(57)【要約】  本発明は、遺伝子座ＧＣＨ１のゲノム遺伝子座由来の核酸又はその断片中に、哺乳動物から得られた試料中の少なくとも１つの特定の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含む、哺乳動物中の疼痛に対する遺伝的素因又は感受性を診断するためのインビトロ法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物から得られた試料中において、遺伝子ＧＣＨ１のゲノム座位から得られた核酸又はその断片中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、前記少なくとも１つのＳＮＰが、ＳＮＰｒｓ８００７２６７Ｇ＞Ａ、ｒｓ３７８３６４１Ａ＞Ｔ、ｒｓ８００７２０１Ｔ＞Ｇ、ｒｓ４４１１４１７Ａ＞Ｇ、ｒｓ７５２６８８Ｇ＞Ａ及びｒｓｌ０４８３６３９Ｃ＞Ｇからなる群から選択される、哺乳類中の急性及び／又は慢性疼痛を発症する遺伝的素因又は感受性を診断するための方法。
【請求項２】
診断が前記急性及び／又は慢性の疼痛、特に神経因性の疼痛から保護される個体を同定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸がＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡである、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
前記検出が、配列決定、ミニ配列決定、ハイブリッド形成、制限断片分析、オリゴヌクレオチド連結アッセイ又は対立遺伝子特異的ＰＣＲによって達成される、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
ＳＮＰの組み合わせが約０．８０又はそれ以上、好ましくは約０．９０又はそれ以上の感受性及び約０．６０又はそれ以上、好ましくは約０．９０又はそれ以上の特異性での検出を提供する、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
遺伝子ＧＣＨ１中の統計学的に有意な他のＳＮＰとの組み合わせが分析される、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
ＫＣＮＳ１、ＯＰＭＲ１、ＣＯＭＴ及びＰＧＨＳ２からなる群から選択される遺伝子中の統計学的に有意な他のＳＮＰとの組み合わせが分析される、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
フォルスコリン、ＬＰＳなどでの刺激を加えた及び加えない、全血及び／又は単離された白血球中のバイオプテリンの分析をさらに含む、請求項１から８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
ａ）請求項１から８の何れかに記載の方法を実施すること、及び
ｂ）工程ａ）で得られた結果に少なくとも部分的に基づいて、前記哺乳動物に対する鎮痛性物質の投薬量を決定すること、並びに
ｃ）前記投薬量を医薬として許容される担体及び／又は希釈剤と混合すること
を含む、有効な鎮痛性組成物を作製する方法。
【請求項１１】
ａ）請求項１から８の何れかに記載の方法、及び
ｂ）工程ａ）で得られた結果に少なくとも部分的に基づいて、哺乳動物に対して鎮痛性物質を与えること
を含む、哺乳動物中の疼痛を治療する方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の有効な鎮痛性組成物が投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＳＮＰｒｓ８００７２６７Ｇ＞Ａ、ｒｓ３７８３６４１Ａ＞Ｔ、ｒｓ８００７２０１Ｔ＞Ｇ、ｒｓ４４１１４１７Ａ＞Ｇ、ｒｓ７５２６８８Ｇ＞Ａ及びｒｓ１０４８３６３９Ｃ＞Ｇからなる群から選択される遺伝子ＧＣＨ１のＳＮＰの少なくとも１つを検出するための少なくとも１つのプローブ及び／又はプライマーの組を含む診断用キット及び／又は研究用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子座ＧＣＨ１のゲノム遺伝子座由来の核酸又はその断片中に、哺乳動物から得られた試料中の少なくとも１つの特定の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含む、哺乳動物中の疼痛に対する遺伝的素因又は感受性を診断するためのインビトロ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝的要因が、疼痛の発症と治療における個体間の変異を説明する割合は益々増加している。多型遺伝子は、病的症状において疼痛を発症する個体の感受性、実験的な疼痛刺激に対する個体の応答及び鎮痛性の薬理学的治療に対する個体の応答を媒介する。
【０００３】
Ｋｅａｌｅｙ  Ｃ他（Ｋｅａｌｅｙ  Ｃ，Ｒｏｃｈｅ  Ｓ，Ｃｌａｆｆｅｙ  Ｅ，ＭｃＫｅｏｎ  Ｐ．Ｌｉｎｋａｇｅ  ａｎｄ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １４ｑ２２−２４  ｉｎ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ：ｓｕｐｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ＧＣＨＩ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｎｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ｂ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒ  Ｇｅｎｅｔ．２００５  Ｊｕｌ５；１３６（１）：７５−８０）は、１４ｑ２２−２４を双極性障害（ＢＰＤ）に関連付ける連鎖について記載している。ウェブに基づく１４ｑ２２−２４の候補遺伝子探索によって、ＢＰＤに関与している可能性が最も高い候補遺伝子として、Ｄ１４Ｓ２８１から３’方向に２００ｋｂの場所に位置しているＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＧＣＨＩ）が選択された。ＢＰＤとＧＣＨ１中の新規一塩基多型（ＳＮＰ）（ＡＴＧコドンの上流−９５９塩基対においてＧ→Ａ）との間の関連研究も発表されている。
【０００４】
ＩｃｈｉｎｏｓｅＨ他（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ  Ｈ，Ｏｈｙｅ  Ｔ，Ｍａｔｓｕｄａ  Ｙ，Ｈｏｒｉ  Ｔ，Ｂｌａｕ  Ｎ，Ｂｕｒｌｉｎａ  Ａ，Ｒｏｕｓｅ  Ｂ，Ｍａｔａｌｏｎ  Ｒ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｋ，Ｎａｇａｔｓｕ  Ｔ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ＧＴＰ  ｃｙｃｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ｉ  ｇｅｎｅｓ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＧＴＰ  ｃｙｃｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ｉ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９５  Ａｐｒ  ２８；２７０（１７）：１００６２−７１）は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ遺伝子及びｍＲＮＡの複数種の性質決定並びに構造解析について記載している。
