(57)【要約】  ヒトＧＭ−ＣＳＦタンパク質に結合する抗原結合性タンパク質を提供する。抗原結合性タンパク質をコードする核酸、該核酸をコードするベクター、および細胞もまた提供する。該抗原結合性タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦＲへのＧＭ−ＣＳＦの結合を阻害し、ＧＭ−ＣＳＦが誘導する骨髄細胞系譜細胞株の増殖およびシグナル伝達を阻害し、そしてＧＭ−ＣＳＦが誘導するヒト単球の活性化を阻害することも可能である。【選択図】図１ａ
2010538676.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＭ−ＣＳＦに結合する単離抗原結合性タンパク質であって：
Ａ）１以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）であって：
（ｉ）配列番号１０、２２、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；
（ｉｉ）配列番号１１、２３、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；
（ｉｉｉ）配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３；ならびに
（ｉｖ）４アミノ酸以下の、アミノ酸置換、欠失または挿入の１以上を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨ
からなる群より選択される前記ＣＤＲＨ；
Ｂ）１以上の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）であって：
（ｉ）配列番号４、１６、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；
（ｉｉ）配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；
（ｉｉｉ）配列番号６、１８、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３；ならびに
（ｉｖ）４アミノ酸以下の、アミノ酸置換、欠失または挿入の１以上を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬ
からなる群より選択される前記ＣＤＲＬ；あるいは
Ｃ）Ａ）の１以上の重鎖ＣＤＲＨおよびＢ）の１以上の軽鎖ＣＤＲＬ
を含む、前記タンパク質。
【請求項２】
Ａ）の少なくとも１つのＣＤＲＨおよびＢ）の少なくとも１つのＣＤＲＬを含む、請求項１の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項３】
Ａ）の少なくとも２つのＣＤＲＨおよびＢ）の少なくとも２つのＣＤＲＬを含む、請求項１の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項４】
前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む、請求項１の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項５】
Ａ）の前記ＣＤＲＨが：
（ｉ）配列番号１０、２２、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；
（ｉｉ）配列番号１１、２３、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；
（ｉｉｉ）配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３；ならびに
（ｉｖ）２アミノ酸以下の、アミノ酸置換、欠失または挿入の１以上を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨ
からなる群より選択され；
Ｂ）の前記ＣＤＲＬが：
（ｉ）配列番号４、１６、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；
（ｉｉ）配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；
（ｉｉｉ）配列番号６、１８、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３；ならびに
（ｉｖ）２アミノ酸以下の、アミノ酸置換、欠失または挿入の１以上を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬ
からなる群より選択され；あるいは
Ｃ）Ａ）の１以上の重鎖ＣＤＲＨおよびＢ）の１以上の軽鎖ＣＤＲＬ
である、請求項１の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項６】
Ａ）：
（ｉ）配列番号１０、２２、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；
（ｉｉ）配列番号１１、２３、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；
（ｉｉｉ）配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３；
からなる群より選択されるＣＤＲＨ；
Ｂ）：
（ｉ）配列番号４、１６、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；
（ｉｉ）配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；
（ｉｉｉ）配列番号６、１８、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３
からなる群より選択されるＣＤＲＬ；あるいは
Ｃ）Ａ）の１以上の重鎖ＣＤＲＨおよびＢ）の１以上の軽鎖ＣＤＲＬ
を含む、請求項１の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項７】
Ａ）配列番号１０、２２、７０および１４２のＣＤＲＨ１、配列番号１１、２３、３５、４７、５９、７１、９５および１４３のＣＤＲＨ２、ならびに配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４のＣＤＲＨ３；ならびに
Ｂ）配列番号４、１６、４０、５２、６４、８８、１００，１１２、１２４、および１３６のＣＤＲＬ１、配列番号５、１７、２９、４１、６５、７７、８９、１０１、１１３および１３７のＣＤＲＬ２、ならびに配列番号６、１８、４２、６６、７８、１２６、および１３８のＣＤＲＬ３
を含む、請求項６の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項８】
配列番号９、２１、３３、４５、５７、６９、８１、９３、１０５、１１７、１２９、および１４１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または配列番号３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、８７、９９、１１１、１２３、および１３５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項９】
ＶＨが配列番号９、２１、３３、４５、５７、６９、８１、９３、１０５、１１７、１２９、および１４１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、そして／またはＶＬが配列番号３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、８７、９９、１１１、１２３、および１３５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項８の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１０】
ＶＨが配列番号９、２１、３３、４５、５７、６９、８１、９３、１０５、１１７、１２９、および１４１からなる群より選択され、そして／またはＶＬが配列番号３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、８７、９９、１１１、１２３、および１３５からなる群より選択される、請求項８の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１１】
ＧＭ−ＣＳＦに結合する単離抗原結合性タンパク質であって：
Ａ）１以上の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）であって：
（ｉ）配列番号１０、２２、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；
（ｉｉ）配列番号１１、２３、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；
（ｉｉｉ）配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３
からなる群より選択される前記ＣＤＲＨ；
Ｂ）１以上の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）であって：
（ｉ）配列番号４、１６、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；
（ｉｉ）配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；
（ｉｉｉ）配列番号６、１８、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３；
からなる群より選択される前記ＣＤＲＬ；あるいは
Ｃ）Ａ）の１以上の重鎖ＣＤＲＨおよびＢ）の１以上の軽鎖ＣＤＲＬ
を含む、前記タンパク質。
【請求項１２】
Ａ）：
（ｉ）配列番号１０、２２、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；
（ｉｉ）配列番号１１、２３、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；
（ｉｉｉ）配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３
からなる群より選択される１以上のＣＤＲＨ；
Ｂ）：
（ｉ）配列番号４、１６、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；
（ｉｉ）配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；
（ｉｉｉ）配列番号６、１８、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３； 
からなる群より選択される１以上のＣＤＲＬ；あるいは
Ｃ）Ａ）の１以上の重鎖ＣＤＲＨおよびＢ）の１以上の軽鎖ＣＤＲＬ
を含む、請求項１１の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１３】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、またはその抗体断片である、請求項１の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１４】
前記抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ディアボディ、または一本鎖抗体分子である、請求項１３の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１５】
ヒト抗体である、請求項１３の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１６】
モノクローナル抗体である、請求項１３の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１７】
ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型またはＩｇＧ４型のものである、請求項１の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１８】
ＩｇＧ型またはＩｇＧ２型のものである、請求項１７の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１９】
標識基とカップリングしている、請求項１のいずれかの単離抗原結合性タンパク質。
【請求項２０】
ヒトＧＭ−ＣＳＦの細胞外部分へのＧＭ−ＣＳＦの結合を阻害する、請求項１の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項２１】
請求項１記載の抗原結合性タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２２】
調節配列に機能可能であるように連結されている、請求項２１記載の核酸分子。
【請求項２３】
請求項２１記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２４】
請求項２２記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２５】
請求項２２記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２４記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１記載の抗原結合性タンパク質を作製する方法であって、前記抗原結合性タンパク質を分泌する宿主細胞から、前記抗原結合性タンパク質を調製する工程を含む、前記方法。
【請求項２８】
請求項１記載の少なくとも１つの抗原結合性タンパク質および薬学的に許容されうる賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
さらなる活性剤をさらに含む、請求項２８の医薬組成物。
【請求項３０】
前記のさらなる活性剤が、放射性同位体、放射性核種、毒素、または療法的および化学療法的基からなる群より選択される、請求項２９の医薬組成物。
【請求項３１】
患者において、ＧＭ−ＣＳＦと関連する状態を治療するかまたは防止するための方法であって、請求項１記載の少なくとも１つの単離抗原結合性タンパク質の有効量を、その必要がある患者に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３２】
状態が、リウマチ性障害、自己免疫障害、血液学的障害、腫瘍学的障害、炎症性障害、神経系の変性状態、胃腸、胃泌尿器障害および内分泌障害からなる群より選択される、請求項３１の方法。
【請求項３３】
状態が、多発性硬化症、関節リウマチ、喘息、乾癬、アトピー性皮膚炎およびサルコイドーシスからなる群より選択される、請求項３１の方法。
【請求項３４】
単離抗原結合性タンパク質を単独でまたは併用療法として投与する、請求項３１の方法。
【請求項３５】
患者において、ＧＭ−ＣＳＦＲの細胞外部分へのＧＭ−ＣＳＦの結合を阻害する方法であって、請求項１記載の少なくとも１つの抗原結合性タンパク質の有効量を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３６】
患者において、ＧＭ−ＣＳＦ活性を阻害する方法であって、請求項１記載の少なくとも１つの抗原結合性タンパク質の有効量を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３７】
ＧＭ−ＣＳＦ活性が、骨髄細胞系譜細胞の分化、生存、増殖および活性化からなる群より選択される、請求項３６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
［０００１］本出願は、米国仮出願第６１／０８７，５５１号、２００８年８月８日出願、および米国仮出願第６０／９９４，３４３号、２００７年９月１８日出願、の優先権を請求し、該出願の開示は参照により本明細書が依存し、そして援用される。
【背景技術】
【０００２】
［０００２］顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；  ＣＳＦ２）は、長年、その造血特性（すなわち、骨髄細胞系譜の前駆体細胞の増殖および分化ならびに成熟細胞の増殖の刺激）に関して認識されてきた、よく研究されたタンパク質である（Blood 77:1131, 1991; Rev Infect Dis 12:41, 1990; Med. Oncol. 13:141, 1996に概説される）。ＧＭ−ＣＳＦは、肺上皮細胞および腸のパネート細胞によって恒常的に産生される（BBRC 312:897, 2003）が、活性化に際して、非常に多様な細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現し、Ｔ細胞、マクロファージ／単球、線維芽細胞および内皮細胞が主に発現する（J Infect Dis 172:1573, 1995; J Infect Dis 185:1490, 2002; J Allergy Cin Immunol 112:653, 2003）。ＧＭ−ＣＳＦ受容体（ＧＭ−ＣＳＦＲ；  ＣＳＦＲ２）は、２つのタンパク質；ＧＭ−ＣＳＦに特異的な高アフィニティのアルファポリペプチド、ならびにＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５によって共有される低アフィニティの共通ベータ・ポリペプチド、の異種複合体からなる（J Allergy Cin Immunol 112:653, 2003; Cytokine and Growth Factor Reviews 12:19, 2001に概説される）。ＧＭ−ＣＳＦＲは、骨髄細胞系譜のすべての細胞上に発現される。
【０００３】
［０００３］ＧＭ−ＣＳＦは、マクロファージ／単球、樹状細胞（ＤＣ）、好中球および好酸球を含む骨髄細胞系譜の細胞の分化、生存、増殖および活性化を引き起こすかまたは達成するシグナルを仲介することによって、自然免疫系の活性を増大させる（J Immun 143:1198, 1989; Rev Infect Dis 12:41, 1990; Blood 77:1131, 1991; Trends in Immun. 23:403, 2002; Growth Factors 22:225, 2004に概説される）。ＧＭ−ＣＳＦは、単球由来ＤＣおよび１型マクロファージのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成に重要な因子であり（PNAS 101:4560, 2004）、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでＤＣの分化および活性化を誘導することが示されてきている（Blood 95:2337, 2000）。ＧＭ−ＣＳＦの存在下で生成されるヒト単球由来マクロファージ（１型マクロファージ）は、高レベルの炎症促進性サイトカイン、例えばＩＬ−２３を産生するが、ＩＬ−１２を産生せず、一方、Ｍ−ＣＳＦ（ＣＳＦ１）の存在下で生成される２型マクロファージは、抗炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１０を産生するが、ＩＬ−２３を産生しない（PNAS 101: 4560, 2004）。
【０００４】
［０００４］ＧＭ−ＣＳＦで刺激されたヒト単球またはマクロファージは、細胞傷害性、他の炎症促進性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦαおよびＩＬ−６）の産生、および食作用を含む機能を増加させている。これらの影響に基づいて、近年、感染性疾患で使用するための、またはワクチンの投与に伴う強力なアジュバントとして、ＧＭ−ＣＳＦを発展させることに多大な努力がなされてきている（Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 13::S47, 1994; Curr Opin Hematol. 7:168, 2000に概説される）。実際、いくつかの臨床設定において、ｒｈＧＭ−ＣＳＦを投与すると、真菌感染の結果およびクリアランスが劇的に改善される（Eur J Clin Microbiol Infect Dis 13: S18, 1994; J Med Microbiol 47: 1998）。
【０００５】
［０００５］ミクログリアは、ＣＮＳの常在マクロファージであり、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究由来のデータによって、ＧＭ−ＣＳＦは、胎児および成人ミクログリア細胞両方の生存、活性化、増殖および分化すら増進する、重要なサイトカインであることが示されている（Glia 12:309,1994; J Immunol Methods 300:32, 2005）。さらに、マウスＭＳモデル研究から、いくつかの報告があり、疾患開始および持続に関する、ＣＮＳの血管周囲空間におけるＡＰＣ（ミクログリアまたはＤＣ）の非常に重要な役割に関する証拠が提供される（Nat. Med. 11:146, 2005; Nat. Med. 11:328, 2005; Nat. Med. 11:335, 2005）。ミクログリアをＧＭ−ＣＳＦで刺激すると、ＭＨＣＩＩが上方制御され、そして抗原提示が増進する。
【０００６】
［０００６］疾患における炎症促進性サイトカインとしてのＧＭ−ＣＳＦの役割および造血増殖因子としての非必須性（Trends in Immun. 23: 403, 2002; Growth Factors 22: 225, 2004に概説される）、ならびに炎症／自己免疫疾患を引き起こすかまたは増進させる際のその役割が確立されたのは、最近になってからに過ぎない。
【０００７】
［０００７］多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、喘息、乾癬、アトピー性皮膚炎およびサルコイドーシスにおいて炎症の局所部位で、ＧＭ−ＣＳＦレベルの上昇が観察されてきている。ＧＭ−ＣＳＦの上昇は、血清においては典型的には観察されず、したがって疾患関連を決定するには、ターゲット組織の分析が必要である。ＭＳでは、活性疾患（組織収集の２週間前以内に、新規症状または現存する症状の悪化）を伴う再発寛解型（ＲＲ）ＭＳ患者由来の脳脊髄液（ＣＳＦ）および血清においてＥＬＩＳＡによってＧＭ−ＣＳＦタンパク質レベルを測定し、そして安定疾患（６ヶ月以内にエピソードなし）を伴うＲＲＭＳ患者または他の神経学的疾患（ＯＮＤ）対照のいずれかと比較した、２つの臨床研究が実行された（Eur Neurol 33:152,1993; Immunopharmacol. Immunotoxicol. 20:373,1998）。重要なことに、アルツハイマー病または血管性認知症患者のＣＳＦおよび血清には、非常に増加したレベルのＧＭ−ＣＳＦが報告されているため、ＯＮＤ対照には、こうした患者は含まれなかった（Acta Neurol Scand 103:166, 2001）。
【０００８】
［０００８］ＧＭ−ＣＳＦレベルは、低ｐｇ範囲であるが、安定疾患ＣＳＦに比較してＲＲＭＳ活性疾患ＣＳＦでは、そしてＯＮＤ  ＣＳＦに比較してＭＳ活性疾患ＣＳＦでは、有意に高かった。さらに、安定疾患に対して活性疾患のＣＳＦにおいて、より高いレベルのＴＮＦ−アルファが、そして活性疾患に対して安定疾患のＣＳＦにおいて、より高いレベルのＴＧＦ−ベータおよびＩＬ−１０両方が存在した。研究には、患者の進行中の治療および安定疾患に対する活性疾患の臨床的定義、ならびに試料収集の同時発生に関して、非常に注意深い包含基準が含まれた。興味深いことに、いかなる群間でも、血清中のＧＭ−ＣＳＦレベルにおいては、有意な相違はなかった。さらに、１つの研究では、ＭＳ病変の星状膠細胞においてＧＭ−ＣＳＦの選択的免疫組織化学検出が観察されたが、対照ＣＮＳ白質では観察されなかった（ｎ＝３  ＭＳドナー、Ｇｌｉａ  １２：３０９，  １９９４）。最後に、活性化Ｔ細胞および単球／マクロファージは、炎症反応中の活性化に際して、大量のＧＭ−ＣＳＦを産生可能である。ＭＳ病変におけるこれらの細胞種両方の存在に関して（Ann Neurol. 47:707, 2000）、そしてＣＳＦ中のＴ細胞に関して（Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 1: 257, 2001に概説される）、十分な証拠がある。
【０００９】
［０００９］ＭＳとＧＭ−ＣＳＦ発現の関連に加えて、他の炎症／自己免疫疾患に関する大量の疾患関連データおよび外因性ＧＭ−ＣＳＦの投与に伴う疾患増悪に関するいくつかの証拠さえある。ＲＡにおいて、ＯＡに比較して（バイオアッセイ、Clin. Exp. Immunol. 72:67, 1988）、そして非ＲＡ対照に比較して（バイオアッセイ、Rheumatol Int. 14:177, 1995）、ＲＡまたは乾癬性関節炎（ＰｓＡ）の患者の滑液（ＳＦ）中、上昇したレベルのＧＭ−ＣＳＦが検出されてきている。さらに、ＲＡ患者において、疾患重症度と関節中のＣＤ６８＋マクロファージの存在の間には強い相関がある（Ann Rheum Dis 64:834, 2005）。最後に、フェルティ症候群（好中球減少症）のＲＡ患者をＧＭ−ＣＳＦで処置すると、疾患が増悪しうることが報告されてきている（Blood 74:2769, 1989）。
【００１０】
［００１０］喘息において、免疫組織化学によって、喘息患者由来の気管支生検中でＧＭ−ＣＳＦが上昇することが見出されてきており、そしてステロイド治療後のＧＭ−ＣＳＦレベルの減少およびＦＥＶ１の増加の間には相関が観察された（Chest 105:687,1994; Am Rev Respir Dis 147:1557, 1993）。ＧＭ−ＣＳＦはまた、断続的軽度喘息患者の痰でも上昇していることが報告された（Ann Allergy Asthma Immunol 86:304, 2001）。ＧＭ−ＣＳＦの拮抗を支持するデータには、症候性患者のＢＡＬＦ由来の好酸球促進活性が抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂによって減弱される研究が含まれる（in vitro、Eur. Respir. J. 12:872, 1998）。
【００１１】
［００１１］乾癬において、ＧＭ−ＣＳＦ発現は、乾癬皮膚では検出されたが、対照皮膚試料では検出されなかった（Arch Dermatol Res. 287:158, 1995; Clin Exp Dermatol. 19:383, 1994; Dermatologica. 181:16, 1990）。乾癬をＧＭ−ＣＳＦで処置すると、疾患が増悪しうることもまた報告されてきている（Br J Dermatol.128:468, 1993）。
【００１２】
［００１２］アトピー性皮膚炎（ＡＤ）において、急性ＡＤまたは非病変皮膚におけるよりも、慢性ＡＤ病変の生検中、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、有意により多数のＧＭ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ発現細胞が検出された（ｐ＜  ０．０５； J Clin Invest. 95:211, 1995）。第二の研究において、非アトピー性対照由来のケラチノサイトと比較して、病変ＡＤ皮膚（上皮および真皮区画両方）の免疫組織化学によって、より高いレベルのＧＭ−ＣＳＦが検出され、そしてＡＤ患者の関与しない皮膚から樹立されたケラチノサイト培養は、ＧＭ−ＣＳＦの自発的およびＰＭＡ刺激生産性の増加を示した（J Clin Invest. 99:3009, 1997）。
【００１３】
［００１３］ＧＭ−ＣＳＦ不全マウス（Science 264:713, 1994; PNAS 91:5592, 1994）およびＧＭ−ＣＳＦＲｃ不全マウス（Immunity 2:211, 1995; PNAS 92:9565, 1995）が多数のグループによって生成された。こうしたマウスは、造血の定常状態レベルには明白な相違を示さなかったが、肺胞タンパク質症の組織学的徴候を有し、より感染しやすく、そしてＫＬＨ免疫後のＩｇＧ産生および抗原特異的Ｔ細胞応答減少に中程度の遅延を示した（PNAS 94:12557, 1997）。ＧＭ−ＣＳＦ−／−マウスは、ＭＯＧ３５−５５が誘導するＥＡＥ（J Exp Med.194:873, 2001）、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ；  JI 161:3639, 1998）およびｍＢＳＡ／ＩＬ−１誘導性関節炎（Arthritis Rheum 44:111, 2001）に耐性である。対照的に、ＧＭ−ＣＳＦトランスジェニック（Ｔｇ）マウスがいくつかの実験室で生成されてきており、そして炎症／自己免疫疾患の発展に関連づけられている（Cell 51:675, 1987; JI 166:2090, 2001; J Clin Invest 97:1102, 1996; J Allergy Clin Immunol 111:1076, 2003; Lab Invest 77:615, 1997）。
【００１４】
［００１４］したがって、当該技術分野にはＧＭ−ＣＳＦ阻害剤に関する必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Blood 77:1131, 1991
【非特許文献２】Rev Infect Dis 12:41, 1990
【非特許文献３】Med. Oncol. 13:141, 1996
【非特許文献４】BBRC 312:897, 2003
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【非特許文献６】J Infect Dis 185:1490, 2002
【非特許文献７】Ｊ Allergy Cin Immunol 112:653, 2003
【非特許文献８】J Allergy Cin Immunol 112:653, 2003
【非特許文献９】Cytokine and Growth Factor Reviews 12:19, 2001
【非特許文献１０】J Immun 143:1198, 1989
【非特許文献１１】Rev Infect Dis 12:41, 1990
【非特許文献１２】Blood 77:1131, 1991
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【非特許文献１４】Growth Factors 22:225, 2004
【非特許文献１５】PNAS 101:4560, 2004
【非特許文献１６】Blood 95:2337, 2000
【非特許文献１７】PNAS 101: 4560, 2004
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【非特許文献２５】Nat. Med. 11:328, 2005
【非特許文献２６】Nat. Med. 11:335, 2005
【非特許文献２７】Trends in Immun. 23: 403, 2002
【非特許文献２８】Growth Factors 22: 225, 2004
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【非特許文献５６】Arthritis Rheum 44:111, 2001
【非特許文献５７】Cell 51:675, 1987
【非特許文献５８】JI 166:2090, 2001
【非特許文献５９】J Clin Invest 97:1102, 1996
【非特許文献６０】J Allergy Clin Immunol 111:1076, 2003
【非特許文献６１】Lab Invest 77:615, 1997
【発明の概要】
【００１６】
［００１５］ＧＭ−ＣＳＦ、特にヒトＧＭ−ＣＳＦに結合する抗原結合性タンパク質を提供する。ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦに関連する生物学的反応の少なくとも１つを阻害するか、該反応に干渉するか、または該反応を調節することも可能であり、そしてこうしたものとして、ＧＭ−ＣＳＦ関連疾患または障害の影響を改善するのに有用である。ＧＭ−ＣＳＦに対する特定の抗原結合性タンパク質の結合は、したがって、ＧＭ−ＣＳＦシグナル伝達を阻害するか、該伝達に干渉するか、または該伝達を遮断し、腫瘍内への単球遊走を減少させ、そして腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の集積を減少させることも可能である。
【００１７】
［００１６］ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質の産生のための、細胞株を含む発現系、およびヒトＧＭ−ＣＳＦに関連する疾患を診断しそして治療するための方法もまた提供する。
【００１８】
［００１７］（Ａ）１以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）であって：（ｉ）配列番号１０、２２、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号１１、２３、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｖ）４アミノ酸以下の、アミノ酸置換、欠失または挿入の１以上を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨ、からなる群より選択される前記ＣＤＲＨ；（Ｂ）１以上の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）であって：（ｉ）配列番号４、１６、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号６、１８、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３；ならびに（ｉｖ）４アミノ酸以下の、アミノ酸置換、欠失または挿入の１以上を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬ、からなる群より選択される前記ＣＤＲＬ；あるいは（Ｃ）（Ａ）の１以上の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１以上の軽鎖ＣＤＲＬを含む、単離抗原結合性タンパク質のいくつかを提供する。
【００１９】
［００１８］１つの態様において、単離抗原結合性タンパク質は、上述の（Ａ）の少なくとも１つまたは２つのＣＤＲＨおよび上述の（Ｂ）の少なくとも１つまたは２つのＣＤＲＬを含んでもよい。さらに別の側面において、単離抗原結合性タンパク質には、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が含まれる。
【００２０】
［００１９］さらに、上述の（Ａ）のＣＤＲＨは：（ｉ）配列番号１０、２２、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号１１、２３、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｖ）２アミノ酸以下の、アミノ酸置換、欠失または挿入の１以上を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨ；からなる群よりさらに選択され、上述の（Ｂ）のＣＤＲＨは：（ｉ）配列番号４、１６、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号６、１８、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３；ならびに（ｉｖ）２アミノ酸以下の、アミノ酸置換、欠失または挿入の１以上を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬ；からなる群より選択され；あるいは（Ｃ）（Ａ）の１以上の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１以上の軽鎖ＣＤＲＬである。
【００２１】
［００２０］さらに別の態様において、単離抗原結合性タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号１０、２２、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号１１、２３、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３；からなる群より選択されるＣＤＲＨ；（Ｂ）（ｉ）配列番号４、１６、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号６、１８、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３；からなる群より選択されるＣＤＲＬ；あるいは（Ｃ）（Ａ）の１以上の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１以上の軽鎖ＣＤＲＬを含んでもよい。１つの態様において、単離抗原結合性タンパク質には、（Ａ）配列番号１０、２２、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；配列番号１１、２３、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３；ならびに（Ｂ）配列番号４、１６、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；ならびに配列番号６、１８、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３；が含まれてもよい。別の態様において、可変重鎖（ＶＨ）は、配列番号９、２１、３３、４５、５７、６９、８１、９３、１０５、１１７、１２９、および１４１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、そして／または可変軽鎖（ＶＬ）は、配列番号３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、８７、９９、１１１、１２３、および１３５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。さらなる態様において、ＶＨは配列番号９、２１、３３、４５、５７、６９、８１、９３、１０５、１１７、１２９、および１４１からなる群より選択され、そして／またはＶＬは配列番号３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、８７、９９、１１１、１２３、および１３５からなる群より選択される。
【００２２】
［００２１］別の側面において、ＧＭ−ＣＳＦ配列を含有するエピトープに特異的に結合する単離抗原結合性タンパク質であって、該抗体がＧＭ−ＣＳＦに結合すると、ＧＭ−ＣＳＦＲを含有する細胞において、ＧＭ−ＣＳＦが仲介するシグナル伝達の活性化に拮抗する、前記単離抗原結合性タンパク質を提供する。
【００２３】
［００２２］さらに別の側面において、ＧＭ−ＣＳＦに結合する単離抗原結合性タンパク質であって：（Ａ）１以上の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）であって（ｉ）配列番号１０、２２、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１と少なくとも８０％の同一性を持つＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号１１、２３、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２と少なくとも８０％の同一性を持つＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３と少なくとも８０％の同一性を持つＣＤＲＨ３からなる群より選択される前記ＣＤＲＨ；（Ｂ）１以上の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）であって：（ｉ）配列番号４、１６、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１と８０％同一であるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２と８０％同一であるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号６、１８、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３と８０％同一であるＣＤＲＬ３；あるいは（Ｃ）（Ａ）の１以上の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１以上の軽鎖ＣＤＲＬを含む、前記タンパク質を提供する。１つの態様において、単離抗原結合性タンパク質には、（Ａ）：（ｉ）配列番号１０、２２、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１と少なくとも９０％の同一性を持つＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号１１、２３、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２と少なくとも９０％の同一性を持つＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３と少なくとも９０％の同一性を持つＣＤＲＨ３からなる群より選択される１以上のＣＤＲＨ；（Ｂ）：（ｉ）配列番号４、１６、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１と少なくとも９０％同一であるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２と少なくとも９０％同一であるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号６、１８、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３と少なくとも９０％同一であるＣＤＲＬ３からなる群より選択される１以上のＣＤＲＬ；あるいは（Ｃ）（Ａ）の１以上の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１以上の軽鎖ＣＤＲＬが含まれる。
【００２４】
［００２３］さらなる側面において、ＧＭ−ＣＳＦに結合する単離抗原結合性タンパク質であって、Ａ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）であって、（ｉ）配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３；（ｉｉ）２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失または置換によって、（ｉ）のＣＤＲＨ３とはアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ３；（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＦＤＸ９（配列番号８３）、式中、Ｘ１はＥおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ２はＧおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ３はＰ、ＤおよびＧからなる群より選択され、Ｘ４はＹ、Ｗ、ＲおよびＫからなる群より選択され、Ｘ５はＳ、Ｗ、Ｆ、およびＴからなる群より選択され、Ｘ６はＹおよびＬからなる群より選択され、Ｘ７はＤおよびＧからなる群より選択され、Ｘ８はＹ、アミノ酸なし、およびＡからなる群より選択され、そしてＸ９はＭ、Ｔ、およびＶからなる群より選択される、からなる群より選択されるＣＤＲＨ３アミノ酸配列；からなる群より選択される、前記ＣＤＲＨ；ならびに／あるいはＢ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）であって、（ｉ）配列番号６、１８、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３（ｉｉ）２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失または置換によって、（ｉ）のＣＤＲＬ３とはアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ３；およびｉｉｉ）Ｘ１ＱＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｔ（配列番号８４）、式中、Ｘ１はＱおよびＬからなる群より選択され、Ｘ２はＹおよびＳからなる群より選択され、Ｘ３はＤ、ＧおよびＦからなる群より選択され、Ｘ４はＲ、Ｔ、およびＳからなる群より選択され、Ｘ５はＳおよびＶからなる群より選択され、Ｘ６はＦおよびＰからなる群より選択され、そしてＸ７はＲおよびＷからなる群より選択され；ならびにＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＤＳＳＮＸ５Ｘ６Ｘ７（配列番号８９）、式中、Ｘ１はＳおよびＡからなる群より選択され、Ｘ２はＳおよびＡからなる群より選択され、Ｘ３はＷおよびＦからなる群より選択され、Ｘ４はＤおよびＴからなる群より選択され、Ｘ５はＧ、Ｗ、およびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ６はＶ、Ｌ、およびＰからなる群より選択され、そしてＸ６はＶおよびアミノ酸なしからなる群より選択される、からなる群より選択されるＣＤＲＬ３アミノ酸配列；からなる群より選択される前記ＣＤＲＬを含む、前記単離抗原結合性タンパク質を提供する。
【００２５】
［００２４］別の態様内で、抗原結合性タンパク質は：Ａ）：（ｉ）配列番号１０、２２、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失または置換によって、（ｉ）のＣＤＲＨ１とはアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ１；（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２ＧＸ３Ｘ４ＸＦＸ５Ｘ６ＹＸ７Ｘ８Ｘ９（配列番号９４）、式中、Ｘ１はＧおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ２はＧおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ３はＹおよびＦからなる群より選択され、Ｘ４はＴおよびＳからなる群より選択され、Ｘ５はＴ、ＳおよびＧからなる群より選択され、Ｘ６はＧおよびＳからなる群より選択され、Ｘ７はＹおよびＧからなる群より選択され、Ｘ８はＩおよびＭからなる群より選択され、そしてＸ９はＨおよびＳからなる群より選択される、からなる群より選択されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列、または（ｉｖ）配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；（ｖ）２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失または置換によって、（ｉｖ）のＣＤＲＨ２とはアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ２；または（ｖｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＧＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｇ（配列番号１０６）、式中、Ｘ１はＷおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ２はＩおよびＹからなる群より選択され、Ｘ３はＮ、ＳおよびＩからなる群より選択され、Ｘ４はＰ、ＡおよびＹからなる群より選択され、Ｘ５はＮおよびＹからなる群より選択され、Ｘ６はＳおよびＮからなる群より選択され、Ｘ７はＧおよびＮからなる群より選択され、Ｘ８はＴおよびＲからなる群より選択され、Ｘ９はＮおよびＤからなる群より選択され、Ｘ１０はＹおよびＳからなる群より選択され、Ｘ１１はＡおよびＮからなる群より選択され、Ｘ１２はＱおよびＲからなる群より選択され、Ｘ１３はＫおよびＲからなる群より選択され、Ｘ１４はＦおよびＬからなる群より選択され、そしてＸ１５はＱ、ＫおよびＲからなる群より選択される、からなるＣＤＲＨ２アミノ酸配列；からなる群より選択されるＣＤＲＨ；あるいはＢ）：（ｉ）配列番号４、１６、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失または置換によって、（ｉ）のＣＤＲＬ１とはアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ１；（ｉｉｉ）ＫＳＳＱＳＸ１ＸＬＹＳＳＸ２ＮＸ３ＮＸ４ＬＸ５（配列番号１０７）、式中、Ｘ１はＶおよびＩからなる群より選択され、Ｘ２はＳおよびＮからなる群より選択され、Ｘ３はＥおよびＫからなる群より選択され、Ｘ４はＹおよびＦからなる群より選択され、そしてＸ５はＴおよびＡからなる群より選択される；ＲＡＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＸ７Ｘ８（配列番号１１８）、式中、Ｘ１はＱおよびＰからなる群より選択され、Ｘ２はＳおよびＹからなる群より選択され、Ｘ３はＶ、ＬおよびＩからなる群より選択され、Ｘ４はＳおよびＣからなる群より選択され、Ｘ５はＳおよびＮからなる群より選択され、Ｘ６はＳ、Ｉ、Ｔおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ７はＦおよびＬからなる群より選択され、そしてＸ８はＡおよびＮからなる群より選択される；またはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＮＸ１１ＶＸ１２（配列番号１２５）、式中、Ｘ１はＩ、ＳおよびＴからなる群より選択され、Ｘ２はＲおよびＧからなる群より選択され、Ｘ３はＴおよびＳからなる群より選択され、Ｘ４はＲおよびＳからなる群より選択され、Ｘ５はＧおよびＳからなる群より選択され、Ｘ６はＳ、ＨおよびＤからなる群より選択され、Ｘ７はＩおよびＶからなる群より選択され、Ｘ８はＡおよびＧからなる群より選択され、Ｘ９はアミノ酸なしおよびＧからなる群より選択され、Ｘ１０はＳおよびＹからなる群より選択され、Ｘ１１はＹおよびＴからなる群より選択され、そしてＸ１２はＱ、ＮおよびＳからなる群より選択される；からなる群より選択されるＣＤＲＬ１アミノ酸配列；または（ｉｖ）配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；（ｖ）２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失または置換によって、（ｉｖ）のＣＤＲＬ２とはアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ２；または（ｖｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１３０）、式中、Ｘ１はＧ、ＴおよびＷからなる群より選択され、Ｘ２はＴおよびＡからなる群より選択され、Ｘ３はＳおよびＡからなる群より選択され、Ｘ４はＳおよびＴからなる群より選択され、Ｘ５はＲおよびＬからなる群より選択され、Ｘ６はＡ、ＥおよびＱからなる群より選択され、そしてＸ７はＴおよびＳからなる群より選択される；またはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＲＰＳ（配列番号１３１）、式中、Ｘ１はＥおよびＳからなる群より選択され、Ｘ２はＤ、ＶおよびＮからなる群より選択され、Ｘ３はＤ、ＳおよびＮからなる群より選択され、そしてＸ４はＱ、ＧおよびＨからなる群より選択される；からなる群より選択されるＣＤＲＬ２アミノ酸配列；からなる群より選択されるＣＤＲＬをさらに含む。
