(57)【要約】標的遺伝子のプロモーターと重複しているコードされたアンチセンス転写物の存在を決定する工程；前記転写物と、前記遺伝子の転写開始部位に対して上流の前記転写物の部分に相補的なagRNAまたはギャップマーとを接触させる工程；および結果として得られる標的遺伝子発現の調節を検出する工程によって、その必要があると決定された哺乳動物細胞のゲノムにおいて遺伝子発現が選択的に調節される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子のプロモーターと重複（overlap）しているコードされたアンチセンス転写物の存在を決定する工程；
前記転写物と、外因性のギャップマー（gapmer）または二本鎖agRNAとを接触させる工程；および
結果として得られる標的遺伝子発現の調節を検出する工程
を含む、その必要があると決定された哺乳動物細胞のゲノム中の標的遺伝子の発現を選択的に調節する方法であって、
ギャップマーが、前記遺伝子の転写開始部位に対して上流の前記転写物の部分に相補的なDNA挿入物を含み、かつagRNAが、前記遺伝子の転写開始部位に対して上流の前記転写物の部分に相補的でありかつ18〜28個の塩基である、
方法。
【請求項２】
決定する工程が、アンチセンス転写物を同定するために転写データを調べることによって、インシリコで実行される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
決定する工程が、アンチセンス転写物を実験により同定するために5'-RACE/3'-RACEを使用することによって、インビトロで実行される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
agRNAまたはDNA挿入物が、遺伝子の転写開始部位に対して100個を超える塩基分上流の転写物の部分に相補的である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
agRNAまたはDNA挿入物が、遺伝子の転写開始部位に対して200個を超える塩基分上流の転写物の部分に相補的である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
agRNAまたはDNA挿入物が、遺伝子の転写開始部位に対して1,000個を超える塩基分上流の転写物の部分に相補的である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
agRNAまたはDNA挿入物が、標的遺伝子のモジュレーターであることがアプリオリ（a priori）に知られているわけではない、請求項1記載の方法。
【請求項８】
アンチセンス転写物が、標的遺伝子のプロモーターと重複していることがアプリオリに知られているわけではない、請求項1記載の方法。
【請求項９】
調節がメチラーゼ非依存性である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
調節がメチラーゼ非依存性であることを確認する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
agRNAまたはDNA挿入物が、CpG島の外側の転写物の部分に相補的である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
agRNAまたはDNA挿入物がCpG島の外側の転写物の部分に相補的であることを確認する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
接触させる工程が、ウイルス形質導入を含まない、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
接触させる工程が、agRNAまたはDNA挿入物から本質的になる組成物と細胞とを接触させることによって実行される、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
接触させる工程が、1〜100ナノモル濃度でagRNAまたはDNA挿入物を含む組成物と細胞とを接触させることによって実行される、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
検出する工程が、標的遺伝子の少なくとも50%増加した発現を検出することによって実行される、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
検出する工程が、標的遺伝子の少なくとも200%増加した発現を検出することによって実行される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
検出する工程が、標的遺伝子の少なくとも50%減少した発現を検出することによって実行される、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
検出する工程が、標的遺伝子の少なくとも75%減少した発現を検出することによって実行される、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
転写物の1つの部分しか標的とされない、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：Jacob C. Schwartz、Scott T. Younger、Bethany A. Janowski、David R. Corey。この研究は、NIHによって与えられた助成金の下で政府支援によって成された（NIGMS 60642および73042ならびにNIBIB F31 EB005556-01）。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2007年10月4日に出願された米国出願第60/977,631号、および2008年2月24日に出願された米国出願第61/030,985号の優先権を主張する。
【０００３】
発明の分野
本発明の分野は、遺伝子のプロモーターと重複（overlap）しているアンチセンス転写物を標的とするアンチジーンRNAまたはギャップマー（gapmer）を使用して、遺伝子発現を調節することである。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
