(57)【要約】本発明は、例えば、室温で、リンタンパク質を含む試料と接触する際、細胞リンタンパク質を固定および安定化し、細胞形態を保存し、試料を凍結して分子解析に適切なクリオスタット凍結切片の生成を可能にし得る組成物に関する。本組成物は、（１）リンタンパク質の固定に有効であり、安定剤および／または透過性増強剤が可溶となるのに十分な含水量を有する固定剤と、（２）（ａ）キナーゼ阻害剤および（ｂ）ホスファターゼ阻害剤、ならびに任意で（ｃ）プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼ）阻害剤を含む安定剤と、（３）透過性増強剤（例えば、ＰＥＧ）と、を含む。そのような組成物を使用して、リンタンパク質を保存するための方法について説明する。翻訳後修飾（リン酸化等）の損失、例えば、それに続く対象からの細胞または組織の採取を含む、タンパク質分解を監視するための内因性代理マーカー、および細胞または組織の集団試料の処理履歴の評価を可能にする外因性分子センチネル（例えば、磁気ナノ粒子に付着したリンタンパク質）についても説明する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
室温で、リンタンパク質を含む試料と接触する際、リンタンパク質を固定および安定化し、細胞形態を保存し、前記試料を凍結して分子解析に適切なクリオスタット凍結切片の生成を可能にし得る組成物であって、
ａ．リンタンパク質の固定に有効であり、安定剤および／または透過性増強剤を可溶するのに十分な含水量を有する固定剤と、
ｂ．（ｉ）キナーゼ阻害剤および（ｉｉ）ホスファターゼ阻害剤、ならびに任意で（ｉｉｉ）プロテアーゼ阻害剤を含む安定剤と、
ｃ．透過性増強剤と、を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記固定剤は、約１０％から約４０％のエタノール、約１０％から４０％のメタノール、約１０％から４０％のベンジルアルコール、または約５％から１５％のアセトンを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記固定剤は、エタノールを約２０％未満の濃度で、またはメタノールを約２０％未満の濃度で含むことを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記固定剤中の前記エタノールの濃度が約１２％であるか、または前記メタノールの濃度が約１２％であることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記固定剤は、バイオセラミック、クエン酸ポリジオール、キトサン、またはヒドロキシアパタイトから成る粒子状物質、キレート化剤、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、クロロホルム／メタノール、または硫酸アンモニウムを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記キナーゼ阻害剤および／または前記ホスファターゼ阻害剤は、酵素の活性を直接阻害し、前記キナーゼ阻害剤は、キナーゼ基質ＡＴＰを干渉し、および／または前記ホスファターゼ阻害剤は、リンタンパク質上のリン酸基と相互作用するか、または前記ホスファターゼの偽基質として作用することを特徴とする、請求項１乃至５のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記キナーゼ阻害剤は、スタウロスポリンまたはゲニステインであり、
前記ホスファターゼ阻害剤は、オルトバナジン酸ナトリウムまたはβグリセロリン酸であり、
前記任意のプロテアーゼ阻害剤は、アルカリ性、酸性、中性、セリン、システイン、アスパラギン、または金属プロテイナーゼの阻害剤であることを特徴とする、請求項１乃至６のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ホスファターゼ阻害剤は、濃度が約１００ｍＭから約４００ｍＭの間のオルトバナジン酸ナトリウム、または濃度が約３７５ｍＭから約１．５Ｍの間のβグリセロリン酸であり、
前記キナーゼ阻害剤は、濃度が約５．０μＭから２０．０μＭの間のスタウロスポリン、または濃度が約０．５μＭから２．０μＭの間のゲニステインであることを特徴とする、請求項１乃至６のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記透過性増強剤は、ポリマー、タンパク質、ナノ粒子、または脂質であることを特徴とする、請求項１乃至８のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記透過性増強剤は、約０．５％から約１５％ＰＥＧであることを特徴とする、請求項１乃至８のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
膜受容体阻害剤、膜安定剤、細胞形態保存剤、架橋結合剤、および／またはアデノシン三リン酸加水分解酵素阻害剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１乃至１０のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記安定剤は、前記透過性増強剤に付着することを特徴とする、請求項１乃至１１のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記安定剤および前記透過性増強剤は、ナノ粒子に付着することを特徴とする、請求項１乃至１１のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のうちのいずれか一項に記載の組成物の成分を１つ以上の容器に含む、細胞リンタンパク質を室温で固定および安定化するためのキット。
【請求項１５】
前記成分は、液体形態、乾燥形態、または両方であることを特徴とする、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記組成物の不安定な成分は乾燥形態であり、残りの成分は液体形態であることを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記乾燥型成分は、表面上に被覆を形成し、前記組成物の残りの成分を含む液体との接触によって再構成され得ることを特徴とする、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
細胞、組織、体液、または細胞産物を含む試料において、室温でリンタンパク質を保存するための方法であって、前記試料におけるリンタンパク質の保存に有効な条件下、前記試料を室温で請求項１乃至１３のうちのいずれか一項に記載の組成物と接触させるステップを含む、方法。
【請求項１９】
前記細胞は分散した細胞集団に由来し、
前記体液は、全血、硝子体液、または全血あるいは硝子体液の分画であり、および／または
前記細胞からの産物は、血液または硝子体液から流出、排出、分泌、または別途採取されたタンパク質であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料は組織を含み、前記保存試料を凍結するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記凍結保存試料を切断するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料のパラフィン埋め込みは行われないことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料中の少なくとも１つのリンタンパク質のリン酸化状態を解析するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１８乃至２０のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料は、全血、硝子体液、または全血あるいは硝子体液の分画であり、前記試料中の前記保存リンタンパク質は、ＦＡＣＳ解析または磁気捕捉によってさらに解析されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記リンタンパク質を、保存する前に、外部エネルギー源で処理することによって変性させるステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１８乃至２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記外部エネルギー源は、超音波、赤外線、マイクロ波、電気、電磁、ＲＦ（高周波）、圧力、熱、または化学エネルギーであることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞、組織、体液、または細胞産物を含む試料中のリンタンパク質の保存状態を判断するための方法であって、表１に列挙した１つ以上の前記内因性代理マーカーのリン酸化状態を測定するステップを含む、方法。
【請求項２８】
リン酸化が測定される前記内因性代理マーカーは、ＳＴＡＴ−３、ＣＣ−３（開裂カスパーゼ−３）およびＡＳＫ−１であることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
５つ以上の前記内因性代理マーカーのリン酸化状態が測定されることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
１０以上の前記内因性代理マーカーのリン酸化状態が測定されることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
表２−１〜表２−３に列挙した１つ以上の前記内因性タンパク質、または炎症マーカーのリン酸化状態も測定されることをさらに特徴とする、請求項２７乃至３０のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
測定される前記内因性代理マーカーは、その保存状態が細胞集団におけるリンタンパク質の保存状態と相関する、非リン酸化タンパク質分子をさらに含むことを特徴とする、請求項２７乃至３１のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料は、対象から採取されたが、まだ安定化手順に供されていないことを特徴とする、請求項２９乃至３２のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料は、前記安定化手順前の４時間未満内に前記対象から採取されたことを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料における前記内因性代理マーカーの保存状態に基づいて、分子診断解析を進めるかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項２９乃至３３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
極めて不安定な内因性代理マーカーである、ＳＴＡＴ−３、ＣＣ−３（開裂カスパーゼ−３）およびＡＳＫ−１に特異的な一連の抗体。
【請求項３７】
表１の５つ以上の前記極めて不安定な内因性代理マーカーに特異的な一連の抗体。
【請求項３８】
表１の１０以上の前記極めて不安定な内因性代理マーカーに特異的な一連の抗体。
【請求項３９】
細胞、組織、体液、または細胞産物を含む試料における、リンタンパク質の保存状態を、２つの異なる時点で判断するための方法であって、第１の時点において、１つ以上の代理リンタンパク質マーカーを含むセンチネルを前記試料と接触させるステップと、第２の時点において、前記センチネルを採取するステップと、前記２つの時点において、前記センチネルの前記代理リンタンパク質のリン酸化状態を測定および比較するステップと、を含むことを特徴とする、方法。
【請求項４０】
前記第１の時点は、前記試料を対象から採取する時点であり、前記第２の時点は、前記試料のプロテオーム解析を開始する時点であることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
対象からの前記試料の採取と解析手順の開始との間の時間量を判断することを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記１つ以上の代理リンタンパク質マーカーは、表１に列挙した前記極めて不安定なリンタンパク質マーカーから選択されることを特徴とする、請求項３９乃至４１のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記１つ以上の代理リンタンパク質マーカーは、ＳＴＡＴ−３、ＣＣ−３（開裂カスパーゼ−３）およびＡＳＫ−１であることを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
５つ以上の代理リンタンパク質マーカーが、表１に列挙した前記極めて不安定なリンタンパク質マーカーから選択されることを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
