(57)【要約】  検出容積において発光団の存在を検出する方法が提供され、当該方法は、その検出容積において励起放射を提供することを含む。発光団がその検出容積において提供され、励起放射によって励起することができる。その発光放射は、検出容積における発光団の存在を識別するように検出される。本発明の一態様では、発光団は、最小寸法の2倍よりも大きい波長を媒体において持つ発光放射を検出するように選択される；及び、最小寸法の2倍よりも小さい波長を媒体において有する励起放射によって励起することが可能であるように選択される。それに応じて、発光放射は、検出器の中へ入るのを妨げられるが、それは開口のインターフェースに存在する部分においてである。
2010513914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出容積において発光団の存在を検出する方法であり：
前記検出容積において励起放射を提供する段階；
前記検出容積において媒体における発光団を提供する段階であり、該発光団は発光放射を発するように、前記励起放射によって励起されることが可能である、段階；及び
前記検出容積の、最小の面内寸法を持つ開口を通して前記発光放射の少なくとも偏光要素を検出器によって検出する段階であり；
前記発光団が前記最小寸法の2倍よりも大きい波長を前記媒体において持つ発光放射を発するように選択される；及び前記発光団が前記最小寸法の2倍よりも小さい波長を前記媒体において持つ励起放射によって励起することが可能であるように選択される、段階；
を含む方法。
【請求項２】
前記容積が限られた数の発光団を含む、請求項1に記載された方法。
【請求項３】
前記励起放射が、前記検出容積の中へ送られるように提供されている、請求項1に記載された方法。
【請求項４】
前記発光団が、量子ドット及びLaF3:Nd粒子のグループから選択される、請求項1に記載された方法。
【請求項５】
前記励起放射が検出されるのを防ぐ段階をさらに含む、請求項1に記載された方法。
【請求項６】
前記励起放射が、前記検出容積と前記検出器との間の中間容積において前記発光団を励起することを防止する段階を含む、請求項1に記載された方法。
【請求項７】
前記発光団が前記中間容積において存在することを防がれている、請求項6に記載された方法。
【請求項８】
前記発光団が、生体分子に結びつくようにされている、請求項1に記載された方法。
【請求項９】
前記励起放射が偏光されている、請求項1に記載された方法。
【請求項１０】
検出容積において発光団の存在を検出するための装置であり：
検出容積であり；最小面内寸法を持つ及び媒体において発光団を含むようにされている、開口を含む、検出容積；
前記検出容積において励起放射を提供するための放射線源であり、前記発光団が発光放射を発するように前記励起放射によって励起することが可能である、放射線源；及び
前記発光放射の少なくとも偏光要素を検出するように配置及び構成されている検出器であり；当該検出器が、前記最小寸法の2倍よりも大きい波長を前記媒体において持つ発光放射を検出するように選択されている；及び前記放射線源が、前記最小寸法の2倍よりも小さい波長を前記媒体において持つ励起放射を提供するように選択されている、検出器；
を含む装置。
【請求項１１】
前記放射線源及び前記検出器が透過性構造において備えられる、請求項10に記載された装置。
【請求項１２】
前記開口が、最大の面内開口の寸法を定める1つ又はそれ以上のピンホールによって形成され；前記最大の面内開口の寸法が前記媒体における回折限界より小さい、請求項10に記載された装置。
【請求項１３】
前記開口が、1つ又はそれ以上のスリットによって形成される、請求項10に記載された装置。
【請求項１４】
前記検出器によって、前記励起放射が検出されることを防ぐためのブロッキング光学素子をさらに含む、請求項10に記載された装置。
【請求項１５】
前記ブロッキング光学素子が、波長フィルター又は偏光フィルターを含む、請求項14に記載された方法。
【請求項１６】
前記ブロッキング光学素子が、前記検出容積から出る前記励起光を防ぐように配置されている、請求項14に記載された装置。
【請求項１７】
前記装置がさらに前記スリットと共に使用される偏光フィルターを含み、前記発光放射の一部を遮断する、請求項16に記載された装置。
