(57)【要約】本発明は、細胞中のＨｉｆ１α  ｍＲＮＡを標的とし、Ｈｉｆ１αの発現の減少を引き起こす、長さが１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、または１４ヌクレオチドであるオリゴマー化合物（オリゴマー）に関する。Ｈｉｆ１α発現の減少は、ある特定の医学的障害、例えば、癌などの過剰増殖性疾患、の治療に有益である。本発明はまた、配列番号１の領域に対して完全に相補的である、１２個の連続ヌクレオチドから成るオリゴマーであって、式５’Ａ−Ｂ−Ｃ３’のヌクレオチドの配列から成り、式中、領域Ａは２個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｂは８個のＤＮＡヌクレオチドから成り、ならびに領域Ｃは２個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成る、オリゴマーを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の領域に対して完全に相補的な、１２、１３、または１４個の連続ヌクレオチドから成るオリゴマーであって、前記オリゴマーは、配列番号５に存在するヌクレオチドの配列を含み、前記連続ヌクレオチド間のすべてのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、オリゴマー。
【請求項２】
前記オリゴマーは、式５’Ａ−Ｂ−Ｃ３’のヌクレオチドの配列から成り、式中、領域Ａは１、２、または３個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｂは７、８、９、または１０個のＤＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｃは１、２、または３個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成る、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項３】
前記オリゴマーは、配列番号５に存在するヌクレオチドの配列から成る、請求項１または２に記載のオリゴマー。
【請求項４】
領域Ａが１または２個のいずれかのＬＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｂが８または９個のいずれかのヌクレオチドから成り、領域Ｃが１または２個のいずれかのＬＮＡヌクレオチドから成り、前記オリゴマーの長さが１２ヌクレオチドである、請求項２または３に記載のオリゴマー。
【請求項５】
前記オリゴマーは、配列番号２０または配列番号２７である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項６】
前記オリゴマーは、式５’Ａ−Ｂ−Ｃ３’のヌクレオチドの配列から成り、式中、領域Ａは２または３個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｂは８または９個のＤＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｃは２または３個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成り、前記オリゴマーの長さが１３ヌクレオチドまたは１４ヌクレオチドのいずれかである、請求項２に記載のオリゴマー。
【請求項７】
前記オリゴマーは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５から選択される連続ヌクレオチド配列から成る、請求項６に記載のオリゴマー。
【請求項８】
前記オリゴマーは、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４から成る群から選択される、請求項６に記載のオリゴマー。
【請求項９】
配列番号１の領域に対して完全に相補的である、１２個の連続ヌクレオチドから成るオリゴマーであって、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオチドを含むオリゴマー。
【請求項１０】
前記オリゴマーは、式５’Ａ−Ｂ−Ｃ３’の配列から成り、式中、領域Ａは１または２個のいずれかのＬＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｂは８または９個のいずれかのヌクレオチドから成り、領域Ｃは１または２個のいずれかのＬＮＡヌクレオチドから成る、請求項９に記載のオリゴマー。
【請求項１１】
Ａが２個のＬＮＡヌクレオチドから成り、Ｂが８個のＤＮＡヌクレオチドから成り、Ｃが２個のＬＮＡヌクレオチドから成る、請求項１０に記載のオリゴマー。
【請求項１２】
Ｈｉｆ１αを発現する細胞においてＨｉｆ１αの発現を阻害する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーと、前記オリゴマーに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲート。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは請求項１３に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、またはアジュバントとを含む医薬組成物。
【請求項１５】
医学的疾患、例えば、癌などの過剰増殖性疾患の治療における医薬品としての使用のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
医学的疾患、例えば、癌などの過剰増殖性疾患の治療のための医薬品を製造するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは請求項１３に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１７】
医学的疾患、例えば、癌などの過剰増殖性疾患を治療する方法であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは請求項１３に記載のコンジュゲートまたは請求項１４に記載の医薬組成物を、前記過剰増殖性疾患を患っている患者または患っている可能性の高い患者に投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞中のＨｉｆ１α  ｍＲＮＡを標的とし、Ｈｉｆ１−αの発現の減少を引き起こす、短いオリゴマー化合物（ショートマー）に関する。Ｈｉｆ１−α発現の減少は、様々な医学的障害、例えば、癌などの過剰増殖性疾患、の治療に有益である。
【０００２】
関連出願
以下の関連出願の米国特許仮出願第６０／９７７４０９号および国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５３３１４号は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【背景技術】
【０００３】
Ｈｉｆ１−αを標的とするＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビボにおけるＨｉｆ１αのダウンレギュレーションに対して有用であることが知られており、例えば、癌などの過剰増殖性疾患の治療といった治療用途において使用することができる。国際公開第２００６／０５０７３４号および国際公開第０３／０８５１１０号では、Ｈｉｆ−１αを標的とするＬＮＡギャップマーオリゴマーが開示されている。具体的には、国際公開第２００６／０５０７３４号では、以下の式（国際公開第２００６／０５０７３４号で開示されるような）のＬＮＡギャップマーオリゴマーが開示されており、
【０００４】
【化１】
2010539961.tif 000002
この場合、大文字は、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチド類似体を示し、小文字は、２−デオキシヌクレオチドを示し、下線は、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチド類似体または２−デオキシヌクレオチドのいずれかを示し、下付文字「ｓ」は、隣接しているヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチド類似体間のホスホロチオエート結合を示し、下付文字「ｘ」は、隣接しているヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチド類似体間のホスホロチオエート結合またはホスホジエステル結合のいずれかを示している。Ｈｉｆ−１αを標的とする改良されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、配列番号１の領域に対して完全に相補的な、１２、１３、または１４個の連続ヌクレオチドから成るオリゴマーであって、配列番号５に存在するヌクレオチドの配列を含み、連続ヌクレオチド間のすべてのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合であるオリゴマーを提供する。
【０００６】
本発明は、配列番号１の領域に対して完全に相補的である、１２個の連続ヌクレオチドから成るオリゴマーであって、少なくとも１個の天然には存在しないヌクレオチド、例えば、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオチド、を含むオリゴマーを提供する。
【０００７】
本発明は、配列番号１の領域に対して完全に相補的である、１２個の連続ヌクレオチドから成るオリゴマーであって、式５’Ａ−Ｂ−Ｃ３’のヌクレオチドの配列から成り、式中、領域Ａは２個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｂは８個のＤＮＡヌクレオチドから成り、ならびに領域Ｃは２個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成る、オリゴマーを提供する。
【０００８】
本発明は、配列番号２１、２２、２３、２４、２７、および２０、ならびに任意に２５および２６から成る配列の群から選択される連続ヌクレオチドの配列から成る、オリゴマーを提供する。
【０００９】
本発明はさらに、配列番号２９および３０のオリゴマーも提供する。
【００１０】
本発明は、本発明によるオリゴマーと当該オリゴマーに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチドもしくは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲートを提供する。
【００１１】
本発明は、本発明によるオリゴマーまたは本発明によるコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
本発明は、医学的障害、例えば、癌などの過剰増殖性疾患、の治療における医薬品としての使用のために、本発明によるオリゴマーまたは本発明によるコンジュゲートを提供する。
【００１３】
本発明は、医学的疾患、例えば、癌などの過剰増殖性疾患、の治療のための医薬品を製造するための、本発明によるオリゴマーまたは本発明によるコンジュゲートの使用を提供する。
【００１４】
本発明は、医学的疾患、例えば、癌などの過剰増殖性疾患、を治療する方法であって、過剰増殖性疾患を患っている患者または過剰増殖性疾患を患っている可能性の高い患者に、本発明によるオリゴマーまたは本発明によるコンジュゲートあるいは本発明による医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】１６ｍｅｒオリゴマー（配列番号１８）および一連の１２、１３、および１４ｍｅｒオリゴマーを使用した、マウス肝臓におけるＨｉｆ１α  ｍＲＮＡのダウンレギュレーションを示す（実施例４を参照のこと）。ＮＭＲＩマウスに、５ｍｇ／ｋｇ／投与量を連続３日間投与し（静脈内に１投与／日）、最後の投与の２４時間後に動物を屠殺した。屠殺時に、肝臓組織を採取した。当該組織からＲＮＡを単離し、ｑＰＣＲを使用してＨｉｆ１α  ｍＲＮＡの発現を測定した。１６ｍｅｒのサイズを減少させると、肝臓におけるＨｉｆ１α  ｍＲＮＡのダウンレギュレーションを分析した場合の活性の長さ依存性は増加し、１２ｍｅｒにおいて最も強かった。２−８−２の１２ｍｅｒ設計は、１−９−２設計より強力であることが見出され、したがって、２−８−２の１２ｍｅｒ設計が好ましくあり得る。
【図２】１６ｍｅｒオリゴマー（配列番号１８）および一連の１２、１３、および１４ｍｅｒオリゴマーを使用した、マウス腎臓におけるＨｉｆ１α  ｍＲＮＡのダウンレギュレーションを示す（実施例４を参照のこと）。ＮＭＲＩマウスに、５ｍｇ／ｋｇ／投与量を連続３日間投与し（静脈内に１投与量／日）、最後の投与の２４時間後に動物を屠殺した。屠殺時に、腎臓組織を採取した。当該組織からＲＮＡを単離し、ｑＰＣＲを使用してＨｉｆ１α  ｍＲＮＡの発現を測定した。１６ｍｅｒのサイズを減少させると、腎臓におけるＨｉｆ１α  ｍＲＮＡダウンレギュレーションを分析した場合の活性の長さ依存性は増加し、肝臓で見られるものほど顕著ではないが、２−８−２の１２ｍｅｒが最も強かった。
【図３】５０ｍｇ／ｋｇを１回注射したマウスの、注射の１時間後、６時間後、および２４時間後における尿中に存在する配列番号２９のオリゴマーの量、ならびにその総量を示す。
【図４】５０ｍｇ／ｋｇを１回注射したマウスの、注射の１時間後、６時間後、および２４時間後における尿中に存在する配列番号３０のオリゴマーの量、ならびにその総量を示す。
【図５】５０ｍｇ／ｋｇを１回注射したマウスの、注射の２４時間後における肝臓および腎臓中に存在する配列番号２９および配列番号３０のオリゴマーの量を示す。
【図６】５０ｍｇ／ｋｇを注射したマウスの、注射の２４時間後における肝臓、腎臓、尿、および他の組織中に存在する配列番号２９および配列番号３０のオリゴマーの生体内分布／バイオアベイラビリティを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
オリゴマー
