(57)【要約】  本発明は、外来遺伝子を含む組換えキメラモノネガウイルス目ベクターの使用に関する。より具体的には、本発明は、イヌ、ネコ又はウマにおける呼吸器疾患を治療するためのこのようなベクターの使用に関する。本発明の一実施形態は、インフルエンザに対するイヌ、ウマ又はネコの保護又は治療における、Ｈ３Ｎ８インフルエンザ由来のヘマグルチニンを含む組換えニューキャッスル病ウイルスベクターの使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ３Ｎ８インフルエンザ由来のヌクレオチド配列を有する組換えモノネガウイルス目ウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項２】
イヌインフルエンザ由来のヌクレオチド配列を有する組換えモノネガウイルス目ウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項３】
ウマインフルエンザ由来のヌクレオチド配列を有する組換えモノネガウイルス目ウイルスを含む免疫原性組成物。
【請求項４】
前記モノネガウイルス目ウイルスがＮＤＶである、請求項１、２又は３の組成物。
【請求項５】
前記インフルエンザ配列がヘマグルチニン配列である、請求項１、２又は３の組成物。
【請求項６】
異種の呼吸器ウイルスのヌクレオチド配列を有する組換えモノネガウイルス目ウイルスを投与することを含む、呼吸器感染症に対してイヌを保護する方法。
【請求項７】
異種の呼吸器ウイルスのヌクレオチド配列を有する組換えモノネガウイルス目ウイルスを投与することを含む、呼吸器感染症に対してネコを保護する方法。
【請求項８】
異種の呼吸器ウイルスのヌクレオチド配列を有する組換えモノネガウイルス目ウイルスを投与することを含む、呼吸器感染症に対してウマを保護する方法。
【請求項９】
前記配列がインフルエンザヌクレオチド配列である、請求項６、７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記配列がイヌインフルエンザ配列である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記配列がネコインフルエンザ配列である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記配列がウマインフルエンザ配列である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記インフルエンザ配列がＨ３Ｎ８インフルエンザ配列である、請求項１０、１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記インフルエンザ配列がヘマグルチニンインフルエンザ配列である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組換えモノネガウイルス目ウイルスが鼻内投与される、請求項６、７又は８に記載の方法。
【請求項１６】
前記組換えモノネガウイルス目ウイルスが組換えＮＤＶウイルスである、請求項６、７又は８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来遺伝子を含む組換えキメラモノネガウイルス目ベクターの使用に関する。より具体的には、本発明は、イヌ、ネコ又はウマにおける呼吸器疾患を治療するためのこのようなベクターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染した宿主中で複製することができる生ウイルスは、それらの発現された抗原に対して強力で、長期間持続する免疫応答を誘導する。それらは、液性及び細胞媒介性免疫応答の両方を惹起する上で、並びにサイトカイン及びケモカイン経路を刺激する上で有効である。従って、弱毒化された生ウイルスは、通例、免疫系の液性アームのみを刺激することが多い不活化された免疫原又はサブユニット免疫原を基礎とするワクチン組成物に比べて顕著な利点を提供する。
【０００３】
ここ１０年にわたって、組換えＤＮＡ技術は、ＤＮＡとＲＮＡウイルスのゲノムの遺伝子操作の分野に変革をもたらした。特に、現在では、宿主動物中で新たなベクターウイルスが複製した際に、宿主動物中で生物学的効果を発揮することができる外来タンパク質が発現されるように、ウイルスのゲノム中に外来遺伝子を導入することが可能である。このため、組換えベクターウイルスは、微生物感染の管理及び予防のために活用されてきたのみならず、悪性腫瘍及び遺伝子療法などの非微生物学疾患のための標的療法を考案するためにも活用されてきた。
【０００４】
「逆遺伝学」と称される技術によってクローニングされたｃＤＮＡから完全に得られる非分節型のマイナス鎖ＲＮＡウイルス（モノネガウイルス目のウイルス）の作製は、米国特許第６，０３３，８８６号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に最初に記載された。この特許によって、モノネガウイルス目（ＭＶ）のウイルスをベクターとして使用することが可能となった。病原体に対するワクチンを開発することを目指して、病原体に由来する外来抗原を発現するために、ウイルスベクターとしてＭＶ目のウイルスの使用を記載する後続の研究が公表されてきた。
【０００５】
モノネガウイルス目は、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科及びボルナウイルス科という４つの主な科に分類される。これらの科に属するウイルスは、単一の負の（−）センスＲＮＡ分子によって表されるゲノムを有する。すなわち、ＲＮＡゲノムの極性は、プラス（＋）センスとして表されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の極性とは反対である。主なヒト及び動物のＭＶウイルスの分類が、下表に示されている。
【０００６】
【表１】
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【０００７】
ＭＶウイルスのゲノムの組織及び生活環の詳細は周知であり、様々な著者によって概説されている。モノネガウイルス目ウイルスは異なる宿主及び別個の形態学的及び生物学的特性を有しているが、ゲノムの構成並びに複製及び遺伝子発現の典型的なモードにとって不可欠な要素など多くの特徴を共有しており、モノネガウイルス目ウイルスは共通の祖先から生じたことを示している。モノネガウイルス目ウイルスは、細胞の細胞質中で複製し、スプライシングされていないｍＲＮＡを産生する、エンベロープに包まれたウイルスである。
【０００８】
モノネガウイルス目ウイルスは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体及びエンベロープという２つの主な機能単位からなる。上に挙げられている全ての科の属の代表的ウイルスに対する完全なゲノム配列が決定されている。ゲノムは約９，０００ヌクレオチドから約１９，０００のサイズの範囲であり、５から１０個の遺伝子を含有する。ＭＶウイルスのゲノムの構造及び構成は極めて似通っており、特有の遺伝子発現様式によって支配されている。ＭＶウイルスゲノムは全て、核タンパク質（Ｎ又はＮＰ）、ホスホタンパク質（Ｐ）及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）をコードする３つのコア遺伝子を含む。ウイルスのエンベロープは、マトリックス（Ｍ）タンパク質、並びにウイルスの集合／出芽並びにウイルスの細胞付着及び／又は侵入において役割を果たしている１つ又はそれ以上の膜貫通糖タンパク質（例えば、Ｇ、ＨＮ及びＦタンパク質）から構成される。属に応じて、タンパク質のレパートリーは、転写及びウイルス複製においてある種の特異的な制御機能を示し、又はウイルス宿主反応に関与する補助タンパク質（例えば、Ｃ，Ｖ及びＮＳタンパク質）によって拡張される。ＭＶウイルスの遺伝子順序は極めて保存されており、コア遺伝子Ｎ及びＰが３’末端又は３’末端付近に位置し、巨大（Ｌ）遺伝子が５’遠位に位置する。表面糖タンパク質遺伝子Ｍ及び他の補助遺伝子は、Ｎ、Ｐ及びＬ遺伝子の間に位置している。
【０００９】
ＲＮＰ複合体において、ゲノム又はアンチゲノムＲＮＡは、Ｎタンパク質とともに強固にキャプシドを形成しており、Ｌ及びＰタンパク質からなるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを伴う。細胞の感染後に、ＲＮＰ複合体は、２つの異なるＲＮＡ合成機能（すなわち、サブゲノムのｍＲＮＡの転写及び完全長ゲノムＲＮＡの複製）に対する鋳型としての役割を果たすが、裸のＲＮＡゲノムは鋳型としての役割を果たさない。
【００１０】
直列に配置された遺伝子は全て、いわゆる「遺伝子接合部」構造によって隔てられている。遺伝子接合部は、保存された「遺伝子終了」（ＧＥ；ｇｅｎｅ  ｅｎｄ）配列、転写されない「遺伝子間領域」（ＩＧＲ）及び保存された「遺伝子開始」（ＧＳ）配列を含む。これらの配列は、遺伝子転写のために必要且つ十分である。転写の間に、各遺伝子は、最初のＧＳ配列におけるゲノムＲＮＡの３’末端において転写プロセスを開始するウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって、ｍＲＮＡに順次転写される。各遺伝子接合部の転写は、ＧＥ配列におけるＲＮＡポリメラーゼの離脱の結果として中断される。転写の再開は後続のＧＳ配列において起こるが、低下した効率で起こる。この中断されたプロセス（「停止−開始」プロセスとも称される。）の結果、後続の下流遺伝子に比べて、ＭＶウイルスゲノム上の３’近位遺伝子がより豊富に転写されるために、各遺伝子接合部では、転写の弱化が生じる。
