(57)【要約】免疫グロブリンＦｃ及びヒトアポリポタンパク質クリングル断片の融合タンパク質を提供する。本発明は、血管生成抑制能及び体内安定性が増強されたＦｃとＬＫ８タンパク質の融合タンパク質に係り、さらに詳しくは、血管新生抑制効果を有するＬＫ８タンパク質とヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ部分とが融合したＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質及び該融合タンパク質を含む癌治療用組成物に関する。本発明によるＦｃ接合ＬＫ８融合タンパク質は、血管生成抑制能とそれによる抗癌及び癌転移抑制能を有しながらも、体内半減期が極めて長いことから、さらに効率的で且つ経済的な癌治療剤または癌抑制剤として使用可能である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＫ８タンパク質とヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ部分とが融合したＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項２】
ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を細胞外に分泌するＩｇκリーダー部位をさらに含有することを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組み換えベクターで形質転換された細胞。
【請求項６】
前記細胞は動物細胞であることを特徴とする請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記動物細胞はＣＨＯ／ＬＫ８−Ｆｃであることを特徴とする請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
請求項５に記載の細胞を培養することを特徴とするＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の製造方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載のＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を含有する癌治療用組成物。
【請求項１０】
前記癌は、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、黒色腫、前立腺癌の骨転移癌及び卵巣癌よりなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１または２に記載のＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を含有する血管新生抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管生成抑制能及び体内安定性が増強されたＦｃ及びＬＫ８タンパク質の融合タンパク質に係り、さらに詳しくは、血管新生抑制効果を有するＬＫ８タンパク質とヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ部分とが融合したＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質及び該融合タンパク質を含む癌治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生とは、既存の血管から新たな血管が生成される過程をいうが、正常的な生理条件下においては血管内皮細胞が分裂をほとんどしない状態で維持され、例外的に、女性の生理周期を含む極めて制限的な場合に限って起こることが知られている。血管新生の調節異常は、癌、糖尿病性網膜症、リウマチ性関節炎、乾癬などをはじめとする数多くの病理学的障害を誘発する恐れがある。腫瘍の場合、癌のサイズが数ｍｍ３体積までは血管の補助なしでも成長可能であるとはいえ、それ以上の体積に成長したり遠隔転移が起こるためには血管新生が必須的であることが知られている(Folkman,J.,N.Eng.J.Med.,333:1757,1995;Folkman,J.,NewEngl.J.Med.,285:1182,1971)。
【０００３】
腫瘍の血管新生の開始のためには、血管形成促進因子の増加と抑制因子の減少が両立される必要がある。内因性血管形成抑制因子の代表例はアンギオスタチンであり、アンギオスタチンは、血液凝固と関連する酵素と言われるプラスミノーゲンの一部分であり、クリングル構造で構成されており、試験管内及び生体内において血管新生抑制能を有していることが報告されている（Lee, T.H. et al., J. Biol. Chem., 273: 28805, 1998; Kim et al., J. Biol. Chem., 278:11449, 2003）。前記クリングルは、約８０個のアミノ酸及び３個の分子内ジスルフィド結合により形成されたタンパク質の構造領域であり、独立した折り畳み単位を構成する。クリングル構造は、プロトロンビン、ウロキナーゼ、肝細胞成長因子、アポリポタンパク質（ａ）などの多数のタンパク質において発見されるが、特に、プロトロンビンのクリングル、ウロキナーゼのクリングルなど多数のクリングルが血管新生抑制能を示すことが報告されている(Lee,T.H.etal.,J.Biol.Chem.,273:28805,1998;Kimetal.,J.Biol.Chem.,278:11449,2003)。
【０００４】
糖タンパク質としてのアポリポタンパク質（ａ）は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の主なタンパク質成分であるアポＢ−１０と共有結合してリポタンパク質（ａ）を形成する(Fless, G.M., J. Biol. Chem., 261:8712, 1986)。リポタンパク質（ａ）は、生体内においてコレステロール運搬を担当し、血漿におけるリポタンパク質（ａ）の濃度増加は動脈硬化及び心臓疾患と関連性があることが知られている(Armstrong,V.W.etal.,Artherosclerosis,62:249,1986;Assmann,G.,Am.J.Cardiol.,77:1179,1996)。アポリポタンパク質（ａ）は、プラスミノーゲンクリングルIV及びクリングルＶと類似性を示す２種類のクリングル領域と、不活性のプロテアーゼ様領域を含んでいる。アポリポタンパク質（ａ）クリングルIV様領域は、アミノ酸配列の相同性によってさらに１０種の亜型（IV１〜IV１０）に分けられ、それぞれは１つずつ存在するが、IV２クリングルはアポリポ（ａ）遺伝子の種々のヒト対立遺伝子に３〜４２個の複製数で存在する。そして、最後のクリングルＶはプラスミノーゲンクリングル−Ｖと８３．５％のアミノ酸配列相同性を有する。
