(57)【要約】２Ｓカノーラタンパク質はカチオン交換媒体に結合させるが、他のタンパク質および不純物は洗い流されるようにすることによって２Ｓカノーラタンパク質を捕捉する手順により、実質的に７Ｓおよび１２Ｓカノーラタンパク質を含まない、実質的に純粋な２Ｓカノーラタンパク質が得られる。次いで、カチオン交換媒体を適当な高さの塩濃度の食塩水に暴露することにより、カチオン交換媒体から２Ｓカノーラタンパク質が切り離される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カノーラ油種子ミールからカノーラタンパク質を可溶化してカノーラタンパク質溶液を形成すること、
残留カノーラ油種子ミールからカノーラタンパク質溶液を分離すること、
２Ｓカノーラタンパク質が他のカノーラタンパク質に優先してカチオン交換媒体に結合する条件下で、カノーラタンパク質溶液をカチオン交換媒体と接触させること、
結合２Ｓカノーラタンパク質を非結合カノーラタンパク質および不純物から分離すること、ならびに
カチオン交換媒体から結合２Ｓカノーラタンパク質を分離すること
を含む、実質的に純粋な２Ｓカノーラタンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記カノーラ油種子ミールからのカノーラタンパク質の可溶化が、２Ｓタンパク質のカチオン交換媒体への選択的結合を促進する（ｆａｖｏｕｒｉｎｇ）塩濃度およびｐＨ条件下で食塩水を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記食塩水が、約０．２５〜約０．３５Ｍの塩濃度および約５〜約６のｐＨを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記カノーラタンパク質溶液が、約５〜約６のｐＨを有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
カチオン交換媒体が、樹脂ビーズまたは膜吸着体（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｄｓｏｒｂｅｒ）の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
２Ｓタンパク質とイオン交換媒体の間の結合を切断するのに十分な濃度の食塩水とカチオン交換媒体を接触させることにより、前記結合２Ｓタンパク質がカチオン交換媒体から分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
カチオン交換媒体から結合２Ｓタンパク質を分離するために使用される前記食塩水が、約０．５５〜約０．７０Ｍの塩濃度を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
カノーラ油種子ミールを約０．２５〜約０．３５Ｍの塩化ナトリウム濃度を有する食塩水と接触させて、約５〜約６のｐＨを有するカノーラタンパク質水溶液を形成すること、
前記カノーラタンパク質水溶液をカチオン交換媒体と接触させて、前記カノーラタンパク質水溶液に含有されている２Ｓカノーラタンパク質を、前記カノーラタンパク質水溶液に含有されている７Ｓおよび１２Ｓカノーラタンパク質を含めた他のカノーラタンパク質に優先して、また前記カノーラタンパク質水溶液に含有されている非タンパク質種に優先して、前記カチオン交換媒体に結合させること、
カチオン交換媒体を洗浄して、カチオン交換媒体から非結合カノーラタンパク質および不純物を除去すること、
洗浄カチオン交換媒体を、約０．５５〜約０．７０Ｍの塩化ナトリウム濃度を有する食塩水と接触させて、カチオン交換媒体から結合２Ｓカノーラタンパク質を分離すること、
分離された２Ｓカノーラタンパク質をその食塩水として回収すること、
２Ｓタンパク質の食塩水を脱塩すること、ならびに
２Ｓタンパク質を乾燥させること
を含む、実質的に純粋な２Ｓカノーラタンパク質の製造方法。
【請求項９】
前記カチオン交換媒体が、カチオン交換基が微孔膜（ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）に結合している膜吸着体（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｄｓｏｒｂｅｒ）である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、イオン交換クロマトグラフィーの使用を含むプロセスによる、実質的に純粋な形態のカノーラ２Ｓタンパク質の製造の手順を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
