(57)【要約】  特定のエピトープに反応性を有する抗体を含むレジスチンアンタゴニストを開示する。間質性肺疾患、肥厚性瘢痕、ケロイド瘢痕及び強皮症を含む、異常な線維芽細胞の活性をともなう疾患を治療するか、あるいはその症状を緩和する方法もまた開示する。ヒトレジスチンに対する抗体を作製するうえで有用な抗原もまた開示する。
2010539937.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトレジスチンに結合し、ＮＦ−κｂにより媒介されるシグナル伝達を調節することが可能なレジスチンアンタゴニスト。
【請求項２】
ヒトレジスチンに結合し、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αからなる群から選択される少なくとも１つの炎症性サイトカインのレジスチンによって媒介される放出を阻害することが可能なレジスチンアンタゴニスト。
【請求項３】
ヒトレジスチンに結合し、Ｉ型コラーゲン、α平滑筋アクチン、ＴＧＦβ１、ＣＴＧＦ、ＴＧＦβＲ、ＰＤＧＦＲ、ＣＤ４４、フィブリリン、フィブロネクチン及びＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも１つの線維化促進遺伝子の発現のレジスチンによって媒介される誘導を阻害することが可能なレジスチンアンタゴニスト。
【請求項４】
ヒトレジスチンに結合し、線維芽細胞の機能を調節することが可能なレジスチンアンタゴニスト。
【請求項５】
前記アンタゴニストが、抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のレジスチンアンタゴニスト。
【請求項６】
ヒトレジスチンの５０番目〜６５番目の残基（配列番号３）に位置するエピトープに反応性を有する単離された抗体。
【請求項７】
ヒトレジスチンの７８番目〜９３番目の残基（配列番号４）に位置するエピトープに反応性を有する単離された抗体。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の有効量のレジスチンアンタゴニスト、及び製薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む製薬学的組成物。
【請求項９】
請求項６に記載の製薬学的組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物のレジスチンの生物学的活性を改変する方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の製薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、間質性肺疾患、肥厚性瘢痕、ケロイド瘢痕、強皮症、肝線維症、腎線維症及び心線維症を含む、異常な線維芽細胞の活性をともなう疾患を治療するか、あるいはその症状を緩和する方法。
【請求項１１】
アミノ酸配列ＥＳＱＳＶＴＳＲＧＤＬＡＴＳＰＲ（配列番号５）を有するペプチドを含む単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
アミノ酸配列ＳＧＳＷＤＶＲＡＥＴＴＳＨＳＱＳ（配列番号６）を有するペプチドを含む単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
前記配列番号５のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
【請求項１４】
前記配列番号６のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体などのレジスチンアンタゴニスト及び線維性病変を示す疾患の治療におけるその使用、並びに抗レジスチン抗体を作製するうえで有用な抗原に関する。
【背景技術】
【０００２】
間質性肺疾患（ＩＬＤ）は、同様の臨床的、放射線学的及び生理学的特徴を有する１００種類を上回る異なる疾患の総称である。その根本となる原因は、全身性疾患又は職業上の曝露によるものがある。しかしながら、一部のＩＬＤでは根本となる病因は不明である。これらの線維性肺疾患は治療が困難であり、その診断には生検を要する。
【０００３】
最も一般的な線維性肺疾患は、ＵＩＰ（通常型間質性肺炎）であり、１００，０００人当たり３〜２９人の発症率である（コルタス（Coultas）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１５０巻、９６７〜９７２頁（１９９４年））。ＵＩＰは数ヶ月から数年をかけて徐々に発症し、臨床的症状よりも先にしばしば放射線学的変化が出現する。ＵＩＰの特徴的な組織学的所見としては斑状の不均一な線維症の存在が挙げられ、病気の進行にともなって肺胞の虚脱、細気管支拡張症及び蜂巣化を生じ得る。非特異的間質性肺炎（ＮＳＩＰ）はＵＩＰと同様の臨床的症状を示す。しかしながら、特定の組織学的所見は類似しているものの、この患者群では線維症はより少ない傾向がある（マクドナルド（MacDonald）ら、放射線学（Radiology）、２２１巻、６００〜６０５頁（２００１年）。更に、ＮＳＩＰの患者はコルチコステロイドに対する反応性が高く、ある研究ではＮＳＩＰの患者の予後は顕著に改善されている（ダニール（Daniil）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１６０巻、８９９〜９０５頁（１９９９年）。
【０００４】
肺腫瘍切除の通常のマージンから得られた試料などの、線維症とは無関係の肺疾患から得られた細胞と比較して、線維性肺疾患から得られた線維芽細胞に相違が見られることが文献に報告されている。ＵＩＰ患者からの組織切片では、血管新生ケモカインであるＣＸＣＬ８（インターロイキン８又はＩＬ８としても知られる）の発現レベルが増大しているが、血管新生抑制ケモカインＣＸＣＬ１０（１０ｋＤａのＩＦＮ誘導性インターロイキン、ＩＰ１０）の発現レベルが低下しており、ＵＩＰ患者の肺における正味の血管新生における不均衡を示唆するものである（キーン（Keane）ら、免疫学（J. Immunol.）、１５９巻、１４３７〜１４４３頁（１９９７年）。更に、これらの患者から得られた線維芽細胞においてもＣＸＣＬ８の発現が増大しており、線維芽細胞が血管新生の不均衡を生じる主要なエフェクター細胞であることを示唆するものである（キーン（Keane）ら、前出）。より最近では、ＵＩＰ患者から得られた線維芽細胞は、高濃度のＣＣＬ７（単球走化性タンパク質３、ＭＣＰ３）を発現及び分泌していることが示されている（チョイ（Choi）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１７０巻、５０８〜５１５頁（２００４年）。非線維化組織、ＵＩＰ及び強皮症誘導性肺線維症から得られた線維芽細胞において、ＴＧＦβ１により誘導される遺伝子発現を比較した研究によっても、細胞が単離された環境に応じて異なる線維芽細胞の表現型及び反応性が示されている（レンゾニ（Renzoni）ら、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．、５巻、２４ページ（２００４年）。
【０００５】
