在下では、405 nmでの吸光度は、アッセイの期間に直線状の増加をたどる。
【００３３】
FXa阻害活性の喪失を決定する試験は、例えば、トロンビンを、試験される変異アンチトロンビンの過剰量と、ペンタサッカライドの存在下又は非存在下で、所定の濃度の色素産生性基質S2765の存在下でインキュベートする、インビトロで行われるアッセイである。変異アンチトロンビンがFXa阻害活性を示す場合、S2765の開裂に起因する405 nmでの吸光度は、時間の関数として一次指数関数に従って増加する。逆の場合において、変異アンチトロンビンがそのFXa阻害活性を喪失するか又は阻害物質の非存在下では、405 nmでの吸光度は、アッセイの期間に直線状の増加をたどる。
【００３４】
有利な実施形態によると、本発明の変異アンチトロンビンの使用は、上記の変異アンチトロンビンと上記の抗凝固剤との結合に起因する複合体の解離平衡定数(Kd)の値が、所定のイオン強度、特に生理的イオン強度にて、血漿アンチトロンビンと上記の抗凝固剤との間の複合体のKdの値と同様であるか又はそれより低いことを特徴とする。
対応する解離平衡定数(Kd)は、ヘパリンの結合による固有タンパク質蛍光の変化をモニターすることにより表される方法に従って測定される(Meagher, Beechem, Olson及びGettins JBC 1998, 23283〜23289)。
【００３５】
アンチトロンビンに結合したヘパリン(又はペンタサッカライド)は、ヘパリンを用いてアンチトロンビンの固定レベルを滴定し、ヘパリンの結合を示すトリプトファンの蛍光の増大をモニターすることにより評価される。それぞれ280及び340 nmの励起及び発光波長を用い、滴定曲線を二次平衡結合方程式に適合させて、Kdを得る(Olson ST, Bjork I及びShore JD, 1993, Methods enzymol., 222, 525〜560)。
同様にして、血漿アンチトロンビンと抗凝固剤との結合に起因する複合体の解離平衡定数(Kd)は、精製血漿アンチトロンビンを用いる同じ方法を用いて測定される。
【００３６】
「所定のイオン強度、特に生理的イオン強度」との表現は、150 mM NaClに相当するイオン強度のことをいう(Vidal辞書によると、注射可能な塩化ナトリウム溶液は、154 mMに相当する0.9%である)。
「同様であるか又はそれより低い」との表現は、我々の実験条件下において、血漿アンチトロンビンについて決定されたKdよりも5倍高い〜500倍低い、より好ましくは2〜50倍低い、の間のKdのことである。
【００３７】
本発明の変異アンチトロンビンは、Kdが血漿アンチトロンビンのものより5倍より高くても、血漿アンチトロンビンと抗凝固剤との結合をシフトするために必要な対応する用量が治療上適合することを条件として、活性であり得る。
【００３８】
有利な実施形態によると、本発明の変異アンチトロンビンの使用は、変異アンチトロンビンと抗凝固剤との結合に起因する複合体のKdの値が、所定のイオン強度、特に生理的イオン強度にて、アンチトロンビン変異体と抗凝固剤との複合体のKdの値と同様であるか又はそれより低いことを特徴とする。
アンチトロンビン変異体と抗凝固剤との複合体のKd値は、上記と同じ手順に従って評価される。
【００３９】
有利な実施形態によると、上記の抗凝固剤は、ヘパリン、ヘパリン誘導体、特に未分画ヘパリン、低分子量ヘパリン、抗凝固剤ペンタサッカライド(フォンダパリヌックス), (Org31540/SR90107, Arixtra (登録商標))及びその誘導体(イドラパリヌックス(Idraparinux): SANORG 34006)、並びにヘパリノイド(ダナパロイドナトリウム(Danaparoid sodium) ORG 10172)から選択される。
【００４０】
用い得る抗凝固剤のその他の例は、抗Xa活性を有するペンタサッカライド、抗-Xa活性及び抗-IIa活性を有するペンタサッカライドである(Chritian Noti及びPeter Seeberger, Chemistry and biology. 2005; 12 : 731〜756) (「ヘパリンのアンチトロンビンIII-結合ペンタサッカライド配列の合成類縁体」(Synthetic analogues of the Antitrombin III- Binding Pentassacharide Sequence of heparin) Ronald G. M. van Amsterdam; Gerard M. T. Vorgel; Arie Visser; Wim J. Kop; Marc T. Buiting; Dirk G. Meuleman. Atheroscler Thromb Vasc Biol. 1995; 15 : 495〜503)。
ペンタサッカライド誘導体のうち、Notiら、2005に記載される化合物番号33-51-78-81-84及び93、並びにvan Amsterdamら、1995に記載される化合物32543及び32271が挙げられる(上記の参考文献を参照)。
【００４１】
有利な実施形態によると、血液凝固異常に関連するか又はそれに伴う病変は、肺塞栓症、深部静脈血栓症、心筋梗塞、不安定狭心症、卒中、播種性血管内凝固のような動脈又は静脈の血栓性障害、並びにFVIII 欠損(血友病A)、FIX欠損(血友病B)、FVII欠損、FX欠損、FXI欠損、FII欠損、vWF欠損のような出血性障害、これらの凝固因子に対する獲得性抗体、フィブリン溶解異常、血小板異常、播種性血管内凝固、並びにこれらの欠陥又は異常の組み合わせに伴う任意の病変である。
【００４２】
抗凝固剤とともに用いる場合、本発明の変異アンチトロンビンは、肺塞栓症、深部静脈血栓症、心筋梗塞、不安定狭心症、卒中、播種性血管内凝固のような血栓性障害の予防又は治療を意図する薬剤の製造のために用いることができる。
【００４３】
有利な実施形態において、本発明は、上記で定義される変異アンチトロンビンの使用であって、該変異アンチトロンビンが、380位のアミノ酸から400位のアミノ酸までの領域内、特に380位のアミノ酸から397位のアミノ酸までの領域内、特に390位のアミノ酸から394のアミノ酸までの領域内、特に393位に少なくとも1つの変異を含み、アミノ酸の番号付けが、配列番号2のアンチトロンビンアミノ酸配列に関し、上記の変異が置換、挿入又は欠失である使用に関する。
【００４４】
380位のアミノ酸から400位のアミノ酸までの領域は、一般的に、「反応中心ループ」(RCL)と命名される。RCL内の残基は、切断されやすいP1-P1'結合(プライムを付していない番号はセルピンのN-末端に向かい、プライムを付した番号はC-末端に向かう)に対するそれらの位置に従って番号付けされる。特に、P14からP4'に広がる領域(残基380〜397)は、その標的プロテアーゼの活性部位に相補的である。特に、P4からP1'の残基(残基390〜394)は、プロテアーゼ触媒溝と直接相互作用する。特に、残基P1 (393)は、プロテアーゼ阻害のために重要である。
【００４５】
本発明の変異アンチトロンビンは、変異アンチトロンビンの上記の特性に変更がないことを条件として、380位のアミノ酸から400位のアミノ酸までの領域の外側にその他の変異を含むことができる。
【００４６】
有利な実施形態において、本発明は、本発明の変異アンチトロンビンの使用であって、該変異アンチトロンビンが、96位、135位、155位又は192位、特に135位のアミノ酸のグリコシル化部位にて少なくとも1つの変異をさらに含む使用に関する。
グリコシル化部位は、アンチトロンビンが真核細胞で発現される場合に、アンチトロンビンの分泌のために必要である。しかし、1つの部位の除去は、アンチトロンビン分泌を損なわず、ヘパリン結合を増大させる。実際に、グリコシル化鎖は、アンチトロンビン-ヘパリン結合に関与する。
【００４７】
有利な実施形態において、本発明は、変異アンチトロンビンの上記のような使用であって、該変異アンチトロンビンが：
-     配列番号4、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換を含み、
-     配列番号6、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入を含み、
-     配列番号8、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸の欠失を含み、又は
-     配列番号10、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸の欠失を含む、
からなる群より選択されるアミノ酸配列である使用に関する。
変異が1つである場合、上記の変異アンチトロンビンは、単一変異体とよばれる。
【００４８】
有利な実施形態において、本発明は、変異アンチトロンビンの上記のような使用であって、該変異アンチトロンビンが：
-     配列番号14、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換と、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含み、
-     配列番号16、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入と、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含み、
