(57)【要約】  DLL4結合抗体、特にNotchシグナリングおよびDLL4のインターナリゼーションを妨げる抗体は、DLL4媒介性Notchシグナリングだけを妨げる阻害薬よりも効率的に、血管新生および腫瘍の成長を含めた病理学的過程をかく乱することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
DLL4に結合し、DLL4媒介性Notchシグナリングを阻止し、DLL4のインターナリゼーションを妨害する抗体。
【請求項２】
一価である、請求項1に記載の抗体。
【請求項３】
二価である、請求項1に記載の抗体。
【請求項４】
多価である、請求項1に記載の抗体。
【請求項５】
請求項1から4のいずれかに記載の抗体を含む組成物。
【請求項６】
癌を処置するためのさらなる薬剤を含む、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
細胞におけるDLL4のシグナリングおよびインターナリゼーションを妨害する抗体を、それを必要とする個体に投与する、血管新生依存性疾患の処置のための方法。
【請求項８】
細胞が内皮細胞である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
血管新生依存性疾患が癌または内皮細胞の疾患など、あらゆるタイプの悪性腫瘍である、請求項7および8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
血管新生依存性疾患に対する別の薬剤での処置をさらに含む、請求項7から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
a)細胞をDLL4結合性物質で処置し、
b)DLL4の局在化を、細胞の表面上または内部に存在すると判定する、
DLL4シグナリングに影響を及ぼす物質を同定するための方法。
【請求項１２】
細胞が内皮細胞から選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
組織が網膜から選択される、請求項11に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血管新生の分野に関する。より詳しくは、本発明は、血管新生依存性疾患に影響を及ぼす、Delta様4(DLL4)経路を阻害する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
発生上の血管新生
血管は、栄養物、酸素、および巨大分子を抹消組織に輸送し、二酸化炭素および老廃物を除去するための身体の基盤構造である。この理由から、心臓血管系は他の器官の発生を支援するので、胎児における最初の機能的な器官である。脈管形成と呼ばれる過程では、最初の血管は分散した中胚葉細胞から組み立てられ、血島を形成する。これらは融合して、未来の大血管および最初の原始的な血管の網状組織を形成する(Risau, W.およびFlamme, I.、1995年、Annu Rev Cell Dev Biol、11巻、73〜91頁)。原始的な網状組織は成長し、まとめて血管形成と呼ばれる、内皮の出芽、分裂、成長、および退行によって再構築される(Adams, R. H.およびAlitalo, K.、2007年、Nat Rev Mol Cell Biol、8巻、464〜78頁)。内皮の神経叢は、早期に壁細胞のコーティング(周皮細胞または平滑筋細胞)を獲得する(Armulik, A.ら、2005年、Circ Res、97巻、512〜23頁)。これは、適切な血管の形態形成および血管の安定性に不可欠である(Hellstrom, M.ら、1999年、Development、126巻、3047〜55頁、Hellstrom, M.ら、2001年、J Cell Biol、153巻、543〜53頁)。血管は、酸素および栄養に対する組織の必要性をカバーするためだけに発生するのではなく、発生する組織間のシグナリング(誘導性シグナリング)の相互作用にも決定的に関与する(Red-Horse, K., J.ら、2007年、Dev Cell、12巻、181〜94)。
【０００３】
腫瘍の血管形成
腫瘍は、最初、それらが発生する組織において既存の血管を上手く利用することがあるが、腫瘍の成長によって、最終的には新しい血管の漸増に依存するようになる。腫瘍の血管は、概ね非常に異常であり、あてのない出芽、血管サイズの制御の制限、および低度の機能性を示す(Baluk, P., J.ら、2005年、Curr Opin Genet Dev、15巻、102〜11頁)。この異常さは、分子的に血管形成性の成長因子にも見られ、内皮のマーカーは異常に発現される(Seaman, S.ら、2007年、Cancer Cell、11巻、539〜54頁)。血管新生の阻害における治療的可能性を活用するために多くの試みがなされており、2004年には血管新生を目標とした最初の治療が、転移性の直腸結腸癌に対して上首尾に着手された(Hurwitz, H.ら、2004年、N Engl J Med、350巻、2335〜42頁)。ベバシズマブ(Avastin(商標))は、血管内皮成長因子-A(VEGF-A)のシグナリングを阻止するモノクローナル抗体である(Ferrara, N., J.ら、2004年、Nat Rev Drug Discov、3巻、391〜400頁)。腫瘍の血管新生は根本的に重要であるにもかかわらず、この過程は依然として理解が不十分であり、この過程を標的とする薬物はほとんどない。したがって、血管新生を阻害する、新しく、改善された薬物が大いに必要とされている。
【０００４】
現在、血管新生が様々な障害の病原性に関係付けられることは十分確立されている。これらには、固形腫瘍および転移、アテローム性動脈硬化、水晶体後線維増殖症、血管腫、慢性炎症、増殖性網膜症などの眼内の新生血管性疾患、例えば、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症(AMD)、新生血管性緑内障、移植された角膜組織および他の組織の免疫拒絶、関節リウマチ、ならびに乾癬が含まれる(Folkmanら、J. Biol. Chem.、267巻、10931〜10934頁(1992年); Klagsbrunら、Annu. Rev. Physiol.、53巻、217〜239頁(1991年);およびGamer A.、「Vascular diseases」、Pathobiology of Ocular Disease.A Dynamic Approach、Garner A.、Klintworth G K編集、第2版(Marcel Dekker、NY、1994年)、1625〜1710頁)。
【０００５】
腫瘍の成長の場合は、血管新生は過形成から新形成への移行に、ならびに腫瘍の成長および転移に栄養を提供するのに決定的であると思われる。Folkmanら、Nature、339巻、58頁(1989年)。血管新生により、正常細胞に比べて腫瘍細胞が成長の優位性および増殖性の自立性を獲得するのが可能になる。腫瘍は、通常、利用可能な毛細管床からの距離のために数平方ミリメートルのサイズにしか増殖することができない単一の異常な細胞として始まり、長期間さらなる成長および広がることのない「休眠」に留まることがある。次いで、いくつかの腫瘍細胞は、内皮細胞を活性化するための血管新生性の表現型に切り替わり、これは増殖し、新しい毛細血管に成熟する。これらの新しく形成された血管により、原発の腫瘍の継続した成長が可能になるだけではなく、転移性の腫瘍細胞の播種および再コロニー形成も可能になる。したがって、腫瘍切片における微小血管の密度と、乳癌およびいくつかの他の腫瘍における患者の生存の間には相関が観察される(Weidnerら、N. Engl. J. Med、324巻、1〜6頁(1991年);Horakら、Lancet、340巻、1120〜1124頁(1992年);Macchiariniら、Lancet、340巻、145〜146頁(1992年))。血管新生の切り替えを制御する正確な機序は十分に理解されていないが、腫瘍塊の新生血管は、多数の血管新生性の刺激と阻害物質のネットバランスに起因すると考えられている(Folkman、1995年、Nat Med、1巻(1)、27〜31頁)。
【０００６】
内皮先端細胞
2003年に内皮先端細胞が発見され、血管新生過程に対する本発明者らの理解は直ちに向上した(Gerhardt, H.ら、2003年、J Cell Biol、161巻、1163〜77頁)。先端細胞は、血管新生性の出芽のまさしく先端に位置し、誘引性および反発性の手がかりを求めて環境を探索する長い糸状仮足の延長を有するので、神経細胞成長円錐に対する類似点を多く有する。これは、気管(肺)の発生の間、管状の枝分れした形態形成をもたらすショウジョウバエの内皮先端細胞にも類似している(Samakovlis, C.ら、1996年、Development、122巻、1395〜407頁)。内皮先端細胞の他の特徴には、その近隣の柄細胞に比べて、別個の遺伝子の発現、管腔の欠如、および低度の増殖が含まれる。先端細胞には、内皮柄細胞または幹細胞(trunk cell)と呼ばれるいくつかの内皮細胞が続く。内皮先端細胞の特徴付けは、血管新生における先端細胞および柄細胞に対して確立される成長因子の明確な役割を可能にする、この分野における著しい進歩であった。これは、また、VEGF-Aと同じくらい有望な抗血管新生の標的として現在考えられているDelta様4(Dll4)シグナリングを理解するための道を開いた(Thurston, G., J.ら、2007年、Nat Rev Cancer、7巻、327〜31頁)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第1998/24893号
【特許文献２】国際公開第1996/34096号
【特許文献３】国際公開第1996/33735号
【特許文献４】国際公開第1991/10741号
【特許文献５】米国特許第5,545,806号
【特許文献６】米国特許第5,569,825号
【特許文献７】米国特許第5,591,669号
【特許文献８】米国特許第5,545,807号
【特許文献９】国際公開第1997/17852号
【特許文献１０】米国特許第5,625,126号
【特許文献１１】米国特許第5,633,425号
【特許文献１２】米国特許第5,661,016号
【特許文献１３】米国特許第4,816,567号
【特許文献１４】欧州特許第404,097号
【特許文献１５】国際公開第93/11161号
【特許文献１６】米国特許第5,500,362号
【特許文献１７】米国特許第5,821,337号
【特許文献１８】米国特許第6,737,056号
【特許文献１９】国際公開第00/42072号
【特許文献２０】米国特許第6,194,551B1号
【特許文献２１】国際公開第99/51642号
【特許文献２２】米国特許第6,582,959号
【特許文献２３】米国特許第6,582,959号
【特許文献２４】国際公開第98/45332号
【特許文献２５】国際公開第96/30046号
【特許文献２６】国際公開第94/10202号
【特許文献２７】国際公開第2005/044853号
【特許文献２８】欧州特許第0666868B1号
【特許文献２９】米国特許出願公開第20030206899号
【特許文献３０】米国特許出願公開第20030190317号
【特許文献３１】米国特許出願公開第20030203409号
【特許文献３２】米国特許出願公開第20050112126号
【特許文献３３】米国特許出願公開第20050186208号
【特許文献３４】国際公開第2005012359号
【特許文献３５】米国特許第6,884,879号
【特許文献３６】国際公開第2004/113304号
【特許文献３７】米国特許出願公開第20030055006号
【特許文献３８】国際公開第9607754号
【特許文献３９】国際公開第92/09690号
【特許文献４０】米国特許第5,869,046号
【特許文献４１】国際公開第93/16185号
【特許文献４２】米国特許第5,571,894号
【特許文献４３】米国特許第5,587,458号
【特許文献４４】米国特許第5,641,870号
【特許文献４５】国際公開第93/06213号
【特許文献４６】国際公開第93/08829号
【特許文献４７】米国特許第4,676,980号
【特許文献４８】国際公開第91/00360号
【特許文献４９】国際公開第92/00373号
【特許文献５０】欧州特許第03089号
【特許文献５１】米国特許出願公開第2003/0157108号
【特許文献５２】米国特許出願公開第2004/0093621号
【特許文献５３】国際公開第2003/011878号
【特許文献５４】米国特許第6,602,684号
【特許文献５５】国際公開第1997/30087号
【特許文献５６】国際公開第1998/58964号
【特許文献５７】国際公開第1999/22764号
【特許文献５８】米国特許出願公開第2005/0123546号
【特許文献５９】国際公開第2000/61739号
【特許文献６０】国際公開第2001/29246号
【特許文献６１】米国特許出願公開第2003/0115614号
【特許文献６２】米国特許出願公開第2002/0164328号
【特許文献６３】米国特許出願公開第2004/0132140号
【特許文献６４】米国特許出願公開第2004/0110704号
【特許文献６５】米国特許出願公開第2004/0110282号
【特許文献６６】米国特許出願公開第2004/0109865号
【特許文献６７】国際公開第2003/085119号
【特許文献６８】国際公開第2003/084570号
【特許文献６９】国際公開第2005/035586号
【特許文献７０】国際公開第2005/035778号
【特許文献７１】国際公開第2005/053742号
【特許文献７２】国際公開第2004/056312 A1号
【特許文献７３】米国特許第5,648,260号
【特許文献７４】米国特許第5,624,821号
【特許文献７５】国際公開第94/29351号
【特許文献７６】国際公開第2004/056312号
【特許文献７７】米国特許出願公開第2005/0014934A1号
【特許文献７８】米国特許第5,648,237号
【特許文献７９】米国特許第5,639,635号
【特許文献８０】米国特許第6,083,715号
【特許文献８１】米国特許第6,027,888号
【特許文献８２】米国特許第5,264,365号
【特許文献８３】米国特許第5,508,192号
【特許文献８４】米国特許第4,965,199号
【特許文献８５】米国特許第4,419,446号
【特許文献８６】米国特許第4,601,987号
【特許文献８７】国際公開第94/11026号
【特許文献８８】米国特許第4,767,704号
【特許文献８９】米国特許第4,657,866号
【特許文献９０】米国特許第4,927,762号
【特許文献９１】米国特許第4,560,655号
【特許文献９２】米国特許第5,122,469号
【特許文献９３】国際公開第90/03430号
【特許文献９４】国際公開第87/00195号
【特許文献９５】米国再発行特許第Re. 30,985号
【特許文献９６】国際公開第87/05330号
【特許文献９７】米国特許第4,640,835号
【特許文献９８】米国特許第4,496,689号
【特許文献９９】米国特許第4,301,144号
【特許文献１００】米国特許第4,670,417号
【特許文献１０１】米国特許第4,791,192号
【特許文献１０２】米国特許第4,179,337号
【特許文献１０３】米国特許第3,773,919号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Risau, W.およびFlamme, I.、1995年、Annu Rev Cell Dev Biol、11巻、73〜91頁
【非特許文献２】Adams, R. H.およびAlitalo, K.、2007年、Nat Rev Mol Cell Biol、8巻、464〜78頁
【非特許文献３】Armulik, A.ら、2005年、Circ Res、97巻、512〜23頁
【非特許文献４】Hellstrom, M.ら、1999年、Development、126巻、3047〜55頁
【非特許文献５】Hellstrom, M.ら、2001年、J Cell Biol、153巻、543〜53頁
【非特許文献６】Red-Horse, K., J.ら、2007年、Dev Cell、12巻、181〜94
【非特許文献７】Baluk, P., J.ら、2005年、Curr Opin Genet Dev、15巻、102〜11頁
【非特許文献８】Seaman, S.ら、2007年、Cancer Cell、11巻、539〜54頁
【非特許文献９】Hurwitz, H.ら、2004年、N Engl J Med、350巻、2335〜42頁
【非特許文献１０】Ferrara, N., J.ら、2004年、Nat Rev Drug Discov、3巻、391〜400頁
【非特許文献１１】Folkmanら、J. Biol. Chem.、267巻、10931〜10934頁(1992年)
【非特許文献１２】Klagsbrunら、Annu. Rev. Physiol.、53巻、217〜239頁(1991年)
【非特許文献１３】Gamer A.、「Vascular diseases」、Pathobiology of Ocular Disease.A Dynamic Approach、Garner A.、Klintworth G K編集、第2版(Marcel Dekker、NY、1994年)、1625〜1710頁
【非特許文献１４】Folkmanら、Nature、339巻、58頁(1989年)
【非特許文献１５】Weidnerら、N. Engl. J. Med、324巻、1〜6頁(1991年)
【非特許文献１６】Horakら、Lancet、340巻、1120〜1124頁(1992年)
【非特許文献１７】Macchiariniら、Lancet、340巻、145〜146頁(1992年)
【非特許文献１８】Folkman、1995年、Nat Med、1巻(1)、27〜31頁
【非特許文献１９】Gerhardt, H.ら、2003年、J Cell Biol、161巻、1163〜77頁
【非特許文献２０】Samakovlis, C.ら、1996年、Development、122巻、1395〜407頁
【非特許文献２１】Thurston, G., J.ら、2007年、Nat Rev Cancer、7巻、327〜31頁
【非特許文献２２】Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、(2001年)Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.
【非特許文献２３】CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubelら編集(2003年))
【非特許文献２４】METHODS IN ENZYMOLOGYシリーズ(Academic Press, Inc.)
【非特許文献２５】PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson、B. D. HamesおよびG. R. Taylor編集(1995年))、Harlow and Lane編集(1988年)
【非特許文献２６】ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney編集(1987年)
【非特許文献２７】Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National institutes of Health、Bethesda, Md.(1991年)
【非特許文献２８】ChothiaおよびLesk. J.、Mol. Biol.、196巻、901〜917頁(1987年)
【非特許文献２９】Kohlerら、Nature、256巻、495頁(1975年)
【非特許文献３０】Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、1988年)
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【非特許文献３３】Marksら、J. Mol. Biol.、222巻、581〜597頁(1991年)
【非特許文献３４】Sidhuら、J. Mol. Biol.、338巻(2):299〜310頁(2004年)
【非特許文献３５】Leeら、J. Mol. Biol.、340巻(5)、1073〜1093頁(2004年)
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【非特許文献３７】Leeら、J. Immunol. Methods、284巻(1〜2)、119〜132巻、(2004年)
【非特許文献３８】Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90巻、2551頁(1993年)
【非特許文献３９】Jakobovitsら、Nature、362巻、255〜258頁(1993年)
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【非特許文献４１】Marksら、Bio/Technology、10巻、779〜783頁(1992年)
【非特許文献４２】Lonbergら、Nature、368巻、856〜859頁(1994年)
【非特許文献４３】Morrison、Nature、368巻、812〜813頁、(1994年)
【非特許文献４４】Fishwildら、Nature Biotechnology、14巻、845〜851頁(1996年)
【非特許文献４５】Neuberger、Nature Biotechnology、14巻、826頁(1996年)
【非特許文献４６】LonbergおよびHuszar、intern. Rev. Immunol.、13巻、65〜93頁(1995年)
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【非特許文献４９】Presta、Curr. Op. Struct. Biol.、2巻、593〜596頁(1992年)
【非特許文献５０】VaswaniおよびHamilton、Ann. Allergy, Asthma & immunol.、1巻、105〜115頁(1998年)
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【非特許文献５２】HurleおよびGross、Curr. Op. Biotech.、5巻、428〜433 (1994年)
【非特許文献５３】Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81巻6851〜6855頁(1984年)
【非特許文献５４】Pluckthun、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、第113巻、RosenburgおよびMoore編集、Springer-Verlag、New York、269〜315頁(1994年)
【非特許文献５５】Hollingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90巻、6444〜6448頁(1993年)
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【非特許文献６１】RavetchおよびKinet、Annu. Rev. Immunol、9巻、457〜92頁(1991年)、464頁
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【非特許文献６３】M. in Daeron、Annu. Rev. Immunol.、15巻、203〜234頁(1997年)
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明に関連するデータは、DLL4媒介性NotchシグナリングおよびDLL4のインターナリゼーションを同時に阻害するとDLL4媒介性Notchシグナリングだけを阻害する阻害薬よりも効率的に血管新生をかく乱するという新規な概念を支持している。さらに、本発明は、DLL4媒介性NotchシグナリングおよびDLL4のインターナリゼーションを同時に阻害すると、DLL4媒介性Notchシグナリングだけを阻害する阻害薬よりも効率的に腫瘍の血管新生および腫瘍の成長をかく乱することを明らかにする。本発明は、単一の薬剤として、または併用処置の一部分としてのいずれかで、DLL4に結合する一価、二価または多価の抗体の形の血管新生変調性の薬物を提供する。DLL4媒介性NotchシグナリングおよびDLL4のインターナリゼーションを両方とも防げるように設計された阻害薬は、血管新生をかく乱し、腫瘍の成長を阻害するための新しい戦略を提供する。
【００１０】
DLL4の活性を効率的に阻止する薬物は、Notch受容体経路によるシグナリングを両方とも標的にしなければならないが、DLL4のインターナリゼーションによって誘発される可能なシグナリングを、また妨げなければならない。本明細書にさらに記載するように、DLL4のシグナリングおよび活性は、DLL4のインターナリゼーションと相関する。一組の支持的な証拠は、マウス網膜における正常な発生上の血管新生の間のDLL4の局在化を分析したことに由来する。そこで、DLL4のインターナリゼーションは、能動的な血管新生が起こる網膜の領域に相関することが示されている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、血管の発生は、Notch受容体経路のDelta様4(交換可能に「DLL4」と呼ばれる)の活性化およびDLL4のインターナリゼーションを同時に変調する薬剤での処置によって阻害されるという発見に部分的に基づく。DLL4拮抗薬での処置は、内皮細胞(EC)の増殖の増大、内皮細胞の不適当な分化、および腫瘍の脈管構造を含めた脈管構造における動脈の不適当な発生をもたらす。顕著なことに、DLL4のインターナリゼーションを引き起こさない阻止性の抗DLL4抗体で処置すると、いくつかの異なる癌において二重の双方向のDLL4のシグナリングの阻害および腫瘍の成長がもたらされた。したがって、本発明は、血管新生に関与する過程を変調する(例えば、促進または阻害する)ための、および血管新生に付随する病状を標的とする上で用いるための、方法、組成物、キット、および物品を提供する。
【００１２】
一態様において、本発明は、腫瘍、癌、および/または細胞増殖性障害を処置するための方法を提供し、この方法は、NotchシグナリングおよびDLL4のインターナリゼーションの両方を同時に阻止する有効量のDLL4拮抗薬を、そのような処置を必要とする対象に投与することを含む。
【００１３】
一態様において、本発明は、腫瘍または癌の成長を低減し、阻害し、阻止し、または防止するための方法を提供し、この方法は、NotchシグナリングおよびDLL4のインターナリゼーションの両方を同時に阻止する有効量のDLL4拮抗薬を、そのような処置を必要とする対象に投与することを含む。
【００１４】
一態様において、本発明は、血管新生を阻害するための方法を提供し、この方法は、NotchシグナリングおよびDLL4のインターナリゼーションの両方を同時に阻止する有効量のDLL4拮抗薬(例えば、抗DLL4抗体)を、そのような処置を必要とする対象に投与することを含む。
【００１５】
一態様において、本発明は、血管新生に付随する病状を処置するための方法を提供し、この方法は、NotchシグナリングおよびDLL4のインターナリゼーションの両方を同時に阻止する有効量のDLL4拮抗薬(例えば、抗DLL4抗体)を、そのような処置を必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、血管新生に付随する病状は、腫瘍、癌、および/または細胞増殖性障害である。いくつかの実施形態において、血管新生に付随する病状は、眼内の新生血管性疾患である。
【００１６】
一態様において、本発明は、内皮細胞の増殖を刺激するための方法を提供し、この方法は、NotchシグナリングおよびDLL4のインターナリゼーションの両方を同時に阻止する有効量のDLL4拮抗薬を、そのような処置を必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象は、血管新生に付随する病状(例えば、腫瘍、癌、および/または細胞増殖性障害)を有する。
【００１７】
一態様において、本発明は、内皮細胞の分化を阻害するための方法を提供し、この方法は、NotchシグナリングおよびDLL4のインターナリゼーションの両方を同時に阻止する有効量のDLL4拮抗薬を、そのような処置を必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、対象は、血管新生に付随する病状(例えば、腫瘍、癌、および/または細胞増殖性障害)を有する。
【００１８】
別の一態様において、本発明は、血管新生に付随する病状を有する対象における抗血管新生薬の処置の有効性を増強する方法を提供し、この方法は、NotchシグナリングおよびDLL4のインターナリゼーションの両方を同時に阻止する有効量のDLL4拮抗薬を、抗血管新生薬と組み合わせて対象に投与することを含む。このような方法は、癌または眼内の新生血管性疾患などの障害、特に、抗血管新生薬単独での処置に対して反応が不十分な疾患または障害の段階を処置するのに有用である。抗血管新生薬は、抗VEGF抗体などのVEGF拮抗薬を含む、血管新生を低減または阻害することができるあらゆる薬剤であってよい。
【００１９】
一態様において、本発明は、NotchシグナリングおよびDLL4のインターナリゼーションの両方を同時に阻止する有効量のDLL4拮抗薬(例えば、抗DLL4抗体)を、有効量の別の治療薬(例えば、抗血管新生薬)と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。例えば、DLL4拮抗薬を、様々な新生物性または非新生物性の病状を処置するための抗癌薬または抗血管新生薬と組み合わせて用いる。一実施形態において、新生物性または非新生物性の状態は、血管新生に付随する病状である。いくつかの実施形態において、他の治療薬は、抗血管新生薬、抗新生物性薬、および/または化学療法薬である。
【００２０】
DLL4拮抗薬を、同じ組成物において、または別々の組成物としてのいずれかで、これらの目的に有効である他の治療薬と、連続的にまたは組み合わせて投与することができる。DLL4拮抗薬および他の治療薬(例えば、抗癌薬、抗血管新生薬)の投与は、同じまたは異なる投与経路を用いて、同時に(例えば、単一の組成物として)、または2つ以上の別々の組成物として行うことができる。その代わりにまたはそれに加えて、投与はあらゆる順序で、逐次に行うことができる。その代わりにまたはそれに加えて、ステップはあらゆる順序で、逐次および同時の両方の組合せとして行うことができる。ある実施形態において、2種以上の組成物の投与間に、数分から数日、数週、数月までの間隔を置くことができる。例えば、抗癌薬を最初に投与し、その後DLL4拮抗薬を投与してもよい。しかし、同時投与、またはDLL4拮抗薬を最初に投与することも企図される。したがって、一態様において、本発明は、DLL4拮抗薬(例えば、抗DLL4抗体)の投与と、その後の抗血管新生薬(例えば、ベバシズマブなどの抗VEGF抗体)の投与を含む方法を提供する。ある実施形態において、2種以上の組成物の投与間に、数分から数日、数週、数月までの間隔を置くことができる。
【００２１】
ある態様において、本発明は、NotchシグナリングおよびDLL4のインターナリゼーションの両方を同時に阻止するDLL4の拮抗薬、および/または血管新生阻害薬(複数可)、および有効量の1つもしくは複数の化学療法薬を投与することによって、障害(例えば、腫瘍、癌、および/または細胞増殖性障害)を処置する方法を提供する。様々な化学療法薬を、本発明の処置方法と組み合わせて用いることができる。企図される化学療法薬の、例示の、および非限定的な列挙を、本明細書の「定義」の下に提供する。DLL4拮抗薬および化学療法薬の投与は、同じまたは異なる投与経路を用いて、同時に(例えば、単一の組成物として)、または2つ以上の別々の組成物として行うことができる。その代わりにまたはそれに加えて、投与はあらゆる順序で、逐次に行うことができる。その代わりにまたはそれに加えて、ステップはあらゆる順序で、逐次および同時の両方の組合せとして行うことができる。ある実施形態において、2種以上の組成物の投与間に、数分から数日、数週、数月までの間隔を置くことができる。例えば、化学療法薬を最初に投与し、その後DLL4拮抗薬を投与してもよい。しかし、同時の投与、またはDLL4拮抗薬を最初に投与することも企図される。したがって、一態様において、本発明は、DLL4拮抗薬(例えば、抗DLL4抗体)の投与と、その後の化学療法薬の投与を含む方法を提供する。ある実施形態において、2種以上の組成物の投与間に、数分から数日、数週、数月までの間隔を置くことができる。
【００２２】
一態様において、本発明は、血管新生に付随する病状などの障害の治療的処置および/または予防的処置のための薬物の調製における、NotchシグナリングおよびDLL4のインターナリゼーションの両方を同時に阻止するDLL4拮抗薬の使用を提供する。いくつかの実施形態において、障害は腫瘍、癌、および/または細胞増殖性障害である。
【００２３】
一態様において、本発明は、障害を処置するための方法を提供し、この方法は、NotchシグナリングおよびDLL4のインターナリゼーションの両方を同時に阻止する有効量のDLL4作用薬を、そのような処置を必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、障害は、DLL4-Notch受容体経路の発現および/または活性(例えば、DLL4-Notch受容体経路の活性化の増大)に付随する。いくつかの実施形態において、障害は、血管新生、新血管新生、および/または肥大が望ましい障害、例えば、血管外傷、創傷、断裂、切開、火傷、潰瘍(例えば、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍、血友病性潰瘍、静脈瘤性潰瘍)、組織成長、体重増加、末梢動脈疾患、分娩誘発、発毛、表皮水疱症、網膜萎縮、骨折、骨脊椎固定術、半月板断裂などである。いくつかの実施形態において、障害は、血管新生の阻害が望ましい障害である。いくつかの実施形態において、DLL4作用薬はDAPTまたはDBZである。