【００１１】
各遺伝子が別個のシストロン又は転写単位の一部であるＭＶウイルス遺伝子の転写のモジュール形態のために、これらのウイルスは、外来遺伝子の挿入及び発現のために極めて適切なものとなる。ＭＶウイルスゲノム中の各転写単位は、以下の要素：３’−ＧＳ−翻訳領域（ＯＲＦ）−ＧＥ−５’を含む。
【００１２】
ＭＶウイルスゲノムの全ては、３’及び５’ゲノム末端に、それぞれ、「リーダー」（約４０から５０ｎｔ）及び「トレーラー」（約２０から６００ｎｔ）と称される転写されない短い領域を有する。リーダー及びトレーラー配列は、ゲノムＲＮＡの複製、ウイルスのキャプシド形成及びパッケージングを調節する必須の配列である。
【００１３】
逆遺伝学技術及び感染性ＭＶウイルスの救出によって、そのｃＤＮＡコピーを通じてそのＲＮＡゲノムを操作することが可能となった。このような技術は、米国特許第６，０３３，８８６号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に引用されている。
【００１４】
ウイルスＲＮＡを合成するために必要とされる最小複製開始複合体は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。感染性ＭＶウイルスは、（Ｔ７）ＲＮＡポリメラーゼによって駆動されるプラスミドからの（アンチ）ゲノムＲＮＡ及び適切な支持タンパク質の細胞内同時発現によって救出することができる。米国特許第６，０３３，８８６号に記載されているプロトコール（又はその僅かな変形プロトコール）に基づいて、多くのＭＶウイルス種の信頼できる回収が達成されている。
【００１５】
ニューキャッスル病は家禽の重要な病気であり、世界中の家禽産業に著しい経済的損失をもたらし得る。ニューキャッスル病ウイルスは、ＭＶ目に属する、非分節型のマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。約１５ｋｂの長さであるゲノムは、核タンパク質（ＮＰ）、リン酸化タンパク質（Ｐ）、マトリックス（Ｍ）タンパク質、融合（Ｆ）タンパク質、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ又は巨大（Ｌ）タンパク質をコードする６つの遺伝子を含有する。ＮＤＶ遺伝子は、３’−ＮＰ−Ｐ−Ｍ−Ｆ−ＨＮ−Ｌ−５’の順序で順に配置されており、異なる長さの遺伝子間領域によって隔てられている。全ての遺伝子には、遺伝子開始（ＧＳ）配列が先行しており、その後に、非コード領域、ＮＤＶタンパク質をコードする翻訳領域、第二の非コード領域及び遺伝子終了（ＧＥ）配列が続いている。ＮＤＶゲノムの長さは、６の倍数であり、外来遺伝子の導入のために考慮しなければならない。
【００１６】
インフルエンザは、穏やかな呼吸症状ないし死亡率が高い重度の疾病によって特徴付けられるイヌ、ウマ及びネコの病気である。インフルエンザは、イヌ及びウマにおいて流行している。Ｈ３Ｎ８インフルエンザウイルス（ＣＩＶ）によって引き起こされるイヌインフルエンザ病は、ウマＨ３Ｎ８ウイルスに極めて近縁であり、全てのイヌが感染に対して感受性を有する。曝露されたイヌの約８０％が臨床徴候を生じる。原因因子は、オルトミクソウイルス科に属するＨ３Ｎ８Ａ型インフルエンザウイルスである。
【００１７】
イヌ及びウマインフルエンザは、２００５年４月２１日に出願された米国特許出願第６０／６７３，４４３号；２００６年４月２１日に出願された同第１１／４０９，４１６号；２００６年３月３日に出願された同第６０／７７９，０８０号；２００５年１０月１９日に出願された６０／７２８，４４９号；２００５年１２日２９日に出願された同第６０／７５４，８８１号；２００６年１月１４日に出願された同第６０／７５９，１６２号；２００６年１月２３日に出願された同第６０／７６１，４５１号及び２００６年４月２１日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１５０９０（ＷＯ０６／１１６０８２として公開）（これら全ての全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）にさらに論述されている。ネコインフルエンザは、２００６年１０月２５日に、Ｌａｋｓｈｍａｎａｎ他の名前で出願された米国特許出願第６０／８５４，３５１号（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）にさらに論述されている。
【００１８】
モノネガウイルス目とは異なり、Ａ型インフルエンザウイルスは、１０のタンパク質をコードする負の極性のゲノムＲＮＡセグメントを８つ含有する。表面糖タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（Ｎ）の抗原性に基づいて、Ａ型インフルエンザウイルスはサブタイプに分類された。これまでのところ、１６のヘマグルチニン（Ｈ１からＨ１６）及び９つのノイラミニダーゼ（Ｎ１からＮ９）サブタイプが知られている。
【００１９】
逆遺伝学技術及び感染性の分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルス（インフルエンザなど）の救出によって、ｃＤＮＡコピーを通じてこのようなＲＮＡゲノムを取り扱うことが可能となった。このような技術は、米国特許第６，５４４，７８５号、米国特許第６，６４９，３７２号及び米国特許第６，９５１，７５４号（参照により、全て、その全体が本明細書に組み込まれる。）に引用されている。このような技術は、公開番号２００４／０１４２００３、２００３／０３５８１４、２００６／００５７１１６、２００６／０１３４１３８、２００５／０１８６５６３を有する様々な公開された米国特許出願（これらの全体が、参照により、全て本明細書に組み込まれる。）中にも引用されている。
【００２０】
外来タンパク質を発現する様々な組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスが構築されてきた。重症急性呼吸器症候群のＳ遺伝子及び呼吸器合胞体ウイルスのＦ遺伝子は、それぞれ、霊長類への投与のためにＮＤＶ中に挿入された。様々なインフルエンザサブタイプ由来のヘマグルチニン（ＨＡ）も、様々なベクターウイルス中に挿入された。例えば、Ｈ５Ｎ２インフルエンザ由来のＨＡをコードする核酸は、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）（Ｌｕｓｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９，  ４２４９−５９，  ２００１）中に挿入され、Ｈ３Ｎ２インフルエンザ由来のＨＡは、牛疫ウイルス（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７４，  １０１６５−７５，  ２０００）中に挿入され、Ｈ１Ｎ１由来のＨＡは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）中に挿入された（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７２，  ４７０４−１１，  １９９８）。
【００２１】
ＮＤＶは、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２及びＨ７Ｎ７インフルエンザサブタイプに由来するヘマグルチニン（又はヘマグルチニン誘導体）を発現するためにも使用されてきた（Ｇｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ８１（１）：１５０−８  （２００７）；Ｖｅｉｔｓ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  １０３（２１）：８１９７−２０２  （２００６）；Ｐａｒｋ，  Ｍ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３（２１）：８２０３−８  （２００６））。
【００２２】
インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）のヘマグルチニン遺伝子は、ＮＤＶ株ＨｉｔｃｈｎｅｒＢ１のＰ遺伝子とＭ遺伝子の間にも挿入された。この組換えは致死的な感染に対してマウスを保護したが、マウスに検出可能な体重低下が存在し、体重低下は１０日以内に完全に回復した（Ｎａｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７５，  １１８６８−７３，  ２００１）。外来遺伝子に対して同じ挿入部位を有するさらなる組換えＮＤＶは、低病原性ＡＩＶのＨ７を発現したが、ワクチン接種されたニワトリの４０％を強毒性ＮＤＶ及び高度に病原性のＡＩＶの両方から保護したに過ぎなかった（Ｓｗａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．４７，  １０４７−５０，  ２００３）。
【００２３】
これまでのところ、インフルエンザ遺伝子がＨ１、Ｈ５又はＨ７サブタイプＡ型インフルエンザヘマグルチニン遺伝子に由来する点で、インフルエンザ遺伝子をコードするＮＤＶウイルスの使用は、限定されている。さらに、このような組換えマイナス鎖ウイルスの使用は、トリインフルエンザに対して家禽又は霊長類を保護することに制限され、焦点を絞ってきた。本明細書に記載されている本発明より前に、ウマ、イヌ又はネコをインフルエンザから保護するための、挿入されたＡ型インフルエンザヘマグルチニン遺伝子を有する組換えＮＤＶの使用を記載する研究は公開されていない。しかしながら、イヌ、ウマ及びネコはインフルエンザに対して感受性を有するので、インフルエンザワクチンに対する基礎としての役割を果たし得るこのような構築物に対する要求が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】米国特許第６，０３３，８８６号明細書
