(57)【要約】  本発明は、マウスをヒト化するための方法に関する。詳細には、本発明は、相同組換えと部位特異的組換えの組合せを用いてマウス遺伝子のクラスターを対応するヒトクラスター由来の単一又は複数の遺伝子で置換するための方法に関する。
2010538632.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスを着目遺伝子に関してヒト化する方法であって、次の段階ａ）及びｂ）：
ａ）置換対象のマウス標的遺伝子配列が各々の端で組換え部位と隣接するように相同組換えによってマウスゲノムに一対の部位特異的組換え部位を組込むことと、
ここにおいて、２個の組換え部位の少なくとも１個はヒト置換遺伝子配列に連続するように構築し、また、前記ヒト置換遺伝子配列は、前記少なくとも１個の組換え部位が前記ヒト置換遺伝子配列と前記マウス標的遺伝子配列との間にあるように配置し、
ｂ）部位特異的組換え部位間で組換えを行い、マウス標的遺伝子が先に占めていたマウスゲノム内の位置においてヒト配列が導入され、残存部位特異的組換え部位と隣接するようにすることとを含む方法。
【請求項２】
ヒト置換遺伝子配列は、内在性等価マウス標的遺伝子が自然に生じるマウス染色体内の場所で挿入する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒト置換遺伝子配列は遺伝子のクラスターを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子のクラスターは薬物代謝に関与するタンパク質をコードする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子のクラスターはシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）遺伝子クラスターの一部である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト置換遺伝子配列の転写は一以上の内在性マウス調節配列の制御下にある、先の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒト置換遺伝子配列の転写は内在性ヒト調節配列の制御下にある、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
部位特異的組換え部位の各々は選択可能マーカーと連続するように構築する、先の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
各選択可能マーカーは、前記マウス標的配列と前記組換え部位との間にあるように配置する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記選択可能マーカーの各々は互いに異なっている、請求項８又は請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択可能マーカーはネオマイシン及びハイグロマイシンから成る群から選択される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
第２対の部位特異的組換え部位をマウスゲノムに組込み、第２対の組換え部位の各々は、第２対の部位間で部位特異的組換えを行うことによってヒト置換配列を除去し得るように第１対の組換え部位に隣接させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト置換遺伝子配列は、第１対の部位特異的組換え部位の半分と第２対の部位特異的組換え部位の半分との間に配置する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト置換遺伝子配列が除去され、着目遺伝子がノックアウトされるように、第２対の部位特異的組換え部位間で第２ラウンドの組換えを行うことを更に含む、請求項１２又は請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記部位特異的組換え部位対はＬｏｘＰ、ＦＲＴ及びａｔｔＰ／ａｔｔＢから成る群から選択される、先の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
部位特異的組換えイベントはマウス胚性幹細胞内で行う、先の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
胚性幹細胞は次に胚盤胞に挿入する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
胚盤胞は次に偽妊娠マウスに移植する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
部位特異的組換えイベントはインビボで行う、先の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
部位特異的組換えイベントは、先の請求項のいずれか１項に従って作出されたトランスジェニックマウスを、該トランスジェニックマウスのゲノムにヒト置換遺伝子配列を組込む際に用いる部位特異的組換え部位を認識する部位特異的リコンビナーゼを発現するマウスと交雑させることによって行う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
部位特異的リコンビナーゼの発現は特定の組織に限定されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該リコンビナーゼはアルブミン−Ｃｒｅである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
先の請求項のいずれか１項に記載の方法によって作出される、着目遺伝子に関してヒト化されたトランスジェニックマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には、マウスをヒト化するための方法に関する。詳細には、本発明は、相同組換えと部位特異的組換えの組合せを用いてマウス遺伝子のクラスターを対応するヒトクラスター由来の単一又は複数の遺伝子で置換するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マウスモデルはヒト疾患を調べるための非常に有益なツールであり、多くの疾患の進行を研究したり、可能性のある治療法を試験するのに広く用いられている。従来、トランスジェニックマウスは外因性ＤＮＡの前核注入によって作出されている。つい最近では、例えば、ＷＯ９４／０２６０２に記載のように、対象となる外因性遺伝子及び選択可能マーカーを含有するバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む細胞と胚性幹細胞を融合させてマウスを作出し、外因性ＤＮＡセグメントの胚細胞ゲノムへの組込みについて評価している。このような方法は、相同組換えプロセスによるＢＡＣ又はＹＡＣの胚性幹細胞ゲノムへの組込みに依存する。この方法による遺伝子組換えは、ＢＡＣやＹＡＣを取り扱う上での技術的要求や、大きなＤＮＡ構築物を用いることによるＥＳ細胞の低トランスフェクション率のため、時間が掛かり、非効率的で不正確である。
【０００３】
Wallaceら（Cell 128, 197-209 2007）は最近、リコンビナーゼ介在ゲノム置換（ＲＭＧＲ）として知られる方法について記載している。この方法では、部位特異的組換えを用いてマウス対立遺伝子をオルソロガス遺伝子のヒト対立遺伝子で置換する。相同組換えによって、相互作用しない２種の部位特異的組換え部位（ｌｏｘＰとｌｏｘ５１１）を標的遺伝子に隣接するマウス染色体に挿入する。非相互作用部位特異的組換え部位のペアと同じペアをＢＡＣに挿入し、標的遺伝子のヒト対立遺伝子に隣接するようにする。マウス細胞にＢＡＣを導入した後、部位特異的リコンビナーゼを発現させることによって、ＢＡＣとマウス染色体の適合性部位特異的組換え部位間（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ及びｌｏｘ５１１／ｌｏｘ５１１）で２種の部位特異的組換え反応が生じ、ヒト遺伝子配列とマウス配列の相互交換が生じる。しかし、この方法は胚性幹細胞内で行う必要のある複数の段階を含み、主に細胞の核型が分裂することが多いという理由から非効率的である。従って、理想的には胚性幹細胞内で行う段階が少なくて済み、且つ上述の非効率に関する問題を克服できる、マウスをヒト化するための合理化された方法の必要性がある。
【０００４】
また、本発明は、ヒト化マウス作出の分野における他の問題を解決することを意図する。例えば、ヒト化マウスモデルを作出するための方法としてこれ迄に発表されている方法は、単一の内在性マウス遺伝子を対応するヒト遺伝子で置換することのみに着目している。これは、１個のマウス遺伝子が１個のヒト遺伝子に対応している遺伝子座においては許容し得る方法である。しかし、進化においては、遺伝子のクラスターが発達することがあり、複製や多様化等の変化を繰り返し受けることが多く、異なる種の間ではクラスターが大きく変わってしまうことがある。従って、一クラスターにおいて、種を超えて真のオルソロガス遺伝子を同定するのは不可能なことがある。極端な場合、ある種のクラスターでは１種類の機能性遺伝子しか存在しないが、他種のクラスターではより多くの機能性遺伝子が存在することがある。このような一例としては代謝酵素のＣＹＰ２Ｄ遺伝子クラスターが挙げられ、この場合、ヒトにおいては１種類の機能性遺伝子（ＣＹＰ２Ｄ６）しか存在しないが、マウスにおいては９種類の機能性遺伝子が存在する。このような場合、従来の相同組換えの遺伝子ターゲティング機構によって単一のマウス遺伝子をオルソロガスヒト遺伝子で置換しても、マウスクラスターからの残存遺伝子の発現のため、機能的なヒト化はもたらされないであろう。
【０００５】