【０００５】
ＷＯ２００５−０４８９２６は、ＢＨ４の発現又は活性を低下させる化合物を、外傷性、代謝性又は毒性の末梢神経病変又は疼痛を予防し、抑制し又は治療することを必要としている哺乳動物に投与することによって、例えば、神経因性疼痛、炎症性及び侵害受容性疼痛などの外傷性、代謝性又は毒性の末梢神経病変又は疼痛を予防し、抑制し又は治療するための方法及び組成物を記載している。この抑制は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、セピアプテリン還元酵素（ＳＰＲ）若しくはジヒドロプテリジン還元酵素（ＤＨＰＲ）などのＢＨ４合成酵素の何れかの酵素活性を低下させることによって、ＢＨ４依存性酵素に対するＢＨ４の補因子機能を拮抗することによって、又は膜結合型受容体へのＢＨ４結合を遮断することによって達成され得る。この出願は、生物学的試料中のＢＨ４又はその代謝物のレベルを測定することによって、哺乳動物中の疼痛又は末梢神経病変を診断するための方法も提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際特許公開２００５／０４８９２６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｅａｌｅｙ  Ｃ，Ｒｏｃｈｅ  Ｓ，Ｃｌａｆｆｅｙ  Ｅ，ＭｃＫｅｏｎ  Ｐ．、Ｌｉｎｋａｇｅ  ａｎｄ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １４ｑ２２−２４  ｉｎ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ：ｓｕｐｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ＧＣＨＩ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｎｅ、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ｂ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒ  Ｇｅｎｅｔ．、Ｊｕｌ５；１３６（１）、２００５年、ｐ．７５−８０
【非特許文献２】Ｉｃｈｉｎｏｓｅ  Ｈ，Ｏｈｙｅ  Ｔ，Ｍａｔｓｕｄａ  Ｙ，Ｈｏｒｉ  Ｔ，Ｂｌａｕ  Ｎ，Ｂｕｒｌｉｎａ  Ａ，Ｒｏｕｓｅ  Ｂ，Ｍａｔａｌｏｎ  Ｒ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｋ，Ｎａｇａｔｓｕ  Ｔ．、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ＧＴＰ  ｃｙｃｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ｉ  ｇｅｎｅｓ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＧＴＰ  ｃｙｃｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ｉ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２７０（１７）、１９９５年４月２８日、ｐ．１００６２−７１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
最近、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１遺伝子（［１］；ＧＣＨ１；図１）中のハプロタイプが、ボランティアにおいて、外科的椎間板切除術後における減少した持続的神経根痛及び低減された実験的疼痛と関連付けられた（２）。この酵素は、カテコールアミン、セロトニン及び一酸化窒素合成に関与する酵素に対する不可欠な補因子であるテトラヒドロバイオプテリンの合成に関して律速である。ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１は、末梢神経障害後に、一次感覚神経中で上方制御される。その阻害は、神経因性及び炎症性疼痛の様々なモデルにおいて、侵害受容性応答を低減し、テトラヒドロバイオプテリンは無処置動物に疼痛を引き起こし、持続性疼痛をさらに増加させる（２）。テトラヒドロバイオプテリンは、ともに疼痛経路への関与が既に推定されている一酸化窒素及びセロトニン合成のための不可欠な補因子であるので、これらの媒介物質の調節はテトラヒドロバイオプテリンの疼痛発生効果に寄与し得る。理論に拘泥することを望むものではないが、疼痛保護的ハプロタイプの機能的な帰結は、ＧＣＨ１のｍＲＮＡ及びタンパク質の低下した上方制御に起因する刺激されたテトラヒドロバイオプテリン合成の低減である。
【０００９】
上記に加えて、前記方法の信頼性を増大及び向上させて、特定の患者及び／又は対象に対する潜在的診断能を完全に活用するために、上記に加えて、疼痛保護的表現型の遺伝分析のための信頼できるマーカーが必要とされている。
【００１０】
最近、ＧＣＨ１遺伝子の１５の位置から構成されるハプロタイプが、疼痛保護と関連するとして同定された（２）。完全な遺伝情報に基づく診断には、１５のＤＮＡ位置の同定及びハプロタイプの割付など、研究室での多大な努力を必要とする。従って、疼痛、特に神経因性疼痛の臨床研究及び治療におけるＧＣＨ１遺伝学の応用を容易にするために、必要とされる研究室の診断労力が大幅に低減したスクリーニングアッセイが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、その第一の好ましい態様において、哺乳動物から得られた試料中において、遺伝子ＧＣＨ１のゲノム座位から得られた核酸又はその断片中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、前記少なくとも１つのＳＮＰが、ＳＮＰｒｓ８００７２６７Ｇ＞Ａ、ｒｓ３７８３６４１Ａ＞Ｔ、ｒｓ８００７２０１Ｔ＞Ｇ、ｒｓ４４１１４１７Ａ＞Ｇ、ｒｓ７５２６８８Ｇ＞Ａ及びｒｓ１０４８３６３９Ｃ＞Ｇからなる群から選択され、好ましくはＳＮＰｒｓ８００７２６７Ｇ＞Ａ、ｒｓ３７８３６４１Ａ＞Ｔ及びｒｓ１０４８３６３９Ｃ＞Ｇからなる群から選択される、哺乳類中の急性及び／又は慢性疼痛を発症する遺伝的素因又は感受性を診断するための方法によって達成される。この方法は、インビトロ、インビボ又はインシチュの方法であり得る。好ましいのは、ＳＮＰｒｓ８００７２６７Ｇ＞Ａ及びｒｓ３７８３６４１Ａ＞Ｔであり、ｒｓ１０４８３６３９Ｃ＞Ｇと組み合わせるのがより好ましい。
【００１２】
