(57)【要約】  本発明は、生細胞を接着、増殖及び分化させる内部及び外部の空間を与える非生分解性ポリマー及び非細胞毒性ポリマーから形成される三次元構築物に関する。この構築物は、設計した三次元パターンで共に連結するポリマー支柱及び／又は繊維から構成される。三次元細胞培養構築物（細胞培養インサート）は、通常の細胞培養条件下で、細胞／組織培養プレート、組織培養フラスコ、バイオリアクタ等と共に使用するのを目的とする。本発明はさらに、三次元細胞培養構築物を製造する方法を提供する。最終的に本発明は、他の細胞培養供給物と共にパッケージ内に１つ又は複数の三次元多孔質細胞培養構築物を有するキット（組織培養プレート及びフラスコ等）を提供する。
2010517590.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が細胞培養培地中で接着するように、堅固な多孔質の三次元設計パターンで連結する支柱及び／又は繊維を含む、三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項２】
細胞が細胞培養培地中で接着するように、多孔質の三次元設計パターンで連結する支柱及び／又は繊維を含む、三次元多孔質細胞培養構築物であって、平均孔径が１５ミクロン〜１０００ミクロン、２５ミクロン〜５００ミクロン、又は５０ミクロン〜１００ミクロンである、三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項３】
細胞が細胞培養培地中で接着するように、多孔質の三次元設計パターンで連結する支柱及び／又は繊維を含む、三次元多孔質細胞培養構築物であって、孔分布が、約５０％、約８０％又は約９５％を超える、三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項４】
前記支柱及び／又は繊維が共に互いに織り込まれているか、又は互いに角度を成して連結する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項５】
前記角度が、直角、鋭角及び鈍角から成る群から選択される、請求項４に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項６】
前記支柱及び／又は繊維がポリマーを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項７】
前記ポリマーが、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド、ポリ塩化ビニル及びそれらの組合せから成る群から選択される、請求項６に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項８】
前記支柱及び／又は繊維の直径が一定である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項９】
前記支柱及び／又は繊維の直径が様々である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項１０】
横断面が、円形、三角形、四角形、長方形、星形、不規則形又はそれらの組合せから成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項１１】
前記支柱及び／又は繊維を、基材に対して斜めに、水平に、垂直に及びそれらの組合せから成る群から選択されるように配置する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項１２】
前記孔の平均孔径が、１５ミクロン〜１０００ミクロン、２５ミクロン〜５００ミクロン、又は５０ミクロン〜１００ミクロンを超える、請求項１又は３のいずれか一項に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項１３】
前記孔のサイズ及び／又は寸法が一定である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項１４】
前記孔のサイズ及び／又は寸法が可変である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項１５】
前記構築物の基材に対して水平である面上の前記孔のサイズ及び／又は寸法が一定である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項１６】
前記構築物の基材に対して水平である面上の孔のサイズ及び／又は寸法が、該構築物の基材に対して水平である別の面上の孔とは異なる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項１７】
前記構築物の基材に対して水平である面上の孔のサイズ及び／又は寸法が、さらに該基材の隣接面上の孔と同じであるか又は減少している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項１８】
前記構築物の基材に対して水平である少なくとも１つの面上の孔のサイズ及び／又は寸法が、さらに該基材の隣接面上の孔に対して減少している、請求項１７のいずれか一項に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項１９】
前記基材に対して水平である面上の前記孔のサイズ及び／又は寸法が、同じ面上の孔とは異なる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項２０】
前記構築物中に含浸させた生体分子をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項２１】
前記生体分子が、タンパク質、ペプチド、グリコアミノグリカン、天然化合物又はポリマー、治療剤及びそれらの組合せから成る群から選択される、請求項２０に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項２２】
前記天然化合物又はポリマーが、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン及びそれらの組合せから成る群から選択される、請求項２１に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項２３】
前記治療剤が、抗生剤、ホルモン剤、成長因子、抗腫瘍剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、抗感染剤、創傷治癒剤、創傷封止剤、細胞誘引剤、サイトカイン及びそれらの組合せから成る群から選択される、請求項２１に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項２４】
前記表面の少なくとも一部分を、前記支柱及び／又は繊維との細胞接着を改善するように修飾する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項２５】
生理化学的手段、化学的手段、コーティング手段及びそれらの組合せから成る群から選択される技法で前記表面を修飾する、請求項２４に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項２６】
前記生理化学的手段が、プラズマ処理、グロー放電及びそれらの組合せから成る群から選択される、請求項２５に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項２７】
前記化学的手段が、酸又は塩基による処理から成る群から選択される、請求項２５に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項２８】
前記酸が、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３、ＨＣｌ、Ｈ３ＰＯ４、Ｈ２ＣｒＯ４及びそれらの組合せから成る群から選択される、請求項２７に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項２９】
前記塩基が、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｂａ（ＯＨ）２、ＣｓＯＨ、Ｓｒ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、ＬｉＯＨ、ＲｂＯＨ及びそれらの組合せから成る群から選択される、請求項２７に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項３０】
前記コーティング手段が、前記支柱及び／又は繊維の材料とは異なるコーティング物質を塗布することを含む、請求項２５に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項３１】
前記コーティング物質が、前記支柱及び／又は繊維の表面と共有結合する、請求項３０に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項３２】
前記コーティング物質が、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力及びそれらの組合せによって前記支柱及び／又は繊維と結合する、請求項３０に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項３３】