また、多くの場合、クラスター全体の主な機能性は一遺伝子の遺伝子産物によって作り上げられており（例えば、ヒトＣＹＰ３ＡクラスターにおけるＣＹＰ３Ａ４や、ヒトＣＹＰ２ＣクラスターにおけるＣＹＰ２Ｃ９）、この遺伝子の機能的相同体を他種で同定するのは不可能なことがある。その結果、どの遺伝子を何で置換すべきかが不明確になる。更なる問題は、全遺伝子クラスターを構成するマウス染色体から大きなＤＮＡ断片を欠失させる場合、マウス染色体上でターゲティングアームが離れすぎていると、相同組換えが非効率的であるため、その欠失が単一イベントとして行えないかもしれないということである。
【０００６】
ヒト化マウスモデルの作出にあたり、ヒト化遺伝子座が、着目している等価な（equivalent）ヒト遺伝子座をうまく反映する該モデルを作出する方法があれば、そのような遺伝子座においてコードされる遺伝子の機能をより現実的に検討することができ、同様の機能性を有する遺伝子クラスターの一部を構成する遺伝子と関連する病態への治療介入の研究が容易になるであろう。
【０００７】
部位特異的リコンビナーゼを用いて特定の染色体位置で相同組換えを行うことができることは本技術分野では知られている（Jessenら、１９９７年参照）。このような部位特異的リコンビナーゼを用いる場合、部位特異的リコンビナーゼの添加によって必要時に組換えを開始することができる。
【０００８】
ＵＳ２００７／００６１９００には、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン可変領域遺伝子座に関してヒト化するための方法が記載されている。この方法は、ヒト免疫グロブリン可変領域の一部に連続するように配置された部位特異的組換え部位を２種類のベクター（ＬＴＶＥＣと称する）の各々に挿入することを伴う。その後、これらのＬＴＶＥＣを直線化し、相同組換えによってマウス細胞のゲノムに導入し、部位特異的組換え部位がマウス免疫グロブリン可変領域配列に隣接するようにし、また、部分ヒト免疫グロブリン可変領域配列が部位特異的組換え部位に隣接するようにする。部位特異的組換えを行うことによって、マウス免疫グロブリン可変領域配列が除去され、その内部に含まれる残存部位特異的組換え部位が２個の部分ヒト免疫グロブリン可変領域配列と連結する。得られたマウスは、ヒト可変領域とマウス定常領域を含有するハイブリッド抗体を産生するが、純粋なヒト抗体を産生させるにはその後に形質転換段階が必要である。免疫グロブリン可変領域のセグメント性によって、不都合な作用を殆ど生じさせることなく、残存部位特異的組換え部位を核酸配列内に残すことができる。しかし、非セグメント遺伝子内に残存部位特異的組換え部位をコードする核酸配列が存在することによってその転写能力が排除される場合には、該遺伝子に関するヒト化に上述の技術を用い得ることは示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これに対し、本発明の方法では、胚性幹細胞内で僅か２ラウンドのターゲティングを行うことによって、如何なるマウス遺伝子又は遺伝子クラスターをも完全にヒト化することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明においては、マウスを着目遺伝子に関してヒト化する方法であって、次の段階ａ）及びｂ）：
ａ）置換対象のマウス標的遺伝子配列が各々の端で組換え部位と隣接するように相同組換えによってマウスゲノムに一対の部位特異的組換え部位を組込むことと、
ここにおいて、２個の組換え部位の少なくとも１個はヒト置換遺伝子配列に連続するように構築し、また、前記ヒト置換遺伝子配列は、前記少なくとも１個の組換え部位が前記ヒト置換遺伝子配列と前記マウス標的遺伝子配列との間にあるように配置し、
ｂ）部位特異的組換え部位間で組換えを行い、マウス標的遺伝子が先に占めていたマウス染色体内の位置においてヒト配列が導入され、残存部位特異的組換え部位と隣接するようにすることとを含む方法が提供される。
【００１１】
本発明のメカニズムの概要を簡単に図１に示す。即ち、２種の別個の従来の相同組換え反応によって、胚性幹細胞内のマウス染色体に２個の部位特異的組換え部位を組込む。相同組換えは当該技術分野ではよく知られている現象であるが、理解を助けるため、相同組換えのメカニズムの概略を図２に示す。２種の組換え反応は、標的マウス染色体と部位特異的組換え部位を含む置換核酸配列との間の短い相同領域によって促進される。これらの相同領域によって鎖侵入とその後の塩基対形成が促進され、鎖伸長によって各組換え部位がマウス染色体に挿入される。
【００１２】
マウス標的配列の一端又は両端においては、部位特異的組換え部位に加え、置換核酸配列が、マウス標的配列との置換が意図されるヒト遺伝子配列に連結されている。従って、全ヒト置換遺伝子配列と付着部位特異的組換え部位をマウス染色体に同時に挿入して、図１に示す構成が得られる。両方の組換え反応が一旦終了すると、部位特異的組換え部位はマウス標的遺伝子に隣接する。図１に示すように、両方の組換え部位を同じ方向に整列させ、その組換えがやがて一緒になるようにする必要がある。
【００１３】
マウス標的遺伝子配列を除去し、それを置換ヒト遺伝子配列で置換するため、部位特異的組換えを２個の組換え部位間で行う。そのメカニズムを図３に示す。これらの組換えイベントによって、マウス標的遺伝子配列が除去され、マウス標的遺伝子が先に占めていたマウス染色体内にヒト置換遺伝子配列が配置され、組換えイベントで形成された残存部位特異的組換え部位と隣接する。
【００１４】
本発明の方法は多くの利点を有する。一例としては、上述のWallaceの方法と比較しても、胚性幹細胞段階で必要な形質転換段階の数が減少するため、必ずしもＢＡＣやＹＡＣを取り扱う必要がなく、ヒト化マウスの作出が大幅に容易になる。本発明の方法においては、胚性幹細胞において必要とされる相同組換えによる従来のターゲティングは最低２ラウンドである（即ち、標的配列の一端における部位特異的組換え部位の組込み、及び他端における部位特異的組換え部位＋ヒト遺伝子の組込み）。その後に必要とされるのは、マウス標的配列を除去する単一の欠失段階のみである。これはインビトロ又はインビボで行うことができる。本発明の方法は、Wallaceの方法に比べて少なくとも１段階少なくて済み（通常の作業では、ＥＳ細胞段階における８週間程度の削減に相当する）、複数ラウンドのトランスフェクション時にＥＳ細胞で分裂が蓄積し、該細胞が生殖系列を通過できなくなるというリスクが大幅に低下するという点でより効率的である。
【００１５】
また、本発明に係る内在性マウス遺伝子又はクラスターの同時置換による遺伝子又は遺伝子クラスターに関するヒト化によって、置換されるマウス遺伝子と同一の部位に確実にヒト遺伝子が位置するため、本発明の方法の後期段階においても効率の面で利点がある。従って、交雑によってホモ接合性を得る場合、置換を必要とする遺伝子座は１種類のみである。これに対し、マウス遺伝子をノックアウトし、その機能を異なる染色体上に位置するヒト遺伝子で置換するためには、遥かに複雑な遺伝学的バックグラウンドが存在する。マウスノックアウト及びヒト置換の両方についてホモ接合性を得るためには更に多くの交雑が必要であろう。
【００１６】
本発明の方法の特に有利な点はその効率にある。Wallaceの研究から明らかなように、リコンビナーゼ介在組換えを用いて、大きな染色体ＤＮＡセグメントをベクター上の同様のサイズのセグメントで置換しようとするのは非常に非効率的である。報告されている効率は１０8に対し１のオーダーである。これに対し、本発明において選択される分子内組換えイベントは通常、１０6に対し１のオーダーである。また、Wallaceによって用いられるＤＮＡは非常に長い（２００ｋｂのオーダー）ため、分子内転位や望ましくない相同組換えイベントが生じる機会が増加し、非機能的又は不正確なＤＮＡ構造が生成する機会が増加する。このような問題は本発明の方法によって回避される。
【００１７】
本発明の方法は、ヒトタンパク質を、等価なマウス遺伝子の非存在下で発現するマウスの作出をもたらす（該遺伝子は、本発明の方法の実施中にマウス染色体から欠失する）。
【００１８】
導入されたヒト遺伝子は、それ自身の調節配列の制御下で組込むことができる。或いは、等価なマウス調節配列がヒト配列の上流に配置され、その場所で用いられるように遺伝的組換えイベントを設定することができる。遺伝子コード配列を有する推定ヒト調節配列を組込むのではなく、マウス調節配列を保持する方が望ましい場合もある。例えば、ＣＹＰ３Ａ４の場合、ヒトプロモーターを有するヒト化マウスを作出し、この活性によってＣＹＰ３Ａ４遺伝子の調節を支配する。しかし、Cheungら（Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 316, 1328-1334 2006）は、この構成の下ではＣＹＰ３Ａ４タンパク質が成体雄において発現しないことを示している。従って、用いる構築物からある種のプロモーターエレメントや他の因子が欠損しているに違いないことが推定される。これに対し、マウス調節配列を保持し、これをヒト配列の代わりに調節に用いることによって、導入遺伝子の忠実な調節が保持され、上述のような問題が回避されることが保証され得る。
【００１９】
従来の技法（即ち、マウス染色体へのヒト遺伝子の組込みが多少ランダムである）に対する本発明の方法の一利点は、等価なマウス遺伝子の部位での組込みによって遺伝子配置のゲノムコンテクストが確実に保持されることである。このような部位で組込むことによって、転写が生じるのに必要な転写因子や他のタンパク質に対して染色体ＤＮＡへのアクセスが可能であるという意味では、局所的染色体構造が「オープン」になる可能性がある。これだけでなく、内在性マウス遺伝子に対しても同じ染色体コンテクストが保持され、染色体三次構造レベルでのＤＮＡ転写の調節がヒストン結合及び染色体の局所的フォールディング／アンフォールディングによって保持されるようにする。これによって、遺伝子転写の全体論的な調節が確実に保持され、その後、内在性マウス遺伝子に見られるのと同様の遺伝子調節の組織分布が、導入されたヒト遺伝子でも生じるようになる。遺伝子転写レベルでのこのような生理学的調節メカニズムの完全な保持は先行技術に対しては共通ではない。
【００２０】