【０００５】
本発明者らは、アポリポタンパク質（ａ）を構成するクリングルの一部分（クリングルＫＶ３８、以下、「ＬＫ８」タンパク質と称する。）が試験管内及び生体内において血管新生抑制能を有していることを確認し、このような効能により抗癌及び転移抑制作用を示すことを見出した（ＷＯ２００１／０１９８６８：ＬＫ６、ＬＫ７、ＬＫ８及びＬＫ６８を含む血管新生抑制剤、ＷＯ２００４／０７３７３０：ＬＫ８を含有する抗癌剤）。しかしながら、既存の発明によるＬＫ８タンパク質は、体内半減期が猿の場合に僅か７〜１１時間に過ぎないと認められ、抗癌効能を示すためには短い周期による反復投与を余儀なくされるという欠点があり、また、血管新生抑制剤は細胞殺傷よりは細胞成長抑制能を有しており、抗癌剤として使用するためには長期間に亘っての持続的な投与が不可避になるという欠点がある(Jain,R.K.etal.,Nat.Clin.Pract.Oncol.,3:24,2006)。
【０００６】
このため、長期間に亘っての持続的な投与には多量のＬＫ８組み換えタンパク質の産生が求められるが、これは産生コストの上昇につながり、患者にとっては高価な治療費及び治療のための長時間の投資が負担になり、ＬＫ８タンパク質を抗癌剤として開発する上で技術的難点があった。
【０００７】
一方、免疫グロブリンまたはその断片と活性タンパク質との融合タンパク質の製造が、抗原性増強、精製の容易性、血中半減期の増加などを目的に行われている。その例として、免疫グロブリン断片そのものの機能及び有用タンパク質の機能を併せ持つタンパク質薬物と免疫グロブリンＦｃを融合させた融合タンパク質であるインターロイキン受容体（大韓民国特許登録第２４９５７２号）、ＩＮＦ−αとＦｃを結合してＩＮＦ−αの血中半減期を増加させた融合タンパク質などがある。しかしながら、ＩＮＦ−αとＦｃの融合タンパク質に対しては、半減期は大幅に増加されたとはいえ、ＩＮＦ−α活性が低下してしまうという欠点がある（米国特許第５、７２３、１２５号公報）。
【０００８】
そこで、本発明者らは、ＬＫ８タンパク質を体内に投与したとき、血管新生抑制能の減少を抑えながらも高い半減期を維持するための方法を見出すために鋭意努力した結果、ＬＫ８タンパク質のＣ末端にヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ部分を融合してＬＫｇ−Ｆｃ融合タンパク質を製作し、その効果を調べてみた結果、Ｆｃ融合によりＬＫ８タンパク質の自体効能に影響を与えないながらも、ＬＫ８タンパク質に比べて半減期が約４０〜５０倍以上に増加されるという全く予期しない効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【０００９】
《技術的課題》
本発明の目的は、抗癌及び転移抑制能を有しているヒトアポリポタンパク質（ａ）クリングル断片であるＬＫ８タンパク質のＣ末端に遺伝子融合技術を用いてヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃタンパク質を融合して、生体内有用性が増強されたＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を含有する癌治療用組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を含有する血管新生抑制用組成物を提供することにある。
【技術的解決方法】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、ＬＫ８タンパク質とヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ部分とが融合したＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。本発明において、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を細胞外に分泌するＩｇκリーダー部位をさらに含有することを特徴とすることができる。
【００１３】
また、本発明は、前記ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子、前記遺伝子を含有する組み換えベクター及び前記組み換えベクターで形質転換された細胞を提供する。本発明において、前記細胞は動物細胞であることが好ましく、前記動物細胞はＣＨＯ／ＬＫ８−Ｆｃであることが好ましい。
【００１４】
さらに、本発明は、前記ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を含有する癌治療用組成物及び血管新生抑制用組成物を提供する。本発明において、前記癌は、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、黒色腫、前立腺癌の骨転移癌及び卵巣癌よりなる群から選択されることが好ましい。
【００１５】
本発明の他の特徴及び具現例は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲から一層明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子の発現ベクターであるｐＭＳＧ／ＬＫ８−Ｆｃの製造過程を示すものである。
【図２】スピナー培養時におけるＣＨＯ／ＬＫ８−Ｆｃ細胞株の成長曲線及び生存率を示すグラフである。
【図３】親和性クロマトグラフィを用いたＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の精製過程において、グリシン緩衝液の濃度と時間によるＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の溶出を示すグラフである。
