(57)【要約】  本発明は、診断手段及び方法に関する。具体的には、本発明は、冠状動脈性心臓病に罹患している被験体の血管新生状態を診断するための方法に関する。さらに、本発明は、冠状動脈性心臓病に罹患している被験体が血管新生誘導療法に感受性か否かを診断する方法に関する。最後に、本発明は、前記方法を実行するための診断装置及びキットを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
冠状動脈性心臓病に罹患している被験体の血管新生状態を診断するための方法であって、
ａ）冠状動脈性心臓病に罹患している被験体のサンプルにおけるPLGF又はその変異体、エンドグリン又はその変異体、及びsFLT1又はその変異体、の量を測定するステップ、及び
ｂ）前記ステップａ）で測定された量と参照量とを比較することによって、血管新生状態を診断するステップ
を含む、前記方法。
【請求項２】
参照量がULNである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ULNに関して、PLGF及びsFLT1の増加量並びにエンドグリンの減少量が抗血管新生状態を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ULNに関して、PLGF及びsFLT1の減少量並びにエンドグリンの増加量が血管新生誘導状態を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップａ）においてTGF-β又はその変異体の量を測定すること、及び前記ステップｂ）において前記量と参照量とを比較すること、をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
TGF-βの参照量がULNである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ULNに関して、TGF-βの増加量は血管新生誘導状態を示し、減少量は抗血管新生状態を示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
冠状動脈性心臓病に罹患している被験体が血管新生誘導療法に感受性か否かを診断する方法であって、
ｃ）冠状動脈性心臓病に罹患している被験体のサンプルにおけるPLGF又はその変異体、エンドグリン又はその変異体、及びsFLT1又はその変異体、の量を測定するステップ、及び
ｄ）前記ａ）ステップで測定された量と参照量とを比較することによって、血管新生誘導療法に感受性か否かを診断するステップ
を含む、前記方法。
【請求項９】
参照量がULNである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ULNに関して、PLGF及びsFLT1の増加量、並びにエンドグリンの減少量が血管新生誘導療法に感受性の被験体であることを示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、前記ステップａ）においてTGF-β又はその変異体の量を測定すること、及び前記量と参照量とを比較すること、をさらに含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
TGF-βの参照量がULNである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１３】
ULNに関して、TGF-βの増加量は血管新生誘導療法に感受性の被験体であることを示す請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
血管新生誘導療法が血管新生剤の投与を含む、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
PLGF又はその変異体のULNが5 pg/mlである、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
sFLT1又はその変異体のULNが3 ng/mlである、請求項２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
エンドグリン又はその変異体のULNが75 ng/mlである、請求項２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
TGF-β又はその変異体のULNが20,000 pg/mlである、請求項６、７、又は１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験体がヒトである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
冠状動脈性心臓病に罹患している被験体の血管新生状態を診断するための装置であって、
ａ）PLGF又はその変異体、エンドグリン又はその変異体、及びsFLT1又はその変異体、の量を測定する手段、及び
ｂ）前記ａ）手段で測定された量と参照量とを比較する手段を含み、
それによって、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を実行するために適合されている前記装置。
【請求項２１】
被験体が血管新生誘導療法に感受性か否かを診断するための装置であって、
ａ）PLGF又はその変異体、エンドグリン又はその変異体、及びsFLT1又はその変異体、の量を測定する手段、及び
ｂ）前記ａ）手段で測定された量と参照量とを比較する手段を含み、
それによって、請求項８〜１９のいずれか１項に記載の方法を実行するために適合されている前記装置。
【請求項２２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を実行するために適合されたキットであって、
ａ）PLGF又はその変異体、エンドグリン又はその変異体、及びsFLT1又はその変異体、の量を測定するための手段、及び
ｂ）前記ａ）手段で測定された量と参照量とを比較する手段を含み、
それによって、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を実行するために適合されている前記キット。
【請求項２３】
請求項１〜７のいずれか１項の方法を実行するための使用説明書をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
請求項８〜１９のいずれか１項に記載の方法を実行するために適合されたキットであって、
