(57)【要約】  バーコードパターンを形成する実質的に平行な線に沿って基板に付着される材料、特に、捕獲剤及び／又は検出可能な標的を含んだアレイ及び基板、並びに、関連する方法及びシステム。
2010533871.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板に付着される少なくとも１つの捕獲剤又はその構成成分を含む、試料内の少なくとも１つの標的を検出するためのアレイであって、前記少なくとも１つの捕獲剤が、前記少なくとも１つの標的に特異的に結合して捕獲剤標的結合複合体を形成する能力を持ち、バーコードパターンを形成する実質的に平行な線に沿って捕獲剤標的結合複合体が検出可能であるように前記少なくとも１つの捕獲剤又はその構成成分が当該アレイ上に配置される、アレイ。
【請求項２】
前記少なくとも１つの標的は複数の標的であり、前記少なくとも１つの捕獲剤又はその構成成分は複数の捕獲剤又はその構成成分であり、前記複数の捕獲剤の各捕獲剤は、互いから結合的に区別可能且つ位置的に区別可能であり、前記複数の捕獲剤の各捕獲剤は、前記複数の標的の各標的に特異的に結合して捕獲剤標的結合複合体を形成する能力を持つ、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３】
前記複数の標的が複数のバイオマーカーを含む、請求項２に記載のアレイ。
【請求項４】
前記バーコードパターンが生物学的プロファイルと付随する、請求項３に記載のアレイ。
【請求項５】
前記生物学的プロファイルが、疾患と付随する所定の生物学的プロファイルとの比較により診断指標を提供する、請求項４に記載のアレイ。
【請求項６】
前記実質的に平行な線がマイクロ流体チャネル又はその一部によって形成され、前記マイクロ流体チャネルが当該アレイのマイクロ流体チャネルである、請求項１乃至５のいずれか一項に記載のアレイ。
【請求項７】
前記複数の捕獲剤又はその構成成分が、
当該アレイに付着される複数のアレイポリヌクレオチドであり、該アレイに付着される複数のアレイポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドが配列特異的で且つ互いから位置的に区別可能である、アレイポリヌクレオチドを含む、請求項２乃至５のいずれか一項に記載のアレイ。
【請求項８】
前記複数の捕獲剤又はその構成成分が、
複数のポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質であり、各ポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質が、蛋白質、及び、該蛋白質に付着されるコード化ポリヌクレオチドを含み、前記蛋白質が、複数の標的のうち所定の標的に特異的に結合し、前記コード化ポリヌクレオチドが、前記アレイに付着される複数のポリヌクレオチドのうち配列特異的且つ位置的に区別可能なポリヌクレオチドに特異的に結合し、各蛋白質及びコード化ポリヌクレオチドが互いから結合的に区別可能である、ポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質をさらに含む、請求項７に記載のアレイ。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載のアレイを含む、マイクロ流体装置。
【請求項１０】
流体試料の流体成分を分離する分離ユニットをさらに含む、請求項９に記載のマイクロ流体装置であって、前記分離ユニットが、
前記注入口と流体連絡し、流れチャネル抵抗を有した流れマイクロ流体チャネル、及び
前記流れチャネルと流体連絡し、アッセイチャネル抵抗を有したアッセイマイクロ流体チャネルを含み、
前記流れマイクロ流体チャネル抵抗及び前記アッセイマイクロ流体チャネル抵抗は、前記流れマイクロ流体チャネルから前記アッセイマイクロ流体チャネルまで前記流体成分の流れを制御するようされ、
前記アレイが前記アッセイマイクロフルイディックス上に配置される、マイクロ流体装置。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの標的が複数の標的であり、前記少なくとも１つの捕獲剤又はその構成成分が複数の捕獲剤又はその構成成分であり、前記複数の捕獲剤の各捕獲剤が、互いから結合的に区別可能且つ位置的に区別可能であり、前記複数の捕獲剤の各捕獲剤は、前記複数の標的の各標的に特異的に結合して捕獲剤標的結合複合体を形成する能力を持つ、請求項９又は１０に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１２】
前記複数の捕獲剤又はその構成成分が、
前記アレイに付着される複数のアレイポリヌクレオチドであり、該アレイに付着される複数のアレイポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドが配列特異的で且つ互いから位置的に区別可能である、アレイポリヌクレオチドを含む、請求項１１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１３】
前記複数の捕獲剤又はその構成成分が、
複数のポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質であり、各ポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質が、蛋白質、及び、該蛋白質に付着されるコード化ポリヌクレオチドを含み、前記蛋白質が、複数の標的のうち所定の標的に特異的に結合し、前記コード化ポリヌクレオチドが、前記アレイに付着される複数のポリヌクレオチドのうち配列特異的且つ位置的に区別可能なポリヌクレオチドに特異的に結合し、各蛋白質及びコード化ポリヌクレオチドが互いから結合的に区別可能である、ポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質を含む、請求項１２に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１４】
試料内の少なくとも１つの標的を検出するためのシステムであって、
請求項１乃至８のいずれか一項に記載のアレイ、及び
該アレイ上のバーコードパターンを検出するための装置、
を含むシステム。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの標的は複数の標的であり、前記少なくとも１つの捕獲剤又はその構成成分は複数の捕獲剤又はその構成成分であり、前記複数の捕獲剤の各捕獲剤は、互いから結合的に区別可能且つ位置的に区別可能であり、前記複数の捕獲剤の各捕獲剤は、前記複数の標的の各標的に特異的に結合して捕獲剤標的結合複合体を形成する能力を持つ、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記アレイのバーコードパターンが生物学的プロファイルと付随し、前記バーコードパターンを検出するための装置が前記生物学的プロファイルの可視指標を提供する、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記アレイのバーコードパターンが診断指標と付随し、前記バーコードパターンを検出するための装置が前記診断指標の可視指標を提供する、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
試料内の複数の標的を検出するためのシステムであって、
請求項７に記載のアレイ、及び
複数のポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質であり、各ポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質が、蛋白質、及び、該蛋白質に付着されるコード化ポリヌクレオチドを含み、前記蛋白質が、前記複数の標的のうち所定の標的に特異的に結合し、前記コード化ポリヌクレオチドが、前記アレイに付着される複数のポリヌクレオチドのうち配列特異的且つ位置的に区別可能なポリヌクレオチドに特異的に結合し、各蛋白質及びコード化ポリヌクレオチドが互いから結合的に区別可能である、ポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質、
を含むシステム。
【請求項１９】
複数のラベルされた分子であって、各ラベルされた分子が前記複数の標的のうち１つの標的に特異的に結合する成分、及び、該成分に付着されるラベル化合物を含み、該ラベル化合物がラベリング信号を提供し、各ラベルされた分子が互いから検出可能な程度に区別可能である、ラベルされた分子をさらに含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
試料内の複数の標的を検出する方法であって、
前記複数の捕獲剤との前記複数の標的の結合を可能にし、捕獲剤標的結合複合体を形成する時間及び状況下で、請求項２乃至５のいずれか一項に記載のアレイに前記試料を接触させるステップ、並びに、
前記捕獲剤標的結合複合体を検出するステップ、
を含む方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの検出可能な標的を検出するための基板であって、バーコードパターンを形成する実質的に平行な線に沿った当該基板上への前記少なくとも１つの検出可能な標的の付着を可能にするよう構成される基板。
【請求項２２】
請求項２１に記載の基板を含むマイクロ流体装置。
【請求項２３】
複数の検出可能な標的を検出するためのシステムであって、
請求項２１に記載の基板、及び
前記バーコードパターンを検出するための装置、
を含むシステム。
【請求項２４】
試料内の複数の標的を検出する方法であって、
前記基板との前記複数の標的の結合を可能にする時間及び状況下で、請求項２１に記載の基板に前記試料を接触させるステップ、並びに、
前記基板に付着された前記複数の標的を検出するステップ、
を含む方法。
【請求項２５】
所定のマイクロ流体パターンに沿って分子を流体支持体上に付着させる方法であって、
注入口及び排出口をそれぞれ有する流体チャネルを含んだ骨組を提供するステップであり、前記チャネルの排出口のそれぞれが前記所定のパターンの一部を形成するよう構成されるステップ、
前記骨組と結合するのに適した前記支持体を提供するステップ、
前記骨組みを前記支持体と結合させるステップ、
前記支持体上での前記分子の付着を可能にする時間及び状況下で、前記流体チャネル内に前記分子を提供するステップ；並びに、
前記骨組を前記支持体から離すステップ、
を含む方法。
【請求項２６】
前記パターンが、バーコードパターンを形成する実質的に平行な線を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記支持体が、請求項２１に記載の基板である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記支持体が、請求項１乃至８のいずれか一項に記載のアレイを含む、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記流体支持体がマイクロ流体支持体であり、前記流体チャネルがマイクロ流体チャネルである、請求項２５乃至２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
所定のマイクロ流体パターンに沿って分子を流体支持体上に付着させるシステムであって、
注入口及び排出口を有するマイクロ流体チャネルを含んだ骨組であり、前記チャネルの排出口が前記所定のパターンの一部を形成するよう構成される、骨組、並びに、
前記骨組と結合するのに適した支持体、
を含むシステム。
【請求項３１】
前記パターンが、バーコードパターンを形成する実質的に平行な線を含む、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
前記支持体が、請求項２１に記載の基板である、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記支持体が、請求項１乃至８のいずれか一項に記載のアレイを含む、請求項３１又は３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、材料のパターン形成及びアッセイの実行に関し、特に、試料内の標的分子の検出に関する。より明確には、本開示は、試料内の複数の標的分子を検出するためのアレイ、装置、方法、及び、システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
標的分子、特に、バイオマーカーの検出は、生物学的な分子分析の分野において挑戦である。特に、バイオマーカーの定性及び定量検出は、診断学から基本的な生物学に及ぶいくつかの用途において重大な段階である場合が多い。
【０００３】
特に、多数のバイオマーカーの定性及び定量検出は、複数のバイオマーカーの正確な検出が望まれる臨床診断等、いくつかの用途においてますます重要になった。特に、それらの用途のうち一部においては、多数のバイオマーカーの検出は、関心のある指標（例えば診断上の指標）と付随し得る生物学的プロファイル（例えば、プロテオーム及び／又はメタボローム）を同定することを課題としている。
【０００４】
多数のバイオマーカーの検出は、当技術分野において既知のいくつかの表面結合アッセイによって行われる。それらのアッセイでは、表面（例えば基板表面）に付着した捕獲剤（例えば一次抗体）は、捕獲剤結合複合体において関心のある標的に結合する。捕獲剤結合複合体は、次に、一般的には標的のラベリング分子（例えば、蛍光色素と結合した二次抗体）とのさらなる結合を介して検出される。
【０００５】
いくつかの重大なパラメータは、表面結合アッセイの成功した実行と付随し：
（ａ）検出することができる生体分子の、アッセイの感度又は最小限の濃度、
（ｂ）生体分子を検出することができる濃度範囲、
（ｃ）同時に検出することができる異なる生体分子の数、
（ｄ）測定間での可変性、
（ｅ）同時に検出することができる（例えばｍＲＮＡ、蛋白質等の）異なる種類の生体分子の数、
（ｆ）測定に必要とされる最小限の試料サイズ、及び
（ｇ）測定を行うことができる速度、
を含む。
【０００６】
いくつかのそれらのアッセイは、一般的に、マイクロ流体環境で行われる。マイクロ流体ベースのアッセイは、少量のみの生物学的材料及び少量のみの捕獲剤、捕獲材料、及び関連する試薬を要するため、最小限の試料サイズ及び短時間での実行が望まれる用途にとって特に魅力的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
試料における大多数の標的の高速且つ高感度の検出を可能にする、及び／又は、容易に可読な様式で結果を提供する、複数の標的を検出するための装置、方法、及び、システムが本明細書において提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様によると、試料内の少なくとも１つの標的、特に、試料内の複数の標的を検出するためのアレイが開示されている。当該アレイは、基板に付着した少なくとも１つの捕獲剤又はその構成成分を含み、前記少なくとも１つの捕獲剤は、前記少なくとも１つの標的に特異的に結合して、捕獲剤標的結合複合体を形成する能力を持つ。当該アレイにおいて、前記少なくとも１つの捕獲剤又はその構成成分は、バーコードパターンを形成する実質的に平行な線に沿って捕獲剤標的結合複合体が検出可能であるように当該アレイ上に配置される。前記少なくとも１つの標的は複数の標的でありえ、前記捕獲剤は複数の捕獲剤でありえ、該複数の捕獲剤の各捕獲剤は、互いから結合的に区別可能且つ位置的に区別可能であり、前記複数の標的の各標的に特異的に結合して捕獲剤標的結合複合体を形成する能力を持つ。
【０００９】
第２の態様によると、本開示によるアレイを含むマイクロ流体装置が開示されている。
【００１０】
第３の態様によると、試料内の複数の標的を検出するためのシステムが開示されている。当該システムは、本明細書に開示されているアレイ、及び、該アレイ上のバーコードパターンを検出するための装置を含む。
【００１１】
第４の態様によると、試料内の複数の標的を検出する方法が開示されている。当該方法は：前記複数の捕獲剤との前記複数の標的の結合を可能にし、捕獲剤標的結合複合体を形成する時間及び状況下で、前記試料を本明細書に開示されているアレイと接触させるステップ；並びに、前記捕獲剤標的結合複合体を検出するステップを含む。
【００１２】
第５の態様によると、試料内の標的、特に複数の標的を検出する基板が開示されている。当該基板は、バーコードパターンを形成する実質的に平行な線に沿って前記標的が検出可能であるように、基板上での標的の付着を可能にするよう構成される。
【００１３】
第６の態様によると、本開示による基板を含むマイクロ流体装置が開示されている。
【００１４】
第７の態様によると、試料内の標的、特に複数の標的を検出するためのシステムが開示されている。当該システムは、本明細書に開示されている基板、及び、該基板上のバーコードパターンを検出するための装置を含む。
【００１５】
第８の態様によると、試料内の標的、特に複数の標的を検出する方法が開示されている。当該方法は：前記基板との前記標的の結合を可能にする時間及び状況下で、前記試料を本明細書に開示されている基板と接触させるステップ；並びに、基板に付着した前記標的を検出するステップを含む。
