(57)【要約】  本発明は、ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者の選択の方法を提供し、それにより、ＲＥＴ薬剤への応答の増大した可能性を予測する。本発明は、ＲＥＴの配列を決定する方法を提供する。本方法は、ＲＥＴの配列を決定するために最適化されたＡＲＭＳプライマーを提供する。本発明は、ＡＲＭＳプライマーを含んでなる診断キットも提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者が、前記治療に応答するであろう可能性を予測するための方法であって、患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列が
配列番号１において定義した１０５位でチミンではなく；又は
配列番号２において定義した９１８位でメチオニンではない；
かどうかを決定することを含んでなり、それによりＲＥＴ薬剤への応答の増大した可能性を予測する、前記方法。
【請求項２】
１０５位がシトシンである；又は
９１８位がスレオニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１０５位がシトシンである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＲＥＴ薬剤の薬理遺伝学を評価するための、請求項１〜３に記載の方法の使用。
【請求項５】
ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者を治療する方法であって：
（ｉ）患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列が、配列番号１において定義した１０５位でチミンではないかどうかを決定すること；又は
（ｉｉ）患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列が、配列番号２において定義した９１８位でメチオニンではないかどうかを決定すること；
及び、ＲＥＴ薬剤の有効量を投与すること；
を含んでなる、前記方法。
【請求項６】
１０５位がシトシンであり；又は
９１８位がスレオニンであり、
及びＲＥＴ薬剤の有効量を投与する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１０５位がシトシンである、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列を決定する方法が、増幅不応性突然変異システム、制限断片長多型又はＷＡＶＥ分析のいずれか一つから選択される、請求項３又は７に記載の方法。
【請求項９】
患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列を決定する方法が増幅不応性突然変異システムである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＲＥＴの配列を、配列番号１において定義した１０５位で認識することが可能なＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマーを使用することを含んでなる、請求項３、７、８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１において定義した１０５位を含んでなるＲＥＴ配列の領域を増幅するために最適化されたＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマー及びＡＲＭＳリバースプライマーを使用することを含んでなる、請求項３、７、８、９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
該ＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマーが配列番号９を含んでなる、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
該ＲＥＴ薬剤がＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤である、前記のいずれか一つの請求項に記載の方法。
【請求項１４】
該ＲＥＴ薬剤がバンデタニブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該ＲＥＴ薬剤がセジラニブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号１において定義した１０５位でＲＥＴの配列を認識することが可能なＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマー。
【請求項１７】
配列番号９を含んでなる、請求項１６に記載のＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマー。
【請求項１８】
請求項１６又は１７のＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマーを含んでなる診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者の選択の方法に関し、それによりＲＥＴ薬剤への応答の可能性増大を予測する。本発明は、ＲＥＴの配列を決定する方法を提供する。該方法は、ＲＥＴの配列を決定するために最適化されたＡＲＭＳプライマーを提供する。本発明は、ＡＲＭＳプライマーを含んでなる診断キットも提供する。
【背景技術】
【０００２】
チロシン残基上でのタンパク質のリン酸化は、細胞内シグナル伝達の鍵となる要素である。こうした反応を触媒することができる酵素はチロシンキナーゼと称される。チロシンキナーゼ活性を有する多くの膜貫通レセプター含有ドメインは、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）として分類されている。ＲＴＫは、細胞増殖、分化、生存及びプログラムされた細胞死のような種々のプロセスのための細胞外シグナルを伝達する。細胞外リガンドの結合に応答し、ＲＴＫは典型的には二量体化し、自己リン酸化及びＲＴＫのリン酸化形態を認識しそして相互作用するエフェクターを介した細胞内シグナル伝達を導く。ＲＴＫのこのファミリーにはいくつかのメンバーがあり、その一つは１２０ｋＤａタンパク質ＲＥＴ（トランスフェクション間に再編成された）をコードするＲＥＴプロト癌遺伝子である。ＲＥＴは、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーの増殖因子のためのレセプターである。ＲＥＴについての二つのリガンドが同定されている；ＧＤＮＦ及びニューチュリン（ＮＴＮ）。ＲＥＴはそのリガンドがコレセプターに結合した時に活性化され、そして複合体が次ぎにＲＥＴと相互作用する（Eng, 1999 Journal Clinical Oncology. 17(1) 380-393）。
【０００３】
活性化は、ＲＥＴがチロシン残基上でリン酸化されることを起こし、ＲＡＳ−ＲＡＦ及びＰＩ３キナーゼ経路及びおそらく追加の経路を介して、細胞増殖及び分化のためのシグナルの伝達を導く。
【０００４】
ＲＥＴを活性化する点突然変異は三つの関連する、優性遺伝性癌症候群を起こすことが知られている；多発性内分泌新生物２Ａ型及び２Ｂ型（ＭＥＮ２Ａ及びＭＥＮ２Ｂ）及び家族性甲状腺髄様癌腫（ＦＭＴＣ）（Santoro et al. 2004 Endocrinology: 145,5448-5451）。
【０００５】