１５の位置全てに対して遺伝子型が決定された２９０のＤＮＡ試料を用いて、本発明者らは、３つのＧＣＨ１ＤＮＡ位置のみを使用することによって、驚くべきことに、症例の１００％において、疼痛保護的ハプロタイプの診断が可能であることを示す。さらに、本発明者らは、１００％正確なハプロタイプの割付はコンピュータ内でのハプロタイプ決定を必要とせず、「単純な」ＳＮＰを基礎として取得できることを示すことができた。従って、ＧＣＨ１ＳＮＰを１５から僅か３つに低下させることによって、疼痛保護的ハプロタイプの遺伝的診断を大幅に容易にするためのスクリーニングアッセイという意図が達成された。さらに、本発明は、以下でさらに詳しく説明されているように、ピロシーケンスアッセイの開発によって達成されたとおり、前記３つのＳＮＰの迅速で、信頼性が高い検出を提供する。
【００１３】
（２）から得られた２９０人の疼痛患者及びそのＤＮＡがピロシーケンスアッセイデザインの役割を果たした６２９人の無作為に選択された健康なボランティアの両方に関して、３つのＳＮＰの検出された対立遺伝子頻度は、白人の試料に対して公知の対立遺伝子頻度（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／におけるＮＣＢＩＳＮＰデータベース）に対応していた。３つのＳＮＰの対立遺伝子頻度には、数個の人種間差が存在する。
【００１４】
ｄｂＳＮＰｒｓ８００７２６７は、白人、中国人、日本人の間で同様の頻度（１４％から１８％）を有しているが、アフリカ系アメリカ人での頻度は２倍である（３４％、出典：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのウェブサイトは、このＳＮＰのｄｂＳＮＰウェブサイト上のリンクを介して閲覧することができる。）。これに対して、ｄｂＳＮＰｒｓ１０４８３６３９は、白人以外の上記人種（３５％から４１％）より、白人において稀である（２３％）。ハプロタイプはハプロタイプを構成する最も稀な対立遺伝子より高頻度となることができないので、ＳＮＰ頻度のこのパターンは、疼痛保護的ＧＣＨ１ハプロタイプが、現在白人に見出されているより、アフリカ系アメリカ人の間でより高頻度である可能性をもたらす。これに対して、ＳＮＰ頻度パターンは、白人と比べて、他の人種に対してハプロタイプ頻度の差を示さない。明らかに、ハプロタイプの複雑さは他の人種におけるその頻度の直接的評価を必要とし、現在の推測は、疼痛保護的ＧＣＨ１ハプロタイプの対立遺伝子頻度に存在し得る人種差に対する感作以上のものを提供することができず、このことは、その臨床的な役割の将来的評価において対処されなければならない。
【００１５】
疼痛、特に神経因性疼痛の発症に対する保護と関連する（以下、「疼痛保護的」とも称する。）本発明に従って同定されたＧＣＨ１ハプロタイプは、ＧＣＨ１遺伝的バリアントに基づいて記載された第三のＧＣＨ１表現型である。ＧＣＨ１突然変異と関連する疾病は、コード領域中のＧＣＨ１突然変異によって又はエクソン欠失を含む遺伝子の大部分の欠失によって引き起こされる（１１、１３、１４）、ＤＯＰＡ応答性遺伝的進行性ジストニア（１１）及び異型フェニルケトン尿症（１２）である。これらの稀なＧＣＨ１バリアントは、テトラヒドロバイオプテリン補因子欠損によるドーパミン合成又はフェニルアラニン代謝の有害な異常を引き起こす。本発明の疼痛保護的ＧＣＨ１ハプロタイプは、何れの神経機能障害又は他の明白な病理とも関連していない。
【００１６】
疼痛保護的ＧＣＨ１ハプロタイプを形成するＳＮＰは全て、遺伝子の非コード領域中に局在化している。理論に拘泥するものではないが、それらがプロモーター、イントロン及び３’下流領域中に局在化するということは、それらが減少したＧＣＨ１転写又はＲＮＡの安定性を引き起こし得ることを示唆し、これは、疼痛保護的ハプロタイプの保有者由来のフォルスコリンで刺激された単球中で観察された、対照と比べて、より低いＧＣＨ１ｍＲＮＡ発現と一致する（２）。
【００１７】
疼痛保護に関連する完全なハプロタイプを、信頼性高く検出するために、本発明の基礎を成すスクリーニングアッセイを設計した（２）。３つのＳＮＰの選択は、疼痛保護ハプロタイプに特有である１５のＧＣＨ１ＤＮＡ位置の単一の対立遺伝子又はその組み合わせの同定に基づいた。これは、ＧＣＨ１遺伝子型／表現型の関連を与えるための完全な１５の位置のハプロタイプ内の特定のＳＮＰの相対的な機能的重要性とは独立したものである。低い疼痛スコアとの関連の統計学的有意性のレベルが最も高い２つのＧＣＨ１ＳＮＰ、すなわちｄｂＳＮＰｒｓ８００７２６７Ｇ＞Ａ及びｄｂＳＮＰｒｓ３７８３６４１Ａ＞Ｔが本発明のスクリーニングアッセイに含まれる。最も好ましいのは、本発明の診断が前記急性及び／又は慢性の疼痛、特に神経因性の疼痛から保護される個体を同定する、本発明の方法である。
【００１８】
本発明の方法は、哺乳動物全般において実施することが可能であるが、ヒト試料を用いて本発明の方法を実施することが好ましい。このような試料は、例えば、血液、尿、精液、毛髪又は分析されるべき核酸を少なくとも含有する他の何れかの組織であり得る。
【００１９】
本発明の方法の一部である核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡであり得る。検出は、配列決定、ミニ配列決定、ハイブリッド形成、制限断片分析、オリゴヌクレオチド連結アッセイ又は対立遺伝子特異的ＰＣＲによって達成することができる。
【００２０】
適用可能な診断技術には、ミニ配列決定などのＤＮＡ配列決定、プライマー伸長、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）とのハイブリッド形成、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）、対立遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲ（ＡＲＭＳ）、ドットブロット分析、フラッププローブ切断アプローチ、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、速度論的ＰＣＲ及びＰＣＲ−ＳＳＣＰ、蛍光インサイチュハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）分析、サザンブロット分析、一本鎖立体構造分析（ＳＳＣＡ）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、変性ＨＰＬＣ（ＤＨＰＬＣ）及びＲＮＡｓｅ保護アッセイが含まれ（これらに限定されるものではない。）、これらは全て当業者に公知であり、以下でさらに詳しく論述されている。
【００２１】
多型／突然変異の存在は、身体の何れかの組織からＤＮＡを抽出することによって決定することができる。例えば、血液を採取し、血液細胞からＤＮＡを抽出し、分析することができる。さらに、胎児の細胞、胎盤の細胞又は羊水の細胞を遺伝子中の突然変異に関して検査することによって、症状の出生前診断が可能である。特異的対立遺伝子の検出を可能とする幾つかの方法が存在し、これらの方法の幾つかが本明細書で論述されている。
【００２２】
