(57)【要約】  Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質のコアＮドメインおよびコアＣドメインを別々のポリペプチドとして含み、さらに免疫応答を誘導する少なくとも１つの外来分子を含む分割コアキャリア物質。本発明によれば、外来分子（特に異種外来アミノ酸配列）は、コアＮドメインのＣ末端、またはコアＣドメインのＮ末端と融合している。また、コアタンパク質はカプシド様粒子を形成できる。また本発明は、上記に関連する産生方法に関する。
2010502658.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質のコアＮドメインおよびコアＣドメインを別々のポリペプチドとして含み、さらに免疫応答を誘発する少なくとも１つの外来分子を含む分割コアキャリアシステムであって、
前記外来分子は、コアＮドメインのＣ末端、またはコアＣドメインのＮ末端に融合し、
前記コアタンパク質は、カプシド様粒子を形成することが可能で、
前記外来分子はコアタンパク質の７３位と９４位の間に位置するコアタンパク質アミノ酸に融合していることを特徴とする分割コアキャリアシステム。
【請求項２】
Ｂ型肝炎ウイルスが、哺乳類特異的であることを特徴とする請求項１に記載の分割コアキャリアシステム。
【請求項３】
コアタンパク質が、ヒトＢ型肝炎ウイルスの配列を有することを特徴とする請求項２に記載の分割コアキャリアシステム。
【請求項４】
コアタンパク質が、ＷＨＶのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２に記載の分割コアキャリアシステム。
【請求項５】
外来分子が、病原性細菌のタンパク質のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の分割コアキャリアシステム。
【請求項６】
外来分子が、病原性真核生物のタンパク質、特にマラリア病原体である熱帯熱マラリア原虫のタンパク質のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の分割コアキャリアシステム。
【請求項７】
外来分子が、ウイルスのタンパク質のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の分割コアキャリアシステム。
【請求項８】
外来分子が、病原性に基づく潜在的能力を有するタンパク質、特に腫瘍マーカータンパク質のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の分割コアキャリアシステム。
【請求項９】
外来分子が、
ａ）  ビオチンアクセプターペプチド配列
ｂ）  ＡＣＩＤペプチド配列
ｃ）  プロテインＡ由来のＺ３３ドメイン配列、および
ｄ）  プロテインＧのＧＢ１ドメイン配列
からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の分割コアキャリアシステム。
【請求項１０】
免疫応答を誘発する外来分子、特に外来タンパク質のためのキャリア作製方法であって、
前記キャリアは、第１にＢ型肝炎ウイルスのコア抗原のタンパク質配列を有し、第２に外来分子、特に異種タンパク質配列を有し、
前記外来分子、特に異種タンパク質配列は、Ｂ型肝炎コア領域の７３位の下流、または９４位の上流でコアＮドメインまたはコアＣドメインと融合し、
前記キャリアのポリペプチド鎖は、コアＮドメインの下流、またはコアＣドメインの上流で分断されており、
ｉ）コアＮドメインおよび外来分子、特に異種タンパク質配列、またはコアＣドメインおよび外来分子、特に異種タンパク質配列を、それぞれ融合タンパク質として発現させるか、または、
ｉｉ）コアＮと外来分子、特に異種タンパク質配列との間に、またはコアＣと外来分子、特に異種タンパク質配列との間にプロテアーゼ認識配列を挿入して分割コアワクチンを発現させた後、使用前にプロテアーゼによって２つのポリペプチドに切断し、
その後続いてカプシド様粒子が形成されることを特徴とするキャリア作製方法。
【請求項１１】
融合によって、Ｂ型肝炎コア抗原の７４位のアミノ酸の下流、または８５位のアミノ酸の上流に異種タンパク質配列を付加することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
異種外来タンパク質配列が、少なくとも全長４０個のアミノ酸からなることを特徴とする請求項１０〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
異種外来タンパク質配列が、少なくとも全長１２０個のアミノ酸からなることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
バイシストロン性のベクターによって２つのポリペプチドを別々に発現し、第１のポリペプチドはコアＮドメインを含み、第２のポリペプチドはコアＣドメインを含み、異種タンパク質配列はコアＮドメインのＣ末端またはコアＣドメインのＮ末端に融合していることを特徴とする請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれかに記載の分割コアキャリアシステムを有するカプシド様粒子を含む医薬。
【請求項１６】
ワクチンであることを特徴とする請求項１４に記載の医薬。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれかに記載の分割コアキャリアシステムを有するカプシド様粒子を含む診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチンおよび他の分子のための、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原由来の新規キャリアに関する。病原体などに由来する外来アミノ酸配列は、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原に組み込まれ、ワクチンは、このようなタンパク質配列に対する抗体、好ましくは防御抗体または中和抗体の産生を目的とするものである。また、本発明の粒子は、細胞性免疫応答（Ｔ細胞）を賦活してもよい。Ｂ型肝炎コアタンパク質は、複数のコピーからカプシド様粒子を形成することができるという特性を持つ。このカプシド様粒子（ＣＬＰ）は、免疫系を賦活し、その結果として抗体産生が増大するので、特にワクチンの製造に適している。本出願において、「ワクチン」とは、好ましくは体液性および細胞性免疫応答のいずれも誘発することが可能なキャリアシステムを意味する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルスのカプシドは、ウイルスコアタンパク質の１８０コピーまたは２４０コピーで構成される、正二十面体対称性を持つナノ粒子（直径：約３０ｎｍ）である。このコアタンパク質は、ＨＢｃＡｇと呼ばれている。カプシドは、外来分子用の粒子状キャリアとして機能し、好ましくはワクチン用の免疫増強作用を有する抗原キャリアとして適用される。コアタンパク質を適切に修飾することによって、粒子表面（必要に応じて内部でも）に外来分子を提示することができる。コアタンパク質のアミノ酸配列の中央に位置するアミノ酸残基（７３位〜９４位付近のアミノ酸領域）は免疫優性Ｂ細胞エピトープである「ｃ／ｅ１」を含み、３次元構造において粒子表面に最も多く提示される。そのため、外来分子をこのアミノ酸残基に結合させることによって、外来分子の粒子表面への提示が最適化される。
【０００３】
ＷＯ０１／７７１５８には、Ｂ型肝炎コア抗原融合タンパク質が記載されており、このタンパク質は、好ましくは６１位と９０位の間の領域に異種性エピトープが挿入されている。ＵＳ２００３／０１９８６４９には、リガンド構造を介してＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質に免疫抗原が結合したＢ型肝炎ウイルスコア抗原粒子が記載されている。Ｋｒａｔｚら（ＰＮＡＳ  （１９９９），  ｐｐ．１９１５−１９２０）は、ＨＢＶコアタンパク質の表面にＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）が提示されたことを報告している。このＨＢＶコアタンパク質では、７９位と８０位のアミノ酸が２３８個のアミノ酸からなるＧＦＰのアミノ酸配列で置換されている。
【０００４】
