(57)【要約】  本発明は、ＡＡＶ複製機構を使用した、細胞における対象の遺伝子産物の産生を増強する方法を提供する。本発明はさらに、本発明の方法で使用する細胞及び本発明の細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の遺伝子産物を産生する方法であって、
ａ）ｉ）細胞において遺伝子産物の発現を駆動することができるプロモーターに作動可能に連結している、対象の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットであって、少なくとも１つのパルボウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列が隣接する第１の発現カセットと、
ｉｉ）細胞においてＲｅｐタンパク質の発現を駆動することができるプロモーターに作動可能に連結している、少なくとも１つのパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、少なくとも第２の発現カセットと
を含む細胞を提供するステップと、
ｂ）ａ）で定義された細胞を、第１及び第２の発現カセットの発現を促す条件下で培養するステップと、
ｃ）任意選択で対象の遺伝子産物を回収するステップと
を含み、
第１の発現カセットが、細胞のゲノム中へ組み込まれておらず、細胞が、パルボウイルスＣａｐタンパク質及びパルボウイルスＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つを含まない方法。
【請求項２】
第１の発現カセットに、パルボウイルスＩＴＲヌクレオチド配列が両側に隣接している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２の発現カセットが、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質の少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含む読み枠を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第１及び第２の発現カセットが単一の構築物に存在し、構築物に少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲ配列が隣接している、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子産物がポリペプチド又は核酸である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
パルボウイルスＩＴＲ配列及びパルボウイルスＲｅｐタンパク質が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞が昆虫細胞である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
発現カセットの少なくとも１つがバキュロウイルスベクターに含まれている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞が哺乳類細胞である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が、パルボウイルスＣａｐタンパク質及びパルボウイルスＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つを含まない、請求項１から９までのいずれか一項において定義された細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の細胞を含む、非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内因性又は異種標的タンパク質の発現の増加を可能にする核酸構築物及び細胞系の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質の工業生産は、開発及び応用の広域に及ぶ。細胞１個当り又は培地１Ｌ当りの組換えタンパク質の収量は、改善された生産システムの開発のための重要な条件である。
【０００３】
組換えタンパク質、モノクローナル抗体又はワクチンの工業生産のために、哺乳類細胞又は昆虫細胞において遺伝子を発現させる現在の方法には、安定な細胞系の使用又はアデノウイルス、シンドビスウイルス、若しくはバキュロウイルス由来のベクターなど、ベクターを使用した産生細胞のトランスフェクションが含まれる。哺乳類細胞又は昆虫細胞において外因性遺伝子を導入する他の方法には、ＤＮＡの直接注入、リガンド−ＤＮＡコンジュゲートの使用、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡコンジュゲートの使用、リン酸カルシウム沈殿、及びリポソーム−又はポリカチオン−ＤＮＡ複合体を利用する方法が含まれる。
【０００４】
天然において、バキュロウイルスは、様々な異なる昆虫種に感染する二本鎖ＤＮＡ含有ウイルスである。バキュロウイルスの科は、２つの属に分けることができ、そのうちの１つが、核多角体病ウイルスである。核多角体病ウイルスは、感染した宿主細胞の核において準結晶の封入体の形成を誘発する。これらの封入体は、非常に高いレベルで発現する、単一のウイルスタンパク質、ポリヘドリンから主に成る。ポリヘドリン遺伝子は、クローニングされ、配列決定され、そのユニークな特徴は、一連のバキュロウイルス発現ベクターの開発の基礎となっている（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，ＴＡＥＳ  Ｂｕｌｌ．１５５５（１９８７）；Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７−５５（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｋ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１７７−１７９（１９８８）；米国特許第４，７４５，０５１号，Ｇ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍ．Ｄ．Ｓｕｍｍｅｒｓ（１９８３年５月２７日出願；１９８８年５月１７日発行））。
【０００５】
昆虫細胞とともに使用されるバキュロウイルス発現システムは、多用途性及び速度において有利であるために、タンパク質の産生について確立されたものとなった。バキュロウイルス発現システムでは、組換えバキュロウイルスベクターを使用して、昆虫細胞に対象の遺伝子を導入する。昆虫細胞への感染は、組換えバキュロウイルスベクターゲノムの複製をもたらし、それによって対象の遺伝子をコードする遺伝的な鋳型の数が増加し、組換えタンパク質発現のレベルが上昇する。
【０００６】
バキュロウイルス媒介タンパク質発現は、適切な生物活性及び機能を提供する、組換えタンパク質の正確な折り畳み、並びにジスルフィド結合の形成、オリゴマー化及び他の重要な翻訳後修飾を提供する。実際に、昆虫細胞における真核生物タンパク質のタンパク質折り畳み及び翻訳後プロセシングは、哺乳類細胞系にほとんど匹敵する。さらに、昆虫細胞は、無血清培地上で増殖することができ、それはコスト並びにバイオセイフティーの観点での利点である。バキュロウイルス媒介タンパク質発現の別の利点は、バキュロウイルスが、鱗翅目昆虫にのみ感染し、したがって脊椎動物に非感染性であり、比較的安全な遺伝子操作手段であることである。さらに、バキュロウイルス発現システムは、昆虫細胞において高いタンパク質発現レベルをもたらすテクノロジー基盤であることが既知である。バキュロウイルス発現システムの不利点は、産生細胞（昆虫細胞）への感染が、数日以内にその細胞に死をもたらし、対象の組換えタンパク質の連続的な産生を妨害することである。
【０００７】
Ｚｅｎｇら（２００７，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５：１０５５−１０６１）は、対象の遺伝子、並びにバキュロウイルス発現構築物をヒト胚性幹細胞のヒトゲノムにおけるＡＡＶＳ１部位へ組み込むためのＡＡＶ  ｒｅｐ７８／６８遺伝子及びＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含むバキュロウイルス発現構築物を開示している。
【０００８】
Ｓｏｌｌｅｒｂｒａｎｔら（２００１，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：２０５１−２０６０）は、ｒＡＡＶベクター産生のための、（ｉ）ＡＡＶ  ＩＴＲ配列が隣接する受容体遺伝子、（ｉｉ）ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子、及び（ｉｉｉ）ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子をそれぞれ含む、別々のバキュロウイルス構築物をトランスフェクトした哺乳類ＨＥＫ２９３細胞を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、今なお当技術分野において、昆虫細胞などの細胞において対象の遺伝子産物の産生レベルを増加させることが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
定義
本明細書では、「作動可能に連結している」という用語は、ポリヌクレオチド（又はポリペプチド）エレメント間の機能的な関係の連結を意味する。核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に配置された場合、「作動可能に連結している」。例えば、転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結している。作動可能に連結しているということは、連結されているＤＮＡ配列が、典型的に近接しており、２つのタンパク質コード領域を結合することが必要である場合、近接しており、さらに読み枠にあることを意味する。
【００１１】
