(57)【要約】ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン-2-インドリノン化合物、特に2-(2-オキソインドリン-3-イリデン)メチル-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-6,7-ジヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4(5H)-オン化合物を提供する。その調製および薬学的組成物、ならびにタンパク質キナーゼ阻害剤としての薬学的使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）を有する化合物またはその薬学的に許容される塩：
2010535819.tif 000063
式中、
R1、R2、R3、R4は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、アリール、ヘテロアリール、-OR5、-O[CH2CH2O]rR7、-NR5R6、-COR5および-NR5COR6からなる群より選択され、アリールまたはヘテロアリールは、アルキル、アルコキシル、およびハロゲンからなる群より選択される1つまたは複数の基によってさらに置換され；
R5およびR6は、それぞれ独立して、水素およびアルキルからなる群より選択され、アルキルは、アリール、ヘテロアリール、ハロアリール、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、カルボン酸、およびカルボン酸エステルからなる群より選択される1つまたは複数の基によってさらに置換され；
R7は水素またはアルキルであり；ならびに
rは1〜6の整数である。
【請求項２】
以下を含む、請求項1記載のピロロ縮合（pyrrolofused）6員複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物またはその薬学的に許容される塩：
2010535819.tif 000064
2010535819.tif 000065
。
【請求項３】
請求項1または2記載のピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効治療量と共に、薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項４】
薬学的に許容される塩が、化合物と、リンゴ酸、乳酸、マレイン酸、塩酸、メタンスルホン酸、硫酸、リン酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、およびトリフルオロ酢酸からなる群より選択される酸とで形成された塩である、請求項1記載のピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
酸がリンゴ酸またはマレイン酸である、請求項4記載のピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
以下の段階を含む、請求項1記載のピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物またはその薬学的に許容される塩の調製方法：
1-アミノ-3-モルフォリン-4-イル-プロパン-2-オールの光学活性化合物（Ia）を5-カルボキシメチル-3-メチル-1H-ピロール-2,4-ジカルボン酸2-tert-ブチルエステル4-エチルエステルと共に、アセトニトリル中で1-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびN-エチル-N'-(ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドの存在下で加熱して、窒素雰囲気下でキラルピロールアミドジカルボン酸ジエステル（Ib）を得る段階；
2010535819.tif 000066
キラルピロールアミドジカルボン酸ジエステル（Ib）を塩酸と共にエタノール中で加熱還流して、アルゴン雰囲気下で光学活性ピロールアミドエチルエステル（Ic）を得る段階；
2010535819.tif 000067
さらに、光学活性ピロールアミドエチルエステル（Ic）をボランと共に無水テトラヒドロフラン中で選択的還元によって加熱還流して、キラル置換ピロールエチルエステル（Id）を得る段階；
2010535819.tif 000068
次に、キラル置換ピロールエチルエステル（Id）を水酸化リチウム一水和物と共にグリコール中で加熱還流して、アルゴン雰囲気下で光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環（Ie）の環状化産物を得る段階；
2010535819.tif 000069
光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環（Ie）をオキシ塩化リンおよびN,N-ジメチルホルムアミドと共に室温で無水ジクロロメタン中でホルミル化反応によって反応させ、光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環ホルムアルデヒド（If）を得る段階；
2010535819.tif 000070
最後に、光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環ホルムアルデヒド（If）を、トリエチルアミンまたはピペリジンなどの塩基の存在下で、異なるインドリノンと共に2〜12時間加熱して、式（I）のキラルピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の標的産物を得る段階；
2010535819.tif 000071
。
【請求項７】
請求項1〜5のいずれか一項記載のピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体またはその薬学的に許容される塩をタンパク質キナーゼに接触させる段階を含む、タンパク質キナーゼの触媒活性を調節するための方法。
【請求項８】
タンパク質キナーゼが、受容体チロシンキナーゼ（RTK）、非受容体タンパク質チロシンキナーゼ（CTK）、およびセリン／トレオニンタンパク質キナーゼ（STK）からなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
タンパク質キナーゼ関連障害を処置するための薬剤の調製における請求項1記載の化合物の使用。
【請求項１０】
タンパク質キナーゼ関連障害が、VEGFR-2、EGFR、HER-2、HER-3、HER-4、PDGFR、c-Kit、c-Met、FGFR、およびFlt3に関連する障害から選択される、請求項9記載の使用。
【請求項１１】
請求項3記載の薬学的組成物をタンパク質キナーゼに接触させる段階を含む、タンパク質キナーゼの触媒活性を調節するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一連の新規ピロロ縮合（pyrrolofused）6員アザ-複素環ヒドロキシルモルヒネ誘導体、特に新規2-(2-オキソインドリン-3-イリデン)メチル-5-(2-ヒドロキシル-3-モルフィン-4-イル-プロピル)-6,7-ジヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4(5H)-オン誘導体、その調製、そのような誘導体を含有する薬学的組成物、およびそのような誘導体を治療物質として、特にタンパク質キナーゼ阻害剤として用いることに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞のシグナル伝達は、それによって細胞外刺激が細胞の内部に中継されて、その後多様な細胞プロセスを規制する基本的な機構である。これらのシグナルは、増殖、分化、アポトーシス、および運動性が含まれる細胞における広く多様な物理的応答を規制する。細胞外シグナルは、パラクライン、オートクライン、および内分泌因子と共に増殖因子が含まれる多種多様な可溶性因子の形をとる。特異的膜貫通受容体に結合することによって、増殖因子リガンドは、細胞外シグナルを細胞内シグナル伝達経路に伝達して、それによって個々の細胞を細胞外シグナルに応答させる。これらのシグナル伝達プロセスの多くは、特異的タンパク質キナーゼおよびホスファターゼを必要とするタンパク質リン酸化の可逆的プロセスを利用する。
【０００３】
タンパク質キナーゼ（PK）は、シグナル伝達プロセスにおいて重大な役割を果たす。これは、機能的タンパク質における特異的アミノ酸残基にATPからのγリン酸基を転移して、それによって一連の生物学的応答が起こる。タンパク質キナーゼは、リン酸化プロセスにおける基質としてのアミノ酸特異性に従って2つの群に分類される：セリン／トレオニンキナーゼ（STK）およびタンパク質チロシンキナーゼ（PTK）。
【０００４】
チロシンリン酸化の機構は、シグナル伝達プロセスにおいて広く存在して、分裂、細胞周期の進行および分化等などのいくつかの細胞機能を制御する（Hanks and Hunter, 1995, FASEB J. 9:576-596（非特許文献1）；Cadena and Gill, 1992, FASEB J. 6:2332-2337（非特許文献2）；Schlessinger and Ullrich, 1992, Neuron 9:383-391（非特許文献3）；Vandergeer et al., 1994, Annu. Rev. Cell Biol. 10:251-337（非特許文献4））。タンパク質チロシンキナーゼの変異、制御されないまたは異常な高レベル発現によって、正常細胞の新生物表現型への変換が起こることが示されている（Chiao et al., 1994, Cancer Metast. Rev. 9:63-80（非特許文献5）；Hunter, 1991, Cell 64:249-270（非特許文献6））。
【０００５】
血管内皮増殖因子（VEGF）は、血管内皮細胞に作用する非特異的増殖因子として同定され、内皮細胞の増殖の刺激、微小血管透過性の増加、および血管新生の誘導などの様々な機能を有することが見いだされている（Hanks and Hunter, 1995, FASEB J. 9:576-596（非特許文献1））。VEGFは、最も有効で直接的に作用する血管新生タンパク質であることが知られている。これは、拡散可能な内皮細胞特異的マイトゲンであり、血管増殖因子である（Ferrara N et al., EndocrRev, 1997, 18, 4-25（非特許文献7）；Tofimura T et al., Hum Pharthol, 1998, 29, 986-991（非特許文献8））。VEGFファミリーには、現在6つの公知のメンバーが含まれる：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、および胎盤増殖因子（PDF）、これらは全て二量体糖タンパク質の形である。VEGFファミリーメンバーは全て「システインノット」モチーフと呼ばれる特徴的な規則的に間隔をあけた8個のシステイン残基を含有する。Li lingら（Li ling et al., Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2002, 34(1), 21-27（非特許文献9））は、悪性腫瘍細胞における高いVEGF発現と共にFlk-1の高い発現を明らかにしたが、このことは腫瘍内にオートクラインおよびパラクラインVEGFループの双方が存在することを暗示している。VEGF発現は明らかに腫瘍内微小血管密度と相関して、組織中のVEGF濃度は乳癌、肺癌、前立腺癌、および結腸癌などの固形腫瘍の予後と相関する。低酸素症が、VEGF発現の刺激において重大な役割を果たすことは公知である。遺伝子転写速度の増強のほかに、腫瘍細胞における低酸素症誘導VEGF遺伝子発現もまた、VEGF mRNAの安定化を促進する。VEGFRファミリーに属する異なる3つのメンバーが同定されている：VEGFR-1/Flt-1、VEGFR-2/Flk-1/KDR、およびVEGFR-4/Flt-4。VEGFR-1およびVEGFR-2は、その発現が主に腫瘍血管内皮細胞に限定される細胞表面チロシンキナーゼ受容体に属する。血管内皮増殖因子（VEGF）および血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）は、腫瘍の血管新生プロセスにおいて重要な役割を果たしており、抗癌生物療法のための重要な標的として確認されている。
【０００６】
抗腫瘍療法のためにVEGFおよびVEGFRを標的とする5つの戦略は、以下のように考察されるであろう：1．遺伝子治療（Ellis LM et al. J Biol Chem 1998, 273, 1052-1057（非特許文献10））：VEGFおよびVEGFRは、腫瘍の血管新生の正の規制に関係している。遺伝子治療は、VEGF/VEGFR発現を低減させるか、またはシグナル伝達経路を破壊してその生物活性を阻害する。2．抗VEGF/VEGFRモノクローナル抗体（Gordon M et al. Proc Am Soc Clin Oneol, I998, I7, 2IIa（非特許文献11））：VEGF/VEGFRに対するモノクローナル抗体は、分泌されたVEGFおよびVEGFRを遮断して、細胞内VEGFシグナル伝達を破壊して血管新生を阻害する。3．低分子阻害剤：Sugenによって開発された一連のsu化合物。4．可溶性VEGFR：これはVEGFに結合するが、シグナル伝達機能を有しない。5．定方向治療：Flt-1およびFlk-1/KDRの2つの主なVEGF受容体は、腫瘍の血管内皮細胞において過剰発現されるが、隣接する正常な組織血管内皮では検出することができない。よって、VEGFおよびVEGFRは、腫瘍に向けた治療の特異的標的を提供する。VEGFは、腫瘍に向けた治療のための他の抗腫瘍物質、毒素、放射性核種と組み合わせることができる。
【０００７】
本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤SU-14813およびピロロ縮合6員アザ-複素環誘導体Aの有効な抗癌剤に基づいて、式（I）の類似体を設計することに向けられる。本発明の化合物は、先行技術における既存の化合物と明白な構造の差を有し、それらはまたより多くの有効性およびより多くの機能を示す。
2010535819.tif 000002
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hanks and Hunter, 1995, FASEB J. 9:576-596
【非特許文献２】Cadena and Gill, 1992, FASEB J. 6:2332-2337
【非特許文献３】Schlessinger and Ullrich, 1992, Neuron 9:383-391
【非特許文献４】Vandergeer et al., 1994, Annu. Rev. Cell Biol. 10:251-337
【非特許文献５】Chiao et al., 1994, Cancer Metast. Rev. 9:63-80
【非特許文献６】Hunter, 1991, Cell 64:249-270
【非特許文献７】Ferrara N et al., EndocrRev, 1997, 18, 4-25
【非特許文献８】Tofimura T et al., Hum Pharthol, 1998, 29, 986-991
【非特許文献９】Li ling et al., Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2002, 34(1), 21-27
【非特許文献１０】Ellis LM et al. J Biol Chem 1998, 273, 1052-1057
【非特許文献１１】Gordon M et al. Proc Am Soc Clin Oneol, I998, I7, 2IIa
