(57)【要約】イソオキサゾリンジエステルの一方の立体異性体を、他方のものに対して優先的に加水分解する方法、ならびにその優先的加水分解を容易にするための酵素が提供される。（ＲＲ）および（ＲＳ）モナチンならびに（ＳＳ）および（ＳＲ）モナチンの混合物を与える方法も提供され、その方法は、イソオキサゾリンジエステルを立体選択的に加水分解するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシルエステラーゼＮＰ酵素を用いて、式ＩＩ：
【化１】
2010539968.tif 000016
［式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｃ１−１０アルキルである。］の化合物を立体選択的に加水分解して；
少なくとも、式ＩＩＩａ：
【化２】
2010539968.tif 000017
の化合物または式ＩＩＩａ′：
【化３】
2010539968.tif 000018
の化合物の少なくともひとつ、および、式ＩＩｂ：
【化４】
2010539968.tif 000019
の化合物を生成する方法。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２の双方がエチルである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
式ＩＩＩａまたはＩＩＩａ′の化合物または双方を式Ｉａ：
【化５】
2010539968.tif 000020
の化合物に転換することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記転換が、
（ａ）式ＩＩＩａまたはＩＩＩａ′の化合物を加水分解して、式ＩＶａ：
【化６】
2010539968.tif 000021
の化合物を生成し；ついで、
（ｂ）式ＩＶａの化合物を水素化する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記水素化が、式Ｉａの化合物および式Ｉｃ：
【化７】
2010539968.tif 000022
の化合物の混合物を生成し；式Ｉａの化合物を式Ｉｃの化合物から分離することをさらに含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
式ＩＩｂの化合物を式Ｉｂ：
【化８】
2010539968.tif 000023
の化合物に転換することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記転換が、
（ａ）式ＩＩｂの化合物を加水分解して、式ＩＶｂ：
【化９】
2010539968.tif 000024
の化合物を生成し；ついで、
（ｂ）式ＩＶｂの化合物を水素化することを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記水素化が、式Ｉｂの化合物および式Ｉｄ：
【化１０】
2010539968.tif 000025
の化合物の混合物を生成し；さらに、式Ｉｂの化合物を式Ｉｄの化合物から分離することを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
さらに、
（ａ）式Ｉａの化合物を食品組成物に配合すること
を含む、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
カルボキシルエステラーゼＮＰ酵素を用いて、立体異性体の混合物を含むイソオキサゾリンジエステル組成物を加水分解することを含む方法。
【請求項１１】
立体異性体的に純粋なまたは立体異性体的に豊富化されたモナチン組成物の生成に有用な酵素を同定する方法であって、イソオキサゾリンジエステルに対する立体選択的加水分解活性につきスクリーニングすることを含み、ここに、前記スクリーニングが、加水分解酵素を選択し、選択された酵素およびイソオキサゾリンジエステルを含む反応混合物を生成し、イソオキサゾリンジエステルの加水分解反応が進行すると予想される条件を提供し、ついで、立体異性体的に純粋なまたは立体異性体的に豊富化されたモナチンの存在につき前記反応混合物を分析することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は有機的かつ生体触媒的合成の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