１０以上の代理リンタンパク質マーカーが、表１に列挙した前記極めて不安定なリンタンパク質マーカーから選択されることを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記１つ以上の代理リンタンパク質マーカーが、表２−１〜表２−３に列挙した前記内因性タンパク質、または炎症マーカーから選択されることをも特徴とする、請求項３９乃至４５のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記内因性代理マーカーは、その保存状態が前記細胞集団におけるリンタンパク質の保存状態と相関する、非リン酸化タンパク質分子を含むことをさらに特徴とする、請求項３９乃至４６のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記粒子体は、磁気ナノ粒子であることを特徴とする、請求項３９乃至４７のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記１つ以上の代理リンタンパク質マーカーは、リンカーを介して前記粒子体と関連することを特徴とする、請求項３９乃至４８のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記センチネルを前記試料中の細胞および／または組織に導入するステップを含むことを特徴とする、請求項３９乃至４９のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記センチネルは、透過剤の存在下で、前記細胞および／または組織に導入されることを特徴とする、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
１つ以上の代理リンタンパク質マーカーと関連する粒子体であるセンチネル。
【請求項５３】
前記粒子体が、表１に列挙した１つ以上の前記代理リンタンパク質マーカーと関連することを特徴とする、請求項５２に記載のセンチネル。
【請求項５４】
細胞、組織、体液、または細胞産物を含む試料における関心対象の１つ以上のリンタンパク質の保存状態を判断するためのキットであって、請求項５２または５３に記載の１つ以上のセンチネルを１つ以上の容器に含み、任意で、前記センチネルに関連する前記代理リンタンパク質マーカーのリン酸化状態を測定するための試薬を含むことを特徴とする、キット。
【請求項５５】
試料中の関心対象のリンタンパク質のリン酸化状態が、関心対象の前記リンタンパク質の分子特性化を行うために適切であるかどうかを判断するための方法であって、前記試料は、細胞、組織、体液、または細胞産物を含み、かつ対象から採取されており、前記方法は、
第１の時点において、前記試料が前記対象から採取されると同時に、前記試料を室温で、代理リンタンパク質マーカーを含む請求項５２または５３に記載のセンチネル、および請求項１乃至１３のうちのいずれか一項に記載の保存剤と接触させ、それにより、前記試料中の関心対象の前記リンタンパク質を固定および安定化するステップと、
第２の時点において、前記試料中のリンタンパク質の分子特性化が行われ、前記センチネルを前記試料から抽出するステップと、
その後、前記センチネルに関連する前記代理リンタンパク質マーカーの保存状態を測定し、それにより、前記代理リンタンパク質マーカーの保存状態が、前記試料中の関心対象の前記リンタンパク質の保存状態がその分子の特性化に適切であることを示すかどうかを判断するステップと、を含むことを特徴とする、方法。
【請求項５６】
細胞または組織標本を収集および保存するための装置であって、請求項１乃至１３のうちのいずれか一項に記載の保存剤を含有する第２の室に接続される、特定量の試料を切除または調達する第１の室を含み、単一の操作で、前記試料が調達され、前記室内の前記保存剤に浸漬されるようにすることを特徴とする、装置。
【請求項５７】
前記第２の室が取り外し可能であり、組織の切断または分子処理に直接使用できることを特徴とする、請求項５６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年１０月３０日出願の米国暫定特許出願第６０／８５５，１２０号、２００６年１１月２７日出願の米国暫定特許出願第６０／８６１，０８６号の出願日の利益を主張し、いずれも参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
リンタンパク質分子プロファイリングは、新興分野である個別化癌治療の重要な構成要素である。分子標的抗癌治療法は、キナーゼシグナル伝達ネットワーク不全の緩和または調節を伴う場合が多い。腫瘍内の乱れたシグナル伝達ネットワークの解明は、分子標的癌治療を個別化し、治療的介入のための全く新しい標的を特定するための手段として、極めて有望である。遺伝子マイクロアレイ（核酸分析）を使用する分子署名／転写研究から得られた証拠は、各患者の腫瘍が固有の遺伝背景を有し得ることを示唆する。しかし、遺伝子マイクロアレイは、身体遺伝的分類に関する重要な情報を提供できるが、転写後に出現し、プロテオームレベルで生じるシグナル伝達分子ネットワーク事象を変動させる、薬物標的自身の有効な反復発生をもたらすことはできない。キナーゼ駆動シグナルネットワークのリン酸化または活性化状態は、疾患の病因およびキナーゼ関連治療標的の進行状態の両方に関する重要な情報を含む。進行細胞キナーゼ活性の調節が、新薬の発見において最も急速に成長している分野の１つであるのはこのためである。特定のリンタンパク質シグナル伝達異常の同定は、例えば、肺癌、乳癌、大腸癌、または他の癌の患者に対する標的治療の開発に使用することができる。ヒト腫瘍生検標本を使用した腫瘍リン酸化プロテオームのプロファイリングは、認知された個別化癌治療の来たる変革の重要な構成要素である。
【０００３】
プロテオーム分子プロファイリングが、腫瘍学の実践を変えるように極めて有望である一方で、組織に適用した診断アッセイから得られたデータの忠実度を監視、保証しなければならず、さもなければ、臨床判断は誤った分子データに基づく可能性がある。今日まで、臨床保存の実践は、日常的に、ホルマリン固定等の数十年前の、組織学的試験用の標本を保存するために設計されたプロトコルに依存している。組織は一般に、３つの主要な設定、すなわち、ａ）病院ベースの手術室での手術、ｂ）外来クリニックで行われる生検、およびｃ）Ｘ線室で行われる画像に従う針生検または針吸引において、病理学的試験のために調達される。現在、プロテオーム研究を行うために、一般に組織をスナップ凍結する。現実世界の多忙な臨床設定において、調達した組織を即時に液体窒素で保存することは不可能な場合がある。さらに、患者切除から病理学的試験および分子解析までの時間遅延は記録されない場合が多く、時刻、手順の長さ、および同時症例数によって、３０分から数時間まで異なり得る。
【０００４】
図１は、組織調達（例えば、ヒト組織から）のための安定性の間隔を定義する可変時間の２つのカテゴリーを示す。時点Ａは、組織が患者から切除され、解析および処理のために体外で利用可能になる時点として定義される。切除後の遅延時間（ＥＤＴ）は、時点Ａから、標本が安定化状態に置かれる、例えば、固定剤に浸漬される、あるいは液体窒素でスナップ凍結されるまでの時間であり、その時点を、本明細書では時点Ｂと称する。患者の治療環境の複雑性を考えると、ＥＤＴ中に、組織は室温で手術室内、または病理学者の裁断板上に置かれるか、または標本容器に入れて冷蔵される可能性がある。第２の可変時間は、処理遅延時間（ＰＤＴ）である。この間隔の初めに、組織は保存剤に浸漬させるか、または凍結装置に保管される。この間隔の終わりの、時点Ｃにおいて、組織は分子解析のための処理に供される。これら２つの時間間隔の長さに関する不確実性に加えて、多くの公知および未知の変数が、これらの期間中に組織分子の安定性に影響し得る。変数には、１）固定または凍結前の温度変動、２）保存剤の化学的性質および組織浸透率、３）組織標本のサイズ、４）組織の取り扱い、切断、および粉砕の程度、５）顕微解剖前の固定および染色、６）組織の水和および脱水、および７）任意の時点における環境からのホスファターゼまたはプロテイナーゼの導入が含まれる。
【０００５】
リンタンパク質等の転写後修飾タンパク質含むタンパク質を収集および保存（固定および安定化）する方法（例えば、身体抽出から約４時間以内）、およびＥＤＴおよびＰＤＴ期間中、タンパク質の状態（例えば、リン酸化状態）を監視する方法が必要とされる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ヒト組織調達のための安定性間隔を定義する可変期間を示す図である。
【図２】調達から保存前までの組織のタンパク質安定性の経時変化を示す図である。本図は、ベースラインと比較した、リンタンパク質の経時的な変化または変動を示す。ベースラインは、切除時に凍結された組織中の同一リンタンパク質のレベルである。タイムゼロベースラインを得るための凍結は、凍結切片を切断するための従来手順である、液体窒素でのスナップ凍結、またはＯＣＴ抗凍結剤ゲルでの凍結のいずれかによって行った。組織試料を一連の時点それぞれで凍結したところ、生きた状態で室温放置した組織と比較して、組織において生じる任意の変化が停止した。組織試料の残りはそれ以上保存せず、室温で異なる時間放置した。本図は経時変化を示し、非保存状態の経時変化から得られた値を、切除直後に保存した試料の値と比較する。評価したエンドポイントは、生存促進、アポトーシス、および転写制御タンパク質／リンタンパク質を表す。
【図３】切除後遅延時間研究を示す図である。１つの子宮切除片を２５の断片に分割した。断片をオープンペトリ皿で４℃または室温でインキュベートした。９０分経過した後、約１５分間隔で断片を採取し、１０の異なるエンドポイントについて、逆相タンパク質マイクロアレイ（ＲＰＭＡ）によって解析した。図３Ａは４℃での経時変化を示す図である。図３Ｂは室温での経時変化を示す図である。正負のいずれにも経時的に最大変動を呈した生存促進およびアポトーシス経路における選択したリン酸化タンパク質は、候補例代理マーカーを構成する。
【図４】リンタンパク質保存の評価のために細胞試料に適用した化学安定剤を示す図である。細針吸引（ＦＮＡ）試料は、２４時間４℃で、それぞれの化学物質／化学溶液中で保管した。逆相タンパク質マイクロアレイ解析のために、細胞試料をさらに処理した。図４Ａは試料を様々な化学溶液でインキュベータした後、リン酸化タンパク質レベル（ＡＫＴ  ｓｅｒ４７３）および試料当たりの全体タンパク質収率（Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ）を評価するために、ＡＫＴｓｅｒ４７（右上）およびＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ（右下）で染色したマイクロアレイの画像を示す図である。４つの水平スポットおよび２つの垂直スポットの各組は、各ＦＮＡ試料に関して、元の試料およびその複製試料を表し、２倍希釈液中のアレイ上に印刷される。希釈系列は、各試料の非希釈、１：２、１：４、および１：８希釈を表す。調達時におけるベースラインリン酸化レベルは、溶解緩衝液に直接溶解した細胞によって表される（表５、実施例Ｖを参照）。図４Ｂは選択した生存促進およびアポトーシスエンドポイントに関して、ＦＮＡ試料から得られた翻訳後修飾タンパク質の相対量を示す図である。細胞の直接溶解は、調達時にリンタンパク質を保存する。異なる化学溶液中でインキュベートした試料をこのベースライン溶解試料と比較することによって、エタノール等の伝統的な固定剤は、リンタンパク質を適切に保存しないことを示す。０．９％食塩水は、２４時間後のリンタンパク質エンドポイントの低下レベルを表す。
【図５】凍結および固定組織試料の間の組織形態の比較を示す図である。脳への転移性乳房組織を、凍結切片を切断する前に、スナップ凍結またはメタノール：水中で固定した。組織形態、凍結切片を切断する能力、および有効なレーザー捕捉顕微解剖は、凍結およびメタノール：水中固定試料において同程度であった。
【図６】リンタンパク質の安定性に関して、メタノール：水固定剤と凍結組織との比較を示す図である。図６Ａにおいて、逆相タンパク質マイクロアレイは、固定および凍結組織に関して、等しいスポット強度を示す。図６Ｂは平均シグナル強度が凍結試料においてより高いが、試料間の傾向は、様々なタンパク質エンドポイントに関して類似することを示す図である。
【図７】試料当たりの細胞等量を逆相タンパク質マイクロアレイ上に印刷し、ｍＴＯＲ（Ｓ２４４８）リン酸化のレベルを測定した分析を示す図である。図７Ａの試料は、スナップ凍結した。図７Ｂの試料は、水中の２０〜５０％メタノールで固定した。分析は、試料保存手技間で同等性を示す。
【図８】ベース固定剤にホスファターゼ阻害剤またはキナーゼ阻害剤のいずれかを追加することが及ぼす、リンタンパク質の安定化への影響を示す図である。試料を採取し、図に示した時点において、選択したリンタンパク質エンドポイントの存在について解析した。図８Ａはエンドポイント、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒｌ８３／Ｔｙｒｌ８５）を示す図である。図８Ｂはβカテニン（Ｓ３３／３７／Ｔｈｒ４１）を示す図である。図８Ｃはエンドポイント、Ｈｅｒ３（Ｔｙｒｌ２８９）を示す図である。図８ＤはＣＣ３（Ａｓｐ１７５）を示す図である。
【図９】ナノ粒子センチネルを示す図である。
【図１０】ホスファターゼ阻害剤（過バナジン酸）の存在下で、体外細胞培養モデル（生細胞内）において経時的に見られるリン酸化の急増を表す線グラフを示す。図１０ＡはＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ  Ｙ１１７３）のリン酸化に対するホスファターゼ阻害剤の影響を示す図である。リン酸化は、４０分未満で急激に高レベルまで上昇し、その後に細胞死が続いた。図１０Ｂは生きた細胞をホスファターゼ阻害剤に曝露した後の、列挙した一連のリンエンドポイントに関して、経時的な高リン酸化を示す図である。
