(57)【要約】一般式Ｉ：【化１２】2010539910.tif 000029［式中，Ｒは，アミノ官能基の保護基（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基（ＢＯＣ），ベンジルオキシカルボニル基，９−フルオレニルメトキシカルボニル基）を表し，Ｘは−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，Ｂｒ，Ｆである］のケト化合物のエナンチオ選択的酵素的還元方法。
2010539910.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ：
【化３】
2010539910.tif 000020
［式中，Ｒはアミノ官能基の保護基（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基（ＢＯＣ），ベンジルオキシカルボニル基，９−フルオレニルメトキシカルボニル基）を表し，およびＸは−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，Ｂｒ，Ｆである］
のケト化合物をエナンチオ選択的に酵素的に還元して一般式ＩＩ（Ｒ，Ｓ−化合物）：
【化４】
2010539910.tif 000021
［式中，ＲおよびＸは式Ｉにおけるものと同じ意味である］
のヒドロキシ化合物とする方法であって，
ケト化合物を，補因子の存在下で酸化還元酵素で還元し，ここで，形成された酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰは，一般式ＲＸＲＹＣＨＯＨ（ＲＸ，ＲＹは，独立して，水素，分枝鎖または非分枝鎖のＣ１−Ｃ８のアルキル基を表し，Ｃの合計は３以上である）の二級アルコールの酸化により連続的に再生されることを特徴とする方法。
【請求項２】
一般式Ｉ：
【化５】
2010539910.tif 000022
［式中，Ｒはアミノ官能基の保護基（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基（ＢＯＣ），ベンジルオキシカルボニル基，９−フルオレニルメトキシカルボニル基）を表し，Ｘは−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，Ｂｒ，Ｆである］
のケト化合物をエナンチオ選択的に酵素的に還元して一般式ＩＩ（Ｒ，Ｓ−化合物）：
【化６】
2010539910.tif 000023
［式中，ＲおよびＸは式Ｉにおけるものと同じ意味である］
のヒドロキシ化合物とする方法であって，
ケト化合物を，補因子の存在下で酸化還元酵素により還元し，該酸化還元酵素は，
ａ）  配列番号１，配列番号２，配列番号３または配列番号４にしたがうアミノ酸配列を含む，または
ｂ）  少なくとも６５％のアミノ酸が配列番号１，配列番号２，配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列のものと同一であるアミノ酸配列を含む，または
ｃ）少なくとも７２％のアミノ酸が配列番号１，配列番号２，配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列のものと同一であるアミノ酸配列を含む，または
ｄ）配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８または配列番号１９の核酸配列によりコードされる，または
ｅ）ストリンジェントな条件下で配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８または配列番号１９にハイブリダイズする核酸配列によりコードされる，または
ｆ）２２０−２６０アミノ酸の長さを有し，配列番号３１−配列番号５１の配列からなる群より選択される部分配列の１または数個を含む，
のいずれかであり，
そして，式Ｉの化合物を還元して好ましくは式ＩＩの化合物とする，
の各工程を含む方法。
【請求項３】
一般式Ｉ：
【化７】
2010539910.tif 000024
［式中，Ｒはアミノ官能基の保護基（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基（ＢＯＣ），ベンジルオキシカルボニル基，９−フルオレニルメトキシカルボニル基）を表し，Ｘは−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，Ｂｒ，Ｆである］
のケト化合物をエナンチオ選択的に酵素的に還元して一般式ＩＩＩ（Ｓ，Ｓ−化合物）：
【化８】
2010539910.tif 000025
［式中，ＲおよびＸは式Ｉにおけるものと同じ意味である］
のヒドロキシ化合物とする方法であって，ケト化合物を補因子の存在下で酸化還元酵素により還元し，ここで，形成された酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰは，一般式ＲＸＲＹＣＨＯＨ［式中，ＲＸ，ＲＹは，独立して，水素，分枝鎖または非分枝鎖のＣ１−Ｃ８のアルキル基であり，およびＣの合計は３以上である］の二級アルコールの酸化により連続的に再生されることを特徴とする方法。
【請求項４】
一般式Ｉ：
【化９】
2010539910.tif 000026
［式中，Ｒはアミノ官能基の保護基（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基，ベンジルオキシカルボニル基，９−フルオレニルメトキシカルボニル基）を表し，Ｘは−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，Ｂｒ，Ｆである］
のケト化合物をエナンチオ選択的に酵素的に還元して，一般式ＩＩＩ（Ｓ，Ｓ−化合物）：
【化１０】
2010539910.tif 000027
［式中，ＲおよびＸは式Ｉにおけるものと同じ意味である］
のヒドロキシ化合物とする方法であって，ケト化合物を補因子の存在下で酸化還元酵素により還元し，該酸化還元酵素は，
ａ）配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４または配列番号１５にしたがうアミノ酸配列を含む，または
ｂ）アミノ酸の少なくとも６５％が配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４または配列番号１５にしたがうアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む，または
ｃ）配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９または配列番号３０の核酸配列によりコードされる，または
ｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９または配列番号３０にハイブリダイズする核酸配列によりコードされる，または
ｅ）２２０−２６０アミノ酸の長さを有し，配列番号３１−配列番号６６の配列からなる群より選択される部分配列の１またはいくつかを含む，
のいずれかであり，
そして，式Ｉの化合物を還元して好ましくは式ＩＩＩの化合物とする，
の各工程を含む方法。
【請求項５】
形成された酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰが連続的に再生される，請求項２または４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
形成された酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰが，一般式ＲＸＲＹＣＨＯＨの二級アルコールの酸化により連続的に再生される，請求項２，４または５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
２−プロパノール，２−ブタノール，２−ペンタノール，４−メチル−２−ペンタノール，２−ヘプタノールまたは２−オクタノールをそれぞれ補基質または二級アルコールとして用いる，請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
補因子の再生用に追加の酸化還元酵素／デヒドロゲナーゼを加える，請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
式１の化合物は，２０ｇ／ｌ以上，好ましくは５０ｇ／ｌより高い，および特に好ましくは１００ｇ／ｌより高い濃度で反応バッチ中に存在する，請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＴＴＮ（総ターンオーバー数＝還元された式Ｉの化合物のモル数／用いられた補因子のモル数）は１０３以上である，請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
水性有機二相系で実施される，請求項１−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