モナチンは高甘味度甘味料であって、下記の化学式：
【０００３】
【化１】
2010539968.tif 000002
を有する。
【０００４】
様々な命名規則により、モナチンは以下の：２−ヒドロキシ−２−（インドル−３−イルメチル）−４−アミノグルタル酸；４−アミノ−２−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−インドル−３−イルメチル）−ペンタン二酸；４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）グルタミン酸；および、３−（１−アミノ−１,３−ジカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブト−４−イル）インドールを含む多数の代替的な名称でも知られている。
【０００５】
モナチンは二つのキラル中心を含有して、４つの可能な立体異性配置を生じる。Ｒ,Ｒ配置（「Ｒ,Ｒ立体異性体」すなわち「（Ｒ,Ｒ）−モナチン）」；Ｓ,Ｓ配置（「Ｓ,Ｓ立体異性体」すなわち「（Ｓ,Ｓ）−モナチン」）；Ｒ,Ｓ配置（「Ｒ,Ｓ立体異性体」すなわち「（Ｒ,Ｓ）−モナチン」）；および、Ｓ,Ｒ配置（「Ｓ,Ｒ立体異性体」すなわち「（Ｓ,Ｒ）−モナチン」）である。異なる立体異性体のモナチンは異なる甘味特性を有する。例えば、（Ｓ,Ｓ）−モナチンは、スクロースよりも重量あたり約５０〜２００倍甘いが、（Ｒ,Ｒ）−モナチンは、スクロースよりも重量あたり約２０００〜２４００倍も甘い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
モナチンの特定の異性体は、主に南アフリカのリンポポ地域に生息するが、ムブマランガや北西部にも生息するシュレロチトン・イリシホリアス（Schlerochiton ilicifolius）植物の根皮内に見いだすことができる。しかしながら、乾燥皮内に存在するモナチンの濃度は、酸形態のインドール換算で、約０．００７質量％であることが分かった。米国特許第４,９７５,２９８を参照せよ。モナチンが植物中で産生される正確な方法は、現在知られていない。
【０００７】
少なくとも部分的には、その甘味特性と食物適用（飲料を含む）における有用性のため、モナチンの経済的な起源を有することが望ましい。さらに、異なる立体異性体の異なる甘味特性のため、Ｒ,Ｒ立体異性体のごときモナチンの単一の立体異性体の経済的な起源を有することが望ましい。かくして、立体異性体的に純粋なまたは立体異性体的に豊富化された形態のモナチンの生成方法を開発する必要性が継続している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、鏡像異性体的に純粋なまたは鏡像異性体的に豊富化されたイソオキサゾリンエステルからの高甘味度甘味料モナチンの生成方法を提供する。
【０００９】
本発明のいくつかの具体例において、イソオキサゾリンジエステルは、鏡像選択的加水分解を受けて、鏡像異性体的に純粋なまたは鏡像異性体的に豊富化されたイソオキサゾリンモノエステルおよび鏡像異性体的に純粋なまたは鏡像異性体的に豊富化されたイソオキサゾリンジエステルを生成する。いくつかの具体例において、鏡像選択的加水分解は、イソオキサゾリンジエステル「Ｓ」−異性体に対して、イソオキサゾリンジエステル「Ｒ」−異性体に優先的に作用して、鏡像異性体的に純粋なまたは鏡像異性体的に豊富化されたＲ−イソオキサゾリンモノエステルおよび鏡像異性体的に純粋なまたは鏡像異性体的に豊富化されたＳ−イソオキサゾリンジエステルを生じる。そして、前記モノエステルおよびジエステルは分離でき、一旦分離されれば、各々は、対応するモナチン異性体に転換できる。かくして、例えば、酵素がＲ−イソオキサゾリンジエステルに対して立体特異的に活性な場合、Ｒ,ＲおよびＲ,Ｓ形態のモナチンの混合物をＲ−イソオキサゾリンモノエステルから生成でき、Ｓ,ＳおよびＳ,Ｒ形態のモナチンの混合物をＳ−イソオキサゾリンジエステルから生成できる。いくつかの具体例において、得られたＲ,ＲおよびＲ,Ｓのモナチンは、例えば、当該分野で公知の物理的手段によって、互いから分離される。いくつかの具体例において、得られたＳ,ＳおよびＳ,Ｒ形態のモナチンは、例えば、当該分野で公知の物理的手段によって、お互いから分離される。