本発明は、哺乳動物Ｈｉｆ１α、例えば、配列番号１に示すＨｉｆ１α核酸など、をコードする核酸分子ならびに哺乳動物Ｈｉｆ１αをコードするそのような核酸分子の天然に存在する変異体の機能の調節における使用のために、オリゴマー化合物（本明細書においてオリゴマーと称する）を採用する。「オリゴマー」なる用語は、本発明との関係において、２個以上のヌクレオチドの共有結合によって形成された分子（すなわち、オリゴヌクレオチド）を意味する。当該オリゴマーは、長さが１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、または１４ヌクレオチドである連続ヌクレオチド配列から成る。
【００１７】
様々な実施形態において、当該オリゴマーは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５から選択される連続ヌクレオチド配列から成るかまたは含む。
【００１８】
様々な実施形態において、当該オリゴマーは、配列番号５において存在するヌクレオチドの配列から成る。
【００１９】
本発明による化合物は、直鎖状分子であるか、または直鎖状分子として合成されるのが好ましい。当該オリゴマーは、一本鎖の分子であり、好ましくは、同じオリゴマー内の同等な領域に対して相補的な（すなわち、二本鎖）、例えば少なくとも３、４または５個の連続ヌクレオチドの短い領域を含まず、この点に関して、当該オリゴマーは、（本質的に）二本鎖ではない。いくつかの実施形態において、当該オリゴマーは、本質的に二本鎖ではなく、例えばｓｉＲＮＡではない。様々な実施形態において、本発明のオリゴマーは、すべて連続ヌクレオチド領域から成り得る。したがって、当該オリゴマーは、実質的に自己相補的ではない。
【００２０】
標的
好適には、本発明のオリゴマーは、Ｈｉｆ１α遺伝子、例えば、ヒトＨｉｆ１α遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）配列である配列番号１など、の発現をダウンレギュレーションすることができる。これに関して、本発明のオリゴマーは、典型的には、ヒトなどの哺乳動物の細胞において、Ｈｉｆ１αを阻害し得る。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴマーは、標的核酸に結合して、通常の発現レベルと比較して少なくとも１０％または２０％の発現の阻害、より好ましくは通常の発現レベルと比較して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の阻害を行う。いくつかの実施形態において、そのような調節は、本発明の化合物を０．０４〜２５ｎＭの間、例えば０．８〜２０ｎＭの間の濃度で用いる場合に見られる。同じ実施形態または異なる実施形態において、当該発現の阻害は、１００％未満、例えば、９８％未満の阻害、９５％未満の阻害、９０％未満の阻害、８０％未満の阻害、例えば、７０％未満の阻害である。発現レベルの調節は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびそれに続く標的タンパク質に対して生じた適切な抗体を用いたウェスタンブロットなどの方法によって、タンパク質レベルを測定することにより特定され得る。あるいは、発現レベルの調節は、ｍＲＮＡのレベルを測定することによって、例えばノーザン・ブロットまたは定量的ＲＴ−ＰＣＲによって特定することができる。ｍＲＮＡレベルを介して測定する場合、適切な投与量、例えば０．０４〜２５ｎＭの間の濃度、例えば０．８〜２０ｎＭの間の濃度、を用いる場合のダウンレギュレーションのレベルは、いくつかの実施形態において、典型的には、本発明の化合物の非存在下における通常のレベルの１０〜２０％の間のレベルである。
【００２１】
したがって、本発明は、Ｈｉｆ１αタンパク質および／またはｍＲＮＡを発現する細胞において、Ｈｉｆ１αタンパク質および／またはｍＲＮＡの発現をダウンレギュレーションまたは阻害する方法であって、当該細胞におけるＨｉｆ１αタンパク質および／またはｍＲＮＡの発現をダウンレギュレーションまたは阻害するために、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートを当該細胞に投与する工程を含む方法を提供する。好適には、当該細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。当該投与は、いくつかの実施形態では、インビトロにおいて行われ得る。当該投与は、いくつかの実施形態では、インビボにおいて行われ得る。
【００２２】
「標的核酸」なる用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＨｉｆ１αなどの哺乳動物Ｈｉｆ１αポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば配列番号１、Ｈｉｆ１αをコードする核酸、またはそれらの天然に存在する変異体、ならびにそれらに由来するＲＮＡ核酸、好ましくはｍＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ前駆体であるが、好ましくは成熟ｍＲＮＡ、を意味する。いくつかの実施形態において、例えば、研究または診断において使用される場合、「標的核酸」は、上記ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸標的に由来するｃＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドであり得る。本発明によるオリゴマーは、好ましくは、標的核酸にハイブリダイズすることができる。配列番号１は、ｃＤＮＡ配列であり、そのようなものとして成熟ｍＲＮＡ標的配列に対応してはいるが、当該ｃＤＮＡ配列においてウラシルがチミジンで置き換えられているということは認識されるであろう。
【００２３】
「それらの天然に存在する変異体」なる用語は、規定された分類学的グループ、例えば、哺乳動物、例えば、マウス、サル、および好ましくはヒト、に元来存在している核酸配列のＨｉｆ１αポリペプチドの変異体を意味する。通常、ポリヌクレオチドの「天然に存在する変異体」について言及する場合、当該用語は、染色体転座または複製により第１４染色体；位置：１４ｑ２１−ｑ２４Ｍｂに見出される、Ｈｉｆ１αをコードするゲノムＤＮＡ、ならびにＲＮＡ、例えばそれらに由来するｍＲＮＡ、の任意の対立遺伝子変異体も包含する。「天然に存在する変異体」は、Ｈｉｆ１α  ｍＲＮＡの選択的スプライシングに由来する変異体も含み得る。例えば、特定のポリペプチド配列について言及する場合、当該用語は、例えば翻訳と同時の修飾または翻訳後の修飾、例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質切断、グリコシル化など、によってプロセシングされていてもよい、タンパク質の天然に存在する形態も含む。
【００２４】
配列
当該オリゴマーは、哺乳動物Ｈｉｆｉαをコードする核酸の同等な領域（例えば、配列番号１）に対して完全に相補的な（完璧に相補的な）連続ヌクレオチド配列を含み得るかまたはから成り得る。したがって、当該オリゴマーは、アンチセンスヌクレオチド配列を含み得るかまたはから成り得る。
【００２５】
当該オリゴマーは、配列番号１に存在するヌクレオチド配列の逆向きの相補体に対応する連続ヌクレオチド配列を含むかまたはから成り、好ましくは、配列番号１に存在する当該ヌクレオチド配列は、残基１１９８〜１２１２（境界値を含む）の間に見出せる（または、残基１１９８および１２１２である）。したがって、いくつかの実施形態において、当該オリゴマーは、配列番号２、３、４、および５から成る群から選択される配列を含み得るかまたはから成り得る。
【００２６】
【化２】
2010539961.tif 000003
したがって、当該オリゴマーは、配列番号２、３、４、または５（配列モチーフ）から、あるいは配列番号６〜１７から選択される配列に存在するヌクレオチドの配列のヌクレオチド（塩基）配列から成り得るかまたは含み得る。この点において、塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）の配列が比較され、オリゴマーのそのようなヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドまたは天然には存在しないヌクレオチドあるいはそれらの組み合わせであってもよく、本明細書において説明するように、例えば、Ａ−Ｂ−Ｃ（Ｄ）設計のギャップマーであってもよい。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴマーは、ポリヌクレオチド領域、すなわち、通常はヌクレオチド／ヌクレオチドの連続配列から成るヌクレオチド領域と、さらなる非ヌクレオチド領域との両方を含み得る。ヌクレオチド配列から成る本発明の化合物について言及する場合、当該化合物は、非ヌクレオチド成分、例えばコンジュゲート成分を含み得る。
【００２８】
あるいは、本発明のオリゴマーは、完全にヌクレオチド領域から成り得る。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは、下記（国際公開第２００６／０５０７３４号において開示されるような）ではなく、
【００３０】
【化３】
2010539961.tif 000004
ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチド類似体などのＬＮＡを示し、小文字は２−デオキシヌクレオチドを示し、下線はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチド類似体または２−デオキシヌクレオチドのいずれかを示し、下付文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチド類似体間のホスホロチオエート結合を示し、下付文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチド類似体間のホスホロチオエート結合またはホスホジエステル結合のいずれかを示す。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーのヌクレオチド配列は、下記ではない。
【００３２】
【化４】
2010539961.tif 000005
「に対応する（”ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ”）」および「に対応する（”ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｔｏ”）」なる用語は、オリゴマーのヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列（第一の配列）と、ｉ）核酸標的の逆向きの相補体のサブ配列、例えば、Ｈｉｆ１αタンパク質をコードするｍＲＮＡ、例えば配列番号１など、および／またはｉｉ）本明細書において提供されるヌクレオチドの配列、例えば、配列番号２、３、４、もしくは５から成る群またはそのサブ配列、のいずれかから選択されるさらなる配列の、同等な連続ヌクレオチド配列との間の比較を意味する。ヌクレオチド類似体は、それらの同等または対応するヌクレオチドと直接比較する。ｉ）またはｉｉ）におけるさらなる配列に対応する第一の配列は、通常は、第一の配列（例えば、連続ヌクレオチド配列）の全長のその配列に一致する。
【００３３】
「対応するヌクレオチド類似体」および「対応するヌクレオチド」なる用語は、ヌクレオチド類似体におけるヌクレオチドと天然に存在するヌクレオチドとが同一であることを示すことが意図される。例えば、ヌクレオチドの２−デオキシリボースユニットがアデニンに結合している場合、「対応するヌクレオチド類似体」は、アデニンに結合しているペントースユニット（２−デオキシリボースとは異なる）を含有する。
【００３４】
長さ
当該オリゴマーは、合計の長さが１２、１３、または１４個の連続ヌクレオチドである連続ヌクレオチド配列を含むかまたはから成る。
【００３５】
他の実施形態、例えば、ある特定の特異的オリゴマーなど、については、当該長さは１６個のヌクレオチドであり得ることに注目すべきである（配列番号２９および３０を参照のこと）。
【００３６】
ヌクレオチド類似体
「ヌクレオチド」なる用語は、本明細書で使用される場合、糖部分、塩基部分、および共有結合しているリン酸基を含むグリコシドを意味し、天然に存在するヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ、ならびに本明細書において「ヌクレオチド類似体」とも称される、修飾された糖部分および／または塩基部分を含む天然に存在しないヌクレオチドの両方を網羅する。
【００３７】
天然に存在しないヌクレオチドとしては、修飾された糖部分を有するヌクレオチド、例えば、二環式ヌクレオチドまたは２’修飾ヌクレオチド、例えば、２’置換ヌクレオチドなど、が挙げられる。
【００３８】
「ヌクレオチド類似体」は、糖および／または塩基部分が修飾された天然のヌクレオチドの変異体、例えば、ＤＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡヌクレオチド、である。類似体は、原則として、オリゴヌクレオチドとの関係において、天然ヌクレオチドに対して単に「サイレント」または「同等」であり得る、すなわち、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子の発現に対して作用する方法に、何ら機能的作用を有さない。それにもかかわらず、そのような「同等」の類似体は、例えば、それらがより簡単にまたは安価に製造される場合、または保管条件もしくは製造条件においてより安定である場合、またはタグまたは標識を表すものである場合、有用であり得る。しかしながら、好ましくは、類似体は、オリゴマーが発現を阻害するように作用する方法に関して、例えば、標的に対する結合親和性の増加、および／または細胞内ヌクレアーゼに対する耐性の増加、および／または細胞内への輸送の容易さの増加を生ずることにより、機能的作用を有するであろう。ヌクレオシド類似体の具体例は、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９−４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３−２１３、ならびにスキーム１に記載されている。
【００３９】
【化５】
2010539961.tif 000006