ほとんど全てのＭＥＮ２Ａの場合及びいくつかのＦＴＭＣの場合において、細胞外、膜近傍システインリッチドメイン中のシステインの置換があり、一方、ＭＥＮ２Ｂの場合の９５％は、キナーゼドメイン中のコドン９１８での単一点突然変異（Ｍ９１８Ｔ）の結果である。コドン９１８は、触媒コアの基質認識ポケット中に位置していると考えられている。この部位での突然変異は、ＲＥＴ触媒ドメインの活性化ループの構造を変化させると考えられており、それにより構成的にＲＥＴを活性化する。Ｍ９１８Ｔ突然変異は、散発性髄様癌腫においても見いだされており、それは進行性疾病表現型と相関している。インビトロ研究は、ＲＥＴが、ｃ−ｓｒｃ及びｃ−ａｂｌのような非レセプターチロシンキナーゼにより好まれる基質を認識し及びリン酸化するように、該突然変異が基質特異性に影響することを示した（Eng et al. 1996 JAMA: 276, 1575-1579; Ponder et al. 1999 Cancer Research: 59, 1736-1741; Schilling et al. 2001 International Journal of Cancer: 95, 62-66; Santoro et al. 1995 Science: 267, 381-383; Zhou et al. 1995 Nature: 273, 536-539) 。
【０００６】
ＲＥＴ遺伝子中の突然変異は、ＭＥＮ２ファミリーの大多数で同定されているので、分子診断試験が可能であり、臨床診断を確認するために有用であり得る。ＲＥＴ突然変異についての試験は、ポリメラーゼ連鎖反応に基づいたプロトコルを使用して実施し得る；標的エキソン配列が、直接シークエンシング又は制限エンドヌクレアーゼ消化のために増幅される（Zhong et al. 2006 Clinica Chimica Acta: 364, 205-208）。
【０００７】
ＲＴＫファミリーの別のメンバーは、血管内皮増殖因子レセプター２（ＶＥＧＦＲ２（キナーゼ挿入ドメイン含有レセプター、ＫＤＲ（Ｆｌｋ−１とも称される）））である。ＶＥＧＦＲ２は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のためのレセプターである。ＶＥＧＦは、正常及び疾患関連血管新生（angiogenesis）の両方（Jakeman, et al. 1993 Endocrinology: 133,848-859; Kolch, et al. 1995 Breast Cancer Research and Treatment: 36,139-155）及び血管透過性（Connolly, et al. 1989 J. Biol. Chem: 264,20017-20024）の重要な刺激因子であると信じられている。抗体でのＶＥＧＦの隔離によるＶＥＧＦ作用の拮抗作用は腫瘍増殖の抑制を生じることが可能である（Kim, et al. 1993 Nature: 362,841-844）。ＶＥＧＦ遺伝子のヘテロ接合性破壊は、血管形成（vascularization）において致死的欠乏を生じた（Carmeliet, et al. 1996 Nature 380:435-439; Ferrara, et al. 1996 Nature 380:439-442）。
【０００８】
ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合は、レセプター二量体化を導き、特異的細胞内チロシン残基のＶＥＧＦＲ２自己リン酸化を引き起こす。自己リン酸化はチロシンキナーゼの触媒活性を増加させ、そしてホスホリパーゼＣ−γのような細胞質シグナル伝達分子のための潜在的ドッキング部位を提供する。これらのタンパク質相互作用はＶＥＧＦＲ２に対する細胞応答、例えば、内皮細胞増殖、生存及び遊走を誘導するのに必要な細胞内シグナリングを仲介する（Ryan et al. 2005 British Journal Cancer: 92(Suppl.1) S6-S13）。
【０００９】
病的血管新生におけるＶＥＧＦ仲介ＶＥＧＦＲ２シグナリングの鍵となる役割の認識は、ＶＥＧＦＲ２活性化を抑制するための種々の選択的アプローチの開発を導いた。これらには、ＡＴＰ結合を防止することにおいて自己リン酸化、そして続いてのシグナル伝達を妨げる、小分子ＡＴＰ競合的チロシンキナーゼ阻害剤が含まれる（Ryan, 2005）。
【００１０】
ＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼの阻害剤であるキナゾリン誘導体が国際特許出願公開番号WO98/13354及びWO01/32651に記載されている。WO98/13354及びWO01/32651において、ＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼに対する活性を有すると同時に、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼに対するいくらかの活性も有する化合物が記載されている。
【００１１】
化合物、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリンはＶＥＧＦＲ２チロシンキナーゼ阻害剤であることが開示されている（Wedge et al. 2002 Cancer Research: 62, 4645-4655）。この化合物はZactima（商標）（登録商標）、一般名バンデタニブとして、及びコード番号ＺＤ６４７４としても知られている。この化合物は以後バンデタニブと同一に扱われる。
【００１２】
バンデタニブは、ＶＥＧＦＲ２チロシンキナーゼへのＡＴＰ結合の強力な及び可逆的阻害剤として開発された。加えて、バンデタニブはＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性も阻害する。ＥＧＦＲシグナリング経路も癌進行の鍵であり、ＶＥＧＦの過剰発現と同様に、異常なＥＧＦＲ活性は腫瘍細胞増殖、生存及び侵襲性を増加させる。ＥＧＦＲシグナリングの阻害は、腫瘍内皮細胞における選択的アポトーシスを誘導することが示されている。
【００１３】
２００２年に、バンデタニブがリガンド依存性ＲＥＴチロシンキナーゼ活性の強い阻害を示すこと、それによりＲＥＴのシグナリング及び形質転換能力を阻害することが報告された。さらに、バンデタニブは、ＲＥＴ依存性甲状腺腫瘍細胞増殖に対する強い増殖阻害効果をインビトロで示した（Carlomagno et al. 2002 Cancer Research: 62, 7284-7290）。バンデタニブは、ＲＥＴの突然変異活性型の大多数及び野生型レセプターも阻害する。それ故、ＶＥＧＦＲ２及びＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害に加え、バンデタニブによるＲＥＴチロシンキナーゼの阻害は、ＲＥＴ依存性腫瘍細胞増殖を導くＲＥＴ遺伝子中の突然変異による腫瘍を治療することにおいて、追加の抗腫瘍効果に寄与することができると考えられている（Ryan, 2005）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際特許出願公開番号WO98/13354号
【特許文献２】国際特許出願公開番号WO01/32651号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Eng, 1999 Journal Clinical Oncology. 17(1) 380-393
【非特許文献２】Santoro et al. 2004 Endocrinology: 145, 5448-5451
【非特許文献３】Eng et al. 1996 JAMA: 276, 1575-1579
【非特許文献４】Ponder et al. 1999 Cancer Research: 59, 1736-1741
【非特許文献５】Schilling et al. 2001 International Journal of Cancer: 95, 62-66
【非特許文献６】Santoro et al. 1995 Science: 267, 381-383
【非特許文献７】Zhou et al. 1995 Nature: 273, 536-539
【非特許文献８】Zhong et al. 2006 Clinica Chimica Acta: 364, 205-208
