(57)【要約】  新規薬剤標的及び抗ウイルス剤が、レンチウイルス疾患、特にＡＩＤＳの治療的介入のために提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルス科のファミリーからのウイルス感染因子タンパク質（Ｖｉｆ）又はその  約１２個を超えるアミノ酸のペプチドフラグメントと、ＥｌＦ４Ａ２タンパク質又はその約１２個を超えるアミノ酸のペプチドフラグメントとを含み、前記のタンパク質又はペプチドフラグメントが、互いに結合することができる組成物。
【請求項２】
前記ウイルス感染因子タンパク質（Ｖｉｆ）がＨＩＶからのものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＨＩＶからの前記ウイルス感染因子タンパク質（Ｖｉｆ）が、配列番号２の配列である、又は、配列番号１の配列でコードされている、又はＥｌＦ４Ａ２に結合することができるそのペプチドフラグメントである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記の２つのタンパク質又はペプチドが複合体の中にある、請求項１〜３に記載の組成物。
【請求項５】
請求項４の複合体に特異的に結合する、或いは対応するＨＩＶタンパク質及び／又はヒトタンパク質又はペプチドそれぞれの結合ドメインに特異的に結合する、抗体。
【請求項６】
複合体形成及び／又は複合体安定性を調節することができる化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物を、
（ｉ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物、及び／又は
（ｉｉ）請求項４記載の複合体
に付す工程；
（ｂ）複合体形成及び／又は複合体安定性における変化をモニタリングする工程；並びに
（ｃ）（ｉ）のタンパク質の複合体形成を変える及び／又は（ｉｉ）の安定性を変える能力に基づいて、化合物が、対照と比較して複合体形成及び／又は安定性を調節できるかを決定する工程
を含む方法。
【請求項７】
ＶＩＦとＥＩＦ４Ａ２の複合体形成及び／又は複合体安定性を調節することができる化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物を、ＥＩＦ４Ａ２タンパク質又は配列番号９でコードされているタンパク質又はそれらのフラグメントを含む組成物に付す工程；
（ｂ）ＥＩＦ４Ａ２タンパク質又は配列番号９でコードされているタンパク質又はそれらのフラグメントに結合することができる化合物を同定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の同定された候補化合物を、
（ｉ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物、及び／又は
（ｉｉ）請求項４に記載の複合体
に付す工程；
（ｂ）複合体形成及び／又は複合体安定性における変化をモニタリングする工程；並びに
（ｃ）（ｉ）のタンパク質の複合体形成を変える及び／又は（ｉｉ）の安定性を変える能力に基づいて、化合物が、対照と比較して複合体形成及び／又は安定性を調節できるかを決定する工程
を含む方法。
【請求項８】
レトロウイルス科のファミリーのウイルス感染因子タンパク質（Ｖｉｆ）に結合することができる、ＥＩＦ４Ａ２の配列（配列番号９）を有するタンパク質又はその小型ペプチドフラグメント若しくはその誘導体。
【請求項９】
前記のタンパク質、誘導体又はペプチドが、ＨＩＶウイルス感染因子タンパク質（Ｖｉｆ）に結合することができる、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
ＰＴＥＮ（配列番号４及び５）、ＨＥＲＣ４（配列番号６及び７）、Ｔｏｍ１Ｌ１（配列番号８）、ＥＩＦ４Ａ２（配列番号９）、ＴＣＴＰ（ＴＰＴ１：配列番号１０、１１、１２及び１３）、ＮＵＰ５０（配列番号１４）、ＣＴＣＦ（配列番号１５）、ｈｎＲＰＵ（配列番号１６）、ＭＲＣＬ（ＭＲＣＬ３：配列番号１７）、ＳＤＣＣＡＧ１（配列番号１８及び１９）、ＰＴＧＥＳ３（配列番号２０）、ＨＳＰｓ（ＨＳＰ９０：配列番号２１；ＨＳＰＡ１：配列番号：２２、２３、２４、２５、２６、２７及び２８；ＨＳＰＡ５：配列番号：２９、３０及び３１；ＨＳＰＡ８：配列番号：３２、３３及び３４；ＨＳＰＨ１：配列番号：３５）、ＣＳＤＥ１（配列番号３６）、ＫＩＡ１４２９（配列番号４２）、ＣＵＬ４Ａ（配列番号４３）、ＲＡＧ２（配列番号４４）、ＣＣＴ５（配列番号４５）、ＶＣＰ（配列番号４６）、ＰＤＩＡ３（配列番号４７）、ＰＴＰＲＣ（配列番号４８）、ＣＡＢ３９（配列番号４９）、ＰＰＭ１Ｂ（配列番号５０）、ＲＡＢ４Ａ（配列番号５１）、ＲＡＢ２１（配列番号５２）からなる群より選択される配列を有するタンパク質又はこれらのいずれかのフラグメント若しくは誘導体であって、前記のタンパク質又はペプチドがＶｉｆに結合することができる、タンパク質又はこれらのいずれかのフラグメント若しくは誘導体。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物及び／又は請求項５に記載の抗体及び／又は請求項８〜１０に記載のタンパク質を含むキット又はアッセイ系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に分子生物学及びウイルス学それぞれの技術分野、特に抗ウイルス薬の開発に関する。一つの態様において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と関連するタンパク質と相互作用することができ、したがって単独で又はＨＩＶタンパク質との複合体により抗ウイルス薬の開発のための標的としての機能を果たすのに適している、新たな種類のタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸分子を同定及びクローニングする方法に関する。これに関連して、本発明は、新規ＨＩＶ相互作用タンパク質及び複合体、並びに複合体を特異的に認識し、それに結合するか又はＨＩＶタンパク質の特定のドメインに結合する抗体を提供する。本発明の更なる目的は、ヒト宿主細胞タンパク質とＨＩＶタンパク質の複合体の形成及び／又は安定性を調節することができる抗ＨＩＶ薬を同定し、提供する方法である。したがって、本発明は、また、ウイルス感染の確立に必須であると考えられるＨＩＶタンパク質とヒトタンパク質の複合体を検出し、標的にするのに有用な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）は、先進国における死亡の主な原因の一つであり、汎流行的な比率で蔓延している。１９８４年には、ＡＩＤＳの病原体がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）として発見され、これは、レンチウイルスサブファミリーのメンバーであるレトロウイルスである。レンチウイルス科（Lentiviridae）には、通常免疫系の細胞、特にマクロファージ及びＴ細胞に感染し、長い潜伏期間を有し、感染細胞に合胞体及び細胞死のような細胞変性効果を及ぼす持続感染を疾患において引き起こす、非腫瘍形成性レトロウイルスが含まれる。レンチウイルス感染は、免疫系により排除されず、長年にわたって蓄積される免疫損傷をもたらす。
【０００３】
レンチウイルス科（Lentiviridae）のメンバーであるＨＩＶはレトロウイルスであり、すなわちＲＮＡゲノム及び逆転写活性を含有し、したがってその成長周期の間に、ＨＩＶはＲＮＡをプロウイルスＤＮＡにコピーし、これを宿主細胞の染色体ＤＮＡの中に組み込むことができる（プロウイルス）。レトロウイルス特性及びゲノムが小型であることに起因して、ＨＩＶ複製は、宿主の細胞機構に強く依存している。したがって、ＨＩＶは、宿主の転写及び翻訳機構を使用してウイルスＲＮＡ及びタンパク質を発現し、最終的に、細胞質膜から出芽することにより細胞から成熟したウイルスを放出する。ＨＩＶの場合、ウイルス複製は宿主のヘルパーＴ細胞の死をもたらし、それは、重篤な免疫不全の状態（ＡＩＤＳ）、多様な悪性腫瘍及び日和見感染の発症、最終的には感染生物の死をもたらす。
【０００４】
ｅｎｖ（ウイルスのエンベロープタンパク質をコードする）、ｇａｇ（カプシド及びヌクレオカプシド構造の形成に関与する内部タンパク質をコードする）及びｐｏｌ（酵素のリバーストランスクリプターゼ、インテグラーゼ及びプロテアーゼをコードする）のようなＨＩＶゲノムの「通常」の遺伝子の他に、転写トランスアクチベーター（ｔａｔ）及びウイルス発現遺伝子のレギュレーター（ｒｅｖ）は、ウイルス複製に必須である小型の非ビリオンタンパク質を産生する。また、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆのようなウイルス発現に関与しない幾つかの遺伝子も、ＨＩＶによりコードされる。
【０００５】
ＨＩＶ疾患の治療は、ＨＩＶの生活環に例えばウイルスの逆転写を阻害すること、プロテアーゼ活性又は融合を阻害することにより多くの段階において介入できることが認識されたことによって、著しく進歩してきた。その結果、３つの主な種類の薬剤：リバーストランスクリプターゼインヒビター、プロテアーゼインヒビター及び融合インヒビターが開発されており、現在、約２５の抗レトロウイルス薬がＨＩＶに感染した個人を治療するために承認されている。更に、ウイルスの異なる生化学的機能に対する、特定の活性を有する異なる薬剤の組み合わせ（併用治療）は、単剤治療への反応において観察された薬剤耐性ウイルスの急速の発生を低減するのに役立ちうることが知られている。
【０００６】
しかし、感染した人を上記に参照された薬剤の種類の少なくとも２つの抗ウイルス薬の組み合わせで治療することに基づいている、現在までＡＩＤＳの進行及び蔓延を低減する唯一の有効な治療である、現行の「高活性抗レトロウイルス剤療法」（ＨＡＡＲＴ）でさえも、長期間使用すると、複雑な投与レジメンの厳守、毒性の副作用及び高い費用のような幾つかの欠点及び制限と関わっている（例えば、リッチマン（Richman）、ネイチャー（Nature）４１０（２００１）、９９５〜１００１：非特許文献１を参照すること）。加えて、不適切なコンプライアンスと組み合わされた、ゲノムの高い突然変異率に起因するＨＩＶの高度な遺伝的及び抗原的変異性が、ＨＡＡＲＴ薬への耐性の原因であり、そのため、ＨＡＡＲＴの使用はＨＩＶ／ＡＩＤＳによる死亡数を著しく低減してきたが、完全なウイルス抑制は達成されなかった。
【０００７】
「必須」ウイルス酵素（リバーストランスクリプターゼ、プロテアーゼ及びインテグラーゼ）のインヒビターの開発に加えて、研究は、現在、ＨＩＶアクセサリータンパク質を標的にすることに焦点を当てている。ＨＩＶアクセサリータンパク質のＶｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ及びＮｅｆについては、正確な生化学的構造は依然として調査中であるが、これらのタンパク質のいずれもそれ自体触媒作用を有さず、むしろ、他のウイルス又は細胞性因子を多様な細胞経路に連結する「アダプター分子」として機能すると思われることを示唆する証拠が、ますます増えている。
【０００８】
４つのアクセサリータンパク質のうちの１つのビリオン感染因子（Ｖｉｆ）は、２３kDaの分子量を有し、１９２個のアミノ酸から構成される小型塩基性リンタンパク質であり、ビリオン産生の後期にＲｅｖ依存様式で合成される。Ｖｉｆの相同体は全てのレンチウイルスに存在し、唯一の例外は、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＶＡ）であり（オベルスト（Oberste）及びゴンダ（Gonda）、ウイルス遺伝子（Virus Genes）６（１９９２）、９５〜１０２：非特許文献２を参照すること）、異なるレンチウイルスのｖｉｆのオープンリーディングフレームに有意に保存されている（ソニゴ（Sonigo）ら、細胞（Cell）４２（１９８５）、３６９〜３８２：非特許文献３を参照すること）。
【０００９】
ＨＩＶの場合では、Ｖｉｆは、一般に一次Ｔ細胞におけるウイルス複製を必要とする。更に、宿主タンパク質、すなわち、酵素のＡＰＯＢＥＣシトジンデアミナーゼファミリーのメンバーであるヒトアポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡエディティング酵素触媒ポリペプチド様３Ｇ（ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）により仲介されるＨＩＶ複製の抑制に対して、反作用することが知られている。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇは、レトロウイルスビリオン（感染性成熟ウイルス粒子）の中にパッケージされ、デオキシシチジンを、新たに合成されたウイルスマイナス鎖ＤＮＡにおいてデオキシウリジンに脱アミノ化し、それによりＧからＡへの超変異を誘発することが知られている。ウイルス産生細胞におけるＶｉｆとＡＰＯＢＥＣ３Ｇの相互作用は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇがビリオンに組み込まれるのを防止し、したがってＡＰＯＢＥＣ３Ｇが、新たに合成されたＨＩＶ  ｃＤＮＡに作用するのを防止する。それに対して、Ｖｉｆは、細胞タンパク質のＣｕｌ５、エロンギンＢ、エロンギンＣ及びＲｂｘ１と相互作用して、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのユビキチン化のためにＥ３ユビキチンリガーゼ複合体を形成し（例えば、ユー（Yu）ら、サイエンス（Science)３０２（２００３）、１０５８〜１０６０：非特許文献４を参照すること）、それにより、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇに結合するとユビキチン化及びプロテオソーム分解、最終的には細胞からのＡＰＯＢＥＣ３Ｇの排除を誘発し、ＨＩＶが感染性ウイルスを産生することを可能にすることが示された。
【００１０】
Ｖｉｆは、また、ＳｒｃチロシンキナーゼＦｙｎ及びＨｃｋと相互作用して、それらの触媒活性の低減をもたらすこと（例えば、ハサイン（Hassaine）ら、生物化学ジャーナル（J. Biol. Chem.）２７６（２００１）、１６８８５〜１６８９３：非特許文献５を参照すること）及びジンクフィンガータンパク質と相互作用して、ＮＦ−ＫＢを阻害すること（フェング（Feng）ら、ウイルス学ジャーナル（J. Virol.）７８（２００４）、１０５７４を参照すること）が示された。宿主細胞におけるＶｉｆのタンパク質相互作用ネットワークがウイルスアクセサリータンパク質の機能的役割に関与していることは部分的にしか理解されていないので、近年、感染細胞の細胞周期調節における新規機能が、ワング（Wang）ら、ウイルス学（Virology）３５９（２００７）、２４３〜２５２（非特許文献６）において記載された。
【００１１】
しかし、ＨＩＶアクセサリータンパク質と相互作用することが今まで同定されているヒトタンパク質のうち、抗ＨＩＶ薬剤開発の標的として適切でありうることを示すものは一つもなかった。したがって、組み合わせ抗ＨＩＶ治療において、「必須」タンパク質、リバーストランスクリプターゼ、プロテアーゼ及びインテグラーゼを補う又はその代わりを提供する、抗ＨＩＶ薬の標的を提供する必要性が、依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ネイチャー（Nature）４１０（２００１）、９９５〜１００１
【非特許文献２】ウイルス遺伝子（Virus Genes）６（１９９２）、９５〜１０２
【非特許文献３】細胞（Cell）４２（１９８５）、３６９〜３８２
【非特許文献４】サイエンス（Science)３０２（２００３）、１０５８〜１０６０
【非特許文献５】生物化学ジャーナル（J. Biol. Chem.）２７６（２００１）、１６８８５〜１６８９３
【非特許文献６】ウイルス学（Virology）３５９（２００７）、２４３〜２５２
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、ウイルス疾患の治療に有用な新規薬剤標的に関する。より詳細には、本発明は、ＨＩＶ関連Ｖｉｆタンパク質と相互作用するヒトタンパク質及び前記相互作用に介入する薬剤を対象とする。
【００１４】
本発明に従って実施した実験は、驚くべきことに、ウイルス疾患関連タンパク質、特にＶｉｆと相互作用する新たな種類のタンパク質を明らかにし、これは今までＶｉｆの標的として知られていないものであった。ＨＩＶタンパク質に結合するタンパク質の同定に使用した実験系のため、本発明の方法によって同定された前記宿主タンパク質が、真に、ＡＩＤＳのような対応するウイルス障害と関連するタンパク質に結合すると予測することは、賢明である。したがって、そのように同定されたタンパク質、並びにタンパク質−タンパク質相互作用及びＨＩＶ  Ｖｉｆと宿主タンパク質の複合体形成は、それぞれ、治療的介入に適した標的及びそれを調節することができる作用物質の設計を提供する。これに関連して、本発明は、ウイルス疾患関連タンパク質と相互作用する対応するタンパク質をコードする核酸分子及び前記核酸分子によりコードされる又は本発明の方法により得られるタンパク質の両方、並びにウイルス疾患関連タンパク質と本発明の方法により同定される宿主（ヒト）タンパク質とを含む複合体を提供する。
【００１５】
更に、本発明は、ＨＩＶタンパク質とヒトタンパク質との複合体に又はＨＩＶタンパク質及びヒトタンパク質それぞれの結合ドメインに特異的に結合する抗体、或いはアミノ酸置換、欠失及び／若しくは付加によって、対応する複合体をＶｉｆと形成することができなくなったタンパク質に結合する抗体に関する。
【００１６】
本発明は、また、特定のタンパク質−タンパク質相互作用及び複合体形成及び／又は安定性をそれぞれ調節することができる化合物をスクリーニングする方法、並びに前記方法により得られる化合物及びレンチウイルス疾患の治療のための医薬の調製における前記化合物の使用に関する。例えば、適切な抗ウイルス薬は、結合ドメインを同定する及び対応するペプチド又はその模倣体を設計することによって、ＨＩＶアクセサリータンパク質のタンパク質結合パートナーとして同定されるヒトタンパク質から誘導することができ、未変性タンパク質とＨＩＶアクセサリータンパク質の相互作用に介入することができる（例えば、実施例４を参照すること）。
【００１７】
別の態様によると、本発明は、本発明の抗体又は化合物と、場合により薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。加えて、本発明の方法を実施するのに有用なキットが提供される。
【００１８】
図面の簡単な説明
図面は、本発明を例示して示す。
図１は、２つの融合タンパク質を同時に発現する酵母細胞の増殖を例示する（第１融合タンパク質は、Ｓｏｓに〔リンカーを介して〕縮合しているＶｉｆを含み、第２融合タンパク質は、膜局在化ドメインに融合した胸腺ライブラリー由来のタンパク質を含む）。特に図１は、２つのタンパク質の相互作用を示し、それによってＳｏｓが細胞膜に動員され、Ｒａｓシグナル伝達経路を活性化し、検出可能な表現型をもたらす、すなわち酵母細胞の増殖を制限温度の３７℃でも可能にする。第１融合タンパク質の発現は、構成的アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）プロモーターの制御下であるが、第２融合タンパク質の発現がＧＡＬ１プロモーターの制御下であるので、制限温度での細胞増殖は、ガラクトースの添加によってのみ検出される（左側部分）。グルコースの添加は、ＧＡＬ１プロモーター依存性発現を抑圧し、細胞増殖をもたらさなかった。グルコースプレートと比較したガラクトースプレートにおける陽性クローンの増殖が同定され、白丸で示されている。両方の培地に増殖しているクローンは、復帰突然変異体であると同定された。一対の既知の相互作用タンパク質を発現している対照酵母細胞は、点線の丸により示されている。
【００１９】
図２は、Ｖｉｆタンパク質と本発明の方法により同定された異なる宿主因子との複合体から得られた微生物増殖反応を示す。Ｖｉｆへの宿主タンパク質の結合特異性も実証されている。制限温度の３７℃での酵母細胞の増殖は、宿主タンパク質とＶｉｆとの相互作用によってのみ細胞増殖に関与するエフェクターが細胞膜に動員されるので、宿主因子の発現にも、相互作用標的タンパク質Ｖｉｆの発現にも依存している。しかし、同定された宿主タンパク質が最も結合しそうにない、陰性対照標的タンパク質ｃＪｕｎの場合では、相互作用、したがって細胞増殖は、何も検出されない。特に、図２の左欄は、本発明の方法により同定され、Ｖｉｆとの対応する及び特異的な相互作用が実証された後に配列決定された、宿主タンパク質を表す。
スクリーニング条件下（ガラクトース３７℃の欄）では、宿主因子の発現が誘発され、増殖は、それとＶｉｆ融合タンパク質との相互作用に依存している。見て分かるように、全ての宿主因子がＶｉｆ融合タンパク質との組み合わせによってのみ増殖を仲介しているが、異種ｃＪｕｎ融合タンパク質との組み合わせの場合では、仲介していない。第３欄（グルコース３７℃）は、宿主因子発現の抑圧（グルコースはＧＡＬ１プロモーター誘導発現カセットを抑圧する）が全ての場合において増殖反応を消滅させたので、宿主因子依存性増殖を示している。図２の右欄は、非制限温度（２４℃）での対照の細胞増殖を表す。
【００２０】
図３ａは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウン実験の結果を表す、１２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを示す。特に図３ａは、ＧＳＴ−Ｖｉｆとインビトロ翻訳タンパク質との相互作用の検出を示す。
レーン１〜４は、放射能標識インビトロ翻訳タンパク質を表し、特に、レーン１はインビトロ翻訳ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（Ａ３Ｇ）を示し、レーン２はインビトロ翻訳ＨＳＰＡ８を示し、レーン３はインビトロ翻訳ＰＴＥＮを示し、そしてレーン４はインビトロ翻訳ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ．）を示す。
レーン６〜９は、ＧＳＴ−Ｖｉｆグルタチオンセファロースビーズによる前述の放射能標識インビトロ翻訳タンパク質の対応するプルダウン結果を表す。
特に、レーン６はＧＳＴ−Ｖｉｆ及びインビトロ翻訳ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（Ａ３Ｇ；陽性対照）を示し、レーン７はＧＳＴ−Ｖｉｆ及びインビトロ翻訳ＨＳＰＡ８を示し、レーン８はＧＳＴ−Ｖｉｆ及びインビトロ翻訳ＰＴＥＮを示し、そしてレーン９はＧＳＴ−Ｖｉｆ及びインビトロ翻訳ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ．；陰性対照）を示す。
レーン１１〜１４は、ＧＳＴプルダウン実験の特異性、すなわちＶｉｆへのインビトロ翻訳タンパク質の結合特異性についての対照を表す。したがって、レーン１１〜１４は、特に、ＧＳＴが単独で、すなわちＶｉｆと融合しないで使用されている、ＧＳＴプルダウンの結果を表している。より詳細には、レーン１１はＧＳＴ及びインビトロ翻訳ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（Ａ３Ｇ）を示し、レーン１２はＧＳＴ及びインビトロ翻訳ＨＳＰＡ８を示し、レーン１３はＧＳＴ及びインビトロ翻訳ＰＴＥＮを示し、そしてレーン１４はＧＳＴ及びインビトロ翻訳ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ．）を示す。ＧＳＴ単独へのインビトロ翻訳タンパク質の非特異的結合のないことが実証されている。
【００２１】