レジスチンは、保存されたＣ末端のＣｙｓリッチドメインを有するＦＩＺＺ（Found in Inflammatory Zone（炎症領域で見出される）、ＲＥＬＭとしても知られる）タンパク質ファミリーに属する分泌因子である（ステッペン（Steppan）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９８巻、５０２〜５０６頁（２００１年）。それは、肥満とインスリン抵抗性との関連を与える脂肪細胞由来ポリペプチドとして最初にマウスで見出された（ステッペン（Steppan）ら、なネイチャー（Nature）、４０９巻、３０７〜３１２頁（２００１年）。一方、ヒトレジスチンは、強力な炎症誘発因子として認識されているマクロファージ／単球由来因子である。ヒトレジスチンは、免疫系の様々な細胞からのサイトカインの放出を誘導し、接着分子の発現量を上昇させ、内皮細胞における血管新生を促進する（バーネット（Burnett）ら、アテロスクレローシス（Atherosclerosis）、１８２巻、２４１〜２４８頁（２００５年）、ムー（Mu）ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、７０巻、１４６〜１５７頁（２００６年）、ヴェルマ（Verma）ら、循環器（Circulation）１０８巻、７３６〜７４０頁（２００３年）、ボカレワ（Bokarewa）ら、免疫学（J. Immunol.）、１７４巻、５７８９〜５７９５頁（２００５年）。
【０００６】
レジスチンの作用はＮＦ−κｂ経路によって媒介されていると考えられている（ボカレワ（Bokarewa）ら、前出）。現在、齧歯類で４種類の、ヒトで２種類のＦＩＺＺファミリーメンバーが同定されている。これらの内、ＦＩＺＺ１（ＲＥＬＭα）はマウスにおける肺線維症の発症に関与している。ＦＩＺＺ１は、アレルギー性肺疾患のマウスモデルの洗浄液中で発見された（ホロコム（Holcomb）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９巻、４０４６〜４０５５頁（２０００年）。更に、ブレオマイシン誘導線維症マウスの肺においてＦＩＺＺ１遺伝子の発現レベルの上昇が見られた（リュー（Liu）ら、米国病理学会雑誌（Am. J．.Pathol.）、１６４巻、１３１５〜１３２６頁（２００４年）。マウスへのＦＩＺＺ１の静脈内注射によって、肺においてＣＤ６８陽性マクロファージが顕著に増大することが示されている（ヤマジ−ケガン（Yamaji-Kegan）ら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８月４日、２００６年、電子版）。インビトロでの実験により、ＦＩＺＺ１は細胞分裂促進作用を有し、平滑筋細胞の増殖並びに肺線維芽細胞におけるアクチンとコラーゲンの沈着を誘導を刺激することによって線維症を媒介している可能性が示されている（テン（Teng）ら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，９２巻、１０６５〜１０６７頁（２００３年）。ＦＩＺＺ１の気道内注入により、ＶＥＧＦの産生が顕著に増大し、これは肺の血管新生におけるＦＩＺＺ１の役割を示唆するものである（トン（Tong）ら、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．、７巻、３７頁（２００６年）。ＦＩＺＺ１のオーソログはヒトのゲノムでは同定されていない。興味深いことに、ヒトレジスチン（ＦＩＺＺ３）は、発現パターンがマウスレジスチンよりもマウスＦＩＺＺ１に類似しており、このことは潜在的な機能的類似性を示唆するものである。
【０００７】
しかしながらヒトレジスチンと肺線維症との関係についてはほとんど解明されていない。レジスチン受容体は同定されておらず、そのためにレジスチンの生物学の理解は限定されている。最近になって、マウスレジスチンの３次元構造が解明された（パテル（Patel）ら、サイエンス（Science）、３０４巻、１１５４〜１１５８頁（２００４年）。マウスレジスチンは、ジスルフィド結合した６量体構造に集合し得る非共有結合による３量体オリゴマーを形成する。ヒトレジスチンについては構造的情報は得られていない。
【０００８】
したがって、上記の観点から、ヒトレジスチンの構造的情報、並びに肺線維症及びこれにともなう症状を治療するためのレジスチンアンタゴニストなどの治療薬が求められている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＵＩＰ、ＮＳＩＰ及び非線維症患者から得た肺の生検におけるレジスチン濃度を示す。
【図２Ａ】線維化肺及び非線維化肺由来の線維芽細胞、並びに線維化肺生検から単離された初代肺線維芽細胞を組み換えレジスチンで処理した後におけるプロコラーゲンＩ及びα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の遺伝子発現の誘導に対するレジスチンの影響を示す。
【図２Ｂ】線維化肺及び非線維化肺由来の線維芽細胞、並びに線維化肺生検から単離された初代肺線維芽細胞を組み換えレジスチンで処理した後におけるプロコラーゲンＩ及びα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の遺伝子発現の誘導に対するレジスチンの影響を示す。
【図２Ｃ】線維化肺及び非線維化肺由来の線維芽細胞、並びに線維化肺生検から単離された初代肺線維芽細胞を組み換えレジスチンで処理した後におけるプロコラーゲンＩ及びα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の遺伝子発現の誘導に対するレジスチンの影響を示す。
【図３Ａ】肺線維芽細胞における線維化促進増殖因子及び増殖因子受容体の遺伝子発現に対するレジスチンの影響を示す。
【図３Ｂ】初代肺線維芽細胞における線維化促進増殖因子及び増殖因子受容体の遺伝子発現に対するレジスチンの影響を示す。
【図４Ａ】肺線維芽細胞における幾つかの細胞外基質関連遺伝子（４Ａ）及びＩＬ−６遺伝子（４Ｂ）の発現レベルの誘導を示す。
【図４Ｂ】肺線維芽細胞における幾つかの細胞外基質関連遺伝子（４Ａ）及びＩＬ−６遺伝子（４Ｂ）の発現レベルの誘導を示す。
【図５Ａ】ヒト肺初代線維芽細胞を組み換えレジスチンで処理した後の炎症誘発サイトカインＩＬ−６（５Ａ）、ＩＬ−８（５Ｂ）及びＭＣＰ−１（５Ｃ）の放出量の増大を示す。
【図５Ｂ】ヒト肺初代線維芽細胞を組み換えレジスチンで処理した後の炎症誘発サイトカインＩＬ−６（５Ａ）、ＩＬ−８（５Ｂ）及びＭＣＰ−１（５Ｃ）の放出量の増大を示す。
【図５Ｃ】ヒト肺初代線維芽細胞を組み換えレジスチンで処理した後の炎症誘発サイトカインＩＬ−６（５Ａ）、ＩＬ−８（５Ｂ）及びＭＣＰ−１（５Ｃ）の放出量の増大を示す。
【図６】ヒト初代単球からのレジスチンの分泌を示す。接着していない、又は接着した単球に線維化促進調節因子による処理を行わないか、あるいはそれぞれの単球を因子で刺激した。*はｐ＜０．０５を示す。
【図７Ａ】ＵＩＰの組織切片においてレジスチンがマクロファージ様細胞とともに局在化している様子を示す。
【図７Ｂ】ＵＩＰの組織切片においてレジスチンがマクロファージ様細胞とともに局在化している様子を示す。
【図８】ヒト及びマウスレジスチンのアミノ酸配列の整合を示す。
【図９】完全長のヒトレジスチンへのポリクローナル抗体Ｃ２８１５及びＣ２８１６の結合を示す。
【図１０Ａ】ヒトレジスチンにより媒介される単離したヒト初代血中単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＭＣＰ−１の放出に対するＣ２８１５及びＣ２８１６ポリクローナル抗体の影響を示す。
【図１０Ｂ】ヒトレジスチンにより媒介される単離したヒト初代血中単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＭＣＰ−１の放出に対するＣ２８１５及びＣ２８１６ポリクローナル抗体の影響を示す。
