(57)【要約】  本発明は、一般的には分子生物学の分野に関し、植物中の以下の核酸配列の発現を増加させることにより各種植物収穫高関連形質を増強する方法に関する：(i)成長調節因子(GRF)ポリペプチドをコードする核酸配列；および(ii)滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドをコードする核酸配列、ここで、該収穫高関連形質は、以下の核酸配列のうちの1つの発現が増加した植物と比較して増強されている：(i) GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii) SYTポリペプチドをコードする核酸配列。本発明はまた、以下の核酸配列の発現が増加した植物にも関する：(i) GRFポリペプチドをコードする核酸配列；および(ii) SYTポリペプチドをコードする核酸配列、ここで、該植物は、以下の核酸配列のうちの1つの発現が増加した植物と比較して増強された収穫高関連形質を有する：(i) GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii) SYTポリペプチドをコードする核酸配列。本発明はまた、本発明の方法で有用な構築物も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物中の以下の核酸配列：(i)成長調節因子(GRF)ポリペプチドをコードする核酸配列；および(ii)滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を増加させるステップを含む、植物収穫高関連形質を増強する方法であって、該収穫高関連形質は、以下の核酸配列のうちの1つ：(i) GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii) SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物と比較して増強されている、上記方法。
【請求項２】
前記GRFポリペプチドが、以下のドメイン：(i)配列番号115により示されるQLQドメインに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するドメイン；および(ii)配列番号116により示されるWRCドメインに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記GRFポリペプチドが、以下のドメイン：(i) InterPro登録番号IPR014978 (PFAM登録番号PF08880)を有するQLQドメイン；(ii) InterPro登録番号IPR014977 (PFAM登録番号PF08879)を有するWRCドメイン；および(iii) 3つのCys残基および1つのHis残基を保存された配置(CX9CX10CX2H)で含む転写エフェクター(ET)ドメインを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記GRFポリペプチドが、配列番号2により示されるGRFポリペプチドに対して、または本明細書中の表A.1に示されるポリペプチド配列のうちいずれかに対して、好ましくなっていく順に、少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記GRFポリペプチドをコードする核酸配列が、表A.1に示される配列番号の核酸配列のうちいずれか1つもしくはその一部分により示されるか、または表A.1に示される配列番号の核酸配列のいずれか1つとハイブリダイズすることが可能な配列である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸配列が、表A.1に示される配列番号のGRFポリペプチド配列のうちいずれかのオルソログまたはパラログをコードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記GRFポリペプチドをコードする核酸配列が、構成的プロモーター、より好ましくはGOS2プロモーター、最も好ましくは配列番号117により示されるイネ由来のGOS2プロモーターに機能的に連結されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記GRFポリペプチドをコードする核酸配列が、植物由来、好ましくは双子葉植物由来、さらに好ましくはアブラナ科由来、最も好ましくはシロイヌナズナ由来である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記SYTポリペプチドをコードする核酸配列のSYTポリペプチドが、N末端からC末端に向かって、以下のドメイン：(i)配列番号262のSNHドメインに対して、好ましくなっていく順に、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するSNHドメイン；および(ii) Metリッチドメイン；および(iii) QGリッチドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記SYTポリペプチドが、配列番号263により示され、図5に黒色で示されるSNHドメインの最も保存された残基をさらに含む、請求項１または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記SYTポリペプチドが、配列番号264のInterPro登録番号IPR007726を有するSSXTドメインに対して、好ましくなっていく順に、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するドメインを含む、請求項１、９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記SYTポリペプチドが、配列番号121により示されるSYTポリペプチドに対して、または本明細書中の表A.2に示される全長ポリペプチド配列のいずれかに対して、好ましくなっていく順に、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有する、請求項１、９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記SYTポリペプチドをコードする核酸配列が、表A.2に示される配列番号の核酸配列のうちいずれか1つもしくはその一部分により示されるか、または表A.2に示される配列番号の核酸配列のいずれか1つとハイブリダイズすることが可能な配列である、請求項１、９、１０、１１または１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸配列が、表A.2に示される配列番号のSYTポリペプチド配列のいずれかのオルソログまたはパラログをコードする、請求項１、９、１０、１１、１２または１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記SYTポリペプチドをコードする核酸配列が、構成的プロモーター、より好ましくはGOS2プロモーター、最も好ましくは配列番号117により示されるイネ由来のGOS2プロモーターに機能的に連結されている、請求項１、９、１０、１１、１２、１３または１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記SYTポリペプチドをコードする核酸配列が、植物由来、好ましくは双子葉植物由来、さらに好ましくはアブラナ科由来、最も好ましくはシロイヌナズナ由来である、請求項１、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記増加した発現が、以下の核酸配列：(i) GRFポリペプチドをコードする核酸配列；および(ii) SYTポリペプチドをコードする核酸配列を植物に導入し、かつ発現させることにより生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記(i)および(ii)の核酸配列が、好ましくは交配により、より好ましくは再形質転換により、植物に逐次的に導入され、かつ発現される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記交配が、GRFポリペプチドをコードする導入され発現される単離核酸配列を含む雌性親植物と、SYTポリペプチドをコードする導入され発現される単離核酸配列を含む雄性親植物との間で行われるか、またはその逆で行なわれ、かつ両方の導入遺伝子の存在および発現について子孫を選別することにより行なわれ、該植物は各親植物と比較して増強された収穫高関連形質を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記再形質転換が、GRFポリペプチドをコードする核酸配列を、SYTポリペプチドをコードする導入され発現される核酸配列を含む植物、植物部分または植物細胞に導入しかつ発現させることにより、またはその逆により行なわれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記(i)および(ii)の核酸配列が、植物に同時に導入され、かつ発現される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記(i)および(ii)の核酸配列が、1以上の核酸分子に含まれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記増強した収穫高関連形質が、以下の形質：(i)増大した初期活力(early vigour)；(ii)増加した地上バイオマス；(iii)増加した植物当たり総種子収穫高；(iv)増加した種子充填率；(v)増加した(充填)種子数；(vi)増加した収穫指数；または(vii)増加した千粒重(TKW)のうち1以上である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記GRFポリペプチドをコードする核酸配列および前記SYTポリペプチドをコードする核酸配列が、構成的プロモーター、好ましくは植物構成的プロモーター、より好ましくはGOS2プロモーター、最も好ましくは配列番号117により示されるイネ由来のGOS2プロモーターに機能的かつ連続的に連結されている、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法により取得可能な植物、植物部分（種子を含む）または植物細胞であって、(i) GRFポリペプチドをコードする単離された核酸導入遺伝子、および(ii) SYTポリペプチドをコードする単離された核酸導入遺伝子を含む、上記植物、植物部分または植物細胞。
【請求項２６】
以下の配列：
(a)請求項２〜６のいずれか１項に規定されるGRFポリペプチドをコードする核酸配列；
(b)請求項９〜１３のいずれか１項に規定されるSYTポリペプチドをコードする核酸配列；
(c) (a)および(b)の核酸配列の発現を駆動することが可能な1以上の制御配列；および任意により
(d)転写終結配列
を含む、構築物。
【請求項２７】
前記制御配列が、少なくとも1つの構成的プロモーター、好ましくはGOS2プロモーター、より好ましくは配列番号117により示されるGOS2プロモーターである、請求項２６に記載の構築物。
【請求項２８】
構築物の混合物であって、少なくとも1つの構築物が以下の配列：
(a)請求項２〜６のいずれか１項に規定されるGRFポリペプチドをコードする核酸配列；
(b) (a)の核酸配列の発現を駆動することが可能な1以上の制御配列；および任意により
(c) 転写終結配列
を含み、少なくとも1つの他の構築物が、以下の配列：
(d)請求項９〜１３のいずれか１項に規定されるSYTポリペプチドをコードする核酸配列；
(e) (d)の核酸配列の発現を駆動することが可能な1以上の制御配列；および任意により
(f)転写終結配列
を含む、上記構築物の混合物。
【請求項２９】
前記(b)および／または(e)の制御配列が、少なくとも1つの構成的プロモーター、好ましくはGOS2プロモーター、より好ましくは配列番号117により示されるGOS2プロモーターである、請求項２８に記載の構築物。
【請求項３０】
以下の核酸配列：(a) GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(b) SYTポリペプチドをコードする核酸配列のうち1つの発現が増加している植物と比較して増強された収穫高関連形質を有する植物を作製する方法での、請求項２６もしくは２７に記載の構築物または請求項２８に記載の構築物の混合物の使用であって、増強した収穫高関連形質とは、以下の形質：(i)増大した初期活力(early vigour)；(ii)増加した地上バイオマス；(iii)増加した植物当たり総種子収穫高；(iv)増加した種子充填率；(v)増加した(充填)種子数；(vi)増加した収穫指数；または(vii)増加した千粒重(TKW)のうち1以上である、上記使用。
【請求項３１】
請求項２６もしくは２７に記載の構築物または請求項２８に記載の構築物の混合物で形質転換された、植物、植物部分または植物細胞。
【請求項３２】
以下の核酸配列：(i) GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii) SYTポリペプチドをコードする核酸配列のうち1つの発現が増加している植物と比較して増強された収穫高関連形質を有するトランスジェニック植物を作製する方法であって、以下のステップ：
a.構成的プロモーターの制御下に、請求項２〜６のいずれか１項に規定されるGRFポリペプチドをコードする核酸配列を、植物、植物部分または植物細胞に導入し、かつ発現させるステップ；および
b.構成的プロモーターの制御下に、請求項９〜１３のいずれか１項に規定されるSYTポリペプチドをコードする核酸配列を、植物、植物部分または植物細胞に導入し、かつ発現させるステップ；および
c.植物の成長および発達を促進する条件下で該植物細胞、植物部分または植物を栽培するステップ
を含む、上記方法。
【請求項３３】
以下の核酸配列：(i)請求項２〜６のいずれか１項に規定されるGRFポリペプチドをコードする核酸配列、および(ii)請求項９〜１３のいずれか１項に規定されるSYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現の増加により生じる、以下の核酸配列：(i) GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii) SYTポリペプチドをコードする核酸配列のうちの1つの発現が増加している植物と比較して増強された収穫高関連形質を有するトランスジェニック植物、または該トランスジェニック植物に由来するトランスジェニック植物細胞もしくはトランスジェニック植物部分。
【請求項３４】
前記植物が、作物植物または単子葉類または穀類、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、アワ、ライムギ、ライコムギ、モロコシおよびオートムギである、請求項２５、３１または３３に記載のトランスジェニック植物、または該トランスジェニック植物に由来するトランスジェニック植物細胞。
【請求項３５】
以下の核酸配列：(i) GRFポリペプチドをコードする単離された核酸配列；および(ii) SYTポリペプチドをコードする単離された核酸配列を含む、請求項３４に記載の植物の収穫可能部分であって、好ましくは種子である、上記収穫可能部分。
【請求項３６】
請求項３４に記載の植物および／または請求項３５に記載の植物の収穫可能部分に由来する製品。
【請求項３７】
以下の核酸配列：(i) GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii) SYTポリペプチドをコードする核酸配列のうちの1つの発現が増加している植物と比較して植物で収穫高関連形質を増強させるステップにおける、以下の核酸配列：(i)請求項２〜６のいずれか１項に規定されるGRFポリペプチドをコードする核酸配列、および(ii)請求項９〜１３のいずれか１項に規定されるSYTポリペプチドをコードする核酸配列の使用であって、増強した収穫高関連形質とは、以下の形質：(i)増大した初期活力(early vigour)；(ii)増加した地上バイオマス；(iii)増加した植物当たり総種子収穫高；(iv)増加した種子充填率；(v)増加した(充填)種子数；(vi)増加した収穫指数；または(vii)増加した千粒重(TKW)のうち1以上である、上記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には分子生物学の分野に関し、植物中の以下の核酸配列の発現を増加させることにより様々な植物の収穫高関連形質を増強する方法に関する:(i)成長調節因子(GRF)ポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドをコードする核酸配列、ここで、該収穫高関連形質は、以下の核酸配列のうちの1つの発現が増加した植物と比較して増強されている:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列。本発明はまた、以下の核酸配列の発現が増加した植物にも関する:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列、ここで、該植物は、以下の核酸配列のうちの1つの発現が増加した植物と比較して増強された収穫高関連形質を有する:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列。本発明はまた、本発明の方法で有用な構築物も提供する。
【背景技術】
【０００２】
増え続ける世界の人口および農業燃料に利用可能な耕地供給の漸減によって、農業の有効性の増大が研究対象となっている。収穫高および園芸の改善のための従来の手段では、選択的交配技法を使用して、望ましい特性を有する植物を同定する。しかしながら、このような選択的交配技法にはいくつかの欠点があり、すなわち、これらの技法は典型的には労働集約的であり、親植物から伝わる望ましい形質を常にもたらすわけではない異種の遺伝成分を含有することが多い植物を生じる。分子生物学の進歩によって、人類は動物および植物の生殖質を改変することが可能となっている。植物の遺伝子工学は、(典型的にはDNAまたはRNAの型の)遺伝物質の単離および操作、ならびに植物中へのその遺伝物質のその後の導入を伴う。このような技術には、様々な改善された経済的な、農学的なまたは園芸上の形質を有する穀物または植物をもたらす能力がある。
【０００３】
経済的に特に興味深い形質は増強された収穫高である。通常収穫高は、穀物からの経済的価値がある測定可能な生産として定義する。これは量および/または質の点で定義することができる。収穫高は、いくつかのファクター、例えば、器官の数および大きさ、植物構造(例えば、枝の数)、種子の生成、葉の老化などに直接依存する。根の発達、栄養摂取、ストレス耐性および初期活力も、収穫高を決定する際の重要なファクターである。したがって前述のファクターの最適化は、穀物収穫高の増大に貢献する可能性がある。
【０００４】
種子の収穫高は特に重要な形質である。多くの植物の種子はヒトおよび動物の栄養に重要であるからである。トウモロコシ、イネ、コムギ、カノーラおよびダイズなどの穀物は、種子自体の直接消費による摂取であれ、または加工種子で飼育した肉の製品の消費による摂取であれ、ヒトの全カロリー摂取の半分より多くを占める。これらは工業過程において使用される糖、油および多くの種類の代謝産物の供給源でもある。種子は胚(新芽および根茎の供給源)および胚乳(発芽中および苗の初期発生中の胚発生のための栄養の供給源)を含有する。種子の発生には多くの遺伝子が関与し、根茎、葉および茎から発生中の種子への代謝産物の移動を必要とする。特に胚乳は、炭水化物、油およびタンパク質の代謝前駆体を同化し、それらを貯蔵マクロ分子に合成して穀粒を膨張させる。
【０００５】
植物のバイオマスは、アルファルファ、サイレージ用トウモロコシおよび干し草のような飼料作物に関する収穫高である。収穫高の多くの代用が穀類作物において使用されている。この中の主なものは植物の大きさの推定値である。植物の大きさは、種および発生段階に応じて多くの方法で測定することが可能であるが、植物全体の乾燥重量、地上乾燥重量、地上生体重、葉面積、茎体積、植物の高さ、ロゼット径、葉長、根茎長、根茎重量、若芽の数および葉の数を含む。多くの生物種は、所与の発生段階における植物の異なる部分の大きさの間で一定の保存率を維持する。これらの相対成長関係を使用して、これらの大きさの測定値の1つから別の測定値を推定する(例えば、Tittonell et al 2005 Agric Ecosys & Environ105:213)。初期発生段階での植物の大きさは、典型的には発生中後期の植物の大きさと相関関係があるはずである。大きな葉面積を有する大きな植物は、典型的には小さな植物より多量の光および二酸化炭素を吸収することができ、したがっておそらく同じ期間中により増量する可能性がある(Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica50:39)。これが、考えられるミクロ環境の継続または植物が最初に大きな大きさに達しなければならなかった遺伝的利点に加わる。植物の大きさおよび成長率の強い遺伝的要素が存在し(例えば、ter Steege et al 2005 Plant Physiology 139:1078)、1つの環境条件下での一定範囲の多様な遺伝子型の植物の大きさは、別の条件下での大きさと相関関係がある可能性がある(Hittalmani et al 2003 Theoretical Applied Genetics 107:679)。このようにして標準環境を、野生で穀物が直面する異なる位置および時間での多様な動的環境の代用として使用する。
【０００６】
多くの穀物に関する別の重要な形質は初期活力(early viguor)である。初期活力の改善は、温度と熱帯イネ栽培品種の両方における現代のイネ交配プログラムの重要な目的である。長い根茎は、水生米の適切な土壌中の固定に重要である。米を水田に直接植え付ける場合、および植物が水中から急速に現れる場合、より長い新芽は活力と関係がある。すじまきを実施する場合、長い中茎および子葉鞘が良い実生発生に重要である。遺伝子操作により植物に初期活力をもたらすことができれば、農業分野で非常に重要である可能性がある。例えば、乏しい初期活力は、欧州大西洋沿岸諸国のCorn Beltの遺伝資源に基づくトウモロコシ(ゼア・メイス(Zea mays L.))ハイブリッドを導入する制約となっている。
【０００７】
収穫指数、すなわち種子収穫高と地上乾燥重量の比は多くの環境条件下で比較的安定しており、植物の大きさと穀粒収穫高の間の確かな相関関係をしばしば得ることができる(例えば、Rebetzke et al 2002 Crop Science42:739)。大部分の穀粒バイオマスは植物の葉および茎による最新または保存状態の光合成による生産量に依存するので、これらのプロセスは本質的に関連している(Gardener et al 1985 Physiology of Crop Plants.Iowa State University Press,pp68-73)。したがって、発生の初期段階であっても、植物の大きさの選択が将来の考えられる収穫高の指標として使用されている(例えば、Tittonell et al 2005 Agric Ecosys & Environ105:213)。ストレス耐性に対する遺伝的差異の影響を試験するとき、土壌の性質、温度、水および栄養素利用性および光強度を標準化する能力は、野生と比較して温室または植物栽培チャンバー環境の固有の利点である。しかしながら、風または昆虫の不在、または成熟根茎または林冠の生長に不充分なスペースが原因である少ない受粉による収穫高に対する人為的制約は、収穫高の差異を試験するためのこれらの制御環境の使用を制限する可能性がある。したがって、栽培チャンバーまたは温室中の標準条件下での初期発生中の植物の大きさの測定は、考えられる遺伝的収穫高の利点の指標を与えるための標準的習慣である。
【０００８】
重要な別の形質は、改善された非生物的ストレス耐性の形質である。非生物的ストレスは世界規模で穀物損失の主な原因であり、50％を超えて大部分の主な穀物植物に関する平均収穫高を減少させる(Wang et al.(2003)Planta218:1-14)。非生物的ストレスは、干ばつ、塩分濃度、極端な温度、化学毒性、栄養過剰または欠乏(マクロ元素および/またはミクロ元素)、放射および酸化ストレスによって引き起こされる可能性がある。非生物的ストレスに対する植物の耐性を増大する能力は、世界規模で農業従事者に大きな経済的利点がある可能性があり、穀物の栽培が他に可能である可能性がない悪条件および地域において、穀物の栽培を可能にする可能性がある。
【０００９】
したがって穀物の収穫高は、前述のファクターの1つの最適化によって増大することができる。
【００１０】
最終用途に応じて、特定の収穫高形質の改変が他の改変より好ましい可能性がある。例えば、飼料または木材生産、またはバイオ燃料資源などの適用例には、植物の植物性部分の増大が望ましい可能性があり、小麦粉、澱粉または石油生産などの適用例には、種子のパラメータの増大が特に望ましい可能性がある。種子のパラメータの中でさえ、いくつかのパラメータは、適用例に応じて他のパラメータより好ましい可能性がある。それが増大した種子の大きさ、または増大した種子の形であれ、様々なメカニズムが種子収穫高の増大に貢献する可能性がある。
【００１１】
植物における収穫高関連形質(種子収穫高および/またはバイオマス)を増強するための一手法は、植物の増殖または防御機構に関与する細胞周期または様々なシグナル伝達経路などの、植物の固有の増殖機構の修飾による手法であってよい。
【００１２】
植物中の以下の核酸配列:(i)成長調節因子(GRF)ポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を増加させることによって、植物中の様々な収穫高関連形質を増強することが可能であり、該収穫高関連形質は、以下の核酸配列の1つ:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物と比較して増強されていることが現在分かっている。増強した収穫高関連形質は、以下の形質:増大した初期活力、増加した地上バイオマス、増加した植物当たり総種子収穫高、増加した種子充填率、増加した(充填)種子数、増加した収穫指数または増加した千粒重(TKW)のうち1以上を含む。
【００１３】
成長調節因子(GRF)ポリペプチドに関する背景
DNA結合タンパク質は、多くのDNA結合ドメインのいずれかを含み、したがってDNAに対する特異的または一般的な親和性を有するタンパク質である。DNA結合タンパク質には、例えば転写のプロセスを調節する転写因子、DNA分子を切断するヌクレアーゼ、および細胞核中のDNAパッケージングに関与するヒストンがある。
【００１４】
転写因子は、配列特異的DNA結合親和性を示し、転写を活性化および/または抑制することができるタンパク質として通常定義される。シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のゲノムは、その推定合計数の遺伝子の約5.9％を占める、少なくとも1533の転写レギュレーターをコードしている(Riechmann et al.(2000)Science290: 2105-2109)。イネ転写因子のデータベース(DRTF)は、オリザ・サティバ(Oryza sativa L.)インディカ種(ssp. indica)およびオリザ・サティバ  ジャポニカ種(ssp. japonica)の既知の予想転写因子の集合体であり、現在はインディカ種では2,025の推定転写因子(TF)遺伝子モデル、およびジャポニカ種では2,384を含有し、63のファミリーに分けられる(Gao et al.(2006) Bioinformatics 2006,22(10):1286-7)。
【００１５】
これらのファミリーの1つは、植物に特異的である転写因子の成長調節因子(GRF)ファミリーである。少なくとも9個のGRFポリペプチドがシロイヌナズナにおいて(Kim et al.(2003)Plant J 36: 94-104)、少なくとも12個がオリザ・サティバにおいて(Choi et al.(2004) Plant Cell Physiol45(7):897-904)同定されている。GRFポリペプチドは、それぞれのドメイン内の最も保存されたアミノ酸の名をとって命名された、少なくとも2つの高度に保存されたドメイン:(i)ドメインの大部分の保存アミノ酸がGln-Leu-Glnである、QLQドメイン(InterPro登録番号IPR014978、PFAM登録番号PF08880)、および(ii)ドメインの大部分の保存アミノ酸がTrp-Arg-Cysである、WRCドメイン(InterPro登録番号IPR014977、PFAM登録番号PF08879)のN末端半分での存在によって特徴付けられる。WRCドメインは2つの異なる構造特徴をさらに含有し、すなわち、WRCドメインには塩基性アミノ酸LysおよびArgが多量に存在し、転写エフェクター(ET)ドメインと呼ばれる保存された配置(CX9CX10CX2H)で3つのCys残基および1つのHis残基をさらに含む(Ellerstrom et al.(2005)Plant Molec Biol59:663-681)。ETドメイン中のシステインおよびヒスチジン残基の保存された配置は、ジンクフィンガー(亜鉛結合)タンパク質を連想させる。さらに、核局在化シグナル(NLS)が通常GRFポリペプチド配列中に含まれる。
【００１６】
いくつかのGRFポリペプチドと転写コアクチベーターであるGRF-相互作用因子(GIF1〜GIF3、滑膜肉腫転座SYT1〜SYT3とも呼ばれる)の小ファミリーとの相互作用は、酵母ツーハイブリッド相互作用アッセイを使用して実証されている(Kim & Kende(2004)Proc Natl Acad Sci101:13374-13379)。
【００１７】
GRFという名称は、本発明の方法を実施する際に有用であるGRFポリペプチドと全く無関係である、ポリペプチドの14-3-3ファミリーに属する別の型のポリペプチドにも与えられている(de Vetten & Ferl(1994)Plant Physiol 106:1593-1604)。
【００１８】
ウイルス構成的35S CaMVプロモーターの制御下においてイネGRF(OsGRF1)ポリペプチドで形質転換したトランスジェニックシロイヌナズナ植物は、縮れた葉、一次花序の著しく低下した伸長、および遅延したボルティング(bolting)を示した(van der Knapp et al.(2000) Plant Physiol 122:695-704)。2つのシロイヌナズナGRFポリペプチド(AtGRF1およびAtGRF2)のいずれか1つで形質転換したトランスジェニックシロイヌナズナ植物は、野生型植物と比較して、大きな葉および子葉を発生し、ボルティングは遅延し、(成育し得る花粉の欠如のため)部分的に不稔であった(Kim et al.(2003)Plant J 36:94-104)。
【００１９】
米国特許出願US2006/0048240号では、配列番号33421としてシロイヌナズナGRFポリペプチドが同定されている。米国特許出願US2007/0022495号では、配列番号1803としてシロイヌナズナGRFポリペプチドが同定されている(その中ではG1438とも呼ばれる)。35S CaMVプロモーターを使用してG1438を過剰発現するトランスジェニックシロイヌナズナ植物は、濃い緑色の葉を示す。
【００２０】
滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドに関する背景
SYTは、タンパク質のGRF(成長調節因子)ファミリーの転写アクチベーターとの機能複合体を植物において形成する、転写コアクチベーターである(Kim HJ,Kende H(2004)Proc Nat Acad Sc101:13374-9)。SYTは、この論文中ではGRF-相互作用因子に関してはGIF、およびHoriguchi et al.(2005)Plant J 43:68-78中でアングスチフォリア(angustifolia)3に関してAN3と呼ばれる。GRF転写アクチベーターは、酵母におけるクロマチンリモデリング複合体のSWI/SNFタンパク質と構造ドメイン(N末端領域中)を共有する(van der Knaap E et al.,(2000)Plant Phys122:695-704)。これらの複合体の転写コアクチベーターは、エンハンサーおよびプロモーター領域とのSWI/SNF複合体を動員して局所クロマチンリモデリングを実施することに関与すると言われている。(総説Naar AM et al.,(2001)Annu Rev Biochem70:475-501)。局所クロマチン構造の変化は転写活性化を調節する。より正確には、SYTは植物のSWI/SNF複合体と相互作用して、(1以上の)GRF標的遺伝子の転写活性化に影響を与えると言われている(Kim HJ,Kende H(2004)Proc Nat Acad Sc101:13374-9)。
【００２１】
SYTはシロイヌナズナにおいて3つのメンバーの遺伝子ファミリーに属する。SYTポリペプチドはヒトSYTと相同性を共有する。ヒトSYTポリペプチドは、転写コアクチベーターであることが示された(Thaete et al.(1999)Hum Molec Genet8:585-591)。以下の3つのドメインが哺乳動物のSYTポリペプチドを特徴付ける:
(i)哺乳動物、植物、線虫および魚類中で保存されたN末端SNH(SYT N末端相同性)ドメイン、
(ii)様々な間隔で存在するグリシン、プロリン、グルタミンおよびチロシンから主に構成されるC末端QPGYリッチドメイン、