さらに，有機溶媒，例えば，ジエチルエーテル，三級ブチルメチルエーテル，ジイソプロピルエーテル，ジブチルエーテル，酢酸エチル，酢酸ブチル，ヘプタン，ヘキサンまたはシクロヘキサンを用いる，請求項１−１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
式ＩＶ：
【化１１】
2010539910.tif 000028
の特定の化合物をケト化合物として用いる，請求項１−１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４または配列番号１５のアミノ酸配列のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４または配列番号１５のアミノ酸配列の１つに対して少なくとも６５％，好ましくは７０％，特に好ましくは７５％より高い同一性を有するポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４または配列番号１５の配列から少なくとも１つのアミノ酸の置換，挿入，欠失または付加により誘導されるポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９または配列番号３０の核酸配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項１８】
ストリンジェントな条件下で配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９または配列番号３０の配列の１つにハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項１９】
２２０−２６０アミノ酸の長さを有し，配列番号３１−配列番号５１からなる群より選択される配列の１またはいくつかの部分配列を含み，かつ式Ｉの化合物を還元して，好ましくは式ＩＩの化合物とするポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，一般式Ｉ：
【化１】
2010539910.tif 000003
［式中，Ｒは，アミノ官能基の保護基（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基，ベンジルオキシカルボニル基，９−フルオレニルメトキシカルボニル基）を表し，Ｘは−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，Ｂｒ，Ｆである］
のケト化合物を，補因子の存在下で酸化還元酵素を用いてエナンチオ選択的に酵素的に還元して，それぞれ式ＩＩ（Ｒ，Ｓ−アルコール）およびＩＩＩ（Ｓ，Ｓ−アルコール）：
【化２】
2010539910.tif 000004
の化合物とする方法に関する。
【０００２】
式Ｉの好ましい化合物は，アミノ保護基としてブチルオキシカルボニル基またはベンジルオキシカルボニル基を含み，Ｘの位置に塩素原子を含む。
【背景技術】
【０００３】
一般式ＩＩおよびＩＩＩのキラルアルコールは，ＨＩＶの治療用のプロテアーゼ阻害剤の製造における重要な中間体である。このようなプロテアーゼ阻害剤としては，例えば，リトナビル，アンプレナビル，フォサンプレナビル，アタザナビルまたはダルナビルが挙げられる。
【０００４】
それぞれ式ＩＩ（Ｒ，Ｓ−アルコール）およびＩＩＩ（Ｓ，Ｓ−アルコール）の中間体は，例えば，対応する式Ｉのケト化合物をエナンチオ選択的に還元することにより得ることができ，これは現在の製造プロセスでは化学的に行われる。これを行う際に，化学的に触媒される還元反応は，一方では激しい反応条件のため副生成物が生じ，他方ではそれぞれエナンチオマーおよびジアステレオマー過剰の収率は満足的できるものではなく，非常に大きな努力を払ってのみ技術的に実現可能であるという欠点を有する。このため，エナンチオマー的に濃縮された形の式ＩＩ（Ｒ，Ｓ−アルコール）の中間体は，式ＩＩＩ（Ｓ，Ｓ−アルコール）より化学的に入手しにくい。
【０００５】
この理由のため，かなり長い期間，該中間体のエナンチオ選択的還元を可能とする生物触媒プロセスを開発しようとする努力がなされてきた。生物触媒プロセスは，通常は，温和な条件下で進行し，このため，さらなる副生成物を形成せずに式Ｉのケト化合物を還元することが可能であると期待することができる。しかし，これまでのところ，単離された酵素を用いる酵素的還元が可能な，適当な生物触媒を見いだすことはできなかった。
【０００６】
我々の知る限りでは，わずかに，式Ｉのケトンを全細胞プロセスでＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの株と反応させることを記載した刊行物が存在する（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  １４（２００３）３１０５−３１０９，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  ８（１９９７）ｐ．２５４７）。しかし，反応はそれぞれ野生型株の全細胞および溶解物を用いて実施されており，したがって，補酵素の再生なしに，２％よりはるかに低い非常に低濃度でしか行われて来なかった。これまでのところ，工業的規模で適用しうる酵素的還元プロセスは利用可能ではなく，反応に関与する酵素は単離されたことも同定されたこともない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は，一般式ＩＩおよびＩＩＩの，エナンチオマー的に純粋な，それぞれエナンチオマー的に濃縮された中間体を，高いエナンチオマー純度で副生成物なしで，高収率かつ経済的に製造することを可能とするプロセスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明にしたがえば，かかる目的は，上述のプロセスにより達成され，このプロセスは，式ＩＩの化合物（Ｒ，Ｓ−アルコール）の製造に用いられる酸化還元酵素が，以下のいずれか：
ａ）配列番号１，配列番号２，配列番号３または配列番号４にしたがうアミノ酸配列を含む，
ｂ）アミノ酸の少なくとも６０％が配列番号１，配列番号２，配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列のものと同一であるアミノ酸配列を含む，または
ｃ）少なくとも７０％のアミノ酸が配列番号１，配列番号２，配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列のものと同一であるアミノ酸配列を含む，または
ｄ）配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８または配列番号１９の核酸配列によりコードされる，または
ｅ）ストリンジェントな条件下で配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８または配列番号１９にハイブリダイズする核酸配列によりコードされる，
ｆ）２２０−２６０アミノ酸の長さを有し，配列番号３１−配列番号５１：
ｎａｌｖｔｇａｓｒｇｉｇ（３１）
ｎａｌｖｔｇｇｓｒｇｉｇ（３２）
ｇｙｓｖｔ（３３）
ｇｙｎｖｔ（３４）
ｇｙｇｉｔｌ（３５）
ｇｙｇｖｔ（５１）
ｖｌａｋｌｐ（３６）
ｖｋａｋｌｐ（３７）
ｆｋｇａｐｌｐａ（３８）
ｆｒｇａｐｌｐａ（３９）
ｌｋｇａｐｌｐａ（４０）
ｓｐｉａｌｔｋ（４１）
ｓｐｖａｌｔｋ（４２）
ｓｑｉａｌｔｑ（４３）
ａｖｙｓａｓｋ（４４）
ａｖｙｓａｔｋ（４５）
ｇｖｙｓａｔｋ（４６）
ｐｉｋｇｗｉ（４７）
ｐｉｅｇｗｉ（４８）
ｐｉｇｇｗｉ（４９）および
ｐｉｓｇｗｉ（５０）
の配列からなる群より選択される部分配列の１または数個を含む，
であることを特徴とし，式Ｉの化合物を還元して，好ましくは式ＩＩの化合物とする。
【０００９】
さらに，かかる目的は，上述のプロセスにより達成され，このプロセスは，式ＩＩＩの化合物（Ｓ，Ｓ−アルコール）の製造に用いられる酸化還元酵素が以下のいずれか，
ａ）配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４または配列番号１５にしたがうアミノ酸配列を含む，
ｂ）少なくとも６０％のアミノ酸が配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４または配列番号１５にしたがうアミノ酸配列のものと同一であるアミノ酸配列を含む，または
ｃ）配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９または配列番号３０の核酸配列によりコードされる，または
ｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９または配列番号３０にハイブリダイズする核酸配列によりコードされる，または
ｅ）２２０−２６０アミノ酸の長さを有し，配列番号３１−配列番号６６：
ｎａｌｖｔｇａｓｒｇｉｇ（３１）
ｎａｌｖｔｇｇｓｒｇｉｇ（３２）
ｇｙｓｖｔ（３３）
ｇｙｎｖｔ（３４）