【図１１】様々な固定製剤に室温で固定した子宮組織の形態を示す画像（ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した）を表す図である。図１１Ａ：１０％メタノール  倍率２Ｘ、図１１Ｂ：最適切断化合物に埋め込まれた凍結組織  倍率２Ｘ、図１１Ｃ：ホルマリン  倍率１０Ｘ、図１１Ｄ：１０％メタノール  倍率１０Ｘ、図１１Ｅ：１０％メタノール＋ポリエチレングリコール  倍率１０Ｘ、図１１Ｆ：１０％メタノール＋ＰＥＧ＋プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤  倍率１０Ｘ。
【図１２】１０％エタノール＋ＰＥＧ＋プロテアーゼ阻害剤で固定した子宮組織のレーザー捕捉顕微解剖を示す。図１２Ａ：解剖前、図１２Ｂ：顕微解剖後、図１２Ｃ：ＬＣＭキャップ上の調達した細胞。
【図１３】ＣＤ４のために染色した細胞であって、本発明の保存剤で固定および安定化された細胞のＦＡＣＳ解析を示す図である。図１３ＡはＦＩＴＣ共役したアイソタイプ抗体対照（ＩｇＧ１、ｋａｐｐａ）で染色した未処理の細胞を示す図である。図１３Ｂは実施例Ｖに記載の保存剤で２０分間処理し、２回洗浄して、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣで染色した細胞を示す図である。図１３Ｃは最初に抗ＣＤ４−ＦＩＴＣで染色し、２回洗浄した後、保存剤での処理に供された細胞を示す図である。図１３Ｄは抗ＣＤ４−ＦＩＴＣで染色し、２回洗浄した後、フローサイトメトリー（固定剤なし）によって解析した未処理の細胞を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、例えば、対象から得られた試料中のタンパク質、特に、リンタンパク質を含む翻訳後修飾タンパク質を保存および監視するための方法を提供する。本発明の一実施形態において、保存したタンパク質は、臨床標本から得られたヒト腫瘍組織のリン酸化プロテオームレパートリーを表すリンタンパク質である。本発明の態様は、室温で試料保存（固定および安定化）するための組成物（例えば、溶液）、例えば、対象から採取されたが、まだ安定化手順に供されていない試料等の試料を監視する品質管理に使用できる代理内因性マーカーの同定、および、例えば、試料が安定化手順に供された時点から、さらなる手順（例えば、分子解析）が実施される時点までの間、試料の監視等の品質評価に使用できる外因性マーカーを含むセンチネル（例えば、一群のセンチネル）を含む。
【０００８】
特に、身体から抽出した後の最初の３〜４時間以内に調達した組織試料には、特定の保存要件がある。本発明者は、意外にも対象から切除（調達）した組織が、組織が切除（調達）されてから保存剤に曝露されるまでの数時間、生存し続け、血管灌流の不在、虚血、低酸素症、アシドーシス、細胞老廃物の蓄積、電解質の不在、温度変化等に反応し得ることを本明細書において示す。本発明者は、微環境およびエネルギー源、シグナル伝達リガンド、ならびに酸素源から離れているにもかかわらず、切除した試料中のリンタンパク質は、それぞれ内因性キナーゼおよびホスファターゼの作用を通じて、代謝変化（リンタンパク質の活性化および不活性化の両方）を続けることを示す。
【０００９】
これらの継続する代謝プロセスによって、試料中のリンタンパク質の保存に対する問題が生じる。例えば、本発明者は、内因性ホスファターゼによってタンパク質リン酸基の除去を遮断するように設計されたホスファターゼ阻害剤を単独で追加することにより、致命的なレベルに達する異常レベルのリンタンパク質の未確認および極めて異常な上昇蓄積を生じ得ることを発見した。例えば、培養した細胞株（Ａ５４９）をチロシンホスファターゼ阻害剤、過バナジン酸で処理した後に続くリン酸化の大きな急増を示す図１０を参照。任意の特定の機構に束縛されるわけではないが、この急増は、ホスファターゼ阻害剤がキナーゼの脱リン酸化を阻止する一方で、キナーゼ自体は依然として活性であり、タンパク質のリン酸化を続けるために生じることが示唆される。
【００１０】
したがって、切除の時点における、生きた組織中の分子（例えば、リンタンパク質）を正確に反映させるために、調達後できる限り早急に組織を固定し、アッセイの時まで細胞シグナル伝達および代謝機能の反応変動を停止させることが重要である。
【００１１】
本発明者は、本明細書において、リンタンパク質を含む試料と室温で接触した場合、単一のステップで、細胞形態および組織学を保存し、さらなる処理（例えば、凍結切片の調製または長期極低温保存）のための試料の凍結を妨害しない条件下で、リンタンパク質のリン酸化状態を固定および安定化（例えば、ホスファターゼ、キナーゼ、および任意でプロテアーゼを阻害）し得る組成物（保存剤）を同定する。
【００１２】
本発明の保存剤の第１の成分は、固定剤（例えば、溶液）であって、沈殿することによって細胞内のタンパク質を固定することができ、さらにホスファターゼ、キナーゼ、および／またはプロテアーゼの阻害剤等の安定剤が可溶性であり、固定した細胞内に進入して機能し得るように十分な水分を含有する。
【００１３】
細胞または組織が調達された後、リンタンパク質の活性化または不活性化が細胞または組織内で生じ続けるという本明細書での観察に照らして、本発明の保存剤は、第２の成分として、少なくとも１つのキナーゼ阻害剤と、少なくとも１つのホスファターゼ阻害剤と、任意で少なくとも１つのプロテアーゼ阻害剤と、を含む安定剤をさらに含む。
【００１４】
一般に本発明の保存剤に存在する第３の成分は、細胞または組織の表面から細胞または組織の内塊への固定剤および／または安定剤の急速な浸透を増強することができる、透過性（透過）増強剤（試薬）である。透過性増強剤は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。（本発明の一部実施形態において、細胞内部にある成分を固定および安定化する必要はなく、透過性増強剤が必要とされない場合がある。例えば、ＦＡＣＳ分類のために細胞を保存する場合、細胞の表面上の抗原性表面タンパク質を固定および安定化することのみが重要であり、透過性増強剤を含む必要がない場合がある。）
【００１５】
固定剤、安定剤、および透過性増強剤を含む組成物は、本明細書において、「本発明の組成物」または「本発明の保存剤」と称され得る。
【００１６】
本発明の組成物は、細胞または組織と接触すると、組織容積を速やかに貫通する、急速に進行する溶媒先端を生成し、切除の衝撃に反応している生きた細胞内のシグナル経路における変動（増加および減少）を停止させる一方で、同時に細胞分子を固定、停止、および／または沈殿させて、凍結切片またはパラフィン切断に続く組織病理学的診断のために細胞形態を保存する。本組成物の安定剤成分は、例えば、固定剤進行先端によって細胞分子を完全に固定または停止させる前に、生きた組織細胞内で生じるシグナル経路の活性を阻害することができる。これらの機能のすべては室温で達成される。
【００１７】
本発明者は、本明細書において、意外にも、対象から採取された試料中で特に不安定な（リン酸化状態の変化を呈する）リンタンパク質を同定する。これらのリンタンパク質（ならびに本明細書で論じられる他のタンパク質）は、内因性代理マーカーとして機能することができ、（例えば、細胞、組織、体液、または細胞産物から得られた）試料中のリンタンパク質の保存状態を測定するために使用され得る。そのような解析を使用して、所定の試料中の他のタンパク質が、試料がさらなる分析、例えば、プロテオーム解析に適切であるように十分に良好に保存されるかどうかを判断することができる。同定した不安定なリンタンパク質、または他のタンパク質は、粒子物質に付着（例えば、結合、連結、固定化）して、例えば、細胞または組織集団試料の処理履歴の評価に使用できる外因性センチネルを形成することもできる。必要に応じて、様々なそのような外因性センチネル分子の一群を使用してもよい。
【００１８】
本発明の方法の利点には、保存が室温で行われるため、費用のかかる冷却の必要性がなくなることが含まれる。本発明の方法は、臨床環境において、冷却が利用できない条件下で（例えば、貧窮した環境または戦場において）の試料の解析を促進する。本発明の方法は、選択したリンタンパク質のリン酸化状態に基づく分子診断解析等のさらなる分析のために、試料を急速、正確、かつ再生可能に調製することを可能にする。細胞形態および組織学的形態は、病理学的診断のために保存される。さらに、本発明の方法において、固定剤および安定剤は、浸漬または処理した細胞の表面から組織の内塊へ急速に浸透し得る。固定剤が細胞または組織に急速に導入されるため、本発明の方法は、浸透の遅い（ミリメートル／時間）ホルマリン、および架橋結合が長時間遅れるアルデヒド等、その間に保存される組織が依然として代謝反応中であり得る従来の固定剤の問題点を克服する。
【００１９】
本発明は、例えば、室温で、リンタンパク質を含む試料と接触した場合に、リンタンパク質を固定および安定化することができ、細胞形態を保存して、分子解析に適した凍結される試料がクリオスタット凍結切片を生成可能にする組成物（保存剤）に関し、本組成物は、
（１）リンタンパク質の固定に有効であって、安定剤および／または透過性増強剤に可溶であるように十分な含水量を有する固定剤と、
（２）（ａ）キナーゼ阻害剤および（ｂ）ホスファターゼ阻害剤、および任意で（ｃ）プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼ）阻害剤を含む安定剤と、
（３）透過性増強剤と、を含む。
【００２０】
本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、上で使用される、「１つの（ａ）」キナーゼ阻害剤は、１つ以上のそのような阻害剤を含む。
【００２１】
本発明の別の態様は、細胞、組織、体液、または細胞産物を含む試料中の１つ以上のリンタンパク質を室温で保存（固定および安定化）するための方法であって、試料中のリンタンパク質の保存に有効な条件下で、試料を室温で本発明の組成物と接触させるステップを含む。本方法は、（例えば、試料が組織を含む場合に）保存した試料を凍結するステップと、任意で、凍結保存した試料を切断するステップと、をさらに含み得る。一実施形態において、本保存方法は、パラフィン埋め込みを必要とすることなく、組織を凍結および切断するためのマトリクスを提供する。本発明の保存方法において、試料中の少なくとも１つの細胞サブセットにおける少なくとも１つのリンタンパク質のリン酸化状態をさらに解析することができる。必要に応じて、外部エネルギー源（例えば、超音波、赤外線、マイクロ波、電磁気、ＲＦ（高周波）エネルギー、または圧力、熱、または化学物質）で処理することによって、保存する前にリンタンパク質を変性させることができる。
【００２２】
試料中のリンタンパク質を保存するための「有効な条件」は、多数の変数の関数であり、使用される保存剤の成分の性質、試料の性質等を含む。適切な条件は、熟練者によって日常的に最適化され得る。
【００２３】
本発明の別の態様は、試料（例えば、細胞、組織、体液、または細胞産物を含む試料）中のリンタンパク質の保存状態を判断するための方法である。本方法によって、検者は、試料中のタンパク質が、試料の後次の（正確な、有意義な）分子プロテオーム解析を行うのに十分に安定しているかどうかを判断できるようにし得る。本方法は、試料中の特に不安定な（比較的不安定な）所定のタンパク質が安定化しているかどうかを判断するステップを含む。「十分に安定化した」とは、経時的な体外変動が、組織が安定化処理される直前に存在するベースライン値から２０％以内であるように、タンパク質の翻訳後修飾（例えば、リン酸化）形態のレベルの正負変動が安定化していることを意味する。
【００２４】
これらの内因性マーカーは、本明細書において、「内因性代理マーカー」または「内因性代理リンタンパク質」と称され得る。内因性代理マーカーは、例えば、表１に列挙した１つ以上のリンタンパク質であり得る。リンタンパク質の保存状態を判断する方法において、試料は、対象から採取されているが、まだ安定化手順に供されていない場合がある（例えば、試料は、安定化手順を行う前の４時間以内に採取されているかもしれない）。保存状態を判断する方法は、判断したリンタンパク質の保存状態に基づいて、分子診断解析を進めるかどうかを決定するステップをさらに含み得る。
【００２５】
本発明の別の態様は、例えば、表１に列挙した１つ以上のリンタンパク質、少なくとも約５つのそのようなリンタンパク質、少なくとも約１０のそのようなリンタンパク質、またはその表中で特に不安定なリンタンパク質である、ＳＴＡＴ−３またはＳＴＡＴ−１（例えば、ＳＴＡＴ−３）、ＣＣ−３（開裂カスパーゼ−３）およびＡＳＫ−１等の、本発明の１つ以上の内因性代理マーカーの、リン酸化アイソフォーム、および／または非リン酸化アイソフォームに対して特異的な一連の抗体である。当該一連の抗体のセットに存在し得る他の抗体は、表２−１〜表２−３に列挙した１つ以上のタンパク質に特異的な抗体、ｐ−セレクチン、ｅ−セレクチン、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、および／またはフィブロネクチンに特異的な抗体、および／または本明細書に記載の他の内因性代理マーカーのうちのいずれかに特異的な抗体を含む。抗体は、例えば、多クローン性または単クローン性であり得る。実際に、内因性代理タンパク質のうちの１つに特異的であり、試料中のリンタンパク質の保存状態を判断する方法に使用可能な任意のリガンドを使用することができ、キットに存在し得る。
【００２６】
本発明の別の態様は、２つの異なる時点において、試料（例えば、細胞、組織、体液、または細胞産物を含む試料）中のリンタンパク質の保存状態を判断するための方法であって、第１の時点において（試料中の細胞へのセンチネルの導入に有効な条件下で）、（１つ以上の）代理リンタンパク質マーカーを含むセンチネルと試料を接触させるステップと、第２の時点において、センチネルを採取するステップと、２つの時点において、センチネルに関連した代理リンタンパク質マーカーのリン酸化状態を測定および比較するステップと、を含む。センチネルは、試料が本発明の保存剤に配置されるのと実質上同時に、試料に導入され得る。センチネルは、試料が導入される保存剤を含む容器に存在するか、または実質上試料がそこに配置された直後に試料／保存剤に追加され得る。