Ｎａｓｓａｌら（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００５），  ｐｐ．６５５−６６５）は、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）のＯｓｐＡ全長タンパク質とＢ型肝炎ウイルスカプシドタンパク質との融合生成物について報告している。このカプシドタンパク質でもまた、７９位と８０位のアミノ酸がＯｓｐＡの１８位〜２７３位のアミノ酸で置換されているが、コアタンパク質とＯｓｐＡの間にリンカー配列が導入されている。Ｓｋａｍｅｌら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００６．，  ｐｐ．１７４７４−１７４８１）は、Ｂ型肝炎ウイルスのカプシド様粒子によって、ボレリア・ブルグドルフェリのＯｓｐＣ完全長タンパク質が提示されたことを報告している。しかしながら、先行技術において解決手段として開示された修飾コアタンパク質は、所望通りにカプシド様粒子（ＣＬＰ）を形成する傾向を持たないことがわかっているため、この修飾コアタンパク質では免疫応答が十分に増強されない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この事実は、ペプチドまたはタンパク質由来の外来分子をコアタンパク質へ遺伝子的に挿入する場合、外来配列がそのＮ末端およびＣ末端の両方を介してコアタンパク質に結合することを意味している。外来配列が両末端で結合することによって、好適な外来配列の種類が大幅に狭まり、選択の余地が限られることが分かっている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に記載の分割コアシステムは、コアタンパク質を２つの部分に分けて生成することによって、このような制限を排除できる。この２つの部分は、驚くほど自然に結合して、元の一続きのタンパク質鎖と同様にカプシド粒子を形成する。外来分子は、キャリアタンパク質のＮ末端断片（「コアＮ」）またはＣ末端断片（「コアＣ」）に融合すればよいため、いずれか一方の末端のみを介してキャリアタンパク質に結合する。その結果、コアタンパク質の一続きのペプチド鎖へ外来配列を挿入する際に、外来配列の両末端が結合することにより生じる構造上の制限が、本質的に排除される。
【発明の効果】
【０００７】
したがって、本発明の分割コアシステムによって、
（ｉ）  従来の一続きのコアタンパク質においては、サイズ上および／または構造上の原因によってほとんどまたは全く提示できない外来分子を提示すること；
（ｉｉ）  ヘテロダイマー性の外来タンパク質を提示すること；
（ｉｉｉ）  所望のパートナー分子との相互作用を実質的に促進するような、柔軟かつ十分に接触可能な状態で相互作用性の外来分子を提示すること；および
（ｉｖ）  従来の一続きのコアシステムには存在せず、本分割コアシステムには存在する、新たに表面に露出したＮ末端およびＣ末端を介して、さらなる外来分子を提示すること
が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】コアタンパク質構造の概略図を示す。
【図２】分割コアシステムの原理を示す。
【図３】微生物由来の発現ベクターを用いて、コアＮとコアＣの２つの断片をそれぞれほぼ等モル産生する２つの例の概略図を示す。
【図４】Ａは、誘導されたＯｓｐＡ−特異的抗体の血中動態を示し、Ｂは、ＯｓｐＡに対する総抗体量とＬＡ２と同等の抗体量とを比較したグラフを示す。
【図５】分割コアシステムにおいて、外来タンパク質に対する抗体が領域特異的に誘導される原理を示す。
【図６】相互作用可能な外来分子が柔軟な構造で提示される分割コア融合を示す。
【図７】相互作用可能な外来分子（本図ではＧＢ１）を表面に提示する自己蛍光性の分割コアＣＬＰの原理を示す。
【図８】ボレリア・ブルグドルフェリで惹起したＳＣＩＤマウスにおける種々の抗ＯｓｐＡ免疫血清の防御能力を示す。
【図９】本図に記載の免疫抗原でＢ１０マウスを１回または２回免疫した後のＣＳＰおよびコアキャリアに対するＢ細胞応答性を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はエンベロープウイルスである。内側のヌクレオカプシドは、コア粒子（「コア」）とも呼ばれ、血清学的にはＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）として定義される。コアは、１８３〜１８５個のアミノ酸からなるコアタンパク質（ＨＢＶのサブタイプに応じて異なる）の１８０コピーまたは２４０コピーから構成される。コアタンパク質を、異種で（微生物、酵母、真核細胞で）発現させて、「カプシド様粒子」（＝ＣＬＰ）を自然に形成させてもよい。カプシド様粒子は、ウイルスゲノムも外側エンベロープも含まないため、非感染性である。このようなＣＬＰは、より近縁の哺乳類（例えば、ヤマネズミ、リスなど）のＨＢＶ、およびより遠縁である鳥類のＨＢＶ（例えば、アヒル、アオサギなど）からも得られる。本発明においては、原則として任意のＨＢＶ配列を使用できるが、ヒトへの感染能力を持つＨＢＶ配列が好ましい。
【００１０】
ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、Ｇａｌｉｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９７９），  ｐｐ．６４６−６５０、  Ｎａｓｓａｌ，  Ｇｅｎｅ  （１９８８），  ｐｐ．２７９−２９４およびＷＯ０１／７７１５８で開示されており、これらの出版物を参照する。ａｙｗサブタイプのコアタンパク質配列を用いることが好ましいが、他の哺乳類または鳥類のＨＢＶ配列のようなＨＢＶ配列の変異体や改変体も同様に使用できる。これらの配列は、一般に入手可能な遺伝子ライブラリーで保存されている。
【００１１】
ヒト病原性のＢ型肝炎ウイルス（狭義のＨＢＶ）以外に、動物に特異的な多数の関連Ｂ型肝炎ウイルスが存在する。例えば北アメリカヤマネズミ（動物学名：Ｍａｒｍｏｔａ  ｍｏｎａｘ；ヤマネズミＢ型肝炎ウイルス＝ＷＨＶ）ＨＢＶ（ヤマネズミＢ型肝炎ウイルス＝ＷＨＶ）や、カリフォルニアジリス（動物学名：Ｓｐｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｂｅｅｃｈｅｙｉ）ＨＢＶ（ジリスＢ型肝炎ウイルス＝ＧＳＨＶ）などが挙げられる。
【００１２】
これらのウイルスは、ヒトＨＢＶと同様の遺伝子構造を有するが、ヌクレオチド配列においては明確な差異があるため、タンパク質のアミノ酸配列も明確に異なる。
【００１３】
ヒトＨＢＶコアをワクチンキャリアとして使用する際には、次のような２つの制限が予想される。
【００１４】
１．  慢性のＨＢＶ感染患者は、ＨＢＶ抗原に対してある程度寛容を示す（このような免疫応答の欠如も感染が長引く一因となっている）。コアも、Ｔ細胞依存性抗原として作用するため、ＨＢＶコアＣＬＰに基づくワクチンの強力な免疫原性には、コアタンパク質配列のＴ細胞エピトープが関与している。ＨＢＶに慢性的に感染している患者では、ＨＢＶコアに対してＴ細胞が免疫寛容を示すため、ヒトＨＢＶコアをワクチンキャリアとして使用しても、効果が表れない可能性がある。しかし、ＷＨＶおよび他の動物のＨＢＶのコアに対しては、上記のような寛容性は示さない（Ｂｉｌｌａｕｄ  ＪＮ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｏｄｅｎｔ  ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２００７  Ｆｅｂ  １９；２５（９）：  ｐｐ．１５９３−６０６参照）。したがって、キャリアとして動物のＨＢＶコアタンパク質を使用することは、ワクチン接種を受けようとする対象者がこのような特別な集団にいる場合には有利かもしれない。
【００１５】
２．  コアは、非常に強力な免疫原性を有するため、ＨＢＶに急性的にまたは慢性的に感染したすべての対象者で、コアに対する強力なＢ細胞応答（抗ＨＢｃＡｇ）が誘発される。感染が治癒した場合は、さらにＨＢＶエンベロープタンパク質に対する抗体（抗ＨＢｓＡｇ抗体）が見られるのが特徴である。ＨＢＶ感染に対する現在の予防ワクチンは、もっぱらＨＢＶエンベロープタンパク質（ＨＢｓＡｇ）由来である。したがって、ワクチン接種に成功した場合は、感染が治癒した場合と同様に、抗ＨＢｓＡｇ抗体が出現する。対象者が感染とＨＢｓＡｇワクチン接種のいずれによって抗ＨＢｓＡｇ抗体を獲得したのかは、時に診断上興味深い問題であり、感染後にのみ生じる抗ＨＢｃＡｇ抗体の検出の有無によって判断することができる。
【００１６】
また、ヒトＨＢＶコアに基づいたワクチンでは、挿入した外来タンパク質に対する所望の応答以外に、コアに対する特定の応答（抗ＨＢｃＡｇ）が誘発される。このワクチンでは、抗ＨＢｓＡｇ抗体も同時に生じるため、ＨＢＶ感染とＨＢｓＡｇワクチン接種を区別するのがより困難になると考えられる。
【００１７】
