(57)【要約】  生物活性物質および細胞を結合するための増強された結合密度を有する、プラズマ処理された環状ポリオレフィン共重合体表面を提供する。これらのプラズマ処理された環状ポリオレフィン共重合体表面に複合体を施用することにより、生物活性物質または細胞の結合をさらに増強してもよい。処理された高分子表面を作製および特性化する方法についても提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物活性化合物を結合することができる作用面を有する高分子基板を作製する方法であって、
環状ポリオレフィン共重合体を提供し、
前記環状ポリオレフィン共重合体をプラズマ処理して前記高分子基板の表面に官能基を提供し、
前記プラズマ処理した共重合体を複合体に曝露することにより、前記高分子基板の表面の前記官能基が前記複合体と共有結合を形成し、
前記複合体に共有結合した前記高分子表面を生物活性化合物に曝露することにより、前記生物活性化合物を前記高分子表面に固定化する、
各工程を有してなる方法。
【請求項２】
前記生物活性化合物がペプチドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記高分子基板が０．５ｐｍｏｌ／ｍｍ2よりも大きいペプチド結合密度を有することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法によって作製された高分子基板。
【請求項５】
細胞が結合可能な作用面を有する高分子基板を作製する方法であって、
環状ポリオレフィン共重合体を提供し、
前記環状ポリオレフィン共重合体をプラズマ処理して前記高分子基板の表面に官能基を提供し、
前記高分子表面を複合体に曝露することにより、前記高分子基板の表面の前記官能基が前記複合体と共有結合を形成し、
前記共有結合した複合体を有する前記高分子表面を細胞結合性ペプチドに曝露することにより、前記細胞結合性ペプチドが前記高分子表面に固定化される、
各工程を有してなる方法。
【請求項６】
前記複合体が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、またはＥＤＣとＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）の組合せを含むことを特徴とする請求項１または５記載の方法。
【請求項７】
前記細胞結合性ペプチドが、ＫＧＧＮＧＥＰＲＧＤＴＹＲＡＹ（配列番号３）、ＮＧＥＰＲＧＤＴＹＲＡＹ（配列番号４）、ＫＧＧＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰ（配列番号５）、またはこれらの組合せを含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記細胞結合性ペプチドが、前記高分子表面にリンカーを介して固定化されることを特徴とする請求項２または５記載の方法。
【請求項９】
前記リンカーがＰＥＧまたはＰＥＯを含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記高分子基板が、フラスコ、皿、平皿、シート、ウェルプレート、ビン、ローラーボトル、容器、ピペット、ピペットチップ、管、ビーズ、医療機器、フィルタ機器、膜、またはスライドのうちの少なくとも一部を提供することを特徴とする請求項１または５記載の方法。
【請求項１１】
細胞結合性ペプチドと共役した、プラズマ処理によって誘発された官能基を有する環状ポリオレフィン共重合体基板を備えた、
細胞が結合可能な作用面を有する高分子基板。
【請求項１２】
前記細胞結合性ペプチドが、ＫＧＧＮＧＥＰＲＧＤＴＹＲＡＹ（配列番号３）、ＮＧＥＰＲＧＤＴＹＲＡＹ（配列番号４）、ＫＧＧＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰ（配列番号５）、またはこれらの組合せを含むことを特徴とする請求項１１記載の高分子基板。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、「高分子基板の反応表面（Reactive Surface on a Polymeric Substrate）」という発明の名称で２００７年８月３１日に出願した米国仮特許出願第６０／９６７，２３０号の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、一般に高分子基板の分野に関し、さらに詳細には、生物活性化合物を結合するため、表面に活性化部分を有する、修飾された高分子基板に関する。処理された高分子表面の解析および使用方法についても本発明によって提供される。
【背景技術】
【０００３】
多くの産業および用途では、堅く、強靭で、溶融しやすく、押出成形および熱成形された、随意的に透明で化学的に不活性であり、温度変動および厳しいｐＨ条件に耐性であり、生体適合性があり、優れた防湿層特性をもたらす、高分子基板が望ましい。生命工学、薬学、食品科学、細胞科学、発酵、および他の分野では、生物関連有機化合物と、該生物関連化合物と接触する容器または表面を作り出す物質との相互作用は重要である。一部の産業では、有機化合物が容器に張り付かないことが重要である。一部の用途では、流体流れ、凍結融解サイクルまたは他の厳しい条件に直面した場合でさえも、有機化合物が表面または容器に張り付くことが重要である
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
細胞科学、薬学、生命工学、発酵、および他の分野に使用可能な幅広い特性を示す高分子基板を開発することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の実施の形態は、生物活性化合物または細胞が結合可能な作用面を有する高分子基板の作製方法であって、
（１）環状ポリオレフィン共重合体を提供し、
（２）前記環状ポリオレフィン共重合体をプラズマ処理して前記高分子基板の表面に官能基を提供し、
（３）前記高分子表面を複合体に曝露することにより、前記高分子基板の表面の前記官能基が前記複合体と共有結合を形成し、
（４）前記複合体と共有結合した前記高分子表面を生物活性化合物に曝露することにより、前記生物活性化合物が前記高分子表面上に固定化される、
各工程を有してなる方法を提供する。さらなる実施の形態は、前記複合体が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、またはＥＤＣとＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）の組合せであり、前記生物活性物質がペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、多糖類、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、細胞外基質分子、細胞接着分子、または細胞、もしくはそれらの組合せまたは断片でありうる、方法を提供する。本発明の追加の実施の形態は、前記開示した方法によって作製される高分子を提供する。追加の実施の形態では、環状ポリオレフィン共重合体はマイクロ波プラズマで処理されうる。
【０００６】
さらなる実施の形態では、高分子基板は、０．５ｐｍｏｌ／ｍｍ2よりも大きい、または１．５ｐｍｏｌ／ｍｍ2よりも大きいペプチド結合密度を有する。さらなる実施の形態では、本発明は、フラスコ、皿、平皿、ウェルプレート、シート、ビン、ローラーボトル、容器、ピペット、ピペットチップ、管、ビーズ、医療機器、フィルタ機器、フィルム、膜、スライド、またはビーズのうちの少なくとも一部を提供する、高分子基板を提供する。
【０００７】
さらなる実施の形態では、本発明は、細胞が結合可能な作用面を有する高分子基板の作製方法であって、
（１）環状ポリオレフィン共重合体を提供し、
（２）前記環状ポリオレフィン共重合体をプラズマ処理して前記高分子基板の表面に官能基を提供し、
