(57)【要約】  本発明の下記の一般式１で表示されるシルク蛋白質−ミミッキングペプチド、これを含む脳神経疾患の予防又は治療用組成物、頭脳又は認知機能の増進の為の組成物及び酸化ストレス関連疾患、疾病又は異常の予防又は治療用組成物に関するものである。下記一般式１で表示されるシルク蛋白質−ミミッキングペプチド：一般式１        Ｇｌｙ−Ｘaa１−Ｇｌｙ−Ｘaa2                   （１）前記一般式において、Ｘaa１はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、Ｘaa2はＡｌａ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであるか；またはＸａａ２はＡｌａ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇに追加的にＧｌｙ−Ｘaa3が結合されているものであり；前記Ｘaa3はＴｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇである。
2010506907.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式１で表示されるシルク蛋白質−ミミッキングペプチド：
一般式１
Ｇｌｙ−Ｘaa１−Ｇｌｙ−Ｘaa2                   （１）
前記一般式において、Ｘaa１はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、Ｘaa2はＡｌａ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであるか；またはＸａａ２はＡｌａ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇに追加的にＧｌｙ−Ｘaa3が結合されているものであり；前記Ｘaa3はＴｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇである。
【請求項２】
前記Ｘaa１はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ又はＴｙｒであることを特徴とする第１項記載のペプチド。
【請求項３】
前記Ｘaa2はＡｌａ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ又はＳｅｒであることを特徴とする第１項記載のペプチド。
【請求項４】
前記Ｘaa2はＡｌａ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ又はＳｅｒに追加的にＧｌｙ−Ｘaa3が結合しているものであり、前記Ｘaa3はＴｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ又はＳｅｒであることを特徴とする第１項記載のペプチド。
【請求項５】
前記Ｘaa3にさらにＧｌｙ−Ｘaa4が結合されており、Ｘaa4はＴｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであることを特徴とする第４項記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１−４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする第１項記載のペプチド。
【請求項７】
前記第１項乃至第６項のいずれか一項記載のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドの有効量を含む、脳神経疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項８】
前記組成物は薬剤学的組成物又は食品組成物であることを特徴とする第７項記載の組成物。
【請求項９】
前記脳神経疾患は神経変性疾患、虚血又は再灌流による疾患及び精神疾患からなる群より選ばれることを特徴とする第７項記載の組成物。
【請求項１０】
前記神経変性疾患は痴呆、ハンチントン疾病、パーキンソン氏疾病及び筋萎縮性側索硬化症からなる群より選ばれることを特徴とする第９項記載の組成物。
【請求項１１】
前記虚血又は再灌流による疾患は虚血性脳卒中であることを特徴とする第９項記載の組成物。
【請求項１２】
前記精神疾患はうつ病、精神分裂症及び心的外傷後ストレス障害からなる群より選ばれることを特徴とする第９項記載の組成物。
【請求項１３】
前記ペプチドは神経細胞の保護作用を有することを特徴とする第７項記載の組成物。
【請求項１４】
前記ペプチドは神経細胞の死滅を抑制して神経細胞の保護作用を示すことを特徴とする第１３項記載の組成物。
【請求項１５】
前記ペプチドは活性酸素種の発生を抑制するか又はミトコンドリアの機能保護をして神経細胞の死滅を抑制することを特徴とする第１４項記載の組成物。
【請求項１６】
前記第１項乃至第６項のいずれか一項記載のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドの有効量を含む頭脳又は認知機能の増進の為の組成物。
【請求項１７】
前記組成物は薬剤学的組成物又は食品組成物であることを特徴とする第１６項記載の組成物。
【請求項１８】
前記頭脳又は認知機能は学習能力、記憶能力又は集中力であることを特徴とする第１６項記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物は脳神経疾患に随伴される頭脳又は認知機能の悪化を改善することを特徴とする第１６項記載の組成物。
【請求項２０】
前記ペプチドは神経細胞の保護作用を有することを特徴とする第１６項記載の組成物。
【請求項２１】
前記ペプチドは神経細胞の死滅を抑制して神経細胞の保護作用を有することを特徴とする第２０項記載の組成物。
【請求項２２】
前記ペプチドは活性酸素種の発生を抑制し、又はミトコンドリアの機能保護をして神経細胞の死滅を抑制することを特徴とする第２１項記載の組成物。
【請求項２３】
前記第１項乃至第６項の内いずれか一つの項のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドの有効量を含む酸化ストレス関連疾患、疾病又は異常の予防又は治療用組成物。
【請求項２４】
前記組成物は薬剤学的組成物又は食品組成物であることを特徴とする第２３項記載の組成物。
【請求項２５】
前記酸化ストレス関連疾患、疾病又は異常は老化；トラウマ（外傷）、脳性麻痺、糖尿病性神経病症を含む中枢神経系疾患；糖尿病性末梢神経病症及び外傷的神経損傷を含む末梢神経系疾患；間歇性跛行及び動脈硬化を含む心血関係疾患；白内障及び関節炎を含む筋−骨格系の疾患；又は、イオン照射に伴う異常、抗癌剤の処置に伴う異常及び抗癌物質に対する露出に伴う異常を含む活性酸素期を招く外部環境により発生する異常であることを特徴とする第２３項記載の組成物。
【請求項２６】
前記ペプチドは活性酸素種、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）又は腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の生成を抑制することを特徴とする第２３項記載の組成物。
【請求項２７】
前記第１項乃至第６項の内、いずれか一つの項のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドの有効量を含む組成物を対象に投与することを含む脳神経疾患の予防又は治療方法。
【請求項２８】
前記組成物は薬剤学的組成物又は食品組成物であることを特徴とする第２７項記載の方法。
【請求項２９】
前記脳神経疾患は神経変性疾患，虚血又は再灌流による疾患及び精神疾患からなる群より選ばれることを特徴とする第２７項記載の方法。
【請求項３０】
前記神経変性疾患は、痴呆、ハンチントン疾病、パーキンソン病及び筋萎縮性側索硬化症からなる群より選ばれることを特徴とする第２９項記載の方法。
【請求項３１】
前記虚血又は再灌流による疾患は、虚血性脳卒中であることを特徴とする第２９項記載の方法。
【請求項３２】
前記精神疾患はうつ病、精神分裂症及び心的外傷後ストレス障害からなる群より選ばれることを特徴とする第２９項記載の方法。
【請求項３３】
前記ペプチドは神経細胞の保護作用を有することを特徴とする第２７項記載の方法。
【請求項３４】
前記ペプチドは神経細胞の死滅を抑制して神経細胞の保護作用を示すことを特徴とする第３３項記載の方法。
【請求項３５】
前記ペプチドは活性酸素種の発生を抑制し、又はミトコンドリアの機能保護をして、神経細胞の死滅を抑制することを特徴とする第３４項記載の方法。
【請求項３６】
前記第１項乃至第６項の内、いずれか一つの項のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドの有効量を含む組成物を対象に投与することを含む頭脳又は認知機能の増進方法。
【請求項３７】
前記組成物は薬剤学的組成物又は食品組成物であることを特徴とする第３６項記載の方法。
【請求項３８】
前記頭脳又は認知機能は学習能力、記憶能力又は集中力であることを特徴とする第３６項記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物は脳神経疾患に随伴される頭脳又は認知機能の悪化を改善することを特徴とする第３６項記載の方法。
【請求項４０】
前記ペプチドは神経細胞の保護作用を有することを特徴とする第３６項記載の方法。
【請求項４１】
前記ペプチドは神経細胞死滅を抑制して神経細胞の保護作用を示すことを特徴とする第４０項記載の方法。
【請求項４２】
前記ペプチドは活性酸素種の発生を抑制し、又はミトコンドリアの機能保護をして神経細胞の死滅を抑制することを特徴とする第４１項記載の方法。
【請求項４３】
前記第１項乃至第６項の内いずれか一つの項のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドの有効量を含む組成物を対象に投与することを含む酸化ストレス関連疾患、疾病又は異常の予防又は治療方法。
【請求項４４】
前記組成物は薬剤学的組成物又は食品組成物であることを特徴とする第４３項記載の方法。
【請求項４５】
前記酸化ストレス関連疾患、疾病又は異常は老化；トラウマ（外傷）、脳性麻痺、糖尿病性神経病症を含む中枢神経系疾患；糖尿病性末梢神経病症及び外傷的神経損傷を含む末梢神経疾患；間歇性跛行及び動脈硬化を含む心血関係疾患；白内障及び関節炎を含む筋−骨格系の疾患；又は、イオン照射に伴う異常、抗癌剤の処置に伴う異常及び抗癌物質に対する露出に伴う異常を含む活性酸素期を招く外部環境により発生する異常であることを特徴とする第４３項記載の方法。