【図１１Ａ】マウスレジスチンにより媒介される単離したヒトＰＢＭＣからのＭＣＰ−１の放出に対するＣ２８１５及びＣ２８１６ポリクローナル抗体の影響を示す。
【図１１Ｂ】マウスレジスチンにより媒介される単離したヒトＰＢＭＣからのＭＣＰ−１の放出に対するＣ２８１５及びＣ２８１６ポリクローナル抗体の影響を示す。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の一態様は、レジスチンのアンタゴニストである。一実施形態では、レジスチンアンタゴニストは、レジスチンに反応性を有し、レジスチンの少なくとも１つの生物学的活性を中和する単離された抗体である。
【００１１】
本発明の別の態様は、ヒトレジスチンの５０〜６５番目の残基に位置するエピトープ（配列番号３）に反応性を有する単離された抗体である。
【００１２】
本発明の別の態様は、ヒトレジスチンの７８〜９３番目の残基に位置するエピトープ（配列番号４）に反応性を有する単離された抗体である。
【００１３】
本発明の別の態様は、ＥＳＱＳＶＴＳＲＧＤＬＡＴＳＰＲ（配列番号５）のペプチドを含む単離されたポリペプチドである。
【００１４】
本発明の別の態様は、ＳＧＳＷＤＶＲＡＥＴＴＳＨＳＱＳ（配列番号６）のペプチドを含む単離されたポリペプチドである。
【００１５】
本発明の別の態様は、配列番号５のアミノ酸配列をコードした単離された核酸である。
【００１６】
本発明の別の態様は、配列番号６のアミノ酸配列をコードした単離された核酸である。
【００１７】
本発明の別の態様は、レジスチンの濃度又は影響を低減することによって哺乳動物の線維症を治療する、又は線維症の症状を緩和する方法である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書に引用する、特許及び特許出願を含むがそれらに限定されない刊行物はすべて、それらがあたかも本明細書に完全に記載されているのとまったく同様に本願に援用するものである。
【００１９】
本発明は、ＩＬＤ、強皮症、肥厚性瘢痕などの線維性病変にともなう疾患、並びに喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの著明な肺のリモデリングにともなう疾患を治療するための、レジスチンアンタゴニストに対する新規な治療ターゲットとしてのサイトカインの１種であるレジスチンの役割に関するものである。
【００２０】
本発明では、レジスチンタンパク質は線維化した肺において検出されることが示されている。抗レジスチンモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学法により、レジスチンは、線維化及びリモデリングプロセスに関与する単球／マクロファージ細胞において発現することが示されている。レジスチンの分泌は線維化促進作用を有する調節因子によって誘導されるが、このことは線維化した肺ではレジスチンの局所濃度が上昇している可能性を示唆するものである。レジスチンは、肺線維症の病因に寄与する２つのプロセスである細胞外基質（ＥＣＭ）の蓄積及び筋線維芽細胞の分化に関与する遺伝子を誘導することによって初代肺線維芽細胞に直接影響する。レジスチンはまた、線維化促進性の増殖因子及び肺線維芽細胞におけるその受容体の発現も誘導する。更に、レジスチンは、炎症誘発性サイトカインの放出を増大させることによって肺線維芽細胞における炎症反応を刺激する。レジスチンは線維化していない線維芽細胞よりも線維化した細胞により大きく作用するが、このことはレジスチンによるシグナル伝達が病的な線維芽細胞において増大していることを示唆するものである。最後に、本発明では、レジスチンの発現及び分泌は線維化促進性の調節因子によって誘導されることが示されている。以上を考え合わせると、これらのデータは、レジスチンが線維芽細胞の活性化及び肺の炎症に寄与することによって線維症を悪化させ得ることを示唆するものである。したがって、レジスチンを阻害することは、異常な線維芽細胞の機能にともなう疾患の治療にとって有益であると考えられる。
【００２１】
更に、本発明では、マウスのタンパク質の結晶構造に基づいたヒトレジスチンの３次元構造のモデルについて述べる。このモデルを用いて、Ｃ１ｑ／ＴＮＦスーパーファミリーとの構造的類似性に基づき、潜在的な受容体結合部位を予測する。予測された受容体結合部位にまたがるペプチドに対する２種類のポリクローナル抗体を作製し、これらの抗体の中和活性をインビトロの機能性アッセイによって確認した。これらのデータは、同定されたエピトープがレジスチンが機能するうえで重要であり、レジスチンを中和する治療薬の作製に利用可能であることを示唆するものである。
【００２２】
本発明の一実施形態では、こうしたエピトープペプチドは、担体タンパク質と接合させるか又はより大きなタンパク質の足場と結合させて、免疫化のため及び／又は中和抗レジスチン抗体を作製するパンニングを行うファージディスプレイのための抗原として、使用される。開示される機能性エピトープを使用して抗体群をスクリーニングすることで中和活性を有する抗体を同定することができる。
【００２３】
抗体ポリペプチド及び組成物
本発明は、レジスチンに対するアンタゴニストを提供する。一実施形態では、レジスチンアンタゴニストは、レジスチンに結合してレジスチンの生物学的活性の少なくとも１つを中和する性質を有する抗体である。
【００２４】
「アンタゴニスト」なる用語は広義で用いられ、レジスチンの１つ以上の生物学的活性を、直接的又は間接的に、部分的又は完全に、中和、低減又は阻害することが可能な分子を含む。
【００２５】
「抗体」なる用語は広義で用いられ、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体などの免疫グロブリン又は抗体分子を含み、マウス、ヒト、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体並びに抗体フラグメントが挙げられる。
【００２６】
一般に、抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はポリペプチドである。完全な抗体とは、２個の同じ軽鎖と２個の同じ重鎖とからなるヘテロ４量体の糖タンパク質である。通常、それぞれの軽鎖は１個の共有ジスルフィド結合によって重鎖と結合しているが、ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンのアイソタイプが異なる重鎖の間で異なる。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた、規則的な間隔をおいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。それぞれの重鎖は可変領域（ＶH）を一端に有し、これに多数の定常領域が続く。それぞれの軽鎖は一端に可変領域（ＶL）を有し、その他端に定常領域を有しており、軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域と並んでおり、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と並んでいる。あらゆる脊椎動物種の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）及びラムダ（λ）の２つの明確に異なるタイプのうちの１つに分類することができる。免疫グロブリンは、重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの大きなクラスに分類することができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のアイソタイプに更に分類される。