公知の多型に関しては、各遺伝子型の直接的決定が、通常選択される方法である。今日、産業的な高情報処理遺伝子型決定のための最新式アプローチは、対立遺伝子特異的なプライマー伸長、対立遺伝子特異的ハイブリッド形成、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド連結及びフラッププローブの対立遺伝子特異的切断という４つの異なる機序の１つに依存している（Ｋｗｏｋ，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  １，９５（２０００））。配列決定又はミニ配列決定プロトコールは、手動の又は自動化された手段のいずれかによる、プライマー伸長法、例えばゲノムＤＮＡ配列決定の一部である。ミニ配列決定（プライマー伸長）技術は、バリアント部位において直接、一塩基だけプライマーを伸長させることによって、特異的塩基において配列を決定することを基礎とする（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．８：７６９−７６（１９９８））。別の検出法と組み合わされた短い配列反応は、リアルタイムピロリン酸配列決定の性質である（Ｎｙｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：３６３（１９９８））。
【００２３】
対立遺伝子特異的ハイブリッド形成プロトコールは、ＳＮＰ位置に存在する対立遺伝子の１つ又は数個を検出するプローブに依存する。ハイブリッド形成現象の検出のために、幾つかの技術が開発された。５’ヌクレアーゼアッセイ及び分子指標アッセイにおいて、ハイブリッド形成プローブは蛍光標識されており、プローブ結合は、蛍光標識の挙動の変化を介して検出される（Ｌｉｖａｋ，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１４，１４３（１９９９）；Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，４９（１９９８））。ハイブリッド形成現象は液相中で又は固体表面に結合されたプローブ若しくは標的を用いて生じ得る。
【００２４】
従って、遺伝子型決定目的でアレイ（マイクロチップ）が使用される場合にも、ハイブリッド形成が使用される。核酸分析のこの技術は、本発明に対しても適用できる。アレイは、シリコンチップ上のアレイ中に構築された異なる数千のヌクレオチドプローブから典型的になる。分析されるべき核酸は蛍光標識されており、チップ上のプローブにハイブリッド形成する。この方法は、プローブの数千の同時平行的な処理の１つであり、解析を極めて加速することができる。幾つかの刊行物に、この方法の使用が記載されている（Ｈａｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４，４４１（１９９６）；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４，４５０（１９９６）；Ｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，６１０（１９９６）；ＤｅＲｉｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４，４５７（１９９６），Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，１０，８５３（２０００））。
【００２５】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド連結アッセイは、高い特異性を有する。５’末端又は３’末端において対立遺伝子特異的塩基が異なるオリゴヌクレオチドは、テンプレートのそれぞれのオリゴヌクレオチド末端に完全に結合された場合にのみ、連結反応において加工される。均一アッセイ系を作製するために、この方法は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）標識と組み合わされてきた（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．８，５４９（１９９８））。フラッププローブの対立遺伝子特異的切断は、２つの重複するオリゴヌクレオチドによって作製された構造を切断するために、最近発見されたフラップエンドヌクレアーゼ（クリーバーゼ）の特性を使用する。このアプローチでは、２つの重複するオリゴヌクレオチドが多型部位に結合される。次いで、標的配列と完全に合致するオリゴが切断反応によって検出される（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：２９２（１９９９））。
【００２６】
特異的な塩基変異を検出する他の方法（対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリッド形成など）は、通常、より低い情報処理量を可能にするに過ぎない。対立遺伝子特異的ＰＣＲに関しては、本発明に係る特定のＧＣＨ１塩基変異の１つに、３’末端でハイブリッド形成するプライマーが使用される。存在する対立遺伝子のみに対して、それぞれのＰＣＲ産物が生成される（Ｒｕａｎｏ  ａｎｄ  Ｋｉｄｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７，８３９２（１９８９））。対立遺伝子特異的ＰＣＲの修飾を増加させる特異性は、欧州特許出願公開０３３２３４５号及び「Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ１７，２５０３（１９８９）」に開示されているような増幅抵抗性突然変異系（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）である。変異が核酸プロセッシングの特異的認識部位の変化をもたらす場合には、これらの変異を検出するために、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブ又はＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などの酵素法も使用し得る。
【００２７】
他のアプローチは、基準配列に関する変化が核酸中に存在することのみを検出することができる。これらの方法の多くは、両ＳＮＰバリアントが同じ試料中に存在するときのミスマッチの形成を基礎とする。現在極めて人気のある方法は、ホモ二本鎖分子からヘテロ二本鎖分子を分離するための変性高性能液体クロマトグラフィーの使用である（ＤＨＰＬＣ；Ｏｅｆｎｅｒ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ５７（Ｓｕｐｐｌ．），Ａ２６６（１９９５））。別の方法は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）である（Ｗａｒｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ１８，２６９９，（１９９０）；Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８６，２３２（１９８９））。ＤＧＧＥを使用することによって、ＤＮＡ中の変異は変性勾配ゲル中での対立遺伝子バリアントの遊走速度の差によって検出することができる。変法は、固定された変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ（ｃｌａｍｐｅｄ  ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）；Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ４９，６９９（１９９１））、ヘテロ二本鎖分析（ＨＡ；Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４，５６０（１９９２））及び化学的ミスマッチ切断（ＣＭＣ（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｃｌｅａｖａｇｅ）；Ｇｒｏｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８６，５８８８（１９８９））である。イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｍｕｔＳタンパク質など、ヌクレオチドのミスマッチを認識するタンパク質の使用は、ミスマッチが生じたＤＮＡ分子を検出するのに役立ち得る（Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２５，２２９（１９９１））。ｍｕｔＳアッセイでは、タンパク質は、突然変異体と野生型配列間でのヘテロ二本鎖中にヌクレオチドミスマッチを含有する配列のみに結合する。ＲＮａｓｅ保護アッセイは、別の選択肢である（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ７，１６７（１９９０））。ＲＮＡｓｅ保護アッセイは、突然変異体断片を２つ又はそれ以上のより小さな断片へ切断させることを含む。別の方法は、一本鎖立体構造多型アッセイ（ＳＳＣＰ；Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８６，２７６６（１９８９））を使用することである。基準配列からの遺伝子のＤＮＡ配列の変異は、ＳＳＣＰゲル中の対応するＤＮＡ断片のシフトした移動度によって検出される。変異は一本鎖の分子内塩基対合の差を引き起こすので、ＳＳＣＰは、異なって遊走するバンドを検出する。
【００２８】
配列変異の検出に関して上述されている間接的な方法は、罹患した家族の構成員中に以前に見出された配列変異の存在に関して、親戚をスクリーニングするために特に有用である。当業者に公知の小さな配列変異を検出するための他のアプローチを使用することができる。
【００２９】
多型／点突然変異の検出は、ゲノム又はｃＤＮＡからの増幅（例えばＰＣＲ）及び増幅された核酸の配列決定によって、又はＧＣＨ１対立遺伝子の分子クローニング及び本分野で周知の技術を用いて対立遺伝子を配列決定することによって達成され得る。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態において、遺伝子ＧＣＨ１のヌクレオチド変化の少なくとも１つは、前記哺乳動物の試料から得た遺伝子の前記変化の少なくとも１つを含有する多型／バリアント核酸の別の形態に対して特異的にハイブリッド形成する遺伝子プローブをハイブリッド形成し、ハイブリッド形成産物の存在を検出することによって、試料中で検出され、前記産物の存在は前記試料中の前記塩基配置の存在を示す。
【００３１】
本明細書において、例えば、遺伝子プローブは、少なくとも１つのバリアント塩基、好ましくは両バリアント塩基を用いて合成され、単一塩基バリアントの区別を可能とする厳格な条件下で個別にハイブリッド形成される１５から５０塩基のオリゴマーＤＮＡ配列である。あるいは、より低い厳格度の条件下で、分析されるＤＮＡ鎖の多型位置に、存在し得る４つの全ての塩基に相当する１５から５０塩基長の遺伝子プローブの組をハイブリッド形成によるタイプ決定のために使用することができる。この場合には、塩基相補性の異なる程度を用いた全てのハイブリッド形成実験から得られた結果は、バリアント部位における最終のヌクレオチド配置を予想するためのアルゴリズムによって分析する必要がある。
【００３２】
好ましいのは、ａ）増幅されたＧＣＨ１核酸を作製するために特異的なプライマーの組を用いて、前記試料中のＧＣＨ１核酸の全部又は一部を増幅し、ｂ）増幅された核酸を配列決定し（例えば、ミニ配列決定し）、ｃ）少なくとも１つのＳＮＰの存在を検出し、これにより、前記試料中の前記ヌクレオチドの変化の存在を検出することによって、少なくとも１つのＳＮＰが検出される本発明の方法である。好ましくは、プライマーは、検出可能な標識、例えば、放射性核種、フルオロフォア、ペプチド、酵素、抗原、抗体、ビタミン又はステロイドをさらに含有することができる。
【００３３】
好ましくは、遺伝子座当り１つ、２つ又は好ましくは３つの全てのＳＮＰ対立遺伝子からなるＧＣＨ１のＳＮＰ対立遺伝子の組み合わせが検出される。遺伝子ＧＣＨ１中の統計的に有意な他のＳＮＰとの組み合わせ、例えば、（２）に開示されているように及び／又は以下の表に従ってＧＣＨ１中の１２の他のＳＮＰから選択されるＳＮＰなどが分析される本発明の方法も好ましい。
【００３４】
【表１】
2010502205.tif 000002
【００３５】
ＫＣＮＳ１、ＯＰＭＲ１（例えば、１１８Ａ＞ＧのＳＮＰ）、ＣＯＭＴ及びＰＧＨＳ２（例えば、−７６５Ｇ＞ＡのＳＮＰ）の群から選択される遺伝子中の他の統計的に有意なＳＮＰとの組み合わせが分析される本発明の方法も好ましい。好ましくは、この検出によって、０．８０を上回る（好ましくは、約０．９０を上回る）感受性及び約０．７０又はそれ以上、好ましくは約０．９又はそれ以上の特異性を有する疼痛保護的ハプロタイプの検出が可能となる。
【００３６】
本発明において、統計学的検定又は別の分類の「感受性」（一般に、真正陽性率とも称される。）という用語は、陽性結果を認識する確率を示す。従って、感受性は、真に存在する陽性結果の合計のうち、陽性として正しく同定された結果（真正陽性）の割合を与える。例えば、疾病を決定するための医学的検査／診断法における感受性は、疾病を有するとして正しく同定された罹病患者の割合を示す。
【００３７】
本発明において、統計学的検定又は別の分類の「特異性」（一般に、真正陰性率とも称される。）という用語は、陰性結果を認識する確率を示す。従って、特異性は、真に存在する陰性結果の合計のうち、陰性として正しく同定された結果（真正陰性）の割合を与える。例えば、疾病を決定するための医学的検査／診断法における特異性は、疾病を有さないとして正しく同定された罹病患者の割合を示す。
【００３８】
本発明の別の態様は、フォルスコリン、ＬＰＳなどでの細胞の刺激を加えて又は細胞の刺激を加えずに、全血及び／又は単離された白血球中のバイオプテリンを分析することをさらに含む、本発明の方法に関する。バイオプテリンの分析のための典型的な方法は、（２）に記載されている。バイオプテリンとのこのような組み合わせ分析は、本発明の方法の機能的な予測性を増加させ、相乗的な増加として最適であることが予測される。
【００３９】
本発明の別の態様は、ａ）上記本発明の方法を実施すること、及びｂ）工程ａ）で得られた結果に少なくとも部分的に基づいて、前記哺乳動物に対する鎮痛性物質の有効な投薬量を決定すること、並びにｃ）前記投薬量を医薬として許容される担体及び／又は希釈剤と混合することを含む、有効な鎮痛性組成物を作製する方法に向けられる。
【００４０】