ａ）PLGF又はその変異体、エンドグリン又はその変異体、及びsFLT1又はその変異体、の量を測定する手段、及び
ｂ）前記ａ）手段で測定された量と参照量とを比較する手段を含み、
それによって、請求項８〜１９のいずれか１項に記載の方法を実行するために適合されている前記キット。
【請求項２５】
請求項８〜１９のいずれか１項に記載の方法を実行するための使用説明書を含んでいる、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断手段及び方法に関する。具体的には、本発明は、冠状動脈性心臓病に罹患している被験体の血管新生状態を診断するための方法に関する。さらに、本発明は、冠状動脈性心臓病に罹患している被験体が血管新生誘導療法に感受性か否かを診断する方法に関する。最後に、本発明は、前記方法を実行するための診断装置及びキットを含む。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、既存の血管から毛細血管出芽工程による新たな血管の形成として知られている。この工程は、生理的条件下で、本質的には血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor ：VEGF）のような血管新生増殖因子によって駆動される。このような血管新生増殖因子の発現は、低酸素状態によって枢軸的に制御されている。したがって、組織が虚血状態になった場合、細胞は、血管新生によって組織に新たな血管を誘致する血管新生増殖因子を生産し始める。
【０００３】
しかしながら、被験体の血管新生能力、すなわち、その血管新生状態は、複雑な生物学的パラメータに依存する。様々な血管新生促進因子及び血管新生の阻害因子が報告されている（Nyberg 2005, Cancer Res 65:3967-3979）。
【０００４】
血管新生は、増殖性の腫瘍が低酸素状態の影響をより一層受けるようになる腫瘍の増殖期間に見られる。
【０００５】
低酸素状態及び虚血状態を伴う他の病状として、冠状動脈性心臓病が挙げられる。前記疾患は、冠動脈系血管における狭窄又は閉塞によって、例えば、アテローム性動脈硬化又は血栓塞栓閉塞によって特徴付けられる。冠状動脈性心臓病は、心筋の虚血をもたらす。このような虚血は、治療せずに放置した場合、心臓の生理作用を激しく妨げ、結果的に心不全又は心筋梗塞さえも含む心疾患を引き起こし得る。冠状動脈性心臓病に罹患している患者については、血管新生療法が前述の生命に係る状態を回避する上で役立ち得る。さらに、血管新生療法は、ステント移植又はバイパス術のような複雑な心臓インターベーションを回避するのにさえも役立つかもしれない。
【０００６】
既に上述したように、VEGFに加えて様々な因子が血管新生に関与することが報告されている。胎盤成長因子（Placental growth factor ：PlGF）は、その推定上の受容体であるFlt-1（Khurana 2005, Circulation 111:2828-2836）と共に、動脈形成に関連した工程で役割を担うことが示唆されている密接に関連した成長因子である。動脈形成及び血管新生に関与し得る他の因子には、形質転換増殖因子-β（Transforming growth factor-beta）スーパーファミリーのメンバー、及びALK受容体やエンドグリンのようなそれらの受容体又は結合パートナーが挙げられる（van Laake 2006, Circulation, 114:2288-2297; Bobik 2006, Arterioscler Thromb Vasc Biol 26: 1712-1720; Bertolino 2005, Chest Supplement 128: 585-590）。線維芽細胞増殖因子（Fibroblast growth factor：FGF）、血小板由来増殖因子（Platlet derived growth factor：PDGF）並びにサイトカイン及びマトリクスメタロプロテアーゼもまた有力な血管新生因子として記載されている（Nyberg, 前掲）。
【０００７】
上記から、冠状動脈性心臓病に罹患している被験体の血管新生状態を、特に緊急時において測定することが非常に望ましいことを理解すべきである。このような血管新生状態の評価に基づいて、冠状動脈心臓病の重篤な結果を防ぐために、被験体が血管新生誘導療法に感受性があるか否かを予測することができる。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本発明の技術的課題は、例えば適切な治療法を選択するために、被験体の血管新生状態を測定するための手段及び方法の提供とみなすことができる。前記技術的課題は、添付の特許請求の範囲及び以下で特徴付けられる実施形態によって解決される。
【０００９】
したがって、本発明は、冠状動脈性心臓病に罹患している被験体の血管新生状態を診断するための方法であって、
ａ）冠状動脈性心臓病に罹患している被験体のサンプルにおけるPLGF又はその変異体、エンドグリン又はその変異体、及びsFLT1又はその変異体、の量を測定するステップ、及び
ｂ）前記ステップａ）で測定された量と参照量とを比較することによって、血管新生状態を診断するステップ、
を含む方法に関する。
【００１０】
本発明の方法は、好ましくは、インビトロ法である。さらに、上記で明確に言及したステップに加えて追加のステップを含むことができる。例えば、さらなるステップは、サンプルの前処理又は前記方法によって得られた結果の評価に関連してもよい。本発明の方法は、血管新生状態のモニタリング、確認及び下位分類に使用することもできる。前記方法は、手動で実行することができ、又は自動的に支援することができる。好ましくは、ステップ（ａ）及び／又は（ｂ）は、全て又は一部を自動化によって、例えば、ステップ（ａ）では測定用の適当なロボット装置及びセンサ装置によって、又はステップ（ｂ）ではコンピュータにより実行される比較によって、支援されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】冠状動脈性心臓病に罹患している患者の、sFLT1及びエンドグリンの線形回帰分析。
【図２】冠状動脈性心臓病に罹患している患者の、sFLT1及びPlGF患者の線形回帰分析。