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、式（I）を有するピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の一定の化合物、特に新規タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤2-(2-オキソインドリン-3-イリデン)メチル-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフィン-4-イル-プロピル)-6,7-ジヒドロ-1H-ピロール[3,2-c]ピリジン-4(5H)-オン化合物、その互変体、エナンチオマー、生理的に許容される塩、代謝物、代謝プロドラッグ、およびタンパク質キナーゼ活性の規制におけるその活性に向けられる。
2010535819.tif 000003
式中
R1、R2、R3、R4は、それぞれ独立して水素、ハロゲン、アルキル、アリール、ヘテロアリール、-OR5、-O[CH2CH2O]rR7、-NR5R6、-COR5および-NR5COR6からなる群より選択され、アリールまたはヘテロアリールは、アルキル、アルコキシル、およびハロゲンからなる群より選択される1つまたは複数の基によってさらに置換されてもよく；
R5およびR6はそれぞれ、水素およびアルキルからなる群より独立して選択され、アルキルは、アリール、ヘテロアリール、ハロアリール、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、カルボン酸、およびカルボン酸エステルからなる群より選択される1つまたは複数の基によってさらに置換されてもよく；
R7は水素またはアルキルであり；ならびに
rは1〜6の整数である。
【００１０】
本発明の代表的な化合物には、以下、またはその薬学的に許容される塩が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
2010535819.tif 000004
2010535819.tif 000005
2010535819.tif 000006
2010535819.tif 000007
【００１１】
ここで、本発明に従う薬学的に許容される塩は、本発明の化合物とリンゴ酸、乳酸、マレイン酸、塩酸、メタンスルホン酸、硫酸、リン酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、またはトリフルオロ酢酸から選択される酸とによって形成された塩であり、好ましくは酸はリンゴ酸またはマレイン酸である。
【００１２】
本発明のもう1つの局面は、式（I）を有するピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物、またはその薬学的に許容される塩、担体、もしくは賦形剤を含む薬学的組成物に向けられる。
【００１３】
本発明のもう1つの局面は、タンパク質キナーゼを、式（I）を有するピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物、またはその薬学的に許容される塩、担体、もしくは賦形剤に接触させる段階を含む、タンパク質キナーゼの触媒活性を調節する方法に向けられる。タンパク質キナーゼは、受容体チロシンキナーゼ（RTK）、非受容体タンパク質チロシンキナーゼ（CTK）、およびセリン／トレオニンタンパク質キナーゼ（STK）から選択される。
【００１４】
もう1つの局面において、本発明は、タンパク質キナーゼ関連障害を処置するための薬剤の調製において、式（I）を有するピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物を用いることに向けられる。タンパク質キナーゼ関連障害は、EGFR、HER-2、HER-3、HER-4、PDGFR、VEGFR-2、c-Kit、c-Met、FGFR、およびFlt3に関連する障害から選択される。
【００１５】
本発明のもう1つの局面は、以下の段階を含む、式（I）を有するピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体またはその薬学的に許容される塩の調製プロセスである：
1-アミノ-3-モルフォリン-4-イル-プロパン-2-オールの光学活性化合物（Ia）を5-カルボキシメチル-3-メチル-1H-ピロール-2,4-ジカルボン酸2-tert-ブチルエステル4-エチルエステルと共に、アセトニトリル中で1-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびN-エチル-N'-(ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドの存在下で加熱して、窒素雰囲気下でキラルピロールアミドジカルボン酸ジエステル（Ib）を得る段階；
2010535819.tif 000008
キラルピロールアミドジカルボン酸ジエステル（Ib）を塩酸と共にエタノール中で加熱還流して、アルゴン雰囲気下で光学活性ピロールアミドエチルエステル（Ic）を得る段階；
2010535819.tif 000009
さらに、光学活性ピロールアミドエチルエステル（Ic）をボランと共に無水テトラヒドロフラン中で選択的還元によって加熱還流して、キラル置換ピロールエチルエステル（Id）を得る段階；
2010535819.tif 000010
次に、キラル置換ピロールエチルエステル（Id）を水酸化リチウム一水和物と共にグリコール中で加熱還流して、アルゴン雰囲気下で光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環（Ie）の環状化産物を得る段階；
2010535819.tif 000011
光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環（Ie）をオキシ塩化リンおよびN,N-ジメチルホルムアミドと共に、室温で無水ジクロロメタン中でホルミル化反応によって反応させて、光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環ホルムアルデヒド（If）を得る段階；
2010535819.tif 000012
最後に、光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環ホルムアルデヒド（If）を、トリエチルアミンまたはピペリジンなどの塩基の存在下で異なるインドリノンと共に2〜12時間加熱して、式（I）のキラルピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の標的産物を得る段階；
2010535819.tif 000013
式中、R1、R2、R3、R4は、先に定義したとおりである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
特に明記していなければ、説明および特許請求の範囲において用いられた以下の用語は、以下に考察される意味を有する。
【００１７】
「アルキル」は、炭素原子1〜20個の直鎖および分岐鎖の基が含まれる飽和脂肪族炭化水素基を指す。好ましくは、アルキル基は、炭素原子1〜10個を有する中等度の大きさのアルキル、たとえばメチル、エチル、プロピル、2-プロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、ペンチル等である。より好ましくは、これは炭素原子1〜4個を有する低級アルキル、たとえばメチル、エチル、プロピル、2-プロピル、n-ブチル、イソブチル、またはtert-ブチル等である。アルキル基は置換されてもよく、または置換されなくてもよい。置換される場合、置換基は、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、ハロアリール、アリールオキシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、-OR5、-O[CH2CH2O]rR7、-NR5R6、-COR5、および-NR5COR6からなる群より選択されてもよい。
【００１８】
「アリール」は、少なくとも1つの芳香環、すなわち全ての炭素環アリール、ヘテロアリール、およびビアリール基が含まれる共役π電子系を有する基を指す。アリール基は、置換されてもよく、または置換されなくてもよい。置換される場合、置換基は、ハロ、アルコキシル、アルキル、ヒドロキシル、アリールオキシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、-OR5、-O[CH2CH2O]rR7、-NR5R6、-COR5、および-NR5COR6からなる群より選択されてもよい。
【００１９】
「ヘテロアリール」は、環原子としてO、S、およびNからなる群より選択される環ヘテロ原子1〜3個を有し、残りの環原子がCであるアリールを指す。環は、5員環または6員環である。ヘテロアリール基の例には、フリル、チエニル、ピリジル、ピロリル、N-アルキルピロリル、ピリミジニル、ピラジニル、イミダゾリル等が含まれる。ヘテロアリール基は、置換されてもよく、または置換されなくてもよい。置換される場合、置換基は、ハロ、アルコキシル、アルキル、ヒドロキシル、アリールオキシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、-OR5、-O[CH2CH2O]rR7、-NR5R6、-COR5、および-NR5COR6からなる群より選択されてもよい。
【００２０】
「ヒドロキシル」は、-OH基を指す。
【００２１】
「アルコキシル」は、-O-(アルキル)および-O-(非置換シクロアルキル)基の双方を指す。代表的な例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。アルコキシル基は置換されてもよく、または置換されなくてもよい。置換される場合、置換基は、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシル、アリール、ヘテロアリール、ハロアリール、アリールオキシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、-OR5、-O[CH2CH2O]rR7、-NR5R6、-COR5、および-NR5COR6からなる群より選択されてもよい。
【００２２】
「アリールオキシル」は、アリールおよびヘテロアリールが先に定義されたとおりである、-O-アリールおよび-O-ヘテロアリール基の双方を指す。代表的な例には、フェノキシ、ピリジニルオキシ、フラニルオキシ、チエニルオキシ、ピリミジニルオキシ、ピラジニルオキシ等、およびその誘導体が含まれるがこれらに限定されるわけではない。アリールオキシル基は置換されてもよく、または置換されなくてもよい。置換される場合、置換基は、ハロ、アルコキシル、アルキル、ヒドロキシル、アリールオキシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、-OR5、-O[CH2CH2O]rR7、-NR5R6、-COR5、および-NR5COR6からなる群より選択されてもよい。
【００２３】
「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを指し、好ましくはフルオロまたはクロロを指す。
【００２４】
「ハロアルコキシ」は、-O-(ハロアルキル)を指す。代表的な例には、トリフルオロメトキシ、トリブロモエトキシ等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００２５】
「カルボン酸」は、(アルキル)C(=O)OHを指す。
【００２６】
「カルボキシレート」は、(アルキル)C(=O)O(アルキル)を指す。
【００２７】
「任意で」または「任意に」とは、その後に記述される事象または状況が起こってもよく起こらなくてもよいこと、およびその記述に、事象または状況が起こってもよいまたは起こらなくてもよい例が含まれることを意味する。たとえば、「アルキル基によって置換されてもよい複素環基」は、アルキルが存在してもしなくてもよいことを意味し、この説明には、複素環がアルキル基によって置換される状況と複素環基がアルキル基によって置換されない状況とが含まれる。
【００２８】
「薬学的組成物」は、本明細書において記述される化合物またはその生理的／薬学的に許容される塩またはプロドラッグの1つまたは複数と、生理的／薬学的に許容される賦形剤剤などの他の化学成分との混合物を指す。薬学的組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【００２９】
調製法
本発明の目標を完全にするために、本発明は、以下の技術的解決策を応用する：
以下の段階を含む、式（I）のピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物またはその薬学的に許容される塩の調製プロセス：
2010535819.tif 000014
【００３０】
1-アミノ-3-モルフォリン-4-イル-プロパン-2-オールの光学活性化合物（Ia）（特許第US20040209937号に従って調製）を開始材料として、光学活性1-アミノ-3-モルフォリン-4-イル-プロパン-2-オール（Ia）を5-カルボキシメチル-3-メチル-1H-ピロール-2,4-ジカルボン酸2-tert-ブチルエステル4-エチルエステルと共に、アセトニトリル中で1-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびN-エチル-N'-(ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドの存在下で加熱して、窒素雰囲気下でキラルピロールアミドジカルボン酸ジエステル（Ib）を得る段階；キラルピロールアミドジカルボン酸ジエステル（Ib）を塩酸と共にエタノール中で加熱還流してアルゴン雰囲気下で光学活性ピロールアミドエチルエステル（Ic）を得る段階；さらに、光学活性ピロールアミドエチルエステル（Ic）をボランと共に無水テトラヒドロフラン中で選択的還元によって加熱還流して、キラル置換ピロールエチルエステル（Id）を得る段階；次に、キラル置換ピロールエチルエステル（Id）を水酸化リチウム一水和物と共にグリコール中で加熱還流して、アルゴン雰囲気下で光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環（Ie）の環状化産物を得る段階；光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環（Ie）をオキシ塩化リンおよびN,N-ジメチルホルムアミドと共に室温で無水ジクロロメタン中でホルミル化反応によって反応させて、光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環ホルムアルデヒド（If）を得る段階；最後に、光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環ホルムアルデヒド（If）を、トリエチルアミンまたはピペリジンなどの塩基の存在下で異なるインドリノンと共に2〜12時間加熱して、式（I）のキラルピロロ縮合6員複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の標的産物を得る段階。ここで、重要な技術は、ボランによる基質（Ic）の選択的還元、および塩基触媒である水酸化リチウム一水和物による基質（Id）の触媒環状化である。特に後者に関して、そのようなピロロ縮合6員ラクタム構造を構築するためのアプローチに関する関連する参考文献はない。
【００３１】
本発明はまた、式（I）の化合物またはその塩の有効な治療的用量と共に薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物にも関する。
【００３２】
本発明はさらに、タンパク質キナーゼ阻害剤としての薬剤の調製における式（I）の本発明の化合物またはその塩の使用に関する。
【００３３】
好ましい態様
以下の実施例は本発明を説明するために役立つが、実施例は本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【００３４】