【特許文献２】米国特許出願第６０／６７３，４４３号明細書
【特許文献３】米国特許出願第６０／７７９，０８０号明細書
【特許文献４】米国特許出願第６０／７２８，４４９号明細書
【特許文献５】米国特許出願第６０／７５４，８８１号明細書
【特許文献６】米国特許出願第６０／７５９，１６２号明細書
【特許文献７】米国特許出願第６０／７６１，４５１号明細書
【特許文献８】国際特許公開第０６／１１６０８２号
【特許文献９】米国特許出願第６０／８５４，３５１号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，５４４，７８５号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，６４９，３７２号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，９５１，７５４号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開２００４／０１４２００３号明細書
【特許文献１４】米国特許出願公開２００３／０３５８１４号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開２００６／００５７１１６号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開２００６／０１３４１３８号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開２００５／０１８６５６３号明細書
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｌｕｓｃｈｏｗ他、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９、２００１年、ｐｐ．４２４９−５９
【非特許文献２】Ｗａｌｓｈ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４、２０００年、ｐｐ．１０１６５−７５
【非特許文献３】Ｒｏｂｅｒｔｓ他、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７２、１９９８年、ｐｐ．４７０４−１１
【非特許文献４】Ｇｅ，  Ｊ．他、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ８１（１）、２００７年、ｐｐ．１５０−８
【非特許文献５】Ｖｅｉｔｓ，Ｊ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  １０３（２１）、２００６年、ｐｐ．８１９７−２０２
【非特許文献６】Ｐａｒｋ，  Ｍ．  Ｓ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３（２１）、２００６年、ｐｐ．８２０３−８
【非特許文献７】Ｎａｋａｙａ他、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７５、２００１年、ｐｐ．１１８６８−７３
【非特許文献８】Ｓｗａｙｎｅ他、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．４７、２００３年、ｐｐ．１０４７−５０
【発明の概要】
【００２６】
本発明は、Ｈ３型インフルエンザ又はＨ３Ｎ８インフルエンザ由来のヌクレオチド配列を有する組換えモノネガウイルス目ウイルスを含む免疫原性組成物に関する。本発明は、イヌインフルエンザ由来のヌクレオチド配列を有する組換えモノネガウイルス目ウイルスを含む免疫原性組成物にも関する。本発明は、ウマインフルエンザ由来のヌクレオチド配列を有する組換えモノネガウイルス目ウイルスを含む免疫原性組成物にも関する。モノネガウイルス目ウイルスはＮＤＶであり得、及びインフルエンザ配列はヘマグルチニン配列であり得る。
【００２７】
本発明は、異種の呼吸器ウイルスのヌクレオチド配列を有する組換えモノネガウイルス目ウイルスを投与することを含む、呼吸器感染症に対してイヌを保護する方法にも関する。本発明は、異種の呼吸器ウイルスのヌクレオチド配列を有する組換えモノネガウイルス目ウイルスを投与することを含む、呼吸器感染症に対してネコを保護する方法にも関する。本発明は、異種の呼吸器ウイルスのヌクレオチド配列を有する組換えモノネガウイルス目ウイルスを投与することを含む、呼吸器感染症に対してウマを保護する方法にも関する。前記配列は、インフルエンザヌクレオチド配列であり得る。配列は、イヌインフルエンザ配列又はウマインフルエンザ配列であり得る。前記配列は、Ｈ３Ｎ８インフルエンザ配列であり得る。インフルエンザ配列は、ヘマグルチニンインフルエンザ配列であり得る。組換えモノネガウイルス目ウイルスは、鼻内に投与することができる。組換えモノネガウイルス目ウイルスは、組換えＮＤＶウイルスであり得る。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、外来又は異種の遺伝子を含有する組換えキメラＭＶウイルスベクターに関する。外来遺伝子は、ＭＶウイルスベクターの同じ種の異なる株であり得る。あるいは、外来遺伝子は、ＭＶウイルスベクターとは異なるウイルス種に由来し得る。より具体的には、本発明は、イヌ、ネコ又はウマにおける呼吸器疾患を治療するためのこのようなベクターの使用に関する。本発明の一実施形態は、インフルエンザに対するイヌ、ウマ又はネコの保護又は治療における、Ｈ３Ｎ８インフルエンザ由来のヘマグルチニンを含む組換えニューキャッスル病ウイルスベクターの使用である。
【００２９】
イヌ、ウマ及びネコは、Ｈ３、Ｎ８及びＨ３Ｎ８サブタイプＡ型インフルエンザウイルスに対して感受性を有する。さらに、イヌ、ウマ及び／又はネコは、Ｈ５、Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３、Ｎ８、Ｈ３Ｎ８、Ｈ７、Ｎ７及び／又はＨ７Ｎ７サブタイプＡ型インフルエンザウイルスに対して感受性を有し得る。インフルエンザＨ及びＮタンパク質に対する抗体は液性免疫応答において重要であり、感染を阻害し、又は疾病を予防するので、本発明のワクチン及びその使用は、上記Ａ型インフルエンザウイルスのサブタイプの１つ又はそれ以上を基礎とし得る。
【００３０】
外来遺伝子を含む追加の転写単位を有するこのような組換えキメラＭＶウイルスベクターを調製するための方法は、本分野において周知である。例えば、Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒ他の名前で２００７年３月１５日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０７／６４０４６及びＲｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒ他の名前で２００６年３月１５日に出願された米国特許出願第６０／７８３，１９４号（何れも、参照により、全体が本明細書に組み込まれる。）は、外来遺伝子を有する追加の転写単位を含むこのような組換えキメラＭＶウイルスベクターをどのようにして作製するかを記載している。これらの特許出願は、様々なＭＶウイルス種に対するこのような組換えベクターウイルスの調製を記載する文献を引用する。原理的に、本発明において使用するためのこのような組換えキメラＭＶウイルスベクターを作製するために使用される方法は、従来技術の方法と同じである。ＭＶウイルスゲノム中に挿入されるべき外来遺伝子は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０７／６４０４６及び米国特許出願第６０／７８３，１９４号によって定義されているような、適切な３’及び５’非コード領域によって隣接され得る。
【００３１】
国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０７／６４０４６及び米国特許出願第６０／７８３，１９４号は、ＭＶウイルスのゲノム中に挿入された外来遺伝子を含む転写単位中のＭＶウイルス遺伝子の３’及び５’非コード領域の存在が、外来遺伝子の転写及び／又は発現に対して、好ましい効果をどのようにして有するかを記載している。ＧＳ配列とトリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子間及びＡＩＶＨＡ遺伝子とＧＥ配列の間のＭＶウイルス遺伝子の非コード領域を改変することは、そのＡＩＶＨＡ遺伝子を有するＭＶウイルスベクターによって合成されるＨＡｍＲＮＡの量を増加させることが、これらの特許出願において示されている。これらの特許出願は、外来（又は異種）遺伝子のタンパク質発現レベルに対して好ましい効果も示す。従って、本発明に従って使用するための組換えＭＶウイルスベクターは、これらの特許出願に記載されているような非コード領域が外来遺伝子に隣接するように構築することができる。
【００３２】
従って、本発明の方法において使用するための組換えキメラＭＶベクターは、外来遺伝子を含む追加の転写単位が上流のＭＶウイルス遺伝子開始（ＧＳ）配列及び下流のＭＶウイルス遺伝子末端（ＧＥ）配列と操作可能に連結されているように構築することができる。ＧＳ配列と外来遺伝子の開始コドンの間には、ＭＶウイルス遺伝子の３’非コード領域（ゲノムセンス）が位置することができる。外来遺伝子の停止コドンとＧＥ配列の間には、ＭＶウイルス遺伝子の５’非コード領域（ゲノムセンス）が位置することができる。