本発明の分割コアシステムでは、主要エピトープすなわちｃ／ｅ１が物理的に分断され、大部分の抗ＨＢｃＡｇ抗体はこのエピトープを認識できなくなっているため、本発明の分割コアシステムは、抗ＨＢｃＡｇ抗体の産生を最小限に抑えられる。しかし、コアタンパク質の他の配列領域に対するＨＢｃＡｇへの応答は残存する。ヒト以外のＨＢＶコアタンパク質、好ましくはＷＨＶコアタンパク質をキャリアベースとして使用することによって、このような応答を一層抑える、または避けることができる。
【００１８】
本発明の分割コアキャリアシステムの基本的な構成要素は、第１にＢ型肝炎ウイルスのコアタンパク質であり、第２に免疫応答を誘発する外来分子である。
【００１９】
本発明の最も広範な実施形態において、コアタンパク質は、任意のＢ型肝炎ウイルス由来である。種々のＢ型肝炎ウイルスが知られているが、本発明においては、哺乳類から単離された、該哺乳類に特異的なＢ型肝炎ウイルス由来の配列を使用することが好ましい。特に、ヒトＨＢＶを使用することが好ましい。しかし、上記に加えて、コアタンパク質配列を提供するＢ型肝炎ウイルスは、例えば、アヒルまたはアオサギのような鳥類などの他の動物由来であってもよい。
【００２０】
もう一方の構成要素、すなわち免疫応答を誘発する外来分子としては、原則として、任意の分子が挙げられる。本発明においては、タンパク質配列が好ましく、病原体の表面に存在し、免疫系と接触するタンパク質配列が特に好ましい。免疫系が、このような病原体の表面構造に対する抗体を産生できれば、病原体は、ワクチン接種を受けた患者の体内で免疫系の個々の要素と接した後に不活性化され、通常このような病原性の感染菌は殺滅される。
【００２１】
データベースから入手可能なヤマネズミＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ）アミノ酸配列を、ＨＢＶコアタンパク質（ａｙｗサブタイプ）と比較すると、両者の相同性は約６０％であった。配列の違いは、６６位と９４位の間のアミノ酸領域で特に顕著である。また、この領域は、ｃ／ｅ１エピトープを含み、ＨＢＶ分割コアシステムにおいてはコアタンパク質のＮ末端領域とＣ末端領域の間に位置する分割部位もさらに含む。特に好ましい実施形態において、このような分割部位は、７９位のアミノ酸と８１位のアミノ酸の間に存在する。
【００２２】
核酸レベルにおいて、ＷＨＶコアタンパク質配列を７９位（グルタミン酸をコードする）と８０位（グルタミンをコードする）の間で分割し、本発明のＷＨＶ分割コアキャリアシステムを作製した。ヌクレオチドレベルでは、ＷＨＶコアタンパク質のＮ末端セグメント（以下、ＷコアＮと略記する）のカルボキシ末端にＢａｍＨ１切断部位をコードする配列を付加した。その下流に、第２のリボソーム結合部位およびＮｄｅ１制限酵素切断部位が続き、この切断部位は、ＷＨＶコアＣ（ＷコアＣ）セグメントの開始コドンと重複している。この配列構造は、対応するＨＢＶ分割コアコンストラクトにおける好ましい配列構造と一致している。このため、ＢａｍＨ１−Ｎｄｅ１消化によって、一方のシステムからもう一方のシステムへ直接挿入を行うことができる。本明細書に記載の事例では、ＢａｍＨ１切断部位の導入により、ＷコアＮは、保存的置換（すなわちＥ７９Ｄ）を伴い、さらにＣ末端アミノ酸としてプロリン（Ｐ）が付加されている。このことが、粒子形成能に対して悪影響を及ぼすことはない。また、Ｃ末端のプロリンは、プロテアーゼ耐性に関与するため、分割タンパク質の安定性が増大する。ＨＢＶ分割コアと同様に、ＷコアＣではＱ８０（ＨＢＶではＳ８１）の上流に開始メチオニンが付加されている。このＷＨＶ分割コアコンストラクトは、対応するＨＢＶ分割コアコンストラクトと同様に均一な粒子を形成した。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態において、コアタンパク質のＣ末端領域およびＮ末端領域は、それぞれ別のＢ型肝炎ウイルス由来であってもよい。この場合、本発明のハイブリッド分割コアキャリアシステムは、本質的には３つの構成要素、すなわち、あるＢ型肝炎ウイルス（例えば、ヒトＢ型肝炎ウイルス）由来のコアタンパク質のＮ末端領域、免疫応答を誘発する外来分子、および別のＢ型肝炎ウイルス（例えば、ＷＨＶ）由来のコアタンパク質のＣ末端領域を有する。このようなハイブリッド分割コアコンストラクトも、粒子を問題なく形成した。異なるＢ型肝炎ウイルス間では、コアタンパク質のアミノ酸配列が異なるので、それぞれのＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープも異なる。したがって、ハイブリッド分割コアシステムは、粒子状キャリアに対する免疫応答に特に影響を及ぼす可能性がある。
【００２４】
核酸レベルにおいて、ＷＨＶコアタンパク質配列を７９位（グルタミン酸をコードする）と８０位（グルタミンをコードする）の間で分割し、本発明の好ましいハイブリッド分割コアキャリアシステムを作製した。ヌクレオチドレベルでは、ＷＨＶコアタンパク質のＮ末端セグメント（以下、ＷコアＮと略記する）のカルボキシ末端にＢａｍＨ１切断部位をコードする配列を付加した。その下流に、第２のリボソーム結合部位およびＮｄｅ１制限酵素切断部位が続き、この切断部位は、ＷＨＶコアＣ（ＷコアＣ）セグメントの開始コドンと重複している。この配列構造は、対応するＨＢＶ分割コアコンストラクトにおける好ましい配列構造と一致している。このため、ＢａｍＨ１−Ｎｄｅ１消化によって、一方のシステムからもう一方のシステムへ直接挿入を行うことができる。本明細書に記載の事例では、ＢａｍＨ１切断部位の導入により、ＷコアＮは、保存的置換（すなわちＥ７９Ｄ）を伴い、さらにＣ末端アミノ酸としてプロリン（Ｐ）が付加されている。このことが、粒子形成能に対して悪影響を及ぼすことはない。また、Ｃ末端のプロリンは、プロテアーゼ耐性に関与するため、分割タンパク質の安定性が増大する。ＨＢＶ分割コアと同様に、ＷコアＣではＱ８０（ＨＢＶではＳ８１）の上流に開始メチオニンが付加されている。このコンストラクトは、問題なく粒子を形成することができた。
【００２５】
天然ＨＢｃＡｇと同様に、組換えＨＢＶ  ＣＬＰも、高い免疫原性を有する（Ｔ細胞非依存性抗原およびＴ細胞依存性抗原として）。本明細書において、対称的な多重体粒子構造はコア粒子にとって不可欠である。慣用のネガティブ染色電子顕微鏡検査法や電子低温顕微鏡検査法によって、前記構造を視覚化することができる。ショ糖密度勾配遠心法（沈降係数は、変異体に応じて６０〜８０Ｓの範囲；比較として、可溶性モノマータンパク質：約１〜５Ｓ；真核生物のリボソームサブユニット：４０Ｓ＋６０Ｓ）により、粒子の性質を生化学的に確認することができる。また粒子は、非変性アガロースゲル電気泳動において明確な泳動挙動を示し、その挙動は非粒子状のものとは異なる。このことから、ＣＬＰの形成能、またはタンパク質のＣＬＰ構造の有無を判断することができる。
【００２６】
ＨＢＶコアタンパク質は、１８３個または１８５個のアミノ酸（ＷＨＶタンパク質は１８７個のアミノ酸）を有し、２つのドメインから構成される。ＣＬＰの構築には、Ｎ末端から約１４０個のアミノ酸（会合ドメイン）が必要十分条件である。Ｃ末端領域は塩基性アミノ酸に富み、核酸と結合している。従来の大腸菌発現システムにおいて、Ｃ末端切断型のコアタンパク質変異体（１−１４９）は、全長タンパク質より実質的に良好な発現を示した。よって、１位〜１４９位のアミノ酸からなるコアタンパク質のＣＬＰ、すなわち核酸結合ドメインを持たないＣＬＰを、中〜高解像度の電子顕微鏡による構造研究に用いた。このようにして、上記ＣＬＰおよびコアタンパク質の結晶構造を決定することができた。生化学的な性質から予想された通り、コアタンパク質は、安定性の高い対称的なダイマーを形成しており、これらのダイマーが会合して９０または１２０のダイマーを含むＣＬＰが形成される。
【００２７】
コア粒子は、特徴的なスパイクを有する。各ダイマーは、４つのヘリックスを１組として構成されるスパイクを形成し、各モノマーは、アミノ酸配列の中央部に長い２つのαヘリックスを有する。スパイク先端は、７４位〜８５位のアミノ酸領域に位置するアミノ酸を含む。この領域は、さらにＨＢｃＡｇの免疫優性Ｂ細胞エピトープ（ｃ／ｅ１エピトープ）を有する。また、この領域の残基が表面に現れることから、ｃ／ｅ１エピトープが特に高い免疫原性を持つことを説明できる。
【００２８】
図１は、コアタンパク質構造を概略的に示したものである。図１の左側にＨＢＶコアタンパク質の一次配列を表す。全長タンパク質は、１８３個のアミノ酸（いくつかのＨＢＶサブタイプでは１８５個のアミノ酸）で構成される。そのうち、ＣＬＰの形成に必要とされるのは、Ｎ末端の約１４０個のアミノ酸（会合ドメイン）のみである。Ｃ末端アミノ酸が、１４９位であることが好ましい。１４９位、および１４９位の下流で１８３位までの任意のアミノ酸であれば、ＣＬＰの形成を妨げることなくＨｉｓタグと融合することができる。ｃ／ｅ１エピトープは、７８位〜８３位のアミノ酸領域に位置し、中央に位置する２つのαヘリックス間のループの一部を形成している（左下参照）。ヘリックス自体は、切断型でもよいが、コアＮではＧｌｙ７３までのアミノ酸残基が、コアＣではＧｌｙ９４から下流のアミノ酸残基が、恐らく最低限必要である。図１の右側は、コアタンパク質ダイマーを概略的に示したものである。各モノマーの中央に位置する２つのへリックスのみが示されている。図中のｃ／ｅ１エピトープは、粒子表面に位置する。