【００１０】
本発明のいくつかの具体例において、立体異性体的に純粋なまたは立体異性体的に豊富化されたモナチン組成物を生成するのに有用な酵素を同定する方法が提供される。いくつかの具体例において、その方法は、イソオキサゾリンジエステルに対する立体選択的加水分解活性について加水分解酵素をスクリーニングすることを含む。そのスクリーニングは、微生物リパーゼおよびエステラーゼを含むヒドロラーゼのごとき加水分解酵素を選択し、選択された酵素およびイソオキサゾリンジエステルを含む反応混合物を形成し、イソオキサゾリンジエステルの加水分解反応が起きることが予測される条件を提供し、鏡像異性体的に純粋なまたは鏡像異性体的に豊富化された形態のイソオキサゾリンモノエステルおよび／または鏡像異性体的に純粋なまたは鏡像異性体的に豊富化された形態のイソオキサゾリンジエステルの存在につき前記反応混合物を分析することを含む。
【００１１】
本明細書は、図面を含めて、本発明の特定の具体例を説明する。しかしながら、当業者ならば、それらの記載から、本発明は、本発明の概念および範囲を逸脱しない全ての様々な態様で修正することができると考えるであろう。したがって、明細書および図面は本質的に例示であって、制限的ではないと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】イソオキサゾリンジエステル（式ＩＩ、Ｒ１およびＲ２はエチル）とカルボキシエステラーゼＮＰとの反応のＬＣクロマトグラム。
【００１３】
【図２】水素添加後の（Ｒ,Ｒ）−および（Ｒ,Ｓ）−モナチンを与えるイソオキサゾリンジエステル（式ＩＩ、Ｒ１およびＲ２はエチル）のカルボキシエステラーゼＮＰ−触媒反応のキラルＨＰＬＣクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
この開示は、イソオキサゾリンジエステルの立体異性体混合物を立体選択的に加水分解する方法を提供する。この開示は、一方のイソオキサゾリンジエステルを、他方のイソオキサゾリンジエステルに対して優先的に加水分解できる酵素も提供する。この開示は、イソオキサゾリンジエステルの異性体混合物を立体選択的に加水分解できる酵素を同定する方法も提供する。
【００１５】
この開示は、（Ｒ,Ｒ）および（Ｒ,Ｓ）モナチンの混合物ならびに（Ｓ,Ｓ）および（Ｓ,Ｒ）モナチンの混合物を生成する方法を提供する。この開示は、モナチンの単一異性体を生成する方法も提供する。いくつかの具体例において、この方法は、酵素を用いて一方のイソオキサゾリンジエステル異性体を、他方に対して優先的に加水分解してモノエステルにし、このモノエステルを前記ジエステルから分離し、前記イソオキサゾリンモノエステルをモナチンジアステレオマーの混合物に転換して、それらのジアステレオマーを当該分野で公知の物理的手段によって溶解し、ついで、前記イソオキサゾリンジエステルをモナチンジアステレオマーの混合物に転換して、当該分野で公知の物理的手段を用いて、それらのジアステレオマーを溶解することを含む。
【００１６】
ここでキラル中心を含有する分子についての言及の各々は、特記がない限り、当該分子の全ての立体異性体を意味する。各立体異性体は別個の化合物であるが、実際は、立体異性体の混合物は、しばしば、例えば、「化合物（±）イソオキサゾリンジエチルエステル」または「イソオキサゾリンジエチルエステル」のごとき「化合物」のことを意味する。同様に、ここでキラル中心を含有する分子の構造描写の各々は、特記がない限り、その分子の全ての立体異性体を表し、例えば、くさび型表記の使用により三次元配座を示す。
【００１７】
また、特記がない限りまたは文脈から明らかでない限り、「Ｒ,Ｒモナチン」または「Ｓ,Ｓモナチン」は、モナチンの単一立体異性体または特定の立体異性体が豊富化された混合物を意味する。「豊富化」は、その混合物が、指定されていない立体異性体に対して指定された立体異性体を、それが得られた元の混合物と比較して高い比率で含むことを意味する。
【００１８】