【００２７】
本明細書で使用される「センチネル」は、１つ以上のリンタンパク質（例えば、極めて不安定なリンタンパク質）に関連した外因性粒子体を意味する。本発明のセンチネルの特性は、本明細書の他の箇所で詳細に論じられる。本方法を使用して、試料中のタンパク質の安定性を監視することができる。本方法を使用して、試料を対象から採取した後、手順（例えば、固定／保存手順）を開始するまでの時間量を判断することができる。
【００２８】
本発明の別の態様は、試料を対象から採取する際に、細胞、組織、体液、または細胞産物を含む試料中の関心対象の１つ以上のリンタンパク質を分子特性化（例えば、分子診断解析）するための方法であって、
【００２９】
第１の時点において、試料が対象から採取されると同時に、試料を室温で本発明の（１つ以上の）センチネルおよび本発明の保存剤と接触させ、それにより、試料中の関心対象のリンタンパク質を固定および安定化させるステップと、
第２の時点において、センチネルを抽出するステップと、
その後、センチネルに関連した代理リンタンパク質マーカーの保存状態を測定し、代理リンタンパク質マーカーの保存状態が、試料中の関心対象のリンタンパク質の保存状態が、その分子特性化に適切であることを示す場合、
関心対象のリンタンパク質の分子特性化を行うステップと、を含む。
【００３０】
本発明の別の態様は、試料（例えば、細胞、組織、体液、または細胞産物を含む試料）中のリンタンパク質を室温で固定および安定化させるためのキットであって、本発明の保存剤の成分を、任意で１つ以上の容器に含む。本発明の別の態様は、試料中のタンパク質（例えば、リンタンパク質）の保存状態を監視するためのキットである。本キットは、本発明の１つ以上のセンチネルを１つ以上の容器に含み、任意で、タンパク質のリン酸化状態を監視（測定）するための試薬および／または本キットの使用説明書を含む。
【００３１】
本発明の別の態様は、細胞または組織標本を収集および保存するための装置であって、本発明の保存剤を含有する第２の室に接続された、特定量の試料を切断または調達する第１の室（例えば、針）を含み、単一の操作で、試料が調達され、室内の保存剤に浸漬されるようにする。第２の室は取り外し可能であり、組織切断または分子処理等のさらなる解析に直接使用され得る。
【００３２】
本明細書で使用される「試料」は、本発明の方法によって固定および保存できる（および、任意でアッセイを行い、例えば、試料中の１つ以上のリンタンパク質のリン酸化状態を判断できる）任意の適切な細胞、組織、体液、または細胞産物（例えば、タンパク質）を含み得る。適切な試料は、例えば、外科的切除または組織生検、例えば、針生検を含む組織、適切な方法、例えば、機械的手段または細い針あるいは他の適切な装置を用いて腫瘍試料等の試料を吸引することによって、細胞集団から分離された細胞、血液、硝子体液、またはそれらの液体のうちの１つの分画等の体液、または細胞から流出、分泌、または排出あるいは別途得られたタンパク質等の細胞産物を含む。試料は、任意の対象（患者）、例えば、研究室動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット等）、農場動物、家畜またはペット（ネコまたはイヌ等）、非ヒト霊長類、あるいは好ましくはヒトを含む、任意の動物から採取され得る。
【００３３】
タンパク質の「リン酸化状態」は、タンパク質のリン酸化の度合い（総量）を意味する。これは、リン酸化されるタンパク質の部位（例えば、適切なＳｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒアミノ酸残基）の数、および／またはアミノ酸鎖の任意の所定の受容体部位におけるリン酸化のレベルの両方を含み得る。試料の「保存状態」は、その部位における試料およびタンパク質等の状態を反映し、リンタンパク質のリン酸化状態を含む。
【００３４】
本発明者は、試料中のタンパク質を沈殿および、よって固定するだけでなく、十分な量の水を含み、安定剤（タンパク質を含む安定化剤）が固定剤中で可溶性を維持するような固定剤（固定化剤）を同定した。一般に、固定剤は、塩基水溶液、例えば、エタノール（例えば、約１０〜４０％、約１０〜２０％、または約１２％）、メタノール（例えば、約１０〜４０％、約１０〜２０％、または約１２％）、ベンジルアルコール（例えば、約１０〜４０％）あるいはアセトン（例えば、約５〜１５％）（すべてＶ／Ｖ）中に、非架橋結合沈殿剤を含む。本明細書で使用される、「約」という用語は、プラスまたはマイナス１０％を意味する。例えば、約１％は、０．９％から１．１％を含む。本明細書で使用される範囲の端点は、その範囲内に含まれる。例えば、５〜１５％（例えば、「５％から１５％の間」の値）は、５％および１５％の両方を含む。本発明者は、意外にも、前述の少量のこれらの沈殿固定剤が、いくつかの理由から、従来量のアルコール（例えば、約５０〜６０％）よりも優れると判断した。従来レベルとは異なり、このような低レベルであることによって、キナーゼおよびホスファターゼ阻害剤等の薬剤が溶液中に残留することができ、また低レベルであることは、細胞形態の保存および凍結切片の調製に特に有効である。
【００３５】
他の種類の適切な固定剤は、以下の成分の溶液または懸濁液を含み、それらは、本発明の安定剤および／または透過性試薬が可溶性であるように十分に希釈された形態である。例えば、粒子物質、バイオセラミック、クエン酸ポリジオール、キトサン、およびヒドロキシアパタイト（０．１〜１０％ｗ／ｗ）のような、水を除去するか、またはタンパク質の沈殿あるいは凝集を誘発できる薬剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）（０．０５％）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）（１〜５％）、クロロホルム／メタノール（１０〜４０％）、または硫酸アンモニウム（５〜１５％）。
【００３６】
本発明の組成物の第２の成分は、キナーゼ阻害剤（シグナル経路活性化の阻害剤）およびホスファターゼ阻害剤（翻訳後リン酸化の除去を阻害する）を含む安定剤（安定化剤）である。任意で、本発明の安定剤は、プロテアーゼ阻害剤も含み得る。
【００３７】
使用できる適切なキナーゼ阻害剤は、例えば、アダフォスチン、ＡＧ４９０、ＡＧ８２５、ＡＧ９５７、ＡＧ１０２４、アロイシン（例えば、アロイシンＡ）、アルスターパウロン、アミノゲニステイン、ＡＰＩ−２、アピゲニン、アークチゲニン、ＡＹ−２２９８９、ビスインドリルマレイミドＩＸ、ＢＭＳ−３５４８２５（ダサチニブ）、チェレリスリン、ＤＭＰｑ、ＤＲＢ、エデルフォソン、アーブスタチン類似体、ＥＴ１８０ＣＨ３、ＥＲＫ阻害剤ファスジル、ゲフィチニブ、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−８９、ＨＡ−１００、ＨＡ−１００４、ＨＡ−１０７７、ＨＡ−１１００、ヒドロキシファスジル、インジルビン−３´−オキシム、５−ヨードツベルジシン、ケンパウロン、ＫＮ−６２、ＫＹ１２４２０、ＬＦＭ−Ａ１３、ルテオリン、ＬＹ−２９４００２、マロトキシン、ＭＬ−９、ＮＳＣ−１５４０２０、ＮＳＣ−２２６０８０、ＮＳＣ−２３１６３４、ＮＳＣ−６６４７０４、ＮＳＣ−６８０４１０、ＮＵ６１０２、オロモウシン、オキシンドールＩ、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ９８０５９、フロリジン、ピセタノール、ピコロポドフィリン、ＰＫＩ、ＰＰ１、ＰＰ２、プルバラノールＡ、クエルセチン、ＲＡＰＡ、ラパミューン、ラパマイシン、Ｒｏ３１−８２２０、ロスコビチン、ロットレリン、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、シロリムス、ＳＬ３２７、ＳＰ６００１２５、スタウロスポリン、ＳＴＩ−５７１、ＳＵ１４９８、ＳＵ４３１２、Ｓｕ６６５６、Ｓｙｋ阻害剤、ＴＢＢ、ＴＣＮ、トリシリビン、チロフォスチンＡＧ４９０、チロフォスチンＡＧ８２５、チロフォスチンＡＧ９５７、チロフォスチンＡＧ１０２４、ＵＯ１２６、Ｗ−７、ワートマニン、Ｙ−２７６３２、ＺＤ１８３９、およびＺＭ２５２８６８である。これらの薬剤のすべて、および本明細書に記載の他の薬剤は、ＳｉｇｍａまたはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ等の商業源から容易に取得できる。
【００３８】
使用できる適切なホスファターゼ阻害剤は、例えば、Ａ−ナフチル酸ホスファターゼ、カリクリンＡ、ノジュラリン、ＮＩＰＰ−Ｉ（ＰＰｌを阻害する）、ミクロシスチン、オカダ酸、エンドタール（ＰＰ２Ａを阻害する）、シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６／イムノフィリン複合体、シペルメトリン、カンタラジン、カンタリジン酸、デルタメトリン（ＰＰ２Ｂを阻害する）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、デフォスタチン、ｍｐＶ（ｐｉｃ）、ＤＭＨＶ（ＰＴＰを阻害する）、β−グリセロリン酸、（−）−ｐ−ブロモテトラミゾールオキサレート、フェンバレラート、Ｌ−６９０，３３０、Ｌ−ホモアルギニン、フェニルアルシンオキシド、ペルメトリン、モリブデン酸ナトリウム（および一過硫酸）、イミダゾール、フッ化ナトリウム、酒石酸ナトリウム二水和物、スチボグルコネートナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、スラミン、バナジン酸（オルトバナジン酸および過バナジン酸）、１，４−ジメチルエンドタール、１−ｎｏｒ−Ｏｋａｄａｏｎｅ、アレスリン、アスコマイシン、ベンジルホスホン酸、タウトマイシン、テトラミソール、およびチロフォスチン８である。
【００３９】
本明細書の他の箇所で記載されるように、キナーゼおよびホスファターゼ阻害剤の適切なバランスを維持することが重要である。例えば、適切な安定剤は、ホスファターゼ阻害剤として、濃度が約１００ｍＭから約４００ｍＭの間のオルトバナジン酸ナトリウム、または濃度が約３７５ｍＭから１．５Ｍの間のβグリセロリン酸のいずれかを含み、キナーゼ阻害剤として、濃度が約５．０μＭおよび２０．０μＭの間のスタウロスポリンまたは濃度が約０．５μＭから２．０μＭの間のゲニステインを含み得る。熟練者は、前述の比率を考慮して、ホスファターゼとキナーゼ阻害剤の他の組み合わせの適切な比率を容易に判断できる。
【００４０】
本発明の組成物および方法に使用されるキナーゼおよびホスファターゼ阻害剤は、任意の適切な機構によって機能し得る。例えば、キナーゼ阻害剤および／またはホスファターゼ阻害剤は、キナーゼまたはホスファターゼ酵素の活性化を直接阻害することができ、キナーゼ阻害剤は、キナーゼ基質ＡＴＰを干渉することができ、および／またはホスファターゼ阻害剤は、リン酸化タンパク質上のリン酸基と相互作用するか、またはホスファターゼの偽基質として作用し得る。
【００４１】
任意で、本発明の安定剤は、プロテアーゼ阻害剤を含む。本明細書で使用される、「プロテアーゼ阻害剤」という用語は、分子の末端から、または内部位置からのタンパク質の分解を遮断する薬剤を意味する。プロテアーゼ阻害剤は、様々なプロテイナーゼ阻害剤、例えば、セリンプロテイナーゼ（例えば、ＰＮＳＦまたはアプロチニン）、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、金属プロテイナーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、酸性プロテイナーゼ、中性プロテイナーゼ、またはアルカリ性プロテイナーゼの阻害剤を含む。
【００４２】
使用できる適切なプロテアーゼ阻害剤は、例えば、アセチル−ペプスタチン、ＡＥＢＳＦ、塩酸、ＡＬＬＮ、ＡＬＬＭ、アマスタチン、ストレプトミセス  ｓｐ．、Ｅ−アミノ−ｎ−カプロン酸（ＥＡＣＡ）、αｌ−アンチキモトリプシン、α２−アンチプラスミン、アンチパイン、二塩酸または塩酸、アンチトロンビンＩＩＩ、αｌ−アンチトリプシン、ｐ−ＡＰＭＳＦ、塩酸、アプロチニン、ＡＴＢＩ、ベンズアミジン、塩酸、ベスタチン、ベスタチン、メチルエステル、カルパスタチン、ＣＡ−０７４、カルペプチン、カルボキシペプチダーゼ、カテプシン阻害剤Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、カテプシンＢ阻害剤Ｉ、ＩＩ、カテプシンＫ阻害剤Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、カテプシンＬ阻害剤Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、カテプシンＳ阻害剤、キモスタチン、キモトリプシン阻害剤Ｉ、シスタチン、３，４−ジクロロイソコウラミン、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤、１，５−ＤＮＳ−ＧＧＡＣＫ、２ＨＣｌ、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ阻害剤、Ｅ−６４プロテアーゼ阻害剤、エコチン、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、エラスターゼ阻害剤Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＥＳＴ、ＦＵＴ−１７５、ＧＧＡＣＫ、ＨＤＳＦ、α−ヨードアセトアミド、キンノゲン、ロイヒスチン、ロイペプチン、α２−マクログロブリン、ＤＬ−２−メルカプトメチル−３−グアニジノエチルチオプロパン酸、ＮＣＯ−７００、ペプスタチンＡ、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ＰＰＡＣＫ、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤、２，３，５，７−テトラニトロ−９−フルオレノン、ＴＬＣＫ塩酸、トロンビン阻害剤、トリペチジルペプチダーゼＩＩ阻害剤、トリプシン阻害剤、チロマイシンＡ、およびＤ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓクロロメチルケトン、二塩酸である。他のプロテアーゼ阻害剤は、例えば、Ｎｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９，１９３−２０４およびＢ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ（２００２）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８７，２４７４−２４８０において開示される。