【請求項４６】
前記ペプチドは活性酸素種、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）又は腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の生成を抑制することを特徴とする第４３項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経保護及び頭脳機能向上効果を有するシルク蛋白質−ミミッキングペプチド及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中は脳血管が破れたり、又は塞がれて結果的に局所脳組織の機能異常をもたらす脳血管疾患にして、俗に、中風とも言い、韓国では死亡原因の第一位である。さらに、産業化と医学の発展による平均寿命の延長により、その発病率が漸次増加する趨勢にある。脳卒中は脳のどの部分においても発生し、従って、身体の対応する部位の機能に障害をもたらす。医学的に脳卒中は大別して脳の血管が塞がれて特定部位に血液循環がなされない為現れる“虚血性脳卒中”と、脳血管による“出血性脳卒中”とに分類することができ、その内、成人病の原因として知られている高血圧、動脈硬化症と密接な関連性がある虚血性脳卒中の発生比率がより高い方。虚血性脳卒中は首の部分にある頸動脈、椎骨脳底動脈から脳内の細い動脈に至まで、どこでも血管が塞がれると発病するようになり、これによりその血管が支配していた脳組織が死ぬ現象、つまり、“脳梗塞（ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）”が発生するようになる。一旦発生した脳梗塞部位はその機能を取り戻すことができず、従って、脳梗塞による中枢神経系障害は回復されず永久的に残るようになる。そこで、脳卒中治療において最も重要なことは、脳卒中発病危険因子として知られている高血圧、糖尿病、高脂血症等の予防と共に、脳虚血脳卒中自体の予防である。さらに、脳卒中発病により脳梗塞が来た時、脳浮腫を減少させ、虚血状態の部位は適切に血液が循環するようにして２次的な脳損傷を減少させることに焦点を絞っている。
【０００３】
現在、神経細胞の保護の為に使用されている物質としては興奮性アミノ酸アンタゴニストであるガングリオシド（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）、ニモジピン（Ｎｉｍｏｄｉｐｉｎｅ）、ＧＡＢＡアゴニスト、たとえばクロメチアゾル（ｃｌｏｍｅｔｈｉａｚｏｌｅ）等がある。硫酸マグネシウムとグリシンアンタゴニストは、フェイズ２での臨床研究中であり、ピラセタム（ｐｉｒａｃｅｔａｍ）は現在大規模の臨床研究が進行中である。しかしながら、現在試図されている神経細胞保護剤（ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ）は虚血進行過程のそれぞれ異なる段階に作用することを目的とする製剤であり、薬剤合併症がほとんどなく、このような多様な過程に同時に作用する複合療法の開発が必要とされている。
【０００４】
さらに、虚血性脳卒中の症状は特別な予候無しに急激に襲ってくることから、脳虚血発病当時に投与される薬物を介して治療を期待するよりは、持続的な虚血予防と虚血後の神経細胞のアポトーシスの抑制の為の機能性食品の摂取がより効果的と判断されている。
【０００５】
アメリカ合衆国特許第６，２４５，７５７号は、虚血による細胞損傷を治療するためのプロゲスチン（ｐｒｏｇｅｓｔｉｎ）の使用を開示しており、アメリカ合衆国特許第６，３８０，１９３号は、ポリ（アデノシン５′−ジホスホーリボス）ポリマラーゼ抑制剤を含む脳卒中治療用組成物を開示している。さらに、アメリカ合衆国特許第６，２８８，０４１号は、シアル酸誘導体を含む脳卒中治療用組成物を開示しており、アメリカ合衆国特許第５，５８０，８６６号は、１，４−チアセチンを有効成分として含む脳卒中治療用組成物を開示している。
【０００６】
神経変性疾患の一種であるパーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ′ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）は、運動及び認知障害を起こす退行性脳疾患にして、１８１７年ゼームスパーキンソンにより初めて報告された。この疾患の発病率は米国で人口１０万人当り１００−１５０人程度で、約７５万−１００万人の患者が報告されており、毎年６万余人が新たに診断される趨勢で、韓国内でも人口の老齢化に伴いその発病率及び癒病率が継続増加するものと予想される。組織病理学的には黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ  ｎｉｇｒａ）に位置するドパーミン神経細胞の消失が特徴的に現れ、その神経繊維の投射部位である尾状核（ｃａｕｄａｔｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ）と被核（ｐｕｔａｍｅｎ）のドパーミンが減少して特徴的な震顫（ｔｒｅｍｏｒ）、運動遅延（ｂｒａｄｙｋｉｎｅｓｉａ）、硬直（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）、姿勢の障害（ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｏｓｔｕｒｅ）等運動及び頭脳機能障害が現れる。
【０００７】
パーキンソン病に使用される主な治療薬物は、脳で不足するドパーミンの機能を補充してくれる薬剤又はその他神経細胞の破壊を、予防又は遅延させようとする目的やその他うつ病等の付随的な症状を調節する為の薬物治療等がある。代表的な薬物にはドパーミン前躯物質であるレボドパ（ｌｅｖｏｄｏｐａ、Ｌ−ｄｏｐａ）成分のマドパ（Ｍａｄｏｐａｒ）、ドパーミン受容体アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）成分のブロミジン（ｂｒｏｍｉｄｉｎｅ）、リシュライド（ｌｉｓｕｒｉｄｅ）、さらに、抗アセチルコリン性薬物であるアルタン（ａｒｔａｎｅ）、コゲンチン（ｃｏｇｅｎｔｉｎ）等の多様な神経薬理学的補償性治療薬剤があげられる。この内、ドパーミンの前躯体であるレボドパは不足する脳内ドパーミンの濃度を補充させることにより、パーキンソン病の症状を改善させるのに最も効果的に使用されているものの、３−５年以上長期間投与すると、薬物効果時間が漸次短くなるか（ｗｅａｒｉｎｇ−ｏｆｆ）、薬物の効果に対する運動調節機能の変動が甚だしくなる現象（ｏｎ−ｏｆｆ現象）、異常運動症（ｄｉｓｋｉｎｅｓｉａ）等の副作用が現れている（Ｆｒｅｅｄ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１５４９−５５（１９９２））。
【０００８】
その他にもパーキンソン病の外科的治療法として視床切断術（ｔｈａｌａｍｏｔｏｍｙ）と胆瘡球切断術（ｐａｌｌｉｄｏｔｏｍｙ）、深部脳刺戟術（ｄｅｅｐ  ｂｒａｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）、神経細胞移植術（Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）等が行われている。しかしながら、治療効果の持続期間が患者によって大差を示し、稀には手術に伴う発声不全（ｈｙｐｏｐｈｏｎｉａ）、口音障害（ｄｉｓａｒｔｈｒｉａ；どもり症）、記憶力減衰等の副作用を同伴するとして知られている（Ｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５０：２６６−２７０（１９９８）；Ｓｈａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５０：４３４−４３８（１９９８））。
【０００９】
アルツハイマー病に対する最近の治療方法は、大脳皮質（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｏｒｔｅｘ）と海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）で機能損傷されたコリン作動性シグナリング及び伝達（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）によりアルツハイマー病が引き起こされる可能性に中心を置いている（Ｂａｒｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２１７（４５５８）：４０８−１４（１９８２））；及びＣｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２１９（４５８９）：１１８４−９０（１９８３））。このような脳の領域は記憶及び知能と連結されていることから、脳のこれらの部分の機能的欠陥は記憶及び判断に対する確実な損傷を与えて知的能力を喪失させる。神経信号伝達（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に損傷がなされる正確な過程が論争の対象にはなっているものの、老人斑（ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅ）及び神経原源繊維変化（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅ：ＮＦＴ）が神経損傷の主原因と見做される。アミロイドベータ（Ａβ）蓄積による老人斑はこの病の最も大きい特徴にして、アルツハイマー病は、死後剖検により確診が可能性である（Ｋｈａｃｈａｔｕｒｉａｎ，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．４２（１１）：１０９７−１０５（１９８５））。
【００１０】
アルツハイマー病の場合、コリン作動性シグナリングの損傷を抑制できるようにアセチルコリンの量を増加、又はアセチルコリンが長期間存在し得るようにするか、若しくは、神経細胞の伝達にアセチルコリンがより効果的に作用する薬物と治療法が開示されていて、アルツハイマー病患者等のアセチルコリン活性度を高める多くの化合物等が使用されている。現在最も効果的な方法はシナプスでアセチルコリンを速かに分解して神経信号伝達を遮るアセチルコリンエステラーゼの活性を抑制する方法である。実際にこのような阻害剤（例：ｔａｃｒｉｎｅ，ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ及びｒｉｖａｓｔｉｇｍｉｎｅ）等は現在ＦＤＡで認定したアルツハイマー病治療薬物として市場で流通されている。多くの場合、前記薬物等は病気の破壊的な進行を防ぐのに有効であるものの、神経系の病気以前状態への回復にはよく適用されていない。
