(57)【要約】本発明は、ピペル・クベバ（Piper cubeba L.）の果実の乾燥抽出物の製造方法であって、−エッセンシャルオイルの除去用の第１ステップにて、ピペル・クベバ（Piper cubeba L.）の果実を、−−水蒸気蒸留にさらし、留出物を除去する、または−−親油性相で少なくとも１回抽出し、この親油性抽出物もしくはこれらの親油性抽出物を除去する、−第２ステップにて、処理をした該果実を、少なくとも１つのアルコールまたは少なくとも１つのアルコールと水の混合液のいずれかで少なくとも１回抽出する、および−第３ステップにて、抽出された果実部分を除去し、得られた該抽出物を助剤の添加後に０.１〜１０ｍ／ｍ  ％の間のアルコール濃度まで最初に濃縮してスピッサム（spissum）抽出物とし、次いで乾燥させて得られること、を特徴とする製造方法に向けられている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤における活性成分としてのピペル・クベバ（Piper cubeba L.）の果実の乾燥抽出物の製造方法であり、
−エッセンシャルオイルの除去用の第１ステップにて、ピペル・クベバ（Piper cubeba L.）の果実を、
−−水蒸気蒸留にさらし、留出物を除去する、または
−−親油性相で少なくとも１回抽出し、この親油性抽出物もしくはこれらの親油性抽出物を除去する、
−第２ステップにて、処理をした該果実を、少なくとも１つのアルコールまたは少なくとも１つのアルコールと水の混合液のいずれかで少なくとも１回抽出する、および
−第３ステップにて、抽出された果実部分を除去し、得られた該抽出物を助剤の添加後に０.１〜１０ｍ／ｍ  ％の間のアルコール濃度まで最初に濃縮してスピッサム（spissum）抽出物とし、次いで乾燥させて得られること、
を特徴とする製造方法。
【請求項２】
ピペル・クベバ（Piper cubeba L.）の未成熟果実を用い、抽出の直前に粉砕し、粉砕形態にて、特に０.１ｍｍ〜０.９ｍｍの粉砕粒径（grinding fineness）を有する粉砕形態にて抽出することを特徴とする、請求項１の製造方法。
【請求項３】
第１ステップにて、親油性相として超臨界ＣＯ２または４〜９個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分枝鎖状炭化水素、特にヘキサンもしくはイソペンタンを用いることを特徴とする、請求項１〜２のいずれか１項の製造方法。
【請求項４】
第１ステップにて抽出される重量部あたりの果実が、親油性相の１〜２０重量部、特に６〜１２重量部にて用いられることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項の製造方法。
【請求項５】
第１ステップにて、親油性相での抽出が温度０℃〜５０℃、特に５℃〜１５℃で、２〜４時間の間に実現されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項の製造方法。
【請求項６】
第２ステップにて、アルコールが１〜５個の炭素原子を有するアルコール、特にエタノールであり、少なくとも１つのアルコールと水の混合液が５０〜９０ｍ／ｍ  ％のアルコールと５０〜１０ｍ／ｍ  ％の水、好ましくは８０〜９０ｍ／ｍ  ％のアルコールと２０〜１０ｍ／ｍ  ％の水からなり、エタノールが好まれることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項の製造方法。
【請求項７】
第２ステップにて抽出される重量部あたりの果実が、少なくとも１つのアルコールまたは少なくとも１つのアルコールと水の混合液の１〜２０重量部、特に６〜１２重量部にて用いられることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項の製造方法。
【請求項８】
第２ステップにて、少なくとも１つのアルコールまたは少なくとも１つのアルコールと水の混合液での抽出が温度２０℃〜６０℃で、２〜４時間の間に実現されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項の製造方法。
【請求項９】
