(57)【要約】  本発明は、リグノセルロース系バイオマスからの発酵製品を製造する方法、この方法を行うための反応器および発酵製品を製造するためのこの反応器の使用に関する。
2010536368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、リグノセルロース系バイオマスから発酵生成物としての有機酸を製造する方法：
ａ）リグノセルロース系バイオマスをアルカリ剤で前処理して、約８．０〜約１４．０のｐＨを有するアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスを得るステップ、
ｂ）発酵槽内でステップａ）の前処理済みリグノセルロース系バイオマスを同時糖化発酵（ＳＳＦ）するステップであって、有機酸の生成に起因するｐＨの低下をアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスを添加することによって、任意にアルカリと組み合わせて、相殺して、ｐＨを約８．０未満として、および／または、８．０未満の特定のｐＨに維持して、加えた微生物（単数もしくは複数）および／または酵素の最適な活性を可能にするステップ、
ｃ）任意に、発酵生成物を取り出すステップ。
【請求項２】
ステップｂ）のＳＳＦが以下のステップを含む、請求項１に記載の方法：
ｉ）場合による前加水分解のステップ、
ｉｉ）加水分解酵素で酵素加水分解して、発酵可能な糖を得るステップ、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）の糖を発酵生成物に転化させることができる微生物を使用する微生物発酵のステップ。
【請求項３】
ステップｂ）のＳＳＦがケモスタット式で操作され、アルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスが栄養素として使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスが、ステップｂ）のＳＳＦに流加バッチ式（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｍａｎｎｅｒ）で加えられる、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
リグノセルロース系バイオマスの前処理に先行するか、組み合わされおよび／もしくは統合されて、リグノセルロース系バイオマスの機械的微細化が行われる、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
機械的微細化が、粉砕、機械的研削（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｒｅｆｉｎｉｎｇ）および押出からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスが、ＳＳＦの前に以下の１つまたは複数に付される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法：
ａ）冷却ステップ；
ｂ）洗浄ステップ；
ｃ）減水ステップ。
【請求項８】
減水が、前処理されたバイオマスに圧力を加えながらろ過することを用いて行われ、加えられる圧力は０〜約１００ｂａｒの範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＳＳＦの間の温度が、約２０〜約８０℃の間の範囲である、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＳＳＦの間のｐＨが、およそ２．０〜およそ１０．０の間に制御される、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＳＳＦの間のｐＨが、アルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスおよびアルカリの添加によって制御される、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＳＦが、前加水分解フェーズ、アルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスの添加によるｐＨ制御を用いる流加バッチフェーズおよびアルカリの添加によるｐＨ制御を用いるバッチフェーズを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
リグノセルロース系バイオマスが、草、木材、バガス、ストロー、紙、植物原料およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップａ）において使用されるアルカリ剤が、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、酸化カルシウム（ＣａＯ）、アンモニア（ＮＨ３）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、尿素またはこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップｂ）の加水分解酵素がセルラーゼ製剤、ヘミセルラーゼ製剤、セロビアーゼ、キシラナーゼ製剤、アミラーゼおよびペクチナーゼからなる群から選択される、請求項２から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
有機酸が、乳酸、クエン酸、イタコン酸、コハク酸、フマル酸、グリコール酸、ピルビン酸、酢酸、グルタミン酸、リンゴ酸、マレイン酸、プロピオン酸、酪酸、グルコン酸およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
微生物が、細菌、真菌、古細菌または藻類である、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
微生物が、酢酸菌属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ・ラセミラクチカス（Ｂ．ｒａｃｅｍｉｌａｃｔｉｃｕｓ）、Ｂ・ラエボラクチカス（Ｂ．ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、乳酸菌（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、糸状菌（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、黒コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）および酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｓｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
反応器であって、アルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスを同時糖化発酵（ＳＳＦ）するため発酵槽と連結された、リグノセルロース系バイオマスをアルカリ前処理するための容器を含み、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の方法に使用するためのものであり、ここで
１）前記容器は
ｉ）混合デバイス；
ｉｉ）加熱デバイス；および
ｉｉｉ）任意に、リグノセルロース系バイオマスからの可溶性成分を前抽出する手段
を含み、
２）発酵槽は、
ｉ）自動ｐＨ制御；および
ｉｉ）該自動ｐＨ制御によって制御される、容器からのアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスのための入口である、反応器。
【請求項２０】
容器と発酵槽の間の連結手段が、ポンプであり、好ましくはアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスの発酵槽中への自動供給を可能にするスクリューフィーダーである、請求項１９に記載の反応器。
【請求項２１】
発酵槽が、以下の１つまたは複数を含む、請求項１９または２０に記載の反応器：
１）自動ｐＨ制御によって制御される、アルカリ剤の自動供給のための入口；
２）酵素、微生物および／または酸もしくは塩基のための入口；
３）サンプリングおよび／もしくはモニターのための出口；並びに／または
４）自動温度制御デバイス；
５）攪拌機アセンブリ。
【請求項２２】
請求項１から１８までに記載の方法によりリグノセルロース系バイオマスからの乳酸を製造するための、請求項１９から２１までのいずれか一項に記載の反応器の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグノセルロース系バイオマスから発酵生成物としての有機酸を製造する方法に関し、その際リグノセルロース系バイオマスはアルカリ剤を使用して前処理される。本発明はさらに、本発明の方法を行うための反応器にも関する。
【０００２】
発明の背景
リグノセルロース系バイオマス原料は発酵プロセス、とくにバイオエタノールおよび乳酸のために使用してよい。リグノセルロース系原料を乳酸などの大量の化学薬品に転化させるための従来のプロセスは、前処理、酵素加水分解および微生物発酵を必要とする。リグノセルロース系バイオマスは、競争力のある栄養価を有していない、安価で幅広く入手可能で再生可能な炭素源である。リグノセルロースは、フェノール系ポリマーであるリグニンのマトリックス中に埋め込まれた主としてセルロースおよびヘミセルロース（主に六炭糖および五炭糖で構成されているポリマー）からなる。リグノセルロースから発酵性の糖類を導く主な経路は、セルロース分解酵素およびヘミセルロース分解酵素による酵素加水分解による。リグニンを改変および／または除去するため、並びにそれによって酵素加水分解への多糖類のアクセスしやすさを高めるために粒子サイズを小さくするためには、リグノセルロースの機械的および化学的前処理が必要である（Ｃｌａｓｓｅｎら、（１９９９年）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｎｎｏｌ．５２巻、７４１〜７５５頁）。
【０００３】
バイオマスの様々な化学的前処理が、リグノセルロースからエタノールへの製造技術の研究開発の中で検討されてきた（Ｍｏｓｉｅｒら、（２００５年）Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、９６巻、６７３〜６８６頁）。温和な温度（＜１００℃）で石灰（Ｃａ（ＯＨ）２）を用いるリグノセルロース系バイオマスのアルカリ前処理は、酵素加水分解を増進するための有望な前処理経路であることが示されており、リグノセルロース性基質の顕著な脱リグニン化またはキシラン分解を伴わない高い酵素分解性によって特徴づけることができる（Ｃｈａｎｇら、（１９９８年）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４巻、１３５〜１５９頁）。しかしながら、この比較的高いｐＨ値（＞１０）におけるアルカリ前処理は、（ヘミ）セルロースの解重合のために必要な共通のセルロース分解性でありキシラン分解性である酵素の活性がこのｐＨにおいては低いため、とくに瞠目に値するものではない。したがって、多糖類の効率的な酵素加水分解を実現するためにはｐＨを下げることが必須である。１つの方法は石灰処理済みバイオマスを、酵素加水分解に先立って洗浄することによって水酸化カルシウムを除去することである（Ｃｈａｎｇら、（１９９８年）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４巻、（１３５〜１５９頁）。しかし、これは大量の水の使用に繋がる。前処理済み原料のｐＨを下げるもう１つの方法は、硫酸および酢酸などの酸を用いてまたはＣＯ２を用いて水酸化カルシウムを中和することである。それでもこれは副生成物として石膏または炭酸カルシウムなどの価値の低い塩の生成をもたらす。したがって、前処理後および酵素加水分解に先立つリグノセルロース系原料における高いｐＨ値（＞１０）にかかるこの問題は、未だに適切には解決されていない。
【０００４】
本発明は、リグノセルロース系バイオマスから発酵生成物として有機酸を製造するための方法、本発明の方法を行うための反応器および本発明の方法を行うためのこの反応器の使用を提供し、この方法において、発酵の間のｐＨ制御のためにアルカリ前処理されたバイオマスのアルカリ性が同時糖化発酵工程において使用される。
【０００５】
発明の説明
１つの側面において、本発明は、リグノセルロース系バイオマスから発酵生成物としての有機酸を製造するための以下のステップを含む方法を提供する：
ａ）リグノセルロース系バイオマスをアルカリ剤で前処理して、約８．０〜約１４．０のｐＨを有するアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスを得るステップと、
ｂ）発酵槽内でステップａ）の前処理済みリグノセルロース系バイオマスを同時糖化発酵（ＳＳＦ）するステップであって、有機酸の生成に起因するｐＨの低下を、任意にアルカリと組み合わせてアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスを添加することによって相殺して、ｐＨを約８．０未満とするおよび／または８．０未満の特定のｐＨに維持して、加えた微生物（単数もしくは複数）および／または酵素の最適な活性を可能にするステップと、
