(57)【要約】本発明は、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを再生するための方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の化合物の溶出後に陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを再生するための方法であって、以下の工程：
−  吸着ポリペプチドを、塩化ナトリウムを少なくとも５００mMの濃度で含む水性緩衝溶液でカラムから溶出すること、
−  カラムを精製水でフラッシングすること、
−  ０．５M水酸化ナトリウム溶液をカラムに適用すること、
−  カラムを精製水でフラッシングすること、
−  ０．５Mリン酸二水素ナトリウム及び１Mリン酸を含む溶液をカラムに適用すること、
−  カラムを精製水でフラッシングすること、
−  ０．５M水酸化ナトリウム溶液をカラムに少なくとも４時間適用すること、及び
−  陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを、カラムを精製水でフラッシングすることにより再生すること
を、この順番で含む方法。
【請求項２】
実質的に均質な形態でモノペグ化エリスロポエチンを得るための方法であって、以下の工程：
ａ）分子量が２０kDa〜４０kDaの活性化ペグ化試薬を使用してエリスロポエチンをペグ化すること、
ｂ）工程ａ）において得られるペグ化エリスロポエチンを２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程（第１及び第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程で同じタイプの陽イオン交換材料を用いる）で精製すること、
ｃ）モノペグ化エリスロポエチンを、第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから実質的に均質な型で回収すること、
ｄ）以下の順番の以下の工程により陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを再生すること：
ｉ）結合ポリペプチドを、塩化ナトリウムを含む水性緩衝溶液で陽イオン交換カラムから除去すること、
ｉｉ）カラムを精製水でフラッシングすること、
ｉｉｉ）水酸化ナトリウム溶液をカラムに適用すること、
ｉｖ）カラムを精製水でフラッシングすること、
ｖ）リン酸二水素ナトリウム及びリン酸を含む溶液をカラムに適用すること、
ｖｉ）カラムを精製水でフラッシングすること、
ｖｉｉ）０．５M水酸化ナトリウム溶液をカラムに少なくとも４時間適用すること、及び
ｖｉｉｉ）陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを、カラムを精製水でフラッシングすることにより再生すること
を含む方法。
【請求項３】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムが強陽イオン交換クロマトグラフィーカラムであることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムがスルホプロピル陽イオン交換クロマトグラフィーカラムであることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記緩衝剤が、リン酸もしくはその塩、又は酢酸もしくはその塩、又はクエン酸もしくはその塩、又はヒスチジンもしくはその塩であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記エリスロポエチンが配列番号１又は２のアミノ酸配列を伴うヒトエリスロポエチンであることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＥＧが分子量２０〜３５kDaを有し、直線型であることを特徴とする、請求項２又は６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＥＧが分子量４０kDaを有し、分岐していることを特徴とする、請求項２又は６のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程が段階溶出として実施され、前記第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程が直線溶出として実施されることを特徴とする、請求項２及び６〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを少なくとも４０の分離サイクルで使用し得ることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド、特にペグ化ポリペプチドの精製のために有用なクロマトグラフィー分離方法の分野にある。
【０００２】
発明の背景
タンパク質は今日の医療ポートフォリオにおいて重要な役割を果たす。ヒトへの適用のために、各治療タンパク質は別々の基準を満たさなければならない。生物薬剤のヒトへの安全性を確保するために、産生プロセス中に蓄積する副産物を特に除かなければならない。規制仕様を満たすために、１つ又は複数の精製工程が製造プロセスに従わなければならない。とりわけ、純度、処理量、及び収率が、適切な精製プロセスを決定する際に重要な役割を果たす。
【０００３】
様々な方法が、タンパク質精製のために十分に確立されており、広く使用される。例えば、微生物タンパク質でのアフィニティークロマトグラフィー（例、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例、陽イオン交換（スルホプロピル又はカルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）、及び混合モードイオン交換）、親イオウ性吸着（例、ベータメルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドによる）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例、フェニル−セファロース、アザアレーン親和性樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例、Ｎｉ（ＩＩ）−及びＣｕ（ＩＩ）−アフィニティー材料）、分子ふるいクロマトグラフィー、及び電気泳動方法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）である。
【０００４】
例えば、次のための抱合体が報告されている：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びインターロイキン６（EP 0 442 724）、ＰＥＧ及びエリスロポエチン（WO 01/02017）、エンドスタチン及び免疫グロブリンを含むキメラ分子（US 2005/008649）、分泌抗体ベースの融合タンパク質（US 2002/147311）、アルブミンを含む融合ポリペプチド（US 2005/0100991；ヒト血清アルブミンUS 5,876,969）、ペグ化ポリペプチド（US 2005/0114037）、及びインターフェロン融合物。
【０００５】