したがって、当該オリゴマーは、天然に存在するヌクレオチドの１個の配列（好ましくは、２’−デオキシヌクレオチド（本明細書において「ＤＮＡ」として称される）であるが、リボヌクレオチド（本明細書において「ＲＮＡ」と称される）であってもよい）、またはそのような天然に存在するヌクレオチドと１つ以上の天然に存在しないヌクレオチド、例えばヌクレオチド類似体、との組み合わせを含み得るかまたはから成り得る。そのようなヌクレオチド類似体は、標的配列に対するオリゴマーの親和性を好適に高め得る。
【００４０】
好適で好ましいヌクレオチド類似体の例は、国際出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２号によって提供されるか、または参照されている。
【００４１】
ＬＮＡまたは２’−置換糖などのオリゴマーに親和性増大ヌクレオチド類似体を組み込むことにより、特異的に結合するオリゴマーのサイズを小さくすることが可能となり得、ならびに非特異的または迷走性の結合が生じる前のオリゴマーのサイズの上限を下げ得る。
【００４２】
いくつかの実施形態において、当該オリゴマーは、少なくとも２個のヌクレオチド類似体、例えば、３、４、５、または６個のヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡユニット、を含む。いくつかの実施形態において、当該オリゴマーは、合計３、４、または５個のヌクレオチド類似体を含む。群を抜いて最も好ましい実施形態では、少なくとも１個の当該ヌクレオチド類似体はロックト核酸（ＬＮＡ）であり、すなわち、例えば、合計３、４、５（または６）個のヌクレオチド類似体はＬＮＡであってもよい。いくつかの実施形態において、全てのヌクレオチド類似体はＬＮＡであり得る。
【００４３】
ヌクレオチドのみから成る、好ましいヌクレオチド配列モチーフまたはヌクレオチド配列について言及する場合、その配列により規定される本発明のオリゴマーは、当該配列に存在する１個以上のヌクレオチドの代わりに、対応するヌクレオチド類似体、例えば、オリゴマー／標的二本鎖の二本鎖安定性／Ｔｍを上げるＬＮＡユニットまたは他のヌクレオチド類似体（すなわち親和性増大ヌクレオチド類似体）を含み得ることは認識されるであろう。
【００４４】
ヌクレオチドのそのような修飾の例としては、２’−置換基を生じる糖部分の修飾、あるいは結合親和性を高め、増大したヌクレアーゼ耐性も提供するような、架橋された（ロックト核酸）構造を生じる糖部分の修飾が挙げられる。
【００４５】
好ましいヌクレオチド類似体は、ＬＮＡ、例えば、オキシ−ＬＮＡ（例えば、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡなど）、および／またはアミノ−ＬＮＡ（例えば、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−アミノ−ＬＮＡ）、および／またはチオ−ＬＮＡ（例えば、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−チオ−ＬＮＡ）、および／またはＥＮＡ（例えば、β−Ｄ−ＥＮＡおよびα−Ｌ−ＥＮＡ）など、である。最も好ましいのは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴマー内に存在するヌクレオチド類似体（例えば、本明細書において言及される領域ＡおよびＣ）は、例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡユニット、２’−アミノ−ＤＮＡユニット、２’−フルオロ−ＤＮＡユニット、ＬＮＡユニット、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ユニット、２’−フルオロ−ＡＮＡユニット、ＨＮＡユニット、ＩＮＡ（インターカレート核酸−Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，２００２．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２００２  ３０：４９１８−４９２５、なお、当該刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる）ユニット、および２’ＭＯＥユニットから独立して選択される。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴマー中に存在するヌクレオチド類似体は、上記のタイプの１つだけ、またはそれらの連続ヌクレオチド配列である。
【００４７】
いくつかの実施形態において、当該ヌクレオチド類似体は、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマーまたはＬＮＡヌクレオチド類似体であり、そのようなものとして本発明のオリゴヌクレオチドは、これらの３タイプの類似体から独立して選択されるヌクレオチド類似体を含み得るか、または３タイプから選択される類似体のうちの１つのみを含み得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの上記ヌクレオチド類似体は、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ、例えば、２、３、４、５、または６個あるいは２’−ＭＯＥ−ＲＮＡヌクレオチドユニットである。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の上記ヌクレオチド類似体は、２’−フルオロＤＮＡ、例えば、２、３、４、５、または６個の２’−フルオロ−ＤＮＡヌクレオチドユニットである。本発明のいくつかの実施形態において、当該オリゴマーは、１−１０−１、２−８−２、１−９−２、または２−９−１ギャップマーであり、ここで、領域ＡおよびＣは、２’ＭＯＥ−ＲＮＡまたは２’−フルオロ−ＤＮＡのいずれかである。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは、少なくとも１つのロックト核酸（ＬＮＡ）ユニット、例えば、２、３、４、または５個のＬＮＡユニット、を含む。いくつかの実施形態において、当該オリゴマーは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡと、以下のＬＮＡユニット：チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、および／またはＥＮＡの１つ以上との両方を、Ｄ−βまたはα−Ｌ立体配置のいずれかにおいて、あるいはそれらの組み合わせにおいて含み得る。いくつかの実施形態において、すべてのＬＮＡシトシンユニットは、５’メチル−シトシンである。本発明のいくつかの実施形態において、当該オリゴマーは、ＬＮＡユニットおよびＤＮＡユニットの両方を含み得る。好ましくは、ＬＮＡユニットおよびＤＮＡユニットを組み合わせた合計が、１２、１３、または１４個のヌクレオチドである。本発明のいくつかの実施形態において、オリゴマーのヌクレオチド配列、例えば、連続ヌクレオチド配列は、少なくとも２個または３個のＬＮＡユニットから成り、残りのヌクレオチドユニットは、ＤＮＡユニットである。いくつかの実施形態において、当該オリゴマーは、必要に応じて、ホスホロチオエートなどの修飾されたヌクレオチド間結合を有する、ＬＮＡヌクレオチド類似体および天然に存在するヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡなど、最も好ましくはＤＮＡヌクレオチド）を含む。
【００４９】
「核酸塩基」なる用語は、ヌクレオチドの塩基部分を意味し、天然に存在する変異体ならびに天然に存在しない変異体の両方を網羅する。したがって、「核酸塩基」は、公知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、それらの複素環類似体および互換変異体も網羅する。
【００５０】
核酸塩基の例としては、これらに限定されるわけではないが、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、５−メチルシトシン、イソシトシン、疑似イソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および２−クロロ−６−アミノプリンが挙げられる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、当該オリゴマー中に存在する少なくとも１つの核酸塩基は、５−メチルシトシン、イソシトシン、疑似イソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および２−クロロ−６−アミノプリンから成る群から選択される修飾された核酸塩基である。
【００５２】
いくつかの局面において、核酸塩基なる用語は、天然に存在し得るヌクレオチドまたは天然に存在し得ないヌクレオチドのいずれかを意味するためにも使用され得ることは理解されるべきである。
【００５３】
ＬＮＡ
「ＬＮＡ」なる用語は、「ロックト核酸」として知られる二環式ヌクレオチド類似体を意味する。それは、ＬＮＡモノマーを意味する場合もあり、または「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」との関係において使用される場合、１つ以上のそのような二環式ヌクレオチド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを意味する。
【００５４】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物において使用されるＬＮＡは、好ましくは、以下の一般式Ｉの構造ならびにそれらの塩基性塩および酸付加塩を有する。
【００５５】
【化６】
2010539961.tif 000007
式中、Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（ＲＮ＊）−、−Ｃ（Ｒ６Ｒ６＊）−から選択され、
Ｂは、水素、必要に応じて置換されていてもよいＣ１〜４−アルコキシ、必要に応じて置換されていてもよいＣ１〜４−アルキル、必要に応じて置換されていてもよいＣ１〜４−アシルオキシ、核酸塩基、ＤＮＡインターカレータ、光化学活性基、熱化学的活性基、キレート性基、レポーター基、リガンドから選択され、
Ｐは、後続のモノマーへのヌクレオチド間結合のための遊離基の位置、または５’−末端基を示し、そのようなヌクレオチド間結合または５’−末端基は、必要に応じて、置換基Ｒ５または同等に適用可能な置換基Ｒ５＊を含み、
Ｐ＊は、先行のモノマーへのヌクレオチド間結合、または３’−末端基を示し、
Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒に、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−、および＞Ｃ＝Ｚ、から選択される１〜４個の基／原子から成る二端遊離基を示し、
ここで、Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、および−Ｎ（Ｒａ）−から選択され、ＲａおよびＲｂそれぞれは、水素、必要に応じて置換されていてもよいＣ１〜１２−アルキル、必要に応じて置換されていてもよいＣ２〜１２−アルケニル、必要に応じて置換されていてもよいＣ２〜１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシ、Ｃ２〜１２−アルコキシアルキル、Ｃ２〜１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ１〜６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１〜６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１〜６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１〜６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１〜６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレータ、光化学活性基、熱化学的活性基、キレート性基、レポーター基、リガンドから独立して選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは、必要に応じて置換されていてもよく、２つのジェミナル置換基のＲａおよびＲｂは一緒に、必要に応じて置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ２）を示し得、
存在するそれぞれの置換基Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊、Ｒ６、およびＲ６＊は、水素、必要に応じて置換されていてもよいＣ１〜１２−アルキル、必要に応じて置換されていてもよいＣ２〜１２−アルケニル、必要に応じて置換されていてもよいＣ２〜１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシ、Ｃ２〜１２−アルコキシアルキル、Ｃ２〜１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ１〜６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１〜６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１〜６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１〜６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１〜６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレータ、光化学活性基、熱化学的活性基、キレート性基、レポーター基、リガンドから独立して選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは、必要に応じて置換されていてもよく、ならびに２つのジェミナル置換基が一緒に、オキソ、チオキソ、イミノ、または必要に応じて置換されていてもよいメチレンを示してもよく、あるいは、必要に応じて、−Ｏ−、−Ｓ−、および−（ＮＲＮ）−から選択される１つ以上のヘテロ原子／ヘテロ基によって割り込まれた、および／又は終結された１〜５個の炭素原子（単数または複数）のアルキレン鎖から成るスピロ二端遊離基を形成してもよく、ここで、ＲＮは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択され、ならびに、２つの隣接する（非ジェミナル）置換基は、結果として二重結合を生じるさらなる結合を示していてもよく、ならびに、ＲＮ＊は、存在しているが二端遊離基に関係ない場合、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択される。