「発現制御配列」は、それが作動可能に連結しているヌクレオチド配列の発現を調節する核酸配列を意味する。発現制御配列は、その発現制御配列が、ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御及び調節する場合、ヌクレオチド配列に「作動可能に連結している」。したがって、発現制御配列には、プロモーター、エンハンサー、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及び終止コドンが含まれる可能性がある。「発現制御配列」という用語には、少なくとも、その存在が発現に影響するように設計されている配列が含まれるものとし、追加の好都合な成分も含まれる可能性がある。例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列は、発現制御配列である。その用語には、望ましくない、枠内外の潜在的な開始コドンが配列から除去されるような、核酸配列の設計も含まれる可能性がある。それには、望ましくない潜在的なスプライス部位が除去されるような、核酸配列の設計も含まれる可能性がある。それには、ポリＡテイル、すなわち、ポリＡ配列と称される配列であるｍＲＮＡの３’末端にある一連のアデニン残基の付加を指示する配列、すなわちポリアデニル化配列（ｐＡ）が含まれる。それは、ｍＲＮＡの安定性を増強するように設計されている可能性もある。転写及び翻訳の安定性に影響を及ぼす発現制御配列、例えばプロモーター、並びに翻訳を実施する配列、例えばＫｏｚａｋ配列は、昆虫細胞において既知である。低発現レベル又は高発現レベルが達成されるように、発現制御配列は、それが作動可能に連結しているヌクレオチド配列を調節するような性質である可能性がある。
【００１２】
本明細書では、「プロモーター」又は「転写調節配列」という用語は、１つ又は複数のコード配列の転写を制御するように働き、コード配列の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、並びに転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位、及び直接的又は間接的にプロモーターからの転写量を調節するように作用することが当業者に既知のヌクレオチドの他の任意の配列を含むが、それらに限定されない、他の任意のＤＮＡ配列の存在によって構造的に識別される核酸断片を意味する。「構成的」プロモーターは、大部分の生理学的及び発達的条件下で大部分の組織において活性があるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、例えば化学誘導物質の適用によって、生理学的又は発達的に調節されたプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定のタイプの組織又は細胞においてのみ活性がある。
【００１３】
「実質的に同一の」、「実質的同一性」又は「本質的に類似の」若しくは「本質的類似性」という用語は、２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列が、例えば、デフォルトパラメーターを使用したＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムによって、最適に整列している場合、本明細書の他の場所で定義されるように、少なくともある割合の配列同一性を共有することを意味する。ＧＡＰは、ニードルマン−ブンシュグローバル配列アルゴリズムを使用して、それらの全長にわたって２つの配列を整列させ、マッチ数を最大にし、ギャップ数を最小にする。一般に、ＧＡＰデフォルトパラメーターは、ギャップ創造ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）で使用する。ヌクレオチドについて使用するデフォルトスコア行列は、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質についてのデフォルトスコア行列は、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ  ８９，９１５−９１９）。ＲＮＡ配列が、ＤＮＡ配列と本質的に類似している又はある程度の配列同一性を有するといわれる場合、ＤＮＡ配列におけるチミン（Ｔ）は、ＲＮＡ配列におけるウラシル（Ｕ）に相当すると考えられることは明らかである。パーセンテージ配列同一性についての配列アラインメント及びスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡ  から入手可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、１０．３版又はオープンソースソフトウェアＥｍｂｏｓｓ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（最新版２．７．１−０７）などのコンピュータプログラムを使用して決定することができる。代わりに、類似性又は同一性割合を、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのデータベースを検索することによって決定することができる。
【００１４】
本発明のＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、中程度の、又は好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２のヌクレオチド配列とハイブリダイズするそれらの能力によっても定義することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、本明細書では、少なくとも約２５、好ましくは約５０ヌクレオチド、７５又は１００、最も好ましくは約２００ヌクレオチド以上の核酸配列が、約６５℃の温度で、約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ又は匹敵するイオン強度を有するすべての他の溶液中で、ハイブリダイズすること及び６５℃で、約０．１Ｍ以下の塩を含む溶液、好ましくは０．２×ＳＳＣ又は匹敵するイオン強度を有するすべての他の溶液中での洗浄を可能にする条件として定義する。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、一晩、すなわち、少なくとも１０時間行い、好ましくは、洗浄は、洗浄液を少なくとも２回交換し、少なくとも１時間行う。これらの条件は、通常、約９０％以上の配列同一性を有する配列の特異的なハイブリダイゼーションを可能にすることになる。
【００１５】
中程度の条件は、本明細書では、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約２００ヌクレオチド以上の核酸配列が、約４５℃の温度で、約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ又は匹敵するイオン強度を有するすべての他の溶液中で、ハイブリダイズすること及び室温で、約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ又は匹敵するイオン強度を有するすべての他の溶液中で洗浄することを可能にする条件として定義する。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、一晩、すなわち、少なくとも１０時間行い、好ましくは、洗浄は、洗浄液を少なくとも２回交換し、少なくとも１時間行う。これらの条件は、通常、最大５０％の配列同一性を有する配列の特異的なハイブリダイゼーションを可能にすることになる。当業者は、５０％から９０％まで同一性が異なる配列を特異的に特定するために、これらのハイブリダイゼーション条件を修正することができるであろう。
【００１６】
「形質転換された」又は「トランスフェクトされた」という用語は、互換的に使用され、外因性ＤＮＡ又はＲＮＡが、適切な宿主細胞中へ移入又は導入されるプロセスを意味する。さらに、他の異種タンパク質をコードする核酸を、宿主細胞中に導入することができる。かかるトランスフェクトされた細胞には、挿入されたＤＮＡが宿主細胞において複製できるようになった、安定にトランスフェクトされた細胞が含まれる。典型的に、安定なトランスフェクションには、外因性ＤＮＡを、例えば、抗生物質耐性を与える核酸配列などの選択マーカー核酸配列とともに移入し、安定なトランスフェクタントの選択を可能にすることが必要である。このマーカー核酸配列は、外因性ＤＮＡに連結されていてもよく、又は外因性ＤＮＡとの同時の共トランスフェクションによって独立に提供してもよい。トランスフェクトした細胞には、ＲＮＡ又はＤＮＡを限られた時間発現する能力がある、一過性に発現する細胞も含まれる。トランスフェクション手順は、トランスフェクトする宿主細胞によって決まる。それには、ポリヌクレオチドをウイルス中にパッケージングすること並びにポリヌクレオチドの直接的な取り込みが含まれる可能性がある。形質転換によって、挿入されたＤＮＡが宿主細胞のゲノム中に組み込まれるか、又は挿入されたＤＮＡがプラスミドの形で宿主細胞内で維持される可能性がある。形質転換／トランスフェクションの方法は、当技術分野ではよく知られており、マイクロインジェクションなどの直接的注入、ウイルス感染、特に複製欠損性アデノウイルス感染、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウムを介した直接的取り込みなどが含まれるが、それらに限定されない。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、細胞における対象のタンパク質及び／又は核酸配列の産生を増強するためにＡＡＶ複製機構を使用する方法に関する。１つ又は複数のＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質及びＡＡＶ−ＩＴＲが隣接する核酸配列の同時発現は、対象のタンパク質の発現と、対象の核酸配列の転写コピー数の両方を増加させる。
【００１８】
パルボウイルス科のウイルスは、小型ＤＮＡ動物ウイルスである。パルボウイルス科は、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科、及び昆虫に感染するデンソウイルス亜科の２つの亜科に分けることができる。パルボウイルス亜科のメンバーは、本明細書では、パルボウイルスと称し、ディペンドウイルス属が含まれる。その属名から推定される可能性があるように、ディペンドウイルスのメンバーは、それらが通常、細胞培養における増殖性感染のためにアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの同時感染を必要とする点でユニークである。ディペンドウイルス属には、通常ヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長類（例えば、血清型１及び４）に感染するＡＡＶ、及び他の温血動物に感染する関連するウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジのアデノ随伴ウイルス）が含まれる。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のメンバーに関するさらなる情報は、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，「パルボウイルス科：ウイルス及びその複製（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，）」Ｃｈａｐｔｅｒ  ６９  ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（３ｄ  Ｅｄ．１９９６）に記載されている。便宜上、本発明を、ＡＡＶを参照することにより、本明細書においてさらに例示し説明する。しかしながら、本発明は、ＡＡＶに限定されず、同様に他のパルボウイルスに適用することができることが理解されよう。