前記コーティング物質を、前記支柱及び／又は繊維上で架橋する、請求項３０に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項３４】
前記コーティング物質を、化学的手段、熱的手段、放射線及びそれらの組合せから成る群から選択される技法によって架橋する、請求項３３に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項３５】
前記コーティング物質を高温真空下で架橋する、請求項３３に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項３６】
前記放射線が、電子線、ガンマ線、紫外線及びそれらの組合せから成る群から選択される、請求項３４に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項３７】
前記コーティング物質が、タンパク質、ペプチド、グリコアミノグリカン、天然化合物又はポリマー、合成化合物又はポリマー、有機物質、無機物質、治療剤及びそれらの組合せから成る群から選択される、請求項３０に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項３８】
前記天然化合物又はポリマーが、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外基質分子及びそれらの組合せから成る群から選択される、請求項３７に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項３９】
前記合成化合物又はポリマーが、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルポリピロリドン、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリリシン及びそれらの組合せから成る群から選択される、請求項３７に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項４０】
前記有機物質が、ゼラチン、キトサン、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びそれらの組合せから成る群から選択される、請求項３７に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項４１】
前記無機物質が、リン酸カルシウム、ＴｉＯ２、ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３及びそれらの組合せから成る群から選択される、請求項３７に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項４２】
前記コーティング物質が、２つ以上の有機材料をコーティングした複合材料である、請求項３７に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項４３】
前記コーティング物質が、２つ以上の無機材料をコーティングした複合材料である、請求項３７に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項４４】
前記コーティング物質が、無機材料と有機材料とをコーティングした複合材料である、請求項３７に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項４５】
前記コーティング物質が、少なくとも１つの無機材料と１つの有機材料とをコーティングした複合材料である、請求項４４に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項４６】
前記複合材料が、リン酸カルシウム／コラーゲン複合材料、リン酸カルシウム／ポリエチレングリコール複合材料、及びリン酸カルシウム／細胞外基質から成る群から選択される、請求項４４に記載の三次元多孔質細胞培養構築物。
【請求項４７】
三次元細胞培養構築物上で細胞を成長させる方法であって、
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養構築物の表面上に或る容量の細胞懸濁液を添加すること、
（ｂ）十分な期間、細胞懸濁液中の前記細胞を前記細胞培養構築物に接着させること、
（ｃ）細胞培養プレート、細胞培養皿又はバイオリアクタから成る群から選択される細胞培養装置内で、前記細胞培養構築物を成長培地に浸漬することを含む、三次元細胞培養構築物上で細胞を成長させる方法。
【請求項４８】
三次元細胞培養構築物上で細胞を成長させる方法であって、
（ａ）スピナーフラスコ内で細胞懸濁液中に請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養構築物を浸すことであって、該フラスコは細胞の維持に適したインキュベータに入れられる、浸すこと、
（ｂ）十分な期間、細胞懸濁液中の前記細胞を前記細胞培養構築物に接着させること、
（ｃ）細胞培養プレート、細胞培養皿又はバイオリアクタから成る群から選択される細胞培養装置内で、前記細胞培養構築物を成長培地に浸漬することを含む、三次元細胞培養構築物上で細胞を成長させる方法。
【請求項４９】
細胞培養インサートを製造する方法であって、
（ａ）支柱及び／又は繊維を含む連続した層を加えることによって、細胞培養インサートを集合化させること、
（ｃ）プラズマ処理又は表面コーティングによって、集合化した細胞培養インサートの表面を処理すること、
（ｄ）放射線を使用して、前記細胞培養インサートを滅菌すること、及び
（ｅ）前記細胞培養インサートをパッケージングすることを含む、細胞培養インサートを製造する方法。
【請求項５０】
前記製造方法が、押出成形、射出成形、繊維製織、結合及びそれらの組合せから成る群から選択されるポリマー処理法を含む、請求項４９に記載の細胞培養インサートを製造する方法。
【請求項５１】
三次元多孔質細胞培養構築物を製造する方法であって、
（ａ）支柱及び／又は繊維を含む連続した層を加えることによって、細胞培養インサートを集合化させること、及び
（ｂ）所定容量の前記細胞培養構築物に対して、前記支柱及び／又は繊維の数を変えること、又は
（ｃ）所定容量の前記細胞培養構築物に対して、前記支柱及び／又は繊維の直径を変えることを含む、三次元多孔質細胞培養構築物を製造する方法。
【請求項５２】
三次元多孔質細胞培養構築物を製造する方法であって、
（ａ）支柱及び／又は繊維を含む連続した層を加えることによって、細胞培養インサートを集合化させること、及び
（ｂ）所定のサイズ及び寸法の孔を与える角度で互いに関連して前記支柱及び／又は繊維を配置することを含む、三次元多孔質細胞培養構築物を製造する方法。
【請求項５３】
前記角度が約９０度である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記角度が９０度より小さい、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記角度が９０度より大きい、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養構築物と細胞培養プレートとを有するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生細胞を接着、増殖及び分化させる多孔質の三次元細胞培養構築物であって、非生分解性ポリマー材料、好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド及びポリ塩化ビニルでできている、三次元細胞培養構築物に関する。本発明は、構築物を形成及び製造する方法であって、具体的には予め作製した構造体の層集合による層の使用を伴う、方法をさらに提供する。細胞培養構築物は、細胞培養皿、細胞培養プレート、細胞培養フラスコ、細胞培養バッグ及びバイオリアクタ等の従来の細胞培養容器内で使用することができる。
【０００２】
本願は、米国仮特許出願第６０／８８９５８０号（その開示は、参照により本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
二次元（２Ｄ）で細胞を培養することは、細胞を調製、観察及び研究するのに、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの調合薬、生物学的因子及び生体材料と細胞との相互作用を研究するのに都合の良い方法であるが、一方で、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞成長様式を模倣しない。実際の生体では、細胞が三次元（３Ｄ）で成長し、三次元の生組織又は器官を構築することが多い。新たな証拠が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの３Ｄ細胞培養系によって、正常及び病的な組織条件下での構造−機能の関連性の理解が容易になり得ることを示している。このような機能的且つ形態学的な相互作用を研究するために、何人かの研究者等は、コラーゲンゲル［非特許文献１］、ゼラチン、フィブリン、アガロース及びアルギン酸塩［非特許文献２、非特許文献３］等の三次元ゲル基材の使用を研究している。これらのゲル系は、細胞が三次元で成長するように、ゲル基質内で細胞を培養した。近年の研究によって、三次元のアルギン酸塩又はアガロースゲル系中で培養したヒト椎間円板細胞が、様々な形態、単層成長細胞に比べてのプロテオグリカン合成の増大、並びに細胞の周囲及び細胞間に付着した細胞外基質による多細胞（multi-celled）コロニーの形成を示したことが分かっている［非特許文献２、非特許文献３］。さらにまた、三次元のアルギン酸ゲル系で培養したヒト椎間円板細胞は、単層細胞培養では見出されなかったＩ型及びＩＩ型コラーゲン生成の兆候を示した［非特許文献４］。３Ｄでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ動物細胞成長は、正常な上皮極性及び分化を促進する［非特許文献５］。細胞はより迅速に移動及び分裂し、生組織における細胞のものに対して、特徴的な非対称の形状を有する［非特許文献６］。
