(57)【要約】  本明細書において、非天然アミノ酸、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチド、このような非天然のアミノ酸およびポリペプチドを作製するための方法が開示される。非天然アミノ酸はそれ自体またはポリペプチドの一部である場合に、種々の官能基を含んでいてもよいが、一般的に少なくとも１つのインドール基、カルボニル基および／またはヒドラジン基を有している。また本明細書において、さらに翻訳後修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、このような修飾をするための方法、このようなポリペプチドを精製するための方法が開示される。修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドは、少なくとも１つのインドール基、カルボニル基および／またはヒドラジン基を含んでいる。さらに、このような非天然アミノ酸のポリペプチドおよび修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを、治療、診断、および他のバイオテクノロジーなどへ使用するための方法が開示される。
2010512800.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化合物１〜４の構造を有し：
【化１】
2010512800.tif 000102
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、一方の末端においてインドールを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、
該リンカーは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、または少なくとも１つのアミノ酸であり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、または少なくとも１つのアミノ酸であり；
ｎは０、１、２または３であり、ｍは０、１、２または３であり、ｎおよびｍの少なくとも１つは０ではなく；
Ｒａ基に結合される構造１、２、３および４のそれぞれの環は、０、１つまたは２つのＲａ基を含んでいることができ、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであるか；あるいは、
２つ以上のＲａ基が存在するときに、２つのＲａは必要に応じて、アリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキルもしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３基およびＲ４基もしくは２つのＲ３基は、必要に応じてシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ５はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＮＯ２、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’’、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２であり、
Ｒ’’はそれぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルであるか、または、
２つ以上のＲ’’基が存在するときに、２つのＲ’’は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルを形成するか；あるいは
Ｒ５はＬ−Ｘであり、
Ｘは、水溶性ポリマー；ポリアルキレンオキシド；ポリエチレングリコール；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；少なくとも１つのアミノ酸；少なくとも１つの糖類；少なくとも１つのヌクレオチド；少なくとも１つのヌクレオシド；リガンド；ビオチン；ビオチンの類似体；検出可能な標識；およびこれらの任意の組合せから成る群より選択され；
Ｌは必要に応じて存在し、存在する場合に、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
２つ以上のＲ５が存在するときに、２つのオルトＲ５基は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルまたは芳香族ヘテロシクロアルキルを形成することができるか；あるいは、
−Ｂ−インドールを含んでいる部分は一緒になって、少なくとも１つのインドール部分を含んでいる二環式または三環式のシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成する化合物、またはその活性のある代謝産物、塩、薬学的に許容可能なプロドラッグ、もしくは溶媒和物。
【請求項２】
上記Ａは、結合、置換もしくは非置換の低級アルキレン、またはフェニレン、ピリジニレン、ピリミジニレンおよびチオフェニレンから成る群より選択される非置換もしくは置換のアリーレンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
上記Ａは結合である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
上記Ｂは、結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’’）ＣＯ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、または−Ｓ（Ｏ）２（アルキレンもしくは置換アルキレン）−である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
上記Ｂは結合である、請求項５に記載の化合物。
【請求項６】
上記Ｒ１は少なくとも１つのアミノ酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
上記Ｒ２は少なくとも１つのアミノ酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
上記Ｒ１は少なくとも１つのアミノ酸である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
上記Ｘは少なくとも１つのアミノ酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
上記Ｘは、蛍光性部分、燐光性部分、化学発光性部分、キレート化部分、電子密度の高い部分、磁性部分、インターカレートする部分、放射性部分、発色性部分、およびエネルギーを伝達する部分から成る群より選択される検出可能な標識である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
上記Ｘは水溶性ポリマーである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
上記水溶性ポリマーは、ポリアルキレンオキシドまたは置換ポリアルキレンオキシドを含んでいる、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
上記水溶性ポリマーは、−［（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−（水素、アルキルまたは置換アルキル）］ｘを含んでおり、ｘは２０〜１０，０００である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
上記水溶性ポリマーは、約２ＫＤａ〜約４０ＫＤａの分子量を有するｍ−ＰＥＧである、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１５】
下記の一般式（ＩＩ）：
【化２】
2010512800.tif 000103
で示される化合物を、カルボニルを含んでいる化合物と反応させる工程を含んでいる、構造１または２の化合物を作製する方法であって、
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、一方の末端においてインドールを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、
該リンカーは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、＝Ｎ−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、または少なくとも１つのアミノ酸であり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、または少なくとも１つのアミノ酸であり；
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素またはアミン保護基であり、
アミン保護基は、特に限定されないが、
【化３】
2010512800.tif 000104
を包含している、方法。
【請求項１６】
上記Ａは結合である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記Ｂは結合である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
上記Ｒ１は少なくとも１つのアミノ酸である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
上記Ｒ２は少なくとも１つのアミノ酸である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
上記一般式（ＩＩ）で示される化合物は、下記の一般式（ＩＶ）：
【化４】
2010512800.tif 000105
で示される構造を有し、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
下記の一般式（Ｖ）：
【化５】
2010512800.tif 000106
で示される化合物とヒドラジンを含んでいる剤とを反応させる工程を含んでいる、構造３または４の化合物を作製する方法であって、
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｊは、
【化６】
2010512800.tif 000107
であり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、または保護基であるか、または２つ以上のＲ’’基が存在するときに、２つのＲ’’は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキルもしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３基およびＲ４基もしくは２つのＲ３基は必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成するか；あるいは、
−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ基は一緒になって、カルボニル基を包含するカルボニル基、保護されたカルボニル基を包含する保護されたカルボニル基、またはマスキングされたカルボニル基を包含するマスキングされたカルボニル基、を少なくとも１つ含んでいる二環式または三環式のシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成するか；あるいは、
−Ｊ−Ｒ基は一緒になって、カルボニル基を包含するカルボニル基、保護されたカルボニル基を包含する保護されたカルボニル基、またはマスキングされたカルボニル基を包含するマスキングされたカルボニル基、を少なくとも１つ含んでいる単環式または二環式のシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成する、方法。
【請求項２２】
下記の一般式（ＶＩ）：
【化７】
2010512800.tif 000108
に相当する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
下記の一般式（ＶＩＩ）：
【化８】
2010512800.tif 000109
に相当し、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１，２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
下記の一般式（Ｘ）：
【化９】
2010512800.tif 000110
に相当し、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり、
ＹおよびＺは独立して、−ＯＨ、アルキルで置換された酸素、−ＳＨまたはアルキルで置換された硫黄から成る群より選択され、ＹおよびＺは一緒になって、ヘテロシクロアルキル環を形成することができる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
下記の一般式（ＸＩ）：
【化１０】
2010512800.tif 000111
に相当し、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’、およびｋは１、２または３である−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｙは、独立して、ＯＲ’’、ＮＲ’’Ｒ’’、およびＮＣ（Ｏ）Ｒ’’から成る群より選択され、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
下記の一般式（ＸＩＩ）：
【化１１】
2010512800.tif 000112
に相当し、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択される、ｋは１、２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであるか；あるいは、２つ以上のＲａ基が存在する場合に、２つのＲａ基は必要に応じてシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、アルキル、置換アルキル、Ｎ（Ｒ’）２、Ｃ（Ｏ）ｋＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
ＸはＣ、ＮまたはＳであり、ただしＸがＯまたはＳである場合に、Ｒ４はＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、アルキル、置換アルキル、Ｎ（Ｒ’）２、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’およびｋが１、２または３である−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’ではあり得ず、ｎは０、１または２である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
下記の一般式（ＸＩＩＩ）：
【化１２】
2010512800.tif 000113
に相当し
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキルから成る群より選択され；
ＹおよびＺは独立して、−ＯＨ、アルキルで置換された酸素、−ＳＨおよびアルキルで置換された硫黄から成る群より選択され、ＹおよびＺは一緒になって、シクロアルキル環を形成することができる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
下記の一般式（ＸＩＶ）：
【化１３】
2010512800.tif 000114
に相当し
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｂは、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−をさらに含み；
ｎは１、２または３であり；
Ｙは、独立して、ＯＲ’’、ＮＲ’’Ｒ’’およびＮＣ（Ｏ）Ｒ’’から成る群より選択され、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
上記化合物を、温和な条件下において水溶液中にてカルボニルを含んでいる剤と反応させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
上記反応は、温和な条件下において水溶液中にて実施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
下記化合物１、２、３または４の構造を有する剤またはその活性のある代謝産物、塩、薬学的に許容可能なプロドラッグもしくは溶媒和物を治療に効果的な量にて投与する工程を含んでいる、障害、疾病または病気を処置するための方法であって、
【化１４】
2010512800.tif 000115
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、一方の末端においてインドールを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、
該リンカーは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、または少なくとも１つのアミノ酸であり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、または少なくとも１つのアミノ酸であり；
ｎは０、１、２または３であり、ｍは０、１、２または３であり、ｎおよびｍの少なくとも１つは０ではなく；
Ｒａ基に結合される構造１、２、３および４のそれぞれの環は、０、１つまたは２つのＲａ基を含んでいることができ、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであるか；あるいは、
２つ以上のＲａ基が存在するときに、２つのＲａは必要に応じて、アリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキルもしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３基およびＲ４基もしくは２つのＲ３基は必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ５はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＮＯ２、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’’、またはＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２であり、
Ｒ’’はそれぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルであるか、または、
２つ以上のＲ’’基が存在するときに、２つのＲ’’は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルを形成するか；あるいは、
Ｒ５はＬ−Ｘであり、
Ｘは、水溶性ポリマー；ポリアルキレンオキシド；ポリエチレングリコール；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤：少なくとも１つのアミノ酸；少なくとも１つの糖類；少なくとも１つのヌクレオチド；少なくとも１つのヌクレオシド；リガンド；ビオチン；ビオチンの類似体；検出可能な標識；およびこれらの任意の組合せから成る群より選択され、
Ｌは必要に応じて存在し、存在する場合に、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
２つ以上のＲ５が存在するときに、２つのオルトＲ５基は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルまたは芳香族ヘテロシクロアルキルを形成することができるか；あるいは、
−Ｂ−インドールを含んでいる部分は一緒になって、少なくとも１つのインドール部分を含んでいる二環式または三環式のシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成する、方法。
【請求項３２】
薬学的に許容可能な担体を投与する工程をさらに含んでいる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
上記Ｘはポリアルキレンオキシドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
上記Ｘは少なくとも１つのアミノ酸である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
上記Ｘの少なくとも１つのアミノ酸は、非天然アミノ酸を含んでいる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
上記Ｘは検出可能な標識である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
下記の化合物５、６、７または８の構造を有する剤またはその活性のある代謝産物、塩、薬学的に許容可能なプロドラッグもしくは溶媒和物を治療に効果的な量にて投与する工程を含んでいる、障害、疾病または病気を処置するための方法であって、
【化１５】
2010512800.tif 000116
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、一方の末端においてインドールを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、
該リンカーは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、または少なくとも１つのアミノ酸であり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、または少なくとも１つのアミノ酸であり；
ｎは０、１、２または３であり、ｍは０、１、２または３であり、ｎおよびｍの少なくとも１つは０ではなく；
Ｒａ基に結合される構造１、２、３および４のそれぞれの環は、０、１つまたは２つのＲａ基を含んでいることができ、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’およびＳ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであるか；あるいは、
２つ以上のＲａ基が存在するときに、２つのＲａは必要に応じて、アリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキルもしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３基およびＲ４基もしくは２つのＲ３基は必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ５はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＮＯ２、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’’、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２であり、
Ｒ’’はそれぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルであるか、または、
２つ以上のＲ’’基が存在するときに、２つのＲ’’は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルを形成するか；あるいは、
Ｒ５はＬ−Ｘであり、
Ｘは、水溶性ポリマー；ポリアルキレンオキシド；ポリエチレングリコール；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤：少なくとも１つのアミノ酸；少なくとも１つの糖類；少なくとも１つのヌクレオチド；少なくとも１つのヌクレオシド；リガンド；ビオチン；ビオチンの類似体；検出可能な標識；およびこれらの任意の組合せから成る群より選択され、
Ｌは必要に応じて存在し、存在する場合に、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、およびＣ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
２つ以上のＲ５基が存在するときに、２つのオルトＲ５基は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルまたは芳香族ヘテロシクロアルキルを形成することができるか；あるいは、
−Ｂ−インドールを含んでいる部分は一緒になって、少なくとも１つのインドール部分を含んでいる二環式または三環式のシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成する、方法。
【請求項３８】
薬学的に許容可能な担体を投与する工程をさらに含んでいる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
上記Ｒ１およびＲ２の両方は、少なくとも１つのアミノ酸である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
上記Ｘはポリアルキレンオキシドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
上記Ｘは少なくとも１つのアミノ酸である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
患者中のポリペプチドの存在を検出するための方法であって、下記の化合物１〜４の構造を有する非天然アミノ酸またはその活性のある代謝産物、塩、薬学的に許容可能なプロドラッグもしくは溶媒和物を、少なくとも１つ含んでいる相同な非天然アミノ酸のポリペプチドを効果的な量にて投与する工程を含んでおり、
【化１６】
2010512800.tif 000117
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、一方の末端においてインドールを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、
該リンカーは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、または少なくとも１つのアミノ酸であり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、または少なくとも１つのアミノ酸であり；
ｎは０、１、２または３であり、ｍは０、１、２または３であり、ｎまたはｍの少なくとも１つは０ではなく；
Ｒａ基に結合される構造１、２、３および４のそれぞれの環は、０、１つまたは２つのＲａ基を含んでいることができ、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルもしくは置換アルキルであるか；または、
２つ以上のＲａ基が存在するときに、２つのＲａは必要に応じて、アリール、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキルもしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３基およびＲ４基もしくは２つのＲ３基は必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ５はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＮＯ２、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’’、またはＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２であり、
Ｒ’’はそれぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルであるか、または、
２つ以上のＲ’’基が存在するときに、２つのＲ’’は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルを形成するか；あるいは
Ｒ５はＬ−Ｘであり、
Ｘは、水溶性ポリマー；ポリアルキレンオキシド；ポリエチレングリコール；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤：少なくとも１つのアミノ酸；少なくとも１つの糖類；少なくとも１つのヌクレオチド；少なくとも１つのヌクレオシド；リガンド；ビオチン；ビオチンの類似体；検出可能な標識；およびこれらの任意の組合せから成る群より選択され、
Ｌは必要に応じて存在し、存在する場合に、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
２つ以上のＲ５基が存在するときに、２つのオルトＲ５基は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルまたは芳香族ヘテロシクロアルキルを形成することができるか；あるいは、
−Ｂ−インドールを含んでいる部分は一緒になって、少なくとも１つのインドール部分を含んでいる二環式または三環式のシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成する、方法。
【請求項４３】
上記ポリペプチドは、アルファ−１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球走化性タンパク質−１、単球走化性タンパク質−２、単球走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉベータ、ランテス、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性化ペプチド、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクターＩＸ、ファクターＶＩＩ、ファクターＶＩＩＩ、ファクターＸ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成された低分子タンパク質、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌のエンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンアルファ１、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンから成る群より選択される治療タンパク質に相同なタンパク質である、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願〕
本出願は、２００６年１２月１８日に出願された、米国特許非仮出願番号６０/８７０，５９４号明細書の便益を主張するものである。
【０００２】
〔技術分野〕
非天然アミノ酸、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチド、このような非天然のアミノ酸およびポリペプチドを生産するための方法、ならびにこのような非天然のアミノ酸およびポリペプチドの診断上の使用、環境への使用、産業上の使用および治療上の使用への利用に関する。
【０００３】
〔背景技術〕
遺伝的にコードされていないアミノ酸（即ち、「非天然アミノ酸」）をタンパク質に組み込むことができれば、リジンのイプシロン位の−ＮＨ２、システインのメルカプト基−ＳＨ、ヒスチジンのイミノ基等のような天然に生じる官能基に代わる有益な化学官能基を導入することができる。特定の化学官能基は、遺伝的にコードされている２０の一般的なアミノ酸に見られる化学官能基に対して不活性であるが、非天然アミノ酸に組み込まれ得る官能基と首尾よく効率的に反応して安定な結合を形成することが立証されている。
【０００４】
タンパク質中には見られず、遺伝的にコードされている２０の一般的なアミノ酸に見られる官能基の全てに対して化学的に不活性であり、特定の官能基を含んでいる試薬と効率的かつ選択的に反応して、安定な共有結合を形成し得る化学官能基を選択的に導入するための方法が、現在利用可能である。
【０００５】
〔発明の概要〕
非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを生産する、精製する、特徴付けるおよび使用するための、方法、組成物、技術、および方針を本明細書に記載した。一実施形態において、このような方法、組成物、技術、および方針は、化学的な誘導体化を含み、他の実施形態において、生物学的な誘導体化を含み、他の実施形態において、物理学的な誘導体化を含み、他の実施形態において、これらの誘導体化の組合せを含んでいる。さらなるまたは付加的な実施形態において、このような誘導体化は部位選択的である。さらなるまたは付加的な実施形態において、このような誘導体化は部位特異的である。さらなるまたは付加的な実施形態において、このような誘導体化は非天然アミノ酸を含んでいる試薬および誘導体化試薬の両方において、化学量論的またはほぼ化学量論的である。さらなるまたは付加的な実施形態において、このような誘導体化は、室温において急速である。さらなるまたは付加的な実施形態において、このような誘導体化は水溶液中にて起こる。さらなるまたは付加的な実施形態において、このような誘導体化は約４〜約１０のｐＨにおいて起こる。さらなるまたは付加的な実施形態において、このような誘導体化は、非天然アミノ酸を含んでいる試薬および誘導体化試薬の両方において、化学量論的、ほぼ化学量論的、または化学量論的様である。さらなるまたは付加的な実施形態は、化学量論的、ほぼ化学量論的、または化学量論的様に所望の基を非天然アミノ酸のポリペプチド上に組み込むことを可能にする方法を提供する。さらなるまたは付加的な実施形態は、化学量論的、ほぼ化学量論的、または化学量論的様に所望の基を非天然アミノ酸のポリペプチド上に組み込むことを可能にする方法論、反応混合物、生成条件を提供する。
【０００６】
ある局面において、非天然アミノ酸は、カルボニル基またはマスキングされたカルボニル基の反応性に基づくペプチドおよびタンパク質の化学的誘導体化のための、非天然アミノ酸である。このようなカルボニル基としては、少なくとも１つのケトン基および／または少なくとも１つのアルデヒド基を含んでいる基が挙げられる。さらなるまたは付加的な局面においては、非天然アミノ酸は、ヒドラジン基またはマスキングされたヒドラジン基の反応性に基づくペプチドおよびタンパク質の化学的誘導体化のための非天然アミノ酸である。さらなるまたは付加的な実施形態において、少なくとも１つの上述した非天然アミノ酸は、ポリペプチドに組み込まれる。つまり、このような実施形態においては、ポリペプチドは、非天然アミノ酸のポリペプチドである。さらなるまたは付加的な実施形態において、非天然アミノ酸の側鎖が誘導体化分子と反応することによってインドールを含んでいる結合を生成するように、非天然アミノ酸はその側鎖において官能基化されている。さらなるまたは付加的な実施形態では、ポリペプチドは、誘導体化分子と反応してインドール結合を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを生成することが可能な非天然アミノ酸のポリペプチドである。さらなるまたは付加的な実施形態において、非天然アミノ酸は、カルボニル側鎖および／またはヒドラジン側鎖を有するアミノ酸から選択される。さらなるまたは付加的な実施形態において、非天然アミノ酸はマスキングされた側鎖を含んでいる。マスキングされた側鎖としては、マスキングされたヒドラジン基および／またはマスキングされたカルボニル基が挙げられる。
【０００７】
さらなるまたは付加的な実施形態において、非天然アミノ酸はカルボニル側鎖を含んでいる。カルボニルはケトンまたはアルデヒドから選択される。他の実施形態おいて、非天然アミノ酸は、適切な官能基化試薬を用いた処理によってインドールが形成され得る官能基を含んでいる。ある実施形態において、非天然アミノ酸は、インドール部分を含んでいる非天然アミノ酸である。さらなる実施形態において、インドール部分を含んでいる非天然アミノ酸は、障害、疾病または病気を処置するためのものである。さらなるまたは付加的な実施形態において、非天然アミノ酸は天然アミノ酸に構造上類似しているが、上述した官能基の１つを含んでいる。他のまたはさらなる実施形態において、非天然アミノ酸はフェニルアラニンまたはチロシン（芳香族アミノ酸）に類似している一方で、分離した実施形態において、非天然アミノ酸は、アラニンおよびロイシン（疎水性アミノ酸）に類似している。一実施形態において、非天然アミノ酸は、天然アミノ酸の特性と区別される特性を有している。一実施形態において、このような区別される特性は側鎖の化学的反応性であり、さらなる実施形態において、この区別される化学反応性によれば、ポリペプチドのユニットである間に非天然アミノ酸の側鎖は、同じポリペプチド内の天然アミノ酸ユニットの側鎖が反応を受けないにもかかわらず、反応を受けることができる。さらなる実施形態において、非天然アミノ酸の側鎖は、天然に生じるアミノ酸の側鎖の化学的性質に直交な化学的性質を有している。さらなる実施形態において、非天然アミノ酸の側鎖は、求電子物質を含んでいる部分を含有している。さらなる実施形態において、非天然アミノ酸の側鎖における求電子物質を含んでいる部分は、求核攻撃を受けて、複素環で誘導体化されたタンパク質（窒素を含んでいる複素環で誘導体化されたタンパク質（例えばインドール部分を含んでいるタンパク質）が挙げられる。）を生成することができる。本段落の上述した何れかの実施形態において、非天然アミノ酸は、分離した分子であるか、または任意の長さのポリペプチドに組み込まれており、後者の場合、いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、さらなる天然に生じたまたは非天然のアミノ酸がさらに組み込まれている。
【０００８】
他の局面においては、ヒドラジンで置換された分子は、インドールを含んでいる複素環結合に基づき、誘導体化された非天然アミノ酸のポリペプチドを製造するためのものである。さらなる実施形態は、ヒドラジンで置換された分子は、インドールを含んでいる複素環結合を形成することによって、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを誘導体化するために使用するものである。さらなる実施形態において、このようなカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸ペプチドは、ケトンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドである。さらなるまたは付加的な実施形態において、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸は側鎖を含み、このカルボニルはケトンまたはアルデヒドから選択される。さらなるまたは付加的な実施形態において、ヒドラジンで置換された分子は、所望の官能基を含んでいる。さらなるまたは付加的な実施形態において、ヒドラジンで置換された分子は、ヒドラジンで置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である。さらなる実施形態において、非天然アミノ酸の側鎖は、天然に生じるアミノ酸の側鎖の化学的性質に直交な化学的性質を有しており、非天然アミノ酸の側鎖の化学的性質は、非天然アミノ酸をヒドラジンで置換された分子と選択的に反応させるものである。さらなる実施形態において、非天然アミノ酸の側鎖は、ヒドラジンを含んでいる分子と選択的に作用する求電子物質を含んでいる部分を含有している。さらなる実施形態において、非天然アミノ酸の側鎖における求電子物質を含んでいる部分は、求核攻撃を受けて、複素環で誘導体化されたタンパク質（窒素を含んでいる複素環で誘導体化されたタンパク質が挙げられる。）を生成することができる。本段落に記載した実施形態に関するさらなる局面は、誘導体化分子と非天然アミノ酸のポリペプチドとの反応の結果得られた、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドである。さらなる実施形態は、すでに修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドのさらなる任意の修飾を含んでいる。
【０００９】
他の局面において、カルボニルで置換された分子は、複素環結合（窒素を含んでいる複素環結合（例えば、インドールまたはインドール部分を含んでいる多環構造）が挙げられる。）に基づき、誘導体化された非天然アミノ酸のポリペプチドを製造するためのものである。さらなる実施形態においては、カルボニルで置換された分子は、インドールを含んでいる複素環結合を形成することによって、ヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを誘導体化するために用いられる。さらなる実施形態において、カルボニルで置換された分子は、ヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドと共に、約１〜約６のｐＨにおいてこのような複素環を形成し得る。さらなる実施形態においては、カルボニルで置換された分子は、誘導体化分子とヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドとの間にインドールを含んでいる複素環結合を形成することによって、ヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを誘導体化するために用いられる。さらなる実施形態において、カルボニルで置換された分子はケトンで置換された分子であり、他の局面においては、アルデヒドで置換された分子である。さらなる実施形態において、カルボニルで置換された分子は、所望の官能基を含んでいる。さらなるまたは付加的な実施形態において、アルデヒドで置換された分子はアルデヒドで置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である。さらなる実施形態において、非天然アミノ酸の側鎖は、天然に生じるアミノ酸の側鎖の化学的性質に直交な化学的性質を有しており、非天然アミノ酸の側鎖の化学的性質は、非天然アミノ酸をカルボニルで置換された分子と選択的に反応させるものである。さらなる実施形態において、非天然アミノ酸の側鎖は、カルボニルを含んでいる分子と選択的に反応する部分（例えば、ヒドラジン基）を含んでいる。さらなる実施形態において、非天然アミノ酸の側鎖における求核部分は、求電子攻撃を受けて、複素環で誘導体化されたタンパク質（窒素を含んでいる複素環で誘導体化されたタンパク質が挙げられる。）を生成することができる。本段落に記載した実施形態が関連するさらなる局面においては、誘導体化分子と非天然アミノ酸のポリペプチドとの反応の結果得られた、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドである。さらなる実施形態は、すでに修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドのさらなる任意の修飾を含んでいる。
【００１０】
他の局面においては、リンカーは、インドールを含んでいる複素環結合に基づき、誘導体化された非天然アミノ酸のポリペプチドを生成するための一官能性リンカー、二官能性リンカー、および多官能性リンカーである。一実施形態において、分子リンカーは、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを他の分子に連結するために用いる分子リンカー（二官能性リンカーおよび多官能性リンカー）である。他の実施形態においては、分子リンカーは、ヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを他の分子に連結するために用いる分子リンカー（二官能性および多官能性）である。他の実施形態において、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、ケトンまたはアルデヒドを含んでいる。ヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを利用する実施形態において、分子リンカーはその一方の末端にカルボニル基を含んでいる。さらなる実施形態において、カルボニル基はアルデヒド基またはケトン基から選択される。さらなるまたは付加的な実施形態において、ヒドラジンで置換されたリンカー分子は、ヒドラジンで置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のリンカー分子である。さらなるまたは付加的な実施形態において、カルボニルで置換されたリンカー分子は、カルボニルで置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のリンカー分子である。さらなる実施形態において、用語「他の分子」は、単なる例ではあるが、タンパク質、他のポリマーおよび低分子を含んでいる。さらなるまたは付加的な実施形態において、ヒドラジンを含んでいる分子リンカーは、全ての末端において同一または同等の基を含み、このため、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドとの反応の結果得られる生成物はカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドのホモ多量体である。さらなる実施形態において、ホモ多量体は、ホモ二量体である。さらなるまたは付加的な実施形態において、カルボニルを含んでいる分子リンカーは、全ての末端に同一または同等の基を含み、このため、ヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドとの反応の結果得られる生成物はヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドのホモ多量体である。さらなる実施形態において、ホモ多量体はホモ二量体である。さらなる実施形態において、非天然アミノ酸の側鎖は、天然に生じるアミノ酸の側鎖の化学的性質に直交な化学的性質を有しており、非天然アミノ酸の側鎖の化学的性質は、非天然アミノ酸をヒドラジンで置換されたリンカーと選択的に反応させるものである。さらなる実施形態において、非天然アミノ酸の側鎖は、天然に生じるアミノ酸の側鎖の化学的性質に直交な化学的性質を有しており、非天然アミノ酸の側鎖の化学的性質は、非天然アミノ酸をカルボニルで置換されたリンカーと選択的に反応させるものである。さらなる実施形態において、非天然アミノ酸の側鎖は、ヒドラジンを含んでいるリンカー分子と選択的に反応する、求電子物質を含んでいる部分を含有している。さらなる実施形態において、非天然アミノ酸の側鎖における求電子物質を含んでいる部分は、求電子攻撃を受けて、複素環で誘導体化されたタンパク質（窒素を含んでいる複素環で誘導体化されたタンパク質が挙げられる。）を生成することができる。本段落に記載した実施形態に関連するさらなる局面においては、リンカー分子と非天然アミノ酸のポリペプチドとの反応の結果得られた、結合された（修飾された）非天然アミノ酸のポリペプチドである。さらなる実施形態は、すでに結合された（修飾された）非天然アミノ酸のポリペプチドのさらなる任意の修飾を含んでいる。
【００１１】
１つの局面において、本発明の方法は、カルボニルの反応物質とヒドラジンの反応物質とを反応させて、複素環で誘導体化されたタンパク質（窒素を含んでいる複素環で誘導体化されたタンパク質が挙げられる。）を生成することによって、タンパク質を誘導体化する方法である。この局面の範囲には、複素環で誘導体化されたタンパク質付加物（窒素を含んでいる複素環で誘導体化されたタンパク質付加物が挙げられる。）を生成するために、カルボニルを含んでいる反応物質とヒドラジンを含んでいる反応物質との縮合に基づいて、タンパク質を誘導体化する方法が含まれる。付加的なまたはさらなる実施形態においては、本発明の方法は、ヒドラジンで官能基化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を用いて、ケトンを含んでいるタンパク質またはアルデヒドを含んでいるタンパク質を誘導体化する方法である。さらに付加的なまたはさらなる局面において、ヒドラジンで置換された分子は、タンパク質、他のポリマーおよび低分子を含んでいることができる。
【００１２】
他の局面においては、本発明の方法は、カルボニルで置換された分子の誘導体化のための、ヒドラジンで置換された分子を化学的に合成する方法である。一実施形態において、ヒドラジンで置換された分子は、ペプチド、他のポリマー（枝分かれポリマーおよび枝分かれしていないポリマー）ならびに低分子を含んでいることができる。一実施形態において、本発明の方法は、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドの誘導体化に適したヒドラジンで置換された分子を調製するための方法である。さらなるまたは付加的な実施形態において、非天然アミノ酸は、インビボにおけるタンパク質翻訳の間に、部位特異的に組み込まれる。さらなるまたは付加的な実施形態において、複素環で誘導体化されたポリペプチド（窒素を含んでいる複素環で誘導体化されたポリペプチドが挙げられる。）を部位特異的な形式で形成するために、ヒドラジンで置換された分子は、各カルボニル基の求核攻撃によって、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸の部位特異的な誘導体化を可能にする。さらなるまたは付加的な実施形態において、ヒドラジンで置換された分子を調製する方法は、部位特異的に誘導体化された多種多様なポリペプチドを得る手段を提供する。さらなるまたは付加的な実施形態において、本発明の方法は、ヒドラジンで官能基化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を合成するための方法である。
【００１３】
他の局面において、本発明の方法は、ヒドラジンで置換された非天然アミノ酸のポリペプチドの誘導体化のための、カルボニルで置換された分子を化学的に合成する方法である。一実施形態において、カルボニルで置換された分子は、ケトンで置換された分子および／またはアルデヒドで置換された分子である。他の実施形態において、カルボニルで置換された分子は、タンパク質、ポリマー（枝分かれポリマーおよび枝分かれしていないポリマー）ならびに分子を含んでいる。さらなるまたは付加的な実施形態において、このような方法は、インビボにおけるタンパク質の翻訳の間に、非天然アミノ酸を部位特異的に組み込むことが可能な技術を補完する。さらなるまたは付加的な実施形態においては、本発明の方法は、部位特異的に誘導体化された非天然アミノ酸のポリペプチドを提供するための、ヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドとの反応に適したカルボニルで置換された分子を調製するための一般的な方法である。さらなるまたは付加的な実施形態において、本発明の方法は、カルボニルで置換されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を合成する方法である。
【００１４】
他の局面において、本発明の方法は、ヒドラジンを含んでいる二官能性リンカーを用いて、カルボニルで置換された非天然アミノ酸のポリペプチドを化学的に誘導体化するための方法である。一実施形態において、本発明の方法は、複素環結合（窒素を含んでいる複素環結合が挙げられる。）を生成するために、ヒドラジンで置換されたリンカーをカルボニルで置換されたタンパク質に縮合反応によって付着させるための方法である。さらなるまたは付加的な実施形態において、カルボニルで置換された非天然アミノ酸は、ケトンで置換された非天然アミノ酸および／またはアルデヒドで置換された非天然アミノ酸である。さらなるまたは付加的な実施形態において、非天然アミノ酸のポリペプチドは、部位特異的におよび／または３次元構造を正確な制御しながら誘導体化される。一実施形態において、このような方法は、分子リンカー（一官能性リンカー、二官能性リンカーおよび多官能性リンカー）を、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド（例としてケトンおよび／またはアルデヒドを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドが挙げられる。）に付着させるために用いられ、リンカーの末端の少なくとも１つは、複素環結合（窒素を含んでいる複素環結合が挙げられる。）を介してカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドに連結し得るヒドラジン基を含んでいる。さらなるまたは付加的な実施形態において、これらのリンカーは、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを、例えばタンパク質、他のポリマー（枝分かれポリマーおよび枝分かれしていないポリマー）ならびに低分子のようなものを含んでいる他の分子に結合するために用いられる。
【００１５】
ある実施形態において、非天然アミノ酸のポリペプチドは水溶性ポリマーに連結されている。ある実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール部分を含んでいる。ある実施形態において、ポリエチレングリコール分子は、二官能性ポリマーである。ある実施形態において、二官能性ポリマーは、第２ポリペプチドに連結されている。ある実施形態において、第２ポリペプチドは第１ポリペプチドと同一であり、他の実施形態において、第２ポリペプチドは第１ポリペプチドと異なるポリペプチドである。ある実施形態において、非天然アミノ酸のポリペプチドは、ポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる水溶性ポリマーに連結された少なくとも２つのアミノ酸を含んでいる。
【００１６】
ある実施形態において、非天然アミノ酸のポリペプチドは、非天然アミノ酸のポリペプチドの受容体に対する親和性を向上させる置換、付加または欠失を含んでいる。ある実施形態において、非天然アミノ酸のポリペプチドは、非天然アミノ酸のポリペプチドの安定性を向上させる置換、付加または欠失を含んでいる。ある実施形態において、非天然アミノ酸のポリペプチドは、非天然アミノ酸のポリペプチドの水溶性を向上させる置換、付加または欠失を含んでいる。ある実施形態において、非天然アミノ酸のポリペプチドは、宿主細胞において生成された非天然アミノ酸のポリペプチドの溶解性を向上させる置換、付加または欠失を含んでいる。ある実施形態において、非天然アミノ酸のポリペプチドは、プロテアーゼ耐性、血中半減期、免疫原性および／または、アミノ酸ポリペプチドに関連する、置換、付加もしくは欠失のない発現を調節する置換、付加または欠失を含んでいる。
【００１７】
ある実施形態において、非天然アミノ酸のポリペプチドは、アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、またはインバースアゴニストである。ある実施形態において、アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト、またはインバースアゴニストは、水溶性ポリマーに連結した非天然アミノ酸を含んでいる。ある実施形態において、水ポリマーは、ポリエチレングリコール部分を含んでいる。ある実施形態において、水溶性ポリマーに連結した非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、対応する受容体の二量化を阻害する。ある実施形態において、水溶性ポリマーに連結した非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、結合パートナー、リガンドまたは受容体とのポリペプチドの結合を調節する。ある実施形態において、水溶性ポリマーに連結した非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、ポリペプチドの１つ以上の特性または活性を調節する。
【００１８】
ある実施形態において、セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、非天然コドン、５塩基コドン、および４塩基コドンから成る群より選択される。
【００１９】
本明細書には、水溶性ポリマーに連結した非天然アミノ酸のポリペプチドを作製する方法が記載されている。ある実施形態において、この方法は、非天然アミノ酸を含んでいる単離したポリペプチドを、非天然アミノ酸と反応する部分を含んでいる水溶性ポリマーに接触させる工程を含んでいる。ある実施形態において、組み込まれた非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーに対して反応性であるが、２０の一般的なアミノ酸に対して非反応性である。ある実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール部分を含んでいる。必要に応じて、この水溶性ポリマーの分子量は所望のポリマー分子量の範囲内である。
【００２０】
また、本明細書には、上述した非天然アミノ酸の少なくとも１つを含んでいるポリペプチドと薬学的に許容可能な担体とを含んでいる組成物が記載されている。ある実施形態において、非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。また、本明細書中で説明するように、組成物は、薬学的に許容される担体とポリペプチドとを含んでいる薬学組成物であり、少なくとも１つのアミノ酸は、非天然アミノ酸に置換されている。ある実施形態において、非天然アミノ酸はサッカライド部分を含んでいる。ある実施形態において、水溶性ポリマーは、サッカライド部分を介してペプチドに連結している。また、本明細書には、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドのプロドラッグが記載されている。さらに、本明細書には、このようなプロドラッグと薬学的に許容される担体とを含んでいる組成物が記載されている。また、本明細書には、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドの代謝産物が記載されている。ある実施形態において、このような代謝産物は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドの活性を補完または相乗する所望の活性を有している。また、本明細書には、代謝産物を必要とする患者などの生物に所望の代謝産物を提供するための、上述した非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドの利用が記載されている。
【００２１】
また、本明細書には、セレクターコドンを含んでいるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいる細胞が記載されている。ある実施形態において、この細胞は、非天然アミノ酸をポリペプチド中に置換するための直交なＲＮＡシンテターゼおよび／または直交なｔＲＮＡを含んでいる。ある実施形態において、細胞は培養細胞であるが、他の実施形態においては、両生類、爬虫類、鳥類、および哺乳類などの多細胞生物の細胞である。細胞の実施形態のいずれかにおいて、さらなる実施形態は、非天然アミノ酸のポリペプチドを生成するためのポリヌクレオチドの発現を含んでいる。他の実施形態においては、修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを生成するために、上述した非天然アミノ酸が利用できる生物である。他の実施形態においては、上述した非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および／または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを含んでいる生物である。このような生物は、両生類、爬虫類、鳥類および哺乳類などの単細胞および多細胞生物を含んでいる。ある実施形態において、非天然アミノ酸のポリペプチドは、インビトロで生産される。ある実施形態において、非天然アミノ酸のポリペプチドは、細胞ライセート中に生成される。ある実施形態において、非天然アミノ酸のポリペプチドは、リボソーム翻訳によって生成される。
【００２２】
また、本明細書には、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを作るための方法が記載される。ある実施形態において、この方法は、ポリペプチドの発現が可能な条件下において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、直交なＲＮＡシンテターゼおよび／または直交なｔＲＮＡを含んでいる細胞を培養する工程と、細胞および／または培養基からポリペプチドを生成する工程とを含んでいる。
【００２３】
また本明細書には、上述した非天然アミノ酸のライブラリー、上述した非天然アミノ酸のポリペプチドのライブラリー、上述した修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドのライブラリー、またはこれらのライブラリーの組合せが記載されている。また本明細書には、少なくとも１つの非天然アミノ酸、少なくとも１つの非天然アミノ酸のポリペプチド、および／または少なくとも１つの修飾された非天然アミノ酸を含んでいるアレイが記載されている。また本明細書には、セレクターコドンを含んでいるポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでいるアレイが記載されている。上述したアレイは、例えば、（ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を検出すること、またはポリペプチドの翻訳を検出することの何れかによって）生物において非天然アミノ酸のポリペプチドを生成するためのスクリーニングのために用いられる。
【００２４】
また本明細書には、所望の活性について上述したライブラリーをスクリーニングするための方法、本明細書に記載のライブラリーをスクリーニングするために本明細書に記載のアレイを使用する方法、所望の活性について化合物および／またはポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの他のライブラリーをスクリーニングする方法が記載されている。また本明細書には、新規の治療剤を開発および発見するためにスクリーニングするライブラリーから得られた活性データの使用、および治療剤自体の使用が記載されている。
【００２５】
また本明細書には、治療剤の半減期、血清の半減期、またはポリペプチドの循環時間を向上させる方法が記載されている。ある実施形態において、この方法は、天然に生じるポリペプチド中の任意の１つ以上のアミノ酸を、少なくとも１つの非天然アミノ酸と置換する工程、および／またはポリペプチドを水溶性ポリマーに連結させる工程を含んでいる。
【００２６】
また本明細書には、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含んでいる効果的な量の薬学組成物を用いて、処置を必要とする患者を処置するための方法が記載されている。ある実施形態において、非天然アミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。
【００２７】
さらなるまたは代替的な実施形態においては、本発明の方法は、障害、疾病または病気を処置するための方法であって、インドールを含んでいる非天然アミノ酸、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸、およびヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸から成る群より選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量にて投与する工程を含んでいる方法である。他の実施形態において、このような非天然アミノ酸は、上述したポリペプチドに合成によって組み込まれている。さらなるまたは代替的な実施形態において、このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、一般式Ｉ〜ＸＶで示されるアミノ酸から選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる。他の実施形態において、このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、一般式１〜４で示されるアミノ酸から選択される少なくとも１つの天然アミノ酸を含んでいる。
【００２８】
さらなるまたは代替の実施形態において、本発明の方法は、障害、疾病または病気を処置するための方法であって、以下の化合物の構造を有する非天然アミノ酸またはその活性のある代謝産物、塩、薬学的に許容可能なプロドラッグもしくは溶媒和物を、少なくとも１つ含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量にて投与する工程を含んでいる。
【００２９】
【化１】
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【００３０】
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、一方の末端においてインドールを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、
このリンカーは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立してＨ、アルキルまたは置換アルキルであり、
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
ｎは０、１、２または３であり、ｍは０、１、２または３であり、ｎおよびｍの少なくとも１つは０ではなく、
Ｒａ基に結合される構造１、２、３および４のそれぞれの環は、０、１つまたは２つのＲａ基を含んでいることができ、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであるか、あるいは、
２つ以上のＲａ基が存在するときに、２つのＲａは必要に応じて、アリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキルもしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３基およびＲ４基もしくは２つのＲ３基は必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ５はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＮＯ２、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’’、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、であり、
Ｒ’’はそれぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルであるか、または、
２つ以上のＲ’’基が存在するときに、２つのＲ’’は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルを形成するか、あるいは、
Ｒ５はＬ−Ｘであり、
Ｘは標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性のある化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素に結合した糖；酸化還元活性のある剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギーを伝達する剤；生物学的に活性な剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体の活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、およびこれらの任意の組合せから成る群より選択され、
Ｌは必要に応じて存在し、存在する場合に、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり、
２つ以上のＲ５が存在するときに、２つのオルトＲ５基は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルまたは芳香族ヘテロシクロアルキルを形成することができるか、あるいは、
−Ｂ−インドールを含んでいる部分は一緒になって、少なくとも１つのインドール部分を含んでいる二環式または三環式のシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成する。
【００３１】
一実施形態において、Ｘは、水溶性ポリマー、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、少なくとも１つのアミノ酸、少なくとも一つの糖類、少なくとも１つのヌクレオチド、少なくとも１つのヌクレオシド、リガンド、ビオチン、ビオチンの類似体、検出可能な標識およびこれらの任意の組合せから選択される。
【００３２】
一実施形態において、ＡおよびＢの両方は結合であり、Ｒ３はそれぞれＨであり、Ｒ４はＨである。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、少なくとも１つのアミノ酸である。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、少なくとも２つのアミノ酸である。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、少なくとも３つのアミノ酸である。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、少なくとも４つのアミノ酸である。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、少なくとも５つのアミノ酸である。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、少なくとも６つのアミノ酸である。
【００３３】
他の実施形態において、本発明の方法は、障害、疾病または病気を処置するための方法である。この方法は、薬学的に許容可能な担体と共に、非天然アミノ酸のポリペプチドを、治療に効果的な量にて投与する工程を含んでいる。さらなる実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法では、Ｘが水溶性ポリマーである。他の実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法では、Ｘがポリエチレングリコールの誘導体である。さらなる実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法では、Ｘが細胞毒性のある化合物である。さらなる実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法であり、Ｘは薬物である。ある実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法では、Ｘが第２ポリペプチドである。さらなる実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法では、第２ポリペプチドとして非天然アミノ酸のポリペプチドが挙げられる。さらなる実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法では、第２ポリペプチドは、構造１〜４を有する化合物の非天然アミノ酸のポリペプチドと同一のアミノ酸構造を有している。他の実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法では、Ｘは検出可能な標識である。さらに他の実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法では、化合物１〜４の少なくとも１つの非天然アミノ酸は、ポリペプチド内の特定の部位に組み込まれている。さらなる実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法では、化合物１〜４の非天然アミノ酸は、翻訳系を用いて組み込まれている。
【００３４】
他の実施形態において、本発明の方法は、障害、疾病または病気を処置するための方法であって、以下の化学式から成る群より選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを、治療に効果的な量にて投与する工程を含んでいる。
【００３５】
【化２】
2010512800.tif 000004
【００３６】
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり、
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、一方の末端においてインドールを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、
このリンカーは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立してＨ、アルキルまたは置換アルキルであり、
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり、
ｎは０、１、２または３であり、ｍは０、１、２または３であり、ｎおよびｍの少なくとも１つは０ではなく、
Ｒａ基に結合される構造１、２、３および４のそれぞれの環は、０、１つまたは２のＲａ基を含んでいることができ、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’、およびＳ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであるか、あるいは、
２つ以上のＲａ基が存在するときに、２つのＲａは必要に応じて、アリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキルもしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３基およびＲ４基もしくは２つのＲ３基は必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ５はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＮＯ２，−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’’、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２であり、
Ｒ’’はそれぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルであるか、または、
２つ以上のＲ’’基が存在するときに、２つのＲ’’は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルを形成するか、あるいは、
Ｒ５はＬ−Ｘであり、
Ｘは標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性のある化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素に結合した糖；酸化還元活性のある剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギーを伝達する剤；生物学的に活性な剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体の活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、およびこれらの任意の組合せから成る群より選択され、
Ｌは必要に応じて存在し、存在する場合に、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２、または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立してＨ、アルキルまたは置換アルキルであり、
２つ以上のＲ５基が存在するときに、２つのオルトＲ５基は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルまたは芳香族ヘテロシクロアルキルを形成することができるか、あるいは、
−Ｂ−インドールを含んでいる部分は一緒になって、少なくとも１つのインドール部分を含んでいる二環式または三環式のシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成している。
【００３７】
一実施形態において、Ｘは、水溶性ポリマー、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、少なくとも１つのアミノ酸、少なくとも１つの糖類、少なくとも１つのヌクレオチド、少なくとも１つのヌクレオシド、リガンド、ビオチン、ビオチンの類似体、検出可能な標識、およびそれらの任意の組合せから選択される。
【００３８】
一実施形態において、ＡおよびＢの両方は結合であり、Ｒ３はそれぞれＨであり、Ｒ４はＨである。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、少なくとも１つのアミノ酸である。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、少なくとも２つのアミノ酸である。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、少なくとも３つのアミノ酸である。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、少なくとも４つのアミノ酸である。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、少なくとも５つのアミノ酸である。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、少なくとも６つのアミノ酸である。
【００３９】