(iii)前出の2つのドメイン間に位置するメチオニンリッチ(Metリッチ)ドメイン。
【００２２】
植物のSYTポリペプチド中では、SNHドメインが十分保存されている。C末端ドメインは、プロリンおよびチロシンではなく、グリシンおよびグルタミンが多量に存在する。したがってそれは、哺乳動物のQPGYドメインと対照的にQGリッチドメインと命名されている。哺乳動物のSYTと同様に、MetリッチドメインをQGドメインのN末端で同定することができる。QGリッチドメインは、実質的に(SHNドメインを差し引いた)ポリペプチドのC末端の残り部分であると考えることができ、Metリッチドメインは典型的にはQGリッチドメインの前半に含まれる(N末端からC末端に)。第2のMetリッチドメインは植物のSYTポリペプチド中ではSNHドメインに先行し得る(図1参照)。
【００２３】
SYTの機能低下突然変異体およびSYTの発現が低下したトランスジェニック植物は、少ない細胞を有する小さく狭い葉および花弁をもたらすことが報告された(Kim HJ,Kende H (2004)Proc Nat Acad Sc101:13374-9)。
【００２４】
シロイヌナズナ中のAN3の過剰発現は、野生型の葉より20〜30％大きい葉を有する植物をもたらした(Horiguchi et al.(2005)Plant J 43:68-78)。
【００２５】
日本国特許出願2004-350553中に、AN3遺伝子の発現を制御することによる、水平方向の葉の大きさを制御する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】米国特許出願US2006/0048240号
【特許文献２】米国特許出願US2007/0022495号
【特許文献３】日本国特許出願2004-350553
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Tittonell et al 2005 Agric Ecosys & Environ105:213
【非特許文献２】Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica50:39)
【非特許文献３】ter Steege et al 2005 Plant Physiology 139:1078
【非特許文献４】Hittalmani et al 2003 Theoretical Applied Genetics 107:679
【非特許文献５】Rebetzke et al 2002 Crop Science42:739
【非特許文献６】Gardener et al 1985 Physiology of Crop Plants.Iowa State University Press,pp68-73
【非特許文献７】Wang et al.(2003)Planta218:1-14
【非特許文献８】Riechmann et al.(2000)Science290: 2105-2109
【非特許文献９】Gao et al.(2006) Bioinformatics 2006,22(10):1286-7
【非特許文献１０】Kim et al.(2003)Plant J 36: 94-104
【非特許文献１１】Choi et al.(2004) Plant Cell Physiol45(7):897-904
【非特許文献１２】Ellerstrom et al.(2005)Plant Molec Biol59:663-681
【非特許文献１３】Kim & Kende(2004)Proc Natl Acad Sci101:13374-13379
【非特許文献１４】de Vetten & Ferl(1994)Plant Physiol 106:1593-1604
【非特許文献１５】van der Knapp et al.(2000) Plant Physiol 122:695-704
【非特許文献１６】Horiguchi et al.(2005)Plant J 43:68-78
【非特許文献１７】Naar AM et al.,(2001)Annu Rev Biochem70:475-501
【非特許文献１８】Thaete et al.(1999)Hum Molec Genet8:585-591
【発明の概要】
【００２８】
驚くことに、植物中の以下の核酸配列:(i)成長調節因子(GRF)ポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドをコードする核酸配列の発現の増大は、以下の核酸配列のうちの1つ:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物と比較して、収穫高関連形質が増強されている植物をもたらすことがここで明らかになった。一実施形態によれば、植物中の以下の核酸配列:(i)成長調節因子(GRF)ポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を増加させることによって、様々な植物収穫高関連形質を増強する方法であって、該収穫高関連形質は、以下の核酸配列のうちの1つ:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物と比較して増強されている方法を提供する。増強した収穫高関連形質は、以下の形質:増大した初期活力、増加した地上バイオマス、増加した植物当たり総種子収穫高、増加した種子充填率、増加した(充填)種子数、増加した収穫指数または増加した千粒重(TKW)のうち1以上を含む。
【００２９】
定義
(1以上の)ポリペプチド/(1以上の)タンパク質
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は本明細書では互換的に使用され、ペプチド結合によって1つに結合した、任意の長さのポリマー型であるアミノ酸を指す。
【００３０】
(1以上の)ポリヌクレオチド/(1以上の)核酸/(1以上の)核酸配列/(1以上の)ヌクレオチド配列
用語「(1以上の)ポリヌクレオチド」、「(1以上の)核酸配列」、「(1以上の)ヌクレオチド配列」、「(1以上の)核酸」は本明細書では互換的に使用され、任意の長さのポリマー非分岐型である、ヌクレオチド、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、または両方の組合せを指す。
【００３１】
(1以上の)対照植物
適切な対照植物の選択は実験設定の通常の部分であり、対応する野生型植物または対象とする遺伝子がない対応する植物を含むことができる。対照植物は典型的には同じ植物種、またはさらに評価する植物と同じ亜種である。対照植物は、評価する植物の非接合型であってもよい。本明細書で使用する「対照植物」は、植物全体だけでなく種子および種子部分を含めた植物部分も指す。
【００３２】
(1以上の)ホモログ
タンパク質の「ホモログ」は、対象となる非修飾タンパク質と比較してアミノ酸置換、欠失および/または挿入を有し、かつそれらが由来する非修飾タンパク質と同様の生物および機能活性を有する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素を含む。
【００３３】
欠失はタンパク質からの1以上のアミノ酸の除去を指す。
【００３４】
挿入は、タンパク質中の所定部位に導入される1以上のアミノ酸残基を指す。挿入は、N末端および/またはC末端融合、および1以上のアミノ酸の配列内挿入を含むことができる。一般に、アミノ酸配列内の挿入は、約1〜10残基の単位で、NまたはC末端融合より小さいはずである。NまたはC末端融合タンパク質またはペプチドの例には、酵母ツーハイブリッド系において使用される転写アクチベーターの結合ドメインまたは活性化ドメイン、ファージのコートタンパク質、(ヒスチジン)-6-タグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ-タグ、タンパク質A、マルトース結合タンパク質、ジヒドロ葉酸還元酵素、タグ100エピトープ、c-mycエピトープ、FLAG(登録商標)エピトープ、lacZ、CMP(カルモジュリン結合ペプチド)、HAエピトープ、タンパク質CエピトープおよびVSVエピトープがある。
【００３５】
置換は、類似した性質(類似した疎水性、親水性、抗原性、α-ヘリックス構造またはβ-シート構造を形成または破壊する傾向など)を有する他のアミノ酸とタンパク質のアミノ酸の交換を指す。アミノ酸置換は典型的には1残基の置換であるが、ポリペプチドに課される機能的制約に応じて集中する可能性がある。挿入は通常約1〜10アミノ酸残基であるはずである。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的置換の表は当技術分野でよく知られている(例えば、Creighton (1984) Proteins.W.H.Freeman and Company(Eds)および以下の表1を参照)。
【表１】
2010538670.tif 000002
【００３６】
アミノ酸置換、欠失および/または挿入は、例えば固相ペプチド合成などの、当技術分野でよく知られているペプチド合成技法を使用して、または組換えDNA操作によって容易に作製することができる。タンパク質の置換、挿入または欠失変異体を生成するためのDNA配列の操作法は、当技術分野でよく知られている。例えば、DNA中の所定部位に置換突然変異を作製するための技法は当業者によく知られており、M13突然変異誘発法、T7-Gen in vitro突然変異誘発法(USB、Cleveland、OH)、QuickChange部位特異的突然変異誘発法(Stratagene、San Diego、CA)、PCR仲介部位特異的突然変異誘発法または他の部位特異的突然変異誘発法プロトコルを含む。
【００３７】
誘導体
「誘導体」は、対象とするタンパク質などの天然に存在する形のタンパク質のアミノ酸配列と比較して、天然に存在しないアミノ酸残基とアミノ酸の置換、または天然に存在しないアミノ酸残基の付加を含み得る、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドを含む。タンパク質の「誘導体」は、天然に存在する形のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、天然に存在する改変(グリコシル化、アシル化、プレニル化、リン酸化、ミリストイル化、硫化などの)または非天然改変アミノ酸残基を含む、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドも含む。誘導体は、それが由来するアミノ酸配列と比較して、1以上の非アミノ酸の置換または付加、例えばアミノ酸配列と共有または非共有結合したレポーター分子または他のリガンド、結合してその検出を容易にするレポーター分子など、および天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列に対する天然に存在しないアミノ酸残基も含み得る。
【００３８】
(1以上の)オルソログ/(1以上の)パラログ
オルソログおよびパラログは、遺伝子の先祖関係を記載するために使用する進化概念を含む。パラログは、先祖遺伝子の複製から生じた同種内の遺伝子であり、オルソログは、種分化によって生じ、かつ共通の先祖遺伝子からも導かれる、異なる生物由来の遺伝子である。
【００３９】
ドメイン
用語「ドメイン」は、進化上関連があるタンパク質の配列のアラインメントに沿った特定の位置で保存された一組のアミノ酸を指す。他の位置のアミノ酸はホモログ間で変わる可能性があるが、特定の位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性または機能におそらく必要不可欠であるアミノ酸を示す。タンパク質ホモログのファミリーのアラインメント配列中でのその高い保存度によって同定されたので、それらは問題の任意のポリペプチドが以前に同定したポリペプチドファミリーに属するかどうか決定するための識別子として使用することができる。
【００４０】
モチーフ/コンセンサス配列/シグネチャー
用語「モチーフ」または「コンセンサス配列」または「シグネチャー」は、進化上関連があるタンパク質の配列中の短い保存領域を指す。モチーフはドメインの高度に保存された部分であることが多いが、ドメインのわずか一部分を含み、(モチーフのアミノ酸の全てが定義したドメインの外に存在する場合)保存ドメインの外に位置する可能性もある。
【００４１】
ハイブリダイゼーション
本明細書で定義する用語「ハイブリダイゼーション」は、実質的に相同である相補ヌクレオチド配列が互いにアニーリングするプロセスである。ハイブリダイゼーションプロセスは、溶液中で全て、すなわち両方の相補的核酸分子が溶液中に存在する状態で行うことができる。ハイブリダイゼーションプロセスは、磁気ビーズ、セファロースビーズまたは任意の他の樹脂などのマトリックスに固定された相補的核酸分子の1つで行うこともできる。さらにハイブリダイゼーションプロセスは、ニトロセルロースまたはナイロン膜などの固形担体に固定された、または例えばフォトリソグラフィーによって、例えばシリカガラス担体に固定された、相補的核酸分子の1つで行うことができる(後者は核酸配列アレイまたはマイクロアレイとして、または核酸配列チップとして知られている)。ハイブリダイゼーションの実施を可能にするために、核酸分子は一般に熱変性または化学変性させて、二本鎖を2本の一本鎖に溶かし、および/または一本鎖核酸分子からヘアピンまたは他の二次構造を除去する。
【００４２】
用語「ストリンジェンシー」は、その下でハイブリダイゼーションが起こる条件を指す。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、塩濃度、イオン強度およびハイブリダイゼーションバッファーの組成などの条件によって影響を受ける。一般に、規定されたイオン強度およびpHで特定配列に関して熱融点(Tm)より約30℃低い、低ストリンジェンシー条件を選択する。中程度のストリンジェンシー条件は温度がTmより20℃低いときであり、高ストリンジェンシー条件は温度がTmより10℃低いときである。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、典型的には標的核酸配列と高い配列類似性を有するハイブリダイズ配列を単離するために使用される。しかしながら、核酸配列は配列が逸脱し、遺伝コードの縮重のため、実質的に同一なポリペプチドを依然としてコードする可能性がある。したがって、中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件が、このような核酸配列分子を同定するために時折必要とされる可能性がある。
【００４３】
Tmは規定されたイオン強度およびpHでの温度であり、その温度で50％の標的配列が完全に適合するプローブとハイブリダイズする。Tmは溶液の状態および塩基組成およびプローブの長さに依存する。例えば、長い配列は高温で特異的にハイブリダイズする。最大ハイブリダイゼーション率はTmより約16℃〜32℃低い温度で得られる。ハイブリダイゼーション溶液中の一価カチオンの存在は、2本の核酸配列鎖間の静電反発力を低減させ、それによってハイブリッド形成を促進する。この影響は0.4Mまでのナトリウム濃度に関して明らかである(高濃度に関しては、この影響は無視することができる)。ホルムアミドはDNA-DNAおよびDNA-RNA二重鎖の融解温度を1％ホルムアミドに関して0.6〜0.7℃で低下させ、かつ50％ホルムアミドの添加は30〜45℃でのハイブリダイゼーションの実施を可能にするが、ハイブリダイゼーション率は低下し得る。塩基対のミスマッチは、二重鎖のハイブリダイゼーション率および熱安定性を低下させる。平均すると大プローブに関して、Tmは1％の塩基対ミスマッチ当たり約1℃低下する。Tmはハイブリッドの型に応じて、以下の等式を使用して計算することができる:
(1)DNA-DNAハイブリッド(Meinkoth and Wahl,Anal.Biochem.,138:267-284,1984):
Tm=81.5℃+16.6×log10[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×[Lc]-1-0.61×ホルムアミド％
(2)DNA-RNAまたはRNA-RNAハイブリッド:
Tm=79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
(3)オリゴ-DNAまたはオリゴ-RNAdハイブリッド:
20を超えるヌクレオチドに関して:Tm=2(In)
20〜35ヌクレオチドに関して:Tm=22+1.46(In)
aまたは他の一価カチオンに関して、ただし0.01〜0.4Mの範囲でのみ正確
b30％〜75％の範囲で％GCに関してのみ正確
cL=塩基対中の二重鎖の長さ
dオリゴ、オリゴヌクレオチド;In=プライマーの有効長=2×(G/Cの数)+(A/Tの数)。
【００４４】
非特異的結合は、例えばタンパク質含有溶液を用いたメンブレンのブロッキング、ハイブリダイゼーションバッファーへの異種RNA、DNA、およびSDSの添加、およびRnaseを用いた処理などの、いくつかの既知の技法のいずれか1つを使用して制御することができる。非相同プローブに関しては、一連のハイブリダイゼーションを、(i)(例えば68℃から42℃に)アニーリング温度を次第に低下させることまたは(ii)(例えば50％から0％に)ホルムアミド濃度を次第に低下させることの1つを変えることによって実施することができる。当業者は、ハイブリダイゼーション中に変えることができ、ストリンジェンシー条件を維持または変更し得る様々なパラメータを理解している。
【００４５】
ハイブリダイゼーション条件以外に、ハイブリダイゼーションの特異性は、典型的にはハイブリダイゼーション後洗浄の機能にも依存する。非特異的ハイブリダイゼーションから生じるバックグラウンドを除去するために、サンプルを希釈塩溶液で洗浄する。このような洗浄の重要なファクターには最終洗浄溶液のイオン強度および温度があり、塩濃度が低下し洗浄温度が上昇すると、洗浄のストリンジェンシーは高くなる。洗浄条件は典型的にはハイブリダイゼーションのストリンジェンシー以下で実施する。陽性ハイブリダイゼーションは、バックグラウンドのシグナルの少なくとも2倍であるシグナルをもたらす。一般に、核酸配列のハイブリダイゼーションアッセイまたは遺伝子増幅検出手順に適したストリンジェント条件は、前に述べたとおりである。多かれ少なかれストリンジェント条件を選択することもできる。当業者は、洗浄中に変えることができ、ストリンジェンシー条件を維持または変更し得る様々なパラメータを理解している。
【００４６】
例えば、50ヌクレオチドより長いDNAハイブリッドに関する典型的な高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、1×SSC中で65℃または1×SSCおよび50％ホルムアミド中で42℃のハイブリダイゼーション、次に0.3×SSC中の65℃での洗浄を含む。50ヌクレオチドより長いDNAハイブリッドに関する中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、4×SSC中で50℃または6×SSCおよび50％ホルムアミド中で40℃のハイブリダイゼーション、次に2×SSC中の50℃での洗浄を含む。ハイブリッドの長さは、核酸のハイブリダイズに関して予想される長さである。既知の配列の核酸分子がハイブリダイズするとき、配列のアラインメントをとること、および本明細書に記載する保存領域を同定することによって、ハイブリッド長を決定することができる。1×SSCは0.15MのNaClおよび15mMのクエン酸ナトリウムであり、ハイブリダイゼーション溶液および洗浄溶液は、5×Denhardtの試薬、0.5〜1.0％のSDS、100μg/mlの変性断片化サケ精子DNA、0.5％のピロリン酸ナトリウムを追加的に含むことができる。
【００４７】
ストリンジェンシーのレベルを定義する目的で、Sambrook et al.(2001)Molecular Cloning:a laboratory manual,3rd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,CSH,New YorkまたはCurrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989および毎年改訂)を参照することができる。
【００４８】
スプライス変異体
本明細書で使用する用語「スプライス変異体」は、その中で選択したイントロンおよび/またはエクソンが切除、交換、置換または付加されている、またはその中でイントロンが短縮または伸長されている核酸配列の変異体を含む。このような変異体は、その中でタンパク質の生物活性が実質的に保持されている変異体であり、これはタンパク質の機能セグメントを選択に保持することによって得ることができる。このようなスプライス変異体は天然で発見することができるか、あるいは人工であってよい。このようなスプライス変異体を予想および単離する方法は当技術分野でよく知られている(例えば、Foissac and Schiex(2005)BMC Bioinformatics6:25を参照)。
【００４９】
対立遺伝子変異体
対立遺伝子または対立遺伝子変異体は、同じ染色体位置に位置する所与の遺伝子の代替形である。対立遺伝子変異体は一塩基多型(SNP)、および短い挿入/欠失多型(INDEL)を含む。INDELの大きさは通常100bp未満である。SNPおよびINDELは、大部分の生物において天然に存在する多型系統の配列変異体の最も大きなセットを形成する。
【００５０】
遺伝子シャッフリング/定方向進化
遺伝子シャッフリングまたは定方向進化は、改変された生物活性を有するタンパク質をコードする核酸配列またはその一部分の変異体を生成するための、DNAシャッフリングとそれに続く適切なスクリーニングおよび/または選択の反復からなる(Castle et al.,(2004)Science 304(5674):1151-4;米国特許第5,811,238号および米国特許第6,395,547号)。
【００５１】
調節エレメント/制御配列/プロモーター
用語「調節エレメント」、「制御配列」および「プロモーター」はいずれも本明細書では互換的に使用され、広い意味で、それらが連結する配列の発現を実施することができる調節核酸配列を指すと考えられる。用語「プロモーター」は、遺伝子の転写開始の上流に位置し、RNAポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与し、したがって機能的に連結した核酸の転写を誘導する、核酸配列制御配列を典型的には指す。前述の用語によって含まれるのは、(正確な転写開始に必要とされるTATAボックス、CCAATボックス配列有りまたは無しを含めた)古典的な真核生物ゲノム遺伝子由来の転写調節配列、および発生および/または外部刺激に応答して、または組織特異的に遺伝子発現を改変する、追加的調節エレメント(すなわち、上流活性化配列、インクリーザーおよびサイレンサー)である。古典的な原核生物遺伝子の転写調節配列もこの用語内に含まれ、この場合それは、-35ボックス配列および/または-10ボックス転写制御配列を含むことができる。用語「調節エレメント」は、細胞、組織または器官中の核酸配列分子の発現をもたらす、活性化するまたは増大する合成融合分子または誘導体も含む。
【００５２】
「植物プロモーター」は、植物細胞中のコード配列セグメントの発現を仲介する調節エレメントを含む。「植物プロモーター」は、植物細胞、例えば本発明の方法中で発現され本明細書に記載する核酸配列で形質転換した植物に由来することが好ましい。これは「植物」ターミネーターなどの他の「植物」調節シグナルにも当てはまる。本発明の方法中で有用なヌクレオチド配列の上流のプロモーターは、プロモーター、オープンリーディングフレーム(ORF)またはターミネーターなどの3'調節領域またはORFから離れて位置する他の3'調節領域のいずれかの機能または活性に干渉せずに、1以上のヌクレオチドの(1以上の)置換、(1以上の)挿入および/または(1以上の)欠失によって修飾することができる。プロモーターの活性はそれらの配列の修飾によって増大すること、またはそれらは、異種生物由来のプロモーターであっても、より活性があるプロモーターによって完全に置換されることがさらに考えられる。植物中での発現のために、核酸配列分子は、前に記載したように、経時的に適切な位置で遺伝子を発現し必要とされる空間的発現パターンを有する適切なプロモーターと機能的に連結しているか、またはそれを含まなければならない。
【００５３】
機能的に同等なプロモーターを同定するために、候補プロモーターのプロモーター強度および/または発現パターンを、例えばレポーター遺伝子とプロモーターを機能的に連結させること、および植物の様々な組織中のレポーター遺伝子の発現レベルおよびパターンをアッセイすることによって分析することができる。適切なよく知られているレポーター遺伝子には、例えばβ-グルクロニダーゼまたはβ-ガラクトシダーゼがある。プロモーター活性は、β-グルクロニダーゼまたはβ-ガラクトシダーゼの酵素活性を測定することによってアッセイする。次いでプロモーター強度および/または発現パターンを、参照プロモーター(本発明の方法中で使用するプロモーターなど)のそれと比較することができる。あるいは、プロモーター強度は、ノーザンブロッティングおよびオートラジオグラムの濃度分析、定量的リアルタイムPCRまたはRT-PCR(Heid et al.,1996 Genome Methods6:986-994)などの当技術分野で知られている方法を使用して、mRNAレベルを定量化することによって、または本発明の方法中で使用する核酸配列のmRNAレベルを、18S rRNAなどのハウスキーピング遺伝子のmRNAレベルと比較することによってアッセイすることができる。一般に、「弱いプロモーター」とは、低レベルでコード配列の発現を駆動するプロモーターを意味する。「低レベル」とは、細胞当たり約1/10,000転写産物から約1/100,000転写産物まで、約1/500,0000転写産物までのレベルを意味する。逆に、「強力なプロモーター」は、高レベルで、または細胞当たり約1/10転写産物から約1/100転写産物まで、約1/1000転写産物までのコード配列の発現を駆動する。一般に、「中強度のプロモーター」とは、いずれの場合も35S CaMVプロモーターの制御下で得るレベルより低いレベルでコード配列の発現を駆動するプロモーターを意味する。
【００５４】
機能的に連結した
本明細書で使用する用語「機能的に連結した」は、プロモーター配列が対象とする遺伝子の転写を開始させることができるような、プロモーター配列と対象とする遺伝子の間の機能的結合を指す。
【００５５】
構成的プロモーター
「構成的プロモーター」は、少なくとも1つの細胞、組織または器官において、増殖期および発生期中、かつ大部分の環境条件下で、必ずしも全てではないが大部分が、転写活性があるプロモーターを指す。以下の表2aで構成的プロモーターの例を示す。
【表２】
2010538670.tif 000003
【００５６】
偏在的プロモーター
偏在的プロモーターは、生物の実質的に全ての組織または細胞中で活性がある。
【００５７】
発生調節プロモーター
発生調節プロモーターは、特定の発生段階中、または発生的変化を経た植物部分において活性がある。
【００５８】
誘導的プロモーター
誘導的プロモーターは、化学的(総説に関しては、Gatz1997,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,48:89-108を参照)、環境的または物理的刺激に応答して誘導または増大された転写開始があり、あるいは「ストレス誘導性」、すなわち植物が様々なストレス状態に曝されるときに活性化する、または「病原体誘導性」、すなわち植物が様々な病原体に曝されるときに活性化する状態であってよい。
【００５９】
器官特異的/組織特異的プロモーター
器官特異的または組織特異的プロモーターは、例えば葉、根茎、種子組織などの特定器官または組織において転写を優先的に開始させることができるプロモーターである。例えば、「根茎特異的プロモーター」は、植物の任意の他の部分を実質的に除いて、これらの他の植物部分中での任意の基底発現を可能にしながら、主に植物の根茎中で転写活性があるプロモーターである。特定の細胞中のみで転写を開始させることができるプロモーターは、本明細書では「細胞特異的」と呼ぶ。
【００６０】
根茎特異的プロモーターの例を以下の表2b中に挙げる:
【表３】
2010538670.tif 000004
【００６１】
種子特異的プロモーターは、(基底発現の場合)必ずしも種子組織中のみではないが、主に種子組織中で転写活性がある。種子特異的プロモーターは、種子発生中および/または発芽中に活性状態である可能性がある。種子特異的プロモーターの例は以下の表2c中に示す。種子特異的プロモーターのさらなる例は、その開示を完全に述べるが如く参照によって本明細書に組み込む、Qing Qu and Takaiwa(Plant Biotechnol.J.2,113-125,2004)中に示されている。
【表４】
2010538670.tif 000005
2010538670.tif 000006
【００６２】
本明細書で定義する緑色組織特異的プロモーターは、植物の任意の他の部分を実質的に除いて、これらの他の植物部分中での任意の基底発現を可能にしながら、主に緑色組織中で転写活性があるプロモーターである。
【００６３】
本発明の方法を実施するために使用することができる緑色組織特異的プロモーターの例は、以下の表2d中に示す。
【表５】
2010538670.tif 000007
【００６４】
組織特異的プロモーターの別の例は、植物の任意の他の部分を実質的に除いて、これらの他の植物部分中での任意の基底発現を可能にしながら、主に分裂組織中で転写活性がある、分裂組織特異的プロモーターである。本発明の方法を実施するために使用することができる分裂組織特異的プロモーターの例は、以下の表2e中に示す。
【表６】
2010538670.tif 000008
【００６５】
ターミネーター
用語「ターミネーター」は、一次転写産物の3'プロセシングおよびポリアデニル化および転写の終了をシグナル伝達する、転写単位の末端におけるDNA配列である制御配列を包含する。ターミネーターは天然遺伝子、様々な他の植物遺伝子、またはT-DNAに由来してよい。加えるターミネーターは、例えばノパリンシンターゼまたはオクトパインシンターゼ遺伝子、または代替的に別の植物遺伝子、またはあまり好ましくないが任意の他の真核生物遺伝子に由来してよい。
【００６６】
調節
用語「調節」は、発現または遺伝子発現に関して、その中で発現レベルを、対照植物と比較して前記遺伝子発現を変えることによって変える、好ましくは発現レベルを増大させるプロセスを意味する。本来の、非調節型発現は、構造RNA(rRNA、tRNA)またはmRNAの任意の種類の発現およびその後の翻訳であってよい。用語「活性の調節」は、植物の増大した収穫高および/または増大した増殖をもたらす、本発明の核酸配列またはコードされるタンパク質の発現の任意の変化を意味するものとする。
【００６７】
増大した発現/過剰発現
本明細書で使用する用語「増大した発現」または「過剰発現」は、本来の野生型の発現レベルに加えた任意の形の発現を意味する。
【００６８】
遺伝子または遺伝子産物の発現を増加する方法は当技術分野で十分に報告されており、例えば適切なプロモーターによって駆動される過剰発現、転写インクリーザーまたは翻訳インクリーザーの使用を含む。プロモーターまたはインクリーザーエレメントとして働く単離核酸配列を、非異種型のポリヌクレオチドの適切な位置(典型的には上流)に導入して、対象とするポリペプチドをコードする核酸配列の発現をアップレギュレートすることができる。例えば、内因性プロモーターを突然変異、欠失、および/または置換によってin vivoで改変することができ(Kmiec,米国特許第5,565,350号;Zarling et al.,WO9322443を参照)、または単離プロモーターを植物細胞中の本発明の遺伝子から適切な方向および距離に導入して、遺伝子の発現を制御することができる。
【００６９】
ポリペプチドの発現が望ましい場合、ポリヌクレオチドコード領域の3'末端にポリアデニル化領域を含むことが一般に望ましい。ポリアデニル化領域は天然遺伝子、様々な他の植物遺伝子由来、またはT-DNAに由来してよい。加える3'末端配列は、例えばノパリンシンターゼまたはオクトパインシンターゼ遺伝子、または代替的に別の植物遺伝子、またはあまり好ましくないが任意の他の真核生物遺伝子に由来してよい。
【００７０】
イントロン配列を5'非翻訳領域(UTR)または部分的コード配列のコード配列に加えて、サイトゾル中に蓄積する成熟メッセージの量を増大することもできる。植物と動物両方の発現構築物における転写単位中のスプライシング可能なイントロンの導入は、1000倍までmRNAレベルとタンパク質レベルの両方で遺伝子発現を増加することが示されている(Buchman and Berg(1988)Mol.Cell biol.8:4395-4405;Callis et al.(1987)Genes Dev1:1183-1200)。このようなイントロンの遺伝子発現の増大は、転写単位の5'末端近くに位置するとき典型的に最大である。トウモロコシのイントロンAdh1-Sイントロン1、2、および6、Bronze-1イントロンの使用が当技術分野で知られている。一般情報に関しては、The Maize Handbook,Chapter116,Freeling and Walbot,Eds.,Springer,N.Y.(1994)を参照。
【００７１】
内因性遺伝子
本明細書における「内因性」遺伝子に対する言及は、植物においてその天然型(すなわち、如何なる人間の介入もなし)で見られる対象となる遺伝子を指すだけでなく、植物中に後に(再)導入される単離型であるその同じ遺伝子(または実質的に相同な核酸/遺伝子)(導入遺伝子)も指す。例えば、このような導入遺伝子を含有するトランスジェニック植物は、導入遺伝子の発現の実質的低減および/または内因性遺伝子の発現の実質的低減に直面する可能性がある。