【００４３】
本発明の保存剤の第３の成分は、透過性増強剤であり（本明細書において、透過性薬剤または透過剤と称され得る）、固定剤および／または安定剤の細胞または組織への輸送を増強する。透過性増強剤は、例えば、組織容積を通る本発明の組成物の成分の浸透率を増補し、生きた組織の内塊中の細胞に急速に到達して、それらの分子を後の診断のために停止させる。細胞または組織への安定剤の透過率は、細胞外空間に対する細胞の比率、および組織の容積に対する表面の比率の関数である。水、溶質に対する組織細胞膜の透過性、および細胞外空間における溶質の拡散係数は、すべて安定剤の透過性に影響する。細胞内空間と細胞外空間との間の大量輸送および交換に続いて、保存剤が細胞に進入する。
【００４４】
様々な透過性増強剤は、本発明の組成物に含まれ得る。適切な透過性増強剤は、ポリマー（ＰＥＧ、ポリソルベート等）、タンパク質（脂肪親和性タンパク質）、脂質、およびナノ粒子（金属またはシクロデキストリンナノ粒子）である。例えば、適切な透過性増強剤は、水、約１．５Ｍのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、デメチルホルミアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＣＭＳ）、Ｃ１０−Ｃ１８飽和アルキル鎖を有する脂肪酸、硫酸ナトリウムラウリル（ＳＤＳ）、ソルビタンモノラウレート２０、セチルトリメチル臭化アンモニウム、ノノキシノール界面活性剤、両性イオン界面活性剤（例えば、ドデシルベタイン）、ラウロカプラム：アゾン（ｌ−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン）、ＳＲ−３８（４−デシクロアゾリジン−２−オン）、エタノール溶液、精油、テルペンおよびテルペノイド（ユーカリ、ｄ−リモニン、ネロリドール、１−８−シネオール、メントール）、脂肪アルコール（アルクノール）、オレイン酸、グリコール、ＰＥＧ２００モノラウレート、ＰＥＧ４００モノラウレート（Ａｌｋａｍｕｌ  ４００−ＭＯ）、ＰＥＧ４００モノラウレート（Ｌｉｐｏｐｅｇ  ４−Ｌ）、ＰＥＧ６００モノオレエート（Ａｌｋａｍｕｌ  ６００−ＭＯ）、ＰＥＧ６０００モノオレエート（Ｋｅｓｓｏポリエチレングリコールエステル）、ポリオキシアリールエーテル（Ｓｙｎ  Ｆａｃ８２１０）、ＰＯＥオレイルアルコール（Ｅｔｈｏｓｐｅｒｓｅ  ＯＡ−９）、ＰＯＥモノオレイイン酸ソルビタン（Ａｔｌａｓ  Ｇ８９６６Ｔ）、ＰＯＥミリスチルエーテル（Ｌｉｐｃｏ−４）、ＰＯＥラウリルアルコール（Ｅｔｈｏｓｐｅｒｓｅ  ＬＡ−４）、ＰＯＥルアリールエーテル（Ｂｒｉｊ３０）、ＰＯＥソルビタンモノオレエート（Ｇｌｙｃｏｓｐｅｒｓｅ  ０−５）、ＰＯＧ硫酸ラウリル（Ｅｍｔｈｏｘ  ５９６７）、オクチフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール（Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ４２０）、直鎖アルコールエトキシレート（Ｒｅｘｏｎｉｃ  Ｎ４）、ポリソルベート８０含有モノおよびジグリセリド（Ｔａｎｄｅｍ  ８）、ノニルフェノールエトキシレート（Ａｌｋａｓｕｒｆ  ＮＰ−４）、ノニルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール（Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−７２０）、ノニルフェノールエトキシレート（Ａｌｋａｓｕｒｆ  ＮＰ−１５）、カストールオイルエトキシレート（Ｓａｎｄｏｘｙｌａｔｅ  Ｃ−３２）、エトキシル化ヤシ油モノグリセリド（Ｖａｒｏｎｉｃ  ＬＩ−６３）、酸化エチレンで濃縮したオレイルアルコール（Ｖｏｌｐｏ−２０）、修飾オキシエチル化直鎖アルコール（Ｐｌｕｒａｆａｃ  Ｃ−１７）、エトキシル化ラノリンアルコール（Ｐｏｌｙｃｈｏｌ  ４０）、エチオキシレートポリオキシプロピレングリコール（Ａｌｋａｔｒｏｎｉｃ  ＰＧＰ２３−７）、エチオキシレートポリオキシプロピレングリコール（Ａｌｋａｔｒｏｎｉｃ  ＰＧＰ２３−８）、ノンフェニルエトキシレート（Ａｌｋａｓｕｒｆ  ＮＰ−３０）、ポリエチレン１００ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ７００）、モノグリセリドおよびエチルパルミテート、アルキルアリールポリエーテルエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−３６３Ｍ）、Ｎ，Ｎ��ジメチルアミド（Ｍａｌｌｃｏｍｉｄ  Ｍ８−１０）、アルキルまたはアリール尿素類似体、グリセロールモノラウレートおよびラウリルアセテート、Ｓｅｆｓｏｌ−３１８媒体鎖グリセリド、細胞浸透ペプチド、ペグ化ペプチド、細胞浸透ペプチド、ポリエチレングリコールモノラウレート、リン脂質、ピロリドン：Ｎ−メチル−２−ピロリドンおよび２−ピロリドン、デンドリマー、レクチン、またはペグ化および／またはコロイド金を含む。
【００４５】
本発明の一実施形態において、透過性薬剤は、濃度が約０．５％から１５％、例えば、約０．５％から５％のＰＥＧである。高濃度のＰＥＧは細胞組織構造を干渉し、組織が切断されるのを妨げ得る。
【００４６】
透過性増強剤は、独立した要素として、本発明の固定剤および安定剤の混合物に添加され、保存剤を形成し得る。本発明の別の実施形態において、本発明の安定剤（その１つ以上の成分）は、透過性増強剤に付着（例えば、結合、連結、固定化）され、透過性増強剤は、細胞または組織への安定剤の浸透を促進できる。安定剤を適切な透過性増強剤に付着させるための方法は従来の方法である。一実施形態において、安定剤（例えば、ホスファターゼ阻害剤およびキナーゼ阻害剤）および透過性増強剤の要素はいずれも、細胞または組織への本発明の組成物の両種の成分の進入を促進するナノ粒子に付着する。結合成分を含有するナノ粒子は、本発明の固定剤に懸濁され得る。
【００４７】
熟練者は、本発明の保存剤、例えば、透過性増強剤の個別成分の相対量、またはその存在は、個別の細胞型または標本型によって異なり得ることを認識するであろう。例えば、一部の組織（例えば、筋肉組織）は、特に密度が高いため、密度の低い組織よりも大量の透過性増強剤を必要とし得る。代替として、高レベルの脂肪または疎水性層から成る一部の組織（例えば、乳房または皮膚）は、そのような脂肪性質を欠く組織よりも少量の透過性増強剤を必要とし得る。そのような調節は、本明細書で論じられる保存剤の一般的な範囲内で日常的に判断することができる。
【００４８】
物理的方法を使用して、細胞または組織への本発明の保存剤の浸透を補助することもできる。これらの方法は、例えば、圧縮波および針のグリッドとの透過性を含む。他の物理的方法は、例えば、超音波、赤外線、マイクロ波、電気（高圧）、電磁気、ＲＦ（高周波）、または化学的方法による過渡熱誘発を含む。これらの物理的方法は、保存剤を組織に導き、かつ、タンパク質を積極的に変性させて、キナーゼ、ホスファターゼ、およびプロテアーゼ活性を阻害する。
【００４９】
本発明の保存剤に存在し得る他の薬剤は、例えば、ＯＳＩ−７７４（タルセバ、エルロチニブ）のような膜受容体阻害剤、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ラパタニブ、およびゲフィニチブ（イレッサ）を含む。使用され得る抗ヒスタミン（Ｈ−Ｉ受容体拮抗薬）は、例えば、アザタジン、アンタゾリン、ブロンフェニラミン、シクリジン、クロルシクリジン、セチリジン、クロルフェニラミン、クレマスチン、シプロヘプタジン、デスロラタジン、デクスクロルフェニラミン、ジメンヒドリナート、ジフェンヒドラミン、ドキシラミン、フェキソフェナジン、ヒドロキシジン、ケトチフェン、ロラタジン、メピラミン、メクリジン、フェニラミン、フェニンダミン、プロメタジン、およびトリプロリジンを含む。
【００５０】
本発明の保存剤に存在し得る他の薬剤は、膜を安定化させるだけでなく、細胞分子およびそれらの翻訳後修飾が沈殿または固定されるまで、細胞を損傷から保護する膜安定剤を含む。適切な細胞膜安定剤は、例えば、トレハロース、炭水化物、プロピレングリコール（例えば、約１．５Ｍ）、エチレングリコール（例えば、約１．５Ｍ）、グリセロール（例えば、約１．５Ｍ）、スクロース、グリシン、キトサンまたはメチルセルロースである。
【００５１】
本発明の保存剤に存在し得るシグナル経路活性化の他の阻害剤は、凍結切片またはポリマーあるいはパラフィン切断に続く組織学的試験、顕微解剖、および病理学的診断のための細胞小器官形態を含む、細胞形態を保存する薬剤を含む。適切なそのような薬剤は、例えば、ポリエチレングリコール（例えば、粒径範囲が約２００から８０００ｋＤ）、キトサン、またはメチルセルロースである。
【００５２】
存在し得る他の薬剤は、架橋結合剤（例えば、ジアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジチオビス−スクシニミジルプロピオン酸、アラビアゴム、ジエチレングリコール、またはアラビアゴム）および分子阻害したポリマーまたはヒドロゲル、例えば、沈殿重合によって形成されたＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡｍ）およびＮ，Ｎ´−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）を含む。
【００５３】
本発明の保存剤に存在し得る他の薬剤は、アデノシン三リン酸加水分解酵素阻害剤を含む。使用され得る適切なアデノシン三リン酸加水分解酵素は、例えば、アデノシン、塩酸アミロライド、バフィロマイコンＡ１、ストレプトミセスグリセウス、ＢＨＱ、（−）−ブレビスタチン、（±）−ブレビスタチン、ＢＴＳ、ブファリン、２，３−ブタンジオン２−モノキシム、カルミダゾリウムクロリド、シクロピアゾン酸、ペニシリウムシクロピウム、ＤＰＣ（ジフェニルアミン２−カルボキシル酸）、Ｅｑ５阻害剤ＩＩＩ、デメチルエナストロン、Ｎ−エチルマレイミド、フォリマイシイン、ストレプトミセス  ｓｐ．、４−ヒドロキシノネナール、ヒポクレリンＢ、ヒポクレラバンブーサ、マストパラン、ミカロリドＢ、Ｍｙｃａｌｅ  ｓｐ．、ＮＣ−１３００−Ｂ、オリゴマイシン、オメプラゾール、カバイン、オクタヒドレート、ホルボール−１２，１３−ジブチレート、スラミン、ナトリウム塩、およびタプシガルジンである。
【００５４】
当然のことながら、特定の機能を提供するとして上で列挙した成分のいずれも、記載される他の機能の１つまたは２つ以上を満たし得る。
【００５５】
本明細書に記載の保存剤（固定／安定化／透過性剤）は、種々の細胞内成分を保存することができる。本出願の大部分は、リンタンパク質の保存を対象とするが、他の細胞成分（例えば、翻訳後に修飾されないタンパク質、翻訳後にリン酸基以外の部分、例えば、グリコシル、脂質または脂質−メチル基等で修飾されるタンパク質、細胞小器官等）も、本発明の方法によって保存できることを理解されたい。一実施形態において、本組成物は、不安定な細胞表面抗原タンパク質を保存するために全血に追加される。表面タンパク質は、それらの抗原性を保持するので、抗原性表面抗原に依存する方法、例えば、ＦＡＣＳ解析による細胞ソーティングまたは磁気捕捉によって、保存した細胞をさらに解析することができる。例えば、実施例Ｖを参照されたい。
【００５６】
種々の従来方法のうちのいずれかを使用して、細胞シグナル伝達および／または代謝機能が、本発明の組成物によって保存されたかどうかを判断することができる。切除した組織の生理化学的特性は、例えば、免疫組織化学、酵素学、顕微鏡検査、または生化学によって測定することができる（例えば、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃｕｅｔｏらによる総論（２０００）Ａｍ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｍｅｄ  Ｐａｔｈ．２１，２１−３１を参照）。評価され得る酵素組織化学的マーカーのうちで、ミトコンドリア酸化酵素活性に関与する酵素は、エステラーゼ、フィブロネクチン、テネイシン、ｅ−セレクチン、ｐ−セレクチン、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インターロイキン１０、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、および／またはグリコサミノグリカンである。実施可能な生化学解析は、ＡＴＰおよびその分解産物（ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＩＭＰ、イノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、および尿酸）、ブロモデオキシウリジンＤＮＡ合成、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ重合、Ｃ３、免疫グロブリンＥ、Ａ、Ｇ、Ｍ、ヒスタミン、セロトニン、カテプシンＤ、Ｄ−二量体、および／または乳酸脱水素酵素の評価である。タンパク質のリン酸化状態の解析は、従来の方法、例えば、本明細書に記載のとおり実行することができる。