【００１１】
或る化合物等は神経の一般的な健康状態を改善し、年を取るにつれて細胞の機能を正常的に維持することを目的としている。例えば、ＮＧＦとエストロゲンのような幾つかの薬物等は、神経の退化を遅延させる神経保護の役割をし、抗酸化剤のような他の薬物等は細胞の酸化を減少させ、正常的な老化の結果として現れる有害な細胞の損傷の増加を減少させる。アミロイドベータペプチドが蓄積される程度が多いとアルツハイマー病が深刻になるものの、神経炎空間（ｎｅｕｒｉｔｉｃ  ｓｐａｃｅ）にアミロイドベータの蓄積を遅延させると、アルツハイマー病の進行を遅延させるものと考えられている。アミロイド前躯体蛋白質（Ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＰＰ）がαー、βー、γーセクレターゼ等のような細胞内の蛋白質分解酵素等と組合わせで、多くの多様な形態等に進行されるものと思われる。しかしながら、アミロイドベータ蛋白質の形成過程が実際科学的に完全に糾明されていない為、アミロイドベータの形成を調節することは未だに可能でない。
【００１２】
アミロイドベータ蛋白質の蓄積が神経信号伝達に異常を来す過程は明確でない。ＡＰＰが異常に伝達されアミロイドベータが多く生成され、神経炎に蓄積されるとプラク形成が誘発される。従って、このような伝達反応に関与する多くの他の要因等（例：炎症反応等）はタウ（ｔａｕ）蛋白質のリン酸化を増加させ、ＮＦＴ等と対螺旋状フィラメント（ｐａｉｒｅｄ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔ：ＰＨＦ）等の蓄積を増加させ、結局神経の損傷を増加させる。このような要因等全て神経の機能障害を誘発して究極的にはアルツハイマー性の痴呆に進行を加速させる。
【００１３】
例えば、アルツハイマー病の影響を減少させる為の治療方法に対する開発が多く進行されてはいるものの、今のところ一時的な症状の改善を提供することである。結論的に現在アルツハイマー病治療は病気の進行過程を取戻すことではなく、病気の症状を改善することに焦点が絞られている。病気の生物学的な知識に対してはより多の知見があるものの、臨床例への適用結果は未だに成功していない。
【００１４】
アメリカ合衆国特許第５，５３２，２１９号は、４，４′−ジアミノジフェニルスルホン等を含むアルツハイマー病治療用組成物を開示していて、アメリカ合衆国特許第５，５０６，０９７号は、パラ−アミジノフェニルメタンスルホニルフルオリド又はエベラクトンＡを含むアルツハイマー病治療用組成物を開示しており、アメリカ合衆国特許第６，１３６，８６１号は、ビシクロ［２．２．１］ヘプタンを含むアルツハイマー病治療用組成物を開示している。
【００１５】
一方、ストレスは現代の社会人等に重要な健康上の問題として台頭しており、韓国の２０歳以上の成人の場合、１／３以上がふだん多くのストレスを受けており、１０代の場合、男性よりは女性が、さらに、年齢が高い程さらに多くのストレスを感じている。ストレスは個人の性格、趣味、解消法、周辺環境、統制能力等によりその強度が異なるものの、大部分うつ病を伴う。うつ病はストレスによっても発病する精神疾患にして、自殺のような極端な結果を呈することもあって、高い再発率と共に大きな再発率により極めて重要な疾患として認識されている。うつ病の原因はアドレナリン、ドパーミン又はセロトニン等のような脳神経伝達物質の欠陥であると糾明されつつあり、海馬部位の萎縮及び成人神経生成の抑制等の脳損傷も伴う。現在知られた代表的なうつ病治療剤には三環系抗憂鬱剤（ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ：ＴＣＡ）があるものの、副作用が大きい短所を有する。特に、アミトリプチリンは、韓国内では広範囲に処方されているものの、多様な副作用等多くの問題点を有している。８０年代米国で選択的セロトニン遮断剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅ−ｕｐｔａｋｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＳＳＲＩ）であるフルオキセチン（ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ）が開発され、ＴＣＡ等の副作用を克服して薬物順応度を大きく高め、治療失敗率を減少させることができ、１９９６年度世界２０の大手販売医薬品の内７位を占める程であった。しかしながら、ＳＳＲＩは効果の面でＴＣＡと比べて大差はなく、さらに、薬剤干渉が深刻である問題点を有している。
【００１６】
さらに、ストレスによる神経障害は持続的に誘発され、現在の治療方法はうつ病薬剤処方後再発防止の為の措置が特にない為、投与薬物の含量を減らして持続的に投与する水準にとどまっている。従って、ストレスによる神経細胞アポトーシスや神経伝達物質体系の矯正に優れた効果がある物質の開発が重要である。さらに、ストレスによるうつ病の治療の為に治療機関を訪問することを忌避したり、ストレスによりセロトニン神経系攪乱と脳損傷等が誘発されること等に対して看過する傾向も多く、実際にストレス性うつ病治療機能を有する機能性食品の必要性が極めて大きい。
【００１７】
既に世界各国では神経変性疾患の予防と治療剤開発に心血を注いでおり、その代表的な例としてアメリカ合衆国特許第６，０２０，１２７号は、人間の染色体５ｑ１３で神経性アポトーシス抑制蛋白質をコードする遺伝子を開示しており、アメリカ合衆国特許第６，２８８，０８９号は、ドパーミンニューロンのアポトーシスを抑制して神経変性疾患を治療できるピリジルイミダゾールを開示している。
【００１８】
しかしながら、今まで多様な脳神経系疾患に対する優れた神経保護効能と脳機能向上効果を有する予防及び治療用物質は勿論、正確な配列を画定する合成ペプチドに対する効能報告及び適用に対しては全無の実情である。
【００１９】
本明細書全体に亙り多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として挿入され、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】アメリカ合衆国特許第６，２４５，７５７号
【特許文献２】アメリカ合衆国特許第６，３８０，１９３号
【特許文献３】アメリカ合衆国特許第６，２８８，０４１号
【特許文献４】アメリカ合衆国特許第５，５８０，８６６号
【特許文献５】アメリカ合衆国特許第５，５３２，２１９号
【特許文献６】アメリカ合衆国特許第５，５０６，０９７号
【特許文献７】アメリカ合衆国特許第６，１３６，８６１号
【特許文献８】アメリカ合衆国特許第６，０２０，１２７号
【特許文献９】アメリカ合衆国特許第６，２８８，０８９号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｏｎｄｏ  ｅｔ   ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５０：２６６−２７０（１９９８）；Ｓｈａｎｎｏｎ  ｅｔ   ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５０：４３４−４３８（１９９８）
【非特許文献２】Ｂａｒｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２１７（４５５８）：４０８−１４（１９８２）
【非特許文献３】Ｃｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２１９（４５８９）：１１８４−９０（１９８３）
【非特許文献４】Ｋｈａｃｈａｔｕｒｉａｎ，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．４２（１１）：１０９７−１０５（１９８５）
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明者等は天然（ｎａｔｕｒａｌ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）シルク蛋白質又はシルクペプチドの機能を発揮できる合成ペプチドを得る為に、多様な方式でペプチドをデザインし、これらペプチド等に対する活性を調査した。結局、特定のアミノ酸配列パターンを有するペプチドが、天然シルク蛋白質又はシルクペプチドと殆ど同一な活性水準を現すことを確認することにより、本発明を完成した。
【００２３】
従って、本発明の目的は、シルク蛋白質−ミミッキングペプチドを提供することにある。
【００２４】
本発明の他の目的は脳神経疾患の予防又は治療用組成物を提供することにある。
【００２５】
本発明のさらに他の目的は、頭脳又は認知機能の増進の為の組成物を提供することにある。
【００２６】
本発明の他の目的は、酸化ストレスに関連する疾患、疾病又は異常の予防又は治療用組成物を提供することにある。
【００２７】
本発明の他の目的は脳神経疾患の予防又は治療方法を提供することにある。
【００２８】
本発明のさらに他の目的は、頭脳又は認知機能の増進方法を提供することにある。
【００２９】
本発明の他の目的は、酸化ストレスに関連する疾患、疾病又は異常の予防又は治療方法を提供することにある。
【００３０】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求範囲及び図面によりさらに明確になる。
【００３１】
本発明の一態様によれば、本発明は下記の一般式１で表示されるシルク蛋白質−ミミッキングペプチドを提供する：
一般式
Ｇｌｙ−Ｘaa1 −Ｇｌｙ−Ｘaa2           （１）
前記一般式において、Ｘaa1 はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、Ｘaa2はＡｌａ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇ；またはＸaa2 はＡｌａ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇに追加的にＧｌｙ−Ｘaa3が結合されているものであり、前記Ｘaa3はＴｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇである。
【００３２】
本発明者等は天然由来のシルク蛋白質又はシルクペプチドの機能を発揮できる合成ペプチドを得る為に、多様な方式で新規な配列のペプチドをデザインし、これらペプチド等に対する活性を調査した。結局、前記一般式１のアミノ酸配列パターンを有するペプチドが、天然シルク蛋白質又はシルクペプチドと殆ど同一な活性水準を示すことを確認した。
