(57)【要約】  第ＩＩ相解毒酵素又は抗酸化酵素の転写のＮｒｆ２（ＳＫＮ−１）活性化を増強する方法及び組成物（植物抽出物（例えばヤナギ抽出物）又はその活性画分を含む）と、それらの酵素のＮｒｆ２調節を増加するさらなる化合物を同定する方法とが提供される。【選択図】図９【特許請求の範囲】
【請求項１】
セイヨウシロヤナギ抽出物又はその活性画分を含む組成物であって、細胞における第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）遺伝子及び抗酸化酵素遺伝子の１つ又は両方の発現を増加させる、組成物。
【請求項２】
グルタミン酸システインリガーゼ調節サブユニット（ＧＣＬＭ）及びグルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）から成る群から選択されるＰ２Ｄ遺伝子、又はスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）を含む抗酸化酵素遺伝子の発現を増加させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＦＯＸＯ１の発現の増加、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）のレベルの低減、又はその両方ももたらす、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
経口投与のために処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
１つ又は複数の経口で許容される担体及び添加物をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
局所投与のために処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
１つ又は複数の局所で許容される担体及び添加物をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ヤナギ抽出物の第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）又は抗酸化酵素の増強活性を増加させる方法であって、
第１のレベルのＰ２Ｄ又は抗酸化酵素の増強活性を有するヤナギ抽出物を準備すること、
２つ以上の画分を得るように、前記抽出物を分画すること、
Ｒｆ値が０．５以上の画分を選択すること、
前記画分のＰ２Ｄ又は抗酸化酵素の増強活性をアッセイすること、及び
前記画分がＰ２Ｄ又は抗酸化酵素の増強活性の前記第１のレベルより高いレベルのＰ２Ｄ又は抗酸化酵素の増強活性を有する場合に該画分を選択すること、
を含む、方法。
【請求項９】
前記抽出物を分画することが、カラムクロマトグラフィ、液液分画及び固液分画から成る群から選択される１つ又は複数の方法を使用することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞において第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）又は抗酸化酵素遺伝子の発現を増加させる化合物を同定する方法であって、
（ａ）（ｉ）Ｐ２Ｄ若しくは抗酸化酵素の遺伝子又は（ｉｉ）Ｐ２Ｄ若しくは抗酸化酵素遺伝子プロモータを含むレポータ構築物を発現する細胞を準備すること、
（ｂ）植物抽出物の画分を準備すること、
（ｃ）前記細胞を前記画分に接触させること、及び
（ｄ）前記Ｐ２Ｄ若しくは前記抗酸化酵素の遺伝子又は前記レポータ構築物の発現に対する前記画分の効果を検出すること、
を含み、前記Ｐ２Ｄ若しくは前記抗酸化酵素の遺伝子又は前記レポータ構築物の発現を増加させる画分が、細胞において第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）又は抗酸化酵素の遺伝子の発現を増加させる化合物を含む、方法。
【請求項１１】
（ｅ）前記Ｐ２Ｄ若しくは前記抗酸化酵素の遺伝子又は前記レポータ構築物の発現を増加させる画分を選択すると共に、２つ以上のサブ画分を生じるように該画分をさらに分割すること、
（ｆ）Ｐ２Ｄ若しくは抗酸化酵素の遺伝子、又はＰ２Ｄ遺伝子プロモータを含むレポータ構築物を発現する細胞を準備すること、
（ｇ）前記細胞を前記サブ画分に接触させること、及び
（ｈ）前記Ｐ２Ｄ若しくは前記抗酸化酵素の遺伝子又は前記レポータ構築物の発現に対する前記サブ画分の効果を検出すること、
をさらに含み、前記Ｐ２Ｄ若しくは前記抗酸化酵素の遺伝子又は前記レポータ構築物の発現を増加させるサブ画分が、細胞において第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）又は抗酸化酵素の遺伝子の発現を増加させる化合物を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
精製化合物が得られるまで工程（ｅ）〜工程（ｈ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
経口投与のために前記精製化合物を処方することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
局所投与のために前記精製化合物を処方することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、培養細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、線維芽細胞、又はシノラブディティス・エレガンスにおける細胞である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記植物抽出物がヤナギ抽出物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
シノラブディティス・エレガンスにおける前記細胞がＡＳＩ細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｐ２Ｄ遺伝子がグルタミン酸システインリガーゼ調節サブユニット（ＧＣＬＭ）、グルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）から成る群から選択され、前記抗酸化酵素遺伝子がスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）である、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
（ｅ）前記Ｐ２Ｄ若しくは前記抗酸化酵素の遺伝子又は前記レポータ構築物の発現を増加させる画分を選択すると共に、２つ以上のサブ画分を生じるように該画分をさらに分割すること、
（ｆ）ＦＯＸＯ１遺伝子、又はＦＯＸＯ１遺伝子プロモータを含むレポータ構築物を発現する細胞を準備すること、
（ｇ）前記細胞を前記サブ画分に接触させること、
（ｈ）前記ＦＯＸＯ１遺伝子又は前記レポータ構築物の発現に対する前記サブ画分の効果を検出すること、及び
前記ＦＯＸＯ１遺伝子又は前記レポータ構築物の発現を増加させるサブ画分を選択すること、
をさらに含む、請求項８又は１０に記載の方法。
【請求項２０】
（ｅ）前記Ｐ２Ｄ若しくは前記抗酸化酵素の遺伝子又は前記レポータ構築物の発現を増加させる画分を選択すると共に、２つ以上のサブ画分を生じるように該画分をさらに分割すること、
（ｆ）前記細胞を前記サブ画分に接触させること、
（ｇ）前記細胞における８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）のレベルに対する前記サブ画分の効果を検出すること、及び
前記細胞において８−ＯＨｄＧのレベルを低減させるサブ画分を選択すること、
をさらに含む、請求項８又は１０に記載の方法。
【請求項２１】
細胞においてフォークヘッドボックスＯ１（ＦＯＸＯ１）遺伝子の発現を増加させる化合物を同定する方法であって、
（ａ）（ｉ）ＦＯＸＯ１遺伝子又は（ｉｉ）ＦＯＸＯ１遺伝子プロモータを含むレポータ構築物を発現する細胞を準備すること、
（ｂ）茶抽出物の画分とヤナギ抽出物の画分とを１つ又は複数準備すること、
（ｃ）前記細胞を前記画分に接触させること、及び
（ｄ）前記ＦＯＸＯ１遺伝子又は前記レポータ構築物の発現に対する前記画分の効果を検出すること、
を含み、前記ＦＯＸＯ１遺伝子又は前記レポータ構築物の発現を増加させる画分が、細胞においてＦＯＸＯ１の発現を増加させる化合物を含む、方法。
【請求項２２】
（ｅ）前記ＦＯＸＯ１遺伝子又は前記レポータ構築物の発現を増加させる画分を選択すると共に、２つ以上のサブ画分を生じるように該画分をさらに分割すること、
（ｆ）ＦＯＸＯ１遺伝子、又はＦＯＸＯ１遺伝子プロモータを含むレポータ構築物を発現する細胞を準備すること、
（ｇ）前記細胞を前記サブ画分に接触させること、及び
（ｈ）前記ＦＯＸＯ１遺伝子又は前記レポータ構築物の発現に対する前記サブ画分の効果を検出すること、
をさらに含み、前記ＦＯＸＯ１遺伝子又は前記レポータ構築物の発現を増加させるサブ画分が、細胞においてＦＯＸＯ１の発現を増加させる化合物を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
精製化合物が得られるまで工程（ｅ）〜工程（ｈ）を繰り返すことをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
経口投与のために前記精製化合物を処方することをさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記細胞が、培養細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、線維芽細胞、又はシノラブディティス・エレガンスにおける細胞である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
シノラブディティス・エレガンスにおける前記細胞がＡＳＩ細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞において第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）又は抗酸化酵素の遺伝子の増強活性を増加する方法であって、該細胞に有効量の植物抽出物又はその活性画分を投与することを含む、方法。
【請求項２８】
細胞において第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）又は抗酸化酵素の遺伝子の増強活性を増加する方法であって、該細胞に植物抽出物又はその活性画分を含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２９】
前記植物抽出物がヤナギ抽出物である、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抽出物が前記細胞への酸化的損傷を軽減する、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が生きている哺乳動物におけるものであり、且つ前記抽出物が該哺乳動物の組織において酸化的損傷を低減する、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が皮膚細胞であり、且つ前記抽出物が前記哺乳動物の皮膚への酸化的損傷を軽減する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が皮膚細胞であり、且つ前記抽出物が、紫外線照射への曝露によって起こる前記哺乳動物の皮膚の色素沈着を低減する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
紫外線照射への曝露前に前記植物抽出物を前記哺乳動物の皮膚に適用する、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヤナギ、茶及びそれらの抽出物の抗酸化及び解毒機能の増強作用に関する。
【０００２】
［優先権主張］
本願は、２００７年９月１１日付けで出願された米国仮特許出願第６０／９９３，３２５号明細書（その内容全体が参照により本明細書に援用される）の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
生体は常に、悪影響を引き起こし得る様々な物質に曝されている。かかる物質としては例えば、重金属、或る特定の食品添加物、紫外線及びタバコが挙げられる。これらの物質が生体に作用すると、フリーラジカルとして知られる活性酸素種が生じる。生体がさらに酸化的ストレスに曝されると、活性酸素種自体が或る特定の生理学的過程の副産物として活性酸素種を産生する。酸化的ストレスは、癌、一般的疾患及び老化症状等の多くの状態に対する危険因子の１つと考えられる。生体は、フリーラジカルを除去し、且つ毒性物質を解毒する機構（本明細書中で宿主防御機構と称される）を用いてかかる酸化的ストレスに対処する。例えば通常の老化過程の結果としてこの媒介／解毒機構が損われると、防御機構はこれらの化学物質を完全に媒介及び解毒することができなくなる。この過程が疾患の発症につながることもある。
【０００４】
この課題を解決するために、抗酸化作用を有する物質（例えば、ビタミンＣ及び／又はビタミンＥを包含する組成物）の摂取又は適用を含む、疾患の発症又は進行を予防する方法が試用されている。これらの方法は有効であるが、臨床的に有意な効果を得るためには、多量の抗酸化物質の摂取が必要となる場合が多い。
【０００５】