単一立体異性体は、立体異性体的に豊富化された立体異性体の混合物から、前者を「単一立体異性体」または「単一異性体」または「単一鏡像異性体」と適宜呼んで区別できる。かくして、例えば、特記がない限りまたは文脈から明らかでない限り、「（Ｓ,Ｓ）モナチンは各立体中心においてＳ配座を持つモナチンの単一立体異性体または（Ｓ,Ｓ）モナチンが豊富化された混合物を示す。
【００１９】
なお、ローマ数字で示される各化合物の式は、ここでは、単一の立体異性体または、小文字が後ろに付くときは、立体異性体が豊富化された混合物を意味するという決まりに従う。例えば、式ＩＩ：
【００２０】
【化２】
2010539968.tif 000003
の「化合物」というときは、示された化合物の異性体の混合物をいう。（「（±）」を用いるのは、示された式が異性体の混合物を含むことの指定を明確にするためである）。同様に、式ＩＩａ：
【００２１】
【化３】
2010539968.tif 000004
の「化合物」というときは、特記がない限りまたは文脈から明らかでない限り、表示されている単一の鏡像異性体およびその鏡像異性体が豊富化された混合物の双方をいう。（「Ｒ」を用いるときは、示された式がＲ異性体またはＲ異性体が豊富化された混合物を意味することの指定を明確にするためである）。典型的に、ここに記載される化合物に対して、文字「ａ」は「Ｒ」配置を有する化合物を指定するか、化合物が２つのキラル中心を有する場合、「ａ」は「Ｒ,Ｒ」または「Ｒ,Ｓ」配置を指定し、「ｂ」は「Ｓ」配置を有する化合物を指定するか、２つのキラル中心が存在する場合、「Ｓ,Ｓ」または「Ｓ,Ｒ」配置を指定する。
【００２２】
特記ない限り、用語「含む」、「含む」「含んでいる」などはオープンエンドであることを意図している。かくして、例えば、「含む」は「限定されないが含む」を意味する。
【００２３】
断わりがあるときを除き、冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、「一以上」を意味する。
【００２４】
ここで用いるとき、用語「約」はいかなる測定でも発生する実験誤差の範囲を包含する。断りない限り、全ての測定値は、語「約」が明示的に用いられていなくても、それらの前に語「約」を有していると推定される。
【００２５】
用語「アルキル」は、それ自体でまたは別の基の一部としてここで用いられるとき、鎖長が限定されていない限り、１０炭素までの直鎖および分枝鎖双方の飽和官能基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、へプチル、４,４−ジメチルペンチル、オクチル、２,２,４−トリメチルペンチル、ノニル、デシルなどである。
【００２６】
本発明の具体例による全プロセスを、下のスキーム１ａおよび１ｂに例示する。
【００２７】
【化４】
2010539968.tif 000005
【００２８】
スキーム１ａに例示されるように、選択された酵素は、一方の異性体を他方の異性体に対して、立体選択的に加水分解し、例示された具体例において、Ｒ異性体がＳ異性体に対して優先的に加水分解される。スキーム１ａは、Ｒ異性体がどちらのエステルも加水分解されることを示しているが、選択された酵素はそれらのエステルのうちのひとつのみを大いに切断するであろうと考えられている。例えば、カルボキシルエステラーゼＮＰ（ＤＳＭ）は-ＣＯ２Ｒ２エステルを大いに切断すると考えられている。特に、混合メチル／エステル  ジエステルについて行われた実験は、カルボキシルエステラーゼ酵素がどちらのエステルも切断できるが、約７５％を超える生成物が式ＩＩＩａ′の化合物であることを示した。反応物中には、およそ１０％の別の位置異性体が存在した。
【００２９】
いくつかの具体例において、本発明は、式ＩＩ：
【００３０】
【化５】
2010539968.tif 000006
［式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｃ１−１０アルキルである。］の化合物を加水分解して；式ＩＩＩａおよび／またはＩＩＩａ′：
【００３１】
【化６】
2010539968.tif 000007
の化合物ならびに式ＩＩｂ：
【００３２】
【化７】
2010539968.tif 000008
の化合物を生成する方法に向けられる。式ＩＩＩａ／ＩＩＩａ′およびＩＩｂの化合物は、それぞれ、（Ｒ,Ｒ）−モナチンおよび（Ｓ,Ｓ）−モナチンの生成に有用である。