ｇｙｇｉｔｌ（３５）
ｇｙｇｖｔ（５１）
ｖｌａｋｌｐ（３６）
ｖｋａｋｌｐ（３７）
ｆｋｇａｐｌｐａ（３８）
ｆｒｇａｐｌｐａ（３９）
ｌｋｇａｐｌｐａ（４０）
ｆｋａａｐｌｐａ（５２）
ｆｋｇｓｐｌｐａ（５３）
ｓｐｉａｌｔｋ（４１）
ｓｐｖａｌｔｋ（４２）
ｓｑｉａｌｔｑ（４３）
ａｖｙｓａｓｋ（４４）
ａｖｙｓａｔｋ（４５）
ｇｖｙｓａｔｋ（４６）
ｐｉｋｇｗｉ（４７）
ｐｉｅｇｗｉ（４８）
ｐｉｇｇｗｉ（４９）
ｐｉｓｇｗｉ（５０）
ｇｉｇｒａｔ（５４）
ｇｉｇｒａｓａ（５５）
ｇｉｇｒｅｔ（５６）
ｎｎａｇｉｇ（５７）
ｎｎａｇｉｅｇ（５８）
ｉｒｖｖａｉａｐｇ（５９）
ｉｒｖｎａｉａｐｇ（６０）
ｉｒｖｎａｉｃｐｇ（６１）
ｉｒｖｖｇｉａｐｇ（６２）
ｐｅｑｉａｇａｖ（６３）
ｐｅａｉａｎａｖ（６４）
ｐｅｅｖａｎａｖ（６５），および
ｐｅａｉａｎａｖ（６６）
の配列からなる群より選択される部分配列の１または数個を含む，
であることを特徴とし，式Ｉの化合物を還元して，好ましくは式ＩＩＩの化合物とする。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
式Ｉの化合物を還元して好ましくは式ＩＩの化合物とするポリペプチドは，最適反応条件下で達成可能なＲ，Ｓ−アルコールの最大エナンチオマー過剰が少なくとも５０％であるようなポリペプチドであることが理解される。したがって，最適反応条件は，ポリペプチドがＲ，Ｓ−アルコールの最高のエナンチオマー過剰を与えるような，ポリペプチドの反応条件であると理解される。
【００１１】
配列番号１，配列番号２，配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドが酸化還元酵素活性を示し，これを用いて式Ｉの化合物を還元して，好ましくは式ＩＩの化合物（Ｒ，Ｓ−化合物）としうることが見いだされた。達成しうるＲ，Ｓ−アルコールのエナンチオマー過剰は５０％より高く，好ましくは８０％より高く，特に好ましくは９５％より高い。例えば，配列番号１を用いたときに達成されるエナンチオマー過剰は，９９％より高いＲ，Ｓ−化合物（式ＩＩ）である。
【００１２】
同様に，配列番号５から配列番号１５のアミノ酸配列を含むポリペプチドが酸化還元酵素活性を示し，これを用いて式Ｉの化合物を還元して，好ましくは式ＩＩＩの化合物（Ｓ，Ｓ−化合物）としうることが見いだされた。達成しうるＲ，Ｓ−アルコールのエナンチオマー過剰は８０％より高く，好ましくは９０％より高く，特に好ましくは９５％より高い。配列番号５，配列番号６，配列番号９または配列番号１２を用いたときに達成されるエナンチオマー過剰は，９９％より高いＲ，Ｓ−化合物（式ＩＩ）でありうる。
【００１３】
上述した多数の酸化還元酵素，例えば，配列番号１，３，４，５，６，７および１５は，二級アルコールを還元することにより，還元の間に形成される酸化された補因子を再生することができるというさらに別の利点を有する。すなわち，従来技術法と比較して，該酸化還元酵素の特に経済的な利点は，補因子再生のためにさらに別の酵素を用いる必要がないという点にもある。
【００１４】
配列番号５を含むポリペプチドをコードする配列番号２０のＤＮＡ配列は，例えば，生物Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ９９４１のゲノムから得ることができる。
【００１５】
配列番号６を含むポリペプチドをコードする配列番号２１のＤＮＡ配列は，例えば，生物Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＤＳＭ４６５のゲノムから得ることができる。
【００１６】
配列番号７を含むポリペプチドをコードする配列番号２２のＤＮＡ配列は，例えば，生物Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ６３５のゲノムから得ることができる。
【００１７】
それぞれ配列番号８または配列番号９を含むポリペプチドをコードする配列番号２３のＤＮＡ配列または配列番号２４のＤＮＡ配列は，例えば，生物Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ  ＤＳＭＺ７０６３８のゲノムから得ることができる。
【００１８】
配列番号１１を含むポリペプチドをコードする配列番号２６のＤＮＡ配列は，例えば，生物Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ  ＤＳＭＺ７０６３９のゲノムから得ることができる。
【００１９】
配列番号１を含むポリペプチドをコードする配列番号１６のＤＮＡ配列は，例えば，生物Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ  ＣＢＳ６３９６のゲノムから得ることができる。
【００２０】
さらに，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４および配列番号１５の酸化還元酵素は，例えば，Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ  ＣＢＳ５６５９，ＣＢＳ７３１８，ＣＢＳ２７９８，ＪＣＭ９４４８，Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｅｏｃｈａｒｅｓ  ＭＵＣＬ２９８３２，Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｅｃ．ＭＵＣＬ４０６６０，Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ  ＭＵＣＬ２９８３６の株からホモロジースクリーニングにより得ることができる。
【００２１】
すなわち，本発明は，一般式Ｉのケト化合物を還元して，それぞれ一般式ＩＩおよびＩＩＩの化合物とするプロセスに関し，このプロセスは，配列番号１〜配列番号１５のアミノ酸配列の１つを含むポリペプチド，または配列番号１〜配列番号１５のアミノ酸配列の１つと少なくとも５０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド，すなわち，少なくとも１つのアミノ酸の置換，挿入，欠失または付加により配列番号１〜配列番号１５の配列から誘導しうるポリペプチドを用いることにより，または，配列番号１６〜配列番号３０の核酸配列の１つ，またはストリンジェントな条件下で配列番号１６〜配列番号３０の配列にハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチドを用いることにより，化合物ＩＩまたはＩＩＩの一方が明らかに過剰に形成されることを特徴とする。
【００２２】
ストリンジェントな条件下で，例えば配列番号１６にハイブリダイズする核酸配列は，配列番号１６をＤＮＡプローブとして用いて，コロニーハイブリダイゼーション法，プラークハイブリダイゼーション法，サザンハイブリダイゼーション法，またはこれらと同等の方法により，同定することができるポリヌクレオチドであることが理解される。
【００２３】
この目的のために，フィルター上に固定化したポリヌクレオチドを，例えば，０．７−１ＭのＮａＣｌ溶液中で６０℃で配列番号１６とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは，例えば，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）または同様の刊行物に記載されるようにして行う。次に，フィルターを０．１から２倍のＳＳＣ溶液で６５℃で洗浄する。ここで，１倍のＳＳＣ溶液とは，１５０ｍＭＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムから構成される混合物であることが理解される。
【００２４】
さらに，本発明は，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列のポリペプチド，ならびに，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４および配列番号１５のアミノ酸配列の１つと少なくとも５５％，好ましくは６５％から７５％，特に好ましくは７５％を越える同一性を有するポリペプチド，すなわち，少なくとも１つのアミノ酸の置換，挿入，欠失または付加により，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４および配列番号１５の配列から誘導することができるポリペプチドに関する。さらに，本発明は，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９または配列番号３０の核酸配列により，またはストリンジェントな条件下で配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９または配列番号３０の配列の１つにハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチドに関する。