第３ステップにて、助剤が乾燥助剤、例えばマンニトールであり、５ｍ／ｍ  ％のアルコール濃度まで濃縮され、乾燥がスプレー乾燥、ベルト乾燥またはブレード乾燥であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項の製造方法。
【請求項１０】
第３ステップにて得られる抽出物が、α−クベベン（cubebene）およびβ−クベベン（cubebene）が存在しない、またはほとんど存在しないことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項の製造方法。
【請求項１１】
ピペル・クベバ（Piper cubeba L.）由来の抽出物または抽出物化合物の使用であり、これらの抽出物またはこれらの抽出物化合物が、癌疾患、特に前立腺癌、精巣癌、乳癌、子宮癌、およびこれらの転移からなる群から選択される少なくとも１つの疾患の治療用の薬剤における活性成分として抗アンドロゲンおよび／または抗エストロゲン活性を有する使用。
【請求項１２】
癌疾患、特に前立腺癌、精巣癌、乳癌、子宮癌、およびこれらの転移ならびに良性前立腺過形成からなる群から選択される少なくとも１つの疾患の治療用の薬剤における活性成分としての、請求項１〜１０のいずれか１項の製造方法で得られた抽出物の使用。
【請求項１３】
抽出物が、前立腺癌、およびその転移、ならびに良性前立腺過形成の治療用の薬剤における活性成分として、ＤＨＴと略される性ホルモンであるジヒドロテストステロンの活性、特に前立腺癌細胞に対するその細胞増殖促進および抗アポトーシス活性と拮抗する、請求項１〜１０のいずれか１項の製造方法で得られた抽出物の使用。
【請求項１４】
癌疾患、特に前立腺癌、精巣癌、乳癌、子宮癌、およびこれらの転移ならびに良性前立腺過形成からなる群から選択される少なくとも１つの疾患の治療用の薬剤であり、活性成分としてピペル・クベバ（Piper cubeba L.）由来の抽出物または抽出物化合物を含み、この抽出物またはこれらの抽出物化合物が抗アンドロゲンおよび／または抗エストロゲン活性を有することを特徴とする薬剤。
【請求項１５】
活性成分が請求項１〜１０のいずれか１項の製造方法で得られた抽出物に含まれることを特徴とする、請求項１４の薬剤。
【請求項１６】
抽出物が、ＤＨＴと略される性ホルモンであるジヒドロテストステロンの活性、特に前立腺癌細胞に対するその細胞増殖促進および抗アポトーシス効果と拮抗する、前立腺癌、およびその転移、または良性前立腺過形成の治療用の薬剤の製造用の、請求項１〜１０のいずれか１項の製造方法で得られた抽出物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療用の薬剤における活性成分としてのピペル・クベバ（Piper cubeba L.）由来の抽出物または抽出物化合物の使用に向けられている。
【背景技術】
【０００２】
ピペル・クベバ（Piper cubeba L.）の成分の使用は、例えば「Hunnius, Pharmazeutisches Worterbuch, 8th edition, 1998, pages 1084 to 1085」に記載されている。
【０００３】
該文献には、頭痛の治療用などの一般的な適用のみならず、利尿薬、尿消毒薬および健胃薬としての使用も記載されている。
【０００４】
薬物として用いられる未成熟果実は水蒸気蒸留によって得られるが、未成熟果実からクベベン（cubeben）のエッセンシャルオイルであるクベベンオイル（cubeben-oil）も得られる。
【０００５】
オレウム・クベバ（Oleum Cubebae）は、果実として同一の効能に適用される。
【０００６】
「J. Seidemann in "World Spice Plants", Springer-Verlag, 2005, page 291」によると、ピペル・クベバ（Piper cubeba L.）は、リキュール、ジンジャーブレッド、およびハニーブレッドの芳香化用に用いられる。用いられる生成物はエッセンシャルオイルであるが、それは未成熟果実から得られる。
【０００７】
ＪＰ２０００−０９５６４９Ａには、抽出物、特に親水性溶媒、例えばアセトン、メタノールおよびエタノール、またはそれらと水との混合液によって得られるクベベン（cubeben）果実からの抽出物も記載されている。従って、該抽出物は、エッセンシャルオイルと親水性物質の両方を含む。
【０００８】