【００７２】
低下した発現
本明細書における「低下した発現」または発現の「低減または実質的消滅」に対する言及は、対照植物に対する、内因性遺伝子の発現および/またはポリペプチドレベルおよび/またはポリペプチド活性の低下を意味すると考えられる。低減または実質的消滅は、対照植物のそれと比較して、好ましくなっていく順に、少なくとも10％、20％、30％、40％または50％、60％、70％、80％、85％、90％、または95％、96％、97％、98％、99％またはそれより低減する。
【００７３】
植物における内因性遺伝子の発現の低減または実質的消滅には、核酸配列の実質的に隣接したヌクレオチドの十分な長さが必要とされる。遺伝子サイレンシングを実施するために、これはわずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10またはそれより少ないヌクレオチドであってよく、あるいはこれは(5'および/または3'UTR、一部分または全体のいずれかを含めた)遺伝子全体ほどであってよい。実質的に隣接したヌクレオチドの伸長部分は、対象とするタンパク質(標的遺伝子)をコードする核酸配列、または対象とするタンパク質のオルソログ、パラログまたはホモログをコードすることができる任意の核酸配列に由来してよい。実質的に隣接したヌクレオチドの伸長部分は、標的遺伝子(センスまたはアンチセンス鎖のいずれか)と水素結合を形成することができることが好ましく、実質的に隣接したヌクレオチドの伸長部分は、標的遺伝子(センスまたはアンチセンス鎖のいずれか)と、好ましくなっていく順に、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％の配列同一性を有することがより好ましい。(機能)ポリペプチドをコードする核酸配列は、内因性遺伝子の発現の低減または実質的消滅のための本明細書で論じる様々な方法の要件ではない。
【００７４】
この発現の低減または実質的消滅は、通常のツールおよび技法を使用して実施することができる。内因性遺伝子の発現の低減または実質的消滅の方法は、好ましくはヘアピン構造を形成することができる、核酸配列またはその一部分の逆方向反復(この場合、実質的に隣接したヌクレオチドの伸長部分は、対象とする遺伝子、または対象とするタンパク質のオルソログ、パラログまたはホモログをコードすることができる任意の核酸配列に由来する)を使用するRNA仲介サイレンシングによる方法である。RNAサイレンシング法の別の例は、植物中へのセンス方向の、核酸配列またはその一部分の導入を含む(この場合、実質的に隣接したヌクレオチドの伸長部分は、対象とする遺伝子、または対象とするタンパク質のオルソログ、パラログまたはホモログをコードすることができる任意の核酸配列に由来する)。RNAサイレンシング法の別の例は、アンチセンス核酸配列の使用を含む。遺伝子サイレンシングは、挿入突然変異誘発法(例えば、T-DNA挿入またはトランスポゾン挿入)によって、または特にAngell and Baulcombe((1999) Plant J 20(3):357-62)、(Amplicon VIGS WO98/36083)、またはBaulcombe(WO99/15682)により記載された戦略によって実施することもできる。植物中でのその機能を阻害するための内因性ポリペプチドを対象とする抗体の使用、またはポリペプチドが関与するシグナル伝達経路における干渉などの他の方法は、当業者によく知られているであろう。人工および/または天然マイクロRNA(miRNA)を使用して、遺伝子発現および/またはmRNA翻訳をノックアウトすることができる。内因性miRNAは、典型的には19〜24ヌクレオチド長の一本鎖低分子RNAである。典型的には21ヌクレオチド長である人工マイクロRNA(amiRNA)を特異的に遺伝子操作して、1以上の対象とする遺伝子の遺伝子発現を負に制御することができる。植物マイクロRNA標的選択の決定因子は当技術分野でよく知られている。標的認識の経験的パラメータは定義されており、それらを使用して特異的amiRNAの設計を容易にすることができる(Schwab et al.,(2005)Dev Cell8(4):517-27)。amiRNAおよびそれらの前駆体の設計および生成に好都合なツールも、一般に公開されている(Schwab et al.,(2006)Plant Cell 18(5):1121-33)。
【００７５】
最適なパフォーマンスのために、植物中での内因性遺伝子の発現の低減のために使用される遺伝子サイレンシング技法は、単子葉植物の形質転換のためには単子葉植物由来の核酸配列、および双子葉植物の形質転換のためには双子葉植物由来の核酸配列の使用を必要とする。任意の所与の植物種由来の核酸配列を、その同じ種に導入することが好ましい。例えば、イネ由来の核酸配列をイネに形質転換する。しかしながら、導入する核酸配列が、それが導入される植物と同じ植物種に由来することは絶対条件ではない。内因性標的遺伝子と導入する核酸配列の間に実質的相同性が存在すれば十分である。
【００７６】
上述したのは、植物における内因性遺伝子の発現を低減または実質的に消滅させるための様々な方法の例である。当業者は、前述のサイレンシング法を適合して、例えば適切なプロモーターの使用によって、植物全体またはその一部分における内因性遺伝子の発現の低減を達成することが容易に可能であるはずである。
【００７７】
選択可能なマーカー(遺伝子)/レポーター遺伝子
「選択可能なマーカー」、「選択可能なマーカー遺伝子」または「レポーター遺伝子」は、細胞に表現型を与える任意の遺伝子を含み、その細胞内でそれが発現されて、本発明の核酸配列構築物でトランスフェクトまたは形質転換した細胞の同定および/または選択を容易にする。これらのマーカー遺伝子は、一連の異なる原理により核酸配列分子の首尾良い移動の確認を可能にする。適切なマーカーは、新たな代謝形質を導入しまたは視覚による選択を可能にする、抗生物質または除草剤耐性を与えるマーカーから選択することができる。選択可能なマーカー遺伝子の例には、抗生物質に耐性を与える遺伝子(ネオマイシンおよびカナマイシンをリン酸化するnptII、またはハイグロマイシンをリン酸化するhpt、または例えばブレオマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、ゲンチシン(G418)、スペクチノマイシンまたはブラスチシジンに対する耐性を与える遺伝子など)、除草剤に耐性を与える遺伝子(例えばBasta(登録商標)に対する耐性を与えるbar、グリホセートに対する耐性を与えるaroAまたはgox、または例えばイミダゾリノン、ホスフィノトリシンまたはスルホニル尿素に耐性を与える遺伝子)、または代謝形質を与える遺伝子(唯一の炭素源としてマンノースまたはキシロースの利用のためにキシロースイソメラーゼを植物が使用するのを可能にするmanA、または2-デオキシグルコースに対する耐性などの抗栄養的マーカーなど)がある。視覚的マーカー遺伝子の発現は、色素(例えば、β-グルクロニダーゼ、GUSまたはβ-ガラクトシダーゼおよびその着色基質、例えばX-Gal)、発光物質(ルシフェリン/ルシフェラーゼ系など)または蛍光物質(緑色蛍光タンパク質、GFP、およびその誘導体)の形成をもたらす。この一覧は少数の考えられるマーカーのみを示す。当業者はこのようなマーカーを熟知している。生物および選択法に応じて異なるマーカーが好ましい。
【００７８】
植物細胞中への核酸配列の安定的または一時的な組み込みによって、ごく少数の細胞が外来性DNAを取り込み、および、望ましい場合、使用する発現ベクターおよび使用するトランスフェクション技法に応じて、それをそのゲノムに組み込むことは知られている。これらの要素を同定および選択するために、(前に記載したマーカーなどの)選択可能なマーカーをコードする遺伝子を、対象とする遺伝子を有する宿主細胞中に通常導入する。これらのマーカーは例えば、これらの遺伝子が例えば従来法による欠失によって機能的でない突然変異体中で使用することができる。さらに、選択可能なマーカーをコードする核酸配列分子は、本発明のポリペプチドをコードする配列を含む同じベクターで宿主細胞中に導入することができ、または本発明の方法中で使用することができ、またはそれ以外は別のベクターで使用することができる。導入核酸配列で安定的にトランスフェクトした細胞は、例えば選択によって同定することができる(例えば、選択可能なマーカーを組み込んだ細胞は生存し、一方他の細胞は死滅する)。
【００７９】
マーカー遺伝子、特に抗生物質および除草剤耐性の遺伝子は、核酸配列が首尾良く導入された後、トランスジェニック宿主細胞においてもはや必要とされないかまたは望ましくないので、核酸配列を導入するための本発明による方法は、これらのマーカー遺伝子の除去または削除を可能にする技法を有利に利用する。1つのこのような方法はいわゆる同時形質転換として知られている方法である。同時形質転換法は、形質転換のための2つのベクター、すなわち本発明による核酸配列を有する1つのベクター、および(1以上の)マーカー遺伝子を有する第2のベクターを同時に利用する。大部分の形質転換体は、両方のベクターを収容し、または植物の場合、それらを(形質転換体の40％以上まで)含む。アグロバクテリウム(Agrobacteria)での形質転換の場合、形質転換体は通常、ベクターの一部分のみ、すなわち発現カセットを通常表すT-DNAと隣接した配列を収容する。マーカー遺伝子は、交配を実施することによって形質転換植物から後に除去することができる。別の方法では、トランスポゾンに組み込まれたマーカー遺伝子を、望ましい核酸配列と共に形質転換に使用する(Ac/Ds技術として知られている)。形質転換体はトランスポサーゼ供給源と交配させることが可能であり、または形質転換体は、一時的または安定的にトランスポサーゼの発現をもたらす核酸配列構築物で形質転換する。いくつかの場合(約10％)、形質転換が首尾良く実施された後、トランスポゾンは宿主細胞のゲノムから移動し、消失する。さらにいくつかの場合、トランスポゾンは異なる位置に移動する。これらの場合、マーカー遺伝子は交配を実施することによって除去しなければならない。微生物学では、このような事象の検出を可能にする、または容易にする技法が開発された。さらなる有利な方法は、いわゆる組換え系として知られている系を利用し、その利点は交配による除去を省略することができることである。この型の最も知られている系は、いわゆるCre/lox系として知られている系である。Cre1はloxP配列間に位置する配列を除去するリコンビナーゼである。マーカー遺伝子がloxP配列間に組み込まれる場合、形質転換が首尾良く起こった後に、リコンビナーゼの発現によってそれを除去する。さらなる組換え系はHIN/HIX、FLP/FRTおよびREP/STB系である(Tribble et al.,J.Biol.Chem.,275,2000:22255-22267;Velmurugan et al.,J.Cell Biol.,149,2000:553-566)。本発明による核酸配列の植物ゲノムへの部位特異的な組み込みが可能である。本来、これらの方法は酵母、真菌または細菌などの微生物にも適用することができる。
【００８０】
トランスジェニック/導入遺伝子/組換え
本発明の目的のために、「トランスジェニック」、「導入遺伝子」または「組換え」は、例えば核酸配列、発現カセット、遺伝子構築物、または核酸配列を含むベクター、または本発明による核酸配列、発現カセットもしくはベクターで形質転換した生物に関して、組換え法によって生成する全てのこれらの構築物を意味し、その中で
(a)本発明の方法中で有用なタンパク質をコードする核酸配列、または
(b)本発明による核酸配列と機能的に連結した(1以上の)遺伝子制御配列、例えばプロモーター、または
(c)(a)および(b)
のいずれかがそれらの本来の遺伝的環境に位置せず、または組換え法によって改変されており、例えば、1以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、逆位または挿入の形をとるための改変が考えられる。本来の遺伝的環境は、元の植物中の本来のゲノムまたは染色体座、またはゲノムライブラリー中の存在を意味するとして理解される。ゲノムライブラリーの場合、核酸配列の本来の遺伝的環境は、少なくとも一部分は保持されることが好ましい。その環境は少なくとも片側で核酸配列と隣接し、かつ少なくとも50bp、好ましくは少なくとも500bp、特に好ましくは少なくとも1000bp、最も好ましくは少なくとも5000bpの配列長を有する。本来存在する発現カセット、例えば核酸配列の本来のプロモーターと、上記で定義したような本発明の方法中で有用なポリペプチドをコードする対応する核酸配列の本来存在する組合せは、この発現カセットを例えば突然変異誘発処理などの、非天然、合成(「人工」)法によって改変するとき、トランスジェニック発現カセットとなる。適切な方法は例えば米国特許第5,565,350号またはWO00/15815中に記載される。
【００８１】
したがって本発明の目的のトランスジェニック植物は、前述のように、本発明の方法中で使用する核酸配列は前記植物のゲノム中のそれらの本来の遺伝子座に存在せず、核酸配列を同種または異種発現させることが可能であることを意味するとして理解される。しかしながら、前述のように、トランスジェニックは、本発明による核酸配列または本発明の方法中で使用する核酸配列は、植物のゲノム中のそれらの本来の位置に存在するが、その配列は本来の配列に対して改変されていること、および/または本来の配列の調節配列が改変されていることも意味する。トランスジェニックは、ゲノム中の非天然遺伝子座における本発明による核酸配列の発現、すなわち核酸配列の同種、または好ましくは異種発現が起こることを意味するとして理解することが好ましい。好ましいトランスジェニック植物は本明細書で述べる。
【００８２】
形質転換
本明細書で言及する用語「導入」または「形質転換」は、移動に使用する方法とは無関係に、宿主細胞中への外因性ポリヌクレオチドの移動を含む。器官形成または胚形成のいずれかによる、後のクローン増殖が可能である植物組織、およびそこから再生する植物全体は、本発明の遺伝子構築物で形質転換することができる。選択する個々の組織は、利用可能なクローン増殖系に応じて変わり、形質転換する個々の種に最も適合させる。例示的な組織標的には、管状花、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、既存の分裂組織(例えば、頂端分裂、腋芽、および根茎分裂)、および誘導分裂組織(例えば、子葉分裂および胚軸分裂)がある。ポリヌクレオチドは、宿主細胞中に一時的または安定的に導入することができ、例えばプラスミドとして非組み込み状態で維持することができる。あるいは、それは宿主ゲノム中に組み込むことができる。したがって、生成した形質転換植物細胞を使用して、当業者に知られている方法で形質転換植物を再生することができる。
【００８３】
植物のゲノムへの外来遺伝子の移動は形質転換と呼ばれる。植物種の形質転換は現在非常に一般的な技法である。有利なことに、いくつかの形質転換法のいずれかを使用して、適切な原細胞に対象とする遺伝子を導入することができる。植物組織または植物細胞からの植物の形質転換および再生に関して記載した方法を、一時的または安定的形質転換に使用することができる。形質転換法には、リポソーム、エレクトロポレーション、遊離DNAの取り込みを増大する化学物質の使用、植物中へのDNAの直接注射、微粒子銃、ウイルスまたは花粉を使用する形質転換、およびマイクロプロジェクションがある。プロトプラスト用のカルシウム/ポリエチレングリコール法(Krens,F.A.et al.,(1982)Nature296,72-74;Negrutiu I et al.(1987)Plant Mol Biol8:363-373)、プロトプラストのエレクトロポレーション(Shillito R.D.et al.(1985)Bio/Technol3,1099-1102)、植物物質中へのマイクロインジェクション(Crossway A et al.,(1986)Mol.Gen Genet202:179-185)、DNAまたはRNAコーティング粒子銃(Klein TM et al.,(1987)Nature327:70)、(非組み込み状態の)ウイルスによる感染などから方法を選択することができる。トランスジェニック作物を含めたトランスジェニック植物は、アグロバクテリウム仲介の形質転換によって生成することが好ましい。有利な形質転換法は植物体における形質転換である。この目的のために、例えば、アグロバクテリウムを植物種子に作用させること、またはアグロバクテリウムを植物の分裂組織に接種することが可能である。本発明によって、形質転換したアグロバクテリウムの懸濁液を完全な植物体または少なくとも花原基に作用させることが、特に好都合であることが証明されている。処理した植物の種子を得るまで、その後植物を生長させる(Clough and Bent,Plant J.(1998)16,735-743)。イネのアグロバクテリウム仲介の形質転換の方法には、その開示を完全に述べるが如く参照によって本明細書に組み込む、以下の:欧州特許出願EP1198985A1、Aldemita and Hodges(Planta 199:612-617,1996);Chan et al.(Plant Mol Biol22(3):491-506,1993)、Hiei et al.(Plant J 6(2):271-282,1994)のいずれかに記載された方法などの、イネ形質転換のためのよく知られている方法がある。トウモロコシの形質転換の場合、好ましい方法は、その開示を完全に述べるが如く参照によって本明細書に組み込む、Ishida et al.(Nat. Biotechnol 14(6):745-50,1996)またはFrame et al.(Plant Physiol 129(1):13-22,2002)のいずれかに記載されたのと同様である。前記方法は、例えばB.Jenes et al.,Techniques for Gene Transfer,in:Transgenic Plants,Vol.1,Engineering and Utilization,eds.S.D.Kung and R.Wu,Academic Press(1993)128-143およびPotrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)によってさらに記載される。発現された核酸配列または構築物は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を形質転換するのに適したベクター、例えばpBin19(Bevan et al.,Nucl.Acids Res.12(1984)8711)にクローニングすることが好ましい。このようなベクターによって形質転換したアグロバクテリウムは、シロイヌナズナ種(シロイヌナズナは本発明の範囲内にあり、作物として考えない)、例えばタバコ科植物などの作物のような、モデルとして使用する植物などの植物の形質転換用の、例えば傷ついた葉または刻んだ葉をアグロバクテリウム溶液中に浸し、次いでそれらを適切な培地中で培養することによる、公知の方法で次いで使用す��ことができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンスによる植物の形質転換は例えばHofgen and Willmitzer in Nucl.Acid Res.(1988)16,9877によって記載され、または特にF.F.White,Vectors for Gene Transfer in Higher Plants;in Transgenic Plants,Vol.1,Engineering and Utilization,eds.S.D.Kung and R.Wu,Academic Press,1993,pp.15-38から知られている。
【００８４】
続いて完全な植物体に再生しなければならない体細胞の形質転換以外に、植物の分裂組織の細胞、および特に配偶子に発達する細胞を形質転換することもできる。この場合、形質転換された配偶子は本来の植物の生長に従い、トランスジェニック植物に生成する。したがって、例えば、シロイヌナズナの種子をアグロバクテリウムで処理し、その特定部分が形質転換されしたがってトランスジェニックである生長中の植物から種子を得る[Feldman,KA and Marks MD(1987).Mol Gen Genet208:274-289;Feldmann K(1992).In:C Koncz,N-H Chua and J Shell,eds,Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific,Singapore,pp.274-289]。代替法は、花房の反復除去、およびアグロバクテリウムで形質転換したロゼットの中心での切除部位のインキュベーション、それによって形質転換種子を経時的に後の時点で同様に得ることができることに基づく(Chang(1994).Plant J.5:551-558;Katavic(1994).Mol Gen Genet,245:363-370)。しかしながら、特に有効な方法は、「フローラルディップ」法などのその修正を加えた減圧浸潤法である。シロイヌナズナの減圧浸潤の場合、減圧下の完全な植物体をアグロバクテリウムの懸濁液で処理し[Bechthold,N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci,316:1194-1199]、一方「フローラルディップ」法の場合、生長中の花組織を界面活性剤処理したアグロバクテリウムの懸濁液と共に軽くインキュベートする[Clough,SJ and Bent AF(1998)The Plant J.16,735-743]。両方の場合共にトランスジェニック種子の特定部分を採取し、かつこれらの種子は、上記で記載した選択条件下で生長させることによって、非トランスジェニック種子と区別することができる。さらに、プラスチドは大部分の穀物において母方から遺伝し、花粉を介した導入遺伝子流動の危険性を低減または排除するので、プラスチドの安定した形質転換には利点がある。葉緑体ゲノムの形質転換は、Klaus et al.,2004[Nature Biotechnology22(2),225-229]に概略的に示されている方法によって一般に実施される。簡単に言うと、形質転換する配列を、葉緑体ゲノムと相同的な隣接配列間の選択可能なマーカー遺伝子と共にクローニングする。これらの相同的な隣接配列はプラストームへの部位特異的組み込みを誘導する。多くの異なる植物種に関するプラスチドの形質転換が記載されており、Bock(2001)Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology.J Mol Biol.2001 Sep21;312(3):425-38またはMaliga,P(2003)Progress towards commercialization of plastid transformation technology.Trends Biotechnol.21,20-28に総説が示されている。さらなるバイオテクノロジーの進歩が、一過性の同時組み込みマーカー遺伝子によって生成することができる、マーカーを含まないプラスチドの形質転換体の形で近年報告されている(Klaus et al.,2004,Nature Biotechnology22(2),225-229)。
【００８５】
T-DNA活性タグ化
T-DNA活性タグ化(Hayashi et al.Science(1992)1350-1353)は、プロモーターが標的遺伝子の発現を誘導するような形状で、対象とする遺伝子のゲノム領域または遺伝子のコード領域の10kb上流または下流中に、プロモーター(翻訳インクリーザーまたはイントロンであってもよい)を通常含有するT-DNAの挿入を含む。典型的には、その天然プロモーターによる標的遺伝子の発現の制御は妨害され、遺伝子は新たに導入されるプロモーターの制御下に入る。プロモーターは典型的にはT-DNAに組み込まれる。このT-DNAは、例えばアグロバクテリウム感染を介して植物ゲノム中にランダムに挿入され、挿入されたT-DNA付近で遺伝子の改変された発現をもたらす。導入プロモーター付近の遺伝子の改変された発現のため、生成するトランスジェニック植物は優性表現型を示す。
【００８６】
TILLING
用語「TILLING」は「Targeted Induced Local Lesions In Genomes」の略語であり、改変された発現および/または活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を生成および/または同定するのに有用な突然変異誘発技術を指す。TILLINGはこのような突然変異体を有する植物の選択も可能にする。これらの突然変異体は、強度または場所またはタイミングのいずれかの点で、改変された発現を示す可能性がある(突然変異が例えばプロモーターに影響を与える場合)。これらの突然変異体は、その天然型の遺伝子によって示される活性より高い活性を示す可能性がある。TILLINGは、高密度突然変異誘発と高スループットスクリーニング法を組み合わせる。TILLINGにおいて典型的にたどるステップは、(a)EMS突然変異誘発(Redei GP and Koncz C (1992)In Methods in Arabidopsis Research,Koncz C,Chua NH,Schell J,eds.Singapore,World Scientific Publishing Co,pp.16-82;Feldmann et al.,(1994)In Meyerowitz EM,Somerville CR,eds,Arabidopsis.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,pp137-172;Lightner J and Caspar T(1998)In J Martinez-Zapater,J Salinas,eds,Methods on Molecular Biology,Vol.82.Humana Press,Totowa,NJ,pp91-104)、(b)DNA調製および個体のプール、(c)対象とする領域のPCR増幅、(d)ヘテロ二重鎖の形成を可能にするための変性およびアニーリング、(e)プール中のヘテロ二重鎖の存在をクロマトグラム中の追加ピークとして検出するDHPLC、(f)突然変異個体の同定、および(g)突然変異PCR産物の塩基配列決定である。TILLING用の方法は当技術分野でよく知られている(McCallum et al.,(2000)Nat Biotechnol 18:455-457;Stemple (2004)Nat Rev Genet5(2):145-50によって総説される)。
【００８７】
相同組換え
相同組換えは、ゲノム中の明確な選択位置への選択した核酸配列の導入を可能にする。相同組換えは、酵母またはヒメツリガネゴケ(moss Physcomitrella)などの下等生物用に生物科学において通常使用される標準的な技術である。植物において相同組換えを実施する方法は、モデル植物に関してだけでなく(Offringa et al.(1990)EMBO J 9(10):3077-84)、作物、例えばイネに関しても記載されている(Terada et al.(2002)Nat Biotech20(10):1030-4;Iida and Terada(2004)Curr Opin Biotech15(2):132-8)。
【００８８】
収穫高
用語「収穫高」は一般に、特定の穀物、領域、および期間と典型的に関係がある、経済的価値がある測定可能な生産量を意味する。個々の植物の部分はその数、大きさおよび/または重量に基づいて収穫高に直接貢献し、あるいは実際の収穫高は、(採取生産量と見積もり生産量の両方を含む)全生産量を作付けエーカーで割ることによって決定される、1穀物および1年間の1エーカー当たりの収穫高である。用語植物の「収穫高」は、その植物の植物性バイオマス、生殖器官、および/または珠芽(種子など)と関係がある可能性がある。
【００８９】
初期活力
「初期活力」(early viguor)は、特に植物生長の初期段階中の活性がある健全でバランスのとれた生長を指し、例えば、植物がそれらの環境に十分適応していること(すなわち、エネルギー資源の使用が最適化しており新芽と根が区分化されている)による、増大した植物の適応度に起因する可能性がある。初期活力を有する植物は増大した苗の生存率および穀物の十分な定着も示し、非常に均一な田畑が生じることが多く(穀物は均一な形式で生長し、すなわち、大部分の植物がほぼ同時に様々な発生段階に到達する)、十分で高い収穫高をもたらすことが多い。したがって、初期活力は、千粒重、発芽率、出現率、苗の生長、苗の高さ、根の長さ、根および新芽のバイオマスおよび多くのその他などの様々なファクターを測定することによって決定することができる。
【００９０】
増大/改善/増大
用語「増大」、「改善」または「増大」は交換可能であり、本出願の意義では、本明細書で定義する対照植物と比較して、少なくとも5％、6％、7％、8％、9％または10％、好ましくは少なくとも15％または20％、より好ましくは25％、30％、35％または40％より多い収穫高および/または生長を意味するものとする。
【００９１】
種子収穫高
増大した種子収穫高は、以下の:(a)個々の種子ベースおよび/または植物当たりおよび/またはヘクタールまたはエーカー当たりであってよい種子バイオマス(種子全体の重量)の増大、(b)増大した円錐花序当たりおよび/または植物当たりの花の数、(c)増加した(充填)種子数、(d)増加した種子充填率(総種子で割った充填種子数間の比として表す)、(e)総バイオマスで割った種子などの採取可能な部分の収穫高の比として表す、増加した収穫指数、(f)増大した一次円錐花序の数、(g)計数した充填種子数およびそれらの総重量から推定する、増加した千粒重(TKW)の1以上として現れる可能性がある。増大したTKWは増大した種子の大きさおよび/または種子重量に起因する可能性があり、胚および/または内胚乳の大きさの増大に起因する可能性もある。
【００９２】
種子収穫高の増大は、種子の大きさおよび/または種子体積の増大として現れる可能性もある。さらに、収穫高の増大は、種子面積および/または種子長および/または種子幅および/または種子周囲の増大として現れる可能性もある。増大した種子収穫高は改変された構造をもたらす可能性もあり、または改変された構造のため生じる可能性がある。
【００９３】
緑色指数
本明細書で使用する「緑色指数」は植物のデジタル画像から計算する。画像上の植物体に属するそれぞれのピクセルに関して、(エンコーディングカラーのRGBモデルにおいて)緑色値と赤色値の比を計算する。緑色指数は、緑色と赤色の比が所与の閾値を超えるピクセルの割合として表す。正常な生長条件下、塩ストレスでの生長条件下、および低下した栄養利用性での生長条件下では、植物の緑色指数は、開花前の最後の画像で測定する。対照的に、干ばつストレスでの生長条件下では、植物の緑色指数は、干ばつ後の最初の画像で測定する。
【００９４】
植物
本明細書で使用する用語「植物」は、植物全体、植物の先祖および子孫、および種子、新芽、茎、葉、根茎(塊茎含む)、花、ならびに組織および器官を含めた植物部分を含み、前述の各々は対象とする遺伝子/核酸配列を含む。用語「植物」は、植物細胞、懸濁培養物、カルス組織、胚、分裂組織領域、配偶体、胞子体、花粉および小胞子も含み、再度前述の各々は対象とする遺伝子/核酸配列を含む。
【００９５】