一方で、上記で言及した宿主防御機構は、一度増強されれば、酸化的ストレスを効率的に取り除くことができ、したがって抗酸化物質を摂取するよりも有効であると期待される。核内転写因子である「Ｎｒｆ２」は、宿主防御機構を調節する必須タンパク質として非常に注目が集まっている。細胞が酸化的ストレス又は毒性物質に曝されると、細胞の細胞質に存在するＮｒｆ２分子が核に取り込まれ、そこで抗酸化応答エレメントとして知られる遺伝子調節領域と結合し（例えばNguyen, et al., Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 2003, 43:233-60を参照されたい）、第ＩＩ相解毒酵素として知られる酸化的ストレス応答酵素の発現を誘導する。Ｎｒｆ２は抗酸化応答エレメントとして知られる配列の下流に存在する。Ｎｒｆ２遺伝子を欠失する動物は宿主防御機構が損われることが知られている。したがって、Ｎｒｆ２は酸化的ストレス及び毒性物質に対する宿主防御機構において必須の役割を果たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、或る特定の植物抽出物における物質が、ＳＫＮ−１／Ｎｒｆ２を活性化し、第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）遺伝子の発現を強く誘導し、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）のレベルを低減し、且つフォークヘッドボックスＯ１（ＦＯＸＯ１）遺伝子発現レベルを増加することを見出した。
【０００７】
このため一態様において、本発明は、Ｐ２Ｄ及び抗酸化酵素の活性を増強するための方法及び組成物、例えば植物抽出物、例えばヤナギ、緑茶、ニンジン又はブロッコリーの抽出物、及び／又はそれらの活性画分を含む組成物を特徴とする。別の態様では、本発明は、ＳＫＮ−１／Ｎｒｆ２を活性化し、その結果Ｐ２Ｄ遺伝子発現を増強する物質を同定する方法を特徴とする。本明細書中で使用される場合、「活性画分」は、非分画抽出物に比べて重量当たりの活性が増加した抽出物の画分である。
【０００８】
一態様において、本発明は、植物抽出物、例えばヤナギ、緑茶、ニンジン若しくはブロッコリーの抽出物、又はそれらの活性画分を含む組成物であって、細胞において第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）遺伝子及び抗酸化酵素遺伝子の１つ又は両方の発現を増加させる、組成物を提供する。例えばこの組成物は、グルタミン酸システインリガーゼ調節サブユニット（ＧＣＬＭ）及びグルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）から成る群から選択されるＰ２Ｄ遺伝子、及び／又は抗酸化酵素遺伝子、例えばスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）の発現を増加させることができる。幾つかの実施の形態では、またこの組成物により、ＦＯＸＯ１の発現の増加、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）のレベルの低減、又はその両方が起こる。
【０００９】
幾つかの実施の形態において、この組成物は、経口投与のために処方され、１つ又は複数の経口で許容される担体及び添加物を含むこともできる。幾つかの実施の形態では、この組成物は、局所投与のために処方され、１つ又は複数の局所で許容される担体及び添加物を含むこともできる。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、ヤナギ抽出物の第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）及び／又は抗酸化遺伝子の増強活性を増加させる方法を提供する。本方法は、第１のレベルのＰ２Ｄ増強活性を有するヤナギ抽出物を準備すること、２つ以上の画分を得るように、抽出物を分画すること、Ｒｆ値が０．５以上の画分を選択すること、画分のＰ２Ｄ増強活性をアッセイすること、及び画分がＰ２Ｄ増強活性の第１のレベルより高いレベルのＰ２Ｄ増強活性を有する場合にこの画分を選択することを含む。
【００１１】
幾つかの実施の形態において、抽出物を分画することが、カラムクロマトグラフィ、液液分画及び固液分画から成る群から選択される１つ又は複数の方法を使用することを含む。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は、細胞において第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）又は抗酸化遺伝子の発現を増加させる化合物を同定する方法を提供する。本方法は、（ｉ）Ｐ２Ｄ若しくは抗酸化遺伝子又は（ｉｉ）Ｐ２Ｄ若しくは抗酸化遺伝子プロモータ、例えばＰ２Ｄ遺伝子プロモータのＮｒｆ２結合配列を含むレポータ構築物を発現する細胞を準備すること、植物抽出物の画分を準備すること、該細胞を該画分に接触させること、及びＰ２Ｄ若しくは抗酸化遺伝子又はレポータ構築物の発現に対する該画分の効果を検出することを含む。Ｐ２Ｄ若しくは抗酸化遺伝子又はレポータ構築物の発現を増加させる画分が、細胞において第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）及び／又は抗酸化遺伝子の発現を増加させる化合物を含む。
【００１３】
幾つかの実施の形態において、本方法は、Ｐ２Ｄ若しくは抗酸化遺伝子又はレポータ構築物の発現を増加させる画分を選択すると共に、２つ以上のサブ画分を生じるように該画分をさらに分割すること、Ｐ２Ｄ若しくは抗酸化遺伝子、又はＰ２Ｄ若しくは抗酸化遺伝子プロモータ、例えばＰ２Ｄ遺伝子プロモータのＮｒｆ２結合配列を含むレポータ構築物を発現する細胞を準備すること、該細胞を該サブ画分に接触させること、及びＰ２Ｄ若しくは抗酸化遺伝子又はレポータ構築物の発現に対する該サブ画分の効果を検出することも含む。Ｐ２Ｄ若しくは抗酸化遺伝子又はレポータ構築物の発現を増加させるサブ画分が、細胞において第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）及び／又は抗酸化遺伝子の発現を増加させる化合物を含む。これらの工程を必要に応じて精製化合物が得られるまで繰り返してもよく、又は精製化合物を、標準的なスプリット・プール（split-pool）法を使用して同定及び取得することができる。
【００１４】
幾つかの実施の形態において、本方法は、経口又は局所投与のために上記精製化合物を処方することも含む。
【００１５】
幾つかの実施の形態において、これらの方法で使用される細胞は、培養細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、又はシノラブディティス・エレガンスにおける細胞（例えばＡＳＩ細胞）である。
【００１６】
幾つかの実施の形態において、植物抽出物はヤナギ抽出物である。
【００１７】
幾つかの実施の形態において、Ｐ２Ｄ遺伝子がグルタミン酸システインリガーゼ調節サブユニット（ＧＣＬＭ）、グルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）から成る群から選択される。これらの方法は、抗酸化遺伝子、例えばスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）を使用して行うこともできる。
【００１８】
幾つかの実施の形態において、本方法は、Ｐ２Ｄ若しくは抗酸化遺伝子又はレポータ構築物の発現を増加させる画分を選択すると共に、２つ以上のサブ画分を生じるように該画分をさらに分割すること、ＦＯＸＯ１遺伝子、又はＦＯＸＯ１遺伝子プロモータを含むレポータ構築物を発現する細胞を準備すること、該細胞を該サブ画分に接触させること、ＦＯＸＯ１遺伝子又はレポータ構築物の発現に対する該サブ画分の効果を検出すること、及びＦＯＸＯ１遺伝子又はレポータ構築物の発現を増加させるサブ画分を選択することも含む。
【００１９】
幾つかの実施の形態において、本方法は、Ｐ２Ｄ若しくは抗酸化遺伝子又はレポータ構築物の発現を増加させる画分を選択すると共に、２つ以上のサブ画分を生じるように該画分をさらに分割すること、細胞を該サブ画分に接触させること、細胞における８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）のレベルに対する該サブ画分の効果を検出すること、及び細胞において８−ＯＨｄＧのレベルを低減するサブ画分を選択することも含む。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、細胞においてフォークヘッドボックスＯ１（ＦＯＸＯ１）遺伝子の発現を増加させる化合物を同定する方法を提供する。本方法は、（ｉ）ＦＯＸＯ１遺伝子又は（ｉｉ）ＦＯＸＯ１遺伝子プロモータを含むレポータ構築物を発現する細胞を準備すること、植物抽出物の画分を準備すること、該細胞を該画分に接触させること、及びＦＯＸＯ１遺伝子又はレポータ構築物の発現に対する該画分の効果を検出することを含む。ＦＯＸＯ１遺伝子又はレポータ構築物の発現を増加させる画分が、細胞においてＦＯＸＯ１遺伝子の発現を増加させる化合物を含む。
【００２１】
幾つかの実施の形態において、本方法は、ＦＯＸＯ１遺伝子又はレポータ構築物の発現を増加させる画分を選択すると共に、２つ以上のサブ画分を生じるように該画分をさらに分割すること、ＦＯＸＯ１遺伝子、又はＦＯＸＯ１遺伝子プロモータを含むレポータ構築物を発現する細胞を準備すること、該細胞を該サブ画分に接触させること、及びＦＯＸＯ１遺伝子又はレポータ構築物の発現に対する該サブ画分の効果を検出することをさらに含む。ＦＯＸＯ１遺伝子又はレポータ構築物の発現を増加させるサブ画分が、細胞においてＦＯＸＯ１遺伝子の発現を増加させる化合物を含む。これらの工程を精製化合物が得られるまで繰り返してもよく、又は他の方法、例えばスプリット・プール法を、精製活性化合物を同定するのに使用することができる。
【００２２】
幾つかの実施の形態において、本方法は、経口又は局所投与のために上記画分又は上記精製化合物を処方することをさらに含む。
【００２３】
幾つかの実施の形態において、細胞は、培養細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、線維芽細胞、又はシノラブディティス・エレガンスにおける細胞、例えばＡＳＩ細胞である。
【００２４】
本明細書中で、細胞に有効量の植物抽出物、例えばヤナギ抽出物又はその活性画分を投与することによって、細胞において第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）遺伝子及び抗酸化酵素遺伝子の増強活性を増加する方法も提供される。
【００２５】
さらに本発明は、細胞に植物抽出物、例えばヤナギ抽出物又はその活性画分を含む有効量の組成物を投与することによって、細胞において第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）遺伝子及び抗酸化酵素遺伝子の増強活性を増加する方法を提供する。
【００２６】
幾つかの実施の形態において、抽出物又は活性画分が細胞への酸化的損傷を軽減又は予防する。
【００２７】
幾つかの実施の形態において、細胞は生きている哺乳動物におけるものであり、且つ抽出物が哺乳動物の組織において酸化的損傷を低減する。幾つかの実施の形態では、細胞が皮膚細胞であり、且つ抽出物が哺乳動物の皮膚への酸化的損傷を軽減する。
【００２８】
幾つかの実施の形態において、細胞が皮膚細胞であり、且つ抽出物が、紫外線照射への曝露によって起こる哺乳動物の皮膚の色素沈着を低減する。
【００２９】
幾つかの実施の形態において、紫外線照射への曝露前に植物抽出物を哺乳動物の皮膚に適用する。
【００３０】
幾つかの実施の形態において、本方法は、抽出物又は経口若しくは局所投与に関して本明細書中で記載の方法によって同定される精製化合物を処方することをさらに含む。化合物及び処方化合物も含まれる。
【００３１】
他に規定のない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において、方法及び材料は、本発明での使用に関して記載されているが、当該技術分野で既知の他の好適な方法及び材料も使用することができる。材料、方法及び実施例は、単に例示的なものであり、限定は意図されない。本明細書中で言及される刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ及び他の参考文献は全て、その全体が参照により援用される。コンフリクトのある場合には、定義を含む本明細書によりコントロールされる。
【００３２】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】緑茶抽出物によって誘導されるＧＦＰ発現を示すグラフである。
【図２】ヤナギ抽出物によって誘導されるＧＦＰ発現を示すグラフである。
【図３】スルフォラファンによって誘導されるＧＦＰ発現を示すグラフである。
【図４】実施例４に記載されるように作製される９つの画分それぞれの分離を示す薄層クロマトグラフの複写図であり、表は画分の物理的特性及び活性を記載している。
【図５】実施例４に記載される分画実験の結果を示す９つ一組の写真である。
【図６】Ｎｒｆ２下流遺伝子発現に対する異なる濃度（１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ）の分画ヤナギ抽出物の効果を示す棒グラフである。グルタミン酸システインリガーゼ調節サブユニット（ＧＣＬＭ）の発現を検出するのに、ＳＹＢＲ（商標）ＧｒｅｅｎによるＲＴ−ＰＣＲを使用した。
【図７】Ｎｒｆ２下流遺伝子発現に対する異なる濃度（１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ又は１００μｇ／ｍｌ）の分画ヤナギ抽出物の効果を示す棒グラフである。グルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）の発現を検出するのに、ＳＹＢＲ（商標）ＧｒｅｅｎによるＲＴ−ＰＣＲを使用した。
【図８】ＳＯＤ１発現に対するヤナギ抽出物補充の効果を示す折れ線グラフである。
【図９】Ｎｒｆ２発現に対するヤナギ抽出物補充の効果を示す折れ線グラフである。
【図１０】ＧＣＬＭ発現に対するヤナギ抽出物補充の効果を示す折れ線グラフである。
【図１１】カタラーゼ発現に対するヤナギ抽出物補充の効果を示す折れ線グラフである。
【図１２】血清８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）推移に対するヤナギ抽出物補充の効果を示す折れ線グラフである。
【図１３】血清ＧＳＨ推移に対するヤナギ抽出物補充の効果を示す折れ線グラフである。
【図１４】血清ＳＯＤ推移に対するヤナギ抽出物補充の効果を示す折れ線グラフである。
【図１５】フォークヘッドボックスＯ１（ＦＯＸＯ１）発現に対するヤナギ抽出物補充の効果を示す折れ線グラフである。