【０００４】
細胞と成長因子との間、及び細胞と薬剤との間の相互作用を研究するのにも、三次元細胞培は利用された。例えば、腫瘍発生成長因子に対する受容体が標準的な二次元組織培養プレートに比して異なる方法で発現するので、癌細胞の三次元細胞培養によって、癌生物学に関する多くの基礎的な課題の検討が可能になる［非特許文献７、非特許文献８］。乳癌では、三次元培養物によって、癌細胞増殖の調節を理解するため及び様々な抗癌薬を評価するためのモデル系が与えられる［非特許文献９、非特許文献１０］。３Ｄ培養で成長する細胞が、単層又は分散培養物における細胞よりも細胞毒性剤に耐性があるという証拠がかなりの量存在する。多くの研究によって、単層における細胞に比べてスフェロイド培養物の高レベルの薬剤耐性が実証されている［非特許文献１１］。初めに、研究者等は、スフェロイドの薬剤耐性は内部細胞への薬剤の拡散が弱いことに起因すると考えたが、今日では三次元培養において、単に栄養素への接近が不可能であるというよりも、薬剤耐性を明らかにしたためにすぎないということが証明されている［非特許文献１２、非特許文献１３］。さらなる研究によって、３Ｄ培養が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗癌薬の細胞毒性評価に対するより良好なモデルであることが確認された［非特許文献１４］。
【０００５】
証拠が増えつつあることで、三次元（３Ｄ）環境が、細胞機能の機能的機序も示すこと、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの３Ｄ培養系によって、正常及び病的な条件下での構造−機能の関連性の理解が容易になり得ることが示される［非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９］。今日では、骨及び軟骨由来細胞が、三次元（３Ｄ）で二次元（２Ｄ）環境とは異なった挙動をすること、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの３Ｄ培養系が、二次元（２Ｄ）培養物よりも密接にｉｎ  ｖｉｖｏ状況を模倣することが広く受け入れられている［非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２］。近年の研究では、３つのヒト骨形成細胞株及び正常なヒト骨形成（ＨＯＳＴ）細胞をヒドロキシプロピルメチルセルロースヒドロゲル基質内で３Ｄで培養することで、骨肉腫細胞がコロニー形成スフェロイドとして増殖すること、及びＨＯＳＴコロニーが少なくとも３週間生存することが実証された。骨芽マーカー及びサイトカインの無機化アッセイ及び遺伝子発現解析によって、このヒドロゲル基質において３Ｄで培養した細胞は全て、プラスチック製の細胞培養プレート上に単層で培養した細胞よりもより成熟した分化状態を示したことが示されている［非特許文献２３］。
【０００６】
今までのところ、３Ｄ環境で細胞を培養することによって、２Ｄ培養環境を上回る大きな利点が与えられる証拠が明確に示されている。しかしながら、現行の３Dゲル系では培養細胞はゲル基質内に埋包されるため、ゲルの制限された拡散性によって培養細胞の栄養素及び代謝産物の交換が困難となっている。また、２Ｄ細胞培養プレートにおける培養細胞とは異なり（この場合、トリプシン溶液を使用して培養プレートから細胞を容易に分離した後、遠心分離によって単離することができる）、３Ｄゲル系で培養した細胞は、培養細胞がゲル内に埋包しているので回収又は単離するのが困難である。さらに、ゲル基質内の培養細胞は、培養する前に毎回ゲル系を調製する必要があり、これは特に大量の培養物を調製する必要がある場合に、研究者等にとって不都合であるだけでなく、様々な研究者等及び研究所間でゲル調製がわずかに変わるので、異なるゲル調製群間で不一致が起こる。
【０００７】
現在利用可能な３Ｄゲル培養系の使用に関連する上記で言及した課題のために、３Ｄ培養物がもたらす利点があるにもかからわず、２Ｄ細胞培養が依然として細胞培養法としては好まれている。したがって、現行の２Ｄ細胞培養系の利便性を全てもたらす３Ｄ培養系は、薬学分野、ライフサイエンス分野及び生体工学研究分野で非常に価値がある。理想的な３Ｄ培養系には以下の特徴がある：
１．３Ｄ細胞又は組織の形成を促進する、外部表面及び内部空間で細胞接着を可能にする３Ｄ構造である。
２．細胞接着のために表面又は内部格子を与える、水平、垂直又は斜めに配置した支柱（struts）又は繊維を有する。
３．細胞が、３Ｄ構造の外面及び内面の両方と接着することができるような多孔質の３Ｄ構造を有する。多孔質構造は、栄養素及び代謝産物の比較的容易な交換を可能にする。
４．３Ｄ構造は、現行の２Ｄ細胞培養プレート及び２Ｄ細胞培養皿並びにバイオリアクタと共に使用するのが容易であるものとする。３Ｄ構築物は、２Ｄ細胞培養皿若しくは２Ｄ細胞培養プレートのウェル又はバイオリアクタのチャンバ内に簡単に入れることができる。
５．構造物は、現行の２Ｄ細胞培養系で使用する材料（特にポリスチレン）等の非細胞毒性材料及び非生分解性材料でできているものとする。非細胞毒性とは、細胞が死滅しないか、又は負の影響を受けないことを意味するのではなく、一般的な細胞集団が、そのままｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で生存可能であることを意味する。
６．構造体は、細胞培養プロセス中に構造を変形及び変化させることなく、細胞培養法の正常な機械的取扱いに耐えるのに十分、堅固であるものとする。
【０００８】
ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン及びポリカーボネートは、非生分解性ポリマーであり、二次元（２Ｄ）細胞培養を行うための基質材料として使用されている。上記で言及したポリマーでできている細胞培養容器及び膜が広く使用されており、多くの供給元から多くの様々なサイズ及び形状で市販されている。細胞又は組織の培養を行う研究者等はこれらのポリマーに非常に精通しているので、これらのポリマーでできている３Ｄ培養系には、３Ｄ培養環境の利点が与えられるだけでなく、２Ｄ細胞培養系では与えられ得ない多くの他の利点（規定の表面特性及び使いやすさ等）も与えられると考えられる。
【０００９】
細胞培養のための３Ｄ基質の作製におけるポリスチレンの使用は、十分には研究されていない。近年、Baker et al.（非特許文献２４）が、エレクトロスピニング法を用いて、３Ｄ多孔質繊維状ポリスチレン基質を作製したことを報告した。得られた３Ｄ繊維状ポリスチレン基質は、繊維間の空間が多孔質空間として働く不織マットであった。この研究によって、これらのポリスチレン３Ｄ繊維状スカフォールドが、２Ｄポリスチレン細胞培養プレート系を補完することが示唆された。しかしながら、これらの繊維状ポリスチレン基質の欠点は、以下の通りである：繊維のサイズを制御することが困難である；孔径及び基質の形状が十分に規定されていない；平均孔径が小さく（約１５ミクロン）、元来繊維状基質が柔らかく、このことが基質を変形せずにはさらに細胞培養操作を行うことを困難にしている。哺乳動物細胞の平均サイズは、１０ミクロン〜１００ミクロンである。
【００１０】
他の研究者等は、日常的な細胞培養のためにより堅固な多孔質ポリスチレン基質を作製しようとも試みている。他の研究者等は、多孔質ポリスチレン構造を作製する鋳型として高内部相エマルジョン（ＨＩＰＥ）を使用した（非特許文献２５）。高度に多孔質の発泡スチロールは、ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）系から調製した。ヒトの神経細胞が、ポリ−ｄ−リシンコーティング表面にしっかりと接着し、神経突起を伸ばすことが研究によって示されている。また表面がラミニンコーティングを受けたときに、特に神経突起の伸長が高まった。しかしながら、発泡スチロールに関して、この発泡プロセスの固有の性質のために、孔径及び孔分布を十分に制御することができない、また非常に複雑で多孔質の構造が栄養素の交換を困難にしている等の幾つかの欠点もある。
【００１１】
現在市販の３Ｄ培養基質に関する上記で言及した欠点のために、３Ｄ培養で与えられ得る利点があるにもかかわらず、依然として２Ｄ細胞培養が主要な細胞培養法である。したがって、日常的な三次元細胞培養に関して規定の孔径及び多孔率を有する３Ｄ培養系には非常に価値がある。本発明は、３Ｄ細胞培養を行うのに、細胞培養容器へのインサート（insert：挿入物）として使用することができる３Ｄ細胞培養構築物を製造する方法を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Douglas WHJ, Moorman GW, and Teel RW, In Vitro, 1976; 12:373-381