さらに他の実施形態において、本発明の方法は、障害、疾病または病気を処置するための方法である。この方法は、薬学的に許容可能な担体と共に、非天然アミノ酸のポリペプチドを、治療に効果的な量にて投与する工程を含んでいる。さらなる実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法では、Ｒ１およびＲ２の両方がポリペプチドである。さらなる実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法では、Ｘは水溶性ポリマーである。他の実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法では、Ｘがポリエチレングリコールの誘導体である。さらなる実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法では、Ｘが細胞毒性のある化合物である。さらなる実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法では、Ｘは薬物である。ある実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法では、Ｘが第２ポリペプチドである。さらなる実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法では、第２ポリペプチドとして非天然アミノ酸のポリペプチドが挙げられる。
【００４０】
さらなるまたは代替の実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法は、化合物１〜４の構造を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを、治療に効果的な量にて投与する工程を含んでおり、このポリペプチドは以下に示すタンパク質から成る群より選択される治療タンパク質と相同なタンパク質である；アルファ−１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、抗体断片、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球走化性タンパク質−１、単球走化性タンパク質−２、単球走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性化ペプチド、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、剥離性トキシン（exfoliating toxin）、ファクターＩＸ、ファクターＶＩＩ、ファクターＶＩＩＩ、ファクターＸ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成された低分子タンパク質、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌のエンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ���、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンアルファ１、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ウロテンシン、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体およびコルチコステロン受容体。
【００４１】
さらなる実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法は、構造５〜８を有する化合物を投与する工程を含んでおり、少なくとも１つの非天然アミノ酸はポリペプチド内の特定の部位に組み込まれている。さらなる実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法は、構造５〜８を有する化合物を投与する工程を含んでおり、非天然アミノ酸は翻訳系を用いて組み込まれている。さらなる実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法は、構造５〜８を有する化合物を投与する工程を含んでおり、非天然アミノ酸は翻訳系および翻訳後修飾系を用いてポリペプチドに組み込まれている。さらなる実施形態においては、障害、疾病または病気を処置するための方法は、構造５〜８を有する化合物を投与する工程を含んでおり、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、少なくとも１ヶ月間安定である。さらなる実施形態においては、障害、疾病または病気を処置するための方法は、構造５〜８を有する化合物を投与する工程を含んでおり、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、少なくとも２週間安定である。
【００４２】
さらなるまたは代替の実施形態において、障害、疾病または病気を処置するための方法は、少なくとも１つのインドールを含んでいる非天然アミノ酸を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量にて投与する工程を含んでおり、結果としてインドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然に生じるアミノ酸ポリペプチドと比べて、ポリペプチドのバイオアベイラビリティを向上させる。
【００４３】
さらなるまたは代替の実施形態においては、障害、疾病または病気を処置するための方法は、少なくとも１つのインドールを含んでいる非天然アミノ酸を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量にて投与する工程を含んでおり、結果としてインドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然に生じるアミノ酸ポリペプチドと比べて、ポリペプチドの安全性を向上させる。
【００４４】
さらなるまたは代替の実施形態においては、障害、疾病または病気を処置するための方法は、少なくとも１つのインドールを含んでいる非天然アミノ酸を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量にて投与する工程を含んでおり、結果としてインドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然に生じるアミノ酸ポリペプチドと比べて、ポリペプチドの水溶性を向上させる。
【００４５】
さらなるまたは代替の実施形態においては、障害、疾病または病気を処置するための方法は、少なくとも１つのインドールを含んでいる非天然アミノ酸を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量にて投与する工程を含んでおり、結果としてインドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然に生じるアミノ酸ポリペプチドと比べて、ポリペプチドの治療半減期を向上させる、
さらなるまたは代替の実施形態においては、障害、疾病または病気を処置するための方法は、少なくとも１つのインドールを含んでいる非天然アミノ酸を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量にて投与する工程を含んでおり、結果としてインドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然に生じるアミノ酸ポリペプチドと比べて、ポリペプチドの血中半減期を向上させる。
【００４６】
さらなるまたは代替の実施形態においては、障害、疾病または病気を処置するための方法は、少なくとも１つのインドールを含んでいる非天然アミノ酸を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量にて投与する工程を含んでおり、結果としてインドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然に生じるアミノ酸ポリペプチドと比べて、ポリペプチドの循環時間を延長させる。
【００４７】
さらなるまたは代替の実施形態においては、障害、疾病または病気を処置するための方法は、少なくとも１つのインドールを含んでいる非天然アミノ酸を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量にて投与する工程を含み、結果としてインドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然に生じるアミノ酸ポリペプチドと比べて、ポリペプチドの生物学的な活性を調節する。
【００４８】
さらなるまたは代替の実施形態においては、障害、疾病または病気を処置するための方法は、少なくとも１つのインドールを含んでいる非天然アミノ酸を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを治療に効果的な量にて投与する工程を含んでおり、結果としてインドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然に生じるアミノ酸ポリペプチドと比べて、ポリペプチドの免疫原性を調節する。
【００４９】
本明細書に記載した方法および組成物は、本明細書に記載した特定の方法論、手順、細胞株、コンストラクトおよび試薬に限定されず、必要に応じて変更されることが理解される。本明細書で使用した用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものである。このため、本明細書に記載した方法および組成物の範囲は、このような用語によって限定されず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００５０】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形の形態は、内容から明らかに分かるものを除いて、複数形の形態も含んでいる。
【００５１】
他に定義されていない限り、本明細書で用いたすべての技術および科学用語は、本明細書に記載した発明が属する技術の分野において、通常の知識を有するものが一般的に理解するのと同一の意味を有する。本明細書に記載したものに類似するまたは同等の方法、装置および材料は全て本明細書に記載した発明を実施または試験するために用いることが可能であり、好ましい方法、装置および材料を本明細書に記載する。
【００５２】
本明細書に議論した刊行物は、本出願の出願日前の開示内容を単に提供するものである。本明細書に記載した発明者が、先行技術の効力によってまたは他のいずれかの理由のために、このような開示の日時を早めるための権利が与えられていないことの自認として、ここで解釈されない。
【００５３】
本明細書で用いられるような用語「親和性標識」は、可逆的もしくは不可逆的に別の分子と結合して、これを修飾もしくは破壊するか、またはこれと一緒に化合物を形成する標識のことをいう。親和性標識としては、酵素およびその基質、または抗体およびその抗原が挙げられる。
【００５４】
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、および「アルキルチオ(またはチオアルコキシ)」は、それぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子に連結するアルキル基のことをいう。
【００５５】
用語「アルキル」は、それ自体または別の分子の一部である場合に、特に明記しない限り、炭素原子の数が指定され（即ち、Ｃ１−Ｃ１０は、１−１０の炭素を意味する。）、必要に応じて完全飽和、一不飽和、または多不飽和である、直鎖状の、分枝状の、または環状の炭化水素基、あるいはそれらの組合せを意味する。このような炭化水素基は、二価の基および多価の基を包含し得る。飽和炭化水素基としては、例えば特に限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、およびシクロプロピルメチル、ならびに例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、およびｎ−オクチルなどの同族体および異性体が挙げられる。不飽和アルキル基は、１つ以上の２重結合または３重結合を有しているものである。不飽和アルキル基としては、例えば特に限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタンジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに、高級同族体および異性体などが挙げられる。また、用語「アルキル」は、特に断りの無い限り、下記においてより詳細に定義されるアルキルの誘導体（「ヘテロアルキル」、「ハロアルキル」および「ホモアルキル」など）を包含することを意味する。
【００５６】
用語「アルキレン」は、それ自体または別の分子の一部である場合に、アルカンから誘導された二価の基を意味し、典型的なものとして、（−ＣＨ２−）ｎ（ｎは、１〜約２４である。）が挙げられる。そのような基としては、例えば特に限定されないが、−ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−という構造のような１０以下の炭素原子を有する基が挙げられる。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般的に、８以下の炭素原子を有する、より鎖の短いアルキル基またはアルキレン基のことをいう。また、用語「アルキレン」は、特に断りの無い限り、「ヘテロアルキレン」として本明細書に記載された基を包含することを意味する。
【００５７】
用語「アミノ酸」は、天然に生じるアミノ酸、および非天然アミノ酸、ならびに、天然に生じるアミノ酸と同じように機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物のことをいう。天然にコードされたアミノ酸は、２０の一般アミノ酸、ピロリジン、およびセレノシステインである。２０の一般アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンである。アミノ酸類似体は、天然に生じるアミノ酸と基本的な化学構造（例えば、α炭素が、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合している構造）が同じである化合物のことをいう。このような類似体では、必要に応じてＲ基が修飾されているか（ノルロイシンなど）、またはペプチド骨格が修飾されているとしても、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造が保たれている。アミノ酸類似体としては、例えば特に限定されないが、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどが挙げられる。
【００５８】
本明細書においてアミノ酸の名称を示すときは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生物化学命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）が推薦する公知の３文字表記または１文字表記のどちらかを用いてもよい。また、ヌクレオチドを示すときは、一般的に受け入れられている１文字コードを用いてもよい。
【００５９】
「抗体断片」は、全長の形態以外の任意の形態の抗体を意味する。本明細書に記載の抗体断片としては、全長の抗体内に存在するより小さい構成要素である抗体、および操作された抗体が挙げられる。抗体断片としては、特に限定されないが、、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、二機能性のハイブリッド抗体、ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、各ＣＤＲの組合せ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域、重鎖、軽鎖、可変領域、ならびに、代替的な骨格を有する非抗体分子、二特異性抗体などが挙げられる(「Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76」; 「Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402」)。別の機能的な部分構造体（substructure）は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。一本鎖Ｆｖは、ペプチドリンカーによって共有的に接続された免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域から構成されているものである(「S-z Huら, 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061」)。これらの低分子タンパク質（Ｍｒ２５，０００）は、通常、１つのポリペプチド内の抗原に対する特異性と親和性とを保持しており、抗原に特異的なより大きい分子を構成するための有用な基礎的要素となり得る。特に断りの無い限り、用語「抗体」が用いられている記載および請求項は、明らかに「抗体断片」を含んでいる。
【００６０】
本明細書で用いられるような用語「芳香族」または「アリール」は、共役π電子系を有する環を少なくとも１つ有する閉環構造体のことをいい、炭素環式アリール基および複素環式アリール基（あるいは「ヘテロアリール基」または「複素環式芳香族基」）を包含する。炭素環式芳香族基または複素環式芳香族基は、必要に応じて５〜２０の環原子を含んでいる。用語「芳香族」または「アリール」としては、共有結合によって連結した単環式の基または融合した多環式の基（すなわち、隣接する何組もの炭素原子を共有する環）が挙げられる。芳香族基は、置換されていてもよいし、または置換されていなくてもよい。「芳香族基」または「アリール基」としては、例えば特に限定されないが、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、アントラセニル、およびフェナントラセニルが挙げられる。このような各アリール環系および各ヘテロアリール環系のための置換基は、本明細書に記載された許容可能な置換基の群より選択される。
【００６１】
他の用語と組み合わせて用いられるときの、略された用語「芳香族」または「アリール」（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アラルキルが挙げられるが、これらに限定されない）としては、上記で定義したようなアリール環およびヘテロアリール環が挙げられる。したがって、用語「アラルキル」または「アルカリル」は、アリール基がアルキル基に付着している基を包含することを意味し、例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。なお、アルキル基（メチレン基が含まれるが、これに限定されない）には、炭素原子がヘテロ原子（酸素原子など）で置換されたアルキル基が含まれる。アリール基としては、例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書で使用されるような用語「アリーレン」は、二価のアリール基のことをいう。「アリーレン」としては、例えば特に限定されないが、フェニレン、ピリジニレン、ピリミジニレンおよびチオフェニレンが挙げられる。アリーレン基のための置換基は、本明細書に記載の許容可能な置換基の群より選択される。
【００６３】
用語「少なくとも１つのアミノ酸」は、１つのアミノ酸、多数のアミノ酸、オリゴペプチド、アミノ酸の二量体、アミノ酸の三量体、アミノ酸の四量体、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはアミノ酸の任意の他の連結した鎖のことをいう。
【００６４】
「二官能性リンカー」とも称される「二官能性ポリマー」は、他の部分と特異的に反応して、共有結合または非共有結合を形成することができる２つの官能基を含んでいるポリマーのことをいう。このような部分としては、特に限定されないが、天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸の側鎖の基、または天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸を含んでいるペプチドの側鎖の基が挙げられる。例えば、二官能性リンカーは、第１ペプチドの基と反応する官能基と、第２ペプチドの基と反応する別の官能基とを有している。これによれば、第１ペプチド、二官能性リンカーおよび第２ペプチドを含む接合体が形成される。様々な化合物をペプチドに付着させる多くの手法およびリンカー分子については、例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号明細書、米国特許第４，６７１，９５８号明細書、米国特許第４，６５９，８３９号明細書、米国特許第４，４１４，１４８号明細書、米国特許第４，６９９，７８４号明細書、米国特許第４，６８０，３３８号明細書、および米国特許第４，５６９，７８９号明細書を参照のこと。また、「多官能性リンカー」とも称される「多官能性ポリマー」は、他の部分と反応することができる２つ以上の官能基を含んでいるポリマーのことをいう。このような部分としては、共有結合あるいは非共有結合を形成するための、天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸の側鎖の基、または天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸を含んでいるペプチドの側鎖の基（特に限定されないが、アミノ酸の側鎖の基が挙げられる。）が挙げられるが、これらに限定されない。二官能性ポリマーまたは多官能性ポリマーは、任意の所望の長さまたは分子量を必要に応じて有しており、化合物に連結している１つ以上の分子と、この化合物もしくはそれが結合している分子との間に特定の所望の空間または立体構造をもたらすように、必要に応じて選択される。
【００６５】
本明細書で用いられるような用語「バイオアベイラビリティ」は、基質またはその活性部分が薬剤の形態として送達されたときに、作用部位または全身循環において利用可能になる割合および程度のことをいう。バイオアベイラビリティの増加は、基質またはその活性部分が、薬剤の形態として送達されたときに、作用部位または全身循環において利用可能になる割合および程度の増加のことをいう。例えば、バイオアベイラビリティの増加は、他の基質または活性部分と比べたときの基質またはその活性部分の血中濃度の増加として示されるこの方法は必要に応じて、任意のポリペプチドのバイオアベイラビリティを評価するために使用される。
【００６６】
本明細書で用いられるときの用語「生物学的に活性な分子」、「生物学的に活性な部分」、または「生物学的に活性な剤」は、生物に関する生物学的な系、経路、分子、または相互作用における任意の物理性質もしくは生物化学性質に影響を与えることが可能な任意の物質を意味する。生物としては、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物、およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。特に、本明細書で用いられるような生物学的に活性な分子としては、ヒトまたは他の動物における疾病の診断、回復、鎮静、処置、または予防を意図した任意の物質、あるいは、ヒトまたは動物の身体的もしくは精神的な健康状態を増強するための任意の物質が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的に活性な分子としては、例えば、ペプチド、タンパク質、酵素、低分子薬物、ハードドラッグ、ソフトドラッグ、炭水化物、無機原子または無機分子、色素、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子、およびミセルが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法および組成物と一緒に使用するために適切な生物学的に活性な剤の種類としては、薬物、プロドラッグ、放射性核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、殺菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心・血管作動薬、抗不安剤、ホルモン、成長因子、ステロイド剤、および細菌由来の毒素などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
「生物学的な活性の調節」は、ポリペプチドの反応性の増加または低下、ポリペプチドの選択性の変更、ポリペプチドの基質選択性の増強または低減を意味する。調節された生物学的な活性の分析は、非天然のポリペプチドの生物学的な活性を天然のポリペプチドの生物学的な活性と比較することによって実施することができる。
【００６８】
本明細書で用いられるような用語「生体材料」は、生物学的に得られた材料のことをいい、例えば特に限定されないが、、バイオリアクターならびに／または組換え方法および組換え技術によって得られた材料が挙げられる。
【００６９】
本明細書で用いられるような用語「生物物理的プローブ」は、分子の構造変化を検出または監視することができるプローブのことをいう。このような分子には、タンパク質が含まれるが、これに限定されない。また、「生物物理的プローブ」は、必要に応じてタンパク質と他の巨大分子との相互作用を検出もしくは監視するために用いられてもよい。生物物理的プローブとしては、例えば特に限定されないが、スピン標識、蛍光団、および光によって活性化可能な基が挙げられる。
【００７０】
本明細書で用いられるような用語「生合成」は、翻訳系（細胞性の翻訳系または非細胞性の翻訳系）を利用し、以下の成分の少なくとも１つを使用する工程を含む任意の方法のことをいう：ポリヌクレオチド、コドン、ｔＲＮＡ、リボソーム。例えば、非天然アミノ酸は、本明細書の「非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドのインビボにおける生成」というＶＩＩＩ項に記載の方法および手法を用いて、非天然アミノ酸のポリペプチドに「生合成的に組み込まれる」。
【００７１】
本明細書で用いられるような「ビオチンの模倣物」とも称される用語「ビオチンの類似体」は、アビジンおよび／またはストレプトアビジンに対して高い親和性で結合する、ビオチン以外の任意の分子のことである。
【００７２】
本明細書で用いられるような用語「カルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、および−Ｃ（Ｓ）−から成る群より選択される部分を含んでいる基のことをいい、特に限定されないが、少なくとも１つのケトン基、および／または少なくとも１つのアルデヒド基、および／または少なくとも１つのエステル基、および／または少なくとも１つのカルボン酸基、および／または少なくとも１つのチオエステル基が挙げられる。このようなカルボニル基としては、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、およびチオエステルが挙げられる。さらに、このような基は必要に応じて線状の分子、枝分かれした分子、または環状の分子の一部である。
【００７３】
本明細書で用いられるような「化学的に不安定な基」としても称される用語「化学的に切断可能な基」は、酸、塩基、酸化剤、還元剤、化学的開始剤、またはラジカル開始剤に暴露されることによって、破壊または切断される基のことをいう。
【００７４】
本明細書で用いられるような用語「化学発光性の基」は、加熱を伴わない化学反応の結果、発光する基のことをいう。例えば、ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）を、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）などの酸化剤と、塩基および金属触媒の存在下において反応させることによって、励起状態の産物（３−アミノフタラート（３−ＡＰＡ））が生成される。
【００７５】
本明細書で用いられるような用語「発色団」は、可視領域の波長、紫外領域の波長、赤外領域の波長の光を吸収する分子のことをいう。
【００７６】
本明細書で用いられるような用語「補助因子」は、大分子の作用に必須の原子または分子のことをいう。補助因子としては、特に限定されないが、無機イオン、補酵素、タンパク質または酵素の活性に必要な他の因子が挙げられる。例えば、補助因子としては、ヘモグロビン中にあるヘム、クロロフィル中にあるマグネシウム、およびタンパク質にとっての金属イオンが挙げられる。
【００７７】
本明細書で用いられるような「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後に、同数の連続した位置の参照配列と、配列を比較するために用いられる連続した位置の何れか１つの区分のことをいう。このような連続した位置としては、特に限定されないが、約２０〜約６００の配列ユニット（特に限定されないが、約５０〜約２００の配列ユニットおよび約１００〜約１５０の配列ユニットが挙げられる。）から成る群が挙げられる。このような配列としては、例えば、配列ユニットを有する、ポリペプチドおよび非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドが挙げられる。配列ユニットとしては、特に限定されないが、天然アミノ酸および非天然アミノ酸が挙げられる。また、例えば、このような配列としては、対応する配列ユニットであるヌクレオチドを有するポリヌクレオチドが挙げられる。比較のために配列を整列させる方法としては、特に限定されないが、例えば「Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c」の局所相同性アルゴリズム、「Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443」の相同性アラインメントアルゴリズム、「Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444」の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピュータソフトウェア（computerizeジmplementation）、（「Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Maジson, WI」のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手動によって整列させて、目視によって検査すること（例えば「Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)」参照）が挙げられる。
【００７８】
例えば、配列同一性および配列類似性の百分率を決定するために使用されるアルゴリズムは、例えば、「Altschulら. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402」および「Altschulら. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410」に、それぞれ記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）から公的に利用可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターであるＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮプログラムは、語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラムは、語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（「Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915」参照）のアライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、ならびに両鎖の比較をデフォルトとして使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、通常、「低い複雑性」のためのフィルタを使用することなく実施される。
【００７９】
また、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えば「Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787」参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによってもたらされる類似性の尺度の１つは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸の配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸と比較した場合の最小合計確率が約０．２未満、約０．０１未満、または約０．００１未満であるときに、核酸は参照核酸と類似しているとみなす。
【００８０】
用語「保存的に修飾されたバリアント」は、天然アミノ酸配列、非天然のアミノ酸配列、天然核酸配列、非天然核酸配列、およびそれらの組合せに適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾されたバリアント」は、同一または本質的に同一な天然および非天然のアミノ酸配列をコードする天然および非天然の核酸のことか、または天然および非天然の核酸が、天然および非天然のアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列のことをいう。例えば、遺伝コードが縮重しているため、多くの機能的に同一の核酸が、任意の所定のタンパク質をコードしている。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵのコドンは、全てアラニンのアミノ酸をコードしている。このため、コドンによってアラニンが特定される全ての位置では、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載された対応するコドンの何れかへコドンを変化させることができる。このような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の１種である。このため、例えば、天然または非天然のポリペプチドをコードする本明細書に記載の全ての天然または非天然の核酸配列は、天然または非天然の核酸のサイレント変異として可能性のある全てのものを表している。機能的に同一の分子が得られるように、天然または非天然の核酸における各コドンは修飾される（なお、メチオニンに対する通常唯一のコドンであるＡＵＧ、およびトリプトファンに対する通常唯一のコドンＴＧＧは除く。）。したがって、天然および非天然のポリペプチドをコードする天然および非天然の核酸の各サイレント変異は、記載された各配列に潜在的に含まれる。
【００８１】
アミノ酸配列に関していえば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列に対して、コードされた配列中の１個の天然および非天然のアミノ酸または数％の天然および非天然のアミノ酸を変更、付加、または欠失する個々の置換、欠失、または付加する場合に、そのような変更によって、アミノ酸が欠失されるか、アミノ酸が付加されるか、または天然および非天然のアミノ酸が化学的に類似のアミノ酸で置換されるときに、「保存的に修飾されたバリアント」が得られる。機能的に類似する天然アミノ酸を示す保存置換表は科学論文から入手することができる。このような保存的に修飾されたバリアントは、本明細書に記載の方法および組成物における多様なバリアント（polymorphic variant）、種間のホモログ（interspecies homologs）、および対立遺伝子に加えられるとともに、それらを排除するものではない。
【００８２】
以下の８群のそれぞれは、互いに保存的な置換となるアミノ酸を含んでいる（例えば、「Creighton, Proteins:Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd eジtion (December 1993)」参照）：
（１）アラニン（Ａ），グリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ），グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ），グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ），リジン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ），ロイシン（Ｌ），メチオニン（Ｍ），バリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ），チロシン（Ｙ），トリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ），トレオニン（Ｔ）；および、
（８）システイン（Ｃ），メチオニン（Ｍ）。
【００８３】
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、それら自体または他の用語との組み合わられた場合に、特に断らない限りは、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」が環化したものを表す。このため、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルには、飽和した環の結合、部分的に不飽和した環の結合、および完全に不飽和した環の結合が含まれる。さらに、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子を複素環が分子の残部に付着する位置に配置していてもよい。ヘテロ原子としては、特に限定されないが、酸素、窒素、または硫黄が挙げられる。シクロアルキルとしては、例えば特に限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、およびシクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルとしては、例えば特に限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、および２−ピペラジニルなどが挙げられる。また、上述した用語は、２環構造および３環構造などの多環構造を包含する。同様に、用語「ヘテロシクロアルキレン」は、それ自体または他の分子の一部であっても、ヘテロシクロアルキルから誘導された二価の基を意味し、用語「シクロアルキレン」は、それ自体または別の分子の一部であっても、シクロアルキルから誘導された二価の基を意味する。
【００８４】
本明細書で用いられるような用語「シクロデキストリン」は、少なくとも６〜８の環状のグルコース分子から成る環状の炭水化物のことをいう。環の外側の部分は、水溶性の基を含んでおり、環の中心に、低分子を収容することができる比較的に非極性の空洞が形成されている。
【００８５】
本明細書で用いられるような用語「細胞毒性」は、細胞に悪影響を与える化合物に関する。
【００８６】
本明細書中で使用する場合、用語「所望の官能基」は、以下に示す基のいずれか１つに関する：標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性のある化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分（photocaged moiety）；化学線によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素に結合した糖；酸化還元活性のある剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギーを伝達する剤；生物学的に活性な剤（この場合、生物学的に活性な剤は治療活性を有する剤を含んでいることができ、非天然アミノ酸のポリペプチドまたは修飾された非天然アミノ酸は付着された治療剤とともに共治療剤（cotherapeutic agent）として機能するか、治療剤を生物内の所望の部位に送達する手段として機能する。）；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体の活性化剤（activated complex activator）、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン（allergan）、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、およびこれらの任意の組合せ。
【００８７】
本明細書中で使用する場合、用語「ヒドラジン」は、少なくとも１つのヒドラジン官能基を含んでいる基／分子のことをいう。
【００８８】
本明細書中で使用する場合、用語「検出可能な標識」は、必要に応じて観察可能な分析技術に使用される標識のことをいう。このような分析技術としては、蛍光法、化学発光法、電子−スピン共鳴法、紫外線／可視線吸光分光法、質量分析法、核磁気共鳴法、磁気共鳴法および電子化学法が挙げあれるが、これらに限定されない。
【００８９】
本明細書中で使用する場合、用語「カルボニル」は、少なくとも１つのアルデヒドまたは少なくとも１つのケトンを含んでいる基／分子に関する。
【００９０】
本明細書中で使用する場合、用語「薬物」は、病気または疾病の予防、診断、緩和、処置、または回復に用いられる任意の物質のことをいう。
【００９１】
本明細書中で使用する場合、用語「色素」は、発色団を含んでいる可溶性の着色物質のこという。
【００９２】
本明細書で用いられるような用語「効果的な量」は、投与される化合物または剤の量であって、処置される疾病または病気の１つ以上の症状をある程度軽減するために十分な量のことをいう。この結果、疾病の兆候、症状もしくは原因の軽減および／または緩和、あるいは生物学的な系の他の任意の所望の変化がもたらされ得る。投与される剤または化合物としては、特に限定されないが、天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドが挙げられる。予防的処置、増強するための処置、および／または治療的処置のために、このような天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを含んでいる組成物を投与することができる。任意の個々の場合における適した「効果的な」量を、用量増加試験の技術を用いて必要に応じて決定する。
【００９３】
本明細書で用いられるような用語「電子密度の高い基」は、電子ビームが照射されたときに、電子を散乱する基のことをいう。このような基としては、特に限定されないが、モリブデン酸アンモニウム、次硝酸ビスマスヨウ化カドミウム、９９％、カルボヒドラジド、塩化第二鉄六水和物、ヘキサメチレンテトラミン、９８．５％、無水インジウム三塩化物、硝酸ランタン、酢酸鉛三水和物、クエン酸鉛三水和物、硝酸鉛、過ヨウ素酸、リンモリブデン酸、リンタングステン酸、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、ルテニウムレッド、硝酸銀、プロテイン銀“ストロング”（Ａｇ含有量：８．０−８．５％）、シルバーテトラフェニルポリフィリン（Ｓ−ＴＰＰＳ）、塩化金酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム、硝酸タリウム、チオセミカルバジド（ＴＳＣ）、酢酸ウラニル、硝酸ウラニル、および硫酸バナジルが挙げられる。
【００９４】
本明細書で用いられるような「エネルギーを伝達する剤」は、別の分子からエネルギーを受容、または別の分子へエネルギーを寄与することが可能な分子のことをいう。例えば、蛍光共鳴エネルギー移転（ＦＲＥＴ）は、蛍光ドナー分子の励起状態のエネルギーが、非励起状態のアクセプター分子に非放射的に移転された後、このアクセプター分子が、寄与されたエネルギーをより長波長の蛍光として放出するという、双極子間のカップリング作用である。
【００９５】
用語「増強する」または「増強」は、所望の効果を効力または持続時間について、増加もしくは延長することを意味する。例えば、治療剤の効果を「増強すること」は、疾病、障害または病気の処置の間に、治療剤の効果を効力または持続時間について増加もしくは延長できることをいう。本明細書で用いられるような「増強するために効果的な量」は、疾病、障害または病気を処置するときに、治療剤の効果を増強するために十分な量のことをいう。患者に使用される場合に、この使用のための効果的な量は、疾病、障害または病気の重症度および治療単位（ｃｏｕｒｓｅ）、薬歴、患者の健康状態、および薬物に対する反応性、ならびに治療を担当する医師の判断に依存する。
【００９６】
本明細書で用いられるような用語「真核生物」は、系統学的なドメイン（phylogenetic domain）の真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）に属する生物のことをいう。真核生物としては、特に限定されないが、動物（特に限定されないが、哺乳類、昆虫、爬虫類、鳥類が挙げられる）、繊毛虫類、植物（特に限定されないが、単子葉植物、双子葉植物および藻類が挙げられる）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫目、および原生生物が挙げられる。
【００９７】
本明細書で用いられるような用語「脂肪酸」は、Ｃ６以上のおおよその長さの炭化水素の側鎖を有するカルボン酸のことをいう。
【００９８】
本明細書で用いられるような用語「蛍光団」は、励起されて光子を放出することによって、蛍光を放つ分子のことをいう。
【００９９】
本明細書で用いられるような用語「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「脱離基」、「反応部位」、「化学反応基」、および「化学反応部分」は、化学反応が起こる分子の一部またはユニットのことをいう。これらの用語は化学の技術分野においてある程度同義であり、ある機能または活性を行使するとともに、他の分子と反応する分子の一部を示すために本明細書において用いられる。
【０１００】
用語「ハロゲン」としては、フッ素、塩素、ヨウ素、および臭素が挙げられる。
【０１０１】
本明細書で用いられるような用語「ハロアシル」は、ハロゲン部分を含んでいるアシル基のことをいう。ハロアシルとしては、特に限定されないが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３，−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３，−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などが挙げられる。
【０１０２】
本明細書で用いられるような用語「ハロアルキル」は、ハロゲン部分を含んでいるアルキル基のことをいう。ハロアルキルとしては、特に限定されないが、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３などが挙げられる。
【０１０３】
本明細書で用いられるような用語「ヘテロアルキル」は、アルキル基および少なくとも１つのヘテロ原子から成る直鎖状、分枝状または環状の炭化水素基、あるいはそれらの組合せのことをいう。ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、ＳｉおよびＳから成る群より選択される原子である。窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化されており、ヘテロ原子である窒素原子は、必要に応じて４級化されていている。ヘテロ原子であるＯ、Ｎ、ＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基の内部の任意の位置、または、アルキル基が分子の残部に付着する位置に必要に応じて配置されている。ヘテロアルキルとしては、例えば特に限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。さらに、２以下のヘテロ原子は、例えば−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３などのように必要に応じて隣接している。
【０１０４】
用語「複素環を基本とする結合」または「複素環結合」は、カルボニル基とヒドラジン基との反応によって形成された部分のことをいう。生じた反応生成物は、ヘテロアリール基またはヘテロシクロアルキル基などの複素環である。生じた複素環基は、非天然アミノ酸または非天然アミノ酸のポリペプチドと他の官能基との化学的な結合として機能する。一実施形態において、複素環結合としては、窒素を含んでいる複素環結合が挙げられ、例えばピロール結合、インドール結合、ベンゾジアゼピン結合およびピラザロン結合が挙げられる。
【０１０５】
同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、ヘテロアルキルから誘導された二価の基のことをいう。ヘテロアルキレンとしては、例えば特に限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−が挙げられる。ヘテロアルキレン基は、同一のまたは異なるヘテロ原子を、鎖の末端の一方または両方に配置していてもよい（特に限定されないが、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、およびアミノオキシアルキレンが挙げられる）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレンの結合基では、結合基の配向性は、結合基の一般式が書かれた方向に従って示されているわけではない。例えば、一般式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。
【０１０６】
本明細書で用いられるような用語「ヘテロアリール」または「複素環式芳香族」は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子を少なくとも１つ含んでいるアリール基のことをいう。窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化されており、窒素原子は必要に応じて４級化されている。ヘテロアリール基は、必要に応じて置換されていているか、または置換されていない。ヘテロアリール基は、必要に応じて、ヘテロ原子を介して分子の残部に付着している。ヘテロアリール基としては、例えば特に限定されないが、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル（ｐｕｒｉｎｙｌ）、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。
【０１０７】
本明細書で用いられるような用語「ホモアルキル」は、炭化水素基であるアルキル基のことをいう。
【０１０８】
本明細書で用いられるような用語「同一」は、２つ以上の配列またはサブ配列が同じであることをいう。また、本明細書で用いられるような用語「実質的に同一」は、２つ以上の配列またはサブ配列を比較ウィンドウまたは指定された領域に対して最大限に対応するように対比および整列させ、比較アルゴリズムを使用して測定するか、または手動で整列させて目視によって検査して測定した場合に、２つ以上の配列またはサブ配列が所定の百分率で同じである配列ユニットを有することをいう。例えば、配列ユニットが、指定の領域に渡って約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一である場合に、２つ以上の配列は「実質的に同一」である。このような百分率は、２つ以上の配列の「同一性の百分率」を記載するものである。配列の同一性は、長さが少なくとも約７５〜１００の配列ユニットである領域に渡って、または長さが約５０の配列ユニットである領域に渡って、あるいは指定されない場合は、配列全体に渡って存在し得る。また、この定義は、試験配列の相補体にも関する。例えば、２つ以上のポリペプチド配列は、アミノ酸残基が同じであるときに同一であり、また、２つ以上のポリペプチド配列は、アミノ酸残基が指定の領域に渡って約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一である場合に「実質的に同一」である。同一性は、長さが少なくとも約７５〜１００アミノ酸である領域に渡って、または長さが約５０アミノ酸である領域に渡って、あるいは、指定されない場合は、ポリペプチド配列の配列全体に渡って存在し得る。また、例えば、２つ以上のポリヌクレオチド配列は、核酸残基が同じであるとき同一であり、２つ以上のポリヌクレオチド配列は、核酸残基が、指定領域に渡って、約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一である場合に「実質的に同一」である。同一性は、長さが少なくとも約７５〜１００の核酸である領域に渡って、または長さが約５０の核酸である領域に渡って、あるいは、指定されない場合は、ポリヌクレオチド配列の配列全体に渡って存在し得る。
【０１０９】
配列比較を行う際には、一般に一方の配列を参照配列として、これを試験配列と比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列とをコンピュータに入力し、サブ配列の座標を指定し、必要に応じて配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。プログラムのデフォルトのパラメーターを用いてもよいし、または代わりのパラメーターを設定してもよい。その後、配列比較アルゴリズムはプログラムのパラメーターに基づいて参照配列に対する試験配列の配列同一性の百分率を計算する。
【０１１０】
本明細書で用いられるような用語「免疫原性」は、治療薬の投与に対する抗体応答のことをいう。治療用の非天然アミノ酸のポリペプチドに対する免疫原性は、生体液中の抗非天然アミノ酸のポリペプチド抗体を検出するための、定量的アッセイおよび定性的アッセイを用いることによって得ることができる。このようなアッセイとしては、特に限定されないが、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、および蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）が挙げられる。治療用の非天然アミノ酸のポリペプチドに対する免疫原性の分析は、治療用の非天然アミノ酸のポリペプチドを投与したときの抗体応答を、治療用の天然アミノ酸のポリペプチドを投与したときの抗体応答と比較する工程を含んでいる。
【０１１１】
本明細書で用いられるような「インターカレートする基」とも称される用語「インターカレート剤」は、分子の分子内空間、または分子間の分子内空間に、インターカレートすることが可能な化学物質のことをいう。例えば、インターカレート剤またはインターカレートする基は、ＤＮＡの２重螺旋の積層された塩基へインターカレートする分子である。
【０１１２】
本明細書で用いられるような用語「単離」は、興味のある成分の興味の無い成分からの分離または除去のことをいう。単離された物質は、乾燥状態もしくは半乾燥状態のどちらかであってもよいし、または溶液（水溶液など）に対して溶解した状態であってもよい。単離された成分は均質な状態であってもよいし、あるいは単離された成分は、薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤をさらに含んでいる薬学的組成物の一部であってもよい。純度および均質性は、化学的技術を用いて決定される。このような化学的技術としては、特に限定されないが、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられる。また、興味のある成分が単離され、調製物に優勢種として存在するとき、このような成分は、実質的に精製されているとして本明細書に記載される。本明細書で用いられるような用語「精製」は、興味のある成分の純度が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ以上であることをいう。例えば、核酸またはタンパク質が天然の状態において結合している細胞の成分の少なくともいくつかから遊離しているとき、あるいは核酸もしくはタンパク質がそれらのインビボまたはインビトロの産物の濃度よりも高く濃縮されているとき、この核酸またはタンパク質は単離されているといえる。また、例えば、遺伝子は、この遺伝子に隣接し、興味のある遺伝子以外のタンパク質をコードする翻訳領域から分離されているとき、単離されているといえる。
【０１１３】
本明細書で用いられるような用語「標識」は、化合物の物理的分布を必要に応じて検出および／または監視するために、化合物に組み込まれ、容易に検出される物質のことをいう。
【０１１４】
本明細書で用いられるような用語「結合」は、リンカーの官能基と別の分子との間の化学反応によって形成された結合または化学部分のことをいう。このような結合としては、特に限定されないが、共有結合および非共有結合が挙げられる。また、このような化学部分としては、特に限定されないが、エステル、カーボネート、イミン、リン酸エステル、ヒドラゾン、アセタール、オルソエステル、ペプチド結合、およびオリゴヌクレオチド結合が挙げられる。加水分解に安定な結合は、連結が実質的に水中において安定であり、（特に限定されないが、長期間、ことによると無期限の生理的条件下を含む）有用なｐＨ値において水と反応しないことを意味する。加水分解に不安定または分解性の結合は、結合が水中または水溶液中（例えば血液中）において分解可能であることを意味する。酵素に不安定または分解性の結合は、結合が１つ以上の酵素によって分解され得ることを意味する。例えば、ＰＥＧおよびそれに関連するポリマーは、分解性の結合をポリマーの骨格、またはポリマーの骨格とこのポリマー分子の末端の官能基の１つ以上との間のリンカー基に含んでいる。このような分解性の結合としては、特に限定されないが、ＰＥＧカルボン酸または活性のあるＰＥＧカルボン酸と生物学的に活性な剤のアルコール基との反応によって形成されるエステル結合が挙げられる。このようなエステル基は、一般的に、生理条件下において加水分解され、生物学的に活性な剤を放出するものである。他の加水分解可能な結合としては、特に限定されないが、カーボネート結合、アミンとアルデヒドとの反応から生じるイミン結合、アルコールとリン酸基との反応によって形成されるリン酸エステル結合、ヒドラジドとアルデヒドとの反応生成物であるヒドラゾン結合、アルデヒドとアルコールとの反応生成物であるアセタール結合、ギ酸塩とアルコールとの反応生成物であるオルソエステル結合、（例えば、ＰＥＧなどのポリマーの末端における）アミン基とペプチドのカルボキシル基とによって形成されるペプチド結合、および（例えばポリマーの末端における）ホスホラミジーテ（phosphoramidite）基とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基とによって形成されるオリゴヌクレオチド結合が挙げられる。
【０１１５】
本明細書で用いられるような「培養基」は、細胞ならびに／あるいはこのような細胞から発現および／または分泌された生成物の、増殖または収集に用いられる任意の培養基のことをいう。このような「培養基」としては、特に限定されないが、任意の宿主細胞を支持するか、または含む溶液、固体、半固体、または剛性の支持体が挙げられる。宿主細胞としては、例えば、細菌の宿主細胞、酵母の宿主細胞、昆虫の宿主細胞、植物の宿主細胞、真核生物の宿主細胞、哺乳類の宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核生物の宿主細胞、E. coliまたはPseudomonasの宿主細胞、および細胞含有物が挙げられる。このような「培養基」としては、特に限定されないが、宿主細胞が増殖し、ポリペプチドが分泌された培養基が挙げられる。さらに、このような培養基は、増幅工程の前もしくは後の培養基を包含する。また、このような「培養基」としては、特に限定されないが、宿主細胞のライセートを含むバッファまたは試薬が挙げられる。例えば、細胞内に製造されたポリペプチドおよび宿主細胞は、このポリペプチドが放出されるために、溶解または破壊される。
【０１１６】
本明細書で用いられるような用語「代謝産物」は、天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドなどの化合物が代謝されたときに形成される、天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドなどの化合物の誘導体のことをいう。用語「薬学的に活性のある代謝産物」または「活性のある代謝産物」は、天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドなどの化合物が代謝されたときに形成される、天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドなどの化合物の生物学的に活性な誘導体のことをいう。
【０１１７】
本明細書で用いられるような用語「代謝」は、生物が特定の物質を変化させるための処理の総体のことをいう。このような処理としては、特に限定されないが、加水分解反応、および酵素によって触媒される反応が挙げられる。代謝についてのさらなる情報は、「The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Edition, McGraw-Hill (1996)」から入手される。例えば、（１）天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを宿主に投与して、宿主からの組織試料を分析することによって、あるいは（２）天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを、インビトロにおいて肝細胞と一緒にインキュベートして、生じた化合物を分析することによって、天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチド、修飾された天然アミノ酸のポリペプチド、または修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドの代謝産物を同定する。
【０１１８】
本明細書で用いられるような用語「金属キレート剤」は、金属と一緒に金属錯体を形成する分子のことをいう。例えば、このような分子は、中心の金属イオンと２以上の配位結合を形成し、環構造を形成する。
【０１１９】
本明細書で用いられるような用語「金属含有部分」は、金属イオン、金属原子または金属粒子を含む基のことをいう。このような部分には、シスプラチン、キレートされる金属イオン（ニッケル、鉄およびプラチナなど）、および金属ナノ粒子（ニッケル、鉄、およびプラチナなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２０】
本明細書で用いられるような用語「重原子を組み込んでいる部分」は、通常は、炭素よりも重い原子のイオンを組み込んでいる基のことをいう。このようなイオンまたは原子には、シリコン、タングステン、金、鉛、およびウランが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２１】
本明細書で用いられるような用語「修飾された」は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸のポリペプチド、または非天然アミノ酸のポリペプチドに変更が存在することをいう。天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸のポリペプチド、または非天然アミノ酸のポリペプチドを合成後に修飾することによって、あるいは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸のポリペプチド、または非天然アミノ酸のポリペプチドを翻訳後に修飾するか、または翻訳と同時に修飾することによって、このような変更または修飾が必要に応じて得られる。「修飾されたまたは修飾されていない」という形態は、検討されている天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸のポリペプチド、または非天然アミノ酸のポリペプチドが、必要に応じて修飾されていること、つまり、検討されている天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸のポリペプチド、または非天然アミノ酸のポリペプチドが、修飾されていてもよいし、または修飾されていななくてもよいということを意味する。
【０１２２】
本明細書で用いられるような用語「調節された血中半減期」は、未修飾の形態と比べたときの、修飾された生物学的に活性な分子の循環半減期における正の変化または負の変化のことをいう。例えば、修飾された生物学的に活性な分子としては、特に限定されないが、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸のポリペプチド、または非天然アミノ酸のポリペプチドが挙げられる。例えば、血中半減期は、生物学的に活性な分子または修飾された生物学的に活性な分子を投与した後の様々な時点の血液試料を採取して、各試料における生物学的に活性な分子または修飾された生物学的に活性な分子の濃度を決定することによって測定される。血清中の濃度と時間との相互関係に基づいて血中半減期を計算することができる。例えば、血中半減期を調節して、投与計画の改善を可能にするか、または毒性効果を避けるように、血中半減期を増加させる。血清におけるこのような増加は、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍である。この方法は、任意のポリペプチドの血中半減期を評価するために必要に応じて使用される。
【０１２３】
本明細書で用いられるような用語「調節された治療半減期」は、未修飾の形態と比べたときの、修飾された生物学的に活性な分子の治療に効果的な量の半減期の正の変化または負の変化のことをいう。例えば、修飾された生物学的に活性な分子としては、特に限定されないが、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸のポリペプチド、または非天然アミノ酸のポリペプチドが挙げられる。例えば、治療半減期は、投与後の様々な時点における上述した分子の薬物動態学的性質および／または薬力学的性質を測定することによって測定される。治療半減期が増加すると、特定の有利な投与計画もしくは特定の有利な総用量を利用すること、または望ましくない効果を場合によっては避けることができる。例えば、治療半減期の増加は、効力の増加、標的に対する修飾された分子の結合の増加もしくは減少、修飾されていない分子の作用に関する別のパラメーターまたは機構の増加もしくは減少、または酵素（プロテアーゼなど）による分子の破壊の増加もしくは減少に起因する。この方法は、任意のポリペプチドの治療半減期を評価するために使用される。
【０１２４】
本明細書で用いられるような用語「ナノ粒子」は、粒径が約５００ｎｍ〜約１ｎｍである粒子のことをいう。
【０１２５】
本明細書で用いられるような用語「ほぼ化学量論的」は、化学反応に参加している各化合物のモル比が、約０．７５〜約１．５であることをいう。
【０１２６】
本明細書で用いられるような用語「非真核生物」は、真核生物ではない生物のことをいう。例えば、非真核生物は、系統学的なドメインの真正細菌（特に限定されないが、Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, またはPseudomonas putidaなどが挙げられる。）、または系統学的なドメインの古細菌(特に限定されないが、Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, またはHalobacterium（Haloferax volcaniiおよびHalobacteriumの種のNRC-1など）が挙げられる。) に属している。
【０１２７】
「非天然アミノ酸」は、２０の一般アミノ酸、セレノシステイン、もしくはピロリジンの１つではないアミノ酸のことをいう。用語「非天然アミノ酸」と同義的に用いてもよい他の用語は、「天然にコードされていないアミノ酸」、「天然ではないアミノ酸」、「天然に生じないアミノ酸」、およびそれらの様々にハイフンで繋げられたもの、およびハイフンで繋げられていないものである。用語「非天然アミノ酸」としては、特に限定されないが、天然にコードされたアミノ酸（特に限定されないが、２０の一般アミノ酸、またはピロリジンおよびセレノシステインなどが挙げられる）の修飾（例えば翻訳後修飾）によって天然に生じるが、それ自体は翻訳複合体によって成長中のポリペプチド鎖に組み込まれないアミノ酸が挙げられる。天然にコードされていない天然に生じるアミノ酸としては、例えば特に限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニン、およびＯ−ホスホチロシンなどが挙げられる。さらに、用語「非天然アミノ酸」としては、特に限定されないが、天然に生じないが、合成によって入手されるか、もしくは非天然アミノ酸の修飾によって入手されるアミノ酸が挙げられる。
【０１２８】
本明細書で用いられる用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、およびそれらの一本鎖または２本鎖の形態のポリマーのことをいう。例えば、このような核酸および核酸のポリマーとしては、（ｉ）参照核酸と同様の結合性質を有し、かつ天然に生じるヌクレオチドと同じように代謝される天然ヌクレオチドの類似体、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドの類似体（ＰＮＡ；ペプチド核酸（peptidonucleic acid））、アンチセンス技術に用いられるＤＮＡの類似体（ホスホチオエート、およびホスホロアミデートなど）（ｉｉｉ）それらの保存的に修飾されたバリアント（特に限定されないが、縮重コドンの置換体が挙げられる。）、相補的配列、および明確に示された配列、が挙げられる。例えば、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置を、混合された塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって、縮重コドンの置換体が得られる（「Batzerら, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)」; 「Ohtsukaら, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);およびRossoliniら, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)」）。
【０１２９】
本明細書で用いられるような用語「酸化剤」は、酸化される化合物から電子を除去する化合物または物質のことをいう。酸化剤としては、例えば特に限定されないが、酸化型グルタチオン、システイン、シスタミン、酸化型ジチオスレイトール、酸化型エリスリトール（oxidized erythreitol）、および酸素が挙げられる。多種多様な酸化剤が、本明細書に記載の方法および組成物における使用に適切である。
【０１３０】
本明細書で用いられるような用語「薬学的に許容可能な」は、物質（特に限定されないが、塩、担体、または希釈剤が挙げられる。）が、化合物の生物学的な活性または性質を抑制せず、比較的無毒性であることをいう。すなわち、この物質は個体に投与されたとしても、望まれない生物学的な効果を引き起こさないか、または物質が含まれている組成物の任意の成分と有害な影響を与えるように相互作用しない。
【０１３１】
本明細書で用いられるような用語「光親和性標識」は、露光されることによって標識が親和性を有する分子と結合を形成する基を有する標識のことをいう。例えば、このような結合は共有結合であるか、または非共有結合である。
【０１３２】
本明細書で用いられるような用語「フォトケージド（photocaged）部分」は、ある波長光が照射されることによって、他のイオンまたは分子と共有結合または非共有結合する基のことをいう。
【０１３３】
本明細書で用いられるような用語「光切断可能な基」は、露光されることによって破壊される基のことをいう。
【０１３４】
本明細書で用いられるような用語「光架橋剤」は、露光されることによって、２つ以上の単量体分子または多量体分子と反応して共有結合または非共有結合を形成する、２つ以上の官能基を含んでいる化合物のことをいう。
【０１３５】
本明細書で用いられるような用語「光異性体化可能な部分」は、光の照射によってある異性体から別の異性体へ変化する基のことをいう。
【０１３６】
本明細書中で使用する場合、用語「ポリアルキレングリコール」は、直鎖状または枝分かれしたポリエーテルポリオールのポリマー（polymeric polyether polyol）のことをいう。このようなポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコールおよびその誘導体を含んでいるがこれに限定されない。他の例示的な実施形態が、例えば、Shearwater Corporationカタログ"Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001)のような、商業的に提供されるカタログに記載される。例えば、このようなポリエーテルポリオールのポリマーの平均分子量は、所望のポリマー分子量の範囲内である。
【０１３７】
本明細書中で使用する場合、用語「所望のポリマー分子量の範囲内」は、約０．１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの間である。例として、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ以上である。ポリマーの分子量は、例えば、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの間であり、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａである。ある実施形態において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。ある実施形態において、ポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。ある実施形態において、ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。ある実施形態において、ポリマーの分子量は、約１０，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。ある実施形態において、ポリマー分子は枝分かれポリマーである。枝分かれポリマーの分子量は、例えば、約１，０００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａであり、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、および１，０００Ｄａを含んでいるがこれらに限定されない。ある実施形態において、枝分かれポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａである。ある実施形態において、枝分かれポリマーの分子量は、約１，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。ある実施形態において、枝分かれポリマーの分子量は、約５，０００〜約４０，０００Ｄａである。ある実施形態において、枝分かれポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａ〜約２０，０００Ｄａである。
【０１３８】
本明細書中で使用する場合、用語「ポリマー」は、繰返しサブユニットから構成される分子のことをいう。このような分子としては、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または多糖もしくはポリアルキレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーのことをいう。すなわち、ポリペプチドに対する記述は、ペプチドの記載およびタンパク質の記載に等しく適用され、また、その逆の場合もあり得る。これらの用語は、天然に生じるアミノ酸のポリマーだけでなく、１つ以上のアミノ酸残基が非天然アミノ酸であるアミノ酸のポリマーにも適用される。また、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」には、アミノ酸残基がペプチド共有結合によって連結されている、アミノ酸鎖の長さが任意のもの（例えば全長のタンパク質）が包含される。
【０１４０】
用語「翻訳後修飾」は、天然または非天然のアミノ酸が翻訳によってペプチド鎖に組み込まれた後に生じる、天然または非天然アミノ酸の任意の修飾のことをいう。このような修飾としては、特に限定されないが、インビボの同時翻訳修飾、インビトロの同時翻訳修飾（無細胞翻訳系での同時翻訳修飾など）、インビボの翻訳後修飾、およびインビトロの翻訳後修飾が挙げられる。
【０１４１】
本明細書で用いられるような用語「プロドラッグ」または「薬学的に許容可能なプロドラッグ」は、インビボまたはインビトロにおいて親薬物へ変換される剤のことをいう。このような剤は、薬物の生物学的な活性または性質を抑制せず、比較的無毒性である。剤は個体に投与されたとしても、望まれない生物学的な効果を引き起こさないか、または剤が含まれている組成物の任意の成分と有害な影響を与えるように相互作用しない。プロドラッグは一般に、被験体に投与され、吸収された後に、いくつかの処理（例えば代謝経路）を経て活性な種またはより活性な種へ変換される薬物の前躯体である。ある種のプロドラッグは、より活性を低くする、および／または薬物を可溶性にするか、もしくは薬物に他の性質を与える化学基をプロドラッグ上に有している。化学基がプロドラッグから切断されるおよび／または修飾されると、活性な薬物が生成される。プロドラッグは、酵素反応または非酵素反応によって体内で活性な薬物へ変換される。プロドラッグは、例えば改善された生理化学的性質（例えばプロドラッグの溶解度の向上）、強化された送達特性（例えば、特定の細胞、組織、臓器、またはリガンドを特異的に標的とすること）、および改善された薬物の治療的価値（therapeutic value）を備えている。このようなプロドラッグの利点としては、特に限定されないが、（ｉ）親薬物と比べて投与が容易であること、（ｉｉ）プロドラッグは、経口投与されることによって、生物的に利用可能であるが、親薬物はそうではないこと、および（ｉｉｉ）プロドラッグは、親薬物と比べて、薬学的組成物における溶解度が改善されていることが挙げられる。プロドラッグとしては、活性な薬物の薬理学的に不活性な誘導体、または活性な薬物の活性が減少している誘導体が挙げられる。生理化学的性質、生物薬剤学的性質、または薬物動態学的性質などの薬物の性質を操作することによって、所望の作用部位に到達する薬物または生物学的に活性な分子の量が調節されるように、プロドラッグは設計される。プロドラッグとしては、例えば特に限定されないが、エステル体（プロドラッグ）として投与される非天然アミノ酸のポリペプチド挙げられる。このエステル体の非天然アミノ酸のポリペプチドは、水溶性であることが移動するために不利となる細胞膜を容易に通過し、水溶性が有利となる細胞内にあるときに、代謝によってカルボン酸である活性体へ加水分解される。また、プロドラッグは、薬物の部位特異的な組織への輸送を向上させる調節剤として使用されるための可逆的な薬物の誘導体として設計される。