【図１６】実施例４に記載されるように作製し、且つ実施例６に記載されるようにプールした５つの画分それぞれの分離を示す薄層クロマトグラフの複写図であり、表は画分の物理的特性及び活性を記載している。
【図１７】分画ヤナギ抽出物による第ＩＩ相応答（ＧＣＳ−１：：ＧＦＰ発現）の誘導を示す棒グラフである。特定数の動物をヤナギ調製物の異なる画分に曝露した。画分Ａを除いて（５μｇ／ｍｌ）、１０ｍｇ／ｍｌの各材料を使用してインキュベーションを行った。ＤＭＳＯが対照であった画分Ａを含有する試料を除く全ての試料でＭ９を対照として使用した。誤差バーは複数の個別実験間の標準偏差に対応している。
【図１８】ヤナギ抽出物（１０ｍｇ／ｍｌ）、緑茶抽出物（２μｇ／ｍｌ）又はヤナギ画分Ａ（５μｇ／ｍＬ）による酸化的ストレスからのＮ２幼虫の保護を示す折れ線グラフである。プレート上で４８時間の代表的実験を図示し、誤差バーは標準偏差を示す（明細書本文を参照されたい）。
【図１９】ニンジン粉末及びブロッコリー粉末による第ＩＩ相応答（ＧＣＳ−１：：ＧＦＰ発現）の誘導を示す棒グラフである。右側に示した対照試料を除いて、特定数の動物をニンジン調製物又はブロッコリー調製物のいずれかに曝露した。代表的実験を図示する。
【図２０Ａ】発現がＮｒｆ１及びＨＯ−１で調節される２つの遺伝子に対するヤナギ抽出物の効果を示す棒グラフである。
【図２０Ｂ】発現がＮｒｆ１及びＮＱＯ１で調節される２つの遺伝子に対するヤナギ抽出物の効果を示す棒グラフである。
【図２１】ヒトＰＢＭＣにおけるＮＲＦ２遺伝子の発現に対する１０ｕｇ／ｍｌ及び１００ｕｇ／ｍｌのヤナギ抽出物の効果を示す棒グラフである。
【図２２】ヒトＰＢＭＣにおけるＮＲＦ２タンパク質のレベルに対する１０ｕｇ／ｍｌ及び１００ｕｇ／ｍｌのヤナギ抽出物の効果を示す棒グラフである。
【図２３】抗酸化ストレスの発現レベルに対する１つのヤナギ抽出物の効果を示す棒グラフである。
【図２４】ヒト被験者におけるＴＢＡＲＳに対するヤナギ抽出物の経口投与の効果を示す折れ線グラフである。
【図２５】ＵＶに曝された皮膚の平均濃淡値によって測定された、ヒトの皮膚における抗酸化応答に対する経口投与されたヤナギ抽出物と（versus）プラシーボとの効果を示す棒グラフである。
【図２６】ＵＶに曝された皮膚の平均濃淡値によって測定された、ヒトの皮膚における抗酸化応答に対する局所投与されたヤナギ抽出物とプラシーボとの効果を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
Ｎｒｆ２活性を増強し、それにより第ＩＩ相解毒系を活性化し、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ、酸化的損傷を受けたＤＮＡの標準的なマーカー）のレベルを低減し、且つ／又はフォークヘッドボックスＯ１（ＦＯＸＯ１）遺伝子発現レベルを増加するのに使用することができる方法及び組成物、並びに同様にＮｒｆ２を増強し、８−ＯＨｄＧレベルを低減し、且つＦＯＸＯ１遺伝子発現レベルを増加させる、ヤナギ及び茶に存在するさらなる化合物を同定する方法が本明細書中に記載される。
Ｎｒｆ２
転写因子であるＮｒｆ２は、哺乳動物における酸化的ストレス応答の主因子である。Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１、ＧＳＫ−３及び他の機構によって抑制される。この抑制は、酸化的ストレスの存在下で取り除かれ、この時にＮｒｆ２が細胞質から核に移入され、そこで第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）遺伝子の抗酸化応答領域に結合する。Ｎｒｆ２の結合はＰ２Ｄ遺伝子の転写を活性化し、それによりＰ２Ｄ酵素の発現を誘導する。このため、ＮＲＦ２の核移入（importation）及びＮＲＦ２とＮｒｆ２の遺伝子との結合が促進されると、Ｐ２Ｄ酵素の産生が増強され、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗酸化力が高まる。Ｎｒｆ２遺伝子ノックアウトマウスは、薬物トキシン（toxins）及び癌により極度に影響されやすく、また化学防御アプローチに使用される抗酸化物質には反応しない（Chan and Kan, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci., 96, 12731-12736; Chan et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci., 98, 4611-4616; Fahey et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., 99, 7610-7615; Ramos-Gomez et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci., 98, 3410-3415）。
【００３５】
線虫の一種であるシノラブディティス・エレガンスは、哺乳動物の酸化的ストレス応答系と類似の酸化的ストレス応答系を有する。この系は、ＭＡＰＫカスケードと呼ばれる。ＭＡＰＫカスケードの標的であるＳＫＮ−１は転写因子である。Ｎｒｆ２と同様に、ＳＫＮ−１のＧＳＫ−３抑制は酸化的ストレスの存在下で緩和される。それから、ＳＫＮ−１は、（例えば消化器系（腸）において）細胞質から核に移動し、Ｐ２Ｄ遺伝子の抗酸化応答領域と結合して、Ｐ２Ｄ遺伝子の転写を活性化することにより、Ｐ２Ｄ酵素の発現を誘導する。したがって、線虫のＳＫＮ−１は、哺乳動物におけるＮｒｆ２の機構と非常に類似した機構によってＰ２Ｄ酵素の産生を調節する。この場合、シノラブディティス・エレガンス（C. elegans）におけるＳＫＮ−１の核移入、及び第ＩＩ相解毒酵素遺伝子と抗酸化応答領域との結合を促進し、それにより第ＩＩ相解毒酵素の産生を増強する物質が、哺乳動物におけるＮｒｆ２による第ＩＩ相解毒酵素の産生を増強すると期待され得る。さらに、癌及び様々な変性疾患の抑制も期待することができる。
【００３６】
ＳＫＮ−１によるＰ２Ｄ遺伝子の発現を検証するために、既知の方法により遺伝子が使用され、ここでγグルタミルシステイン合成酵素をコードするｇｃｓ−１遺伝子、シノラブディティス・エレガンスにおける既知のＰ２Ｄ遺伝子、及びＳＫＮ−１の結合標的を、レポータ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子（ＧＣＳ−１：：ＧＦＰ）と融合することができる（An and Blackwell, 2003, Genes & Dev., 17, 1882-1893; An et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 102, 16275-16280; Inoue et al., 2005, Genes Dev., 19, 2278-2283）。この方法では初めに、融合ＧＣＳ−１：：ＧＦＰ遺伝子を、形質転換のために線虫に移動させる。酸化的ストレスが低い標準条件下で、シノラブディティス・エレガンスの咽頭及びＡＳＩにおける融合遺伝子の発現を、ＧＦＰの蛍光発光によって確認することができる。酸化的ストレス条件下では、この融合遺伝子はシノラブディティス・エレガンスの腸で発現する。本明細書中に記載のように、ＳＫＮ−１活性化物質、例えばヤナギ抽出物及び茶抽出物により、ＧＣＳ−１：：ＧＦＰ融合遺伝子の発現が強く引き起こされる。
ＦＯＸＯ１
ＦＯＸＯタンパク質は、インスリン関連シグナル伝達によって阻害される転写因子群であり、幹細胞維持、脂肪分化、インスリン感受性、抗酸化酵素遺伝子の増強活性を増加することによる活性酸素種（ＲＯＳ）に対する防御、アポトーシス、腫瘍抑制及び長寿命化（longevity）を含む多くの生物学的過程に関与する。それらの既知の標的遺伝子の多くはＳＯＤを含むストレス応答遺伝子である。例えばAntebi, PLOS genetics 3, 1565-1571 （2007）; Tothova and Gilliland, Cell Stem Cell 1, 140-152 （2007）、及びAccili and Arden, Cell 117, 421-476 （2004）を参照されたい。
ヤナギ抽出物
本明細書中に記載の方法で使用されるヤナギは、ヤナギ科ヤナギ（Salix）属又はヤマナラシ属の植物である。ヤマナラシ属の植物の例としては、「ウラジロハコヤナギ」（別名、「ハクヨウ」、「ギンドロ」；ポルプス・アルバ（P. alba））、カナダポプラ（ポプルス・カナデンシス（P. x Canadensis））、コットンウッド（cottonwood）（ポルプス・デルトイデス（P. deltoides））（別名、「ヒロハハコヤナギ」）、「コトカケヤナギ」（ポルプス・ユーフラティカ（P. euphratica））、「オオバヤマナラシ」（ポルプス・トメントサ（P. tomentosa））、「チリメンドロ」（ポルプス・コリアナ（P. koreana））、「ドロノキ」（ポルプス・マキシモウィクシィ（P. maximowiczii））、「ヨーロッパクロヤマナラシ」（ポルプス・ニグラ（P. nigra））、「セイヨウハコヤナギ」（別名、「イタリアヤマナラシ」；ポルプス・ニグライタリカ変種（P. nigra var. italica））、「ヤマナラシ」（別名、「ハコヤナギ」、「ポプラ」；ポルプス・シーボルディ（P. sieboldii））、ヒロハハコヤナギ（ポルプス・タカマハカ（P. tacamahaca））、「シナヤマナラシ」、「チョウセンヤマナラシ」（ポルプス・ダビディアーナ（P. davidiana））、アメリカポプラ（ポルプス・トレムロイデス（P. tremuloides））及びポルプス・ユーラメリカナ（P. euramericana）が挙げられる。ヤナギ属の植物の例としては、セイヨウシロヤナギ（White Willow）（サリックス・アルバ（S. alba））、「サイコクキツネヤナギ」（サリックス・アロポクロア（S. alopochroa））、「ユスラバヤナギ」（サリックス・アウリタ（S. aurita））、「シダレヤナギ」（別名、「イトウヤナギ」、サリックス・バビロニカ（S. babylonica））、「ヤマネコヤナギ」（別名、「バッコヤナギ」、サリックス・バッコ（S. bakko））、「アカネヤナギ」（別名、「マルバヤナギ」、サリックス・ケノメロイデス（S. chaenomeloides））、「コガネシダレ」（サリックス・クリソコーマ（S. chrysochoma））、サリックス・ダフノイデス（S. daphnoides：セイヨウエゾヤナギ）、「サリックス・エレアグノス」（サリックス・エレアグノス「Ｓｃｏｐｏｌｉ」（S. elaeagaos 'Scopoli'））、「ポッキリヤナギ」（サリックス・フラギリス（S.fragilis））、「オオキツネヤナギ」（別名、「キンメヤナギ」、サリックス・フツラ（S. futura））、「カワヤナギ」（別名、「ナガバカワヤナギ」、サリックス・ギルギアナ（S. gilgiana））、「ネコヤナギ」（サリックス・グラシリスチラ（S. gracilistyla））、「クロヤナギ」（サリックス・グラシリスチラメラノスタキス変種（S. gracilistyla var. melanostachys））、「サウセ」（サリックス・フンボルディアナ（S. humboldtiana））、「イヌコリヤナギ」（サリックス・インテグラ（S. integra））、「シバヤナギ」（サリックス・ジャポニカ（S. japonica））、「シロヤナギ」（サリックス・ジェッソエンシス（S. jessoensis）、「キヌヤナギ」（サリックス・キヌヤナギ（S. kinuyanagi））、「コリヤナギ」（サリックス・コリヤナギ（S. koriyanagi））、「エゾヤナギ」（サリックス・ロリダ（S. rorida））、「フリソデヤナギ」（サリックス・レウコピテキア（S. leucopithecia））、「ウンリュウヤナギ」（サリックス・マツダナトルツオサ品種（S. matsudana f. tortuosa））、「タカネイワヤナギ」（別名、「レンゲイワヤナギ」）、「オオシダレヤナギ」（サリックス・オオシダレ（S. ohsidare））、「エゾマメヤナギ」（サリックス・ヌンムラリアパウシフローラ亜種（S. nummularia ssp. Pauciflora））、「エゾノキヌヤナギ」（サリックス・ペッスス（S. pet-susu））、サリックス・プルプレア（S. purpurea：セイヨウコリヤナギ）、「コウヒリュウ」、「ミヤマヤナギ」（別名、「ミネヤナギ」、サリックス・レイニィ（S. reinii））、「コマイワヤナギ」（サリックス・ルピフラガ（S. rupifraga））、「オノエヤナギ」（別名、「カラフトヤナギ」、サリックス・サッカリネンシス（S. sachalinensis））、「コゴメヤナギ」（サリックス・セリッセフォリア（S. serissaefolia））、「シライヤナギ」（サリックス・シライ（S. shiraii））、サリックス種、「タチヤナギ」（サリックス・サブフラギリス）、「ノヤナギ」（別名、「ヒメヤナギ」）、「セイヨウタチヤナギ」、「キツネヤナギ」（別名、「イワヤナギ」、サリックス・ブルピン（S. vulpine））及び「エゾノタカネヤナギ」（サリックス・エゾアルピナ（S. yezoalpina））が挙げられる。ヤナギの芽、葉、果実、枝、幹、樹皮及び／又は根を単独で又はそれらを任意に組み合わせて使用することができ、必要に応じて摂取に好適な形態に処理される。好ましいヤナギは、サリックス・ダフノイデス、ヤナギ属、サリックス・プルプレア、サリックス・フラギリスを含むセイヨウシロヤナギであり、サリックス・アルバが特に好ましい。幾つかの実施形態では、ヤナギは、サリックス・アルバ、サリックス・ダフノイデス、サリックス・プルプレア又はサリックス・フラギリスである。
【００３７】
本発明のヤナギ抽出物は、上記のヤナギを必要に応じて抽出に適した処理、例えば細断（chopping）、乾燥及び／又は粉砕（crushing）にかけた後に抽出するのが好ましい。上述の処理ヤナギは通常、抽出剤を使用して、例えば独立して静置、振盪、超音波照射、加熱、及び／又は加圧によって、又は必要に応じてそれらの任意の組合せで抽出する。幾つかの実施形態では、好ましい手順は、ヤナギを抽出剤中に浸漬した後、振盪又は撹拌することである。幾つかの実施形態では、ヤナギ抽出物を本明細書中に記載のように分画し、活性が最も高い画分を本明細書中に記載の組成物に使用する。