【非特許文献２】Gruber HE, Fisher EC Jr, Desai B, Stasky AA, Hoelscher G, Hanley EN, Exp. Cell Res, 1997, 235:13-21
【非特許文献３】Gruber HE, Stasky AA, Hanley EN Jr, Matrix Biol, 1997; 16:285-288
【非特許文献４】Gruber HE and Hanley EN, Jr, BMC Musculoskeletal Disorders, 2000; 1: 1
【非特許文献５】Roskelley CD, Bissell MJ, Biochem Cell Biol, 1995; 73（7-8）:391-7
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【発明の概要】
【００１３】
細胞培養構築物
したがって本発明の目的は、細胞培養用途のために、組織培養プレート等の現行の２Ｄ組織培養系で使用する非分解性の多孔質３Ｄ細胞培養構築物を提供することである。また本発明の目的は、細胞接着のために内部及び外部の空間を与える３Ｄ細胞培養構築物を製造する方法を提供することである。この細胞培養構築物は、多孔率、孔径、表面積及び表面化学を含む規定の構造を有する。好ましくは、細胞培養構築物は、非分解性のポリマー材料でできている。ポリマー材料はポリスチレンであるのが好ましく、これは２Ｄマルチウェル細胞／組織培養プレート及びフラスコを作製するのに使用する。
【００１４】
３Ｄ構築物構造における支柱のサイズ及び形状、それぞれの単位体積における支柱／繊維の数、並びに支柱／繊維の構成パターンを含む構築物の設計によって、表面積、多孔率及び孔径が決定される。支柱は、繊維と同様に構造成分である。繊維は、糸長と同程度の分離した細片である。
【００１５】
したがって一実施の形態において、本発明は、細胞が細胞培養培地中で接着するように、堅固な多孔質３Ｄパターンで連結する支柱及び／又は繊維を含む３Ｄ多孔質細胞培養構築物を提供する。構築物は、構築後にその最終的な発現（manifestation）／組成が、日常的な操作下でその形状を維持するか、又は実質的に維持する場合に堅固であると考えられる。
【００１６】
したがって一実施の形態において、本発明は、細胞が細胞培養培地中で接着するように、多孔質の３Ｄパターンで連結する支柱及び／又は繊維を含む、３Ｄ多孔質細胞培養構築物であって、平均孔径が１５ミクロン〜１０００ミクロン、２５ミクロン〜５００ミクロン、又は５０ミクロン〜１００ミクロンである、３Ｄ多孔質細胞培養構築物を提供する。
【００１７】
したがって一実施の形態において、本発明は、細胞が細胞培養培地中で接着するように、多孔質の３Ｄパターンで連結する支柱及び／又は繊維を含む、３Ｄ多孔質細胞培養構築物であって、孔分布が、約５０％、約８０％又は約９５％を超える、３Ｄ多孔質細胞培養構築物を提供する。
【００１８】
特定の実施の形態において、上記細胞培養構築物は、任意の所定の水平面で均等に分布した孔を有する三次元多孔質構造である。均等な分布は、所定の領域の孔の数と、同じサイズ及び寸法を持つ別の所定の領域の孔の数を比較することで、求められる。絶対的に均等な孔分布では、ある平面の２箇所の相当領域を比較した結果は１００％である。同じ平面の２つの相当領域間の孔数の比（孔数が少ない領域を、孔数が多い領域と比較する）が５０％、又は８０％、又は９５％を超えると、平面に均等に分布されていると考えられる。
【００１９】
したがって一実施の形態において、本発明は、接合部において或る角度で共に連結する支柱及び／又は頑健な繊維から成る３Ｄ細胞培養構築物を提供する（図２及び図４）。さらに、支柱及び／又は繊維は共に織り込むことができる。
【００２０】
したがって一実施の形態において、本発明は、接合部で互いに直交する支柱及び／又は頑健な繊維から成る３Ｄ細胞培養構築物を提供する（図１〜図３、図５）。他の実施の形態では、支柱及び／又は繊維は、鋭角（９０度未満）又は鈍角（９０度超）で連結する。
【００２１】
特定の実施の形態において、上記細胞培養構築物は、三次元円板型多孔質構造物である。別の特定の実施の形態では、細胞培養構築物は、三次元立方型多孔質構造物である。
【００２２】
したがって一実施の形態において、本発明は、ポリマーである、支柱及び／又は頑健な繊維から成る３Ｄ細胞培養構築物を提供する。構築物は、支柱及び／又は繊維の断面図が様々な形状である、一定直径又は可変直径の支柱及び／又は繊維を有し得る。
【００２３】
したがって一実施の形態において、本発明は、細胞が互いとの、並びに支柱及び繊維との３Ｄ接着を介在及び形成する空間を与えるように、基材に対して水平、垂直又は斜めに配置する支柱及び／又は頑健な繊維から成る３Ｄ細胞培養構築物を提供する。
【００２４】
したがって一実施の形態において、本発明は、細胞が細胞培養培地中で接着するように、多孔質３Ｄパターンで連結する支柱及び／又は繊維を含む３Ｄ多孔質細胞培養構築物であって、一定のサイズ及び／又は寸法の孔、又は可変のサイズ及び／又は寸法の孔を有する、構築物を提供する。
【００２５】
したがって一実施の形態において、本発明は、支柱及び／又は繊維から成る３Ｄ細胞培養構築物を提供し、この支柱及び繊維は予め設計した様式又はパターンで共に連結する。特定の実施の形態では、該細胞培養構築物は、非細胞毒性及び非分解性のポリマーでできている支柱及び繊維から成る。細胞培養目的で現用されている標準的な材料（例えば細胞培養プレート及び細胞培養皿）と同様、材料は、非細胞毒性及び非分解性であると考えられる。より具体的な実施の形態では、該非分解性ポリマーはポリスチレンである。
【００２６】
特定の実施の形態において、細胞培養構築物に、１つ又は複数の生体分子を含浸させる。生体分子は、タンパク質、ペプチド、グリコアミノグリカン、天然化合物若しくはポリマー、治療剤又はそれらの組合せであり得る。
【００２７】
三次元細胞培養構築物上で細胞を成長させる別の方法は、スピナーフラスコ内で細胞懸濁液中に細胞培養構築物を浸すことであり、フラスコは細胞の維持に適したインキュベータに入れる。それから、細胞懸濁液中の細胞を十分な期間、細胞培養構築物に接着させた後、細胞培養プレート、細胞培養皿又はバイオリアクタ等の細胞培養装置内の成長培地中に細胞培養構築物を浸漬する。
【００２８】
特定の実施の形態において、本発明は、細胞培養インサートを製造する方法である。支柱及び／又は繊維を含む連続層を加えることによって、細胞培養インサートを集合化させる（assembled：組み立てる）。集合化した細胞培養インサートの表面を、プラズマ処理又は表面コーティングで処理する。最終的に、放射線を用いて細胞培養インサートを滅菌し、パッケージングする。さらに、用いるポリマー処理法は、射出成形、繊維製織、結合又はそれらの組合せである。
【００２９】
特定の実施の形態において、本発明は、三次元多孔質細胞培養構築物を製造する方法である。支柱及び／又は繊維を含む連続層を加えること、及び所定容量の細胞培養構築物に対して、支柱及び／又は繊維の数を変えること、所定容量の細胞培養構築物に対して、支柱及び／又は繊維の直径を変えることによって、細胞培養インサートを集合化させる。
【００３０】
特定の実施の形態において、本発明は、三次元多孔質細胞培養構築物を製造する方法である。支柱及び／又は繊維を含む連続層を加えること、並びに所定のサイズ及び寸法の孔を与える角度で互いに関連して支柱及び／又は繊維を配置することによって、細胞培養インサートを集合化させる。互いに対する支柱及び／又は繊維の角度は、およそ直角（９０度）である。代替的に、この角度は、鋭角（９０度未満）又は鈍角（９０度超）であり得る。
【００３１】
特定の実施の形態において、本発明は、三次元多孔質細胞培養構築物のキットである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】共に連結及び集合化した多層整列ポリマー繊維を含む細胞培養構築物を示す図である。
【図２】繊維配向及び繊維が共に連結する様式を示す、細胞培養構築物の一実施形態の断面図である。
【図３】図１の実施形態を形成するのに集合化された予め作製した層を示す図である。
【図４】共に連結及び集合化した多層整列ポリマー繊維を含む細胞培養構築物の別の実施形態を示す図である。
【図５】異なる立体配置の３Ｄ細胞培養構築物を形成する、集合化された予め作製した層の別の実施形態を示す図である。
【図６】異なる立体配置の３Ｄ細胞培養構築物を形成する、集合化された予め作製した層の別の実施形態を示す図である。
【図７】予め作製した層を集合化するのに、且つ３Ｄ細胞培養構築物において適所にこれらの層を固定するのに使用する繊維クラップ（clap）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、非分解性ポリマー材料、好ましくはポリスチレン又は組織培養プレート及びフラスコを作製するのに使用されている別のポリマーでできている、細胞接着のために内部及び外部の空間を与える三次元培養構築物を提供する。細胞培養構築物は、予め設計された様式又はパターンで共に連結する多層の相互接続した支柱及び／又は頑健な繊維から成る。このような立体配置が、細胞培養構築物の孔相互接続が１００％になるのを可能にする。細胞培養構築物の他に、本発明は、細胞培養構築物を作製する方法、細胞培養研究の場で細胞培養構築物を使用する方法も提供する。