一般に、疼痛の治療及びそれぞれの鎮痛性組成物は当業者に周知であり、本発明は、本発明のこの態様において、患者の他の群に比べて、「個別化された」治療に対して異なって反応し得る個別の患者及び／又は患者の群の疼痛の「個別化された」治療に対する基礎を与える。本発明の方法は、（例えば、過剰投薬による）医薬の望ましくない副作用を低減させるのに役立ち、毒性物質又は依存性物質（例えば、オピオイドなど）の服用量を低下させるのに役立ち、従って、有効でない不必要な治療及び高価な医薬を避けることによって費用を節約するのに役立ち得るという点で特に有利である。鎮痛性物質そのもの及び鎮痛性組成物がどのようにして調合されるかは当業者に周知であり、それぞれの文献中に詳しく記載されている。本発明の方法は、例えば、ウイルス感染（例えば、帯状疱疹、ＨＩＶ）を有する患者中の慢性的疼痛又は神経毒性である可能性を有する治療（化学療法、放射線照射又は他の薬物）又は神経の損傷を伴う手術（例えば、ヘルニア切除術、乳房切除術）に対するリスクを評価するのに役立つという点で特に有利である。
【００４１】
従って、本発明の別の態様は、ａ）上記本発明の方法、及びｂ）工程ａ）で得られた結果に少なくとも部分的に基づいて、前記哺乳動物に鎮痛性物質を与えることを含む、哺乳動物中の疼痛を治療する改善された方法に向けられる。好ましいのは、上記本発明の有効な鎮痛性組成物が投与される本発明の方法である。
【００４２】
最後に、本発明は、ＳＮＰｒｓ８００７２６７Ｇ＞Ａ、ｒｓ３７８３６４１Ａ＞Ｔ、ｒｓ８００７２０１Ｔ＞Ｇ、ｒｓ４４１１４１７Ａ＞Ｇ、ｒｓ７５２６８８Ｇ＞Ａ及びｒｓ１０４８３６３９Ｃ＞Ｇからなる群から、好ましくはＳＮＰｒｓ８００７２６７Ｇ＞Ａ、ｒｓ３７８３６４１Ａ＞Ｔ及びｒｓ１０４８３６３９Ｃ＞Ｇからなる群から選択される遺伝子ＧＣＨ１のＳＮＰの少なくとも１つを検出するための少なくとも１つのプローブ及び／又はプライマーの組を含む診断用キット及び／又は研究用キットにも向けられる。キットは、本発明の方法を実施するための酵素、緩衝液及び／又は色素などの他の化合物を含有することができる。別の例において、本発明のキットは、本発明の少なくとも１つのＳＮＰ中でチップをベースとする分析を実施することが適切である。キットは、本明細書に記載されている統計解析のためのＳＮＰ分析及び／又はソフトウェアを実施するための指示書も含むことができる。
【００４３】
本発明において「素因がある」又は「疼痛に対して感受性を有する」とは、検査中の個体が、それぞれ、より短い、より頻度が少ない又はより激しくない疼痛感覚を有する個体と比べて、より長く、より頻繁な又はより激しい疼痛の感覚を体験することを意味するものとする。
【００４４】
本発明の別の態様によれば、本発明の方法は、疼痛及び疼痛を伴う症状から保護される個体、すなわち、前記疼痛に罹患する可能性がより低い個体の同定を可能とする。好ましくは、前記遺伝的素因又は感受性は、神経損傷（例えば、外傷性、虚血性、毒性、代謝性、感染性、免疫媒介性、収縮性、変性性など）、炎症（例えば、感染性、免疫媒介性）、虚血又は腫瘍増殖によって引き起こされ又は寄与する疼痛を含む。
【００４５】
要約すると、本発明者らは、３つのＳＮＰからなる疼痛保護的ＧＣＨ１ハプロタイプに対する高情報処理量の自動化可能なスクリーニングアッセイとなる可能性を秘めたアッセイを開発した。情報分析によって、遺伝子型決定されるべきＤＮＡ位置の数はこれらの３つまで減少させることができ、ハプロタイプの信頼できる診断をなお可能とすることを示す。これによって、その診断に対する研究室の労力が大幅に減少し、従って、疼痛保護的ＧＣＨ１ハプロタイプの臨床的な重要性のさらなる調査を容易にする。
【００４６】
本発明の目的において、本明細書中に引用されている全ての参考文献は、参照により、その全体が組み込まれる。ここで、添付の図面に関して、以下の実施例において、本発明をさらに説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、ＧＣＨ１一塩基多型（Ｅｎｓｅｍｂｌｅデータベースｖ．３８−２００６年４月）の位置の概要を示しており、低い疼痛スコアと有意に関連する一塩基多型は薄い灰色で符号化されている（＊Ｐ＜０．０５；表１中の各ＳＮＰに対する疼痛スコア）。１％を超える頻度を有し、研究された染色体の９４％を占める８つのハプロタイプの遺伝子型−表現型の関連を分析した。各ハプロタイプ中の文字は、１５のＧＣＨ１ＳＮＰに対する対立遺伝子である。各ハプロタイプに対する疼痛スコアは、共変量に対して調整された、安静時、歩行後の疼痛の頻度及び手術後におけるそれらの改善を評価する４つの質問から計算された「下肢痛」に対する平均ｚスコアである。より低いスコアは、より低い疼痛に対応する。強調表示されたハプロタイプ（白）は、７つの他のハプロタイプに比べて、より低い「下肢痛」スコアと関連していた。Ｐ０．００９。分析の前に、進行中の神経因性疼痛の反映として、本発明者らは、単一の主要評価項目である椎間板切除術後の術後最初の年にわたる持続的下肢痛を指定した。４つの項目により、手術前並びに手術から３ヶ月、６ヶ月及び１２ヶ月後に下肢痛を評価した。前週における「下肢痛」の頻度及び「歩行後の下肢痛」の頻度に、なし（０点）、極めて稀（１）、数回（２）、約１／２の回数、（３）、日常的に（４）、ほぼ常に（５）及び常に（６）として評点を与えた。手術以来の「下肢痛」の改善又は「歩行後の下肢痛」の改善には、疼痛が完全に消失（０）、大幅に改善（１）、改善（３）、僅かに改善（３）、ほぼ同じ（４）、僅かに悪化（５）及び大幅に悪化（６）として評点を与えた。各患者における各変数に対して、本発明者らは、最初の年に対する曲線下面積スコアを計算し、０に等しい平均と１に等しい標準偏差を有するｚスコアに対して、各変数に対する患者のＡＵＣスコアを標準化した。主要な疼痛結果変数は、これら４つのｚスコアの平均であった。方程式：個体の疼痛スコア＝（一般的でない対立遺伝子のＲ１＊数）＋（Ｒ２＊共変量）＋誤差を用いた回帰分析によって、各ＳＮＰに対する遺伝子型−表現型関連性を求めた。（Ｒ１、Ｒ２＝回帰係数）。共変量は、性別、年齢、作業者の補償状況、最初の登録後における手術の遅れ及びＳｈｏｒｔ−Ｆｏｒｍ３６（ＳＦ−３６）一般的健康尺度など、多数の人口学的、心理学的及び環境的因子であった。１５のＧＣＨ１ＳＮＰによって生成される全てのハプロタイプの関数及び関連する共変量の関数として疼痛スコアをモデル化することによって、疼痛スコアとジプロロタイプ（ｄｉｐｌｏｌｏｔｙｐｅ）間の関連を評価するために、段階的回帰を適用した。１％を超える頻度を有するハプロタイプのみをモデルに組み入れ、独立した変数として使用した。ハプロタイプが平均疼痛スコアから有意に異なる（Ｐ＜０．０５）疼痛スコアと関連していれば、個別のＳＮＰに対して上述されている類似のモデルを用いた回帰分析によって、表現型−ジプロタイプ関連分析を行った。
【実施例】
【００４８】
染色体１４ｑ２２．１−ｑ２２．２上のＧＣＨ１遺伝子の配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ／ｇｅｎｅｖｉｅｗ？ｄｂ＝ｃｏｒｅ；ｇｅｎｅ＝ＥＮＳＧ０００００１３１９７９において、データベースＥｎｓｅｍｂｌＧｅｎｅＩＤＥＮＳＧ０００００１３１９７９から得た。ＳＮＰは、ＮＣＢＩＳＮＰデータベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／（ｄｂＳＮＰに受付番号が後続）に従って名付けられる。
【００４９】
ＧＣＨ１遺伝子スクリーニングに対するＳＮＰ選択
スクリーニングアッセイのためのＧＣＨ１ＳＮＰの選択は、（ｉ）疼痛ＧＣＨ１ハプロタイプに対する識別特性、（ｉｉ）腰部椎間板切除術後の最初の１２ヶ月にわたる下肢痛の第一義的転帰に対する統計的有意性（２）及び（ｉｉｉ）疼痛保護的ハプロタイプを検出するための得られたスクリーニングアッセイの感受性及び特異性に基づいた。感受性＝真正陽性／（真正陽性＋偽陰性）及び特異性＝真正陰性／（真正陰性＋偽陽性）として計算した。