-     配列番号18、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位及び394位のアミノ酸の欠失を含み、
-     配列番号20、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸の欠失と、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含み、
-     配列番号22、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸の欠失と、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含み、
-     配列番号24、このアミノ酸配列は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位及び394位のアミノ酸の欠失と、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含む、
からなる群より選択されるアミノ酸配列である使用に関する。
変異が2つ又は3つである場合、上記の変異アンチトロンビンは、それぞれ二重及び三重変異体とよばれる。
【００４９】
有利な実施形態において、本発明は、上記の変異アンチトロンビンの使用であって、該変異アンチトロンビンが、412位のアミノ酸から432位のアミノ酸までの領域内、特に412位のアミノ酸から429位のアミノ酸までの領域内、特に422位のアミノ酸から426位のアミノ酸までの領域内、特に425位に少なくとも1つの変異を含み、アミノ酸の番号付けが、配列番号26で表されるシグナルペプチドを含むアンチトロンビンアミノ酸配列に関し、上記の変異が置換、挿入又は欠失である使用に関する。
【００５０】
本発明の変異アンチトロンビンは、変異アンチトロンビンの上記の特性に変更がないことを条件として、412位のアミノ酸から432位のアミノ酸までの領域の外側にその他の変異を含むことができる。
【００５１】
有利な実施形態において、本発明は、上記の変異アンチトロンビンの使用であって、該変異アンチトロンビンが、128位、167位、187位又は224位、特に167位のアミノ酸のグリコシル化部位にて少なくとも1つの変異をさらに含む使用に関する。
【００５２】
有利な実施形態において、本発明は、上記の変異アンチトロンビンの使用であって、該変異アンチトロンビンが：
-     配列番号28、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換を含み、
-     配列番号30、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入を含み、
-     配列番号32、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸の欠失を含み、又は
-     配列番号34、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸の欠失を含む
からなる群より選択されるアミノ酸配列である使用に関する。
【００５３】
有利な実施形態において、本発明は、上記の変異アンチトロンビンの使用であって、該変異アンチトロンビンが：
-     配列番号38、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換と、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含み、
-     配列番号40、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入と、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含み、
-     配列番号42、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸の欠失を含み、
-     配列番号44、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸の欠失と、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含み、
-     配列番号46、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸の欠失と、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含み、
-     配列番号48、このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸の欠失と、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含む、
からなる群より選択されるアミノ酸配列である使用に関する。
【００５４】
本発明は、抗凝固剤の副作用に起因する出血性障害及び関連する病変の予防又は治療における別々又は逐次的な使用のための組み合わせ製品としての、実質的に活性を有さず、特に抗凝固活性を有さない少なくとも1つの変異アンチトロンビンと、少なくとも1つの化合物、特に抗凝固剤とを含む製品にも関する。
「別々又は逐次的な使用のため」との表現は、前回の抗凝固剤の投与の5分後〜7日後、特に5分後〜72時間後の変異アンチトロンビンの使用のことをいう。
【００５５】
本発明は、変異アンチトロンビンが抗凝固剤に結合し、かつ特にインビボにおいて、血漿アンチトロンビンと該抗凝固剤との結合をシフトする能力を有する、上記の製品に関する。
【００５６】
本発明は、変異アンチトロンビンが、特にインビボにおいて、血漿アンチトロンビンと抗凝固剤との結合をシフトする能力と、特にインビボにおいて、アンチトロンビン変異体と抗凝固剤との結合をシフトする能力とを有する、上記の製品に関する。
【００５７】
本発明は、変異アンチトロンビンが、第Xa因子阻害活性及びトロンビン阻害活性を実質的に喪失した、上記の製品に関する。
【００５８】
有利な実施形態によると、本発明による製品は、変異アンチトロンビンと抗凝固剤との結合に起因する複合体の解離平衡定数(Kd)の値が、所定のイオン強度、特に生理的イオン強度にて、血漿アンチトロンビンと上記の抗凝固剤との複合体のKdの値と同様であるか又はそれより低いことを特徴とする。
【００５９】
有利な実施形態によると、本発明による製品は、変異アンチトロンビンと抗凝固剤との結合に起因する複合体のKdの値が、所定のイオン強度、特に生理的イオン強度にて、アンチトロンビン変異体と上記の抗凝固剤との複合体のKdの値と同様であるか又はそれより低いことを特徴とする。
【００６０】
有利な実施形態によると、上記の抗凝固剤は、ヘパリン、ヘパリン誘導体、特に未分画ヘパリン、低分子量ヘパリン、抗凝固剤ペンタサッカライド(フォンダパリヌックス)及びその誘導体(イドラパリヌックス: SANORG 34006)、並びにヘパリノイド(ダナパロイドナトリウム ORG 10172)から選択される。
【００６１】
有利な実施形態において、上記の血液凝固異常は、肺塞栓症、深部静脈血栓症、心筋梗塞、不安定狭心症、卒中、播種性血管内凝固のような動脈又は静脈の血栓性障害、並びにFVIII 欠損(血友病A)、FIX欠損(血友病B)、FVII欠損、FX欠損、FXI欠損、FII欠損、vWF欠損のような出血性障害、これらの凝固因子に対する獲得性抗体、フィブリン溶解異常、血小板異常、播種性血管内凝固、並びにこれらの欠陥又は異常の組み合わせに伴う任意の病変である。
【００６２】
有利な実施形態において、本発明は、変異アンチトロンビンが、380位のアミノ酸から400位のアミノ酸までの領域内、特に380位のアミノ酸から397位のアミノ酸までの領域内、特に390位のアミノ酸から394のアミノ酸までの領域内、特に393位に少なくとも1つの変異を含み、アミノ酸の番号付けが、配列番号2のアンチトロンビンIIIアミノ酸配列に関し、上記の変異が置換、挿入又は欠失である、上記で定義される製品に関する。
【００６３】
有利な実施形態において、本発明は、該変異アンチトロンビンが、96位、135位、155位又は192位、特に135位のアミノ酸のグリコシル化部位にて少なくとも1つの変異をさらに含む、上記で定義される製品に関する。
【００６４】
有利な実施形態において、本発明は、上記の変異アンチトロンビンが：
-     配列番号4、
-     配列番号6、
-     配列番号8又は
-     配列番号10
からなる群より選択されるアミノ酸配列である上記で定義されるような製品に関する。
【００６５】
有利な実施形態において、本発明は、上記の変異アンチトロンビンが：
-     配列番号14、
-     配列番号16、
-     配列番号18、
-     配列番号20、
-     配列番号22又は
-     配列番号24
からなる群より選択されるアミノ酸配列である上記で定義されるような製品に関する。
【００６６】