【００１９】
すべての既知のＡＡＶ血清型のゲノム構造は、非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満である、直線状の一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質をコードするユニークなヌクレオチド配列に隣接する。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）は、キャプシドを形成する。末端１４５ｎｔは、自己相補的であり、Ｔ型ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二本鎖を形成することができるように、組織される。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製の開始点として働き、細胞性ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとしての機能を果たす。哺乳類細胞におけるｗｔＡＡＶ感染に続き、Ｒｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）が、それぞれＰ５プロモーター及びＰ１９プロモーターから発現し、両方のＲｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製においてある機能を有する。Ｒｅｐ  ＯＲＦにおけるスプライシング事象は、実際に４つのＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）の発現をもたらす。しかしながら、哺乳類細胞においてＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードするスプライスされていないｍＲＮＡは、ＡＡＶベクター産生に十分であることが示された。昆虫細胞においても、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質は、ＡＡＶベクター産生に十分である。
【００２０】
「組換えパルボウイルス又はＡＡＶベクター」（又は「ｒＡＡＶベクター」）は、本明細書において、１つ又は複数の対象のポリヌクレオチド配列、対象の遺伝子又はパルボウイルス若しくはＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する「導入遺伝子」を含むベクターを意味する。ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ  Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質）を発現している昆虫宿主細胞に存在する場合、かかるｒＡＡＶベクターを、複製し、感染ウイルス粒子中にパッケージングすることができる。ｒＡＡＶベクターが、より大きい核酸構築物（例えば、染色体又はクローニング若しくはトランスフェクションに使用するプラスミド若しくはバキュロウイルスなどの別のベクターにおける）中に組み込まれた場合、ｒＡＡＶベクターは、典型的に、ＡＡＶパッケージング機能及び必要なヘルパー機能の存在下で複製及びキャプシド形成によって「救済」することができる「プロベクター」と称される。
【００２１】
第１の態様においては、本発明は、対象の遺伝子産物を産生する方法に関し、その方法は、
ａ）ｉ）細胞において遺伝子産物の発現を駆動することができるプロモーターに作動可能に連結している、対象の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセットであって、少なくとも１つのパルボウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列が隣接する第１の発現カセットと、
ｉｉ）細胞においてＲｅｐタンパク質の発現を駆動することができるプロモーターに作動可能に連結している、少なくとも１つのパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、少なくとも第２の発現カセットと
を含む細胞を提供するステップと、
ｂ）ａ）で定義された細胞を、第１及び第２の発現カセットの発現を促す条件下で培養するステップと、
ｃ）任意選択で対象の遺伝子産物を回収するステップとを含む。
【００２２】
本発明の対象の遺伝子産物は、対象のポリペプチドでも対象のヌクレオチド（核酸）配列でもよい。ポリペプチドは、ジペプチド、トリペプチド、（オリゴ）ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を含め、どんな長さでのものでもよい。ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質という用語は、本明細書において互換的に使用することができることが理解されよう。ポリペプチドは、同種ポリペプチドでもよいが、本発明の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、宿主細胞にとって異種のポリペプチドである。
【００２３】
本発明によるヌクレオチド（核酸）配列は、ＲＮＡの形で存在することもあり、又はゲノムＤＮＡを含めたＤＮＡ、すなわち、イントロン、ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ及び混合ＤＮＡ−ＲＮＡ配列を含めたＤＮＡの形で存在することもある。
【００２４】
「同種」という用語は、所与の（組換え）核酸又はポリペプチド分子と所与の宿主生物又は宿主細胞との関係を示すために使用する場合、天然において、核酸又はポリペプチド分子が、同一種の、好ましくは同一の変種又は系統の宿主細胞又は生物によって産生されることを意味することが理解されよう。宿主細胞と同種である場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、典型的に、その天然環境のものとは、別のプロモーター配列又は該当する場合、別の分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に作動可能に連結していることになる。
【００２５】
「異種」という用語は、核酸又はポリペプチド分子に関して使用する場合、それが存在する生物、細胞、ゲノム又はＤＮＡ又はＲＮＡ配列の一部として天然には生じない、又はそれが天然に見出されるものとは異なる細胞又はゲノム若しくはＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列における１つ又は複数の位置において見出される、外来性細胞由来の核酸又はポリペプチドを意味する。異種核酸配列又はタンパク質は、それらが導入される細胞に内在しないが、別の細胞由来であるか又は合成的に若しくは組換えで産生されている。一般に、必ずしもそうではないが、かかる核酸は、そのＤＮＡが転写される又は発現する細胞によって通常産生されないタンパク質をコードし、同様に、外因性ＲＮＡは、その外因性ＲＮＡが存在する細胞において通常発現しないタンパク質をコードする。さらに、異種タンパク質又はポリペプチドは、それが移入される宿主生物、その組織又は細胞において通常見出されない順番及び／又は方向で配置された同種のエレメントから構成されていてもよく、すなわち、前述のタンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、同一の種由来であるが、その天然の形から組成及び／又はゲノム遺伝子座が人為的な介入によって実質的に改変されていることは既知である。異種核酸配列及びタンパク質は、外来性の核酸又はタンパク質とも称することができる。当業者が、それが発現する細胞にとって異種の又は外来のものとして認識するであろう、どんな核酸又はタンパク質も、本明細書では、異種核酸又はタンパク質という用語によって包含される。異種という用語は、核酸配列又はアミノ酸配列の非天然の組み合わせ、すなわち、組み合わせられた配列のうち少なくとも２つが互いに外来性である組み合わせにも適用される。
【００２６】
対象のポリペプチドは、工業的又は医学的（薬学的）に適用することができる。タンパク質又はポリペプチドの工業的適用例には、例えば、リパーゼ（例えば、洗剤工業で使用される）、プロテアーゼ（特に洗剤工業、醸造などで使用される）、細胞壁分解酵素（例えば、果物加工ワイン醸造など又は飼料で使用されるセルラーゼ、ペクチナーゼ、β−１，３／４−グルカナーゼ及びβ−１，６−グルカナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、プルラナーゼ、ガラクタナーゼ、エステラーゼなど）、フィターゼ、ホスホリパーゼ、グリコシダーゼ（例えば、アミラーゼ、βグルコシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、ラムノシダーゼ、アピオシダーゼなど）、乳製品用酵素（例えば、キモシン）などの酵素が含まれる。治療用、化粧用又は診断用に適用される、哺乳類、好ましくはヒトのポリペプチドには、酵素（酵素補充療法用）、ホルモン、ケモカイン、インターロイキン、（ヒト化）モノクローナル抗体などが含まれるが、これらに限定されない。