【図４】ウエスタンブロットを用いて精製されたＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を確認した結果を示すものである。
【図５】ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質で処理された血管内皮細胞を用いた傷移動実験において、試料処理による単位面積当たりの移動細胞数を示すグラフである。
【図６】ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質で処理された血管内皮細胞を用いた傷移動実験において、試料処理による細胞移動率（％）を示すグラフである。
【図７】ＣＡＭアッセイによるＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の生体内力価を示すグラフである。
【図８】ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示すグラフである。
【図９】ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質処理による腫瘍成長抑制能を示すグラフである。
【図１０】ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質処理による転移抑制能を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明においては、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子配列を含む組み換えプラスミドｐＭＳＧ／ＬＫ８−Ｆｃを製作し、この遺伝子が形質導入されて組み換えＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を産生するＣＨＯ／ＬＫ８−Ｆｃ細胞株を確立し、前記確立されたＣＨＯ／ＬＫ８−Ｆｃ細胞株から産生されたＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質によってマウスの癌組織を処理した結果、癌組織の成長及び転移を抑制するということを確認した。
【００１８】
また、本発明によるＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ融合がＬＫ８タンパク質自体の効能に影響を与えないながらも、ＬＫ８タンパク質に比べて半減期が約４０〜５０倍以上増加されて合計の投与タンパク量及び投与頻度の節減効果があるということを確認した。
【００１９】
このような事実は、通常、有用タンパク質にＦｃが結合された融合タンパク質の方が母タンパク質よりも低い効能を示すか、あるいは、半減期の増加効果があまりないのに対し、本発明のＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質は、既存のＬＫ８タンパク質と同じ効能を有しながらも、遥かに高い半減期増加率を示し、当業者にとって全く予測できない効果であると言える。
【００２０】
本発明において、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質は、試験管内においてｂＦＧＦにより誘導されたヒト内皮細胞の移動を阻害し、生体内において血管生成を抑制する機能を有していることを確認した。一方、ＬＫ８−Ｆｃタンパク質を６週齢のＳＤ雄ラット（日本チャールス・リバー株式会社）の筋肉に単回投与時に、融合したＦｃ断片に起因して、生体内半減期が既存のＬＫ８タンパク質に比べて約４０〜５０倍増加することにより、薬物の投与頻度及び投与容量を減少させても高い効能を示すということを確認した。そこで、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の投与量をＬＫ８タンパク質に比べて少なくとも１０分の１未満
の容量にし、且つ、投与期間を少なくとも１週間に１回投与した場合でさえ、抗癌及び転移効能を期待することができる。しかしながら、上記の条件は限定的なものではなく、患者の年齢及び性別、健康状態、疾患の種類及び進行の度合いによって調節可能である。
【００２１】
本発明によるＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質は、既存の抗癌化学療法や放射線療法と併用した場合に相乗効果を発揮することが期待され、他の種類の血管新生抑制効果を有する製剤とも複合製剤として使用可能である。例えば、腫瘍を標的とする抗癌化学療法や放射線療法と、腫瘍周辺または腫瘍内に流入する血管を標的とするＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質投与を併用すれば、腫瘍の成長及び転移がより有効に抑制可能である。また、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質と本発明のタンパク質は、異なる機序を有する他の血管新生抑制剤とも併用投与可能であり、この場合にも、有効な抗癌または転移抑制能を期待することができる。
【００２２】
免疫グロブリン重鎖不変領域は４個または５個のドメインを含み、前記ドメインはＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）からなる。重鎖ドメインのＤＮＡ配列は免疫グロブリンクラス間に交差相同性を有するが、例えば、ＩｇＧのＣＨ２ドメインはＩｇＡ及びＩｇＤのＣＨ２ドメインと相同性を有し、ＩｇＭ及びＩｇＥのＣＨ３ドメインと相同性を有する。
【００２３】
本発明において使用される「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン連鎖不変領域のカルボキシル末端部分、好ましくは、免疫グロブリン重鎖不変領域またはその一部を意味する。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、（１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、（３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、または（５）２以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域との組み合わせを含むことができる。好適な実施形態において、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、好ましくは、ＣＨ１ドメインが欠如されている。