（３）前記高分子表面を複合体に曝露することにより、前記高分子基板の表面上の前記官能基が前記複合体と共有結合を形成し、
（４）共有結合した複合体を有する前記高分子表面を細胞結合性ペプチドに曝露することにより、前記細胞結合性ペプチドが前記高分子表面上に固定化される、
各工程を有してなる方法を提供する。追加の実施の形態では、細胞結合性ペプチドは、ＫＧＧＮＧＥＰＲＧＤＴＹＲＡＹ（配列番号３）、ＮＧＥＰＲＧＤＴＹＲＡＹ（配列番号４）、ＫＧＧＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰ（配列番号５）、またはこれらの組合せでありうる。実施の形態では、細胞結合性ペプチドは、ＰＥＧまたはＰＥＯでありうるリンカーを介して表面に固定化されて差し支えない。
【０００８】
実施の形態では、本発明はまた、結合に利用可能な高分子の表面の接触可能な官能基の数を評価する方法であって、
（１）検査する表面上に多くの官能基を有する、プラズマ処理された環状ポリオレフィン共重合体表面を提供し、
（２）前記プラズマ処理された環状ポリオレフィン共重合体表面を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）に曝露し、
（３）前記プラズマ処理された環状ポリオレフィン共重合体表面を、混合物中の標識化した生物剤、または、標識化および非標識化生物剤に曝露することにより、生物剤を前記表面に固定化し、
（４）前記表面に間接的に結合した標識の量を決定する、
各工程を有してなる方法を提供する。
【０００９】
さらなる実施の形態では、本発明は、高分子表面に対し、格付けを付与する方法であって、
検査する表面上に多くの官能基を有する、処理された高分子表面を提供し、
前記高分子表面を複合体に曝露することにより、前記高分子の表面上の官能基が複合体と共有結合を形成し、
前記複合体に共有結合した前記高分子表面を、混合物の標識化した生物剤、または標識化および非標識化生物剤に曝露することにより、前記標識化した生物剤を前記高分子表面に固定化し、
前記高分子表面に固定化された標識の量を決定し、
前記表面に固定化された標識の量に基づいて、前記高分子表面に対する格付けを付与する、
方法を提供する。
【００１０】
さらなる実施の形態では、本発明は、細胞結合性ペプチドと共役した、プラズマ処理によって誘発された官能基を有する、環状ポリオレフィン共重合体基板を備えた、細胞が結合可能な作用面を有する高分子基板を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】表面またはその近くに官能基を有する高分子の概略図。
【図２】表面に官能基を有する高分子の概略図。
【図３】表面に官能基を有するように処理された高分子表面に結合する、生体分子の概略図。
【図４】第１級アミン基を有する生物活性化合物と結合するように処理された高分子表面を生成するための化学スキーム。
【図５】共役ペプチド、ブロッキングペプチド、および未処理ペプチドのウェルの処理表面を比較する、蛍光スキャンの較正曲線。
【図６】図５に示すプレートから測定した、較正、共役、ブロッキング、およびバックグラウンドの蛍光スキャン結果。
【図７】３種類の異なる高分子表面における生物活性化合物の結合レベルを示すグラフ。
【図８】本発明の実施の形態に従って処理したさまざまな表面におけるＨＴ−１０８０細胞結合を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の実施の形態には、生命工学、薬学、食品科学、細胞科学、発酵、生物科学および他の分野などの産業用途のための、表面特性が改善されるように処理されたプラスチック表面が含まれる。実施の形態では、本発明は、プラズマ処理することによって、酸素含有基が豊富であり、生物関連化合物または細胞が結合するための接触可能な官能基を提供する表面をもたらす、環状ポリオレフィン共重合体表面を含めた表面を提供する。追加の実施の形態では、本発明は、生物活性化合物または細胞にさらに結合可能な複合体または架橋剤に結合する、プラズマ処理された表面を提供する。さらには、本発明の実施の形態は、生物活性化合物に結合する表面の能力を測定するための方法を提供する。
【００１３】
プラズマ処理されたプラスチック表面は、商業的な細胞培養用途および研究に広く用いられている。例としては、利用可能な表面を有するCorning Incorporated社（米国ニューヨーク州コーニング所在）製の「TCT」CellBIND（登録商標）、およびBD Biosciences社（米国ニュージャージー州フランクリン・レイクス所在）製のPrimaria（登録商標）が挙げられるが、粘着性に乏しい細胞および細胞系の要求を満たすさらなる表面が必要とされている。ヒトＥＳ細胞（ｈＥＳＣs）を含む幹細胞は、これらの市販の表面上では増殖しない可能性がある。
【００１４】
これらの問題の解決に向けて取り組むため、培養耐性細胞が増殖および繁栄するであろう表面を提供する、表面コーティングが開発されている。これらのコーティングの例としては、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ならびに、ポリ−Ｄ−リジンおよびBeckton Dickinson社（米国ニュージャージー州フランクリン・レイクス所在）から市販されるマウス腫瘍細胞から分泌されたタンパク質混合物であるマトリゲル（Matrigel（登録商標））などの合成のペプチド・コーティングが挙げられる。理論的には、これらの化合物は、通常、インビボにおいて細胞が付着する細胞外基質内に存在しうる。しかしながら、これらのコーティング材料に用いられるタンパク質は、その大部分が動物性であり、したがって、コスト高、予測不可能なロット間のばらつき、保存寿命の乏しさ、および細胞培養がプリオンおよびウイルスなどの動物由来の感染体で汚染される可能性の原因となる。
【００１５】
非動物性の表面についても開示されている。Invitrogen社（米国カリフォルニア州カールズバッド所在）製のAlgiMatrix（商標）はアルギン酸スポンジである。Ultra-Web（商標）は、Surmodics社（米国ミネソタ州エデン・プレーリー.所在）およびCorning Incorporated社（米国ニューヨーク州コーニング所在）から市販される合成のナノファイバー細胞外基質である。Corning Incorporated社はまた、Cell-BIND（登録商標）、DNA-BIND（登録商標）（Ｎ−オキシコハク酸イミド）、Sulfhydryl-BIND（商標）（マレイミド）、Carbo-BIND（商標）（ヒドラジド）およびUniversal-BIND（商標）など、プラスチック表面で利用することができる反応性官能基を有するポリスチレン表面も販売している。
【００１６】
活性化した表面の提供は、他の分野においても所望されている。例えば、化学、生化学、および生物学的なアッセイおよび研究のための生物活性化合物との結合に利用可能な活性部位を有する高分子表面を提供することが望まれている。例えば、アッセイを支援する材料がより効率的に試薬に結合する場合、ＥＬＩＳＡ法はさらに高い感度で行なわれうる。酵素活性アッセイ、代謝産物の定量、核酸の定量、タンパク質の定量、細胞の生存性、細胞増殖、細胞機能、細胞分化、およびアポトーシスの研究は、活性化した高分子表面と共に使用されうるアッセイの例である。
【００１７】
ほとんどの用途では、生物活性分子の操作および取り扱いに関する用途に有用な表面を提供するため、高分子の表面において、高密度の生物活性分子を実現することが望ましい。生物活性分子への結合能力がより良好な表面は、より効率的でありうる。それらは、表面に結合する検体の測定可能な官能特性を拡大しうる。言い換えれば、生物活性化合物の共役に利用可能な高分子表面に高密度の官能基を提供することが好ましいであろう。
【００１８】
