(57)【要約】  クラミジア抗原(例えば、ポリペプチド、ポリペプチド断片、及び融合タンパク質)が提供される。また、対象において、クラミジアなどの細菌感染を治療又は予防するためのワクチン及び医薬組成物も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1と実質的に同一のアミノ酸配列を含む単離されたCT144ポリペプチド又はその断片であって、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて少なくとも40倍増加して誘発する、上記ポリペプチド又は断片。
【請求項２】
哺乳動物に投与された場合、免疫応答を誘発する、請求項1に記載のポリペプチド又は断片。
【請求項３】
断片がCD4+ T細胞応答を誘発する、請求項1に記載のポリペプチド又は断片。
【請求項４】
配列番号2又は3の配列及び少なくとも1個の隣接アミノ酸を含む、請求項1に記載の断片。
【請求項５】
アミノ酸長が200未満である、請求項4に記載の断片。
【請求項６】
アミノ酸長が150未満である、請求項4に記載の断片。
【請求項７】
アミノ酸長が100未満である、請求項4に記載の断片。
【請求項８】
アミノ酸長が50未満である、請求項4に記載の断片。
【請求項９】
アミノ酸長が30未満である、請求項4に記載の断片。
【請求項１０】
配列番号2又は3の配列からなる、請求項1に記載の断片。
【請求項１１】
N末端及び/又はC末端で1、2、3、4、5又は6個のアミノ酸が切断されたものである、請求項10に記載の断片。
【請求項１２】
配列番号2又は3の配列において1個又は複数個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項4に記載の断片。
【請求項１３】
配列番号2又は3の配列において1個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項12に記載の断片。
【請求項１４】
配列番号2又は3の配列において2個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項12に記載の断片。
【請求項１５】
配列番号2又は3の配列において3個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項12に記載の断片。
【請求項１６】
配列番号2又は3の配列において4個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項12に記載の断片。
【請求項１７】
1個又は複数個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項10に記載の断片。
【請求項１８】
1個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項17に記載の断片。
【請求項１９】
2個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項17に記載の断片。
【請求項２０】
3個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項17に記載の断片。
【請求項２１】
4個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項17に記載の断片。
【請求項２２】
請求項1に記載のポリペプチド又は断片を薬学的に許容される担体中に含む医薬組成物。
【請求項２３】
(a)請求項1に記載のポリペプチド又は断片と、
(b)薬学的に許容される担体と
を含むワクチン。
【請求項２４】
細菌感染を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に請求項1に記載のポリペプチド又は断片の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチド又は断片が薬学的に許容される担体中に存在する、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリペプチド又は断片が、前記対象の免疫応答を生じさせることができる、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
前記細菌感染がクラミジア感染である、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象がクラミジアを有している又はそれに罹患するリスクがある、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
配列番号5又は6の配列を含み、アミノ酸長が170未満であり、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて少なくとも40倍増加して誘発する、CT242ポリペプチドの単離された断片。
【請求項３０】
哺乳動物に投与された場合、免疫応答を誘発する、請求項29に記載の断片。
【請求項３１】
CD8+ T細胞応答を誘発する、請求項29に記載の断片。
【請求項３２】
配列番号5又は6の配列及び少なくとも1個の隣接アミノ酸を含む、請求項29に記載の断片。
【請求項３３】
アミノ酸長が150未満である、請求項32に記載の断片。
【請求項３４】
アミノ酸長が100未満である、請求項32に記載の断片。
【請求項３５】
アミノ酸長が50未満である、請求項32に記載の断片。
【請求項３６】
アミノ酸長が30未満である、請求項32に記載の断片。
【請求項３７】
アミノ酸長が15未満である、請求項32に記載の断片。
【請求項３８】
配列番号5又は6の配列からなる、請求項29に記載の断片。
【請求項３９】
N末端及び/又はC末端で1個又は2個のアミノ酸が切断されたものである、請求項38に記載の断片。
【請求項４０】
配列番号5又は6の配列において1個又は複数個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項32に記載の断片。
【請求項４１】
配列番号5又は6の配列において1個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項40に記載の断片。
【請求項４２】
配列番号5又は6の配列において2個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項40に記載の断片。
【請求項４３】
配列番号5又は6の配列において3個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項40に記載の断片。
【請求項４４】
1個又は複数個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項38に記載の断片。
【請求項４５】
1個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項44に記載の断片。
【請求項４６】
2個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項44に記載の断片。
【請求項４７】
3個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項44に記載の断片。
【請求項４８】
請求項29に記載の断片を薬学的に許容される担体中に含む医薬組成物。
【請求項４９】
(a)請求項29に記載の断片と、
(b)薬学的に許容される担体と
を含むワクチン。
【請求項５０】
細菌感染を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に請求項29に記載の断片の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項５１】
前記断片が薬学的に許容される担体中に存在する、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
前記断片が、前記対象において免疫応答を生じさせることができる、請求項50に記載の方法。
【請求項５３】
前記細菌感染がクラミジア感染である、請求項50に記載の方法。
【請求項５４】
前記対象がクラミジアを有している又はそれに罹患するリスクがある、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
配列番号8の配列を含み、アミノ酸長が770未満であり、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて少なくとも40倍増加して誘発する、CT812ポリペプチドの単離された断片。
【請求項５６】
哺乳動物に投与された場合、免疫応答を誘発する、請求項55に記載の断片。
【請求項５７】
CD8+ T細胞応答を誘発する、請求項55に記載の断片。
【請求項５８】
配列番号8の配列及び少なくとも1個の隣接アミノ酸を含む、請求項55に記載の断片。
【請求項５９】
アミノ酸長が600未満である、請求項58に記載の断片。
【請求項６０】
アミノ酸長が400未満である、請求項58に記載の断片。
【請求項６１】
アミノ酸長が200未満である、請求項58に記載の断片。
【請求項６２】
アミノ酸長が100未満である、請求項58に記載の断片。
【請求項６３】
アミノ酸長が50未満である、請求項58に記載の断片。
【請求項６４】
アミノ酸長が30未満である、請求項58に記載の断片。
【請求項６５】
アミノ酸長が15未満である、請求項58に記載の断片。
【請求項６６】
配列番号8の配列からなる、請求項55に記載の断片。
【請求項６７】
N末端及び/又はC末端で1個又は2個のアミノ酸が切断されたものである、請求項66に記載の断片。
【請求項６８】
配列番号8の配列において1個又は複数個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項58に記載の断片。
【請求項６９】
配列番号8の配列において1個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項68に記載の断片。
【請求項７０】
配列番号8の配列において2個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項68に記載の断片。
【請求項７１】
配列番号8の配列において3個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項68に記載の断片。
【請求項７２】
1個又は複数個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項66に記載の断片。
【請求項７３】
1個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項72に記載の断片。
【請求項７４】
2個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項72に記載の断片。
【請求項７５】
3個の保存的アミノ酸置換を含有する、請求項72に記載の断片。
【請求項７６】
請求項55に記載の断片を薬学的に許容される担体中に含む医薬組成物。
【請求項７７】
(a)請求項55に記載の断片と、
(b)薬学的に許容される担体と
を含むワクチン。
【請求項７８】
細菌感染を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に請求項55に記載の断片の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項７９】
前記断片が薬学的に許容される担体中に存在する、請求項78に記載の方法。
【請求項８０】
前記断片が、前記対象において免疫応答を生じさせることができる、請求項78に記載の方法。
【請求項８１】
前記細菌感染がクラミジア感染である、請求項78に記載の方法。
【請求項８２】
前記対象がクラミジアを有している又はそれに罹患するリスクがある、請求項81に記載の方法。
【請求項８３】