例には、インスリン、アポリポタンパク質Ａ（好ましくはアポリポタンパク質Ａ１）又はＥ、血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＣＦＴＲ、第ＩＸ因子、ラクトフェリン、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ、好ましくはＬＰＬ  Ｓ４４７Ｘ、０１／００２２０参照）、ヘモグロビンα及びβ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＢＭＰ（骨形態形成タンパク質）、増殖因子（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦなど）、ペプチドホルモン（例えば、カルシトニン、ソマトメジン、ソマトトロピン、成長ホルモン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ））、サイトカイン又はインターロイキン（ＩＬ−ｘ）、インターフェロン（ＩＦＮ−ｙ）、インスリン受容体、ＥＧＦ受容体、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、網膜色素変性ＧＴＰ分解酵素調節因子結合タンパク質（ＲＰ−ＧＲＩＰ）、ポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）並びにアラニン：グリオキシル酸アミノ基転移酵素が含まれるが、これらに限定されない。さらに、単一鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ）が含まれる。例えば、熱不安定性の毒素Ｂサブユニット、コレラ毒素Ｂサブユニット、エンベロープ表面タンパク質Ｂ型肝炎ウイルス、キャプシドタンパク質ノーウォークウイルス、糖タンパク質Ｂヒトサイトメガロウイルス、糖タンパク質Ｓ、及び伝染性胃腸炎コロナウイルス受容体、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ−１）ｐ４０ｘ、ＨＴＬＶ−１  ｅｎｖ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）ｇａｇ、ｐｏｌ、ｓｏｒ、ｇｐ４ｌ、及びｇｐ１２０、アデノウイルスＥ１ａ、日本脳炎ウイルスｅｎｖ（Ｎ）、ウシパピローマウイルス１（ＢＰＶ１）Ｅ２、ＨＰＶ６ｂ  Ｅ２、ＢＰＶ１  Ｅ６、Ｂ型肝炎表面抗原、ＨＩＶ−１  ｅｎｖ、ＨＩＶ−１  ｇａｇ、ＨＴＬＶ−１  ｐ４０ｘ、キイロショウジョウバエＫｒｕｐｐｅｌ遺伝子産物、ブルータングウイルスＶＰ２及びＶＰ３、ヒトパラインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、インフルエンザポリメラーゼＰＡ、ＰＢ１、及びＰＢ２、インフルエンザウイルスＨＡ、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）ＧＰＣ及びＮタンパク質、アカパンカビ活性化タンパク質、ポリオーマウイルスＴ抗原、サルウイルス４０（ＳＶ４０）スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、Ｐｕｎｔａ  ＴｏｒｏフレボウイルスＮ及びＮｓタンパク質、サルロタウイルスＶＰ６、ＣＤ４（Ｔ４）、ハンタンウイルス構造タンパク質、ヒトＢリンパ向性ウイルス１３０ｋｄタンパク質、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトパルボウイルス−Ｂ１９のＶＰ１、ＶＰ１及びＶＰ２、非パルボウイルスキャップタンパク質、ブタコレラウイルスＥ２−糖タンパク質などを含めた、例えば、ワクチンとしての使用のための、原生動物、細菌、ウイルス抗原も含まれる。前述のポリペプチドの変異体又は類似体もさらに含まれる。
【００２７】
異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、細菌若しくはウイルスゲノム又はエピソーム、真核生物の核若しくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は化学的に合成されたＤＮＡを含めた、当技術分野で既知のあらゆる供給源から全体的又は部分的に得ることができる。対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、連続したコード領域を構成してもよく、又は適切なスプライスジャンクションが結合する１つ又は複数のイントロンを含んでもよく、さらには、天然に存在する又は合成の、様々な供給源由来のセグメントから構成されていてもよい。本発明の方法による対象のタンパク質をコードする核酸配列は、好ましくは、全長ヌクレオチド配列であるが、前述の全長ヌクレオチド配列の機能的に活性がある部分又は他の部分であってもよい。
【００２８】
好ましい実施形態において、対象のヌクレオチド配列は、任意のポリペプチドをコードすることができるが、好ましくは、工業的又は医学的（薬学的）に適用されるポリペプチドをコードすることができる。工業的又は医学的に適用されるポリペプチドの例は、上記で提供されている。
【００２９】
先の好ましい実施形態の代わりに、又はそれと組み合わせて、別の好ましい実施形態において、本発明の方法において使用する細胞は、昆虫細胞でも哺乳類細胞でもよい。好ましい実施形態において、本発明の方法による遺伝子産物の発現を可能にし、培養物中で維持することができる、任意の昆虫細胞又は哺乳類細胞を、本発明に従って使用することができる。別の好ましい実施形態において、昆虫細胞又は哺乳類細胞は、バキュロウイルスによる感染に感受性である細胞又はバキュロウイルスの複製を可能にする細胞である。別の好ましい実施形態において、細胞は、昆虫細胞である。例えば、使用する細胞系は、ヨトウガ、ショウジョウバエ細胞系、又は蚊細胞系、例えば、ヒトスジシマカ由来細胞系由来であってもよい。
【００３０】
本発明で使用する好ましい昆虫細胞又は細胞系には、例えば、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、Ｓ２、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、ＭＧ−１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）（ＵＳ  ６，１０３，５２６；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，ＣＴ，ＵＳＡ）が含まれる。
【００３１】
本発明で使用する好ましい哺乳類細胞又は細胞系には、例えば、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、Ｐｅｒ．Ｃ６、Ｈｅｋ２９３、ＣＨＯ、ＭＤＣＫ、ＣＥＫ、ハイブリドーマ、及び非分泌性の（ＮＳ０）骨髄腫細胞系が含まれる。一実施形態において、本発明の方法で使用する細胞は、ヒト胚性幹細胞ではない。別の実施形態において、本発明の方法で使用する細胞は、胚性幹細胞ではない。
【００３２】
「第１の発現カセット」という用語は、本明細書では、細胞において遺伝子産物の発現を駆動することができるプロモーターに作動可能に連結している、対象の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と定義し、第１の発現カセットには、少なくとも１つのパルボウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列が隣接している。第１の発現カセットは、対象の遺伝子産物に作動可能に連結している他の発現制御配列を任意選択で含む。
【００３３】
先の好ましい実施形態の代わりに、又はそれと組み合わせて、別の好ましい実施形態において、本発明の第１の発現カセットに、少なくとも２つのパルボウイルスＩＴＲヌクレオチド配列が隣接している。さらに好ましい実施形態において、第１の発現カセットに、両側、すなわち３’末端及び５’末端の両方でパルボウイルスＩＴＲヌクレオチド配列が隣接している。「隣接している」という用語は、本明細書では、ＩＴＲが、少なくとも１つのパルボウイルスＲｅｐタンパク質による第１の発現カセットの複製、すなわち、コピー数の増加を可能にするのに十分なほど第１の発現カセットに近接していることとして理解される。好ましくは、隣接するＩＴＲ配列と、発現カセットにおける最も上流又は下流（すなわち、末端）の調節エレメントとの間の距離は、５０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．２又は０．１ｋｂ未満であり、さらに好ましくは、その距離は、５０、２０又は１０ヌクレオチド未満であり、最も好ましくは、隣接するＩＴＲは、発現カセットに直接連結している。
【００３４】
「第２の発現カセット」という用語は、本明細書では、細胞においてＲｅｐタンパク質の発現を駆動することができるプロモーターに作動可能に連結している、少なくとも１つのパルボウイルス複製（Ｒｅｐ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物と定義する。第２の発現カセットは、少なくとも１つのパルボウイルスＲｅｐタンパク質に作動可能に連結している他の発現制御配列を任意選択で含む。
【００３５】
本発明の方法においては、第２の発現カセットにおいてコードされる少なくとも１つのパルボウイルスＲｅｐタンパク質は、好ましくは少なくとも、ＡＡＶ  Ｒｅｐ７８及び／若しくはＲｅｐ６８タンパク質、又は他のパルボウイルス由来の対応するＲｅｐタンパク質である。第２の発現カセットは、パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む読み枠を含むこともでき、パルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質の翻訳のための開始コドンは、細胞において発現されると部分的なエキソンスキッピングを実施する開始コドンである。しかしながら、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０タンパク質は、ＩＴＲを介した複製に必要ではないので、それらの発現及び存在は必要ではない。したがって、細胞が、パルボウイルスＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８タンパク質のための第２の発現カセット及びＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０パルボウイルスタンパク質のための第３の発現カセットを含む実施形態は、本発明から除外されないが、かかる第３の発現カセットの存在は必要ではなく、それを欠くことが好ましい。
【００３６】