Necina, R., et al.（Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698）は、高電荷密度を示すイオン交換媒体による細胞培養上清から直接的にヒトモノクローナル抗体を捕捉した報告した。WO 89/05157において、細胞培養液を陽イオン交換処置に直接的にかけることによる産物免疫グロブリンの精製のための方法が報告される。マウス腹腔からのモノクローナルＩｇＧ抗体の１段階精製が、Danielsson, A., et al., J. Immun. Meth. 115 (1988), 79-88により記載される。イオン交換クロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するための方法が、WO 2004/024866において報告され、そこでは、勾配洗浄を使用して、１つ又は複数の混入物から目的のポリペプチドを分離する。EP 0 530 447において、３つのクロマトグラフィー工程の組み合わせによりＩｇＧモノクローナル抗体を精製するための方法が報告される。モノペグ化インターロイキン１受容体アンタゴニストの簡易精製が、Yu, G., et al., Process Biotechnol. 42 (2007) 971-977により報告される。Wang et al. (Wang, H., et al., Peptides 26 (2005) 1213-1218) は、２段階陽イオン交換クロマトグラフィーによる、大腸菌において発現させたｈＴＦＦ３の精製を報告する。Yun et al. (Yun, Q., et al., J. Biotechnol. 118 (2005) 67-74) は、２連続イオン交換クロマトグラフィー工程によるペグ化ｒｈＧ−ＣＳＦの精製を報告する。
【０００６】
発明の概要
本発明の一局面は、目的の化合物の溶出後に陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを再生するための方法であって、以下の工程：
−  吸着ポリペプチドを、塩化ナトリウムを少なくとも５００mMの濃度で含む水性緩衝溶液でカラムから溶出すること、
−  カラムを精製水でフラッシングすること、
−  ０．５M水酸化ナトリウム溶液をカラムに適用すること、
−  カラムを精製水でフラッシングすること、
−  ０．５Mリン酸二水素ナトリウム及び１Mリン酸を含む溶液をカラムに適用すること、
−  カラムを精製水でフラッシングすること、
−  ０．５M水酸化ナトリウム溶液をカラムに少なくとも４時間適用すること、及び
−  カラムを精製水でフラッシングすることにより陽イオン交換カラムを再生すること
を、この順番で含む方法である。
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、第１の局面として、以下の工程：
−  残留結合ポリペプチドを、塩化ナトリウムを含む水性緩衝溶液で陽イオン交換カラムから除去すること、
−  カラムを精製水でフラッシングすること、
−  水酸化ナトリウム溶液をカラムに適用すること、
−  カラムを精製水でフラッシングすること、
−  リン酸二水素ナトリウム及びリン酸を含む溶液をカラムに適用すること、
−  カラムを精製水でフラッシングすること、
−  ０．５M水酸化ナトリウム溶液をカラムに少なくとも４時間適用すること、及び
−  カラムを精製水でフラッシングすることにより陽イオン交換カラムを再生すること
を含む、目的の化合物の溶出後の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムの再生のための方法を含む。
【０００８】
本出願内で使用する「精製水」という用語は、米国薬局方に従った注射用の水を意味する。
【０００９】
本出願内で使用する「イオン交換材料」という用語は、イオン交換クロマトグラフィー中の固定相として使用する共有結合した荷電置換基を担持する固定高分子量マトリクスを意味する。全体的な電荷中性のために、共有結合していない対イオンはそれに結合する。「イオン交換材料」は、その共有結合していない対イオンを、周囲溶液の同様に荷電したイオンと交換する能力を有する。その交換可能な対イオンの電荷に応じて、「イオン交換樹脂」は、陽イオン交換樹脂又は陰イオン交換樹脂と呼ぶ。荷電基（置換基）の性質に応じて、「イオン交換樹脂」は、例えば、陽イオン交換樹脂の場合において、スルホン酸樹脂（Ｓ）、又はスルホプロピル樹脂（ＳＰ）、又はカルボキシメチル樹脂（ＣＭ）と呼ぶ。荷電基／置換基の化学的性質に応じて、「イオン交換樹脂」は、共有結合した荷電置換基の強度に応じて、強又は弱イオン交換樹脂にさらに分類できる。例えば、強陽イオン交換樹脂は、荷電置換基として、スルホン酸基、好ましくはスルホプロピル基を有し、弱陽イオン交換樹脂は、荷電置換基として、カルボン酸基、好ましくはカルボキシメチル基を有し、そして、弱陰イオン交換樹脂は、荷電置換基としてジエチルアミノエチル基を有する。一実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムはスルホプロピル陽イオン交換樹脂を含み、即ち、それはスルホプロピル陽イオン交換クロマトグラフィーカラムである。
【００１０】
異なるタイプのイオン交換材料、即ち、固定相が、異なる名称で、多数の会社から入手可能であり、例えば、陽イオン交換材料はBio-Rex（登録商標）（例、タイプ70）、Chelex（登録商標）（例、タイプ100）、Macro-Prep（登録商標）（例、タイプCM、High S、25 S）、AG（登録商標）（例、タイプ50W、MP）をBioRad Laboratoriesから全て入手可能であり、WCX 2をCiphergenから入手可能であり、Dowex（登録商標）MAC-3をDow Chemical Companyから入手可能であり、Mustang C及びMustang SをPall Corporationから入手可能であり、Cellulose CM（例、タイプ23、52）、Hyper-D、PartisphereをWhatman plc.から入手可能であり、Amberlite（登録商標）IRC（例、タイプ76、747、748）、Amberlite（登録商標）GT 73、Toyopearl（登録商標）（例、タイプSP、CM、650M）をTosoh Bioscience GmbHから全て入手可能であり、CM 1500及びCM 3000をBioChrom Labsから入手可能であり、SP-Sepharose（商標）、CM-Sepharose（商標）をGE Healthcareから入手可能であり、Poros樹脂をPerSeptive Biosystemsから入手可能であり、Asahipak ES（例、タイプ502C）、CXpak P、IEC CM（例、タイプ825、2825、5025、LG）、IEC SP（例、タイプ420N、825）、IEC QA（例、タイプLG、825）をShoko America Inc.から入手可能であり、50W陽イオン交換樹脂をEichrom Technologies Inc.から入手可能である。一実施態様において、陽イオン交換材料は、Macro-Prep（登録商標）High Sもしくは25S、又はMacroCap SP、又はToyopearl（登録商標）SP 650M、又はSource S、又はSP Sepharose、又はPOLYCAT Aなどの強陽イオン交換材料である。例示的な陰イオン交換材料は、Dowex（登録商標）1をDow Chemical Companyから入手可能であり、AG（登録商標）（例、タイプ1、2、4）、Bio-Rex（登録商標）5、DEAE Bio-Gel 1、Macro-Prep（登録商標）DEAEをBioRad Laboratoriesから全て入手可能であり、陰イオン交換樹脂タイプ１をEichrom Technologies Inc.から入手可能であり、Source Q、ANX Sepharose 4、DEAE Sepharose（例、タイプCL-6B、FF）、Q Sepharose、Capto Q、Capto SをGE Healthcareから全て入手可能であり、AX-300をPerkinElmerから入手可能であり、Asahipak ES-502C、AXpak WA（例、タイプ624、G）、IEC DEAEをShoko America Inc.から全て入手可能であり、Amberlite（登録商標）IRA-96、Toyopearl（登録商標）DEAE、TSKgel DEAEをTosoh Bioscience GmbHから全て入手可能であり、Mustang QをPall Corporationから入手可能である。
【００１１】
本出願内で使用する「フラッシング」という用語は、２つ又は複数のカラム容積の特定溶液でのカラムの洗浄を意味する。
【００１２】