少なくとも１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するカノーラタンパク質分離物は、両方とも本明細書の譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、２００２年５月３日に出願された同時係属の米国特許出願第１０／１３７，３９１号（米国特許出願公開第２００３０１２５５２６  Ａ１号）、２００４年６月９日に出願された同第１０／４７６，２３０号（米国特許出願公開第２００４０２５４３５３  Ａ１号）および対応するＰＣＴ国際公開第０２／０８９５９７号に記載されているように、カノーラ油種子ミール（ｃａｎｏｌａ  ｏｉｌ  ｓｅｅｄ  ｍｅａｌ）から形成することができる。その手順は、食塩水を使用してカノーラ油種子ミールを抽出し、得られたタンパク質水溶液を残留油種子ミールから分離し、選択的膜技術の使用により該水溶液のイオン強度を実質的に一定に維持しながら、タンパク質水溶液中のタンパク質濃度を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増大させ、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水中で希釈してタンパク質ミセルを形成し、タンパク質ミセルを沈殿させて非晶、粘着性、ゼラチン状、グルテン様のタンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を形成し、ケルダール（Ｋｊｅｌｄａｈｌ）窒素（Ｎ×６．２５）により測定した少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有する上澄みからタンパク質ミセル塊を回収することを含む、多段階式プロセスを有する。本明細書で使用する場合、タンパク質含量は、乾燥重量ベースで測定する。回収したＰＭＭは、乾燥することができる。
【０００３】
上述のプロセスの一実施形態では、ＰＭＭ沈殿ステップからの上澄みは、湿ったＰＭＭおよび上澄みから乾燥タンパク質を含むタンパク質分離物を回収するために処理する。この手順は、最初に限外濾過膜を使用して上澄みを濃縮し、濃縮上澄みを湿ったＰＭＭと混合し、混合物を乾燥させることにより実施することができる。得られたカノーラタンパク質分離物は、高純度の少なくとも約９０ｗｔ％のタンパク質（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質（Ｎ×６．２５）を有する。
【０００４】
上述のプロセスの別の実施形態では、ＰＭＭ沈殿ステップからの上澄みは、上澄みからタンパク質を回収するために処理する。この手順は、最初に限外濾過膜を使用して上澄みを濃縮し、濃縮物を乾燥させることにより実施することができる。得られたカノーラタンパク質分離物は、高純度の少なくとも約９０ｗｔ％タンパク質（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％タンパク質（Ｎ×６．２５）を有する。
【０００５】
前述の米国特許出願に記載されている手順は、基本的にバッチ手順である。本明細書の譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、２００２年１１月９日に出願された同時係属の米国特許出願第１０／２９８，６７８号（米国特許出願公開第２００４００３９１７４  Ａ１）および対応する国際公開第０３／０４３４３９号では、カノーラタンパク質分離物を製造するための連続プロセスが記載されている。それらによると、カノーラ油種子ミールを食塩水と連続的に混合し、カノーラ油種子ミールからタンパク質を抽出しながら管を通して混合物を搬送してタンパク質水溶液を形成し、残留カノーラ油種子ミールからタンパク質水溶液を連続的に分離し、選択的膜処理によりタンパク質水溶液を連続的に搬送して、タンパク質水溶液のイオン強度を実質的に一定に維持しながら、タンパク質水溶液のタンパク質含量を少なくとも約２００ｇ／Ｌまで増大させ、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水と連続的に混合してタンパク質ミセルを形成し、所望の量のＰＭＭが沈殿容器中に蓄積するまで上澄みを連続的に溢流させながらタンパク質ミセルを連続的に沈殿させる。ＰＭＭは、沈殿容器から除去し、乾燥することができる。ＰＭＭは、ケルダール窒素により測定すると、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する。
【０００６】
前述の米国特許出願第１０／１３７，３９１号および同第１０／４７１，２３０号に記載されているように、溢流した上澄みは、そこからカノーラタンパク質分離物を回収するために処理することができる。
【０００７】