【非特許文献９】Jakeman, et al. 1993 Endocrinology: 133, 848-859
【非特許文献１０】Kolch, et al. 1995 Breast Cancer Research and Treatment: 36,139-155
【非特許文献１１】Connolly, et al. 1989 J. Biol. Chem: 264,20017-20024
【非特許文献１２】Kim, et al. 1993 Nature: 362,841-844
【非特許文献１３】Carmeliet, et al. 1996 Nature 380:435-439;
【非特許文献１４】Ferrara, et al. 1996 Nature 380:439-442
【非特許文献１５】Ryan et al. 2005 British Journal Cancer: 92(Suppl.1) S6-S13
【非特許文献１６】Wedge et al. 2002 Cancer Research: 62, 4645-4655
【非特許文献１７】Carlomagno et al. 2002 Cancer Research: 62, 7284-7290
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、ＲＥＴ薬剤への応答の可能性増大を予測するため、ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者の選択を可能にする。構成的にＲＥＴを活性化する突然変異はいくつかのＲＥＴシグナリング依存性癌症候群を導くことが知られているので、患者におけるこれらの突然変異の決定は、ＲＥＴ薬剤による治療に対する患者の適合性を評価するために使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、慣用的ＤＮＡ  ＡＲＭＳプライマーを使用する、Ｍ９１８Ｔ  ＲＥＴ突然変異の検出を示す。白抜き菱形は１０００コピーの突然変異体ＤＮＡで得られたシグナルを示し、黒四角は１００００コピーの野生型ＤＮＡで得られたシグナルを示し、及び黒菱形は１０００コピーの野生型ＤＮＡで得られたシグナルを示す。
【図２】図２は、ＬＮＡ修飾ＡＲＭＳプライマーを使用する、Ｍ９１８Ｔ  ＲＥＴ突然変異の検出を示す。黒三角は１０００コピーの突然変異体ＤＮＡで得られたシグナルを示し、黒四角は１０００コピーの野生型ＤＮＡで得られたシグナルを示し、及び黒丸は１００００コピーの野生型ＤＮＡで得られたシグナルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の一つの側面に従うと、ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者が、前記治療に応答するであろう可能性を予測するための方法が提供され、患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号１において定義した下記の位置：１０５位でチミンではないことを決定することを含んでなる。一つの態様において、該方法は、患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号１において定義した１０５位でチミンではないかどうかを決定することを含んでなり、それにより、ＲＥＴ薬剤への応答の可能性の増大を予測する。一つの態様において、該方法は、患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号１において定義した下記の位置：１０５位でシトシンではないことを決定することを含んでなる。一つの態様において、該方法は、患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号１において定義した１０５位でシトシンではないかどうかを決定することを含んでなり、それにより、ＲＥＴ薬剤への応答の可能性増大を予測する。
【００１９】
本発明のもう一つの側面に従うと、ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者が、前記治療に応答するであろう可能性を予測するための方法が提供され、患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号２において定義した下記の位置：９１８位でメチオニンではないことを決定することを含んでなる。一つの態様において、該方法は、患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号２において定義した９１８位でメチオニンではないかどうかを決定することを含んでなり、それにより、ＲＥＴ薬剤への応答の可能性増大を予測する。一つの態様において、該方法は、患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号２において定義した下記の位置：９１８位でスレオニンであることを決定することを含んでなる。一つの態様において、該方法は、患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号２において定義した９１８位でスレオニンであるかどうかを決定することを含んでなり、それにより、ＲＥＴ薬剤への応答の可能性増大を予測する。
【００２０】
一つの態様において、ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者が前記治療に応答するであろう可能性を予測する方法が提供され、患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号１において定義した１０５位でシトシンであり、又は配列番号２において定義した下記の位置：９１８位でスレオニンであるかどうかを決定することを含んでなり、それにより、ＲＥＴ薬剤への応答の可能性の増大を予測する。
【００２１】
一つの態様において、本発明は、単独で又は一部がＲＥＴに依存する腫瘍を有する患者において、ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者のＲＥＴ薬剤への応答を予測することに使用するために特に適している。一つの態様において、本発明は、単独で又は一部が突然変異体ＲＥＴに依存する腫瘍を有する患者において、ＲＥＴ薬剤への応答を予測することにおいて使用するために特に適している。こうした腫瘍には、例えば、甲状腺癌腫が含まれる。別の態様において、本発明は、甲状腺髄様癌腫、副腎腫瘍（褐色細胞腫のような）、肺癌（特に、小細胞肺癌）、甲状腺乳頭癌腫、中皮腫及び結腸直腸癌から選択される腫瘍を有する患者において、ＲＥＴ薬剤への応答を予測することに使用するために特に適している。別の態様において、本発明は、甲状腺髄様癌腫、副腎腫瘍（褐色細胞腫のような）及び肺癌（特に、小細胞肺癌）から選択される腫瘍を有する患者において、ＲＥＴ薬剤への応答を予測することに使用するために特に適している。
【００２２】
別の態様において、本発明は、単独で又は一部がＲＥＴに依存する腫瘍を有する患者において、ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者が前記治療へ応答するであろう可能性を予測することに使用するために特に適している。一つの態様において、本発明は、単独で又は一部が突然変異体ＲＥＴに依存する腫瘍を有する患者において、ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者が前記治療へ応答するであろう可能性を予測することに使用するために特に適している。こうした腫瘍には、例えば、甲状腺癌腫が含まれる。別の態様において、本発明は、甲状腺髄様癌腫、副腎腫瘍（褐色細胞腫のような）、肺癌（特に、小細胞肺癌）、甲状腺乳頭癌腫、中皮腫及び結腸直腸癌から選択される腫瘍を有する患者において、前記治療へ応答するであろう可能性を予測することに使用するために特に適している。別の態様において、本発明は、甲状腺髄様癌腫、副腎腫瘍（褐色細胞腫のような）及び肺癌（特に、小細胞肺癌）から選択される腫瘍を有する患者において、ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者が前記治療へ応答するであろう可能性を予測することに使用するために特に適している。