「同じタイプの陽イオン交換材料」という用語は、同一の陽イオン交換材料を用いることにより実施される２つの連続したイオン交換クロマトグラフィー工程を意味する。これは、連続陽イオン交換クロマトグラフィー工程を、第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程のための陽イオン交換材料の第１部分の使用、及び第２の陽イオン交換クロマトグラフィーのための同じ陽イオン交換材料の第２部分の使用；又は両方の陽イオン交換クロマトグラフィー工程のための同じ陽イオン交換材料の使用；のいずれかにより実施することを意味する。
【００１３】
「段階溶出」又は「段階溶出方法」という用語は、本願で互換的に使用し、例えば、溶出、即ち、材料から結合化合物の解離を起こす物質の濃度を、一度に、即ち、１つの値／レベルから次の値／レベルに直接的に、上げるか又は下げる方法を意味する。この「段階溶出」において、１つ以上の条件、例えば、ｐＨ、イオン強度、塩濃度、及び／又はクロマトグラフィーの流量を、一度に、第１の、例えば、開始値から、第２の、例えば、最終値まで全て変化させ、即ち、条件を、直線的変化とは対照的に、増加的に、即ち、段階的に変化させる。「段階溶出方法」において、イオン強度の各増大後、新しい分画を回収する。この分画は、対応するイオン強度の増大によりイオン交換材料から回収される化合物を含む。各増大後、条件は、溶出方法における次の工程まで維持する。
【００１４】
「連続溶出」及び「連続溶出方法」という用語は、本願で互換的に使用され、例えば、溶出、即ち、材料から結合化合物の解離を起こす物質の濃度を、連続的に上げるか又は下げる、即ち、濃度が一連の小工程により変化し、各々で溶出を起こす物質の濃度が２％、好ましくは１％の変化より大きくない方法を意味する。この「連続溶出」において、１つ以上の条件、例えば、ｐＨ、イオン強度、塩濃度、及び／又はクロマトグラフィーの流量を、直線的に又は指数関数的に又は漸近的に変化させてよい。好ましくは、変化は直線的である。
【００１５】
本出願内で使用する「適用する」という用語及びその文法的な相当語句は、例えば、精製すべき目的物質を含む溶液を固定相と接触させる精製方法の部分的工程を意味する。これは、ａ）溶液を、固定相を位置づけたクロマトグラフィー装置に加えること、又は、ｂ）固定相を溶液に加えることを意味する。ａ）の場合において、例えば、精製すべき目的物質を含む溶液を固定相に通過させて、固定相と溶液中の物質の間の相互作用を可能にする。条件、例えば、ｐＨ、伝導度、塩濃度、温度、及び／又は流速などの条件に応じて、溶液の一部の物質が固定相に結合して、その結果溶液から除去される。他の物質は溶液中に残るか又は固定相から脱着する。溶液中の物質はフロースルー中に見出すことができる。「フロースルー」はクロマトグラフィー装置の通過後に得られる溶液を意味し、目的物質を含む適用溶液、又は緩衝液（カラムをフラッシングするため、又は固定相に結合した１つ以上の物質の溶出を起こすために使用する）のいずれかであってもよい。一実施態様において、クロマトグラフィー装置はカラム、又はカセットである。目的物質は、精製工程後に、当業者に周知の方法、例えば、沈殿、塩析、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、アフィニティークロマトグラフィー、又は溶媒容積減少（solvent volume reduction）などにより溶液から回収して、実質的に均質な形態で目的物質を得ることができる。ｂ）の場合において、固定相を、例えば、固形物として、例えば、精製すべき目的物質を含む溶液に加えて、固定相と溶液中の物質の間の相互作用を可能にする。相互作用後、固定相を、例えば、ろ過により除去し、それにより、例えば、目的物質が、固定相に結合し、溶液からそれと共に除去されるか、又は固定相に結合せず、溶液中に残るかである。
【００１６】
本出願内で使用する「結合に適した条件下で」という用語及びその文法的な相当語句は、目的物質、例えば、ペグ化エリスロポエチンが、それと、例えば、イオン交換材料を接触させた際に、固定相に結合することを意味する。これは、目的物質の１００％が結合していることを必ずしも意味しないが、しかし、目的物質の本質的に１００％が結合している、即ち、目的物質の少なくとも５０％が結合している、好ましくは目的物質の少なくとも７５％が結合している、好ましくは目的物質の少なくとも８５％が結合している、より好ましくは目的物質の９５％超が固定相に結合している。
【００１７】
本出願内で使用する「緩衝化」という用語は、酸性又は塩基性物質の添加又は放出に起因するｐＨの変化が緩衝物質により平らになる溶液を意味する。そのような効果をもたらす任意の緩衝物質を使用できる。一実施態様において、薬学的に許容可能な緩衝物質、例えば、リン酸もしくはその塩、酢酸もしくはその塩、クエン酸もしくはその塩、モルホリン、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸もしくはその塩、ヒスチジンもしくはその塩、グリシンもしくはその塩、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）もしくはその塩が使用できる。好ましい実施態様において、リン酸もしくはその塩、又は酢酸もしくはその塩、又はクエン酸もしくはその塩、又はヒスチジンもしくはその塩を使用する。任意に、緩衝溶液は、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、又はクエン酸カリウムなどの追加の塩を含んでよい。
【００１８】
一般的なクロマトグラフィー方法及びその使用は、当業者に公知である。例えば、Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann (ed) Elsevier Science Publishing Company 1992 Chromatography 5th ed 51 A 1992；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998)；Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)；Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；又はCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照のこと。
【００１９】
エリスロポエチンのペグ化は、通常、ポリペグ化エリスロポエチン、モノペグ化エリスロポエチン、非ペグ化エリスロポエチン、活性化ＰＥＧエステルの加水分解産物、ならびに、エリスロポエチン自体の加水分解産物などの異なる化合物の混合物をもたらす。実質的に均質な形態のモノペグ化エリスロポエチンを得るために、これらの物質を分離し、目的の化合物を精製しなければならない。
【００２０】
従って、本発明の第２の局面は、実質的に均質な形態でモノペグ化エリスロポエチンを得るための方法であって、以下の工程：
ａ）分子量が２０kDa〜４０kDaの活性化ペグ化試薬を使用してエリスロポエチンをペグ化すること、
ｂ）工程ａ）において得られるペグ化エリスロポエチンを２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程（第１及び第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程で同じタイプの陽イオン交換材料を用いる）で精製すること、
ｃ）モノペグ化エリスロポエチンを、第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから実質的に均質な型で回収すること、
ｄ）本発明の方法により陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを再生すること
を含む方法を提供する。
【００２１】
この方法は、グリコシル化した、即ち、哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６（登録商標）細胞、又はＨｅＬａ細胞により産生され、その後に化学的にペグ化した、ペグ化組換えポリペプチドの精製のために特に有用である。一実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムの再生は以下の工程：