ｃ）任意に、発酵生成物を取り出すステップ。
【０００６】
「発酵生成物としての有機酸」という用語は、本明細書において、１つまたは複数の微生物による発酵によって得られた生成物であり、この生成物は少なくとも１つのカルボキシ基を含む有機分子であると定義される。一態様において、本発明の方法によって生成される発酵生成物は、これらだけには限定されないが、乳酸、クエン酸、イタコン酸、コハク酸、フマル酸、グリコール酸、ピルビン酸、酢酸、グルタミン酸、リンゴ酸、マレイン酸、プロピオン酸、酪酸、グルコン酸およびこれらの混合物からなる群から選択される。とくに好ましい一態様において、発酵生成物は乳酸である。
【０００７】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、さらに好ましい態様において、リグノセルロース系バイオマスは、草、木材、バガス、ストロー（ｓｔｒａｗ）、紙、植物原料（ストロー、干草など）およびこれらの組合せから選択される。一態様において、リグノセルロース系バイオマスは小麦ストロー、トウモロコシストロー、大麦ストロー、稲ストロー、ライムギストローまたは任意の栽培植物のストローである。
【０００８】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、さらなる一態様において、リグノセルロース系バイオマスは風乾されたもの（ａｉｒ  ｄｒｙ）であり、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、８９．５、９０、または９５％（ｗ／ｗ）の乾燥物質を有する。もう１つの態様において、リグノセルロース系バイオマスは未乾燥であり、すなわち生のバイオマスを使用してよい。
【０００９】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、さらなる一態様において、リグノセルロース系バイオマスは、タンパク質、アミノ酸または可溶性無機成分などのバイオマス中に含まれている、続く加水分解および発酵を妨げ得る発酵不可能な可溶性成分を除去するために、前処理に先立って前抽出される。もう１つの好ましい態様において、発酵可能な可溶性成分をリグノセルロース系バイオマスから除去し得る。本明細書において「前抽出」という用語は、リグノセルロース系バイオマスから可溶性成分を除去する任意の処理として定義される。
【００１０】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、さらなる好ましい一態様において、リグノセルロース系バイオマスの前処理は、リグノセルロース系バイオマスの機械的微細化に先行するまたはこれと組み合わせるおよび／もしくは統合される。機械的微細化は、前処理およびそれに続く工程の効率が向上し、またアルカリ剤がリグノセルロース系バイオマス中に完全に混合されるように、リグノセルロース系バイオマスの粒子サイズ分布を変更するために行われる。好ましい一態様において、機械的微細化は、これらだけには限定されないが、粉砕、機械的細密化（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｒｅｆｉｎｉｎｇ）および押出を含む。
【００１１】
ステップａ）アルカリ剤によるリグノセルロース系バイオマスの前処理
リグノセルロース系バイオマスの前処理は、リグノセルロースのマトリックスを切り開き、リグニンを除去または改変し、セルロースの表面積を増大させるために必要とされる。本明細書において「前処理」という用語は、リグノセルロースの加水分解後の加水分解の程度を上げることを目的として、加水分解の前に行われる任意の方法と定義される。リグノセルロース系バイオマスの前処理は好ましくは、約２４時間などの妥当な時間内に、前処理されたバイオマス中の炭水化物成分の少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％が、１つまたは複数の加水分解酵素によって１つまたは複数のモノマー糖に転化されるまで行われる。
【００１２】
先の好ましい態様と組み合わせて、さらなる一態様において、本発明は、約８．０〜約１４．０の間のｐＨ、好ましくは約ｐＨ８．０〜ｐＨ１２．５または１２．０を有するアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスを得るための、アルカリ剤によるリグノセルロース系バイオマスの前処理に関する。したがって、適当な量の１つまたは複数のアルカリ剤をバイオマスに加え、本明細書の下記に示す通り適当な時間および適当な温度においてインキュベートする。リグノセルロース系バイオマスのアルカリ前処理の間、リグノセルロース系バイオマス中に含有されている酸の放出によってｐＨは約０．５〜約２．０単位低下し得る。好ましい一態様において、本発明によるアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスは、約８．５〜約１２．５の間の範囲、より好ましくは約９．０〜約１２．０の間の範囲、さらにより好ましくは約９．５〜約１２．０の間の範囲のｐＨ値を有し、最も好ましくは約１１〜８のｐＨ値を有する。
【００１３】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、さらなる好ましい一態様において、本発明の方法のステップａ）において使用されるアルカリ剤は、これらだけには限定されないが、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、酸化カルシウム（ＣａＯ）、アンモニア（ＮＨ３）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、尿素またはこれらの組合せからなる群から選択される。
【００１４】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、さらなる好ましい一態様において、アルカリ剤：リグノセルロース系バイオマスの比は、約１：１００〜２０：１００の間、より好ましくは２．５：１００〜約１７．５：１００の間、最も好ましくは約５：１００〜約１５：１００の間の範囲である。アルカリ剤：リグノセルロース系バイオマスの比は、セルロースおよびヘミセルロースの酵素分解性および発酵性を向上させるように選択してよい。
【００１５】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、さらなる好ましい一態様において、アルカリ剤を用いるリグノセルロース系バイオマスの前処理は適当な温度において行われる。本発明のステップ（ａ）を行うための最も適当な温度は、好ましくはバイオマスのいかなる選択された種類および濃度、選択された前処理の他の条件（例えば、ｐＨおよび時間）並びにＳＳＦ（例えば、微生物（単数または複数）、温度、酵素（単数または複数））について選択された条件に対しても発酵効率に影響を及ぼすことなく、発酵製品の最も低い製造コストをもたらす温度である。好ましい一態様において、適当な温度は約５０℃〜約１１５℃の間、より好ましくは約６０℃〜約９５℃の間、より好ましくは約７０℃〜約９０℃の間、さらにより好ましくは約８０℃〜約９０℃の間の範囲であり、最も好ましくは約８５℃である。
【００１６】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、さらなる好ましい一態様において、アルカリ剤を用いるリグノセルロース系バイオマスの前処理は、約２時間〜約２０時間の間、より好ましくは約４時間〜約１６時間の間、より好ましくは約５時間〜約１２時間の間、より好ましくは約６時間〜約１０時間の間の範囲であり、最も好ましくは約８時間行われる。本発明のステップ（ａ）を行うための最も適当な時間は、好ましくはバイオマスのいかなる選択された種類および濃度、選択された前処理の他の条件（例えば、ｐＨおよび温度）並びにＳＳＦ（例えば、微生物（単数または複数）、温度、酵素（単数または複数））について選択された条件に対しても発酵効率に影響を及ぼすことなく、発酵製品の最も低い製造コストをもたらす時間である。
【００１７】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、さらなる好ましい一態様において、本発明のアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスは、ＳＳＦに先立って次のステップ：冷却ステップ、洗浄ステップおよび／または減水ステップの１つまたは複数に付される。より好ましい一態様において、アルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスは、約８０℃まで、より好ましくは約７０℃まで、より好ましくは約６０℃まで、より好ましくは約５０℃まで、より好ましくは約４０℃まで、最も好ましくは約３０℃まで冷却させる。本明細書において使用される「減水（ｄｅｗａｔｅｒｉｎｇ）」または「脱水（ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）」という用語は、バイオマスから自由水を除去することと定義される。もう１つの好ましい態様において、減水ステップは前処理されたバイオマスに圧力を加えながらろ過を使用することによって行われ、その際加えられる圧力は０〜約１００ｂａｒの間の範囲である。他の減水の方法は、当業者に知られている。もう１つのより好ましい態様において、洗浄ステップは有機酸（例えば酢酸）などの発酵阻害物質を除去するために行われる。好ましい一態様において、洗浄ステップは減水後の水の添加に続く次なる減水ステップによって行われる。
【００１８】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、本発明のさらなる好ましい一態様において、ステップ（ｂ）における微生物発酵に起因する酸性化を中和するために、下記のステップ（ｂ）の同時糖化発酵（ＳＳＦ）工程に、ステップ（ａ）のアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスを、より好ましくは流加バッチ式（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｍａｎｎｅｒ）で加える。「中和する」または「中和」という用語は、本明細書において、ＳＳＦ混合物のｐＨを約８．０以下にするまたは維持することと定義され、例えば加水分解酵素（単数または複数）および／または微生物（単数または複数）の最適ｐＨに応じて約４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５または８．０の特定のｐＨにするおよび／または維持するなどである。したがって、下記のステップ（ｂ）のＳＳＦ工程において、アルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスをＳＳＦ混合物に加えて、有機酸の生成によって生じたｐＨの低下を相殺してｐＨを一定のレベルに維持する。当業者はＳＳＦ混合物中で維持すべきｐＨレベルを選択する方法を知っていよう。
【００１９】
ステップ（ｂ）同時糖化発酵
「同時糖化発酵」という用語は、本明細書において、同時に行われるアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスのポリマー炭水化物の発酵可能な糖への酵素加水分解および１つまたは複数の微生物による糖の発酵生成物へのさらなる転化と定義される。
【００２０】
本発明はアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスの発酵槽におけるＳＳＦに関し、その際、ステップ（ｂ）における微生物発酵によって生じた酸性化を中和するために、ＳＳＦ混合物中に、アルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスを、好ましくは流加バッチ式（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｍａｎｎｅｒ）で加える。
【００２１】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、本発明のさらなる好ましい一態様において、ステップ（ｂ）のＳＳＦ工程は、アルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスが栄養素として使用されるケモスタット式で操作される。「ケモスタット式」は、本明細書において、栄養素濃度およびｐＨなどの発酵パラメーターを本質的に一定に保つための発酵槽デバイスと定義される。
【００２２】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、さらなる好ましい一態様において、ＳＳＦは、ｉ）場合による前加水分解フェーズのステップと、ｉｉ）加水分解酵素で酵素加水分解して、発酵可能な糖を得るステップと、ｉｉｉ）ステップｉｉ）の糖を発酵生成物に転化させることができる１つまたは複数の微生物を使用する微生物発酵ステップとを含む。
【００２３】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、さらなる好ましい一態様において、ＳＳＦは、前加水分解フェーズを含み、そのフェーズでは、１つまたは複数の酸の添加によってｐＨが望まれるレベルに合わせられているアルカリ前処理されたバイオマスの一部分を発酵可能な糖に転化させて、バイオマスの有機酸への微生物転化を開始するために微生物（単数または複数）にとって適当な環境を提供する。