本発明の方法の更なる利点は、重要な遺伝子又は遺伝子クラスターの欠失によって生じる致死（特に、欠失した遺伝子又は遺伝子クラスターに対してハプロ不全（ヘテロ接合体動物においては致死の原因となる）が生じる場合）についての問題に関する。本発明の方法においては、マウス遺伝子を欠失させると同時に、該遺伝子をヒトにおけるその機能等価物で置換するため、該遺伝子がコードしている機能が損なわれる時間的余裕を与えない。従って、ヒトタンパク質の機能が等価なマウスタンパク質の機能に本当に取って代わるのであれば、このような性質の問題は回避される。
【００２１】
また、本発明においては、染色体上のマウス遺伝子又はクラスターの両端に導入された２個の半成分（component halves）を結合させて機能性ヒト遺伝子を形成することもできる。部位特異的組換えによってマウス遺伝子又はクラスターを除去する際に、ヒト遺伝子の半成分同士を一体化させて機能性ヒト遺伝子を形成する。コード配列を分裂させる残存ＲＴ部位についての潜在的問題は、このＲＴ部位をイントロン内に配置することによって解決できる。同様に、本発明によって、通常はヒト染色体上で連続して配置されていない異なる遺伝子を結合させることができる。当然のことながら、この戦略は、結合させる成分が異なる染色体上にあるか又は離れすぎていて単一のＢＡＣやＹＡＣでカバーできない場合には、Wallaceの技術等の先行技術によっては行うことができないであろう。
【００２２】
本明細書に記載のアプローチは、特定のマウスやヒトの機能性がクラスター内の染色体で連続して連結している多数の異なる遺伝子によってコードされている状況においては、特に有利に用いることができる。本発明の方法によって、マウス遺伝子クラスターを等価なヒト遺伝子又はクラスターで簡単に置換することができる。
【００２３】
同様に、同じ理由から、本発明の方法は、遺伝子レベルで高レベルの冗長性を有するマウス遺伝子系に関するヒト化によく適している。例えば、第１の選択遺伝子の非存在下、あるマウス遺伝子の機能の全部又は一部が同じ遺伝子クラスター内の他のマウス遺伝子によって引き継がれ得る場合、ヒト化の際に遺伝子全てをヒト等価物で確実に置換するのが重要である。これが行われない場合には、ヒト化系の読み取りが混乱し、最終的には無意味になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の方法の概要。この方法は、相同組換えによって２対の部位特異的組換え部位（その内の一方は、ヒト遺伝子置換配列に連続するように配置する）を挿入することと、第１対の部位間で部位特異的組換えを行ってマウス標的遺伝子を除去することとを含む、ヒト化のためのメカニズムを提供する。第２対の部位特異的組換え部位で組換えを行ってヒト遺伝子置換配列を除去し、遺伝子ノックアウトを作出する。
【図２】相同組換えのメカニズム。相同組換えは二本鎖染色体の切断後に生じる。５’−３’エクソヌクレアーゼ活性によって３’オーバーハングが産生し、鎖侵入が生じる。ＤＮＡ合成では無傷の鎖を鋳型として用い、連結によって染色体切断が修復され、ホリデイジャンクションが生じる。その後の分岐点移動と回復によって組換え産物が産生する。
【図３Ａ】ＬｏｘＰ部位特異的組換え部位。
【図３Ｂ】部位特異的組換えのメカニズム。相補的塩基対形成によって２個のＬｏｘＰ部位が整列し、Ｃｒｅリコンビナーゼによって２個の部位間の組換えが触媒され、マウス標的遺伝子が除去される。
【図４Ａ】ヒト遺伝子の発現がマウスプロモーターによって制御される場合の本発明の原理。好適なマウスプロモーターがマウスクラスターの一端において内側に向いている場合。ヒト置換遺伝子配列をマウスプロモーターとマウス標的遺伝子との間に挿入し、マウスプロモーターを存続させると共に、ヒト遺伝子置換配列からの発現を制御する。この戦略はＣＹＰ３Ａ４をＣＹＰ３Ａ１１に挿入する場合に選択された（図１１参照）。クローニング目的のみのために更なるＦＲＴ部位を設けた。従って、また、好適なプロモーターは必ずしもマウスクラスターの末端に配置されないという理由からも、以下の図面で示すヒトプロモーターの使用又はマウスプロモーターの再導入も、かなり一般的に適用し得る。
【図４Ｂ】ヒト遺伝子の発現がマウスプロモーターによって制御される場合の本発明の原理。好適なマウスプロモーターがマウスクラスターの一端において外側に向いている場合。この戦略は本発明の方法には適用されない。従って、また、好適なプロモーターは必ずしもマウスクラスターの末端に配置されないという理由からも、以下の図面で示すヒトプロモーターの使用又はマウスプロモーターの再導入も、かなり一般的に適用し得る。
【図５Ａ】ヒト遺伝子の発現がヒトプロモーターによって制御される場合の本発明の原理。クラスター末端におけるマウス遺伝子の発現が外側に向いている場合。マウス遺伝子及びマウスプロモーターの上流のマウスゲノムにヒト置換遺伝子配列を挿入する。その後のＣｒｅ介在組換えによって、プロモーター配列を含むクラスターの末端においてマウス遺伝子が物理的に欠失する。この戦略は、ＣＹＰ３Ａ４のＣｙｐ３ａ１１への挿入（図１１）及びＣＹＰ３Ａ４のＣｙｐ３ａ２５への挿入（図７）の両方の場合にＣｙｐ３ａクラスターの一端において選択され、また、ＣＹＰ２Ｄヒト化（図９）の場合にＣｙｐ２ｄクラスターの一端において選択された。
【図５Ｂ】ヒト遺伝子の発現がヒトプロモーターによって制御される場合の本発明の原理。クラスター末端におけるマウス遺伝子の発現が内側に向いて、該遺伝子のプロモーターが明確である場合。マウス遺伝子及びマウスプロモーターの上流のマウスゲノムにヒト置換遺伝子配列を挿入する。その後のＣｒｅ介在組換えによって、プロモーター配列を含むクラスターの末端においてマウス遺伝子が物理的に欠失する。しかし、マウスプロモーターの長さは通常、十分に明確ではないため、この戦略は本発明の方法に用いるべきではない。
【図５Ｃ】ヒト遺伝子の発現がヒトプロモーターによって制御される場合の本発明の原理。クラスター末端におけるマウス遺伝子の発現が内側に向いて、該遺伝子のプロモーターが明確ではない場合。マウスプロモーターとマウス遺伝子との間のマウスゲノムにヒト置換遺伝子配列を挿入する。従って、Ｃｒｅ介在組換えによってマウスプロモーターが無傷のまま残る。ヒト発現カセットとの干渉を回避するため、スプライスアクセプターポリＡ（ｓＡｐＡ）配列によってｍＲＮＡの転写を終結させる。ｓＡｐＡ配列はイントロン１（マウス遺伝子の場合）又はいずれかの下流イントロンに配置させることができる。相同組換えがマウス遺伝子のエクソン内で生じるような場合、転写の終結にはポリＡシグナルのみ（スプライスアクセプター部位無し）で十分である。この戦略は、ＣＹＰ３Ａ４のＣｙｐ３ａ１１への挿入（図１１）及びＣＹＰ３Ａ４のＣｙｐ３ａ２５への挿入（図７）の両方の場合にＣｙｐ３ａクラスターの他端において選択され、ＣＹＰ２Ｄヒト化（図９）の場合にＣｙｐ２ｄクラスターの他端において選択され、ＣＹＰ２Ｃ９のＣｙｐ２ｃ５５への挿入（図８）の場合にＣｙｐ２ｃクラスターの両端において選択された。注目すべきは、マウスクラスターの一端に対してＡ）、Ｂ）及びＣ）で示す（図５中の左端に示す）のと同じことを該クラスターの他端に対しても考慮する必要がある点である。
【図６】トランスジェニックマウスを作出するための方法。トランスジェニックマウスは、発育胚盤胞に一以上の変化した胚性幹細胞を挿入することによって作出する。その後、胚盤胞を偽妊娠マウスに移植し、発育させてキメラを作出する。キメラを欠失株と交雑させてマウス標的遺伝子を除去し、ヒト化遺伝子に対してヘテロ接合性のマウスを作出する。２種の前記へテロ接合体を交雑させて、ヒト化イベントに対してホモ接合性のマウスを作出する。
【図７】対応するヒトプロモーターを用い、ＣＹＰ３Ａ４に関してヒト化する方法。ＣＹＰ３Ａ４に関してヒト化したマウスを作出するための標的戦略（マウスＣＹＰ３Ａクラスターを欠失させ、その後、ヒト発現カセットをノックアウトすることができる）。
【図８】対応するヒトプロモーターを用い、ＣＹＰ２Ｃ９に関してヒト化する方法。ＣＹＰ２Ｃ９に関してヒト化したマウスを作出するための標的戦略（マウスＣＹＰ２Ｃクラスターを欠失させ、その後、ヒト発現カセットをノックアウトすることができる）。
【図９】対応するヒトプロモーターを用い、ＣＹＰ２Ｄ６に関してヒト化する方法。ＣＹＰ２Ｄ６に関してヒト化したマウスを作出するための標的戦略（ＣＹＰ２Ｄクラスターを欠失させ、その後、ヒト発現カセットをノックアウトすることができる）。
【図１０Ａ】ＰＣＲ解析から、ヘテロ接合体ＣＹＰ２Ｄ６ヒト化マウスの作出が成功したことが分かる。特定のプライマーを用いて、ＰＣＲによるマウス染色体の解析を行うことができる。その結果から、所望のヒト置換ＣＹＰ２Ｄ遺伝子配列が導入され、マウスＣＹＰ２Ｄクラスターが欠失し、ＣＹＰ２Ｄ６に関してヘテロ接合的にヒト化したマウスの作出が成功したことが分かる。
【図１０Ｂ】ＰＣＲ解析から、ヘテロ接合体ＣＹＰ２Ｄ６ヒト化マウスの作出が成功したことが分かる。特定のプライマーを用いて、ＰＣＲによるマウス染色体の解析を行うことができる。ホモ接合体ＣＹＰ２Ｄ６ヒト化マウスのＰＣＲ確認。ＩＤが２２４５０４、２２５９３８、２２５９３９及び２２５９４４のマウスをＣＹＰ２Ｄ６に関してホモ接合的にヒト化し、マウスＣｙｐ２ｄクラスターを欠失させる。
【図１０Ｃ】ＰＣＲ解析から、ヘテロ接合体ＣＹＰ２Ｄ６ヒト化マウスの作出が成功したことが分かる。特定のプライマーを用いて、ＰＣＲによるマウス染色体の解析を行うことができる。ｈｕＣＹＰ２Ｄ６マウス肝臓におけるＣＹＰ２Ｄ６タンパク質の発現。プールされた野生型マウス（ｎ＝２０）及びヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）（ｎ＝２０）（両性）と共に、１ｕｇの雄性ｈｕＣＹＰ２Ｄ６マウス肝ミクロソーム（ＭＬＭ）（ｎ＝１）を１０％Ｎｕ−ＰＡＧＥゲル上にロードした。モノクローナルマウスヒト特異的ＣＹＰ２Ｄ６抗体（１：２０００、ゲンテスト）及び抗マウスＨＲＰ接合体（１：２０００、ＧＥヘルスケア）と共に膜をインキュベートした。３０秒間の曝露によるＥＣＬ展開。ロードした標準品は以下の通りである。１．マウス組換えｈｉｓタグＣｙｐ２ｄ２２（０．０１ｐｍｏｌ、ＣＸＲバイオサイエンシーズ）、２．ヒトＣＹＰ２Ｄ６バキュロソーム（０．０１ｐｍｏｌ、インビトロジェン）、３．マウス組換えｈｉｓタグＣｙｐ３ａ１１（０．１ｐｍｏｌ、ＣＸＲバイオサイエンシーズ）、４．ヒトＣＹＰ３Ａ４バキュロソーム（０．１ｐｍｏｌ、インビトロジェン）、５．マウス組換えｈｉｓタグＣｙｐ２ｃ２９（０．１ｐｍｏｌ、ＣＸＲバイオサイエンシーズ）、６．ヒトＣＹＰ２Ｃ９バキュロソーム（０．５ｐｍｏｌ）。