(a)請求項1に記載のポリペプチド又は断片と、
(b)融合パートナーと
を含む単離された融合タンパク質。
【請求項８４】
前記断片が、配列番号2又は3の配列及び少なくとも1個の隣接アミノ酸を含む、請求項83に記載の融合タンパク質。
【請求項８５】
前記断片が配列番号2又は3の配列からなる、請求項83に記載の融合タンパク質。
【請求項８６】
請求項83に記載の融合タンパク質を薬学的に許容される担体中に含む医薬組成物。
【請求項８７】
(a)請求項83に記載の融合タンパク質と、
(b)薬学的に許容される担体と
を含むワクチン。
【請求項８８】
a)請求項29に記載の断片と、
b)融合パートナーと
を含む単離された融合タンパク質。
【請求項８９】
前記断片が、配列番号5又は6の配列及び少なくとも1個の隣接アミノ酸を含む、請求項88に記載の融合タンパク質。
【請求項９０】
前記断片が配列番号5又は6の配列からなる、請求項88に記載の融合タンパク質。
【請求項９１】
請求項88に記載の融合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項９２】
(a)請求項88に記載の融合タンパク質と、
(b)薬学的に許容される担体と
を含むワクチン。
【請求項９３】
(a)請求項55に記載の断片と、
(b)融合パートナーと
を含む単離された融合タンパク質。
【請求項９４】
前記断片が、配列番号8の配列及び少なくとも1個の隣接アミノ酸を含む、請求項93に記載の融合タンパク質。
【請求項９５】
前記断片が配列番号8の配列からなる、請求項93に記載の融合タンパク質。
【請求項９６】
請求項93に記載の融合タンパク質を薬学的に許容される担体中に含む医薬組成物。
【請求項９７】
(a)請求項93に記載の融合タンパク質と、
(b)薬学的に許容される担体と
を含むワクチン。
【請求項９８】
請求項1に記載のポリペプチド又は断片をコードするポリヌクレオチド配列を含むDNAワクチン。
【請求項９９】
請求項83に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むDNAワクチン。
【請求項１００】
細菌感染を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に請求項98又は99に記載のDNAワクチンの治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項１０１】
前記DNAワクチンが薬学的に許容される担体中に存在する、請求項100に記載の方法。
【請求項１０２】
前記DNAワクチンが、前記対象において免疫応答を生じさせることができる、請求項100に記載の方法。
【請求項１０３】
前記細菌感染がクラミジア感染である、請求項100に記載の方法。
【請求項１０４】
前記対象がクラミジアを有している又はそれに罹患するリスクがある、請求項103に記載の方法。
【請求項１０５】
請求項29に記載の断片をコードするポリヌクレオチド配列を含むDNAワクチン。
【請求項１０６】
請求項88に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むDNAワクチン。
【請求項１０７】
細菌感染を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に請求項105又は106に記載のDNAワクチンの治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項１０８】
前記DNAワクチンが薬学的に許容される担体中に存在する、請求項107に記載の方法。
【請求項１０９】
前記DNAワクチンが、前記対象において免疫応答を生じさせることができる、請求項107に記載の方法。
【請求項１１０】
前記細菌感染がクラミジア感染である、請求項107に記載の方法。
【請求項１１１】
前記対象がクラミジアを有している又はそれに罹患するリスクがある、請求項110に記載の方法。
【請求項１１２】
請求項55に記載の断片をコードするポリヌクレオチド配列を含むDNAワクチン。
【請求項１１３】
請求項93に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むDNAワクチン。
【請求項１１４】
細菌感染を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に請求項112又は113に記載のDNAワクチンの治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項１１５】
前記DNAワクチンが薬学的に許容される担体中に存在する、請求項114に記載の方法。
【請求項１１６】
前記DNAワクチンが、前記対象において免疫応答を生じさせることができる、請求項114に記載の方法。
【請求項１１７】
前記細菌感染がクラミジア感染である、請求項114に記載の方法。
【請求項１１８】
前記対象がクラミジアを有している又はそれに罹患するリスクがある、請求項117に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府資金による研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金AI039558の下で政府支援により行われた。政府は本発明に対し一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)は、眼及び生殖器表面にコロニーを形成し感染する細胞内細菌病原体である。クラミジア・トラコマチスの眼感染は、瘢痕及び失明をもたらす慢性濾胞性結膜炎であるトラコーマの原因となる。世界保健機関(WHO)の推定では、世界中で3〜5億人がトラコーマに苦しんでおり(Resnikoffら、Bull. WHO 82:844〜851頁、2004年)、感染性の予防可能な失明の最も蔓延した形態になっている(Whitcherら、Bull. WHO 79:214〜221頁、2001年)。泌尿生殖器感染は、途上国及び産業国の両方で(WHO、Global Prevalence and Incidence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: Overview and Estimates、WHO、Geneva、2001年)細菌性性感染症の主要原因となっている(Division of STD Prevention、Sexually Transmitted Disease Surveillance 1997、Centers Dis. Cont. Prev.、Atlanta、1998年)。さらに、性感染症は、HIV感染(Plummerら、J. Infect. Dis. 163:233〜239頁、1991年)、不妊(Westromら、Sex. Trans. Dis. 19:185〜192頁、1991年)、及びヒトパピローマウイルスにより誘導される子宮頸部新生物(Anttilaら、J. Am. Med. Assoc. 285:47〜51頁、2001年)のリスク因子となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記のすべての理由により、C.トラコマチス感染の制御は重要な公衆衛生の目標である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、C.トラコマチス抗原、及びこのような抗原の治療用途を特徴とする。本発明の抗原は、対象におけるクラミジア感染を治療又は予防するのに使用することができる。
【０００５】
第1の態様では、本発明は、配列番号1と実質的に同一の配列を含有する単離されたCT144ポリペプチド又はその断片であって、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチド(例えば、同じアッセイにおいて最も低い測定可能値のIFN-γを誘発するペプチド)から誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する上記CT144ポリペプチド又はその断片を提供する。望ましいCT144断片は、少なくとも7個のアミノ酸を有し、及び/又はCD4+ T細胞応答を誘発する。
【０００６】
本発明の好ましい一実施形態は、(1)CT144ポリペプチドのアミノ酸67〜86(AQGKLIVTNPKSDISFGGRV;配列番号2)又はアミノ酸77〜96(KSDISFGGRVNLADNTVNYS;配列番号3)の配列を含み、(2)配列番号2又は3のN末端及び/又はC末端に少なくとも1個の隣接アミノ酸を有し、(3)アミノ酸長が280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、35、30、25又は20未満であり、(4)Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する、CT144ポリペプチドの単離された断片である。
【０００７】
本発明の関連する実施形態は、(1)配列番号2又は3の配列を含み、(2)配列番号2又は3の配列のN末端及び/又はC末端に少なくとも1個の隣接アミノ酸を有し、(3)アミノ酸長が280未満であり、(4)配列番号2又は3の配列において1個又は複数個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の保存的アミノ酸置換を含有し、(5)Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する、CT144ポリペプチドの単離された断片である。
【０００８】
好ましい一実施形態は、配列番号2又は3の配列を有し、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する、CT144ポリペプチドの単離された断片である。
【０００９】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号2又は3の配列を有し、ポリペプチドのN末端及び/又はC末端で1、2、3、4、5又は6個のアミノ酸が切断されており、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する、CT144ポリペプチドの単離された断片である。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、(1)配列番号2又は3の配列からなり、(2)1個又は複数個、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の保存的アミノ酸置換を含有し、(3)Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する、CT144ポリペプチドの単離された断片である。
【００１１】
本発明はさらに、(1)CT242ポリペプチドのアミノ酸109〜117(YQILNQSNL;配列番号5)又はアミノ酸112〜120(LNQSNLKRM;配列番号6)を含み、(2)170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、15又は10個未満のアミノ酸を有し、(3)Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する、CT242ポリペプチド(配列番号4)の単離された断片を提供する。望ましいCT242断片は、少なくとも7個のアミノ酸を有し、及び/又はCD8+ T細胞応答を誘発する。
【００１２】
本発明の好ましい一実施形態は、(1)配列番号5又は6の配列を含有し、(2)配列番号5又は6の配列のN末端及び/又はC末端に少なくとも1個の隣接アミノ酸を有し、(3)アミノ酸長が170未満であり、(4)Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する、CT242ポリペプチドの単離された断片である。
【００１３】