最近の研究によって、プロモーター領域に相補的な二本鎖RNAが、遺伝子発現を抑制1-8または活性化9,10し得ることが報告された。これらのプロモーター指向性RNA（promoter directed RNA）（pdRNA）の機構ははっきりしていない。マイクロアレイ解析を使用する他の最近の研究によって、mRNAをコードするゲノムの領域を取り囲む非コード転写物のネットワークが明らかにされた11-14。これらのRNAネットワークの機能もまた理解されていない。本明細書において、本発明者らは、これら2つのセットの謎の結果を結び付ける。本発明者らは、プロゲステロン受容体（PR）についてのプロモーターにおけるアンチセンス転写物のネットワークを究明する。本発明者らは、pdRNAがアンチセンス転写物と結合すること、およびpdRNAによる遺伝子発現の活性化はアンチセンス転写物の発現を必要とすることを示す。pdRNAは、PRプロモーターおよびPRアンチセンス転写物の両方へアルゴノートタンパク質をリクルートする。pdRNAは、多機能タンパク質であるヘテロ核リボタンパク質k（hnRNP-k）の局在を染色体DNAからアンチセンス転写物へ移す。これらのデータは、pdRNAが遺伝子プロモーターにおけるタンパク質相互作用を著しくリモデリングし得ることを実証している。本発明者らの結果は、pdRNAの作用とアンチセンス転写物の認識とを結び付け、プロモーターにおけるRNA媒介遺伝子調節についての機構を提供する。
【０００５】
本発明者らは、遺伝子プロモーター内の標的配列に相補的なpdRNAが、哺乳動物細胞中における遺伝子発現を選択的に活性化または阻害し得ることを観察した。pdRNAは、プロモーターDNAへアルゴノートタンパク質をリクルートし、アルゴノートタンパク質のレベルを低下させることは、pdRNA活性を遮断する。アルゴノートタンパク質は、転写後RNAiの間、低分子RNAによるmRNAの認識を媒介することが公知であり15, 16、本発明者らは、それらのpdRNAもまたRNA標的を有し得ると仮定した。しかし、本発明者らのpdRNAについて公知のRNA標的はなかった。本発明者らは、pdRNAは、遺伝子プロモーターと重複している、以前は未発見であった転写物を認識すること、および、標的遺伝子の発現を調節するために、アンチジーンRNAおよびギャップマーを含む、標的化pdRNAを使用し得ることを開示する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、その必要があると決定された哺乳動物細胞のゲノム中の標的遺伝子の発現を選択的に調節する包括的な方法を提供し、該方法は、（a）転写物と、外因性のギャップマーまたは二本鎖agRNAとを接触させる工程；および（b）結果として得られる標的遺伝子発現の調節を検出する工程を含み、ギャップマーは、前記遺伝子の転写開始部位に対して上流の前記転写物の部分に相補的なDNA挿入物を含み、かつagRNAは、前記遺伝子の転写開始部位に対して上流の前記転写物の部分に相補的でありかつ18〜28個の塩基である。
【０００７】
本発明の各局面および態様の特定の態様において、発現は、標的遺伝子転写のレベルで調節および/または検出される。
【０００８】
特定の態様において、本方法は、標的遺伝子のプロモーターと重複しているコードされたアンチセンス転写物の存在を決定する先行工程を含み、この工程は、アンチセンス転写物を同定するために転写データを調べることによってインシリコで、および/またはアンチセンス転写物を実験により同定するために5'-RACE/3'-RACE（相補末端の迅速増幅）を使用することによってインビトロで、実行され得る。
【０００９】
特定の態様において、DNA挿入物は、遺伝子の転写開始部位に対して100個を超える、200個を超える、または1,000個を超える塩基分上流の転写物の部分に相補的である。
【００１０】
特定の態様において、agRNA、ギャップマーおよび/またはDNA挿入物は、標的遺伝子のモジュレーターであることがアプリオリ（a priori）に知られているわけではなく、および/またはアンチセンス転写物は、標的遺伝子のプロモーターと重複していることがアプリオリに知られているわけではない。
【００１１】
特定の態様において、調節はメチラーゼ非依存性であり、および/またはagRNAまたはDNA挿入物は、CpG島を含まない転写物の部分に相補的である。関連する態様において、本方法は、調節がメチラーゼ非依存性であることを確認する工程、および/またはagRNAまたはDNA挿入物がCpG島を含まない転写物の部分に相補的であることを確認する工程をさらに含む。
【００１２】
特定の態様において、接触させる工程は、ウイルス形質導入を含まない。
【００１３】
特定の態様において、接触させる工程は、agRNAまたはDNA挿入物から本質的になる組成物と、および/または1〜100ナノモル濃度でagRNAまたはDNA挿入物を含む組成物と細胞とを接触させることによって実行される。
【００１４】
特定の態様において、検出する工程は、陰性対照と比較して、標的遺伝子の少なくとも25%、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも200%増加した発現、または標的遺伝子の少なくとも50%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも90%減少した発現を検出することによって実行される。
【００１５】
特定の態様において、アンチセンス転写物の1つの部分しか標的とされない。
【００１６】
さらなる態様は、前述の特定の態様と、主題態様の販売促進、マーケティング、販売、および/またはライセンシングを含むビジネスを行う方法との組み合わせを包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の具体的な態様の詳細な説明
特定の一態様において、本発明は、その必要があると決定された哺乳動物細胞のゲノム中の標的遺伝子の転写を選択的に調節する包括的な方法を提供し、該方法は、（a）標的遺伝子のプロモーターと重複しているコードされたアンチセンス転写物の、ゲノム中における存在を決定する工程；（b）前記転写物と、前記遺伝子の転写開始部位に対して上流の前記転写物の部分に相補的である18〜28個の塩基の外因性二本鎖agRNAとを接触させる工程；および（c）結果として得られる標的遺伝子転写の調節を検出する工程を含む。