図３ｂは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウン実験の結果を表す、１２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを示す。特に図３ｂは、ＧＳＴ−Ｖｉｆとインビトロ翻訳タンパク質との相互作用の検出を示す。
レーン１〜５は、放射能標識インビトロ翻訳タンパク質を表し、特に、レーン１はインビトロ翻訳ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（Ａ３Ｇ）を示し、レーン２はインビトロ翻訳ＨＥＲＣ４を示し、レーン３はインビトロ翻訳ＮＵＰ５０を示し、レーン４はインビトロ翻訳ＴＯＭ１Ｌ１を示し、そしてレーン５はインビトロ翻訳ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ．）を示す。
レーン６〜１０は、ＧＳＴ−Ｖｉｆグルタチオンセファロースビーズによる前述の放射能標識インビトロ翻訳タンパク質の対応するプルダウン結果を表す。
特に、レーン６はＧＳＴ−Ｖｉｆ及びインビトロ翻訳ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（Ａ３Ｇ；陽性対照）を示し、レーン７はＧＳＴ−Ｖｉｆ及びインビトロ翻訳ＨＥＲＣ４を示し、レーン８はＧＳＴ−Ｖｉｆ及びインビトロ翻訳ＮＵＰ５０を示し、レーン９はＧＳＴ−Ｖｉｆ及びインビトロ翻訳ＴＯＭ１Ｌ１を示し、そしてレーン１０はＧＳＴ−Ｖｉｆ及びインビトロ翻訳ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ．；陰性対照）を示す。
レーン１１〜１５は、ＧＳＴプルダウン実験の特異性、すなわちＶｉｆへのインビトロ翻訳タンパク質の結合特異性についての対照を表す。したがって、レーン１１〜１５は、特に、ＧＳＴが単独で、すなわちＶｉｆと融合しないで使用されている、ＧＳＴプルダウンの結果を表している。より詳細には、レーン１１はＧＳＴ及びインビトロ翻訳ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（Ａ３Ｇ）を示し、レーン１２はＧＳＴ及びインビトロ翻訳ＨＥＲＣ４を示し、レーン１３はＧＳＴ及びインビトロ翻訳ＮＵＰ５０を示し、レーン１４はＧＳＴ及びインビトロ翻訳ＴＯＭ１Ｌ１を示し、そしてレーン１５はＧＳＴ及びインビトロ翻訳ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ．）を示す。ＧＳＴ単独へのインビトロ翻訳タンパク質の非特異的結合のないことが実証されている。
【００２２】
図３ｃは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウン実験の結果を表す、１２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを示す。特に図３ｃは、ＧＳＴ−Ｖｉｆとインビトロ翻訳タンパク質との相互作用の検出を示す。
レーン１〜６は、放射能標識インビトロ翻訳タンパク質を表し、特に、レーン１はインビトロ翻訳ＥＩＦ４Ａ２を示し、レーン２はインビトロ翻訳ＴＰＴ１を示し、レーン３はインビトロ翻訳ＰＴＧＥＳ３を示し、レーン４はインビトロ翻訳ＴＯＭ１Ｌ１を示し、レーン５はインビトロ翻訳ＨＳＰＡ８を示し、そしてレーン６はインビトロ翻訳ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ．）を示す。
レーン７〜１２は、ＧＳＴ−Ｖｉｆグルタチオンセファロースビーズによる前述の放射能標識インビトロ翻訳タンパク質の対応するプルダウン結果を表す。
特に、レーン７はＧＳＴ−Ｖｉｆ及びインビトロ翻訳ＥＩＦ４Ａ２を示し、レーン８はＧＳＴ−Ｖｉｆ及びインビトロ翻訳ＴＰＴ１を示し、レーン９はＧＳＴ−Ｖｉｆ及びインビトロ翻訳ＰＴＧＥＳ３を示し、レーン１０はＧＳＴ−Ｖｉｆ及びインビトロ翻訳ＴＯＭ１Ｌ１を示し、レーン１１はＧＳＴ−Ｖｉｆ及びインビトロ翻訳ＨＳＰＡ８を示し、そしてレーン１２はＧＳＴ−Ｖｉｆ及びインビトロ翻訳ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ．；陰性対照）を示す。
レーン１３〜１８は、ＧＳＴプルダウン実験の特異性、すなわちＶｉｆへのインビトロ翻訳タンパク質の結合特異性についての対照を表す。したがって、レーン１３〜１８は、特に、ＧＳＴが単独で、すなわちＶｉｆと融合しないで使用されている、ＧＳＴプルダウンの結果を表している。より詳細には、レーン１３はＧＳＴ及びインビトロ翻訳ＥＩＦ４Ａ２を示し、レーン１４はＧＳＴ及びインビトロ翻訳ＴＰＴ１を示し、レーン１５はＧＳＴ及びインビトロ翻訳ＰＴＧＥＳ３を示し、レーン１６はＧＳＴ及びインビトロ翻訳ＴＯＭ１Ｌ１を示し、レーン１７はＧＳＴ及びインビトロ翻訳ＨＳＰＡ８を示し、そしてレーン１８はＧＳＴ及びインビトロ翻訳ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ．）を示す。ＧＳＴ単独へのインビトロ翻訳タンパク質の非特異的結合のないことが実証されている。
【００２３】
図４は、ＧＳＴプルダウン実験に使用するＶｉｆの発現のために使用した、ベルターｐＧＥＸ−４Ｔ２−ｖｉｆを概略的に表す。ｌａｃＩＱプロモーター、ＧＳＴ及びｖｉｆの部位を示す。
【００２４】
図５は、本発明の方法に使用する第１融合タンパク質の発現のために使用した、ベクターｐＡＤＨ  Ｓｏｓ−２ｘＳｐｃ−ｖｉｆを概略的に表す。（構成的）ＡＤＨプロモーター、Ｓｏｓ、スペーサー（リンカー）及びｖｉｆの部位を示す。
【００２５】
図６は、本発明の方法に使用する第２融合タンパク質の発現のために使用した、ベクターｐＭｙｒを概略的に表す。（誘導性）ＧＡＬ１プロモーター、ミリストイル化シグナル及び胸腺ｃＤＮＡライブラリーの部位を示す。
【００２６】
図７は、２つの融合タンパク質を同時に発現する酵母細胞の増殖を例示する（第１融合タンパク質は、Ｓｏｓに〔リンカーを介して〕縮合しているＶｉｆを含み、第２融合タンパク質は、膜局在化ドメインに融合した胸腺ライブラリー由来のタンパク質を含む）。特に図７は、２つのタンパク質の相互作用を示し、それによってＳｏｓが細胞膜に動員され、Ｒａｓシグナル伝達経路を活性化し、検出可能な表現型をもたらす、すなわち酵母細胞の増殖を制限温度の３７℃でも可能にする。第１融合タンパク質の発現は、構成的アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターの制御下であるが、第２融合タンパク質の発現がＧＡＬ１プロモーターの制御下であるので、制限温度での細胞増殖は、ガラクトースの添加によってのみ検出され（左側部分）、一方、グルコースの添加はプレイ（餌）発現を抑圧し、検出可能な増殖を生じることができない。ｖｉｆの宿主タンパク質への結合特異性は、Ｓｏｓに融合した対照タンパク質ｃＪｕｎがシグナルを生じないことによって示されている。ベイト及びプレイ（餌）発現プラスミドを有する単一の酵母株からの５つの異なるクローンが、糖としてガラクトース又はグルコースのいずれかを含有し、制限温度にシフトされた選択プレートにおいて見出された。
【００２７】
定義
「ｃＤＮＡ」は、この用語が本明細書で使用されるとき、一般に相補的ＤＮＡ、すなわち内部非コードセグメント（イントロン）及び転写調節配列を欠いている一片のＤＮＡを示す。ｃＤＮＡは、更に、対応するＲＮＡ分子における翻訳制御に関与している非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有することができる。ｃＤＮＡは、実験室において細胞から抽出されたメッセンジャーＲＮＡから逆転写する合成のような多様な方法を使用して、産生することができる。
【００２８】
「感染」は、この用語が本明細書で使用されるとき、一般に、宿主細胞へのウイルスの侵入、複製、挿入、溶解、又は病因に関わる他の事象若しくはプロセスに関する。したがって、感染を減少することには、細胞又は被験者へのウイルスの侵入、複製、挿入、溶解、若しくは他の病因又はこれらの組み合わせを減少することが含まれる。感染には、非組み換えウイルス、組み換えウイルス、プラスミドのような感染病原体、又は被験者の細胞のような宿主を感染することができる他の病原体の導入が含まれる。
【００２９】
「模倣体」は、この用語が本明細書で使用されるとき、一般に病原体の活性を模倣する分子を意味する。用語「模倣体」は、ペプチドの文脈で使用されるとき、ＨＩＶ  Ｖｉｆとの相互作用において本発明のペプチドの代わりとして機能する分子構造を意味する。ペプチド模倣体には、本明細書で使用されるとき、アミノ酸及び／又はペプチド結合を含有しても含有しなくてもよいが、ペプチドリガンドの構造及び機能特性を保持する合成構造が含まれる。用語「ペプチド模倣体」には、また、ペプチド及びオリゴペプチドも含まれ、これらは、Ｎ置換アミノ酸のペプチド又はオリゴマーである。ペプチド模倣体として更に含まれるものは、ペプチドライブラリーであり、これは、所定のアミノ酸の長さに設計され、対応する考えられる全てのアミノ酸配列を表すペプチドのコレクションである。
【００３０】
「機能的に結合している」は、この用語が本明細書で使用されるとき、一般に、第１核酸配列を第２核酸配列と機能的な関係で配置した場合に、第１核酸配列が第２核酸配列と機能的に結合していると記載する。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列と機能的に結合している。一般に、機能的に結合しているＤＮＡ配列は隣接しており、必要な場合には２つのタンパク質コード領域を同じリーディングフレーム内で結合する。
【００３１】
「医薬品又は薬剤」は、この用語が本明細書で使用されるとき、一般に、被験者に単独で又は１つ以上の治療剤若しくは薬学的に許容される担体と組み合わせて投与した場合、所望の治療又は予防効果を誘発することができる化学化合物又は組成物に関する。
【００３２】
疾患を「予防する」は、この用語が本明細書で使用されるとき、一般に、疾患が完全に発症するのを阻害すること、例えばウイルス感染の発症を予防することに関する。
【００３３】
「治療」は、この用語が本明細書で使用されるとき、一般に、例えばＨＩＶ−１感染に関連する疾患又は病理状態の兆候又は症状を改善する治療的介入、例えばＨＩＶ−１感染を阻害又は減少することを示す。
【００３４】
「第１融合タンパク質」は、この用語が本明細書で使用されるとき、一般に、エフェクターと「標的」タンパク質、例えばＨＩＶタンパク質とを含むタンパク質に関する。標的タンパク質は、一般に、タンパク質−タンパク質相互作用に関与しうるかについて検査される既知のタンパク質である。好ましくは、本発明の第１タンパク質は、エフェクターと標的タンパク質の間に配置されているペプチドリンカー分子を含む。
【００３５】
「第２融合タンパク質」は、この用語が本明細書で使用されるとき、一般に、細胞区画局在化ドメインと、標的タンパク質に結合できる又は標的タンパク質に結合できることが推定されるヒトタンパク質のような第２タンパク質とを含むタンパク質に関する。
【００３６】
「エフェクター」は、この用語が本明細書で使用されるとき、一般に、融合タンパク質として発現することができ、エフェクタータンパク質が、レポーター分子を含有する細胞区画に転位している場合には、そのように発現したとき、レポーター分子を活性化することができる、ペプチド又はポリペプチドを示す。しかし、グアニン交換因子（ＧＥＦ）のようなエフェクターの活性フラグメントも、活性フラグメントがエフェクター機能を付与するのに十分なエフェクター部分を含む場合には、本発明を実施するために使用することができる。そのようなエフェクターの活性フラグメントは、本明細書で使用される用語「エフェクター」の意味の範囲内であると考慮される。
【００３７】
「レンチウイルス」は、この用語が本明細書で使用されるとき、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス−２（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）及びネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）を意味する。
【００３８】
「候補タンパク質」は、この用語が本明細書で使用されるとき、一般に、ＨＩＶ標的タンパク質に結合することが推定されるタンパク質に関する。用語「候補タンパク質」は、用語「宿主タンパク質」及び「ヒトタンパク質」と交換可能に使用することができる。本発明によると、用語「候補タンパク質」は、完全長タンパク質を含むばかりでなく、タンパク質の一部分も、例えばオリゴペプチド及びペプチドをそれぞれ含んでいる。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、組成物は任意の混合物を意味する。溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性又はこれらの任意の組み合わせであることができる。
【００４０】
本明細書においてタンパク質又はペプチドに適用される用語「誘導体」は、ペプチドの側鎖における１つ以上のアミノ、ヒドロキシル若しくはカルボキシル基、又は末端アミノ若しくはカルボキシル基が誘導体官能基に改質されている化合物を意味する。アミノ基を誘導体化して、アミド（例えば、アルキルカルボキサミド、アセトアミド）、カルバメート（例えば、アルキルカルバメート、例はメチルカルバメート若しくはｔ−ブチルカルバメート）、又は尿素にすることができる。ヒドロキシル基を誘導体化して、エステル（例えば、アルカノエート、例はアセテート、プロピオネート又は全てのアレーンカルボキシレート、例はベンゾエート）、カルバメート（例えば、アルキルカルバメート、例はメチルカルバメート）、カーボネート（例えば、アルキルカーボネート、例はエチルカーボネート）にすることができる。カルボキシル基を誘導体化して、エステル（例えば、アルキルエステル、例はエチルエステル）又はアミド（例えば、第一級カルボキサミド、Ｎ−アルキル第二級カルボキサミド若しくはＮ，Ｎ−ジアルキルカルボキサミド）にすることができる。当業者は、誘導体基の組み込みがペプチドの特性を変化させないか又は誘導体化基がインビボで（例えば、代謝を介して）除去されるために、ペプチドの誘導体は、親ペプチドの特性の保持をもたらすことが予測されることを理解する。本発明の好ましい実施態様は、３つ以下のアミノ、カルボキシル及びヒドロキシル基、好ましくは２つ以下若しくは１つが誘導体官能基に改質されるか、又は何も改質されないものである。用語「誘導体」には、塩が含まれ、塩の誘導体も含まれる。誘導体には、末端誘導体が含まれうる。
ペプチドを参照して使用される用語「末端誘導体」は、Ｃ末端カルボキシレート基若しくはＮ末端アミノ基、又はその両方が誘導体官能基に改質されているペプチドを意味する。Ｃ末端カルボキシル基を誘導体化して、エステル（例えば、アルキルエステル、例はエチルエステル）又はアミド（例えば、第一級カルボキサミド、Ｎ−アルキル第二級カルボキサミド若しくはＮ，Ｎ−ジアルキルカルボキサミド）にすることができる。Ｎ末端アミノ基を誘導体化して、エステル（例えば、アルキルエステル、例はエチルエステル）又はアミド（例えば、第一級カルボキサミド、Ｎ−アルキル第二級カルボキサミド若しくはＮ，Ｎ−ジアルキルカルボキサミド）にすることができる。Ｃ末端カルボキシル基及び／又はＮ末端アミノ基は、塩の形態であることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】２つの融合タンパク質を同時に発現する酵母細胞の増殖を例示する図である。
【図２】Ｖｉｆタンパク質と本発明の方法により同定された異なる宿主因子との複合体から得られた微生物増殖反応を示す図である。
【図３】グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウン実験の結果を表す図である。
【図４】ＧＳＴプルダウン実験に使用するＶｉｆの発現のために使用した、ベルターｐＧＥＸ−４Ｔ２−ｖｉｆを概略的に表す図である。
【図５】本発明の方法に使用する第１融合タンパク質の発現のために使用した、ベクターｐＡＤＨ  Ｓｏｓ−２ｘＳｐｃ−ｖｉｆを概略的に表す図である。
【図６】本発明の方法に使用する第２融合タンパク質の発現のために使用した、ベクターｐＭｙｒを概略的に表す図である。
【図７】２つの融合タンパク質を同時に発現する酵母細胞の増殖を例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
発明の詳細な説明
本発明は、ＡＩＤＳのようなウイルス疾患の治療及び予防に使用される薬剤発見のための標的の同定に焦点を当てている。
【００４３】
背景のセクションで記載されているように、ＨＩＶ感染と更に戦う一つの戦略は、潜在的には、ウイルスのアクセサリータンパク質及びそれらの宿主タンパク質結合パートナーとの相互作用を標的にすることでありうる。しかし、この手法は、一方ではこれらのアクセサリータンパク質のタンパク質相互作用ネットワークの複雑性に対する知識の欠如により、他方では今まで知られているヒトタンパク質は細胞の正常な機能の観点から薬剤開発に適切な候補であるとは思われないことにより、妨げられている。ＨＩＶアクセサリータンパク質と他のウイルス性又は細胞性因子との相互作用の特異性を更に特定する初期の試みは、失敗した。しかし、米国特許第５，７７６，６８９号に本質的に記載されている改変型のＳｏｓ動員系（ＳＲＳ）を使用して本発明に従って実施した実験は、今までウイルス／ヒトタンパク質相互作用の文脈で考慮されたことはないが、驚くべきことに、ＨＩＶアクセサリータンパク質の一つ、すなわちＶｉｆの特異的標的として新規ヒト宿主タンパク質を明らかにした。したがって、ＨＩＶ感染に関与する新たな種類のヒト細胞タンパク質を同定することができ、それによって薬剤開発の新規標的を提供することができる。
【００４４】
Ｓｏｓ動員系の特性及び信頼性、並びに本発明の方法の展開の際に実施される更なる展開のために、本発明の方法により同定される宿主（好ましくは、ヒト）ＨＩＶ  Ｖｉｆ結合タンパク質が、事実、ＨＩＶ感染、ウイルス生活環及びＡＩＤＳそれぞれの経過において主要な役割を果たすとすることは、賢明である。したがって、本発明は、また、ウイルス疾患関連タンパク質とその結合パートナーとの相互作用を調査するためにＳｏｓ動員系を使用すること、特にＶｉｆのようなＨＩＶ関連タンパク質に結合するタンパク質の同定に特定して取り組むことに関する。
【００４５】
したがって、一つの態様において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タンパク質と相互作用することができるタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸分子を同定及びクローニングする方法であって、
（ａ）宿主細胞において、標的ＨＩＶタンパク質に融合している、転写因子ではないエフェクタータンパク質を含む第１融合タンパク質をコードする第１核酸分子を発現させること；
（ｂ）前記細胞において、ヒトタンパク質又はそのフラグメントに融合している細胞膜局在化ドメインを含む第２融合タンパク質をコードする第２核酸分子を更に発現させること；及び
（ｃ）（ａ）の標的ＨＩＶタンパク質と（ｂ）のヒトタンパク質との相互作用を同定するシグナルを検出することにより、レポーター分子の活性化を検出すること；並びに場合により
（ｄ）工程（ｃ）でレポーター分子の活性化が検出されたヒトタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸分子をクローニングすること
を含む方法に関する。
【００４６】
本発明の方法は、ＨＩＶと関連する多種多様な異なる因子、酵素又はタンパク質の調査に有用であるが、好ましい実施態様において、本発明の方法に使用される標的ＨＩＶタンパク質は、アクセサリーＨＩＶタンパク質、好ましくはウイルス感染因子（Ｖｉｆ）である。
【００４７】
本発明に従って実施され、効率的な方法を確立するために必要である初期最適化実験の際に、驚くべきことに、Ｖｉｆと相互作用するタンパク質（「候補タンパク質」と「宿主タンパク質」それぞれ）の同定は、追加のペプチドリンカー分子の存在によって著しく改善されたことが判明した。配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）を有するリンカーの使用及びその記載又は類似の記載は、例えば、エバーズ（Evers）ら、生化学（Biochemistry）４５（２００６）、１３１８３及びマエダ（Maeda)ら、バイオ技術（BioTechniques）２０（１９９６）、１１６において見出すことができ、エフェクター分子と候補タンパク質の間に配置されると、Ｖｉｆの標的であるヒトタンパク質を同定する可能性をもたらすが、これは従来の方法を使用して今まで同定されたことはなかったものである。したがって、更なる実施態様において、本発明の方法は、更に、ペプチドリンカーにより標的ＨＩＶタンパク質に融合しているエフェクターを含む第１融合タンパク質をコードする第１核酸分子を、宿主細胞において発現させることを含む。
【００４８】
本発明は、核酸ライブラリー、例えばｃＤＮＡ又はＥＳＴライブラリーによりコードされたタンパク質及びタンパク質の個体群を用い、その例は実施例において詳細に記載されている。したがって、本発明の方法に使用されるヒトタンパク質は、ｃＤＮＡによりコードされ、好ましくは、ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡのプールの中から、より好ましくはｃＤＮＡライブラリーの中から提供される。Ｔ細胞ライブラリー、ヒトＢリンパ芽球様ｃＤＮＡライブラリー、リンパ節由来ｃＤＮＡライブラリー又はＨｅＬａ細胞ライブラリーのような幾つかのライブラリーを本発明の方法に使用することができるが、最も好ましくは、本発明の方法に使用されるｃＤＮＡライブラリーは、胸腺ライブラリーである。
【００４９】
本発明の方法の一つの大きな利点は、哺乳類、鳥類、昆虫、酵母及び大腸菌細胞のようにほぼあらゆる種類の細胞に適用できることである。しかし、好ましい実施態様において、本発明の方法に使用される宿主細胞は、酵母細胞である。
【００５０】
本発明の方法によると、タンパク質−タンパク質相互作用は、細胞増殖の発生又は不在によって示される。したがって、細胞を使用することが必要であり、その表現型（細胞増殖）はタンパク質−タンパク質相互作用によって変わる。例えば、最終的に細胞増殖を誘発するＲａｓシグナル伝達経路を活性化するのに必要な内因的に発現したエフェクターの欠如によって対応する表現型を明白にしている、従来技術で既知の細胞株が存在する。そのような細胞株の一つは、例えば、ｃｄｃ２５遺伝子（ｃｄｃ２５−２）が突然変異している酵母細胞株である。Ｃｄｃ２５は、原形質膜に局在化したときにＲａｓの活性化をもたらすグアニン交換因子（ＧＥＦ）である（プティジャン（Petitjean）ら、遺伝学（Genetics）１２４（１９９０）、７９７〜８０６を参照すること）。したがって、Ｃｄｃ２５−２の突然変異は、機能性Ｒａｓエフェクターの発現の欠失をもたらし、制限温度、すなわち３７℃で増殖欠損をもたらす。この欠損は、対応するＲａｓエフェクターを細胞膜に／細胞膜で提供する又は「動員」することにより克服できる。これに関連して、本発明の融合タンパク質は、一方の融合タンパク質が細胞膜局在化ドメインを含み、他方の融合タンパク質が、Ｒａｓシグナル伝達経路を活性化することができるエフェクター分子を含むように設計されるので、タンパク質−タンパク質相互作用の際に、Ｒａｓエフェクターを細胞膜に動員し、それによりＲａｓシグナル伝達経路を活性化し、細胞の増殖を可能にする。したがって、前記細胞の使用は、細胞増殖の存在又は不在を光学的に観察することによって、この方法がタンパク質−タンパク質相互作用を決定するのを非常に容易にするので、本発明の方法の特に好ましい実施態様では、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ｃｄｃ２５−２細胞である。