【００３３】
非コード領域は、ＭＶウイルスエンベロープタンパク質、特に、Ｍ、Ｇ、Ｆ若しくはＨＮタンパク質又はＲＮＰタンパク質、特に、Ｎ、Ｐ若しくはＬタンパク質をコードする遺伝子の非コード領域であり得る。転写調節配列として本発明において使用されるべきＧＳ及びＧＥ配列は、好ましくは、ＭＶウイルスの天然遺伝子に由来するＧＳ及びＧＥ配列である。以下の理論に限定するものではないが、これらの配列が転写過程の間に、とりわけ、転写開始及びｍＲＮＡ５’末端修飾の過程において、並びに転写３’末端ポリアデニル化及び終結の調節において、ＲＮＡポリメラーゼの活性を調節すると考えられる。
【００３４】
様々なＭＶウイルス遺伝子のヌクレオチド配列及びそれらの転写調節（ＧＳ及びＧＥ）配列及び遺伝子に隣接する非コード配列など、ＭＶウイルスのゲノムの構成の詳しい情報は、本分野において公知である。このような情報は、例えば、保健社会福祉省の国立衛生研究所の国立医学図書館の全米バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトを通じて入手することができる。これらの配列の幾つかは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０７／６４０４６及び米国特許出願第６０／７８３，１９４号（これらの全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【００３５】
本発明において使用するための組換えキメラＭＶウイルスベクターは、得られたＭＶウイルスベクターにおいて、特に、ＧＥ−ＩＧＲ−ＧＳ要素を含むゲノムヌクレオチド配列断片によって、外来遺伝子にＭＶウイルス遺伝子接合部が先行し、且つ後続するように、（ｉ）上記のような３’及び５’非コード領域に隣接している外来遺伝子及び（ｉｉ）適切な転写調節配列を含む単離された核酸分子をＭＶウイルスのゲノム中に挿入することによって調製される。このような上流及び下流要素の存在は、挿入された外来遺伝子の適切な転写を保証するのみならず、挿入された外来遺伝子の上流及び下流に位置するＭＶウイルス遺伝子の適切な転写を保証する。
【００３６】
ＭＶウイルスの単離された核酸分子及びゲノムは、それらのｃＤＮＡ形態（＋センス）で遺伝学的に操作され得る。これによって、所望の核酸分子の取り扱い及びウイルスゲノム中への挿入が容易になる。２つの遺伝子間に、すなわち遺伝子間領域（ＩＧＲ）中に、遺伝子の３’又は５’非コード領域及びゲノムの３’プロモーター近位（Ｎ／ＮＰ遺伝子の前）又は５’遠位末端（Ｌ遺伝子の後）に外来遺伝子を挿入するためにゲノムの様々な部分を使用することができる。
【００３７】
外来遺伝子は、ＮＰ遺伝子の前、ＮＰとＰ遺伝子の間，ＰとＭ遺伝子の間、ＭとＦ遺伝子の間、ＦとＨＮ遺伝子の間、ＨＮとＬ遺伝子の間に及びＬ遺伝子の後に有利に挿入することができる。
【００３８】
このような転写カセットの調製及びＭＶウイルスゲノム中へのその挿入は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０７／６４０４６及び米国特許出願第６０／７８３，１９４号に例示されているような定型的な分子生物学的技術を使用するに過ぎない。特に、部位指定突然変異導入及びＰＣＲ突然変異導入などの技術を、この目的のために使用することができる。より具体的には、本発明の組換えＭＶウイルスベクターは、米国特許第６，０３３，８８６号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されているような、ＭＶ目の非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの遺伝的修飾を可能とする十分に確立された「逆遺伝学」法を用いて調製することが可能である。
【００３９】
この方法では、適切な細胞は、ＭＶ（アンチ）ゲノム及び支持タンパク質の転写及び同時発現を可能とし、組換えＭＶベクターの作製を可能とするのに十分な条件下で、ＭＶウイルスの完全長ゲノム、又は、好ましくはアンチゲノム（ポジティブセンス）をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ分子と、及び必要とされる支持タンパク質をコードするヌクレオチド配列（すなわち、リボ核タンパク質複合体を形成することができる機能的なウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを発現させるために）を含むｃＤＮＡ分子を含む１つ又はそれ以上のベクターとを含むベクターによって、同時形質移入される。この方法では、完全長ＭＶウイルス（アンチ）ゲノムをコードする前記核酸分子は、上に定義されている追加の転写単位を含む。
【００４０】
ウイルスのポリメラーゼを発現するための又はゲノムＲＮＡを作製するためのベクターの非限定的な例には、このベクターで形質移入された細胞中での付着されたＤＮＡセグメントの複製並びにその転写及び／又は発現をもたらすために、別のＤＮＡセグメントを付着し得るプラスミド、ファージ又はコスミドが含まれる。適切な支持タンパク質の細胞内発現のために、好ましくは、適切な発現調節配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター）の調節下にある、これらのタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を含むプラスミドが使用される。
【００４１】
好ましくは、完全長ゲノムを転写するためのベクターは、その５’末端にＴ７ポリメラーゼプロモーターが隣接し、及びその３’末端に（肝炎デルタ）リボザイム配列が隣接されたＭＶウイルスの（アンチ）ゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含むプラスミドであるが、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーターも使用することができる。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態において、本発明に従って使用するための組換えＭＶウイルスベクターは、ＭＶウイルスのＮ（又はＮＰ）、Ｐ及びＬタンパク質をコードする発現プラスミドを用いて調製される。
【００４３】
この逆遺伝学技術において使用されるべき形質移入された支持プラスミドの量又は比は、幅広い範囲にわたる。支持プラスミドＮ：Ｐ：Ｌに対する比は、約２０：１０：１から１：１：２の範囲であり得、各ウイルスに対する効率的な形質移入プロトコールが本分野において公知である。
【００４４】
ゲノムＲＮＡの正確なコピーが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとリボザイム配列の複合的な作用によって、形質移入された細胞中において作製され、このＲＮＡは、続いて、同時形質移入された発現プラスミドによって供給されたウイルス支持タンパク質によってパッケージ及び複製される。
【００４５】
Ｔ７ポリメラーゼ酵素は、形質移入された細胞に感染する組換えワクシニアウイルスによって、特に、ワクシニアウイルスｖＴＦ７−３によって提供され得、鶏痘ウイルスなどの他の組換えポックスベクター、例えばｆｐＥＦＬＴ７ｐｏｌ又はその他のウイルスベクターも、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現のために使用され得る。
【００４６】
救出されたウイルスのワクシニアウイルスからの分離は、ろ過などの単純な物理的技術によって容易に達成することができる。ＮＤＶの救出は、孵化卵中の形質移入された細胞の上清の接種によって達成することもできる。
【００４７】
あるいは、（Ｔ７）ＲＮＡポリメラーゼ及び／又は必要とされる支持タンパク質の１つ若しくはそれ以上を恒常的に発現する転写及び発現ベクターの形質移入のために、細胞株が使用され得る。
【００４８】
さらに、本発明のＭＶウイルスを調製するための、本明細書において使用されるべき逆遺伝学技術に関するさらに詳しい情報は、米国特許第６，０３３，８８６号（その全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）中に開示されている。
【００４９】
本発明の一実施形態において、ＭＶウイルスがイヌ、ウマ又はネコインフルエンザ由来の抗原を発現する組換えニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である組換えＭＶウイルスベクターが提供される。イヌ、ウマ又はネコインフルエンザは、Ｈ３Ｎ８サブタイプＡ型インフルエンザであり得る。ＮＤＶの遺伝的操作のための一般的な逆遺伝学の方法は、米国特許第６，１４６，６４２号、同第６，４５１，３２３号及び同第６，７１９，９７９号（これらの全体が、参照により、全て本明細書に組み込まれる。）によって以前に開示されている。
【００５０】
外来遺伝子は、上でＭＶウイルスに関して一般的に概説したように、ＮＤＶゲノムの様々な位置に有利に導入することができる。特に、本発明の組換えＮＤＶベクター中において、以下のＮＤＶ遺伝子間、すなわちＮＰとＰ遺伝子の間、ＰとＭ遺伝子の間，ＭとＦ遺伝子の間、ＦとＨＮ遺伝子、ＨＮとＬ遺伝子の間に、並びに３’近位及び５’遠位遺伝子坐（３’近位、Ｐ−Ｍ、Ｍ−Ｆ及びＦ−ＨＮ領域など）に（適切な転写単位の一部として）外来遺伝子を挿入することが可能である。