本発明の方法において特に有用である植物には、カエデ種(Acer spp.)、マタタビ種(Actinidia spp.)、トロロアオイ種(Abelmoschus spp.)、サイザルアサ(Agave sisalana)、カモジグサ種(Agropyron spp.)、ハイコヌカグサ(Agrostis stolonifera)、アリウム種(Allium spp.)、ヒユ種(Amaranthus spp.)、アンモフィラ・アレナリア(Ammophila arenaria)、パイナップル(Ananas comosus)、バンレイシ種(Annona spp.)、セロリ(Apium graveolens)、ラッカセイ種(Arachis spp.)、パンノキ種(Artocarpus spp.)、アスパラガス(Asparagus officinalis)、カラスムギ種(例えば、アヴィーナ・サティバ(Avena sativa)、アヴィーナ・ファツア(Avena fatua)、アヴィーナ・ビザンチア(Avena byzantina)、アヴィーナ・ファツア・バール・サティバ(Avena fatua var. sativa)、アヴィーナハイブリダ(Avena hybrida))、スターフルーツ(Averrhoa carambola)、ホウライチク種(Bambusa sp.)、トウガン(Benincasa hispida)、ブラジルナッツ(Bertholletia excelsea)、サトウダイコン(Beta vulgaris)、アブラナ種(Brassica spp.)(例えば、セイヨウアブラナ(Brassica napus)、カブ種(Brassica rapa ssp.)[キャノーラ(canola)、ナタネ(oilseed rape)、カブラ(turnip rape)])、カダバ・ファリノーサ(Cadaba farinosa)、カメリヤ・シネンシス(Camellia sinensis)、カンナ・インディカ(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、トウガラシ種(Capsicum spp.)、カレックス・エラータ(Carex elata)、カリカ・パパイヤ(Carica papaya)、カリッサ・マクロカルパ(Carissa macrocarpa)、ペカン種(Carya spp.)、ベニバナ(Carthamus tinctorius)、クリ種(Castanea spp.)、パンヤノキ(Ceiba pentandra)、エンダイブ(Cichorium endivia)、ニッケイ種(Cinnamomum spp.)、スイカ(Citrullus lanatus)、シトラス種(Citrus spp.)、ココス種(Cocos spp.)、コーヒーノキ種(Coffea spp.)、サトイモ(Colocasia esculenta)、コラノキ(Cola spp.)、シナノキツナソ種(Corchorus sp.)、コリアンダー(Coriandrum sativum)、ハシバミ種(Corylus spp.)、サンザシ種(Crataegus spp.)、サフラン(Crocus sativus)、カボチャ(Cucurbita spp.)、キュウリ種(Cucumis spp.)、チョウセンアザミ種(Cynara spp.)、ニンジン(Daucus carota)、ヌスビトハギ種(Desmodium spp.)、リュウガン(Dimocarpus longan)、ヤマノイモ種(Dioscorea spp.)、カキノキ種(Diospyros spp.)、ヒエ種(Echinochloa spp.)、アブラヤシ属(Elaeis)(例えば、アブラヤシ(Elaeis guineensis)、アメリカアブラヤシ(Elaeis oleifera)、シコクビエ(Eleusine coracana)、エリアンサス種(Erianthus sp.)、ビワ(Eriobotrya japonica)、ユーカリ種(Eucalyptus sp.)、ビタンガ(Eugenia uniflora)、ソバ種(Fagopyrum spp.)、ブナ種(Fagus spp.)、オニウシノケグサ(Festuca arundinacea)、イチジク(Ficus carica)、キンカン種(Fortunella spp.)、フラガリア種(Fragaria spp.)、ギンコ・ビローバ(Ginkgo biloba)、グリシン種(Glycine spp.)(例えば、ダイズ(Glycine max)、ソヤ・ヒスピダ(Soja hispida)またはソヤ・マックス(Soja max)、ケブカワタ(Gossypium hirsutum)、ヘリアンサス種(Helianthus spp.)(例えばヒマワリ(Helianthus annuus)、ノカンゾウ(Hemerocallis fulva)、ハイビスカス種(Hibiscus spp.)、オオムギ属種(Hordeum spp.)(例えばオオムギ(Hordeum vulgare)、サツマイモ(Ipomoea batatas)、クルミ種(Juglans spp.)、レタス(Lactuca sativa)、ラティルス種(Lathyrus spp.)、レンズマメ(Lens culinaris)、アマ(Linum usitatissimum)、レイシ(Litchi chinensis)、ハス種(Lotus spp.)、トカドヘチマ(Luffa acutangula)、ルピナス種(Lupinus spp.)、ルズラ・シルバチカ(Luzula sylvatica)、トマト属種(Lycopersicon spp.)(例えば、トマト(Lycopersicon esculentum)、リコペルシコン・リコペルシカム(Lycopersicon lycopersicum)、リコペルシコン・ピリフォルメ(Lycopersicon pyriforme)、マクロチローマ種(Macrotyloma spp.)、リンゴ属種(Malus spp.)、アセロラ(Malpighia emarginata)、マミーアップル(Mammea americana)、マンゴー(Mangifera indica)、キャッサバ種(Manihot spp.)、サポジラ(Manilkara zapota)、ムラサキウマゴヤシ(Medicago sativa)、シナガワハギ属種(Melilotus spp.)、ハッカ種(Mentha spp.)、ススキ(Miscanthus sinensis)、ツルレイシ種(Momordica spp.)、クロミグワ(Morus nigra)、バショウ種(Musa spp.)、タバコ種(Nicotiana spp.)、オリーブ属種(Olea spp.)、オプンティア属種(Opuntia spp.)、オルニトプス種(Ornithopus spp.)、オリザ種(例えば、イネ(Oryza sativa)、オリザ・ラチフォリア(Oryza latifolia)、キビ(Panicum miliaceum)、スイッチグラス(Panicum virgatum)、クダモノトケイソウ(Passiflora edulis)、バースニップ(Pastinaca sativa)、チカラシバ属種(Pennisetum sp.)、ワニナシ種(Persea spp.)、イタリアンパセリ(Petroselinum crispum)、クサヨシ(Phalaris arundinacea)、インゲンマメ属種(Phaseolus spp.)、オオアワガエリ(Phleum pratense)、ナツメヤシ属種(Phoenix spp.)、ヨシ(Phragmites australis)、ホオズキ属種(Physalis spp.)、マツ属種(Pinus spp.)、ピスタシア・ヴェラ(Pistacia vera)、エンドウ属種(Pisum spp.)、イチゴツナギ種(Poa spp.)、ハコヤナギ種(Populus spp.)、パロソピス種(Prosopis spp.)、サクラ属種(Prunus spp.)、パンジロウ属種(Psidium spp.)、ザクロ(Punica granatum)、セイヨウナシ(Pyrus communis)、コナラ属種(Quercus spp.)、ラディッシュ(Raphanus sativus)、ショクヨウダイオウ(Rheum rhabarbarum)、スグリ属種(Ribes spp.)、トウゴマ(Ricinus communis)、キイチゴ属種(Rubus spp.)、サトウキビ属種(Saccharum spp.)、ヤナギ属種(Salix sp.)、ニワトコ属種(Sambucus spp.)、ライムギ(Secale cereale)、ゴマ属種(Sesamum spp.)、シナピス属種(Sinapis sp.)、ナス属種(Solanum spp.)(例えば、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、ヒラナス(Solanum integrifolium)またはトマト(Solanum lycopersicum)、モロコシ(Sorghum bicolor)、ホウレンソウ種(Spinacia spp.)、シジジウム種(Syzygium spp.)、マンジュギク種(Tagetes spp.)、タマリンディス・インディカ(Tamarindus indica)、テオブロマ・カカオ(Theobroma cacao)、トリフォリウム属種(Trifolium spp.)、ライコムギ種(Triticale sp.)、トリチコセケル・リンパウイ(Triticosecale rimpaui)、コムギ属種(Triticum spp.)(例えば、コムギ(Triticum aestivum)、マカロニコムギ(Triticum durum)、デュラムコムギ(Triticum turgidum)、トリチカム・ハイバーナム(Triticum hybernum)、トリチカム・マーハ(Triticum macha)、トリチカム・サティバム(Triticum sativum)または小麦胚芽油(Triticum vulgare)、トロパエオルム・ミヌス(Tropaeolum minus)、トロパエオルム・マジャス(Tropaeolum majus)、スノキ属種(Vaccinium spp.)、ソラマメ属種(Vicia spp.)、ササゲ属種(Vigna spp.)、ニオイスミレ(Viola odorata)、ブドウ属種(Vitis spp.)、トウモロコシ、ワイルドライス(Zizania palustris)、ナツメ属種(Zizphus spp.)を特に含めた一覧から選択される、緑色植物亜界の上科、特に飼葉または飼料用マメ科植物を含めた単子葉および双子葉植物、観葉植物、食用穀物、樹木または低木に属する全ての植物がある。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】以下の特質:(i)InterPro登録番号IPR014978(PFAM登録番号PF08880)を有するQLQドメイン;(ii)InterPro登録番号IPR014977(PFAM登録番号PF08879)を有するWRCドメイン;および(iii)3つのCys残基および1つのHis残基を保存された配置(CX9CX10CX2H)で含み、WRCドメイン内に位置する転写エフェクター(ET)ドメインを含む、配列番号2により示されるGRFポリペプチドの図である。
【図２】表A.1に示されるGRFポリペプチドのQLQドメイン(配列番号2について配列番号115により示す)のAlignX(Vector NTI 10.3,Invitrogen Corporationから)多重配列アラインメントを示す図である。保存されたQLQアミノ酸残基は、多重アラインメントの上部に示されている。他の2個の良く保存された残基(黒色で囲む)はE(Glu)およびP(Pro)である。
【図３】表A.1に示されるGRFポリペプチドのWRCドメイン(配列番号2について配列番号116により示す)のAlignX(Vector NTI 10.3,Invitrogen Corporationから)多重配列アラインメントを示す図である。保存されたWRCアミノ酸残基は、コンセンサス配列中で太字で示す。転写エフェクター(ET)ドメインと称される、保存された配置(CX9CX10CX2H)中の3つのCys残基および1つのHis残基をアラインメントにおいて縦に枠で囲み、アラインメントの一番下にも記載する。WRCドメイン中の推定核局在化シグナル(NLS)に二重下線を付ける。
【図４】植物および哺乳動物由来のSYTポリペプチドの典型的なドメイン構造を示す図である。保存されたSNHドメインは、ポリペプチドのN末端に位置する。ポリペプチドのC末端の残部は、植物SYTポリペプチド中ではQGリッチドメインから、哺乳動物SYTポリペプチド中ではQPGYリッチドメインからなる。Metリッチドメインは、典型的には植物ではQGリッチ(N末端からC末端へ)の、または哺乳動物ではQPGYリッチの前半に含まれる。第2のMetリッチドメインは、植物SYTポリペプチドではSNHドメインに先行する場合がある。
【図５−１】改良型ClustalWアルゴリズム(InforMax,Bethesda,MD,http://www.informaxinc.com)に基づいて、VNTI Align X多重アラインメントプログラムをギャップ開始ペナルティー10およびギャップ伸長0.05での初期設定で使用する、いくつかのSYTポリペプチドのN末端の多重アラインメントを示す図である。SNHドメインを植物およびヒトのSYTポリペプチドにわたって枠で囲む。アラインメント中の最終行はアラインした配列に由来するコンセンサス配列からなる。
【図５−２】改良型ClustalWアルゴリズム(InforMax,Bethesda,MD,http://www.informaxinc.com)に基づいて、VNTI Align X多重アラインメントプログラムをギャップ開始ペナルティー10およびギャップ伸長0.05での初期設定で使用する、いくつかのSYTポリペプチドのN末端の多重アラインメントを示す図である。SNHドメインを植物およびヒトのSYTポリペプチドにわたって枠で囲む。アラインメント中の最終行はアラインした配列に由来するコンセンサス配列からなる。
【図６−１】改良型ClustalWアルゴリズム(InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com)に基づいて、VNTI Align X多重アラインメントプログラムをギャップ開始ペナルティー10およびギャップ伸長0.05での初期設定で使用する、いくつかの植物SYTポリペプチドの多重アラインメントを示す図である。N末端からC末端への2つの主なドメインを枠で囲み、SNHドメインおよびMetリッチ/QGリッチドメインとして特定する。加えて、N末端Metリッチドメインも枠で囲み、配列番号90および配列91の位置を太い下線で強調する。
【図６−２】改良型ClustalWアルゴリズム(InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com)に基づいて、VNTI Align X多重アラインメントプログラムをギャップ開始ペナルティー10およびギャップ伸長0.05での初期設定で使用する、いくつかの植物SYTポリペプチドの多重アラインメントを示す図である。N末端からC末端への2つの主なドメインを枠で囲み、SNHドメインおよびMetリッチ/QGリッチドメインとして特定する。加えて、N末端Metリッチドメインも枠で囲み、配列番号90および配列91の位置を太い下線で強調する。
【図６−３】改良型ClustalWアルゴリズム(InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com)に基づいて、VNTI Align X多重アラインメントプログラムをギャップ開始ペナルティー10およびギャップ伸長0.05での初期設定で使用する、いくつかの植物SYTポリペプチドの多重アラインメントを示す図である。N末端からC末端への2つの主なドメインを枠で囲み、SNHドメインおよびMetリッチ/QGリッチドメインとして特定する。加えて、N末端Metリッチドメインも枠で囲み、配列番号90および配列91の位置を太い下線で強調する。
【図６−４】改良型ClustalWアルゴリズム(InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com)に基づいて、VNTI Align X多重アラインメントプログラムをギャップ開始ペナルティー10およびギャップ伸長0.05での初期設定で使用する、いくつかの植物SYTポリペプチドの多重アラインメントを示す図である。N末端からC末端への2つの主なドメインを枠で囲み、SNHドメインおよびMetリッチ/QGリッチドメインとして特定する。加えて、N末端Metリッチドメインも枠で囲み、配列番号90および配列91の位置を太い下線で強調する。
【図６−５】改良型ClustalWアルゴリズム(InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com)に基づいて、VNTI Align X多重アラインメントプログラムをギャップ開始ペナルティー10およびギャップ伸長0.05での初期設定で使用する、いくつかの植物SYTポリペプチドの多重アラインメントを示す図である。N末端からC末端への2つの主なドメインを枠で囲み、SNHドメインおよびMetリッチ/QGリッチドメインとして特定する。加えて、N末端Metリッチドメインも枠で囲み、配列番号90および配列91の位置を太い下線で強調する。
【図６−６】改良型ClustalWアルゴリズム(InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com)に基づいて、VNTI Align X多重アラインメントプログラムをギャップ開始ペナルティー10およびギャップ伸長0.05での初期設定で使用する、いくつかの植物SYTポリペプチドの多重アラインメントを示す図である。N末端からC末端への2つの主なドメインを枠で囲み、SNHドメインおよびMetリッチ/QGリッチドメインとして特定する。加えて、N末端Metリッチドメインも枠で囲み、配列番号90および配列91の位置を太い下線で強調する。
【図６−７】改良型ClustalWアルゴリズム(InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com)に基づいて、VNTI Align X多重アラインメントプログラムをギャップ開始ペナルティー10およびギャップ伸長0.05での初期設定で使用する、いくつかの植物SYTポリペプチドの多重アラインメントを示す図である。N末端からC末端への2つの主なドメインを枠で囲み、SNHドメインおよびMetリッチ/QGリッチドメインとして特定する。加えて、N末端Metリッチドメインも枠で囲み、配列番号90および配列91の位置を太い下線で強調する。
【図６−８】改良型ClustalWアルゴリズム(InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com)に基づいて、VNTI Align X多重アラインメントプログラムをギャップ開始ペナルティー10およびギャップ伸長0.05での初期設定で使用する、いくつかの植物SYTポリペプチドの多重アラインメントを示す図である。N末端からC末端への2つの主なドメインを枠で囲み、SNHドメインおよびMetリッチ/QGリッチドメインとして特定する。加えて、N末端Metリッチドメインも枠で囲み、配列番号90および配列91の位置を太い下線で強調する。
【図６−９】改良型ClustalWアルゴリズム(InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com)に基づいて、VNTI Align X多重アラインメントプログラムをギャップ開始ペナルティー10およびギャップ伸長0.05での初期設定で使用する、いくつかの植物SYTポリペプチドの多重アラインメントを示す図である。N末端からC末端への2つの主なドメインを枠で囲み、SNHドメインおよびMetリッチ/QGリッチドメインとして特定する。加えて、N末端Metリッチドメインも枠で囲み、配列番号90および配列91の位置を太い下線で強調する。
【図６−１０】改良型ClustalWアルゴリズム(InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com)に基づいて、VNTI Align X多重アラインメントプログラムをギャップ開始ペナルティー10およびギャップ伸長0.05での初期設定で使用する、いくつかの植物SYTポリペプチドの多重アラインメントを示す図である。N末端からC末端への2つの主なドメインを枠で囲み、SNHドメインおよびMetリッチ/QGリッチドメインとして特定する。加えて、N末端Metリッチドメインも枠で囲み、配列番号90および配列91の位置を太い下線で強調する。
【図７】左側は対照ベクターで形質転換したイネ植物(オリザ・サティバ  ジャポニカ種、栽培種  日本晴(Nipponbare))由来の穂を、右側は2種の構築物:(1)イネ由来のGOS2プロモーター(pGOS2)の制御下にGRFポリペプチドをコードする核酸配列;および(2)イネ由来のGOS2プロモーター(pGOS2)の制御下にSYTポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換したイネ植物(オリザ・サティバ  ジャポニカ種、栽培種  日本晴)由来の穂を示す図である。
【図８】上列、左から右へ:a.イネ由来のGOS2プロモーター(pGOS2)の制御下にSYTポリペプチドをコードする核酸配列を含む1つの構築物で形質転換した植物;b.2つの構築物:(1)イネ由来のGOS2プロモーター(pGOS2)の制御下にGRFポリペプチドをコードする核酸配列;および(2)イネ由来のGOS2プロモーター(pGOS2)の制御下にSYTポリペプチドをコードする核酸配列、で形質転換した植物;c.イネ由来のGOS2プロモーター(pGOS2)の制御下にGRFポリペプチドをコードする核酸配列を含む1つの構築物で形質転換した植物、d.a由来のヌル欠損植物(対照植物)、e.c由来のヌル欠損植物(対照植物)由来の成熟イネ種子(オリザ・サティバ  ジャポニカ種、栽培種  日本晴)30個を示す図である。
【図９】イネ由来のGOS2プロモーター(pGOS2)の制御下にGRFポリペプチドをコードする核酸配列のオリザ・サティバにおける発現増加のための、または代替的にイネ由来のGOS2プロモーター(pGOS2)の制御下にSYTポリペプチドをコードする核酸配列のオリザ・サティバにおける発現増加のためのバイナリーベクターを示す図である。
【図１０−１】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−２】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−３】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−４】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−５】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−６】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−７】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−８】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−９】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−１０】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−１１】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−１２】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−１３】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−１４】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−１５】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−１６】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−１７】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−１８】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−１９】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−２０】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−２１】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−２２】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−２３】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−２４】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−２５】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−２６】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−２７】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−２８】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−２９】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−３０】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−３１】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−３２】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−３３】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−３４】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−３５】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−３６】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−３７】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−３８】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−３９】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−４０】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−４１】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−４２】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−４３】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−４４】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−４５】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−４６】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−４７】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−４８】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−４９】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−５０】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−５１】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−５２】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−５３】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−５４】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−５５】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−５６】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−５７】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−５８】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−５９】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−６０】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−６１】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−６２】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−６３】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−６４】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−６５】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−６６】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−６７】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−６８】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−６９】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−７０】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−７１】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【図１０−７２】本発明による方法の実施において有用な配列の詳細な例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
驚くことに、植物中でのGRFポリペプチドをコードする核酸配列の発現の増大は、対照植物と比較して増強した収穫高関連形質を有する植物をもたらすことが現在分かっている。第1の実施形態によれば、本発明は、対照植物と比較して植物における収穫高関連形質を増強する方法であって、植物中でのGRFポリペプチドをコードする核酸配列の発現を増加することを含む方法を提供する。
【００９８】
驚くことに、植物中の以下の核酸配列:(i)成長調節因子(GRF)ポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を増加させることによって、(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物と比較して収穫高関連形質が増強されている植物をもたらすことがここで明らかになった。第1の実施形態によれば、植物中の以下の核酸配列:(i)成長調節因子(GRF)ポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を増加させることによって、様々な植物収穫高関連形質を増強する方法であって、該収穫高関連形質は、以下の核酸配列のうちの1つ:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物と比較して増強されている方法を提供する。増強した収穫高関連形質は、以下の形質:増大した初期活力、増加した地上バイオマス、増加した植物当たり総種子収穫高、増加した種子充填率、増加した(充填)種子数、増加した収穫指数または増加した千粒重(TKW)のうち1以上を含む。
【００９９】
成長調節因子(GRF)ポリペプチドに関する詳細な記載
GRFポリペプチドをコードする核酸配列の発現を増加するのに好ましい方法は、植物におけるGRFポリペプチドをコードする核酸配列の導入および発現による方法である。
【０１００】
本明細書における以後の「本発明の方法中で有用なGRFタンパク質」に対する任意の言及は、本明細書で定義するGRFポリペプチドを意味すると考えられる。本明細書における以後の「本発明の方法中で有用なGRF核酸配列」に対する任意の言及は、このようなGRFポリペプチドをコードすることができる核酸配列を意味すると考えられる。植物中に導入され(したがって本発明の方法を実施する際に有用である)核酸配列は、ここに記載する型のポリペプチドをコードする任意の核酸配列であり、本明細書では以後「GRF核酸配列」または「GRF遺伝子」とも呼ぶ。
【０１０１】
本明細書で定義する「GRFポリペプチド」は、(i)(配列番号2に含まれる)配列番号115により示されるQLQドメインに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するドメイン;および(ii)(配列番号2に含まれる)配列番号116により示されるWRCドメインに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するドメインを含む任意のポリペプチドを指す。
【０１０２】
その代わりにまたはそれに加えて、本明細書で定義する「GRFポリペプチド」は、(i)InterPro登録番号IPR014978(PFAM登録番号PF08880)を有するQLQドメイン;(ii)InterPro登録番号IPR014977(PFAM登録番号PF08879)を有するWRCドメイン;および(iii)3つのCys残基および1つのHis残基を保存された配置(CX9CX10CX2H)で含む転写エフェクター(ET)ドメインを含む任意のポリペプチドを指す。
【０１０３】
その代わりにまたはそれに加えて、本明細書で定義する「GRFポリペプチド」は、配列番号2により示されるGRFポリペプチドに対して、または本明細書中の表A.1に示される完全長ポリペプチド配列のうちいずれかに対して、好ましくなっていく順に、少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有する任意のポリペプチドを指す。
【０１０４】
その代わりにまたはそれに加えて、「GRFポリペプチド」は、酵母ツーハイブリッド相互作用アッセイにおいて、本明細書中の表A.2に示されるポリペプチドなどの、GRF相互作用因子(GIF;GIF1〜GIF3;滑膜肉腫転座SYT1〜SYT3とも呼ばれる)ポリペプチドと相互作用する。
【０１０５】