【００５６】
いくつかの実施形態において、Ｒ５＊は、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ２から選択される。
【００５７】
いくつかの実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒に、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｃ（ＲｅＲｆ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｃ（ＲｅＲｆ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｎ（Ｒｅ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−、および−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｓ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｓ−から選択される二端遊離基を示し、ここで、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆのそれぞれは、水素、必要に応じて置換されていてもよいＣ１〜１２−アルキル、必要に応じて置換されていてもよいＣ２〜１２−アルケニル、必要に応じて置換されていてもよいＣ２〜１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシ、Ｃ２〜１２−アルコキシアルキル、Ｃ２〜１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１〜６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１〜６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１〜６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１〜６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレータ、光化学活性基、熱化学的活性基、キレート性基、レポーター基、リガンドから独立して選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは、必要に応じて置換されていてもよく、２つのジェミナル置換基のＲａおよびＲｂは一緒に、必要に応じて置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ２）を示していてもよい。
【００５８】
さらなる実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は一緒に、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−、−ＣＨ（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３）−Ｏ−から選択される二端遊離基（二価の基）を示す。
【００５９】
すべてのキラル中心に対して、ＲまたはＳ配向のいずれかの不斉基が見出され得る。
【００６０】
好ましくは、本発明のオリゴマーにおいて用いられるＬＮＡは、以下のいずれかの式による少なくとも１個のＬＮＡユニットを含む。
【００６１】
【化７】
2010539961.tif 000008
式中、Ｙは、−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−，−Ｓ−、−ＮＨ−、またはＮ（ＲＨ）であり、ＺおよびＺ＊は、ヌクレオチド間結合、末端基、または保護基の中から独立して選択され、Ｂは、天然または非天然のヌクレオチド塩基部分を構成し、ＲＨは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択される。
【００６２】
特に好ましいＬＮＡユニットを、スキーム２に示す。
【００６３】
【化８】
2010539961.tif 000009
「チオ−ＬＮＡ」なる用語は、上記一般式におけるＹが、Ｓまたは−ＣＨ２−Ｓ−から選択されるロックトヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡは、β−Ｄおよびα−Ｌ−立体配置の両方であり得る。
【００６４】
「アミノ−ＬＮＡ」なる用語は、上記の一般式におけるＹが、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、および−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−から選択されるロックトヌクレオチドを含み、ここで、Ｒは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択される。アミノ−ＬＮＡは、β−Ｄおよびα−Ｌ−立体配置の両方であり得る。
【００６５】
「オキシ−ＬＮＡ」なる用語は、上記の一般式におけるＹが−Ｏ−または−ＣＨ２−Ｏ−を表す、ロックトヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡは、β−Ｄおよびα−Ｌ−立体配置の両方であり得る。
【００６６】
「ＥＮＡ」なる用語は、上記の一般式におけるＹが、−ＣＨ２−Ｏ−であるロックトヌクレオチドを含む（ここで、−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子は、塩基Ｂに対して２’位に結合している）。
【００６７】
好ましい実施形態において、ＬＮＡは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡ、およびβ−Ｄ−チオ−ＬＮＡから選択され、特にβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡから選択される。
【００６８】
ＲＮＡｓｅの動員
オリゴマー性化合物は、例えば翻訳の立体障害または他の方法によって、標的ｍＲＮＡの非ＲＮａｓｅ媒介性分解を介して機能し得るが、本発明の好ましいオリゴマーは、エンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、例えばＲＮａｓｅＨ、を動員することができるということは認識される。
【００６９】
当該オリゴマー、または連続ヌクレオチド配列は、相補的な標的ＲＮＡとの二本鎖において形成される場合にＲＮａｓｅを動員することができる、７、８、９、または１０個の連続ヌクレオチドの領域を含むことが好ましい。ＲＮａｓｅを動員することができる連続配列は、本明細書において説明したようなギャップマーとの関係において称されるような領域Ｂであってもよい。
【００７０】
欧州特許第１２２２３０９号では、インビトロにおいてＲＮａｓｅＨ活性を特定する方法が提供されており、当該方法は、ＲＮａｓｅＨを動員する能力を特定するために用いることができる。オリゴマーは、相補的ＲＮＡ標的を与えられた時に、欧州特許第１２２２３０９号の実施例９１〜９５によって提供されている方法論を用いて、同等のＤＮＡだけのオリゴヌクレオチドの少なくとも１％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、または２０％未満の初期の比率（ｐｍｏｌ／ｌ／分）を有し、２’置換基を有さず、オリゴヌクレオチドにおけるすべてのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基を有する場合に、ＲＮａｓｅＨを動員することが可能であると見なされる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、オリゴマーは、相補的ＲＮＡ標的およびＲＮａｓｅＨを与えられた時に、欧州特許第１２２２３０９号の実施例９１〜９５によって提供されている方法論を用いて、当該ＲＮａｓｅＨの初期の比率（ｐｍｏｌ／ｌ／分）が、同等のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを用いて特定された初期の比率の１％未満、例えば５％未満、例えば１０％未満、または２０％未満であり、２’置換を有さず、オリゴヌクレオチド内の全てのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基を有する場合に、ＲＮａｓｅＨを動員することが実質的に可能でないと見なされる。
【００７２】
他の実施形態において、オリゴマーは、相補的ＲＮＡ標的およびＲＮａｓｅＨを与えられた時に、欧州特許出願公開第１２２２３０９号明細書の実施例９１〜９５に提供されている方法論を用いて、当該ＲＮａｓｅＨの初期の比率（ｐｍｏｌ／ｌ／分）が、同等のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを用いて特定された初期の比率の少なくとも２０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも８０％であり、２’置換を有さず、オリゴヌクレオチド内の全てのヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基を有する場合に、ＲＮａｓｅＨを動員することが可能であると見なされる。
【００７３】
通常、相補的標的ＲＮＡとの二本鎖において形成される場合にＲＮａｓｅを動員することができるような連続したヌクレオチドユニットを形成するオリゴマーの領域は、ＲＮＡ標的との二本鎖のようなＤＮＡ／ＲＮＡを形成するヌクレオチドユニットから成り、α−Ｌ−立体配置、特に好ましくはα−Ｌ−オキシＬＮＡであるＤＮＡユニットおよびＬＮＡユニットの両方を含む。
【００７４】
本発明のオリゴマーは、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体の両方を含むヌクレオチド配列を含み得、ギャップマー、ヘッドマー、またはミックスマーの形態であり得る。
【００７５】
ヘッドマーは、５’末端における非ＲＮａｓｅ動員ヌクレオチド類似体の連続的伸長、および３’末端に向けて続く、ＲＮａｓｅによって認識可能および切断可能なＤＮＡまたは修飾ヌクレオチドユニットの連続的伸長（例えば、少なくとも７個のそのようなヌクレオチド）によって定義され、テールマーは、５’末端におけるＲＮａｓｅによって認識可能および切断可能なＤＮＡまたは修飾ヌクレオチドユニットの連続的伸長（例えば、少なくとも７個のそのようなヌクレオチド）、および３’末端へと続く非ＲＮａｓｅ動員ヌクレオチド類似体の連続的伸長によって定義される。本発明による他のキメラは、ミックスマーと呼ばれ、ＲＮａｓｅによって認識可能および切断可能なＤＮＡまたは修飾されたヌクレオチドと非ＲＮａｓｅ動員ヌクレオチド類似体との交互の組成から成る。いくつかのヌクレオチド類似体は、ＲＮａｓｅＨの結合および切断を媒介することも可能であり得る。α−Ｌ−ＬＮＡは、ＲＮａｓｅＨ活性をある程度にまで動員するので、ギャップマー構築物のためにＲＮａｓｅＨによって認識可能および切断可能なＤＮＡまたは修飾されたヌクレオチドのより小さいギャップが要求される場合があり、ミックスマー構築物においてより高い柔軟性が導入される場合がある。
【００７６】
ギャップマー設計
好ましくは、本発明のオリゴマーはギャップマーである。ギャップマーオリゴマーは、ＲＮａｓｅＨなどのＲＮａｓｅを動員することができるヌクレオチドの連続的伸長、例えば、本明細書において領域Ｂとも称される少なくとも７個のＤＮＡヌクレオチドの領域など、を含むオリゴマーであり、領域Ｂは、親和性増大ヌクレオチド類似体の領域、例えば、５’および３’と、ＲＮａｓｅを動員することができるヌクレオチドの連続的伸長との間の１、２、または３個のヌクレオチド類似体（これらの領域は、それぞれ領域ＡおよびＣと称される）、を５’および３’の両側に有する。
【００７７】
様々な実施形態において、当該オリゴマーは、式５’Ａ−Ｂ−Ｃ３’のヌクレオチドの配列から成り、式中、領域Ａは、１、２、または３個の連続ヌクレオチド類似体から成り、領域Ｂは、ＲＮａｓｅＨを動員することができる７、８、９、または１０個のヌクレオチド、例えばＤＮＡヌクレオチド、から成り、ならびに、領域Ｃは、１、２、または３個の連続ヌクレオチド類似体から成る。いくつかの実施形態において、当該オリゴマーは、式５’Ａ−Ｂ−Ｃ（−Ｄ）３’のヌクレオチドの配列から成り、式中、領域Ａは、１，２，または３個の連続ヌクレオチド類似体から成り、領域Ｂは、ＲＮａｓｅＨを動員することができる７、８、９、または１０個のヌクレオチド、例えばＤＮＡヌクレオチド、から成り、領域Ｃは、１，２，または３個の連続ヌクレオチド類似体から成り、ならびに、Ｄが状況に応じて存在してもよく、存在する場合には、１個のＤＮＡヌクレオチドである。
【００７８】
いくつかの実施形態において、当該オリゴマーは、Ａ−Ｂ−Ｃ（−Ｄ）設計、例えば、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７から選択される設計配列、を有する。
【００７９】
【表１】
2010539961.tif 000010