【００５１】
上記に記述されているように、本発明の実験の際に、アッセイを実施した細胞の増殖は、タンパク質−タンパク質相互作用を示している。しかし、既に記述しているように、これは一方の融合タンパク質が細胞膜局在化ドメインを含み、他方の融合タンパク質がエフェクター分子を含むことを必要とする。当該技術において、対応するＲａｓ活性化を実施することができる幾つかの分子が知られているが、本発明の方法の好ましい実施態様では、このエフェクター分子は、セブンレス（Ｓｏｓ）タンパク質の息子（Ｓｏｎ）である。
【００５２】
当然のことながら、本発明は、本発明の方法により得られる核酸にも関し、好ましくは、核酸分子は、Ｖｉｆと相互作用することができるタンパク質をコードする。しかし、コードされたタンパク質の配列の決定は、驚くべきことに、本発明の方法により同定された核酸分子が、当業者には認識されるであろう、一般に認められているアミノ酸の１文字コードを使用して表されるモチーフ：〔ＤＬＮ〕〔∧ＡＦ〕〔ＤＬＮ〕〔∧Ｐ〕〔∧Ｐ〕〔∧Ｐ〕〔∧Ｐ〕〔ＤＬＮ〕を含む、新たな種類のＶｉｆ結合タンパク質をコードすることを明らかにした。しかし、符号及び文字それぞれの簡潔な説明を以下に示す。
【００５３】
「〔ＤＬＮ〕は、この位置のアミノ酸がＤ、Ｌ又はＮ（アスパラギン酸、ロイシン又はアスパラギン）のいずれかであることを意味する。
「〔∧ＡＦ〕」は、Ａ、Ｆ（アラニン、フェニルアラニン）以外の任意のアミノ酸がこの位置でありうることを意味する。
「〔∧Ｐ〕」は、Ｐ（プロリン）以外の任意のアミノ酸がこの位置でありうることを意味する。
【００５４】
したがって、更なる実施態様において、本発明は、本発明の方法により得られる核酸分子を参照し、最も好ましくは、コードされるタンパク質は、モチーフ：〔ＤＬＮ〕〔∧ＡＦ〕〔ＤＬＮ〕〔∧Ｐ〕〔∧Ｐ〕〔∧Ｐ〕〔∧Ｐ〕〔ＤＬＮ〕を含む。
【００５５】
一般に、本発明において使用される第１及び第２融合タンパク質をそれぞれコードする第１及び第２核酸分子は、融合タンパク質の相互作用が生じる特定の細胞に適した発現ベクターに存在する。適切な発現ベクターの例は、例えば、本方法が実施される細胞に応じて、酵母発現ベクター又は哺乳類発現ベクターを含む。特に、本発明のベクターは、標的タンパク質をコードする核酸分子の挿入に都合の良い手段をもたらす多重クローニング部位のようなクローニング部位を含有する。本発明によると、プロモーター及び核酸分子は、いわゆる「発現カセット」に配置されており、第１融合タンパク質の発現カセットは、エフェクタータンパク質とのフレーム中で、標的タンパク質（Ｖｉｆ又はその相同体、誘導体若しくはフラグメント）をコードする核酸に機能的に結合しているプロモーターを含み、他の発現カセットは、リンカー及び細胞区画局在化シグナルとのフレームの中で、候補（宿主）タンパク質（又はその相同体、誘導体若しくはフラグメント）をコードする核酸に機能的に結合しているプロモーターを含む。加えて、ベクターは、適切な転写又は翻訳の開始又は終止シグナルなどを含有することができる。好ましくは、発現カセットは、異種プロモーターを含むキメラ発現カセットである。
【００５６】
したがって、別の実施態様において、本発明は上記記載の核酸分子を含むベクターに関し、好ましくは、ベクターは、上記で定義された標的ＨＩＶタンパク質又はその結合フラグメントをコードする核酸分子を更に含む。
【００５７】
当然のことながら、本発明は、本発明の方法により又は上記記載のベクターにより得られる核酸分子を含む組み換え宿主細胞にも関する。
【００５８】
更なる実施態様において、本発明は、ＨＩＶタンパク質と又はＨＩＶタンパク質及びヒトタンパク質を含む複合体と相互作用することができるタンパク質を調製する方法であって、
（ａ）インビトロで、上記の特徴決定された宿主細胞を培養する、及び／又は本発明の方法により若しくは本発明のベクターにより得られうる核酸分子を発現すること、
（ｂ）タンパク質又は複合体を単離すること
を含む方法を提供する。
【００５９】
現在まで、幾つかのタンパク質は、ＨＩＶ複製サイクルに関与するタンパク質と相互作用することが同定されている。しかし、本発明の方法を使用すると、今までＶｉｆと結合することが決定されたことのない宿主（ヒト）タンパク質が同定された。更なる分析は、タンパク質が新たな種類のタンパク質に属していることを明らかにし、そのメンバーは、Ｖｉｆ及び上記参照のモチーフに結合する能力を共有している。
【００６０】
したがって、なお別の実施態様において、本発明は、核酸分子によりコードされるか又は本発明の上記に記述された方法により得られうるＨＩＶ相互作用タンパク質を対象とし、好ましくは、タンパク質は、ＰＴＥＮ（配列番号４及び５）、ＨＥＲＣ４（配列番号６及び７）、Ｔｏｍ１Ｌ１（配列番号８）、ＥＩＦ４Ａ２（配列番号９）、ＴＣＴＰ（ＴＰＴ１：配列番号１０、１１、１２及び１３）、ＮＵＰ５０（配列番号１４）、ＣＴＣＦ（配列番号１５）、ｈｎＲＰＵ（配列番号１６）、ＭＲＣＬ（ＭＲＣＬ３：配列番号１７）、ＳＤＣＣＡＧ１（配列番号１８及び１９）、ＰＴＧＥＳ３（配列番号２０）、ＨＳＰｓ（ＨＳＰ９０：配列番号２１；ＨＳＰＡ１：配列番号：２２、２３、２４、２５、２６、２７及び２８；ＨＳＰＡ５：配列番号：２９、３０及び３１；ＨＳＰＡ８：配列番号：３２、３３及び３４；ＨＳＰＨ１：配列番号：３５）、ＣＳＤＥ１（配列番号３６）、ＫＩＡ１４２９（配列番号４２）、ＣＵＬ４Ａ（配列番号４３）、ＲＡＧ２（配列番号４４）、ＣＣＴ５（配列番号４５）、ＶＣＰ（配列番号４６）、ＰＤＩＡ３（配列番号４７）、ＰＴＰＲＣ（配列番号４８）、ＣＡＢ３９（配列番号４９）、ＰＰＭ１Ｂ（配列番号５０）、ＲＡＢ４Ａ（配列番号５１）、ＲＡＢ２１（配列番号５２）又はこれらのいずれかのフラグメント若しくは誘導体からなる群より選択される。
【００６１】
Ｖｉｆの機能は宿主細胞因子の活性と密接につながっていると思われるが、Ｖｉｆの分子機構は依然として不明のままである。理論に束縛されることを意図するものではないが、Ｖｉｆはウイルス種と宿主との接触を「仲介する」、すなわちウイルス性因子と細胞性因子及び／又は宿主の経路とを連結する「アダプター」として作用すると考えられる。このことは、ＨＩＶのレトロウイルス特性、また小型であることに起因して宿主細胞機構の利用可能性に強く依存しているウイルスが、複製プログラムを通過することを可能にする。したがって、Ｖｉｆと宿主の相互作用を防止すること及びそれに介入することは、宿主細胞機構の利用を拒絶し、ＨＩＶ複製、したがってＡＩＤＳの発症又は進行を防ぐ治療手法であると考えられる。
【００６２】
したがって、Ｖｉｆは、新たな治療手法を考えるときに対処されるべき重要な標的であると思われ、Ｖｉｆと相互反応する宿主因子を同定すること及びＨＩＶ複製に対するそれらの可能な影響力を評価することが必要となる。タンパク質−タンパク質相互作用を調査する幾つかの方法が従来技術において記載されているが、生理学的条件下において、ウイルスタンパク質の相互作用パートナーを同定する及びウイルスタンパク質と宿主タンパク質との相互作用を検出する、それぞれの方法を開発することが、主な関心事である。
【００６３】
以下に、健康な生物に保持されている、本発明の方法によりＶｉｆ結合タンパク質として同定されているタンパク質の「通常」の機能について、簡潔な概要を提示する。以下は、更に、検出されたタンパク質のどれもが、以前にＶｉｆの標的であると決定されていなかったこと又は示唆さえもされていなかったことを実証している。
【００６４】
・ホスファターゼ及びテンシン相同体（ＰＴＥＮ）（異名：ＢＺＳ、ＭＨＡＭ、ＴＥＰ１、ＭＭＡＣ１、ＰＴＥＮ１、ＭＧＣ１１２７）、受入番号ＮＭ＿０００３１４。この酵素は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の作用により生成され、それ自体Ｔ細胞レセプターとＢ細胞レセプターの会合に反応して活性化する、第２メッセンジャー分子のホスファチジルイノシトール３，４，５−トリスホスフェート（ＰＩ−３，４，５−Ｐ3）の脱リン酸化を触媒する。とりわけ、ＰＩ３Ｋは、また、インスリン様増殖因子ＩＧＦ−１（ヤマモト（Yamamoto）ら、内分泌学（Endocrinology）１３０（１９９２）、１４９０〜９８）及びインスリン（ハダリ（Hadari）ら、生物化学ジャーナル（J. Biol. Chem.）２６７（１９９２）、１７４８３〜１７４８９）により誘発されるシグナル伝達によって活性化され、主に抗アポトーシス、繁殖及び腫瘍形成に関与するセリン−トレオニンキナーゼＰＫＢ／Ａｋｔ経路の下流において自身を活性化する。ＰＴＥＮは、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の負のレギュレーターであり、その不在下では、ＰＫＢ／Ａｋｔ経路の過剰活性化が、アポトーシスに対する抵抗性の増大、細胞生存の増強及び繁殖をもたらす。Ｔ細胞特異的欠失ＰＴＥＮのマウスによる調査は、胸腺における発生中のＴ細胞の繁殖に対するその重要な調節機能を示した（ハーゲンビーク（Hagenbeek）ら、実験医学ジャーナル（J. Exp. Med.）２００（２００４）、８８３〜８９４を参照すること）。
【００６５】
ＨＩＶ感染の際のＴ細胞アポトーシスの調節は、臨床潜伏及び更なる疾患進行の期間において重要であるが、ＨＩＶによるＴ細胞死の誘発、また、ＨＩＶ感染Ｔ細胞の保護について分子機構は、十分に定義されていない。ＨＩＶ感染の場合、ウイルス感染誘発アポトーシスは、免疫不全に関連する、ＣＤ４＋Ｔ細胞の涸渇及びＨＩＶ感染とＡＩＤＳの進行に寄与する。したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞のアポトーシスの阻害は、ＨＩＶ感染の予防又は治療の戦略でありうる。
【００６６】
異なるＨＩＶタンパク質が細胞死の調節において役割を果たすことが記載されている（セリアー（Selliah）及びフィンケル（Finkel）、細胞死及び分化（Cell death and differentiation）８（２００１）、１２７〜１３６を参照すること）。例えば、非感染バイスタンダーＴ細胞のアポトーシスは、ＨＩＶ−Ｔａｔ及びＨＩＶ−Ｖｐｒによって誘発されうる。更に、エンベロープ糖タンパク質ＨＩＶ−Ｅｎｖの細胞レセプターＣＤ４及びＣＸＣＲ４への結合も、一次Ｔリンパ球のアポトーシスを誘発することが示されている（シカラ（Cicala）ら、ＰＮＡＳ  ９７（２０００）、１１７８〜１１８３を参照すること）。一方、ＰＩ３Ｋとウイルスタンパク質Ｎｅｆの相互作用は、ＰＩ３Ｋ活性化のために抗アポトーシスシグナル伝達をもたらすことが実証された（ウルフ（Wolf）ら、ネイチャー医薬（Nature Med.）７（２００１）、１２１７〜１２２４を参照すること）。細胞内Ｔａｔ及びＨＩＶ−１感染によるＰＴＥＮの下方制御は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ生存経路を刺激する潜在的な機構として示唆されている（クー（Chugh）ら、分子生物学ジャーナル（J. Mol. Biol.）３６６（２００７）、６７〜８１を参照すること）。これに関連して、ＨＩＶ  Ｇａｇ及びＰＩ３Ｋを含むタンパク質複合体、並びにこれらのタンパク質複合体の使用は、国際出願ＷＯ０２／０９０５４９において既に記載されている。
【００６７】
更に、国際出願ＷＯ０３／０６００６７は、有効量のＰＩ３Ｋ経路インヒビター、並びにＰＩ３Ｋの調節サブユニット、Ｈｅｒｃユビキチンリガーゼ及びＮｅｆのタンパク質複合体を投与する、ウイルス感染及びウイルス成熟を阻害する組成物及び方法を記載する。
【００６８】
ＰＥＴＮ触媒反応の産物であるＰＩ（４，５）Ｐ2も、Ｇａｇ局在化及びウイルス構築の調節に関与することが示されている（オノ（Ono）ら、ＰＮＡＳ  １０１（２００４）、１４８８９〜１４８９４を参照すること）。更に、ウイルス産生は、原形質膜ＰＩ（４，５）Ｐ2のレベルの低減により強力に阻害されることを示し、この効果は、原形質膜へのＧａｇ局在化の阻害に起因する。加えて、Ｇａｇ及びＰＩ（４，５）Ｐ2のマトリックスドメインの複合体の構造研究が、サード（Saad）ら、ＰＮＡＳ  １０３（２００６）、１１３６４〜１１３６９において実施された。しかし、ＰＴＥＮとＨＩＶ  Ｖｉｆの複合体は、以前に記載されたことはない。
【００６９】
このような状況において、ＰＴＥＮ（それぞれ配列番号４及び５）を本発明の方法によりＶｉｆそれぞれの直接的相互作用パートナー及び標的として同定することにより、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳそれぞれの治療及び予防の新たな戦略に選択肢が提供され、例えば、ＰＴＥＮ若しくはその模倣体を供給することにより又はＰＴＥＮの発現を修飾することができる若しくはＰＴＥＮとＶｉｆの複合体に影響を与えることができる化合物を適用することにより、対応する相互作用を防止する。その結果、ウイルスの、宿主細胞機構の利用が禁止され、ウイルス複製が停止する。更に、宿主のアポトーシス調節は、まるでＨＩＶの不在の場合のように、宿主に対してそれぞれ維持及び再指示されるであろう。
【００７０】
・ＨＥＲＣ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ、受入番号ＨＥＲＣ４：ＮＭ＿００１０１７９７２、ＮＭ＿０１５６０１、ＮＭ＿０２２０７９。ＨＥＣＴドメインに加えてＲＣＣ１（染色体凝縮１のレギュレーター）様ドメイン（ＲＬＤ）を含有するＥ３ユビキチンリガーゼは、ＨＥＲＣと命名されている。ＲＣＣ１は、ＲａｎのＧＥＦ（グアニンヌクレオチド交換因子）であり、核細胞質間輸送及び紡錘体形成に参加する。したがって、ＧＥＦ及びユビキチンリガーゼの両方の役割が、ＨＥＲＣタンパク質において想定されるが、そのタンパク質ファミリーは、６つの異なるＨＥＲＣタンパク質（大型が２つ、小型が４つ）から構成されている。
【００７１】
ＨＩＶ  Ｖｉｆと、カリンに基づいたＥ３リガーゼとの相互作用は、既に、ユー（Yu）ら、サイエンス（Science）３０２（２００３）、１０５６〜１０６０；メール（Mehle）ら、遺伝子及び開発（Genes and Dev.）１８（２００４）、２８６１〜２８６６；メールら、生物化学ジャーナル（J Biol. Chem.）２８１（２００６）、１７２５９〜１７２６５において示されている。更に、このタンパク質相互作用は、シチジンデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ３Ｇの脱活性化に必須であることが、シラカワ（Shirakawa）ら、ウイルス学（Virology）３４４（２００６）、２６３〜２６６、コバヤシ（Kobayashi）ら、生物化学ジャーナル（J. Biol. Chem.）２８０（２００５）、１８５７３〜１８５７８において記載されている。加えて、ＨＩＶタンパク質Ｖｉｆは細胞内で急速に分解することが示されており、Ｖｉｆの急速な代謝回転は、このタンパク質の高い発現レベルでの有害な影響を防止するのに生物学的に重要であることが示唆されている（フジタ（Fujita）ら、微生物及び感染（Microbes and Infection）６（２００４）、７９１〜７９８を参照すること）。大量のＶｉｆのポリユビキチン化誘導体が細胞において検出された。更に、ＨＩＶ  Ｖｉｆのユビキチン化が、デュソー（Dussart）らにより２００４年に調査され、ＨＥＣＴ  Ｅ３ユビキチンリガーゼファミリーのタンパク質との相互作用が報告され、また、ＶｉｆとｈＮｅｄｄ４−１及びＡＩＰ４との複合体が記載された。しかし、本発明の方法により発見されたＨＩＶ  ＶｉｆとＨＥＲＣ  Ｅ３ユビキチンリガーゼとのタンパク質複合体は、以前に記載されたことはない。
【００７２】
更に、国際出願ＷＯ０２／０９０５４９は、ＨＥＲＣタンパク質とＨＩＶ  Ｇａｇの相互作用が、ウイルス成熟において役割を果たすことを記載し、国際出願ＷＯ０３／０６００６７は、ＨＥＲＣユビキチンリガーゼと、Ｎｅｆタンパク質を含有するＰＩ３Ｋの調節サブユニットとのタンパク質複合体を記載する。
【００７３】
したがって、ＨＥＲＣ  Ｅ３（それぞれ配列番号６及び７）を本発明の方法によりＶｉｆ結合タンパク質として同定することにより、それが、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳの分野における新規戦略を考えたときに適切な標的となる。ＰＴＥＮに関連して既に記述されたように、このことは、ウイルス複製を停止させるために、ＨＥＲＣ  Ｅ３若しくはその模倣体の供給、又はＨＥＲＣ  Ｅ３の発現若しくはＨＥＲＣ  Ｅ３とＶｉｆとの複合体の形成のいずれかを修飾することができる化合物の供給を含むことができる。
【００７４】
・ｍｙｂ１様１の標的（ＴＯＭ１Ｌ１）、受入番号ＮＭ＿００５４８６及び関連タンパク質Ｔｏｍ１及びＴｏｍ１Ｌ２は、Ｎ末端領域におけるＶＨＳドメイン（Ｖｓｐ２７ｐ、Ｈｒｓ及びＳｔａｍ）及び小胞運搬に関与するＧＡＴ相同ドメイン（ＧＧＡ及びＴｏｍ）によって特徴決定されているタンパク質ファミリーを構成する（ボニファシノ（Bonifacino）ＪＳ、ネイチャーレビュー分子細胞生物学（Nat. Rev. Mol. Cell Biol.）５（２００４）２３〜３２；ローヒ（Lohi）ら、ＦＥＢＳレターズ５１３（２００２）、１９〜２３を参照すること）。フランコ（Franco）ら、分子細胞生物学（Mol. Cell Biol.）２６（２００６）、１９３２〜１９４７は、ＳＦＫ（ｓｒｃキナーゼファミリー）／レセプター会合を調節することによって、Ｓｒｃ分裂促進シグナル伝達の負のレギュレーターとしてＴＯＭ１Ｌ１を同定した。更に、Ｖｉｆは、ＳｒｃチロシンキナーゼのＦｙｎ及びＨｃｋと相互作用し、それらの触媒活性に低減をもたらすことが、ハサイン（Hassaine）ら、生物化学ジャーナル（J. Biol. Chem.）２７６（２００１）、１６８８５〜１６８９３；ドゥアイシ（Douaisi）ら、生化学、生物理学研究通信（Biochem. Biophys. Res. Commun.）（２００５）において示された。
【００７５】
ＴＯＭ１Ｌ１と多小胞体ソーティング機構との相互作用が、プエルトリャノ（Puertollano）ら、生物化学ジャーナル（J. Biol. Chem.）２８０（２００５）９２５８〜９２６４において示されている。より詳細には、ＴＳＧ１０１とのタンパク質相互作用が実証され、このタンパク質は、エンドソームタンパク質ソーティングに関与する因子である。興味深いことに、Ｔｓｇ１０１とのＨＩＶ−１  Ｇａｇ相互作用は、効率的なウイルス出芽にとって重要である（マーチン−セラノ（Martin-Serrano）ら、ネイチャー医薬（Nat Med）７（２００１）１３１３、国際出願ＷＯ０２／０９０５４９及びＷＯ０２／０７２７９０を参照すること）。加えて、抗ＴＳＧ１０１抗体及びＴＳＧ１０１誘導ペプチドが、ウイルス感染の治療において記載されている（国際出願ＷＯ０４／０３１２０９及びＷＯ０２／０９４３１４を参照すること）。
【００７６】
したがって、本発明の方法によりＴＯＭ１Ｌ１（配列番号８）とＶｉｆとの分子相互作用を同定することによって、ＴＯＭ１Ｌ１又はＴＯＭ１Ｌ１とＶｉｆとの複合体が、ＨＩＶ及びＡＩＤＳそれぞれの治療及び予防の分野における適切な標的となる。特に、ウイルスタンパク質Ｖｉｆがウイルス生活環の後期に発現することが知られており、Ｖｉｆがウイルス構築プロセスに関与することが考察されたので（チャン（Zhang）ら、ウイルス学ジャーナル（J. Virology）７４（２０００）、８２５２〜８２６１を参照すること）、理論に束縛されることを意図するものではないが、ＶｉｆとＴｏｍタンパク質との分子相互作用は、Ｔｏｍ１Ｌ１がシグナル伝達と分解性細胞経路とを連結し、したがってウイルス複製において重要な役割を果たすと思われるので、細胞宿主因子のＶｉｆ調節における主要な構成要素であると考えられる。したがって、対応するＴＯＭ１Ｌ１／Ｖｉｆ複合体の形成を防止することは、ウイルス複製を停止する、並びに宿主においてタンパク質ソーティング及び分解機構をそれぞれ維持及び再指示すると考えられる。
【００７７】
・ヒト真核生物翻訳開始因子４Ａ（ｅＩＦ４Ａ）、受付番号ＮＭ＿００１９６７、ｅＩＦ４Ｆの構成要素は、翻訳開始のリボソーム動員工程において機能するＤＥＡＤボックスヘリカーゼである。ｅＩＦ４Ｆ複合体は、また、ＡＴＰ非依存性様式でｍＲＮＡキャップ構造に結合するｅＩＦ４Ｅ及び４３Ｓ開始前複合体のｍＲＮＡ結合を仲介するモジュールの足場であるｅＩＦ４Ｇを含む。ｅＩＦ４Ａは、ｍＲＮＡの５′領域の二次構造を巻き戻して翻訳を促進する重要な役割を果たす。ｅＩＦ４Ａは、ｍＲＮＡリボソーム結合において、その遊離形態でも、ｅＩＦ４Ｆ複合体の一部としても関与することができる。
【００７８】
宿主細胞のウイルス感染の際に、ウイルスｍＲＮＡは、ウイルスと細胞の両方のｍＲＮＡへのリボソーム動員を仲介する真核生物翻訳開始因子の限定されたプールを宿主ｍＲＮＡと競合しなければならない。したがって、ウイルスは、ウイルスゲノムの複製のために感染細胞内の特定のｅＩＦを修飾する。ｅＩＦ４Ａと、単純ヘルペスウイルスのビリオン宿主シャットオフ（ｖｈｓ）タンパク質との相互作用（フェング（Feng）ら、ウイルス学ジャーナル（J. Virology）７９（２００５）、９６５１）及びＨＣＶのＮＳ５Ｂタンパク質との相互作用（キョーノ（Kyono）ら、生化学、生物理学研究通信（Biochem. Biophys. Res. Commun.）２９２（２００２）、６５９）が既に実証されているが、本発明は、ｅＩＦ４Ａと、ＨＩＶのタンパク質、すなわちＨＩＶ  Ｖｉｆとの複合体の検出を提供する。
【００７９】
したがって、ｅＩＦ４Ａ（配列番号９）がＶｉｆの直接的な標的でもあるという本発明の方法による新たな所見は、新たな抗ＨＩＶ／ＡＩＤＳ治療手法を開発するために有用な潜在的標的を提供する。例えば、ｅＩＦ４Ａ又はｅＩＦ４ＡとＶｉｆの複合体に影響を与えることは、ｅＩＦ４Ａのような宿主翻訳開始因子への結合についてウイルスと宿主との競合を防止し、それによりウイルス複製を妨害するばかりでなく、天然であるが限定された開始因子のプールを宿主の支配下に維持すると考えられる。
【００８０】
・翻訳制御された腫瘍タンパク質（ＴＣＴＰ）（異名：フォーチリン、ヒスタミン放出因子、ＨＲＦ、ＴＰＴ１、ｐ０２）、受入番号ＮＭ＿００３２９５は、腫瘍特異的又は組織特異的タンパク質ではなく、全ての真核生物及び５００を超える組織及び細胞型に普遍的に発現する（ボマー（Bommer）及びティエレー（Thiele）、生化学細胞生物学ジャーナル（J. Biochem. Cell Biol.）３６（２００４）、３７９〜３８５；サンチェス（Sanchez）ら、電気泳動（Electrophoresis）１８（１９９７）、１５０〜１５５を参照すること）。ＴＣＰＴレベルは、ストレス条件のような広範囲の細胞外刺激に反応して、高度に調節されている（ボマー（Bommer）ら、ＲＮＡ  ８（２００２）、４７８〜４９６；ボネット（Bonnet）ら、酵母（Yeast）１６（２０００）、２３〜３３を参照すること）。ＴＣＰＴは、また、ヒスタミン放出因子として細胞外機能を有すること及び抗アポトーシス活性を有することを示した（リー（Li）ら、生物化学ジャーナル（J. Biol. Chem.）２７６（２００１）、４７５４２〜４７５４９を参照すること）。
【００８１】
フォーチリンとしても知られているＴＣＴＰは、抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーのタンパク質であるＭＣＬ１に結合し、フォーチリンがアポトーシスの調節においてＭＣＬ１特異的補助因子であるかもしれないことを示唆している（チャン（Zhang）ら、生物化学ジャーナル（J. Biol. Chem.）２７７（２００２）、３７４３０を参照すること）。フォーチリン活性及びＭＴＬ−１及びｐ５３との相互作用を調節する方法が、国際出願ＷＯ０２／３６６２４に記載されており、抗アポトーシス遺伝子ＭＴＬ−１は、バレストリエリ（Balestrieri）ら、医療ウイルス学ジャーナル（J. Med. Virol.）７９（２００７）、１１１〜１１７において、ＨＩＶ患者の成功した抗レトロウイルス療法に反応して有意に上方制御されたことが示された。