【０１４２】
本明細書で用いられるような用語「予防に効果的な量」は、処置される疾病、病気または障害の症状の１つ以上をある程度軽減するであろう、少なくとも１つの非天然アミノ酸のポリペプチド、または少なくとも１つの修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを含んでいる組成物の患者に予防的に適用される量のことをいう。このような予防的な適用では、このような量は、患者の健康状態および体重などに依存する。
【０１４３】
本明細書で用いられるような用語「保護された」は、「保護基」、すなわちある反応条件下において化学的に反応性の官能基の反応を抑制する部分が存在することをいう。保護される化学的に反応性の基の種類に依存して保護基は変更される。例えば、（ｉ）化学的に反応性の基がアミンまたはヒドラジドである場合に、保護基はｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）から選択され、（ｉｉ）化学的に反応性の基がチオールである場合に、保護基はオルソピリジルジスルフィドであり、（ｉｉｉ）化学的に反応性の基がカルボン酸（ブタン酸またはプロピオン酸など）またはヒドロキシル基である場合に、保護基はベンジル基またはアルキル基（メチル、エチル、またはｔｅｒｔ−ブチルなど）である。
【０１４４】
例えば、ブロック基／保護基は、以下の化合物から選択される。
【０１４５】
【化３】
2010512800.tif 000005
【０１４６】
また、保護基としては、特に限定されないが、感光性基（ＮｖｏｃおよびＭｅＮｖｏｃなど）、およびGreene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999に記載の他の保護基が挙げられる。
【０１４７】
本明細書で用いられるような用語「放射性部分」は、自発的に放射線を放つ核を有する基のことをいう。放射線は、アルファ粒子、ベータ粒子またはガンマ粒子などである。アルファ粒子はヘリウムの核であり、ベータ粒子は電子であり、ガンマ粒子は高エネルギーの光子である。
【０１４８】
本明細書で用いられるような用語「反応性化合物」は、適切な条件下において、別の原子、分子または化合物と反応性である化合物のことをいう。
【０１４９】
「宿主細胞」とも称される用語「組換え宿主細胞」は、外因性のポリヌクレオチドを含んでいる細胞のことをいう。外因性のポリヌクレオチドを細胞に挿入するために用いられる方法としては、特に限定されないが、組換え宿主細胞を作製するための、直接的な取込み、形質導入またはｆ−交配が挙げられる。例えば、このような外因性のポリヌクレオチドは、非組込み型のベクター（特に限定されないが、プラスミドが挙げられる。）であるか、または宿主のゲノムに組み込まれるものである。
【０１５０】
本明細書で用いられるような「酸化還元活性のある剤」は、別の分子を酸化または還元する分子のことをいう。なお、別の分子を酸化または還元することによって、酸化還元活性化剤は還元または酸化される。酸化還元活性化剤としては、例えば特に限定されないが、フェロセン、キノン、Ｒｕ２＋／３＋錯体、Ｃｏ２＋／３＋錯体、およびＯｓ２＋／３＋錯体が挙げられる。
【０１５１】
本明細書で用いられるような用語「還元剤」は、還元される化合物に電子を追加することができる化合物もしくは物質のことをいう。還元剤としては、例えば特に限定されないが、、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン（２−アミノエタンチオール）、および還元型グルタチオンが挙げられる。例えば、スルヒドリル基を還元状態に維持し、分子内または分子間のジスルフィド結合を減少させるために、このような還元剤を用いる。
【０１５２】
本明細書で用いられるような用語「樹脂」は、高分子量で不溶性のポリマービーズのことをいう。例えば、このようなビーズを、固相ペプチド合成の支持体として、あるいは精製前に分子が付着する部位として用いる。
【０１５３】
本明細書で用いられるような用語「サッカライド」は、一連の炭水化物のことをいう。サッカライドとしては、例えば特に限定されないが、糖、モノサッカライド、オリゴサッカライド、およびポリサッカライドが挙げられる。
【０１５４】
本明細書で用いられるような用語「安全性」または「安全性プロフィール」は、投与された薬物の回数に対する薬物の投与に関する副作用のことをいう。例えば、何度も投与されたが、ごく軽度の副作用をもたらすか、または副作用をもたらさない薬物は優れた安全性プロフィールを有する。この方法は、例えば任意のポリペプチドの安全性プロフィールを評価するために使用される。
【０１５５】
本明細書で用いられる用語「スピン標識」は、電子スピン共鳴分光法によって検出されることができ、別の分子に付着することができる不対の電子スピンを示す原子または原子の基（すなわち安定な常磁性の基）を含んでいる分子のことをいう。このようなスピン標識分子としては、特に限定されないが、ニトリル基および窒素酸化物が挙げられる。また、スピン標識はシングルスピン標識またはダブルスピン標識である。
【０１５６】
本明細書で用いられるような用語「化学量論的」は、化学反応に参加している化合物のモル比が、約０．９〜約１．１であることをいう。
【０１５７】
本明細書で用いられるような用語「化学量論様」は、反応条件の変化または添加剤の存在の変化に応じて、化学量論的またはほぼ化学量論的になる化学反応のことをいう。このような反応条件の変化としては、特に限定されないが、温度の上昇、またはｐＨの変化が挙げられる。添加剤としては、特に限定されないが、促進剤が挙げられる。
【０１５８】
本明細書で用いられるような用語「被験体」は、処置、観察または実験の対象である動物のことをいう。被験体としては、例えば特に限定されないが、哺乳類が挙げられる。哺乳類としては、特に限定されないが、ヒトが挙げられる。
【０１５９】
本明細書で用いられるような用語「実質的な精製」は、普通は精製前の興味のある成分と付いているか、または相互作用している他の成分から、興味のある成分が実質的もしくは本質的に遊離していることをいう。例えば、興味のある成分の調製物が、（乾燥重量で）約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の不純な成分を含んでいるとき、「実質的に精製されている」。したがって、「実質的に精製された」興味のある成分は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上の純度を有している。例えば、組換え技術によって製造される天然アミノ酸のポリペプチドまたは非天然アミノ酸のポリペプチドの場合に、天然アミノ酸のポリペプチドまたは非天然アミノ酸のポリペプチドは、自然の細胞または宿主細胞から精製される。天然アミノ酸のポリペプチドまたは非天然アミノ酸のポリペプチドは、調製物が（乾燥重量で）約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満の不純物を含んでいるとき、「実質的に精製されている」。例えば、天然アミノ酸のポリペプチドまたは非天然アミノ酸のポリペプチドは、組み換え技術に基づいて宿主細胞によって製造されるとき、天然アミノ酸のポリペプチドまたは非天然アミノ酸のポリペプチドは、細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％またはそれ以下で存在している。例えば、天然アミノ酸のポリペプチドまたは非天然アミノ酸のポリペプチドは、組み換え技術に基づいて宿主細胞によって製造されるとき、天然アミノ酸のポリペプチドまたは非天然アミノ酸のポリペプチドは、培地に、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌまたはそれ以下で存在している。例えば、「実質的に精製された」天然アミノ酸のポリペプチドまたは非天然アミノ酸のポリペプチドは、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、またはそれ以上の純度を有している。このような純度は、特に限定されないが、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびキャピラリー電気泳動などの適切な方法によって決定される。
【０１６０】
「不干渉性置換基」とも称される用語「置換基」は、分子上の別の基を置き換えるために用いられる。このような基としては、特に限定されないが、ハロゲン（ｈａｌｏ）、Ｃ１−Ｃ１０のアルキル、Ｃ２−Ｃ１０のアルケニル、Ｃ２−Ｃ１０のアルキニル、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ、Ｃ５−Ｃ１２のアラルキル、Ｃ３−Ｃ１２のシクロアルキル、Ｃ４−Ｃ１２のシクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２−Ｃ１２のアルコキシアルキル、Ｃ５−Ｃ１２のアルコキシアリール、Ｃ５−Ｃ１２のアリールオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ１２のオキシアリール、Ｃ１−Ｃ６のアルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ１０のアルキルスルホニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）（ｍは１〜８である。）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、複素環基、置換複素環基、ニトロアルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、Ｃ２−Ｃ１０のアルキルチオアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、−ＯＨ、−ＳＯ２、＝Ｓ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ２、カルボニル、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−（Ｃ１−Ｃ１０のアリール）−Ｓ−（Ｃ６−Ｃ１０のアリール）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６−Ｃ１０のアリール）、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）（各ｍは１〜８である。）、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−ＳＯ２ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、およびそれらの塩などが挙げられる。上述した各Ｒ基としては、特に限定されないが、Ｈ、アルキルまたは置換アルキル、アリールまたは置換アリール、あるいはアルカリルが挙げられる。置換基が、左から右へ書くという従来の化学式に基づいて記載されている場合に、このような置換基は、右から左へ書かれた構造に由来する化学的に同一の置換基を等しく包含する。例えば、−ＣＨ２Ｏ−は−ＯＣＨ２−と同等である。
【０１６１】
アルキル基およびヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと称される基を包含する。）のための置換基としては、例えば特に限定されないが、−ＯＲ、＝Ｏ、＝ＮＲ、＝Ｎ−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＳＲ、−ハロゲン、−ＳｉＲ３、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲ（Ｏ）２Ｒ、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ２）＝ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−ＮＲＳＯ２Ｒ、−ＣＮ、および−ＮＯ２が挙げられる。上述した各Ｒとしては、特に限定されないが、水素、置換または非置換のヘテロアルキル基、置換または非置換のアリール基（特に限定されないが、１つまたは２つのハロゲンで置換されたアリール基）、置換または非置換のアルキル基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、あるいはアラルキル基が挙げられる。２つのＲ基が、同じ窒素原子に付着している場合に、それらは窒素原子と結合して、５員環、６員環、または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ２は、特に限定されないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを包含することを意味する。
【０１６２】
アリール基およびヘテロアリール基のための置換基としては、例えば特に限定されないが、−ＯＲ、＝Ｏ、＝ＮＲ、＝Ｎ−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＳＲ、−ハロゲン、−ＳｉＲ３、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲ（Ｏ）２Ｒ、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ２）＝ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−ＮＲＳＯ２Ｒ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｒ、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルが挙げられる。このような置換基の数は、０〜芳香環系の開放原子価の総数である。上述した各Ｒとしては、特に限定されないが、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、およびヘテロアリールが挙げられる。
【０１６３】
本明細書中で使用する場合に、用語「治療タンパク質」は、以下に示すポリペプチド／タンパク質のいずれか１つまたは全てのことをいう：アルファ−１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、抗体断片、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球走化性タンパク質−１、単球走化性タンパク質−２、単球走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉベータ、ランテス、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６，ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性化ペプチド、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクターＩＸ、ファクターＶＩＩ、ファクターＶＩＩＩ、ファクターＸ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、いずれかのインターフェロン様分子もしくはＩＦＮファミリーのメンバー、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成された低分子タンパク質、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌のエンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンアルファ１、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体およびコルチコステロン。
【０１６４】
本明細書で用いられるような用語「治療に効果的な量」は、疾病、病気もしくは障害にすでに罹患している患者に投与される、少なくとも１つの非天然アミノ酸のポリペプチド、および／または少なくとも１つの修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを含んでいる組成物の量であって、処置される疾病、病気もしくは障害の症状の１つ以上を回復するか、このような症状の１つ以上の進行を少なくとも部分的に停止するか、あるいはこのような症状の１つ以上をある程度緩和するために十分な量のことをいう。このような組成物の有効性は、状態（特に限定されないが、疾病、病気、または障害の重症度および治療単位、薬歴、患者の健康状態、および薬物への反応性が挙げられる。）および治療を担当する医師の判断に依存する。例えば、治療に効果的な量は、用量を増加する臨床試験などの方法によって決定される。
【０１６５】
本明細書で用いられるような用語「チオアルコキシ」は、酸素原子を介して分子に連結する硫黄を含むアルキル基のことをいう。
【０１６６】
用語「熱融解温度」またはＴｍは、（既定のイオン強度、ｐＨ、および核酸の濃度において）標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。
【０１６７】
本明細書で用いられるような用語「毒性部分」は、死または危害をもたらし得る化合物のことをいう。
【０１６８】
本明細書で用いられるような用語「処置する」、「処置すること」、または「処置」は、疾病または病気の症状の軽減、柔和もしくは改善、さらなる症状の予防、症状の根本的な代謝の原因の改善もしくは予防、疾病もしくは病気の抑制（例えば、疾病もしくは病気の発症の停止）、疾病もしくは病気の緩和、疾病もしくは病気の回復の誘導、疾病もしくは病気によって引き起こされた状態の緩和、または疾病もしくは病気の症状の停止が含まれる。用語「処置する」、「処置すること」、または「処置」は、予防的処置および／または治療的処置を包含する。
【０１６９】
本明細書で用いられるような用語「水溶性ポリマー」は、水溶性の溶媒に可溶性である任意のポリマーのことをいう。このような水溶性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポチエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそれらのＣ１−Ｃ１０のモノアルコキシもしくはモノアリールオキシ誘導体（これらは、このような水溶性ポリマーを開示するために、参照によって本明細書に援用される米国特許第５，２５２，７１４号明細書に記載されている。）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体（デキストラン  サルフェートなど）、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、ヘパリン、ヘパリンの断片、ポリサッカライド、オリゴサッカライド、グリカン、セルロースおよびセルロース誘導体（メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースなど）、血清アルブミン、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールのコポリマーおよびその誘導体、ポリビニルエチルエーテル、およびアルファ−ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド（aspartamide）など、ならびに、それらの混合物が挙げられる。例えば、このような水溶性ポリマーを天然アミノ酸のポリペプチドもしくは非天然アミノ酸のポリペプチドに連結させることによって、例えば、以下のような変化が生じる。すなわち、未修飾の形態のものと比べたときの、水溶性の増加、血中半減期の増加もしくは調節、または治療半減期の増加もしくは調節、バイオアベイラビリティの増加、生物学的な活性の調節、循環時間の延長、免疫原性の調節、物理的会合特性（凝集および多量体形成など）の調節、受容体結合性の変更、１つ以上の結合パートナーに対する結合性の変更、および、受容体の二量体化および多量体化の変更など。また、このような水溶性ポリマーは、必要に応じてそれ自体生物学的な活性を有ている。
【０１７０】
特に断りのない限り、質量分析法、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生物化学、組換えＤＮＡ技術、および薬理学の従来方法が用いられる。
【０１７１】
本明細書に示された化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびにこのような化合物を製造するための試薬が挙げられる）としては、同位体で標識された化合物が挙げられる。この同位体で標識された化合物は、１つ以上の原子が、天然に一般的に発見される原子量または質量数と異なる原子量または質量数を有する原子で置換されていることを除いて、本明細書に示された様々な式および構造にて詳述されている化合物と同一の化合物である。本化合物に組み込まれ得る同位体としては、水素、炭素、窒素、酸素、フッ素、および塩素の同位体が挙げられ、例えば、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌなどである。本明細書に記載の特定の同位体で標識された化合物（例えば、３Ｈおよび１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれた化合物）は、組織分布アッセイの基質および／または薬物に有用である。さらに、重水素（つまり２Ｈ）などの同位体で置換することによって、インビボの半減期の増加もしくは必要な用量の減少などの代謝安定性が向上し、これによって、特定の治療上の利点を得ることができる。
【０１７２】
本明細書に記載の化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびにこのような化合物を製造するための試薬が含まれる。）のいくつかは、不斉炭素を有しているため、エナンチオマーまたはジアステレオマーとして存在する。ジアステレオマーの混合物は、特に限定されないが、クロマトグラフィーおよび／または分別結晶などの実証された方法によって、物理化学的な違いに基づいて、それぞれのジアステレオマーに分けられ得る。エナンチオマーの混合物を適切な光活性化合物（アルコールなど）と反応させて、このような混合物をジアステレオマーの混合物に変換し、ジアステレオマーを分けてから、それぞれのジアステレオマーを対応する純粋なエナンチオマーに変換する（例えば加水分解する）ことによって、エナンチオマーは分けられ得る。全ての上述した異性体（ジアステレオマー、エナンチオマー、およびそれらの混合物など）は本明細書に記載の組成物の一部として考慮される。
【０１７３】
別のまたはさらなる実施形態では、本明細書に記載の化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびにこのような化合物を製造するための試薬が挙げられる。）は、プロドラッグの形態で用いられる。別のまたはさらなる実施形態では、本明細書に記載の化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびにこのような化合物を製造するための試薬が挙げられる。）は、所望の効果（所望の治療効果など）を引き起こすために使用される代謝産物を製造する必要がある生物に投与されることによって代謝される。さらなる、または別の実施形態では、非天然アミノ酸および“修飾されたまたは修飾されていない”非天然アミノ酸のポリペプチドの活性のある代謝産物である。
【０１７４】
本明細書に記載の方法および製剤には、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドのＮ酸化物、結晶形態（多形としても知られている）、または薬学的に許容可能な塩の使用が含まれる。さらに、本明細書に示された非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドは、薬学的に許容可能な溶媒（水およびエタノールなど）と一緒になった溶媒和物の形態で存在しているだけでなく、非溶媒和の形態でも存在することができる。また、本明細書に示された非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドの溶媒和物の形態も、本明細書に開示されていると考慮される。
【０１７５】
特本明細書に記載の化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびにこのような化合物を製造するための試薬が挙げられる。）のいくつかは、互変異性体のいくつかの形態にて存在してもよい。このような互変異性体の全ては、本明細書に記載の組成物の一部として考慮される。また、例えば、本明細書における任意の化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびにこのような化合物を製造するための試薬が挙げられる。）のエノール−ケトの形態も、本明細書に開示の組成物の一部として考慮される。
【０１７６】
本明細書に記載の化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびにこのような化合物のどれか１つを製造するための試薬が挙げられる。）のいくつかは、酸性であり、薬学的に許容可能な陽イオンと塩を形成する。本明細書に記載の化合物（特に限定されないが、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびにこのような化合物を製造するための試薬が挙げられる。）のいくつかは、塩基性であり、このため、薬学的許容可能な陰イオンと塩を形成する。二塩などの全ての塩が、本明細書に記載の組成物の範囲に含まれる。またこのような塩は立証された方法によって調製される。例えば、酸性物質と塩基性物質とを、水性の媒体、非水性の媒体、または部分的に水性の媒体において、接触させることによって、塩は必要に応じて調製される。また、塩は、（ろ過する、非溶媒によって沈殿させた後にろ過する、溶媒を蒸発させる、あるいは、水溶液の場合に凍結乾燥するという）技術の少なくとも１つを用いて、回収される。
【０１７７】
本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドの薬学的に許容可能な塩は、親の非天然アミノ酸のポリペプチドに存在する酸性のプロトンが、金属イオン（例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、またはアルミニウムイオン）によって置換されるか、または有機塩基と配位結合するときに、必要に応じて形成される。また、開示された非天然アミノ酸のポリペプチドの塩の形態は、出発物質または中間体の塩を用いて必要に応じて調製される。本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドは、遊離塩基の形態である本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドを、薬学的に許容可能な無機酸または有機酸と反応させることによって、薬学的に許容可能な酸付加塩（薬学的に許容可能な塩の一種である。）として必要に応じて調製される。また、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドは、遊離酸の形態の本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドを、薬学的に許容可能な無機塩基または有機塩基と反応させることによって、薬学的に許容可能な塩基付加塩（base addition salt）（薬学的に許容可能な塩の一種である。）として調製される。
【０１７８】
薬学的に許容可能な塩の種類としては、特に限定されないが、（１）無機酸または有機酸と一緒に形成された酸付加塩、（２）親化合物に存在する酸性のプロトンが、金属イオンで置換されたとき、または有機塩基と配位結合するときに形成するときに形成される塩が挙げられる。無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸などが挙げられる。有機酸としては、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、エチレンコハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−メチルビシクロ−［２．２．２］オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトニック酸（glucoheptonic acid）、４，４′−メチレンビス（３−ヒドロキシ２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第３級ブチル酢酸（tertiary butylacetic acid）、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、およびムコン酸などが挙げられる。金属イオンとしては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、またはアルミニウムイオンなどが挙げられる。許容可能な有機塩基としては、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、およびＮ−メチルグルカミンなどが挙げられる。許容可能な無機塩基としては、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、および水酸化ナトリウムなどが挙げられる。
【０１７９】
非天然アミノ酸のポリペプチドの薬学的に許容可能な塩の対応する対イオンは、様々な方法を用いて分析および同定される。様々な方法としては、特に限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、誘導結合プラズマ、原子吸光分光分析、質量分析、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。さらに、このような非天然アミノ酸のポリペプチドの薬学的に許容可能な塩の治療活性は、実施例９〜１７に記載の技術および方法を用いて試験される。
【０１８０】
塩を参照するとき、塩には、溶媒が付加された形態または結晶形態（特に、溶媒和物または多形）が包含されることを理解すべきである。溶媒和物は、化学量論的または非化学量論的な量の溶媒を含んでいる。また、溶媒和物は多くの場合に、水およびエタノールなどの薬学的に許容可能な溶媒と結晶する過程の間に形成される。水和物は、溶媒が水のときに形成され、アルコラートは、溶媒がアルコールのときに形成される。多形には、化合物の基本的な組成は同じであるが、結晶の凝集の構成が異なるものが包含される。各多形では、一般的に、Ｘ線回折パターン、赤外スペクトル、融点、密度、硬度、結晶形状、光学特性、電気的特性、安定性、および可溶性が異なっている。様々な要因（再結晶溶媒、結晶化速度、および保存温度など）によって、単結晶が優先的に形成されると期待される。
【０１８１】
非天然アミノ酸のポリペプチドの薬学的に許容可能な塩、多形、および／または溶媒和物のスクリーニングと特徴付けとは、様々な技術を用いて実施される。このような技術としては、特に限定されないが、熱分析、Ｘ線回折、分光法、蒸気収着、および顕微鏡検査が挙げられる。熱分析法は、多形転移などの熱化学的な分解、または熱物理学的な分解を調べるものである。熱分析法は、多形同士の関係を分析するか、重量の減少を決定するか、ガラス転移温度を見つけるか、または賦形剤の適合性試験を行うために使用される。このような熱分析法としては、特に限定されないが、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、調節された示差走査熱量測定（ＭＤＣＳ）、熱重量分析（ＴＧＡ）、および熱重量と赤外との分析（Thermogravimetric anジnfrared analysis(TG/IR)）が挙げられる。Ｘ線回折法としては、特に限定されないが、単結晶回折法、粉末回折法、シンクロトロン放射源（synchrotron source）が挙げられる。使用される様々な分光技術としては、特に限定されないが、ラマン分光法、ＦＴＩＲ、ＵＶＩＳ、およびＮＭＲ（液体および固体）が挙げられる。様々な顕微鏡検査技術としては、特に限定されないが、偏光顕微鏡検査、エネルギー分散型Ｘ線分析装置（ＥＤＸ）を有する走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、ＥＤＸを有する環境制御型走査電子顕微鏡（ガス雰囲気または水蒸気雰囲気）、ＩＲ顕微鏡検査、およびラマン顕微鏡検査が挙げられる。
【０１８２】
以下の詳細な説明では、我々の方法、組成物、装置および器具の原理を利用した実施形態が説明のために記載されており、詳細な説明と添付の図面とを参照することによって、本方法および本組成物の特徴および利点がより理解される。
【０１８３】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、本明細書に記載の方法、組成物、方策および技術に係るある態様の関係を表わす非限定的な略図である。
【０１８４】
図２は、フィッシャーのインドール合成のメカニズムを表わす非限定的な略図である。
【０１８５】
図３は、本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【０１８６】
図４は、本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【０１８７】
図５は、本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法を説明するための非限定的な一実施例を示す。
【０１８８】
図６は、本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【０１８９】
図７は、本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【０１９０】
図８は、本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【０１９１】
図９は、本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【０１９２】
図１０は、本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【０１９３】
図１１は、本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【０１９４】
図１２は、フィッシャーのインドール合成に対する金属イオンの効果の非限定的な具体例を示す図である。
【０１９５】
図１３は、本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法に対して、ニッケル金属イオンが奏する促進効果の非限定的な具体例を示す図である。
【０１９６】
図１４は、本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法に対して、溶媒が奏する効果の非限定的な具体例を示す図である。
【０１９７】
図１５は、本明細書に記載のインドールを含んでいる非天然アミノ酸の合成に用いられるヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸試薬の非限定的な具体例を示す図である。
【０１９８】
図１６は、本明細書に記載のインドールを含んでいる非天然アミノ酸の合成に用いられる、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸試薬およびマスクされているカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸試薬の非限定的な具体例を示す図である。
【０１９９】
図１７は、本明細書に記載のインドールを含んでいる非天然アミノ酸の合成に用いられるカルボニルを含んでいるおよびマスクされているカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸試薬の非限定的な具体例を示す図である。
【０２００】
図１８は、本明細書に記載のインドールを含んでいる非天然アミノ酸の合成に用いられるカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸試薬の非限定的な具体例を示す図である。
【０２０１】
図１９は、修飾されたインドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成するために行われる、ヒドラジンを含んでいる試薬を用いた、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドの翻訳後修飾の非限定的な具体例を示す図である。
【０２０２】
図２０は、修飾されたインドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成するために行われる、カルボニルを含んでいる試薬を用いた、ヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドの翻訳後修飾の非限定的な具体例を示す図である。
【０２０３】
図２１は、インドールを含んでいる非天然アミノ酸タンパク質を形成するために行われる、ヒドラジンを含んでいる試薬を用いた、カルボニルを含んでいるおよびマスクされているカルボニルを含んでいるタンパク質の標識または修飾の非限定的な具体例を示す図である。
【０２０４】
図２２は、インドールを含んでいる非天然アミノ酸タンパク質を形成するために行われる、カルボニルを含んでいる試薬を用いた、ヒドラジンを含んでいるタンパク質の標識または修飾の非限定的な具体例を示す図である。
【０２０５】
図２３の（Ａ）は非天然アミノ酸のポリペプチドをカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドへ化学変換する修飾の非限定的な具体例を示す図であり、（Ｂ）は非天然アミノ酸のポリペプチドをヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドへ化学変換する修飾の非限定的な具体例を示す図である。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびに修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドの作製、精製、特徴づけ、および使用を実施するための方法、組成物、技術および方策の何れに用いられるか、または組み込まれてもよい。
【０２０６】
図２４の（Ａ）は、ヒドラジンまたはカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドもしくはタンパク質を修飾して、所望の官能基を導入する非限定的な具体例を示す図である。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術および方策の何れに用いられるか、または組み込まれてもよい。
【０２０７】
図２４の（Ｂ）は、官能基を含有するポリペプチドまたはタンパク質をＰＥＧ誘導体と反応させる非限定的な具体例を示す図である。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドを作製、精製、特徴づけ、および使用するための方法、組成物、技術および方策の何れに用いられるか、または組み込まれてもよい。
【０２０８】
図２５は、二官能リンカー基を使用して、インドールを形成することによって、非天然アミノ酸含有するタンパク質またはポリペプチドをＰＥＧ誘導体と連結することを説明する非限定的な図である。
【０２０９】
図２６は、両末端にヒドラジンを含んでいる二官能リンカー基の合成の非限定的な具体例を示す図である。
【０２１０】
図２７は、二官能リンカーを使用して、２つの非天然アミノ酸のポリペプチドのホモ二量体を形成する非限定的な具体例を示す図である。
【０２１１】
図２８は、枝分かれＰＥＧを含有する試薬とカルボニルの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドとを反応させて、インドールで修飾されたポリペプチドを形成する非限定的な具体例を示す図である。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびに修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドの作製、精製、特徴づけ、および使用を実施するための方法、組成物、技術および方策の何れに用いられるか、または組み込まれてもよい。
【０２１２】
図２９は、インドールで修飾されたポリペプチドを形成するための、試薬を含有する枝分かれＰＥＧとポリペプチドを含んでいるヒドラジン非天然アミノ酸との間の反応の非限定的な具体例を示す図である。このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、ならびに修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドの作製、精製、特徴づけ、および使用を実施するための方法、組成物、技術および方策の何れに用いられるか、または組み込まれてもよい。
【０２１３】
図３０は、ヒドラジン基とカルボニル基とを含んでいるＰＥＧ誘導体の非限定的な具体例を示す図である。
【０２１４】
〔発明を実施するための形態〕
＜Ｉ．序論＞
タンパク質の部位特異的な修飾に関連する限界の多くを克服する、タンパク質科学における全く新しい技術が近年報告された。具体的には、原核生物であるEscherichia coli（E. coli）（例えば、L.Wangら[2001]、Science 292:498-500）、および真核生物であるSacchromyces cerevisiae（S. cerevisiae）（例えば、J.Chinら、Science 301:964-7[2003]）のタンパク質生合成機構に新規の成分を加えることによって、遺伝的にコードされていなアミノ酸をタンパク質にインビボにおいて組み込むことが可能になった。これまでにない化学的、物理的または生物学的性質を有する多数の新たなアミノ酸、例えば、光親和性標識されたアミノ酸、光異性化可能な（photoisomerizable）アミノ酸、ケトアミノ酸、およびグリコシル化アミノ酸などが、この手法によって、アンバーコドンであるＴＡＧと反応して、Ｅ．ｃｏｌｉおよび酵母においてタンパク質に高い忠実性でもって効率的に組み込まれた。例えば、「J.W.Chinら、(2002) Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027」、「J.W.Chin,& P.G.Schultz、(2002)、ChemBioChem 3(11):1135-1137」、「J.W.Chinら、(2002)、PNAS United States of America 99(71):11020-11024」および「L.Wang,& P.G.Schultz、(2002)、Chem. Comm.,1-11」参照（これらの文献は、その全体が参照することによって援用される。）。これらの研究では、（１）タンパク質中に存在せず、（２）２０の遺伝的にコードされた一般的なアミノ酸において存在する全ての官能基に対して化学的に不活性であり、（３）使用されたときに、選択的かつ効率的に反応して安定な共有結合を形成し得る、化学官能基を選択的に導入できることが証明された。
＜ＩＩ．概要＞
図１は、本明細書に記載の組成物、方法、技術および方策の非限定的な例を示す図である。ある水準において、カルボニル基、ヒドラジン基、または複素環基（窒素を含んでいる複素環基など）を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸もしくは修飾された非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを製造および使用するための道具（方法、組成物、技術）が、本明細書に記載されている。カルボニル基としては、ケトンおよびアルデヒドが挙げられるが、これらに限定されない。非天然アミノ酸は、必要に応じて別の官能基を含んでいる。このような官能基としては、所望の官能基が挙げられるが、これに限定されない。なお、上記に様々な官能基を示したが、ある官能基のメンバーが別の官能基のメンバーとして分類されないということではない。実際に、特定の状況下では重複することもある。例えば、水溶性ポリマーはポリエチレングリコールの誘導体と範囲が重複する。しかし、この重複は完全ではないため、上記で両方の官能基を挙げた。
【０２１５】
図１に示されたように、１態様では、本発明の方法は、本明細書に記載の方法、組成物および技術を用いて修飾されるポリペプチドを選択および設計する方法である。新規ポリペプチドは、必要に応じて例えば、ハイスループットスクリーニング過程の一部として、または、研究者の興味に基づいて、新規に（de novo）設計される。新規ポリペプチドがハイスループットスクリーニング過程の一部として新規に設計される場合は、非常に多数のポリペプチドが設計、合成、特徴づけ、および／または試験される。また、新規ポリペプチドは、必要に応じて、公知のポリペプチドの構造または部分的に特徴づけられているポリペプチドの構造に基づいて設計される。例えば、科学界は、後述する成長ホルモン遺伝子のスーパーファミリーを精力的に研究している。新規ポリペプチドは、１実施形態では、この遺伝子のスーパーファミリーのメンバーの構造に基づいて設計される。置換および／または修飾されるアミノ酸を選択する原理が、本明細書には別々に記載されている。また、採用される修飾の選択についても本明細書に記載されており、この選択は、実験者または最終使用者の必要性に合うように用いられる。このような必要性としては、ポリペプチドの治療有効性の操作、ポリペプチドの安全性プロフィールの改善、ポリペプチドの薬物動態学的性質、薬理学的性質および／または薬力学的性質の調節（例えば、水溶性の増加、バイオアベイラビリティ、血中半減期の増加、治療半減期の増加、免疫原性の調節、生物学的な活性の調節、または循環時間の延長）が挙げられるが、これらに限定されない。また、このような修飾には、例えば、ポリペプチドへのさらなる官能基の提供、タグ、標識、または検出可能なシグナルのポリペプチドへの組込み、ポリペプチドの単離性の緩和、およびこのような修飾の任意の組合せが含まれる。
【０２１６】
また、本明細書には、ヒドラジン基、カルボニル基、または窒素を含んでいる複素環基などの複素環基を含んでいるように修飾された、または修飾され得る非天然アミノ酸が記載されている。カルボニル基としては、ケトンおよびアルデヒドが挙げられるが、これらに限定されない。この態様には、上述した非天然アミノ酸を製造、精製、特徴づけ、および使用するための方法が含まれる。本明細書に記載の別の態様では、上述した非天然アミノ酸の少なくとも１つをポリペプチドに組み込むための方法、方策および技術が記載されている。また、この態様には、上述した非天然アミノ酸の少なくとも１つを含んでいる上述したポリペプチドを製造、精製、特徴づけ、および使用するための方法が含まれる。また、この態様には、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを、少なくとも部分的に、製造するために用いられ得るオリゴヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）を製造、精製、特徴づけ、および使用するための組成物および方法が含まれる。また、この態様には、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを、少なくとも部分的に、製造するために用いられ得るオリゴヌクレオチドを発現することができる細胞を製造、精製、特徴づけ、および使用するための組成物および方法が記載されている。
【０２１７】
したがって、本明細書には、ヒドラジン基、カルボニル基、または窒素を含んでいる複素環基などの複素環基を有する非天然アミノ酸もしくは修飾された非天然アミノ酸の少なくとも１つを含んでいるポリペプチドが、提供および記載されている。カルボニルで修飾された非天然アミノ酸としては、ケトンで修飾された非天然アミノ酸およびアルデヒドで修飾された非天然アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ヒドラジン基、カルボニル基、または窒素を含んでいる複素環基などの複素環基を有する非天然アミノ酸もしくは修飾された非天然アミノ酸の少なくとも１つを含んでいるポリペプチドは、ポリペプチドのある位置に、翻訳と同時の修飾（co-translational modification）または翻訳後修飾を少なくとも１つ含んでいる。このような実施形態では、カルボニルで修飾された非天然アミノ酸はケトンおよびアルデヒドをさらに含んでいるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、翻訳と同時の修飾もしくは翻訳後修飾は、細胞機構を介して生じるものであり、例えば、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテート付加、リン酸化、および糖脂質が結合する修飾などが挙げられる。多くの場合、このような細胞機構に基づく翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾は、ポリペプチドの天然に生じたアミノ酸の部位において生じるが、ある実施形態では、このような細胞機構に基づく翻訳と同時の修飾もしくは翻訳後修飾は、ポリペプチドの非天然アミノ酸の部位において生じる。
【０２１８】
他の実施形態では、翻訳後修飾は、細胞機構を利用しないが、その代わり、官能基は、第２反応基を含んでいる分子（所望の官能基が含まれるが、これには限定されない）と、第１反応基を含んでいる少なくとも１つの非天然アミノ酸（特に限定されないが、ケトン基、アルデヒド基、ヒドラジン基、または窒素を含んでいる複素環基などの複素環基を含んでいる非天然アミノ酸が挙げられる。）とを、本明細書に記載の化学方法、または上記の特定の反応基に適した他の方法を利用して結合させることによって提供される。特定の実施形態では、翻訳と同時の修飾もしくは翻訳後修飾は、真核細胞または非真核細胞においてインビボで作製される。特定の実施形態では、翻訳と同時の修飾もしくは翻訳後修飾は、細胞機構を利用することなく、インビトロで作製される。また、この態様には、翻訳後修飾された非天然アミノ酸を少なくとも１つ含んでいるポリペプチドを製造、精製、特徴づけ、および使用するための方法が含まれる。
【０２１９】
また、本明細書に記載の方法、組成物、方策および技術の範囲には、ポリペプチドの一部である非天然アミノ酸と反応して、上述した翻訳後修飾の何れかを行うことができる試薬が含まれる。非天然アミノ酸は、カルボニル基、ケトン基、ケトアルデヒド基、ヒドラジン基、またはそれらの保護された形態のものの何れか１つを含んでいる。一般的に、翻訳後修飾された非天然アミノ酸が生じた場合に、この非天然アミノ酸を用いて、少なくとも１つのインドール誘導体が製造される。結果物である、インドールを基本として修飾された非天然アミノ酸は、いくつかの実施形態において、さらなる修飾反応を受ける。また、この態様には、非天然アミノ酸に対して上述した翻訳後修飾を行うことができる試薬を製造、精製、特徴づけ、および使用する方法が含まれる。
【０２２０】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、ある宿主細胞によってインビボで作製された翻訳と同時の修飾もしくは翻訳後修飾を少なくとも１つ含んでいる。このような翻訳後修飾は、通常は別の宿主細胞によって作製されないものである。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ある真核細胞によってインビボで作製された翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾を少なくとも１つ含んでいる。このような翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾は、通常は非真核細胞によって作製されないものである。このような翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテート付加、リン酸化、および糖脂質が結合する修飾などが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾としては、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合を介した、アスパラギンに対するオリゴサッカライドの結合が挙げられる（オリゴサッカライドが（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃなどを含んでいる場合が挙げられるが、これは限定されない。）。別の実施形態において、翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾としては、ＧａｌＮＡｃ−セリン結合、ＧａｌＮＡｃ−トレオニン結合、ＧｌｃＮＡｃ−セリン結合、あるいはＧｌｃＮＡｃ−トレオニン結合を介した、セリンまたはトレオニンに対するオリゴサッカライド（このようなオリゴサッカライドとしては、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃが挙げられるが、これらに限定されない。）の結合が挙げられる。分泌シグナル配列としては、例えば、原核生物の分泌シグナル配列、真核生物の分泌シグナル配列、細菌での発現のために５’が最適化された真核細胞の分泌シグナル配列、新規の分泌シグナル配列、ペクチン酸リアーゼ分泌シグナル配列、ＯｍｐＡ分泌シグナル配列、およびファージ分泌シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。分泌シグナル配列としては、例えば、ＳＴＩＩ（原核生物）、Ｆｄ  ＧＩＩＩ、およびＭ１３（ファージ）、Ｂｇｌ２（酵母）、ならびにトランスポゾンに由来するシグナル配列ｂｌａが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、分泌または局在化の配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、および／またはＧＳＴ融合などを含んでいてもよい。また、この態様には、このような翻訳と同時の修飾もしくは翻訳後修飾を少なくとも１つ含んでいるポリペプチドを製造、精製、特徴づけ、および使用するための方法が含まれる。他の実施形態では、グリコシル化された非天然アミノ酸のポリペプチドは、グリコシル化されていない形態の非天然アミノ酸のポリペプチドから製造される。グリコシル化された非天然アミノ酸のポリペプチドのためのこのようなグリコシル化されていない形態のものは、必要に応じて以下の方法から製造される。すなわち、（１）単離された、実質的に精製された、または精製されていないグリコシル化された非天然アミノ酸のポリペプチドからオリゴサッカライド基を化学的もしくは酵素的に除去する工程を含んでいる方法、（２）非天然アミノ酸のポリペプチドをグリコシル化しない宿主に���いて非天然アミノ酸を製造する工程を含んでいる方法（そのような宿主としては、原核生物または上記ポリペプチドをグリコシル化しないように操作された、もしくは突然変異させられた真核細胞が挙げられる。）、（３）通常は上記ポリペプチドをグリコシル化する真核細胞によって上記非天然アミノ酸のポリペプチドが製造される細胞培養液に、グリコシル化阻害剤を導入する工程を含んでいる方法、あるいは（４）上記方法の任意の組合せ。また、本明細書には、標準的にグリコシル化される非天然アミノ酸のポリペプチドのための上記グリコシル化されていない形態のものが含まれる。ここで、「標準的なグリコシル化」は、天然に生じるポリペプチドがグリコシル化される条件下にて製造されるときの、ポリペプチドのグリコシル化を意味する。勿論、標準的にグリコシル化される非天然アミノ酸のポリペプチドのためのこのようなグリコシル化されていない形態のものは、必要に応じて未精製の形態であるか、実質的に精製された形態であるか、または単離された形態である。
【０２２１】
他の実施形態において、非天然アミノ酸のポリペプチドは、カルボニル基、ケトン基、アルデヒド基、ヒドラジン基、窒素を含んでいる複素環基などの複素環基、またはそれらの保護された形態のものを有する非天然アミノ酸を、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、あるいは１０以上含んでいる。非天然アミノ酸は、同一であっても異なっていてもよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含んでいる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の異なる場所が、タンパク質に存在し得る。特定の実施形態では、天然発生型のタンパク質に存在する特定のアミノ酸の少なくとも１つ（ただし、全てではない。）が非天然アミノ酸で置換されている。
【０２２２】
本明細書に記載および提供されている方法および組成物には、カルボニル基、ケトン基、アルデヒド基、ヒドラジン基、窒素を含んでいる複素環基などの複素環基、またはそれらの保護された形態もしくはマスキングされた形態のものを含んでいる非天然アミノ酸を、少なくとも１つ含有しているポリペプチドが含まれている。少なくとも１つの非天然アミノ酸をポリペプチドに導入することによって、例えば特に限定されないが、２０の一般的に生じるアミノ酸ではなく、１以上の非天然アミノ酸と特異的に化学反応する接合化学反応を適用することができる。組み込まれた後に、本明細書に記載の化学的方法を利用するか、または天然にコードされたアミノ酸に存在する特定の官能基もしくは置換基に適切な化学的方法を利用して、天然に生じないアミノ酸側鎖を修飾することもできる。
【０２２３】
本明細書に記載の非天然アミノ酸に関する方法および組成物は、多種多様な官能基、置換基または部分を有する物質と、例えば所望の官能基などの他の物質との接合体を提供する。
【０２２４】
特定の実施形態では、一般式Ｉ〜ＸＶの化合物および１〜４の化合物などの、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、リンカーおよび試薬は、弱酸性の環境下で（例えば、ｐＨ約１〜約６で）水溶液において安定である。別の実施形態では、この化合物は弱酸性の環境下で少なくとも１ヶ月安定している。別の実施形態では、この化合物は弱酸性の環境下で少なくとも２週間安定している。別の実施形態では、この化合物は弱酸性の環境下で少なくとも５日間安定している。
【０２２５】
本明細書に記載の組成物、方法、技術および方策の別の態様は、上記の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドの何れかを研究するか、または使用するための方法である。この態様には、例えば、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドもしくはタンパク質を含んでいるポリペプチドから利益を受ける、治療上の使用、診断上の使用、アッセイに基づく使用、産業上の使用、美容への使用、植物生物学的使用、環境への使用、エネルギー生産への使用、消費財への使用および／または軍事上の使用が含まれる。
【０２２６】
＜ＩＩＩ．ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の場所＞
本明細書に記載の方法および組成物は、１つ以上の非天然アミノ酸のポリペプチドへの組み込みを含んでいる。特定の実施形態では、１つ以上の非天然アミノ酸は、ポリペプチドの活性を阻害しない１つ以上の特定の位置に組み込まれる。このことは、「保存的」置換をすること、および／または、活性に必須ではない箇所に非天然アミノ酸を挿入することによって必要に応じて達成される。「保存的」置換としては、例えば、疎水性アミノ酸を非天然または天然の疎水性アミノ酸で置換する、かさ高いアミノ酸を非天然または天然のかさ高いアミノ酸で置換する、親水性アミノ酸を非天然または天然の親水性アミノ酸で置換するなどが挙げられるが、これらに限定されない。このような置換は、本明細書に記載の非天然アミノ酸に関連して公知ではないが、天然に生じるアミノ酸同士で保存的置換を行うことはすでに実証されている。本明細書に記載の非天然アミノ酸に対して、同様の手法が必要に応じて用いられる。
【０２２７】
非天然アミノ酸で置換されるポリペプチド内の所望の部位を選択するために、様々な生物学的手法および構造的手法を使用することができる。非天然アミノ酸が組み込まれるポリペプチド鎖の部位を選択する場合に、ポリペプチド鎖の任意の部位が適切である。このような選択は、必要に応じて合理的な設計に基づいているか、あるいは任意の目的または特に望まれていない目的のための無作為の選択に基づいている。任意の所望の性質または活性を有する非天然アミノ酸のポリペプチド（必要に応じてさらに修飾されるか、または修飾されないままである。）の製造に基づいて所望の部位が選択される。このような任意の所望の性質または活性の例としては、アゴニスト、スーパーアゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニスト、アンタゴニスト、受容体の結合を調節する物質、受容体の活性を調節する物質、結合パートナーに対する結合を調節する物質、結合パートナーの活性を調節する物質、結合パートナーの高次構造を調節する物質、二量体形成、多量体形成、本来の分子と比較して活性に対しても性質に対しても変化がないこと、またはポリペプチドの任意の物理的性質もしくは化学的性質（例えば、可溶性、凝集性、または安定性）を操作することなどが挙げられる。例えば、ポリペプチドの生物学的な活性に必要なポリペプチド内の位置は、当該分野において公知のポイントミューテーション分析、アラニンスキャニング法、または相同物スキャニング法などの方法を用いて同定されることができるが、これらに限定されない。例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発法、または相同物スキャニング突然変異誘発法などの方法によって、生物学的な活性に重要であると同定されたもの以外の残基は、ポリペプチドに求められる所望の活性次第ではあるが、非天然アミノ酸で置換される良い候補である。また、生物学的な活性に重要であると同定された部位は、この場合もやはりポリペプチドに求められる所望の活性次第ではあるが、非天然アミノ酸で置換される良い候補である。その他の方法としては、ポリペプチド鎖の各位置を非天然アミノ酸で連続的に置換し、ポリペプチドの活性に対する影響を観察するというものが挙げられる。非天然アミノ酸が任意のポリペプチドへ置換される位置を選択する任意の手段、技術、または方法が、本明細書に記載の方法、技術および組成物に好適に使用される。
【０２２８】
また、ポリペプチドの欠失を含んでいる天然に生じる突然変異体の構造および活性を調査して、非天然アミノ酸による置換に対して耐性があると思われるタンパク質の領域を決定することができる。非天然アミノ酸による置換に対して耐性がないと思われる残基が排除されると、残りの位置のそれぞれにおいて計画される置換の影響を、関連するポリペプチドおよび任意の会合するリガンドまたは任意の会合する結合タンパク質の、例えば３次元構造などを利用する方法を用いて調査することができる。多くのポリペプチドのＸ線結晶学的な構造およびＮＭＲの構造は、タンパク質および核酸の巨大分子の３次元構造データを含んでいる集中化されたデータベースであるProtein Data Bank （PDB，www.rcsb.org）から利用可能であり、そのうちの１つを、非天然アミノ酸で置換され得るアミノ酸の位置を同定するために用いることができる。また、３次元構造データが利用できない場合には、必要に応じてポリペプチドの２次構造および３次構造を調査することによって、モデルを作製する。このようにして、非天然アミノ酸で置換され得るアミノ酸の位置の同定は容易に行われる。
【０２２９】
非天然アミノ酸の組み込みの例示的な部位としては、（１）受容体に結合する可能性のある領域または結合タンパク質もしくはリガンドと結合する領域以外の部位、（２）完全にまたは部分的に溶媒に露出される部位、（３）近くの残基との水素結合に基づく相互作用がないか、または最小である部位、（４）近くの反応性残基に対して最小限で露出される部位、および／あるいは（５）特定のポリペプチドとそれが会合する受容体、リガンドまたはタンパク質との３次元結晶構造に基づいて予想される柔軟性が高い領域内である部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３０】
多種多様な非天然アミノ酸は、必要に応じて、ポリペプチド内の所定の位置で置換されるか、または所定の位置に組み込まれる。例えば、特定の非天然アミノ酸は、会合するリガンド、受容体および／または結合タンパク質を有するポリペプチドの３次元結晶構造の調査に基づいて組み込むことができるように選択される、即ち、保存的な置換ができるように選択されることが好ましい。
【０２３１】
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、第１反応基を含んでいる非天然アミノ酸をポリペプチドに組み込む工程、および第２反応基を含んでいる分子（所望の官能基が挙げられるが、これに限定されない。）とこのポリペプチドとを接触させる工程を含んでいる。ある種の実施形態では、第１反応基は、カルボニル部分であり、かつ第２反応基は、ヒドラジン部分である。これによって、インドール結合が形成される。ある種の実施形態では、第１反応基は、ヒドラジン部分であり、かつ第２反応基は、カルボニル部分である。これによって、インドール結合が形成される。
【０２３２】
いくつかの場合において、非天然アミノ酸の置換または組込みは、他の化学的性向、物理的性向、薬理学的性向、および／または生物学的性向に影響を与える、ポリペプチド内における他の付加、置換または欠失と組み合わせられる。いくつかの場合において、他の付加、置換または欠失は、ポリペプチドの安定性（例としては、タンパク質分解に対する耐性が挙げられるが、これに限定されない）を増強するか、あるいは適切な受容体、リガンドおよび／または結合タンパク質に対するポリペプチドの親和性を増強する。いくつかの場合において、他の付加、置換または欠失は、ポリペプチドの可溶性（Ｅ．  ｃｏｌｉまたは他の宿主細胞において発現される場合が例として挙げられるが、これに限定されない）を増強する。いくつかの実施形態では、天然にコードされるアミノ酸または非天然アミノ酸で置換するための部位が選択される上に、Ｅ．  ｃｏｌｉまたは他の組換え宿主細胞において発現した後のポリペプチドの可溶性を増強させるために、非天然アミノ酸を組み込む他の部位が選択される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、会合するリガンド、結合タンパク質および／または受容体分子に対する親和性を調節するか、受容体の二量体化を調節する（例えば特に限定されないが、受容体の二量体化を促進するか、または低減する。）か、受容体の二量体を安定化するか、循環半減期を調節するか、放出またはバイオアベイラビリティを調節するか、精製を容易にするか、あるいは投与の特定の経路を改善または変更するかの何れかである、他の付加、置換または欠失を含んでいる。同様に、非天然アミノ酸のポリペプチドは、化学的に切断される配列、酵素によって切断される配列、プロテアーゼ切断配列、反応性基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧまたはポリ−Ｈｉｓが挙げられるが、これらに限定されない。）、または検出（ＧＦＰが挙げられるが、これに限定されない。）、組織もしくは細胞膜を介する輸送、プロドラッグの放出もしくは活性化、サイズの低下、精製、あるいはポリペプチドの他の特徴の何れかを改善する、他の親和性に基づく配列（ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなどが挙げられるが、これらに限定されない。）または親和性に基づく結合分子（ビオチンが挙げられるが、これに限定されない。）を含んでいてもよい。
【０２３３】
＜ＩＶ．例としての成長ホルモンスーパーファミリー＞
本明細書に記載の方法、組成物、方策および技術は、ポリペプチドまたはタンパク質の特定の種類、分類またはファミリーに限定されない。実際に、ほとんどあらゆるポリペプチドが、本明細書に記載されている少なくとも１つの修飾された非天然アミノ酸、または修飾されていない非天然アミノ酸を含んでいるように、必要に応じて設計または修飾される。単なる一例として、このようなポリペプチドは、治療タンパク質と相同である。
【０２３４】
従って、成長ホルモン（ＧＨ）スーパーファミリーについての以下の記述は、説明を目的とし、しかも単なる一例として提供され、かつ本明細書に記載されている方法、組成物、方策および技術の範囲を制限するようなものではない。さらに、本出願におけるＧＨポリペプチドへの言及は、ＧＨスーパーファミリーの任意のメンバーの例として総称を使うことを意味する。従って、ＧＨポリペプチドまたはＧＨタンパク質に関して本明細書に記載されている修飾および化学反応が、本明細書に具体的に挙げられたものを包含する、ＧＨスーパーファミリーの任意のメンバーに等しく適用され得ることは、理解される。
【０２３５】
以下のタンパク質：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチン  Ｍ、繊毛状の神経栄養因子、白血病抑制因子、アルファ  インターフェロン、ベータ  インターフェロン、イプシロン  インタフェロン、ガンマ  インターフェロン、オメガ  インターフェロン、タウ  インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、およびカージオトロフィン−１（cardiotrophin-1）（ＣＴ−１）（「ＧＨスーパーファミリー」）は、成長ホルモン（ＧＨ）スーパーファミリーの遺伝子によってコードされるタンパク質を含んでいる（「Bazan、F.、Immunology Today 11: 350-354 (1990); Bazan、J. F. Science 257: 410-411 (1992); Mott、H. R. and Campbell、I. D.、Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)」、「Silvennoinen、O. and Ihle、J. N.、SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS (1996)」）。今後、遺伝子のクローニングおよび配列決定を経て、このような遺伝子ファミリーの更なるメンバーが同定されるであろうということが、予想される。ＧＨスーパーファミリーの各メンバーは、それらのアミノ酸配列またはＤＮＡ配列の同一性が通常、限られているにもかかわらず、類似した二次構造および三次構造を有する。共通の構造的特徴によって、遺伝子ファミリーの新しいメンバーを迅速に同定することができる。また、本明細書に記載される非天然アミノ酸に関する方法および組成物に対しても、このような共通の構造的特徴を同様に適用可能である。
【０２３６】
多くのサイトカイン（例としては、Ｇ−ＣＳＦ（「Zinkら、FEBS Lett.314:435 (1992); Zinkら、Biochemistry 33:8453 (1994); Hillら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5167 (1993)」）、ＧＭ−ＣＳＦ（「Diederichs、K.,ら Science 154: 1779-1782 (1991); Walterら、J. MoI. Biol. 224:1075-1085 (1992)」）、ＩＬ−２（「Bazan、J. F. and McKay、D. B. Science 257: 410-413 (1992)」）、ＩＬ−４（「Redfieldら、Biochemistry 30: 11029-11035 (1991); Powersら、Science 256:1673-1677 (1992)」）、およびＩＬ−５（「Milburnら、Nature 363: 172-176 (1993)」）が挙げられる）の構造は、Ｘ線回折およびＮＭＲ調査によって決定されている。そして、このような多くのサイトカインの構造は、有意な一次配列の相同性がないにもかかわらず、ＧＨ構造が顕著に保存されていることを示す。インターフェロンは、モデリングおよび他の研究（「Leeら、J. Interferon Cytokine Res. 15:341 (1995); Murgoloら、Proteins 17:62 (1993); Radhakrishnanら、Structure 4:1453 (1996); Klausら、J. MoI. Biol. 274:661 (1997) 」）に基づいて、このようなファミリーのメンバーであると考えられる。インターフェロン（ＩＮＦ）（例えば、アルファ、ベータ、オメガ、タウ、イプシロン、およびガンマ  インターフェロン）だけでなく、多数の更なるサイトカインおよび成長因子（例としては、繊毛状の神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、オンコスタチン  Ｍ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が挙げられる。）は、このようなファミリーに属する（「Mott and Campbell、Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen and Ihle (1996) SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS」において概説された）。現在、上記のサイトカインおよび成長因子のすべては、一つの大きい遺伝子ファミリーを構成すると考えられている。
【０２３７】
共有する類似した二次構造および三次構造に加えて、このようなファミリーのメンバーは、細胞内シグナル伝達経路を活性化するために、細胞表面受容体をオリゴマー化する必要があるという性質を共有している。ＧＨおよびＥＰＯなどが含まれるいくつかのＧＨファミリーのメンバーは、一種類の受容体に結合し、かつそれのホモ二量体を形成させる。ＩＬ−２、ＩＬ４、およびＩＬ−６などが含まれる他のファミリーのメンバーは、２種類以上の受容体に結合し、かつその受容体のヘテロ二量体またはそれよりも高次の集合体を形成させる（「Davisら、(1993) Science 260: 1805-1808; Paonessaら、(1995) EMBO J. 14: 1942-1951; Mott and Campbell、Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)」）。突然変異誘導法の研究は、ＧＨのように、これらの他のサイトカインおよび成長因子が複数（通常２つ）の受容体結合部位を含み、かつそれらの同種の受容体に連続的に結合することを示している（「Mott and Campbell、Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Matthewsら、(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9471-9476」）。ＧＨのように、これらの他のファミリーのメンバーにとって主要な受容体結合部位は、主として４つのアルファヘリックスおよびＡ−Ｂループに存在する。受容体結合に関与する、ヘリカルバンドルにおける特定のアミノ酸は、このようなファミリーのメンバー間で異なる。ＧＨスーパーファミリーのメンバーと相互作用する細胞表面受容体のほとんどは、構造的に関連し、かつ第２の大きな複数の遺伝子のファミリーを構成する。例えば、ＧＨスーパーファミリーの記載に関して参照することによって援用される米国特許出願第６，６０８，１８３号明細書を参照のこと。
【０２３８】
ＧＨスーパーファミリーの多様なメンバーの突然変異に関する研究から、通常、アルファヘリックスに結合したループが、受容体結合に関与しない傾向があるという一般的な結論が得られた。特に、短いＢ−Ｃループは、すべてではないがほとんどのファミリーのメンバーにおいて、受容体結合に必須ではないと思われる。従って、ＧＨスーパーファミリーの各メンバーにおいて、Ｂ−Ｃループは、本明細書に記載されているような非天然アミノ酸で必要に応じて置換される。また、Ａ−Ｂループ、Ｃ−Ｄループ（およびＧＨスーパーファミリーのインターフェロン／ＩＬ−１０のような一員のＤ−Ｅループ）は、非天然アミノ酸で必要に応じて置換される。また、ヘリックスＡに近接したアミノ酸および最後のヘリックスに遠位のアミノ酸は、受容体結合に関与しない傾向があるので、非天然アミノ酸を導入するための部位であってもよい。いくつかの実施形態では、ループ構造内の任意の場所（例えば、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ、またはＤ−Ｅループの最初の１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のアミノ酸）において、非天然アミノ酸は置換される。いくつかの実施形態では、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ、またはＤ−Ｅループの最後の１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のアミノ酸において、非天然アミノ酸は置換される。
【０２３９】
ＥＰＯ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２  ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、およびベータ  インターフェロンなどを包含するＧＨファミリーの特定のメンバーは、Ｎ−結合される糖および／またはＯ−結合される糖を含んでいる。このようなタンパク質内のグリコシル化部位は、ほぼ例外なくループ領域に生じ、かつアルファヘリックスバンドルには生じない。ループ部位は、一般的に受容体結合に関与せず、かつこの部位は糖類によって共有結合されるための部位であるので、この部位は、非天然アミノ酸の置換をこのようなタンパク質に導入するための有用な部位である。タンパク質内のＮ−結合されるグリコシル化部位およびＯ−結合されるグリコシル化部位を含んでいるアミノ酸は、これらのアミノ酸が表面に露出しているので、非天然アミノ酸で置換されるための部位である。このように、天然のタンパク質は、これらの部位においてタンパク質に付着する嵩高い糖類を許容し、かつグリコシル化部位は、受容体結合部位から離れて位置する傾向がある。