−  結合ポリペプチドを、塩化ナトリウムを含む水性緩衝溶液で陽イオン交換カラムから除去すること、
−  カラムを、精製水、好ましくは少なくとも２つのカラム容積でフラッシングすること、
−  水酸化ナトリウム溶液をカラムに、好ましくは少なくとも２つのカラム容積で適用すること、
−  カラムを、精製水、好ましくは少なくとも２つのカラム容積でフラッシングすること、
−  リン酸二水素ナトリウム及びリン酸を含む溶液をカラムに、好ましくは少なくとも３つのカラム容積で適用すること、
−  カラムを、精製水、好ましくは少なくとも２つのカラム容積でフラッシングすること、
−  ０．５M水酸化ナトリウム溶液をカラムに少なくとも４時間、好ましくは４時間適用すること、及び
−  カラムを、精製水、好ましくは少なくとも２つのカラム容積でフラッシングすることにより陽イオン交換カラムを再生すること
を含む。
【００２２】
方法の第１の工程において、エリスロポエチンをペグ化する。ペグ化反応において使用するポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ポリマー分子は、分子量約２０kDa〜４０kDaを有する（本明細書で使用する「分子量」により、ＰＥＧの平均分子量が理解されるはずであり、なぜなら、ポリマー化合物としてのＰＥＧは、規定の分子量で得られず、しかし、実際に、分子量分布を有する；「約」という用語は、前記ＰＥＧ調製物において、一部の分子が示した分子量よりも重い、及び、いくらか軽く、即ち、約という用語は分子量分布を指し、それにおいてＰＥＧ分子の９５％が示した分子量の＋／−１０％内の分子量を有する。例えば、分子量３０kDaは２７kDa〜３３kDaの範囲を意味する）。
【００２３】
「エリスロポエチン」という用語は、配列番号１又は配列番号２の配列を有するタンパク質、又はそれと実質的に相同であるタンパク質もしくはポリペプチドを指し、その生物学的特性は、赤血球産生の刺激ならびに骨髄中の赤血球前駆細胞（committed erythroid progenitor）の分裂及び分化の刺激に関する。組換えエリスロポエチンは、組換えＤＮＡ技術によるか又は内因性遺伝子の活性化による真核細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、又はＢＨＫ細胞、又はＨｅＬａ細胞における発現を介して調製でき、即ち、エリスロポエチン糖タンパク質は内因性遺伝子の活性化により発現される。例えば、US 5,733,761、US 5,641,670、US 5,733,746、WO 93/09222、WO 94/12650、WO 95/31560、WO 90/11354、WO 91/06667、及びWO 91/09955を参照のこと。一実施態様において、本発明のエリスロポエチンはヒトＥＰＯの配列に基づく。好ましい実施態様において、ヒトエリスロポエチンは配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、より好ましくは、ヒトエリスロポエチンは配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。「エリスロポエチン」という用語は、また、配列番号１又は配列番号２のタンパク質の変異体を意味し、それにおいて１つ又は複数のアミノ酸残基が変化、欠失、又は挿入しており、例えば、EP 1 064 951、又はUS 6,583,272において報告される、修飾されていないタンパク質と同じ生物学的活性を有する。変異体は、グリコシル化のための１〜６つまでの追加部位を有するヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列を有しうる。ペグ化エリスロポエチンの特異的活性を、当技術分野において公知の様々なアッセイにより決定できる。本発明の精製ペグ化エリスロポエチンの生物学的活性は、ヒト患者への注入によるタンパク質の投与が、非注入群又は対照群の被験者と比較して、骨髄細胞における網状赤血球及び赤血球の産生増大をもたらすほどである。本発明に従って得られ、そして精製されるペグ化エリスロポエチンの生物学的活性を、Pharmeuropa Spec. Issue Biologicals BRP Erythropoietin Bio 97-2 (1997) 31-48の方法によりテストできる。
【００２４】
本発明の「ＰＥＧ」又は「ＰＥＧ基」は、必須部分としてポリ（エチレングリコール）を含む残基を意味する。そのようなＰＥＧは、分子の化学合成に起因するか又は分子の部分の最適な距離のためのスペーサーである、結合反応のために必要であるさらなる化学基を含むことができる。これらのさらなる化学基は、ＰＥＧポリマー分子の分子量の算出のために使用されない。また、そのようなＰＥＧは、互いに連結された１つ又は複数のＰＥＧ側鎖からなりうる。１を超えるＰＥＧ鎖を伴うＰＥＧは、マルチアーム（multiarmed）又は分岐ＰＥＧと呼ばれる。分岐ＰＥＧは、例えば、ポリエチレンオキシドの、グリセロール、ペンタエリトリオール、及びソルビトールなどの様々なポリオールへの付加により調製できる。分岐ＰＥＧは、例えば、EP 0 473 084、US 5,932,462において記載される。分子量２０−３５kDaのＰＥＧとして、直鎖ＰＥＧ分子を一実施態様において使用し、分子量が３５kDaを超える、特に４０kDaのＰＥＧポリマーとして、分岐ＰＥＧを別の実施態様において使用する。ＰＥＧ  ４０kDaとして、２アーム（two-armed）ＰＥＧが特に好ましい。
【００２５】
「ペグ化」という用語は、ポリペプチドのＮ末端及び／又は内部リジン残基でのポリ（エチレングリコール）残基の共有結合を意味する。タンパク質のペグ化は最新技術において広く公知であり、例えば、Veronese, F. M., Biomaterials 22 (2001) 405-417において概説される。ＰＥＧは、異なる官能基及び異なる分子量を有するポリ（エチレングリコール）、直鎖及び分岐ＰＥＧならびに異なる連結基を使用して連結できる（Francis, G. E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18；Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304も参照のこと）。エリスロポエチンのペグ化は、例えば、WO 00/44785において記載されるペグ化試薬を伴う水溶液中で、一実施態様において分子量５kDaと４０kDaの間のＮＨＳ活性化直鎖又は分岐ＰＥＧ分子を使用して実施できる。ペグ化は、また、Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229に従って固相で実施できる。非ランダムにＮ末端がペグ化されたポリペプチドを、WO 94/01451に従って産生することもできる。
【００２６】
そのような方法は、リジン残基の１つ又は複数のεアミノ基で、及び／又はＮ末端アミノ基でペグ化されるエリスロポエチンをもたらす。Ｎ末端アミノ酸での選択的ペグ化は、Felix, A. M., et al., ACS Symp. Ser. 680 (Poly(ethylene glycol) (1997) 218-238に従って実施できる。選択的Ｎ末端ペグ化は、固相合成中に、Ｎαペグ化アミノ酸誘導体のペプチド鎖のＮ−１末端アミノ酸への共役により達成できる。側鎖のペグ化は、固相合成中に、Ｎεペグ化リジン誘導体の成長鎖への共役により実施できる。Ｎ末端及び側鎖のペグ化の組み合わせは、上記の通りに固相合成内で、又は、活性化ＰＥＧ試薬をアミノ脱保護ペプチドに適用することによる溶液相合成により実行可能である。
【００２７】
適したＰＥＧ誘導体は、一実施態様において約５〜約４０kDa、好ましい実施態様において約２０〜約４０kDa、及びより好ましい実施態様において約３０〜約３５kDaの平均分子量を有する活性化ＰＥＧ分子である。ＰＥＧ誘導体は直鎖又は分岐のＰＥＧでありうる。ＰＥＧタンパク質及びＰＥＧペプチド抱合体の調製における使用に適した多種類のＰＥＧ誘導体が、Shearwater Polymers（Huntsville, AL, U.S.A.; www.nektar.com）から入手できる。