高分子を積極的な液体試薬で処理すると、共役に利用可能な高分子の表面材料に高密度の官能基をもたらす結果となりうる。例えばポリエチレンを硫酸中、７２℃で５分間、次いで７０％硝酸中、５０℃で１５分間、三酸化クロムで酸化すると、３３ｐｍｏｌ／ｍｍ2の密度のカルボン酸基が得られる（James R. Rasmussen, Erwin R. Stedronsky, and George M. Whitesides, Introduction, Modification, and Characterization of Functional Groups on the Surface of Low-Density polyethylene Film, J.Am.Chem.Sci., 99(1977) 4736）。ポリ（メチルメタクリレート）を１０ＭのＮａＯＨを用いて４０℃で１６時間処理すると、６．６ｎｍｏｌ／ｍｍ2の密度のカルボン酸基が得られる（Holmberg K., Hyden H., Methods of Immobilization of Proteins to Polymethylmethacrylate, Prep. Biochem. 15(1985) 309）。しかしながら、これらの方法は、処理問題を引き起こし、厳格な安全指針を強制され、細胞培養または他の生物学的用途に使用できないであろう残渣を残す可能性がある、濃縮された腐食性の溶液で長時間処理することを要する。したがって、湿式化学プロセスは産業上の利用にはあまり適していないであろう。さらには、湿式化学処理は、高分子の表面に限定されず、処理高分子内の所定の深さにまで及ぶ可能性がある。したがって、表面に与えられたすべての官能基が、表面に存在する嵩高い場合が多い生体分子との共役に利用可能というわけではないであろう。湿式化学プロセスのこれら特性を所与とすると、プラズマ処理および機能性コーティングには、依然として、プラスチック表面の修飾および官能化のための主要な産業プロセスが残されている。
【００１９】
プラズマ表面修飾は、化学物質の消費率の低さ、処理速度の速さ、および環境影響の低さから、魅力的である。プラズマ処理は非常に有効であるが、通常は高密度の特定の官能基を生じる結果にはならず、さまざまな官能基のスペクトルが生じる。例えば、ポリスチレンの酸素プラズマ処理は、カルボキシル、カルボニル、ヒドロキシル、エステル、エーテル、および他の酸素含有基を生じ、その割合はプラズマ処理条件に応じて決まる。本発明の実施の形態に従った処理が可能なプラスチック表面としては、ポリアクリレート、ポリメチルアクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリサルフォン、ポリヒドロキシ酸、ポリ酸無水物、ポリオレフィン、ポリオルトエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリフォスファゼン、ポリホスフェート、ポリエステル、ポリエーテル、ナイロン、環状ポリオレフィン共重合体、アクリル、またはそれらの混合物が挙げられる。
【００２０】
完全に合成であり、望ましくない材料を浸出せず、細胞の付着および増殖を支援する、細胞培養および他の用途のための表面を提供することが望ましい。細胞は、細胞の表面から伸びるタンパク質でできた結合を通じて表面に付着する。言い換えれば、細胞が、細胞の表面タンパク質との相互作用を通じて、細胞外基質成分と相互作用すると同時に、細胞は、細胞の表面タンパク質との相互作用を通じて、細胞培養容器の表面とも相互作用する。幾つかの細胞は特に気難しく、培養するのが困難である。一部の細胞は、結合するための活性部位をより多く有する細胞培養表面を好み、また一部の細胞は、結合のための活性部位が少ない細胞培養表面を好むであろう。言い換えれば、細胞の結合に利用可能な活性部位が特定の濃度範囲内にある、細胞培養表面を提供することが好ましい。顧客がさまざまな表面上で特定の細胞培養を試験し、特定の細胞培養が必要とする最良の環境を顧客が選択するためには、結合のための活性部位をさまざまな範囲で提供する複数の細胞培養表面を提供できることが望ましい。
【００２１】
また、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、多糖類、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、ホルモン、細胞外基質分子、細胞接着分子、天然高分子、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチド、増殖因子、合成高分子、ポリリジン、薬物、および他の分子、またはこれらの組合せまたは断片など、生物関連化合物が接着するための表面を提供することが望ましい。これらの化合物の表面への結合は、上述のような表面への細胞の結合、および、生化学的な試験および分析、実験および技術における用途、ならびに、さらなる処理を可能にするために化合物を表面に捕捉することを要する実験および技術における用途にも関係している。１つの表面の別の表面に対する相対的な表面結合特性の大きさを利用者が測定可能であることを特徴とする表面を提供することも望まれている。
【００２２】
高分子表面を表面処理するための方法は、例えば、参照することによりその全体が本明細書に援用される、米国特許第６，６１７，１５２号明細書に記載されている。その参考文献には、ポリアクリレート、ポリメチルアクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリサルフォン、ポリヒドロキシ酸、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリプロピレン、ポリフォスファゼン、ポリホスフェート、ポリエステル、ナイロン、またはそれらの混合物を含む、高分子材料の処理について記載されている。しかしながら、出願人は、限定はしないが、TOPAS Advanced Polymers, Inc.社（米国ケンタッキー州フローレンス所在）製のTopas（登録商標）、およびZEON Inc.社（日本国東京所在）製のZeonex（登録商標）／Zeonor（登録商標）という銘柄で販売されるものなど、環状ポリオレフィン共重合体が、本発明の実施の形態のための基板として有用であることを見出した。環状ポリオレフィン共重合体表面は、有機溶媒に対して比較的耐性であり、化学処理およびプラズマ処理に対して肯定的に反応する。
【００２３】
処理された高分子材料は、通常、ＸＰＳすなわちＸ線光電子分光法によって特徴付けられる。この技術を用いて、材料の表面の化学的組成（構造)を特徴付けることができる。取り出し角として知られる、測定時に表面に向けられるＸ線の角度に応じて、測定は、材料の表面からの深さをさまざまに変えて行なわれうる。この方法は、表面に存在する化学種を同定するために用いることができるが、表面に存在する、生物関連化合物の付着に利用可能な官能基の数を測定することはできない。例えば、８０°の取り出し角におけるＣＯＯＨ炭素のＸＰＳ測定は、表面より５〜１０ｎｍ下の深さに至るまでのＣＯＯＨ炭素の存在についての情報を与えうる。この測定は興味深いが、反応種は高分子の表面に対して深いところに存在しうる。この深い反応部位は、大きい嵩高いペプチドまたは高分子表面に存在する他の生物活性化合物への結合に利用できる場合も、利用できない場合もある。
【００２４】
図１は、化学処理、プラズマ処理、または他の処理によって処理された基板または高分子１を示しており、官能基２が材料に導入されている。図１は、この処理が高分子１の表面３上およびその下の材料に官能基または反応基２が導入される結果となりうることを示している。ＸＰＳなどの通常用いられる技術を使用すると、官能基のすべてがカウントされうるが、実際には、これら官能基４のサブセットのみが実質的に高分子１の表面３上に存在する。
【００２５】