【図３】冠状動脈性心臓病に罹患している患者の、エンドグリン及びPlGFの線形回帰分析。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書で使用する用語「診断（する）」とは、被験体が特定の血管新生状態、すなわち、本明細書で言うところの血管新生誘導状態又は抗血管新生状態、にある可能性を評価することを言う。当業者であれば理解できるように、このような評価は、通常、診断されるべき被験体の100％について正しいことを目的としていない。しかし、本用語は、被験体の統計的に有意な部分が前記血管新生状態を示すことを正確に診断できることを要する。一部が統計的に有意かどうかについては、様々な周知の統計的評価ツール（例えば、信頼区間の測定、p値測定、スチューデントt検定、マン・ホイットニー検定等）を用いて、当業者は難なく決定することができる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に記載されている。好ましい信頼区間は、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005又は0.001である。本発明によって予想される確率は、前記診断が被験体の所定のコホート又は母集団の少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％又は少なくとも90％について正しいことが好ましい。
【００１３】
本明細書で使用する用語「血管新生状態」とは、既存の血管から、例えば出芽によって、血管を形成する被験体の能力をいう。具体的には、被験体中に存在する本明細書中で言及する分子の量に依存して、血管新生は、簡便に、すなわち生理的開始因子によって及び好ましくは低酸素状態によって、誘発され得ること、又は本明細書中で特定される血管新生剤のような外部から供給される開始因子をさらに必要とし得ること、が明らかとなっている。したがって、血管新生状態、すなわち被験体における血管新生能は、前述の分子に関する被験体の生理学的体質によって定まる。
【００１４】
本明細書で使用する用語「被験体」とは、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに関する。しかし、本発明は、前記被験体が本明細書中で特定されるような冠状動脈性心臓病に罹患していることを想定している。
【００１５】
用語「冠状動脈性心臓病」は、狭窄、冠状血管のアテローム性動脈硬化症又は閉塞、例えば冠状血管系中の血栓塞栓性閉塞、を包含する冠動脈疾患をいう。本明細書で使用される冠状動脈性心臓病は、収縮機能障害を伴うことが好ましい。収縮機能障害は、左心室駆出分画率（LVEF：left ventricular ejection fraction）が60％未満、より好ましくは40％未満であること、及び50％の容量減少をもたらす少なくとも一の狭窄によって特徴付けられる。さらに、冠状動脈性心臓病は、冠状動脈造影で１つ、２つ又は３つの血管疾患として現れることが好ましい。
【００１６】
用語「サンプル」は、生物学的流体サンプル、分離細胞サンプル、又は組織若しくは器官由来のサンプルをいう。生物学的流体サンプルは、周知技術によって得ることができ、好ましくは血液、血漿、血清、又は尿のサンプルを、より好ましくは血液、血漿又は血清のサンプルを含む。組織若しくは器官由来のサンプルは、あらゆる組織又は器官から、例えば、バイオプシーによって得ることができる。分離細胞は、生物学的流体、又は組織若しくは器官から、遠心又はセルソーティングのような分離技術によって得ることができる。細胞、組織又は器官のサンプルは、本明細書に記載のペプチドを発現又は生産する細胞、組織又は器官から得ることが好ましい。
【００１７】
本明細書で使用する用語「PlGF（胎盤成長因子）」とは、149アミノ酸長のポリペプチドからなり、ヒト血管内皮細胞増殖因子（VEGF）の血小板由来増殖因子様領域と高い相同性（53％同一性）を有する胎盤由来の成長因子をいう。VEGFと同様、PlGFはインビトロ及びインビボで血管新生活性を有する。例えば、トランスフェクトしたCOS-1細胞由来のPlGFの生化学的及び機能的特徴により、PlGFは、インビトロで内皮細胞の増殖を刺激することができる糖化二量体性分泌タンパク質であることが明らかとなった（Maqlione1993, Oncogene 8(4):925-31）。好ましくは、PlGFは、ヒトPlGFをいい、より好ましくはGenebankアクセッション番号P49763, GI: 17380553 (Genebankは、米国NCBIのウェブサイトwww.ncbi.nlm.nih.gov/entrezから利用可能である)で示されるアミノ酸配列を有するヒトPlGFをいう。さらに、本発明に従って記載される変異体とは、少なくとも一のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加によって異なるアミノ酸配列を有し、その際、その変異体のアミノ酸配列が、特定のPlGFのアミノ酸配列と依然として、好ましくは少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%又は99%同一であると理解されるものとする。変異体は、アレル変異体、スプライス変異体又はその他あらゆる種の特定のホモログ、パラログ若しくはオルソログであってもよい。さらに、本明細書に記載の変異体は、特定のPlGF又は上述のタイプの変異体の断片を、それらが上述した必須の免疫学的及び生物学的性質を有する限り、包含する。このような断片は、例えば、PlGFの分解産物であってもよい。さらに、変異体は、リン酸化又はミリスチル化のような翻訳後修飾により異なる変異体も包含する。
【００１８】
本明細書で使用する用語「エンドグリン」とは、非還元型が180kDa、還元後が95kDa、及びN末端が脱グリコシル化された還元型が66kDaの分子量を有するポリペプチドを言う。このポリペプチドは、二量体を形成することができ、TGF-β及びTGF-β受容体に結合する（下記参照）。エンドグリンはリン酸化され得る。エンドグリンは、ヒトエンドグリンであることが好ましい。Genebankアクセッション番号AAC63386.1, GI: 3201489で示されるようなアミノ酸配列を有するヒトエンドグリンであることがより好ましい。さらに、本発明に従って記載される変異体は、少なくとも一のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加によって異なるアミノ酸配列を有し、その際、そのアミノ酸配列が特定のエンドグリンのアミノ酸配列と依然として、好ましくは少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%又は99%同一であると理解されるものとする。変異体は、アレル変異体、スプライス変異体又はその他あらゆる種の特定のホモログ、パラログ若しくはオルソログであってもよい。さらに、本明細書に記載の変異体は、特定のエンドグリン又は上述のタイプの変異体の断片を、それらが上述した必須の免疫学的及び生物学的性質を有する限り、包含する。このような断片は、例えば、エンドグリンの分解産物であってもよい。さらに、リン酸化又はミリスチル化のような翻訳後修飾により異なる変異体も包含する。