【００３８】
通常、水性溶媒及び有機溶媒を抽出剤として使用し、単独で又はそれらを組み合わせて使用することができる。有機溶媒の例としては、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等の低級アルコール；ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール等の多価アルコール；酢酸エチル、酢酸ブチル及び同様のエステル；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；並びにＣＯ２及び同様の超臨界流体が挙げられる。幾つかの実施形態では、好ましい抽出剤としては、水、エタノール及びそれらの混合物が挙げられる。幾つかの実施形態では、水を抽出剤として使用する。
【００３９】
これらの操作を行う温度は変更することもできる。抽出温度は通常、３℃〜使用される抽出剤の沸点である。抽出時間は、例えば抽出剤の種類、抽出温度、及び／又はヤナギの形態によって様々であるが、典型的には１時間〜７日間、好ましくは２時間〜３日間である。必要に応じて、加圧することができる。幾つかの実施形態では、ヤナギ抽出物を沸騰水を使用して調製する。
【００４０】
本明細書中に記載の組成物及び方法において変更することなく、抽出物を使用することができる。例えば濃縮、乾燥保存（desiccated）、無水化（exsiccated）及び／又は凍結乾燥した後；抽出物の効果を損わない限りにおいて、脱色、脱臭及び／又は脱塩等の精製処理にかけた後；及び／又は分画処理、例えば液液分配クロマトグラフィ及びカラムクロマトグラフィにかけた後、抽出物を例えば水又は有機溶媒中に溶解するものとして使用することもできる。代替的に、ヤナギ抽出物を好適な担体、例えばリポソーム又はマイクロカプセル中に含有させることができる。
【００４１】
幾つかの実施形態では、画分の保持因子（Ｒｆ）を求め、Ｒｆ値が０．５を超える、例えば０．６、０．７、０．７５又は０．７８を超える画分を選択する。幾つかの実施形態では、本方法で有用な画分は有意量のサリシンを含有しない。
茶抽出物
本明細書中に記載の方法及び組成物で使用される茶は、例えば緑茶、烏龍茶、紅茶又はプーアール茶を含み得る（それらの全てがカメリア・シネンシス（Camellia sinensis）由来である）。植物の任意の組織（part）、例えば花、葉及び／又は枝を単独で又はそれらを任意に組み合わせて使用することができ、必要に応じて摂取に好適な形態に処理される。幾つかの実施形態では、葉を単独で使用する。幾つかの実施形態では、好ましい茶は緑茶である。
【００４２】
本明細書中に記載の茶抽出物は一般的に、茶を必要に応じて抽出に適した処理、例えば細断、乾燥及び／又は粉砕にかけた後で調製される。次いで、処理茶を通常、抽出剤に接触させ、例えば独立して静置、振盪、超音波照射、加熱、及び／又は加圧によって、又はそれらの任意の組合せで抽出する。幾つかの実施形態では、茶を抽出剤中に浸漬した後、振盪又は撹拌する。
【００４３】
通常、水性溶媒及び有機溶媒を抽出剤として、単独で又はそれらを任意に組み合わせて使用する。有機溶媒の例としては、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等の低級アルコール；ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール等の多価アルコール；並びにＣＯ２及び他の超臨界流体が挙げられるが、これらに限定されない。これらを単独で又は組み合わせて使用することができる。好ましい抽出剤としては、水及びエタノールである。幾つかの実施形態では、抽出剤は、約６５％〜８５％エタノール水溶液、例えば約７０％〜８０％エタノール水溶液である。
【００４４】
抽出温度は通常、３℃〜使用される抽出剤の沸点である。抽出時間は、例えば抽出剤の種類、抽出温度、及び／又は茶の形態によって様々であるが、典型的には１時間〜７日間、例えば２時間〜３日間である。必要に応じて、さらに加圧することができる。さらには、必要に応じて、活性成分の安定抽出のために事前にアスコルビン酸等の抗酸化物質を抽出剤に添加することができる。
【００４５】
幾つかの実施形態において、茶抽出物を本明細書中に記載のように分画し、活性が最も高い画分を本明細書中に記載の組成物に使用する。
【００４６】
本明細書中に記載の組成物及び方法において変更することなく、抽出物を使用することができる。濃縮、乾燥保存、無水化又は凍結乾燥した後；抽出物の効果を損わない限りにおいて、脱色、脱臭又は脱塩等の精製処理にかけた後；及び／又は液液分配クロマトグラフィ及びカラムクロマトグラフィ等の分画処理にかけた後、抽出物を例えば水、有機溶媒中に溶解することもできる。代替的に、茶抽出物を好適な担体、例えばマイクロカプセル又はリポソーム中に含有されるものとして使用することができる。
ブロッコリー粉末
本明細書中に記載の方法で使用されるブロッコリーは、キャベツ科、アブラナ科（Brassicaceae）（前十字花科（Cruciferae））のブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea：ヤセイカンラン）属の植物である。ブロッコリーの花、芽、茎及び葉を単独で又はそれらを任意に組み合わせて使用することができ、必要に応じて内用又は外用に好適な形態に処理する。好ましくは、花芽及び茎の両方を使用する。上記のブロッコリーを必要に応じて抽出のために調製するのに適した処理、例えば細断、乾燥及び／又は粉砕にかけた後、ブロッコリー粉末を抽出するのが好ましい。次いで、上述の処理ブロッコリーは通常、抽出剤、例えば水、エタノール又はそれらの混合物を使用して、独立して静置、振盪、超音波照射、加熱、及び／又は加圧によって、又は必要に応じてそれらの任意の組合せで圧搾及び／又は抽出する。幾つかの実施形態では、好ましい手順は、ブロッコリーの花芽の集まり（flower heads）の大きな塊のピューレを圧搾することである。幾つかの実施形態では、ブロッコリー抽出物を本明細書中に記載のように分画し、活性が最も高い画分を本明細書中に記載の組成物に使用する。
【００４７】
幾つかの実施形態において、本明細書中に記載の組成物及び方法において変更することなく、抽出物を使用することができる。例えば濃縮、乾燥保存、無水化及び／又は凍結乾燥した後；抽出物の効果を損わない限りにおいて、脱色、脱臭及び／又は脱塩等の精製処理にかけた後；及び／又は分画処理、例えば液液分配クロマトグラフィ及び／又はカラムクロマトグラフィにかけた後、抽出物を例えば水又は有機溶媒中に溶解するものとして使用することもできる。
ニンジン粉末
本明細書中に記載の方法で使用されるニンジンは、ダウカス・カロータ（Daucus carota：ニンジン）属の植物である。ニンジンの根、葉及び茎を単独で又はそれらを任意に組み合わせて使用することができ、必要に応じて内用又は外用に好適な形態に処理する。好ましくは、根を使用する。上記のニンジンを必要に応じて抽出のために調製するのに適した処理、例えば細断、乾燥及び／又は粉砕にかけた後、ニンジン粉末を抽出するのが好ましい。次いで、上述の処理ニンジンは通常、抽出剤、例えば水、エタノール又はそれらの混合物を使用して、例えば独立して静置、振盪、超音波照射、加熱、及び／又は加圧によって、又は必要に応じてそれらの任意の組合せで圧搾及び／又は抽出する。幾つかの実施形態では、好ましい手順は、ニンジンの根のピューレを圧搾することである。幾つかの実施形態では、ニンジン抽出物を本明細書中に記載のように分画し、活性が最も高い画分を本明細書中に記載の組成物に使用する。
【００４８】
本明細書中に記載の組成物及び方法において変更することなく、抽出物を使用することができる。例えば濃縮、乾燥保存、無水化及び／又は凍結乾燥した後；抽出物の効果を損わない限りにおいて、脱色、脱臭及び／又は脱塩等の精製処理にかけた後；及び／又は分画処理、例えば液液分配クロマトグラフィ及びカラムクロマトグラフィにかけた後、抽出物を例えば水又は有機溶媒中に溶解するものとして使用することもできる。
組成物
本明細書中に記載の組成物は、１つ又は複数の植物抽出物、例えばニンジン、ブロッコリー、ヤナギ及び／又は茶の抽出物、及び／又はそれらに由来する活性画分又は作用物質を典型的に、約０．０００１重量％〜９５重量％、好ましくは０．００１重量％〜７０重量％、より好ましくは０．０１重量％〜３０重量％含むことができる。幾つかの実施形態では、有用な組成物は、以下の実施例４に記載のように調製されるヤナギ抽出物のより活性の高い画分の幾つか又は全て、例えば画分１＋画分２又は画分１＋画分２＋画分３を含む。さらに、本明細書中に記載の組成物は、化合物の活性に有意に悪影響を与えなければ、例えば化粧品、医薬品又は食品の分野で有用な添加物を含有してもよい。
経口投与用の医薬品組成物
一態様において、本発明は、本明細書中に記載の抽出物及び活性画分を含む医薬品組成物を含む。１つ又は複数の植物抽出物、及び／又はそれらに由来する活性画分又は作用物質に加えて、本明細書中に記載の組成物は、経口で許容される担体、添加物等をさらに含有することができる。組成物は、様々な形態、例えば経口摂取に適した形態、例えば液体製剤；錠剤、顆粒、細粒、粉末等の固体製剤；該液体又は固体製剤を含有するカプセル；経口噴霧剤；及びトローチにおいて使用することができる。これらの形態の製剤を標準的な方法で作製することができる。製剤はピル（特に錠剤）、カプセル、小丸薬、粉末又は顆粒、より好ましくはピル又はカプセルの形態であるのが好ましい。また医薬品製剤分野で使用される経口で許容される添加物及び担体が組成物中に含まれ得る。例は以下で与えられるが、それらに限定されない。賦形剤としては、例えば糖アルコール（例えばマルチトール、キシリトール、ソルビトール又はエリスリトール）、ラクトース、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、デンプン、炭酸塩（例えば炭酸カルシウム）、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセロール、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、タルク、リン酸塩（例えば第二リン酸カルシウム、リン酸二水素カルシウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素カルシウム又はリン酸二水素ナトリウム）、硫酸カルシウム、乳酸カルシウム又はカカオバターが挙げられる。粘度調整剤としては、例えば単シロップ、グルコース液、デンプン液及びゼラチン溶液が挙げられる。結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、架橋ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、結晶セルロース、粉末セルロース、結晶セルロース−カルメロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、シェラック、メチルセルロース、エチルセルロース、リン酸カリウム、粉末アラビアゴム、プルラン、ペクチン、デキストリン、コーンスターチ、α−デンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、ゼラチン、キサンタンゴム、カラギーナン、トラガカント、粉末トラガカント及びマクロゴール（macrogoal）が挙げられる。崩壊剤としては、例えば乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、寒天粉末、ラミナラン粉末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン及びラクトースが挙げられる。崩壊阻害剤としては例えば、白糖、ステアリン酸、カカオバター、硬化油等；第四アンモニウム塩及びラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤が挙げられる。吸収剤としては例えば、デンプン、ラクトース、カオリン、ベントナイト及びコロイドケイ酸が挙げられる。滑剤としては例えば、強化タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸粉末及びポリエチレングリコールが挙げられる。乳化剤としては例えば、スクロース脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、酵素処理したレシチン、発酵レシ���ン及びサポニンが挙げられる。抗酸化剤としては例えば、アスコルビン酸及びトコフェロールが挙げられる。酸味料としては例えば、乳酸、クエン酸、グルコン酸及びグルタミン酸が挙げられる。強化剤としては例えば、ビタミン、アミノ酸、乳酸塩、クエン酸塩及びグルコン酸塩が挙げられる。可塑剤としては例えば、二酸化ケイ素が挙げられる。甘味料としては例えば、スクラロース、アセスルファームカリウム、アスパルテーム及びグルチルリチン（glycyrrhizin）が挙げられる。香料としては例えば、ペパーミント油、ユーカリ油、シナモン油、ウイキョウ油、チョウジ油、オレンジ油、レモン油、バラ油、果実フレバー、ミントフレバー、ペパーミント粉末、ｄｌ−メントール及びｌ−メントールが挙げられる。オリゴ糖としては例えば、ラクトース、ラフィノース及びラクトスクロースが挙げられる。調製溶媒としては例えば酢酸ナトリウムが挙げられる。
【００４９】
さらに、例えば糖衣（sugar-coated）錠、ゼラチン膜コーティング錠剤、腸溶性（enteric-coated）錠剤、膜コーティング錠剤、二重層錠剤、又は多層錠剤を調製するのに必要であれば、錠剤等の固体製剤に、典型的なコーティングを被覆することができる。液体製剤は、水性又は油性の懸濁液、溶液、シロップ又はエリキシルの形態であってもよく、標準的な方法によって、例えば当該技術分野で知られるような、及び／又は本明細書中に記載のような典型的な担体及び／又は添加物を使用して調製することができる。
経口投与用の栄養補助組成物