【００５１】
さらに、本発明の組換えＮＤＶベクターにおいて、外来遺伝子に隣接する非コード領域は、天然に存在する全てのＮＤＶ遺伝子に、特に、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ又はＨＮ遺伝子に由来し得る。
【００５２】
一実施形態において、組換えＮＤＶベクター変異体は、Ａ型インフルエンザウイルス、好ましくは、イヌ、ウマ又はネコインフルエンザウイルス、より好ましくは、Ｈ３、Ｎ８又はｈ３Ｎ８インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を含む。本発明の組換えＭＶウイルスベクターにおいて有用な外来遺伝子の他の例には、Ｈ３Ｎ８、Ｈ７Ｎ７又はＨ５Ｎ１サブタイプＡ型インフルエンザ種のヘマグルチニン若しくはノイラミニダーゼ遺伝子又は他の何れかの遺伝子が含まれる。
【００５３】
ＭＶベクターウイルスは弱化することができる。すなわち、ベクターウイルスは標的動物に対して病原性でなく、又は野生型ウイルスに比べて毒性の大幅な低下を呈する。例えば、ＮＤＶウイルスは、イヌ、ウマ及びネコの中で限定された複製のみを有し、イヌは、ＮＤＶウイルスに曝露されたときに、臨床的症候を示さない。さらに、限られた複製能又は感染能を示す弱毒化ウイルスを取得し、スクリーニングするための慣用の技術が存在する。このような技術には、異種の基質中へのウイルスの連続（冷）継代及び化学的突然変異導入が含まれる。このようなウイルスは、米国特許第６，１７７，０８２号、同第６，３９８，７７４号、同第６，４８２，４１４号、同第６，５７９，５２８号、同第７，０２９，９０３号及び同第７，０７４，４１４号（参照により、全ての全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【００５４】
本発明の組換えＮＤＶベクターは、あらゆる慣用のＮＤワクチン株に由来し得る。このような適切なＮＤＶ株の非限定的な例は、Ｃｌｏｎｅ−３０（Ｃｏｍｂｏｖａｃ−３０（Ｒ）ワクチン、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｌｓｂｏｒｏ，Ｄｅｌａｗａｒｅから入手可能）、Ｌａ  Ｓｏｔａ株、ＨｉｔｃｈｎｅｒＢ１株、ＮＤＷ株、Ｃ２株及びＡＶ４株などの市販のＮＤＶワクチン中に存在するＮＤＶ株である。
【００５５】
本発明の組換えＭＶウイルスベクターは動物中の防御免疫応答を誘導することができる。従って、本発明の別の実施形態において、生又は不活化形態の上記組換えＭＶウイルスベクター及び医薬として許容される担体又は希釈剤を含む、ウイルス、微生物又は寄生生物病原体に対するワクチンが提供される。
【００５６】
本発明のワクチンは、市販の生及び不活化ＭＶウイルスワクチンに対して一般的に使用されているものなど、慣用の方法によって調製することができる。感受性基質に組換えＭＶウイルスベクターを接種し、ウイルスが所望の力価に複製されるまで増殖し、その後、ウイルスを含有する材料を採取する。その後、採集された材料は、免疫化特性を有する医薬調製物へ製剤化される。
【００５７】
本発明では、組換えＭＶウイルスベクターの複製を支持することができる全ての基質を使用することができる。基質として、ＭＶウイルスに応じて、原核及び真核両起源から得られた宿主細胞を使用することが可能である。適切な宿主細胞は、脊椎動物、例えば霊長類細胞であり得る。適切な例は、ヒト細胞株ＨＥＫ、ＷＩ−３８，ＭＲＣ−５若しくはＨ−２３９、サル細胞株Ｖｅｒｏ、げっ歯類細胞株ＣＨＯ、ＢＨＫ、イヌ細胞株ＭＤＣＫ又はトリＣＥＦ若しくはＣＥＫ細胞である。
【００５８】
その上で本発明の組換えＮＤＶベクターを増殖させることができる特に適切な基質は、特定病原体未感染の孵化卵である。孵化卵には、例えば、少なくとも１０２．０ＥＩＤ５０／卵を含む尿膜腔液を含有するＮＤＶ０．２ｍＬを接種することができる。好ましくは、９から１１日齢の孵化卵に約１０５０ＥＩＤ５０で接種し、続いて、３７℃で２から４日間温置する。２から４日後に、ＮＤウイルス産物は、好ましくは、尿膜液を収集することによって採集することができる。液体は、その後、２５００ｇで１０分間遠心され、続いて、上清をフィルター（１００μｍ）に通してろ過することができる。
【００５９】
本発明のワクチンは、このような組成物に対して慣用されている医薬として許容される担体又は希釈液と一緒に、組換えＭＶウイルスベクターを含む。生ウイルスを含有するワクチンは、懸濁液の形態又は凍結乾燥された形態で調製及び市販され得る。担体は、安定化剤、防腐剤及び緩衝液を含む。希釈剤は、水、水性緩衝液及びポリオールを含む。
【００６０】
本発明の別の態様において、不活化された形態で組換えＭＶウイルスベクターを含むワクチンが提供される。不活化ワクチンの主な利点は、その安全性及び誘導され得る長期の保護抗体の高いレベルである。増殖工程後に採集されたウイルスの不活化の目的は、ウイルスの再生をなくすことである。一般に、これは、周知の化学的又は物理的手段によって達成することができる。
【００６１】
所望であれば、本発明のワクチンは、アジュバントを含有し得る。この目的のためにアジュバント活性を有する適切な化合物及び組成物の例は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウム、例えば、鉱物油又は植物油（ビタミンＥアセタートなど）を基礎とする水中油又は油中水エマルジョン及びサポニンである。
【００６２】
対象へのワクチンの投与は、対象哺乳動物中での免疫応答の刺激をもたらす。哺乳動物標的へのワクチンの投与経路は、本分野において公知の方法に従って達成することができる。このような方法には、皮内、筋肉内、眼内、腹腔内、静脈内、非経口、鼻内、経口、口鼻及び皮下並びに吸入、坐薬又は経皮が含まれるが、これらに限定されない。ワクチンは、注射器、噴霧器、霧吹き、スプレー、無針注射用具又は微粒子遺伝子銃（弾道衝撃法）を含む（但し、これらに限定されない。）あらゆる手段によって投与され得る。
【００６３】
本発明に従って使用するための組換えＮＤＶベクターワクチンは、好ましくは、ＮＤＶワクチン接種のために一般的に使用される同じ安価な大量適用技術によって投与される。ＮＤＶワクチン接種に関して、これらの技術は飲料水及びスプレーワクチン接種を含む。
【００６４】
標的哺乳動物への本発明のワクチンの適用のスキームは、剤形及び製剤と適合的な様式で、及び免疫学的に有効な量での単回又は複数回投薬であり得、同時に又は順次に与え得る。
【００６５】
本発明のワクチンは、活性成分として組換えＭＶウイルスベクターの有効用量（すなわち、毒性ウイルス又は微生物若しくは寄生生物による攻撃誘発に対してワクチン接種されたイヌ、ネコ又はウマ）に免疫を誘導する免疫化ＭＶウイルス材料の量）を含む。本明細書において、免疫は、ワクチン接種されていない群と比べて、ワクチン接種後に、死亡及び臨床症候に対して動物の集団中に保護の著しくより高いレベルを誘導することとして定義される。特に、本発明のワクチンは、疾病の臨床症候及び死亡の発生に対して、ワクチン接種された動物の多くの割合を予防する。
【００６６】
典型的には、生ワクチンは、１０２．０から１０８．０組織培養／胚感染量（ＴＣ／ＥＩＤ５０）の用量で、好ましくは、１０４．０から１０７．０ＴＣ／ＥＩＤ５０の範囲の用量で投与され得る。不活化ワクチンは、１０４．０から１０９．０ＴＣ／ＥＩＤ５０の抗原当量（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）を含有し得る。
【００６７】
本発明は、本発明の組換えＭＶウイルスベクターの他に、さらなる病原体に対して保護を誘導し得るワクチンを含む組み合わせワクチンも含む。従って、本発明の組換えＭＶウイルスベクターは、１つ又はそれ以上の追加の免疫原を含むワクチン中に調合され得る。追加の免疫活性成分は、完全な寄生生物、細菌若しくはウイルス（不活化又は改変された生）又はそれらの分画された一部若しくは抽出物（例えば、タンパク質、脂質、リポ多糖、炭水化物又は核酸）であり得る。
【００６８】
本発明の組換えＭＶウイルスベクターがイヌワクチン中で使用される場合には、他のイヌ病原体に対する抗原を製剤中に添加し得る。それに対する追加の抗原が添加され得る他の病原体の非限定的な例には、ボルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）によって引き起こされるイヌジステンパー、イヌアデノウイルス１型（ＣＡＶ−１）ウイルスによって引き起こされるイヌ伝染性肝炎（ＩＣＨ）、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）ウイルスによって引き起こされる呼吸器疾患、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルスによって引き起こされるイヌパラインフルエンザ、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）及びイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、麻疹ウイルスによって引き起こされる腸炎、並びにレプトスピラ・ブラティスラバ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）、レプトスピラ・インテロガンス・セロバール・カニコラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・グリッポチフォサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、レプトスピラ・イクテロヘモラジアエ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）又はレプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｐｏｍｏｎａ）、狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ヘパトゾーン・キャニス（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ  ｃａｎｉｓ）及びボレリア・バーグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、イヌロタウイルス（Ｃａｎｉｎｅ  Ｒｏｔａ  Ｖｉｒｕｓ（ＣＲＶ））、イヌヘルペスイルス（Ｃａｎｉｎｅ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ（ＣＨＶ））、イヌの微小ウイルス（Ｍｉｎｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｃａｎｉｎｅｓ（ＭＶＣ））、ギアルディア種（Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ）、ビー・ボゲリ（Ｂ．  