【００２６】
［００２５］１つの側面において、本明細書に提供する単離抗原結合性タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、またはその抗体断片であってもよい。別の態様において、単離抗原結合性タンパク質の抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ディアボディ、または一本鎖抗体分子であってもよい。さらなる態様において、単離抗原結合性タンパク質はヒト抗体であり、そしてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であってもよい。
【００２７】
［００２６］さらに別の側面において、単離抗原結合性タンパク質は、標識基とカップリングしていてもよく、そしてヒトＧＭ−ＣＳＦの細胞外部分への結合に関して、提供する単離抗原結合性タンパク質の１つの抗原結合性タンパク質と競合してもよい。
【００２８】
［００２７］さらに別の側面において、単離抗原結合性タンパク質は、ヒトＧＭ−ＣＳＦの受容体相互作用部分への結合に関して、本明細書に提供するような抗原結合性タンパク質と競合する。１つの態様において、抗原結合性タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、またはその抗体断片である。関連する態様において、ヒトおよびモノクローナル抗体ならびにＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ディアボディ、または一本鎖抗体分子を含む、抗原断片を提供する。他の態様において、抗原結合性タンパク質は、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型またはＩｇＧ４型のものである。標識基にカップリングされた単離抗原結合性タンパク質をさらに提供する。
【００２９】
［００２８］さらに別の側面において、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ活性を阻害して、マクロファージ／単球、樹状細胞（ＤＣ）、好中球および好酸球を含む骨髄細胞系譜細胞の分化、生存、増殖および活性化、ならびに／あるいはＤＣの分化および／または活性化を引き起こすかまたは達成するシグナルを制限することをさらに意図する。さらに、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ活性を阻害して、単球由来マクロファージ（１型マクロファージ）がＩＬ−２３などの炎症促進性サイトカインを高レベルで産生するのを制限することを意図する。
【００３０】
［００２９］さらなる側面において、ＧＭ−ＣＳＦに結合する抗原結合性タンパクをコードする単離ポリヌクレオチドであって、調節配列に機能可能であるように連結されている、前記ポリヌクレオチドもまた提供する。
【００３１】
［００３０］別の側面において、ＧＭ−ＣＳＦに結合可能な抗原結合性タンパク質をコードする前述の単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および該発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされている宿主細胞もまた、提供する。
【００３２】
［００３１］別の側面において、抗原結合性タンパク質を分泌する宿主細胞から抗原結合性タンパク質を調製する工程を含む、抗原結合性タンパク質の調製法もまた提供する。
［００３２］さらに別の側面において、提供する前述の抗原結合性タンパク質の少なくとも１つおよび薬学的に許容されうる賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。１つの態様において、医薬組成物は、放射性同位体、放射性核種、毒素、または療法的および化学療法的基からなる群より選択される、さらなる活性剤を含んでもよい。
【００３３】
［００３３］さらに別の側面において、患者において、ＧＭ−ＣＳＦと関連する状態を治療するかまたは防止するための方法であって、少なくとも１つの単離抗原結合性タンパク質の有効量を患者に投与する工程を含む、前記方法を提供する。１つの態様において、状態は、リウマチ性障害、自己免疫障害、血液学的障害、腫瘍学的障害、炎症性障害、神経系の変性状態、胃腸、胃泌尿器障害、内分泌障害等からなる群より選択される。１つの態様において、状態は、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、喘息、乾癬、アトピー性皮膚炎およびサルコイドーシスからなる群より選択される障害または疾患である。別の態様において、単離抗原結合性タンパク質を単独でまたは併用療法として用いる治療が含まれる。さらに別の態様において、状態は、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、子宮内膜腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、胃癌、星状膠細胞癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、および卵巣癌から選択される。
【００３４】
［００３４］別の側面において、本発明は、患者において、ＧＭ−ＣＳＦＲの細胞外部分へのＧＭ−ＣＳＦの結合を阻害する方法であって、本明細書に提供する少なくとも１つの抗原結合性タンパク質の有効量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００３５】
［００３５］さらに別の側面において、本発明は、患者において、ヒトＧＭ−ＣＳＦＲのリン酸化を阻害する方法であって、本明細書に記載するような少なくとも１つの抗原結合性タンパク質の有効量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【００３６】
［００３６］さらに別の側面において、単離抗原結合性タンパク質は、患者に投与された際、単球走化性を減少させる。１つの態様において、抗原結合性タンパク質は、単球遊走を阻害する。さらに別の態様において、単離抗原結合性タンパク質を患者に投与した際、腫瘍内への単球遊走が阻害される。
【００３７】
［００３７］さらに、さらなる別の側面として、本明細書に記載するような単離抗原結合性タンパク質を投与する工程を含む、多発性硬化症治療法を提供する。
［００３８］多発性硬化症が、再発寛解型多発性硬化症、進行性再発型多発性硬化症、一次進行型多発性硬化症または二次進行型多発性硬化症である状態もまた意図される。
【００３８】
［００３９］１つの側面において、本明細書に記載するような単離抗原結合性タンパク質を投与する工程を含む、関節リウマチ治療法もまた提供する。
［００４０］さらなる側面において、ヒトＧＭ−ＣＳＦの１対数以内で、カニクイザル（cynomologous）ＧＭ−ＣＳＦと交差反応性であり、そしてＧＭ−ＣＳＦ依存性アッセイで測定した際に、＜１ｎＭのＩＣ５０でＧＭ−ＣＳＦに結合する、単離抗原結合性タンパク質を提供する。
【００３９】
［００４１］これらの側面および他の側面を、本明細書において、より詳細に説明する。提供する側面は各々、本明細書に提供する多様な態様を含みうる。したがって、１つの要素または要素の組み合わせを伴う態様は各々、記載する各側面に含まれうると予期される。開示される他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明において明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１ａ】［００４２］図１ａ〜ｄ：  Ａ）活性ＥＡＥ開始遅延および疾患の発生減少における、抗ネズミＧＭ−ＣＳＦ  ＭＡｂの予防的投与。活性ＳＪＬ／ＰＬＰ１３９−１５１  ＥＡＥを誘導するため、１１匹のマウスに２５０μｇのＰＬＰ１３９−１５１＋ＣＦＡを皮下投与し、そして３週間の評価に供した。群あたり１１匹のマウスに、免疫当日、５００μｇの抗ネズミＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂ、アイソタイプ対照ｍＡｂまたはＰＢＳを投与した。毎日、体重およびスコアを記録した。臨床スコア０：疾患なし；１：垂れた尻尾；２：立ち直り反射のわずかな機能障害または異常な足取り；３：重度の後肢衰弱、部分的後肢麻痺；４：完全後肢麻痺、前肢を用いた移動。抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂは、対照に比較して、開始遅延を示し、発生は対照における９１〜１００％に比較して、４５％である。
【図１ｂ】［００４３］ＢおよびＣ）抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂの予防的投与は、体重減少を防止し（Ｂ）、そして平均臨床スコアを減少させた（Ｃ）。
【図１ｃ】［００４３］ＢおよびＣ）抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂの予防的投与は、体重減少を防止し（Ｂ）、そして平均臨床スコアを減少させた（Ｃ）。
【図１ｄ】［００４４］Ｄ）疾患開始日の５００μｇ抗ｍＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂ、アイソタイプ対照ｍＡｂまたはＰＢＳの単回用量からの結果、ｎ＝１４マウス。活性ＥＡＥにおける抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂの療法的投与は、平均臨床スコアを減少させた。アイソタイプ対照またはＰＢＳに対してＰ＜０．０５。  ［００４５］
【図２ａ】［００４６］図２ａ〜ｃ：  Ａ）活性ＥＡＥにおける抗ｍＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂの療法的投与は、回復を加速させた。回復＝≧２日連続で≧１フルスコア減少して≦１のスコアになる。
【図２ｂ】［００４７］Ｂ）疾患開始日（免疫後第１３日）の療法的抗ｍＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂ治療は、抗ｍＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂ、アイソタイプ対照ｍＡｂまたはＰＢＳ対照で治療したマウスに比較して、ＣＮＳ炎症を減少させた。
【図２ｃ】［００４８］ＣおよびＤ）養子移植ＥＡＥ疾患改善における抗ｍＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂの予防的または療法的投与。養子移植ＥＡＥモデルにおいて、１５匹のマウスに１００μｇのＰＬＰ１３９−１５１＋ＣＦＡを投与し、そして免疫後第１０日にリンパ節を採取し、ＰＬＰペプチドで４日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激し、そしてレシピエントマウス内に注射した。マウスを体重および臨床スコアの３週間の評価に供した。図Ｃは、細胞移植日の治療を示し、図ＤはＥＡＥ開始日の治療を示す。  ［００４９］
【図３】［００５０］図３：  抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂ阻害または０．４ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅを示す代表的なＴＦ−１  Ｓｔａｔ５リン酸化アッセイ。
【図４】［００５１］図４：  大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｈＧＭ−ＣＳＦ免疫マウス由来のハイブリドーマ上清による、ＴＦ−１  Ｓｔａｔ５リン酸化アッセイにおけるｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅの阻害の分布を示すヒストグラム。
【図５】［００５２］図５：  ０．１５ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅの抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂ阻害を示す、代表的なＡＭＬ−５増殖アッセイ。
【図６ａ】［００５３］図６ａ〜ｆ：  ＡＭＬ−５増殖アッセイにおける、ハイブリドーマ上清から精製されたｍＡｂによるＧＭ−ＣＳＦおよびＣＳＦ−１の阻害。
【図６ｂ】図６ａ〜ｆ：  ＡＭＬ−５増殖アッセイにおける、ハイブリドーマ上清から精製されたｍＡｂによるＧＭ−ＣＳＦおよびＣＳＦ−１の阻害。
【図６ｃ】図６ａ〜ｆ：  ＡＭＬ−５増殖アッセイにおける、ハイブリドーマ上清から精製されたｍＡｂによるＧＭ−ＣＳＦおよびＣＳＦ−１の阻害。
【図６ｄ】図６ａ〜ｆ：  ＡＭＬ−５増殖アッセイにおける、ハイブリドーマ上清から精製されたｍＡｂによるＧＭ−ＣＳＦおよびＣＳＦ−１の阻害。
【図６ｅ】図６ａ〜ｆ：  ＡＭＬ−５増殖アッセイにおける、ハイブリドーマ上清から精製されたｍＡｂによるＧＭ−ＣＳＦおよびＣＳＦ−１の阻害。
【図６ｆ】図６ａ〜ｆ：  ＡＭＬ−５増殖アッセイにおける、ハイブリドーマ上清から精製されたｍＡｂによるＧＭ−ＣＳＦおよびＣＳＦ−１の阻害。
【図７ａ】［００５４］図７ａ〜ｂ：  ＴＦ−１  Ｓｔａｔ５リン酸化アッセイにおける、ハイブリドーマ上清から精製されたｍＡｂによるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３の阻害。
【図７ｂ】図７ａ〜ｂ：  ＴＦ−１  Ｓｔａｔ５リン酸化アッセイにおける、ハイブリドーマ上清から精製されたｍＡｂによるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３の阻害。
【図８ａ】［００５５］図８ａ〜ｂ：  多様な種由来のＧＭ−ＣＳＦに対するハイブリドーマ上清抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂまたは組換え抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂの結合を測定するＥＬＩＳＡからの結果。
【図８ｂ】図８ａ〜ｂ：  多様な種由来のＧＭ−ＣＳＦに対するハイブリドーマ上清抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂまたは組換え抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂの結合を測定するＥＬＩＳＡからの結果。
【図９】［００５６］図９：  ＡＭＬ−５増殖アッセイにおける、組換えｍＡｂ（第二のＴＴおよび第二のＳＣＬ）によるヒトおよびカニクイザルＧＭ−ＣＳＦの阻害。
【図１０】［００５７］図１０：  ＴＦ−１  Ｓｔａｔ５リン酸化アッセイにおける、組換えｍＡｂ（第二のＴＴおよび第二のＳＣＬ）によるヒトおよびカニクイザルＧＭ−ＣＳＦの阻害。
【図１１】［００５８］図１１：  ＴＦ−１  Ｓｔａｔ５リン酸化アッセイにおける、組換えｍＡｂ（第一のＴＴ）による天然ヒトおよびカニクイザル肺由来ＧＭ−ＣＳＦの阻害。
【図１２】［００５９］図１２：  ＴＦ−１  Ｓｔａｔ５リン酸化アッセイにおける、組換えｍＡｂ（第二のＳＣＬ）ＩｇＧ  Ｂによる天然カニクイザルＰＢＭＣ由来ＧＭ−ＣＳＦの阻害。
【図１３】［００６０］図１３：  ヒト単球アッセイにおける、組換えｍＡｂ（第二のＴＴ）によるヒトＧＭ−ＣＳＦの阻害。
【図１４】［００６１］図１４：  組換えｍＡｂ（第二のＳＣＬ）ＩｇＧ  Ｂによる、ＧＭ−ＣＳＦが誘導する全血中のＭＩＰ−１ｂおよびＥＮＡ７８産生の阻害。
【図１５ａ】［００６２］図１５ａ〜ｂ：  ハイブリドーマ上清から精製されたｍＡｂは、ＡＭＬ−５増殖アッセイ（ａ）または単球アッセイ（ｂ）において、酵母由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））を阻害しない。
【図１５ｂ】図１５ａ〜ｂ：  ハイブリドーマ上清から精製されたｍＡｂは、ＡＭＬ−５増殖アッセイ（ａ）または単球アッセイ（ｂ）において、酵母由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））を阻害しない。
【図１６】［００６３］図１６：  ｍＡｂは大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦを中和したが、酵母由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））または非グリコシル化大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ２３Ｌを中和しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
［００６４］本発明は、本明細書に記載する特定の方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、そしてこれはこうしたものが多様でありうるためであることを理解しなければならない。本明細書に用いる専門用語は、特定の態様を説明する目的のためのみのものであり、そして本開示の範囲を限定することを意図せず、本開示の範囲は、請求項のみによって定義されるであろう。
【００４２】
［００６５］本出願の方法および技術は、別に示さない限り、一般的に、当該技術分野に周知の慣用法にしたがって、そして本明細書全体で引用され、そして論じられる、多様な一般的な参考文献およびより特異的な参考文献に記載されるように、行われる。例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual，  第３版，  Cold Spring Harbor Laboratory Press，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２００１）、ならびにAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates(1992)、ならびにHarlowおよびLane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９９０）を参照されたい。
【００４３】
［００６６］用語「ポリヌクレオチド」には、一本鎖および二本鎖核酸両方が含まれ、そしてゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、あるいは合成起源または天然に通常見られる配列とは関連していないそのいくつかの組み合わせが含まれる。明記する配列を含む単離ポリヌクレオチドには、明記する配列に加えて、最大１０またはさらに最大２０の他のタンパク質またはその部分のコード配列が含まれてもよく、あるいは、列挙する核酸配列のコード領域の発現を調節する、機能可能であるように連結された制御配列が含まれてもよく、そして／あるいはベクター配列が含まれてもよい。ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、あるいはヌクレオチドのいずれかのタイプの修飾型であってもよい。前記修飾には、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体などの塩基修飾、２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデートおよびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間連結修飾が含まれる。
【００４４】
［００６７］用語「オリゴヌクレオチド」は、１００以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは長さ１０〜６０塩基である。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、例えば突然変異体遺伝子の構築に使用するため、一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドには、検出アッセイのため、放射標識、蛍光標識、ハプテンまたは抗原性標識などの検出可能標識が含まれてもよい。オリゴヌクレオチドを、例えばＰＣＲプライマー、クローニングプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして用いてもよい。
【００４５】
［００６８］用語「調節配列」は、連結されているコード配列の発現およびプロセシングに影響を及ぼしうるポリヌクレオチド配列を指す。こうした調節配列の性質は、宿主生物に応じうる。特定の態様において、原核生物のための調節配列には、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が含まれてもよい。例えば、真核生物のための調節配列には、１つまたは複数の転写因子認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列、および転写終結配列が含まれてもよい。「調節配列」には、リーダー配列および／または融合パートナー配列が含まれてもよい。
【００４６】
［００６９］用語「ベクター」は、タンパク質コード情報を宿主細胞内に移動させるために用いられる、任意の分子または実体（例えば核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。用語「発現ベクター」または「発現構築物」は、宿主細胞の形質転換に適しており、そして機能可能であるように連結されている１以上の異種コード領域の発現を（宿主細胞と組み合わされて）導きそして／または調節する核酸配列を含有するベクターを指す。発現構築物には、限定されるわけではないが、転写、翻訳に影響を及ぼすかまたはこれらを調節し、そしてイントロンが存在する場合、機能可能であるように連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列が含まれてもよい。
【００４７】
［００７０］本明細書において、「機能可能であるように連結された」は、この用語が適用されている構成要素が、その生得的な機能を実行することを可能にする関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「機能可能であるように連結された」ベクター中の調節配列、例えばプロモーターは、調節配列の正常な活性が、タンパク質コード配列の転写を導き、コードされるタンパク質の組換え発現を生じるように配置されている。
【００４８】
［００７１］用語「トランスフェクション」は、細胞による外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）または外因性ＤＮＡの取り込みを意味し、そして外因性ＤＮＡが細胞膜内部に導入されている場合、細胞は「トランスフェクション」されている。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野に周知であり、そして本明細書に開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら，1973, Virology 52:456；  Sambrookら, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual，  上記；  Davisら, 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier； Chuら, 1981, Gene 13:197を参照されたい。こうした技術を用いて、適切な宿主細胞内に、１以上の外因性ＤＮＡ部分を導入してもよい。
【００４９】
［００７２］用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、天然タンパク質、すなわち天然に存在し、そして非組換え体である細胞によって産生されるタンパク質のアミノ酸配列を有する巨大分子を意味する；またはこれは、遺伝子操作された細胞または組換え細胞によって産生され、そして天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、あるいは天然配列からの１以上のアミノ酸の欠失、該配列への付加、および／または該配列の置換を有する分子を含む。該用語にはまた、１以上のアミノ酸が、対応する天然存在アミノ酸およびポリマーの化学的類似体であるアミノ酸ポリマーも含まれる。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質、抗体、あるいは抗原結合性タンパク質からの１以上のアミノ酸の欠失、該タンパク質への付加、および／または該タンパク質の置換を有する配列を含む。用語「ポリペプチド断片」は、全長天然タンパク質と比較した際に、アミノ末端欠失、カルボキシ末端欠失、および／または内部欠失を有するポリペプチドを指す。こうした断片はまた、天然タンパク質と比較した際に修飾アミノ酸も含有してもよい。特定の態様において、断片は、長さ約５〜５００アミノ酸である。例えば、断片は、長さ少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸であってもよい。有用なポリペプチド断片には、結合ドメインを含む、抗体の免疫学的に機能する断片が含まれる。ＧＭ−ＣＳＦ結合抗体の場合、有用な断片には、限定されるわけではないが、ＣＤＲ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の部分、あるいは２つのＣＤＲを含む可変領域のみ等が含まれる。
【００５０】
［００７３］用語「単離タンパク質」は、療法的、診断的、予防的、研究上のまたは他の使用と干渉するであろう、タンパク質またはポリペプチドまたは他の混入物質から精製されたタンパク質を指す。
【００５１】
［００７４］ポリペプチド（例えば抗原結合性タンパク質、または抗体）の「変異体」は、１以上のアミノ酸残基が、別のポリペプチド配列に比較して、アミノ酸配列内に挿入され、該配列から欠失し、そして／または該配列内に置換されている、アミノ酸配列を含む。変異体には融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドの「誘導体」は、挿入、欠失、または置換変異体とは別個の何らかの方式で、例えば別の化学部分へのコンジュゲート化を介して、化学的に修飾されているポリペプチド（例えば抗原結合性タンパク質、または抗体）である。
【００５２】
［００７５］用語「天然存在」は、ポリペプチド、核酸、宿主細胞等の生物学的物質と関連して、本明細書全体で用いた際、天然に見られる物質を指す。
［００７６］「抗原結合性タンパク質」は、本明細書において、明記するターゲット抗原に特異的に結合するタンパク質を意味し；提供するものの抗原は、ＧＭ−ＣＳＦ、またはヒトＧＭ−ＣＳＦである。
【００５３】
［００７７］抗原結合性タンパク質は、解離定数（Ｋｄ）が≦１０−８Ｍである場合、ターゲット抗原に「特異的に結合する」と言われる。Ｋｄが≦５ｘ１０−９Ｍである場合、抗体は、抗原に「高アフィニティ」で結合し、そしてＫｄが≦５ｘ１０−１０Ｍである場合、「非常に高いアフィニティ」で結合する。１つの態様において、抗体は、≦１０−９ＭのＫｄおよび約１ｘ１０−４／秒のオフ速度を有する。１つの態様において、オフ速度は＜１ｘ１０−５である。他の態様において、抗体は、約１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍの間のＫｄで、ＧＭ−ＣＳＦまたはヒトＧＭ−ＣＳＦに結合し、そしてさらに別の態様において、≦２ｘ１０−１０ＭのＫｄで結合するであろう。
【００５４】
［００７８］「抗原結合性領域」は、明記する抗原に特異的に結合するタンパク質またはタンパク質の部分を意味する。例えば、抗原と相互作用し、そして抗原結合性タンパク質に、抗原に対する特異性およびアフィニティを与えるアミノ酸残基を含有する、抗原結合性タンパク質の部分を、「抗原結合性領域」と称する。抗原結合性領域には、典型的には、１以上の「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）が含まれる。特定の抗原結合性領域にはまた、１以上の「フレームワーク」領域が含まれる。「ＣＤＲ」は、抗原結合特異性およびアフィニティに寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、ＣＤＲの適切なコンホメーションを維持するのを補助して、抗原結合性領域および抗原間の結合を促進しうる。
【００５５】
［００７９］特定の側面において、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質またはヒトＧＭ−ＣＳＦに結合する組換え抗原結合性タンパク質を提供する。この関連において、「組換えタンパク質」は、組み換え技術を用いて、すなわち本明細書に記載するような組換え核酸の発現を通じて作製されるタンパク質である。組換えタンパク質の産生のための方法および技術は、当該技術分野に周知である。
【００５６】
［００８０］用語「抗体」は、任意のアイソタイプの損なわれていない（intact）免疫グロブリン、またはターゲット抗原への特異的結合に関して、損なわれていない抗体と競合可能なその断片であり、そしてこれには、例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒト、および二重特異性抗体が含まれる。こうしたものとして、「抗体」は、抗原結合性タンパク質の一種である。損なわれていない抗体は、一般的に、少なくとも２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含むであろうが、いくつかの場合、重鎖のみを含みうる、ラクダ科（camelid）において天然に存在する抗体のように、より少ない鎖が含まれる可能性もある。抗体は、単一の供給源のみに由来してもよいし、または「キメラ」であってもよく、すなわち、以下にさらに記載するように、抗体の異なる部分が２つの異なる抗体に由来してもよい。抗原結合性タンパク質、抗体、または結合性断片を、ハイブリドーマ中で、組換えＤＮＡ技術によって、あるいは損なわれていない抗体の酵素的または化学的切断によって産生してもよい。別に示さない限り、用語「抗体」には、２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、断片、および突然変異タンパク質（mutein）が含まれ、この例を以下に記載する。
【００５７】
［００８１］用語「軽鎖」には、全長軽鎖および結合特異性を与えるのに十分な配列を有するその断片が含まれる。典型的な哺乳動物抗体において、全長軽鎖には、可変領域ドメイン、ＶＬ、および定常領域ドメインＣＬが含まれ、ここで軽鎖可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端側にある。典型的なヒト抗体軽鎖には、カッパ鎖またはラムダ鎖が含まれる。
【００５８】
［００８２］用語「重鎖」には、全長重鎖および結合特異性を与えるのに十分な可変領域配列を有するその断片が含まれる。哺乳動物全長重鎖抗体には、典型的には、可変領域ドメイン、ＶＨ、および３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３が含まれる。ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端側にあり、そしてＣＨドメインはカルボキシ末端側にあり、ＣＨ３がポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。ヒト重鎖は、典型的には、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥを含むアイソタイプのものであってもよい。
【００５９】
［００８３］用語、抗体または免疫グロブリン鎖（重鎖または軽鎖）の「機能性断片」（または単に「断片」）は、本明細書において、全長鎖に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠くが、抗原に特異的に結合可能な抗体の部分（その部分がどのように得られたかまたは合成されたかに関わらず）を含む抗原結合性タンパク質である。こうした断片は、これらがターゲット抗原に特異的に結合し、そして損なわれていない抗体を含む他の抗原結合性タンパク質と、所定のエピトープへの特異的結合に関して競合しうる点で生物学的に活性である。１つの側面において、こうした断片は、全長軽鎖または重鎖に存在する少なくとも１つのＣＤＲを保持し、そしていくつかの態様において、単一の重鎖および／または軽鎖またはその部分を含むであろう。これらの生物学的活性断片は、組換えＤＮＡ技術によって産生可能であるか、あるいは損なわれていない抗体を含む抗原結合性タンパク質の酵素的または化学的切断によって産生可能である。免疫学的に機能する免疫グロブリン断片には、限定されるわけではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体および一本鎖抗体が含まれ、そしてこれらは、限定されるわけではないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダ科またはウサギを含む、任意の哺乳動物供給源に由来してもよい。本明細書に開示する抗原結合性タンパク質の機能性部分、例えば１以上のＣＤＲが、第二のタンパク質または小分子に共有結合して、体の特定のターゲットに対して向けられるか、二重機能性療法特性を所持するか、または延長された血清半減期を有する療法剤を生成可能であることがさらに意図される。
【００６０】
［００８４］「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖、ならびに１つの重鎖のＣＨ１および可変領域で構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成不能である。
【００６１】
［００８５］「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含有する。２つの重鎖断片は、２以上のジスルフィド結合によって、そしてＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって一緒に保持される。
【００６２】
［００８６］「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖、ならびにＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン、ならびにまたＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の領域も含有する１つの重鎖の部分を含有し、したがって、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成可能である。
【００６３】
［００８７］「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つの軽鎖、ならびにＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間の定常領域部分を含有する２つの重鎖を含有し、したがって、２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成される。Ｆ（ａｂ’）２断片は、したがって、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって一緒に保持される、２つのＦａｂ’断片で構成される。
【００６４】
［００８８］「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠く。
［００８９］「一本鎖抗体」は、重鎖および軽鎖可変領域が、柔軟なリンカーによって連結されて、単一のポリペプチド鎖を形成し、該ポリペプチド鎖が抗原結合性領域を形成するＦｖ分子である。一本鎖抗体は、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ８８／０１６４９号、ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号に詳細に論じられる。
【００６５】
［００９０］「ドメイン抗体」は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域のみを含有する、免疫学的に機能する免疫グロブリン断片である。いくつかの例において、２以上のＶＨ領域がペプチドリンカーと共有結合して、二価ドメイン抗体が生成される。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同じかまたは異なる抗原をターゲティングしうる。
【００６６】
［００９１］「二価抗原結合性タンパク質」または「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。いくつかの場合、２つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。二価抗原結合性タンパク質および二価抗体は、二重特異性であってもよい。以下を参照されたい。
【００６７】
［００９２］「多重特異性抗原結合性タンパク質」または「多重特異性抗体」は、１より多い抗原またはエピトープをターゲティングするものである。
［００９３］「二重特異性」「二元特異性」または「二重機能性」抗原結合性タンパク質または抗体は、それぞれ、２つの異なる抗原結合部位を有する、ハイブリッド抗原結合性タンパク質または抗体である。二重特異性抗原結合性タンパク質および抗体は、多重特異性抗原結合性タンパク質抗体の一種であり、そして限定されるわけではないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む、多様な方法によって産生可能である。例えば、ＳongsivilaiおよびLachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelnyら，1992, J. Immunol. 148:1547-1553を参照されたい。二重特異性抗原結合性タンパク質または抗体の２つの結合部位は、同じまたは異なるタンパク質ターゲット上に存在しうる、２つの異なるエピトープに結合するであろう。
【００６８】
［００９４］用語「中和性抗原結合性タンパク質」または「中和抗体」は、それぞれ、リガンドに結合し、リガンドが結合パートナーに結合するのを防止し、そしてそうでなければリガンドが結合パートナーに結合して生じるであろう生物学的反応を中断する、抗原結合性タンパク質または抗体を指す。抗原結合性タンパク質、例えば抗体またはその免疫学的に機能する断片の結合および特異性を評価する際、過剰な抗体が、リガンドに結合する結合パートナーの量を、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれより多く減少させる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ競合的結合アッセイで評価した際）場合、抗体または断片は、リガンドがその結合パートナーに結合するのを実質的に阻害するであろう。ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質の場合、こうした中和分子は、ＧＭ−ＣＳＦがＧＭ−ＣＳＦＲに結合する能力を減少させるであろう。
【００６９】
［００９５］用語「競合する」は、同じエピトープに関して競合する抗原結合性タンパク質（例えば中和性抗原結合性タンパク質または中和抗体）に関連して用いた場合、共通の抗原（例えばＧＭ−ＣＳＦまたはその断片）への参照抗原結合性タンパク質（例えばリガンド、または参照抗体）の特異的結合を、試験下の抗原結合性タンパク質（例えば抗体またはその免疫学的に機能する断片）が防止するかまたは阻害するアッセイによって、抗原結合性タンパク質間の競合が決定されることを意味する。多くのタイプの競合的結合アッセイが使用可能であり、例えば：固相直接または間接的ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接的酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Stahliら, 1983, Methods in Enzymology 9:242-253を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Kirklandら, 1986, J. Immunol. 137:3614-3619を参照されたい）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、HarlowおよびLane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pressを参照されたい）；Ｉ−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Morelら, 1988, Molec. Immunol. 25:7-15を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Cheungら, 1990, Virology 176:546-552を参照されたい）；および直接標識ＲＩＡ（Moldenhauerら, 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82）を用いてもよい。典型的には、こうしたアッセイには、固相表面に結合した精製抗原またはこれらのいずれかを所持する細胞、非標識試験抗原結合性タンパク質および標識参照抗原結合性タンパク質の使用が伴う。
【００７０】
［００９６］試験抗原結合性タンパク質の存在下で固相表面または細胞に結合した標識の量を決定することによって、競合的阻害を測定する。通常、試験抗原結合性タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗原結合性タンパク質（競合的抗原結合性タンパク質）には、参照抗原結合性タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合性タンパク質、および参照抗原結合性タンパク質が結合するエピトープと十分に近接した隣接エピトープに結合して、立体障害を生じる抗原結合性タンパク質が含まれる。競合的結合を決定するための方法に関するさらなる詳細を、本明細書の実施例に提供する。通常、競合的抗原結合性タンパク質が過剰に存在する場合、これは共通の抗原への参照抗原結合性タンパク質の特異的結合を、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害するであろう。いくつかの場合、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％、あるいはそれより多く阻害される。
【００７１】
［００９７］用語「抗原」は、選択的結合剤、例えば抗原結合性タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的に機能する断片を含む）によって結合可能であり、そしてさらに、動物においてその抗原に結合可能な抗体を産生するのに使用可能である分子または分子の部分を指す。抗原は、異なる抗原結合性タンパク質、例えば抗体と相互作用可能な１以上のエピトープを所持してもよい。
【００７２】
［００９８］用語「エピトープ」には、抗原結合性タンパク質に特異的に結合可能な任意の決定基が含まれる。エピトープは、その抗原を特異的にターゲティングする抗原結合性タンパク質が結合する抗原の領域であり、そして抗原がタンパク質である場合、エピトープには、抗原結合性タンパク質と接触する特定のアミノ酸が含まれる。もっともしばしば、エピトープは、非アミノ酸翻訳後修飾を含むと理解されるタンパク質上に存在するが、いくつかの場合、核酸などの他の種類の分子上に存在することも可能である。エピトープには、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基などの分子の化学的活性表面基が含まれてもよく、そしてエピトープは、特異的三次元構造特性、および／または特異的電荷特性を有しうる。一般的に、特定のターゲット抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複雑な混合物中、ターゲット抗原上のエピトープを優先的に認識するであろう。
【００７３】
［００９９］用語「同一性」は、配列を並列させそして比較することによって決定した際の、２以上のポリペプチド分子または２以上のポリヌクレオチドの配列間の関係を指す。「同一性パーセント」は、比較する分子中のアミノ酸またはヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、そして比較中の分子の最小のもののサイズに基づいて計算される。これらの計算のため、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって（存在するならば）並列中のギャップに取り組まなければならない。並列核酸またはポリペプチドの同一性を計算するのに使用可能な方法には、Computational Molecular Biology (Lesk, A. M.監修), 1988, ニューヨーク: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects(Smith, D. W.監修), 1993, ニューヨーク: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I(Griffin, A. M.およびGriffin, H. G.監修), 1994, ニュージャージー: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, ニューヨーク: Academic Press; Sequence Analysis Primer(Gribskov, M.およびDevereux, J.監修), 1991, ニューヨーク: M. Stockton Press;ならびにCarilloら, 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073に記載されるものが含まれる。
【００７４】