【００１８】
別の特定の態様において、本発明は、その必要があると決定された哺乳動物細胞のゲノム中の標的遺伝子の発現を選択的に調節する包括的な方法を提供し、該方法は、（a）転写物と、前記遺伝子の転写開始部位に対して上流の前記転写物の部分に相補的なDNA挿入物を含む外因性ギャップマーとを接触させる工程；および（b）結果として得られる標的遺伝子発現の調節を検出する工程を含む。
【００１９】
記載の哺乳動物細胞は、好ましくはヒトであり、かつインビトロ（例えば、培養細胞）であり得、または宿主中においてインサイチューであり得る。培養細胞の例としては、初代細胞、癌細胞（例えば、細胞株由来のもの）、成体または胚性幹細胞、神経細胞、線維芽細胞、筋細胞などが挙げられる。ヒト疾患または障害についての推定上の治療法を検証するために一般的に使用される培養ヒト細胞が、治療効果（例えば、アポトーシスの誘導、癌細胞における増殖の停止など）について、アンチセンス転写物を標的とするagRNAまたはギャップマーをスクリーニングするために使用され得る。細胞がインサイチューである場合、宿主は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、またはヒト疾患または障害の研究に使用される動物モデル（例えば、齧歯類、イヌ、ブタなどの動物モデル）であり得る。
【００２０】
哺乳動物細胞は、通例の方法を使用して、標的遺伝子の発現調節の必要があると決定され得る。例えば、所望のレベルと比較して低下したレベルの標的遺伝子発現および/またはタンパク質は、直接、測定され得る。または、増加または減少した発現についての必要性は、低下または増加したレベルの標的遺伝子産物に関連する表現型から推測され得る。
【００２１】
記載の決定する工程は、例えば、アンチセンス転写物を同定するために転写データを調べることによって、インシリコで、および/または例えば、アンチセンス転写物を実験により同定するために5'-RACE/3'-RACEを使用することによって、インビトロまたはインビボで、実行され得る。
【００２２】
一態様において、新たな遺伝子を標的とするための決定する工程は、以下の工程によって実行され得る：
1．標的遺伝子のmRNAのプロモーターと重複する転写物のマップ（転写ランドスケープ）を得るために、1つまたは複数の転写データベース、例えば、FANTOMまたはENCODEデータベースを調べる工程；および/または
2．プロモーターと重複する転写ランドスケープを実験によって特徴付けるために、5'-RACE/3'-RACEを使用する工程；
3．プロモーター領域および1つまたは複数のアンチセンス転写物（非コード転写物が好ましい）の両方と重複する多数（例えば、3〜10）の二本鎖RNAを設計する工程；
4．同定された活性agRNAについて、アンチセンスRNAがagRNAによって結合されることを確認するために、ビオチン標識agRNAを使用する工程。
【００２３】
記載のagRNAは、各鎖上に3'ジヌクレオチドもしくはトリヌクレオチド突出部を任意で有する。dsRNAを調製する方法およびそれらを細胞へ送達する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Elbashir et al, 2001；TuschlらのWO/017164；およびFireらの米国特許第6,506,559号を参照のこと）。カスタムメイドのdsRNAはまた市販されている（例えば、Ambion Inc., Austin, TX）。dsRNAは、分子の所望の特性を高めるために化学的に修飾され得る。転写を選択的に調節するagRNAの能力に対して負に影響を与えることなく、広範囲の化学修飾が二本鎖RNAに対して成され得る。一態様において、agRNAは、2'修飾を有する1つまたは複数のヌクレオチドを含み、完全に2'置換され得る。種々の2'修飾が、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第5,859,221号；米国特許第6,673,611号；およびCzauderna et al, 2003, Nucleic Acids Res. 31:2705-16を参照のこと）。好ましい化学修飾は、血清中での安定性を高め、インビボで投与された場合のdsRNAの半減期を増加させる。血清中での安定性を高める化学修飾の例としては、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、2'-O-メチルリボヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロリボヌクレオチド、2'-デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、および逆位デオキシ脱塩基残基組込み（inverted deoxyabasic residue incorporation）（例えば、米国特許出願公開第20050032733号を参照のこと）が挙げられる。agRNAは、安定性を改善しヌクレアーゼ耐性を増加させるために、ロックされた核酸（LNA）を任意で含有し得る（例えば、Elmen et al, 2005 Nucleic Acids Res. 33:439-47；およびBraasch et al, 2003 Biochemistry. 42:7967-75を参照のこと）。別のタイプの修飾は、宿主への送達の際にagRNAが追跡されることを可能にするために、またはトランスフェクション効率決定を容易にするために、agRNAへ蛍光分子、例えば、TAMRA、FAM、Texas Redなどを結合することである。
【００２４】