本発明の関連する実施形態は、(1)配列番号5又は6の配列を含み、(2)配列番号5又は6の配列のN末端及び/又はC末端に少なくとも1個の隣接アミノ酸を有し、(3)アミノ酸長が170未満であり、(4)配列番号7、8又は9の配列において1個又は複数個、好ましくは1、2、3、4又は5個の保存的アミノ酸置換を含有し、(4)Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する、CT242ポリペプチドの単離された断片である。
【００１４】
好ましい一実施形態は、配列番号5又は6の配列を有し、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する、CT242ポリペプチドの単離された断片である。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号5又は6の配列を有し、ポリペプチドのN末端及び/又はC末端で1個又は2個のアミノ酸が切断されており、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍の増加を誘発する、CT242ポリペプチドの単離された断片である。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、(1)配列番号5又は6の配列を有し、(2)1個又は複数個、好ましくは1、2、3、4又は5個の保存的アミノ酸置換を含有し、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する、CT242ポリペプチドの単離された断片である。
【００１７】
本発明はさらに、(1)CT812ポリペプチドのアミノ酸103〜111(FSVTNPVVF;配列番号8)を含み、(2)770、760、750、740、730、720、710、700、690、680、670、660、650、640、630、620、610、600、590、580、570、560、550、540、530、520、510、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、15又は10個未満のアミノ酸を有し、(3)Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する、CT812ポリペプチド(配列番号7)の単離された断片を提供する。望ましくは、CT812断片は、少なくとも7個のアミノ酸を有し、及び/又はCD8+ T細胞応答を誘発する。
【００１８】
本発明の好ましい一実施形態は、(1)配列番号8の配列を含有し、(2)配列番号8の配列のN末端及び/又はC末端に少なくとも1個の隣接アミノ酸を有し、(3)アミノ酸長が770未満であり、(4)Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する、CT812ポリペプチドの単離された断片である。
【００１９】
関連する本発明の実施形態は、(1)配列番号8の配列を含み、(2)配列番号8の配列のN末端及び/又はC末端に少なくとも1個の隣接アミノ酸を有し、(3)アミノ酸長が770未満であり、(4)配列番号8の配列において1個又は複数個、好ましくは1、2、3、4又は5個の保存的アミノ酸置換を含有し、(5)Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する、CT812ポリペプチドの単離された断片である。
【００２０】
好ましい一実施形態は、配列番号8の配列を有し、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する、CT812ポリペプチドの単離された断片である。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号8の配列を有し、ポリペプチドのN末端及び/又はC末端で1個又は2個のアミノ酸が切断されており、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する、CT812ポリペプチドの単離された断片である。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、配列番号8の配列を有し、1個又は複数個、好ましくは1、2、3、4又は5個の保存的アミノ酸置換を含有し、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチドから誘発されるインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する、CT812ポリペプチドの単離された断片である。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、(1)本発明の上記CT144ポリペプチド又は断片のいずれかの配列、及び(2)融合パートナーを含有する単離された融合タンパク質である。
【００２４】
本発明は、さらに、(1)本発明の上記CT242ポリペプチド又は断片のいずれかの配列、及び(2)融合パートナーを有する融合タンパク質を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、(1)本発明の上記CT812ポリペプチド又は断片のいずれかの配列、及び(2)融合パートナーを有する単離された融合タンパク質を特徴とする。
【００２６】
本発明はさらに、本発明の上述のポリペプチド、断片、及び融合タンパク質のいずれか、並びに薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、本発明の上述のポリペプチド、断片、及び融合タンパク質のいずれか、並びに薬学的に許容される担体を含有するワクチンを提供する。さらに、本発明は、本発明の上述のポリペプチド、断片、及び融合タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列、並びに薬学的に許容される担体を含有するDNAワクチンを提供する。
【００２８】
すべての上記態様の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチド、ポリペプチド断片、融合タンパク質、及びワクチン(例えば、タンパク質ワクチン及びDNAワクチン)は、哺乳動物に投与された場合、免疫応答を誘発する。望ましくは、本発明のポリペプチド、ポリペプチド断片、融合タンパク質、及びワクチンは、ヒトに投与された場合、免疫応答を誘発する。
【００２９】
本発明はさらに、それを必要とする対象(例えば、クラミジアを有している又はそれに罹患するリスクがある対象)に、本発明の上述のポリペプチド、断片、融合タンパク質、ワクチン(例えば、タンパク質ワクチン又はDNAワクチン)のいずれかの治療有効量を投与することにより、細菌感染、好ましくはクラミジア感染を治療又は予防する方法を提供する。上記方法の望ましい実施形態では、本発明のポリペプチド、断片、融合タンパク質、又はワクチン(例えば、タンパク質ワクチン若しくはDNAワクチン)は、対象の免疫応答を生じさせることができ、及び/又は薬学的に許容される担体中で投与される。
【００３０】
定義
「CT144ポリペプチド」は、配列番号1のアミノ酸配列と実質的に同一であるポリペプチドを意味する。望ましくは、CT144ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、99％又はさらには100％の配列同一性を有する。望ましくは、CT144ポリペプチドは、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチド(例えば、同じアッセイにおいて最も低い測定可能値のIFN-γを誘発するペプチド)で処理されたTリンパ球からのインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する。
【００３１】
「CT144ポリペプチドの断片」又は「CT144断片」は、280個未満のアミノ酸を含有するCT144ポリペプチドの断片を意味する。望ましくは、CT144断片は、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチド(例えば、同じアッセイにおいて最も低い測定可能値のIFN-γを誘発するペプチド)で処理されたTリンパ球からのインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する。望ましくは、断片は、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、35、30、25又は20個未満のアミノ酸を含有し、望ましくは免疫原性である。望ましくは、CT144断片は、配列番号2又は3の配列を含有し、280個未満のアミノ酸を有する。好ましいCT144断片は、7から279アミノ酸長(例えば、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100又は150アミノ酸長)である。CT144断片は、配列番号2又は3の配列において1個又は複数個の保存的アミノ酸置換を含有することができる。さらなる望ましいCT144断片は、配列番号2又は3の配列からなり、あるいは配列番号2又は3の配列において1個又は複数個の保存的アミノ酸置換を含有し、並びに/あるいは配列番号2又は3の配列のN末端及び/又はC末端で少なくとも1個の隣接アミノ酸を含有する。他の好ましいCT144断片は、配列番号2又は3の配列の7個以上の連続アミノ酸を含有する。
【００３２】
「CT242ポリペプチド」は、配列番号4のアミノ酸配列と実質的に同一であるポリペプチドを意味する。望ましくは、CT242ポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、99％又はさらには100％の配列同一性を有する。望ましくは、CT242ポリペプチドは、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチド(例えば、同じアッセイにおいて最も低い測定可能値のIFN-γを誘発するペプチド)で処理されたTリンパ球からのインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する。
【００３３】
「CT242ポリペプチドの断片」又は「CT242断片」は、170個未満のアミノ酸を含有するCT242ポリペプチドの断片を意味する。望ましくは、CT242断片は、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチド(例えば、同じアッセイにおいて最も低い測定可能値のIFN-γを誘発するペプチド)で処理されたTリンパ球からのインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する。望ましくは、断片は、アミノ酸長が160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、15又は10未満であり、望ましくは免疫原性である。好ましいCT242断片は、7から169アミノ酸長(例えば、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100又は150アミノ酸長)である。望ましくは、CT242断片は、配列番号5又は6の配列を含有し、170個未満のアミノ酸を有する。CT242断片は、配列番号5又は6の配列において1個又は複数個の保存的アミノ酸置換を含有することができる。さらなる望ましいCT242断片は、配列番号5又は6の配列からなり、あるいは配列番号5又は6の配列において1個又は複数個の保存的アミノ酸置換を含有し、並びに/あるいは配列番号5又は6の配列のN末端及び/又はC末端で少なくとも1個の隣接アミノ酸を含有する。他の好ましいCT242断片は、配列番号5又は6の配列の7個以上の連続アミノ酸を含有する。
【００３４】
「CT812ポリペプチド」は、配列番号7のアミノ酸配列と実質的に同一であるポリペプチドを意味する。望ましくは、CT812ポリペプチドは、配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、99％又はさらには100％の同一性を有する。望ましくは、CT812ポリペプチドは、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチド(例えば、同じアッセイにおいて最も低い測定可能値のIFN-γを誘発するペプチド)で処理されたTリンパ球からのインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する。