【００８２】
加えて、ＴＣＴＰは、アポトーシスレギュレーターＢｃｌ−ＸＬと特異的に相互作用する（ヤン（Yang）ら、腫瘍遺伝子（Oncogene）２４（２００５）、４７７８〜４７８８を参照すること）。Ｂｃｌ−ＸＬは、アポトーシスのレギュレーターとして機能し、かつミトコンドリア膜に局在することが見出されているＢｃｌ−２関連タンパク質でもあり、ミトコンドリア電位依存性アニオンチャンネルに結合して、それを閉鎖し、それによってカスパーゼアクチベーターであるチトクロームｃの、ミトコンドリア内腔から細胞質への輸送を防止する（シミズ（Shimizu）ら、ネイチャー（Nature）３９９（１９９９）、４８３〜４８７を参照すること）。Ｂｃｌ−ＸＬ／ＴＣＴＰタンパク質複合体のモジュレーターのスクリーニングアッセイ、調節化合物の同定、及びＨＩＶを含むアポトーシス関連疾患の治療における治療用途が、ＵＳ２００２／０１７７６９２に記載されている。更に、ＴＣＴＰは、国際出願ＷＯ０１／１６３２２においてＨＩＶ阻害タンパク質として記載された。しかし、ＨＩＶ  Ｖｉｆ及びＴＣＴＰを含有するタンパク質複合体は、以前に記載されたことはない。
【００８３】
Ｖｉｆ結合タンパク質として同定された上記に参照されているタンパク質の状況において既に考察された利点によると、Ｖｉｆの直接的な標的としてＴＣＴＰ（ＴＰＴ１：それぞれ配列番号１０、１１、１２及び１３）を同定することも、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの分野における新規戦略の開発のための、更に適切な標的、すなわちＴＣＴＰか、又はＶＩｆとの対応する複合体を提供すると考えられる。特に、ＶｉｆとＴＣＴＰとの各相互作用を防止することは、ウイルスが宿主の細胞機構を利用するのを防止し、それによってウイルス複製を防止すると考えられる。更に、アポトーシスの調節は、ＨＩＶによって影響を受けることがないはずであり、むしろ、非感染生物の場合のように、宿主により制御されるはずである。
【００８４】
・ヌクレオポリン（ＮＵＰ５０）（異名：ＮＰＡＰ６０、ＮＰＡＰ６０Ｌ、ＭＧＣ３９９６１、ＤＫＦＺ５６４Ａ０４３）、受入番号ＮＭ＿００７１７２、ＮＭ＿１５３６４５。
生活環を完了するために、ヒト免疫不全ウイルスは、そのゲノムを宿主の非分化細胞の核に導入することを必要とする。宿主細胞を感染した後、ＨＩＶカプシドは急速に脱コートされ、ゲノムＨＩＶ  ＲＮＡは、直鎖ｄｓＤＮＡに逆転写され、核タンパク質複合体と関連したままの状態を維持し、組み込み前複合体（ＰＩＣ）と呼ばれる。ウイルスゲノムは、核局在化シグナル（ＮＬＣ）を含有するウイルスタンパク質と複合体を形成し、３つのＨＩＶタンパク質は、細胞核内移行機構：ＨＩＶ−１マトリックスタンパク質、補助タンパク質Ｖｐｒ及びＨＩＶインテグラーゼを動員することによって、ＰＩＣの核内移行において核親和性タンパク質として関与することが知られている（概説については、ブクリンスキー（Bukrinsky）、分子医学（Mol. Med.）１０（２００４）、１〜５を参照すること）。加えて、ウイルスタンパク質Ｒｅｖは、短Ｃ末端ロイシン豊富モチーフを、ウイルスｍＲＮＡの核細胞質間往復輸送及びＲｅｖ依存性輸送に重要な核外移行シグナルとして有する。
【００８５】
Ｖｉｆの細胞内局在化についての調査は、Ｖｉｆが主に細胞質タンパク質であること明らかにした（コンサルヴェス（Goncalves）ら、ウイルス学ジャーナル（J. Virol.）６８（１９９４）、７０４〜７１２；コンサルヴェスら、ウイルス学ジャーナル６９（１９９５）、７１９６〜７２０４；マイケルズ（Michaels）ら、エイズ研究ヒトレトロウイルス（AIDS Res. Hum. Retroviruses）９（１９９３）、１０２５〜１０３０を参照すること）。それにもかかわらず、Ｖｉｆの核酸局在化も観察された（ヴィクロスキー（Wichroski）ら、生物化学ジャーナル（J. Biol. Chem.）２８０（２００５）、８３８７〜８３９６を参照すること）。Ｖｉｆ配列は、塩基領域の90ＲＫＫＲ93を含有し、これはプロトタイプ核局在化シグナルと類似しており、このモチーフは、潜在的な核輸送阻害シグナルとして同定された。Ｖｉｆが核細胞質間輸送のレギュレーターとして機能しうることが前提とされている（フリードラー（Friedler）ら、分子生物学ジャーナル（J. Mol. Biol.）２８９（１９９９）、４３１〜４３７を参照すること）。更に、ＶｉｆのＮＬＳ様配列の主鎖環状ペプチド類似体が、ウイルスゲノムの核内移行の阻害に基づいた薬剤の候補として国際出願ＷＯ９９／２８３３８に記載されている。
【００８６】
ヌクレオポリンＮＵＰ５０は、移入複合体解体及びインポーチン再利用と協調して機能することが示された（マツウラ（Matsuura）ら、ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J.）２４（２００５）、３６８１〜３６９８を参照すること）。その局在化のために、ＮＵＰ５０は、ＮＰＣの核質部分の範囲内、おそらく主に核バスケットにおいて機能すると示唆されている（グアン（Guan）ら、分子細胞生物学（Mol. Cell Biol.）２０（２０００）、５６１９〜５６３０を参照すること）。他のヌクレオポリンＮＵＰ６２及びＮＵＰ１３３は、ｃＤＮＡスクリーニングによりＨＩＶ感染のエンハンサーとして同定されている（グエン（Nguyen）ら、ウイルス学（Virology）３６２（２００７）、１６〜２５を参照すること）。
【００８７】
したがって、ＮＵＰ５０（配列番号１４）をＶｉｆの直接的な標的として同定することにより、ＨＩＶ感染及び／又はＡＩＤＳの治療の新規治療手法を考えている場合、ＮＵＰ５０及び／又はＮＵＰ５０とＶｉｆの複合体が適切な標的になる。複合体形成を防止する場合、ウイルス複製が妨害又は停止されると考えられる事実のほかに、加えて、理論に束縛されることを意図するものではないが、ＨＩＶ  ＶｉｆとＮＵＰ５０の分子相互作用が、宿主の核細胞質間輸送機構を調節すると考えられるので、対応するＶｉｆ／ＮＵＰ５０相互作用を防止する又は崩壊させると、細胞内の核細胞質間輸送の制御は、まるでＨＩＶ感染がないかのように、宿主に戻されるはずである。
【００８８】
・ＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）、受入番号ＮＭ＿００６５６５。
転写リプレッサーＣＴＣＦは、遺伝子サイレンシングをもたらす複数のタスクに関与する普遍性タンパク質である。ＣＴＣＦは、プロモーター活性化又は抑圧、ホルモン反応性遺伝子サンレンシング、メチル化依存性クロマチン遮断及びゲノムインプリンティングを含む遺伝子調節の異なる局面において役割を果たす１１ジンクフィンガー転写因子である（ダン（Dunn）及びデーブ（Davie）、生化学及び細胞生物学（Biochem. Cell Biol.）８１（２００３）、１６１〜１６７；ダンら、実験細胞研究（Exp. Cell Res.）２８８（２００３）、２１８〜２２３を参照すること）。興味深いことに、転写リプレッサーＣＴＣＦの特定の上方制御は、Ｔ細胞クローンを分泌するＨＩＶ−１耐性因子のＨＩＶ−１に対する細胞抵抗性に直接関連していた（カルトベリシュビリ（Kartvelishvili）ら、免疫学レターズ（Immunology Letters）９３（２００４）７９〜８６を参照すること）。しかし、ＨＩＶ  Ｖｉｆ及びＣＴＣＦを含有するタンパク質複合体は、以前に記載されたことはない。
【００８９】
したがって、Ｖｉｆと相互作用するタンパク質としてＣＴＣＦ（配列番号１５）を同定することによっても、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳそれぞれの分野において新規治療手法を開発することを考える場合、取り組むべき更なる標的が提供される。特に、理論に束縛されることを意図するものではないが、Ｖｉｆと転写因子ＣＴＣＦとの相互作用がヒト宿主細胞におけるＨＩＶ複製にとって重要であると考えられるので、その対応する防止は、ウイルスが宿主の細胞機構を利用するのを邪魔し、したがってウイルス複製を停止させるはずである。
【００９０】
・ＨＮＲＰＵ（異名：ｈｎＲＮＰＵ、足場付着因子Ａ、ＳＡＦ−Ａ、ｐ１２０、ｐｐ１２０）、受入番号ＮＭ＿００４５０１、ＮＭ＿０３１８４４。
このタンパク質は普遍的に発現しているヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）のサブファミリーに属する。ｈｎＲＮＰは、特有の核酸結合特性を有し、かつヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）と複合体を形成する、ＲＮＡ結合タンパク質である。これらのタンパク質は、核においてプレｍＲＮＡと関連し、プレｍＲＮＡプロセシング、並びにｍＲＮＡ代謝及び輸送についての他の局面に影響を与えると思われる。ｈｎＲＮＰは全て核に存在するが、一部は、核と細胞質の間を往復すると思われる。
【００９１】
タンパク質ｈｎＲＮＰＵは、ＲＮＡ結合ドメイン及び足場関連領域（ＳＡＲ）特異的二分ＤＮＡ結合ドメインを含有することが記載されており、更に、大型リボヌクレオタンパク質複合体へのｈｎＲＮＡのパッケージングに関与すると考えられる。アポトーシスの際には、このタンパク質はカスパーゼ依存的に切断され、切断はＳＡＬＤ部位において生じ、その結果、ＤＮＡ結合活性の損失及び核構造部位からのこのタンパク質の同時脱離をもたらす。しかし、この切断は、ＲＮＡ代謝におけるコードタンパク質の機能に影響を与えない。
【００９２】
組み換えＨＩＶ−１ゲノムによる感染に対して抵抗性を誘発するクローンのヒトｃＤＮＡライブラリーからの選択は、ＨＩＶ制限活性を持つ遺伝子フラグメントの同定をもたらした。活性ｃＤＮＡは、ｈｎＲＮＰＵのＮ末端フラグメントをコードする。遺伝子フラグメントは、ウイルスｍＲＮＡの３′ＬＴＲを標的にして、ＨＩＶ  ｍＲＮＡの細胞質蓄積を阻止する（バレンテ（Valente）及びゴフ（Goff）、分子細胞（Mol Cell）２３（２００６）、５９７〜６０５を参照すること）。異なるヘテロ核リボヌクレオタンパク質が、ｃＤＮＡスクリーニングによりＨＩＶ感染のエンハンサーとして同定されている（グエン（Nguyen）ら、ウイルス学（Virology）３６２（２００７）、１６〜２５を参照すること）。
【００９３】
したがって、本発明によりＨＮＲＰＵ（配列番号１６）をＶｉｆ結合タンパク質として同定することにより、一般に、上記のタンパク質について考察したウイルス複製に関して、同じ利点及び選択肢がそれぞれ提供され、すなわち、ＶｉｆとＨＮＲＰＵの対応する相互作用を防止すると、ウイルスの宿主細胞の使用が阻止され、したがってＨＩＶ複製がそれぞれ妨害又は防止及び停止されるはずである。更に、理論に束縛されることを意図するものではないが、宿主ＲＮＡとの複合体形成、並びにＲＮＡ代謝及び輸送それぞれにおけるＨＮＲＰＵの「通常」の関与は、ＶｉｆとＨＮＲＰＵの相互作用を防止すると、宿主のみの支配下に置かれ、ＨＩＶにより悪用される危険性がなくなるはずである。
【００９４】
・ミオシン制御軽鎖ＭＲＣＬ（異名：ＭＬＣＢ、ＭＲＬＣ３）、受入番号ＮＭ＿００６４７１。
ＨＩＶタンパク質と宿主細胞細胞骨格構成要素との相互作用は、効率的なウイルス複製にとって大きな重要性がある。ウイルス侵入、細胞内運搬、出芽及びウイルス放出におけるアクチン及び微小管の特定の機能が実験的に実証されている。加えて、細胞骨格の調節も、ＨＩＶ誘発アポトーシスにとって重要であると考えられる。ウイルスタンパク質のＴａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｒ及びＮｅｆは、細胞骨格再構築の決定因子として同定されている（ファクラー（Fackler）及びクロイスリッヒ（Krausslich）、微生物学の最新見解（Curr. Opinion Microbiol.）９（２００６）、４０９〜４１５；マタレーセ（Matarrese）及びマロリーニ（Malorni）、細胞死及び分化（Cell Death Differ.）１２（２００５）、９３２〜９４１を参照すること）。
【００９５】
更に、ＨＩＶアクセサリータンパク質Ｖｉｆの細胞骨格会合が実証され、共焦点顕微鏡検査法によって確認することにより、中間体フィラメントのビメンチン及びケラチンの近接した局在下を明らかになった（カルチェウスキー（Karczewski）及びストレベル（Strebel）、ウイルス学ジャーナル（J. Virol.）７０（１９９６）、４９４〜５０７を参照すること）。細胞骨格Ｖｉｆは、可溶性細胞質ゾルＶｉｆよりもプロテアソーム分解に対して安定していることが見出された（フジタ（Fujita）ら、微生物及び感染（Microbes and Infection）６（２００４）、７９１〜７９８を参照すること）。Ｖｉｆによるビメンチン及びプレクチン凝集の誘発が異なる細胞で観察された（ヘンツラー（Henzler）ら、一般ウイルス学ジャーナル（J. Gen. Virology）８２（２００１）、５６１〜５７３を参照すること）。
【００９６】
加えて、ミオシンＩＩは、感染細胞からのＨＩＶ−１ビリオンの放出において重要な役割を果たすことが示されており、ミオシン軽鎖キナーゼの化学インヒビターは、ササキ（Sasaki）ら、ＰＮＡＳ  ９２（１９９５）、２０２６〜２０３０において、ＨＩＶ−１の放出を阻止することが示されている。ＭＬＣリン酸化の阻害は、チャオ（Zhao）ら：http://medschool.slu.edu/imv/index. phtml?page=zhao&cat = directoryにおいて観察され、ＭＬＣとＶｐｒとの直接相互作用に関連付けられた。しかし、ＨＩＶ  Ｖｉｆ及びＭＲＣＬを含有するタンパク質複合体が、記載されたことは未だにない。
【００９７】
したがって、ＭＲＣＬ（ＭＲＣＬ３：配列番号１７）をＶｉｆの直接的な標的として同定することにより、それ及びＶｉｆとの対応する複合体が、ウイルスが宿主タンパク質、酵素及び因子それぞれを使用して生活環を経過するのを停止させることが意図される治療手法において、適切な標的になる。特に、Ｖｉｆと細胞骨格構成要素ＭＲＣＬとの相互作用が宿主細胞骨格のウイルス修飾を可能にしうるので、ＭＲＣＬとＶｉｆとの複合体形成を防止することは、まるでＨＩＶ感染がないかのように、骨格構造の構成を宿主の制御下にそれぞれ維持及び再指示するはずである。
【００９８】
・血清学的に定義された結腸癌抗原１（ＳＤＣＣＡＧ１）（異名：ＮＹ−ＣＯ−１、ＦＬＪ１００５１）、受入番号ＮＭ＿００４７１３は、腫瘍サプレッサータンパク質として同定された。ＳＤＣＣＡＧ１を誘発することにより細胞周期停止が癌細胞株に生じた（カルボネレ（Carbonnelle）ら、国際癌ジャーナル（Int. J. Cancer）９２（２００１）、３８８〜３９７を参照すること）。加えて、ＳＤＣＣＡＧ１が核外移行のメディエーターであることが、ビー（Bi）ら、腫瘍遺伝子（Oncogene）２４（２００５）、８２２９〜８２３９において示された。しかし、ＨＩＶ病因の疾患関連機能は、報告されていない。
【００９９】
このような状況において、ＳＤＣＣＡＧ１（それぞれ配列番号１８及び１９）をＶｉｆの直接的な相互作用パートナーとして同定することにより、対応する相互作用を防止又は破壊してウイルスが宿主細胞機構を利用するのを中断するため、それを標的にすること又はＶｉｆとの対応する複合体を標的にすることが可能になる。更に、理論に束縛されることを意図するものではないが、腫瘍の抑制及び核外移行それぞれにおけるＳＤＣＣＡＧ１の「通常」の関与は、宿主のみの支配下に置かれ、ＨＩＶにより悪用される危険性がなくなるはずである。したがって、ＳＤＣＡＧ１をＶｉｆ結合タンパク質として決定することは、新たな抗ＨＩＶ及び抗ＡＩＤＳのそれぞれの戦略に更なる選択肢を提供する。
【０１００】
・プロスタグランジンＥシンターゼ３（ＰＴＧＥＳ３）（異名：Ｐ２３、ＴＥＢＰ）、受入番号ＮＭ＿００６６０１。
プロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）は、有効なｃＡＭＰ上昇脂質メディエーターであり、幾つかの免疫調節効果を有している。ＰＧＥ2の血清レベルは、ＨＩＶ感染の際に有意に増加することが示されている（デレマール（Delemarre）ら、エイズ（AIDS）９（１１９５）、４４１〜４４５；フォレイ（Foley）ら、免疫学（Immunol.）７５（１９９２）、３９１〜３９７を参照すること）。細胞研究において、ＰＧＥ2は、ＨＩＶ複製を増強することが実証された（クノ（Kuno）ら、ＰＮＡＳ  ８３（１９８６）、３４８７〜３４９０；リマ（Lima）ら、ＩＡＳ会議ＨＩＶ病因、治療２００５：要約ＷｅＰｅ８．６Ｂ０４（２００５）（IAS Conf HIV Pathog. Treat 2005: abstract No. WePe8.6B04 (2005)）を参照すること）。これに関連して、ヒトＣＤ８＋Ｔリンパ球における機能性阻害ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡレセプターのＰＧＥ2誘発発現が、ゼッドウ（Zeddou）ら、生化学的薬理学（Biochemical Pharmacology）７０（２００５）、７１４〜７２４において観察されている。更に、ＰＧＥ2産生は、ＨＩＶコアタンパク質ｐ２４の保存配列モチーフから誘導されるペプチドにより刺激されることが示されている（ジャコミニ（Giacomini）ら、免疫学スカンジナビアジャーナル（Scand. J. Immunol.）４８（１９９８）２４８〜２５３を参照すること）。
【０１０１】
このような状況において、本発明によりＰＴＧＥＳ３（配列番号２０）をＶｉｆ結合タンパク質として同定することにより、それが又はＶｉｆとの対応する複合体が、前記相互作用を防止又は破壊するのに適した標的になる。特に、理論に束縛されることを意図するものではないが、ＶｉｆとＰＴＧＥＳとの直接的な相互作用によりＨＩＶ病因の際に免疫調節効果の調節が想定されるので、ＨＩＶ感染の間の免疫調節効果の前記調節は、相互作用の対応する禁止により防止されるはずであり、むしろ免疫系の調節は、健康な生物のように、宿主の制御下となるはずである。
【０１０２】
・熱ショックタンパク質：ＨＳＰＡ１、ＨＳＰＡ５、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰＢ（異名：ＨＳＰ７２、ＨＳＰ７０−１）受入番号ＨＳＰＡ１：ＮＭ＿００５３４５、（異名：ＢＩＰ、ＭＩＦ２、ＧＲＰ７８）受入番号ＨＳＰＡ５：ＮＭ＿００５３４７、（異名：ＬＡＰ１、ＨＳＣ５４、ＨＳＣ７０、ＨＳＣ７１、ＨＳＰ７１、ＨＳＰ７３、ＨＳＰＡ１０  ＭＧＣ２９９２９）受入番号ＨＳＰＡ８：ＮＭ＿００６５９７、ＮＭ１５３２０１、（異名：ＨＳＰ９０Ｂ、ＨＳＰＣ２、Ｄ６Ｓ１８２）受入番号ＨＳＰＢ：ＮＭ＿００７３５５。
熱ショックタンパク質は、細胞において分子シャペロンとして作用する高度に進化的保存されたタンパク質である。分子機能は、タンパク質折り畳み、輸送及び構築に関連している。ＨＳＰも、タンパク質の凝集及び分解の防止に関与している。更に、ＨＳＰの生合成は、熱ばかりでなく、酸化ストレス、重金属の影響、細菌及びウイルス感染を含む他の細胞ストレスによっても誘発されることが示された。
【０１０３】
熱ショックタンパク質は、ブレナー（Brenner）及びワインベルグ（Wainberg）、生物学的治療における専門家の意見（Exp. Opin. Biol. Ther.）１（２００１）、１４７１〜２５９８において、ＨＩＶ感染の治療の新規治療ツールとして既に認識されている。しかし、ＨＩＶ疾患の病因におけるＨＳＰの役割は部分的にしか理解されていない。ＣＤ４＋リンパ球細胞株を使用したインビトロ研究、並びにＨＩＶ感染者のリンパ球の分析は、ＨＩＶ感染が熱ショックタンパク質の合成の増加を誘発したことを示した（ワインベルグ（Wainberg）ら、ウイルス学（Virology）２３３（１９９７）、３６４〜３７３：アグニュー（Agnew）ら、エイズ（AIDS）１７（２００３）、１９８５〜１９８８；フュースト（Fust）ら、分子免疫学（Mol. Immunol.）４２（２００５）、７９〜８５を参照すること）。加えて、感染の後期に誘発されたＨｓｐ７０は、細胞をアポトーシスから保護することが示された（モッサー（Mosser）ら、分子細胞生物学（Mol. Cell Biol.）１７（１９９７）、５２１７〜５２３７を参照すること）。
【０１０４】
異なるＨＩＶタンパク質と熱ショックタンパク質との相互作用は、既に観察されており、例えば、ＮｅｆとＨｓｐ４０の相互作用は、感染細胞の核へのＨｓｐ４０の転位の増加のために重要であることが示された（クマール（Kumar）ら、生物化学ジャーナル（J. Biol. Chem.）２８０（２００５）、４００１４〜４００５０を参照すること）。加えて、異なる熱ショックタンパク質へのビリオンの組み込みが、グラー（Gurer）ら、ウイルス学ジャーナル（J. Virol.）７６（２００２）、４６６６〜４６７０において実証された。このような状況において、Ｇａｇ相互作用は、Ｈｓｐ７０のビリオン組み込みに決定的に関与している。ＨＥＣＴ−ＲＣＣ１ポリペプチドとＨＩＶ  ｇａｇ及び熱ショックタンパク質とのタンパク質複合体、並びにＨＩＶ治療におけるこれらの複合体のモジュレーターとしての使用は、国際出願ＷＯ０２／０９０５４９に記載された。しかし、熱ショックタンパク質とのＶｉｆ複合体は、以前に記載されたことはない。
【０１０５】
したがって、本発明の方法によりＨＳＰ（ＨＳＰ９０：配列番号２１；ＨＳＰＡ１：それぞれ配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７及び２８；ＨＳＰＡ５：それぞれ配列番号２９、３０及び３１；ＨＳＰＡ８：それぞれ配列番号３２、３３及び３４；ＨＳＰＨ１：配列番号３５）をＶｉｆの直接的な相互作用パートナーとして同定することにより、一般に、新規抗ＨＩＶ及び抗ＡＩＤＳ戦略それぞれの開発のために、上記に参照したタンパク質について既に考察したものと同様の選択肢が提供される。特に、ＶｉｆとＨＳＰとの相互作用を防止することによって、ウイルスタンパク質を折り畳むためのＨＩＶによる宿主の分子「シャペロン」機構の使用（悪用）（ウイルス構築又はウイルス複合体の形成）は、防止されるはずであり、それによりウイルス複製周期が妨害されるはずである。更に、相互作用を防止することにより、宿主ＨＳＰに結合するためのＶｉｆと宿主との競合が禁止され、最終的に十分なプールのＨＳＰが宿主の支配下に維持されることが確実になる。
【０１０６】
・寒冷ショックドメイン含有タンパク質Ｅ（ＣＳＤＥ１）、受入番号ＮＭ＿００１００７５５３、異名：ＵＮＲタンパク質、Ｎ−ｒａｓ上流遺伝子タンパク質は、約７０個のアミノ酸から構成され、かつ核酸結合モチーフＲＮＰ１及びＲＮＰ２を含有する、高度に保存された寒冷ショックドメイン（ＣＳＤ）を含有するＲＮＡ相互作用タンパク質である。このタンパク質は、ヒトライノウイルス及びポリオウイルスＲＮＡの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）仲介翻訳開始に関与する（ハント（Hunt）ら、遺伝子開発（Genes Dev）１５（１９９９）、４３７：ボウサディア（Boussadia）ら、ウイルス学ジャーナル（J Virol.）７７（２００３）、３３５３〜３３５９を参照すること）。これは、ｍＣＲＤ結合及びＰＡＢＰ相互作用タンパク質であることが見出され、主要な細胞質ポリ（Ａ）結合タンパク質であるＰＡＢＰとのＲＮＡ非依存性相互作用が、チャン（Chang）ら、遺伝子開発（Genes Dev）１８（２００４）、２０１０において実証された。しかし、ＨＩＶのタンパク質との複合体は、以前に記載されたことはない。
【０１０７】
したがって、ＣＳＤＥ１（配列番号３６）をＶｉｆの直接的な標的として同定することにより、前述したタンパク質に関して既に考察したものと同様の選択肢が提供され、例えば、それぞれ、ウイルスが宿主の「資源」を利用することが中断され、ウイルス生活環が妨害され、例としてはＶｉｆとＣＳＤＥ１との対応する複合体形成が防止される。特に、宿主ＣＳＤＥ１への結合のためのＶｉｆと宿主との競合が防止され、それにより十分なプールのＣＳＤＥ１が宿主の支配下に維持され、したがって、まるでＨＩＶ感染がないかのように、宿主のｍＲＮＡ代謝回転が確実になる。