化合物の構造は、核磁気共鳴（NMR）または質量分析（MS）によって同定した。NMRケミカルシフト（δ）は、百万分率（ppm）で与えられた。NMRは、Bruker AVANCE-400機器によって決定した。溶媒は重水素化クロロホルム（CDCl3）および重水素化ジメチルスルホキシド（DMSO-d6）であり、内部標準としてテトラメチルシラン（TMS）であった。ケミカルシフトは、百万分率（ppm）で与えられた。
【００３５】
MSは、FINNIGAN LCQAd（ESI）質量分析計によって決定した。
【００３６】
薄層シリカゲルは、Yantai Huanghai HSGF254またはQingdao GF254シリカゲルプレートであった。
【００３７】
カラムクロマトグラフィーは一般的にYantai Huanghai 200-300メッシュシリカゲルを担体として用いた。
【００３８】
DMSO-D6：重水素化ジメチルスルホキシド。
【００３９】
CDCl3：重水素化クロロホルム。
【００４０】
調製実施例
実施例1
(R,Z)-2-(5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000015
2010535819.tif 000016
【００４１】
段階1
5-[(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルカルバモイル)-メチル]-3-メチル-1H-ピロール-2,4-ジカルボン酸(S)-2-tert-ブチルエステル4-エチルエステル
(S)-1-アミノ-3-モルフォリン-4-イル-プロパン-2-オール1a（15.125 g、94.5 mmol）、5-カルボキシメチル-3-メチル-1H-ピロール-2,4-ジカルボン酸2-tert-ブチルエステル4-エチルエステル（32.34 g、104 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（25.5 g、189.06 mmol）、およびN-エチル-N'-(ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド（36.2 g、189.06 mmol）を、アセトニトリル450 mLに室温で撹拌しながら溶解して、反応混合物を50℃の油浴中で3時間撹拌した。薄層クロマトグラフィー（TLC）が開始材料の消失を示した場合に反応は完了し、減圧下で溶媒を蒸発させて、飽和塩水150 mLを残渣に加えた。混合物を酢酸エチルとテトラヒドロフランの溶媒混合物（V：V＝4：1、200 mL×5）によって抽出した。合わせた有機抽出物を飽和塩水（100 mL）によって洗浄して、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させて、濾過して乾燥剤を除去した。濾液を減圧下で濃縮すると油（75 g）が与えられた。油をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製すると、表題の化合物5-[(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルカルバモイル)-メチル]-3-メチル-1H-ピロール-2,4-ジカルボン酸(S)-2-tert-ブチルエステル4-エチルエステル1b（30 g、収率70％）が薄茶色の固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：454.4[M+1]。
【００４２】
段階2
(S)-2-[(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルカルバモイル)-メチル]-4-メチル-1H-ピロール-3-カルボン酸エチルエステル
5-[(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルカルバモイル)-メチル]-3-メチル-1H-ピロール-2,4-ジカルボン酸(S)-2-tert-ブチルエステル4-エチルエステル1b（25.7 g、56.7 mmol）を無水エタノール70 mLに撹拌しながらアルゴン雰囲気下で溶解して、塩酸（12 N）71 mLを氷水浴中で溶液に滴下して加えた。添加が完了した後、氷水浴を外した。反応系を60℃の油浴中で1.5時間撹拌した。TLCが開始材料の消失を示す場合、反応は完了し、ドライアイス-アセトン浴において10 N水酸化ナトリウム溶液によって反応系のpHを約7に調整すると、大量の沈殿物が形成された。混合物を濾過して、濾過ケークをエタノールによって洗浄した。濾液を減圧下で濃縮して溶媒を除去して、残渣のpHを10N水酸化ナトリウム溶液によって約10に調整した。混合物をジクロロメタン（150 mL×3）によって抽出した。合わせた有機抽出物を飽和塩水（100 mL）によって洗浄して、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させて、濾過して乾燥剤を除去して、減圧下で濃縮すると、表題の化合物(S)-2-[(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルカルバモイル)-メチル]-4-メチル-1H-ピロール-3-カルボン酸エチルエステル1c（16.9 g、収率84％）が暗緑色の油として与えられた。
MS m/z（ESI）：354.3[M+1]。
【００４３】
段階3
(S)-2-[2-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルアミノ)-エチル]-4-メチル-1H-ピロール-3-カルボン酸エチルエステル
(S)-2-[(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルカルバモイル)-メチル]-4-メチル-1H-ピロール-3-カルボン酸エチルエステル1c（16.9 g、47.9 mmol）を、無水テトラヒドロフラン143.6 mLにアルゴン雰囲気下で溶解して、ボラン-テトラヒドロフラン複合体のテトラヒドロフラン溶液（143.6 mL、1 mol/L、143.6 mmol）を氷水浴中で溶液に加えた。添加が完了した後、氷水浴を外した。反応系を室温まで加温して95℃の油浴中で1時間還流した。TLCが開始材料の消失を示した場合、反応は完了した。減圧下で溶媒を蒸発させ、次に塩酸（2 N）150 mLを残渣に加えた。混合物を0.5時間撹拌した後、氷水50 mLを加えた。10 N水酸化ナトリウム溶液によって混合物のpHを約10に調整して、酢酸エチル（200 mL×2）によって抽出した。合わせた有機抽出物を飽和塩水（100 mL）によって洗浄して、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させて、濾過して乾燥剤を除去し、減圧下で濃縮すると、表題の化合物(S)-2-[2-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルアミノ)-エチル]-4-メチル-1H-ピロール-3-カルボン酸エチルエステル1d（15.6 g、収率96％）が茶色の油として与えられた。
MS m/z（ESI）：340.3[M+1]。
【００４４】
段階4
(R)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
(S)-2-[2-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルアミノ)-エチル]-4-メチル-1H-ピロール-3-カルボン酸エチルエステル1d（16.2 g、47.9 mmol）および水酸化リチウム一水和物（8 g、190.6 mmol）を、アルゴン雰囲気下で撹拌しながらグリコール50 mLに溶解した。反応系を135℃の油浴中で50分間撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合、反応は完了した。減圧下で溶媒を蒸発させて、飽和塩水150 mLを残渣に加えた。混合物をジクロロメタン（150 mL×5）によって抽出した。合わせた有機抽出物を飽和塩水（150 mL）によって洗浄して、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去して、減圧下で濃縮すると油（12.3 g）が与えられた。油をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製すると、表題の化合物(R)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン1e（7.9 g、収率60.6％）が白色固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：294.2[M+1]。
【００４５】
段階5
(R)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド
オキシ塩化リン（674 μL、4.04 mmol）およびN,N-ジメチルホルムアミド（963μL、12.32 mmol）を、室温で撹拌しながらジクロロメタン21.18 mLに溶解して、-10℃の氷水浴において温度を維持しながら反応液を15分間撹拌した。(R)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン1e（790 mg、2.7 mmol）をジクロロメタン10 mLに撹拌しながら溶解した後、溶液を上記の反応系に滴下して加えた。添加の完了後、氷水浴を外して、反応系を室温まで加温して、さらに2時間撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合に、反応は完了し、反応系を氷水によって停止させて、15分間撹拌した。10 N水酸化ナトリウム溶液によって混合物のpHを約12に調整して、ジクロロメタンとメタノールの溶媒混合物（V：V＝20：1、100 mL×8）によって抽出した。合わせた有機抽出物を飽和塩水（150 mL）によって洗浄して、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去して、減圧下で濃縮すると粗産物（800 mg）が与えられた。粗産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製すると、表題の化合物(R)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド1f（650 mg、収率75％）が白色固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：322.6[M+1]。
【００４６】
段階6
(R,Z)-2-(5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
(R)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド1f（200 mg、0.623 mmol）、5-フルオロ-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン（84.67 mg、0.56 mmol）およびピペリジン（30.8μL、0.31 mmol）を室温でエタノール1.09 mLに撹拌しながら溶解した。反応系を80℃の油浴中で暗所で2時間撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合、反応は完了し、油浴を外した。反応系を室温まで冷却して、固体を沈殿させた。得られた固体を濾過すると、表題の化合物(R,Z)-2-(5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン1（256 mg、90％）が黄色固体として与えられた。
2010535819.tif 000017
【００４７】
実施例2
(R,Z)-2-(5-クロロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000018
表題の化合物は、開始材料として、実施例1の段階5から得られた(R)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド1fおよび5-クロロ-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オンによって、実施例1の段階6において記述された条件と同じ条件下で調製され、(R,Z)-2-(5-クロロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン2（42 mg、収率64％）が黄色固体として与えられた。
2010535819.tif 000019
【００４８】
実施例3
2-[(Z)-4-(2,3-ジフルオロ-フェニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル]-5-[(R)-2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル]-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000020
【００４９】
段階1
4-(4,4,5,5-テトラメチル-[1,3,2]ジオキサボロラン-2-イル)-1H-インドール
4-ブロモ-1H-インドール3a（29.4 g、150 mmol）をアルゴン雰囲気下でジメチルスルホキシド600 mLに撹拌しながら溶解して、ビス(ピナコラート)ジボロン（41.9 g、165 mmol）、酢酸カリウム（44.1 g、450 mmol）および[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム（3.6 g、4.8 mmol）を溶液に加えた。添加の完了後、反応混合物を80℃の油浴中で22時間撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合、反応は完了して、水2 Lを反応混合物に加えた。混合物を酢酸エチル（2L×3）によって抽出した。合わせた有機抽出物を飽和塩水（2L×5）によって洗浄して、無水硫酸ナトリウムによって乾燥させて、濾過して乾燥剤を除去して、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、再結晶すると、表題の化合物4-(4,4,5,5-テトラメチル-[1,3,2]ジオキサボロラン-2-イル)-1H-インドール3b（20 g、収率60％）が白色固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：243.9[M+1]。
【００５０】
段階2
4-(2,3-ジフルオロ-フェニル)-1H-インドール
4-(4,4,5,5-テトラメチル-[1,3,2]ジオキサボロラン-2-イル)-1H-インドール3b（1.22 g、5 mmol）をアルゴン雰囲気下でテトラヒドロフラン20 mLに撹拌しながら溶解して、1-ブロモ-2,3-ジフルオロ-ベンゼン（0.97 g、5 mmol）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）、パラジウム（0.17 g、0.15 mmol）および水酸化ナトリウム溶液（2 M）7 mLを溶液に加えた。添加完了後、反応系を75℃の油浴中で終夜撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合、反応は完了した。反応混合物を室温まで自然に冷却して、酢酸エチル（20 mL×3）によって抽出した。合わせた有機抽出物を飽和塩水（10 mL）によって洗浄し、無水硫酸ナトリウムによって乾燥させて、濾過して乾燥剤を除去し、減圧下で濃縮した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製すると、表題の化合物4-(2,3-ジフルオロ-フェニル)-1H-インドール3c（800 mg、収率70％）が白色固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：228.4[M-1]。
【００５１】
段階3