用語「ドメイン」および「モチーフ」は、本明細書中の「定義」のセクションで定義する。ドメインの同定に関する専門のデータベース、例えばSMART(Schultz et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,5857-5864;Letunic et al.(2002)Nucleic Acids Res30,242-244),InterPro(Mulder et al.,(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318),Prosite(Bucher and Bairoch(1994),A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation.(In)ISMB-94;Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology.Altman R.,Brutlag D.,Karp P.,Lathrop R.,Searls D.,Eds.,pp53-61,AAAI Press,Menlo Park;Hulo et al.,Nucl.Acids.Res.32:D134-D137,(2004))、またはPfam(Bateman et al.,Nucleic Acids Research30(1):276-280(2002)が存在する。タンパク質配列のin silico分析用の一組のツールがExPASyプロテオミクスサーバー(Swiss Institute of Bioinformatics(Gasteiger et al.,ExPASy:the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis,Nucleic Acids Res.31:3784-3788(2003))で利用可能である。
【０１０６】
配列番号2のポリペプチド配列の分析は、本明細書の実施例2および4において以下に示す。例えば、配列番号2により示されるGRFポリペプチドは、InterProドメインデータベース中の、InterPro登録番号IPR014978(PFAM登録番号PF08880)を有するQLQドメインおよびInterPro登録番号IPR014977(PFAM登録番号PF08879)を有するWRCドメインを含む。配列アラインメントなどによる通常の技法を使用して、ドメインを同定することもできる。本明細書の表A.1のポリペプチドのQLQドメインのアラインメントは図2に示し、かつ本明細書の表A.1のポリペプチドのWRCドメインは図3に示す。このようなアラインメントは、QLQおよびWRCアミノ酸残基などの、GRFポリペプチド間の大部分の保存アミノ酸を同定するのに有用である。
【０１０７】
比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野でよく知られており、このような方法にはGAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTAがある。GAPはNeedleman and Wunsch((1970)J Mol Biol48:443-453)のアルゴリズムを使用して、一致の数を最大にしギャップの数を最小にする、2配列の全体の(すなわち完全配列に及ぶ)アラインメントを発見する。BLASTアルゴリズム(Altschul et al.(1990)J Mol Biol215:403-10)は配列同一性の割合を計算し、かつ2配列間の類似性の統計分析を実施する。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Centre for Biotechnology Information(NCBI)によって公表されている。ホモログは、例えばデフォルトペアワイズアラインメントパラメータを用いる、ClustalW多重配列アラインメントアルゴリズム(バージョン1.83)、およびパーセンテージの記録法を使用して容易に同定することができる。全体的な類似性および同一性の割合も、MatGATソフトウェアパッケージ(Campanella et al.,(2003)BMC Bioinformatics,10:29.MatGAT:タンパク質またはDNA配列を使用して類似性/同一性マトリクスを生成するアプリケーション)において利用可能な方法の1つを使用して決定することができる。当業者には明らかであるように、わずかな手作業の編集を実施して保存モチーフ間のアラインメントを最適化することができる。さらに、ホモログの同定のために完全長配列を使用する代わりに、特異的ドメインを使用することもできる。配列同一性の値は、デフォルトパラメータを使用する前述のプログラムを使用して、核酸配列もしくはポリペプチド配列全体で、または選択したドメインもしくは(1以上の)保存モチーフで決定することができる。QLQドメインおよびWRCドメインの外側では、GRFポリペプチドは低いアミノ酸配列の同一性を有すると言われている。本明細書の実施例3は、配列番号2により示されるGRFポリペプチドと表Aに挙げるGRFポリペプチドの間の配列同一性の割合を表B.1に記載し、それはわずか15％のアミノ酸配列の同一性であってよい。QLQドメイン配列番号2(配列番号2に含まれ配列番号115により示される;図2に示される表A.1のGRFポリペプチドのQLQドメイン)と、本発明を実施する際に有用であるポリペプチドのQLQドメインの間で同一性の計算を実施する場合、同一性の割合は実質的に増大し得る。同様に、WRCドメイン配列番号2(配列番号2に含まれ配列番号116により示される;図3に示される表A.1のWRCポリペプチドのQLQドメイン)と、本発明を実施する際に有用であるポリペプチドのWRCドメインの間で同一性の計算を実施する場合、同一性の割合は実質的に増大し得る。本発明の方法を実施する際に有用であるポリペプチド配列間のQLQドメインでの同一性の割合は25％〜99％のアミノ酸同一性の範囲であり、かつ本発明の方法を実施する際に有用であるポリペプチド配列間のWRCドメインでの同一性の割合は60％〜99％のアミノ酸同一性の範囲である。図3においても観察することができるように、WRCドメインは図2に示すようなQLQドメインよりよく異なるGRFポリペプチド間で保存されている。
【０１０８】
タンパク質の細胞内局在性の予想の作業は重要であり、十分研究されている。タンパク質の局在性を知ることは、その機能を解明するのを助ける。タンパク質の局在性に関する実験法は、免疫学的局在決定から緑色蛍光タンパク質(GFP)またはβ-グルクロニダーゼ(GUS)を使用するタンパク質のタグ化に及ぶ。計算法と比較して、このような方法は正確ではあるが労力を要する。配列データからのタンパク質の局在性の計算予測において、近年多大な進歩がある。当業者によく知られているアルゴリズムの中で、例えば、PSort、TargetP、ChloroP、LocTree、Predotar、LipoP、MITOPROT、PATS、PTS1、SignaIPおよびその他が、Swiss Institute for Bioinformaticsによって支援されるExPASyプロテオミクスツールで利用可能である。
【０１０９】
さらに、本発明の方法で有用であるGRFポリペプチドは(少なくともその天然型で)典型的には、必ずではないが、転写制御活性および他のタンパク質と相互作用する能力を有する。したがって、低下した転写制御活性を有する、転写制御活性を有さない、低下したタンパク質-タンパク質相互作用能力を有する、またはタンパク質-タンパク質相互作用能力を有さないGRFポリペプチドは、本発明の方法中で同様に有用である可能性がある。DNA結合活性およびタンパク質-タンパク質相互作用は、(例えばCurrent Protocols in Molecular Biology,Volumes 1 and 2,Ausubel et al.(1994),Current Protocols中の)当技術分野でよく知られている方法を使用してin vitroまたはin vivoで容易に決定することができる。GRFポリペプチドは、酵母細胞中でレポーター遺伝子の転写を活性化することができる(Kim & Kende(2004)Proc Natl Acad Sci101(36):13374-13379)。GRFポリペプチドは、酵母ツーハイブリッドタンパク質-タンパク質相互作用アッセイ(Kim & Kende、上掲)を使用して、酵母細胞中in vivoでGRF相互作用因子ポリペプチド(GIF1〜GIF3;滑膜肉腫転座(SYT)とも呼ばれる)と相互作用することもできる。in vitro結合アッセイも使用して、GRFポリペプチドとSYT(またはGIF)ポリペプチドは相互作用パートナーであることを示す(Kim & Kende、上掲)。
【０１１０】
本発明は、配列番号2のGRFポリペプチド配列をコードする配列番号1により示される核酸配列で、植物を形質転換することによって例示される。しかしながら、本発明の実施はこれらの配列に限られず、本明細書で定義するGRFポリペプチドをコードする任意の核酸配列を使用して、本発明の方法を有利に実施することができる。
【０１１１】
GRFポリペプチドをコードする核酸配列の例を、本明細書の実施例1の表A.1に示す。このような核酸配列は、本発明の方法を実施する際に有用である。実施例1の表A.1に示すポリペプチド配列は、配列番号2により示されるGRFポリペプチドのオルソログおよびパラログの例示的な配列であり、用語「オルソログ」および「パラログ」は本明細書で定義するとおりである。さらなるオルソログおよびパラログは、いわゆる相互blast検索を実施することによって容易に同定することができる。典型的には、これは、公表されているNCBIデータベースなどの任意の配列データベースに対する、(例えば、実施例1の表A.1に挙げた配列のいずれかを使用する)クエリ配列のBLAST検索を含む第1のBLASTを含む。ヌクレオチド配列から始めるときは(標準デフォルト値を使用する)BLASTNまたはTBLASTXが一般に使用され、タンパク質配列から始めるときは(標準デフォルト値を使用する)BLASTPまたはTBLASTNが使用される。BLASTの結果を任意によりフィルタリングすることができる。フィルタリング結果または非フィルタリング結果のいずれかの完全長配列を、次いでクエリ配列が由来する生物からの配列に対して再度BLAST検索する(第2のBLAST)(この場合クエリ配列は配列番号1または配列番号2であり、したがって第2のBLASTはシロイヌナズナの配列に対するものであり得る)。第1のBLASTと第2のBLASTの結果を次いで比較する。第1のblastからの高位ヒット値がクエリ配列を誘導したのと同種に由来する場合はパラログを同定し、したがってBLASTは最高ヒット値間でクエリ配列を再度理想的にもたらし、第1のBLASTにおける高位ヒット値がクエリ配列を誘導したのと同種に由来せず、および好ましくは再度のBLASTによって最高ヒット値間に存在するクエリ配列をもたらす場合は、オルソログを同定する。
【０１１２】
高位ヒット値は低いE値を有するものである。E値が低くなるほど、記録はより有意になる(または言い換えると、偶然にヒット値を発見する確率が低くなる)。E値の計算は当技術分野でよく知られている。E値以外に、同一性の割合による比較も記録する。同一性の割合は、特定の長さ中の2つの比較する核酸(またはポリペプチド)配列間の同一ヌクレオチド(またはアミノ酸)の数を指す。大きなファミリーの場合、ClustalW、次に隣接接合系統樹を使用して、関連遺伝子のクラスタリングの視覚化を手助けすること、およびオルソログとパラログを同定することができる。
【０１１３】
核酸変異体も本発明の方法を実施する際に有用であり得る。このような変異体の例には、実施例1の表A.1に示すポリペプチド配列のいずれか1つのホモログおよび誘導体をコードする核酸配列があり、用語「ホモログ」および「誘導体」は本明細書で定義するとおりである。実施例1の表A.1に示すポリペプチド配列のいずれか1つのオルソログまたはパラログのホモログおよび誘導体をコードする核酸配列も、本発明の方法で有用である。本発明の方法で有用であるホモログおよび誘導体は、それらが由来する非修飾タンパク質と実質的に同じ生物および機能活性を有する。
【０１１４】
本発明の方法を実施する際に有用であるさらなる核酸変異体には、GRFポリペプチドをコードする核酸配列の一部分、GRFポリペプチドをコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸配列、GRFポリペプチドをコードする核酸配列のスプライス変異体、GRFポリペプチドをコードする核酸配列の対立遺伝子変異体、および遺伝子シャッフリングによって得られるGRFポリペプチドをコードする核酸配列の変異体がある。用語ハイブリダイズ配列、スプライス変異体、対立遺伝子変異体、および遺伝子シャッフリングは本明細書で記載するとおりである。
【０１１５】
本発明の方法の実施は完全長核酸配列の使用に頼るものではないので、GRFポリペプチドをコードする核酸配列は完全長核酸配列である必要はない。本発明によれば、植物における収穫高関連形質を増強する方法であって、実施例1の表A.1に示す核酸配列のいずれか1つの一部分、実施例1の表A.1に示すポリペプチド配列のいずれかのオルソログ、パラログまたはホモログをコードする核酸配列の一部分を植物に導入し、かつ発現させるステップを含む方法を提供する。
【０１１６】
核酸配列の一部分は、例えば核酸配列に1以上の欠失を施すことによって調製することができる。核酸配列の一部分は単離された形態で使用することができ、あるいはそれらを他のコード(または非コード)配列と融合させて、例えばいくつかの活性を組み合わせたタンパク質を生成することが可能である。他のコード配列と融合したとき、翻訳によって生じる生成ポリペプチドはタンパク質部分に関して予想されるものより大きい可能性がある。
【０１１７】
本発明の方法で有用である一部分は本明細書で定義するGRFポリペプチドをコードし、実施例1の表A.1に示すポリペプチド配列と実質的に同じ生物活性を有する。好ましくは、一部分は実施例1の表A.1に示す核酸配列のいずれか1つの一部分であり、あるいは実施例1の表A.1に示すポリペプチド配列のいずれか1つのオルソログまたはパラログをコードする核酸配列の一部分である。好ましくは、一部分は、好ましくなっていく順に、少なくとも400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1190の連続ヌクレオチド長であり、連続ヌクレオチドは実施例1の表A.1中に示す核酸配列のいずれか1つ、または実施例1の表A.1に示すポリペプチド配列のいずれか1つのオルソログまたはパラログをコードする核酸配列である。好ましくは、一部分は、(i)(配列番号2に含まれる)配列番号115により示されるQLQドメインに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するドメイン;および(ii)(配列番号2に含まれる)配列番号116により示されるWRCドメインに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するドメインを含むポリペプチド配列ポリペプチドをコードする核酸配列の一部分である。一部分は、配列番号1の核酸配列の一部分であることが最も好ましい。
【０１１８】
本発明の方法で有用である別の核酸配列変異体は、低ストリンジェンシー条件下、好ましくはストリンジェント条件下で、本明細書で定義するGRFポリペプチドをコードする核酸配列と、または本明細書で定義する一部分とハイブリダイズすることができる核酸配列である。
【０１１９】
本発明によれば、植物における収穫高関連形質を増強する方法であって、実施例1の表A.1に示す核酸配列のいずれか1つとハイブリダイズすることができる核酸配列を植物に導入し、かつ発現させるステップ、または実施例1の表A.1に示すポリペプチド配列のいずれかのオルソログ、パラログまたはホモログをコードする核酸配列とハイブリダイズすることができる核酸配列を植物に導入し、かつ発現させるステップを含む方法を提供する。
【０１２０】
本発明の方法で有用であるハイブリダイズ配列は、本明細書で定義するGRFポリペプチドをコードし、実施例1の表A.1に示すポリペプチド配列と実質的に同じ生物活性を有する。好ましくは、ハイブリダイズ配列は、実施例1の表A.1に示す核酸配列のいずれか1つ、またはこれらの配列のいずれかの一部分、または上記で定義した一部分とハイブリダイズすることができ、またはハイブリダイズ配列は、実施例1の表A.1に示すポリペプチド配列のいずれか1つのオルソログまたはパラログをコードする核酸配列とハイブリダイズすることができる。好ましくは、ハイブリダイズ配列は、(i)(配列番号2に含まれる)配列番号115により示されるQLQドメインに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するドメイン;および(ii)(配列番号2に含まれる)配列番号116により示されるWRCドメインに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するドメインを含むポリペプチド配列ポリペプチドをコードする核酸配列とハイブリダイズすることができる。ハイブリダイズ配列は、配列番号1により示される核酸配列またはその一部分とハイブリダイズすることができることが最も好ましい。
【０１２１】
本発明の方法で有用である別の核酸変異体は、本明細書で上記で定義したGRFポリペプチドをコードするスプライス変異体であり、スプライス変異体は本明細書で定義するとおりである。
【０１２２】
本発明によれば、植物における収穫高関連形質を増強する方法であって、実施例1の表A.1に示す核酸配列のいずれか1つのスプライス変異体、または実施例1の表A.1に示すポリペプチド配列のいずれかのオルソログ、パラログまたはホモログをコードする核酸配列のスプライス変異体を植物に導入し、かつ発現させるステップを含む方法を提供する。
【０１２３】
好ましいスプライス変異体は、配列番号1により示される核酸配列のスプライス変異体、または配列番号2のオルソログまたはパラログをコードする核酸配列のスプライス変異体である。好ましくは、スプライス変異体は、(i)(配列番号2に含まれる)配列番号115により示されるQLQドメインに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するドメイン;および(ii)(配列番号2に含まれる)配列番号116により示されるWRCドメインに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するドメインを含むポリペプチド配列ポリペプチドをコードする核酸配列のスプライス変異体である。
【０１２４】
本発明の方法を実施する際に有用である別の核酸変異体は、本明細書で上記で定義したGRFポリペプチドをコードする核酸配列の対立遺伝子変異体であり、対立遺伝子変異体は本明細書で定義するとおりである。
【０１２５】
本発明によれば、植物における収穫高関連形質を増強する方法であって、実施例1の表A.1に示す核酸配列のいずれか1つの対立遺伝子変異体を植物に導入し、かつ発現させるステップ、または実施例1の表A.1に示すポリペプチド配列のいずれかのオルソログ、パラログまたはホモログをコードする核酸配列の対立遺伝子変異体を植物に導入し、かつ発現させるステップを含む方法を提供する。
【０１２６】
本発明の方法で有用である対立遺伝子変異体は、配列番号2のGRFポリペプチド、および実施例1の表A.1に示すポリペプチド配列のいずれかと実質的に同じ生物活性を有する。対立遺伝子変異体は天然に存在し、これらの天然対立遺伝子の使用は本発明の方法中に含まれる。対立遺伝子変異体は、配列番号1の対立遺伝子変異体、または配列番号2のオルソログまたはパラログをコードする核酸配列の対立遺伝子変異体であることが好ましい。好ましくは、対立遺伝子変異体は、(i)(配列番号2に含まれる)配列番号115により示されるQLQドメインに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するドメイン;および(ii)(配列番号2に含まれる)配列番号116により示されるWRCドメインに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するドメインを含むポリペプチド配列の対立遺伝子変異体である。
【０１２７】
遺伝子シャッフリングまたは定方向進化を使用して、上記で定義したGRFポリペプチドをコードする核酸配列の変異体を作製することもでき、用語「遺伝子シャッフリング」は本明細書で定義するとおりである。
【０１２８】
本発明によれば、植物における収穫高関連形質を増強する方法であって、実施例1の表A.1に示す核酸配列のいずれか1つの変異体を植物に導入し、かつ発現させるステップ、または実施例1の表A.1に示すポリペプチド配列のいずれかのオルソログ、パラログまたはホモログをコードする核酸配列の変異体を植物に導入し、かつ発現させるステップを含む方法を提供し、この変異体核酸配列は遺伝子シャッフリングによって得られる。
【０１２９】
好ましくは、遺伝子シャッフリングによって得られる変異体核酸配列は、(i)(配列番号2に含まれる)配列番号115により示されるQLQドメインに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するドメイン;および(ii)(配列番号2に含まれる)配列番号116により示されるWRCドメインに対して少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するドメインを含むポリペプチド配列をコードする。
【０１３０】
さらに、核酸配列変異体は部位特異的突然変異誘発法によって得ることもできる。いくつかの方法を利用して部位特異的突然変異誘発法を実施し、最も一般的なのはPCRベースの方法である(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley Eds.)。
【０１３１】
GRFポリペプチドをコードする核酸配列は、任意の天然または人工の供給源由来であってよい。核酸配列は、意図的なヒトの操作によって組成および/またはゲノム環境を、その天然型から改変することができる。好ましくは、GRFポリペプチドをコードする核酸配列は植物由来であり、さらに好ましくは双子葉植物由来、より好ましくはアブラナ科(family Brassicaceae)由来であり、核酸配列はシロイヌナズナ由来であることが最も好ましい。
【０１３２】
滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドに関する詳細な説明
SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現を増加するのに好ましい方法は、SYTポリペプチドをコードする核酸配列を植物に導入し、かつ発現させるステップによる方法である。
【０１３３】
本明細書における以後の「本発明の方法中で有用であるSYTタンパク質」に対する任意の言及は、本明細書で定義するSYTポリペプチドを意味すると考える。本明細書における以後の「本発明の方法中で有用であるSYT核酸配列」に対する任意の言及は、このようなSYTポリペプチドをコードすることができる核酸配列を意味すると考える。植物中に導入する(したがって本発明の方法を実施する際に有用である)核酸配列は、ここに記載し本明細書で以後「SYT核酸配列」または「SYT遺伝子」とも呼ぶ型のポリペプチドをコードする任意の核酸配列である。
【０１３４】
本明細書で定義する用語「SYTポリペプチド」は、N末端からC末端に向かって:(i)配列番号262のSNHドメインに対して、好ましくなっていく順に、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するSNHドメイン;および(ii)Metリッチドメイン;および(iii)QGリッチドメインを含むポリペプチドを指す。SNHドメインは、配列番号263によって表され図5中に黒色で示される最も保存された残基を含むことが好ましい。
【０１３５】
その代わりにまたはそれに加えて、本明細書で定義する「SYTポリペプチド」は、配列番号264のInterPro登録番号IPR007726(PFAM登録番号PF05030、SSXTタンパク質(N末端領域))を有するSSXTドメインに対して、好ましくなっていく順に、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するドメインを含む任意のポリペプチドを指す。
【０１３６】
その代わりにまたはそれに加えて、本明細書で定義する「SYTポリペプチド」は、配列番号121により示されるSYTポリペプチドに対して、または本明細書中の表A.2に示される全長ポリペプチド配列のいずれかに対して、好ましくなっていく順に、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有する任意のポリペプチドを指す。
【０１３７】
その代わりにまたはそれに加えて、「SYTポリペプチド」は、酵母ツーハイブリッド相互作用アッセイにおいて成長調節因子(GRF)ポリペプチドと、例えば本明細書の表A.1中に示すGRFポリペプチド配列と相互作用する。
【０１３８】
配列番号121のSYTポリペプチド配列の分析は、本明細書の実施例2および4において以下で示す。例えば、配列番号121により示されるSYTポリペプチドは、InterProドメインデータベース中のInterPro登録番号IPR007726(PFAM登録番号PF05030)を有するSSXTドメインを含む。配列アラインメントなどにより通常の技法を使用して、ドメインを同定することもできる。本明細書中の表A.2のポリペプチドのSNHドメインのアラインメントは図5に示す。このようなアラインメントは、配列番号263で示される大部分の保存残基などの、SYTポリペプチド間の大部分の保存アミノ酸を同定するのに有用である。
【０１３９】
本明細書において前に簡潔に記載したように、比較用の配列のアラインメントの方法は当技術分野でよく知られている。配列同一性の値は、デフォルトパラメータを使用する前述のプログラムを使用して、核酸配列もしくはポリペプチド配列全体で、または選択したドメインもしくは(1以上の)保存モチーフで決定することができる。SNHドメインおよびSSXTドメインの外側では、SYTポリペプチドは低いアミノ酸配列の同一性を有すると言われている。本明細書の実施例3は、配列番号121により示されるSYTポリペプチドと表A.2に挙げるSYTポリペプチドの間の配列同一性の割合を表B.2に記載し、それはわずか25％のアミノ酸配列の同一性であってよい。(配列番号121に含まれる)配列番号262により示されるSNHドメインと、(図5に示す)表A.2のSYTポリペプチドのSNHドメインの間で同一性の計算を実施する場合、アミノ酸の同一性の割合は実質的に増大し得る。同様に、(配列番号121に含まれる)配列番号264により示されるSSXTドメインと、本発明を実施する際に有用であるSYTポリペプチドのSSXTドメインの間で同一性の計算を実施する場合、アミノ酸の同一性の割合は実質的に増大し得る。SSXTドメイン中に含まれるSNHドメインは、SSXTドメインよりよく異なるSYTポリペプチド間で保存されている。
【０１４０】
さらに、本発明の方法で有用であるSYTポリペプチドは(少なくともその天然型で)典型的には、必ずではないが、転写制御活性および他のタンパク質と相互作用する能力を有する。したがって、低下した転写制御活性を有する、転写制御活性を有さない、低下したタンパク質-タンパク質相互作用能力を有する、またはタンパク質-タンパク質相互作用能力を有さないSYTポリペプチドは、本発明の方法で同様に有用である可能性がある。DNA結合活性およびタンパク質-タンパク質相互作用は、(例えばCurrent Protocols in Molecular Biology,Volumes 1 and 2,Ausubel et al.(1994),Current Protocols中の)当技術分野でよく知られている技法を使用してin vitroまたはin vivoで容易に決定することができる。SYTポリペプチドは、酵母ツーハイブリッドタンパク質-タンパク質相互作用アッセイ(Kim & Kende、上掲)を使用して、酵母細胞中in vivoでGRFポリペプチドと相互作用することができる。in vitro結合アッセイも使用して、GRFポリペプチドとSYTポリペプチドは相互作用パートナーであることを示す(Kim & Kende、上掲)。
【０１４１】
本発明は、配列番号121のSYTポリペプチド配列をコードする配列番号120により示される核酸配列で、植物を形質転換することによって例示される。しかしながら、本発明の実施はこれらの配列に限られず、本明細書で定義するSYTポリペプチドをコードする任意の核酸配列を使用して、本発明の方法を有利に実施することができる。
【０１４２】
SYTポリペプチドをコードする核酸配列の例は、本明細書の実施例1の表A.2に示す。このような核酸配列は、本発明の方法を実施する際に有用である。実施例1の表A.2中に示すポリペプチド配列は、配列番号121により示されるSYTポリペプチドのオルソログおよびパラログの例示的な配列であり、用語「オルソログ」および「パラログ」は本明細書で定義するとおりである。さらなるオルソログおよびパラログは、(本明細書で上述したように)相互blast検索を実施することによって容易に同定することができる。
【０１４３】
核酸変異体も本発明の方法を実施する際に有用であり得る。このような変異体の例には、実施例1の表A.2に示すポリペプチド配列のいずれか1つのホモログおよび誘導体をコードする核酸配列があり、用語「ホモログ」および「誘導体」は本明細書で定義するとおりである。実施例1の表A.2に示すポリペプチド配列のいずれか1つのオルソログまたはパラログのホモログおよび誘導体をコードする核酸配列も、本発明の方法中で有用である。本発明の方法中で有用であるホモログおよび誘導体は、それらが由来する非修飾タンパク質と実質的に同じ生物および機能活性を有する。
【０１４４】
本発明の方法を実施する際に有用であるさらなる核酸変異体には、SYTポリペプチドをコードする核酸配列の一部分、SYTポリペプチドをコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸配列、SYTポリペプチドをコードする核酸配列のスプライス変異体、SYTポリペプチドをコードする核酸配列の対立遺伝子変異体、および遺伝子シャッフリングによって得られるSYTポリペプチドをコードする核酸配列の変異体がある。用語ハイブリダイズ配列、スプライス変異体、対立遺伝子変異体、および遺伝子シャッフリングは本明細書で記載するとおりである。
【０１４５】
本発明の方法の実施は完全長核酸配列の使用に頼るものではないので、SYTポリペプチドをコードする核酸配列は完全長核酸配列である必要はない。本発明によれば、植物における収穫高関連形質を増強する方法であって、実施例1の表A.2に示す核酸配列のいずれか1つの一部分、または実施例1の表A.2に示すポリペプチド配列のいずれかのオルソログ、パラログまたはホモログをコードする核酸配列の一部分を植物に導入し、かつ発現させるステップを含む方法を提供する。
【０１４６】
核酸配列の一部分は、例えば核酸配列に1以上の欠失を施すことによって調製することができる。核酸配列の一部分は単離された形態で使用することができ、あるいはそれらを他のコード(または非コード)配列と融合させて、例えばいくつかの活性を組み合わせたタンパク質を生成することが可能である。他のコード配列と融合したとき、翻訳によって生じる生成ポリペプチドはタンパク質部分に関して予想されるものより大きい可能性がある。
【０１４７】
本発明の方法で有用である一部分は本明細書で定義するSYTポリペプチドをコードし、実施例1の表A.2に示すポリペプチド配列と実質的に同じ生物活性を有する。好ましくは、一部分は実施例1の表A.2に示す核酸配列のいずれか1つの一部分であり、あるいは実施例1の表A.2に示すポリペプチド配列のいずれか1つのオルソログまたはパラログをコードする核酸配列の一部分である。好ましくは、一部分は、好ましくなっていく順に、少なくとも100、125、150、175、200または225の連続ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも250、275、300、325、350、375、400、425、450または475の連続ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも500、525、550、575、600、625、650、675、700または725の連続ヌクレオチド長であり、または完全長SYT核酸配列に関する限り、連続ヌクレオチドは、実施例1の表A.2中に示す核酸配列のいずれか1つ、または実施例1の表A.2に示すポリペプチド配列のいずれか1つのオルソログもしくはパラログをコードする核酸配列のヌクレオチドである。好ましくは、一部分は、N末端からC末端に向かって:(i)配列番号262のSNHドメインに対して、好ましくなっていく順に、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するSNHドメイン;および(ii)Metリッチドメイン、および(iii)QGリッチドメインを含むポリペプチド配列ポリペプチドをコードする核酸配列の一部分である。SNHドメインは、配列番号263によって表され図5中に黒色で示される最も保存された残基を含むことが好ましい。一部分は、配列番号120の核酸配列の一部分であることが最も好ましい。
【０１４８】
本発明の方法中で有用である別の核酸配列変異体は、低ストリンジェンシー条件下、好ましくはストリンジェント条件下で、本明細書で定義するSYTポリペプチドをコードする核酸配列と、または本明細書で定義する一部分とハイブリダイズすることができる核酸配列である。
【０１４９】