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド類似体はＬＮＡである。様々な実施形態において、当該オリゴマーは、式５’Ａ−Ｂ−Ｃ３’のヌクレオチドの配列から成り、式中、領域Ａは、１、２、または３個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｂは、７、８、９、または１０個のＤＮＡヌクレオチドから成り、ならびに領域Ｃは、１、２、または３個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成る。いくつかの実施形態において、当該オリゴマーは、式５’Ａ−Ｂ−Ｃ（−Ｄ）３’のヌクレオチドの配列から成り、式中、領域Ａは、１、２、または３個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｂは、７、８、９、または１０個のＤＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｃは、１、２、または３個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成り、ならびにＤが状況に応じて存在してもよく、存在する場合には、１個のＤＮＡヌクレオチドである。
【００８０】
様々な実施形態において、領域Ａは、１または２個のいずれかのＬＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｂは、８または９個のいずれかのヌクレオチドから成り、ならびに領域Ｃは、１または２個のいずれかのＬＮＡヌクレオチドから成り、この場合、当該オリゴマーの長さは、１２個のヌクレオチドである。
【００８１】
様々な実施形態において、当該オリゴマーは、式５’Ａ−Ｂ−Ｃ３’のヌクレオチドの配列から成り、式中、領域Ａは、２または３個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｂは、８または９個のＤＮＡヌクレオチドから成り、ならびに領域Ｃは、２または３個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成り、この場合、当該オリゴマーの長さは、１３または１４個のヌクレオチドである。
【００８２】
好ましくは、当該ギャップマーは、式（５’−３’），Ａ−Ｂ−Ｃの（ポリ）ヌクレオチド配列を含み、式中、領域Ａ（５’領域）は、少なくとも１個のヌクレオチド類似体、例えば、少なくとも１つのＬＮＡユニット、例えば、１、２、または３個のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡユニット、から成り、領域Ｂは、（相補的ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ標的、との二本鎖において形成される場合に）ＲＮａｓｅを動員することができる７、８、９、または１０個の連続ヌクレオチド、例えばＤＮＡヌクレオチド、から成るかまたは含み、ならびに領域Ｃ（３’領域）は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えば、少なくとも１つのＬＮＡユニット、例えば１、２、または３個のヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡ、から成るかまたは含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、当該オリゴマーは、合計で１２、１３、または１４個のヌクレオチドユニットの連続ヌクレオチド配列から成り、この場合、当該連続ヌクレオチド配列は式（５’−３’），Ａ−Ｂ−Ｃで表される。いくつかの実施形態において、Ａは１個のＬＮＡユニットから成る。いくつかの実施形態において、Ａは２個のＬＮＡユニットから成る。いくつかの実施形態において、Ａは３個のＬＮＡユニットから成る。いくつかの実施形態において、Ｃは１個のＬＮＡユニットから成る。いくつかの実施形態において、Ｃは２個のＬＮＡユニットから成る。いくつかの実施形態において、Ｃは３個のＬＮＡユニットから成る。いくつかの実施形態において、Ｂは７個のヌクレオチドユニットから成る。いくつかの実施形態において、Ｂは８個のヌクレオチドユニットから成る。いくつかの実施形態において、Ｂは９個のヌクレオチドユニットから成る。いくつかの実施形態において、Ｂは１０個のヌクレオチドユニットから成る。いくつかの実施形態において、ＢはＤＮＡユニットから成る。いくつかの実施形態において、Ｂは、α−Ｌ立体配置である少なくとも１個のＬＮＡユニット、例えば、α−Ｌ−立体配置の２、３、４、５、６、７、８、または９個のＬＮＡユニット、を含む。いくつかの実施形態において、Ｂは、少なくとも１つのα−Ｌ−オキシＬＮＡユニットから構成され、あるいは、この場合、全てのα−Ｌ−立体配置のＬＮＡユニットは、α−Ｌ−オキシＬＮＡユニットである。いくつかの実施形態において、Ａ−Ｂ−Ｃに存在するヌクレオチドの数は、２−８−２、３−８−３、２−８−３、３−８−２、４−８−１、４−８−２、１−８−４、２−８−４、または１−９−１、１−９−２、２−９−１、２−９−２、２−９−３、３−９−２、１−９−３、３−９−１、４−９−１、１−９−４、または１−１０−１、１−１０−２、２−１０−１、２−１０−２、１−１０−３、３−１０−１から成る群から選択される（ヌクレオチド類似体ユニット−領域Ｂ−ヌクレオチド類似体ユニット−例えば、ＬＮＡ、２’ＭＯＥ  ＲＮＡまたは２’フルオロＤＮＡ）。いくつかの実施形態において、Ａ−Ｂ−Ｃにおけるヌクレオチドの数は、３−７−３、２−７−３、３−７−２、３−７−４、および４−７−３から成る群から選択される。いくつかの実施形態において、領域ＡおよびＣは、２’フルオロＤＮＡヌクレオチドの２’ＭＯＥ  ＲＮＡから成る。いくつかの実施形態において、ＡおよびＣの両方は、それぞれ２個のＬＮＡユニットから成り、Ｂは８または９個のヌクレオチドユニット、好ましくはＤＮＡユニットから成る。
【００８４】
いくつかの実施形態において、当該オリゴマーは１２ｍｅｒであり、この場合、Ａは、１個のヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡであり、Ｂは、長さ９個のヌクレオチド、好ましくはＤＮＡユニットであり、ならびにＣは、２個のヌクレオチドユニット、好ましくはＬＮＡユニットである（１−９−２設計）。いくつかの実施形態において、当該１２ｍｅｒは、２−８−２設計、例えば、領域ＡおよびＣがＬＮＡであり、ならびにＢがＤＮＡである２−８−２設計を有する。
【００８５】
ヌクレオチド間結合
「結合基」または「ヌクレオチド間結合」または「ヌクレオシド間結合」なる用語は、２つのヌクレオチド、２つのヌクレオチド類似体、ならびにヌクレオチドとヌクレオチド類似体、などを一緒に共有カップリングさせることができる基を意味することが意図される。具体的かつ好ましい例としては、ホスフェート基およびホスホロチオエート基が挙げられる。
【００８６】
本発明のオリゴマーのヌクレオチドまたはそれらの連続ヌクレオチド配列は、結合基を介して一緒にカップリングされる。好適には、それぞれのヌクレオチドは、結合基を介して３’の隣接するヌクレオチドに結合している。
【００８７】
好適なヌクレオチド間結合としては、国際出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２号に記載のもの、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２号の第３４頁の第１段落に記載のヌクレオチド間結合、が挙げられる（当該刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８８】
いくつかの実施形態において、通常のホスホジエステルから、ヌクレアーゼアタックに対してより耐性のものへ、例えば、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートなど（ＲＮａｓｅＨにより切断されるこれら２つにより、標的遺伝子の発現の減少におけるアンチセンス阻害の経路も可能になる）へとヌクレオチド間結合を修飾することは好ましい。
【００８９】
本明細書において提供されるような好適な硫黄（Ｓ）含有ヌクレオチド間結合が好ましくあり得る。ホスホロチオエートのヌクレオチド間結合も、特にギャップマーのギャップ領域（Ｂ）に対して好ましい。ホスホロチオエート結合も、フランキング領域（ＡおよびＣ）に対して用いることができる。
【００９０】
しかしながら、特に、例えばヌクレオチド類似体の使用により領域ＡおよびＣ内のヌクレオチド間結合がエンド−ヌクレアーゼ分解から保護される場合、例えば、領域ＡおよびＣがＬＮＡヌクレオチドを含む場合に、領域Ａ、Ｂ、およびＣは、ホスホロチオエート以外のヌクレオチド間結合、例えばホスホジエステル結合、を含み得る。
【００９１】
標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ切断を可能にするために、当該オリゴマーにおけるヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはボラノホスフェートであってもよい。ホスホロチオエートは、ヌクレアーゼ耐性の向上および他の理由、例えば製造の容易さなどにおいて好ましい。
【００９２】
本発明のオリゴマーのいくつかの局面において、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエート基によって互いに結合している。
【００９３】
ホスホジエステル結合、例えば１つまたは２つの結合を、別のホスホロチオエートオリゴマー中へ、特に、（通常、領域ＡおよびまたはＣにおける）ヌクレオチド類似体ユニットの間または隣接して導入することにより、オリゴマーのバイオアベイラビリティおよび／または生体内分布を改変することができるということは認識される（国際公開第２００８／０５３３１４号を参照のこと。なお、当該刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９４】
本発明のいくつかの実施形態、例えば、１２ｍｅｒ、１３ｍｅｒ、または１４ｍｅｒのいくつかの実施形態など、において、当該オリゴマーは、領域ＡまたはＣのヌクレオチド類似体ユニットの間、３’ヌクレオチドまたは領域Ａと領域Ｂの５’ヌクレオチドとの間、あるいは領域Ｂの３’ヌクレオチドと領域Ｃの５’ヌクレオチドとの間のいずれかに位置する、１個のホスホジエステル結合を含む。好適には、残りのヌクレオチド間結合は、すべてホスホロチオエート結合である。
【００９５】
本発明のいくつかの実施形態、例えば、１２ｍｅｒ、１３ｍｅｒ、または１４ｍｅｒのいくつかの実施形態など、において、当該オリゴマーは、２つのホスホジエステル結合を、領域Ａ内または領域Ａに隣接する位置に、ならびに領域Ｃ内または領域Ｃに隣接する位置に、例えば、領域ＡおよびまたはＣの２つのＬＮＡヌクレオチドの間の位置に、含む。これに関係して、隣接は、それぞれ、３’ヌクレオチドまたは領域Ａと領域Ｂの５’ヌクレオチドとの間、領域Ｂの３’ヌクレオチドと領域Ｃの５’ヌクレオチドとの間を意味する。好適には、残りのヌクレオチド間結合は、すべてホスホロチオエート結合である。
【００９６】
いくつかの実施形態、例えば、上記において言及した実施形態などにおいて、好適であるが具体的に示されていない、全ての残りの結合基は、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート、あるいはそれらの混合のいずれかである。
【００９７】
しかしながら、本発明のいくつかの別の実施形態において、すべてのヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列、例えば、本明細書において提供されるもの、について言及する場合、様々な実施形態において、当該結合がホスホロチオエート結合の場合、特にヌクレオチド類似体、例えばＬＮＡユニット、の間の結合に対して、別の結合、例えば本明細書において開示するもの、を用いてもよく、例えば、ホスフェート（ホスホジエステル）結合を用いてもよいということが理解されるであろう。同様に、特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列、例えば本明細書に提供されたもの、について言及する場合、Ｃ残基が、５’メチル修飾シトシンとして注釈されている場合、様々な実施形態において、オリゴマー中に存在するＣの１つ以上は、非修飾Ｃ残基であってもよい。
【００９８】
オリゴマー性化合物
本発明のオリゴマーは、例えば、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２８、および２７から成る群から選択され得る。様々な実施形態において、当該オリゴマーは、配列番号２０または配列番号２７のどちらかである。
【００９９】
【表２】
2010539961.tif 000011
コンジュゲート
本関係において、「コンジュゲート」なる用語は、１つ以上の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分への、本明細書に記載のようなオリゴマーによる共有結合（「コンジュゲーション」）によって形成されるヘテロ分子を示すことが意図される。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の例としては、巨大分子物質、例えばタンパク質など、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはそれらの組み合わせが挙げられる。通常は、タンパク質は、標的タンパク質に対する抗体であり得る。典型的なポリマーは、ポリエチレングリコールであり得る。
【０１００】
したがって、様々な実施形態において、本発明のオリゴマーは、典型的には、ヌクレオチドの連続配列から成るポリヌクレオチド領域と、さらなる非ヌクレオチド領域との両方を含み得る。連続ヌクレオチド配列から成る本発明のオリゴマーについて言及する場合、当該化合物は、非ヌクレオチド成分、例えばコンジュゲート成分を含み得る。
【０１０１】
本発明の様々な実施形態において、当該オリゴマー性化合物は、例えばオリゴマー性化合物の細胞内取り込みを増大させるためなどに用いられ得るリガンド／コンジュゲートに結合している。国際公開第２００７／０３１０９１号は、好適なリガンドおよびコンジュゲートを提供しており、なお、当該刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
本発明はさらに、本明細書に記載されているような本発明による化合物と、当該化合物に共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲートも提供する。したがって、本明細書に開示されているような、本発明の化合物が特定の核酸またはヌクレオチド配列から成る様々な実施形態において、当該化合物はさらに、当該化合物に共有結合している少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分（例えば、１個以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含んでいない）を含み得る。