【００２５】
本発明にしたがうプロセスにおいては，配列番号１−配列番号１５の配列を含むポリペプチドおよびかかるポリペプチドから誘導しうるポリペプチドは，それぞれ，完全に精製された状態で，部分的に精製された状態で，または配列番号１−配列番号１５のポリペプチドの１つを含む細胞として，用いることができる。このようにして用いられる細胞は，天然の状態で，透過性にした状態で，または溶解した状態で提供することができる。好ましくは，配列番号１から配列番号１５の配列を含むポリペプチドおよびこれらから誘導しうるそれぞれの誘導体は，適当な宿主生物，例えば，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉで過剰発現させ，組換えポリペプチドを用いて一般式Ｉのヒドロキシケトンを還元する。
【００２６】
本発明にしたがう酵素的還元は，温和な条件下で進行するため，式Ｉの不安定な化合物の分解を，したがって望ましくない副生成物の形成を，大幅に回避することができる。本発明にしたがうプロセスは，式ＩＩの化合物（Ｒ，Ｓ−化合物）の９９％までの，ただし用いられるポリペプチドによっては少なくとも５０％の，Ｒ，Ｓ−化合物のエナンチオマー純度を有する。
【００２７】
式ＩＩＩの化合物（Ｓ，Ｓ−化合物）については，本発明にしたがうプロセスは，式ＩＩＩの化合物（Ｓ，Ｓ−化合物）の少なくとも９９％の，ただし用いられるポリペプチドによっては８０％の，Ｒ，Ｓ−化合物のエナンチオマー純度を有する。
【００２８】
本発明の好ましい態様は，プロセス中で用いられる補因子が補基質により連続的に還元されることを特徴とする。好ましくは，ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補因子として用い，還元において形成されるＮＡＤ（Ｐ）は補基質によって還元されて元のＮＡＤ（Ｐ）Ｈとなる。
【００２９】
本発明にしたがうプロセスにおいては，酸化還元酵素／デヒドロゲナーゼにより形成される酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰは，好ましくは連続的に再生される。
【００３０】
本発明にしたがうプロセスのすべての好ましい態様によれば，酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰはアルコールの酸化により再生される。
【００３１】
好ましくは，二級アルコール，例えば，２−プロパノール，２−ブタノール，２−ペンタノール，３−ペンタノール，４−メチル−２−ペンタノール，２−ヘプタノール，２−オクタノールまたはシクロヘキサノールを補基質として用いる。特に好ましい態様にしたがえば，２−プロパノールまたは４−メチル−２−ペンタノールを補酵素再生に用いる。再生のための補基質の量は，総容量に基づいて５−９５容量％の範囲であることができる。
【００３２】
好ましくは，一般式ＲＸＲＹＣＨＯＨの二級アルコールを補因子再生に用い，ここで，ＲＸおよびＲＹは，独立して，水素，分枝鎖または非分枝鎖のＣ１−Ｃ８−アルキル基であり，Ｃの合計（Ｃｔｏｔａｌ）は３以上である。
【００３３】
本発明にしたがうプロセスのさらに別の好ましい態様によれば，追加の酸化還元酵素／デヒドロゲナーゼを補因子の再生用に加える。
【００３４】
さらに別の好ましい態様においては，補因子の再生用にさらに追加のアルコールデヒドロゲナーゼを加える。適当なＮＡＤＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼは，例えば，パン酵母から，Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（ＣＰＣＲ）（ＵＳ５，５２３，２２３およびＵＳ５，７６３，２３６，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９３，１５（１１）：９５０−８），Ｐｉｃｈｉａ  ｃａｐｓｕｌａｔａ（ＤＥ１０３２７４５４．４）から，Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＲＥＣＲ）（ＵＳ５，５２３，２２３），Ｎｏｒｃａｒｄｉａ  ｆｕｓｃａ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３（１０），１９９９，ｐ．１７２１−１７２９；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，．２００３，６２（４）：３８０−６；Ｅｐｕｂ  ２００３，Ａｐｒ．２６）またはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００３，６８（２）：４０２−６）から得ることができる。これらのアルコールデヒドロゲナーゼ用の適当な補基質は，例えば，上述した二級アルコール，例えば２−プロパノール（イソプロパノール），２−ブタノール，２−ペンタノール，４−メチル−２−ペンタノール，２−オクタノールまたはシクロヘキサノールである。
【００３５】
ＮＡＤＰＨの再生用の適当な二級アルコールデヒドロゲナーゼは，例えば上述したものであり，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓの目の生物，例えば，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ（ＵＳ５，２００，３３５），Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（ＤＥ１９６１０９８４  Ａ１；Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２０００  Ｄｅｃ；５６  Ｐｔ  １２：１６９６−８），Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒ（ＤＥ１０１１９２７４），Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃａｒｎｏｓｕｍ（Ａ１２６１／２００５，Ｋｌ．Ｃ１２Ｎ），または上述されるようなＴｈｅｒｍｏａｎｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ，Ｔｈｅｒｍｏａｎｅｒｏｂｉｕｍ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉから単離される。
【００３６】
しかし，原理的には他の酵素系も補因子再生に用いることができる。例えば，補因子再生は，ＮＡＤ−またはＮＡＤＰ−依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ（Ｔｉｓｈｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．［１９９９］６４，１８７−１９３，Ｐｉｌｏｔ−ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＮＡＤ  ａｎｄ  ＮＡＤＰ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｏｒｇｅｎａｓｅ）を用いて行うことができる。ギ酸デヒドロゲナーゼの適当な補基質は，例えば，ギ酸の塩，例えばギ酸アンモニウム，ギ酸ナトリウムまたはギ酸カルシウムである。
【００３７】
本発明にしたがうプロセスにおいては，一般式Ｉの化合物は，反応バッチ中で，好ましくは総容量に基づいて１０ｇ／ｌから５００ｇ／ｌ，好ましくは２５ｇ／ｌから３００ｇ／ｌ，特に好ましくは５０ｇ／ｌから２００ｇ／ｌで用いる。
【００３８】
酵素的還元が進行する反応混合物の水性部分は，好ましくはバッファー，例えば，５−１０のｐＨ値，好ましくは６−９のｐＨを有するリン酸カリウム，ｔｒｉｓ／ＨＣｌまたはトリエタノールアミンバッファーを含む。さらに，バッファーは，酵素を安定化させるかまたは活性化させるイオン，例えば，亜鉛イオンまたはマグネシウムイオンを含んでいてもよい。
【００３９】
本発明にしたがうプロセスの実施に際しては，温度は約１０℃−７０℃，好ましくは２０℃−４５℃の範囲が適している。
【００４０】
本発明にしたがうプロセスのさらに別の好ましい態様においては，酵素的反応は，水と混和性でないか，または限定された程度でしか水と混和性でない有機溶媒の存在下で行う。このような溶媒は，例えば，対称のまたは非対称のジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルエーテル，直鎖または分枝鎖のアルカンまたはシクロアルカン，または同時に補基質でもある水不溶性二級アルコールである。好ましい有機溶媒は，ジエチルエーテル，三級ブチルメチルエーテル，ジイソプロピルエーテル，ジブチルエーテル，酢酸ブチル，ヘプタン，ヘキサン，２−オクタノール，２−ヘプタノール，４−メチル−２−ペンタノールおよびシクロヘキサノールである。この場合，溶媒は同時に補因子再生用の補基質としても作用してもよい。
【００４１】