【００３４】
立体配置
本発明の細胞培養構築物は、手軽に特定目的を達成する任意のサイズ及び形状、例えば細胞／組織培養プレート、フラスコ、及びバイオリアクタに適合するサイズ及び形状で構成され得る。
【００３５】
したがって一実施形態において、本発明は、支柱及び／又は繊維から成る３Ｄ細胞培養構築物を提供する。支柱及び繊維は、予め設計された様式又はパターンで共に連結する。一実施形態では、支柱及び／又は繊維は直角で連結する。別の実施形態では、支柱及び／又は繊維は鋭角（９０度未満）又は鈍角（９０度超）で連結する。
【００３６】
３Ｄ構築物構造における支柱のサイズ及び形状、それぞれの単位体積における支柱の数、並びに支柱の構成パターンを含む構築物の設計によって、細胞培養構築物の表面積、多孔率及び孔径が決定される。
【００３７】
したがって一実施形態において、本発明は、細胞が細胞培養培地中で接着するように、多孔質３Ｄパターンで連結した支柱及び／又は繊維を含む３Ｄ多孔質細胞培養構築物であって、直径が一定の支柱及び／又は繊維、又は直径が異なる支柱及び／又は繊維を有する、３Ｄ多孔質細胞培養構築物を提供する。さらに、支柱及び／又は繊維の横断面は、円形、三角形、四角形、長方形、星形、又は不規則形であり得る。
【００３８】
したがって一実施形態において、本発明は、細胞が互いとの、並びに支柱及び繊維との３Ｄ接着を介在及び形成する空間を提供するように、基材に対して水平、垂直又は斜めに配置した支柱及び／又は頑健な繊維から成る３Ｄ細胞培養構築物を提供する。
【００３９】
したがって一実施形態において、本発明は、結合部で互いに直交する支柱及び／又は頑健な繊維から成る３Ｄ細胞培養構築物を提供する。
【００４０】
したがって一実施形態において、本発明は、全てが結合部で互いと直交する訳ではなく、様々な角度で連結する支柱及び／又は繊維から成る３Ｄ細胞培養構築物を提供する。
【００４１】
特定の実施形態において、上記細胞培養構築物が、三次元円板型多孔質構造物である。別の特定の実施形態では、該細胞培養構築物は、三次元立方型多孔質構造物である。
【００４２】
特定の実施形態において、上記細胞培養構築物は、孔のサイズ及び／又は寸法が一定又は可変である。また構築物は、各平面で一定のサイズ及び／又は寸法の孔を有し得るが、各平面上の孔は、サイズ及び／又は寸法に関して平面間で異なる。代替的に、孔サイズ及び／又は寸法が変化しているのは、他の平面上の孔と比べて或る平面上でほんの１つ又は数個の孔だけであり得る。さらに、各平面上の孔に関するサイズ及び／又は寸法は、拡大又は縮小し得る。
【００４３】
寸法
本発明の細胞培養構築物は、標準サイズに予め作製してあってもよく、又は特定の細胞培養プレートウェル、チャンバ、フラスコ、バイオリアクタに適合するように特注してもよい。したがって一実施形態では、本発明は、市販の組織培養プレートの円形ウェルに適合するサイズ（直径及び高さの両方）で細胞培養構築物を提供する。別の実施形態では、本発明は、組織培養プレートの矩形ウェルに適合する立方型のサイズ（長さ×幅×高さ）で細胞培養構築物を提供する。別の実施形態では、細胞培養構築物は、バイオリアクタのチャンバに適合するサイズ及び形状を有する。特定の実施の形態では、細胞培養構築物のサイズは、組織培養フラスコに適合する。
【００４４】
３Ｄ細胞培養構築物の支柱／繊維の直径は、５０ｎｍ〜１ｍｍで変わり得る。
【００４５】
細胞培養構築物の平均孔径は、５０ｎｍ〜１ｍｍで変わり得る。
【００４６】
材料
本発明の細胞培養構築物は、主に又は単独で非分解性ポリマーでできている。このよう
な非分解性ポリマーとしては例えば、非分解性合成ポリマー（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド、ポリ塩化ビニル等であるが、それらに限定されない）が挙げられる。
【００４７】
細胞培養構築物に、１つ又は複数の生体分子を含浸することができる。生体分子は、タンパク質、ペプチド、グリコアミノグリカン、天然化合物若しくはポリマー、治療剤又はそれらの組合せであり得る。天然化合物又はポリマーの例は、コラーゲン、ラミニン、又はフィブロネクチンである。治療剤としては、抗生剤、ホルモン剤、成長因子、抗腫瘍剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、鎮痛剤、抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、抗感染剤、創傷治癒剤、創傷封止剤、細胞誘引剤、サイトカイン等が挙げられるが、それらに限定されない。治療剤は、細胞に適用すると、ヒトの健康に役立つものである。
【００４８】
抗生剤は、微生物（細菌、真菌又は原生動物等）の成長を阻害又は停止する化学療法剤である。一般的な抗生剤の例は、ペニシリン及びストレプトマイシンである。他の既知の抗生剤は、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、ロラカルベフ、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン又はセファロティン、セファレキシン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフジニル、セフェピム、テイコプラニン、バンコマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スペクチノマイシン、アズトレオナム、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、ナフシリン、ピペラシリン、チカルシリン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、マフェニド、プロントジル、スルファセタミド、スルファメチゾール（slfamethizole）、スルファニルイミド（slfanilimide）、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン（lincoamycin）、エタンブトール、ホスホマイシン、フシジン酸、フラゾリドン、イソニアジド、リネゾリド、メトロニダゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、プラテンシマイシン、ピラジンアミド、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、リファンピン又はリファンピシン及びチニダゾールである。
【００４９】
ホルモン剤は、血液を介して或る細胞（又は細胞群）から別の細胞へとシグナルを伝える化学伝達物質である。ホルモン剤の例は、メラトニン、セロトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、抗ミュラー管ホルモン、アディポネクチン、副腎皮質刺激ホルモン、アンギオテンシノゲン及びアンギオテンシン、抗利尿ホルモン、心房ナトリウム利尿性ペプチド、カルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン放出ホルモン、エリスロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、成長ホルモン、インヒビン、インスリン、インスリン様成長因子、レプチン、黄体形成ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポイエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモン、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、プロゲステロン、カルシトリオール、カルシジオール、プロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、プロラクチン放出ホルモン、リポトロピン、脳ナトリウム利尿ペプチド、神経ペプチドＹ、ヒスタミン、エンドセリン、膵臓ポリペプチド、レニン、及びエンケファリンである。
【００５０】
成長因子は、細胞増殖及び細胞分化を刺激することができる天然タンパク質を指す。例としては、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、成長分化因子−９（ＧＤＦ９）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ又はＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ−２）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）である。
【００５１】
抗腫瘍剤又は抗新生物剤は、腫瘍の進行を阻害し、これに対抗する薬剤である。例としては、アクチノマイシン（例えばアクチノマイシン−Ｄ）、アントラサイクリン（例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン）、ブレオマイシン、プリカマイシン、及びマイトマイシンである。
【００５２】