【０１０３】
（コンジュゲート部分への）コンジュゲーションは、本発明のオリゴマーの活性、細胞内分布、または細胞内取り込みを増強し得る。そのような部分としては、これらに限定されるわけではないが、抗体、ポリペプチド、脂質部分、例えばコレステロール部分など、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル−ｓ−トリチルチオールなど、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基など、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ｈ−ホスホネートなど、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミン、あるいはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられる。
【０１０４】
本発明のオリゴマーはさらに、活性薬剤物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌薬、または抗生物質などにコンジュゲートし得る。
【０１０５】
ある特定の実施形態において、コンジュゲートされる部分は、ステロール、例えばコレステロールなど、である。
【０１０６】
様々な実施形態において、コンジュゲートされる部分は、陽性に荷電されたポリマー、例えば、長さが１〜５０個、例えば２〜２０個、例えば３〜１０個の間のアミノ酸残基の、陽性に荷電したペプチドなど、および／またはポリアルキレンオキシド、例えばポリエチルグリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｇｌｙｃｏｌ）もしくはポリプロピレングリコールなど、を含むかまたはから成る（国際公開第２００８／０３４１２３号を参照のこと。なお、当該刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる）。好適には、陽性に帯電したポリマー、例えばポリアルキレンオキシドなどが、結合基、例えば国際公開第２００８／０３４１２３号に記載されている放出可能な結合基など、を介して本発明のオリゴマーに結合していてもよい。
【０１０７】
一例として、以下のコンジュゲート部分は、本発明のコンジュゲートに使用され得る。
【０１０８】
【化９】
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活性オリゴマー
「活性オリゴマー」なる用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載されたコンジュゲー卜を形成するために、１つ以上のコンジュゲートされた部分への当該オリゴマーの共有結合が可能な、少なくとも１つの官能性部分、すなわち、それ自身は核酸またはモノマーではない部分、に共有結合している（すなわち、官能化されている）本発明のオリゴマーを意味する。通常、官能性部分は、例えば、アデニン塩基の３’−ヒドロキシル基または環外ＮＨ２基を介してオリゴマーに共有結合することができる化学基、好ましくは親水性であるスペーサー、ならびにコンジュゲートした部分に結合することができる末端基（例えば、アミノ基、スルフヒドリル基、またはヒドロキシル基）を含むであろう。いくつかの実施形態において、この末端基は保護されておらず、例えば、ＮＨ２基である。他の実施形態において、当該末端基は、例えば、任意の好適な保護基、例えば、”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  ｂｙ  Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ  Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ  Ｍ  Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９）に記載されているものなど、によって保護されている。好適なヒドロキシル保護基の例としては、エステル、例えば酢酸エステルなど、アラルキル基、例えば、ベンジル、ジフェニルメチル、またはトリフェニルメチルなど、ならびにテトラヒドロピラニルが挙げられる。好適なアミノ保護基の例としては、ベンジル、α−メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、およびアシル基、例えば、トリクロロアセチルまたはトリフルオロアセチルなど、が挙げられる。いくつかの実施形態において、当該官能性部分は自己切断性である。他の実施形態において、当該官能性部分は生分解性である。例えば、米国特許第７，０８７，２２９号を参照のこと。なお、当該刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組入れられる。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴマーは、コンジュゲートされた部分が、当該オリゴマーの５’末端へ共有結合できるように、５’末端において官能化されている。他の実施形態において、本発明のオリゴマーは、３’末端において官能化されていてもよい。さらなる他の実施形態において、本発明のオリゴマーは、主鎖に沿って、または複素環式の塩基部分上において、官能化され得る。さらに他の実施形態において、本発明のオリゴマーは、５’末端、３’末端、主鎖、および塩基から独立して選択される１つ以上の位置において官能化され得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、本発明の活性オリゴマーは、合成中に、官能性部分に共有結合している１つ以上のモノマーを組み込むことによって合成される。他の実施形態において、本発明の活性オリゴマーは、官能化されていないモノマーを用いて合成され、合成の完了時に官能化される。いくつかの実施形態において、当該オリゴマーは、アミノアルキル結合基を含有するヒンダードエステルによって官能化され、この場合、アルキル部分は式（ＣＨ２）ｗを有しており、ｗは１〜１０の範囲の整数、好ましくは約６であり、当該アルキルアミノ基のアルキル部分は、直鎖または分岐鎖であり得、当該官能基は、エステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｗＮＨ）を介して当該オリゴマーに結合している。
【０１１１】
他の実施形態において、当該オリゴマーは、（ＣＨ２）ｗ−スルフヒドリル（ＳＨ）結合基を含有するヒンダードエステルによって官能化され、この場合、ｗは１〜１０の範囲の整数、好ましくは約６であり、当該アルキルアミノ基のアルキル部分は、直鎖または分岐鎖であり得、当該官能基は、エステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｗＳＨ）を介して当該オリゴマーに結合している。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、スルフヒドリル−活性オリゴヌクレオチドは、ポリマー性部分、例えば、ポリエチレングリコールまたはペプチドなどを（ジスルフィド結合の形成を介して）コンジュゲートしている。
【０１１３】
上で説明したような、ヒンダードエステルを含有する活性オリゴマーは、当分野において公知の任意の方法、ならびに、特に、国際公開第２００８／０３４１２２号およびその中の実施例において開示されている方法によって合成することができる。なお、当該刊行物は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０１１４】
さらなる他の実施形態において、本発明のオリゴマーは、実質的に米国特許第４，９６２，０２９号および同第４，９１４，２１０号に記載されているような官能化試薬によって、すなわち、ホスホルアミダイトを有する一方の末端が保護されているかまたは保護されていないスルフヒドリル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を含む反対の末端に、親水性スペーサー鎖を介して結合している実質的に直鎖状の試薬によって、オリゴマー中にスルフヒドリル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を組み込むことによって官能化される。そのような試薬は、主に、当該オリゴマーのヒドロキシル基と反応する。いくつかの実施形態において、そのような活性オリゴマーは、当該オリゴマーの５’−ヒドロキシル基にカップリングした官能化試薬を有する。他の実施形態において、活性オリゴマーは、３’−ヒドロキシル基にカップリングした官能化試薬を有する。さらなる他の実施形態において、本発明の活性オリゴマーは、オリゴマーの主鎖上のヒドロキシル基にカップリングした官能化試薬を有する。さらなる実施形態において、本発明のオリゴマーは、米国特許第４，９６２，０２９号および同第４，９１４，２１０号に記載されているような２種以上の官能化試薬によって官能化される。なお、当該刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。そのような官能化試薬を合成し、それらをモノマーまたはオリゴマーに組み込む方法については、米国特許第４，９６２，０２９号および同第４，９１４，２１０号において開示されている。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、固相結合オリゴマーの５’末端は、ジエニルホスホルアミダイト誘導体によって官能化され、続いて、脱保護されたオリゴマーが、例えば、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環状付加反応を介してアミノ酸またはペプチドによってコンジュゲーションされる。
【０１１６】
様々な実施形態において、２’−糖修飾を含有するモノマー、例えば、２’−カルバメート置換糖または２’−（Ｏ−ペンチル−Ｎ−フタルイミド）−デオキシリボース糖など、を糖オリゴマーへ組み込むことにより、当該オリゴマーの糖への、コンジュゲートされた部分の共有結合が促進される。他の実施形態において、１つ以上のモノマーの２’位にアミノ基含有結合基を有するオリゴマーは、例えば、５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（ｅ−フタルイミジルアミノペンチル）−２’−デオキシアデノシン−３’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−シアノエトキシホスホルアミダイトなどの試薬を用いて調製される。例えば、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９１，３４，７１７１を参照のこと。
【０１１７】
さらなる実施形態において、本発明のオリゴマーは、Ｎ６プリンアミノ基上、グアニンの環外Ｎ２上、またはシトシンのＮ４もしくは５位上などの核酸塩基上にアミン含有官能性部分を有していてもよい。様々な実施形態において、そのような官能化は、オリゴマー合成において既に官能化されている市販の試薬を使用することによって達成することができる。
【０１１８】
いくつかの官能性部分が市販されており、例えば、ヘテロ二官能性およびホモ二官能性結合部位が、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＩＩ．）から入手可能である。他の市販の結合基は、５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６および３’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ試薬であり、両方ともＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖａ．）から入手可能である。５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６は、ＡＢＩ社  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）からもＡｍｉｎｏｌｉｎｋ−２として入手可能であり、３’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．社（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）からも入手可能である。
組成物
本発明のオリゴマーは、医薬製剤および医薬組成物において使用することができる。好適には、そのような組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、またはアジュバントを含む。国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２号では、好適で好ましい薬学的に許容される希釈剤、担体、およびアジュバントが提供されている。なお、当該刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。好適な投与量、配合処方、投与経路、組成物、投与剤形、他の治療薬との組み合わせ、プロドラッグ配合処方も、国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２号において提供されている。なお、当該刊行物も、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
適用
本発明のオリゴマーは、例えば、診断、治療、および予防のための研究試薬として利用することができる。
【０１２０】
研究において、そのようなオリゴマーは、細胞および実験動物におけるＨｉｆ１αタンパク質の合成を特異的に阻害するために使用することができ（通常は、ｍＲＮＡを分解または阻害して、それによってタンパク質の形成を防ぐ）、それによって、標的の機能解析あるいは治療介入のための標的としての有用性の評価が促進される。
【０１２１】