【請求項１８】
前記偏光フィルターが、前記スリットによって偏光された発光放射を選択的に通すように回転することが可能である、請求項17に記載された装置。
【請求項１９】
前記偏光フィルターが前記スリットと前記検出器との間に備えられている、請求項17又は18に記載された装置。
【請求項２０】
物質が前記開口を閉じるために提供され、前記励起放射が、前記検出容積と前記検出器との間の中間容積において前記発光団を励起することを防ぐための、請求項10に記載された装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出容積における発光団の存在を検出する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献1は、エバネセント波の手段による発光団の励起のための構造を公開している。エバネセント波は、サブ波長開口によって伝播することができない、急速に崩壊している電磁界である。本開示では、生体分子を含む混合物においてエバネセント波として伝播する励起放射が提供されている。そのエバネセント波は、サブ波長開口を持つ構造物によって生成される。しかし、その開口は生成された放射のごく一部が送り出されることを可能にするのみである。これは、検出の目的に使用されるべき発光の光の限られた取得の原因となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第2005244863号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】B.D.Butkus  “Quantum  Dots  Lend  Simplicity”,  Biophotonics  International,  pp.  34-40,  May  2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、発光放射の生産量を増加させることに対する要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
それに応じて、本発明の一態様では、検出容積における発光団の存在を検出するための方法が提供されており、当該方法は：該検出容積において励起放射を提供する；該検出容積における媒体の発光団であり、その発光団は発光放射を発するために該励起放射によって励起されることが可能である；及び検出器によって開口を通して該発光放射の少なくとも偏光要素を検出し、該開口は最小の面内寸法を持つ；前記発光団は、該媒体においてその最小寸法の2倍よりも大きい波長を持つ発光放射を該媒体において放射するように選択される；及び該発光団は該最小寸法の2倍よりも小さい波長を該媒体において持つ励起放射によって励起がされるように選択される；段階を含む。
【０００７】
本発明の他の態様では、検出容積において発光団の存在を検出するための装置が提供され、当該装置は：検出容積；最小の面内寸法を持つ開口を含み、媒体において該発光団を含むようにされている検出容積；該検出容積において励起放射を提供するための放射線源、該励起放射によって励起が可能な、発光放射をする発光団；及び該発光放射の少なくとも偏光要素を検出するように配置及び構成された検出器であり、該最小寸法の2倍よりも大きい波長を媒体において持つ発光放射を検出するように選択される検出器；及び該媒体において最小寸法の2倍よりも小さい波長を持つ励起放射を提供するように選択される放射線源；を含む。
【０００８】
本発明のある一態様では、開口は、発光団が励起される面内インターフェースを定義する。励起光のエバネセント波の尾部（evanescent  tail）を使用して励起容積を限定する代わりに、ここでは、その検出容積は、開口のインターフェース上で生成される蛍光発光を検出することによって限定することができる。それに応じて、励起効率が改善できる；その一方検出容積は限定されたままである。本発明のこれら及び他の態様は以下において説明される実施形態の参照によって明らかになり、解明されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の態様に従った基本的な実施形態；