【００２４】
DLL4拮抗薬および作用薬は当技術分野では知られており、いくつかを本明細書に記載および例示する。いくつかの実施形態において、DLL4拮抗薬は、DLL4に結合し、DLL4に付随する作用の1つまたは複数の局面を中和し、阻止し、阻害し、抑止し、低減し、または干渉する分子である。いくつかの実施形態において、DLL4拮抗薬は、Notch受容体(例えば、Notch1、Notch2、Notch3、および/またはNotch4)に結合し、DLL4に付随する効果の1つまたは複数の局面を中和し、阻止し、阻害し、抑止し、低減し、または干渉する分子である。いくつかの実施形態において、DLL4拮抗薬は、内皮細胞の増殖を促進し、内皮細胞の分化を阻害し、動脈の発生を阻害し、および/または血管の潅流を低減することができる。当技術分野では十分確立されているように、内皮細胞の増殖、内皮細胞の分化、内皮細胞の発生、および血管の機能(例えば、血管の潅流)を、あらゆる様々なアッセイ(そのいくつかを本明細書に記載および例示する)を用いて評価することができ、様々な定量値によって表される。いくつかの実施形態において、内皮細胞の増殖を促進し、内皮細胞の分化を阻害し、動脈の発生を阻害し、および/または血管の機能を低減する(例えば、血管の潅流を低減する)DLL4拮抗薬の能力を、DLL4拮抗薬での処置の非存在下における、内皮細胞の増殖、内皮細胞の分化、動脈の発生、および/または血管の機能(例えば、血管の潅流)のレベルに対して評価する。いくつかの実施形態において、内皮細胞の増殖を促進し、内皮細胞の分化を阻害し、動脈の発生を阻害し、および/または血管の機能を低減する(例えば、血管の潅流を低減する)能力を、in vitroのアッセイ(例えば、本明細書に記載するHUVECアッセイ)で決定する。いくつかの実施形態において、内皮細胞の増殖を促進し、内皮細胞の分化を阻害し、動脈の発生を阻害し、および/または血管の機能を低減する(例えば、血管の潅流を低減する)能力を、in vivoのアッセイ(例えば、本明細書に記載するマウス網膜発生アッセイ)において決定する。
【００２５】
DLL4拮抗薬は、抗DLL4抗体であってよい。いくつかの実施形態において、抗DLL4抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、キメラ抗体、アフィニティー成熟抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗体は抗体フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体は、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、またはscFvである。
【００２６】
一実施形態において、抗体はキメラ抗体、例えば、異種性の非ヒト、ヒト、またはヒト化の配列(例えば、フレームワーク配列および/または定常ドメイン配列)にグラフトしている非ヒトのドナーからの抗原結合性配列を含む抗体である。一実施形態において、非ヒトのドナーはマウスである。一実施形態において、抗原結合性配列は合成であり、例えば、突然変異誘発(例えば、ファージディスプレイスクリーニングなど)によって得られる。一実施形態において、本発明のキメラ抗体は、マウスV領域およびヒトC領域を有する。一実施形態において、マウス軽鎖V領域がヒトカッパ軽鎖に融合している。一実施形態において、マウス重鎖V領域がヒトIgG1のC領域に融合している。
【００２７】
ヒト化抗体は、FRにおけるアミノ酸置換、およびグラフトされたCDRにおける変更を有するアフィニティー成熟の変異体を有するものを含む。CDRまたはFRにおける置換されたアミノ酸は、ドナーまたはレシピエントの抗体に存在するものに限定されない。他の実施形態において、本発明の抗体は、CDCおよび/またはADCC機能の増強ならびにB細胞の死滅を含めたエフェクター機能の改善をもたらす、Fc領域におけるアミノ酸残基における変更をさらに含む。本発明の他の抗体には、安定性を改善する特定の変更を有するものが含まれる。他の実施形態において、本発明の抗体は、エフェクター機能の低減(例えば、CDCおよび/またはADCC機能の低減ならびにB細胞の死滅の低減)をもたらす、Fc領域におけるアミノ酸残基における変更を含む。
【００２８】
一態様において、本発明は、1つまたは複数のDLL4拮抗薬および担体を含む組成物を提供する。一実施形態において、担体は薬学的に許容できる。いくつかの実施形態において、DLL4拮抗薬は抗DLL4抗体である。
【００２９】
一態様において、本発明は、有効量のDLL4拮抗薬および薬学的に許容できる担体を含む、腫瘍、癌、および/または細胞増殖性障害を処置するのに使用するための組成物を提供し、前記使用は、抗血管新生薬の同時投与または逐次投与を含む。いくつかの実施形態において、DLL4拮抗薬は抗DLL4抗体である。いくつかの実施形態において、抗血管新生薬は、抗VEGF抗体(例えば、ベバシズマブ)である。
【００３０】
一態様において、本発明は、有効量のDLL4拮抗薬および薬学的に許容できる担体を含む、腫瘍、癌、および/または細胞増殖性障害を処置するのに使用するための組成物を提供し、前記使用は、抗血管新生薬の同時投与または逐次投与を含む。いくつかの実施形態において、DLL4拮抗薬は、NotchシグナリングおよびDLL4インターナリゼーションを防止する抗DLL4抗体である。いくつかの実施形態において、抗血管新生薬は、別の抗DLL4抗体である。
【００３１】
一態様において、本発明は、有効量のDLL4拮抗薬および薬学的に許容できる担体を含む、腫瘍、癌、および/または細胞増殖性障害を処置するのに使用するための組成物を提供し、前記使用は、抗癌薬の同時投与または逐次投与を含む。いくつかの実施形態において、DLL4拮抗薬は抗DLL4抗体である。いくつかの実施形態において、抗癌薬は化学療法薬である。いくつかの実施形態において、使用は、抗血管新生薬の同時投与または逐次投与をさらに含む。いくつかの実施形態において、DLL4拮抗薬は抗DLL4抗体である。いくつかの実施形態において、抗血管新生薬は抗VEGF抗体(例えば、ベバシズマブ)である。
【００３２】
一態様において、本発明は、容器、および容器内に含まれている組成物を含む製品を提供し、組成物は、1つまたは複数のDLL4拮抗薬またはDLL4作用薬を含む。
【００３３】
一態様において、本発明は、1つまたは複数のDLL4拮抗薬またはDLL4作用薬を含む組成物を含む第1の容器、およびバッファーを含む第2の容器を含むキットを提供する。一実施形態において、バッファーは薬学的に許容できる。一実施形態において、DLL4拮抗薬は抗DLL4抗体である。
【００３４】
別の一態様において、本発明は、組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、治療上有効な量のDLL4拮抗薬またはDLL4作用薬を、薬学的に許容できる担体と混合することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】「実施例5」に従って染色した生後5日のマウスの網膜から取り込んだ画像を示す図である。図aおよびa'、bおよびb'などにおける画像は、緑色および赤色のチャンネルがa、bなどにおいて取り込まれ、赤色のチャンネルだけがa'、b'などにおいて取り込まれたこと以外は同じである。これにより、インターナリゼーションされたDLL4がより鮮明に視覚化された。DLL4(赤色)は、概して、殆どの毛細血管の内皮細胞(緑色)である細胞膜に存在する(a')。膜以外のある位置に蓄積している(不均等に分布)ことが認められたインターナリゼーションされたDLL4(矢印)は、能動的な血管新生が起こるマウス網膜の血管の前面の内皮細胞に頻繁に観察された(a)。DLL4は、成熟しているがインターナリゼーションされていない血管の神経叢における内皮細胞の細胞膜に存在する(cおよびc')。インターナリゼーションされたDLL4も、発生中の細動脈(矢印)に観察されるが(bおよびb')、静脈には観察されない(dおよびd')。  まとめると、いくつかのDLL4陽性の細胞は、DLL4染色の細胞内蓄積を示し、Notch活性化における以前または現在の関与を示唆している。これは、能動的な血管新生および血管のリモデリングが起こる部位と相関する。ほとんど全ての先端細胞(分析した50個のうち48個)は、Dll4染色の細胞内蓄積を示していた。興味深いことに、直ちに先端細胞と接触する多くの柄細胞(33/58)も、Dll4染色の細胞内蓄積を示し、出芽前面の先端細胞と柄細胞の間の能動的な双方向のDll4のシグナリングを示していた。DLL4蓄積は、DLL4/Notchシグナリングの知られている部位である細動脈に同様に観察されたが、細動脈に隣接し、または静脈における、成長する前面の裏側の神経叢における内皮細胞は、DLL4の細胞内蓄積は示さず、または少々示した。
【図２】ヒトDLL4タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】ヒトDLL4cDNAのヌクレオチド配列を示す図である。
【図４】マウスDLL4タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】マウスDLL4cDNAのヌクレオチド配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
一般的技術
本明細書に記載し、または参照する技術および手順は、当業者によって従来の方法論(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、(2001年)Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.;CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubelら編集(2003年));METHODS IN ENZYMOLOGYシリーズ(Academic Press, Inc.);PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson、B. D. HamesおよびG. R. Taylor編集(1995年))、Harlow and Lane編集(1988年) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney編集(1987年)に記載されている広く利用されている方法論)を用いて、概ね十分に理解され通常使用されている。
【００３７】
定義
本明細書で用いられる「DLL4」(交換可能に「Delta様4」と呼ばれる)の語は、特に具体的にまたは文脈上示されない限り、あらゆる天然または変異体の(天然でも、または合成でも)DLL4ポリペプチドを意味する。「天然の配列」の語は、天然に存在する切断または分泌された形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、天然に存在する変異体の形態(例えば、選択的にスプライシングされた形)、および天然に存在する対立遺伝子の変異体を特に包含する。「野生型のDLL4」の語は、天然に存在するDLL4タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを一般に意味する。「野生型のDLL4配列」の語は、天然に存在するDLL4に見られるアミノ酸配列を一般に意味する。
【００３８】
本明細書で用いられる「Notch受容体」(交換可能に「Notch」と呼ばれる)の語は、特に具体的にまたは文脈上示されない限り、あらゆる天然または変異体の(天然でも、または合成でも)Notch受容体ポリペプチドを意味する。ヒトはNotch受容体を4つ有する(Notch1、Notch2、Notch3、およびNotch4)。本明細書で用いられるNotch受容体の語は、4つのヒトNotch受容体のいずれか1つまたは全てを含む。「天然の配列」の語は、天然に存在する切断または分泌された形(例えば、細胞外ドメイン配列)、天然に存在する変異体の形(例えば、選択的にスプライシングされた形)、および天然に存在する対立遺伝子の変異体を特に包含する。「野生型のNotch受容体」の語は、天然に存在するNotch受容体タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを一般に意味する。「野生型のNotch受容体配列」の語は、天然に存在するNotch受容体に見られるアミノ酸配列を一般に意味する。
【００３９】
「DLL4核酸」は、上記で定義したDLL4ポリペプチドをコードするRNAもしくはDNAであり、またはそのようなDNAもしくはRNAにハイブリダイズし、厳密なハイブリダイゼーション条件下で安定に結合したままであり、ヌクレオチドの長さが約10個を超えるRNAもしくはDNAである。厳密な条件は、(1)洗浄のために低いイオン強度および高温(例えば、50℃の0.15MNaCl/0.015Mクエン酸ナトリウム/0.1%NaDodSO4)を用い、(2)ハイブリダイゼーションの間、ホルムアミドなど(例えば、42℃の750mMNaCl2、75mMクエン酸ナトリウムを有するpH6.5の0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%ポリビニルピロリドン/50mMリン酸ナトリウムバッファーを有する50%(体積/体積)ホルムアミド)の変性剤を用いる条件である。
【００４０】
「キメラのDLL4」分子は、異種性のポリペプチドに融合または結合している、全長のDLL4または1つもしくは複数のそのドメインを含むポリペプチドである。キメラのDLL4分子は、天然に存在するDLL4と共通の少なくとも1つの生物学的性質を一般的に共有している。キメラのDLL4分子の例は、精製の目的でタグ付けされているエピトープである分子である。別のキメラのDLL4分子は、DLL4のイムノアドヘジンである。
【００４１】
「Fc領域」の語は、本明細書において、天然配列のFc領域および変異のFc領域を含めた、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は変化してもよいが、ヒトIgG重鎖のFc領域は、Cys226の位置のアミノ酸残基から、またはPro230から、そのカルボキシ末端までの一続きと通常定義される。Fc領域のC末端のリジン(EUの番号付け方式による残基447)は、例えば、抗体の生成もしくは精製の間に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組換え操作することによって、除去することができる。したがって、インタクトな抗体の組成は、全てのK447残基が除去された抗体の集団、K447残基が除去されなかった抗体の集団、およびK447残基のある抗体とない抗体の混合物を有する抗体の集団を含むことができる。
【００４２】
別段の指摘がなければ、本明細書における、免疫グロブリン重鎖における残基の番号付けは、参照によって本明細書に明確に組み入れられる、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National institutes of Health、Bethesda, Md.(1991年)におけるようなEU指標のものである。「KabatにおけるようなEU指標」は、ヒトIgG1のEU抗体の残基の番号付けを意味する。
【００４３】
「機能的なFc領域」は、天然の配列のFc領域の「エフェクター機能」を有する。例示の「エフェクター機能」には、C1q結合、補体依存性細胞傷害、Fc受容体結合抗体依存性細胞傷害(ADCC)、貪食、細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体、BCR)の下方制御などが含まれる。このようなエフェクター機能は、結合性ドメイン(例えば、抗体の可変ドメイン)と連結するのにFc領域を一般に必要とし、例えば、本明細書に開示する様々なアッセイを用いて評価され得る。
【００４４】
「天然配列のFc領域」は、天然に見出されるFc領域のアミノ酸配列に同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトFc領域には、天然配列のヒトIgG1のFc領域(非λおよびλのアロタイプ)、天然配列のヒトIgG2のFc領域、天然配列のヒトIgG3のFc領域、および天然配列のヒトIgG4のFc領域、ならびに天然に存在するそれらの変異体が含まれる。
【００４５】
「変異体のFc領域」は、少なくとも1つのアミノ酸の改変、好ましくは1つまたは複数のアミノ酸の置換によって、天然配列のFc領域と異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異のFc領域は、天然配列のFc領域に比べて、または親のポリペプチドのFc領域に比べて、少なくとも1つのアミノ酸置換、例えば、天然配列のFc領域における、または親のポリペプチドのFc領域における約1つから約10つのアミノ酸の置換、好ましくは約1つから約5つのアミノ酸の置換を有する。本明細書における変異のFc領域は、好ましくは天然配列のFc領域および/または親のポリペプチドのFc領域と少なくとも約80%の相同性を有し、最も好ましくはそれと少なくとも約90%の相同性を有し、より好ましくはそれと少なくとも約95%の相同性を有する。
【００４６】
「単離された」抗体は、その天然の環境の成分から、同定され、分離され、および/または回復されているものである。その天然の環境の汚染成分は、抗体の診断上または治療上の使用に干渉する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれていてよい。好ましい実施形態において、抗体は、(1)ローリー法によって決定して抗体の95重量%を超え、最も好ましくは99重量%を超えて、(2)スピニングカップシーケネーター(spinning cup sequenator)の使用によって、N末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも15個の残基を得るのに十分な程度まで、または(3)クーマシーブルー染色、もしくは好ましくは銀染色を用いて、還元性もしくは非還元性の条件下でSDS-PAGEによって均一になるまで精製される。単離された抗体は、抗体の天然の環境の少なくとも1つの成分が存在しないので、組換えの細胞内に本来の場所で抗体を含む。しかし、通常は、単離された抗体は、少なくとも1つの精製ステップによって調製される。
【００４７】
「抗体」および「免疫グロブリン」の語は、最も広い意味において交換可能に用いられ、モノクローナル抗体(例えば、全長またはインタクトなモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、多価抗体、多特異性抗体(例えば、望ましい生物学的活性を示す限り二特異性抗体)を含み、ある種の抗体フラグメント(本明細書により詳しく記載する)も含むことができる。抗体は、ヒト、ヒト化、および/またはアフィニティー成熟であってよい。
【００４８】
「可変」の語は、可変ドメインのある部分が、抗体間の配列において広範に異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性および特異性において用いられる事実を意味する。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均等に分配されるものではない。これは、軽鎖および重鎖両方の可変ドメインにおける、相補性決定領域(CDR)、または高頻度可変領域と呼ばれる3つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分はフレームワーク(FR)と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、大部分はβシートの立体配置を採用し、3つのCDRによって連結されている4つのFR領域を各々含んでおり、3つのCDRはループの連結を形成し、ある場合にはβシート構造の部分を形成している。各鎖におけるCDRは、FR領域によって密接に近接して一緒に保持されており、他の鎖からのCDRは、抗体の抗原結合性部位の形成に寄与している(Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、National institute of Health、Bethesda、Md(1991年)を参照されたい)。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与など、様々なエフェクター機能を示す。
【００４９】
抗体をパパイン消化すると、「Fab」フラグメントと呼ばれる、各々単一の抗原結合性部位、および残りの「Fc」フラグメントを有する2つの同一の抗原結合性フラグメントがもたらされ、この名称は、それが容易に結晶化することができる能力を反映している。ペプシン処理によって、2つの抗原連結性部位を有し、依然として抗原を架橋連結することができるF(ab')2フラグメントが産生される。
【００５０】
「Fv」は、完全な抗原認識部位および抗原結合性部位を含む最小の抗体フラグメントである。2本鎖Fv種では、この領域は、緊密に、非共有性に会合した1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインの2量体からなる。1本鎖Fv種では、軽鎖および重鎖が2本鎖Fv種におけるものに類似する「2量体」構造において会合することができるように、1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインが柔軟なペプチドリンカーによって共有性に連結していてよい。各々の可変ドメインの3つのCDRが相互作用してVH-VL2量体の表面上の抗原結合性部位を規定するのは、この立体配置においてである。ひとまとめにして6つのCDRが、抗体に抗原結合性の特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメインでも(または、抗原に特異的な3つのCDRだけを含む半分のFvでも)、全体の結合性部位より低い親和性であるが、抗原を認識し、結合する能力を有している。
【００５１】
Fabフラグメントは、軽鎖の定常ドメイン、および重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)も含む。Fab'フラグメントは、抗体のヒンジ領域からの1つまたは複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に残基を数個加えることによって、Fabフラグメントと異なる。Fab'-SHは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基(複数可)が遊離のチオール基を保有するFab'に対する呼称である。F(ab')2抗体フラグメントは、本来、その間にヒンジのシステインを有する1対のFab'フラグメントとして生成された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。
【００５２】
あらゆる脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる明らかに異なる2つのタイプの1つに割り当てることができる。
【００５３】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMの5つの主要なクラスが存在し、これらのいくつかはサブクラス(イソ型)(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および3次元立体配置はよく知られている。
【００５４】
「抗体フラグメント」はインタクトな抗体の部分だけを含み、この場合、部分は、インタクトな抗体に存在する場合はその部分に通常付随している機能の少なくとも1つ、好ましくは殆どまたは全てを保持するのが好ましい。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFvフラグメント、ダイアボディー、線状抗体、1本鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成される多特異性抗体が含まれる。一実施形態において、抗体フラグメントはインタクトな抗体の抗原結合性部位を含み、したがって抗原に結合する能力を保持している。別の一実施形態において、Fc領域を含んでいるものなどの抗体フラグメントは、インタクトな抗体に存在する場合にFc領域に通常付随する生物学的機能(例えば、FcRn結合抗体の半減期の変調、ADCC機能、および補体の結合性)の少なくとも1つを保持している。一実施形態において、抗体フラグメントは、インタクトな抗体に実質的に同様なin vivoの半減期を有する一価の抗体である。例えば、このような抗体フラグメントは、フラグメントにin vivoの安定性を付与することができるFc配列に連結している抗原結合性アームを含んでいてよい。
【００５５】
本明細書において用いる場合の「高頻度可変性領域」、「HVR」、または「HV」の語は、配列および/または形態が構造的に規定されるループにおいて高頻度可変性である抗体の可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は、VHに3つ(H1、H2、H3)およびVLに3つ(L1、L2、L3)の6つの高頻度可変性領域を含んでいる。高頻度可変性領域の番号の記述は、用いられているものであり、本明細書に包含される。Kabatの相補性決定領域(CDR)は配列の可変性に基づくものであり、最も一般的に用いられている(Kabatら、Sequences of Proteins of immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991年))。Chothiaは、代わりに、構造ループの位置に言及した(ChothiaおよびLesk. J.、Mol. Biol.、196巻、901〜917頁(1987年))。AbMの高頻度可変性領域は、KabatのCDRとChothiaの構造ループの間の折衷を表しており、Oxford Molecular's AbM抗体モデリングソフトウェアによって用いられている。「接点」の高頻度可変性領域は、入手可能な複雑な結晶構造の分析に基づくものである。各々のこれらの高頻度可変性領域からの残基を以下に記す。表-US-00002 Loop Kabat AbM Chothia接点L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B(Kabatの番号付け)H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35(Chothiaの番号付け)H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
【００５６】
高頻度可変性領域は、以下のような「拡張された高頻度可変性領域」を含むことができる:VLにおける24〜36または24〜34(L1)、46〜56または50〜56(L2)および89〜97(L3)、ならびにVHにおける26〜35(H1)、50〜65または49〜65(H2)および93〜102、94〜102または95〜102(H3)。可変ドメインの残基は、これらの定義の各々に対して、Kabatら、上述に従って番号付けされる。
【００５７】
「フレームワーク」または「FR」残基は、本明細書で定義する高頻度可変性領域の残基以外の可変ドメイン残基である。
【００５８】
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」の語は、本質的に均一な抗体の集団からの抗体を意味し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、モノクローナル抗体の生成の間に生じることがある可能な変異体を除いて同一であり、および/または同じエピトープ(複数可)に結合し、そのような変異体は一般的に少量存在する。このようなモノクローナル抗体は、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を典型的に含み、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合性ポリペプチド配列を選択することを含む過程によって得られたものである。例えば、選択の過程は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えDNAクローンのプールなど、多数のクローンからの唯一のクローンの選択であってよい。選択された標的結合性配列は、例えば、標的に対する親和性を改善し、標的結合性配列をヒト化し、細胞培養物におけるその生成を改善し、in vivoにおけるその免疫原性を低減し、多特異性の抗体を作り出すなどのためにさらに変更されることがあり、および変更された標的結合性配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解すべきである。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。モノクローナル抗体調製物は、その特異性に加えて、典型的に他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点で有利である。「モノクローナル」の修飾語は、本質的に均一な集団の抗体から得られたという抗体の特徴を示すものであり、あらゆる特定の方法によって抗体を生成することを必要とすると解釈してはならない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohlerら、Nature、256巻、495頁(1975年);Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、1988年);Hammerlingら、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas、563〜681頁、(Elsevier、N.Y.、1981年))、組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照されたい)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clacksonら、Nature、352巻、624〜628頁(1991年);Marksら、J. Mol. Biol.、222巻、581〜597頁(1991年);Sidhuら、J. Mol. Biol.、338巻(2):299〜310頁(2004年);Leeら、J. Mol. Biol.、340巻(5)、1073〜1093頁(2004年);Fellouse、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、101巻(34)、12467〜12472頁(2004年);およびLeeら、J. Immunol. Methods、284巻(1〜2)、119〜132巻、(2004年)を参照されたい)、ならびにヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の部分または全てを有する動物におけるヒトまたはヒト様抗体を生成するための技術(例えば、国際公開第1998/24893号、国際公開第1996/34096号、国際公開第1996/33735号、国際公開第1991/10741号、Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90巻、2551頁(1993年); Jakobovitsら、Nature、362巻、255〜258頁(1993年); Bruggemannら、Year in Immunol.、7巻、33頁(1993年); 米国特許第5,545,806号、第5,569,825号、第5,591,669号(以上GenPharm)、米国特許第5,545,807号、国際公開第1997/17852号、米国特許第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号; Marksら、Bio/Technology、10巻、779〜783頁(1992年);Lonbergら、Nature、368巻、856〜859頁(1994年);Morrison、Nature、368巻、812〜813頁、(1994年);Fishwildら、Nature Biotechnology、14巻、845〜851頁(1996年);Neuberger、Nature Biotechn
ology、14巻、826頁(1996年);ならびにLonbergおよびHuszar、intern. Rev. Immunol.、13巻、65〜93頁(1995年)を参照されたい)を含めた様々な技術によって作成され得る。
【００５９】
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒトの免疫グロブリンに由来する最小の配列を含むキメラ抗体である。殆どの部分、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変性領域からの残基が、望ましい特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒトの霊長動物などの非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変性領域からの残基によって置換されているヒト免疫グロブリン(レシピエントの抗体)である。いくつかの場合では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基が、対応する非ヒトの残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエントの抗体において、またはドナーの抗体において見られない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインを本質的に全て含み、これらの非ヒトの免疫グロブリンに対応する全ての、または本質的に全ての高頻度可変性のループ、および全ての、または本質的に全てのFRは、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部分も場合により含む。さらなる詳細には、Jonesら、Nature、321巻、522〜525頁(1986年);Riechmannら、Nature、332巻、323〜327頁(1988年);およびPresta、Curr. Op. Struct. Biol.、2巻、593〜596頁(1992年)を参照されたい。また、本明細書に引用する以下の総説文献および参照も参照されたい:VaswaniおよびHamilton、Ann. Allergy, Asthma & Immunol.、1巻、105〜115頁(1998年); Harris、Biochern. Soc. Transactions、23巻、1035〜1038頁(1995年); HurleおよびGross、Curr. Op. Biotech.、5巻、428〜433 (1994年)。