【００１９】
本明細書で使用する用語「可溶性(s)Flt-1)」は、VEGF受容体FLT1の可溶性形態であるポリペプチドを言う。sFLT1は、ヒト臍帯静脈内皮細胞のならし培養培地中で同定された。内在性可溶性Flt1(sFLT1)受容体は、グロマトグラフィー的に及び免疫学的に組換えヒトsFLT1と類似し、同程度の高親和性で［125I］VEGFと結合する。ヒトsFLT1は、インビトロでKDR/Flk-1の細胞外ドメインと共にVEGF安定化複合体を形成することが知られている。sFLT1は、ヒトsFLT1であることが好ましい。ヒトsFLT1は、Genebankアクセッション番号P17948, GI: 125361で示されるようなFlt-1のアミノ酸配列から推定できることがより好ましい。マウスsFLT1の塩基配列は、Genebankアクセッション番号BAA24499.1, GI: 2809071で示される。さらに、本発明に従って記載される変異体は、少なくとも一のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加によって異なるアミノ酸配列を有し、その際、そのアミノ酸配列が、特定のsFLT1のアミノ酸配列と依然として、好ましくは少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%又は99%同一であると理解されるものとする。変異体は、アレル変異体、スプライス変異体又はその他あらゆる種の特定のホモログ、パラログ若しくはオルソログであってもよい。さらに、本明細書に記載の変異体は、特定のsFLT1又は上述のタイプの変異体の断片を、それらが上述した必須の免疫学的及び生物学的性質を有する限り、包含する。このような断片は、例えば、sFLT1の分解産物であってもよい。さらに、リン酸化又はミリスチル化のような翻訳後修飾により異なる変異体も包含する。
【００２０】
本明細書で言及されるペプチド又はポリペプチドの量を測定するとは、量又は濃度を、好ましくは半定量的に又は定量的に測定することに関する。測定は、直接的に又は間接的に行うことができる。直接的測定は、ペプチド又はポリペプチドの量又は濃度を、ペプチド又はポリペプチド自身から得られるシグナル、あるいはサンプル中に存在するペプチドの分子数と直接的に相関する強度、に基づいて測定することに関する。このようなシグナル（本明細書では、しばしば強度シグナルと呼ぶ）は、例えば、そのペプチド又はポリペプチドの特異的な物理的又は化学的性質の強度値を測定することによって得ることができる。間接的測定は、二次的な成分（つまり、成分それ自体は、ペプチド又はポリペプチドではない）又は生物学的読出システム（例えば、測定可能な細胞応答、リガンド、標識、又は酵素反応産物）から得られるシグナルの測定を含む。
【００２１】
本発明によれば、ペプチド又はポリペプチドの測定は、サンプル中のペプチドの量を測定するための公知のあらゆる手段によって達成することができる。前記手段は、多様なサンドイッチ、競合又は他のアッセイフォーマットで標識した分子を利用できる免疫アッセイ装置及び方法を含む。前記アッセイは、ペプチド又はポリペプチドの存在の有無を示すシグナルを発し得る。さらに、シグナルの強さは、好ましくは、直接的に又は間接的に（例えば、反比例で）サンプル中に存在するポリペプチドの量と相関することができる。さらなる好適な方法は、正確な分子量又はNMRスペクトルといったペプチド又はポリペプチドに特異的な物理的又は化学的性質を測定することを含む。前記方法は、好ましくは、バイオセンサ、免疫アッセイと連動した光学装置、バイオチップ、マススペクトルメータ、NMR分析機又はクロマトグラフィー装置のような分析装置を含む。さらに、方法は、マイクロプレートELISAベースの方法、完全自動化若しくはロボット免疫アッセイ（例えば、ElecsysTM アナライザを利用できる）、CBA（酵素的コバルト結合アッセイ：Cobalt Binding Assay；Roche-HitachiTMアナライザを利用できる）、及びラテックス凝集アッセイ（Roche-HitachiTMアナライザを利用できる）を含む。
【００２２】
ペプチド又はポリペプチドの量の測定は、（ａ）細胞応答(その強度がペプチド又はポリペプチドの量を示す)を誘発することのできる細胞を前記ペプチド又はポリペプチドと適当な時間で接触させるステップ、及び（ｂ）前記細胞応答を測定するステップ、を含むことが好ましい。細胞応答を測定するために、サンプル又は処理済みのサンプルは、好ましくは細胞培養液に添加され、細胞内応答及び細胞外応答が測定される。細胞応答は、レポーター遺伝子の測定可能な発現、又は物質（例えば、ペプチド、ポリペプチド、又は低分子）の分泌を含んでいてもよい。発現又は物質は、ペプチド又はポリペプチドの量と相関する強度シグナルを生じるものとする。
【００２３】
また、ペプチド又はポリペプチドの量の測定は、サンプル中のペプチド又はポリペプチドから得られる特異的な強度のシグナルを測定するステップを含むことが好ましい。上記のように、このようなシグナルは、そのペプチド又はポリペプチドに特異的なNMRスペクトル或いは質量スペクトルで観察されるそのペプチド又はポリペプチドに特異的な質量電荷(m/z)変数、で観察されるシグナル強度であってよい。
【００２４】