【００２３】
本発明の一つの態様において、上記の方法が提供され、ＲＥＴ中の核酸突然変異を検出し、そしてそれによりＲＥＴの配列を決定する該方法は、シークエンシング、ＷＡＶＥ分析、増幅不応性突然変異システム（ＡＲＭＳ）及び制限断片長多型（ＲＦＬＰ）から選択される。ＡＲＭＳは、その内容が本明細書において援用されるヨーロッパ特許公開番号０３３２４３５に記載されており、わずか一塩基異なっている鋳型配列の選択的増幅のための方法を開示及び特許請求しており、その方法は現在一般にＡＲＭＳと称されている。ＲＦＬＰは、Zhong （Zhong et al. 2006 Clinica Chimica Acta: 364, 205-208）により記述されている。本発明の一つの態様において、上記の方法が提供され、患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列を決定するための該方法は、増幅不応性突然変異システム、制限断片長多型又はＷＡＶＥ分析のいずれか一つから選択される。本発明の一つの態様において、上記の方法が提供され、患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列を決定するための該方法は、増幅不応性突然変異システムである。一つの態様において、ＡＲＭＳはアガロースゲル、シークエンシングゲル又はリアルタイムＰＣＲの使用を含むことができる。一つの態様において、ＡＲＭＳはリアルタイムＰＣＲの使用を含んでなる。該ＡＲＭＳアッセイは、反応中のＤＮＡの存在を検出し、それによりＰＣＲの成功を示唆する第二のＰＣＲ反応と多重化することができる。異なった蛍光タグで標識されたTaqMan（商標）プローブを使用し、両方の反応の生成物を検出するため、TaqMan（商標）技術を使用することができる。突然変異を検出するためにシークエンシング又はＲＦＬＰよりむしろＡＲＭＳを使用する利点は、ＡＲＭＳがより迅速な一工程アッセイであり、より少ないプロセシング及びデータ分析しか必要とせず、そしてＡＲＭＳは、野生型ポリヌクレオチドのバックグラウンドに対するサンプル中の突然変異を検出し得ることである。
【００２４】
本発明の一つの態様において、患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列を決定する方法が提供され、配列番号１に示した１０５位でＲＥＴの配列を認識することが可能であるＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマーの使用を含んでなる。本発明の一つの態様において、患者から得られたサンプル中の、ＲＥＴの配列を決定する方法が提供され、配列番号１に示した１０５位を含んでなるＲＥＴ配列の領域を増幅するように最適化されたＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマー及びＡＲＭＳリバースプライマーの使用を含んでなる。当業者は、「増幅するように最適化された」とは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの最も適切な長さ及び位置を決定することを含んでなることを理解するであろう。一つの態様において、該ＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマー及び該ＡＲＭＳリバースプライマーは、５００塩基未満の領域を増幅するために最適化されている。一つの態様において、該ＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマー及び該ＡＲＭＳリバースプライマーは、２５０塩基未満の領域を増幅するために最適化されている。一つの態様において、該ＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマー及び該ＡＲＭＳリバースプライマーは、２００塩基未満の領域を増幅するために最適化されている。一つの態様において、該ＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマー及び該ＡＲＭＳリバースプライマーは、１００塩基より大きな領域を増幅するために最適化されている。
【００２５】
一つの態様において、該ＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマーは、配列番号１に定義した１０５位でＲＥＴの配列を認識することが可能である。一つの態様において、該ＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマーは、配列番号３に開示した配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含んでなる。別の態様において、該ＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマーは配列番号３を含んでなる。さらなる態様において、該ＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマーは配列番号３から成る。
【００２６】
一つの態様において、該ＡＲＭＳリバースプライマーは、配列番号４に開示した配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含んでなる。一つの態様において、該ＡＲＭＳリバースプライマーは配列番号４を含んでなる。一つの態様において、該ＡＲＭＳリバースプライマーは配列番号４から成る。
【００２７】
ロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドは、リボースの２’−酸素と４’−炭素を連結しているメチレン架橋を含有する。この架橋はロックされた３’−エンドコンホメーションを生じ、リボースの構造的柔軟性を減少させ、そしてリン酸骨格の局所的組織化を増加させる。Braasch 及びCorey がＬＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの特性について概説している（Braasch and Corey, 2001, Chemistry & Biology 8,1-7 ）。
【００２８】
いくつかの研究は、ＬＮＡを含んでなるプライマーが相補的ＤＮＡ配列に対して改善された親和性を有することを示した。単一ＬＮＡ塩基の組み入れは、同一の長さ及び配列のＤＮＡ：ＤＮＡ複合体と比較した場合、融解温度（Ｔｍ）を４１℃まで上昇させることが可能であり、そしてＴｍ値を９．６℃ほど上昇させることも可能である。Braasch 及びCorey は、ＬＮＡ塩基の包含が、１０塩基より短いオリゴヌクレオチドに最も大きな効果を有するであろうことを提唱している。
【００２９】
ＰＣＲプライマーの設計について、ＬＮＡの使用の意味が概説されている（Latorra, Arar and Hurley, 2003, Molecular and Cellular Probes 17, 253-259 ）。確固たる設計ルールは未だ確立されておらず、ＰＣＲプライマー中のＬＮＡ置換の最適化は複雑であり、数、位置及び配列状況に依存していることが留意された。Ugozolli ら（Ugozolli, Latorra, Pucket, Arar and Hamby, 2004, Analytical  Biochemistry 324, 143-152 ）は、５’ヌクレアーゼアッセイを使用するリアルタイムＰＣＲにおいて、ＳＮＰを検出するためのＬＮＡプローブの使用を記載している。Latorra ら（Latorra, Campbell, Wolter and Hurley, 2003, Human Mutation 22, 79-85）は、アレル特異的プライマーとして使用するための、３’末端に及び３’末端に隣接する位置にＬＮＡ塩基を含有する一連のプライマーを合成した。不適正なＬＮＡ配列から開始することは、ＤＮＡプライマーと比較して減少されるが、個々の反応の最適化が必要とされた。