【００２４】
重鎖不変領域が由来する好適なクラスの免疫グロブリンは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３または４）である。他のクラスの免疫グロブリンＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）及びＩｇＭ（Ｉｇμ）が利用可能である。好適な免疫グロブリン重鎖不変領域の選択については、米国特許第５、５４１、０８７号及び第５、７２６、０４４号に詳細に開示されている。特定の結果を得るために特定の免疫グロブリンクラス及びサブクラス由来の特定の免疫グロブリン重鎖不変領域配列を選択することは当業界における技術レベルに属すると考えられる。免疫グロブリンＦｃ領域をコード化するＤＮＡ構成物の部分は、少なくともヒンジドメインの一部分を含むことが好ましく、少なくともＦｃγのＣＨ３ドメインの一部分、または、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭのうちいずれかの相同性ドメインを含むことが好ましい。
【００２５】
用途に応じて、ヒト以外の他の種（例えば、マウスまたはラット）由来の不変領域遺伝子が使用可能である。ＤＮＡ構成物において融合パトナーとして用いられる免疫グロブリンＦｃ領域は、一般的に、任意の哺乳動物種から得られる。宿主細胞または動物においてＦｃ領域に対する免疫反応を誘発させることが好ましくない場合、Ｆｃ領域は宿主細胞または動物と同じ種から由来したものでありうる。例えば、宿主動物または細胞がヒトである場合、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域が使用可能であり、同様に、宿主動物または細胞がマウスである場合、げっ歯類の免疫グロブリンＦｃ領域が使用可能である。
【００２６】
本発明の実施に有用なヒト免疫グロブリンＦｃ領域をコードする核酸配列及びこれを限定するアミノ酸配列は、配列番号２に示されているが、これに制限されるものではない。例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたはＥＭＢＬデータベースに示されたヌクレオチド配列によりコード化されるもの、例えば、ＡＦ０４５５３６．１(Macaca fuscicularis)、ＡＦ０４５５３７．１(Macaca mulatta)、ＡＢ０１６７１０(Felix catus)、Ｋ００７５２(Oryctolagus cuniculus)、Ｕ０３７８０(Sus scrofa)、Ｚ４８９４７(Camelus dromedarius)、Ｘ６２９１６(Bos taurus)、Ｌ０７７８９(Mustela vision)、Ｘ６９７９７(Ovis aries)、Ｕ１７１６６(Cricetulus migratorius)、Ｘ０７１８９(Rattus rattus)、ＡＦ５７６１９．１(Trichosurus vulpecula)またはＡＦ０３５１９５(Monodelphis domestica)など他の免疫グロブリンＦｃ領域配列も使用可能である。
【００２７】
また、免疫グロブリン重鎖不変領域内のアミノ酸の置換または欠失が本発明の実施に有用になる場合もある。一例としては、Ｆｃ受容体に対する親和力が減少されたＦｃ変異体を生成するために上部ＣＨ２領域にアミノ酸置換を導入することが挙げられる（Cole et al., J. Immunnol., 159:3613, 1997）。当業者であれば、周知の分子生物学技術を用いてこのような構成物を製造することができる
【００２８】
本発明においては、本発明の実施に有用なＦｃ融合タンパク質を生成するための通常の組み換えＤＮＡ技術を利用する。Ｆｃ融合構成物は、好ましくは、ＤＮＡレベルにおいて生成され、このようにして生成されたＤＮＡを発現ベクターに挿入させ、これを発現させて本発明の融合タンパク質を産生する。
【００２９】
本発明において使用される「ベクター」という用語は、宿主細胞に挿入されて宿主細胞ゲノムと組み換えられ、ここに挿入されるか、または、エピソームとして自発的に複製するコンピテントヌクレオチド配列を含む任意の核酸を意味する。このようなベクターとしては、線形核酸（linear nucleic acids）、プラスミド、ファージミッド、コスミッド、ＲＮＡベクター、ウィルスベクターなどがある。ウィルスベクターの例としては、レトロウィルス、アデノウィルス及びアデノ関連ウィルスがあるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
本発明において使用される「遺伝子発現」または標的タンパク質の「発現」という用語は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写体の翻訳及びＦｃ融合タンパク質生成物の分泌を意味する。
【００３１】
適切な宿主細胞を本発明のＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェクトさせ、これを標的タンパク質の発現及び／または分泌に使用することができる。本発明において、好適な宿主細胞としては、不死化（immortal）ハイブリドーマ細胞、ＮＳ／Ｏ骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＨＥＬＡ細胞及びＣＯＳ細胞がある。
【００３２】
哺乳動物細胞において高発現レベルで融合タンパク質を産生するために使用されてきた１種類の発現システムは、５’から３’の方向にシグナル配列、免疫グロブリンＦｃ領域及び標的タンパク質をはじめとする分泌カセットをコード化するＤＮＡ構成物である。
【００３３】
本明細書において使用される「リーダー配列」という用語は、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の分泌を指令し、その後、宿主細胞において翻訳後に切断される配列を意味する。本発明のリーダー配列は、小胞体膜を横切るタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチドである。本発明において、好適なリーダー配列としては、抗体軽鎖リーダー配列、例えば、抗体１４．１８(Gillies et al., J. Immunol. Meth., 125:191, 1989)、Ｉｇκリーダー配列、抗体重鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖リーダー配列（Sakano et al., Nature, 286:5774, 1980）、及び当業界に周知な任意の他のリーダー配列（Watson et al., Nucleic Acids Research, 12:5145, 1984）がある。