これらの抽出物は、テストステロン−５α−レダクターゼ阻害剤として作用するであろう。それによって、これらの抽出物は、毛髪の増殖にポジティブに影響するであろう。
【０００９】
これらの抽出物は、良性前立腺過形成の治療用にも役立つであろう。
【００１０】
該文献の表１にてＩＣ５０値が示されているが、これはテストステロン−５α−レダクターゼの阻害を示している。
【００１１】
該表によると、クベベン（cubeben）の抽出物は、濃度０.７９ｍｇ／ｍｌで酵素を５０％阻害する。
【００１２】
「A. Chatterjee et.al., Jour. Indian Chem. Soc., Vol. 45, No. 8, 1968, pages 723 to 725」には、純物質クベビン（Cubebin）のスペクトル特性が記載されている。この化学化合物は、ピペル・クベバ（Piper cubeba L.）の脱脂した果実のアルコール抽出物から単離された。
【００１３】
「A. Dasgupta et.al., Quart. J. Crude Drug Res., 18, (1980), No. 1, pages 17 to 25」には、例えば膀胱炎、および淋病の治療用のピペル・クベバ（Piper cubeba L.）のエッセンシャルオイルの使用が記載されている。
【００１４】
「Eun-Mi Choi et. al., Journal of Ethnopharmacology, Elsevier Scientific Publishers Ltd., 89, 2003, pages 171 to 175」には、ピペル・クベバ（Piper cubeba L.）の乾燥果実から８０％メタノールで製造された抽出物の抗炎症特性が記載されている。
【００１５】
スクリーニングプロセスの間、いくつかの熱帯性薬用植物を、腫瘍細胞に対するそれらのインビトロでの活性について検査した。
【００１６】
非常に驚いたことに、クベベン（cubeben）の未成熟果実からのエタノール抽出物が、検査した全ての腫瘍細胞を死滅させることが分かった。
【００１７】
医薬において用いられるのは主にクベベン（cubeben）果実のエッセンシャルオイルであるため、エッセンシャルオイルを得るために果実を適切な抽出剤で抽出することは当然のことであった。
【００１８】
これは、ヘキサンでの排気抽出によって実現された。
【００１９】
このようにエッセンシャルオイルを除去した果実について、中間極性（medium polar）の抽出物化合物を得るために９０％エタノール水溶液でさらに抽出し、抽出を完全なものとした。
【００２０】
次いで、得られたエッセンシャルオイルおよびエタノール第２抽出物の両方について、腫瘍細胞に対するそれらの活性を検査した。
【００２１】
予想された通り、得られたエッセンシャルオイルが検査した全ての腫瘍細胞を死滅させることが分かった。これは、観察された細胞毒性効果は非特異的性質のものであり、それゆえ抗腫瘍効果を示さないという事実を示す。
【００２２】
しかしながら、非常に驚いたことに、エタノール第２抽出物は実際、検査したいずれの腫瘍細胞も直接的には死滅させなかったが、一部の腫瘍細胞においてそれらの細胞増殖作用を変化させることが分かった。
【００２３】
該腫瘍細胞は、それらの増殖に増殖因子として性ホルモンを必要とする場合に、エタノール第２抽出物に対して特に感受性があることが分かった。例として、乳癌細胞株ＭＣＦ７および前立腺癌細胞株ＬｎＣＡＰがある。この観察は、テストステロン−５α−レダクターゼは乳癌細胞株ＭＣＦ７の増殖に無関係であるため、細胞増殖阻害活性が該物質の阻害に主として依存し得ないという結論を可能にする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
ピペル・クベバ（Piper cubeba L.）の果実からの抽出物の製造方法を提供することは、本発明の目的である。
【００２５】
この抽出物は、細胞毒性エッセンシャルオイルが存在しない、またはほとんど存在しないであろう。
【００２６】
この抽出物は、増殖について増殖因子として性ホルモンを必要とする腫瘍細胞の増殖を特に阻害するであろう。
【００２７】
この抽出物は、抗アンドロゲンおよび／または抗エストロゲン活性を示すであろう。
【００２８】
この抽出物は、ＤＨＴと略される性ホルモンであるジヒドロテストステロンの活性、特に前立腺癌細胞に対するその細胞増殖促進および抗アポトーシス効果と拮抗するであろう。