【００５７】
本発明者は、様々なリンタンパク質の経時変化解析を行い、身体からの切除後に一連の不安定性（例えば、リン酸化等の翻訳後修飾の損失または取得）を示すマーカーを同定した。表１に示すリンタンパク質は、「特に不安定（「比較的不安定」）な」タンパク質である。つまり、それらのタンパク質は、組織切除後の保存処理において、２０％以上長い期間の保存によって、それらのリン酸化状態を変化させる。エンドポイントは、表において細胞シグナル伝達経路ごとに整理される。表に記載される特定のリン酸化アミノ酸残基を使用して、表中のタンパク質のリン酸化状態を監視したが、タンパク質の他のリン酸化残基を監視することができる。
【００５８】
【表１】
2010515012.tif 000002
【００５９】
本発明の一実施形態は、例えば、細胞、組織、体液、または細胞産物を含む試料中のタンパク質（例えば、リンタンパク質）の保存状態を判断するための方法である。本方法は、試料中の１つ以上の内因性代理マーカー（例えば、表１の非常に不安定な内因性代理マーカー）のリン酸化状態を測定するステップを含む。本方法を使用して、試料中の他のタンパク質（例えば、リンタンパク質）が、診断分子プロテオーム解析等の後次解析、タンパク質のリン酸化状態の研究等に使用するために十分に良好に保存されているかどうかを判断することができる。
【００６０】
単一の内因性代理マーカーを使用するか、または複数のそのようなマーカー（例えば、約２から１０の間、またはそれ以上）を使用することができる。本発明の一実施形態において、使用される表１からの代理マーカーは、特に不安定なリンタンパク質ＳＴＡＴ−１および／またはＳＴＡＴ−３（例えば、ＳＴＡＴ−３）、ＣＣ−３（開裂カスパーゼ−３）およびＡＳＫ−１である。表１に列挙した非常に不安定な内因性代理マーカーは、悪化した保存状態の早期警告を構成する。
【００６１】
これらのリンタンパク質に加えて、またはそれらの代わりに、他種のリンタンパク質を使用し得る。例えば、特定の経路から得られるもの、残基のクラス（チロシン、セリンまたはスレオニン）、ならびに核、細胞質、および細胞膜分画を含む、様々なクラスのリンタンパク質から適切な内因性代理マーカーを選択することができる。内因性代理マーカーは、異なる不安定度を呈する一群の選択リンタンパク質の形式であり得る。
【００６２】
様々な他種の内因性代理マーカーを、上述のリンタンパク質に加えて、またはそれらの代わりに使用し得る。例えば、内因性代理マーカーは、その安定性が、細胞集団におけるリンタンパク質の保存状態と相関する、非リンタンパク質分子（例えば、乳酸脱水素酵素、ＬＤＨ、グルコース−６デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ等）であってもよい。
【００６３】
一実施形態において、内因性代理マーカーは、表２−１〜表２−３に列挙した１つ以上のリンタンパク質、および／または１つ以上のｐ−セレクチン、ｅ−セレクチン、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、またはフィブロネクチンを含む。
【００６４】
【表２−１】
2010515012.tif 000003
【表２−２】
2010515012.tif 000004
【表２−３】
2010515012.tif 000005
【００６５】
対象から試料を採取したさ後、早期、中期、または後期に不安定であるマーカーを、保存することなく使用することができる。
【００６６】
使用できる他の内因性代理マーカーは、炎症マーカーである。切除した組織は、細胞シグナル伝達経路の活性化に関して、本質的に損傷または外傷を受けた組織である。損傷活力は、法医学的病理において十分に特徴付けられている。損傷治癒の段階は、典型的に、４つの経路：炎症、血管形成、上皮形成、および組織改造をたどる。したがって、切除した組織は、外傷、環境ストレス、低酸素症、生存促進シグナル、およびアポトーシスシグナルに基づく、細胞シグナル伝達活性の同様の段階を有することが予想される。適切な炎症の内因性代理マーカーとしては、例えば、
細胞−細胞接着−ＰＡＸ、Ｓｒｃ、ＦＡＫ、ｐｌ３０ｃａｓ、コフィリン、フィブロネクチン、アクチン、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ｅ−セレクチン、ｐ−セレクチン、
サイトカイン−ＴＮＦα、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＥＲＫ、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ＩＫＫ、ＩｋＢ、ＮＦＫβ、
ストレスの代理マーカー：ＩＬ−６、ｉＮＯＳ、ｅＮＯＳ、Ｊａｋｌ／２、Ｓｔａｔ３、Ｓｔａｔ５、Ｓｔａｔ１、Ｓｈｐ２、Ｇｒｂ２、ＭＥＫ、ＥＲＫ、
低酸素症の代理マーカー：ＨＩＦ−１α、ＡＭＰＫα、ＡＭＰＫβ、ＡＭＰＫγ、ＰＫＡ、ＬＫＢ１、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、シトクロムｃ、ＣＯＸ２、
生存促進の代理マーカー：ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、４ＥＢＰ１、ｐ７０Ｓ６、ｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４Ｅ、ＧＳＫ３β、
アポトーシスの代理マーカー：アネキシン、ＴＮＦα、ＡＫＳ−１、ＩＫＫ、ＩｋＢ，ＮＦＫＢ、カスパーゼ３，６，７，９、ＪＮＫ、Ｂｃｌ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂａｄ、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、Ａｐａｆ−１、シトクロムｃ、ラミンＡ
が挙げられる。
【００６７】
内因性代理マーカーの測定は、センチネルの使用が以下に記載のとおり不可能である場合、試料の保存状態を判断するために特に有用である。例えば、センチネルが利用可能でないか、または解析される組織が、身体から組織を採取した後にセンチネルが追加されなかったアーカイブ組織であり得る。
【００６８】
本発明の別の態様は、２つの異なる時点において、試料中のタンパク質の保存状態を監視するために使用できるセンチネル（外因性センチネル）である。本発明のセンチネルは、本明細書で論じられる１つ以上の（内因性）代理マーカーが付着（関連、結合、固定化）する粒子体を含む。マーカーは、センチネルに付着すると、もはや「内因性」ではなくなるため、「代理マーカー」または「代理リンタンパク質」と称され得る。本明細書で論じられる代理マーカーのいずれか、または熟練者に明らかであろう他の適切なマーカーは、本発明のセンチネルに付着し得る。
【００６９】
粒子体は、第１の時点において試料と接触させることができ、その後、第２の時点において、試料から採取され、センチネルに付着したタンパク質マーカーの保存状態（例えば、リン酸化状態）を判断することができる、任意の構成要素であり得る。例えば、粒子材料は、ヒドロゲル、シリコン、多孔質不活性粘土、ポリソルベートまたは他のポリマー、あるいはコロイド金から形成され得る。一実施形態において、粒子材料は、シクロデキストリンまたは金属ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子）等のナノ粒子である。センチネルは、様々な方法のうちのいずれかによって、試料から採取され得る。例えば、遠心分離する（回転させて試料から分離する）、またはサイズ別あるいは適切なタグの用途別に分離することができる。磁気ナノ粒子は、磁気の減耗を介して、標本の細胞ライセートから単離され得る。
【００７０】
センチネルを使用して、試料が対象から採取される時点から、分子特性化等の手順に供される時点までの間の試料中のタンパク質の安定性を監視することができる。その後、センチネルに付着した代理マーカー上のリン酸基の有無またはレベルを測定し、センチネルが最初に標本に導入された時のレベルと比較して、処理履歴を評価することができる。この客観的な基準を通じて、組織リン酸プロテオームに対する処理変数の影響を、研究室標本品質管理アセスメントの一部として測定することができる。一実施形態において、センチネルを使用して、試料を対象から採取してから手順（例えば、固定／保存手順）の開始までの間の時間量を判断する。
【００７１】
試料は、例えば、細胞、組織、体液、または細胞産物であり得る。
【００７２】
本発明の一態様は、２つの異なる時点において、試料（例えば、細胞、組織、体液、または細胞産物を含む試料）中のタンパク質の保存状態を判断するための方法である。本方法は、第１の時点において、本明細書で論じられる非常に不安定なリンタンパク質等の１つ以上の代理マーカーに付着（関連）したセンチネルと試料を接触させるステップと、第２の時点において（例えば、試料中のタンパク質の後次解析を干渉しない条件下で）、センチネルを試料から採取するステップと、センチネルを試料から採取するステップと、２つの時点において、センチネルに付着（関連）したタンパク質のリン酸化状態を測定および比較するステップと、を含む。
【００７３】
本明細書で使用される、「１つの（ａ）」センチネルという用語は、１つ以上のセンチネルを含む。例えば、単一のセンチネルが使用されるか、または複数（例えば、一群）のセンチネルが使用されてもよく、それらは同一であるか、または異なり得る。
【００７４】
一実施形態において、本試料は細胞または組織を含み、本方法は、第１の時点において（例えば、センチネルが細胞に進入するために有効な条件下で）、試料中の細胞をセンチネルと接触させるステップと、第２の時点において（例えば、試料中のタンパク質の後次解析を干渉しない条件下で）、試料中の細胞からセンチネルを採取するステップと、２つの時点において、センチネル上の代理マーカーのリン酸化レベルを解析および比較するステップと、を含む。センチネルは、透過剤の存在下で細胞に導入され得る。
【００７５】
一実施形態において、１つ以上のセンチネル分子は、処理前の時点、例えば、収集時において試料に添加され、処理後にセンチネルは試料から採取され、特性化される（例えば、分子のリン酸化状態が分析される）。本発明のセンチネルに関するさらなる説明については、実施例ＩＶおよび図９を参照されたい。
【００７６】
一実施形態において、センチネル上に存在するリンプロテオームエンドポイントは、特に不安定であり、半減期が短い（例えば、表１のリンタンパク質から選択したリンタンパク質）。本明細書で使用される、「リンタンパク質」という用語は、リンペプチドを含む、任意の適切なサイズのポリペプチドを含む。１つ以上（例えば、２、５、１０、またはそれ以上）のこれらのエンドポイントは、センチネル（例えば、ナノ粒子センチネル）に組み込まれ得、大量生産可能な化学的に定義されたセンチネルを生成することができる。
【００７７】
ナノ粒子は、生きた組織に注入され、それらに浸透し得る（例えば、Ｍｕｌｄｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４７，１８４０−１８５１を参照）。例えば、単結晶酸化鉄ナノ粒子（デキストランの外核を持つ直径５ｎｍ、約２０ｎｍの全体粒子サイズを形成する）は、ラット脳に注入することができ、粒子は、約７．９３ｍｍの幅、粒子のサイズより何倍も大きい距離で大脳皮質に浸透する。
【００７８】
従来の方法を使用して、本発明のセンチネル（例えば、ナノ粒子センチネル）を形成し、それらに適切なマーカータンパク質を付着させることができる。代理タンパク質マーカーは、リンカーを介する等、従来の方法によって、センチネル（例えば、ナノ粒子）に付着（関連、結合、固定化）され得る。例えば、シラン被覆を有する磁気鉄ナノ粒子は、ＮＨＳ官能基の追加を通じて誘導体化され得る。これは、合成ペプチドのアミノ末端の連結部位を提供する。センチネルとして機能するリンペプチドの一群（例えば、約１、２、５、１０、またはそれ以上）が合成される（例えば、約９５％の純度）。ペプチドは、スペーサー要素として機能するグリシンのアミノ末端伸長を含み得る。これらのペプチドのリン酸化形態を特異的に認識する抗体が利用可能である。多くのそのような抗体が、リンタンパク質のリン酸化を監視するために有効であると確認されている。
【００７９】
本発明の一実施形態において、単一の標本容器（例えば、典型的に生検試料の保管に使用される従来のメッシュバッグまたはパウチ）には、本発明の保存剤と１つ以上のセンチネルとの組み合わせが事前に充填される。手術室（Ｏ．Ｒ．）または外来クリニックにおける切除の直後に、組織標本が専用容器に配置される。容器および標本は、輸送または出荷中に室温で安定している。臨床研究室内で、センチネル添加剤が適用され、処理および解析フェーズのための品質保証データを収集し、規制（米国病理医境界［Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ（ＣＡＰ）］／臨床検査質改善法［Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ａｃｔ（ＣＬＩＡ）］）基準を支持し得る。しかし、保存剤およびセンチネルは、肉眼的検査、組織学、または形態を改変せず、定量的タンパク質エンドポイントの収率を最大化する。容器から組織を採取した後、内因性代理エンドポイントの測定を使用して、例えば、分子解析またはバンキングのための標本の受容を認めることができる。