水不溶性である溶媒および補基質を用いる場合には，反応バッチは水性相と有機相から構成される。上記式の化合物は，その溶解度にしたがって，有機相と水性相との間に分配される。一般に，有機相は，全反応容量に基づいて，５から９５％，好ましくは１０から９０％の割合である。２つの液相は，好ましくはこれらの間に大きな表面積が生成するよう，機械的に混合する。また，この態様においては，例えば，上述したもの等の補基質を用いて，酵素的還元の間に形成されるＮＡＤ（Ｐ）を還元して元のＮＡＤ（Ｐ）Ｈとしてもよい。
【００４２】
補因子，特にＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのそれぞれの水性相における濃度は，一般に，０．００１ｍＭから１０ｍＭの範囲であり，特に０．０１ｍＭから１ｍＭである。
【００４３】
本発明にしたがうプロセスにおいて達成されるＴＴＮ（総ターンオーバー数＝還元された式Ｉの化合物のモル数／用いられた補因子のモル数）は，通常は１０２−１０５の範囲内であるが，好ましくは１０３以上である。
【００４４】
本発明にしたがうプロセスにおいては，さらに酸化還元酵素／デヒドロゲナーゼの安定化剤を用いてもよい。適当な安定化剤としては，例えば，グリセロール，ソルビトール，１，４−ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられる。
【００４５】
本発明にしたがうプロセスは，例えば，ガラスまたは金属製の密封反応容器中で行うことができる。この目的のためには，成分を個別に反応容器に入れ，例えば窒素または空気雰囲気下で撹拌する。
【００４６】
本発明の別の可能な態様にしたがえば，反応の平衡を反応生成物側にシフトさせるために，酸化された補基質（例えばアセトン）を連続的に除去することができ，および／または，補基質（例えば２−プロパノール）を連続的に新たに加えることができる。
【００４７】
さらに別の態様においては，配列番号１−配列番号１５にしたがう酸化還元酵素，および／または補基質の添加は，プロセスの経過中に少しずつ行ってもよい。
【００４８】
還元が完了した後，反応混合物を加工する。この目的のために，例えば，水性相を任意に有機相から分離し，生成物を含む有機相を濾過する。任意に，有機相と同様に，水性相も抽出してさらに加工してもよい。その後，有機相から溶媒を蒸発させて一般式ＩＩまたはＩＩＩの生成物を粗生成物として得る。次に，粗生成物をさらに精製してもよく，または最終生成物の合成に直接使用してもよい。
【実施例】
【００４９】
以下に実施例により本発明を具体的に説明する。
【００５０】
実施例１
Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ９９４１（配列番号５）からの酸化還元酵素のクローニングおよび提供
Ａ）  Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ９９４１の培養
Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ９９４１の細胞を，細菌振盪機で下記の培地で５０℃（ｐＨ７．２）で１４０ｒｐｍで培養した：０．１％酵母エキス，０．１％トリプトン，０．００４％ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ，０．０２％ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．０１％ニトリロ三酢酸，１００ｍｌリン酸バッファー［５．４４ｇ／ｌＫＨ２ＰＯ４，４３ｇ／ｌＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ］，５００μｌ／ｌ０．０１Ｍクエン酸Ｆｅ，５００μｌ／ｌ微量元素［５００μｌ／ｌＨ２ＳＯ４，２．２８ｇ／ｌＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ，５００ｍｇ／ｌＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，５００ｍｇＨ３ＢＯ３，２５ｍｇ／ｌＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，２５ｍｇ／ｌＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ，４５ｍｇ／ｌＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ］。培養の第６日に，遠心分離により細胞を培地から分離し，−８０℃で保存した。
【００５１】
Ｂ）  選択的酸化還元酵素をコードする遺伝子の増幅
ゲノムＤＮＡを，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ"，Ｍａｎｎｉａｔｉｓ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載される方法にしたがって抽出した。得られた核酸をテンプレートとして用いて，ＮＣＢＩデータベース番号４６１０６８１７として公表されている遺伝子配列に基づく特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。これを行うにあたって，プライマーには，続く発現ベクターへのクローニング用に５’末端の位置にそれぞれエンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＳｐｈＩの制限部位を含めた（配列番号６７，配列番号６８，配列番号６９）。
【００５２】
増幅は，ＰＣＲバッファー［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．０）；５０ｍＭ  ＫＣｌ；１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４；１ｍＭ  ｄＮＴＰミックス；それぞれの場合に２０ｐＭｏｌのプライマーおよび２．５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］中で，５００ｎｇのゲノムＤＮＡを用い，下記の温度サイクルで行った：
サイクル１：        ９４℃，２分間
サイクル２ｘ３０：  ９４℃，１５秒間
５４℃，３０秒間
６８℃，６０秒間
サイクル３：        ６８℃，７分間
４℃，∞
【００５３】
得られた約７５０ｂｐのサイズのＰＣＲ産物を，１％アガロースゲルで精製した後に，それぞれエンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し，それぞれ同じエンドヌクレアーゼで処理したｐＥＴ２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐＱＥ７０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ）の骨格にライゲーションした。２μｌのライゲーションバッチをＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフォームした後，アンピリシン−耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを，それぞれエンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる制限分析により，７５０ｂｐのサイズを有する挿入物の存在について調べた。フラグメントが陽性であるクローンからのプラスミド調製物を配列分析し，次にそれぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＥ．ｃｏｌｉ  ＲＢ７９１（ｇｅｎｅｔｉｃｓｔｏｃｋ，Ｙａｌｅ）にトランスフォームした。
【００５４】
Ｃ）  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞におけるポリペプチド配列番号５の効率的発現
配列番号５のポリペプチドのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞における効率的な発現のため，配列番号７０のコーディングＤＮＡをテンプレートとして用いて，発現ベクターへのクローニングのためのＰＣＲ反応を行った。第１の領域において，このＤＮＡ配列は既知のＤＮＡ配列（配列番号２０）から１５３塩基異なっていた。この変更は保存的でありアミノ酸配列を変化させない。
【００５５】
増幅は，ＰＣＲバッファー［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．０）；５０ｍＭ  ＫＣｌ；１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４；１ｍＭ  ｄＮＴＰミックス；それぞれ２０ｐＭｏｌのプライマー（配列番号７１，配列番号６８）および２，５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］中で，５０ｎｇの配列番号７０のＤＮＡをテンプレートとして，以下の温度サイクルで行った：