診断においては、当該オリゴマーは、ノーザン・ブロット、インサイチュのハイブリダイゼーション、または同様の技術による、細胞および組織におけるＨｉｆ１α発現の検出および定量に用いることができる。
【０１２２】
治療においては、本発明によるオリゴマー性化合物を投与することにより、Ｈｉｆ１αの発現を調節することによって治療することができる疾患または障害を有する疑いのある動物またはヒトを治療する。さらに、本発明の１種以上のオリゴマーまたは組成物の治療有効量または予防有効量を投与することによって、Ｈｉｆ１αの発現に関連する疾患または状態を有するまたはその傾向があると疑われる哺乳動物を治療する方法、例えば、ヒトを治療する方法も提供される。
【０１２３】
本発明はさらに、本明細書において言及されたような障害の治療のための医薬品を製造するための、説明したような本発明の化合物またはコンジュゲートの使用、あるいは本明細書において言及されたような障害の治療方法も提供する。
【０１２４】
本発明はさらに、本明細書において言及されたような障害を治療する方法であって、本明細書で説明したような本発明による化合物、および／または本発明によるコンジュゲート、および／または本発明による医薬組成物を、それらを必要とする患者に投与する工程を含む方法も提供する。
【０１２５】
医療適応
したがって、本発明による組成物は、異常なレベルのＨｉｆ−１αに関連する状態、例えば、癌などの過剰増殖性疾患、の治療のために、あるいは、Ｈｉｆ１αが示唆される他の障害において、例えば、アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、網膜黄斑部変性、慢性関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、疣贅、アレルギー性皮膚炎、炎症、皮膚炎などにおいて、使用することができる。Ｈｉｆ−１α標的オリゴマーは、本発明による医薬組成物において、さらなる治療薬、例えば、国際公開第２００６／０５０７３４号において提供されるさらなる治療薬など、と組み合わせてもよいことは認識されるであろう。なお、当該刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、当該癌は、腎癌または肝臓癌であり得る。
【０１２７】
本発明はさらに、本明細書において言及されたような疾患、障害、または状態を治療するための医薬品の製造における、本発明の化合物の使用を提供する。
【０１２８】
概説すると、いくつかの局面において、本発明は、異常なレベルのＨｉｆ１αに関連する状態に罹患している、またはその疑いのある哺乳動物を治療する方法であって、１個以上のＬＮＡユニットを含む、Ｈｉｆ１αを標的とするオリゴマーの治療有効量を哺乳動物に投与する工程を含む方法を対象とする。
【０１２９】
本発明の興味深い局面は、本明細書において言及されたような疾患、障害、または状態の治療のための医薬品を製造するための、本明細書において定義されたようなオリゴマー（化合物）または本明細書において定義されたようなコンジュゲートの使用を対象とする。
【０１３０】
本発明の方法は、好ましくは、異常なレベルのＨｉｆ１αにより引き起こされる疾患に対する治療または予防のために用いられる。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、本発明は、さらに、異常なレベルのＨｉｆ１αを治療する方法であって、本発明のオリゴマー、または本発明のコンジュゲート、または本発明の医薬組成物を、それらを必要とする患者に投与する工程を含む方法を対象とする。
【０１３２】
本発明はさらに、医薬品として使用するための、本明細書において定義されるオリゴマー、組成物、またはコンジュゲートに関する。
【０１３３】
さらに、本発明は、疾患または状態、例えば、本明細書において言及されるようなもの、を患っている対象を治療する方法に関する。
【０１３４】
治療を必要としている患者は、疾患または障害を患っている患者または患っている可能性が高い患者である。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、「治療」なる用語は、本明細書で使用される場合、既存の疾患（例えば、本明細書において言及されたような疾患または障害）の治療または疾患の予防、すなわち予防法、の両方を意味する。したがって、本明細書において言及されたような治療は、いくつかの実施形態では、予防法であり得ることが認識されるであろう。
【０１３６】
実施形態
本発明の以下の実施形態は、本明細書に記載された他の実施形態と組み合わせて使用することができる。
【０１３７】
１．合計１０、１１、１２、１３、または１４個の核酸塩基ユニットの、式（５’−３’），Ａ−Ｂ−Ｃで表される連続核酸塩基配列から成るオリゴマーであって、式中、Ａは、１、２、または３個のＬＮＡユニットから成り、Ｂは、相補的ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ標的）との二本鎖において形成される場合にＲＮａｓｅＨを動員することができる７、８、または９個の連続核酸塩基ユニットから成り、Ｃは、１、２、または３個のＬＮＡユニットから成る。
【０１３８】
２．Ａが１個のＬＮＡユニットから成る、実施形態１によるオリゴマー。
【０１３９】
３．Ａが２個のＬＮＡユニットから成る、実施形態１によるオリゴマー。
【０１４０】
４．Ａが３個のＬＮＡユニットから成る、実施形態１によるオリゴマー。
【０１４１】
５．Ｃが１個のＬＮＡユニットから成る、実施形態１〜４のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１４２】
６．Ｃが２個のＬＮＡユニットから成る、実施形態１〜４のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１４３】
７．Ｃが３個のＬＮＡユニットから成る、実施形態１〜５のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１４４】
８．Ｂが７個の核酸塩基ユニットから成る、実施形態１〜７のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１４５】
９．Ｂが８個の核酸塩基ユニットから成る、実施形態１〜７のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１４６】
１０．Ｂが９個の核酸塩基ユニットから成る、実施形態１〜７のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１４７】
１１．Ｂが１〜９個の間のＤＮＡユニット、例えば、２、３、４、５、６、７、または８個のＤＮＡユニットを含む、実施形態１〜１０のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１４８】
１２．ＢがＤＮＡユニットから成る、実施形態１１によるオリゴマー。
【０１４９】
１３．Ｂが、α−Ｌ立体配置である少なくとも１個のＬＮＡユニット、例えば、α−Ｌ−立体配置である２、３、４、５、６、７、８、または９個のＬＮＡユニット、を含む、実施形態１〜１１のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１５０】
１４．Ｂが、少なくとも１個のα−Ｌ−オキシＬＮＡユニットを含むか、あるいは、α−Ｌ−立体配置の全てのＬＮＡユニットが、α−Ｌ−オキシＬＮＡユニットである、実施形態１３によるオリゴマー。
【０１５１】
１５．Ａ−Ｂ−Ｃにおける核酸塩基の数が、１−８−２、２−８−１、２−８−２、３−８−３、２−８−３、３−８−２から成る群から選択される、実施形態１〜１４のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１５２】
１６．ＡおよびＣの両方が、それぞれ２個のＬＮＡユニットから成り、Ｂが８個の核酸塩基ユニット、好ましくはＤＮＡユニットから成る、実施形態１〜１５のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１５３】
１７．ＡおよびＣのＬＮＡユニットが、β−Ｄおよびα−Ｌ立体配置またはそれらの組み合わせのいずれかの、オキシ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、およびアミノ−ＬＮＡから独立して選択される、実施形態１〜１６のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１５４】
１８．ＡおよびＣのＬＮＡユニットが、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、実施形態１７によるオリゴマー。
【０１５５】
１９．Ａが、どちらもα−Ｌ−オキシＬＮＡではない２個のＬＮＡユニットから成る、実施形態１〜１８のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１５６】
２０．Ｃが、どちらもα−Ｌ−オキシＬＮＡではない２個のＬＮＡユニットから成る、実施形態１〜１９のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１５７】
２１．Ａが、いずれのチオ−ＬＮＡ核酸塩基も含まない、実施形態１〜２０のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１５８】
２２．Ｃが、いずれのチオ−ＬＮＡ核酸塩基も含まない、実施形態１〜２１のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１５９】
２３．Ａが、いずれのアミノ−ＬＮＡ核酸塩基も含まない、実施形態１〜２２のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１６０】
２４．Ｃが、いずれのアミノ−ＬＮＡ核酸塩基も含まない、実施形態１〜２３のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１６１】
２５．ヌクレオシド間結合が、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、およびボラノホスフェートから成る群から独立して選択される、実施形態１〜２４のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１６２】
２６．少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、実施形態２５によるオリゴマー。
【０１６３】
２７．ＤＮＡユニットに隣接するか、またはＤＮＡユニットの間にあるヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、実施形態２５によるオリゴマー。
【０１６４】
２８．少なくとも１対の連続するＬＮＡユニット、例えば、領域ＡまたはＣにおける２個のＬＮＡユニットの間の結合が、ホスホジエステル結合である、実施形態２６または２７によるオリゴマー。
【０１６５】
２９．連続するＬＮＡユニット、例えば、領域ＡおよびＣにおける２個のＬＮＡユニット、の間のすべての結合が、ホスホジエステル結合である、実施形態２８によるオリゴマー。
【０１６６】
３０．すべてのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、実施形態２６によるオリゴマー。
【０１６７】
３１．連続核酸塩基配列が、Ｈｉｆ１αを形成する哺乳動物の相当する領域、例えばヒトｍＲＮＡ、に対して相補的である、実施形態１〜３０のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１６８】
３２．連続核酸塩基配列が、本明細書において開示されたオリゴマー配列の核酸塩基配列中に存在するかまたは当該配列に対応する連続核酸配列から成る群から選択される、実施形態１〜３１のいずれか１つによるオリゴマー。
【０１６９】
３３．実施形態１〜３２のいずれか１つよるオリゴマーと、当該化合物に共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチドもしくは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲート。
【０１７０】
３４．実施形態１−３２のいずれか１つに規定されたようなオリゴマーまたは実施形態３３に規定されたようなコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、またはアジュバントとを含む医薬組成物。
【０１７１】
３５．オリゴマーがプロドラッグとして構成される、実施形態３４による医薬組成物。
【０１７２】
３６．哺乳動物細胞中のｍＲＮＡの細胞内濃度を減少させるための、実施形態１〜３２のいずれか１つによるオリゴマーの使用。
【０１７３】
３７．ｍＲＮＡが、Ｈｉｆ１αを形成するヒトｍＲＮＡである、実施形態３６によるオリゴマーの使用。
【０１７４】
３８．哺乳動物細胞への実施形態１〜３２のいずれか１つによるオリゴマーの投与を含む、哺乳動物細胞中のｍＲＮＡの細胞内濃度を減少させる方法であって、当該哺乳動物細胞が、当該オリゴマーに相補的な核酸塩基配列を含むｍＲＮＡ種を含む方法。
【実施例】
【０１７５】
（実施例１）
モノマー合成
ＬＮＡヌクレオチド類似体構築ブロック（例えば、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡ、およびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ）は、以下の確立された公開の手順（例えば、国際公開第２００７／０３１０８１号を参照のこと。なお、当該刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる）に従って調製することができる。
【０１７６】
（実施例２）
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドは、国際公開第０７／０３１０８１号に記載および参照された方法に従って合成した。β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡを使用した。
【０１７７】
（実施例３）
ｍＲＮＡレベルの測定