［００１００］同一性パーセントを計算する際、比較中の配列を、配列間の最大マッチが生じる方式で並列させる。同一性パーセントを決定するのに用いられるコンピュータプログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージであり、該パッケージには、ＧＡＰ（Devereuxら, 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin，  ウィスコンシン州マディソン）が含まれる。コンピュータアルゴリズムＧＡＰを用いて、配列同一性パーセントを決定しようとする２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを並列させる。それぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適マッチングのために、配列を並列させる（アルゴリズムによって決定されるような「マッチしたスパン」）。ギャップオープニングペナルティ（平均対角の３ｘとして計算される、ここで「平均対角」は、使用中の比較マトリックスの対角の平均であり；「対角」は、特定の比較マトリックスによって、完全アミノ酸マッチ各々に割り当てられたスコアまたは数字である）およびギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップオープニングペナルティの１／１０倍）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２などの比較マトリックスがアルゴリズムと組み合わせて用いられる。特定の態様において、標準的比較マトリックス（ＰＡＭ  ２５０比較マトリックスに関しては、Dayhoffら, 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352；  ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較マトリックスに関しては、Henikoffら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919を参照されたい）もまた、アルゴリズムによって用いられる。
【００７５】
［００１０１］ＧＡＰプログラムを用いたポリペプチドまたはヌクレオチド配列に関する同一性パーセントを決定するために推奨されるパラメーターは、以下の通りである：
アルゴリズム：  Needlemanら, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453；
比較マトリックス：  Henikoffら、１９９２、上記由来のＢＬＯＳＵＭ  ６２；
ギャップペナルティ：  １２（しかし末端ギャップに関するペナルティなし）
ギャップ長ペナルティ：  ４
類似性の閾値：  ０
［００１０２］２つのアミノ酸配列を並列させるための特定の並列スキームは、２つの配列の短い領域のみのマッチングを生じる可能性もあり、そして２つの全長配列間に有意な関係がない場合であってさえ、この小さい並列領域が非常に高い配列同一性を有する可能性もある。したがって、望ましい場合、選択された並列法（ＧＡＰプログラム）を調整して、ターゲットポリペプチドの少なくとも５０の隣接アミノ酸に渡る並列を生じてもよい。
【００７６】
［００１０３］本明細書において、「実質的に純粋な」は、分子の記載する種が、存在する主な種である、すなわちモル濃度に基づいて、同じ混合物中のいかなる他の個々の種よりも豊富であることを意味する。特定の態様において、実質的に純粋な分子は、対象の種が、存在するすべての巨大分子種の少なくとも５０％（モル濃度に基づく）を構成する組成物である。他の態様において、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての巨大分子種の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を構成するであろう。
【００７７】
［００１０４］特定の態様において、本質的に均一な物質は、混入種が慣用的な検出法によって組成物中に検出不能であり、そしてしたがって組成物が単一の検出可能な巨大分子種からなるような度合いまで精製されてきている。
【００７８】
［００１０５］用語「療法的有効量」は、哺乳動物において、任意の療法的応答を生じると決定されたＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質の量を指す。こうした療法的有効量は、一般の当業者によって容易に確認される。
【００７９】
［００１０６］「アミノ酸」には、当該技術分野における通常の意味が含まれる。２０の天然存在アミノ酸およびその略語は、慣用的用法にしたがう。Immunology- A Synthesis,  第２版（Ｅ．  Ｓ．  ＧｏｌｕｂおよびＤ．  Ｒ．  Ｇｒｅｎ監修），  Sinauer Associates：  マサチューセッツ州サンダーランド（１９９１）を参照されたい。２０の慣用的アミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、［アルファ］−，［アルファ］−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸などの非天然アミノ酸、および他の非慣用的アミノ酸もまた、ポリペプチドの適切な構成要素でありうる。非慣用的アミノ酸の例には：４−ヒドロキシプロリン、［ガンマ］−カルボキシグルタメート、［イプシロン］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、［イプシロン］−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、［シグマ］−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書に用いるポリペプチド表記法において、標準的用法および慣用にしたがって、左側がアミノ末端方向であり、そして右側がカルボキシ末端方向である。
【００８０】
Ａ．全般的概説
［００１０７］ＧＭ−ＣＳＦタンパク質、特にヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｈＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質に結合する抗原結合性タンパク質を本明細書に提供する。提供する抗原結合性タンパク質は、本明細書に記載するような１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）が包埋され、そして／または連結されているポリペプチドである。いくつかの抗原結合性タンパク質において、ＣＤＲは、「フレームワーク」領域内に包埋され、該領域は、ＣＤＲ（単数または複数）の適切な抗原結合特性が達成されるように、ＣＤＲ（単数または複数）を方向付ける。一般的に、提供する抗原結合性タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦＲおよびＧＭ−ＣＳＦ間の相互作用に干渉するか、該相互作用を遮断するか、減少させるか、または調節することも可能である。
【００８１】
［００１０８］本明細書に記載する特定の抗原結合性タンパク質は、抗体であるか、または抗体に由来する。特定の態様において、抗原結合性タンパク質のポリペプチド構造は抗体に基づき、抗体には、限定されるわけではないが、それぞれ、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書において、ときに、「抗体模倣体」と称される）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（本明細書において、ときに、「抗体コンジュゲート」と称される）、およびその断片が含まれる。本明細書に、多様な構造をさらに記載する。
【００８２】
［００１０９］本明細書に提供する抗原結合性タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦ、特にヒトＧＭ−ＣＳＦの特定のエピトープに結合することが立証されてきている。その結果、本明細書に提供する抗原結合性タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦ活性を阻害可能である。特に、これらのエピトープに結合する抗原結合性タンパク質は、とりわけ、ＧＭ−ＣＳＦＲシグナル伝達、ＧＭ−ＣＳＦが誘導する細胞増殖または分化、およびＧＭ−ＣＳＦＲへの結合に際してＧＭ−ＣＳＦによって誘導される他の生理学的影響の誘導を阻害する。
【００８３】
［００１１０］本明細書に開示する抗原結合性タンパク質は、多様な有用性を有する。抗原結合性タンパク質のいくつかは、例えば、特異的結合アッセイ、ＧＭ−ＣＳＦ、特にｈＧＭ−ＣＳＦまたはそのリガンドのアフィニティ精製、およびＧＭ−ＣＳＦ活性の他のアンタゴニストを同定するスクリーニングアッセイにおいて有用である。いくつかの抗原結合性タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦへのＧＭ−ＣＳＦＲの結合を阻害するか、またはＧＭ−ＣＳＦの自己リン酸化を阻害するのに有用である。
【００８４】
［００１１１］本明細書に説明するように、抗原結合性タンパク質を多様な治療適用において用いてもよい。例えば、本明細書にさらに記載するように、特定のＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦと関連する状態を治療する、例えば患者において単球走化性を減少させ、腫瘍内への単球遊走を阻害し、または腫瘍における腫瘍関連マクロファージの集積を阻害するのに有用である。抗原結合性タンパク質のための他の使用には、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ関連疾患または状態の診断、およびＧＭ−ＣＳＦの存在または非存在を決定するスクリーニングアッセイが含まれる。本明細書記載の抗原結合性タンパク質のいくつかは、ＧＭ−ＣＳＦ活性と関連する結果、症状、および／または病変を治療する際に有用である。これらには、限定されるわけではないが、多様なタイプの炎症性疾患が含まれる。
【００８５】
Ｂ．ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質
［００１１２］ＧＭ−ＣＳＦの活性を制御するのに有用な、多様な選択的結合剤を提供する。これらの剤には、例えば、抗原結合性ドメインを含有し（例えば一本鎖抗体、ドメイン抗体、免疫接着、および抗原結合性領域を含むポリペプチド）、そしてＧＭ−ＣＳＦポリペプチド、特にヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する、抗原結合性タンパク質が含まれる。例えば、剤のいくつかは、ＧＭ−ＣＳＦへのＧＭ−ＣＳＦＲの結合を阻害する際に有用であり、そしてしたがって、これを用いて、ＧＭ−ＣＳＦシグナル伝達と関連する１以上の活性を阻害するのに使用可能である。
【００８６】
［００１１３］一般的に、提供する抗原結合性タンパク質は、典型的には、本明細書に記載するような１以上のＣＤＲ（例えば１、２、３、４、５または６のＣＤＲ）を含む。いくつかの例で、抗原結合性タンパク質は、（ａ）ポリペプチド構造および（ｂ）ポリペプチド構造内に挿入され、そして／または該構造に連結された１以上のＣＤＲを含む。ポリペプチド構造は、多様な異なる型を取りうる。例えば、該構造は、天然存在抗体のフレームワーク、またはその断片もしくは変異体であるか、またはそれを含むか、あるいは事実上、完全に合成であってもよい。多様なポリペプチド構造の例を以下にさらに記載する。
【００８７】
［００１１４］特定の態様において、抗原結合性タンパク質のポリペプチド構造は、抗体であるかまたは抗体に由来し、抗体には、限定されるわけではないが、それぞれ、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書において、ときに、「抗体模倣体」と称される）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（ときに、「抗体コンジュゲート」と称される）、および各々の部分または断片が含まれる。いくつかの場合、抗原結合性タンパク質は、抗体の免疫学的断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖ）である。多様な構造を本明細書にさらに記載し、そして定義する。
【００８８】
［００１１５］本明細書に提供するような特定の抗原結合性タンパク質は、ヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する。「特異的に結合する」は、本明細書において、平衡解離定数が、＜１０−８〜＜１０−１０Ｍ、あるいは＜１０−９〜＜１０−１０Ｍであることを意味する。
【００８９】
［００１１６］抗原結合性タンパク質を療法的適用のために用いる態様において、抗原結合性タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦの１以上の生物学的活性を阻害するか、該活性に干渉するか、または該活性を調節することも可能である。この場合、過剰な抗体が、ＧＭ−ＣＳＦＲに結合したヒトＧＭ−ＣＳＦの量またはその逆の量を、少なくとも約４０％、６０％、８０％、８５％、またはそれより多く減少させる場合（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ競合的結合アッセイにおいて結合を測定することによって）、抗原結合性タンパク質は、ヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合し、そして／またはヒトＧＭ−ＣＳＦがＧＭ−ＣＳＦＲに結合するのを実質的に阻害する。ＧＭ−ＣＳＦは、多くの別個の生物学的影響を有し、これらの影響は、異なる細胞種における異なるアッセイにおいて測定可能であり；こうしたアッセイの例を本明細書に提供する。
【００９０】
［００１１７］提供する抗原結合性タンパク質のいくつかは、天然存在抗体と典型的に関連する構造を有する。これらの抗体の構造単位は、典型的には、各々、ポリペプチド鎖の２つの同一のカプレット（couplets）で構成される、１以上の四量体を含むが、いくつかの種の哺乳動物はまた、単一の重鎖しか持たない抗体も産生する。典型的な抗体において、各対またはカプレットには、１つの全長「軽」鎖（特定の態様において、約２５ｋＤａ）および１つの全長「重」鎖（特定の態様において、約５０〜７０ｋＤａ）が含まれる。各個々の免疫グロブリン鎖は、いくつかの「免疫グロブリンドメイン」で構成され、各ドメインは、およそ９０〜１１０アミノ酸からなり、そして特徴的なフォールディングパターンを示す。これらのドメインは、抗体ポリペプチドが構成される基本的な単位である。各鎖のアミノ末端部分には、典型的には、抗原認識に関与する可変ドメインが含まれる。カルボキシ末端部分は、鎖のもう一方の末端よりも進化的により保存されており、そして「定常領域」または「Ｃ領域」と称される。ヒト軽鎖は、一般的に、カッパおよびラムダ軽鎖と分類され、そしてこれらの各々は、１つの可変ドメインおよび１つの定常ドメインを含有する。重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロン鎖と分類され、そしてこれらは、抗体のアイソタイプを、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義する。ＩｇＧは、限定されるわけではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む、いくつかのサブタイプを有する。ＩｇＭサブタイプには、ＩｇＭ、およびＩｇＭ２が含まれる。ＩｇＡサブタイプには、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２が含まれる。ヒトにおいて、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプは４つの重鎖および４つの軽鎖を含有し；ＩｇＧおよびＩｇＥアイソタイプは２つの重鎖および２つの軽鎖を含有し；そしてＩｇＭアイソタイプは５つの重鎖および５つの軽鎖を含有する。重鎖Ｃ領域は、典型的には、エフェクター機能に関与しうる１以上のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数は、アイソタイプに応じる。ＩｇＧ重鎖は、例えば、各々、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３として知られる３つのＣ領域ドメインを含有する。提供する抗体は、これらのアイソタイプおよびサブタイプのいずれを有してもよい。特定の態様において、ＧＭ−ＣＳＦ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４サブタイプのものである。
【００９１】
［００１１８］全長軽鎖および重鎖において、可変および定常領域は、約１２アミノ酸以上の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた、約１０アミノ酸以上の「Ｄ」領域もまた含む。例えば、Fundamental Immunology,  第２版，  第７章（Ｐａｕｌ，  Ｗ．監修）  １９８９，  ニューヨーク：  Raven Pressを参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、典型的には、抗原結合部位を形成する。
【００９２】
１．抗体の可変ドメイン
［００１１９］本明細書に提供する多様な重鎖および軽鎖可変領域を表１に示す。これらの可変領域は各々、上記重鎖および軽鎖定常領域に付着して、それぞれ、完全抗体重鎖および軽鎖を形成可能である。さらに、こうして生成された重鎖および軽鎖配列の各々を組み合わせて、完全抗体構造を形成してもよい。
【００９３】
［００１２０］以下の表１に示すように、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０、ＶＨ１１、およびＶＨ１２からなる群より選択される抗体重鎖可変領域、ならびに／あるいはＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、およびＶＬ１２からなる群より選択される抗体軽鎖可変領域を含有する抗原結合性タンパク質を提供する。
【００９４】
［００１２１］このタイプの抗原結合性タンパク質は、表１に列挙するように、一般的に、式「ＶＨｘ／ＶＬｙ」、式中、「ｘ」は重鎖可変領域の番号に対応し、そして「ｙ」は軽鎖可変領域の番号に対応する、によって示すことも可能である：
表１
例示的なＶＨおよびＶＬ鎖
【００９５】
【表１−１】
2010538676.tif 000003
【００９６】
【表１−２】
2010538676.tif 000004
【００９７】
【表１−３】
2010538676.tif 000005
【００９８】
［００１２２］表１に列挙する重鎖可変領域を各々、表１に示す軽鎖可変領域のいずれかと組み合わせて、抗原結合性タンパク質を形成してもよい。こうした組み合わせの例には、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、およびＶＬ１２のいずれかと組み合わされたＶＨ１、またはＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、およびＶＬ１２のいずれかと組み合わされたＶＨ２等が含まれる。
【００９９】
［００１２３］いくつかの例において、抗原結合性タンパク質には、表１に列挙するものからの少なくとも１つの重鎖可変領域および／または１つの軽鎖可変領域が含まれる。いくつかの例において、抗原結合性タンパク質には、表１に列挙するものからの少なくとも２つの異なる重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域が含まれる。こうした抗原結合性タンパク質の例は、（ａ）１つのＶＨ１、および（ｂ）ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０、ＶＨ１１、またはＶＨ１２の１つを含む。
【０１００】
［００１２４］別の例は、（ａ）１つのＶＨ２、および（ｂ）ＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０、ＶＨ１１、またはＶＨ１２の１つを含む。また、別の例は、（ａ）１つのＶＨ３、および（ｂ）ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０、ＶＨ１１、またはＶＨ１２の１つを含むなどである。
【０１０１】
［００１２５］こうした抗原結合性タンパク質のまた別の例は、（ａ）１つのＶＬ１、および（ｂ）ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、またはＶＬ１２の１つを含む。こうした抗原結合性タンパク質のまた別の例は、（ａ）１つのＶＬ２、および（ｂ）ＶＬ１、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、またはＶＬ１２の１つを含む。こうした抗原結合性タンパク質のまた別の例は、（ａ）１つのＶＬ３、および（ｂ）ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、またはＶＬ１２の１つを含むなどである。
【０１０２】
［００１２６］重鎖可変領域の多様な組み合わせを、軽鎖可変領域の多様な任意の組み合わせと組み合わせてもよい。
［００１２７］他の例において、抗原結合性タンパク質は、２つの同一の軽鎖可変領域および／または２つの同一の重鎖可変領域を含有する。例えば、抗原結合性タンパク質は、表１に列挙するような軽鎖可変領域対および重鎖可変領域対の組み合わせ中に、２つの軽鎖可変領域および２つの重鎖可変領域を含む抗体または免疫学的に機能する断片であってもよい。
【０１０３】
［００１２８］提供するいくつかの抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基のみで、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０、ＶＨ１１、およびＶＨ１２より選択される重鎖可変ドメインの配列と異なるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメインを含み、ここでこうした配列相違は各々、独立に、１つのアミノ酸の欠失、挿入または置換のいずれかである。いくつかの抗体において、重鎖可変領域は、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０、ＶＨ１１、およびＶＨ１２の重鎖可変領域のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０４】
［００１２９］特定の抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基のみで、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、およびＶＬ１２より選択される軽鎖可変ドメインの配列と異なるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインを含み、ここでこうした配列相違は各々、独立に、１つのアミノ酸の欠失、挿入または置換のいずれかである。いくつかの抗体において、軽鎖可変領域は、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、およびＶＬ１２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
［００１３０］さらに他の抗原結合性タンパク質、例えば抗体または免疫学的に機能する断片には、ちょうど記載した、変異体重鎖および変異体軽鎖の変異体型が含まれる。
２．ＣＤＲ
［００１３１］伝統的な抗体において、ＣＤＲは、重鎖および軽鎖可変領域中のフレームワーク内に包埋されており、ここでＣＤＲは抗原結合および認識に関与する領域を構成する。同じ種の免疫グロブリン鎖の可変ドメインは、一般的に、類似の全体構造を示し、超可変領域、よりしばしば「相補性決定領域」またはＣＤＲと呼ばれる領域によって連結される、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。可変領域は、少なくとも３つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む。上述の重鎖／軽鎖各対の２つの鎖由来のＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって並列されて、ターゲットタンパク質（例えばＧＭ−ＣＳＦ）上の特定のエピトープと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端まで、天然存在軽鎖および重鎖可変領域は、どちらも、典型的には、これらの要素を以下の順序に合わせる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。これらのドメイン各々において位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるため、番号付け系が考案されてきている。この系を用いて、所定の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）を同定してもよい。この番号付け系は、Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest,  第５版，  US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication No. 91-3242, 1991、またはChothiaおよびLesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothiaら, 1989, Nature 342:878-883に定義されている。本明細書に提供するＣＤＲは、伝統的な抗体構造の抗原結合性ドメインを定義するのに用いてもよいだけでなく、本明細書に記載するように、多様な他のポリペプチド構造中に包埋してもよい。
【０１０６】
［００１３２］本明細書に開示する抗原結合性タンパク質は、１以上のＣＤＲが移植され、挿入され、そして／または連結されているポリペプチドである。抗原結合性タンパク質は、１、２、３、４、５または６のＣＤＲを有してもよい。しかし、抗原結合性タンパク質が６より多いＣＤＲを有してもよいこともまた意図される。したがって、抗原結合性タンパク質は、例えば、１つの重鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）、および／または１つの重鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）、および／または１つの重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）、および／または１つの軽鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＬ２」）、および／または軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）を有してもよい。いくつかの抗原結合性タンパク質には、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３両方が含まれる。本明細書に開示する特定の抗原結合性タンパク質は、表２（ＣＤＲＨ）および表３（ＣＤＲＬ）に提示する１以上のＣＤＲのアミノ酸配列に同一であるか、または実質的な配列同一性を有する、１以上のアミノ酸配列を含む。
【０１０７】
表２
例示的なＣＤＲＨ配列
【０１０８】
【表２】
2010538676.tif 000006
【０１０９】
表３
例示的なＣＤＲＬ配列
【０１１０】
【表３】
2010538676.tif 000007
【０１１１】
［００１３３］１つの側面において、本明細書に開示するＣＤＲには、関連するモノクローナル抗体の群に由来するコンセンサス配列が含まれる。本明細書において、「コンセンサス配列」は、所定のアミノ酸配列内で多様である、いくつかの配列および可変アミノ酸の間で共通の保存されるアミノ酸を有するアミノ酸配列を指す。提供するＣＤＲコンセンサス配列には、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の各々に対応するＣＤＲが含まれる。
【０１１２】
［００１３４］抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体のＶＨおよびＶＬに対応するＣＤＲの標準的系統学的分析を用いて、コンセンサス配列を決定した。ＶＨまたはＶＬに対応する同じ配列内で隣接するＣＤＲを維持することによって、コンセンサス配列を決定した。
【０１１３】
［００１３５］ＣＤＲＨ１コンセンサス配列には、Ｘ１Ｘ２ＧＸ３Ｘ４ＦＸ５Ｘ６ＹＸ７Ｘ８Ｘ９（配列番号９４）、式中、Ｘ１はＧおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ２はＧおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ３はＹおよびＦからなる群より選択され、Ｘ４はＴおよびＳからなる群より選択され、Ｘ５はＴ、ＳおよびＧからなる群より選択され、Ｘ６はＧおよびＳからなる群より選択され、Ｘ７はＹおよびＧからなる群より選択され、Ｘ８はＩおよびＭからなる群より選択され、そしてＸ９はＨおよびＳからなる群より選択される、からなるアミノ酸配列が含まれる。１つの側面において、ＣＤＲＨ１コンセンサスは、配列番号９４、Ｘ１Ｘ２ＧＸ３Ｘ４ＸＦＸ５Ｘ６ＹＸ７Ｘ８Ｘ９、式中、Ｘ１はＧおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ２はＧおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ３はＹおよびＦからなる群より選択され、Ｘ４はＴおよびＳからなる群より選択され、Ｘ５はＴ、ＳおよびＧからなる群より選択され、Ｘ６はＧおよびＳからなる群より選択され、Ｘ７はＹおよびＧからなる群より選択され、Ｘ８はＩおよびＭからなる群より選択され、そしてＸ９はＨおよびＳからなる群より選択される、である。
【０１１４】
［００１３６］ＣＤＲＨ２コンセンサス配列には、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＧＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｇ（配列番号１０６）、式中、Ｘ１はＷおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ２はＩおよびＹからなる群より選択され、Ｘ３はＮ、ＳおよびＩからなる群より選択され、Ｘ４はＰ、ＡおよびＹからなる群より選択され、Ｘ５はＮおよびＹからなる群より選択され、Ｘ６はＳおよびＮからなる群より選択され、Ｘ７はＧおよびＮからなる群より選択され、Ｘ８はＴおよびＲからなる群より選択され、Ｘ９はＮおよびＤからなる群より選択され、Ｘ１０はＹおよびＳからなる群より選択され、Ｘ１１はＡおよびＮからなる群より選択され、Ｘ１２はＱおよびＲからなる群より選択され、Ｘ１３はＫおよびＲからなる群より選択され、Ｘ１４はＦおよびＬからなる群より選択され、そしてＸ１５はＱ、ＫおよびＲからなる群より選択される、からなるアミノ酸配列が含まれる。１つの側面において、ＣＤＲＨ２コンセンサス配列は、ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＸ１ＡＸ２Ｘ３ＦＸ４Ｇ、式中、Ｘ１はＹまたはＳであり、Ｘ２はＱまたはＲであり、Ｘ３はＫまたはＲであり、そしてＸ４はＲ、ＫまたはＱである、である（配列番号２８）。
【０１１５】
［００１３７］ＣＤＲＨ３コンセンサス配列には、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＦＤＸ９（配列番号８３）、式中、Ｘ１はＥおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ２はＧおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ３はＰ、ＤおよびＧからなる群より選択され、Ｘ４はＹ、Ｗ、ＲおよびＫからなる群より選択され、Ｘ５はＳ、Ｗ、Ｆ、およびＴからなる群より選択され、Ｘ６はＹおよびＬからなる群より選択され、Ｘ７はＤおよびＧからなる群より選択され、Ｘ８はＹ、アミノ酸なし、およびＡからなる群より選択され、そしてＸ９はＭ、Ｔ、およびＶからなる群より選択される、からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれる。
【０１１６】
［００１３８］ＣＤＲＬ１コンセンサス配列には、ＫＳＳＱＳＸ１ＬＹＳＳＸ２ＮＸ３ＮＸ４ＬＸ５（配列番号１０７）、式中、Ｘ１はＶおよびＩからなる群より選択され、Ｘ２はＳおよびＮからなる群より選択され、Ｘ３はＥおよびＫからなる群より選択され、Ｘ４はＹおよびＦからなる群より選択され、そしてＸ５はＴおよびＡからなる群より選択される；ＲＡＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＸ７Ｘ８（配列番号１１８）、式中、Ｘ１はＱおよびＰからなる群より選択され、Ｘ２はＳおよびＹからなる群より選択され、Ｘ３はＶ、ＬおよびＩからなる群より選択され、Ｘ４はＳおよびＣからなる群より選択され、Ｘ５はＳおよびＮからなる群より選択され、Ｘ６はＳ、Ｉ、Ｔおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ７はＦおよびＬからなる群より選択され、そしてＸ８はＡおよびＮからなる群より選択される；ならびにＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＮＸ１１ＶＸ１２（配列番号１２５）、式中、Ｘ１はＩ、ＳおよびＴからなる群より選択され、Ｘ２はＲおよびＧからなる群より選択され、Ｘ３はＴおよびＳからなる群より選択され、Ｘ４はＲおよびＳからなる群より選択され、Ｘ５はＧおよびＳからなる群より選択され、Ｘ６はＳ、ＨおよびＤからなる群より選択され、Ｘ７はＩおよびＶからなる群より選択され、Ｘ８はＡおよびＧからなる群より選択され、Ｘ９はアミノ酸なしおよびＧからなる群より選択され、Ｘ１０はＳおよびＹからなる群より選択され、Ｘ１１はＹおよびＴからなる群より選択され、そしてＸ１２はＱ、ＮおよびＳからなる群より選択される、からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれる。１つの側面において、ＣＤＲＬ１コンセンサス配列は、ＲＡＳＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＹＸ６Ａ、式中Ｘ１はｓまたはｙであり、Ｘ２はＶ、ＩまたはＬであり、Ｘ３はＳまたはＮであり、Ｘ４はＳまたはＣであり、Ｘ４はＳ、Ｔ、ＳまたはＹであり、Ｘ５はＦまたはＬである、である（配列番号３０）。
【０１１７】
［００１３９］ＣＤＲＬ２コンセンサス配列には、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１３０）、式中、Ｘ１はＧ、ＴおよびＷからなる群より選択され、Ｘ２はＴおよびＡからなる群より選択され、Ｘ３はＳおよびＡからなる群より選択され、Ｘ４はＳおよびＴからなる群より選択され、Ｘ５はＲおよびＬからなる群より選択され、Ｘ６はＡ、ＥおよびＱからなる群より選択され、そしてＸ７はＴおよびＳからなる群より選択される；ならびにＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＲＰＳ（配列番号１３１）、式中、Ｘ１はＥおよびＳからなる群より選択され、Ｘ２はＤ、ＶおよびＮからなる群より選択され、Ｘ３はＤ、ＳおよびＮからなる群より選択され、そしてＸ４はＱ、ＧおよびＨからなる群より選択される、からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれる。１つの側面内で、ＣＤＲＬ２コンセンサス配列は、ＧＸ１ＳＳＲＡＴ、式中、Ｘ１はａまたはＴである、である（配列番号３４）。
【０１１８】
［００１４０］ＣＤＲＬ３コンセンサス配列には、Ｘ１ＱＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｔ（配列番号８４）、式中、Ｘ１はＱおよびＬからなる群より選択され、Ｘ２はＹおよびｓからなる群より選択され、Ｘ３はＤ、ＧおよびＦからなる群より選択され、Ｘ４はＲ、Ｔ、およびＳからなる群より選択され、Ｘ５はＳおよびＶからなる群より選択され、Ｘ６はＦおよびＰからなる群より選択され、そしてＸ７はＲおよびＷからなる群より選択される；ならびにＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＤＳＳＮＸ５Ｘ６Ｘ７（配列番号８９）、式中、Ｘ１はＳおよびＡからなる群より選択され、Ｘ２はＳおよびＡからなる群より選択され、Ｘ３はＷおよびＦからなる群より選択され、Ｘ４はＤおよびＴからなる群より選択され、Ｘ５はＧ、Ｗ、およびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ６はＶ、Ｌ、およびＰからなる群より選択され、そしてＸ６はＶおよびアミノ酸なしからなる群より選択される、からなる群より選択されるアミノ酸配列が含まれる。１つの側面内で、ＣＤＲＬ３コンセンサス配列は、ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｔ、式中、Ｘ１はＹまたはＳであり、Ｘ２はＦ、ＧまたはＡであり、Ｘ３はＳ、ＴまたはＷであり、Ｘ４はＶ、Ｓ、Ｆであり、Ｘ５はＦまたはＰであり、Ｘ６はＲ、Ｗ，またはＩである、である（配列番号４６）。
【０１１９】
［００１４１］別の側面において、提供するＣＤＲは、（ａ）（ｉ）配列番号１０、２２、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号１１、２３、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｖ）５、４、３、２、または１アミノ酸以下の、アミノ酸置換、欠失または挿入の１以上を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨ；からなる群より選択されるＣＤＲＨ；（Ｂ）（ｉ）配列番号４、１６、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号６、１８、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３；ならびに（ｉｖ）５、４、３、２、または１アミノ酸以下の、アミノ酸置換、欠失または挿入の１以上を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬ；からなる群より選択されるＣＤＲＬである。
【０１２０】
［００１４２］さらに別の側面において、表２および３に列挙するＣＤＲの変異体型は、表２および３に列挙するＣＤＲ配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する。
【０１２１】
［００１４３］１つの側面にしたがって、ＧＭ−ＣＳＦに結合する単離抗原結合性タンパク質であって、（Ａ）１以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）であって：（ｉ）配列番号１０、２２、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号１１、２３、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；（ｉｉｉ）配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３；ならびに（ｉｖ）５、４、３、２または１アミノ酸以下の、アミノ酸置換、欠失または挿入の１以上を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨ；からなる群より選択される前記ＣＤＲＨ；（Ｂ）１以上の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）であって：（ｉ）配列番号４、１６、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号６、１８、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３；ならびに（ｉｖ）５、４、３、２または１アミノ酸以下の、アミノ酸置換、欠失または挿入の１以上を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬ；からなる群より選択される前記ＣＤＲＬ；あるいは（Ｃ）（Ａ）の１以上の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１以上の軽鎖ＣＤＲＬを含む、前記単離抗原結合性タンパク質を提供する。
【０１２２】
［００１４４］さらに別の態様において、単離抗原結合性タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号１０、２２、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）配列番号１１、２３、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；ならびに（ｉｉｉ）配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３；からなる群より選択されるＣＤＲＨ；（Ｂ）（ｉ）配列番号４、１６、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；（ｉｉｉ）配列番号６、１８、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３；からなる群より選択されるＣＤＲＬ；あるいは（Ｃ）（Ａ）の１以上の重鎖ＣＤＲＨおよび（Ｂ）の１以上の軽鎖ＣＤＲＬを含んでもよい。
【０１２３】
［００１４５］別の態様において、可変重鎖（ＶＨ）は、配列番号９、２１、３３、４５、５７、６９、８１、９３、１０５、１１７、１２９、および１４１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、そして／または可変軽鎖（ＶＬ）は、配列番号３、１５、２７、３９、５１、６３、７５、８７、９９、１１１、１２３、および１３５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する。
【０１２４】
［００１４６］さらなる側面において、ＧＭ−ＣＳＦに結合する単離抗原結合性タンパク質であって、Ａ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）であって、（ｉ）配列番号１２、２４、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３；（ｉｉ）２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失または置換によって、（ｉ）のＣＤＲＨ３とはアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ３；（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＦＤＸ９（配列番号８３）、式中、Ｘ１はＥおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ２はＧおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ３はＰ、ＤおよびＧからなる群より選択され、Ｘ４はＹ、Ｗ、ＲおよびＫからなる群より選択され、Ｘ５はＳ、Ｗ、Ｆ、およびＴからなる群より選択され、Ｘ６はＹおよびＬからなる群より選択され、Ｘ７はＤおよびＧからなる群より選択され、Ｘ８はＹ、アミノ酸なし、およびＡからなる群より選択され、そしてＸ９はＭ、Ｔ、およびＶからなる群より選択される、からなる群より選択されるＣＤＲＨ３アミノ酸配列；からなる群より選択される、前記ＣＤＲＨ；ならびに／あるいはＢ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）であって、（ｉ）配列番号６、１８、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３、（ｉｉ）２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失または置換によって、（ｉ）のＣＤＲＬ３とはアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ３；ならびにｉｉｉ）Ｘ１ＱＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｔ（配列番号８４）、式中、Ｘ１はＱおよびＬからなる群より選択され、Ｘ２はＹおよびＳからなる群より選択され、Ｘ３はＤ、ＧおよびＦからなる群より選択され、Ｘ４はＲ、Ｔ、およびＳからなる群より選択され、Ｘ５はＳおよびＶからなる群より選択され、Ｘ６はＦおよびＰからなる群より選択され、そしてＸ７はＲおよびＷからなる群より選択される；ならびにＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＤＳＳＮＸ５Ｘ６Ｘ７（配列番号８９）、式中、Ｘ１はＳおよびＡからなる群より選択され、Ｘ２はＳおよびＡからなる群より選択され、Ｘ３はＷおよびＦからなる群より選択され、Ｘ４はＤおよびＴからなる群より選択され、Ｘ５はＧ、Ｗ、およびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ６はＶ、Ｌ、およびＰからなる群より選択され、そしてＸ６はＶおよびアミノ酸なしからなる群より選択される、からなる群より選択されるＣＤＲＬ３アミノ酸配列；からなる群より選択される前記ＣＤＲＬを含む、前記単離抗原結合性タンパク質を提供する。
【０１２５】
［００１４７］別の態様内で、抗原結合性タンパク質は：Ａ）：（ｉ）配列番号１０、２２、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；（ｉｉ）２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失または置換によって、（ｉ）のＣＤＲＨ１とはアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ１；（ｉｉｉ）Ｘ１Ｘ２ＧＸ３Ｘ４ＸＦＸ５Ｘ６ＹＸ７Ｘ８Ｘ９（配列番号９４）、式中、Ｘ１はＧおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ２はＧおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ３はＹおよびＦからなる群より選択され、Ｘ４はＴおよびＳからなる群より選択され、Ｘ５はＴ、ＳおよびＧからなる群より選択され、Ｘ６はＧおよびＳからなる群より選択され、Ｘ７はＹおよびＧからなる群より選択され、Ｘ８はＩおよびＭからなる群より選択され、そしてＸ９はＨおよびＳからなる群より選択される、からなる群より選択されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列、または（ｉｖ）配列番号１１、２３、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；（ｖ）２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失または置換によって、（ｉｖ）のＣＤＲＨ２とはアミノ酸配列が異なるＣＤＲＨ２；または（ｖｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＧＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｇ（配列番号１０６）、式中、Ｘ１はＷおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ２はＩおよびＹからなる群より選択され、Ｘ３はＮ、ＳおよびＩからなる群より選択され、Ｘ４はＰ、ＡおよびＹからなる群より選択され、Ｘ５はＮおよびＹからなる群より選択され、Ｘ６はＳおよびＮからなる群より選択され、Ｘ７はＧおよびＮからなる群より選択され、Ｘ８はＴおよびＲからなる群より選択され、Ｘ９はＮおよびＤからなる群より選択され、Ｘ１０はＹおよびＳからなる群より選択され、Ｘ１１はＡおよびＮからなる群より選択され、Ｘ１２はＱおよびＲからなる群より選択され、Ｘ１３はＫおよびＲからなる群より選択され、Ｘ１４はＦおよびＬからなる群より選択され、そしてＸ１５はＱ、ＫおよびＲからなる群より選択される、からなるＣＤＲＨ２アミノ酸配列；からなる群より選択されるＣＤＲＨ；あるいはＢ）：（ｉ）配列番号４、１６、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；（ｉｉ）２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失または置換によって、（ｉ）のＣＤＲＬ１とはアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ１；（ｉｉｉ）ＫＳＳＱＳＸ１ＸＬＹＳＳＸ２ＮＸ３ＮＸ４ＬＸ５（配列番号１０７）、式中、Ｘ１はＶおよびＩからなる群より選択され、Ｘ２はＳおよびＮからなる群より選択され、Ｘ３はＥおよびＫからなる群より選択され、Ｘ４はＹおよびＦからなる群より選択され、そしてＸ５はＴおよびＡからなる群より選択される；ＲＡＳＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＸ７Ｘ８（配列番号１１８）、式中、Ｘ１はＱおよびＰからなる群より選択され、Ｘ２はＳおよびＹからなる群より選択され、Ｘ３はＶ、ＬおよびＩからなる群より選択され、Ｘ４はＳおよびＣからなる群より選択され、Ｘ５はＳおよびＮからなる群より選択され、Ｘ６はＳ、Ｉ、Ｔおよびアミノ酸なしからなる群より選択され、Ｘ７はＦおよびＬからなる群より選択され、そしてＸ８はＡおよびＮからなる群より選択される；またはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＮＸ１１ＶＸ１２（配列番号１２５）、式中、Ｘ１はＩ、ＳおよびＴからなる群より選択され、Ｘ２はＲおよびＧからなる群より選択され、Ｘ３はＴおよびＳからなる群より選択され、Ｘ４はＲおよびＳからなる群より選択され、Ｘ５はＧおよびＳからなる群より選択され、Ｘ６はＳ、ＨおよびＤからなる群より選択され、Ｘ７はＩおよびＶからなる群より選択され、Ｘ８はＡおよびＧからなる群より選択され、Ｘ９はアミノ酸なしおよびＧからなる群より選択され、Ｘ１０はＳおよびＹからなる群より選択され、Ｘ１１はＹおよびＴからなる群より選択され、そしてＸ１２はＱ、ＮおよびＳからなる群より選択される、からなる群より選択されるＣＤＲＬ１アミノ酸配列；あるいは（ｉｖ）配列番号５、１７、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；（ｖ）２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失または置換によって、（ｉｖ）のＣＤＲＬ２とはアミノ酸配列が異なるＣＤＲＬ２；あるいは（ｖｉ）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１３０）、式中、Ｘ１はＧ、ＴおよびＷからなる群より選択され、Ｘ２はＴおよびＡからなる群より選択され、Ｘ３はＳおよびＡからなる群より選択され、Ｘ４はＳおよびＴからなる群より選択され、Ｘ５はＲおよびＬからなる群より選択され、Ｘ６はＡ、ＥおよびＱからなる群より選択され、そしてＸ７はＴおよびＳからなる群より選択される；またはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＲＰＳ（配列番号１３１）、式中、Ｘ１はＥおよびＳからなる群より選択され、Ｘ２はＤ、ＶおよびＮからなる群より選択され、Ｘ３はＤ、ＳおよびＮからなる群より選択され、そしてＸ４はＱ、ＧおよびＨからなる群より選択される、からなる群より選択されるＣＤＲＬ２アミノ酸配列；からなる群より選択されるＣＤＲＬをさらに含む。