【００３４】
本発明は、各種の癌、ウィルス疾患、その他の疾患、関連症状及びこれらの原因を、このような症状を有する哺乳動物に本発明のLK8-Fc融合タンパク質を投与することにより治療する方法を提供する。関連症状としては、血管新生により増殖及び転移される各種の固形癌が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００３５】
本発明において、癌は、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、黒色腫、前立腺癌の骨転移癌または卵巣癌があるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
本発明の組成物は、特定の分子に適した任意の経路により投与可能である。本発明の組成物は、任意の適切な手段を用いて動物に直接的に（例えば、注射、皮下注入または組織位置への局所的投与のように局所的に）、または全身的に（例えば、非経口または経口的に）提供可能である。組成物が非経口、例えば、静脈、皮下、目、腹腔、筋肉内、口腔、直腸、膣内、眼窩内、大脳内、脊髄内、心室内、鞘内、嚢内、関節包内、鼻腔内、または煙霧質投与（aerosol administration）により提供される場合、組成物は、水性または生理的に相溶性を示す流体懸濁液または溶液部分を含むことが好ましい。このため、担体または賦形剤は生理的に許容可能なものであって、所望の組成物を患者に伝達する以外にも、患者の電解質及び／または体積バランスに悪影響を及ぼさなければならない。このため、このような製剤用流体媒質は標準生理塩水を含むことができる。
【００３７】
本発明によるＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の容量は０．０３〜３００ｍｇ／ｍ２であることが好ましく、０．３〜３０ｍｇ／ｍ２であることがさらに好ましい。しかしながら、最適投与量は、治療の対象となる疾患と副作用の存否によって異なってくる。ところが、最適投与量は、通常の実験により決定することができる。融合タンパク質の投与は、周期的な丸剤注入、または外部貯蔵器（例えば、静脈袋（i.v. bag））または内部貯蔵器（例えば、生体分解性インプラント）からの連続した静脈または腹腔注射により行うことができる。また、本発明の融合タンパク質は、多数の相異なる生物学的活性分子と共に標的受容体に投与することができる。しかしながら、融合タンパク質及びその他の分子間の最適な組み合わせ、投与方式及び投与量は、当業者の技術レベルに属する通常の実験により決定することができる。
【００３８】
本発明による血管新生抑制剤は、血管生成と関連する様々な病変、すなわち、様々な腫瘍及び腫瘍の転移、リウマチ性関節炎、糖尿性網膜症、乾癬などの治療剤として適用可能である。この場合にも、本発明によるＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質は、当該疾患と関連する他の治療剤と併用可能である。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例により詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界において通常の知識を持った者にとって自明である。
【００４０】
《実施例１：ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を発現する組み換えベクターの製造》
ＬＫ８とＦｃを融合させた融合タンパク質をコード化するベクターを製造するために、本発明者らは、既に製造したＬＫ８遺伝子（配列番号１）を含むベクターであるｐＥＴ１１Ｂベクター（ＷＯ２００１／０１９８６８）を鋳型として用いたＰＣＲによりＬＫ８遺伝子を得た。また、ｐＲＣ１３−Ｈｐａベクター（大韓民国登録特許第４６７７０６号）を鋳型として用いたＰＣＲによりＦｃをコード化する遺伝子（配列番号２）を得た。それぞれのＰＣＲ反応に用いられたプライマーは、下記表１に示した。
【００４１】
具体的に、前記ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡを９４℃において５分間反応させた後、９４℃において３０秒、５６℃において３０秒及び７２℃において１分という過程を３０回繰り返し行い、最後に、７２℃において５分間伸張させる過程により行われた。このとき、クローニングを容易に行うために、各プライマーには制限酵素切断部位を挿入して、生成されるＰＣＲ産物に制限酵素切断部位を持たせた。
【００４２】
前記ＰＣＲにより生成された２本の遺伝子断片を、産生されるタンパク質が細胞外に円滑に分泌されることを補助するために、Ｉｇκリーダー配列を含有しているｐＳｅｃＴａｇ（Invitrogen, USA）ベクターに挿入した。具体的には、ＬＫ８遺伝子断片及びｐＳｅｃＴａｇベクターをＳｆｉＩ及びＢａｍＨＩで切断した後、ＬＫ８遺伝子断片をｐＳｅｃＴａｇベクターにライゲートしてｐＳｅｃＴａｇ−ＬＫ８を製作し、Ｆｃ遺伝子断片をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断し、ｐＳｅｃＴａｇ−ＬＫ８をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断した後にライゲートしてｐＳｅｃＴａｇ／ＬＫ８−Ｆｃを製作した。
【００４３】
前記プラスミドｐＳｅｃＴａｇ／ＬＫ８−Ｆｃにおいて、Ｉｇκリーダー配列、ＬＫ８遺伝子及びＦｃ遺伝子を制限酵素で切断して、動物細胞発現用ベクターであるｐＭＳＧベクター（ＫＣＣＭ１０２０２、大韓民国公開特許１０−２００２−００１０３２７）に挿入した。すなわち、ｐＭＳＧベクター及びｐＳｅｃＴａｇ−ＬＫ８−Ｆｃプラスミドを制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩを用いて切断した後、切断されたＩｇκ−ＬＫ８−Ｆｃ断片をｐＭＳＧベクターに挿入してｐＭＳＧ／ＬＫ８−Ｆｃを製造した（図１）。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