【００１６】
第９の態様によると、所定のマイクロ流体パターンに沿って分子をマイクロ流体支持体上に付着させる方法が開示されている。当該方法は：注入口及び排出口を有するマイクロ流体チャネルを含んだ骨組を提供するステップであって、前記チャネルの排出口が前記所定のパターンの一部を形成するよう構成されるステップ、前記骨組と結合するのに適した前記支持体を提供するステップ、前記骨組みを前記支持体と結合させるステップ、前記支持体上での前記分子の付着を可能にする時間及び状況下で、前記マイクロ流体チャネル内に前記分子を提供するステップ；並びに、前記骨組を前記支持体から離すステップを含む。
【００１７】
第１０の態様によると、所定のマイクロ流体パターンに沿って分子をマイクロ流体支持体上に付着させるシステムが開示されている。当該システムは：注入口及び排出口を有するマイクロ流体チャネルを含んだ骨組であって、前記チャネルの排出口が前記所定のパターンの一部を形成するよう構成される骨組、並びに、前記骨組と結合するのに適した支持体を含む。
【００１８】
バーコードパターンを形成する実質的に平行な線からパターンが構成される実施形態において、所定のマイクロ流体パターンに沿って、マイクロ流体支持体の上にある支持体上に分子を付着させる方法及びシステムを使用して、本開示によるアレイ及び／又は基板を製造することができる。
【００１９】
本明細書に開示されているアレイ、基板、装置、方法、及び、システムは、全ての情報を読み終えるためにストリップ方向と垂直のシングルラインスキャンを用いて検出することができる一次元様式の情報（ラインプロファイル）を提供する。この方法で、リーダ（例えばスキャンヘッド）の正確な動きを要することなく必要な情報全てを得ることが可能であり、前記リーダの正確な動きは、その代わり、当技術分野の２Ｄアレイをイメージすることにおいて必要とされる。この特徴は、特定の実施形態において、スーパーマーケットにて商品のバーコードをスキャンするのと同じくらい容易なバーコードＤＮＡアレイの読み取りを可能にし得る。
【００２０】
本明細書に開示されているアレイ、基板、装置、方法、及び、システムは、標的に結合するのに適した増加した濃度の捕獲剤を提供し、従って、従来技術と比較して、（例えば０．１ピコモルまで等）増加した検出感度を提供することができる。
【００２１】
本明細書に開示されているアレイ、基板、装置、方法、及び、システムは、増加した数の（本明細書においてスポットとしても示されている）表面上の特定の捕獲剤に対する位置を可能にし得る。従って、本明細書に開示されているアレイ、装置、方法、及び、システムは、従来技術で検出可能なものと比較して、増加した数の標的又は標的に関連するパラメータ（例えば５０個の標的又はそれ以上）の検出も可能にする。
【００２２】
前記スポットは、互いに対してだけでなくマイクロ流体チャネル及び／又は表面上の他の構造体に対しても画定することができる位置に配置することができるため、本明細書に開示されているアレイ、基板、装置、方法、及び、システムは、マイクロ流体製造技術とも両立する。
【００２３】
本明細書に開示されているアレイ、基板、装置、方法、及び、システムは、従来技術と比較して、不純物のレベルを減少させながら、基板上に高密度の捕獲剤を提供することを可能にする。
【００２４】
本明細書に開示されているアレイ、基板、装置、方法、及び、システムは、特にアレイがマイクロフルイディックスに結びつけられる実施形態において、従来技術に対して、より多くのバイオマーカーを短縮された時間（例えば約９分）で検出することも可能にする。
【００２５】
本明細書に開示されているアレイ、基板、装置、方法、及び、システムは、特にアレイがマイクロフルイディックスに結びつけられる実施形態において、従来技術で分析される試料と比較して、サイズが減少した試料（例えば、１つのバーコードあたり５００ナノリットル、及び／又は、たった１つの細胞由来の蛋白質区分）からの検出を可能にする。
【００２６】
さらに、本明細書に開示されているアレイ、基板、装置、システム、及び、方法は、シングルアッセイ技術を使用して、同じ環境内、特に同じマイクロ流体環境内で多数のバイオマーカーの検出を可能にするため、同じ試料由来の異なるバイオマーカーの測定に付随する相対誤差は最小限にされる。
【００２７】
本明細書に開示されているアレイ、基板、装置、方法、及び、システムは、固定化された捕獲剤に結合することができる種々のタイプの標的分子の検出の実行に適用できる。適した標的分子には、それだけに限らないが、蛋白質、ペプチド、ポリペプチド、リガンド、代謝物、核酸、ポリヌクレオチド、炭水化物、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物、薬物候補、ウイルス、細菌、細胞、微生物、ウイルス、細菌、微生物、及び／又は、細胞の断片、部分、構成成分、産物、エピトープ、多糖類、脂質、リポ多糖類、糖蛋白質、細胞表面マーカー、受容体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、揮発性ガス分子、粒子、金属イオン、並びに、上記基板のいずれに対する抗体も含まれる。
【００２８】
本明細書に開示されているアレイ、基板、装置、方法、及び、システムは、診断アッセイ、環境モニタリングアッセイ、健康／薬物反応モニタリングアッセイ、並びに、研究目的のために行われるアッセイを含めたアッセイの実行に適用できる。実行することができる例証的なアッセイには、それだけに限らないが、癌バイオマーカー（例えば、前立腺癌抗原（ＰＳＡ）、及び、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ））の検出、肝毒性バイオマーカーＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）及びプラスミノゲンの検出、Ｃ３のような免疫補体蛋白質の検出、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１アルファ（ＩＬ−１アルファ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ−１ベータ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦベータ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等のサイトカインの検出、ケモカイン：（単球走化性蛋白質−１、ＭＣＰ−１とも呼ばれる）ＣＣＬ２の検出、並びに、相補ＤＮＡ分子の検出の実証が含まれる。
【００２９】
本明細書に開示されているアレイ、基板、装置、方法、及び、システムのさらなる用途には、それだけに限らないが、パターン形成技術を使用してガスセンサとしてのガス選択性ポリマーのバーコードアレイを作製する、ＬＣＤのための液晶フィルムをパターン形成する、及び、磁気バーコード（商品ＩＤ）に対する（ちょうど抗体−ＤＮＡコンジュゲートのような）ＤＮＡ−酸化鉄ナノ粒子コンジュゲートを使用して磁気粒子アレイを組み立てることが含まれる。
【００３０】
本開示の１又は複数の実施形態における詳細が、付随の図面及び以下の説明において明記される。他の特徴、目的、及び利点が、説明及び図面から、並びに、特許請求の範囲から明らかになる。
【００３１】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する付随の図面は、本開示の１又は複数の実施形態を例示し、詳細な説明と共に、本開示の原理及び実行を説明するよう役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本明細書に開示された実施形態による、逆相バーコードアレイを製造する方法の概略図を示している。パネルＡは、種々の患者由来の固定化された血清分子に対応するストライプ又はバーをいくつか含んだバーコードパターンを示している。パネルＢは、パネルＡのアレイの上部に形成されたマイクロ流体チャネルによってバーが提供されたバーコードパターンを示している。
【図２】本明細書に開示された実施形態による、バーコードアレイを検出する方法及び機器の概略図を示している。
【図３】スポットアレイ及び本明細書に開示された実施形態によるバーコードアレイを比較した場合の検出の概略図を示している。
【図４】本明細書に開示された実施形態によるバーコードアレイを生成するためのパターン形成方法及びシステムにおける例証的な推移の概略図を示している。
【図５】本明細書に開示された実施形態による多層流体チャネル装置を使用した、パターン形成された基板を製造する方法の概略図を示している。
【図６】本明細書に開示された実施形態による例証的なアレイを示している。
【図７】本明細書に開示された実施形態による２０μｍのバーコードアレイ（パネルＡ）及び２μｍのバーコードアレイ（パネルＢ）を使用した例証的な分子検出に対応した２つの画像を示している。
【図８】本明細書に開示された実施形態によるバーコードアレイのコンピュータ支援設計及び関連する使用を示している。下のパネルは、各チャネルが２０μｍの幅を有した平行な流体チャネルのセット内に流し込んだ１３の異なる捕獲剤（Ａ−Ｍ）を示している。上のパネルは、選択された領域の拡大図である。
【図９】本明細書に開示された実施形態によるバーコードアレイを使用した、１２個の分離されたウェルにおける多数のアッセイの遂行を示している。パネルＡは、支持ガラススライド上に製造したバーコードアレイを示している。パネルＢは、蛍光画像法によって可視化されたパネルＡのアレイ由来の蛋白質検出を示している。
【図１０】本明細書に開示された実施形態によるバーコードアレイ内に直接パターン形成された異なる捕獲剤の群を使用した、標的分子を検出する方法の概略図を示している。
【図１１】本明細書に開示された実施形態による、リンカーのセットを介して所定のバーコードアレイの特異的な位置上に固定化された異なる捕獲剤の群を使用した、標的分子を検出する方法の概略図を示している。これは、相補的なＤＮＡ分子のセットによってコード化され捕獲された抗体を使用した、標的抗原の検出によって例証されている。
【図１２】本明細書に開示された実施形態によるバーコードアレイを使用した、捕獲剤の荷重を変え、その結果、標的の検出に対する感度及び濃度範囲を変える方法の概略図を示している。
【図１３】本明細書に開示された実施形態によるバーコードアレイを含めた装置を製造する方法及び関連する使用の概略図を示している。
【図１４】本明細書に開示された実施形態による、例証的な蛋白質標的の検出を示している。
【図１５】本明細書に開示された実施形態によるバーコードアレイを使用した例証的な蛋白質検出、及び、従来のピンスポットアレイを使用した蛋白質検出との比較を示している。
【図１６】本明細書に開示された実施形態による、例証的な標的ポリヌクレオチドの検出を示している。
【図１７】本明細書に開示された実施形態によるバーコードアレイを使用した、試料内の多数の蛋白質標的における例証的な多重化検出を示している。
【図１８】本明細書に開示された実施形態による、例証的な蛋白質標的の検出を示している。
【図１９】本明細書に開示された実施形態によるバーコードアレイを使用した、試料内の多数の標的における例証的な検出、及び、従来のアレイとの比較を示している。
【図２０】本明細書に開示された実施形態による、標的を検出する方法及びシステムの概略図を示している。
【図２１】本明細書に開示された実施形態による、一連の試料における標的の例証的な検出を示している。
【図２２】本明細書に開示された実施形態による、広範な濃度範囲に渡った一連の試料における蛋白質標的の例証的な検出を示している。
【図２３】本明細書に開示された実施形態による、例証的な生物学的プロファイルの検出を示している。
【図２４】本明細書に開示された実施形態による、異なる濃度範囲での例証的な標的の検出を示している。
【図２５】図２０Ａの生物学的プロファイルの例証的な検出に関するデータを示している。
【図２６】本明細書に開示された実施形態による、ある特定の継続時間における蛋白質プロファイリングの検出を示している。
【図２７】本明細書に開示された実施形態による、例証的な定量検出を示している。
【図２８】本明細書に開示され、図２１（Ａ）に例示された例証的な実施形態による、検出した生物学的プロファイルにおける例証的な合成を示している。
【図２９】少量の新鮮なヒト血液内の標的蛋白質における例証的な検出を示している。
【図３０】本明細書に開示された実施形態による、例証的なヒト血漿プロテオームの検出を示している。
【図３１】本明細書に開示された実施形態による、パターン形成した基板を製造する方法の概略図を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
試料内の標的、特に複数の標的分子を検出するためのアレイ、基板、装置、方法、及び、システムが本明細書において開示されている。
【００３４】
「検出する」又は「検出」という用語は、本明細書において使用された場合、それだけに限らないが、試料、反応混合物、分子複合体、及び基板を含めた限られたスペース部分における標的又は信号の存在若しくは実態の決定を表している。標的又は信号の量の測定を参照する、前記測定に関する、又は、前記測定を含む場合に、検出は「定量的」であり（定量化とも呼ばれる）、それだけに限らないが、標的又は信号の量若しくは比率を決定するよう設計されたいかなる分析も含む。別の標的又は信号に対する相対存在量という点で、標的又は信号の質若しくは種類の同定を参照する、前記同定に関する、又は、前記同定を含む場合に、検出は「定性的」であり、定量化されない。
【００３５】
「標的」又は「標的分子」という用語は、本明細書において使用された場合、関心のある分析物を表している。「分析物」という用語は、試料内に存在しているかどうか検出されなければならない物質、化合物、又は組成物を意味する。分析物には、それだけに限らないが生体分子、及び、特にバイオマーカーが含まれる。「生体分子」という用語は、本明細書において使用された場合、それだけに限らないが、糖、アミノ酸、ペプチド蛋白質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、有機分子、ハプテン、エピトープ、生物細胞、生物細胞の一部、ビタミン、ホルモン等を含めた、生物学的環境に関連する物質、化合物、又は組成物を表している。「バイオマーカー」という用語は、それだけに限らないが、細胞周期の段階、健康及び疾患の状態を含めた生物学的環境の特定の状態と関連した生体分子を表している。バイオマーカーの有無、減少、増加は、特定の状態に関連しているか、又は、特定の状態を示している。典型的なバイオマーカーには、乳癌マーカーＨＥＲ２、卵巣癌マーカーＣＡ１２５、及び、心臓病マーカートロンビンが含まれる。
【００３６】
「試料」という用語は、本明細書において使用された場合、制限された量の何かを表し、それはより多くの量のその何かを示しており、それだけに限らないが、生物学的環境由来の流体、標本、培養物、組織、市販の組み換え蛋白質、合成化合物又はその一部を含む。
【００３７】
一部の実施形態において、アレイ、基板、方法、及び、システムが、生体分子又はバイオマーカーのパネル等、多数の異なる標的の検出のために本明細書において開示されている。本明細書に開示されているアレイ、基板、装置、方法、及び、システムにおいて、各標的は、表面上の特定の位置において検出され、検出された生体分子の収集物は、パターン又はバーコードを形成する。特に、本明細書に開示されているアレイ、装置、方法、及び、システムは、マイクロ流体環境内のバイオマーカーパネルの検出に適用することができる。
【００３８】
本明細書に開示されているアレイ、基板、装置、方法、及び、システムにおける一部の実施形態では、複数の捕獲剤が基板に付着される。
【００３９】
「捕獲剤」という表現は、本明細書において使用された場合、所定の結合剤と特異的に結合する能力がある分子を表している。例証的な捕獲剤には、それだけに限らないが、ポリヌクレオチド及び蛋白質、特には抗体が含まれる。
【００４０】
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において使用された場合、ヌクレオチド、ヌクレオシド、又はその類似体を含めた２つ以上のモノマーから成る有機ポリマーを表している。「ヌクレオチド」という用語は、プリン若しくはピリミジン塩基、及び、リン酸基に結合したリボース又はデオキシリボースの糖から成り、核酸の基本構造単位であるいくつかの化合物のうちどれも意味している。「ヌクレオシド」という用語は、デオキシリボース若しくはリボースと組み合わされたプリン又はピリミジン塩基から成り、特に核酸に存在する（グアノシン又はアデノシンとしての）化合物を意味している。「ヌクレオチド類似体」又は「ヌクレオシド類似体」という用語は、１若しくは複数の個々の原子が異なる原子又は異なる官能基と交換されたヌクレオチド又はヌクレオシドをそれぞれ意味している。従って、ポリヌクレオチドという用語は、いかなる長さのＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその類似体の核酸並びにその断片も含んでいる。３つ以上のヌクレオチドから成るポリヌクレオチドは、ヌクレオチドオリゴマー又はオリゴヌクレオチドとも呼ばれる。