別の有利な実施形態において、本発明は、変異アンチトロンビンが、412位のアミノ酸から432位のアミノ酸までの領域内、特に412位のアミノ酸から429位のアミノ酸までの領域内、特に422位のアミノ酸から426位のアミノ酸までの領域内、特に425位に少なくとも1つの変異を含み、アミノ酸の番号付けが、配列番号26で表されるシグナルペプチドを含むアンチトロンビンアミノ酸配列に関し、上記の変異が置換、挿入又は欠失である、上記で定義される製品に関する。
【００６７】
有利な実施形態において、本発明は、変異アンチトロンビンが、128位、167位、187位又は224位、特に167位のアミノ酸のグリコシル化部位にて少なくとも1つの変異をさらに含む、上記で定義される製品に関する。
【００６８】
有利な実施形態において、本発明は、上記の変異アンチトロンビンが：
-     配列番号28、
-     配列番号30、
-     配列番号32又は
-     配列番号34
からなる群より選択される、上記で定義されるような製品に関する。
【００６９】
有利な実施形態において、本発明は、上記の変異アンチトロンビンが：
-     配列番号38、
-     配列番号40、
-     配列番号42、
-     配列番号44、
-     配列番号46又は
-     配列番号48
からなる群より選択される、上記で定義されるような製品に関する。
【００７０】
本発明は、抗凝固剤なしでの、実質的に活性を有さず、特に抗凝固活性を有さない変異アンチトロンビンの、血液凝固異常に関連するか又はそれに伴う病変の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための使用に関する。
抗凝固剤なしで用いる場合、本発明の変異アンチトロンビンは、FVIII欠損(血友病A)、FIX欠損(血友病B)、FVII欠損、FX欠損、FXI欠損、FII欠損、vWF欠損のような出血性障害、これらの凝固因子に対する獲得性抗体、フィブリン溶解異常、血小板異常、播種性血管内凝固、並びにこれらの欠陥又は異常の組み合わせに伴う任意の病変の予防又は治療を意図する薬剤の製造のために用いることができる。
【００７１】
有利な実施形態において、本発明は、抗凝固剤なしでの、実質的に活性を有さず、特に抗凝固活性を有さない変異アンチトロンビンの、出血性障害の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための上記で定義される使用に関する。
【００７２】
本発明は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内で、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間にアミノ酸挿入を少なくとも含有する、特にプロリン(Pro)の挿入を含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号6で表される変異アンチトロンビンにも関する。
【００７３】
本発明は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内で、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間にアミノ酸挿入を少なくとも含有する、特にプロリン(Pro)の挿入を含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号30で表される変異アンチトロンビンにも関する。
【００７４】
本発明は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内で、393位のアミノ酸のアミノ酸欠失を少なくとも含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号8で表される変異アンチトロンビンにも関する。
【００７５】
本発明は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内で、425位のアミノ酸のアミノ酸欠失を少なくとも含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号32で表される変異アンチトロンビンにも関する。
【００７６】
本発明は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内で、394位のアミノ酸のアミノ酸欠失を少なくとも含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号10で表される変異アンチトロンビンにも関する。
【００７７】
本発明は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内で、426位のアミノ酸のアミノ酸欠失を少なくとも含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号34で表される変異アンチトロンビンにも関する。
【００７８】
本発明は、少なくとも2つの変異を含有する変異アンチトロンビンにも関する：
-     第1変異は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内での、393位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換であり、第2変異は、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号14で表され、
-     第1変異は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内での、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入であり、第2変異は、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号16で表され、
-     第1変異は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内での、393位のアミノ酸の欠失であり、第2変異は、394位のアミノ酸の欠失であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号18で表され、
-     第1変異は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内での、393位のアミノ酸の欠失であり、第2変異は、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号20で表され、
-     第1変異は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内での、394位のアミノ酸の欠失であり、第2変異は、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号22で表され、又は
-     第1変異は、配列番号2で表されるアンチトロンビンの配列内での、393位のアミノ酸の欠失であり、第2変異は、394位のアミノ酸の欠失であり、第3変異は、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号24で表される。
【００７９】
本発明は、少なくとも2つの変異を含有する変異アンチトロンビンにも関する：
-     第1変異は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内での、425位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換であり、第2変異は、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号38で表され、
-     第1変異は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内での、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入であり、第2変異は、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号40で表され、
-     第1変異は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内での、425位のアミノ酸の欠失であり、第2変異は、426位のアミノ酸の欠失であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号42で表され、
-     第1変異は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内での、425位のアミノ酸の欠失であり、第2変異は、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号44で表され、
-     第1変異は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内での、426位のアミノ酸の欠失であり、第2変異は、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号46で表され、又は