【００２８】
活性化ＰＥＧ誘導体は当技術分野において公知であり、例えば、ＰＥＧビニルスルホンについて、Morpurgo, M., et al., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368において記載される。直鎖及び分岐鎖のＰＥＧ種は、ペグ化フラグメントの調製に適する。反応性ＰＥＧ試薬の例は、ヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧ、又はメトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホンである（ｍは一実施態様において約４５０〜約９００までの整数であり、Ｒは１〜６つの炭素原子を有する直鎖又は分岐の低級アルキル基、例えばメチル、エチル、イソプロピルなどであり、メチルが好ましい）：
【化１】
2010533845.tif 000002
【００２９】
これらのヨード活性化物質の使用は当技術分野において公知であり、例えば、Hermanson, G. T.により、Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p. 147-148において記載される。
【００３０】
一実施態様において、ＰＥＧ種は活性化ＰＥＧエステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルプロピオナート、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミジルブタナート、又はＰＥＧ−ＮＨＳなどのＮ−ヒドロキシスクシンイミドである（Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69）。一実施態様において、ＰＥＧは、メトキシ−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＷ３００００；Shearwater Polymers, Inc.）などのアルコキシ−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用してＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
【化２】
2010533845.tif 000003
により活性化され、式中Ｒ及びｍは上で定義する通りである。一実施態様において、ＰＥＧ種はメトキシポリ（エチレングリコール）酪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである。「アルコキシ」という用語はアルキルエーテル基を指し、「アルキル」という用語は、最高４つの炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖アルキル基、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピル、好ましくはメトキシを意味する。
【００３１】
本出願内で使用する「実質的に均質な形態」という用語は、得られる、含まれる、又は使用されるペグ化エリスロポエチンが、付着した規定数のＰＥＧ基を有するものであることを意味する。一実施態様において、ペグ化エリスロポエチンはモノペグ化エリスロポエチンである。調製物は、未反応（即ち、ＰＥＧ基を欠く）エリスロポエチン、ポリペグ化エリスロポエチン、ならびにペグ化反応中に生成されるポリペプチドのフラグメントを含みうる。「実質的に均質な形態」という用語は、モノペグ化エリスロポエチンの調製物が、少なくとも５０％（w/w）のモノペグ化エリスロポエチン、少なくとも７５％のモノペグ化エリスロポエチン、少なくとも９０％のモノペグ化エリスロポエチン、又は９５％を超えるモノペグ化エリスロポエチンを含むことを意味する。パーセント値は、モノペグ化エリスロポエチンが得られる陽イオン交換クロマトグラフィーに対応するクロマトグラムの面積％に基づく。
【００３２】
本発明は、実質的に均質な形態のモノペグ化エリスロポエチンを得るためのモノペグ化エリスロポエチンの精製のための方法を報告する。驚くべきことに、いずれも同じタイプの陽イオン交換材料を用いる２つの連続陽イオン交換クロマトグラフィー工程の組み合わせが、実質的に均質な形態のモノペグ化エリスロポエチンを提供することが見出されている。従って、本発明は、モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチンを含む溶液を提供すること、２つの連続陽イオン交換クロマトグラフィー工程を実施すること、第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において精製モノペグ化エリスロポエチンを回収すること（同じタイプの陽イオン交換材料を両方の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において使用する）、及び本発明の第１の局面に従った方法により陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを再生することの工程を含む、モノペグ化エリスロポエチンの精製のための方法を提供する。
【００３３】
第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において精製モノペグ化エリスロポエチンの回収は、第２の陽イオン交換クロマトグラフィー材料からモノペグ化エリスロポエチンを溶出することによる。本発明の方法の一実施態様において、溶出方法において用いられる２つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程は異なる。第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、一実施態様において、段階溶出方法として実施し、即ち、使用する緩衝液のイオン強度を段階的に、即ち、一度に、１つのイオン強度値から次のイオン強度値に増大させる。段階溶出方法は、一実施態様において、三段階溶出方法として実施する。第１の工程において、主にポリペグ化エリスロポエチンを陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出する。イオン強度における第２の増大によって、基本的に、対応する分子ふるいクロマトグラムの面積（面積％）に基づき６０％を超える純度を伴うモノペグ化エリスロポエチンが溶出される。イオン強度における第３の増大によって、主に残りの非ペグ化エリスロポエチンがカラムから溶出される。
【００３４】
第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、一実施態様において、連続溶出方法として実施し、即ち、緩衝液のイオン強度を連続的に増大させる。対応するクロマトグラムの面積に基づき０．５％未満の低分子量型を一実施態様において含む、実質的に均質な形態のモノペグ化エリスロポエチンを得るために、モノペグ化エリスロポエチンを含む溶出分画を合わせる。緩衝液は、一実施態様において、濃度１０mM〜２５０mMまで、好ましくは５０mM〜１５０mMまで、より好ましくは約１００mMで存在する。
【００３５】
従って、本発明の方法において、２つの連続陽イオン交換クロマトグラフィー工程は以下の工程：
ａ）モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチンの混合物を含む水性緩衝溶液を、第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに、前記モノペグ化エリスロポエチンが前記第１カラム中に含まれる陽イオン交換材料に結合するために適した条件下で適用すること、
ｂ）モノペグ化エリスロポエチンを、貫流緩衝液のイオン強度の段階的増大を伴う段階溶出方法により第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収すること（モノペグ化エリスロポエチンの相対含量が、工程ａ）の適用混合物と比較して増大する）、