【０２４０】
今後、ＧＨ遺伝子ファミリーのさらなるメンバーが、おそらく発見されるであろう。ＧＨスーパーファミリーの新しいメンバーは、予想されるタンパク質配列をコンピュータを使って二次構造解析および三次構造解析することによって、ならびに特定の目標に対して結合する分子を同定するために作られた選択技術を用いることによって同定され得る。ＧＨスーパーファミリーのメンバーは、通常、非螺旋形のアミノ酸（ループ部位）によって結合される、４つまたは５つの両親媒性のヘリックスを有している。このようなタンパク質は、いくつかの実施形態において、細胞からの分泌を促進するために、このようなタンパク質のＮ末端に疎水性のシグナル配列を含んでいる。また上記のような後日発見されたＧＨスーパーファミリーのメンバーも、本明細書に記載の方法および組成物の中に含まれる。
【０２４１】
＜Ｖ．非天然アミノ酸＞
本明細書に記載の方法および組成物に用いられる非天然アミノ酸は、以下の４つの性質のうち少なくとも１つを有する：
（１）非天然アミノ酸の側鎖上における少なくとも１つの官能基が、遺伝的にコードされる２０の一般的なアミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）の化学反応性に対して直交な（orthogonal）、または非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドに存在する天然に生じるアミノ酸の化学反応性に対して少なくとも直交な、特性および／または活性および／または反応性の少なくとも１つを有する；（２）導入された非天然アミノ酸が、遺伝的にコードされた２０の一般的なアミノ酸に対して実質的に化学的に不活性である；（３）非天然アミノ酸は、（好ましくは天然に生じるアミノ酸と相応の安定性を有しているか、または典型的な生理的条件下において）ポリペプチドに安定に組み込むことができ、さらに好ましくはそのような組込みは、インビボの系によって実施され得る；ならびに（４）非天然アミノ酸は、カルボニル基、ケトン基、アルデヒド基、ヒドラジン基、窒素を含んでいる複素環基などの複素環基（インドール基を含んでいる）、または以下の官能基を含んでいる。即ち、この官能基は、試薬を用いた反応によって、カルボニル基、ケトン基、アルデヒド基、ヒドラジン基、または窒素を含んでいる複素環基などの複素環基（インドール基を含んでいる）に変換され得る官能基であり、このような変換は、好ましくは非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドの生物学的性質を破壊しない条件下において起こるか（もちろん、このような生物学的性質の破壊が修飾／変換の目的である場合を除く。）、好ましくはこのような変換はｐＨが約１〜約６である水性条件下において起こり得るか、あるいは好ましくはこのような変換では、非天然アミノ酸における反応部位が求核性部位である。本明細書に記載されている組成物および方法とともに使用され得る非天然アミノ酸に関する４つの性質を満たすアミノ酸の、例証的な非限定的な例が、図１５〜１８に示されている。あらゆる数の非天然アミノ酸が、ポリペプチドに導入され得る。
【０２４２】
ただし、図１５、１６および１８には置換炭素環式アリール側鎖を有するアミノ酸が示されているが、これらの図にはまた置換ヘテロアリール側鎖も開示されていることがわかるであろう。例えば、図１５の化合物はそれぞれ置換フェニル側鎖を有するが、いくつかの実施形態においては、フェニル基はピリジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、チオフラニル基、またはフラニル基に置換される。従って、炭素環式アリール側鎖は単に、本明細書の開示内容に含まれる数多くの芳香族基の具体例に過ぎない。
【０２４３】
非天然アミノ酸はまた、必要に応じて、カルボニル基、カルボニル基に変換され得る保護された基もしくはマスクキングされた基、保護された基が脱保護された後のカルボニル基、マスキングされた基がデマスキングされた後のカルボニル基、ヒドラジン基、またはヒドラジン基に変換され得る保護された基もしくはマスキングされた基を含んでいる。
【０２４４】
本明細書に記載されている方法および組成物に必要に応じて使用される非天然アミノ酸の例としては、光活性化可能な架橋剤を含んでいるアミノ酸、スピン標識したアミノ酸、蛍光性アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用するアミノ酸、フォトケージドアミノ酸および／または光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチンの類似体を含んでいるアミノ酸、糖鎖付加アミノ酸（例えば、糖置換されたセリン）、他の炭水化物を用いて修飾したアミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコールまたは他のポリエーテルを含んでいるアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学切断可能および／または光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比べて伸長した側鎖を有するアミノ酸（例としては、ポリエーテルまたは長鎖炭化水素（例としては、約５以上のまたは１０以上の炭素が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）、炭素に結合した糖含有アミノ酸、酸化還元活性のあるアミノ酸、アミノチオ酸を含んでいるアミノ酸、ならびに１つ以上の毒性部分を含んでいるアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、サッカライド部分を含んでいる。そのようなアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチルＬ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルＬ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルＬ−グルコサミニル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−アセチルＬ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン、およびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。また、そのようなアミノ酸の例としては、天然に生じるアミノ酸とサッカライドとの間におけるＮ−結合またはＯ−結合が、通常には天然に見られない共有結合（例としては、アルケン、オキシム、チオエーテル、アミド、窒素を含んでいる複素環などの複素環、カルボニルなどが挙げられるが、これに限定されない）によって置換されている例が挙げられる。そのようなアミノ酸の例はまた、天然に生じるタンパク質に通常は見られないサッカライド（例えば、２−デオキシ−グルコース、および２−デオキシガラクトースなど）を含んでいる。
【０２４６】
非天然アミノ酸を組み込むことによってポリペプチドに組み込まれる化学部分は、ポリペプチドに対する多様な利点および操作を提供する。例えば、ユニークな非天然アミノ酸（ベンゾフェノンおよびアリールアジド（フェニルアジド側鎖が挙げられるが、これに限定されない。）を有するアミノ酸が挙げられるが、これに限定されない。）は、例えば、インビボおよびインビトロにおけるタンパク質の効率的な光架橋を可能にする。光反応性非天然アミノ酸の例としては、ｐ−アジド−フェニルアラニンおよびｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。光反応性非天然アミノ酸を有するタンパク質はその後、必要に応じて光反応性基が供給する（photoreactive group-providing）一時的な制御の励起によって、自由自在に架橋される。１つの非限定的な例を挙げると、非天然アミノ酸のメチル基は、核磁気共鳴および振動分光法（例として挙げられるが、これらに限定されない。）を利用して、局所的な構造および動態のプローブとしての同位体標識されたメチル基（例として挙げられるが、これに限定されない。）で置換される。
‐Ａ．非天然アミノ酸（ヒドラジン基、ヒドラジン類似の基、マスキングされたヒドラジン基、および保護されたヒドラジン基）の構造および合成‐
ヒドラジン基を含んでいる非天然アミノ酸は、様々なカルボニル基およびカルボニル基に相当する基との反応を可能にし、インドール結合を介して接合体を形成する。従って、本明細書に記載の特定の実施形態では、ヒドラジン基、（反応性がヒドラジン基に類似し、構造面でもヒドラジン基に類似する）ヒドラジン基に類似する基、（容易にヒドラジン基に変換され得る）マスキングされたヒドラジン基または（脱保護された場合の反応性がヒドラジン基に類似する）保護されたヒドラジン基、を含んでいる側鎖を有する非天然アミノ酸が記載されている。このようなアミノ酸としては、一般式（Ｉ）：
【０２４７】
【化４】
2010512800.tif 000006
【０２４８】
で示される構造を有するアミノ酸が挙げられる。ここで、
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｊは、
【０２４９】
【化５】
2010512800.tif 000007
【０２５０】
であり；
Ｒは、Ｈ、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、カルボニル、または置換カルボニルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキルもしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３基およびＲ４基もしくは２つのＲ３基は必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成するか；あるいは、
−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ基はヒドラジン基、保護されたヒドラジン基、またはマスキングされたヒドラジン基を含んでいる二環式または三環式のシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成する。
構造Ｊにおいて、
【０２５１】
【化６】
2010512800.tif 000008
【０２５２】
が見られる場合、これはＪがどの位置においてもＢおよびＲと結合し得ることを意味する。非限定的な例として、Ｊがヒドラジンフェニル誘導体である場合、ＢおよびＪは必要に応じて下記に示すように環の周りに位置される。
【０２５３】
【化７】
2010512800.tif 000009
【０２５４】
さらに、環は必要に応じて置換されている。また、ヒドラジン基に隣接する置換基の少なくとも１つは水素である。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２５５】
一実施形態では、ＡおよびＢはともに結合であり、Ｒ３のそれぞれがＨであり、Ｒ４はＨである。さらなる実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ少なくとも１つのアミノ酸である。さらなる実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ少なくとも２つのアミノ酸である。さらなる実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ少なくとも３つのアミノ酸である。さらなる実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ少なくとも４つのアミノ酸である。さらなる実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ少なくとも５つのアミノ酸である。さらなる実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ少なくとも６つ(eix)のアミノ酸である。
【０２５６】
特定の実施形態では、一般式（Ｉ）で示される化合物は弱酸性の環境下で少なくとも１ヶ月水溶液において安定している。特定の実施形態では、一般式（Ｉ）で示される化合物は弱酸性の環境下で少なくとも２週間安定している。特定の実施形態では、一般式（Ｉ）で示される化合物は弱酸性の環境下で少なくとも５日間安定している。特定の実施形態では、酸性条件はｐＨが約２から約８である。
【０２５７】
さらに、一般式（ＩＩ）：
【０２５８】
【化８】
2010512800.tif 000010
【０２５９】
で示される構造を有するアミノ酸が挙げられる。ここで、
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、＝Ｎ−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４は独立して、水素およびアミン保護基から成る群より選択され、
アミン保護基は、特に限定されないが、
【０２６０】
【化９】
2010512800.tif 000011
【０２６１】
を包含し；
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−、ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルである。
このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２６２】
一実施形態では、ＡおよびＢは共に結合である。さらなる実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ少なくとも１つのアミノ酸である。さらなる実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ少なくとも２つのアミノ酸である。さらなる実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ少なくとも３つのアミノ酸である。さらなる実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ少なくとも４つのアミノ酸である。さらなる実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ少なくとも５つのアミノ酸である。さらなる実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ少なくとも６つ（eix）のアミノ酸である。
【０２６３】
さらに、一般式（ＩＩＩ）：
【０２６４】
【化１０】
2010512800.tif 000012
【０２６５】
で示される構造を有するアミノ酸が挙げられる。ここで、Ｂはに、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４は独立して、水素およびアミン保護基から成る群より選択され、
アミン保護基は、特に限定されないが、
【０２６６】
【化１１】
2010512800.tif 000013
【０２６７】
が挙げられ；
Ｒａは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−、ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであり；
ｎは０〜８である。
このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２６８】
さらに別の実施形態では、
【０２６９】
【化１２】
2010512800.tif 000014
【０２７０】
で示される構造を有する一般式（ＩＩ）で示される化合物が挙げられる。
ここで、ｎ＋ｍが１、２、３、４または５である場合に、ｎは０、１、２、３または４であり、ｍは０、１、２、３または４であり、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して結合、ＯまたはＮＨであり、ｙは０または１である。
【０２７１】
また、下記のアミノ酸が挙げられる。
【０２７２】
【化１３】
2010512800.tif 000015
【０２７３】
ここで、このような化合物は必要に応じて、アミノ保護されているか、カルボキシル保護されていているか、その塩であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２７４】
さらに、一般式（ＩＶ）：
【０２７５】
【化１４】
2010512800.tif 000016
【０２７６】
で示される構造を有するアミノ酸が挙げられる。
ここで、Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４は独立して、水素およびアミン保護基から成る群より選択され、
アミン保護基は、特に限定されないが、
【０２７７】
【化１５】
2010512800.tif 000017
【０２７８】
を包含し；
Ｒａは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−、ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２または３である。）から成る群より選択され、Ｒ’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルである。
このような非天然アミノ酸は、必要に応じてその塩の形態であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２７９】
また、下記のアミノ酸が挙げられる。
【０２８０】
【化１６】
2010512800.tif 000018
【０２８１】
ここで、このような化合物は必要に応じてアミノ保護されているか、必要に応じてカルボキシル保護されているか、必要に応じてアミノ保護およびカルボキシル保護されているか、その塩であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれていているか、あるいは翻訳後修飾されている。
【０２８２】
‐Ｂ．非天然アミノ酸（カルボニル基、カルボニル基に類似の基、マスキングされたカルボニル基、および保護されたカルボニル基）の構造および合成‐
求電子性の反応性基を有するアミノ酸は様々な反応を可能にし、例えば求核付加反応などの様々な化学反応を介して分子同士を結びつける。このような求電子性の反応性基としては、（例えばケト基、アルデヒド基などの）カルボニル基、（反応性がカルボニル基に類似し、構造面でもカルボニル基に類似する）カルボニルに類似の基、（容易にカルボニル基に変換され得る）マスキングされたカルボニル基、または（脱保護された場合の反応性がカルボニル基に類似する）保護されたカルボニル基が挙げられる。このようなアミノ酸としては、一般式（Ｖ）：
【０２８３】
【化１７】
2010512800.tif 000019
【０２８４】
で示される構造を有するアミノ酸が挙げられる。ここで、
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｊは、
【０２８５】
【化１８】
2010512800.tif 000020
【０２８６】
であり；
ＲはＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキルまたは置換シクロアルキルであり；
Ｒ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、置換アルキルもしくは保護基であるか、または２つ以上のＲ’’基が存在するときに、２つのＲ’’は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；ならびに、
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４もしくは２つのＲ３基は必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成するか；あるいは、
−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ基は、ジカルボニル基を包含するカルボニル基、保護されたジカルボニル基を包含する保護されたカルボニル基、またはマスキングされたジカルボニル基を包含するマスキングされたカルボニル基を、少なくとも１つ含んでいる二環式または三環式のシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成するか；あるいは、
−Ｊ−Ｒ基は、ジカルボニル基を包含するカルボニル基、保護されたジカルボニル基を包含する保護されたカルボニル基、またはマスキングされたジカルボニル基を包含するマスキングされたカルボニル基を、少なくとも１つ含んでいる単環式または二環式シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成する；
ただし、Ａがフェニレンであり、Ｒ３がそれぞれＨであるときに、Ｂが存在し；Ａが−（ＣＨ２）４−であり、Ｒ３がそれぞれＨであるときに、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）ではなく；ＡもＢも存在せず、Ｒ３がそれぞれＨであるときに、Ｒはメチルではない。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２８７】
特定の実施形態では、一般式（Ｖ）で示される化合物は弱酸性の環境下で少なくとも１ヶ月間水溶液中において安定している。特定の実施形態では、一般式（Ｖ）で示される化合物は弱酸性の環境下で少なくとも２週間安定している。特定の実施形態では、一般式（Ｖ）で示される化合物は弱酸性の環境下で少なくとも５日間安定している。特定の実施形態では、酸性条件はｐＨが約２〜約８である。
【０２８８】
一般式（Ｖ）で示される化合物に係る特定の実施形態では、Ｂは低級アルキレン、置換低級アルキレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）（アルキレンまたは置換アルキレン）−、または−Ｓ（Ｏ）２（アルキレンまたは置換アルキレン）−である。一般式（Ｉ）で示される化合物に係る特定の実施形態では、Ｂは−Ｏ（ＣＨ２）−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−、−ＮＨＣＨ２−、−ＮＨＣＯ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）−、−ＳＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）ＣＨ２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＣＨ２−である。一般式（Ｖ）で示される化合物に係る特定の実施形態では、Ｒは炭素数が１〜６のアルキルまたはシクロアルキルである。一般式（Ｖ）で示される化合物に係る特定の実施形態では、Ｒは−ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、またはシクロプロピルである。一般式（Ｖ）で示される化合物に係る特定の実施形態では、Ｒ１はＨ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、Ｎ−アセチル、テトラフルオロアセチル（ＴＦＡ）、またはベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。一般式（Ｖ）で示される化合物に係る特定の実施形態では、Ｒ１は樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである。一般式（Ｖ）で示される化合物に係る特定の実施形態では、Ｒ２はＯＨ、Ｏ−メチル、Ｏ−エチル、またはＯ−ｔ−ブチルである。一般式（Ｖ）で示される化合物に係る特定の実施形態では、Ｒ２は樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである。一般式（Ｖ）で示される化合物に係る特定の実施形態では、Ｒ２はポリヌクレオチドである。一般式（Ｖ）で示される化合物に係る特定の実施形態では、Ｒ２はリボ核酸（ＲＮＡ）である。一般式（Ｖ）で示される化合物に係る特定の実施形態では、Ｒ２はｔＲＮＡである。一般式（Ｖ）で示される化合物に係る特定の実施形態では、ｔＲＮＡはセレクターコドンを特異的に認識する。一般式（Ｖ）で示される化合物に係る特定の実施形態では、セレクターコドンはアンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、非天然コドン、５塩基コドンおよび４塩基コドンから成る群より選択される。一般式（Ｖ）で示される化合物に係る特定の実施形態では、Ｒ２はサプレッサーｔＲＮＡである。
【０２８９】
一般式（Ｖ）で示される化合物に係る特定の実施形態では、
【０２９０】
【化１９】
2010512800.tif 000021
【０２９１】
は以下の（ｉ）〜（ｉｖ）から成る群より選択されるものであり：
（ｉ）Ａは置換低級アルキレン、炭素数４のアリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）Ｎ（Ｒ’）−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択される二価のリンカーである；
（ｉｉ）Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、置換低級アルキレン、炭素数４のアリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）Ｎ（Ｒ’）−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択される二価のリンカーである；
（ｉｉｉ）Ａは低級アルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−から成る群より選択される二価のリンカーである；ならびに、
（ｉｖ）Ａはフェニレンであり；
Ｂは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−から成る群より選択される二価のリンカーである；
さらに、Ｊは、
【０２９２】
【化２０】
2010512800.tif 000022
【０２９３】
であり；
Ｒ’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであり；
Ｒ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、置換アルキルまたは保護基、もしくは、１つを超える数のＲ’’基が存在する場合、２つのＲ’’がヘテロシクロアルキルを形成してもよく；
Ｒ１は必要に応じて存在し、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は必要に応じて存在し、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキルもしくは置換低級アルキルであり；
Ｒ’はＨ、アルキル、または置換アルキルであり；
ＲはＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであるか；あるいは、
−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ基は少なくとも１つのカルボニルを含んでいる二環式または三環式のシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成する。
【０２９４】
また、一般式（ＶＩ）：
【０２９５】
【化２１】
2010512800.tif 000023
【０２９６】
で示される構造を有するアミノ酸が挙げられる。
ここで、Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
ＲはＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキルまたは置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；ならびに、
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
ただし、Ａがフェニレンであるときに、Ｂが存在し；Ａが−（ＣＨ２）４−であるとき、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）ではなく；ＡもＢも存在しないときに、Ｒはメチルではない。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０２９７】
また、一般式（ＶＩＩ）：
【０２９８】
【化２２】
2010512800.tif 000024
【０２９９】
で示される構造を有するアミノ酸が挙げられる。
ここで、Ｂは低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
ＲはＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキルまたは置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒａは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＮＯ２、ＣＮ、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−、ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであるか；あるいは、少なくとも２つのＲａが複素環、ヘテロアリール、またはアリールを形成する。
このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０３００】
また、以下のアミノ酸が挙げられる。
【０３０１】
【化２３】
2010512800.tif 000025
【０３０２】
このような非天然アミノ酸は、必要に応じてアミノ保護されており、カルボキシル保護されており、および／または塩の形態であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれていているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０３０３】
また、一般式（ＶＩＩＩ）：
【０３０４】
【化２４】
2010512800.tif 000026
【０３０５】
で示される構造を有するアミノ酸が挙げられる。
ここで、Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
ＲはＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキルまたは置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；ならびに、
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒａは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−、ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであり；ｎは０〜８であり；
ただし、Ａが−（ＣＨ２）４−であるとき、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）ではない。このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０３０６】
また、以下のアミノ酸が含まれる。
【０３０７】
【化２５】
2010512800.tif 000027
【０３０８】
ここで、このような化合物は必要に応じてアミノ保護されているか、必要に応じてカルボキシル保護されているか、必要に応じてアミノ保護およびカルボキシル保護されているか、その塩であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０３０９】
また、一般式（ＩＸ）：
【０３１０】
【化２６】
2010512800.tif 000028
【０３１１】
で示される構造を有するアミノ酸が含まれる。ここで、
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
ＹおよびＺは、−ＯＨ、アルキルで置換された酸素、−ＳＨおよびアルキルで置換された硫黄から成る群より独立して選択され、ＹおよびＺは一緒になって、シクロアルキル環を形成することができる。
【０３１２】
このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０３１３】
また、一般式（Ｘ）：
【０３１４】
【化２７】
2010512800.tif 000029
【０３１５】
で示される構造を有するアミノ酸が挙げられる。ここで、
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒａは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−、ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであり；もしくは少なくとも２つのＲａが複素環、ヘテロアリール、またはアリールを形成し；
ＹおよびＺは、−ＯＨ、アルキルで置換された酸素、−ＳＨ、およびアルキルで置換された硫黄から成る群より独立して選択され、ＹおよびＺは一緒になって、シクロアルキル環を形成することができる。
このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０３１６】
また、以下のアミノ酸が挙げられる。
【０３１７】
【化２８】
2010512800.tif 000030
【０３１８】
ここで、このような化合物は必要に応じてアミノ保護されているか、必要に応じてカルボキシル保護されているか、必要に応じてアミノ保護およびカルボキシル保護されているか、その塩であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれていているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０３１９】
また、一般式（ＸＩ）：
【０３２０】
【化２９】
2010512800.tif 000031
【０３２１】
で示される構造を有するアミノ酸が含まれる。ここで、
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
ＲはＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒａは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−、ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであり；もしくは少なくとも２つのＲａが複素環、ヘテロアリール、またはアリールを形成し；
ＹはＯＲ’’、ＮＲ’’Ｒ’’、およびＮＣ（Ｏ）Ｒ’’から成る群より独立して選択され、Ｒ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルである。
このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０３２２】
また、以下のアミノ酸が挙げられる。
【０３２３】
【化３０】
2010512800.tif 000032
【０３２４】
このような化合物は必要に応じてアミノ保護されているか、必要に応じてカルボキシル保護されているか、必要に応じてアミノ保護およびカルボキシル保護されているか、その塩であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれていているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０３２５】
また、一般式（ＸＩＩ）：
【０３２６】
【化３１】
2010512800.tif 000033
【０３２７】
で示される構造を有するアミノ酸が挙げられる。ここで、
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒａは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−、ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであるか；あるいは少なくとも２つのＲａが複素環、ヘテロアリール、またはアリールを形成し；
Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、アルキル、置換アルキル、Ｎ（Ｒ’）２、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’であり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであり；
ＸはＣ、Ｎ、ＯまたはＳであり；ただし、ＸがＯまたはＳのとき、Ｒ４はＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、アルキル、置換アルキル、Ｎ（Ｒ’）２、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、およびｋが１、２または３である−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’ではあり得ず；ｎは０、１または２である。
【０３２８】
また、以下のアミノ酸が挙げられる。
【０３２９】
【化３２】
2010512800.tif 000034
【０３３０】
このような化合物は必要に応じてアミノ保護されているか、必要に応じてカルボキシル保護されているか、必要に応じてアミノ保護およびカルボキシル保護されているか、その塩であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０３３１】
また、一般式（ＸＩＩＩ）：
【０３３２】
【化３３】
2010512800.tif 000035
【０３３３】
で示される構造を有するアミノ酸が含まれる。ここで、
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒａは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−、ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであり；ならびにｎは０〜８であり；
ＹおよびＺは、−ＯＨ、アルキルで置換された酸素、−ＳＨ、およびアルキルで置換された硫黄から成る群より独立して選択され、ＹおよびＺは一緒になって、シクロアルキル環を形成することができる。
このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０３３４】
また、以下のアミノ酸が挙げられる。
【０３３５】
【化３４】
2010512800.tif 000036
【０３３６】
このような化合物は必要に応じてアミノ保護されているか、必要に応じてカルボキシル保護されているか、必要に応じてアミノ保護およびカルボキシル保護されているか、その塩であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０３３７】
また、一般式（ＸＩＶ）：
【０３３８】
【化３５】
2010512800.tif 000037
【０３３９】
で示される構造を有するアミノ酸が含まれる。ここで、
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
ＲはＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒａは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２−、ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルであり；ならびにｎは０〜８であり；
ＹはＯＲ’’、ＮＲ’’Ｒ’’、およびＮＣ（Ｏ）Ｒ’’から成る群より独立して選択され、Ｒ’’はそれぞれ独立してＨ、アルキル、または置換アルキルである。
このような非天然アミノ酸は、必要に応じて塩の形態であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０３４０】
また、以下のアミノ酸が挙げられる。
【０３４１】
【化３６】
2010512800.tif 000038
【０３４２】
このような化合物は必要に応じてアミノ保護されているか、必要に応じてカルボキシル保護されているか、必要に応じてアミノ保護およびカルボキシル保護されているか、その塩であるか、非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライドまたはポリヌクレオチドに組み込まれているか、あるいは必要に応じて翻訳後修飾されている。
【０３４３】
-Ｃ：インドリル官能基を含んでいる非天然アミノ酸-
インドリル基を含んでいる非天然アミノ酸は、ヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸とカルボニル基を含んでいる試薬とを反応させるか、あるいは、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸とヒドラジン基を含んでいる試薬とを反応させることによって生成される。この反応は、フィッシャーのインドール合成（Fisher indole synthesis）と呼ばれている。この反応は、今まで、強酸および／または金属イオン促進剤が存在する非常に過酷な条件下において、あるいは有機溶媒の還流下において実施されてきた。図２は、アリールヒドラジンの化合物とカルボニルの化合物とによってアリールヒドラゾンの中間体が形成され、続いて、［３，３］シグマトロピー転位が生じた後に、アンモニアが除去されることによってインドール生成物が形成される反応のメカニズムを説明する図である。
【０３４４】
一実施形態では、カルボニルとアリールヒドラジンとの反応は、室温の水性の緩衝液中にて実施される。別の実施形態では、カルボニルとアリールヒドラジンとの反応は、約１〜約６のｐＨおよび約２〜約４のｐＨにおいて起こる。また、ヒドラゾン中間体の形成および転位を異なるｐＨにて実施してインドールを形成することによって、この反応は促進される。一実施形態では、ヒドラゾン中間体の形成はｐＨ５で実現される。別の実施形態では、転位工程はｐＨ１で実施される。図３〜６、８〜１１はフィッシャーのインドール合成におけるｐＨの影響を説明する図である。
【０３４５】
ある種の実施形態では、インドール生成物の生成速度を速めるために金属イオンが用いられる。図１２は、インドール生成物の生成速度を速める効果のある金属イオンの例を示す図であるが、金属イオンはこれに限定されない。別の実施形態では、反応環境下における有機溶媒の量が、インドール生成物の生成速度に影響を与える。図１４は、溶媒がインドール生成物の生成速度に与える影響を説明する図である。
【０３４６】
この反応に用いられた試薬は、必要に応じて所望の官能基とさらに連結される。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸がポリペプチドに組み込まれ、次いで、適切な試薬と反応させられることによって、このポリペプチドと興味のある分子との間に接合体が形成される。
【０３４７】
このようなアミノ酸としては、一般式（ＸＶ）：
【０３４８】
【化３７】
2010512800.tif 000039
【０３４９】
で示される構造を有するアミノ酸が挙げられる。ここで、
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２、または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、もしくは置換アルキルであり；
Ｊは、
【０３５０】
【化３８】
2010512800.tif 000040
【０３５１】
であり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキルもしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３基およびＲ４もしくは２つのＲ３基は必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ５はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、ＣＮ、ＮＯ２、―（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’’、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２であり、
Ｒ’’はそれぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、またはＬ−Ｙであるか、あるいは、
２つ以上のＲ’’基が存在するときに、２つのＲ’’は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルを形成し；
２つ以上のＲ５基が存在するときに、２つのＲ５は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルまたは芳香族ヘテロシクロアルキルを形成し；
ｎは０、１、２、または３であり、ｍは０、１、２、または３であり、ｎおよびｍの少なくとも１つは０ではなく；
Ｒａ基に結合される構造１、２、３および４のそれぞれの環は、０、１、または２のＲａ基を含んでいることができ、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであるか；あるいは、
２つ以上のＲａ基が存在するときに、２つのＲａは必要に応じて、アリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｙは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性のある化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団；金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素に結合した糖；酸化還元活性のある剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギーを伝達する剤；生物学的に活性な剤（この場合、生物学的に活性な剤としては、治療活性を有する剤が挙げられ、非天然アミノ酸のポリペプチドまたは修飾された非天然アミノ酸は付着された治療剤とともに共治療剤（cotherapeutic agent）として機能するか、付着された治療剤を生物内の所望の部位に送達する手段として機能する。）；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体の活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、およびこれらの任意の組合せから成る群より選択され；
Ｌは必要に応じて存在し、存在する場合に、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであるか：あるいは、
−Ａ−Ｂ−Ｊ基は一緒になって、インドール部分を含んでいる二環式または三環式のシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成する。
【０３５２】
一実施形態では、Ｙは、水溶性ポリマー；ポリアルキレンオキシド；ポリエチレングリコール；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；少なくとも１つのアミノ酸；少なくとも１つの糖類（sugar group）；少なくとも１つのヌクレオチド；少なくとも１つのヌクレオシド；リガンド；ビオチン；ビオチンの類似体；検出可能な標識；およびこれらの任意の組合せから成る群より選択される。
【０３５３】
さらなる実施形態では、本明細書に記載の化合物は、化合物１〜４：
【０３５４】
【化３９】
2010512800.tif 000041
【０３５５】
で示される構造を有し、
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、一方の末端においてインドールを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、
このリンカーは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
ｎは０、１、２または３であり、ｍは０、１、２または３であり、ｎおよびｍの少なくとも１つは０ではなく；
Ｒａ基に結合される構造１、２、３および４のそれぞれの環は、０、１つまたは２つのＲａ基を含んでいることができ、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであるか；あるいは、
２つ以上のＲａ基が存在するときに、２つのＲａは必要に応じて、アリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキルもしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３基およびＲ４基または２つのＲ３基は必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ５はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＮＯ２、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’’、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２であり、
Ｒ’’はそれぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルであるか、または、
２つ以上のＲ’’基が存在するときに、２つのＲ’’は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルを形成するか；あるいは、
Ｒ５はＬ−Ｘであり、
Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性のある化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体；抗体もしくは抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素に結合した糖；酸化還元活性のある剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギーを伝達する剤；生物学的に活性な剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体の活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、およびこれらの任意の組合せから成る群より選択され；
Ｌは必要に応じて存在し、存在する場合に、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
２つ以上のＲ５が存在するときに、２つのオルトＲ５基は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルまたは芳香族ヘテロシクロアルキルを形成することができるか；あるいは、
−Ｂ−インドールを含んでいる部分は一緒になって、少なくとも１つのインドール部分を含んでいる二環式または三環式のシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成する化合物、またはその活性のある代謝産物、塩、薬学的に許容可能なプロドラッグ、もしくは溶媒和物である。
【０３５６】
一実施形態では、Ｘは、水溶性ポリマー；ポリアルキレンオキシド；ポリエチレングリコール；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；少なくとも１つのアミノ酸；少なくとも１つの糖類；少なくとも１つのヌクレオチド；少なくとも１つのヌクレオシド；リガンド；ビオチン；ビオチンの類似体；検出可能な標識；およびこれらの任意の組合せから成る群より選択される。
【０３５７】
さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ａが結合、置換または非置換の低級アルキレン、あるいはフェニレン、ピリジニレン、ピリミジニレンおよびチオフェニレンから成る群より選択される非置換または置換のアリーレンである。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ａが結合である。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ａが置換または非置換の低級ヘテロアルキレンである。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ａがフェニレンである。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ａが置換低級ヘテロアルキレンであり、置換基は＝Ｏ基１つである。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ａが置換低級アルキレンであり、置換基は＝Ｏ基１つである。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｂが結合、低級アルキレン、置換低級アルキレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’’）ＣＯ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）（アルキレンまたは置換アルキレン）−、または−Ｓ（Ｏ）２（アルキレンまたは置換アルキレン）−である。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｂが結合である。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｂが−Ｏ（ＣＨ２）−、−ＮＨＣＨ２−、−ＮＨＣＯ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）−、−ＳＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）ＣＨ２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＣＨ２−である。いくつかの実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｒ５が−ＯＨ、−ＮＨ２またはＮＯ２である。別の実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｒ１がＨ、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、Ｎ−アセチル、テトラフルオロアセチル（ＴＦＡ）またはベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｒ１が樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである。別の実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｒ２がＯＨ、Ｏ−メチル、Ｏ−エチル、またはＯ−ｔ−ブチルである。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｒ２が樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｒ２がポリヌクレオチドである。別の実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｒ２がリボ核酸（ＲＮＡ）である。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｒ２がｔＲＮＡである。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、このｔＲＮＡはセレクターコドンを特異的に認識するものである。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、セレクターコドンはアンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、非天然コドン、５塩基コドンおよび４塩基コドンから成る群より選択される。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｒ２はサプレッサーｔＲＮＡである。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｘはペプチド、タンパク質、酵素、抗体、薬物、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子、およびミセルから成る群より選択される生物学的に活性な剤である。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｘは抗生物質、殺菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心・血管作動薬、抗不安剤、ホルモン、成長因子、およびステロイド剤から成る群より選択される薬物である。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｘはホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼから成る群より選択される酵素である。別の実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｘは蛍光性部分、燐光性部分、化学発光性部分、キレート化部分、電子密度の高い部分、磁性部分、インターカレートする部分、放射性部分、発色性部分、およびエネルギーを伝達する部分から成る群より選択される検出可能な標識である。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、Ｘはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、または置換アラルキルを含んでいるポリマーである。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、このポリマーは、ポリアルキレンオキシドまたは置換ポリアルキレンオキシドを含んでいる。別の実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、このポリマーは、−［（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−（水素、アルキルまたは置換アルキル）］ｘを含んでおり、ｘは２０〜１０，０００である。さらなる実施形態では、化合物１〜４で示される構造を有する化合物において、ポリマーは、約２〜約４０ＫＤａの分子量を有するｍ−ＰＥＧである。ある種の実施形態では、一般式（ＸＶ）で示される化合物は、弱酸性の条件下において、水溶液中で少なくとも１ヶ月間安定している。ある種の実施形態では、一般式（ＸＶ）で示される化合物は、弱酸性の条件下において少なくとも２週間安定している。ある種の実施形態では、一般式（ＸＶ���で示される化合物は、弱酸性の条件下において少なくとも５日間は安定している。ある種の実施形態では、この弱酸性の条件は、約２〜約８のｐＨである。
【０３５８】
このようなアミノ酸としては、以下構造：
【０３５９】
【化４０】
2010512800.tif 000042
【０３６０】
を含んでいるアミノ酸；またはこれらの塩；またはこれらの化合物を任意の位置に組み込んでいるポリペプチドが挙げられるが、これらに特に限定されない。このような非天然アミノ酸は必要に応じて塩の形態であるか、あるいは非天然アミノ酸のポリペプチド、ポリマー、ポリサッカライド、またはポリヌクレチドに組み込まれ、必要に応じて翻訳後修飾される。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、構造５〜８：
【０３６２】
【化４１】
2010512800.tif 000043
【０３６３】
を有し、
ｎは０、１、２または３であり、ｍは０、１、２または３であり、ｎおよびｍの少なくとも１つが０ではなく；
Ｒａに結合される構造５〜８の環のそれぞれは、０、１または２のＲａ基を含んでいることができ、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであるか；あるいは、
２つ以上のＲａ基が存在するときに、２つのＲａが必要に応じてアリール、シクロアリールまたはヘテロシクロアリールを形成する化合物である。
【０３６４】
別の実施形態では、本明細書に記載の化合物は、構造９〜１２：
【０３６５】
【化４２】
2010512800.tif 000044
【０３６６】
を有する化合物であり、
ここで、ｎは０、１、２、３または４であり；ｍは０、１、２、３または４であり、ｎ＋ｍは１、２、３、４または５であり；Ｘ１およびＸ２は独立して、結合、Ｏ、またはＮＨであり；ｙは０または１である。
【０３６７】
さらなる実施形態では、
【０３６８】
【化４３】
2010512800.tif 000045
【０３６９】
から成る群より選択される化合物、またはこれらの塩；またはこれらの化合物の何れかを任意の位置に組み込んでいるポリペプチドである。
【０３７０】
−Ｃ．非天然アミノ酸の細胞の取り込み−
真核細胞による非天然アミノ酸の取込みは、タンパク質へ組み込まれる（例として挙げられるが、これに限定されない。）ための非天然アミノ酸を設計および選択する上で考慮される１つの課題である。例えば、α−アミノ酸は、電荷密度が高いために、細胞透過性ではないかもしれないことを示唆する。天然アミノ酸は、タンパク質を基本とする輸送系の収集を介して真核細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が少しでも細胞によって取り込まれるならば、これを評価する急速なスクリーニングを実施することができる。例えば、参照によってその全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２００４／１９８６３７号明細書（発明の名称「Protein Arrays」）、および「Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785 」に記載の毒性アッセイなどを参照のこと。取込みは、多様なアッセイを用いて容易に分析されるが、細胞の取込み経路に受け容れられる非天然アミノ酸を設計するための代替案は、インビボにおいてアミノ酸を作り出す生合成経路を提供することである。
【０３７１】
典型的に、本明細書に記載されている細胞の取込みに基づく非天然アミノ酸の生成は、タンパク質の効率的な生合成に十分な濃度（例としては、天然の細胞における量があげられるが、これに限定されない）でなされるが、他のアミノ酸の濃度に影響するか、または細胞の資源を使い果たす程ではない。このような方法で生成される典型的な濃度は約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。
【０３７２】
−Ｄ．非天然アミノ酸の生合成−
多くの生合成経路が、アミノ酸および他の化合物を生成するために細胞にすでに存在している。特定の非天然アミノ酸用の生合成方法は、天然に（例としては、細胞内が挙げられるが、これに限定されない）は存在し得ないが、本明細書に記載の方法および組成物は、そのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸用の生合成経路は、新しい酵素の添加、または存在する宿主細胞経路の修飾によって宿主細胞において必要に応じて生成される。追加の新しい酵素は、必要に応じて天然に生じる酵素または人工的に進化させた酵素である。例えば、ｐ‐アミノフェニルアラニンの生合成（国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレット（発明の名称「In vivo incorporation of unnatural amino acids」）の実施例に示されている）は、他の生物に由来する公知の酵素の組合せの追加を基にしている。これらの酵素に関する遺伝子は、これらの遺伝子を含んでいるプラスミドを用いて細胞を形質転換することによって真核細胞に導入され得る。細胞に発現した場合に、このような遺伝子は、所望の化合物を合成する酵素経路を提供する。必要に応じて追加されるこの種の酵素の例は本明細書に記載されている。追加の酵素の配列は、例えば、ジーンバンクに見出される。また、人工的に進化させた酵素は、同様の方法を用いて細胞内に必要に応じて加えられる。このようにして、細胞および細胞の資源は、非天然アミノ酸を生成するように操作される。
【０３７３】
種々の方法が、生合成経路に使用するための、または存在する経路を進化させるための新規な酵素の生成に利用可能である。例えば、Maxygen, Incなどによって開発されたような反復的な組換え.(www.maxigen.comにおけるワールドワイドウェブ上において購入可能である)は、新規の酵素および経路の開発に必要に応じて使用される。例えば、「Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389- 391」、および「Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751」を参照のこと。同様に、Genencorによって開発されたDesignPath（登録商標）（genencor.comにおけるワールドワイドウェブ上において購入可能である）は、代謝経路の設計（細胞に内おいて非天然アミノ酸を作り出す経路の設計が挙げられるが、これに限定されない。）に必要に応じて使用される。この技術は、新しい遺伝子の組合せ（ゲノム機能解析によって同定された遺伝子が挙げられるが、これに限定されない。）、ならびに分子進化および分子設計を用いて、宿主生物に存在する経路をリコンストラクションする。また、Diversa Corporationは、新しい経路を作り出すための（例として挙げられるが、これに限定されない。）、遺伝子および遺伝子経路のライブラリーを迅速にスクリーニングする技術を提供する（diversa.comにおけるワールドワイドウェブ上において購入可能である。）。
【０３７４】
典型的に、本明細書に記載されている設計された生合成経路を用いて生成された非天然アミノ酸は、タンパク質の効率的な生合成に十分な濃度（例としては、天然の細胞における量が挙げられるが、これに限定されない。）で生成されるが、他のアミノ酸の濃度に影響する、または細胞の資源を使い果たす程ではない。この方法においてインビボにおいて生成される通常の濃度は、約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特定の経路に関して所望される酵素の生成に使用される遺伝子を含んでいるプラスミドを用いて、細胞が形質転換され、非天然アミノ酸が生成される場合に、インビボにおける選択を必要に応じて使用して、リボソームタンパク質の合成および細胞増殖の両方について非天然アミノ酸の生成をさらに最適化する。
【０３７５】
−Ｅ．その他の合成方法論−
本明細書に記載されている非天然アミノ酸は、実証されている方法論を用いて、または本明細書に記載されている技術を用いて、あるいはこれらの組合せによって合成され得る。補足として、所望の官能基を作り出すために組み合わせられ得る、多様な出発物質となる求電子試薬および求核試薬を提供する表を以下に示す。なお、与えられる情報は例示的であり、かつ本明細書に記載されている合成技術を制限するものではないことを意図されている。
【０３７６】
【表１】
2010512800.tif 000046
【０３７７】
一般的に、炭素求電子試薬は、相補的な求核試薬（例としては、炭素求核試薬が挙げられる）による作用に影響を受けやすい。ここで、作用する求核試薬は、求核試薬と求電子試薬との間に新しい結合を形成するために炭素求電子試薬に対して電子対をもたらすものである。
【０３７８】
適切な炭素求核試薬の例としては、アルキルのグリニャール試薬（Grignard）、アルケニルのグリニャール試薬、アリールのグリニャール試薬、アルキニルのグリニャール、有機リチウム、有機亜鉛、アルキル−スズ試薬、アルケニル−スズ試薬、アリール−スズ試薬、アルキニル−スズ試薬（有機スズ化合物（organostannanes））、アルキル−ボラン試薬、アルケニル−ボラン試薬、アリール−ボラン試薬、アルキニル−ボラン試薬（有機ホウ素化合物および有機ボロネート（organoboronate））が挙げられるが、これらに限定されない。これらの炭素求核試薬は、水または極性有機溶媒において動力学的に安定であるという利点を有する。他の炭素求核試薬の例としては、リンイリド試薬、エノール試薬、エノラート試薬が挙げられる。これらの炭素求核試薬は、合成有機化学の当業者によく知られている前駆体から比較的に容易に生成されるという利点を有する。炭素求電子試薬との接合に使用されるときに、炭素求核試薬は、炭素求核試薬と炭素求電子試薬との間に新たな炭素−炭素結合を生み出す。
【０３７９】
炭素求電子試薬に対するカップリングに好適な非炭素求核試薬の例としては、１級アミンおよび２級アミン、チオール、チオレート（thiolate）およびチオエーテル、アルコール、アルコキシド、アジド、ならびにセミカルバジドなどが挙げられる。炭素求電子試薬との接合に使用されるとき、これらの非炭素求核試薬は、通常、異種原子結合（Ｃ−Ｘ−Ｃ）を生じる（Ｘは異種原子（例えば、酸素、硫黄または窒素）である）。
【０３８０】
一実施形態は、構造１または２の化合物を作製する方法であり、一般式（ＩＩ）：
【０３８１】
【化４４】
2010512800.tif 000047
【０３８２】
で示される化合物を、カルボニルを含んでいる化合物と反応させる工程を含んでいる。ここで、
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、一方の末端においてインドールを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、
このリンカーは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、＝Ｎ−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素またはアミン保護基であり、
アミン保護基は、特に限定されないが、
【０３８３】
【化４５】
2010512800.tif 000048
【０３８４】
を包含している。
【０３８５】
さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ａは置換または非置換の低級アルキレン、あるいはフェニレン、ピリジニレン、ピリミジニレンおよびチオフェニレンから成る群より選択される非置換または置換のアリーレンである。別の実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ａは置換または非置換の低級ヘテロアルキレンである。
【０３８６】
さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ａは置換低級ヘテロアルキレンであり、置換基は＝Ｏ基１つである。さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ａは置換低級アルキレンであり、置換基は＝Ｏ基１つである。
【０３８７】
さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ｂは低級アルキレン、置換低級アルキレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’’）−、−ＮＲ’’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’’）ＣＯ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）（アルキレンまたは置換アルキレン）−または−Ｓ（Ｏ）２（アルキレンまたは置換アルキレン）−であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである。
【０３８８】
さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ｂは−Ｏ（ＣＨ２）−、−ＮＨＣＨ２−、−ＮＨＣＯ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）−、−ＳＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）ＣＨ２−または−Ｓ（Ｏ）２ＣＨ２−である。
【０３８９】
さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ｒ１はＨ、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、Ｎ−アセチル、テトラフルオロアセチル（ＴＦＡ）またはベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。
【０３９０】
さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ｒ３およびＲ４は、水素、
【０３９１】
【化４６】
2010512800.tif 000049
【０３９２】
である。
【０３９３】
さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ｒ１は樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。別の実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ｒ２はＯＨ、Ｏ−メチル、Ｏ−エチルまたはＯ−ｔ−ブチルである。さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ｒ２は樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。
【０３９４】
いくつかの実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、一般式（ＩＩ）で示される化合物は以下の構造を有している：
【０３９５】
【化４７】
2010512800.tif 000050
【０３９６】
ここで、
ｎは０、１、２、３または４であり；ｍは０、１、２、３または４であり、ｎ＋ｍは１、２、３、４または５であり；Ｘ１およびＸ２は独立して、結合、Ｏ、またはＮＨであり；ｙは０または１である。
【０３９７】
さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ｒ２はポリヌクレオチドである。別の実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ｒ２はリボ核酸（ＲＮＡ）である。さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ｒ２はｔＲＮＡである。さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、このｔＲＮＡはセレクターコドンを特異的に認識するものである。さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、このセレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、非天然コドン、５塩基コドンおよび４塩基コドンから成る群より選択される。さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ｒ２はサプレッサーｔＲＮＡである。
【０３９８】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、
【０３９９】
【化４８】
2010512800.tif 000051
【０４００】
から成る群より選択される構造１または２の化合物を作製する方法である。
【０４０１】
いくつかの実施の形態では、本発明の方法は、一般式（ＩＶ）：
【０４０２】
【化４９】
2010512800.tif 000052
【０４０３】
に相当する構造１または２の化合物を作製する方法であり、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１，２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである。
【０４０４】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、
【０４０５】
【化５０】
2010512800.tif 000053
【０４０６】
から成る群より選択される構造１または２の化合物を作製する方法である。
【０４０７】
さらなる実施形態は、一般式（Ｖ）：
【０４０８】
【化５１】
2010512800.tif 000054
【０４０９】
で示される化合物を、ヒドラジンを含んでいる剤と反応させる工程を含んでいる。ここで、
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、および−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンから置換アルキレン）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｊは、
【０４１０】
【化５２】
2010512800.tif 000055
【０４１１】