【０１０８】
本発明の更なる標的は、ヒトＲＮＡ結合モチーフタンパク質３９、受入番号ＮＭ１８４２３４．１である、ＲＢＭ３９である。このステロイド核レセプターの転写補助因子は、プレｍＲＮＡスプライシングプロセスに関与する。この標的も、ＨＩＶ薬剤の開発を可能にする。配列番号４１は、Ｖｉｆ結合モチーフ〔アミノ酸１９５〜５３０〕を有することが部分的に同定されているタンパク質を開示する。
【０１０９】
本発明の標的は、ＫＩＡＡ１４２９（受入番号ＮＭ０１５４９６．３）である。このタンパク質（配列番号４２）は、ｍＲＮＡスプライシングに関与していると考えられている。配列番号４２は、アミノ酸１３６０〜１７５３を開示する。
ＨＩＶ遺伝子発現は、ウイルス転写、選択的スプライシング、核細胞質間輸送及び翻訳の間の複雑な相互作用に関与し、これは多くの場合に内在性ウイルス調節配列及びウイルスタンパク質により調節される。ＨＩＶタンパク質のＴａｔにより増強された転写は、３０個の異なるウイルスｍＲＮＡの合成をもたらす。これらのウイルス転写物は、約９kbのゲノムＲＮＡ、約４kbの単独スプライスｍＲＮＡ及び２kbの多重スプライスｍＲＮＡを含む。これらは、単独完全長転写物の選択的スプライシングにより誘導され、共通の５′及び３′末端を有するｍＲＮＡを生じ、これは３′末端においてポリアデニル化されている。単独にスプライスされた及びスプライスされていないウイルスｍＲＮＡは、両方とも、ウイルスタンパク質Ｒｅｖの結合によりイントロン含有ｍＲＮＡの輸出を促進する、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答配列）を含有する。細胞質へイントロン含有ｍＲＮＡが輸送されることにより、ウイルスｍＲＮＡが翻訳され、後に成熟ビリオンへパッケージングされうることが確実になる。異なるウイルス機構が、宿主ｍＲＮＡスプライシングの特異的阻害を含む宿主ｍＲＮＡレベルの下方制御おいて知られている。したがって、ＨＩＶ−Ｖｉｆと、ｍＲＮＡ及びプレｍＲＮＡスプライシングプロセスに関与するタンパク質との相互作用は、ヒト細胞におけるウイルス複製に介入する新規手法を提供する。
【０１１０】
ペプチド／タンパク質ＣＵＬ４Ａは、本発明の更なる標的である（ヒトカリン４Ａ（ＣＵＬ４Ａ）、転写物変種２、受入番号ＮＭ＿００３５８９．２）。本明細書において配列番号４３として開示されている。この配列は、アミノ酸４９８〜６５９を包含する。
Ｃｕｌ４Ａは、標的タンパク質のユビキチン化、続くプロテアソーム分解を仲介する、多重カリンＲＩＮＧに基づいたＥ３ユビキチン−タンパク質リガーゼ複合体のコア構成要素である。足場タンパク質として、このタンパク質は、基質及びユビキチン結合酵素を配置することにより触媒作用に寄与することができる。複合体のＥ３ユビキチン−タンパク質リガーゼ活性は、カリンサブユニットのｎｅｄｄ化に依存し、脱ｎｅｄｄ化カリンサブユニットとＴＩＰ１２０Ａ／ＣＡＮＤ１との会合により阻害される。Ｅ３ユビキチン−タンパク質リガーゼ複合体の機能的特異性は、多様な基質認識構成要素によって決まる。
【０１１１】
ＤＤＢ１−Ｃｕｌ４−ＲＯＣ１は、ＤＮＡ修復、ＤＮＡ複製及び転写を調節し、病原性ウイルスにより破壊されて、ウイルス感染に利することもありうる。ＨＩＶタンパク質Ｖｐｒは、ＤＤＢ１及びＣｕｌ４Ａを含有するユビキチンリガーゼ複合体と会合して、Ｇ2の細胞周期停止を仲介することが示された。
【０１１２】
ＲＡＧ２は、本発明の更なる標的である（ヒト組み換え活性化遺伝子２、受入番号ＮＭ０００５３６．２）。配列番号４４として開示されている。この配列は、アミノ酸１８２〜５２７を開示している。
リンパ球発生の際に、免疫グロブリン及びＴ細胞レセプターをコードしている遺伝子が、可変（Ｖ）、多様（Ｄ）及び連結（Ｊ）遺伝子セグメントから構築される。このＶ（Ｄ）Ｊの組み換えプロセスにより、限定された遺伝子情報供給源から途方もなく大きな範囲の結合特異性を生させることが可能になる。ＲＡＧ１／ＲＡＧ２複合体は、保存組み換えシグナル配列（ＲＲＳ）に結合すること及びＲＳＳシグナルと隣接するコード配列セグメントとの境界に二重鎖切断を導入することによって、このプロセスを開始させる。このプロセスは、平滑シグナル末端及び閉鎖ヘアピン構造を有するコード末端を生じる。これらのヘアピンは、構築された抗原レセプター遺伝子の形成をもたらす中間体である。ＲＡＧ２における欠損は、活性化されたアレルギー性及び少クローン性Ｔ細胞の存在により特徴決定される重篤な免疫不全を引き起こす。
Ｖｉｆと、Ｔ細胞発生の重要なレギュレーターであるＲＡＧ２との相互作用は、以前に記載されたことはない。したがって、本発明の方法によるＲＡＧ２の所見は、ＨＩＶの治療的介入に有用である潜在的な標的を提供する。
【０１１３】
ＣＣＴ５は、本発明の更なる標的である。（ＴＣＰ１、サブユニット５を含有するヒトシャペロン、受入番号ＮＭ０１２０７３．３）。この配列の配列番号４５は、アミノ酸１〜５４１を開示する。
ＣＣＴ５は、タンパク質の折り畳みを助ける細胞質ゾルシャペロンＣＣＴ環複合体のサブユニットである。折り畳まれていないポリペプチドが複合体の中心空洞に侵入し、ＡＴＰ依存性の様式で折り畳まれる。ＣＣＴ環複合体は、アクチン及びチューブリンの折り畳みにおいて役割を果たすことが知られている。ＨＩＶ感染細胞におけるＴＣＰ１タンパク質レベルの減少が示されている（ヒックマン（Hickman）ら、２００３）。 ＨＩＶインテグラーゼを含む異なるレトロウイルスタンパク質と、ＴＣＰ１複合体のサブユニットとの相互作用は、既に記載されている。したがって、ＣＣＴ５をＶｉｆ相互作用タンパク質として同定することにより、タンパク質折り畳みに関与する宿主細胞機構へのウイルスの利用を阻害するために、それを標的にすること又は対応するタンパク質複合体を標的にすることが可能になる。
【０１１４】
ＶＣＰは、本発明の更なる標的である（ヒトバロシン含有タンパク質、受入番号ＮＭ０７１２６．３）。異名は、移行型小胞体ＡＴＰアーゼ、ＴＥＲ  ＡＴＰアーゼ、１５Ｓ  Ｍｇ（２＋）−ＡＴＰアーゼｐ９７サブユニットである。配列番号４６は、アミノ酸２７４〜８０６を開示する。
タンパク質ＶＣＰは、有糸分裂の際のゴルジ層板の断片化、並びに有糸分裂後の再構築及び移行型小胞体の形成に関与する。小胞体からゴルジ体への膜の移動は、小胞体の部分的に粗く部分的に平滑な移行要素から誘導される５０〜７０nmの移行小胞を介して生じる。ｔＥＲからの小胞出芽は、ＡＴＰ依存性プロセスである。ＵＦＤ１Ｌ、ＶＣＰ及びＮＰＬＯＣ４を含有する三成分複合体は、ユビキチン化タンパク質に結合し、誤って折り畳まれたタンパク質の、ＥＲから細胞質への輸出に必要であり、そこでプロテアソームにより分解される。これに関連して、ＶＣＰは、また、免疫系の中心的レギュレーターの核因子κＢ（ＮＦκＢ）のインヒビターである、インヒビターκＢα（ＩκＢα）のユビキチン依存性プロテアソーム分解経路に関与すると考えられている。ＶＣＰにより形質移入された細胞株は、ＮＦκＢの定常的な活性化、リン酸化ＩκＢα（ｐ−ＩκＢα）の急速な分解及び腫瘍壊死因子アルファ刺激後アポトーシス率の減少を示す。
ＨＩＶは、ＣＤ４の下方制御に効率的な機構を発生して、感染性ビリオンを産生する。ＣＤ４の小胞体関連タンパク質分解（ＥＲＡＤ）は、ＨＩＶ−Ｖｐｕの結合により誘発される。Ｖｐｕはリン酸化されると、Ｅ３複合体ＳＣＦβTrCPの基質を模倣する。ＨＩＶに感染した細胞において、ＳＣＦβTrCPは、Ｖｐｕと相互作用し、ＣＤ４をユビキチン化し、続いてプロテアソームにより分解される。このプロセスは、また、ＶＣＰ／ｐ９７に依存性であると考えられている。
ＶＣＰは、ＥＲＡＤ及びタンパク質の輸送プロセスにおいて重要な役割を果たすことが示された。したがって、ＶＣＰを本発明の方法によりＶｉｆ相互作用タンパク質として同定することにより、新規抗ＨＩＶ治療戦略にとって更なる選択肢が提供される。
【０１１５】
ＰＤＩＡ３は、本発明の更なる標的である（ヒトタンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーＡ、メンバー３（ＰＤＩＡ３）、受入番号ＮＭ＿００５３１３．４）。異名は、ジスルフィドイソメラーゼＥＲ−６０、ＥＲｐ６０、５８ｋＤａミクロソームタンパク質、ｐ５８及びＥＲｐ５７である。配列番号４７は、アミノ酸３２２〜５０５を開示する。
ＥＲｐ５７は、オキシドレダクターゼのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーのメンバーであり、哺乳類細胞の小胞体における天然のジスルフィド結合形成に関与する。この酵素は、糖タンパク質特異的オキシドレダクターゼであると提案されている。異なる強ジスルフィド結合糖タンパク質が、インテグリン及びラミニンを含む基質として同定されている（ジェソップ（Jessop）ら、２００７）。２つのＥＲタンパク質カルネキシン及びカルレチキュリンと会合して、ＥＲｐ５７は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ装填複合体に不可欠な構成要素を形成する。この複合体は、ＣＤ８+Ｔリンパ球に表示するため、最適なペプチドをＭＨＣクラスＩ分子に装填するように機能する。
異なるウイルス免疫回避分子阻害クラスＩ抗原表示が、既に見出されている。単純ヘルペスウイルスのＩＣＰ４７タンパク質及びヒトサイトメガウイルス（ＨＣＭＶ）のＵＳ６タンパク質は、ペプチド装填複合体の重要な構成要素であるＴＡＰ（抗原プロセッシングと関連するトランスポーター）のインヒビターとして同定されている。他のウイルスタンパク質、例えばＨＣＭＶタンパク質ＵＳ３は、タパシンに結合して、クラスＩ分子によるペプチド獲得を促進するその能力を阻害する。ＶｉｆとＥＲｐ５７の相互作用は、以前に記載されたことはない。したがって、本発明は、ＥＲｐ５７及びＨＩＶ−Ｖｉｆとの対応するタンパク質複合体を、抗ＨＩＶ治療の新規標的として提供する。免疫反応におけるタンパク質の中心的な役割のため、複合体形成を阻害する化合物を、ウイルス感染及び疾患進行の阻害のために使用することができる。
【０１１６】
ＰＴＰＲＣは、本発明の更なる標的である（ヒトタンパク質チロシンホスファターゼ、レセプター型、Ｃ（ＰＴＰＲＣ）、転写変種３、受入番号ＮＭ＿０８０９２２．２）。配列番号４８は、アミノ酸７４３〜１２５６を開示する。異名は、白血球共通抗原、Ｌ−ＣＡ、Ｔ２００及びＣＤ４５抗原である。チロシンホスファターゼＣＤ４５は、多重リンパ球シグナル伝達経路の主要な正の構成要素であり、抗原レセプターを介したＴ細胞活性化に必要である。Ｔ細胞活性化の際に、脱リン酸化物ＳＫＡＰ１及びＦＹＮを動員する。ＨＩＶ−１疾患の異なる病期の患者からのリンパ球のＣＤ４５関連チロシンホスファターゼ活性は、疾患進行の間に低減したことを示した。対照的に、長期非進行型（ＬＴＮＰ）において、チロシンホスファターゼ活性は、有意に損なわれなかった。Ｔ細胞活性化の初期段階でオンになったＮＦＡＴ１転写因子の、ＣＤ４５による負の調節が、観察された。したがって、チロシンホスファターゼＣＤ４５をＶｉｆの相互作用物質として同定することにより、それ及びＶｉｆとの対応するタンパク質複合体が、ＨＩＶの治療的介入に適した標的となる。特に、リンパ球シグナル伝達及びＴ細胞活性化における中心的な機能のため、ウイルスタンパク質との複合体形成の防止は、ウイルス感染及び疾患進行を阻害することができる。
【０１１７】
ＣＡＢ３９は、本発明の標的である（ヒトカルシウム結合タンパク質３９（ＣＡＢ３９）、受入番号ＮＭ＿０１６２８９．２）。異名は、タンパク質Ｍｏ２５、ＣＧＩ−６６及びＦＬＪ２２６８２である。配列番号４９は、アミノ酸８０〜３４１を開示する。
ＳＴＥ２０関連アダプターアルファ（ＳＴＲＡＤアルファ）偽キナーゼと一緒に、このタンパク質は、ＬＫＢ１セリン／トレオニンタンパク質キナーゼの活性を刺激することができる調節複合体を形成する。ＬＫＢ１は、細胞繁殖及び極性の調節に関与している。ＬＫＢ１は、腫瘍サプレッサーとして機能すると考えられている。ＣＡＢ３９とウイルス又はレトロウイルスタンパク質との相互作用は、以前に記載されたことはない。ＣＡＢ３９をＶｉｆの相互作用物質として同定することにより、新規抗ＨＩＶ治療の開発に更に適した標的が提供されると考えられる。
【０１１８】
ＰＲＭ１Ｂは、本発明の標的である（ヒトタンパク質ホスファターゼ１Ｂ（旧２Ｃ）、受入番号ＮＭ＿００２７０６．４）。異名は、タンパク質ホスファターゼ２Ｃアイソフォームベータ及びＰＰ２Ｃベータである。配列番号５０は、アミノ酸２５８〜４７９を開示する。この遺伝子でコードされたタンパク質は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質ホスファターゼのＰＰ２Ｃファミリーのメンバーである。ＰＰ２Ｃファミリーメンバーは、細胞ストレス反応経路の負のレギュレーターであることが知られている。このホスファターゼは、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＫＤ）を脱リン酸化することが示されており、したがって、細胞周期制御に関与しているかもしれない。このホスファターゼの過剰発現は、細胞増殖停止又は細胞死を引き起こすことが報告されている。ＰＰＭ１Ｂは、ＩＫＢキナーゼ複合体と関連していることが示され、したがって、ＮＦ−ＫＢ活性の調節に関与すると考えられている。ＰＰＭ１ＢとＨＩＶタンパク質との相互作用は、以前に記載されたことはない。この細胞ストレス反応のレギュレーターのＶｉｆ相互作用タンパク質としての同定は、新規治療化合物の開発に使用することができる。
【０１１９】
ＲＡＢ４Ａは、本発明の標的である（ヒトＲＡＢ４Ａ、ＲＡＳ腫瘍遺伝子ファミリーのメンバー（ＲＡＢ４Ａ）、ｍＲＮＡ、受入番号ＮＭ＿００４５７８．２）。配列番号５１は、アミノ酸１１５〜２１８を開示する。
ＲＡＢ２１は、本発明の更なる標的である（ヒトＲＡＢ２１、ＲＡＳ腫瘍遺伝子ファミリーのメンバー（ＲＡＢ２１）、受入番号ＮＭ＿０１４９９９）。配列番号５２は、アミノ酸９５〜２２５を開示する。
Ｒａｂ遺伝子は、分泌及びエンドサイトーシス経路内で輸送小胞の標的化及び融合を調節するｒａｓスーパーファミリー内の小型ＧＴＰ結合タンパク質のサブグループを、コードする。ＨＩＶを含む異なるウイルスは、エンドサイトーシス／運搬機構の多様な要素を使用して宿主細胞の中に入り、感染を成功させる。
したがって、Ｖｉｆと、タンパク質輸送及び運搬に関与する宿主タンパク質との相互作用は、新規抗ウイルス治療戦略の開発に新たな可能性を提供する。
【０１２０】
ＥＬＦ４Ａが特に好ましい。次の標的も同様に極めて好ましい：ＣＣＴ５、ＣＵＬ４Ａ、ＨＳＰ９０、ＨＳＰＡ１、ＨＳＰＡ５、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰＨ１、ＲＡＢ４Ａ、ＲＡＢ２１、ＲＡＧ２、ＰＤＩＡ３、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＲＣ、ＴＰＴ１及びＶＣＰ。
【０１２１】
本発明は、レトロウイルス科のファミリーからのウイルス感染因子タンパク質（Ｖｉｆ）又は、その約１２個を超えるアミノ酸のペプチドフラグメントと、ＥｌＦ４Ａ２タンパク質又はその約１２個を超えるアミノ酸のペプチドフラグメントとを含む組成物に関し、ここでタンパク質又はペプチドフラグメントは、互いに結合することができる。ペプチドも１２個のアミノ酸を有していることができる。好ましくは、ペプチドは、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、２０個のアミノ酸、２１個のアミノ酸、２２個のアミノ酸、２３個のアミノ酸及び２４個のアミノ酸よりも長い。理想的には、ペプチドは、タンパク質自体の完全長よりも短い。何を意味するかの例としては、組成物におけるタンパク質ＥｌＦ４Ａ２は、１２個以上の長さのアミノ酸であることができるが、その最長は、タンパク質の既知の完全長に対応する。
【０１２２】
好ましくは、このウイルス感染因子タンパク質（Ｖｉｆ）は、ＨＩＶからのものである。より好ましくは、ＥｌＦ４Ａ２に結合することができる、配列番号２の配列である若しくは配列番号１の配列でコードされているウイルス感染因子タンパク質（Ｖｉｆ）、又はそのペプチドフラグメントである。
本発明の組成物の一つの実施態様において、２つのタンパク質又はペプチドが複合体の中にある。
【０１２３】
本発明は、請求項４の複合体に特異的に結合する、或いは対応するＨＩＶタンパク質及び／又はヒトタンパク質又はペプチドそれぞれの結合ドメインに特異的に結合する抗体に関する。
【０１２４】
本発明は、複合体形成及び／又は複合体安定性を調節することができる化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）試験化合物を（ｉ）本明細書上記に概説された組成物及び／又は（ｉｉ）本明細書上記に概説された複合体に付す工程、（ｂ）複合体形成及び／又は複合体安定性における変化をモニタリングする工程、（ｃ）（ｉ）のタンパク質の複合体形成を変える及び／又は（ｉｉ）の安定性を変える能力に基づいて、化合物が、対照と比較して複合体形成及び／又は安定性を調節できるかを決定する工程を含む方法に関する。
【０１２５】
本発明は、ＶＩＦ及びＥＩＦ４Ａ２の複合体形成及び／又は複合体安定性を調節することができる化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）試験化合物を、ＥＩＦ４Ａ２タンパク質又は配列番号９でコードされているタンパク質又はそれらのフラグメントを含む組成物に付す工程、（ｂ）ＥＩＦ４Ａ２タンパク質又は配列番号９でコードされているタンパク質又はそれらのフラグメントに結合することができる化合物を同定する工程、（ｃ）工程（ｂ）の同定された候補化合物を、（ｉ）本発明の組成物及び／又は（ｉｉ）上記に概説された複合体に付す工程、（ｂ）複合体形成及び／又は複合体安定性における変化をモニタリングする工程、（ｃ）（ｉ）のタンパク質の複合体形成を変える及び／又は（ｉｉ）の安定性を変える能力に基づいて、化合物が、対照と比較して複合体形成及び／又は安定性を調節できるかを決定する工程を含む方法に関する。この方法におけるＥＩＦ４Ａ２タンパク質は、完全長タンパク質であることもできる。
【０１２６】
本発明は、ＥＩＦ４Ａ２の配列（配列番号９）を有するタンパク質又はその小型ペプチドフラグメント若しくはその誘導体に関し、タンパク質、誘導体又はペプチドは、レトロウイルス科のファミリーのウイルス感染因子タンパク質（Ｖｉｆ）に結合することができる。好ましくは、前記タンパク質、誘導体又はペプチドは、ＨＩＶウイルス感染因子タンパク質（Ｖｉｆ）に結合することができる。
【０１２７】
本発明は、ＰＴＥＮ（配列番号４及び５）、ＨＥＲＣ４（配列番号６及び７）、Ｔｏｍ１Ｌ１（配列番号８）、ＥＩＦ４Ａ２（配列番号９）、ＴＣＴＰ（ＴＰＴ１：配列番号１０、１１、１２及び１３）、ＮＵＰ５０（配列番号１４）、ＣＴＣＦ（配列番号１５）、ｈｎＲＰＵ（配列番号１６）、ＭＲＣＬ（ＭＲＣＬ３：配列番号１７）、ＳＤＣＣＡＧ１（配列番号１８及び１９）、ＰＴＧＥＳ３（配列番号２０）、ＨＳＰｓ（ＨＳＰ９０：配列番号２１；ＨＳＰＡ１：配列番号：２２、２３、２４、２５、２６、２７及び２８；ＨＳＰＡ５：配列番号：２９、３０及び３１；ＨＳＰＡ８：配列番号：３２、３３及び３４；ＨＳＰＨ１：配列番号：３５）、ＣＳＤＥ１（配列番号３６）、ＫＩＡ１４２９（配列番号４２）、ＣＵＬ４Ａ（配列番号４３）、ＲＡＧ２（配列番号４４）、ＣＣＴ５（配列番号４５）、ＶＣＰ（配列番号４６）、ＰＤＩＡ３（配列番号４７）、ＰＴＰＲＣ（配列番号４８）、ＣＡＢ３９（配列番号４９）、ＰＰＭ１Ｂ（配列番号５０）、ＲＡＢ４Ａ（配列番号５１）、ＲＡＢ２１（配列番号５２）からなる群より選択される配列を有するタンパク質又はこれらのいずれかのフラグメント若しくは誘導体に関し、ここでタンパク質又はペプチドは、Ｖｉｆに結合することができる。
【０１２８】
本発明は、本発明の組成物及び／又は本発明の抗体及び／又は本発明のタンパク質を含むキット又はアッセイ系に関する。
【０１２９】
本発明の方法を使用して同定される上記に参照されたＶｉｆ結合タンパク質は、Ｖｉｆの直接的な標的として以前に記載されたことはなく、したがって、特に本発明の主題である。
【０１３０】
上記に既に記載されているように、Ｖｉｆは、ウイルス因子を宿主因子に連結する「アダプター」として作用すると考えられ、相互作用すると、宿主の幾つかの細胞機能が、中断、再プログラム又はウイルスの目的に悪用され、Ｖｉｆのこれらの異なる機能は、Ｖｉｆと異なる宿主タンパク質との結合によって実施される。したがって、Ｖｉｆは、相互作用するタンパク質に応じて、幾つかの異なる効果を発揮する。上記に記載されているように、そして理論に束縛されることを意図するものではないが、Ｖｉｆは、ＰＴＥＮ又はＴＣＴＰに結合したときは、アポトーシスに影響を与え、ＴＯＭ１Ｌ１と結合したときは、タンパク質ソーティング及び分解を修飾し、Ｎｕｐ５０と複合体を形成する場合は、宿主の核細胞質間輸送機構に影響を及ぼし、また、ＭＲＬＣに結合したときは、細胞骨格の組織に影響を及ぼす。更に、Ｖｉｆは、例えばＥＩＦ４Ａ２又はＣＴＣＦに結合する場合、宿主と競合して、それにより宿主から開始因子又は転写因子を取り除くと想定される。加えて、Ｖｉｆは、ＰＴＧＥＳと複合体を形成する場合、宿主の免疫調節に影響を与えると考えられ、ＨＳＰに結合する場合、宿主の「タンパク質折り畳み」機構を悪用し、また、例えばＨＥＲＣ  Ｅ３に結合して、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇを脱活性化することが更に想定される。
【０１３１】
しかし、既に個別のタンパク質についてそれぞれ考察されているように、これらのＶｉｆの効果は、本発明の方法により同定される、今まで記載されたことがなく知られていなかった新たな種類のＶｉｆ結合タンパク質の知識に基づいた新規戦略を開発することによって防止されると考えられる。上記に既に記述されているように、新規抗ＨＩＶ戦略の一つの例は、同定されたタンパク質若しくはその模倣体を供給すること、又は対応する同定されたタンパク質の発現に影響を及ぼすことができる若しくは同定された宿主タンパク質とＶｉｆとの対応する複合体に影響を与える（それを防止する又は破壊する）ことができる化合物を投与することを含む。しかし、Ｖｉｆと同定された（ヒト）宿主タンパク質又は個別のタンパク質との相互作用を調節する幾つかの様式が存在しうる。したがって、Ｖｉｆの新たに同定されたこれらの結合パートナーは、治療的介入及び薬理学的調節それぞれにとっての新規標的を表す。
【０１３２】
更に、本発明の方法によりＶｉｆの標的として同定されたタンパク質に加えて、Ｖｉｆと宿主タンパク質の複合体を、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの分野において分析、治療又は診断用途に使用することもできる。特に、Ｖｉｆと、本発明の方法により同定された宿主タンパク質との複合体、好ましくはＶｉｆと上記参照タンパク質との複合体も、新規抗ＨＩＶ／抗ＡＩＤＳ戦略の対応する分析又は開発のために適した標的を提供する。しかし、本発明による複合体は、完全長タンパク質のみならず、標的及び宿主タンパク質のフラグメント、また、その相同体又は誘導体も含む。このような状況において、本発明による複合体は、対応する複合体相互作用を形成することができる限り、標的及び／又は宿主タンパク質の任意のフラグメント又は最少部分を含むことができることが理解される。本発明のタンパク質−タンパク質複合体を、例えば、ＨＩＶ疾患の発生を診断するために使用することができ、その実施においては、それをタンパク質マイクロチップ又はマイクロアレイに組み込むことができる。
【０１３３】
したがって、更なる態様において、本発明は、ＨＩＶタンパク質、好ましくはＶｉｆのようなアクセサリーＨＩＶタンパク質及び前述したように同定される又は本発明の方法により得られる核酸分子によりコードされたタンパク質を含む複合体を提供する。