【００３３】
本発明は、新規なアミノ酸配列を有するシルク蛋白質−ミミッキングペプチドを提供する。
【００３４】
本明細書において用語“シルク蛋白質−ミミッキングペプチド”とは、天然由来のシルク蛋白質、又はシルクペプチドの生理学的活性を有する合成ペプチドを意味する。本発明者により、開発されたシルク蛋白質−ミミッキングペプチドは略語で“ＳＭＰ（Ｓｉｌｋ  Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）”と称す。
【００３５】
本明細書で用語“ペプチド”とは、ペプチド結合によりアミノ酸残基が互いに結合して形成された線状の分子を意味し、本発明のペプチドはアミノ酸残基４−５０個、好ましくは、４−４０個、より好ましくは、４−３０個、最も好ましくは、４−２０個である。
【００３６】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記Ｘaa1はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ又はＴｙｒで、より好ましくは、Ａｌａ又はＶａｌである。
【００３７】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記Ｘaa2はＡｌａ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ又はＳｅｒであり、より好ましくは、Ａｌａ又はＴｙｒであり、最も好ましくは、Ａｌａである。
【００３８】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記Ｘaa2はＡｌａ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ又はＳｅｒに追加的にＧｌｙ−Ｘaa3が結合されているものであり、前記Ｘaa3 はＴｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ又はＳｅｒである。この場合、一般式１は下記の通り一般式２として表示できる。
一般式２
Ｇｌｙ−Ｘaa1−Ｇｌｙ−Ｘaa2−Ｇｌｙ−Ｘaa3        （２）
前記一般式において、前記Ｘaa3はＴｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ又はＳｅｒである。
より好ましくは、前記一般式２において、Ｘaa3はＴｙｒ又はＶａｌである。
本発明の他の発明例によれば、前記Ｘaa３にはＧｌｙ−Ｘaa4が追加的に結合されていて、Ｘaa４はＴｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇである。
好ましくは、前記Ｘaa４ はＴｙｒ、Ａｌａ又はＶａｌである。
最も好ましくは、本発明のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ．１−４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３９】
本発明のペプチドは当業界に公知された化学的合成方法、特に、固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｈｐａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）により製造できる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ，ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ，Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１（１９８４））。
【００４０】
本発明のペプチドは、それ自体でも優れた安定性を呈するものの、安定性をさらに大きく向上させる為に、多様な保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｇｒｏｕｐ）が結合できる。保護基の例は、アミノ酸、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、最も好ましくは、アセチル保護基が本発明のペプチドに結合されている。
【００４１】
前記保護基は、本発明のペプチドの多様なアミノ酸残基に結合され得るものの、好ましくは、Ｎ−又はＣ−末端に結合されている。
【００４２】
本発明のペプチド配列の特徴は、Ｇｌｙ残基が一つの残基置きに周期的に位置することである。従って、前記一般式１に示される配列を含み、Ｇｌｙ残基がアミノ酸配列で一つの残基置きに位置するパターンを有するとすれば、アミノ酸配列の長さに関係なく本発明の範囲に属するものである。つまり、前記一般式１は本発明のペプチド配列の長さを限定する為のものでなく、本発明のペプチドを明確に表現する為に使用したものである。
【００４３】
本発明のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドは、天然−由来シルク蛋白質又はシルクペプチド（シルク蛋白質の加水分解物、参照：本発明者等の大韓民国特許第０４９４３５７号）の生理活性、例えば、神経細胞保護、脳神経疾患又は疾病の治療、頭脳又は認知機能の改善、酸化ストレス抑制、二日酔防止及び皮膚保湿改善等の活性を有しながらも、極めて優れた安定性を示す。特に、本発明のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドは、神経細胞保護、脳神経疾患又は疾病の治療、頭脳又は認知機能の改善、さらに、酸化ストレス抑制に極めて有効である。
【００４４】
さらに、本発明のペプチドは、従来の天然−由来シルク蛋白質又はシルクペプチドと比較して分子量が小さく、高い安定性を有することから、生体内ターゲットとする組織等に運搬（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）が容易である。ＳＭＰｓ自体が生体内運搬が円滑に行われ、他の薬物運搬システムの助け、生体内運搬が円滑になされる。ここに、医薬又は機能性食品として開発するのに極めて有利である。
【００４５】
従来のシルク蛋白質又はシルクペプチド原料等は均質でない為、多くの限界を有している。例えば、従来のシルク蛋白質又はシルクペプチドを使用して医薬及び機能性食品を開発するにおいて、一定した品質を有する原料を供給することが極めて難しかった。
【００４６】
本発明のＳＭＰｓは、従来のシルク蛋白質又はシルクペプチドと殆ど同一な生理学的活性を示し、上述した問題点を解決し得る方案を提示する。
【００４７】
本発明の他の態様によれば、本発明は上述した本発明のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドの有効量を含む脳神経疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
【００４８】
本発明の他の態様によれば、本発明は上述した本発明のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドの有効量を含む組成物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与することを含む脳神経疾患の予防又は治療方法を提供する。
【００４９】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は上述した本発明のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドの有効量を含む、頭脳又は認知機能の増進の為の組成物を提供する。
【００５０】
本発明の他の態様によれば、本発明は上述した本発明のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドの有効量を含む組成物を対象に投与する段階を含む、頭脳又は認知機能の増進方法を提供する。
【００５１】
本発明の他の態様によれば、本発明は上述した本発明のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドの有効量を含む、酸化ストレス関連疾患、疾病又は異常の予防又は治療用組成物を提供する。
【００５２】
本発明の他の態様によれば、本発明は上述した本発明のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドの有効量を含む組成物を対象に投与することを含む酸化ストレス関連疾患、疾病又は異常の予防又は治療方法を提供する。
【００５３】
本発明の組成物は、多様な脳神経疾患に適用することができ、好ましくは、神経変性疾患、虚血又は再潅流による疾患及び精神疾患に適用される。本発明の組成物により治療される前記神経変性疾患は、好ましくは、痴呆、ハンチントン病、パーキンソン病及び筋萎縮性側索硬化症があげられる。本発明の組成物により治療される前記虚血又は再潅流による疾患は、好ましくは、虚血性脳卒中である。本発明の組成物により治療される前記精神疾患は、うつ病、精神分裂症及び心的外傷後ストレス精神障害である。
【００５４】
さらに、本発明の組成物は、頭脳又は認知機能の増進に極めて効果的である。好ましくは、前記頭脳又は認知機能は学習能力、記憶能力又は集中力である。さらに、本発明の組成物は脳神経疾患に伴われる頭脳又は認知機能の悪化を改善するに極めて有効である。
【００５５】
このような本発明の組成物の神経系に関連する効能は、ほとんど神経細胞の保護活性に帰される。本明細書において用語“神経細胞”とは、中枢神経系、脳、悩幹、脊椎、中枢神経系と抹消神経系の接合部分等の構造をなすニューロン、神経支持細胞、グリア、シュワン細胞等を含む。本明細書において用語“神経細胞の保護作用”とは、神経性インサルト（ｎｅｒｖｏｕｓ  ｉｎｓｕｌｔ）を軽減又は改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）する作用、又は神経性インサルトにより損傷された神経細胞の保護又は回復させる作用を意味する。さらに、本明細書で用語“神経性インサルト”とは、多様な原因（例：代謝性原因、毒性原因、神経毒性原因及び化学的原因等）によりもたらされる神経細胞又は神経組織の損傷を意味する。
【００５６】
本発明のシルクペプチドによる神経細胞の保護作用は、多様な機構を介して発揮でき、例えば、神経細胞の死滅を抑制することにより発揮され、このような神経細胞の死滅としては神経細胞のネクローシス（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）及びアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を含む。本発明の組成物による神経細胞のアポトーシスの禁止は活性酸素種の発生抑制又はミトコンドリアの機能保護を介して達成されることができる（参照：実施例）。