4-(2,3-ジフルオロ-フェニル)-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン
4-(2,3-ジフルオロ-フェニル)-1H-インドール3c（744 mg、3.25 mmol）を、室温でエタノール12 mLに撹拌しながら溶解して、tert-ブタノール21 mL、氷酢酸6.4 mLおよび三臭化ピリジニウム（3.12 g、9.7 mmol）を溶液に連続的に加えた。添加の完了後、反応混合物を3時間撹拌して、氷酢酸16 mLおよび亜鉛末（1.1 g、16.25 mmol）を混合物に加えた。反応混合物をさらに1時間撹拌して、濾過して残渣を除去して、減圧下で濃縮した。残渣に酢酸エチル30 mLを加えて、水10 mL、飽和重炭酸ナトリウム溶液10 mL、および飽和塩水10 mLによって連続的に洗浄して、無水硫酸ナトリウムによって乾燥させて、濾過して乾燥剤を除去した。濾液を減圧下で濃縮すると、表題の化合物4-(2,3-ジフルオロ-フェニル)-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン3d（780 mg、収率97％）が白色固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：246.6[M+1]。
【００５２】
段階4
2-[(Z)-4-(2,3-ジフルオロ-フェニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル]-5-[(R)-2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル]-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
(R)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド1f（50 mg、0.156 mmol）、4-(2,3-ジフルオロ-フェニル)-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン3d（34.3 mg、0.14 mmol）、およびピペリジン（7.7μL、0.078 mmol）を、エタノール0.3 mLに室温で撹拌しながら溶解した。反応系を80℃の油浴中で暗所で2時間撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合に、反応は完了し、油浴を外した。反応系を室温まで自然に冷却して、固体を沈殿させた。得られた固体を濾過すると、表題の化合物2-[(Z)-4-(2,3-ジフルオロ-フェニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル]-5-[(R)-2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル]-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン3（56 mg、収率73％）が黄色固体として与えられた。
2010535819.tif 000021
【００５３】
実施例4
(R,Z)-2-(5-ブロモ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000022
表題の化合物は、開始材料として、実施例1の段階5から得られた(R)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド1f、および5-ブロモ-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オンと共に、実施例1の段階6において記述された条件と同じ条件で調製され、(R,Z)-2-(5-ブロモ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン4（24 mg、収率50％）が黄色固体として与えられた。
2010535819.tif 000023
【００５４】
実施例5
(S,Z)-2-(5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000024
【００５５】
段階1
5-[(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルカルバモイル)-メチル]-3-メチル-1H-ピロール-2,4-ジカルボン酸(R)-2-tert-ブチルエステル4-エチルエステル
(R)-1-アミノ-3-モルフォリン-4-イル-プロパン-2-オール5a（15.125 g、94.5 mmol）、5-カルボキシメチル-3-メチル-1H-ピロール-2,4-ジカルボン酸2-tert-ブチルエステル4-エチルエステル（32.34 g、104 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（25.5 g、189.06 mmol）およびN-エチル-N'-(ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド（36.2 g、189.06 mmol）をアセトニトリル450 mLに室温で撹拌しながら溶解した。反応混合物を50℃の油浴中で3時間撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合、反応は完了した。減圧下で溶媒を蒸発させて、飽和塩水150 mLを残渣に加えた。混合物を酢酸エチルとテトラヒドロフランの溶媒混合物（V：V＝4：1、200 mL×5）によって抽出した。合わせた有機抽出物を飽和塩水（100 mL）によって洗浄して、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させて、濾過して乾燥剤を除去して濃縮すると油（75 g）が与えられた。油をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製すると、表題の化合物5-[(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルカルバモイル)-メチル]-3-メチル-1H-ピロール-2,4-ジカルボン酸(R)-2-tert-ブチルエステル4-エチルエステル5b（30 g、収率70％）が薄茶色の固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：454.4[M+1]。
【００５６】
段階2
(R)-2-[(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルカルバモイル)-メチル]-4-メチル-1H-ピロール-3-カルボン酸エチルエステル
アルゴン雰囲気下で、5-[(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルカルバモイル)-メチル]-3-メチル-1H-ピロール-2,4-ジカルボン酸(R)2-tert-ブチルエステル4-エチルエステル5b（23 g、50.77 mmol）を無水エタノール60 mLに撹拌しながら溶解して、塩酸（12 N）63.5 mLを氷水浴中で溶液に滴下して加えた。添加完了後、氷水浴を外して、反応系を60℃の油浴中で1.5時間撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合、反応は完了した。ドライアイス-アセトン浴において10N水酸化ナトリウム溶液によって反応系のpHを約7に調整すると、大量の沈殿物が形成された。混合物を濾過して濾過ケークをエタノールによって洗浄した。濾液を減圧下で濃縮して溶媒を除去し、残渣を水酸化ナトリウム溶液（10N）によってpH約10に調整した。混合物をジクロロメタン（150 mL×3）によって抽出した。合わせた有機抽出物を飽和塩水（100 mL）によって洗浄して、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去して、減圧下で濃縮すると、表題の化合物(R)-2-[(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルカルバモイル)-メチル]-4-メチル-1H-ピロール-3-カルボン酸エチルエステル5c（14.6 g、収率81.6％）が黄緑色の油として与えられた。
MS m/z（ESI）：354.8[M+1]。
【００５７】
段階3
(R)-2-[2-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルアミノ)-エチル]-4-メチル-1H-ピロール-3-カルボン酸エチルエステル
(R)-2-[(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルカルバモイル)-メチル]-4-メチル-1H-ピロール-3-カルボン酸エチルエステル5c（2.332 g、6.6 mmol）を無水テトラヒドロフラン23 mLにアルゴン雰囲気下で溶解して、次に、ボラン-テトラヒドロフラン複合体のテトラヒドロフラン溶液（23.12 mL、1 mol/L、23.12 mmol）を氷水浴において溶液に滴下して加えた。添加の完了後、氷水浴を外した。反応系を室温まで加温して、95℃の油浴中で1時間還流した。TLCが開始材料の消失を示した場合に反応は完了した。溶媒を減圧下で蒸発させて、塩酸（2 N）5 mLを残渣に加えた。混合物を0.5時間撹拌して、氷水5 mLを混合物に加えた。10 N水酸化ナトリウム溶液によって混合物のpHを約10に調整した。混合物を酢酸エチル（100 mL×2）によって抽出した。合わせた有機層を飽和塩水（50 mL）によって洗浄して、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去して減圧下で濃縮すると、表題の化合物(R)-2-[2-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルアミノ)-エチル]-4-メチル-1H-ピロール-3-カルボン酸エチルエステル5d（2.1 g、収率93.75％）が白色固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：340.9[M+1]。
【００５８】
段階4
(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
(R)-2-[2-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピルアミノ)-エチル]-4-メチル-1H-ピロール-3-カルボン酸エチルエステル5d（2.1 g、6.2 mmol）および水酸化リチウム一水和物（1.56 g、37 mmol）を、アルゴン雰囲気下でグリコール25 mLに撹拌しながら溶解した。反応系を140℃の油浴中で50分間撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合、反応は完了した。薄層クロマトグラフィーが開始材料の消失を示した後、溶媒を減圧下で蒸発させて、飽和塩水50 mLを残渣に加えた。混合物をジクロロメタン（80 mL×3）によって抽出した。合わせた有機抽出物を飽和塩水（80 mL）によって洗浄して、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させた後、濾過して乾燥剤を除去し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製すると、表題の化合物(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン5e（610 g、収率33.9％）が白色固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：294.5[M+1]。
【００５９】
段階5
(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド
オキシ塩化リン（500μL、1.3 mmol）およびN,N-ジメチルホルムアミド（704μL、9 mmol）を、室温で無水ジクロロメタン15 mLに撹拌しながら溶解して、-10℃の氷水浴において温度を維持しながら反応液を15分間撹拌した。(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン5e（586 mg、2 mmol）をジクロロメタン8 mLに撹拌しながら溶解した後、溶液を上記の反応系に滴下して加えた。添加の完了後、氷水浴を外した。反応系を室温まで加温して、さらに2時間撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合、反応は完了した。反応混合物を氷水によって停止させて、15分間撹拌した。10 N水酸化ナトリウム溶液によって混合物のpHを約12に調整した。混合物をジクロロメタンとメタノールの溶媒混合物（V：V＝20：1、100 mL×5）によって抽出した。合わせた有機抽出物を飽和塩水（100 mL）によって洗浄して、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去して、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製すると、表題の化合物(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド5f（490 mg、収率78.8％）が白色固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：322.1[M+1]。
【００６０】
段階6
(S,Z)-2-(5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド5f（490 mg、1.53 mmol）、5-フルオロ-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン（219 mg、1.45 mmol）、およびピペリジン（100 μL、1.0 mmol）を室温でエタノール5 mLに撹拌しながら溶解した。反応系を80℃の油浴中で暗所で2時間撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合、反応は完了し、油浴を外した。反応混合物を室温まで自然に冷却して、固体を沈殿させた。得られた固体を濾過すると、表題の化合物(S,Z)-2-(5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン5（460 mg、69.9％）が黄色固体として与えられた。
2010535819.tif 000025
【００６１】
実施例6
(S,Z)-2-(5-クロロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000026
表題の化合物は、開始材料として、実施例5の段階5から得られた(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド5fおよび5-クロロ-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オンによって、実施例5の段階6において記述された条件と同じ条件で調製され、(S,Z)-2-(5-クロロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン6（87 mg、収率85％）が黄色の固体として与えられた。
2010535819.tif 000027
【００６２】
実施例7
2-(Z)-[4-(2,3-ジフルオロ-フェニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル]-5-[(S)-2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル]-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000028