【００６０】
「キメラ」抗体(免疫グロブリン)は、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に同一または相同である重鎖および/または軽鎖の一部分を有し、鎖の残りは、これらが望ましい生物学的活性を表す限り、別の種に由来する抗体、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体、およびこのような抗体のフラグメントにおける対応する配列に同一または相同である(米国特許第4,816,567号、およびMorrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81巻6851〜6855頁(1984年))。本明細書で用いるヒト化抗体は、キメラ抗体のサブセットである。
【００６１】
「一本鎖Fv」または「scFv」抗体フラグメントは、抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインは一本鎖ポリペプチドに存在する。一般に、scFvポリペプチドは、scFvが抗原の結合に望ましい構造を形成できるようにするVHドメインとVLドメインの間のポリペプチドのリンカーをさらに含む。scFvの総説には、Pluckthun、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、第113巻、RosenburgおよびMoore編集、Springer-Verlag、New York、269〜315頁(1994年)を参照されたい。
【００６２】
「抗原」は、抗体が選択的に結合することができる予め決定された抗原である。標的の抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、または他の天然に存在するもしくは合成の化合物であってよい。標的の抗原がポリペプチドであるのが好ましい。
【００６３】
「ダイアボディー」の語は、抗原結合性部位を2つ有する小型の抗体フラグメントを意味し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖(VH-VL)において軽鎖可変ドメイン(VL)に連結している重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖上の2つのドメイン間に対を形成するには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補性ドメインと強制的に対にし、2つの抗原結合性部位を作り出す。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第404,097号、国際公開第93/11161号、およびHollingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90巻、6444〜6448頁(1993年)により詳しく記載されている。
【００６４】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生成され、および/または本明細書に記載するヒト抗体を作成するためのあらゆる技術を用いて作成された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒトの抗原結合性残基を含むヒト化抗体を特に除外するものである。
【００６５】
「アフィニティー成熟した」抗体は、変更(複数可)を所有しない親の抗体に比べて抗原に対する抗体の親和性における改善をもたらす、1つまたは複数のそのCDRにおける1つまたは複数の変更を有する抗体である。好ましいアフィニティー成熟した抗体は、標的の抗原に対してナノモル、またはさらにピコモルの親和性を有する。アフィニティー成熟した抗体は、当技術分野では知られている手順によって生成される。Marksら、Bio/Technology、10巻、779〜783頁(1992年)は、VHおよびVLドメインのシャフリングによるアフィニティー成熟を記載している。CDRおよび/またはフレームワーク残基のランダム変異導入法は、Barbasら、Proc Nat. Acad. Sci, USA、91巻、3809〜3813頁(1994年);Schierら、Gene、169巻、147〜155頁(1995年);Yeltonら、J. Immunol.、155巻、1994〜2004頁(1995年);Jacksonら、J. Immunol.、154巻(7)、3310〜9頁(1995年);およびHawkinsら、J. Mol. Biol.、226巻、889〜896頁(1992年)によって記載されている。
【００６６】
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のFc領域(天然配列のFc領域またはアミノ酸配列変異のFc領域)に起因し得る生物学的活性を意味し、抗体のイソ型で変化する。抗体のエフェクター機能の例には、C1q結合性および補体依存性細胞傷害、Fc受容体結合抗体依存性細胞傷害(ADCC)、貪食作用、細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)の下方制御、およびB細胞の活性化が含まれる。
【００６７】
「抗体依存性細胞傷害」または「ADCC」は、ある種の細胞傷害性の細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)上に存在するFc受容体(FcR)上に結合した分泌されたIgが、これらの細胞傷害性のエフェクター細胞を、抗原を保有する標的細胞に特異的に結合できるようにし、引き続き細胞毒で標的細胞を死滅させる一形態の細胞傷害性を意味する。抗体は細胞傷害性細胞で「武装」し、このような死滅には絶対的に必要とされる。ADCCを媒介するための主要な細胞であるNK細胞はFcγRIIIだけを発現し、単球はFcγRI、FxγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcRの発現は、RavetchおよびKinet、Annu. Rev. Immunol、9巻、457〜92頁(1991年)、464頁の表3に概略されている。対象の分子のADCC活性を評価するために、米国特許第5,500,362号、または第5,821,337号、またはPrestaの米国特許第6,737,056号に記載されているものなど、in vitroのADCCアッセイを行ってもよい。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。その代わりにまたはそれに加えて、対象の分子のADCC活性は、in vivoで、例えば、Clynesら、PNAS (USA) 95巻、652〜656頁(1998年)に記載されているものなど、動物モデルにおいて評価してもよい。
【００６８】
「ヒトエフェクター細胞」は、1つまたは複数のFcRを発現し、エフェクター機能を行う白血球である。細胞が少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を行うのが好ましい。ADCCを媒介するヒト白血球の例には、末梢血単核球(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞傷害性T細胞、および好中球が含まれ、PBMCおよびNK細胞が好ましい。エフェクター細胞は、天然の供給源から、例えば血液から単離され得る。
【００６９】
「Fc受容体」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体を記述するものである。好ましいFcRは、天然の配列のヒトFcRである。さらに、好ましいFcRは、IgG抗体に結合するものであり(ガンマ受容体)、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIのサブクラスの受容体(これらの受容体の対立形質の変異体および選択的にスプライシングされた形を含む)を含む。FcγRII受容体は、FcγRIIA(「活性化受容体」)およびFcγRIIB(「阻害性受容体」)を含み、これらは主にそれらの細胞質ドメインにおいて異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を含んでいる。阻害性受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を含んでいる(総説である、M. in Daeron、Annu. Rev. Immunol.、15巻、203〜234頁(1997年)を参照されたい)。FcRは、RavetchおよびKinet、Annu. Rev. Immunol、9巻、457〜92頁(1991年);Capelら、Immunomethods、4巻、25〜34頁(1994年);ならびにde Haasら、J. Lab. Clin. Med.、126巻、330〜41頁(1995年)に概説されている。将来同定されるものを含めた他のFcRは、本明細書「FcR」の語に包含される。この語には、母親のIgGの胎児への輸送を担い(Guyerら、J. Immunol.、117巻、587頁(1976年)、およびKimら、J. Immunol.、24巻、249頁(1994年))、免疫グロブリンの恒常性を調節する新生児受容体であるFcRnも含まれる。
【００７０】
国際公開第00/42072号(Presta)は、FcRへの結合を改善または低減した抗体の変異体を記載している。この特許公報の内容は、参照によって本明細書に特に組み入れられる。Shieldsら、J. Biol. Chem.、9巻(2)、6591〜6604頁(2001年)も参照されたい。
【００７１】
FcRnに対する結合を測定する方法は知られている(例えば、Ghetie、1997年、Hinton、2004年を参照されたい)。in vivoにおけるヒトFcRnに対する結合、およびヒトFcRn高親和性結合性ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトしたヒト細胞系において、またはFc変異体ポリペプチドを投与した霊長動物においてアッセイすることができる。
【００７２】
「補体依存性細胞傷害」または「CDC」は、補体の存在下における標的細胞の溶解を意味する。古典的な補体経路の活性化は、補体系の第1の成分(C1q)が、その同種の抗原に結合している(好適なサブクラスの)抗体に対して結合することによって始まる。補体の活性化を評価するには、例えば、Gazzano-Santoroら、J. Immunol. Methods、202巻、163頁(1996年)に記載されるCDCアッセイを行ってもよい。
【００７３】
Fc領域アミノ酸配列を変更し、C1q結合可能性を増大または低減したポリペプチドの変異体は、米国特許第6,194,551B1号および国際公開第99/51642号に記載されている。これらの特許公報の内容は、参照によって本明細書に特に組み入れられる。Idusogieら、J.Immunol.、164巻、4178〜4184頁(2000年)も参照されたい。
【００７４】
「Fc領域含有ポリペプチド」の語は、Fc領域を含む、抗体またはイムノアドヘシン(以下の定義を参照されたい)などのポリペプチドを意味する。Fc領域のC末端リジン(EU番号付けシステムによる残基447)を、例えば、ポリペプチドの精製の間に、またはポリペプチドをコードする核酸を組換え操作することによって除去してもよい。したがって、本発明によるFc領域を有するポリペプチドを含む組成物は、K447を有するポリペプチド、K447が全て除去されたポリペプチド、またはK447残基のあるポリペプチドとないポリペプチドの混合物を含むことができる。
【００７５】
「阻止」抗体または「拮抗」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減する抗体である。好ましい阻止抗体または拮抗抗体は、実質的に、または完全に、抗原の生物学的活性を阻害する。
【００７６】
「慢性の」投与は、長期間、最初の治療効果(活性)を維持するための、急性の様式に対する連続的な様式における薬剤(複数可)の投与を意味する。「断続的な」投与は、中断なしであるが継続的になされない処置であり、むしろ本来周期的である。
【００７７】
「障害」または「疾患」は、本発明の物質/分子または方法での処置の恩恵を受けるあらゆる状態である。これには、問題の障害に哺乳動物を罹患しやすくするこれらの病状を含めた慢性および急性の障害または疾患が含まれる。本明細書で処置される障害の非制限的な例には、悪性および良性の腫瘍、癌腫、芽腫、および肉腫が含まれる。
【００７８】
「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」の語は、ある程度の異常な細胞増殖に付随する障害を意味する。一実施形態において、細胞増殖性障害は癌である。
【００７９】
本明細書で用いられる「腫瘍」は、悪性でも、または良性でも、全ての新生物性の細胞の成長および増殖、ならびに全ての前癌性のおよび癌性の細胞および組織を意味する。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、および「腫瘍」の語は、本明細書で言及するように相互に排他的ではない。
【００８０】
「癌」および「癌性の」の語は、典型的には非制御の細胞の成長/増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を意味し、または記載するものである。癌の例には、それだけには限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が含まれる。このような癌のより詳しい例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化器癌、すい臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、大腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜または子宮の癌腫、唾液腺の癌腫、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部の癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、メラノーマ、ならびに様々なタイプの頭部および頸部の癌が含まれる。血管新生の調節不全は、本発明の組成物および方法によって処置することができる多くの障害をもたらし得る。これらの障害には、非新生物性の状態も、新生物性の状態も、両方含まれる。新生物には、それだけには限定されないが、上記に記載したものが含まれる。非新生物性の障害には、それだけには限定されないが、望ましくないまたは異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬プラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、動脈硬化プラーク、未熟児網膜症を含む糖尿病性および他の増殖性網膜症、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植新血管新生、角膜移植拒絶反応、網膜/脈絡膜新生血管、隅角の新血管新生(ルベオーシス)、眼の新血管新生疾患、血管再狭窄、動静脈奇形(AVM)、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成(グレーブス病を含む)、角膜および他の組織の移植、慢性炎症、肺の炎症、急性肺傷害/ARDS、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出液、脳浮腫(例えば、急性脳卒中/閉鎖性頭部外傷/外傷に付随する)、滑膜の炎症、RAにおけるパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎(OA)、難治性腹水症、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、液体疾患の第3スペーシング (3rd spacing of fluid disease) (膵炎、コンパートメント症候群、火傷、腸疾患)、子宮筋腫、早産、IBD(クローン病および潰瘍性大腸炎)などの慢性炎症、同種移植腎拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくないまたは異常な組織塊成長(非癌性)、血友
病関節、肥厚性瘢痕、発毛の阻害、オースラーウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管癒着、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢液貯留(心膜炎に付随するものなど)、ならびに胸膜滲出液が含まれる。
【００８１】
本明細書で用いられる「処置」は、処置されている個体または細胞の自然の経過を変更しようという試みにおける臨床上の介入を意味し、予防のため、または臨床病理学の経過の間に行われ得る。処置の望ましい効果には、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患のあらゆる直接的または間接的な病理学的結果の縮小、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の寛解または緩和、および、予後の緩解または改善が含まれる。いくつかの実施形態において、抗体は、疾患または障害の発生を遅らせるために用いられる。
【００８２】
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、それだけには限定されないが、農場家畜(例えば、ウシ)、スポーツ動物、ペット(例えば、ネコ、イヌ、およびウマ)、霊長動物、マウス、ならびにラットが含まれる。
【００８３】
処置の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜および農場家畜、動物園動物、スポーツ動物、またはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含めた哺乳動物と分類されるあらゆる動物を意味する。哺乳動物がヒトであるのが好ましい。
【００８４】
「有効量」は、望ましい治療または予防の結果を達成するのに必要な投与量および期間の間、有効である量を意味する。
【００８５】
物質/分子の「治療上有効な量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重などの因子、ならびに個体において望ましい反応を誘発する物質/分子、作用薬または拮抗薬の能力に従って変化してよい。治療上有効な量は、物質/分子、作用薬または拮抗薬のあらゆる毒性の、または有害な効果を、治療上有益な効果が上回る量でもある。「予防上有効な量」は、望ましい予防上の結果を達成するのに、必要な投与量および期間の間、有効である量を意味する。必ずというわけではないが、典型的には、予防的な投与量を疾患の前に、または早期段階に対象に用いるので、予防上有効な量は治療上有効な量よりも少ない。
【００８６】
「眼内の新生血管性疾患」は、目の新生血管新生を特徴とする疾患である。眼内の新生血管性疾患の例には、それだけには限定されないが、増殖性網膜症、脈絡膜新生血管(CNV)、加齢黄斑変性症(AMD)、糖尿病性および他の虚血関連の網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォンヒッペルリンダウ病、眼のヒストプラズマ症、中心網膜静脈閉塞(CRVO)を含む網膜静脈閉鎖症、角膜新血管新生、網膜新生血管などが含まれる。
【００８７】
疾患の「病理」には、患者の幸福を損なう全ての現象が含まれる。癌では、これには、制限なく、異常な、または非制御の細胞の成長、転移、隣接する細胞の正常の機能の干渉、異常なレベルのサイトカインまたは他の分泌性生成物の放出、炎症反応または免疫学的反応の抑制または増悪などが含まれる。
【００８８】
1つまたは複数のさらなる治療用薬剤と「組み合わせた」投与には、あらゆる順序の同時の(併用の)および連続の投与が含まれる。
【００８９】
本明細書で用いられる「担体」には、使用される投与量および濃度で、それに曝露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤が含まれる。生理学的に許容できる担体は、pH緩衝水溶液であることが多い。生理学的に許容できる担体の例には、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸を含めた抗酸化剤;低分子量(残基約10個未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物、EDTAなどのキレート化剤、マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成性対イオン;ならびに/またはTWEEN(商標)、ポリエチレングリコール(PEG)、およびPLURONICS(商標)などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００９０】
「リポソーム」は、薬物(例えば、DLL4ポリペプチドまたはそれに対する抗体)を哺乳動物に送達するのに有用である様々なタイプの脂質、リン脂質、および/または界面活性剤からなる小型の小胞である。リポソームの成分は、一般に、生物学的な膜の脂質の配列と同様の2重膜構造に配列される。
【００９１】
「VEGF」および「VEGF-A」の語は、交換可能に用いられて、天然に存在する対立遺伝子形態およびそのプロセシングされた形態とともに、Leungら、Science、246巻、1306頁(1989年)、Houckら、Mol. Endocrin.、5巻、1806頁(1991年)、ならびにRobinsonおよびStringer、Journal of Cell Science、144巻(5)、853〜865頁(2001年)によって記載されているように、アミノ酸165個の血管内皮細胞増殖因子、および関連する、アミノ酸121個、145個、183個、189個、および206個の血管内皮細胞増殖因子を意味する。
【００９２】
「VEGF拮抗薬」は、1つまたは複数のVEGF受容体に対するVEGFの結合を含む、VEGF活性を中和し、阻止し、阻害し、抑止し、低減し、または干渉することができる分子を意味する。VEGF拮抗薬には、抗VEGF抗体、およびその抗原結合性フラグメント;VEGFに特異的に結合し、その結果1つまたは複数の受容体に対するその結合を隔絶する受容体分子および誘導体;VEGFRチロシンキナーゼの小型分子阻害物質などの、抗VEGF受容体抗体およびVEGF受容体拮抗薬;ならびに融合タンパク質、例えば、VEGF-Trap(Regeneron)、VEGF121-gelonin(Peregrine)が含まれる。VEGF拮抗薬には、また、VEGFの拮抗薬変異体、VEGFに対するアンチセンス分子、RNAアプタマー、およびVEGFまたはVEGF受容体に対するリボザイムが含まれる。
【００９３】
「抗VEGF抗体」は、十分な親和性および特異性でVEGFに結合する抗体である。抗VEGF抗体は、VEGF活性が関与する疾患または状態を標的とし、干渉する点で治療用薬剤として用いられ得る。例えば、米国特許第6,582,959号、第6,703,020号、国際公開第98/45332号、国際公開第96/30046号、国際公開第94/10202号、国際公開第2005/044853号、欧州特許第0666868B1号、米国特許出願公開第20030206899号、第20030190317号、第20030203409号、第20050112126号、第20050186208号、および第20050112126号;Popkovら、Journal of Immunological Methods、288巻、149〜164頁(2004年)、および国際公開第2005012359号を参照されたい。抗VEGF抗体は、通常、VEGF-BまたはVEGF-Cなどの他のVEGFホモログにも結合せず、PIGF、PDGF、またはbFGFなどの他の成長因子にも通常結合しない。「rhuMAbVEGF」または「Avastin」としても知られている、抗VEGF抗体である「ベバシズマズ(BV)」は、Prestaら、Cancer Res.、57巻、4593〜4599頁(1997年)に従って産生される組換えのヒト化抗VEGFモノクローナル抗体である。これは、ヒトVEGFのその受容体に対する結合を阻止するマウス抗-hVEGFモノクローナル抗体A.4.6.1からの、突然変異したヒトIgG1フレームワーク領域および抗原結合性相補性決定領域を含んでいる。殆どのフレームワーク領域を含む、ベバシズマブのアミノ酸配列の約93%はヒトIgG1に由来し、配列の約7%はマウス抗体A4.6.1に由来する。ベバシズマブは約149000ダルトンの分子量を有し、グリコシル化されている。「Lucentis(登録商標)」としても知られている抗VEGF抗体フラグメントである「ラニビズマブ」を含む、ベバシズマブおよび他のヒト化抗VEGF抗体は、2005年2月26日発行の米国特許第6,884,879号にさらに記載されている。
【００９４】
DLL4ポリペプチドに関する「生物学的活性」および「生物学的に活性な」の語は、DLL4に付随する物理的/化学的性質および生物学的機能を意味する。いくつかの実施形態において、DLL4の「生物学的活性」には、Notch受容体(例えば、Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)の結合、Notch受容体の活性化、およびNotch受容体の下流の分子シグナリングの活性化の1つまたは複数が含まれる。この文脈において「変調する」の語は、促進および阻害の両方を含む。
【００９５】
「DLL4拮抗薬」は、Notch受容体の活性化の阻止、Notch受容体の下流の分子シグナリングの低減もしくは阻止、Notch受容体のDLL4に対する結合のかく乱もしくは阻止、および/または内皮細胞の増殖の促進、および/または内皮細胞の分化の阻害、および/または動脈の分化の阻害を含む、DLL4の活性を中和し、阻止し、阻害し、抑止し、低減し、または干渉することができる分子を意味する。DLL4拮抗薬には、抗体およびその抗原結合性フラグメント、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチドミメティック、薬理学的物質およびその代謝産物、転写および翻訳制御配列などが含まれる。拮抗薬には、また、タンパク質の小分子阻害薬、および融合タンパク質;タンパク質に特異的に結合し、その結果その標的に対する結合を隔絶する受容体分子および誘導体、タンパク質の拮抗薬の変異体、タンパク質の拮抗薬の変異体、タンパク質に対するsiRNA分子、タンパク質に対するアンチセンス分子、RNAアプタマー、およびタンパク質に対するリボザイムが含まれる。いくつかの実施形態において、DLL拮抗薬は、DLL4に結合し、DLL4の生物学的活性を中和し、阻止し、阻害し、抑止し、低減し、または干渉する分子である。いくつかの実施形態において、DLL4拮抗薬は、Notch受容体(例えば、Notch1、Notch2、Notch3、および/またはNotch4)に結合し、DLL4の生物学的活性を中和し、阻止し、阻害し、抑止し、低減し、または干渉する分子である。いくつかの実施形態において、DLL4拮抗薬は、それだけには限定されないが、Notch受容体の活性化の低減または阻止、Notch受容体の下流の分子シグナリングの低減もしくは阻止、Notch受容体のDLL4に対する結合のかく乱もしくは阻止、ならびに/または内皮細胞の増殖の促進、ならびに/または内皮細胞の分化の阻害、ならびに/または動脈の分化の阻害、ならびに/または腫瘍血管の潅流の阻害;ならびに/または腫瘍、細胞増殖性障害、もしくは癌の処置および/もしくは防止;ならびに/またはDLL4発現および/もしくは活性に付随する障害の処置もしくは防止、ならびに/またはNotch受容体の発現および/もしくは活性に付随する障害の処置もしくは防止を含む、DLL4に付随する効果の1つまたは複数の局面を変調する。
【００９６】
「抗新生物性組成物」の語は、「抗癌薬」など、少なくとも1つの治療用有効薬剤を含む、癌を処置するのに有用な組成物を意味する。治療用薬剤(本明細書において「抗新生物薬」とも呼ばれる抗癌薬)の例には、それだけには限定されないが、例えば、化学療法薬、成長阻害薬、細胞傷害性薬、放射線治療において用いられる薬剤、抗血管新生薬、アポトーシス薬、抗チューブリン薬、癌を処置するための毒素および他の薬剤(例えば、抗VEGF中和抗体)、VEGF拮抗薬、抗HER-2、抗CD20、上皮成長因子受容体(EGFR)拮抗薬(例えば、チロシンキナーゼ阻害薬)、HER1/EGFR阻害薬、エルロチニブ、COX-2阻害薬(例えば、セレコキシブ)、インターフェロン、サイトカイン、1つまたは複数のErbB2、ErbB3、ErbB4、またはVEGF受容体(複数可)に結合する拮抗薬(例えば、中和抗体)、血小板由来成長因子(PDGF)および/または幹細胞因子(SCF)に対するレセプターチロシンキナーゼに対する阻害薬(例えば、イマチニブメシレート(Gleevec(登録商標)、Novartis))、TRAIL/Apo2L、ならびに他の生理活性物質および有機化学物質などが含まれる。
【００９７】
本出願で用いられる「プロドラッグ」の語は、親の薬物に比べて腫瘍細胞に対する細胞傷害性が低く、酵素的な活性化が可能であり、またはより活性な親の形態に変換することができる、薬学的に活性な物質の前駆物質または誘導体の形態を意味する。例えば、Wilman、「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」、Biochemical Society Transactions、14巻、375〜382頁、第615回Meeting Belfast(1986年)、およびStellaら、「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery、Borchardtら(編集)、247〜267頁Humana Press(1985年)を参照されたい。本発明のプロドラッグには、それだけには限定されないが、リン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、D-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化されたプロドラッグ、ベータラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されているフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、または場合により置換されているフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性な細胞傷害性の遊離薬物に変換され得る5-フルオロシトシンおよび他の5-フルオロウリジンプロドラッグが含まれる。本発明で用いるためにプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞傷害性薬物の例には、それだけには限定されないが、上記に記載したこれらの化学療法薬が含まれる。
【００９８】
「血管新生因子または薬剤」は、血管の発生を刺激する、例えば、血管新生、内皮細胞の成長、血管の安定性、および/または脈管形成などを促進する成長因子である。例えば、血管新生因子には、それだけには限定されないが、例えば、VEGFおよびVEGFファミリーのメンバー、PIGF、PDGFファミリー、線維芽細胞成長因子ファミリー(FGF)、TIEリガンド(アンジオポエチン)、エフリン、ANGPTL3、DLL4などが含まれる。これには、成長ホルモン、インスリン様成長因子-I(IGF-I)、VIGF、上皮成長因子(EGF)、CTGFおよびそのファミリーのメンバー、ならびにTGF-αおよびTGF-βなど、創傷治癒を加速する因子も含まれる。例えば、KlagsbrunおよびD'Amore、Annu. Rev. Physiol.、53巻、217〜39頁(1991年); StreitおよびDetmar、Oncogene、22巻、3172〜3179頁(2003年); FerraraおよびAlitalo、Nature Medicine、5巻(12)、1359〜1364頁(1999年);Toniniら、Oncogene、22巻、6549〜6556頁(2003年)(例、表1、血管新生因子のリスト);ならびにSato、Int. J. Clin. Oncol.、8巻、200〜206頁(2003年)を参照されたい。
【００９９】