カノーラ種子は、約１０〜約３０ｗｔ％タンパク質を含有することが知られており、いくつかの異なるタンパク質成分が同定されている。これらのタンパク質は、異なる沈降係数（Ｓ）（ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ）により識別される。これらの知られ、同定されているタンパク質には、クルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）として知られている１２Ｓグロブリン、７Ｓグロブリンおよびナピン（ｎａｐｉｎ）として知られている２Ｓアルブミンが含まれる。
【０００８】
カノーラは、菜種または油菜としても知られている。
【０００９】
本明細書の譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、２００３年８月２５日に出願された同時係属の米国特許出願第１０／４１３，３７１号（米国特許出願公開第２００４００３４２０４号）および２００３年４月１５日に出願された同第１０／５１０，７６６号、ならびに対応するＰＣＴ国際公開第０３／０８８７６号では、ＰＭＭカノーラタンパク質分離物および上澄み由来のカノーラタンパク質分離物の組成が記載されている。上澄み由来のカノーラタンパク質分離物は、より少量の７Ｓタンパク質および極微量の１２Ｓタンパク質と共に、２Ｓタンパク質を主に含む。２Ｓタンパク質は、低分子量アルブミンである。ＰＭＭ生成物は、７Ｓタンパク質を主に含み、２Ｓタンパク質および１２Ｓタンパク質は比較的微量な成分である。７Ｓおよび１２Ｓタンパク質は、高分子量グロブリンであり、７Ｓ分子は、１２Ｓタンパク質の半分子である。
【００１０】
そこに記載されているように、上澄み由来のカノーラタンパク質分離物は、
約６０〜約９５％質量％の２Ｓタンパク質、
約５〜約４０質量％の７Ｓタンパク質、および
０〜約５質量％の１２Ｓタンパク質、好ましくは
約７０〜約９５質量％の２Ｓタンパク質、
約５〜約３０質量％の７Ｓタンパク質、および
０〜約２質量％の１２Ｓタンパク質
というタンパク質プロファイルを示す。
【００１１】
ＰＭＭカノーラタンパク質分離物は、
約６０〜約９８質量％の７Ｓタンパク質、
約１〜約１５質量％の１２Ｓタンパク質、および
０〜約２５質量％の２Ｓタンパク質、好ましくは
約８８〜約９８質量％の７Ｓタンパク質、
約１〜約１０質量％の１２Ｓタンパク質、および
０〜約６質量％の２Ｓタンパク質
というタンパク質プロファイルを示す。
【００１２】
主に２Ｓタンパク質からなる上澄み由来のカノーラタンパク質分離物が、主に７Ｓタンパク質からなるＰＭＭ由来のカノーラタンパク質分離物より、特定の用途向けの優れた機能特性を示すことが見出されている。先行の出願に記載されている手順では、上澄み由来のカノーラタンパク質分離物を発生させるために、ＰＭＭ形成のステップ、および上澄みの提供のステップを順に経て、事実上、カノーラタンパク質を分別する必要があった。
【００１３】
本明細書の譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、２００５年７月２１日に出願された米国特許出願第１１／０３８，０８６号（米国特許出願公開第２００５−０１８１１１２  Ａ１号）（国際公開第２００５／０６７７２９号）では、ＰＭＭ沈殿からの上澄みが、膜処理の前または後に、７Ｓタンパク質を沈殿させて２Ｓタンパク質が豊富なタンパク質溶液を残すための熱処理を受ける手順が記載されている。残存する溶液は、２Ｓタンパク質を乾燥形態で回収するために、噴霧乾燥することができる。
【００１４】
最小の割合の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を有する２Ｓタンパク質は、未処理の２Ｓタンパク質より増大した溶解度（酸性ｐＨ値のものを含む）を示し、水溶液中で改善した透明度を付与することができ、清涼飲料およびスポーツ飲料については、透明なタンパク質強化飲料を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、実質的に７Ｓおよび１２Ｓカノーラタンパク質を含まない、実質的に純粋な２Ｓカノーラタンパク質を調製するための、イオン交換を含む代替手順を利用する。
【００１６】
イオン交換クロマトグラフィーでは、荷電イオン交換媒体は、逆に荷電した分子を結合させるために使用されるが、同様に荷電した物質および非荷電物質は保持しない。このことにより、イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質などの荷電分子を精製するための有用なツールとなる。カノーラタンパク質の２つの主要なクラスは、有意に異なる等電点を有する。７Ｓ／１２Ｓグロブリンは約６〜７の範囲の等電点を有するが、２Ｓアルブミンのその値は約１１である。本明細書では、この差を利用して、イオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質を互いに分離する。
【００１７】