ペプチド又はポリペプチドの量の測定は、好ましくは、（ａ）ペプチドと特異的リガンドとの接触ステップ、（ｂ）（任意で）非結合リガンドを除去するステップ、（ｃ）結合リガンドの量を測定するステップを含むことができる。結合したリガンドは、強度シグナルを生成する。本発明に記載の結合は、共有及び非共有結合の両方を包含する。本発明に記載のリガンドは、本明細書に記載のペプチド又はポリペプチドに結合するあらゆる化合物、例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸又は低分子であることができる。好ましいリガンドは、抗体、核酸、ペプチド又はポリペプチド（例えば、受容体又はペプチド若しくはポリペプチドの結合パートナー、及びペプチドの結合ドメインを含むそれらの断片）、及びアプタマー（例えば、核酸若しくはペプチドアプタマー）を含む。そのようなリガンドを調製する方法は、当該分野で周知である。例えば、好適な抗体又はアプタマーの同定及び製造は、販売業者からも提供されている。当業者であれば、高い親和性又は特異性を持った前記リガンドの誘導体を開発する方法には精通している。例えば、ランダム突然変異を核酸、ペプチド又はポリペプチド中に導入することができる。これらの誘導体は、その後、当該分野で公知のスクリーニング方法、例えばファージディスプレイにより、結合について検証することができる。本明細書で言う抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方、及びそれらの断片（例えば、抗原又はハプテンに結合できるFv、Fab及びF(ab)2フラグメント等）を包含する。本発明は、一本鎖抗体、及び所望の抗原特異性を示す非ヒトドナー抗体のアミノ酸配列がヒトアクセプター抗体の配列と組み合わされているヒト化ハイブリッド抗体も包含する。ドナー配列は、通常、少なくともドナーの抗原結合性アミノ酸残基を含むが、さらにドナー抗体の他の構造的及び／又は機能的に関係のあるアミノ酸残基を含むことができる。前記ハイブリッドは、当該分野で周知のいくつかの方法によって調製することができる。リガンド又は作用剤は、前記ペプチド又はポリペプチドに特異的に結合することが好ましい。本発明に記載の特異的結合とは、リガンド又は作用剤が解析されるべきサンプル中に存在する他のペプチド、ポリペプチド又は物質と実質的に結合（「交差反応」）しないことを意味する。好ましくは、特異的に結合したペプチド又はポリペプチドは、他の関連する任意のペプチド又はポリペプチドよりも、少なくとも３倍高い、より好ましくは少なくとも１０倍高い、さらに好ましくは少なくとも５０倍高い親和性で結合されなければならない。非特異的結合は、例えば、ウェスタンブロットでのサイズによって、又はサンプル中に比較的多量に存在することで、区別でき、かつ明白に測定可能であるのであれば、許容することができる。リガンドの結合は、当該分野で公知のあらゆる方法によって測定することができる。前記方法は、半定量的又は定量的であることが好ましい。好適な方法を以下で説明する。
【００２５】
第一に、リガンドの結合は、例えば、NMR又は表面プラズモン共鳴によって直接的に測定することができる。
【００２６】
第二に、リガンドが目的のペプチド又はポリペプチドの酵素的活性の基質としても働くのであれば、酵素反応産物を測定することができる（例えば、プロテアーゼの量は、切断した基質の量をウェスタンブロット等で測定することによって測定することができる）。あるいは、リガンドは、それ自身が酵素的性質を示してもよく、「リガンド／ペプチド又はポリペプチド」複合体又はペプチド若しくはポリペプチドとそれぞれ結合したリガンドを、強度シグナルの生成による検出を可能にする好適な基質と接触させてもよい。酵素反応産物の測定のために、基質の量を飽和しておくことが好ましい。基質は、反応前に検出可能な標識で標識することもできる。サンプルは、基質と適当な時間接触されることが好ましい。適当な時間とは、検出可能な、好ましくは測定可能な産物量が生産されるのに必要な時間をいう。産物の量を測定する代わりに、所与の（例えば、検出可能な）産物の量が出現するのに必要な時間を測定することができる。
【００２７】
第三に、リガンドは、共有結合又は非共有結合により、リガンドの検出及び測定を可能にする標識と結合させることができる。標識化は、直接的又は間接的方法によって行うことができる。直接的な標識化は、標識を直接（共有結合又は非共有結合により）リガンドに結合することを含む。間接的な標識化は、第二リガンドと第一リガンドとの結合(共有結合又は非共有結合)を含む。第二リガンドは、第一リガンドと特異的に結合しなければならない。前記第二リガンドは、好適な標識と結合していてもよく、及び／又は第二リガンドと結合する第三のリガンドの標的（受容体）であってもよい。第二リガンド、第三リガンド又はさらに高次のリガンドを使用は、しばしばシグナルを増加するのに用いられる。好適な第二及びより高次のリガンドは、抗体、第二抗体、及び周知のストレプトアビジン−ビオチンシステム（Vector Laboratories, Inc.）を包含することができる。また、リガンド又は基質は、当該分野で公知の一以上のタグで「タグ標識され」てもよい。前記タグは、その後、より高次のリガンドの標的となることができる。好適なタグには、ビオチン、ジゴキシゲニン、Hisタグ、グルタチオンSトランスフェラーゼ、FLAG、GFP、myc-tag、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（HA）、マルトース結合性タンパク質等が含まれる。ペプチド又はポリペプチドの場合には、前記タグは、N末端及び／又はC末端にあることが好ましい。好適な標識は、適当な検出方法によって検出可能なあらゆる標識である。典型的な標識には、金粒子、ラテックスビーズ、アクリダンエステル、ルミノール、ルテニウム、酵素活性型標識、放射性標識、磁気標識（例えば、常磁性及び超磁性標識を含む「磁気ビーズ」）及び蛍光標識が含まれる。酵素活性型標識には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びそれらの誘導体が含まれる。検出に好適な基質には、ジアミノベンジジン（DAB）、3,3'-5,5'-テトラメチルベンジジン、NBT-BCIP（4-ニトロ・ブルー・テトラゾリウムクロライド及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸：Roche Diagnostics社から既製品ストック溶液として入手可能）、CDP-StarTM（Amersham Biosciences社）、ECFTM（Amersham Biosciences社）が含まれる。好適な酵素と基質の組み合わせは、当該分野で公知の方法によって（例えば、感光フィルム又は適当なカメラシステムを用いて）測定することのできる呈色反応産物、蛍光又は化学発光をもたらし得る。酵素反応を測定することに関しては、上述した基準が同様に適用される。代表的な蛍光標識には、蛍光タンパク質（例えば、GFPやその誘導体等）、Cy3、Cy5、テキサスレッド、フルオレセイン及びAlexa色素（例えば、Alexa 568）が含まれる。さらなる蛍光標識は、例えば、Molecular Probe社（オレゴン州）から入手可能である。