【００３５】
「CT812ポリペプチドの断片」又は「CT812断片」は、770個未満のアミノ酸を含有するCT812ポリペプチドの断片を意味する。好ましいCT812断片は、7から769アミノ酸長の間(例えば、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100又は150アミノ酸長)である。望ましくは、CT812断片は、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチド(例えば、同じアッセイにおいて最も低い測定可能値のIFN-γを誘発するペプチド)で処理されたTリンパ球からのインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、又は500倍増加して誘発する。望ましくは、断片は、760、750、740、730、720、710、700、690、680、670、660、650、640、630、620、610、600、590、580、570、560、550、540、530、520、510、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、15又は10個未満のアミノ酸を有し、望ましくは免疫原性である。望ましくは、CT812断片は、配列番号8の配列を含有し、770個未満のアミノ酸を有する。CT812断片は、配列番号8の配列において1個又は複数個の保存的アミノ酸置換を含有することができる。さらなる望ましいCT812断片は、配列番号8の配列からなり、あるいは配列番号8の配列において1個又は複数個の保存的アミノ酸置換を含有し、並びに/あるいは配列番号8の配列のN末端及び/又はC末端で少なくとも1個の隣接アミノ酸を含有する。他の好ましいCT812断片は、配列番号8の配列の7個以上の連続アミノ酸を含有する。
【００３６】
「実質的に同一の」は、参照アミノ酸配列と少なくとも50％、望ましくは60％、70％、75％又は80％、より望ましくは85％、90％又は95％、最も望ましくは99％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドを意味する。比較配列の長さは、一般に少なくとも10個のアミノ酸、望ましくは少なくとも15個の連続アミノ酸、より望ましくは少なくとも20、25、50、75、90、100、150、200、250、300又は350個の連続アミノ酸、最も望ましくは完全長のアミノ酸配列となるであろう。
【００３７】
配列同一性は、デフォルト設定で配列分析ソフトウェアを用いて測定することができる（例えば、Sequence Analysis Software Package（Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、1710 University Avenue、Madison、WI 53705））。このようなソフトウェアは、さまざまな置換、欠失、及びその他の修飾に相同性の度合いを割り当てて類似の配列を一致させることができる。
【００３８】
複数の配列は、Clustal W(1.4)プログラム(European Molecular Biology Laboratory、ドイツのJulie D. Thompson及びToby Gibson、並びにEuropean Bioinformatics Institute、Cambridge、UKのDesmond Higginsにより作成された)を用いて、ペアワイズアライメントモードを「スロー(slow)」に、ペアワイズアライメントパラメータをオープンギャップペナルティー10.0及び伸長ギャップペナルティー0.1を含むように設定し、類似度マトリックスを「ブロサム(blosum)」に設定して整列させることもできる。さらに、マルチプルアライメントパラメータは、オープンギャップペナルティー10.0、伸長ギャップペナルティー0.1、並びに類似度マトリックスを「ブロサム」に、ディレイダイバージェント(delay divergent)を40％に、及びギャップ距離を8に設定することを含むことができる。
【００３９】
「保存的アミノ酸置換」は、本明細書では、アミノ酸配列におけるあるアミノ酸を、その側鎖の化学的性質に関連があるアミノ酸ファミリー内の別のアミノ酸に置き換えることを意味する。遺伝的にコードされたアミノ酸は、四つのファミリー、すなわち、酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸)、塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン)、非極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、及び非電荷極性(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン)に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族アミノ酸としてグループ化される場合もある。同様に、アミノ酸は次の群に分類することもできる:酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸)、塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン)、脂肪族(グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン)(セリン及びスレオニンは場合により脂肪族ヒドロキシルとして別にグループ化される)、芳香族(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン)、アミド(アスパラギン、グルタミン)、及び含硫アミノ酸(システイン、メチオニン)。
【００４０】
アミノ酸配列の変化が機能的相同体をもたらすかどうかは、本明細書に記載されたアッセイなどの標準的方法を用いて、変異体ペプチドが野生型タンパク質と同様に機能する能力を評価して判定することができる。例えば、C.トラコマチス特異的CD4+又はCD8+細胞は、特定のC.トラコマチスポリペプチド又はその断片が免疫原性であるかどうかを判定するのに使用することができる。本発明の望ましい実施形態は、配列番号2、3、5、6又は8のアミノ酸配列において少なくとも1個の保存的アミノ酸置換;より望ましくは配列番号2又は3の配列において1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の保存的アミノ酸置換;及び配列番号5、6、又は8の配列において1、2、3、4又は5個の保存的アミノ酸置換を含む。
【００４１】
「隣接アミノ酸」は、特定の定義された配列のN又はC末端に直接隣接したポリペプチド配列におけるアミノ酸を意味する。望ましくは、隣接アミノ酸は、配列番号2、3、5、6又は8のアミノ酸配列のN末端及び/又はC末端に存在する。配列番号2又は3の配列に関して、隣接アミノ酸は、配列番号1の配列に存在する1個又は複数個の天然に隣接するアミノ酸からなってよい。配列番号5又は6の配列に関して、隣接アミノ酸は、配列番号4の配列に存在する1個又は複数個の天然に隣接するアミノ酸からなってよい。配列番号8の配列に関して、隣接アミノ酸は、配列番号7の配列に存在する1個又は複数個の天然に隣接するアミノ酸からなってよい。
【００４２】
本明細書では「融合タンパク質」は、(1)CT144ポリペプチドの断片、CT242ポリペプチドの断片、又はCT812ポリペプチドの断片、及び(2)融合パートナーからなるポリペプチドを指す。
【００４３】
本明細書では「融合パートナー」は、本発明のCT144ポリペプチドの断片、CT242ポリペプチドの断片、又はCT812ポリペプチドの断片に融合することができる異種配列を指す。望ましくは、融合パートナーは、CT144ポリペプチドの断片、CT242ポリペプチドの断片、又はCT812ポリペプチドの断片に新たな機能又は活性を提供する。融合パートナーの例は、本明細書に記載されており、検出マーカー、DNA結合ドメイン、遺伝子活性化ドメイン、安定化ドメイン、又はタンパク質の産生若しくは精製を助ける配列を含む。
【００４４】
本明細書では「免疫応答」は、抗原又は感染性因子に応答した生物の免疫系の活性化を指す。脊椎動物では、これには一つ又は複数の次のもの、すなわち、記憶B細胞への未感作B細胞の成熟、形質細胞(エフェクターB細胞)による抗体産生、細胞性免疫の誘導、CD4+ T細胞による活性化及びサイトカイン放出、CD8+ T細胞の活性化及びサイトカイン放出、サイトカイン動員及び食細胞(例えば、マクロファージ、好中球、好酸球)の活性化、並びに/あるいは補体活性化が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
「免疫原性の」は、対象における免疫応答を誘導することができる任意の物質を意味する。
【００４６】
「非免疫原性の」は、実施例に記載されたTリンパ球アッセイにおける他の試験ペプチドに比べて、最も低いレベルのインターフェロン-γ産生を誘発する任意のペプチドを意味する。非免疫原性ペプチドは、ヒトペプチド又はクラミジア・トラコマチスペプチドであってよい。
【００４７】
「薬学的に許容される塩」は、製薬業界で使用される任意の非毒性酸付加塩又は金属錯体を意味する。酸付加塩の例には、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸又はトリフルオロ酢酸等などの有機酸;タンニン酸、カルボキシメチルセルロース等などのポリマー酸;及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸等などの無機酸が含まれる。金属錯体には、亜鉛、鉄等が含まれる。
【００４８】
「薬学的に許容される担体」は、薬剤を可溶化し対象に送達するのに使用される任意の溶液を意味する。望ましい薬学的に許容される担体は生理食塩水である。望ましい実施形態では、薬学的に許容される担体はアジュバントを含む。例示的アジュバントは本明細書に記載されている。他の生理学的に許容される担体及びこの製剤は、当業者に公知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、(第19版)、A. Gennaro編、1995年、Mack Publishing Company、Easton、PA.に記載されている。
【００４９】
「単離された」は、天然にタンパク質(又はその断片)に伴う成分から分離されたタンパク質(又はその断片)を意味する。典型的には、ポリペプチドは、これが天然に結合するタンパク質及び天然の有機分子を少なくとも60重量％含まない場合、実質的に単離されている。該定義はまた、その隣接アミノ酸から分離されたポリペプチドにも及ぶ(例えば、アミノ酸配列に関して、「単離された」は、配列がポリペプチドにおいて天然に結合する隣接アミノ酸を含まない配列を指す)。好ましくは、ポリペプチドは、少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99重量％単離される。単離ポリペプチドは、例えば、天然源からの抽出(例えば、C.トラコマチスに感染した細胞からの精製)、CT144、CT242若しくはCT812ポリペプチドの断片をコードする組換え核酸の発現、又はポリペプチドの化学合成による、標準的手法により得ることができる。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はHPLC分析による任意の適切な方法により測定することができる。
【００５０】