-     第1変異は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列内での、425位のアミノ酸の欠失であり、第2変異は、426位のアミノ酸の欠失であり、第3変異は、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換であり、該変異アンチトロンビンは、特に配列番号48で表される。
【００８０】
本発明は、上記で定義される変異アンチトロンビンをコードするヌクレオチド配列、特に配列番号5、7、9、13、15、17、19、21、23、29、31、33、37、39、41、43、47からなる群より選択されるヌクレオチド配列にも関する。
【００８１】
本発明は、有効成分として、上記で定義される変異アンチトロンビン、特に配列番号6、8、10、14、16、18、21、22、24、30、32、34、38、40、42、44、46、48の変異アンチトロンビンを、医薬的に許容されるビヒクルと組み合わせて含む医薬組成物にも関する。
【００８２】
本発明は、有効成分として、配列番号4、12、28又は36の変異アンチトロンビンを、医薬的に許容されるビヒクルと組み合わせて含む医薬組成物にも関する。
【００８３】
図面
図1：全長アンチトロンビンcDNAを有するシャトルベクターの調製
切断形AT cDNAを含有する2μgのpENTRベクター(レーン1及び2)、全長AT cDNAを含有するpCMV6ベクター(レーン3及び4)、又はシャトルベクターpENTR-AT (レーン5及び6)を、1%アガロースゲルに、SacII及びStuIの両方による完全消化の前(レーン1、3、5)又は後(レーン2、4、6)で載せた。分子量標準サイズは、図の左側に示し、塩基対(bp)で表す。全長AT cDNAを含有するpCMV6ベクターのSacII/StuI消化により、切断形AT cDNAを含有するpENTRベクターのSacII/StuI消化により単離されたpENTRベクターにクローニングされる全長AT cDNAに相当する1182 bpのバンドが遊離される。これらの2つのフラグメントをライゲーションした後に、最終生成物は効率的に再環化され、SacII/StuI消化の後のpENTR-ATについての予測されるプロファイルを示す。
【００８４】
図2：AT発現ベクターの特徴決定。
2μgのpCDNA 3.2ベクター(レーン1、2、3)、全長AT cDNAを含有するpCDNA 3.2ベクター(レーン4、5、6)、又は全長AT-N135Q-Pro394 cDNAを含有するpCDNA 3.2ベクター(レーン7、8、9)を、エンドヌクレアーゼ処理の前(レーン1、4、7)、StuIによる切断(レーン2、5、8)、又はSacII及びStuIの両方による完全切断の後(レーン3、6、9)に、1%アガロースゲルに載せる。分子量標準のサイズを、図の右側に示し、塩基対(bp)で表す。pCDNA 3.2ベクターの3189位及び4329位にそれぞれ1つのSacII及び1つのStuI切断部位がある。よって、StuIによるpCDNA 3.2の切断は、ベクターの線状化だけを導くが(7711 bpのバンド)、StuI及びSacIIの両方によるpCDNA 3.2の切断は、ベクターを2つのフラグメントに切断する(6571 bp及び1140 bp)。pCDNA 3.2へのAT cDNAフラグメント(1448 bp)による912〜3174フラグメントの組換えによる置換は、pcDNA-AT の1070位にもう1つのSacII部位と2252位にもう1つのStuI部位を導入する。次いで、StuIによるpCDNA-ATの切断は、2つのフラグメント(5634bp及び1263 bp)をもたらし、両方のヌクレアーゼによる切断は、4つのフラグメント(4452 bp、1182 bp、1140及び123 bp)をもたらす。同じことが、-N135Q-Pro394 cDNAについてもいえる。
【００８５】
図3：細胞培養培地中の組換えATの分泌についてのクローンのスクリーニング。
pCDNA-AT (レーン1〜5でそれぞれクローン1〜5)、pCDNA-AT-N135Q (レーン6〜9でそれぞれクローン1〜4)、又はpCDNA-AT-N135Q-Pro394 (レーン10〜14でそれぞれクローン1〜5)でのトランスフェクションの後に単離された各クローンについて、細胞との接触の24時間後に採集された30μlの馴化培地を、全長組換えアンチトロンビンを分泌するそれらの能力について、変性条件でウェスタンブロッティングにより分析する。各クローンについて、組換えアンチトロンビンに対応する多様な強度の単一バンドが観察できる。組換え野生型アンチトロンビンは、血漿から精製された対照アンチトロンビン(レーン15、150 ng/レーン)と同じレベルで泳動され、発現レベルは、バンド強度測定により、2 mg/L付近であると見積もられる。wt-ATについて、クローン4は、セルファクトリー(cell factory)への増殖のために選択される。なぜなら、発現のレベルが他のものよりもわずかにより高いようであるからである。変異AT-N135Q及びAT-N135Q-Pro394は、血漿から精製された対照アンチトロンビン(レーン15)のすぐ下に泳動され、このことにより、N135Qの置換によるグリコシル化部位の喪失が確認される。大規模タンパク質生成のために選択された安定発現クローンは、AT-N135Q及びAT-N135Q-Pro394の両方についてクローン1である。
【００８６】
図4：組換えアンチトロンビンの完全性及び純度
ヘパリン親和性精製及びイオン交換濃縮の後の組換えアンチトロンビンの完全性及び純度を確認するために、2μgのAT-N135Q-R393H (レーン1)、AT-N135Q-Pro394 (レーン2)、又は対照血漿アンチトロンビン(レーン3)を、SDS-PAGE及びその後のクーマシー染色により分析する。予測されたように、2つの変異アンチトロンビンが、グリコシル化部位の喪失(置換N135Q)のために血漿アンチトロンビンよりもわずかに低い分子量で泳動され、これらは、ゲルに載せた量に相当するバンド強度の単一バンドパターンを示す(吸光度評価に基づく)。組換えアンチトロンビンは、純粋のようであり、その抗凝固性及びヘパリン誘導体に対する親和性について試験できる。分子量標準のサイズは図の右側に示し、キロダルトン(KD)で表す。
【００８７】
図5：飽和ペンタサッカライド濃度での血漿アンチトロンビン又は変異アンチトロンビンの抗第Xa因子活性
図5a：血漿AT (黒四角(又は黒方形)：80nM、中空四角：40nM、黒丸：20 nM、中空丸：10 nM)を、色素産生性基質S2765 (200μM)の加水分解をFXa (1 nM)により、ペンタサッカライド (1μM又は1.73 mg/L)の存在下で阻害する能力について、連続アッセイで試験する。秒で表す時間を横座標にプロットする。405 nmでの吸光度を縦座標にプロットする。
図5 b：図5aの基質加水分解曲線を、等式3を用いて適合させて、動力学速度定数(k)を決定する。この定数kを、AT濃度の関数としてプロットし、等式4を用いて適合させて、阻害速度定数konを決定する。血漿アンチトロンビン濃度(nM)を横座標にプロットする。s-1で表す動力学速度定数(k)を縦座標にプロットする。
【００８８】
図6：不連続アッセイにおける変異アンチトロンビンの抗第Xa因子活性
AT-N135Q-R393H及びAT-N135Q-Pro394を、FXa活性を阻害するその能力について、不連続アッセイで試験する。1回目に、AT-N135Q-R393H (黒四角：200 nM)又はAT-N135Q-Pro394 (中空四角：2.5μM)をFXa (20 nM)と、ペンタサッカライド(10μM又は17.3 mg/L)の存在下で、0〜120分の期間(AT-N135Q-R393Hについて)又は0〜1400分の期間(AT-N135Q-Pro394について)インキュベートする。2回目に、FXa残存活性を、190μlのS2765 (200μM)を、10μlの前の混合物に加えることにより測定する。基質加水分解の初速度を、次いで、阻害物質とのインキュベーション時間の関数としてプロットし、曲線を等式1に適合させてkonを決定する(灰色の線)。分で表される時間を横座標にプロットする。OD/s-1で表される基質加水分解速度を縦座標にプロットする。
【００８９】
図7：ATは、ペンタサッカライド結合について血漿ATと競合できる
AT-N135Q-R393H及びAT-N135Q-Pro394を、Rotachrom (登録商標)ヘパリンアッセイにおいて試験して、残存ペンタサッカライド活性を確立する。血漿アンチトロンビンと比較して1/1、2/1及び4/1の比の変異アンチトロンビンを、ペンタサッカライドを過量投与した(3μg/mlの濃度)ヒト血漿プールに加える。
バー1、3、5及び7は、AT-N135Q-R393Hを用いた結果を表し、バー2、4、6及び8は、AT-N135Q-Pro394を用いた結果を表す。バー1及び2は、変異アンチトロンビンがない対照のバーである。バー3及び4は、血漿アンチトロンビンに対する変異アンチトロンビンの比1/1を表す。バー5及び6は、血漿アンチトロンビンに対する変異アンチトロンビンの比2/1を表す。バー7及び8は、血漿アンチトロンビンに対する変異アンチトロンビンの比4/1を表す。
【００９０】
図8：ATは、HUVEC表面でインキュベートされたときに、ペンタサッカライド結合について血漿ATと競合できる。