【００２９】
粒子を形成させるためには、コアアミノ酸配列は、少なくとも１４０位まで、好ましくは少なくとも１４９位まで必要であるが、ＨＢＶサブタイプに応じて、Ｃ末端の１８３位または１８５位までさらに伸長させてもよい。１４０位より下流、好ましくは１４９位より下流のアミノ酸配列を外来配列で置換して、該外来配列が通常ＣＬＰの内部に存在するようにしてもよい。このような外来アミノ酸は、主として抗体産生を促すものではなく、他の機能を発揮してもよい。
【００３０】
ＨＢｃＡｇは、非常に高い免疫原性を有するため、組換えＨＢＶ  ＣＬＰは、外来抗原用の免疫原性を増強するキャリアとして使用する上で注目されている。
【００３１】
他の解決手段としては、既に形成されたＣＬＰに外来分子を化学的に結合させる方法が挙げられる。本発明により、外来アミノ酸配列のコアタンパク質への遺伝子融合が提供される。Ｘ線結晶構造が決定される前にすでに経験的な試みに基づいて、強力なＢ細胞応答の誘発にはｃ／ｅ１エピトープの領域が最適であることがわかっていた。現在、Ｘ線結晶構造に基づいて、上記の融合によって、中央に位置する２つのヘリックス間のループに挿入が起こっていることが明らかになっている。このループ自体は、いかなる構造的な機能も持たないので、外来配列が挿入されても少なくとも原理的には、コアタンパク質の３次元構造は保持される。挿入された外来配列にもよるが、規則的なＣＬＰの形成を維持できる融合タンパク質もある。しかし、外来アミノ酸配列は融合タンパク質構造の形成に悪影響を及ぼす可能性があるので、ＣＬＰの形成が必ずしも保証されているわけではない。粒子構造自体は、高い免疫原性を示す上で不可欠である。
【００３２】
これまでにも様々な外来配列がコアタンパク質に挿入され、その一部で免疫原性の増大が実験的に確認されている（Ｕｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．  （１９９８），  ｐｐ．１４１−１８２）。しかし、約４０個を超えるアミノ酸からなる比較的長い外来配列を挿入する数多くの試みが失敗に終わっている（粒子の形成は認められなかった）ことから、挿入可能な外来配列の長さにはおのずと制限があると考えられており、通常最大４０個までのアミノ酸、または特別な場合には最大１２０個までのアミノ酸が限度とされていた。
【００３３】
少なくとも下記の２つの本質的な基準を満たす場合、コアタンパク質のＣ末端およびＮ末端に融合した外来アミノ酸配列は、粒子のみを形成することが分かった。
（ｉ）外来タンパク質は、そのＮ末端とＣ末端が、コアタンパク質の結合点（Ｎ末端コア部分（つまりおよそ１位〜およそ７８位までのコアアミノ酸（コアＮ））のＣ末端；Ｃ末端コア部分（つまりおよそ８０位〜１４９位または１８３位までのコアアミノ酸（コアＣ））のＮ末端）の空間配置に適合するような３次元構造でなければならない。
（ｉｉ）外来タンパク質自体がホモメリックな相互作用をしてダイマー、トリマー等を形成する場合、このホモオリゴマーの構造も、同様に２つのコアタンパク質部分の構造と適合しなければならない。
【００３４】
したがって、天然の３次元構造でＮ末端とＣ末端が近接している外来タンパク質は、先に開示された融合タンパク質で提示されるのに十分な構造をしている。ＧＦＰは、上記必要条件をいずれも満たすが、他の多くのタンパク質はこの条件を満たさない。後者の１つの例は、ライム病病原体（ボレリア・ブルグドルフェリ）の表層タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）であり、その長い３次元構造においてＮ末端とＣ末端は反対側に位置する。
【００３５】
ＯｓｐＡまたは同様に不都合な構造を有する他のタンパク質を挿入すると、融合タンパク質に張力が生じる。外来タンパク質が、正しく折りたたまれたままで、２つのコアタンパク質部分が互いに接触できない場合、コアタンパク質が折りたたまれて起こる二量化および粒子形成が妨げられる。あるいは、コアタンパク質部分が折りたたまれていると、外来タンパク質の折りたたみに支障をきたす。その結果、外来タンパク質は、天然の構造をとれなくなる（抗原性が変異する）、または著しく異常に折りたたまれた場合は、凝集してしまう。
【００３６】
ＯｓｐＡの場合には、非常に長いリンカー配列を利用することで、部分的ではあるが、この問題を回避することができた。このリンカー配列は、それ自体が望ましくない抗原性を有する可能性があり、その結果、例えば内因性の抗原と有害な交差反応を起こす可能性があるという点で、特にワクチンへの応用を考慮すると潜在的な問題がある。さらに、これに対応するタンパク製剤においては、規則的なＣＬＰを形成する能力はきわめて限定的なものであった。
【００３７】
さらに、コアタンパク質キャリアのダイマー構造や、キャリア粒子の表面が幾何学上制限されている（ＣＬＰの「球面」での有効なスペースが制限されている）ことから、非常に大きな外来タンパク質、または球状構造から大幅に外れる外来タンパク質では、全般的な立体障害が問題になる可能性がある。外来タンパク質の最大サイズは、複数の要因に依存する。本発明の方法によって、約３２０個のアミノ酸からなる外来タンパク質（ＣＳＰ）を提示することに既に成功している。
【００３８】
したがって、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質のコアＮドメインおよびコアＣドメインを別々のポリペプチドとして有し、さらに体液性免疫応答および必要に応じて細胞性免疫応答を誘発する少なくとも１つの外来アミノ酸配列を有する分割コアワクチンに関する。前記外来アミノ酸配列は、コアＮドメインのＣ末端、またはコアＣドメインのＮ末端と融合し、前記コアタンパク質は、カプシド様粒子を形成することができる。また、中和抗体を誘導するキャリアシステムが好ましい。
【００３９】
本発明の分割コアワクチンにおいて、コアタンパク質は、ｃ／ｅ１エピトープ領域、すなわちおよそ７３位のアミノ酸と９４位のアミノ酸の間で分断、すなわち分割されていることが不可欠である。次いで、コアＮ領域のＣ末端に外来アミノ酸配列を融合させてもよい。この場合、コアＣ部分のＮ末端は、コアＮタンパク質が切り離された位置のアミノ酸で始まる。さらに、ｃ／ｅ１エピトープの一部を欠失させる、すなわち７３位と９４位の間のアミノ酸領域から１つ以上のアミノ酸を欠失させることも可能である。あるいは、コアＣ領域のＮ末端に、抗体を産生させることが可能な外来アミノ酸配列を融合することも可能である。この場合、コアＮのＣ末端領域は、コアタンパク質を分断した位置のアミノ酸が終端となる。分割コアワクチンの本質的な作用として、外来アミノ酸配列が融合した分割コアワクチン粒子でも、コアカプシド様粒子を形成する能力を保持していなければならない。この形成能は、ショ糖密度勾配遠心法または非変性アガロースゲル電気泳動法によって調べることができる。さらに、電子顕微鏡による検査も可能である。
【００４０】
抗体を産生させることが可能な外来アミノ酸配列としては、微生物の表面構造由来の配列が好適である。上記の微生物は、ヒトでは通常疾病の原因となる。この表面構造に対する中和抗体を産生できれば、免疫防御システムが働き、侵入する微生物を非常に速やかに排除することができる。既にワクチン開発がかなり進展している微生物としては、ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病病原体）が挙げられる。本発明の範囲内で好ましく使用される外来アミノ酸配列は、ボレリア・ブルグドルフェリの表面タンパク質ＯｓｐＡおよびＯｓｐＣである。しかし、外来アミノ酸配列は、病原性生物由来の他の配列であってもよい。一例として、マラリア病原体である熱帯熱マラリア原虫が挙げられる。
【００４１】
抗体を産生させることが可能な外来アミノ酸配列としては、他にウイルス由来の配列が挙げられる。宿主生物の免疫系と接するウイルスタンパク質由来のアミノ酸配列を用いることが好ましい。通常、宿主生物の免疫系とまず初めに接するのは表面タンパク質であるため、前記タンパク質は、主として表面タンパク質である。しかし、ウイルスが、自身の生命サイクルの中で分泌するタンパク質であってもよい。上記タンパク質は、ウイルスの種類に応じて、例えば、ウイルスコアタンパク質またはヌクレオカプシドタンパク質であってもよい。
【００４２】