「治療有効量」は、対象において1又は複数の次の効果、すなわち、免疫応答;クラミジア感染レベルの低下(例えば、少なくとも5％、10％、20％又は30％、より望ましくは40％、50％、60％又は70％、最も望ましくは80％又は90％の低下);あるいは新たなクラミジア感染に対する抵抗性の増大(例えば、少なくとも5％、10％、20％、30％、40％又は50％;より望ましくは60％、70％、80％又は90％;又は最も望ましくは100％、200％又は300％の増大)を生じさせるのに必要な免疫原性化合物(例えば、ポリペプチド、断片、融合タンパク質、又はワクチン)の量を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ポリペプチドCT144の完全アミノ酸配列(配列番号1)(Genbankアクセッション番号NP_219647)を示す図である。
【図２】ポリペプチドCT242の完全アミノ酸配列(配列番号4)(Genbankアクセッション番号NP_219747)を示す図である。
【図３−１】図3-1から3-2は、ポリペプチドCT812の完全アミノ酸配列(配列番号7)(Genbankアクセッション番号NP_220332)を示す図である。
【図３−２】図３−１の続き。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
クラミジアワクチンを開発するための以前の試みはほとんど成果がなかった(Cotterら、Infect. Immun. 63:4704〜4714頁、1995年)(Palら、Vaccine 17:459〜465頁、1999年)(Palら、Infect. Immun. 65:3361〜3369頁、1997年)(Suら、Vaccine 13:1023〜1032頁、1995年)(Taylorら、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29:1847〜1853頁、1988年)(Zhangら、J. Infect. Dis. 176:1035〜1040頁、1997年)。サブユニットワクチンは、これまで古典的なワクチン接種戦略に抵抗してきた多くの重要なヒト病原体を制御できる可能性を有する。
【００５３】
クラミジア・トラコマチスは、ヒト社会への著しい負担であっても防御ワクチンが開発されてこなかったヒト病原体である。クラミジア・トラコマチスは、米国における性感染症の最も一般的な細菌性因子である。C.トラコマチスに起因する女性生殖管での慢性炎症は、骨盤内炎症性疾患及び子宮外妊娠などの深刻な病変をもたらし得る。C.トラコマチスはまた、世界中の予防可能な失明の最も一般的な原因でもあり、推定100〜150万人がこの疾患から現在失明している。
【００５４】
死菌による免疫化が、該疾患に伴う病変の重症度の増大をもたらし、該細菌を操作するための遺伝系の欠如が、弱毒クラミジア株の開発を妨げてきたことから、古典的ワクチン学方法の使用が、C.トラコマチス病原体に対するワクチンの成功をもたらすことはなかった。C.トラコマチス由来の特定のタンパク質を免疫応答の誘発に使用するサブユニットワクチンは、生体全体による免疫化に伴う病的反応を回避する一方で、防御抗原に対する反応を誘発してワクチンの成功に対する障害を克服する可能性を有する。成功するC.トラコマチスサブユニットワクチンを作製するには、防御免疫応答を誘発するC.トラコマチスプロテオーム中のタンパク質が同定されなければならない。本発明者らは、C.トラコマチス感染中にCD8+及びCD4+ T細胞応答を誘発する新規のC.トラコマチスタンパク質の同定をここで報告する。
【００５５】
本発明の免疫原性クラミジアペプチドは、C.トラコマチス特異的CD4+又はCD8+ T細胞、及びC.トラコマチス血清型D由来ゲノム配列の発現ライブラリーを利用するアッセイにおいて同定された。アッセイ及びこの成分の詳細な記載は以下に提供される。
【００５６】
本発明は、CT144、CT242及びCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、並びに融合タンパク質を特徴とする。本発明は、さらに、CT144、CT242若しくはCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質(あるいは本発明のポリペプチド、ポリペプチド断片、若しくは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列)を含有する組成物、ワクチン(例えば、DNAワクチン)、及びキットを特徴とする。
【００５７】
特定のタンパク質配列のアミノ又はカルボキシ末端への隣接アミノ酸の付加方法は、当技術分野でよく知られている。付加された隣接アミノ酸は、天然ポリペプチドの完全長配列に存在する、天然に隣接する配列であってよく(例えば、CT144断片に関しては、配列番号1の配列における隣接配列;CT242断片に関しては、配列番号4の配列における隣接配列;及びCT812断片に関しては、配列番号7の配列における隣接配列)、又は任意の他のアミノ酸配列を含んでよい。
【００５８】
さらに、本発明はまた、(1)本発明のCT144、CT242若しくはCT812ポリペプチド又はポリペプチド断片のいずれか、及び(2)融合パートナーからなる融合タンパク質も提供する。融合パートナーは、本発明の断片に追加の機能又は活性を提供することができる異種タンパク質配列である。例えば、融合パートナーは、直接的又は間接的に検出する(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、血球凝集素若しくはアルカリホスファターゼ)、DNA結合ドメイン(例えば、GAL4若しくはLexA)を提供する、遺伝子活性化ドメイン(例えば、GAL4若しくはVP16)を提供する、ポリペプチドを安定化する、あるいはポリペプチドの産生又は精製を促進(例えば、His6、mycタグ、ストレプトアビジン、SIINFEKLエピトープ(配列番号9)若しくは分泌シグナル)することができる。
【００５９】
融合パートナーは、免疫刺激機能を提供する配列を含有することもでき、例にはインターロイキン-2(Fanら、Acta Biochem. Biophys. Sin. 38:683〜690頁、2006年)、免疫グロブリン(例えば、IgG、IgM、IgE若しくはIgA)、Toll様受容体-5フラジェリン(Huleattら、Vaccine 8:763〜775頁、2007年)、サル免疫不全ウイルスTat(Chenら、Vaccine 24:708〜715頁、2006年)、又はC群連鎖球菌のフィブリノゲン-アルブミン-IgG受容体(Schulzeら、Vaccine 23:1408〜1413頁、2005年)が含まれる。さらに、融合パートナー配列は、可溶性を増強又は半減期を増大するために、例えば、親水性アミノ酸残基(Murbyら、Eur. J. Biochem. 230:38〜44頁、1995年)、グリコシル化配列(Sinclair及びElliott、J. Pharm. Sci. 94:1626〜1635頁、2005年)、又はヒト絨毛性ゴナドトロピン若しくはトロンボポエチンのカルボキシ末端(Leeら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 339:380〜385頁、2006年)を付加することができる。これらの隣接配列の付加方法は、当技術分野で公知であり、さらに、本明細書に記載されている。
【００６０】
さらに、ポリペプチド配列への保存的アミノ酸置換の導入方法も、当技術分野で公知である。配列番号2、3、5、6、及び8の配列内のアミノ酸は、類似の化学特性を有する他のアミノ酸で置き換えることができる。例えば、保存的置換は、ある酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸に置き換えることである(例えば、アスパラギン酸をグルタミン酸に、又はこの逆)。別の例は、ある塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸に置き換えることである(リジンをヒスチジンに、又はこの逆)。
【００６１】
ポリペプチド配列のアミノ及び/又はカルボキシ末端からのアミノ酸の除去方法も、当技術分野で公知である。アミノ酸は、望ましくは、配列番号2、3、5、6、又は8のタンパク質断片のアミノ及び/又はカルボキシ末端から除去される。
【００６２】
本明細書に開示された特定のポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質は、例えば、以下の実施例に記載されているような標準的方法を用いてこれらの免疫原性についてアッセイすることができる
CT144、CT242及びCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質発現
本発明のCT144、CT242及びCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質は、適切な発現ビヒクル中にポリペプチド断片又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子による、適切な宿主細胞の形質転換により産生することができる。
【００６３】
分子生物学の当業者は、多種多様な発現系の任意のものを、本明細書に開示されたCT144、CT242及びCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質を提供するのに使用できることを理解するであろう。使用される正確な宿主細胞は、本発明にとって重要ではない。CT144、CT242及びCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質は、原核生物宿主(例えば、大腸菌(E. coli))、あるいは真核生物宿主(例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(S. cerevisiae)、昆虫細胞、例えば、Sf21細胞、又は哺乳動物細胞、例えば、NIH 3T3、HeLa、若しくは好ましくはCOS細胞)で産生することができる。このような細胞は、幅広い供給源(例えば、American Type Culture Collection、Manassas、VA)から入手可能である。形質転換又はトランスフェクション方法及び発現ビヒクルの選択は、選択された宿主系により決まるであろう。形質転換及びトランスフェクション方法は、例えば、Kucherlapatiら(CRC Crit. Rev. Biochem. 16:349〜379頁、1982年)及びDNA Transfer to Cultured Cells (Ravid及びFreshney編、Wiley-Liss、1998年)に記載されており、発現ビヒクルは、例えば、Vectors:Expression Systems: Essential Techniques (Jones編、Wiley & Sons Ltd.、1998年)で提供されたものから選択することができる。
【００６４】
組換えポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質を発現させた後、例えば、アフィニティークロマトグラフィーを用いてこれを単離することができる。一つの例では、CT144、CT242若しくはCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質に対して生起された抗体は、カラムに付着することができ、組換えポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質を単離するのに使用することができる。アフィニティークロマトグラフィー前のポリペプチド保有細胞、ポリペプチド断片保有細胞、又は融合タンパク質保有細胞の溶解及び分画は、標準的方法(例えば、Methods in Enzymology、Volume 182、Abelson、Simon、及びDeutscher編、Elsevier、1990年参照)により行うことができる。
【００６５】