【００２７】
「抗体フラグメント」なる用語は、完全な抗体の部分、通常は完全な抗体の抗原結合領域又は可変領域を意味する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント、並びに一本鎖抗体分子が挙げられる。
【００２８】
「ＣＤＲ」は、抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列として定義され、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の超可変領域である。例えば、カバト（Kabat）らによる「免疫学的対象のタンパク質の配列」（Sequences of Proteins of Immunological Interest）第４編、米国保険社会福祉省、米国立衛生研究所（１９８７年）を参照されたい。免疫グロブリンの可変部分には３個の重鎖ＣＤＲ又はＣＤＲ領域及び３個の軽鎖ＣＤＲ又はＣＤＲ領域が存在する。したがって、本明細書で用いる「ＣＤＲ」とは、状況に応じて、３個の重鎖ＣＤＲのすべて、又は３個の軽鎖ＣＤＲのすべて、又は重鎖ＣＤＲのすべてと軽鎖のＣＤＲのすべての両方を指す。
【００２９】
ＣＤＲは、抗体が抗原又はエピトープと結合するための接触残基の大部分を提供する。本発明の対象となるＣＤＲは、ドナー抗体の可変重鎖及び軽鎖配列に由来するものであり、自然界に存在するＣＤＲの類似体を含み、これらの類似体もまた、それらが由来するドナー抗体と同じ抗原結合特異性及び／又は中和能力を共有又は保持している。
【００３０】
本明細書で用いる「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）とは、ほぼ均質な抗体の集団から得られる抗体（又は抗体フラグメント）を意味する。モノクローナル抗体は極めて特異性が高く、通常、単一の抗原決定基に対して作製される。「モノクローナル」という修飾語は、抗体のほぼ均質な性質を指して言うものであり、抗体がいずれかの特定の方法によって作製される必要はない。例えば、マウスｍＡｂは、コーラー（Kohler）らのハイブリドーマ法によって作製することができる（コーラー（Kohler）ら、ネイチャー（Nature）、２５６巻、４９５〜４９７頁）１９７５年）。ドナー抗体（通常はマウス）に由来する軽鎖及び重鎖の可変領域を、アクセプター抗体（通常はヒトなどの別の哺乳動物種）に由来する軽鎖及び重鎖の定常領域とともに含むキメラｍＡｂを、米国特許第４，８１６，５６７号に開示される方法によって作製することができる。ヒト以外のドナー免疫グロブリン（通常はマウス）に由来するＣＤＲと、結合親和性を保存するために変化させたフレームワーク支持残基を場合に応じて有する、１つ以上のヒト免疫グロブリンに由来する分子の免疫グロブリン由来の残りの部分とを有するヒト化ｍＡｂを、クイーン（Queen）らによって開示される技法によって得ることができる（クイーン（Queen）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８６巻、１００２９〜１００３２頁（１９８９年）及びホドソン（Hodgson）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻、４２１頁（１９９１年）。
【００３１】
ヒト化に有用なフレームワーク配列の例は、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ．ｐｈｐ；ｗｗｗ．ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ／ｔｏｐ．ｈｔｍｌ；ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｋａｂａｔ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／〜ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／〜ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／〜ｙａｓｕｈｉｔｏ／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ．ｏｒｇ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／〜ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓ１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃｇ０７ｓ；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ；ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ、及びカバト（Kabat）ら「免疫学的対象のタンパク質の配列」（Sequences of Proteins of Immunological Interest）米国保険社会福祉省（１９８７年）に開示されており、これらの全容を本願に援用する。
【００３２】
ヒト以外のいかなる配列も有さない完全なヒトｍＡｂを、例えば、ロンバーグ（Lonberg）ら（ネイチャー（Nature）、３６８巻、８５６〜８５９頁（１９９４年））、フィッシュワイルド（Fishwild）ら（ネイチャーバイオテクノロジー（Nature Biotechnology）、１４巻、８４５〜８５１頁（１９９６年））及びメンデス（Mendez）ら（ネイチャージェネティクス（Nature Genetics）、１５巻、１４６〜１５６頁（１９９７年））によって参照される方法によってヒト免疫グロブリン形質転換マウスから調製することができる。ヒトｍＡｂは、例えば、ナッピク（Knappik）ら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９６巻、５７〜８６頁（２０００年））、及びクレブス（Krebs）ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、２５４巻、６７〜８４頁（２００１年）によって参照される方法によってファージディスプレイライブラリーから調製及び最適化することもできる。
【００３３】
本発明は、ヒトレジスチンに結合し、ＮＦ−κｂによって媒介されるシグナル伝達を調節することが可能なレジスチンアンタゴニストに関する。本発明はまた、ヒトレジスチンに結合し、線維芽細胞の異常活性化、線維化を促進する遺伝子発現の誘導、炎症性反応の刺激を含むがこれらに限定されないレジスチン媒介活性を調節することが可能なレジスチンアンタゴニストにも関する。こうしたアンタゴニストには、レジスチンに結合してレジスチンによるシグナル伝達を調節する性質を有する抗レジスチン抗体が含まれる。本発明の一態様は、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８及びＩＬ−６を含むがこれらに限定されない他の炎症性サイトカインのレジスチンによって媒介される放出を阻害する、ヒトレジスチンに反応性を有する抗体である。これらの抗体は、研究用試薬、診断用試薬及び治療薬として有用である。特に、本発明の抗体は、線維症を治療する、又は線維症の症状を緩和するための治療薬として有用である。
【００３４】