AT-N135Q-R393H及びAT-N135Q-Pro394を、Rotachrom (登録商標)ヘパリンアッセイにおいて試験して、残存ペンタサッカライド活性を確立する。血漿アンチトロンビンと比較して1/1、2/1及び4/1の比の変異アンチトロンビンを、ペンタサッカライドを過量投与した(3μg/mlの濃度)ヒト血漿プールに加え、HUVEC表面上でインキュベートする。
バー1、3、5及び7は、AT-N135Q-R393Hを用いた結果を表し、バー2、4、6及び8は、AT-N135Q-Pro394を用いた結果を表す。バー1及び2は、変異アンチトロンビンがない対照のバーである。バー3及び4は、血漿アンチトロンビンに対する変異アンチトロンビンの比1/1を表す。バー5及び6は、血漿アンチトロンビンに対する変異アンチトロンビンの比2/1を表す。バー7及び8は、血漿アンチトロンビンに対する変異アンチトロンビンの比4/1を表す。
【実施例】
【００９１】
実験部
抗凝固剤としての活性、特に第Xa因子及び第IIa因子の阻害活性を喪失し、かつヘパリン及びペンタサッカライドに結合できる変異アンチトロンビンを製造するために、種々のタイプの変異、特に、反応中心ループ(アミノ酸380〜アミノ酸400の領域)内の変異、ループから離れたプロテイナーゼ相互作用のために近づきやすいエキソサイト領域内の変異(Chuang YJ, Swanson R, Raja SM, Olson ST ヘパリンは、トロンビン及び第Xa因子に対するアンチトロンビンの特異性を、反応中心ループ配列とは独立して増強する。ヘパリン活性化アンチトロンビンにおける第Xa因子の特異性のエキソサイト決定因子の証拠J Biol Chem. 2001; 276:14961〜71)及びグリコシル化のコンセンサス配列内の変異(アミノ酸135〜137及び155〜157) (Fan B, Crews BC, Turko IV, Choay J, Zettlmeissl G, Gettins P. ベビーハムスター腎臓細胞で発現された組換えヒトアンチトロンビンIIIの不均質性。ヘパリン結合及び構造に対するグリコシル化の違いの影響J Biol Chem. 1993; 268:17588〜96)が考えられる。
【００９２】
変異アンチトロンビンを得るために、いくつかの変異、特に以下のものを行った：
- FXa及びFIIaのようないずれの凝固プロテアーゼに対するアンチトロンビン阻害活性をなくすための、アンチトロンビンの反応性ループ内の、領域P4-P4'における欠失、
- 反応性ループ内の領域P4-P4' (Ala 391〜Asn 396)内のアミノ酸の置換、特に393位のアミノ酸(Arg)のヒスチジンによる置換、
- 393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリンの挿入、並びに
- ヘパリン及びペンタサッカライドとの親和性を増大させるための、アンチトロンビンのグリコシル化領域内のアミノ酸の置換、特に135位のアミノ酸(Asp)のグルタミンによる置換。
【００９３】
材料及び方法
I 変異アンチトロンビンの調製
全長アンチトロンビン cDNAを有するシャトルベクターpENTR (pENTR-AT)の調製
pENTRベクター(Invitrogen, HORFクローンリファレンスIOH14497)にまずクローニングされたアンチトロンビンcDNA配列は、pCMV6 (Origene, リファレンスTC110831)にクローニングされた全長アンチトロンビン配列で置き換えられなければならない。全長アンチトロンビンcDNAを含有するpCMV6を、SacII及びStuIエンドヌクレアーゼの両方で消化する。1182塩基対のフラグメントを1%アガロースゲルで単離し、QIAquickゲル抽出キットを用いて精製する。アンチトロンビンcDNAのSacII-StuIフラグメントに相当するこの1182塩基対のフラグメントを、SacII及びStuIにより線状にしたpENTRベクター(2760 bp)にライゲーションし、上記のようにして回収する。このカセット交換の結果は、1%アガロースゲルでの電気泳動(図1)及び配列決定により確認する。
【００９４】
アンチトロンビンcDNAに対する突然変異誘発：
野生型アンチトロンビンをコードするcDNAを有する、得られたプラスミドpENTR (pENTR-ATwt)を、製造業者の推奨(Stratagene)に従ってQuickChange II部位特異的突然変異誘発キットを用いるPCRによるさらなる突然変異誘発のための鋳型として用いる。野生型アンチトロンビンは、血漿アンチトロンビンと同じアミノ酸配列を有するが、組み換え型の下で生成される。突然変異誘発プライマー(表1)を用いて、アルギニン135のコドンの代わりにグルタミンのコドンを導入して、プラスミドpENTR-AT-N135Qを作製する。アルギニン393のヒスチジンによる単一アミノ酸置換(R393H)、アルギニン393とセリン394の間のプロリンの挿入(Pro394)、又はアルギニン393 (ΔR393)、セリン394 (ΔS394)若しくはアルギニン393とセリン394の両方(ΔR393S394)の欠失を、pENTR-ATwtを鋳型として用い、表1に記載される突然変異誘発プライマーを用い、QuickChange II部位特異的突然変異誘発キットを用いるPCRにより導入する。突然変異誘発プライマーの同じ組を、pENTR-AT-N135Qを鋳型として用いるPCR反応において用いて、二重変異体又は三重変異体アンチトロンビンN135Q-R393H、N135Q-Pro394、N135Q-ΔR393、N135Q-ΔS394及びN135Q-ΔR393S394をそれぞれコードするcDNAを有するプラスミドを調製する。次いで、各変異体カセット、すなわち上記の二重変異体又は三重変異体アンチトロンビンをコードするcDNAの完全性を、DNA配列決定により確立する。
【００９５】
シャトルベクターと発現ベクターとの間のカセット交換：
アンチトロンビン、アンチトロンビン単一変異体又はアンチトロンビン二重変異体をコードする上記の全てのcDNAを、シャトルベクターpENTRから、真核生物発現ベクターpCDNA 3.2に、Gateway LR Clonase II酵素ミックス(Invitrogenにより開発された「Gatewayテクノロジー」)を用いる組換えにより移す。最終発現構築物は、1%アガロースゲル上での電気泳動及びトランスフェクション前の再配列決定により確認する(図2)。
【００９６】
真核細胞のトランスフェクション及びタンパク質生成
以前の組換えによるプラスミド構築物pCDNA-ATwt、pCDNA-AT-N135Q、pCDNA-AT-R393H、pCDNA-AT-Pro394、pCDNA-AT-ΔR393、pCDNA-AT-ΔS394、pCDNA-AT-ΔR393S394、pCDNA-AT-N135Q-R393H、pCDNA-AT-N135Q-Pro394、pCDNA-AT-N135Q-ΔR393、pCDNA-AT-N135Q-ΔS394及びpCDNA-AT-N135Q-ΔR393S394をそれぞれ、改変ヒト胚性腎臓細胞(HEK-293)又はベビーハムスター腎臓細胞(BHK-21)のトランスフェクションのために用いる。細胞は、2 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び5%胎児ウシ血清を含有する「ダルベッコの改変イーグル培地/F-12」(Invitrogen)で成長させ、およそ106細胞を、20μgのDNAに、リン酸カルシウム共沈によりトランスフェクションさせる(Sambrookら、Molecular cloning: A laboratory manual, 第2版、16.33頁)。安定発現株化細胞は、G418により選択し(クローン選択中に、G418濃度は細胞培養培地中に0.8 mg/mlであり、次いで0.4 mg/mlに減少させて、クローン増殖の間の選択圧を維持する)、マウスモノクローナル抗体抗アンチトロンビンを捕捉抗体として、セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヒツジポリクローナル抗体抗アンチトロンビンを検出抗体として用いて(BioAssay (商標) ELISAキット(EUROMEDEX))、アンチトロンビン分泌についてELISAによりスクリーニングする。分泌アンチトロンビンの完全性は、ヒツジモノクローナル抗体抗アンチトロンビン及びセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートロバポリクローナル抗体抗ヒツジ(The Binding Site、UK)を用いるウェスタンブロッティングにより確立する(図3)。それぞれの変異アンチトロンビンについて、単一安定発現クローンは、「セルファクトリーヌンクロン(cell factories nunclon)」(Nunc)で増殖させ、大規模タンパク質生産を、300μl/cm2 (製造業者により推奨されるように、6320 cm2培養面積のセルファクトリーに適する最小容量は2リットルである)の2 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び5μg/mlインスリン/トランスフェリン/セレンを含有する「ダルベッコの改変イーグル培地/F-12」(Invitrogen)を用いて行う。毎日回収する馴化培地を、3000g、4℃にて15分間遠心分離し、5 mMベンズアミジン、5 mM EDTAを用いて処理し、-20℃にて保存する。