ｃ）工程ｂ）からの回収モノペグ化エリスロポエチンを、第２陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに、前記エリスロポエチンが前記第２カラムに含まれる陽イオン交換材料に結合するために適した条件下で適用すること（前記第２カラムに含まれる陽イオン交換材料は第１カラム中の陽イオン交換材料と同じタイプである）、
ｄ）実質的に均質な形態の精製モノペグ化エリスロポエチンを、貫流緩衝液のイオン強度の連続増大を伴う連続溶出方法により、前記第２陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収すること
である。
【００３６】
ポリペプチドのペグ化によって、通常、均質な形態のペグ化産物は提供されない。それは、さらに、モノペグ化、ポリペグ化、及び非ペグ化産物の混合物として得られる。従って、方法の工程ａ）において適用するペグ化エリスロポエチンの溶液は、水性緩衝液中のモノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチン、ならびに低分子量型又はフラグメントの混合物である。異なる物質の相対含量は、分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により決定する。分子ふるいクロマトグラムにおける相関ピークの面積、即ち、ピーク下の面積の総和は、分子ふるいクロマトグラムの総面積である。単一ピークの分画は、面積％として、即ち、クロマトグラムの総面積の相対面積分画として与えられる。
【００３７】
一般的なクロマトグラフィー方法、その使用、及び関連用語は、当業者に公知である。例えば、Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann (ed.), Elsevier Science Publishing Company, Chromatography 5th ed., 51 A (1992)及び他の関連テキストを参照のこと。クロマトグラフィーの間、緩衝液は陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを貫流する。この「貫流緩衝液」は、クロマトグラフィー方法の工程の必要条件に従って調整する。それは、目的物質を、クロマトグラフィー材料に輸送する（適用する）、及びそれから輸送する（溶出する）。
【００３８】
第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において、モノペグ化、ポリペグ化、及び非ペグ化エリスロポエチンの混合物を、約１mg/mlのタンパク質濃度で、約１００mMリン酸カリウムで約ｐＨ３．０に緩衝化した水溶液中の第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する。本出願内で使用する「約」という用語は、所与の値の前後１０％の範囲、即ち、±１０％を意味する。適用前後に第１カラムを同じ緩衝溶液で洗浄する。段階溶出方法における第１段階のために、緩衝液を、約１００mMリン酸カリウム、約９０mM塩化ナトリウムを伴う約ｐＨ３．０の緩衝液に変える。この緩衝液で、加水分解したＰＥＧ試薬、即ち、対応するペグ化炭酸、未反応カップリング試薬、及びポリペグ化エリスロポエチンを、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出する。三段階溶出方法における第２段階のために、緩衝液を、約１００mMリン酸カリウム、約２５０mM塩化ナトリウムを伴う約ｐＨ３．０の緩衝液に変える。この工程において、モノペグ化エリスロポエチンを第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する。この溶出段階の回収した貫流緩衝液を、精製水で約１：５〜１：８に希釈する。第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程後、回収したモノペグ化エリスロポエチンには遊離ＰＥＧがない。
【００３９】
第１の陽イオン交換クロマトグラフィーの第２段階の回収した貫流緩衝液は、相対含量が増大したモノペグ化エリスロポエチンを含んでおり、即ち、モノペグ化エリスロポエチンの重量当たり又は面積％当たり（第２工程の回収した貫流緩衝液の分子ふるいクロマトグラフィーのクロマトグラムにおける）の分画が、第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程の前と比較した場合に増大している。一実施態様において、モノペグ化エリスロポエチンの相対含量は少なくとも６０面積％である。好ましい実施態様において、モノペグ化エリスロポエチンの相対含量は少なくとも８０面積％である。
【００４０】
モノペグ化エリスロポエチンのさらなる精製のために、第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程を実施する。第２の陽イオン交換クロマトグラフィーのために、約１００mMのリン酸カリウム濃度及び約ｐＨ３．０のｐＨに調整した第２の溶出段階の回収及び希釈した貫流緩衝液を、第１の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと同じタイプの、陽イオン交換材料を含む第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する。一実施態様において、第２の陽イオン交換カラム及びそれに含まれる陽イオン交換材料は、第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程のと同じである。モノペグ化エリスロポエチンは、約ｐＨ３．０の約５０mM塩化ナトリウムを伴う濃度約１００mMのリン酸カリウム緩衝液で開始し、そして、約ｐＨ３．０の約５００mM塩化ナトリウムを伴う濃度約１００mMのリン酸カリウム緩衝液で終了する直線勾配を適用することにより第２の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する。塩化ナトリウム濃度における変化は、１０のカラム容積にわたり直線型である。貫流緩衝液を分画し、各分画を１Mリン酸水素二カリウムで希釈して、ｐＨ値を約ｐＨ６〜８に増大させる。
【００４１】
第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程後、モノペグ化エリスロポエチンが、実質的に均質な形態で、好ましくは面積当たり少なくとも９５％の純度で得られる。
【００４２】
当業者はイオン交換クロマトグラフィーの技術に精通している。陽イオン交換材料に結合したポリペプチドの回収工程において、イオン交換カラムを通過する緩衝液／溶液のイオン強度、即ち、伝導度が増大する。これは、緩衝塩濃度の増大によるか、又は他の塩、いわゆる溶出塩の緩衝溶液への添加のいずれかにより達成できる。溶出方法に応じて、緩衝液／塩濃度を、一度に（段階溶出方法）、又は連続的に（連続溶出方法）、濃縮緩衝液又は溶出塩溶液の分画添加により増大させる。一実施態様において、溶出塩は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウム、又はクエン酸もしくはリン酸の他の塩、又はこれらの成分の任意の混合物である。好ましい実施態様において、溶出塩はクエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、又はそれらの混合物である。
【００４３】
本方法の一実施態様において、陽イオン交換材料は、強陽イオン交換材料、好ましい実施態様においてToyopearl（登録商標）SP 650 M、別の好ましい実施態様においてスルホプロピル陽イオン交換材料である。溶出を起こす塩の濃度は、一実施態様において５mM〜５００mM、好ましい実施態様において５mM〜４００mM、特に好ましい実施態様において５mM〜２５０mMの範囲である。本発明の別の実施態様において、溶出を起こす塩は、同時に、緩衝物質、例えば、クエン酸もしくはその塩又はリン酸もしくはその塩として使用される。
【００４４】