好ましくは、本発明の方法においては、パルボウイルスＩＴＲ配列及びパルボウイルスＲｅｐタンパク質は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来である。本発明の文脈で使用する「ＡＡＶ−ＩＴＲ」配列又は「ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質」は、ＡＡＶ−ＩＴＲ又はＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質と「実質的に同一」である。かかる「実質的に同一の」配列には、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８若しくはＡＡＶ９  ＩＴＲ配列又は少なくとも１つのＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、若しくはそれ以上のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列同一性（例えば、約７５〜９９％のヌクレオチド配列同一性を有する配列）を有する配列が含まれる。さらに好ましくは、ＡＡＶ−ＩＴＲは、配列番号１と実質的に同一の配列を含む。さらにより好ましくは、ＡＡＶ−ＩＴＲは、配列番号１と同一の配列を含む。
【００３７】
好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号３と実質的に同一の少なくとも１つのパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする。さらにより好ましくは、第２の発現カセットのアミノ酸配列によってコードされるパルボウイルスＲｅｐタンパク質は、配列番号３と同一である。
【００３８】
少なくとも１つのパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書では、１つ又は複数の非構造Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列として理解されよう。好ましくは、ヌクレオチド配列は、細胞においてＩＴＲが隣接する第１の発現カセットの複製及び対象の遺伝子産物の発現に必要であり十分である、少なくともＡＡＶ  Ｒｅｐ７８、又はＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質をコードする。核酸配列は、好ましくは、通常ヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長類（例えば、血清型１及び４）に感染するＡＡＶ由来である。ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸配列の例を、Ｒｅｐタンパク質をコードするＡＡＶ血清型−２配列ゲノムの一部を表す、配列番号２に示す。Ｒｅｐ７８コード配列は、ヌクレオチド１１〜１８７６を含み、Ｒｅｐ５２コード配列は、ヌクレオチド６８３〜１８７６を含む。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質の正確な分子量、並びに翻訳開始コドンの正確な位置は、異なるパルボウイルス間で異なる可能性があることが理解されよう。しかしながら、ＡＡＶ−２以外のパルボウイルス由来のヌクレオチド配列における対応する位置を特定する方法は当業者に知られている。
【００３９】
先の好ましい実施形態の代わりに、又はそれと組み合わせて、別の好ましい実施形態において、本発明の発現カセットの１つ又は複数は、発現ベクターの一部である。別の好ましい実施形態において、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、単一の発現ベクターの一部であり、好ましくは少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲヌクレオチド配列が隣接している。さらに別の好ましい実施形態において、第１の発現カセット及び第２の発現カセットは、２つの別々の発現ベクターの一部である。本明細書で使用する「ベクター」という用語は、外因性ＤＮＡを宿主細胞中に導入するために使用する核酸化合物を意味する。ベクターは、宿主細胞（本発明の方法で使用する）のゲノム中に組み込むためのベクターであってもよく、又はベクターは、例えば、エピソームベクターなどの、宿主細胞のゲノム中に組み込まれないベクターであってもよい。エピソームベクターの例は、例えば、プラスミドベクターであり、したがってレプリコンと、好ましくはプラスミドの複製能力を妨げることなく組換え技法によって外因性ＤＮＡをベクター中に挿入するために使用することができるＤＮＡセグメントとを少なくとも含む。レプリコンは、好ましくは、本発明の方法において使用する細胞における複製のためのレプリコンである。ベクターは、通常、例えば、選択マーカー、多重クローニング部位などの、分子クローニングでのそれらの使用を促進するさらなる遺伝的エレメントを含む（下記参照）。本明細書で使用する「発現ベクター」は、発現ベクターが適切な宿主細胞中に存在する場合、プロモーター及び他の調節エレメントが、挿入された外因性ＤＮＡの転写を可能にするために存在する、任意のプラスミドベースのクローニングベクターを意味する。「シャトルベクター」は、少なくとも２つの異なる宿主生物、例えば、異なる種又は異なる属の２つの生物において複製及び安定な維持能力があるプラスミドベクターを意味する。この能力のために、シャトルベクターは、単一の広宿主域レプリコンを利用することができるが、通常、シャトルベクターは、異なる宿主生物又は宿主生物の異なる群のための異なるレプリコンを含むことになる。
【００４０】
本発明の一実施形態において、対象の遺伝子及び少なくとも１つのＩＴＲを含む第１の発現カセットは、（宿主）細胞のゲノム中に組み込まれない。好ましくは、少なくとも第１の発現カセットは、（宿主）細胞のゲノム中に組み込まれないベクター、例えば、エピソームベクターに存在する。第２の発現カセットは、第１のカセットと同じ非組み込み型ベクター、異なるエピソームベクターに存在してもよく、又は第２の発現カセットは、宿主細胞のゲノム中に組み込まれてもよい。
【００４１】
好ましい実施形態において、発現ベクターは、当技術分野で既知の、多重クローニング部位を含む。かかる多重クローニング部位は、断片をベクター中へ挿入するために好都合に使用することができるいくつかの異なるユニークな制限酵素部位を含有する。
【００４２】
好ましい実施形態において、第１の発現カセット及び／又は第２の発現カセットは、細胞において活性があるプロモーターを少なくとも含む。細胞が昆虫細胞である場合、昆虫宿主細胞において外来性遺伝子を発現させるための当業者に既知の技法を使用して、本発明を実施することができる。分子工学及び昆虫細胞におけるポリペプチドの発現についての方法論は、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ．１９８６．「バキュロウイルスベクター及び昆虫培養手順に関する方法マニュアル（Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）」，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌ．Ｎｏ．７５５５，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘ．、Ｌｕｃｋｏｗ．１９９１．Ｉｎ  Ｐｒｏｋｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，「バキュロウイルスベクターの組換えＤＮＡテクノロジー及び応用を用いた昆虫細胞における異種遺伝子のクローニング及び発現（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ’  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，９７−１５２、Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ．  ａｎｄ  Ｒ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ，１９９２，Ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ，１９９２，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．，１９９５，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ３９、ＵＳ４，７４５，０５１、ＵＳ２００３１４８５０６、及びＷＯ０３／０７４７１４に記載されている。好ましい実施形態において、発現カセットの少なくとも１つは、バキュロウイルスベクターに含まれている。別の実施形態において、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列の転写に特に適したプロモーターは、例えば、ポリヘドロンプロモーターである。しかしながら、昆虫細胞において活性がある他のプロモーター、例えば、ｐ１０、ｐ３５、ＩＥ−１又はΔＩＥ−１プロモーター及び上記の参考文献に記載されている別のプロモーターも、当技術分野において既知である。
【００４３】
細胞が哺乳類細胞である場合、対象の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、哺乳類細胞に適合する発現制御配列、例えば、プロモーターに作動可能に連結している。多くのかかるプロモーターは、当技術分野において既知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１、上記参照）。多くの細胞型において広範に発現する、ＣＭＶプロモーターなどの、構成的プロモーターを使用することができる。しかしながら、さらに好ましいのは、誘導性の、組織特異的、細胞型特異的、又は細胞周期特異的なプロモーターである。例えば、肝臓特異的な発現について、プロモーターを、α１−抗トリプシンプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、ＬＰＳ（チロキシン結合グロブリン）プロモーター、ＨＣＲ−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターから選択することができる。他の例には、腫瘍選択的、特に、神経学的細胞腫瘍選択的発現のためのＥ２Ｆプロモーター（Ｐａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１４５−９）又は単核血液細胞に使用するためのＩＬ−２プロモーター（Ｈａｇｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ；１８５：２１０１−１０）が含まれる。哺乳類細胞における発現のための好ましいプロモーターは、ＣＭＶｉｅ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＭＭＴＶ−ＬＴＲ及びＬＴＲなどの哺乳類ウイルスプロモーター、βアクチン、伸長因子１、初期増殖応答１、ｆｅｒｒｉｔｉｎｅ、ＨＳＰ７０及びＧＡＰＤＨなどの構成的細胞プロモーター、並びにＡＡＴ、αアクチン、ＣＭＤ１、ＮＳＥ、クレアチンキナーゼ、ＭＬＣ−２ｖ及びＥＡｌｂ／ｈＡＡＴなどの組織特異的プロモーターである。