【００９７】
タンパク質精製：
馴化培地を融解し、プールし、塩濃度を0.4 M NaClに調整し、次いで、10 mM Tris、又は20 mMリン酸バッファー、0.4 M NaCl及び0.1 mM EDTA、pH 7.4を用いて平衡化したヘパリン固定化カラム(Hitrap Heparin 5ml又はHeparin-sepharose CL6B 50 ml、GE Biological)に供する。結合したタンパク質を、0.4 Mから2 M NaClまでの勾配の同じバッファーで溶出する。0.8 M NaCl以上で溶出されたフラクションは、ヘパリン親和性が高い野生型アンチトロンビン又は変異アンチトロンビンのみを含有した。アスパラギン135のグルタミンによる置換を有する変異アンチトロンビン(AT-N135、ATN135Q-R393H、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394、AT-N135Q-ΔR393S394)は、野生型アンチトロンビンよりも高いイオン強度にて親和性カラムから溶出され、このことにより、135位のグリコシル化部位の破壊が、ヘパリンに対するアンチトロンビンの親和性を増大させることが確認される(90%が0.8 Mと1.2 M NaClの間で溶出される野生型アンチトロンビンと比較して、置換N135Qを有する変異アンチトロンビンの約90%が、1 Mと1.4 Mの間のNaClで溶出される)。回収されたフラクションをプールし、10 mM Tris又は20 mMリン酸塩、及び0.1 M NaCl、pH 7.4に対して4℃にて一晩透析することによるか、又は10 mM Tris若しくは20 mMリン酸塩、及び0.1 M NaCl、pH 7.4で平衡化したHiPrep 26/10脱塩カラムに供することのいずれかにより、塩濃度を減少させる。アンチトロンビンは、次いで、10 mM Tris又は20 mMリン酸塩、及び0.1 M NaCl、pH 7.4を用いて平衡化した「Resource Q」1mlカラム(GE, Biological)を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより濃縮し、0.1 mMから0.5 M又は20 mMから0.5 MのNaCl勾配の同じバッファー中に溶出させる。それぞれの溶出フラクション中のアンチトロンビン濃度は、280 nMでの吸光度により、吸光係数ε = 0.65 g-1.l.cm-1を用いて評価し、精製された野生型アンチトロンビン又は変異アンチトロンビンの完全性は、上記と同じ抗体の組を用いるウェスタンブロッティング、未変性及び変性条件下での10%アクリルアミド/ビスアクリルアミドゲル上での電気泳動と、その後のクーマシーブリリアントブルーR-250染色(図4)により試験する。次いで、アンチトロンビン調製物を分割し、機能的アッセイに用いるまで-80℃で貯蔵する。同じ手順を用いて、ヒト血漿から血漿アンチトロンビン(内部参照として用いられる)を得る。
【００９８】
【表１】
2010533684.tif 000002
【００９９】
II 変異アンチトロンビンのインビトロ特徴決定
変異アンチトロンビンの特徴決定は、以下のことを目的として行う：
- a) 精製された系において、以下の変異アンチトロンビン：AT-R393H、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393及びAT-N135Q-ΔS394が、野生型アンチトロンビン(AT-wt)と比較して、無視できる程度の抗FXa活性及び抗FIIa活性を、ヘパリン又はペンタサッカライドの存在又は非存在下で示すことを確かめること、
- b) 血漿中で、以下の変異アンチトロンビン：AT-R393H、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394が、ヘパリン又はペンタサッカライドへの結合について血漿アンチトロンビンと競合でき、血漿中で抗第Xa因子活性又は抗第IIa因子活性を著しく減少させることを確かめること。
【０１００】
a) 精製された系での変異アンチトロンビンの抗第Xa因子阻害活性
第Xa因子(FXa, Kordia)のアンチトロンビン阻害についての動力学アッセイは、「動力学」バッファー(Hepes、20 mMリン酸塩、pH 7.4、0.15 M NaCl、0.1% PEG 8000及び1 mg/mlウシ血清アルブミン)中の、擬似一次反応条件で行う。簡単に、第Xa因子を、過剰の試験されるアンチトロンビン(血漿アンチトロンビン又は野生型アンチトロンビン又は変異アンチトロンビンに相当し、行うアッセイにおいてそれぞれ変動する)と、ペンタサッカライド(フォンダパリヌックスナトリウム、Arixtra (登録商標)、GlaxoSmithKline)の存在下又は非存在下でインキュベートし、第Xa因子残存活性を、時間の関数として測定する。ペンタサッカライドは、全ての試験されたアンチトロンビンがペンタサッカライドと結合するように、反応媒体中に過剰に加える。ペンタサッカライドの非存在下では、反応媒体中に存在する可能性があるいずれの硫酸化グリコサミノグリカンを中和するために、ポリブレンを加える。残存第Xa因子活性は、色素産生性基質(S2765又はS2222、Chromogenix)の開裂に起因する405 nmでの吸光度の増大として、マイクロプレートリーダー(Dynatech MR 5000)を用いて測定する。データの分析は、GraphPad Prismバージョン3ソフトウェアを用いて行う。吸光度の記録は、予測される阻害速度定数(kon)に応じて連続又は不連続である。
【０１０１】
阻害速度定数(kon)は、M-1.s-1で示される二次速度定数であり、プロテアーゼとアンチトロンビンとの安定複合体形成の速度を規定する(konの値が高いほど、複合体がより速く形成される)。
予測されるkonが104 M-1.s-1より低い場合、不連続法を用いる。第Xa因子(0.02〜1μM、又は0.1〜1μM)を、試験されるアンチトロンビン(0.2〜10μM、又は1〜10μM)と、ペンタサッカライド(10〜100μM)又はポリブレン(100μg/ml)の存在下で、10μlの最終容量中で10秒間〜5時間、又は10秒間〜24時間インキュベートする。このインキュベーション時間の最後に、200μMの基質を含有する190μlの動力学バッファーを加え、405 nmでの吸光度を記録する。
【０１０２】
動力学速度定数(k)は、非線形回帰を用いて、基質加水分解初速度曲線を等式(1)に適合させることにより判断され、ここで、v0及び v∞は、それぞれ時間t0又はt∞における基質加水分解速度である：
vt = (v0 + v∞) . exp (-k.t)                                      (1)
【０１０３】
阻害速度定数(kon)は、速度定数(k)から、等式(2)を用いて算出され、ここで、ATは試験されるアンチトロンビンの濃度である：
k = AT . kon                                                      (2)
【０１０４】
予測されるkonが104 M-1.s-1より高い場合、連続法を用いる。試験されるアンチトロンビン(0.01〜1μM、又は0.1〜1μM)を、基質(200μM)と、ペンタサッカライド又はポリブレンの存在下で、100μL、又は190μlの最終容量でインキュベートし、反応を、100μL、又は10μLの第Xa因子(2 nM又は10 nM)を加えることにより開始する。速度定数(k)は、基質加水分解曲線を等式(3)又は(3')に、非線形回帰分析を用いて適合させることにより得られ、ここで、A0はt0での吸光度であり、vi及びvsはそれぞれ、試験されるアンチトロンビンの非存在下での基質加水分解の初速度及び終速度である。
A405 = A0 + vi .(1 - exp (-k.t)) / k.                                   (3)
等式(3')も、特に血漿の存在下で用いられる。
A405 = A0 + vs * t + (vi - vs) * (1 - exp (-k.t)) / k.                  (3')
【０１０５】
阻害速度定数(kon)は、基質の競合効果を考慮に入れた等式(4)を用いて動力学定数(k)から算出され、ここで、Sは基質初濃度であり、Kmは第Xa因子-基質相互作用についてのミカエリス定数であり、ATは、試験されるアンチトロンビン濃度である。
k = (kon / (1 + S / Km)) . [AT]                                   (4)
変異アンチトロンビン及び野生型AT阻害活性は、同じ条件下で測定され、血漿AT阻害活性と比較される。
【０１０６】
ペンタサッカライドを用いるか又は用いない結果は：
- 野生型アンチトロンビン及びAT-N135Q第Xa因子阻害活性は、血漿アンチトロンビン第Xa因子阻害活性と同様であり、
- 以下の変異アンチトロンビン：AT-R393H、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394の第Xa因子阻害活性は、野生型アンチトロンビン第Xa因子阻害活性と比較して無視できる。