ギャップマーは、センス遺伝子の転写開始部位に最も近い配列に重点を置くアンチセンス転写物の種々の領域を標的とするように設計される。本発明者らは、およそ60℃の融解温度、約25%〜75%のGC含有量、および約20ヌクレオチド長を有する配列へ選択を偏らせた。何故ならば、歴史的に、これらの特性を有するオリゴヌクレオチドは、機能するのがより容易であるためである。5'および3'末端での5個のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、2'MOEまたは2'OMeまたはロックされた核酸塩基（LNA）であるべきである。ギャップマーの外側の修飾ヌクレオチドは、ヌクレアーゼからの保護を提供し、中央DNA領域は、細胞中において、対応するRNA配列へハイブリダイズする。その後のDNA-RNAハイブリッドは、ヌクレアーゼRNase Hによって認識され、それによってRNA分子が破壊される。
【００２５】
ギャップマーのDNA挿入物またはagRNAは、標的遺伝子のプロモーターより上流の転写物の任意の部分に相補的であり得、DNA挿入物の結合標的が、アンチセンス転写物であって、標的遺伝子の転写物ではないことが保証される。特定の態様において、agRNAまたはDNA挿入物は、遺伝子の転写開始部位に対して100個を超える、200個を超える、または1,000個を超える塩基分上流の転写物の部分に相補的である。
【００２６】
標的プロモーターの多数の部分が標的とされ得るが、標的転写物の非常に効率的な増加した合成は、標的プロモーターの単一の領域のみを標的とすることによって達成され得る。特定の態様においては、転写物の1つの部分しか標的とされない。
【００２７】
agRNAまたはギャップマーについてのスクリーニングアッセイなどの特定の態様において、agRNAまたはギャップマーは、標的遺伝子のモジュレーターであることがアプリオリに知られているわけではない。本方法の新規の遺伝子標的を同定することなどの特定の態様において、アンチセンス転写物は、標的遺伝子のプロモーターと重複していることがアプリオリに知られているわけではない。
【００２８】
特定の態様において、調節はメチラーゼ非依存性であり、ここで、標的転写物の合成は、有効なメチル化とは無関係に、かつ、有効なメチル化を必要とすることなく、調節される。特定の態様において、ギャップマーのDNA挿入物またはagRNAは、CpG島の外側の（CpG島内に含有されない）アンチセンス転写物の部分に相補的である。ゲノム配列中のCpG島を同定するためのアルゴリズムは、公知である（例えば、Takai and Jones, 2002 Proc Natl Acad Sci U S A. 99:3740-5；およびTakai and Jones 2003 In Silico Biol. 3:235-40を参照のこと）。別の態様において、標的部分は、CGジヌクレオチドを含まない。関連する態様において、本方法は、調節がメチラーゼ非依存性であることを確認する工程、および/またはagRNAまたはギャップマーのDNA挿入物がCpG島の外側の転写物の部分に相補的であることを確認する工程をさらに含む。
【００２９】
ある態様において、標的遺伝子は、1つまたは複数のアイソフォームをコードおよび/または発現することが公知であり、本方法は、アイソフォームの相対発現を選択的に調節し（増加および減少を含む）、これらは、相互的な協調関係にあり得、例えば、一方は増加するが、他方は減少する。アイソフォームは、同一のプロモーターおよび/または転写開始部位を共有してもよく、またはそれらは、異なるプロモーターおよび/または転写開始部位を有してもよい。従って、種々の態様において、記載のプロモーターは、（1）標的遺伝子の第1転写物のプロモーター、（2）標的遺伝子の第1転写物のアイソフォームのプロモーター、または（3）標的遺伝子の第1転写物およびそのアイソフォームの両方のプロモーターである。
【００３０】
例えば、本方法は、そのアイソフォームの転写開始部位と重複しているアンチセンス転写物へとagRNAまたはギャップマーを向けることによって、第1標的遺伝子転写物の発現を増加させるために使用され得る。例えば、第1転写物の合成が増加され、かつアイソフォームの合成が阻害される場合、本方法は、宿主細胞中における相対アイソフォーム合成を効率的にかつ選択的に調節する。従って、所定の望ましいまたは過小発現されたアイソフォームにおける増加した合成は、所定の望ましくないまたは過剰発現されたアイソフォームにおける減少した合成と結び付けられ得る。この態様は、宿主細胞中において所定のアイソフォームスイッチをもたらすために使用され得る。
【００３１】
標的遺伝子発現の著しい調節が、ナノモル（マイクロモル以下）またはピコモル（ナノモル以下）の濃度のagRNAまたはギャップマーを使用して達成され得、所望の得られる増加した合成を達成することができる最低の濃度を使用することが、典型的には好ましく、例えば、1〜100 nMの範囲のagRNAまたはギャップマー濃度が好ましく；より好ましくは、濃度は、1〜50 nM、1〜25 nM、1〜10 nM、またはピコモル濃度範囲内にある。特定の態様において、接触させる工程は、agRNAまたはギャップマーから本質的になる組成物と細胞とを接触させることによって実行される。
【００３２】
種々の方法が、細胞内部にagRNAまたはギャップマーを送達するために使用され得る。インビトロの細胞について、送達は、細胞中への直接注入によってしばしば行われ得、送達は、疎水性またはカチオン性担体、例えば、Lipofectamine（商標）（Invitrogen, Carlsbad, CA）を使用してしばしば増強され得る。または、細胞は、透過処理剤、例えば、リゾレシチンで透過処理され得、次いで、agRNAまたはギャップマーと接触され得る。
【００３３】
インサイチューの細胞について、カチオン性脂質（例えば、Hassani et al, 2004 J Gene Med. 7: 198-207を参照のこと）およびポリマー、例えば、ポリエチレンイミン（例えば、Urban-Klein, 2005 Gene Ther.12:461-6を参照のこと）が、agRNAおよびギャップマー送達を促進するために使用されてきた。（担体溶液中の）agRNAまたはギャップマーから本質的になる組成物が、宿主中へ直接注入され得る（例えば、Tyler et al, 1999 PNAS 96:7053-7058；McMahon et al, 2002 Life Sci. 2002 Jun 7;71(3):325-37を参照のこと）。二本鎖RNAのインビボ適用が、Paroo and Corey, 2004 Trends Biotechnol 22:390-4において検討されている。