また、蛍光標識として量子ドットの使用も考えられる。代表的な放射性標識には、35S、125I、32P、33P等が含まれる。放射性標識は、公知及び適当な任意の方法、例えば、感光フィルム又はフォスフォイメージャで検出することができる。本発明による好適な測定方法は、沈降（特に、免疫沈降）、電気化学発光（電気的に生じる化学発光）、RIA（放射性免疫アッセイ法）、ELISA（酵素結合免疫吸着法）、サンドイ���チ酵素免疫テスト、電気化学発光サンドイッチ免疫アッセイ法（ECLIA）、解離促進ランタニド蛍光免疫アッセイ法（DELFIA）、シンチレーション近接アッセイ法（SPA）、比濁法、比濁分析法、ラテックス増強比濁法若しくは比濁分析法、又は固相免疫テストが含まれる。当該分野で公知のさらなる方法（例えば、ゲル電気泳動法、２次元ゲル電気泳動法、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）、ウェスタンブロット法、及びマススペクトル）を単独で又は上述した標識化若しくは他の検出方法と組み合わせて使用することもできる。
【００２８】
また、好ましくは、ペプチド又はポリペプチドの量は、以下のように測定することができる。すなわち、（ａ）上記特定のペプチド又はポリペプチドに対するリガンドを含む固体支持体と該ペプチド又はポリペプチドを含むサンプルとを接触させ、及び（ｂ）前記支持体に結合したペプチド又はポリペプチドの量を測定する。リガンド(好ましくは核酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体及びアプタマーからなる群から好ましくは選択される)は、固定された形態で固体支持体上に存在することが好ましい。固体支持体を製造するための材料は、当該分野では周知であり、とりわけ、市販のカラム材、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラス及び／又はシリコンチップ及び表面、ニトロセルロース・ストリップ、メンブレン、シート、デュラサイト（duracyte）、反応トレイのウェルおよび壁、プラスチックチューブ等が挙げられる。リガンドまたは作用剤は多くの異なる担体に結合することができる。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然及び修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、本発明の目的用に可溶性又は不溶性にいずれであってもよい。前記リガンドを固定化／不動化するための適当な方法は周知であり、限定はしないが、イオン、疎水性、共有結合相互作用等が含まれる。本発明によるアレイとして「サスペンションアレイ」を利用することも意図している（Nolan, 2002, Trends Biotechnol. 20(1):9-12)。前記サスペンションアレイにおいて、サスペンション中に担体、例えばマイクロビーズ又はマイクロスフェアが存在する。アレイは、場合によっては標識され、異なるリガンドを担持する、種々のマイクロビーズ又はマイクロスフェアからなる。このようなアレイを、例えば、固相化学及び光分解性保護基をベースとして作る方法は、一般的に公知である（米国特許第5,744,305号）。
【００２９】
本明細書で使用する用語「量」は、ポリペプチド又はペプチドの絶対量、前記ポリペプチド又はペプチドの相対量又は濃度、及びそれらに相関する又はそれらに由来し得る任意の値又はパラメータを包含する。前記値又はパラメータは、前記ペプチドから直接的測定（例えば、マススペクトル又はNMRスペクトルにおける強度値）によって得られるあらゆる特有の物理的又は化学的性質からの強度シグナル値を含む。さらに、本明細書中に明記された間接的測定（例えば、ペプチドに応答して生物学的読出システムから測定される応答レベル、又は特異的に結合したリガンドから得られる強度シグナル）によって得られる全ての値又はパラメータを包含する。前述の量又はパラメータに相関する値は、全ての数学的標準手法によって得ることも可能であるとする。
【００３０】
本明細書で使用する用語「比較する」とは、解析すべきサンプルに含まれるペプチド又はポリペプチドの量を本明細書中で特定した適切な参照源の量と比較することを包含する。本明細書で使用する比較するとは、対応するパラメータ又は値の比較を言うものと理解される。例えば、絶対量が絶対参照量と比較され、濃度は参照濃度と比較され、又はテストサンプルから得られた強度シグナルは、参照サンプルの同タイプの強度シグナルと比較される。本発明の方法のステップ（ｂ）でいう比較は、手動で又はコンピュータを使って実行することができる。コンピュータを使った比較については、測定量の値は、コンピュータプログラムによってデータベース中に保存された適当な参照に対応する値と比較することができる。コンピュータプログラムは、さらに比較結果を評価することができる。すなわち、適切なアウトプットフォーマットで所望の評価を自動的に提供することができる。ステップ（a）で測定された量及び参照量の比較に基づいて、心臓壊死の原因を同定することが可能である。したがって、前記参照量は、比較される量の差異又は類似性のいずれかにより、特定の血管新生状態、すなわち血管新生誘導状態又は抗血管新生状態、を有する被験体の同定が可能であるように選択される。
【００３１】
それ故、本明細書で使用する用語「参照量」は、被験体の血管新生状態を血管新生誘導状態又は抗血管新生状態のいずれか一方に割り当てることを可能にするポリペプチドの量をいう。したがって、前記参照は、（i）血管新生誘導状態であることが公知の被験体又は（i）抗血管新生状態であることが公知の被験体のいずれかに由来し得る。さらに、前記参照量は、閾値を明確にすることが好ましい。好適な参照量又は閾値量は、本発明の方法によって共に分析すべき参照サンプルから、試験サンプルと共に、すなわち同時に又は連続的に、測定される。閾値となる好ましい参照量は、正常上限（ULN）、すなわち被験体の集団（例えば、臨床試験に登録された患者）中に見出されるべき生理学的量の上限、から導き出すことができる。所与の被験体集団のULNは、様々な周知の技術によって測定することができる。好適な技術は、本発明の方法で測定されるべきペプチド量又はポリペプチド量について集団の中央値を測定することであってもよい。本発明でいうPlGFのULNは、好ましくは、3〜8pg/mlの範囲で変化する。より好ましくは、前記PlGFのULNは、5pg/mlである。本発明でいうエンドグリンのULNは、好ましくは、1〜4ng/mlの範囲で変化する。より好ましくは、前記エンドグリンのULNは、3ng/mlである。本発明でいうsFLT1のULNは、好ましくは、70〜80ng/mlの範囲で変化する。より好ましくは、前記sFLT1のULNは、75ng/mlである。