単離後、組換えCT144、CT242及びCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質は、所望であれば、例えば、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製することができる(例えば、Fisher、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology、Work及びBurdon編、Elsevier、1980年;Scopes、Protein Purification: Principles and Practice、第3版、Cantor編、Springer、1994年参照)。
【００６６】
CT144、CT242及びCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質は、化学合成により(例えば、Solid Phase Peptide Synthesis、第2版、1984年、The Pierce Chemical Co.、Rockford、IL;Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide、Kates及びAlbericio編、Marcel Dekker Inc.、2000年に記載された方法により)産生することもできる。
【００６７】
本明細書に記載されたポリペプチドを発現する安定な細胞系の産生に関して、本発明のCT144、CT242若しくはCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質のいずれかをコードするPCR増幅核酸は、哺乳動物発現ベクターの誘導体の制限部位にクローン化することができる。例えば、pcDNA3誘導体であるKA (Invitrogen社、Carlsbad、CA)は、インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)をコードするDNA断片を含有する。或いは、c-myc又はポリ-ヒスチジンタグなどの他のタグをコードするベクター誘導体を使用することができる。
【００６８】
ワクチン産生
本発明はまた、本発明のCT144、CT242若しくはCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質を含むワクチン組成物も提供する。本発明はまた、本発明のCT144、CT242若しくはCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有するDNAワクチンも提供する。ワクチン組成物で使用するための好ましいポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質は、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチド(例えば、同じアッセイにおいて最も低い測定可能値のIFN-γを誘発するペプチド)で処理されたTリンパ球からのインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200又は500倍増加して誘発する。同様に、DNAワクチンで使用するための好ましいポリヌクレオチド配列は、本発明のCT144、CT242若しくはCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有し、Tリンパ球集団からのインターフェロン-γ産生を、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチド(例えば、同じアッセイにおいて最も低い測定可能値のIFN-γを誘発するペプチド)で処理されたTリンパ球からのインターフェロン-γ産生レベルに比べて、少なくとも3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、又は500倍増加して誘発する。本発明は、さらに、対象、特にヒトにおける免疫学的応答の誘導方法であって、感染、望ましくは細菌感染、最も望ましくは、C.トラコマチス感染から対象を予防又は防御するための免疫応答を誘導する目的に適した担体中に、本明細書に開示されたCT144、CT242若しくはCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質、あるいは本明細書に開示されたCT144、CT242若しくはCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有するDNAワクチンを、対象に接種することを含む方法を含む。この免疫学的組成物(例えば、DNAワクチン)の投与は、既に感染を経験している対象において治療目的で使用されてもよいし、又は感染を防ぐのに予防目的で使用されてもよい。さらに、上述のワクチンは、対象を受動免疫するのに使用できるポリクローナル抗体(標準的方法を用いて血清から精製又は単離された)を生じさせるため対象に投与することもできる。これらのポリクローナル抗体は、免疫化学試薬として役立つ可能性がある。
【００６９】
免疫原性ポリペプチドを含有するワクチンの調製は、当業者に公知である。本発明のCT144、CT242若しくはCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質は、ワクチン接種のための抗原として役立ちうる。本明細書に記載されたタンパク質ベースのワクチン、及び本発明のポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質をコードするDNAワクチンはいずれも、対象における抗体産生、又は、特に、CD4+及び/若しくはCD8+ T細胞応答を含む免疫学的応答を誘導するために対象に送達され得る。
【００７０】
タンパク質ベースのワクチンは、典型的には、水性組成物を形成するための水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、酢酸緩衝生理食塩水(ABS)、リンゲル液等などの生理学的に許容される希釈ビヒクル(diluent vehicle)中で、本発明の精製組換えCT144、CT242若しくはCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質から調製される。希釈ビヒクルは、以下で考察されるようなスクアラン又はスクアレンなどの油性物質を含むこともできる。
【００７１】
ワクチン抗原は、通常、担体を投与する対象に有害な抗体の産生を含まない任意の担体を含む、薬学的に許容される担体と組み合わされる。適切な担体は、典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体及び不活性ウイルス粒子などのゆっくり代謝される大きな高分子を含む。このような担体は当業者によく知られている。これらの担体は、アジュバントとして機能することもできる。
【００７２】
本発明のCT144、CT242及びCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質は、薬学的に許容され、かつ免疫原性ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質と適合可能な賦形剤と混合することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等及びこれらの組合せである。さらに、所望であれば、ワクチンは、組成物の免疫原性有効性を増強する湿潤剤若しくは乳化剤、又はpH緩衝剤などの少量の補助物質を含有することができる。
【００７３】
タンパク質ベースのワクチンは、有利にはアジュバントも含む。本発明のワクチンのための適切なアジュバントは、本発明の免疫原性ポリペプチド又は断片に対するB細胞及び/又はT細胞応答(例えば、CD4+及び/又はCD8+ T細胞応答)を増強することができるアジュバントを含む。アジュバントは当技術分野でよく知られている(例えば、Vaccine Design-The Subunit and Adjuvant Approach、1995年、Pharmaceutical Biotechnology、Volume 6、Powell及びNewman編、Plenum Press、New York and London参照)。
【００７４】
本発明の免疫原との使用に好ましいアジュバントには、アルミニウム又はカルシウム塩(例えば、水酸化物塩又はリン酸塩)が含まれる。望ましいアジュバントは、Alhydrogel(商標)などの水酸化アルミニウムゲルである。水酸化アルミニウムゲル(alum)に関して、免疫原性ポリペプチド断片又は融合タンパク質は、投与量当たり50から800μgのアルミニウムが存在する、好ましくは400から600μgが存在するようにアジュバントと混合される。
【００７５】
本発明の免疫原性ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質と共に使用するための別のアジュバントはエマルションである。エマルションは、水中油型エマルション又は油中水型エマルションであってよい。免疫原性ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質に加えて、このようなエマルションは、周知のスクアレン、スクアラン等の油相、及び分散剤を含む。非イオン性分散剤が好ましく、このような物質には、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、及びモノオレイン酸マンニド(mannide mono-oleate)などソルビタン及びマンニドのモノ-及びジ-C12〜C24-脂肪酸エステルが含まれる。免疫原含有エマルションは、エマルションとして投与される。
【００７６】
望ましくは、このようなエマルションは、水相中の免疫原性ポリペプチド断片又は融合タンパク質により乳化された、スクアレン及びモノオレイン酸マンニド(Arlacel(商標)A)を含む(場合によりスクアランと共に含む)油中水型エマルションである。このようなエマルションのよく知られた例には、Montanide(商標)ISA-720及びMontanide(商標)ISA-703(Seppic社、カストル、フランス)が含まれ、各々がスクアレン及びスクアランの両方を含有すること、各々でスクアレンの方が多いが、Montanide(商標)ISA-703では程度は少ないことが理解されている。望ましくは、Montanide(商標)ISA-720が使用され、油対水の比7:3(w/w)が使用される。他の好ましい水中油型エマルションアジュバントには、参照により本明細書に組み込まれている、WO 95/17210号及びEP 0399842で開示されたものが含まれる。
【００７７】
低分子アジュバントの使用も、本明細書で企図される。本明細書で有用な低分子アジュバントの一つのタイプは、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第4,539,205号、第4,643,992号、第5,011,828号及び第5,093,318号に記載された7-置換-8-オキソ-又は8-スルホ-グアノシン誘導体である。これらの物質のうち、7-アリル-8-オキソグアノシン(ロキソリビン)は特に好ましい。ロキソリビンは、免疫原特異的応答を誘導する上で特に効果があることが示されている。
【００７８】
さらなる有用なアジュバントには、Corixa Corp社から入手可能なモノホスホリル脂質A(MPL)(米国特許第4,987,237号参照)、Coley Pharmaceutical Group社から入手可能なCPG、Aquila Biopharmaceuticals, Inc.社から入手可能なQS21、SmithKline Beecham社から入手可能なSBAS2、米国特許第4,767,842号に記載されたいわゆるムラミルジペプチド類似体、及びChiron Corp.社から入手可能なMF59(米国特許第5,709,879号及び第6,086,901号参照)が含まれる。さらなるアジュバントには、南米の樹木モラヤ(Quillaja Saponaria Molina)の樹皮由来の活性サポニン画分(例えば、Quil(商標)A)が含まれる。Quil(商標)Aの誘導体、例えばQS21(Quil(商標)AのHPLC精製画分誘導体)、及びこの産生方法が、米国特許第5,057,540号に開示されている。QS21(QA21として知られる)に加えて、QA17などの他の画分も開示されている。