ｖｏｇｅｌｉ）、ビー・ロッシ（Ｂ．  ｒｏｓｓｉ）、ギアルディア及びサルモネラ種（Ｇｉａｒｄｉａ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）並びにリーシュマニア・ドノバニ複合体（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ−ｃｏｍｐｌｅｘ）によって引き起こされるレプトスピラ症が含まれる。
【００６９】
本発明の組換えＭＶウイルスベクターがウマワクチン中で使用される場合には、他のウマ病原体に対する抗原を製剤中に添加し得る。それに対する追加の抗原が添加され得る他の病原体の非限定的な例には、東部脳脊髄炎ウイルス、西部脳脊髄炎ウイルス、ベネズエラ脳脊髄炎ウイルス、ウマヘルペス１型ウイルス、ウマヘルペス４型ウイルス、ウマインフルエンザウイルス（例えば、ＫＹ９３／Ａ２、ＫＹ０２／Ａ２及びＮＭ／２／９３／Ａ２株）、ウエストナイルウイルス、鼻肺炎ウイルス、狂犬病ウイルス、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、クロストリジアル種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ）（例えば、シー・ボツリナム（Ｃ．  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ））、エールリヒア・リスチシイ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｒｉｓｔｉｃｉｉ）、イー・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、サルコシスティス・ニューロナ（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｎｅｕｒｏｎａ）及びテナヌス毒素画分（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）が含まれる。
【００７０】
本発明の組換えＭＶウイルスベクターがネコワクチン中で使用される場合には、他のネコ病原体に対する抗原を製剤中に添加し得る。それに対する追加の抗原が添加され得る他の病原体の非限定的な例には、鼻気管炎ウイルス、カリシウイルス、汎白血球減少症ウイルス、クラミジア（シー・シッタシ（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ））、ボルデテラ・ブロンキセプティカ（ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ギアルディア種（Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、ネコ免疫不全症ウイルス、ネコ白血病ウイルス又は狂犬病ウイルスが含まれる。
【００７１】
あるいは、本発明の組換えＭＶを基礎とするワクチンは、他の生ワクチン又は不活化ワクチンとともに、同時に又は併用して投与され得る。
【００７２】
以下の実施例は、例示の目的でのみ提供されるものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。下記の実施例は、鼻内又は皮下経路によってイヌにワクチンを接種した後における、Ｈ３Ｎ８インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子を発現する組換えＮＤＶの効力を示す。
【００７３】
実施例
【実施例１】
【００７４】
イヌインフルエンザヘマグルチニン遺伝子を発現する組換えＮＤＶの構築
Ａ．インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）をコードするＤＮＡの調製
ＡｃｃｅｓｓＲＴ−ＰＣＲＳｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ  ）を使用する逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、インフルエンザＨＡ挿入物を得た。キットからのＴｆｌＤＮＡポリメラーゼとともに、マイクロプロセッサ制御されたロボット式温度サイクラーＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）上で、ヘマグルチニン特異的プライマー（５’−ａｃｇｇｃａａｔｃｇＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴＴＡＴＴＴＴＧＡ−３’）及び（５’−ａｃｇｇｃａｇｃｇｃｇｃＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＣＡＴＣ−３’）を使用し、ウイルス単離株Ａ／Ｃａｎｉｎｅ／Ｊａｃｋｓｏｎｖｉｌｌｅ／０５（ｃａｎｉｎｅ／Ｊａｘ／０５としても知られる。寄託番号ＰＴＡ−７９４１、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９）を用いて、ＨＡ挿入物を増幅した。
【００７５】
電気泳動ゲル上で、増幅されたＨＡ配列をＰＣＲ混合物の他の成分から分離し、単離した。ベクターキットの製造業者の指示書に従って、精製されたＨＡ配列をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｒ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中にクローニングした。得られたプラスミドｐＣＲＩＩ：ＣＢ１は、増幅されたインフルエンザＨＡ配列を含有していた。Ｂｉｇ−ＤｙｅＴＭターミネータサイクル配列決定（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてヘマグルチニン配列を確認し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１００−Ａｖａｎｔ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて分析した。
【００７６】
Ｂ．中間プラスミド中へのインフルエンザＨＡ遺伝子配列のクローニング
まず、ｐＣＲＩＩ：ＣＢ１からＨＡ遺伝子配列を切り出し、中間プラスミドｐＭ３Ｅ中にサブクローニングした。組換えｐＭ３Ｅ中間プラスミドの作製は、以前に記載されている（Ｅｎｇｅｌ−Ｈｅｒｂｅｒｔ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ，”  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０８：１９−２８（２００３））。
【００７７】
簡潔に述べれば、ｐＭ３Ｅは、ワクチン株クローン−３０（以下に、さらに詳しく記載されている。）を基礎とする完全長ｃＤＮＡクローンに由来する。ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理した後、ｎｔ５２３３からｎｔ６５５９までＮＤＶ配列を含有するＤｒａＩ−ＮｈｅＩ断片をｐＵＣ１８（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）のＳｍａＩ部位中にクローニングした。次いで、プライマー５’−ｇａｇａｇｔｔａａｇａａａａａａｃｔａｃｃｇｔｔａａｔｔａａｔｇａｃｃａａａｇｇａｃｇ−３’を用いる部位指定突然変異誘発によって、ｎｔ位置６３００のＰａｃＩ制限部位（６２９６−６３０３）を含有するように、Ｆ及びＨＮ遺伝子（ｎｔ６２９０からｎｔ６３２０に位置する。）の間の遺伝子間領域（ｉｇｒ）を修飾した。得られたプラスミドは、ｐＭ１Ｅと名付けられた。ＰｓｈＡＩ部位を用いて、ＰａｃＩ部位を含有する新しいｇｉｒによるクローン−３０のＦ−ＨＮｉｇｒの効果を行った。転写開始及び停止シグナルを導入するために、ｐＭ１ＥのＰａｃＩ消化後に、合成遺伝子開始（ＧＳ）及び遺伝子終了（ＧＥ）シグナル）を含有する２つの相補的オリゴヌクレオチド（５’ｃｇａｔｔａａｔｔａａａｃｇｇｇｔａｇａａｇｃｇａｔｃｇｃａｃｇｃｇｔｔａａｇａａａａａａｔｔａａｔｔａａｃａｇ及び５’−ｃｔｇｔｔａａｔｔａａｔｔｔｔｔｔｃｔｔａａｃｇｃｇｔｇｃｇａｔｃｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｇｔｔｔａａｔｔａａｔｃｇ（ＰａｃＩ−及びＭｌｕＩ−部位（ｓｔｅｄ）を有する。）を導入して、プラスミドｐＭ３Ｅを得た。