【００５７】
さらに、本発明の組成物は酸化ストレスに関連する疾患、疾病又は異常を予防又は治療するにも極めて効果的である。
【００５８】
酸化ストレスは多様な疾病の原因になるものにして、一般的に、酸化力が極めて大きい物質、活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ、例：スーパーオキシド、パーオキシド、等）によりもたらされる。このような酸化ストレスは老化の主原因として作用する。本発明のペプチドは生体内の酸化ストレスを減少させる作用をし、例えば、活性酸素種の生成を抑制して酸化ストレスを減少させる。
【００５９】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の組成物により治療できる酸化ストレス関連疾患、疾病又は異常としては老化；トラウマ（外傷）、脳性麻痺、糖尿病性神経病症を含む中枢神経系障害；糖尿病性末梢神経病症及び外傷的神経損傷を含む末梢神経疾患；間歇性跛行及び動脈硬化を含む心血管系疾患；白内障；関節炎を含む筋−骨格系の疾患；又はイオン照射（ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ）に伴う異常を含む活性酸素種の発生を引き起こす外部環境に関連する異常、化学療法に伴う異常及び発癌物質に対する暴露に伴う異常があげられる。
【００６０】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明のペプチドはインターロイキン−１β（１Ｌ−１β）又は腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の生成を抑制して外傷損傷から脳を保護する。
【００６１】
本発明の組成物は薬剤学的組成物及び食品組成物に配合できる。
【００６２】
本発明の組成物が薬剤学的組成物である場合、本発明の組成物は（ｉ）本発明のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドの薬物学的有効量；及び（ｉｉ）薬剤学的に許容される担体を含む。本明細書で用語“薬物学的有効量”とは、上述した本発明のペプチドの効能および作用を発揮するに十分な量を意味する。
【００６３】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体としては、公知の製剤時に利用されるものであって、炭水化物類化合物（例；ラクトース、アミロース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、セルロース等）、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物性油（例；トウモロコシ油、綿実油、大豆油、オリーブ油、ココナッツ油）、ポリ（エチレングリコール）、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルがあげられるが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存料等を追加して含め得る。好適な薬剤学的に許容される担体及び製剤はＲｅｍｉｎｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【００６４】
本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与することができ、非経口投与の場合には静脈内注入、皮下注入、筋肉注入等で投与することができる。
【００６５】
本発明の薬剤学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年令、体重、性別、病状、食事、投与時間、投与経路、排泄速度及び使用される薬剤組成物に対する感応性のような要因等により多様であり、通常の熟練した医師は望む治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、好適な１日当たりの投与量は、０．００１−１００ｍｇ／ｋｇ（体重）である。投与は１日に１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
【００６６】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施し得る方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態で製造されるか又は多容量形態で製造できる。非限定的な剤形の例としては、油性又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか又は、抽出剤、エリキシル剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤形態の場合もあり得、分散剤又は安定化剤を追加的に含め得る。
【００６７】
本発明の組成物は、食品、特に健康食品組成物に製造できる。本発明の健康食品組成物は食品製造の際に、通常的に添加される成分、例えば、蛋白質、炭水化物、脂肪、栄養素及び香料を含むことができる。例えば、ドリンク剤として製造する場合には、有効成分としてのペプチド以外に香味剤又は天然炭水化物を追加成分として包含できる。天然炭水化物の非制限的例示としては、たとえばモノサッカライド（例えば、グルコース、フルクトース等）；ジサッカライド（例えば、マルトース、スクロース等）；オリゴ糖；ポリサッカライド（例えば、デキストリン、シクロデキストリン等）；糖アルコール（例えば、キシリトール、ソルビトール、エリトリトール等）があげられる。香味剤の非制限的例示としては、天然香味剤（例えば、タウマチン、ステビア抽出物等）及び合成香味剤（例えば、サッカリン、アスパルテーム等）があげられる。
【００６８】
本発明の特徴及び利点（ａｄｖａｎｔａｇｅｓ）を要約すれば下記の通りである：
（ｉ）本発明のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドは天然由来シルク蛋白質又はシルクペプチドの生物学的および生理学的活性を、殆ど同一な水準に維持しながらも、ペプチド固有の優れた特性、例えば、優れた安定性等を有する。
（ｉｉ）本発明のペプチドの分子量が非常に小さい為、分子量が大きい従来のシルク蛋白質又はペプチドが適用（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）できない範囲まで適用範囲を拡大できる。
（ｉｉｉ）本発明のペプチドは、分子量が小さい為、生体内適用の際、運搬（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）が極めて有利であり、従って、生体利用性（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）が優れている。
（ｉｖ）本発明の合成ペプチドを利用すれば、均質な医薬又は食品組成物を製造できる。従って、一定した品質を有する医薬又は食品組成物を提供することができ、医薬又は機能性食品として開発するにおいて極めて有利である。
（ｖ）本発明のペプチドは特に、神経保護活性が極めて優れ、多様な脳神経疾患の予防及び治療に利用できる。
【００６９】
前記にて詳細に説明した通り、本発明のシルク蛋白質−ミミッキングペプチドは天然−由来シルク蛋白質又はシルクペプチドとほとんど同一水準な生物学的および生理学的活性を維持しながらも、ペプチド固有の優れた特性、例えば、優れた安定性等を有する。さらに、本発明のペプチドは分子量が小さい為、分子量が大きい従来のシルク蛋白質又はシルクペプチドが適用（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）できない範囲まで適用範囲を拡大することができ、生体内適用の際、運搬が極めて有利で、従って、生体利用性（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）が優れている。本発明の合成ペプチドを利用すれば、均質な医薬又は食品組成物を製造することができる。従って、一定した品質を有する医薬又は食品組成物を提供することができ、医薬又は機能性食品として開発するにおいて極めて有利である。本発明のペプチドは特に、神経保護活性が極めて優れ、多様な脳神経疾患の予防又は治療に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、６−ＯＨＤＡ（６−ヒドロキシドーパミン）で処理されたドパーミン作動性の神経細胞において、本発明のペプチドの保護効果を示す写真である。対照群は６−ＯＨＤＡのみで処理した群である。
【図２】図２は、６−ＯＨＤＡを利用したドパーミン作動性の神経細胞アポトーシス動物モデル（パーキンソン病動物モデル）において、本発明のペプチド等の処理による行動異常保護効果を示すグラフである。
【図３】図３は、アミロイド蛋白質による海馬内神経細胞死滅（ｄｅａｔｈ）において、本発明のペプチドの神経細胞保護効果を示す写真である。
【図４】図４は、アミロイドベータ蛋白質による神経毒性に対する本発明のペプチド保護効果を受動回避行動実験で分析した結果を示すグラフである。
【図５】図５ａ−５ｂは、アミロイドベータ蛋白質による神経毒性に対する本発明のペプチドの保護効果を水中迷路学習記憶行動実験で分析した結果を示すグラフである。
【図６】図６ａ−６ｂは、アミロイドベータ蛋白質の神経細胞死滅に対する本発明のペプチドの保護効果を示し、図６ａは核分断の分析結果であり、図６ｂは、神経細胞生存率に対する分析結果である。図面で、ｏｌｉｇｏ１及びｏｌｉｇｏ２はそれぞれＳＭＰ−１及びＳＭＰ−４を示す。
【図７】図７ａ−７ｃは、活性酸素種による神経細胞死滅において、本発明のペプチドの保護効果を示す。
【図８】図８ａ−８ｃは、ミトコンドリアの機能異常を介した神経細胞死滅において、本発明のペプチドの保護効果を示す。
【図９】図９ａ−９ｂは、高濃度のブドウ糖による神経細胞損傷に対する本発明のペプチドの保護効果を示す。
【図１０】図１０ａ−１０ｂは、脳に直接的に加えられる外傷性（ｔｒａｕｍａｔｉｃ）神経細胞損傷に対する本発明のペプチドの保護効果を示す。
【図１１】図１１は、本発明のペプチドが炎症誘発性サイトカイン、インターロイキン−１β及びＴＮＦ−αのレベルに及ぼす影響を示すグラフである。
【００７１】
以下、実施例を介して本発明をより詳細に説明する。これら実施例はひたすら本発明をより具体的に説明する為のものであって、本発明の範囲がこれら実施例により制限されないことは、当業界で通常の知識を有する者において明らかなことである。