【００３４】
ウイルス形質導入もまた、細胞へagRNAを送達するために使用され得る（例えば、レンチウイルス形質導入）。しかし、ある態様において、接触させる工程がウイルス形質導入を含まないこと、および/またはagRNAが核局在化ペプチドへ結合されないことが、好ましい。
【００３５】
検出する工程は、標的遺伝子の発現の有意な変化を検出することによって、好ましくは、陰性対照、例えば、基底発現レベルと比較して、標的遺伝子の少なくとも10%、25%、50%、200%または500%増加した発現、または標的遺伝子の少なくとも10%、25%、50%、75%、または90%減少した発現を検出することによって、実行される。
【００３６】
検出は、種々の通例の方法、例えば、標的遺伝子mRNA転写物のレベルの変化を直接測定すること、または陰性対照と比較して、対応するコードされたタンパク質の増加または減少したレベルを間接的に検出することによって行われ得る。または、結果として得られる標的遺伝子発現の選択的調節は、標的遺伝子の増加または減少した発現を示す表現型の変化から推測され得る。
【００３７】
本明細書において開示および例示されるように、遺伝子発現の選択的調節についての今まで価値を認められていなかった内因性機構を利用することによって、本発明者らの方法は、多種態様の標的遺伝子、プロモーター領域、agRNA、ギャップマー、哺乳動物細胞型および送達条件にわたって一般的に適用可能である。所定のagRNAまたはギャップマーが所定の標的遺伝子の発現を選択的に調節する条件は、（例えば、本明細書に記載されるプロトコルに従って）経験的に確認され得るが、本発明者らは、本発明者らが研究した各々の哺乳動物遺伝子について調節（活性化および阻害を含む）するagRNAおよびギャップマーを一貫して見出し；本発明者らのデータは、哺乳動物細胞が、これらの方法を使用した標的遺伝子発現の標的遺伝子選択的調節を概して受け入れることを示している。
【００３８】
さらなる態様は、前述の特定の態様と、主題態様の販売促進、マーケティング、販売、および/またはライセンシングを含むビジネスを行う方法との組み合わせを包含する。
【００３９】
agRNAの例
特定の遺伝子標的、および転写物合成を選択的に増加させるdsRNA配列を表1に列挙する。各dsRNAの1本だけの鎖（5'→3'で示される）を示す。さらに、dsRNAは、各鎖上に3'-ジチミジン突出部を有する。
【００４０】
本発明者らの研究は、低分子RNAの内因性標的を単離するための新規の技術を確立し、多くのプロモーターが、agRNAのサブストレートとして役立つ重複アンチセンスncRNA転写物を含有すること；agRNAが、染色体DNAとではなく、直接、アンチセンス転写物と相互作用すること；agRNAが、アンチセンス転写物へとアルゴノートをリクルートすること；およびアンチセンス転写物が、agRNAの標的であることを実証する。
【００４１】
例として、アンチセンスRNA転写物を、プロゲステロン受容体（PR）遺伝子のプロモーター中において同定した：（a）PR mRNAの転写開始部位を、5' RACEによって決定した。（b）PR転写物中の各エキソン境界を標的とし、PRB転写開始部位をわたってプロモーターへ及ぶ、定量的RT-PCRプライマーを設計した。（c）逆転写酵素対照はいずれも、検出される産物がRNAでありかつ混入DNAではないということを確実にしない。（d）RNA転写物は、T47D細胞から精製されたポリA RNA中の主要なPR転写物の10〜1000分の1である低い発現の範囲でPRプロモーター中において検出された。（e）同様のレベルでのRNA転写物が、MCF7細胞から精製されたポリA RNA中において検出された。（f）多数の非コードアンチセンス転写開始部位が、5' RACEによって同定された。（g）標的化可能なncRNAは、スプライシングされ、PRB転写開始部位の70 kb上流まで位置する。（h）PR mRNAと比較した各アンチセンス転写物の発現レベルを、qPCRによって分析した。
【００４２】
agRNAは、アンチセンス転写物へ直接結合することが示された：（a）ビオチン化agRNAは、遺伝子発現を阻害する。（b）ビオチン化agRNAは、遺伝子発現を活性化する。（c）阻害性agRNAのセンス鎖は、アンチセンス転写物へ直接結合する。（d）活性化（activating）agRNAのセンス鎖は、アンチセンス転写物へ直接結合する。
【００４３】
agRNAは、アンチセンス転写物へアルゴノートをリクルートすることが示された：（a）RNA免疫沈降は、阻害性agRNAがアンチセンス転写物へアルゴノートをリクルートすることを示す。（b）RNA免疫沈降は、活性化agRNAがアンチセンス転写物へアルゴノートをリクルートすることを示す。
【００４４】
下記のものは、アンチセンス転写物を標的とする例示的なagRNAであり、太字のヌクレオチドは、転写開始部位（+1）を示す。
【００４５】
I．腫瘍抑制因子候補タンパク質4（NM_006545）
プロモーター（-200で開始）
2010539990.tif 000002
agRNA
2010539990.tif 000003
【００４６】
II．ロイシンジッパー推定腫瘍抑制因子1（NM_021020）
プロモーター（-200で開始）
2010539990.tif 000004
agRNA
2010539990.tif 000005
【００４７】
III．腫瘍タンパク質p53（NM_000546）
プロモーター（-200で開始）
2010539990.tif 000006
agRNA
2010539990.tif 000007
【００４８】
IV．神経成長因子受容体（NM_002507）
プロモーター（-200で開始）
2010539990.tif 000008
agRNA
2010539990.tif 000009
【００４９】
ギャップマーの例
本発明者らは、モデル遺伝子としてPRを使用してpdRNA作用の機構を最初に特徴付けることにした。何故ならば、本発明者らは、異なる細胞状況においてその発現を活性化または阻害するpdRNAを発見したためである。PR遺伝子プロモーター内の標的配列に相補的なpdRNAは、高レベルのPRを発現する細胞株であるT47D乳癌細胞株中において、PRの転写を阻害する3, 6。同様のpdRNAが、低レベルのPRを発現するMCF7乳癌細胞中においてはPR発現を活性化する10。