本明細書では、２Ｓタンパク質はカチオン交換媒体に結合させるが、他のタンパク質および不純物は洗い流されるようにすることによって２Ｓタンパク質を捕捉するイオン交換プロセスを提供する。次いで、カチオン交換媒体を適当な高さの塩濃度の食塩水（ｓａｌｉｎｅ）に暴露することにより、カチオン交換媒体から２Ｓタンパク質が遊離する。
【００１８】
本発明の一態様によると、カノーラ油種子ミールからカノーラタンパク質を可溶化してカノーラタンパク質溶液を形成すること、残留カノーラ油種子ミールからカノーラタンパク質溶液を分離すること、２Ｓカノーラタンパク質が他のカノーラタンパク質に優先してカチオン交換媒体に結合する条件下で、カノーラタンパク質溶液をカチオン交換媒体と接触させること、結合２Ｓカノーラタンパク質を非結合カノーラタンパク質および不純物から分離すること、ならびにカチオン交換媒体から結合２Ｓカノーラタンパク質を分離することを含む、実質的に純粋な２Ｓカノーラタンパク質の製造方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の全般的説明
上述したように、カノーラタンパク質溶液に対してイオン交換クロマトグラフィーを実施して、２Ｓカノーラタンパク質をイオン交換媒体に優先的に結合させ、続いてイオン交換媒体から２Ｓカノーラタンパク質を実質的に純粋な形態で回収する。
【００２０】
その手順は、任意の好都合な方法で実施することができる。本発明の好ましい一態様では、両方のクラスのタンパク質が正に荷電している約５〜６のｐＨで、カノーラタンパク質の水溶液をカチオン交換媒体と接触させる。塩濃度は、それほど正に荷電していない７Ｓ／１２Ｓカノーラタンパク質ならびにシナピン（ｓｉｎａｐｉｎｅ）などの不純物の結合を制限するために利用する。
【００２１】
カノーラタンパク質水溶液は、カノーラ油種子ミールからの抽出により最も好都合に形成することができる。抽出は、２Ｓタンパク質のカチオン交換媒体への優先的結合を確実にするために効果的な所望の食塩濃度およびｐＨ値を有する食塩水を使用して実施する。食塩水は、一般に、約０．２５〜０．３５ＭのＮａＣｌの範囲の塩濃度を有し、カノーラタンパク質水溶液のｐＨは、約５〜約６の範囲である。
【００２２】
カノーラ油種子ミールの抽出は、所望のｐＨ範囲外で実施することができ、次いで、カノーラタンパク質溶液のｐＨは、必要に応じて、任意の好都合な酸または塩基を用いて、約５〜約６のｐＨ範囲に調整することができる。
【００２３】
代替として、タンパク質は、より低い塩濃度の食塩水を使用することによりカノーラ油種子ミールから抽出することができ、次いで、所望の濃度まで追加の塩を添加する。しかし、抽出溶液は、形成直後に２Ｓカノーラタンパク質の分離のためにカチオン交換媒体に直接適用するための形態であるため、イオン交換に必要な濃度の食塩を用いて抽出を実施することが好ましい。したがって、酸化反応の発生またはフェノール類のタンパク質への結合のための時間がほとんどない。
【００２４】
カノーラタンパク質抽出溶液は、樹脂ビーズまたは膜吸着体（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｄｓｏｒｂｅｒ）の形態などの、任意の好都合な形態で提供できるカチオン交換媒体に適用する。膜吸着体では、イオン交換基は、微孔膜（ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に結合している。樹脂充填カラム（ｒｅｓｉｎ−ｐａｃｋｅｄ  ｃｏｌｕｍｎ）の代わりとしての膜の使用は、より高い流量の使用を可能にし、より早い処理につながる。
【００２５】
適切なｐＨおよび塩濃度下でカノーラタンパク質抽出溶液をカチオン交換媒体と接触させることにより、２Ｓタンパク質がそれほど正に荷電していない７Ｓ／１２Ｓタンパク質に優先して吸着する。カノーラタンパク質抽出溶液からカチオン交換媒体を分離した後、２Ｓタンパク質は、約０．５５〜約０．７０ＭのＮａＣｌなどの、カノーラタンパク質食塩水の塩濃度より高い塩濃度を有する食塩水と接触させることにより、カチオン交換媒体から切り離すことができる。
【００２６】
２Ｓタンパク質の溶出溶液は、高塩濃度を有し、タンパク質を乾燥させる前に、ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）などの、任意の好都合な方法により脱塩する。この手順では、実質的に７Ｓ／１２Ｓタンパク質を含まず、乾燥重量ベース（ｄ．ｂ．）で少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する、高純度２Ｓカノーラタンパク質分離物を生成する。
【００２７】
カノーラ７Ｓ／１２Ｓタンパク質は、タンパク質を２Ｓタンパク質から分離するために等電沈殿または熱沈殿を利用する場合の形態とは対照的に、イオン交換媒体との接触後、カノーラタンパク質抽出物から未変性形態で回収することができる。