【００４１】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書において使用された場合、２つ以上のアミノ酸モノマー及び／又はその類似体から成る有機ポリマーを表している。「ポリペプチド」という用語は、完全長の蛋白質及びペプチド、並びにその類似体及び断片を含めたいかなる長さのアミノ酸ポリマーも含む。３つ以上のアミノ酸から成るポリペプチドは、蛋白質オリゴマー又はオリゴペプチドとも呼ばれている。本明細書において使用された場合、「アミノ酸」、「アミノ酸モノマー」、又は「アミノ酸残基」という用語は、不自然な側鎖を有する合成アミノ酸及びＤ型光学異性体もＬ型光学異性体も含めた２０個の天然アミノ酸のうちどれも意味している。「アミノ酸類似体」という用語は、１又は複数の個々の原子が異なる原子、同位体、又は異なる官能基と交換されたか、さもなければその天然のアミノ酸類似体と同一であるアミノ酸を意味している。
【００４２】
「蛋白質」という用語は、本明細書において使用された場合、それだけに限らないが、他の蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、代謝物、ホルモン、ケモカイン、及び小分子を含めた他の生体分子との相互作用に関与することができる特定の二次構造及び三次構造を有するポリペプチドを表している。
【００４３】
「抗体」という用語は、本明細書において使用された場合、抗原による刺激後の活性化されたＢ細胞によって産生され、その抗原に特異的に結合して生物学的システムにおける免疫反応を促進する、並びに、一般的に２つの重鎖及び２つの軽鎖を含めた４つのサブユニットから成る蛋白質を意味している。抗体という用語は、それだけに限らないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はその断片を含めた天然及び合成の抗体を含む。典型的な抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ等が含まれる。典型的な断片には、Ｆａｂ  Ｆｖ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２等が含まれる。モノクローナル抗体は、特定の空間及び極性の構成の、「エピトープ」と呼ばれる別の生体分子１つに特異的に結合し、その結果、前記別の分子に相補的であると定義される抗体である。ポリクローナル抗体は、各モノクローナル抗体が異なる抗原エピトープに結合する、モノクローナル抗体の混合物を意味している。抗体は、宿主の免疫化及び血清（ポリクローナル）の採取等当技術分野において周知の技術によって、又は、連続的なハイブリドーマ細胞株を調製する及び分泌された蛋白質（モノクローナル）を採取することによって調製することができる。
【００４４】
「特異的な」、「特異的に」、又は「特異性」という表現は、分子の別の分子への結合に関して本明細書において使用された場合、その分子と別の分子との間に生じる認識、接触、及び、安定した複合体の形成を意味し、その分子及び別の分子のそれぞれは、他の分子との間に認識、接触、及び安定した複合体の形成を実質的により生じない又は全く生じないことを意味している。典型的な特異的結合は、抗体−抗原の相互作用、細胞受容体−リガンドの相互作用、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、酵素基質の相互作用等である。「特異的な」という用語は、複合体の分子要素に関して本明細書において使用された場合、その要素が一部を成す特異的な複合体に対するその要素の独特な結合を意味している。「特異的な」という用語は、ポリヌクレオチドの配列に関して本明細書において使用された場合、その配列の相補的配列である単一のポリヌクレオチドへの独特な結合を意味している。
【００４５】
「付着する」又は「付着した」という用語は、本明細書において使用された場合、２つ以上の要素を一緒にするための、接着、連結、力、又は結びによる接続又は合体を意味し、例えば第１の分子が第２の分子又は材料に直接結合する、及び、１若しくは複数の中間分子が第１の分子と第２の分子又は材料の間に配置される実施形態のように、直接的又は間接的な付着を含む。
【００４６】
「基板」という用語は、本明細書において使用された場合、基礎をなす支持体又は基層を示している。典型的な基板には、ガラス板、マイクロタイターウェルプレート、磁気ビーズ、シリコンウェハー、及び、本開示を読んだ後に当業者により同定され得るさらなる基板等の固体の基板が含まれる。
【００４７】
一部の実施形態において、本明細書に開示されているアレイ、装置、方法、及び、システムに使用される捕獲剤は、アレイを形成するよう基板上に直接堆積させるか、又は、基板上に予め堆積され、アレイを形成するために捕獲剤に特異的に結合する能力があるリンカー分子によって固定化することができる。リンカー分子は、基板への捕獲剤の付着に対して機能的であるため、捕獲剤の構成成分として考慮することができる。
【００４８】
多数の捕獲剤が使用される本明細書に開示されているアレイ、基板、装置、方法、及び、システムにおいて、各捕獲剤は、互いから結合的に区別可能、及び／又は、位置的に区別可能であり得る。
【００４９】
「結合的に区別可能である」という表現は、分子に関して本明細書において使用された場合、特異的な分子に特異的に結合するその能力に基づき区別可能であり、その結果、前記特異的な分子に相補的であると定義される分子を表している。従って、第１の分子が第３の分子に特異的に結合し、その結果、前記第３の分子に相補的であると定義され、第２の分子が第４の分子に特異的に結合し、その結果、前記第４の分子に相補的であると定義され、前記第４の分子が前記第３の分子とは異なる場合、前記第１の分子は前記第２の分子と結合的に区別できる。
【００５０】
「位置的に区別可能である」という表現は、分子に関して本明細書において使用された場合、前記分子により占有される点又は領域に基づき区別可能である分子を表している。従って、位置的に区別可能である捕獲剤は、前記アッセイチャネル上の異なる点又は領域を占有し、その結果、位置的に区別可能である基板のポリヌクレオチドである。
【００５１】
本明細書に開示されているアレイにおいて、複数の捕獲剤のうち各捕獲剤は、複数の標的のうち各標的に特異的に結合して、捕獲剤標的結合複合体を形成する能力があり、前記複数の捕獲剤は、バーコードパターンを形成する実質的に平行な線に沿って捕獲剤標的結合複合体が検出可能であるようにアレイ上に配置される。
【００５２】
他の実施形態では、バーコードパターンを形成する実質的に平行な線にそって（本明細書において逆バーコード又は逆相バーコードとも呼ばれる）標的、特に検出可能な標的の付着を可能にするよう構成された基板、システム、及び、方法が、本明細書において開示されている。逆バーコードの例証的な説明が図１において例示されており、バイオアッセイのための、種々の患者由来の固定化された血清分子に対応するいくつかのバー、及び、前記患者の血清と接触されることになる種々の薬物を提供するマイクロ流体チャネルを含んだバーコードパターンが示されている。
【００５３】
一部の実施形態では、付着した標的及び／又は捕獲剤標的複合体の検出がラベルされた分子を提供することによって行われ、前記ラベルされた分子は、検出されることになる捕獲剤標的複合体に特異的に結合することができるいかなる分子（例えば、抗体、アプタマー、ペプチド等）、及び、ラベリング信号を提供するラベルも含み、そのラベル化合物は前記分子に付着される。本開示、特に実施例の項を読んだ後に当業者には明らかな手順に従って、ラベルされた分子は、付着した標的及び／又は捕獲剤標的複合体に接触され、次に、基板上の付着した標的及び／又は捕獲剤−標的複合体に結合したラベル化合物からのラベリング信号を検出することができる。
【００５４】
特に、本明細書に開示されているアレイ、装置、方法、及び、システムに使用される信号の読み取りは、標的分子の捕獲事象を光、電気、又は、磁気信号に変換するプローブ等のラベルを使用して実現することができる。典型的なプローブには、それだけに限らないが、蛍光色素、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、半導体ナノ粒子（例えば、ＣｄＳｅ、ＺｎＳｅ、及び／又は、そのコアシェルナノ粒子）、並びに、酸化鉄ナノ粒子が含まれる。
【００５５】
「ラベル」及び「ラベルされた分子」という用語は、複合体又は分子の構成成分として本明細書において使用された場合、検出能力を持つ分子を意味し、それだけに限らないが、放射性同位体、フルオロフォア、化学発光色素、発色団、酵素、酵素の基質、酵素の補助因子、酵素の阻害物、色素、金属イオン、ナノ粒子、金属ゾル、リガンド等（ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、又はハプテン等）を含む。「フルオロフォア」という用語は、検出可能な画像において蛍光を示すことができる物質又はその一部を意味している。結果として、「ラベリング信号」という表現は、本明細書において使用された場合、ラベルから放出され、そのラベルの検出を可能にする信号を表し、それだけに限らないが、放射活性、蛍光発光、化学発光、酵素反応の結果における化合物の生成等を含む。
【００５６】
以下においてより詳しく記述される、１又は複数の標的及び／又は複数の標的が検出される実施形態において、ラベルされた分子は、複数のラベルされた分子から形成され得る。各ラベルされた分子は、前記１又は複数の標的／複数の標的のうち１つの標的に特異的に結合する分子、及び、該分子に付着したラベル化合物を含み、ラベル化合物はラベリング信号を提供し、各ラベルされた分子は別のラベルされた分子から検出可能な程度に区別可能である。
【００５７】
「検出可能な程度に区別可能である」という表現は、ラベルされた分子に関して本明細書において使用された場合、分子に結合したラベル化合物により生じるラベリング信号に基づき区別可能な分子を示している。検出可能な程度に区別可能であるラベルされた分子を提供するために使用することができる典型的なラベル化合物には、それだけに限らないが、放射性同位体、フルオロフォア、化学発光色素、発色団、酵素、酵素の基質、酵素の補助因子、酵素の阻害物、色素、金属イオン、ナノ粒子、金属ゾル、リガンド（ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、又はハプテン等）、及び、本開示を読んだ後に当業者には明らかなさらなる化合物が含まれる。
【００５８】
結合的に区別可能な捕獲剤が使用される実施形態において、それぞれが個々の関心のある分析物に特異的な、検出可能な程度に区別可能であるラベルされた分子の使用によって異なる分析物を検出することができる。
【００５９】
一部の実施形態では、ラベルされる抗体がフルオロフォアでラベルされる蛍光ベースの読み取りを介して検出方法を実行することができ、フルオロフォアは、それだけに限らないが、小分子色素、蛋白質の発光団、及び、量子ドットを含む。他の実施形態では、蛍光ベースの技術以外の方法を用いてオンチップ検出を行うことができる。典型的な適した技術には、比色検出、酵素により触媒された異なる色又は蛍光の色素の生成（異なる色は別の分析物に関連する）、電子顕微鏡法、ＡＦＭ、又は暗視野顕微鏡法を使用したマイクロ粒子／ナノ粒子ベースの検出、磁気のマイクロ／ナノ粒子を使用した磁気検出、電気検出法が含まれる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、金ナノ粒子ベースの検出の後に続く金又は銀増幅等、１回の増幅を使用する方法によって検出を行うことができる。特に、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法及びシステムのうちどれにおいても、以下でさらに記述されるように一般的な現像液が金ナノ粒子を増幅することができる金ナノ粒子でラベルされた第２の検出システムで検出を行うことができる。さらに、金粒子を拡散させる暗視野から読み取りが生じる場合、単一分子のデジタルプロテオミクス（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）が可能になる。
【００６１】
適した器具を用いて検出を行うことができる。特に、バーコードパターンを読み取るよう構成されたいかなる器具も、選択した検出に相対感度が適用可能である限り使用することができる。
【００６２】
例えば、一部の実施形態において、本明細書に開示されているアレイの情報の読み取りは、図２において概略的に例示されたレーザラインスキャナ等、シンプルなラインスキャンリーダを使用して行うことができる。図３において概略的に例示されているように、アレイの一次元設計は、従来の円形スポットアレイと比較してより高い信頼度を与える。図３の例では、スポットされたアレイ（パネルＡ）と比較した場合、どのようにして同じラインスキャナからのスキャンの読み取り（スキャンＢ）がバーコードパターン（パネルＢ）に対してより高い信頼度を提供するかが示されている。
【００６３】
本明細書に開示されているアレイを検出するのに適したさらなる器具は、本開示を読んだ後、当業者によって同定することができる。例えば、蛍光プローブが信号の読み取りに対して使用される場合、（Ａｘｏｎ  Ｇｅｎｅｐｉｘ４０００シリーズのスキャナ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ３００スキャナ等の）レーザマイクロアレイスキャナ、走査型レーザ共焦点顕微鏡（例えば、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｃｌｓｉ顕微鏡）を使用して、パターンを可視化することができる。図２及び３に例示されているように、特に、平行ストライプパターンは、高い忠実度と信頼度を有して、１回のレーザの走査で全情報を読み取ることを可能にする。この特徴によって、本明細書に記述されているバーコードアレイを読み取るために、スーパーマーケットにおけるバーコードリーダに類似のシンプルなレーザラインスキャナを実行するという可能性が開かれる。
【００６４】
金のナノ粒子が使用される他の実施形態において、（Ｎｉｋｏｎ（登録商標）  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＬＶ１００等の）光散乱式顕微鏡を使用することができる。無電解メッキを使用してナノ粒子信号を高める他の実施形態では、光散乱式顕微鏡に加えて（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｖｅｒｉｇｅｎｅ（登録商標）リーダ等の）平床式スキャナを使用することができる。磁気粒子がプローブとして使用されるさらに他の実施形態において、ハードディスクのスキャンヘッドに類似の磁気抵抗センサを使用してバーコード情報を読み取ることができる。
【００６５】
さらなる技術が、本開示を読んだ後に当業者には明らかであり、詳細にはさらに記述されない。
【００６６】
本明細書に開示されているアレイ及び基板は、同様に本明細書において開示されている所定のパターンに沿って材料を支持体に付着させる方法及びシステム（パターン形成方法及びシステムとして同様に本明細書に示されている）を使用して製造することができる。材料を付着させる方法及びシステムを使用して、いかなる所定のパターンにも従ったアレイ及び基板を製造することができる。パターン形成される材料がバーコードパターンを形成する実質的に平行な線に沿って構成される実施形態において、本明細書に開示されている方法及びシステムを使用してバーコードアレイ及び基板を製造することができる。
【００６７】
一部の実施形態では、ガラスの基板に弱く又は強く結合されるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からパターン形成されたマイクロ流体チャネルに関して例示された例証的な手順において以下に記述されるようにバーコード表面パターン形成を行うことができる。パターン形成方法は特定のマイクロ流体特徴及び使用される材料に制限されないこと、並びに、その全てが本開示を読んだ後に当業者には明らかである、射出成形マイクロ流体チャネル、半導体ウェーハ等の異なる大きさ及び他の材料を有する異なる数のチャネル全てを利用することができるということを当業者は理解するであろう。
【００６８】
一部の実施形態では、それぞれが注入口及び排出口を有し、該排出口のそれぞれが所望のパターン（特にバーコードパターン）の一部を形成するようにされるマイクロチャネルを含むよう、ＰＤＭＳエラストマー等のポリマーをマスターテンプレートから成形することによって骨組を製造することができる。一部の実施形態において、シリコンウェハー上にフォトレジストパターンを生じるようフォトリソグラフィーを使用してポリマーは成形される。それらの実施形態は、特定のラピッドプロトタイピングを可能にする。本明細書に開示されているパターン形成方法及びシステムのための骨組製造の例証的な説明が図４において例示されており、バーコードアレイのフローパターンに対するＰＤＭＳマイクロチャネルスタンプの製造が開示されている。
【００６９】
別の実施形態では、シリコン「ハード」マスターを提供することによって、及び、深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）製法を使用して、基礎をなすシリコンウェハー内にフォトリソグラフィーにより画定されるパターンを転写することよって骨組を製造することができる。それらの実施形態は、より高生産のチップ製造のための強固で再利用できる骨組を可能にする。
【００７０】