【００２４】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、本発明のさらなる好ましい一態様において、前加水分解フェーズは反応槽中の発酵可能な糖の濃度を０．５〜１０の間、より好ましくは１〜５ｇ／ｌの間の値まで増大させるに足る時間行われる。
【００２５】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、本発明のさらなる好ましい一態様において、ＳＳＦは、糖を得るための１つまたは複数の加水分解酵素製剤を用いる酵素加水分解フェーズを含む。酵素加水分解によって得ることができる糖は、例えばグルコース、マンノース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、ラムノース、キシロース、アラビノース、ガラクチュロン酸およびこれらの（組合せの）オリゴ糖を含み得る。
【００２６】
本発明の方法によるポリマー炭水化物の酵素加水分解は、発酵ステップにおいて微生物（単数または複数）によって使用してよい基質の形成のために必要である。本発明の方法における使用のための加水分解酵素、すなわち適当な量でステップ（ｂ）のＳＳＦ工程に加えられる酵素は、これらだけには限定されないが、セルラーゼ製剤、ヘミセルラーゼ、セロビアーゼ、キシラナーゼ製剤、アミラーゼおよびペクチナーゼであってよい。かかる酵素製剤は市販されており、例えばＧｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｎａｌ  Ｂ．Ｖ．（Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得ることができる。本発明の方法に使用するための適当な加水分解酵素活性の量は、バイオマスの選択された種類および濃度、選択された前処理の条件（例えば、ｐＨ、時間および温度）並びにＳＳＦのために選択された条件（例えば、微生物（単数または複数）および温度）と共に、良好なまたは最適の酵素活性を保持しつつ発酵製品の最も低い製造コストをもたらす加水分解酵素活性の量である。加水分解酵素活性の適当な量は、例えば約０．０１〜約５０、より好ましくは約５〜約４０ろ紙単位（ＦＰＵ）の範囲内であると考えられるが、より高い加水分解酵素活性も使用してよい。
【００２７】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、さらに好ましい一態様において、本発明の方法によるＳＳＦの間の酵素加水分解は、極めて低い濃度または無視できさえもする濃度の発酵阻害化合物しか含まない加水分解物をもたらす。好ましい一態様において、ＳＳＦの間に形成されるフルフラル、５−ｈｍｆおよびフェノール系化合物の濃度は０．２ｇ／ｌ未満である。かかる化合物の量は、ＨＰＬＣ分析などの標準的な方法を使用して測定し得る。
【００２８】
本発明の方法における使用のための１つまたは複数の微生物、すなわち上記ステップ（ｂ）のＳＳＦ混合物に、ＳＳＦの前におよび／またはＳＳＦの間に加えられる微生物（単数または複数）は、細菌、真菌（酵母を含む）、古細菌または藻類であってよい。好ましい一態様において、細菌は耐熱性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株から選択される。もう１つの好ましい態様において、微生物は、これらだけには限定されないが、以下のものからなる群から選択される：Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ、Ａ．ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ａ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａ．ｍｅｓｏｘｙｄａｎｓ、Ａ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ａ．ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ、Ａ．ｘｙｌｉｎｕｍ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｉｌｅ、Ａ．ｌａｃｔｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉ、Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａ．ｇｅｎｏｓｐｅｃｉｅｓ、Ａ．ｇｅｎｏｓｐｅｓｉｓ、Ａ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａ．ｊｕｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ  ｓｐ．、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｃｌｏａｃａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃｕｌｉｃｉｃｏｌａ、Ａ．ｆｏｒｍｉｃａｎｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．、Ａ．ｔｏｌｅｒａｎｓ、Ａ．ｖｉｓｃｏｌａｃｔｉｓ、Ａｍｙｌｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ａｎａｂａｅｎａ  ａｍｂｉｇｕａ、Ａ．ｓｕｂｃｙｌｉｎｄｒｉａ、Ａｑｕａｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ  ｉｎｔｅｒｓｏｎｉｉ、Ａｒｔｈｒｏａｓｃｕｓ  ｊａｖａｎｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｂｉｄｕｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｌｕｔｅｕｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉｎａｅ、Ａ．ｐｏｌｙｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｓｉｍｐｌｅｘ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａ．ｕｒｅａｆａｅｃａｌｉｓ、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ａｚｏｍｏｎａｓ  ｍａｃｒｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ、Ａ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ、Ａ．ａｇｉｌｉｓ、Ａ．ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ、Ａ．ｍａｃｒｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ａｚｏｔｏｍｏｎａｓ  ｉｎｓｏｌｉｔａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂ．ａｐｏｒｒｈｅｏｕｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｍｙｃｏｉｄｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ、Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ、Ｂ．ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂ．ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｍｅｓｅｎｔ���ｒｉｃｕｓ、Ｂ．ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｐａｓｔｅｕｒｉｉ、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｒａｃｅｍｉｌａｃｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｚｏｐｆｉｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ、Ｂ．ｌａｃｔｉｏｇｅｎｅｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅ、Ｂ．ｄｉｖｅｒｔｉｃａｔｕｍ、Ｂ．ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂ．ｉｍｐｅｒｉａｌｅ、Ｂ．ｌｉｎｅｎｓ、Ｂ．ｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｌｕｔｅｕｍ、Ｂ．ｒｏｓｅｕｍ、Ｂ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｂ．ｖｉｔａｒｕｍｅｎ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｂｏｍｂｉｉ、Ｃ．ｂｒｕｍｐｔｉｉ、Ｃ．ｃａｔｅｎｕｌａｔａ、Ｃ．ｃｏｌｌｉｃｕｌｏｓａ、Ｃ．ｄｅｆｏｒｍａｎｓ、Ｃ．ｅｐｉｃｏｌａ、Ｃ．ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ、Ｃ．ｆａｍａｔａ、Ｃ．ｆｒｅｙｓｃｈｕｓｓｉｉ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｌａｍｂｉｃａ、Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｃ．ｍａｇｎｏｌｉａｅ、Ｃ．ｍａｎｎｉｔｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｃ．ｍｅｌｉｂｉｏｓｉｃａ、Ｃ．ｍｕｃｉｆｅｒａ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｒｕｇｏｓａ、Ｃ．ｒｕｇｏｓａ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｃ．ｓａｋｅ、Ｃ．ｓｈｅｈａｔａｅ  Ｃａｎｄｉｄａ  Ｓｐ．、Ｃ．ｓｔｅｌｌａｔａ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｂｉｂｕｌａ、Ｃ．ｂｉｚｏｔｅａ、Ｃ．ｃａｒｔａｅ、Ｃ．ｆｉｍｉ、Ｃ．ｆｌａｖｉｇｅｎａ、Ｃ．ｇｅｌｉｄａ、Ｃ．ｕｄａ、Ｃｈａｉｎｉａ  ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｓｐ．、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｔｒｉｔｅｎｓｉｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｕｅｎｄｉｉ、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｆｅｌｓｉｎｅｕｍ、Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｒｏｓｅｕｍ、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃ．ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃ．ｌｅｔｅｏｌｕｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｒｙｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｃａｓｔｅｌｌｉｉ、Ｄ．ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｄ．ｍａｒａｍａ、Ｄ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖａｎｒｉｊｉ、Ｄｅｋｅｒｒａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｄ．ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ、Ｄ．ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｄ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｄ．ｎａａｒｄｅｎｓｉ��、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｎｉｇｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅ．ｃｌｏｃａｅ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｅｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｅ．ｉｒｒｅｇｕｌａｒ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｃａｐｓｕｌｉｇｅｎｕｍ、Ｆ．ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｍ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｎｓ、Ｆ．ｄｅｖｏｒａｎｓ、Ｆ．ｏｄｏｒａｔｕｍ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓ、Ｇ．ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ、Ｇ．ｒｏｓｅｕｓ、Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ  ｓｅｌｅｎｏｓｐｏｒａ、Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｕｔｉｒｕｂｒｕｍ、Ｈ．ｈａｌｏｂｉｕｍ、Ｈ．ｓａｌｉｎａｒｉｕｍ、Ｈ．ｔｒａｐｉｎｉｕｍ、Ｈａｎｅｓｅｎｉａｓｐｏｒａ  ｖｉｎｅａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｂｅｃｋｉｉ、Ｈ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｈ．ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔａ、Ｈ．ｃｉｆｅｒｒｉｉ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｈ、ｖａｌｂｉｅｎｓｉｓ、Ｈｏｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｍｂｒｏｓｉａｅ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｖｉｄｕｍ、Ｊｅｎｓｉｎｉａ  ｃａｎｉｃｒｕｒｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｔｅｒｒｉｇｅｎａ、Ｋｌｏｃｋｅｒａ  ｃｏｒｔｉｃｉｓ、Ｋ．ｊａｖａｎｃｉａ、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ、Ｋ．ｌｏｄｄｅｒｉ、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ｖａｒ．ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｃａｓｅｉ  ｖａｒ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌ．ｊｕｇｕｒｔｉ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、Ｌ．ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ、Ｌ．ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｌ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌ．ｏｅｎｏｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｆｒｉｇｉｄｉｕｍ、Ｌｉｎｅｏｌａ  ｌｏｎｇａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｐｏｆｅｒａ、Ｌ．ｓｔａｒｋｅｙｉ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｍ．ｒｅｕｋａｕｆｉｉ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｍ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ、Ｍｉｃｒｏｃｙｃｌｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｍ．ｆｌａｖｕｓ、Ｍｏｒｅｘｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｂｕｌ���ａｔａ、Ｍ．ｄｉｍｏｒｐｈａ、Ｍｙｃｒｏｃｙｃｌｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｎａｄｓｏｎｉａ  ｅｌｏｎｇａｔａ、Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ  ｃｏｒｙｌｉ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｓ、Ｎ．ｃａｌｃａｒｉａ、Ｎ．ｃｅｌｌｕｌａｎｓ、Ｎ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｘｙｄａｎｓ、Ｎ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｎ．ｒｕｇｏｓａ、
Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐ．、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｅｌｉｐｓｏｓｐｏｒｕｍ、Ｎ．ｅｎｔｒｏｐｈｙｔｕｍ、Ｎ．ｍｕｓｃｏｒｕｍ、Ｎ．ｐｕｎｃｔｒｉｆｏｒｍｅ、Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ  ｘａｎｔｈｉｎｅｏｌｙｔｉｃａ、Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｍａｒｇａｒｉｔｉｆｅｒｕｍ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ  ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ  ｔｒａｎｓｖａａｌｅｎｓｉｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｐ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｏｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｐ．ｃａｒｓｏｎｉｉ、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａ、Ｐ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｐ．ｆｌｕｘｕｕｍ、Ｐ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｐ．ｈａｐｌｏｐｈｉｌａ、Ｐ．ｏｈｍｅｒｉ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐ．ｒｈｏｄａｎｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｔｏｌｅｔａｎａ、Ｐ．ｔｒｉｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ、Ｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ、Ｐ．ｔｈｏｅｎｉｉ、Ｐ．ｚｅａｅ、Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｂｏｆｌａｖｕｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｙａｒｔｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ａｕｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ａｚｏｔｏｇｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ、Ｐ．ｃｏｎｖｅｘａ、Ｐ．ｃｒｕｃｉｖｉａｅ、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｐ．ｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｐ．ｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｐ．ｄｉｍｉｎｕｔａ、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐ．ｆｒａｇｉ、Ｐ．ｇｌｕｔａｒｉｓ、Ｐ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｐ．ｌｅｍｏｎｎｉｅｒｉ、Ｐ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｐ．ｍｉｌｄｅｎｂｅｒｇｉ、Ｐ．ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｏｖａｌｉｓ、Ｐ．ｐｉｃｔｏｒｕｍ、Ｐ．ｐｉｓｉ、Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｐ．ｐｓｅｕｄｏｆｌａｖａ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａ、Ｐ．ｒｅｓｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐ．ｓｏｌａｎａｃｅｒｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｐ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ、Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ、Ｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｒ．ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、Ｒ．ｌｕｐｉｎｉ、Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｒ．ｐｈａｓｅｏｌｉ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ、Ｒ．ｔｒｉｆｏｌｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｒ．ｔｅｒｒａｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｒｅｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ、Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｒ．ｍａｒｉｎａ、Ｒ．ｍｉｎｕｔａ、Ｒ．ｒｕｂｒａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｐｓｕｌｒａｒｉｅｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃ��ｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ  ｌｕｄｗｉｇｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｎｙ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｒｃｉｎａ  ｌｕｔｅａ、Ｓａｒｃｉｎａ  ｓｐ．、Ｓ．ｓｕｂｆｌａｖａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｂｕｎｄａｎｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｓ．ｓｌｏｏｆｆｉｉ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ｍａｒｉｎｏｒｕｂｒａ、Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｅａ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｈｏｌｓａｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｒｏｓｅｕｓ、Ｓ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ、Ｓｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｏｌｉｖａｃｅｏｕｓ、Ｓ．ｒｉｍｏｓｕｓ、Ｓｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｓ．ａｌｂｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｓ．ｄｉａｃｅｔｉｌａｃｔｉｓ、Ｓ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓ．ｌａｃｔｉｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．ｚｙｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｃｕｓ、Ｓ．ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓ．ａｌｂｕｓ、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓ．ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ｃａｅｌａｓｔｉｓ、Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅｕｓ、Ｓ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓ．ｈａｗａｉｉｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓ．ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓ．ｎａｔａｌｉｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｎｉｔｒｏｓｐｏｒｅｕｓ、Ｓ．ｎｉｖｅｕｓ、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ、Ｓ．ｏｌｉｖａｃｅｏｕｓ、Ｓ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓ、Ｓ．ｐｈａｃｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕａｌａｅ、Ｓ．ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓ．ｖｉｒｉｄｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ、Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ｔ．ｎｏｖｅｌｌｕｓ、Ｔ．ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｅｔｈａｎｏｌｉｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｓｐ．、Ｔｒｅｍｅｌｌａ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｅｉｇｅｌｉｉ、Ｔ．ｃａｐｉｔａｔｕｍ、Ｔ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｗ．ｓａｔｕｒｎｕｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｘ．ｍａｌｖａｃｅａｒｕｍ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ、Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚ．ｐｒｉｏｒｉｏｎｕｓ、Ｚｙｇｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚ．ｐｒｉｏｒｉｏｎｕｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ａｎａｅｒｏｂｉａ、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｓｐ．、Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｔｏｒｑｕｉｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ、Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐ．、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｒｔｒｈｏｂｏｔｒｙｓ  ｃｏｎｏｉｄｅｓ、Ａ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ、Ａ．ｇｏｓｓｙｐｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ、Ａ．ｃａｎｄｉｄｕｓ、Ａ．ｃｌａｖｔｕｓ、Ａ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ａ．ｆｌａｖｉｐｅｓ、Ａ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｆｏｅｔｉｄｕｓ、Ａ．ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｓ、Ａ．ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ  ｖａｒ．ｖｉｒｉｄｉｓ、Ａ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｎｓ、Ａ．ｓｏｊａｅ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ  ｖａｒ．ａｕｒｅｕｓ、Ａ．ｕｓｔｕｓ、Ａ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ａ．ｗｅｎｔｉｉ、Ａｕｒｅｂａｓｉｄｉｕｍ  ｍａｕｓｏｎｉｉ、Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ  Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｐｏｌｙｔｒｉｃｈａ、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｈａｐｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ、Ｂｅｎｊａｍｉｎｅｌｌａ  ｍｕｌｔｉｓｐｏｒａ、Ｂ．ｐｏｉｔｒａｓｉｉ、Ｂｏｔｒｙｏｄｉｐｌｏｄｉａ  ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ、Ｂｏｔｒｙｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｐｉｌｕｌｉｆｅｒｕｍ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ａｌｌｉｉ、Ｃｅｐｈａｌｉｏｐｈｏｒａ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｃｈａｅｔｏｍｅｌｌａ  ｒａｐｈｉｇｅｒａ、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｇｌｏｂｏｓｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｐａｓｐａｌｉ、Ｃ．ｐｕｒｐｕｒｅａ、Ｃｏｋｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎａ、Ｃ．ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、Ｃ．ｓｐ．、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｂｒａｃｈｙｓｐｏｒａ、Ｃ．ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎｉｓ、Ｃ．ｆａｌｌａｘ、Ｃ．ｌｕｎａｔａ、Ｄａｅｄａｌｅａ  ｆｌａｖｉｄａ、Ｄａｔｒｏｎｉａ  ｍｏｌｌｉｓ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ  ｕｎｉｎｕｃｌｅａｔｕｓ、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ、Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｆ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆ．ｔｒｉｃｉｎｃｔｕｍ、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍ、Ｇｅｏｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ、��ｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ｇ．ｓａｕｂｉｎｅｔｔｉ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ  ｂｕｔｌｅｒｉ、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ、Ｈｙｍｅｎｏｃｈａｅｔｅ  ｒｕｂｉｇｏｎｏｓａ、Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ、Ｌｅｎｚｉｔｅｓ  ｓｔｒｉａｔａ、Ｌｅｐｉｏｔａ  ｒｈａｃｏｄｅｓ、Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ  ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ、Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｉｌｓ、Ｍ．ｐｌｕｍｂｅｕｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．、Ｍｙｃｏｔｙｐｈａ  ａｆｒｉｃａｎａ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｒｏｒｉｄｕｍ、Ｍ．ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｎ．ｓｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｐ．ｖａｒｉｏｔｉ、Ｐｅｎｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｃｈｒｏｃｈｌｏｒｏｎ、Ｐｅｎｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．、Ｐ．ａｒｇｉｌｌａｃｅｕｍ、Ｐ．ａｓｐｅｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｐ．ｆｒｅｑｕｅｎｔａｎｓ、Ｐ．ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ、Ｐ．ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ、Ｐ．ｌｉｇｎｏｒｕｍ、Ｐ．ｎｏｔａｔｕｍ、Ｐ．ｏｃｈｒｏｃｈｌｏｒｏｎ、Ｐ．ｐｉｎｏｐｈｉｌｌｕｍ、Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ、Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ、Ｐ．ｖａｒｉａｂｉｌｅ、Ｐｈａｅｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｂｕｂａｋｉｉ、Ｐ．ｃａｌｃｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐ．ｆａｓｔｉｇｉａｔａ、Ｐ．ｌａｇｅｒｂｅｒｇｉｉ、Ｐ．ｒｉｃｈａｒｄｓｉａｅ、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｓｐ．、Ｐｈｏｍａ  ｅｘｉｇｕａ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ  ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓ、
Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｆｌａｂｅｌｌａｔｕｓ、Ｐ．ｆｌｏｒｉｄａ、Ｐ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ、Ｐ．ｏｓｔｒｅａｔｕｓ、Ｐ．ｓａｊｏｒ−ｃａｊｕ、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｍｅｌｉａｅ、Ｐｏｒｉａ  ｐｌａｃｅｎｔａ、Ｐｔｙｃｈｏｇａｓｔｅｒ  ｓｐ．、Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ、Ｐ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ、Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ  ｂｒｅｖｉｃａｕｌｉｓ、Ｓｐｏｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｓａｒｃｉｎａｅｆｏｒｍｅ、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｓｐ．、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ｉｎｆｌａｔｕｍ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｃｕｂｅｎｓｉｓ、Ｔ．ｈｉｒｓｕｔａ、Ｔ．ｌａｃｔｉｎｅａ、Ｔ．ｓｅｒｉａｌｉｓ、Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｔ．ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ、Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．、Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ  ｄｉｐｌａｓｉａ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ  ｓｐ．およびＶ．ｖｏｌｖａｃｅａ。本発明の方法における使用のために最も好ましい微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｒａｃｅｍｉｌａｃｔｉｃｕｓ、Ｂ．ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ、ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ  およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