「抗血管新生薬」または「血管新生阻害薬」は、血管新生、脈管形成、または望ましくない血管の透過性を、直接的または間接的のいずれかで阻害する、低分子量の物質、ポリヌクレオチド(例えば、阻害性RNA(RNAiまたはsiRNA)を含む)、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体、またはコンジュゲートもしくはその融合タンパク質を意味する。例えば、抗血管新生薬は、上記で定義した抗体、または血管新生薬剤に対する他の拮抗薬である(例えば、VEGFに対する抗体、VEGF受容体に対する抗体、VEGF受容体のシグナリングを阻止する小分子(例えば、PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT(登録商標)/SU11248(スニチニブマレエート)、AMG706、または例えば国際公開第2004/113304号に記載されているものなど)。抗血管新生薬は、天然の血管新生阻害薬、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチンなども含む。例えば、KlagsbrunおよびD'Amore、Annu. Rev. Physiol.、53巻、217〜39頁(1991年);StreitおよびDetmar、Oncogene、22巻、3172〜3179頁(2003年)(例、表3、悪性メラノーマにおける抗血管新生治療の列挙);FerraraおよびAlitalo、Nature Medicine、5巻(12)、1359〜1364頁(1999年);Toniniら、Oncogene、22巻、6549〜6556頁(2003年)(例、表2、抗血管新生因子の列挙);ならびにSato、Int. J. Clin. Oncol.、8巻、200〜206頁(2003年)(例、表1、臨床試験で用いられる抗血管新生薬の列挙)を参照されたい。
【０１００】
本発明の方法および組成物
本発明は、血管の発生は、Notch受容体経路のDelta様4(交換可能に「DLL4」と呼ばれる)活性化を変調し、DLL4のインターナリゼーションを少なくとも60%、または少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%妨害する薬剤で処置することによって阻害されるという発見に部分的に基づくものである。架橋結合し、DLL4のインターナリゼーションを誘発する典型的な(二価の)抗体とは異なって、DLL4拮抗薬での処置は、内皮細胞(EC)増殖の増大、不適当な内皮細胞の分化、および腫瘍の脈管を含めた脈管構造における不適当な動脈の発生をもたらす。顕著なことに、抗DLL4抗体での処置は、いくつかの異なる癌における腫瘍の成長の阻害をもたらす。理論によって拘泥するものではないが、EC増殖を増大し、EC分化を損なうと、不適当な腫瘍の脈管の機能がもたらされ、腫瘍の成長の阻害がもたらされると考えられている。したがって、DLL4阻害薬は、癌の処置に対して、広範に有効な取り組みを実証すると考えられている。
【０１０１】
したがって、本発明は、血管新生に関与する過程を変調(例えば、促進または阻害)し、癌などの血管新生に付随する病状を標的にする点で使用するための方法、組成物、キット、および製品を提供する。
【０１０２】
本発明によると、DLL4モジュレーター、および/またはDLL4モジュレーターと他の治療用薬剤との組合せを用いて、様々な障害を処置することができることが企図される。
【０１０３】
したがって、本発明は、Notch受容体(例えば、Notch1、Notch2、Notch3、および/またはNotch4)のDLL4活性化を阻害するための、有効量のDLL4阻害薬(例えば、抗DLL4抗体またはDLL4イムノアドヘジン)を用いて血管新生を阻害するための方法を包含する。別の一態様において、本発明は、有効量のDLL4拮抗薬をそのような処置を必要とする対象に投与することを含む、血管新生を阻害するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、DLL4拮抗薬は内皮細胞の増殖を促進し、内皮細胞の分化を阻害し、動脈の発生を阻害し、および/または血管の潅流を低減することができる。別の一態様において、本発明は、有効量のDLL4拮抗薬をそのような処置を必要とする対象に投与することを含む、内皮細胞の増殖を刺激し、内皮細胞の分化を阻害し、動脈の発生を阻害し、および/または腫瘍の血管の潅流を阻害するための方法を提供する。
【０１０４】
DLL4拮抗薬(例えば、抗DLL4抗体)で処置される新生物性障害の例には、それだけには限定されないが、本明細書において「癌」および「癌性の」の語の下に記載されるものが含まれる。本発明において有用な拮抗薬での処置に適用できる、非新生物性の状態には、それだけには限定されないが、例えば、望ましくないまたは異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬プラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、動脈硬化プラーク、心筋梗塞からの浮腫、未熟児網膜症を含む糖尿病性および他の増殖性網膜症、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植新血管新生、角膜移植拒絶反応、網膜/脈絡膜新生血管、隅角の新血管新生(ルベオーシス)、眼の新血管新生疾患、血管再狭窄、動静脈奇形(AVM)、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成(グレーブス病を含む)、角膜および他の組織の移植、慢性炎症、肺の炎症、急性肺傷害/ARDS、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出液、脳浮腫(例えば、急性脳卒中/閉鎖性頭部外傷/外傷に付随する)、滑膜の炎症、RAにおけるパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎(OA)、難治性腹水症、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、液体疾患の第3スペーシング(膵炎、コンパートメント症候群、火傷、腸疾患)、子宮筋腫、早産、IBD(クローン病および潰瘍性大腸炎)などの慢性炎症、同種移植腎拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくないまたは異常な組織塊成長(非癌性)、肥満、脂肪組織量成長、血友病関節、肥厚性瘢痕、発毛の阻害、オースラーウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管癒着、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢液貯留(心膜炎に付随するものなど)、および胸膜滲出液が含まれる。DLL4阻害薬(例えば、抗DLL4抗体)で処置される障害のさらなる例には、上皮の障害または心臓の障害が含まれる。
【０１０５】
DLL4のモジュレーター、例えばDLL4作用薬または活性薬を病理学的障害の処置に利用することができる。いくつかの実施形態において、DLL4のモジュレーター、例えばDLL4作用薬を、血管新生の阻害が望ましい病理学的障害の処置に利用することができる。DLL4のモジュレーター、例えばDLL4作用薬を、血管新生または新血管形成および/または肥大が望ましい病理学的障害の処置にも使用することができ、これら病理学的障害には、それだけには限定されないが、例えば、血管の外傷、創傷、断裂、切開、火傷、潰瘍(例えば、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍、血友病性潰瘍、静脈瘤性潰瘍)、組織成長、体重増加、末梢動脈疾患、分娩の誘発、発毛、表皮水疱症、網膜萎縮、骨折、骨脊椎固定術、半月板断裂などが含まれる。
【０１０６】
併用治療
上記で指摘したように、本発明は、DLL4拮抗薬(例えば、抗DLL4抗体)またはDLL4作用薬を別の治療と一緒に投与する併用治療を提供する。例えば、DLL4拮抗薬を、様々な新生物性または非新生物性の状態を処置するための抗癌薬または抗血管新生薬と組み合わせて使用する。一実施形態において、新生物性または非新生物性の状態は、異常な、または望ましくない血管新生に付随する病理学的障害を特徴とする。DLL4拮抗薬を、これらの目的に有効である別の薬剤と連続して、または組み合わせて、同じ組成物において、もしくは別々の組成物としてのいずれかで、投与することができる。その代わりにまたはそれに加えて、DLL4の複数の阻害物質(例えば、DLL4媒介性Notchシグナリングだけを阻止する抗体1つ、ならびにDLL4媒介性NotchシグナリングおよびDLL4のインターナリゼーションの両方を阻害する抗体1つを含む)を投与することができる。
【０１０７】
DLL4拮抗薬(またはDLL4作用薬)、および他の治療用薬剤(例えば、抗癌薬、抗血管新生薬)の投与は、同時に(例えば、単一の組成物として、または同じもしくは異なる投与経路を用いた2つ以上の別々の組成物として)行うことができる。その代わりにまたはそれに加えて、投与は、あらゆる順序で逐次に行うことができる。その代わりにまたはそれに加えて、ステップは、あらゆる順序で、逐次および同時の両方の組合せとして行うことができる。
【０１０８】
ある実施形態において、2種以上の組成物の投与間に、数分から数日、数週、数月までの間隔を置くことができる。例えば、抗癌薬を最初に投与し、DLL4拮抗薬を続けてもよい。しかし、同時投与、またはDLL4拮抗薬を最初に投与することも企図される。したがって、一態様において、本発明は、DLL4拮抗薬(例えば、抗DLL4抗体)の投与と、その後の抗血管新生薬(例えば、抗VEGF)の投与を含む方法を提供する。ある実施形態において、2種以上の組成物の投与間に、数分から数日、数週、数月までの間隔を置くことができる。
【０１０９】
DLL4拮抗薬(またはDLL4作用薬)と組み合わせて投与する治療用薬剤の有効量は、医師または獣医師の判断である。処置する状態の最大のマネージメントを達成するために、投与量の投与および調節を行う。投与量は、用いる治療薬のタイプおよび処置される特定の患者などの因子にさらに依存する。抗癌薬に適する投与量は現在用いられているものであり、抗癌薬およびDLL4拮抗薬の併用作用(相乗作用)によって低減することができる。ある実施形態において、阻害薬を組み合わせることにより、単一の阻害薬の有効性を増強する。「増強する」の語は、通常または認められた投与量の治療薬の効力における向上を意味する。本明細書における薬剤組成物というタイトルのセクションも参照されたい。
【０１１０】
典型的には、DLL4拮抗薬および抗癌薬は、腫瘍、癌、または細胞増殖性障害などの病理学的障害を阻止または低減する、同じまたは類似の疾患に適している。一実施形態において、抗癌薬は抗血管新生薬である。
【０１１１】
癌との関連における抗血管新生治療は、腫瘍の成長を支援するために栄養を提供するのに必要とされる腫瘍血管の発生を阻害することをねらった、癌の処置の戦略である。血管新生は、原発腫瘍の成長および転移の両方に関与しているので、本発明が提供する抗血管新生処置は、原発部位における腫瘍の新生物性の成長を阻害することができ、2次的部位における腫瘍の転移を防ぐことができ、その結果他の治療法による腫瘍の攻撃を可能にする。
【０１１２】
本明細書に列挙するものを含めた、多くの抗血管新生薬が同定され、当技術分野において知られている(例えば、定義の下に列挙するもの、ならびにCarmelietおよびJain、Nature、407巻、249〜257頁(2000年);Ferraraら、Nature Reviews:Drug Discovery、3巻、391〜400頁(2004年);ならびにSato、Int. J. Clin. Oncol.、8巻、200〜206頁(2003年))。米国特許出願公開第20030055006号も参照されたい。一実施形態において、DLL4拮抗薬は、それだけには限定されないが、例えば、可溶性VEGF受容体(例えば、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、ニューロピリン(例えば、NRP1、NRP2))フラグメント、VEGFもしくはVEGFRを阻止することができるアプタマー、中和抗VEGFR抗体、VEGFRチロシンキナーゼ(RTK)の低分子量の阻害薬、VEGFに対するアンチセンスの戦略、VEGFまたはVEGF受容体に対するリボザイム、VEGFの拮抗薬変異体、およびこれらのあらゆる組合せを含めた、抗VEGF中和抗体(もしくはフラグメント)、および/または別のVEGF拮抗薬、またはVEGF受容体拮抗薬と組み合わせて用いられる。その代わりにまたはそれに加えて、2種以上の血管新生阻害薬を、任意選択で、VEGF拮抗薬および他の薬剤に加えて患者に同時投与してもよい。ある実施形態において、1つまたは複数のさらなる治療用薬剤、例えば抗癌薬を、DLL4拮抗薬、VEGF拮抗薬、および抗血管新生薬と組み合わせて投与することができる。
【０１１３】
本発明によると、併用処置は、放射線処置などの他のタイプの癌の処置との組合せも想定するものである。
【０１１４】
DLL4
DLL4は膜貫通タンパク質である。細胞外領域は、8EGF様リピートを含んでおり、全てのNotchリガンドの間に保存されており、受容体の結合に必要とされるDSLドメインも含んでいる。予想されるタンパク質は、膜貫通領域、およびあらゆる触媒作用のモチーフを欠く細胞質側末端も含んでいる。ヒトDLL4タンパク質は、アミノ酸685個のタンパク質であり、以下の領域を含んでいる:シグナルペプチド(アミノ酸1〜25)、MNNL(アミノ酸26〜92)、DSL(アミノ酸155〜217)、EGF様(アミノ酸221〜251)、EGF様(アミノ酸252〜282)、EGF様(アミノ酸284〜322)、EGF様(アミノ酸324〜360)、EGF様(アミノ酸366〜400)、EGF様(アミノ酸402〜438)、EGF様(アミノ酸440〜476)、EGF様(アミノ酸480〜518)、膜貫通(アミノ酸529〜551)、細胞質ドメイン(アミノ酸552〜685)。DLL4の核酸およびアミノ酸配列は、当技術分野では知られており、本明細書においてさらに論じられる。DLL4をコードする核酸配列は、DLL4の望ましい領域のアミノ酸配列を用いてデザインされ得る。あるいは、DLL4のcDNA配列(またはそのフラグメント)を用いることができる。ヒトDLL4の受諾番号は、NM-019074であり、マウスDLL4の受諾番号はNM-019454である。
【０１１５】
DLL4はNotch受容体に結合する。進化的に保存されているNotch経路は、多くの発生上の過程、および出生後の自己複製性の器官系の重要な制御因子である。無脊椎動物から哺乳動物まで、Notchシグナリングは、無数の細胞の運命の決定によって細胞を導き、増殖、分化、およびアポトーシスに影響を及ぼしている(MieleおよびOsborne、1999年)。Notchファミリーは、DSL遺伝子ファミリー(ショウジョウバエからのDeltaおよびSerrate、ならびに線虫(C.elegans)からのLag-2に対して命名された)の膜結合性リガンドによって活性化される、構造的に保存されている細胞表面受容体からなる。哺乳動物は、4つの受容体(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)、および5つのリガンド(Jag1、Jag2、DLL1、Dll3、およびDLL4)を有する。近隣の細胞上に提示されたリガンドによって活性化されると、Notch受容体は連続的なタンパク質分解性の切断を受ける。これにより、Notch細胞内ドメイン(NICD)の放出がもたらされ、NICDは核内に移動し、DNA結合性タンパク質であるRBP-JK(CSL[CBF1/Su(H)/Lag-1に対して]としても知られている)および他の転写因子と転写複合体を形成する。Notch活性化の主な標的遺伝子には、HES(ヘアリー/エンハンサーオブスプリット(Hairy/Enhancer of Split))遺伝子ファミリーおよびHES関連遺伝子(Hey、CHF、HRT、HESR)が含まれ、これらは次に組織および細胞型に特異的な様式で下流の転写エフェクターを制御する(Isoら、2003年;LiおよびHarris、2005年)。
【０１１６】
DLL4インターナリゼーションおよびシグナリング
細胞膜に存在する細胞表面受容体が、リガンドの刺激時にインターナリゼーションされ(すなわち、形質膜陥入し)、細胞膜に再利用され、または分解されるのは一般的である。Notchリガンドは膜貫通タンパク質でもあり、これはやはりインターナリゼーションされることが示されており、(LeBorgne R.ら、2005年、Development、132巻、1751〜1762頁)に概説されている。Delta様1タンパク質のインターナリゼーションは、近隣の細胞上のNotch受容体の活性化に必要とされている(Itoh M.ら、2003年、Dev Cell、4巻、67〜82頁)。DLL1の細胞内部分およびDeltaが核において検出されており、転写因子と相互作用することが見出されているので、Delta様1およびDelta(ヒトDLLタンパク質のショウジョウバエのオーソログ)も、Notchとは独立に、それぞれ固有のシグナリングの性質を持っている(Blandら、2003年、JBC、J. Biol. Chem.、278、16、13607〜13610頁、Hiratochi M.ら、2007年、Nucleic Acids Res.、35巻(3)、912〜22頁)。したがって、DLL-Notchリガンドおよび受容体が2重の双方向性のシグナリング(すなわち、別々の細胞におけるNotch受容体およびDLLリガンドのインターナリゼーションの両方)の可能性を有する潜在性が存在する。
【０１１７】
抗体媒介性受容体インターナリゼーションおよび抗体の価
細胞表面受容体に対する抗体のターゲティングにより、抗体のインターナリゼーションがもたらされることが示唆されているが、細胞膜に存在しない他の標的はそうではない(Lammert van Buerenら、2006年、Cancer Research、66巻、7630〜7638頁;Baselga Jら、J Clin Oncol、2000年、18巻、904〜14頁;Mould DRら、Clin Pharmacol Ther、1999年、66巻、246〜57頁;Rowinsky EKら、J Clin Oncol、2004年、22巻、3003〜15頁;Robert Fら、J Clin Oncol、2001年、19巻、3234〜43頁;Bauer RJら、J Pharmacokinet Biopharm、1999年、27巻、397〜420頁;Tokuda Yら、Br J Cancer、1999年、81巻、1419〜25頁;Kloft Cら、Invest New Drugs、2004年、22巻、39〜52頁;Duconge Jら、Eur J Drug Metab Pharmacokinet、2002年、27巻、101〜5頁;Lin YSら、J Pharmacol Exp Ther、1999年、288巻、371〜8頁;Benincosa LJら、J Pharmacol Exp Ther、2000年、292巻、810〜6頁;Coffey GPら、J Pharmacol Exp Ther、2004年、310巻、896〜904頁;Shih LBら、Int J Cancer、1994年、56巻、538〜45頁;Shockley TRら、Cancer Res、1992年、52巻、357〜66頁;およびCoffey GPら、Drug Metab Dispos、2005年、33巻、623〜9頁)。当技術分野において、抗体の価(抗体の価は、個々の抗体分子が結合することができる抗原決定基の数を意味する)は、抗体のインターナリゼーションの程度に影響を及ぼすことが知られている(例えば、HER受容体に結合し、活性化する二価の抗体は受容体のインターナリゼーションを誘発するが、抗体の一価のバージョンは受容体のインターナリゼーションを誘発する能力がない(Yarden Y.、1990年、PNAS、87巻、2569〜2573頁、およびSrinivas U.ら、1993年、Cancer Immunology and Immunotherapy、36、6、397〜402頁)。したがって、インターナリゼーションされる、またはされない、異なる性向を有する細胞膜でタンパク質に結合する抗体をデザインするのが可能である。
【０１１８】
DLL4モジュレーター
DLL4のモジュレーターは、DLL4の活性を変調する分子、例えば、作用薬および拮抗薬である。「DLL4作用薬」の語は、DLL4のペプチドおよび非ペプチドの類似体(例えば、本明細書に記載する多量体化されたDLL4)を、および天然のNotch受容体(例えば、Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)によってシグナルを送る能力を有するのであれば他の薬剤を意味するために用いられる。「作用薬」の語は、Notch受容体の生物学的役割の状況で定義される。ある実施形態において、作用薬は、Notch受容体(例えば、Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)に対する結合、Notch受容体の活性化、およびNotch受容体の下流の分子のシグナリングの活性化など、上記で定義したDLL4の生物学的活性を有する。いくつかの実施形態において、DLL4作用薬は、内皮細胞の増殖を阻害し、上皮細胞の分化を促進し、および/または動脈の発生を促進する。いくつかの実施形態において、DLL4作用薬は血管の発生を阻害する。
【０１１９】
DLL4モジュレーターは当技術分野では知られており、いくつかを本明細書に記載および例示する。DLL4拮抗薬(例えば、抗DLL4抗体)の例示の、および非限定的な列挙は、「定義」の下に本明細書に提供されることが企図される。
【０１２０】
本発明において有用なモジュレーターを、当技術分野では知られている様々なアッセイによって、その物理的/化学的性質および生物学的機能に対して特徴付けることができる。いくつかの実施形態において、DLL4拮抗薬は、DLL4に対する結合、Notch受容体に対する結合、Notch受容体の活性化の低減もしくは阻止、Notch受容体の下流の分子のシグナリングの低減もしくは阻止、Notch受容体のDLL4に対する結合のかく乱もしくは阻止、DLL4インターナリゼーションに対する効果、ならびに/または内皮細胞の増殖の促進、ならびに/または内皮細胞の分化の阻害、ならびに/または動脈の分化の阻害、ならびに/または腫瘍血管潅流の阻害;ならびに/または腫瘍、細胞増殖性障害、もしくは癌の処置および/もしくは防止、ならびに/またはDLL4発現および/もしくは活性に付随する障害の処置もしくは防止、ならびに/またはNotch受容体発現および/または活性に付随する障害の処置もしくは防止の任意の1つまたは複数に対して特徴付けられる。いくつかの実施形態において、DLL4作用薬は、Notch受容体(例えば、Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)に対する結合、Notch受容体の活性化、Notch受容体の下流の分子のシグナリングの活性化、内皮細胞の増殖の阻害、上皮細胞の分化の促進、および/または動脈の発生の促進の任意の1つまたは複数に対して特徴付けられる。DLL4拮抗薬および作用薬を特徴付けるための方法は、当技術分野においては知られており、いくつかを本明細書に記載および例示する。
【０１２１】
抗体
DLL4抗体は、当技術分野においては知られており、いくつかを本明細書に記載および例示する。抗DLL4抗体は、好ましくはモノクローナルである。本明細書に提供される、抗DLL4抗体のFab、Fab'、Fab'-SH、およびF(ab')2フラグメントも、本発明の範囲内に包含される。これらの抗体フラグメントは、酵素消化などの伝統的な手段によって作成することができ、または組換え技術によって産生してもよい。このような抗体フラグメントは、キメラでも、またはヒト化でもよい。これらのフラグメントは、以下に記載する診断および治療の目的に有用である。
【０１２２】
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量存在することがある天然に存在する可能な突然変異を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」の修飾語は、別々の抗体の混合ではないという抗体の特徴を示すものである。
【０１２３】
抗DLL4モノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature、256巻、495頁(1975年)によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作成することができ、または組換えDNA法によって作成してもよい(米国特許第4,816,567号)。
【０１２４】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の好適な宿主動物、例えばハムスターを免疫化して、免疫化に用いたタンパク質に特異的に結合する抗体を生成し、または生成することができるリンパ球を誘発する。DLL4に対する抗体は、一般に、DLL4の複数の皮下(sc)または腹腔内(ip)注射およびアジュバントによって動物で産生される。DLL4は、当技術分野ではよく知られている方法を用いて調製することができ、そのいくつかを本明細書にさらに記載する。例えば、DLL4の組換えの生成を以下に記載する。一実施形態において、免疫グロブリン重鎖のFc部分に融合しているDLL4の細胞外ドメイン(ECD)を含むDLL4の誘導体で動物を免疫化する。好ましい一実施形態において、動物をDLL4-IgG1融合タンパク質で免疫化する。動物を、通常、一リン酸化脂質A(MPL)/トレハロースジクリノミコレート(dicrynomycolate)(TDM)(Ribi Immunochem. Research, Inc.、Hamilton、Mont.)とのDLL4の免疫原性のコンジュゲートまたは誘導体に対して免疫化し、溶液を複数の部位に皮内注射する。2週間後、動物に追加免疫する。7日から14日後、動物を出血させ、抗DLL4の力価に対して血清をアッセイする。力価がプラトーになるまで動物に追加免疫する。
【０１２５】
あるいは、リンパ球をin vitroで免疫化してもよい。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールなどの適切な融剤を用いてミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice、59〜103頁(Academic Press、1986年))。
【０１２６】
このように調製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは非融合の親のミエローマ細胞の成長または生存を阻害する物質を1つまたは複数含む適切な培地に接種し、成長させる。例えば、親のミエローマ細胞が、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)酵素を欠く場合、ハイブリドーマ用の培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み(HAT培地)、これらの物質はGHPRT欠乏細胞の成長を妨げる。
【０１２７】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定で高レベルな抗体の生成を支持し、HAT培地などの培地に感受性である細胞である。このような細胞の中で好ましいミエローマ細胞系は、Salk Institute Cell Distribution Center、San Diego、Calif.、米国から入手可能なMOPC-21およびMPC-11マウス腫瘍、ならびにAmerican Type Culture Collection、Rockville、Md.、米国から入手可能なSP-2またはX63-Ag8-653細胞に由来するものなど、マウスミエローマ系である。ヒトミエローマおよびマウス-ヒトへテロミエローマ細胞系も、ヒトモノクローナル抗体の生成用に記載されている(Kozbor、J. Immunol.、133巻、3001頁(1984年);Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、51〜63頁(Marcel Dekker, Inc.、New York、1987年))。
【０１２８】
ハイブリドーマ細胞が成長する培地を、DLL4に対するモノクローナル抗体の生成に対してアッセイする。ハイブリドーマ細胞によって生成されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によって、またはin vitroの結合アッセイによって、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)または酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)によって決定するのが好ましい。
【０１２９】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munsonら、Anal.Biochem.、107巻、220頁(1980年)のスキャッチャード分析によって決定することができる。
【０１３０】
望ましい特異性、親和性、および/または活性の抗体を生成するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準の方法によって成長させてもよい(Goding、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、59〜103頁(Academic Press、1986年))。抗体の目的に適する培地には、例えば、D-MEMまたはRPMI-1640培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞を、動物における腹水腫瘍としてin vivoで成長させてもよい。
【０１３１】
サブクローニングによって分泌されたモノクローナル抗体を、培地、腹水液、または血清から、例えば、タンパク質-Aセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製方法によって適切に分離する。
【０１３２】
抗DLL4抗体を、望ましい活性または活性(複数)を有する合成の抗体のクローンに対してスクリーニングするために、組換えライブラリーを用いて作成することができる。原理的には、合成の抗体のクローンを、ファージコートタンパク質に融合している抗体の可変領域(Fv)の様々なフラグメントをディスプレイするファージを含むファージライブラリーをスクリーニングすることによって選択する。このようなファージライブラリーを、望ましい抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによってパニングする。望ましい抗原に結合することができるFvフラグメントを発現するクローンを抗原に吸着させ、したがって、ライブラリーにおける非結合性のクローンから分離する。次いで、結合性のクローンを抗原から溶出させ、抗原の吸着/溶出のさらなるサイクルによってさらに濃縮させることができる。対象のファージクローンに対して選択するのに適切な抗原スクリーニング方法をデザインし、引き続き対象のファージクローンからのFv配列、およびKabatら、Sequences of Proteins of immunological Interest、第5版、NIH Publication、91〜3242頁、Bethesda Md.(1991年)1〜3巻に記載される適切な定常領域(Fc)の配列を用いて全長の抗DLL4の抗体クローンを構築することによって、あらゆる抗DLL4抗体を得ることができる。
【０１３３】
抗体の抗原結合性ドメインを、両方とも3つの高頻度可変性のループまたは相補性決定領域(CDR)を提示する軽(VL)鎖および重(VH)鎖から各1つの、アミノ酸約110個の2つの可変(V)領域から形成する。可変ドメインは、VHおよびVLが短い柔軟なペプチドによって共有性に連結している1本鎖Fv(scFv)フラグメントとして、またはWinterら、Ann. Rev. Immunol.、12巻、433〜455頁(1994年)に記載されているようにこれらが各々定常ドメインに融合し、非共有性に相互作用するFabフラグメントとしてのいずれかで、ファージ上に機能的にディスプレイされ得る。本明細書で用いられる、ファージクローンをコードするscFv、およびファージクローンをコードするFabを、まとめて「Fvファージクローン」または「Fvクローン」と呼ぶ。
【０１３４】
VHおよびVLの遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいてランダムに組み換えられ、これを、次いで、Winterら、Ann. Rev. Immunol.、12巻、433〜455頁(1994年)に記載されているように抗原結合性クローンに対して検索することができる。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性なしに免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Griffithsら、EMBO J、12巻、725〜734頁(1993年)によって記載されているように、いかなる免疫化なしに広範囲の非自己および同様に自己の抗原に対するヒト抗体の単一の供給源を提供するために、天然のレパートリーをクローニングすることができる。最後に、幹細胞から再構成されていないV遺伝子のセグメントをクローニングすることによって、および高度に可変性のCDR3領域をコードし、HoogenboomおよびWinter、J. Mol. Biol.、227巻、381〜388頁(1992年)によって記載されているin vitroの再構成を実現するためのランダム配列を含むPCRプライマーを用いて、天然のライブラリーを合成的に作成することもできる。
【０１３５】
マイナーコートタンパク質pIIIに融合することによって、繊維状ファージを用いて抗体フラグメントをディスプレイする。抗体フラグメントは、1本鎖Fvフラグメントとしてディスプレイされてよく(1本鎖Fvフラグメントでは、VHおよびVLドメインは、例えば、Hoogenboomら、Nucl. Acids.、19巻、4133〜4137頁(1991年)によって記載されている柔軟なポリペプチドのスペーサーによって同じポリペプチド鎖に連結している)、またはFabフラグメントとしてディスプレイされてよい(Fabフラグメントでは1本の鎖がpIIIに融合し、他方が、例えば、Hoogenboomら、Nucl. Acids.、19巻、4133〜4137頁(1991年)に記載されているように、野生型のコートタンパク質のいくつかを置き換えることによってファージ表面上にディスプレイされるようになるFabコートタンパク質構造のアセンブリーである細菌の宿主細胞の周辺質中に分泌される)。
【０１３６】