【実施例】
【００７２】
製造例１：本発明のペプチドの製造
シルク蛋白質の生理学的活性を発揮し、種々のアミノ酸配列を有するシルク蛋白質−ミミッキングペプチド配列をデザインした。デザインされた本発明のペプチド等は、（株）ペプトロン社に依頼して化学的に合成して製造した。合成されたペプチドは下記表１に整理されている。合成されたペプチドを“ＳＭＰ（Ｓｉｌｋ  Ｍｉｍｉｋｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）”と命名した。
【００７３】
【表１】
2010506907.tif 000003
【００７４】
実施例１：６−ＯＨＤＡによるドパーミン作動性神経細胞死滅における多様なペプチ    ドの神経保護効果
本発明のペプチド、ＳＭＰｓの神経細胞保護効果を確認する為に、パーキンソン病の主原因であるドパーミン作動性神経性細胞の死滅抑制効果を分析した。ステレオタキシックシステム（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ）を利用して、６−ＯＨＤＡ（６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ）を脳組織内に注入してドパーミン作動性神経性細胞の死滅を組織化学的染色方法を利用して確認した。
【００７５】
６−ＯＨＤＡによる動物神経毒性を確認する為に、５週令の雄マウス（ＳＡＭＴＡＣＯ，Ｋｏｒｅａ）を利用した。４週令の鼠を註文して１週間順応させ、ステレオタキシックシステム（ＫＯＦＴ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用して神経細胞死滅を誘導した。適応化した５週目のマウスを利用して実験をした。本実施例ではステレオタキシックシステムを利用して望む部位（ブレグマ後面０．０ｍｍ、正中線  側面  ２．０ｍｍ、硬膜腹面  ３．０ｍｍ；０．０ｍｍ  ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｔｏ  ｂｒｅｇｍａ；２．０ｍｍ  ｌａｔｅｒａｌ  ｔｏ  ｍｉｄｌｉｎｅ；３．０ｍｍ  ｖｅｎｔｒａｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｒｕａ）に６−ＯＨＤＡ（塩水内３μｇ／μｌ）を注入してモデルを製作した。本研究では６−ＯＨＤＡを黒質に注入した。ここはドパーミン作動性神経性細胞の神経突起と連結されている個所であって、除々にドパーミン作動性脳神経細胞を死滅させるに適当な位置である。６−ＯＨＤＡ注入後効果を確認しようとする、ＳＭＰｓを５ｍｇ／ｋｇの濃度で２週間腹腔投与した。その後、動物行動実験を行った各実験群を４％パラホルムアルデヒドを利用して固定した。このように固定した鼠の脳を摘出して４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで２４時間洗滌し、さらに１５，２０，２５及び３０％のスクロースを利用して４日間、固定された鼠の脳を脱水した。さらに、このように処理された脳を冷凍組織切片機を利用して切片を作った。３０ｍｍ厚さの脳切片をメチルグリーン組織化学染色方法を利用して染色し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  ５１０  ｍｅｔａ，Ｚｅｉｓｓ，Ｆｅｌｄｂａｃｈ，スイス）を利用してその影響を撮影した。
【００７６】
図１で示した通り、対照群（非処理群）では６−ＯＨＤＡを注入した方の脳組織内に染色されたドパーミン作動性神経細胞が発見されなかった。しかしながら、陽性対照群であるＭＤ（シルクタンパク質の酵素加水分解産物で処理したもの）とメラトニンを注入した動物の場合、効果的に６−ＯＨＤＡの毒性を保護していることが確認できた。さらに、本発明のＳＭＰｓを注入した場合、陽性対照群と類似して脳組織内に染色されたドパーミン作動性神経性細胞を発見することができ、ここに、本発明のペプチドは神経細胞死滅を抑制する活性を有することが分かった。
【００７７】
一方、陽性対照群に使用されるＭＤは本発明者等の先特許である大韓民国特許第０４９４３５７号に開示されたシルク蛋白質の酵素加水分解産物であるＢＧ１０１である。
【００７８】
実施例２：６−ＯＨＤＡを利用したドパーミン作動性神経細胞アポトーシス動物モデル（ＰＤ動物モデル）における本発明ペプチドの処理による行動異常防止効果
本発明のペプチドのドパーミン作動性神経細胞保護効果を、動物モデルを使用して行動実験により確認した。本研究は６−ＯＨＤＡでドパーミン性神経細胞が破壊された動物にアンフェタミン（Ａｍｐｈｅｔａｍｉｎ）を注入して非対称回転行動異常を誘導し、神経細胞保護物質等により行動異常がどれ程正常化できるかについて確認した。
【００７９】
本研究でアルツハイマー動物モデルは、５週令の雄マウス（ＳＡＭＴＡＣＯ，Ｋｏｒｅａ）を利用した。４週令のマウスを註文して１週間順応させ、ステレオタキシックシステム（ＫＯＦＴ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用して動物モデルを作った。順応した５週目のマウスを利用して実験を行った。本実験ではステレオタキシックシステムを利用して、望む部位（ブレグマ後面０．０ｍｍ、正中線  側面  ２．０ｍｍ、硬膜腹面  ３．０ｍｍ）に６−ＯＨＤＡ（塩水内３μｇ／μｌ）を注入してモデルを製作した。本研究では、６−ＯＨＤＡを黒質に注入した。ここはドパーミン神経細胞の神経突起と連結されている個所であって、除々にドパーミン性神経細胞を死滅させるに適した位置である。マウスに６−ＯＨＤＡを注入して２週後にアンフェタミン（ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ、０．１ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）により誘導された回転行動を１分３０秒間確認した。少なくとも４００回以上の非対称回転を行った動物モデルのみを利用して、毒性保護効果を確認した。５ｍｇ／ｋｇの濃度でそれぞれのＳＭＰｓを２週間腹腔投与した後、その効果を各行動実験で確認し、時間の経過とともに対照群に比べて非対称回転行動が極めて早く回復されることを確認できた。
【００８０】
本実験は、パーキンソン疾患動物モデルにおいて、本発明のシルク蛋白質ミミッキングペプチドが効果を示すか否かを確認することである。図２に示した通り、本発明のＳＭＰｓ，ＭＤ及びメラトニンの全てが動物中でドパーミン性神経細胞の死滅を効果的に抑制して動物の行動異常を正常化させていることが確認できた。
【００８１】
実施例３：本発明のペプチドのアミロイド蛋白質による海馬内神経細胞死滅からの神経    細胞保護効果
本研究はアミロイド蛋白質による海馬部位の神経毒性をＳＭＰｓが効果的に保護できるか否かを分析することである。メチルグリーン（ｍｅｔｈｙｌ  ｇｒｅｅｎ）によりアミロイド蛋白質のステレオタキシックシステムを利用した注入で海馬部位における神経細胞死滅を観察した。
【００８２】
アミロイドベータ蛋白質による動物毒性を確認する為に、５週令の雄マウス（ＳＡＭＴＡＣＯ，Ｋｏｒｅａ）を利用した。４週令の鼠を註文して１週間順応させ、ステレオタキシックシステム（ＫＯＦＴ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用して疾病動物を作った。順応された５週目のマウスを利用して実験を行った。本実験ではステレオラクシキシステムを利用して望む部位にアミロイドベータ１−４２蛋白質（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  ＣＡ  ＵＳＡ）を４ｎｍｏｌ／５μｌ注入してモデルを製作した。本研究ではアミロイドベータ蛋白質を脳室内ゾーン（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）に注入した。このゾーンは左右の半球が連結されているゾーンであって、左右両半球全体においてアミロイドベータ蛋白質の影響を受けるようになる。アミロイドベータ蛋白質注入後の効果を確認する為、ＳＭＰｓを５ｍｇ／ｋｇの濃度で２週間腹腔投与し、動物行動実験を進行した各実験群を４％パラホルムアルデヒドを利用して固定した。このように固定したマウスの脳を摘出して４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで２４時間洗滌し、さらに１５，２０，２５，３０％のスクロースを利用して４日かけて脱水を行った。このように処理された脳を冷凍組織切片機を利用して切断して３０ｍｍ厚の切片を製造し、メチルグリーン組織化学染色方法を利用して染色後、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  ５１０  ｍｅｔａ，Ｚｅｉｓｓ，Ｆｅｌｄｂａｃｈ，スイス）を利用して撮影した。
【００８３】
図３に示されるように、本発明のＳＭＰｓがアミロイド蛋白質による神経細胞死滅を効果的に抑制していることを確認できた。外側脳室(lateral ventricle)に注入したＳＭＰｓは効果的に海馬内の歯状回部位の神経細胞死滅を保護した。
【００８４】
実施例４：本発明のペプチドのアミロイドベータ蛋白質による神経毒性保護効果（受動回避行動実験）
本実験は神経細胞毒性物質による動物モデルの学習及び記憶力低下において、各ペプチド別保護効果を受動回避動物実験方法を介して確認することである。学習実験を行う前に、アミロイドベータ蛋白質をステレオタキシックシステムを介して外側脳室を介して注入して、アルツハイマー疾患動物モデルを確立した。さらに、３日目から持続的に実験が進行する間、それぞれのペプチドＳＭＰｓを５ｍｇ／ｋｇの濃度で２週間腹腔投与した。
【００８５】
各ペプチド別保護効果を確認する為の受動回避行動実験機構としては、自動化されたシャトル箱（Ｍｏｄｅｌ  ＰＡＣＳ−３０，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を利用した。シャトル箱は間仕切りドア（３″Ｌ×２．６２５″Ｗ）により、同じ大きさ（１９″Ｌ×９″Ｗ×１０．８７５″Ｈ）の二つの室に分割されており、床には電流が流れるように装置されており、ヒンジプレキシグラスリッド（ｈｉｎｇｅｄ  ｐｌｅｘｉｇｌａｓｓ  ｌｉｄ）に載せた２０Ｗ電球で各室を照明するようにした。白鼠は間仕切りドアを介して騒音が６０ｄＢ以下で、照明を暗くした暗い室に入ることができる。白鼠を最初には灯がついている室に入れて間仕切りのドアを開けてやると、室内のあちこちを調べて暗い室へと移行するようになるものの、この時、間仕切りのドアが自動的に閉まりながら照明が消えるようになる。この訓練過程を白鼠が２０秒内に暗い室に戻るまで継続実施した。訓練過程を終えた２４時間後、再び白鼠を照明がある室に入れた後、暗い室に入ると間仕切りのドアが閉まり、シャトル箱の底に３秒間電流（１ｍＡ）が流れるようにした。アミロイドベータ蛋白質（塩水中８ｎｍｏｌ／５μｌ）の外側脳室注入２週後、再度この白鼠をシャトル箱の照明がある室に入れた後、暗い室に移行するまでの時間を測定した。最大で暗い部屋に入らない時間を５分にして実施した。