表題の化合物は、開始材料として、実施例5の段階5から得られた(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド5fおよび4-(2,3-ジフルオロ-フェニル)-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン3dによって、実施例5の段階6において記述された条件と同じ条件で調製され、2-(Z)-[4-(2,3-ジフルオロ-フェニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル]-5-[(S)-2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル]-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン7（49 mg、収率73％）が赤色固体として与えられた。
2010535819.tif 000029
【００６３】
実施例8
(S,Z)-2-(5-ブロモ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000030
表題の化合物は、開始材料として実施例5の段階5から得られた(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド5fおよび5-ブロモ-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オンによって実施例5の段階6において記述された条件と同じ条件で調製され、(S,Z)-2-(5-ブロモ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン8（49 mg、収率78％）が黄色の固体として与えられた。
2010535819.tif 000031
【００６４】
実施例9
(S,Z)-N-{5-フルオロ-3-[5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-イルメチレン］-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル}-2-ヒドロキシ-アセトアミド
2010535819.tif 000032
【００６５】
段階1
(5-フルオロ-2,4-ジニトロ-フェニル)-酢酸
(3-フルオロ-フェニル)酢酸9a（31.5 g、0.204 mol）を、室温で硫酸（98％）64 mLに加えて、温度を35℃に維持しながら硝酸（65％〜68％）と硫酸（98％）の溶媒混合物（V：V＝1：1）100 mLを溶液に滴下して加えた。添加の完了後、反応混合物を35℃で撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合、反応は完了した。反応混合物に氷を加えて、氷を取り出した後混合物を濾過すると、表題の化合物(5-フルオロ-2,4-ジニトロ-フェニル)-酢酸9b（49 mg）が淡黄色の油として与えられた。
MS m/z（ESI）：243.5[M-1]。
【００６６】
段階2
(2,4-ジアミノ-5-フルオロ-フェニル)-酢酸
（5-フルオロ-2,4-ジニトロ-フェニル）-酢酸9b（10 g、38.7 mmol）を、室温でメタノール150 mLに撹拌しながら溶解して、パラジウム活性炭素（5％、1.5 g）を溶液に加えた。反応混合物を0.3 MPaの水素下で水素化した。TLCが開始材料の消失を示した場合、反応は完了した。上記の混合物を2回濾過して、濾液を減圧下で濃縮すると、表題の化合物(2,4-ジアミノ-5-フルオロ-フェニル)-酢酸9c（7.12 g）が茶色の固体として与えられ、これをさらなる反応に直接用いた。
【００６７】
段階3
6-アミノ-5-フルオロ-インドル-2-オン
(2,4-ジアミノ-5-フルオロ-フェニル)-酢酸9c（7.12 g、38.7 mmol）を、室温で塩酸（1 M）100 mLに撹拌しながら溶解して、反応液を1時間加熱還流した。TLCが開始材料の消失を示した場合、反応は完了した。反応混合物を室温まで自然に冷却した後氷水浴で冷却し、水酸化ナトリウム溶液（1 M）100 mLを滴下して加えて、反応液を中和した。混合物を酢酸エチル（125 mL×4）によって抽出した。合わせた有機抽出物を飽和塩水（100 mL）によって洗浄して、無水硫酸マグネシウムによって乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮すると、表題の化合物5-フルオロ-6-アミノ-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン9d（5.3 g、収率82.8％）が黄色の固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：165.3[M-1]。
【００６８】
段階4
酢酸(5-フルオロ-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イルカルバモイル)-メチルエステル
5-フルオロ-6-アミノ-インドル-2-オン9d（500 mg、3.0 mmol）を、室温でテトラヒドロフラン10 mLに撹拌しながら溶解し、ピリジン0.4 mLを溶液に加えた。撹拌して十分に混合した後、反応系をドライアイス-アセトン浴において-40℃まで冷却した。クロロカルボニルメチルエステル（420 mg、3.0 mmol）をテトラヒドロフラン10 mLに溶解して、溶液を上記の反応系に滴下して加えた。添加の完了後、ドライアイス-アセトン浴を外した。反応系を室温まで加温して、TLCが開始材料の消失を示すまで終夜撹拌した。反応混合物を濾過して、濾過ケークを水で3回洗浄すると、表題の化合物酢酸(5-フルオロ-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イルカルバモイル)-メチルエステル9e（562 mg、収率70.4％）が灰色の固体として与えられた。
MS：265.3[M-1]。
【００６９】
段階5
N-(5-フルオロ-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル)-2-ヒドロキシ-アセトアミド
酢酸(5-フルオロ-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イルカルバモイル)-メチルエステル9e（58 mg、0.22 mmol）を、室温でメタノール1 mLに撹拌しながら溶解して、水1 mLおよび水酸化ナトリウム（15 mg、0.375 mmol）を溶液に加えた。反応の完了後、反応混合物をさらに1時間撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合に、反応は完了した。上記の混合物を濾過して、濾過ケークを水で3回洗浄して乾燥させると、表題の化合物N-(5-フルオロ-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル)-2-ヒドロキシ-アセトアミド9f（46 mg、収率93.8％）が灰色の固体として与えられた。
MS：223.7[M-1]
【００７０】
段階6
(S,Z)-N-{5-フルオロ-3-[5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-イルメチレン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル}-2-ヒドロキシ-アセトアミド
(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド5f（40 mg、0.125 mmol）を、室温でエタノール2 mLに撹拌しながら溶解して、N-(5-フルオロ-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル)-2-ヒドロキシ-アセトアミド9f（25.1 mg、0.112 mmol）を溶液に加えた。添加の完了後、全て溶解するまで混合物を撹拌して、ピペリジン（50μL、0.5 mmol）を反応液に加えた。添加の完了後、反応系を80℃の油浴で暗所で2時間撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合に反応は完了し、油浴を外した。反応系を室温まで自然に冷却して、固体を沈殿させた。得られた固体を濾過すると、表題の化合物(S,Z)-N-{5-フルオロ-3-[5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-イルメチレン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル}-2-ヒドロキシ-アセトアミド9（51 mg、収率80％）が黄色の固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：528.3[M+1]。
【００７１】
実施例10
(S,Z)-2-[5-フルオロ-6-(4-フルオロ-ベンジルアミノ)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル]-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000033
【００７２】
段階1
5-フルオロ-6-(4-メチル-ベンジルアミノ)-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン
5-フルオロ-6-アミノ-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン9d（2.26 g、13.6 mmol）を室温でエタノール40 mLに撹拌しながら溶解した。溶液を氷水浴において0℃まで冷却して、4-フルオロ-ベンズアルデヒド（1.5 mL、13.6 mmol）を溶液に加えた。添加の完了後、反応混合物を室温で1時間撹拌して、ホウ化水素ナトリウム（1.08 g、28.5 mmol）を混合物に加えた。反応混合物を18時間還流した。反応混合物を室温まで自然に冷却して、氷水を加えて固体を沈殿させた。得られた固体を濾過した。濾過ケークを水（50 mL×3）によって洗浄して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製すると、表題の化合物5-フルオロ-6-(4-メチル-ベンジルアミノ)-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン10a（1.67 g、45％）が白色固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：275[M+1]。
【００７３】
段階2
(S,Z)-2-[5-フルオロ-6-(4-フルオロ-ベンジルアミノ)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル]-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド5f（40 mg、0.125 mmol）を室温でエタノール2 mLに撹拌しながら溶解して、5-フルオロ-6-(4-メチル-ベンジルアミノ)-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン10a（30.7 mg、0.112 mmol）を溶液に加えた。添加の完了後、全てが溶解するまで混合物を撹拌して、ピペリジン（0.05 mL、0.5 mmol）を反応液に加えた。添加の完了後、反応混合物を油浴において2時間還流した。TLCが開始材料の消失を示した場合、反応は完了し、反応混合物を室温まで自然に冷却して、減圧下で濾過すると、表題の化合物(S,Z)-2-[5-フルオロ-6-(4-フルオロ-ベンジルアミノ)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル]-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン10（18 mg、27.8％）が灰色の固体として与えられた。
2010535819.tif 000034
【００７４】
実施例11
(S,Z)-N-{5-フルオロ-3-[5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-イルメチレン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル}-2-ヒドロキシ-2-メチル-プロピオンアミド
2010535819.tif 000035
【００７５】
段階1
酢酸1-(5-フルオロ-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イルカルバモイル)-1-メチル-エチルエステル
5-フルオロ-6-アミノ-インドル-2-オン9d（410 mg、2.47 mmol）を室温でテトラヒドロフラン10 mLに溶解して、ドライアイス-アセトン浴において溶液を-45℃に冷却した後、ピリジン332μLを溶液に加えた。2-アセトキシイソブリリルクロリド（423 mg、2.71 mmol）をテトラヒドロフラン10 mLに溶解して、溶液を上記の反応液に滴下して加えた。添加の完了後、ドライアイス-アセトン浴を外した。反応系を室温まで加温して、終夜撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合に反応は完了した。反応混合物を濾過して、濾過ケークを水によって洗浄し、乾燥させると、表題の化合物酢酸1-(5-フルオロ-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イルカルバモイル)-1-メチル-エチルエステル11a（792 mg）が白色固体として与えられ、これをさらなる反応において直接用いた。
MS m/z（ESI）：293.7[M-1]。
【００７６】
段階2
N-(5-フルオロ-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル)-2-ヒドロキシ-2-メチル-プロピオンアミド
酢酸1-(5-フルオロ-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イルカルバモイル)-1-メチル-エチルエステル11a（2.035 g、6.9 mmol）を室温でメタノール20 mLに撹拌しながら溶解して、水酸化ナトリウム溶液（0.7 M）20 mLを溶液に加えた。反応液を4時間撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合に反応は完了し、上記の溶液を塩酸（1 M）によって中和して、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、乾燥させると、表題の化合物N-(5-フルオロ-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル)-2-ヒドロキシ-2-メチル-プロピオンアミド11b（900 mg、収率59.2％）が白色固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：253.6[M+1]。
【００７７】
段階3
(S,Z)-N-{5-フルオロ-3-[5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-イルメチレン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル}-2-ヒドロキシ-2-メチル-プロピオンアミド