【００８０】
本発明の一実施形態において、メッシュパウチは、キナーゼまたはホスファターゼのタンパク性阻害剤を含む、本発明の保存剤の不安定な成分、例えば、タンパク性の成分で満たされ、これらの不安定な成分は、後に乾燥され、液体で保存された場合よりも長い保存寿命を有することができる。試料がメッシュパウチに配置された後、保存溶液の残りの液体成分をパウチに追加し、それにより、保存溶液を再構成して、試料を固定および安定化することができる。
【００８１】
別の実施形態において、メッシュパウチは、試料および／または本発明の保存溶液と接触する際、短時間に激しい熱を放出し、１−１５分以内に温度を６５℃以上に高め、それにより、組織を変性させてその保存を助ける化合物で満たされる。熱生成化合物は、当技術分野において知られるハンドウォーマーおよびストーブフリー調理において使用される化学反応等の発熱反応を生成し得る任意の乾燥した薬剤（例えば、過マンガン酸カリウム、酸化マンガン、塩素酸カリウム、過酸化バリウム、硝酸カリウム、金属、半金属、金属合金、または金属−半金属合金）である。
【００８２】
本発明の別の態様は、本明細書で開示された方法のいずれかに有用なキットである。そのようなキットは、本発明の組成物（例えば、試料中のタンパク質を固定および安定化させる）、本発明の内因性代理マーカー、またはセンチネル上の代理マーカーのリン酸化量を測定するための特定の抗体等の試薬、および／または本発明のセンチネルを含み得る。本発明のキットは、（１つ以上の）容器または包装材料をさらに含み得る。本発明のキットは、例えば、さらなる解析、バンキング、または実験的適用のための試料を調製するために使用することができる。熟練者は、本発明の方法のうちのいずれかを実行するために適切なキットの成分等を認識するであろう。
【００８３】
任意で、キットは、方法を実施するための説明を含む。本発明のキットの随意的要素は、適切な緩衝液、薬剤として許容される担体等、容器、または包装材料を含む。キットの試薬は容器内にあってもよく、そこで試薬は、例えば、凍結乾燥型または乾燥型であるか、あるいは安定化した液体として安定し得る。試薬は、例えば、単一患者の試料、または単一患者から得られた複数の試料の保存のために、使い切り型であってもよい。
【００８４】
キットに存在する本発明の保存剤の成分は、液体形態、乾燥形態、またはそれら両方であり得る。分解から保護するために、不安定な成分（例えば、タンパク性成分）は乾燥形態であって、残りの成分は液体形態であり得る。乾燥成分は、表面上にコーティングを形成することができ、組成物の残りの成分を含む液体との接触によって再構成され得る。
【００８５】
本発明の別の態様は、細胞または組織標本を対象から収集し、保存するための装置であって、本発明の保存剤を含有する第２の室に接続された、特定量の試料を切除または調達する第１の室（例えば、針）を含み、単一の操作で、試料が調達され、保存剤を含有する室内の保存剤に浸漬されるようにする。一実施形態において、第２の室は取り外し可能であり、組織切断、分子処理等に直接使用することができる。例えば、第２の室は、保管および保存した組織を郵送するための多目的容器であり得、および／または組織切断のための自動または半自動システムと直接相互作用できる出口域を含み得る。
【００８６】
前述および以下の実施例において、すべての温度は、訂正されていない摂氏温度で記載され、別段の指示がない限り、すべての部分およびパーセンテージは重量による。
【００８７】
(実施例)
実施例Ｉ．材料および方法
Ａ．逆相タンパク質アレイ（ＲＰＡ）−組織および細胞中のリンタンパク質の定量
本発明者および協力者によって発案されたＲＰＡ形式は（例えば、Ｐａｗｅｌｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０，１９８１−１９８９を参照）、縮小希釈曲線において個別の試験試料を固定化し、何百もの異なる患者試料、処理、または時点がアレイに含まれるようにする。ＲＰＡ形式において、１つの検出タンパク質（例えば、アンチペプチド抗体）で各アレイをインキュベートし、単一の検体エンドポイントを測定して、複数の試料間で直接比較する。簡潔に述べると、ロボットアレイ印刷装置（１２５−５００μｍピンを備えるＧＭＳ４１７アレイヤー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡまたはＡｕｓｈｏｎ２５７０，Ａｕｓｈｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、ライセートをガラス基板ニトロセルロースアレイスライドに印刷する（ＦＡＳＴスライド  Ｗｈａｔｍａｎ，Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪまたはＯＮＣＹＴＥスライド  Ｇｒａｃｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｎｄ，ＯＲ）。各ライセートは、希釈曲線に印刷され、純希釈、１：２、１：４、１：８、１：１６および負の対照希釈を表す。スライドは、乾燥剤（Ｄｒｉｅｒｉｔｅ，Ｗ．Ａ．Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｘｅｎｉａ，ＯＨ）を用いて、−２０℃で免疫染色前に保管する。
【００８８】
今日我々は、多様な検体を認識する１５０の有効な抗体を有する（例えば、Ｇｕｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，５８４７−５８５５；Ｓｈｅｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４，３４６−３５５；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２，７９１−７９９；Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，１４２２９−１４２３４；Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３，３６１４−３６２１；Ｗｕｌｆｋｕｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ３，２０８５−２０９０）および表２−１〜表２−３を参照）。
【００８９】
Ｂ．タンパク質マイクロアレイ免疫染色  免疫染色は、製造者の指示によって自動スライド着色剤で行う（Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  ＣＳＡキット、Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）。各スライドは、単一の一次抗体を用いて室温で３０分間インキュベートする。多クローン性の一次抗体は、例えば、ＧＳＫ３α／β  Ｔｙｒ２７９／２１６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＢＣＬ−２、ＨＩＦ−１α（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、４ＥＢＰ１、ＦＫＨＲ  ｓｅｒ２５６、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ｅ  ｓｅｒ２０９、ｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４Ｇ  ｓｅｒ１１０８、ＩＧＦＲ−β、ＩＲＳ−ｌ、ＩＲＳ−２、ＩＲＳ−１  ｓｅｒ６１２、ＳＧＫ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＢＡＤ、ＢＡＤ  ｓｅｒ１１２、ＢＡＤ  ｓｅｒ１３６、ＢＡＤ  ｓｅｒ１５５、Ｂ−Ｒａｆ、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲ  ｓｅｒ２４４８、ｐ７０Ｓ６  Ｔｈｒ３８９、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、ｐ７０Ｓ６  ｓｅｒ３７１、Ｓ６キナーゼ  ｓｅｒ２４０／２４４、Ａｋｔ、Ａｋｔ  ｓｅｒ４７３、Ａｋｔ  Ｔｈｒ３０８、４ＥＢＰ１  ｓｅｒ６５、４ＥＢＰ１  ｓｅｒ７０、および４ＥＢＰ１  Ｔｈｒ３７／４６（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）であり得る。負の対照スライドは、抗体希釈剤でインキュベートする。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ（１：５０００）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）であり得る。
【００９０】
Ｃ．マイクロアレイ解析の生物情報科学的方法  各アレイを走査し、スポット強度を分析し、データを規格化して、標準の単一データ値をアレイ上の各試料に対して生成できる（Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ｖ５．２，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）または（ＭｉｃｒｏＶｉｇｅｎｅ  ｖ２．８，Ｖｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）。スポット強度は、固定領域全体で統合する。局所領域の背景強度は、印刷されていない隣接スライド背景を用いて、各スポットに関して計算する。これにより、各試料に対する単一データポイントが得られ、アレイ上の他のすべてのスポットと比較する。ＪＭＰ  ｖ５．０（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して、二方向階層的クラスタ分析のためのＷａｒｄ方法を行ってもよい。ウィルコクソンの二試料順位和検定を使用して、値を２群間で比較することができる。０．０５未満のＰ値を有意であると見なす。変数の正規分布を想定できない場合は、非パラメトリック法を使用する。一変量生存時間解析のためのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ（ログランク）生存時間推定値を使用することができる。
【００９１】
実施例ＩＩ．（「現実世界」の病院設定における）ヒト組織リンタンパク質安定性の経時変化解析
ＲＰＡマイクロアレイ手技を採用して、以下の大組織標本から調達された組織に関するリンタンパク質残基のエンドポイントの経時変化解析を行った。ａ）罹患していない子宮、子宮内膜、および子宮筋層、ｂ）子宮平滑筋腫、ｃ）罹患していない大腸粘膜および粘膜下組織、ｄ）罹患していない肺、およびｅ）肺腺癌。「タイムゼロ」ウィンドウを括弧でくくる手段として、患者からの採取直後にかかる時間、例えば、５分、１０分、および２０分を特に重視した。これは、組織を３７℃から室温まで冷却したことによって最初に起こる変化を観察できるように行った。子宮の場合、９０分まで延長した時点でも試料を採取した。エンドポイントは、成長因子受容体、生存促進、およびストレス経路関連タンパク質を網羅するよう選択した（図２）。各時点の試料の細胞含有物は、１６ゲージの針生検の容積を表した。８μで切断した２０の連続する凍結切片を処理および溶解した。各シグナル伝達タンパク質エンドポイントは、総細胞タンパク質内容に対して正規化した。すべてのエンドポイントは、収率、線形性、および精密性に関して既に確認されている（上記のＳｈｅｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５））。リンタンパク質エンドポイントレベルの変化は、組織採取直後に測定した定量値のパーセントとして表した。
【００９２】
結果  １）収率：得られた組織細胞容積は極めて適正であり、背景（一次抗体なしの値）の１０倍以上も広い範囲であり、かつアッセイの線形範囲内で各リンタンパク質エンドポイントが測定された。各組織試料の時点ライセートに対して１５０μＬ容積の５％未満を使用し、図２に示す１２のエンドポイントを分析した。２）安定性の経時変化：図２Ａ〜２Ｅに示されるように、調達直後に、選択リンタンパク質標的に変動が生じた。一部のエンドポイントは時間とともに一時的に増加したが、他のエンドポイントは、緩やかな減少を呈した。図２Ａ〜２Ｅに示すリンタンパク質は、組織の安定状態の判断に使用できる一群の内因性代理の典型的なメンバーを表す。本発明の一実施形態において、検者は、関心対象の試料（例えば、細胞または組織を含む）が、分子診断分析に供されるために適切な保存状態にあるかどうかを判断する。別の実施形態において、検者は、関心対象の試料を対象から採取してからどれだけの期間が経ったかを判断する。この実施形態において、検者は、１つ以上の内因性リンタンパク質のリン酸化状態を、タンパク質のリン酸化状態の経時変化を示す較正曲線と比較する。ここに提示したデータは、提案した代理の実現可能性と、選択した方法の適切性を支持する。
【００９３】
子宮組織のみを試験したことを除いて、さらなる経時変化を上記のように行い、選択したエンドポイントは、生存促進、ストレス、およびアポトーシス経路内であった。室温および４℃での経時変化の設計を図３に示す。リン酸化状態の変化は、４℃で減速したが停止しなかった。内因性マーカーが、様々な用途に対して代理マーカーとして機能し得るということは、実施例において提示された経時変化から明らかである。