【００３３】
有用なＲ１およびＲ２は、Ｃ１−１０アルキル、特別にはＣ１−６アルキル、より特別にはＣ１−４アルキルを含む。有用なＲ１およびＲ２の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルおよびブチル、特にメチルおよびエチルを含む。いくつかの具体例において、Ｒ１およびＲ２はどちらもエチルである。
【００３４】
式ＩＩの化合物は、当該分野で公知の方法で合成できる。例えば、Ｒ１がメチルでＲ２がエチルである式ＩＩの化合物の合成が、C.W. Holzapfel, Synth. Comm. 24:3197-3211 (1994)に記載されている。米国特許第 5,128,482号も参照せよ。
【００３５】
式ＩＩｂの化合物が式ＩＩの化合物から他の鏡像異性体の除去によって「生成される」ことは、当業者には明らかである。すなわち、式ＩＩの化合物が式ＩＩａの化合物および式ＩＩｂの化合物の混合物（例えば、式ＩＩａの化合物および式ＩＩｂの化合物のラセミ混合物）であることが分かっていれば、ＩＩＩａに対するＩＩａの優先転換が非水和鏡像異性体における出発ラセミ混合物の豊富化につながる。かくして、出発ラセミ体ＩＩは、すでに説明した命名法を用いれば、「式ＩＩｂの化合物」となる。
【００３６】
当業者は、あるとしてもわずかな立体特異的反応しか立体異性体間を完全に区別しないことも理解している。かくして、式ＩＩの化合物の加水分解は式ＩＩＩｂ：
【００３７】
【化８】
2010539968.tif 000009
の化合物の生成をＩＩｂの望ましくない加水分解によって生じるであろう。そのような結果は本発明によって十分に考慮されているが、生成された式ＩＩＩｂの単一鏡像異性体の量は生成された標的の単一鏡像異性体（すなわち、式ＩＩＩａおよび／またはＩＩＩａ′）の量よりも少ない。
【００３８】
式ＩＩの化合物の加水分解は酵素的または非酵素的に達成することができる。ある具体例において、酵素的加水分解はカルボキシエステル化酵素、カルボキシエステラーゼＮＰを用いて達成することができる。酵素活性カルボキシルエステラーゼＮＰは、最初、Bacillus thai 1-8中に見出され、それは、アクセス番号CBS 679.85として寄託されている［Yuki, S., 1967, Jpn.  J. Genet. 42 p 251］。カルボキシルエステラーゼＮＰの遺伝子は、その後、Bacillus subtilis 1-85/pNAPT-7にクローン化され、それはアクセス番号CBS 673.86 として寄託されている［W J Quax and C. P. Broekhuizen 1994.  Development of a new Bacillus carboxyl esterase for use in the resolution of chiral drugs.  Journal Applied Microbiology and Biotechnology   41: 425-431］。これは、本研究で用いられた生物である。この遺伝子もクローン化され、Bacillus subtilis 1A-40/pNAPT-8 (CBS 674.86)、および Bacillus subtilis 1A-40/pNAPT-7 (CBS 675.86)として寄託されている。カルボキシエステラーゼＮＰの遺伝子配列は公開されている［Melloney J. Droege, Rein Bos and Wim J. Quax (2001). Paralogous gene analysis reveals a highly enantioselective 1,2-O-isopropylideneglycerol caprylate esterase of Bacillus subtilis. Eur. J. Biochem. 268: 3332-3338］。
【００３９】
酵素反応の生成物、例えば、式ＩＩＩａおよび式ＩＩａの化合物は、クロマトグラフ技術を用いて分離できる。本発明の方法のひとつの具体例は図１に代表されている。図１に示されるように、イソオキサゾリンジエステル（式ＩＩ、Ｒ１およびＲ２はエチル）は酵素的にカルボキシルエステラーゼＮＰと反応され、生成物はＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー―質量分析）クロマトグラフィー（ここでは、代表としてWaters Platform LC-MS  システムを用いた）で分離、分析された。