【００５０】
当初の（２）ＧＣＨ１遺伝子データの組は、外科的な椎間板切除術後の患者から得た２９０のＤＮＡ試料からなり、５’−エキソヌクレアーゼ法を用いて、１５のＧＣＨ１一塩基多型（ＳＮＰ）がスクリーニングされた（６）。ＧＣＨ１ハプロタイプは、ＰＨＡＳＥを用いたコンピュータ上でのハプロタイプ決定を用いて同定された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔａｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｓｔｅｐｈｅｎｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｈｍｌ）［７．８］。疼痛保護的ハプロタイプ＃３（２）は、ＤＮＡＳＮＰ４（ｄｂＳＮＰｒｓ３７８３６４１Ａ＞Ｔ、イントロン１の８９００番目のヌクレオチド）のチミンとともに、ＳＮＰ１（ｄｂＳＮＰｒｓ８００７２６７Ｇ＞Ａ＝ＧＨＣ１プロモーターＳＮＰ−９６１０Ｇ＞Ａ）におけるアデニンにより、１０の最も高頻度のハプロタイプ（計９４．４％に達する。）とは異なる。これらの２つのＤＮＡ位置に基づく、疼痛保護的ハプロタイプへの２９０人の個体の正確な割り当ては、ＰＨＡＳＥを用いたコンピュータ上でのハプロタイプ決定によって評価した（７，８）。これは１を下回る特異性をもたらしたので、第三のＳＮＰであるｄｂＳＮＰｒｓ１０４８３６３９Ｃ＞Ｇをスクリーニングアッセイ中に含めた。これにより、所望される１の検査感受性及び特異性が得られた。
【００５１】
ピロシーケンシングスクリーニングアッセイ
ＤＮＡ抽出
遺伝子型の決定に同意した６２９人の健康な親戚関係にない白人被験者（年齢２７．１＋／−５．５歳）から、スクリーニングアッセイを開発するためのＤＮＡ試料を得た。被験者は、フランクフルト大学病院で、チラシによって募集した。この手続きは、フランクフルトのヨハン・ウォルフガング・ゲーテ大学の医学施設倫理委員会によって承認された。ＮＨ４−ヘパリン管中に血液試料を採取した。ＢｉｏＲｏｂｏｔＥＺ１Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上のＥＺ１ＤＮＡＢｌｏｏｄ２００μＬＫｉｔに提供されていた「血液及び体液の遠心プロトコール（ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｂｏｄｙ  ｆｌｕｉｄ  ｓｐｉｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）」を用いて、２００μＬの血液からゲノムＤＮＡを抽出した。
【００５２】
アッセイのデザイン
ピロシーケンシング（９，１０）では、短いオリゴヌクレオチド（シーケンシングプライマー）は、突然変異に近接した一本鎖ＤＮＡに結合し、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を分配することによって伸長される。分配されたｄＮＴＰがＤＮＡ配列の次のヌクレオチドと合致すれば、分配されたｄＮＴＰはオリゴヌクレオチド中に取り込まれ、ピロリン酸（ＰＰｉ）が放出される（ＤＮＡｎ＋ｄＮＴＰ＋ＤＮＡｎ＋１＋ＰＰｉ）。ＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼに対する基質としてのアデノシン５−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）と一緒に使用される。生じたＡＴＰは、ルシフェラーゼによって触媒されるルシフェリンのオキシルシフェリンへの転化の引き金を引き、添加されたヌクレオチドの数に比例する強度の光を発する。光はいわゆるプログラム中でピークとして可視化されるのに対して、取り込みが存在しない場合には、ピークは観察されない。
【００５３】
目的のＧＣＨ１遺伝子セグメント（プロモーター／５’ＵＴＲ、イントロン１及び３’ＵＴＲの一部）のＰＣＲ増幅にとって必要なプライマー及びシーケンシングプライマーは、ピロシーケンシングＡｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン１．０．６；ＢｉｏｔａｇｅＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて設計された。
【００５４】
ＳＮＰｄｂＳＮＰｒｓ８００７２６７Ｇ＞Ａに対するＰＣＲプライマーは、
フォワード：５’−ＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＴＧＡＧＴＴ−３’（配列番号１）及び
リバース：５’−ビオチン−ＡＡＴＧＴＴＡＡＣＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＣＧ−３’（配列番号２）であり、
ｄｂＳＮＰｒｓ３７８３６４１Ａ＞Ｔに対するＰＣＲプライマーは、
フォワード：５’−ＧＣＴＡＴＴＴＧＣＴＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＣＴＡ−３’（配列番号３）及び
リバース：５−ビオチン−ＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＡＡＴＴＧＴＴＣＡＣ−３’（配列番号４）であり、並びに
ｄｂＳＮＰｒｓ１０４８３６３９Ｃ＞Ｇに対するＰＣＲプライマーは、
フォワード：５’−ＡＴＣＣＴＴＴＣＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＴＧ−３’（配列番号５）及びリバース：５’−ビオチン−ＧＣＡＴＴＣＴＡＡＡＡＴＣＡＧＧＧＡＡＡＡＴＣＡ−３’（配列番号６）
であった。
【００５５】
ｄｂＳＮＰｒｓ８００７２６７Ｇ＞Ａに対するシーケンシングプライマーは、５’−ＣＴＴＧＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＴＧＧ−３’（配列番号７）、
ｄｂＳＮＰｒｓ３７８３６４１Ａ＞Ｔに対するシーケンシングプライマーは、５’−ＣＣＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴ−３’（配列番号８）、
ｄｂＳＮＰｒｓ１０４８３６３９Ｃ＞Ｇに対するシーケンシングプライマーは、５’−ＧＧＴＧＴＧＴＧＴＡＴＧＴＡＣＡＡＣＴＴ−３’（配列番号９）であった。
【００５６】
ＧＣＨ１遺伝子に対するプライマーの特異性は、並置によって確認した（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）。さらに、ソフトウェアは、３つのＳＮＰを検出するためのｄＮＴＰの分配順序を規定した。同様に、本明細書に開示されているような他のＳＮＰに対する全てのプライマー配列は、同じ方法を用いて設計することができる。
【００５７】
ＰＣＲ増幅
ポリメラーゼ連鎖反応は、５０μＬの総容量で行った。ＰＣＲ増幅後、臭化エチジウム染色されたアガロースゲル上で、数個の試料を制御した。ゲルでは、特異的な産物のバンドが観察された（ＳＮＰｄｂＳＮＰｒｓ８００７２６７Ｇ＞Ａに関しては３２１塩基対のＰＣＲ産物、ｄｂＳＮＰｒｓ３７８３６４１Ａ＞Ｔに関しては２１６塩基対及びｄｂＳＮＰｒｓ１０４８３６３９Ｃ＞Ｇに関しては１６１塩基対）。
【００５８】