本発明の方法における使用のための適当な微生物（単数または複数）の接種密度は、バイオマスの選択された種類および濃度、選択された前処理の他の条件（例えば、ｐＨ、時間および温度）並びにＳＳＦのために選択された条件（例えば、酵素（単数または複数）および温度）と共に、良好な増殖、代謝および発酵能力を提供しつつ発酵製品の最も低い製造コストをもたらす微生物（単数または複数）の密度である。好ましい一態様において、微生物（単数または複数）の密度は約０．１〜約５０、より好ましくは約２〜約２０、さらにより好ましくは約５〜約１０ｇ微生物（単数または複数）／ｋｇの前処理されたリグノセルロース系バイオマスである。
【００２９】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、さらに好ましい一態様において、ＳＳＦ中の全固体濃度は約５％〜約５０％、例えば約５％〜約４０％、３０％または２５％などであり、最も好ましくは約４０％〜約５０％である。
【００３０】
ＳＳＦを行うための最適温度は、微生物（単数または複数）および／または酵素もしくは酵素混合物の最適温度に依存する。当業者はＳＳＦを行うための最適温度の決定の仕方を知っている。１つまたは複数の微生物および／または酵素（単数または複数）との組合せで使用される最適温度は、知られている方法を使用して種々の温度条件における微生物（単数または複数）および／または酵素（単数または複数）の活性を解析することによって確立することができる。好ましい一態様において、ＳＳＦの間の温度は約２０〜約８０℃の範囲内、より好ましくは約２５〜約６０℃の範囲内、最も好ましくは約３０〜約５０℃の範囲内である。
【００３１】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、さらに好ましい一態様において、ＳＳＦの間のｐＨは、約２．０〜１０．０の間、より好ましくは約４．０〜８．０、より好ましくは約５．０〜７．０の間となるように調節されおよび／または維持され、最も好ましくはＳＳＦの間のｐＨは約６．０に調節されるおよび／または維持される。ｐＨはアルカリ前処理されたバイオマスおよび任意に溶液または懸濁液形態のアルカリの（例えば自動の）添加によって、例えば吐出量が、望まれるｐＨ値および標準ｐＨ電極によって測定されるｐＨ値に基づいて、制御装置（コンピュータ）によって設定されるポンプまたは供給装置によって制御してよい。
【００３２】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、さらに好ましい一態様において、ＳＳＦの間のｐＨは、アルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスの添加によって、さらなるアルカリの供給源の必要がなく、大きなｐＨの変動もなく、制御してよい。もう１つの好ましい態様において、ＳＳＦの間のｐＨは、アルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスおよびアルカリ剤の添加によって制御してよい。
【００３３】
好ましい一態様において、ＳＳＦは前加水分解フェーズ、アルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスの添加によるｐＨ制御を有する流加バッチフェーズおよびアルカリの添加によるｐＨ制御を有するバッチフェーズを有し得る。好ましい一態様において、流加バッチフェーズには有機酸の生成に起因するｐＨ低下を打ち消すためにアルカリが加えられるバッチフェーズが伴いおよび／または続き、ｐＨを一定のレベルに維持する。好ましい一態様において、アルカリは、これらだけには限定されないが、水酸化カルシウム、（Ｃａ（ＯＨ）２）、酸化カルシウム（ＣａＯ）、アンモニア（ＮＨ３）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、炭酸ナトリウム、尿素またはこれらの組合せからなる群から選択される。
【００３４】
代わりにまたは先の好ましい態様と組み合わせて、さらに好ましい一態様において、発酵生成物は、理論的最大量の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは１００％の量で生成される。理論的最大量は次の式によって計算できる：
ＬＡｔｈｅｏｒｍａｘ＝ＤＭ＊Ｆ＊ＨＦ＊ＦＦ
（式中、
ＤＭ＝アルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスの全乾物（ｇ）
Ｆ＝アルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマス１ｇ当たりの多糖類（ｇ）の分率
ＨＦ＝多糖類の分子量から単糖類の分子量に変換する加水分解ファクター
ＦＦ＝多糖類１ｇ当たり発酵生成物１．００ｇの発酵ファクター（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ））。
【００３５】
ステップｃ）回収
「回収」という用語は、本明細書において、本発明の発酵生成物がステップ（ｂ）のＳＳＦ混合物から純粋および／またはより濃縮された形態で得られる、例えばステップ（ｂ）のＳＳＦ混合物と比較してより低い濃度の他の成分またはより少ない数の他の成分を有する発酵生成物を得るための、任意の方法または方法の組合せと定義される。
【００３６】
もう１つの側面において、本発明はアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスの同時糖化発酵のための発酵槽と任意にまたは一時的に連結されたリグノセルロース系バイオマスのアルカリ前処理のための容器を含む反応槽に関し、反応槽は本発明の方法に使用され、
１）容器は次のもの：
ｉ）攪拌デバイス；
ｉｉ）加熱デバイス；および
ｉｉｉ）任意に、リグノセルロース系バイオマスからの可溶性成分の前抽出のための手段
を含み、
２）発酵槽は次のもの：
ｉ）自動ｐＨ制御；および
ｉｉ）該自動ｐＨ制御によって制御される、容器からのアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスのための入口
を含む。
【００３７】
好ましい一態様において、混合デバイスはアルカリ剤をアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスに混合することができる。
【００３８】
もう１つの好ましい態様において、加熱デバイスはアルカリ剤およびアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスの混合物を必要な処理温度まで加熱することができる。好ましい一態様において、混合物は電気加熱によってまたはスチームによって加熱される。
【００３９】
好ましい一態様において、容器および発酵槽の間の連結デバイスまたは連結手段は、ポンプ、好ましくはアルカリ前処理済みリグノセルロース系バイオマスの発酵槽への自動供給を可能にするスクリューフィーダーである。前処理フェーズの間は連結デバイスまたは連結手段が存在する必要は必ずしもなく、または物理的に連結されている必要もないが、好ましくは少なくともＳＳＦフェーズの前および／またはその間は設置される、加えられるまたは取り付けられる。したがって、連結デバイスまたは連結手段は一時的にまたは任意に存在してもよい。異なる一態様において、容器および発酵槽の間の連結デバイスまたは連結手段は常時存在する。
【００４０】
好ましい一態様において、アルカリは上記のアルカリから選択してよい。
【００４１】
もう１つの好ましい態様において、発酵槽は１つまたは複数の次のもの：自動ｐＨ制御によって制御されるアルカリの自動供給のための入口；１つまたは複数の酵素または酵素混合物（単数または複数）のための、１つまたは複数の微生物および／または酸もしくは塩基、例えば硫酸もしくはＣａ（ＯＨ）２、より好ましくは３Ｍ硫酸または２０重量／容積％のＣａ（ＯＨ）２のための入口；サンプリングおよび／またはモニターのための出口；自動温度制御デバイス；および／または攪拌機アセンブリを含む。
【００４２】
もう１つの側面において、本発明は、本発明の方法によるリグノセルロース系バイオマスからの有機酸を製造するための上記の通りの本発明の反応器の使用に関する。
【００４３】
本文書およびその特許請求の範囲において、「含む」という動詞およびその活用形は、その非限定的意味で使用され、この語に続く項目が包含されるが、具体的に言及されていない項目も排除はされない。加えて、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、文脈が１つであり且つただ１つの要素だけがあることを明確に必要としない限りは、１を超える要素が存在する可能性を排除しない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】石灰処理済み小麦ストローから乳酸への同時糖化発酵の概略図である。
【図２】市販の酵素製剤ＧＣ  ２２０およびバシラス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＤＳＭ  ２３１４（Ｂ）による石灰処理済み小麦ストローの同時糖化発酵の間のｐＨ（Ａ）制御である。点線の間の領域は前加水分解フェーズ（Ｉ）、アルカリ性ＬＴＷＳおよび酵素の添加によるｐＨ制御を有する流加バッチフェーズ（ＩＩ）およびＣａ（ＯＨ）２懸濁液の添加によるｐＨ制御を有するバッチフェーズ（ＩＩＩ）を表す。追加の酵素製剤ＧＣ２２０が矢印によって示されている時間に加えられた。
【図３】市販の酵素製剤ＧＣ  ２２０およびバシラス・コアギュランスＤＳＭ  ２３１４による石灰処理済み小麦ストローの同時糖化発酵におけるグルコース（□）、キシロース（◇）、アラビノース（△）（Ａ）および乳酸（◆）（Ｂ）のプロファイルである。点線の間の領域は前加水分解フェーズ（Ｉ）、流加バッチフェーズ（ＩＩ）およびバッチフェーズ（ＩＩＩ）を表す。追加の酵素製剤ＧＣ２２０が矢印によって示されている時間に加えられた。
【図４】石灰処理済み小麦ストローの同時糖化発酵の間の様々な時点における多糖体グルカン（Ａ）、キシラン（Ｂ）およびアラビナン（Ｃ）の不溶性画分（□）および加水分解された可溶性画分（斜線付き白抜き四角）（ｇ）（当初の量と分析された不溶性物質の量との間の差によって計算された）。図は可溶性生成物に加水分解された多糖類（▲）のパーセンテージも表している。エラーバーは、２回の分析の偏差を示す。
【００４５】
例
例１．原料および前処理
小麦ストローをリグノセルロース系モデル原料として選択し、オランダ北東部の農場から購入した。小麦ストローは空気乾燥し（８９．５（重量／重量）％乾物）、２ｍｍのスクリーンを通して砕いた。石灰前処理は、２基の１５ｌのミキサー（Ｔｅｒｌｅｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の両方を砕いた小麦ストロー１６５０ｇ、水道水１３ｋｇおよび水酸化カルシウム１６５ｇで満たすことによって行った。この小麦ストロー懸濁液を加熱し、３０ｒｐｍで連続攪拌しながら１６時間８５℃に保った。続いて石灰処理済み小麦ストロー懸濁液（ＬＴＷＳ）を３０℃まで冷却し、ＬＴＷＳを木綿袋に入れ、懸濁液を手動のピストンプレスを使用して９．７ｋｇ／ｍ２までの圧力でプレスすることによって脱水した。脱水後、１１．４５ｋｇの量の平均乾物含有量２７．０（重量／重量）％およびｐＨ１１．８を有するＬＴＷＳを得て、以後の実験のための基材とした。ＬＴＷＳの化学組成はｖａｎ  ｄｅｎ  Ｏｅｖｅｒら、によって記載された通りに決定した（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｏｅｖｅｒら、（２００３年）、Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．、３８巻、３６９７〜３７０７頁）。
【００４６】
例２．酵素製剤