【実施例】
【００２８】
例
例１
この例は、カチオン交換カラムを使用した、実質的に純粋な２Ｓカノーラタンパク質の調製を例示する。
【００２９】
（ａ）タンパク質抽出：
一般にミール２２．５ｇ当たり食塩水１５０ｍｌを使用して、カノーラ油種子ミールの一連の１５％ｗ／ｖ抽出を実施した。磁気撹拌子を使用して、試料を室温で３０分撹拌した。各例で、１０，２００ｇで１０分の遠心分離により、使用済みミール（ｓｐｅｎｔ  ｍｅａｌ）から抽出物を分離し、次いで、２５μｍ孔径の濾紙および０．４５μｍ孔径のシリンジフィルターを用いた連続濾過により、さらに清澄化した。清澄化抽出物のタンパク質含量は、ＬＥＣＯ分析（ＬＥＣＯ  ＦＰ５２８窒素測定器（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ））、およびサイズ排除（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）（ＳＥＣ）ＨＰＬＣにより求めたタンパク質プロファイルにより測定した。様々な試験で、食塩水中の塩濃度は、０．２６から０．３５ＭのＮａＣｌまで変化した。
【００３０】
抽出塩濃度を操作したため、このことが、初期の清澄化抽出物のタンパク質含量およびプロファイルに多少影響を及ぼした（以下の表１）。タンパク質収率および２Ｓタンパク質の抽出の観点から、より高い塩濃度が望ましかったが、以下に示すように、分離に対して悪影響を及ぼした。
【００３１】
【表１】
2010535207.tif 000002
【００３２】
（ｂ）クロマトグラフィー：
ピーク分取（ｐｅａｋ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）が可能なＧｒａｄｉＦｒａｃ  ＬＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して操作した、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ（２０ｍｌ）カラムを使用して、試料をカチオンイオン交換（ＣＩＥＸ）クロマトグラフィーに付した。各試験で、該システムにおいて、試料ループにより、１０ｍｌの清澄化抽出物をカラムに適用した。採用した食塩濃度下で、７Ｓおよび１２Ｓカノーラタンパク質ならびに他の不純物がカラムを通過する一方で、２Ｓタンパク質がカラムに結合した。多孔性物質（ｖｏｉｄ  ｍａｔｅｒｉａｌ）を捕捉し、次いで、結合２Ｓタンパク質が遊離するために、抽出物より高い塩濃度の食塩水をカラムに適用した。タンパク質を最も良好に分離し、結合物質の遊離を確実にするために、試験が進むにつれて、採用した塩濃度を調整した。使用したＧｒａｄｉＦｒａｃのサンプルプログラムは以下の表２に示す。
【００３３】
【表２】
2010535207.tif 000003
【００３４】
毎日、すべての試験からの溶出画分を合わせて、次の日に脱塩するために冷却した試験２０〜２６の生成物を除いては、−６０℃で凍結した。以下の表３は、様々な生成試験で抽出および溶出のために使用した塩濃度を説明する。
【００３５】
【表３】
2010535207.tif 000004
【００３６】
生成試験が進むにつれて、抽出／タンパク質分離および２Ｓタンパク質の溶出のために使用した食塩の濃度を微調整した。最初の試験では、使用した塩濃度は、０．３０Ｍ／０．５５Ｍであった。重複二重線ピーク（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｄｏｕｂｌｅｔ  ｐｅａｋｓ）として多孔性物質を分取し、最初のピークは、７Ｓ／１２Ｓのほぼすべて、少量の非結合２Ｓタンパク質、および抽出物中に見られるシナピンの一部以外の不純物の大部分を含有することが分かった。カラムから出現するのに僅かに長くかかった二重線の第２のピークは、顕著な量のシナピン、ならびに非常に少量のタンパク質および他の不純物を含有することが分かった。カラムを１ＭのＮａＣｌを用いて洗浄したときに顕著な２Ｓタンパク質ピークを得たが、０．５５ＭのＮａＣｌを用いた溶出では、２Ｓタンパク質のすべてをカラムから溶出できなかった。
【００３７】
２回目の試験に関しては、より良好に２Ｓタンパク質を遊離するために、溶出塩濃度を０．６０Ｍまで上昇させた。今回は、カラムを洗浄したときに、より小さい２Ｓタンパク質ピークが見られた。３回目の試験では、溶出ステップを０．６５ＭのＮａＣｌまで増大させ、このレベルが、カラムを洗浄したときに見られるピークを効果的に除去することが分かった。２つの空隙ピーク（ｖｏｉｄ  ｐｅａｋ）の距離を縮めることを期待して、３回目の試験における初期の塩濃度を０．３５ＭのＮａＣｌまで増大させた。二重線ピークの間の分離を減少させたが、依然として二重線が得られた。また、より高いこの塩濃度での操作は、カラムに結合せず、空隙中に見られる２Ｓタンパク質の量を増大させた。
【００３８】