例えば食用担体、食品成分又は食品添加物と組み合わせた、１つ又は複数の植物抽出物、及び／又はそれらに由来する活性画分又は作用物質を含む栄養補助組成物も本発明に含まれる。かかる組成物を当該技術分野で既知の方法で調製する。かかる栄養補助食品の例としては、飲料等の液体食品、及びバー（bars）、ケーキ、錠剤、顆粒、チュアブル錠等の固体食品が挙げられる。代替的にそれらは半固体、例えばヨーグルト又はヨーグルトのような硬さであり得る。かかる食品形態の具体例としては、ジュース、ソフトドリンク及び茶等の液体飲料；ジュース粉末又はスープ粉末等の粉末飲料；チョコレート、キャンディー、チューイングガム、アイスクリーム、ゼリー、クッキー、ビスケット、コーンフレーク、チュアブル錠、膜シート（film sheets）、ウエハース、グミ、煎餅及び餡子が詰まった団子等のスナック菓子；ドレッシング、ソース等の調味料；パン、パスタ、コンニャクマンナン、魚のすり身（例えばかまぼこ）、ふりかけ、経口噴霧剤並びにトローチが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
また栄養補助食品は、当該技術分野で既知の様々な添加物及び担体を含むことができる。例えば、乳酸菌、不活性化細菌、他のプロバイオティクス等の生きている微生物、ビタミン、薬用植物（botanical medicines）、ハーブ等の他の植物、及びそれらの抽出物を添加物として使用することができる。担体の例としては、糖アルコール、賦形剤、結合剤、乳化剤、抗酸化剤、酸性化剤、強化剤、アンチケーキング剤、滑剤、甘味料及び香味料が挙げられる。
【００５１】
栄養補助組成物を、例えば健康食品、機能性食品、指定健康食品、栄養機能性食品又は、被験者における状態、例えば老化に伴う疾患又は症状の治療のための食品として使用することができる。
オーラルケア製品
本明細書中に記載の植物抽出物及びそれらの活性画分を練り歯磨き粉、歯磨き粉、液体歯磨剤、ゲル歯磨剤、歯科用予防ペースト、口腔スプレー及び口腔洗浄液等のオーラルケア用の組成物で使用することができる。かかる組成物、並びに好適な担体及び添加物を調製する方法が当該技術分野で既知である。
局所投与用の組成物
１つ又は複数の植物抽出物、及び／又はそれらに由来する活性画分又は作用物質に加えて、本明細書中に記載の組成物は、外用的に許容される担体、添加物等をさらに含有することができる。これらの組成物は、皮膚への適用に適した様々な形態、例えば水溶液、可溶化局所組成物、粉末分散体、水油２層組成物、水油粉末３層組成物、油／水エマルション、水／油エマルション、水／油／水エマルション、ゲル、エアロゾル、ミスト、カプセル、錠剤、顆粒及び粉末で使用することができる。これらの形態の製剤を標準的な方法で作製することができる。これらの製剤は、水溶液、油／水エマルション、水／油エマルション、水／油／水エマルション、ゲル、エアロゾル又はミストの形態であるのが好ましい。また医薬品又は化粧品の分野で使用される外用的に許容される添加物及び担体を組成物中に含むことができる。例は以下に挙げられるが、それらに限定されない。賦形剤としては、例えば陰イオン界面活性剤（例えばアルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルアラニン酸塩、アルキルグルタミン酸塩、アルキルイセチオン酸塩、アルキルサルコシネート又はソープ）、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤（例えばアルキルベタイン、アミドプロピルベタイン又はイミダゾリウムベタイン）、非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ブロックコポリマー、脂肪酸エステル、アルキルグリセリルエーテル、レシチン、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、サポリン、糖エステル又はアルカノールアミド）、油性物質（例えば鉱油、スクアラン、ラノリン、ワセリン、植物油、動物油、セレシン、脂肪酸エステル又は高級アルコール）、多価アルコール（例えばプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、１，２−ヘキサンジオール、ペンチレングリコール又はポリオキシエチレングリコール）、ポリマー（例えばポリシロキサン、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、プルラン、ペクチン、デキストリン又はキサンタンゴム）、粉末（例えばカオリン、結晶セルロース、タルク又はベントナイト）、有機酸及び無機酸が挙げられる。化粧品、医薬部外品（quasi-drugs）、薬剤等に組み込むのに適した他の様々な成分（例えばシクロシロキサン、ポリビニルアルコール、タンパク質、加水分解タンパク質、ペプチド、アミノ酸、紫外線吸収剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、湿潤剤、ビタミン、医学的有効成分、保存料、着色剤又は香料）を、それにより本発明の目的に重大な悪影響を及ぼさなければ、例えば活性成分の活性が有意に低減しなければ組み込むことができる。医薬部外品は身体に対して軽度の作用を有するが、疾患の診断、予防又は治療を対象とするものではなく、身体の構造又は機能に影響を与えるものでもない。
【００５２】
製品は、例えば、ローション、乳液（milky emulsions）、クリーム及びパック等の顔用化粧品；ファンデーション、頬紅、口紅、アイシャドー、アイライナー及び日焼け止め剤等の化粧品；身体用化粧品、例えばローション及びクリーム；メイク落とし剤（make-up removers）、フェイスクレンザー及びボディシャンプー等のスキンクレンジング化粧品；浴剤；並びにシャンプー及びコンディショナ等のヘアーケア剤を含む、皮膚に対して外用に従来使用される任意の種類のものであってもよい。
有効用量
本明細書中に記載の組成物の有効用量を、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験及び動物実験に基づき、当該技術分野で既知の方法を使用して決定することができる。幾つかの実施形態では、（例えば経口組成物として）内用される植物抽出物の用量は、成人１人当たり約５０ｍｇ／日〜２０００ｍｇ／日、例えば約１００ｍｇ／日〜１０００ｍｇ／日である。さらに、経口組成物は、１日１回から数回に分けて、食前（例えば５分以内）、食間、食後（例えば５分以内）又は食事と共に摂取することができる。幾つかの実施形態では、食事と共に又は食後に経口用量を摂取する。幾つかの実施形態では、（例えばクリーム又はローション等の局所製剤において）外用される植物抽出物の用量は、製剤の約０．０００１重量％〜９５重量％、好ましくは０．００１重量％〜７０重量％及びより好ましくは０．００１重量％〜３０重量％である。幾つかの実施形態では、局所製剤を１日１回又は複数回適用することができる。
使用
本明細書中に記載の、又は本明細書中に記載の方法によって発見された組成物は、第ＩＩ相解毒活性の向上を必要とする被験者の治療に有用である。例えば、酸化的ストレスは、組織の細胞における進行性の形態変化及び正常な代謝活性の進行性喪失を一般的に特徴とする変性疾患の病因に重要な役割を果たし得ると考えられている。幾つかの実施形態では、変性疾患は、例えば病変細胞又は組織に存在する異常なレベルのグルタチオン又は任意の第ＩＩ相酵素を特徴とし得る。これらの異常なレベルは、変性疾患の原因又は兆候のいずれかであり得る。本明細書中で使用される「変性疾患」という語句は、腫瘍成長又は急性毒性発作によるものではない罹患組織における正常細胞の破壊を特徴とする生理学的状態を表す。変性障害の例としては、糖尿病、慢性肝不全、慢性腎不全、ウィルソン病、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症及び神経変性疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、癲癇、重症筋無力症、神経障害、運動失調、認知症、慢性軸索神経障害及び脳卒中が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に記載の治療を使用して、先在している変性状態を有する被験者を治療するか、又は変性障害に罹りやすい被験者における疾患の発症又は進行を予防又は遅延させることができる。
【００５３】
さらに、これらの化合物は、例えば被験者の皮膚上での被験者における老化の影響の処置に有用である。したがって、本明細書中に記載の組成物を、例えばしわ、不要な色素沈着、皮膚の荒れ及び乾燥肌、又は皮膚のくすみを処置するのに使用することができる。
スクリーニング方法
茶抽出物及びヤナギ抽出物に存在する化合物がＰ２Ｄ遺伝子のＮｒｆ２／Ｓｋｎ−１活性化のエンハンサーであるという発見により、それらの抽出物において活性化合物を同定する方法に対する基盤が与えられる。多くのアッセイ（例えばシノラブディティス・エレガンスにおける天然又は改変Ｓｋｎ−１活性、及び任意の好適な細胞、例えばＮｒｆ２を発現する哺乳動物細胞におけるレポーター遺伝子構築物）をこれらの方法で使用することができる。抗酸化応答エレメントの活性因子に対する遺伝的スクリーニングは、Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104（12）:5205-5210 （2007）に記載されている。レポータ構築物には、任意の検出可能なレポーターエレメント、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）若しくはそれらの変異体、例えば赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）若しくは強化ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）等の蛍光タンパク質；ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）又はβ−ガラクトシダーゼと共に典型的な最小プロモータ配列と連結した抗酸化応答エレメントが含まれる。かかる構築物を設計、選択及び作製する方法が当該技術分野で既知であり、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）を参照されたい。
抗酸化応答エレメント（ＡＲＥ）
ＡＲＥは、多くの第ＩＩ相解毒酵素の５’隣接領域に見出されるシス作用調節エンハンサーエレメント（コアコンセンサス配列：５’−ＧＴＧＡＣｎｎｎＧＣ−３’）である。ＡＲＥは、活性酸素種及び他の求電子剤によって、並びにＮｒｆ２の結合によって活性化される。ＡＲＥによって調節される遺伝子には、Ｐ２Ｄヘムオキシゲナーゼ−１、グルタチオン合成酵素、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ１（ＮＱＯ１）、グルタミルシステイン合成酵素（例えばグルタミン酸システインリガーゼ調節サブユニット（ＧＣＬＭ）、グルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット（ＧＣＬＣ））及びカタラーゼ、並びに抗酸化酵素スーパーオキシドジスムターゼ（例えばＳＯＤ１）が含まれる。
第ＩＩ相解毒酵素
グルクロン酸化、硫酸化、メチル化、アセチル化、アミノ酸抱合及びグルタチオン抱合を含む６種類の第ＩＩ相抱合反応がある。ロダネーゼ酵素によって触媒される反応（硫黄イオンをシアニドに移動させて、チオシアネートを生成する）も本明細書中において第ＩＩ相反応であると考えられる。例えば米国特許第６，８１２，２４８号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）を参照されたい。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載のスクリーニング方法には、細胞においてこれらの抱合反応の１つ又は複数を検出すること、及び画分が抱合反応を増加させる化合物を含むかどうかを求めるために、かかる活性を定量することが含まれる。
分画試料
概して、本明細書中に記載の方法は、抽出物の画分、例えば抽出物に存在する全ての構成要素の一部の使用を含む。かかる画分は、当該技術分野で既知の方法のいずれかを使用して作製することができ、また任意の１つ又は複数の抽出物の構成要素の物理的特性、例えばサイズ、ｐＨ、ｐＩ、可溶性又は電荷に基づき調製することができる。本明細書中に記載の抽出物を分画する方法、例えば免疫除去（immunodepletion）（アフィニティ除去）、ゲル電気泳動、逆相クロマトグラフィ、ゲル若しくは他の濾過、イオン交換、例えばシリカゲルを使用したカラムクロマトグラフィ、等電点電気泳動（isoelectric focusing）、例えば固定ｐＨ勾配等電点電気泳動（ＩＰＧ  ＩＥＦ）を含む（が、これらに限定されない）タンパク質及びペプチド分画法の多くが当該技術分野で既知であり、溶液相のｐＩに基づく分画系はｐＩによってタンパク質又はペプチドを分画する。液液分画法又は固液分画法も使用することができる。
【００５４】