【０１０７】
例えば、飽和量のペンタサッカライドの存在下での第Xa因子についての血漿ATの阻害速度定数(kon)は、連続法を用いて判断する(図5a及び5b)。2.52×105 M-1.s-1の値が見出され、これは、発表された値に匹敵する(Olson ST, Bjork I, Sheffer R, Craig PA, Shore JD, Choay J., J Biol Chem. 1992 Jun 25; 267 (18) : 12528〜38, 「アンチトロンビン-プロテイナーゼ反応のヘパリンによる促進におけるアンチトロンビン結合ペンタサッカライドの役割。ヘパリン速度増大に対するアンチトロンビンコンホメーション変化の寄与による解決("Role of the antithrombin-binding pentasaccharide in heparin acceleration of antithrombin-proteinase reactions. Resolution of the antithrombin conformational change contribution to heparin rate enhancement.)。この方法を用いて、AT-N135Q-R393H及びAT-N135Q-Pro394は、飽和ペンタサッカライド濃度の存在下であっても、第Xa因子の遅い阻害物質であることが見出される。よって、不連続法を行って、AT-N135Q-R393H及びAT-N135Q-Pro394によるペンタサッカライドの存在下での第Xa因子阻害についてのkonの値を評価した(図6)。AT-N135Q-R393H抗凝固活性は、大きく低減されたが、AT-N135Q-Pro394は、抗第Xa因子活性がほとんどない。AT-N135Q-R393H及びAT-N135Q-Pro394のkonの値は、それぞれ4415 M-1.s-1及び33 M-1.s-1と見積もられ、これは、血漿ATよりも95倍(1/95)及び少なくとも7600倍(1/7600)低い。
【０１０８】
b) ヒト血漿における変異アンチトロンビンの抗第Xa因子阻害活性
変異アンチトロンビンAT-R393H、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394の第Xa因子阻害活性を、ペンタサッカライド含有血漿中で測定する。ペンタサッカライドの血漿濃度は、この分子の定期的な(治療上の)使用の条件の下でペンタサッカライドにより処置される患者、又はこの薬剤の過量投与を示す患者で測定される濃度に基づいて定義するが、治療によるペンタサッカライド処置中の最適平衡濃度が1.20〜1.26 mg/Lであり、最少平衡濃度が0.46〜0.62 mg/Lであることはわかっている(研究論文、 Arixtra (登録商標))。
【０１０９】
抗第Xa因子アッセイは、マイクロプレートリーダー(Dynatech MR 5000)又はSTAアナライザ(Stago)での吸光度の読み取りに適合させたRotachrom (登録商標)ヘパリン法(Stago)を用いて行う。
手順は、動力学バッファーで4倍(four times)に希釈した30μlのペンタサッカライド含有血漿試料を、75μlの色素産生性基質(1 mM、Rotachrom (登録商標)ヘパリンキットで提供される)と混合することからなる。4分間のインキュベーションの後に、75μlのウシ第Xa因子(24 nM、Rotachrom (登録商標)ヘパリンキット)を、血漿-基質混合物に加える。第Xa因子活性を、色素産生性基質の切断に起因する405 nmの吸光度の増加として、マイクロプレートリーダー(Dynatech MR 5000)を用いて測定する。抗第Xa因子活性に比例する速度定数(k)を、基質加水分解曲線を等式(3)又は(3')に適合させることにより得る。
【０１１０】
まず、アッセイを、ペンタサッカライド含有クエン酸塩添加(0.105 M)正常ヒト血漿の濃度を、0〜3 mg/Lの濃度に校正する。標準曲線を作成し、抗第Xa因子活性を、血漿1リットルあたりのペンタサッカライドのmgとして表す。
次に、変異アンチトロンビンの抗第Xa因子阻害活性を評価するために、変異アンチトロンビン(0〜0.6 g/L、好ましくは0.15〜0.6 g/L、動力学バッファー中の最終濃度)を、血漿試料を含有する等容量のペンタサッカライド(0〜3 mg/L、好ましくは1〜3 mg/L)と30分間、37℃にて予備インキュベートする。
【０１１１】
これらの条件下で、変異アンチトロンビン濃度は、血漿アンチトロンビンレベルのものの1〜4倍の範囲であり、これは、アンチトロンビンの治療上の使用に適合する。実際に、変異アンチトロンビンの非常に高い用量である血漿アンチトロンビンレベルの5倍の増加は、既に、副作用なく臨床試験期間中に用いられた(Leitner JM, Firbas C, Mayr FB, Reiter RA, Steinlechner B, Jilma B.,組換えヒトアンチトロンビンはトロンビン形成及びインターロイキン6放出をヒト内毒血症において阻害する(Recombinant human antithrombin inhibits thrombin formation and interleukin 6 release in human endotoxemia.) Clin Pharmacol Ther. 2006 Jan;79(1):23〜34)。抗第Xa因子阻害活性は、次いで、以前に記載されたようにして評価される。
【０１１２】
最後に、インビボ条件に可能な限り近い条件での変異アンチトロンビンの抗第Xa因子活性に対する影響を評価するために、Rotachrom (登録商標)ヘパリン法を用いて、変異アンチトロンビン(動力学バッファー中で0〜0.6 g/L、好ましくは0.15-0.6 g/L)と予備インキュベートした血漿中の抗第Xa因子活性を、30分間、37℃にて、培養ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に対して試験する。細胞を、20000細胞/cm2にて96ウェルプレートに播種し、24時間、EGM-2培地(Clonetics, Cambrex)中で集密まで成長させる。リン酸緩衝塩水(Gibco, Invitrogen)で2回洗浄した後に、細胞を4時間、EBM-2培地(Clonetics, Cambrex)中で空腹にし、リン酸緩衝塩水で再び2回洗浄して、培養培地中に存在するヘパリンの余分な混入を回避する。HUVECで被覆したウェルを、次いで、ペンタサッカライド含有血漿-変異アンチトロンビン混合物(125μl/cm2)の30分間のインキュベーションに用いた後に、Rotachrom (登録商標)ヘパリンアッセイを行う。
【０１１３】
変異アンチトロンビンが、ペンタサッカライド結合について血漿アンチトロンビンと競合し、血漿抗第Xa因子活性を著しく減少させることができることが示される。
アッセイの条件において、AT-R393H、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394を加えることにより、血漿試料中に含有されるペンタサッカライドの抗第Xa因子活性が著しく減少する。
【０１１４】
変異アンチトロンビンが、過量投与の場合にペンタサッカライドを逆にする(reversal)ことができるかを評価するために、AT-N135Q-R393H及びAT-N135Q-Pro394を、Rotachrom (登録商標)ヘパリンアッセイにおいて、第Xa因子活性を回復させるその能力について試験する。静脈血栓塞栓事象を予防するための処置の状態において、最適なペンタサッカライドの濃度は、血漿中に1.2〜1.26μg/mLの範囲である。過量投与を模倣するために、ペンタサッカライドをヒト血漿プールに、3μg/mlの濃度で加える。Rotachrom (登録商標)ヘパリンアッセイを、次いで、ペンタサッカライドを過量投与した血漿を、変異アンチトロンビンの存在下で、血漿アンチトロンビン濃度と比較して1/1、2/1及び4/1の比(すなわち0.15、0.3、0.6 g/l)でインキュベートすることにより行う。このエクスビボアッセイにおいて、抗第Xa因子活性は、試験血漿中に存在する天然のアンチトロンビンと結合したペンタサッカライドの量に比例し、この量は、血漿中のペンタサッカライドの濃度に直接比例する。よって、変異アンチトロンビンの影響は、ペンタサッカライドに結合した天然アンチトロンビンの濃度の減少に実際に対応するペンタサッカライドの濃度の事実上の減少として表される(図7)。血漿アンチトロンビン濃度と等しい濃度でのAT-N135Q-R393H又はAT-N135Q-Pro394は、抗第Xa因子活性を、治療のためのペンタサッカライド処置に匹敵するレベルまで著しく減少させることができる(3μg/mLからそれぞれ事実上の1.04μg又は1.16μg/mLまで)。AT-N135Q-R393Hを、天然アンチトロンビンと比較して2又は4倍(モル)過剰で試験する場合、事実上のペンタサッカライド濃度は、それぞれ0.49又は0.29μg/mLまで減少する(それぞれ0.59又は0.36、AT-N135Q-Pro394を用いて)。
【０１１５】