【図１１】マウスＣｙｐ３ａ１１プロモーターを用い、ｈｕＣＹＰ３Ａ４に関してヒト化する方法。Ｃｙｐ３ａ１１プロモーターを用いてＣＹＰ３Ａ４に関してヒト化したマウスを作出するための標的戦略（マウスＣＹＰ３Ａクラスターを欠失させる）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、マウスを着目遺伝子に関してヒト化する方法であって、次の段階ａ）及びｂ）：
ａ）置換対象のマウス標的遺伝子配列が各々の端で組換え部位と隣接するように相同組換えによってマウス染色体に一対の部位特異的組換え部位を組込むことと、
ここにおいて、２個の組換え部位の少なくとも１個はヒト置換遺伝子配列に連続するように構築し、また、前記ヒト置換遺伝子配列は、前記少なくとも一個の組換え部位が前記ヒト置換遺伝子配列と前記マウス標的遺伝子配列との間にあるように配置し、
ｂ）部位特異的組換え部位間で組換えを行い、マウス標的遺伝子が先に占めていたマウス染色体内の位置においてヒト配列が導入され、残存部位特異的組換え部位と隣接するようにすることとを含む方法を提供する。
【００２６】
本明細書においては、「ヒト化」、「ヒト化された」及び「ヒト化する」とは、内在性マウス遺伝子に代わってマウスのゲノム内にヒト遺伝子を導入することに関する。これらのタームを用いて、染色体や細胞、組織、器官、生体レベルでのマウスに対するこのような遺伝子置換の作用について説明することができる。
【００２７】
方法
本発明においては、トランスジェニックモデルに挿入される置換ヒト遺伝子は、内在性等価遺伝子又は遺伝子クラスターが自然に生じる染色体内の場所で挿入するのが好ましい。これは、遺伝子座のコンテクストが保持される、即ち、この部位からの転写の忠実度が野生型の系で生じる転写レベルにできるだけ近くなるという点で有利である。
【００２８】
当該技術分野でよく知られており、以下に更に説明する方法に従って、組換え段階はマウス胚性幹細胞内で行うのが好ましい。胚性幹細胞は全能性細胞の培養細胞株であり、該細胞を初期胚に導入すると発育して生体の全組織に定着するようになる。
【００２９】
本発明の方法の第１の段階は、一対の部位特異的組換え部位（組換え標的部位又はＲＴ部位とも称する）をマウス染色体内に組込むことである。ＲＴ部位は部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）によって認識される。ＳＳＲ酵素活性に曝露することによって、ＲＴ部位の配置で確認されるＤＮＡ再構成が生じ、その結果、直線ＤＮＡ分子内で介在配列が除去又は切除される。
【００３０】
置換されるマウス標的遺伝子配列は、各々の端においてＲＴ部位と隣接する必要がある。２個のＲＴ部位間での組換えによって介在配列が切除される。
【００３１】
２個の組換え部位の一方又は両方はヒト置換遺伝子配列と連続するようにデザインする。置換されるマウス標的遺伝子配列とヒト置換遺伝子配列との間に組換え部位が位置するようにヒト配列を配置する必要がある。これによって、２個のＲＴ部位間で組換えが生じ、マウス標的配列が切除される際に、マウス標的遺伝子が先に占めていたマウス染色体内の位置でヒト配列が導入されるという作用が得られる。残存部位特異的組換え部位は、先にマウス標的配列があった場所に残る。残存ＲＴ部位が導入遺伝子のコード配列を妨害しないように、又は支配プロモーターからの転写に悪影響を及ぼさないように組込みイベントをデザインするのが有利である。これは、該コード配列を乱さないようにＲＴ部位を注意深く配置するか、又はＲＴ部位をイントロン内に配置することによって行うことができる。
【００３２】
本発明の一実施形態においては、ヒト置換遺伝子配列が内在性マウス標的遺伝子配列の上流及び下流の両方に配置されるように、一を超えるヒト置換遺伝子配列を用いることができる。こうして、部位特異的組換えの際にはマウス標的配列が除去され、その場所において置換ヒト配列が一体化される。
【００３３】
このような戦略が有利となり得る状況が数多く存在する。例えば、既存の相同組換え技法におけるサイズ制限を考慮すると、所望量の置換配列を導入するために２種の別個のヒトフランキング置換配列を組込むことが必要な場合がある。例えば、ＣＹＰ１Ａ１を内在性マウス等価物の上流に導入し得る一方、ＣＹＰ１Ａ２を下流に導入することができる。
【００３４】
また、このようにして２種の別個の遺伝子（恐らく、遺伝子クラスター内で離れすぎていて単一のＢＡＣやＹＡＣでカバーされない遺伝子や、異なる染色体上に位置する２種の遺伝子）を導入するのが適切な場合もある。このような戦略は、先行技術システムによっては実際に行うことができなかった。
【００３５】
また、本発明によって、染色体上のマウス遺伝子又はクラスターの両端に導入された２個の半成分を結合させて機能性ヒト遺伝子を形成することもできる。部位特異的組換えによってマウス遺伝子又はクラスターを除去する際に、ヒト遺伝子の半成分同士を一体化させて機能性ヒト遺伝子を形成する。この手段によって、ヒト遺伝子の時間又は組織特異的活性化とマウス遺伝子の不活性化を成し遂げることができる。コード配列を分裂させる残存ＲＴ部位についての潜在的問題は、このＲＴ部位をイントロン内に配置することによって解決できる。
【００３６】
ＲＴ部位を染色体内に組込むための方法は当業者には知られているであろうが、相同組換えプロセスを用いて行うのが好ましい。相同組換えは、核酸配列をマウス染色体に挿入させるのに用いることのできる遺伝的メカニズムに関する。このメカニズムは、二本鎖のマウス及びヒト核酸配列を整列させることによって開始する。マウス配列内での二本鎖切断と５’−３’エクソヌクレアーゼ活性によって鎖侵入が促進され、その結果、短い相同領域によって相同的なヒト及びマウス配列の塩基対形成が生じる。その後のマウス配列の鎖伸長ではヒト配列を鋳型として用い、回復によって、ヒト配列が内部に配置されたマウスゲノム配列が生成するが、ヒト配列は無傷のまま残る。
【００３７】
相同組換えを行うための方法は当該技術分野においては公知であり、外部から供給されたＤＮＡ分子と標的染色体との間で相同領域を用いてＲＴ部位を導入する。好適な標的のデリバリーシステムは当業者には明らかであろうが、その例としては、注入又は標的ネイキッドＤＮＡや、ＤＮＡを封入及び／又はＤＮＡと複合体を形成した標的リポソーム、標的レトロウイルス系、プロタミン及びポリリジン凝縮ＤＮＡ等の標的凝縮ＤＮＡ、エレクトロポレーションの使用が挙げられる。また、他のデリバリー方法を用いることもでき、例えば、核酸発現ベクターやポリカチオン凝縮ＤＮＡ、リガンド連結ＤＮＡを用いる方法（Curiel (1992) Hum Gene Ther 3:147-154; Wu (1989) J Biol Chem 264:16985-16987参照）、及び遺伝子導入粒子銃の使用（米国特許第５，１４９，６５５号に記載）が挙げられる。また、国際特許公開ＷＯ９０／１１０９２に詳述のように、ネイキッドＤＮＡを用いることもできる。
【００３８】
ＲＴ対は、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、ａｔｔＰ／ａｔｔＢ及びｒｏｘ（Sauer and McDermott. Nucleic Acids Res. 32(20): 6086-95, 2004）から成る群から選択されるのが好ましい。このリストはほんの一例として挙げたに過ぎず、これらに限定されるものではない。この様相においては、前記部位特異的組換え部位対間の組換えは、対応する部位特異的リコンビナーゼ（即ち、Ｃｒｅ、ＦＬＰ、ＰｈｉＣ３１及びＤｒｅ）によって行われる。前記部位特異的組換えはインビボ又はインビトロで実施し得ることは理解されよう。
【００３９】
実際には、各ＲＴ部位は、選択可能マーカーと連結する（好ましくは、連続する）ように構築する必要がある。選択可能マーカーを組込むことによってマウス染色体内のＲＴ部位を検出することができ、それによって、ＲＴ部位対の挿入が成功したかどうかをモニターすることができる。
【００４０】
各選択可能マーカーは、マウス標的配列とＲＴ部位との間の空間にあるように配置するのが好ましい。これは、組換えが成功した際には、選択可能マーカーが染色体から除去され、本発明の方法においてはこれ以上関与しないことを意味する。このように、ヒト化後に染色体内に残るヒト配列の調節を選択可能マーカーが乱すことがないことを確実にできる。
【００４１】
選択可能マーカーの各々は互いに異なっているのが好ましい。これによって、各組換え部位の挿入を互いに別々に独立してモニターすることができる。
【００４２】
選択可能マーカーは、成長ＥＳ細胞が曝露され得る化合物（例えば、抗生物質）に対するある種の耐性をコードする遺伝子であるのが好ましい。その例としては、細胞成長培地に添加される抗生物質に対する耐性を付与する選択可能マーカー（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はピューロマイシンに対する耐性を付与するネオマイシン耐性マーカー）の使用が挙げられる。更なる例としては、本発明の上述の様相における核酸配列（又はその一部）に相補的であり、それに対してハイブリダイズする核酸配列を用いた検出が挙げられる。例えば、サザンブロット解析やノーザンブロット解析、ＰＣＲが挙げられる。
【００４３】
好ましい戦略においては、変化したマウス胚性幹細胞の作出（好ましくは、別々の段階での作出）を伴い、これによって、各ＲＴ部位がその選択可能マーカーと共に別々に組込まれる。その後、変化した胚性幹細胞を胚盤胞に挿入することができる。従来、胚盤胞は雌性マウスから交配の約３日後に単離している。最大２０個の変化した胚性幹細胞（好ましくは、約１６個）をそのような胚盤胞に同時に挿入し得ることは理解されよう。変化した胚性幹細胞を胚盤胞に挿入することにより、好ましくは、妊娠マウスの特性を反映するように誘導された偽妊娠マウスに移植することによって、胚性幹細胞は発育初期胚に組込まれるようになる。この方法によると、変化した胚性幹細胞を含む胚盤胞は偽妊娠マウスの子宮壁内に移植され、妊娠期間が終了するまで該マウス内で発育し続ける。変化した胚性幹細胞は増殖し、分裂して発育トランスジェニックマウスの全組織（生殖系列を含む）に定着するようになる。