サイクル１：        ９４℃，２分間
サイクル２ｘ３０：  ９４℃，４０秒間
５６℃，３０秒間
６８℃，６０秒間
サイクル３：        ６８℃，７分間
４℃，∞
【００５６】
得られた約７５０ｂｐのサイズを有するＰＣＲ産物を，１％アガロースゲルで精製した後，エンドヌクレアーゼＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて，ｐＥＴ２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）の骨格にライゲーションした。この骨格は，予め同じエンドヌクレアーゼで処理したものである。２μｌのライゲーションバッチをＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフォームした後，アンピリシン−耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを，エンドヌクレアーゼＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる制限分析により，７５０ｂｐのサイズを有する挿入物の存在について調べた。フラグメントについて陽性のクローンからのプラスミド調製物を配列分析し，次にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフォームした。
【００５７】
Ｄ）  Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ９９４１からの酸化還元酵素の調製
それぞれ発現コンストラクトでトランスフォームしたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  Ｓｔａｒ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＲＢ７９１株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｏｃｋ，Ｙａｌｅ，ＵＳＡ）を，アンピリシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む培地（１％トリプトン，０．５％酵母エキス，１％ＮａＣｌ）で，５５０ｎｍで測定した光学密度が０．５となるまで培養した。イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭの濃度で加えることにより組換え蛋白質の発現を誘導した。２５℃，２２０ｒｐｍで１６時間誘導した後，細胞を回収し，−２０℃で凍結した。
【００５８】
酵素の回収のためには，３０ｇの細胞を１５０ｍｌのトリエタノールアミンバッファー（１００ｍＭ，ｐＨ＝７，２ｍＭＭｇＣｌ２，１０％グリセロール）に懸濁し，高圧ホモジナイザーを用いて破壊した。次に，酵素溶液を１５０ｍｌのグリセロールと混合し，−２０℃で保存した。
【００５９】
このようにして得られた酵素溶液を用いて化合物Ｉを還元した（実施例３）。
【００６０】
実施例２に記載される手順と同様にして，配列番号６および配列番号７の酸化還元酵素も得ることができる。
【００６１】
実施例２
分子スクリーニングによるＣａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅからの酸化還元酵素のクローニングおよび提供（配列番号１）
Ａ）  酸化還元酵素の分子スクリーニング
Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ  ＣＢＳ６３９６の細胞から単離したゲノムＤＮＡを，ＰＣＲによる分子スクリーニングのテンプレートとして用いた。これを行うに際し，増幅は，ＰＣＲバッファー［１６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４；６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３（２５℃）；１．５ｍＭｇＣｌ２；０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０；０．２ｍＭｄＮＴＰミックス；それぞれ３０ｐＭｏｌのプライマー（配列番号７２，配列番号７３）および１．２５ＵのＢｉｏＴｈｅｒｍ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ）］中で，Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ  ＣＢＳ６３９６の細胞から単離した５０ｎｇのゲノムＤＮＡをテンプレートとして，下記のサイクルで行った：
サイクル１：        ９５℃，７分間
サイクル２ｘ２８：  ９４℃，４０秒間
温度降下開始６３℃  −０，５℃／段階，３０秒間
６８℃，６０秒間ｘ２０
９４℃，４０秒間
５３℃，４０秒間
７０℃，６０秒間
サイクル３：７０℃，７分間
４℃，∞
【００６２】
全ＰＣＲバッチを１％アガロースゲルで分画した後，約４００ｂｐのバンドを同定し，オーバーハングしたアデノシン成分を利用してＴｏｐｏ−ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして，ＤＮＡ配列を決定した。
【００６３】
スクリーニング反応から得られたＤＮＡバンドは，１３７アミノ酸残基の酸化還元酵素のフラグメントに対応するオープンリーディングフレームを示した。
【００６４】
Ｂ）  単離（総ＲＮＡおよびｍＲＮＡ）
６００ｍｇの新鮮な細胞を２．５ｍｌの氷冷ＬＥＴＳバッファーに再懸濁した。この細胞懸濁液に，硝酸で洗浄し，３ｍｌのフェノール（ｐＨ７．０）で平衡化した５ｍｌ（約２０ｇ）のガラスビーズを加えた。次に全バッチを，３０秒間のボルテックスと３０秒間の氷冷を交互に，合計１０分間処理した。次に，５ｍｌの氷冷ＬＥＴＳバッファーを加え，再び激しくボルテックスした。この細胞懸濁液を４℃で１１０００ｇで５分間遠心分離した。水性相を回収し，等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：２４：１）で２回抽出した。次に，クロロホルムで抽出した。最後の抽出後，１／１０用量の５ＭＬｉＣｌ２を加えて，総ＲＮＡを−２０℃で４時間沈殿させた。
【００６５】
このようにして得られた１ｍｇの総ＲＮＡを用いて，オリゴｄＴセルロース（ＮＥＢ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によりｍＲＮＡ分子を濃縮した。酸化還元酵素をコードする全配列の決定は，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ"，Ｍａｎｎｉａｔｉｓ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載される方法にしたがって，ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）により行った。酸化還元酵素をコードする遺伝子配列は，２３９アミノ酸残基の長さに対応する７２０塩基対を含んでいた。
【００６６】
Ｃ）  ＰＣＲによるＣａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅＣＢＳ６３９６から短鎖ＡＤＨをコードする全長転写産物の合成
続いて全長転写産物を適当な発現系にクローニングするために，特異的プライマーを構築した。これを行うに際し，ＮｄｅＩの認識配列を有する５’−プライマーおよびＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を有する３’−プライマーを改変した（配列番号７４，配列番号７５）。Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ  ＣＢＳ６３９６の細胞から単離したゲノムＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応のテンプレートとして用いた。増幅は，ＰＣＲバッファー［１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；５０ｍＭＫＣｌ；１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４；１ｍＭｄＮＴＰミックス；それぞれ２０ｐＭｏｌのプライマーおよび２．５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］中で，５０ｎｇのテンプレートおよび以下の温度サイクルを用いて行った:
サイクル１：        ９４℃，２分間
サイクル２ｘ３０：  ９４℃，１５秒間
５８℃，３０秒間
６８℃，７５秒間
サイクル３：        ６８℃，７分間
４℃，∞
【００６７】