【００４０】
追加的にまたは代替的に、カルボン酸とエステルとの異なる反応性を利用して（［March and Larock, 上掲］を参照）、式ＩＩＩａまたは式ＩＩｂの化合物のうちのひとつを、他方から分離する前に、異なる化合物へと変換することができる。例えば、水素化ホウ素は、エステルよりも相当容易にカルボン酸を還元する（例えば、［Marchの１５４４−４６頁］を参照）。かくして、式ＩＩＩａの化合物を対応するアルコールに選択的に還元する水素化ホウ素を用いる還元条件に、その混合物を付すことができる。ついで、このアルコールを、クロマトグラフィーのごとき標準技術によって式ＩＩｂの化合物から分離できる。本発明は、式ＩＩＩａの化合物またはそれから誘導された化合物を、式ＩＩｂの化合物またはそれから誘導された化合物から上記の選択的加水分解によって分離するそのようないかなる分離をも、鏡像異性体的に純粋なまたは鏡像異性体的に豊富化された（Ｒ,Ｒ）−または（Ｓ,Ｓ）−モナチンを得るための手段として、「式ＩＩＩａの化合物を式ＩＩｂの化合物から分離すること」と考える。
【００４１】
いくつかの具体例において、本発明は、さらに、式ＩＩＩａの化合物を式Ｉａ：
【００４２】
【化９】
2010539968.tif 000010
の化合物、すなわち、（Ｒ,Ｒ）−モナチンへ転換することを含む。
【００４３】
いくつかの具体例において、式ＩＩＩａの化合物の式Ｉａの化合物への転換は、
（ａ）式ＩＩＩａの化合物を加水分解して、式ＩＶａ：
【００４４】
【化１０】
2010539968.tif 000011
の化合物を生成し；ついで、
（ｂ）式ＩＶａの化合物を水素化すること
により達成もできる。
【００４５】
加水分解に有用な試薬は当業者に周知であり、例えば、［M.B. Smith and J. March, March's Advanced Organic Chemistry, 5th ed., New York:  John Wiley & Sons, Inc., 2001 ("March"), 特に469-74頁］；および［R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, 2nd ed., New York:  John Wiley & Sons, Inc., 1999 ("Larock"), 特に1959-68頁］に記載されている。加水分解に有用な試薬の例は、LiOH、NaOH、KOHおよびBa(OH)2のごときＩＡおよびＩＩＡ族アルコキシドを含む。他の有用な試薬はSm/I2/MeOHおよびMgI2を含む。メチルエステルも、例えば、(Na2CO3 もしくは K2CO3)/MeOH/H2O、NaO2/DMSO、KSCN/DMF、EtSH/(AlCl3 もしくは AlBr3)、Me2S/(AlCl3 もしくは AlBr3)、(Li もしくは Na)SeCH3/DMF、NaCN/HMPA、(LiI もしくは LiBr)/DMF、LiI/(NaOAc もしくは NaCN)/DMF、BCl3、AlI3 または MeSiCl3で切断することができる。いくつかの具体例において、加水分解はMeOHまたはEtOHのごときアルコール性溶媒中でKOHを用いて行う。
【００４６】
さらに、式ＩＩＩａの化合物の式ＩＶａへの加水分解は加水分解酵素、および特に、式ＩＩＩａの化合物を生成物として受容し、かつ、式ＩＶａの化合物を生成することができるカルボキシエステル化酵素を用いて達成できる。
【００４７】
水素化の有用な条件は当業者に周知であり、例えば、［March and Larock, 上掲］に記載されている。いくつかの具体例において、水素化はＨ２およびスポンジ状ニッケル触媒を用いて行われる。
【００４８】
式ＩＶａの化合物の水素化が立体選択的に行われないならば、式Ｉａの化合物および式Ｉｃ：
【００４９】
【化１１】
2010539968.tif 000012