であり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、または保護基であるか、２つ以上のＲ’’基が存在するときに、２つのＲ’’は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、もしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３基およびＲ４基もしくは２つのＲ３基は必要に応じて、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成するか；あるいは、
−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ基は一緒になって、少なくとも１つの、カルボニル基を包含するカルボニル基、保護されたカルボニル基を包含する保護されたカルボニル基、またはマスキングされたカルボニル基を包含するマスキングされたカルボニル基、を含んでいる二環式または三環式のシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成するか；あるいは、
−Ｊ−Ｒ基は一緒になって、少なくとも１つの、カルボニル基を包含するカルボニル基、保護されたカルボニル基を包含する保護されたカルボニル基、またはマスキングされたカルボニル基を包含するマスキングされたカルボニル基、を含んでいる単環式または二環式のシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ａがフェニレンであり、Ｒ３がそれぞれＨである場合に、Ｂが存在し；Ａが−（ＣＨ２）４−であり、Ｒ３がそれぞれＨである場合に、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではなく；ＡおよびＢが存在せずに、Ｒ３がそれぞれＨである場合に、Ｒはメチルではない。
【０４１２】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、一般式（ＶＩ）：
【０４１３】
【化５３】
2010512800.tif 000056
【０４１４】
に相当する構造１または２の化合物を作製する方法である。
【０４１５】
さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ａは置換または非置換の低級アルキレン、あるいはフェニレン、ピリジニレン、ピリミジニレン、および方法から成る群より選択される置換または非置換のアリーレンである。
【０４１６】
さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ｂは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’’）−、−ＮＲ’’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’’）ＣＯ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）（アルキレンまたは置換アルキレン）−、または−Ｓ（Ｏ）２（アルキレンまたは置換アルキレン）−である。さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、Ｂは、−Ｏ（ＣＨ２）−、−ＮＨＣＨ２−、−ＮＨＣＯ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）−、−ＳＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）ＣＨ２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＣＨ２−である。
【０４１７】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、
【０４１８】
【化５４】
2010512800.tif 000057
【０４１９】
から成る群より選択される構造１または２の化合物を作製する方法である。
【０４２０】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、一般式（ＶＩＩ）：
【０４２１】
【化５５】
2010512800.tif 000058
【０４２２】
に相当する構造１または２の化合物を作製する方法である。
【０４２３】
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１，２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである。
【０４２４】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、
【０４２５】
【化５６】
2010512800.tif 000059
【０４２６】
から成る群より選択される構造１または２の化合物を作製する方法である。
【０４２７】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、一般式（ＶＩＩＩ）：
【０４２８】
【化５７】
2010512800.tif 000060
【０４２９】
に相当する構造１または２の化合物を作製する方法である。
【０４３０】
ここで、Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’’のそれぞれが、独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり；
ＹおよびＺは独立して、−ＯＨ、アルキルで置換された酸素、−ＳＨおよびアルキルで置換された硫黄から成る群より選択され、ＹとＺは一緒になってシクロアルキル環を形成することができる。
【０４３１】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、
【０４３２】
【化５８】
2010512800.tif 000061
【０４３３】
から成る群より選択される構造１または２の化合物を作製する方法である。
【０４３４】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、一般式（ＩＸ）：
【０４３５】
【化５９】
2010512800.tif 000062
に相当する構造１または２の化合物を作製する方法である。
【０４３６】
ここで、Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’、およびーＳ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｙは、独立して、ＯＲ’’、ＮＲ’’Ｒ’ ’、ＮＣ（Ｏ）Ｒ’’から成る群より選択され、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルである。
【０４３７】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、
【０４３８】
【化６０】
2010512800.tif 000063
【０４３９】
から成る群より選択される構造１または２の化合物を作製する方法である。
【０４４０】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、一般式（Ｘ）：
【０４４１】
【化６１】
2010512800.tif 000064
【０４４２】
に相当する構造１または２の化合物を作製する方法である。ここで、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択される、ｋは１、２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであるか；あるいは、２つ以上のＲａ基が存在する場合に、２つのＲａ基は必要に応じてシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、アルキル、置換アルキル、Ｎ（Ｒ’）２、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’から成る群より選択され、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
ＸはＣ、ＮまたはＳであり、ただしＸがＯまたはＳである場合に、Ｒ４はＨ、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、アルキル、置換アルキル、Ｎ（Ｒ’）２、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’およびｋが１、２または３である−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’ではあり得ず、ｎは０、１または２である。
【０４４３】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、
【０４４４】
【化６２】
2010512800.tif 000065
【０４４５】
から成る群より選択される構造１または２の化合物を作製する方法である。
【０４４６】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、一般式（ＸＩ）：
【０４４７】
【化６３】
2010512800.tif 000066
【０４４８】
に相当する構造１または２の化合物を作製する方法である。ここで、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキルから成る群より選択され；
ＹおよびＺは独立して、−ＯＨ、アルキルで置換された酸素、−ＳＨおよびアルキルで置換された硫黄から成る群より選択され、ＹおよびＺは一緒になってシクロアルキル環を形成することができる。
【０４４９】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、
【０４５０】
【化６４】
2010512800.tif 000067
【０４５１】
から成る群より選択される構造１または２の化合物を作製する方法である。
【０４５２】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、一般式（ＸＩＩ）：
【０４５３】
【化６５】
2010512800.tif 000068
【０４５４】
に相当する構造１または２の化合物を作製する方法であって、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは１、２または３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｂは、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−をさらに含み；
ｎは１、２または３であり；
Ｙは、独立して、ＯＲ’’、ＮＲ’’Ｒ’’およびＮＣ（Ｏ）Ｒ’’から成る群より選択され、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキルである、方法である。
【０４５５】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、
【０４５６】
【化６６】
2010512800.tif 000069
【０４５７】
から成る群より選択される構造１または２の化合物を作製する方法である。
【０４５８】
さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、このような化合物を、温和な条件下において水溶液中にてカルボニルを含んでいる剤と反応させる、方法である。
【０４５９】
さらなる実施形態は、構造１または２の化合物を作製する方法において、カルボニルまたは保護されたカルボニルを含んでいる剤と化合物との反応は、以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）の特徴の少なくとも１つを有する、方法である：（ｉ）約１〜約６のｐＨにて起きる、（ｉｉ）生物学的条件下において安定なインドール結合を生成する；（ｉｉｉ）部位特異的である；（ｉｖ）ポリペプチドの三次元構造を非可逆的に破壊しない；（ｖ）室温にて起きる；（ｖｉ）水性条件下にて容易に起きる；あるいは（ｖｉｉ）位置選択的またおよび／または位置特異的である。
【０４６０】
さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、温和な条件は約１〜約６のｐＨである。構造１または２の化合物を作製する方法の別の実施形態では、温和な条件は約３〜約６のｐＨである。さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、このような反応は温和な条件下において水溶液中にて実施される。
【０４６１】
さらなる実施形態では、構造１または２の化合物を作製する方法において、一般式（Ｖ）で示される化合物とヒドラジンを含んでいる剤との反応は、以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）の少なくとも１つの特徴を有する：（ｉ）約１〜約６のｐＨの範囲内にて起きる、（ｉｉ）生物学的条件下において安定なインドール結合を生成する；（ｉｉｉ）部位特異的である；（ｉｖ）ポリペプチドの三次元構造を非可逆的に破壊しない；（ｖ）室温にて起きる；（ｖｉ）水性条件下にて容易に起きる；または（ｖｉｉ）位置選択的また／もしくは位置特異的である。
【０４６２】
＜ＶＩ．非天然アミノ酸を有するポリペプチド＞
便宜上、この項において説明されている化合物の形態、特性、および他の特徴は、一般的におよび／または具体例を挙げて説明されている。しかしながら、この項において説明されている形態、特性や他の特徴は、この項における一般的な説明もしくは具体例のみに限定されるものではなく、この項において説明されている形態、特性、および他の特徴は、本明細書、特許請求の範囲および図面において説明されている一般式Ｉ〜ＸＶで示される化合物および構造１〜４を有する化合物の範囲内に含まれる全ての化合物（一般式Ｉ〜ＸＶで示される化合物および構造１〜４を有する化合物の範囲内に含まれる任意の下位の一般式（sub-formula）で示される化合物または特定の化合物をも含んでいる）に対して等しく適用される。
【０４６３】
本明細書に記載されている組成物および方法は、ポリペプチドへの少なくとも１つの非天然アミノ酸の組み込みを提供する。非天然アミノ酸は、ポリペプチド内の任意の位置（例としては、ポリペプチドの任意の末端、または任意の内部が挙げられる）に存在し得る。ポリペプチドに非天然アミノ酸を組み込む目的の１つが、ポリペプチドの活性および／または三次元構造の破壊ではない限り、非天然アミノ酸は、相同な天然に生じるアミノ酸ポリペプチドの活性および／または三次元構造と比較して、ポリペプチドの活性および／または三次構造を破壊しないことが好ましい。さらに、ポリペプチドへ非天然アミノ酸の組み込むことによって、相同な天然に生じるアミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの活性および／またはポリペプチドの三次構造がある程度に、このような活性および／または三次構造が完全に破壊されることなく、修飾され得る。例えば、ポリペプチドの活性の修飾には、ポリペプチドの治療有効性の操作、ポリペプチドの安全性プロフィールの改善、ポリペプチドの薬物動態学的性質、薬理学的性質および／または薬力学的性質の調節（例えば、水溶性の増加、バイオアベイラビリティ、血中半減期の増加、治療半減期の増加、免疫原性の調節、生物学的な活性の調節、または循環時間の延長）、ポリペプチドへのさらなる官能基の付与、ポリペプチドへのタグ、標識または検出可能なシグナルの組み込み、ポリペプチドの単離性の緩和、ならびに上述した修飾の任意の組合せが挙げられる。活性および／または三次構造のこのような修飾は、しばしば上述した組込みをもたらすことの目的の１つであるが、当然にポリペプチドへの非天然アミノ酸の組込みはまた、相同な天然に生じるアミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの活性および／または三次構造にほとんど影響を与えなくてもよい。同様に、非天然アミノ酸のポリペプチド、非天然アミノ酸のポリペプチドを含んでいる組成物、このようなポリペプチドおよびポリペプチド組成物を作製する方法、このようなポリペプチドおよびポリペプチド組成物を精製、単離、および特徴づける方法、ならびにこのようなポリペプチドおよびポリペプチド組成物を使用する方法は、この開示内容の範囲内にあることが考慮される。さらに、本明細書に記載されている非天然アミノ酸のポリペプチドはまた、他のポリペプチド（単なる一例としては、非天然アミノ酸のポリペプチドまたは天然に生じるアミノ酸ポリペプチドが挙げられる）と連結され得る。
【０４６４】
ポリペプチドは、例えば、いかなる公知の治療タンパク質から選択される。この治療タンパク質とは、疾病、病気または障害に罹患しているヒトに対して治療効果があると知られているタンパク質のことである。例えば、ポリペプチドは、アルファ−１  抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、抗体の断片、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球走化性タンパク質−１、単球走化性タンパク質−２、単球走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１  アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ  ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子  ５ａ、補体阻害剤、補体受容体  １、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性化ペプチド、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター  ＩＸ、ファクター  ＶＩＩ、ファクター  ＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１  受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素  Ａ、発熱性外毒素  Ｂ、発熱性外毒素  Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成された低分子タンパク質、可溶性補体受容体  Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌のエンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒���、チモシンアルファ  １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ウロテンシン、ＶＬＡ−４  タンパク質、ＶＣＡＭ−１  タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロン受容体から成る群より選択される。
【０４６５】
本明細書に記載されている非天然アミノ酸のポリペプチドは、必要に応じて生合成的にまたは非生合成的に生成される。生合成的に生成する方法は、翻訳系（細胞の翻訳系または無細胞翻訳系）を利用したあらゆる方法（以下の成分の少なくとも１つの使用が挙げられる：ポリヌクレオチド、コドン、ｔＲＮＡ、およびリボソーム。）を意図している。非生合成的に生成する方法は、翻訳系を利用しないあらゆる方法を意図しており、この方法は、固体ペプチド合成法（solid state synthetic method）、固相ペプチド合成法、少なくとも１つの酵素を利用する方法、および少なくとも１つの酵素を利用しない方法にさらに分られてもよく、その上に、あらゆるこの小区分は重複していてもよく、かつ多くの方法はこれらの小区分の組合せを利用し得る。
【０４６６】
本明細書に記載されている方法、組成物、方策、および技術は、特定の種類、分類もしくはファミリーのポリペプチドまたはタンパク質に限定されない。実際に、本明細書に記載の組成物の範囲においては、ほとんどあらゆるポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸を含み得る。単なる一例として、ポリペプチドは、治療タンパク質と相同である。関連するもしくはさらなる実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、成長ホルモンスーパーファミリーのあらゆるポリペプチドメンバーと相同である。
【０４６７】
非天然アミノ酸は、この開示内容の他の場所に記載されているようにさらに修飾され得るか、非天然アミノ酸は、さらに修飾されることなく使用され得る。ポリペプチドへの非天然アミノ酸の組込みは、多様な目的（特に限定されないが、タンパク質の構造および／または機能の変化の修正、大きさの変更、酸性度の変更、求核性の変更、水素結合の変更、疎水性の変更、プロテアーゼ標的部位の接触性の変更、部分に対する標的化の変更（タンパク質アレイ用の部分に対する標的化の変更が挙げられるが、これに限定されない。）などが挙げられる。）のためになされ得る。非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、増強されたもしくはまさに完全に新しい触媒性または生物物理学的性質を有し得る。単なる一例として、以下の性質がポリペプチドへ非天然アミノ酸を含ませることによって修飾され得る：毒性、体内分布、構造的性質、分光学的な性質、化学的および／または光化学的な性質、触媒能、半減期（特に限定されないが、血中半減期が挙げられる。）、ならびに共有結合的なまたは非共有結合的な（例として挙げられるが、これらに限定されない。）他の分子との反応性など。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを含有している組成物は、新規の治療、診断、触媒酵素、工業的触媒、結合タンパク質（抗体が挙げられるが、これに限定されない。）ならびにタンパク質の構造および機能（例として挙げられるが、これらに限定されない。）の研究に有用である（例として挙げられるが、これらに限定されない）。例えば、「Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4:645-652」を参照のこと。
【０４６８】
さらに、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分の側鎖は、ポリペプチドに対して多種多様なさらなる官能基を提供することができ、限定されるようなものではなく単なる一例として、ポリペプチドの非天然アミノ酸部分の側鎖は任意の所望の官能基を含んでいる。
【０４６９】
１態様において、組成物は、少なくとも１（例としては、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれ以上が挙げられるが、これらに限定されない。）の非天然アミノ酸を有する少なくとも１つのポリペプチドを含んでいる。非天然アミノ酸は、必要に応じて同じでああるか、または異なっている。さらに必要に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の異なるもしくは同一の非天然アミノ酸を含んでいる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の異なる場所がポリペプチドに存在する。他の態様において、組成物は、非天然アミノ酸で置換されているポリペプチドに存在する少なくとも１つ（ただし、全てではない）の特定の天然アミノ酸を有する、ポリペプチドを含んでいる。２つ以上の非天然アミノ酸を有する所定のポリペプチドに関して、非天然アミノ酸は、同一であっても異なっていてもよい（このようなポリペプチドが２種類以上の異なる種類の非天然アミノ酸を含んでいてもよく、２つの同じ非天然アミノ酸を含んでいてもよい。このような例が挙げられるが、これらに限定されない）。３以上の非天然アミノ酸を有する所定のポリペプチドに関して、非天然アミノ酸は、同じであり得るか、異なり得るか、または複数の同種類の非天然アミノ酸と少なくとも１つの異なる非天然アミノ酸との組合せであり得る。
【０４７０】
本明細書に記載されている非天然アミノ酸のポリペプチドの実施形態は、固相ペプチド合成法によって（例えば、固体樹脂上において）、液相ペプチド合成法によって、および／または酵素の補助なしに、化学的に合成され得るが、本明細書に記載されている非天然アミノ酸のポリペプチドの他の実施形態は、細胞膜、細胞抽出物、もしくはライセートの系を用いるか、またはインビボの系を用いた（例えば、原核細胞または真核細胞の細胞機構を用いた）合成を可能にする。さらなるまたは付加的な実施形態では、本明細書に記載されている非天然アミノ酸のポリペプチドの重要な特徴の１つは、それらがリボソームを利用して合成され得ることである。本明細書に記載されている非天然アミノ酸のポリペプチドの、さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、このような方法の任意の組合せ（特に限定されないが、酵素の補助がなく、リボソームの補助および／またはインビボの系を用いた固体樹脂の組合せが挙げられる。）によって合成され得る。
【０４７１】
リボソームおよび／またはインビボの系を介した、非天然アミノ酸のポリペプチドの合成は、固体樹脂上において、または酵素の補助なしで合成された非天然アミノ酸のポリペプチドとは異なる、利点および特性を有する。これらの利点または特性としては、異なる不純物プロファイルが挙げられる。リボソームを利用した系および／またはインビボの系は、利用した生物系に由来する不純物（例としては、宿主細胞タンパク質、膜部分および脂質が挙げられるが、これらに限定されない）を有するのに対し、固体樹脂を利用したおよび／または酵素の補助なしの系に由来する不純物プロファイルは、合成処理に使用された、有機溶媒、保護基、樹脂材料、カップリング試薬および他の化学物質を含んでいる。その上に、リボソームの使用および／またはインビボの系を介して合成された非天然アミノ酸のポリペプチドの同位体の型は、細胞のために利用される供給原料の同位体の型を正確に反映するのに対し、固体樹脂上においておよび／または酵素の補助なしで合成された非天然アミノ酸のポリペプチドの同位体の型は、合成に使用されたアミノ酸の同位体の型を正確に反映する。さらに、リボソームおよび／またはインビボの系の使用を介して合成された非天然アミノ酸のポリペプチドは、アミノ酸のＤ−異性体が実質的になく、および／またはポリペプチドの構造の内部にシステインアミノ酸を組み込むことができ、および／またはポリペプチドの内部のアミノ酸がまれに欠失する。これに対し、固体樹脂を介しておよび／または酵素の補助なしで合成された非天然アミノ酸のポリペプチドは、アミノ酸のＤ−異性体の含有量が高く、ポリペプチドの内部のシステインの含有量が低く、および／またはポリペプチドの内部のアミノ酸が高い割合で欠失する。さらに、当業者は、固体樹脂を介しておよび／または酵素の補助なしで合成された非天然アミノ酸のポリペプチドから、リボソームおよび／またはインビボの系の使用によって合成された非天然アミノ酸のポリペプチドを区別することができる。
【０４７２】
＜ＶＩＩ．核酸およびオリゴヌクレオチドを含んでいる、組成物および方法＞
-Ａ．本明細書における使用のための一般的な組み換え核酸方法-
本明細書に記載されている方法および組成物の多くの実施形態では、興味のあるポリペプチド（単なる一例としては、ＧＨポリペプチドが挙げられる）をコードする核酸は、単離され、クローニングされ、多くの場合に組換え法を用いて変更される。そのような実施形態は、例えば、特に限定されないが、タンパク質の発現に、またはバリアント、誘導体、発現カセット、もしくは他のポリペプチドに由来する他の配列を生成する間に使用される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする配列は、異種のプロモーターに作動可能に連結される。
【０４７３】
また、本明細書には、非天然アミノ酸のポリペプチドを製造することができる細胞が記載されている。ポリペプチド内の少なくとも１つの非天然アミノ酸は、カルボニル結合、ヒドラジン結合、インドール結合を有する側鎖を含んでいるものである。このような細胞は、本明細書に記載されている技術やその変形を用いてこのような非天然アミノ酸のポリペプチドを製造するが、少なくとも１つの非天然アミノ酸を生合成によって生成する。少なくとも１つの非天然アミノ酸のポリペプチドを生合成する細胞は、本明細書に記載されている技術、方法、組成物および方策か、これらの変形かを用いて生成され得る。
【０４７４】
非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて合成して、関連のあるアミノ酸残基を導入（例えば、組み込みまたは置換）するか、除去（例えば、欠失または置換）するように核酸を変更してもよい。ヌクレオチド配列は、従来の方法に従った部位特異的突然変異誘発法によって、簡便に修飾され得る。あるいは、ヌクレオチド配列は、化学合成によって（例としては、オリゴヌクレオチド合成機を用いる化学合成が挙げられるが、これに限定されない。）、調製されてもよい。このような化学合成では、オリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計される。オリゴヌクレオチドの設計の際には、組換えポリペプチドが生成される宿主細胞に有利に働くコドンを選択することが好ましい。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードする多様な小さいオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ、ライゲーションまたはライゲーション連鎖反応によって合成されて組み立てられ得る。例えば、参照によって本明細書に援用される「Baranyら, Proc. Natl. Acad. ScL 88: 189-193 (1991) 」；米国特許第６，５２１，４２７号明細書を参照のこと。
【０４７５】
本明細書に記載されている非天然アミノ酸に関する方法および組成物は、組換え遺伝学の分野において一般的な技術を利用する。本明細書に記載されている非天然アミノ酸に関する方法および組成物に使用する通常の方法を開示する、基本的なテキストの例としては、「Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)」；「Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)」；および「Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら, eds., 1994)」が挙げられる。
【０４７６】
分子生物学的技術について説明するテキストの例としては、「Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques. Methods in Enzvmology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)」「Sambrookら, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.). Vol. 1または2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (「Sambrook」)」、「Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら, eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) (「Ausubel」)」が挙げられる。これらのテキストは、突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター、および多くの他の関連する話題（例としては、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質を製造するためのセレクターコドンを含んでいるポリヌクレオチド、直交な（orthogonal）ｔＲＮＡ、直交なシンテターゼおよびこれらの対の生成、が挙げられるが、これらに限定されない。）について述べている。
【０４７７】
多様な種類の突然変異誘発法は、多様な目的のため（例としては、新規なシンテターゼまたはｔＲＮＡを生成するため、ｔＲＮＡ分子を突然変異させるため、シンテターゼをコードするポリヌクレオチドを突然変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリーを生成するため、シンテターゼのライブラリーを生成するため、セレクターコドンを生成するため、興味のあるタンパク質またはポリペプチドに非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを挿入するためが挙げられるが、これらに限定されない）に、本明細書に記載されている非天然アミノ酸に関する方法および組成物において使用される。突然変異誘導法の例としては、部位特異的突然変異誘発法、ランダム点突然変異誘発法、相同組換え、ＤＮＡシャッフリングもしくは他の反復的な突然変異誘発法方法、キメラコンストラクション、ウラシルを含んでいる鋳型を用いた突然変異誘発法、オリゴヌクレオチドの定方向突然変異誘発法、ホスホロチオネートで修飾されたＤＮＡの突然変異誘発法、またはギャップドデュプレックスＤＮＡ（gapped duplex DNA）を用いた突然変異誘発法など、またはこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。付加的な適切な方法の例としては、ポイントミスマッチ修復、修復欠損のある宿主株を用いた突然変異誘発法、制限選択および制限精製、欠失突然変異誘発法、全体の遺伝子合成による突然変異誘発法、および二本鎖破壊修復などが挙げられる。また、キメラコンストラクションに関与する（例として挙げられるが、これに限定されない。）突然変異誘発法は、本明細書に記載されているアミノ酸に関する方法および組成物に含まれる。一実施形態では、突然変異誘発法は、天然に生じる分子、または変更もしくは突然変異された天然に生じる分子の公知の情報（例としては、配列比較、物理的な性質、または結晶構造などが挙げられるが、これらに限定されない。）によって誘導され得る。
【０４７８】
本明細書に見られるテキストおよび例は、これらの手法について説明している。付加的な情報が、引用された以下の公報および参考文献に見られる：「Lingら, Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): - 157-178 (1997)」；「Daleら, Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996) 」；「Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462(1985)」；「Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193- 1201(1985)」；「Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J, eds., Springer Verlag, Berlin) (1987)」；「Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)」；「Kunkelら, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987)」；「Bassら, Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988)」；「Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982)」；「Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983)」；「Zoller & Smith, Oligonucleotide- directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987)」;「Taylorら, The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985) 」；「Taylorら, The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8785 (1985) 」；「Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986)」；「Sayersら, 5’-3’ Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988) 」;「Sayersら, Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814」；「Kramerら, The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984) 」;「Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987)」；「Kramerら, Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988) 」；「Fritzら, Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988) 」；「Kramerら, Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Carterら, Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431 -4443 (1985) 」；「Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987)」；「Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986) 」；「Wellsら, Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986)」；「Nambiarら, Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984)」；「Sakmar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988) 」；「Wellsら, Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985) 」；「Grundstroemら, Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ‘shot-gun’ gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985) 」；「Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:7177-7181 (1986)」；「Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993)」；「Sieberら, Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001). W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994) 」および「I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995) 」。上述した多くの方法に関する付加的な詳細は、多様な突然変異誘発法方法とともに異常処理にとって有用な調整についても説明している、「Methods in Enzymology Volume 154」に見られ得る。
【０４７９】
また、本明細書に記載されている方法および組成物は、直交なｔＲＮＡ／ＲＳの対を介した非天然アミノ酸のインビボにおける組込みに対する、真核宿主細胞、非真核宿主細胞、および生物の使用を包含する。宿主細胞は、本明細書に記載されているポリペプチドに対応するポリヌクレオチド、または本明細書に記載されているポリペプチドに対応するポリヌクレオチドを含んでいるコンストラクト（例としては、本明細書に記載されているポリペプチドに対応するベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る）が挙げられるが、これに限定されない）を用いて、遺伝子組換えされる。遺伝子組換えの例としては、形質転換、形質導入またはトランスフェクションが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、直交なｔＲＮＡ、直交なｔＲＮＡシンテターゼ、および誘導体化されるタンパク質にとってのコーディング領域は、所望の宿主細胞において機能的である遺伝子発現制御エレメントと作動可能に連結される。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド、または接合されたポリヌクレオチドの形態であり得る。ベクターは、エレクトロポレーション（「Frommら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985) 」）、ウイルスベクターによる感染、および／または小さなビーズもしくは粒子の何れかの中か表面上における核酸を用いた低分子による高速弾丸侵入（high velocity ballistic penetratrion）（「Kleinら, Nature 327.70-73 (1987) 」）などのような方法によって細胞および／または微生物に導入される。
【０４８０】
操作された宿主細胞は、スクリーニング段階、プロモーターの活性化、または形質転換体の選択といった活動に適するように修飾された、従来の培養液において培養され得る。これらの細胞は、トランスジェニック生物中において任意に培養され得る。（例えば、その後に核酸を単離するための）細胞の単離および培養などに関する他の有用な文献の例としては、「Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York」、およびこれらに引用されている参考文献、「Payneら (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY」、「Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)」、ならびに「Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL」が挙げられる。
【０４８１】
細胞に標的の核酸を導入する多様なよく知られている方法は利用可能であり、これらの方法の何れかを本明細書に記載されている方法および組成物に使用することができる。これら方法の例としては、ＤＮＡを含んでいる細菌の原形質体と受容細胞の融合、エレクトロポレーション、粒子衝撃法（projectile bombardment）、およびウイルスベクターを用いた感染（以下にさらに詳しく述べる）などが挙げられる。細菌細胞は、本明細書に記載されているポリペプチドに対応するＤＮＡコンストラクトを含んでいるプラスミドの数を増幅するために使用され得る。細菌は、対数増殖期まで成長され、細菌内のプラスミドは、当該分野に周知の多様な方法によって単離される（例えば、Sambrookを参照のこと）。また、細菌からのプラスミドの精製を目的とする数多くのキットが、市販されている（例えば、EasyPrep（登録商標）、FlexiPrep（登録商標）（いずれもPharmacia Biotechが提供している）；StrataClean（登録商標）（Stratageneが提供している）；およびQIAprep（登録商標）（Qiagenが提供している）を参照のこと）。それから、単離され、かつ精製されたプラスミドは、他のプラスミドを産生するためにさらに操作されるか、細胞のトランスフェクションに使用されるか、または生体に感染させるために関連するベクターに組み込まれる。典型的なベクターは、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、転写開始配列および翻訳開始配列、ならびに特定の標的核酸の発現を制御するために有用なプロモーターを含んでいる。ベクターは、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物、または原核生物、またはその両方の系（例としては、シャトルベクターが挙げられるが、これに限定されない）において、カセットの複製を許容する配列、ならびに原核生物および真核細胞の両方の系にとっての選択マーカーを含んでいる、通常の発現カセットを必要に応じて含んでいる。ベクターは、原核生物、真核生物、またはその両方における複製および組込みに好適である。「Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979)」；「Robertsら, Nature. 328:731 (1987)」；「Schneider, E.ら, Protein Expr. Purif. 6(l)-10-14 (1995)」；（すべて上述の）「Ausubel」、「Sambrook」、「Berger」を参照のこと。クローニングに有用な細菌およびバクテリオファージの一覧表が、提供される（例えば、ＡＴＣＣによって公開されている「The ATCC Catalogue of bacteria and bacteriophage (1992) Ghernaら (eds)」）。また、配列決定、クローニング、ならびに分子生物学の他の態様、および基礎をなす理論的な考察のための別の基本的手法は、「Watsonら (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY. 」に見られる。また、本質的にあらゆる核酸（および標準的かまたは非標準的な、ほとんどあらゆる標識核酸）は、様々な商業的供給業者の何れか（例えば、the Midland Certified Reagent Company(Midland, TX mcrc.com),The Great American Gene Company(Ramona、CA、ワールドワイドウェブのgenco.comにおいて購入可能である)、ExpressGen Inc.（Chicago,IL,ワールドワイドウェブのexpressgen.comにおいて購入可能である）、Operon Technologies Inc.（Alameda, CA）および多くの他社）が提供して、特別にまたは通常に注文され得る。
【０４８２】
-Ｂ．セレクターコドン-
本明細書に記載されている方法および組成物に包含されるセレクターコドンは、タンパク質の生合成機構の遺伝学的なコドンの枠組みを拡張する。例えば、セレクターコドンの例としては、固有の３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えば、終止コドン（例としては、アンバーコドン（ＵＡＧ）、またはオパールコドン（ＵＧＡ）が挙げられるが、これらに限定されない））、非天然コドン、４塩基以上のコドン、またはレアコドン（rare codon）などが挙げられるが、これらに限定されない。所望の遺伝子またはポリヌクレオチドに導入され得るセレクターコドンの数は様々である（例としては、興味のあるポリペプチドの少なくとも一部分をコードする単一のポリヌクレオチドにおける１以上、２以上、３以上、４、５、６、７、８、９、１０以上が挙げられるが、これらに限定されない）。
【０４８３】
一実施形態では、本方法は、インビボにおいて１つ以上の非天然アミノ酸を組み込むための、終止コドンであるセレクターコドンの使用を含んでいる。例えば、終止コドン（例としては、ＵＡＧが挙げられるが、これに限定されない。）を認識する、Ｏ−ｔＲＮＡは生成され、このようなＯ−ｔＲＮＡは所望の非天然アミノ酸でＯ−ＲＳによってアミノアシル化される。このＯ−ｔＲＮＡは、天然に生じる宿主のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによって認識されないものである。部位特異的な突然変異誘発法は、興味のあるポリペプチドにおける興味のある部位に、終止コドン（例としては、ＵＡＧが挙げられるが、これに限定されない）を導入するために使用され得る。例えば、「Sayers, J.R.,ら (1988), 5’-3’ Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 16(3):791-802」を参照のこと。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡおよび興味のあるポリペプチドをコードする核酸がインビボにおいて組み合わせられると、非天然アミノ酸はＵＡＧコドンに応じて組み込まれ、その結果、特定の位置に非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドが生じる。
【０４８４】
また、非天然アミノ酸は、レアコドンによってコードされ得る。例えば、インビトロでのタンパク質合成反応においてアルギニン濃度が低下すると、アルギニンのレアコドンであるＡＧＧは、アラニンによってアシル化される合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが証明されている。例えば、「Maら, Biochemistry. 32:7939 (1993)」を参照のこと。この場合に、合成ｔＲＮＡは、Escherichia coliにおいて微量種として存在する天然に生じるｔＲＮＡ  Ａｒｇと競合する。いくつかの生物は、すべてのトリプレットコドンを使用するわけではない。Micrococcus luteusの割り当てられていないコドンＡＧＡは、インビトロの転写／翻訳の抽出物における、アミノ酸の挿入に使用されている。例えば、「Kowal and Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997) 」を参照のこと。一実施形態では、本明細書に記載の成分は、インビボにおいてこれらのレアコドンを使用するために生成され得る。
【０４８５】
インビボにおける非天然アミノ酸の組込みは、真核宿主細胞を有意に乱すことなくなされ得る。例えば、ＵＡＧコドンに関する抑圧効率は、Ｏ−ｔＲＮＡと、真核細胞の放出因子との間の競合に依存するので、抑圧効率は、例えば、特に限定されないがＯ−ｔＲＮＡおよび／またはＯ−ＲＳの発現レベルの増加によって変更され得る。なお、Ｏ−ｔＲＮＡには、アンバーサプレッサーｔＲＮＡが含まれるが、これに限定されない。また、放出因子は、終止コドンと結合し、リボソームから成長しているペプチドの放出を開始するものであり、例としては、ｅＲＦが挙げられるが、これに限定されない。
【０４８６】
また、セレクターコドンは、延長されたコドン（延長コドン）（例としては、４塩基以上のコドン（例えば、４塩基、５塩基、６塩基以上のコドン）が挙げられるが、これらに限定されない）を含んでいる。４塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、およびＣＣＣＵなどが挙げられるが、これらに限定されない。５塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、およびＵＡＧＧＣなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載されている方法および組成物の特徴は、フレームシフト抑圧に基づく、延長コドンの使用を含んでいる。４塩基以上のコドンは、同じタンパク質に１つまたは複数の非天然アミノ酸（例として挙げられるが、これらに限定されない。）を挿入可能である。例えば、アンチコドンループ（少なくとも８−１０ｎｔのアンチコドンループなど）を有する、突然変異されたＯ−ｔＲＮＡ（例としては、特別なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡが挙げられるが、これに限定されない。）の存在下において、４塩基以上のコドンが単一のアミノ酸として読まれる。他の実施形態では、アンチコドンループは、少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、または少なくとも６塩基コドン（例として挙げられるが、これらに限定されない。）を解読可能である。４塩基コドンには２５６通りの可能性があるので、複数の非天然アミノ酸は、４塩基以上のコドンを用いて同じ細胞においてコードされ得る。「Andersonら, (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology. 9:237-244」；「Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of ‘Shifty’ Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769」を参照のこと。
【０４８７】
例えば、４塩基コドンは、インビトロ生合成方法を用いた、タンパク質への非天然アミノ酸の組込みに使用されている。例えば、「Maら, (1993) Biochemistry. 32:7939-7945」、および「Hohsakaら, (1999) L Am. Chem. Soc. 121:34-40」を参照のこと。ＣＧＧＧおよびＡＧＧＵは、化学的にアシル化された２つのフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて、インビトロにおいて、ストレプトアビジンに２−ナフチルアラニンおよびリジンＮＢＤ誘導体を同時に組み込むために使用された。例えば、「Hohsakaら, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121: 12194-12195」を参照のこと。Ｍｏｏｒらは、インビボの研究にて、ＵＡＧＮコドンを抑圧するというＮＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕ誘導体の能力を調べた（ＮはＵ、Ａ、ＧまたはＣであり得る）。そして、ＵＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕによって、４塩基のＵＡＧＡが、１３〜２６％の効率でもって、０または−１フレームにおける解読がほとんどなく、解読され得ることを発見した。例えば、「Mooreら, (2000) J. Mol. Biol., 298:195-205」を参照のこと。一実施形態では、レアコドンまたはナンセンスコドンに基づく延長コドンは、本明細書に記載の方法および組成物に使用され得る。これによれば、他の望ましくない部位におけるミスセンスのリードスルーと、フレームシフト抑圧とを減少することができる。
【０４８８】
また、所定の系に関して、内在性の系が天然塩基コドンを使用しない（または稀にしか使用しない）場合に、セレクターコドンは、天然の３塩基コドンの１つを含んでいることができる。例えば、この例としては、天然の３塩基コドンを認識するｔＲＮＡが欠如している系、および／または３塩基コドンがレアコドンである系が挙げられる。
【０４８９】
セレクターコドンは、非天然塩基対を必要に応じて含んでいる。これらの非天然塩基対は、存在する遺伝アルファベットをさらに拡張する。塩基対を１つ追加することにより、３塩基コドンの数が６４から１２５まで増加する。第３の塩基対の性質の例としては、安定かつ選択的な塩基対の形成、ポリメラーゼによる高い忠実度を伴ったＤＮＡへの効率的な酵素的組込み、および新生の非天然塩基対を合成した後における効率的な連続するプライマー伸張が挙げられる。本方法および本組成物に適合し得る非天然塩基対の記述の例としては、例えば、「Hiraoら, (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182」が挙げられ、かつまた、「Wu, Y.,ら(2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630」を参照のこと。他の関連する公報は、以下に載せられている。
【０４９０】
インビボにおける使用法に関して、非天然ヌクレオシドは、膜透過性であり、かつリン酸化されて、対応する３リン酸塩を形成する。その上に、増加した遺伝情報は、安定であり、かつ細胞性の酵素によって破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒおよびその他によるこれまでの試みは、もっとも注目すべき例であるイソ−Ｃ：イソ−Ｇ対という、基準のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対における水素結合様式とは異なる、水素結合様式を巧く活用した。例えば、「Switzerら, (1989) J. Am. Chem. Soc, 111 :8322-8322; and Piccirilliら, (1990) Nature, 343:33-37」；「Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602-608」を参照のこと。これらの塩基は、通常、ある程度に天然塩基と誤対合し、かつ酵素的に修復され得ない。Ｋｏｏｌおよび共同研究者は、塩基間の疎水性パッキング相互作用が水素結合と入れ替わって、塩基対の形成を生じることができることを証明した。例えば、「Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602-608」、および「Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825-2828」を参照のこと。上述した条件のすべてを満たす非天然塩基対を開発する試みにおいて、Schultz、Romesbergおよび共同研究者は、一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、かつ研究している。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は、天然塩基対より安定であることが見出されており、かつEscherichia coliのＤＮＡポリメラーゼ  Ｉのクレノー酵素（ＫＦ）によって、ＤＮＡに効率的に組み込まれ得る。例えば、「McMinnら, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121: 11585-11586」；および「Ogawaら, (2000) J. Am. Chem. Soc. 122:3274-3278」を参照のこと。３ＭＮ：３ＭＮ自己対は、生物学的機能に対して十分な効率性および選択性を伴って、ＫＦによって合成され得る。例えば、「Ogawaら, (2000) J Am. Chem. Soc, 122:8803-8804」を参照のこと。しかし、両方の塩基は、さらなる複製に対して連鎖停止剤として作用する。近年、突然変異体ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対の複製に使用され得るように進化させられている。その上に、７ＡＩ．自己対は、複製され得る。例えば、「Taeら, (2001) J. Am. Chem. Soc. 123:7439-7440」を参照のこと。また、Ｃｕ（ＩＩ）との結合によって安定な対を形成する新規な金属塩基対であるＤｉｐｉｃ：Ｐｙが、開発されている。例えば、「Meggersら, (2000) J. Am. Chem. Soc 122:10714-10715」を参照のこと。延長コドンおよび非天然コドンは、天然コドンに対して本来的に直交であるので、本明細書に記載されている非天然アミノ酸に関する方法は、この性質を活かして非天然アミノ酸用の直交なｔＲＮＡを生成し得る。
【０４９１】
また、翻訳回避系（translational bypassing system）が、所望のポリペプチドにおける非天然アミノ酸の組み込みに使用され得る。翻訳回避系において、大きな配列が遺伝子に組み込まれるが、この配列はタンパク質に翻訳されない。このような配列は、リボソームにこの配列を跳び越し、かつ挿入の下流にある翻訳を再開させる合図としての機能を果たす構造を含んでいる。
【０４９２】
ある種の実施形態では、本明細書に記載の方法および／または組成物における興味のあるタンパク質またはポリペプチド（またはこれらの一部）は、核酸によってコードされている。典型的に、核酸は、少なくとも１のセレクターコドン、少なくとも２のセレクターコドン、少なくとも３のセレクターコドン、少なくとも４のセレクターコドン、少なくとも５のセレクターコドン、少なくとも６のセレクターコドン、少なくとも７のセレクターコドン、少なくとも８のセレクターコドン、少なくとも９のセレクターコドン、１０またはそれ以上のセレクターコドンを含んでいる。
【０４９３】
興味のあるタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、例えば、非天然アミノ酸の組み込みための１以上のセレクターコドンを含めるために、本明細書の「突然変異誘発法および他の分子生物学技術」の項目に記載されている方法を用いて、突然変異誘発され得る。例えば、興味のあるタンパク質に関する核酸は、１以上の非天然アミノ酸の組込みを提供する１以上のセレクターコドンを含んでいるように突然変異誘発される。本明細書に記載されている方法および組成物は、あらゆるバリアント（例としては、例えば、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる突然変異体、あらゆるタンパク質の型が挙げられるが、これらに限定されない。）を包含する。同様に、本明細書に記載されている方法および組成物は、対応する核酸（例えば、１以上の非天然アミノ酸をコードする１以上のセレクターコドンを有する核酸）を包含する。
【０４９４】
興味のあるポリペプチド（単なる一例として、ＧＨポリペプチドが挙げられる。）をコードする核酸分子は、ポリペプチドの任意の所望の位置にシステインを導入するように容易に突然変異誘発され得る。システインは、反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質、または多種多様な他の分子を、興味のあるタンパク質に導入するために、広く使用される。ポリペプチドの所望の位置にシステインを組込む好適な方法として、例えば、参照によって本明細書に援用される米国特許第６，６０８，１８３号明細書に記載の方法、および突然変異誘発技術などが挙げられる。このようなシステインの導入および活用技術は、本明細書に記載されている非天然アミノ酸の導入および活用技術と合わせて利用し得る。
【０４９５】
＜ＶＩＩＩ．非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドのインビボにおける生成＞
便宜上、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドのインビボにおける生成は、この項では一般的におよび／もしくは具体例を挙げて説明されている。しかしながら、この項で説明されている非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドのインビボにおける生成は、この項において挙げられている一般的な説明または具体例に限られるものではなく、この項で説明される非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドのインビボにおける生成は、本明細書、請求項および図面において説明されている一般式Ｉ〜ＸＶで示される化合物の範囲内に含まれる全ての化合物（一般式式Ｉ〜ＸＶで示される化合物の範囲内に含まれるいかなる下位の一般式または特定の化合物をも含んでいる）に対して等しく適用される。
【０４９６】
本明細書において説明されているポリペプチドは、天然に生じる系にコードされないアミノ酸を付加または置換するために、修飾されたｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンセターゼを用いて、インビボにおいて生成され得る。
【０４９７】
天然に生じる系にコードされないアミノ酸を使用するｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼを生成する方法は、参照によって本明細書に援用される、「In vivo incorporation of unnatural amino acids」と題された米国特許第７，０４５，３３７号明細書、および「Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyl tRNA synthetase pairs」と題された米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載されている。これらの方法は、翻訳系に対して内在性のシンテターゼおよびｔＲＮＡと独立して機能する（そして、このためにときに「直交」と呼ばれる）翻訳系の生成を含んでいる。一実施形態では、翻訳系は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み；このようなポリヌクレオチドは対応するＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、またはＲＮＡウイルスベクターから生じ得るｍＲＮＡであってもよく；さらに、このようなポリヌクレオチドは、非天然アミノ酸の組み込み用に予定された部位と対応するセレクターコドンを含んでいる。翻訳は、上述したセレクターコドンに特異的な、非天然アミノ酸を含んでいるｔＲＮＡを、さらに含み；さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は、アミノアシル化される。さらなるまたは付加的な実施形態では、翻訳系は、直交なｔＲＮＡおよび直交なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含んでいる。さらなるまたは付加的な実施形態では、翻訳系は、以下：上述したポリヌクレオチド（典型的にＤＮＡの形態において）を含んでいるプラスミド、上述したポリヌクレオチド（典型的にＤＮＡの形態において）を含んでいるゲノムＤＮＡ、または上述したポリヌクレオチドが組み込まれている（さらなる実施形態では、組み込みが安定な組み込みである）ゲノムＤＮＡのうちの少なくとも１つを含んでいる。翻訳系のさらなるまたは付加的な実施形態では、セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、非天然コドン、５塩基コドンおよび４塩基コドンから成る群より選択される。翻訳系のさらなるまたは付加的な実施形態では、ｔＲＮＡはサプレッサーｔＲＮＡである。さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、リボソームによって合成される。
【０４９８】
さらなるまたは付加的な実施形態では、翻訳系は、直交なｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含んでいる。典型的に、Ｏ−ＲＳは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡを、翻訳系において好ましくアミノアシル化し、かつＯ−ｔＲＮＡは、このような系において他のｔＲＮＡによって認識されない少なくとも１つのセレクターコドンを認識する。従って、翻訳系は、このような系において産生されるポリペプチドに非天然アミノ酸を、コードされるセレクターコドンに応じて挿入して、コードされるポリペプチドにおける位置にアミノ酸を「置換する」。
【０４９９】
広範な直交なｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡは、ポリペプチドに特定の合成アミノ酸を挿入することについて、当該技術分野において説明されており、かつ一般的に本明細書に記載されている非天然アミノ酸のポリペプチドを産生する、本明細書に記載されている方法に好適である。例えば、ケト特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、「Wang, L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(1):56-61 (2003) 」、および「Zhang, Z.ら, Biochem. 42(22):6735-6746 (2003)」に記載されている。例示的なＯ−ＲＳまたはこれらの一部は、米国特許第７，０４５，３３７号明細書、および米国特許第７，０８３，９７０号明細書（それぞれ、参照によって本明細書に援用される）に開示されているポリヌクレオチド配列にコードされており、かつこれら文献に開示されているアミノ酸配列を含んでいる。また、Ｏ−ＲＳとともに使用するための対応するＯ−ｔＲＮＡ分子は、参照によって本明細書に援用される、米国特許第７，０４５，３３７号明細書、および米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載されている。その上に、その全体が参照することによって援用される「Mehlら in J. Am. Chem. Soc. 2003; 125:935-939」、および「Santoroら Nature Biotechnology 2002 Oct; 20:1044-1048」では、ポリペプチドへｐ−アミノフェニルアラニンを組み込むためのスクリーニング方法、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼおよびｔＲＮＡ分子が議論されている。
【０５００】
本明細書に記載さている方法に使用する典型的なＯ−ｔＲＮＡとしては、参照によって本明細書に援用される米国特許第７，０４５，３３７号明細書に開示されているような配列番号１または２のヌクレオチド配列が挙げられる。特定の非天然アミノ酸に対して特異的な、他の例示的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮシンテターゼの対は、参照によって本明細書に援用される米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載されている。S. cerevisiaeにおいてケトを含んでいるアミノ酸およびアジドを含んでいるアミノ酸の両方を組み込む、Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡは、「Chin, J. W.ら, Science 301: 964-967 (2003) 」に記載されている。
【０５０１】
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの使用は、非天然アミノ酸をコードする特定のコドンの選択に関与する。あらゆるコドンが使用され得るが、一般的にＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが発現されている細胞においてまれにしか使用されないか、または決して使用されないコドンを選択することが好ましい。例えば、例示的なコドンとしては、ナンセンスコドン（例えば、終止コドン（アンバー、オーカー、およびオパール）、４または５塩基コドン、ならびにまれにしか使用されないか、または使用されない他の天然の３塩基コドン）が挙げられる。
【０５０２】
特定のセレクターコドンは、突然変異誘発法（例としては、部位特異的突然変異誘発法、カセット突然変異誘発法、制限選択突然変異誘発法などが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて、配列をコードするポリヌクレオチドにおける適切な位置に組み込まれ得る。
【０５０３】
非天然アミノ酸の組込みに用いることができる、タンパク質生合成機構の成分（Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡおよび直交なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対など）を生成する方法は、「Wang, L.ら, Science 292: 498-500 (2001)」、「Chin, J. W.ら, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002)」、および「Zhang, Z.ら, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)」に記載されている。非天然アミノ酸をインビボにおいて組み込むための方法と組成物とは、米国特許第７，０４５，３３７号明細書に記載されている（なおこれらの特許文献は、参照によって本明細書に援用される）。また、生物のインビボでの翻訳系に使用される直交なｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼの対を選択する方法も、参照によって本明細書に援用される、米国特許第７，０４５，３３７号明細書、および米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載されている。その上に、その全体が参照によって本明細書に援用される、「Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into proteins」と題された国際公開第０４／０３５７４３号パンフレットには、ケトアミノ酸の組み込み用の直交なＲＳおよびｔＲＮＡ対について記載されている。参照によって本明細書に援用される、「Expanding the Eukaryotic Genetic Code」と題された国際公開第０４／０９４５９３号パンフレットには、真核宿主細胞における天然にコードされていないアミノ酸の組み込み用の直交なＲＳおよびｔＲＮＡ対について記載されている。
【０５０４】
少なくとも１つの組み換え直交なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を製造する方法は、（ａ）第１生物からの少なくとも１つのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを生成する工程、（ｂ）非天然アミノ酸と天然アミノ酸との存在下において、直交なｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバーについて、ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを選択（および／またはスクリーニング）して、活性のあるＲＳ（必要に応じてＲＳの活性のある突然変異体）のプールを提供する工程、および／または、（ｃ）天然にコードされていないアミノ酸の非存在下において、Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性のあるＲＳ（ＲＳの活性のある突然変異体など）のプールを選択して、少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳを提供する工程を含んでおり、少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳは、天然にコードされていないアミノ酸を用いてＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する、方法である。第１生物は、例えば、原核生物（Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, またはT. thermophilusなど）、あるいは、真核生物である。（ｃ）工程では、必要に応じて、陰性選択によって、活性のあるＲＳ（ＲＳの活性のある突然変異体など）のプールを選択してもよい。
【０５０５】
一実施形態では、ＲＳは、不活性なＲＳである。活性のあるＲＳを突然変異させることによって、不活性なＲＳを生成することができる。例えば、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、または少なくとも約１０、あるいはそれ以上のアミノ酸を、異なるアミノ酸（アラニンなど）に突然変異させることによって、不活性なＲＳを生成することができる。
【０５０６】
様々な技術を用いて、ＲＳの突然変異体のライブラリーを生成することができる。そのような技術として、例えば、（１）ＲＳについてのタンパク質の３次元構造に基づく合理的設計、または（２）無作為的技術もしくは合理的設計技術におけるＲＳヌクレオチドの突然変異誘発法が挙げられる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、ランダム突然変異誘発法、多様性を生成する組み換え突然変異誘発法、キメラコンストラクト、合理的設計、および本明細書に記載の他の方法によって、ＲＳの突然変異体を生成することができる。
【０５０７】
一実施形態では、天然にコードされていないアミノ酸と天然アミノ酸との存在下において、活性のあるメンバー（例えば、直交なｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する活性のあるメンバー）について、ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを選択（および／またはスクリーニング）する工程は、（ｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陽性選択またはスクリーニングマーカーと、ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーとを複数の細胞へ導入する段階、（ｉｉ）選択剤の存在下において、複数の細胞を成長させる段階、ならびに（ｉｉｉ）選択および／またはスクリーニング剤の存在下において、陽性選択またはスクリーニングマーカーにおける少なくとも１つのセレクターコドンを抑圧することによって、生存する（または特定の反応を示す）細胞を同定して、活性のあるＲＳ（必要に応じてＲＳの活性のある突然変異体）のプールを含んでいる陽性選択された細胞の一部（ｓｕｂｓｅｔ）を提供する段階を含んでいる。陽性選択および／またはスクリーニングマーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子である。セレクターコドンは、例えば、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、非天然コドン、５塩基コドンおよび４塩基コドンである。また、必要に応じて、選択剤および／またはスクリーニング剤の濃度を、変更することができる。
【０５０８】
１態様では、陽性選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子であり、セレクターコドンは、ＣＡＴ遺伝子におけるアンバー終止コドンである。付加的な選択マーカーの例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、またはその他入手可能な耐性遺伝子などが挙げられるが、これらに特に限定されない。必要に応じて、陽性選択マーカーは、β−ラクタマーゼであり、セレクターコドンは、β−ラクタマーゼ遺伝子におけるアンバー終止コドンである。別の態様では、陽性スクリーニングマーカーは、蛍光もしくは発光スクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカー（細胞表面マーカーなど）を含んでいる。