【００４４】
好ましくは、発現ベクターは、本発明が実施される細胞に適合する。適切な発現ベクターを選択する方法は当業者に知られている。
【００４５】
「昆虫細胞に適合する発現ベクター」は、昆虫又は昆虫細胞の生産的な形質転換又はトランスフェクション能力がある核酸分子であると理解されよう。例となる生物学的ベクターには、プラスミド、直線状核酸分子、及び組換えウイルスが含まれる。昆虫細胞に適合するものであれば、どんなベクターを使用してもよい。ベクターは、昆虫細胞のゲノム中に組み込まれることがあるが、昆虫細胞中にベクターが恒久的に存在する必要はなく、一過性及び／又はエピソームベクターも含まれる。ベクターを、既知の任意の手段、例えば、細胞の化学的処置、電気穿孔、又は感染によって、導入することができる。好ましい実施形態において、ベクターは、バキュロウイルス、ウイルスベクター、又はプラスミドである。より好ましい実施形態において、ベクターは、バキュロウイルスであり、すなわち、構築物は、バキュロウイルスベクターである。バキュロウイルスベクター及びその使用方法は、昆虫細胞の分子工学についての上記の参考文献に記載されている。
【００４６】
哺乳類細胞に適合する様々なベクターを、当業者は入手することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１、上記参照）。ベクターは、哺乳類細胞のゲノム中に組み込まれることがあるが、哺乳類細胞中にベクターが恒久的に存在する必要はなく、一過性及び／又はエピソームベクターも含まれる。ベクターを、既知の任意の手段、例えば、ＣａＰＯ４−トランスフェクション、リポフェクション、トランスフェクション又は電気穿孔によって、導入することができる。好ましい実施形態において、ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はバキュロウイルスである。より好ましい実施形態において、ベクターは、アデノウイルスであり、すなわち、構築物は、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクター及びその使用方法は、Ｘ  Ｄａｎｔｈｉｎｎｅ  ａｎｄ  Ｍ  Ｊ  Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ（２０００）「第１世代アデノウイルスベクターの産生：総説（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｒｓｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ）」，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ７（２０）：１７０７−１７１４に記載されている。
【００４７】
先の好ましい実施形態の代わりに、又はそれと組み合わせて、別の好ましい実施形態において、第２の発現カセットは、細胞中にトランスフェクトしても形質転換してよもい。第２の発現カセットのトランスフェクション又は形質転換の好ましい方法は、例えば、ＣａＰＯ４−トランスフェクション、リポフェクション、トランスフェクション及び電気穿孔である。
【００４８】
先の好ましい実施形態の代わりに、又はそれと組み合わせて、別の好ましい実施形態において、第１の発現カセット及び／又は第２の発現カセット及び／又は発現ベクターは、トランスフェクション（又は形質転換）によって細胞中に導入される。より好ましい実施形態において、トランスフェクションは、ウイルストランスフェクション、化学的トランスフェクション又は電気穿孔である。より好ましい実施形態において、トランスフェクションは、安定な細胞系を作製するために使用される。さらにより好ましい実施形態において、安定な細胞系の作製のためのトランスフェクションは、ＣａＰＯ４トランスフェクション、リポフェクション又は電気穿孔である。発現ベクター及び核酸構築物のトランスフェクション（又は形質転換）は、順々に又は共トランスフェクションで行うことができる。好ましい実施形態において、第２の発現カセットは、少なくとも１つのパルボウイルスＲｅｐタンパク質を発現することができる安定な細胞系を作製するためにトランスフェクトされる。
【００４９】
先の好ましい実施形態の代わりに、又はそれと組み合わせて、別の好ましい実施形態において、対象の遺伝子産物の産生は、同様の条件であるが、少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲヌクレオチド配列及び／又は少なくとも１つのパルボウイルスＲｅｐタンパク質が存在しない条件下での産生と比較した場合、増強される。これは、ＲＴ−ＱＰＣＲアッセイ及び／又はタンパク質定量アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡなど）によって測定することができる。これらの又は当技術分野で既知の他の方法を使用して、対象の遺伝子産物の産生量を決定する方法は当業者に知られている。
【００５０】
任意選択で、本発明の方法は、ポリペプチドの回収、又は単離及び／又は精製を含むことができる。ポリペプチドは、例えば、それ自体が当技術分野で既知の様々なクロマトグラフィー方法を含めた、標準的なタンパク質精製技法によって培地から回収することができる。対象のポリペプチドの回収は、発現したポリペプチド及び使用する宿主細胞によって決まるが、単離を通してポリペプチドを回収することを含むことができる。ポリペプチドに適用する場合、「単離」という用語は、タンパク質が、その天然環境以外の条件で見出されることを示す。好ましい形態において、単離したポリペプチドは、他のタンパク質／ポリペプチド、特に他の同種ポリペプチドを実質的に含まない。ポリペプチドを、４０％を超える純粋な形態で、より好ましくは６０％を超える純粋な形態で提供することが好ましい。さらにより好ましくは、ポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定したところ、高度に精製した、すなわち、８０％を超える純粋な、より好ましくは９５％を超える純粋な、さらにより好ましくは９９％を超える純粋な形態で提供することが好ましい。ポリペプチドの精製及び、例えばウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡでのポリペプチドの検出を促進するために、対象のポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させることは、非常に役立つ可能性がある。適切な融合配列には、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、金属結合ポリヒスチジン、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ及びβガラクトシダーゼなどのタンパク質の配列が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチドはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で、ポリペプチドの追跡を促進し、ポリペプチドと基質の結合の特定及び定量を可能にする、非ペプチド担体、タグ又は標識に結合させることもできる。かかる標識、タグ又は担体は、当技術分野でよく知られており、ビオチン、放射性標識及び蛍光標識が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
先の好ましい実施形態の代わりに、又はそれと組み合わせて、別の好ましい実施形態において、細胞は、パルボウイルスＣａｐタンパク質及びパルボウイルスＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つを含まない。
【００５２】
先の好ましい実施形態の代わりに、又はそれと組み合わせて、本発明の方法の別の好ましい実施形態において、ＡＡＶベクターゲノムコピー数は、細胞に、細胞においてＲｅｐタンパク質の発現を駆動することができるプロモーターに作動可能に連結している、少なくとも１つのパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列が提供されない方法と比較して、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１５０倍、より好ましくは少なくとも２００倍増加する。例えば、Ｑ−ＰＣＲによって、コピー数、例えば、ＡＡＶベクターゲノムコピー数を測定する方法は当業者に知られている。
【００５３】
先の好ましい実施形態の代わりに、又はそれと組み合わせて、本発明の方法の別の好ましい実施形態において、対象の遺伝子産物のタンパク質発現量は、細胞に、細胞においてＲｅｐタンパク質の発現を駆動することができるプロモーターに作動可能に連結している、少なくとも１つのパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列が提供されない方法と比較して、少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１５倍、より好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも２５倍、より好ましくは少なくとも３０倍増加する。例えば、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットによって、対象の遺伝子産物のタンパク質発現量を測定する方法は当業者に知られている。
【００５４】
先の好ましい実施形態の代わりに、又はそれと組み合わせて、本発明の方法の別の好ましい実施形態において、対象の遺伝子産物によってコードされるタンパク質の活性は、細胞に、細胞においてＲｅｐタンパク質の発現を駆動することができるプロモーターに作動可能に連結している、少なくとも１つのパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列が提供されない方法と比較して、少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１５倍、より好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも２５倍、より好ましくは少なくとも３０倍増加する。
【００５５】