【０１３４】
本発明は、また、本明細書に開示されている組成物又は複合体の産生のための、本明細書において同定される新規標的をコードする核酸の使用に関する。
【０１３５】
更に、概して本発明により同定されるタンパク質に対応するが、Ｖｉｆと複合体を形成することがもはやできないタンパク質が望ましい場合がある。これらのタンパク質は、例えば置換、欠失又は付加により、例えば同定されたタンパク質のアミノ酸配列を調節することによって達成することができ、これらの調節、また影響を与える方法も、当業者に知られている。特に、これらのタンパク質は、結合領域及びＶｉｆへの結合に必須のアミノ酸それぞれを決定するような分析目的に有用であると考慮されうる。しかし、例えば、一方では「通常の健康な機能」を発揮することができるが、他方ではＶｉｆに結合することができず、それによりウイルスが細胞を利用するのを拒み、通常の細胞機能を維持する、対応するタンパク質を設計及び使用することが考えられる幾つかの目的が存在する。したがって、別の実施態様において、本発明は、本発明により同定される核酸分子によりコードされるタンパク質から、アミノ酸置換、欠失及び／又は付加によって誘導され、上記において特徴付けられた複合体を形成することがもはやできないタンパク質に関する。
【０１３６】
なお更に提供されるものは、上記において特徴付けられた複合体に、又は対応するＨＩＶタンパク質及びヒトタンパク質それぞれの結合ドメインに、又は本発明の核酸分子によりコードされたタンパク質から誘導されるが、アミノ酸配列変更によりもはや対応する複合体を形成することができない上記に参照されたタンパク質に、特異的に結合する抗体である。
【０１３７】
本発明に有用である適切な抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であり、また合成抗体、並びにＦａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦｖフラグメントなどのような抗体のフラグメントである。抗体又はそのフラグメントは、例えば、ハーロー（Harlow）及びレーン（Land）「抗体、実験室マニュアル」（"Antibodies, A Laboratory Manual"）、ＣＨＳプレス、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）１９８８年又は欧州特許出願ＥＰ−Ａ０４５１２１６及びそれに引用されている参考文献に記載されている方法を使用して得ることができる。キメラ抗体の産生は、例えば国際出願ＷＯ８９／０９６２２に記載されており、特にヒト化抗体の産生方法は、例えばＥＰ−Ａ１０２３９４００及びＷＯ９０／０７８６１に記載されている。本発明により利用される抗体の更なる供給源は、いわゆる異種抗体である。マウスにおけるヒト抗体のような異種抗体を産生する一般的な原理は、例えば国際出願ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６及びＷＯ９６／３３７３５に記載されている。
【０１３８】
本発明の一つの大きな要旨は、ＶｉｆのようなＨＩＶ関連タンパク質と相互作用することができる、宿主タンパク質、好ましくはヒトタンパク質を同定することである。しかし、いったん宿主タンパク質が、本発明の方法によりＶｉｆに結合することが同定されると、このことは、ウイルス生活環と結びつく新たな接触点を更に提供する。ＨＩＶウイルスは、その生活環及び増殖それぞれを維持するために、宿主の細胞機構に強く依存し、更にＶｉｆは、とりわけ、宿主の細胞「資源」へのウイルスの利用をもたらすための「機能」を有する「アダプター」であると考えられるので、このウイルスと宿主の相互作用を邪魔することは、ウイルス複製、感染進行及びＡＩＤ発症それぞれを停止させる有望な治療ツールであると考えられる。したがって、本発明の方法により同定され、今までＶｉｆと結合することが知られていなかった新規Ｖｉｆ結合タンパク質の知識は、Ｖｉｆ、Ｖｉｆ結合タンパク質又はそれらの相互作用に影響を与えることができる適切な化合物をスクリーニングすることを可能にする。
【０１３９】
したがって、本発明の方法によるＶｉｆ相互作用タンパク質の同定の他に、宿主タンパク質とＶｉｆの相互作用に影響を与える、好ましくは前記相互作用を阻害又は妨害できる化合物を、それぞれ同定及びスクリーニングすることが、本発明の別の要旨であった。対応する化合物を発見する一つの方法は、相互作用が生じ、Ｖｉｆそれ自体又は相互作用タンパク質が影響を受ける、例えば阻害される細胞を、化合物に、すなわち試験化合物に、上記に例示された効果を発揮する能力に関して暴露することを含むことができる。特に、試験化合物を、アッセイが実施される細胞に、ＨＩＶ標的タンパク質又はそのフラグメントと、宿主タンパク質のような推定される相互作用パートナーとの複合体形成の前、その間又はその後に付すことができる。化合物との接触による複合体形成及び／又は安定性における変化をモニタリングすることができ、試験化合物は、宿主タンパク質へのＶｉｆの結合を調節する能力によって選択され、好ましくは上記に記載された本発明の方法により同定されるタンパク質である。
【０１４０】
化合物の作用様式は異なることができ、すなわちＶｉｆそれ自体又は好ましくは本発明の方法により同定される宿主タンパク質と相互作用することができ、前記相互作用は、通常、対応する相互作用パートナーとの結合に関与するタンパク質結合部位で生じ、前記部位を阻止することができる。しかし、相互作用は、潜在的な相互作用分子との結合に通常は直接関与しない部位においても生じることができ、それにより例えばタンパク質の立体配座を変え、結合部位の消滅又は変更をもたらし、結果的に前述の相互作用を防止する。したがって、試験化合物は、競合的又はアロステリックインヒビターとして作用することができる。更に、本発明によると、「調節する」又は「影響を与える」は、相互作用の形成中に影響を与えることを意味するのみならず、既に形成された複合体にも作用する、すなわちそれらを破壊することも意味する。しかし、上記に既に記述されているように、前記宿主タンパク質／Ｖｉｆ相互作用が成功している場合では、ウイルスは、宿主の細胞機構への利用が邪魔されており、ウイルス感染及び拡散はそれぞれ防止されているか又は少なくとも高度に制限されているはずである。
【０１４１】
したがって、更なる実施態様において、本発明は、複合体形成及び／又は複合体安定性を調節することができる化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物を、
（ｉ）ＨＩＶ標的タンパク質及び上記で定義及び特徴決定されたヒトタンパク質、又は
（ｉｉ）本発明の複合体
に付す工程、
（ｂ）複合体形成及び／又は複合体安定性における変化をモニタリングする工程、並びに
（ｃ）（ｉ）のタンパク質の複合体形成を変える及び／又は（ｉｉ）の安定性を変える能力に基づいて、化合物が、対照と比較して複合体形成及び／又は安定性を調節できるかを決定する工程
を含む方法に関する。
【０１４２】
本方法は所望の効果及び特徴をそれぞれ有する新規化合物のスクリーニングに有用であるが、この方法は、実際の効能及び効果それぞれについて抗ウイルス特性を有すると思われる又は考えられる化合物又は薬剤のアッセイにも有用である。特に、本発明のタンパク質複合体を使用する本方法は、例えば国際出願ＷＯ０６／１１１８６６に記載されているＶｉｆ関連治療用ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド又は抗体の機能研究及び品質管理に使用することもできる。したがって、特定の実施態様において、本発明は、既知の抗ウイルス薬の効能分析について上記に参照された方法に関する。
【０１４３】
潜在的な調節化合物の不在下及び存在下で複合体形成、安定性及び複合体の結合定数それぞれを検出する当該技術において既知の幾つかの方法が存在し、等温熱量測定法、表面プラスモン共鳴分光法、蛍光技術及びＮＭＲ分光法のような方法が、対応する調査のためによく使用され、本発明において使用することもできるが、上記の方法の一つの欠点は、大規模な実験設定及び高価な装置の必要性である。したがって、本発明の好ましい実施態様において、複合体形成及び／又は安定性は、ＧＳＴプルダウン実験、続くＳＤＳゲル分析により試験され、それは実施例３において詳細に記載されている。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの実施は、当業者に既知であり、最新号の分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）（サムブルック（Sambrook）ら、（１９８９）分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press））のような関連教科書に十分に記載されている。既知の医薬化合物及び薬剤を実際の抗ウイルス効果について試験するには、一般に、標準的教科書「薬学的研究におけるインビトロ法」（"In vitro Methods in Pharmaceutical Research"）、アカデミックプレス（Academic Press）１９９７が参照される。
【０１４４】
本発明の方法によると、化合物又は化合物群は、化合物が添加されない対照と比較して、前記化合物又は化合物群の存在下でそれぞれ妨害及び減少されたとき、複合体の形成を調節できるかが評価される。当然のことながら、複合体安定性及び結合定数それぞれを試験するときにも同じことが当てはまり、化合物は、化合物が添加されない対照と比較して、前記化合物の存在下で安定性が弱められた（減少した）とき、複合体安定性を調節できるかが評価される。一般に、本発明によると、試験化合物を用いない方法による実施と比較した複合体形成又は複合体安定性の減少は、推定される有力な治療剤（薬）を示している。そのように同定された薬剤を任意の標準的アッセイに付して、ＨＩＶ生活環、すなわち、例えばウイルス複製及び増殖それぞれに対する効果を更に試験することができる。次に、好ましくはＨＩＶ感染により仲介される障害から救出する及び／又は障害に対して抵抗性を付与する薬剤を選択する。
【０１４５】
上記から、本発明は、Ｖｉｆ及びＨＩＶタンパク質との対応する複合体に結合する多数の新たに同定された宿主タンパク質を提供し、すなわちＨＩＶ生活環に介入することが予測され、したがってウイルス疾患、好ましくはＡＩＤＳのようなレンチウイルス疾患を改善する潜在的な療法として大変有望な化合物をスクリーニングするために実現性のある標的を提供する。本発明の化合物は、所望の効果を示す、すなわち、Ｖｉｆ、宿主タンパク質又はこれらの対応する相互作用に影響を与えることによりＶｉｆと宿主タンパク質との相互作用に介入することができる任意の物質を含むことができる。そのような化合物には、天然に生じるか又は合成的に調製される、ペプチド、ポリペプチド、ＰＮＡ、ペプチド模倣体、抗体、核酸分子、アプタマー又は小型有機化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４６】
いったん潜在的な化合物が同定されると、追加的に化学類似体を、メルク（Merck）、グラクソウエルカム（GlaxoWelcome）、ブリストールマイヤズースクイブ（Bristol Meyers Squib）、モンサント／サール（Monsanto/Searle）、エリリリー（Eli Lilly）、ノバルティス（Novartis）及びファーマシアアップジョン（Pharmacia UpJohn）を含むほとんどの大きな化学薬品会社から市販されている化学薬品のライブラリーから選択することができるか、あるいは新規に合成することができる。これらの潜在的な化合物の合成は、当業者には知られている。
【０１４７】
Ｖｉｆと（ヒト）宿主タンパク質のような相互作用分子との相互作用に影響を与えることができる、上記に記述された方法により同定される化合物は限定されないが、本発明の好ましい実施態様において、化合物は、抗体、タンパク質、ペプチド及びアプタマーからなる群より選択され、好ましくはペプチドである。本発明の更に好ましい実施態様において、ペプチドは、ＨＩＶ標的タンパク質から又はヒトタンパク質から誘導され、好ましくは約１０〜２０個のアミノ酸から構成される。
【０１４８】
適切なペプチドは、２００６年８月３１日に出願された係属欧州特許出願ＥＰ０６０１８２７７．１「ペプチド−ペプチド相互作用を検出する手段及び方法」（"Means and methods for detecting protein-peptide interactions"）（代理人案件番号ＣＡ１８Ａ０４／Ｐ−ＥＰ）、続く２００７年８月３１日に出願された国際出願において出願人により開示されているように、特に、タンパク質−タンパク質相互作用をインビボで検出し、対応する相互作用パートナーを単離する方法により得ることもできる。しかし、当然のことながら、例えば本発明の方法により同定されるタンパク質から誘導される合成ペプチドも考慮され、固相、液相若しくはペプチド縮合技術、又はこれらのいずれかの組み合わせの周知の技術を使用して調製することができる。これらには、天然及び非天然アミノ酸が含まれうる。有用なペプチドは、Ｄアミノ酸、Ｄ−及びＬアミノ酸の組み合わせ、並びに特殊な特性を伝える多様な「デザイナー」アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸及びＮａ−メチルアミノ酸など）を含むことができる。本発明の方法により同定されるものから誘導されるが改質アミノ酸配列を含んでいるタンパク質に関して既に記述されているように、結合領域又は最少必量アミノ酸配列を同定するために、ペプチドを使用して、対応する複合体を形成することもできる。本発明によると、好ましくは、Ｖｉｆに結合することが決定され、実施例４に詳細に記載されているタンパク質の相互作用ドメインの同定に使用されるペプチドは、例えば、国際出願ＷＯ０５／１１１０６１に記載されているようにして調製した。
【０１４９】
加えて、新たに同定された化合物の他に、本発明は、本発明の方法により同定されるが、今までウイルス疾患、特にＡＩＤＳのようなレンチウイルス疾患の治療に有用であると考えられたことのなかったＶｉｆ相互作用タンパク質のいずれかに結合することが知られている化合物又は作用物質の確認も考慮する。そのような化合物は、Ｖｉｆ相互作用タンパク質のいずれかに関する文献、例えば欧州特許庁主催の“espacenet”又は公開文献のデータベース、例えば“Medline”のような特許データベースから容易に検索することができる。加えて、当業者は、例えば受入番号又はＩＵＰＡＣ命名法又はタンパク質の名称を入力して、ヌクレオチド及びタンパク質配列それぞれについて“Genbank”、“EMBL”又は“UniprotKB/Swiss-Prot”のようないわゆる「一次データベース」をスクリーニングすることにより、本発明に使用される化合物を同定することができる。記述されたデータベースにおけるヌクレオチド及びアミノ酸配列は、通常、対応する引用により注釈が付けられており、それは対応する遺伝子の調節に関して更なる情報を提供し、したがって、本発明に使用される調節作用物質についての指針を提供する。加えて、いわゆる「二次データベース」、例えば“PROSITE”、“PRINTS”、“Pfam”、“INTER Pro”、“SCOP”又は“CATH”を使用することができ、これらはタンパク質ファミリー及びドメインのデータベースであり、配列分類のフィンガープリント又はタンパク質構造を提供する。探索の開始を可能にする最も適切なウエブインターフェースは、NCBIの“Entrez”及び配列検索システム“SRS”によりそれぞれ提供されている。多くの場合、“Google”によるキーワード探索は、適切な情報供給源を確認するのに既に成功するだろう。
【０１５０】
本発明のスクリーニング方法において、相互作用に影響を与えることができる、標的タンパク質、宿主タンパク質又は化合物を、固体表面に固着することができる。本発明の方法を実施する一つの方法は、例えば、標的タンパク質（Ｖｉｆ）を固体支持体に付着し、次にそれを洗浄して、付着していない過剰標的タンパク質を除去することでありうる。続いて、支持体を、例えば相互作用を試験する標識候補タンパク質又は試験化合物と接触させ、したがって、Ｖｉｆをそれらに暴露する。その後、固体支持体を再び洗浄して、標的タンパク質に結合していないタンパク質又は化合物を除去し、固体支持体に残留している、したがってＶｉｆに結合していると確認される量を決定することができる。あるいは又は加えて、例えば標識化合物とＶｉｆの解離定数を決定することができる。Ｖｉｆ、候補タンパク質又は化合物に適した標識は、当該技術において周知であり、酵素、蛍光体（幾つかの蛍光体を挙げると、例えば、フルオレセインイソチオチシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＲＴ）、ローダミン、遊離又はキレートランタニドシリーズの塩、特にＥｕ3+である）、発色団、35Ｓのような放射性同位体、キレート剤、染料、金コロイド、ラテックス粒子、リガンド（例えば、ビオチン）及び化学発光剤が含まれる。
【０１５１】
したがって、本発明の方法の更に好ましい実施態様において、スクリーニングされるＨＩＶ標的タンパク質、ヒトタンパク質又は化合物は、固体支持体に配列され、ここで、好ましくは、固体支持体は、マイクロチップ又はマイクロアレイのようなアレイ又はチップである。このような状況において、本発明は、当然のことながら、本発明の方法に使用されるチップ又はアレイにも関する。
【０１５２】
例えばタンパク質を固体支持体に付着する方法は、当該技術において周知であり、例えばタグを標的タンパク質に結合することが含まれる。本発明及び実施例３に詳細に記載されている方法によると、タグは、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）であり、標的タンパク質は、Ｖｉｆであり、好ましくは、Ｖｉｆは対応するＶｉｆ−ＧＳＴ融合タンパク質として発現している。更に、グルタチオン（ＧＳＨ）アガロースビーズのような対応する固体支持体及びマトリックスが、それぞれ提供される。ＧＳＴタグＶｉｆを固体支持体に接触させ、続いて洗浄して非反応種を除去すると、Ｖｉｆは、グルタチオン−ＧＳＴ相互作用を介して支持体に結合する。ビオチンをＶｉｆに結合すること及びアビジンを固体支持体に結合することのような、タンパク質を固体支持体に付着させる幾つかの更なる方法が存在する。タンパク質を固体支持体に付着させる対応する適切な方法の選択が、実施される個別のアッセイの特徴及び実験設定それぞれによって左右されうることは、当業者の一般知識の範囲内である。
【０１５３】
しかし、複合体形成及び／又は複合体安定性を調節することができる化合物をスクリーニングする本発明の方法の特に好ましい実施態様において、ＨＩＶ標的タンパク質は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合タンパク質であり、好ましくは、ヒトタンパク質はＳ35−メチオニンで標識されている。
【０１５４】
本発明のさらにより好ましい実施態様において、複合体形成は、細胞に基づいた２又は３ハイブリッド系のタンパク質−タンパク質相互作用によってもたらされる。
【０１５５】
上記のアッセイは固体支持体に付着する標的タンパク質（Ｖｉｆ）について例示的に記載されているが、当業者は、このアッセイは当然のことながら逆に実施できる、すなわち、例えば候補タンパク質を固体支持体に付着することにより実施できることを理解している。
【０１５６】
スクリーニング方法を実施するときは、多くの場合、多様な化合物を１回の実験でスクリーニングすることが意図される。したがって、本発明の方法は、一般に、従来の実験室で使用されるフォーマットに設計することができるか又はハイスループットスクリーニングに適合させることができる。このような状況において、用語「ハイスループットスクリーニング」（ＨＴＳ）は、複数試料の容易な同時分析及びロボット操作能力を可能にするアッセイ設計を意味する。ハイスループットアッセイの別の望ましい特徴は、試薬の使用を低減するように又は所望の分析を達成するための操作数を最小限にするように最適化されたアッセイ設計である。
【０１５７】
当然のことながら、更なる実施態様において、本発明は、本発明の方法により同定できた又は得られえた化合物に関し、好ましくは、前記化合物は、今まで当該技術においてウイルス疾患、特にＡＩＤＳのようなレンチウイルス疾患の治療のための薬剤として開示されたことがない。
【０１５８】
更に、本発明は、本発明の抗体又は化合物と、場合により薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、当該技術において周知の方法に従って配合することができる（例えば、フィラデルフィアのユニバーシティ・オブ・サイエンス（the University of Sciences in Philadelphia）によるレミントン：化学及び薬学の実施（Remington: The Science and Practice of Pharmacy）（２０００）、ＩＳＢＮ０−６８３−３０６４７２を参照すること）。適切な薬学的に許容される担体は、対応する文献から取ることができ、例えば、リン酸緩衝食塩水、水、油／水エマルションのようなエマルション、多様な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが含まれる。医薬組成物は、適切な用量で被験者に投与することができ、適切な組成物は、異なる方法、すなわち適切な投与経路で実施することができ、それらのうちの幾つかは、対応する文献に記載されており、例えば、経口、鼻腔内、直腸内、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、真皮下、経皮、鞘内及び頭蓋内投与が含まれる。鼻腔スプレー製剤のようなエアゾール製剤は、例えば、活性剤の精製された水性又は他の液剤を防腐剤及び等張剤と共に含む。そのような製剤は、好ましくは鼻粘膜と適合するｐＨ及び等張状態に調整される。直腸内又は膣内投与用の製剤は、適切な担体を有する坐剤として存在することができる。多様な種類の投与に適した製剤に関する更なる指針を、ペンシルベニア州フィラデルフィアのメイス・パブリッシング・カンパニー（Mace Publishing Company, Philadelphia, PA）のレミントン医薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）第１７版及び対応する最新版において見出すことができる。薬剤送達の方法のついての簡潔な検討は、ランガー（Langer）、サイエンス（Science）２４９（１９９０）、１５２７〜１５３３を参照すること。
【０１５９】
投与レジメンは、担当医師及び臨床要因によって決定される。医療技術において周知であるように、任意の患者への投与は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時期及び経路、身体全体の健康状態及び同時に投与される他の薬剤を含む、多くの要因によって決まる。非経口投与用の調合剤には、滅菌水性又は非水性液剤、懸濁剤及び乳剤が含まれうる。非水性溶媒の例は、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油及びエチレンオレエートのような注射用有機エステルを含む。水性担体には、食塩及び緩衝媒質を含む、水、アルコール／水溶液、エマルション又は懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液又は固定油が含まれる。静脈ビヒクルには、流体及び栄養補液、電解質補液（例えば、リンゲルデキストロースに基づいたもの）などが含まれる。例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤及び不活性ガスのような、防腐剤及び他の添加剤も存在していてよい。更に、医薬組成物を、例えば本発明の医薬組成物が受動免疫化のために抗ＨＩＶ抗体を含む場合は、ワクチンとして配合することもできる。