その後、初期の塩濃度を０．２９Ｍ、次いで、０．２６Ｍまで低下させ、空隙の中に残される２Ｓタンパク質のレベルを連続的に低下させた（以下の表４）。この初期の塩濃度を低下させることが、２Ｓ溶出ステップを複雑にするため非常に望ましくない７Ｓ／１２Ｓタンパク質またはシナピンのカラムへの多少の結合につながることが懸念されていた。しかし、０．２６ＭのＮａＣｌで、２Ｓタンパク質は、カラムへ結合することが観察された唯一の種であった。
【００３９】
【表４】
2010535207.tif 000005
【００４０】
（ｃ）溶出２Ｓタンパク質の脱塩：
解凍するために、溶出２Ｓタンパク質の凍結試料を終夜冷蔵庫に入れた。翌日、依然として凍結している容器を温浴に入れ、その中で、ちょうど氷晶が溶解するまで試料を温めた。次いで、解凍した試料すべてを、２５μｍ孔径の濾紙で濾過し、合わせて１つの大きな試料とした。Ｖｉｖａｆｌｏｗ  ５０００  ＭＷＣＯ  Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ限外濾過膜装置による濃縮およびダイアフィルトレーションにより、得られた２Ｓタンパク質溶液を脱塩した。分取した２Ｓタンパク質画分の合計体積は、約１５００ｍｌであった。合わせた２Ｓタンパク質溶液を２５〜３０ｍｌに至るまで濃縮し、次いで、ダイアフィルトレーションのために３００ｍｌの水を添加した。試料を２５〜３０ｍｌまで再濃縮し、さらに３００ｍｌの水を添加し、次いで、試料を再度再濃縮した。以下の表５に含まれる結果から分かるように、約１０ダイアフィルトレーション体積（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅｓ）の２つのステップを用いて脱塩を効果的に実施した。
【００４１】
【表５】
2010535207.tif 000006
【００４２】
次いで、保持物を凍結乾燥させた。
【００４３】
（ｄ）最終生成物：
Ｍｉｎｏｌｔａ  ＣＲ−３１０彩度計（Ｃｈｒｏｍａ  ｍｅｔｅｒ）を使用して最終生成物の乾き色を評価し、また、濡れ色分析のために溶液を調製した。ボルテックスミキサーを使用して、タンパク質粉末（０．５ｇ）を水（１０ｍｌ）と合わせた。次いで、試料を７８００ｇで１０分遠心分離し（主に空気を除去するために）、ＬＥＣＯにより上澄みのタンパク質含量を測定した。一定分量（８ｍｌ）の上澄みを小さいビーカーに移し、タンパク質含量を５％に調整するために十分な水を添加した。次いで、試料を撮影し、一定分量の試料をタンパク質プロファイル分析（ＳＥＣ  ＨＰＬＣ）のために使用した。また、一部の試料を３．５％タンパク質まで希釈し、別の写真を撮影した。ＬＥＣＯにより乾燥粉末のタンパク質含量を試験したが、含水量分析を実施するために十分な量の試料は存在しなかった。したがって、タンパク質含量は、湿量基準でのみ表現した。
【００４４】
合計で１．６３ｇの最終生成物をこの研究で分取した。該粉末の湿量基準でのタンパク質含量は、１０５．８２％ｗ／ｗ（Ｎ×６．２５）であった。次いで、標準的な方法のように乾量基準で表現すると、タンパク質含量はより高いであろう。再水和生成物のクロマトグラフィー分析は、２８０ｎｍで検出したピーク面積の９６．１％が２Ｓに起因し、ピーク面積の３．８％がプロナピン（ｐｒｏｎａｐｉｎ）に起因していることを示した。したがって、ピーク面積の９９．９％が、目的のタンパク質に起因していた。７Ｓまたは１２Ｓタンパク質は検出しなかった。
【００４５】
乾燥生成物の色譜（ｃｏｌｏｕｒ  ｓｃｏｒｅ）は表６に示す。
【００４６】
【表６】
2010535207.tif 000007
【００４７】
水中で再水和した生成物の濡れ色は、緑がかった色合いを示し、その溶液の透明度は優良であった。７Ｓ／１２Ｓタンパク質がまったく存在しないと、その溶液の透明度は大抵の条件で相当安定なままであるはずであると考えられる。
【００４８】
生成物の収率は、相当に良好だと思われる。分離条件を何回も変更し、樹脂への不完全な結合、さらには不完全な溶出が原因で、２Ｓタンパク質の減少が特に初期の試験で生じることが知られているため、典型的収率を計算することは困難であった。最後の試験までに、すべての２Ｓタンパク質が溶出したが、依然としてカラムに結合しない少量の２Ｓタンパク質があった。上述したように、他の種をカラムに結合させない場合、初期の塩含量を低下させることが、この問題を解決させることができる。次いで、１．６３ｇの２Ｓタンパク質が２６０ｍｌ（２６×１０ｍｌ注入）の清澄化抽出物から生成したことを考慮するならば、このことを１０００Ｌの清澄化抽出物からの６．３ｋｇの２Ｓに当てはめることができる。
【００４９】
例２
この例は、実質的に純粋な２Ｓカノーラタンパク質を生成するためのカチオン交換膜の使用を例示する。
【００５０】
（ａ）タンパク質抽出：