【００４４】
本発明の方法の一様相においては、作出したトランスジェニックマウスは、各体細胞組織及び生殖系列内に変化した細胞と未変化の細胞を含むキメラとなり得る。
【００４５】
ＲＴ部位間で組換えを行うためには、ゲノムをＳＳＲ酵素形態のＳＳＲ活性に曝露する必要がある。「ＳＳＲ」とは、特定のＤＮＡ遺伝子座におけるＤＮＡ再構成を仲介する組換え系の如何なるタンパク質成分をも意味し、例えば、インテグラーゼ又はレゾルバーゼ／インベルターゼクラスのＳＳＲ（Abremski, K.E. and Hoess, R.H. (1992) Protein Engineering 5, 87-91; Khan, et al., (1991) Nucleic acids Res. 19, 851-860; Nunes-Duby et al., (1998) Nucleic Acids Res 26 391-406; Thorpe and Smith, (1998) P.N.A.S USA 95 5505-10）及びイントロンコード化エンドヌクレアーゼによって仲介される部位特異的組換え（Perrin et al, (1993) EMBO J. 12, 2939-2947）が挙げられる。
【００４６】
好ましいリコンビナーゼタンパク質は、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｄｒｅリコンビナーゼ、ジゴサッカロマイセス・ルキシープラスミドｐＳＲｌ由来のＲリコンビナーゼ、クルイベロマイセス・ドロソフィラリウムプラスミドｐＫＤ１由来のリコンビナーゼ、クルイベロマイセス・ワルティープラスミドｐＫＷ１由来のリコンビナーゼ、バチルストランスポゾンＴｎ４４３０由来のＴｒｐＩ、λＩｎｔ組換え系のいずれかの成分、ｐｈｉＣ３１、Ｇｉｎ組換え系のいずれかの成分、及びこれらのバリアントから成る群から選択される。
【００４７】
大きいＤＮＡ断片（２００ｋｂ〜数メガベース）の欠失に適したＣｒｅ／ｌｏｘ介在欠失を仲介するための方法は以下の論文に記載されている（Li ZW, Stark G, Gotz J, Rulicke T, Gschwind M, Huber G, Muller U, Weissmann C. Generation of mice with a 200-kb amyloid precursor protein gene deletion by Cre recombinase-mediated site-specific recombination in embryonic stem cells Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Jun 11;93(12):6158-62. Erratum in: Proc Natl Acad Sci U S A 1996 Oct 15;93(21):12052; in Su H, Wang X, Bradley A. Nested chromosomal deletions induced with retroviral vectors in mice. Nat Genet. 2000 Jan;24(l):92-5）; Call LM, Moore CS, Stetten G, Gearhart JD. A cre-lox recombination system for the targeted integration of circular yeast artificial chromosomes into embryonic stem cells. Hum Mol Genet. 2000 JuI 22;9(12):1745-51）。
【００４８】
上述のように、部位特異的組換えイベントはインビトロ又はインビボで行うことができる。部位特異的組換えは、トランスジェニックマウス内でＳＳＲの活性を誘導することによって行うことができる。実際、生体系で遺伝子型を変化させるために部位特異的組換えをうまく利用するには、組換えイベントを調節するための戦略が必要である。これは、得られる発現パターンが上述の組織特異的な要素が活性となる時間及び場所に制限されるように、リコンビナーゼｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を制御することによって行うことができる（Baubonis and Sauer (1993) Nucl Acids Res. 21, 2025-2029; Sauer B, (1994) Curr Opin Biotechnol 5:521-7; Rajewsky et al., (1996) J Clin Invest 98, 600-3; Metzger and Feil, (1999) Curr. Opinions Biotechnology 10, 470-476）。
【００４９】
研究者らは、ＳＳＲ酵素を発現させるために、直接トランスフェクションや組換えウイルスによる感染、ＳＳＲタンパク質をコードするＤＮＡやｍＲＮＡ又は該タンパク質自身の注入を用いてきた（Konsolaki et al, (1992) New Biol. 4: 551-557）。このようなＳＳＲ酵素の発現ではなく活性を調節することによって、より正確に制御することができる。一戦略においては、ＳＳＲ酵素をステロイド受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に融合させた融合タンパク質を用いてＳＳＲ−ＬＢＤタンパク質を得る（EP-B-0 707 599；Logie and Stewart (1995) P.N.A.S. USA 92: 5940-5944; Brocard et al, (1997) P.N.A.S. USA 94: 14559-14563; Akagi et al, (1997) Nucleic Acids Res 25, 1766-73)参照）。この戦略は、ＳＳＲ活性を活性化するステロイド受容体のリガンドをリガンドが受容体部分に結合している場合のみ用いることに依存している。該受容体のＬＢＤは、同族リガンドの非存在下ではＳＳＲの活性を抑制する。同族リガンドのデリバリーによってＳＳＲの抑制を軽減し、ＲＴ部位間での組換えを行うことができる。
【００５０】
このように、誘導については、前記ＳＳＲの転写を誘導するか、ＳＳＲの翻訳を誘導するか、又はＳＳＲから阻害剤を除去することによって行うことができる。或いは、ＳＳＲを前記トランスジェニックマウスに人工的に導入することができる。本発明の方法の一要素は、トランスジェニックマウス内で部位特異的組換えを行うことによってマウス標的遺伝子の除去と共にヒト化マウスの作出が可能であることである。
【００５１】
トランスジェニックマウスを欠失株マウスと交雑させることによって部位特異的組換えを実施し得るのが好ましい。本明細書において「欠失株」とは、生殖系列で部位特異的リコンビナーゼを発現するマウスに関するが、これをトランスジェニックマウスと交雑させてマウス標的遺伝子配列を除去することができる。このように、インビボ組換えによって着目遺伝子に対してヘテロ接合性の子孫が産生する。こうして、トランスジェニックマウスを欠失株と交雑させることによって、ヒト置換遺伝子配列と部位特異的リコンビナーゼを含有するように変化したマウス染色体を含む細胞を有する後代が産生し、そこではマウス標的遺伝子が除去され、細胞の機能的ヒト化が生じている。従って、このようなトランスジェニックマウスは、特定の遺伝子又は遺伝子クラスターに関するヒト化に対してヘテロ接合性となる。
【００５２】
本発明の方法の更なる様相においては、部位特異的リコンビナーゼはリコンビナーゼ株マウスのある組織でのみ発現し得る。ある遺伝子又は遺伝子クラスターの欠失が致死的であるか又は亜致死性の表現型作用をもたらし得ることは、当該技術分野では知られている。また、このような遺伝子をそのヒト等価物で置換しても致死を防止できない場合がある。このような状況下では、部位特異的リコンビナーゼをある組織でのみ発現させることによって、致死に関する如何なるこのような問題をも克服し得る。これは、特定の遺伝子がある組織において必須である場合、このように部位特異的リコンビナーゼを発現させることによってマウス遺伝子が該組織において存続し得るため、特に有利となる。
【００５３】
本発明のこの様相においては、ＳＳＲはアルブミン−Ｃｒｅであることができる。アルブミン−Ｃｒｅは、ＲＴ部位ＬｏｘＰに作用するＳＳＲ  Ｃｒｅの特定のバリアントである。アルブミン−Ｃｒｅは肝臓においてのみ発現するため、マウス標的配列を肝臓以外の全ての組織で存続させることができ、致死に関する潜在的な問題を克服する一方、機能的にヒト化された肝臓が得られる。
【００５４】
最終的には、上述の方法によって作出した２種のヘテロ接合体マウスを交雑させて、着目遺伝子のヒト対立遺伝子に対してホモ接合性のトランスジェニックマウスを作出することができる。２種のヘテロ接合体トランスジェニックマウスの交雑によって生ずる後代の一部は、ヒト化に対してホモ接合性であろう。
【００５５】
本発明の更なる実施形態においては、以降に開示の方法によって、トランスジェニック非ヒト動物を上述の特徴を全て有するように新しく作出する。
【００５６】
また、部位特異的組換えイベントを体細胞において行うことも可能であり、その後、該細胞をＷＯ００／５１４２４の方法に記載のクローン化マウス又はそのバリアントのコロニーを形成するために核移植ドナーとして用いることができる。
【００５７】
核酸構築物を上述のように用いることを含む、トランスジェニック宿主細胞又はトランスジェニック非ヒト動物の作出に関する本発明の実施形態においては、細胞又は非ヒト動物を更なる遺伝子組換えに付すことができるが、該遺伝子組換えは更なる遺伝子又はタンパク質コード核酸配列の導入である。該遺伝子組換えは、細胞又は細胞株の一過性又は安定トランスフェクション；細胞又は細胞株におけるエピソーム発現系；或いは、前核マイクロインジェクションや非胚性幹（ＥＳ）細胞における組換えイベント、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞におけるランダムな遺伝子組換え、又は核移植クローニング手順においてドナー核として用いる核を有する細胞のトランスフェクションによるトランスジェニック非ヒト動物の作出、であることができる。