抗真菌剤は、真菌感染を治療するのに使用する薬物である。例としては、ナタマイシン、リモシジン、フィリピン、ナイスタチン、アンホテリシンＢ、ミコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、ビホナゾール、ブトコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、テルコナゾール、テルビナフィン、アモロルフィン、ナフチフィン、ブテナフィン、アニデュラフンジン、カスポファンギン、ミカファンギン、安息香酸、シクロピロックス、フルシトシン、グリセオフルビン、ゲンチアナバイオレット、ハロプロギン、トルナフテート、ウンデシレン酸、ティーツリー油、シトロネラ油、レモングラス油、オレンジ油、パルマローザ油、パチョリ油、レモンマートル油、ニーム種子油、ココナッツ油、亜鉛、及びセレンである。
【００５３】
抗ウイルス剤は、ウイルス感染を治療するのに特異的に使用される薬物群である。例としては、アバカビル、アシクロビル（aciclovir）、アシクロビル（acyclovir）、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、ブリブジン、シドフォビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビリチド（enfuvirtide）、エンテカビル、侵入阻害剤（融合阻害剤）、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、ガンシクロビル、ガーダシル、イバシタビン、イムノビル（imunovir）、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、ＩＩＩ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、Ｉ型インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド（loviride）、ＭＫ−０５１８（ラルテグラビル）、マラビロク、モロキシジン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル、ヌクレオシド類似体、オセルタミビル、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、プロテアーゼ阻害剤（薬理学）、逆転写酵素阻害剤、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、相乗的エンハンサー（抗レトロウイルス性）、テノホビル、テノホビル、ジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルハダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル、及びジドブジンである。
【００５４】
鎮痛薬又は鎮痛剤（口語的には痛み止めとして知られている）は、疼痛を緩和するのに使用される別の薬剤群成員である。例としては、パラセタモール／アセトアミノフェン、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばロフェコキシブ及びセレコキシブ）、モルフィン、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、ジアモルフィン、ぺチジン、トラマドール、ブプレノルフィン、三環系抗鬱剤（例えばアミトリプチリン）、カルバマゼピン、ガバペンチン及びプレガバリンである。
【００５５】
抗ヒスタミン剤は、アレルギー反応中に放出される内因性化学媒介物質であるヒスタミンによって媒介する作用を低減するか又は取り除くのに有用なヒスタミンアンタゴニストである。例としては、Ｈ１抗ヒスタミン剤、アセプロメタジン、アリメマジン、アステミゾール、アザタジン、アゼラスチン、ベナドリル、ブルムフェニラミン、クロルシクリジン、クロロピラミン、クロルフェナミン、フェニルプロパノールアミン、シンナリジン、クレマスチン、シクリジン、シプロヘプタジン、デキスブロムフェニルアミン、デキスクロルフェニルアミン、ジフェンヒドラミン、ドキシラミン、エバスチン、エメダスチン、エピナスチン、フェキソフェナジン、ヒスタミンアンタゴニスト（例えばシメチジン、ラニチジン、及びファモチジン；ＡＢＴ−２３９、チオペラミド、クロベンプロピット、インプロミジン、チオペラミド、クロモグリク酸、ネドクリミル）、ヒドロキシジン、ケトチフェン、レボカバスチン、メブヒドロリン、メピラミン、メタピリレン（mthapyrilene）、メトジラジン、オロパタジン、フェニラミン、フェニルトロキサミン、レスポラル（resporal）、センプレックス−Ｄ、ソミネックス、タラスチン、テルフェナジン、及びトリプロリジンである。
【００５６】
抗炎症剤は、炎症を低減する物質に関する。例としては、コルチコステロイド、イブプロフェン、ジクロフェナク及びナプロキセン、ヘレナリン、サリチル酸、カプサイシン及びω−３脂肪酸である。
【００５７】
抗感染剤は、感染を予防するか又は感染に対抗することができる任意の作用物質である。抗感染剤は、幾つかの群に分けることができる。駆虫薬（Anthelminthics）は、アルベンダゾール、レベミゾール、メベンダゾール、ニクロサミド、プラジカンテル、及びピランテルから成る抗感染剤の群の１つである。別の群は、抗フィラリア薬、例えばジエチルカルバマジン、イベルメクチン、スラミンナトリウム、抗住血吸虫薬及び抗吸虫薬（antitrematode medicine）、オキサムニキン、プラジカンテル、及びトリクラベンダゾールである。別の群は、抗菌薬であり、これをさらに細分化することができる。βラクタム薬は、アモキシシリン、アンピシリン、ベンザチンベンジルペニシリン、ベンジルペニシリン、セファゾリン、セフィキシム、セフタジジム、セフトリアキソン、クロキサシリン、コ−アモキシクラブ、イミペネム／シラスタチン、フェノキシメチルペニシリン、及びプロカインベンジルペニシリンである。他の抗菌薬は、アジスロマイシン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、コ−トリモキサゾール、ドキシシクリン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、メトロニダゾール、ニトロフラントイン、スペクチノマイシン、スルファジアジン、トリメトプリム、及びバンコマイシンである。抗ハンセン病薬の例は、クロファジミン、ダプソン、及びリファンピシンである。抗結核薬の例は、アミカシン、ｐ−アミノサリチル酸、カプレオマイシン、シクロセリン、エタンブトール、エチオンアミド、イソニアジド、カナマイシン、オフロキサシン、ピラジンアミド、リファンピシン、及びストレプトマイシンである。抗真菌薬の例は、アンフォテリシンＢ、シクロトリマゾール、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、ナイスタチン（nnystatin）、ヨウ化カリウムである。抗ウイルス剤は、抗感染剤でもある。抗ヘルペス薬の例は、アシクロビルである。抗レトロウイルス薬の例は、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤である。他の例は、アバカビル、ジダノシン、エムトリシタビン、ラミブジン、スタブジン、フマル酸テノフォビルジソプロキシル、ジドブジン、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、エファビレンツ、ネビラピン、プロテアーゼ阻害剤、インジナビル、ロピナビル＋リトナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル及びリバビリンである。抗原虫薬の例は、ジロキサニド、メトロニダゾール等の抗アメーバ薬及び抗ジアルジア虫症薬；アンホテリシンＢ、アンチモン酸メグルミン、ペンタミジン等の抗リーシュマニア症薬；アモジアキン、アルテメテル、アルテメテル＋ルメファントリン、アーテスネート、クロロキン、ドキシシクリン、メフロキン、プリマキン、キニーネ、スルファドシン＋ピリメタミン、クロロキン、及びプログアニル等の抗マラリア薬である。抗ニューモシスティス肺炎症（Antipneumocytosis）症薬及び抗トキソプラズマ症（antioxoplasmosis）薬は、ペンタミジン（pentamindine）、ピリメタミン、スルファメトキサゾール＋トリメトプリムである。抗トリパノソーマ薬は、エフロルニチン、メラルソプロール、ペンタミジン、スラミンナトリウム、ベンズニダゾール、及びニフルチモックスである。抗偏頭痛薬は、アセチルサリチル酸、パラ���タモール、及びプロプラノロールである。
【００５８】
創傷治癒剤は、皮膚及び表皮組織を再生する身体の自然過程を促進する。例としては、フィブリン、フィブロネクチン、コラーゲン、セロトニン、ブラジキニン、プロスタグランジン、プロスタシクリン、トロンボキサン、ヒスタミン、神経ペプチド、キニン、コラゲナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、亜鉛依存性メタロプロテイナーゼ、乳酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、エラスチン、成長因子（ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β）、一酸化窒素、及び基質メタロプロテイナーゼである。創傷封止剤の例は、血小板ゲル及びフィブリンである。
【００５９】