しかし、本発明の分割コアワクチンは、外因性のアミノ酸配列に対する抗体の産生だけでなく、例えば腫瘍マーカーのような望ましくない内因性の構造に対する抗体の産生にも使用してよい。腫瘍細胞は、多くの場合、正常細胞とは異なる表面マーカーを発現している。したがって、分割コアワクチンで上記の内因性のアミノ酸配列が提示されると、免疫応答が誘発され、生体内で漸増的に前記腫瘍細胞に対する抗体が産生される。この抗体によって免疫防御システムが働き、腫瘍細胞を容易に認識して最終的には排除する。また本発明のキャリアシステムは、さらに効率を向上させるために細胞性免疫応答を誘発してもよい。
【００４３】
さらに本出願は、異種タンパク質配列に対するワクチンを作製する方法にも関する。上記分割コアワクチンは、２つの部分に分かれたＢ型肝炎ウイルスのコア抗原で構成され、異種タンパク質配列がコアＮ領域に融合しているか、コアＣタンパク質が異種タンパク質配列のＣ末端に融合しているかのいずれかである。コア抗原のアミノ酸鎖において、２つのドメインに分割される位置は７３位と９４位の間である。このアミノ酸領域は、ｃ／ｅ１エピトープに相当し、この領域の個々のアミノ酸を欠失させてもよい。
【００４４】
本発明の方法は、原則として２つの異なる方法で実行できる。本発明において、２つの部分の分割コア抗原をたった１本のポリペプチド鎖として発現する場合、所望の位置にプロテアーゼ認識配列を挿入する。これにより、発現したポリペプチドは、プロテアーゼによって先に定義した２つの部分に切断される。この実施形態において、ポリペプチドを所望の切断部位で切断するプロテアーゼを共発現することも可能である。上記プロテアーゼをコードする遺伝子配列を、同じベクターまたは別のベクターに導入してもよい。
【００４５】
一方、別の好ましい実施形態においては、特別のベクターを使用して、上記２つのポリペプチドを発現する。好ましくは「バイシストロン性の」ベクターを使用する。バイシストロン性のベクターでは、分割コアワクチンの第１の部分が１本のポリペプチド鎖として発現され、そのＣ末端に終止コドンが位置する。その直後に、リボソームが再び付着し、第２のポリペプチドが発現される。これにより、分割コアワクチンの２つの部分が、ほぼ同量産生されることが保証される。また、分割コアワクチンのどちらか一方の部分しか得られないベクターの場合と異なり、宿主生物がベクターの一方を欠損しないよう注意する必要もない。
【００４６】
「融合タンパク質」または「融合した」とは、２つの異なるタンパク質またはポリペプチドがペプチド結合によって互いと結合していることを意味する。融合タンパク質をコードする核酸配列を発現させることによって、一続きになった融合タンパク質を産生する。
【００４７】
本発明において、ＨＢＶ−ＣＬＰキャリアシステムのより広い有用性（一般的には外来分子の提示を目的とし、具体的にはワクチンキャリアとして）を実現するためには、挿入された外来タンパク質がＮ末端およびＣ末端の両方を介して結合してしまうことが、タンパク化学上の主な問題であった。２つの共有結合のいずれか一方（挿入断片のＮ末端側またはＣ末端側）を解消できれば、挿入可能な外来タンパク質の数および種類は大幅に増加する。分割されたコアタンパク質部分（分割コア）は、互いを見つけて正しく折りたたまれるため、この場合でも粒子は形成される。これが、本発明の本質的な態様である。
【００４８】
図２は、不都合な３次元構造を有する外来タンパク質（例えばＯｓｐＡ）の挿入によって、コアタンパク質キャリアの粒子形成可能な構造の形成が妨げられる様子を概略的に示したものである（上ルート）。もう一方は、コアタンパク質キャリアの正しい３次元構造が形成されることによって、外来タンパク質の天然の３次元構造の形成が妨げられる様子を示している（下ルート）。このような現象は、所望の抗体の結合に悪影響を及ぼす。外来タンパク質挿入断片とキャリアとの間に形成された２つの共有結合のいずれか一方（挿入断片のＣ末端側またはＮ末端側）が切断されると（矢印）、この立体構造上の問題は解消される。これを達成するための１つの方法は、一続きの融合タンパク質を続いて切断することである。そのために、特定のプロテアーゼによる切断部位をさらに導入することが必要である。したがって、最初から２つの断片を別々に発現させることが好ましい。
【００４９】
本発明の解決手段によって、さらに別の効果が生じる。
（ｉ）ｃ／ｅ１エピトープは粒子表面に存在するため、新たなＮ末端およびＣ末端が、この粒子表面で形成される。これによりさらなる誘導（派生）が可能になる。例えば、コアＮ断片に外来分子Ｘを融合し、コアＣ断片に外来分子Ｙを融合できる。これは、ヘテロダイマー性の外来分子の提示に適用可能である。しかし、ここで、融合によって付加されたこの２つの部分によって立体障害が起こらないよう考慮する必要がある。
（ｉｉ）粒子表面のＮ末端とＣ末端のいずれに結合するかによって、挿入された外来配列の特定のサブ領域（例えば、特に重要なエピトープ）が、粒子表面に近い位置、および粒子表面から離れた位置のいずれかに配向される。一例としては、ボレリア・ブルグドルフェリのＯｓｐＡの「ＬＡ２エピトープ」が挙げられ、これはＣ末端領域に位置することが分かっている。このエピトープを認識する抗体は、中和作用を有する。
【００５０】
また、このことは、さらに相互作用性の表面を提示する外来配列を挿入する場合は重要である（第３の分子を付加した例を参照）。相互作用可能な外来配列を片側にのみ結合するので、不自然な３次元構造を強いられない。むしろ、種類に応じて柔軟な構造、または妨げられることなく正しい３次元構造を形成できる。これによって、相互作用パートナーとの相互作用が実質的に促進される。
【００５１】
本発明は、また分割コアシステムに基づいたカプシド様粒子を含む医薬、特にワクチンに関する。
【００５２】
本発明の医薬は、本発明のカプシド様粒子を含有する。また、本発明の医薬が、免疫系にプラスの影響を及ぼすことが好ましい。通常、本発明の分割コアキャリアシステムは、免疫系に外来アミノ酸配列を提示し、その結果免疫系がその外来アミノ酸配列に対する抗体、好ましくは中和抗体を産生する。次いで、これらの抗体は、生体内に侵入した微生物またはウイルスの制御に決定的な役割を担う。または、望ましくない腫瘍細胞を特異的に破壊するよう補助的に働く。
【００５３】
さらに別の実施形態において、診断用および／または分析的な手段として、本発明の分割コアキャリアシステムを使用してもよい。このような適用については、実施例１２および実施例１３でより詳細に示す。例えば、上記の手段により、抗原と結合してその抗原を蛍光によって可視化する、接触可能な自己蛍光性の抗体結合粒子を作製することが可能である。さらに別の実施形態において、本発明の分割コアキャリアシステムは、特定の金属イオン／ランタニド元素と特異的に結合するペプチド配列を含んでもよい。分割コアシステムにこのようなペプチドを導入すると、１つの粒子につき、この種のリポーター原子／イオンを複数含有する粒子が得られ、よりよく検出することができる。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
ＴＥＶプロテアーゼ認識配列が挿入された野生型コアタンパク質
野生型コアタンパク質（１−１４９）（アミノ酸Ｐ７９およびＡ８０がＧＧＧＧＴ−ＥＮＬＹＦＱＧＴ−ＧＧＧＧで置換されたコアタンパク質。残基Ｇは、プロテアーゼが認識配列に接触しやすいように付加されたリンカーである）のｃ／ｅ１エピトープにタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識配列を導入した。組換え発現されたタンパク質は粒子を形成した。このタンパク質をＴＥＶプロテアーゼとともにインキュベートし、ＳＤＳ  ＰＡＧＥで切断反応が成功したかどうかを確認した。次いで、プロテアーゼ分解物をショ糖密度勾配遠心法により沈殿させた。ほぼ同じサイズの断片が２つ生成されたことから、予想された位置でほぼ完全に切断が起こったことが示された。このタンパク質は、切断されているにもかかわらず、切断されていない野生型コアタンパク質（１−１４９）とほぼ同じ濃度勾配位置で沈殿した。全長コアタンパク質（１−１８３）に基づいた融合タンパク質でも、同様の結果が得られた。
【００５５】
（実施例２）
比較的大きな外来配列が挿入されたコアタンパク質変異体
やや大きな断片が挿入された融合タンパク質の例としては、人工ペプチド配列「ＡＣＩＤ」のための配列（６５個のアミノ酸からなる、グリシンに富んだリンカーに挟まれた配列）を、ｃ／ｅ１エピトープに挿入した例が挙げられる。この「ＡＣＩＤ」は、その相補的なペプチドである「ＢＡＳＥ」と相互作用することが可能である。（Ｏ’Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９３），  ６５６−６６７）。そこで、コアタンパク質の下流に、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＶＥＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴ−ＡＱＬＥＫＥＬＱＡＬＥＫＥＮＡＱＬＥＷＥＬＱＡＬＥＫＥＬＡＱＴＧ−ＥＮＬＹＦＱＧＴＧＧＧＧを挿入した。