【００２９】
これらの目的は、本発明で達成される。
【００３０】
本発明は、独立請求項にて定義される特徴によって特徴付けられる。
【００３１】
好ましい実施態様は、従属請求項にて定義される。
【００３２】
下記において、本発明の可能な実施態様が記載されている。
【００３３】
それに関して、図面も参照する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１ａ】図１ａは、ＬＮＣａｐおよびＰＣ−３細胞に対する実施例１に従って製造した抽出物の抗増殖効果を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、ＬＮＣａｐおよびＰＣ−３細胞に対する純物質クベビン（Cubebin）の抗増殖効果を示す。
【図２】図２は、実施例１に従って製造した抽出物によるＬＮＣａｐ細胞のＤＮＡ合成の阻害を示す。
【図３】図３は、ＬＮＣａｐ細胞のアンドロゲン依存性細胞増殖に対する、実施例１に従って製造した抽出物の抗アンドロゲン効果を示す。
【図４】図４は、ＬＮＣａｐ細胞のＤＮＡ合成に対する、実施例１に従って製造した抽出物の抗アンドロゲン効果を示す。
【図５】図５は、ＭＣＦ−７細胞のＤＮＡ合成に対する、実施例１に従って製造した抽出物の抗エストロゲン効果を示す。
【図６ａ】図６ａは、５α−レダクターゼＩＩ型の活性に対する、実施例１に従って製造した抽出物および純物質クベビン（Cubebin）の阻害効果を示す。
【図６ｂ】図６ｂは、５α−レダクターゼＩＩ型の活性に対する、既知の５α−レダクターゼ阻害剤「フィナステリド」の阻害効果を示す。
【図７ａ】図７ａは、ＴＮＦ−αが用量に依存して腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するが、腫瘍細胞においてこの効果がＤＨＴで完全に消滅することを示す。
【図７ｂ】図７ｂは、ＤＨＴの抗アポトーシス効果が実施例１に従って製造した抽出物によって消滅することを示す。
【図８】図８は、実施例１に従って製造した抽出物および純物質クベビン（Cubebin）の両方が、各用量に依存して前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の分泌を阻害することを示す。
【図９】図９は、実施例１に従って製造した抽出物が、ＤＨＴ誘導性の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の分泌を強く阻害することを示す。
【図１０】図１０は、ＬＮＣａｐ細胞内のアンドロゲン受容体濃度が、実施例１に従って製造した抽出物での処理および純物質クベビン（Cubebin）での処理の両方によって、用量に依存して次第に減少することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
下記の実施例は、本発明を例証する。
【実施例】
【００３６】
実施例１（液体抽出物の製造）
粉砕粒径（grinding fineness）０.１ｍｍ〜０.９ｍｍを有する１１０ｇのピペル・クベバ（Piper cubeba L.）の未成熟乾燥果実を、０.５リットルのヘキサンによって、８時間、温度１０℃〜２０℃で撹拌しながら抽出した。次いで、エッセンシャルオイルで満たされたヘキサン層と高度に親油性の成分を分離した。この手順をもう１度行ったが、抽出時間は２時間に制限した。
【００３７】
次いで、脱脂した該果実を重量が一定になるまで温度４０℃で真空キャビネット内にて乾燥させた。９２ｇの脱脂した薬物原料が得られた。
【００３８】
次いで、処理をした該果実を、９０重量部のエタノールと１０重量部の水との混合液によって、２時間、温度２０℃〜３０℃で撹拌しながら抽出した。
【００３９】
薬物と抽出混合液の重量比は、１:５であった。
【００４０】
抽出した該薬物を層濾過によって分離した。１.９２ｍ／ｍ  ％の乾燥物質含有量を有する３８０ｇの暗褐色の液体抽出物が得られたが、これは９２ｇの脱脂した果実から収量７.３ｇの絶対量の抽出物化合物が得られたことに相当する。
【００４１】
この抽出物を、以下Ｐ９６０５と表示する。
【００４２】
この抽出物は２０ｍ／ｍ  ％のクベビン（Cubebin）を含むが、これは乾燥物質含有量を示している。
【００４３】