【００３２】
原則として、ULNに関して、PlGF及びsFLT1の増加量並びにエンドグリンの減少量は、抗血管新生状態を示すが、ULNに関して、PLGF及びsFLT1の減少量並びにエンドグリンの増加量は、血管新生誘導状態を示すことが明らかとなった。故に、本明細書の方法の好ましい実施例において、ULNに関して、PlGF及びsFLT1の増加量並びにエンドグリンの減少量は、抗血管新生状態を示す。本発明の方法の他の好ましい実施形態において、ULNに関して、PLGF及びsFLT1の減少量並びにエンドグリンの増加量は、血管新生誘導状態を示す。
【００３３】
好都合なことに、本発明の基礎となる研究で、バイオマーカーとしてのPlGF、エンドグリン及びsFLT1の組み合わせが、被験体の血管新生状態を信頼できかつ効率的な様式で測定するのに必要なことが明らかとなった。さらに、前記各バイオマーカーは、統計的に互いに独立していることが判明した。したがって、本発明の方法は、信頼性の高い診断を提供する。上記のように、この問題を解決するために現在用いられている技術は、時間を要し、かつコストがかかる。しかしながら、本発明の方法は、信用でき、迅速で、かつより少ないコストでの診断が可能であり、またテストストリップのような携帯式アッセイであっても実行することができる。したがって、前記方法は、緊急を要する患者の診断に特に適している。本発明の知見のおかけで、被験体に好適な血管新生療法を確実に選択することができる。患者の誤った治療を原因とする重篤な副作用を回避することができる。
【００３４】
本発明の方法の好ましい実施形態において、前記方法は、ステップａ）においてTGF-β又はその変異体の量を測定すること、及びステップｂ）において前記量と参照量とを比較すること、をさらに含む。好ましくは、TGF-β用の前記参照量はULNである。より好ましくは、このULNに関して、TGF-βの増加量は血管新生誘導状態を示すが、減少量は抗血管新生状態を示す。
【００３５】
本明細書で使用する用語「TGF-β（形質転換増殖因子-β）」とは、TGF-β1ポリペプチドファミリーの構造的に関連するタンパク質増殖因子群の一員であるTGF-β1をいう。この因子は、もともとは線維芽細胞の足場非依存性増殖の刺激剤として同定された。その一方で、さらに多様な活性が当該分野で知られている。TGF-β1は、血管新生及び血管壁の完全性に関与する（Bertolino Chest （増刊）2005, 128:585S-590S）。TGF-βは、ヒトTGF-βであることが好ましい。ヒトTGF-βが、Genebankアクセッション番号AAB26284, GI: 299150で示されるアミノ酸配列を含むことがより好ましい。さらに、本発明でいう変異体とは、少なくとも一のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加によって異なるアミノ酸配列を有し、その際、そのアミノ酸配列が、特定のsFLT1のアミノ酸配列と依然として、好ましくは少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%又は99%同一であると理解されるものとする。変異体は、アレル変異体、又はその他あらゆる種の特定のホモログ、パラログ若しくはオルソログであってもよい。さらに、本発明でいう変異体は、特定のsFLT1又は前記タイプの変異体の断片を、それらが上述した必須の免疫学的及び生物学的性質を有する限り含む。このような断片は、例えば、sFLT1の分解産物であってもよい。さらにリン酸化又はミリスチル化のような翻訳後修飾により異なる変異体も包含する。
【００３６】
また、本発明は、冠状動脈性心臓病に罹患している被験体が血管新生誘導療法に感受性か否かを診断する方法に関する。本方法は、
ａ）冠状動脈性心臓病に罹患している被験体のサンプルにおけるPlGF又はその変異体、エンドグリン又はその変異体、及びsFLT1又はその変異体、の量を測定するステップ、及び
ｂ）前記ステップａ）で測定された量と参照量とを比較することによって、被験体が血管新生誘導療法に感受性か否かを診断するステップを含む。
【００３７】
本明細書で使用する用語「血管新生誘導療法」とは、血管新生のプロセスを被験体において全身的に又は局所的に誘導する又は増強する治療法に関する。前記血管新生誘導療法は、好ましくはVEGF、PlGF、エンドグリン、抗-Flt-1抗体及びALK5修飾因子からなる群より選択される、血管新生剤の投与を含むことが好ましい。
【００３８】
具体的には、ULNに関して、PLGF及びsFLT1の増加量及びエンドグリンの減少量が抗血管新生状態を有する被験体を示し、それ故、血管新生誘導療法に感受性であることが明らかとなった。
【００３９】
本発明の上述の方法のより好ましい実施形態において、ULNに関して、PlGF及びsFLT1の増加量及びエンドグリンの減少量は、血管新生誘導療法に感受性の被験体を示す。
【００４０】
本発明の上述の方法の他の好ましい方法において、前記方法は、前記ａ）ステップにおいてTGF-β又はその変異体の量を測定すること、及び前記量と参照量とを比較することをさらに含む。TGF-βの参照量は、ULNであることが好ましい。より好ましくは、ULNに関して、TGF-βの増加量は、血管新生誘導療法に感受性の被験体を示す。
【００４１】
本発明はさらに、冠状動脈性心臓病に罹患している被験体の血管新生状態を診断するための装置を含む。本装置は、
ａ）PLGF又はその変異体、エンドグリン又はその変異体、及びsFLT1又はその変異体、の量を測定する手段、及び
ｂ）前記ａ）手段で測定された量と参照量とを比較する手段を含み、
それによって、前記装置は、上述した本発明の方法を実行するために適合されている。
【００４２】