【００５０】
本発明者らは、PR遺伝子の転写開始部位より上流で開始する未発見のセンス転写物を探索するために5'-RACEを使用した。5'-RACEは、mRNA転写物の5’末端をクローニングするためのPCRベースの方法である。本発明者らは、5'キャップが無傷である全長RNAを選択するバージョンの5'-RACEを使用した17。転写物の検出を最大限にするために、本発明者らは、多数のプライマーセットを使用し、以前に決定された転写開始部位18, 19の上流および下流の両方の領域を増幅した。本発明者らは、T47D細胞について60個のクローン、MCF7細胞について62個のクローンを配列決定したが、本発明者らは、以前に決定された18, 19転写開始部位の上流で開始する転写物は同定しなかった。
【００５１】
PRプロモーターにおける転写物についての本発明者らの探索を拡大するために、本発明者らは、該プロモーターと重複している転写物を検出するように設計されたプライマーを使用して、RT-PCRを用いた。これらのプライマーは、PR mRNAに対してセンスまたはアンチセンスのいずれかである転写物を検出することができた。この実験によって、PRプロモーターと重複しているRNAが検出された。PRプロモーターに相補的な多数のプライマー対を用いた定量的PCR（qPCR）によって、MCF7細胞またはT47D細胞いずれにおいてもPRプロモーターにおけるRNAレベルは、PR mRNAレベルの10〜1000分の1の低さであることが明らかとなった。
【００５２】
PRプロモーターにおけるRNAの本発明者らの検出は、本発明者らがセンス転写物を検出することができなかったことと合わせて、転写がアンチセンス方向に生じ得ることを示唆した。この仮説を検証するために、本発明者らは、可能性のあるアンチセンス転写物に相補的なプライマーを使用して、5'-RACEを行った。5'-RACE産物を配列決定することによって、PRプロモーターにおける4つのアンチセンスRNA転写物の存在が明らかとなり、これらのうちの2つは類似していた。アンチセンス転写物である、AT1、AT2-T47D（T47D細胞においてのみ見られた）、およびAT2-MCF7（MCF7細胞においてのみ見られた）は、pdRNAによって標的とされる領域と重複し、それらは、pdRNAとの直接的な物理的相互作用の標的となる。
【００５３】
密接に関連するAT2-T47DおよびAT2-MCF7アンチセンス転写物は、最も高度に発現され、これらをさらなる研究のために選択した。続いて、本発明者らは、多数のプライマーセットを用いるPCRベースのクローニングを使用し、アンチセンス転写物AT2-T47DおよびAT2-MCF7の全長配列を同定した。本発明者らは、それらがスプライシングされ、ポリアデニル化され、ゲノムDNAの70 kB領域にわたって転写されることを観察した。AT2T47DおよびAT2-MCF7は、202塩基離れた異なる位置で開始するが、その他は同一である。
【００５４】
pdRNAによる遺伝子発現の調節におけるアンチセンス転写物の関与を評価するために、本発明者らは、アンチセンス転写物AT2-MCF7およびAT2-T47Dによって共有される配列に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを得た。これらの一本鎖オリゴヌクレオチドは、RNAse HをリクルートしそれらのRNA標的を切断するように設計された中央DNA部分と、標的配列への親和性を高めるための隣接2'-メトキシエチルRNA領域とを含有する「ギャップマー」である20, 21。ギャップマーは、有効な遺伝子サイレンシング剤であり、第II相臨床試験において実質的な見込みを示している21。これらの実験の目標は、pdRNAの活性に対する、アンチセンス転写物レベルを低下させることの効果を検証するためにギャップマーを使用することである。
【００５５】
本発明者らは、MCF7およびT47D細胞の両方においてアンチセンス転写物AT2のレベルを低下させるそれらの能力について、10個のギャップマー（G1〜G10、表1）を試験した。ギャップマーG1〜G3は、AT2に相補的であり、G4〜G10はそうでなかった。本発明者らは、MCF7およびT47D細胞の両方においてAT2のレベルを低下させることができる1つのギャップマー、G1を同定した。本発明者らはまた、MCF7細胞において転写物レベルを低下させることができる、より活性が低いギャップマー、G2を同定した。
【００５６】
（表１）一本鎖オリゴヌクレオチド「ギャップマー」
2010539990.tif 000010
各配列の5個の5'および3'ヌクレオチドは、2'メトキシエチルRNAヌクレオチドである。中間区分は、DNAである。相補性は、配列が転写物AT2に相補的であるかどうかを指す。TSSからの位置は、プロゲステロン受容体についての転写開始部位に対しての標的配列の場所を指す。ギャップマーG6〜G10は、逆方向である。
【００５７】
MCF7細胞へのギャップマーG1の添加は、活性化pdRNA PR11（PRプロモーターにおける-11/+8配列を標的とする）10による遺伝子活性化を妨げた。この結果は、アンチセンス転写物がRNA媒介遺伝子活性化に関与することを示している。より活性が低いギャップマーG2、または、センス方向であった（即ち、アンチセンス転写物と同一の配列を有した）ギャップマーG7の添加は、PR発現の活性化を妨げなかった。T47D細胞へのギャップマーG1の添加は、阻害性pdRNA PR9（PRプロモーターにおける-9/+10配列を標的とする）3, 6による遺伝子サイレンシングに有意には影響を与えなかった。ギャップマーG1が遺伝子サイレンシングを逆転（reverse）できないことは、アンチセンス転写物がMCF-7細胞中においてよりもT47D細胞中において4.5倍多く広まっていることと一致しており、このため、G1がアンチセンス転写物のレベルを低下させ、pdRNAの作用を遮断することは、より困難となる。
【００５８】
pdRNAとアンチセンス転写物との物理的な相互作用についての可能性を調べるために、本発明者らは、ビオチンでpdRNA鎖の3'末端を修飾した。本発明者らは、いずれかの鎖へビオチンが結合されているRNA二本鎖を試験した。本発明者らは、先ず、ビオチン標識は活性に影響を与えないことを実証した。ビオチン化pdRNAは、類似の未修飾pdRNAによって示されたものと同様の効率で、MCF7細胞中においてPR発現を活性化し、T47D細胞中においてPR発現を阻害した。