一変異アンチトロンビンが過量投与の場合にペンタサッカライドを逆にすることができるかを評価するために、AT-Pro394を、Rotachrom (登録商標)ヘパリンアッセイにおいて、第Xa因子活性を回復するその能力について試験する。AT-Pro394処置は、ペンタサッカライド過量投与を模倣する場合に、AT-N135Q-R393H及びAT-N135Q-Pro394についてと同じ条件下で行う。血漿アンチトロンビン濃度と等しい濃度でのAT-Pro394は、抗第Xa因子活性を著しく減少させることができる。AT-Pro394を、天然アンチトロンビンと比較して2又は4倍(モル)過剰で試験する場合、事実上のペンタサッカライド濃度は、治療上のペンタサッカライド処置に匹敵するレベルまで減少する。
【０１１６】
ペンタサッカライド結合についての天然アンチトロンビンと変異アンチトロンビンとの競合に対する血管内皮の役割、より正確には、内皮細胞表面上で曝露されるグリコサミノグリカンの役割を評価するために、HUVEC表面でのペンタサッカライド含有血漿-変異アンチトロンビン混合物の予備インキュベーションを用いる以外は上記と同じ実験を行う(図8)。細胞表面での予備インキュベーションは、過量投与の場合にペンタサッカライドを逆にするように変異アンチトロンビンの効果に対してわずかに影響する。なぜなら、血漿アンチトロンビン濃度と比較して1/1、2/1及び4/1の比では、AT-N135Q-R393Hは、抗第Xa因子活性を、3μg/mLのペンタサッカライドから、事実上1.66、0.91および0.26μg/mLまでそれぞれ減少させるからである(予備インキュベーション中の内皮細胞の非存在下での1.04、0.49及び0.29μg/mLと比較して)。同じ条件下で、AT-N135Q-Pro394は、抗第Xa因子活性を、3μg/mLのペンタサッカライドから事実上1.69、0.94及び0.27μg/mLまでそれぞれ減少させる(予備インキュベーション中の内皮細胞の非存在下での1.16、0.59及び0.36μg/mLと比較して)。
【０１１７】
同様に、ペンタサッカライド結合についての天然アンチトロンビンと一変異アンチトロンビンとの競合に対する血管内皮の役割を評価するための上記と同じ実験を、HUVEC表面でのペンタサッカライド含有血漿-一変異アンチトロンビン混合物の予備インキュベーションを用いて行う。同じ条件で、細胞表面での予備インキュベーションは、過量投与の場合のペンタサッカライドを逆にするように一変異アンチトロンビンの効果に対してわずかに影響し、AT-Pro394は、ペンタサッカライドの抗第Xa因子活性を減少させる。
【０１１８】
このエクスビボ競合実験は、一変異及び変異アンチトロンビンが、穏やかな過量投与の場合に、血漿アンチトロンビンと等しい用量にてペンタサッカライドを逆にするように用いることができることを強く示唆する。4モル過剰の変異アンチトロンビンは、約10倍(又はそれより多く)の最初のペンタサッカライド濃度を減少させ、著しい過量投与の場合の治療上の使用にまだ適合する。
【０１１９】
c) マウス血漿中の変異アンチトロンビンの抗第Xa因子阻害活性の例
動物実験中に(詳細は以下のプロトコルを参照)、ヒト変異アンチトロンビンは、マウスアンチトロンビンと、ペンタサッカライドへのそれらの結合について競合する。よって、予備的なインビトロアッセイを行って、フォンダパリヌックスを補ったマウス血漿中に存在するマウスアンチトロンビンと競合するために必要なヒト変異アンチトロンビン濃度を決定する。
これらの実験は、セクションII-bに記載したようにして、ヒト血漿の代わりにマウス血漿を用いて行う。
【０１２０】
変異アンチトロンビンが、血漿アンチトロンビンと、ペンタサッカライド結合について競合し、血漿抗Xa活性を著しく減少させることができることが示される。
アッセイの条件において、AT-R393H、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394を加えることにより、マウス血漿に含有されるペンタサッカライドの抗Xa活性が、著しく減少する。
【０１２１】
変異アンチトロンビンが、ヒト血漿及びマウス血漿中でペンタサッカライド結合について血漿アンチトロンビンと競合することが示される。マウスアンチトロンビンと競合するために必要なヒト変異アンチトロンビンの量は、等しいか又はより重要である。
【０１２２】
III 変異アンチトロンビンのインビボ特徴決定
変異アンチトロンビンAT-R393H、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394の解毒剤としての効率を、マウスモデルにおいて評価する。
【０１２３】
a) 動物
動物(マウスCF、成体の雄；又はスイスマウス、成体の雌(JANVIER))に、凝固パラメータを変更しないプロトコルを用い、動物実験の欧州のガイドラインに従って麻酔をかける。
試験される種々の薬剤(フォンダパリヌックス、低分子量ヘパリン、全長ヘパリン及び変異アンチトロンビン)を、皮下投与の場合に遭遇する変動を避けるために、尾静脈への静脈内注射により投与する。しかし、ヘパリン誘導体(フォンダパリヌックス、低分子量ヘパリン及び全長ヘパリン)は、皮下投与もできる。
血液を、空静脈への穿刺により0.105 mol/Lクエン酸三ナトリウム(1:10)を含有する試験管に回収する。貧血小板血漿を、2300gで12℃にて10分間遠心分離することにより得て、用時まで-80℃にて貯蔵する。
【０１２４】
b) 実験プロトコル
以下の要素を決定する：
- マウスで過量投与を誘発するフォンダパリヌックスの用量、
- 変異アンチトロンビンの時間経過、特に最大の生物学的効果を観察するために必要な時間、
- フォンダパリヌックスを中和するのに必要な変異アンチトロンビンの最少用量。
これらの実験のそれぞれのために、それぞれ5匹のマウスの4群を用いる：
- 第1群では、マウスはフォンダパリヌックスビヒクル、次いで解毒剤(変異アンチトロンビン)ビヒクルを受ける。
- 第2群では、マウスはフォンダパリヌックス、次いで解毒剤ビヒクルを受ける。
- 第3群では、マウスはフォンダパリヌックスビヒクル、次いで解毒剤を受ける。
- 最後の群では、マウスはフォンダパリヌックス、次いで解毒剤を受ける。
【０１２５】
1- マウスでの過量投与を誘導するフォンダパリヌックスの用量の決定
ラットでのフォンダパリヌックスの薬物動態学に関する発表データ(Herbert J 4197)、又はマウスでのフォンダパリヌックス薬物動態学の実験による決定を用いて、モデルを開発する。
ラットでは、フォンダパリヌックスは、100 nmol/kg (又は0.17 mg/kg)の用量で最大抗血栓活性を有する。
この用量を用いて、Cmaxは1.2±0.8 nmol/ml (又は2.1±1.4 mg/L)である。過量投与を誘導するために、3倍用量(300 nmol/kg又は0.52 mg/kg)を試験する。この用量では、フォンダパリヌックスの血漿濃度は、約3.5〜4 nmol/mlである(又は6〜7 mg/L)。抗Xa活性を決定して、過量投与が得られたことを確実にする。
【０１２６】
抗FXa活性測定を、以前に記載したようにして、Stachrom heparin (登録商標)キットをSTA (Stago, France)に対して用いるか、又はRotachrom heparin(登録商標)キットをマイクロプレートリーダー(Dynatech MR 5000)での測定に適合させた手順を用いて行う。ペンタサッカライドの検量線を得て、結果をnmol/血漿のml (又はmg/L)で表すことが可能になる。
【０１２７】
2- 変異アンチトロンビンの作用時間の研究
ラットでは、フォンダパリヌックスは、100 nmol/kg (又は0.17 mg/kg)の静脈内注射後5分、又は100 nmol/kg (又は0.17 mg/kg)の皮下注射後30分のTmaxを有する。
マウスでは、フォンダパリヌックスの過量投与は、300 nmol/kg (又は0.52 mg/kg)で観察されるが、血漿中の最大濃度は、皮下注射後の15分未満で観察される。
よって、解毒剤(変異アンチトロンビン)を、フォンダパリヌックスの静脈内注射の5分後、及びフォンダパリヌックスの皮下注射の5、15又は30分後に静脈内投与する。
【０１２８】
変異アンチトロンビンの時間経過を、血漿抗Xa活性を、解毒剤投与の5分後、10分後、20分後及び40分後に測定することにより研究する。
これらの実験は、解毒剤の作用の時間を決定することを可能にする。
【０１２９】
3- フォンダパリヌックス中和に必要な変異アンチトロンビンの最少用量の決定
作用時間が一旦決定すると、用量応答曲線をインビボで作成して、治療的な範囲であるおよそ1.2 nmol/ml (又は2 mg/L)、又はおよそ0.7 nmol/ml (又は1.2 mg/L)内でフォンダパリヌックス血漿濃度を低減するために必要な解毒剤の用量を決定する。
【０１３０】
これらの実験条件を用いて、変異アンチトロンビン(AT-R393H、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393又はAT-N135Q-ΔS394)の注射は、ペンタサッカライドで処置したマウスでの血漿抗FXa活性の著しい減少をもたらす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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