一部の実施形態では、次に、バーコードパターンのチャネルに対して底部を提供するガラス表面等の支持体上に成形されたポリマーを結合、特にくっつけることができる。ガラススライド上に多数のリングパターン（的の中心）を生じるために使用される設計２層ＰＤＭＳ流体チャネル装置の例証的な説明が、図５に示されている。
【００７１】
実施形態の一部において、関心のある材料を用いて基板を予め被覆することができる。例えば、以下でさらに例示されるＤＥＡＬ技術を使用してバーコードが製造される実施形態では、ポリアミンポリマー又はポリ−Ｌ−リシンポリマー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を結合に先立ち予め被覆して、最終的なバーコードパターンのＤＮＡ荷重を上げることができる（以下、特に実施例２を参照）。
【００７２】
マイクロ流体チャネルの数によって、バーコードアレイのサイズが決定される。一部の例証的な実施形態において、バーコードアレイは、ＤＮＡバーコードマイクロアレイを有する支持体の大面積（３ｃｍ×２ｃｍ）を覆うように前後に進む１３から２０個の平行なマイクロチャネルを含む。
【００７３】
一部の実施形態において、支持体上での付着を可能にする時間及び状況下で、捕獲剤又は選択した分子を支持体上に接触させることによってパターン形成を行うことができる。特に、一部の実施形態では、それぞれが選択した分子（例えば、アレイがＤＥＡＬ技術に連関される実施形態で１×ＰＢＳバッファにおいて調製された一次ＤＮＡオリゴマーの異なる鎖）を含有し、マイクロ流体チャネルのそれぞれに流し入れることができる溶液を提供することによってパターン形成を行うことができる。次に、例えば溶液で充填されたチップを乾燥器内に配置して、気体透過ＰＤＭＳを介して溶媒（例えば水）が完全に蒸発するのを可能にすることによって、その溶液の溶媒を蒸発させることができ、付着されることになる分子（例えばＤＮＡ分子）を残す。一部の実施形態において、この過程は、完了するのに数時間から一晩かかり得る。
【００７４】
分子のパターン形成に続いて、骨組は、通常、支持体から分離される。一部の実施形態において、骨組が支持体から取り外されると、パターン形成された分子に次の処理を受けさせることができる（例えば、血液アッセイチップをスライドに結合させるのに先立ち脱イオン水にスライドを迅速に浸すことによって取り除くことができる１又は複数の前の操作中に形成された可能性がある塩又は他の沈殿物を除去する、例えば、８０℃で４時間の熱処理、又は、ＵＶ架橋によってＤＮＡ分子をガラス表面に固定することができる）。本明細書に開示されているパターン形成方法の例証的な手順が実施例１５に例示されている。
【００７５】
特に、一部の特定の実施形態では、一連のマイクロ流体チャネルがＰＤＭＳにパターン形成され、４つのチャネル壁のうち１つがガラス表面自体であるように、それらのチャネルはガラス表面上に結合される。マイクロ流体チャネルの数によって、バーコードアレイのサイズが決定される。この方法で、マイクロ流体チャネルを流れる溶液は、ガラスの基板と接触される。生物学的アッセイに使用されるバーコードに対するこれらのマイクロ流体チャネルの典型的な寸法は、１０マイクロメートル以上である。特に、バイオアッセイを受けるよう材料がパターン形成される実施形態において、チャネルの幅は、最終的なバーコード内の個々のバイオアッセイ測定領域の幅を画定する。それらの実施形態では、生体分子の最終測定が光学方法を使用して行われる場合、従って、１０マイクロメートル幅の領域は、安価なオプティクスを使用して容易に画像化されるサイズを構成する。より大きなバー及びより小さなバーも可能である。
【００７６】
ＤＮＡオリゴマー等、異なる材料、特に異なる生物学的種（又は、異なる濃度の同じ生物学的種）を、次に、個々のマイクロ流体チャネルのそれぞれの中に流すことができる。
【００７７】
次に、前記生物学的種又は他のパターン形成された材料を、静電相互作用又は他の化学的相互作用を使用して、それらのマイクロ流体チャネル内のガラス表面領域に付着させることができる。ガラスは、生物学的種とガラス表面との化学的相互作用を増やすある分子構成成分で予め被覆することができる（上記及び以下、特に実施例２を参照）。
【００７８】
次に、パターン形成される材料（例えば生物学的種）を含有する溶液由来の溶媒が取り除かれる。その溶液が水であり、フルイディックス（例えばマイクロフルイディックス）がＰＤＭＳから作製される場合、前記水をＰＤＭＳを介して自然に蒸発させ、パターン形成される材料を基板に付着させたまま残し、従って、基板上にパターン形成されたアレイを提供することができる。一部の実施形態では、関心のある生物学的試料を扱い導入するために、この時点でさらなるチャネル（例えばマイクロ流体チャネル）を導入することが所望される場合がある。
【００７９】
マスターテンプレートからシリコンエラストマーを成形することによって、マイクロ流体バーコードパターン形成チップを作製することができる。マスターテンプレートは、多数の材料から製造することができる。１つの方法は、ＳＵ８  ２０１５フォトレジストを曝露するフォトリソグラフィーを使用することによってマスターを製造することである。リソグラフィーの曝露に続いてフォトレジストの領域は取り除かれ、残りの材料がマスターを構成する。あるいは、フォトリソグラフィーのパターン形成法を、深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）と連結させ、シリコンウェハーからマスターを調製するために使用することができる。マイクロ流体骨組及び該骨組からマイクロ流体チャネルを調製するこれら種々の方法は、当技術分野において周知である（Ｇａｅｌ  Ｔｈｕｉｌｌｉｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｔａｌ  Ｋｈａｎ  Ｍａｌｅｋ，Ｍｉｃｒｏｓｙｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ  １２，１８０，２００５）。
【００８０】
パターン形成される材料は、有機物質又は無機物質を含めた、支持体に付着するのに適したいかなる関心のある物質も含むことができる。本明細書に開示されているパターン形成方法及びシステムを使用してパターン形成することができる例証的な無機材料には、それだけに限らないが、チオールにより官能性を持たせた基板表面に付着することができる金ナノ粒子、磁場を使用して基板上に堆積することができる酸化鉄ナノ粒子、及び、カチオンポリマーで被覆された基板によって固定化することができるシリカ粒子等が含まれる。
【００８１】
本明細書に開示されているパターン形成方法及びシステムを使用してパターン形成することができる例証的な有機物質には、それだけに限らないが、細胞、ウイルス、細菌、及び真菌等の現生種及びその混合物、組織、組織可溶化液、細胞可溶化液、血清、唾液、及び滑液等の複雑な生物試料及びその混合体、ポリヌクレオチド、蛋白質、抗体、糖蛋白質、多糖類、リポ多糖類、リガンド、ペプチド、ポリペプチド、脂質、薬物、薬物候補、抗原、並びに、上記うちいかなるものの断片、一部、及び構成成分等の単型分子及びその混合物が含まれる。前記有機材料は、ポリマー、オリゴマー、色素分子、導電性ポリマー、反応性ポリマー、ガス検出ポリマー、液晶及び有機金属構造体（ＭＯＦ）、カーボンナノチューブ、フラーレン、グラフィーム、並びにそのナノ／マイクロ構造体等の非生物学的材料も含み得る。一部の実施形態では、パターン形成される材料は捕獲剤を含む。一部の実施形態では、パターン形成される材料は検出可能な標的を含む。他の実施形態では、パターン形成される材料は、細胞又はアッセイされることになる他の生物学的材料等の材料を含む。他の実施形態では、パターン形成される材料は、（例えば、ＬＣＤ製造のための液晶、又は、ガスセンサとして使用されることになるガス選択性ポリマー等）バーコード構成が所望される他の有機物質又は無機物質を含むことができる。
【００８２】
本明細書に開示されているパターン形成方法及びシステムによると、パターン、特にバーコードパターン又はアレイを非常に小さな領域上に作製することができ、従って、磁気ＩＤ又は他の材料のパターン形成を小型の製品上で行うことができる。
【００８３】
捕獲剤を介した検出にパターンが使用される一部の実施形態において、前記捕獲剤は、ポリヌクレオチド、特に、相補的なハイブリダイゼーションを介して標的ＲＮＡの約１０から２０個の連続した塩基に結合するＤＮＡポリヌクレオチドによって形成される。それらの実施形態のうち一部においては、本明細書に開示されているアレイ、基板、方法、及びシステムを使用して、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、特に生物試料（例えば組織可溶化液）由来のｍＲＮＡを検出することができる。それらの実施形態のうち一部においては、（例えば蛍光でラベルされた）別のラベルされたＤＮＡ鎖が、信号の読み取りのために、捕獲されたｍＲＮＡの１０から２０個までの種々の塩基に結合するよう設計される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子のパネルの多重化測定を、その捕獲剤ＤＮＡのストライプを用いてパターン形成されたバーコードアレイ上で行うことができる。
【００８４】
パターンが検出に使用される一部の実施形態において、標的は、転写後のレベルで遺伝子発現を制御する短いＲＮＡ分子（２２塩基）の一種であるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。
【００８５】
パターンが検出に使用される一部の実施形態において、標的は転写因子でありえ、捕獲剤は、転写因子と同じ配列の結合部位若しくはその一部、又は、その相同配列を有したポリヌクレオチド、特にＤＮＡポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、蛍光でラベルされた又はビオチンでラベルされた抗体が、次に、信号読み取りのために使用される。
【００８６】
一部の実施形態では、パターン形成されることになる材料を宿すよう構成された１又は複数のチャネルによって線が形成される。特に、一部の実施形態では、流体チャネルの幅は、０．５μｍから１ｃｍまでに及んで作製することができる。ＰＤＭＳ等の軟質材料が利用される場合、高さは、一般的に、チャネルの幅の１／１０を超えるものでありえ、より硬い材料（例えば、ガラス、シリコン、ポリスチレン、ＰＭＭＡ、ポリカーボネート、又はエポキシ樹脂）を使用して流体チャネルを作製する場合、高さはより低くあり得る。
【００８７】
パターン形成アレイに対して二層装置が使用される実施形態において、チャネルは１ｍｍ程短くありえ、例えば、基板上で行き来することによって物質全体（例えば１”×３”のガラススライド）を覆うようチャネルが形作られる場合何メートルにまで達し得る。より大きな基板が使用される実施形態において、チャネルの長さは、基板及び関心のある用途によって画定されるため、より長くあり得る。
【００８８】
アレイは、原則として、平面、凸面、凹面、又は平らでない基板上で、ストライプ、円環、同心円環（例えば図５及び６の例を参照）、三角形、長方形、多面体、星形、クロスバー、文字、絵等、いかなる注文設計された形状にも作製することができる。特に、図６では、真ん中に配置された細胞等の試料によって分泌された標的の検出に対するバイオアッセイ等の用途に適した多数の円環パターンが示されている。特に、図６の画像は、Ｃｙ３及びＣｙ５の蛍光プローブによって可視化された蛋白質ＩＬ−２及びＴＮＦ−αの検出を示している。
【００８９】
ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）又は蛋白質（例えば抗体）をパターン形成するためにチャネルが使用される実施形態では、チャネルの幅は０．５μｍから１ｃｍでありえ、高さは１μｍから１ｃｍまで及ぶことができ、さらに、長さは所与の基板の領域によって可能にされるいかなる長さでもあり得る。例証的な２μｍのバーコードアレイが図７に示され、本開示の教示に従って製造された蛍光ＤＮＡ分子のバーコードアレイが例示されている。相補ＤＮＡバーコードアレイを使用した最適な実証されたポリヌクレオチド検出の実行には、２００μＭの捕獲ＤＮＡ溶液が使用され、展開されたアレイが蛍光スキャナを使用して可視化される場合、２０μｍのチャネル幅及び２０μｍの高さが好ましい。ＤＮＡによりコード化された抗体及び後のイムノサンドイッチアッセイを固体化するためにＤＮＡバーコードアレイが使用される実施形態では、同じチャネル幅及び高さが好ましい（以下のＤＥＡＬ技術に関する説明を参照）。
【００９０】
一部の実施形態では、実質的に平行な線の一部又は全てが、末端部の少なくとも１つを介して互いに接続される。特に、線がチャネルによって形成される用途において、実質的に平行な線を互いに接続させ、曲がりくねった形状に構成された１つのチャネルを形成することができる。曲がりくねった形状のチャネルによって、１回の捕獲剤を流すステップにおける、例えばガラススライド全体（１”×３”）等、広範囲に渡る反復バーコードアレイの作製が可能になる。それは、大規模で費用のかからない検出用バーコードアレイの製造における重要な利点を表している。さらに、それは、何度も繰り返して同様にアッセイが実行されることを可能にし、従って、統計のエラーを減らしている。曲がりくねった形状のチャネルの例証的な説明は、図８に示されている。１又は多数のパターンの実質的に平行な線間にさらなる接続が生じる（例えば、ＤＥＡＬ技術に関してバーコードが製造される用途において、多数のバーコードパターンがピラミッドを形成するよう接続されてＤＮＡの荷重を上げる）。
【００９１】
パターン形成されることになる材料は、選択された特定の実験計画に従い平行な線に沿って配置することができる。例えば、複数の捕獲剤がパターン形成される実施形態では、各捕獲剤を１つの線に沿って配置するか、又は、２つ以上の捕獲剤を１つのチャネルの部分に沿って位置づけ配置して、捕獲剤を配置することができる。他の実施形態では、検査（特に、検出）されることになる材料は、バーコードの１つの線又は線の一部に沿ってパターン形成することができる。それらの実施形態の例証的な説明は、図１及び７に示されている。
【００９２】
一部の実施形態において、パターン形成された材料は標的の検出に使用することができる。それらの実施形態では、一般的に、捕獲剤は基板上にパターン形成され、検出可能な捕獲剤標的複合体を形成する。他の実施形態では、検出可能な標的が直接前記材料上でパターン形成される。例えば、多数の患者由来のいくつかの血清試料を、バーコードアレイにパターン形成することができる。そのようなアレイでは、各ストライプは、その患者の血漿プロテオーム全体に生体分子を含有する。抗体、リガンド、薬物候補、及び、患者間での生物学的プロファイルの比較を求めてスクリーニングするために、このアレイを活用することができる。それらの実施形態は、実施例３〜１４のバーコードアレイ、基板、方法、及びシステムのために例証され、関連する図において例示され、さらに以下で説明される。
【００９３】
一部の実施形態では、非マイクロ流体環境でアッセイが実行される。それらの実施形態の例証的な説明が図９に示され、バーコードアレイを使用した１２個の分離したウェルにおける多数のアッセイの履行が例示されている。特に、図９に例示されたバーコードアレイは、ウェルを含んだ支持ガラススライド上で製造され、各ウェルは、ヒト血清等の異なる試料を含有している。図９において例示された実験では、異なる試料由来の蛋白質の検出が、蛍光画像法によって可視化される。
【００９４】
一部の実施形態では、（血液のフィンガープリック、細針生検からの組織等）特に少量のバイオ試料の取り扱いを可能にするマイクロフルイディックスでアッセイが行われる。
【００９５】
一部の実施形態では、バーコードアレイを使用して、オンチップ単細胞培養、溶解、ｍＲＮＡ及び蛋白質単離／精製を介して、特に、全内容を本出願に援用する、２００８年７月１６日に出願した“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”と題された米国特許出願（Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｐ２３５−ＵＳ）に記載されたもの等の統合マイクロ流体装置を使用して、単細胞由来の蛋白質及び／又は遺伝子を多数検出することができる。
【００９６】
試料が生物起源の材料（バイオ試料）であり、標的がバイオマーカーであるマイクロ流体用途を参考にして、本開示のアレイ、基板、装置、方法、及びシステムのさらなる説明が提供される。当業者は、非マイクロ流体用途におけるマイクロフルイディックス及びバイオマーカーに対して、並びに／又は、他の生物学的、有機及び無機の試料及び標的に対して詳しく記述された特徴の適応性を正しく理解するであろう。
【００９７】
一部の実施形態において、本明細書に開示されているアレイ、装置、方法、及びシステムを使用して、血液、血清、生物学的組織、又は、細胞培養の構成成分として等、いくつかの生体材料内の関心のある生体分子の検出に基づいた表面結合バイオアッセイを行うことができる（本明細書において、バイオバーコードアッセイとも呼ばれる）。
【００９８】