【００５９】
本発明者らは、細胞を採取し、ストレプトアビジンで修飾されたビーズを使用してビオチン化物質を精製し、結合された物質をビーズから溶離し、それをqPCRによって増幅した。本発明者らは、AT2と相補的な鎖上においてビオチン化された活性化pdRNA PR1110を、MCF7細胞にトランスフェクションした後、アンチセンス転写物AT2を検出した。同様に、AT2と相補的な鎖上においてビオチン化された阻害性pdRNA PR93, 6を、T47D細胞にトランスフェクションした後、アンチセンス転写物AT2を精製することができた。増幅産物の同一性を、配列決定によって確認した。
【００６０】
対照実験によって、pdRNAがアンチセンス転写物に結合していることが確認される。ビオチンを欠いたpdRNAでの処理後に、アンチセンス転写物は検出されなかった。ビオチン化鎖がAT2相補的でなかった場合、増幅産物は観察されず、このことは、認識の特異性を実証している。本発明者らが、ゲノムDNAを検出するように設計されたプライマーを使用した場合、産物は検出されなかった。この結果は、ビオチン化pdRNAと染色体DNAとの間には直接的な相互作用は存在しないことを示している。
【００６１】
Grewal22、Eglin22、およびMoazed23は、転写されたRNAが、分裂酵母（s. Pombe）およびキイロショウジョウバエ（d. Melanogaster）中においてヘテロクロマチン形成に影響を与えるタンパク質複合体に対する足場としてどのように作用し得るかについてのモデルを記載した。本発明者らは、アンチセンス転写物はまた、プロモーターにおけるタンパク質を組織化するための足場として作用し得るという仮説を立て、アルゴノートタンパク質が恐らく関与すると推論した。
【００６２】
PRのpdRNA媒介活性化におけるアルゴノートタンパク質の関与を検出するために、本発明者らは、ヒト細胞における4つのアルゴノートタンパク質の全てを検出することができる十分に特徴付けられた抗体を使用して、クロマチン免疫沈降（ChIP）を行った24。pdRNAによるPRの活性化または阻害を、処理された細胞のウエスタン分析によって確認した。ChIP、続いてのqPCRによって、ミスマッチRNAで処理されたものと比較して、活性化pdRNA PR11で処理されたMCF7細胞におけるアルゴノートタンパク質とPRのプロモーターとの5倍超多い会合が明らかとなった。本発明者らは、サイレンシングRNA PR9で処理されたT47D細胞中でのPRプロモーターとのアルゴノート会合の同様の増加を観察した。これらのデータは、活性化pdRNAおよび阻害性pdRNAが、アルゴノートを遺伝子プロモーターへとリクルートすることを実証している。
【００６３】
アンチセンス転写物AT-2とアルゴノートタンパク質との相互作用についての可能性を調べるために、本発明者らは、RNA免疫沈降（RIP）25を利用した。この方法は、クロマチン免疫沈降と類似しているが、タンパク質と会合したRNAを検出するように改変されている。本発明者らは、上述のChIP実験において使用した同一の抗アルゴノート抗体24を使用した。
【００６４】
本発明者らは、活性化RNA PR11をMCF7細胞へ添加し、次いでRIPを行った。qPCR増幅によって、pdRNA PR11の添加が、アルゴノートタンパク質とアンチセンス転写物AT2-MCF7との会合を促進したことが明らかとなった。ミスマッチ含有二本鎖RNAを添加した場合、または対照IgGを使用した場合、ほとんどまたは全くPCR産物が観察されなかった。本発明者らは、T47D細胞を使用してRIPを行い、サイレンシングpdRNA PR9もまたアンチセンス転写物AT2-T47Dへのアルゴノートの会合を促進したことを観察した。
【００６５】
本発明者らのデータは、細胞へのpdRNAの添加が、アルゴノート、アンチセンス転写物、およびPRプロモーターにおける染色体DNAの会合を促進することを実証している。ビオチン化pdRNAでのデータは、pdRNAとアンチセンス転写物との直接的な相互作用を示している。アルゴノートと染色体DNAとの会合は、恐らくタンパク質によって媒介され、このため、それはあまり直接的ではなくなる。本発明者らのChIPプロトコルは、タンパク質と核酸とを架橋する工程を含む。架橋されたタンパク質は、アルゴノートタンパク質、アンチセンス転写物、および染色体DNAの間に架橋を提供する可能性が高い。
【００６６】
本発明者らは、プロモーターにおけるRNA/タンパク質複合体の形成が、アルゴノート以外のRNA結合タンパク質との相互作用を含むという仮説を立てた。本発明者らは、pdRNAの作用におけるヘテロ核リボタンパク質k（heterogeneous ribonuclear protein-k）（hnRNP-k）の可能性のある役割を調べることにした。hnRNP-kは、核中に広く認められる転写因子であり、RNAおよびDNAの両方を認識する。それは、遺伝子転写、伸長、スプライシング、DNA修復に関与し、ヒストンを修飾するタンパク質と相互作用する26。PRプロモーターは、hnRNP-kについての可能性のある結合部位を含有し、その関与を検証するための別の理由を提供している。
【００６７】
本発明者らは、抗hnRNP-k抗体を用いるChIPを使用し、PRプロモーターにおけるhnRNPkの会合を特徴付けた。活性化pdRNA PR11または阻害性pdRNA PR9を用いた細胞のトランスフェクションによって、ミスマッチ含有RNA二本鎖の添加と比較して、PRプロモーターにおけるhnRNP-kのレベルが低下した。
【００６８】
次いで、本発明者らは、RIPを使用し、hnRNP-kがpdRNAの添加時にPRアンチセンス転写物と会合するかどうかを決定した。本発明者らは、活性化pdRNA PR11で処理したMCF7細胞中においてまたは阻害性pdRNA PR9で処理したT47D細胞中において、抗hnRNP-k抗体を使用して、RIP実験を行った。本発明者らは、pdRNA PR11またはpdRNA PR9のいずれかの添加によって、hnRNP-kとアンチセンス転写物AT2との会合が増強されたことを観察した。まとめると、ChIPおよびRIPデータは、pdRNAの添加は、hnRNP-kの局在を染色体DNAからアンチセンス転写物へ移すことを実証しており、このことは、pdRNAが遺伝子プロモーターにおけるタンパク質相互作用のリモデリングを誘導し得ることを示している。