《実施例２：ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を多量発現する動物細胞株の確立》
ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を産生する動物細胞株を確立するために、実施例１に従い製造されたｐＭＳＧ／ＬＫ８−Ｆｃを、ＤＨＦＲ（dihydrofolate reductase）遺伝子（Columbia University, USA）と共に、Dosper（Roche, Switzerland）を用いて、ＤＨＦＲ遺伝子が欠失された細胞株であるＣＨＯＤＧ４４細胞（Columbia university, USA）にトランスフェクさせた。次いで、１０％血清を含有しているＭＥＭ−α最少培地（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）において適応されたコロニーを１次選別した後、選別されたコロニーを５０ｎＭ及び１μＭ濃度など段階的に増加されたＭＴＸ（methotrexate；ChoongWae Pharma Corporation, Korea）の濃度において継代培養しながら、ＭＴＸに対する耐性を示すコロニーの中で標的タンパク質を多量分泌する細胞株を２次選別した。選別された細胞株を、タンパク質の量産の便宜性を図るために、無血清培地であるＨｙＱ−ＳＦＭ−ＣＨＯ培地（Promega, USA）含有スピナーフラスコにおいて培養し、最終的に選別された細胞株をＣＨＯ／ＬＫ８−Ｆｃと命名した。
【００４６】
《実施例３：ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の精製》
ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を精製するために、ＣＨＯ／ＬＫ８−Ｆｃ細胞株に対し、実施例２の方法と同様にしてＨｙＱ−ＳＦＭ−ＣＨＯ培地においてスピナー培養を行った。図２に示すように、細胞の成長及び生存率を観察しながら培養していて、培養６日目に遠心分離によって上澄液を得た後、上澄液に含まれているＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を下記の方法により精製した。ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質中のＦｃ部分がプロテインＧセファロース（Amersham Pharmacia, USA）に対する親和性を有しているという点を用いて、親和性カラムクロマトグラフィを行った。具体的に、２０〜１００ｍＭナトリウムホスフェイト（ｐＨ６〜８）からなる結合バッファの条件下において、上澄液に含まれているＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を前記プロテインＧセファロースカラムに結合させた後、ｐＨ２〜５のグリシンバッファを用いてカラムから溶出させた（図３）。
【００４７】
精製されたＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を最終的にＰＢＳにより透析した後、４〜２０％濃度勾配ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットにより純度を確認した（図４）。電気泳動の結果、還元性状態では分子量が約３７ｋＤａであり、非還元性状態では約７５ｋＤａであることが確認された。これは、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質中のＦｃ部分にあるジスルフィド結合により非還元状態では二量体として存在するため、分子量が還元性状態よりも約２倍増大された形態で現れることに起因する（図４）。
【００４８】
《実施例４：ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の内皮細胞移動抑制能の分析》
組み換えタンパク質ＬＫ８−Ｆｃが血管新生抑制能を有するかどうかを分析するために、試験管内においてヒト内皮細胞であるＨＵＶＥＣ細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell, Cambrex, USA）を用いて創傷移動分析（wounding migration assay）を実施した（Kim et al., J. Biol. Chem., 278:29000, 2003）。１．５％ゲラチンがコーティンクされた２４ウェル組織培養平板の各ウェルにＥＧＭ−２（Cambrex, USA）培地で懸濁させたＨＵＶＥＣ細胞を入れ、細胞が９０％以上に成長するまで培養した後、０．１％のＦＢＳ入りＥＢＭ−２（Cambrex, USA）培地に交換した。前記条件下において約１５時間培養した後、マイクロピペットチップを用いて細胞を掻き取り、培養平板から離れた細胞をＰＢＳにより２回洗い取った。引っ掻かれた部分は写真撮影をしておき、表示線を引いておいた。その後、８時間細胞をさらに培養し、細胞の移動抑制の度合いを観察して写真撮影した後、表示線を越えて移動した細胞の数を計数した。前記実験は３回繰り返し行い、その結果を図５及び図６に示した。図５中、Ｘ軸は処理済み試料の種類及び濃度であり、Ｙ軸は表示線を越えて移動した細胞数を示す。また、図６は、図５のデータを百分率（％）にて示すグラフであり、具体的に、試料処理なしのＰＢＳ単独処理群における細胞移動数を各データからいずれも排除した後、ｂＦＧＦ単独処理群の細胞移動数を１００％に換算して、ＬＫ８−Ｆｃタンパク質を濃度別に処理時の細胞移動の相対的な阻害度を示した。ＬＫ８タンパク質を陽性対照群として使用した。
【００４９】