【００７８】
ＭｌｕＩ消化、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いた平滑末端化及びゲル精製後のウシ腸アルカリホスファターゼを用いた脱リン酸化によって、ヘマグルチニン挿入のために、ｐＭ３Ｅを調製した。ｐ３ＭＥ中への挿入を調製するために、ＳｐｅＩでの消化及びＣｌａＩでの部分消化、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いた平滑末端化によって、ヘマグルチニン遺伝子を切り出し、得られた約１．７ｋｂ断片を切り出し、精製した。調製されたヘマグルチニンをコードするＤＮＡを、調製されたｐＭ３Ｅ中間ベクター中にクローニングして、中間組換えプラスミドＭ３Ｅ：ＣＩを作製した。
【００７９】
Ｃ．クローン３０ｃＤＮＡ中へのインフルエンザＨＡ遺伝子配列のクローニング
ＮＤＶクローン３０株は、Ｃｏｍｂｏｖａｃ−３０（Ｒ）ワクチン（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｃ．，  Ｍｉｌｌｓｂｏｒｏ，  Ｄｅｌａｗａｒｅ）において市販されている。当業者は、この市販のウイルスからＲＮＡを単離し、ＮＤＶクローン３０株の完全長ｃＤＮＡクローンを作製する方法に習熟している。このような完全長ｃＤＮＡクローンの構築は、以前に記載されている。「Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｌｅｎｔｏｇｅｎｉｃ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ，”  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．５０：２９８７−２９９５  （１９９９）」を参照されたい。
【００８０】
簡潔に述べれば、ＮＤＶ株クローン−３０の完全長クローンのｃＤＮＡ合成及び構築は、以下のとおりである。ＮＤＶ株クローン３０は、ＬａＳｏｔａの弱毒性ＮＤＶ株に由来するワクチン株であり、ＩｎｔｅｒｖｅｔＩｎｃ．，Ｍｉｌｌｓｂｏｒｏ，Ｄｅｌａｗａｒｅから入手可能である。１０１０卵感染用量（ＥＩＤ５０）／ｍＬの力価で、尿膜液５０ｍＬからＮＤＶ株クローン−３０を精製した。尿膜液の清澄化の後、超遠心（１．５時間、４℃、１５００００ｇ）によってＮＤＶを沈降させ、グアニジンイソチオシアナート抽出及びＣｓＣｌクッションを通じたその後の遠心によって、ウイルスＲＮＡを単離した。プライマーＰ１Ｆ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＥＭＢＬ−ＥＢＩ）受託番号Ｙ１８８９８のクローンー３０ｎｔ１から２１）及びＰ５Ｆ（クローンー３０ｎｔ８３２６−８３４６）を用いて、２つの特異的に開始されたｃＤＮＡ合成（第一鎖反応、Ｔｉｍｅ  Ｓａｖｅ  ｃＤＮＡ合成キット、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって、ゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡを作製した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて、プライマーＰ７Ｆ（クローン−３０ｎｔ１２７３６−１２７５４）によって、第三の第一鎖反応を行った。その後、２単位のＲＮａｓｅＨ（Ｂｉｏｚｙｍ）とともに、反応混合物を３７℃で２０分間温置した。熱不活化後（５分、７０℃）、フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって、第一鎖ｃＤＮＡを精製した。それぞれの第一鎖ｃＤＮＡをＨ２Ｏ計２０μＬ中に再溶解した。続いて、断片Ｎ１（クローン−３０ｎｔ１から８９１１）並びに断片Ｎ２（クローン−３０ｎｔ８３２６から１２９１９）を作製するためのプライマー対Ｐ５Ｆ（クローン−３０ｎｔ８３２６から８３４６）及びＰ６Ｒ（クローン−３０ｎｔ１２９１９から１２９００）を得るために、プライマー対Ｐ２ＦＭｌｕＩ（
【００８１】
【化１】
2010539093.tif 000003
、クローン−３０ｎｔ６８−９１、ＭｌｕＩ部位に下線が付されており、クローン−３０コンセンサス配列と異なるヌクレオチドは太字で記載されている。）及びＰ３Ｒ（
【００８２】
【化２】
2010539093.tif 000004
、クローン−３０のヌクレオチド８９１１から８８９０、ＳａｐＩ認識部位を含有する合成アダプター（下線が付されている。）、追加のヌクレオチドは斜字体で記載されている。）とともに、ＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ（ＨＦ）ＰＣＲシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、第一鎖ｃＤＮＡ１μＬに対してＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲによって既に取得されていたクローニングされたＮＤＶ断片（ｎｔ１２７３６から１５０７３）から、プライマー対Ｐ７Ｆ（クローン−３０のｎｔ１２７３６から１２７５４）及びＰ８ＲＭｌｕＩ（
【００８３】
【化３】
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、ＢｅａｕｄｅｔｔｅＣのｎｔ１５０５８から１５０３３；ＭｌｕＩ部位に下線が付されており、クローン−３０コンセンサス配列と異なるヌクレオチドは太字で記載されている。）を使用するＨＦ−ＰＣＲによって、断片Ｎ３（クローン３０のｎｔ１２７３６から１５０５８）を作製した。ＲＮＡのポリアデニル化及び３’末端の増幅並びに「Ｍｕｎｄｔ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０９：１０−１８  （１９９５）」に記載されているような５’−ＲＡＣＥプロトコール（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いた５’末端の増幅によって、ゲノムＲＮＡの末端配列を決定した。５つのヌクレオチド（太字）（クローン−３０のｎｔ７６Ｔ−＞Ａ、ｎｔ７９Ａ−＞Ｃ、１５０３９Ｔ−＞Ａ、ｎｔ１５０４１Ｔ−＞Ｇ及びｎｔ１５０４２Ｔ−＞Ｃ）の変異によって２つの人工のＭｌｕＩ部位（下線が付されている、ｎｔ７６、１ＮＰ遺伝子非コード領域及びｎｔ１５０３９、Ｌ遺伝子非コード領域）を導入するＨＦ−ＰＣＲによって、プライマーＰ４ＦＴ７（
【００８４】
【化４】
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、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線が付されており、Ｔ７プロモーター及び３つの追加のＧ残基が太字で記されている。Ｃｌｏｎｅ−３０のｎｔ１−２１）及びＰ２ＲＭｌｕＩ（
【００８５】
【化５】
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、クローン−３０のｎｔ９１から６５）及びＰ８ＦＭｌｕＩ（
【００８６】
【化６】
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、クローン−３０のｎｔ１５０３３から１５０６２）及びＰ９Ｒ（
【００８７】
【化７】
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、下線が付されたＰｓｔＩ／ＢｂｓＩ認識部位を含有する合成アダプター（斜字体で記載されている。）、クローン−３０のｎｔ１５１８６から１５１６６）を用いて、それぞれ、リーダー及びトレーラーを含むＰＣＲ断片を増幅するために、特異的オリゴヌクレオチドを推定した。多段階クローニング手法において、天然に存在する制限部位及び人工のＭｌｕＩ部位を用いて、上記のクローニングされたＰＣＲ断片から、「Ｓｃｈｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４１９５−４２０３（１９９４）」に記載されているように、完全なＮＤＶアンチゲノム発現プラスミド（ｐｆｌＮＤＶ−１）をｐＸ８δＴのＳｍａＩ部位中に構築した。
【００８８】
ＮＤＶ転写開始及び停止シグナル（Ｍ３Ｅ：ＣＩ）が隣接したヘマグルチニン遺伝子をＰａｃＩ消化によって切り出し、唯一のＰａｃＩ部位を含有するＮＤＶ株クローン−３０の完全長クローン中に連結して、完全長のクローンＮＤＶ：ＣＩを得た。
【００８９】
Ｄ．哺乳動物細胞中へのＮＤＶ：ＣＩの形質移入及び組換えＮＤＶの回収
形質移入実験は、「Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｌｅｎｔｏｇｅｎｉｃ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ，”  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．５０：２９８７−２９９５  （１９９９）」に以前に記載されているように行われた。簡潔に述べれば、「Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，  Ｕ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７３（１）：２５１−９（１９９９）」に記載されているように、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを安定に発現するＢＨＫ２１細胞、クローンＢＳＲＴ７／５を用いて、形質移入実験を行った。３２ｍｍ直径の皿の中で、約７０％の集密度になるように細胞を増殖させ、ＤＮＡ２０μｇの合計量（ＮＰＤＮＡ５μｇ、ＰＤＮＡ２．５μｇ、ＬＤＮＡ２．５μｇ及び完全長ＤＮＡ１０μｇ）（Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓ  ＩＴ形質移入キット、Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を形質移入した。