【００８６】
図４で確認できるように、本発明のＳＭＰｓはＭＤとメラトニンと殆ど同一な水準で神経細胞保護を介した学習及び記憶力低下を抑制することが確認できた。電気刺戟を与える前に学習が進行される速度をみても確かに対照群と比較するに、３０秒以下に維持されることを確認することができ、２４時間経過後電気刺戟に対する記憶維持の確認においても対照群と比較した時、有意差のある結果を示した。
【００８７】
実施例５：本発明のペプチドのアミロイドベータ蛋白質による神経毒性保護効果（水中迷路学習記憶行動物実験）
本実験の目的は神経細胞毒性物質による動物モデルの学習及び記憶力低下を防止するかどうかを、各物質別保護効果を水中迷路動物実験を介して確認することである。学習実験を進行する前にアミロイドベータ蛋白質をステレオタクシキシステムを介して外側脳室を通じて注入してアルツハイマー疾患動物モデルを確立した。さらに、手術３日目以降から持続的に水中迷路行動実験が進行される７日間それぞれの物質等を腹腔投与した。先ず、５日間学習の進行程度及び周囲環境を認知して記憶を形成する時間を確認し得るレファレンステストを行った。
【００８８】
アミロイドベータ蛋白質を注入したモデル製作をした後、２週間持続的にそれぞれのペプチドＳＭＰｓを５ｍｇ／ｋｇの濃度で注入した鼠に水中迷路実験を開始した。黒色のプラチック材質の水槽をゲージに利用し、径が１２０ｃｍで黒色に塗られた金属材質の円形プラットホーム（１４×１４ｃｍ）を水線の下１ｃｍに位置させてかくして、実験を行った。プラットホームは水槽の壁の間に位置し水槽を４区域に分けた。東西南北に分けた水槽の４区域でそれぞれ出発することにして無作為に出発点を定めた。反応潜時（Ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅ）は出発地点からプラットホームに到着した時間として定義した。イメージ分析機器（ＳＭＡＲＴ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｂａｓｉｃ  ｖｅｒｓｉｏｎ，Ｆｒａｍｅ  Ｇｒａｂｂｅｒ  ｂｏａｒｄ，Ｐａｎｌａｂ  ｓ．ｌ．，Ｄｅｎｍａｒｋ）が連結されたコンピュータを利用して水槽における水泳行動様相を観察した。最初水槽にマウスを入れた後、３秒後に分析と機械作動が開始され、プラットホームで２秒間とどまると自動的に記録が停止するようにデザインした。本実験は４日間それぞれ４回ずつ出発位置を異にして、同じ条件で実験が進行され、それぞれ反応潜時を記録して分析比較した。この際、分析はワーキングメモリとして分析され、これは短期記憶とも分析され得る。さらに、５日目は同じ条件でプラットホームのみを除去して、元のプラットホームが存在していた位置を探して行く回数を測定した。これはレファレンス記憶として分析され、長期記憶とも分析され得る。この際、最長の時間の基準は５分とし、プラットホームを探して行く回数を分析する時間も５分を基準にした。反応潜時（Ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅ）の変化は記憶力の減退と回復を示すものの、この時間が長引く程記憶力が上昇したことを意味する。
【００８９】
図５ａ及び図５ｂに示した通り、対照群と比較して投与した全ての物質等が似た効果を示すことを確認することができた。実際、すべての処理された群は誤差範囲内で効果が同一であることを確認できる結果である。さらに、５日間の学習が終わった後、２４時間後に再び水中迷路テストを行ったとき、記憶がどれ程維持されるかをワーキングテストを通じて確認できた。本結果によれば、学習の維持において５日目のテストの速度と、７日目テストの速度を比較するに、学習と記憶の維持においても全ての物質で殆ど差がないことを確認できた。
【００９０】
従って、本発明のＳＭＰｓは神経毒性から神経細胞を保護することにより、学習と記憶の形成のみならず、記憶の維持に優れた効能を発揮することが分かった。
【００９１】
実施例６：本発明のペプチドのアミロイドベータ蛋白質による神経細胞死滅に対する保護効果（神経細胞生存率及び核分断による細胞死滅分析）
アミロイドベータタンパク質の神経細胞毒性に対する本発明のＳＭＰｓの保護効果を確認する為に、神経細胞の生存率と細胞死滅の証拠である核分断形態を評価した。動物実験を介したアミロイドベータ蛋白質に対する保護効果が、どのような経路を経て起こるのか確認しようと神経細胞腫の細胞毒性影響とその細胞の核損傷を観察した。実験に使用される“ｃｏｓｍｏ”物質は、ＭＤ物質と同じ方式で製造されたものにして、別の配置で製造されたことを示す。
【００９２】
アミロイドベータ蛋白質による神経細胞腫の細胞毒性影響を確認する為に、ＭＴＴ還元分析を行い、この為に人間神経母細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ）であるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ）をＰＥＩ−コーティングされた９６−ウェルプレートに４０，０００ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で置いた。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞はＤＭＥＮに１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を補充した培養液で培養し、実験２時間前に低血清培地（ＤＭＥＭ  ｗｉｔｈ  １％  ＦＢＳ）に変えてそれぞれの試験物質をインキュベートした。ＭＴＴ還元分析は既に報告された方法（Ｓｈｅａｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ，Ｓｃｉ，９１（４）：１４７０−４（１９９４），Ｓｈｅａｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６５（１）：２１８−２７（１９９５），及びＫａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６５（６）：２５８５−９３（１９９５））を変形して行った。培養された細胞にアミロイドベータ蛋白質を処理した後、３７℃、５％ＣＯ2恒温器で培養した後、４８時間後にＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム  ブロミド；Ｓｉｇｍａ］溶液を最終濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ濃度になるように各ウェルに添加した後、４時間半培養した。ＳＭＰｓ処理はアミロイドベータ処理前に２時間かけて１０ｆＭの濃度で行った。ＭＴＴの還元により形成されたホルマザン沈殿物（ｆｏｒｍａｚａｎ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）を溶解液（無水イソプロパノール中、０．１  Ｎ  ＨＣｌ）に溶解後、ＥＬＩＳＡリーダを利用して５７０ｎｍでの吸光度を測定した。各試料の値は、該当する溶媒のみを追加した対照群値を１００％とし、０．９％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００により細胞が完全に破壊された時のＭＴＴ還元程度を０％にして相対的値で表示した。
【００９３】
アミロイドベータ蛋白質による核染色体等の形態変化は、ＤＮＡ−結合フルオロクロームビスーベンズ（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８  ｄｙｅ）で染色して観察した。培養されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に１０ｆＭの濃度のＳＭＰｓと２時間インキュベートした後、２０μＭの濃度のアミロイドベータ蛋白質と２４時間インキュベートした。処理された０．５−３．０×１０6 細胞を３００ｘｇで１０分間遠心分離して集めた後、ＰＢＳで洗滌し、細胞を５０μｌのパラホルムアルデヒドに懸濁した後、常温で１０分間固定した。細胞をＰＢＳで洗滌し、１６μｇ／ｍｌのビスーベンズイミドを含むＰＢＳ１５μｌと、常温で１５分間放置し、した後、１０μｌのアリコートをスライドガラスに載せて蛍光顕微鏡下でアポトーシス性の核染色体の変化を観察した。
【００９４】
図６ａ及び６ｂはそれぞれ核分断及び細胞生存率実験結果である。図面でｏｌｉｇｏ１及びｏｌｉｇｏ２はそれぞれＳＭＰ−１及びＳＭＰ−４を示す。
【００９５】
先ず、神経細胞ＳＫ−Ｎ−ＳＨをアルツハイマー誘発主要物質であるアミロイドベータ蛋白質で処理した際、約５５％程度の細胞死滅が誘発され、本発明のｏｌｉｇｏ１及びｏｌｉｇｏ２を処理した時、ＭＤ及びｃｏｓｍｏと同様に細胞死滅を劇的に抑制することを確認できた。
【００９６】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８染色を利用してＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の核形態変化を観察した結果、アミロイドベータ蛋白質とインキュベートした場合、対照群に比べて深刻な核凝縮と分断現象が観察されたが、本発明のｏｌｉｇｏ１及びｏｌｉｇｏ２でインキュベートした時には、アミロイドベータ蛋白質単独処理群で観察された核凝縮と分断現象がＭＤ及びｃｏｓｍｏ水準にまで優れた阻害効果を示した。
【００９７】
従って、本発明のＳＭＰｓは神経毒性物質による核分断を抑制することにより、神経細胞の死滅を防ぎ、究極的には神経細胞の保護作用をすることが分かる。
【００９８】
実施例７：活性酸素種による神経細胞死滅に対する本発明のペプチドの保護効果
本発明者等は上述した本発明のペプチドの神経細胞の毒性に対する保護がどのような経路を経て起こるのか確認する為に、アミロイドベータ蛋白質による神経細胞毒性で重要な信号伝達経路として知られた活性酸素種（ＲＯＳ）の量を分析した。ＤＣＦ−ＤＡ染色方法を利用して活性酸素の量を定量化し、蛍光顕微鏡を利用してその形態も観察した、
【００９９】