(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド5f（40 mg、0.125 mmol）、N-(5-フルオロ-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル)-2-ヒドロキシ-2-メチル-プロピオンアミド11b（28.3 mg、0.112 mmol）およびピペリジン（50μL、0.5 mmol）を室温でエタノール2 mLに撹拌しながら溶解した。反応系を80℃の油浴中で暗所で2時間撹拌した。TLCが開始材料の消失を示した場合に反応は完了し、油浴を外した。反応系を室温まで自然に冷却して、固体を沈殿させた。得られた固体を濾過すると、表題の化合物(S,Z)-N-{5-フルオロ-3-[5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-イルメチレン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル}-2-ヒドロキシ-2-メチル-プロピオンアミド11（46 mg、74％）が黄色の固体として与えられた。
2010535819.tif 000036
【００７８】
実施例12
(S,Z)-2-(7-ブロモ-5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000037
【００７９】
段階1
7-ブロモ-5-フルオロ-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン
5-フルオロ-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン12a（1.5 g、0.01 mol）を、室温でアセトニトリル15 mLに撹拌しながら溶解して、N-ブロモスクシニミド（1.8 g、0.01 mol）を溶液に滴下して加えた。添加の完了後、反応混合物を終夜撹拌すると、大量の沈殿物が形成された。TLCが開始材料の消失を示した場合に、反応は完了し、反応混合物を濾過すると、7-ブロモ-5-フルオロ-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン12b（2 g、87％）が灰色の固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：228.3[M-1]。
【００８０】
段階2
(S,Z)-2-(7-ブロモ-5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド5f（40 mg、0.125 mmol）を室温でエタノール2 mLに撹拌しながら溶解して、7-ブロモ-5-フルオロ-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン12b（25.8 mg、0.112 mmol）を溶液に加えた。添加の完了後、全てが溶解するまで反応混合物を撹拌して、ピペリジン（0.05 mL、0.5 mmol）を溶液に加えた。添加の完了後、反応混合物を油浴中で2時間加熱還流した。TLCが開始材料の消失を示した場合に、反応は完了し、反応混合物を室温まで自然に冷却して、減圧下で濾過すると、表題の化合物(S,Z)-2-(7-ブロモ-5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン12（45 mg、75.4％）が黄色固体として与えられた。
2010535819.tif 000038
【００８１】
実施例13
(S,Z)-N-{5-フルオロ-3-[5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-イルメチレン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル}-2-メトキシ-アセトアミド
2010535819.tif 000039
【００８２】
段階1
5-フルオロ-6-メトキシアセトアミド-2-オキソインドール
5-フルオロ-6-アミノ-インドル-2-オン9d（2.028 g、12.2 mmol）を室温でテトラヒドロフラン30 mLに撹拌しながら溶解して、ピリジン1.3 mLを溶液に加えた。反応系をドライアイス-エタノール浴において-50℃に冷却した。メトキシ-アセチルクロリド（1.35 g、12.5 mmol）を撹拌しながらテトラヒドロフラン20 mLに溶解した後、溶液を上記の反応系に滴下して加えた。添加の完了後、ドライアイス-エタノール浴を外した。反応系を室温まで加温して、TLCが開始材料の消失を示すまで終夜撹拌した。得られた固体を濾過して、水（10 mL×3）によって洗浄し、メタノールから再結晶すると、表題の化合物5-フルオロ-6-メトキシアセトアミド-2-オキソインドール13a（1.18 g、収率40.6％）が灰色の固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：239.3[M+1]。
【００８３】
段階2
(S,Z)-N-{5-フルオロ-3-[5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-イルメチレン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル}-2-メトキシ-アセトアミド
(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド5f（40 mg、0.125 mmol）を室温でエタノール2 mLに撹拌しながら溶解した後、5-フルオロ-6-メトキシアセトアミド-2-オキソインドール13a（26.7 mg、0.112 mmol）を溶液に加えた。添加の完了後、全てが溶解するまで反応混合物を撹拌して、ピペリジン（0.05 mL、0.5 mmol）を溶液に加えた。添加の完了後、反応混合物を、油浴において2時間加熱還流した。TLCが開始材料の消失を示した場合に反応は完了した。反応混合物を室温まで自然に冷却して、減圧下で濾過すると、表題の化合物(S,Z)-N-{5-フルオロ-3-[5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-イルメチレン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル}-2-メトキシ-アセトアミド13（52 mg、収率85.8％）が黄色固体として与えられた。
2010535819.tif 000040
【００８４】
実施例14
(R,Z)-2-(7-ブロモ-5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000041
表題の化合物は、開始材料として、実施例1の段階5から得られた(R)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド1fおよび7-ブロモ-5-フルオロ-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン12bによって、実施例1の段階6において記述される条件と同じ条件で調製され、(R,Z)-2-(7-ブロモ-5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン14（20 mg、収率40％）が黄色固体として与えられた。
2010535819.tif 000042
【００８５】
実施例15
(R,Z)-2-[5-フルオロ-6-(4-フルオロ-ベンジルアミノ)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル]-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000043
表題の化合物は、開始材料として、実施例1の段階5から得られた(R)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド1fおよび5-フルオロ-6-(4-メチル-ベンジルアミノ)-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オン10aによって、実施例1の段階6において記述される条件と同じ条件で調製され、(R,Z)-2-[5-フルオロ-6-(4-フルオロ-ベンジルアミノ)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル]-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン15（53 mg、収率65.6％）が深紅の固体として与えられた。
2010535819.tif 000044
【００８６】
実施例16
(R,Z)-N-{5-フルオロ-3-[5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-イルメチレン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル}-2-メトキシ-アセトアミド
2010535819.tif 000045
表題の化合物は、開始材料として、実施例1の段階5から得られた(R)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド1fおよび5-フルオロ-6-メトキシアセトアミド-2-オキソインドール13aによって、実施例1の段階6において記述される条件と同じ条件で調製され、(R,Z)-N-{5-フルオロ-3-[5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-イルメチレン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル}-2-メトキシ-アセトアミド16（60 mg、収率87％）が黄色の固体として与えられた。
2010535819.tif 000046
【００８７】
実施例17
(R,Z)-N-{5-フルオロ-3-[5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-イルメチレン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル}-2-ヒドロキシ-2-メチル-プロピオンアミド
2010535819.tif 000047
表題の化合物は、開始材料として、実施例1の段階5から得られた(R)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド1fおよびN-(5-フルオロ-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル)-2-ヒドロキシ-2-メチル-プロピオンアミド11bによって、実施例1の段階6において記述される条件と同じ条件で調製され、(R,Z)-N-{5-フルオロ-3-[5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-イルメチレン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドル-6-イル}-2-ヒドロキシ-2-メチル-プロピオンアミド17（71 mg、収率82％）が黄色固体として与えられた。
2010535819.tif 000048
【００８８】
実施例18
(R,Z)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-2-(2-オキソ-4-ピリジン-4-イル-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000049
表題の化合物は、開始材料として、実施例1の段階5から得られた(R)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド1fおよび4-ピリジン-4-イル-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オンによって、実施例1の段階6において記述される条件と同じ条件で調製され、(R,Z)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-2-(2-オキソ-4-ピリジン-4-イル-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン18（58 mg、収率72.5％）が黄色固体として与えられた。
2010535819.tif 000050
【００８９】
実施例19
(S,Z)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-2-(5-メトキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000051
表題の化合物は、開始材料として、実施例5の段階5から得られた(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド5fおよび5-メトキシ-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オンによって実施例5の段階6において記述された条件と同じ条件で調製され、(S,Z)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-2-(5-メトキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン19（40 mg、収率76.6％）が赤色固体として与えられた。
2010535819.tif 000052
【００９０】
実施例20
(S,Z)-2-[4-(2,6-ジフルオロ-フェニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル]-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000053
表題の化合物は、開始材料として、実施例5の段階5から得られた(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド5fおよび4-(2,6-ジフルオロ-フェニル)-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オンによって実施例5の段階6において記述された条件と同じ条件で調製され、(S,Z)-2-[4-(2,6-ジフルオロ-フェニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル]-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン20（52 mg、収率84.7％）が黄色固体として与えられた。
2010535819.tif 000054
【００９１】
実施例21
(S,Z)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-2-[5-(4-メトキシ-フェニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル]-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000055
表題の化合物は、開始材料として、実施例5の段階5から得られた(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド5fおよび5-(4-メトキシ-フェニル)-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オンによって実施例5の段階6において記述された条件と同じ条件で調製され、(S,Z)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-2-[5-(4-メトキシ-フェニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル]-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン21（53 mg、収率87.2％）が黄色固体として与えられた。
2010535819.tif 000056
【００９２】
実施例22
(S,Z)-2-(4-ブロモ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン
2010535819.tif 000057