この修飾された高分子表面は、ＸＰＳ、すなわち表面における水の液滴の接触角の測定、表面の特定の基と相互作用する染料の使用、表面のゼータ電位の測定、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、または走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を含めた、いくつかの既知の方法によって特徴付けることができる。これらの方法のそれぞれは、高分子の表面またはその近くの官能基の数および特性を特徴とする。
【００２６】
しかしながら、高分子の表面またはその近くの官能基の数は、必ずしも、その表面を表すのに最も関連した情報ではない。例えば、処理表面の望ましい使用が、タンパク質が表面に付着することである場合、その表面についての最も関連した情報は、どのくらいの数のタンパク質が修飾表面に付着可能であるかであって、表面またはその近くに存在する極性基の数ではないであろう。例えば、Ｎ2Ｏマイクロ波プラズマを用いて高分子処理したＣＯＣが、ＸＰＳで測定された１００Åの深さにおけるカルボキシル基の所定の濃度を有する場合、その情報は、高分子の表面で生体分子と相互作用するカルボキシル基の利用可能性に関するものではないであろう。さらには、さまざまな方法で処理したさまざまな表面は異なる表面特性を有し、生物活性化合物の結合特性に変化を生じさせる。
【００２７】
例えば、生物活性化合物、すなわち、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、多糖類、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、またはそれらの組合せ、ホルモン、細胞外基質分子、細胞接着分子、天然高分子、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチド、増殖因子、合成高分子、ポリリジン、薬物、および他の分子などの反応基を有する有機化合物への結合についての表面の官能基の利用可能性は、ＸＰＳ解析によって間接的に表されるのみであろう。表面からの所定の深さにおける化学基のこの物理学的測定の代わりに、生物活性化合物に結合する表面の能力をさらに関連付けて測定することが望まれている。
【００２８】
本発明の方法の実施の形態では、細胞、またはペプチドなどの生物活性化合物を結合できる基板が提供される。ある実施の形態では、基板は環状ポリオレフィン共重合体（ＣＯＣ）材料、言い換えれば、プラズマに曝露する処理によって高分子の表面またはその近くに活性基を生成させたものである。温度、使用する気体、圧力、容積、表面の形状、湿度、エネルギー源の力、および表面を渡るプラズマの流速を含めたプラズマ処理のパラメータに応じて、より多い、またはより少ない官能基が高分子の表面またはその近くに提供されうる。処理に用いる気体の種類に応じて、さまざまな化学基が高分子のプレ表面層に導入されうる。高分子のプレ表面層とは、処理によって操作され、変化しうる、高分子の最上層である（図１、１０参照）。さらには、高分子表面は、高分子基板の表面上の官能基が複合体または架橋剤と共有結合を形成するように、複合体または架橋剤に曝露させてもよい。共役した高分子表面をさらに生物活性化合物に曝露させることにより、複合体または共役した高分子表面が生物剤と共有結合を形成するか、あるいは、生物剤が高分子表面と結合を形成することにより、追加の化学構造が生物剤と高分子表面との間に残らないようにすることができる。
【００２９】
実施の形態では、生物活性化合物を結合するための表面の能力の測定方法が提供される。例えば、表面は、特性評価の目的で提供される。この表面は、環状ポリオレフィン共重合体、ポリスチレン、アクリル、または他の表面などの高分子表面でありうる。表面は、例えば、プラズマ、紫外線、熱、化学処理または他の処理などによって処理されて差し支えない。表面を複合体に曝露することにより、高分子の表面上の官能基に複合体との共有結合を形成してもよい。複合体または架橋剤は、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、ＥＤＣ／ＮＨＳ混合物、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル)カルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３'−スルホナート、Ｎ，Ｎ'−カルボニルジイミダゾール、４−（ｐ−アジドサリチルアミド）−ブチルアミン、１，４−ジ−［３'−（２'−ピリジルジチオ)プロピオンアミド］ブタン、ビスマレイミドヘキサン、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、４，４'−ジフルオロ−３，３'−ジニトロフェニルスルフォン、Ｎ，Ｎ'−エチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、Ｎ，Ｎ'−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、Ｎ，Ｎ'−ウンデカメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、α，α'−ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸、トリス（２−クロロエチル）アミン、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）、３，３'−ジチオビスプロピオン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、スベリン酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、酒石酸ジスクシンイミジル、ビス［２−（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシナート）、グルタル酸ジスクシンイミジル、Ｎ，Ｎ'−炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）、アジピミド酸ジメチル、ピメルイミド酸ジメチル、スベルイミノ酸ジメチル、ジメチル３，３'−ジチオビス（プロピオンイミダート）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドアルチル酸、スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３'−ジチオプロピオネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジド安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４'−アジド−２'−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノアート、Ｎ−（５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシ）コハク酸イミド、スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）エチル１，３'−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル（４−アジドフェニル）−１，３'−ジチオプロピオナート、４−（ｐ−アジドフェニル）酪酸スルホスクシンイミジル、スルホスクシンイミジル−２−（７−アジド−５−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３'−ジチオプロピオナート、スルホスクシンイミジル−７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート、ｐ−ニトロフェニルジアゾピルベート、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸N-スクシンイミジル、