【０１２６】
［００１４８］１つの側面において、本明細書に提供する単離抗原結合性タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、またはその抗体断片であってもよい。
【０１２７】
［００１４９］別の態様において、本明細書に提供する単離抗原結合性タンパク質の抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ディアボディ、または一本鎖抗体分子であってもよい。
【０１２８】
［００１５０］さらなる態様において、本明細書に提供する単離抗原結合性タンパク質はヒト抗体であり、そしてＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型またはＩｇＧ４型であってもよい。
【０１２９】
［００１５１］さらに別の側面において、本明細書に提供する単離抗原結合性タンパク質は、標識基とカップリングしていてもよく、そしてヒトＧＭ−ＣＳＦの細胞外部分への結合に関して、本明細書に提供する単離抗原結合性タンパク質の１つの抗原結合性タンパク質と競合してもよい。１つの態様において、本明細書に提供する単離抗原結合性タンパク質は、患者に投与した際、単球走化性を減少させるか、腫瘍内への単球遊走を阻害するか、または腫瘍中の腫瘍関連マクロファージの集積を阻害しうる。
【０１３０】
［００１５２］当業者に認識されるであろうように、示す配列由来の１より多いＣＤＲを含む任意の抗原結合性タンパク質に関して、示す配列から独立に選択されるＣＤＲの任意の組み合わせが有用である。したがって、独立に選択されるＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つを含む抗原結合性タンパク質を生成してもよい。しかし、当業者に認識されるであろうように、特定の態様は、一般的に、反復しないＣＤＲの組み合わせを利用し、例えば抗原結合性タンパク質は、一般的に、２つのＣＤＲＨ２領域を用いては作製されないなどである。
【０１３１】
［００１５３］提供する抗原結合性タンパク質のいくつかを以下により詳細に論じる。
抗原結合性タンパク質および結合エピトープ
［００１５４］抗原結合性タンパク質が、明記する残基内のエピトープ、例えばＧＭ−ＣＳＦ、または例えば、ＧＭ−ＣＳＦの細胞外ドメインに結合すると言われる場合、抗原結合性タンパク質が、明記する残基（例えばＧＭ−ＣＳＦの明記するセグメント）からなるポリペプチドに特異的に結合することを意味する。こうした抗原結合性タンパク質は、典型的には、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＧＭ−ＣＳＦの細胞外ドメイン内のすべての残基とは接触しない。また、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＧＭ−ＣＳＦの細胞外ドメイン内のすべての単一のアミノ酸置換または欠失が、結合アフィニティに必ずしも有意に影響を及ぼすわけではない。抗原結合性タンパク質のエピトープ特異性は、多様な方法で決定可能である。１つのアプローチは、例えば、抗原の配列に渡り、そして少数のアミノ酸（例えば３アミノ酸）の増分で異なる、約１５アミノ酸の重複ペプチドのコレクションを試験する工程を伴う。ペプチドをマイクロタイタープレートのウェル内に固定する。ペプチドの一端をビオチン化することによって、固定を達成してもよい。場合によって、同じペプチドの異なる試料を、アミノ末端およびカルボキシ末端でビオチン化して、そして比較の目的のため、別個のウェル中に固定してもよい。これは、末端特異的抗原結合性タンパク質を同定するのに有用である。場合によって、関心対象の特定のアミノ酸を末端とする、さらなるペプチドが含まれてもよい。このアプローチは、ＧＭ−ＣＳＦ（またはＧＭ−ＣＳＦの細胞外ドメイン）の内部断片に対する末端特異的抗原結合性タンパク質を同定するのに有用である。多様なペプチド各々への特異的結合に関して、抗原結合性タンパク質または免疫学的に機能する断片をスクリーニングする。抗原結合性タンパク質が特異的結合を示すすべてのペプチドに共通のアミノ酸のセグメントとともに存在するものとして、エピトープを定義する。エピトープを定義するための特定のアプローチに関する詳細を実施例１３に示す。
【０１３２】
競合的抗原結合性タンパク質
［００１５５］別の側面において、ＧＭ−ＣＳＦへの特異的結合に関して、例示する抗体または機能性断片の１つの、上述のエピトープに対する結合に競合する抗原結合性タンパク質を提供する。こうした抗原結合性タンパク質はまた、本明細書に例示する抗原結合性タンパク質の１つと同じエピトープまたは重複するエピトープにも結合可能である。例示する抗原結合性タンパク質と同じエピトープと競合するか、または該エピトープに結合する抗原結合性タンパク質および断片は、類似の機能特性を示すと予期される。例示する抗原結合性タンパク質および断片には、上述のものが含まれ、表１、２、および３に含まれる重鎖および軽鎖、可変領域ドメインならびにＣＤＲを持つものが含まれる。
【０１３３】
１．モノクローナル抗体
［００１５６］提供する抗原結合性タンパク質には、ＧＭ−ＣＳＦに結合するモノクローナル抗体が含まれる。当該技術分野に知られる技術いずれかを用いて、例えば、免疫スケジュールの完了後に、トランスジェニック動物から採取した脾臓細胞を不死化することによって、モノクローナル抗体を産生してもよい。当該技術分野に知られる任意の技術を用いて、例えば、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを産生することによって、脾臓細胞を不死化してもよい。ハイブリドーマを産生する融合法で使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、そして所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地中で増殖することが不可能であるようにする酵素不全を有する。マウス融合体で使用するのに適した細胞株の例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ  ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ  １．７およびＳ１９４／５ＸＸＯ  Ｂｕｌが含まれ；ラット融合体で使用する細胞株の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ  １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が含まれる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。
【０１３４】
［００１５７］いくつかの例において、動物（例えばヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）をＧＭ−ＣＳＦ免疫原で免疫し；免疫動物から脾臓細胞を採取し；採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株と融合させ、それによってハイブリドーマ細胞を生成し；ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、そしてＧＭ−ＣＳＦポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することによって、ハイブリドーマ細胞株を産生する。こうしたハイブリドーマ細胞株、およびこれらに産生される抗ＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体が、本出願の側面である。
【０１３５】
［００１５８］当該技術分野に知られるいかなる技術を用いて、ハイブリドーマ細胞株によって分泌されるモノクローナル抗体を精製してもよい。ハイブリドーマまたはｍＡｂをさらにスクリーニングして、Ｗｎｔが誘導する活性を遮断する能力などの、特定の特性を持つｍＡｂを同定してもよい。こうしたスクリーニングの例を以下の実施例に提供する。
【０１３６】
２．キメラ抗体およびヒト化抗体
［００１５９］前述の配列に基づくキメラ抗体およびヒト化抗体もまた提供する。療法剤として使用するためのモノクローナル抗体を、使用前に多様な方式で修飾してもよい。１つの例はキメラ抗体であり、機能する免疫グロブリン軽鎖または重鎖あるいは免疫学的に機能するその部分を産生するように共有結合された、異なる抗体由来のタンパク質セグメントで構成される抗体である。一般的に、重鎖および／または軽鎖の部分は、特定の種に由来するか、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列に同一または相同である一方、鎖（単数または複数）の残りは、別の種に由来するか、あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列に同一または相同である。キメラ抗体に関連する方法に関しては、例えば米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrisonら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855を参照されたい。ＣＤＲ移植は例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，６９３，７６１号、第５，５８５，０８９号、および第５，５３０，１０１号に記載される。
【０１３７】
［００１６０］一般的に、キメラ抗体を作製する目的は、意図される患者種由来のアミノ酸の数が最大であるキメラを生成することである。１つの例が「ＣＤＲ移植」抗体であり、ここで、抗体は、特定の種に由来するか、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む一方、抗体鎖（単数または複数）の残りは、別の種に由来するか、あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列に同一または相同である。ヒトで使用するため、しばしば、げっ歯類抗体由来の可変領域または選択されたＣＤＲをヒト抗体内に移植し、ヒト抗体の天然存在可変領域またはＣＤＲと交換する。
【０１３８】
［００１６１］キメラ抗体の１つの有用なタイプは、「ヒト化」抗体である。一般的に、ヒト化抗体は、最初に非ヒト動物で作製されたモノクローナル抗体から産生される。このモノクローナル抗体中の、典型的には抗体の非抗原認識部分に由来する特定のアミノ酸残基を、対応するアイソタイプのヒト抗体中の対応する残基に相同であるように修飾する。例えば、多様な方法を用いて、ヒト抗体の対応する領域に関して、げっ歯類可変領域の少なくとも部分を置換することによって、ヒト化を実行してもよい（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、および第５，６９３，７６２号；  Jonesら, 1986, Nature 321:522-525; Riechmannら, 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyenら, 1988, Science 239:1534-1536を参照されたい）。
【０１３９】
［００１６２］１つの側面において、本明細書に提供する抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲ（表２を参照されたい）を、同じまたは異なる系統学的種に由来する抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ）に移植する。例えば、重鎖および軽鎖可変領域ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０、ＶＨ１１、およびＶＨ１２、ならびに／あるいはＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９、ＶＬ１０、ＶＬ１１、およびＶＬ１２のＣＤＲをコンセンサス・ヒトＦＲに移植してもよい。コンセンサス・ヒトＦＲを生成するため、いくつかのヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列由来のＦＲを並列させて、コンセンサス・アミノ酸配列を同定してもよい。他の態様において、本明細書に開示する重鎖または軽鎖のＦＲを、異なる重鎖または軽鎖由来のＦＲで置き換える。１つの側面において、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の重鎖および軽鎖のＦＲ中の稀なアミノ酸は置き換えられない一方、残りのＦＲアミノ酸を置き換える。「稀なアミノ酸」は、この特定のアミノ酸が通常はＦＲでは見られない位にある特定のアミノ酸である。あるいは、１つの重鎖または軽鎖由来の移植可変領域を、本明細書に開示するような特定の重鎖または軽鎖の定常領域とは異なる定常領域とともに用いてもよい。他の態様において、移植される可変領域は、一本鎖Ｆｖ抗体の一部である。
【０１４０】
［００１６３］特定の態様において、ヒト以外の種由来の定常領域をヒト可変領域（単数または複数）と一緒に用いて、ハイブリッド抗体を産生してもよい。
３．完全ヒト抗体
［００１６４］完全ヒト抗体もまた提供する。ヒトを抗原に曝露することなく、所定の抗原に特異的な完全ヒト抗体を作製するための方法が利用可能である（「完全ヒト抗体」）。完全ヒト抗体の産生を実行するために提供される１つの特定の手段は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されているマウス内にヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を導入することが、任意の所望の抗原で免疫可能な動物であるマウスにおいて、完全ヒト・モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生する１つの手段である。完全ヒト抗体を用いると、療法剤としてヒトにマウスまたはマウス誘導体化ｍＡｂを投与することによって、ときに引き起こされうる免疫原性およびアレルギー性反応が最小限になりうる。
【０１４１】
［００１６５］内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（通常はマウス）を免疫することによって、完全ヒト抗体を産生してもよい。この目的のための抗原は、典型的には、６以上の隣接アミノ酸を有し、そして場合によってキャリアー、例えばハプテンとコンジュゲート化される。例えば、Jakobovitsら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovitsら, 1993, Nature 362:255-258;およびBruggermannら, 1993, Year in Immunol. 7:33を参照されたい。こうした方法の１つの例において、マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無能力化し、そしてマウスゲノム内に、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含有するヒトゲノムＤＮＡの巨大断片を挿入することによって、トランスジェニック動物を産生する。次いで、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全補完物未満を有する、部分的に修飾された動物を交差育種して、すべての所望の免疫系修飾を有する動物を得る。免疫原を投与した際、これらのトランスジェニック動物は、免疫原に免疫特異的であるが、可変領域を含めてネズミアミノ酸配列ではなくヒト配列を有する抗体を産生する。こうした方法のさらなる詳細に関しては、例えば、ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９４／０２６０２を参照されたい。ヒト抗体を作製するためのトランスジェニックマウスに関するさらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号：第６，７１３，６１０号；第６，６７３，９８６号；第６，１６２，９６３号；第５，５４５，８０７号；第６，３００，１２９号；第６，２５５，４５８号；第５，８７７，３９７号；第５，８７４，２９９号および第５，５４５，８０６号；  ＰＣＲ公報ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９０／０４０３６、ならびにＥＰ  ５４６０７３Ｂ１およびＥＰ  ５４６０７３Ａ１に記載される。
【０１４２】
［００１６６］上述のトランスジェニックマウスは、本明細書において、「ＨｕＭａｂ」マウスと称され、内因性［ミュー］および［カッパ］鎖遺伝子座を不活性化させるターゲティング突然変異とともに、再配置されていないヒト重鎖（［ミュー］および［ガンマ］）および［カッパ］軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含有する（Ｌｏｎｂｅｒｇら，  １９９４，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたは［カッパ］の発現減少を示し、そして免疫に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチングおよび体細胞突然変異を経て、高アフィニティ・ヒトＩｇＧ［カッパ］モノクローナル抗体を生成する（Lonbergら、上記; LonbergおよびHuszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; HardingおよびLonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546）。ＨｕＭａｂマウスの調製は、Taylorら, 1992, Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chenら, 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillonら, 1994, J. Immunol. 152:2912-2920; Lonbergら, 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylorら, 1994, International Immunology 6:579-591; LonbergおよびHuszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; HardingおよびLonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546; Fishwildら, 1996, Nature Biotechnology 14:845-85に詳細に記載される。米国特許第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，７８９，６５０号；第５，８７７，３９７号；第５，６６１，０１６号；第５，８１４，３１８号；第５，８７４，２９９号；および第５，７７０，４２９号；ならびに米国特許第５，５４５，８０７号；  ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９３／１２２７号；第ＷＯ  ９２／２２６４６号；および第ＷＯ  ９２／０３９１８号をさらに参照されたい。これらのトランスジェニックマウスにおいて、ヒト抗体を産生するのに利用される技術はまた、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９８／２４８９３号、およびMendezら, 1997, Nature Genetics 15:146-156にも開示される。例えば、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２トランスジェニックマウス系統を用いて、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体を生成してもよい。
【０１４３】
［００１６７］ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を持つ抗原特異的ヒトｍＡｂを産生し、そして上述のようなトランスジェニックマウスから選択してもよい。こうした抗体をクローニングし、そして適切なベクターおよび宿主細胞を用いて発現させてもよいし、または培養ハイブリドーマ細胞から抗体を採取してもよい。
【０１４４】
［００１６８］完全ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーに由来してもよい（Hoogenboomら, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; およびMarksら, 1991, J. Mol. Biol. 222:581に開示されるとおり）。ファージディスプレイ技術は、糸状バクテリオファージの表面上に抗体レパートリーをディスプレイさせ、そして続いて、選択した抗原への結合によってファージを選択することによって、免疫選択を模倣する。１つのこうした技術が、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９９／１０４９４号に記載され、該公報は、こうしたアプローチを用いた、ＭＰＬまたはｍｓｋ受容体に関する高アフィニティおよび機能性アゴニスト抗体の単離を記載する。
【０１４５】
４．二重特異性または二重機能性抗原結合性タンパク質
［００１６９］提供する抗原結合性タンパク質にはまた、上述のような１以上のＣＤＲまたは１以上の可変領域を含む、二重特異性および二重機能性抗体も含まれる。いくつかの場合、二重特異性または二重機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工的ハイブリッド抗体である。限定されるわけではないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む、多様な方法によって、二重特異性抗体を産生してもよい。例えば、SongsivilaiおよびLachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelnyら, 1992, J. Immunol. 148:1547-1553を参照されたい。
【０１４６】
５．多様な他の型
［００１７０］提供する抗原結合性タンパク質のいくつかは、上に開示する抗原結合性タンパク質（例えば表１〜４に列挙する配列を有するもの）の変異体型である。例えば、いくつかの抗原結合性タンパク質は、表１〜４に列挙する重鎖または軽鎖、可変領域あるいはＣＤＲの１以上に、１以上の保存的アミノ酸置換を有する。
【０１４７】
［００１７１］天然存在アミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいて、種類に分けることも可能である：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１４８】
［００１７２］保存的アミノ酸置換は、これらの種類の１つのメンバーと、同じ種類の別のメンバーを交換することを伴ってもよい。保存的アミノ酸置換は、非天然存在アミノ酸残基を含むことも可能であり、これは典型的には、生物学的系における合成よりも、化学的ペプチド合成によって取り込まれる。これらには、ペプチド擬似体、およびアミノ酸部分の他の逆転（reversed）型または反転（inverted）型が含まれる。
【０１４９】
［００１７３］非保存的置換は、上記種類の１つのメンバーと別の種類のメンバーとの交換を伴ってもよい。こうした置換残基を、ヒト抗体と相同である抗体領域内に、または該分子の非相同領域内に導入してもよい。
【０１５０】
［００１７４］こうした変化を作製する際、特定の態様にしたがって、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮してもよい。タンパク質のヒドロパシープロフィールは、各アミノ酸に数値（「ヒドロパシー指数」）を割り当て、そして次いで、これらの値をペプチド鎖に沿って反復して平均することによって計算される。各アミノ酸には、疎水性および電荷特性に基づいて、ヒドロパシー指数が割り当てられている。これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【０１５１】
［００１７５］相互作用性の生物学的機能をタンパク質に与える際に、ヒドロパシープロフィールが重要であることが、当該技術分野において理解されている（例えば、Kyteら, 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131を参照されたい）。類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸を、特定のアミノ酸で置換して、そしてなお類似の生物学的活性が保持されうることが知られる。特定の態様において、ヒドロパシー指数に基づいて変化を作製する際、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。いくつかの側面において、±１以内であるものが含まれ、そして他の側面において、±０．５以内であるものが含まれる。
【０１５２】
［００１７６］当該技術分野において、親水性に基づいて、同様のアミノ酸の置換を有効に行うことが可能であることもまた、理解されており、本発明の場合におけるように、それによって生成された生物学的に機能するタンパク質またはペプチドが免疫学的態様における使用を意図される場合には特に当てはまる。特定の態様において、隣接するアミノ酸の親水性によって決定されるような、タンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性および抗原結合性または免疫原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と相関する。
【０１５３】
［００１７７］以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化を作製する際、特定の態様において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、他の態様において、±１以内であるものが含まれ、そしてさらに他の態様において、±０．５以内であるものが含まれる。いくつかの場合、また、親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを同定してもよい。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」とも称される。
【０１５４】
［００１７８］典型的な保存的アミノ酸置換を以下の表４に示す。
表４
保存的アミノ酸置換
【０１５５】
【表４】
2010538676.tif 000008
【０１５６】
［００１７９］当業者は、周知の技術を用いて、本明細書に示すようなポリペプチドの適切な変異体を決定可能であろう。当業者は、活性に重要でないと考えられる領域をターゲティングすることによって、活性を破壊することなく変化させうる分子の適切な領域を同定可能である。当業者はまた、類似のポリペプチド中に保存される分子の残基および部分も同定可能である。さらなる態様において、生物学的活性にまたは構造に重要でありうる領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、またポリペプチド構造に不都合に影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に供することも可能である。
【０１５７】
［００１８０］さらに、当業者は、類似のポリペプチドにおいて、活性または構造に重要な残基を同定するため、構造−機能研究を再検討してもよい。こうした比較を考慮して、類似のタンパク質において、活性または構造に重要なアミノ酸残基に対応する、タンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測してもよい。当業者は、こうして予測された重要なアミノ酸残基に関して、化学的に類似のアミノ酸置換を選択してもよい。
【０１５８】
［００１８１］当業者はまた、類似のポリペプチド中の構造に関連して、３次元構造およびアミノ酸配列も分析してもよい。こうした情報を考慮して、当業者が、三次元構造に関して、抗体のアミノ酸残基の整列を予測することも可能である。タンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与する可能性もあるため、当業者は、こうした残基に根本的な変化を与えないように、選択することも可能である。さらに、当業者は、所望のアミノ酸残基各々の位で、単一のアミノ酸置換を含有する試験変異体を生成することも可能である。次いで、ＧＭ−ＣＳＦ中和活性に関するアッセイ（以下の実施例を参照されたい）を用いて、これらの変異体をスクリーニングして、こうして、どのアミノ酸を変化させてもよく、そしてどれを変化させてはならないかに関する情報を得ることも可能である。言い換えると、こうしたルーチンの実験から集めた情報に基づいて、当業者は、単独の、または他の突然変異と組み合わせた、さらなる置換を回避すべきであるアミノ酸位を容易に決定可能である。
【０１５９】
［００１８２］いくつかの科学的刊行物が二次構造の予測に当てられてきている。Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chouら, 1974, Biochem. 13:222-245; Chouら, 1974, Biochemistry 113:211-222; Chouら, 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chouら, 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276;およびChouら, 1979, Biophys. J. 26:367-384を参照されたい。さらに、二次構造を予測するのを補助するコンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％を越える配列同一性または４０％を越える類似性を有する、２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造的トポロジーを有する。近年、タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）が大きくなり、ポリペプチドまたはタンパク質構造内でのフォールディングのありうる数を含む、二次構造の予測可能性が増進してきている。Holmら, 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247を参照されたい。所定のポリペプチドまたはタンパク質には、限定される数のフォールディングしかなく、そして決定的な数の構造が解明されたなら、構造予測は劇的により正確になるであろうことが示唆されている（Brennerら, 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376）。
【０１６０】
［００１８３］二次構造を予測するさらなる方法には、「スレッディング（threading）」（Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87; Sipplら, 1996, Structure 4:15-19）、「プロフィール分析」（Bowieら, 1991, Science 253:164-170; Gribskovら, 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskovら, 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358）、および「進化連関（evolutionary linkage）」（Ｈｏｌｍ、１９９０、上記；およびＢｒｅｎｎｅｒ、１９９７、上記を参照されたい）が含まれる。
【０１６１】
［００１８４］いくつかの態様において：（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させ、（２）酸化に対する感受性を減少させ、（３）タンパク質複合体を形成するための結合アフィニティを改変し、（４）リガンドまたは抗原結合アフィニティを改変し、そして／または（４）こうしたポリペプチドに他の物理化学特性または機能特性を与えるかまたはこうした特性を修正するアミノ酸置換が行われる。例えば、単数または多数のアミノ酸置換（特定の態様において、保存的アミノ酸置換）を天然存在配列において行うことも可能である。分子間接触を形成するドメイン（単数または複数）外の抗体部分において置換を行ってもよい。こうした態様において、親配列の構造特徴を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換を用いてもよい（例えば、親または天然抗原結合性タンパク質を特徴付ける二次構造を破壊しない１以上の置換アミノ酸）。当該技術分野に認識されるポリペプチド二次構造および三次構造の例が、Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton監修), 1984，  Ｗ．Ｈ．  ニューヨーク：  Freeman and Company; Introduction to Protein Structure(BrandenおよびTooze監修), 1991，  ニューヨーク：  Garland Publishing ;およびThorntonら, 1991, Nature 354:105に記載される。
【０１６２】
［００１８５］さらなる好ましい抗体変異体には、システイン変異体が含まれ、ここで親または天然アミノ酸配列中の１以上のシステイン残基が、欠失されているか、または別のアミノ酸（例えばセリン）で置換されている。システイン変異体は、抗体が、生物学的活性コンホメーションになるように再フォールディングされなければならない場合に、とりわけ有用である。システイン変異体は、天然抗体より少ないシステイン残基を有することも可能であり、そして典型的には、対でないシステインから生じる相互作用を最小限にするため、偶数のシステイン残基を有する。
【０１６３】
［００１８６］開示する重鎖および軽鎖、可変領域ドメインおよびＣＤＲを用いて、ＧＭ−ＣＳＦポリペプチドに特異的に結合可能な抗原結合性領域を含有するポリペプチドを調製してもよい。例えば、表３および４に列挙するＣＤＲの１以上を、共有的または非共有的に分子（例えばポリペプチド）内に取り込んで、免疫接着を作製してもよい。免疫接着は、より大きいポリペプチド鎖の一部として、ＣＤＲ（単数または複数）を取り込んでもよいし、ＣＤＲ（単数または複数）を別のポリペプチド鎖に共有結合させてもよいし、またはＣＤＲ（単数または複数）を非共有的に取り込んでもよい。ＣＤＲ（単数または複数）は、免疫接着が関心対象の特定の抗原（例えばＧＭ−ＣＳＦポリペプチドまたはそのエピトープ）に特異的に結合するようにしうる。
【０１６４】
［００１８７］本明細書に記載する可変領域ドメインおよびＣＤＲに基づく模倣体（例えば「ペプチド模倣体（peptide mimeticsまたはpeptidomimetics）」）もまた提供する。これらの類似体は、ペプチド、非ペプチド、またはペプチドおよび非ペプチド領域の組み合わせであってもよい。Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; VeberおよびFreidinger, 1985, TINS p. 392; ならびにEvansら, 1987, J. Med. Chem. 30:1229。療法的に有用なペプチドに構造的に類似であるペプチド模倣体を用いて、類似の療法的または予防的効果を生じることも可能である。こうした化合物はしばしば、コンピュータ化分子モデリングの補助によって発展する。一般的に、ペプチド模倣体は、所望の生物学的活性、例えばここではＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する能力を示す抗体に構造的に類似であるが、当該技術分野に周知の方法によって：  −ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ−ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−より選択される連結によって場合によって置換される１以上のペプチド連結を有するタンパク質である。同じタイプのＤ−アミノ酸（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）でのコンセンサス配列の１以上のアミノ酸の体系的な置換を特定の態様で用いて、より安定なタンパク質を生成してもよい。さらに、当該技術分野に知られる方法（RizoおよびGierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387）によって、例えばペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成可能な内部システイン残基を付加することによって、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む拘束されたペプチドを生成してもよい。
【０１６５】
［００１８８］本明細書記載の抗原結合性タンパク質の誘導体もまた提供する。誘導体化抗原結合性タンパク質は、特定の使用における半減期増加など、抗体または断片に望ましい特性を与える分子または物質いずれかを含んでもよい。誘導体化抗原結合性タンパク質は、例えば、検出可能（または標識）部分（例えば放射性、比色、抗原性または酵素性分子、検出可能ビーズ（磁気ビーズまたは電子密度が高い（electrodense）（例えば金）ビーズ）、または別の分子に結合する分子（例えばビオチンまたはストレプトアビジン））、療法または診断部分（例えば放射性、細胞傷害性、または薬学的活性部分）、あるいは特定の使用（例えばヒト被験体などの被験体への投与、あるいは他のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用）のための抗原結合性タンパク質の適合性を増加させる分子を含むことも可能である。抗原結合性タンパク質を誘導体化するのに使用可能な分子の例には、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。当該技術分野に周知の技術を用いて、抗原結合性タンパク質のアルブミン連結およびＰＥＧ化誘導体を調製することも可能である。１つの態様において、抗原結合性タンパク質をトランスサイレチン（ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異体にコンジュゲート化するかまたは別の方式で連結させる。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異体を、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール・ホモ二量体、酸化ポリプロピレン／酸化エチレン・コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群より選択される化学薬品で化学的に修飾してもよい。
【０１６６】
［００１８９］他の誘導体には、ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合した異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現によるなどの、他のタンパク質またはポリペプチドとのＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質の共有または凝集コンジュゲートが含まれる。例えば、コンジュゲート化されるペプチドは、異種シグナル（またはリーダー）ポリペプチド、例えば酵母アルファ因子リーダー、またはエピトープタグなどのペプチドであってもよい。ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を含有する融合タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質の精製または同定を促進するために付加されるペプチド（例えばポリＨｉｓ）を含んでもよい。また、ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を、Hoppら, 1998, Bio/Technology 6:1204；および米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるような、ＦＬＡＧペプチドに連結してもよい。ＦＬＡＧペプチドは、非常に抗原性であり、そして特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドが所定のポリペプチドに融合される融合タンパク質を調製するのに有用な試薬が、商業的に入手可能である（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）。
【０１６７】
［００１９０］１以上のＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を含有するオリゴマーをＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストとして使用してもよい。オリゴマーは、共有結合したまたは非共有結合した、二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーの形であることも可能である。２以上のＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を含むオリゴマーが使用のために意図され、一例がホモ二量体である。他のオリゴマーには、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体等が含まれる。
【０１６８】
［００１９１］１つの態様は、ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質に融合したペプチド部分間の共有相互作用または非共有相互作用を介して連結された、多数のＧＭ−ＣＳＦ結合性ポリペプチドを含むオリゴマーに向けられる。こうしたペプチドは、ペプチド・リンカー（スペーサー）、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。以下により詳細に記載するように、ロイシンジッパー、および抗体由来の特定のポリペプチドが、それに付着したＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質のオリゴマー化を促進可能なペプチドの中にある。
【０１６９】
［００１９２］特定の態様において、オリゴマーは、２〜４のＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を含む。オリゴマーのＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質部分は、上述の型のいずれか、例えば変異体または断片などの、いかなる型であってもよい。好ましくは、オリゴマーは、ＧＭ−ＣＳＦ結合活性を有する、ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を含む。
【０１７０】
［００１９３］１つの態様において、免疫グロブリン由来のポリペプチドを用いて、オリゴマーを調製する。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合した特定の異種ポリペプチドを含む、融合タンパク質の調製は、例えばAshkenaziら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Byrnら, 1990, Nature 344:677;およびHollenbaughら, 1992 “Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, Current Protocols in Immunology中，  補遺４，  １０．１９．１−１０．１９．１１ページに記載されてきている。
【０１７１】
［００１９４］１つの態様は、ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を、抗体のＦｃ領域に融合させることによって生成される２つの融合タンパク質を含む二量体に向けられる。二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を、適切な発現ベクター内に挿入し、組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞において、遺伝子融合体を発現させ、そして発現された融合タンパク質を抗体分子とそっくりに集合させて、その際、Ｆｃ部分間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるのを可能にして、二量体を生じることによって、作製可能である。
【０１７２】
［００１９５］用語「Ｆｃポリペプチド」には、本明細書において、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドの天然型および突然変異タンパク質型が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有する、こうしたポリペプチドの一部切除（truncated）型もまた含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（およびそこから形成されるオリゴマー）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上のアフィニティクロマトグラフィーによる精製が容易であるという利点を提供する。
【０１７３】
［００１９６］ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９３／１０１５１号、ならびに米国特許第５，４２６，０４８号および第５，２６２，５２２号に記載される、１つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然Ｃ末端に渡る一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号およびBaumら, 1994, EMBO J. 13:3992-4001に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除けば、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９３／１０１５１号に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。該突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少したアフィニティを示す。