特に例えば、Jin et al., Biotechnol J. 2006 Feb;1（2）:209-13、Si et al.,中国緑茶抽出物における抗菌成分の、バイオアッセイによって誘導された精製及び同定（Bioassay-guided purification and identification of antimicrobial components in Chinese green tea extract）. J Chromatogr A. 2006;1125（2）:204-10、Paveto et al.,緑茶（カメリア・シネンシス）のカテキンの抗クルーズ・トリパノソーマ活性（Anti-Trypanosoma cruzi activity of green tea（Camellia sinensis） catechins）. Antimicrob Agents Chemother. 2004;48（1）:69-74、Kinjo et al.,ヒト胃癌細胞に対する抗増殖活性による緑茶抽出物の、活性によって誘導された分画（Activity-guided fractionation of green tea extract with antiproliferative activity against human stomach cancer cells）. Biol Pharm Bull. 2002;25（9）: 1238-40、Satoh et al.,紅茶抽出物であるテアルビギン画分がマウスにおける破傷風毒素の影響に対抗する（Black tea extract, thearubigin fraction, counteracts the effect of tetanus toxin in mice）. Exp Biol Med （Maywood）. 2001 ;226（6）:577-80; Sagesake-Mitane et al.,緑茶の熱水抽出物における血小板凝固阻害因子（Platelet aggregation inhibitors in hot water extract of green tea）. Chem Pharm Bull （Tokyo）. 1990;38（3）:790-3、Jassbi, Z Naturforsch [C]. 2003;58（7-8）:573-9. ヤナギルリハムシに関するサリックス・インテグラの刺激因子及び摂食阻害剤としての二次代謝産物（Secondary metabolites as stimulants and antifeedants of Salix Integra for the leaf beetle Plagiodera versicolora）、並びにWildermuth and Fall,ヤナギの葉におけるイソプレン合成の間質及びチラコイド結合アイソフォームの生化学的特徴付け（Biochemical characterization of stromal and thylakoid-bound isoforms of isoprene synthase in willow leaves）. Plant Physiol. 1998; 116（3）: 1111-23を参照されたい。
【実施例】
【００５５】
本発明は以下の実施例においてさらに説明されるが、実施例は特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１  −  抽出物の調製
緑茶、セイヨウシロヤナギ、松樹皮、及びブロッコリー（スルフォラファン）の抽出物を含む多数の抽出物を、本実験において使用するために調製した。
緑茶抽出物
緑茶抽出物（テア・シネンシス（Thaea Sinensis）、Emil Flachsmann AG/Frutarom，Haifa，Israel、製造番号８５．９４２）は、０．００２５％アスコルビン酸をエタノール（８０％）に溶解した溶液に緑茶の葉を浸漬し、室温で４時間ゆっくりと攪拌した後、抽出物を濾過して茶葉を除去することにより調製した。次に、抽出剤を減圧濃縮器を用いて除去することにより緑色／褐色抽出物を調製し、これに賦形剤としてデキストリンを添加し、混合物を実験において使用するために粉末状にした。
【００５６】
緑茶抽出物を含有する２ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ溶液を調製した。ＤＭＳＯは、高濃度でシノラブディティス・エレガンスにおいて酸化的ストレスを引き起こし得るため、緑茶抽出物を試験材料として使用するために、Ｍ９塩類培地（saline medium）（４２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、８６ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）に最終濃度が２μｇ／ｍＬとなるように添加した。ＤＭＳＯの最終濃度は０．１％であった。このように低い濃度のＤＭＳＯは、シノラブディティス・エレガンスにおいて酸化的ストレスを引き起こさなかった。
セイヨウシロヤナギ抽出物
セイヨウシロヤナギ抽出物（サリクス・コルテクス（Salicis Cortex）、Emil Flachsmann AG/Frutarom，Haifa，Israel、製造番号００８５８１６）は、乾燥させた市販のセイヨウシロヤナギの樹皮及び芽を精製水に浸漬し、室温で４時間ゆっくりと攪拌した後、抽出物を濾過して固体物質を除去することにより調製した。次に、抽出剤を減圧濃縮器を用いて除去することにより褐色抽出物を調製し、これに賦形剤としてアラビアゴムを添加し、混合物を実験において使用するために粉末状にした。
【００５７】
ヤナギ抽出物を１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＭ９塩類培地に溶解したものを、試験材料として使用した。
松樹皮抽出物
松樹皮抽出物を実験において使用するために、乾燥松樹皮から熱水中で３時間〜４時間抽出することにより調製した。
【００５８】
松樹皮抽出物を濃度が２ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯに溶解し、試験材料として使用するために最終濃度が２μｇ／ｍＬとなるようにＭ９塩類培地に添加した。
スルフォラファン
さらに、スルフォラファン（ブロッコリー芽の活性誘導体）を陽性対照として使用した。スルフォラファンをアセトニトリルに溶解した後、試験材料として使用するためにＭ９塩類培地で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。
実施例２  −  ｇｃｓ−１：：ＧＦＰ融合構築物の作製及び発現
第ＩＩ相解毒酵素（Ｐ２Ｄ）である、ｇｃｓ−１遺伝子によりコードされる酵素（ＣＧＳ−１）が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのグルタチオン合成の律速酵素であり、ｇｃｓ−１遺伝子が、解毒及び抗酸化を調節するＳＫＮ−１の第二世代標的遺伝子であることはよく知られている。
【００５９】
ＧＣＳ−１プロモータをコードする核酸（An and Blackwell, 2003, Genes & Dev., 17, 1882-1893に記載される）を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列と融合させて、標準的な分子生物学の技法を用いてレポータ構築物（ｇｃｓ−１：：ＧＦＰ）を作製した。この融合構築物遺伝子をシノラブディティス・エレガンスに導入して（transfer）（An and Blackwell, 2003, Genes & Dev., 17, 1882-1893、Mello, et al., EMBO J., 1991. 10（12）:3959-70）、得られた形質転換シノラブディティス・エレガンスを実験において使用した。酸化的ストレスの少ない標準条件下で、ｇｃｓ−１：：ＧＦＰ構築物をシノラブディティス・エレガンスの咽頭領域及びＡＳＩにおいて発現させるが、ここでＧＦＰの蛍光発光を測定することができる。
【００６０】
比較として、ｇｃｓ−１遺伝子プロモータにおけるＳＫＮ−１結合部位の変異株（ｇｃｓ−１Δ２Ｍｕｔ３）（An and Blackwell, 2003, Genes & Dev., 17, 1882-1893を参照されたい）を、ＧＦＰをコードする配列と融合させて、遺伝子（ｇｃｓ−１Δ２Ｍｕｔ３：：ＧＦＰ遺伝子）を作製し、これをｇｃｓ−１：：ＧＦＰ遺伝子と同じ方法で試験した。この変異株遺伝子はＳＫＮ−１と結合することができないため、ＳＫＮ−１により調節されるＧＣＳ−１を発現させることは不可能であった。ＳＫＮ−１のＧＣＳ−１発現の調節はしたがって、上記融合遺伝子においてＧＦＰが発現されたが、変異株遺伝子においては発現されなかった場合に確認される。
実施例３  −  ヤナギ抽出物及び茶抽出物はＧＣＳ−１：：ＧＦＰ発現を増強する
シノラブディティス・エレガンスにおけるＧＣＳ−１：：ＧＦＰレポータ構築物（実施例２に記載される）の発現に対する、実施例１において調製した各種抽出物の影響を研究するために、An and Blackwell, 2003, Genes & Dev., 17, 1882-1893による方法に従って実験を行った。
【００６１】
各実験の前に、ＧＣＳ−１：：ＧＦＰレポータ構築物トランス遺伝子を有するおよそ２０匹のＬ４期幼虫を、ＯＰ５０細菌（大腸菌株；シノラブディティス・エレガンスの餌）を含有するＮＧＭプレート（寒天培地の一種、Brenner, Genetics, 1974 May;77（1）:71-94を参照されたい）に取り、２日〜３日間成長させた。幼虫を試験材料で処理するために、ＮＧＭプレート表面を塩類培地（Ｍ９）で満たすことにより、幼虫を塩類培地（Ｍ９）と共に微小遠心管に移した。次に、微小遠心管を遠心分離にかけ、上清を除去した。同じ手順を再度繰り返して、幼虫を洗浄した。この洗浄により餌として与えた細菌が除去された。
【００６２】
幼虫を洗浄した後、特定の試験材料において特定の濃度で以下の期間インキュベーションを行った。初めは、インキュベーション時間は３０分間であり、後に６０分間、９０分間、及び１２０分間まで延長した。上記の所与の時間処理した後、幼虫をＭ９中で少なくとも２回洗浄し、細菌を含有するＮＧＭプレートに戻し、約３０分間回復させた。幼虫を次にスライド上に載せ、顕微鏡下でＧＦＰ発現レベルについてスコア付けした。各幼虫の腸におけるＧＦＰ発現レベルを３つのスコア（高度、中度、及び低度の発現）に基づいて評価した。高度というスコアは、腸全体にわたってＧＦＰ発現を有する幼虫に与えた。腸の途中までＧＦＰ発現を有する幼虫は、中度としてスコア付けした。低度というスコアは、腸においてＧＦＰをほとんど又は全く発現しない幼虫に与えた。
【００６３】
図１及び図２に示す結果により、緑茶抽出物又はヤナギ抽出物のいずれかによる処理は、ｇｃｓ−１プロモータによって駆動されるＧＦＰ発現を、対照条件と比較して劇的に増加させたことが実証される。
【００６４】
ヤナギ抽出物は、中度又は高度という発現のスコアを与えられる幼虫の数を有意に増加させた。これらの実験において、陰性対照であるＭ９塩類溶液は、腸においてＧＦＰ発現を誘導せず、全ての幼虫が低度とスコア付けされた。６０分間の処理によって最大反応が認められた。しかしながら、スルフォラファンに関しては３０分間、６０分間又は９０分間のインキュベーション後に、効果は全く認められなかった。この理由から、スルフォラファンによる処理には、より長いインキュベーション時間をかけたが、効果は６時間後に初めて認められた。図３に示すデータにより、茶抽出物及びヤナギ抽出物が、スルフォラファンと比較して明らかに短い時間でＧＣＳ−１：：ＧＦＰ発現を有意に誘導したことが明らかとなった。
【００６５】
ｇｃｓ−１Δ２：：ＧＦＰ遺伝子を導入した幼虫（ＧＣＳ−１Δ２：：ＧＦＰ幼虫）を使用して、試験材料の効果がＳＫＮ−１に依存するか否かを試験した。このプロモータ変異株のトランス遺伝子は咽頭のｇｃｓ−１遺伝子発現を欠いているが、ＡＳＩニューロン及び腸においてＳＫＮ−１依存的発現を維持するものである。緑茶抽出物及びヤナギ抽出物の両方を用いた場合、ＧＣＳ−１Δ２：：ＧＦＰ幼虫は、６０分間のインキュベーション条件下でＧＣＳ−１：：ＧＦＰ幼虫と同じ発現レベルを示した。また、変異株トランス遺伝子ＣＧＳ−１Δ２ｍｕｔ３：：ＧＦＰ幼虫を使用して、反応がＳＫＮ−１依存的であるか否かを決定した。ｇｃｓ−１Δ２：：ＧＦＰ遺伝子の変異型であるこの遺伝子（ｇｃｓ−１Δ２ｍｕｔ３：：ＧＦＰ遺伝子）は、そのプロモータ領域にＳＫＮ−１結合部位を欠いており、そのためＧＦＰは標準条件及びストレス条件下で咽頭、ＡＳＩニューロン、又は腸において発現されない。これらの変異株（ＣＧＳ−１Δ２ｍｕｔ３：：ＧＦＰ幼虫）を緑茶抽出物又はヤナギ抽出物のいずれかで処理した場合、ＧＦＰ発現は観察されなかった。ＣＧＳ−１：：ＧＦＰ幼虫、ＣＧＳ−１Δ２：：ＧＦＰ幼虫、及びＣＧＳ−１Δ２ｍｕｔ３：：ＧＦＰ幼虫における試験材料による結果の比較によると、緑茶抽出物及びヤナギ抽出物を用いた場合、ＡＳＩニューロン及び腸においてはＧＣＳ−１：：ＧＦＰ発現が認められ、咽頭においてはＧＣＳ−１：：ＧＦＰ発現は実質的に認められなかったため、ＧＣＳ−１：：ＧＦＰ発現がＳＫＮ−１結合により調節されることが明らかとなった。しかしながら、スルフォラファンを用いた場合、約半分のＧＣＳ−１：：ＧＦＰ発現が咽頭において認められ、ＧＣＳ−１：：ＧＦＰ発現がＳＫＮ−１により部分的に調節されなかったことが比較によって示された。
【００６６】
実施例４  −  ヤナギ抽出物の分画
元のヤナギ抽出物から第ＩＩ相活性化に対して最も大きな効果を有する画分を同定するために、カラムクロマトグラフィ法を使用した。例えば、シリカゲル充填カラムをヤナギ抽出物の分画に使用することができる。図４及び図５は、カラムクロマトグラフィを用いて行った分画実験の代表的な結果を示す。
【００６７】
分離カラムを準備するために、４００ｇのシリカゲル６０（７０〜２３０メッシュ（ＡＳＴＭ）、Merckから入手した）をメタノールに懸濁し、カラムに流し込んだ。その後、メタノールをクロロホルム：メタノール（１０：１）溶液に置き換えた。元のヤナギ抽出物５ｇを水に再懸濁し、シリカゲル表面の上側に載せた。最初の溶出溶媒として、約１．５Ｌのクロロホルム：メタノール（１０：１）を材料の溶出に使用した。溶出溶液を２０ｍＬ毎に画分チューブ（fraction tube）に回収した。液相はクロロホルム：メタノール（１０：１）溶液、続いて上層のクロロホルム：メタノール：水（７：３：１）、次にクロロホルム：メタノール：水（６：４：１）、クロロホルム：メタノール：水（５：５：１）、最後にメタノール洗浄液を使用した。次に、材料を薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）法によりアッセイした。溶出溶液をクロロホルム：メタノール：水（６：４：１）溶液を用いてＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０  Ｆ２５４、Merckにより提供された）上で展開した。画分を検出するために、５０％硫酸をＴＬＣプレート上に塗布し、これを次に２５０℃で加熱した。
【００６８】
より効果的な材料をＴＬＣ展開の保持因子（Ｒｆ）値によりさらに明らかにした。Ｒｆとは、化合物が移動する距離を溶媒が移動する距離で除したものと定義される。画分１〜画分４に関するＲｆ値を表１に示す。効果的な画分のＲｆ値は０．５〜０．９であった。最も効果的な画分のＲｆ値は０．６〜０．９であった。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
０．６〜０．９のＲｆ値を有する画分は他の方法によっても単離することができる。例えば、逆相粒子（Ｃ２、Ｃ８、Ｃ１８：Ｃは炭素を意味する）もシリカゲルの代わりに使用することができる。この場合、より効果的な画分は水：メタノール又は水：エタノール溶液を用いて溶出させることができ、そのＲｆ値から画分を同定することができる。