【０１６０】
加えて、他の作用物質の同時投与又は連続投与が望ましい場合がある。治療有効用量又は量は、症状又は状態を改善するのに十分な活性成分の量を意味する。そのような化合物の治療有効性及び毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的薬学手順により、例えばＥＤ５０（個体群の５０％に治療上有効な用量）及びＬＤ５０（個体群の５０％が致死の用量）を決定することができる。治療と毒性の効果の用量比は、治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表わすことができる。上記に既に記述されているように、作用物質の投与量は、治療、投与経路、療法の性質、療法に対する患者の感受性などによって左右される。ＬＤＳＯ動物データ及び他の情報を利用して、臨床医は、個人にとっての最大安全用量を決定することができる。組成物は、被験者に１回を超える一連の投与により投与することができる。治療組成物では、時には定期的な投与が必要であり、望ましい場合がある。治療レジメンは、作用物質によって変わり、例えば、小型有機化合物を、１日に１回又は１日に２回で長期間摂取することができ、一方、ペプチド模倣体又は抗体のようなより選択的な作用物質を、より確定された期間、例えば１日に１回、１日に２回、週に２回、週に１回などで摂取して、１、２、３又はそれ以上の日数、１週間又はそれ以上、１か月又はそれ以上などで投与することができる。
【０１６１】
Ｖｉｆと複合体を形成するタンパク質、並びに前記複合体形成及び／又は安定性に影響を与える化合物の検出及び同定に加えて、一つの大きな関心事は、複合体、特に本発明の複合体、すなわちウイルス要因と宿主要因で形成された複合体の「性質」に関連する。特に、治療的手法を考える場合、複合体それ自体を、薬剤標的として考慮することができるので、対応する複合体の性質についての知識が、治療剤及び療法それぞれの開発において必要となる。複合体の典型的な特性は、安定性、種類、大きさ（多量体又は単量体の複合体）、形状及び三次元構造のような物理的又は構造的特性を含むが、また、結合領域のアミノ酸組成又は結合領域における相互作用の種類、並びに、例えば個別の複合体パートナーが配置されない更なる結合部位を生じる複合体形成の影響のような生物学的特性も含む。これらの代替的結合部位の発生は、例えば、複合体形成の際の少なくとも１つの複合体パートナーの立体配座の変化に起因するか、又は複合体パートナーにより若しくは立体配座の再構成により前記部位が占領され、それにより前の結合部位の消滅をもたらすので、前の結合部位の欠如に起因することがありうる。更に、塩濃度、ｐＨ値などのような当該技術に既知の多様なパラメーターによって決まる複合体の寿命に関する知識が、重要でありうる。加えて、化学的、磁気的又は静電気的特性も関心事であり、例えば水素結合、また複合体の表面電荷のような複合体をまとめて保持する相互作用の種類でありうる。
【０１６２】
既に記述されたように、上記に例示的に列挙された特性の知識は、例えば、複合体の挙動又は潜在的な結合領域（特に、複合体の形成及び／又は安定性を調節することができる作用物質、並びに薬剤標的化における）を予測するのに重要である。したがって、複合体特性の知識は、破壊又は形成の防止のような多様な目的において対応する複合体にどのように影響を与えるかを考えるときに、必要な情報を提供する。当業者は理解するように、対応する複合体を調製、検出及び分析する幾つかの方法が存在する。これらの方法は、インビトロ及びインビボのシステムを使用するタンパク質複合体の形成手順を含むことができ、これを本発明に適合することができる。例えば、方法は、第１タンパク質Ｖｉｆ及び宿主細胞タンパク質の群から選択された第２タンパク質の合成及び単離、周知のインビトロ方法を使用したタンパク質複合体の形成を含むことができる。あるいは、タンパク質複合体は、組織若しくは細胞から単離若しくは精製することができるか、又はタンパク質メンバーの組み換え発現により産生することができる。どの方法を使用するかは、複合体の種類、調査の目的、また個別の実験パラメーターによって決まる。
【０１６３】
しかし、一つの特定に実施態様において、本発明は、本発明の及び上記で定義された複合体を調製する、検出する及び分析する方法であって、
（ａ）ＨＩＶタンパク質を合成及び／又は単離する工程；
（ｂ）ヒトタンパク質を合成及び／又は単離する工程；
（ｃ）（ａ）と（ｂ）のタンパク質を接触させる工程；
（ｄ）複合体形成をモニタリングする工程；及び場合により
（ｅ）既知のインビトロ方法により複合体特性（安定性又は動態）を決定する工程
を含む方法を提供する。
【０１６４】
なお別の実施態様において、本発明は、本発明の核酸、ベクター、組み換え宿主細胞、タンパク質、複合体、抗体、化合物及び／又はチップ若しくはアレイを含む診断用組成物に関する。
【０１６５】
上記に既に記載されているように、いったん化合物が、複合体形成及び／又は安定性に介入することが本発明により同定されると、有望な治療ツールであると考えられ、したがってこれを治療剤、薬剤及び医薬それぞれを開発するために使用することができる。前記薬剤は、好ましくは、複合体形成を防止すること又は既に形成された複合体を崩壊すること又は少なくとも複合体安定性を減少することができ、したがって、宿主の細胞機構へのウイルスの利用及びウイルスの効果を阻害することができる。しかし、ウイルス利用が拒否される場合、結果的にウイルス複製、増殖、拡散及びＡＩＤＳのようなウイルス疾患の発症がそれぞれ防止されるか又は少なくとも高度に減少されると想定される。更に、宿主の細胞機構は、宿主のためだけに「働く」ことが維持され、ウイルスにより悪用されない。
【０１６６】
したがって、本発明は、更に、レンチウイルス疾患、好ましくはＡＩＤＳの治療のための医薬の調製における、本発明の複合体形成及び／又は安定性に介入できる前述の化合物の使用に関する。
【０１６７】
更なる実施態様において、本発明は、また、本発明の方法に使用されるキット又はアッセイ系に関し、前記キット又はアッセイ系は、上記に記載された本発明の構成要素及び／又は試薬、自動ツール、貯蔵装置、液体操作ロボット、モニタリング配置などを含む。特に、本発明は、上記に記載された方法のいずれかで使用するためのキット、すなわち、本発明の核酸分子、タンパク質、化合物、複合体及び複合体形成それぞれ若しくは組成物を、同定する、クローニングする、調製する、スクリーニングする、モニタリングする、決定する、試験する、分析する並びに／又は使用するキットに関する。したがって、そのようなキットは、好ましくは、標的タンパク質（Ｖｉｆ）、１つ以上の候補（宿主）タンパク質若しくはそのフラグメント、又は対応するタンパク質（Ｖｉｆ、候補タンパク質若しくはフラグメント）をコードする組み換え核酸分子のような必須構成要素を、より好ましくは、対応する第１及び第２発現性核酸分子の形態で含む。さらにより好ましくは、発現性核酸分子は、相互作用アッセイが実施される特定の細胞に適した発現ベクターに存在する。適切な発現ベクターは、例えば、本方法が実施される細胞に応じて、酵母発現ベクター又は哺乳類細胞発現ベクターであることができる。
【０１６８】
望ましい場合、キットは、更に、例えば特定の宿主細胞の種類にとって最適な核酸形質移入効率をもたらす試薬を含有する。加えて、適切な宿主細胞をキットに含めることができるが、そのような細胞は、一般に入手可能であるか、又は本方法の特定の実施態様から選択することができる。好ましくは、本発明のキットは、例えば、選択性マーカー、培地構成要素、基準試料、マイクロアレイ、培養容器、ベクター、タンパク質、ペプチド、場合により、複合体形成を、すなわち（場合によりタグを付けた）Ｖｉｆと（場合によりタグを付けた）宿主タンパク質のような相互作用分子との複合体形成の減少又は増加をモニタリングすることができる、適切な検出手段、分光装置及び／又はモニタリングシステムを含む、本発明の上記記載の方法のいずれかを実施するのに有用な本明細書前記に記載されたような試薬を含有する。更に、対照と比較して増加又は減少した結合能は、例えば、当業者に既知の蛍光標識、リン光標識、放射性標識を含む標識により検出することができる。場合により、キットは、本発明のいずれかの方法をどのように実施するかについての使用説明書、好ましくは、Ｖｉｆの相互作用分子をコードする核酸分子の同定及び／若しくはクローニングに関する、又は前記相互作用に影響を及ぼす（それを阻害する又は増強する）潜在的な薬剤、作用物質、組成物若しくは化合物の確認若しくは評価に関する方法におけるキットの使用についての使用説明書を含む。これらの使用説明書はキットの構成要素の使用を詳述するために提供することができ、例えば書面の使用説明書、ビデオ表示又はコンピューターで開くことができる、例としてはディスケット若しくはＣＤ−ＲＯＭディスクのフォーマットの使用説明書である。
【０１６９】
更に、そのようなキットは、典型的には少なくとも１つの容器を密閉して保持するのに適した区画化担体を含み、キットの化合物は適切であれば滅菌でありうる。キットは、更に、任意の流動性構成要素を移動するためピペットのような移動手段を含むことができる。本発明のキットは、好ましくは商業的な製造及び規模に適しており、また更に、適切な基準、陽性及び陰性対照を含むことができる。
【０１７０】
本発明の方法及び構成要素、それにより得られるタンパク質、並びに本明細書に実質的に記載されている又は記載及び実施例に例示されている使用も、本発明及び特許請求されている主題であることが理解される。この観点から、また、実施例のいずれかにおいて記載されている実施態様を、独立して使用できること及び本明細書前記に記載され、添付の請求項において特許請求される実施態様のいずれかと組み合わせることができることも理解される。したがって、これら及び他の実施態様は、本発明の記載及び実施例に開示及び包含されている。本発明に用いられる物質、方法、使用及び化合物のいずれかに関する更なる文献は、例えば電子装置を使用して公共の図書館及びデータベースから検索することができる。例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）及び／又は国立衛生研究所（National Institutes of Health）の国立医学図書館（National Library of Medicine）が主催する公共データベース“Medline”を利用することができる。更なるデータベース及びウェブアドレス、例えば欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）の一部である欧州バイオフィンフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute）（ＥＢＩ）のものが当業者には知られており、検索エンジンを使用して得ることもできる。バイオテクノロジーについての特許情報の概説、並びに遡及検索及び最新知識に有用な特許情報の関連供給源の調査は、ベルクス（Berks）、ＴＩＢＴＥＣＨ  １２（１９９４）、３５２〜３６４に提示されている。
【０１７１】
上記の開示は、本発明を一般的に記載する。幾つかの文書は、本明細書の文章の全体にわたって引用されている。完全な書誌引用は、請求項の直前の明細書の最後の部分において見出すことができる。引用された全ての参考文献（本出願の全体にわたって引用された参考文献、発行された特許、公開された特許出願、及び製造会社の仕様書、使用説明書など）の内容は、参照として本明細書に明確に組み込まれるが、引用されたいずれかの文書を本発明の従来技術として認めるということは全くない。
【０１７２】
本発明は、また、本明細書に開示されている標的タンパク質又はペプチドのいずれかとＶｉｆとの複合体が検出されるＨＩＶ検出のための診断アッセイに関する。そのようなアッセイにおいては、血液又は他の任意の組織が使用されてもよい。したがって、本発明は、また、本明細書の標的タンパク質のいずかが使用される、ＨＩＶ検出のための診断アッセイに関する。
【０１７３】
上記の開示は、本発明を一般的に記載する。より完全な理解は、以下の特定の実施例を参照して得ることができ、これは例示のみの目的で本明細書において提示され、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【０１７４】
本明細書に特許請求されているペプチドは、以下のように生成することができる。ＥＩＦ４Ａ２タンパク質をコードする核配列を、小型フラグメントが生成されるように、酵素的に消化する又は機械的に剪断する。フラグメントは所望の長さを有する。フラグメントを、コードペプチドの発現のために、ベクターにクローンする。多様なペプチドをＶｉｆへの結合について試験する。結合領域を決定することができる。また、所定の長さのペプチドを化学的に合成することができ、Ｖｉｆへの結合を試験することができる。
【０１７５】
実施例
以下の実施例は、本発明を更に例示するが、本発明の範囲をいかようにも制限するものとして考慮されるべきではない。本明細書に用いられる従来の方法の詳細な記載は、引用文献において見出すことができる（「診断及び治療のメルクマニュアル」（"The Merck Manual of Diagnosis and Therapy"）第１７版、ベールズ（Beers）及びベルコウ（Berkow）編（メルク社（Merck & Co., Inc.）２００３）も参照すること）。
【０１７６】
本発明の実施は、特に指示のない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組換生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技術を用い、それらは当業者の技能の範囲内である。
分子遺伝子技術及び遺伝子技術の方法は、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）、（サムブルック（Sambrook）ら、（１９８９）分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）；ＤＮＡクローニング（DNA Cloning）、第Ｉ及びＩＩ巻（グローバー（Glover）編、１９８５）；オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）（ガイト（Gait）編、１９８４）；核酸ハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）（ハメス（Hames）及びヒギンズ（Higgins）編、１９８４）；転写及び翻訳（Transcription And Translation）（ハメス 及びヒギンズ編、１９８４）；動物細胞の培養（Culture Of Animal Cells）（フレッシュニー（Freshney）及びアラン（Alan）、リス社（Liss, Inc.）、１９８７）；哺乳類細胞の遺伝子導入ベクター（Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells）（ミラー（Miller）及びカロス（Calos）編）；分子生物学の現行プロトコール及び分子生物学のショートプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology）第３版（アウスベル（Ausubel）ら編）；組み換えＤＮＡ方法論（Recombinant DNA Methodology）（ウー（Wu）編、アカデミックプレス（Academic Press））；哺乳類細胞の遺伝子導入ベクター（ミラー及びカロス編、１９８７、コールドスプリングハーバーラボラトリー）；酵素学における方法（Methods In Enzymology）、第１５４及び１５５巻（ウー（Wu）ら編）；固定細胞及び酵素（Immobilized Cells And Enzymes）（ＩＲＬプレス（IRL Press）、１９８６）；ペルバル、分子クローニングの実践的指針（Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning）（１９８４）；論文、酵素学における方法（the treatise, Methods In Enzymology）（アカデミックプレス社（Academic Press, Inc.）、Ｎ．Ｙ．）；細胞における免疫科学法及び分子生物学（Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology）（メイヤー（Mayer）及びウオーカー（Walker）編、アカデミックプレス（Academic Press）、ロンドン、１９８７）；実験免疫学のハンドブック（Handbook Of Experimental Immunology）、第Ｉ〜ＩＶ巻（ウイアー（Weir）及びブラックウエル（Blackwell）編、１９８６）の最新号において一般的に記載されている。本開示において参照される試薬、クローニングベクター及び遺伝子操作用のキットは、バイオラッド（BioRad）、ストラタジーン（Stratagene）、インビトロゲン（Invitrogen）及びクローンテック（ClonTech）のような商業的供給者から入手可能である。細胞培養及び培地採取についての一般的技術は、大規模哺乳類細胞培養（Large Scale Mammalian Cell Culture）（フー（Hu）ら、バイオテクノロジーにおける最新見解（Curr. Opin. Biotechnol.）８（１９９７）、１４８）；血清無含有培地（Serum-free Media）（キタノ（Kitano）、バイオテクノロジー（Biotechnology）１７（１９９１）、７３）；大規模哺乳類細胞培養（バイオテクノロジーにおける最新見解２（１９９１）、３７５）及び哺乳類細胞の懸濁培養（Suspension Culture of Mammalian Cells）（ビルヒ（Birch）ら、バイオプロセス技術（Bioprocess Technol.）１９（１９９０）、２５１）；ｃＤＮＡアレイから情報を抽出する（Extracting information from cDNA arrays）、ヘルツェル（Herzel）ら、ＣＨＡＯＳ  １１、（２００１）、９８〜１０７において概説されている。
【０１７７】
実施例１：新規Ｖｉｆ相互作用物質の同定
この実施例は、組み換えＨＩＶ  Ｖｉｆ（配列番号２）と、胸腺ｃＤＮＡライブラリー（CytoTrap（登録商標）XRヒト胸腺ｃＤＮＡライブラリー（Human Thymus cDNA Library）、ストラタジーン（Stratagene））によりコードされた新規ヒトポリペプチドとのタンパク質複合体の同定を実証する。
【０１７８】
ベイト構造
ＮＬ４−３Ｖｉｆ  ｃＤＮＡを、小型スペーサー（配列番号３）を含むＳｏｓを有する融合タンパク質として異種タンパク質を酵母において発現するために、適切なベクター（ｐＡＤＨ−Ｓｏｓ−２ｘＳｐｃ、ｐＳｏｓベクター（シコルスキー（Sikorski）及びハイエター（Hieter）、遺伝学（Genetics）１２２（１９８９）、１９〜２７）を改質）にクローンした。Ｖｉｆ  ｃＤＮＡを、プライマーのＶｉｆ／ＲｓｒＩＩ（５′−ｔｔｔｔＣＧＧＡＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧ−３′；配列番号３７）及びＶｉｆ／ＮｏｔＩ（５′ａａａｔａｔＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＴＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＧ−３′；配列番号３８）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。続いて、ＲｓｒＩＩ及びＮｏｔＩ制限消化Ｖｉｆ  ＰＣＲ産物を、同様に消化されたｐＡＤＨ−Ｓｏｓ−２ｘＳｐｃにクローンし、ｐＡＤＨ−Ｓｏｓ−２ｘＳｐｃ−ｖｉｆおいてアミノ末端Ｓｏｓ融合タンパク質の発現をもたらした（図５を参照すること）。
【０１７９】
ライブラリーの増幅
ライブラリーの形質変換を、製造会社の使用説明書に従って、大腸菌（XL10-Gold（登録商標）、超コンピテント細胞（Ultracompetent Cells）、ストラタジーン（Stratagene））により実施した。ライブラリーの増幅において、大部分のｃＤＮＡを確実に増幅ｃＤＮＡライブラリーにより表されるようにするために、１×１０7個の個別のクローンが必要であった。したがって、１６０mmのペトリ皿をライブラリー増幅に使用した。ペトリ皿毎に、約５×１０4個のコロニー形成単位（ｃｆｕ）を増殖することができる。購入した胸腺ｃＤＮＡライブラリーの大腸菌株の滴定量は、１μあたり２．６×１０5個の大腸菌であった。プレートに０．２０μlの大腸菌ライブラリー株を接種して、所望の数のｃｆｕを達成した。
大腸菌ライブラリー株を氷上で解凍した。解凍した後、大腸菌懸濁液を穏やかに混合し、４１μlをＬＢ培地（２．５％（w/v）ＬＢ、ミラー（Miller））で１：２５に希釈した。ＬＢクロラムフェニコールプレート（ＬＢクロラムフェニコールアガー：１mlの濾過滅菌クロラムフェニコールを３０μg  ml-1の濃度で補充したＬＢアガー）の接種の前に、続いて添加される大腸菌株のより良好な分布のため、１００μlのＬＢ培地をそれぞれのプレートに加えた。次に、５μlの希釈大腸菌ライブラリー株を各ペトリ皿に加え、オートクレーブしたガラスビーズ（２．８５〜３．３mm、ロス（Roth））の助けを借りて分布させた。３７℃で一晩インキュベートした後、大腸菌コロニーを、ラバーポリスマンを用いて、プレートからこすり取った。
１０枚のプレートの大腸菌を５０mlの遠心分離管に移し、５０mlのＬＢクロラムフェニコール培地に注意深く再懸濁した。次にそのような５本の遠心分離管の内容物を５００mlの滅菌遠心分離ビーカーに移し、１５分間（４℃、６０００rpm（JA-10））遠心分離した。上澄みを廃棄し、細胞ペレットの重量を測定した。ペレットを、１０％グリセロールを含有する、２０mlの氷冷ＳＴＥ緩衝液（０．１MのＮａＣｌ、１０mMのトリス、ｐＨ８．０、１mMのＥＤＴＡ）に再懸濁した。終了時に、３ｇの大腸菌細胞ペレットを含有する適切な容量を、１０mlのクリオチューブ（cryotube）に移し、−８０℃で保存した。４つの胸腺ｃＤＮＡプールを、５０個のペトリ皿のそれぞれのプールから生成した。プラスミド単離には、Kit AX2000（マケレイ−ナゲル（Macherey-Nagel））を使用した。
【０１８０】
酵母の形質転換
ｃｄｃ２５−２酵母細胞（ＭＡＴα、ｕｒａ３、ｌｙｓ２、Ｌｅｕ２、ｔｒｐｌ  ｃｄｃ２５−２、ｈｉｓ３Δ２００、ａｄｅ１００、ＧＡＬ＋）の形質転換を、シーストル（Schiestl）及びギーツ（Gietz）（１９８９）の高効率形質転換法を変更したプロトコールに従って実施した。コンピテント酵母細胞の調製には、１０mlのＹＥＰＤ培地にｃｄｃ２５−５酵母細胞を接種し、２４℃で一晩インキュベートした。一晩培養の適切な容量を使用し５０mlのＹＥＰＤ培地に接種して、０．２のＯＤ600を得た。２４℃でインキュベートした後（約０．８のＯＤ600まで）、培養を沈降させ（１０００ｇ、５分間、室温）、ペレットを滅菌ｄｄＨ2Ｏで洗浄し、前記に記載されているように遠心分離した。その後、ペレットを１０mlのＬｉＳＯＲＢ（１００mMの酢酸リチウム、１０mMのトリス中の１MのＤ−ソルビトール、１mMのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、濾過滅菌）に再懸濁し、再び沈降させた。ペレットを、形質転換毎に５０μlのＬｉＳＯＲＢに再懸濁した（最大５００μl）。細胞は形質転換に直接使用した。
担体ＤＮＡミックスの調製には、形質転換毎に１０μlの断片化担体ＤＮＡ（サケ精子ＤＮＡ、ＴＥ緩衝液中１０mg  ml-1）を、９５℃で５分間沸騰させた。次に担体ＤＮＡを、形質転換毎に４０μlのＬｉＳＯＲＢと混合し、氷上に置いて室温に冷却した。