得られたＰＣＲ産物を，１％アガロースゲルで精製した後，エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断し，ｐＥＴ２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）の骨格にライゲーションした。この骨格は，同じエンドヌクレアーゼで予め処理したものである。２μｌのライゲーションバッチをＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフォームした後，アンピリシン（またはカナマイシン）耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを，エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＨｉｎｄを用いる制限分析により，７５０ｂｐのサイズを有する挿入物について調べた。発現コンストラクトｐＥＴ２１−ＭＩＸを配列決定した。Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅからの短鎖酸化還元酵素をコードする遺伝子は，合計で７２０ｂｐ（配列番号１６）のオープンリーディングフレームを有しており，これは２３９アミノ酸（配列番号１）の蛋白質に対応した。
【００６８】
Ｄ）  組換え酸化還元酵素のＥ．ｃｏｌｉ細胞における発現
コンピテントのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓｔａｒ  ＢＬ２１（Ｄｅ３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＲＢ７９１細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇｅｎｅｔｉｃｓｔｏｃｋ，Ｙａｌｅ，ＵＳＡ）をそれぞれ，酸化還元酵素をコードする発現コンストラクトｐＥＴ２１−ＭＩＸでトランスフォームした。次に，発現コンストラクトでトランスフォームしたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉコロニーを，それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピリシンまたは４０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２００ｍｌのＬＢ培地（１％トリプトン，０．５％酵母エキス，１％ＮａＣｌ）で，５５０ｎｍで測定した光学密度が０．５となるまで培養した。イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭの濃度で加えることにより組換え蛋白質の発現を誘導した。２５℃で２２０ｒｐｍで１６時間インキュベーションした後，細胞を回収し，−２０℃で凍結した。活性試験用には，１０ｍｇの細胞を５００μｌの１００ｍＭＴＥＡバッファー（ｐＨ７．０），１ｍＭＭｇＣｌ２および５００μｌのガラスビーズと混合し，グローブミルを用いて１０分間破砕した。次に，得られた溶解物を希釈した状態で用いて，それぞれの測定を行った。
【００６９】
活性試験は次のように作成した：９６０μｌの１００ｍＭＴＥＡバッファー（ｐＨ７．０），１ｍＭのＭｇＣｌ２，１６０μｇのＮＡＤＰＨ，１０μｌの希釈細胞溶解物。反応は，１０μｌの１００ｍＭ基質溶液を反応混合物に加えることにより開始した。
【００７０】
酵素を大量に回収するためには，３０ｇの細胞を１５０ｍｌのトリエタノールアミンバッファー（１００ｍＭ，ｐＨ７，２ｍＭＭｇＣｌ２，１０％グリセロール）に再懸濁し，高圧ホモジナイザーを用いて破砕した。次に，酵素溶液を１５０ｍｌのグリセロールと混合し，−２０℃で保存した。
【００７１】
実施例２に記載される手順と同様にして，配列番号２，３，４，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５の酸化還元酵素も得ることができる。
【００７２】
実施例３：
配列番号１から配列番号１５の酸化還元酵素が式Ｉの化合物を還元する特性についての特徴付け
配列番号１から配列番号１５の配列の酸化還元酵素を，式Ｉの化合物の変換について下記のようにして試験した。
【表１】
2010539910.tif 000005
【００７３】
サンプルＡおよびＢを２４時間インキュベーションした後，１ｍｌのアセトニトリルをそれぞれ全反応バッチに加え，反応バッチを遠心分離し，ＨＰＬＣ分析容器（１ｍｇ／ｍｌ）に移した。
【００７４】
反応バッチをＨＰＬＣ（Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ  １００５  Ｃ１８ｅｃ，１２５ｍｍ，直径４ｍｍ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）により分析した。流速１ｍｌ／分で，アセトニトリル（Ｂ）と水（Ａ）の溶媒系を使用した。４０％から８０％に増加するアセトニトリルの直線勾配により，式Ｉ，ＩＩおよびＩＩＩの化合物を１０分以内に分離することができた。
【００７５】
保持時間は次のとおりであった：（ケトン，式Ｉ）１０．０分間；（Ｒ，Ｓ−化合物，式ＩＩ）９．３分間および（Ｓ，Ｓ−化合物，式ＩＩＩ）８．５分間。
【００７６】
結果
【表２】
2010539910.tif 000006
【００７７】
実施例４：
配列番号１の酸化還元酵素による式Ｉの化合物の式ＩＩの化合物（Ｒ，Ｓ−化合物）への変換
式Ｉの化合物を式ＩＩの化合物（Ｒ，Ｓ−化合物）に変換するために，２．２５ｍｌの配列番号１（実施例１Ｄを参照）の酵素懸濁液および７５ユニット（＝２ｍｌ）の過剰発現させたＴｈｅｒｍｏａｎｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉのアルコールデヒドロゲナーゼをそれぞれ３ｍｌのバッファー（１００ｍＭＴＥＡ，ｐＨ＝８，１０％グリセロール），１．５ｇの式Ｉの化合物，０．３ｍｇのＮＡＤＰおよび７ｍｌの４−メチル−２−ペンタノールの混合物に加えた。反応混合物を室温でよく撹拌しながらインキュベーションした。４８時間後，用いた式Ｉの化合物の９５％より多くが式ＩＩの化合物に還元された。エナンチオマー過剰は９８％より高かった。
【００７８】
実施例５：
配列番号５の酸化還元酵素による式Ｉの化合物の式ＩＩＩの化合物（Ｓ，Ｓ−化合物）への変換
さらに，式Ｉの化合物を式ＩＩＩの化合物（Ｓ，Ｓ−化合物）に変換するために，６００μｌのバッファー（１００ｍＭＴＥＡ，ｐＨ＝９），２００μｌの２−プロパノール，５０ｍｇの式Ｉの化合物，０．１ｍｇのＮＡＤおよび２００μｌの配列番号５の酵素懸濁液（実施例１Ｄを参照）の混合物をエッペンドルフ反応容器中でインキュベーションした。反応混合物を室温でよく撹拌しながらインキュベーションした。４８時間後，用いた式Ｉの化合物の９０％より多くが式ＩＩＩの化合物（Ｓ，Ｓ）に還元された。エナンチオマー過剰は９８％より高かった。
【表３】
2010539910.tif 000007
【００７９】
【表４】
2010539910.tif 000008
【００８０】
【表５】
2010539910.tif 000009
【００８１】
【表６】
2010539910.tif 000010
【００８２】
【表７】
2010539910.tif 000011
【００８３】
【表８】
2010539910.tif 000012
【００８４】
【表９】
2010539910.tif 000013
【００８５】
【表１０】
2010539910.tif 000014
【００８６】
【表１１】
2010539910.tif 000015
【００８７】
【表１２】
2010539910.tif 000016
【００８８】
【表１３】
2010539910.tif 000017
【００８９】
【表１４】
2010539910.tif 000018
【００９０】
【表１５】
2010539910.tif 000019

【配列表】
2010539910000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年11月20日(2009.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ：
【化１】
2010539910.tif 000043
［式中，Ｒはアミノ官能基の保護基を表し，およびＸは−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，Ｂｒ，Ｆである］
のケト化合物をエナンチオ選択的に酵素的に還元して一般式ＩＩ（Ｒ，Ｓ−化合物）：
【化２】
2010539910.tif 000044
［式中，ＲおよびＸは式Ｉにおけるものと同じ意味である］
のヒドロキシ化合物とする方法であって，
ケト化合物を，補因子の存在下で酸化還元酵素で還元し，ここで，形成された酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰは，一般式ＲＸＲＹＣＨＯＨ（ＲＸ，ＲＹは，独立して，水素，分枝鎖または非分枝鎖のＣ１−Ｃ８のアルキル基を表し，Ｃの合計は３以上である）の二級アルコールの酸化により連続的に再生されることを特徴とする方法。
【請求項２】
一般式Ｉ：
【化３】
2010539910.tif 000045