抗体の例は、アイソタイプがＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＧＡ又はＩｇＭである抗体である。加えて、こうした抗体は、グリコシル化、異性化、非グリコシル化、又はポリエチレングリコール部分の付加（ペギレーション）及び脂質化などの自然界には存在しない共有結合修飾などの反応によって翻訳後修飾されることができる。こうした修飾はインビボあるいはインビトロで行ってよい。完全なヒトの、ヒト化された及び親和性成熟させた抗体分子又は抗体フラグメントは、模倣体、結合タンパク質及びキメラタンパク質と同様、本発明の範囲に含まれる。
【００３５】
本発明の抗体は、ヒトレジスチンのエピトープ50ＥＣＱＳＶＴＳＲＧＤＬＡＴＣＰＲ65（配列番号３）又は78ＣＧＳＷＤＶＲＡＥＴＴＣＨＣＱＣ93（配列番号４）の一方又は両方に結合し得る。これらのレジスチンエピトープは、ヒトレジスチンに対するモノクローナル抗体を作製及びスクリーニングするための抗原として使用するために単離及び修飾することができる。例えば、エピトープ配列を修飾してシステイン残基を取り除くことによってジスルフィド結合を防止できる。これらの残基はセリンで置換することができる。修飾されたレジスチンエピトープの例として、ＥＳＱＳＶＴＳＲＧＤＬＡＴＳＰＲ（配列番号５）及びＳＧＳＷＤＶＲＡＥＴＴＣＨＳＱＳ（配列番号６）のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドがある。これらのポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【００３６】
本発明の抗体は、１０-7、１０-8、１０-9、１０-10、１０-11又は１０-12Ｍ以下のＫdでヒトレジスチンに結合できる。ヒトレジスチンに対する特定の抗体の親和性は、任意の好適な方法を用いて実験によって測定することができる。こうした方法では、当業者には周知であるバイアコア（Biacore）又はＫｉｎＥｘａ装置、ＥＬＩＳＡ又は競合的結合アッセイを使用することができる。所望の親和性でヒトレジスチンと結合する抗体分子は、抗体親和性成熟法及び当該技術分野で認識されている他の好適な技法などの技法によって変異体又はフラグメントのライブラリーから選択することができる。
【００３７】
本発明の別の態様は、少なくとも１種類のレジスチン抗体及び当該技術分野では周知の製薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む製薬学的組成物である。担体又は希釈剤は、溶液、懸濁液、エマルション、コロイド又は粉末であってよい。
【００３８】
本発明のレジスチン抗体は、治療に有効な量で製薬学的組成物として処方される。「有効な量」なる用語は、有効な治療、すなわち、治療を要する症状又は疾患の部分的又は完全な緩和に必要とされる抗体の量を一般に指す。有効な治療の定義には、上記に述べた症状又は疾患が発症する確率を低減させることを目的とした予防的治療が含まれる。
【００３９】
核酸、ベクター及び細胞株
本発明の別の態様は、ＣＤＲのアミノ酸配列を有する抗体の重鎖又は軽鎖をコードするポリペプチドを含むか、そのポリペプチドと相補的であるか又はそのポリペプチドと充分な相同性を有する単離された核酸分子である。特定の発現系における遺伝子コードの縮重又はコドン選択性を考慮すると、重鎖又は軽鎖の可変領域のＣＤＲをコードした他のポリヌクレオチドも本発明の範囲に含まれる。
【００４０】
通常、本発明の核酸は、本発明のレジスチン抗体ポリペプチドを調製するために発現ベクターとして用いられる。本発明の範囲に含まれるベクターは真核生物の発現に必要な要素を与えるものであり、ＣＭＶプロモーターにより制御されるベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＥＰ４及びそれらの誘導体など、のウイルスプロモーターにより制御されるベクター、バキュロウイルス発現ベクター、ショウジョウバエ発現ベクター及びヒトＩｇ遺伝子プロモーターなどの哺乳動物の遺伝子プロモーターにより制御される発現ベクターを含む。他の例としては、Ｔ７プロモーターにより制御されるベクター（例えば、ｐＥＴ４１）、ラクトースプロモーターにより制御されるベクター及びアラビノース遺伝子のプロモーターにより制御されるベクターなどの原核生物の発現ベクターが挙げられる。
【００４１】
本発明はまた、レジスチン抗体を発現する細胞株にも関する。ホスト細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。真核細胞の例は、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、６５３、ＳＰ２／０、ＮＳ０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫細胞、又はそれらの誘導体を含むがこれらに限定されない哺乳動物細胞である。最も好ましくは、ホスト細胞はＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＳＰ２／０又はＣＨＯ細胞である。細胞株は、当該技術分野では周知の安定的又は一過性形質導入によって作製することができる。
【００４２】
本発明は更に、レジスチン抗体を発現させるための方法であって、レジスチン抗体が検出可能又は回収可能な量で発現されるような条件下でその細胞株を培養する工程を含む方法を提供する。本発明はまた、レジスチン抗体を作製するための方法であって、レジスチン抗体をコードした核酸をインビトロ又はその場でトランスレートすることによってレジスチン抗体が検出可能又は回収可能な量で発現される工程を含む方法を提供する。本発明はまた、上記の方法により作製されたレジスチン抗体も含む。
【００４３】
レジスチン抗体は、これらに限定されるものではないが、タンパク質Ａ精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーなどの周知の方法によって回収及び精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を精製に使用することもできる。
【００４４】
線維症を治療する又は線維症の症状を緩和するための治療方法
レジスチン抗体は、とりわけ、研究用試薬及び治療薬として有用である。一態様において、本発明は、レジスチンの生物学的活性を改変する方法であって、本発明のレジスチン抗体を必要とする哺乳動物に本発明のレジスチン抗体を提供する工程を含む方法に関する。レジスチンのこうした生物学的活性の例としては、線維芽細胞の異常活性化、筋芽細胞の分化の刺激、線維化促進遺伝子の誘導、炎症誘発性サイトカインの放出、Ｉ型コラーゲンの蓄積の誘導並びに当業者には周知の他の活性が挙げられる。特に、レジスチン抗体は、ＮＦ−κｂ経路を含むがこれに限定されないレジスチンによって媒介される細胞シグナル伝達カスケードを低減又は阻害し得る。
【００４５】
本発明は更に、線維症の症状を緩和するか又は線維症を治療するための方法であって、レジスチン抗体製薬学的組成物の治療に有効な量をそれを必要とする患者に投与する工程を含む方法を提供する。上述したように、このような組成物は有効量のレジスチン抗体及び製薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む。治療目的であるか予防目的であるかによらず、特定の治療法における有効量は、投与手段、標的部位及び投与される他の薬剤などの多くの異なる要因に応じて一般的に異なり得る。したがって、治療薬の用量は滴定することによって安全性及び有効性を最適化する必要がある。加えて、レジスチン抗体は単独で、又は線維症を治療するうえで有用な少なくとも１種類の更なる化合物、タンパク質若しくは組成物と組み合わせて投与することができる。