生物学的材料は、関心のある生体分子を放出するように予め処理して、表面結合バイオアッセイにおける生体分子の結合に干渉する恐れがある生物学的材料を除去することができる。典型的な前処理の手順は、血漿（又は血清）から血液細胞を分離するステップ、続いて、血漿由来の蛋白質を測定するステップを含む。他の手順では、分離された細胞は、さらに白血球及び赤血球に分離することができ、従って、さらなる分析を受けさせることができる。典型的な表面結合バイオアッセイは、以下のように実行することができる：関心のある生体分子を、該関心のある生体分子を特異的に認識しそれに結合する（一次又は１°）表面結合捕獲剤分子（例えば、抗体又は相補的な一本鎖ＤＮＡオリゴマー）に結合させる。一般的に、蛍光分子等のある検出用ラベルを含有した二次（又は２°）捕獲剤を導入させ、表面結合生体分子に結合させる。
【００９９】
実質的に平行な線に沿って基板上に選択された捕獲剤をパターン形成するバイオバーコードを製造することができる。特定のマイクロ流体用途において、実質的に平行な線は、チャネル又はチャネルの一部分によって形成することができる。捕獲剤がバイオバーコードにおける表面に付着される種々の実施形態の例証的な説明が、図１０（バーコードアレイ内に形成されることになる、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ）の検出に対する捕獲剤ＤＮＡ分子）、図１１（マルチプレックスな蛋白質、細胞表面マーカー、糖蛋白質、ウイルス、及び、細菌の検出を可能にする、バーコードアレイ上でのイムノサンドイッチアッセイを可能にするＤＮＡ−コード化抗体）、並びに、図１２（バイオバーコードがＤＥＡＬ技術に結合された用途において、どのようにして高められたＤＮＡ荷重が検出感度の向上に寄与するかを示した概略図、以下を参照）に示されている。
【０１００】
例えば、蛋白質を検出するための抗体アレイ、又は、ポリヌクレオチドを検出するための相補的なＤＮＡアレイ等の捕獲剤のパターン形成によって、ポリヌクレオチド、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡ）等の分子の感度が上がる。上がった感度は、特に、２つの要因：（１）（捕獲剤がポリヌクレオチド、特にＤＮＡである実施形態に対して）基板表面を被覆するためにポリアミンを使用した、高められた捕獲ＤＮＡの荷重の要因、及び、（２）（例えば、バーコードアレイ２０μｍ  ｖｓ  従来のピンスポットアレイ２００μｍ等）従来のピンスポットアレイに対して減少した特色をなすサイズが、拡散隔膜を下げて結合効率を上げる要因と付随し得る。
【０１０１】
一部の実施形態において、捕獲剤は１又は複数の構成成分を含む。特に、一部の実施形態では、全内容を本出願に援用する、米国特許出願第１１／８８８，５０２号に記載の技術（本明細書においてＤＥＡＬとも呼ばれる）の適用において、基板ポリヌクレオチド及びポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質によって捕獲剤を形成することができる。
【０１０２】
従って、「基板ポリヌクレオチド」という表現は、本明細書において使用される場合、その相補的なポリヌクレオチドに結合する能力を維持するように基板に付着されたポリヌクレオチドを意味している。基板ポリヌクレオチドは、特に、ポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質のコード化ポリヌクレオチドと特異的に結合する、その結果、ポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質のコード化ポリヌクレオチドに相補的であるとして規定される配列から成り得る。
【０１０３】
「ポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質」という表現は、ある蛋白質成分を含んだポリヌクレオチド−蛋白質複合体を意味しており、該蛋白質成分に付着される標的及びコード化ポリヌクレオチドに特異的に結合し、その結果、該標的及びコード化ポリヌクレオチドに対して相補的であるとして規定される。一部の実施形態において、蛋白質に付着されたコード化ポリヌクレオチドは、蛋白質特異的である。それらの実施形態を使用して、標的が既知であり、その標的の高感度検出が必要とされる時はいつでも、蛋白質特異的な相互作用を活用して他の蛋白質、サイトカイン、ケモカイン、小分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質等を検出するアッセイを行うことができる。「ポリヌクレオチドによりコード化された抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、蛋白質成分が抗体であるポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質を意味している。
【０１０４】
本明細書に開示されているポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質において、各蛋白質は、所定の標的に特異的に結合し、その結果、該所定の標的に対して相補的であるとして規定され、各コード化ポリヌクレオチドは、所定の基板ポリヌクレオチドに特異的に結合し、その結果、該所定の基板ポリヌクレオチドに対して相補的であるとして規定される。
【０１０５】
蛋白質が抗体である実施形態では、蛋白質−標的の相互作用は、抗体−抗原の相互作用である。蛋白質が抗体以外のものである実施形態では、相互作用は、受容体−リガンド、酵素−基質、及び、本開示を読んだ後に当業者によって同定可能であるさらなる蛋白質−蛋白質の相互作用であり得る。例えば、蛋白質がストレプトアビジンである実施形態では、蛋白質−標的の相互作用は受容体−リガンドの相互作用であり、受容体がストレプトアビジン、リガンドが遊離の又はいかなる生体分子にも付着されたビオチンである。例証的な概略図が図１２に示されている。
【０１０６】
ＤＥＡＬ技術に結合される場合、バイオバーコードアレイ内の所与の空間的位置上に堆積されるポリヌクレオチドの量は、所望の感度、及び、関心のある生体分子を検出することができる濃度範囲を考慮して制御することができる。同じ生体分子を検出するがその検出は異なる濃度範囲であるようそれぞれが最適化された、２つ以上のストライプを同じバイオバーコードアレイ内で使用することによって、蛋白質を検出することができる濃度範囲を従来のアッセイと比較して劇的に広げることができる。
【０１０７】
ＤＥＡＬに結合されたＢｉｏ−Ｂａｒｃｏｄｅアレイで検出可能なＤＮＡの濃度範囲は、２０μｍのバーコードストライプに対して２００μＭの捕獲ＤＮＡの荷重を使用して、１ｐＭ程の低さから１００ｎＭまでであり得る。この技術に適した標的分子には、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ゲノムＤＮＡの断片、ウイルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、及び、合成ポリヌクレオチドが含まれる。
【０１０８】
Ｂｉｏ−ＢａｒｃｏｄｅがＤＥＡＬに結合されたいくつかの実施形態は、蛋白質捕獲剤が直接基板上にパターン形成された実施形態と比較して高い感度を示している。特に、抗体が基板に付着する場合に高い温度の適用を必要とする製造方法を用いて、抗体が直接バーコードアレイにパターン形成される一部の実施形態では、ＤＥＡＬによって検出することができる標的分子は全て原則的に検出可能であるが、乾燥状態での抗体の乏しい安定性により、より低い感度が見られる場合がある。
【０１０９】
ＤＥＡＬ技術に結合される場合、バイオバーコードアレイは、マイクロ流体チップ製造に付随する処理条件に耐える。その結果、Ｂｉｏ  Ｂａｒｃｏｄｅアレイを、コード化ポリヌクレオチドとして使用される一本鎖ＤＮＡでラベルされた捕獲剤として使用される１０個の抗体（１０ＣＡ）を含んだ例証的なアレイを参考にして以下で概説される例証的な手順で例示したように、有利に製造することができる。
【０１１０】
関心のあるバイオマーカーに対する１０個の抗体は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴマーで化学的にラベルされる。相補的なｓｓＤＮＡ’オリゴマーを、表面の領域上に堆積させることができる。ＤＮＡハイブリダイゼーションによって、１０ＣＡはそれらの特定の領域上へ構築される。
【０１１１】
１０ＣＡは、マイクロ流体チャネルを使用してパターン形成される。チャネルの幅及び密度は、パターン形成することができるものによって制限され、すなわち、他の方法を使用した実用的なチャネルの幅及び密度よりも小さなチャネル及び高い密度を容易に達成することができる。一般的に、少なくとも５０マイクロメートルという距離だけ離れた少なくとも１０マイクロメートルという幅のチャネルが、血清から多数の蛋白質を分析する等、典型的なバイオアッセイに対して最も実用的である。これによって、比較的小さなマイクロ流体チャネルで多数の測定を実行することが可能になる。
【０１１２】
１０マイクロメートルよりも有意に小さいスポットサイズも、有意に高いスポット密度のように、この技術を用いて可能である。これらは、循環腫瘍細胞、癌幹細胞、及び他の極めて稀な細胞種由来の蛋白質バイオマーカー及び他の生体分子のパネルを測定するのに必要とされるもの等、より限定された用途に対して有用であり得る。
【０１１３】
バイオバーコードパターン形成されたマイクロ流体チャネルは、アッセイが行われる生物種の扱いに使用されるもの等、他のマイクロ流体チャネルと容易に一列に並べられる。例えば、バイオバーコードマイクロ流体チャネルを並べるために利用される位置合わせマーカーを使用して、生物学的試料を取り扱うためのマイクロ流体チャネルを構築することもできる。これはスタンダードな製造実施技法である。
【０１１４】
そのような小さいスポットの上に堆積することができる１°ＣＡの密度は、スポッティング法を用いて達成することができるものよりも有意に高くあり得る。同じマイクロ流体チャネルを介した１０ＣＡの繰り返しの堆積によって、非常に高い１０ＣＡの表面荷重を達成することができる。逆に、ＤＥＡＬ技術は、１０ＣＡ抗体に対する捕獲剤として一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴマーを利用し、１０ＣＡ抗体は、次に、蛋白質を検出するために利用される。水におけるＤＮＡの高い溶解性のため、バイオバーコードアレイを使用して非常に高いレベルでＤＮＡを荷重することができる。これは、次に、１°抗体ＣＡの非常に広い適用範囲をもたらし得る。
【０１１５】
１０個の捕獲剤のマイクロ流体パターン形成を使用して、多くの数及び種類の捕獲剤を、表面上の特定の微視的な位置上に配置することができる。この方法で、表面のうち、１０個の捕獲剤のパターンが配置された領域から（例えば蛍光等の）ラベリング信号を検出することによって生体分子のパネルが検出される。
【０１１６】
本明細書に開示されているアレイ、基板、方法、及びシステムがマイクロフルイディックスで行われる一部の実施形態では、本明細書に開示されている所定のパターンに沿って分子を付着させる方法を用いて、捕獲剤を前記位置上に付着させることができる。それらの実施形態では、マイクロチャネルにより誘導されたフローパターン方法を使用して、従来のマイクロアレイよりも少なくとも１０倍密度の高いバーコードアレイを製造することができる。一部の実施形態において、この結果は、各チャネルが異なる生体分子の捕獲剤を運ぶ、例えば１３〜２０個の平行なマイクロ流体チャネル等、所望の数のマイクロ流体チャネルを含有した例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）型等の型を作製することによって実現することができる。チャネルの数は、１００個以上の異なる捕獲剤を含むよう容易に拡大させることができる一方、マイクロコンタクトプリンティングにおいて、多数の蛋白質を印刷するために多数の型を並べるという挑戦のため、印刷される蛋白質の数が増えるに従い、パターン形成が急激に困難になるということを当業者は理解するであろう。
【０１１７】
一部の実施形態において、バーコードアレイはＤＥＡＬバーコードアレイである。それらの実施形態の一部において、ポリアミンで被覆されたガラスの表面を使用して、より従来のアミン化された表面よりも有意に高いＤＮＡ荷重を可能にすることができる。幅が２マイクロメートルのＤＮＡ「バー」をパターン形成することに成功した。本明細書に記述されている一部の例証的な実施形態では、蛍光マイクロアレイスキャナーが５μｍの解像度を有しているため、約２０マイクロメートル（μｍ）のチャネル幅を選択した。
【０１１８】
それらの実施形態では、典型的なピンスポットＤＮＡアレイ（すなわち、３００μｍのピッチで１５０μｍのスポット直径）と比較して１０倍のアレイ密度が達成され、所与の試料サイズに対して、本明細書に開示されているマイクロ流体チップ内で測定することができる蛋白質の数を大いに拡大する。特に、一部の実施形態では、１２から２０個，５０個まで、さらには５０個を超える蛋白質が同時に検出される。この特徴は、例えば試料内の生物学的プロファイルだけでなく（例えばカーエンジンの排気由来の）種々の廃ガス又は汚染の検出でもある、多数の標的の検出が望まれる用途に使用することができる。
【０１１９】
蛋白質アッセイを、上記のように１０ＣＡアレイ上で実行することができる。検出されるべき蛋白質によって異なる１０ＣＡ抗体を異なるｓｓＤＮＡオリゴマーでそれぞれラベルすることができるため、構築戦略としてのＤＮＡハイブリダイゼーションの使用によって、同じ微環境内で多数の蛋白質が検出されることが可能になる。さらに、構築戦略としてのＤＮＡハイブリダイゼーションの使用によって、製造工程の初期の段階におけるｓｓＤＮＡを含んだ基板の調製が可能になるため、ｓｓＤＮＡを含んだ基板を、処理、乾燥、加熱、輸送して、相補的な捕獲剤も含んだすぐ使用できるシステムで最終的なユーザーに提供することができる。蛋白質の検出に対するバーコードアレイのパターン形成技術及びＤＥＡＬバーコードチップを記述する実施例１から７及び関連する図において、例証的な用途が記述されている。
【０１２０】
本明細書に開示されているアレイは、マイクロ流体チャネルを使用した、例えばＤＮＡ、蛋白質、血清、及び組織ライセート等の種々の生物学的材料のパターン形成を含み得るということを当業者は理解するであろう。癌等のヒト疾患の診療所での診断における高密度且つ多重で感度のよいＤＮＡ及び蛋白質の検出のための、並びに、ハイスループット薬物スクリーニングのためのバイオチップ及び統合バイオセンシング装置の製造に、Ｂｉｏ  Ｂａｒ−ｃｏｄｅ  Ａｒｒａｙ方法を適用することができる。一部の実施形態において、パターン形成は、新しく、さらに簡単で信頼のできる方法、すなわち、小さなサイズで高密度のアレイを作製するために、マイクロチャネルにより誘導された、多数の異なる生物種の表面パターン形成に基づいている。
【０１２１】
本明細書に開示されているシステムは、アレイ又はキットの形状で提供することができる。「マイクロアレイ」と呼ばれる場合があるアレイは、処理可能な領域のいかなる１、２、又は３次元の配置も含み、前記処理可能な領域は、該領域に関連する特定な分子を持つ。通常、マイクロアレイに対して特色をなすサイズはマイクロメートルである。
【０１２２】
キットにおいて、種々の構成要素を独立してキットに含ませることができる。一部の実施形態では、検出を行うのに適したラベル及び／又は他の試薬と共にパターン形成された基板を提供することができる。一部の実施形態では、パターンの検出に適した装置も含むことができる。
【０１２３】
パターン形成された基板がＤＥＡＬ技術と統合された実施形態において、システムは、キットに独立して含まれたポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質及びパターン形成された基板を含み得る。キットに含まれた分子（例えば、ポリヌクレオチドによりコード化される蛋白質）は、特に、１又は複数の組成物に含まれ、該組成物の各分子は適した運搬キャリア又は補助剤と共に含まれ得る。
【０１２４】
当該システムに提供される基板は、所望のパターンに従い、基板ポリヌクレオチド又は他の分子を付着させることができる。一部の実施形態において、パターン形成されることになる基板ポリヌクレオチド又は材料は、キットの追加の要素としてさらに提供され得る。追加の要素は、ラベルされたポリヌクレオチド、ラベルされた抗体、ラベル、マイクロ流体チップ、参照標準、及び、本開示を読んだ後に当業者によって同定可能なさらなる要素を含み得る。特に、本明細書に開示された方法を行うために、適した指示及び他の必要な試薬と共に、前記キットの要素を提供することができる。キットは、通常、別々の容器に組成物を含んでいる。アッセイを実行するための、例えば、紙面、又は、テープ若しくはＣＤ−ＲＯＭ等の電子支援上の書面又は音声による指示は、通常、キットに含まれる。キットは、使用される特定の方法に応じて、他のパッケージされた試薬及び材料（すなわち、洗浄バッファ等）も含むことができる。
【０１２５】
パターン形成された材料が生物学的試料に限定されないさらなる用途が、当業者によって同定されるであろう。特に、一部の実施形態では、それだけに限定されないが、生物学的材料を担持する製品を含み得る小さなサイズの製品に対する磁気ＩＤに、パターン形成された材料を使用することができる。例えば、磁気ＩＤバーは、製品の追跡において広く使用されてきた。しかし、従来の磁気ＩＤパッドは大きすぎて、小さなカメラＣＭＯＳチップ、ごく小さな宝石、及び小さな人工品等の小さなサイズの対象に使用することができない。実施例１５において、バーコードアレイ、基板、方法、及びシステムに対する実施形態が例証されている。