【００７９】
3-脱-O-アシル化モノホスホリル脂質Aは、Ribi Immunochem社により製造される周知のアジュバントである。アジュバントは、細菌から抽出された三つの成分、すなわち、モノホスホリル脂質(MPL)A、トレハロースジミコレート(trehalose dimycolate (TDM))、及び細胞壁骨格(CWS)を2％スクアレン/Tween(商標)80エマルション中に含有する。このアジュバントは、英国特許第2122204B号に教示された方法により調製することができる。3-脱-O-アシル化モノホスホリル脂質Aの好ましい形態は、直径0.2μm未満の小さな粒子サイズを有するエマルション形態である(EP 0689454 B1)。
【００８０】
ムラミルジペプチドアジュバントには、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP、米国特許第4,606,918号)、N-アセチル-ノル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(CGP11637、nor-MDPと呼ばれる)、及びN-アクテリル(acteryl)-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1',2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン(CGP)1983A (MTP-PEと呼ばれる)が含まれる。
【００８１】
望ましいアジュバント混合物には、3D-MPL及びQS21(EP0671948 B1)、3D-MPL及びQS21(WO 95/17210号、PCT/EP98/05714号)を含む水中油型エマルション、他の担体と処方された3D-MPL(EP 0689454 B1)、コレステロール含有リポソーム中に処方されたQS21(WO 96/33739号)、又は免疫刺激オリゴヌクレオチド(WO 96/02555号)の組合せが含まれる。別のアジュバントには、WO 99/52549号に記載されたもの及びポリオキシエチレンエーテルの非微粒子懸濁液(英国特許出願第9807805.8号)が含まれる。
【００８２】
アジュバントは、アジュバント、哺乳動物、並びに免疫原性CT144、CT242及びCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質により異なり得るアジュバント量で利用される。典型的な量は、免疫化ごとに約1μgから約1mgまで異なり得る。当業者は、適切な濃度又は量は容易に決定できることを認識している。
【００８３】
本発明はまた、本発明のポリペプチド、ポリペプチド断片、及び融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有するDNAワクチンも提供する。本発明のCT144、CT242若しくはCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有するDNAワクチンの調製方法は、当技術分野で公知である。例えば、本発明のCT144、CT242若しくはCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、コードされたポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質が細胞で発現されるようにCT144、CT242若しくはCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列(例えば、DNA又はRNA)を細胞にトランスファーする、ウイルスに基づくベクターに入れることができる。CT144、CT242若しくはCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を送達するのに使用することができるさまざまなウイルスに基づくベクターには、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルス由来ベクター、レトロウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスに基づくベクター、脾臓壊死ウイルスに基づくベクター、フレンドマウス白血病に基づくベクター、レンチウイルスに基づくベクター(Loisら、Science、295:868〜872頁、2002年)、パポバウイルスに基づくベクター(例えば、SV40ウイルスベクター)、ヘルペスウイルスに基づくベクター、水疱性口内炎ウイルスG糖タンパク質スパイクを含有又は提示するウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルスに基づくベクター、ヘパドナウイルスに基づくベクター、及びバキュロウイルスに基づくベクターが含まれる。さらなる、例示的DNAワクチンベクター(制限する意図はない)は、「Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells」、Savvas C. Makrides(編)、Elsevier Science Ltd、2003年に見出すことができる。DNAワクチンは、任意の投与経路又はex vivo負荷(loading)を用いて、一若しくは複数の許容可能な希釈ビヒクル、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、湿潤剤若しくは乳化剤、又はpH緩衝剤(本明細書で提供された例)、及び/又は一若しくは複数の核酸送達剤(例えば、ポリマー粒子、脂質粒子、ペプチドベースの粒子、分解可能な粒子、マイクロエマルション、VPL、弱毒細菌ベクター若しくはウイルスベクター)と併用して対象に提供することができる。
【００８４】
ワクチンは、従来、注射により非経口で、例えば、皮下又は筋肉内に投与される。典型的にはワクチンは、溶液又は懸濁液としての注射可能な形態で調製される。注射に適切な固形は、エマルションとして、又は免疫原性ポリペプチド、ポリペプチド断片若しくは融合タンパク質をリポソームに封入して調製することもできる。他の投与方法に適切なさらなる製剤には、座剤、及び場合によっては、経口製剤又は鼻噴霧剤によるが含まれる。座剤に関しては、伝統的な結合剤及び担体には、例えば、ポリアルカレン(polyalkalene)グリコール又はトリグリセリドを含めることができる。このような座薬は、0.5％から10％、好ましくは1〜2％の範囲で活性成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような通常使用される賦形剤が含まれる。
【００８５】
ワクチン組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤又は粉末の形態をとり、開示されたCT144、CT242及びCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、融合タンパク質、又はDNAワクチンの免疫原性有効量を含有する。典型的な組成物では、免疫原性ポリペプチド、ポリペプチド断片、融合タンパク質、又はDNAワクチンの免疫原性有効量は、投与量当たり約1μg〜10mg、より望ましくは投与量当たり約5μgから5mgである。
【００８６】
ワクチンは、典型的には非経口投与用に製剤化される。例示的な免疫化は、皮下(SC)、筋肉内(IM)、静脈内(IV)、腹腔内(IP)、又は皮内(ID)により実施される。
【００８７】
本明細書に記載された免疫原性CT144、CT242又はCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、及び融合タンパク質は、中性又は塩形態としてワクチンに処方することができる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩(ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質の遊離アミノ基により形成される)が含まれ、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸により形成される。遊離カルボキシル基により形成された塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基から誘導されるものであってもよい。
【００８８】
ワクチンは、投与剤形と適合可能な方法で、並びに治療的に有効及び免疫原性であるような量で投与される。投与される量は、治療対象、免疫応答を提供する対象の免疫系の能力、及び望まれる防御程度(例えば、予防治療又はクラミジア患者の治療)により決まる。投与される必要なCT144、CT242及びCT8I2ポリペプチド、ポリペプチド断片、融合タンパク質、又はDNAワクチンの正確な量は、施術者の判断により決まり、各対象に特有である。しかし、適切な用量範囲は、対象1人当たり約数百マイクログラム程度の活性成分である。初回投与及び追加接種の適切なレジメンも利用可能であるが、初回投与後間隔をあけて、続いて注射又は他の投与をする(数週間又は数カ月)のが典型的である。
【００８９】
医薬組成物
ワクチンに加えて、本発明はまた、本発明のCT144、CT242若しくはCT812ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質を含む医薬組成物も提供する。このような組成物は、薬学的に許容される担体、ビヒクル、又は希釈剤に組み込むことができる。
【００９０】
一つの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。本発明の化合物は、当技術分野でよく知られているように、例えば、目的とする用途により、任意の適切な手段により本説明に基づき投与することができる。例えば、本発明のポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質が経口投与される場合、これらは錠剤、カプセル剤、粒剤、粉剤、又はシロップ剤として製剤化することができる。或いは、本発明の製剤は、注射(静脈内、筋肉内若しくは皮下)、点滴製剤、又は座剤として非経口投与することができる。眼粘膜経路による適用に関して、本発明の化合物は、点眼剤又は眼軟膏剤として製剤化することができる。水溶液は、一般に、製剤化の容易さ、生物学的適合性、及び例えば、1〜2滴の溶液を眼に注入してこのような組成物を容易に投与する対象の能力に基づいていることが眼投与に好ましい。しかし、組成物は、懸濁液、粘着性若しくは半粘着性ゲル、又は他のタイプの固体若しくは半固体組成物であってもよい。
【００９１】
上述の製剤は、従来の手段により調製することができ、所望であれば、化合物は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、可溶化剤、懸濁助剤、乳化剤、又はコーティング剤などの任意の従来の添加剤と混合することができる。
【００９２】
対象の化合物は、経口、鼻腔、局所(口腔及び舌下を含む)、直腸、膣、エアロゾル及び/又は非経口投与に好適である。製剤は、好都合には単位投与剤形で提示することができ、薬学の技術分野で周知の任意の方法により調製することができる。単回投与量を作製するため担体物質と組み合わせることができる薬剤量は、処置される対象、及び特定の投与方法により異なる。
【００９３】
非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、一若しくは複数の薬学的に許容される滅菌等張水性若しくは非水性溶液、分散剤、懸濁液若しくはエマルション、又は使用する直前に滅菌注射溶液若しくは分散剤に戻すことができる滅菌粉末と併用して、一若しくは複数の補助成分を含む。これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、意図されたレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質、又は懸濁剤若しくは濃化剤を含有し得る。