各２５μＬ容量のＰＣＲ−テンプレート（ビオチン化された一本鎖及びビオチン化されていない一本鎖）を１つのウェル中にピペット操作で添加し、ストレプトアビジンで被覆されたセファロースビーズ３μＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、結合緩衝液３７μＬ及びＨＰＬＣによって精製された水１５μＬの混合物との温置（振盪装置８００分−１、５分室温）によって固定化した。特異的複合体は、ストレプトアビジンによって被覆されたセファロースビーズ及びビオチン化された一本鎖から構成される。
【００５９】
ビオチン化されていない一本鎖からのこれらの複合体の分離は、Ｖａｃｕｕｍ  Ｐｒｅｐ  Ｗｏｒｋｔａｂｌｅ（ＢｉｏｔａｇｅＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で行った。真空によって全ての液体を除去した後、特異的複合体を捕捉し、７０％エタノール中に５秒間移し、０．２ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ中で５秒間変性し、Ｔｒｉｓ緩衝液で５秒間洗浄した。次いで、１０μｍｏｌ／Ｌのシーケンシングプライマー０．１５μＬ及び徐冷緩衝液（２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ、２ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウム四水和物、ｐＨ７．６）４３．５μＬを予め充填したＰＳＱ９６ＰｌａｔｅＬｏｗ（ＢｉｏｔａｇｅＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に複合体を移した。続いて、ＰＳＱ９６ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐＴｈｅｒｍｏｐｌａｔｅＬｏｗ（ＢｉｏｔａｇｅＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）中で、８０℃で２分間プレートを加熱し、室温まで冷却した。
【００６０】
ピロシーケンシング分析
配列決定は、提供された（ＰｙｒｏＧｏｌｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＳＮＰ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｂｉｏｔａｇｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の酵素、基質及びヌクレオチドを用いてＰＳＱ９６ＭＡ（ＢｉｏｔａｇｅＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で行った。全ての緩衝液は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｅａｄ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｂｕｆｆｅｒ調製（ＢｉｏｔａｇｅＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の推奨される操作手順に従って調製した。各ＳＮＰのＰＣＲテンプレートの十分な量を、ストレプトアビジンで被覆されたセファロースビーズ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を加えた振盪装置中で温置し（１０分）、ビオチン化されたテンプレートを対応する０．３５μｍｏｌ／Ｌシーケンシングプライマー５５μＬ中に移すために、ＶａｃｕｕｍＰｒｅｐＷｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ピロシーケンシングＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）中の７０％エタノール及び変性緩衝液を用いて調製した。配列決定は、８０℃で２分間の温置後に行った。
【００６１】
古典的な配列決定
３つのアッセイによって提供された正しい遺伝的診断を確認するために、野生型（ｎ＝ＸＸ対照試料）、ヘテロ接合（ｎ＝Ｘｘ対照試料）及びホモ接合（ｎ＝ＸＸ対照試料）遺伝子型の計４０の試料を旧来の方法で配列決定し（ＡＧＯＷＡ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ピロシーケンシングの際の陽性対照として実行した。
【００６２】
３つのＳＮＰによる疼痛保護的な１５位置のＧＣＨ１ハプロタイプの予想
１５のＤＮＡ位置を用いた最初のハプロタイプ決定に基づいて、疼痛保護的ハプロタイプの７８のヘテロ接合、６つのホモ接合及び２０６の非保有者を見出した（１５．５％の当該ハプロタイプの対立遺伝子頻度に相当する（二項９５％信頼区間：１２．７％から１８・７％）。）。
【００６３】
２つのＤＮＡ位置（ｄｂＳＮＰｒｓ８００７２６７Ａ及びｄｂＳＮＰｒｓ３７８３６４１Ｔ）を含むハプロタイプの割り当てに基づいて、疼痛保護的ハプロタイプの８６のヘテロ接合性及び６つのホモ接合性保有者が予想された（１６．８％の当該ハプロタイプの対立遺伝子頻度に相当する。）。偽陽性の割り当てが８つ及び偽陰性の割り当ては０であり、ハプロタイプ＃３に対するスクリーニング試験の感受性及び特異性は、それぞれ、１及び０．９６であった。３つのＤＮＡ位置（ｄｂＳＮＰｒｓ８００７２６７Ａ、ｄｂＳＮＰｒｓ３７８３６４１Ｔ及びｄｂＳＮＰｒｓ１０４８３６３９Ｇ）を含むハプロタイプの割り当てによって、疼痛保護的ハプロタイプの７８のヘテロ接合保有者及び６つのホモ接合保有者全てが正しく予想された（１のスクリーニング試験感受性及び特異性に相当する。）。ホモ接合及びヘテロ接合の被験者の数は、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡（χ２検定；ｐ＞０．０５）に従っていた。２９０ｍの試料（２）中のｄｂＳＮＰｒｓ８００７２６７Ａ、ｄｂＳＮＰｒｓ３７８３６４１Ｔ０及びｄｂＳＮＰｒｓ１０４８３６３９Ｇ間の連鎖は、それぞれ、Ｄ’＝０．９、０．８１及び０．８８、並びにｒ２＝０．７８、０．６１及び０．７５によって示された。
【００６４】
疼痛保護的ハプロタイプは、コンピュータ上でのハプロタイプ決定なしに、３つのＳＮＰの遺伝的情報から高い信頼性で割り当てることができた。すなわち、全てのホモ接合性保有者はｄｂＳＮＰｒｓ８００７２６７Ｇ＞Ａに基づいて既に正しく予測することができた。すなわち、ホモ接合性ｄｂＳＮＰｒｓ８００７２６７ＡＡ保有者は疼痛保護ハプロタイプに対してホモ接合であったのに対して、ｄｂＳＮＰｒｓ８００７２６７ＧＧは疼痛保護的ハプロタイプを含んでいなかった。ヘテロ接合性ｄｂＳＮＰｒｓ８００７２６７Ｇ＞Ａを用いると、ｄｂＳＮＰｒｓ３７８３６４１Ａ＞Ｔからの情報は、疼痛保護的ハプロタイプを検出するための特異性を０．９６まで増加させ、ｄｂＳＮＰｒｓ１０４８３６３９０Ｇからの追加的情報は特異性を１まで増加させた。ｒｓ８００７２６７Ｇ＞Ａ、ｒｓ３７８３６４１Ａ＞Ｔ、ｒｓ８００７２０１Ｔ＞Ｇ、ｒｓ４４１１４１７Ａ＞Ｇ及び／又はｒｓ７５２６８８Ｇ＞Ａの組み合わせを分析することによって、類似の効果が達成された。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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