の化合物の混合物が生成される。例えば、図２を参照すると、水素化後に（Ｒ,Ｒ）−および（Ｒ,Ｓ）−モナチンを与えるイソオキサゾリンジエステル（式ＩＩ、Ｒ１およびＲ２はエチル）のカルボキシルエステラーゼＮＰ−触媒反応のキラルＨＰＬＣクロマトグラムが図示されている。
【００５０】
次いで、式Ｉａおよび式Ｉｃの化合物を、例えば、選択結晶化によって互いから分離する。これらの化合物はジアステレオマーとして関連し、ジアステレオマーの分離は周知であり、当該分野において通常業務と考えられている。例えば、［D. Kozma (ed.), CRC Handbook of Optical Resolutions via Diastereomeric Salt Formation, CRC Press:  Boca Raton (2002)］を参照せよ。
【００５１】
いくつかの具体例において、本発明は、さらに、式ＩＩｂの化合物を式Ｉｂ：
【００５２】
【化１２】
2010539968.tif 000013
の化合物に転換することを含む。
【００５３】
いくつかの具体例において、式ＩＩｂの化合物の式Ｉｂの化合物への転換は、
（ａ）式ＩＩｂの化合物を加水分解して、式ＩＶｂ：
【００５４】
【化１３】
2010539968.tif 000014
の化合物を生成し；ついで
【００５５】
（ｂ）式ＩＶｂの化合物を水素化すること
によって達成することができる。
【００５６】
式ＩＶｂの化合物の水素化が、立体選択的に行われないならば、式Ｉｂの化合物および式Ｉｄ：
【００５７】
【化１４】
2010539968.tif 000015
の化合物の混合物が生成される。次いで、式Ｉｂおよび式Ｉｄの化合物を互いから分離する。これらの化合物はジアステレオマーとして関連し、上記のように、ジアステレオマーの分離は周知であり、当該分野において通常業務と考えられている。 
【００５８】
本発明の特定の方法を以下の実施例で例示する。ここに複数の具体例を開示するが、本発明のさらに別の具体例が、この明細書全体の精査から当業者に明らかになるであろう。ここの記載から理解されるように、本発明は、本発明の真髄および範囲から逸脱しない全ての様々な局面の修正が可能である。したがって、図面および明細書全体は本質的に例示的なものであって、限定的な意味はないと理解されるべきである。
【実施例】
【００５９】
実施例１：イソオキサゾリンジエステルについての加水分解酵素のスクリーニング
スクリーニングは０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７中で行われる。１％トリトンＸ−１００をこのバッファーに添加し、ついで、イソオキサゾリンジエステルを３７℃にてゆっくりと飽和に達するまで添加する。
【００６０】
上記溶液の１．５ｍｌのアリコートをエッペンドルフ管に入れ、異なる加水分解酵素をそれらの管に添加する。マイクロスパチュラの先端量の粉末化酵素を用いるか、１００μｌの液体酵素を用いる。反応物を、適当な温度、通常は室温にて、振盪器上で２０時間インキュベートする。
【００６１】
インキュベーション後、反応混合物を１０,０００ｒｐｍにて２分間遠心していかなる不溶物をも除去する。ついで、サンプルをＨＰＬＣで分析する。Phenomenex Luna C18 カラムを、溶出液Ａ：TEA中の0.1% H3PO4 pH 3.5 および溶出液Ｂ: 100% アセトニトリルからなる線形勾配として用いる。
【００６２】
実施例２：イソオキサゾリンジエステルに対するカルボキシルエステラーゼＮＰ（ＤＳＭ）活性の評価
カルボキシルエステラーゼＮＰのみを、実施例１のプロトコルに準じて活性につき試験した。ＨＰＬＣにより単一の生成物ピークが得られ、それは、水素化および精製後のキラルＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳによれば、鏡像異性体的に純粋なＲ−モナチンに対応する。
【００６３】
実施例３：モナチンの合成
カルボキシルエステラーゼＮＰを、さらなる分析作業を行うため、１０ｍｌスケールで再試験した。
【００６４】
１％トリトンＸ−１００を含有する１０ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウムを試験管に入れた。５０ｍｇの基質を添加し、５０ｍｇの乾燥酵素または１ｍｌの液体酵素のいずれかを添加した。試験管を封鎖し、反応物を１８０ｒｐｍにて２０時間、４０℃にて振盪した（微生物の増殖を防ぐため）。未反応の基質を３０００ｒｐｍにて３分間の遠心により除去し、等量の酢酸エチルでの抽出によっていかなる過剰な基質をも除去した。水相をＫＯＨで加水分解し、ついで、水素化してモナチンを得た。