第２の態様においては、本発明は、パルボウイルスＣａｐタンパク質及びパルボウイルスＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つを含まない、上記のような細胞に関する。
【００５６】
先の好ましい実施形態の代わりに、又はそれと組み合わせて、別の好ましい実施形態において、細胞は、パルボウイルスＲｅｐ５２タンパク質及びＲｅｐ４０タンパク質、例えば、ＡＡＶ  Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０タンパク質、又は対応するパルボウイルス複製タンパク質の少なくとも１つを発現しない。
【００５７】
第３の態様においては、本発明は、パルボウイルスＲｅｐ５２タンパク質及びＲｅｐ４０タンパク質、例えば、ＡＡＶ  Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０タンパク質、又は対応するパルボウイルス複製タンパク質の少なくとも１つを発現しない上記のような細胞に関する。
【００５８】
好ましい実施形態において、細胞は、細胞系であってもよい。さらに好ましい実施形態において、細胞は、安定な細胞系であってもよい。
【００５９】
第４の態様においては、本発明は、上記のような細胞を含む、非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物に関する。
【００６０】
本発明の別の態様は、その体細胞及び生殖細胞に上記のベクターを含むトランスジェニック動物に関する。トランスジェニック動物は、好ましくは、非ヒト動物である。トランスジェニック動物を作製する方法は、例えば、ＷＯ０１／５７０７９及びそこに引用された参考文献に記載されている。かかるトランスジェニック動物を、対象のポリペプチドを産生する方法で使用することができ、その方法は、ベクターを含むトランスジェニック動物又はその雌の子孫からポリペプチドを含有する体液を回収するステップ、及び任意選択で体液からのポリペプチドを回収するステップを含む。かかる方法も、ＷＯ０１／５７０７９及びそこに引用された参考文献に記載されている。ポリペプチドを含有する体液は、好ましくは血液、又はより好ましくは乳である。
【００６１】
本発明の別の態様は、その細胞に上記のベクターを含むトランスジェニック植物に関する。トランスジェニック植物を作製する方法は、例えば、Ｕ．Ｓ．６，３５９，１９６及びそこに引用された参考文献に記載されている。かかるトランスジェニック植物を、対象のポリペプチドを産生する方法で使用することができ、その方法は、その細胞にベクターを含むトランスジェニック植物の一部又はかかるトランスジェニック植物の子孫の一部を回収するステップであって、その植物の一部がポリペプチドを含有するステップ、及び任意選択でその植物の一部からポリペプチドを回収するステップを含む。かかる方法も、Ｕ．Ｓ．６，３５９，１９６及びそこに引用された参考文献に記載されている。
【００６２】
本明細書に記載された方法論には、当業者が本発明を実施するのを可能にするのに十分な詳細が含まれていると考えられるが、プラスミドは、米国保健教育福祉省、国立衛生研究所（ＮＩＨ）の組換えＤＮＡ研究に関するガイドラインに記載された現在の規制下で、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載された標準的な組換えＤＮＡ技法を使用して、構築及び精製することができる。これらの参考文献には、以下の標準的な方法についての手順が含まれる：大腸菌プラスミドを用いたクローニング手順、大腸菌細胞の形質転換、プラスミドＤＮＡ精製、ＤＮＡのフェノール抽出、ＤＮＡのエタノール沈殿、アガロースゲル電気泳動、アガロースゲルからのＤＮＡ断片の精製、並びに制限エンドヌクレアーゼ及び他のＤＮＡ修飾酵素反応。
【００６３】
本明細書の例３は、本発明の予想外の利点を実証している：（１）対象の導入遺伝子を有するバキュロウイルスと、（２）パルボウイルス（すなわちＡＡＶ）Ｒｅｐタンパク質を発現するバキュロウイルスとの昆虫細胞への同時感染は、細胞死を減少させ、同時感染した昆虫細胞の生存可能な寿命を増加させる。したがって、対象の導入遺伝子の産生段階が延長され、その結果として特異的な産生収量が増加する。したがって、別の態様においては、本発明は、細胞死を減少させる並びに／又はバキュロウイルス及び／若しくはバキュロウイルスベクターに感染した昆虫細胞の生存可能な寿命を増加させる方法に関し、その方法は、昆虫細胞において本明細書で上記のパルボウイルスＲｅｐタンパク質を（同時）発現させるステップを含む。好ましくは、パルボウイルス複製タンパク質は、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質の少なくとも１つである。好ましくは、昆虫細胞は、ＡＡＶ  Ｒｅｐ５２タンパク質及びＲｅｐ４０タンパク質又は対応するパルボウイルス複製タンパク質の少なくとも１つを発現しない。
【００６４】
本文書及びその特許請求の範囲においては、「含む」という動詞及びその活用は、その言葉に続く項目が含まれるが、明確に言及されていない項目が除外されないことを意味するようにその非限定的な意味で使用される。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」によるエレメントへの言及は、文脈上で明らかに、エレメントが１つ、１つのみであることが要求されない限り、エレメントが２つ以上存在する可能性を除外しない。不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、したがって、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００６５】
本明細書で引用したすべての特許及び参考文献は、参照によりその全体がこれによって組み込まれる。
【００６６】
以下の実施例は、単に例示の目的のみで示したものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ＳＦ＋細胞にＢａｃ．ＶＤ１４２  ｐ０又はＢａｃ．ＶＤ１４３  ｐ０を感染させてから３日後のＳＦ９００ＩＩ培地におけるＧＦＰ蛍光を示す図である。培地における非感染ＳＦ＋細胞の同量のバックグラウンド蛍光をデータから引いた。
【図２】ＳＦ＋細胞にＢａｃ．ＶＤ１４２  ｐ３又はＢａｃ．ＶＤ１４３  ｐ３を感染させた後の異なる時点（ｐｉ）で測定した、ＰＢＳ中に再懸濁した生細胞におけるＧＦＰ蛍光を示す図である。ＰＢＳにおける非感染ＳＦ＋細胞の同量のバックグラウンド蛍光を、データから引いた。
【図３】単独の組換えバキュロウイルスが有するベクターゲノムのバキュロウイルス誘導複製（棒２）と比較した、ＡＡＶ−ＩＴＲが隣接するＣＭＶ−ＬＰＬ導入遺伝子単位のＡＡＶ−Ｒｅｐ誘導複製（棒１）によるベクターゲノムコピー数の増加を示す図である。
【図４】Ｒｅｐタンパク質を同時発現しているＨｅＬａ細胞におけるＳＥＡＰ活性の増強を示す図である。トランスフェクション２日又は３日後に、ｐＶＤ１７９（−）又はｐＶＤ１７９及びｐＶＤ２０３の組み合わせ（ｐＶＤ２０３）をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の培地においてＳＥＡＰ活性を測定した。実験は、２連で行った。
【実施例】
【００６８】
（例１）
ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質の同時発現による、ＳＦ＋細胞におけるタンパク質発現の増強
１．１  材料及び方法
１．１．１  バキュロウイルスの作製
プラスミドｐＶＤ１４２及びｐＶＤ１４３を使用して、組換えバキュロウイルスを作製した。ｐＶＤ１４２は、ＩＴＲ間にｐＣＭＶ−ｐ１０−ＧＦＰ発現カセットを含有し、ｐＶＤ１４３は、ＩＴＲ間にｐＰｏｌＨ−ＡＡＶ２  Ｒｅｐ７８／ＡＣＧ及びｐＣＭＶ−ｐ１０−ＧＦＰ発現カセットを含有する。ｆｌａｓｈＢＡＣシステムを使用して、組換えＢａｃ．ＶＤ１４２及びＢａｃ．ＶＤ１４３（ｐ０）を作製した。その後、ｐ０のバキュロウイルスを、対数増殖期の２Ｅ＋６個細胞／ｍｌの密度のＳＦ＋細胞中１００倍に希釈することによって増幅させた。感染３日後に、ｐ１の増幅したバキュロウイルスを採取した。次の継代の増幅も同様に行った。
【００６９】
１．１．２  ＳＦ＋細胞における蛍光分析測定
対数増殖期の２Ｅ＋６個細胞／ｍｌの密度のＳＦ＋細胞をバキュロウイルスＢａｃ．ＶＤ１４２又はＢａｃ．ＶＤ１４３（継代ｐ０又はｐ３由来）に１００倍希釈で感染させた。感染後のいくつかの異なる時点で、ＧＦＰ蛍光を測定した。最初に、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒを使用して各試料中の生細胞の量を測定した。その後、感染した細胞をＳＦ９００ＩＩ培地で０．５Ｅ＋６個生細胞／ｍｌの密度に希釈した。各試料のうち、１００μｌ（約５０，０００個細胞）を黒色９６ウェルに移し、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔを使用して蛍光を測定した（励起４８５ｎｍ及び励起５２０ｎｍで）。ＰＢＳに再懸濁した細胞における蛍光を測定する場合（図２）、８００μｌの細胞（０．５Ｅ＋６個生細胞／ｍｌの密度）を１０００ｒｃｆで５分間遠心分離した。細胞ペレットを８００μｌのＰＢＳに再懸濁し、上記のように蛍光を測定した。
【００７０】
１．２  結果
図１は、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔを使用して測定した、ＳＦ＋細胞にＢａｃ．ＶＤ１４２  ｐ０又はＢａｃ．ＶＤ１４３  ｐ０を感染させてから３日後の、ＳＦ９００ＩＩ培地において希釈した生細胞における蛍光を示す。培地における非感染ＳＦ＋細胞の同量のバックグラウンド蛍光をデータから引いた。図２は、ＳＦ＋細胞をＢａｃ．ＶＤ１４２  ｐ３又はＢａｃ．ＶＤ１４３  ｐ３に感染させた後の異なる時点（ｐｉ）で２連で測定した、ＰＢＳに再懸濁した生細胞における蛍光を示す。Ｂａｃ．ＶＤ１４３に感染したＳＦ＋細胞におけるＧＦＰ発現の増強は、明白である。３日後、Ｂａｃ．ＶＤ１４３に感染した細胞のＧＦＰ蛍光は、Ｂａｃ．ＶＤ１４２に感染した細胞の同量（０．５ａ．ｕ）と比較して、５倍高い（２．５ａ．ｕ．）ことが示された。
【００７１】
（例２）
ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質の同時発現による、ＳＦ＋細胞における導入遺伝子発現の増強
２．１  材料及び方法
２．１．１  バキュロウイルスの作製