【００４６】
投与形態は、製薬学的に有効な量の本発明のレジスチン抗体をホストに与えるための任意の好適な経路であってよい。例えば、レジスチン抗体は、皮下、気道内、筋肉内、皮内、静脈内若しくは鼻孔内投与などの非経口投与、又は当該技術分野では周知の他の任意の手段によって投与することができる。
【００４７】
本発明を以下の実施例を参照しながら更に説明する。これらの実施例はあくまで本発明の態様を説明することを目的としたものであって、本発明を限定することを目的とするものではない。
【実施例】
【００４８】
（実施例１）
レジスチンは肺に存在する。
【００４９】
ＵＩＰ、ＮＳＩＰ及び胚腫瘍の通常のマージンから得た肺の生検試料をコンプリートプロテアーゼインヒビター（Complete Protease Inhibitor）（ロシュ社（Roche））を含むＰＢＳ中でホモジナイズした。製造者の指示にしたがってＥＬＩＳＡ（リンコ・リサーチ社（Linco Research Inc.）、ミズーリ州セントチャールズ（St. Charles））によってレジスチン濃度を測定した。それぞれの肺生検の全タンパク質をＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアス・バイオテクノロジー社（Pierce Biotechnology, Inc.）イリノイ州ロックフォード（Rockford））を用いて測定した。次いでレジスチン濃度をそれぞれの患者の試料中のタンパク質の量に対して正規化し、これを図１に示す。レジスチンタンパク質は、すべての肺生検試料から得られたホモジネート中に検出された。非線維症群と線維症群との間に有意差は認められなかった。
【００５０】
（実施例２）
レジスチンは線維症に関連する遺伝子の発現を刺激する。
【００５１】
ＵＩＰ患者から採取した肺生検から肺線維芽細胞を単離し（ｎ＝４）、ここでは、これを「線維化線維芽細胞」又は「ＵＩＰ線維芽細胞」と呼ぶこととする。線維芽細胞も肺腫瘍切除の際に採取した肺組織から単離し（ｎ＝５）、組織学的分析によってこれらの試料が非線維性であることを確認した。これらの非線維化組織に由来する線維芽細胞をここでは「非線維化線維芽細胞」（ＮＦ）と呼ぶ。
【００５２】
ヒト肺線維芽細胞を、１００，０００細胞／ウェルで２４穴プレート（コースター社（Costar）、ニューヨーク州コーニング（Corning））に播種し、８時間、接着させた。次いで、細胞をＰＢＳで洗い、無血清培地（Ｌ−グルタミンを加えたＤＭＥＭ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で一晩培養した。次いで細胞をＴＧＦβ−１（１又は１０ｎｇ／ｍＬ）又はレジスチン（１又は１０μｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下で２４時間、刺激した。ヒト組み換えレジスチンをペプロテック社（Peprotech, Inc.）ニュージャージー州ロッキーヒル（Rocky Hill））より購入した。タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析により確認したところ、エンドトキシン濃度は低いことが分かった（０．９ＥＵ／ｍｇ）。上清を除去し、市販のＥＬＩＳＡ又はＬｕｍｉｎｅｘを用いてレジスチンタンパク質について分析した。次いで、製造者の指示にしたがってＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ−Ｋｉｔ（キアジェン社（QIAGEN）カリフォルニア州バレンシア（Valencia））を用いてＲＮＡを単離し、タックマン（TaqMan）（登録商標名）リバートランスクリプション（Reverse Transcription）試薬（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）カリフォルニア州フォスターシティー（Foster City））を用いてｃＤＮＡに逆転写した。線維化促進遺伝子の発現を、製造者の指示にしたがってタックマン（TaqMan）（登録商標名）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems））及び予め開発されたタックマン（TaqMan）（登録商標名）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems））を用いたリアルタイムＰＣＲによって調べた。比較ＣT法を用い、ＣT値を遺伝子発現が最初に検出された閾値サイクル数として求めることにより定量的な遺伝子発現を計算した。対象とする遺伝子の遺伝子発現の倍数変化を最初にハウスキーピング遺伝子１８Ｓに対して正規化し、ΔＣT値を得た。インビトロでの刺激による遺伝子発現の倍数変化を、刺激しない試料を基準として用いてΔΔＣT＝ΔＣT(刺激無シ)−ΔＣT(刺激有リ)により計算した。レジスチンの潜在的な線維化促進活性を調べるため、プロコラーゲンＩ、α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）、ＣＴＧＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦｂＲ、ＰＤＧＦＲ、ヒアルロナン受容体ＣＤ４４、フィブリリン（ｆｂｎ１）、フィブロネクチン（ｆｎ１）及びＩＬ−６の発現レベルを非処理及びレジスチン処理した肺線維芽細胞で評価した。
【００５３】
コラーゲン沈着の蓄積及び筋線維芽細胞の存在は線維症の２つの重要な特徴である。この研究でポジティブコントロールとして用いられる公知の線維化促進調節因子であるＴＧＦβ１によって、プロコラーゲンＩ及びαＳＭＡは肺線維芽細胞中でいずれも発現レベルの上昇が誘導された。同様に、肺線維芽細胞の組み換えレジスチンによる処理によって、プロコラーゲンＩ及びαＳＭＡの発現が誘導された（図２）。レジスチンは非線維化線維芽細胞における遺伝子発現には影響を及ぼさなかったことから、このレジスチンの作用は線維症患者から単離された線維芽細胞に特異的であることは重要である。これらのデータは、線維化した細胞ではレジスチン受容体／シグナル伝達が発現上昇／活性化していることを示唆する。
【００５４】
図３Ａに示されるように、レジスチンは、公知の線維化促進調節因子であるＣＴＧＦ及びＴＧＦβ１遺伝子の発現レベルの上昇を誘導した。更に、レジスチンは、ＴＧＦβ受容体及びＰＤＧＦ受容体の遺伝子の発現レベルの上昇も誘導した（図３Ｂ）。既に述べた他の遺伝子と同様、レジスチンは線維化した線維芽細胞の遺伝子発現のみを増大させた。
【００５５】
細胞外基質（ＥＣＭ）成分の変化並びに異常な基質ターンオーバーは、様々な線維性疾患又は組織リモデリングにともなう疾患の特徴である。ヒアルロナン受容体ＣＤ４４、フィブリリン（ｆｂｎ１）及びフィブロネクチン（ｆｎ１）を含むＥＣＭ遺伝子の内の幾つかに対するレジスチンの影響を評価した。レジスチンは、ＣＤ４４、フィブリリン及びフィブロネクチンの発現を線維化線維芽細胞に特異的に上昇させた（図４Ａ）。レジスチンによる遺伝子発現の誘導は、低濃度においてより顕著であった（１μｇ／ｍｌ）。レジスチンはまた、線維化及び非線維化線維芽細胞の両方においてＩＬ−６の発現レベルの上昇を誘導した（図４Ｂ）。
【００５６】
（実施例３）
レジスチンはサイトカイン放出の誘導を通じて炎症誘発性環境を促進する。
【００５７】