Ｈｉｆ１−α発現のアンチセンス調節は、当分野において公知の様々な方法においてアッセイすることができる。例えば、Ｈｉｆ１ーα  ｍＲＮＡのレベルは、例えば、ノーザン・ブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、またはリアルタイムＰＣＲによって定量化することができる。現在のところ、リアルタイム定量ＰＣＲが好ましい。ＲＮＡ解析は、全細胞内ＲＮＡまたはｍＲＮＡについて実施することができる。ＲＮＡの単離方法およびノーザン・ブロット解析などのＲＮＡの解析方法は、当該技術分野における日常的な方法であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓにおいて教示されている。
【０１７８】
リアルタイム定量（ＰＣＲ）は、ＢｉｏＲＡＤ社から入手可能な市販のｉＱ  Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｌｏｒ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて簡便に行うことができる。リアルタイム定量ＰＣＲは、当技術分野において周知の技術であり、例えば、Ｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９６）、６：９８６−９９４において教示されている。
【０１７９】
（実施例４）
Ｈｉｆ１α  ｍＲＮＡを標的とする様々な長さ（１６ｍｅｒ〜１２ｍｅｒ）のオリゴヌクレオタイド（連続３日間での５ｍｇ／ｋｇ×３回の静脈内投与）
この研究において、５ｍｇ／ｋｇ／投与量を連続３日間投与し（静脈内に１投与量／日）、最後の投与の２４時間後に動物を屠殺した。屠殺時に、肝臓を採取した。当該肝臓からＲＮＡを単離し、ｑＰＣＲを用いてＨｉｆ１αの発現を測定した。結果を、図１に示す。
【０１８０】
（実施例５）
肝臓におけるＨｉｆ１α  ｍＲＮＡを標的とする様々な長さ（１６ｍｅｒ〜１２ｍｅｒ）のオリゴヌクレオタイド（連続３日間での５ｍｇ／ｋｇ×３回の静脈内投与）
この研究において、ＮＭＲＩマウスに５ｍｇ／ｋｇ／投与量を連続３日間投与し（静脈内に１投与／日）、最後の投与の２４時間後に動物を屠殺した。屠殺時に、肝臓組織および腎臓組織を採取した。当該組織からＲＮＡを単離し、ｑＰＣＲを使用してＨｉｆ１α  ｍＲＮＡの発現を測定した。結果を図２に示す。結果は、肝臓において見られるものほど劇的でないが、これは、通常、オリゴヌクレオチドは腎臓皮質に到達するだけであるのに対し、Ｈｉｆ−１α  ｍＲＮＡは腎臓全体（髄質および皮質の両方において）で発現されるので、腎臓においてＨＩＦ−１ａの強力なノックダウンを達成することが困難なためであると考えられる。１２ｍｅｒなどのショートマーの使用は、腎臓でのダウンレギュレーションの効力を向上させると考えられ、これは、髄質に浸透する能力のためであり得、および／または特定のショートマー設計、特に２−８−２設計、の効力が高いためであり得る。
【０１８１】
（実施例６）
２つのホスホロチオエート結合がホスホジエステルで置き換えられた同等なオリゴマーによる完全ホスホロチオエートギャップマーの生体内分布の比較
オリゴヌクレオチド化合物
配列番号２８〜２９において、ボールドの大文字はＬＮＡユニットを示し、下付文字「ｓ」はホスホロチオエート結合を表す。「ｓ」の不在は、ホスホジエステル結合を示す。ＬＮＡは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡであった。
【０１８２】
以下のオリゴマーを合成した。
【０１８３】
【表３】
2010539961.tif 000013
配列番号２９および３０オリゴマーを、５０ｍｇ／ｋｇの投与量でマウスに注射した。１時間後、６時間後、および２４時間後に尿を採取した。動物は、２４時間後に屠殺し、肝臓および腎臓に存在する各オリゴマーのレベルを評価した。
【０１８４】
結果を、図３、４、５、および６に示す。
【０１８５】
尿から分泌される初期の比率は、配列番号３０の方がより高いように見えるが、２４時間後では、配列番号２９の方がわずかに高いことがわかった。
【０１８６】
腎臓へ分配された、２つのＰＯを有する配列番号３０の量は、配列番号２９のほぼ倍近い。
【０１８７】
配列番号３０は、他の組織に対してより広い生体内分布を示し、他の組織への分布は、配列番号２９が６４％であるのに対し、配列番号３０は６９％である。
【０１８８】
１個のホスホジエステル結合の存在により、明らかに、腎臓におけるダウンレギュレーションの効力が増強され、生体内分布が改善されるため、腎臓のショートマーの活性をさらに高めるために、以下のオリゴヌクレオタイドを設計した。
【０１８９】
【表４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
2010539961.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年6月2日(2010.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明は、配列番号１の領域に対して完全に相補的な、１２、１３、または１４個の連続ヌクレオチドから成るオリゴマーであって、配列番号５に存在するヌクレオチドの配列を含み、連続ヌクレオチド間のすべてのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合であるオリゴマーを提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号１の領域に対して完全に相補的な、１２、１３、または１４個の連続ヌクレオチドから成るオリゴマーであって、前記オリゴマーは、配列番号５に存在するヌクレオチドの配列を含み、前記連続ヌクレオチド間のすべてのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、オリゴマー。
（項目２）
前記オリゴマーは、式５’Ａ−Ｂ−Ｃ３’のヌクレオチドの配列から成り、式中、領域Ａは１、２、または３個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｂは７、８、９、または１０個のＤＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｃは１、２、または３個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成る、項目１に記載のオリゴマー。
（項目３）
前記オリゴマーは、配列番号５に存在するヌクレオチドの配列から成る、項目１または２に記載のオリゴマー。
（項目４）
領域Ａが１または２個のいずれかのＬＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｂが８または９個のいずれかのヌクレオチドから成り、領域Ｃが１または２個のいずれかのＬＮＡヌクレオチドから成り、前記オリゴマーの長さが１２ヌクレオチドである、項目２または３に記載のオリゴマー。
（項目５）
前記オリゴマーは、配列番号２０または配列番号２７である、項目１〜４のいずれか１項に記載のオリゴマー。
（項目６）
前記オリゴマーは、式５’Ａ−Ｂ−Ｃ３’のヌクレオチドの配列から成り、式中、領域Ａは２または３個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｂは８または９個のＤＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｃは２または３個の連続ＬＮＡヌクレオチドから成り、前記オリゴマーの長さが１３ヌクレオチドまたは１４ヌクレオチドのいずれかである、項目２に記載のオリゴマー。
（項目７）
前記オリゴマーは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５から選択される連続ヌクレオチド配列から成る、項目６に記載のオリゴマー。
（項目８）
前記オリゴマーは、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４から成る群から選択される、項目６に記載のオリゴマー。
（項目９）
配列番号１の領域に対して完全に相補的である、１２個の連続ヌクレオチドから成るオリゴマーであって、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオチドを含むオリゴマー。
（項目１０）
前記オリゴマーは、式５’Ａ−Ｂ−Ｃ３’の配列から成り、式中、領域Ａは１または２個のいずれかのＬＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｂは８または９個のいずれかのヌクレオチドから成り、領域Ｃは１または２個のいずれかのＬＮＡヌクレオチドから成る、項目９に記載のオリゴマー。
（項目１１）
Ａが２個のＬＮＡヌクレオチドから成り、Ｂが８個のＤＮＡヌクレオチドから成り、Ｃが２個のＬＮＡヌクレオチドから成る、項目１０に記載のオリゴマー。
（項目１２）
Ｈｉｆ１αを発現する細胞においてＨｉｆ１αの発現を阻害する、項目１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー。
（項目１３）
項目１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーと、前記オリゴマーに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲート。
（項目１４）
項目１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは項目１３に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、またはアジュバントとを含む医薬組成物。
（項目１５）
医学的疾患、例えば、癌などの過剰増殖性疾患の治療における医薬品としての使用のための、項目１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは項目１３に記載のコンジュゲート。
（項目１６）
医学的疾患、例えば、癌などの過剰増殖性疾患の治療のための医薬品を製造するための、項目１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは項目１３に記載のコンジュゲートの使用。
（項目１７）
医学的疾患、例えば、癌などの過剰増殖性疾患を治療する方法であって、項目１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは項目１３に記載のコンジュゲートまたは項目１４に記載の医薬組成物を、前記過剰増殖性疾患を患っている患者または患っている可能性の高い患者に投与する工程を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の領域に対して完全に相補的な、１２個の連続ヌクレオチドから成るオリゴマーであって、前記オリゴマーは、配列番号５に存在するヌクレオチドの配列からなり、前記連続ヌクレオチド間のすべてのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、オリゴマー。
【請求項２】
前記オリゴマーは、式５’Ａ−Ｂ−Ｃ３’のヌクレオチドの配列から成り、式中、領域Ａは１個または２個のいずれかのＬＮＡヌクレオチドから成り、領域Ｂは８個または９個のいずれかのヌクレオチドから成り、領域Ｃは１個または２個のいずれかのＬＮＡヌクレオチドから成る、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項３】
前記オリゴマーは、配列番号１６で示される配列を有する、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項４】
Ａが２個のＬＮＡヌクレオチドから成り、Ｂが８個のＤＮＡヌクレオチドから成り、Ｃが２個のＬＮＡヌクレオチドから成る、請求項２に記載のオリゴマー。
【請求項５】
前記オリゴマーは、
【化１０】
2010539961.tif 000021
であり、ここでボールドの大文字はＬＮＡヌクレオチド（ユニット）であり、小文字は、ＤＮＡユニットであり、下付文字ｓはホスホロチオエート結合であり、Ｃの前の上付文字ｍは、５’メチルシトシンを表す、請求項４に記載のオリゴマー。
【請求項６】
前記ＬＮＡユニットはβ−Ｄ−オキシＬＮＡユニットである、請求項５に記載のオリゴマー。
【請求項７】
前記オリゴマーは、配列番号１５で示される配列を有する、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項８】
Ａが１個のＬＮＡヌクレオチドから成り、Ｂが９個のＤＮＡヌクレオチドから成り、Ｃが２個のＬＮＡヌクレオチドから成る、請求項２に記載のオリゴマー。
【請求項９】
前記オリゴマーは、
【化１１】
2010539961.tif 000022
であり、ここでボールドの大文字はＬＮＡヌクレオチド（ユニット）であり、小文字は、ＤＮＡユニットであり、下付文字ｓはホスホロチオエート結合である、請求項８に記載のオリゴマー。
【請求項１０】
前記ＬＮＡユニットはβ−Ｄ−オキシＬＮＡユニットである、請求項９に記載のオリゴマー。
【請求項１１】
前記オリゴマーは、Ｈｉｆ１αを発現する細胞においてＨｉｆ１αの発現を阻害し得る、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマーと、前記オリゴマーに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲート。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは請求項１２に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、またはアジュバントとを含む医薬組成物。
【請求項１４】
医学的疾患、例えば、癌などの過剰増殖性疾患の治療のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは請求項１２に記載のコンジュゲートを含む組成物。
【請求項１５】
医学的疾患、例えば、癌などの過剰増殖性疾患の治療のための医薬品を製造するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは請求項１２に記載のコンジュゲートの使用。
【国際調査報告】
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