【００５８】
トランスジェニック細胞、トランスジェニック細胞株又はトランスジェニック非ヒト動物を調製する方法であって、細胞又は細胞株の一過性又は安定トランスフェクション、細胞又は細胞株におけるエピソーム発現系の発現、前核マイクロインジェクション、ＥＳ細胞又は他の細胞株における組換えイベント、又は、異なる発生経路で分化し、核移植用ドナーとして用いられる核を有する細胞株のトランスフェクションを含む方法においては、更なる核酸配列や構築物の発現を用いて、本発明の上述の様相に係るトランスフェクションや遺伝子組換えをスクリーニングする。その例としては、細胞成長培地に添加される抗生物質に対する耐性を付与する選択可能マーカー（例えば、Ｇ４１８に対する耐性を付与するネオマイシン耐性マーカー）の使用が挙げられる。更なる例としては、本発明の上述の様相における核酸配列（又はその一部）に相補的であり、それに対してハイブリダイズする核酸配列を用いた検出が挙げられる。例えば、サザンブロット解析やノーザンブロット解析、ＰＣＲが挙げられる。
【００５９】
ヒト置換遺伝子配列
本発明は、当業者には明らかであろう多数の遺伝子の如何なる１種を用いても実施することができる。マウス標的とヒト置換との間で交換し得る遺伝子の種類に対しては技術的な制限はない。しかし、本発明は、クラスター内の染色体で連続して連結している多数の異なる遺伝子によってマウスの機能性がコードされている遺伝子系に対して特に役立つ。本発明の方法によって、マウス遺伝子クラスターを等価なヒト遺伝子又はクラスターで簡単に置換することができる。また、本発明は、遺伝子レベルで高レベルの冗長性を有するマウス遺伝子系に関するヒト化にも適している。先に用いられている方法とは対照的に、交換遺伝子がセグメント遺伝子（例えば、免疫グロブリン遺伝子）である必要はなく、また、それが好ましいということもない。好ましい実施形態においては、交換遺伝子はセグメント遺伝子（例えば、免疫グロブリン遺伝子）ではない。
【００６０】
従って、少なくとも１種のマウス標的遺伝子の発現産物は、等価なヒト置換遺伝子と同一又は同様の機能を保持しているのが好ましい。これらの遺伝子は機能的に等価、及び／又は構造的に相同であり得る。例えば、マウス標的遺伝子とヒト置換遺伝子は一定の相同性を有し得る。このような相同性は、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超又は９５％超であるのが好ましい。
【００６１】
ヒト置換遺伝子配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はこれら２種の混合物であることができる。ゲノムＤＮＡは、スプライシングの忠実度が保持されるため、多くの状況下で有利である。しかし、配列の残部がｃＤＮＡであり得るように、大半のスプライスイベントが生じるイントロンを保持することだけは必要であろう。これによって、特にゲノムＤＮＡが大きなイントロンを含む場合にクローニングプロセスを簡単にすることができるが、このような場合、スプライスアイソフォームがゲノムＤＮＡのこの領域でコードされていなければ、より大きなイントロンは含まれ得ない。
【００６２】
本発明の方法に用いる特に好適な遺伝子の例は薬物代謝酵素遺伝子であり、例えば、第１相薬物代謝酵素や第２相薬物代謝酵素、転写因子が挙げられる。例としては、ｃｙｐ酵素ファミリー、即ち、ヘム鉄中心を含み、電子伝達システムによって様々な基質を酸化する血液タンパク質のファミリーが挙げられる。ｃｙｐタンパク質のヘム中心は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、フェレドキシン又はシトクロムｂ５を通過する電子によって還元され、還元されたヘム基によって分子状酸素が結合、分割され、基質が酸化されてアルコール又はエポシキドになると共に、ヘム基の静止Ｆｅ3+状態が再生する。ヒトとマウスのＣＹＰ遺伝子を比較した、このようなタンパク質の概説は、Nelsonら、２００４年（Pharmacogenomics 14(1); 1-18）に記載されている。他の例は当業者には明らかであろう。
【００６３】
第１相薬物代謝酵素をコードするヒトＤＮＡは、シトクロムＰ４５０（例えば、ＣＹＰ３Ａ４やＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６が挙げられるが、これらに限定されない）から成る群から選択されるのが好ましい。この例においては、遺伝子間の等価性は、基質特異性、調節モード（例えば、転写因子や外因性薬物による）、配列相同性及び組織分布の組合せによって評価することができる。ある遺伝子は正確な等価物を有するが、このような遺伝子の例としては、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６及びＣＹＰ２Ｄ（ヒトには１種類の遺伝子しか存在しないが、マウスには多数の等価遺伝子が存在する）が挙げられる。ヒトには４種類のＣＹＰ２Ｃ遺伝子が存在し、マウスには多数の等価遺伝子が存在する。このような状況下では、等価マウス遺伝子の少なくとも１種、好ましくは、２種、３種、４種、５種又はそれ以上、又はその全種を無効化する。ＣＹＰ３Ａ４はマウスに明らかなオルソログが存在しない例であるが、ＣＹＰ３Ａ１１は、その肝臓発現、調節モード及び配列相同性のため、少なくとも１種の等価マウス遺伝子と考えられ得る。他の例としては、ＣＹＰ２Ｄ６の場合（即ち、マウスには９種類の遺伝子が存在するが、ヒトには対応する機能性遺伝子が１種類しか存在しない）を挙げることができる。
【００６４】
Ｐ４５０ヒト化非ヒト動物に導入するヒトＰ４５０アイソフォームの選択は主に、関連組織での代謝における各種Ｐ４５０アイソフォームについて知られている相対的な重要度によって行う。例えば、これまでにヒト肝臓内で認識された最重要Ｐ４５０アイソフォームはＣＹＰ３Ａ４であるため、恐らく、ＣＹＰ３Ａ４が肝臓のＰ４５０ヒト化に際し第一に選択されるヒトＰ４５０アイソフォームとなる。本発明の多重Ｐ４５０ヒト化マウス用のヒトＰ４５０の選択は、ユーザーの必要性によって決まる。この点で、次のヒトアイソフォーム、即ち、３Ａ４、３Ａ５、２Ｄ６、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｃ１９、１Ａ１、１Ａ２、２Ｃ８及び２Ｅ１のいずれか一以上が好ましいことが予想される。しかし、動物細胞に組み込まれるアイソフォームはユーザーの要求によって決まることは理解されよう。このように、ヒト化トランスジェニック動物を「デザイン」して代謝プロセスにおける特定のアイソフォームの役割を調べることができる。
【００６５】
本発明の教示によると、単一遺伝子、遺伝子クラスター、又は単一遺伝子や遺伝子クラスターの組合せを置換することができる。可能であれば、個々の遺伝子を単に置換するのではなく、遺伝子クラスター全体を置換するのが好ましい。これによって、いずれの遺伝子クラスターにおいても遺伝子の発現レベルの割合（ratios）がこの遺伝子のインビボでの発現割合と同じであるという状態が生み出される。導入された遺伝子クラスターはマウス標的遺伝子と機能的に等価であることが意図されており、等価な遺伝子クラスターが存在する場合には、マウス標的遺伝子クラスターと等価である。従って、適切なマウス標的遺伝子を等価なヒト置換遺伝子配列で置換すれば、ヒト又はマウスクラスターが同じ数の遺伝子を含んでいるかどうかとは関係なく、ゲノム、細胞、組織、器官又は生体に関してヒト化される。
【００６６】
本明細書において「クラスター」とは、３種以上の（more than two）を超える遺伝子産物を産生する能力を有し、同一遺伝子の複数のスプライシングを含むゲノムのいずれの領域をも指す。この様相においては、遺伝子クラスターは、代謝に関与するタンパク質をコードするのが好ましく、シトクロムＰ４５０（ｃｙｐ）遺伝子クラスターの一部を構成するのがより好ましい。例えば、マウスには７種類のＰ４５０遺伝子クラスター、即ち、ＣＹＰ２ＡＢＦＧＳＴクラスター、ＣＹＰ２Ｃクラスター、ＣＹＰ２Ｄクラスター、ＣＹＰ２Ｊクラスター、ＣＹＰ３Ａクラスター、ＣＹＰ４ＡＢＸクラスター及びＣＹＰ４Ｆクラスターが存在すると考えられる。ＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ２Ｃ及びＣＹＰ２Ｄクラスターは、本発明に係る置換用の第１相薬物代謝酵素の好ましいクラスターである。本発明に従って、これらの遺伝子クラスターのいずれか一以上を置換することができる。
【００６７】
従って、本発明においては、特定の経路に関与する遺伝子のカスケードの一部（好ましくは全体）を置換するのが好ましい。これによって遺伝子機能の部分的冗長性が確実に保持されるため、実際の生理学的状態が反映される。ヒト化に用いる第１相薬物代謝酵素のクラスターは、ＣＹＰ３Ａクラスター及びＣＹＰ２Ｃクラスターであるのが好ましい。
【００６８】
一般に用いる標的トランスジェニック動物（例えば、マウス）とヒトとの間のタンパク質機能の冗長性を考慮すると、第１相薬物代謝酵素に関するヒト化は、標的動物の第１相薬物代謝酵素のごく一部（例えば、１、２、３、４又は５個）がかなりのレベルで発現している（好ましくは、該酵素のいずれも発現していない）欠失バックグラウンドに対して行うのが好ましい。
【００６９】
本発明に係るヒト化用の候補であるヒト薬物代謝酵素の他の例としては、グルクロニルトランスフェラーゼ（例えば、ＵＧＴ１Ａ遺伝子や遺伝子クラスター）や、グルタチオントランスフェラーゼ（例えば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ））、スルホニルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼが挙げられる。ヒト化に用いる第２相薬物代謝酵素のクラスターは、ＵＧＴ１Ａ遺伝子クラスターであるのが好ましい。
【００７０】
調節配列
転写因子の発現を支配する調節配列はヒト由来であるのが好ましいが、標的動物種（例えば、マウス）に由来してもよい。