【図２】励起及び蛍光検出効率を組み合わせた効果を表わす；
【図３】本発明の態様に従った発光放射の透過性検出を表わす；
【図４】本発明の態様に従ったスリットを使用した代替の実施形態を表す；及び
【図５】図4に表わされた実施形態の検出効率を表わす概略的なグラフを表わす。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
この技術では、開口バイオセンサーがフルオロフォア（fluorophore）などの発光団を検出するのに使用され、吟味されている生体分子の明確な種類を特定する。一般的にこれらの開口は、ピンホール又はスリットの着想を使用し、励起光を検出容積へのエバネセント放射として受け入れる。しかし、開口バイオセンサーにとって励起及び蛍光検出効率を組み合わせた効果は、そのバイオセンサーの全体の効率を減少させる。第2の問題は、透過モードにおいてピンホール・バイオセンサーの特定のケースでは、全体の効率はそのバイオセンサーの全ての部分において同じである。より小さい励起／検出容積を効率的に与えるために、全体の効率はある一定の部分でより高い方が望ましい。ある一態様では、検出容積のみを限定するサブ波長開口が提案されている。これは、励起と発光団との間の非常に大きな波長の差（stokes  shift）を持つ発光団を、開口バイオセンサーと共に使用して達成できる。このような方法では、励起光は、実質的に妨げられずにその検出容積の開口1の中に入ることができ、それは励起の有効性を大幅に増加させる。該発光団は、その発光放射が開口の内部のエバネセント場を生成するように、1つの波長を持つ発光放射を発するように選択される。それに応じて、発光放射は、開口1のインターフェース20に存在する部分を除いて開口1から出て行くのを阻止される。そうすることによって、検出容積101は小さく保たれ、背景の蛍光効果を低減し、従ってバイオセンサーのS/N比を改善することによって検出の選択性を増やす。本発明の他の態様では、励起及び検出効率を改善するため、ホール（hole）の代わりにスリット（slit）が使用されてもよい。スリットを使用することの利点は、抑制が偏光に依存するようになり、これによって発せられた蛍光の50%が抑制されずにスリットを出ることができる。
【００１１】
本発明のある態様では、最小寸法の開口が、該媒体における励起光の波長の2分の1よりも大きいように選択される；及び励起光によって励起される発光団によって放射される発光の光の媒体における波長の2分の1よりも小さいように選択される。この観点では、使用される種類の発光団は、該媒体における波長が実質的に最小の開口寸法の2倍よりも小さい放射によって励起できるように選択される；一方発光する光の放射は実質的にその最小の開口寸法の2倍よりも大きい。そうすることによって、発光放射は、実質的に開口のインターフェース20の上に発生させられる発光を除いては、開口の内部で捕獲される。具体的には、そのインターフェース20は、蛍光発光4の発光方向から見ると、開口1によって定義される外側の面によって形成される。
【００１２】
それに応じて、1態様において、本発明は励起と蛍光との間の波長差（stokes  shift）が（非常に）大きい発光団の使用を提案する。この目的において当業者は、例えば量子ドットなどの発光団を使用することができる（参照：非特許文献1）。例えば、量子ドットは、330nmの波長で照射され、610nmの蛍光放射をしてもよい。しかし、この蛍光放射はまた、異なる蛍光放射波長による多重化を可能にするため、変えられることができる（例えば、330nmの励起及び510、555、590、610nmの放射で4つの分析物の同時測定を可能にする）。大きいStoke  shiftを持つ他の発光団の例に、LaF3:Ndナノ粒子がある。これらのナノ粒子は、ランタン・イオン（La3+）の約5%がネオジム・イオン（Nd3+）で取り替えられたフッ化ランタン（LaF3）の結晶で構成される。これらのナノ粒子は、典型的な直径が6nmであり、励起状態のクエンチ（quench）を防ぐ。それぞれのナノ粒子は、60個のネオジム・イオン、1200個のランタン・イオン及び3780個のフッ化物イオンから成る。575nmの辺りの波長でポンプ（Pump）すると、880nm、1050nm及び1330nmの辺りの波長の放射が起こる。