【００３０】
一つの態様において、該ＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマーは、一つ又はそれより多くの標準ＤＮＡ塩基がＬＮＡ塩基で置換されている配列を含んでなる。一つの態様において、該ＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマーは、配列番号９に開示された配列と少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含んでなる。別の態様において、該ＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマーは配列番号９を含んでなる。さらなる態様において、該ＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマーは配列番号９から成る。
【００３１】
一つの態様において、ＡＲＭＳアッセイにおいて前に記載したＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマー及びＡＲＭＳリバースプライマーの使用により生じる増幅産物と結合できるＡＲＭＳプローブが提供される。一つの態様において、該ＡＲＭＳプローブは配列番号５に開示された配列と少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含んでなる。別の態様において、該ＡＲＭＳプローブは配列番号５を含んでなる。さらなる態様において、該ＡＲＭＳプローブは配列番号５から成る。一つの態様において、該ＡＲＭＳプローブは一つ又はそれより多くの標準ＤＮＡ塩基がＬＮＡ塩基で置換されている配列を含んでなる。一つの態様において、該ＡＲＭＳプローブは配列番号１０に開示された配列と少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含んでなる。別の態様において、該ＡＲＭＳプローブは配列番号１０を含んでなる。さらなる態様において、該ＡＲＭＳプローブは配列番号１０から成る。一つの態様において、該ＡＲＭＳプローブは５’末端にYakima Yellow（商標）蛍光タグを含んでなる。一つの態様において、該ＡＲＭＳプローブは３’末端にＢＨＱ（商標）消光剤を含んでなる。当業者は、増幅生成物中のプローブが結合する位置は（及び、それ故にプローブの配列は相補的である）、該増幅生成物を決定するフォワード及びリバースプライマーにより強いられる境界によってのみ制限されることを認識するであろう。
【００３２】
ＡＲＭＳアッセイが意図されたように働いていることを確認するため、及びＡＲＭＳアッセイに使用されたサンプル中にＤＮＡがあることを確認するため対照プローブを使用する。当業者は、対照プローブがいずれの選択された遺伝子も標的とすることができることを理解するであろう。一つの態様において、対照フォワードプライマーは、配列番号６に開示された配列と少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含んでなる。別の態様において、対照フォワードプライマーは、配列番号６を含んでなる。さらなる態様において、対照フォワードプライマーは配列番号６から成る。一つの態様において、対照リバースプライマーは、配列番号７に開示された配列と少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含んでなる。別の態様において、対照リバースプライマーは配列番号７を含んでなる。さらなる態様において、対照リバースプライマーは配列番号７から成る。一つの態様において、対照プローブは、配列番号８に開示された配列と少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含んでなる。別の態様において対照プローブは配列番号８を含んでなる。さらなる態様において、対照プローブは配列番号８から成る。一つの態様において、対照プローブは一つ又はそれより多くの標準ＤＮＡ塩基がＬＮＡ塩基で置換されている配列を含んでなる。一つの態様において、対照プローブは、配列番号１１に開示された配列と少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含んでなる。別の態様において、対照プローブは配列番号１１を含んでなる。さらなる態様において、対照プローブは配列番号１１から成る。一つの態様において、対照プローブは５’末端にＣｙ（商標）−５蛍光タグを含んでなる。一つの態様において、対照プローブは３’末端にElleQuencher（商標）消光剤を含んでなる。
【００３３】
【表１】
2010502209.tif 000003
【００３４】
本発明の別の側面において上記の方法が提供され、ＲＥＴの配列を決定するための該方法は、保存腫瘍切片又は他の臨床材料から抽出されたＲＥＴ  ｍＲＮＡの逆転写により発生させたｃＤＮＡの配列を決定することを含んでなる。ホルマリン固定組織からのＲＮＡの抽出は、Bock et al., 2001 Analytical Biochemistry: 295 116-117 、に記載されており、非固定組織からのＲＮＡの抽出、及び逆転写によるｃＤＮＡの発生、ＰＣＲ増幅及びシークエンシングのためのプロトコルは、Sambrook, J. and Russell,D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, the third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001 、に記載されている。
【００３５】
本発明の別の側面において、上記の方法が提供され、ＲＥＴの配列を決定するための該方法は、ＲＥＴ遺伝子の個々のエキソンの増幅、個々のエキソンのヘテロ二重体アニーリング、続いてのＣｅｌ  Ｉによる消化を含んでなる（Crepin et al., 2006 Endocrinology: 36, 369-376；及びMarsh et al., 2001 Neoplasia: 3, 236-244 に記載されているような）。
【００３６】
別の側面において、本発明は、配列番号１において定義した下記の位置に下記の核酸塩基を含んでなる突然変異体ヒトＲＥＴポリヌクレオチド：１０５位にシトシン、又は、少なくとも２０核酸塩基を含んでなるそれらの断片、但し該断片は１０５位を含んでなる、を提供する。
【００３７】
さらなる側面において、本発明は、配列番号２において定義した下記の位置に下記のアミノ酸残基を含んでなる突然変異体ヒトＲＥＴポリペプチド：９１８位にスレオニン、又は、少なくとも１０アミノ酸残基を含んでなるそれらの断片、但し該断片は９１８位を含んでなる、を提供する。
【００３８】
別の側面において、突然変異体ＲＥＴ遺伝子によりコードされたｍＲＮＡ中のＲＥＴの配列を決定する方法が提供される。
本発明の別の側面において、上記の方法を提供が提供され、ＲＥＴの配列を決定するための該方法は、例えば、単一患者からのスライド、又は組織マイクロアレイを使用することができる免疫組織化学に基づいたアッセイ（Mayr et al., 2006 American Journal of Clinical Pathology: 126, 101-109; Zheng et al., 2006 Anticancer Research: 26, 2353-2360 ）、又は、細胞を溶解すること、タンパク質を消化すること、ゲル上でタンパク質断片を分離すること、突然変異したアミノ酸を含有するペプチドを得ること、及び質量分析法によりペプチドを分析することを含んでなることができる、代替のプロテオミクス方法論の応用から選択される。
【００３９】
別の側面において、本発明は上記の突然変異体ヒトＲＥＴポリペプチドに対して特異的な抗体を提供する。