【０１２６】
当該組成物の適したキャリア剤又は補助剤の同定、並びに、キットの一般的な製造及びパッケージングに関するさらなる詳細を、本開示を読んだ当業者は同定することができる。
【０１２７】
本明細書に開示された方法及びシステムは、例示によって提供され、本開示の範囲を限定するよう意図されない以下の実施例においてさらに説明される。
【実施例１】
【０１２８】
統合されたＤＥＡＬ技術を有したバーコードチップの作製及び使用
図１３のパネルＡに概略的に例示された手順に従い、バーコードチップを作製した。
【０１２９】
シリコンエラストマー（ＰＤＭＳ）スタンプを、リソグラフィーでパターン形成したシリコンマスターから成形し、次に、ポリアミンで被覆されたガラススライド上に熱接着させた。そのガラススライド上で、異なる生体分子液が平行なマイクロチャネル内に流し込まれる。前記液が完全に蒸発すると、ＰＤＭＳスタンプは剥がされ、ガラススライドは、強固なＢｉｏ−Ｂａｒ−ｃｏｄｅアレイを作製するよう焼き固められる。バーコードストライプを、２〜２０μｍの幅及び間隔で作製し、従来のマイクロアレイと比較してアレイの密度を上げることができる。原則として、この技術を使用してパターン形成することができるＤＮＡのような一次分子の数に対する制限はなく、システム生物学及び疾患診断学に対する大規模で高密度の生体分子アレイの作製を確かに可能にする。
【０１３０】
特に、それぞれのチャネルがＤＥＡＬコードとして異なるＤＮＡオリゴマーを運搬する、１３〜２０個の平行なマイクロ流体チャネルを含有したポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の骨組をソフトリソグラフィによって作製した。ＰＤＭＳの骨組を、８０℃で２時間の熱処理を介してポリリシンで被覆されたガラススライドに結合させた。ポリアミン表面は、従来のアミン化された表面よりも有意に高いＤＮＡ荷重を可能にする。幅２マイクロメートルのＤＮＡ「バー」を、この技術を使用してパターン形成するのに成功した。本願においては、用途によって使用される蛍光マイクロアレイスキャナーは５μｍの解像度を有するため、２０マイクロメートル（μｍ）のチャネル幅を選択した。それにもかかわらず、本発明の設計は、すでに、ピンスポットによって作製された従来のマイクロアレイよりも１０倍分だけ濃い密度のＤＮＡバーコードアレイを生じた。１×ＰＢＳで調製したコード化ＤＮＡ液（癌血清検査に対するＡ−Ｍ及びフィンガープリック血液検査に対するＡＡ−ＨＨ）を個々のチャネル内に流し込み、次に、完全に蒸発させた。最後に、ＰＤＭＳを剥がし、ＤＮＡバーコードアレイを有した基板を、８０℃で２〜４時間焼き固めた。ＤＮＡ液の濃度は、ｈＣＧ検査以外の全ての実験において１００μＭまでであり、６×１０１３分子／ｃｍ２という高い荷重をもたらした（５０％を基板上で回収したと仮定する）。
【０１３１】
このように作製したアレイを、図１３のパネルＢにおいて例示されているように、バイオアッセイに使用した。統合マイクロ流体装置をバイオバーコードチップマイクロ流体チャネル上に配置した。バイオバーコードパターンをマイクロ流体システムと統合させるための細かな調整は必要なかった。患者の血清、組織溶解物等の異なる試料を、各マイクロ流体チャネルにおいてそれぞれアッセイすることができる。図１３のパネルＢにおいて描写されたアレイは、最小限の試料消費での高処理のバイオ検出を可能にする。
【０１３２】
上記の実験は、選択する実験計画に従い、感度及び検出可能な標的の範囲を調節するよう修正することができる。可能な修正は、１３個のチャネルによるパターン形成チップにおけるマスク設計の概略図を示した図８に例示されており、Ａ−Ｍというアルファベットは、異なるＤＮＡ分子を流し込むためのチャネルを示している。さらなる修正は、例えば、以下の実施例２において例証される手順を用いて、前記アレイにポリアミンによる表面修正を受けさせて、ＤＮＡ荷重の増加を可能にすることを含む。この修正によって、以下の実施例３の例証的な手順において説明されるように、感度が上がり、ダイナミックレンジが広がる。
【実施例２】
【０１３３】
上げられたＤＮＡ荷重を有するＤＥＡＬバーコードチップの作製
ＤＥＡＬバーコードアレイのマイクロチャネルにより誘導されたフローパターン形成の間、ポリ−Ｌ−リシン（ポリアミン）による処理によってガラスの表面を修飾し、ＤＮＡ吸着のための３次元マトリックスを生じて、ＤＮＡ荷重の量を著しく高めた。
【０１３４】
図１４に例示されている結果は、ＤＥＡＬ技術を用いて行われるアッセイに対するポリリシン被覆の効果を示している。特に、図１４は、製造されたバーコードアレイを使用した蛋白質の標的の検出を示し、一次ＤＮＡ分子の低荷重及び高荷重、並びに、蛋白質の検出において結果として生じる差異を示している。パネル（ａ）の概略図に示されているように、ＰＤＭＳ支持体のポリリシン被覆によって、ＤＮＡオリゴマーコードの荷重が上がる。
【０１３５】
特に、本願においては、ＤＮＡ荷重の密度は、アミノシランにより被覆されたガラススライド上の典型的な荷重密度よりも十倍高い６×１０１３分子／ｃｍ２であるよう見積もられる。結果として、蛋白質の検出感度を１０倍改善し、小分子アミン（すなわち、アミノ−プロピル−トリエトキシシラン、ＡＰＴＥＳ）により官能性を持たせたガラススライドに対する２〜３０倍と比較して、ダイナミックレンジを４０倍まで広げた。この比較分析の例証的な結果は、図１４のパネル（ｂ）に例示されており、アミノシラン及びポリリシンで被覆された基板を使用した３種類のヒトサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２）の検出が、それぞれ示されている。
【実施例３】
【０１３６】
ＥＬＩＳＡ様感度を有したバーコードチップ
ＤＥＡＬ技術と統合されたバーコードチップは多重化された蛋白質測定に対する高密度アレイを与えるということが、本出願人により行われた一連の実験によって示された。さらに、ＤＥＡＬバーコードチップは、従来のピンスポットマイクロアレイと比較して、感度の著しい改善も実証する。
【０１３７】
特に、同一条件下で３種類のサイトカインに対してＤＥＡＬアッセイを実行させることによって、並列比較調査を行った。マイクロチャネルによって誘導されたフローパターン形成法を使用して、ガラススライドをＤＮＡオリゴマーＡ、Ｂ、Ｃ、及び、ブランク対照Ｏでパターン形成した。各バーは、幅２０μｍであった。ＤＮＡ溶液は、全て５０〜１００μＭであった。ピンスポットアレイは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙにて１００μＭの濃度で印刷された。典型的なスポットサイズは１５０〜２００μｍであった。オリゴマーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦに対応する６つのスポットのセットを印刷した。ポリリシンにより被覆されたスライドをどちらのタイプのアレイにも使用した。
【０１３８】
ＤＥＡＬアッセイに先立ち、捕獲抗体をＤＮＡオリゴマーコードに、以下のように、Ａ’をＩＦＮ−γに、Ｂ’をＴＮＦ−αに、及び、Ｃ’をＩＬ−２に結合させた。蛋白質の標準物質を、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ液において、１ｆＭから１ｎＭに及ぶ濃度で希釈した。各ステップ（遮断、結合ハイブリダイゼーション、試料結合、検出−抗体結合、及び、蛍光−分子結合）に対するインキュベーション時間は３０分であった。バーの幅は２０μｍであった。
【０１３９】
結果は図１５に例示されており、ＤＥＡＬバーコードアレイに対して実行されたイムノアッセイが示されている。特に、パネル（ａ）に例示されているように、３種類のヒトサイトカイン（Ａ：ＩＦＮ−γ、Ｂ：ＴＮＦ−α、Ｃ：ＩＬ−２、Ｏ：負の対照）の検出は濃度依存的であると証明した。パネル（ａ）の例示において、バーコードアレイはＡＢＣＯＡＢＣＯＡＢＣＯＡという配列を有している（本明細書において、「０」は、１°ＤＮＡをそのようなマイクロチャネルに流し込まなかったことを意味している）。このデータは、１ｐＭ程の低い濃度で蛋白質を検出することができるということを示している。蛍光強度の定量化がＴＮＦ−α濃度に対して表されているパネル（ｂ）の図表によって、濃度依存は表されている。パネル（ａ）において表されている１ｐＭの蛋白質試料で得られた結果に対するスペクトル線の線プロファイルが、パネル（ｃ）の図表に示されている。
【０１４０】
さらなる比較として、（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社からの抗体対及び蛋白質の標準物質を使用した）ＥＬＩＳＡアッセイで得られた感度は、ＴＮＦ−αに対して１０ｐｇ／ｍＬ（０．８ｐＭ）までであるよう予測される。従って、それらの実験によって、ＤＥＡＬバーコードアレイは蛋白質測定に対する高程度の多重化とＥＬＩＳＡ様感度を組み合わせることが示される。
【０１４１】
さらに、以下の比較による実施例６でさらに例示されるパネル（ｄ）の従来のピンスポット法を使用して同じ条件の下行われた比較アッセイに例示されているように、ＤＥＡＬバーコードアレイのＴＮＦ−α検出感度はより高く、予測した感度限界は、従来のマイクロアレイに対する１０〜１００ｐＭと比較して、１ｐＭよりも低かった。これらの結果によって、従来のアッセイと比較して、バーコードチップが感度をはるかに高め、且つ、蛋白質測定に対する直線範囲を広げたことが確証された。
【実施例４】
【０１４２】
ＤＮＡ検出に対するバーコードアレイの使用
ＤＮＡの検出に対するバイオアッセイにおいてバーコードアレイを使用した。特に、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を基板上でパターン形成し、試料内の相補的なポリヌクレオチドを検出するために使用した。パターン形成されたＤＮＡオリゴマーがその相補鎖に結合するために高い親和性を示すことが、図１６に例示されている結果によって示されている。
【０１４３】
特に、図１６のパネルＡにおいては、Ａ’鎖のそのＡｌｅｘａ５３２でラベルされた相補鎖に対するハイブリダイゼーションの前及び後に撮られた蛍光画像が報告されている。３つの異なるＤＮＡオリゴマーの鎖、非蛍光Ａ、Ａｌｅｘａ５３２でラベルされたＢ（赤）、及び、Ａｌｅｘａ６３５でラベルされたもの（深緑）をポリＬ−リシンスライド上でフローパターン形成し、本発明のバーコードチップを形成した。「０」は、ブランク対照のためのパターン形成されていないチャネルを意味している。Ａｌｅｘａ５３２でラベルされたＡ’分子（その濃度は１ナノモルであり、これらのＤＮＡ分子は表面結合したＡ鎖に相補的である）を適用した後、鮮明ではっきりとした緑色の蛍光バンドが現れ、非常に効果的で特異的なＡ’ＤＮＡ分子の感知を示している。
【０１４４】
バーコードアレイのセット全体に渡った蛍光強度におけるスペクトル線の線プロファイルが、図１６のパネルＢに示されている。図１６の例示において、Ａ’は、試料ｂ内に添加して星印により示された位置における蛍光の変化によって検出した標的ポリヌクレオチドである。
【実施例５】
【０１４５】
蛋白質検出に対するバーコードアレイの使用
本明細書において開示されるように組み立てたバーコードアレイを、本出願人によって開発された実験法に従い、蛋白質検出のために使用した。
【０１４６】
特に、本出願人は、ＤＥＡＬバーコードアレイを使用した、１２個の血漿蛋白質の多重化されたアッセイを開発した。第１の検査において、各抗原と該抗原に特異的ではないＤＥＡＬのストライプとの交差反応性のレベルをアッセイした。全１２個の抗原に対するＤＮＡコード化捕獲抗体及びビオチン化検出抗体を例の通り使用したが、別の抗原（１０ｎＭ）を各アッセイレーンに添加した。Ｃｙ５−ストレプトアビジン（赤い蛍光タグ）を例の通り流し、分析物捕獲の程度を可視化させた。
【０１４７】
参照マーク（ＤＮＡ鎖Ｍ）を、蛍光緑色のＣｙ３−Ｍ’ＤＮＡ分子を用いて全てのレーンにおいて可視化させた。１２個の蛋白質はわずかな程度のクロストークを示した。第２の検査において、使用した特定の装置によって課された制限を考慮して、ＤＥＡＬバーコードチップ上で全１２個の蛋白質の段階希釈に対してアッセイを行い、それぞれ最大１２個の実行されるべき並列アッセイを可能にした。この設定に対して選択された特定の実験法では、クロストークの確認に対して６つのレーンを使用し、ダイナミックレンジの調査に対して６つのレーンを使用した。
【０１４８】
結果は、全１２個の蛋白質に対する交差反応性のチェック及び希釈曲線を示した図１７に例示されている。特に、パネル（ａ）の１つの装置由来のＤＥＡＬバーコード画像及び線プロファイルは、全１２個の蛋白質に対して、最小限のクロストーク及び１ｎＭから１ｐＭに及ぶ一連の標準抗原を示している。パネル（ａ）に示された実験では、２個の蛋白質を各アッセイレーンにおいて組み合わせた（図１７パネル（ａ））。
【０１４９】
１ｎＭから１ｐＭまで下がる濃度範囲（ＰＳＡ及びＴＧＦ−ｂ：５ｎＭから５ｐＭは除く）に渡り、同じチップ上で全蛋白質をアッセイし、全１２個の蛋白質に対する希釈曲線が示される図１７のパネル（ｂ）に例示されるように、全１２個の抗原に対して、蛍光信号対濃度を定量化した。
【０１５０】
この実験では、定量比較のために、同じレーザ力（６３５ｎｍに対して５５、５３２ｎｍに対して１５）、光利得（６３５ｎｍに対して５００、５３２ｎｍに対して４００）、及び、明度／コントラスト（９２／９０）で、Ｇｅｎｅｐｉｘスキャナを使用して全ての濃度を画像化した。明らかに、見積もった感度は、（例えばＩＬ−１β及びＩＬ−１２等の）０．３ｐＭまでから３０ｐＭ（ＴＧＦ−β）まで非常に変動し、それは使用される抗体に大いに依存している。例えば、ＴＧＦ−ｂ抗体対は、比較的低い結合親和性及びＥＬＩＳＡにおいて乏しい検出限界を有している（仕様書によると、大部分の他のサイトカインに対する５〜１０ｐｇ／ｍＬと比較して、７０ｐｇ／ｍＬまでである）。予想通り、これは、ＤＥＡＬアッセイの乏しい性能を向上させた。これらの曲線は、抗原の濃度に対するＤＥＡＬ信号の動的応答を明らかに示しているけれども、ＥＬＩＳＡ等の大規模なイムノアッセイと比較して、変動が非常に大きいまま残る。
【０１５１】
検出プローブは蛍光色素に限定されないが、捕獲した標的からの信号を光学、磁気、又は電気読み取りに変換する能力を持ついかなる他の物でもあり得る。
【０１５２】
特に、プローブとしての金ナノ粒子の使用によって別の検出方法が提供される。金ナノ粒子を使用して行った検出の例証的な説明は図１８に示され、プローブとして金ナノ粒子を使用した標的蛋白質ＩＬ−１βの検出が示されている。
【０１５３】
特に、図１８の例において、４０ｎｍの金ナノ粒子を使用して、ヒト血清から関心のある捕獲した蛋白質（例えばＩＬ−１β）を可視化させた。
【０１５４】
さらなるラベルの例及び検出方法が、全内容を本願に援用する、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ”と題された、２００７年８月１日に出願した米国特許出願第１１／８８８，５０２において例示されている。
【実施例６】
【０１５５】
蛋白質検出に対する、バーコードアレイ及び従来のマイクロアレイの使用に関係した比較例
実施例３のバーコードアレイ、及び、ピンスポット技術を使用して印刷された従来のマイクロアレイにおいて比較実験を行った。図１５パネルｄに例示された結果は、どれ程明瞭に、従来のマイクロアレイがＤＥＡＬバーコードチップよりも１〜２０倍低い感度を得ただけかを示している。
【０１５６】
実施例３で例示された実験条件の下、バーコードアレイ及びピンスポットマイクロアレイ上で、同一の条件下で３種類のサイトカインに対してＤＥＡＬアッセイを実行することによって、並列比較調査を行った。ピンスポットアレイは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙにて１００μＭの濃度で印刷された。典型的なスポットサイズは、１５０〜２００μｍであった。オリゴマーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦに対応する６つのスポットのセットを印刷した。ポリ−１−リシンで被覆されたスライドを、どちらのタイプのアレイにも使用した。さらなる詳細は実施例３において例示されている。
【０１５７】
バーコードアレイは従来のアレイよりも高い感度を有した優れた性能を示すということが、図１５パネルｅにおいて例示された結果によって示されている。
【０１５８】
特に、ＤＥＡＬバーコードアレイの検出感度がより高く、従来のマイクロアレイに対する１０〜１００ｐＭと比較して、予測された感度限界は１ｐＭよりも低かったことをこれらの結果は実証している（図１５パネルｅ）。
【０１５９】
図１５に示された実験に使用したバーコードプラットフォームと従来のピンスポットプラットフォームにおける唯一の相違点はそのサイズである。バーコードアレイは２０μｍという線幅を有するが、従来のアレイにおけるスポットサイズは１５０μｍを超える。ＤＥＡＬバーコードアッセイにおける改善された感度に対する機構は、完全に理解されたわけではない。限定されるよう意図しない可能な説明は、改善された感度は減少した運動バリア及び短縮された拡散時間のおかげであり得るということである。これらの結果は、より小さいスポットサイズを有したＤＮＡマイクロアレイが増加した感度でＤＮＡを検出することができたと実証した最近の報告と一致している。