本発明によれば、植物における収穫高関連形質を増強する方法であって、実施例1の表A.2に示す核酸配列のいずれか1つとハイブリダイズすることができる核酸配列を植物に導入し、かつ発現させるステップ、または実施例1の表A.2に示す核酸配列のいずれかのオルソログ、パラログまたはホモログをコードする核酸配列とハイブリダイズすることができる核酸配列を植物に導入し、かつ発現させるステップを含む方法を提供する。
【０１５０】
本発明の方法で有用であるハイブリダイズ配列は、本明細書で定義するSYTポリペプチドをコードし、実施例1の表A.2に示すポリペプチド配列と実質的に同じ生物活性を有する。好ましくは、ハイブリダイズ配列は、実施例1の表A.2に示す核酸配列のいずれか1つ、またはこれらの配列のいずれかの一部分、または上記で定義した一部分とハイブリダイズすることができ、またはハイブリダイズ配列は、実施例1の表A.2に示すポリペプチド配列のいずれか1つのオルソログまたはパラログをコードする核酸配列とハイブリダイズすることができる。好ましくは、ハイブリダイズ配列は、N末端からC末端に向かって:(i)配列番号262のSNHドメインに対して、好ましくなっていく順に、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するSNHドメイン;および(ii)Metリッチドメイン、および(iii)QGリッチドメインを含むポリペプチド配列をコードする核酸配列とハイブリダイズすることができる。SNHドメインは、配列番号263によって表され図5に黒色で示される最も保存された残基を含むことが好ましい。ハイブリダイズ配列は、配列番号120によって表される核酸配列またはその一部分とハイブリダイズすることができることが最も好ましい。
【０１５１】
本発明の方法で有用である別の核酸配列変異体は、本明細書で上記で定義したSYTポリペプチドをコードするスプライス変異体であり、スプライス変異体は本明細書で定義するとおりである。
【０１５２】
本発明によれば、収穫高関連形質を増強する方法であって、実施例1の表A.2に示す核酸配列のいずれか1つのスプライス変異体、または実施例1の表A.2に示すポリペプチド配列のいずれかのオルソログ、パラログまたはホモログをコードする核酸配列のスプライス変異体を植物に導入し、かつ発現させるステップを含む方法を提供する。
【０１５３】
好ましいスプライス変異体は、配列番号120により示される核酸配列のスプライス変異体、または配列番号121のオルソログまたはパラログをコードする核酸配列のスプライス変異体である。好ましくは、スプライス変異体は、N末端からC末端に向かって:(i)配列番号262のSNHドメインに対して、好ましくなっていく順に、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するSNHドメイン;および(ii)Metリッチドメイン、および(iii)QGリッチドメインを含むポリペプチド配列ポリペプチドをコードする核酸配列のスプライス変異体である。SNHドメインは、配列番号263によって表され図5に黒色で示される最も保存された残基を含むことが好ましい。
【０１５４】
本発明の方法を実施する際に有用である別の核酸配列変異体は、本明細書で上記で定義したSYTポリペプチドをコードする核酸配列の対立遺伝子変異体であり、対立遺伝子変異体は本明細書で定義するとおりである。
【０１５５】
本発明によれば、収穫高関連形質を増強する方法であって、実施例1の表A.2に示す核酸配列のいずれか1つの対立遺伝子変異体を植物に導入し、かつ発現させるステップ、または実施例1の表A.2に示すポリペプチド配列のいずれかのオルソログ、パラログまたはホモログをコードする核酸配列の対立遺伝子変異体を植物に導入し、かつ発現させるステップを含む方法を提供する。
【０１５６】
本発明の方法で有用である対立遺伝子変異体は、配列番号121のGRFポリペプチド、および実施例1の表A.2に示すポリペプチド配列のいずれかと実質的に同じ生物活性を有する。対立遺伝子変異体は天然に存在し、これらの天然対立遺伝子の使用は本発明の方法に含まれる。対立遺伝子変異体は、配列番号120の対立遺伝子変異体、または配列番号121のオルソログまたはパラログをコードする核酸配列の対立遺伝子変異体であることが好ましい。好ましくは、対立遺伝子変異体は、N末端からC末端に向かって:(i)配列番号262のSNHドメインに対して、好ましくなっていく順に、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するSNHドメイン;および(ii)Metリッチドメイン、および(iii)QGリッチドメインを含むポリペプチド配列の対立遺伝子変異体である。SNHドメインは、配列番号263によって表され図5に黒色で示される最も保存された残基を含むことが好ましい。
【０１５７】
遺伝子シャッフリングまたは定方向進化を使用して、上記で定義したSYTポリペプチドをコードする核酸配列の変異体を作製することもでき、用語「遺伝子シャッフリング」は本明細書で定義するとおりである。
【０１５８】
本発明によれば、収穫高関連形質を増強する方法であって、実施例1の表A.2に示す核酸配列のいずれか1つの変異体を植物に導入し、かつ発現させるステップ、または実施例1の表A.2に示すポリペプチド配列のいずれかのオルソログ、パラログまたはホモログをコードする核酸配列の変異体を植物に導入し、かつ発現させるステップを含む方法を提供し、この変異体核酸配列は遺伝子シャッフリングによって得られる。
【０１５９】
好ましくは、遺伝子シャッフリングによって得られる変異体核酸配列は、N末端からC末端に向かって:(i)配列番号262のSNHドメインに対して、好ましくなっていく順に、少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を有するSNHドメイン;および(ii)Metリッチドメイン、および(iii)QGリッチドメインを含むポリペプチド配列をコードする。SNHドメインは、配列番号263によって表され図5に黒色で示される最も保存された残基を含むことが好ましい。
【０１６０】
さらに、核酸配列変異体は部位特異的突然変異誘発法によって得ることもできる。いくつかの方法を利用して部位特異的突然変異誘発法を実施するが、最も一般的なのはPCRベースの方法である(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley Eds.)。
【０１６１】
SYTポリペプチドをコードする核酸配列は、任意の天然または人工の供給源由来であってよい。核酸配列は、意図的なヒトの操作によって組成および/またはゲノム環境を、その天然型から改変することができる。好ましくは、SYTポリペプチドをコードする核酸配列は植物由来であり、さらに好ましくは双子葉植物由来、より好ましくはアブラナ科由来であり、核酸配列はシロイヌナズナ由来であることが最も好ましい。
【０１６２】
本発明の方法の実施、すなわち植物での以下の核酸配列:(i)成長調節因子(GRF)ポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を増加させることによって、以下の核酸配列のうちの1つ:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物と比較して増強した収穫高関連形質を有する植物をもたらす。用語「収穫高」および「種子収穫高」は本明細書の「定義」のセクション中に、より詳細に記載されている。
【０１６３】
一例としてトウモロコシを挙げると、収穫高の増大は、特に以下:ヘクタールまたはエーカー当たりの定着した植物の数の増大、植物当たりの穂の数の増大、列の数、列当たりの粒の数、粒重、千粒重、穂の長さ/直径の増大、(総種子数で割り100を掛けた充填種子の数である)種子充填率の増大の1以上として現れる可能性がある。一例としてイネを挙げると、収穫高の増大は、特に以下:ヘクタールまたはエーカー当たりの植物の数、植物当たりの円錐花序の数、円錐花序当たりの小穂の数、円錐花序当たりの花(小花)の数(充填種子の数と一次円錐花序の数の比として表す)、(総種子数で割り100を掛けた充填種子の数である)種子充填率の増大、千粒重の増大の1以上の増大として現れる可能性がある。
【０１６４】
本発明の方法の実施、すなわち植物中の以下の核酸配列:(i)成長調節因子(GRF)ポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を増加させることによって、以下の核酸配列のうちの1つ:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物と比較して増強した収穫高関連形質を有する植物をもたらす。前記増強した収穫高関連形質は、以下の形質:(i)増大した初期活力、(ii)増加した地上バイオマス、(iii)増加した植物当たり総種子収穫高、(iv)増加した種子充填率、(v)増加した(充填)種子数;(vi)増加した収穫指数、または(vii)増加した千粒重(TKW)のうち1以上であることが好ましい。
【０１６５】
本発明によるトランスジェニック植物は増強した収穫高関連形質を有するので、これらの植物は、それらの生活環中の対応する段階での対照植物の生長率と比較して、(少なくともそれらの生活環の一部分中に)増大した生長率を示すと考えられる。
【０１６６】
「対照植物」は、「定義」のセクション中に示したように、対応する野生型植物、または対象とする遺伝子がない対応する植物、または以下の核酸配列のうちの1つ:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した対応する植物を含むことができる。本明細書で使用する「対照植物」は、植物全体だけでなく種子および種子部分を含めた植物部分も指す。
【０１６７】
増大した生長率は(種子を含めた)植物の1以上の部分に特異的である可能性があり、または植物全体に実質的である可能性がある。増大した生長率を有する植物は短い生活環を有する可能性がある。植物の生活環は、乾燥成熟種子から植物が出発物質と同様に乾燥成熟種子を生成する段階まで、生長するのに必要とされる時間を意味すると考えることができる。この生活環は、初期活力、生長率、緑色指数、開花時間および種子成熟の速度などの要因によって影響を受ける可能性がある。生長率の増大は、植物の生活環中の1以上の段階で、または植物全体の生活環中で実質的に起こる可能性がある。植物の生活環における初期段階中の増大した生長率は、増大した(初期)活力を反映する可能性がある。生長率の増大は植物の収穫サイクルを変える可能性があり、植物の種をより遅くまくことおよび/または他の場合可能であり得るより早く収穫することを可能にする(同様の効果をより早い開花時間で得ることができ、遅延した開花は通常穀物において望ましい形質ではない)。生長率が十分増大する場合、それは同じ植物種の種子のさらなる播種を可能にし得る(例えば、イネの播種および収穫、次にいずれも1つの従来の生長期内でのさらなるイネの播種および収穫)。同様に、生長率が十分増大する場合、異なる植物種の種子のさらなる播種を可能にし得る(例えば、トウモロコシ植物の播種および収穫、次に例えば、ダイズ、ジャガイモまたは任意の他の適切な植物の播種および任意選択の収穫)。いくつかの作物の場合、同じ根茎からの追加的時間の収穫も可能であり得る。植物の収穫サイクルの変更は、(任意の特定の植物を生長させ収穫することが可能である時間数の増大(例えば一年中)によって)エーカー当たりの年間バイオマス生産の増大をもたらす可能性がある。生長率の増大は、それらの野生型相当物より広い地理的領域でのトランスジェニック植物の栽培も可能にし得る。穀物の生長に関する地域的制約は、プレーティングのとき(初期)または収穫のとき(後期)のいずれかで、不利な環境条件によって決定されることが多いからである。収穫サイクルを短縮する場合、このような不利な条件は回避することができる。生長率は、生長曲線から様々なパラメータを誘導することにより決定することができ、このようなパラメータは特にT-Mid(植物がそれらの最大の大きさの50％に達するのに要する時間)およびT-90(植物がそれらの最大の大きさの90％に達するのに要する時間)であってよい。
【０１６８】
本発明の好ましい特徴によれば、本発明の方法の実施は、対照植物と比較して増大した生長率を有する植物をもたらす。したがって、本発明によれば、植物の生長率を増大させる方法であって、植物中の以下の核酸配列:(i)成長調節因子(GRF)ポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を増加させるステップを含み、植物が以下の核酸配列のうちの1つ:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物と比較して増大した生長率を有する方法を提供する。
【０１６９】
植物が非ストレス条件下に存在しようと、または植物を比較可能な条件下で生長した対照植物と比較して様々なストレスに曝そうと、増強した収穫高関連形質は生じる。植物は典型的には、よりゆっくりと生長することによりストレスへの露出に応答する。重度のストレスの条件では、植物は完全に生長を止める可能性さえある。一方適度なストレスは、生長を再開する能力がない植物の完全な生長停止をもたらさない、植物が曝される任意のストレスであるとして、本明細書では定義する。本発明の意味における適度なストレスは、非ストレス条件下で対照植物と比較して、40％、35％または30％未満、好ましくは25％、20％または15％、より好ましくは14％、13％、12％、11％または10％またはそれより低い、ストレスを受けた植物の生長の低下をもたらす。農作業(潅漑、肥沃化、農薬処理)の進歩によって、栽培した作物において重度のストレスに直面することは多くない。結果として、適度なストレスによって誘導される生長障害は、農業に望ましくない特徴であることが多い。適度なストレスは、植物が曝される毎日の生物学的および/または非生物学的(環境)ストレスである。非生物学的ストレスは、干ばつまたは過剰な水、嫌気ストレス、塩ストレス、化学毒性、酸化ストレスおよび高温、低温または凍結温度によるストレスであってよい。非生物学的ストレスは、(特に干ばつによる)水ストレスによって引き起こされる浸透圧ストレス、塩ストレス、酸化ストレスまたはイオン性ストレスであってよい。生物学的ストレスは、典型的には細菌、ウイルス、真菌、線虫、および昆虫などの病原体によって引き起こされるストレスである。本明細書で使用する用語「非ストレス」条件は、植物の最適な生長を可能にする環境条件である。当業者は、所与の場所に関する正常な土壌条件および気候条件を理解している。
【０１７０】
本発明の方法の実施は、比較可能なストレス条件下で生長する対照植物と比較して増強した収穫高関連形質を有する、非ストレス条件下または適度なストレス条件下で生長する植物をもたらす。したがって、本発明によれば、非ストレス条件下または適度なストレス条件下で生長する植物における収穫高関連形質を増大させる方法であって、植物中の以下の核酸配列:(i)成長調節因子(GRF)ポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を増加させるステップを含み、比較可能な条件下で生長する、以下の核酸配列のうちの1つ:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物と比較して、植物が増大した収穫高関連形質を有する方法を提供する。
【０１７１】
本発明による方法の実施は、比較可能なストレス条件下で生長する対照植物と比較して増強した収穫高関連形質を有する、非生物学的ストレス条件下で生長する植物をもたらす。Wang et al.(Planta (2003)218:1-14)中に報告されたように、非生物学的ストレスは、植物の生長および生産性に悪影響を与える、一連の形態的、生理的、生化学的および分子的変化をもたらす。干ばつ、塩濃度、極端な温度および酸化ストレスは相互に関係があることは知られており、類似したメカニズムによって生長および細胞損傷を誘導する可能性がある。Rabbani et al.(Plant Physiol(2003)133:1755-1767)は、干ばつストレスと高塩濃度ストレスの間の特に高度な「クロストーク」を記載する。例えば、干ばつおよび/または塩濃度は浸透圧ストレスとして主に現れ、細胞中の恒常性およびイオン分布の混乱をもたらす。高温または低温、塩濃度または干ばつストレスを頻繁に伴う酸化ストレスは、機能タンパク質および構造タンパク質の変性を引き起こす可能性がある。結果として、これらの多様な環境ストレスは、類似した細胞シグナル伝達経路および細胞応答、例えば、ストレスタンパク質の生成、抗酸化物質のアップレギュレーション、適合溶質の蓄積および生長停止などを活性化することが多い。多様な環境ストレスは類似した経路を活性化するので、比較可能なストレス条件下で生長する対照植物と比較して増強した収穫高関連形質における、一般に非生物学的ストレスにおける、干ばつストレスによる本発明の例示は、干ばつストレスに対する制約として見るべきではなく、上記で定義したGRFポリペプチドの関与を示すためのスクリーンとしてさらに見るべきである。
【０１７２】
本明細書で定義する用語「非生物学的ストレス」は、(干ばつまたは過剰な水による)水ストレス、嫌気ストレス、塩ストレス、温度ストレス(高温、低温または凍結温度による)、化学毒性ストレスおよび酸化ストレスのいずれか1以上を意味すると考えられる。本発明の一態様によれば、非生物学的ストレスは、水ストレス、塩ストレスから選択される浸透圧ストレス、酸化ストレスおよびイオン性ストレスである。水ストレスは干ばつストレスであることが好ましい。塩ストレスとの用語は一般的な塩(NaCl)に限られないが、特に1以上のNaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2によって引き起こされる任意のストレスであってよい。
【０１７３】
本発明の方法の実施は、比較可能なストレス条件下で生長する対照植物と比較して、非生物学的ストレス条件下で、増強した収穫高関連形質を有する植物をもたらす。したがって、本発明によれば、非生物学的ストレス条件下で生長する植物における収穫高関連形質を増大させる方法であって、植物中の以下の核酸配列:(i)成長調節因子(GRF)ポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を増加させるステップを含み、比較可能な条件下で生長する、以下の核酸配列のうちの1つ:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物と比較して、植物が増大した収穫高関連形質を有する方法を提供する。
【０１７４】
非生物学的環境ストレスの別の例は、増殖および発生のため植物によって同化される必要がある1以上の栄養素の低下した利用性である。植物の収穫高および品質に対する栄養利用効率の強い影響のために、膨大な量の肥料を畑にまいて植物の生長および質を最適化する。植物の生産性は通常、3つの主な栄養素、リン、カリウム、および窒素によって制限され、窒素は、通常この3つの植物生長における律速元素である。したがって、植物生長に必要とされる主な栄養素は窒素(N)である。窒素は、アミノ酸、タンパク質(酵素)、核酸、および葉緑素を含む、生きた細胞中で見られる多数の重要な化合物の構成成分である。植物の乾燥物質の1.5％〜2％、および植物の全タンパク質の約16％は窒素である。したがって、窒素利用性は、作物の生長および生産の主な律速要因であり(Frink et al.(1999)Proc Natl Acad Sci USA96(4):1175-1180)、タンパク質の蓄積およびアミノ酸組成に対しても大きな影響がある。したがって、非常に興味深いのは、窒素律速条件下で生長したとき、増強した収穫高関連形質を有する作物である。
【０１７５】
本発明の方法の実施は、比較可能なストレス条件下で生長する対照植物と比較して増強した収穫高関連形質を有する、低下した栄養素の利用性の条件下、特に低下した窒素利用性の条件下で生長する植物をもたらす。したがって、本発明によれば、低下した栄養素の利用性、好ましくは低下した窒素利用性の条件下で生長する植物における収穫高関連形質を増強する方法であって、植物中の以下の核酸配列:(i)成長調節因子(GRF)ポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を増加させるステップを含み、比較可能なストレス条件下で生長する、以下の核酸配列のうちの1つ:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物と比較して、植物が増強した収穫高関連形質を有する方法を提供する。低下した栄養素の利用性は、特に窒素、リン酸および他のリン含有化合物、カリウム、カルシウム、カドミウム、マグネシウム、マンガン、鉄およびホウ素などの栄養素の欠乏または過剰に起因する可能性がある。低下した栄養素の利用性は、低下した窒素利用性であることが好ましい。
【０１７６】
本発明は、本発明による方法によって得ることができる、植物または(種子を含めた)その一部分またはその細胞を含む。植物またはその一部分またはその細胞は、(i)成長調節因子(GRF)ポリペプチドをコードする単離核酸導入遺伝子;および(ii)滑膜肉腫転座(SYT)ポリペプチドをコードする単離核酸導入遺伝子を含む。
【０１７７】
前述のように、(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現を増加するのに好ましい方法は、(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列を植物に導入し、かつ発現させるステップによる方法である。したがって、本発明によれば、植物における収穫高関連形質を増強する方法であって、以下の核酸配列:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列を植物に導入し、かつ発現させるステップを含み、以下の核酸配列のうちの1つ:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列;または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物と比較して、植物が増強した収穫高関連形質を有する方法を提供する。
【０１７８】
(遺伝子スタッキングとも呼ばれる)トランスジェニック植物に2つ以上の導入遺伝子を導入し発現させる方法は、当技術分野でよく知られている(例えば、Halpin(2005)Plant Biotech J(3):141-155による総説を参照されたい。遺伝子スタッキングは反復ステップによって進めることができ、この場合2つ以上の導入遺伝子を、1つの導入遺伝子を含有する植物と他の導入遺伝子を有する個体を交配することによって、あるいは代替的に新たな遺伝子で1つの導入遺伝子を含有する植物を再形質転換(またはスーパー形質転換)することによって、植物中に連続的に導入することができる。
【０１７９】
本発明によれば、植物における収穫高関連形質を増強する方法であって、以下の核酸配列:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列を植物に連続的に導入し、かつ発現させるステップを含み、以下の核酸配列のうちの1つ:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列;または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物と比較して、植物が増強した収穫高関連形質を有する方法を提供する。
【０１８０】
(i)および(ii)の核酸配列は、交配により連続的に導入し、かつ発現させるのが好ましい。GRFポリペプチドをコードする導入および発現される単離核酸配列を含む雌の親植物と、SYTポリペプチドをコードする導入および発現される単離核酸配列を含む雄の親植物の間で、または交互に、両方の導入遺伝子の存在および発現を子孫において選択することによって、交配を実施する。したがって、本発明によれば、GRFポリペプチドをコードする導入および発現される単離核酸配列を含む雌の親植物と、SYTポリペプチドをコードする導入および発現される単離核酸配列を含む雄の親植物の間の交配によって、または交互に、両方の導入遺伝子の存在および発現を子孫において選択することによって、植物における収穫高関連形質を増強する方法であって、前記植物が、親植物または本明細書で定義する任意の他の対照植物と比較して、増強した収穫高関連形質を有する方法を提供する。
【０１８１】
あるいは、(i)および(ii)の核酸配列は、再形質転換により連続的に導入し発現させる。SYTポリペプチドをコードする導入および発現される核酸配列を含む植物、植物部分、または植物細胞にGRFポリペプチドをコードする核酸配列を導入し、かつ発現させるステップによって、または交互に、両方の導入遺伝子の存在および発現を子孫において選択することによって、再形質転換を実施する。したがって、本発明によれば、SYTポリペプチドをコードする導入および発現される核酸配列を含む植物、植物部分、または植物細胞へのGRFポリペプチドをコードする核酸配列の導入および発現により実施する再形質転換によって、または交互に、両方の導入遺伝子の存在および発現について子孫において選択することによって、植物における収穫高関連形質を増強する方法であって、前記植物が、以下の核酸配列のうちの1つ:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列;または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物、または本明細書で定義する任意の他の対照植物と比較して、増強した収穫高関連形質を有する方法を提供する。
【０１８２】
あるいは、遺伝子スタッキングは、本明細書の「定義」のセクション中により詳細に記載されるように、より迅速である同時形質転換、または共形質転換によって行うことができ、全範囲の形質転換技法において使用することができる。
【０１８３】
例えばアグロバクテリウムによる形質転換を使用するとき、導入遺伝子(少なくとも2つ)は当技術分野でよく知られているいくつかのコンホメーションで存在する可能性があり、そのいくつかを以下に挙げる:
(i)翻訳されたときに1つのポリペプチドを形成するようにいくつかの核酸コード配列を融合し、1つのプロモーターの制御下に置く;
(ii)核酸コード配列が、mRNA合成(内部リボソーム侵入部位IRES、2Aスタタリングシグナルなど)、またはポリペプチド合成(プロテアーゼ基質部位によって隔てられたポリタンパク質など)に影響を与える核酸シグナルによって隔てられて、1つのプロモーターの下流に連続的に位置する;
(iii)核酸コード配列が別個のプロモーターによって独立に駆動され、プロモーターと核酸コード配列の組合せは1つのT-DNA内に位置する;
(iv)核酸コード配列が別個のプロモーターによって独立に駆動され、プロモーターと核酸コード配列の組合せは1つのプラスミドにおける異なるT-DNA内に位置する;
(v)核酸コード配列が別個のプロモーターによって独立に駆動され、プロモーターと核酸コード配列の組合せは、1つまたは別個のアグロバクテリウム菌株に宿主する異なるプラスミドにおける異なるT-DNA内に位置する。
【０１８４】
物理的または化学的送達系(例えば、微粒子銃、PEG、エレクトロポレーション、リポソーム、ガラス針など)を使用する、直接的遺伝子形質転換を考える場合、導入遺伝子(少なくとも2つ)はいくつかのコンホメーションで存在することができるが、原則的には、遺伝子形質転換の中間体であるアグロバクテリウムまたはウイルス中で複製することができるベクターに含まれる必要はない。2つの導入遺伝子は1以上の核酸分子中に含まれ得るが、遺伝子形質転換法に同時に使用することができる。
【０１８５】
本発明によれば、植物における収穫高関連形質を増強する方法であって、以下の核酸配列:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列を植物に同時に導入し、かつ発現させるステップを含み、以下の核酸配列のうちの1つ:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列;または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物と比較して、植物が増強した収穫高関連形質を有する方法を提供する。
【０１８６】
同時に導入され発現される(i)および(ii)の核酸配列は、1以上の核酸分子中に含まれる。したがって、本発明によれば、植物における収穫高関連形質を増強する方法であって、1以上の核酸分子中に含まれる、以下の核酸配列:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列を植物に同時に導入し、かつ発現させるステップを含み、以下の核酸配列のうちの1つ:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列;または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現が増加した植物と比較して、植物が増強した収穫高関連形質を有する方法を提供する。
【０１８７】
本発明は、植物中のGRFポリペプチドをコードする核酸配列の導入および/または発現の増大を容易にする遺伝子構築物およびベクターも提供する。遺伝子構築物は、植物への形質転換および形質転換細胞中での対象とする遺伝子の発現に適した、市販であってよいベクター中に挿入することができる。
【０１８８】
本発明は、本発明の方法での、本明細書で定義する遺伝子構築物の使用も提供する。
【０１８９】
より具体的には、本発明は、
(a)上記で定義したGRFポリペプチドをコードする核酸配列;
(b)上記で定義したSYTポリペプチドをコードする核酸配列;
(c)(a)および(b)の核酸配列の発現を増加することが可能な1以上の制御配列;および任意により
(d)転写終結配列
を含む、構築物を提供する。
【０１９０】
(a)および(b)の核酸配列は配列番号267または配列番号268により示される1つの核酸分子中に含まれる可能性があり、この核酸分子は配列番号269または配列番号270により示されるポリペプチド配列をコードする。
【０１９１】
用語「制御配列」および「終結配列」は本明細書で定義するとおりである。構築物の制御配列の1つは構成的プロモーターであることが好ましい。構成的プロモーターの一例は、GOS2プロモーター、好ましくはイネGOS2プロモーター、より好ましくは配列番号117により示されるGOS2プロモーターである。
【０１９２】
1つの構築物において、1つの制御配列を使用して、配列番号267または配列番号268により示される1つの核酸分子中に含まれる(a)と(b)の両方の核酸配列の発現を誘導し、この核酸分子は配列番号269または配列番号270により示されるポリペプチド配列をコードする。
【０１９３】
本発明は、例えば(a)上記で定義したGRFポリペプチドをコードする核酸配列;および(b)上記で定義したSYTポリペプチドをコードする核酸配列を植物に同時に導入し発現させるのに有用である構築物の混合物であって、少なくとも1つの構築物が、
(a)上記で定義したGRFポリペプチドをコードする核酸配列;
(b)(a)の核酸配列の発現を駆動することが可能な1以上の制御配列;および任意により
(c)転写終結配列
を含み、かつ少なくとも1つの他の構築物が、
(d)上記で定義したSYTポリペプチドをコードする核酸配列;
(e)(d)の核酸配列の発現を駆動することが可能な1以上の制御配列;および任意により
(f)転写終結配列
を含む、構築物の混合物も提供する。
【０１９４】
構築物の制御配列の1つは構成的プロモーターであることが好ましい。構成的プロモーターの一例は、GOS2プロモーター、好ましくはイネGOS2プロモーター、より好ましくは配列番号117により示されるGOS2プロモーターである。
【０１９５】
本発明は、以下の核酸配列:(a)GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(b)SYTポリペプチドをコードする核酸配列のうち1つの発現が増加している植物と比較して、増強された収穫高関連形質を有する植物を作製する方法での、(a)上記で定義したGRFポリペプチドをコードする核酸配列、および(b)上記で定義したSYTポリペプチドをコードする核酸配列を含む構築物、または上記で定義した(a)および(b)を含む構築物の混合物の使用であって、増強した収穫高関連形質が、以下の形質:(i)増大した初期活力;(ii)増加した地上バイオマス;(iii)増加した植物当たり総種子収穫高;(iv)増加した種子充填率;(v)増加した(充填)種子数;(vi)増加した収穫指数;または(vii)増加した千粒重(TKW)のうち1以上である使用も提供する。
【０１９６】
本発明は、(a)上記で定義したGRFポリペプチドをコードする核酸配列、および(b)上記で定義したSYTポリペプチドをコードする核酸配列を含む構築物、または上記で定義した(a)および(b)を含む構築物の混合物で形質転換した、植物、植物部分または植物細胞も提供する。
【０１９７】
上述の核酸配列のいずれかを含む1以上のベクターで植物を形質転換する。当業者は、対象とする配列を含有する宿主細胞を首尾良く形質転換、選択および増殖するために、ベクター上に存在しなければならない遺伝子エレメントを十分理解している。対象とする配列は、1以上の制御配列(少なくともプロモーター)と機能的に連結している。
【０１９８】
有利には、天然または合成であろうと任意の型のプロモーターを使用して、核酸配列の発現を増加することができる。構成的プロモーターが該方法で特に有用である。
【０１９９】
例えば葉、茎、塊茎、分裂組織、種子(胚および/または内胚乳)における好ましい発現用の、他の器官特異的プロモーターは、本発明の方法を実施する際に有用である。様々なプロモーター型の定義に関しては、本明細書の「定義」のセクションを参照されたい。
【０２００】