【００７１】
多くの状況下ではヒト調節配列を用いるのが望ましいであろう。これについては、相同組換えによってマウス染色体に挿入するヒト置換遺伝子配列内にヒト調節配列を組込むだけで実施することができる。こうして、ＲＴ部位を挿入し、両方のＲＴ部位に隣接するマウス標的配列が、後に部位特異的組換えの際に除去される内在性マウスプロモーターを含むようにする。
【００７２】
図５に示すように、ヒト調節配列の使用を決める際には数種類の因子を考慮に入れる必要がある。これらの因子としては、クラスターの端におけるマウス遺伝子の方向や、マウスプロモーター及びエンハンサー要素に関する情報の有効性が挙げられる。しかし、一般には、ヒトプロモーターをマウスゲノムに機能的に挿入し、ヒト化遺伝子の発現を制御することが可能なメカニズムが存在する。
【００７３】
ヒト調節配列を用いる際に好ましい有利な一実施形態においては、特に置換遺伝子をマウス染色体の転写的に活性な領域に挿入する場合、挿入するヒト配列の上流のいずれかの遺伝子の下流エクソンに人工ポリアデニル化配列を融合することができる。例えば、このコンテクストにおけるスプライスアクセプターポリアデニル化（ｓＡｐＡ）部位の使用は、Ishida及びLeder（Nucleic Acids Res. 27(24), e35, 1999）に記載のこの配列の使用と同様に行うことができる。これによって、導入されたヒト置換遺伝子及び調節配列の上流での転写活性からの通読（read-through）が確実になくなり、他のプロモーター配列からの影響を受けずにヒト配列を正確に検討することができる。
【００７４】
ある状況下では、図４に示すように、好適な内在性調節配列がマウスクラスターの端において要求される方向に配置されていれば、マウス染色体内のマウス標的遺伝子が先に占めていた位置でヒト遺伝子を挿入することによって、マウス遺伝子の内在性調節配列を用いることが可能となる。
【００７５】
本発明を利用する可能性のある状況下では、内在性マウス調節配列が用いられることもあるであろう。このように、本発明に従って作出したヒト化動物は、適切な生理学的レベルにおいてだけでなく、マウスが等価内在性タンパク質を通常発現するであろう組織全てにおいてヒトタンパク質を発現することができる。しかし、注目すべきは、ある場合においては、マウス調節配列の方が、対応するヒトプロモーターに比べて、ヒト様の発現をマウス内のヒト遺伝子に付与し得るということである。例えば、ＣＹＰ３Ａ４は成人の肝臓で恒常的に発現するが、トランスジェニックマウスにおいては、ＣＹＰ３Ａ４プロモーターは６週齢超の雄の肝臓では発現が抑制されているように思われる。従って、ヒトにおいてＣＹＰ３Ａ４プロモーターと同様の肝臓発現や調節を示すマウスＣｙｐ３ａ１１プロモーターを用いてヒトＣＹＰ３Ａ４を発現させれば、マウスにおいてこの遺伝子をより真正に発現させることができるであろう。
【００７６】
この実施形態においては、内在性マウスプロモーターがヒト置換遺伝子配列を発現させるのに正しい位置及び方向で存在しているのが分かっている場合、一対のＲＴ部位の上流側の部位がマウス標的遺伝子とマウス標的遺伝子の内在性マウスプロモーターとの間にあるようにＲＴ部位をマウス染色体に挿入する必要がある。部位特異的組換えの際には、図４Ａに示すように、染色体内に残る内在性マウスプロモーターが置換ヒト遺伝子配列と転写的に連結し、ヒト置換遺伝子配列の転写が行われるようになる。「調節配列」とは、着目遺伝子の転写に必要なプロモーター配列やエンハンサー配列、５’ＵＴＲや３’ＵＴＲ、ポリＡ終結配列、又は他のＤＮＡ配列を含むことを意味する。ヒト配列の挿入に用いる転写物はポリＡモチーフによって終結するのが好ましい。
【００７７】
「内在性プロモーター」とは、マウスにおける着目遺伝子の発現を自然に指示するプロモーターを意味する。
【００７８】
内在性配列及びヒトプロモーター配列の両方において、プロモーター活性に必要な５’上流配列の全て（好ましくはいずれのエンハンサーをも含む）を組み込むことによって、自然状態と同様に内在性プロモーター又はヒト誘導性プロモーターの全体が関連タンパク質の発現を生理学的に関連するように完全に指示することができるため、強力な構成的プロモーターを実際に用いる必要がなく、また、用いるのが望ましくない方が多いことが分かった。一例としてはヒトＣＹＰ１Ａ２遺伝子が挙げられるが、これは、転写開始点の上流に強力なエンハンサー要素を有する。このヒト配列全てを組み込むことによって適切な転写メカニズムを生じさせることができるが、このような上流配列の脱落によってもたらされる系においては、遺伝子発現の忠実度を保持させることが可能な調節配列の存在が不完全又は不十分になることが、Chenら（Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 318, 1330-1342, 2006）によって示されている。
【００７９】
先行技術で使用されているアルブミンプロモーター等のプロモーターを用いて得られる不都合な一結果（ＣＹＰ３Ａ２等の薬物代謝遺伝子の場合には確実に生じる）は、遺伝子の発現作用が特定の組織（アルブミンプロモーターの場合には肝臓）でしかモニターできないことである。当然のことながら、多くの遺伝子は非常に多様な発現パターンを有しているが、これらは殆ど研究されていないことが多い。内在性マウスプロモーター又は対応するヒトプロモーターを用いることによって、このような問題は全て回避され、ヒト遺伝子は、染色体内で適切に構成、整列されていれば、野生型マウス発現レベルの忠実度を発生的に（developmentally）、時間的に且つ組織特異的に保持することは確実である。その結果、ヒトタンパク質は、正しい場所において正しいレベルで正しい時間に適切な時間の間だけ産生される。従って、ＣＹＰ３Ａ２に関してヒト化したマウスの場合、本発明によって薬物代謝プロセスの包括的で全体論的なスナップショットを得ることができる。
【００８０】
また、内在性プロモーター又は対応するヒトプロモーターを用いることによって他の利点ももたらされる。特に、発生過程での発現（developmental expression）の忠実度が保持される。天然内在性プロモーターを用いることによって、タンパク質をそれが自然発生する組織内で確実に発現させ、しかも成体動物だけでなく各発達段階においても発現させる。これによって、トランスジェニック動物を生育できる可能性が高くなるため、該動物がスクリーニングや下流交雑種（downstream crosses）の開発において有用であるという利点ももたらされる。また、薬物代謝遺伝子の場合には、薬物代謝酵素の胎盤発現が保持されるため、該動物を用いて試験化合物を催奇形作用についてスクリーニングすることもできる。ある状況下では、標的遺伝子とヒト置換遺伝子配列とがリーダー配列を共有することがある。これは、構築物において少なくとも１個のイントロンを保持することによってなし得るが、通常良好な発現がもたらされる。また、この戦略によって、遺伝子産物が正しい細胞内位置に確実に導かれるようにもなる。ヒトリーダー配列がその機能をも果たすことができるかもしれないが、代わりにマウスリーダーを用いる方が安全であることが多い。例えば、ＭＲＰ２タンパク質の場合、エクソン１によってコードされるマウスタンパク質の「リーダー配列」を保持することができる。そして、エクソン１由来の配列を有しないヒトｃＤＮＡをマウスゲノム配列のエクソン２に導入する。マウスイントロン１の元のスプライス部位が保持されるため、この構築物は、マウスエクソン１及びヒトエクソン２〜３２に由来するアミノ酸の融合タンパク質をコードする。この構築物によって高レベルの発現が確実になると共に、ＭＲＰ２がその正しい位置（即ち、形質膜）に確実に導かれる。
【００８１】
また、当業者であれば、ヒト置換遺伝子配列がどのようにマウス標的遺伝子のプロモーターの制御下でもたらされ、該プロモーターと転写的に連結し得るかも分かるであろう。「転写的に連結する」とは、プロモーターの活性が対応するタンパク質の発現レベルを決めることを意味する。これは、ヒト置換遺伝子配列を対応するマウスプロモーターの翻訳開始部位に融合させて成し遂げるのが好ましい。例えば、多剤耐性タンパク質ＭＤＲ１の場合、ヒトＭＤＲ１のｃＤＮＡを対応するマウス遺伝子（Ｍｄｒ１ａ又はＭｄｒ１ｂ）の翻訳開始部位に融合させることができる。翻訳因子ＰＸＲの例においては、ヒトＰＸＲｃＤＮＡとゲノム配列のハイブリッドをマウスＰＸＲ遺伝子の翻訳開始部位に融合させて、マウス開始ＡＴＧを保持することができる。他のヒト翻訳因子ＣＡＲの場合、ヒト配列をマウスＣＡＲ遺伝子の翻訳開始部位に融合させることができる。
【００８２】
レポーター遺伝子
有利なことに、本発明は、レポーター遺伝子の発現産物の簡便なアッセイによりヒト細胞において薬物や他の生体異物化合物の代謝経路を把握するために用いることができるようにレポーター遺伝子が導入された、非ヒト動物細胞及びトランスジェニック非ヒト動物も提供する。
【００８３】
本発明の方法によって作出された非ヒト動物細胞又はトランスジェニック非ヒト動物にレポーター遺伝子を組み込んだ場合（後述参照）、該細胞又は動物を用いれば、レポーター遺伝子ＤＮＡ配列の発現をアッセイすることによって遺伝子の調節を確認することができると共に、相同的ヒト細胞において生じ得る薬物や他の生体異物化合物の機序や代謝を把握することができる。また、該細胞又は動物を用いて、薬物や他の生体異物化合物の代謝の程度を把握することもできる。例えば、特定の組織内でのレポーター遺伝子発現の分布を解析することによって、特定の薬物化合物に応じた遺伝子発現の誘導の程度をモニターすることができる。
【００８４】
レポーター遺伝子は、直接的又は間接的にアッセイ可能なタンパク質をコードする核酸配列である。これらを用いて、予定されるアッセイが不適切であるか又は容易に行えないタンパク質産物に対応する他のコード領域を置換する。当該技術分野では公知で本発明で用いることのできる好適なレポーター遺伝子は次のタンパク質（例えば、クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼやβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）等が挙げられるが、これらに限定されない）をコードする遺伝子から選択される。上述の好適なレポーター遺伝子リストは網羅的でも排他的でもなく、適用の範囲を制限するものではないことは理解されよう。当業者であれば、本発明に同様に適用し得る他のレポーター系を選択することができる。