一般的に、抗体遺伝子のフラグメントをコードする核酸は、ヒトまたは動物から収集した免疫細胞から得られる。抗DLL4クローンに有利なように偏ったライブラリーが望ましい場合は、対象をDLL4で免疫化して抗体反応を産生させ、脾臓細胞、および/または循環するB細胞、他の末梢血リンパ球(PBS)をライブラリーの構築用に回収する。好ましい一実施形態において、DLL4免疫化によってDLL4に対するヒト抗体を生成するB細胞を生じるように、抗DLL4クローンに有利なように偏ったヒト抗体遺伝子フラグメントのライブラリーを、機能的なヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを保有する(そして、機能的な内因性の抗体生成系を欠く)トランスジェニックマウスにおいて抗DLL4抗体反応を産生することによって得る。ヒト抗体生成性トランスジェニックマウスの産生を以下に記載する。
【０１３７】
抗DLL4反応性細胞の集団に対するさらなる濃縮は、DLL4特異的膜結合抗体を発現するB細胞を単離するのに適するスクリーニング方法を用いることによって、例えば、DLL4アフィニティークロマトグラフィーでの細胞の分離によって、または蛍光色素標識したDLL4に細胞を吸着させ、引き続きフロー活性化細胞ソーティング(FACS)によって得ることができる。
【０１３８】
あるいは、非免疫化のドナーからの脾臓細胞および/またはB細胞または他のPBLを使用すると、可能な抗体レパートリーのより良好な提示がもたらされ、DLL4が抗原性ではないあらゆる動物(ヒトまたは非ヒト)種を用いて抗体ライブラリーを構築することも可能になる。in vitroの抗体遺伝子の構築を組み入れるライブラリー用に、対象から幹細胞を収集して、再構成されていない抗体遺伝子のセグメントをコードする核酸を提供する。対象の免疫細胞は、様々な動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ目、ルプリン(luprine)、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、およびトリの種などから得ることができる。
【０１３９】
抗体の可変遺伝子セグメント(VHおよびVLセグメントを含む)をコードする核酸を、対象の細胞から収集し、増幅する。再構成されたVHおよびBL遺伝子ライブラリーの場合は、望ましいDNAは、リンパ球からのゲノムDNAまたはmRNAを単離し、引き続きOrlandiら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)、86巻、3833〜3837頁(1989年)に記載されている再構成されたVHおよびVL遺伝子の5'および3'末端にマッチするプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって得、その結果発現用に多様なV遺伝子レパートリーを作成することができる。V遺伝子は、成熟Vドメインをコードするエキソンの5'末端のバックプライマー(back primer)、ならびにOrlandiら(1989年)およびWardら、Nature、341巻、544〜546頁(1989年)に記載されているJセグメント内をベースとするフォワードプライマーでcDNAおよびゲノムDNAから増幅することができる。しかし、cDNAから増幅するには、バックプライマーはJonesら、Biotechnol.、9巻、88〜89頁(1991年)に記載されているリーダーエキソンをベースにすることができ、フォワードプライマーはSastryら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)、86巻、5728〜5732頁(1989年)に記載されている定常領域内をベースにしていてよい。相補性を最大にするためには、例えば、Orlandiら(1989年)またはSastryら(1989年)に記載されているように、縮重をプライマーに組み入れることができる。好ましくは、例えば、Marksら、J. Mol. Biol.、222巻、581〜597頁(1991年)の方法に記載されるように、またはOrumら、Nucleic Acids Res.、21巻、4491〜4498頁(1993年)の方法に記載されるように、免疫細胞の核酸試料に存在する利用可能な全てのVHおよびVL配列を増幅するために、各V遺伝子ファミリーを標的とするPCRプライマーを用いることによってライブラリーの多様性を最大にする。増幅したDNAを発現ベクター中にクローニングするには、Orlandiら(1989年)に記載されるように一末端のタグとして、またはClacksonら、Nature、352巻、624〜628頁(1991年)に記載されるようにタグ付けしたプライマーとさらなるPCR増幅を行うことによって、PCRプライマー内にまれな制限部位を導入することができる。
【０１４０】
合成的に再構成したV遺伝子のレパートリーは、in vitroのV遺伝子のセグメントに由来してよい。殆どのヒトVH遺伝子セグメントはクローニングおよび配列決定されており(Tomlinsonら、J. Mol. Biol.、227巻776〜798頁(1992年)に報告されている)、マッピングされており(Matsudaら、Nature Genet.、3巻、88〜94頁(1993年)に報告されている)、これらクローニングされたセグメント(H1およびH2ループの主な立体配置を全て含む)を、HoogenboomおよびWinter、J. Mol. Biol.、227巻、381〜388頁(1992年)に記載されている多様な配列および長さのH3ループをコードするPCRプライマーで、多様なVH遺伝子レパートリーを産生するのに用いることができる。VHレパートリーも、全ての配列の多様性をBarbasら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻、4457〜4461頁(1992年)に報告されている単一の長さの長いH3ループに焦点をあてて作成され得る。ヒトVκセグメントおよびVλセグメントはクローニングおよび配列決定されており(WilliamsおよびWinter、Eur. J. Immunol.、23巻、1456〜1461頁(1993年)に報告されている)、合成の軽鎖レパートリーを作成するために用いられ得る。VHおよびVLフォールドの範囲、ならびにL3およびH3の長さに基づく合成のV遺伝子レパートリーは、構造上の多様性がかなりある抗体をコードする。V遺伝子をコードするDNAを増幅した後は、生殖系列V遺伝子セグメントを、HoogenboomおよびWinter、J. Mol. Biol.、227巻、381〜388頁(1992年)の方法に従ってin vitroで再構成することができる。
【０１４１】
抗体フラグメントのレパートリーを、いくつかの方法においてVHおよびVL遺伝子のレパートリーを一緒に組み合わせることによって構築することができる。各レパートリーを、異なるベクターで作り出すことができ、ベクターはin vitroで、例えば、Hogrefeら、Gene、128巻、119〜126頁(1993年)に記載されているように、またはin vivoでコンビナトリアル感染によって、例えば、Waterhouseら、Nucl. Acids Res.、21巻、2265〜2266頁(1993年)に記載されているloxPシステムによって組み換えられる。in vivoの組換えの取組みは、大腸菌(E.coli)の形質転換の効率によって課されるライブラリーサイズに対する限界を克服するために、Fabフラグメントの2本鎖の性質を活用するものである。天然のVHおよびVLレパートリーを、片方はファーミジド(phargemid)中に、他方はファージベクター中に別々にクローニングする。次いで、2つのライブラリーを、各細胞が異なる組合せを含み、ライブラリーサイズが存在する細胞の数(約1012クローン)だけによって制限されるように、ファージミド含有バクテリアのファージ感染によって組み合わせる。両方のベクターは、VHおよびVL遺伝子が単一のレプリコン上に組み換えられ、ファージビリオン中に一緒にパッケージングされるように、in vivoの組換えシグナルを含む。これらの巨大なライブラリーは、アフィニティーの良好な、多数の多様な抗体を提供する(約10-8MのKd-1)。
【０１４２】
あるいは、レパートリーを、例えば、Barbasら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88巻、7978〜7982頁(1991年)に記載されているように同じベクター中に逐次にクローニングしてもよく、または、例えばClacksonら、Nature、352巻、624〜628頁(1991年)に記載されているようにPCRによって一緒にアセンブルし、次いでクローニングしてもよい。PCRアセンブリーを用いて、VHおよびVLのDNAを柔軟なペプチドスペーサーをコードするDNAと連結して1本鎖Fv(scFv)レパートリーを形成することもできる。さらに別の技術では、「細胞PCRアセンブリー」を用いて、Embletonら、Nucl. Acids Res.、20巻、3831〜3837頁(1992年)に記載されているように、リンパ球内でPCRによってVH遺伝子とVL遺伝子を組み合わせ、次いで連結した遺伝子のレパートリーをクローニングする。
【０１４３】
ナイーブライブラリー(天然または合成のいずれか)によって生成された抗体は、中程度の親和性(約106から107M-1のKd-1)であってよいが、アフィニティー成熟は、Winterら(1994年)上述に記載されるように2次ライブラリーからの構築および再選択によって、in vitroで模倣してもよい。例えば、突然変異を、Hawkinsら、J. Mol. Biol.、226巻、889〜896頁(1992年)の方法におけるエラープローンポリメラーゼを用いることによって(Leungら、Technique、1巻、11〜15頁(1989年)に報告されている)、またはGramら、Proc. Natl. Acad. Sci USA、89巻、3576〜3580頁(1992年)の方法においてin vitroで無作為に導入することができる。さらに、アフィニティー成熟は、例えば、選択された個々のFvクローンにおいて対象のCDRをまたぐランダムな配列を保有するプライマーでのPCRを用いて、およびより高い親和性のクローンを求めてスクリーニングすることによって、1つまたは複数のCDRをランダムに突然変異させることによって行うことができる。国際公開第9607754号(1996年5月14日公表)は、軽鎖遺伝子のライブラリーを作り出すために、免疫グロブリンの軽鎖の相補性決定領域における突然変異誘発を誘発するための方法を記載している。別の効果的な取組みは、Marksら、Biotechnol.、10巻、779〜783頁(1992年)に記載されているように、非免疫化のドナーから得た天然に存在するVドメイン変異体のレパートリーでのファージディスプレイによって選択されたVHまたはVLドメインを組合せ、数ラウンドのチェーンレシャフリングにおいてより高い親和性を求めてスクリーニングすることである。この技術により、10-9Mの範囲の親和性を有する抗体および抗体フラグメントの生成が可能になる。
【０１４４】
DLL4の核酸およびアミノ酸配列は当技術分野では知られており、本明細書でさらに論じられる。DLL4をコードするDNAは、当技術分野では知られている様々な方法によって調製することができる。これらの方法には、それだけには限定されないが、トリエステル、亜リン酸エステル、ホスホラミダイト、およびH-ホスホン酸塩法など、Engelsら、Agnew. Chem. Int. Ed. Engl.、28巻、716〜734頁(1989年)に記載されているあらゆる方法による化学合成が含まれる。一実施形態において、発現宿主細胞に好ましいコドンを、DLL4をコードするDNAのデザインに用いる。あるいは、DLL4をコードするDNAを、ゲノムまたはcDNAのライブラリーから単離することができる。
【０１４５】
DLL4をコードするDNA分子を構築した後は、DNA分子を、プラスミドなどの発現ベクターにおける発現制御配列に操作可能に連結し、制御配列はベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される。一般に、プラスミドベクターは、宿主細胞と適合性の種に由来する複製および制御配列を含んでいる。ベクターは、通常、複製部位、および形質転換された細胞において表現型の選択をもたらすことができるタンパク質をコードする配列を保有している。原核生物および真核生物の宿主細胞における発現に適するベクターは当技術分野においては知られており、いくつかを本明細書にさらに記載する。酵母菌などの真核細胞の生物体、または哺乳動物などの多細胞生物体に由来する細胞を用いてもよい。
【０１４６】
任意選択で、DLL4をコードするDNAを分泌性のリーダー配列に操作可能に連結し、宿主細胞による培地中への発現生成物の分泌がもたらされる。分泌性のリーダー配列の例には、stll、エコチン(ecotin)、ラム(lamb)、ヘルペスGD、lpp、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、およびアルファ因子が含まれる。アミノ酸36個のリーダー配列オフプロテイン(ofprotein)Aも、本明細書で用いるのに適している(Abrahmsenら、EMBO J.、4巻、3901頁(1985年))。
【０１４７】
宿主細胞は、上記に記載した本発明の発現ベクターまたはクローニングベクターでトランスフェクトされ、好ましくは形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または望ましい配列をコードする遺伝子を増幅するのに好適に改変された従来の栄養培地で培養される。
【０１４８】
トランスフェクトは、あらゆるコード配列が実際に発現されてもされなくても、宿主細胞による発現ベクターの吸収を意味する。当業者であれば、CaPO4沈澱および電気穿孔など、多くのトランスフェクトの方法を知っている。トランスフェクトの成功は、一般に、このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で起こった場合に認められる。トランスフェクトの方法は当技術分野ではよく知られており、いくつかを本明細書にさらに記載する。
【０１４９】
軽質転換は、染色体外のエレメントとして、または染色体の組込み体によってのいずれかで、DNAが複製可能であるようにDNAを生物体内に導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、形質転換は、そのような細胞に好適な標準の技術を用いて行われる。形質転換のための方法は当技術分野ではよく知られており、いくつかを本明細書にさらに記載する。
【０１５０】
DLL4を生成するために用いられる原核生物の宿主細胞は、Sambrookら、上述に概ね記載されている通りに培養することができる。
【０１５１】
DLL4を生成するために用いられる哺乳動物の宿主細胞は、様々な培地において培養することができ、培地は当技術分野ではよく知られており、そのいくつかを本明細書にさらに記載する。
【０１５２】
本開示において言及する宿主細胞には、in vitroの培養物における細胞および宿主動物内にある細胞が包含される。
【０１５３】
DLL4の精製は技術分野で認められている方法を用いて実現することができ、その方法のいくつかを本明細書に記載する。
【０１５４】
精製されたDLL4は、ファージディスプレイクローンのアフィニティークロマトグラフィー分離で用いるために、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、様々なアクリル共重合体、ヒドロキシルメタクリレートゲル、ポリアクリルおよびポリメタクリル共重合体、ナイロン、中性の、およびイオン性の担体などの適切なマトリックスに付着させることができる。DLL4タンパク質のマトリックスに対する付着は、Methods in Enzymology、44巻(1976年)に記載されている方法によって行うことができる。タンパク質のリガンドを、アガロース、デキストラン、またはセルロースなどの多糖のマトリックスに付着させるための一般的に用いられる技術は、ハロゲン化シアンで担体を活性化し、引き続きペプチドリガンドの1級の脂肪族または芳香族のアミンを活性化したマトリックスにカップリングすることを伴う。
【０１５５】
あるいは、DLL4を、吸着プレートのウェルをコーティングするのに用い、吸着プレートに固定された、もしくは細胞選別で用いられた宿主細胞上で発現させ、またはストレプトアビジンコーティングしたビーズで捕獲するためにビオチンにコンジュゲートさせ、またはファージディスプレイライブラリーをパニングするための技術分野では知られているあらゆる他の方法において用いることができる。
【０１５６】
ファージライブラリーの試料を、ファージ粒子の少なくとも一部分を吸収剤と結合させるのに適する条件下で、固定化したDLL4と接触させる。通常、pH、イオン強度、温度などを含めた条件は、生理学的条件を擬するように選択される。固相に結合したファージを洗浄し、次いで、例えばBarbasら、Proc. Natl. Acad. Sci USA、88巻、7978〜7982頁(1991年)に記載されているように酸によって、または、例えばMarksら、J. Mol. Biol.、222巻、581〜597頁(1991年)に記載されているようにアルカリによって、または、例えば、Clacksonら、Nature、352巻、624〜628頁(1991年)の抗原競合法に類似の方法でDLL4抗原競合によって溶出する。ファージは、単一ラウンドの選択において20〜1000倍濃縮され得る。さらに、濃縮されたファージを、細菌の培地で成長させ、さらなるラウンドの選択を受けさせることができる。
【０１５７】
選択の効率は、洗浄の間の解離の動態学、および単一のファージ上の複数の抗体フラグメントが抗原と同時に会合することができるか否かを含めた多くの因子に依存する。解離の動態学の速い(そして結合親和性が弱い)抗体は、短い洗浄、多価のファージのディスプレイ、および固相における抗原の高密度のコーティングの使用によって保持され得る。高密度は多価の相互作用によってファージを安定化させるだけではなく、解離しているファージの再結合を支持する。解離の動態学が遅い(そして結合親和性が良好な)抗体の選択は、Bassら、Proteins、8巻、309〜314頁(1990年)および国際公開第92/09690号に記載されているように、長い洗浄および一価のファージディスプレイを使用することによって、ならびにMarksら、Biotechnol.、10巻、779〜783頁(1992年)に記載されているように抗原の低密度のコーティングによって促進され得る。
【０１５８】
わずかに異なる親和性であっても、異なる親和性のファージ抗体間でDLL4に対して選択することが可能である。しかし、選択された抗体のランダム突然変異(例えば、上記で記載したアフィニティー成熟技術のいくつかにおいて行った)は、殆どが抗原に対して結合性の、および少数がより高い親和性で多くの突然変異を生じる可能性がある。DLL4を制限すると、まれに高親和性のファージが競合して脱落することがある。より高い親和性の突然変異体を全て保持するために、ファージを過剰のビオチン化DLL4とインキュベートすることができるが、ビオチン化DLL4のモル濃度はDLL4に対する標的のモルアフィニティー定数よりも低い。次いで、高親和性結合性のファージを、ストレプトアビジンコーティングした常磁性ビーズによって捕獲してもよい。このような「平衡捕獲」により、親和性の低い非常に過剰のファージから2倍程度高い親和性の突然変異のクローンの単離を可能にする感度で、抗体の結合の親和性に従って抗体を選択するのが可能となる。固相に結合しているファージを洗浄するのに用いられる条件をやはり操作して、解離の動態学に基づいて識別してもよい。
【０１５９】
抗DLL4クローンを積極的に選択してもよい。一実施形態において、本発明は、Notch受容体(例えば、Notch1、Notch2、Notch3、および/またはNotch4)とDLL4の間の結合を阻止するがNotch受容体と第2のタンパク質の間の結合は阻止しない抗DLL4抗体を提供する。このような抗DLL4抗体に対応するFvクローンを、(1)上記に記載したファージライブラリーから抗DLL4クローンを単離し、場合により、適切な細菌の宿主において集団を成長させることにより単離されたファージクローンの集団を増幅すること、(2)それに対して阻止および非阻止活性がそれぞれ望ましい、DLL4および第2のタンパク質を選択すること、(3)固定化したDLL4に対して抗DLL4ファージクローンを吸着させること、(4)第2のタンパク質の結合決定基と重なる、または結合決定基を共有するDLL4結合性決定基を認識する、あらゆる望ましくないクローンを溶出するために過剰の第2のタンパク質を用いること、および(5)ステップ(4)の後、吸着されたままであるクローンを溶出することによって選択することができる。場合により、望ましい阻止/非阻止の性質を有するクローンを、本明細書に記載する選択方法を1回または複数回繰り返すことによって、さらに濃縮することができる。
【０１６０】
ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体またはファージディスプレイFvクローンをコードするDNAを、従来の手順を用いて(例えば、ハイブリドーマまたはファージDNAテンプレートから対象の重鎖および軽鎖コード領域を特異的に増幅するようにデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて)単離および配列決定するのは容易である。単離した後は、DNAを発現ベクター中に配置してよく、次いで発現ベクターを、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはその他の方法で免疫グロブリンタンパク質を生成しないミエローマ細胞などの宿主細胞中にトランスフェクトして、組換えの宿主細胞における望ましいモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするDNAのバクテリアにおける組換え発現についての総説の文献には、Skerraら、Curr. Opinion in Immunol.、5巻、256頁(1993年)、およびPluckthun、Immunol.Revs、130巻、151頁(1992年)が含まれる。
【０１６１】
FvのクローンをコードするDNAを、重鎖および/または軽鎖の定常領域をコードする知られているDNA配列(例えば、好適なDNA配列はKabatら、上述から得ることができる)と組み合わせて、全長または部分的な長さの重鎖および/または軽鎖をコードするクローンを形成することができる。IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgDの定常領域を含む、あらゆるイソ型の定常領域をこの目的に用いることができ、このような定常領域をあらゆるヒトまたは動物種から得ることができることが理解されよう。一動物(例えばヒト)種の可変ドメインのDNAに由来し、次いで別の一動物種の定常領域のDNAに融合して「ハイブリッド」の、全長の重鎖および/または軽鎖に対するコード配列(複数可)を形成するFvクローンが、本明細書で用いられる「キメラの」および「ハイブリッドの」抗体の定義に含まれる。好ましい一実施形態において、ヒト可変DNAに由来するFvクローンをヒト定常領域のDNAに融合して、全てのヒトの、全長または部分的な長さの重鎖および/または軽鎖に対するコード配列(複数可)を形成する。
【０１６２】
ハイブリドーマに由来する抗DLL4抗体をコードするDNAを、例えば、ヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインに対するコード配列を、ハイブリドーマクローンに由来する相同のマウス配列の場所に置換することによって改変することもできる(例えば、Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81巻、6851〜6855頁(1984年)の方法におけるように)。ハイブリドーマまたはFvクローン由来の抗体もしくはフラグメントをコードするDNAを、免疫グロブリンのコード配列の、非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列の全部または部分に共有性に連結することによって、さらに改変することができる。この様式において、Fvクローンまたはハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有する「キメラの」または「ハイブリッドの」抗体を調製する。
【０１６３】
抗体フラグメント
本発明は抗体フラグメントを包含する。ある状況において、抗体全体よりも抗体フラグメントを用いるのが有利である。フラグメントのサイズが小型であるほど速やかなクリアランスが可能となり、固形腫瘍に対する接近の改善がもたらされ得る。
【０１６４】
抗体フラグメントを生成するために、様々な技術が開発されている。伝統的には、これらのフラグメントはインタクトな抗体のタンパク質分解性の消化によって引き出された(例えば、Morimotoら、Journal of Biochemical and Biophysical Methods、24巻、107〜117頁(1992年)、ならびにBrennanら、Science、229巻、81頁(1985年)を参照されたい)。しかし、これらのフラグメントは、現在では組換えの宿主細胞によって直接生成され得る。Fab、Fv、およびScFv抗体フラグメントは、全て大腸菌において発現され、大腸菌から分泌され得、したがってこれらのフラグメントを大量に容易に生成することが可能となっている。抗体フラグメントを、上記で論じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Fab'-SHフラグメントを、大腸菌から直接回収し、化学的に連結してF(ab')2フラグメントを形成することができる(Carterら、Bio/Technology、10巻、163〜167頁(1992年))。別の取り組みによると、F(ab')2フラグメントを、組換えの宿主細胞の培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合性エピトープ残基を含む、in vivoの半減期の増大したFabおよびF(ab')2フラグメントが、米国特許第5,869,046号に記載されている。抗体フラグメントを生成するための他の技術は当業者には明らかである。他の実施形態において、選択される抗体は1本鎖Fvフラグメント(scFv)である。国際公開第93/16185号、米国特許第5,571,894号、および米国特許第5,587,458号を参照されたい。FvおよびsFvは、定常領域を欠く、インタクトな連結部位を有する唯一の種であり、したがって、これらは、in vivoで使用する間、非特異的な結合の低減に適する。sFv融合タンパク質は、sFvのアミノ末端またはカルボキシ末端いずれかのエフェクタータンパク質の融合をもたらすように構築されていてよい。Antibody Engineering、Borrebaeck編集、上述を参照されたい。抗体フラグメントは、例えば、米国特許第5,641,870号に記載されているものなど、「線状抗体」であってもよい。このような線状抗体フラグメントは、単一特異性でもよく、または2特異性でもよい。
【０１６５】
ヒト化抗体
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が、当技術分野では知られている。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその中に導入された1つまたは複数のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトのアミノ酸残基は、典型的には「インポート」の可変ドメインからとられる、「インポート」残基と呼ばれることが多い。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列に高頻度可変性の領域の配列を置換することによって、本質的にWinterおよび共同研究者の方法に従って行われ得る(Jonesら、(1986年)、Nature、321巻、522〜525頁;Riechmannら、(1988年)、Nature、332巻、323〜327頁;Verhoeyenら、(1988年)、Science、239巻、1534〜1536頁)。したがって、このような「ヒト化」抗体は、本質的にインタクトなヒト可変ドメインより短い部分が、非ヒト種からの対応する配列によって置換されているキメラの抗体である(米国特許第4,816,567号)。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの高頻度可変性領域の残基が、およびおそらくはいくつかのFR残基が、齧歯動物の抗体における類似の部位からの残基によって置換されているヒトの抗体である。
【０１６６】
ヒト化抗体を作成するのに用いられる、軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するのに非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従って、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、知られているヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、齧歯動物の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体に対するヒトフレームワークとして認められる(Simsら、(1993年)、J. Immunol.、151巻、2296頁;Chothiaら、(1987年)、J. Mol. Biol.、196巻、901頁)。別の方法は、ヒト抗体の特定のサブグループの軽鎖または重鎖のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体に対して同じフレームワークを用いることができる(Carterら、(1992年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻、4285頁;Prestaら、(1993年)、J. Immnunol.、151巻、2623頁)。
【０１６７】
抗体が抗原に対する高親和性および他の好ましい生物学的性質を保持しながら、抗体をヒト化することがさらに重要である。この目標を達成するために、一方法によると、親の配列およびヒト化配列の3次元モデルを用いて、親の配列および様々な概念的なヒト化生成物の分析のプロセスによって、ヒト化抗体を調製する。3次元の免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者には馴染みがある。選択された候補の免疫グロブリン配列の可能な3次元の立体配置上の構造を図示および表示するコンピュータプログラムが入手可能である。これらの表示を調査することで、候補の免疫グロブリン配列の機能における残基の有望な役割の分析、すなわち、候補の免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。この方法で、標的の抗原(複数可)に対する親和性の増大など、望ましい抗体の特徴が達成されるように、FR残基を選択し、レシピエントおよびインポートの配列から組み合わせることができる。一般に、高頻度可変性領域の残基は、直接的に、および最も実質的に、抗原の結合に影響を及ぼすことに関与している。
【０１６８】
ヒト抗体
ヒト抗DLL4抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されるFvクローン可変ドメイン配列(複数可)を、上記に記載した知られているヒト定常ドメイン配列(複数可)と組み合わせることによって構築することができる。あるいは、ヒトモノクローナル抗DLL4抗体を、ハイブリドーマ法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体を生成するための、ヒトミエローマおよびマウス-ヒトへテロミエローマの細胞系は、例えば、Kozbor J.、Immunol.、133巻、3001頁(1984年);Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、51〜63頁(Marcel Dekker, Inc.、New York、1987年);およびBoernerら、J. Immunol.、147巻、86頁(1991年)によって記載されている。
【０１６９】
免疫化時に、内因性の免疫グロブリンの生成の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを生成することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を生成することが、現在、可能である。例えば、キメラマウスおよび生殖細胞系列変異マウスにおける抗体の重鎖連結領域(JH)遺伝子のホモ接合性の欠失は、内因性の抗体生成の完全な阻害をもたらすことが記載されている。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖細胞系列変異マウスに移植すると、抗原チャレンジをしたときにヒト抗体の生成をもたらす。例えば、Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci USA、90巻、2551頁(1993年);Jakobovitsら、Nature、362巻、255頁(1993年);Bruggermannら、Year in Immunol.、7巻、33頁(1993年)を参照されたい。
【０１７０】