本発明の適用は、(i)構成的プロモーターによって発現が駆動される、配列番号1により示されるGRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii)構成的プロモーターによって発現が駆動される、配列番号120により示されるSYTポリペプチドをコードする核酸配列に限られないことは明らかであるはずである。
【０２０１】
任意により、1以上のターミネーター配列を、植物に導入する構築物に使用することができる。追加的な調節エレメントは、転写および翻訳インクリーザーを含むことができる。当業者は、本発明の実施において使用するのに適している可能性がある、ターミネーターおよび増大配列を理解している。定義のセクションに記載したように、イントロン配列を5'非翻訳領域(UTR)またはコード配列に加えて、サイトゾル中に蓄積する成熟メッセージの量を増大することもできる。他の制御配列(プロモーター、インクリーザー、サイレンサー、イントロン配列、3'UTRおよび/または5'UTR領域以外)は、タンパク質および/またはRNA安定化エレメントであってよい。このような配列は公知であるはずであり、または当業者によって容易に得ることができる。
【０２０２】
本発明の遺伝子構築物は、特定の細胞タイプでの維持および/または複製に必要とされる、複製配列の起点をさらに含むことができる。一例は、エピソーム遺伝子エレメント(例えばプラスミドまたはコスミド分子)として細菌細胞中で、遺伝子構築物が維持されることが必要とされるときである。好ましい複製起点には、f1-oriおよびcolE1があるが、これらだけには限られない。
【０２０３】
本発明の方法中で使用する核酸配列の首尾良い移動の検出、および/またはこれらの核酸配列を含むトランスジェニック植物の選択のために、マーカー遺伝子(またはレポーター遺伝子)を使用することが有利である。したがって、遺伝子構築物は選択可能なマーカー遺伝子を任意により含むことができる。選択可能なマーカーは、本明細書の「定義」のセクション中に、より詳細に記載されている。
【０２０４】
植物細胞への核酸配列の安定的または一時的な組み込みによって、ごく少数の細胞が外来性DNAを取り込み、および、望ましい場合、使用する発現ベクターおよび使用するトランスフェクション技法に応じて、それをそのゲノムに組み込むことは知られている。これらの要素を同定および選択するために、(上述したマーカーなどの)選択可能なマーカーをコードする遺伝子を、対象とする遺伝子を有する宿主細胞中に通常導入する。これらのマーカーは例えば、これらの遺伝子が例えば従来法による欠失によって機能的でない突然変異体で使用することができる。さらに、選択可能なマーカーをコードする核酸配列分子は、本発明のポリペプチドをコードする配列を含む同じベクターで宿主細胞中に導入することができ、または本発明の方法で使用することができ、またはそれ以外は別のベクターで使用することができる。導入核酸配列で安定的にトランスフェクトした細胞は、例えば選択によって同定することができる(例えば、選択可能なマーカーを組み込んだ細胞は生存し、一方他の細胞は死滅する)。マーカー遺伝子は、それらがもはや必要とされなくなった後、トランスジェニック細胞から除去または削除することができる。マーカー遺伝子除去のための技法は当技術分野で知られており、有用な技法は定義のセクション中で上述されている。
【０２０５】
本発明は、増強された収穫高関連形質を有するトランスジェニック植物を生成する方法であって、以下の核酸配列:(i)本明細書で上記で定義したGRFポリペプチドをコードする任意の核酸配列、および(ii)本明細書で上記で定義したSYTポリペプチドをコードする任意の核酸配列を植物に導入し、かつ発現させるステップを含み、植物が以下の核酸配列:(i)本明細書で上記で定義したGRFポリペプチドをコードする任意の核酸配列、または(ii)本明細書で上記で定義したSYTポリペプチドをコードする任意の核酸配列の発現の増大を有する植物と比較して、増強した収穫高関連形質を有する方法も提供する。
【０２０６】
より具体的には、本発明は、以下の核酸配列:(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列、または(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列のうち1つの発現が増加している植物と比較して増強された収穫高関連形質を有するトランスジェニック植物を作製する方法であって、
a.構成的プロモーターの制御下に、上記で定義したGRFポリペプチドをコードする核酸配列を、植物、植物部分、または植物細胞に導入し、かつ発現させるステップ;および
b.構成的プロモーターの制御下に、上記で定義したSYTポリペプチドをコードする核酸配列を、植物、植物部分、または植物細胞に導入し、かつ発現させるステップ;および
c.植物の成長および発達を促進する条件下で植物細胞、植物部分、または植物を栽培するステップ
を含む方法を提供する。
【０２０７】
(i)の核酸配列は本明細書で定義するGRFポリペプチドをコードすることができる任意の核酸配列であってよく、かつ(ii)の核酸配列は本明細書で定義するSYTポリペプチドをコードすることができる任意の核酸配列であってよい。
【０２０８】
核酸配列は、植物細胞中または植物自体に直接導入することができる(植物の組織、器官または任意の他の部分への導入を含む)。本発明の好ましい特徴によれば、核酸配列は形質転換によって植物に導入することが好ましい。用語「形質転換」は本明細書の「定義」のセクション中に、より詳細に記載されている。
【０２０９】
遺伝子改変植物細胞は、当業者が熟知しているあらゆる方法によって再生することができる。適切な方法は、S.D.Kung and R.Wu,Potrykus or Hofgen and Willmitzerによる前述の刊行物中で見ることができる。
【０２１０】
一般に形質転換後、植物細胞または細胞集団を、対象とする遺伝子と共に移動する、植物で発現可能な遺伝子によってコードされる1以上のマーカーの存在に関して選択し、その後、形質転換物質を完全な植物に再生する。形質転換植物を選択するために、形質転換において得た植物物質は一般に、形質転換植物を非形質転換植物と区別することができるような選択条件に曝す。例えば、上述した方法で得た種をまくことができ、初期生長期後、散布により適切な選択に曝す。さらなる可能性は、滅菌後適切な場合、形質転換種子のみが植物に生長することができるように適切な選択物質を使用する寒天プレート上での、種子の生長である。あるいは、形質転換植物を、上述したマーカーなどの選択可能なマーカーの存在に関してスクリーニングする。
【０２１１】
DNA導入および再生後、おそらく形質転換された植物を、例えばサザン分析を使用して、対象とする遺伝子の存在、コピー数および/またはゲノム編成に関して評価することもできる。その代わりにまたはそれに加えて、新たに導入されたDNAの発現レベルを、いずれの技法も当業者によく知られているノーザンおよび/またはウエスタン分析を使用してモニタリングすることができる。
【０２１２】
生成した形質転換植物は、クローン増殖または古典的交配技法などによる、様々な手段によって増殖することができる。例えば、第1世代(またはT1)の形質転換植物を、選択した同型第2世代(またはT2)の形質転換体と自殖することが可能であり、次いで古典的交配技法によってT2植物をさらに増殖することができる。生成する形質転換生物は様々な形をとる可能性がある。例えば、それらは形質転換細胞と非形質転換細胞のキメラ、(例えば、全細胞が形質転換されて発現カセットを含有する)クローン形質転換体、形質転換組織と非形質転換組織の移植片(例えば植物中では、非形質転換接ぎ穂に移植した形質転換根茎)であってよい。
【０２１３】
本発明は明らかに、本明細書に記載する方法のいずれかによって生成する任意の植物細胞または植物、ならびに全ての植物部分およびその珠芽に広がる。本発明はさらに広がり、前述の方法のいずれかによって生成した一次形質転換またはトランスフェクト細胞、組織、器官または植物全体の子孫を含み、唯一の要件は、本発明による方法で親によってもたらされたのと同じ(1以上の)遺伝子型および/または表現型特性を、子孫が示すことである。
【０２１４】
本発明は、(i)構成的プロモーターと機能的に連結した、本明細書で上記で定義したGRFポリペプチドをコードする単離核酸配列、および(ii)構成的プロモーターと機能的に連結した、本明細書で上記で定義したSYTポリペプチドをコードする単離核酸配列を含有する宿主細胞も含む。本発明による好ましい宿主細胞は植物細胞である。本発明による方法で使用する核酸配列またはベクター、発現カセットまたは構築物またはベクターのための宿主植物は、原則として、有利なことに、本発明の方法で使用するポリペプチドを合成することができる全ての植物である。
【０２１５】
本発明の方法は、有利なことに任意の植物に適用可能である。本発明の方法で特に有用である植物には、緑色植物亜界の上科、特に飼葉または飼料用マメ科植物をはじめとする単子葉および双子葉植物、観葉植物、食用穀物、樹木または低木に属する全ての植物がある。本発明の好ましい実施形態によれば、植物は作物である。作物の例としては、ダイズ、ヒマワリ、カノーラ、アルファルファ、菜種、ワタ、トマト、ジャガイモおよびタバコが挙げられる。植物は単子葉植物であることがさらに好ましい。単子葉植物の例としてはサトウキビが挙げられる。植物は穀類であることがより好ましい。穀類の例としては、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、アワ、ライムギ、ライコムギ、モロコシおよびオートムギが挙げられる。
【０２１６】
本発明は、種子、葉、果実、花、茎、根茎、塊茎および球根だけには限られないが、これらなどの、(i)(本明細書で上記で定義した)GRFポリペプチドをコードする単離核酸配列、および(ii)(本明細書で上記で定義した)SYTポリペプチドをコードする単離核酸配列を含む、植物の収穫可能部分にも広がる。本発明はさらに、乾燥ペレットまたは粉末、油、脂質および脂肪酸、デンプンまたはタンパク質などの、このような植物の収穫可能部分に由来する、好ましくは直接由来する生成物に関する。
【０２１７】
核酸配列または遺伝子、または遺伝子産物の発現を増加する方法は当技術分野では十分に報告されており、いくつかの例は定義のセクション中に示されている。
【０２１８】
前述のように、(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列の発現を増加するのに好ましい方法は、(i)GRFポリペプチドをコードする核酸配列;および(ii)SYTポリペプチドをコードする核酸配列を植物に導入し、かつ発現させるステップによる方法であるが、しかしながら、本発明の方法の実施、すなわち収穫高関連形質の増強の効果は、T-DNA活性タグ化、TILLING、相同組換えだけには限られないが、これらを含めた、他のよく知られている技法を使用して得ることもできる。これらの技法の記載は定義のセクション中に示されている。
【０２１９】
本発明は、正常な生長条件下、非生物学的ストレス生長(好ましくは浸透圧ストレス生長条件)条件下、および低下した栄養素の利用性の生長条件下、好ましくは低下した窒素利用性の条件下での、(i)本明細書に記載するGRFポリペプチドをコードする核酸配列、および本明細書に記載するSYTポリペプチドをコードする核酸配列の使用、および植物において前述の収穫高関連形質のいずれかを増大する際の、これらのGRFポリペプチドおよびSYTポリペプチドの使用も含む。
【０２２０】
本明細書に記載するGRFポリペプチドおよびSYTポリペプチドをコードする核酸配列、またはポリペプチド自体が、ポリペプチドコード遺伝子と遺伝的に関連し得るDNAマーカーを同定する品種改良プログラムにおいて用途を見出す可能性がある。遺伝子/核酸配列、またはGRFポリペプチドおよびSYTポリペプチド自体を使用して分子マーカーを定義することができる。したがって、このDNAまたはタンパク質マーカーを品種改良プログラム中で使用して、本発明の方法において本明細書で上記で定義したように、増強した収穫高関連形質を有する植物を選択することができる。
【０２２１】
GRFポリペプチドおよびSYTポリペプチドをコードする遺伝子/核酸配列の対立遺伝子変異体も、マーカー支援型品種改良プログラムにおいて用途を見出す可能性がある。このような品種改良プログラムは、例えばEMS突然変異誘発を使用する植物の突然変異誘発処理による、対立遺伝子変異体の導入を時折必要とし、あるいは該プログラムは、非意図的に生じるいわゆる「天然」起源の対立遺伝子変異体の回収で始めることができる。次いで対立遺伝子変異体の同定を、例えばPCRによって行う。これに問題の配列の優性対立遺伝子変異体を選択するステップが続き、これによって増強した収穫高関連形質をもたらす。選択は典型的には、問題の配列の異なる対立遺伝子変異体を含有する植物の生長能力をモニタリングすることによって実施する。生長能力は温室中または田畑でモニタリングすることができる。さらなる任意選択のステップは、優性対立遺伝子変異体を同定した植物と他の植物の交配を含む。これを使用して、例えば興味深い表現型特徴の組合せを作製することが可能である。
【０２２２】
GRFポリペプチドおよびSYTポリペプチドをコードする核酸配列は、それらがその一部分である遺伝子を遺伝的および物理的にマッピングするためのプローブとして、またこれらの遺伝子と関係がある形質のマーカーとして使用することもできる。望ましい表現型を有する系を開発するための植物の品種改良において、このような情報が有用である可能性がある。GRFポリペプチドおよび/またはSYTポリペプチドをコードする核酸配列のこのような使用は、少なくとも15ヌクレオチド長の核酸配列のみを必要とする。GRFポリペプチドおよび/またはSYTポリペプチドをコードする核酸配列は、制限断片長多型(RFLP)マーカーとして使用することができる。制限酵素により消化した植物のゲノムDNAのサザンブロット(Sambrook J,Fritsch EF and Maniatis T(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual)は、GRFポリペプチドをコードする核酸配列でプローブ処理することができる。生成するバンドパターンを、次いでMapMaker(Lander et al. (1987)Genomics 1:174-181)などのコンピュータプログラムを使用する遺伝子分析にかけて、遺伝子マップを構築することができる。さらに、核酸配列を使用して、明確な遺伝的交配の親および子孫を示す個体組の制限酵素エンドヌクレアーゼで処理したゲノムDNAを含有するサザンブロットをプローブ処理することができる。DNA多型の分離を記録し、これを使用して、この集団を使用して以前に得た遺伝子マップ中の特異的ポリペプチドをコードする核酸配列の位置を計算する(Botstein et al.(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。
【０２２３】
遺伝子マッピングにおいて使用するための植物遺伝子由来のプローブの生成および使用は、Bernatzky and Tanksley(1986)Plant Mol. Biol.Reporter4:37-41に記載される。多数の刊行物が、上記で概説した方法またはその変形を使用する特異的cDNAクローンの遺伝子マッピングを記載する。例えば、F2異型交配集団、戻し交配集団、ランダムに突然変異した集団、準同質遺伝子系統、および他の個体組を、マッピングに使用することができる。このような方法は当業者に周知である。
【０２２４】
核酸配列プローブも物理的マッピングに使用することができる(すなわち、物理的マップ上での配列の置換、Hoheisel et al.In: Non-mammalian Genomic Analysis:A Practical Guide,Academic press 1996,pp.319-346、およびその中に挙げられた参照文献を参照されたい)。
【０２２５】
別の実施形態では、核酸配列プローブを直接的蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)マッピングに使用することができる(Trask(1991)Trends Genet.7:149-154)。現在のFISHマッピング法は大きなクローン(数kb〜数百kb、Laan et al.(1995)Genome Res. 5:13-20を参照)の使用を好むが、感度の向上がより短いプローブを使用するFISHマッピングの実施を可能にし得る。
【０２２６】
遺伝的および物理的マッピングのための様々な核酸配列の増幅ベースの方法を、核酸配列を使用して実施することができる。いくつかの例には、対立遺伝子特異的増幅(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11:95-96)、PCR増幅断片多型(CAPS;Sheffield et al.(1993)Genomics 16:325-332)、対立遺伝子特異的連結(Landegren et al.(1988)Science 241:1077-1080)、ヌクレオチド伸長反応(Sokolov(1990)Nucleic acid sequence Res.18:3671)、放射線ハイブリッドマッピング(Walter et al.(1997)Nat.Genet.7:22-28)およびHappyマッピング(Dear and Cook(1989)Nucleic acid sequence Res.17:6795-6807)がある。これらの方法のために、核酸配列の配列を使用して、増幅反応中またはプライマー伸長反応で使用するためのプライマー対を設計および生成する。このようなプライマーの設計は当業者に周知である。PCRベースの遺伝的マッピングを利用する方法では、本発明の核酸配列に対応する領域中のマッピング交差の親の間のDNA配列の差を同定することが必要である場合がある。しかしながらこれは、マッピング法には一般に必要ではない。
【０２２７】
本明細書で上述したように、本発明による方法は増強した収穫高関連形質を有する植物をもたらす。これらの形質は、さらなる収穫高増強形質、非生物学的および生物学的ストレスに対する耐性、除草剤、殺虫剤に対する耐性、様々な構造的特徴および/または生化学的および/または生理的特徴を改変する形質などの、他の経済的に利点がある形質と組み合わせることもできる。
【実施例】
【０２２８】
ここで以下の実施例を参照して本発明を詳細に説明するが、この実施例は例示する目的のものに過ぎない。以下の実施例は、本発明の範囲を完全に定義するまたはその他の形で限定することを意図しない。
【０２２９】
DNA操作:他に記載しない限り、組換えDNA技術は(Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York)またはAusubel et al.(1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocolsの1および2巻に記載の標準的手順に従って実施される。植物分子研究のための標準的材料および方法は、BIOS Scientific Publications Ltd(UK)およびBlackwell Scientific Publications(UK)によって出版されたR.D.D.Croyによる、Plant Molecular Biology Labfax(1993)に記載されている。
【０２３０】
実施例１
本発明の方法で使用される核酸配列に関連する配列の同定
本発明の方法で使用される核酸配列に関連する配列(全長cDNA、ESTまたはゲノム)を、Basic Local Alignment Tool(BLAST)(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410;およびAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-3402)などのデータベース配列検索ツールを使用してNational Center for Biotechnology Information (NCBI)のEntrez Nucleotidesデータベースに保持されている配列の中から同定した。プログラムを使用して、核酸配列またはポリペプチド配列と配列データベースとを比較し、マッチの統計的有意性を算出することによって配列間での局所的に類似な領域を見出す。例えば、本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチドを、初期設定、低複雑度配列を無視するためのフィルター付きでTBLASTNアルゴリズムに使用した。分析の出力は、ペアワイズ比較によって考察し、確率スコア(E値)によって分類した。ここでスコアは特定のアラインメントが偶然生じる確率を反映する(より低いE値は、より有意なヒットである)。E値に加えて、比較は同一性パーセントによってもスコア化された。同一性パーセントは、特定の長さについて比較される2つの核酸配列(またはポリペプチド)配列間での同一ヌクレオチド(またはアミノ酸)の数に関する。場合により初期設定パラメータは、検索のストリンジェンシーを変更するために調整できる。例えば低ストリンジェントなマッチを示すために、E値を増加させることができる。このようにして、短いほとんど完全なマッチ(short nearly exact matches)を同定できる。
【０２３１】
表A.1は、本発明の方法の実施において有用なGRFポリペプチドをコードする関連する核酸配列の一覧を提供する。表A.2は、本発明の方法の実施において有用なSYTポリペプチドをコードする関連する核酸配列の一覧を提供する。
【表７】
2010538670.tif 000009
2010538670.tif 000010
2010538670.tif 000011
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【０２３２】
【表８】
2010538670.tif 000013
2010538670.tif 000014
2010538670.tif 000015
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【０２３３】
いくつかの場合において、関連配列は試みにアセンブリされ、The Institute for Genomic Research(TIGR)などの研究機関によって公に開示されている。Eukaryotic Gene Orthologs(EGO)データベースを、キーワード検索によってまたは目的の核酸配列もしくはペプチド配列とBLASTアルゴリズムを使用することによってそのような関連配列を同定するために使用できる。他の場合は、特定の生物について特別な核酸配列データベースが、例えばポプラおよびオスオレオコッカス・タウリ(Ostreococcus tauri)についてJoint Genome Instituteなどによって作製されている。
【０２３４】
実施例２
本発明の方法の実施において有用なポリペプチド配列のアラインメント
GRFポリペプチド配列のアラインメント
表A.1の全てのGRFポリペプチド配列の多重配列アラインメントを、AlignX  アルゴリズム(Vector NTI 10.3、Invitrogen Corporationから)を使用して実施した。表A.1からのGRFポリペプチドのQLQドメイン(配列番号2について配列番号115により表される)についてのアラインメントの結果を本願の図2に示す。保存されたQLQアミノ酸残基は、多重アラインメントの上部に示す。良く保存された他の2つの残基(黒色で囲む)は、E(Glu)およびP(Pro)である。表A.1からのGRFポリペプチドのWRCドメイン(配列番号2についての配列番号116で表される)についてのアラインメントの結果を本願の図3に示す。保存されたWRCアミノ酸残基をコンセンサス配列で太字にする。保存された配置(CX9CX10CX2H)で3つのCys残基および1つのHis残基を含む転写エフェクター(ET)ドメインをアラインメントの一番下に記載する。
【０２３５】
SYTポリペプチド配列のアラインメント
Align Xアルゴリズム(改良型ClustalWアルゴリズムに基づいて; Vector NTI 10.3、Invitrogen Corporationから)を、ギャップ開始ペナルティー10およびギャップ伸長0.05について初期設定で使用して、表A.2の全てのSYTポリペプチド配列の多重配列アラインメントを実施し、図6に示す。N末端からC末端への2つの主なドメインを枠で囲み、SNHドメインおよびMetリッチ/QGリッチドメインとして特定する。加えて、N末端Metリッチドメインも枠で囲む。
【０２３６】
表A.2からのSYTポリペプチドのSNHドメイン(配列番号2について配列番号115で表される)についてのアラインメントの結果を本願の図5に示す。SNHドメイン中で最も保存されたアミノ酸残基を、配列番号263により示し黒色で囲む。
【０２３７】
実施例３
本発明の方法の実施において有用なポリペプチド配列間の包括的な同一性パーセントの算出
本発明の方法の実施において有用な全長ポリペプチド配列間の類似性および同一性の包括的なパーセンテージを、当技術分野において利用可能な方法のうちの1つ、MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)ソフトウェア(BMC Bioinformatics.2003 4:29.MatGAT:タンパク質またはDNAの配列を使用して類似性/同一性マトリクスを作製するアプリケーション。Campanella JJ,Bitincka L, Smalley J;Ledion Bitinckaがホストのソフトウェア)を使用して決定した。MatGATソフトウェアは、DNAまたはタンパク質の配列についての類似性/同一性マトリクスをデータのプレアラインメントの必要無く作製する。プログラムは、メイヤースおよびミラー包括的アラインメントアルゴリズム(ギャップ開始ペナルティー12およびギャップ伸長ペナルティー2)を使用して一連のペアワイズアラインメントを実施し、例えばBlosum62(ポリペプチド用)を使用して類似性および同一性を算出し、次いで結果を距離マトリクス中に置く。配列類似性を境界線の下半分に示し、配列同一性を対角の境界線の上半分に示す。
【０２３８】
比較において使用したパラメータは:
スコアリングマトリクス:Blosum62
初期ギャップ:12
伸長ギャップ:2
であった。GRFポリペプチド配列の全長(部分ポリペプチド配列を除く)にわたっての包括的な類似性および同一性についてのソフトウェア分析の結果を表B.1に示し、SYTポリペプチド配列の全長にわたる包括的な類似性および同一性についてを表B.2に示す。
【０２３９】
本発明の方法の実施において有用な全長GRFポリペプチド配列間の同一性パーセントは、配列番号2と比較してアミノ酸同一性15％程度に低くてもよい。
【０２４０】
同一性パーセントは、同一性算出がQLQドメイン配列番号2(配列番号2に含まれる配列番号115により示される;図2で示す表A.1のGRFポリペプチドのQLQドメイン)と本発明の実施において有用なポリペプチドQLQドメインとの間で実施される場合に実質的に増加しうる。同様に同一性パーセントは、同一性算出がWRCドメイン配列番号2(配列番号2に含まれる配列番号116により示される;図3で示す表A.1のGRFポリペプチドのWRCドメイン)と本発明の実施において有用なポリペプチドWRCドメインとの間で実施される場合に実質的に増加しうる。本発明の方法の実施において有用なポリペプチド配列中のQLQドメインにわたる同一性パーセントは、アミノ酸同一性25％〜99％に及び、本発明の方法の実施において有用なポリペプチド配列中のWRCドメインにわたる同一性パーセントは、アミノ酸同一性60％〜99％に及ぶ。図3において観察されうるとおり、WRCドメインは、さまざまなGRFポリペプチドにおいて図2に示すQLQドメインよりもより良く保存されている。
【０２４１】
QLQドメイン間のアミノ酸同一性における百分率、およびWRCドメイン間の同一性パーセントは全長GRFポリペプチド配列間で算出されたアミノ酸同一性パーセントよりも有意に高い。
【表９】
2010538670.tif 000017
2010538670.tif 000018
2010538670.tif 000019
2010538670.tif 000020
【０２４２】
【表１０】
2010538670.tif 000021
2010538670.tif 000022
2010538670.tif 000023
2010538670.tif 000024
【０２４３】
本発明の方法の実施において有用な全長SYTポリペプチド配列間での同一性パーセントは、配列番号121(表B.2および図6を参照されたい)のポリペプチド配列と比較してアミノ酸同一性25％程度に低くてもよい。
【０２４４】
同一性パーセントは、同一性算出が配列番号262により示されるSNHドメイン(配列番号121に含まれる)と本発明の実施において有用なポリペプチドSNHドメインとの間で実施される場合に実質的に増加しうる。本発明の方法の実施において有用なポリペプチド配列のSNHドメインにわたる同一性パーセントは、アミノ酸同一性30％〜99％に及ぶ。
【０２４５】
表A.2のポリペプチドのSNHドメイン間のアミノ酸同一性における百分率は、全長SYTポリペプチド配列間で算出されたアミノ酸同一性パーセントよりも有意に高い。
【０２４６】
実施例４
本発明の方法の実施において有用なポリペプチド配列に含まれるドメインの同定
タンパク質ファミリー、ドメインおよび部位の統合されたリソース(InterPro)データベースは、テキストおよび配列に基づく検索のための一般に使用されるシグニチャーデータベースのための統合インターフェースである。InterProデータベースは、プロテインシグニチャー(protein signature)を導くために十分に特徴付けられたタンパク質についての異なる方法および異なる程度の生物学的情報を使用するこれらのデータベースを組み合わせる。共働するデータベースは、SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDomおよびPfam、SmartおよびTIGRFAMsを含む。InterProは英国のEuropean  Bioinformatics Instituteをホストとする。
【０２４７】
配列番号2により示されるポリペプチド配列のInterProスキャンの結果を表C.1に示す。
【表１１】
2010538670.tif 000025
【０２４８】
配列番号121により示されるポリペプチド配列のInterProスキャンの結果を表C.2に示す。
【表１２】
2010538670.tif 000026
【０２４９】
さらに、SYTポリペプチド配列中のMetリッチドメインまたはQGリッチドメインの存在も容易に同定できる。図6に示すとおり、MetリッチドメインおよびQGリッチドメインはSNHドメインのあとに続く。QGリッチドメインはポリペプチドのC末端残部(SHNドメインを差し引く)に実質的に取り込まれる場合があり、Metリッチドメインは典型的にはQGリッチ(N末端からC末端へ)ドメインの前半部分に含まれる。ポリペプチドドメインが特定のアミノ酸についてリッチであるかどうかを決定するための一次アミノ酸組成(％)は、ExPASyサーバーからのソフトウェアプログラム(Gasteiger E et al. (2003) ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res 31:3784-3788)を特定のProtParam toolで使用して算出できる。目的のポリペプチドの組成は、次いでSwiss-Prot Protein Sequenceデータバンク(表C.3)での平均アミノ酸組成(％)と比較できる。このデータバンクにおいて平均Met(M)含有量は2.37％であり、平均Gln(Q)含有量は3.93％であり、かつ平均Gly(G)含有量は6.93％である(表C.3)。本明細書で定義する場合、MetリッチドメインまたはQGリッチドメインは、Swiss-Prot Protein Sequenceデータバンクにおける平均アミノ酸組成(％)を超えるMet含有量(％)またはGlnおよびGly含有量(％)を有する。例えば配列番号121において、SNHドメインに先行するN末端のMetリッチドメイン(アミノ酸位置1〜24)は、20.8％のMet含有量を有し、QGリッチドメイン(アミノ酸位置71〜200)は、18.6％のGln(Q)含有量および21.4％のGly(G)含有量を有する。好ましくは、本明細書において定義するMetドメインは、少なくとも1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0、5.25、5.0、5.75、6.0、6.25、6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75、8.0、8.25、8.5、8.75、9.0、9.25、9.5、9.75、10または、それをSwiss-Prot Protein Sequenceデータバンクに含まれる前記種類のタンパク質配列の平均アミノ酸組成(％)と同程度に超えるMet含有量(％)を有する。好ましくは本明細書において定義するQGリッチドメインは、少なくとも1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0、5.25、5.0、5.75、6.0、6.25、6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75、8.0、8.25、8.5、8.75、9.0、9.25、9.5、9.75、10またはそれをSwiss-Prot Protein Sequenceデータバンクに含まれる前記種類のタンパク質配列の平均アミノ酸組成(％)と同程度に超えるGln(Q)含有量および/またはGly(G)含有量を有する。