【００８５】
本発明においては、レポーター遺伝子に連結させる好ましい標的であるマウスプロモーターはＰＸＲ、ＣＡＲ、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＵＧＴ１Ａ、ＭＲＰ２及びＭＤＲ１である。
【００８６】
更なる部位特異的組換え部位
本発明の更なる実施形態においては、第２対のＲＴ部位をマウス染色体に（好ましくは、相同組換えによって）組込むことができる。図１に示すように、この第２対のＲＴ部位は、両方の成分ＲＴ部位が第１対のＲＴ部位に隣接するように配置する必要がある。この第２対のＲＴ部位によって、必要に応じてヒト置換遺伝子配列を除去することができる。これによって、特性を比較することができるトランスジェニックマウスの一式（パネル）を作出することができる（一式には、野生型、ヒト化ノックイン及び完全ノックアウトが含まれ得る）。また、ある用途の場合には、ノックイン又はノックアウトに対してヘテロ接合性のマウスもパネル内で比較することができる。
【００８７】
第２対のＲＴ部位は、第１対の部位特異的組換え部位間でＲＴを行う前又は後に、マウス染色体に同時に挿入することができる。操作やクローニングの便宜上、これら２対の部位を同時に挿入するのが好ましい。
【００８８】
第１対のＲＴ部位間で部位特異的組換えを行った後、第２対のＲＴ部位をヒト置換遺伝子配列に隣接する染色体内に配置する。この構成においては、第１対のＲＴ部位間での組換え時に生じた残存ＲＴ部位は、図１に示すように、第２対の部位特異的組換え部位の一成分とヒト置換遺伝子配列との間に配置される。
【００８９】
この様相においては、ヒト置換遺伝子配列が除去され、着目遺伝子がノックアウトされるように第２のＲＴラウンドを第２対のＲＴ部位間で実施し得ることが意図されている。この場合、残存する第１のＲＴ部位も除去されるが、第２のＲＴ部位は残される。
【００９０】
第２対のＲＴ部位と第１対のＲＴ部位は、マウス染色体に同時に又は別々に組込むことができる。
【００９１】
第２対のＲＴ部位を第１対のＲＴ部位と同時に組込む場合、各々の対の一成分は単一の核酸配列内に含有させるのが好ましいが、これは１ラウンドの相同組換えによってマウス染色体に組込むことができる。各々の対の他成分は第２の核酸配列内に含有させることができるが、これについても、第２の相同組換えラウンドによってマウス染色体に組込むことができる。第２対のＲＴ部位の各成分を染色体内に配置する際には、第１対のＲＴ部位の半分が第２対のＲＴ部位の半分と選択可能マーカーとの間に配置されるように行う。これらの２ラウンドの相同組換えは同時に行ってもよく、別々に行ってもよい。
【００９２】
第２対のＲＴ部位を第１対のＲＴ部位とは別にマウス染色体に組込む場合、第２対のＲＴ部位の各半分を別々の核酸配列内に含有させるのが好ましく、図２に示すメカニズムにより、第２対のＲＴ部位を更なる２種の別々の相同組換え反応によってマウス染色体に組込む。これらの更なる２ラウンドの相同組換えは互いに同時に又は連続して行うことができ、また、第１の２ラウンドの相同組換えと同時に又は連続して行うことができる。組換え反応がインビボ又はインビトロで行われるよう意図されていることは理解されよう。
【００９３】
第１対のＲＴ部位と第２対のＲＴ部位は互いに異なっているのが好ましい。
【００９４】
トランスジェニックマウス
本発明の更なる様相においては、上述の本発明の実施形態のいずれか一の方法によって作出されたトランスジェニックマウスが提供される。このようなマウスは、遺伝子又は遺伝子クラスターに関してヒト化され、対応するマウス遺伝子又はクラスターは欠失している。
【００９５】
以下、本発明の様々な様相や実施形態を実施例によって更に詳細に説明する。本発明の範囲を逸脱することなく詳細な変更を実施し得ることは理解されよう。
【実施例】
【００９６】
実施例１：対応するヒトプロモーターを用いたＣＹＰ３Ａ４ヒト化及びマウスＣＹＰ３Ａクラスターのノックアウト
図７に示すように、マウスＣＹＰ３ＡクラスターをｌｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位に隣接させ、ＣＹＰ３Ａ４発現カセットをマウスクラスターの一端において挿入して、１３ｋｂのヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターの制御下でヒトＣＹＰ３Ａ４を発現させることができた。
ターゲティングベクターに含まれるｌｏｘＰ配列要素によって、マウスＣＹＰ３ＡクラスターのＣｒｅ介在欠失が可能となり、ＣＹＰ３Ａ４を対応するマウス遺伝子の非存在下で発現させることができる（図７参照）。
次に、ＦＲＴ配列要素によって、ヒト発現カセットのＦｌｐ介在欠失が可能となり、その結果、マウスＣＹＰ３Ａ遺伝子座における完全なノックアウトがもたらされる（図７）。
【００９７】
実施例２：対応するヒトプロモーターを用いたＣＹＰ２Ｃ９ヒト化及びマウスＣＹＰ２Ｃクラスターのノックアウト
図８に示すように、マウスＣＹＰ２ＣクラスターをｌｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位に隣接させ、ＣＹＰ２Ｃ９発現カセットをマウスクラスターの一端において挿入して、１２ｋｂのヒトＣＹＰ２Ｃ９プロモーターの制御下でヒトＣＹＰ２Ｃ９を発現させることができた。
ターゲティングベクターに含まれるｌｏｘＰ配列要素によって、マウスＣＹＰ２ＣクラスターのＣｒｅ介在欠失が可能となり、ＣＹＰ２Ｃ９を対応するマウス遺伝子の非存在下で発現させることができる（図８）。
次に、ＦＲＴ配列要素によって、ヒト発現カセットのＦｌｐ介在欠失が可能となり、その結果、マウスＣＹＰ２Ｃ遺伝子座における完全なノックアウトがもたらされる（図８）。
【００９８】
実施例３：対応するヒトプロモーターを用いたＣＹＰ２Ｄ６ヒト化及びマウスＣＹＰ２Ｄクラスターのノックアウト
図９に示すように、マウスＣＹＰ２ＤクラスターをｌｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位に隣接させ、ＣＹＰ２Ｄ６発現カセットをマウスクラスターの一端において挿入して、９ｋｂのヒトＣＹＰ２Ｄ６プロモーターの制御下でヒトＣＹＰ２Ｄ６を発現させることができた。
ターゲティングベクターに含まれるｌｏｘＰ配列要素によって、マウスＣｙｐ２ｄクラスターのＣｒｅ介在欠失が可能となり、ＣＹＰ２Ｄ６を対応するマウス遺伝子の非存在下で発現させることができる。次に、ＦＲＴ配列要素によって、ヒト発現カセットのＦｌｐ介在欠失が可能となり、その結果、マウスＣＹＰ２Ｄ遺伝子座における完全なノックアウトがもたらされる。
特定のプライマーを用いて、ＰＣＲによるマウス染色体の解析を行うことができた。その結果から、所望のヒト置換ＣＹＰ２Ｄ遺伝子配列の導入及びマウスＣｙｐ２ｄクラスターの欠失が成功したことが分かる（図１０Ａ及び１０Ｂ参照）。図１０Ｃから、ヒトＣＹＰ２Ｄ６タンパク質がこのようなマウスの肝臓でうまく発現することが分かる。
【００９９】
実施例４：マウスＣｙｐ３ａ１１プロモーターを用いたＣＹＰ３Ａ４ヒト化及びマウスＣＹＰ３Ａクラスターのノックアウト
図１０に示すように、ヒトＣＹＰ３Ａ４をコードするＤＮＡ配列をＣｙｐ３ａ１１遺伝子座においてマウスＣｙｐ３ａクラスターに挿入して、マウスＣｙｐ３ａ１１プロモーターの制御下でヒトＣＹＰ３Ａ４を発現させることができる。このターゲティング戦略は、ＣＹＰ３Ａ４プロモーターによって不可能であろう、雄性マウスにおけるＣＹＰ３Ａ４の発現を可能にするようにデザインされる。
ヒトＣＹＰ３Ａ４をコードするＤＮＡ配列は、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子のイントロン１の少なくとも一部を含む（図１０参照）。
図１０に示すように、ターゲティングベクターにはＦＲＴ部位が含まれているため、選択マーカー（図１０のｎｅｏR）は、野生型のマウスＣｙｐ３ａ１１遺伝子座にヒトＣＹＰ３Ａ４を挿入した後、ＦＬＰ欠失株と交雑させることによって欠失させることができる。
図示のように、ターゲティングベクターにはｌｏｘＰ部位及びＦＲＴ部位の両方が含まれているため、ヒトＣＹＰ３Ａ４をＣｙｐ３ａクラスター５’標的細胞に挿入する場合、マウスＣｙｐ３ａ１１クラスターの大部分はＦＬＰ欠失株又はＣｒｅ欠失株との交雑によって欠失させることができる。
【図１】
2010538632.tif 000003
【図２】
2010538632.tif 000004
【図３Ａ】
2010538632.tif 000005
【図３Ｂ】
2010538632.tif 000006
【図４Ａ】
2010538632.tif 000007
【図４Ｂ】
2010538632.tif 000008
【図５Ａ】
2010538632.tif 000009
【図５Ｂ】
2010538632.tif 000010
【図５Ｃ】
2010538632.tif 000011
【図６】
2010538632.tif 000012
【図７】
2010538632.tif 000013
【図８】
2010538632.tif 000014
【図９】
2010538632.tif 000015
【図１０Ａ】
2010538632.tif 000016
【図１０Ｂ】
2010538632.tif 000017
【図１０Ｃ】
2010538632.tif 000018
【図１１】
2010538632.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月12日(2010.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010538632000001.app
【国際調査報告】
2010538632.tif 000020
2010538632.tif 000021
2010538632.tif 000022
2010538632.tif 000023