ｂＦＧＦを内皮細胞に処理すれば、細胞の移動が大いに誘導されるが、図５及び図６に示すように、ＬＫ８タンパク質を処理した場合、ｂＦＧＦにより誘導された細胞の移動が抑制され、処理されたＬＫ８タンパク質の濃度が増加するにつれて抑制能が増強された。このとき、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質をＬＫ８タンパク質と同じモル濃度にて内皮細胞に処理した場合にも、ＬＫ８タンパク質と同様な程度にＨＵＶＥＣの移動を有効に抑制することが分かる。代表的に、ＬＫ８タンパク質とＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質をそれぞれ１μＭの濃度にて処理した場合、ｂＦＧＦ単独処理群に比べて、ＬＫ８タンパク質処理群及びＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質処理群はそれぞれ約６８％（ｂＦＧＦ単独処理群と比較時、ｐ＜０．００５）及び約６４％（ｂＦＧＦ単独処理群と比較時、ｐ＜０．０５）の内皮細胞移動抑制能を示した。前記結果から、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質が試験管内においてＬＫ８タンパク質と同様なレベルの内皮細胞移動抑制能を示すことを確認することができた。
【００５０】
《実施例５：ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の生体内血管形成阻害能の分析》
ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質が生体内において血管形成を阻害するかを確認するために、有精卵の絨毛尿膜（以下、「ＣＡＭ」と略称する。）におけるＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の血管形成への影響を観察した（Kim et al., J. Biol. Chem., 278:29000, 2003）。有精卵の卵白アルブミンの一部を除去した後、タンパク質処理及び観察のための窓を作った後、３７℃培養器において４８時間培養した。ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質及びＬＫ８タンパク質をサーマノックスカバースリップ（Ｎｕｎｃ、ＵＳＡ）に載せ、乾燥させて準備した後、それぞれ胚芽ＣＡＭに注入、４８時間さらに培養した後、脂肪乳液を胚芽の絨毛尿膜に注入してサーマノックス周辺の血管形成を観察した。このとき、１群当たりに６０個の有精卵を使用した（図７）。
【００５１】
その結果、陰性対照群であるサーマノックスに生理食塩水のみを処理した有精卵において基本的に約３９．２±５．６％の毛細血管形成阻害が現れた。これに対し、それぞれ１０μｇのＬＫ８タンパク質及びＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を処理した場合、約６６．２％（対照群と比較時、ｐ＜０．０５）及び約６３．２％（対照群と比較時、ｐ＜０．０５）の血管形成阻害が観察された。すなわち、それぞれ両試料の処理が統計的に有意に血管形成を抑制していることが分かり、両試料間には効果の差が観察されなかった。このため、実施例３における試験管内だけではなく、生体内においても、Ｆｃ接合ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質が血管形成抑制能を有していることを確認した。
【００５２】
《実施例６：ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態（ＰＫ）分析》
ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態（ＰＫ）を観察するために、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質及びＬＫ８タンパク質を６週齢のＳＤ雄ラット（日本チャールス・リバー株式会社）に単回投与後、時間別に血漿に含まれているＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の濃度を測定した。具体的に、タンパク質の探知のために、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質及びＬＫ８タンパク質にＦＩＴＣ（Sigma, USA）を標識し、標識されたタンパク質であるＬＫ８−Ｆｃ−ＦＩＴＣとＬＫ８−ＦＩＴＣタンパク質１８０μｇをそれぞれＳＤラット（１群当たりに３匹）に単回に亘って筋肉注射した。タンパク質投与後、０．０１７、０．０５１、０．０８５、０．１７、０．５１、１、２、４、６、８、２４、４８、７２、１２０、１６８（ｈ）の間隔にて眼内出血により２００μｌの血液を試料採取した後、血漿を確保した。血漿に含まれているタンパク質の濃度は、ＦＩＴＣの励起波長である４９０ｎｍと放射波長である５３５ｎｍの条件下において蛍光光度計（PerkinElmer, USA）を用いて吸光度を測定し、標準曲線を用いて濃度を算出した（表２）。
【００５３】
【表２】
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【００５４】
表２に示すデータを用いて薬物動態（ＰＫ）を分析した結果、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を投与した群において、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の半減期（ｔ１／２）は約１７７ｈｒであり、体内露出度であるＡＵＣ（０−ｔ）及びＡＵＣ（ｉｎｆ）はそれぞれ１０３、００１ｈ・ｐｍｏｌ／ｍ及び１７６、７５９ｈ・ｐｍｏｌ／ｍＬであることが分析された（表３及び図８）。要するに、Ｆｃ融合によりＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の半減期が増加され、その結果、生体内利用率が有意に増加されたことを確認した。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
《実施例７：ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質処理による固形癌成長抑制》