【００９４】
実施例ＩＩＩ．組織リンタンパク質安定剤の同定
以下の固定剤および／または安定剤のうちの１つ以上の組み合わせを含む、保存溶液の候補を評価した。ａ）市販のホスファターゼ阻害剤、ｂ）市販のキナーゼおよびプロテイナーゼ阻害剤、ｃ）３０％スクロース、１５％トレハロース安定剤、ｄ）市販のＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ、ｅ）市販のＣｙｔｏＬｙｔ、ｆ）中性洗剤、およびｇ）沈殿固定剤（表３および４、ならびに図４および５を参照）。この解析に基づいて、適切な組み合わせを選択し、室温または４℃で２４時間保存するために有効な保存剤の候補を生成することができる。
【００９５】
【表３】
2010515012.tif 000006
【００９６】
【表４】
2010515012.tif 000007
【００９７】
固定剤の研究
第１の研究
リン酸プロテオーム保存および固定のための１０の異なる化学安定剤において、細針吸引（ＦＮＡ）試料を研究した（化学式については表３を参照）。リン酸タンパク質の相対保存に関して、様々な水中濃度を比較した液体試験：エタノール／メタノールの沈殿固定剤の結果を、２４時間における相互の比較を図４に示す。
【００９８】
その後、様々な溶液について、凍結切片の切断または顕微解剖を可能にし、リンタンパク質の安定性を得るそれらの能力を試験した。図５に示されるように、エタノール単独、アセトン単独、ＰＥＧ単独、またはそれらの組み合わせは、これらの能力において十分に機能しないことを発見した。しかしながら、水と低比率のメタノールまたはエタノールの組み合わせを使用する場合（例えば、水中の１０％メタノール）、凍結は阻止されず、凍結切片を切断することができ、組織構造はＬＣＭ（レーザー捕捉顕微解剖）のために許容可能である（表２−１〜表２−３）。凍結切片の調製に適した条件の例については、図１１および１２も参照されたい。
【００９９】
リアルタイムの室温出荷条件から得られたメタノール：水またはエタノール：水固定剤中のリンタンパク質を、スナップ凍結した試料と比較した。図６Ａ、６Ｂ、および７に示すように、研究した選択エンドポイントは、２つの方法が同等であることを示した。
【０１００】
第２の研究、リンタンパク質固定剤をさらに評価する
組織リンタンパク質安定剤の候補を同定するためのさらなる研究において、様々な固定剤ベースを、いくつかの阻害剤の組み合わせを用いて試験した。本研究は、本質的に上記のとおり行った。
【０１０１】
表２−１〜表２−３および３に列挙した一連の化学物質について、リンタンパク質エンドポイントの安定化を試験した。４つの異なる安定化学物質について、選択したリンタンパク質エンドポイントの保存を比較した。様々な経路にわたる、２６のポイントを評価した（表１）。研究のために選択した４つの不安定リンタンパク質エンドポイント−ＣＣ３  Ｄｌ７５、ＳＴＡＴｌ  Ｙ７０１、ＡＳＫｌ  Ｓｅｒ８３、ＥＧＦＲ  Ｙ１１４８−は、最初の３０〜９０分以内に変動することが分かった。データは、切除から１５分後の値を候補保存剤に浸漬させて２４時間後の値と比較した場合に、固定剤および添加剤の種類が、個別の組織検体の保存に影響することを示した。プロテアーゼ、キナーゼ、およびホスファターゼ阻害剤の添加は、特定のエンドポイントの安定化に必要であると考えられる。
【０１０２】
第３の研究、リンタンパク質固定剤をさらに評価する
大腸組織を８５％エタノール中で固定し、凍結および切断した。本手順は、少なくとも組織がＯＣＴに結合しなかったことにより、凍結切片に穴が残り、凍結切片に適した組織を提供しなかった。ＯＣＴは、凍結切片を切断するためにチャックに接着するよう組織が配置される標準の当業界で認識されるゲルである。ＯＣＴゲルを組織上に噴出し、ブロック全体を凍結した後スライスする。抗凍結として作用する他の高率固定剤、例えば８５％メタノール中での保存も、凍結に適さないことが分かった。対照的に、組織（例えば、乳房組織）を５つの有意に低率の固定剤（例えば、４０％メタノール）を含有する保存剤に固定し、４℃で３０日間保存した後、凍結および切断した結果、穴のない平滑な凍結切片を生じた。この固定およびスライス手順には、ホルマリンもパラフィンも使用しなかった。
【０１０３】
第４の研究、形態を保存するための条件を評価する
形態の保存は、診断および顕微解剖の両方に重要である。細胞以下の小器官の形態保存は、組織の内塊への沈殿固定剤浸透の組織学的評価基準である。この実施例（図１１および１２に示す）は、本発明の組成物における組織インキュベーションから２４時間後の組織の形態に対する浸透増強剤ＰＥＧの添加の劇的な影響を示す。例えば、浸透増強剤ＰＥＧの存在下で、組織内塊における上皮腺の核形態は良好に保存されるが（図１１Ｆ）、ＰＥＧの不在下では、上皮細胞核の保存は完全に欠損した（図１１４Ｄ）。図１２に示されるように、本組成物（化学的性質）は、レーザー捕捉顕微解剖に適しており、有効性は９５％以上である。
【０１０４】
第５の研究、リンタンパク質を安定化する従来の固定剤の欠陥を示す
様々な種類の腫瘍組織を一連の従来の保存剤中でインキュベートし、保存剤が、選択したリンタンパク質を安定化できるかどうかを判断した。表５に示されるように、全体として、試験した保存剤は、試験した５つのリンタンパク質の大部分を安定化できなかった。
【０１０５】
簡潔に述べると、ガストリノーマ／肝臓、中皮腫、および副甲状腺腫瘍から得た腫瘍組織を、５つの針の挿入によって試験し、表５に列挙した保存剤に配置した。「溶解緩衝液」と標識される試料は、溶解直後に凍結したため、リンタンパク質が全く変性しなかった正の対照を表す。細胞タンパク質の即時溶解および変性は、標準Ｐｉｅｒｃｅ組織タンパク質抽出緩衝剤（Ｔ−ＰＥＲ）によって、追加のＳＤＳ、変性試薬、および洗剤を用いて得られた。細胞試料を、２４時間列挙した保存剤に４℃で保存した後、列挙したリンタンパク質エンドポイントを測定した。ＲＰＭＩ媒体において、組織は生きたままであり、リンタンパク質の値に大きな変動が見られた。一部の値はゼロまで落ちたが、他の値は、新しく溶解した細胞ベースラインと比較して顕著に上昇した。特に、細胞病理学用の標準沈殿固定剤である７０％エタノールとＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔは、リンエンドポイントの有意な再現可能な変性を生じたことに留意されたい。それらは、細胞または組織出荷の典型的な時間遅延である、２４時間の保存期間中に主要シグナルタンパク質のリン酸化状態を安定化できなかった。表中の数字は、本明細書に記載のＲＰＡ手技を使用した場合の相対規格化強度値である。
【０１０６】
【表５】
2010515012.tif 000008
【０１０７】
第の６研究  ホスファターゼ阻害剤またはキナーゼ阻害剤の影響を示す
乳房の腫瘍および乳房の脂肪組織から採取した試料を、以下の安定化添加剤：ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ緩衝食塩水）のみ、ＨＢＳＳ＋ホスファターゼ阻害剤、オルトバナジン酸（１００〜４００ｍＭ）およびβグリセロリン酸（３７５ｍＭ〜１．５Ｍ）、またはＨＢＳＳ＋キナーゼ阻害剤、スタウロスポリン（５．０μＭ〜２０．０μＭ）およびゲニステイン（０．５μＭ〜２．０μＭ）を含有する３つの固定剤のうちの１つに入れ、２１０分間室温で置いた。図８に示される時点で試料を採取し、ＡｃＣｏＡ（Ｓ７９）、ＡＫＴ（Ｓ４７３）、Ｅ−カドヘリン、ＨＳＰ９０、１ＫＢａ（Ｓ３２）、ＣＣ３（Ａｓｐｌ７５）、ＣＣ９（Ａｓｐ３３０）、ＶＥＧＦＲ２（Ｙ１１７５）、ＳＴＡＴ３（Ｓ７２７）、ＡＳＫ１（Ｓ８３）、ＭＡＲＣＫＳ（Ｓ１５２）、ＥＲＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）、βカテニン（Ｓ３３／Ｓ３７／Ｔ４１）、ＩＲＳ−１（Ｓ６１２）、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒｌ８３／Ｔｙｒｌ８５）、およびＨｅｒ３（Ｔｙｒｌ２８９）を含む、様々なリンエンドポイントのリン酸化レベルに関して本明細書の他の箇所で記載されるＲＰＭＡ手順によって解析した。
【０１０８】
リン酸化の程度は、複雑な代謝事象（タンパク質へのリン酸基の追加と除去のバランス）を反映して、試験したリンエンドポイント間で大幅に異なった。すべての実施例において、ＨＢＳＳ担体のみにおける組織のインキュベーションは、結果として、翻訳後修飾されたタンパク質のレベルを経時的に減少させた（図８Ａ〜図８Ｄ）。ホスファターゼ阻害剤の存在下における過度のリン酸化の例として、ホスファターゼ阻害剤のみが存在する場合（ＨＢＳＳ＋ホスファターゼ阻害剤）、ＨＢＳＳのみまたはＨＢＳＳ＋キナーゼ阻害剤の場合と比較して、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ  Ｔｈｒｌ８３／Ｔｙｒｌ８５およびＨｅｒ３  Ｔｙｒｌ２８９のレベルを経時的に増加させた（ＳＡＰＫ／ＪＮＫおよびＨｅｒ３について、それぞれ図８Ａおよび８Ｃを参照）。キナーゼ阻害剤のみが存在する場合において、これらの同一リンタンパク質レベルは、経時的に比較的安定していた。他のエンドポイント（例えば、βカテニン（Ｓ３３／Ｓ３７／Ｔ４１）に関して、ＨＢＳＳ＋キナーゼ阻害剤は、他の２つの固定剤のいずれかと比較して、リン酸化のレベルを経時的に安定化した（図８Ｂ）。その他の場合（例えば、ＣＣ３（Ａｓｐｌ７５）、ホスファターゼまたはキナーゼ阻害剤の添加が、ＨＢＳＳ単独と比較して、タンパク質の開裂形状を安定化した（図８Ｄを参照）。これらの発見は、細胞または組織を固定する場合に、適切な平衡量で、ホスファターゼおよびキナーゼ阻害剤の両方を含むことが好ましいことを強調する。
【０１０９】
実施例ＩＶ．ナノ粒子ベースのリン酸プロテオームセンチネル
リン酸化タンパク質を含むナノ粒子は、試料中のリンタンパク質の保存状態に対するマーカーとして機能し得る。
【０１１０】
本実施例において、ナノ粒子を厚みの異なる組織を用いてインキュベートする。蛍光標識した粒子による組織の透過は、顕微鏡検査によって示される。必要に応じて、組織を凍結切片に切断し、レーザー捕捉顕微解剖を使用して、選択した細胞を単離することができる。細胞（凍結または室温のいずれか）を溶解し、含有物を可溶化する。その後、磁石を使用して、放出された粒子を細胞ライセートから精製する。洗浄後、精製した粒子をマイクロアレイ上（例えば、ＲＰＭＡを使用して測定されるタンパク質ライセートと同一の基質上）に配置する。ナノ粒子からのリン特異的エピトープの損失を、細胞タンパク質ライセート中のリンプロテオームエンドポイントの変化と比較する。
【０１１１】
実施例Ｖ．フローサイトメトリーによる解析中の細胞サイズおよび形態に対する本発明の保存剤の影響の解析
細胞表面受容体糖タンパク質ＣＤ４は、抗体−抗原相互作用および細胞のサイズならびに形態に対する保存剤の影響を評価するための代表的タンパク質として選択した。ＣＤ４は、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞の表面上に発現するため、白血球（ＷＢＣ）を含有する末梢血液試料中に存在するであろう。
【０１１２】
末梢血液をＦｉｃｏｌｌ密度勾配媒体で処理し、豊富なＷＢＣ（軟膜）源を提供した。フローサイトメトリーのために、この軟膜細胞懸濁液を４つのアリコート、すなわち、１．アイソタイプ抗体染色のための未処理の細胞、２．保存剤で処理した後に染色した細胞、１０〜２０％エタノール、０．５〜５％ＰＥＧ、オルトバナジン酸を含むＨＢＳＳ（１００〜４００ｍＭ）、βグリセロリン酸（３７５ｍＭ〜１．５Ｍ）、スタウロスポリン（５．０μＭ〜２０．０μＭ）、およびゲニステイン（０．５μＭ〜２．０μＭ）、３．最初に染色した後、固定剤で処理した細胞、または４．未処理の細胞、固定剤なし（対照）に分割した。
【０１１３】
本解析の結果を図１３に示す。固定剤で処理した細胞に関して、未処理の細胞と比較した場合に、前方散乱解析は細胞サイズの一貫性を示し、側方散乱解析は細胞形態の一貫性を示す。（Ａ）未処理の細胞をＦＩＴＣ共役したアイソタイプ抗体対照（ＩｇＧ１，ｋａｐｐａ）で染色した。（Ｂ）本明細書に記載の固定剤を用いて、細胞を２０分間固定した。その後、細胞を２回洗浄し、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣで染色した。（Ｃ）最初に細胞を抗ＣＤ４−ＦＩＴＣで染色し、２回洗浄した後、本明細書に記載の固定剤を用いた固定に供した。（Ｄ）未処理の細胞を抗ＣＤ４−ＦＩＴＣで染色し、２回洗浄して、フローサイトメトリー（固定剤なし）によって解析した。保存剤の添加は、細胞のサイズまたは形態に有意に影響せず、フローサイトメトリーのための抗体染色も干渉しなかった。
【０１１４】
前述の説明から、当業者は、本発明の本質的特質を容易に確認することができ、その精神および範囲を逸脱することなく、本発明の変更および修正を行い、様々な用途および条件に適合させ、本発明を最大限に利用することができる。前述の好ましい特定実施形態は、単なる例示として解釈されるものであり、本発明の範囲をいかようにも限定しない。２００６年１０月３０日出願の米国暫定特許出願第６０／８５５，１２０、および２００６年１１月２７日出願の米国暫定特許出願第６０／８６１，０８６を含む、上で引用したすべての出願、特許、および発行物の全体開示、および図面における全体開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2010515012.tif 000009
【図２】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ−１３Ｄ】
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