非ヒト(例えば、齧歯動物)の抗体からヒト抗体を誘導するのに、遺伝子シャフリングも用いることができ、この場合ヒト抗体は、開始の非ヒト抗体と同様の親和性および特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法に従って、上記に記載したファージディスプレイ技術によって得られた非ヒト抗体フラグメントの重鎖または軽鎖可変領域のいずれかが、ヒトVドメイン遺伝子のレパートリーで置換され、非ヒト鎖/ヒト鎖scFvまたはFabのキメラの集団が作り出される。抗原で選択すると、非ヒト鎖/ヒト鎖のキメラのscFvまたはFabの単離がもたらされ、この場合、ヒト鎖は、1次ファージディスプレイクローンにおいて対応する非ヒト鎖を除去したときに破壊された抗原結合性部位を回復し、すなわち、エピトープは、ヒト鎖パートナーの選択を支配する(インプリントする)。残りの非ヒト鎖を置換するためにこの過程を繰り返す場合に、ヒト抗体が獲られる(1993年4月1日公開のPCT国際公開第93/06213号を参照されたい)。CDRグラフティングによる非ヒト抗体の伝統的なヒト化と異なり、この技術は非ヒト起源のFRまたはCDR残基のない完全なヒト抗体を提供する。
【０１７１】
二特異性抗体
二特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、モノクローナルの、好ましくはヒトまたはヒト化の抗体である。本発明の場合は、結合特異性の1つはDLL4に対するものであり、他方はあらゆる他の抗原に対するものである。例示の二特異性抗体は、DLL4タンパク質の2つの異なるエピトープに結合することができる。二特異性抗体は、DLL4を発現する細胞に対して細胞傷害性薬を局在化させるのにも用いることができる。これらの抗体は、DLL4結合性アーム、および細胞傷害性薬(例えば、サポリン、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセート、または放射性同位元素ハプテン)に結合しているアームを所有する。二特異性抗体は、全長の抗体または抗体フラグメント(例えば、F(ab')2二特異性抗体)として調製することができる。
【０１７２】
二特異性抗体を作成するための方法は、当技術分野では知られている。伝統的には、二特異性抗体の組換えの生成が、2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現のベースとなっており、この場合2つの重鎖は異なる特異性を有する(MilsteinおよびCuello、Nature、305巻、537頁(1983年))。免疫グロブリン重鎖および軽鎖はランダムに組み合わされているので、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は、10個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生成し、そのうち1つだけが正確な2特異性の構造を有する。正確な分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィーのステップによって行われ、多少厄介であり、生成物の収量は低い。同様の方法が、1993年5月13日公開の国際公開第93/08829号、およびTrauneckerら、EMBO J.、10巻、3655頁(1991年)に公開されている。
【０１７３】
異なる、より好ましい取組みに従って、望ましい結合特異性(抗体-抗原連結部位)を有する抗体の可変ドメインを、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。融合は、少なくともヒンジの部分、CH2、およびCH3領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとであるのが好ましい。少なくとも1つの融合物に存在する、軽鎖の結合に必要な部位を含む、第1の重鎖定常領域(CH1)を有するのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、および所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを別々の発現ベクター中に挿入し、適切な宿主生物体内に同時形質移入する。これにより、構築において用いられた不均等な比率の3つのポリペプチド鎖が最適の収量をもたらす実施形態において、3つのポリペプチドフラグメントの相互の割合を調節するのに大きな柔軟性がもたらされる。しかし、等しい比率の少なくとも2つのポリペプチド鎖の発現が高収量をもたらす場合、または比率が特に重要ではない場合、1つの発現ベクターに、2つまたは3つの全てのポリペプチド鎖に対するコード配列を挿入することは可能である。
【０１７４】
この取組みの好ましい一実施形態において、二特異性抗体は、一方のアームに第1の結合特異性を有するハイブリッドの免疫グロブリン重鎖、および他方のアームにハイブリッドの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第2の結合特異性を提供する)から構成される。2特異性分子の半分だけに免疫グロブリン軽鎖が存在することで分離の容易な方法がもたらされるので、この非対称性の構造は、望まれない免疫グロブリン鎖の組合せから望ましい2特異性の化合物の分離を促進することが見出された。この取組みは、国際公開第93/08829号に開示されている。二特異性抗体を産生するさらなる詳細には、例えば、Sureshら、Methods in Enzymology、121巻、210頁(1986年)を参照されたい。
【０１７５】
別の一取組みによると、1対の抗体分子間の界面を、組換えの細胞培養物から回収されるヘテロ2量体のパーセント値を最大にするように操作することができる。好ましい界面は、抗体の定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部分を含む。この方法では、第1の抗体分子の界面からの小型アミノ酸側鎖の1つまたは複数が、より大型の側鎖(例えば、チロシンまたはトリプトファン)で置き換えられる。大型の側鎖(複数可)に対する、同一または同様のサイズの代償性の「キャビティー」が、大型のアミノ酸側鎖を小型のアミノ酸(例えば、アラニンまたはスレオニン)で置換することによって第2の抗体分子の界面上に作り出される。これにより、ホモ2量体など、他の望まれない最終産物を上回ってヘテロ2量体の収量を増大するための機序が提供される。
【０１７６】
二特異性抗体には、架橋された、または「ヘテロコンジュゲート」の抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の一方をアビジンに、他方をビオチンにカップリングすることができる。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を標的とするために(米国特許第4,676,980号)、およびHIV感染の処置のために(国際公開第91/00360号、国際公開第92/00373号、および欧州特許第03089号)提唱されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる好都合な架橋法を用いて作成され得る。適切な架橋剤は当技術分野では知られており、数々の架橋技術とともに米国特許第4,676,980号に開示されている。
【０１７７】
抗体フラグメントから二特異性抗体を産生するための技術は、文献にも記載されている。例えば、二特異性抗体は、化学的な連結を用いて調製することができる。Brennanら、Science、229巻、81頁(1985年)は、インタクトな抗体をタンパク質分解性に切断してF(ab')2フラグメントを産生する方法を記載している。これらのフラグメントを、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して近接するジチオールを安定化し、分子内ジスルフィドの形成を防ぐ。産生されたFab'フラグメントを、次いで、チオニトロベンゾエート(TNB)誘導体に変換する。次いで、一方のFab'-TNB誘導体を、メルカプトエチルアミンで還元することによってFab'-チオールに再変換し、等モル量の他のFab'-TNB誘導体と混合して二特異性抗体を形成させる。生成された二特異性抗体を、酵素の選択的固定化のための薬剤として用いることができる。
【０１７８】
最近の進歩により大腸菌からFab'-SHフラグメントを直接回収するのが容易になっており、このフラグメントを化学的に連結して二特異性抗体を形成してもよい。Shalabyら、J. Exp. Med.、175巻、217〜225頁(1992年)は、完全にヒト化された二特異性抗体であるF(ab')2分子の生成を記載している。各Fab'フラグメントを大腸菌から別々に選択し、in vitroで定方向の化学的カップリングを受けさせて二特異性抗体を形成する。このように形成された二特異性抗体は、HER2受容体を過剰発現する細胞、および通常のヒトT細胞に結合することができ、また、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解性の活性を引き起こすことができた。
【０１７９】
組換え細胞の培養物から直接二特異性抗体を作成し、単離するための様々な技術も記載されている。例えば、二特異性抗体はロイシンジッパーを用いて生成されている。Kostelnyら、J. Immunol、148巻(5)、1547〜1553頁(1992年)。FosおよびJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により2つの異なる抗体のFab'部分に連結した。抗体のホモ2量体はヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで再び酸化されて抗体のヘテロ2量体を形成した。この方法を、抗体のホモ2量体の生成にも利用することができる。Hollingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90巻、6444〜6448頁(1993年)によって記載されている「ダイアボディー」技術は、二特異性抗体フラグメントを作成するための代替の機序を提供している。フラグメントは、非常に短いので同じ鎖上の2つのドメイン間で対を作ることができないリンカーによって軽鎖可変ドメイン(VL)に連結している重鎖可変ドメイン(VH)を含んでいる。したがって、一方のフラグメントのVHおよびVLドメインは、別のフラグメントの相補的なVLおよびVHドメインと強制的に対を作らされ、その結果2つの抗原結合性部位が形成される。1本鎖Fv(sFv)の2量体の使用により二特異性抗体フラグメントを作成するための別の一戦略も報告されている。Gruberら、J. Immunol.、152巻、5368頁(1994年)を参照されたい。
【０１８０】
二価を超える抗体が企図される。例えば、3特異性抗体を調製することができる。Tuttら、J. Immunol.、147巻、60頁(1991年)。
【０１８１】
多価抗体
多価抗体は、それに対して抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体よりも速くインターナリゼーション(および/または異化)されることがある。本発明の抗体は、3つまたはそれを超える抗原結合性部位を有する(IgMクラス以外のものである)多価抗体(例えば、4価抗体)であってよく、これは抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換えの発現によって容易に生成され得る。多価抗体は、2量体化ドメイン、および3つまたはそれを超える抗原結合性部位を含むことができる。好ましい2量体化ドメインは、Fc領域またはヒンジ領域を含む(またはそれらからなる)。この筋書において、抗体は、Fc領域、およびFe領域に対する3つまたはそれを超える抗原結合性部位のアミノ末端を含む。本明細書における好ましい多価抗体は、3つから8つの、好ましくは4つの抗原結合性部位を含む(またはそれらからなる)。多価抗体は、少なくとも1つのポリペプチド鎖(および好ましくは2つのポリペプチド鎖)を含み、ポリペプチド鎖(複数可)は2種以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖(複数可)はVD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fcを含むことができ、この場合VD1は第1の可変ドメインであり、VD2は第2の可変ドメインであり、FcはFc領域の1つのポリペプチド鎖であり、X1およびX2はアミノ酸またはポリペプチドを表し、nは0または1である。例えば、ポリペプチド鎖(複数可)は、VH-CH1-柔軟なリンカー-VH-CH1-Fc領域鎖;またはVH-CH1-VH-CH1-Fc領域鎖を含むことができる。本明細書の多価抗体は、少なくとも2つの(好ましくは4つの)軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含むのが好ましい。本明細書における多価抗体は、例えば、約2つから約8つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含むことができる。本発明で企図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを含み、場合によりCLドメインをさらに含む。
【０１８２】
抗体の変異体
いくつかの実施形態において、本明細書に記載する抗体のアミノ酸配列の改変(複数可)が企図される。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的性質を改善するのが望ましいことがある。抗体の核酸中に好適なヌクレオチドの変更を導入することによって、またはペプチド合成によって、抗体のアミノ酸配列の変異体を調製する。このような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および/または残基中への挿入、および/または残基の置換が含まれる。最終構築物が望ましい特徴を有するのであれば、最終構築物に到達するために欠失、挿入、および置換のあらゆる組合せがなされる。配列を作成するときに、アミノ酸の変更を対象の抗体のアミノ酸配列に導入してもよい。
【０１８３】
突然変異誘発に好ましい位置にある抗体の、ある残基または領域を同定するのに有用な方法は、CunninghamおよびWells、(1989年)、Science、244巻、1081〜1085頁によって記載されている「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここでは、標的の残基の残基または基が同定され(例えば、アルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、およびグルタミン酸などの荷電した残基)、中性または負に荷電したアミノ酸(最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン)によって置換されてアミノ酸の抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで、置換に対する機能的な感受性を実証するこれらのアミノ酸の位置を、置換の部位の、または置換の部位に対する、さらなる、または他の変異体を導入することによって洗練する。このように、アミノ酸配列の変異を導入するための部位は予め決定するが、突然変異の性質それ自体を予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を分析するために、標的のコドンまたは領域でアラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘発を行い、発現した免疫グロブリンを望ましい活性に対してスクリーニングする。
【０１８４】
アミノ酸配列の挿入には、残基1個の長さから100個またはそれを超える残基を含むポリペプチドまでの範囲のアミノ末端および/またはカルボキシル末端の融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端の挿入の例には、N末端のメチオニル残基を有する抗体、または細胞傷害性ポリペプチドに融合している抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入の変異体には、抗体のN末端またはC末端の、酵素(例えば、ADEPTに対する)またはポリペプチドに対する融合が含まれ、これは抗体の血清半減期を増大する。
【０１８５】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはN連結またはO連結のいずれかである。N連結は、炭水化物部分の、アスパラギン残基の側鎖への付着を意味する。トリペプチド配列のアスパラギン-X-セリン、およびアスパラギン-X-スレオニン(Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である)は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的付着に対する認識配列である。このようにポリペプチドにおけるこれらのいずれかのトリペプチド配列の存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。O連結したグリコシル化は、N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの糖の1つがヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの付着を意味するが、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリジンも用いられることがある。
【０１８６】
抗体に対するグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が1つまたは複数の上記に記載したトリペプチド配列(N連結したグリコシル化部位に対して)を含むように、アミノ酸配列を変更することによって行うと好都合である。変更は、また、オリジナルの抗体の配列(O連結したグリコシル化部位に対して)に対する1つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の付加、またはそれらによる置換によってなされてもよい。
【０１８７】
抗体がFc領域を含む場合、それに付着している炭水化物を変更してもよい。例えば、抗体のFc領域に付着しているフコースを欠く成熟した炭水化物構造を有する抗体が、米国特許出願公開第2003/0157108号に記載されている。米国特許出願公開第2004/0093621号(協和発酵工業(株))も参照されたい。抗体のFc領域に付着している炭水化物における2分するN-アセチルグルコサミンを有する抗体は、国際公開第2003/011878号、Jean-Mairetら、および米国特許第6,602,684号、Umanaらに参照されている。抗体のFc領域に付着しているオリゴ糖における少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体は、国際公開第1997/30087号、Patelらに報告されている。そのFc領域に付着している変更された炭水化物を有する抗体に関する国際公開第1998/58964号(Raju,S.)、および国際公開第1999/22764号(Raju,S.)も参照されたい。グリコシル化の改変された抗原結合性分子に関する米国特許出願公開第2005/0123546号、Umanaらも参照されたい。
【０１８８】
本明細書における好ましいグリコシル化の変異体はFc領域を含んでおり、この場合、Fc領域に付着している炭水化物構造はフコースを欠く。このような変異体は改善されたADCC機能を有する。場合により、Fc領域は、例えば、Fc領域のポジション298、333、および/または334の置換(残基のEu番号付け)など、ADCCをさらに改善する1つまたは複数のアミノ酸置換をその中にさらに含む。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体に関する公報の例には、米国特許出願公開第2003/0157108号、国際公開第2000/61739号、国際公開第2001/29246号、米国特許出願公開第2003/0115614号、米国特許出願公開第2002/0164328号、米国特許出願公開第2004/0093621号、米国特許出願公開第2004/0132140号、米国特許出願公開第2004/0110704号、米国特許出願公開第2004/0110282号、米国特許出願公開第2004/0109865号、国際公開第2003/085119号、国際公開第2003/084570号、国際公開第2005/035586号、国際公開第2005/035778号、国際公開第2005/053742号、Okazakiら、J. Mol. Biol、336巻、1239〜1249頁(2004年);Yamane-Ohnukiら、Biotech. Bioeng.、87巻、614頁、(2004年)が含まれる。脱フコシル化抗体を生成する細胞系の例には、タンパク質のフコシル化を欠くLec13CHO細胞(Ripkaら、Arch. Biochem. Biophys.、249巻、533〜545頁(1986年);米国特許出願公開第2003/0157108 A1号、Presta, L;および国際公開第2004/056312 A1号、Adamsら、特に実施例11)、およびノックアウト細胞系、例えば、α-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8、ノックアウトCHO細胞(Yamane-Ohnukiら、Biotech. Bioeng.、87巻、614頁(2004年))が含まれる。
【０１８９】
別の一タイプの変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置き換えられた抗体分子において少なくとも1つのアミノ酸残基を有する。置換の突然変異誘発に対して最も関心の高い部位には高頻度可変性の領域が含まれるが、FRの変更も企図される。保存的置換は、「好ましい置換」の表題の下、表2に示す。このような置換が生物学的活性における変更をもたらす場合、表2において「例示の置換」と命名する、またはアミノ酸のクラスに関して以下にさらに記載するより実質的な変化が導入されてよく、生成物がスクリーニングされてよい。表-US-00003表2オリジナルの例示の好ましい残基の置換Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg I Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Leu Phe;ノルロイシンLeu (L)ノルロイシン;Ile; Val; Ile Met; Ala; Phe Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe;Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Leu Ala;ノルロイシン
【０１９０】
抗体の生物学的性質における実質的な改変は、(a)置換の場所におけるポリペプチドのバックボーンの構造(例えば、シートもしくはらせんの立体配置として)の維持、(b)標的部位における分子の荷電もしくは疎水性の維持、または(c)側鎖の容積の維持に対して改変の効果が著しく異なる置換を選択することによって遂行される。天然に存在する残基は、一般的な側鎖の性質に基づいてグループに分けられる:[0215](1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;[0216](2)中性の疎水性: Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;[0217](3)酸性:asp、glu;[0218](4)塩基性:his、lys、arg;[0219](5)鎖の方向性に影響を及ぼす残基: gly、pro;および[0220](6)芳香族:trp、tyr、phe。
【０１９１】
非保存的な置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【０１９２】
1タイプの置換変異体は、親の抗体(例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体)の1つまたは複数の高頻度可変性の領域の残基を置換することを伴う。一般に、さらなる開発に対して選択された得られた変異体(複数可)は、それからそれらが産生された親の抗体に比べて生物学的性質が改善される。このような置換変異体を産生するための便利な方法は、ファージディスプレイを用いるアフィニティー成熟を伴う。簡潔に述べると、いくつかの高頻度可変性領域の部位(例えば、6〜7部位)を突然変異させて、各部位に全ての可能なアミノ酸置換を産生させる。このように産生された抗体は、各粒子内にパッケージングされたM13の遺伝子III生成物に対する融合物として繊維状のファージ粒子からディスプレイされる。次いで、ファージディスプレイされた変異体を、本明細書に開示するように、それらの生物学的活性(例えば、結合親和性)に対してスクリーニングする。改変するための候補の高頻度可変性領域の部位を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を行って、抗原の結合性に著しく寄与する高頻度可変性領域の残基を同定することができる。その代わりにまたはそれに加えて、抗体と抗原の間の接触点を同定するために、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析すると有益であることがある。このような接触する残基および隣接の残基は、本明細書で作り上げた技術による置換に対する候補である。このような変異体を産生した後は、本明細書に記載するように、変異体のパネルをスクリーニングにかけ、1つまたは複数の関連するアッセイにおいて優れた性質を有する抗体をさらなる開発用に選択してもよい。
【０１９３】
抗体のアミノ酸配列の変異体をコードする核酸分子を、当技術分野では知られている様々な方法によって調製する。これらの方法には、それだけには限定されないが、天然の供給源からの単離(天然に存在するアミノ酸配列の変異体の場合)またはオリゴヌクレオチド媒介性(もしくは部位特異的)突然変異誘発による調製、PCR突然変異誘発、および抗体の初期に調製された変異体もしくは非変異体バージョンのカセット突然変異誘発が含まれる。
【０１９４】
免疫グロブリンポリペプチドのFc領域に1つまたは複数のアミノ酸の改変を導入し、その結果Fc領域の変異体を産生するのが望ましいことがある。Fc領域の変異体は、ヒンジのシステインのものを含む1つまたは複数のアミノ酸ポジションのアミノ酸改変(例えば、置換)を含む、ヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4領域)を含むことができる。
【０１９５】
本明細書および当技術分野の教示によると、いくつかの実施形態において、方法において用いられる抗体は、野生型の対応する抗体に比べて、例えばFc領域において、1つまたは複数の変更を含むことがあることが企図される。これらの抗体は、それにもかかわらず、それらの野生型の対応物に比べて治療上の有用性に必要とされる実質的に同じ特徴を保持している。例えば、国際公開第99/51642号に記載されるように、C1q結合および/または補体依存性細胞傷害(CDC)の変更(すなわち、改善または低減のいずれか)がもたらされるFc領域に、ある種の変更を行うことができると考えられている。Fc領域の変異体の他の例に関するDuncanおよびWinter、Nature、322巻、738〜40頁(1988年);米国特許第5,648,260号、米国特許第5,624,821号、ならびに国際公開第94/29351号も参照されたい。国際公開第00/42072号(Presta)および国際公開第2004/056312号(Lowman)は、FcRに対する結合性が改善または低減した抗体変異体を記載している。これら特許出版物の内容は、参照によって本明細書に特に組み入れられる。Shieldsら、J. Biol. Chem.、9巻(2)、6591〜6604頁(2001年)も参照されたい。半減期が増大し、母親のIgGの胎児への移行を担う新生児Fc受容体(FcRn)に対する結合性が改善した抗体(Guyerら、J. Immunol.、117巻、587頁(1976年)およびKimら、J. Immunol.、24巻、249頁(1994年))は、米国特許出願公開第2005/0014934A1号(Hintonら)に記載されている。これらの抗体は、Fc領域のFcRnに対する結合を改善する1つまたは複数の置換をその中に有するFc領域を含んでいる。Fc領域のアミノ酸配列が変更され、C1q結合可能性が増大または低減したポリペプチドの変異体は、米国特許第6,194,551B1号、国際公開第99/51642号に記載されている。これら特許出版物の内容は、参照によって本明細書に特に組み入れられる。Idusogieら、J. Immunol. 164巻、4178〜4184頁(2000年)も参照されたい。
【０１９６】
抗体の誘導体
抗体を、当技術分野では知られており、容易に入手可能なさらなる非タンパク質部分を含むようにさらに改変することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適する部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、それだけには限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキソラン、エチレン/マレイン酸無水物共重合体、ポリアミノ酸(ホモポリマーもしくはランダム共重合体のいずれか)、およびデキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン(prolypropylene)オキサイド/エチレンオキサイド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中で安定であるため、製造における利点を有することがある。ポリマーは、あらゆる分子量であってよく、分枝でも、または非分枝でもよい。抗体に付着しているポリマーの数は変化してよく、1個を超えるポリマーが付着している場合、それらは同じ分子でもよく、または異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に用いられるポリマーの数および/またはタイプは、それだけには限定されないが、抗体の誘導体を規定された条件下で治療に用いるか否かなど、改善すべき抗体の特定の性質または機能を含めた考慮に基づいて決定され得る。
【０１９７】
望ましい性質を有する抗体のスクリーニング
抗体を、当技術分野では知られている様々なアッセイによって、その物理的/化学的性質、および生物学的機能に対して特徴付けることができる。いくつかの実施形態において、抗体は、DLL4に対する結合、Notch受容体活性化の低減もしくは阻止、Notch受容体の下流の分子のシグナリングの低減もしくは阻止、Notch受容体のDLL4に対する結合のかく乱もしくは阻止、DLL4インターナリゼーションの誘発もしくは妨害、ならびに/または内皮細胞の増殖の促進、ならびに/または内皮細胞の分化の阻害、ならびに/または動脈の分化の阻害、ならびに/または腫瘍血管の潅流の阻害、ならびに/または腫瘍、細胞増殖性障害もしくは癌の処置および/もしくは防止、ならびに/またはDLL4発現に付随する障害の処置もしくは防止、ならびに/またはNotch受容体の発現および/もしくは活性に付随する障害の処置もしくは防止のあらゆる1つもしくは複数に対して特徴付けられる。
【０１９８】
精製した抗体を、それだけには限定されないが、N末端の配列決定、アミノ酸分析、非変性性のサイズ排除高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー、およびパパイン消化を含む一連のアッセイによってさらに特徴付けることができる。
【０１９９】
本発明のある実施形態において、本明細書で生成された抗体を、その生物学的活性に対して分析する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体を、その抗原結合性活性に対して試験する。当技術分野では知られており、本明細書で用いられ得る抗原結合性アッセイには、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光免疫アッセイ、およびタンパク質A免疫アッセイなどの技術を用いた、制限なくあらゆる直接の、または競合性の結合アッセイが含まれる。例示の抗原結合性アッセイを、以下の実施例のセクションに提供する。
【０２００】
本発明のある実施形態において、本明細書で生成される抗体を、DLL4のインターナリゼーション生物学的活性に対するその効果に対して分析する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体を、DLL4のインターナリゼーションに対するその効果に対して試験する。細胞表面に発現されるタンパク質のインターナリゼーションに対するアッセイは当技術分野では知られており、本明細書で用いることができ、抗体ベースの蛍光局在技術および細胞表面ビオチン化アッセイなど、制限なくあらゆる免疫組織化学的局在技術を含む。例示の細胞表面タンパク質のインターナリゼーションアッセイを、以下の実施例セクションに提供する。
【０２０１】
本明細書に記載する独特の性質を保有する抗DLL4抗体を、あらゆる好都合な方法によって、望ましい性質に対して抗DLL4ハイブリドーマクローンをスクリーニングすることによって得ることができ、好都合な方法のいくつかを本明細書に記載および例示する。例えば、DLL4に対するNotch受容体の結合を阻止する抗DLL4モノクローナル抗体、または阻止しない抗DLL4モノクローナル抗体が望ましい場合は、候補の抗体を、競合的結合性ELISAなどの結合性競合アッセイにおいて試験することができ、この場合、プレートのウェルをDLL4でコーティングし、過量の対象のNotch受容体中の抗体の溶液をコーティングしたプレート上に層積し、結合した抗体を酵素的に検出する(例えば、結合した抗体をHRPコンジュゲートした抗Ig抗体またはビオチン化した抗Ig抗体と接触させ、HRP着色反応を発色させ(例えば、プレートをストレプトアビジン-HRPおよび/または過酸化水素で発色させることにより)、HRP着色反応を490nmのELISAプレートリーダーで分光光度法によって検出する)。
【０２０２】