【実施例１】
【００１３】
図1では本発明に従った基本的な実施形態が概説されており、物質2の中の開口1を表わしている。その図では、開口１は、検出容積101の低い側を定義する、この紙面に垂直なインターフェース面20の、最小の面内寸法とする幅102を定義する。検出容積101はさらに開口幅102によって限定される。その開口1のサイズは、励起放射3が抑制されずにその開口を通るには十分に大きい。特に、発光団5は励起放射３によって励起が可能なように選択され、該励起放射3は該開口幅102の2倍よりも小さい波長を該媒体において持つ。しかし、フルオロフォア（fluorophore）5及び6によって生成される蛍光4は抑制されており、それは、その蛍光波長が開口幅102よりも実質的に大きいためである。これにより、少なくとも開口の幅102を横切る方向に偏光されている蛍光4のため、検出容積101は限定される。インターフェース20の近辺に位置するフルオロフォア（fluorophore）5によって発せられる蛍光4（偏光に依存しない）は、開口1から出て検出器（非表示）に到達することができる。例えばフルオロフォア6によって開口1にさらに発せられる蛍光4は、そのフルオロフォア6が、該最小の寸法の2倍よりも大きい波長を該媒体に持つ発光放射を発するように選択されているため、開口1の出口に到達する前に抑制される。これは、利点である。なぜならば、バイオセンサーによる分析において、シグナルフルオロフォアは、フルオロフォア5がシグナル粒子である一方、フルオロフォア6は背景粒子であるという条件を満たすように、検出容積101の内部でプローブを捕獲するように限定されていてもよいことからである。励起放射3が検出器によって検出されるのを防ぐことができるように、励起を防ぎ、蛍光放射4を通すフィルター（非表示）が設けられてもよい。
【００１４】
望ましい実施形態において、開口1の最小寸法の幅102は：
励起光3が開口1を（実質的に）抑制されずに通り抜けることができる；
蛍光発光4が、開口1の中を通り抜ける時、少なくとも開口幅102によって定められる寸法において実質的に抑制される；
上記の条件が、その開口のサイズが、励起放射の該媒体における回折限界よりも大きい時、及び同時に、そのサイズが蛍光放射の該媒体における回折限界よりも小さい時（この回折限界は該開口を充填する媒体の屈折率に依存することに注目するべきである）に満たされる。
【００１５】
ある1例では、励起波長が575nmで発せられた蛍光が880nmである；屈折率1.3を持つ水で充填された開口を有する。最小寸法250nmを持つ開口及び400nmの開口奥行きを用いた計算は、開口全体を通り抜ける時、約84.4%の励起光の透過及び約0.7%の蛍光の透過が起こることを示す。
【００１６】
図2は、図1のような通常の構成における励起及び検出効率の組み合わせた効果を表わす；つまり、励起光は開口1の中に向かう。x軸は、開口1の奥行きを任意の単位で表わし、励起放射3の効率は、一般的に開口1を妨げられずに通り抜け、距離と共に起こる励起効率の小さい減少をもたらす；典型的な効率は1乃至0.8よりも低い。しかし、通常開口1よりも大きい波長を持つ蛍光発光4は、それに応じてその開口1に強く抑制される。従って検出効率は開口の出口付近で増加する。この場合、開口は透過モードで使用されることに注目するべきである。組み合わされる時、全体の効率はいまだに高く、実質的に蛍光検出効率によってのみ限定される。蛍光検出は、開口の出口、つまり検出される前に発光放射が通って逃げる端、から見て距離と共に減少するため、小さい検出容積、実質的にその開口の出口のすぐ前の開口の部分の間の容積によって形成される、が設けられ、それに応じて、ごく限られた数の発光団を含む。
【００１７】
本発明の実施形態では、この図に見られるように、励起／検出容積は、出口付近の蛍光4だけが開口1を出ることができるため、検出容積によって限定される。
【００１８】