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、スクシンイミジル６−［６−（（（ヨードアセチル）アミノ）−ヘキサノイル）アミノ］ヘキサノアート、スクシンイミジル６−［（ヨードアセチル）−アミノ］ヘキサノアート、スクシンイミジル６−（（（（４−ヨードアセチル）−アミノ）メチル−シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノ）ヘキサノアート、スクシンイミジル−４（（ヨードアセチル）−アミノ）メチルシクロヘキサン−１−カルボキシラート、ヨード酢酸４−ニトロフェニル、１−(ｐ−アジドサリチルアミド）−４−（ヨードアセトアミド）ブタン、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３−（２'−ピリジルジチオ）プロピオンアミド、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｐ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオナート、ｐ−アジドベンゾイルヒドラジド、ベンゾフェノン−４−ヨードアセトアミド、ベンゾフェノン−４−マレイミド,４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド・塩酸塩、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド・塩酸塩、および３−（２−ピリジルジチオ）プロピオノヒドラジドでありうる（Goddardら, Prog. Polym. Sci. 32(2007) 698-725, p. 706参照）。
【００３０】
実施の形態では、次に、結合複合体を有する表面を関連する生物活性物質に曝露し、生物活性物質を高分子の表面に固定化して差し支えない。生物活性物質は標識化してもよい。例えば、生物活性物質は、蛍光プローブ、すなわち特定の波長のエネルギーを吸収し、異なる（が、同様に特異的な）波長でエネルギーを再放射する分子の化学的タグで標識化されうる。フルオレセインの反応誘導体であるフルオレセインイソチオシアネートは、他の非蛍光の分子に化学的に結合し、さまざまな用途のための新しい蛍光分子を生み出す、最も一般的な蛍光プローブの１つである。他の歴史的に一般的な蛍光プローブは、ローダミン、クマリン、シアニン、（CyDyes）、ピレン、ナフタリン、ビマン（bimane）、ピリジルオキサゾール、ベンゾオキサジアゾール、ダポキシル、ジアゾアルカン、ＢＯＤＩＰＹ蛍光プローブ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ染料、および他の蛍光標識の誘導体である。生物活性物質は、例えば、ローダミン（カルボン酸の確認）またはフルオレセイン（第４級アンモニウム化合物）などの蛍光標識、または、トルイジンブルーＯ（カルボン酸）、アシッド・オレンジ７（第１級アミン）、ピクリン酸（第１級アミン）、酢酸チオニン（カルボン酸）、アクリフラビン（カルボン酸）、臭化エチジウム（カルボン酸）、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（フリーラジカル）、アミン官能化ＢＯＤＩＰＹ（カルボン酸）、ダンシルカダベリン（カルボン酸）、スクシンイミドエステル官能化ＢＯＤＩＰＹ（第１級アミン）、フルオレサミン（第１級アミン）、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（第１級アミン）、塩化ダンシル（ヒドロキシル）、標識化したストレプトアビジン（ビオチン）、ドラーゲンドルフ試薬（ポリエチレングリコール）、シッフ試薬、エルマン試薬、ブロモクレゾールグリーン、またはニンヒドリンなどの他のマーカーで標識化して差し支えない。32Ｐ、35Ｓ、Ｔ、または14Ｃなどの放射性標識、Ｄ、15Ｎ、13Ｃなどの同位体標識、または他の標識を使用してもよい。表面を適切にすすいだ後、蛍光読取または他の適切な方法を用いて、表面に結合した標識の量を決定して差し支えない。
【００３１】
図２は、高分子１の表面３に官能基４を生じるように処理された高分子１を示す、本発明の実施の形態を示している。この処理された高分子表面は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（カルボジイミド塩酸塩の形態であってもよい）（ＥＤＣ）、またはＥＤＣとＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）の組合せなどの複合体または架橋剤にさらに曝露される。この反応は、ペプチドおよびタンパク質などの遊離の第１級アミン基を有する生物活性化合物との結合に利用可能な高分子の表面に活性化基を形成する。この化学反応を図４に示す。
【００３２】
図３は、高分子１の表面３に官能基４が生じるように処理された高分子１を示す、本発明の実施の形態を示しており、ここで、処理された高分子１は複合体または架橋剤５にさらに曝露され、複合化処理された高分子は標識化された生物活性物質６にさらに曝露される。この標識化された生物活性物質は、例えば、蛍光標識であるテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）で標識化されたペプチドである。洗浄工程の後、高分子の表面に存在する、標識化されたタンパク質の量を評価することができる。図３は、反応完了時に複合体または架橋剤が存在してもよく（生物活性物質６が基板１の表面において官能基４に連結した複合体５に連結するように示されている）、あるいは存在しなくてもよい（生物活性物質７が、基板１の表面において官能基４に直接連結するように示されている）ことを例証するものである。例えば、架橋剤はゼロ長の架橋剤であってもよい。これは例えば図４に示されている。１０７は、複合体または架橋剤がＥＤＣ／ＮＨＳである場合、反応の完了時に複合体または架橋剤が存在しないことを示している。一部の実施の形態では、複合体５は生物活性物質への曝露の後に必ずしも存在しなくてもよい。
【００３３】
追加の実施の形態では、例えば図２においてリンカー８として示されるように、リンカーが存在していてもよい。この実施の形態では、リンカーは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）、あるいは同様のリンカー化合物でありうる。これらのリンカー化合物は、基板の表面から離れて、リンカーと結合しうる生物活性物質６を引き上げる役割をする。これは、嵩高い生物活性物質または細胞を表面に結合させることを可能にするためには重要でありうる。
【００３４】
図１を図３と比較すると、処理された高分子表面は、ＸＰＳなどの方法を用いて検出されうる非常に多くの官能基を有するが、これらの基の測定は、生物活性化合物の結合に利用可能な処理された高分子の表面における利用可能な官能基の数に必ずしも関係していないことが分かる。それは、特定の要求を満たす結合利用可能範囲内にある結合特性を有する表面を必要とするであろう科学者にとって興味深い真の表面特性である、生物活性化合物の結合に利用可能な官能基を、表面が有する度合いである。
【００３５】
例えば、細胞培養の分野では、表面が特定の範囲の結合密度を示し、高分子表面がその範囲外でない場合、一部の細胞は高分子表面に付着しうる。一部の細胞群は、特定の結合親和力を有する高分子表面上においてさらに生産的に増殖しうるが、他の細胞群は、同一の表面特性に否定的な反応を示す場合がある。細胞増殖を成功に導くパラメータは複雑であることから、特に細胞培養の分野で、また他の分野においても、１つの表面の結合特性を別の表面のものと比較することは非常に困難である。
【００３６】