それぞれ１１６、２１５および６７７Ｕ／ｍｌのセルラーゼ、セロビアーゼおよびキシラナーゼ活性を含有している酵素製剤ＧＣ  ２２０（Ｇｅｎｅｃｏｒ−Ｄａｎｉｓｃｏ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＳＡ）（Ｋａｂｅｌら、（２００６年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．、９３巻（１号）、５６〜６３頁）を本研究のために使用した。この製剤は、１．２ｇ／ｍｌの比重を有し、４．５ｍｇ／ｍｌのグルコース、２．９ｍｇ／ｍｌのマンノースおよび０．８ｍｇ／ｍｌのガラクトースを有していた。
【００４７】
例３．微生物および前培養
細菌バシラス・コアギュランスＤＳＭ  ２３１４株（ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を乳酸産生微生物として使用した。細菌細胞は、１０（重量／重量）％のグリセリン貯蔵溶液中に維持し、−８０℃において貯蔵した。化学薬品は、別途に表示しない限りは、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ゲルライトプレートは、グルコース、１０ｇ；ゲルライト、２０ｇ（Ｄｕｃｈｅｆａ、Ｈａａｒｌｅｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；酵母抽出物、１０ｇ（Ｄｕｃｈｅｆａ）；（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、２ｇ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、３．５ｇ；ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、１０ｇ（ＵＳＢ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．０２ｇおよびＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．１ｇを含有している（１ｌ当たり）培地を用いて調製した。グルコースおよびゲルライトは貯蔵溶液Ａ中に溶解させた（４倍に濃縮されている）。この貯蔵溶液のｐＨを、２Ｍ塩酸を用いて６．４に調整し、１２５℃において１５分間オートクレーブで加熱した。残りの栄養素は貯蔵溶液Ｂ（１．３３倍に濃縮されている）中に溶解させ、これも２Ｍ塩酸を用いてｐＨ６．４に調整したが、滅菌はフィルター（細孔径０．２μｍを有する酢酸セルロースフィルター、Ｍｉｎｉｓａｒｔ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で行った。滅菌後、培地を貯蔵溶液ＡおよびＢを合わせてゲルライトプレートに注いだ。細菌をゲルライトプレート上で５０℃において４８時間培養した。
【００４８】
同様の組成を有し、同様に調製したが、ゲルライトは加えなかったブロス１００ｍｌに接種するために、単離されたコロニーを使用した。培養物は５０℃で２４時間、静的にインキュベートし、１４００ｍｌのブロスのための接種材料として機能した。この培養物も静的に５０℃で１２時間インキュベートし、ＳＳＦ実験のための１０（容積／容積）％前培養物として使用できた。
【００４９】
例４．同時糖化発酵
ＬＴＷＳのＳＳＦは、ｐＨおよび温度制御（バイオコントローラーＡＤＩ  １０２０）を有する２０Ｌ発酵槽（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、Ｓｃｈｉｅｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｅｒｌａｎｄｓ）において行った。ＳＳＦの開始時には、発酵槽を水道水６．０ｋｇおよび脱水されたＬＴＷＳ（乾物含有量２７．０（重量／重量）％）１４００ｇで満たした。次いで、次の栄養素：酵母抽出物、１５０ｇ（Ｄｕｃｈｅｆａ）；（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、３０ｇ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、５２．５ｇ；ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．３ｇおよびＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１．５ｇをＬＴＷＳに加えた。次いで、ＬＴＷＳ懸濁液を５０℃まで加熱し、ｐＨを３Ｍ硫酸１０１ｇ（Ｈ２ＳＯ４約３０ｇ）を用いて６．０に調節した。ＬＴＷＳから乳酸へのＳＳＦ工程は３つのフェーズから成っていた：Ｉ）予め投入されているＬＴＷＳの前加水分解フェーズ、ＩＩ）スクリューフィーダーからのＬＴＷＳの自動供給を用いる流加バッチフェーズおよびＩＩＩ）水酸化カルシウム懸濁液によるｐＨ制御を用いＬＴＷ供給のないバッチフェーズ。実験装置構成の概略図を図１に示す。前加水分解は酵素製剤４０ｍｌのＬＴＷＳ懸濁液への添加によって開始させ、２５０ｒｐｍで連続攪拌しながら５０℃において２時間インキュベートした。流加バッチフェーズは、バチルス・コアギュランスＤＭＳ  ２３１４の前培養物１５００ｍｌの発酵槽への添加によって開始させた。細菌によって生成された乳酸は、脱水されたＬＴＷＳ（乾物２７．０％）８６２３ｇのフィーダー（Ｋ−Ｔｒｏｎ  Ｓｏｄｅｒ  Ｆｅｅｄｅｒｓ、Ｃａｎａｄａ）による発酵槽への自動添加によって中和し、６．０に設定された培地のｐＨによって調節制御した（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）。流加バッチフェーズを通じて、酵素製剤２８０ｍｌの量（酵素投入量合計９８ｍｇ／ｇ乾物基質）をＬＴＷＳ添加速度に比例して発酵槽に加えた。バッチフェーズの間は、ｐＨを２０．０（重量／容積）％の水酸化カルシウムの懸濁液の添加によって６．０に制御した。乾物、基質および（副）生成物の分析のためにサンプルを抜き出した。
【００５０】
例５．分析方法
単糖の分析のために、発酵ブロスのサンプルを遠心分離し（１７４００ｇにおいて３分間）、上澄み液のｐＨを炭酸バリウムを用い、ｐＨ指示薬（ブロモフェノールブルー）を使用して５．０に調整し、続いて液体をろ過した。分析はＣａｒｂｏｐａｃｋ  ＰＡ１カラム（カラム温度３０℃）およびパルスアンペロメトリック検出器（ＥＤ５０）（Ｄｉｏｎｅｘ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用する高性能アニオン交換クロマトグラフィーによって行った。注入の前に、システムを２５．５ｍＭのＮａＯＨを用いて１．０ｍｌ／分の流速において１０分間平衡させた。単糖の分離のために、注入時に移動相を３０分間脱イオン水に切り替えた。中性の単糖の検出のために水酸化ナトリウムのポストカラム添加を使用した。
【００５１】
可溶性オリゴ糖の測定は、予め計重したサンプルの３０００ｒｐｍでの５分間の遠心分離（Ｃｅｎｔａｕｒ  ２、Ｂｅｕｎ  ｄｅ  Ｒｏｎｄｅ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）および上澄み液を一晩凍結乾燥することによって行った。ペレットを計重し、硫酸を用いて加水分解して中性の単糖をｖａｎ  ｄｅｎ  Ｏｅｖｅｒらによって記載された通りの方法によって測定した（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｏｅｖｅｒら、（２００３年）、Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．、３８巻、３６９７〜３７０７頁）。計算のために、グルカンおよびキシランからのオリゴマーの平均分子量それぞれ１６６および１３２ｇ／ｍｏｌを適用し、それぞれ１．０８および１．１４の加水分解ファクターを得た。
【００５２】
不溶性ポリマー糖の分析のために、２５ｇのサンプルを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｃｅｎｔａｕｒ  ２、Ｂｅｕｎ  ｄｅ  Ｒｏｎｄｅ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、上澄み液を除去してペレットを新たに鉱物物質を除去した水２５ｍｌ中に再懸濁し、続いて３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った（Ｃｅｎｔａｕｒ  ２、Ｂｅｕｎ  ｄｅ  Ｒｏｎｄｅ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。再懸濁および遠心分離の順序を３回繰返した。最後の上澄み液の除去の後、ペレットを一晩凍結乾燥した。ペレットを秤量し（値は乾物（ＤＭ）の計算に使用した）、ポリマー材料を硫酸を用いて加水分解し、中性の糖をｖａｎ  ｄｅｎ  Ｏｖｅｒらによって記載された通りの方法によって分析した（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｏｖｅｒら、（２００３年）、Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．、３８巻、３６９７〜３７０７頁）。計算のために、グルカンおよびキシランの分子量それぞれ１６２および１３２ｇ／ｍｏｌを適用し、それぞれ１．１１および１．１４の加水分解ファクターを得た。
【００５３】
有機酸の分析は高性能液体クロマトグラフィーによってＭａａｓらによって記載された手順に従って行った（Ｍａａｓら、（２００６年）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７２巻、８６１〜８６８頁）。
【００５４】
乳酸のキラル純度（％）は、すべてのラクテートをメタノールを使用して誘導体化し、その後で乳酸メチルの双方のエナンチオマーをキラルガスクロマトグラフィーカラム上で分離し、炎イオン化検出器を使用して検出した。キラル純度は主なエナンチオマーの面積を双方のエナンチオマーの面積の和で割ったものとして表現した。
【００５５】
例６．計算
理論的最大乳酸生成量（ＬＡｔｈｅｏｒ．ｍａｘ（ｇ））は、次の式［式１］によって計算した。
ＬＡｔｈｅｏｒ．ｍａｘ＝ＤＭｓｕｂｓｔｒａｔｅ＊Ｆｐｏｌｙｓａｃｃｈ．＊ＨＦｍｏｎｏｓａｃｃｈ．／ｐｏｌｙｓａｃｃｈ．＊ＦＦ    ［式１］
（式中、ＤＭｓｕｂｓｔｒａｔｅ＝基質ＬＴＷＳの全乾物（ｇ）；Ｆｍｏｎｏｓａｃｃｈ＝基質当たりの多糖分率（ｇ／ｇ）；ＨＦｍｏｎｏｓａｃｃｈ．／ｐｏｌｙｓａｃｃｈ．＝多糖の加水分解ファクター、水の組み込みがグルカン１．００ｇから六炭糖１．１１ｇおよびキシランおよびアラビナンから五炭糖１．１４ｇをもたらす（ｇ／ｇ）並びにＦＦ＝単糖のｇ当たり乳酸１．００ｇの発酵ファクター（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ））。
【００５６】
酵素加水分解の効率（％、重量／重量）は、加水分解された多糖（ｇ）（当初の量と分析された不溶性物質の量との差によって計算される）の量を当初に基質中に存在した多糖の量（ｇ）で割ったものに基づいた。発酵効率（％、重量／重量）は、生成された乳酸の量（ｇ）を微生物によって消費された単糖の量（ｇ）で割ったものとして表現される。ＳＳＦの全体の効率（％、重量／重量）は、生成した乳酸の量を式１に記載された通りに決定される乳酸の理論上の最大量で割ることによって計算した。
【００５７】
例７．ＬＴＷＳの乳酸への同時糖化発酵
石灰前処理された小麦ストロー（ＬＴＷＳ）の多糖組成物は、主にそれぞれ３３．０、１９．０および２．０（重量／重量）％のグルカン、キシランおよびアラビナンから成り、残りの大部分はリグニン、灰分、エキス分およびウロン酸から構成されていた。小麦ストロー中の可溶性成分の一部は、ＬＴＷＳの固／液分離（脱水）によって部分的に除去した。本研究の焦点は、ＬＴＷＳ中に存在する圧倒的に多い多糖であり、全ポリマー糖の９９．８％を占めるグルカン、キシランおよびアラビナンの転化にある。以前の研究は、多糖の糖化のために使用されたセルラーゼ製剤ＧＣ  ２２０は、５０℃およびｐＨ５．０において最適に機能したが（原稿提出中）、バチルス・コアギュランスＤＳＭ  ２３１４のための増殖条件は５４℃およびｐＨ６．５であった（国際特許公開第２００４／０６３３８２号）。本研究においては、酵素加水分解および発酵の両方が、同じ反応器において、妥協的な条件である５０℃およびｐＨ６．０に設定された条件において同時に生じた。
【００５８】
ＬＴＷＳから乳酸へのＳＳＦは、２０Ｌの制御された攪拌されている発酵槽において研究した。以前の結果は、この工程をＬＴＷＳの当初の量の前加水分解を用いることなく行われ、単糖の濃度が低く、したがって比較的低い乳酸の生産性をもたらした。その結果として、生成された乳酸を中和するアルカリ性基質の流加バッチ添加速度が低かった（結果は示されていない）。発酵可能な糖のかなりの当初の量（＞２ｇ／ｌ）を用いて発酵を始めるために、ＬＴＷＳ  ３７８ｇおよび約６リットルの容積中の酵素製剤（ＬＴＷＳ乾物１ｇ当たりに８８ｍｇ）のｐＨ６．０において２時間の前加水分解を導入した。これはグルコース、キシロースおよびアラビノースのそれぞれ２．０、０．４および０．３ｇ／ｌの濃度をもたらした（図３Ａ）。
【００５９】
第２フェーズ（ＩＩ）は、バチルス・コアギュランスＤＭＳ  ２３１４の前培養物１５００ｍｌを導入することによって開始した。少量の前培養物中に生成した乳酸によりｐＨが若干低下し、ＬＴＷＳの添加によって自動的に中和された（図２Ａ、Ｂ）。４時間の遅延フェーズ後に、溶存酸素濃度が１００％から急速に１％未満の酸素の制限条件まで減少した（結果は示されていない）。その際、それぞれ３．３、０．７および０．３ｇ／ｌの濃度のグルコース、キシロースおよびアラビノースが存在した（図３Ａ）。これらの糖は同時に消費され、グルコースはキシロースおよびアラビノースよりも速く利用された。