プラスミドｐＶＤ４３及びｐＶＤ８８を使用して、組換えバキュロウイルスストック（それぞれＢａｃ．ＶＤ４３及びＢａｃ．ＶＤ８８）を調製した。ＶＤ４３構築物は、２つのＡＡＶ２  ＩＴＲの間にＣＭＶ−ＬＰＬ−ＷＰＲＥ−ポリＡ発現ユニットを含有する。ＶＤ８８構築物は、ＰｏｌＨ昆虫細胞プロモーターの制御下にあるＡＡＶ２  Ｒｅｐ７８／５２  ＯＲＦ（Ｒｅｐ７８の開始コドンがＡＴＧからＡＣＧに改変された）を含有する。
【００７２】
２．１．２  ＡＡＶベクターゲノムの増幅
第４継代ワーキングシードウイルスを使用して、Ｂａｃ．ＶＤ４３及びＢａｃ．ＶＤ８８の第５継代バキュロウイルス接種物を作製した。この接種物を使用して、対数増殖期の２Ｅ＋６細胞個／ｍＬの細胞密度のＳＦ＋昆虫細胞を、Ｂａｃ．ＶＤ４３単独か又はＢａｃ．ＶＤ４３とＢａｃ．ＶＤ８８の混合物に感染させた。感染３日後に、溶解緩衝液で細胞培養物を採取し、不純物を除去した粗溶解物を直ちにＱ−ＰＣＲアッセイに供して、ＣＭＶコピー数を測定した。
【００７３】
２．１．３  ＡＡＶベクターゲノムコピー数の測定
ＡＡＶベクターゲノムの産生に続き、ＣＭＶプロモーターへ方向付けられたプライマーを使用して溶解した培養物を直ちにＱ−ＰＣＲアッセイに供した。産生したベクターＤＮＡの分解を避けるために、溶解した培養物の試料は、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅを処置せず、Ｑ−ＰＣＲ手順中、デオキシリボヌクレアーゼステップを除いた。
【００７４】
２．２  結果
図３は、Ｂａｃ．ＶＤ４３＋Ｂａｃ．ＶＤ８８（棒１）又はＢａｃ．ＶＤ４３単独（棒２）に感染した昆虫細胞におけるベクターコピー数を示す。感染３日後に、細胞を採取し、Ｑ−ＰＣＲによってベクターコピー数を測定した。ＡＡＶ−ＩＴＲが隣接するＣＭＶ−ＬＰＬ導入遺伝子単位（Ｂａｃ．ＶＤ４３）のＡＡＶ  Ｒｅｐ誘導複製（Ｂａｃ．ＶＤ８８）は、単独の組換えバキュロウイルス（Ｂａｃ．ＶＤ４３）が有するベクターゲノムのバキュロウイルス誘導複製と比較して、ベクターゲノム（ＣＭＶ−ＬＰＬ−ＷＰＲＥ−ｐｌｙＡ）コピー数の２００倍を超える増加をもたらした。
【００７５】
（例３）
ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質の同時発現によるＳＦ＋細胞の生存率の増加
３．１  材料及び方法
３．１．１  細胞密度測定
バキュロウイルス感染後の昆虫細胞の生細胞密度をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒで測定した。
【００７６】
３．１．２  ウイルス
この実験では、２つの組換えバキュロウイルスを比較した。導入遺伝子ＬＰＬのための発現カセットを有するバキュロウイルス及びＡＡＶ２  Ｒｅｐ  ＯＲＦのための発現カセットを有するバキュロウイルス：
Ｖｉｒｕｓ  ＷＳＶ  ｂａｎｋ  Ｂａｃ．ＶＤ８８  Ｐ４  Ｌｏｔ＃Ｐ．５３６．Ｃ０１０２．０１（ＡＡＶ  Ｒｅｐ−発現カセットを有するバキュロウイルス）
Ｖｉｒｕｓ  ＷＳＶ  ｂａｎｋ  Ｂａｃ．ＶＤ４３  Ｐ４  Ｌｏｔ＃Ｐ．５３６．Ｃ０１００．０１（対象の遺伝子、すなわちＬＰＬのための発現カセットを有するバキュロウイルス）
【００７７】
３．１．３  細胞
ＥｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）細胞を、５００ｍｌシェーカーフラスコ中に１Ｅ６細胞個／ｍＬで播種し、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｉｎｎｏｖａ  ４４Ｒシェーカーインキュベーター（ＭＦ−ＳＩＮ−２００２−ｓ００）中で１３５ｒｐｍ、２８℃で１７時間インキュベートした。これらの培養物を、ＳＦ９００ＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して播種した。
【００７８】
３．１．４  感染
この実験では、Ｂａｃ．ＶＤ４３又はＢａｃ．ＶＤ８８を単独か又は組み合わせでＳＦ＋細胞に感染させた。１：３３３のウイルス体積対細胞培養物体積を使用して、感染させた。
【００７９】
３．２  結果
組換えバキュロウイルスストック（Ｂａｃ．ＶＤ４３、Ｂａｃ．ＶＤ８８又はＢａｃ．ＶＤ４３＋Ｂａｃ．ＶＤ８８）の添加前に、細胞計数を行い、ＧＥＮ−ＳＯＰ−ＳＮＣ−８０００（０３版）に従ってＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（ＥＮＳ：ＲＤ−ＳＮＣ−０００１−ｓ００）を使用して生存率を測定した。培地は、２．１４Ｅ６個生細胞／ｍＬを含有し、９９．７％の生存率であった。ＳＦ＋細胞にバキュロウイルス構築物を感染させてから約７０時間後に、細胞計数を行い、生存率を再び測定した。
【００８０】
表１は、対象の発現カセット（すなわち、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＬＰＬ）を有するＢａｃ．ＶＤ４３の感染が、７０時間にわたって細胞死の増加をもたらすことを示している。７０時間後、まだ生存している細胞は実質的に存在しない。しかしながら、細胞が、ＡＡＶ  Ｒｅｐのための発現カセットを有するＢａｃ．ＶＤ８８に感染した場合、細胞死は遅くなり、感染７０時間後で８６％の生細胞密度をもたらす。これは、昆虫細胞における発現後のＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質が、抗アポトーシス性の機能を有することを示唆している。さらに、この結果から、細胞にＢａｃ．ＶＤ４３とＢａｃ．ＶＤ８８の両方が感染すると、細胞にＢａｃ．ＶＤ４３単独が感染している場合に通常起こる細胞死が遅れる可能性がある（生存率６１％対０％）ことが示される。これは、パルボウイルスＲｅｐタンパク質を発現するバキュロウイルス（Ｂａｃ．ＶＤ８８）と対象の導入遺伝子を有するバキュロウイルスの同時感染が、対象の導入遺伝子のための産生段階を延長し、続いて産生収量を増加させることを実証している。
【００８１】
哺乳類細胞におけるＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質発現が、今までのところ常に細胞のアポトーシスの誘導と関連づけられていたので、この知見は注目すべきである。昆虫細胞についてのこの現象は、まだ報告されていない。
表１：Ｂａｃ．ＶＤ４３、Ｂａｃ．ＶＤ８８又はＢａｃ．ＶＤ４３及びＢａｃ．ＶＤ８８を、ＳＦ＋細胞に感染させ、感染７０時間後に生細胞密度をモニターした。
【表１】
2010538675.tif 000002
【００８２】
（例４）
ＡＡＶ−Ｒｅｐタンパク質の同時発現による、哺乳類細胞におけるタンパク質発現の増強
４．１  材料及び方法
４．１．１  プラスミドの作製
プラスミドｐＶＤ１７９は、ＣＭＶプロモーターの制御下にある分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）発現カセットを含有し、ウイルスＩＴＲが隣接している。このプラスミドは、ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）のＳＥＡＰ発現カセットをｐＶＤ４３中にクローニングすることによって構築した。簡潔に述べると、ｐＳＥＡＰ２−ＣｏｎｔｒｏｌをＥｃｏＲＩ及びＨｐａＩで消化し、１６９４ｂｐ断片を平滑末端化し、精製し、ＲｓｒＩＩ消化によってＬＰＬ−ＷＰＲＥカセットが除去された平滑末端化ｐＶＤ４３プラスミド中に連結した。プラスミドｐＶＤ２０３は、ＡＡＶ２  ｐ５プロモーターの制御下にあるＡＡＶ２  Ｒｅｐ発現カセットを含有するものであり、ｐ５Ｅ１８−ＶＤ２／８からＥｃｏＮＩ及びＰｍｅＩ消化によってＡＡＶ８キャプシド発現カセットを除去し、５’オーバーハングを平滑末端化し、プラスミドを再連結することによって構築した。
【００８３】
４．１．２  哺乳類細胞のトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を、１０％胎児ウシ血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養し、５％ＣＯ２下３７°Ｃで増殖した。細胞を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、ＭＷ約２５０００、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用してトランスフェクトする前日に、２４ウェルプレートのウェル当り２Ｅ５個細胞の密度で播種した。各ウェルについて、０．５μｇのｐＶＤ１７９及び０．５μｇのｓｔｕｆｆｅｒ  ＤＮＡ又は０．５μｇのｐＶＤ２０３を含有する５０μｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌに３．０μｌのＰＥＩ（１μｇ／μｌ）を添加し、直ちにボルテックスした後、このトランスフェクション混合物を室温で１０分間インキュベートした。ウェル中の培地を４５０μｌの新鮮な培地と交換した後、細胞にトランスフェクション混合物を添加し、５％ＣＯ２で３７℃でインキュベートした。
【００８４】
４．１．３  ＳＥＡＰ活性アッセイ
トランスフェクション２日及び３日後に、７５μｌの培地をＨｅＬａ細胞から取り出し、１２０００ｇで１０秒間遠心分離して、分離した細胞をペレット化し、６０μｌの上澄みを−２０℃で保管した。製造元のプロトコールに従って、Ｇｒｅａｔ  Ｅｓｃａｐｅ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｋｉｔ  ２．０（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）でＳＥＡＰ発現を測定した。簡潔に述べると、各試料２５μｌを７５μｌの１×希釈用緩衝液中で希釈し、６５℃で３０分間インキュベートし、氷上で２〜３分間冷却した。試料を室温に平衡化した後、１００μｌのＳＥＡＰ基質溶液を各試料に添加し、２０分間インキュベートした。化学発光シグナルをルミノメーターを用いて４７０ｎｍで１秒間検出した。
【００８５】
４．２  結果
図４は、ｐＶＤ１７９（−）又はｐＶＤ１７９＋ｐＶＤ２０３（ｐＶＤ２０３）に感染したＨｅＬａ細胞における、トランスフェクション２日及び３日後のＳＥＡＰ活性を示す。ｐＶＤ２０３（Ｒｅｐタンパク質）の同時発現は、ｐＶＤ１７９のみをトランスフェクトした細胞と比較して、それぞれ、培地におけるＳＥＡＰ活性の１．８倍及び１．５倍の増加をもたらした。
【図３】
2010538675.tif 000003
【図１】
2010538675.tif 000004
【図２】
2010538675.tif 000005
【図４】
2010538675.tif 000006
【配列表】
2010538675000001.app
【国際調査報告】
2010538675.tif 000007
2010538675.tif 000008