【０５０９】
一実施形態では、例えば非天然アミノ酸の非存在下において、Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性のあるＲＳ（必要に応じてＲＳの活性のある突然変異体）について、上述したプールを陰性選択またはスクリーニングする工程は、（ｉ）陽性選択またはスクリーニングからの活性のあるＲＳ（必要に応じてＲＳの活性のある突然変異体）のプールと一緒に、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陰性選択またはスクリーニングマーカーを、第２生物の複数の細胞に導入する段階、ならびに（ｉｉ）非天然アミノ酸とスクリーニングまたは選択剤とが補充された第１培養基では、生存するか、もしくは特定のスクリーニング反応を示すが、非天然アミノ酸と選択またはスクリーニング剤とが補充されていない第２培養基では、生存しないか、もしくは特定のスクリーニング反応を示さない、細胞を同定して、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを有する生存細胞またはスクリーニングされた細胞を提供する段階を含んでいる。陰性選択および／またはスクリーニングマーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子など）である。例えば、ＣＡＴ同定のプロトコールは、必要に応じて、適切なＯ−ＲＳ組換え体を決定するときの陽性選択および／または陰性スクリーニングとしての役割を果たす。例えば、必要に応じて、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいるＣＡＴを含み、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるか、または含んでいない成長プレート上において、クローンのプールは複製される。したがって、非天然アミノ酸を含んでいるプレートにおいて、排他的に成長するコロニーは、組み換えＯ−ＲＳを含んでいると見なされる。１態様では、選択（および／またはスクリーニング）剤の濃度は、変更される。いくつかの態様では、第１生物と第２生物とは、異なっている。よって、第１生物および／または第２生物は、原核生物、真核生物、哺乳類、Escherichia coli、菌類、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などを、必要に応じて含んでいる。他の実施形態では、スクリーニングマーカーは、蛍光または発光スクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカーを含んでいる。
【０５１０】
別の実施形態では、活性のあるＲＳ（必要に応じてＲＳの活性のある突然変異体）について、プールをスクリーニングまたは選択する工程（陰性選択する工程など）は、（ｉ）陽性選択の工程（ｂ）からの、ＲＳの活性のある突然変異体のプールを単離する段階、（ｉｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陰性選択またはスクリーニングマーカーと、活性のあるＲＳ（必要に応じてＲＳの活性のある突然変異体）のプールとを、第２生物の複数の細胞へ導入する段階、ならびに、（ｉｉｉ）非天然アミノ酸が補充されていない第１培養基では、生存するか、もしくは特定のスクリーニング反応を示すが、非天然アミノ酸が補充されている第２培養基では、生存しないか、もしくは特定のスクリーニング反応を示さない細胞を同定して、非天然アミノ酸に特異的な組換えＯ−ＲＳを少なくとも１つ有する生存細胞またはスクリーニングされた細胞を提供する段階を含んでいる。少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陰性選択またはスクリーニングマーカーは、例えば、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる毒性マーカー遺伝子（リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子など）である。１態様では、少なくとも１つのセレクターコドンは、約２つ以上のセレクターコドンを含んでいる。そのような実施形態は、必要に応じて、少なくとも１つのセレクターコドンが２つ以上のセレクターコドンを含んでおり、第１生物と第２生物とが異なっているということを含んでいてもよい。第１生物と第２生物とは、それぞれ、原核生物、真核生物、哺乳類、Escherichia coli、菌類、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などを、必要に応じて含んでいる。また、いくつかの態様は、陰性選択マーカーが、リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子（このような遺伝子は少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる）を含んでいるということを包含している。他の態様では、スクリーニングマーカーは、必要に応じて蛍光または発光スクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカーを含んでいるということを包含している。本明細書における実施形態では、スクリーニングおよび／または選択は、必要に応じて、スクリーニングおよび／または選択のストリンジェンシーが変更されることを含んでいる。
【０５１１】
別の実施形態では、少なくとも１つの組み換え直交なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を製造する方法は、（ｄ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを単離する工程、（ｅ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳに由来するＯ−ＲＳ（必要に応じてＯ−ＲＳの突然変異体）の第２組を生成する工程、ならびに、（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する能力を含んでいるＯ−ＲＳの突然変異体が得られるまで、（ｂ）工程と（ｃ）工程とを繰り返す工程を、さらに含んでいてもよい。必要に応じて、（ｄ）工程‐（ｆ）工程は、繰り返される（例えば少なくとも約２回）。１態様では、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳに由来するＯ−ＲＳの突然変異体の第２組は、突然変異誘発法によって生成されてもよい。このような突然変異誘発法としては、例えば、ランダム突然変異誘発法、部位特異的突然変異誘発法、組み換え、またはそれらの組合せが挙げられる。
【０５１２】
このような方法における、陽性選択／スクリーニングの（ｂ）工程、陰性選択／スクリーニングの（ｃ）工程、または陽性および陰性選択／スクリーニングの（ｂ）工程と（ｃ）工程との両方などを含んでいる選択／スクリーニング工程のストリンジェンシーは、必要に応じて、選択／スクリーニングのストリンジェンシーを変更する段階を含んでいる。別の実施形態では、陽性選択／スクリーニングの（ｂ）工程、陰性選択／スクリーニングの（ｃ）工程、または陽性および陰性選択／スクリーニングの（ｂ）工程と（ｃ）工程との両方は、レポーターを使用する段階を含んでおり、このようなレポーターは、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって検出されるか、または発光によって検出されるものである。必要に応じて、レポーターは、ファージディスプレイ、または細胞表面などに提示される。また、レポーターは、非天然アミノ酸またはその類似体に関する親和性または触媒活性に基づいて選択される。一実施形態では、シンテターゼの突然変異体は、ファージディスプレイ、または細胞表面に提示される。
【０５１３】
組換え直交なｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を製造する方法は、（ａ）第１生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡ（サプレッサーｔＲＮＡなど）に由来するｔＲＮＡの突然変異体のライブラリーを生成する工程、（ｂ）第１生物からのＲＳの非存在下において、第２生物からのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によって、アミノアシル化されるｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）について、このようなライブラリーをスクリーニングまたは選択（陰性選択など）して、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを提供する工程、ならびに（ｃ）導入された直交なＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化されるメンバーについて、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを選択またはスクリーニングして、少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡを提供する工程を含んでおり、少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識するとともに、第２生物からのＲＳによって効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳによって優先的にアミノアシル化される、方法である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡであり、ならびに／あるいは、天然および／もしくは非天然の塩基のユニークな３塩基コドンを含んでいるか、またはナンセンスコドン、レアコドン、非天然コドン、少なくとも４塩基を含んでいるコドン、アンバーコドン、オーカーコドン、またはオパール終止コドンである。一実施形態では、組換えＯ−ｔＲＮＡの直交性は、改善されている。いくつかの実施形態では、Ｏ−ｔＲＮＡが、修飾の必要なく、第２生物から第１生物へ必要に応じて移入されることが好ましい。様々な実施形態では、第１生物と第２生物とは、同じであるか、異なっている。さらに、第１生物と第２生物とは、必要に応じて、原核生物（Methanococcus jannaschii, Methanobacteium thermoautotrophicum, Escherichia coli, Halobacteriumなど）、真核生物、哺乳類、菌類、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などから選択される。さらに、組み換えｔＲＮＡは、必要に応じて、非天然アミノ酸でアミノアシル化されるものであり、このような非天然アミノ酸は、天然にまたは遺伝子操作によって、インビボにおいて生合成されるものである。非天然アミノ酸は、少なくとも第１生物または第２生物の成長培養基に、必要に応じて加えられ、このような非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸のポリペプチドに組み込み可能である適切な細胞内濃度を得られる。
【０５１４】
１態様では、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによってアミノアシル化される、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）について、上述したライブラリーをスクリーニングまたは選択（陰性選択など）する工程（（ｂ）工程）は、（ｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる毒性マーカー遺伝子と、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のライブラリーとを、第２生物からの複数の細胞へ導入する段階、ならびに、（ｉｉ）少なくとも１つの直交なｔＲＮＡまたは非機能的なｔＲＮＡを含んでいるｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを含有している生存細胞を選択する段階を含んでいる。また、毒性マーカー遺伝子の代わりに、毒物もしくは静止剤の産生を引き起こす遺伝子、または生物にとって必須の遺伝子を用いてもよい（ただし、これらマーカー遺伝子は、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる。）。例えば、細胞密度比の比較アッセイを用いて、生存細胞を選択することができる。
【０５１５】
別の態様では、毒性マーカー遺伝子は、２つ以上のセレクターコドンを含んでいてもよい。このような方法の別の実施形態では、毒性マーカー遺伝子は、リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子であり、リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子は、少なくとも１つのアンバーコドンを含んでいる。必要に応じて、リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子は、２つ以上のアンバーコドンを含んでいてもよい。
【０５１６】
別の実施形態では、導入された直交なＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によって、アミノアシル化されるメンバーについて、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを選択またはスクリーニングする工程は、Ｏ−ＲＳと一緒に陽性選択またはスクリーニングマーカー遺伝子と、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールとを、第２細胞からの複数の細胞へ導入する段階、ならびに、抗生物質などの選択またはスクリーニング剤の存在下において成長した、生存細胞またはスクリーニングされた細胞を同定して、少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡを有する細胞のプールを提供する段階を含んでいてもよい。少なくとも１つの組換えｔＲＮＡは、Ｏ−ＲＳによってアミノアシル化され、陽性マーカー遺伝子によってコードされた翻訳生成物へ、少なくとも１つのセレクターコドンに応じて、アミノ酸を挿入するものである。陽性マーカー遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子、生物に必須の遺伝子、または毒物の解毒を引き起こす遺伝子が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、少なくとも１つのセレクターコドン（少なくとも１つのアンバー終止コドンなど）を含んでいるβ−ラクタマーゼ遺伝子が挙げられる。別の実施形態では、選択またはスクリーニング剤の濃度が、変更される。
【０５１７】
特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対を生成する方法が提供される。この方法は、（ａ）第１生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡに由来するｔＲＮＡの突然変異体のライブラリーを生成する工程、（ｂ）第１生物からＲＳの非存在下において、第２生物からのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によってアミノアシル化されるｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）について、上述したライブラリーを陰性選択またはスクリーニングして、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを提供する工程、ならびに（ｃ）導入された直交なＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化されるメンバーについて、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを選択またはスクリーニングして、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを提供する工程を含んでいる。少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、第２生物からのＲＳによって効率的に認識されず、そして、Ｏ−ＲＳによって優先的にアミノアシル化される。また、このような方法は、（ｄ）第３生物からの少なくとも１つのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを生成する工程、（ｅ）非天然アミノ酸と天然アミノ酸との存在下において、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するメンバーについて、ＲＳの突然変異体のライブラリーを選択またはスクリーニングして、活性のあるＲＳ（必要に応じてＲＳの活性のある突然変異体）のプールを提供する工程、ならびに（ｆ）非天然アミノ酸の非存在下において、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性のあるＲＳ（必要に応じてＲＳの活性のある突然変異体）について、上述したプールを陰性選択またはスクリーニングして、少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対を提供する工程を含んでおり、少なくとも１つの特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対は、非天然アミノ酸に対して特異的な少なくとも１つの組換えＯ−ＲＳと、少なくとも１つの組換えＯ−ｔＲＮＡとを含んでいる、方法である。本方法によって製造される特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対は、本明細書に記載されている範囲や方法に含まれている。特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対には、例えば、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳの対（ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳの対など）、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳの対、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳの対、またはｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳの対などが含まれる。さらに、このような方法は、第１生物および第３生物が、同じであること（例えばMethanococcus jannaschiiであること）を含んでいる。
【０５１８】
また、本明細書に記載の方法には、第２生物のインビボの翻訳系に使用するための直交なｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼの対を選択する方法が含まれる。この方法は、第１生物から単離されたか、または第１生物に由来するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）およびｔＲＮＡと、マーカー遺伝子とを、第２生物からの細胞の第１組に導入する工程、マーカー遺伝子とｔＲＮＡとを、第２生物からの複製した細胞の組に導入する工程、ならびに、複製した細胞の組では生存できないが、第１組では生存する細胞について選択するか、複製した細胞の組では特定のスクリーニング反応を示さないが、第１組では特定のスクリーニング反応を示す細胞をスクリーニングする工程を含んでおり、第１組と複製した細胞の組とは、選択またはスクリーニング剤の存在下において成長させられ、生存細胞またはスクリーニングされた細胞は、第２生物のインビボの翻訳系に使用するための直交なｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼの対を含んでいる、方法である。一実施形態では、比較および選択またはスクリーニングする工程は、インビボでの相補性試験（complementation assay）を含んでいる。選択またはスクリーニング剤の濃度は、変更可能である。
【０５１９】
本明細書に記載の生物は、様々な生物および様々な組合せを含んでいる。一実施形態では、生物は、必要に応じて、原核生物である。原核生物としては、例えば、Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, またはT. thermophilusなどが挙げられる。代わりに、生物は、必要に応じて真核生物である。真核生物としては、例えば、植物（例えば、単子葉植物または双子葉植物などの複雑な生物）、藻類、原生生物、菌類（酵母など）、または動物（例えば哺乳類、昆虫、節足動物）などが挙げられる。
【０５２０】
‐Ａ．非真核生物および真核生物の発現‐
この項に開示されている技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドの非真核生物および真核生物の発現に適用できる。このような発現系は、米国特許出願第にさらに記載されている。
【０５２１】
本明細書に記載されているように真核宿主細胞または非真核宿主細胞は、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを、有用かつ大量に合成する能力を提供する。ある態様において組成物は、例えば少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラム、またはそれ以上の非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを必要に応じて含有しているか、あるいはインビボでのポリペプチド製造方法（組換えタンパク質の製造および精製の詳細については本明細書において提供する。）によって得られる量を含有している。別の態様において、ポリペプチドは、例えば、特に限定されないが、細胞ライセート、緩衝液、薬理学的な緩衝液、またはその他の液体懸濁液（特に限定されないが、約１ｎｌから約１００Ｌまで、またはそれ以上のどの量も含んでいる）中に、特に限定されないが、少なくとも１０μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも５０μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも７５μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも１００μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも２００μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも２５０μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも５００μｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも１ｍｇ／Ｌのポリペプチド、少なくとも１０ｍｇ／Ｌまたはそれ以上という濃度で、組成物に必要に応じて存在する。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる真核細胞において、タンパク質の大量生産（例えば、インビトロにおける翻訳のような、その他の方法によって一般的に生産される量よりも多い量）は、本明細書に記載される方法、技術および組成物の特徴である。
【０５２２】
本明細書に記載されているような真核宿主細胞または非真核宿主細胞は、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを、有用かつ大量に生合成する能力を提供する。例えば、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、特に限定されないが、細胞抽出物、細胞ライセート、細胞培地、および／または緩衝液などにおいて、少なくとも１０μｇ／Ｌ、少なくとも５０μｇ／Ｌ、少なくとも７５μｇ／Ｌ、少なくとも１００μｇ／Ｌ、少なくとも２００μｇ／Ｌ、少なくとも２５０μｇ／Ｌ、少なくとも５００μｇ／Ｌ、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、少なくとも２ｍｇ／Ｌ、少なくとも３ｍｇ／Ｌ、少なくとも４ｍｇ／Ｌ、少なくとも５ｍｇ／Ｌ、少なくとも６ｍｇ／Ｌ、少なくとも７ｍｇ／Ｌ、少なくとも８ｍｇ／Ｌ、少なくとも９ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、またはそれ以上のタンパク質濃度で製造することができる。
【０５２３】
この項に開示される技術は、本明細書に記載される非天然アミノ酸のポリペプチドの発現系、培養、および単離に適用できる。非天然アミノ酸のポリペプチドは、適切な発現系においていくらでも発現されてよい。そのような発現系としては、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞、および細菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５２４】
組換え宿主細胞株が、確立されれば（すなわち、発現コンストラクトが、宿主細胞に導入され、適切な発現コンストラクトを有する宿主細胞が単離されれば）、組換え宿主細胞株がポリペプチドの産生に適切な条件下において培養される。組み替え宿主細胞株の培養方法は、利用される発現コンストラクトの性質と宿主細胞の属性とに依存する。組み換え宿主株は、通常、文書化された方法論を用いて培養される。組み換え宿主細胞は、通常、炭素、窒素および無機塩の吸収可能な供給源を含んでいる液体培養基にて培養される。さらに、液体培養基は、必要に応じて、ビタミン、アミノ酸、成長因子、および他のタンパク質性の培養補助物を含んでいる。宿主細胞の培養のための液体培養基は、望ましくない微生物の成長を阻害するための抗生物質、もしくは抗真菌剤、および／または発現ベクターを含んでいる宿主細胞を選択するための抗生物質などの化合物を必要に応じて含んでいてもよい。
【０５２５】
組み換え宿主細胞は、バッチ式または連続式で培養され得る。ポリペプチドが細胞内に蓄積する場合、細胞は収集されるか、またはバッチ式もしくは連続式で培養液上清が収集される。原核生物の宿主細胞での製造については、バッチ式培養および細胞収集が好ましい。細胞または細胞株発現系を通じてタンパク質発現が成される場合、細胞を様々な様態のインビトロで繁殖する事ができる。このような様態は、特に限定されないが、培地の大半にわたる懸濁液中で成長する非足場依存性細胞、または、自身の繁殖のために、固体基板への付着が必要な足場依存性細胞（つまり、単層型細胞成長）を含んでいる。非足場依存性または連続的に確立された細胞株からの懸濁培養は、細胞または細胞生成物の大規模な生成に、最も広く使用される方法である。かさねて、細胞の種類や繁殖様態は、上記の様に、生成検討事項の種類に基づいて選択されてもよい。
【０５２６】
一実施形態では、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドは組換え系において発現した後に、精製される。ポリペプチドは、様々な文書化された方法論によって、宿主細胞または細胞培地から精製されてもよい。通常、細菌宿主細胞中に産生された多くのポリペプチドは、難溶性であっても不溶性（封入体の形態において）であってもよい。一実施形態では、アミノ酸の置換はポリペプチドにおいて容易に行われ得る。このアミノ酸の置換は、本明細書にて開示される方法を利用して、組換えによって製造されたポリペプチドの溶解度の増加を目的として選択される。不溶性のポリペプチドの場合、このようなポリペプチドは宿主細胞ライセートから遠心分離またはろ過によって回収されればよく、続いて、細胞のホモジナイゼーションが行われてもよい。難溶性ポリペプチドの場合、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などを含んでいる組成物は、部分的に可溶性のポリペプチドの沈殿を引き起こすために加えられてもよい。その後、沈殿したタンパク質は、遠心分離またはろ過によって好都合に回収されてもよい。組み換え宿主細胞は、文書化された方法論によって、細胞内部から封入体を放出させるために、分離またはホモジナイズされてもよい。宿主細胞の分離またはホモジナイゼーションは文書化された方法論を用いて実施されればよく、例えば、酵素的細胞崩壊、超音波処理、ダウンス型ホモジナイゼーション、または高圧放出崩壊を含んでいるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法の一実施形態では、高圧放出技術を、E. coli宿主細胞の崩壊に使用することによって、ポリペプチドの封入体を放出させてもよい。ポリペプチドの封入体を取り扱うときに、繰り返しのホモジナイゼーション時間を最小化することが好都合である。これによって、可溶化、器械的なせん断またはタンパク質分解などの要因による損失を無くし、封入体の収量を最大にする。
【０５２７】
次いで、不溶性のまたは沈殿したポリペプチドは、文書化された、多くの適切な可溶化試薬の何れかを用いて可溶化されてもよい。例えば、ポリペプチドは尿素またはグアニジン塩酸塩を用いて可溶化される。都合よく扱いやすい大きさのバッチを用いて、大規模なバッチが産生され得るように、可溶化されたポリペプチドの容積は、最小化されるべきである。組換え宿主細胞が一度に数千リットルの容積であるバッチで成長され得るとき、この要因は、大規模な工業的設定において重要であり得る。また、特にヒトへの製薬利用のために大規模な工業的設定においてポリペプチドを製造するとき機械および容器か、ポリペプチド生成物自体かの何れかを損傷するおそれのある過酷な化学物質の回避は、可能であれば、避けられるべきである。穏やかな変性試薬である尿素を、過酷な変性試薬であるグアニジン塩酸塩の代わりに、ポリペプチド封入体の可溶化に使用できることが、本明細書に記載および包含される方法に示されている。尿素の使用は、ポリペプチドの製造過程および精製過程に利用されるステンレス鋼の設備に対する損傷の危険度を有為に低減すると同時に、ポリペプチドの封入体を効率的に可溶化する。
【０５２８】
可溶性ポリペプチドの場合、ペプチドは細胞膜周辺腔に、または培地に分泌され得る。また、可溶性ペプチドは宿主細胞の細胞質に存在し得る。精製段階を実施する前に、可溶性ペプチドを濃縮することが望ましいことがある。本明細書に記載されるような、文書化された方法論は、特に限定されないが、細胞ライセートまたは培地などからの可溶性ペプチドの濃縮に使用され得る。また、本明細書に記載されるような文書化された方法論は、特に限定されないが、宿主細胞の崩壊、および宿主細胞の細胞質もしくは細胞膜周辺腔からの可溶性ペプチドの放出に使用されてもよい。
【０５２９】
ポリペプチドが融合タンパク質として産生されるとき、融合配列は、好ましく除去される。融合配列の除去は、例えば、酵素的切断または化学的切断によって果たされ得るが、これらに限定されない。中でも、酵素的切断が好ましい。融合配列の酵素的除去は、文書化された方法論を用いて果たされ得る。融合配列の除去にふさわしい酵素の選択は、融合の個性によって決定され、かつ反応条件は、酵素の選択によって特定される。化学的切断は、例えば、臭化シアン、ＴＥＶプロテアーゼ、および他の試薬などの試薬を用いて果たされ得る。切断されたポリペプチドは、文書化された方法論によって、切断された融合配列から必要に応じて精製される。そのような方法は、融合配列およびポリペプチドの個性および性質によって決定される。精製方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換グラフィー、もしくは透析、またはこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５３０】
また、ポリペプチドは、タンパク質溶液からＤＮＡを除去するために、精製されることが好ましい。ＤＮＡは、文書化された方法論（例えば、沈殿またはイオン交換クロマトグラフィー）によって除去され得る。一実施形態では、ＤＮＡは核酸沈殿剤（例えば、硫酸プロタミンであるが、これに限定されない。）を用いた沈殿によって除去される。ポリペプチドは文書化された方法論（例えば、遠心分離またはろ過が挙げられるが、これらに限定されない。）を用いて、沈殿されたＤＮＡから分離され得る。ポリペプチドがヒトの治療に用いられ、本明細書に記載の方法が薬学的に許容可能なレベルまで宿主細胞のＤＮＡを低減する設定において、宿主核酸分子の除去は重要な要素となる。
【０５３１】
また、小規模または大規模な発酵方法は、タンパク質発現（例としては、発酵槽、振とうフラスコ、流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトル培養系、および攪拌タンクバイオリアクター系が挙げられるが、これらに限定されない）に使用され得る。これらの方法のそれぞれは、バッチ処理、給飼バッチ処理、連続様式処理において実施され得る。
【０５３２】
本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドのヒト様式は、文書化された方法論を用いて、通常に回収され得る。例えば、培地または細胞ライセートは、細胞破片を除去するために遠心分離またはろ過され得る。上清は、所望の容積まで濃縮または希釈されてもよいし、またはさらなる精製用の調製物を適当な状態にする適切な緩衝液の中に透析されてもよい。本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドのさらなる精製は、原型の形態からジアミド化され、かつ短縮されたポリペプチドの形態の分離を含んでいる。
【０５３３】
本明細書に記載の方法および組成物の範囲にあるポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチド、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドに対する抗体、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドにとっての結合パートナーなどが挙げられるが、これらに限定されない。）は、文書化された方法論に従って、部分的または実質的に均質に精製される。したがって、本明細書に記載のポリペプチドは、文書化された方法論（例としては、硫酸アンモニウム沈殿もしくはエタノール沈殿、酸抽出もしくは塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、およびゲル電気泳動などを含んでいてもよく、またそれらの何れかの組合せであってもよいが、これらに限定されない。）によって、回収および精製され得る。タンパク質をリフォールディングする工程は、必要に応じて、正確に折りたたまれた成熟タンパク質を作製するときに、使用され得る。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、または他の適切な方法は、高い純度が所望される最終的な精製工程において採用され得る。一実施形態では、非天然アミノ酸（または非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチド）に対して作製された抗体は、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるペプチドの親和性に基づく精製などのための精製試薬として使用され得る。所望のように、部分的にまたは均質になるまで精製されると、ポリペプチドは、多種多様な有用物（例えば、アッセイの構成要素、治療学、予防法、診断学、研究試薬として、および／または抗体生成用の抗原としてであるが、これらに限定されない）に関して、必要に応じて使用される。
【０５３４】
真核生物の宿主細胞または非真核生物の宿主細胞において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドを生成することの１つの利点は、通常、ポリペプチドがそれらの本来の立体構造に折りたたまれることである。しかしながら、本明細書に記載の方法および組成物の一実施形態では、合成、発現および／または精製の後に、ポリペプチドが関連するポリペプチドの所望の立体構造とは異なる立体構造を有することがある。本明細書に記載の方法および組成物の別の実施形態では、発現タンパク質は必要に応じて変性され、且つその後復元される。この随意的な変性および復元は、実証されている方法によって成し遂げられるものであり、特に限定されないが、関連するポリペプチドに対するシャペロニンの添加によって、およびカオトロピック剤（特に限定されないが、例えば塩酸グアニジン）中においてポリペプチドを可溶化することによって、ならびにタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを用いることによって成し遂げられる。
【０５３５】
一般的に、発現したポリペプチドを変性および還元して、その後に、ポリペプチドを好ましい立体構造へリフォールディングさせることが望ましいことがある。例えば、このリフォールディングは、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥおよび／またはシャペロニンを関連する翻訳生成物に添加することによって実現され得る。タンパク質の還元、変性および復元の方法としては、上述した参考文献、「Debinskiら(1993)J.Biol.Chem.,268:14065-14070」、「Kreitman an Pastan(1993)Bioconjug.Chem.,4:581-585」、および「Bucherら(1992)Anal.Biochem.,205:263-270」に記載の方法が挙げられる。Ｄｅｂｉｎｓｋｉ，らは、例えば、グアニジン−ＤＴＥにおける封入体タンパク質の変性および還元を記載している。タンパク質は、還元剤（酸化型グルタチオンおよびＬ−アルギニンを含有する還元剤が挙げられるが、これらに限定されない。）においてリフォールディングされ得る。リフォールディング剤は、流されてもよいし、またはそうでなければ、１つ以上のポリペプチドもしくは他の発現生成物と接触するように移動させられてもよい。また、その逆もあり得る。
【０５３６】
非天然アミノ酸のポリペプチドを原核生物において生成する場合、そのように生成されるポリペプチドは、誤って折りたたまれることがある。このため、ポリペプチドの生物学的な活性が、欠如または低減されていることがあり得る。タンパク質の生物学的な活性は、「リフォールディング」によって復帰され得る。一実施形態では、誤って折りたたまれたポリペプチドは、例えば、１つ以上のカオトロピック剤（例えば、尿素および／またはグアニジン）およびジスルフィド結合を還元可能な還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または２メルカプトエタノール（２−ＭＥ））を用いて、ポリペプチド鎖を可溶化（ポリペプチドも不溶性である場合に）、アンフォールディングおよび還元されることによってリフォールディングされ得る。カオトロープの濃度が穏やかな場合に、ジスルフィド結合の強化を可能にする、酸化剤（例えば、限定されないが、酸素、クリスチン（crystine）またはクリスタミン（crystamine））が添加される。折りたたまれていない、または誤って折りたたまれたポリペプチドは、実証されている方法論（例えば、米国特許出願第４，５１１，５０２号明細書、米国特許出願第４，５１１，５０３号明細書、および米国特許出願第４，５１２，９２２号明細書に記載の方法、これらの文献は、引用によって本明細書に援用される。）を用いてリフォールディングされ得る。また、ポリペプチドは、他のタンパク質とコフォールディングされて、ヘテロ二量体またはヘテロ多量体を形成し得る。リフォールディングまたはコフォールディングの後に、ポリペプチドは、さらに必要に応じて精製される。
【０５３７】
精製の後、非天然アミノ酸のポリペプチドは、実証されている方法論（例として、ダイアフィルトレーションおよび透析が挙げられるが、これらに限定されない）の何れかによって異なる緩衝液に交換されてもよいし、および／または濃縮されてもよい。１つの精製されたタンパク質として提供されるｈＧＨは、凝集しやすく、且つ沈殿しやすくてもよい。いくつかの実施形態では、精製された非天然アミノ酸のポリペプチドは少なくとも９０％の純度であればよい（逆相高速液体クロマトグラフィー、ＲＰ−ＨＰＬＣ、またはドデシル硫酸−ポリアクリルアミドナトリウムゲル電気泳動，ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定される）。別の実施形態では、精製された非天然アミノ酸のポリペプチドは少なくとも９５％の純度、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％の純度またはそれ以上の純度であればよい。非天然アミノ酸のポリペプチドの純度の正確な数値にかかわらず、非天然アミノ酸のポリペプチドは、医薬品として利用するのに十分な純度であるか、またはさらなる処理（例えば、ＰＥＧのような水溶性ポリマーとの結合）にとって十分な純度である。
【０５３８】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチド分子は、（賦形剤、担体、安定剤、および血清アルブミンなど以外の）他の活性のある成分またはタンパク質が存在していない治療剤として用いられ得る。また、いくつかの実施形態では非天然アミノ酸のポリペプチド分子は他のポリペプチドまたはポリマーと複合されてもよい。
【０５３９】
多様な方法および工程が、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドの収量や純度の評価に使用され得る。例えば、タンパク質染色法と一緒になったＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫ブロッティング、質量分析、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析、調製用等電点電気泳動（isoelectric focusing）、分析陰イオン交換、等電点電気泳動（chromatofocusing）、および円偏光二色性が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質を特徴付けるための方法および工程の例としては、例えば、ブラッドフォード分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色されるＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシィー染色されるＳＤＳ−ＰＡＧＥなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる方法としては、特に限定されないが、例えばエンドトキシンを除去する工程が挙げられる。エンドトキシンは、グラム陰性の宿主細胞（例えば、Escherichia coli）の外膜上に位置するリポポリサッカライド（ＬＰＳ）である。エンドトキシンのレベルを低減させる方法は、特に限定されないが、シリカ支持体、ガラス粉末、またはヒドロキシアパタイトを用いた精製技術、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびこれらの方法の組合せなどが挙げられる。修正した方法、または別の方法が、混入物質（例えば、関連するポリペプチドから得られる共に混合するタンパク質）を除去するために必要になる可能性がある。エンドトキシンレベルを計測する方法は、例えば、リムルスアメーバリセート（Limulus Amebocyte Lysate）（ＬＡＬ）アッセイが挙げられる。
【０５４０】
いくつかの実施形態では、一般式Ｉ〜ＸＶの範囲に含まれる下位の一般式または特定の化合物を含んでいる一般式Ｉ〜ＸＶで示されるアミノ酸は、ポリペプチドに生合成的に導入され、これによって非天然アミノ酸のポリペプチドが作製される。別の実施形態では、このようなアミノ酸はポリペプチド内の特定の部位に組み込まれる。別の実施形態では、このようなアミノ酸は翻訳系によってポリペプチドに組み込まれる。別の実施形態では、このような翻訳系は：（ｉ）このようなポリペプチドをコードし、このようなアミノ酸が組み込まれる予め設計された部位に対応するセレクターコドンを含んでいるポリヌクレオチドと、（ｉｉ）このアミノ酸を含み、このセレクターコドンに対して特異的であるｔＲＮＡとを含んでいる。このような翻訳系の別の実施形態では、このようなポリヌクレオチドは翻訳系において生成されるｍＲＮＡである。このような翻訳系の別の実施形態では、翻訳系は、このようなポリヌクレオチドを含んでいるプラスミドまたはファージを含んでいる。このような翻訳系の別の実施形態では、翻訳系は、このようなポリヌクレオチドを含んでいるゲノムＤＮＡを含んでいる。このような翻訳系の別の実施形態では、このようなポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに安定的に組み込まれている。このような翻訳系の別の実施形態では、翻訳系は、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、非天然のコドン、５塩基コドン、および４塩基コドンから成る群より選択されるセレクターコドンに対して特異的なｔＲＮＡを含んでいる。このような翻訳系の別の実施形態では、ｔＲＮＡはサプレッサーｔＲＮＡである。このような翻訳系の別の実施形態では、翻訳系は、このようなアミノ酸によってアミノアシル化されたｔＲＮＡを含んでいる。このような翻訳系の別の実施形態では、翻訳系には、ｔＲＮＡに対して特異的なアミノアシルシンテターゼを含んでいる。このような翻訳系の別の実施形態では、翻訳系には直交なｔＲＮＡおよび直交なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含んでいる。このような翻訳系の別の実施形態では、ポリペプチドはリボソームによって合成され、さらなる実施形態では翻訳系は、細菌細胞、古細菌細胞、および真核細胞から成る群より選択される細胞を含んでいる、インビボにおける翻訳系である。別の実施形態では、細胞はEscherichia coli細胞、酵母細胞、Pseudomonas種由来の細胞、哺乳類細胞、植物細胞、または昆虫細胞である。このような翻訳系の別の実施形態では、翻訳系は、細菌細胞、古細菌細胞または真核細胞に由来する細胞抽出物を含んでいる、インビトロにおける翻訳系である。別の実施形態では、細胞抽出物は、Escherichia coli細胞、Pseudomonas種由来の細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、植物細胞、または昆虫細胞に由来する。別の実施形態では、少なくとも一部のポリペプチドは、固相ペプチド合成または液相ペプチド合成あるいはそれらの組合せによって合成される。一方、別の実施形態では、ポリペプチドと別のポリペプチドとの結合反応をさらに含んでいる。別の実施形態では、一般式Ｉ〜ＸＶの範囲に含まれる下位式または特定の化合物を含んでいる一般式Ｉ〜ＸＶで示されるアミノ酸は、ポリペプチドに生合成的に導入され、このポリペプチドは、治療タンパク質と相同なタンパク質である。
【０５４１】
‐Ｂ．インビボにおける翻訳後修飾‐
真核細胞において、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するポリペプチドを製造した場合に、このポリペプチドは真核細胞の翻訳後修飾を含んでいてもよい。ある実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含み、且つ、少なくとも１つの翻訳後修飾を含んでいる。なお、翻訳後修飾は、原核細胞によってなされず、真核細胞によってインビボにおいてなされるものである。例えば、翻訳後修飾としては、特に限定されないが、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸の付加、リン酸化、糖脂質が結合する修飾、グリコシル化などが挙げられる。一態様において、翻訳後修飾としては、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合による、オリゴサッカライド（例えば、（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃが挙げられるが、これに限定されない）とアスパラギンとの結合が挙げられる。真核細胞のタンパク質のＮ−結合されたオリゴサッカライドについて、いくつかの例を記載した表１を参照のこと（別の残基も存在し得るが、示されていない）。別の態様において、翻訳後修飾としては、ＧａｌＮＡｃ−セリンの結合もしくはＧａｌＮＡｃ−トレオニンの結合、またはＧｌｃＮＡｃ−セリンの結合もしくはＧｌｃＮＡｃ−トレオニンの結合による、オリゴサッカライド（特に限定されないが、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどが挙げられる。）とセリンまたはトレオニンとの結合が挙げられる。
【０５４２】
【表２】
2010512800.tif 000070
【０５４３】
さらに別の態様において、翻訳後修飾としては、前躯体のタンパク質分解処理、マルチサブユニットのタンパク質への集合または高分子集合、細胞内の別の部位への翻訳（translation）が挙げられる。前躯体としては、カルシトニン前躯体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド前躯体、プレプロパラチロイドホルモン、プレプロインシュリン、プロインシュリン、プレプロ−オピオメラノコルチン（prepro-opiomelanocortin）、プロ−オピオメラノコルチン（pro-opiomelanocortin）などが挙げられるが、これらに限定されない。細胞内の別の部位としては、例えば、小胞体、ゴルジ体、核、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などの細胞小器官、または分泌経路を経由することもあるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、タンパク質は、分泌、または、局在性配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、あるいはＧＳＴ融合などを含んでいる。
【０５４４】
非天然アミノ酸の利点の１つは、非天然アミノ酸は付加的な分子を加えるために用いられ得る、付加的な化学部分が存在することである。これらの修飾は、真核細胞または非真核細胞のインビボにおいて、あるいはインビトロにおいて行われ得る。このように、いくつかの実施形態では翻訳後修飾は、非天然アミノ酸を介して生じる。例えば、翻訳後修飾は求核−求電子反応によってなされる。多くの反応は、一般に求核と求電子との反応パートナー間での共有結合形成（特に限定されないが、α−ハロケトンと、ヒスチジンまたはシステイン側鎖との反応）を含んでいるタンパク質を選択的に修飾するために利用される。これらの場合における選択性は、タンパク質における求核性の残基の数および近接性によって決定される。本明細書に記載のポリペプチド、または本明細書に記載の方法を用いて作製されたポリペプチドにおいて、他のより選択的な反応を用いることができる。そのような反応としては、特に限定されないが、インビトロおよびインビボにおける、非天然のカルボニルアミノ酸とヒドラジンとの反応が挙げられる。例えば、「Cornishら, (1996)J.Am.Chem.Soc.,118:8150-8151」、「Mahalら, (1997)Science,276:1125-1128」、「Wangら(2001) Science,292:498-500」、「Chinら, (2002)J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027」、「Chinら, (2002)Proc.Natl.Acad.Sci.,99:11020-11024」、「Wangら, (2003)Proc.Natl.Acad.Sci.,100:56-61」、「Zhangら, (2003)Biochemistry42:6735-6746」、および「Chinら, (2003) Science,300:964-967」を参照のこと。これによれば、多くの試薬（蛍光団、架橋剤、サッカライド誘導体および細胞毒性分子など）によって、実質的に任意のタンパク質を選択的に標識することができる。また、米国特許出願第10/686,944号（発明の名称：「Glycoprotein synthesis」、２００３年１月１６日出願）も参照のこと。なお、これらの特許文献は、参照によって本明細書に援用される。また、翻訳後修飾（アジドアミノ酸を介した翻訳後修飾など）を、シュタウディンガーライゲーションによって（例えば、トリアリールホスフィン試薬を用いて）作製することができる。例えば、「Kiickら, (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99（1）:19-24」を参照のこと。
【０５４５】
＜ＩＸ．非天然アミノ酸のポリペプチドを製造するための代替系＞
いくつかの方策が、非組み換え宿主細胞、突然変異を起した宿主細胞、または無細胞系においてタンパク質に非天然アミノ酸を組み込むために採用されている。この点に関するさらなる詳細は、米国特許出願第11/316.534号に記載されている。
【０５４６】
＜Ｘ．ポリペプチドの非天然アミノ酸要素の翻訳後修飾＞
便宜上、この項（ＸＡ〜ＸＪ）に記載されているポリペプチドの非天然アミノ酸要素の翻訳後修飾は、一般的に、および／または特定の例を伴って説明されている。しかしながら、この項に記載されているポリペプチドの非天然アミノ酸要素の翻訳後修飾は、この項において提供される一般的な説明または特定の例のみに限定されるものではない。むしろこの項に記載のポリペプチドの非天然アミノ酸要素の翻訳後修飾は、本明細書、特許請求の範囲および図面に記載の一般式Ｉ〜ＸＶで示される化合物および構造１〜４の化合物の範囲内に含まれるすべての化合物（一般式Ｉ〜ＸＶおよび構造１〜４の化合物の範囲内に含まれるあらゆる下位の一般式または特定の化合物を包含する。）に対して等しく適用される。
【０５４７】
方法、組成物、技術および方策は、インビボにおけるタンパク質の翻訳中に、非天然アミノ酸を部位特異的に組み込むために開発されている。天然アミノ酸の側鎖の化学的性質に対して直交する化学的性質の側鎖を有する非天然アミノ酸を組み込むことによって、この技術は、組換えタンパク質の部位特異的な誘導対化を可能にする。結果として、本明細書に記載の方法、組成物、技術および方策の主な利点は、誘導体化されたタンパク質が規定された均質な生成物として直ちに調製され得ることである。しかしながら、本明細書に記載の方法、組成物、反応混合物、技術および方策は、インビボのタンパク質翻訳技術によって形成される非天然アミノ酸のポリペプチドに限定されず、例えば、発現したタンパク質のライゲーション、化学合成、リボザイムに基づく技術（例えば、本明細書の「代替系における発現」と表題される項を参照のこと。）などの任意の技術によって形成される非天然アミノ酸のポリペプチドをも含んでいる。
【０５４８】
組換えタンパク質へ非天然アミノ酸を組み込むことができことによって、インビトロまたはインビボのどちらかにおいて生じる、翻訳後の誘導体化のために実施され得る化学反応が多様化される。より具体的には、ポリペプチドの非天然アミノ酸部位にインドール結合を形成するためのカルボニルとヒドラジンとの反応を利用した、ポリペプチドの誘導体化は、いくつかの利点を提供する。まず第１に、天然に生じるアミノ酸は、（ａ）ヒドラジン基と反応することによってインドール結合を形成することができるカルボニル基を含まない。また（ｂ）ヒドラジン基は、カルボニル基と反応することによってインドール結合を形成することができる。したがって、インドール結合を形成するように作られた試薬は、ポリペプチドの非天然アミノ酸要素と部位特異的に反応することがある（言うまでもなく、非天然アミノ酸および対応する試薬は、そのような結合を形成するように作られていることを想定する。）。したがって、タンパク質を部位特異的に誘導体化することによって、実証されている方法によってタンパク質を誘導体化することとは対照的に、単一の均質な生成物が生成される。第２に、このようなインドール結合は、生物学的環境下で安定している。これは、インドール結合によって誘導体化されたタンパク質が、治療への応用にとって有効な候補であるということを示唆している。第３に、生じたインドール結合の安定性は、インドール結合が形成された非天然アミノ酸の固有性（例えば、官能基および／または構造）に基づいて操作することができる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドに連結したインドール結合の分解半減期は、１時間未満であり、別の実施形態では１日未満であり、別の実施形態では２日未満であり、別の実施形態では１週間未満であり、別の実施形態では１週間よりも長い。さらに別の実施形態では、生じたインドール結合は、弱酸性の環境下で少なくとも２週間安定している。さらに別の実施形態では、生じたインドール結合は、弱酸性の環境下で少なくとも５日間安定している。別の実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは約２〜約８のｐＨにおいて少なくとも１日間安定しており、別の実施形態では、約２〜約６のｐＨで少なくとも１日間安定しており、別の実施形態では、約２〜約４のｐＨにおいて、少なくとも１日間安定している。別の実施形態では、別の実施形態では、本明細書に記載の方策、方法、組成物および技術を用いた、非天然アミノ酸のポリペプチドとのインドール結合は、例えば、治療上の使用（例えば徐放）、診断上の使用、産業上の使用、または軍事上の使用などの間近の状況にあわせて調整した分解半減期で合成される。
【０５４９】
上述した非天然アミノ酸のポリペプチドは、特に限定されないが、新規の治療、診断、触媒酵素、工業用酵素、および結合タンパク質（抗体および抗体断片があるが、これらに限定されない。）に有用であるとともに、タンパク質の構造や機能の研究などに有用である。例えば、「Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4:645-652」を参照のこと。上述した非天然アミノ酸のポリペプチドに関する別の使用としては、例えば、アッセイに基づく使用、化粧品への使用、植物生物学な使用、環境への使用、エネルギー生産への使用および／または軍事上の使用が挙げられる。また一方、上述した非天然アミノ酸のポリペプチドは、新たなまたは修飾された官能基を組み込むために、さらなる修飾を受けることができる。この官能基としては、ポリペプチドの治療有効性の操作、ポリペプチドの安全性プロフィールの改善、ポリペプチドの薬物動態学的性質、薬理学的性質および／または薬力学的性質の調節（例えば、水溶性の増加、バイオアベイラビリティ、血中半減期の増加、治療半減期の増加、免疫原性の調節、生物学的な活性の調節、または循環時間の延長）、ポリペプチドへのさらなる官能基の提供、ポリペプチドへのタグ、標識または検出可能なシグナルの組込み、ポリペプチドの単離性の緩和、および上述した修飾の何れかの組合せが挙げられる。
【０５５０】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドの単離性を緩和する方法は、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸とヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸から成る群より選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる均質な非天然アミノ酸のポリペプチドを利用する工程を含んでいる。別の実施形態においては、このような非天然アミノ酸は、生合成的に本明細書に記載のポリペプチドに組み込まれている。さらに別の実施形態においては、このような非天然アミノ酸のポリペプチドは一般式Ｉ〜ＸＶで示されるアミノ酸から選択された少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる。さらに別の実施形態においては、このような非天然アミノ酸のポリペプチドは、構造１〜４で示された化合物のアミノ酸から選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる。
【０５５１】
本明細書に記載の方法、組成物、方策および技術は、ポリペプチドの、特定のタイプ、クラス、あるいはファミリーに限定されるものではない。実際に、事実上すべてのポリペプチドが、本明細書に記載の少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでもよい。単なる一例として、ポリペプチドは、治療タンパク質と相同であり得る。また、非天然アミノ酸のポリペプチドは、成長ホルモンスーパーファミリーのいかなるポリペプチドメンバーと相同であってもよい。
【０５５２】
このような修飾は、ポリペプチドの非天然アミノ酸の組成物へのさらなる官能基（例えば、特に限定されないが、所望の官能基）の組み込みを含んでいる。
【０５５３】
さらに、非天然アミノ酸のポリペプチドは、例えばカルボニルまたはヒドラジンの様な他の官能基に変換される部分を含んでもよい。図２３は非天然アミノ酸のポリペプチドの、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドおよびヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドへの化学変換を示す。生成されたカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドおよびヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、本発明に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸のポリペプチド、および修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドの生成、精製、特徴付け、および使用のための、方法、組成物、方策および技術に使用されてもよいし、または組み込まれてもよい。例えばカルボニルまたはヒドラジンといった他の官能基への化学部分の化学変換は、例えば、「in March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 5th Ed., (Wiley 2001)」や、「Carey and Sundberg, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4th Ed., Vols. A and B (Plenum 2000, 2001)」といった実証された方法を用いて行うことができる。
【０５５４】
さらに、ヒドラジンを含んでいる試薬でカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを化学修飾することを用いて、適度な励起条件下において強い蛍光を発するインドール誘導体を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを生成することができる。図１９および図２１はヒドラジンを含んでいる試薬によるカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドの化学修飾を示す。加えて、ヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、カルボニルを含んでいる試薬と化学的に反応して、適度な励起条件下で強い蛍光を発するインドール誘導体を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチド生成することができる。図２０および図２２は、カルボニルを含んでいる試薬によるヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドの化学修飾を示す。
【０５５５】
‐Ａ．非天然アミノ酸のポリペプチドの翻訳後修飾の方法：インドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドの合成‐
置換カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸および置換ヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸をリペプチドへ組み込みむことによって、インドール結合の形成に基づく部位特異的な誘導体化をもたらす。誘導体化および／またはさらなる修飾の方法は、誘導体化の工程の前もしくは誘導体化の工程の後に精製されたポリペプチドを使用して行えばよい。加えて、誘導体化および／またはさらなる修飾の方法は、このような修飾の前もしくは後に精製された合成高分子、ポリサッカライド、もしくはポリヌクレオチドを使用して行えばよい。加えて、誘導体化の工程は、例えば約１〜約６の間のｐＨの弱酸性の状況下で効率的に起こる可能性がある。
【０５５６】
さらに、いくらかのインドール結合は、様々な検出方法にて使用される蛍光性の非天然アミノ酸のポリペプチドの生成を可能にする。
【０５５７】
図２１はヒドラジンを含んでいる試薬によるカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドの部位特異的な標識を示す。図２２はカルボニルを含んでいる試薬によるヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドの部位特異的な標識を示す。
【０５５８】
加えて、誘導体化は一方の末端にカルボニル基またはヒドラジン基を、他方の末端に官能基を含んでいる試薬を使用して行えばよい。生成したインドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、分子を導入するためにさらに修飾する事ができる。このような分子には、例えば、ポリマー、ポリサッカライド、またはポリヌクレオチドなどが挙げられる。図２４Ｂは、ＰＥＧ誘導体と官能基を含んでいるポリペプチドとの反応の例を説明する図である。
【０５５９】
例えば、一般式（ＸＶＩ）で示される試薬はインドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを生成するために使用される、カルボニルを含んでいる試薬またはヒドラジンを含んでいる試薬のタイプであり、さらに、他の分子を導入するために修飾されることができる。一実施形態において、一般式Ｉ〜ＩＶで示されるヒドラジンを含んでいる化合物は、カルボニル基を含んでいる一般式ＸＶＩで示される試薬と反応し、インドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを生成する。別の実施形態においては、一般式Ｖ〜ＸＩＶで示されるカルボニルを含んでいる化合物は、ヒドラジン基を含んでいる一般式ＸＶＩ：
【０５６０】
【化６７】
2010512800.tif 000071
【０５６１】
で示される試薬と反応し、インドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを生成する。ここで、
Ｘはそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’’、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２であり、Ｒ’’は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルであるか、または、
Ｘはそれぞれ独立して、所望の官能基であり；
Ｌはそれぞれ独立して、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２または３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択され；
Ｌ１は必要に応じて存在し、存在する場合に、−Ｃ（Ｒ’）ｐ−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−であり、ｐは０、１、または２であり；
Ｒ’は独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
Ｗは、
【０５６２】
【化６８】
2010512800.tif 000072
【０５６３】
であり；ＲはＨ、アルキルまたは置換アルキルである。
【０５６４】
一般式（ＸＶＩ）で示される化合物のいくつの実施形態において、Ｘは、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキルまたは置換アラルキルを含んでいるポリマーである。一般式（ＸＶＩ）で示される化合物のいくつかの実施形態においては、Ｘは、ポリアルキレンオキシドまたは置換ポリアルキレンオキシドを含んでいるポリマーである。一般式（ＸＶＩ）で示される化合物のいくつかの実施形態においては、Ｘは、−［（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−（ハロゲン、アルキルまたは置換アルキル）］ｘ（ｘは約２０〜約１０，０００である）を含んでいるポリマーである。一般式（ＸＶＩ）で示される化合物のいくつかの実施形態においては、Ｘは、約２〜約４０ｋＤａの分子量を有するｍ−ＰＥＧである。一般式（ＸＶＩ）で示される化合物のいくつかの実施形態においては、Ｘは、ペプチド、タンパク質、酵素、抗体、薬物、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子、およびミセルから成る群より選択される生物学的に活性な剤である。一般式（ＸＶＩ）で示される化合物のいくつかの実施形態においては、Ｘは、抗生物質、殺菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心・血管作動薬、抗不安剤、ホルモン、成長因子、およびステロイド剤から成る群より選択される薬物である。一般式（ＸＶＩ）で示される化合物のいくつかの実施形態においては、Ｘは、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼから成る群より選択される酵素である。一般式（ＸＶＩ）で示される化合物のいくつかの実施形態においては、Ｘは、蛍光性部分、燐光性部分、化学発光性部分、キレート化部分、電子密度の高い部分、磁性部分、インターカレートする部分、放射性部分、発色性部分、およびエネルギーを伝達する部分から成る群より選択される検出可能な標識である。一般式（ＸＶＩ）で示される化合物のいくつかの実施形態においては、Ｘは、カルボニルを含んでいる部分およびヒドラジンを含んでいる部分からなる反応基である。一般式（ＸＶＩ）で示される化合物のいくつかの実施形態においては、Ｘは、インドール誘導体ある。一般式（ＸＶＩ）で示される化合物のいくつかの実施形態においては、Ｌは、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、および−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−から成る群より選択される。
【０５６５】
いくつかの実施形態においては、一般式（ＸＶＩ）で示される化合物は、一般式（ＸＶＩＩ）：
【０５６６】
【化６９】
2010512800.tif 000073
【０５６７】
で示される構造であって：
Ｗは、
【０５６８】
【化７０】
2010512800.tif 000074
【０５６９】
であり；ＲはＨ、アルキルまたは置換アルキルである。
【０５７０】
いくつかの実施形態においては、一般式（ＸＶＩＩ）で示される化合物は、一般式（ＸＶＩＩＩ）：
【０５７１】
【化７１】
2010512800.tif 000075
【０５７２】
で示される構造を有し、他の実施形態においては、このようなｍ−ＰＥＧ基またはＰＥＧ基は約５〜約３０ｋＤａの分子量を有するものである。
【０５７３】
いくつかの実施形態においては、一般式（ＸＶＩＩ）で示される化合物は、一般式（ＸＩＸ）：
【０５７４】
【化７２】
2010512800.tif 000076
【０５７５】
で示される構造を有し、
Ｗは、
【０５７６】
【化７３】
2010512800.tif 000077
【０５７７】
であり；ＲはＨ、アルキルまたは置換アルキルである。
【０５７８】
Ｙは、存在する場合には、アルキルまたは置換アルキルである。
【０５７９】
Ｌは、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−である。いくつかの実施形態において、一般式（ＸＶＩＩ）で示される化合物は、一般式（ＸＸ）：
【０５８０】
【化７４】
2010512800.tif 000078
【０５８１】
で示される構造を有し、他の実施形態においては、一般式（ＸＸ）で示される化合物中のｍ−ＰＥＧ基は約５〜約３０ｋＤａの分子量を有するものである。
【０５８２】
いくつかの実施形態においては、一般式（ＸＶＩＩ）で示される化合物は、一般式（ＸＸＩ）：
【０５８３】
【化７５】
2010512800.tif 000079
【０５８４】
で示される構造を有し、
Ｗは、
【０５８５】
【化７６】
2010512800.tif 000080
【０５８６】
であり、ＲはＨ、アルキルまたは置換アルキルである。
【０５８７】
Ｙは、存在する場合には、アルキルまたは置換アルキルである。
【０５８８】
Ｌは、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−である。いくつかの実施形態においては、一般式（ＸＸＩ）で示される化合物は、一般式（ＸＸＩＩ）：
【０５８９】
【化７７】
2010512800.tif 000081
【０５９０】
で示される構造を有し、他の実施形態においては、一般式（ＸＸＩＩ）で示される化合物中のｍ−ＰＥＧ基は約５〜約３０ｋＤａの分子量を有する。
【０５９１】
いくつかの実施形態においては、一般式（ＸＶＩＩ）で示されるリンカーはカルボニルを含んでいるポリペプチドまたはヒドラジンを含んでいるポリペプチドと、酸性条件の水溶液中にて反応する。いくつかの実施形態において、この酸性条件は、約１〜約６のｐＨである。
【０５９２】
いくつかの実施形態においては、一般式（ＸＶＩＩ）で示される化合物は、一般式（ＸＸＩＩＩ）：
【０５９３】
【化７８】
2010512800.tif 000082
【０５９４】
で示される構造を有し、
ＺはＯまたはＮＨであり、ｎは１、２、３、および４であり、
Ｗは、
【０５９５】
【化７９】
2010512800.tif 000083
【０５９６】
であり、ＲはＨ、アルキルまたは置換アルキルである。いくつかの実施形態においては、一般式（ＸＸＩＩＩ）で示される化合物は、一般式（ＸＸＩＶ）：
【０５９７】
【化８０】
2010512800.tif 000084
【０５９８】
で示される構造を有している。
【０５９９】
いくつかの実施形態においては、一般式（ＸＸＩＩＩ）で示される化合物は、一般式（ＸＸＶ）：
【０６００】
【化８１】
2010512800.tif 000085
【０６０１】
で示される構造を有している。
【０６０２】
いくつかの実施形態において、一般式Ｉ〜ＸＶで示されるアミノ酸および構造１〜４を有する化合物（一般式Ｉ〜ＸＶで示される化合物の範囲に包含される任意の下位の一般式で示されう化合物または特定の化合物を含んでいる。）を含んでいるポリペプチドを誘導体化する方法は、一般式Ｉ〜ＸＶで示されるアミノ酸を少なくとも１つ含んでいるポリペプチドを、一般式（ＸＶＩ）で示される試薬と接触させる工程を含んでいる。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドは、一般式（ＸＶＩ）で示される試薬との接触の前または後に精製される。別の実施形態において、生成されたポリペプチドは、カルボニルを少なくとも１つの含んでいるか、またはヒドラジンを少なくとも１つの含んでいる一般式Ｉ〜ＸＶで示されるアミノ酸を含んでいる。別の実施形態において、生成されたポリペプチドは、一般式Ｉ〜ＸＶで示される化合物と一般式（ＸＶＩ）で示される試薬との結合によって生成した少なくとも１つのインドールを含んでいるポリペプチドを含んでいる。
【０６０３】
図２６は一般式（ＸＸＩＶ）で示される二官能性リンカーの合成を説明するための例を示す。この方法では、両端にアミン基またはヒドロキシル基を含んでいるスペーサー試薬と、Ｂｏｃによって保護されたヒドラジンを含んでいる酸とを結合させる。Ｂｏｃ基を切断することによって、一般式（ＸＸＩＶ）で示されるリンカーが得られる。
【０６０４】
図２７は、カルボニルの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドと一般式（ＸＸＩＶ）の試薬との翻訳後修飾によってインドールを含んでいるポリペプチドを形成することを示す概略図である。
【０６０５】
図２８は、カルボニルの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドと一般式ＸＸおよびＸＸＩＩの試薬との翻訳後修飾によってインドールを含んでいるポリペプチドを形成することを示す概略図である。
【０６０６】
図２９は、ヒドラジンの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドと一般式ＸＸおよびＸＸＩＩの試薬との翻訳後修飾によってインドールを含んでいるポリペプチドを形成することを示す概略図である。
【０６０７】
図３０は、一般式（ＸＶＩＩＩ）で示される試薬の例を示す。
【０６０８】
いくつかの実施形態では、インドール結合によってポリペプチド二量体を生成する方法は、一般式（ＸＸＩＩＩ）で示されるリンカーとカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドまたはヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドとを反応させる工程を含んでいる。図２７は、一般式（ＸＸＩＶ）で示されるリンカーとカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドとの縮合を用いた二量体の形成の代表例を示す。
【０６０９】