【００５６】
この融合タンパク質はＣＬＰを形成した。これを単離し、上記と同様ＴＥＶプロテアーゼとともにインキュベートした。この場合も、特異的な切断が生じたが、粒子は完全なままだった。この場合、ＴＥＶによる切断断片は、それぞれサイズが異なるため、ＳＤＳゲルで直接識別できる。ＴＥＶによる切断が起こっても、これらの断片は、ＣＬＰに特異的な濃度勾配画分に共沈した。
【００５７】
本実施例により、６５個のアミノ酸からなるペプチド（リンカー＋ＡＣＩＤ＋ＴＥＶ切断部位）が挿入されたコアタンパク質で構成されるＣＬＰも、特異的に切断されているにもかかわらず、粒子構造が保持されることが示された。
【００５８】
（実施例３）
別の実施例として、ボレリア・ブルグドルフェリＯｓｐＡタンパク質の１８位〜２７３位のアミノ酸配列を含有するコアタンパク質を用いた上記と同様の実験を示す。これに対応するＴＥＶ切断部位のないコアタンパク質については、Ｎａｓｓａｌらによる２００５年の論文に記載がある。このタンパク質では、規則的な粒子を形成したのはごく一部にすぎなかった。この結果は、ショ糖密度勾配遠心法で広い分布が見られたことからも明らかだった。このような切断されないワクチンは、限られた程度でしか用いることができない。さらに、調製物の少なくとも一部をＣＬＰとして得るためには、非常に長いリンカー配列を付加することが必要であり、その上、このリンカー配列は内因性の望ましくない抗原性を有する可能性があるため、このような切断されないワクチンを医学的にヒトに適用するのは困難であった。
【００５９】
ＴＥＶ切断部位を導入した後、実施例２と同様にＴＥＶプロテアーゼで融合タンパク質を処理し、次いで、ショ糖密度勾配遠心法で沈殿させた。この場合も特異的な切断が生じたが、融合タンパク質は、完全には切断されなかった（ＯｓｐＡによる立体障害により、プロテアーゼのＴＥＶ切断部位への接触が困難だったと推測される）。Ｎ末端コア部分またはＣ末端コア部分を特異的に認識するモノクローナル抗体によって断片を分類すると、結果として、ａ−コアＮ抗体は、切断されていない融合タンパク質およびＮ末端側切断断片に反応する。このタンパク質は、部分的に切断されているにもかかわらず粒子特有の泳動挙動を示した。これらのデータより、コアキャリアと、挿入された外来タンパク質との結合部２箇所のうちいずれか一方が開裂することによって、粒子形成が著しく向上したことがわかる。
【００６０】
本実施例によって、大きな外来タンパク質（２５５個のアミノ酸からなるＯｓｐＡ＋リンカー＋ＴＥＶ切断部位）が挿入されたコア融合タンパク質は、効率的とは言えないが、特異的に切断されることが示された。前述の一続きのコアＯｓｐＡ融合タンパク質は、濃度勾配全体にわたって広く分布するが（Ｎａｓｓａｌら、２００５年）、（部分的に）切断された融合タンパク質は、粒子特有の濃度勾配画分に明らかに集中している。これは、切断によって粒子形成の効率が向上していることを示している。
【００６１】
さらに別の実験より、（互換性のあるプラスミドによって）共発現されたＴＥＶプロテアーゼは、ＴＥＶ切断部位を有するコア融合タンパク質を切断し、場合によっては、続いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断するよりも効率的に切断できることが示されている。微生物の体内で既に切断された融合タンパク質を、ショ糖密度勾配遠心法で沈殿させることにより、粒子形成も確認された。実施例１〜実施例３は、既に形成されたＣＬＰが、ｃ／ｅ１エピトープの領域が切断された後も、完全なまま保たれることを示している。スパイクを形成する２つのヘリックス間をつなぐループは、それ自体構造的な機能を持たず、そのような機能を持つとも考えられないことから、この実験結果を構造的にも説明することができる。この結果を得たことが、一続きのタンパク質鎖を続いて切断する代わりに、別々のタンパク質断片としてコアＮ部分とコアＣ部分を直接発現させ、これらの断片が自然に結合して粒子を形成するといったさらに好ましい実施形態につながることになった。この手法には少なくとも３つの本質的な長所が挙げられる。
（ｉ）  ＴＥＶプロテアーゼ（または他のプロテアーゼ）によるさらなる切断工程が不要となり、手法が簡略化されること。
（ｉｉ）  特定のプロテアーゼ認識配列ペプチドを融合タンパク質に付加する必要がなくなること。
（ｉｉｉ）  ＯｓｐＡのような立体構造上好ましくない外来タンパク質が挿入された融合タンパク質を部分的にでも粒子形成させるには、非常に長いリンカー配列が必要であったが、外来タンパク質がコアキャリアタンパク質と両末端で結合する必要がなくなることにより立体障害が回避され、長いリンカーが不要になること。
【００６２】
付加する配列は、いかなる配列であっても、予測不可能な免疫学的影響をもたらす可能性がある（付加した配列によって新たなエピトープが出現し、内因性のエピトープと交差反応することがある）ので、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、ワクチンへ応用する上で特に重要である。
【００６３】
（実施例４）
コアＮ断片とコアＣ断片をほぼ等モル発現するための発現コンストラクト
当然のことながら、一続きのペプチド鎖は、後の切断により生じる２つの切断産物を等モル量含んでいる。したがって、２つの部分を別々に発現させる場合も同様に、２つの部分をほぼ等モル量生成することによって効率的に結合させるのがよい。第１の実験において、キャリアタンパク質の２つの部分を発現させるために、互換性のある２つの別個のプラスミドを使用したが、並みの成功確率しか得られなかった。
【００６４】
好ましい実施形態において、バイシストロン性のベクターを使用する。バイシストロン性のベクターには、別の抗生物質（別の方法の場合には、第２のプラスミドが必要となり、このプラスミドを維持するために使用する）による選択を実施する必要がないという長所もある。
【００６５】
タイプ１のコンストラクトは、共有プロモーター（ここでは、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター）の下流に、それぞれリボソーム結合部位（ＲＢＳ；シャイン−ダルガルノ配列）を上流に有する２つの発現カセットを含有する。ここに示すベクターでは、アミノ酸プロリン７９（Ｐ７９）の下流にある人工的な終止コドンによって、コアＮ断片の翻訳が終了する。また、アミノ酸セリン８１（Ｓ８１）の上流にある人工的な開始コドンによって、第２の断片の翻訳が開始される。この種のオペロン構造は、微生物でよく見られる（「ポリシストロン性ｍＲＮＡ」；ｍＲＮＡの各ＲＢＳに対して比較的独立してリボソームが結合し、３’末端から遺伝子の翻訳を開始する）。ここに示すコンストラクトにおいて、第２のＲＢＳは、もともとｐＥＴベクターが持っている第１のＲＢＳと全く同一のものである。もちろん同様に、ＲＢＳ配列をさらに含有することも可能である。第２のシストロンの開始コドンＡＴＧは、外来配列のクローニングを容易に行うために設けたＮｄｅ切断部位（ＣＡＴＡＴＧ）の一部である。
【００６６】
タイプ２のコンストラクト（「終止／開始」）は、別のＲＢＳを含有しない、すなわち第２のＲＢＳを含有しない。正確に述べると、下流の遺伝子（ＮＮＡ  ＴＧＡ）の開始コドンは、リーディングフレームが１つシフトした状態で、上流の遺伝子（ＮＮＮ  ＴＧＡ）の終止コドンと重複している。この場合、リボソームは第１の遺伝子を解読した後、このまま第２の遺伝子のＡＴＧから翻訳を再開することができる。このような配列構造により、２つの遺伝子を共発現することができる。バクテリオファージの中には、同様の「終止／開始」の配列構造が見られるものもある。また、前記配列構造は、ある真核生物の非ＬＴＲ型レトロトランスポゾン（ＯＲＦ１／ＯＲＦ２ジャンクション領域）でも使われている。例えば大腸菌Ｔｒｐオペロンにおける公知の配列に基づいた、終止／開始コドンが隣接または重複している他の組み合わせ（例えばＴＡＡ  ＴＧ，  ＴＧＡ  ＴＧ，など）も同様に好適である。
【００６７】
図３は、好ましい発現ベクターを概略的に示したものである。
【００６８】
上段：タイプ１のコンストラクト。
プロモーター、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターによって、バイシストロン性ｍＲＮＡの転写が起こる（効率的に転写を終了させるために、３’末端にターミネーター配列を挿入してもよい）。第１のシストロンは、ＨＢＶコアタンパク質の１位〜７９位のアミノ酸配列をコードする。上流のリボソーム結合部位（ＲＢＳ１）によって、翻訳が開始される（大小それぞれのリボソームサブユニットを卵形で表示）。終止コドンは、Ｐ７９を表すコドンの３’末端の下流に位置する。コアＣ断片の翻訳を開始するための、もう一つのＲＢＳ（ＲＢＳ２）が、第２のシストロンの５’末端に位置する。この断片自体も開始コドン（ＡＴＧ）を有する。この例に示すように、コアＣ配列はＡｌａ８０から始まり、１４０位、好ましくは１４９位、または本来の末端に相当する１８３位のアミノ酸まで伸長されていてもよい。１４０位より下流、好ましくは１４９位より下流のアミノ酸配列を、外来配列で置換してもよい。