【実施例７】
【０１６０】
多数の異なる標的の検出に対するバーコードアレイの使用
図１９に例示されているように、ＤＥＡＬ技術と統合させたバーコードアレイを使用して多数の蛋白質を検出した。特に、図１９は、５つの異なる蛋白質の検出に対するＤＥＡＬバーコードイムノアッセイの使用を示している。前記蛋白質は、従来のスポットマイクロアレイを使用した１つの蛋白質の検出に必要とされる領域よりも小さい領域内で検出される。
【０１６１】
図１９に例示された結果は、特に、ＤＥＡＬバイオバーコードを使用して同時に検出された多数の蛋白質を示している。パネルＡは、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、細胞内シグナル分子、及び、癌マーカーを含めた種々の蛋白質の同時検出に対するＤＥＡＬバーコードアレイの概略図を示している。パネルＢは、５つの蛋白質：ｈＣＧ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−ａ、及びＩＬ−１βを加えたヒト参照血清から検出された、同時の５つの蛋白質における多パラメータＤＥＡＬバーコードイムノアッセイを示している。原則として、バーコードアレイは、単にフローパターン形成に使用されるマイクロチャネルの数を増やすことによって、はるかに多い数の蛋白質における高密度のアッセイを提供することができる。
【０１６２】
多数の標的の検出を、患者の血清測定に使用したマイクロ流体装置を示した図２０の概略図に従って行った。特に、図２０のパネルＡは、バーコードアレイのガラススライド上に結合したマイクロ流体装置の操作の概略を示している。
【０１６３】
図２０のパネルＢは、分子検出のためにマイクロ流体装置内に流体を導入する方法、特に、プラスチックの管及び金属ピンを使用して、外側にある試料荷重／注入システムをマイクロ流体装置に連結させる方法を例示した概略図を示している。
【実施例８】
【０１６４】
広範なダイナミック濃度レンジに渡って蛋白質を検出するためのバーコードアレイの使用
図２１に例示されているように、ＤＥＡＬ技術と統合させたバイオバーコードを使用してバイオマーカーを検出した。特に、図２１は、ＤＥＡＬ技術と共に利用された場合に広げられたバーコードアレイのダイナミックレンジを例示している。データは、４０倍を超える広大なダイナミックレンジをカバーすることができるＤＥＡＬバーコードイムノアッセイを使用した、ヒト血清内の、妊娠検査のマーカーであるｈＣＧの測定を示している。
【０１６５】
特に、１つのＤＥＡＬベースのバイオバーコードから検出することができる拡大された濃度の範囲がｈＣＧの検出を実証したということが、図２１に例示された結果によって示されている。ｈＣＧは妊娠検査用マーカーであるだけでなく、血清癌マーカーでもある。最初のフローパターン形成ステップの間に１°抗体捕獲剤に結合する一次ＤＮＡオリゴマーの濃度を変えることによって、１つのバーコードセットが、１つのステップにおいて２５０００ｍＩＵ／ｍＬから０．２５ｍＩＵ／ｍＬに及ぶｈＣＧ濃度（図示せず）を識別することができる。
【実施例９】
【０１６６】
生物学的プロファイルを検出するバーコードアレイ：ある期間に及ぶヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の検出
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）により提供された、一連の標準的なヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を加えたヒト血清試料に対して検査を行った。ｈＣＧは、妊娠検査に対して広く使用されており、妊娠性トロホブラスト腫瘍、並びに、卵巣及び精巣の胚細胞癌に対するバイオマーカーとしても役に立っている。
【０１６７】
これらのｈＣＧアッセイからの結果は図２２に示されており、全内容を本願に援用する、２００８年７月１６日に出願した“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”と題された米国出願（Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｐ２３５−ＵＳ）に記載されているように製造したバーコードアレイを含めた、統合されたプラットフォーム上のマイクロ流体ＤＥＡＬバーコードチップを使用した、血清に加えられたヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の測定を例示している。
【０１６８】
図２２のパネルａでは、標準的なｈＣＧ試料及び２つの未知の試料の測定に使用したＤＥＡＬバーコードの蛍光画像が示されている。ｈＣＧを測定するために使用されるバーを、異なる濃度にてＤＮＡ鎖Ａでパターン形成した。鎖Ｂによってコード化されるＴＮＦ−αを負の対照として利用した。ＲＥＦで示されたレーンは参照マーカーを表し、その他のレーンは、２μＭから２００μＭまで変えられる濃度でＤＮＡを溶液からパターン形成したｈＣＧ検査結果を示している。ＴＮＦ−αを使用した負の対照も含めた。
【０１６９】
１ｍＩＵ／ｍＬまでではあるが、より広い検出可能な濃度範囲（〜１０５）を有したＥＬＩＳＡ様感度を、蛍光強度を定量化することによって実証した。さらに、光子蓄積なしでも、大きな範囲に渡る分析物濃度は、完全なバーコードのパターン認識を介して眼によって容易に見積もることができる（実施例５において表示したものも参照）。
【０１７０】
異なるＤＮＡ荷重で得られる蛍光信号の定量化も、図２２のパネル（ｂ）において示したように行った。そのようなバーコードアレイにおいて、高いＤＮＡ荷重を有したバーは、低い分析物濃度で優れた感度を生じたけれども、低いＤＮＡ荷重を有したバーを使用して、高い分析物濃度を有した試料を容易に区別した。２つの未知の試料もアッセイし、その結果は、ＮＣＩ実験室で実行されたＥＬＩＳＡ検査とよく一致している。
【０１７１】
妊娠中ｈＣＧレベルが追跡され、血液中の濃度が、妊娠第１週において５ｍＩＵ／ｍＬまでから、１０週で２×１０５ｍＩＵ／ｍＬまで増加することに注目した。本明細書に記載の実験に使用されるマイクロ流体バーコードアレイは、そのような広範囲の生理学的なｈＣＧの範囲を正確にカバーすることができる。
【実施例１０】
【０１７２】
生物学的プロファイルを検出するためのバーコードアレイ：癌患者における蛋白質プロファイリング
図２３に例示されているように、バーコードアレイを使用して生物学的プロファイルを検出した。特に、図２３は、ヒト血清蛋白質プロファイリングに対する統合されたマイクロ流体ＤＥＡＬバーコード装置の使用を示している。１２人の癌患者由来の血清試料を、そのようなプロトタイプの臨床検査プラットフォーム（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｃｌｉｎｉｃ  ｔｅｓｔ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）において測定した。
【０１７３】
この実験から得た蛋白質プロファイルは、個々の患者において独特なパターンを明示しており、血清ベースの癌診断及び個別化医療に対するＤＥＡＬバーコードアッセイの効果を示唆している。この結果は、診断学、特に、ヒト疾患診断学のための、バーコード装置、特に、統合されたＤＥＡＬバーコード装置を使用するための優れた指示を表示している。
【０１７４】
特に、統合されたＤＥＡＬバイオバーコード装置を、癌患者の血清からの迅速で感度の高いハイスループット蛋白質測定に使用することができると、図２３の結果は示している。パネルＡは統合マイクロ流体装置の設計を例示しており、前記装置は、高度自動化な様式で同時に多数の血清アッセイを行うことができる。青色は、全試薬及び試料を送達するためのマイクロ流体チャネルを示している。深紅色は、圧力による発動値に対する制御チャネルを示しており、該制御チャネルはマイクロ流体チャネルに交差する。オーバーレイは、Ｃｙ５蛍光プローブにより可視化したＤＥＡＬバーコードチップの画像を表している。
【０１７５】
１１の癌患者血清試料及び参照血清由来の１２個の蛋白質の測定がパネルＢに例示されている。数字は、患者試料からの蛋白質検出に使用された各個々のレーンを示している。
【０１７６】
１２人の異なる患者（ＳＩ−Ｓ１２）由来の血清試料に存在する１２個の蛋白質レベルの統計がパネルＣに示されており、そのうち、Ｓ１−５は乳癌患者であり、Ｓ６−Ｓ１１は前立腺癌患者である。各患者は独特な血清蛋白質のパターンを表示しており、それは、独特な癌の分子起源に付随していると考えられる。
【０１７７】
癌患者の詳述及び病歴を列挙した図表がパネルＤに示されている。病歴、及び、ＤＥＡＬバーコードアッセイから測定した血清蛋白質プロファイルを比較することによって、いくつかの独特な特徴を見ることができる。
【実施例１１】
【０１７８】
生物学的プロファイルを検出するためのバーコードアレイ：癌患者におけるさらなる蛋白質プロファイリング
臨床血液試料に対するバーコードアレイの有用性及び再現性をさらに評価するために、２４人の癌患者からの少量の血清由来の１２個の蛋白質のパネルをＤＥＡＬバーコードマイクロ流体装置において測定した。このパネル中の蛋白質は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、並びに、種々の白血球によって分泌された１１個の蛋白質を含んだ。各血清試料に対して、各バーコードを何度も測定した。
【０１７９】
１１人の乳癌患者（全員女性）及び１１人の前立腺癌患者（全員男性）由来の貯蔵血清試料を、Ａｓｔｅｒａｎｄ社から取得した。２つの未知の試料を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から取得した。２２人の患者のうち１９人が白人系であり、残りの３人が、アジア系、ヒスパニック系、及び、アフリカ系アメリカ人であった。病歴は、捕捉試料に要約されている。
【０１８０】
ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ  Ｃｏｎｔａｃｔ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｌａｎｃｅｔｓを使用してフィンガープリックを行った。８０μＬの２５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で予め充填したＳＡＦＥ−Ｔ−ＦＩＬＬ毛細血管採血用チューブ（ＲＡＭ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて血液を採取した。健常人から１０μＬボリュームの新鮮なヒトの血液を、このＥＤＴＡで被覆した毛細血管において採取し、チューブ内に分注し、さらに、何度かひっくり返すことによって迅速に混ぜ合わせた。４０μＬの２５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液と４０μＬの組換え溶液を混ぜ合わせ、採血用チューブ内に予め添加したこと以外、類似の手段で、添加される血液試料を調製した。次に、２μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加し、全ＥＤＴＡ濃度を２５ｍＭまでもっていった。
【０１８１】
全内容を本願に援用する、２００８年７月１６日に出願した“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”と題された米国出願（Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｐ２３５−ＵＳ）に広範囲に記載された、統合されたプラットフォームを使用して、血液分離及び血漿蛋白質測定の遂行を行った。
【０１８２】
統合されたプラットフォームを、第一に、バッファ液で３０〜６０分間遮断した。調製したバッファ液は、カルシウム／マグネシウム塩のない１５０ｍＭ  １×ＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中１％ｗ／ｖのウシ血清アルブミン画分Ｖ（Ｓｉｇｍａ社）であった。次に、ＤＮＡ−抗体結合（５０〜１００ｎＭまで）を血漿アッセイチャネルを通して３０〜４５分間流した。このステップによって、ＤＮＡアレイを捕獲−抗体アレイに変換した。バッファ液をチャネルを通して流すことによって、非結合の複合物を洗い流した。このステップで、血液検査に対する統合されたプラットフォームの用意ができた。上記のように調製した２つの血液試料を、１分の採血内で統合されたプラットフォームに流し込んだ。統合されたプラットフォームは血漿を全血から急速に分離し、ＤＥＡＬバーコードアレイを配置したアッセイ領域において関心のある血漿蛋白質を捕獲した。フィンガープリックから血漿蛋白質捕獲までのこの全手順には、１０分未満の時間がかかった。癌患者血清実験において、いかなる前処理もなく（すなわち、精製も希釈もなく）、受け入れたままの血清試料を統合されたプラットフォーム内に流し込んだ。その後、蛋白質パネル全体に対するビオチンでラベルされた検出用抗体の混合物（５０〜１００ｎＭまで）と蛍光Ｃｙ５−ストレプトアビジン複合体（１００ｎＭまで）とを、統合されたプラットフォーム内に順次流し込み、ＤＥＡＬイムノアッセイを完成させた。バッファ液を１０分間流すことによって、非結合の蛍光プローブをすすいだ。ついに、ＰＤＭＳチップをガラススライドから取り除いた。１／２×ＰＢＳ溶液及び脱イオン水においてスライドを直ちにすすぎ、次に、窒素ガンで乾燥させた。最後に、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｇｅｎｅｐｉｘ  Ｓｃａｎｎｅｒによって、ＤＥＡＬバーコードスライドをスキャンした。
【０１８３】
２つのチップを使用して２４人の癌患者由来の血清試料をアッセイし、各チップは平行に操作した１２個の別のアッセイ単位を含有した。血清の統計学的サンプリングために、全てのアッセイ単位において、５０セットのＤＥＡＬバーコードを検出チャネルに配置した。全ての実験において、２５μＬの患者血清又は１つのバーコードあたり５００ナノリットルを各アッセイに使用した。白血球により分泌された蛋白質は、炎症性分子及びサイトカインを含んだ。これらの蛋白質は、細胞内通信のために免疫細胞によって利用され、腫瘍微環境において、並びに、腫瘍進行及び転移において重要な関わり合いを有している。このように、このパネルは、癌に対する情報も免疫系に対する情報も提供する。
【０１８４】
実験を少なくとも２〜３回繰り返した。全ての統合されたプラットフォームにおいて、多数のセットのバーコードアレイを１つのアッセイチャネルにおいてパターン形成し、同時の並列測定を可能にした。例えば、癌患者の血清試料をアッセイすることにおいて５０セットのバーコードを使用し、各バーコードは完全な蛋白質のパネルを検出した。Ｇｅｎｅｐｉｘソフトウェア又はｉｍａｇｅＪ（ＮＩＨ社）を使用して、蛍光信号の定量化を行った。癌患者データの処理において、各チャネルに対するバックグラウンド強度を個々に同定し、次に、２０任意単位という一般的なバックグラウンドレベルに再び割り当てた。所与のチャネル内の全ての「バー」の強度は、そのチャネルのバックグラウンドに規準化される。従って、図１０におけるデータは、バーの蛍光強度とその独自のチャネルのバックグラウンドとの差に、共通のバックグラウンドレベル２０を足したものに一致している。この処理によって、非特異的なバックグラウンド信号からの干渉が最小限にされるが、高いバックグラウンドを有した正の結果（例えばＢ１０）と本当の負の結果（例えばＢ９及びＢ１１）との間でその信号を識別不能にしてしまう。
【０１８５】
結果は図２４及び２５に例示されており、癌患者の関連プロファイル（図２４）をその病歴（図２５）と共に示している。
【０１８６】
特に、２４人の患者の試料から得た代表バーコードをそれぞれが４つのセット示した蛍光画像が、図２４に示されている。測定した蛋白質は、同様に図２５に詳しく示された癌マーカーＰＳＡ及び１１個のサイトカインを含んでいる。バーコード画像パネルにおいて、左側の２つのコラムを同じチップ上で行い、同時に、右側の２つのコラムはその他のチップからのものであった。試料をアッセイにおいて無作為に選び、任意の偏りを最小限にした。Ｂ０１〜Ｂ１１は、乳癌患者由来の１１個の試料を示し、Ｐ０１〜Ｐ１１は、前立腺癌患者由来の試料を示し、Ｓ０１とＳ０２は異なる供給者由来の未知の試料である。
【０１８７】
全ての患者に対する病歴が図２４に要約されており、癌患者の病歴の簡単な要約を示している。２つの未知の試料は表には含まれていない。
【０１８８】
患者のより詳細な病歴が以下の表１に含まれている。
【０１８９】
【表１】
2010533871.tif 000003
高い信号雑音比で多くの蛋白質を検出するのに成功し、バーコードの特徴は、患者間で特有であった。大部分のアッセイは、比較的低い蛍光バックグラウンドを示している。しかし、Ｐ０５、Ｐ０４、Ｐ１０、及びＢ１０に対するアッセイは、高い干渉バックグラウンドによって特徴づけられた。これらの高いバックグラウンドのアッセイは全て、ヘビースモーカー（１１〜２０本のタバコ／１日まで）であった患者と相関し、ヘビースモーカー由来の血清試料１つのみが、高いバックグラウンドを示さなかった（Ｐ０６）。この高いバックグラウンド蛍光の理由は、依然として不明のままである。あり得る原因は、肺内で形成される蛍光一酸化炭素ヘモグロビンの増加した血液量である。このスモーカーの同定は、ＩＢＢＣから予想外の情報を構成するけれども、これらの患者に対して、血漿蛋白質レベルをアッセイするために、血漿又は血清の前精製がいくつか必要とされるということも意味している。