実際の形質転換では、０．５〜１μgのプラスミドＤＮＡ、５０μlの担体ＤＮＡミックス及び５０μlのコンピテント酵母細胞を混合した。混合物を、振とうしながら２４℃で３０分間インキュベートした。９００μlのＬｉＰＥＧ（１００mMの酢酸リチウム（ｐＨ７．５）、１０mMのトリス中４０％(w/v）ＰＥＧ4000、１mMのＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）、濾過滅菌）を各試料に加え、再び、振とうしながら２４℃で３０分間インキュベートした。１００μlのＤＭＳＯを加え、細胞に、振とうすることなく、４２℃で７分間熱ショックを与えた。細胞を沈降させ（１分間、１０００ｇ）、１００μlの１Mソルビトール（濾過滅菌）に再懸濁した。５０μlの懸濁液を、適切に選択したプレートに接種し、２４℃でインキュベートした。コロニーは、４〜６日後に現れた。
【０１８１】
ライブラリースクリーニング
胸腺ライブラリーを、大規模形質転換（シーストル（Schiestl）及びギーツ（Gietz）、１９９５）によりベイト株に形質転換した。ベイト株は、ｃｄｃ２５−２酵母株を、上記に記載されたｐＡＤＨ−ＳＯＳ−２ｘＳｐｃ−ｖｉｆプラスミドで形質転換することによって生成した。新たなベイト株培養（６００mlでＯＤが１．０）を、７０μgの上記に記載されているライブラリープラスミドＤＮＡの形質転換に使用し、１６０mmの−Ｌｅｕ−Ｕｒａ＋グルコースプレートで平板培養した。２４℃で３〜４日間インキュベートすると、１プレートあたりおよそ３００００個の形質転換体をもたらした。Ｖｉｆ相互作用タンパク質を発現するクローンの選択には、形質転換体を、−Ｌｅｕ−Ｕｒａ＋ガラクトースプレートにおいて膜フィルターによりレプリカ平板培養し、３７℃で４〜１０日間増殖させた。
【０１８２】
現れたコロニーを取り出し、２００μlの−Ｌｅｕ−Ｕｒａ＋グルコース培地に再懸濁し、２４℃で一晩インキュベートした。推定される相互作用候補の３７℃での増殖がプレイ（餌）発現に依存しているかを試験するため、クローンを−Ｌｅｕ−Ｕｒａ＋ガラクトースプレートにより、また同様に−Ｌｅｕ−Ｕｒａ＋グルコースプレートにより平板培養し、続いて３７℃で５〜７日間インキュベートした。Ｖｉｆ相互作用融合タンパク質の発現は、ライブラリープラスミドのＧＡＬ１誘発性プロモーターの制御下である。したがって、発現は培地（３％ガラクトース及び２％ラフィノース）へのガラクトースの添加により誘発されたが、グルコースの添加により抑圧された。胸腺ライブラリーのＶｉｆ相互作用タンパク質を発現する酵母細胞は、ガラクトースプレート（３％ガラクトース及び２％ラフィノース）においてのみ増殖するが、グルコースプレートでは増殖しない（図１を参照すること）。
【０１８３】
コードされたＶｉｆ相互作用タンパク質を含むプラスミドの単離
プラスミドを、QIAprep（登録商標）スピン・ミニプレップ・キット（Spin Miniprep Kit）（www.qiagen.com/literature/protocols/pdf/PR04.pdf）を使用し、マイケルジョーンズ（Michael Jones）のプロトコールに従って単離した。単一酵母コロニーを、５mlの−Ｕｒａ＋グルコース培地に接種し、振とうしながら２４℃で２４時間増殖させた。細胞を、５０００×ｇで５分間遠心分離して採取し、０．１mg/mlのＲＮアーゼＡ（RNase A）（キアゲン（Qiagen））を含有する２５０μlの緩衝液Ｐ１（キアゲン）に再懸濁した。細胞懸濁液を、新たな１．５mlのマイクロ遠心分離管に移した。崩壊のために、５０〜１００μlの酸洗浄ガラスビーズ（シグマ（Sigma））を加え、懸濁液を５分間ボルテックスした。ビーズが沈降した後、上澄みを新たな１．５mlのマイクロ遠心分離管に移した。次に、２５０μlの溶解緩衝液Ｐ２（キアゲン（Qiagen））を管に加え、管を４〜６回逆さまにし、室温で５分間インキュベートした。インキュベートした後、３５０μlの中和緩衝液Ｎ３（キアゲン（Qiagen））を管に加え、直ぐにしかし穏やかに管を４〜６回逆さまにした。溶解産物を１５０００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、清澄になった溶解産物をQIAprepスピンカラム（Spin Column）に移し、１５０００×ｇで１分間遠心分離した。カラムを、０．７５mlの緩衝液ＰＥ（キアゲン（Qiagen））の添加により洗浄し、１５０００×ｇで１分間遠心分離した。ＤＮＡの溶離は、２５μlのＥＢキアゲン（Qiagen）をQIAprepスピンカラム（Spin Column）の中心に添加することにより実施した。１分間のインキュベーション時間の後、溶離液を１５０００×ｇで１分間の遠心分離により得た。続く、ＣａＣｌ2コンピテント大腸菌への形質転換は、１０μlの溶離液で実施した。細菌を、５０μg/mlのクロラムフェニコールを含有するＬＢプレートで平板培養した。プレイ（餌）プラスミドを、大腸菌から単離し、挿入断片を放出するＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ制限消化により分析した。
【０１８４】
実施例２：酵母細胞におけるＶｉｆタンパク質複合体の検出
この実施例は、本発明が、Ｖｉｆ融合タンパク質及び同定された宿主因子の融合タンパク質の発現により、酵母において特定のタンパク質複合体を検出することにも有用であることを実証する。
【０１８５】
実施例１において同定された「陽性相互作用物質」の同定には、対応するライブラリー配列のＤＮＡを細胞から単離した。
【０１８６】
新規Ｖｉｆ相互作用タンパク質の同定に加えて、この相互作用を、特異性について、すなわち第１融合タンパク質（ベイト）の発現へのタンパク質−タンパク質相互作用の依存性について、すなわち標的タンパク質がＶｉｆであることについて試験した。したがって、Ｖｉｆ相互作用タンパク質の単離されたライブラリープラスミドを、標的タンパク質としてコードされた第１融合タンパク質、すなわちＶｉｆを含むベクターｐＡＤＨ−Ｓｏｓ−２ｘＳｐｃ−ｖｉｆを含有する酵母株に導入するばかりでなく、追加的に、「陰性対照」標的タンパク質としてｃＪｕｎを提供する融合タンパク質を含む対照として異質ベイトベクターｐＡＤＨ−Ｓｏｓ−２ｘＳｐｃ−ｃＪｕｎを含有するｃｄｃ２５−５酵母株にも導入した。上記に記載されているように、細胞をＹＮＢ−Ｌｅｕ、−Ｕｒａ及びグルコースプレートで平板培養し、２４℃でインキュベートした。それぞれの形質転換アッセイのクローンを液体培地に懸濁し、１セットのガラクトースプレート及び２セットのグルコースプレート（それぞれ、−Ｕｒａ−Ｌｅｕ）にそれぞれ移し、３７℃でインキュベートした。ガラクトースプレートでは、相互作用の依存性を、ガラクトース誘発性プロモーターの制御下にあるプレイ（餌）タンパク質の発現によって試験した。３７℃でインキュベートしたグルコースプレートを、復帰突然変異体の潜在的な増殖についての試験に使用した。２４℃でインキュベートしたグルコースプレートのセットを、一般的な増殖対照として使用した。制限温度３７℃での対照ベクター（「陰性対照」標的タンパク質を提供する）は、同定された新規宿主因子を非関連ｐＡＤＨ−Ｓｏｓ−２ｘＳｐｃ−ｃＪｕｎ作成物と組み合わせて含有する細胞の増殖がなかったので、ｐＡＤＨ−Ｓｏｓ−２ｘＳｐｃベイト作成物への同定された新規宿主細胞相互作用物質の結合特異性を示す（図２及び図７を参照すること）。Ｖｉｆへの結合について相互作用宿主タンパク質の特異性を実証した後、対応するライブラリー配列のＤＮＡを配列決定した。
【０１８７】
実施例３：ＨＩＶ  Ｖｉｆタンパク質複合体のインビトロ形成（ＧＳＴプルダウン）
Ｖｉｆベクター
ｐＮＬ４．３の完全長Ｖｉｆ遺伝子を、プライマーのＶｉｆ／Ｂａｍ（５′−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧ−３′；配列番号３９）及びＶｉｆ／Ｘｈｏ（５′−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＴＧＡＣＣＡＴＴＣＡＴＴＧＴＡＴＧ−３′；配列番号４０）を使用してＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅Ｖｉｆ  ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断し、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＧＥＸ−４Ｔ２発現ベクター（アマシャム・ファーマシア・バイオテック（Amersham Pharmacia Biotech））にサブクローンして、ｐＧＥＸ−４Ｔ２−Ｖｉｆをもたらし、これはＧＳＴ−Ｖｉｆ融合オープンリーディングフレームを含有する（図４を参照すること）。
【０１８８】
ＧＳＴ−Ｖｉｆの発現及び精製
ＧＳＴ−Ｖｉｆの発現及び精製は、ハサイン（Hassaine）ら、生物科学ジャーナル（J. Biol. Chem.）２７６（２００１）、１６８８５〜１６８９３を変更したプロトコールに従って実施した。したがって、ｐＧＥＸ−４Ｔ２−Ｖｉｆプラスミドで形質転換された大腸菌ＢＬ２１コドン＋ＲＰ（ストラタジーン（Stratagene））を３０℃で増殖させた。タンパク質発現を、０．１mMのイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを３０℃で３時間用いて、６００nmのＯＤが０．５〜０．７で誘発した。細菌を５０００×ｇで１５分間遠心分離し、ペレットを、プロテアーゼインヒビター（ロッシュ（Roche））及びリゾチーム（１mg/ml）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。細菌を、氷上で超音波処理（３×３０秒）により溶解し、溶解産物を、１％トリトンＸの存在下、振とうしながら、４℃で３０分間インキュベートした。不溶性物質を１４０００×ｇで４０分間ペレット化し、上澄みを、５０％(v/v）グルタチオン（ＧＳＨ）アガロースビーズ（アマシャム（Amersham））と共に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ中の０．５M  ＮａＣｌで３回洗浄した後、ＧＳＨアガロースビーズに固定したＧＳＴ融合タンパク質を、１２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲルによるアリコートの電気泳動、続くクーマシーブリリアントブルーによるゲルの染色によって定量化した。
【０１８９】
タンパク質複合体のインビトロ形成
相互作用候補の放射能標識タンパク質は、対応するライブラリープラスミドをテンプレートとして使用し製造会社の推奨に従って、35Ｓ（１０００Ci/mmol；アマシャム・ファーマシア・バイオテック（Amersham Pharmacia Biotech））の存在下、共役インビトロ転写−翻訳（ＴＮＴ  Ｔ７共役網状赤血球溶解産物系、プロメガ（Promega））により生成した。翻訳タンパク質抽出物の１／５を、アガロースビーズに結合したＧＳＴ−Ｖｉｆと共にインキュベートした。
一つの結合実験において、Ｖｉｆを発現するＢＬ２１細胞４０mlに対応するＶｉｆタンパク質を、ＧＳＴ融合タンパク質として使用した。精製プロトコールは上記に記載されている。
Ｖｉｆへの相互作用候補の結合は、２０mMのＮａＣｌ、２０mMのトリス、ｐＨ８．０、０．５％のＮＰ４０及び１００μg/mlのウシ血清アルブミンを含有する結合緩衝液の中、室温で１時間振とうすることにより実施した。インキュベートした後、ビーズを５００ｇで２分間回転してペレット化し、続いて１mlの洗浄緩衝液（血清アルブミンなしの結合緩衝液）による４工程の洗浄を行った。タンパク質を３０μlの２×ＳＤＳ試料緩衝液で溶離し、溶離液の半分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により、続いてオートラジオグラフィーにより分析した（図３ａ〜ｃを参照すること）。
【０１９０】
実施例４：相互作用ドメインの同定
相互作用ドメインの同定には、相互作用タンパク質のタンパク質配列から誘導した１４個のアミノ酸長ペプチドを含有するマイクロアレイを、例えば国際出願ＷＯ０５／１１１０６１に記載されているように作製した。ペプチドは、完全自動化合成機（マルチペン自動化ペプチド合成機（Multipep Automated Peptide Synthesizer）、インタビスＡＧバイオアナリティカル・インストルメント（Intavis AG Bioanalytical Instruments））を使用して、Ｆｍｏｃ方法論に従って合成した。単一ペプチドを、別個の誘導体化セルロースディスク（Ｆｍｏｃ−β−アラニンセルロース）で合成した。合成が終了し、ＴＦＡにより側鎖保護基を除去した後、セルロースディスクを、９０％ＴＦＡ（８９．５％ＴＦＡ、４％トリフルオロメタンスルホン酸、２．５％トリイソプロピルシラン、４％Ｈ2Ｏ）に一晩溶解した。セルロース結合ペプチドを、冷tert−ブチルメチルエーテルと関与させ、遠心分離した（５分間、１５００rpm）。tert−ブチルメチルエーテルで洗浄した後、ペレットをＤＭＳＯに溶解した。その後、得られたＤＭＳＯ中セルロース結合ペプチドの溶液を、０．０６μl容量の溶液を顕微鏡スライドにスポットすることにより、アレイの作製に使用した。
【０１９１】
ペプチドアレイを、供給者の推奨に従って、相互作用スクリーニング及びプロメガ（Promega）ＴＮＴ共役転写／翻訳系の陽性クローンから単離されたプラスミドを使用してインビトロで産生された、35Ｓ標識相互作用タンパク質の溶液と共にインキュベートした。タンパク質の形成は、ＳＤＳゲル電気泳動、オートラジオグラフィー及び銀染色によって確認した。５０μlの粗インビトロ合成タンパク質を、１０mlの１０×膜遮断緩衝液（シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）、カゼインに基づいた遮断緩衝液、０．０５％アジ化ナトリウム）に加え、十分に混合した。この混合物を、予め一晩遮断したペプチドアレイに直接適用した。インキュベーションを、持続的にゆっくりと水平に撹拌しながら、室温で４時間実施した。上澄みを除去し、膜をＴＢＳＴ（２５mMのトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．５；１２５mMのＮａＣｌ；０．１％ツイーン２０）により１０分間で３回洗浄した。ペプチドと35Ｓ標識タンパク質との複合体形成を、スポット膜のサランに覆われた面上に７０時間設置し、使用前に常に消去した画像化スクリーンＫ（Imaging screen K）（バイオラッド（Biorad））により検出し、パーソナル分子画像機ＦＸ（Personel Molecular Imager FX）（バイオラッド、解像度：５０μm）により読み取った。得られた画像ファイルを、バイオラッド数量ワンソフトウエア（Biorad Quantity One software）（バージョン４．４）を使用して、スポットの強度に関して直接評価した。
【０１９２】
実施例５：細胞溶解産物におけるタンパク質複合体の検出
この実施例は、ヒト細胞の細胞溶解産物における本発明のタンパク質複合体の検出を実証する。本明細書に記載される実験的方法を、タンパク質複合体の記載されている形成に影響を及ぼす（それを阻害する又は増強する）潜在的薬剤、作用物質、組成物又は化合物の開発又は確認に使用することもできる。
【０１９３】
改質ヒト胎児腎細胞株２９３Ｔを、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン及びストレプトマイシン、１％グルタミンを補充したダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）から構成される完全培地に維持した。２９３Ｔ細胞を、１００mm皿に５×１０6個の細胞で接種した。
陽性対照を生成するには、２９３Ｔ細胞に、ＦＬＡＧタグＡｐｏｂｅｃ３Ｇをｖｉｆ相互作用タンパク質として発現するｐＦＬＡＧ−Ａ３Ｇの３μgを形質移入した（接種の２４時間後）。上澄みを形質移入の４８時間後に除去し、細胞を５mlの冷ＰＢＳで１回洗浄した。ＦＬＡＧ−Ａ３Ｇ形質移入及び非形質移入細胞を、冷ラジオイムノ沈殿アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（ピアース（Pierce）、１００mm皿あたり８００μl）で溶解した。
細胞溶解産物を、供給者の推奨に従って、プロメガ（Promega）ＴＮＴ共役転写／翻訳系を使用してｐｃＤＮＡ−ｖｉｆプラスミドからインビトロで産生した、35Ｓ標識ｖｉｆタンパク質の溶液と共にインキュベートした。タンパク質複合体の形成には、１０μlのインビトロ翻訳35Ｓ標識ｖｉｆタンパク質を、６００μlの総細胞溶解産物と共に、撹拌しながら、室温で１時間インキュベートした。タンパク質複合体の免疫沈降は、２５μlの一次抗体の懸濁液（撹拌しながら４℃で４時間インキュベートした）の添加、続く３０μlのアガロース結合タンパク質Ａ／Ｇアガロースの懸濁液（サンタクルーズ（Santa Cruz）、撹拌しながら４℃で１時間インキュベートした）とのインキュベーションにより実施した。遠心分離し（８０００×ｇ、５分間、４℃）、ＴＢＳで洗浄した後、得られたペレットを、１０μlの４×濃縮電気泳動試料緩衝液（１２５mMのトリス、ｐＨ６．８、４％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、２％のβ−メルカプトエタノール）に再懸濁し、５分間沸騰させた。
得られた試料の等量のアリコートを、２つのＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル（１２％）に装填し、電気泳動で分離した。第１ゲルのタンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、適切な一次及び二次抗体でイムノブロットした。第２ゲルを乾燥し、画像化スクリーンＫ（Imaging screen K）（バイオラッド（Biorad））による、複合体中の35Ｓ標識ｖｉｆタンパク質の検出に使用した。したがって、使用前には常に消去したスクリーンを、膜の上に４８時間設置し、パーソナル画像機ＦＸ（Personal Imager FX）（バイオラッド（Biorad）、解像度５０μm）で読み取った。
【図１】
2010535846.tif 000002
【図２】
2010535846.tif 000003
【図３】
2010535846.tif 000004
【図４】
2010535846.tif 000005
【図５】
2010535846.tif 000006
【図６】
2010535846.tif 000007
【図７】
2010535846.tif 000008
【配列表】
2010535846000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月13日(2010.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルス科のファミリーからのウイルス感染因子タンパク質（Ｖｉｆ）又はその約１２個を超えるアミノ酸のペプチドフラグメントと、ＥｌＦ４Ａ２タンパク質又はその約１２個を超えるアミノ酸のペプチドフラグメントとを含み、前記のタンパク質又はペプチドフラグメントが、互いに結合することができる組成物。
【請求項２】
前記ウイルス感染因子タンパク質（Ｖｉｆ）がＨＩＶからのものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＨＩＶからの前記ウイルス感染因子タンパク質（Ｖｉｆ）が、配列番号２の配列である、又は、配列番号１の配列でコードされている、又はＥｌＦ４Ａ２に結合することができるそのペプチドフラグメントである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記の２つのタンパク質又はペプチドが複合体の中にある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項４の複合体に特異的に結合する、或いは対応するＨＩＶタンパク質及び／又はヒトタンパク質又はペプチドそれぞれの結合ドメインに特異的に結合する、抗体。
【請求項６】
複合体形成及び／又は複合体安定性を調節することができる化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物を、
（ｉ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物、及び／又は
（ｉｉ）請求項４記載の複合体
に付す工程；
（ｂ）複合体形成及び／又は複合体安定性における変化をモニタリングする工程；並びに
（ｃ）（ｉ）のタンパク質の複合体形成を変える及び／又は（ｉｉ）の安定性を変える能力に基づいて、化合物が、対照と比較して複合体形成及び／又は安定性を調節できるかを決定する工程
を含む方法。
【請求項７】
ＶＩＦとＥＩＦ４Ａ２の複合体形成及び／又は複合体安定性を調節することができる化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物を、ＥＩＦ４Ａ２タンパク質又は配列番号９でコードされているタンパク質又はそれらのフラグメントを含む組成物に付す工程；
（ｂ）ＥＩＦ４Ａ２タンパク質又は配列番号９でコードされているタンパク質又はそれらのフラグメントに結合することができる化合物を同定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の同定された候補化合物を、
（ｉ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物、及び／又は
（ｉｉ）請求項４に記載の複合体
に付す工程；
（ｄ）複合体形成及び／又は複合体安定性における変化をモニタリングする工程；並びに
（ｅ）（ｉ）のタンパク質の複合体形成を変える及び／又は（ｉｉ）の安定性を変える能力に基づいて、化合物が、対照と比較して複合体形成及び／又は安定性を調節できるかを決定する工程
を含む方法。
【請求項８】
レトロウイルス科のファミリーのウイルス感染因子タンパク質（Ｖｉｆ）に結合することができる、ＥＩＦ４Ａ２の配列（配列番号９）を有するタンパク質又はその小型ペプチドフラグメント若しくはその誘導体。
【請求項９】
前記のタンパク質、誘導体又はペプチドが、ＨＩＶウイルス感染因子タンパク質（Ｖｉｆ）に結合することができる、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
ＥＩＦ４Ａ２（配列番号９）、ＨＳＰｓ（ＨＳＰ９０：配列番号２１；ＨＳＰＡ１：配列番号：２２、２３、２４、２５、２６、２７及び２８；ＨＳＰＡ５：配列番号：２９、３０及び３１；ＨＳＰＡ８：配列番号：３２、３３及び３４；ＨＳＰＨ１：配列番号：３５）、ＣＵＬ４Ａ（配列番号４３）、およびＰＴＰＲＣ（配列番号４８）からなる群より選択される配列を有するタンパク質又はこれらのいずれかのフラグメント若しくは誘導体であって、前記のタンパク質又はペプチドがＶｉｆに結合することができる、タンパク質又はこれらのいずれかのフラグメント若しくは誘導体。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物及び／又は請求項５に記載の抗体及び／又は請求項８〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質を含むキット又はアッセイ系。
【国際調査報告】
2010535846.tif 000063
2010535846.tif 000064
2010535846.tif 000065
2010535846.tif 000066
2010535846.tif 000067
2010535846.tif 000068
2010535846.tif 000069
2010535846.tif 000070
2010535846.tif 000071
2010535846.tif 000072