本明細書で使用する用語「装置」とは、予測を可能にするために、動作可能なように互いに連結された前述の手段を少なくとも含む、手段のシステムをいう。上記ポリペプチドの一つの量を測定するための好ましい手段及び前記比較を実行するための手段は、本発明の方法に関連して上述している。動作様式でどのように手段を連結するかは、装置内に含まれる手段の型に拠るであろう。例えば、ペプチドの量を自動的に測定する手段が適用されている場合、前記自動化動作手段によって得られるデータは、所望の結果を得るために、例えば、コンピュータプログラムによって処理することができる。このような場合には、手段は、単一装置に含まれることが好ましい。したがって、前記手段は、アプライされたサンプル中のペプチド又はポリペプチドの量を測定するための分析ユニット、及び評価のため得られたデータを処理するコンピュータユニットを含むことができる。コンピュータユニットは、本明細書中で挙げた保存参照量又は保存参照値を包含するデータベース、及びポリペプチドの測定量とデータベースの保存参照量との比較を実行するためのコンピュータ実行アルゴリズムを含むことが好ましい。本明細書で使用するコンピュータ実行とは、コンピュータユニット中に具体的に包含されるコンピュータ可読プログラムコードをいう。或いは、テストストリップのような手段をペプチド又はポリペプチドの量を測定するのに使用する場合、比較用手段は、対照ストリップと参照量に測定量を割り当てる対照表とを含むことができる。テストストリップは、本明細書に記載のペプチド又はポリペプチドと特異的に結合するリガンドと結合されていることが好ましい。ストリップ又は装置は、好ましくは、前記ペプチド又はポリペプチドと前記リガンドとの結合を検出するための手段を含む。検出のための好ましい手段は、上記本発明の方法に関する実施形態に関連して開示されている。この場合、本手段は、システムのユーザが量の測定結果及びその診断値又は予後値をマニュアル中に記載の指示及び説明によってまとめるという点において、動作可能なように連結されている。前記手段は、このような実施形態において分離した装置とみなすことができ、かつ好ましくはキットとして一緒にパッケージングされる。当業者であれば、前記手段をどうやって関連付けるかが難なくわかるであろう。好ましい装置は、専門医の専門知識なしに適用することができる装置である。例えば、単にサンプルを載せることのみを必要とするテストストリップ又は電子装置が該当する。前記結果は、臨床医による解釈を必要とする生データのアウトプットとして提供されてもよい。しかし、装置のアウトプットは、解釈に臨床医を必要としない処理された、すなわち評価された生データであることが好ましい。さらに好ましい装置は、分析ユニット／装置（例えば、バイオセンサ、アレイ、ナトリウム利尿ペプチドを特異的に認識するリガンドと結合した固体支持体、表面プラズモン共鳴装置、NMRスペクトロメータ、マス−スペクトロメータ等）及び／又は本発明の方法による上述の評価ユニット／装置を含む。
【００４３】
また、本発明は、被験体が血管新生誘導療法に感受性か否かを診断するための装置に関する。本装置は、
ａ）PLGF又はその変異体、エンドグリン又はその変異体、及びsFLT1又はその変異体、の量を測定する手段、及び
ｂ）前記ａ）手段で測定された量と参照量とを比較する手段を含み、
それによって、前記装置は、前述の本発明の方法を実行するために適合されている。
【００４４】
さらに、本発明は、上記本発明の方法を実行するために適合されたキットに関する。本キットは、
ａ）PLGF又はその変異体、エンドグリン又はその変異体、及びsFLT1又はその変異体を測定するための手段、及び
ｂ）前記ａ）手段で測定された量と参照量とを比較する手段を含み、
それによって、本キットは、上記本発明の方法を実行するために適合されている。キットは、本発明の前記方法を実行するための説明書を含むことが好ましい。
【００４５】
本明細書で使用する用語「キット」とは、上述の手段の集合であって、好ましくは、別々に又は単一容器に内包して提供される。容器は、好ましくは、本発明の方法を実行するための説明書を含む。
【００４６】
最後に、本発明は、上述の本発明の方法を実行するために適合されたキットを包含する。本キットは、
ａ）PLGF又はその変異体、エンドグリン又はその変異体、及びsFLT1又はその変異体、の量を測定するための手段、及び
ｂ）前記ａ）手段で測定された量と参照量とを比較する手段を含み、
それによって、上記本発明の方法を実行するために適合されている。本キットは、本発明の前記方法を実行するための説明書を含むことが好ましい。
【００４７】
本明細書に引用した全ての文献は、それらの開示内容の全て及び本明細書で具体的に記載した開示内容に関し、参照によって本明細書に援用される。
【００４８】
以下の実施例は、単に本発明を説明するためのものに過ぎない。それ故、本発明の範囲は、下記実施例によって全く制限されないものとする。
【実施例】
【００４９】
実施例：PlGF、sFLT1及びエンドグリンは、冠状動脈性疾患に罹患している患者における血管新生状態用の統計的に独立した共通の予測因子である
総数274人の冠状動脈性心臓病に罹患している患者におけるsFLT1、エンドグリン、PlGF及びTGF-β1の血中レベルについて調べた。全患者の病歴（喫煙、糖尿病、動脈性高血圧又は過去の心筋梗塞などの冠状動脈性心臓病の潜在的リスクファクターを含む）を慎重に記録した。
【００５０】
患者を心エコー検査によって解析した。さらに、左心室駆出分画率（LVEF）を測定した。患者を40％未満（収縮機能障害）、40〜60％（不明瞭）及び60％超（非収縮機能障害）に分けた。また、収縮機能障害を有するか又は不明瞭である患者を冠動脈造影法で調べた。冠動脈系の血管が50％の容量減少をもたらす少なくとも一の狭窄を示すのであれば、冠状動脈性心臓病であると認定した。患者を、さらに一つ、二つ又は三つの血管疾患によって細分類した。
【００５１】
sFLT1、PlGF及びエンドグリンの血中レベルを市販の免疫アッセイ「Quantikine」（カタログ番号 DVR100B, DPG00及びDNDG00；R & D Systems社、 USA）を用いて測定した。
【００５２】
研究結果を以下の表１〜４にまとめる。さらに、PlGF、エンドグリン及びsFLT1は、線形回帰分析によって示したように統計的に互いに独立している（図１〜３参照）
【表１】
2010513891.tif 000002
【表２】
2010513891.tif 000003
【表３】
2010513891.tif 000004
【表４】
2010513891.tif 000005
【図１】
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【図２】
2010513891.tif 000007
【図３】
2010513891.tif 000008
【国際調査報告】
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