カノーラ油種子ミールと食塩水を合わせるステップ、および磁気撹拌子を使用して試料を室温で３０分撹拌するステップにより、３００ｍｌの０．３ＭのＮａＣｌを使用して、３０ｇのカノーラ油種子ミールの１０％ｗ／ｖ抽出を実施した。次いで、１０，２００ｇでの１０分の遠心分離により、使用済みミールから抽出物を分離し、２５μｍ孔径の濾紙および１μｍと０．４５μｍ孔径の円形濾紙（ｆｉｌｔｅｒ  ｄｉｓｋ）を用いた連続濾過によりさらに清澄化した。抽出物のタンパク質プロファイルはＳＥＣ  ＨＰＬＣにより求めた。
【００５１】
例１で、抽出溶液のための塩濃度の最良の選択として、０．２６ＭのＮａＣｌを同定した。この塩濃度は、膜吸着体を用いた予備試験で最初に採用した（データ非表示）が、少量の７Ｓ／１２Ｓタンパク質および一部のシナピンが、膜により結合されることが分かった。抽出溶液の塩含量を０．３ＭのＮａＣｌまで増大させることにより、７Ｓ／１２Ｓタンパク質結合が制限された。０．３ＭのＮａＣｌ抽出物のタンパク質プロファイルは、７Ｓ／１２Ｓに起因するタンパク質ピーク面積の６４．６％、２Ｓに起因するタンパク質ピーク面積の３５．４％であった。
【００５２】
（ｂ）イオン交換：
連続して接続した２つのＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ７５（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）強酸性カチオン吸着膜装置（ｓｔｒｏｎｇ  ａｃｉｄｉｃ  ｃａｔｉｏｎ  ａｄｓｏｒｂｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｕｎｉｔ）を使用して、イオン交換分離を実施した。該膜装置を介して様々な溶液を押し出すために蠕動ポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  ｐｕｍｐ）を使用した。分離のサンプルプロトコルを表７に示す。
【００５３】
【表７】
2010535207.tif 000008
【００５４】
２日間連続して約３２回の試験を完了した。毎日、すべての試験からの溶出２Ｓタンパク質画分を合わせて、脱塩まで冷却した。空隙／すすぎおよび溶出画分のタンパク質プロファイルをＳＥＣ  ＨＰＬＣにより導出した。
【００５５】
おそらくシステムの過負荷が原因で、少ない割合の２Ｓ（タンパク質ピーク面積の７．７％）が、空隙画分の中に残されたことが分かった。溶出画分は、ほぼ完全に２Ｓであった（タンパク質ピーク面積の９９．６％）。生成試験の初日に、溶出緩衝液として０．６５ＭのＮａＣｌを使用し、その日の最後に、１ＭのＮａＣｌ（４０ｍｌ）を用いて膜吸着体を洗浄した。１ＭのＮａＣｌ溶出物の分析（ＳＥＣ  ＨＰＬＣ）は、０．６５ＭのＮａＣｌにより溶出しなかった少量の２Ｓを示した。分離試験の２日目に関しては、溶出緩衝液として０．６７ＭのＮａＣｌを使用した。１ＭのＮａＣｌを用いた膜洗浄により、２Ｓタンパク質はまったく遊離されず、結合２Ｓタンパク質のすべてを回収するために０．６７ＭのＮａＣｌが十分であることを示した。
【００５６】
（ｃ）分離２Ｓタンパク質の脱塩：
Ｖｉｖａｆｌｏｗ  ５０００  ＭＷＣＯ  Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ限外濾過膜装置による濃縮およびダイアフィルトレーションにより、溶出２Ｓタンパク質を脱塩した。分取したすべての２Ｓタンパク質画分の体積は、約１０００ｍｌであった。これを２５〜３０ｍｌに至るまで濃縮し、次いで、ダイアフィルトレーションのために３００ｍｌの水を添加した。試料を２５〜３０ｍｌまで再濃縮し、さらに４００ｍｌの水を添加し、試料を再度再濃縮した。２回目のダイアフィルトレーションステップ後、保持物を凍結乾燥させた。
【００５７】
導電率計を使用して、様々な試料の導電率を測定した。ダイアフィルトレーションの目的は、試料の導電率を１ｍＳ未満に低下させることであった。ＳＥＣ  ＨＰＬＣにより透過物（ｐｅｒｍｅａｔｅｓ）をタンパク質プロファイルについて確認した。
【００５８】
２つのダイアフィルトレーションステップは、効果的に２Ｓタンパク質試料の導電率を低下させた（表８）。限外濾過またはダイアフィルトレーション透過物中で、タンパク質は検出しなかった。
【００５９】
【表８】
2010535207.tif 000009
【００６０】
（ｄ）最終生成物：
Ｍｉｎｏｌｔａ  ＣＲ−３１０彩度計を使用して最終生成物の乾き色を評価し、また、濡れ色分析のために溶液を調製した。ボルテックスミキサーを使用して、タンパク質粉末（０．６ｇ）を水（１０ｍｌ）と合わせた。次いで、試料を７８００ｇで１０分遠心分離し、ＬＥＣＯにより上澄みのタンパク質含量を測定した。一定分量（８ｍｌ）の上澄みを小さいビーカーに移し、タンパク質含量を５％に調整するために十分な水を添加した。次いで、試料を撮影し、一定分量の試料をタンパク質プロファイル分析（ＳＥＣ  ＨＰＬＣ）のために使用した。また、一部の試料を３．５％まで希釈し、別の写真を撮影した。ＬＥＣＯにより乾燥粉末のタンパク質含量を試験したが、含水量分析を実施するために十分な量の試料は存在しなかった。したがって、タンパク質含量は、湿量基準でのみ表現した。