【００７１】
分子量により種を分離するゲルクロマトグラフィ法、及び分子の極性により分離を行うイオン吸光度ゲルクロマトグラフィ法も分画に使用することができる。また、液液分画法又は固液分画法をカラムクロマトグラフィの代わりに使用してもよい。
【００７２】
カラムクロマトグラフィを行う前に、活性炭、例えば活性炭カラムを前処理として使用して、色を除去する（例えば、暗く変わった色の抽出物からクロロフィルを除去する）ことができる。
【００７３】
図４及び図５は、カラムクロマトグラフィを用いた或る分画実験の結果を示す。カラムは、固相シリカゲル６０（７０〜２３０メッシュ（ＡＳＴＭ）、Merckから入手した）であった。液相はクロロホルム：メタノール（１０：１）溶液、続いてクロロホルム：メタノール：水（７：３：１）、次にクロロホルム：メタノール：水（６：４：１）、クロロホルム：メタノール：水（５：５：１）、及び最後にメタノール洗浄液であった。図５に示す抽出物は以下のように調製した：抽出物１〜抽出物３をクロロホルム：メタノール（１０：１）溶液を用いて抽出し、抽出物４をクロロホルム：メタノール：水（７：３：１）を用いて抽出し、抽出物５〜抽出物７をクロロホルム：メタノール：水（６：４：１）を用いて抽出し、抽出物８をクロロホルム：メタノール：水（５：５：１）を用いて抽出し、その後抽出物９をメタノールを用いて抽出した。次に、溶媒を標準的な蒸発器を用いて除去した。「様相」とは目視検査による画分の外観を表す。０．０５ｇの材料を５ｍｌの水に入れ、ボルテックスした。材料が室温において明らかに可溶である場合には、水溶性を測定した。図４において、白丸は材料が明らかに可溶であることを示し、「×」は明らかに可溶ではない（例えば、粒子状物質が存在していた）ことを示す。ＵＶスポットをＵＶ検出器を用いて観察し、ＵＶ吸光度を目視検査により測定した。また、図４において、白丸はＵＶスポットが観察されたことを示し、「×」はスポットが全く観察されなかったことを示す。図４に示す百分率は重量によるものである。ＧＣＬＭ及びＧＣＬＣの両方の遺伝子発現が対照と比較して有意に高く、且つ相対値が（１００μｇ／ｍｌで）４を超えていた場合、「高度」の遺伝子発現であると指定した。ＧＣＬＭ及びＧＣＬＣの両方の遺伝子発現が対照と比較して有意に高く、且つ相対値が（１００μｇ／ｍｌで）４未満であった場合、「中度（Mild）」と指定した。また、「低度」とはＧＣＬＭ及びＧＣＬＣの両方の遺伝子発現が、対照と比較して有意に高くはなく、且つ相対値が（１００μｇ／ｍｌで）４未満であったことを意味していた。
【００７４】
図６及び図７は、Ｎｒｆ２下流遺伝子の発現に対する分画したヤナギ抽出物の効果を評価した結果を示す。ヒト線維芽細胞を、図４及び図５に示す９つの分画したヤナギ抽出物と、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、又は１００μｇ／ｍｌの濃度で接触させ、２４時間インキュベートした。ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎを用いたＲＴ−ＰＣＲを使用して、グルタミン酸システインリガーゼ調節サブユニット（ＧＣＬＭ、図６）及びグルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット（ＧＣＬＣ、図７）の発現を検出した。内部対照遺伝子としてＰＰＩＡも評価した。結果により画分１、画分２、及び画分３が最大量のＮＲＦ２活性化活性を有していたことが実証された。
実施例５  −  ヒト被験者へのヤナギ抽出物の投与
本実施例では、年齢約２６歳〜４５歳（平均年齢３４．２歳）の健常ヒトボランティアにおいてヤナギ抽出物の抗酸化能を調べるために行った、小規模の試験について説明する。１６人の被験者（男性７人及び女性９人）が登録されたが、３人が試験中に脱落した。
【００７５】
被験者にAsk Intercity Co., Ltd.から入手したヤナギ抽出物を投与した。このヤナギ抽出物は、加熱しながら市販の乾燥させたヤナギの樹皮及び芽を精製水に浸漬することにより調製したが、このヤナギの樹皮及び若枝は、欧州薬局方及びコミッションＥモノグラフに基づくと「セイヨウシロヤナギ樹皮」である。投与レジメンは、６カプセル／日（１日当たり合計８００ｍｇのヤナギ抽出物）で２週間の期間（続く２週間のウォッシュアウト期間）であった。次に、各被験者に以下を含む臨床検査を行った：
（ｉ）ヘパリン化血から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ（Ficcoll-Conray）密度勾配法を用いた抗酸化物質関連遺伝子発現の測定  −  Ｎｒｆ２、ＧＣＬＭ、フォークヘッドボックスＯ１（ＦＯＸＯ１）、ＳＯＤ１、及びカタラーゼ。内部対照としてＧＡＰＤＨを使用した（０週目、１週目、２週目、及び４週目にＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した）、
（ｉｉ）血清抗酸化指標  −  ８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）、ＧＳＨ、ＳＯＤ、８−イソプロスタン、及びＴＲＡＰのレベル（０週目、１週目、２週目、及び４週目に測定した）、
（ｉｉｉ）血液生化学  −  総タンパク質、ＧＯＴ、ＧＰＴ、総コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、トリグリセリド、ＡＬＰ、アルブミン、Ａ／Ｇ比、γ−ＧＴＰ、アミラーゼ、尿素窒素、尿酸、クレアチニン、及びアテローム性動脈硬化指標（０週目、２週目、及び４週目に測定した）、
（ｉｖ）血液の血球数  −  血中グルコース、ＨｂＡ１ｃ、ＷＢＣ、ＲＢＣ、Ｈｂ、Ｈｔ、血小板、好塩基球、好酸球（acidphol）、好中球、白血球、単球、ＭＣＶ、ＭＣＨ、及びＭＣＨＣ（０週目、２週目、及び４週目に測定した）、及び
（ｖ）その他  −  インスリン、アディポネクチン、ＩＧＦ−１、及びサリチル酸（０週目、２週目、及び４週目に測定した）。
【００７６】
被験者のプロファイルを表２に示す。
【００７７】
【表２】
2010539102.tif 000003
【００７８】
結果を図８〜図１５に示す。最初に、図８及び表２に示すように、２週間のヤナギ抽出物補充によりＰＢＭＣにおいてＳＯＤ１遺伝子発現を誘導した。図９〜図１１に示すように、ＰＢＭＣにおけるＮｒｆ２の遺伝子発現は、摂取後１週間で有意に減少したが、下流遺伝子ＧＣＬＭ又はカタラーゼのいずれも補充期間中に有意に変化しなかった（カタラーゼ遺伝子発現は摂取期間の第１週にわずかに増加したが、摂取期間の第２週にベースラインに戻り、残りの期間は減少した）。図１２に示すように、ヤナギ抽出物の補充により、血清８−ＯＨｄＧレベルが２週間で有意に低下し、処置を終えた後もこの効果は持続した。しかしながら、図１３及び図１４に示すように、血清中のＧＳＨ及びＳＯＤの推移レベルは、試験期間にわたって変化しなかった。
【００７９】
対照的に、図１５に示すように、ＦＯＸＯ１のｍＲＮＡはヤナギ抽出物の２週間の補充の後、ＰＢＭＣにおいて有意に増加した。ＦＯＸＯ１は、ＳＯＤ１を含む解毒及び抗酸化遺伝子の発現を調節することが知られる転写因子である。
実施例６  −  疎水性ヤナギ抽出物はｉｎ  ｖｉｖｏでＧＣＳ−１発現を増加させる
本実施例では、ヤナギ抽出物の或る特定の画分が、生シノラブディティス・エレガンスにおいてＳＫＮ−１／第ＩＩ相解毒経路を誘導するか否かを調べるために行った実験を説明する。ヤナギ抽出物の分画生成物を上記に記載されるように調製し、表３に示すようにプールして、画分Ａ〜画分Ｅ（Ｆｒ．Ａ〜Ｆｒ．Ｅ）を形成した。
【００８０】
【表３】
2010539102.tif 000004
【００８１】
上記のように、これらの実験は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合させたｇｃｓ−１トランス遺伝子（ＧＣＳ−１：：ＧＦＰ）を用いて、シノラブディティス・エレガンスにおいて行った。ｇｃｓ−１はグルタチオン合成を律速する酵素をコードし、第ＩＩ相解毒の主調節因子ＳＫＮ−１に関する特によく特徴付けられた診断標的遺伝子である（An and Blackwell, Genes Dev. （17）:1882-93 （2003）、An et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. （102）:16275-80 （2005）、Inoue et al., Genes Dev. （19）:2278-83 （2005）、Tullet et al., Cell. 132:1025-38 （2008））。酸化的ストレス条件下では、ＳＫＮ−１依存的ｇｃｓ−１発現が腸細胞において誘導される。
【００８２】
ＧＣＳ−１：：ＧＦＰ幼虫を各種画分を用いて処理し、この動物の腸におけるＧＦＰ発現レベルを観察した。個々の実験においては、およそ２０匹のＬ４期幼虫を、０Ｐ５０細菌を含有する新鮮プレートに取った。２日〜３日後、動物を材料で処理した。幼虫を含有するプレートをＭ９（塩類培地）で満たし、それをピペットを用いて管に移すことにより、幼虫を微小遠心管に移した。高速回転の後、Ｍ９を除去して、動物を再度Ｍ９で洗浄した。この洗浄により残留する細菌が全て除去される。幼虫を洗浄した後、所与の調製物と共に３０分又は６０分のいずれかの間インキュベートした。インキュベーションの後、幼虫をさらに２回Ｍ９中で洗浄し、細菌を含有する新鮮ＮＧＭプレートに移し、約３０分間回復させた。次に、幼虫をスライドに載せ、顕微鏡下でＧＦＰ発現に関してスコア付けした。（An and Blackwell, Genes Dev. （17）:1882-93 （2003）、Tullet et al., Cell. 132:1025-38 （2008））に記載されるように、腸におけるＧＦＰ発現のレベルに基づいて、３つのスコア（高度、中度、又は低度の発現）のうち１つを与えた。高度というスコアは、腸全体にわたってＧＦＰ発現を有する動物に与えた。腸の途中でのＧＦＰ発現は、中度というスコアの一例である。低度というスコアは、腸においてＧＦＰをほとんど又は全く発現しない幼虫に与えた。
【００８３】
最初に、ヤナギ抽出物画分による処理後のｇｃｓ−１トランス遺伝子レポータの誘導を調べた（図１７）。画分Ａによる処理は、３０分間の処理の後、腸におけるＧＦＰ発現において、対照と比較して最高の増加をもたらした（図１７）。画分Ａからの材料を、高濃度で酸化的ストレス反応を誘発し得るＤＭＳＯに溶解しているために低い濃度（５μｇ／ｍＬ）で投与した。画分Ａ試料中で低い最終濃度のＤＭＳＯ（０．００６％ＤＭＳＯ）は、ｇｃｓ−１幼虫においてストレス反応を誘発しなかった（対照、図１７）。Ｍ９培地において１０ｍｇ／ｍｌで投与した画分Ｂ〜画分Ｅも、腸におけるＧＣＳ−１：：ＧＦＰ発現を誘導したが、連続する画分は各々、先の画分よりわずかに低い誘導レベルをもたらした（図１７）。興味深いことに、画分Ｂは５μｇ／ｍＬで投与した場合に比較的強い反応を誘発し（図示せず）、その効力が画分Ａの効力に相当することが示唆される。
【００８４】
要するに、全てのヤナギ画分がｇｃｓ−１誘導活性を特徴とするが、画分Ａ及び画分Ｂが最も強力であり、他の画分が示す活性は次第に低下する。
実施例７  −  緑茶抽出物及びヤナギ抽出物の保護効果
本実施例では、先に分析した緑茶抽出物材料及びヤナギ抽出物材料での処理が、酸化的ストレス条件及び標準条件下でのシノラブディティス・エレガンスの生存を高めるか否かを調べるために行った実験を説明する。
【００８５】
以下の材料を、動物を酸化的ストレスに対する曝露から保護するか否かについて試験した：
ヤナギ抽出物
緑茶抽出物
ヤナギ抽出物の分画生成物（Ｆｒ．Ａ）
各実験において、幼虫は、脂溶性の過酸化ラジカル源であるｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド溶液（ｔ−ＢＯＯＨ）で処理することにより酸化的ストレスに曝露した（図１８）。Ｌ４期幼虫を、試験を受ける材料又は対照を含有するプレートに取った。これらのプレートに、遠沈し、それぞれの材料５ｍｌに再懸濁した細菌培養物を播種した。２０℃で２４時間又は４８時間のインキュベーションの後、幼虫を少量の細菌と共に、１５．４ｍＭ  ｔ−ＢＯＯＨを含有するプレートに移した。次に、幼虫の運動及び咽頭のポンピングを、全ての幼虫が死滅するまで毎時間確認した。各分析は、プレート１枚当たりおよそ２０匹の幼虫を用いて３連で行った。以下の対照を使用した：ヤナギ：ＬＢに再懸濁したＯＰ５０細菌餌、緑茶：０．１％ＤＭＳＯを含有するＬＢに再懸濁したＯＰ５０、ヤナギ画分Ａ：０．００６％ＤＭＳＯを含有するＬＢに再懸濁したＯＰ５０。
【００８６】
４８時間後、３つ全ての材料が、適当な対照と比較して増加した生存により示されるように、酸化的ストレスに対する保護をもたらした。ヤナギ抽出物は１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＬＢに可溶性であった。この群に対する陰性対照（ＯＰ５０細菌単独）は、ｔ−ＢＯＯＨに対する保護を全くもたらさず、全ての幼虫は９時間以内に死滅した。対照的に、ヤナギ抽出物で処理した一部の幼虫は、１２時間生存した（図１８）。緑茶抽出物も、２ｕｇ／ｍＬというその最終濃度にもかかわらず（ＤＭＳＯ（０．０１％）にしか溶けなかったため）、保護をもたらした。最後に、ヤナギ抽出物画分Ａによる処理も有意な保護をもたらした。
【００８７】
対照的に、これらの同じ抽出物材料に２４時間だけ曝露した場合は、ｔ−ＢＯＯＨストレスに対する保護は全く得られなかった。
【００８８】
要するに、試験を受ける各調製物による処理は、続く酸化的ストレスチャレンジ（ｔ−ＢＯＯＨによる処理）からシノラブディティス・エレガンスを保護した。条件は寿命に対する効果の分析に合わせて確立した。
実施例８  −  ニンジン抽出物及びブロッコリー抽出物の効果
上記実施例６に記載されるような実験を、ヤナギ抽出物又は茶抽出物の代わりに以下の材料を用いて行った：
ニンジン粉末
発酵ニンジン粉末
ブロッコリー粉末
発酵ブロッコリー粉末