本発明のさらなる側面は、配列番号１において定義した１０５位でＲＥＴ中の突然変異を検出することが可能なＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマー、及び任意選択でＡＲＭＳリバースプライマー、及び任意選択で使用のための説明書を含んでなる診断キットを提供する。本発明の一つの態様において、一つ以上のＬＮＡ塩基を含んでなり、及び配列番号１において定義した１０５位でＲＥＴ中の突然変異を認識することが可能なＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマー、及び任意選択でＡＲＭＳリバースプライマー、及び任意選択で使用のための説明書を含んでなる診断キットが提供される。一つの態様において、該診断キットは、ＲＥＴ薬剤での治療についての候補者である患者が前記治療に応答するであろう可能性を予想する方法において使用することができる。代替態様において、該診断キットはＲＥＴ薬剤による治療についての候補者である、前記治療の患者を選択することにおいて使用することができる。代替態様において、該診断キットはＲＥＴ薬剤による治療についての候補者である、前記治療の患者の適合性を評価するために使用することができる。
【００４０】
本発明のさらなる側面は、上に定義した突然変異体ヒトＲＥＴポリペプチド、及び任意選択で使用のための説明書を含んでなる診断キットを提供する。一つの態様において、該診断キットは、ＲＥＴ薬剤による治療についての候補者である患者が前記治療に応答するであろう可能性を予想する方法で使用することができる。代替態様において、該診断キットはＲＥＴ薬剤での治療についての候補者である、前記治療の患者を選択することにおいて使用することができる。代替態様において、該診断キットはＲＥＴ薬剤での治療についての候補者である、前記治療の患者の適合性を評価するために使用することができる。
【００４１】
本発明のさらなる側面において、上記ＡＲＭＳプライマー及びプローブは、野生型か又は突然変異体ＲＥＴを発現している細胞株の一団におけるＲＥＴの配列を決定するために使用することができる。細胞株が野生型か又は突然変異体ＲＥＴを発現しているかどうかの知識は、突然変異体ＲＥＴ表現型に特異性を有する新規ＲＥＴ阻害剤、又は野生型レセプターに関連する表現型に対する活性を有する新規阻害剤を同定するためのスクリーニングプログラムにおいて使用し得る。突然変異体ＲＥＴを発現している細胞株の一団の有効性は、ＲＥＴを介して活性化されるシグナリング経路の定義を助けるであろうし、療法的介入のための追加の標的の同定を導くことができる。
【００４２】
別の側面において、本発明は患者のための個別化されたゲノムプロファイルを準備する方法を提供し、配列番号１において定義した下記の位置：１０５位、及び／又は配列番号２において定義した下記の位置：９１８位、の患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列を決定すること、及び前記分析により得られたデータを要約している報告を作成することを含んでなる。
【００４３】
具体的態様において、上記の該方法は、ＲＥＴ薬剤の薬理遺伝学を評価するために使用することができる。薬理遺伝学とは、薬剤に対する異なる応答を生じる遺伝的変異の研究である。患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列を決定すること、及びＲＥＴ薬剤に対する応答を分析することにより、ＲＥＴ薬剤の遺伝薬理学を評価し得る。
【００４４】
一つの態様において、ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者が、前記治療に応答するであろう可能性を予測するための方法は、ＲＥＴ薬剤により治療する腫瘍を有する患者又は患者集団を選択するために使用することができる。
【００４５】
一つの態様において、ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者が、前記治療に応答するであろう可能性を予測するための方法は、ＲＥＴ薬剤により治療する腫瘍を有する患者又は患者集団の応答性を予測するために使用することができる。
【００４６】
患者から得られたサンプルは、腫瘍に由来する物質を含有するいずれの腫瘍組織又はいずれの生体サンプル、例えば、循環腫瘍細胞又はＤＮＡを含有する血液サンプル、であることができる。一つの態様において、該血液サンプルは、全血、血漿、血清又はペレット状血液であることができる。一つの態様において、腫瘍サンプルは腫瘍組織サンプルである。該腫瘍組織サンプルは、固定された又は固定されていないサンプルであることができる。別の態様において、該生体サンプルは、腫瘍又は疑わしい腫瘍の少量のサンプル（これらからＲＥＴ配列を決定する）を得るため、低侵襲技術を使用して得られたものであろう。別の態様において、該生体サンプルは、上記のいずれかの突然変異を試験することができる単一サンプルか、又は上記のいずれかの突然変異を試験することができる複数のサンプルを含んでなる。
【００４７】
本発明の別の側面に従うと、ＲＥＴ薬剤の適切な用量を決定することにおいて、上記の方法の結果を使用する方法が提供される。例えば、患者がＲＥＴ薬剤に対する応答の増大した可能性を有すると予測されるという知識は、ＲＥＴ薬剤の適切な用量を決定することにおいて使用することができる。療法的薬剤用量を計算することは、医薬、薬物動態学及び薬理遺伝学の考慮を必要とする複雑な課題である。所与の患者についての療法的薬剤用量は、疾患の重症度及びタイプ、体重、性、食事、投与の回数及び経路、他の医薬投与及び他の関連する臨床学的因子を含む、薬剤の作用を改変することが知られている種々の因子を考慮して主治医により決定されるであろう。療法的有効投与量は、インビトロか又はインビボ法により決定することができる。
【００４８】
ＲＥＴ薬剤はＲＥＴ阻害剤である。ＲＥＴ阻害剤は、ＲＥＴの活性を阻害する剤である。前記剤は、抗体又は小分子であることができる。一つの態様において、ＲＥＴ阻害剤はＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤である。ＲＥＴ阻害剤は、他のチロシンキナーゼ、例えば、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＥＧＦＲの活性の阻害のように、他のタンパク質に対する活性を有することができる。一つの態様において、ＲＥＴ阻害剤はＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性も阻害する。一つの態様において、ＲＥＴ阻害剤はＶＥＧＦＲ２チロシンキナーゼ活性も阻害する。一つの態様において、ＲＥＴ阻害剤は、ＶＥＧＦＲ２及びＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性も阻害する。
【００４９】
ＲＥＴ、ＥＧＦＲ又はＶＥＧＦＲ２チロシンキナーゼ阻害剤には、バンデタニブ、セジラニブ（AZD2171、リセンチン（商標） (Wedge et al., 2005 Cancer Research: 65, 4389-44001 ））、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ (SUl1248、ステント（登録商標）、Pfizer)、SU14813 (Pfizer)、バタラニブ(Novartis)、ソラフェニブ(BAY43-9006、ネクサバール、Bayer)、XL-647 (Exelixis)、XL-999 (Exelixis)、AG-013736 (Pfizer)、モテサニブ(AMG706, Amgen)、BIBFl120 (Boehringer)、TSU68 (Taiho)、GW786034 、AEE788 (Novartis)、CP-547632 (Pfizer)、KRN951 (Kirin)、CHIR258 (Chiron)、CEP-7055 (Cephalon)、OSI-930 (OSI Pharmaceuticals)、ABT-869 (Abbott)、E7080 (Eisai)、ZK-304709 (Schering)、BAY57-9352 (Bayer)、L-21649 (Merck)、BMS582664（BMS)、XL-880 (Exelixis)、XL-184 (Exelixis)又はXL-820 (Exelixis) が含まれる。