細胞誘引剤又は走化性剤は、体細胞、細菌及びそれらの動きに影響を与える他の単細胞又は多細胞の有機体によって検知される環境下での化学物質又は分子である。例としては、アミノ酸、ホルミルペプチド［例えばＮ−ホルミルメチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（参考文献中、ｆＭＬＦ又はｆＭＬＰ）]、補体３ａ（Ｃ３ａ）及び補体５ａ（Ｃ５ａ）、ケモカイン（例えばＩＬ−８）；ロイコトリエン［例えばロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）］である。
【００６０】
サイトカインは、互いに伝達するために動物細胞で生成されたシグナル化合物であるタンパク質群及びペプチド群である。サイトカインは、幾つかのファミリーに分けることができる。例としては、４つのα−へリックス束ファミリーであり、：ＩＬ−２サブファミリー［例えばエリスロポイエチン（ＥＰＯ）及びトロンボポイエチン（ＴＨＰＯ）］、インターフェロン（ＩＦＮ）サブファミリー、ＩＬ−１０サブファミリーの３つのサブファミリーから成る。他の例は、ＩＬ−１ファミリー（例えばＩＬ−１及びＩＬ−１８）、ＩＬ−１７ファミリー、ケモカイン、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー、造血成長因子（１型）ファミリー、インターフェロン（２型）ファミリー、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（３型）ファミリー、７回膜貫通へリックスファミリー、及び形質転換成長因子βスーパーファミリーである。
【００６１】
細胞培養構築物の表面又は部分表面は、生理化学的手段、化学的手段、コーティング手段又はそれらの組合せでさらに処理し、細胞接着を改善させることができる。
【００６２】
細胞培養構築物の表面は、より良好な細胞接着のために構築物の表面特性を改善する、当該技術分野で既知の生理化学的手段に関する表面修飾法（プラズマ又はグロー放電等であるが、それらに限定されない）でさらに処理することができる。
【００６３】
細胞培養構築物の表面は、化学的手段、特に酸又は塩基によってさらに表面処理することができる。特定の実施形態では、細胞培養構築物を、Ｈ２ＳＯ４、ＨＮＯ３、ＨＣｌ、Ｈ３ＰＯ４、Ｈ２ＣｒＯ４、又はそれらの組合せで処理する。特定の実施形態では、細胞培養構築物は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｂａ（ＯＨ）２、ＣｓＯＨ、Ｓｒ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、ＬｉＯＨ、ＲｂＯＨ又はそれらの組合せで処理する。
【００６４】
細胞培養構築物の表面は、支柱及び／又は繊維の材料とは異なる物質を表面上に塗布することである、コーティング手段によってさらに表面処理することができる。物質は、支柱及び／又は繊維の表面に共有結合又は物理的に吸着することができる。代替的に、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力又はそれらの組合せによって、この物質を構築物の表面に結合させることができる。生体分子コーティングの安定性を増大させるために、化学架橋、放射線、熱処理、又はそれらの組合せ等の様々な架橋法を使用してコーティングを架橋することができる。さらに、室温を超える高温で、真空下で架橋を行うことができる。架橋に使用する放射線は、電子線、ガンマ線、紫外線又はそれらの組合せであり得る。
【００６５】
コーティング物質は、タンパク質、ペプチド、グリコアミノグリカン、天然物質、無機物質、治療剤、又はそれらの組合せであり得る。
【００６６】
細胞培養構築物の表面は、生体分子又は天然化合物又はポリマー（コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＩＶ型等）、フィブロネクチン、ラミニン、又は他の細胞外基質分子等であるが、それらに限定されない）でさらにコーティングすることができる。細胞外基質分子の例は、へパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、エラスチン、ヘミセルロース、ペクチン、及びエクステンシンである。生体分子は、表面に共有結合するか、又は細胞培養構築物の表面に物理的に吸着する。
【００６７】
細胞培養構築物の表面は、合成ポリマー（ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルポリピロリドン、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリリシン等であるが、それらに限定されない）でさらに表面コーティングすることができる。
【００６８】
三次元多孔質細胞培養構築物は、有機物質（ゼラチン、キトサン、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びそれらの組合せ等であるが、それらに限定されない）でコーティングすることができる。
【００６９】
特定の実施形態において、細胞培養構築物は、無機材料（リン酸カルシウム、ＴｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、又はそれらの組合せ等）でコーティングする。
【００７０】
特定の実施形態において、細胞培養構築物は、２つ以上の有機材料をコーティングした複合材料（ゼラチン及びキトサン、ポリアクリル酸及びポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドン等であるが、それらに限定されない）でコーティングする。
【００７１】
特定の実施形態において、細胞培養構築物は、無機材料の複合材料（リン酸カルシウム及びＴｉＯ２、リン酸カルシウム及びＡｌ２Ｏ３等）でコーティングする。コーティングする無機複合材料は、上記細胞培養構築物の表面に化学結合するか、又は表面に物理的に吸着する。
【００７２】
特定の実施形態において、細胞培養構築物は、無機材料と有機材料とをコーティングした複合材料（リン酸カルシウム／コラーゲン、リン酸カルシウム／ゼラチン、リン酸カルシム／ポリエチレングリコール等であるが、それらに限定されない）でコーティングする。コーティングする複合材料は、上記細胞培養構築物の表面に化学結合するか、又は表面に物理的に吸着する。
【００７３】
細胞培養構築物を作製する方法
細胞培養構築物は、幾つかの方法（層間集合化法及び層間作製法等であるが、それらに限定されない）を使用して作製することができる。以下に一例を示す。
【００７４】
この方法は、本発明者等が、スカフォールド集合化法として説明するものである。本発明の細胞培養構築物を製造する一例示的方法には、以下の工程が含まれる。
【００７５】
工程Ｉ。  構造設計に従って、好適なポリマー処理法によって、スカフォールドの各層を予め作製する。ポリマー処理法は、射出成形、繊維製織プロセス、及び結合であり、これらがポリマー部及びポリマースクリーンを作製するのに最も効果的且つ費用効率が高い方法であるが、これらに限定されない。
【００７６】
工程ＩＩ。  それから、互いの上部に幾つかのスカフォールド層を置くことによって、スカフォールド層を共に集合化させる。各スカフォールド層は、様々な構造を有してもよく、また最終産物の面積よりも面積が大きくてもよい。構築物の面積が所望の最終産物よりも大きい場合、ダイカッター又はレーザービーム等の機械装置を使用して、所望の最終産物を、集合化した大きい構築物から正しいサイズ及び形状に切断することができる。１つ又は複数の最終細胞培養構築物は、単一の集合化した大きい構築物から切断し得る。別の実施形態では、各スカフォールド層を所望のサイズに予め作製し、機械装置を用いて、細胞培養構築物を共に集合化させて、集合化プロセス中にスカフォールド層を導き、配向させる。例えば、円盤型の細胞培養構築物を作製する場合、機械装置は直径が適当な中空管であり、これが幾つかの予め作製した円形のスカフォールド部を適合させる。管ガイドは、集合化後に規定の立体配置を達成する或る特定の方法で、予め作製した部分を整列させる機械的機序を有してもよい。機械的な集合化装置を用いて、スカフォールド部を適所に組み立てた後、非細胞毒性であり、好ましくは細胞培養構築物と同じ種類の材料でできているポリマー繊維又はフリップ等を使用して、この部分を束ねる。立方型の細胞培養構築物を集合化させるために、断面積が正方形又は長方形の機械的な集合化ガイドを使用して同じ集合化プロセスを適用することができる。
【００７７】
集合化ガイドは、予め整列したポリマー繊維でもあり得る。これらの予め整列した繊維は、予め作製したスカフォールド部の穴又は孔の幾つかを通り、最終的に集合化後、規定の立体配置を達成するようにこれらの部分を束ねる。
【００７８】
このスカフォールド集合化法は、幾つかの異なる構造設計を有する予め作製した部分を幾つか組み立てることによって、不均一な構造の細胞培養構築物を集合化させる可能性も与える。或る部分と他の部分との相対的位置を変えること、例えば幾つかの部分を或る程度まで回転させることによって、細胞培養構築物の構造も変えることができる。
【００７９】
上記の集合化法を使用して細胞培養構築物を作製する利点は、個々の部分をまとめる集合化フリップ又は集合化繊維を、細胞培養液中で使用した後に単純に取り除くことで、構築物を容易に脱集合化することができることである。光学顕微鏡、走査電子顕微鏡等の従来の顕微鏡法によって、脱集合化した部分を容易に評価することができる。