【０１７４】
［００１９７］他の態様において、本明細書に開示するものなどのＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質の重鎖および／または軽鎖の可変部分を、抗体重鎖および／または軽鎖の可変部分に対して置換してもよい。
【０１７５】
［００１９８］あるいは、オリゴマーは、ペプチド・リンカー（スペーサー・ペプチド）を含むかまたは含まない、多数のＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を含む融合タンパク質である。適切なペプチド・リンカーの中には、米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されるものがある。
【０１７６】
［００１９９］オリゴマー性ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質誘導体を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、これらが見られるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元来、いくつかのＤＮＡ結合性タンパク質で同定され（Landschulzら, 1988, Science 240:1759）、そして以来、多様な異なるタンパク質で発見されてきた。既知のロイシンジッパーの中には、二量体化または三量体化する天然存在ペプチドおよびその誘導体がある。可溶性オリゴマー性タンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例が、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９４／１０３０８号に記載され、そして肺界面活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーが、Hoppeら, 1994, FEBS Letters 344:191に記載される。融合された異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする、修飾ロイシンジッパーの使用が、Fanslowら, 1994, Semin. Immunol. 6:267-278に記載される。１つのアプローチにおいて、ロイシンジッパーペプチドに融合したＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質を、適切な宿主細胞において発現させて、そして形成される可溶性オリゴマー性ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質断片または誘導体を、培養上清から回収する。
【０１７７】
［００２００］提供するいくつかの抗原結合性タンパク質は、以下の実施例に記載するように、ＧＭ−ＣＳＦに対して、少なくとも１０４または１０５／Ｍｘ測定秒の結合アフィニティ（Ｋａ）を有する。他の抗原結合性タンパク質は、少なくとも１０６、１０７、１０８または１０９／Ｍ  ｘ  秒のＫａを有する。提供する特定の抗原結合性タンパク質は、低い解離速度を有する。いくつかの抗体は、例えば、１ｘ１０４ｓ−１、１ｘ１０−５ｓ−１以下のＫｏｆｆを有する。別の態様において、Ｋｏｆｆは、表２および３の可変領域ドメインの以下の組み合わせを有する抗体と同じである。
【０１７８】
［００２０１］別の側面は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで（例えばヒト被験体に投与した際）、少なくとも１日の半減期を有する抗原結合性タンパク質を提供する。１つの態様において、抗原結合性タンパク質は、少なくとも３日の半減期を有する。別の態様において、抗体またはその部分は、４日以上の半減期を有する。別の態様において、抗体またはその部分は、８日以上の半減期を有する。別の態様において、非誘導体化または非修飾抗体に比較した際、抗体またはその抗原結合性部分が、より長い半減期を有するように、これらを誘導体化するかまたは修飾する。別の態様において、抗原結合性タンパク質は、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ００／０９５６０号に記載されるような、血清半減期を増加させる点突然変異を含有する。
【０１７９】
６．グリコシル化
［００２０２］抗原結合性タンパク質は、天然の種に見られるものとは異なるかまたは改変されたグリコシル化パターンを有しうる。当該技術分野に知られるように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下に論じる、特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または非存在）、あるいはタンパク質が産生される宿主細胞または生物の両方に応じうる。特定の発現系を以下に論じる。
【０１８０】
［００２０３］ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ連結またはＯ連結のいずれかである。Ｎ連結は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン、式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である、は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列いずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生成する。Ｏ連結グリコシル化は、糖、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの付着を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用可能である。
【０１８１】
［００２０４］抗原結合性タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、上述のトリペプチド配列（Ｎ連結グリコシル化部位のため）の１以上を含有するように、アミノ酸配列を改変することによって、好適に達成される。改変はまた、出発配列に対する１以上のセリンまたはスレオニン残基（Ｏ連結グリコシル化部位のため）の付加または該残基による置換によっても作製可能である。容易にするため、抗原結合性タンパク質アミノ酸配列を、ＤＮＡレベルでの変化を通じて改変してもよく、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成するように、あらかじめ選択された塩基でターゲットポリペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることによってもよい。
【０１８２】
［００２０５］抗原結合性タンパク質上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、タンパク質に対するグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。これらの方法は、ＮおよびＯ連結グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としない点で、好適である。用いるカップリング様式に応じて、糖（単数または複数）を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）未結合（ｆｒｅｅ）カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの、未結合スルフィドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンのものなどの、未結合ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのものなどの、芳香族残基、あるいは（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させてもよい。これらの方法は、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ８７／０５３３０号、ならびにAplinおよびWriston, 1981, CRC Crit. Rev, Biochem., pp. 259-306に記載される。
【０１８３】
［００２０６］出発抗原結合性タンパク質上に存在する炭水化物部分の除去を化学的または酵素的に達成してもよい。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物へのタンパク質の曝露を必要とする。この処理は、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く、大部分のまたはすべての糖の切断を生じる一方、ポリペプチドを損なわれないままにする。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddinら, 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52およびEdgeら, 1981, Anal. Biochem. 118:131によって記載される。Thotakuraら, 1987, Meth. Enzymol. 138:350に記載されるように、多様なエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用によって、ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断を達成してもよい。潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Duskinら, 1982, J. Biol. Chem. 257:3105に記載されるように、化合物ツニカマイシンの使用によって防止されうる。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド連結の形成を遮断する。
【０１８４】
［００２０７］したがって、側面には、親ポリペプチドのアミノ酸配列に比較して、グリコシル化部位（単数または複数）の数および／またはタイプが改変されている抗原結合性タンパク質のグリコシル化変異体が含まれる。特定の態様において、抗体タンパク質変異体は、天然抗体よりも、より多数またはより少数のＮ−連結グリコシル化部位を含む。Ｎ連結グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、式中、Ｘと示されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であってもよい。この配列を生成するアミノ酸残基の置換によって、Ｎ連結炭水化物鎖の付加のための潜在的な新規部位が提供される。あるいは、この配列を除去するかまたは改変する置換は、天然ポリペプチド中に存在するＮ連結炭水化物鎖の付加を防止するであろう。例えば、Ａｓｎの欠失によって、またはＡｓｎを異なるアミノ酸で置換することによって、グリコシル化を減少させてもよい。他の態様において、１以上の新規Ｎ連結部位を生成する。抗体は、典型的には、Ｆｃ領域中にＮ連結グリコシル化部位を有する。
【０１８５】
７．標識およびエフェクター基
［００２０８］いくつかの態様において、抗原結合性タンパク質は１以上の標識を含む。用語「標識基」または「標識」は、任意の検出可能標識を意味する。適切な標識基の例には、限定されるわけではないが、以下：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えばＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド・リン光体（lanthanide phosphors））、酵素基（例えば西洋ワサビ（horseradish）ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、または二次レポーターに認識されることがあらかじめ決定されているポリペプチド・エピトープ（例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ・タグ）が含まれる。いくつかの態様において、多様な長さのスペーサー・アームを介して抗原結合性タンパク質に標識基をカップリングさせて、潜在的な立体障害を減少させる。タンパク質を標識するための多様な方法が当該技術分野に知られ、そして適切に思われるように、こうした方法を用いてもよい。
【０１８６】
［００２０９］用語「エフェクター基」は、細胞傷害性剤として作用する、抗原結合性タンパク質にカップリングした任意の基を意味する。適切なエフェクター基の例は、放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）である。他の適切な基には、毒素、療法的基または化学療法的基が含まれる。適切な基の例には、カリケアマイシン、アウリスタチン、ゲルダナマイシンおよびメイタンシンが含まれる。いくつかの態様において、多様な長さのスペーサー・アームを介して抗原結合性タンパク質にエフェクター基をカップリングさせて、潜在的な立体障害を減少させる。
【０１８７】
［００２１０］一般的に、標識はすべて、検出されるべきアッセイに応じて、多様な種類に属する：ａ）放射性であってもまたは重同位体であってもよい、同位体標識；ｂ）磁気標識（例えば磁気粒子）；ｃ）レドックス活性部分；ｄ）光学的色素；酵素基（例えば西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；ｅ）ビオチン化基；およびｆ）二次レポーター（例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ等）によって認識される、あらかじめ決定されたポリペプチドエピトープ。いくつかの態様において、多様な長さのスペーサー・アームを介して、抗原結合性タンパク質に標識基をカップリングさせて、潜在的な立体障害を減少させる。タンパク質を標識するための多様な方法が当該技術分野に知られる。
【０１８８】
［００２１１］特定の標識には、限定されるわけではないが、発色団、リン光体および蛍光体を含む光学的色素が含まれ、多くの例で、後者が特異的である。蛍光体は、「小分子」蛍光体またはタンパク質性蛍光体のいずれであってもよい。
【０１８９】
［００２１２］「蛍光標識」は、生得的な蛍光特性を介して検出されうる任意の分子を意味する。適切な蛍光標識には、限定されるわけではないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クーマリン、メチル−クーマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣレッド６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣレッド７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ蛍光色素（Ａｌｅｘａ蛍光３５０、Ａｌｅｘａ蛍光４３０、Ａｌｅｘａ蛍光４８８、Ａｌｅｘａ蛍光５４６、Ａｌｅｘａ蛍光５６８、Ａｌｅｘａ蛍光５９４、Ａｌｅｘａ蛍光６３３、Ａｌｅｘａ蛍光６６０、Ａｌｅｘａ蛍光６８０）、カスケードブルー、カスケードイエローおよびＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Molecular Probes、オレゴン州ユージーン）、ＦＩＴＣ、ローダミン、およびテキサスレッド（Pierce、イリノイ州ロックフォード）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Amersham Life Science、ペンシルバニア州ピッツバーグ）が含まれる。蛍光体を含む適切な光学色素は、Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Richard P. Haugland, Molecular Probes, 1992に記載される。
【０１９０】
［００２１３］適切なタンパク質性蛍光標識にはまた、限定されるわけではないが、ＧＦＰのＲｅｎｉｌｌａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、またはＡｅｑｕｏｒｅａ種（Chalfieら, 1994, Science 263:802-805）、ＥＧＦＰ（Clontech、カリフォルニア州マウンテンビュー、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Quantum Biotechnologies, Inc.、カナダ・ケベック；  Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heimら, 1996, Curr. Biol. 6:178-182）、増進黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Clontech）、ルシフェラーゼ（Ichikiら, 1993, J. Immunol. 150:5408-5417）、βガラクトシダーゼ（Nolanら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607）およびＲｅｎｉｌｌａ（ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９２／１５６７３号、第ＷＯ９５／０７４６３号、第ＷＯ９８／１４６０５号、第ＷＯ９８／２６２７７号、第ＷＯ９９／４９０１９号、米国特許第５２９２６５８号、第５４１８１５５号、第５６８３８８８号、第５７４１６６８号、第５７７７０７９号、第５８０４３８７号、第５８７４３０４号、第５８７６９９５号、第５９２５５５８号）も含まれる。
【０１９１】
Ｃ．  ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質をコードする核酸
［００２１４］本明細書に記載する抗原結合性タンパク質をコードする核酸、またはその部分もまた提供し、こうした核酸には、抗体の一方または両方の鎖、あるいはその断片、誘導体、突然変異タンパク質、または変異体をコードする核酸、重鎖可変領域またはＣＤＲのみをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定するか、分析するか、突然変異させるかまたは増幅するための、ハイブリダイゼーション・プローブ、ＰＣＲプライマーまたは配列決定プライマーとして使用するのに十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、および前述のものの相補配列が含まれる。核酸はいかなる長さであってもよい。これらは、間のすべての値を含めて、例えば、長さ５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００またはそれより長いヌクレオチドであってもよく、そして／または１以上のさらなる配列、例えば制御配列を含んでもよく、そして／またはより大きい核酸、例えばベクターの一部であってもよい。核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよく、そしてＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチド、ならびにその人工的変異体（例えばペプチド核酸）を含んでもよい。
【０１９２】
［００２１５］特定の抗原結合性タンパク質またはその部分（例えば、全長抗体、重鎖または軽鎖、可変ドメイン、あるいはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、またはＣＤＲＬ３）をコードする核酸を、ＧＭ−ＣＳＦまたはその免疫原性断片で免疫されているマウスのＢ細胞から単離してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの慣用法によって、核酸を単離してもよい。抗体および他の抗原結合性タンパク質の誘導体を調製可能なファージディスプレイが、既知の技術の別の例である。１つのアプローチにおいて、関心対象の抗原結合性タンパク質の構成要素であるポリペプチドが、任意の適切な組換え発現系で発現され、そして発現されるポリペプチドは、抗原結合性タンパク質分子を形成するように組み立てられる。
【０１９３】
［００２１６］遺伝暗号の縮重のため、表１〜４に列挙するかまたは別の方式で本明細書に示すポリペプチド配列は、各々、提供するものに加えて、多数の他の核酸配列によってもまたコードされる。一般の当業者は、本出願がしたがって、各抗原結合性タンパク質をコードする各縮重ヌクレオチド配列に関する、適切な文書の説明および使用可能性を提供することを認識するであろう。
【０１９４】
［００２１７］側面は、特定のハイブリダイゼーション条件下で、他の核酸にハイブリダイズする核酸をさらに提供する。核酸をハイブリダイズさせるための方法は当該技術分野に周知である。例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,  ニューヨーク(1989），  ６．３．１−６．３．６を参照されたい。本明細書に定義するように、中程度にストリンジェントなハイブリダーゼション条件は、５ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する前洗浄溶液、約５０％ホルムアミド、６ｘＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、および５５℃のハイブリダイゼーション温度（または４２℃のハイブリダイゼーション温度を伴う、約５０％ホルムアミドを含有するものなどの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）、ならびに６０℃、０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６ｘＳＳＣ、４５℃でハイブリダイズさせ、その後、０．１ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中、６８℃での１以上の洗浄が続く。さらに、当業者は、間のすべての値を含めて、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％互いに同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的には互いにハイブリダイズしたままであるように、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を操作して、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させるかまたは減少させることも可能である。
【０１９５】
［００２１８］ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本的なパラメータおよび適切な条件を考案するための指針が、例えば、Sambrook, Fritsch, およびManiatis（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバーおよびCurrent Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubelら監修， John Wiley & Sons, Inc.，  セクション２．１０および６．３−６．４）に示され、そして例えば核酸の長さおよび／または塩基組成に基づいて、一般の当業者が容易に決定可能である。
【０１９６】
［００２１９］突然変異によって核酸内に変化を導入し、それによってコードするポリペプチド（例えば抗体または抗体誘導体）のアミノ酸配列の変化を導くことも可能である。当該技術分野に知られるいかなる技術を用いて、突然変異を導入してもよい。１つの態様において、例えば部位特異的突然変異誘発プロトコルを用いて、１以上の特定のアミノ酸残基を変化させる。別の態様において、例えばランダム突然変異誘発プロトコルを用いて、１以上のランダムに選択された残基を変化させる。どのように作製されても、突然変異体ポリペプチドを発現させ、そして所望の特性に関してスクリーニングしてもよい。
【０１９７】
［００２２０］コードするポリペプチドの生物学的活性を有意に改変することなく、核酸内に突然変異を導入することも可能である。例えば、非必須アミノ酸残基でのアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換を行ってもよい。あるいは、コードするポリペプチドの生物学的活性を選択的に変化させる１以上の突然変異を核酸内に導入してもよい。例えば、突然変異は、定量的にまたは定性的に、生物学的活性を変化させうる。定量的変化の例には、活性の増加、減少、または排除が含まれる。定性的変化の例には、抗体の抗原特異性を変化させることが含まれる。
【０１９８】
［００２２１］別の側面は、核酸配列の検出のため、プライマーまたはハイブリダイゼーション・プローブとして使用するのに適したポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、全長ポリペプチドをコードする核酸配列の部分のみを含んでもよく、例えば、プローブまたはプライマーとして使用可能な断片、あるいはポリペプチドの活性部分（例えばＧＭ−ＣＳＦ結合性部分）をコードする断片を含んでもよい。
【０１９９】
［００２２２］核酸の配列に基づくプローブを用いて、核酸または類似の核酸、例えばポリペプチドをコードする転写物を検出してもよい。プローブは、標識基、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子を含んでもよい。こうしたプローブを用いて、ポリペプチドを発現する細胞を同定してもよい。
【０２００】
［００２２３］別の側面は、本明細書に記載するようなポリペプチドまたはその部分（例えば１以上のＣＤＲまたは１以上の可変領域ドメインを含有する断片）をコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターの例には、限定されるわけではないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクターおよび発現ベクター、例えば組換え発現ベクターが含まれる。組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した型で、核酸を含むことも可能である。組換え発現ベクターには、発現に用いようとする宿主に基づいて選択される１以上の制御配列が含まれ、制御配列は、発現させようとする核酸配列に機能可能であるように連結されている。制御配列には、宿主細胞の多くの種類において、ヌクレオチド配列の恒常的発現を導くもの（例えばＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）、特定の宿主細胞においてのみ、ヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば組織特異的制御配列、Vossら, 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatisら, 1987, Science 236:1237を参照されたい）、および特定の処理または条件に反応して、ヌクレオチド配列の誘導性発現を導くもの（例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオネインプロモーター、ならびに原核系および真核系の両方における、ｔｅｔ応答性および／またはストレプトマイシン応答性プロモーター（同文献を参照されたい））が含まれる。当業者は、発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、タンパク質の所望の発現レベル等の要因に応じうることを認識するであろう。発現ベクターを宿主細胞内に導入して、それによって本明細書に記載するような核酸にコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチドを産生してもよい。
【０２０１】
［００２２４］別の側面は、組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核細胞（例えば大腸菌）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞））であってもよい。慣用的な形質転換またはトランスフェクション技術を介して、原核または真核細胞内にベクターＤＮＡを導入してもよい。哺乳動物細胞の安定トランスフェクションのため、用いる発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、少ない割合の細胞のみが、ゲノム内に外来ＤＮＡを組み込みうることが知られる。これらの組込み体を同定し、そして選択するため、選択可能マーカー（例えば抗生物質に対する耐性に関するもの）をコードする遺伝子を、一般的に、関心対象の遺伝子とともに、宿主細胞内に導入する。好ましい選択可能マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートなどの薬剤に対する耐性を与えるものが含まれる。導入された核酸で安定にトランスフェクションされた細胞を、他の方法の中でも、薬剤選択によって、同定してもよい（例えば選択可能マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生き残り、一方、他の細胞は死ぬであろう）。
【０２０２】
Ｄ．抗原結合性タンパク質の調製
［００２２５］ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニック動物を免疫することによって、またはヒト抗体のレパートリーを発現するファージディスプレイライブラリーを選択することによって、上述のように、完全ヒト抗体を調製してもよい。
【０２０３】
［００２２６］慣用的モノクローナル抗体方法論、例えばKohlerおよびMilstein, 1975, Nature 256:495の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、多様な技術によって、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生してもよい。あるいは、モノクローナル抗体を産生するための他の技術、例えばＢリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換を使用してもよい。ハイブリドーマを調製するための１つの適切な動物系は、非常によく確立された方法であるネズミ系である。融合のための免疫脾臓細胞を単離するための免疫プロトコルおよび技術は、当該技術分野に知られる。こうした方法のため、免疫マウス由来のＢ細胞を、ネズミ骨髄腫細胞株などの適切な不死化融合パートナーと融合させる。望ましい場合、ラットまたはそれ以外の他の哺乳動物をマウスの代わりに免疫して、そしてこうした動物由来のＢ細胞を、ネズミ骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマを形成してもよい。あるいは、マウス以外の供給源由来の骨髄腫細胞株を用いてもよい。ハイブリドーマを作製するための融合法もまた周知である。
【０２０４】
［００２２７］アミノ酸架橋（短いペプチド・リンカー）を介して、重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片を連結して、単一ポリペプチド鎖を生じることによって、提供する一本鎖抗体を形成してもよい。こうした一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメイン・ポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡ間に、ペプチド・リンカーをコードするＤＮＡを融合させることによって、調製されてきている。２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーの長さに応じて、生じるポリペプチドは、それ自体、折り畳まれて、抗原結合性単量体を形成することも可能であるし、または多量体（例えば二量体、三量体、または四量体）を形成することも可能である（Korttら, 1997, Prot. Eng. 10:423; Korttら, 2001, Biomol. Eng. 18:95-108）。異なるＶＬおよびＶＨを含むポリペプチドを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖを形成することも可能である（Kriangkumら, 2001, Biomol. Eng. 18:31-40）。一本鎖抗体産生のために開発された技術には、米国特許第４，９４６，７７８号；  Bird, 1988, Science 242:423; Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Wardら, 1989, Nature 334:544, de Graafら, 2002, Methods Mol Biol. 178:379-387に記載されるものが含まれる。本明細書に提供する抗体由来の一本鎖抗体には、限定されるわけではないが、表１に示す重鎖および軽鎖可変領域の可変ドメイン組み合わせ、あるいは表２および３に示す任意のＣＤＲ内に移植された軽鎖および重鎖可変ドメインの組み合わせを含むｓｃＦｖが含まれる。
【０２０５】
［００２２８］サブクラス・スイッチング法を用いて、１つのサブクラスのものである本明細書に提供する抗体を変化させて、異なるサブクラスを形成してもよい。したがって、例えば、ＩｇＭ抗体からＩｇＧ抗体を得ることも可能であり、そして逆も可能である。こうした技術は、所定の抗体（親抗体）の抗原結合特性を所持するが、親抗体のものと異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスと関連する生物学的特性もまた示す、新規抗体の調製を可能にする。組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。特定の抗体ポリペプチドをコードする、クローニングされたＤＮＡ、例えば所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡを、こうした方法において使用してもよい。例えば、Lanttoら, 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-316を参照されたい。したがって、提供する抗体には、例えば、所望のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、およびＩｇＤ）を有する上述の可変ドメインの組み合わせを含むもの、ならびにそのＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。さらに、ＩｇＧ４が望ましい場合、Bloomら, 1997, Protein Science 6:407に記載されるようなヒンジ領域中の点突然変異（ＣＰＳＣＰ→ＣＰＰＣＰ）を導入して、ＩｇＧ４抗体における不均一性を導きうる、Ｈ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減することが望ましい可能性もまたある。
【０２０６】
［００２２９］さらに、異なる特性（すなわち結合する抗原に対する多様なアフィニティ）を有する抗体を得るための技術もまた知られる。鎖シャッフリングと呼ばれる１つのこうした技術は、糸状バクテリオファージの表面上に免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーをディスプレイすることを伴い、しばしばファージ・ディスプレイと呼ばれる。鎖シャッフリングは、Marksら, 1992, BioTechnology, 10:779に記載されるように、ハプテン、２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する高アフィニティ抗体を調製するのに用いられてきている。
【０２０７】
［００２３０］表１に記載する重鎖および軽鎖可変領域、または表２および３に記載するＣＤＲに保存的修飾を作製して（そしてコードする核酸に、対応する修飾を行って）、機能的および生化学的特性を有するＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を産生してもよい。こうした修飾を達成するための方法を上に記載する。
【０２０８】
［００２３１］ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を多様な方式でさらに修飾してもよい。例えば、これらを療法的目的で用いようとする場合、これらをポリエチレングリコールにコンジュゲート化（ＰＥＧ化）して、血清半減期を延長させるかまたはタンパク質送達を増進してもよい。あるいは、本抗体またはその断片のＶ領域を、異なる抗体分子のＦｃ領域と融合させてもよい。この目的に用いるＦｃ領域を修飾して、補体に結合しないようにして、こうして融合タンパク質を療法剤として用いた場合に、患者において、細胞溶解を誘導する可能性を減少させてもよい。さらに、本抗体またはその機能性断片をヒト血清アルブミンとコンジュゲート化して、抗体またはその断片の血清半減期を増進してもよい。本発明の抗体またはその断片の別の有用な融合パートナーは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）である。ＴＴＲは、四量体を形成する能力を有し、したがって、抗体−ＴＴＲ融合タンパク質は、四量体を形成する能力を有し、したがって抗体−ＴＴＲ融合タンパク質は、多価抗体を形成可能であり、これによって結合アビディティが増加しうる。
【０２０９】
［００２３２］あるいは、（ａ）置換領域における分子主鎖の構造、例えばシートまたはらせんコンホメーションとしての構造、（ｂ）ターゲット部位での分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖のかさばり（bulkiness）の維持に対する影響が有意に異なる、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列における置換を生成することによって、本明細書記載の抗原結合性タンパク質の機能的および／または生化学的特性における実質的な修飾を達成してもよい。「保存的アミノ酸置換」は、その位のアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたはまったく影響を持たない、非天然残基での天然アミノ酸残基の置換を伴ってもよい。表５を参照されたい。さらにまた、アラニン・スキャニング突然変異誘発に関して以前記載されているように、ポリペプチド中の任意の天然残基をアラニンで置換してもよい。
【０２１０】
［００２３３］ルーチン技術を適用することによって、当業者は本抗体のアミノ酸置換（保存的であってもまたは非保存的であっても）を達成可能である。アミノ酸置換を用いて、本明細書に提供する抗体の重要な残基を同定するか、あるいはヒトＧＭ−ＣＳＦに対するこれらの抗体のアフィニティを増加させるかまたは減少させるか、あるいは本明細書記載の他の抗原結合性タンパク質の結合アフィニティを修飾してもよい。
【０２１１】
Ｅ．抗原結合性タンパク質を発現する方法
［００２３４］上述のような少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、転写または発現カセットの形の発現系および構築物、ならびにこうした発現系または構築物を含む宿主細胞もまた提供する。
【０２１２】
［００２３５］多くの慣用的技術のいずれによって、本明細書に提供する抗原結合性タンパク質を調製してもよい。例えば、当該技術分野に知られる任意の技術を用いて、組換え発現系によって、ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を産生してもよい。例えば、Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennetら（監修）, Plenum Press，  ニューヨーク（１９８０）；ならびにAntibodies: A Laboratory Manual, HarlowおよびLane（監修），  Cold Spring Harbor Laboratory Press，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）を参照されたい。
【０２１３】
［００２３６］抗原結合性タンパク質を、ハイブリドーマ細胞株中（例えば特に抗体をハイブリドーマ中で発現させてもよい）またはハイブリドーマ以外の細胞株中で、発現させてもよい。抗体をコードする発現構築物を用いて、哺乳動物、昆虫または微生物宿主細胞を形質転換してもよい。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号；第４，９１２，０４０号；第４，７４０，４６１号；第４，９５９，４５５号によって例示されるように、当該技術分野に知られるトランスフェクション法によって、ウイルスまたはバクテリオファージ中にポリヌクレオチドをパッケージングし、そして宿主細胞に構築物を形質導入する工程を含めて、宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するための任意の既知の方法を用いて、形質転換を行ってもよい。用いる最適な形質転換法は、形質転換しようとする宿主細胞のタイプ次第であろう。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞内に導入するための方法は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、限定されるわけではないが、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中のポリヌクレオチド（単数または複数）の被包、正荷電脂質と核酸の混合、および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが含まれる。
【０２１４】
［００２３７］組換え発現構築物は、典型的には、１以上の以下：本明細書に提供する１以上のＣＤＲ；軽鎖定常領域；軽鎖可変領域；重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３）；および／またはＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質の別の骨格部分を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。標準的連結技術を用いて、これらの核酸配列を適切な発現ベクター内に挿入する。１つの態様において、重鎖または軽鎖定常領域を、抗ＧＭ−ＣＳＦ特異的重鎖または軽鎖可変領域のＣ末端に付加して、そして発現ベクター内に連結する。ベクターは、典型的には、使用する特定の宿主細胞において機能するように選択される（すなわちベクターは、宿主細胞機構と適合し、遺伝子の増幅および／または発現が起こるのを可能にする）。いくつかの態様において、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどのタンパク質レポーターを用いて、タンパク質断片補完アッセイを使用するベクターを用いる（例えば、米国特許第６，２７０，９６４号を参照されたい）。例えば、Invitrogen Life Technologies（カリフォルニア州カールスバッド）またはBD Biosciences（カリフォルニア州サンノゼ）から、適切な発現ベクターを購入してもよい。抗体および断片をクローニングしそして発現するのに有用な他のベクターには、BianchiおよびMcGrew, 2003, Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439-44に記載されるものが含まれる。さらなる適切な発現ベクターが、例えば、Methods Enzymol., vol. 185（D. V. Goeddel監修），1990, New York: Academic Pressに論じられる。
【０２１５】
［００２３８］典型的には、任意の宿主細胞で用いる発現ベクターは、プラスミド維持のための配列、ならびに外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含有するであろう。こうした配列は、特定の態様において、集合的に「隣接配列」と呼ばれ、典型的には１以上の以下のヌクレオチド配列を含む：プロモーター、１以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプター・スプライシング部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させようとするポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択可能マーカー要素。
【０２１６】
［００２３９］場合によって、ベクターは、「タグ」コード配列、すなわちＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質コード配列の５’または３’端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有してもよく；該オリゴヌクレオチド配列は、商業的に入手可能な抗体が存在するポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）、あるいはＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ（インフルエンザウイルス赤血球凝集素）、またはｍｙｃなどの別の「タグ」をコードする。このタグは、典型的には、ポリペプチドの発現の際、ポリペプチドに融合され、そして宿主細胞からのＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質のアフィニティ精製または検出のための手段として働きうる。例えば、アフィニティマトリックスとしてタグに対する抗体を用いるカラムクロマトグラフィーによって、アフィニティ精製を達成してもよい。場合によって、続いて、切断のために特定のペプチダーゼを用いるなどの多様な手段によって、精製ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質からタグを取り除いてもよい。
【０２１７】
［００２４０］隣接配列は、合成または天然の同種（すなわち宿主細胞と同じ種および／または株由来）、異種（すなわち宿主細胞種または株以外の種）、ハイブリッド（すなわち１より多い供給源由来の隣接配列の組み合わせ）であってもよい。こうしたものとして、隣接配列が宿主細胞機構で機能し、そして該機構によって活性化可能であるならば、隣接配列の供給源は、任意の原核または真核生物、任意の脊椎または無脊椎生物、あるいは任意の植物であってもよい。
【０２１８】
［００２４１］当該技術分野に周知の任意のいくつかの方法によって、ベクターで有用な隣接配列を得てもよい。典型的には、本明細書で有用な隣接配列は、マッピングによって、そして／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって、先に同定されているであろうし、そしてしたがって、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な組織供給源から単離可能である。いくつかの場合、隣接配列の全長ヌクレオチド配列が知られていてもよい。ここで、核酸合成またはクローニングのため、本明細書記載の方法を用いて、隣接配列を合成してもよい。
【０２１９】
［００２４２］隣接配列のすべてまたは部分のみが知られているかにかかわらず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、そして／またはオリゴヌクレオチドおよび／または同じまたは別の種由来の隣接配列断片などの適切なプローブでゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、隣接配列を得てもよい。隣接配列が知られていない場合、例えばコード配列あるいは別の単数または複数の遺伝子さえも含有してもよいＤＮＡの巨大片から、隣接配列を含有するＤＮＡの断片を単離してもよい。制限エンドヌクレアーゼ消化して、適切なＤＮＡ断片を産生した後、アガロースゲル精製、Qiagen（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Qiagen、カリフォルニア州チャツワース）を用いて単離することによって、または当業者に知られる他の方法によって、単離を達成してもよい。この目的を達成するのに適した酵素の選択は、一般の当業者に容易に明らかであろう。
【０２２０】