【０１９０】
癌−患者血清実験（パネル１）及びフィンガープリック血液検査（パネル２）に使用した蛋白質パネル、対応するＤＮＡコード、並びに、その配列が、表２及び３に要約されている。これらのＤＮＡオリゴマーを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって合成し、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。質量分析によって質を確かめた。
【０１９１】
【表２】
2010533871.tif 000004
2010533871.tif 000005
【０１９２】
【表３】
2010533871.tif 000006
2010533871.tif 000007
【実施例１２】
【０１９３】
生物学的プロファイルを検出するためのバーコードアレイ：癌患者における定量蛋白質プロファイリング
実施例１０に例示された実験を通じて測定した血液バーコードは、各患者に特有であった。
【０１９４】
図２６乃至２８は、実施例８で例証されたように設計したバーコードアレイを使用して得た癌患者のバーコードデータの定量化及びクラスター形成を示している。特に、図２６は、この調査で使用したバーコードアレイのレイアウトを示している。鎖Ｍは、参照（対照）を示している。図２７は、全ての癌患者（左から：Ｂ０１−Ｂ１１、Ｐ０１−Ｐ１１、Ｓ０１、及びＳ０２）に対して図２１Ａで示されたように検出した全蛋白質の蛍光信号の定量化（左の軸）を示したグラフを例示している。Ｓ０１及びＳ０２は、２つの未知の血清試料である。図２８は、蛋白質パターンに基づき得た癌患者の例証的な手動クラスター形成を示している。第一に、全ての前立腺癌患者は、ＰＳＡによって明確に同定される。第二に、乳癌患者も前立腺癌患者も、異なるサイトカインプロファイルを有したあり得る分集団を示している。
【０１９５】
患者の試料全てに対する蛍光信号の強度が、図２６に記されている。癌マーカーＰＳＡは、乳癌患者と前立腺癌患者とを明確に区別し、未知の試料Ｓ０１及びＳ０１が前立腺癌患者に割り当てられるのを可能にした。次に、患者の層別化に対するこの技術の可能性を評価するために、蛋白質信号に基づき手動で患者のクラスター形成を行い、図２７に概略的に例示されたマップを生じた。この方法は、バイオマーカーパネル自体と同じ位よくなるだけであって、プロファイルされる血清試料の数は少ない。それにもかかわらず、結果は有望である。例えば、測定した乳癌患者のプロファイルは、３つのサブセット、非炎症性、ＩＬ−１β陽性、及びＴＮＦ−α陽性に分類することができる。前立腺癌患者のデータは、一般的に高いレベルの炎症性を明示し、それらの炎症性−陽性の試料も、図２７に示されているように分類することができる。興味深い観察は、大部分の患者に対するＩＬ−１０信号の欠如である。ＩＬ−１０は、抗炎症メディエータとして機能するサイトカイン産生抑制因子であり、その欠如は、局所的な腫瘍部位における正常な免疫恒常性からのずれを反映している場合がある。より多い数の蛋白質及びはるかに多い数の血液試料を含む検査を開始した。研究者等は、サイトカインの多重化測定に対する技術を開発することに焦点をおき、血清サイトカインプロファイリングは、癌診断及び予後徴候における関連性を示してきた。上記の結果は、統合されたプラットフォームをヒト健康関連蛋白質の多パラメータ分析に適用することができるということを明確に実証してきた。
【０１９６】
統合されたプラットフォームを開発することより劣った主要な目的は、血漿が貯蔵された場合に生じ得る蛋白質分解を回避するように、ヒトの血液中の多数の蛋白質のレベルを、その血液のサンプリングの数分内で測定することができるということであった。典型的な９６ウェルプレートのイムノアッセイにおいて、関心のある生物学的試料が添加され、蛋白質は表面結合抗体に拡散する。十分な流れ条件の下、拡散はもはや重要ではなく、アッセイの速度を制限する唯一のパラメータは、蛋白質／抗体結合動態学（ラングミュアの式）であり、従って、たった数分以内でイムノアッセイを完全にするということを可能にしている。
【実施例１３】
【０１９７】
生物学的プロファイルを検出するためのバーコードアレイ：ヒト血漿プロテオーム
血漿蛋白質アッセイに対する改善された感度を確証するよう、バーコードアレイの使用を検査した。
【０１９８】
ヒト血漿プロテオームは、３つの主要なクラスの蛋白質、標準的な血漿蛋白質、組織漏出蛋白質、及び細胞−細胞シグナリング分子（サイトカイン及びケモカイン）からなる。細胞−細胞シグナリング分子は、種々の生理学的及び病理学的な工程、すなわち、腫瘍宿主免疫及び炎症において生物学的に有益である。
【０１９９】
行った第１の一連の実験の結果は図２９に例示されており、サイトカイン、ＴＮＦ−α、及び、ＩＬ−６、ＩＬ−１０等のインターロイキン以外の標的蛋白質の検出が示されている。特に、図２９はＣＲＰ、Ｃ３、及びプラスミノゲン等の分子の検出を示しており、前記分子は、炎症反応（ＣＲＰ）、補体系（Ｃ３）、及び肝毒性反応（ＣＲＰ及びプラスミノゲン）等の生物学的プロファイルに付随する。
【０２００】
行った第２の一連の実験の結果は図３０の概念図に要約されており、ヒト血漿プロテオームの概略を示している（Ｎ．Ｌ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｎ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １１，８４５，２００１を参照）。
【０２０１】
図３０に示されているように、血漿蛋白質の濃度範囲は１２０倍に及び、最も低い限度は、ハイスループット蛋白質プロファイリング技術である質量分析のほぼ検出限界である。臨床的な蛋白質測定に対する最新技術は、依然としてＥＬＩＳＡアッセイである。しかし、ＥＬＩＳＡは、ロースループットプロセスであり、多パラメータ血漿蛋白質測定を完全にするのに多量の試料及び長い時間を必要とする。高性能なＤＥＡＬバーコードチップ、特に、その上げられた感度は、少量の臨床血液試料由来の少量のサイトカインを含む、蛋白質のパネルの非常に多重化された測定を実現するための鍵である。
【０２０２】
従って、ＤＥＡＬバーコードアレイはＥＬＩＳＡに匹敵する著しく高い感度を有し、少量の試料由来の、例えばサイトカイン及びケモカイン等の細胞−細胞シグナリング分子を少量含む、血漿蛋白質の多重化検出の可能性を生じるという結論を下した。
【実施例１４】
【０２０３】
バーコードアレイにおいて行うアッセイ。
【０２０４】
関連する図に例示されている実施例３〜１３に示されたアッセイに対して、ＤＥＡＬイムノアッセイを使用した。各蛋白質を検出するために、抗体の対を選択した。１つの抗体は、ガラススライド上にフローパターン形成した一次ＤＮＡ鎖に相補的な二次ＤＮＡ鎖に結合される。この抗体も、検出される蛋白質を捕獲するよう役立ち、次に、ビオチンでラベルされた検出が同じ蛋白質に結合し、イムノサンドイッチ構造を生じるようになる。最後に、Ｃｙ−３又はＣｙ５でラベルされた蛍光ストレプトアビジンを使用して、ストレプトアビジン−ビオチン結合を介してバーコードの結果を可視化した。
【０２０５】
異なる濃度で調製したヒトサイトカイン蛋白質の検出を第一に検査した（図１５）。その結果によって、検出は非常に特異的であり、ＥＬＩＳＡと匹敵する程の上げられた感度を明示すると示されている。次に、（５つの蛋白質までの）多パラメータ検出を、図１６のように実証した。ＴＮＦ−αは、１０抗ＴＮＦ−αＡＢの高い親和性による最高の信号強度を明示している。一次ＤＮＡオリゴマーの高い荷重を有し、フローパターン形成ステップにおいてＤＮＡ濃度を変えることによって、いかなる従来の蛋白質検出法よりも数十倍優れて、広範なダイナミックレンジに渡りｈＣＧのような蛋白質を１つのバーコードが検出することができると示されている（図２１）。最後に、１２個の異なるヒト血清試料からの迅速で感度のよい１３個の異なる蛋白質の検出を同時に可能にする、バーＤＥＡＬバーコードガラスチップ上に結合した２層のＰＤＭＳマイクロ流体チップからなる統合マイクロ流体装置を作製した。ＤＥＡＬバーコード装置は、最新技術のＥＬＩＳＡアッセイと同じ位の極めて高い感度での蛋白質検出に対して、（蛋白質マイクロアレイ及び質量分析のように）非常に多重化された方法を初めて提供する。
【０２０６】
バーコードアレイパターン形成は、ＤＮＡ、蛋白質、又は、血清及び組織溶解物でさえもパターン形成するために利用することができる一般的な技術である。逆相バーコードアレイ（血清又は溶解物アレイ）を、ハイスループットな薬物スクリーニング及びバイオマーカーの発見に使用することができる。
【実施例１５】
【０２０７】
磁気ＩＤに対するバーコードアレイの製造
指輪等の小物に対する磁気ＩＤバーコードを製造する方法の概略図が図３１に示されている。
【０２０８】
２層リソグラフィーを使用して、小さな曝露された接触領域を有したＰＤＭＳマイクロ流体チャネルを製造することができる（２つの層の流体チャネルがあることを意味する）。例えば小型製品等の基板に下層を接触させることができ、小さな接触領域の下層チャネルをＰＤＭＳ装置の側面にある大きな注入口に連結するために埋め込まれた流体チャネルを含有する上層から流体を導入することができる。
【０２０９】
このＰＤＭＳ装置を前記小物上に取り付けると、いくつか異なる分子を前記接触領域に流してＤＮＡバーコードアレイを生じた。次に、相補的なＤＮＡ−磁気ナノ粒子複合体のライブラリを合成することができる。
【０２１０】
従って、磁気バーコードの作製は、単に、ＤＮＡバーコードでパターン形成した小型の小物を、いくつかの相補的なＤＮＡ−磁気ナノ粒子複合体を含有する溶液内に浸すことによって実現することができる。相補的なＤＮＡ−磁気ナノ粒子複合体の異なる組合せによって、磁気抵抗スキャンヘッドで容易に読むことができる、異なる磁気ＩＤバーコードが生じる。
【０２１１】
上記の実施例は、本開示の装置、システム、及び方法の実施形態の作成方法及び使用方法における完全な開示及び説明を同業者に与えるよう提供され、本発明者等がその開示としてみなすものの範囲を限定するよう意図されない。
【０２１２】
要約すると、一部の実施形態において、材料を含んだアレイ及び基板が開示され、方法及びシステムに関連づけられる。アレイ及び基板において、前記材料は、特に、捕獲剤及び／又は検出可能な標的によって形成することができ、バーコードパターンを形成する実質的に平行な線に沿って基板に付着させることができる。
【０２１３】
当業者には明らかである、本開示を実行するための上記の方法における修正は、以下の特許請求の範囲内であると意図される。本明細書において言及された全ての特許及び刊行物は、本開示が関連する当業者の技術のレベルを示している。本開示において引用された全ての参考文献は、各参考文献が個々にその全内容を参照により引用されたかのように、同じ程度まで参照により引用される。
【０２１４】
背景技術、発明の概要、並びに実施例における（特許、特許出願、学術誌の記事、要旨、実験マニュアル、本、又は、他の開示を含めた）引用された各文書の開示全体を、参照により本明細書に援用する。さらに、本明細書に添えて提出される配列表のハードコピー及び対応するコンピュータで読み取り可能な形態は、どちらもその全内容を参照により本明細書に援用する。
【０２１５】
本開示は、特定の組成物又は生物学的システムに限定されず、当然ながら変化し得ることを理解されたい。本明細書に使用される用語は特定の実施形態を記述するという目的のためだけであり、限定するとして意図されないことも理解されたい。本明細書及び付随の特許請求の範囲において使用された場合、単数形の不定冠詞又は定冠詞は、その内容が何か他に明確に指示していない限り、その指示対象の複数形を含む。「複数の」という用語は、その内容が何か他に明確に指示していない限り、２つ以上の指示対象を含む。他に規定されない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示に関連する、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有している。本明細書に開示されているものと類似又は同等のいかなる方法及び材料も使用することができるけれども、適切な材料及び方法の特定の例をテストする実行が本明細書には記述されている。
【０２１６】
本開示の実施形態をいくつか記述してきた。それにもかかわらず、本開示の真意及び範囲から逸脱することなく、種々の修正をすることができるということが理解されたい。従って、他の実施形態が以下の特許請求の範囲内である。
【０２１７】
本出願は、２００７年７月１６日に出願した、“Ａｎ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”と題された米国仮特許出願第６０／９５９，６６６号（Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．ＣＩＴ４９４３−Ｐ）、及び、２００７年１０月１５日に出願した、“Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｂａｒ−ｃｏｄｅ  Ａｒｒａｙ：Ａ  Ｇｅｎｅｒｉｃ  Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｔｈｅｒｅｆｒｏｍ”と題された米国仮特許出願第６０／９９８，９８１号（Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．ＣＩＴ−５０１７）に基づく優先権を主張するものであり、どちらの開示も全内容を本出願に援用する。本出願は、また、２００７年８月１日に出願した、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ／ｏｒ  ＳｏｒｔｉｎｇＴａｒｇｅｔｓ”と題された米国特許第１１／８８８，５０２号（Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．Ｐ０１７−ＵＳ）、及び、２００８年７月１６日に出願した“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ＤｅｔｅｃｔｉｎｇＴａｒｇｅｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”と題された米国特許（Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．Ｐ２３５−ＵＳ）に関し、どちらの開示もまた全内容を本出願に援用する。
政府基金に関する記述
米国政府は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより与えられた基金Ｎｏ．ＣＡ１１９３４７のもとに行われた本開示についてある種の権利を有している。
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【０２１８】
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【図１】
2010533871.tif 000008
【図２】
2010533871.tif 000009
【図３】
2010533871.tif 000010
【図４】
2010533871.tif 000011
【図５】
2010533871.tif 000012
【図６】
2010533871.tif 000013
【図７】
2010533871.tif 000014
【図８】
2010533871.tif 000015
【図９】
2010533871.tif 000016
【図１０】
2010533871.tif 000017
【図１１】
2010533871.tif 000018
【図１２】
2010533871.tif 000019
【図１３】
2010533871.tif 000020
【図１４】
2010533871.tif 000021
【図１５】
2010533871.tif 000022
【図１６】
2010533871.tif 000023
【図１７】
2010533871.tif 000024
【図１８】
2010533871.tif 000025
【図１９】
2010533871.tif 000026
【図２０】
2010533871.tif 000027
【図２１】
2010533871.tif 000028
【図２２】
2010533871.tif 000029
【図２３】
2010533871.tif 000030
【図２４】
2010533871.tif 000031
【図２５】
2010533871.tif 000032
2010533871.tif 000033
【図２６】
2010533871.tif 000034
【図２７】
2010533871.tif 000035
【図２８】
2010533871.tif 000036
【図２９】
2010533871.tif 000037
【図３０】
2010533871.tif 000038
【図３１】
2010533871.tif 000039
【配列表】
2010533871000001.app
【国際調査報告】
2010533871.tif 000040
2010533871.tif 000041
2010533871.tif 000042