図3は、ガラスプレートなどの基板7が開口1のインターフェース20に位置する実施形態を表わす。それに応じて、ガラスプレートの上層は、インターフェース20を形成し、それが、フルオロフォア5、6が検出容積101と検出器10の中間の容積の中に存在することを防ぐ。従って、検出容積101と検出器10との間の中間容積において励起放射は、フルオロフォアの励起に貢献する。それは、検出器と開口のインターフェース20（検出器の側）との間にフルオロフォアが存在しないからである。このような方法では、背景蛍光シグナルに貢献するフルオロフォアの励起ビームによる不注意な照射が防止される。従って、本発明の望ましい実施形態では、（開口の下に基板が無い図5に示される実施形態の代わりに）ガラスプレート7が開口の基板として使用される。これは図3に表わされており、基板7が開口の下に存在する。その図はまた、蛍光を検出器10にフォーカスするのに使用されるレンズ8を表わす。検出フィルター9は残りの励起放射をブロックするのに使用される。
【００１９】
基板7の追加の利点は、フルオロフォアが開口の内部のガラス表面に固定できることであり、そのフルオロフォアは励起＋検出の全体的な効率が最も高い位置に置かれる。
【００２０】
図3の実施形態は透過モードで使用されるが、その代わりとして、もう1つの実施形態では、開口1は反射モードで使用されてもよい。この場合、励起及び検出の組み合わせた効率は、図2に参照して説明された透過モードの実施形態に似ている。そのような実施形態において励起ビームは、ガラスプレート7を通して開口を表わすことができる。
【実施例２】
【００２１】
さらに、図1及び図3で開示されたピンホールの実施形態に加えて、開口が図4で示されるようなスリット47によって備えられている実施形態が使用できる。図4の実施形態において、スリットの方向に平行な偏光要素を持つ（背景）蛍光42がスリット47から出るのを防がれている一方、この実施形態では、該最小の寸法に沿った偏光（つまり、電界の方向）を持つ蛍光42はスリット47によって形成された開口を通って検出器46の方向に向かう。そのスリットの如何なる位置に発生する背景蛍光とそのスリットの端部に発生する蛍光との間を区別するには、偏光フィルター45を使用し、スリットの端部の蛍光の要素だけを選択してもよい。この実施形態の利点は、大きい検出容積と小さい検出容積との間で切替えが可能なことである。図4はこの場合の実施形態を表わし、図5は検出器の前の偏光子が、大きい検出容積と小さい検出容積との間でどう使用されるかを表わす。図4では、励起光のビーム（41）がスリット（47）（例えばワイヤグリッド偏光子）を照射する。励起放射は、（TE偏光された）励起波長がワイヤグリッドによって抑制されるにはあまりにも短いため、又はワイヤグリッドによって抑制されないように励起ビームがTM偏光されているため、実質的に抑制されずにスリットを通り抜けることができる。そのワイヤグリッドの後ろに置かれたレンズ（43）が放射された発光（42）を収集し検出器（46）に向けてフォーカスするのに使用される。そのレンズと検出器との間に、検出フィルター（44）（励起光を遮断する）及び偏光子（45）が置かれる（43、44及び45の順番は混合することができることに注意）。望ましくは、その偏光子（45）は回転することができる又は簡単に取り除くことができる。
【００２２】
図5はワイヤグリッドの後ろでその偏光素子を取り除く際の効果を表わす。上部の図は、偏光子がワイヤグリッドの後ろに位置し、通常は抑制されることなくそのワイヤグリッドを通過する偏光を妨げるように置かれている場合の検出＋励起の、組み合わせた効率を表わす。この場合、その偏光子が蛍光発光の少なくとも50%を抑制するため、最大検出効率は50%である。図で見られるように、検出容積は、傾向の抑制によって限定され、その結果小さい検出容積をもたらす。
【００２３】
望まれる場合、その検出容積は偏光子を取り除くことによって増加させることができる。これは、全体の効率が全体の距離において高い図5の下部のイメージに示されるような効率をもたらす。偏光子を取り除く代わりに、偏光子を90度回転させることも可能であるが、この場合、全体の効率は概ね50%低くなる。その代わりに、両方の状態を活用するためにその偏光子を連続的に回転させてもよい。
【００２４】
図4の実施形態が小さい検出容積を達成するためだけに使用される場合、検出フィルター（44）を完全に取り除くことが可能である。なぜならば、この場合その偏光子45は、抑制されずにスリットの中を通ることができるように偏光された光を全て遮断するからである（これは励起光も含む）。