インビトロでヒト組み換えレジスチンで刺激した肺生検から単離した線維芽細胞からの無細胞上清を、ＬＩＮＣＯヒトサイトカインキット（リンコリサーチ社（Linco Research））によりサイトカイン濃度について分析した。レジスチンは、肺線維芽細胞からのＩＬ−６（図５Ａ）、ＩＬ−８（図５Ｂ）及びＭＣＰ−１（図５Ｃ）の放出を刺激した。分析した他のサイトカインは検出可能濃度を下回った。これらのデータは、レジスチンが肺線維芽細胞において炎症性反応を引き起こすことが可能であり、これにより線維症の発症及び進行に寄与し得ることを示唆する。これらのデータは、レジスチンが免疫細胞からのサイトカインの放出を刺激する能力を有する強力な炎症誘発因子であることを示唆する。
【００５８】
（実施例４）
レジスチンの分泌は線維化促進性メディエータによって増大する。
【００５９】
単離したばかりの初代血中単核細胞から精製されたヒトＣＤ１４+単球を、オールセルズ社（（AllCells, LLC）カリフォルニア州エメリービル（Emeryville））より購入した。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ中、９６穴Ｕ字底プレートにそれぞれのウェル当たり７５，０００個の細胞密度で播種した。０又は１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）、ミネソタ州ミネアポリス（Minneapolis））及びＰＤＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems））で細胞を処理した。４８時間の培養後、上清中のレジスチン濃度をＥＬＩＳＡキットによって測定した。マクロファージの分化を誘導するために、単球を１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中、９６穴プレートに播種し、接着させた後、上記と同様にして細胞を処理した。図６のデータは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表わし、ｎ＝３であり、*はｐ＜０．０５であることを示す。
【００６０】
図６に示されるように、レジスチンは初代単球及び接着した単球において発現及び分泌されている。ＴＧＦβ１及びＰＤＧＦ処理により、単球及び接着した単球の両方においてレジスチンの産生が誘導された。レジスチンは、肺線維芽細胞においてもＴ細胞又はＢ細胞などの他の免疫細胞（データは示していない）においても検出されなかった。これらのデータは、リモデリング部位に存在するＴＧＦβ１及びＰＤＧＦなどの増殖因子は、浸潤した単球及びマクロファージからのレジスチンの産生を誘導し得ることを示す。
【００６１】
（実施例５）
レジスチンは肺のマクロファージ細胞で発現される。
【００６２】
肺腫瘍の通常のマージン、ＵＩＰ又はＮＳＩＰの患者からの肺生検試料（全体でｎ＝９、それぞれの患者コホートにつき、ｎ＝３）を２μｇ／ｍｌの濃度の抗レジスチン抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems））で染色した。肺の試料中、マクロファージ、組織球（組織に限局したマクロファージ）及びマスト細胞においてレジスチンタンパク質が検出された。高度の炎症を有する非線維化肺試料を、ＣＤ６８抗体で共染色したところ、レジスチンはＣＤ６８陽性マクロファージ細胞とともに局在化していることが示された（図７Ａ）。単球及びマクロファージ細胞におけるヒトレジスチンの発現はこれまでに報告されており（ジュン（Jung）ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、６９巻、７６〜８５頁（２００６年）、リルケ（Lehrke）ら、ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ．、１巻、ｅ４５（２００４年）並びに本発明者らの知見によっても確認された（図６）。ＵＩＰ及びＮＳＩＰの患者からの肺試料の抗レジスチン抗体による染色の代表的な例を図７Ｂに示す。非線維化肺試料と線維化肺試料との間でレジスチン染色の明らかな差異は認められなかった。
【００６３】
（実施例６）
ヒトレジスチンの３次元構造のモデリング。
【００６４】
ヒトレジスチン（配列番号１）及びマウスレジスチン（配列番号２）のアミノ酸配列を、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔよりアクセッション番号Ｑ９ＨＤ８９及びＱ９９Ｐ８７でそれぞれ取得し、並べた。図８は、ヒトレジスチンとマウスレジスチンとの間の配列の整合を示したものであり、全体的な配列相同性は５５％である。
【００６５】
マウスレジスチンの結晶構造（ペテル（Patel）ら、前出）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋよりアクセッション番号１ＲＦＸで入手可能である。この構造に基づき、配列の整合性にしたがってアミノ酸を置換することによりヒトレジスチンの３Ｄモデルを構築した。この目的ではコンピュータプログラムＣＯＯＴ（Emsley, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60:2126-32（2004））を使用した。側鎖の立体配座を調節して他の残基との接近を防止した。可能なかぎり、最もエネルギー的に好ましい回転異性体を選択した。主鎖の立体配座は変化させる必要はなかった。得られたモデルは、禁制立体配座をなす残基がなく、立体障害のない、分子内部の相殺されない電荷や、分子の表面上の広範囲にわたる疎水性領域のような好ましくない環境をなす残基を有さないものであった。マウスタンパク質に対する配列類似性が比較的高く、立体化学的な基準が満たされているものと仮定すると、得られる３次元モデルは実際の構造のよい近似を与えるものである。
【００６６】
レジスチンのポリペプチド鎖は、Ｎ末端のαへリックス構造（２２〜４７番目の残基）にロールケーキ（jelly-roll）形のβ構造を有する球状のドメイン（４８〜１０８番目の残基）が続く構造に折り畳まれている。３個のタンパク質モノマーが、αへリックスがコイルドコイルを形成する３量体を形成し、球状ドメインがそれぞれのモノマーの表面の約３０％に相当する広範囲の境界面を有する密な頭部を形成している。レジスチンの初期の理論的モデルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋからアクセッション番号１ＬＶ６で入手できる。この初期のモデルは、マウスレジスチンについて現在入手可能な結晶構造のデータとは一致してしない。
【００６７】
（実施例７）
仮説に基づいたレジスチン受容体結合部位の予想。
【００６８】
レジスチン３量体の球状ドメインの側面が受容体結合部位である可能性を示唆する複数の証拠がある。例えば、レジスチンは３量体の形で活性を示すことから（パテル（Patel）ら、前出）、溶媒に接触可能な３量体の表面のみが潜在的な受容体結合部位であると考えられる。更に、Ｃ１ｑ／ＴＮＦタンパク質の構造的スーパーファミリーの一部を構成するレジスチンは、他のファミリーメンバーと共通の方式、すなわち、球状ドメインの側面において受容体と結合する可能性がある。Ｃ１ｑ／ＴＮＦスーパーファミリーは、Ｐｆａｍデータベースにアクセッション番号ＣＬ０１００で登録されている。Ｃ１ｑ／ＴＮＦスーパーファミリーには、アジポネクチン、ＴＮＦα及びＴＮＦβ、並びにＣＤ４０Ｌなどの多くのサイトカインが含まれる。このスーパーファミリーのメンバーは、特徴的な螺旋形／ロールケーキ（jelly-roll）形の折り畳み部分と、コイルドコイルをなすホモ３量体構造を有している。このスーパーファミリーの多くのメンバーについて並びに対応する受容体とそれらの複合体について結晶構造が解明されている。これらの構造は、受容体との結合が、例えばＡＰＯＬ２Ｌ＋ＤＲ５及びＴＮＦβ＋ＴＮＦＲ５５に見られるように、球状ドメインの側面、通常はドメインの境界面において起こることを示している。受容体が球状ドメインの上部又は螺旋状ドメインに結合することは観察されていない。