【００９４】
細菌感染の治療方法
本明細書に記載されたポリペプチド断片、融合タンパク質、医薬組成物、及びワクチンは、対象における細菌感染、最も好ましくはC.トラコマチス感染を含む種々の疾患治療で使用することができる。当業者は、本明細書に記載されたいずれかの組成物の用量が、例えば、対象の症状、年齢、及び体重、治療又は予防される感染の性質及び重症度、投与経路、並びに補助剤形態により異なるであろうことを理解するであろう。いずれの対象とする製剤も、例えば、単回投与量又は分割投与量などの任意の適切な投与量で投与することができる。単独若しくは本発明の任意の他の化合物と一緒の、又は治療される特定の感染に有用と思われる任意の化合物との併用での、本発明の化合物の用量は、当業者に公知の手法により容易に決定することができる。また、本発明は、一を超える対象化合物、及び他の治療剤の混合物を提供する。
【００９５】
さまざまな成分の効果の発現及び持続は相補的（complimentary）であることから、本発明の幾つかの化合物、或いは他の治療剤の併用は、任意の個々の成分に必要とされる用量を減らすことができる。このような併用療法では、さまざまな活性剤は、一緒に又は個別に、同時に又は1日のうち別の時間に送達することができる。
【００９６】
本発明により治療又は予防され得るさまざまな細菌感染には、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・シッタシ(Chlamydia psittaci)、及びクラミジア・トラコマチスが含まれる。
【００９７】
治療抗体及びT細胞枯渇
或いは、クラミジアに対する免疫応答は、感染自体よりむしろ、対象における不妊及び骨盤内炎症性疾患を含む、感染に伴う症状に関与し得る。このケースでは、感染対象内のCD4+又はCDB+ T細胞サブセットによる免疫応答を制限することが望ましい可能性がある。したがって、本発明のポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質を標的にするT細胞クローンを特異的に認識する抗体が、クラミジア感染に伴う有害作用を治療又は予防する上で有用になり得る。T細胞の特定集団の選択的枯渇方法は、例えば、Weinbergら(Nature Med. 2:183〜189頁、1966年)に記載されている。
【００９８】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００９９】
C.トラコマチスポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質が免疫原性であるかどうかの判定
方法
C.トラコマチスポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する細胞又はウイルスライブラリーは、該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質のうちどれが免疫原性であるかを判定するためにスクリーニングすることができる。これは、C.トラコマチスライブラリーの細胞を飲食する、及び第2の細胞表面でライブラリーの発現ポリペプチドの部分を提示することができる第2の細胞(例えば、マクロファージ又は抗原提示細胞)と、ライブラリーの各メンバーを接触させて達成することができる(例えば、米国特許第6,008,415号参照)。第2の細胞は、次いで、C.トラコマチスに以前に感染した生物由来のC.トラコマチス特異的T細胞(例えば、C.トラコマチス特異的CD4+又はCD8+ T細胞)と接触させる。第2の細胞は、C.トラコマチス特異的T細胞と接触させる前に(例えば、パラホルムアルデヒドを用いて)固定することもできる。C.トラコマチスタンパク質の提示された部分と結合することができるC.トラコマチス特異的T細胞は、サイトカイン分泌をもたらすであろう。サイトカイン分泌(例えば、IFN-γ、IL-2、又はTNFの分泌)は、当技術分野で公知のような、例えば、ELISAアッセイを用いてアッセイすることができる。
【０１００】
特に、マウスH2b骨髄由来マクロファージ(BMM)を、96ウェルプレートに1×105細胞/ウェルの密度で播種した。14から16時間後、凍結C.トラコマチスライブラリーのアリコートを解凍した。培地をBMMから吸引し、ライブラリーのアリコート及び60μLの新鮮RP-10培地と交換した。37℃で1時間後、BMMをPBSで洗浄し、100μLのRP-10培地を添加し、細胞をさらに1時間37℃でインキュベートした。BMMを次いで1％パラホルムアルデヒドで15分間固定し、PBSで大規模洗浄した。BMM固定は、T細胞によるIFN-γ分泌のバックグラウンドレベルを大幅に減少させることが分かった。T細胞(C.トラコマチス特異的CD4+又はCD8+マウスT細胞のどちらか、1×105)を、200μLのRP-10培地で各ウェルに添加した。プレートを18〜24時間37℃でインキュベートし、各ウェルの上清中のIFN-γ量をIFN-γELISAアッセイ(Endogen社)を使用して判定した。
【０１０１】
抗原性ペプチドを同定する別の方法は、ポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質をマクロファージにパルスし、C.トラコマチス特異的CD4+又はCD8+マウスT細胞(上述のような)を活性化する能力についてスクリーニングすることである。このようなアッセイで使用されるペプチドは、当技術分野で公知の方法を用いて合成することができる。C.トラコマチス特異的CD4+又はCD8+マウスT細胞を活性化することができるポリペプチド、ポリペプチド断片、又は融合タンパク質は、免疫原性であると思われる。
【０１０２】
C. トラコマチス特異的CD8+マウスT細胞
免疫原性C.トラコマチスポリペプチド、ポリペプチド断片、及び融合タンパク質の同定で使用するための活性化CD8+マウスT細胞プールは、当技術分野で公知の方法を用いて得ることができる。典型的には、病原体に対する抗原のスクリーニングでは、CD8+ T細胞は病原体に以前に感染した哺乳動物から調製される。この調製物は、病原体由来の抗原に特異的なCD8+ T細胞を含有する。
【０１０３】
C.トラコマチス特異的CD8+ T細胞は、以下のようにマウスから回収した。C57BL/6マウスに107感染形成単位のC.トラコマチスを腹腔内注射した。14日後、マウスを安楽死させ、脾臓を回収した。70μmスクリーンを用いて脾臓をすりつぶし、脾細胞の単一細胞溶液を作製した。CD8+ T細胞を、MACS(商標)磁気ビーズに結合した抗CD8抗体及び当技術分野の分離プロトコル基準を用いて脾細胞から単離した(例えば、Miltenyi Biotec Inc.社、Auburn、CAから入手可能なMACS(商標)技術参照)。単離したCD8+細胞を、24ウェル皿で18時間前にC.トラコマチスに感染させた同じハプロタイプ(H2b)のマクロファージに添加した。未感作マウス(C57BL/6)由来の照射脾細胞を、IL-2含有培地に支持細胞として添加した。細胞は、10日間インキュベートし、その間にC.トラコマチス特異的CD8+ T細胞が感染マクロファージにより刺激され複製された。10日目に、C.トラコマチスに感染させた(18時間前)マクロファージを用いてCD8+ T細胞を再度刺激し、脾細胞を照射した。ライブラリーをスクリーニングするのに十分な量のCD8+ T細胞が存在するまで、この手順を繰り返した。
【０１０４】
CD8+ T細胞は、例えば、Hassellら(Immunology 79: 513〜519頁、1993年)により記載されているようにヒト対象からクローン化することもできる。
【０１０５】
C. トラコマチス特異的マウスCD4+ T細胞
免疫原性C.トラコマチスポリペプチド、ポリペプチド断片、及び融合タンパク質の同定で使用するための活性化CD4+マウスT細胞は、当技術分野で公知の方法を用いて得ることができる。マウス由来の脾細胞を、C.トラコマチス血清型L2による感染後21日目に単離し、α-メチルマンノシド及びCon A-刺激ラット脾細胞由来の5％上清を含むRP-10(10％ウシ胎仔血清、L-グルタミン、HEPES、50μM 2-β-メルカプトエタノール、50単位/mlペニシリン、及び50μg/mlストレプトマイシンを添加したRPMI培地1640)で、照射した(2,000 rad)骨髄由来樹状細胞、UV不活化C.トラコマチス血清型L2、及び未感作同系脾細胞と共に培養した。CD8+ T細胞を、Dynabeads Mouse CD8 (Invitrogen社、Carlsbad、CA)を用いて培養物から枯渇させた。CD4+ T細胞は、C.トラコマチスでパルスした骨髄由来樹状細胞により7日ごとに再刺激した。C.トラコマチス特異的CD4+細胞系を確立した後、CD4+ T細胞クローンを限界希釈により単離した。
【０１０６】
CD4+ T細胞は、例えば、Hassellら(Immunology 79: 513〜519頁、1993年)により記載されているようにヒト対象からクローン化することもできる。
【０１０７】
結果
上記手法を用いて、CT144のアミノ酸67〜86 (配列番号2)及びアミノ酸77〜96(配列番号3)をCD4+マウスT細胞エピトープとして同定し、CT242のアミノ酸109〜117(配列番号5)及びアミノ酸112〜120(配列番号6)、並びにCT812のアミノ酸103〜111(配列番号8)をCD8+マウスT細胞エピトープとして同定した(表1)。なぜなら、これらは、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチド(例えば、同じアッセイにおいて最も低い測定可能値のIFN-γを誘発するペプチド)で処理されたTリンパ球に比べて、Tリンパ球でのIFN-γ産生を少なくとも40倍の増加を誘発したためである。この実施例に記載されたCD4+及びCD8+抗原がマウスT細胞を用いて同定されたのに対し、この発見に照らして及び本明細書に記載された手法を用いて、当業者は対応するCD4+及びCD8+ヒトT細胞抗原を同定することもできよう。
【表１】
2010535504.tif 000002
【０１０８】
すべての特許、特許出願、特許出願公開、及び他の引用された参考文献は、それぞれの独立した特許、特許出願、又は公開が参照により組み込まれることを具体的及び個々に示したのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2010535504.tif 000003
【図２】
2010535504.tif 000004
【図３−１】
2010535504.tif 000005
【図３−２】
2010535504.tif 000006
【配列表】
2010535504000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月2日(2010.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
結果
上記手法を用いて、CT144のアミノ酸67〜86 (配列番号2)及びアミノ酸77〜96(配列番号3)をCD4+マウスT細胞エピトープとして同定し、CT242のアミノ酸109〜117(配列番号5)及びアミノ酸112〜120(配列番号6)、並びにCT812のアミノ酸103〜111(配列番号8)をCD8+マウスT細胞エピトープとして同定した(表1)。なぜなら、これらは、同じアッセイにおいて非免疫原性ペプチド(例えば、同じアッセイにおいて最も低い測定可能値のIFN-γを誘発するペプチド)で処理されたTリンパ球に比べて、Tリンパ球でのIFN-γ産生を少なくとも40倍の増加を誘発したためである。この実施例に記載されたCD4+及びCD8+抗原がマウスT細胞を用いて同定されたのに対し、この発見に照らして及び本明細書に記載された手法を用いて、当業者は対応するCD4+及びCD8+ヒトT細胞抗原を同定することもできよう。
【表１】
2010535504.tif 000007
【国際調査報告】
2010535504.tif 000008
2010535504.tif 000009
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