幼虫をそれぞれの調製物１０ｍｇ／ｍＬで３０分間処理した。ニンジン粉末による処理は、３０分間の処理の後、腸におけるＧＦＰレポータの発現において、他の材料と比較して最高の増加をもたらした（図１９）。これらは各々、Ｍ９塩類培地に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶性であった。陰性Ｍ９対照は再び、腸においてＧＦＰに対する効果を示さず、全ての幼虫が低度としてスコア付けされた。
【００８９】
結論として、試験した全ての材料は、Ｍ９対照と比較して中度のｇｃｓ−１発現を誘導した。
実施例９  −  Ｎｒｆ２により調節される遺伝子（ＨＯ−１及びＮＱＯ１）の発現に対するヤナギ抽出物の効果
Ｎｒｆ２により調節される遺伝子の発現に対するヤナギ抽出物の効果を調べるために、ＨＵＶＥＣを三光純薬株式会社（日本）から購入し、Ｉ型コラーゲン被覆プレートにおいて、１０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ、及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＭＣＤＢ１３１中、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。４代目のＨＵＶＥＣを、１２ウェルＩ型コラーゲン被覆プレートに播種した。細胞がコンフルエントに達した後、２％ＦＢＳを含有し、ＦＧＦを含有しない培地において、細胞を続く２４時間飢餓状態にした。飢餓期間の後、培地を、所望の最終濃度（図２０Ａ及び図２０Ｂを参照されたい）で溶解したヤナギ抽出物（Ask Intercity Co., Ltd.）を含有する新鮮培地と交換した。ヤナギ抽出物導入の６時間後、総ＲＮＡをＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（BIO-RAD，USA）を用いて細胞から抽出した。一本鎖ｃＤＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ試薬Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社、日本）を用いて０．５μｇの総ＲＮＡから合成した。ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）及びＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ（キノン）１（ＮＱＯ１）のｍＲＮＡの定量分析を、ＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ、日本）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより行った。定量的リアルタイムＰＣＲ分析には、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社、日本）及びＡｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓを使用した。全ての定量的データは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現レベルにより正規化した。
【００９０】
図２０Ａ及び図２０Ｂに示す結果は、ヤナギ抽出物が、Ｎｒｆ−２により調節される遺伝子であるＨＯ−１及びＮＱＯ１の発現を用量依存的に増加させることを示す。
実施例１０  −  単離ＰＢＭＣにおけるＮｒｆ２発現に対するヤナギ抽出物の効果
健常ボランティアからの血液をヘパリン管に回収し、等量のＰＢＳ（−）を添加することにより希釈した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、希釈した血液からＦｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ密度勾配法を用いて単離した。１．０×１０６個のＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０中で、Ask Intercity Co., Ltd.から入手したヤナギ抽出物の存在又は非存在下、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。インキュベーションの４時間後に、総ＲＮＡをＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（BIO-RAD，USA）を用いて細胞から抽出した。一本鎖ｃＤＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ試薬Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社、日本）を用いて総ＲＮＡから合成した。グルタミン酸システインリガーゼ調節サブユニット（ＧＣＬＭ）及びＮＦ−Ｅ２関連因子２（ＮＲＦ２）のｍＲＮＡの定量分析を、ＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ、日本）を用いてリアルタイムＰＣＲにより行った。定量的リアルタイムＰＣＲ分析には、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社、日本）及びＡｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓを使用した。全ての定量的データは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現レベルにより正規化した。
【００９１】
図２１に示す結果は、ヤナギ抽出物が、ヒトＰＢＭＣにおいてＮｒｆ−２の発現を用量依存的に増加させることを示す。
実施例１１  −  細胞質から核へのＮｒｆ２転移の評価：皮膚線維芽細胞におけるＮｒｆ２活性化効果
本実施例に使用した皮膚線維芽細胞は、５０歳の白人女性から得た腹部線維芽細胞（以下ＨＤＦ５０と略する）（Cell Applications, Inc.）であった。使用した培養培地は、５０ｍＬの標準ウシ胎仔血清（SIGMA）及び５．０ｍＬのＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００×）（SIGMA）を、５００ｍＬのＭＥＭ−イーグル培地（SIGMA）に添加し、混合することにより調製したＭＥＭ（＋）培地であった。
【００９２】
ＨＤＦ５０を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータにおいてＭＥＭ（＋）培地中で培養した。ＨＤＦ５０がコンフルエントな状態に達した後、細胞を単離して、血球計算盤（ビルケルチュルク血球計算盤）を用いて細胞数を計数した。得られた細胞をＭＥＭ（＋）培地で希釈して、１．９×１０５細胞／１５ｍＬとした。評価を受ける材料を希釈培地に添加した後、混合物を３７℃、５％ＣＯ２インキュベータにおいてさらに２４時間インキュベートした。その後、細胞を再度単離して、Ｎｕｃｌｅａｒ／Ｃｙｔｏｓｏｌ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて細胞核抽出物を得た。細胞核抽出物中のタンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒａｐｉｄ  Ｋｉｔを用いて定量し、タンパク質濃度を調節して、タンパク質量を全ての試料で等しくした。このようにして調製した試料を、５％２−メルカプトエタノールを含有する等量のＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファーと混合し、煮沸した。煮沸した混合物から得た上清をゲル電気泳動にかけた。電気泳動が完了した直後に、ゲルをキットに付属するニトロセルロース膜にｉＢｌｏｔゲルトランスファー装置を用いて移し、AmershamのＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、１００Ｋｄａ付近でＮｒｆ２のバンドを検出した。さらに、Ｒｅ−Ｂｌｏｔ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて抗体を除去した後、対照としてラミンＡ／Ｃを同様の方法で検出した。Ｎｒｆ２バンドに関しては、ゲル画像を走査して、Ｎｒｆ２バンドの濃さをＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（米国立衛生研究所のＷｉｎｄｏｗｓ(登録商標)バージョン）を用いて定量化し、相対Ｎｒｆ２タンパク質レベルを対照として算出した。
【００９３】
図２２に示す結果は、ヤナギ抽出物が、ヒト線維芽細胞においてＮｒｆ−２タンパク質のレベルを用量依存的に増加させることを示す。
実施例１２  −  酸化的ストレスを予防する能力の評価
希釈した材料を有する培地中で２４時間培養した後、ＨＤＦ５０を５ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（SIGMA）（以下Ｄ−ＰＢＳと略する）中で３０分間インキュベートした。その後、培地をＭＥＭ（＋）培地で置き換え、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベータにおいてさらに３時間培養を継続した。
【００９４】
培養が完了した後、生細胞数（Ａ）を血球計算盤（ビルケルチュルク血球計算盤）を用いて求め、細胞生存率を、以下の式に従ってＨ２Ｏ２不添加条件の生細胞数（Ｂ）と比較して算出した：
細胞生存率（％）＝［（Ａ）／（Ｂ）］×１００
図２３に示す結果は、ヤナギ抽出物が酸化的ストレスの予防に対して陽性効果を有することを示す。
実施例１３  −  ヒト皮膚における抗酸化（経口摂取）
ヒト皮膚における抗酸化に対するヤナギ抽出物の促進作用を評価するために、ヤナギ抽出物（Ask Intercity Co., Ltd.）を、年齢３２歳〜４３歳の７人の健常男性に１日当たり８００ｍｇの用量で経口投与した。摂取期間は４週間であり、ウォッシュアウト期間は８週間であった。抗酸化活性を皮脂中の過酸化脂質の量により測定した。皮脂は、摂取開始の直前、摂取期間の完了後、ウォッシュアウト期間中（第４週）、及びウォッシュアウト期間の完了後の計４回採取した。
【００９５】
皮脂は、アセトン／エーテル（１：１）溶液を、採取部位に密接して置かれた内径４ｃｍのシリンダーに注入することにより採取した。各被験者の背部の３つの部位から採取した皮脂試料を合わせ、過酸化脂質をＴＢＡＲＳ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（OXITEK）を用いて定量した。過酸化脂質の定量における蛍光測定は、ＲＦ５４０分光蛍光光度計（株式会社島津製作所、日本）を用いて行い、過酸化脂質の量はＭＤＡ値（ＴＢＡＲＳの含量（ｎｍｏｌ／ｍＬ／ｇ））として得た。
【００９６】
図２４に示す結果は、ヤナギ抽出物が４週間の経口投与後に、有意に且つ可逆的に抗酸化活性を増加させることを示す。
【００９７】
ヒト皮膚における抗酸化に対する経口投与したヤナギ抽出物の促進作用をさらに評価するために、年齢２４歳〜４７歳の１６人の健常男性を試験群（１１人の男性）及びプラシーボ群（５人の男性）に分けた。試験群には、１日当たり６カプセル（１日当たり合計８００ｍｇのヤナギ抽出物（Ask Intercity Co., Ltd.）及び結晶セルロース）を経口投与した。プラシーボ群には、１日当たり６カプセル（結晶セルロースのみを含有する）を経口投与した。摂取期間は６週間であった。ＵＶ照射を、摂取開始の２週間前及び摂取開始の４週間後の２回行った。ＵＶは、太陽光シミュレータを用いて各被験者の背部に３０ｍＪ／ｃｍ２で照射した。ＵＶ照射部位の写真を各ＵＶ照射の２週間後に撮影した。ＵＶ照射及び撮影は、プラシーボ群においても試験群と同時に行った。写真画像データの自動色度補正をＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（Adobe）のカラーチャートを用いて行った後、Ｊａｖａ(登録商標)  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３９（米国立衛生研究所）の画像処理及び分析を用いて色素量（平均濃淡値）を得た。
【００９８】
図２５に示す結果は、ＵＶ照射により産生される色素の量の有意な低下によって実証されるように、ヤナギ抽出物が経口投与後に抗酸化活性を増加させることを示す。
実施例１４  −  ヒト皮膚における抗酸化（局所適用）
本実施例では、ヒト皮膚における抗酸化に対する局所投与したヤナギ抽出物の促進作用の評価を説明する。外用期間は１週間であった。水性アルコールゲル（０．４５％カルボマー及び４．７５％エチルアルコールを含有する）中に、試験されるヤナギ抽出物（Ask Intercity Co., Ltd.）を１％含有する試験試料を使用した。プラシーボ試料には、０．４５％カルボマー及び４．７５％エチルアルコールを含有するものを使用した。水性アルコールゲルは、０．２ｇ／５ｃｍ２の用量で前腕に１日２回適用した。適用期間の完了後、適用部位を水で洗浄し、乾燥させた。次に、部位に３０ｍＪ／ｃｍ２〜４０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶ（パネルのＵＶ感受性に応じて調節した）を、太陽光シミュレータを用いて照射した。ＵＶ照射後６日目に、照射部位の写真を撮影した。写真画像データの自動色度補正をＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（Adobe）のカラーチャートを用いて行った後、Ｊａｖａ(登録商標)  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３９（米国立衛生研究所）の画像処理及び分析を用いて色素量（平均濃淡値）を得た。
【００９９】
図２６に示す結果は、ＵＶ照射により産生される色素の量の低下によって実証されるように、ヤナギ抽出物が局所適用後に抗酸化活性を増加させることを示す。
他の実施形態
本発明を発明の詳細な説明と関連して記載したが、前述の記載は説明を意図しており、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び変更形態も以下の特許請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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