実施例２（乾燥抽出物の製造）
実施例１に従って得られた液体抽出物を、用量ごとに温度４０℃のエバポレーターへ入れ、減圧下（３００ｍｂａｒから２０ｍｂａｒへ）、温度を上昇させて（４０℃から５５℃へ）蒸発を開始した。
【００４４】
蒸留の間、流体抽出物の全量を加え、得られたスピッサム（spissum）抽出物における乾燥物質含有量が３０〜４０ｍ／ｍ  ％に達するまで、流体抽出物の残りの部分を用量ごとに連続的にエバポレーターへ入れた。
【００４５】
暗褐色で、自由流動性があり、均一組成のスピッサム（spissum）抽出物が２０.０ｇ得られた。スピッサム（spissum）抽出物は、乾燥物質含有量３６.５ｍ／ｍ  ％を示したが、これは抽出物化合物の含有量７.３ｇに相当する。
【００４６】
この濃縮スピッサム（spissum）抽出物を７.８ｇの４０ｍ／ｍ  ％アラビアゴム水溶液と均一に混合し、次いで乾燥機内にて圧力を１５０ｍｂａｒから１０ｍｂａｒへ減圧し、温度を４０℃から５５℃に上昇させて乾燥させた。
【００４７】
助剤として含有量３０ｍ／ｍ  ％のアラビアゴムを有する１０.４ｇの黄褐色（ochre brown）の乾燥抽出物が得られた。
【００４８】
実施例３（乾燥抽出油懸濁液の製造）
実施例１に従って得られた液体抽出物を用量ごとに温度４０℃のエバポレーターへ入れ、減圧下（３００ｍｂａｒから２０ｍｂａｒへ）、温度を上昇させて（４０℃から５５℃へ）蒸発を開始した。
【００４９】
蒸留の間、流体抽出物の全量を加え、得られたスピッサム（spissum）抽出物における乾燥物質含有量が１０〜２０ｍ／ｍ  ％に達するまで、流体抽出物の残りの部分を用量ごとに連続的にエバポレーターに入れた。
【００５０】
暗褐色で、自由流動性があり、均一組成のスピッサム（spissum）抽出物が５４.０ｇ得られた。スピッサム（spissum）抽出物は乾燥物質含有量１５.７ｍ／ｍ  ％を示したが、これは抽出物化合物の含有量７.３ｇに相当する。
【００５１】
この低粘度のスピッサム（spissum）抽出物を６.８ｇの中鎖トリグリセリド（Ph. Eur.）および０.５ｇの大豆レシチン（OAB 90）と混合し、用量ごとに温度４０℃のエバポレーターへ入れた。得られたスピッサム（spissum）抽出物における乾燥物質含有量が７０〜８０ｍ／ｍ  ％に達するまで、減圧下（３００ｍｂａｒから４０ｍｂａｒへ）で、温度を上昇させ（４０℃から５０℃へ）、この混合液の蒸発を非常に長時間行った。
【００５２】
粘性のあるスピッサム（spissum）抽出物が得られ、次いで乾燥物質含有量が９９.５ｍ／ｍ  ％に達するまで、乾燥機内にて圧力を１５０ｍｂａｒから１０ｍｂａｒへ減圧し、温度を４０℃から５５℃に上昇させて乾燥させた。
【００５３】
助剤として含有量４９ｍ／ｍ  ％の中鎖トリグリセリドおよび３.３６ｍ／ｍ  ％の大豆レシチンを有する１４.９ｇの暗褐色の乾燥抽出油懸濁液が得られた。
【００５４】
実施例４（細胞増殖阻害）
実施例１に従って製造した液体抽出物Ｐ９６０５について、細胞増殖検査を行った。コントロールとして、クベベン（cubeben）果実の内容物として典型的な物質、リグナンクベビン（lignan Cubebin）の検査も行った。
【００５５】
細胞増殖阻害の測定のために、この抽出物をＬＮＣａｐおよびＰＣ−３細胞に加えた。処理した該細胞を１０％ＦＢＳ培養液中で４日間培養した。
【００５６】
比較のために、本発明および実施例１に従って製造した抽出物において２０ｍ／ｍ  ％の乾燥物質量にて含まれる純粋なリグナンクベビン（lignan Cubebin）も、ＬＮＣａｐおよびＰＣ−３細胞に加えた。処理した該細胞を、１０％ＦＢＳ培養液中で４日間培養した。
【００５７】
それに関しては、「T. Lindl, Zell- und Gewebekultur, 4th revised edition, 2000, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg」に従って進めた。
【００５８】
溶媒コントロール（抽出物およびクベビン（Cubebin）なしの検査）に関しては、得られた全データをパーセントで示している；４通りの実験について、それぞれ３回繰り返した平均値と標準偏差を示している。
【００５９】