本発明の実施の形態では、細胞結合または生物活性物質の結合に利用可能な高分子表面上における接触可能な官能基の数を評価するための方法が提供される。ある高分子表面が提供される。この表面は、例えば、検査する表面上に多くの官能基を有する、プラズマ処理された環状ポリオレフィン共重合体表面でありうる。高分子表面は、例えば、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）、またはＥＤＣとＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）の組合せなどの複合体または架橋剤に曝露することにより、プラズマ処理された環状ポリオレフィン共重合体の表面上のカルボキシル基が、一時的に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドまたはＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと共有結合を形成しうる。次に、この処理された高分子を、例えばテトラメチルローダミンで標識化したペプチドなど、標識化した生物剤に曝露することにより、標識化した生物剤を高分子表面に固定化する。次いで、結合した標識化生物剤の量を決定する。
【００３７】
この方法を用いて、細胞結合または生物活性物質の結合に利用可能な、高分子の表面上の接触可能な官能基の数を評価することができる。この方法を用いる利用者は、高分子基板の表面に結合可能なレベルに直接関係する方法を用いて、利用者の用途に良好に機能するであろう表面を、より上手く特定することができよう。
【００３８】
複合体または架橋剤に曝露された処理表面が上述のペプチドまたはタンパク質などの生物活性化合物と結合することができる程度は、表面に結合した標識の量を測定することにより測定することができる。次いで、本発明の方法の実施の形態を用いて測定された結合の量に基づいた表面について格付け（rating）を割り当てることができる。格付けは、例えばConjugation Density Rating、またはBinding Rating、またはSurface Binding Ratingでありうる。当業者は、本発明の精神から逸脱することなく、格付けシステムに付けられた名前を変更することができることを認識するであろう。
【００３９】
表面に結合した標識の量、および、表面に結合した標識の測定に基づく、システムに適用される格付けは、表面自体、表面に適用される処理の性質、表面に適用される複合体または架橋剤のタイプ、量、および性質、ならびに、複合化または架橋化された表面に適用される生物活性化合物のタイプ、量、および性質によって決まる。
【００４０】
例えば、ＣＯＣまたはポリスチレン（ＰＳ）でありうる表面は、プラズマ処理および／または複合体化合物で処理して差し支えない。次に、例えばペプチド、タンパク質、または核酸など、所望の標識化した生物活性化合物を、表面に施用して構わない。適切に洗浄した後、表面の結合能力を測定して差し支えない。同一の表面であっても、タンパク質と核酸とでは、結合について異なる格付けを有する場合がある。しかしながら、格付けを提供することを目的とした、表面の処理および分析についての標準化法に基づいた、格付けの情報は価値がある。相対的な表面特性に基づいた標準的な格付けシステムは、処理表面の購入者がより容易に１つの表面を別の表面と比較可能にし、より効率的な表面の購入を決定するための方法を作りうる。
【００４１】
図４は、複合体または架橋化合物と反応させて、第１級アミン基を有する生物活性化合物と結合する高分子表面を生成するための例となる化学反応を示している。図４は、プラズマ処理された高分子表面など、カルボン酸基１０１を備えた表面を例証している。次に、この表面を、限定はしないが１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）１０２などの複合体または架橋剤に曝露することができる。ＥＤＣはＨＣｌ塩であって差し支えなく、または別の形態で提供されてもよい。この曝露により、限定はしないが、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド・ナトリウム塩、ｐ−ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール、１−ヒドロキシ−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−カルボン酸エチル、およびメチルイミダゾールなどのアシル基移動剤の存在下または非存在下で、第１級アミン基１０６を有する生物活性化合物で処理することが可能な、不安定な反応性のＯ−アシルイソ尿素１０３を生じうる。一部の事例では、Ｏ−アシルイソ尿素エステルをＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）１０４と反応させ、次いで生物活性化合物と反応させることにより、安定なアミド結合を通じて表面に結合した生物活性化合物１０７を備えた基板を形成することは、有利であろう。この構造は、１１２に示すものと同一であって差し支えない。もしくは、１０７および１１２は、表面に結合した、さまざまな化学的性質の生体分子を備えていてもよい（図７参照）。非対称な無水物の棒グラフは図４の１１２に対応し、図７のＮＨＳの棒グラフは図４の１０７と一致し、対称な無水物の化学的性質は図４の１１４と関係している。ＮＨＳの非存在下では、不安定な反応性のＯ−アシルイソ尿素は、対称な無水物１０９の形成を通じて、基板と生物活性化合物１１３の間に安定なアミド結合を形成しうる。あるいは、工程１１０において、不安定な反応性のＯ−アシルイソ尿素は、トリフルオロ酢酸などの酸の存在下で、対称な無水物１１１を形成しうる。第１級アミン基１０６を備えた生物活性化合物で処理する際に、基板と生体分子１１２の間に安定な結合が形成されうる。生物活性化合物は標識化されていてもよい。反応性のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルは、水分の存在下で容易に加水分解可能であり、したがって、共役工程を乾燥有機溶媒中で行ない、共役工程の効率を高めることは有利であろう。反応性のＯ−アシルイソ尿素を水分１０８に曝露すると、カルボキシル基が再生１０１される。
【００４２】
次の実施例において、本発明の実施の形態をさらに例証する。
【実施例】
【００４３】
実施例１：高分子表面における化学的共役
処理された高分子、すなわち、表面上にカルボン酸基を生じさせるためにマイクロ波プラズマ処理された環状ポリオレフィン共重合体（ＣＯＣ）を提供１０１した。処理ガスとして湿った空気を使用し、表面をPlasma-Preen II 973マイクロ波プラズマシステムにおけるマイクロ波プラズマに曝露した。処理時間は、約６５０Ｗに相当する、５０％のパワー設定で３０秒間であった。Plasma-preen II 973のガラス・ベルジャー・リアクター内のマイクロ波にＣＯＣサンプルを設置し、それを次にオイル真空ポンプで真空排気し、プラズマ処理の間、処理ガスでパージした。プラズマ・リアクター内部の圧力は約１０-2〜１０-3Ｔｏｒｒであった。プラズマ・リアクター内部の温度は、最初は室温であり（約２５℃）、処理の間に約３０℃まで上昇した。
【００４４】
次に、この処理されたＣＯＣ高分子表面をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、０．１Ｍの１−エチル−３−［ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）１０２および０．０５ＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）１０４で１．５時間処理し、図４の１０３に示されるように、不安定な反応性のＯ−アシルイソ尿素を経て、高分子表面のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル基１０５に転換した。次に、このＮＨＳエステルポリマーを、第１級アミン基１０６を有する蛍光標識された生物活性化合物に１．５時間曝露した。標識化された化合物１０６は、２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、９９：１の割合の蛍光標識化／非標識化ペプチドアミド（ＲＧＧＳＤＰＩＹＫ−ＮＨ2／ＴＡＭＲＡ−ＧＲＧＤＳＰＩＩＫ−ＮＨ２）の混合物であった。（配列番号１：ＲＧＧＳＤＰＩＹＫ）（配列番号２：ＧＲＧＤＳＰＩＩＫ）。