【００６１】
合計で１．５４ｇの最終生成物をこの研究で分取した。該生成物の純度は非常に良好であり、湿量基準での該粉末のタンパク質含量は、１０１．９９％ｗ／ｗ（Ｎ×６．２５）であった。前述したように、含水量分析を実施するために十分な試料が生成されず、したがって、タンパク質含量は、乾式基準で表現することができない。再水和生成物のクロマトグラフィー分析は、２８０ｎｍで検出したピーク面積の９９．８５％が２Ｓタンパク質に起因することを示した。７Ｓまたは１２Ｓタンパク質は検出しなかった。
【００６２】
膜吸着体２Ｓに関して測定した乾き色値は表９に示す。
【００６３】
【表９】
2010535207.tif 000010
【００６４】
水中で再水和した生成物の濡れ色および透明度は、カラムクロマトグラフィーにより生成した２Ｓタンパク質によく似ていた。７Ｓ／１２Ｓタンパク質がまったく存在しないと、その溶液の透明度は大抵の条件で相当安定なままであるはずであると考えられる。
【００６５】
開示の概要
本開示のまとめとして、本発明は、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、高純度２Ｓカノーラタンパク質を回収する方法を提供する。本発明の範囲内で、変更は可能である。
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月1日(2010.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．２５〜０．３５Ｍの塩濃度および５〜６のｐＨを有する食塩水を使用して、カノーラ油種子ミールからカノーラタンパク質を可溶化してカノーラタンパク質溶液を形成すること、
残留カノーラ油種子ミールからカノーラタンパク質溶液を分離すること、
５〜６のｐＨでカノーラタンパク質溶液をカチオン交換媒体と接触させることにより、２Ｓカノーラタンパク質を他のカノーラタンパク質に優先してカチオン交換媒体に結合させること、
結合２Ｓカノーラタンパク質を非結合カノーラタンパク質および不純物から分離すること、ならびに
カチオン交換媒体から結合２Ｓカノーラタンパク質を分離すること
を含むことを特徴とする、実質的に純粋な２Ｓカノーラタンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記カチオン交換媒体が、樹脂ビーズまたは膜吸着体（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｄｓｏｒｂｅｒ）の形態であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カチオン交換媒体が、カチオン交換基が微孔膜（ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）に結合している膜吸着体（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｄｓｏｒｂｅｒ）であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記結合２Ｓカノーラタンパク質とカチオン交換媒体の間の結合を切断するのに十分な濃度の食塩水をカチオン交換媒体と接触させることにより、前記結合２Ｓカノーラタンパク質がカチオン交換媒体から分離されることを特徴とする、請求項１〜３の何れか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記カチオン交換媒体から結合２Ｓカノーラタンパク質を分離するために使用される前記食塩水が、０．５５〜０．７０Ｍの塩濃度を有することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
分離した２Ｓカノーラタンパク質が、２Ｓカノーラタンパク質の食塩水溶液として捕集されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
２Ｓカノーラタンパク質の食塩水溶液が脱塩され、２Ｓカノーラタンパク質が乾燥されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記カチオン交換媒体を洗浄することにより、非結合カノーラタンパク質及び不純物が結合２Ｓカノーラタンパク質と分離されることを特徴とする、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2010535207.tif 000011
2010535207.tif 000012