【００６９】
遺伝子発現を活性化または阻害するpdRNAの能力は、一部にはpdRNAが明確な分子標的を有さなかったために、論争の的であった27。最近、Morrisおよび共同研究者は、伸長因子1α（EF1α）の発現を阻害するpdRNAと、EF1a転写開始の上流から生じるセンス転写物との会合を報告した28。対照的に、本発明者らは、以下を観察している：i）標的遺伝子内から生じるアンチセンス転写物へのpdRNAの結合、ii）アンチセンス転写物との相互作用は、遺伝子活性化および遺伝子サイレンシングをもたらし得ること、ならびにiii）pdRNAは、アンチセンス転写物へとタンパク質をリクルートし得、かつタンパク質の局在をプロモーターDNAから移し得ること。本発明者らのデータは、アンチセンス転写物、プロモーターDNA、アルゴノートタンパク質、およびhnRNP-kの動的会合を示している。
【００７０】
タンパク質因子および小分子と同様に、pdRNAは、ある細胞状況においては遺伝子発現を活性化し得、別のものにおいてはそれを阻害し得る。MCF7およびT47D細胞株の両方において、発現レベルは、小分子リガンドの添加で、または細胞培養条件を変更することによって、変化するように釣り合わされる。例えば、エストロゲンの添加は、MCF7細胞中においてPR発現を増加させ29、一方、ホルモン様化合物の除去は、T47D細胞中においてPR発現を低下させる30。小分子は、プロモーターにおけるタンパク質のリクルートメントを変化させることによって、発現を変化させる。これらの小分子がPRプロモーターにおけるタンパク質機構をリモデリングし、RNAおよびタンパク質合成に影響を与え得るならば、タンパク質のRNA媒介リクルートメントもまた遺伝子発現を誘発または抑制し得ることは、驚くべきことではない。
【００７１】
本発明者らは、遺伝子発現のpdRNA媒介調節についてのモデルを開示する。細胞に入った後、PRプロモーターに相補的なpdRNAは、アルゴノートタンパク質と複合体を形成し、アンチセンスRNA転写物を認識する。次いで、アンチセンス転写物：pdRNA：アルゴノート複合体は、hnRNP-kなどの他の因子をリクルートするまたはそれらを再び方向付ける（redirect）ための足場として作用する。このpdRNA：アンチセンスRNA転写物：タンパク質複合体は、プロモーターの近くで生じ、調節のバランスに影響を与える。より高い発現について誘導されるように既に釣り合わされている、MCF7細胞については、バランスは、PR発現の活性化に向かって押し進められる。T47D細胞については、バランスは、遺伝子サイレンシングに向かって押し進められる。
【００７２】
本発明者らは、本発明者らのプロトコルを拡大し、アンチセンス転写物を標的とするギャップマーを使用して多様な標的遺伝子発現の調節を実証した。下記の各々は、遺伝子の5’末端と重複しているセンス・アンチセンス対である。遺伝子は、その参照配列番号（refseq number）（NM_******）とともに記載され、Pubmedのヌクレオチドデータベースにおいて検索可能である。その次は、同一のデータベース中においてこれも検索可能なアンチセンス転写物の配列である。その次は、アンチセンス転写物を標的とすることによって標的遺伝子発現を有効に調節するギャップマーの表である。
【００７３】
1．腫瘍抑制因子候補タンパク質4（NM_006545）
アンチセンス転写産物配列AL552018
2010539990.tif 000011
ギャップマー：下線付きの塩基は修飾されている；他の塩基はDNAである。
2010539990.tif 000012
【００７４】
2．ロイシンジッパー推定腫瘍抑制因子1（NM_021020）
アンチセンス転写産物配列BC033138
2010539990.tif 000013
2010539990.tif 000014
ギャップマー：
2010539990.tif 000015
【００７５】
3．腫瘍タンパク質p53（NM_000546）
アンチセンス転写産物配列AK056669
2010539990.tif 000016
2010539990.tif 000017
ギャップマー：
2010539990.tif 000018
【００７６】
4．プロゲステロン受容体（NM_000926）
アンチセンス転写物配列 - AT2-T47D；太字のヌクレオチドは、転写物AT2-T47D中の各エキソンの始まりを示す（エキソン1  +536〜-71；エキソン2  -871〜-964；エキソン3  -3193〜-3309；エキソン4  -18327〜-18416；エキソン5  -29343〜-29440；エキソン6  -65672〜-65822；エキソン7  -68912〜-69083）
2010539990.tif 000019
ギャップマー：
2010539990.tif 000020
【００７７】
参考文献
2010539990.tif 000021
2010539990.tif 000022
【００７８】
前述の説明および実施例は、例示のために提供され、限定のためではない。本明細書に引用される全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が参照によって組み入れられるように具体的かつ個々に示されるかのように、参照によって本明細書に組み入れられる。前述の発明は、理解の明確さのために例示および実施例によっていくぶん詳細に記載されたが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくそれに対してある変化および変更が成され得ることが、本発明の開示に照らして、当業者に容易に明らかである。
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月18日(2010.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010539990000001.app
【国際調査報告】
2010539990.tif 000023