【００５０】
一つの態様において、該ＲＥＴ阻害剤はバンデタニブ、セジラニブ、スニチニブ、モテサニブ又は抗体から選択される。一つの態様において、該ＲＥＴ阻害剤はバンデタニブである。一つの態様において、該ＲＥＴ阻害剤はセジラニブである。一つの態様において、該ＲＥＴ阻害剤はモテサニブである。一つの態様において、該ＲＥＴ阻害剤はスニチニブである。一つの態様において、該ＲＥＴ阻害剤は抗体である。
【００５１】
ＲＥＴ薬剤の有効量は、例えば、療法目的、投与経路、及び患者の状態に依存するであろう。従って、最適の療法効果を得るために必要とされるように、療法士は投薬量を滴定し及び投与の経路を修正するのが好ましい。典型的な日用量又は間欠的（例えば、毎週、２週間ごと又は毎月のような）投薬量は、上記因子に依存して、約０．５ｍｇ〜３００ｍｇ、５００ｍｇ、ｌ０００ｍｇ又は１２００ｍｇまで又はそれ以上、の範囲であることができる。
【００５２】
我々は、ＲＥＴ薬剤は単剤療法として、又は他の薬剤と併用して使用することができることを企図している。本発明は、補助療法において又は第一の療法としても有用である。
一つの態様において、本発明の方法は、上記の方法に従ってＲＥＴ薬剤による治療に選択された、又は応答することが予期される患者へのＲＥＴ薬剤の投与をさらに含んでなる。
【００５３】
本発明の一つの態様において、上記の方法に従ってＲＥＴ薬剤による治療に選択された、又は応答することが予期される患者又は患者集団を治療するための医薬の製造におけるＲＥＴ薬剤の使用が提供される。
【００５４】
本発明の一つの態様において、上記の方法に従ってＲＥＴ薬剤への応答の増大した可能性を有すると選択された、又は予期された患者又は患者集団を治療する方法が提供され、該方法は、前記患者（単数又は複数）へＲＥＴ薬剤を投与することを含んでなる。
【００５５】
本発明の一つの態様において、ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者を治療する方法が提供され：該方法は
（ｉ）該患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号１において定義した下記の位置：１０５位で、チミンではないかどうかを決定すること；又は
（ｉｉ）該患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号２において定義した下記の位置：９１８位で、メチオニンではないかどうかを決定すること、及びＲＥＴ薬剤の有効量を投与することを含んでなる。
【００５６】
本発明の一つの態様において、ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者を治療する方法が提供され：該方法は
（ｉ）該患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号１において定義した１０５位で、チミンではないかどうかを決定すること；又は
（ｉｉ）該患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号２において定義した９１８位で、メチオニンではないかどうかを決定すること、及びＲＥＴ薬剤の有効量を投与することを含んでなる。
【００５７】
本発明の一つの態様において、ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者を治療する方法が提供され：該方法は
（ｉ）該患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号１において定義した下記の位置：１０５位で、シトシンであるかどうかを決定すること；又は
（ｉｉ）該患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号２において定義した下記の位置：９１８位で、スレオニンであるかどうかを決定すること、及びＲＥＴ薬剤の有効量を投与することを含んでなる。
【００５８】
本発明の一つの態様において、ＲＥＴ薬剤による治療の候補者である患者を治療する方法が提供され：該方法は
（ｉ）該患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号１において定義した１０５位で、シトシンであるかどうかを決定すること；又は
（ｉｉ）該患者から得られたサンプル中のＲＥＴの配列は、配列番号２において定義した９１８位で、スレオニンであるかどうかを決定すること、及びＲＥＴ薬剤の有効量を投与することを含んでなる。
【実施例】
【００５９】
本発明は以下の非制限例により例示される。
一般的分子生物学技術は、"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1-3, F M Asubel, R Brent and R E Kingston編；John Wiley出版, 1998 、及びSambrook, J. and Russell, D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第三版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001に記載されている。
【００６０】
実施例１−孤発性髄様甲状腺腫瘍切片における突然変異の同定
腫瘍切片は、診断又は手術時に患者から採取した。切片はホルマリン固定し、パラフィンワックス中に包埋した。調製したサンプルは５〜２０ミクロンの厚さのさまざまな切片に切断した。腫瘍を含有する切片の領域は、Lynch et al. 2004 New England Journal of Medicine: 350 2129-2139 により記載されているように、マスタースライドの病理組織診断により同定し、腫瘍材料は同一腫瘍サンプルから切り出された隣接スライドの関連領域から回収した。他のタイプの腫瘍サンプルとしては、例えば、新鮮な又は凍結組織又は循環腫瘍細胞を含むことができる。こうしたサンプルを使用する技術の詳細は、Sambrook, J. and Russell, D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第三版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001 、に見ることができる。
【００６１】
実施例２−スライド切片からのＤＮＡ抽出
容量は一つの切片の抽出について与えられている。一つの切片上の病理組織診断により同定された腫瘍の領域は、スライドからエッペンドルフチューブ内へ関連領域を削りとることにより隣接切片から単離した。２０ミクロン切片からの物質をｌ００μｌの０．５％ツイーン−２０(Sigma Aldrich)中に再懸濁し、９０℃でｌ０分加熱し、次ぎに５５℃まで冷却した。プロテイナーゼＫ（２μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ）を懸濁液に加え、溶液を混合し、時々撹拌しながら５５℃で３時間インキュベートした。Chelex-100（商標）（C7901,Sigma）（１００μｌ、５％（ｗ／ｖ）トリスＥＤＴＡ溶液）を加え、懸濁液を９９℃で１０分インキュベートした。抽出されたＤＮＡを１０５００ｘｇで１５分の遠心分離により回収し、形成されたワックス層下の溶液を透明なチューブに移した。溶液はクロロホルム（ｌ００μｌ）を加える前に４５℃に加熱した。懸濁液を混合した後、さらに１０５００ｘｇで１５分遠心分離し、次ぎにＤＮＡをエタノール沈澱により上部の水層から回収した。ＤＮＡペレットを７０％エタノール中ですすぎ、遠心分離のパルスにより回収し、風乾し、そして水に溶解した（５０μｌ）。