図１ａおよび１ｂに示したデータから、本発明に従って製造した抽出物および純物質クベビン（Cubebin）の両方が、ＬＮＣａｐおよびＰＣ−３細胞に対して各用量に依存して抗増殖効果を示すことが明らかである。
【００６０】
阻害は、ＰＣ−３細胞よりもＬＮＣａｐ細胞についての阻害の方がより明らかであった。
【００６１】
図１ａおよび１ｂから、実施例１に従って製造した抽出物Ｐ９６０５の阻害活性が、そのクベビン（Cubebin）の含有量によって説明しうるよりもはるかに強いことが明らかである。抽出物はわずか２０ｍ／ｍ  ％のクベビン（Cubebin）しか含まないが、同一の（ＬＮＣａｐ）またはより強い（ＰＣ−３）阻害活性を示す。
【００６２】
実施例５（ＤＮＡ合成の阻害）
実施例１に従って製造した液体抽出物Ｐ９６０５について、ＤＮＡ合成検査を行った。
【００６３】
ＤＮＡ合成の阻害の測定のために、本発明に従って製造した抽出物をＬＮＣａｐ細胞に加えた。処理した該細胞を、１０％ＦＢＳ培養液中で４日間培養した。
【００６４】
次いで、取り込まれた３Ｈ−チミジンの量を測定した。
【００６５】
それに関しては、「T. Lindl, Zell- und Gewebekultur, 4th revised edition, 2000, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg」に従って進めた。
【００６６】
溶媒コントロール（抽出物なしの検査）に関しては、得られた全データをパーセントで示している；４通りの実験について、それぞれ３回繰り返した平均値と標準偏差を示している。
【００６７】
図２に示したデータから、本発明に従って製造した抽出物が、各用量に依存してＤＮＡ合成を阻害することは明らかである。
【００６８】
実施例６（細胞増殖に対する抗アンドロゲン効果）
アンドロゲン依存性細胞増殖に対する、実施例１に従って製造した液体抽出物Ｐ９６０５の抗アンドロゲン効果を測定した。
【００６９】
それに関して、本発明に従って製造した抽出物をＬＮＣａｐ細胞に加えた。処理した該細胞を、１０％ＣＳＳ培養液中で６日間培養した。
【００７０】
この培養は、１度はＤＨＴと略されるジヒドロテストステロンの付加をせずに行い、１度は１ｎＭ  ＤＨＴの付加をして行った。
【００７１】
次いで、ＤＮＡ含有量に基づいて、腫瘍細胞の細胞増殖に対する本発明に従って製造した抽出物の影響を測定した。
【００７２】
溶媒コントロール（抽出物なしの検査）に関しては、得られた全データをパーセントで示している；４通りの実験について、それぞれ３回繰り返した平均値と標準偏差を示している。
【００７３】
図３に示したデータから、本発明に従って製造した抽出物が、腫瘍細胞の細胞増殖に対するＤＨＴの刺激効果を用量に依存して過度に刺激し、さらに該細胞の基礎的な細胞増殖を低下させることは明らかである。
【００７４】
ＤＨＴが細胞増殖を増強することが知られている；ゼロでのコントロール値を参照のこと。
【００７５】
実施例７（ＤＮＡ合成に対する抗アンドロゲン効果）
ＤＮＡ合成に対する、実施例１に従って製造した液体抽出物Ｐ９６０５の抗アンドロゲン効果を測定した。
【００７６】
それに関して、本発明に従って製造した抽出物をＬＮＣａｐ細胞に加えた。処理した該細胞を、１０％ＣＳＳ培養液中で６日間培養した。
【００７７】
この培養は、１度はＤＨＴと略されるジヒドロテストステロンの付加をせずに行い、１度は１ｎＭ  ＤＨＴの付加をして行った。
【００７８】
次いで、取り込まれた３Ｈ−チミジンの量を測定した。
【００７９】
それに関しては、「T. Lindl, Zell- und Gewebekultur, 4th revised edition, 2000, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg」に従って進めた。
【００８０】
溶媒コントロール（抽出物なしの検査）に関しては、得られた全データをパーセントで示している；４通りの実験について、それぞれ３回繰り返した平均値と標準偏差を示している。
【００８１】
図４に示したデータから、本発明に従って製造した抽出物が、腫瘍細胞のＤＮＡ合成に対するＤＨＴの刺激効果を用量に依存して過度に刺激し、さらに該細胞の基礎的なＤＮＡ合成を低下させることは明らかである。
【００８２】
ＤＨＴがＤＮＡ合成を増強することが知られている；ゼロでのコントロール値を参照のこと。
【００８３】