【００６９】
下段：タイプ２のコンストラクト。
このコンストラクトは、第１のシストロンの上流にＲＢＳを１つだけ含有している。例に示すように、コアＮの終止コドン（ＴＧＡ）と重複するコアＣの人工的な開始コドン（ＡＴＧ）により、翻訳が再開され、コアＣ断片が翻訳される。この例では、コアＣ配列はＳｅｒ８１から始まる。
【００７０】
コアタンパク質の７７位、７８位および７９位のアミノ酸は、それぞれグルタミン酸（Ｅ；対応するコドンはＧＡＡまたはＧＡＧ）、アスパラギン酸（Ｄ；対応するコドンはＧＡＣまたはＧＡＴ）、およびアミノ酸７９プロリン（Ｐ；対応するコドンはＣＣＮ）である。ここに示すタイプ１コンストラクトにおいて、アミノ酸配列ＥＤＰとして、ヌクレオチド配列ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＣＣＮを選択した。この配列によって、ＢａｍＨＩ切断部位（ＧＧＡＴＣＣ）が生じる。この唯一存在するＢａｍＨＩ切断部位によって、コアＮとコアＣをそれぞれコードするＤＮＡ断片を簡単にクローニングできる。プロリンに相当するコドンＣＣＮのヌクレオチドＮは、限定されない。終止コドンとしては、ＴＡＡ，ＴＡＧまたはＴＧＡが挙げられる。
【００７１】
タイプ２コンストラクトにおける第１の遺伝子の末端部分の配列は、Ｇ  ＧＡＴ  ＣＣａ  ＴＧＡである。この配列には、コアＮまたはコアＣを別々にコードするＤＮＡ断片をクローニングするための、ＢａｍＨＩ切断部位（下線で表示）も含まれる。ここに示すタイプ２コンストラクトには、Ｐ７９としてコドンＣＣａが含まれており、終止コドンは、第２の遺伝子と重複して開始コドンＡＴＧを生じるために、ＴＧＡでなければならない（よって、ＣＣａ  ＴＧａとなる）。よって、第２の遺伝子において、開始コドンＡＴＧの次に位置する第１のアミノ酸のコドンは、Ａで始まらなければならない。他の「終止／開始」ヌクレオチド配列としては、大腸菌Ｔｒｐオペロンと同様に、ＴｒｐＥとＴｒｐＤとの間またはＴｒｐＢとＴｒｐＡとの間に位置するＴＧＡ  ＴＧまたはＴＡＡ  ＴＧが挙げられる（Ｄａｓ  ａｎｄ  Ｙａｎｏｆｓｋｙ（１９８９），  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｐｐ．９３３３−９３４０；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ａｎｄ  Ｙａｎｏｆｓｋｙ（１９６０），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｐｐ．７８５−７９５）。
【００７２】
ここに示すベクター（ｐＥＴ２８ａ２−ｘｘｘ）の基本構成は、市販のベクターｐＥＴ−２８のカナマイシン耐性遺伝子をアンピシリン耐性遺伝子で置換したものに基づいている。しかし、他のベクターの基本構成要素（他の複製開始点、他の耐性遺伝子、他のプロモーター、他のＲＢＳなど）ももちろん適用できる。２つの別個のＲＢＳ、または「終止／開始」配列構造を用いて、コアＮおよびコアＣをそれぞれコードする遺伝子のバイシストロン性配列構造を作製することは不可欠である。我々が行った実験において、タイプ１およびタイプ２コンストラクトのいずれも、複数の分割コアタンパク質を発現することが可能であった。ただし、タイプ２（終止／開始）コンストラクトの数はタイプ１より少なく、しかもタイプ２コンストラクトでは配列の多様性に乏しい（上記参照）。したがって、タイプ１コンストラクトの方がより広い範囲で適用可能である。
【００７３】
プロリンが特にプロテアーゼ耐性であるため断片の分解が最小限に抑えられるので、コアＮ部分のＣ末端アミノ酸としてＰ７９を選択した。公知の３次元構造および記載の中央部分の欠失変異体から、以下のことが推測される。
（ｉ）  コアＮ断片の終点が、およそ７２位〜７４位のアミノ酸、特にＧｌｙ７３に位置する場合、および
（ｉｉ）  コアＣ断片の開始点が、およそ７８位〜８６位（場合により９４位グリシンまで可能）のアミノ酸に位置する場合では、ここで選択した条件（コアＮの終点がＰ７９、コアＣの開始点がＳ８１、上流に開始コドンＡＴＧが位置する）を用いた場合と実質的に同じ結果を得ることができる。
【００７４】
真核細胞では転写および翻訳機構が異なるため、記載のコンストラクトをこのまま真核細胞で発現させることはできない。この場合、原核生物のプロモーターではなく真核生物のプロモーターを用いる必要がある（例えばＣＭＶ−ＩＥなど）。また、ポリアデニル化信号（例えばＳＶ４０ウイルスなどに由来するもの）を、オープンリーディングフレームの終点の下流に導入する必要がある。
【００７５】
（ｉ）２つのプラスミド（コアＮとコアＣに対してそれぞれ１つずつ）のコトランスフェクション、
（ｉｉ）２つの独立した発現カセットを含むプラスミドのトランスフェクション、および
（ｉｉｉ）機能的にバイシストロン性のｍＲＮＡを有するプラスミドのトランスフェクション（例えば、第２の遺伝子は上流の内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）によって発現される）
によって、真核生物においてコアＮおよびコアＣをほぼ同等に発現させることができる。
また、
（ｉｖ）  タイプ２ベクター様の終止／開始配列構造も、真核生物において機能し得る。
【００７６】
（実施例５）
別々に発現した野生型コアＮ断片およびコアＣ断片による完全なＣＬＰの産生
タイプ１（図３）の発現ベクターを用いて、野生型コアタンパク質の２つの部分を大腸菌ＢＬ２１細胞で発現させた。野生型コアタンパク質としては、１位〜１４９位のアミノ酸配列に基づくコアタンパク質、または１位〜１８３位のアミノ酸配列に基づくコアタンパク質を用いた。予想された２つの断片が産生され、会合して完全なＣＬＰが得られた。このことは、ショ糖密度勾配遠心法および非変性アガロースゲル電気泳動法を用いて確認された。Ｃ末端にＨｉｓ６タグが付加された１位〜１８３位の一続きのアミノ酸鎖で構成される粒子と、これに対応する分割コアシステムで構成される粒子とを電子顕微鏡を用いて比較（ネガティブ染色）して、ＣＬＰの形成を直接確認した。この解決手段では、両者に差は見られなかった。
【００７７】
野生型ＨＢＶ  ＣＬＰは、非常に強く、様々なモル濃度の尿素に対して耐性がある。Ｃ末端切断型のコアタンパク質（１−１４９）で構成されるＣＬＰは、３〜５Ｍ尿素によってダイマーに解離するが、バッファー条件を変える（尿素を取り除く、中性ｐＨ、塩濃度を上げる）と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再びＣＬＰを形成することができる。分割コアで構成されるＣＬＰの安定性に関して比較実験を行ったところ、分割コアＣＬＰも同様に高い安定性を示した。この結果は、コアＮ部分とコアＣ部分が互いに高い親和性を持つことを示すと同時に、外来分子用キャリアシステムとして使用する上で重要である。
【００７８】
（実施例６）
野生型コアＣ断片と、外来タンパク質が融合したコアＮ断片とを別々に発現させ完全なＣＬＰを産生する、あるいは野生型コアＮ断片と、外来タンパク質が融合したコアＣ断片とを別々に発現させ完全なＣＬＰを産生する。
分割コアシステムが、ＣＬＰの形成および外来タンパク質の提示に原則として好適であることを実証するために、モデル外来タンパク質としてコアＮまたはコアＣに融合したＧＦＰを用いた。コアＮコンストラクトに、タイプ１（第２のＲＢＳを有する）ベクターまたはタイプ２（終止／開始）ベクターを用いた。生成物をショ糖密度勾配遠心法で沈殿させたところ、すべてのコンストラクトで粒子が形成され、緑色蛍光タンパク質が発現された。
【００７９】
このコアＮ断片およびコアＣ断片が物理的に結合していることをさらに証明するために、濃度勾配画分を分取して、非変性アガロースゲル電気泳動を行った。この場合、粒子もＧＦＰ発色団も完全なままであった。コアＮに融合したＧＦＰおよびコアＣに融合したＧＦＰのいずれの画分でも、明確な緑色蛍光性のバンドが見られた。会合していないＧＦＰ融合タンパク質は、上部に位置する濃度勾配画分に残存し、異なる泳動挙動やより広い分布を示した（１８０または２４０サブユニットで構成される粒子と比較すると、実質的により小さな構造であるため、アガロースゲルにおいてより速く移動した）。また、コアＮに融合したＧＦＰ、およびコアＣに融合したＧＦＰのいずれの場合も、緑色蛍光性の（つまり、ＧＦＰ含有する）バンドから、α−コアＣ抗体によってコアＣが検出された。
【００８０】
本実施例によって、下記の２つのことが示された。すなわち、