【００８０】
当業者にとって既知のプラズマ法及びグロー放電法等の様々な表面修飾法で集合化した細胞培養構築物をさらに処理することができる。ディップコーティング、化学グラフト化、及び／又は当業者にとって既知の他の技法によって、無機材料、有機材料、及び無機／有機材料で細胞培養構築物をコーティングすることもできる。表面処理した細胞培養構築物をパッケージング及び滅菌することができる。
【００８１】
キット
本発明は、１つのパッケージ容器内で組織培養プレートに、１つ又は複数の細胞培養構築物を与えるキットをさらに含む。本発明のキットは、１つ又は複数の細胞培養構築物を含み、細胞培養構築物を、組織培養プレート、滅菌パッケージング発泡体（foam：フォーム）又は他のディスポ等から取り出し、または挿入する機械装置等の他の構成要素を含み得る。
【００８２】
本発明のキットは、滅菌包装して、即時に使用することができる状態にある単一細胞培養構築物を含み得る。一実施形態では、本発明のキットは、２つ以上の同じサイズの細胞培養構築物を含み得る。別の実施形態では、本発明のキットは、２つ以上の異なるサイズの細胞培養構築物を含み得る。
【００８３】
本発明のキットは、滅菌包装して、即時に使用することができる状態にある単一又は複数の細胞／組織培養プレートウェルに挿入された単一の細胞培養構築物又は複数の細胞培養構築物を含み得る。
【００８４】
細胞培養構築物の細胞培養使用
組織培養ポリスチレンプレートによる使用
本発明は、組織培養ポリスチレンプレート内で生細胞を培養するのに、細胞培養構築物を使用する方法も提供する。細胞培養構築物は、組織培養プレートのウェルに適合する円板型又は立方型であり得る。動的播種法又は静的播種法を使用して、細胞を細胞培養構築物に播種することができる。
【００８５】
静的播種法を使用した一例において、或る特定容量の細胞懸濁液を、細胞培養構築物の上面に擦り付け、或る特定時間接着させた後、培地に漬けた。細胞を播種した後、成長培地中に浸漬させたウェルプレートで細胞培養構築物を維持し、空気中、５％〜１０％二酸化炭素の９０％加湿雰囲気下、３７℃のインキュベータ内で培養した。
【００８６】
動的播種法を使用した別の例において、細胞培養構築物をスピナーフラスコ内の細胞懸濁液中に浸すことによって播種を行い、３７℃の加湿５％ＣＯ２インキュベータに入れた。播種後、３７℃の加湿５％ＣＯ２インキュベータ内でさらに培養するために、培地の入った組織培養プレートのウェルに細胞培養構築物を入れた。定期的に細胞培地を取り替えた。
【００８７】
細胞培養を或る特定時点で終了させた後、細胞培養構築物を細胞培養プレートから取り出し、従来のアッセイにかけた。顕微鏡で、細胞培養構築物の様々な層又は位置内で細胞接着及び細胞活性を視覚化するために、細胞培養構築物を脱集合化した。
【００８８】
細胞を回収する必要がある場合、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を使用して、細胞をトリプシン処理した。細胞培養構築物から分離した後、少ない容量の新鮮血清含有培地中で細胞を再懸濁し、トリプシンを不活性化した。それから、これらの細胞を他の目的に使用することができる。
【００８９】
バイオリアクタによる使用
本発明は、バイオリアクタ内で生細胞を培養するのに、細胞培養構築物を使用する方法も提供する。細胞培養構築物は、円板型又は立方型であってもよく、バイオリアクタに適合する。
【００９０】
静的播種法を使用した一例において、或る特定容量の細胞懸濁液を、細胞培養構築物の上面に擦り付け、或る特定時間接着させた後、培地に漬けた。静的播種法又は動的播種法のいずれかによって細胞を播種した後、成長培地中に浸漬させたバイオリアクタ内でこれらの細胞を播種した細胞培養構築物を維持し、空気中、５％〜１０％二酸化炭素の９０％加湿雰囲気下で、３７℃で培養した。定期的に培養培地を取り替え、細胞培養構築物によって絶えず循環させた。
【００９１】
細胞培養を或る特定時点で終了させた後、細胞培養構築物を細胞培養プレートから取り出し、従来のアッセイにかけた。顕微鏡で、細胞培養構築物の様々な層又は位置内で細胞接着及び細胞活性を視覚化するために、細胞培養構築物を脱集合化した。
【００９２】
細胞を回収する必要がある場合、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を使用して、細胞をトリプシン処理した。細胞培養構築物から分離した後、少ない容量の新鮮血清含有培地中で細胞を再懸濁し、トリプシンを不活性化した。それから、これらの細胞を他の目的に使用することができる。
【実施例】
【００９３】
実施例１：細胞培養構築物を作製する方法
ポリスチレン材料を使用して、細胞培養構築物を作製する。図５に示す細胞培養構築部を使用して、細胞培養構築物に集合化させた。設計に従って、これらの部分を射出成形した。この部分を作製した後、初めに集合化ガイドに第１の層を入れた後、そのガイドに第２、第３及び第４の層部分を入れた。そのため、層部分の総数は４であった。それから、図７に示すポリスチレン繊維クラップを使用して、これらの４つの部分を束ねた。クラップの２つの末端が構築物の穴から延出しないように、束（tie）を形成するか、又は２つの末端を変形させることによって、２つの末端をさらに固定した。集合化した後、ポラーロンＰＴ７３００ＲＦプラズマバレルエッチャー（Quorum Technology, East Sussex, UK）を使用してアルゴン下で細胞培養構築物をプラズマ処理した。高周波電力、圧力及び処理時間をそれぞれ、２９６Ｗ、１×１０−１ｍｂａｒ及び５分に固定した。
【００９４】
プラズマ処理した細胞培養構築物を個々にパッケージングし、２０ＫＧｙの線量でγ放射線を使用して最終滅菌した。
【００９５】
実施例２：細胞培養への細胞培養構築物の使用
本発明は、組織培養ポリスチレンプレート内で生細胞を培養するのに、細胞培養構築物を使用する方法も提供する。この研究で使用する細胞培養構築物のサイズは、１０ｍｍ幅×１０ｍｍ長×０．３ｍｍ厚であり、平方孔開口が２００μｍ、繊維径が４００μｍであった。静的播種法を使用して、平滑筋細胞を播種した。構築物の上面に、平滑筋細胞懸濁液５００μｌ（１×１０５細胞／ｍｌ）をピペッティングし、３７℃で２時間接着させた後、培地に漬けた。細胞を播種した後、成長培地に浸漬したウェルプレートで細胞培養構築物を維持し、空気中、５％〜１０％二酸化炭素の９０％加湿雰囲気下、３７℃のインキュベータ内で培養した。細胞培養成長培地は、５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）から成っていた。動的播種法を使用した場合、細胞培養構築物を、６０ｒｐｍで撹拌するスピナーフラスコ内の細胞懸濁液中に浸すことによって播種を行い、３７℃の加湿５％ＣＯ２インキュベータ内で細胞培養構築物を含有した。播種後、３７℃の加湿５％ＣＯ２インキュベータ内でさらに培養するために、培地の入った組織培養プレートのウェルに細胞培養構築物を入れた。定期的に培養培地を取り替えた。
【００９６】
細胞培養を或る特定時点で終了させた後、細胞培養構築物を細胞培養プレートから取り出し、従来のアッセイにかけた。顕微鏡で、細胞培養構築物の様々な層又は位置の細胞接着及び細胞活性を視覚化するために、細胞培養構築物を脱集合化した。
【００９７】
細胞を回収する必要がある場合、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Sigma  Ｔ４０４９）を使用して、細胞をトリプシン処理した。細胞培養構築物から分離した後、少ない容量の新鮮血清含有培地中で細胞を再懸濁し、トリプシンを不活性化した。それから、これらの細胞を他の目的に使用することができる。
【００９８】
実施例３：バイオリアクタにおける細胞培養への細胞培養構築物の使用
本発明は、バイオリアクタ内で生細胞を培養するのに、細胞培養構築物を使用する方法も提供する。実施例３で使用する細胞培養構築物は円板型であり（厚さ０．８ｍｍ、多孔率８０％及び繊維径２００μｍである１０ｍｍ径の円板）、バイオリアクタに適合する。
【００９９】
初めにラット骨髄間質細胞（ＭＳＣ）を細胞培養構築物上に静的に播種した。２５００００個のラットＭＳＣを有するＭＳＣ懸濁液５００μｌを細胞培養構築物の上面にピペッティングし、３７℃で２時間接着させた後、培地に漬けた。細胞を播種した後、灌流培養バイオリアクタでこれらの播種細胞培養構築物を維持した。これらの細胞を播種した細胞培養構築物を完全骨分化培地に浸漬して、空気中、５％〜１０％二酸化炭素の９０％加湿雰囲気下、３７℃で培養した。１ｍｌ／分の速度で設定した蠕動ポンプで、バイオリアクタ系の動作を駆動した。培養期間中、培養培地をかき混ぜ、構築物の孔を介して細胞培養構築物に通した。したがって、細胞を動的せん断条件下で培養した。４８時間毎に完全培地を交換して、４日、８日及び１６日、バイオリアクタ内で細胞を培養した。
【０１００】
培養期間の終了時に、ＰＢＳで全ての細胞培養構築物を洗い、さらに分析するまで、−２０℃で蒸留した脱イオン水１．５ｍｌで保存した。顕微鏡で、細胞培養構築物の様々な層又は位置で細胞接着及び細胞活性を視覚化するために、細胞培養構築物を脱集合化した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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