表題の化合物は、開始材料として、実施例5の段階5から得られた(S)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-4-オキソ-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピロロ[3,2-c]ピリジン-2-カルバルデヒド5fおよび4-ブロモ-1,3-ジヒドロ-インドル-2-オンによって実施例5の段階6において記述された条件と同じ条件で調製され、(S,Z)-2-(4-ブロモ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン22（43 mg、収率74.5％）が黄色の固体として与えられた。
2010535819.tif 000058
【００９３】
実施例23
(R,Z)-2-(5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オンマレエート
2010535819.tif 000059
(R,Z)-2-(5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン1（709 mg、1.562 mmol）およびシスブテンジオン酸（217 mg、1.874 mmol）を室温でメタノール150 mLに撹拌しながら溶解した。撹拌して十分に混合した後、反応混合物を40℃の油浴で20分間加熱して、減圧下で濾過した。濾液を減圧下で濃縮して、アセトニトリル50 mLを残渣に加えた。添加の完了後、混合物を20分間加熱還流した。反応混合物を室温まで冷却して、減圧下で濾過すると、表題の化合物(R,Z)-2-(5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オンマレイン酸塩23（811 mg、収率91.1％）が黄色固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：455.2[M+1]。
【００９４】
実施例24
(R,Z)-2-(5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オンマレート
2010535819.tif 000060
2-ヒドロキシコハク酸（231 mg、1.72 mmol）を室温でメタノール100 mLに撹拌しながら溶解し、(R,Z)-2-(5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オン1（560 mg、1.233 mmol）、メタノール200 mL、および水100 mLをまとめて溶液に加えた。添加の完了後、透明な溶液が得られるまで、反応系を50℃の油浴において暗所で加熱した。反応混合物を濾過して、濾液を減圧下で濃縮して溶媒を除去すると、黄色の固体が与えられた。得られた固体をアセトニトリル100 mLに溶解して、混合物を暗所で1.5時間加熱還流した。油浴を外した。反応系を室温まで自然に冷却して、表題の化合物(R,Z)-2-(5-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドル-3-イリデンメチル)-5-(2-ヒドロキシ-3-モルフォリン-4-イル-プロピル)-3-メチル-1,5,6,7-テトラヒドロ-ピロロ[3,2-c]ピリジン-4-オンリンゴ酸塩24（718 mg、収率99％）が黄色固体として与えられた。
MS m/z（ESI）：455.2[M+1]。
【００９５】
生物学的アッセイ
実施例1：細胞増殖阻害アッセイ
以下のインビトロアッセイを用いて、VEGFRの高い発現を有するヒトHUVEC細胞における増殖阻害実験（細胞毒性）を通して、本発明の異なる化合物の活性レベルおよび効果を決定することができるであろう。
【００９６】
本明細書において記述される細胞アッセイを用いて、インビトロで癌細胞に及ぼすVEGFRを通しての化合物の抗血管新生および増殖阻害の活性および効果を試験する。効果および活性は、癌細胞を殺すIC50値によって表される。アッセイの一般的技法は以下のとおりである：VEGFRを高度に発現するヒト細胞を選んで、96ウェル細胞培養プレートに適した濃度（たとえば、5000個/mL培地）で播種した。次に、細胞を二酸化炭素（CO2）インキュベーターにおいて85％コンフルエンシーに達するまでインキュベートした。次に、細胞培養培地を、試験化合物を連続濃度（一般的に6または7個の濃度）でその中に加えた新鮮な培地に交換した。次に、細胞をインキュベーターに戻して連続的に72時間培養した。72時間後、処置した化合物を、スルホローダミンB（SRB）法を用いてその増殖状態に関してアッセイした。試験した細胞における化合物のIC50を、試験化合物の連続濃度の阻害率のデータを用いて計算した。
【００９７】
材料および方法
a．ジメチルスルホキシド（Sinophma chemical reagent company、カタログ番号T20050806）
b．HUVEC細胞（Institute of biochemistry and cell biologyから購入）
c．Falcon 100 mm細胞培養プレート（Baton Dickison Labware, Baton Dickison and company、カタログ番号18677）
d．Corning 96ウェル培養クラスタ（Corning Incorporated、カタログ番号3599）
e．Fisherピペット（Fisher scientific、カタログ番号03-692-164）
f．DMEM/F12細胞培地（Gibco、カタログ番号12400-024）
g．ウシ胎児血清、オーストラリア起源（Gibco、カタログ番号10099-141）
h．リン酸緩衝生理食塩液（Gibco、カタログ番号10010-072）
i．0.25％トリプシン-EDTA（Gibco、カタログ番号25200-056）
j．スルホローダミンB（Sigma、カタログ番号3520-42-1）
k．酢酸（Sinophma chemical reagent company、カタログ番号T20060508）
l．トリクロロ酢酸（Sinophma chemical reagent company、カタログ番号T20060305）
m．トリス塩基（Amresco、カタログ番号0826）
n．クラスII A/B3生物学的安全キャビネット（ThermoForma、カタログ番号HB0053-03）
o．シリーズII水ジャケットCO2インキュベータ（ThermoForma、モデル3111）
p．遠心器（Fisher scientific Marathon 8k、カタログ番号0027-02）
q．Novastarプレートリーダー（BMG Labtech、カタログ番号700-0081）
r．オービタルシェーカー（Qilinbeier、カタログ番号TS-1）
【００９８】
プロトコール
以下のプロトコールを用いて、HUVEC細胞に及ぼす本発明の試験化合物の細胞毒性（抗増殖活性、IC50値で表記される）をアッセイする：
1．HUVEC細胞を、100 mm Corning培養プレートにおいて増殖培地（DMEM/F12、10％FBSを添加）と共に37℃、5％CO2でコンフルエンシーとなるまで培養した。
2．HUVEC細胞を冷PBS溶液によって洗浄した後、細胞をトリプシン処理によって回収して、Corning 96ウェル細胞培養プレートに50,000個/mlの濃度で播種して、各プレートあたり空のウェル6個をプレートバックグラウンドとして残した。
3．細胞を85％コンフルエンシーとなるまで37℃、5％CO2において96ウェルプレートにおいて培養した。
4．化合物の保存溶液を、候補化合物を溶解するためにDMSOを用いて20 mMの濃度に調製した。次に、試験化合物溶液試料を調製するために、DMSOを用いて、保存溶液を連続濃度に希釈した（たとえば、2 mM、1 mM、0.2 mM、20μM、2μM、0.2μM）。
5．細胞培養培地（DMEM/F12＋10％FBS）を用いて、既に調製された化合物溶液を希釈した。DMSO化合物溶液5μLを培養培地95μLに加えることによって、試験化合物溶液の各濃度を20倍希釈して、ボルテックスミキサーによって十分に混合した。これによって、HUVEC細胞培養培地における最終DMSO濃度は確実に0.5％未満となるであろう。
6．HUVEC細胞が培養皿の底に付着して、85％コンフルエンシーに達した後、培養培地を新鮮なDMEM/F12培地プラス10％FBSに交換した。培地180μLを各ウェルに加えた後、段階5において調製した希釈試験化合物溶液20μLを加えた。陰性対照群の細胞に関して、0.5％純粋DMSOを含有する培養培地20μlをその代わりに加えた。すなわち、HUVEC細胞を、最終濃度100μM、10μM、5μM、1μM、0.1μM、0.01μM、および0.001μMの各試験化合物に曝露した。
7．細胞プレートをインキュベータに戻して37℃、5％CO2で72時間培養した。
8．72時間後、培養プレートをインキュベータから無菌作業区域に移した。
9．試薬等級の水をTCAに加えることによって、固定溶液（50％トリクロロ酢酸、TCA）を調製し、増殖培地の上部に冷TCA溶液50μlを静かに上層することによって細胞を固定した。
10．プレートを4℃で1時間インキュベートした後、蒸留水で数回すすいでTCA、血清タンパク質等を除去した。プレートを空気乾燥させて、使用するまで4℃で保存した。増殖培地のみと共にインキュベートしたウェルにおいてバックグラウンド吸光度を測定した。
11．10％酢酸溶液を用いて0.4％スルホローダミンB溶液を調製した。スルホローダミンB溶液50μlを96ウェルプレートの各ウェルに加えた。
12．細胞を30分間染色させた。
13．10％酢酸洗浄溶液を調製した。染色終了後、染色溶液を捨てて、細胞を10％酢酸によって速やかにすすいだ。取り込まれていない色素が除去されるまで上記の操作を繰り返した。タンパク質結合色素の脱着を低減するために洗浄回数を最小限に維持した。すすいだ後、培養物を空気乾燥させた。
14．取り込まれた色素をスルホローダミンBの一定容積に溶解した。可溶化溶液（10 mMトリス）は、培養培地の当初の容積（通常、200μl）と等しかった。培養物は全て、溶解プロセスを加速するために、オービタルシェーカー上で室温で5分間インキュベートした。
15．波長565 nmでの吸光度を分光光度計によって測定した。690 nmでの96ウェルプレートのバックグラウンド吸光度を測定して、565 nmでの測定値から差し引いた。
16．阻害率（IR）を以下のように計算した：
IR＝100×（対照細胞の吸光度−各濃度の化合物に曝露された細胞の吸光度）／対照細胞の吸光度％。
IC50値は、異なる濃度勾配での化合物のIRから計算することができる。
【００９９】
本発明の化合物の活性
本発明の化合物の生物活性を、先に記述したアッセイを用いて試験する。IC50値を計算して、以下の表に示す。
2010535819.tif 000061
【０１００】
実施例2：VEGF-R2キナーゼアッセイ
このアッセイを用いて酵素免疫測定法（ELISA）において組み換え型ヒトVEGF-R2のインビトロキナーゼ活性を測定する。
【０１０１】
材料および試薬
a．洗浄緩衝液（PBS-T緩衝液）：1×PBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na2HPO4、1.4 mM KH2PO4、pH 7.2）プラス0.05％Tween-20。
b．1％ウシ血清アルブミン（BSA、Calbiochem #136593）のPBS-T緩衝液溶液。
c．停止溶液：50 mM EDTA、pH 8.0。
d．DELFIA（登録商標）ユーロピウム標識抗マウスIgG（PerkinElmer Life Sciences #AD0124）。
e．DELFIA（登録商標）増強溶液（PerkinElmer Life Sciences #1244-105）。
f．DELFIA（登録商標）ストレプトアビジンコーティング96ウェルイエロープレート（PerkinElmer Life Sciences #AAAND-0005）。
g．組み換え型ヒトVEGFR-2キナーゼ（50 mMトリス-HCl、pH 8.0、100 mM NaCl、5 mM DTT、15 mM還元グルタチオン、および20％グリセロール中）（Cell signaling technology #7787）。
h．10 mM ATP溶液（Cell signaling technology #9804）。
i．ビオチン-ガストリン前駆体（Tyr87）ペプチド（Cell signaling technology #1310）。
j．ホスホ-チロシンマウスmAb（P-Tyr-100）（Cell signaling technology #9411）。
k．HTScan（商標）チロシンキナーゼ緩衝液（4×）。
1×キナーゼ緩衝液：
60 mM HEPES
5 mM MgCl2
5 mM MnCl2
3μM Na3VO4
（Cell signaling technology #9805）
l．1.25 M DTT（1000×）（Cell signaling technology）。
【０１０２】
技法
以下の技法を用いた。
1．試験化合物をDMSOによって所望の最終濃度に希釈した。試験化合物1μl、陰性対照、およびブランク対照（陰性対照およびブランク対照のアッセイはいかなる試験化合物も含有しなかった）を各アッセイのために加えた。
2．6 μMペプチド基質（Tyr87）をdH2Oによって1：1の比率で希釈して、15μlを各アッセイに加えた。
3．VEGFR-2キナーゼを-80℃から氷中に直ちに移して、キナーゼを氷中で融解した。
4．VEGFR-2酵素2.2μgを酵素試験管に加えた。
5．DTT（1.25 M）10μlを4×HTScan（商標）チロシンキナーゼ緩衝液（240 mM HEPES、pH 7.5、20 mM MgCl2、20 mM MnCl2、12μM Na3VO4）2.5 mlに加えて、DTT/キナーゼ緩衝液を調製した。
6．DTT/キナーゼ緩衝液0.75 mLを酵素試験管に移して4×反応カクテルを調製して、4×反応カクテル7.5μlを各アッセイに加えた。
7．ATP（10 mM）2μlをdH2O 498 μlに加えて、7.5μlを各アッセイに加えた。
30μl反応系に関する最終アッセイ条件：
60 mM HEPES pH 7.5
5 mM MgCl2
5 mM MnCl2
3μM Na3VO4
1.25 mM DTT
10μM ATP
1.5μM基質ペプチド
22 ng VEGFR-2キナーゼ
8．反応試験管を25℃で30分間インキュベートした。
9．アッセイ停止溶液（50 mM EDTA、pH8.0）30μlを加えて反応を停止させた。
10．各反応物25μlおよびdH2O 75μlを96ウェルストレプトアビジンコーティングプレートに移して、室温で60分間振とうさせた。
11．各ウェルをPBS-T緩衝液200μlによって3回洗浄した。プレートをペーパータオルの上で軽くたたいて過剰な液体を除去した。
12．一次抗体ホスホ-チロシンmAb（P-Tyr-100）を、1％BSAを含有するPBS-T緩衝液によって1：1000の比率で希釈して、希釈した一次抗体100μlを各ウェルに加えた。
13．プレートを室温で60分間振とうさせながらインキュベートした。
14．洗浄段階を段階11において記述されるように行った。
15．ユーロピウム標識抗マウスIgGを、1％BSAを含有するPBS-T緩衝液によって1：500に希釈した。希釈抗体100μlを各ウェルに加えた。
16．プレートを室温で振とうさせながら30分間インキュベートした。
17．各ウェルをPBS-T緩衝液200μlによって5回洗浄した。プレートをペーパータオルの上で軽くたたいて余分な液体を除去した。
18．DELFIA（登録商標）増強溶液100μlを各ウェルに加えた。
19．プレートを室温で振とうさせながら5分間インキュベートした。
20．プレートリーダーにおいて時間分解型蛍光モードで蛍光強度を615 nmで検出した。
阻害率を計算する：
IR（％）＝100−100＊（X−B）/（N−B）
X＝試験化合物を含有するウェルの蛍光値
N＝陽性対照の蛍光値
B＝ブランク
IC50値は異なる濃度勾配で化合物のIRから計算することができる。
【０１０３】