いくつかの実施形態では、二官能性リンカーの使用して、インドール部分を含んでいるポリペプチドを調製する方法は、 (ｉ) 二官能性リンカーを用いて、一般式（Ｉ）で示されるアミノ酸を含んでいる第一のポリペプチドを誘導体化する工程、および（ii）工程（ｉ）において生じたから誘導体化されたタンパク質をＰＥＧ等の第二の試薬と接触させる工程を含んでいる。いくつかの実施形態においてポリペプチドは、二官能性リンカーとの接触の前もしくは後に調製される。
【０６１０】
図２４は、二官能性リンカーおよびこの二官能性リンカーを使用してＰＥＧ基に付着したインドールを含んでいるポリペプチドを生成することを説明する例を示す図である。
【０６１１】
例えば、下記は一般式（ＸＸＶＩ）：
【０６１２】
【化８２】
2010512800.tif 000086
【０６１３】
の二官能性リンカーの代表例であって、
Ｗは、
【０６１４】
【化８３】
2010512800.tif 000087
【０６１５】
であり；ＲはＨ、アルキルまたは置換アルキルであり、
Ｌは、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−である。
【０６１６】
一実施形態において、複数のリンカーは、カルボニルまたはヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドと部位特異的に反応し得る。一実施形態において、本明細書に記載されたリンカーを用いる方法は、リンカー（一官能性リンカー、二官能性リンカーまたは多官能性リンカー）の少なくとも１つの末端にヒドラジン官能基を含んでいるリンカーを利用するものである。ヒドラジンで誘導体化されたリンカーとカルボニルで置換されたタンパク質とを反応させることによって、インドールで置換された非天然タンパク質が生成される。別の実施形態において、本明細書に記載されるリンカーを用いる方法は、リンカーリンカー（一官能性リンカー、二官能性リンカーまたは多官能性リンカー）の少なくとも１つの末端にカルボニル官能基を含んでいるリンカーを利用する。カルボニルで誘導体化されたリンカーとヒドラジンで置換されたタンパク質とを反応させることによって、インドールで置換された非天然タンパク質が生成される。
【０６１７】
いくつかの実施形態においては、カルボニルを含んでいる非天然ポリペプチドまたはヒドラジンを含んでいる非天然ポリペプチドを含んでいる化学的に合成されたポリペプチドを、カルボニルを含んでいる試薬またはヒドラジンを含んでいる試薬を用いて誘導体化し、インドール誘導体を形成する。
【０６１８】
図１９は、ヒドラジンを含んでいる試薬を用いた、カルボニルを含んでいるウロテンシンの誘導体化の例を示す。この説明のための実施形態において、ヒドラジンを含んでいる試薬は、カルボニルを含んでいるウロテンシン類似体の緩衝液（ｐＨ１〜５）に加えられる。反応は、室温にて数時間〜数日にわたって進行する。
【０６１９】
図２０はカルボニルを含んでいる試薬を用いた、ヒドラジンを含んでいるウロテンシンの誘導体化を説明するための例を示す。この説明のための実施形態においては、カルボニルを含んでいる試薬は、ヒドラジンを含んでいるウロテンシン類似体の緩衝液（ｐＨ１〜５）に加えられる。反応は、室温にて数時間〜数日にわたって進行する。
【０６２０】
他の実施形態において、このような誘導体化されたポリペプチドは、弱酸性の水溶液中にて少なくとも一ヶ月間安定である。他の実施形態において、このような誘導体化されたポリペプチドは、弱酸性の水溶液中にて少なくとも２週間安定である。他の実施形態において、このような誘導体化されたポリペプチドは、弱酸性の水溶液中にて少なくとも５日間安定である。他の実施形態において、このような弱酸性の条件は、約１〜６のｐＨである。いくつかの実施形態において、誘導体化されたポリペプチドの三次構造は保存されている。他の実施形態においては、ポリペプチドの誘導体化はさらに、誘導体化されたポリペプチドを、別のポリペプチドに結合させることを含んでいる。別の実施形態においては、このような誘導体化されたポリペプチドは治療タンパク質と相同である。
【０６２１】
‐Ｂ．さらなる官能基の追加の例：非天然アミノ酸のポリペプチドと結合する高分子ポリマー‐
本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドに対する様々な修飾は、本明細書に記載の組成物、方法、技術および方策を用いてもたらされ得る。これらの修飾は、ポリペプチドの非天然アミノ酸の組成物へさらなる官能基を組み込むことを含んでいる。このような官能基としては、特に限定されないが、所望の官能基が挙げられる。本明細書に記載の組成物、方法、技術および方策の非限定的な例として、以下の説明では、高分子ポリマーを非天然アミノ酸のポリペプチドに追加する方法について述べる。しかし、この説明において記載されている組成物、方法、技術および方策は、他の官能基（上述した官能基が含まれるが、これらに限定されない。）を追加するために適用可能であることが理解される。
【０６２２】
多種多様な高分子ポリマーおよび他の分子は、非天然アミノ酸のポリペプチド（または対応する天然アミノ酸のポリペプチド）の生物学的性質を調節するため、および／または非天然アミノ酸のポリペプチド（または対応する天然アミノ酸のポリペプチド）へ新規な生物学的性質を提供するために、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドと結合され得る。これらの高分子ポリマーは、非天然アミノ酸、または非天然アミノ酸の任意の置換基、あるいは非天然アミノ酸に追加された任意の置換基または官能基によって非天然アミノ酸のポリペプチドと結合することが可能である。
【０６２３】
水溶性ポリマーは、本明細書に記載の（天然または合成の）ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリサッカライドまたは合成ポリマーに組み込まれる非天然アミノ酸と連結され得る。水溶性ポリマーは、ポリペプチドに組み込まれた非天然アミノ酸、または非天然アミノ酸の任意の官能基または置換基、あるいは非天然アミノ酸に追加された任意の官能基または置換基によって結合され得る。ある例では、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドは、水溶性ポリマーと連結される１つ以上の非天然アミノ酸、および水溶性ポリマーと結合される１つ以上の天然アミノ酸を含んでいる。親水性ポリマーと生物学的に活性な分子との共有結合は、水溶性の増加（例えば、生理的環境での水溶性の増加）、バイオアベイラビリティ、血中半減期の増加、治療半減期の増加、免疫原性の調節、生物学的な活性の調節、または生物学的に活性な分子（例えば、タンパク質、ペプチド、および特定の親水性分子）の循環時間の延長を行うための１つの手段であるといえる。このような親水性ポリマーのさらに重要な性質としては、例えば生体適合性、毒性の欠如、および免疫原性の欠如が挙げられる。好ましくは、最終的に製造された調製品の治療上の使用にとって、ポリマーは薬学的に許容可能である。
【０６２４】
親水性ポリマーの例としては、特に限定されないが、ポリアルキルエーテルおよびアルコキシによってキャップされたポリアルキルエーテルの類似体（例えば、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレン／プロピレングリコール、およびメトキシによってキャップされているか、またはエトキシによってキャップされたそれらの類似体が挙げられ、特にポリオキシエチレングリコールが好ましい。また、後者はポリエチレングリコールまたはＰＥＧとして知られている。）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルキルエーテル、ポリオキサゾリン、ポリアルキルオキサゾリンおよびポリヒドロキシアルキルオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリアルキルアクリルアミド、ならびにポリヒドロキシアルキルアクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドおよびその誘導体）、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリシアリック酸およびその類似体、親水性ペプチド配列、ポリサッカライドおよびその誘導体（例えば、デキストラン、およびカルボキシメチルデキストラン、デキストラン硫酸、アミノデキストランなどのデキストラン誘導体）、セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース）、キチンおよびその誘導体（例えば、キトサン、スクシニルキトサン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン）、ヒアルロン酸およびその誘導体、スターチ、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、アルブミン、プルランおよびカルボキシメチルプルラン、ポリアミノ酸およびその誘導体（例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリアスパルトアミド（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔａｍｉｄｅｓ））、無水マレイン酸の共重合体（例えば：スチレンと無水マレイン酸との共重合体、ジビニルエチルエーテルと無水マレイン酸との共重合体）、ポリビニルアルコール、それらの共重合体、それらの三元重合体、それらの混合物、およびそれらの誘導体が挙げられる。水溶性ポリマーは、特に限定されないが、任意の構造であってもよい。このような構造としては、特に限定されないが、直線状の構造、分岐した構造、または枝分かれ構造が挙げられる。いくつかの実施形態では、約２〜約３００の末端を有する水溶性ポリマーの骨格が、特に有用である。多官能性ポリマー誘導体としては、２つの末端のそれぞれが、同一の官能基、または異なる官能基と結合されている直線状のポリマーが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、水性ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる。ポリマーの分子量は広い範囲に亘るものであってもよい。実質的な水溶性骨格に関する上述の例示は、決して包括的ではないただの一例にすぎず、また、このような性質を有するすべてのポリマー材料が、本明細書に記載の方法および組成物に利用するために適しているとして検討されている。
【０６２５】
上述したように、親水性ポリマーの一例としては、人工移植において、または毒性および免疫原性のない生体適合性が重要となる他の用途において、薬学的に広範囲に亘って用いられている、ＰＥＧと省略されるポリエチレングリコールである。本明細書に記載されている、ポリマー：ポリペプチドの実施形態では、親水性ポリマーの例としてＰＥＧが用いられるが、このような実施形態では他の親水性ポリマーが同様に利用され得ることが理解される。
【０６２６】
ＰＥＧは、市販されている水溶性ポリマー、または当該技術分野において実証されている方法（例えば、「Sandler and Karo,Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161」を参照のこと。）に従って、エチレングリコールの開環重合によって調製され得る。ＰＥＧは、一般的に透明、無色、無臭、水に可溶、熱に対して安定、多くの化学製剤に対して不活性、加水分解または劣化しないものであり、一般的に無毒である。ポリ（エチレングリコール）は生体適合性があるとみなされている。すなわち、ＰＥＧは、危害を加えることなく生体組織または有機体と共存できる。より具体的には、ＰＥＧは実質的に免疫原性がなく、このことは、ＰＥＧが生体において免疫応答を引き起こす傾向にはないことを示す。生体において、いくつかの望ましい機能を有する分子（例えば、生物学的に活性な剤）とＰＥＧとが結合する場合、ＰＥＧはこのような生物学的に活性な剤をマスクキングする傾向にあり、任意の免疫応答を緩和または除去することができるので、生物はこのような生物学的に活性な剤の存在に耐えることができる。ＰＥＧ接合体は、実質的な免疫応答を引き起こしたり、凝固または他の望ましくない影響をもたらしたりする傾向はない。
【０６２７】
用語「ＰＥＧ」は、ＰＥＧのサイズまたは末端での修飾には関係なく、任意のポリエチレングリコール分子を包含するために、幅広く用いられる。非天然アミノ酸のポリペプチドと連結するようなＰＥＧは、一般式：
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
で表わされ得る。この一般式において、ｎは２〜１０，０００であり、ＸはＨまたは末端修飾（特に限定されないが、Ｃ１−４アルキル、保護基、または末端官能基を含んでいる。）である。用語「ＰＥＧ」は、特に限定されないが、例えば、二官能性ＰＥＧ、マルチアームドＰＥＧ、誘導体化されたＰＥＧ、分枝状のＰＥＧ、枝分かれＰＥＧ（各鎖の分子量は、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、または約１ｋＤａ〜約２０ｋＤａである）、垂れ下がった（ｐｅｎｄｅｎｔ）ＰＥＧ（例えば、ポリマー骨格へ垂れ下がっている１つ以上の官能基を有するＰＥＧまたは関連するポリマー）、または分解可能な連結を有するＰＥＧを含んでいる形態の何れかのポリエチレングリコールを包含する。一実施形態では、ｎが約２０〜約２，０００であるＰＥＧは、本明細書に記載の方法および組成物において用いるために適している。いくつかの実施形態では、水性ポリマーはポリエチレングリコール部分を含んでいる。ＰＥＧポリマーの分子量は、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ、またはそれ以上の広い範囲におよんでもよく、特に限定されない。ＰＥＧポリマーの分子量は所望の範囲内であればよい。多様なＰＥＧの分子は、特に限定されないが、「the Shearwater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog」に記載されており、参照することによって本明細書に援用される。
【０６２８】
この文献における末端官能基の具体的な例は、Ｎ−スクシニミジル炭酸（N- succinimidyl carbonate）（例えば、米国特許出願第５，２８１，６９８号明細書、米国特許出願第５，４６８，４７８号明細書を参照のこと。）、アミン（例えば、「Buckmannら, Makromol. Cheｍ. 182:1379 (1981)」、「Zalipskyら, Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)」を参照のこと。）、ヒドラジド（例えば、「Andreszら, Makromol. Chem. 179:301 (1978)」を参照のこと。）、スクシニミジルプロピオン酸（succinimidyl propionate）およびスクシニミジルブタン酸（succinimidyl butanoate）(例えば、「Olsonら, in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181 , Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997」、米国特許出願第５，６７２，６６２号明細書を参照のこと。)、スクシニミジルコハク酸（例えば、「Abuchowskiら, Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984)」および「Joppichら, Makromol. Chem. 180:1381 (1979)」）、スクシニミジルエステル（例えば、米国特許出願第４，６７０，４１７号明細書を参照のこと。）、ベンゾトリアゾール炭酸（benzotriazole carbonate）（例えば、米国特許出願第５，６５０，２３４号明細書を参照のこと。）、グリシジルエーテル（例えば、「Pithaら, Eur. J Biochem. 94:11 (1979)」、「Ellingら, Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991)」を参照のこと。）、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、「Beauchampら, Anal. Biochem. 131 :25 (1983)」、「Tondelliら, J. Controlled Release 1:251 (1985)」を参照のこと。）、ｐ−ニトロフェニル炭酸（例えば、「Veroneseら, Appl.Biochem. Biotech., 11 : 141 (1985)」：および「Sartoreら, Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)」を参照のこと。）、アルデヒド（例えば、「Harrisら, J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984)」、米国特許出願第５，８２４，７８４号明細書、米国特許出願第５，２５２，７１４号明細書を参照のこと。）、マレイミド（例えば、「Goodsonら, Bio/Technology 8:343 (1990)」、「Romaniら, in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)」、および「Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)」を参照のこと。）、オルトピリジルジスルフィド（例えば、「Woghirenら, Bioconj. Chem. 4:314(1993)」を参照のこと。）、アクリロール（acrylol）（例えば、「Sawhneyら, Macromolecules, 26:581 (1993)」を参照のこと。）、ビニルスルフォン（例えば、米国特許出願第５，９００，４６１号明細書を参照のこと。）が挙げられる。これらの参考文献および特許文献はすべて参考によって本明細書に援用される。
【０６２９】
ある場合に、ＰＥＧの末端の１つは、ヒドロキシまたはメトキシを有して終結している。すなわち、ＸはＨあるいはＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。別の場合では、ＰＥＧの末端の１つは反応性基を有して終結していてもよい。これによって、二官能性ポリマーを形成する。一般的な反応性基は、（１）２０の一般的なアミノ酸において見られる官能基（例えば、マレイミド基、活性のある炭酸塩（例えば、ｐ−ニトロフェニルエステル）、活性のあるエステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、ｐ−ニトロフェニルエステル）、およびアルデヒド）と反応するために通常用いられる反応性基、ならびに、（２）２０の一般的なアミノ酸に対して不活性であるが、非天然アミノ酸に存在する相補的な官能基（例えば、フェニルヒドラジン基およびカルボニル基）と特異的に反応する官能基と反応するために通常用いられる反応性基を含んでいることができる。
【０６３０】
なお、上述した一般式においてＹとして示されるＰＥＧのもう一方の末端は、非天然アミノ酸によって、ポリペプチド（合成または天然）、ポリヌクレオチド、ポリサッカライド、または合成ポリマーと、直接的または間接的に結合する。Ｙがフェニルヒドラジン基である場合に、フェニルヒドラジンを含んでいるＰＥＧ試薬は、ポリペプチド内のカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸と反応し、インドール結合によってポリペプチドとＰＥＧ基とを連結することができる。Ｙがカルボニル基である場合に、カルボニルを含んでいるＰＥＧ試薬は、ポリペプチド内のフェニルヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸と反応し、インドール結合によってポリペプチドとＰＥＧ基とを連結することができる。図３０は、カルボニルを含んでいるＰＥＧ試薬およびヒドラジンを含んでいるＰＥＧ試薬の例を示すが、これに限定されない。
【０６３１】
ある実施形態においては、ヒドラジンは、非天然アミノ酸内のカルボニル基と反応し、インドールを形成することができる。また、ヒドラジンは、非天然アミノ酸によってポリペプチドに組み込まれ、水溶性ポリマー内のカルボニル基との優先的な反応に使用される。一般的に、ＰＥＧ分子の少なくとも１つの末端は、非天然アミノ酸との反応に使用される。
【０６３２】
このように、ある実施形態においては、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、非天然アミノ酸の側鎖によって、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））と連結される。本明細書に記載される非天然アミノ酸を用いる方法および非天然アミノ酸の組成物は、ＰＥＧ誘導体によってタンパク質を選択的修飾するための極めて効率的な方法を提供する。この効率的な方法は、セレクターコドンに応じてタンパク質へ非天然アミノ酸を選択的に組み込み、次いで、適切な反応性のＰＥＧ誘導体によって非天然アミノ酸を修飾する工程を含んでいる。このような非天然アミノ酸としては、特に限定されないが、２０の天然に組み込まれるアミノ酸には見られない官能基または置換基を含んでいるアミノ酸が挙げられる。様々な実証されている化学的方法は、タンパク質に水溶性ポリマーを組み込むために、本明細書に記載されている非天然アミノ酸の方法および非天然アミノ酸の組成物とともに使用するために適している。
【０６３３】
ポリマー骨格は、直線状または枝分かれ状であってもよい。枝分かれポリマー骨格は一般的に実証されている。通常、枝分かれポリマーは枝分かれの中心となるコア部分、およびこのコア部分と連結される複数個の直線状ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、様々なポリオール（例えば、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトールおよびソルビトール）へエチレンオキシドを付加することによって調製され得る、枝分かれの形態において用いられる。枝分かれの中心となるコア部分は、いくつかのアミノ酸（例えばリジン）から生じることもできる。枝分かれポリ（エチレングリコール）を、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍという一般式で表わすことができる。ここで、Ｒはコア部分（例えばグリセロール、グリセロールオリゴマー、またはペンタエリスリトール）に由来し、ｍは枝の数を表わす。例えば、その開示が本明細書において参照することによって援用される、米国特許出願第５，９３２，４６２号明細書、米国特許出願第５，６４３，５７５号明細書、米国特許出願第５，２２９，４９０号明細書、米国特許出願第４，２８９，８７２号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書、国際公開第９６／２１４６９号パンフレット、および国際公開第９３／２１２５９号パンフレットに記載されている、マルチアームドＰＥＧ分子を、ポリマー骨格として用いることが可能である。
【０６３４】
また、枝分かれＰＥＧは、ＰＥＧ（−ＹＣＨＺ２）ｎで表わされる枝分かれＰＥＧの形態で存在することができる。ここで、Ｙは連結基であり、Ｚは規定の長さの原子鎖によってＣＨと連結される、活性化された末端基である。さらに、別の分枝形態であるペンダント型のＰＥＧ（pendant PEG）は、ＰＥＧ鎖の末端よりもむしろＰＥＧ骨格に沿って、反応性の基（例えば、カルボキシル）を有する。
【０６３５】
また、これらＰＥＧの形態に加えて、弱い結合または分解可能な結合を骨格に有するポリマーを調製することができる。例えば、加水分解の影響を受けるエステル結合をポリマー骨格に有するＰＥＧを調製することができる。以下に示すように、この加水分解の結果、ポリマーが開裂されて、低分子量の断片が生じる：
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−  ＋  Ｈ２Ｏ  →  ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ  ＋  ＨＯ−ＰＥＧ−
用語「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」には、特に限定されないが、本明細書において開示されるすべての文書化された形態を表わすか、または含んでいる。ポリマーの分子量は、所望するポリマーの分子量の範囲に亘ってもよい。
【０６３６】
ＰＥＧの望ましい特性を最大限に発揮させるために、生物学的に活性な分子と接着されるＰＥＧポリマーの全分子量および水和状態は、ＰＥＧポリマーが結合することと特に関連のある有利な性質（例えば、上昇された水溶性、および増加された循環半減期）を与えるために、十分に高くなければならず、さらに親分子の生物学的な活性に悪影響を及ぼすことのない必要がある。
【０６３７】
本明細書に記載の方法および組成物は、ポリマーとタンパク質との実質的に均質な接合体分子を生成するために使用され得る。ここで用いられる、「実質的に均質」とは、ポリマーとタンパク質との接合体分子が、全タンパク質のうち半分よりも多くあるように観察される、ということを意味する。このポリマーとタンパク質との接合体は生物学的な活性を有しており、本明細書において提供される、本明細書に記載の「実質的に均質」なＰＥＧ化されたポリペプチドの調製物は、均質な調製物の利点（例えば、例えば、臨床に適用される際に、ロット間の薬物動態を容易に予測できること。）を十分示すほど均質なものである。
【０６３８】
また、当業者は、ポリマーとタンパク質との接合体の混合物を調製することを選択してもよい。このとき、本明細書において提供される利点としては、モノポリマーとタンパク質との接合体の比率を選択して混合物に包含させ得ることである。このように、当業者は、必要に応じて、様々な数（すなわち２、３、４など）のポリマー部分が接着されている様々なタンパク質の混合物を調製し、このような各種接合体を本明細書に記載の方法を用いて調製されたモノ−ポリマーとタンパク質との接合体と組み合わせて、モノ−ポリマーとタンパク質との接合体を所定の割合で有する混合物を得てもよい。
【０６３９】
ポリエチレングリコール分子とタンパク質分子との比は、反応混合物におけるこれらの濃度と同様に、変えてもよい。一般的に、最適な比（余分な未反応のタンパク質またはポリマーを最小限にするという反応効率の観点から見た場合の最適な比）は、選択されたポリエチレングリコールの分子量および利用可能な反応性基の有効な数に基づいて決定すればよい。分子量に関して言えば、一般にポリマーの分子量が大きくなるほど、タンパク質と結合され得るポリマー分子の数は少なくなる。また、これらのパラメーターを最適にする場合に、枝分かれポリマーを考慮すべきである。一般的に、分子量が大きくなるにつれ（または、枝分かれが多くなるにつれ）、ポリマーとタンパク質との比は大きくなる。
【０６４０】
本明細書において使用されるような親水性ポリマーとポリペプチド／タンパク質との接合体を熟慮する場合に、用語「治療に効果的な量」はさらに、患者にとっての望ましい効果が増強される量のことをいう。この治療に効果的な量は人によって異なり、種々の要因（例えば、全般的な患者の身体条件）および治療すべき疾病、障害または病気の根本にある原因に依存する。
【０６４１】
本明細書に記載の修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドと連結される水溶性ポリマーの数（すなわちＰＥＧ化またはグリコシル化の程度）は、薬理学的な特性、薬物動態学的な特性、または薬力学的な特性（例えば、インビボにおける半減期）の変化（特に限定されないが、増加または減少）をもたらすように調節することができる。いくつかの実施形態では、このようなポリペプチドの半減期は少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０パーセント増加し、修飾されていないポリペプチドの２倍、５倍、１０倍、５０倍、または少なくとも１００倍以上、増加する。
【０６４２】
一実施形態では、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、ＰＥＧ骨格に直接連結されているヒドラジンの末端部分を含んでいるＰＥＧ誘導体によって修飾される。
【０６４３】
一実施形態では、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、ＰＥＧ骨格と直接連結されているヒドラジンの末端部分を含んでいる、ＰＥＧ誘導体によって修飾される。
【０６４４】
別の実施形態では、ヒドラジンを含んでいるアミノ酸を含んでいるポリペプチドは、ＰＥＧ骨格と直接連結されるカルボニルの末端部分を含んでいる、ＰＥＧ誘導体によって修飾される。
【０６４５】
いくつかの実施形態では、カルボニル末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造を有する：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ
ここで、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００（すなわち、平均分子量は５〜４０ｋＤａ）である。ポリマーの分子量は広範囲であってよく、特に限定されないが、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ、またはそれ以上であってもよい。ポリマーの分子量は所望のポリマー分子量範囲内でも良い。
【０６４６】
ＰＥＧの官能基化およびＰＥＧの接合体について、いくつかの考察およびモノグラフが得られる。例えば、「Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985)」、「Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987)」、「Wongら, Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992)」、「Delgadoら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992)」、「Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995)」を参照のこと。
【０６４７】
また、ポリマーを活性化する方法は、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、米国特許出願第５，３２４，８４４号明細書、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、米国特許出願第５，２１９，５６４号明細書、米国特許出願第５，１２２，６１４号明細書、国際公開第９０／１３５４０号パンフレット、米国特許出願第５，２８１，６９８号明細書、および国際公開第９３／１５１８９号パンフレットから入手可能であり、これらは活性化されたポリマーと酵素（特に限定されないが、結合因子ＶＩＩＩ（国際公開第９４／１５６２５号パンフレット）、ヘモグロビン（国際公開第９４／０９０２７号パンフレット）、酸素輸送分子（米国特許出願第４，４１２，９８９号明細書）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（「Veroneseら, App. Biochem. Biotech. 11 : 141-152 (1985)」））との接合に関するものである。これらは、本明細書においてその開示が参照することによって援用される。
【０６４８】
必要に応じて、疎水性クロマトグラフィーによって得られた本明細書に記載のＰＥＧ化された非天然アミノ酸のポリペプチドは、実証されている方法によってさらに精製され得る。そのような方法としては特に限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー（例えば、DEAE SEPHAROSEを用いる）、シリカ上におけるクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（特に限定されないが、SEPHADEX G-75を用いたものが挙げられる。）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；等電点クロマトグラフィー；置換クロマトグラフィー；電気泳動（特に限定されないが、例えば調製用の等電点電気泳動を含んでいる。）；差別的可溶性（differential solubility）（例としては、硫酸アンモニウム沈殿が挙げられるが、これに限定されない。）、または抽出が挙げられる。見かけの分子量は、球形タンパク質の基準と比較する、ＧＰＣを用いて算出されてもよい（「Preneta AZ, PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.)IRL Press 1989, 293-306」）。（非天然アミノ酸のポリペプチド）とＰＥＧとの接合体の純度は、タンパク質分解（特に限定されないが、トリプシン開裂が挙げられる。）を行った後に、質量分析をすることによって評価できる。「Pepinsky R.B.ら, J. Pharmacol & Exp. Ther. 297(3): 1059-66 (2001)」。
【０６４９】
本明細書に記載されているポリペプチドの非天然アミノ酸と連結される水溶性ポリマーは、制限無く、さらに誘導体化または置換されてもよい。
【０６５０】
‐Ｃ．血清アルブミンの親和性の増強‐
様々な分子が、血中半減期を調節するために、本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドに融合され得る。いくつかの実施形態では、分子は、動物において内在性の血清アルブミンの親和性を高めるために、本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドと連結されるか、あるいは融合される。
【０６５１】
例えば、ある場合には、ポリペプチドとアルブミン結合配列との組換え融合体が作製される。一般的なアルブミン結合配列としては、例えば、連鎖球菌プロテインＧから得られるアルブミン結合ドメイン（「Makridesら,J. Pharmacol. Exp. Ther 277(1):534-542 (1996)」および「Sjolanderら,J, Immunol. Methods 201 :115-123 (1997)」参照。）が挙げられる。またアルブミン結合ペプチドとしては、例えば、「Dennisら, J. Biol. Chem. 277(38):35035-35043(2002)」に記載されているペプチドが挙げられる。
￥  別の実施形態では、本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、脂肪酸によってアシル化される。ある場合において、脂肪酸は血清アルブミンへの結合を促進する。例えば、「Kurtzhals,ら, Biochem. J. 312:725-731 (1995) 」を参照のこと。
【０６５２】
別の実施形態では、本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、血清アルブミン（特に限定されないが、ヒト血清アルブミンが挙げられる。）と直接融合される。血清アルブミンまたは別の血清成分との結合を調節するために、多種多様な他の分子は、本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドと連結され得る。
【０６５３】
‐Ａ．本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチドのグリコシル化‐
本明細書に記載の方法および組成物は、サッカライド残基を有する非天然アミノ酸を１つ以上組み込んでいるポリペプチドを含んでいる。サッカライド残基は、天然のサッカライド残基（特に限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミンが挙げられる。）または非天然のサッカライド残基（特に限定されないが、３−フルオロガラクトースが挙げられる。）のどちらであってもよい。サッカライドは、Ｎ−結合型のグリコシド結合、またはＯ−結合型のグリコシド結合（特に限定されないが、Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリン）、あるいは非天然の結合（特に限定されないが、複素環（例えば、窒素を含んでいる複素環）の結合、あるいは対応するＣ−結合型のグリコシド結合またはＳ−結合型のグリコシド結合が挙げられる。）の何れかによって非天然アミノ酸のポリペプチドと連結されてもよい。
【０６５４】
サッカライド（例えば、グリコシル）部分は、インビボまたはインビトロのどちらかにおいて非天然アミノ酸のポリペプチドに付加され得る。いくつかの実施形態では、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、アリールヒドラジン基によって誘導体化されたサッカライドを用いて修飾された場合に、インドール結合を介して連結された対応するグリコシル化ポリペプチドが生成する。別の実施形態では、アリールヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸は、カルボニル基によって誘導体化されたサッカライドを用いて修飾された場合に、結合を介して連結された対応するグリコシル化ポリペプチドが生成する。サッカライドを非天然アミノ酸と結合させてから、グリコシルトランスフェラーゼまたは他の酵素を用いてこのサッカライドを処理することによって、非天然アミノ酸のポリペプチドに結合したオリゴサッカライドを生成してもよい。例えば、「H. Liuら. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003)」を参照のこと。
【０６５５】
図２６は２つの同一の末端（すなわちヒドラジン基）を有する二官能性ホモリンカーの合成の説明に役立つ例を示す。このようなリンカーは、二つのインドール結合を形成して、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドのホモ二量体を形成するために使用されてもよい。あるいは、このようなリンカーの一方の末端が保護されている場合に、この一部が保護されているリンカーは保護されていないヒドラジン末端とカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドとをインドール結合によって結合させるために使用することができ、他方の保護された末端は脱保護の後のさらなる連結反応のために使用できる。あるいは、試薬の化学量論を注意深く制御することによって、同様の結果（ヘテロ二量体）が得られるが、所望のヘテロ二量体の他にいくつかのホモ二量体が混入することもある。
【０６５６】
図２７は、二官能性のホモリンカーによって、二つのタンパク質を結合させて、タンパク質を二量体化する説明のための例を示す。
【０６５７】
図２５は、例えば、カルボニル基および反応基によって、リンカーが二つの異なる末端を有する二官能性のヘテロリンカーの使用について説明するための例を示す。さらに、図２５は、多段合成において非天然アミノ酸のポリペプチドにＰＥＧ基を付加するヘテロ二官能性リンカーの使用について説明するための例を示す。第一工程では、この説明図に示すように、ヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、カルボニルを含んでいる二官能性リンカーと反応して、インドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成する。しかしながら、二官能性リンカーは反応性の官能基を有しており、第二工程において、この反応性の官能基はＰＥＧ試薬と反応し、複素環の結合を生成することによってＰＥＧ化した非天然アミノ酸のポリペプチドを形成する。
【０６５８】
また、本明細書に記載の方法および組成物は、ポリペプチドの組合せ（例えば、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体、またはヘテロ多量体（すなわち、三量体、四量体など））を提供する。一例として、以下の説明では、ＧＨスーパーファミリーメンバーを中心に進める。しかしながら、この項に記載される方法、技術および組成物は、二量体および多量体の形態において利益をもたらし得る、他の任意のポリペプチドにも、事実上適用され得る。なお、他の任意のポリペプチドとしては、例えば治療タンパク質が挙げられる。
【０６５９】
したがって、本明細書に記載の方法、技術、および組成物に包含されるのは、ポリペプチド骨格と直接的に、またはリンカーを介して、別のＧＨスーパーファミリーメンバーまたはそのバリアント、あるいはＧＨスーパーファミリーメンバーではない他のポリペプチドまたはそのバリアントと結合する、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチドである。モノマーと比較して分子量が増加するために、ＧＨスーパーファミリーメンバーの二量体の接合体または多量体の接合体は、新規なあるいは望ましい性質を示す。このような性質としては、例えば、モノマーのＧＨスーパーファミリーと比べて、異なる薬理学的性質、薬物動態学的性質または薬力学的性質、あるいは調節された治療半減期または調節された血漿半減期が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、ＧＨスーパーファミリーメンバーの二量体は、ＧＨスーパーファミリーメンバー受容体の二量体化を調節する。別の実施形態では、本明細書に記載されているＧＨスーパーファミリーメンバーの二量体または多量体は、ＧＨスーパーファミリーメンバーの受容体アンタゴニスト、アゴニスト、あるいは調節因子として作用し得る。
【０６６０】
いくつかの実施形態では、ＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチドは、例えば、Ａｓｎ−Ｌｙｓのアミド結合またはＣｙｓ−Ｃｙｓのジスルフィド結合を介して、直接的に連結される。いくつかの実施形態では、連結されたＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチド、および／または、連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーは、二量体化を促進するための異なる非天然アミノ酸を含んでいる。例えば、特に限定されないが、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸を含有しているポリペプチドである、第１のＧＨスーパーファミリーメンバーおよび／または連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーは、ヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸を含有している第２のＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチドと接合されており、これらのポリペプチドは、対応するインドールを形成することによって反応する。
【０６６１】
別の方法では、２つのＧＨスーパーファミリーメンバーポリペプチドおよび／または連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーは、リンカーを介して連結される。二官能性のヘテロリンカーまたは二官能性のホモリンカーは、同一の一次配列または異なる一次配列を有し得る２つのＧＨスーパーファミリーメンバーおよび／または連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーのポリペプチドを連結するために用いることができる。ある場合において、ＧＨスーパーファミリーメンバーおよび／または連結された非ＧＨスーパーファミリーメンバーのポリペプチドを繋ぐために用いられているリンカーは、二官能性のＰＥＧ試薬であってもよい。
【０６６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、アレイ型構造を有する水溶性の二官能性リンカーを提供するものである。このようなアレイ型構造は：ａ）ポリマー骨格の少なくとも第１の末端にアジドを含んでいる部分、アルキンを含んでいる部分、ヒドラジンを含んでいる部分、ジアミンを含んでいる部分、ヒドラジドを含んでいる部分、ヒドロキシルアミンを含んでいる部分、またはカルボニル（ジカルボニルを包含する。）を含んでいる部分、および、ｂ）ポリマー骨格の第２の末端に少なくとも第２の官能基を含んでいる。第２の官能基は、第１の官能基と同一であってもよいし、または異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、第２の官能基は第１の官能基と反応しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、少なくとも１つの枝を有する枝分かれ分子の構造を含んでいる水溶性組成物である。例えば、枝分かれ分子の構造は、樹状であってもよい。
【０６６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、以下の構造を有する水溶性活性化ポリマーとの反応によって形成される、１つ以上のＧＨスーパーファミリーメンバー含んでいる多量体を提供する：
Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ
ここで、ｎは約５〜約３，０００であり、ｍは２〜１０、Ｘはアジドを含んでいる部分、アルキンを含んでいる部分、ヒドラジンを含んでいる部分、ジアミンを含んでいる部分、ヒドラジドを含んでいる部分、ヒドロキシルアミンを含んでいる部分、アセチルを含んでいる部分、またはカルボニル（ジカルボニルを包含する。）を含んでいる部分であり得る。また、Ｒはキャッピング基（capping group）、官能基、あるいは脱離基であり、Ｘのように同一であってもよいし、または異なっていてもよい。Ｒは、例えば、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、１−ベンゾトリアゾールエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカルボン酸、１−ベンゾトリアゾールカルボン酸、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリル酸、メタクリル樹脂、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン（ｄｉｏｎｅｓ）、メシレート、トシレート、およびトレシレート、アルケン、ならびにケトンから成る群より選択される官能基である。別の実施形態では、リンカー群は転写因子を連結するのに使用される。遺伝子は、符号化されたタンパク質の発現を効率的に開始するために複数の転写因子を要する。非天然アミノ酸を用いて合成された転写因子は、上記のようなリンカーによって連結されることができ、対象となる遺伝子の人工的な活性化を促進するために使用することができる。連結した転写因子は、対象となるＤＮＡと結合し、通常の活性化のためのシグナルカスケードがない場合でも、ＲＮＡポリメラーゼの動員を促進させることができる。これにより、必要なシグナルがなくとも遺伝子を発現させることができる。さらに別の実施形態では、細胞受容体のためのリガンドは、受容体の効率的な活性化のために連結されることができる。血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、自身の受容体に結合するために、二量体を形成する。非天然アミノ酸を含んでいるＰＤＧＦは、上述したように、二量体形成においてリンカーによって連結される事ができ、ＰＤＧＦ受容体の効率的な結合を提供するために処理される。さらに別の実施形態では、連結されたタンパク質は連結された抗体を含んでいる。同一または隣接する標的上の特異的エピトープ（unique epitope）に対してそれぞれ特異的である２つの異なる抗体は、刺激、結合または中和を向上させるために連結させることができる。例えば、ＨＩＶのｇｐ１２０において発見されｇｐ４０と結合する二つの異なるエピトープに特異的な抗体は、標的をより効率よく中和できるように連結されることができる。同様に、連結された抗体を細胞表面の受容体を刺激するために使用することができる。例えば、Ｔ−細胞受容体のＣＤ４およびＣＤ３に対する抗体は、結合して受容体の活性化に必要な刺激を提供することができる。さらに別の実施形態は、核酸に連結したペプチドを包含する。例えば、細胞の受容体のリガンドまたは細胞表面に結合するタンパク質は、望ましい標的に投与される治療核酸に連結されることができる。連結されたリガンドは核酸の吸収を促進し、次いで細胞内において発現してこの核酸の治療効果が発揮される。同様に、ペプチドを核酸と連結して、核酸の凝縮または濃縮を促進してもよい。
【０６６４】
リンカーの官能基は同一である必要はなく、フェニルヒドラジン基である必要もない。本明細書で詳述した化学反応は、非天然アミノ酸のポリペプチドとインドール基を形成することができる官能基を少なくとも１つ含んでいるリンカーの設計を可能にする。ある実施形態において、リンカー上の他の官能基は、他の実証されている方法を利用するものである。この方法としては、求核／求電子に基づく化学反応が挙げられる。
【０６６５】
‐Ｃ．官能基を付加する例：ポリペプチドの単離性の緩和‐
天然または非天然のアミノ酸のポリペプチドは、多くの原因（例えば、ポリペプチドの溶解性または結合性）のために試料から単離することが困難なこともあり得る。例えば、治療に使用するためにポリペプチドを調製するとき、このポリペプチドは、ポリペプチドを過剰生産するように設計されている組換え系から単離されてもよい。しかしながら、ポリペプチドの溶解性または結合特性のために、望ましい水準の純度に達することは、多くの場合に困難である。本明細書に記載されている方法、組成物、技術および方策は、この問題への解決策を提供する。
【０６６６】
本明細書に記載されている方法、組成物、技術および方策は、所望のポリペプチドと相同な複素環（窒素を含んでいる複素環を包含する。）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドの生成を可能にする。複素環（窒素を含んでいる複素環を包含する。）を含んでいるう非天然アミノ酸のポリペプチドは、改良された単離性を有する。一実施形態では、相同な非天然アミノ酸のポリペプチドは、生合成的に生成される。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は、本明細書に記載されている１つの非天然アミノ酸の構造に組み込まれている。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は末端または内部に組み込まれ、部位特異的にさらに組み込まれる。
【０６６７】
一実施形態では、生合成的に生成されるとき、生じた非天然アミノ酸は、すでに望ましい改良された単離性を有する。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は、改良された単離性をもたらす基との複素環（窒素を含んでいる複素環を包含する。）の結合を含んでいる。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は、修飾された複素環（窒素を含んでいる複素環を包含する。）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成するために、さらに修飾される。この修飾は改良された単離性をもたらす基との複素環（窒素を含んでいる複素環を包含する。）の連結を提供する。いくつかの実施形態では、このような基は非天然アミノ酸と直接連結し、別の実施形態では、このような基は非天然アミノ酸とリンカー基を介して連結される。いくつかの実施形態では、このような基は１つの化学反応によって非天然のアミノ酸と連結され、別の実施形態では、一連の化学反応は、このような基と非天然アミノ酸とを連結するために必要とされる。好ましくは、改良された単離性をもたらす基は、非天然アミノ酸のポリペプチドにおいて非天然アミノ酸と部位特異的に連結されるものであり、利用される反応条件下において天然アミノ酸とは連結しない。
【０６６８】
さらなる実施形態では、生じた非天然アミノ酸のポリペプチドは、ＧＨスーパーファミリーメンバーと相同である。しかしながら、この項に記載されている方法、技術および組成物は、改良された単離性から利益を得ることのできるのであれば、実質的に任意のポリペプチドにも適用できる。このようなポリペプチドとしては、例えば治療タンパク質が挙げられる。
【０６６９】
さらなる実施形態では、改良された単離性をもたらす基は、ポリペプチドの水溶性を改良し、別の実施形態では、このような基はポリペプチドの結合特性を改良し、別の実施形態では、このような基はポリペプチドへの新たな結合特性を提供する（単なる一例として、ビオチン基またはビオチンに結合する基が挙げられる。）。このような基がポリペプチドの水溶性を改善する実施形態では、この基は本明細書に記載されている水溶性ポリマー（例えば、本明細書に記載されているＰＥＧポリマーの群の何れか）から選択される。
【０６７０】
‐Ｂ．官能基を付加する例：ポリペプチドの存在の検出‐
天然もしくは非天然アミノ酸のポリペプチドは、いくつかの原因（ポリペプチドと迅速に結合し得る試薬もしくは標識が不足していることが挙げられる。）のために、試料（インビボの試料、およびインビトロの試料を含んでいる。）において検出することが難しいこともある。本明細書に記載されている方法、組成物、技術および方策は、この状況への解決策を提供する。
【０６７１】
本明細書に記載の方法、組成物、技術および方策によれば、所望のポリペプチドと相同な複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドの生成を可能にする。複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、インビボの試料およびインビトロの試料におけるこのポリペプチドの検出を可能にする。いくつかの実施形態では、相同な非天然アミノ酸のポリペプチドは、生合成的に生成される。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は、本明細書に記載されている非天然アミノ酸の１つの構造に組み込まれている。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は末端もしくは内部に組み込まれ、部位特異的にさらに組み込まれる。
【０６７２】
一実施形態では、生合成的に生成したとき、生じた非天然アミノ酸のポリペプチドは、すでに望ましい検出特性を有している。さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸、ヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸、および改良された検出特性をもたらすインドールを含んでいるアミノ酸から成る群より選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる。他の実施形態では、本明細書に記載されているように、このような非天然アミノ酸は生合成的にポリペプチドに組み込まれている。さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、一般式（Ｉ）〜（ＸＶ）で示されるアミノ酸から選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる。さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸のポリペプチドは、構造１〜４で示される化合物から成るアミノ酸から選択される少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる。さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸は改良された検出特性をもたらすインドール結合を含んでいる。さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸は、修飾されたインドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成するためにさらに修飾される。この修飾は、改良された検出特性をもたらす基とのインドールを含んでいる結合を提供する。いくつかの実施形態では、このような基は、非天然アミノ酸と直接連結され、また別の実施形態では、このような基は非天然アミノ酸とリンカー基を介して連結される。いくつかの実施形態では、このような基は１つの化学反応によって非天然アミノ酸と連結され、別の実施形態では、このような基と非天然アミノ酸とを連結するために、一連の化学反応が必要とされる。好ましくは、改良された検出特性をもたらす基は、非天然アミノ酸のポリペプチドにおいて非天然アミノ酸と部位特異的に連結されるものであり、利用される反応条件下において天然アミノ酸とは連結しない。
【０６７３】
さらなる実施形態では、生じた非天然アミノ酸のポリペプチドは、ＧＨスーパーファミリーメンバーと相同である。しかしながら、この項に記載されている方法、技術および組成物は、インビボの試料およびインビトロの試料において検出される必要のある、例えば治療タンパク質などの他の任意のポリペプチドにも実質的に適用できる。
【０６７４】
さらなる実施形態では、改良された検出特性をもたらす基は、標識、色素、親和性標識、光親和性標識、スピン標識、蛍光団、放射性部分、重原子を組み込んでいる部分、同位体標識されている部分、生物物理学的なプローブ、燐光性の基、化学発光性の基、電子密度の高い基、磁性基、発色団、エネルギーを伝達する剤、検出可能な標識、および上記の任意の組合せから成る群より選択される。
【０６７５】
ある実施形態では、抗体がインドールの非天然アミノ酸を含んでいるように操作され、この抗体は癌性細胞における特異的な抗原を認識する。本明細書に記載のインドールを介した方法を用いて抗体を標識もしくは修飾し、標識された抗体を精製した後に、標識された抗体によって認識され得る癌に罹患していることが疑われる被験体に対して、このような抗体が投与される。標識された抗体の投与後に、患者中の標識された抗体の存在および位置によって、癌組織の存在が確認され得る。標識された抗体を投与することによって、患者中の癌、被験体中の腫瘍の転移、および／もしくは被験体中の癌治療の有効性を検出することができる。
【０６７６】
他の実施形態において、細胞の表面において抗原と結合するペプチドは、被験体への投与後にこのペプチドを追跡するために用いることができる色素（蛍光色素など）を含んでいるように操作される。この色素は、ペプチド内に位置する非天然アミノ酸を介してペプチドに付着される。そして、ペプチドは被験体に投与される。ペプチドの局在化およびそのリガンドとの結合は、実証されたイメージング技術または検出技術を用いて達成される。
【０６７７】
他の実施形態では、患者中のポリペプチドの存在を検出するための方法が記載される。この方法は、下記の化合物１〜４：
【０６７８】
【化８４】
2010512800.tif 000088
【０６７９】
で示される構造を有する非天然アミノ酸またはその活性のある代謝産物、塩、薬学的に許容可能なプロドラッグもしくは溶媒和物を、少なくとも１つ含んでいる相同な非天然アミノ酸のポリペプチドを効果的な量にて投与する工程を含んでいる。ここで、
Ａは必要に応じて存在し、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、置換アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは必要に応じて存在し、存在する場合に、一方の末端においてインドールを含んでいる部分と連結しているリンカーであり、
このリンカーは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＮ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＮＯ２）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（ＮＣＯＯＲ’）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択され、ｋは、１、２または３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルもしくは置換アルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、少なくとも１つのアミノ酸、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドであり；
ｎは０、１、２もしくは３であり、ｍは０、１、２もしくは３であり、ｎおよびｍの少なくとも１つは０ではなく；
Ｒａ基に結合される構造１、２、３および４のそれぞれの環は、０、１つまたは２つのＲａ基を含んでいることができ、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２、−ＯＲ’’および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’’から成る群より選択され、ｋは、１、２もしくは３であり、Ｒ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルもしくは置換アルキルであるか；または、
２つ以上のＲａ基が存在するときに、２つのＲａは必要に応じて、アリール、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキルもしくは置換低級アルキルであるか、またはＲ３基およびＲ４基もしくは２つのＲ３基は必要に応じて、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ５はそれぞれ独立して、Ｈ，ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ’’）２、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＮＯ２、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ’’、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリールまたは置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’’、またはＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’’）２であり、
Ｒ’’はそれぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリル、置換アルカリル、アラルキル、もしくは置換アラルキルであるか、または、
２つ以上のＲ’’基が存在するときに、２つのＲ’’は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルを形成するか；あるいは、
Ｒ５はＬ−Ｘであり、
Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋剤；細胞毒性のある化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体；抗体または抗体断片；金属キレート剤；補助因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；蛍光団、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的もしくは非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能な部分；ビオチン；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素に結合した糖；酸化還元活性のある剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；インターカレートする基；発色団；エネルギーを伝達する剤；生物学的に活性な剤；検出可能な標識；低分子；阻害性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチンの誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；抗体酵素、活性錯体の活性化剤、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルゲン、アンギオスタチン、抗ホルモン、酸化防止剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、ミモトープ、巨大分子、受容体、逆ミセル、およびこれらの任意の組合せから成る群より選択され、
Ｌは必要に応じて存在し、存在する場合に、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレンまたは置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−から成る群より選択されるリンカーであり、ｋは１、２もしくは３であり、Ｒ’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり；
２つ以上のＲ５基が存在するときに、２つのオルトＲ５基は必要に応じて、ヘテロシクロアルキルまたは芳香族ヘテロシクロアルキルを形成することができるか；あるいは、
−Ｂ−インドールを含んでいる部分は一緒になって、少なくとも１つのインドール部分を含んでいる二環式または三環式のシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルを形成する。
【０６８０】
他の実施形態では、患者中のポリペプチドの存在を検出するための方法であって、化合物１〜４で示される構造を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる相同な非天然アミノ酸のポリペプチドを効果的な量にて投与する工程を含んでおり、この少なくとも１つの非天然アミノ酸は、ポリペプチド内の特定の部位に組み込まれる、方法が記載される。さらに他の実施形態では、患者中のポリペプチドの存在を検出するための方法であって、化合物１〜４で示される構造を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる相同な非天然アミノ酸のポリペプチドを効果的な量にて投与する工程を含んでおり、この非天然アミノ酸は翻訳系を用いて組み込まれる、方法が記載される。他の実施形態では、患者中のポリペプチドの存在を検出するための方法であって、化合物１〜４で示される構造を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる相同な非天然アミノ酸のポリペプチドを効果的な量にて投与する工程を含んでおり、この非天然アミノ酸は翻訳系および翻訳後修飾系を用いてポリペプチドに組み込まれる、方法が記載される。他の実施形態では、患者中のポリペプチドの存在を検出するための方法であって、化合物１〜４で示される構造を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる相同な非天然アミノ酸のポリペプチドを効果的な量にて投与する工程を含んでおり、この少なくとも１つの非天然アミノ酸は少なくとも１ヶ月間水溶液中において安定である、方法が記載される。他の実施形態では、患者中のポリペプチドの存在を検出するための方法であって、化合物１〜４で示される構造を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる相同な非天然アミノ酸のポリペプチドを効果的な量にて投与する工程を含んでおり、この少なくとも１つの非天然アミノ酸は少なくとも２週間安定である、方法が記載される。他の実施形態では、患者中のポリペプチドの存在を検出するための方法であって、化合物１〜４で示される構造を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる相同な非天然アミノ酸のポリペプチドを効果的な量にて投与することを含んでおり、この少なくとも１つの非天然アミノ酸は少なくとも５日間安定である、方法が記載される。
【０６８１】
他の実施形態では、患者中のポリペプチドの存在を検出するための方法が記載される。この方法は、化合物１〜４で示される構造を有する少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる相同な非天然アミノ酸のポリペプチドを効果的な量にて投与する工程を含んでおり、このポリペプチドはアルファ−１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球走化性タンパク質−１、単球走化性タンパク質−２、単球走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性化ペプチド、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクターＩＸ、ファクターＶＩＩ、ファクターＶＩＩＩ、ファクター  Ｘ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１  受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成された低分子タンパク質、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌のエンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性��ョック症候群毒素、チモシンアルファ１、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロンから成る群より選択される治療タンパク質と相同なタンパク質である。
【０６８２】
さらに他の実施形態では、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の内部に位置している非天然アミノ酸を介して、インドールを含んでいる部分はこのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に付着している。適切に標識されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、実証された方法を用いて検出およびイメージングされるために、望ましい被験体に対して投与される。これらの標識されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を通じて、様々な疾病、代謝経路、生理学的な構造または細胞の成分がイメージングされ得る。被験体中における標識されたペプチドポリペプチドまたはタンパク質の存在を検出するために、例えば蛍光イメージング顕微法を用いることができる。
【０６８３】
‐Ｃ．官能基を付加する例：ポリペプチドの治療特性の改善‐
天然または非天然のアミノ酸は、特定の障害、疾病または病気に罹患している患者に対して特定の治療効果をもたらし得る。この治療効果は、様々な要因に依存し得るものである。この要因としては、例えば：ポリペプチドの安全性プロフィール、ならびにポリペプチドの薬物動態学的性質、薬理学的性質および／または薬力学的性質（例えば、水溶性、バイオアベイラビリティ、血中半減期、治療半減期、免疫原性、生物学的な活性、または循環時間）が挙げられる。さらに、ポリペプチドに官能基の付加を提供すること（例えば、細胞毒性のある化合物または薬剤の結合）は有効であり、また、本明細書に記載されているホモ多量体およびヘテロ多量体を形成するために、さらなるポリペプチドと結合することが望ましいこともある。この修飾は、元のペプチドの活性および／または三次構造を破壊するものではないことが好ましい。本明細書に記載されている方法、組成物、技術および方策は、これらの問題に対する解決策を提供する。
【０６８４】
本明細書に記載の方法、組成物、技術および方策によって、所望のポリペプチドと相同な複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを生成することができる。複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、改良された治療特性を有する。いくつかの実施形態では、相同な非天然アミノ酸のポリペプチドは生合成的に生成される。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は本明細書に記載されている非天然アミノ酸の１つのコンストラクトに組み込まれている。さらなる実施形態では、非天然アミノ酸は末端または内部において組み込まれ、さらに部位特異的に組み込まれる。
【０６８５】
一実施形態では、生合成的に生成したとき、生じた非天然アミノ酸のポリペプチドは、すでに望ましい改良された治療特性を有している。さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸は、複素環（窒素を含んでいる複素環など）と改良された治療特性をもたらす基との結合を含んでいる。さらなるまたは付加的な実施形態では、非天然アミノ酸は、修飾された複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成するためにさらに修飾される。ここで、この修飾は、改良された治療特性をもたらす基との複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる結合を提供する。いくつかの実施形態では、このような基は、非天然アミノ酸と直接連結され、また別の実施形態では、このような基は非天然アミノ酸とリンカー基を介して連結される。いくつかの実施形態では、このような基は１つの化学反応によって非天然アミノ酸と連結され、別の実施形態では、このような基と非天然アミノ酸とを連結するために、一連の化学反応が必要とされる。好ましくは、改良された治療特性をもたらす基は、非天然アミノ酸のポリペプチドにおいて非天然アミノ酸と部位特異的に連結されるものであり、利用される反応条件下において天然アミノ酸とは連結しない。
【０６８６】
さらなるまたは付加的な実施形態では、生じた非天然アミノ酸のポリペプチドは、ＧＨスーパーファミリーの各メンバーと相同であるが、この項に記載の方法、技術および組成物は、例えば治療タンパク質などの改良された治療特性から利益を得ることのできるものであれば、実質的に任意のポリペプチドにも適用できる。
【０６８７】
さらなるまたは付加的な実施形態では、改良された治療特性をもたらす基は、ポリペプチドの水溶性を改良し、別の実施形態では、このような基はポリペプチドの結合特性を改良し、別の実施形態では、このような基はポリペプチドへの新たな結合特性を提供する（単なる一例として、ビオチン基またはビオチンに結合する基が挙げられる。）。このような基がポリペプチドの水溶性を改善する実施形態では、この基は本明細書に記載されている水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧポリマーの群）から選択される。さらなるまたは付加的な実施形態では、このような基は細胞毒性のある化合物であり、他の実施形態では、このような基は薬剤である。さらなる実施形態では、連結された薬剤または細胞毒性のある化合物は非天然アミノ酸のポリペプチドから開裂されることによって、薬剤または細胞毒性のある化合物を望ましい治療のための位置へ送達することができる。他の実施形態では、このような基は例えば、第２のポリペプチドである。第２のポリペプチドとしては、例えば、複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドが挙げられ、さらに第１の非天然アミノ酸のポリペプチドと同じアミノ酸構造を有するポリペプチドが挙げられる。
【０６８８】
さらなるまたは付加的な実施形態では、複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、修飾された複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドである。さらなるまたは付加的な実施形態では、複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然アミノ酸のポリペプチドに比べて、ポリペプチドのバイオアベイラビリティが向上している。さらなるまたは付加的な実施形態では、複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然アミノ酸のポリペプチドに比べて、ポリペプチドの安全性プロフィールが向上している。さらなるまたは付加的な実施形態では、複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然アミノ酸のポリペプチドに比べて、ポリペプチドの水溶性が向上している。さらなるまたは付加的な実施形態では、複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然アミノ酸のポリペプチドに比べて、ポリペプチドの治療半減期が増加している。さらなるまたは付加的な実施形態では、複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然アミノ酸のポリペプチドに比べて、ポリペプチドの血中半減期が増加している。さらなるまたは付加的な実施形態では、複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然アミノ酸のポリペプチドに比べて、ポリペプチドの循環時間が延長している。さらなるまたは付加的な実施形態では、複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然アミノ酸のポリペプチドに比べて、ポリペプチドの生物学的な活性が調節されている。さらなるまたは付加的な実施形態では、複素環（窒素を含んでいる複素環など）を含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドは、相同な天然アミノ酸のポリペプチドに比べて、ポリペプチドの免疫原性が調節されている。
＜ＸＩ．修飾されたポリペプチドの治療上の使用＞