【００６０】
これらの単糖の消費と同時に、乳酸が生成され、これはアルカリ性ＬＴＷＳの自動的な添加によって中和された。流加バッチフェーズを通じて、アルカリ性基質の添加によってｐＨは６．０±０．１に正確に維持した（図２Ａ、Ｂ）。フェーズＩＩの終了時に、脱水されたＬＴＷＳ１００２３ｇの全量および酵素製剤３２０ｍｌを発酵槽に加えた。２０．５ｇ／ｌ上澄み液の乳酸濃度が検出され（図３Ｂ）、合計３４２ｇの乳酸に相当した。乳酸のキラルＬ（＋）純度は９９．４％と測定されたところ、これはキシロースを唯一の炭素源として得られたものと同様である（国際特許公開第２００４／０６３３８２号パンフレット）。
【００６１】
フェーズＩの終わりに、低い酢酸濃度が培地中で検出され、この濃度はフェーズＩＩを通じて１．５ｇ／ｌまで増加したが、フェーズＩＩＩの間は一定に留まった（結果は示されていない）。これは酢酸がバチルス・コアギュランスによって形成された発酵生成物ではなかった可能性が最も高いことを示している。酢酸は化学的前処理の間にヘミセルロースの可溶化および加水分解のときに放出され得る。（Ｐａｌｍｑｖｉｓｔら、（１９９９年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、６３巻、（１号）、４６〜５５頁）。ＬＴＷＳの脱水処理により、酢酸の一部はプレス水を除去することによって簡単に基質から分離された。見掛上、酢酸の残量は基質と一緒に発酵槽へ供給された。コハク酸およびフマル酸などの他の有機酸のわずかな痕跡が（＜０．５ｇ／ｌ）発酵ブロス中で検出された。
【００６２】
フェーズＩＩＩは、アルカリ性ＬＴＷＳの添加から２０（重量／容積）％水酸化カルシウム懸濁液にｐＨ制御を変更することによって開始した。ｐＨを６．０に維持するために水酸化カルシウム懸濁液の投入を比較的速く行われたが、数時間後にはより低い投入速度に切り替われた。容積当たりの乳酸の生産性の低下を示していた（図２Ｂ、３Ｂ）。酵素の限界（例えば失活）を排除するために、２３．５時間のインキュベーション後に酵素製剤の追加の投入量（８０ｍｌ）を発酵槽に加えた。これによって直ちに水酸化カルシウム添加速度が若干加速され、増大した乳酸の生産性および酵素活性の限界が示された（図３Ｂ）。しかしながら、２９．７時間のインキュベーション後には、水酸化カルシウム添加速度の低下が再び観察された。したがって、２回目の酵素製剤の添加投入量（２４０ｍｌ）を加え、このときにはグルコースおよびキシロースのそれぞれ１．５ｇ／ｌおよび１．０ｇ／ｌのわずかな蓄積を若干もたらし（図３Ａ）、酵素加水分解ではなく微生物添加が律速であることを示していた。３２時間のインキュベーション後に、３７．１ｇ／ｌの乳酸濃度を、９９．４％のキラルＬ（＋）−乳酸純度と共にもたらした。５５時間の合計インキュベーション時間までのＳＳＦ工程の継続は、４０．７ｇ／ｌ上澄み液（〜３７．８ｇ乳酸／ｋｇ発酵ブロス）までの若干増加した乳酸濃度を、０．７４ｇ／ｌ／ｈの全体の容積当たりの乳酸生産性と共にもたらした。このフェーズで、９７．２％のキラルＬ（＋）−乳酸純度が分析された。乳酸の純度におけるこの若干の低下は、他の望まれない乳酸生成微生物による感染の結果である可能性がある。使用した基質は無菌ではなく、化学的前処理および発酵は開放のシステムにおいて非無菌の条件下で行われるのでＳＳＦ工程全体に微生物汚染の可能性がある。
【００６３】
例８．転化効率
ＬＴＷＳ中に存在するポリマー原料の酵素加水分解の効率は図４に示されている。不溶性ポリマー画分はＳＳＦ実験を通じて様々な時点において決定した。ＬＴＷＳ  ３７８ｇの前加水分解（２時間）の終わりには、不溶性グルカン（図４Ａ）、キシランの５５％（図４Ｂ）およびアラビナンの６２％（図４Ｃ）が単糖およびオリゴ糖を含む可溶性の糖類に転化された。流加バッチフェーズ（１３時間）の後に、ＬＴＷＳ  ２７０６ｇが加えられ、グルカンの４２％、キシランの５７％およびアラビナンの６３％が可溶性糖類および乳酸を含む生成物に転化された。インキュベーションの１３時間目と３２時間目との間で、多糖のさらなる加水分解が観察された。しかし、ＳＳＦの最後の２３時間の間は、多糖のわずかな加水分解しか起こらず、これはこのフェーズの間の乳酸生産性の低下に対応していた。５５時間以後はグルカン３９８ｇ、キシラン１３０ｇおよびアラビナン１１ｇが依然として不溶性ポリマー原料として存在していた。これらの値を用いて、ＬＴＷＳ中に存在している当初のグルカン、キシランおよびアラビナンの加水分解効率はそれぞれ５５、７５および８０％と計算された。ＬＴＷＳから得られる単糖は、バチルス・コアギュランスによって部分的に乳酸（７１１ｇ）に転化され、理論的最大限度の８１重量／重量％に相当し、微生物バイオマスおよび二酸化炭素などの他の生成物の形成を示していた。理論的最大限度の４３重量／重量％の全転化率は、式１によって計算された。当初のＬＴＷＳ中に存在している多糖のインキュベーションの５５時間後の結末は表Ｉに示されている。ＬＴＷＳ中に存在している多糖の一部分は、不溶性多糖のままであり（３７重量／重量％）、わずかな部分が可溶性オリゴ糖（５重量／重量％）および単糖（３重量／重量％）に転化された。ＬＴＷＳ中に存在する当初の多糖のもう１つの部分は、糖類または乳酸の形態では回収されず、したがって「不明」とみなした。
【００６４】
表Ｉ．石灰処理済み小麦ストロー中に当初に存在する多糖ａの、同時糖化発酵の５５時間後の行方。示されている値は２回の分析測定に基づく平均値である。
【表１】
2010536368.tif 000003
ａグルカン、キシランおよびアラビナンの合計
ｂ当初の多糖の一部は不溶性多糖として残存した。
ｃ当初の多糖の一部は回収されなかったため「不明」と表記した。
【００６５】
例９．アルカリ性基質による酸の中和
流加バッチフェーズ（ＩＩ）の間に生成された乳酸（３４２ｇ）は、アルカリ前処理済み小麦ストローによって中和された。このフェーズの間に、２３２８ｇの量のＬＴＷＳを発酵槽に加えた。この基質と共に、２３０ｇの量の水酸化カルシウムを発酵槽に加え、乳酸１ｇ当たりの水酸化カルシウム０．６７ｇの比に相当した。バッチフェーズ（ＩＩＩ）の間に生成された乳酸（３６９ｇ）は、水酸化カルシウム１６３ｇによって中和され、水酸化カルシウム１ｇ当たりの乳酸０．４４ｇの比となった。
【００６６】
考察
リグノセルロース系原料は大量生産化学薬品のための見込みのある魅力的な基質と考えられる。リグノセルロースのマトリックスを切り開くためにはバイオマスの前処理が必要とされ、ポリマー炭水化物の加水分解のためには酵素加水分解が必要である。石灰前処理は、リグノセルロース中に存在する多糖の酵素消化性を高め（Ｃｈａｎｇら、（１９９８年）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４巻、１３５〜１５９頁）；ＫａａｒおよびＨｏｌｔｚａｐｐｅ、（２０００年）、Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ、１８巻、１〜８９９頁）、他の前処理経路と比較してわずかな阻害物質しかもたらさないことを証明した。しかし、酵素加水分解の前にはｐＨを酵素活性に対して最適のレベルに調節することが不可欠である。本研究において、ＳＳＦ工程の間に微生物発酵によって生成された乳酸を中和するためにＬＴＷＳのアルカリ性を使用することによって、洗浄または中和によるｐＨの低減は省略された。
【００６７】
これらの結果は、ＬＴＷＳ中の多糖の最大の部分は酵素によって転化され、もたらされた糖は同時にバチルス・コアギュランスＤＳＭ  ２３１４によって主として乳酸に発酵されたことを示すものであった。１０〜３０時間のインキュベーションの間に、細菌は単糖を、それらが培地中に現れると直ぐに利用して比較的低い単糖濃度をもたらした（＜２ｇ／ｌ）。これは、この期間を通じてずっと酵素加水分解が律速フェーズであったことを示している。最高の乳酸生産性は流加バッチフェーズの間およびバッチフェーズの始めの時間の間に観察され、約２０時間のインキュベーション以後は図３Ｂに示すように急速に低下した。酵素製剤の添加により、容積当たりの乳酸生産性は若干向上したが、数時間以内に再び比較的低い生成速度に転じた。２回目の酵素の添加は乳酸生産性に有意には影響を及ぼさなかった（図３Ｂ）。この新しい酵素の添加は少量のヘミセルロース糖（キシロース、アラビノース）の遊離をもたらしたが、グルカンのさらなる加水分解は起こらなかった。このことは、残っていたグルカンがさらなる加水分解に対して抵抗性であったかまたは接近可能ではなかったため、乳酸の生成性が低下したことを示している。低減された乳酸生産性のもう１つの可能な説明は、増加しつつある乳酸濃度による酵素および／または細菌の阻害である。
【００６８】
５５時間のインキュベーションの後に、４０．７ｇ／ｌ上澄み液（約３７．８ｇ乳酸／ｋｇ発酵ブロス）の乳酸濃度が比較的高いキラル純度と共に決定されたところ、これは理論的最大の４３％の全体の乳酸収率に相当する。さらに、酵素糖化および発酵の効率が両方とも決定された。これらの計算は、ＳＳＦ工程（５５時間）の終わりにおける残留物の分析に基づいてＬＴＷＳ中に存在するグルカン５５％、キシランの７５％およびアラビナンの８０％が酵素加水分解されたことを示し、これらは先に得られた結果とよく一致している。収率を向上させるためには、前処理手順の最適化によってＬＴＷＳ中の多糖の抵抗性を低減するまたは接近可能性を向上させることが必要である。ＳＳＦ工程において予想される培地中の可溶性単糖および多糖の濃度は比較的低かった。８１％の発酵収率が決定され、唯一の炭素源としての５０ｇ／ｌのキシロースからの３５ｇ／ｌの乳酸の生成を報告したＯｔｔｏによって得られた結果を若干上回った（上記参照）。他の可溶性発酵生成物は検出されなかったことから、残りの１９％のＬＴＷＳ由来の単糖が転化されたのは、発酵の好気性部分の間に細菌のバイオマスおよび一部である可能性が最も高いと考えられた。
【００６９】
流加バッチフェーズ（ＩＩ）の間には、乳酸生成に起因するｐＨ低下をアルカリ性供給原料の添加によって相殺することが可能であり、石灰処理が幅広い範囲の有機酸のリグノセルロース系バイオマスからの製造とうまく組み合わせられ得ることを示している。このフェーズを通してずっと、加えられたＬＴＷＳ中の水酸化カルシウムの生成された乳酸当たりの比は、０．６７ｇ／ｇであると特定された。乳酸１．００ｇの理論的動力学的中和は、水酸化カルシウム０．４１ｇを必要とする。したがって、当初小麦ストローに加えられた水酸化カルシウムの６１％だけが乳酸の中和のために使用された。他方で、バッチフェーズを通じてずっと、０．４４ｇ／ｇのアルカリ／酸比は乳酸の中和のために使用された加えられた水酸化カルシウムの９３％に相当すると計算された。フェーズＩＩの間に乳酸の中和のためにＬＴＷＳと共に加えられた水酸化カルシウムの低い効率は、３とおりの説明が可能である。第１に、水酸化カルシウムの部分が、小麦ストローの化学的前処理の間に、酢酸もしくは他の有機酸の中和および／またはリグニンへの不可逆性の結合など使用された可能性がある。第２に、水酸化カルシウムは不溶性の小麦ストロー繊維からゆっくり遊離され、それ故に部分的に流加バッチフェーズにおいて乳酸の中和のために使用された可能性がある。最後に、乳酸の生成に加えて、他の酸性化反応が、ｐＨの低下に寄与し、それ故にアルカリ性基質が必要とされた可能性がある。例えば窒素源アンモニウムの微生物による摂取およびアンモニアおよびプロトンへの解離である（Ｇｕｅｌ、（１９９２年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４巻（１２号）、１１９３〜１１９８頁）。
【００７０】
本文書における結果は、リグノセルロース系原料を乳酸の製造において使用することが可能であるということを示している。リグノセルロース系バイオマスは比較的安価な基質であり、これは乳酸製造のための原料コストに良い影響を及ぼす。しかしながら、十分に規定された組成を有する、伝統的な比較的「清浄な」原料と比較して、不均質なリグノセルロース系基質は、複雑な発酵ブロスから乳酸を取り出して精製するためにより増強された下流での処理（ＤＳＰ）を必要とする。原料物質のコストおよびＤＳＰの操業コストは乳酸の全製造コストにかなりの負担を強いる（ＡｋｅｒｂｅｒｇおよびＺａｃｃｈｉ、（２０００年）、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、７５巻、１１９〜１２６頁）。リグノセルロース系原料を使用することによって低減されるコストが、ＤＳＰについての増大し得るコストをより有利であるかは、今のところ解析されていない。
【００７１】
要約すれば、石灰処理済み小麦ストローが、バチルス・コアギュランスによって、２０Ｌのベンチスケールにおける同時糖化発酵によりＬ（＋）−乳酸に転化された。ポリマー原料から得られた五炭糖および六炭糖の糖類がバチルス・コアギュランスによって同時に利用されて、理論収率の４３（重量／重量）％に相当する４０．７ｇ／ｌ上澄み液の最終の乳酸濃度をもたらした。本発明者らの知る限りでは、これは組み合わされたリグノセルロース系バイオマスのアルカリ前処理および有機酸発酵におけるｐＨ制御を有する方法が、石灰消費の顕著な節減および石灰をリサイクルする必要性が回避できることを初めて立証したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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