本発明の化合物の活性
本発明の化合物の生化学活性を、先に記述したアッセイを用いて試験する。IC50値を測定して、以下の表に示す。
2010535819.tif 000062
【手続補正書】
【提出日】平成22年3月24日(2010.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）を有する化合物またはその薬学的に許容される塩：
2010535819.tif 000072
式中、
R1、R2、R3、R4は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、アリール、ヘテロアリール、-OR5、-O[CH2CH2O]rR7、-NR5R6、-COR5および-NR5COR6からなる群より選択され、アリールまたはヘテロアリールは、アルキル、アルコキシル、およびハロゲンからなる群より選択される1つまたは複数の基によってさらに置換されてもよく；
R5およびR6は、それぞれ独立して、水素およびアルキルからなる群より選択され、アルキルは、アリール、ヘテロアリール、ハロアリール、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、カルボン酸、およびカルボン酸エステルからなる群より選択される1つまたは複数の基によってさらに置換されてもよく；
R7は水素またはアルキルであり；ならびに
rは1〜6の整数である。
【請求項２】
以下を含む、請求項1記載のピロロ縮合（pyrrolofused）6員複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物またはその薬学的に許容される塩：
2010535819.tif 000073
2010535819.tif 000074
。
【請求項３】
請求項1または2記載のピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効治療量と共に、薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項４】
薬学的に許容される塩が、化合物と、リンゴ酸、乳酸、マレイン酸、塩酸、メタンスルホン酸、硫酸、リン酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、およびトリフルオロ酢酸からなる群より選択される酸とで形成された塩である、請求項1記載のピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
酸がリンゴ酸またはマレイン酸である、請求項4記載のピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
以下の段階を含む、請求項1記載のピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物またはその薬学的に許容される塩の調製方法：
1-アミノ-3-モルフォリン-4-イル-プロパン-2-オールの光学活性化合物（Ia）を5-カルボキシメチル-3-メチル-1H-ピロール-2,4-ジカルボン酸2-tert-ブチルエステル4-エチルエステルと共に、アセトニトリル中で1-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびN-エチル-N'-(ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドの存在下で加熱して、窒素雰囲気下でキラルピロールアミドジカルボン酸ジエステル（Ib）を得る段階；
2010535819.tif 000075
キラルピロールアミドジカルボン酸ジエステル（Ib）を塩酸と共にエタノール中で加熱還流して、アルゴン雰囲気下で光学活性ピロールアミドエチルエステル（Ic）を得る段階；
2010535819.tif 000076
さらに、光学活性ピロールアミドエチルエステル（Ic）をボランと共に無水テトラヒドロフラン中で選択的還元によって加熱還流して、キラル置換ピロールエチルエステル（Id）を得る段階；
2010535819.tif 000077
次に、キラル置換ピロールエチルエステル（Id）を水酸化リチウム一水和物と共にグリコール中で加熱還流して、アルゴン雰囲気下で光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環（Ie）の環状化産物を得る段階；
2010535819.tif 000078
光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環（Ie）をオキシ塩化リンおよびN,N-ジメチルホルムアミドと共に室温で無水ジクロロメタン中でホルミル化反応によって反応させ、光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環ホルムアルデヒド（If）を得る段階；
2010535819.tif 000079
最後に、光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環ホルムアルデヒド（If）を、トリエチルアミンまたはピペリジンなどの塩基の存在下で、異なるインドリノンと共に2〜12時間加熱して、式（I）のキラルピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の標的産物を得る段階；
2010535819.tif 000080
。
【請求項７】
請求項1〜5のいずれか一項記載のピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体またはその薬学的に許容される塩をタンパク質キナーゼに接触させる段階を含む、タンパク質キナーゼの触媒活性を調節するための方法。
【請求項８】
タンパク質キナーゼが、受容体チロシンキナーゼ（RTK）、非受容体タンパク質チロシンキナーゼ（CTK）、およびセリン／トレオニンタンパク質キナーゼ（STK）からなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
タンパク質キナーゼ関連障害を処置するための薬剤の調製における請求項1記載の化合物の使用。
【請求項１０】
タンパク質キナーゼ関連障害が、VEGFR-2、EGFR、HER-2、HER-3、HER-4、PDGFR、c-Kit、c-Met、FGFR、およびFlt3に関連する障害から選択される、請求項9記載の使用。
【請求項１１】
請求項3記載の薬学的組成物をタンパク質キナーゼに接触させる段階を含む、タンパク質キナーゼの触媒活性を調節するための方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明のもう1つの局面は、以下の段階を含む、式（I）を有するピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体またはその薬学的に許容される塩の調製プロセスである：
1-アミノ-3-モルフォリン-4-イル-プロパン-2-オールの光学活性化合物（Ia）を5-カルボキシメチル-3-メチル-1H-ピロール-2,4-ジカルボン酸2-tert-ブチルエステル4-エチルエステルと共に、アセトニトリル中で1-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびN-エチル-N'-(ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドの存在下で加熱して、窒素雰囲気下でキラルピロールアミドジカルボン酸ジエステル（Ib）を得る段階；
2010535819.tif 000081
キラルピロールアミドジカルボン酸ジエステル（Ib）を塩酸と共にエタノール中で加熱還流して、アルゴン雰囲気下で光学活性ピロールアミドエチルエステル（Ic）を得る段階；
2010535819.tif 000082
さらに、光学活性ピロールアミドエチルエステル（Ic）をボランと共に無水テトラヒドロフラン中で選択的還元によって加熱還流して、キラル置換ピロールエチルエステル（Id）を得る段階；
2010535819.tif 000083
次に、キラル置換ピロールエチルエステル（Id）を水酸化リチウム一水和物と共にグリコール中で加熱還流して、アルゴン雰囲気下で光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環（Ie）の環状化産物を得る段階；
2010535819.tif 000084
光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環（Ie）をオキシ塩化リンおよびN,N-ジメチルホルムアミドと共に、室温で無水ジクロロメタン中でホルミル化反応によって反応させて、光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環ホルムアルデヒド（If）を得る段階；
2010535819.tif 000085
最後に、光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環ホルムアルデヒド（If）を、トリエチルアミンまたはピペリジンなどの塩基の存在下で異なるインドリノンと共に2〜12時間加熱して、式（I）のキラルピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の標的産物を得る段階；
2010535819.tif 000086
式中、R1、R2、R3、R4は、先に定義したとおりである。
[請求項101]
式(I)を有する化合物またはその薬学的に許容される塩:
2010535819.tif 000087
式中、
R1、R2、R3、R4は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、アリール、ヘテロアリール、-OR5、-O[CH2CH2O]rR7、-NR5R6、-COR5および-NR5COR6からなる群より選択され、アリールまたはヘテロアリールは、アルキル、アルコキシル、およびハロゲンからなる群より選択される1つまたは複数の基によってさらに置換されてもよく;
R5およびR6は、それぞれ独立して、水素およびアルキルからなる群より選択され、アルキルは、アリール、ヘテロアリール、ハロアリール、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、カルボン酸、およびカルボン酸エステルからなる群より選択される1つまたは複数の基によってさらに置換されてもよく;
R7は水素またはアルキルであり;ならびに
rは1〜6の整数である。
[請求項102]
以下を含む、請求項101記載のピロロ縮合(pyrrolofused)6員複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物またはその薬学的に許容される塩:
2010535819.tif 000088
2010535819.tif 000089
。
[請求項103]
請求項101または102記載のピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効治療量と共に、薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
[請求項104]
薬学的に許容される塩が、化合物と、リンゴ酸、乳酸、マレイン酸、塩酸、メタンスルホン酸、硫酸、リン酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、およびトリフルオロ酢酸からなる群より選択される酸とで形成された塩である、請求項101記載のピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物またはその薬学的に許容される塩。
[請求項105]
酸がリンゴ酸またはマレイン酸である、請求項104記載のピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物またはその薬学的に許容される塩。
[請求項106]
以下の段階を含む、請求項101記載のピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の化合物またはその薬学的に許容される塩の調製方法:
1-アミノ-3-モルフォリン-4-イル-プロパン-2-オールの光学活性化合物(Ia)を5-カルボキシメチル-3-メチル-1H-ピロール-2,4-ジカルボン酸2-tert-ブチルエステル4-エチルエステルと共に、アセトニトリル中で1-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびN-エチル-N'-(ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドの存在下で加熱して、窒素雰囲気下でキラルピロールアミドジカルボン酸ジエステル(Ib)を得る段階;
2010535819.tif 000090
キラルピロールアミドジカルボン酸ジエステル(Ib)を塩酸と共にエタノール中で加熱還流して、アルゴン雰囲気下で光学活性ピロールアミドエチルエステル(Ic)を得る段階;
2010535819.tif 000091
さらに、光学活性ピロールアミドエチルエステル(Ic)をボランと共に無水テトラヒドロフラン中で選択的還元によって加熱還流して、キラル置換ピロールエチルエステル(Id)を得る段階;
2010535819.tif 000092
次に、キラル置換ピロールエチルエステル(Id)を水酸化リチウム一水和物と共にグリコール中で加熱還流して、アルゴン雰囲気下で光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環(Ie)の環状化産物を得る段階;
2010535819.tif 000093
光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環(Ie)をオキシ塩化リンおよびN,N-ジメチルホルムアミドと共に室温で無水ジクロロメタン中でホルミル化反応によって反応させ、光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環ホルムアルデヒド(If)を得る段階;
2010535819.tif 000094
最後に、光学活性ピロロ縮合6員アザ-複素環ホルムアルデヒド(If)を、トリエチルアミンまたはピペリジンなどの塩基の存在下で、異なるインドリノンと共に2〜12時間加熱して、式(I)のキラルピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体の標的産物を得る段階;
2010535819.tif 000095
。
[請求項107]
請求項101〜105のいずれか一項記載のピロロ縮合6員アザ-複素環ヒドロキシルモルフォリン誘導体またはその薬学的に許容される塩をタンパク質キナーゼに接触させる段階を含む、タンパク質キナーゼの触媒活性を調節するための方法。
[請求項108]
タンパク質キナーゼが、受容体チロシンキナーゼ(RTK)、非受容体タンパク質チロシンキナーゼ(CTK)、およびセリン/トレオニンタンパク質キナーゼ(STK)からなる群より選択される、請求項107記載の方法。
[請求項109]
タンパク質キナーゼ関連障害を処置するための薬剤の調製における請求項101記載の化合物の使用。
[請求項110]
タンパク質キナーゼ関連障害が、VEGFR-2、EGFR、HER-2、HER-3、HER-4、PDGFR、c-Kit、c-Met、FGFR、およびFlt3に関連する障害から選択される、請求項109記載の使用。
[請求項111]
請求項103記載の薬学的組成物をタンパク質キナーゼに接触させる段階を含む、タンパク質キナーゼの触媒活性を調節するための方法。
【国際調査報告】
2010535819.tif 000096
2010535819.tif 000097
2010535819.tif 000098
2010535819.tif 000099
2010535819.tif 000100
2010535819.tif 000101
2010535819.tif 000102
2010535819.tif 000103