［００２４３］複製起点は、典型的には、商業的に購入される原核発現ベクターの一部であり、そして起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅を補助する。選択するベクターが複製起点部位を含有しない場合、既知の配列に基づいて化学的に合成して、そしてベクター内に連結してもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（New England Biolabs、マサチューセッツ州ビバリー）由来の複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適しており、そして多様なウイルス起点（例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、あるいはＨＰＶまたはＢＰＶなどのパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点構成要素は哺乳動物発現ベクターには必要ない（例えば、ＳＶ４０起点がしばしば用いられるが、これはただこれがウイルス初期プロモーターもまた含有するからである）。
【０２２１】
［００２４４］転写終結配列は、典型的にはポリペプチドコード領域の３’端に位置し、そして転写を終結させるように働く。通常、原核細胞中の転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチ断片に続くポリＴ配列である。該配列はライブラリーから容易にクローニングされるか、またはさらにベクターの一部として商業的に購入されるが、本明細書記載のものなどの核酸合成法を用いて、容易に合成することもまた可能である。
【０２２２】
［００２４５］選択可能マーカー遺伝子は、選択培地中で増殖する宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば原核宿主細胞ではアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を与えるタンパク質；（ｂ）細胞の栄養要求不全を補足するタンパク質；あるいは（ｃ）複合培地または定義される培地から入手可能でない決定的に重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。特定の選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。都合よくは、原核宿主細胞および真核宿主細胞両方において、ネオマイシン耐性遺伝子もまた選択に使用可能である。
【０２２３】
［００２４６］他の選択可能遺伝子を用いて、発現しようとする遺伝子を増幅することも可能である。増幅は、増殖または細胞の生存に決定的に重要なタンパク質の産生に必要な遺伝子が、組換え細胞の代々の世代の染色体内で、タンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に適した選択可能マーカーの例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびプロモーター不含チミジンキナーゼ遺伝子が含まれる。ベクター中に存在する選択可能遺伝子のため、形質転換体のみがユニークに適応して生存する選択圧下に、哺乳動物細胞形質転換体を置く。培地中の選択剤の濃度を連続的に増加させて、それによって選択可能遺伝子および別の遺伝子、例えば、ＧＭ−ＳＣＦポリペプチドに結合する抗原結合性タンパク質をコードするＤＮＡ両方の増幅が導かれる条件下で、形質転換細胞を培養することによって、選択圧を課す。その結果、増幅されたＤＮＡから、増加した量の抗原結合性タンパク質などのポリペプチドが合成される。
【０２２４】
［００２４７］リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてシャイン・ダルガノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。これら要素は、典型的には、発現しようとするポリペプチドのプロモーターの３’に、そしてコード配列の５’に位置する。
【０２２５】
［００２４８］真核宿主細胞発現系におけるグリコシル化が望ましいなどのいくつかの場合、グリコシル化または収率を改善するため、多様なプレまたはプロ配列を操作することも可能である。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を改変することも可能であるし、またはグリコシル化に影響を及ぼすことも可能なプロ配列を付加することも可能である。最終タンパク質産物は、−１位（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に比較して）に、完全には除去されなかった可能性もある、発現によって生じる１以上のさらなるアミノ酸を有することも可能である。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に付着して、ペプチダーゼ切断部位に見られる１つまたは２つのアミノ酸残基を有することも可能である。あるいは、いくつかの酵素切断部位を用いることによって、所望のポリペプチドのわずかに一部切除された型を生じることも可能であり、これは酵素が成熟ポリペプチド内のこうした領域を切断する場合である。
【０２２６】
［００２４９］発現およびクローニングは、典型的には、宿主生物に認識され、そしてＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質をコードする分子に機能可能であるように連結されているプロモーターを含有するであろう。プロモーターは、構造遺伝子の転写を調節する、構造遺伝子の開始コドンの上流（すなわち５’）（一般的には約１００〜１０００ｂｐ以内）に位置する転写されない配列である。プロモーターは、慣用的に、２つの種類：誘導性プロモーターおよび恒常的プロモーターの１つにグループ分けされる。誘導性プロモーターは、栄養素の存在または非存在、あるいは温度変化などの培養条件の何らかの変化に反応して、調節下にあるＤＮＡからの転写レベル増加を開始する。他方、恒常的プロモーターは、機能可能であるように連結された遺伝子を均一に、すなわちほとんどまたはまったく遺伝子発現を調節せずに、転写する。多様な潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、そしてベクター内に所望のプロモーター配列を挿入することによって、ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を含む重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡに、適切なプロモーターを機能可能であるように連結する。
【０２２７】
［００２５０］酵母宿主で用いるのに適したプロモーターもまた、当該技術分野に周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとともに、好適に用いられる。哺乳動物宿主細胞で用いるのに適したプロモーターが周知であり、そしてこれには、限定されるわけではないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ・パピローマウイルス、鳥・肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびサル・ウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが含まれる。他の適切な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、例えば熱ショックプロモーターおよびアクチン・プロモーターが含まれる。
【０２２８】
［００２５１］関心対象となりうるさらなるプロモーターには、限定されるわけではないが：ＳＶ４０初期プロモーター（BernoistおよびChambon, 1981, Nature 290:304-310）；ＣＭＶプロモーター（Thornsenら, 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663）；ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列（long terminal repeat）に含有されるプロモーター（Yamamotoら, 1980, Cell 22:787-797）；ヘルペス・チミジンキナーゼ・プロモーター（Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445）；メタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターおよび制御配列（Prinsterら, 1982, Nature 296:39-42）；およびベータ−ラクタマーゼ・プロモーターなどの原核生物プロモーター（Villa-Kamaroffら, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731）；またはｔａｃプロモーター（DeBoerら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25)が含まれる。やはり関心対象であるのは、組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されてきている、以下の動物転写調節領域である：膵臓腺房細胞で活性であるエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Swiftら, 1984, Cell 38:639-646; Ornitzら,1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515）；膵臓ベータ細胞で活性であるインスリン遺伝子調節領域（Hanahan, 1985, Nature 315:115-122）；リンパ球で活性である免疫グロブリン遺伝子調節領域（Grosschedlら, 1984, Cell 38:647-658; Adamesら, 1985, Nature 318:533-538; Alexanderら, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ球およびマスト細胞で活性であるマウス乳腺腫瘍ウイルス調節領域（Lederら, 1986, Cell 45:485-495）；肝臓で活性であるアルブミン遺伝子調節領域（Pinkertら, 1987, Genes and Devel. 1:268-276）；肝臓で活性であるアルファ・フェトプロテイン遺伝子調節領域（Krumlaufら, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammerら, 1987, Science 253:53-58）；肝臓で活性であるアルファ１−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Kelseyら, 1987, Genes and Devel. 1:161-171）；骨髄細胞で活性であるベータ−グロビン遺伝子調節領域（Mogramら, 1985, Nature 315:338-340; Kolliasら, 1986, Cell 46:89-94）；脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Readheadら, 1987, Cell 48:703-712）；骨格筋で活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Sani, 1985, Nature 314:283-286）；および視床下部で活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域（Masonら, 1986, Science 234:1372-1378）。
【０２２９】
［００２５２］エンハンサー配列をベクター内に挿入して、より高次の真核生物による、ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を含む、軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡの転写を増加させることも可能である。エンハンサーは、通常、長さ約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性要素であり、プロモーターに作用して、転写を増加させる。エンハンサーは、比較的配向および位置独立性であり、転写単位の５’および３’両方の位で見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られる（例えばグロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェト−プロテインおよびインスリン）。しかし、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーが用いられる。当該技術分野に知られるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーター・エンハンサー、ポリオーマ・エンハンサー、およびアデノウイルス・エンハンサーは、真核プロモーター活性化のための典型的な増進要素である。エンハンサーは、コード配列の５’または３’のいずれかで、ベクター中に位置していてもよいが、典型的には、プロモーターの５’の部位に位置する。適切な天然または異種シグナル配列（リーダー配列またはシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクター内に取り込んで、抗体の細胞外分泌を促進してもよい。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、抗体を産生しようとする宿主細胞のタイプに応じ、そして異種シグナル配列が天然シグナル配列を置換してもよい。哺乳動物宿主細胞で機能するシグナルペプチドの例には、以下が含まれる：米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；  Cosmanら,1984, Nature 312:768に記載されるインターロイキン−２受容体のシグナル配列；  ＥＰ特許第０３６７  ５６６に記載されるインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；  米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；  ＥＰ特許第０  ４６０  ８４６号に記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド。
【０２３０】
［００２５３］商業的に入手可能なベクターなどの出発ベクターから、提供する発現ベクターを構築してもよい。こうしたベクターは、所望の隣接配列をすべて含有していてもまたはしていなくてもよい。本明細書記載の１以上の隣接配列がベクター中にすでに存在している場合、これらを個々に得て、そしてベクター内に連結してもよい。隣接配列各々を得るために用いられる方法は、当業者に周知である。
【０２３１】
［００２５４］ベクターが構築され、そしてＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性配列を含む軽鎖、重鎖、または軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドが、ベクターの適切な部位内に挿入された後、増幅および／またはポリペプチド発現のため、完成したベクターを適切な宿主細胞内に挿入してもよい。トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、または他の既知の技術を含む、周知の方法によって、選択した宿主細胞内への抗原結合性タンパク質の発現ベクターの形質転換を達成してもよい。選択する方法は、部分的に、用いる宿主細胞の種類に応じるであろう。これらの方法および他の適切な方法が当業者に周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、上記に示される。
【０２３２】
［００２５５］宿主細胞は、適切な条件下で培養した際、抗原結合性タンパク質を合成し、該タンパク質を続いて、培地から収集してもよいし（宿主細胞が該タンパク質を培地内に分泌する場合）、または産生している宿主細胞から直接収集してもよい（該タンパク質が分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいかまたは必要なポリペプチド修飾（グリコシル化またはリン酸化など）および生物学的活性分子へのフォールティングの容易さなどの、多様な要因に応じるであろう。
【０２３３】
［００２５６］発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株が当該技術分野に周知であり、そしてこれには、限定されるわけではないが、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株が含まれ、これには限定されるわけではないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐＧ２）、およびいくつかの他の細胞株が含まれる。特定の態様において、どの細胞株が高発現レベルを有し、そしてＧＭ−ＣＳＦ結合特性を持つ抗原結合性タンパク質を恒常的に産生するかを決定することによって、細胞株を選択してもよい。別の態様において、それ自体、抗体を作製しないが、異種抗体を作製しそして分泌する能力を有する、Ｂ細胞系譜由来の細胞株を選択してもよい。
【０２３４】
Ｆ．診断および療法目的のためのヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質の使用
［００２５７］抗原結合性タンパク質は、生物学的試料中でＧＭ−ＣＳＦを検出し、そしてＧＭ−ＣＳＦを産生する細胞または組織を同定するのに有用である。ＧＭ−ＣＳＦに特異的に結合する抗原結合性タンパク質を、治療の必要がある患者において、ＧＭ−ＣＳＦに関連する疾患の治療に用いてもよい。一例として、ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を診断アッセイ、例えば結合アッセイに用いて、組織または細胞中で発現されるＧＭ−ＣＳＦを検出し、そして／または定量化してもよい。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を用いて、ＧＭ−ＣＳＦがその受容体と複合体を形成するのを阻害して、それによって、細胞または組織におけるＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性を調節してもよい。したがって、ＧＭ−ＣＳＦに結合する抗原結合性タンパク質は、他の結合化合物との相互作用を調節し、そして／または遮断することも可能であり、そしてこうしたものとして、ＧＭ−ＣＳＦに関連する疾患を改善する際に療法的使用を有しうる。
【０２３５】
１．適応症
［００２５８］本発明はまた、本明細書に開示する各医学的障害の防止または療法的治療のための薬物の製造における、ＧＭ−ＣＳＦ抗体などのＧＭ−ＣＳＦ阻害剤（開示するとおり）の使用にも関する。ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は、根底にある疾患または障害に寄与する際に過剰なＧＭ−ＣＳＦが役割を果たすか、あるいは別の方式で負の症状に寄与する、多様な状態を治療するのに有用である。
【０２３６】
［００２５９］本発明の態様には、開示するＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、特にＧＭ−ＣＳＦ抗体、組成物または併用療法を用いて、多様なリウマチ性障害を治療するかまたは防止するための方法が含まれる。これらには、成人および若年性関節リウマチ；強皮症；全身性エリテマトーデス；痛風；骨関節症；リウマチ性多発筋痛症；強直性脊椎炎を含む血清反応陰性脊椎関節炎、およびライター病が含まれる。また、本ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、組成物および併用療法を用いて、乾癬性関節炎および慢性ライム関節炎を治療する。これらの化合物、組成物および併用療法でやはり治療可能または防止可能であるのは、スティル病および関節リウマチに関連するブドウ膜炎である。さらに、随意筋および他の筋肉の炎症を生じる、皮膚筋炎、封入体筋炎、多発性筋炎、およびリンパ平滑筋腫症を含む障害を治療する際に、本発明の化合物、組成物および併用療法を用いる。
【０２３７】
［００２６０］本発明は、骨および関節の非関節炎医学状態の治療のためのＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、例えばＧＭ−ＣＳＦ抗体、組成物および併用療法（例えばＧＭ−ＣＳＦ阻害剤およびＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（エタネルセプト）などのＴＮＦ阻害剤または他の活性剤）を提供する。これは、限定されるわけではないが、骨粗鬆症などの骨喪失を導く破骨細胞障害を含み、これには閉経後骨粗鬆症、骨関節症、歯のゆるみまたは喪失を生じる歯周炎、ならびに関節置換後の人工関節のゆるみ（一般的に、摩耗片（wear debris）に対する炎症反応に関連する）が含まれる。この後者の状態はまた、「整形外科用インプラント骨溶解」とも呼ばれる。本発明の化合物、組成物および併用療法で治療可能な別の状態は、一時性顎関節機能不全（ＴＭＪ）である。
【０２３８】
［００２６１］開示するＧＭ−ＣＳＦ阻害剤組成物および併用療法で治療可能な多様な他の医学的障害には；多発性硬化症；ベーチェット症候群；シェーグレン症候群；自己免疫溶血性貧血；ベータ・サラセミア；筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）；パーキンソン病；および未知の原因の腱鞘炎、ならびにＸ染色体性精神遅滞を含む遺伝的不全と関連する多様な自己免疫障害または疾患が含まれる。
【０２３９】
［００２６２］ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、組成物または併用療法を用いて、内分泌系の多様な障害を治療するための方法もまた提供する。例えば、ＴＮＦ阻害剤（例えばＥＮＢＲＥＬ）または上述の他の活性剤を含むまたは含まない、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤組成物または他のＧＭ−ＣＳＦ阻害剤組成物は、若年性糖尿病（自己免疫糖尿病および糖尿病のインスリン依存型を含む）を治療するために使用するのに適しており、そしてまた成人型糖尿病（非インスリン依存型および肥満仲介糖尿病を含む）を治療するのにも適している。さらに、本化合物、組成物および併用療法を用いて、糖尿病と関連する続発性状態、例えば糖尿病網膜症、糖尿病患者における腎移植拒絶、肥満仲介性インスリン耐性、ならびにそれ自体タンパク尿および高血圧と関連しうる腎不全を治療する。他の内分泌障害もまた、これらの化合物、組成物または併用療法で治療可能であり、これには、多嚢胞性卵巣疾患、Ｘ染色体性副腎白質ジストロフィ症、甲状腺機能低下症、および橋本甲状腺炎（すなわち自己免疫甲状腺炎）を含む甲状腺炎が含まれる。さらに、単独で、またはＥＮＢＲＥＬなどのＴＮＦ阻害剤を含む他のサイトカインと組み合わせて、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤を含むＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は、甲状腺機能正常病態症候群を含む甲状腺細胞機能不全と関連する医学的状態を治療するかまたは防止する際に有用である。
【０２４０】
［００２６３］セリアック病を含む胃腸系の状態を、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、組成物または併用療法で治療可能であるかまたは防止可能である。例えば、ＴＮＦ阻害剤（例えばＥＮＢＲＥＬ）または上述の他の活性剤を含むまたは含まない、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤組成物は、セリアック病を治療するかまたは防止するのに適している。さらに、本発明の化合物、組成物および併用療法は、クローン病；潰瘍性大腸炎；特発性胃不全麻痺；慢性膵炎を含む膵炎；急性膵炎；炎症性腸疾患、ならびに胃潰瘍および十二指腸潰瘍を含む潰瘍を治療するかまたは防止するのに適している。
【０２４１】
［００２６４］尿生殖器系の障害を治療するための本ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、組成物または併用療法を用いるための方法もまた含まれる。例えば、単独の、あるいはＩＬ−１（例えばＫｉｎｅｒｅｔ（登録商標）（アナキンラ））もしくはＴＮＦ阻害剤（例えばＥＮＢＲＥＬ）または上述の他の活性剤と組み合わせた、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤組成物は、自己免疫糸球体腎炎、毒素への曝露による糸球体腎炎、あるいは溶血性連鎖球菌または他の感染性病原体での感染に続発性の糸球体腎炎を含む糸球体腎炎を治療するかまたは防止するのに適している。環境性毒素、薬剤または他の原因への曝露に関連する尿毒症症候群を含む、尿毒症症候群およびその臨床的合併症（例えば腎不全、貧血、および肥大型心筋症）もまた、本発明の化合物、組成物および併用療法で治療可能である。単独で、またはＴＮＦ阻害剤、特にＥＮＢＲＥＬと組み合わせた、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、特にＧＭ−ＣＳＦ抗体は、吸収機能の改変を導く胆嚢壁の炎症から生じる合併症を治療し、そして防止するのに有用である。こうした合併症に含まれるのは、胆石症（胆石）および総胆管結石（胆管石）、ならびに胆石症および総胆管結石の再発である。本発明の化合物、組成物および併用療法で治療可能なさらなる状態は、血液透析；良性前立腺肥大、非細菌性前立腺炎および慢性前立腺炎を含む前立腺状態；ならびに血液透析の合併症である。
【０２４２】
［００２６５］本明細書にやはり提供するのは、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、組成物または併用療法を用いて、多様な血液学的および腫瘍学的障害を治療するための方法である。例えば、単独の、あるいはＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、ＴＮＦ阻害剤（例えばＥＮＢＲＥＬ）または上述のような他の活性剤と組み合わせた、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤を用いて、癌関連悪液質、疲労、無力症、悪液質および高カルシウム血症の傍腫瘍性症候群を含めて、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、エプスタイン−バーウイルス陽性鼻咽頭癌、神経膠腫、結腸癌、胃癌、前立腺癌、腎細胞癌、子宮頸癌および卵巣癌、肺癌（ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ）を含む、多様な型の癌と関連する症状を治療してもよい。本ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、組成物または併用療法で治療可能なさらなる疾患は、肉腫、骨肉腫、および癌腫、例えば腺癌（例えば乳癌）および扁平上皮癌を含む、固形腫瘍である。さらに、本化合物、組成物または併用療法は、食道癌、胃癌、胆嚢癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄性白血病、慢性または急性リンパ芽球性白血病および毛様細胞白血病を含む白血病を治療するのに有用である。多発性骨髄腫を含む、侵襲性転移能を持つ他の悪性腫瘍を、化合物、組成物および併用療法、ならびに特にＧＭ−ＣＳＦ阻害剤および可溶性ＴＮＦ受容体（例えばＥＮＢＲＥＬ）を含む併用療法で治療してもよい。さらに、開示するＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、組成物および併用療法を用いて、慢性特発性好中球減少症、慢性疾患の貧血、ファンコニーの再生不良性貧血を含む再生不良性貧血；特発性血小板減少性紫斑症（ＩＴＰ）；血栓性血小板減少性紫斑病、骨髄異形成症候群（不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、過剰な芽細胞を伴う不応性貧血、形質転換中に過剰な芽細胞を伴う不応性貧血を含む）；骨髄線維症／骨髄形成異常症；ならびに鎌状細胞血管閉塞性発作を含む、貧血および血液学的障害を治療してもよい。
【０２４３】
［００２６６］多様なリンパ増殖性障害もまた、開示するＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、組成物または併用療法で治療可能である。単独の、あるいはＥＮＢＲＥＬなどのＴＮＦ阻害剤または他の活性剤と組み合わせた、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は、自己免疫リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、慢性リンパ芽球性白血病、毛様細胞白血病、慢性リンパ性白血病、末梢Ｔ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、エプスタイン−バーウイルス陽性Ｔ細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、ホジキン病、びらん性侵攻性リンパ腫、急性リンパ性白血病、Ｔガンマリンパ増殖性疾患、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（すなわち菌状息肉症）およびセザリー症候群を治療するかまたは防止するのに有用である。
【０２４４】
［００２６７］さらに、本ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、組成物および併用療法を用いて、遺伝性状態を治療する。特に、単独の、またはＥＮＢＲＥＬなどのＴＮＦ阻害剤と組み合わせた、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は、ゴーシェ病、ハンチントン病、線状ＩｇＡ疾患、および筋ジストロフィーなどの疾患を治療するのに有用である。
【０２４５】
［００２６８］開示するＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、組成物および併用療法によって治療可能または防止可能な他の状態には、頭部への外傷による硬膜下血腫を含む、頭部または脊髄への傷害から生じるものが含まれる。例えば、単独の、またはＥＮＢＲＥＬなどのＴＮＦ阻害剤と組み合わせた、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は、頭部傷害および脊髄傷害を治療するのに有用である。この療法と関連して、記載する組成物および組み合わせは、頭蓋神経学的損傷を防止し、そして頸部から生じる（cervicogenic）頭痛を防止しそして治療するのに適している。記載する組成物および組み合わせはさらに、脳照射と関連する神経学的副作用を治療するのに適している。
【０２４６】
［００２６９］さらに、開示するＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、組成物および併用療法を用いて、肝臓の状態を治療する。例えば、単独の、あるいはＥＮＢＲＥＬなどのＴＮＦ阻害剤または他の活性剤と組み合わせた、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤を用いて、急性アルコール性肝炎、急性薬物誘導性またはウイルス性肝炎、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎、硬化性胆管炎および未知の原因による肝臓の炎症を含む肝炎を治療してもよい。肝臓炎症と関連して、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤はさらに、肝臓類洞上皮を治療するのに有用である。
【０２４７】
［００２７０］さらに、開示するＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、組成物および併用療法を用いて、難聴を伴う多様な障害、および異常なＩＬ−１発現と関連する多様な障害を治療する。例えば、単独の、またはＴＮＦ阻害剤と組み合わせた、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤を用いて、自己免疫プロセスから生じると考えられる、蝸牛神経関連難聴、すなわち自己免疫難聴を治療するかまたは防止してもよい。この状態は、現在、ステロイド、メトトレキセートおよび／またはシクロホスファミドで治療されている。開示するＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、組成物および併用療法でやはり治療可能または防止可能であるのは、メニエール症候群、およびコレステリン腫、難聴としばしば関連する中耳障害である。
【０２４８】
［００２７１］移植と関連する障害もまた、開示するＧＭ−ＣＳＦ阻害剤組成物または併用療法で治療可能または防止可能である。こうした障害には、移植片対宿主疾患、および心臓、肝臓、皮膚、腎臓、肺（肺移植気道閉塞）または骨髄移植片を含む他の移植片などの固形臓器移植から生じる合併症が含まれる。
【０２４９】
［００２７２］目の障害もまた、開示するＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、特にＧＭ−ＣＳＦ抗体、組成物または併用療法で治療可能または防止可能であり、こうした障害には、裂孔原性網膜剥離、ならびに喫煙および黄斑変性と関連する炎症性の目の疾患を含む、炎症性の目の疾患が含まれる。
【０２５０】
［００２７３］ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤組成物および併用療法はまた、女性生殖器系に影響を及ぼす障害を治療するのにも有用である。例には、限定されるわけではないが、多発性着床不全／不妊；胎児消失症候群またはＩＶ胚消失（自然流産）；子癇前症妊娠または子癇；子宮内膜炎、慢性子宮頸管炎、および早期分娩が含まれる。
【０２５１】
［００２７４］さらに、開示するＧＭ−ＣＳＦ阻害剤組成物および併用療法は、座骨神経痛、加齢症状、重度薬物反応（例えば１１−２毒性またはブレオマイシン誘導性肺疾患および線維症）を治療するかまたは防止するために、あるいは心臓または他の手術において、同種赤血球の輸血前、輸血中、または輸血後の炎症反応を抑制するために、あるいは外傷性膝傷害などの肢または関節への外傷性傷害を治療する際に有用である。
【０２５２】
［００２７５］開示するＧＭ−ＣＳＦ阻害剤組成物および併用療法は、中枢神経系における炎症の興奮中に放出される神経毒性神経伝達物質の影響を含む、中枢神経系（ＣＮＳ）傷害を治療するために、そして中枢神経系傷害部位の神経膠瘢痕の発展を阻害するかまたは防止するのに有用である。中枢神経系医学的状態と関連して、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は、側頭葉癲癇を治療する際に有用である。癲癇および癲癇発作の治療と関連して、再発性癲癇発作の重症度および数を減少させ、そして癲癇発作の有害な影響の重症度を減少させる。単独の、または本明細書に記載する剤と組み合わせた、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は、ニューロン減少、ニューロン変性、および癲癇発作と関連する神経膠症を減少させるのに有用である。
【０２５３】
［００２７６］さらに、開示するＧＭ−ＣＳＦ阻害剤組成物および併用療法は、重症疾患多発ニューロパシーおよびミオパシー（ＣＩＰＮＭ）、急性多発ニューロパシー；神経性食欲不振症；ベル麻痺；慢性疲労症候群；クロイツフェルト−ヤコブ病を含む伝染性認知症；脱ミエリン性ニューロパシー；ギラン−バレー症候群；椎間板（vertebral disc）疾患；湾岸戦争症候群；慢性炎症性脱ミエリン性多発ニューロパシー、重症筋無力症；潜在性脳虚血；ナルコレプシーおよび睡眠時無呼吸を含む睡眠障害；慢性神経変性；ならびに脳虚血性疾患を含む脳卒中を治療するのに有用である。
【０２５４】
［００２７７］単独の、または本明細書に記載する活性剤と組み合わせた、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤を投与することによって治療または防止可能な他の疾患および医学的状態には、食欲不振および／または食欲不振性状態、腹膜炎、内毒素血症および敗血症ショック、肉芽腫形成、熱射病、チャーグ−ストラウス症候群、結核およびハンセン病などの急性感染後の慢性炎症、全身性硬化症および肥厚性瘢痕形成が含まれる。さらに、ＩＬ−１阻害剤、ＴＮＦ阻害剤、ＩＦＮ−アルファ、−ベータまたは−ガンマおよび／またはＩＬ−４阻害剤と組み合わせた、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤が、肥厚性瘢痕形成を治療するのに適切である。
【０２５５】
［００２７８］本明細書に開示するＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は、抗体療法、化学療法、放射線療法と関連する毒性、ならびに他のアポトーシス誘導剤、例えばＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＤＥの影響を減少させるのに有用である。
【０２５６】
［００２７９］療法的有効量のＧＭ−ＣＳＦ阻害剤をヒト患者に投与する工程を含む、乾癬性病変を治療するかまたは防止する方法を、本明細書に提供する。治療は、一般的な乾癬または乾癬性関節炎を有する患者で起こる乾癬性病変に対して有効である。
【０２５７】
［００２８０］ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤によって有効に治療される状態は、炎症反応において役割を果たす。肺障害には、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺胞タンパク症、ブレオマイシン誘導性肺障害および線維症、放射線誘導性肺線維症、嚢胞性線維症、肺におけるコラーゲン集積、およびＡＲＤＳが含まれる。ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は、限定されるわけではないが、疱疹状皮膚炎（デューリング病）、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、蕁麻疹（慢性特発性蕁麻疹を含む）、ならびに尋常性天疱瘡および類天疱瘡を含む自己免疫疱疹性疾患を含む、多様な皮膚障害を患う患者を治療するのに有用である。ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤の組み合わせで治療可能な他の疾患には、重症筋無力症、肺サルコイドーシスを含むサルコイドーシス、強皮症、反応性関節炎、超ＩｇＥ症候群、多発性硬化症および特発性過好酸球増加症が含まれる。本発明の療法剤はまた、薬物に対するアレルギー性反応を治療するために、そしてアレルギー免疫療法に対するアジュバントとしても有用である。
【０２５８】
［００２８１］１つの態様において、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤組成物は、神経系の変性状態、例えば多発性硬化症、再発寛解型多発性硬化症、進行性再発型多発性硬化症、一次および二次進行型多発性硬化症を治療するのに有用である。ＧＭ−ＣＳＦをターゲティングすると、多発性硬化症の前臨床モデルにおいて有効であり、そして多発性硬化症において、ＧＭ−ＣＳＦ経路に療法的に介入すると、獲得免疫を残しつつ、単球、マクロファージおよび樹状細胞に対する直接的な効果を介して、ＣＮＳ炎症が減少されうる。ＧＭ−ＣＳＦノックアウトマウスは、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）誘導に耐性である。McQualterら, 2001, J. Exp. Med. 194:873-881。ＧＭ−ＣＳＦを発現するレトロウイルス形質導入Ｔ細胞を養子移植すると、ＥＡＥ悪化が誘導される。Marusicら, 2002, Neurosci. Lett. 332:185-9。ＧＭ−ＣＳＦノックアウトＴ細胞を養子移植すると、ＥＡＥの誘導に失敗する。Ponomarevら, 2007, J. Immunol., 178:39-48。本出願者らは、再発寛解型多発性硬化症のＳＪＬ−ＰＬＰ１３９−１５１ＥＡＥモデルにおいて、抗ネズミＧＭ−ＣＳＦ抗体で予防的に治療すると、アイソタイプ対照モノクローナル抗体での治療に比較して、疾患の発症が有意に遅延され、そしてその発生が減少し、そして体重減少および平均臨床スコアの両方が、減少したことを示した。図１および２を参照されたい。ＳＪＬ／ＰＬＰ  １２５−１５１  ＥＡＥを抗ｍＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体で療法的に治療すると、疾患重症度およびＣＮＳ炎症が有意に減少し、そして回復が加速された。ＳＪＬ−ＰＬＰ  １３９−１５１  ＡＴ−ＥＡＥにおいて抗ｍＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体で予防的および療法的に治療すると、アイソタイプ対照モノクローナル抗体での治療に比較して、平均臨床スコアが減少した。図２を参照されたい。ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤組成物を単独で、あるいは他の薬剤、例えばインターフェロンβ−１ａ（ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）；  Biogen-IdecおよびＲＥＢＩＦ（登録商標）EDM Serono, Inc., Pfizer, Inc.）、インターフェロンβ−１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）；  Bayer Health Care.）、酢酸グラチラマー（ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）；  Teva Pharmaceuticals）および／または抗ＶＬＡ４  ｍＡｂ（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）， Biogen-Idec, Elan）と組み合わせて用いてもよい。
【０２５９】
［００２８２］本発明の１つの態様において、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤（例えばＧＭ−ＣＳＦ抗体）で治療可能であると本明細書に開示する多様な医学的障害を、別のサイトカインまたはサイトカイン阻害剤と組み合わせて治療する。例えば、他の炎症性サイトカインとその受容体の相互作用を阻害する化合物もまた含有する組成物中で、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤を投与してもよい。ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤および他のサイトカイン阻害剤を別個の組成物として投与してもよく、そして同じまたは異なる経路によってこれらを投与してもよい。ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤と組み合わせて用いるサイトカイン阻害剤の例には、例えばＴＧＦ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−６またはＩＬ−８およびＴＮＦ、特にＴＮＦ−アルファに拮抗するものが含まれる。ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤およびＩＬ−６の組み合わせを用いて、ＧＡＢＡ−Ａ受容体拮抗によって誘導される癲癇発作、ＥＥＧ発作エピソードと関連する癲癇発作および癲癇重積症中に起こる運動辺縁系癲癇発作（motor limbic seizures）を含む癲癇発作の再発を治療し、そして防止しうる。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤およびＩＦＮ−ガンマ−１ｂおよび／またはｃ−Ｋｉｔ阻害剤の組み合わせは、特発性肺線維症および嚢胞性線維症を治療するのに有用である。疾患を治療するための他の組み合わせには、ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫ−リガンドの結合に干渉する化合物、例えばＲＡＮＫ：Ｆｃを含むＲＡＮＫ−リガンド阻害剤またはＲＡＮＫの可溶性型を伴うＧＭ−ＣＳＦ阻害剤の使用が含まれる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤およびＲＡＮＫ：Ｆｃの組み合わせは、限定されるわけではないが、多様なリウマチ性障害、骨粗鬆症、多発性骨髄腫、または骨変性を引き起こす他の悪性腫瘍を含む多様な設定において骨破壊を防止するために有用であり、あるいは骨への転移、または人工関節摩耗片または歯周炎と関連する骨破壊を防止することを目的とする抗腫瘍療法に有用である。
【０２６０】
［００２８３］本明細書に記載する、開示するＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、組成物および併用療法は、細菌、ウイルスまたは原生動物感染から生じる副作用および／または合併症を治療するための薬物において有用である。この態様にしたがって、感染が免疫系の過剰な刺激を誘発し、したがってＧＭ−ＣＳＦの産生および／または活性が患者に対して負の影響を生じる場合、感染にさらされた患者におけるＧＭ−ＣＳＦ阻害剤での治療は、感染、または感染を治療するのに用いられる療法剤と関連する、これらの副作用および／または合併症を改善するのに有用である。こうした感染性病原体および感染の限定されない例には、マイコプラズマ肺炎、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳと関連するおよび／またはＡＩＤＳに関連する状態、例えばＡＩＤＳ認知症症候群、ＡＩＤＳ関連消耗、抗レトロウイルス療法によるリポジストロフィー（lipidistrophy）；ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、カポジ肉腫；マラリアおよび住血吸虫症を含む原生動物疾患；癩性結節性紅斑；細菌性またはウイルス性髄膜炎；肺結核を含む結核；および細菌またはウイルス感染に続発性の肺炎；シラミ媒介性回帰熱、例えば回帰熱ボレリア（Borrelia recurrentis）によって引き起こされるもの；ヘルペスウイルス、例えばヘルペス性角膜実質炎、角膜病変；およびウイルス誘導性角質障害；ヒト・パピローマウイルス感染；インフルエンザ感染および感染性単核症である。
【０２６１】
［００２８４］心臓血管障害および傷害は、開示するＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、医薬組成物または併用療法で治療可能および／または防止可能である。特に、心臓血管障害は、単独の、あるいはＴＮＦ阻害剤（例えばＥＮＢＲＥＬ）およびまたは上述のような他の剤と組み合わせた、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤組成物で治療可能である。こうして治療可能な心臓血管障害には大動脈瘤が含まれ；胸部大動脈瘤、急性冠動脈症候群、動脈炎；大脳動脈閉塞を含む血管閉塞；冠動脈バイパス手術の合併症；虚血／再灌流傷害；アテローム硬化性心臓病、慢性自己免疫心筋炎およびウイルス性心筋炎を含む心筋炎を含む心臓病；慢性心不全、鬱血性心不全、心不全の悪液質を含む心不全；心筋梗塞；心臓手術後または頸動脈バルーン血管形成術後の再狭窄および／またはアテローム性動脈硬化症；潜在性心筋虚血；左心室ポンプ機能不全、左心室補助デバイスの移植後合併症；レイノー現象；血栓性静脈炎；川崎血管炎を含む血管炎；静脈閉塞性疾患、巨細胞動脈炎、ヴェゲナー肉芽腫症；心肺バイパス手術後の精神錯乱、およびシェーンライン・ヘノッホ紫斑病が含まれる。ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、ＴＮＦ阻害剤および血管形成阻害剤（例えば抗ＶＥＧＦ）は、動脈瘤および腫瘍などの特定の心臓血管疾患を治療するのに有用である。
【０２６２】
［００２８５］さらに、本ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、組成物および併用療法を用いて、慢性疼痛状態、例えば慢性前立腺炎／骨盤痛症候群を含む慢性骨盤痛を治療する。さらなる例として、本発明のＧＭ−ＣＳＦ阻害剤、ならびに組成物および併用療法を用いて、ヘルペス後疼痛を治療する。
【０２６３】
［００２８６］ヒト患者に加えて、ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤は、非ヒト動物、例えばペット（イヌ、ネコ、小鳥、霊長類など）、家畜農場動物（ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、家禽など）、あるいはＩＬ−１仲介性炎症または関節炎状態を患ういかなる動物の治療にも有用である。こうした例において、動物の体重にしたがって、適切な用量を決定してもよい。例えば、０．２〜１ｍｇ／ｋｇの用量を用いてもよい。あるいは、動物表面積にしたがって用量を決定し、例示的な用量は０．１〜２０ｍｇ／ｍ２の範囲であり、またはより好ましくは、５〜１２ｍｇ／ｍ２の範囲である。小動物、例えばイヌまたはネコに関しては、適切な用量は０．４ｍｇ／ｋｇである。ＧＭ−ＣＳＦ阻害剤（好ましくはレシピエント種に由来する遺伝子から構築される）、または別の可溶性ＩＬ−１受容体模倣体を、注射または他の適切な経路によって、週あたり１回以上、動物の状態が改善されるまで投与するか、あるいは無期限に投与してもよい。