【表１３】
2010538670.tif 000027
【０２５０】
実施例５
本発明の方法の実施において有用なGRFポリペプチド配列の細胞内局在予測
タンパク質局在についての実験的方法は免疫局在性から、緑色蛍光タンパク質(GRP)またはβグルクロニダーゼ(GUS)を使用するタンパク質のタグ付けに及ぶ。例えばGUSレポーター遺伝子に融合したGRFポリペプチドはタマネギ上皮細胞を一過的に形質転換するために使用された(van der Knapp et al. (2000) Plant Phys 122: 695-704)。核はGRFポリペプチドの細胞内区画として同定された。GRFポリペプチドの細胞内区画化を同定するためのそのような方法は、当技術分野において周知である。
【０２５１】
予測された核局在化シグナル(NLS)は、表AのGRFポリペプチドのWRCドメイン(CRRTDGKKWRC)での多重配列アラインメントに続く目視によって見出された。NLSは正に荷電したリジンまたはアルギニンの1以上の短い配列である。
【０２５２】
配列データからのタンパク質局在の計算による予測を実施した。当業者に周知のアルゴリズムは、Swiss Institute for BioinformaticsがホストのExPASy Proteomics toolで取得可能であり、例えばPSort、TargetP、ChloroP、LocTree、Predotar、LipoP、MITOPROT、PATS、PTS1、SignalPなどがある。
【０２５３】
LOCtreeは、非植物および植物の真核生物ならびに原核生物における非膜タンパク質の細胞内局在およびDNA結合傾向を予測できるアルゴリズムである。LOCtreeは、真核動物タンパク質を5つの細胞内クラスのうちの1つに分類し、一方植物タンパク質は6つのクラスのうちの1つに分類され、原核生物タンパク質は3つのクラスのうちの1つに分類される。以下の表Dは、配列番号2のポリペプチド配列情報を使用するLOCtreeの出力を示す。高信頼度の予測は、5より大きい信頼度指数値を有する。
【表１４】
2010538670.tif 000028
【０２５４】
配列番号2により示されるGRFポリペプチドの、LOCTreeアルゴリズムを使用して予測される細胞内区画は核である。
【０２５５】
実施例６
本発明の方法の実施において有用なポリペプチド配列に関するアッセイ
本発明の方法において有用なGRFポリペプチドおよびSYTポリペプチド(少なくともそれらの天然形態において)は、典型的には、しかし必要ではなく、転写調節活性および他のタンパク質と相互作用する能力を有する。DNA結合活性およびタンパク質-タンパク質相互作用は、当技術分野において周知の技術(例えば、Current Protocols in Molecular Biology,Volumes 1 and 2,Ausubel et al.(1994),Current Protocols)を使用してin vitroまたはin vivoで容易に決定しうる。GRFポリペプチドは、酵母細胞でレポーター遺伝子の転写活性化が可能である(Kim & Kende(2004)Proc Natl Acad Sci 101(36):13374-13379)。GRFポリペプチドはSYTポリペプチド(GRF相互作用因子またはGIFとも称される)とも、酵母細胞中in vivoで、酵母ツーハイブリッドタンパク質-タンパク質相互作用アッセイを使用して相互作用できる(Kim & Kende、上掲)。In vitro結合アッセイも、GRFポリペプチドとSYTポリペプチドとが相互作用するパートナーであることを示すために使用されている(Kim & Kende、上掲)。本文献において記載されている実験は、GRFポリペプチドおよびSYTポリペプチドを特徴付けることにおいて有用であり、当技術分野において周知である。
【０２５６】
実施例７
本発明の方法の実施において有用な核酸配列のクローニング
他に記載しない限り、組換えDNA技術は、(Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York)またはAusubel et al.(1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocolsの1および2巻に記載の標準的手順に従って実施される。植物分子生物学研究のための標準的材料および方法は、BIOS Scientific Publications Ltd (UK)およびBlackwell Scientific Publications (UK)によって出版されたR.D.D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax (1993)に記載されている。
【０２５７】
配列番号1により示される核酸配列のクローニング
配列番号2により示されるGRFポリペプチド配列をコードするシロイヌナズナcDNAを、混合された植物組織から抽出されたmRNAから合成したシロイヌナズナcDNAバンクを鋳型として使用してPCRによって増幅した。プライマーprm08136配列番号42;,:5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttaaaaaccattttaacgcacg)、Gateway組換えのためのAttB部位を含む以下のプライマーをPCR増幅に使用した:
(1) Prm10010(配列番号118、センス)
5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAAACAATGATGAGTCTAAGTGGAAGTAG-3'
(2) Prm10011(配列番号119、リバース、相補的)
5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGCTCTACTTAATTAGCTACCAG-3'。
【０２５８】
配列番号120により示される核酸配列のクローニング
配列番号121により示されるSYTポリペプチド配列をコードするシロイヌナズナcDNAを、混合された植物組織から抽出されたmRNAから合成したシロイヌナズナcDNAバンクを鋳型として使用してPCRによって増幅した。Gateway組換えのためのAttB部位を含む以下のプライマーをPCR増幅に使用した:
(1)Prm06681(配列番号265、センス)
5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAAACAATGCAACAGCACCTGATG-3'
(2)Prm06682(配列番号266、リバース、相補的)
5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCATCATTAAGATTCCTTGTGC-3'。
【０２５９】
PCR反応を、標準的条件でHifi Taq DNAポリメラーゼを使用して配列番号1および配列番号120について個々に実施した。予測される長さのPCR断片(attB部位を含む)を増幅し、同様に標準的方法を使用して精製した。次いで、Gateway手順の最初のステップであるBP反応を実施し、その間にGateway用語による「エントリークローン」を作製するために、PCR断片をpDONR201プラスミドにin vivoで組み換えた。プラスミドpDONR201は、InvitrogenからGateway(登録商標)technologyの一部として購入した。
【０２６０】
実施例８
配列番号1および配列番号120により示される核酸配列を使用する発現ベクター構築
配列番号1および配列番号120を個々に含むエントリークローンを、次にオリザ・サティバの形質転換のために使用するデスティネーションベクター(destination vector)と共にLR反応に個々に使用した。このベクターは、機能的エレメントとしてT-DNA境界に:植物選択可能マーカー;スクリーニング可能マーカー発現カセット;およびエントリークローンに既にクローニングされた目的の核酸配列でのLR in vivo組換えのためのGatewayカセットを含有した。構成的発現のためのイネGOS2プロモーター(配列番号117)をこのGatewayカセットの上流に配置した。
【０２６１】
LR組換えステップの後に、得られた発現ベクターpGOS2::GRFおよびpGOS2::SYT(図9)を当技術分野において周知の方法によりアグロバクテリウムLBA4044株に個々に形質転換した。
【０２６２】
実施例９
植物形質転換
イネ形質転換
発現ベクターpGOS2::SYTを含有するアグロバクテリウムをオリザ・サティバ植物を形質転換するために使用した。イネ、ジャポニカ種、栽培種  日本晴の成熟乾燥種子の殻を剥いた。70％エタノール中での1分間に続く、0.2％HgCl2中での30分間のインキュベートにより滅菌を行い、続いて滅菌蒸留水での15分間、6回洗浄した。次いで滅菌種子を2,4-Dを含む培地(カルス誘導培地)で出芽させた。暗所、4週間のインキュベーション後、胚発生、胚盤由来カルスを切り取り、同じ培地で増殖させた。2週間後、同じ培地でのさらなる2週間の継代培養によってカルスを増やし、または増殖させた。共存培養の3日前に胚発生カルス片を新鮮培地で継代培養した(細胞分裂活性を促進するため)。
【０２６３】
それぞれ個々の発現ベクターを含有するアグロバクテリウム株LBA4404を共存培養に個々に使用した。アグロバクテリウムを適切な抗生物質を含むAB培地に接種し、3日間、28℃で培養した。次いで細菌を回収し、約1の密度(OD600)で液体の共存培養培地に懸濁した。次いで懸濁液をペトリ皿に移し、カルスを懸濁液中に15分間浸漬した。次いでカルス組織を濾紙上でブロット乾燥し、固化させた共存培養培地に移し、3日間、暗所、25℃でインキュベートした。共存培養カルスを2,4-D-含有培地で4週間、暗所、28℃で選択剤の存在下で増殖させた。この期間中、急速に増殖する耐性カルス島が生じた。この材料の再生培地への移植および明所でのインキュベーション後、胚発生能が戻され、シュートが続く4〜5週間で生じた。シュートをカルスから切り取り、2〜3週間オーキシン含有培地でインキュベートし、そこからそれらを土壌に移植した。硬化したシュートを温室で高湿度下、短日で成長させた。
【０２６４】
およそ35個の独立したT0イネ形質転換体を各構築物について作製した。一次形質転換体を組織培養チャンバーから温室に移した。T-DNA挿入物のコピー数を確認するための定量的PCR分析後、選択剤への耐性を示す単一コピートランスジェニック植物だけをT1種子の収穫のために維持した。次いで、移植の3〜5ヵ月後に種子を収穫した。本方法は、単一遺伝子座形質転換体を50％を超える割合で生じた(Aldemita and Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994)。
【０２６５】
イネ再形質転換
イネ再形質転換は、本明細書において、他の構築物について既にトランスジェニックであるイネ植物の形質転換を意味する。
【０２６６】
具体的には、SYTペプチドをコードする核酸配列を発現するトランスジェニックホモ接合植物から収穫した種子を、実施例7の発現ベクターで再形質転換した。開始植物原材料におけるこの差異、および最初の形質転換のための選択可能マーカーと比べて異なる再形質転換用の選択可能マーカーの使用を除いて、他の手順は上記のとおりであった。
【０２６７】
実施例１０
表現型評価手順
10.1  評価設定
およそ35個の独立したT0イネ再形質転換体を作製した。これらの植物を、栽培およびT1種子の収穫のために組織培養チャンバーから温室にさらに移した。温室の条件は、短日(12時間明期)、明期28℃および暗期22℃、相対湿度70％であった。
【０２６８】
PCR確認を、(i)配列番号2により示されるGRFポリペプチドをコードする単離された核酸導入遺伝子;および(ii)配列番号121により示されるSYTポリペプチドをコードする単離された核酸導入遺伝子の存在を確かめるために実施した。PCR確認は、プロモーター、転写終結配列および植物選択可能マーカーの存在およびコピー数についても実施した。選択されたトランスジェニック植物をさらに両導入遺伝子の遺伝子座についてホモ接合になるまで栽培した。
【０２６９】
10.2  統計的分析:F検定
二元(two factor)ANOVA(変量の分析)を植物の表現型的特徴の総合的評価のための統計モデルとして使用した。F検定を、本発明の遺伝子で形質転換した全ての事象の全ての植物で測定した全てのパラメータについて実施した。F検定を全ての形質転換事象にわたる遺伝子の効果について確かめるため、および、包括的遺伝子効果としても公知の、遺伝子の総合的効果について確認するために実施した。真の包括的遺伝子効果の有意性についての閾値をF検定について確率レベル5％に設定した。有意なF検定値は、遺伝子効果を意味し、これは表現型における差異を生じる遺伝子の単なる存在または位置ではないことを意味する。
【０２７０】
10.3  測定されたパラメータ
種子関連パラメータ測定
個々の種子パラメータ(短径、長径、面積を含む)を、画像分析用ソフトウェアを付随する主な2個の構成要素である秤量デバイスおよび画像化デバイスからなる特別注文の装置を使用して測定した。
【０２７１】
実施例１１
再形質転換イネ植物から収穫した種子での種子サイズ測定の結果
配列番号121により示されるSYTポリペプチドをコードする核酸配列を構成的プロモーターの制御下で発現するホモ接合性トランスジェニックイネ植物を、配列番号2のGRFポリペプチドをコードする核酸配列を、同様に構成的プロモーターの制御下に含む上記の実施例7の発現ベクターで再形質転換した。再形質転換イネ植物を両遺伝子座についてホモ接合になるまでさらに栽培した。
【０２７２】
図7は、左側に、対照ベクターで形質転換したイネ植物(オリザ・サティバ、ジャポニカ種、栽培種  日本晴)由来の穂を示し、右側に、2種の構築物:(1)イネ由来のGOS2プロモーター(pGOS2)の制御下にGRFポリペプチドをコードする核酸配列;および(2)イネ由来のGOS2プロモーター(pGOS2)の制御下にSYTポリペプチドをコードする核酸配列、で形質転換したイネ植物(オリザ・サティバ、ジャポニカ種、栽培種  日本晴)由来の穂を示す。両方の構築物で形質転換したイネ植物は、両遺伝子座についてホモ接合である。植物バイオマス、穂の数、穂のサイズ、種子数および種子のサイズは、対照ベクターで形質転換したイネにおける同じパラメータと比較して、再形質転換したイネにおいて明らかに増加している。
【０２７３】
再形質転換し、かつ両遺伝子座についてホモ接合であるイネ植物から収穫した種子を収穫し、種子30個の試料を写真撮影した。図8は、上列左から右に:
(a)イネ由来のGOS2プロモーター(pGOS2)の制御下に配列番号120により示されるSYTポリペプチドをコードする核酸配列を含む1つの構築物で形質転換した植物;
(b)2つの構築物(1)イネ由来のGOS2プロモーター(pGOS2)の制御下に配列番号2により示されるGRFポリペプチドをコードする核酸配列;および(2)イネ由来のGOS2プロモーター(pGOS2)の制御下に配列番号120により示されるSYTポリペプチドをコードする核酸配列、で形質転換した植物;
(c)イネ由来のGOS2プロモーター(pGOS2)の制御下に配列番号2により示されるGRFポリペプチドをコードする核酸配列を含む1つの構築物で形質転換した植物;
(d)a由来のヌル欠損植物(対照植物);
(e)c由来のヌル欠損植物(対照植物);
由来の成熟イネ種子(オリザ・サティバ、ジャポニカ種、栽培種  日本晴)30個を示す;
種子のサイズにおける増加は単純な目視によって明白であった。
【０２７４】
6個のトランスジェニック事象由来のホモ接合種子を、次いで平均種子面積、平均種子長径および平均種子短径を評価するために画像化し、次いで、(i)SYTポリペプチドをコードする核酸配列を含む1つの構築物で形質転換した植物由来のホモ接合種子;および(ii)(i)由来の対照植物(ヌル欠損)対照植物由来の種子において測定した同じパラメータと比較した。結果を以下の表Eに示す。
【表１５】
2010538670.tif 000029
【０２７５】
実施例１２
他の作物の形質転換例
トウモロコシ形質転換
トウモロコシ(ゼア・メイス)の形質転換をIshida et al. (1996)Nature Biotech 14(6): 745-50によって記載された方法の変法で実施する。形質転換は、トウモロコシにおいて遺伝子型依存性であり、特定の遺伝子型だけが形質転換および再生に適している。近交系A188(University of Minnesota)またはA188を親とするハイブリッドは、形質転換のための提供材料の良い供給源であるが、他の遺伝子型も同様に十分に使用できる。未成熟胚の長さが約1〜1.2mmである、受粉後日数(DAP)およそ11でトウモロコシ植物から穂を収穫する。未成熟胚を発現ベクターを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスと共存培養し、トランスジェニック植物を器官形成を通じて再生する。切り取った胚をカルス誘導培地、次いで選択剤(例えばイミダゾリノンだが種々の選択マーカーを使用できる)を含有するトウモロコシ再生培地上で増殖させる。ペトリプレートを明所、25℃で2〜3週間、シュートが生じるまでインキュベートする。緑色シュートを各胚からトウモロコシ発根培地へ移し、根が生じるまで25℃、2〜3週間インキュベートする。発根したシュートを温室の土壌に移植する。T1種子は、選択剤に耐性を示し、T-DNA挿入断片の単一コピーを含有する植物から産生される。
【０２７６】
コムギ形質転換
コムギの形質転換をIshida et al. (1996)Nature Biotech 14(6): 745-50によって記載された方法で実施する。栽培種ボブホワイト(Bobwhite)(CIMMYT, Mexicoから入手可能)は、形質転換に一般に使用される。未成熟胚を発現ベクターを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスと共存培養し、トランスジェニック植物を器官形成を通じて再生する。アグロバクテリウムとのインキュベーション後、胚をin vitroでカルス誘導培地、次いで選択剤(例えばイミダゾリノンだが種々の選択マーカーを使用できる)を含有する再生培地上で増殖させる。ペトリプレートを明所、25℃で2〜3週間、シュートが生じるまでインキュベートする。緑色シュートを各胚から発根培地へ移し、根が生じるまで25℃、2〜3週間インキュベートする。発根したシュートを温室の土壌に移植する。T1種子は、選択剤に耐性を示し、T-DNA挿入断片の単一コピーを含有する植物から産生される。
【０２７７】
ダイズ形質転換
ダイズを、Texas A & M  米国特許第5,164,310号に記載の方法の変法によって形質転換する。いくつかの商業用ダイズ種は、この方法による形質転換に適している。栽培種ジャック(Jack)(the Illinois Seed foundationから入手可能)は、形質転換に一般に使用される。ダイズ種子をin vitro播種のために滅菌する。胚軸、小根および子葉1枚を、7日間育った若い実生から切り出す。上胚軸および残部の子葉を腋性の節を生じさせるためにさらに育てる。これらの腋性の節を切り出し、発現ベクターを含有するアグロバクテリウムツメファシエンスとインキュベートする。共存培養処置後、外植物を洗浄し、選択培地に移す。再生シュートを切り出し、シュート伸長培地に置く。1cmより長くないシュートを根が生じるまで発根培地に置く。発根したシュートを温室の土壌に移植する。T1種子は、選択剤に耐性を示し、T-DNA挿入物の単一コピーを含有する植物から産生される。
【０２７８】
アブラナ/セイヨウアブラナ形質転換
5〜6日間育った若い実生の子葉の葉柄および胚軸を組織培養用の外植片として使用し、Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188)に従い形質転換する。商業的栽培種ウェスター(Westar)(Agriculture Canada)は形質転換に使用される標準的な品種であるが、他の品種も使用できる。セイヨウアブラナ種子をin vitro播種のために表面滅菌する。子葉が付いた子葉の葉柄外植片をin vitro実生から切り出し、葉柄外植片の切断端を細菌懸濁液に浸漬することによってアグロバクテリウム(発現ベクターを含有する)を接種する。次いで外植片を、3mg/ml BAP、3％スクロース、0.7％フィトアガー(Phytagar)を含有するMSBAP-3培地、23℃、明期16時間で2日間培養する。アグロバクテリウムとの2日間の共存培養後、葉柄外植片を3mg/ml BAP、セフォタキシム、カルベニシリンまたはチメンチン(300mg/l)を含有するMSBAP-3培地に7日間移し、次いでセフォタキシム、カルベニシリンまたはチメンチンおよび選択剤を含むMSBAP-3培地でシュート再生まで培養する。シュートが長さ5〜10mmになったらそれらを切断し、シュート伸長培地(0.5mg/ml BAPを含むMSBAP-0.5)に移す。長さ約2cmのシュートは発根培地(MS0)に根の誘導のために移す。発根したシュートを温室の土壌に移植する。T1種子は、選択剤に耐性を示し、T-DNA挿入断片の単一コピーを含有する植物から産生される。
【０２７９】
アルファルファ形質転換
アルファルファ(ムラサキウマゴヤシ)の再生クローンを(McKersie et al. 1999 Plant Physiol 119:839-847)の方法を使用して形質転換する。アルファルファの再生および形質転換は、遺伝型依存性であり、したがって再生用植物が必要である。再生植物を得る方法は、報告されている。例えばこれらは、栽培種レンジランダー(Rangelander)(Agriculture Canada)からまたは任意の他の商業的アルファルファ品種からBrown DCW and A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112)により記載されたとおり選択することができる。代替的に、RA3種(University of Wisconsin)が組織培養における使用のために選択されている(Walker et al. 1978 Am J Bot 65:654-659)。葉柄外植片を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスC58C1 pMP90 (Mckersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847)または発現ベクターを含むLBA4404の終夜培養物と共存培養する。外植片を288mg/L Pro、53mg/L チオプロリン、4.35g/L K2SO4および100μmアセトシリンギノンを含有するSH誘導培地で3日間、暗所で、共存培養する。外植片を、半分の強度のムラシゲ-スクーグ培地(Murashige-Skoog medium) (Murashige and Skoog,1962)で洗浄し、アセトシリンギノンを含まないが、適切な選択剤および、アグロバクテリウムの増殖を阻害するための適切な抗生物質を含む同じSH誘導培地に置く。数週間後、不定胚を成長調節因子、抗生物質を含まないが、50ng/Lスクロースを含むBOi2Y発生培地に移す。不定胚を続いて半分の強度のムラシゲ-スクーグ培地で発芽させる。発根した実生をポットに移し、温室で育てた。T1種子は、選択剤に耐性を示し、T-DNA挿入断片の単一コピーを含有する植物から産生される。
【０２８０】
ワタ形質転換
ワタ(ケブカワタ)形質転換をアグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用して、胚軸外植片に実施する。Coker130またはCoker312(SeedCo, Lubbock, TX)などの商業的栽培種は形質転換のために使用される標準的な品種であるが、しかし他の品種も使用できる。種子を表面滅菌し、暗所で発芽させる。胚軸外植片を、約1〜1.5センチメートルの長さに発芽した実生から切断する。胚軸外植片を、発現ベクターを含有するアグロバクテリウムツメファシエンス接種物に、5分間浸漬し、次いでMS+1.8mg/l KNO3 +2％ グルコース、暗所、24℃で約48時間共存培養する。外植片を適切な細菌および植物の選択可能マーカー(数回新しくする)を含有する同じ培地に、胚形成カルスが見られるまで移す。カルスを分離し、不定胚が現れるまで継代培養する。不定胚に由来する小植物は、根が生じるまで発根培地で成熟させる。発根したシュートを温室の鉢植え土に移植する。T1種子は、選択剤に耐性を示し、T-DNA挿入断片の単一コピーを含有する植物から産生される。
【図１】
2010538670.tif 000030
【図２】
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【図３】
2010538670.tif 000032
【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【図１０−９】
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【図１０−１０】
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【図１０−１１】
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【図１０−１２】
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【図１０−１３】
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【図１０−１４】
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【図１０−１５】
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【図１０−１６】
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【図１０−１７】
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【図１０−１８】
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【図１０−１９】
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【図１０−２０】
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【図１０−２１】
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【図１０−２２】
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【図１０−２３】
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【図１０−２４】
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【図１０−２５】
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【図１０−２６】
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【図１０−２７】
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【図１０−２８】
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【図１０−２９】
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【図１０−３０】
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【図１０−３１】
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【図１０−３２】
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【図１０−３３】
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【図１０−３４】
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【図１０−３５】
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【図１０−３６】
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【図１０−３７】
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【図１０−３８】
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【図１０−３９】
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【図１０−４０】
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【図１０−４１】
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【図１０−４２】
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【図１０−４３】
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【図１０−４４】
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【図１０−４５】
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【図１０−４６】
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【図１０−４７】
2010538670.tif 000095
【図１０−４８】
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【図１０−４９】
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【図１０−５０】
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【図１０−５１】
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【図１０−５２】
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【図１０−５３】
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【図１０−５４】
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【図１０−５５】
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【図１０−５６】
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【図１０−５７】
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【図１０−５８】
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【図１０−５９】
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【図１０−６０】
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【図１０−６１】
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【図１０−６２】
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【図１０−６３】
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【図１０−６４】
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【図１０−６５】
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【図１０−６６】
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【図１０−６７】
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【図１０−６８】
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【図１０−６９】
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【図１０−７０】
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【図１０−７１】
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【図１０−７２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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