ヒト大腸癌細胞が異種移植された腫瘍モデルを用いて、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質が固形癌の生長に抑制能があるかどうかを観察した。具体的に、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）入りＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、ＵＳＡ）培地において培養された約５ｘ１０６個のＬＳ１７４Ｔヒト大腸癌細胞（ＡＴＣＣＬＳ１７４Ｔ、ＵＳＡ）をＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（日本チャールス・リバー株式会社）の背側近位中央部に皮下接種した。大腸癌細胞移植後１０日経過時、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質及びＬＫ８タンパク質を投与した。ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質及びＬＫ８タンパク質はそれぞれ３５ｍｇ／ｋｇ／回及び１０ｍｇ／ｋｇ／回にて処理することにより、同じモル濃度にて投与し、投与スケジュールは、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の場合、実施例６のＰＫ実験結果に基づいて１週間に１回投与し、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質とＬＫ８タンパク質との効能比較のために、ＬＫ８タンパク質は、１週間に１回投与群と、以前の実験において効能が確認されたスケジュールである１日１回投与群を陽性対照群として設定して投与した。１群あたりに５匹を使用し、腫瘍を移植後約１ヶ月間癌の生長を観察した。処理過程は２０日間継続され、その後、腫瘍のサイズを３〜４日おきに１回ずつ測定し、全ての実験は２回繰り返し行った。
【００５７】
その結果、ＬＫ８タンパク質及びＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の処理により腫瘍の成長が低下し、ＬＫ８タンパク質処理群の中で、１日１回投与群とＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を１週間に１回投与した群は、対照群に比べて腫瘍成長抑制効果が観察された（図９）。しかしながら、ＬＫ８をＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質スケジュールと同様に１週間に１回投与した場合、腫瘍成長抑制能が観察されなかった。具体的に、細胞株を移植後２１日目に観察した結果、対照群である生理食塩水投与群の腫瘍体積は平均２４０９±５９１ｍｍ３（±標準偏差）であるのに対し、ＬＫ８タンパク質を１日１回投与した群の腫瘍体積は１１８８±１０２２ｍｍ３（±標準偏差）であり、ＬＫ８タンパク質を１週間に１回投与した群の腫瘍体積は３２０３±３２８４ｍｍ３（±標準偏差）であり、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を１週間に１回投与した群の腫瘍体積は８９９±７７３ｍｍ３（±標準偏差）であった。すなわち、対照群であるサリン投与群を腫瘍成長率の平均値と比較したとき、ＬＫ８タンパク質の１日１回投与群は約５０％の腫瘍生長抑制効果を示し、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を１週間に１回投与した群は約６３％の腫瘍生長抑制効果を示した。ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を１週間に１回投与した群がＬＫ８タンパク質の１日１回投与群と同様な腫瘍成長抑制能を示し、これは、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の増加された半減期に起因する。
【００５８】
《実施例８：ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の転移抑制能分析》
ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質が大腸癌細胞株の肝転移に対して抑制能があるかどうかを観察するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（日本チャールス・リバー株式会社）の脾臟に結腸癌を移植させた動物モデルを用いて、癌の肝転移の度合いを観察した。具体的に、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスをケタミン（Sigma, USA）を用いて麻酔した後、脾臟に３ｘ１０５個のＬＳ１７４Ｔヒト大腸癌細胞を移植し、１日経過後に各ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質の投与を開始した。タンパク質の投与濃度は、固形癌モデルの場合と同様に、３５ｍｇ／ｋｇ／回の濃度にて実施例６のＰＫ実験結果に基づいて１週間に１回投与した。腫瘍移植１４日後、マウスを解剖して肝を摘出した後、癌を観察し、且つ、転移された癌の結節数を計数して転移の度合いを測定した。
【００５９】
その結果、肝表面に転移されて生成された結節の数は、対照群であるサリン処理群の場合には単位面積あたりに１２０．３±３５．１個（±標準偏差）であるのに対し、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を処理した群の場合には５６．８±３１．９個（±標準偏差）であり、ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質投与群の方が対照群に比べて転移により生成された結節の数が顕著に減少されていることが確認できた（図１０）。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
以上、詳述したように、本発明は、ＬＫ８タンパク質とヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ部分とが融合したＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を提供する効果があり、前記ＬＫ８−Ｆｃ融合タンパク質を含有する癌治療用組成物を提供する効果もある。本発明によるＦｃ接合ＬＫ８融合タンパク質は、血管生成抑制能とそれによる抗癌及び癌転移抑制能を有しながらも、体内半減期が極めて長いことから、さらに効率的且つ経済的な癌治療剤または癌抑制剤として使用可能である。
【００６１】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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