【００４５】
標識化／非標識化ペプチドの混合物を用い、表面に結合した蛍光標識された分子間の距離を増大させた。蛍光分子が近接近している場合には蛍光信号の消光が生じ、これにより蛍光プローブの量に対する蛍光信号の非線形の依存性がもたらされる。これは、蛍光法に関係する通常の現象である。
【００４６】
図５は、共役した陰性対照（ブロッキング）および未処理表面と比較した較正曲線と共に、処理された高分子のペプチド結合を例証している。陰性対照では、２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、標識化／非標識化ペプチドアミド（Ｈ−ＲＧＧＳＤＰＩＹＫ（配列番号１）−ＮＨ2／ＴＡＭＲＡ−ＧＲＧＤＳＰＩＩＫ（配列番号２）−ＮＨ2、９９：１）の混合物に曝露する前に、ＮＨＳエステルをエタノールアミンまたはＮ−（３−アミノプロピル）モルホリン（ｐＨ７．５〜８．０における１〜３Ｍの溶液）と１．５時間反応させた。次に、表面を脱イオン水で洗浄し、乾燥させた。洗浄後の表面に吸着されたペプチドの量を決定するため、陰性対照実験を行った。したがって、表面に結合したペプチドの本当の蛍光を得るためには、ブロッキングしたウェルの蛍光を、共役したウェルの蛍光から差し引かなくてはならない。
【００４７】
表面に結合したペプチドの密度を評価するため、較正試験と並行して、標識化ペプチドの共役を行った。脱イオン水中、既知量の蛍光標識化／非標識化ペプチドの混合物（ＲＧＧＳＤＰＩＹＫ（配列番号１）−ＮＨ2／Ｒｈｏｄ−ＧＲＧＤＳＰＩＩＫ（配列番号２）−ＮＨ2、９９：１）をウェルに分配し、真空下で水を蒸発させることにより、較正曲線を得た。較正曲線は、０、０．１６、０．３２、０．４７、０．７９、１．５８、３．１６、および４．７４ｐｍｏｌ／ｍｍ2の総ペプチド濃度において蛍光を測定する。
【００４８】
標識化した／標識化していないペプチド混合物の活性化した表面への共役を、２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、７種類のペプチド溶液の濃度：１ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００５ｍＭ、および０．００１ｍＭの消失を用いて行った。共役緩衝液におけるペプチド濃度が増大する際、表面におけるペプチド密度（蛍光強度）の増加をモニタするように実験を設計した。これらの結果を図６Ｂに示す。共役緩衝液におけるペプチド濃度の増大により、ペプチドの結合工程の効率が向上し、結果的に蛍光強度がより強まるはずである。例えば、共役緩衝液におけるペプチド濃度が増大するときに蛍光の減少が見られる場合には、蛍光消光が示唆されるであろう。その場合、非標識化／標識化ペプチドの割合については、表面において互いにさらに遠く離れるように、蛍光標識されたペプチドの間隔を増大させる必要があろう。共役したペプチドの蛍光を、較正曲線における既知の濃度のペプチドのものと比較することにより、共役したペプチドの密度を評価した。同一の共役方法を用いて、マイクロプレートの較正ウェルにおける表面にペプチドを共役し、表面被覆の均一性を向上させ、較正曲線の直線性を確保することは、有益でありうる。
【００４９】
ＴＥＣＡＮマイクロアレイ・スキャナー（×１０００）を用いて蛍光を測定した。図６Ａおよび６Ｂは、図５に示すように、測定蛍光の較正曲線および共役実験を例証している。図６Ａは、較正曲線から得られたペプチド密度に対する蛍光のプロットを示す。図６Ａは、これらの環境下でのペプチドの蛍光測定における問題を例証している。１．７５ｐｍｏｌ／ｍｍ2以下の濃度では、予想通り、蛍光測定はほぼ線形であった。しかしながら、３〜５ｐｍｏｌ／ｍｍ2では、蛍光測定は平坦になり、さらには下降した。これは、較正ウェルにおけるペプチドを用いた均一ではない表面被覆の結果として、蛍光消光することに起因するものである。ペプチド溶液の体積および／または溶媒の添加を調整することは、問題の修正の助けとなるであろう。これは、較正用の表面へのペプチドの共役の観点から、特に有用な方法である。
【００５０】
図６Ｂは、共役およびブロッキングしたウェル、ならびに、共役したペプチドの本当の蛍光を表す、一方から他方を差し引いたもの（複合−ブロッキング）についての蛍光強度のプロットを示す。したがって、上記実験において、２．３ｐｍｏｌ／ｍｍ2以下のペプチド密度が達成されたが、表面の共役または活性化を行なう条件を調整することにより、０〜２．３ｐｍｏｌ／ｍｍ2の任意のペプチド密度が容易に達成されうることは、当業者にとって明らかである。例えば、存在する較正および共役データに基づき、０．０１５ｍＭ溶液のペプチドを用いて０．５ｐｍｏｌ／ｍｍ2のペプチド密度を達成することができる一方で、０．４ｍＭ溶液のペプチドは、同一の条件下で、１．５ｐｍｏｌ／ｍｍ2のペプチド密度を達成するであろう。
【００５１】
実施例２：さまざまな表面へのペプチドの共役
図７は、３種類の異なる表面、すなわち、環状ポリオレフィン共重合体（ＣＯＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、およびアクリル（Ａｃｒ）上でのペプチドの共役を例証している。処理ガスとして湿った空気を用い、Plasma-Preen II 973マイクロ波プラズマシステムのマイクロ波プラズマに各表面を曝露した。処理時間は約６５０Ｗに相当する５０％のパワー設定で３０秒間であった。Plasma-preen II 973マイクロ波のガラス・ベルジャー・リアクター内に各サンプルを設置し、それを次にオイル真空ポンプで真空排気し、プラズマ処理の間、処理ガスでパージした。プラズマ・リアクター内部の圧力は約１０-2〜１０-3Ｔｏｒｒであった。プラズマ・リアクター内部の温度は、最初は室温であり（約２５℃）、処理の間に約３０℃まで上昇した。
【００５２】
マイクロ波プラズマ処理の後、水中、０．４ＭのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）および０．１ＭのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）を用いて、１０分間、表面のカルボン酸基を活性化した。次に、溶液を、０．０１８ｍＭおよび０．１８ｍＭの濃度のｐＨ７．４、２５ｍＭのリン酸緩衝液溶液中、蛍光標識されたペプチドに置き換えた。蛍光標識されたペプチドを処理表面と反応させるために３０分間放置し、次に共役溶液を吸引し、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含むリン酸緩衝液で表面を洗浄し、脱イオン水で再度洗浄した。マイクロアレイスキャナーを用いて蛍光の強度を測定した。
【００５３】
図７は、同様に処理したポリスチレンまたはアクリルの表面の２倍を超える結合能力を示す表面を提供する、ＥＤＣ／ＮＨＳで処理したＣＯＣ表面を示す。この結果は驚きであった。ＥＤＣ／ＮＨＳで処理したＣＯＣ表面は、他のプラズマ処理されたプラスチックと比較して、生体分子を高密度で固定化することができる表面をもたらす結果となった。
【００５４】
図７はまた、表面がさまざまな反応を経ることについても例証している。例えば、生物活性化合物（図４に１０９および１１１として示す）と結合する前の、対称または非対称の無水物中間体の形成が、同一の密度におけるＥＤＣ／ＮＨＳ処理表面では生物活性化合物を結合しない表面を形成する。
【００５５】
実施例４：細胞接着アッセイ
細胞接着に関して、図４に示す共役方法を用いてペプチドの共役の効率を評価するため、ＨＴ−１０８０細胞接着アッセイを行った。これらの表面の一部を、図４に示すＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応に従ってさらに処理した。