先ず、培養したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ）に１０ｆＭの濃度のＳＭＰｓで２時間処理し、次いで２０μＭの濃度のアミロイドベータ蛋白質で処理した。その後、細胞をＨＣＳＳ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，２．３ｍＭ  ＣａＣｌ2 ，１２０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＮａＯＨ、５ｍＭ  ＫＣｌ，１．６ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、１５ｍＭグルコース）に溶解させた、１０μＭのＤＣＦ−ＤＡ（６−カルボキシ−２′，７′−ジクロロ−ジヒドロ  フルオレセイン  ジアセテート，ジカルボキシメチルエステル）と懸濁補助剤である２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を３７℃で３０分間インキュベートした。細胞内自由ラジカルによるＤＣＦ蛍光は室温で水銀ランプ蛍光装置を備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０倒立顕微鏡で観察し（励起波長＝４８８ｎｍ，発光波長＝５１０ｎｍ）、ＣＣＤカメラで画像を取り、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  １．６５プログラムを利用して映像分析するか、又はフローサイトメーター（ＧＥＮｉｏｓ，Ｔｅｃａｎ，ＮＣ，ＵＳＡ）を利用して４８５ｎｍ励起波長と５１０ｎｍ発光波長で測定した。
【０１００】
図７ａに示した通り、本発明のｏｌｉｇｏ１及びｏｌｉｇｏ２はＭＤ及びｃｏｓｍｏと同一水準に活性酸素種の量を減少させることを確認し、ｏｌｉｇｏ２が１に比べて相対的に若干効果が優れた。これは先に、行動実験を介して糾明された内容と或る程度一致する。さらに、図７ｂ及び７ｃの蛍光顕微鏡分析結果からも、本発明のペプチドが活性酸素種を効果的に抑制することが確認できた。
【０１０１】
従って、本発明のペプチドは活性酸素種の発生を妨害することにより、神経細胞死滅を抑制することが分かる。
【０１０２】
実施例８：ミトコンドリアの機能異常を通じた神経細胞死滅に対する保護効果
最終的に、細胞内エネルギー代謝に極めて重要な役割をする細胞ミトコンドリアに対する本発明のペプチドの効果を分析した。実際に、アミロイドベータ蛋白質は、細胞内活性酸素種の量の増加を引き起こすと共に、核の分断とミトコンドリア膜の機能異常、ミトコンドリアの機能損失まで誘発することが既に報告されている。従って、本発明を介して、細胞生存に密接な影響を及ぼすミトコンドリアの機能維持に本発明のＳＭＰｓがどのような役割をするかを観察した。
【０１０３】
アミロイドベータ蛋白質により、ミトコンドリアの機能低下が伴われるか否かを確認する為に、ミトコンドリア膜電位差に特異的な蛍光染色試料であるＴＭＲＥ（テトラメチル  ローダミン−エチルエステル，分子プローブ）による蛍光染色を利用してアミロイドベータ蛋白質により、ミトコンドリアの膜電位差崩壊が誘発されるか否かを確認した。正電荷にされたＴＭＲＥはミトコンドリアの膜電位差によりミトコンドリア膜の内側に移動し、染色される蛍光の強度により膜電位差の正常な維持を示す。培養されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ）を１０ｆＭの濃度のＳＭＰｓで２時間処理し、次いで２０μＭの濃度のアミロイドベータ蛋白質で６時間処理した。処理されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ）は１００ｎＭの濃度のＴＭＲＥで３７℃で１５分間インキュベートされ、フルオレメトリーを利用して励起５４９ｎｍ、発光５７４ｎｍで蛍光強度を測定し、蛍光映像は蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０）を利用し、ＣＣＤカメラを利用して観察した。
【０１０４】
アミロイドベータ蛋白質で処理した時、膜異常を測定できるＴＭＲＥ染色方法を適用すると数値の低下が誘発され、神経細胞のミトコンドリア膜の電位差異常が確認された（図８ａ）。しかしながら、本発明のペプチドｏｌｉｇｏ１とｏｌｉｇｏ２でインキュベートした細胞では、このようなミトコンドリア膜異常が観察されず、蛍光顕微鏡で観察した形態学的観察においても、健康にその機能を維持していることが確認できた（図８ａ−８ｃ）。
【０１０５】
前記の結果は、本発明のペプチドｏｌｉｇｏ１とｏｌｉｇｏ２が細胞の生存に重要な役割をするミトコンドリア機能を保護し、効果的に維持し得ることを示している。つまり、本発明のペプチドがミトコンドリアの機能維持等を介してアミロイドベータ等の毒性で細胞を効果的に保護し、細胞死滅を抑制することが分かる。
【０１０６】
実施例９：高濃度ブドウ糖による神経細胞の損傷に対する保護効果
生体内に高濃度で糖が維持される糖尿病は細胞組織に多くの損傷を誘発し得る状況を作る。本実験は糖尿病モデルを反映し得る高濃度のブドウ糖（３５ｍＭ）でＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経細胞の損傷を確認し、この際、ＳＭＰｓの保護効果を確認しようとした。図９ａに示した通り、高濃度の糖が維持された時、３時間以降から神経細胞の死滅が観察され、アポトーシスの形態を示すものと確認された。しかしながら、本発明のペプチドｏｌｉｇｏ１及びｏｌｉｇｏ２で処理した場合には、このようなアポトーシスが効果的に抑制されることが示された。細胞生存率が約３０％以上にまで向上したことを観察することができた。
【０１０７】
糖による神経細胞死滅において、ある信号伝達機転を経て、本発明のペプチドが保護作用するか否かを確認する為に、ｐ−Ａｋｔｓとｐ−ＪＮＫを蛋白質電気泳動方法を介して確認した。
【０１０８】
図９ｂに示した通り、３５ｍＭのブドウ糖で処理した際、ｐ−Ａｋｔは処理後３０分から持続的に減少し始め、３時間後、最も小さいｐ−Ａｋｔを示した。しかしながら、本発明のペプチドで処理した際、細胞の生存に大きな影響を及ぼすｐ−Ａｋｔの活性が極めて劇的に向上された。特に、ｏｌｉｇｏ１で処理した時、ｐ−Ａｋｔの活性が最大となり、他の蛋白質も似た水準に細胞の生存率を高める為に、重要なＡｋｔの活性を向上させることを示した。さらに、細胞の死滅で重要な役割をすると報告されたｐ−ＪＮＫ蛋白質の活性度を蛋白質電気泳動方法を利用して確認した。図９ｂに示した通り、ブドウ糖を処理して３時間後に最も高いｐ−ＪＮＫ活性度を示し、本発明のペプチドを特に、ｏｌｉｇｏ１を処理した時、効果的にｐ−ＪＮＫの活性度を抑制した。
【０１０９】
結論的に本発明のペプチドはｐ−Ａｋｔの活性を高め、相対的にｐ−ＪＮＫの活性を抑制し、神経細胞のアポトーシスを効果的に抑制するものと判断される。さらに、この結果は糖尿病患者において、本発明のペプチドが高濃度の糖に露出された神経細胞の損傷を保護して神経細胞のアポトーシスを効果的に抑制できることを示すものである。
【０１１０】
実施例１０：脳に直接的に加えられる外傷性神経細胞損傷に対する保護効果
本発明者等は直接的に脳に物理的衝撃を加えた時、ペプチドにより損傷が回復されるか否かを確認する為に、５週令マウスを利用して実験を行った。全体的に１７ゲージニードルトラックを作り、この時起こる損傷をペプチドが効果的に抑制して炎症作用を減少できるか否かを確認した。動物は全て５週令で、実験群毎に５匹以上で、Ｔ−ｔｅｓｔを使用して統計的に計算した。実験結果は組織の回復機能に損傷を与え４週以降に確認したものである。上の結果によれば脳に物理的な損傷を与えた後、ＰＢＳを損傷部位に注入した場合（Ｓｈａｍ群）は損傷部位に炎症作用によりさらに損傷の悪化が確認された。しかしながら、本発明のペプチドで処理した時、効果的に損傷部位が回復されることを確認することができた（図１０ａ）。極めて驚くべきことに、損傷部位が治療されていることを明瞭に確認することができた。このような損傷部位を正確に比較する為にわれわれは、４．７Ｔ  ＭＲＴ（核磁気共鳴画像法：ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ）を利用して確認した（図１０ｂ）。図１０ｂに示した通り、物理的衝撃部位は損傷を受けて壊死するものの、本発明のペプチドを損傷以降に病変部位に注入した場合、効果的にこのような損傷を保護していることを確認することができた。
【０１１１】
前記損傷に対する治療効果は、どのような信号伝達機転により起こるかを確認した。前記にて観察した多くの実験結果等により本発明のペプチドが細胞の死滅を効果的に抑制し、特に活性酸素種を含む多様な毒性の影響を除去し得ると言う判断を基に、このような機能がインターロイキン−１β及びＴＮＦ−αを含む代表的な炎症誘発サイトカインに及ぼす影響をＥＬＩＳＡ−検出キットを使用して確認した。測定する為の脳組織は損傷を与え１２時間後に採り、損傷を受けた脳組織部位に局限して得た。先ず、最初ＩＬ−１βを確認した時、損傷部位において大脳皮質部位は、余りにも大きい組織的損傷が報告された為、周囲から起こる正確なサイトカインの量を測定することができなかった。損傷が加えられ炎症作用が活発に起こる海馬部位では、炎症誘発サイトカインが過量に維持されていることを確認した。しかしながら、本発明のペプチドで処理した動物の場合は、このようなＩＬ−１β因子が効果的に抑制されていることが確認できた（図１１）。同時にＴＮＦ−αについてもＩＬ−１βと類似した結果を示した（図１１）。なお、ＴＮＦ−α因子の場合でも余りにも大きい損傷部位のため、損傷周囲部をまともに反映できなかった大脳皮質部位よりも海馬部位でその差がはっきり現れた。本発明のペプチドを損傷部位に処理した場合、全てから海馬損傷周辺部位で炎症誘発サイトカインＴＮＦ−αが抑制されていることが確認できた。
【０１１２】
結果的にこれは極めて興味深い結果にして、全体的に本発明のペプチドが物理的損傷により発生する炎症作用を抑制することを示すものである。特に、持続的に炎症作用により損傷周辺部位の損傷が継続誘発されることを防ぎ、損傷周辺部組織の損失を防いで効果的に損傷部位を治療できるペプチドの効果を反映した結果と言い得るであろう。
【０１１３】
以上から本発明の特定した部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者に明らかな変更及び修正は本発明の範囲に含まれ、このような具体的な例示は単に好ましき実施態様であり、これらに本発明の範囲が制限されるものでないことは明らかである。本発明の実質的な範囲は添付された請求項とその均等物により定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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