【０２６４】
２．診断法
［００２８７］記載する抗原結合性タンパク質を診断目的で用いて、ＧＭ−ＣＳＦに関連する疾患および／または状態を検出するか、診断するか、または監視してもよい。開示するものは、当業者に知られる古典的免疫組織学的方法を用いて、試料中のＧＭ−ＣＳＦの存在の検出を提供する（例えば、Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol 15  （R.H. BurdonおよびP.H. van Knippenberg監修，  Elsevier，  アムステルダム）；  Zola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158（CRC Press, Inc.）； Jalkanenら, 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; Jalkanenら, 1987, J. Cell Biol. 105:3087-3096）。ＧＭ−ＣＳＦの検出をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行ってもよい。
【０２６５】
［００２８８］本明細書に提供する診断適用には、ＧＭ−ＣＳＦの発現およびリガンドのＧＭ−ＣＳＦへの結合を検出する、抗原結合性タンパク質の使用が含まれる。ＧＭ−ＣＳＦの存在を検出する際に有用な方法の例には、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイが含まれる。
【０２６６】
［００２８９］診断適用のため、抗原結合性タンパク質は、典型的には、検出可能標識基で標識されるであろう。適切な標識基には、限定されるわけではないが、以下：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド・リン光体）、酵素基（例えば、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、または二次レポーターに認識されることがあらかじめ決定されているポリペプチド・エピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ・タグ）が含まれる。いくつかの態様において、多様な長さのスペーサー・アームを介して標識基を抗原結合性タンパク質にカップリングして、潜在的な立体障害を減少させる。タンパク質を標識するための多様な方法が当該技術分野に知られ、そしてこうした方法を用いてもよい。
【０２６７】
［００２９０］開示する１つの側面は、ＧＭ−ＣＳＦを発現する単数または複数の細胞を同定する工程を提供する。特定の態様において、抗原結合性タンパク質を標識基で標識し、そしてＧＭ−ＣＳＦへの標識抗原結合性タンパク質の結合を検出する。さらなる特定の態様において、ＧＭ−ＣＳＦへの抗原結合性タンパク質の結合をｉｎ  ｖｉｖｏで検出する。さらなる特定の態様において、当該技術分野に知られる技術を用いて、ＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を単離し、そして測定する。例えば、HarlowおよびLane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual，  ニューヨーク：  Cold Spring Harbor（１９９１年版および定期的な補遺）；  John E. Coligan監修, 1993, Current Protocols In Immunology  ニューヨーク： John Wiley & Sonsを参照されたい。
【０２６８】
［００２９１］開示する別の側面は、提供する抗原結合性タンパク質と、ＧＭ−ＣＳＦへの結合に関して競合する試験分子の存在を検出する工程を提供する。１つのこうしたアッセイの例は、試験分子の存在下または非存在下で、ＧＭ−ＣＳＦのある量を含有する溶液中で、未結合抗原結合性タンパク質の量を検出する工程を伴う。未結合抗原結合性タンパク質（すなわちＧＭ−ＣＳＦに結合していない抗原結合性タンパク質）の量の増加は、試験分子が、抗原結合性タンパク質とのＧＭ−ＣＳＦの結合に関して競合可能であることを示す。１つの態様において、抗原結合性タンパク質を標識基で標識する。あるいは、試験分子を標識し、そして抗原結合性タンパク質の存在下および非存在下で、未結合試験分子の量を監視する。
【０２６９】
３．治療法：薬学的配合物、投与経路
［００２９２］抗原結合性タンパク質を用いる方法もまた提供する。いくつかの方法において、抗原結合性タンパク質を患者に提供する。抗原結合性タンパク質は、ヒトＧＭ−ＣＳＦへのＧＭ−ＣＳＦＲの結合を阻害する。いくつかの方法において、抗原結合性タンパク質の投与はまた、ＧＭ−ＣＳＦＲのヒトＧＭ−ＣＳＦへの結合を阻害することによって、ヒトＧＭ−ＣＳＦの自己リン酸化も阻害しうる。さらに、特定の方法において、患者に少なくとも１つの抗原結合性タンパク質の有効量を投与することによって、単球走化性が減少する。いくつかの方法における腫瘍内への単球遊走は、抗原結合性タンパク質の有効量を投与することによって阻害される。さらに、本明細書に提供するような抗原結合性タンパク質を投与することによって、腫瘍における腫瘍関連マクロファージの集積が阻害されうる。
【０２７０】
［００２９３］療法的有効量の１つまたは複数の抗原結合性タンパク質および薬学的に許容されうる希釈剤、キャリアー、可溶化剤、乳化剤、保存剤、および／またはアジュバントを含む医薬組成物もまた提供する。さらに、こうした医薬組成物を投与することによって患者を治療する方法が含まれる。用語「患者」には、ヒト患者が含まれる。
【０２７１】
［００２９４］許容されうる配合物質は、使用する投薬型および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。特定の態様において、療法的有効量のヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【０２７２】
［００２９５］特定の態様において、許容されうる配合物質は、好ましくは、使用する投薬型および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。特定の態様において、医薬組成物は、例えば組成物のｐＨ、浸透圧、粘性、透明度、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解速度または放出速度、吸着または浸透を修飾するか、維持するか、または保存するための配合物質を含有してもよい。こうした態様において、適切な配合物質には、限定されるわけではないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）；抗菌剤；酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸など）；充填剤（bulking agent）（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなど）；増量剤（filler）；単糖；二糖；および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン類など）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；着色剤；フレーバー剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール（tyloxapal））；安定性増進剤（スクロースまたはソルビトールなど）；等張化増進剤（tonicity enhancing agent）（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または薬学的アジュバントが含まれる。Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第１８版，（A.R. Genrmo監修）， 1995, Mack Publishing Companyを参照されたい。
【０２７３】
［００２９６］特定の態様において、最適医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に応じて、当業者によって決定されるであろう。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、上記を参照されたい。特定の態様において、こうした組成物は、開示する抗原結合性タンパク質の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼしうる。特定の態様において、医薬組成物中の主なビヒクルまたはキャリアーは、水性または非水性いずれであってもよい。例えば、適切なビヒクルまたはキャリアーは、注射用水、生理学的食塩水溶液または人工的脳脊髄液であって、場合によって非経口投与用の組成物において一般的な他の物質が補充されているものであることも可能である。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水が、さらなる典型的なビヒクルである。特定の態様において、医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、そしてこれらはソルビトールまたは適切な代用物をさらに含んでもよい。特定の態様において、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形で、場合による配合剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences、上記）と、望ましい度合いの純度を有する、選択した組成物を混合することによって、保存用のヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質組成物を調製してもよい。さらに、特定の態様において、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて、ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を凍結乾燥物として配合してもよい。
【０２７４】
［００２９７］医薬組成物を非経口送達用に選択してもよい。あるいは、吸入または消化管を通じた送達のため、例えば経口送達のため、組成物を選択してもよい。こうした薬学的に許容されうる組成物の調製は、当該技術分野の技術範囲内である。
【０２７５】
［００２９８］配合物構成要素は、好ましくは、投与部位に許容されうる濃度で存在する。特定の態様において、緩衝液を用いて、生理学的ｐＨまたはわずかにより低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に、組成物を維持する。
【０２７６】
［００２９９］非経口投与が意図される場合、療法組成物は、薬学的に許容されうるビヒクル中の所望のヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を含む、発熱物質不含の、非経口的に許容されうる水溶液の形で提供されてもよい。非経口注射に特に適したビヒクルは、無菌蒸留水であり、この中でヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質は、適切に保存された無菌等張溶液として配合される。特定の態様において、調製物は、産物の徐放または持続放出を提供し、産物が蓄積注射（depot injection）を介して送達されうる、注射可能微小球体、生体浸食性粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどの剤と所望の分子の配合を伴ってもよい。特定の態様において、ヒアルロン酸もまた使用可能であり；これは循環中にある期間の維持を促進する効果を有しうる。特定の態様において、移植可能薬剤送達デバイスを用いて、所望の抗原結合性タンパク質を導入してもよい。
【０２７７】
［００３００］特定の医薬組成物は吸入用に配合される。いくつかの態様において、ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質は、乾燥吸入可能粉末として配合される。特定の態様において、また、ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質吸入溶液をエアロゾル送達用の噴霧剤（propellant）とともに配合してもよい。特定の態様において、溶液を噴霧してもよい。したがって、肺投与および配合法が、ＰＣＴ公報第ＷＯ９４／２００６９号にさらに記載され、そして該文献は、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達を記載する。いくつかの配合物を経口投与してもよい。この方式で投与可能なヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を、錠剤およびカプセルなどの固形投薬型の配合において、通例用いられるキャリアーを含むかまたは含まずに配合してもよい。特定の態様において、生物学的利用能が最大になり、そして前全身分解が最小限になる胃腸管の地点で配合物の活性部分を放出するように、カプセルを設計してもよい。ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質の吸収を促進するため、さらなる剤を含めてもよい。希釈剤、フレーバー剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤（binder）もまた、使用可能である。
【０２７８】
［００３０１］いくつかの医薬組成物は、錠剤の製造に適した非毒性賦形剤と混合された、有効量の１つまたは複数のヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を含む。錠剤を、無菌水、または別の適切なビヒクル中に溶解することによって、単位用量型で溶液を調製することも可能である。適切な賦形剤には、限定されるわけではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；あるいはデンプン、ゼラチン、またはアカシアなどの結合剤；あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなどの潤滑剤が含まれる。
【０２７９】
［００３０２］さらなる医薬組成物が当業者に明らかであり、こうした組成物には、持続送達または徐放送達配合物中のヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を伴う配合物が含まれる。多様な他の持続送達または徐放送達手段、例えばリポソームキャリアー、生体浸食性微小粒子または多孔ビーズおよび蓄積注射を配合する技術もまた、当業者に知られる。例えば、医薬組成物を送達するための多孔ポリマー性微小粒子の徐放を記載する、ＰＣＴ公報第ＷＯ９３／１５７２２号を参照されたい。持続放出調製物には、成型物品、例えばフィルムまたは微小カプセルの形の半透性ポリマーマトリックスが含まれることも可能である。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公報第ＥＰ  ５８，４８１号に開示されるようなもの）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ・エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Sidmanら, 1983, Biopolymers 2:547-556）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Langerら, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277;およびLangerら, 1982, Chem. Tech. 12:98-105）、エチレン酢酸ビニル（Langerら、1981、上記）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公報第１３３，９８８号）が含まれることも可能である。持続放出組成物にはまた、当該技術分野に知られる任意のいくつかの方法によって調製可能なリポソームも含まれてもよい。例えばEppsteinら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692；欧州特許出願公報第ＥＰ  ０３６，６７６号；第ＥＰ  ０８８，０４６号；第ＥＰ  １４３，９４９号を参照されたい。
【０２８０】
［００３０３］ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に用いようとする医薬組成物は、典型的には無菌調製物として提供される。滅菌は、無菌ろ過膜を通じたろ過によって達成可能である。組成物を凍結乾燥する場合、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥および再構成前またはその後のいずれに行うことも可能である。投与用の組成物を、凍結乾燥型で、または溶液中で保存することも可能である。非経口組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば静脈内溶液バッグ、または皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアル中に入れられる。
【０２８１】
［００３０４］医薬組成物を配合したら、溶液、懸濁物、ゲル、エマルジョン、固体、結晶、あるいは脱水または凍結乾燥粉末として、無菌バイアル中で保存することも可能である。こうした配合物は、すぐに使える型、または投与前に再構成される型（例えば凍結乾燥型）のいずれで保存することも可能である。単回用量投与単位を生じるキットもまた提供する。特定のキットは、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性配合物を有する第二の容器を含有することも可能である。特定の態様において、単一チャンバーおよび多チャンバーのあらかじめ充填されたシリンジ（例えば液体シリンジおよびリオシリンジ（lyosyringes））を含有するキットを提供する。
【０２８２】
［００３０５］ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を含有する使用すべき医薬組成物の療法的有効量は、例えば、療法背景および目的に応じるであろう。当業者は、治療に適した投薬レベルが、部分的に、送達する分子、ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を用いようとする徴候、投与経路、ならびに患者の大きさ（体重、体表面積または臓器の大きさ）および／または状態（年齢および全身の健康状態）に応じて多様であろうことを認識するであろう。特定の態様において、臨床医は、投薬量を滴定し、そして投与経路を修正して、最適療法効果を得ることも可能である。
【０２８３】
［００３０６］典型的な投薬量は、上述の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまで、またはそれより多い範囲であることも可能である。特定の態様において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまで、場合によって１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまで、場合によって１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまで、場合によって約０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、または場合によって約０．３ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇの範囲であることも可能である。
【０２８４】
［００３０７］投薬頻度は、用いる配合物中の特定のヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質の薬物動態学パラメーターに応じるであろう。典型的には、望ましい効果を達成する投薬量に達するまで、臨床医が組成物を投与する。したがって、単回用量として、または長期に渡る２回以上の用量として（所望の分子の同量を含有してもまたはしなくてもよい）、あるいは移植デバイスまたはカテーテルを介した連続注入として、組成物を投与してもよい。適切な用量−反応データを使用して、適切な投薬量を確定することも可能である。特定の態様において、抗原結合性タンパク質を長期間に渡って患者に投与してもよい。抗原結合性タンパク質の慢性投与は、完全にヒトではない、例えば非ヒト動物においてヒト抗原に対して作製された抗体、例えば非完全ヒト抗体または非ヒト種で産生された非ヒト抗体と一般的に関連する、不都合な免疫またはアレルギー性反応を最小限にする。
【０２８５】
［００３０８］医薬組成物の投与経路は、既知の方法にしたがい、例えば経口投与、注射を通じた、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内経路によるもの；持続放出系によるもの、または移植デバイスによるものである。特定の態様において、ボーラス（bolus）注射によって、または注入によって連続して、または移植デバイスによって組成物を投与してもよい。
【０２８６】
［００３０９］また、所望の分子が吸着されるかまたは被包される膜、スポンジまたは別の適切な物質の移植を介して、組成物を局所的に投与してもよい。移植デバイスを用いる特定の態様において、任意の適切な組成または臓器内にデバイスを移植してもよいし、そして所望の分子の送達は、拡散、持続放出型ボーラス、または連続投与によってもよい。
【０２８７】
［００３１０］また、開示するｅｘ  ｖｉｖｏ方式でヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質医薬組成物を用いることが望ましい可能性もある。こうした場合、患者から除去された細胞、組織、または臓器をヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質医薬組成物に曝露し、その後、細胞、組織および／または臓器を、続いて患者に移植しなおす。
【０２８８】
［００３１１］特に、本明細書に記載するものなどの方法を用いて、遺伝子操作した特定の細胞を移植して、ポリペプチドを発現させ、そして分泌させることによって、ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原結合性タンパク質を送達してもよい。特定の態様において、こうした細胞は、動物細胞またはヒト細胞であってもよいし、そして自己、異種（heterologous、またはxenogeneic）であってもよい。特定の態様において、細胞を不死化してもよい。他の態様において、免疫学的応答の可能性を減少させるため、細胞を被包して、取り巻く組織の浸潤を回避することも可能である。さらなる態様において、被包物質は、典型的には、生体適合性半透性ポリマー封入物または膜であり、これらはタンパク質産物（単数または複数）の放出を可能にするが、患者免疫系による、または取り巻く組織からの他の有害な因子による、細胞の破壊を防止する。
【０２８９】
［００３１２］同定するすべての特許および他の刊行物は、例えば、記載するものと関連して用いられうる刊行物中に記載される方法論を記載しそして開示する目的のため、本明細書に完全に援用される。これらの刊行物は、本出願の出願日前の開示に関してのみ提供される。これに関連して、先行発明によって、またはいかなる他の理由によっても、本発明者らがこうした開示に先行することの権利を与えられていないことの承認と見なされてはならない。これらの文書の日付に関する言及または内容に関する説明はすべて、本出願者らに利用可能な情報に基づき、そしてこれらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。
【０２９０】
［００３１３］行う実験および得られる結果を含む以下の実施例は、例示目的のためにのみ提供され、そして付随する請求項の範囲を限定するとみなしてはならない。
【実施例】
【０２９１】
実施例１  抗ＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体の生成、選択および性質決定のために用いるＧＭ−ＣＳＦおよび他の分子の説明
［００３１４］いくつかの異なる組換えおよび天然ＧＭ−ＣＳＦ分子を用いて、抗ＧＭ−ＣＳＦハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を生成し、選択し、そして性質決定した。
【０２９２】
ヒトＧＭ−ＣＳＦ
［００３１５］１１７位の単一アミノ酸が異なる、ヒトＧＭ−ＣＳＦの２つの天然存在アレル変異体がある。アミノ酸１１７位にスレオニン（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｔｈｒ、配列番号１４６）またはイソロイシン（ＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅ、配列番号１４５）のいずれかを持つ組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ分子を一過性トランスフェクションＣＨＯまたはＣＯＳ細胞から産生し、そしてアフィニティ精製した。ＰＭＡ（０．０１μｇ／ｍｌ）、イオノマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）およびＥＧＦ（０．０２μｇ／ｍｌ）で刺激した後のＡ４３１細胞の上清から、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍＬ）で４８時間３７℃で刺激した後のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の上清から、またはＴＮＦα（２５ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激したヒト小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）の上清から、天然ヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｎｈＧＭ−ＣＳＦ）をアフィニティ精製した。大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。アミノ酸２３位でアルギニンに対するロイシンの置換を有する酵母由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））をBerlex, Inc.（ニュージャージー州モンビル）から購入した。大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ２３Ｌは、アミノ酸２３位でアルギニンに対するロイシンの置換を有する大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦである。酵母由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、ｎｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））、大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦおよび大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ２３Ｌは、ＴＦ−１  ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおいて、同等のＧＭ−ＣＳＦ活性を示した。
【０２９３】
［００３１６］カニクイザルＧＭ−ＣＳＦ
［００３１７］組換えカニクイザルＧＭ−ＣＳＦ（ｒｃｙｎｏＧＭ−ＣＳＦ、配列番号５３）をトランスフェクション大腸菌から産生した。ＴＮＦα（２５ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した後の刻んだ肺組織上清から、またはＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍＬ）で４８時間３７℃で刺激した後のカニクイザルＰＢＭＣ上清から、天然カニクイザルＧＭ−ＣＳＦ（ｎｃｙｎｏＧＭ−ＣＳＦ）をアフィニティ精製した。
【０２９４】
イヌＧＭ−ＣＳＦ
［００３１８］イヌＧＭ−ＣＳＦ（配列番号５４）を形質転換大腸菌から産生し、そして標準的カラムクロマトグラフィーを用いて、封入体から精製した。
【０２９５】
ウサギＧＭ−ＣＳＦ
［００３１９］Ｈｉｓタグを含む組換えウサギＧＭ−ＣＳＦ（配列番号８２）を２９３６Ｅ細胞から産生し、そして５ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２で洗浄し、そしてイミダゾール勾配（１０ｍＭ〜３００ｍＭ）で溶出させることによって、ＴａｌｏｎコバルトＩＭＡＣにより精製した。
【０２９６】
マウスＧＭ−ＣＳＦ
［００３２０］組換えマウスＧＭ−ＣＳＦ（配列番号５８）を形質転換酵母細胞から生成し、そして３つのカラムクロマトグラフィー工程：ＳＰ−Sepharose（捕捉）、Ｃ１８（逆相精製）およびＳＰ−Sepharose（緩衝液交換）で精製した。
【０２９７】
ラットＧＭ−ＣＳＦ
［００３２１］組換えラットＧＭ−ＣＳＦをR&D Systemsから購入した。
アフィニティ精製
［００３２２］抗ＧＭＣＳＦ  ｍＡｂ（Ｍ８）アフィニティ樹脂上で上清を循環させ、クエン酸Ｎａ  ｐＨ６．０で洗浄し、そしてクエン酸Ｎａ  ｐＨ４．５で溶出させることによって、刺激した細胞の上清からのＧＭ−ＣＳＦのアフィニティ精製を行った。適切な分画をプールし、そしてＰＢＳに緩衝液交換した。組換えＧＭ−ＣＳＦの濃度をＯＤ２８０によって決定する一方、天然ＧＭ−ＣＳＦの濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。
【０２９８】
抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂの性質決定に用いた非ＧＭ−ＣＳＦ試薬
［００３２３］組換えヒトＣＳＦ−１をR&D Systemsから購入した。トランスフェクションしたＣＨＯ細胞から組換えｈＩＬ−１５を生成し、そして２カラム工程の精製プロセスを用いて精製した。Fractogel TMAE 650Mを１０ｍｇ／ｍｌ樹脂ｐＨ７．５で装填し、次いで２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、次いで２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５、次いで１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＭＥＳで洗浄して、陰イオン交換精製を行った。組換えｈＩＬ−１５を２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５で溶出させた。１０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４  ｐＨ２．０で１時間タンパク質を維持し（ウイルス不活性化工程）、次いで、Fractogel EMD SO3-650(M)を２０ｍｇ／ｍｌ樹脂、１０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４  ｐＨ２．０で装填する陽イオン交換精製工程に供し、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、１０ｍＭ酢酸Ｎａ、１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ４．０で洗浄し、そして１０ｍＭクエン酸Ｎａ、１０ｍＭ酢酸Ｎａ、１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０で勾配溶出させ、そしてＰＢＳに緩衝液交換した。
【０２９９】
実施例２  中和性ヒト抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の生成および選択
２．１  免疫およびＧＭ−ＣＳＦ結合性ハイブリドーマの選択
［００３２４］ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を用いて、ヒトＧＭ−ＣＳＦに対して向けられる完全ヒト・モノクローナル抗体の開発を行った。１０ＫＬ  Ｘｅｎｏｍｉｃｅの２つの別個のコホートを、各々、大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、または哺乳動物細胞由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩｌｅおよびｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｔｈｒの交互の注射のいずれかで、３〜４日ごとに７週間（全部で１６回の注射）免疫した。７回目および１１回目の追加免疫後に、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、血清力価を監視し、そしてハイブリドーマを生成するため、１６回目の追加免疫の４日後、最高の力価を持つマウス由来の脾臓細胞をパートナー細胞株に融合させた。ＧＭ−ＣＳＦに対する結合に関して、生じたポリクローナル・ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、そしてヒト重鎖ならびにカッパおよび／またはラムダ軽鎖の存在に関してＡｌｐｈａ  ｓｃｒｅｅｎによってスクリーニングした。免疫キャンペーンによって、ヒト重鎖および軽鎖を発現するＧＭ−ＣＳＦ結合活性を持つ４９９の株が生じた。
【０３００】
２．２  ｈＧＭ−ＣＳＦ依存性細胞に基づくバイオアッセイを用いた、ＧＭ−ＣＳＦ中和活性を持つハイブリドーマの同定
［００３２５］細胞に基づく２つのバイオアッセイ：ＴＦ−１細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ誘導性ＳＴＡＴ５リン酸化（２．２．１）およびＡＭＬ−５細胞のＧＭ−ＣＳＦ誘導性増殖（２．２．２）を用いて、ＧＭ−ＣＳＦ中和活性に関して、４９９のハイブリドーマ上清をさらに性質決定した。これらの結果から、１４のハイブリドーマをクローニング用に選択した。
【０３０１】
２．２．１  ＴＦ−１細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ誘導性ＳＴＡＴ−５リン酸化の阻害
［００３２６］５％ＦＢＳ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５５μＭベータ−メルカプトエタノール、および１０ｎｇ／ｍＬ大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦを補ったＩＭＤＭ中、３７℃、１０％ＣＯ２で、ＴＦ−１細胞を増殖させた。アッセイの１日前、３５０ｘｇで６分間遠心分離することによって、ＴＦ−１細胞を採取し、そしてＰＢＳ中で３回洗浄した。１ｘ１０６／ｍＬで細胞を再懸濁し、そしてＧＭ−ＣＳＦを含まずに、ＩＭＤＭ＋０．５％ＦＢＳ中、３７℃、１０％ＣＯ２で一晩培養した。１００μＬ総体積中、２ｍＬ  ９６ウェル丸底プレート中で、アッセイを実行した。ハイブリドーマ上清を１：４の最終希釈で二つ組にプレーティングし、そしてｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅ（０．４ｎｇ／ｍＬ最終濃度）と、３７℃で３０分間インキュベーションした。血清およびＧＭ−ＣＳＦ枯渇ＴＦ−１細胞を採取し、ＰＢＳ中で洗浄し、そして０．５％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ中に、６ｘ１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。５０μＬの細胞懸濁物を添加し（３ｘ１０５細胞／ウェル）、そしてプレートを３７℃で１５分間インキュベーションした。細胞を固定するため、２５μＬのＰＢＳ中の１０％パラホルムアルデヒドを添加して、最終濃度２％のパラホルムアルデヒドとし、そしてプレートを３７℃で１５分間インキュベーションした。２００μＬ  ＩＭＤＭ＋０．５％ＦＢＳをウェルに添加して固定を停止し、そしてプレートを３５０ｘｇで７分間遠心分離した。細胞上清を取り除き、そして４００μＬの９０％ＭｅＯＨをゆっくりと添加する一方、細胞を激しく混合した。−２０℃で一晩インキュベーションした後、プレートを回転させ、４００μＬ  ＰＢＳ／２％ＦＣＳで洗浄し、そして抗ホスホＳＴＡＴ５−Ａｌｅｘａ４８８（Becton Dickinson 612598、ニュージャージー州フランクリンレークス）の５０μＬの１：５希釈（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ中）と室温で３０分間インキュベーションした。細胞を洗浄し、２％ＦＢＳを含むＰＢＳ中に再懸濁し、そしてMultiWell FACScalibur（Becton Dickinson）を用いたフローサイトメトリー分析のため、丸底マイクロタイタープレートに移した。ＦｌｏｗＪｏ  ＦＡＣＳ分析ソフトウェアを用いて、ＳＴＡＴ５＋細胞パーセントを決定した。以下の等式を用いて、ハイブリドーマ上清によるＳＴＡＴ５リン酸化の阻害パーセントを計算した：
１００−（｛［ＡのＳＴＡＴ５＋の％  −  ＢのＳＴＡＴ５＋の％］／［ＣのＳＴＡＴ５＋の％  −  ＢのＳＴＡＴ５＋の％］｝＊１００）
式中、Ａ＝細胞＋ハイブリドーマ上清＋ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、Ｂ＝細胞のみ、Ｃ＝細胞＋ｒｈＧＭ−ＣＳＦ
［００３２７］ＧＭ−ＣＳＦ依存性ＳＴＡＴ５リン酸化を、各アッセイに関して決定された閾値よりも大きく阻害したハイブリドーマ上清を、ＩＬ−３誘導性ＳＴＡＴ５リン酸化を用いて特異性に関して、そしてＴＦ−１ホスフローバイオアッセイおよびＡＭＬ−５細胞株ＧＭ−ＣＳＦ誘導性増殖バイオアッセイ（２．２．２）を用いてｎｈＧＭ−ＣＳＦおよびｒｃｙｎｏＧＭ−ＣＳＦに対する強度に関して、さらに性質決定した。ＧＭ−ＣＳＦ依存性ホスホ−ＳＴＡＴ５応答および抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体（ＭＡＢ２１５、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）が０．４ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅによって誘導されるＳＴＡＴ５リン酸化を阻害する能力を示す代表的な実験を図３に示す。図４は、大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦで免疫したコホート由来のハイブリドーマ上清によるｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅ誘導性ＳＴＡＴ５リン酸化の阻害パーセントのヒストグラムを示す。
【０３０２】
２．２．２  ハイブリドーマ上清によるＡＭＬ−５細胞のＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖の阻害
［００３２８］５％ＦＢＳ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５５μＭベータ−メルカプトエタノール、および１０ｎｇ／ｍＬ大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦを補ったＩＭＤＭ中、３７℃、１０％ＣＯ２で、ＡＭＬ−５細胞を増殖させた。実験当日、ＡＭＬ−５細胞を３５０ｘｇで５分間遠心分離し、そしてＰＢＳ中で４回洗浄して残ったＧＭ−ＣＳＦを除去した。ＧＭ−ＣＳＦまたはＣＳＦ−１が誘導するＡＭＬ−５細胞の増殖の阻害に関して試験するため、１：１０および／または１：３０および／または１：９０の最終希釈で９６ウェル平底マイクロタイタープレート中に二つ組でポリクローナル・ハイブリドーマ上清をプレーティングし、そしてあらかじめ決定されたＥＣ９０値でサイトカインを添加した：Ａ４３１細胞由来ｎｈＧＭ−ＣＳＦおよびｒｃｙｎｏＧＭ−ＣＳＦ、０．０５ｎｇ／ｍＬ；  ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩｌｅおよびｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｔｈｒ、０．１５ｎｇ／ｍＬ；ならびにｒｈＣＳＦ−１、１０ｎｇ／ｍＬ。抗体／サイトカイン混合物を３７℃で３０分間インキュベーションした後、総体積１００μＬに対して５ｘ１０４細胞／ｍＬのＡＭＬ−５細胞を５０μＬ添加した（２．５ｘ１０３細胞／ウェル）。プレートを３７℃、１０％ＣＯ２で７２時間インキュベーションした。ＡＭＬ−５細胞増殖を検出するため、プレートを１マイクロキュリーのトリチウム化チミジンでパルス処理し、６時間後に採取し、そして液体シンチレーションカウンター上で読み取った。以下の等式を用いて、ハイブリドーマ上清によるＡＭＬ−５増殖の阻害パーセントを計算した：
１００−（｛ＡのＣＰＭ／ＢのＣＰＭ｝＊１００）
式中、Ａ＝細胞＋ハイブリドーマ上清＋サイトカイン、そしてＢ＝細胞＋サイトカイン
［００３２９］１：３０希釈で、ヒトおよびカニクイザルＧＭ−ＣＳＦが誘導するＡＭＬ−５細胞増殖の両方を強力に阻害するが、ヒトＣＳＦ−１が誘導するＡＭＬ−５細胞増殖を阻害しないハイブリドーマ上清をクローニングのために選択して、モノクローナル抗ＧＭ−ＣＳＦハイブリドーマを生成した。ＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖応答および抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体（ＭＡＢ２１５、R&D Systems）が、０．１５ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅによって誘導されたＡＭＬ−５細胞増殖を阻害する能力を示す代表的な実験を図５に示す。
【０３０３】
２．３  モノクローナル・ハイブリドーマ細胞株の生成
［００３３０］バイオアッセイスクリーニングからの結果に基づいて、１４のポリクローナル・ハイブリドーマ株を、限界希釈によるモノクローナル性までのクローニングのために選択した。ポリクローナル・ハイブリドーマ・プレート由来の細胞を計数し、４８細胞／ｍＬで再懸濁し、そして２０ｍＬ培地中、２４細胞／ｍＬ、４．８細胞／ｍＬおよび２．４細胞／ｍＬに希釈した。２００μｌ／ウェルで細胞をプレーティングし、クローニングした各株に関して４つの異なる密度のプレートを生成した（１０細胞／ウェル、５細胞／ウェル、１細胞／ウェル、および０．５細胞／ウェル）。クローニング後、２週間以内に、プレートを顕微鏡下で視覚的に検査し、そして単一のコロニーのみが検出される、１細胞／ウェルおよび０．５細胞／ウェルのクローニングプレートから上清を採取した。ＥＬＩＳＡによって抗原特異性に関して上清をスクリーニングし、そしてＥＬＩＳＡによって抗原陽性上清を、重鎖および軽鎖種ならびにアイソタイプ組成に関して、分析した。ウェル中での単一コロニー増殖、抗原特異的免疫反応性、ならびにヒト・ラムダまたはカッパおよびＩｇＧ組み合わせのみを示した各株由来の１〜３の娘クローンを維持し、そして凍結した。各娘クローンの配列分析によって、モノクローナル性を確認した。
【０３０４】
２．４  モノクローナル・ハイブリドーマ上清から精製された抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体によるＧＭ−ＣＳＦ中和活性の性質決定
２．４．１  ハイブリドーマ上清からのＩｇＧの精製
［００３３１］プロテインＡカラムクロマトグラフィーを用いて、モノクローナル・ハイブリドーマ上清からＩｇＧをアフィニティ精製し、そしてNanoDrop ND-1000 UV-Vis分光光度計を用いて、Ａ２８０で定量化した（Nanodrop Technologies、デラウェア州ウィルミントン）。
【０３０５】
２．４．２  モノクローナル抗体によるＡＭＬ−５細胞のＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖の阻害
［００３３２］ＡＭＬ−５細胞を増殖させ、そして実施例２．２．２に記載するようなアッセイのために調製した。ハイブリドーマ上清から精製したモノクローナル抗体が、ＧＭ−ＣＳＦまたはＣＳＦ−１が誘導するＡＭＬ−５細胞の増殖を阻害する能力を評価するため、抗体を各々、９６ウェル平底プレート中、二つ組で力価決定した（５μｇ／ｍＬで始まる８倍連続希釈）。あらかじめ決定されたＥＣ９０値でサイトカインを添加した：ｎｈＧＭ−ＣＳＦ（Ａ４３１またはヒトＰＢＭＣ由来）、０．１ｎｇ／ｍＬ；  ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅ、０．３ｎｇ／ｍＬ；  ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｔｈｒ、０．８ｎｇ／ｍＬ；  ｒＣｙｎｏＧＭ−ＣＳＦ、０．０５ｎｇ／ｍＬ；およびｒｈＣＳＦ−１、３ｎｇ／ｍＬ。各実験において、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣＳＦ−１をまた、２倍連続希釈でも力価決定して、その実験におけるＥＣ９０値を計算した。サイトカインおよび抗体を３７℃で３０分間インキュベーションした後、総体積１００μＬ中、ＡＭＬ−５細胞を２．５ｘ１０４細胞／ｍＬで添加した。プレートを３７℃、１０％ＣＯ２でインキュベーションした。３日後、プレートを１マイクロキュリーのトリチウム化チミジンでパルス処理し、６時間後に採取し、そして液体シンチレーションカウンター上で読み取った。以下の等式を用いて、ハイブリドーマ上清から精製したｍＡｂによるＡＭＬ−５増殖の阻害パーセントを計算した：
（｛ＡのＣＰＭ  −  ＢのＣＰＭ  ／  ＡのＣＰＭ  −  ＣのＣＰＭ｝）＊１００
式中、Ａ＝細胞＋サイトカイン、Ｂ＝細胞＋ｍＡｂ＋サイトカイン、そしてＣ＝細胞のみ。
【０３０６】
［００３３３］Microsoft Excel（ワシントン州レッドモンド）を用いて、非線形回帰分析および増殖の５０％阻害（ＩＣ５０）値計算を行った。細胞を刺激するのに用いたサイトカインの量が、そのＥＣ９０値の２倍以内である実験を用いて、モノクローナル・ハイブリドーマ抗体の平均ＩＣ５０値を計算した（表５）。同じｍＡｂの１以上のクローン（配列によって確認されるようなもの）を用いた実験を平均に含めた。
【０３０７】
表５  ＡＭＬ−５増殖およびＴＦ−１  Ｓｔａｔ５リン酸化アッセイにおける、ハイブリドーマ上清から精製したｍＡｂに関するＩＣ５０（ｎＭ）値の表
【０３０８】
【表５】
2010538676.tif 000009
【０３０９】
［００３３４］図６および表５に示すように、ハイブリドーマ上清由来のいくつかのモノクローナル抗体は、ＧＭ−ＣＳＦが誘導するＡＭＬ−５細胞増殖を用量依存方式で阻害したが、ＣＳＦ−１が誘導する増殖は阻害しなかった。増殖の最大半量阻害に適合させることによって、このアッセイで試験したＧＭ−ＣＳＦの型に対して、モノクローナル抗体は、＜１ｎＭのＩＣ５０値を有した。
【０３１０】
２．４．３  ハイブリドーマ上清から精製した抗ＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体による、ＴＦ−１細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ依存性ＳＴＡＴ−５リン酸化の阻害
［００３３５］ＴＦ−１細胞を増殖させ、そして実施例２．２．１に記載するようなアッセイのために調製した。ＧＭ−ＣＳＦまたはｒｈＩＬ−３が誘導するＴＦ−１細胞のＳＴＡＴ５リン酸化の阻害を評価するため、ハイブリドーマ上清から精製したモノクローナル抗体を各々、９６ウェル丸底深ウェルプレート中、二つ組で力価決定した（２μｇ／ｍＬで始まる５倍連続希釈）。あらかじめ決定されたＥＣ９０値でサイトカインを添加した：  ｎｈＧＭ−ＣＳＦ（Ａ４３１）およびｒｃｙｎｏＧＭ−ＣＳＦ、０．３ｎｇ／ｍＬ；  ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−ＩｌｅおよびｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｔｈｒ、０．９ｎｇ／ｍＬ；ならびにｒｈＩＬ−３、３０ｎｇ／ｍＬ。各アッセイにおいて、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３をまた、２倍連続希釈でも力価決定して、各アッセイにおけるＥＣ９０値を計算した。サイトカインおよび抗体を３７℃で３０分間インキュベーションした後、総体積１００μＬ中、血清およびＧＭ−ＣＳＦ枯渇ＴＦ−１細胞を３ｘ１０５細胞／ｍＬで添加した。細胞を３７℃で１５分間刺激し、次いで固定し、透過処理して、そして実施例２．２．１に記載するようにＳＴＡＴ５リン酸化に関して分析した。以下の等式を用いて、クローン性ハイブリドーマ上清から精製したｍＡｂによるＳｔａｔ５リン酸化の阻害パーセントを計算した：