モノペグ化エリスロポエチンは、当技術分野において公知の方法により、薬学的に許容可能な担体又は媒体との注入のために適した薬学的組成物中で使用してよい。例えば、適切な組成物は、WO 97/09996、WO 97/40850、WO 98/58660、及びWO 99/07401において記載されている。本発明の産物を製剤化するための好ましい薬学的に許容可能な担体には、ヒト血清アルブミン、ヒト血漿タンパク質などがある。本発明の化合物は、等張化剤、例えば１３２mM塩化ナトリウムを含む、ｐＨ７の１０mMリン酸ナトリウム／カリウム緩衝液中で製剤化してよい。任意に、薬学的組成物は保存剤を含んでよい。薬学的組成物は、異なる量のモノペグ化エリスロポエチン、例えば１０〜１０００μg/ml、例えば５０μg又は４００μgを含んでよい。
【００４５】
本発明のエリスロポエチン糖タンパク質産物の投与は、ヒトにおいて赤血球の形成をもたらす。従って、モノペグ化エリスロポエチン糖タンパク質産物の投与によって赤血球の産生において重要であるこのエリスロポエチンタンパク質が補充される。モノペグ化エリスロポエチン糖タンパク質産物を含む薬学的組成物は、様々な手段により、単独で又は状態もしくは疾患の一部として、低い又は欠損した赤血球産生により特徴付けられる血液疾患を経験するヒト患者に投与するために効果的な強度で製剤化できる。薬学的組成物は、皮下又は静脈内注入などの注入により投与してよい。モノペグ化エリスロポエチン糖タンパク質産物の平均量は変動しうる。抱合体の正確な量は、処置中の状態の正確なタイプ、処置中の患者の状態、ならびに組成物中の他の成分などの要因の対象となる優先度の問題である。例えば、０．０１〜１０μg/kg（体重）、好ましくは０．１〜１μg/kg（体重）を、例えば週１回投与してよい。
【００４６】
驚くべきことに、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムは、分離効率の大幅な低下なく、本発明の方法で再生できることが見出されている。本発明の再生方法で、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを、少なくとも４０の分離サイクル、一実施態様において少なくとも５０の分離サイクル、さらなる実施態様において少なくとも６０の分離サイクルで、分離効率（図１を参照のこと）及び収率（図２を参照のこと）の大幅な低下なく使用できることが示されている。本出願内で使用する「分離サイクル」という用語は、一連のｉ）カラムの平衡化、ｉｉ）カラムで分離すべき溶液の適用、ｉｉｉ）カラムの洗浄、ｉｖ）カラムからの吸着化合物の回収、ｖ）カラムの洗浄、ｖｉ）カラムの再生を意味する。また、本発明の再生方法で、分離効率における低下が避けられるだけでなく、負荷能力における低下を防止できることが見出されている（図２を参照のこと）。
【００４７】
本出願内で使用する「分離効率」という用語は、陽イオンクロマトグラフィーカラムが溶液の化合物を分離する能力を意味する。本出願内で使用する「大幅な低下なく」という用語は、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムが、同じ化合物を含む溶液の連続クロマトグラフィーにおいて、同じ、即ち、＋／−５％の変動内で、一実施態様において＋／−２．５％の変動内で化合物の分離を提供することを意味する。本出願内で使用する「負荷能力」という用語は、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収される目的の化合物の量を意味する。
【００４８】
以下の実施例、配列表、及び図は本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲を添付の特許請求の範囲において示す。本発明の精神から逸脱することなく、示した手順を修正できることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】再生プロセスのサイクル数バリデーション中での第１のクロマトグラフィーの貫流緩衝液プールにおけるモノペグ化エリスロポエチンの純度。
【図２】再生プロセスのサイクル数バリデーション中での第１のクロマトグラフィーの貫流緩衝液プールにおけるモノペグ化エリスロポエチンの収率。
【００５０】
材料及び方法
ＳＥ−ＨＰＬＣ
ＳＥ−ＨＰＬＣによってタンパク質がそれらの見掛け上の分子量に従って分離される。従って、この方法によって、モノペグ化エリスロポエチン（低分子量型及びフラグメント）、ポリペグ化型及びより高い凝集体のエリスロポエチンの存在を検出できる。ＨＰＬＣには２２０nm検出器及びSuperose 6 HRカラム（寸法１０×３００mm、Pharmacia Biotech, Cat-Nr: 17-0537-01）又はSuperose 6 10/300 GLカラム（Pharmacia Biotech, Cat-Nr: 17-5172-01）が備わっている。カラムは、均一溶媒の条件下で、室温で、約０．４ml/分の流速を使用して操作する。移動相緩衝液は、３００mM塩化ナトリウムを伴うｐＨ６．８の５０mMリン酸ナトリウム緩衝液である。使用するＨＰＬＣシステムに応じて、この方法は、１００μl又は５００μlのいずれかのサンプル適用容積で実施できる。サンプルは、移動相緩衝液で、約０．５mg/ml（１００μl負荷）又は約０．１mg/ml（５００μl負荷）のタンパク質濃度まで希釈する。タンパク質濃度が０．１mg/ml未満のサンプルは、未希釈で使用できる。溶出タンパク質は検出器波長２２０nmで検出する。
【００５１】
ＲＰ−ＨＰＬＣ：
純度はＲＰ−ＨＰＬＣにより分析し、モノペグ化エリスロポエチンをオリゴ型及び関連物質から分離する。アッセイは、Poroshellカラムで、アセトニトリル／水性ＴＦＡ勾配を使用して実施する。溶出プロファイルを２２０nmでのＵＶ吸光度としてモニタリングする。モノペグ化エリスロポエチン及び関連物質又はオリゴ型のパーセンテージは、溶出タンパク質の全ピーク面積に基づき算出する。
【００５２】
実施例１
モノペグ化エリスロポエチンの精製
エリスロポエチンは、例えばWO 01/87329に従って産生し、そして、WO 96/135718に報告される通りに精製できる。ペグ化エリスロポエチンは、例えばWO 03/029291に従って産生できる。
【００５３】
ａ）SP Toyopearl 650 Mでの第１のクロマトグラフィー
第１のクロマトグラフィー工程は、SP Toyopearl（登録商標）650Mを充てんしたスルホプロピル（ＳＰ）カラムで実施する。カラムは室温で操作する。第１のカラムの最高負荷能力は、カラム容積（ＣＶ）１リットル当たり１．５gタンパク質と規定する。カラムは、ｐＨ２．９〜３．１の１００mMリン酸カリウム緩衝液（ＳＰ−Ａ緩衝液）で平衡化した。負荷工程後、カラムは、増加量のＮａＣｌを含む一連のリン酸カリウム緩衝液で洗浄及び溶出した。遊離のペグ化炭酸、即ち、加水分解ＰＥＧ試薬、及びポリペグ化型を、ＳＰ−Ａ緩衝液、及び９０mM塩化ナトリウムを含む１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．９〜３．１）（ＳＰ−Ｂ緩衝液）での貫流、及び続く洗浄工程においてそれぞれ除去した。モノペグ化エリスロポエチンを、２５０mM塩化ナトリウムを含む１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．９〜３．１）（ＳＰ−Ｃ緩衝液）を適用することにより溶出し、容器中に回収し、そして精製水で直接１：５に希釈した。この回収した溶出液を「ＳＰ溶出液プールＩ」と呼ぶ。カラムを続いて、７５０mM塩化ナトリウムを含む１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．９〜３．１）（ＳＰ−Ｄ緩衝液）で洗浄し、未反応エリスロポエチンを除去し、そしてカラムを再生した。
【００５４】
ｂ）SP Toyopearl 650 Mでの第２のクロマトグラフィー