［式中，Ｒはアミノ官能基の保護基を表し，Ｘは−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，Ｂｒ，Ｆである］
のケト化合物をエナンチオ選択的に酵素的に還元して一般式ＩＩ（Ｒ，Ｓ−化合物）：
【化４】
2010539910.tif 000046
［式中，ＲおよびＸは式Ｉにおけるものと同じ意味である］
のヒドロキシ化合物とする方法であって，
ケト化合物を，補因子の存在下で酸化還元酵素により還元し，該酸化還元酵素は，
ａ）  配列番号１，配列番号２，配列番号３または配列番号４にしたがうアミノ酸配列を含む，または
ｂ）  少なくとも６５％のアミノ酸が配列番号１，配列番号２，配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列のものと同一であるアミノ酸配列を含む，または
ｃ）少なくとも７２％のアミノ酸が配列番号１，配列番号２，配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列のものと同一であるアミノ酸配列を含む，または
ｄ）配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８または配列番号１９の核酸配列によりコードされる，または
ｅ）ストリンジェントな条件下で配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８または配列番号１９にハイブリダイズする核酸配列によりコードされる，または
ｆ）２２０−２６０アミノ酸の長さを有し，配列番号３１−配列番号５１の配列からなる群より選択される部分配列の１または数個を含む，
のいずれかであり，
そして，式Ｉの化合物を還元して式ＩＩの化合物とする，
の各工程を含む方法。
【請求項３】
一般式Ｉ：
【化５】
2010539910.tif 000047
［式中，Ｒはアミノ官能基の保護基を表し，Ｘは−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，Ｂｒ，Ｆである］
のケト化合物をエナンチオ選択的に酵素的に還元して一般式ＩＩＩ（Ｓ，Ｓ−化合物）：
【化６】
2010539910.tif 000048
［式中，ＲおよびＸは式Ｉにおけるものと同じ意味である］
のヒドロキシ化合物とする方法であって，ケト化合物を補因子の存在下で酸化還元酵素により還元し，ここで，形成された酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰは，一般式ＲＸＲＹＣＨＯＨ［式中，ＲＸ，ＲＹは，独立して，水素，分枝鎖または非分枝鎖のＣ１−Ｃ８のアルキル基であり，およびＣの合計は３以上である］の二級アルコールの酸化により連続的に再生されることを特徴とする方法。
【請求項４】
一般式Ｉ：
【化７】
2010539910.tif 000049
［式中，Ｒはアミノ官能基の保護基を表し，Ｘは−Ｃｌ，−ＣＮ，−ＯＨ，Ｂｒ，Ｆである］
のケト化合物をエナンチオ選択的に酵素的に還元して，一般式ＩＩＩ（Ｓ，Ｓ−化合物）：
【化８】
2010539910.tif 000050
［式中，ＲおよびＸは式Ｉにおけるものと同じ意味である］
のヒドロキシ化合物とする方法であって，ケト化合物を補因子の存在下で酸化還元酵素により還元し，該酸化還元酵素は，
ａ）配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４または配列番号１５にしたがうアミノ酸配列を含む，または
ｂ）アミノ酸の少なくとも６５％が配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４または配列番号１５にしたがうアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む，または
ｃ）配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９または配列番号３０の核酸配列によりコードされる，または
ｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９または配列番号３０にハイブリダイズする核酸配列によりコードされる，または
ｅ）２２０−２６０アミノ酸の長さを有し，配列番号３１−配列番号６６の配列からなる群より選択される部分配列の１またはいくつかを含む，
のいずれかであり，
そして，式Ｉの化合物を還元して式ＩＩＩの化合物とする，
の各工程を含む方法。
【請求項５】
アミノ官能基の保護基は，ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基，ベンジルオキシカルボニル基または９−フルオレニルメトキシカルボニル基である，請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
形成された酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰが連続的に再生される，請求項２または４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
形成された酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰが，一般式ＲＸＲＹＣＨＯＨの二級アルコールの酸化により連続的に再生される，請求項２または４−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
２−プロパノール，２−ブタノール，２−ペンタノール，４−メチル−２−ペンタノール，２−ヘプタノールまたは２−オクタノールをそれぞれ補基質または二級アルコールとして用いる，請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
補因子の再生用に追加の酸化還元酵素／デヒドロゲナーゼを加える，請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
式１の化合物は，２０ｇ／ｌ以上の濃度で反応バッチ中に存在する，請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
式１の化合物は，５０ｇ／ｌより高い高い濃度で反応バッチ中に存在する，請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
式１の化合物は，１００ｇ／ｌより高い濃度で反応バッチ中に存在する，請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＴＴＮ（総ターンオーバー数＝還元された式Ｉの化合物のモル数／用いられた補因子のモル数）は１０３以上である，請求項１−１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
水性有機二相系で実施される，請求項１−１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
さらに，有機溶媒を用いる，請求項１−１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
有機溶媒は，ジエチルエーテル，三級ブチルメチルエーテル，ジイソプロピルエーテル，ジブチルエーテル，酢酸エチル，酢酸ブチル，ヘプタン，ヘキサンおよびシクロヘキサンから選択される，請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
式ＩＶ：
【化９】
2010539910.tif 000051
の特定の化合物をケト化合物として用いる，請求項１−１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４または配列番号１５のアミノ酸配列のポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４のアミノ酸配列の１つに対して少なくとも６５％の同一性を有するか，または配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号１１のアミノ酸配列の１つに対して少なくとも７０％の同一性を有するか，または配列番号１５のアミノ酸配列の１つに対して７５％より高い同一性を有するポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９または配列番号３０の核酸配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項２１】
ストリンジェントな条件下で配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９または配列番号３０の配列の１つにハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド。
【国際調査報告】
2010539910.tif 000052
2010539910.tif 000053
2010539910.tif 000054