【００６９】
また、レジスチンファミリーのタンパク質における配列の類似性は、螺旋状ドメインにおけるよりも球状ドメイン内においてはるかに高く、球状ドメインの機能上の重要性を示唆する。ヒトレジスチンとマウスレジスチンとのアミノ酸の相同性は、螺旋状ドメインでは約３６％であるのに対して球状ドメインでは約６６％である。同様に、ヒトレジスチンとウシ又はブタレジスチンとの相同性は、螺旋状ドメインでは約２８％であるのに対して球状ドメインでは約８５％である。
【００７０】
最後に、レジスチン３量体の球状頭部の３重の対称性は、受容体が頭部の上部に結合するならば、その認識部位として内部に３重の対称性を有さなければならないことを意味するものであり、これは非常に考えにくい。このことは、頭部の上部への結合の可能性を事実上否定するものである。
【００７１】
球状ドメインの側面上に存在し、かつ３量体の形態において溶媒と接触可能なヒトレジスチンのポリペプチド鎖のフラグメントは２つだけ存在する。これらは、５０〜６５番目の残基（配列番号３）及び７８番目〜９３番目の残基（配列番号４）を含む。いずれのペプチドも２つのタイプの残基を有しており、すなわち、受容体と接触可能でありしたがって受容体と相互作用可能なものと、内部に埋まり込んでいるために相互作用に関与しないものである。ペプチドの生物物理的性質を改良するため、表面上に存在しないアミノ酸を置換することができる。非特異的なジスルフィド架橋を防止するためにペプチドに以下の置換、すなわち、Ｃ５１Ｓ、Ｃ６３Ｓ（ペプチド１）及びＣ７８Ｓ、Ｃ８９Ｓ、Ｃ９１Ｓ、Ｃ９３Ｓ（ペプチド２）を行い、これにより以下のペプチドエピトープ配列を得た。
【００７２】
ペプチド２８１５：ＥＳＱＳＶＴＳＲＧＤＬＡＴＳＰＲ（配列番号５）
ペプチド２８１６：ＳＧＳＷＤＶＲＡＥＴＴＳＨＳＱＳ（配列番号６）
これら２つのペプチドは、合わせると球状ドメインの表面の６４％に相当する。ペプチド２８１５の利点の１つは、２個のシステイン以外のすべての残基がレジスチン中で露出されるために、遊離形態のペプチドのフォールディングとは無関係に、潜在的なエピトープ残基が抗体産生に利用され得る点である。ペプチド２８１６は、タンパク質中でβヘアピン構造を形成する。βヘアピン構造の１つの面のみが受容体認識に関与している可能性がある。ここで重要となる残基はＲ８４−Ａ８５−Ｅ８６である。ペプチド２８１６の別の利点は、この領域が高等な哺乳動物では１００％保存されており、マウスのレジスチンに対しても７５％保存されている点である。このフラグメントの高い配列類似性のため、複数の生物種に由来するレジスチンタンパク質と交叉反応する抗体を作製することが可能である。
【００７３】
（実施例８）
同定されたエピトープの機能上の重要性の確認。
【００７４】
ポリクローナル抗体の作製：エピトープペプチド２８１５及び２８１６をＲｉｎｋ  Ｒｅｓｉｎ  ＳＳ（アドバンスド・ケムテック社（Advanced ChemTech）ＳＡ５０３０、ロット番号１７０４６）を用い、ＡＢＩ４３３Ａペプチドシンセサイザー上で化学的に合成した。ペプチドを樹脂から開裂させ、沈殿、濾過、洗浄及び乾燥した。ペプチドをインビトロジェン社（（Invitrogen Corporation）カリフォルニア州カールスバーグ（Carlsburg））に送付し、ここでＫＬＨタンパク質に結合させて免疫化を行った。標準的な方法（カタログ番号Ｍ０３００）を用いてそれぞれのペプチドにつき２匹のウサギを免疫した。ペプチドのＥＬＩＳＡアッセイにより抗体価を測定し、４週間の免疫処置の後、ウサギを失血死させた。血清アルブミンに結合させたペプチドを用いて抗体を親和精製した。２８１５及び２８１６ペプチドに対して作製されたポリクローナル抗体をそれぞれＣ２８１５及びＣ２８１６と呼ぶ。
【００７５】
完全長ヒトレジスチンへの結合：完全長のヒトレジスチンに対するポリクローナル抗体Ｃ２８１５及びＣ２８１６の結合能を標準的なサンドウィッチＥＬＩＳＡ形式を用いて試験した。プレートを、０．２Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）に加えた２μｇ／ｍｌのＣ２８１５又はＣ２８１６で一晩、４℃でコーティングした。非特異的結合を防ぐため、ＰＢＳに加えた０．５％ウシ血清アルブミン２８０μｌでプレートを２時間、３７℃でブロックした。異なる濃度のヒトレジスチンをプレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。検出のため、ユーロピウムを含むビオチン標識した抗レジスチン抗体ＢＡＭ１３５９（Ｒ＆Ｄシステム社（R&D System）ミネソタ州、ミネアポリス（Minneapolis））を加えた後、増強試薬を加えた。蛍光シグナルをビクター（Victor）プレートリーダー上で読み取り、データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにプロットした。
【００７６】
図９の結果は、ポリクローナル抗体Ｃ２８１５及びＣ２８１６が完全長のヒトレジスチンにそれぞれ３．９及び０．８μｇ／ｍｌのＫｄで結合したことを示している。
【００７７】
中和活性：Ｃ２８１６及びＣ２８１５の中和活性をサイトカイン放出アッセイで評価した。簡単に述べると、２μｇ／ｍｌのヒト又はマウスレジスチンを、増大する濃度のそれぞれの抗体とともに室温で２０分間インキュベートした。このレジスチン／抗体混合物を単離したヒト初代血中単核細胞（ＰＢＭＣ）に加え、２４時間インキュベートした。無細胞上清を回収し、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステム社（R&D System）、ミネソタ州ミネアポリス（Minneapolis））によってＭＣＰ−１濃度を測定した。
【００７８】
図１０Ａ及びＢの結果は、ヒトレジスチンにより媒介される単離したヒトＰＢＭＣからのＭＣＰ−１の放出に対するポリクリーナル抗体Ｃ２８１５及びＣ２８１６の影響を示したものである。この結果は、ＭＣＰ−１放出アッセイにおいてそれぞれの抗体がヒトレジスチンの活性を用量依存的に阻害したことを示し、同定されたエピトープがレジスチンの活性に重要であることを裏付ける。Ｃ２８１６（ＩＣ５０  ６５μｇ／ｍｌ）はＣ２５１５と比較して優れた中和活性を示した。しかしながら、これは完全長のヒトレジスチンタンパク質に対するＣ２８１６のより高い親和性によって一部説明がなされ得るものである（図９）。
【００７９】
図１１Ａ及びＢは、マウスレジスチンにより媒介される単離したヒト初代血中単核細胞からのＭＣＰ−１の放出に対するＣ２８１５及びＣ２８１６ポリクローナル抗体の影響を示したものである。この結果は、ＭＣＰ−１放出アッセイにおいてそれぞれの抗体がマウスレジスチンの活性を用量依存的に阻害したことを示す。これらのデータは、Ｃ２８１５及びＣ２８１６が選択されたこれらのエピトープにおける高い配列保存度と一致してマウスレジスチンと交叉反応することを示唆する。
【００８０】
以上、本発明の全容を述べたが、付属の特許請求の範囲の趣旨又は範囲を逸脱することなく本発明に多くの変更及び改変をなし得ることは、当業者にとって明白であろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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