【００５６】
プラズマ処理（黒い棒線）および未処理（白い棒線）の環状ポリオレフィン共重合体表面（「Topas」）を、９６ウェルプレートの形態で調製した。「Ａ」（フィブロネクチン）として示される対象データ、および図８における「Ｂ」（ラミニン）について、ラミニンおよびフィブロネクチンの対照ウェルを、室温で１時間、それぞれのタンパク質（５μｇ／ｍＬ、Sigma-Aldrich社（米国ミズーリ州セントルイス所在）製）でコーティングした。すべてのウェルを、３７℃で１時間、ＰＢＳ中、１％のＢＳＡでブロッキングした。細胞播種前、ＩＭＤＭ培地（Iscove's Modified Dulbecco's Media）中、０．１％のＢＳＡを用いたインキュベーションの前に、ウェルをＰＢＳで簡単に洗浄した。
【００５７】
ＨＴ−１０８０ヒト線維肉腫細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１２１）を、３０，０００細胞／ウェルの密度で対照プレートおよびペプチド−共役プレートに播種した。ＩＭＤＭ（Lonza社（スイス国バーゼル所在）製）中、１０％のＦＢＳ（Lonza社製）の標準的な細胞培養条件で１時間、細胞接着を行った。培地をウェルから吸引し、付着した細胞を固定し、２０％メタノール中、５０μＬの０．２％クリスタルバオレットで、室温で５分間染色した。クリスタルバオレット染料をウェルから吸引し、すべての表面を水で３回洗浄した。５７０ｎｍにおける吸収の測定前に、５分間、Ｈ2Ｏ中、１％のＳＤＳの添加を通じて、クリスタルバオレットの細胞吸着を定量化した。
【００５８】
図８は、本発明の実施の形態にしたがって調製したさまざまな表面におけるＨＴ−１０８０の細胞結合を示すグラフである。図８に存在するデータは、ラミニンでコーティングした、プラズマ処理およびプラズマ未処理の環状ポリオレフィン共重合体（「Topas」）の表面に正規化した。ラミニンでコーティングした、プラズマ処理およびプラズマ未処理の環状ポリオレフィン共重合体（「Topas」）の表面を図８におけるＢに示す。
【００５９】
図８では、対照ＡおよびＢは、ＮＨＳ／ＥＤＣの化学反応およびペプチド結合の非存在下、プラズマ処理の有無における、フィブロネクチンでコーティングした表面およびラミニンでコーティングした環状ポリオレフィン共重合体表面への細胞結合を示す。対照Ｃは、さらなる共役またはペプチドの適用がない、プラズマ処理（黒い棒線）および未処理の環状ポリオレフィン共重合体表面における細胞結合を示している。対照表面Ｄは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングされた、プラズマ処理（黒い棒線）および未処理（白い棒線）の環状ポリオレフィン共重合体表面における細胞結合を示している。
【００６０】
棒線Ｅ、ＦおよびＨは、ペプチドと共役した表面（プラズマ処理は黒い棒線、未処理は白い棒線）に対する細胞結合を示している（共役は、図４に示すように、最初のＮＨＳ／ＥＤＣ活性化、およびその後のペプチドの共有結合による表面への固定化からなる）。Ｅに示す表面を、細胞結合または細胞結合性ペプチドを増強することが知られているペプチドである、ＢＳＰペプチド（Ａｃ−ＫＧＧＮＧＥＰＲＧＤＴＹＲＡＹ−ＮＨ2（配列番号３）で処理した。プラズマ処理および未処理の表面を、細胞結合または細胞結合性ペプチドを増強することが知られているペプチドである４つの反復およびＢＳＰペプチド（ＮＨ2−ＰＥＯ4−ＮＧＥＰＲＧＤＴＹＲＡＹ−ＮＨ2）（配列番号４）を有する、ポリ（エチレンオキサイド）（ＰＥＯ）のリンカーと結合させた後、Ｆに示す細胞増殖データを得た。プラズマ処理および未処理の表面を、細胞結合または細胞結合性ペプチドを増強することが知られている別のペプチドであるビトロネクチンペプチド（Ａｃ−ＫＧＧＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰ−ＮＨ2（配列番号５）と結合させた後、Ｈに示す細胞増殖データを得た。Ｇは、エタノールアミンで処理した陰性対照である。ＥＤＣ／ＮＨＳ処理し、プラズマ処理したＣＯＣ材料を、１Ｍ、ｐＨ８．１のエタノールアミン溶液で処理し、エタノールアミンを表面に固定することによって、ＮＨＳエステルを不活性化した。次にペプチド溶液を加え、サンプルを通常通り処理した。この陰性対照の処理は、ペプチドが表面に固定化されないことを確実にする。
【００６１】
図８は、細胞培養表面のプラズマ処理が、ペプチド結合の存在下（Ｅ、ＦおよびＨ参照）および非存在下（Ｃ参照）において、細胞結合にとって重要であることを示している。細胞培養表面のプラズマ処理はまた、ペプチドの固定化にとっても重要である（ペプチド結合の陰性対照であるＧを考慮してＥ、ＦおよびＨを参照）。リンカー構造の有無における、既知の細胞接着性のペプチドを表面に結合させることは、細胞結合を促進する（Ｅ、ＦおよびＨ参照）。さらには、図８は、細胞結合の反応が表面に共有結合しているペプチドに由来するが、表面に非特異的に結合するペプチドには由来しないことを示している（ＥおよびＧの黒い棒線を参照）。
【００６２】
本明細書に開示される方法によって処理されうる基板の例としては、限定はしないが、フラスコ、皿、平皿、シート、ウェルプレート、ビン、ローラーボトル、容器、ピペット、ピペットチップ、管、シート、医療機器、フィルタ機器、ビーズ、膜、スライド、および医療移植片などが挙げられる。これらの品目は、典型的には、射出成形、エンドキャッピングの有無による押出成形、ブロー成形、インジェクションブロー成形などの通常実施される技術によって形成される。例えば、マイクロビーズまたはマイクロキャリアビーズを含めたビーズは、可塑性プラスチックのマイクロエマルジョン重合によって作ることができる。それらは、ジェット切断、静電発電機、共鳴ノズル、あるいは回転ディスクまたはスピンディスクなどの工業技術を用いることによって作製することができる。
【００６３】
本発明の実施の形態は、細胞の接着、付着、および増殖、ならびに、限定はしないが、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、多糖類、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、またはそれらの組合せ、ホルモン、細胞外基質分子、細胞接着分子、天然高分子、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチド、増殖因子、合成高分子、リジン、薬物、および他の分子など、多くの生物学的または化学的に活性な分子の共役または結合を目標とする。当業者に既知の任意の細胞型は、本発明の処理基板上に付着および増殖しうる。用いることができる細胞型の例としては、神経細胞、上皮細胞、間葉細胞、幹細胞、線維芽細胞、肝細胞、および他の細胞型が挙げられる。
【００６４】
前述の特定の実施の形態は、本発明の一般概念から逸脱することなく、不必要な実験をせずに、さまざまな用途について、他人が当業者の知識を適用することによって、特定の実施の形態を容易に改変および／または適合することができる、本発明の一般的性質を示すものである。したがって、このような適合および改変は、本明細書に提示される教示および指導に基づいて、開示される実施の形態と同等の意味および範囲内にあることが意図されている。本明細書に記載される表現または専門用語は説明の目的であって、限定するものではなく、したがって、本発明の専門用語または表現は、当業者の知識と組み合わせて、本明細書に提示される教示および指導の観点から、当業者によって解釈されるべきであるものと理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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