【００６２】
実施例３−ＡＲＭＳプライマーを使用する、ＲＥＴ中のＭｅｔ９１８Ｔｈｒ突然変異の検出のための増幅不応性突然変異システム
増幅不応性突然変異システムアッセイ（ＡＲＭＳ）を、正常ＤＮＡのバックグラウンドと比較されたＲＥＴ遺伝子中のヌクレオチド塩基変化の存在を検出するために使用することができる。各ＡＲＭＳアッセイは所与の突然変異について特異的であり、例えば、所与の位置での一つの塩基から別の塩基への変化を検出するように設計されている。本アッセイは、反応物中のＤＮＡの存在を検出する第二のＰＣＲ反応と多重化され、それによりＰＣＲの成功が示される。異なった蛍光タグで標識されたTaqMan（商標）プローブを使用するTaqMan（商標）技術を使用して、両方の反応のＰＣＲ生成物を検出する。
【００６３】
ＰＣＲは、さまざまな割合の突然変異体及び野生型ＤＮＡ及びさまざまな濃度の投入ＤＮＡを含有する５μｌのゲノムＤＮＡで実施した。２５μｌの総反応容量を各ＰＣＲについて使用した。緩衝液（最終緩衝液組成、１５ｍＭトリス−ＨＣｌ  Ｐｈ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ）中、３．５ｍＭ塩化マグネシウム、２００μＭ  ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）及び１．０μＭの各ＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマー及びＡＲＭＳリバースプライマーショート（表１参照）の最終濃度を有する各反応液に、１ユニットのAmplitaq gold ＤＮＡポリメラーゼ（N80080246、ABI）を使用した。TaqMan（商標）プローブ（Eurogentech）を０．５μＭの最終濃度で各反応液に加えた。サイクル条件は以下の通りである：リアルタイムＰＣＲ装置（例えば、Stratagene Mx4000又はABI7900）中、９５℃で１０分、続いて９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、７２℃で１分を４０サイクル。１０００コピーの野生型ＤＮＡのバックグラウンド中、１０コピーの突然変異体を検出することができた。
【００６４】
実施例４−ＡＲＭＳ  ＬＮＡプライマーを使用する、臨床サンプルからのＲＥＴ中のＭｅｔ９１８Ｔｈｒ突然変異の検出のための増幅不応性突然変異システム
ホルマリン固定組織サンプルは、孤発性髄様甲状腺癌におけるバンデタニブの活性を評価するための臨床試行に関与している患者から得られた。
【００６５】
ＤＮＡは、実施例２に記載されているように抽出した。分析に１９サンプルが利用可能であり、単一患者からの２つのサンプルが含まれていた。すべてのサンプルは三重に分析し、２人の独立した作業者によりスコア化した。
【００６６】
増幅不応性突然変異システムアッセイ（ＡＲＭＳ）を、正常ＤＮＡのバックグラウンドと比較されたＲＥＴ遺伝子中のヌクレオチド塩基変化の存在を検出するために使用した。本アッセイは、反応物中のＤＮＡの存在を検出する第二のＰＣＲ反応と多重化され、それによりＰＣＲの成功が示される。異なった蛍光タグで標識されたTaqMan（商標）プローブを使用するTaqMan（商標）技術を使用して、両方の反応のＰＣＲ生成物を検出する。
【００６７】
ＰＣＲは、さまざまな割合の突然変異体及び野生型ＤＮＡ及びさまざまな濃度の投入ＤＮＡを含有するゲノムＤＮＡで実施した。２５μｌの総反応容量を各ＰＣＲについて使用した。緩衝液（最終緩衝液組成、１５ｍＭトリス−ＨＣｌ  Ｐｈ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ）中、３．５ｍＭ塩化マグネシウム、２００μＭ  ｄＮＴＰ及び１．０μＭの各ＡＲＭＳ  ＬＮＡ突然変異体フォワードプライマー及びＡＲＭＳリバースプライマーショート（表１参照）の最終濃度を有する各反応液に、１ユニットのAmplitaq gold ＤＮＡポリメラーゼ（N80080246、ABI）を使用した。TaqMan（商標）プローブを０．５μＭの最終濃度で各反応液に加えた。サイクル条件は以下の通りである：リアルタイムＰＣＲ装置（例えば、Stratagene Mx4000又はABI7900）中、９５℃で１０分、続いて９４℃で４５秒、６０℃で１分、７２℃で４５秒を４０サイクル。
【００６８】
低ＤＮＡ濃度のため、６サンプルはスコア化することができなかった。突然変異は１３の評価可能サンプル中の８つで検出され、６１．５％の突然変異頻度を与えた。突然変異状態を確認するため、すべてのサンプルにシークエンシングを実施した；しかし、配列データはＤＮＡ濃度＞５０コピーのサンプルからのみ得ることができ、それ故、４つのみのサンプルが、コドン９１８を読み取り可能な配列を与えた。シークエンシングにより得られた結果は、ＡＲＭＳアッセイから得られたデータと完全に一致した。
【００６９】
【表２】
2010502209.tif 000004
【００７０】
実施例５-Ｍ９１８Ｔ  ＲＥＴ突然変異を検出するＡＲＭＳアッセイにおける、ＬＮＡプライマーと比較した慣用的ＤＮＡプライマーの特異性の比較
Ｍ９１８Ｔ  ＲＥＴ突然変異を検出するために設計されたＡＲＭＳプライマーが、野生型ＤＮＡからシグナルを発生し得る閾値を決定するために実験を実施した。ＰＣＲは、異なった濃度の投入ＤＮＡを示す５μｌの突然変異体か又は野生型ゲノムＤＮＡに対して実施した。各ＰＣＲについて２５μｌの総反応容量を使用した。緩衝液（最終緩衝液組成、１５ｍＭトリス−ＨＣｌ  Ｐｈ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ）中、３．５ｍＭ塩化マグネシウム、２００μＭ  ｄＮＴＰ及び１．０μＭの各ＡＲＭＳ突然変異体フォワードプライマー及びＡＲＭＳリバースプライマーショート（表１参照）の最終濃度を有する各反応液に、１ユニットのAmplitaq gold ＤＮＡポリメラーゼ（N80080246、ABI）を使用した。TaqMan（商標）プローブを０．５μＭの最終濃度で各反応液に加えた。サイクル条件は以下の通りである：リアルタイムＰＣＲ装置（例えば、Stratagene Mx4000又はABI7900）中、９５℃で１０分、続いて９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、７２℃で１分を４５サイクルまで。
【００７１】
シグナルは、慣用的ＤＮＡ  ＡＲＭＳプライマーを使用すると、１０００コピーの突然変異体ＤＮＡから２９サイクルで発生した（図１）。しかしながら、１０００か又は１００００コピーの野生型ＤＮＡを含有するサンプルからもシグナルが発生される。野生型ＤＮＡからのシグナルは、それぞれ３５及び３２サイクルで発生したが、野生型ＤＮＡからシグナルが得られる可能性は、固定された腫瘍サンプルについては正常及び腫瘍組織の混合物を含有するのが普通である臨床設定において、慣用的ＤＮＡ  ＡＲＭＳプライマーの使用を制限することもあり得る。
【００７２】
同様の実験を、ＬＮＡ修飾プライマーを使用して実施した。この実験において、シグナルは１０００コピーの突然変異体ＤＮＡを含有するサンプルから３１サイクルで発生したが、１０００か又は１００００コピーの野生型ＤＮＡを含有するサンプルからは、分析を４５サイクルまで延長してもシグナルは発生しなかった（図２）。
【００７３】
実施例６-治療のための患者の選択
腫瘍サンプルにおけるＲＥＴ遺伝子中の突然変異の検出は、単剤療法として又は併用療法において、バンデタニブ又は他のＲＥＴチロシンキナーゼの阻害剤による治療の候補者である患者の選択を改善するために、それにより、バンデタニブ又は他のＲＥＴチロシンキナーゼの阻害剤への応答の増大した可能性を予測するために使用し得る。
【図１】
2010502209.tif 000005
【図２】
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【国際調査報告】
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