【００２５】
この実施形態においても、開口の出口と検出器との間に背景シグナルが発生するのを防ぐために、望ましくはスリットの検出側にガラスプレート（非表示）が存在することに注目するべきである。
【００２６】
本発明は、図表及び前述の説明によって詳しく例証及び説明されている一方、そのような例証及び説明は実例的又は模範的であり限定的ではないと解釈されるべきである；本発明は開示された実施形態に限られていない。
【００２７】
例えば、蛍光が生物医学的な目的でマーカー又はトレーサーとして使用される実施形態において本発明を操作することが可能である。
【００２８】
開示された実施形態の他の形態が、請求項に係る実施において当業者によって、図表、開示及び請求項を研究することより理解及び達成されることができる。請求項において、「有する」又は「含む」という表現は、請求項に記載されていない要素又は段階を除外していない。単数として表わされる要素は複数の同様の要素を除外しない。単一のプロセッサ又は他のユニットが請求項に記載された多数の項目の機能を満たしてもよい。特定の基準が相互的に異なる請求項に記載されているという単なる事実はこれらの基準の組み合わせを利用してはいけないことは示していない。コンピューター・プログラムは、ハードウェアと一緒又はその一部に供給された光学ストレージ媒体又は固体媒体などの適切な媒体に保管／分配されてもよいが、また、インターネット又は他の有線若しくは無線のテレコミュニケーション・システムを通した他の形で分配されてもよい。
【符号の説明】
【００２９】
1…開口
2…物質
3…励起放射
4…蛍光発光
5…フルオロフォア（fluorophore）
6…フルオロフォア（fluorophore）
7…基板
8…レンズ
9…検出フィルター
10…検出器
20…インターフェース
41…励起光
42…蛍光発光
43…レンズ
44…検出フィルター
45…偏光子
46…検出器
47…スリット
101…検出容積
102…開口幅
【図１】
2010513914.tif 000003
【図２】
2010513914.tif 000004
【図３】
2010513914.tif 000005
【図４】
2010513914.tif 000006
【図５】
2010513914.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月23日(2009.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出容積において発光団の存在を検出する方法であり：
前記検出容積において励起放射を提供する段階；
前記検出容積において媒体における発光団を提供する段階であり、該発光団は発光放射を発するように、前記励起放射によって励起されることが可能である、段階；及び
前記検出容積の、最小の面内寸法を持つ開口を通して前記発光放射の少なくとも偏光要素を検出器によって検出する段階であり；
前記発光団が前記最小寸法の2倍よりも大きい波長を前記媒体において持つ発光放射を発するように選択される；及び前記発光団が前記最小寸法の2倍よりも小さい波長を前記媒体において持つ励起放射によって励起することが可能であるように選択される、段階；
を含む方法。
【請求項２】
前記容積が限られた数の発光団を含む、請求項1に記載された方法。
【請求項３】
前記励起放射が、前記検出容積の中へ送られるように提供されている、請求項1に記載された方法。
【請求項４】
前記発光団が、量子ドット及びLaF3:Nd粒子のグループから選択される、請求項1に記載された方法。
【請求項５】
前記励起放射が検出されるのを防ぐ段階をさらに含む、請求項1に記載された方法。
【請求項６】
前記励起放射が、前記検出容積と前記検出器との間の中間容積において前記発光団を励起することを防止する段階を含む、請求項1に記載された方法。
【請求項７】
前記発光団が前記中間容積において存在することを防がれている、請求項6に記載された方法。
【請求項８】
前記発光団が、生体分子に結びつくようにされている、請求項1に記載された方法。
【請求項９】
前記励起放射が偏光されている、請求項1に記載された方法。
【国際調査報告】
2010513914.tif 000008
2010513914.tif 000009