（［ＡのＳｔａｔ５＋の％  −  ＢのＳｔａｔ５＋の％］  ／  ［ＡのＳｔａｔ５＋の％  −  ＣのＳｔａｔ５＋の％］＊１００）
式中、Ａ＝細胞＋サイトカイン、Ｂ＝細胞＋ｍＡｂ＋サイトカイン、そしてＣ＝細胞のみ
［００３３６］ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０１を用いて、非線形回帰分析および増殖の最大半量阻害（ＩＣ５０ｈｍ）値計算を行った。細胞を刺激するのに用いたサイトカインの量が、そのＥＣ９０値の２倍以内である実験を用いて、モノクローナル抗体の平均ＩＣ５０値を計算した（表５）。
【０３１１】
［００３３７］図７および表５に示すように、いくつかのモノクローナル抗体は、ＧＭ−ＣＳＦが誘導するＴＦ−１細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を用量依存方式で阻害したが、ｒｈＩＬ−３が誘導する増殖は阻害しなかった。このアッセイで試験したＧＭ−ＣＳＦの型に対して、モノクローナル抗体は、＜０．３ｎＭのＩＣ５０ｈｍ値を有した。
【０３１２】
実施例３  クローニングおよびトランスフェクション細胞株からの組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の発現
［００３３８］抗体クローンに関する重鎖および軽鎖可変領域をヒトＩｇＧ２フレームワーク内にサブクローニングし、そしてＣＯＳ（一過性トランスフェクション）またはＣＨＯ（安定トランスフェクション）細胞において、一過性にまたは安定にトランスフェクションして、そして発現させた。ＴＢＳ、ｐＨ７．４中で、２．２ｘ１０ｃｍ  MabSelectSure rProtein Aに結合させ、そして５０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．４＋／−０．２で溶出させて、ＣＯＳ細胞における一過性トランスフェクションによって発現された抗体を上清から精製した。１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基ストックｐＨ８．０を用いて、溶出物をｐＨ６．０に調整し、そして透析を用いて、１０ｍＭ酢酸、９％スクロース、ｐＨ５．２に緩衝液交換した。１つのクローンを、続いて、１０ｍＭ  ＫＰ、１６１ｍＭ  Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ７．６を有する緩衝液に透析し、そして次いで２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【０３１３】
［００３３９］ＴＢＳ、ｐＨ７．４中で、１．１ｘ１０ｃｍ  MabSelectSure rProtein Aに結合させ、そして１００ｍＭ酢酸、ｐＨ３．６で溶出させて、安定ＣＨＯ細胞株から発現された抗体を上清から精製した。ＧＥ脱塩カラムを用いて、溶出物５ｍｇを１０ｍＭアセテート、９％スクロース、ｐＨ５．２に緩衝液交換した。次いで、ＧＥ脱塩を用いて、２０〜３０ｍｇの物質をＣｅｌｌｇｒｏ  ＰＢＳ、ｐＨ７．２に緩衝液交換した。プールを０．２ミクロンろ過した。２回目に、第二の安定細胞トランスフェクションからの材料を精製し、そして１０ｍＭ酢酸、９％スクロース、ｐＨ５．２緩衝液中で維持した。
【０３１４】
実施例４  表面プラズモン共鳴による、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅへの組換えｍＡｂの動力学的結合分析
［００３４０］ＣＭ４センサーチップを備えたBiacore 3000装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、スウェーデン・ウプサラ）を用い、２５℃で表面プラズモン共鳴を用いて、抗ＧＭ−ＣＳＦ組換えモノクローナル抗体の動力学的結合分析を行った。泳動緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰを用い、標準的アミンカップリング化学反応を用いて、ヤギ抗ヒトＩｇＧ捕捉抗体をチップに共有的に固定した。簡潔には、０．１Ｍ  ＮＨＳおよび０．４Ｍ  ＥＤＣの１：１（ｖ／ｖ）混合物、フロー速度５μＬ／分で、各フローセルを７分間活性化した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中、３０μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧを、２つのフローセル上に、〜３２００ＲＵの密度で固定した。１Ｍエタノールアミンを５μＬ／分で７分間注入して、残った反応表面を脱活性化した。５０μＬの１０ｍＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ１．５を各フローセル上に１００μＬ／分で３回注入して、残った非共有結合捕捉抗体を取り除き、そして各表面を調えた。残りのすべての工程に関して、泳動緩衝液を、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡおよび２ｍｇ／ｍＬ  ＣＭ−デキストランを含むＨＢＳ−ＥＰに交換した。
【０３１５】
［００３４１］０．５μｇ／ｍＬの組換え抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂを、１つのヤギ抗ヒトＩｇＧ表面上に、１０μＬ／分で１．５分間注入して、〜１１１ＲＵの表面密度を得た。残りのヤギ抗ヒトＩｇＧ表面を参照として修飾せずに放置した。まず、５サイクルの緩衝液ブランクを流して、チップ表面を調えた。組換えｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅ試料を３００、１００、３３．３、１１．１、３．７０および１．２３ｎＭの濃度で三つ組で調製し、そして６つの緩衝液ブランクとともに、捕捉組換え抗ＧＭ−ＣＳＦ  ＩｇＧおよび参照表面両方に、１００μＬ／分で、ランダムな順序で注入した。各複合体を２．５分間会合させ、そして２．５分間解離させた。さらに、１００ｎＭ  ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅおよび緩衝液ブランクの三つ組試料を、１００μＬ／分で両表面に交互に注入し、そして２．５分間会合させ、そして９０分間解離させて、より多くの解離期データを収集した。各ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅまたは緩衝液注入後、１０ｍＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ１．５を１００μＬ／分で３０秒間パルス処理し、その後、緩衝液を３０秒間注入して、表面を再生した。
【０３１６】
［００３４２］参照表面応答を減じて、バルクの屈折率変化を除去し、そして次いで、平均緩衝液ブランク応答を減じて、実験フローセルから系のアーチファクトを除去することによって、データを二重参照した。データが屈折を持たず、そして濃度がＫＤの〜６０００ｘであったため、動力学的情報がないことから、３００ｎＭ曲線から収集したデータを分析から削除した。データをプロセシングし、そしてScrubber（バージョン２．０ａ、BioLogic Software、オーストラリア・キャンベル）で、広範囲に１：１相互作用モデルに適合させて、動力学的速度定数ｋｄおよびｋａ、ならびに平衡結合定数ＫＤを得た。結果を表６に示す。
【０３１７】
表６  表面プラズモン共鳴による、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅに対する組換えｍＡｂの動力学的結合分析
【０３１８】
【表６】
2010538676.tif 000010
【０３１９】
実施例５  ＥＬＩＳＡによって測定されるような、他の種由来のＧＭ−ＣＳＦに対する抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の交差反応性
［００３４３］ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅ、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｔｈｒ、酵母由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））、大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、ｎｈＧＭ−ＣＳＦ、および／または以下の種：マウス、ラット、ウサギ、イヌおよびカニクイザルの１以上に由来する、組換えＧＭ−ＣＳＦに結合する能力に関して、上記由来のハイブリドーマｍＡｂクローンおよび組換えｍＡｂを評価した（図８Ａおよび８Ｂ）。９６ウェルプレートの個々のウェルを、ＧＭ−ＣＳＦまたは対照タンパク質の５０μＬの１μｇ／ｍＬ溶液でコーティングし、そして４℃で一晩インキュベーションした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、次いで、リード抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂ（または対照抗体）を２μｇ／ｍｌで各ＧＭ−ＣＳＦタンパク質と一緒にウェルに添加し、室温で１時間インキュベーションして、そしてＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。ＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧを１：８０００で添加し、室温で１時間インキュベーションし、そしてプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。ＴＭＢ現像剤を添加し、１０分間インキュベーションし、そしてプレートをプレート読み取り装置上、６５０ｎｍで読み取った。抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂクローンおよび組換えｍＡｂは、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅ、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｔｈｒ、大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦおよび組換えｃｙｎｏＧＭ−ＣＳＦには結合したが、マウス、ラットまたはイヌＧＭ−ＣＳＦには結合しなかった。すべてではないがいくつかのクローンはまた、酵母由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））にも結合した（図８Ａ）。別個のアッセイにおいて、ハイブリドーマ上清由来の１つの抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂクローンおよび第二の安定細胞株（ＳＣＬ）トランスフェクションは、ＰＢＭＣ由来ｎｈＧＭ−ＣＳＦ、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅ、およびｒｃｙｎｏＧＭ−ＣＳＦに結合したが、マウス、ラット、ウサギまたはイヌＧＭ−ＣＳＦには結合しなかった（図８Ｂ）。
【０３２０】
実施例６  多数のＧＭ−ＣＳＦ分子を用いた、細胞に基づくバイオアッセイおよびヒト全血における、組換え抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂに関するＩＣ５０値の決定
［００３４４］上述のように、完全ヒト組換え抗ｈＧＭ−ＣＳＦ抗体を一過性トランスフェクション細胞および安定トランスフェクション細胞株の両方から発現させた。２つの独立の一過性トランスフェクション（第一のＴＴおよび第二のＴＴ）および安定細胞株の２つの別個の採取物（第一のＳＣＬおよび第二のＳＣＬ）から材料を精製した。以下の実験は、ヒトおよびカニクイザルＧＭ−ＣＳＦの異なる型に対する６つの組換え抗体クローンに関するＩＣ５０値の決定を記載する（表７〜９）。
【０３２１】
６．１  組換え抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂによる、ＡＭＬ−５細胞のＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖の阻害
［００３４５］１０μｇ／ｍＬで出発するｍＡｂの９倍連続希釈、およびあらかじめ決定されたＥＣ９０濃度のサイトカインを用いて、実施例２．４．２に記載するように、ＡＭＬ−５増殖アッセイを行った。第二のＴＴおよび第一のＳＣＬ材料を用いた実験に関しては（図９）、サイトカインを以下の濃度で添加した：  ＰＢＭＣ由来ｎｈＧＭ−ＣＳＦ、０．２ｎｇ／ｍＬ；  ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅ、０．４ｎｇ／ｍＬ；およびｒＣｙｎｏＧＭ−ＣＳＦ、０．１ｎｇ／ｍＬ。他のアッセイに関しては、上述のサイトカインに加えて、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｔｈｒ（０．４ｎｇ／ｍＬ）および肺組織由来ｎｃｙｎｏＧＭ−ＣＳＦ（３ｎｇ／ｍＬ）を試験した。各実験において、用いたサイトカインをまた、２倍連続希釈を用いて力価決定して、その実験に関するＥＣ９０値を計算した。サイトカインおよび抗体を３７℃で３０分間インキュベーションした後、総体積１００μＬで、２．５ｘ１０４  ＡＭＬ−５細胞／ｍＬを添加した。３７℃、１０％ＣＯ２で７２時間置いた後、ウェルあたり１マイクロキュリーのトリチウム化チミジンを添加した。６時間後に細胞培養を採取し、そして液体シンチレーション計測によって、取り込まれたトリチウム化チミジンを測定した。組換えｍＡｂによるＡＭＬ−５増殖の阻害パーセントを実施例２．４．２におけるように計算した。Microsoft Excelを用いて、非線形回帰分析および増殖の５０％阻害（ＩＣ５０）値計算を行った。細胞を刺激するのに用いたサイトカインの量が、そのＥＣ９０値の２倍以内である実験を用いて、ｍＡｂ各々の平均ＩＣ５０値を計算した。
【０３２２】
［００３４６］すべての一過性および安定細胞株から生成された組換え抗体は、ＧＭ−ＣＳＦが誘導するＡＭＬ−５細胞増殖を用量依存方式で阻害した。一過性トランスフェクション由来の６つのリード抗体はすべて、＜０．８ｎＭのＩＣ５０値でヒトＧＭ−ＣＳＦを、そして＜３．５ｎＭのＩＣ５０値でカニクイザルＧＭ−ＣＳＦを阻害した。６つの安定細胞株リード抗体はすべて、＜１．５ｎＭのＩＣ５０値でヒトＧＭ−ＣＳＦを、そして＜３．５ｎＭのＩＣ５０値でカニクイザルＧＭ−ＣＳＦを阻害した。抗体のうち３つに関する結果を図９に示す。ＡＭＬ−５増殖アッセイで試験したすべての抗体およびサイトカインに関するＩＣ５０値の要約を表７に示す。
【０３２３】
表７  ＡＭＬ−５増殖アッセイにおける組換えｍＡｂに関するＩＣ５０（ｎＭ）値の表
【０３２４】
【表７】
2010538676.tif 000011
【０３２５】
６．２  組換え抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂによる、ＴＦ−１細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ依存性ＳＴＡＴ５リン酸化の阻害
［００３４７］２μｇ／ｍＬで出発するｍＡｂの６倍連続希釈、およびあらかじめ決定されたＥＣ９０濃度のサイトカインを用いて、実施例２．４．３に記載するように、ＴＦ−１  ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイを行った。第二のＴＴおよび第二のＳＣＬ材料を用いた実験に関しては（図１０）、サイトカインを以下の濃度で添加した：  ＰＢＭＣ由来ｎｈＧＭ−ＣＳＦおよびｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅ、０．６ｎｇ／ｍＬ；  ｒｃｙｎｏＧＭ−ＣＳＦ、０．１ｎｇ／ｍＬ。第一のＴＴ材料を用いる実験に関しては（図１１）、刺激したヒト小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）培養（０．２ｎｇ／ｍＬの最終ｎｈＧＭ−ＣＳＦ濃度）由来の上清、および刺激したカニクイザル肺培養（最終ｎｃｙｎｏＧＭ−ＣＳＦ濃度、０．１ｎｇ／ｍＬ）由来の上清を用いた。図１２では、刺激したカニクイザルＰＢＭＣ培養（最終ＧＭ−ＣＳＦ濃度、１ｎｇ／ｍＬ）由来の上清を、第二のＳＣＬ由来のＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂに添加した。他のアッセイに関しては、上述のサイトカインに加えて、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｔｈｒ、０．７５ｎｇ／ｍＬを試験した。各実験において、用いたサイトカインをまた、２倍連続希釈で力価決定して、その実験に関するＥＣ９０値を計算した。１５分後、細胞を固定し、そして透過処理して、そして実施例２．２．１および２．４．３に上述するように、抗ホスホＳＴＡＴ５抗体を用いて、ＳＴＡＴ５リン酸化の量を検出した。組換えｍＡｂによるＳｔａｔ５リン酸化の阻害パーセントを実施例２．４．３におけるように計算した。GraphPad Prism 4.01を用いて、非線形回帰分析および増殖の最大半量阻害（ＩＣ５０ｈｍ）値計算を行った。細胞を刺激するのに用いたサイトカインの量が、そのＥＣ９０値の２倍以内である実験を用いて、モノクローナル抗体の平均ＩＣ５０値を計算した。
【０３２６】
６．３  組換え抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂによる、初代ヒト単球のＧＭ−ＣＳＦ依存性活性化の阻害
［００３４８］ヒト単球において、ＧＭ−ＣＳＦが誘導する代謝活性を中和する能力に関して、ｍＡｂを評価するため、単球単離キットＩＩ（Miltenyi Biotech）を用いて、白血球除去輸血パック（Amgen Washington Blood Donor Program）から初代単球を単離した。負に選択された細胞は、フローサイトメトリーによって評価した際、９０％〜９５％  ＣＤ１４＋細胞であった（データは示さない）。９６ウェル平底プレート中、ＰＭＢＣ由来ｎｈＧＭ−ＣＳＦまたはｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅ（０．０５ｎｇ／ｍＬ）を、２０μｇ／ｍＬで出発するｍＡｂの６倍連続希釈と３０分間インキュベーションした。ＣＤ１４＋細胞（１５０，０００／ｍＬ）を総体積１００μＬの培地（１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および５５μＭベータ−メルカプトエタノールを補ったＲＰＭＩ）中、プレートに添加して、そして３７℃、５％ＣＯ２で、５日間インキュベーションした。Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（BioSource、DAL1025、Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）および培地の１：１混合物２０μＬを添加して、そして４〜８時間後の５７０〜６００ｎｍでの吸光度を計算することによって、ＧＭ−ＣＳＦが誘導する代謝活性を評価した。組換えｍＡｂによるヒトＣＤ１４＋単球活性の阻害パーセントを、以下の等式を用いて計算した：
（［ＡのＯＤ５７０−６００  −  ＢのＯＤ５７０−６００］／［ＡのＯＤ５７０−６００  −  ＣのＯＤ５７０−６００］）＊１００
式中、Ａ＝細胞＋サイトカイン、Ｂ＝細胞＋ｍＡｂ＋サイトカイン、そしてＣ＝細胞のみ
［００３４９］Microsoft Excelを用いて、非線形回帰分析および増殖の５０％阻害（ＩＣ５０）値計算を行った。細胞を刺激するのに用いたサイトカインの量が、そのＥＣ９０値の２倍以内である実験を用いて、ｍＡｂの平均ＩＣ５０値を計算した（表８）。一過性および安定細胞株に生成された組換え抗体は、用量依存方式で、ＧＭ−ＣＳＦが誘導するＡＭＬ−５細胞増殖を阻害した。抗体は、ヒトＧＭ−ＣＳＦを＜０．１３ｎＭのＩＣ５０ｈｍ値で、そしてカニクイザルＧＭ−ＣＳＦを＜０．３１ｎＭのＩＣ５０ｈｍ値で阻害した。
【０３２７】
表８  ＴＦ−１  Ｓｔａｔ５リン酸化アッセイにおける、組換えｍＡｂに関するＩＣ５０（ｎＭ）値の表
【０３２８】
【表８】
2010538676.tif 000012
【０３２９】
［００３５０］一過性および安定細胞株から生成された組換え抗体は、ＧＭ−ＣＳＦが誘導するヒト単球活性を用量依存方式で阻害した。リード抗体は、発現法に関わらず、天然および組換えｈＧＭ−ＣＳＦ両方を、＜０．５５ｎＭのＩＣ５０値で阻害した。第一のＴＴ材料に関する結果を図１３に示す。ヒト単球アッセイにおいて試験したすべての抗体に関するＩＣ５０値の要約を表９に示す。
【０３３０】
表９  ヒト単球アッセイにおける組換えｍＡｂに関するＩＣ５０（ｎＭ）値の表
【０３３１】
【表９】
2010538676.tif 000013
【０３３２】
６．４  安定ＣＨＯ細胞株から産生される組換え抗ＧＭ−ＣＳＦによる、ヒト全血中のＧＭ−ＣＳＦが誘導するＥＮＡ−７８またはＭＩＰ−１ベータ産生の阻害
［００３５１］組換えｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅ（最終濃度２ｎｇ／ｍＬ）を、１０％正常ヒト血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを補ったＲＰＭＩ中で調製し、そして９６ウェル平底プレート中、１００μｇ／ｍＬで出発して、安定ＣＨＯ細胞株由来の組換えｍＡｂの６倍連続希釈に添加した。ヒトＩｇＧ２アイソタイプマッチ・モノクローナル抗体（抗ＫＬＨ）をすべてのウェルに添加して、最終総ＩｇＧ濃度を１００μｇ／ｍＬとし、そしてプレートを３７℃で３０分間インキュベーションした。４倍連続希釈＋／−１００μｇ／ｍＬアイソタイプマッチ・ヒトＩｇＧ２中でサイトカインを力価決定して、その実験に関するＥＣ９０値を計算した。Ａｍｇｅｎ全血ドナープログラムによって、ヒト全血をＮａ−ヘパリンＶａｃｕｔａｉｎｅｒ試験管（Becton Dickinson）内に収集し、そして２２８μＬ（総体積２８５μＬ）の血液をウェルに添加し、そして穏やかにピペッティングして混合した。３７℃、５％ＣＯ２で４０時間インキュベーションした後、プレートを７３０ｘｇで５分間回転させ、そして５５μＬ血漿を注意深く収集し、そして新たな９６ウェルプレートに移し、そして凍結した。血漿を融解し、そして二つ組ウェルをプールした後、R&D SystemsのｈＥＮＡ７８およびｈＭＩＰ−１ｂ  ＤｕｏＳｅｔの試薬およびプロトコルを用いて、ＥＬＩＳＡによってＥＮＡ７８およびＭＩＰ−１ｂに関して分析した。GraphPad Prism 4.01を用いて、非線形回帰分析および増殖の最大半量阻害（ＩＣ５０ｈｍ）値計算を行った。
【０３３３】
［００３５２］このヒト全血アッセイにおいて、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂは、ＧＭ−ＣＳＦが誘導するＥＮＡ−７８またはＭＩＰ−１ｂ産生を阻害することを示した。ＩＣ５０ｈｍ値は、ＥＮＡ７８産生に関しては０．１５５ｎＭ、そしてＭＩＰ−１ｂ産生に関しては０．２９９ｎＭであると決定された（図１４）。
【０３３４】
実施例７  ＧＭ−ＣＳＦが誘導するＡＭＬ−５増殖アッセイ、ヒト単球バイオアッセイ、およびＴＦ−１細胞アッセイにおいてＧＭ−ＣＳＦが誘導するＴＦ−１  ＳＴＡＴ−５リン酸化における、酵母由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））、Ａ４３１由来ｎｈＧＭ−ＣＳＦ、大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦおよび大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ２３Ｌの中和
［００３５３］５μｇ／ｍＬで出発する、ハイブリドーマ上清から精製されたＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂの９倍連続希釈、およびあらかじめ決定されたＥＣ９０濃度のサイトカイン（大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦは０．１ｎｇ／ｍＬ、酵母由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦは０．０５ｎｇ／ｍＬ）を用いて、実施例２．４．２に記載するように、ＡＭＬ−５増殖アッセイを行った。用いたサイトカインをまた、２倍連続希釈を用いて力価決定して、その実験に関するＥＣ９０値を計算した。サイトカインおよび抗体を３７℃で３０分間インキュベーションした後、総体積１００μＬで、２．５ｘ１０４  ＡＭＬ−５細胞／ｍＬを添加した。３７℃、１０％ＣＯ２で７２時間置いた後、ウェルあたり１マイクロキュリーのトリチウム化チミジンを添加した。６時間後に細胞培養を採取し、そして液体シンチレーション計測によって、取り込まれたトリチウム化チミジンを測定した。図１５ａに示すように、４つのｍＡｂは、大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦの活性を中和可能であったが、酵母由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））の活性を中和しなかった。
【０３３５】
［００３５４］１２μｇ／ｍＬで出発する、ハイブリドーマ上清から精製されたｍＡｂの３倍連続希釈、およびあらかじめ決定されたＥＣ９０濃度のサイトカイン（Ａ４３１細胞由来ｎｈＧＭ−ＣＳＦおよび酵母由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、０．０４ｎｇ／ｍＬ）を用いて、実施例６．３に記載するように、ヒト単球アッセイを行った。用いたサイトカインをまた、２倍連続希釈を用いて力価決定して、その実験に関するＥＣ９０値を計算した。サイトカインおよび抗体を３７℃で３０分間、一緒にインキュベーションした後、総体積１００μＬで、１．５ｘ１０５ヒトＣＤ１４＋細胞／ｍＬを添加した。５％ＣＯ２中、３７℃で５日間プレートをインキュベーションし、そしてＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅの還元を測定することによって、ＧＭ−ＣＳＦが誘導する代謝活性を評価した。どちらのアッセイに関しても、Microsoft Excelを用いて、非線形回帰分析および増殖の５０％阻害（ＩＣ５０）値計算を行った。細胞を刺激するのに用いたサイトカインの量が、そのＥＣ９０値の２倍以内である実験を分析に含めた。図１５ｂに示すように、４つのｍＡｂは、Ａ４３１細胞由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦの活性を中和可能であったが、酵母由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））の活性を中和しなかった。
【０３３６】
［００３５５］実施例２．２．１に記載するように、組換え抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂを用いて、ＴＦ−１  ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイを行った。９６ウェルプレートの二つ組ウェル内に、２μｇ／ｍＬで出発する、抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂの６倍連続希釈、およびあらかじめ決定されたＥＣ９０濃度のサイトカイン（大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦおよび大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ２３Ｌは０．５ｎｇ／ｍＬ、酵母由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ２３Ｌ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））は０．２ｎｇ／ｍＬ）。３０分間インキュベーションした後、３ｘ１０５  ＴＦ−１細胞／ｍｌを総体積１００μＬまで添加した。プレートを３７℃で１５分間インキュベーションした。細胞を固定するため、ＰＢＳ中の１０％パラホルムアルデヒド２５μＬを添加して、最終濃度２％のパラホルムアルデヒドとし、そしてプレートを３７℃で１０分間インキュベーションした。２００μＬ  ＩＭＤＭ＋０．５％ＦＢＳ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５５μＭベータ−メルカプトエタノールをウェルに添加して固定を停止し、そしてプレートを３５０ｘｇで１０分間遠心分離した。細胞上清を取り除き、そして４００μＬの９０％ＭｅＯＨをゆっくりと添加する一方、細胞を激しく混合した。−２０℃で一晩インキュベーションした後、プレートを回転させ、６００μＬ  ＰＢＳ／２％ＦＣＳで洗浄し、そして抗ホスホＳＴＡＴ５−Ａｌｅｘａ４８８（Becton Dickinson 612598、ニュージャージー州フランクリンレークス）の５０μＬの１：５希釈（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ中）と室温で３０分間インキュベーションした。細胞を洗浄し、２％ＦＢＳを含むＰＢＳに再懸濁し、そしてMultiWell FACScalibur（Becton Dickinson）を用いたフローサイトメトリー分析のため、丸底マイクロタイタープレートに移した。ＦｌｏｗＪｏ  ＦＡＣＳ分析ソフトウェアを用いて、ＳＴＡＴ５＋細胞パーセントを決定した。以下の等式を用いて、ハイブリドーマ上清によるＳＴＡＴ５リン酸化の阻害パーセントを計算した：
１００−（｛［ＡのＳＴＡＴ５＋の％  −  ＢのＳＴＡＴ５＋の％］／［ＣのＳＴＡＴ５＋の％  −  ＢのＳＴＡＴ５＋の％］｝＊１００）
［００３５６］式中、Ａ＝細胞＋ハイブリドーマ上清＋ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、Ｂ＝細胞のみ、Ｃ＝細胞＋ｒｈＧＭ−ＣＳＦ
［００３５７］ＧＭ−ＣＳＦが誘導するＴＦ−１細胞ｐＳＴＡＴ５アッセイにおいて、大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ２３Ｌは、酵母由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ２３Ｌ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））（０．１３０ｎｇ／ｍＬ）および大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（０．２９８ｎｇ／ｍＬ）のものと匹敵するＥＣ９０（０．３８４ｎｇ／ｍＬ）を示した。図１６に示すように、抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂは、大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦを中和したが、酵母由来（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））または非グリコシル化大腸菌由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ２３Ｌを中和しなかった。これは、この区別の基礎が、酵母発現によるグリコシル化相違ではなく、天然ＧＭ−ＣＳＦに比較した際の、酵母由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ２３Ｌ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標））および大腸菌ｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ２３Ｌの一次配列の同じ単一アミノ酸相違（２３位のロイシンからアルギニン）によることを示唆する。
【０３３７】
実施例８  結合競合による、６つのリード抗ＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体のエピトープ結合
［００３５８］１つの標識ｍＡｂがｒｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｉｌｅへの結合に関して、過剰量の他の非標識ｍＡｂと競合する結合競合アッセイを用いて、エピトープ・ビニングを行った。互いに競合する抗体を、同じビンに割り当てた。６つのリード抗ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＡｂのうち５つが、ｒｈＧＭ−ＣＳＦへの結合に関して互いに競合したが、１つは競合しなかった。
【図１ａ】
2010538676.tif 000014
【図１ｂ】
2010538676.tif 000015
【図１ｃ】
2010538676.tif 000016
【図１ｄ】
2010538676.tif 000017
【図２ａ】
2010538676.tif 000018
【図２ｂ】
2010538676.tif 000019
【図２ｃ】
2010538676.tif 000020
【図３】
2010538676.tif 000021
【図４】
2010538676.tif 000022
【図５】
2010538676.tif 000023
【図６ａ】
2010538676.tif 000024
【図６ｂ】
2010538676.tif 000025
【図６ｃ】
2010538676.tif 000026
【図６ｄ】
2010538676.tif 000027
【図６ｅ】
2010538676.tif 000028
【図６ｆ】
2010538676.tif 000029
【図７ａ】
2010538676.tif 000030
【図７ｂ】
2010538676.tif 000031
【図９】
2010538676.tif 000032
【図１０】
2010538676.tif 000033
【図１１】
2010538676.tif 000034
【図１２】
2010538676.tif 000035
【図１３】
2010538676.tif 000036
【図１４】
2010538676.tif 000037
【図１５ａ】
2010538676.tif 000038
【図１５ｂ】
2010538676.tif 000039
【図１６】
2010538676.tif 000040
【図８ａ】
2010538676.tif 000041
【図８ｂ】
2010538676.tif 000042
【配列表】
2010538676000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年9月7日(2010.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＭ−ＣＳＦに結合する単離抗原結合性タンパク質であって：
Ａ）１以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）であって：
（ｉ）配列番号２２、１０、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；
（ｉｉ）配列番号２３、１１、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；
（ｉｉｉ）配列番号２４、１２、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３；ならびに
（ｉｖ）４アミノ酸以下の、アミノ酸置換、欠失または挿入の１以上を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨ
からなる群より選択される前記ＣＤＲＨ；
Ｂ）１以上の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）であって：
（ｉ）配列番号１６、４、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；
（ｉｉ）配列番号１７、５、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；
（ｉｉｉ）配列番号１８、６、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３；ならびに
（ｉｖ）４アミノ酸以下の、アミノ酸置換、欠失または挿入の１以上を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬ
からなる群より選択される前記ＣＤＲＬ；あるいは
Ｃ）Ａ）の１以上の重鎖ＣＤＲＨおよびＢ）の１以上の軽鎖ＣＤＲＬ
を含む、前記タンパク質。
【請求項２】
Ａ）の前記ＣＤＲＨが：
（ｉ）配列番号２２、１０、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；
（ｉｉ）配列番号２３、１１、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；
（ｉｉｉ）配列番号２４、１２、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３；ならびに
（ｉｖ）２アミノ酸以下の、アミノ酸置換、欠失または挿入の１以上を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＨ
からなる群より選択され；
Ｂ）の前記ＣＤＲＬが：
（ｉ）配列番号１６、４、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；
（ｉｉ）配列番号１７、５、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；
（ｉｉｉ）配列番号１８、６、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３；ならびに
（ｉｖ）２アミノ酸以下の、アミノ酸置換、欠失または挿入の１以上を含有する（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のＣＤＲＬ
からなる群より選択され；あるいは
Ｃ）Ａ）の１以上の重鎖ＣＤＲＨおよびＢ）の１以上の軽鎖ＣＤＲＬ
である、請求項１に記載の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項３】
Ａ）：
（ｉ）配列番号２２、１０、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；
（ｉｉ）配列番号２３、１１、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；
（ｉｉｉ）配列番号２４、１２、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３；
からなる群より選択されるＣＤＲＨ；
Ｂ）：
（ｉ）配列番号１６、４、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；
（ｉｉ）配列番号１７、５、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；
（ｉｉｉ）配列番号１８、６、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３
からなる群より選択されるＣＤＲＬ；あるいは
Ｃ）Ａ）の１以上の重鎖ＣＤＲＨおよびＢ）の１以上の軽鎖ＣＤＲＬ
を含む、請求項１または２に記載の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項４】
Ａ）の少なくとも１つのＣＤＲＨおよびＢ）の少なくとも１つのＣＤＲＬを含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項５】
Ａ）の少なくとも２つのＣＤＲＨおよびＢ）の少なくとも２つのＣＤＲＬを含む、請求項１ないし４のいずれか１項に単離抗原結合性タンパク質。
【請求項６】
前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項７】
Ａ）配列番号２２、１０、７０および１４２のＣＤＲＨ１、配列番号２３、１１、３５、４７、５９、７１、９５および１４３のＣＤＲＨ２、ならびに配列番号２４、１２、３６、４８、６０、７２、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４のＣＤＲＨ３；ならびに
Ｂ）配列番号１６、４、４０、５２、６４、８８、１００，１１２、１２４、および１３６のＣＤＲＬ１、配列番号１７、５、２９、４１、６５、７７、８９、１０１、１１３および１３７のＣＤＲＬ２、ならびに配列番号１８、６、４２、６６、７８、１２６、および１３８のＣＤＲＬ３
を含む、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項８】
配列番号２１、９、３３、４５、５７、６９、８１、９３、１０５、１１７、１２９、および１４１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または配列番号１５、３、２７、３９、５１、６３、７５、８７、９９、１１１、１２３、および１３５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項９】
ＶＨが配列番号２１、９、３３、４５、５７、６９、８１、９３、１０５、１１７、１２９、および１４１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、そして／またはＶＬが配列番号１５、３、２７、３９、５１、６３、７５、８７、９９、１１１、１２３、および１３５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項８の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１０】
ＶＨが配列番号２１、９、３３、４５、５７、６９、８１、９３、１０５、１１７、１２９、および１４１からなる群より選択され、そして／またはＶＬが配列番号１５、３、２７、３９、５１、６３、７５、８７、９９、１１１、１２３、および１３５からなる群より選択される、請求項８または９に記載の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１１】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、またはその抗体断片である、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１２】
前記抗体断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ディアボディ、または一本鎖抗体分子である、請求項１１に記載の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１３】
ヒト抗体である、請求項１１に記載の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１４】
モノクローナル抗体である、請求項１１に記載の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１５】
ＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ３型またはＩｇＧ４型のものである、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１６】
ＩｇＧ型またはＩｇＧ２型のものである、請求項１５に記載の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１７】
標識基とカップリングしている、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１８】
ヒトＧＭ−ＣＳＦの細胞外部分へのＧＭ−ＣＳＦの結合を阻害する、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の単離抗原結合性タンパク質。
【請求項１９】
ＧＭ−ＣＳＦに結合する単離抗原結合性タンパク質であって：
Ａ）１以上の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）であって：
（ｉ）配列番号２２、１０、７０、９４および１４２からなる群より選択されるＣＤＲＨ１；
（ｉｉ）配列番号２３、１１、２８、３５、４７、５９、７１、９５、１０６、１１９および１４３からなる群より選択されるＣＤＲＨ２；
（ｉｉｉ）配列番号２４、１２、３６、４８、６０、７２、８３、９６、１０８、１２０、１３２、および１４４からなる群より選択されるＣＤＲＨ３
からなる群より選択される前記ＣＤＲＨ；
Ｂ）１以上の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）であって：
（ｉ）配列番号１６、４、３０、４０、５２、６４、８８、１００、１０７、１１２、１１８、１２４、１２５および１３６からなる群より選択されるＣＤＲＬ１；
（ｉｉ）配列番号１７、５、２９、３４、４１、６５、７７、１０１、１１３、１３０、１３１および１３７からなる群より選択されるＣＤＲＬ２；
（ｉｉｉ）配列番号１８、６、４２、４６、６６、７８、８４、８９、９０、１０２、１１４、１２６、および１３８からなる群より選択されるＣＤＲＬ３； 
からなる群より選択される前記ＣＤＲＬ；あるいは
Ｃ）Ａ）の１以上の重鎖ＣＤＲＨおよびＢ）の１以上の軽鎖ＣＤＲＬ
を含む、前記タンパク質。
【請求項２０】
請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の抗原結合性タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２１】
調節配列に機能可能であるように連結されている、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２２】
請求項２０に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２３】
請求項２１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２４】
請求項２１に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項２５】
請求項２３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の抗原結合性タンパク質を作製する方法であって、前記抗原結合性タンパク質を分泌する宿主細胞から、前記抗原結合性タンパク質を調製する工程を含む、前記方法。
【請求項２７】
請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗原結合性タンパク質および薬学的に許容されうる賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
さらなる活性剤をさらに含む、請求項２７の医薬組成物。
【請求項２９】
前記のさらなる活性剤が、放射性同位体、放射性核種、毒素、または療法的および化学療法的基からなる群より選択される、請求項２８の医薬組成物。
【請求項３０】
患者において、ＧＭ−ＣＳＦと関連する状態を治療するかまたは防止するための医薬組成物であって、請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗原結合性タンパク質を含む、前記医薬組成物。
【請求項３１】
状態が、リウマチ性障害、自己免疫障害、血液学的障害、腫瘍学的障害、炎症性障害、神経系の変性状態、胃腸、胃泌尿器障害および内分泌障害からなる群より選択される、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
状態が、多発性硬化症、関節リウマチ、喘息、乾癬、アトピー性皮膚炎およびサルコイドーシスからなる群より選択される、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
単離抗原結合性タンパク質を単独でまたは併用療法として投与する、請求項３０ないし３２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
患者において、ＧＭ−ＣＳＦＲの細胞外部分へのＧＭ−ＣＳＦの結合を阻害するための医薬組成物であって、請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗原結合性タンパク質を含む、前記医薬組成物。
【請求項３５】
患者において、ＧＭ−ＣＳＦ活性を阻害するための医薬組成物であって、請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗原結合性タンパク質を含む、前記医薬組成物。
【請求項３６】
ＧＭ−ＣＳＦ活性が、骨髄細胞系譜細胞の分化、生存、増殖および活性化からなる群より選択される、請求項３５に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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