一実施形態において、抗体は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を保有する変更された抗体であり、エフェクター機能により、in vivoにおける抗体の半減期は重要であるが、あるエフェクター機能(例えば、補体およびADCC)は不必要または有害である多くの適用に望ましい候補物質となっている。ある実施形態において、生成した免疫グロブリンのFc活性を測定して、望ましい性質だけが維持されることを確認する。in vitroおよび/またはin vivoの細胞傷害性アッセイを行って、CDCおよび/またはADCC活性の低減/枯渇を確認してもよい。例えば、Fc受容体(FcR)結合性アッセイを行って、抗体がFcγR結合性を欠く(それゆえADCC活性を欠く)可能性があるがFcRn結合性の能力を保持することを確認することができる。ADCCを媒介するための主な細胞であるNK細胞はFcγRIIIだけを発現するが、単球はFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcRの発現は、RavetchおよびKinet、Annu. Rev. Immunol、9巻、457〜92頁(1991年)の464頁、表3にまとめてある。対象の分子のADCC活性を評価するためのin vitroアッセイの例は、米国特許第5,500,362号または第5,821,337号に記載されている。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。その代わりにまたはそれに加えて、対象の分子のADCC活性は、例えば、Clynesら、PNAS (USA)、95巻、652〜656頁(1998年)に記載されているものなどの動物モデルにおいて、in vivoで評価してもよい。C1q結合性アッセイをやはり行って、抗体がC1qに結合することができず、したがってCDC活性を欠くことを確認してもよい。補体の活性化を評価するために、例えば、Gazzano-Santoroら、J. Immunol. Methods、202巻、163頁(1996年)に記載されているCDCアッセイを行ってもよい。当技術分野では知られている方法、例えば、実施例のセクションに記載するものを用いて、FcRn結合性およびin vivoのクリアランス/半減期の定量を行ってもよい。
【０２０３】
ベクター、宿主細胞、および組換えの方法
抗体を組換えで生成するために、それをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング(DNAの増幅)用にまたは発現用に複製可能なベクター中に挿入する。抗体をコードするDNAは、従来の方法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)、容易に単離および配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクターの選択は用いられる宿主細胞に部分的に依存する。一般に、好ましい宿主細胞は、原核生物または真核生物(一般に哺乳動物)いずれかの起源である。IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEの定常領域を含むあらゆるイソ型の定常領域をこの目的に用いることができ、このような定常領域をあらゆるヒトまたは動物種から得ることができることが理解されよう。
【０２０４】
a.原核生物の宿主細胞を用いた抗体の産生
i.ベクターの構築
抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列を、標準の組換え技術を用いて得ることができる。望ましいポリヌクレオチド配列をハイブリドーマ細胞などの抗体生成細胞から単離し、配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドを、ヌクレオチド合成装置またはPCR技術を用いて合成することができる。得た後は、ポリペプチドをコードする配列を、原核生物の宿主において異種性のポリヌクレオチドを複製および発現することが可能な組換えベクター中に挿入する。入手可能であり、当技術分野で知られている多くのベクターを、本発明の目的に用いることができる。好適なベクターの選択は、主にベクター中に挿入される核酸のサイズ、およびベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能(異種性のポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、または両方)、およびそれが存在する特定の宿主細胞との適合性に応じて、様々な成分を含む。ベクターの成分は、それだけには限定されないが、複製開始点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種性の核酸挿入物、および転写終結配列を一般に含む。
【０２０５】
一般に、宿主細胞と適合性である種に由来するレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して用いられる。ベクターは通常、複製部位、および形質転換された細胞において表現型の分泌を提供することができるマーキング配列を保有する。例えば、大腸菌は、典型的には大腸菌種に由来するプラスミドであるpBR322を用いて形質転換される。pBR322は、アンピシリン(Amp)およびテトラサイクリン(Tet)耐性をコードする遺伝子を含み、したがって形質転換された細胞を同定する容易な手段がもたらされる。pBR322、その誘導体、または他の微生物のプラスミドもしくはバクテリオファージも、内因性タンパク質を発現するために微生物によって用いられ得るプロモーターを含んでもよく、または含むように改変されてもよい。特定の抗体を発現するために用いられるpBR322誘導体の例は、Carterら、米国特許第5,648,237号に詳しく記載されている。
【０２０６】
さらに、宿主の微生物と適合性であるレプリコンおよび制御配列を含むファージベクターを、これらの宿主に関連して形質転換用ベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌LE392などの形質転換を受けやすい宿主細胞に用いることができる組換えベクターを作成するのにλGEM(商標)-11を利用してもよい。
【０２０７】
発現ベクターは、各々のポリペプチド成分をコードするプロモーター-シストロン対を2つまたはそれを超えて含むことができる。プロモーターは上流(5')からその発現を変調するシストロンに位置する、非翻訳の制御配列である。原核生物のプロモーターは、典型的には、誘導性および構成性の2つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、栄養の存在もしくは非存在、または温度の変化など、培養条件における変化に反応して、その制御下でシストロンの転写レベルの増大を開始するプロモーターである。
【０２０８】
様々な潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。選択されたプロモーターを、制限酵素の消化によって、および単離したプロモーター配列をベクター中に挿入することによって、原料のDNAからプロモーターを除去することによって、軽鎖または重鎖をコードするシストロンDNAに操作可能に連結することができる。天然のプロモーター配列および多くの異種性のプロモーターの両方を用いて、標的遺伝子を直接増幅および/または発現させてもよい。いくつかの実施形態において、異種性のプロモーターは天然の標的のポリペプチドプロモーターに比べて、発現される標的遺伝子のより大量の転写およびより高収量を一般に可能にするので、異種性のプロモーターが利用される。
【０２０９】
原核生物の宿主で用いるのに適するプロモーターには、PhoAプロモーター、βガラクタマーゼおよびラクトースのプロモーター系、トリプトファン(trp)プロモーター系、およびtacまたはtrcプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかし、細菌において機能的である他のプロモーター(例えば、他の知られている細菌またはファージのプロモーター)も適切である。これらのヌクレオチド配列は公開されており、したがって熟練した研究者であれば、あらゆる必要とされる制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプターを用いて、標的の軽鎖および重鎖をコードするシストロンにそれらを操作可能にライゲートすることができる(Siebenlistら、(1980年)Cell、20巻、269頁)。
【０２１０】
本発明の一態様において、組換えベクター内の各シストロンは、発現されたポリペプチドの膜を超えた移動を指示する分泌シグナル配列の成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分であってよく、またはベクター中に挿入される標的のポリペプチドのDNAの成分であってもよい。本発明の目的に対して選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識され、または処理加工される(例えば、シグナルペプチダーゼによって切断される)配列でなければならない。異種性のポリペプチドに固有のシグナル配列を認識および処理加工しない原核生物の宿主細胞では、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lpp、または熱安定性エンドトキシンII(STII)リーダー、LamB、PhoE、PelB、OmpA、およびMBPからなる群から選択される原核生物のシグナル配列によって置換される。本発明の一実施形態において、発現系の両方のシストロンで用いられるシグナル配列は、STIIシグナル配列またはその変異体である。
【０２１１】
別の一態様において、本発明による免疫グロブリンの生成は宿主細胞の原形質で起こることがあり、したがって各シストロン内に分泌シグナル配列が存在することを必要としない。この点に関して、原形質内で免疫グロブリンの軽鎖および重鎖が発現され、フォールディングされ、組み合わさって機能的な免疫グロブリンが形成される。ある種の宿主株(例えば、大腸菌trxB株)はジスルフィド結合の形成に好ましい原形質の条件を提供し、その結果発現されたタンパク質のサブユニットの好適なフォールディングおよびアセンブリーが可能になる。ProbaおよびPluckthun、Gene、159巻、203頁(1995年)。
【０２１２】
抗体を発現するのに適する原核生物の宿主細胞には、グラム陰性またはグラム陽性の生物体などの古細菌および真正細菌が含まれる。有用な細菌の例には、大腸菌属(Escherichia)(例えば、大腸菌)、桿菌(Bacilli)(例えば、枯草菌(B.subtilis))、腸内細菌科(Enterobacteria)、シュードモナス(Pseudomonas)種(例えば、緑膿菌(P.aeruginosa))、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、セラチアマルセカンス(Serratia marcescans)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、シゲラ(Shigella)、根粒菌(Rhizobia)、ビトレオシラ(Vitreoscilla)、またはパラコッカス属(Paracoccus)が含まれる。一実施形態において、グラム陰性細胞が用いられる。一実施形態において、大腸菌が本発明の宿主として用いられる。大腸菌株の例には、W3110株(Bachmann、Cellular and Molecular Biology、第2巻(Washington, D.C.: American Society for Microbiology、1987年)、1190〜1219頁;ATCC寄託番号27,325)およびその類縁種が含まれる(遺伝子型W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac lq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR(米国特許第5,639,635号)を有する33D3株を含む)。大腸菌294(ATCC31,446)、大腸菌B、大腸菌λ1776(ATCC31,537)、および大腸菌RV308(ATCC31,608)などの他の株およびその類縁種も適切である。これらの例は、限定的ではなく例示である。規定した遺伝子型を有する上記で言及した細菌のあらゆるものの類縁種を構築するための方法は、当技術分野では知られており、例えば、Bassら、Proteins、8巻、309〜314頁(1990年)に記載されている。細菌の細胞におけるレプリコンの複製可能性を考慮に入れて好適な細菌を選択することが、一般に必要とされている。例えば、大腸菌、セラチア、またはサルモネラの種は、レプリコンを供給するためにpBR322、pBR325、pACYC177、またはpKN410などのよく知られているプラスミドを用いる場合に、宿主として用いると適切であり得る。典型的には、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、さらなるプロテアーゼ阻害物質を細胞培養物に組み入れると望ましいことがある。
【０２１３】
ii.抗体生成
宿主細胞を上記に記載した発現ベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または望ましい配列をコードする遺伝子を増幅するのに好適に改変された従来の栄養培地で培養する。
【０２１４】
形質転換は、染色体外のエレメントとして、または染色体の組込み体によってのいずれかで、DNAが複製可能であるようにDNAを原核生物の宿主に導入することを意味する。用いる宿主細胞に応じて、このような細胞に好適な標準の技術を用いて形質転換を行う。かなりの細胞壁バリアを含む細菌細胞には、塩化カルシウムを使用するカルシウム処置を一般的に用いる。形質転換のための別の方法はポリエチレングリコール/DMSOを用いるものである。さらに別の用いられる技術は電気穿孔である。
【０２１５】
ポリペプチドを生成するために用いられる原核細胞は、当技術分野では知られており、選択された宿主細胞を培養するのに適する培地で成長させる。適切な培地の例には、必要な栄養サプリメントを加えたルリアブロス(LB)が含まれる。いくつかの実施形態において、培地は、発現ベクターを含む原核細胞の成長を選択的に可能にするために、発現ベクターの構築に基づいて選択された選択剤も含む。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞を成長させるために、アンピシリンを培地に加える。
【０２１６】
炭素、窒素、および無機のリン酸塩の供給源の他にあらゆる必要なサプリメントも、単独で、または複合窒素源など、別のサプリメントもしくは培地との混合物として導入するのに好適な濃度で、含まれていてよい。場合により、培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコール酸、ジチオエリスリトール、およびジチオスレイトールからなる群から選択される還元剤を1つまたは複数含むことができる。
【０２１７】
原核生物の宿主細胞を、適切な温度で培養する。例えば、大腸菌の成長に対して、好ましい温度は約20℃から約39℃の範囲であり、より好ましくは約25℃から約37℃の範囲であり、さらにより好ましくは約30℃である。培地のpHは、主に宿主の生物体に応じて、約5から約9までの範囲のあらゆるpHであってよい。大腸菌に対しては、pHは好ましくは約6.8から約7.4までであり、より好ましくは約7.0である。
【０２１８】
発現ベクターにおいて誘導プロモーターを用いる場合、プロモーターの活性化に適する条件下でタンパク質の発現を誘導する。本発明の一態様において、ポリペプチドの転写を制御するためにPhoAプロモーターを用いる。したがって、形質転換された宿主細胞を、誘導のためにリン酸制限培地で培養する。リン酸制限培地がC.R.A.P培地であるのが好ましい(例えば、Simmonsら、J. Immunol. Methods、(2002年)、263巻、133〜147頁を参照されたい)。当技術分野で知られているように、使用するベクター構築物に従って様々な他の誘導因子を用いることができる。
【０２１９】
一実施形態において、本発明の発現されたポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズム中に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、典型的には、一般的に浸透圧ショック、超音波処理、または溶解などの手段による微生物の破壊を伴う。細胞を破壊した後、細胞デブリまたは細胞全体を遠心分離またはろ過によって除去してもよい。タンパク質を、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによってさらに精製してもよい。あるいは、タンパク質を培地中に移動させ、そこで単離することができる。生成したタンパク質をさらに精製するためにろ過し、濃縮した培地および培地上清から細胞を除去してもよい。発現したポリペプチドを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)およびウェスタンブロットアッセイなどの一般的に知られている方法を用いて、さらに単離し、同定することができる。
【０２２０】
本発明の一態様において、抗体の生成を、発酵過程によって大量に行う。様々な大規模の流加発酵方法が、組換えタンパク質の生成のために利用できる。大規模な発酵は、少なくとも1000リットルの容量を有し、好ましくは約1000リットルから100000リットルの容量を有する。これらの発酵槽は、酸素および栄養物、特にグルコース(好ましい炭素/エネルギー源)を分配するための撹拌器インペラーを用いている。小規模の発酵は、容積約100リットル以下の発酵槽における発酵を一般に意味し、約1リットルから約100リットルまでの範囲であってよい。
【０２２１】
発酵過程において、タンパク質発現の誘導を、典型的に、細胞が適切な条件下で望ましい密度(例えば、その段階では細胞が初期の定常期である、OD550約180〜220)に成長した後に開始する。当技術分野では知られており、上記に記載したように、使用するベクター構築物に従って、様々な誘導因子を用いることができる。誘導前に細胞をより短い期間成長させてもよい。細胞は、通常約12〜50時間誘導するが、より長い、またはより短い誘導時間を用いてもよい。
【０２２２】
ポリペプチドの生成の収量および品質を改善するために、様々な発酵条件を改変することができる。例えば、分泌された抗体のポリペプチドの適正なアセンブリーおよびフォールディングを改善するために、Dsbタンパク質(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、および/もしくはDsbG)またはFkpA(シャペロン活性を有するペプチジルプロピルシス、トランスイソメラーゼ)などのシャペロンタンパク質を過剰発現するさらなるベクターを用いて、宿主の原核細胞を同時形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、細菌の宿主細胞において生成された異種性のタンパク質の適正なフォールディングおよび可溶性を促進することが実証されている。Chenら、(1999年)、J Bio Chem、274巻、19601〜19605頁;Georgiouら、米国特許第6,083,715号; Georgiouら、米国特許第6,027,888号;BothmannおよびPluckthun、(2000年)、J. Biol. Chem.、275巻、17100〜17105頁;RammおよびPluckthun、(2000年)、J. Biol. Chem.、275巻、17106〜17113頁;Arieら、(2001年)、Mol. Microbial.、39巻、199〜210頁。
【０２２３】
発現された異種性のタンパク質(特に、タンパク質分解に感受性のもの)のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素の欠損したある宿主株を本発明に用いることができる。例えば、宿主細胞株を改変して、プロテアーゼIII、OmpT、DegP、Tsp、プロテアーゼI、プロテアーゼMi、プロテアーゼV、プロテアーゼVI、およびこれらの組合せなどの知られている細菌のプロテアーゼをコードする遺伝子に遺伝子の突然変異(複数可)をもたらしてもよい。いくつかの大腸菌のプロテアーゼ欠損株が入手可能であり、例えば、Jolyら、(1998年)、上述; Georgiouら、米国特許第5,264,365号;Georgiouら、米国特許第5,508,192号;Haraら、Microbial Drug Resistance、2巻、63〜72頁(1996年)に記載されている。
【０２２４】
一実施形態において、タンパク質分解酵素が欠損し、1つまたは複数のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を、発現系において宿主細胞として用いる。
【０２２５】
iii.抗体の精製
当技術分野において知られている標準のタンパク質精製方法を使用することができる。以下の方法は、適切な精製方法の例示である:イムノアフィニティーカラムまたはイオン交換カラム上の分取、エタノール沈降、逆相HPLC、シリカまたはDEAEなどの陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、硫酸アンモニウム沈降、およびセファデックスG-75などを用いたゲルろ過。
【０２２６】
一態様において、固相上に固定化したタンパク質Aを、全長の抗体生成物のイムノアフィニティー精製に用いる。タンパク質Aは、抗体のFc領域にに対して高親和性で結合する黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureas)からの41kDの細胞壁タンパク質である。Lindmarkら、(1983年)、J. Immunol. Meth.、62巻、1〜13頁。それに対してタンパク質Aが固定化される固相は、好ましくはガラスまたはシリカ表面を含むカラムであり、より好ましくは制御された多孔性ガラスカラムまたはケイ酸カラムである。いくつかの適用において、汚染物質の非特異的な付着を防ごうという試みで、カラムはグリセロールなどの試薬でコーティングされている。
【０２２７】
最初の精製ステップとして、対象の抗体をタンパク質Aに対して特異的に結合させるために、上記に記載したような細胞培養物に由来する調製物を、固相に固定化したタンパク質A上に適用する。次いで、固相を洗浄して固相に対して非特異的に結合している汚染物質を除去する。最後に、対象の抗体を、溶出によって固相から回収する。
【０２２８】
b.真核生物の宿主細胞を用いた抗体の産生
ベクターの成分は、一般に、それだけには限定されないが、以下のものを1つまたは複数含む:シグナル配列、複製開始点、1つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列。
【０２２９】
(i)シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞で用いるためのベクターは、対象の成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端に、特異的な切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドも含んでよい。選択された異種性のシグナル配列は、宿主細胞によって認識および処理加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものであるのが好ましい。哺乳動物細胞の発現では、哺乳動物のシグナル配列、およびウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペス(herpes simplex)gDシグナルが入手可能である。
【０２３０】
このような前駆領域のためのDNAを、抗体をコードするDNAのリーディングフレームにライゲートする。
【０２３１】
(ii)複製開始点
一般的に、複製開始点の成分は哺乳動物の発現ベクターには必要とされない。例えば、SV40の開始点は、初期プロモーターを含んでいるという理由だけで、典型的に用いられ得る。
【０２３２】
(iii)選択遺伝子の成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質または他の毒素(例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、もしくはテトラサイクリン)に対する耐性を付与し、(b)関係のある場合には、栄養要求性の欠損を補足し、または(c)複合培地から得ることができない決定的な栄養を供給するタンパク質をコードしている。
【０２３３】
選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を阻む薬物を利用するものである。異種性の遺伝子で上首尾に形質転換された細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生成し、したがって選択のレジメンを生き残る。このような優勢な選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸、およびハイグロマイシンの薬剤を用いる。
【０２３４】
哺乳動物細胞に適する選択可能なマーカーの別の一例は、DHFR、チミジンキナーゼ、メタロチオネインIおよびII、好ましくは霊長動物のメタロチオネインの遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど、抗体の核酸を吸収することができる細胞の同定を可能にするものである。
【０２３５】
例えば、DHFR選択遺伝子で形質転換した細胞を、最初に、DHFRの競合的拮抗薬であるメトトレキセート(Mtx)を含む培地で形質転換体を全部培養することによって同定する。野生型のDHFRを使用する場合の好適な宿主細胞は、DHFR活性の欠損したチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系(例えば、ATCC CRL-9096)である。
【０２３６】
あるいは、抗体、野生型DHFRタンパク質、およびアミノグリコシド3'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)などの別の選択マーカーをコードするDNA配列で形質転換または同時形質転換した宿主細胞(特に、内因性DHFRを含む野生型の宿主)を、アミドグリコシド系抗生物質(例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはG418)などの選択マーカーに対する選択薬剤を含む培地における細胞の成長によって選択することができる。米国特許第4,965,199号を参照されたい。
【０２３７】
(iv)プロモーターの成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、宿主の生物体によって認識され、抗体のポリペプチドの核酸に操作可能に連結しているプロモーターを通常含んでいる。プロモーター配列は、真核生物では知られている。実質的には、真核生物の遺伝子は全て、転写が開始される部位から約25から30塩基上流に位置するATリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から70から80塩基上流に見られる別の一配列は、CNCAAT領域(Nはあらゆるヌクレオチドであってよい)である(配列番号3)。殆どの真核生物の遺伝子の3'末端は、コード配列の3'末端にポリAテイルを付加するためのシグナルであってよいAATAAA配列である(配列番号4)。これらの配列は全て、真核生物の発現ベクター中に適切に挿入される。
【０２３８】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合性であるならば、熱ショックプロモーターからの、異種性の哺乳動物プロモーター(例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター)からの、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス2)、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、およびシミアンウイルス40(SV40)などのウイルスのゲノムから得られたプロモーターによって制御される。
【０２３９】
SV40ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製開始点も含むSV40の制限フラグメントとして好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時型初期プロモーターは、HindIII E制限フラグメントとして好都合に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いて哺乳動物の宿主でDNAを発現させるための系は、米国特許第4,419,446号に開示されている。この系の修飾は米国特許第4,601,987号に記載されている。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列をプロモーターとして用いることができる。
【０２４０】
(v)エンハンサーエレメントの成分
より高等な真核生物による本発明の抗体のポリペプチドをコードするDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大することが多い。今では、多くのエンハンサー配列が、哺乳動物の遺伝子から知られている(グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン、およびインスリン)。しかし、典型的には、真核細胞のウイルスからのエンハンサーが用いられる。例には、複製開始点の遅い側(bp100〜270)上のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の遅い側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物のプロモーターを活性化するためのエンハンシングエレメント(enhancing element)に関して、Yaniv、Nature、297巻、17〜18頁(1982年)も参照されたい。エンハンサーは、抗体のポリペプチドをコードする配列に対してポジション5'または3'でベクター中にスプライシングしてもよいが、プロモーターから5'の部位に位置するのが好ましい。
【０２４１】
(vi)転写終結成分
真核生物の宿主細胞で用いられる発現ベクターは、典型的には、転写を終結させ、mRNAを安定化するのに必要な配列も含んでいる。このような配列は、真核生物またはウイルスのDNAまたはcDNAの非翻訳領域である5'、時には3'から、通常入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするmRNAの非翻訳の部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含んでいる。1つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号、および本明細書に開示する発現ベクターを参照されたい。
【０２４２】
(vii)宿主細胞の選択および形質転換
本明細書におけるベクターにおいてDNAをクローニングおよび発現するのに適する宿主細胞には、脊椎動物の宿主細胞を含む、本明細書に記載する高等な真核細胞が含まれる。培地(組織培地)における脊椎動物細胞の増殖は、ルーチンの方法となっている。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、SV40(COS-7、ATCC CRL1651)によって形質転換したサル腎臓CV1系、ヒト胎児腎臓系(懸濁培養液における成長のためにサブクローニングした293または293細胞、Grahamら、J. Gen Virol.、36巻、59頁(1977年))、仔ハムスター腎細胞(BHK、ATCC CCL 10)、チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO、Urlaubら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、77巻、4216頁(1980年))、マウスセルトリ細胞(TM4、Mather、Biol. Reprod.、23巻、243〜251頁(1980年))、サル腎細胞(CV1、ATCC CCL 70)、アフリカミドリザル腎細胞(VERO-76、ATCC CRL-1587)、ヒト子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL 2)、イヌ腎細胞(MDCK、ATCC CCL 34)、バッファローラット肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442)、ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75)、ヒト肝細胞(Hep G2、HB 8065)、マウス乳腺腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL51)、TRI細胞(Matherら、Annals N.Y. Acad. Sci.、383巻、44〜68頁(1982年))、MRC5細胞、FS4細胞、およびヒト肝細胞癌系(Hep G2)である。
【０２４３】
宿主細胞を、上記に記載した発現ベクターまたはクローニングベクターで抗体生成用に形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または望ましい配列をコードする遺伝子を増幅するのに好適に改変された従来の栄養培地で培養する。
【０２４４】
(viii)宿主細胞の培養