【００９０】
細胞中への形質移入から４８ないし７２時間後に、上清を採集した。低速遠心によって細胞破砕物を清澄化した後、１０日齢の特定病原体未感染の孵化鶏卵の尿膜腔中に、上清７００μＬの容量を接種した。尿膜液の約２００μＬの接種容量を、その後の卵の継代において使用した。第二の７２時間の卵の継代後に採集された尿膜液を加えた５％ニワトリ赤血球を用いて、ヘマグルチン化血球凝集検査を行った。さらなる卵の継代のために、ＨＡ陽性尿膜液を使用した。
【００９１】
Ｅ．組換えＮＤＶ中でのＨ３Ｎ８インフルエンザヘマグルチニンの発現の確認
免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）実験：５％ウシ胎児血清が補充された培地中で、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＳＲ細胞）を培養した。１６ないし２４時間のそれぞれの卵の継代から集められた尿膜液０．５から２μＬに細胞を感染させた後、１００％エタノールで固定した。Ｆプロテインに対して誘導されたモノクローナル抗体ＮＤＶ−５７及びＦＩＴＣ連結されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使用することによって、ＮＤＶ抗原の存在をアッセイした。Ａ／Ｃａｎｉｎｅ／Ｆｌｏｒｉｄａ／２４２／２００３イヌインフルエンザウイルス単離株（寄託番号ＰＴＡ−７９１５、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９）で攻撃誘発されたイヌから得られた回復期血清及びＦＩＴＣ連結されたヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて、イヌＨ３Ｎ８インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの発現をアッセイした。
【００９２】
ウェスタンブロット分析：感染した尿膜液の超遠心によって、組換え及び親ニューキャッスル病ウイルスを集めた。ポリクローナル抗血清を作製するために使用された原株から、イヌインフルエンザウイルス（Ａ／Ｃａｎｉｎｅ／Ｆｌｏｒｉｄａ／２４２／２００３）を得た。抗ＮＰモノクローナルＮＤＶ−３６及びＨＲＰ連結されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使用するウェスタンブロット中で、組換え及び親ニューキャッスルウイルスを検出し、抗ウイルスイヌポリクローナル及びＨＲＰ連結されたヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いたウェスタンブロット中で、イヌインフルエンザ抗原を検出した。
【実施例２】
【００９３】
イヌインフルエンザワクチン効力の研究
以下の研究では、異種の呼吸器ウイルスのヌクレオチド配列を有する組換えモノネガウイルス目ウイルスを投与することを含む、呼吸器感染症に対してイヌを保護する方法を調べた。
【００９４】
組換えウイルスを合計７回卵の中に継代し、尿膜液を集めた。１０個の１０日齢の孵化卵／希釈中に、Ｐ７尿膜液の１０倍系列希釈２００μＬを接種することによって、ＥＩＤ５０力価を測定した。５日の温置後の凝集に関して、尿膜液を検査した。ＥＩＤ５０滴定値を計算した。１０８ビリオン／ｍＬのおよその力価になるように、リン酸緩衝化された無菌生理的食塩水中に尿膜腔液を１０倍希釈することによって、ワクチンを調製し、分注し、凍結した。
【００９５】
ワクチンの各投薬は、１０８のＥＩＤ５０及び合計投薬量を１ｍＬとするのに十分なＰＢＳを含有した。
【００９６】
この研究では、１年齢以上の雌のビーグル１５匹を使用した。ビーグルを３つのグループに無作為に割り当てた（表２）。全てのイヌに、標準的な成長食を与え、水を自由に飲ませた。
【００９７】
【表２】
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【００９８】
グループ１のイヌには、皮下経路によって、４週の間隔で、イヌインフルエンザヘマグルチニンを発現する組換えニューキャッスルウイルスの投薬を２回与えた。グループ２のイヌには、鼻内経路によって、４週の間隔で、イヌインフルエンザヘマグルチニンを発現する組換えニューキャッスルウイルスの投薬を２回与えた。グループ３のイヌは、インフルエンザウイルス攻撃誘発後の臨床的徴候を評価するための攻撃誘発対照動物として使用した。攻撃誘発の７日前に、イヌをＢＳＬ−２施設に移動し、それぞれの檻の中で飼育した。第二のワクチン接種から２週後に、毒性イヌインフルエンザウイルス（Ａ／Ｃａｎｉｎｅ／Ｆｌｏｒｉｄａ／２４２／２００３の１０７．２ＴＣＩＤ５０／イヌ）を用いて、口鼻的に、全てのワクチン接種及び対照イヌに攻撃誘発を行った。攻撃誘発ウイルスは、噴霧器を用いて、ミスト（２ｍＬ／イヌ）として投与した。攻撃誘発投与後１４日間、インフルエンザ関連の臨床的徴候に関して、イヌを観察した。−１日目（すなわち、攻撃誘発から１日前）から攻撃誘発から１４日後に、ウイルス単離のためのウイルス輸送培地２ｍＬを含有するチューブ中に、鼻及び中咽頭綿棒を毎日集めた。攻撃誘発観察後の間に観察された臨床的徴候は、表３に示されている
Ｈ３Ｎ８ウマインフルエンザウイルス標準プロトコール（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄ  （ＳＡＭ）  ＃  １２４，  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ  （ＣＶＢ），  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  （ＵＳＤＡ），  Ａｍｅｓ，  ＩＡ）を用いて、ＨＩ力価を測定するために、第一のワクチン接種の日、攻撃誘発の日及び攻撃誘発から１４日後に、全てのイヌから血清試料を集めた。
【００９９】
結果：グループ１の全てのイヌ（皮下、ＳＣ）が、ワクチン構築物の皮下投与に応答して、ＨＩ抗体力価を生じた。グループ２及び３のイヌは、攻撃誘発前に、ＨＩ力価に対して一切力価を生じなった（表４）。全てのイヌが攻撃誘発に応答して増加したＨＩ抗体力価を生じたが、グループ１の平均力価が最も高かった。全てのグループのイヌが、イヌインフルエンザの以下の臨床的徴候の１つ又はそれ以上を示した。発熱（＞１０３．０°Ｆ；＞３９．４℃）、咳、くしゃみ、目及び鼻からの分泌物、嘔吐及び食欲不振。しかしながら、イヌの数及び症候発生の数は、群間で大幅に異なった（表５）。組換えワクチンを鼻内から服用したイヌ（グループ２）は、グループ１ワクチン接種群及びグループ３対照と比べたときに、インフルエンザ関連の臨床的症候の期間がかなり穏やかで、より短かった（表５）。
【０１００】
ウイルス単離の結果は、表６に示されている。毒性のイヌインフルエンザウイルス攻撃誘発後に、グループ１（ＮＤＶ：ＣＩＳＣ）の５匹のイヌのうち５匹（１００％）、グループ２（ＮＤＶ−ＣＩＩＮ）の５匹のイヌのうち３匹（６０％）及び対照５匹のうち５匹（１００％）（グループ３）から得た鼻綿棒から、イヌインフルエンザウイルスを単離した。イヌインフルエンザウイルスは、グループ１及び３（それぞれ、ＮＤＶ：ＣＩＳＣ及び対照）の５匹のイヌのうち２匹（４０％）並びにグループ２の５匹のうち０匹（０％）から得た中咽頭綿棒から単離された。組換えワクチンの鼻内投与は、ワクチン接種されていない対照群と比較すると、経口及び経鼻分泌経路の両方において、ウイルスの排出の計４０％の低下を示した（表６）。
【０１０１】
結論：この研究から得られた結果は、（１）異種の呼吸器ウイルスヌクレオチド配列（この例では、Ｈ３）を有する組換えモノネガウイルス目ウイルス（この例では、ＮＤＶ）は、呼吸器病原体に対して、イヌに（おそらく、ネコ及びウマにも）、効果的な鼻内ワクチンとして投与できること、（２）組換えＮＤＶ：Ｈ３ウマインフルエンザウイルス又はイヌインフルエンザウイルスワクチンの鼻内での使用は、イヌにおけるイヌインフルエンザウイルス疾患の重度を低下させ得ること、並びに（３）ＮＤＶＨ３ウマ又はイヌインフルエンザウイルスワクチンの鼻内適用は、鼻及び／又は口の分泌内のウイルス排出を大幅に低下させ得ることを示した。
【０１０２】
【表３】
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【０１０３】
【表４】
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【０１０４】
【表５】
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【０１０５】
【表６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2010539093.tif 000016
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