第２のカラムは室温で操作した。ＳＰ−Ａ緩衝液での平衡化後、ＳＰ溶出液プールＩをカラムに適用し、カラムをその後にＳＰ−Ａ緩衝液で洗浄した。モノペグ化エリスロポエチンは、５０〜５００mMの塩化ナトリウムの傾きを伴う直線勾配を、ｐＨ２．９〜３．１の１００mMリン酸カリウム緩衝液で緩衝化した１０のカラム容積にわたり適用することにより溶出した。産物ピークを８つまでの単一分画に分画し、各分画を１Ｍリン酸水素二カリウムで直接希釈し、ｐＨを６〜８に増大させた。モノペグ化エリスロポエチンの溶出が完了した後、勾配の傾きを増大させて、５００mM塩化ナトリウムを含む１００mMリン酸カリウム（ｐＨ２．９〜３．１）での迅速なカラム洗浄をもたらすことができる。
【００５５】
ｃ）SP Toyopearl 650 Mカラムの再生
両方のカラムの樹脂を一連の７工程において再生した。カラムを精製水、続いて０．５M水酸化ナトリウム溶液でフラッシングした。アルカリ溶液を精製水で置換し、酸洗浄（０．５Mリン酸二水素ナトリウム、１Mリン酸）が続く。別の精製水工程後、カラムを０．５M水酸化ナトリウムで≧４時間、発熱物資を除去した。苛性再生後、カラムを精製水で再び洗浄した。精製水（ＰＷ  ＩＩＩ）を限外ろ過により産生した。ＰＷ  ＩＩＩの品質は、米国薬局方の注射用水のそれと同等である。テストはＰｈ．  Ｅｕｒ．及びＵＳＰに従って実施する。上に概説する第１のクロマトグラフィー工程に従って実施する対照実行中、残留するタンパク質又はＰＥＧ部分は各貫流緩衝液中で検出できなかった。６０サイクル後の樹脂のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によってゲル上に残留するタンパク質又はＰＥＧ部分は示されなかった。これらのデータに基づき、残留するタンパク質又はＰＥＧ部分のバッチ間の持ち越しは除外でき、このようにカラムの再生は非常に効果的である（図１も参照のこと）。各クロマトグラフィーにおいて得られた収率の決定によって低下は示されなかった（図２も参照のこと）。
【００５６】
【表１】
2010533845.tif 000004
【００５７】
図１及び２において示す通り、全サイクルでの第１のクロマトグラフィー工程について、貫流緩衝液プール中のモノペグ化エリスロポエチンの純度及び収率は、明らかに少なくとも８０％純度及び少なくとも３５％収率の範囲内である。また、カラムの寿命中にモノペグ化エリスロポエチンの純度における傾向は観察できなかった。
【図１】
2010533845.tif 000005
【図２】
2010533845.tif 000006
【配列表】
2010533845000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年5月15日(2009.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の化合物の溶出後に陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを再生するための方法であって、以下の工程：
−  吸着ポリペプチドを、塩化ナトリウムを少なくとも５００mMの濃度で含む水性緩衝溶液でカラムから溶出すること、
−  カラムを精製水でフラッシングすること、
−  ０．５M水酸化ナトリウム溶液をカラムに適用すること、
−  カラムを精製水でフラッシングすること、
−  ０．５Mリン酸二水素ナトリウム及び１Mリン酸を含む溶液をカラムに適用すること、
−  カラムを精製水でフラッシングすること、
−  ０．５M水酸化ナトリウム溶液をカラムに少なくとも４時間適用すること、及び
−  陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを、カラムを精製水でフラッシングすることにより再生すること
を、この順番で含む方法。
【請求項２】
実質的に均質な形態で、１個のポリ（エチレングリコール）残基がエリスロポエチンのＮ末端及び／又は内部リジン残基に共有結合するエリスロポエチンを得るための方法であって、以下の工程：
ａ）ポリ（エチレングリコール）残基をエリスロポエチンのＮ末端及び／又は内部リジン残基に共有結合させるための分子量が２０kDa〜４０kDaの活性化試薬を使用して、ポリ（エチレングリコール）残基をエリスロポエチンのＮ末端及び／又はエリスロポエチンの内部リジン残基に共有結合させること、
ｂ）工程ａ）において得られるポリ（エチレングリコール）残基がエリスロポエチンのＮ末端及び／又は内部リジン残基に共有結合するエリスロポエチンを２つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程（第１及び第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程で同じタイプの陽イオン交換材料を用いる）で精製すること、
ｃ）１個のポリ（エチレングリコール）残基がエリスロポエチンのＮ末端及び／又は内部リジン残基に共有結合するエリスロポエチンを、第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程から実質的に均質な形態で回収すること、
ｄ）以下の順番の以下の工程により陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを再生すること：
ｉ）結合ポリペプチドを、少なくとも５００mMの塩化ナトリウムを含む水性緩衝溶液で陽イオン交換カラムから除去すること、
ｉｉ）カラムを精製水でフラッシングすること、
ｉｉｉ）０．５M水酸化ナトリウム溶液をカラムに適用すること、
ｉｖ）カラムを精製水でフラッシングすること、
ｖ）０．５Mリン酸二水素ナトリウム及び１Mリン酸を含む溶液をカラムに適用すること、
ｖｉ）カラムを精製水でフラッシングすること、
ｖｉｉ）０．５M水酸化ナトリウム溶液をカラムに少なくとも４時間適用すること、及び
ｖｉｉｉ）陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを、カラムを精製水でフラッシングすることにより再生すること
を含む方法。
【請求項３】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムが強陽イオン交換クロマトグラフィーカラムであることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムがスルホプロピル陽イオン交換クロマトグラフィーカラムであることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記緩衝剤が、リン酸もしくはその塩、又は酢酸もしくはその塩、又はクエン酸もしくはその塩、又はヒスチジンもしくはその塩であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記エリスロポエチンが配列番号１又は２のアミノ酸配列を伴うヒトエリスロポエチンであることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記ポリ（エチレングリコール）が分子量２０〜３５kDaを有し、直線型であることを特徴とする、請求項２又は６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記ポリ（エチレングリコール）が分子量４０kDaを有し、分岐していることを特徴とする、請求項２又は６のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記第１の陽イオン交換クロマトグラフィー工程が段階溶出として実施され、前記第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程が直線溶出として実施されることを特徴とする、請求項２及び６〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを少なくとも４０の分離サイクルで使用し得ることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【国際調査報告】
2010533845.tif 000007
2010533845.tif 000008
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