本発明の抗体を生成するために用いられる宿主細胞を、様々な培地で培養することができる。Ham's F10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)、およびダルベッコ変法イーグル培地((DMEM)、(Sigma))などの市販の培地が、宿主細胞の培地に適する。さらに、Hamら、Meth. Enz.、58巻、44頁(1979年)、Barnesら、Anal. Biochem.、102巻、255頁(1980年)、米国特許第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号、または第5,122,469号、国際公開第90/03430号、国際公開第87/00195号、または米国再発行特許第Re. 30,985号に記載されているあらゆる培地を、宿主細胞陽の培地として用いることができる。あらゆるこれらの培地を、必要に応じて、ホルモンおよび/または他の成長因子(例えば、インスリン、トランスフェリン、もしくは上皮成長因子)、塩(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸)、バッファー(例えば、HEPES)、ヌクレオチド(例えば、アデノシンおよびチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCIN(商標)薬物)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物と定義される)、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源を補うことができる。当業者であれば知っている好適な濃度のあらゆる他の必要なサプリメントを含むこともできる。温度、pHなどの培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で予め用いられているものであり、当業者であれば明らかである。
【０２４５】
(ix)抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内に生成され、または培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内に生成される場合は、第1のステップとして、宿主細胞または溶解したフラグメントのいずれかである粒子状のデブリを、例えば遠心分離または限外ろ過によって除去する。抗体が培地中に分泌される場合は、このような発現系からの上清を、一般的には、市販のタンパク質濃縮フィルター(例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外ろ過ユニット)を用いて最初に濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害物質が、タンパク質分解を阻害するためにあらゆる前述のステップに含まれていてよく、抗生物質が、外来性の汚染物質の成長を防ぐために含まれていてよい。
【０２４６】
細胞から調製された抗体組成物を、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。タンパク質Aのアフィニティーリガンドとしての適合性は、抗体に存在するあらゆる免疫グロブリンFcドメインの種およびイソ型に依存する。タンパク質Aは、ヒトγ1、γ2、またはγ4重鎖をもとにする抗体を精製するために用いられ得る(Lindmarkら、J. Immunol. Meth.、62巻、1〜13頁(1983年))。タンパク質Gは、マウスのイソ型全て、およびヒトγ3に対して推薦される(Gussら、EMBO J.、5巻、1567〜1575頁(1986年))。それに対してアフィニティーリガンドが付着しているマトリックスは殆どの場合アガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。制御された多孔性ガラスまたはポリ(スチレンジビニル)ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成できるよりも早い流速および短い処理時間を可能にする。抗体がCH3ドメインを含む場合は、Bakerbond ABX(商標)樹脂(J. T. Baker、Phillipsburg、N.J.)が精製に有用である。イオン交換カラム上の分取、エタノール沈降、逆相HPLC、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンSEPHAROSE(商標)上のクロマトグラフィー、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂(例えば、ポリアスパラギン酸カラム)上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、および硫酸アンモニウム沈降などの、タンパク質を精製するための他の技術も、回収すべき抗体に応じて利用可能である。
【０２４７】
予備的な精製ステップ(複数可)の後は、対象の抗体および汚染物質を含む混合物を、約2.5〜4.5の間のpHの溶出バッファーを用いて、好ましくは低塩濃度(例えば、約0〜0.25Mの塩)で行う低pH疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけてもよい。
【０２４８】
別のタイプの共有性の改変は、本発明のポリペプチドに対して化学的または酵素的にグリコシドをカップリングすることを伴うものである。これらの方法は、NまたはO連結のグリコシル化に対するグリコシル化能力を有する宿主細胞ではポリペプチドの生成を必要としないという点で有利である。用いられるカップリングの様式に応じて、糖(複数可)は、(a)アルギニンおよびヒスチジン、(b)遊離のカルボキシル基、(c)遊離のスルフヒドリル基(例えば、システインのスルフヒドリル基)、(d)遊離のヒドロキシル基(例えば、セリン、スレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基)、(e)芳香族残基(例えば、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンの残基)、または(f)グルタミンのアミド基に付着することができる。これらの方法は、1987年9月11日公開の国際公開第87/05330号、ならびにAplinおよびWriston、CRC Crit. Rev. Biochem.、259〜306頁(1981年)に記載されている。
【０２４９】
本発明のポリペプチド上に存在するあらゆる炭水化物部分の除去は、化学的に、または酵素的に行うことができる。化学的な脱グリコシル化は、トリフルオロメタンスルホン酸化合物、または同等の化合物に対するポリペプチドの曝露を必要とする。この処置により、連結性の糖(N-アセチルグルコサミンまたはN-アセチルガラクトサミン)以外の殆どまたは全ての糖の切断がもたらされ、ポリペプチドはインタクトなままである。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddinら、Arch. Biochem. Biophys.、259巻、52頁(1987年)、およびEdgeら、Anal. Biochem.、118巻、131頁(1981年)によって記載されている。例えば抗体上の、炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakuraら、Meth. Enzymol.、138巻、350頁(1987年)によって記載されている様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリココシダーゼの使用によって達成することができる。
【０２５０】
本発明のポリペプチドの別のタイプの共有性の改変は、米国特許第4,640,835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192号、または第4,179,337号に記載されている様式における、様々な非タンパク質性ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン)の1つに対するポリペプチドの連結を含む。
【０２５１】
薬剤製剤
望ましい純度を有する抗体を、水溶液、凍結乾燥、または他の乾燥製剤の形態の任意選択の生理学的に許容できる担体、賦形剤、または安定化剤と混合することによって、貯蔵用の、抗体を含む治療用製剤を調製する(Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第20版(2000年))。許容できる担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、ヒスチジン、および他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤、保存剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール、メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、およびm-クレゾール)、低分子量(残基約10個未満)のポリペプチド、タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン)、疎水性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン)、アミノ酸(例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン)、単糖類、二糖類、および他の炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン)、キレート化剤(例えば、EDTA)、糖(例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール)、塩形成性の対イオン(例えば、ナトリウム)、金属複合体(例えば、Zn-タンパク質複合体)、ならびに/または非イオン性界面活性剤(例えば、TWEEN(商標)、PLURONICS(商標))、またはポリエチレングリコール(PEG)を含む。
【０２５２】
本明細書における製剤は、処置する特定の徴候に対する必要に応じて1つを超える有効化合物、好ましくは相互に有害な影響を及ぼさない補足的な活性を有するものも含むことができる。このような分子は、意図する目的に有効である量の組合せで存在するのが適切である。
【０２５３】
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面の重合によって調製されたマイクロカプセルにおいて、コロイド薬物の送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)において、またはマクロエマルジョンの、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセルに、およびポリ-(メチルメタクリレート(methylmethacylate)のマイクロカプセルに封入してもよい。このような技術は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第20版(2000年)に公開されている。
【０２５４】
in vivoの投与に用いる製剤は無菌でなければならない。これは無菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成される。
【０２５５】
持続放出性製剤を調製してもよい。持続放出性製剤の適切な例には、免疫グロブリンを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形された物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタメートの共重合体、非分解性のエチレン-酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸共重合体(例えば、LUPRON DEPOT(商標)(乳酸-グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア))、ならびにポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸などのポリマーは100日を超える分子の放出を可能にする一方で、ある種のヒドロゲルはより短い期間タンパク質を放出する。カプセル化された免疫グロブリンは体内に長時間留まる場合、これらは37℃の水分に曝された結果、変性または凝集することがあり、生物学的活性の喪失および免疫原性の可能な変化がもたらされる。関与する機序に応じて安定化するために、合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集の機序がチオ-ジスルフィド交換による分子内S-S結合の形成であることが見出された場合、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量の制御、好適な添加物の使用、および特定のポリマーのマトリックス組成物の開発によって安定化を達成してもよい。
【０２５６】
本発明において有用な薬剤を、遺伝子治療によって対象に導入することができることがさらに企図される。遺伝子治療は、核酸を対象に投与することによって行われる治療を意味する。遺伝子治療の適用において、例えば、欠陥のある遺伝子を置き換えるために、治療上有効な遺伝子生成物のin vivoの合成を達成するために、遺伝子を細胞内に導入する。「遺伝子治療」は、単一の処置によって継続する効果を達成する従来の遺伝子治療、および治療上有効なDNAまたはmRNAを1回または繰返し投与することを伴う遺伝子治療薬の投与の両方を含む。in vivoである種の遺伝子の発現を阻止するための治療用薬剤として、アンチセンスのRNAおよびDNAを用いてもよい。例えば、実施例に記載されているDLL4-SiRNAを参照されたい。細胞膜による制限された取り込みによって引き起こされる低い細胞内濃度に関わらず、短いアンチセンスのオリゴヌクレオチドを、それらが阻害物質として働く細胞内に移入することができることはすでに示されている。(Zamecnikら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、83巻、4143〜4146頁(1986年))。オリゴヌクレオチドを、例えば、負に荷電したホスホジエステル基を非荷電の基によって置換することによって、その取り込みを増強するように改変することができる。遺伝子治療の方法の一般的な総説は、例えば、Goldspielら、Clinical Pharmacy、12巻、488〜505頁(1993年);WuおよびWu、Biotherapy、3巻、87〜95頁(1991年);Tolstoshev、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.、32巻、573〜596頁(1993年);Mulligan、Science、260巻、926〜932頁(1993年); MorganおよびAnderson、Ann. Rev. Biochem.、62巻、191〜217頁(1993年);ならびにMay、TIBTECH、11巻、155〜215頁(1993年)を参照されたい。組換えDNA技術の技術分野で一般に知られている、用いることができる方法は、Ausubelら編集、(1993年)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NY;およびKriegler、(1990年)、Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual、Stockton Press、NYに記載されている。
【０２５７】
投与量および投与
分子を、ボーラスまたはある期間にわたる持続的な注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、または吸入の経路、および/または皮下投与によってなど、知られている方法に従ってヒト患者に投与する。
【０２５８】
ある実施形態において、本発明の処置は、DLL4拮抗薬、および1つまたは複数の抗癌薬、例えば、抗血管新生薬の併用投与を伴う。一実施形態において、例えば、1つまたは複数の異なる抗血管新生薬、1つまたは複数の化学療法薬など、さらなる抗癌薬が存在する。本発明は、複数の阻害薬、例えば、同じ抗原に対する複数の抗体、または様々な癌活性分子に対する複数の抗体の投与も企図するものである。一実施形態において、DLL4拮抗薬および/または1つもしくは複数の抗血管新生薬と、異なる化学療法薬のカクテルを投与する。併用投与には、別々の製剤もしくは単一の薬剤製剤を用いる同時投与、および/またはいずれかの順序における連続投与が含まれる。例えば、DLL4拮抗薬が、抗癌薬の投与に先行し、その後に続き、それと交互になってよく、またはそれと同時に投与してもよい。一実施形態において、両方(または全部の)有効薬剤が同時にその生物学的活性を発揮する間にある期間が存在する。
【０２５９】
疾患を防止または処置するためのDLL4拮抗薬の好適な投与量は、上記で定義した通りの処置すべき疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、阻害薬を防止目的で投与するか、または治療目的で投与するか、以前の治療、患者の病歴および阻害薬に対する反応、ならびに主治医の判断に依存する。阻害薬は、一度に、または一連の処置にわたって患者に適切に投与される。併用治療のレジメンにおいて、本発明の組成物を、治療上有効な量または治療上相乗的な量投与する。本明細書で用いられる、治療上有効な量は、本発明の組成物の投与、および/またはDLL4拮抗薬と1つもしくは複数の他の治療用薬剤の同時投与が、標的の疾患または状態の低減または阻害をもたらすものである。薬剤の組合せの投与の効果は相加的であってよい。一実施形態において、投与の結果は相乗効果である。治療上相乗的な量は、特定の疾患に付随する状態または症状を、相乗的に、または著しく低減または除去するのに必要な、DLL4拮抗薬および1つまたは複数の他の治療用薬剤、例えば、血管新生阻害薬の量である。
【０２６０】
疾患のタイプおよび重症度に応じて、例えば、1つまたは複数の別々の投与によっても、または持続的な注入によっても、DLL4拮抗薬または血管新生阻害薬約1μg/kgから50mg/kg(例えば、0.1〜20mg/kg)が、患者に投与するための最初の候補の投与量である。典型的な1日投与量は、上記で言及した因子に応じて、約1μg/kgから約100mg/kgまで、またはそれを超える範囲であってよい。数日にわたる、またはそれを超える繰返し投与には、状態に応じて、疾患の症状の望ましい抑制が生じるまで処置を持続する。しかし、他の投与量レジメンも有用であり得る。典型的には、臨床医は、望ましい生物学的効果をもたらす投与量(複数可)に到達するまで分子(複数可)を投与する。本発明の治療の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０２６１】
例えば、血管新生阻害薬、例えば、AVASTIN(登録商標)(Genentech)などの抗VEGF抗体に対する調製物および投与スケジュールを製造元の指示に従って用いてもよく、または熟達した技術者が経験的に決定してもよい。別の一例において、このような化学療法薬に対する調製物および投与スケジュールを、製造元の指示に従って、または熟達した技術者が経験的に決定した通りに用いてもよい。化学療法に対する調製物および投与スケジュールは、Chemotherapy Service編集、M. C. Perry、WilliamsおよびWilkins、Baltimore、Md(1992年)にも記載されている。
【０２６２】
処置の有効性
本発明の処置の有効性を、新生物性または非新生物性の障害を評価するのに一般に用いられている様々なエンドポイントによって測定することができる。例えば、癌の処置は、例えば、それだけには限定されないが、腫瘍の退行、腫瘍の重量またはサイズの縮小、進行までの時間、生存の期間、無進行生存、全体的な反応率、反応の期間、および生活の質によって評価され得る。本明細書に記載する抗血管新生薬は、腫瘍の脈管構造を標的としており、必ずしも新生物細胞自体を標的としていないので、これらは独特なクラスの抗癌薬を代表しており、したがって薬物に対する臨床反応の独特な尺度および定義を必要とすることがある。例えば、2次元分析における50%を超える腫瘍の縮小は、反応を宣言するための標準のカットオフである。しかし、阻害薬は、原発腫瘍を縮小せずに転移拡散の阻害を引き起こすこともあり、または腫瘍増殖抑制効果を発揮するだけのこともある。したがって、例えば、血管新生の血漿マーカーまたは尿マーカーの測定、および放射線画像による反応の測定を含めた、治療の効果を決定するための取り組みを使用することができる。
【０２６３】
以下の実施例は、例示の目的のみに提供するものであり、決して本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０２６４】
本明細書に引用する全ての特許および文献の参照の公表は、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０２６５】
実施例において言及する市販の試薬は、別段の指摘がなければ製造元の指示に従って用いた。ATCC受諾番号によって、以下の実施例において、および本明細書にわたって同定した細胞の供給源は、アメリカ培養細胞系統保存機関、Manassas、Va.20108である。実施例において引用した参考文献を実施例の後に列挙する。本明細書に引用した参考文献は全て、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０２６６】
(実施例1)
DLL4阻止抗体の同定
Notch阻止ELISA。96ウェルのマイクロタイタープレートを、0.5μg/mlの組換えラットNotch1-Fc(rrNotch1-Fc、R&D Systems)でコーティングした。アッセイではDLL4-AP(ヒト胎盤アルカリホスファターゼに融合したDLL4のアミノ酸1〜404)を含む条件培地を用いた。条件培地を調製するために、293細胞に、Fugene6試薬(Roche Molecular Biochemics)でDLL4-APを発現するプラスミドを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクト5日後、条件培地を収集し、ろ過し、4℃で貯蔵した。力価0.15μg/mlから25μg/mlまでの精製した抗体を、コーティングしたrrNotch1-Fcに対して最大に達成可能な結合の50%を付与する希釈したDLL4-AP条件培地と、室温で1時間プレインキュベートした。次いで、抗体/DLL4-AP混合物を、rrNotch1-Fcでコーティングしたプレートに室温で1時間加え、その後プレートをPBSで数回洗浄した。結合したDLL4-APを、基質として1-Step PNPP(Pierce)およびOD405nmの吸光度の測定を用いて検出した。DLL1-AP(ヒトDLL1、アミノ酸1〜455)で同一のアッセイを行った。精製したDLL4-His(C末端をHisタグ付けしたヒトDLL4、アミノ酸1〜404)およびJag1-His(R&D systems)で同様のアッセイを行った。結合したHisタグ付けしたリガンドを、マウス抗-His mAb(1μg/ml、Roche Molecular Biochemicals)、ビオチン化したヤギ抗マウス(Jackson ImmunoResearch)、およびストレプトアビジン-AP(Jackson ImmunoResearch)で検出した。
【０２６７】
(実施例2)
DLL4の細胞表面発現およびインターナリゼーションの可視化および定量
タグ付けした(例えば、HisもしくはMycでタグ付けした)、またはタグ付けしていない、全長またはフラグメントのDLL4を、細胞(例えば、COS7細胞)中にトランスフェクトした。DLL4の局在化を、タグ付けした、または通常のDLL4タンパク質を認識する蛍光抗体を用いて可視化した。ある種の細胞下の位置に位置した膜もしくは核の染色、または標識したタンパク質(例えば、増強した緑色蛍光タンパク質に対する、例えばRab9-もしくはRhoB-の融合)の同時トランスフェクトを用いて、DLL4タンパク質の相対的な分布を決定した。蛍光タンパク質を、共焦点顕微鏡を用いて検出した。
【０２６８】
DLL4結合抗体のDLL4のインターナリゼーションに対する効果を、細胞の培地に特異的な抗体を加え、その後DLL4タンパク質の細胞の分布を分析することによって評価した。
【０２６９】
リガンド-受容体相互作用/活性化によってDLL4のインターナリゼーションを増強するために、DLL4を発現する細胞を、Notch受容体(複数可)を内因性に発現する細胞、またはNotch受容体をトランスフェクトした細胞と、また同時培養した。あるいは、DLL4のインターナリゼーションを増強するために、DLL4を発現する細胞を、Notchタンパク質でコーティングしたプレート上で培養した。
【０２７０】
(実施例3)
DLL4タンパク質の細胞膜対全量の定量
タグ付けした(例えば、HisもしくはMycでタグ付けした)、またはタグ付けしていない、全長またはフラグメントのDLL4を、細胞(例えば、COS7細胞)中にトランスフェクトし、これをビオチン化してから収集した。DLL4タンパク質を、抗タグ抗体、またはDLL4に対する抗体を用いて溶解物全体から免疫沈降し、ビオチン化したDLL4を検出するためにストレプトアビジン-HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)を用いてブロットした。DLL4の全量を、抗タグ抗体を再検出することによって検出した。DLL4の細胞表面と全量の間の相対的分布の変化を、DLL4結合抗体の存在下および非存在下で決定した。
【０２７１】
リガンド-受容体相互作用/活性化によってDLL4のインターナリゼーションを増強するために、DLL4を発現する細胞を、Notch受容体(複数可)を内因性に発現する細胞、またはNotch受容体をトランスフェクトした細胞と、また、一緒に培養した。あるいは、DLL4を発現する細胞を、Notchタンパク質でコーティングしたプレート上で培養した。
【０２７２】
(実施例4)
DLL4結合抗体のインターナリゼーション
DLL4を内因性に発現する生存細胞(例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞、もしくはヒト微小血管内皮細胞、もしくはヒト大動脈内皮細胞)、またはDLL4をトランスフェクトした細胞(例えば、COS7細胞)を、DLL4結合抗体とインキュベートした。これらの抗体の細胞の局在を、DLL4結合抗体を検出する2次標識した抗体を用いて引き続き可視化した。
【０２７３】
(実施例5)
DLL4のインターナリゼーションのin vivo分析
DLL4結合抗体を、網膜の血管新生が依然として進行中である(好ましくは生後4日および5日)仔マウスに与えた。DLL4結合抗体を投与し3〜24時間後、仔マウスを屠殺し、眼球除去し、4%パラホルムアルデヒドで10〜60分間固定した。網膜を、実体顕微鏡下で切開することによって単離した。網膜を、室温または4℃で1時間から一夜、PBS(リン酸緩衝食塩水)中1%BSA(ウシ血清アルブミン)および0.5%TritonX100(Sigma)を用いて阻止および透過処理した。DLL4タンパク質を、4℃で一夜、0.5%BSAおよび0.25%TritonX100を有するPBSで1:100に希釈した、R&D systemsからの抗DLL4ポリクローナルヤギ血清(AF1389)のインキュベートによって可視化した。網膜を、PBSで5分間、3回洗浄した。ウサギ抗ヤギ2次抗体Alexa555(Invitrogen)を用いて、1次抗体を検出した。DLL4結合した抗体およびコントロールの抗体で処置した仔マウスからの内皮細胞の表面対インターナリゼーションしたDLL4の染色の度合いを、共焦点顕微鏡によって捕えた画像を用いて決定した。
【０２７４】
DLL4陽性細胞のいくつかはDll4染色の細胞内蓄積を表し、Notch活性化において以前に関与していたことを示唆していた(図1)。殆ど全ての先端細胞(分析した50個中48個)が、Dll4染色の細胞内蓄積を示した。興味深いことに、先端細胞と直ちに接触した柄細胞の多く(33/58)もDLL4染色の細胞内蓄積を示し、出芽前面における先端細胞と柄細胞の間の、能動的な双方向のDll4シグナリングを示していた。Dll4蓄積は、DLL4/Notchシグナリングの知られている部位である細動脈に同様に観察されたが、成長する前面の後ろの神経叢または細動脈に隣接する神経叢における内皮細胞は、DLL4の細胞内蓄積を示さず、または少々示した。
【０２７５】
(実施例6)
マウス腫瘍モデル
T241繊維肉腫、B16メラノーマ、およびルイス肺癌細胞を、10%FCS(ウシ胎児血清)(Invitrogen)および標準のサプリメントを有するDMEM(Invitrogen)において増殖させた。腫瘍実験用に、腫瘍細胞0.5〜1×106個をPBS100μLに懸濁し、C57B16マウスの背面上に皮内または皮下注射した。腫瘍の長さおよび幅を測定することによって腫瘍の成長を追跡し、10〜20日後、腫瘍の直径は5mmから10mmであり、マウスを屠殺し、腫瘍を取り出し、重量を量り、写真撮影し、組織学的および免疫組織化学的分析用に処理加工した。DLL4結合抗体の効果を、コントロールの抗体と比較した。
【０２７６】
(実施例7)
in vitroの出芽性血管新生アッセイ
3次元コラーゲン(BD)マトリックスにおけるVEGF-A(25ng/ml、R&D Systems)が駆動するヒト臍帯静脈内皮細胞(Promocell)の出芽を、本質的に(Korff TおよびAugustin HG.、1999年、J Cell Sci.、10月、112巻(Pt19)、3249〜58頁)に記載されているようにDLL4結合抗体の存在下または非存在下で定量した。10個の内皮の集団からの最も長い出芽5個を各ウェルから測定し、DLL4結合抗体の効果をVEGF-Aの効果と比較した。
【０２７７】
実施例において用いた方法
細胞培養、トランスフェクト、免疫沈降、およびウェスタンブロット分析
COS7細胞に、Fugene6(Roche)またはGene Porter2(Gene Therapy Systems)のいずれかを用いて、6cmディッシュ1枚あたりプラスミドDNA2〜4μgを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトに用いたプラスミドDNAの全量を、好適な量のCD2+ベクタープラスミドを加えることによって一定に保った。トランスフェクト2日後、細胞を収集し、プロテアーゼ阻害薬カクテル(Sigma)を含むTENTバッファー(50mMTris-HCI[pH8.0]、2mMEDTA、150mMNaCl、1%TritonX-100)で溶解した。溶解物を遠心分離によって清澄にし、4℃で2時間抗体とインキュベートし、次いで4℃で1時間タンパク質AまたはGセファロースとインキュベートした。セファロースビーズをTENTバッファーで7回洗浄した。ビーズをSDSゲルローディングバッファーで煮沸し、溶出したタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ポリ二フッ化ビニリデン膜(Invitrogen)に移した。ブロットを、2時間、1次抗体(全て1:5000希釈の、抗FLAG M2、抗Myc 9E10、および抗HA 12C5)とインキュベートした。2次抗体(両方とも1:10000希釈の、抗マウスまたは抗ラットの免疫グロブリン-西洋ワサビペルオキシダーゼ)を用いて、化学発光検出システム(Pierce)でシグナルを可視化した。
【０２７８】
免疫細胞化学
トランスフェクトしたCOS7細胞を、トランスフェクト24時間後、MeOH中-20℃で5分間固定し、空気乾燥した。次いで、固定した細胞を阻止溶液(PBS中10%正常ヤギ血清)で1時間インキュベートし、その後、室温で1時間、阻止溶液中好適な1次抗体(全て1:1000希釈の、ウサギ抗Myc(A14)またはFLAGポリクローナル、ビオチン化ラット抗HA)で染色した。引き続き、カバーガラス上の細胞をPBSで3回洗浄し、Alexa488もしくは594とコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ抗体と、またはAlexa 594もしくは350とコンジュゲートしたストレプトアビジンと、室温の暗所で1時間インキュベートした。カバーガラスを3回洗浄し、スライドガラス上に搭載し、Zeiss Axiophot蛍光顕微鏡上で分析した。Hamamatsu Orcaカメラ上に画像を集め、OpenlabおよびPhotoshopソフトウェアを用いて処理加工した。
【０２７９】
DLL4抗体のインターナリゼーション
トランスフェクト24時間後、DLL4結合抗体(10μg/ml)およびロイペプチン(10μg/ml)を加え、細胞を9時間さらにインキュベートした。固定および透過処理後、DLL4結合抗体を、ヤギ抗マウスAlexa594 2次抗体を用いて検出した。
【０２８０】
表面ビオチン化アッセイ
トランスフェクトしたCOS7細胞を、氷冷したPBSバッファーで3回洗浄した。次いで、細胞を、4℃で30分間、ビオチン化バッファー(PBS中0.25mg/mlEZ-連結スルホ-NHS-LC-ビオチン[Pierce])でインキュベートした。ビオチン化バッファーを除去した後、細胞を4℃で20分間クエンチングバッファー(PBS中100mMグリシン)でインキュベートし、氷冷したPBSで1回洗浄し、1mlのTENTで溶解した。溶解物を抗HAコンジュゲートしたビーズ(Roche)で1時間インキュベートし、次いでビーズを1mlのTENTで5回洗浄し、煮沸によってSDSサンプルバッファーで抽出した。表面がビオチン化した分画を、ウェスタンブロットにウェスタンブロットペルオキシダーゼコンジュゲートしたストレプトアビジン(Vector Laboratory)を用いて可視化した。
【０２８１】
先に記載した明細書は、当業者が本発明を実践するのを可能にするのに十分であるとみなされる。しかし、本明細書に示し記載したものの他に、当業者には本発明の様々な改変が先の記載から明らかであり、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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