【００６５】
この反応は、アキラルおよびキラル分析ならびにＬＳ−ＭＳによって定量したところ、Ｒ′Ｒ′モナチンとＲ′Ｓ′モナチンとをほぼ等量生じた。図２は、水素化後に（Ｒ,Ｒ）−および（Ｓ,Ｓ）−モナチンを与えるイソオキサゾリンジエステル（式ＩＩ、Ｒ１およびＲ２はエチル）のカルボキシエステル化酵素ＮＰ−触媒反応のキラルＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００６６】
実施例４：カルボキシルエステラーゼＮＰでのイソオキサゾリンジエステルの酵素加水分解
この反応は１％トリトンＸ−１００を含有する０．１Ｍリン酸バッファー中、３７℃およびｐＨ７にて行われた。基質イソオキサゾリンジエステルを２００ｍＬのバッファーに添加し、混合物を飽和溶液になるまで攪拌した。２００μＬの液体酵素カルボキシルエステラーゼＮＰ（ＤＳＭ）を２ｍＬの反応混合物に添加した。反応物を４０℃にて２０時間２３０ｒｐｍにて攪拌した。反応の終わりに、反応混合物をエッペンドルフ管に移し、遠心していかなる未溶解の物質も除去した。上清をWaters Platform LC-MSシステムで分析した。反応混合物を酢酸エチルで抽出して、未反応の基質を除去し、加水分解生成物を水性反応混合物に残した。クロマトグラフ分離は、その出力は図１に示すが、Waters Alliance 2695 HPLCシステムおよびPhenomenex Gemini C18 カラム (250 mm x 2.1 mm (5 μm))で行った。出発溶出液は、１０ｍＭ酢酸アンモニウム（酢酸でｐＨ４．５）および５％アセトニトリルを含有する９５％水であった。これらの条件を５分間維持した後、１５分間で１００％アセトニトリルまで線形勾配、ついで、１００％アセトニトリルを２分間維持した。ついで、カラムを初期条件に戻し、７分間安定化した。総ラン時間は３０分間であった。フローレートは０．２ｍＬ／分であり、カラム温度は４０℃に安定に保った。質量分析をエレクトロスプレーモードで行い、＋／−電圧スイッチングを用いた。分析条件を以下にまとめる。
キャピラリー電圧 2.5 kV; コーン電圧 25 V; エクストラクターレンズ電圧 1 V; RF レンズ電圧 0.5 V; ソースブロック温度 120℃; 脱溶媒温度 450℃; スキャン質量範囲100-400 ダルトン (0.5 秒サイクル時間)。窒素を噴霧および脱溶媒ガスとして用い、それぞれのフローレートは７５および５７５Ｌ／時間であった。Waters 2996 Photo Diode Array (PDA) 検出器を用いて、クロマトグラフ分離を最適化し、200-600 nmの波長領域をカバーするスキャンモードで用いた。
【００６７】
実施例５：化学加水分解および水素化
反応は２０ｍＬ加圧反応器中で行った。実施例２で生成されたような反応混合物（２５ｍｇのモノエステルを含有する１０ｍＬ体積）をエタノール（１．５ｍＬ）で処理し、ｐＨを水酸化カリウム（２００ｍｇ）で１２に調節した。反応混合物を室温にて３０分間攪拌し、その後、ＨＰＬＣによる分析で、二酸への完全加水分解が示された。この混合物にスポンジ状ニッケル触媒(A-7063, 50 mg)を約５０％の水を含有する湿ったペーストとして添加した。反応器を封鎖し、３回脱気と水素ガスパージを行い、最後には、容器を水素で５バールに加圧した。反応を攪拌しながらこれらの条件下で６０分間継続し、ＨＰＬＣでモニターした。
【００６８】
本発明を今まで完全に説明してきたが、本発明の範囲やそのいかなる具体例にも影響を与えることなく、条件、組成および他のパラメータの広範かつ等価な範囲内で、同じことが行えることを当業者は理解するであろう。ここに引用される全ての特許および刊行物はここに出典明示して、それらの全てが完全に本明細書に含まれるものとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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