実施例８（乳癌細胞のＤＮＡ合成に対する抗エストロゲン効果）
乳癌細胞のＤＮＡ合成に対する、実施例１に従って製造した液体抽出物Ｐ９６０５の抗エストロゲン効果を測定した。
【００８４】
それに関しては、ＭＣＦ−７細胞を１０％ＣＳＳ培養液中で３日間培養し、そこへ異なる濃度のエストラジオールを加えた。
【００８５】
この培養は、１度は本発明に従って製造した抽出物の付加をせずに行い、１度は１０μｇ／ｍｌの抽出物の付加をして行った。
【００８６】
次いで、取り込まれた３Ｈ−チミジンの量を測定した。
【００８７】
それに関しては、「T. Lindl, Zell- und Gewebekultur, 4th revised edition, 2000, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg」に従って進めた。
【００８８】
得られた全結果は、ＤＰＭ（放射性壊変毎分）で示している；４通りの実験について、それぞれ３回繰り返した平均値と標準偏差を示している。
【００８９】
図５に示したデータから、本発明に従って製造した抽出物が、エストラジオールによる乳癌細胞のＤＮＡ合成の刺激を完全にまたはほとんど完全に停止することは明らかである。
【００９０】
エストラジオールは、乳癌細胞のＤＮＡ合成を増強することが知られている；ゼロでのコントロール値を参照のこと。
【００９１】
実施例９（５α−レダクターゼＩＩ型活性の阻害）
実施例１に従って製造した液体抽出物Ｐ９６０５を用いて、５α−レダクターゼＩＩ型活性の阻害を測定した。
【００９２】
アッセイは、５α−レダクターゼＩＩ型を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞のホモジネートで行った（Reichert W., Hartmann R.W. and Jose J.; 2001, Journal Enzyme Inhibition, Vol. 16, 47-53）。
【００９３】
３Ｈ−テストステロンの３Ｈ−ＤＨＴへの変化の測定によって、５α−レダクターゼＩＩ型の活性に対する、本発明に従って製造した抽出物および純物質クベビン（Cubebin）の影響を測定した。
【００９４】
コントロール物質として、既知の５α−レダクターゼ阻害剤「フィナステリド」を用いた。
【００９５】
溶媒コントロール（抽出物なしの検査）に関しては、得られた全データをパーセントで示している；４通りの実験について、それぞれ３回繰り返した平均値と標準偏差を示している。
【００９６】
図６ａに示したデータから、本発明に従って製造した抽出物および純物質クベビン（Cubebin）の両方が、５α−レダクターゼＩＩ型の活性に対して阻害効果を示すことは明らかである。
【００９７】
阻害は、純物質クベビン（Cubebin）よりも抽出物での阻害の方がより強い。
【００９８】
抽出物はＩＣ５０値３.６μｇ／ｍｌで阻害するが、一方で純物質クベビン（Cubebin）はＩＣ５０値９.９μｇ／ｍｌで阻害する。
【００９９】
抽出物および純物質クベビン（Cubebin）の用量活性グラフの経過は、既知の５α−レダクターゼ阻害剤「フィナステリド」の用量活性グラフの経過と類似している（図６ｂ）。
【０１００】
実施例１０（アポトーシスの増加）
実施例１に従って製造した液体抽出物Ｐ９６０５による、アポトーシスの誘導を測定した。
【０１０１】
予備検査として、アポトーシスの誘導の測定用に、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを単独で、さらにはＤＨＴと略される１００ｎＭジヒドロテストステロンと組み合わせて、ＬＮＣａｐ細胞に加えた。処理した該細胞を、１０％ＦＢＳ培養液中で２日間培養した。
【０１０２】
モノおよびオリゴヌクレオソームとして存在しているＤＮＡおよびヒストンフラグメントを特異的に検出する市販のアポトーシスイムノアッセイキットを適用することによって、該細胞のアポトーシスを測定した。
【０１０３】
図７ａに示したデータから、ＴＮＦ−αが用量に依存して腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することは明らかである。
【０１０４】
腫瘍細胞において、この効果はＤＨＴによって完全にまたはほとんど完全に消滅する。
【０１０５】