便宜上、この項に記載されている修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、一般的に、および／または特定の例を伴って説明されている。しかしながら、この項に記載されている修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、この項において提供される一般的な説明または特定の例のみに限定されるものではない。むしろこの項に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、一般式（Ｉ）−（ＸＶ）の範囲内に含まれる少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる、すべての修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドに対して等しく適用される。例えば、一般式（Ｉ）−（ＸＶ）の範囲内に含まれる少なくとも１つのアミノ酸には、本明細書、特許請求の範囲および図面に記載の一般式（Ｉ）−（ＬＸＶ）の範囲内に含まれる、あらゆる下位の一般式または特定の化合物が挙げられる。
【０６８９】
本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチド（そのホモ多量体およびヘテロ多量体を含んでいる。）は、多様な使用が見出されている。このような使用としては、特に限定されないが、治療上の使用、診断上の使用、アッセイに基づく使用、産業上の使用、美容への使用、植物生物学的使用、環境への使用、エネルギー生産への使用、消費財への使用および／または軍事上の使用が挙げられる。以下に、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドの治療上の使用における例を提供するが、本発明はこれに限定されない。
【０６９０】
本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、多種多様な障害、疾病または病気の処置に有効である。本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチド生成物を投与した結果、ヒトにおいて市販されているポリペプチド調製物によって実証された活性の何れか１つが得られる。修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチド生成物の平均量は変更されてもよく、特に医師の推奨および指示に基づいているべきである。修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチド生成物の的確な量は、処置される病気の正確な症例、処置している患者の健康状態、および組成物に含まれる他の含有成分などの要因に、優先的に従う事項である。投与量は、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドを用いる療法に基づいて決定され得る。
【０６９１】
（Ａ．投与および薬学的組成物）
本明細書に記載されるような、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチド（特に限定されないが、シンテターゼ、１つ以上の非天然アミノ酸を含有するタンパク質が挙げられる。）は、治療上の使用のために必要に応じて使用され、特に限定されないが、適切な薬学的担体と組み合わせて用いられる。このような組成物は、例えば、本明細書に記載されているような、治療に効果的な量の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチド、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含んでいる。このような担体または賦形剤としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、および／またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。製剤は、投与に適した形態に作製される。一般的に、タンパク質の投与方法は、本明細書に記載されているような、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドの投与に適用できる。
【０６９２】
本明細書に記載されているような、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドを１つ以上含んでいる治療組成物は、実証された方法に従って有効性および組織代謝の確認ならびに投与量の評価をするために、インビボおよび／またはインビトロの１つ以上の疾患モデル動物において必要に応じて試験される。特に、投与量は、天然アミノ酸の相同物に対する非天然アミノ酸の活性、安定性または他の適切な評価基準（特に限定されないが、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるように修飾されたポリペプチドと、天然アミノ酸のポリペプチドとの比較が挙げられる。）に基づいて最初に決定され得る。換言すれば、投与量は比較アッセイにおいて最初に決定され得る。
【０６９３】
投与は、分子を血液または組織細胞に最終的に接触させるために用いられる通常の任意の投与経路を介して行われる。本明細書に記載されているような、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、任意の適切な様式において、必要に応じて１つ以上の薬学的に許容可能な担体と一緒に投与される。患者に対して、本明細書に記載されるような、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドを投与するために適した方法は利用できる一方、１つ以上の投与経路は、特定の組成物を投与するために用いることが可能であり、しばしば特定の投与経路は、別の投与経路よりも、より迅速、且つより効果的な作用または反応を提供し得る。
【０６９４】
薬学的に許容可能な担体は、投与されている特定の組成物によって部分的に決定され、同様に、組成物を投与するために用いられる特定の方法によって決定される。したがって、本明細書に記載されている薬学的な組成物の適切な製剤は、幅広く存在する。
【０６９５】
本明細書に記載の非天然アミノ酸のポリペプチド、およびこのようなポリペプチドを含んでいる組成物は、タンパク質またはポリペプチドにとって適した任意の投与経路によって投与されればよい。このような投与経路としては、注射などの非経口投与が挙げられる。注射としては、皮下注射または静脈注射、あるいは注射または点滴の任意の他の形態のものが挙げられる。本明細書に記載の様々な非天然アミノ酸のポリペプチドを含んでいるポリペプチドの薬学的組成物は、種々の投与経路を介して投与されてもよい。この投与経路としては、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経皮投与、皮下投与、局所投与、舌下投与または直腸投与が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるような、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、リポソームを介して投与され得る。本明細書に記載されている非天然アミノ酸のポリペプチドは単独で用いられてもよいし、または別の適切な成分（例えば、薬学的な担体）と組み合わせて用いられてもよい。
【０６９６】
また、単独または別の適切な成分と組み合わされた、本明細書に記載されるような、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、吸入器を用いて投与されるように噴霧剤として作製され得る（例えば、このポリペプチドは「霧状」になり得る。）。噴霧剤は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などのような圧縮可能な噴射剤に収められ得る。
【０６９７】
非経口投与（例えば、関節内投与（接合部での関節内投与）、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、および皮下投与など）に適した製剤は、水性および非水性の等張性無菌注入溶液ならびに水性および非水性の無菌懸濁液を含んでいる。等張性無菌注入溶液は、酸化防止剤、緩衝剤および製剤投与の対象者の血液と等張の製剤が溶解された溶剤を含んでいてもよい。無菌懸濁液は、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤および保存料を含んでいてもよい。パッケージ化された核酸製剤は、単回投与または多回投与される密閉した容器（例えば、プラスチック容器およびガラス容器）の中に配置され得る。
【０６９８】
非経口投与および静脈内投与は、好ましい投与方法である。とりわけ、現在使用中の製剤とともに、天然アミノ酸の相同物を用いた療法（特に限定されないが、ＥＰＯ、ＩＦＮ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ、インターロイキン、抗体、および／または、他の任意の薬学的に送達されるタンパク質のために使用される一般的な療法が挙げられる。）においてすでに利用されている投与経路は、本明細書に記載されるような、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドにとって好ましい投与経路および製剤を提供する。
【０６９９】
本明細書に記載されている組成物および方法の範囲において、患者に対して投与される投与量は、患者が長期にわたって有益な治療反応を示すために十分な量である。投与量は、特定の製剤の有効性、使用される修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドの活性、安定性または血中半減期、および患者の健康状態によって決定されるとともに、処置される患者の体重または体表面積によっても決定される。また、投与量の大小は、投与する特定の製剤、または特定の患者に投与する製剤に付随して起こる、いかなる有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。
【０７００】
病気（特に限定されないが、ガン、遺伝的障害、糖尿病、ＡＩＤＳなど）の治療または予防の際に投与される製剤の有効量を決定する際に、医師は、血漿の循環量、製剤の毒性、病気の進行を評価し、および／または、関連する場合は、抗非天然アミノ酸のポリペプチド抗体の生成を評価する。
【０７０１】
例えば、７０ｋｇの患者に対して投与される投与量は、一般的に、現在使用中の治療組成物の投与量と同様の範囲であるが、関連する組成物の活性または血中半減期の変化によって調節される。本明細書に記載されている薬学的製剤は、例えば、抗体の投与、ワクチンの投与、細胞毒性製剤の投与、天然アミノ酸のポリペプチドの投与、核酸の投与、ヌクレオチド類似体の投与、生物学的応答調節剤の投与などの、様々な療法を補うことができる。
【０７０２】
投与に関して、本明細書に記載されている薬学的組成物は、関連する製剤のＬＤ−５０またはＥＤ−５０によって決定される比率、および／または、各種濃度（特に限定されないが、健康な患者の大半および全体に適用されるような濃度が挙げられる。）において、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドの任意の副作用の観測によって決定される比率において投与される。投与は、単回投与または多回投与によって達成され得る。
【０７０３】
製剤を投与されている患者が、発熱、悪寒、または筋肉痛の症状を訴える場合、この患者に、アスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン、または他の痛み／熱を調節する製剤を適切に投与する。発熱、筋肉痛、または悪寒などの、製剤投与に対する反応を示す患者は、この製剤を投与する３０分前に、アスピリン、アセトアミノフェン、または特に限定されないがジフェニドラミンの何れかを事前に投与される。メペリジンは、解熱剤および抗ヒスタミン剤と即座に反応しないより激しい悪寒および筋肉痛に対して用いられる。
【０７０４】
本明細書に記載されているような、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、被験体となる哺乳動物に直接投与され得る。投与は、被験体にポリペプチドを導入するために使用される、通常の任意の投与経路によるものである。本明細書に記載されているような、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドとしては、経口投与、直腸投与、局所投与、吸入投与（特に限定されないが噴霧剤を介する吸入投与）、口腔投与（特に限定されないが、下舌（sub-lingual）投与が挙げられる。）、膣内投与、非経口投与（特に限定されないが、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、関節内投与、胸腔内投与、腹腔内投与、脳内投与、動脈内投与または静脈内投与が挙げられる。）、局所投与（例えば、皮膚および粘膜表面（気道表面を含んでいる。））、および経皮投与に適したものが挙げられるが、任意の特定の症状における最も適切な投与経路は、処置される疾病の性質および重傷度に依存する。投与は、局所的または体系的になされ得る。製剤は、単回投与または多回投与される密閉した容器（例えば、プラスチック容器およびガラス容器）に配置され得る。本明細書に記載されるような修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、薬学的に許容可能な担体を含んでいる、単回投与可能な形態（特に限定されないが、溶剤、懸濁液、または乳化剤が挙げられる。）の混合物で調製され得る。また、本明細書に記載されるような、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、持続注入（特に限定されないが、例えば浸透ポンプのような小型ポンプを用いる持続注入が挙げられる。）、単回ボーラス、または徐放性薬剤によって投与され得る。
【０７０５】
投与に適した製剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を等張にする溶液を含み得る、水性および非水性の溶液、等張性無菌溶液、ならびに、懸濁化剤、可溶化剤、濃化剤、安定化剤、および防腐剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液を含んでいる。溶液および懸濁液は、無菌粉末、顆粒、および上述した種類の錠剤から調製され得る。
【０７０６】
凍結乾燥法は、関連するタンパク質製剤から水を取り除くことによって、タンパク質を保存するために一般的に使用される技術である。凍結乾燥法、または材料乾燥工程である凍結乾燥では、まず、材料を氷結させ、それから、氷溶剤または氷結した溶剤が真空環境下における昇華によって取り除かれる。賦形剤は、凍結乾燥工程の間に安定性を高めるため、および／または、貯蔵下において凍結乾燥された生成物の安定性を改良するために、事前に凍結乾燥された製剤に含まれてもよい。「Pikal, M． Biopharm． ３（９）２６-３０ （１９９０） and Arakawa ら． Pharm． Res． ８（３）:２８５-２９１ （１９９１）」を参照のこと。
【０７０７】
また、薬剤の噴霧乾燥法は実証されている。例えば、「Broadhead, J． ら．, ‘The Spray Drying of Pharmaceuticals,’ in Drug Dev． Ind． Pharm, １８ （１１& １２）, １１６９-１２０６ （１９９２）」を参照のこと。低分子の薬剤に加えて、様々な生物材料が噴霧乾燥されている。このような生物材料としては、酵素、血清、血漿、微生物および酵母が挙げられる。噴霧乾燥法は、１つの工程において、薬学的製剤の溶液を、良質な粉末、ほこりのない粉末、または凝固した粉末に変えることができるため、有用な技術である。基本的な技術は以下の４つの工程を含んでいる：ａ）噴霧器中での給水溶液の噴霧化、ｂ）噴霧空気の接触、ｃ）噴霧器の乾燥、およびｄ）乾燥空気から乾燥された生成物の分離。このことを開示するために参照によって本明細書に援用される、米国特許出願第６，２３５，７１０号明細書、および米国特許出願第６，００１，８００号明細書では、噴霧乾燥法による組換えエリスロポエチンの製造が記載されている。
【０７０８】
本明細書において記載されている薬学的組成物には、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤が含まれてもよい。薬学的に許容可能な担体は、投与される特定の組成物によって部分的に決定されており、同様に、組成物の投与に用いられる特定の方法によって、部分的に決定される。したがって、本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドのための薬学的組成物（薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤を任意に含んでいる。）の適切な調合は、多種多様である（例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed （Easton, Pa．: Mack Publishing Company, １９９５）」、「Hoover, John E．, RemingtoＮ’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co．, Easton, Pennsylvania １９７５、 Liberman, H． A． and Lachman, L．, Eds．, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N．Y．, １９８０」、および「Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed． （Lippincott Williams & Wilkins, １９９９）」を参照のこと）。適した担体としては、コハク酸塩を含んでいる緩衝剤、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩、イミダゾール、酢酸塩、重炭酸塩、およびその他の有機酸が挙げられる。他の有機酸としては：酸化防止剤（特に限定されないが、アスコルビン酸）、低分子量のポリペプチド（特に限定されないが、約１０残基未満）、タンパク質（特に限定されないが、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）、疎水性ポリマー（特に限定されないが、ポリビニルピロリドン）、アミノ酸（特に限定されないが、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン、またはヒスチジン誘導体、メチオニン、グルタミン酸、またはリジン）、単糖類、二糖類、およびその他の炭水化物（特に限定されないが、トレハロース、スクロース、グルコース、マンノース、またはデキストリン）、キレート剤（特に限定されないが、ＥＤＴＡおよびエデンテート２ナトリウム（edentate disodium））、二価金属イオン（特に限定されないが、亜鉛、コバルト、または銅）、糖アルコール（特に限定されないが、マンニトール、またはソルビトール）、塩形成対イオン（salt-forming counter ions）（特に限定されないが、ナトリウム）、および／または非イオン性界面活性剤（特に限定されないが、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート８０）およびＴｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０））、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）および他のプルロニック酸）を含んでいる。また、他のプルロニック酸としては、プルロニック酸Ｆ６８（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８）またはＰＥＧを含んでいる。適切な界面活性剤としては、例えば、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）に基づくポリエーテルを含み、例えば、（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）またはポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）、例えば、（ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）またはそれらの組合せが挙げられる。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯおよびＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、Ｒ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＴｅｔｒｏｎｉｃｓおよびＲ−Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ（いずれも登録商標：ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ社、ワイアンドット、ミシガン州）として、市販されている。これらは米国特許出願第４，８２０，３５２号明細書においてさらに記載されており、本明細書において、その全体が参照によって援用される。他のエチレン／ポリプロピレンブロック重合体は、適切な界面活性剤であってもよい。界面活性剤または界面活性剤の組合せは、ＰＥＧ化された非天然アミノ酸のポリペプチドを、１つ以上の応力（例えば、攪拌によってもたらされる圧力など）に対して安定化するために用いられ得る。上記のいくつかは、「充填剤」と称されることもある。また、いくつかは、「等張化重合調整剤（tonicity modifiers）」と称されることもある。また、抗菌防腐剤は、安定性および抗菌効果をもたらすために適用され得る。適切な防腐剤としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、メタクレゾール、メチル／プロピルパラベン（ｐａｒａｂｅｎｅ）、クレゾール、およびフェノール、またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７０９】
本明細書に記載の修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチド（ＰＥＧなどの水溶性ポリマーと連結されているものが包含される。）は、徐放性製剤（sustained-release system）によって、または徐放性製剤の一部として投与され得る。徐放性組成物は、加工品の形態（特に限定されないが、フィルムまたはマイクロカプセル）の半透過性性のポリマーマトリクスを含んでいるが、これに限定されない。徐放性マトリクスとしては、生体適合性を有する材料に由来するマトリクスが挙げられる。生体適合性を有する材料としては、例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（「Langer ら．, J． Biomed． Mater． Res．, １５: ２６７- ２７７ （１９８１）」、「Langer, Chem． Tech．, １２: ９８-１０５ （１９８２）」）、エチレンビニル酢酸（上記「Langerら」）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸（欧州特許出願公開第１３３９８８号明細書）、ポリラクチド（ポリラクチック酸）（米国特許出願第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許出願公開第５８４８１号明細書）、ポリグリコリド（グリコリック酸のポリマー）、ポリラクチド共グリコリド（乳酸およびグリコリック酸の共重合体）ポリアンヒドリド、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（「U． Sidman ら．, Biopolymers, ２２, ５４７-５５６ （１９８３）」）、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン酸、ポリサッカライド、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン）ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、およびシリコンが挙げられる。また、徐放性組成物は、リポソームに取り込まれる化合物を含んでいる。この化合物を含んでいるリポソームは、独国特許出願公開第３，２１８，１２１号明細書、「Eppstein ら, Proc．Natl． Acad． Sci U．S．A．, ８２: ３６８８-３６９２ （１９８５）」、「Hwang ら, Proc． Natl． Acad． Sci． U．S．A．, ７７: ４０３０-４０３４ （１９８０）」、欧州特許出願公開第５２，３２２号明細書、欧州特許出願公開３６，６７６号明細書、欧州特許出願公開第１４３，９４９号明細書、欧州特許出願公開第１４２，６４１号明細書、日本特許出願公開（Japanese Pat． Appln．）第８３−１１８００８号明細書、米国特許出願第４，４８５，０４５号明細書、米国特許出願第４，６１９，７９４号明細書、および米国特許出願第４，５４４，５４５号明細書、ならびに欧州特許出願公開第１０２，３２４号明細書に記載の方法によって調製される。
【０７１０】
リポソームに取り込まれるポリペプチドは、例えば、独国特許出願公開第３，２１８，１２１号明細書、「Eppstein ら, Proc．Natl． Acad． Sci U．S．A．, ８２: ３６８８-３６９２ （１９８５）」、「Hwang ら, Proc． Natl． Acad． Sci U．S．A．, ７７: ４０３０-４０３４ （１９８０）」、欧州特許出願公開第５２，３２２号明細書、欧州特許出願公開第３６，６７６号明細書、欧州特許出願公開第８８，０４６号明細書、欧州特許出願公開第１４３，９４９号明細書、日本特許出願公開第８３−１１８００８号明細書、米国特許出願第４，４８５，０４５号明細書、米国特許出願第５，０２１，２３４号明細書、および米国特許出願第４，５４４，５４５号明細書、ならびに欧州特許出願公開第１０２，３２４号明細書に記載の方法によって調製することができる。リポソームの組成および大きさは実証された方法を用いて決定される。リポソームのいくつかの例は、「Park JWら．, Proc．Natl． Acad． Sci． USA ９２:１３２７-１３３１ （１９９５）」、「Lasic D and Papahadjopoulos D （eds）」、「MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES （１９９８）」、「Drummond DC,ら．, Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B （ed） CANCER 創薬 AND DEVELOPMENT （２００２）」、「Park JW,ら．, Clin．Cancer Res． ８:１１７２-１１８１ （２００２）」、「Nielsen UBら, Biochim． Biophys． Acta １５９１（lまたは２） :１０９-l １８ （２００２）」、「Mamot Cら, Cancer Res． ６３: ３１５４-３１６１ （２００３）」に記載されている。
【０７１１】
本明細書に記載されている組成物、製剤および方法の範囲において、患者に対して投与される投与量は、患者に長期にわたって有益な反応をもたらすために十分であるようにすべきである。一般的に、非経口によって１回毎に投与される、本明細書に記載されるような、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドの全薬学的有効量は、患者の体重当り、約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約１００μｇ／ｋｇ、または約０．０５μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲内であるが、この値は治療上の判断に従うものである。また、投与回数は治療上の判断に従うものであり、その回数は、ヒトへの利用を認可された市販の生成物よりも多くても少なくてもよい。一般的に、本明細書に記載されるようなポリマーとポリペプチドとの接合体（例えば、ＰＥＧ化されたポリペプチド）は、上述した投与経路の何れかによって投与され得る。
【０７１２】
＜ＸＩＩ．修飾されたポリペプチドの構造−機能関係＞
本明細書に記載されるような、修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチド（特に限定されないが、シンテターゼ、１つ以上の非天然アミノ酸を含有するタンパク質など）は、その属するポリペプチドに対して様々な物理的および化学的特性を与える。これらの特性の有用性は、非天然アミノ酸の構造、非天然アミノ酸の修飾の構造、またはそれらの両方に依存し、試験ポリペプチドの構造−機能の関係を評価する実験モデルを用いて評価することができる。
【０７１３】
いかなる実験モデルでも、所望のポリペプチドまたはタンパク質中の天然アミノ酸が非天然アミノ酸によって置換される。非天然アミノ酸を含んでいるペプチドまたはタンパク質が発現した後に、このタンパク質は代替のＲ基のライブラリーを用いて誘導体化される。これらのＲ基はポリペプチドまたはタンパク質に含まれる非天然アミノ酸と反応する。Ｒ基のライブラリーは、置換されるアミノ酸に含まれるＲ基との構造的または化学的な類似性に基づいて選択される。タンパク質の非天然アミノ酸に新規のＲ基を加えた後に、タンパク質は適切な試験系において機能または活性に基づいてスクリーニングされる。例えば、タンパク質においてフェニルアラニンが非天然アミノ酸に置換される。さらに、フェニルアラニンのＲ基に類似した特性を有する代替のＲ基のライブラリーが非天然アミノ酸に加えられる。ひとつの代替のＲ基は非天然のＲ基に加えられる。この非天然のＲ基は環、複素環、共役環またはその他の例えば類似した化学的および構造的な特性を与える化学部分を含んでいる。誘導体化したタンパク質はその後、適切な実験モデルにおいて試験を行うことによって、新しく置換された非天然アミノ酸の添加に関する機能に従ってスクリーニングされる。実験モデルの例としては、ベースドアッセイ（based assay）、無細胞アッセイ、細胞アッセイ、組織培養モデルおよび動物モデルなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０７１４】
さらなる実施形態では、創薬におけるファルマコフォアの活性のため、または検出に有用な蛍光の核として、インドールが非天然アミノ酸に加えられる。この添加を容易にするために、インドールを基本とするＲ基またはインドール合成に適したＲ基が非天然アミノ酸に加えられ、最適化された２段階の反応によって、室温にて水溶性の緩衝液中でインドールの形成が誘導される。この反応の後に、誘導体化したタンパク質はその望ましい活性に基づいてスクリーニングされる。
【０７１５】
例えば、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）酵素における非天然アミノ酸による置換が与えるポンペ病の軽減効果は、ポンペ病のマウスモデルで評価することができる。酵素内の選択された部位における様々なアミノ酸の置換を含んでいるＧＡＡ分子のライブラリーは、本明細書に記載の方法および組成物を用いて作製され、発現されることができる。本明細書に記載されるように修飾されていないまたは翻訳後修飾された形態の非天然アミノ酸を含んでる酵素はその後に、その活性に基づいてポンペ病のマウスモデル（ＧＡＡが遺伝的に欠乏するように繁殖されたマウス（ＧＡＡ−／−））を用いて評価することができる。非天然アミノ酸を含んでいる酵素は、静脈を介して、経口的に、またはその他の、タンパク質の効率的な運搬および吸収を可能にするいかなる投与経路によって投与することができる。投与、酵素、半減期およびポンペ病の軽減に関する有効性は、例えばマウス中のグリコーゲンの分解および／または排除の測定、ＧＡＡの血清レベルならびに心肥大、心筋症および骨格筋ミオパチーの変化または減少の評価に基づいて評価することができる。
【０７１６】
本明細書に記載された修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、広範囲の工業的用途に有用である。本明細書に記載された修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチド製品を用いることによって、工業的用途における商用のポリペプチド調製によって実証される活性の何れかが得られる。
【０７１７】
例えば、エタノールの生成に用いる酵素を、非天然アミノ酸を用いて修飾し、機能の変化をアッセイすることができる。様々な非天然アミノ酸の置換を含んでいるアルコールデヒドロゲナーゼＩＩおよびピルビン酸脱炭酸酵素のライブラリーを、本明細書に記載の方法および組成物を用いて作製し、発現させることができる。非天然アミノ酸によって修飾された酵素はその後に、非天然アミノ酸によって置換されることによって得られたエタノール生成効率の変化に基づいて、または非天然アミノ酸によって置換された結果としてのエタノール生成効率の変化に基づいてスクリーニングされる。例えば、基質に対する親和性および変換率などの増加は、実証された方法を用いてスクリーニングし、エタノールの工業的生産へ適用することができる。
【０７１８】
本明細書に記載される方法および組成物の工業的な適用のさらなる例には、除草剤および殺虫薬の環境的な清浄化が含まれる。一般に用いられる除草剤のアトラジンを汚染された土壌から除去することは、アトラジンを代謝することによって無毒とする酵素によって容易になる。非天然アミノ酸の置換を含んでいる修飾されたアトラジンクロロヒドロラーゼ酵素のライブラリーは、本明細書に記載の方法および組成物を用いて作製され、発現されることができる。非天然アミノ酸によって修飾されたアトラジンクロロヒドロラーゼ酵素のライブラリーはその後、非天然アミノ酸によって置換されることによって得られるか、または非天然アミノ酸によって置換された結果としての環境中に見られるアトラジンを脱塩素する能力の変化およびアトラジン代謝の任意の新しい形式に基づいてスクリーニングされる。上述したように、酵素効率の変化は、例えばアトラジンまたは中間体の代謝の増加などの実証された方法を用いて評価することができる。
【０７１９】
〔実施例〕
（実施例１：
【０７２０】
【化８５】
2010512800.tif 000089
の合成）
【０７２１】
用いられた合成は、以下の反応スキームに記載される。
【０７２２】
【化８６】
2010512800.tif 000090
ａ）
【０７２３】
【化８７】
2010512800.tif 000091
の合成
【０７２４】
ピリジン（５０ｍＬ）に１−ｐ−トリルヒドラジン（５．０ｇ、３１ミリモル）が含まれる０℃の溶液に、Ａｃ２Ｏ（３０ｍＬ、３１８ミリモル）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌し、ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）を用いて急冷した。溶媒を真空中で取り除いた後、残留物をフラッシュ・クロマトグラフィー（シリカ、２０−５０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、無色の油を得た（６．７２ｇ、８７％）：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．２８（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．２４（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．４７（ｓ、６Ｈ）、２．４０ （ｓ, ３Ｈ）、２．１４（ｓ, ３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣＩ３）δ１７１．８、１６９．５、１３９．１、１３８．８、１３０．４、１２６．４、２５．４、２２．３、２１．３。
ｂ）
【０７２５】
【化８８】
2010512800.tif 000092
の合成
【０７２６】
ＣＣｌ４（３００ｍＬ）にＮ’，Ｎ’−ジアセチル−Ｎ−ｐ−トリルアセトヒドラジド（６．４ｇ、２５．８ミリモル）が含まれる溶液に、Ｎ−ブロモスクシンイミド （５．１ｇ、２８．７ミリモル）を添加した。混合物を還流しながら加熱した。２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、０．２ｇ、１．２ミリモル）を添加した。結果として生じた混合物を３６時間、還流しながら撹拌し、室温まで冷却した。混合物をＨ２Ｏおよび鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥させ、ろ過・濃縮させて、褐色の油としての臭化物（８．６２ｇ）を得た。未精製の生成物を精製せずに次の段階に直接用いた。
ｃ）
【０７２７】
【化８９】
2010512800.tif 000093
の合成
【０７２８】
ＥｔＯＨ（８０ｍＬ）にＥｔＮａ（２．３ｇ、３２．１ミリモル）が含まれる溶液に、２−アセトアミドマロン酸（６．３ｇ、２９．０ミリモル）を添加した。結果として生じる混合物を０℃で２０分間撹拌した。Ｎ’，Ｎ’−ジアセチル−Ｎ−（４−（ブロモメチル）フェニル）アセトヒドラジド（８．６２ｇ、２６．４ミリモル）を一度に添加した。混合物を８０℃で一晩加熱し、室温に冷却した。クエン酸（１０ｇ、５０ミリモル）を反応混合物に添加した。ほとんどの溶媒を除去した後、残留物をＥｔＯＡｃ（５００ ｍＬ）を用いて希釈した。混合物をＨ２Ｏおよび鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥させ、ろ過・濃縮させた。残留物をフラッシュ・クロマトグラフィー（シリカ、１５−８０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、黄色の油としてジエチル  ２−（４−（アセトアミド）ベンジル）−２−アセトアミドマロン酸（４．１７ｇ、二段階で３５％）を得た：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．２３（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．０３（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、６．５７（ｓ、１Ｈ）、４．２９−４．２０（ｍ, ４Ｈ）、３．６５（ｍ, ２Ｈ）、２．４１（ｓ、６Ｈ）、２．０８ （ｓ, ３Ｈ）、２．０１（ｓ, ３Ｈ）１．２７（ｔ, Ｊ＝３．６Ｈｚ、６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１７１．７、１６９．３、１６９．２、１６７．４、１４０．３、１３６．４、１３１．３、１２６．２、６７．２、６３．０、３７．４、２５．３、２３．２、２２．３、１４．２。
ｄ）
【０７２９】
【化９０】
2010512800.tif 000094
の合成
【０７３０】
ジオキサン（１５ｍＬ）にジエチル２−（４−（アセトアミド）ベンジル）−２−アセトアミドマロン酸（５７２ｍｇ、１．２４ミリモル）が含まれる溶液に、ＨＣｌ（１２Ｎ、１５ｍＬ）を添加した。結果として生じる混合物を還流しながら一晩加熱し、真空中で濃縮させた。残留物にＭｅＯＨ（１ｍＬ）を添加した。エーテル（２００ｍＬ）を添加し、生成物（２３１ｍｇ、８１％）を固体として沈殿させた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ７．２８（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．００（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、４．２１（ｄｄ、Ｊ＝７．４、５．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．２６（ｄｄ、Ｊ＝９．２、５．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．１５（ｄｄ、Ｊ＝１４．７、７．４Ｈｚ、１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ１７１．５、１４２．９、１３０．３、１２９．０、１１５．７、５４．１、３４．７。
【０７３１】
（実施例２）
このカルボニルを含んでいるアミノ酸の合成は標準的な方法に従って行う。
【０７３２】
【化９１】
2010512800.tif 000095
【０７３３】
（実施例３）
このカルボニルを含んでいるアミノ酸の合成は標準的な方法に従って行う。
【０７３４】
【化９２】
2010512800.tif 000096
【０７３５】
（実施例４：アリールヒドラジンとアルデヒドとの反応）
図３〜７に、インドールを形成するための２つの分子同士のモデル反応を示す。２つの出発材料の何れか一方が非天然アミノ酸のポリペプチドの側鎖として存在することができるが、他方の試薬はこの側鎖を誘導体化するための化合物を形成する官能基を表わす。すなわち、非天然アミノ酸のポリペプチドに付着する側鎖はアリールヒドラジン基であってもよく、また反応部分が、水溶性ポリマー、少なくとも１つのアミノ酸、または検出可能な標識と連結するアルデヒドである。逆に、非天然アミノ酸のポリペプチドに付着する側鎖はアルデヒド基であってもよく、また反応部分が、水溶性ポリマー、少なくとも１つのアミノ酸、または検出可能な標識と連結するアリールヒドラジンである。
【０７３６】
【化９３】
2010512800.tif 000097
【０７３７】
（実施例５：アリールヒドラジンとケトンとの反応）
図８〜１１、１３および１４に、インドールを形成するための２つの分子同士のモデル反応を示す。２つの出発材料の何れか一方が非天然アミノ酸のポリペプチドの側鎖として存在することができるが、他方の試薬はこの側鎖を誘導体化するための化合物を形成する官能基を表わす。すなわち、非天然アミノ酸のポリペプチドに付着する側鎖はアリールヒドラジン基であってもよく、また反応部分が、水溶性ポリマー、少なくとも１つのアミノ酸、または検出可能な標識と連結するケトンである。逆に、非天然アミノ酸のポリペプチドに付着する側鎖はケトン基であってもよく、また反応部分が、水溶性ポリマー、少なくとも１つのアミノ酸、または検出可能な標識と連結するアリールヒドラジンである。
【０７３８】
（実施例６：アリールヒドラジンの非天然アミノ酸を含んでいるウロテンシン類似体）
図２０に、「Ｘ」位置にアリールヒドラジン側鎖を有する非天然アミノ酸を含んでいるウロテンシン類似体を示す。この化合物は標準的な技術を用いて化学的に合成された。側鎖はケトン、アルデヒドまたは保護されたカルボニル側鎖を含んでいてもよいことがわかる（図２１にその概略を示す。）。
【０７３９】
（実施例７：非天然アミノ酸の誘導体化のためのインドール形成）
図２０〜２２、２４、２８および２９は、アリールヒドラジンとカルボニル基との反応によるインドール部分の形成を、非天然アミノ酸のポリペプチドの誘導体化に用いる方法の各例を示す。これらの図に示すタンパク質の「イラスト」は、ウロテンシン、ヒト成長ホルモン、インシュリン、抗体、キナーゼ、エリスロポエチンまたは本明細書に記載のもしくは文献から利用可能な他のいかなるポリペプチドまたはタンパク質であってもよい。
【０７４０】
（実施例８）
本実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉにおける、修飾されたポリペプチドのクローニングおよび発現が詳しく述べられている。直交なｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、および直交なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含んでいる、導入された翻訳系は、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドの発現に使用される。Ｏ−ＲＳは、非天然アミノ酸によって、Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。翻訳系は、コードされるセレクターコドンに応じて、ポリペプチドに非天然アミノ酸を次々に挿入する。非天然アミノ酸を組み込むために有用な、Ｏ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳのアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列は、米国特許出願第１０／１２６，９２７号明細書（発明の名称：「In Vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids」）および米国特許出願第１０／１２６，９３１号明細書（発明の名称：「Methods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs」）に記載されており、これらの全体が参照することによって援用される。
【０７４１】
【表３】
2010512800.tif 000098
【０７４２】
修飾された遺伝子、および（所望の非天然アミノ酸に対して特異的である）直交なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡの対を含んでいるプラスミドを用いた、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換によって、ポリペプチドへの非天然アミノ酸の部位特異的な組み込みが可能になる。形質転換後のＥ．ｃｏｌｉは、０．０１〜１００ｍＭの特定の非天然アミノ酸を含んでいる培養液において３７℃にて成長させられると、高い忠実度および効率で修飾されたポリペプチドを発現する。非天然アミノ酸を含んでいるヒスチジンタグが付加されたポリペプチドは、封入体または凝集体として、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞において生成される。凝集体は、６ＭのグアニジンＨＣｌにおいて変性されることによって可溶化されて親和性精製される。５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４０μＭ  ＣｕＳＯ４、および２％（Ｗ／Ｖ）サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）中にて一晩４℃で透析することによって、リフォールディングが実施される。次いで、２０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２中にてポリペプチドを透析し、続いて、ヒスチジンタグを除去した（「Boissel ら., (1993) 268:15983- 93」を参照のこと）。ポリペプチドの精製方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット分析、またはエレクトロスプレーイオン化質量分析などによって確認される。
【０７４３】
次に、治療活性を有する修飾された非天然アミノ酸のポリペプチドのインビトロでの活性およびインビボでの活性、ならびに治療活性を有する天然アミノ酸のポリペプチドのインビトロでの活性およびインビボでの活性を測定する方法ならびに比較する方法を、例を用いて記載する。
【０７４４】
（実施例９：細胞結合アッセイ）
２つ組の（３×１０６）細胞は、各種濃度（容積：１０μｌ）の未標識ＧＨ、ｈＧＨまたはＧＭ−ＣＳＦの非在下または存在下、および１２５Ｉ−ＧＨ（約１００，０００ｃｐｍまたは１ｎｇ）の存在下において、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（１００μｌ）中にて０℃で９０分間インキュベートされる（全量：１２０μｌ）。細胞は、その後再び懸濁され、３５０μｌのプラスチック遠心分離管内の氷冷された２００μｌのＦＣＳ上に積層され、遠心分離にかけられる（１，０００ｇ、１分）。ペレットは遠心管の末端を切断することによって採集され、ペレットおよび上澄みはガンマ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ社）において別々に計測される。
【０７４５】
特異的な結合（ｃｐｍ）は、競合相手の非在下におけるすべての結合（２回の平均値）から１００倍の過度の未標識ＧＨ（非特異的な結合）の存在下における結合（ｃｐｍ）を引いたものとして測定される。非特異的な結合は、使用されるそれぞれの細胞の種類に応じて測定される。実験は１２５Ｉ−ＧＨの調製液と同じものを用いて別の日に行うことで、内部的な一貫性を示すべきである。１２５Ｉ−ＧＨは、ＧＨ受容体を産生する細胞との結合を実証する。この結合は、未標識の天然ＧＨまたはｈＧＨによって用量依存的に阻害されるが、ＧＭ−ＣＳＦまたはその他のネガティブコントロールによっては阻害されない。天然ＧＨに類似する天然１２５Ｉ−ＧＨの結合に対して競合するｈＧＨの能力は、受容体が両方の形式を同じ様に良好に認識することを示唆している。
【０７４６】
（実施例１０：インドール結合を介してＰＥＧ化されたｈＧＨのインビボにおける検討）
ＰＥＧ−ｈＧＨ、修飾されていないｈＧＨおよび緩衝液がマウスまたはラットに投与される。その結果、本明細書に記載のＰＥＧ化されたｈＧＨでは、顕著な体重の増加が見られる修飾されていないｈＧＨと比べて、活性が優れていること、および半減期が延長していることが示される。
【０７４７】
（実施例１１：治療活性を有する修飾されたｈＧＨならびにそのバリアントの、接合体および非接合体のインビボにおける半減期の測定）
すべての動物実験は、ＡＡＡＬＡＣに認定された設備、およびSt. Louis UniversityのInstitutional Animal Care and Use委員会によって認可されたプロトコールに基づき実施される。ラットは、１２時間毎の明／暗サイクルに設定した室内において、個々のケージに収容される。下垂体切除されたラットに対しては、飲料水にはさらに５％のグルコースが含まれる。
【０７４８】
（実施例１２：薬物動態の検討）
各ＰＥＧ化された変異ｈＧＨの質は、動物実験開始前に、３つのアッセイを用いて測定される。（インドール結合を介してＰＥＧ化された）ＰＥＧ−ｈＧＨの純度は、非還元条件下において、ＭＥＳ  ＳＤＳ移動緩衝液を用いて、４〜１２％のアクリルアミドのＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを流動させることによって検査される（Invitrogen社、Carlsbad、CA）。ゲルは、クマシーブルーによって染色される。ＰＥＧ−ｈＧＨの接合体は、デンシトメトリースキャンに基づいて分析した結果、９５％の純度よりも高い。ＰＥＧ−ｈＧＨそれぞれの内毒素の値は、Charles River Laboratories(Wilmington, MA)から入手可能なＫＴＡ２キットを用いて、動態ＬＡＬアッセイによって検査されている。この検査の結果、１回の投与につき、内毒素は５ＥＵよりも少ないことが分っている。ＰＥＧ−ｈＧＨの生物学的な活性はＩＭ−９  ｐＳＴＡＴ５バイオアッセイよって評価され、ＥＣ５０の値は１５ｎＭ未満であることが確認された。
【０７４９】
ＰＥＧによって修飾された各成長ホルモンの薬物動態学的性質は、Charles River Laboratoriesから入手されるSprague-Dawleyラット（雄、２６１〜４２５ｇ）において、互いに比較され、またＰＥＧ化されていない成長ホルモンと比較される。カテーテルは、血液を採取するため頚動脈に外科的に挿入される。カテーテルの挿入に成功した後に、各動物は投与前に各治療群（１群：３〜６匹）に割り当てられる。動物は、１ｍｇ／ｋｇの化合物を含んでいる０．４１〜０．５５ｍｌ／ｋｇの投与量で皮下に投与される。血液サンプルは、留置カテーテルを介して各時点において、ＥＤＴＡでコーティングされたマイクロ遠心分離チューブの中に集められる。血漿は遠心分離することによって集められ、分析するまで−８０℃にて貯蔵される。化合物の濃度は、BioSource International(Camarillo, CA)またはDiagnostic Systems Laboratories (Webster, TX)から入手可能な抗体サンドイッチ成長ホルモンＥＬＩＺＡキットを用いて測定される。濃度は投与される類似体に対応するスタンダードに基づいて計算される。薬物動態学的パラメーターは、モデル化プログラムWinNonlin(Pharsight社, version 4.1)によって評価される。リンナーアップ／ログダウン（linear-up/log-down）台形積分を用いた非分画分析が使用されており、これにより、濃度データが一律に加重される。
【０７５０】
ラットに対する一度の皮下投与に続いて、血漿濃度を定期的に得る。ラット（１群：３〜６匹）にタンパク質１ｍｇ／ｋｇを一回で瞬時投与する。ｈＧＨの野生型タンパク質（ＷＨＯ  ｈＧＨ）、ヒスチジンタグが付加されたｈＧＨポリペプチド（ｈｉｓ−ｈＧＨ）、または６つの異なる位置でそれぞれ３０ｋＤａのＰＥＧとインドールを介して共有結合する非天然アミノ酸を含み、ヒスチジンタグが付加されたｈＧＨポリペプチドが、ＷＨＯ  ｈＧＨおよび（ｈｉｓ）−ｈＧＨと比較される。血漿試料は定期的に採取され、記載されているように、注入された化合物に対してアッセイされる。濃度−時間の曲線は、ノンコンパートメンタル解析(Pharsight社, version 4.1)によって評価される。表示される値は平均値である（標準偏差を＋／−で表す。）。Ｃｍａｘ：最大濃度、末端ｔ１／２：末端半減期、ＡＵＣ０＞ｉｎｆ：無限大と推定される濃縮時間曲線に基づく領域、ＭＲＴ：滞留時間という意味、Ｃｌ／ｆ：見かけの総量、血漿クリアランス、およびＶｚ／ｆ：終末期間の分布における見かけの体積。
【０７５１】
（実施例１３：薬力学に関する研究）
下垂体を切除したSprague-Dawleyラット（雄）は、Charles River Laboratoriesから入手可能である。下垂体は生後３〜４週間で外科的に除去される。動物は３週間馴化飼育され、その間体重が観察される。研究を開始する前の７日間で体重が０〜８ｋｇ増加した動物が選ばれ、治療群へ無作為に抽出される。ラットは、ボーラス投与量または日用量の何れかを皮下に投与される。研究の初めから終わりまで、ラットは毎日連続して計量され、麻酔され、血液採取され、（適用可能な場合には）投与される。血液は、ヘパリンが添加された毛細血管チューブを用いて眼窩洞から採取され、ＥＤＴＡでコーディングされたマイクロ遠心分離チューブの中に収められる。血漿は遠心分離によって単離され、分析まで−８０℃で貯蔵される。血漿濃度はラットにおける１回の皮下投与量に基づいて得られる。平均の血漿濃度（標準偏差を＋／−で表す。）は、時間間隔に対してプロットされる。
【０７５２】
ペプチドＩＧＦ−１は、ソマトメジンまたはインシュリンに類似する成長因子のファミリーの一員である。ＩＧＦ−１は、成長ホルモンが有する成長促進効果の多くを媒介する。ＩＧＦ−１の濃度は、競合的結合酵素イムノアッセイキット（Diagnosic Systems Laboratories社）を用いて、付属されたラット／マウスＩＧＦ−１のスタンダードと比較することによって測定される。下垂体を切除されたラット（１群：３〜６匹）は一回または毎日皮下投与される。動物は毎日連続して計量され、麻酔され、血液採取され、（適用可能な場合には）投与される。プラシーボの処置、野生型ｈＧＨ（ｈＧＨ）、ヒスチジンタグが付加されたｈＧＨ（（ｈｉｓ）ｈＧＨ）、ならびに３５位および９２位において３０ｋＤａのＰＥＧと共有結合するインドールを含んでいるｈＧＨポリペプチドについて、体重測定の結果を得た。
【０７５３】
（実施例１４：天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨ（ＰＥＧ化はインドール結合を介して行われている。）の安全性および／または有効性に関する、ヒトでの臨床試験）
以下の臨床試験の実施例は以下の用途に用いられる：小児および成人の成長ホルモン欠乏症、ターナー症候群、慢性腎不全、プラダー・ウィリー症候群、子宮内胎児発育不全の小児、特発性低身長、グルココルチコイドを慢性に多く投与したおことに伴う成長不全、移植後の成長不全、Ｘ染色体関連低リン血症性くる病、炎症性腸障害、ヌーナン症候群、骨異形成症、セリアック病に伴う成長不全、進行した後天性免疫不全症候群などに伴う筋消耗の治療；火傷、肥満を患う人の苛酷な食事制限の副作用、線維筋痛症、慢性疲労症候群および老齢化に伴う衰弱の治癒の促進；ならびにその他のヒト成長ホルモンの利用。
【０７５４】
（目的）皮下投与される、天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＰＥＧ化された組換えヒトｈＧＨの安全性および薬物動態を、市販のｈＧＨ製品（例えば、HumatropeＴＭ（Eli Lilly & Co．社）、NutropinＴＭ（Genentech社）、NorditropinＴＭ（Novo-Nordisk社）、GenotropinＴＭ（Pfizer社）およびSaizen/SerostimＴＭ（Serono社）などが挙げられるが、これらに限定されない）の１つ以上と比較すること。
【０７５５】
（患者）この調査に参加した１８人の健康な志願者は、年齢が８〜４０歳であり、体重が２０〜９０ｋｇである（例えば、小児は小児適応症（pediatric indications）について調査され、成人は成人の適応症(adult indication)について調査される。）。被験体は、血液学または血清化学、陰性の尿薬物中毒のスクリーニング検査、ＨＩＶスクリーニング検査、およびＨＢ抗原に関して、臨床的に重大な異常を示す検査値を有しない。被験体は、高血圧、主な血液病の何れかの病歴、重篤な肝臓障害、腎臓障害、心臓血管障害、胃腸障害、泌尿器障害、代謝障害、または神経障害の病歴、貧血または発作性障害の病歴、細菌由来または哺乳動物由来の生成物、ＰＥＧ、あるいはヒト血清アルブミンに対する既知の感受性、カフェイン含有飲料の習慣的且つ過剰な消費、本調査を開始する３０日以内に別の臨床試験に参加しているか、輸血または献血されている、本調査を開始する３ヶ月以内にｈＧＨを曝露されている、本調査を開始する７日以内に病気を発症している、および本調査を開始する１４日以内に、調査前の身体検査または臨床検査の値において顕著な異常を有する、という何れの兆候も有するべきではない。すべての被験体は、安全性についての評価が可能であり、薬物動態分析のためのすべての血液採取物は、予定通りに収集される。すべての試験は、制度倫理委員会の承認および患者の同意を得て実施される。
【０７５６】
（研究計画）本研究はフェーズＩ（phase I）であり、健康な男性志願者に対する、１施設の非盲検による任意に抽出した２つの区間の交差試験である。１８人の被験体は、２つの治療配列群のうち１つを任意に与えられる（９人／群）。ＧＨは、等量の天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨおよび選択された市販製品を用いた、大腿上方におけるボーラス皮下注射として、２回に分けられた投与期間の間中投与される。市販製品の投与量および投与回数は、パッケージのラベルに記載の指示に従う。市販製品の使用にあたって、さらなる投与、投与回数、または別のパラメーターが望まれるとき、これらは別の被験体群を含ませることによって、本研究に加えられてもよい。各投与期間は、１４日目のウオッシュアウト期間で分けられる。被験体は、各２つの投与期間の前に少なくとも１２時間、および各２つの投与期間の後に７２時間、研究施設に拘束されるが、投与期間中は拘束されない。また、ＰＥＧ化されたｈＧＨに関して試験するために、追加の投与、投与回数、または別のパラメーターが存在するのであれば、さらなる被験体群が加えられてもよい。本研究においては、ヒトに対しての使用が認められる、複数のＧＨの剤形を用いることができる。HumatropeＴＭ（Eli Lilly & Co．社）、NutropinＴＭ（Genentech社）、NorditropinＴＭ（Novo-Nordisk社）、GenotropinＴＭ（Pfizer社）およびSaizen/SerostimＴＭ（Serono社）は、ヒトに対しての使用が認められる市販のＧＨ製品である。ｈＧＨの実験用の剤形は、天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨである。
【０７５７】
（血液サンプリング）連番の血液は、ｈＧＨの投与前後に、直接血管に穴を開けることによって取り出される。血清中のＧＨ濃度の測定のための静脈血サンプル（５ｍＬ）は、投与前の約３０、２０、および１０分（３つの基準サンプル）、および投与後の約３０分および１、２、５、８、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０、および７２時間で得られる。それぞれの血清サンプルは２つのアリコート単位に分けられる。すべての血清サンプルは−２０℃で貯蔵される。血清サンプルはドライアイスの状態で出荷される。空腹時の臨床検査試験（血液学、血清化学、および尿検査）は、１日目の最初の投与前、４日目の朝、１６日目の投与される前、および１９日目の朝に迅速に実施される。
【０７５８】
（生物分析法）ＥＬＩＺＡキットを用いた方法（Diagnostic Systems Laboratory [DSL], Webster TX）が、血清中のＧＨ濃度を測定するために用いられる。
【０７５９】
（安全性の測定）生命兆候は、１日目および１６日目それぞれの投与前、およびこれらの投与後６、２４、４８、ならびに７２時間経過時点で速やかに記録される。安全性の測定は、有害事象発生率および有害事象の種類、ならびに臨床検査試験における基準値からの変化に基づく。さらに、生命兆候（例えば、血圧）の測定における検査前からの変化、および身体検査の結果が測定される。
【０７６０】
（データ分析）投与後の血清中濃度値は、投与後のそれぞれの値から差し引くことによって、投与前の基準のＧＨ濃度に対して補正される。ここで、基準のＧＨ濃度とは、投与前３０分、２０分、および１０分に採取された３つのサンプルから得られるＧＨの値を平均化することによって求められる。投与前に採取されたサンプルの血清中ＧＨ濃度がアッセイの定量化値を下回る場合、この濃度は平均値の算出には含まれない。薬物動態学的パラメーターは、基準のＧＨ濃度に対して補正された血清中濃度データから求められる。薬物動態学的パラメーターは、最新版のＢＩＯＡＶＬソフトウェアを用いて、ＶＡＸ  ８６００コンピュータシステム（Digital Equipment社）上のモデル独立法（model independent methods）によって算出される。このシステムでは、次の薬物動態パラメーターが求められる。すなわち、血清中の濃度ピーク（Ｃｍａｘ）、血清中の濃度ピークに達する期間（Ｔｍａｘ）、線形台形法則の利用によって算出される、０時から最終血液採取時（ＡＵＣ０−７２）までの濃度−時間の曲線（ＡＵＣ）、および消失速度定数から算出された末端消失半減期（ｔ１／２）である。消失速度定数は、対数−直線濃度−期間プロットの末端にある直線領域における、連続したデータポイントの直線回帰によって算定される。薬物動態学的パラメーターの標準偏差（ＳＤ）および変動係数（ＣＶ）は、各処理に対して算出されるものを意味する。パラメーター平均値の比（保存された公式／保存されていない公式）が、算出される。
【０７６１】
（安全性の結果）有害事象発生率は、治療群全体に均等に分散される。臨床検査試験または血圧測定の基準値あるいは調査前の値から、臨床的に著しい変化はみられず、また、身体検査の結果および生命兆候想定において調査前からの注目すべき変化はみられない。２つの治療群に関する安全性は、類似しているであろう。
【０７６２】
（薬物動態の結果）市販のｈＧＨ製品（例えば、HumatropeＴＭ（Eli Lilly & Co．社）、NutropinＴＭ（Genentech社）、NorditropinＴＭ（Novo-Nordisk社）、GenotropinＴＭ（Pfizer社）およびSaizen/SerostimＴＭ（Serono社）などが挙げられるが、これらに限定されない）の１つ以上を１回投与された後の１８人すべての被験体において、平均血清中のＧＨ濃度−時間のプロフィール（ＧＨの基準値に対して補正されていない。）と、天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨとが、測定された各時点において比較される。すべての被験体は、投与前に正常な生理的範囲内の基準のＧＨ濃度を有するべきである。薬物動態学的パラメーターは、投与前の平均的な基準のＧＨ濃度に対して補正された血清データから割り出されることによって、ＣｍａｘおよびＴｍａｘが求められる。選択された臨床コンパレータ（HumatropeＴＭ（Eli Lilly & Co．社）、NutropinＴＭ（Genentech社）、NorditropinＴＭ（Novo-Nordisk社）、GenotropinＴＭ（Pfizer社）およびSaizen/SerostimＴＭ（Serono社））のＴｍａｘの平均値は、天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨのＴｍａｘの平均値よりも著しく短い。テストされた市販のｈＧＨ製品の末端半減期の値は、天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨの末端半減期と比較して、著しく短い。
【０７６３】
本発明は、健康な男性を被験体として実施されるが、別の患者集団において、同様の吸収特性および安全性プロフィールが予測され得る。別の患者集団としては、例えば、ガンまたは慢性腎不全を発症している男性あるいは女性患者、小児腎不全患者、自己貯血式プログラムにおける患者、または選択的手術を予定している患者が挙げられる。
【０７６４】
結論として、天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨを皮下に投与する１回の投与量は、安全且つ健康な男性被験体がよく耐え得る。有害事象の比較発症率、臨床検査値、生命兆候、および生理学的試験の結果に基づく、市販される形式のｈＧＨおよび天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨの安全性プロフィールは均等である。天然にコードされていないアミノ酸を含んでいるＰＥＧ化されたｈＧＨは、潜在的に患者および医療提供者に大きな臨床利用性をもたらす。
（実施例１５：ＰＥＧ化されたｈＧＨおよびＰＥＧ化されていないｈＧＨの水溶性の比較）
ｈＧＨ野生型タンパク質（ＷＨＯ  ｈＧＨ）、ヒスチジンタグが付加されたｈＧＨポリペプチド（ｈｉｓ-ｈＧＨ）または位置９２において３０ｋＤａのＰＥＧと共有結合する非天然アミノ酸インドールを含んでいる、ヒスチジンタグが付加されたｈＧＨポリペプチドの水溶性は、１００μＬの水に溶かすことができるそれぞれのポリペプチドの量を特定することによって得られる。ＰＥＧ化されたｈＧＨの量がＷＨＯ  ｈＧＨおよびｈＧＨの量よりも大きく、これにより、非天然アミノ酸のポリペプチドをＰＥＧ化することで水溶性が向上することがわかる。
【０７６５】
（実施例１６：修飾された治療活性を有する非天然アミノ酸のポリペプチドのインビボによる検討）
前立腺癌腫瘍の異種移植片をマウスに移植し、２つの群に分ける。１つの群は、修飾された治療活性を有する非天然アミノ酸のポリペプチドを用いて毎日治療され、もう１つの群は、治療活性を有する天然アミノ酸のポリペプチドを用いて毎日治療される。腫瘍の大きさを毎日測定し、修飾された治療活性を有する非天然アミノ酸のポリペプチドは、それを用いて治療された群における腫瘍の大きさの減少に示されるように、治療活性を有する天然アミノ酸のポリペプチドと比較して、治療効率を向上させた。
【０７６６】
（実施例１７：非天然アミノ酸のポリペプチドの活性および親和性の測定）
この実施例では、非天然アミノ酸のポリペプチドの活性、および非天然アミノ酸のポリペプチドの、その受容体、結合パートナー、またはリガンドに対する親和性の測定について述べる。
【０７６７】
非天然アミノ酸のポリペプチド受容体、結合パートナー、またはリガンドに対するタンパク質は、実証された方法に従って発現および単離される。Ｂｉｏｃｏｒｅ（登録商標）システムは、非天然アミノ酸のポリペプチドとその受容体との結合を分析するために使用される。同様に、結合パートナーおよびリガンドは、このアッセイにおいて使用され得る。
【０７６８】
製造業者によって推奨されているアミンカップリング法を用いて、約６００〜８００ＲＵの水溶性受容体は、Ｂｉｏｃｏｒｅ（登録商標）ＣＭ５チップの上に固定化される。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Ｂｉｏｃｏｒｅ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に溶解されている、各種濃度の野生型（天然）アミノ酸ポリペプチドまたは修飾されたもしくは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドは、流速４０μｌ／分で４〜５分間、表層に投与され、投与後の１５分間分離が観察された。表層は、４．５ＭのＭｇＣｌ２を１５秒律動的に送ること（pulse）によって再生される。再生を１００回繰り返したとしても、観察される結合親和性の損失は、極めて少なく、１〜５％である。固定化された受容体を有しない参照セルは、任意の緩衝バルク効果および非特異的な結合を差し引くために用いられる。
【０７６９】
修飾されたまたは修飾されていない非天然アミノ酸のポリペプチドの滴定実験から得られた動的結合のデータは、BiaEvaluation 4.1 software（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））を用いて処理される。平衡解離定数（Ｋｄ）は個々の速度定数（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）の割合として計算される。
【０７７０】
非天然アミノ酸のポリペプチドの受容体、結合パートナー、またはリガンドを発現する安定細胞株は樹立される。細胞は、受容体、結合パートナー、またはリガンドｃＤＮＡを含んでいるコンストラクトを用いてエレクトロポレーションされる。トランスフェクションされた細胞は、クローニング前に４８時間回復させられ得る。受容体、結合パートナー、またはリガンドを発現する形質転換体は、受容体に対する抗体を用いて表面染色することによって同定され、ＦＡＣＳアレイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンディエゴ、ＣＡ）で分析される。安定にトランスフェクションされた細胞クローンは、所望の形質転換体を繰り返しサブクローニングすることによって、樹立される。このような細胞は、細胞結合アッセイにおいて使用される。
【０７７１】
２つ組の（３×１０６）細胞は、各種濃度（容積：１０μｌ）の未標識の非天然アミノ酸のポリペプチドまたは陰性対照のポリペプチドの非在下または存在下、および１２５Ｉ−（修飾された）非天然アミノ酸のポリペプチド（約１００，０００ｃｐｍまたは１ｎｇ）の存在下において、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（１００μｌ）中にて、０℃で９０分間インキュベートされる（全量：１２０μｌ）。細胞は、その後再び懸濁され、３５０μｌプラスチック遠心分離管内の氷冷された２００μｌのＦＣＳ上に積層され、遠心分離にかけられる（１，０００ｇ、１分）。ペレットは遠心管の末端を切断することによって採集され、ペレットおよび上澄みはガンマ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ社）において別々に計測される。
【０７７２】
特異的な結合（ｃｐｍ）は、競合相手の非在下におけるすべての結合（２回の平均値）から非特異的な結合を引いたものとして測定される。非特異的な結合は、使用されるそれぞれの細胞の種類に応じて測定される。実験は１２５Ｉ−（修飾された）非天然アミノ酸のポリペプチドの調製液と同じものを用いて別の日に行うことで、内部的な一貫性を示すべきである。１２５Ｉ−（修飾された）非天然アミノ酸のポリペプチドは、受容体、結合タンパク質、またはリガンド生成細胞との結合を実証する。この結合は、未標識非天然アミノ酸のポリペプチドにより用量依存的に阻害されるが、陰性対照ポリペプチドによっては阻害されない。
【０７７３】
本明細書に記載の実施例および実施形態は単に実例を示す目的のためのものであって、これを考慮した様々な変形例および変更も本願の精神および範囲ならびに添付の請求項の範囲に含まれることがわかる。
【０７７４】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０７７５】
【図１】本明細書に記載の方法、組成物、方策および技術に係るある態様の関係を表わす非限定的な略図である。
【図２】フィッシャーのインドール合成のメカニズムを表わす非限定的な略図である。
【図３】本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【図４】本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【図５】本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法を説明するための非限定的な一実施例を示す。
【図６】本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【図７】本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【図８】本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【図９】本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【図１０】本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【図１１】本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法の非限定的な具体例を示す図である。
【図１２】フィッシャーのインドール合成に対する金属イオンの効果の非限定的な具体例を示す図である。
【図１３】本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法に対して、ニッケル金属イオンが奏する促進効果の非限定的な具体例を示す図である。
【図１４】本明細書に記載の非天然アミノ酸を作製するために用いられる合成方法に対して、溶媒が奏する効果の非限定的な具体例を示す図である。
【図１５】本明細書に記載のインドールを含んでいる非天然アミノ酸の合成に用いられるヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸試薬の非限定的な具体例を示す図である。
【図１６】本明細書に記載のインドールを含んでいる非天然アミノ酸の合成に用いられる、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸試薬およびマスクされているカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸試薬の非限定的な具体例を示す図である。
【図１７】本明細書に記載のインドールを含んでいる非天然アミノ酸の合成に用いられるカルボニルを含んでいるおよびマスクされているカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸試薬の非限定的な具体例を示す図である。
【図１８】本明細書に記載のインドールを含んでいる非天然アミノ酸の合成に用いられるカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸試薬の非限定的な具体例を示す図である。
【図１９】修飾されたインドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成するために行われる、ヒドラジンを含んでいる試薬を用いた、カルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドの翻訳後修飾の非限定的な具体例を示す図である。
【図２０】修飾されたインドールを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドを形成するために行われる、カルボニルを含んでいる試薬を用いた、ヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドの翻訳後修飾の非限定的な具体例を示す図である。
【図２１】インドールを含んでいる非天然アミノ酸タンパク質を形成するために行われる、ヒドラジンを含んでいる試薬を用いた、カルボニルを含んでいるおよびマスクされているカルボニルを含んでいるタンパク質の標識または修飾の非限定的な具体例を示す図である。
【図２２】インドールを含んでいる非天然アミノ酸タンパク質を形成するために行われる、カルボニルを含んでいる試薬を用いた、ヒドラジンを含んでいるタンパク質の標識または修飾の非限定的な具体例を示す図である。
【図２３】（Ａ）は非天然アミノ酸のポリペプチドをカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドへ化学変換する修飾の非限定的な具体例を示す図であり、（Ｂ）は非天然アミノ酸のポリペプチドをヒドラジンを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドへ化学変換する修飾の非限定的な具体例を示す図である。
【図２４】（Ａ）は、ヒドラジンまたはカルボニルを含んでいる非天然アミノ酸のポリペプチドもしくはタンパク質を修飾して、所望の官能基を導入する非限定的な具体例を示す図であり、（Ｂ）は、官能基を含有するポリペプチドまたはタンパク質をＰＥＧ誘導体と反応させる非限定的な具体例を示す図である。
【図２５】二官能リンカー基を使用して、インドールを形成することによって、非天然アミノ酸を含有するタンパク質またはポリペプチドをＰＥＧ誘導体と連結することを説明する非限定的な図である。
【図２６】両末端にヒドラジンを含んでいる二官能リンカー基の合成の非限定的な具体例を示す図である。
【図２７】二官能リンカーを使用して、２つの非天然アミノ酸のポリペプチドのホモ二量体を形成する非限定的な具体例を示す図である。
【図２８】枝分かれＰＥＧを含有する試薬とカルボニルの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドとを反応させて、インドールで修飾されたポリペプチドを形成する非限定的な具体例を示す図である。
【図２９】インドールで修飾されたポリペプチドを形成するための、試薬を含有する枝分かれＰＥＧとポリペプチドを含んでいるヒドラジン非天然アミノ酸との間の反応の非限定的な具体例を示す図である。
【図３０】ヒドラジン基とカルボニル基とを含んでいるＰＥＧ誘導体の非限定的な具体例を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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