類似の実験をＤＨＴ単独で、さらには本発明に従って製造した１０μｇ／ｍｌの抽出物と組み合わせて行った。
【０１０６】
図７ｂに示したデータから、ＤＨＴの抗アポトーシス活性が、本発明に従って製造した抽出物によって消滅することは明らかである。
【０１０７】
実施例１１（前立腺特異抗原の分泌の阻害）
実施例１に従って製造した液体抽出物Ｐ９６０５による、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の阻害を測定した。
【０１０８】
それに関しては、１つの実験において、ＬＮＣａｐ細胞を１０％ＣＳＳ培養液中で２日間培養し、そこへ異なる濃度の本発明に従って製造した抽出物、または純物質クベビン（Cubebin）のいずれかを加えた。
【０１０９】
次いで、イムノアッセイによって、細胞上清中の分泌されたＰＳＡ量を測定した。さらに、ＤＮＡの量を測定した。
【０１１０】
図８は、ＤＮＡの量に対するＰＳＡの量のパーセントの比率を示している。
【０１１１】
４通りの実験について、それぞれ３回繰り返した平均値と標準偏差を示している。
【０１１２】
図８に示したデータから、抽出物および純物質クベビン（Cubebin）の両方が、各用量に依存して前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の分泌を阻害することは明らかである。
【０１１３】
第２の実験では、ＬＮＣａｐ細胞を１０％ＣＳＳ培養液中で２日間培養し、そこへ異なる濃度のＤＨＴと略されるジヒドロテストステロンを加えた。
【０１１４】
この培養は、１度は本発明に従って製造した抽出物の付加をせずに行い、１度は１０μｇ／ｍｌの抽出物の付加をして行った。
【０１１５】
次いで、イムノアッセイによって細胞上清中の分泌されたＰＳＡ量を測定した。さらに、ＤＮＡの量を測定した。
【０１１６】
図９は、ＤＮＡの量に対するＰＳＡの量のパーセントの比率を示している。
【０１１７】
４通りの実験について、それぞれ３回繰り返した平均値と標準偏差を示している。
【０１１８】
図９に示したデータから、ＤＨＴによって誘導される前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の分泌が、本発明に従って製造した抽出物によって強く阻害されることは明らかである。
【０１１９】
実施例１２（アンドロゲン受容体の産生）
実施例１に従って製造した液体抽出物Ｐ９６０５によるアンドロゲン受容体の産生の影響を測定した。
【０１２０】
それに関しては、１つの実験において、ＬＮＣａｐ細胞を１０％ＦＢＳ培養液中で２日間培養し、そこへ異なる濃度の本発明に従って製造した抽出物、または純物質クベビン（Cubebin）のいずれかを加えた。
【０１２１】
次いで、ウェスタンブロット分析によってアンドロゲン受容体の量の変化を測定した。
【０１２２】
図１０は、アンドロゲン受容体のバンドを示している。
【０１２３】
ＬＮＣａｐ細胞中のアンドロゲン受容体の濃度は、本発明に従って製造した抽出物での処理、および純物質クベビン（Cubebin）での処理の両方によって、用量に依存して次第に減少する。
【０１２４】
結論
実施例１〜３は、新規の特性を示し、かつ本発明の目的に適合する、エッセンシャルオイルが存在しない、またはほとんど存在しないクベベン（cubeben）果実の抽出物が製造されうる製法ステップの組み合わせを示している。
【０１２５】
実施例４〜１２は、本発明に従って製造した抽出物の抗腫瘍活性を実証し、ホルモン依存性腫瘍細胞に対する活性の基礎を形成する活性機構を例証する。これらの実施例は、本発明に従って製造した抽出物の高い治療上の可能性、特にその進行が女性または男性ホルモンによって影響を受ける悪性の疾患の治療用の可能性を示す。
【０１２６】
ヒト５α−レダクターゼに対する本発明に従って製造した抽出物の有効性（ＩＣ５０：３.６μｇ／ｍｌ）と、ＪＰ２０００−０９５６４９Ａに記載されている活性（ＩＣ５０：７９０μｇ／ｍｌ）との比較を考慮すると、本発明に従って製造した抽出物が約２００倍高い活性を有し、それゆえ前立腺過形成の治療用の全く新しい可能性をも開くことは明らかである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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