（ｉ）  分割コアシステムにおいて、約２４０個のアミノ酸からなる外来タンパク質（本実施例においてはＧＦＰ）は、ＣＬＰの形成を妨げずにコアＮにもコアＣにも融合できる。
（ｉｉ）  タイプ１およびタイプ２の分割コアベクターはいずれも、融合によって外来配列が付加されたコアＮおよびコアＣの共発現に適している。
【００８１】
（実施例７）
分割コアシステムを用いた、ＣＬＰによる医学的に重要な外来タンパク質の提示（これは、従来の方法では不可能、または非常に限定的であった）
ボレリア・ブルグドルフェリのＯｓｐＡ
冒頭で説明したように、挿入された外来タンパク質が両末端を介してキャリアタンパク質と結合することは従来のシステムでは必要であるが、このことによって、大幅に位相幾何学的な制限が課せられる。ＧＦＰとは異なり、ＯｓｐＡは、自然な状態ではキャリアタンパク質の構造に「適合」しない。したがって、分割コアシステムにおいて、ＯｓｐＡを不都合な構造を有する外来タンパク質の好例として用い、コアＮまたはコアＣと融合させた。濃度勾配において広い分布を示した前述の一続きのコンストラクト（Ｎａｓｓａｌら、２００５年の論文に記載）とは対照的に、いずれの融合タンパク質も、粒子特有の画分に明確に蓄積した。電子顕微鏡検査法で分析したところ、従来の一続きのコンストラクトと比較して、コアＮとＯｓｐＡの融合、およびコアＣとＯｓｐＡの融合のいずれの場合も、ＣＬＰの形成効率が大幅に改善されることが示された。
【００８２】
本実施例によって下記のことが示された。
（ｉ）  従来の一続きのコアシステムではＣＬＰの形成の妨げになる構造を持つ外来タンパク質でも、分割コアシステムによって、ＣＬＰとして提示することができる。
（ｉｉ）  分割コアシステムは、外来タンパク質をコアＮおよびコアＣのいずれに融合しても、ＣＬＰを効率的に形成できる。
【００８３】
同様に、本発明の分割コアシステムを用いてボレリア・ブルグドルフェリのＯｓｐＣを提示させることも可能であった。
【００８４】
（実施例８）
マラリア病原体である熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質
ワクチンへの応用を考慮すると、別の非常に重要な病原性タンパク質として、マラリア病原体である熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）が挙げられる。ＣＳＰ（本明細書で用いられるＣＳＰは、全長３１９個のアミノ酸からなる）は、約１１０個のアミノ酸からなる、テトラペプチドＮＡＮＰモチーフとＮＶＤＰモチーフの繰り返し構造を含有している。ＣＳＰの構造はまだ知られていない。配列相同性から、トロンボスポンジン−１の繰り返し構造と同様に、４つのシステイン残基を含む約５０個のアミノ酸からなるＣ末端ドメインは折りたたまれている可能性が高い。この繰り返し構造は免疫原性を有するが、他のＣＳＰの領域も、恐らく重要なエピトープを含有している。従来の一続きのコアシステムでは、ＣＬＰの状態で全長ＣＳＰを調製することは不可能であったが、分割コアシステムでは、非常に容易に達成できた。現在のところ、明確なデータが得られているのは、コアＮとＣＳＰを融合した場合である。コアＣが、１４９位までのアミノ酸からなるコンストラクト、および１８３位までのアミノ酸からなるコンストラクトのいずれであっても、コアＣと共発現させることによって、効率的に粒子構造が形成される。
【００８５】
一続きのコアシステムまたは分割コアシステムを用いて、一連のコンストラクト（コア１−１４９およびコア１−１８３の両方に基づく）、すなわち繰り返し配列のみ含有しているコンストラクト、またはシステインに富んだドメインを持たない切断型ＣＳＰを含有しているコンストラクトを調製した。これに加えて、完全長のＣＳＰをコアＮと融合させた。マウスを用いた免疫原性に関する比較実験において、上記調製したＣＬＰを用いた。しかし、実験はまだ終了していない。これまでのデータより、分割コアシステムで調製されたワクチンは、優れた特性を持つことが示されている。これは、本発明のキャリアシステムを適用した場合のみ、完全長のＣＳＰがＣＬＰを形成できるという事実に基づく。一方、他のシステムではＣＬＰは形成されない。その結果、本発明のキャリアシステムによって調製されたＣＳＰのワクチンは、優れた免疫原性を有し、特に中和抗体を誘導するだろう。
【００８６】
（実施例９）
外来タンパク質用キャリアとしての分割コアＣＬＰは、外来タンパク質に対するＢ細胞応答性を増強する。
マウスを用いた免疫原性実験で、分割コアシステムによる５つのコア−ＯｓｐＡコンストラクトを、コアと融合していない、脂質付加されたＯｓｐＡ（ＬｉｐＯｓｐＡ）と比較した。市販のＬｙｍｅｒｉｘ（ライム病ワクチン）は、脂質付加されたＯｓｐＡに基づいており、したがって、これがライム病ワクチンの現在の「ゴールドスタンダード」である。ＬｉｐＯｓｐＡ（トリス−パルミトイル−システイン−（Ｐａｍ３−Ｃｙｓ））は比較的高い免疫原性を示すが、そのために脂質部分は不可欠である。脂質付加されていないＯｓｐＡは、非常に弱い免疫原性しか示さない（Ｎａｓｓａｌら、２００５年参照）。コア−ＯｓｐＡコンストラクトのうち３つは、全長ＯｓｐＡ（アミノ酸１８位〜２７３位）を含有している。また、残りの２つは、切断型ＯｓｐＡ（アミノ酸１８５位〜２７３位）を含有している。
【００８７】
この目的のために、ＢＡＬＢ／ｃマウスを５匹ずつ６つのグループに分け、各抗原１０μｇで４回免疫した（０、１４、２９、４９日目）。
グループ１：ＬｉｐＯｓｐＡ
グループ２：コアＮに融合した全長ＯｓｐＡ（アミノ酸１８位〜２７３位）とコアアミノ酸８１位〜１８３位のコアＣ
グループ３：コアＮに融合した全長ＯｓｐＡ（アミノ酸１８位〜２７３位）とコアアミノ酸８１位〜１４９位のコアＣ
グループ４：コアＮに融合した切断型ＯｓｐＡ（アミノ酸１８５位〜２７３位）とコアアミノ酸８１位〜１８３位のコアＣ
グループ５：コアＮに融合した切断型ＯｓｐＡ（アミノ酸１８５位〜２７３位）とコアアミノ酸８１位〜１４９位のコアＣ
グループ６：コア１８３のコアＣに融合した全長ＯｓｐＡ（アミノ酸１８位〜２７３位）とアミノ酸１位〜７９位のコアＮ
【００８８】
−１日目（初回免疫の１日前；免疫前血清に相当する）と、８、２６、３６および５７日目に採血を行い、誘導された抗体量を測定した。ＥＬＩＳＡによって、産生されたＯｓｐＡ−特異的抗体の血中動態と、各群におけるＬＡ２と同等の抗体の割合を求めた。ＬＡ２は、中和作用があることが知られているモノクローナル抗体で、ＯｓｐＡの１８５位のアミノ酸の下流に位置する不連続なアミノ酸配列からなる複雑な立体構造を有するエピトープを認識する。図４に、この実験の詳細な結果を示す。
【００８９】
図４Ａは、ＯｓｐＡに対して誘導された総抗体量の血中動態を示す（特異的抗体μｇ／血清ｍｌ）。全長ＯｓｐＡ分割コアコンストラクトで免疫したマウスの血清は、２回目の免疫後でも、ＯｓｐＡに対して検出可能なレベルの抗体価を示し、これはＬｉｐＯｓｐＡで免疫した場合の抗体価と同等である。３回目と４回目の免疫後、分割コア全長ＯｓｐＡで免疫したマウスのＯｓｐＡに対する抗体価は、ＬｉｐＯｓｐＡで免疫したマウスのＯｓｐＡに対する抗体価を顕著に上回っていた。コアＣに融合したＯｓｐＡ１８−２７３（グループ６）で免疫した場合の抗体価は、特に高い。コア１４９およびコア１８３に融合した切断型ＯｓｐＡ１８５−２７３（それぞれグループ５および４）は、非常に低いレベルでしかＯｓｐＡ特異的な応答を誘発しなかった。
【００９０】
図４Ｂは、ＯｓｐＡに対する総抗体価を、ＯｓｐＡのＣ末端領域に位置する公知のＬＡ２中和エピトープに対する抗体価と直接比較したものである。コア１４９およびコア１８３を用いた場合、コアＮに融合した全長ＯｓｐＡ（それぞれグループ２および３）が誘導するＬＡ２と同等の抗体は、ＬｉｐＯｓｐＡが誘導する場合より高い抗体価を示したが、コアＣに融合した全長ＯｓｐＡは、顕著に低い抗体価を示した。それぞれの中和抗体含有量（ボレリア・ブルグドルフェリ病原体で惹起された場合の防御能力）に関する実験は現在継続中である。
【００９１】
本実施例より、分割コアＣＬＰは、提示された全長ＯｓｐＡ外来タンパク質に対する特異的抗体を誘導し、その抗体価は、脂質部分が免疫原性にとって不可欠である従来の脂質付加されたＬｉｐＯｓｐＡよりも高いことが示された。コアＮに融合したＯｓｐＡで免疫した場合と、コアＣに融合したＯｓｐＡで免疫した場合とでは、ＬＡ２と同等の抗体の割合が異なる（コアＮ（約３０％）、コアＣ（５％未満））ことから、結合の種類によって産生される抗体の種類に影響が現れることがわかる。これに関しては、実施例１０を参照のこと。
【００９２】
（実施例１０）
コアＮまたはコアＣと融合することによって、外来タンパク質に対する領域特異的な抗体を特異的に誘導する。
ＧＦＰとは異なり、Ｎ末端とＣ末端が互いに近接していないタンパク質は、コアＮに融合する場合と、コアＣに融合する場合とでは粒子表面における配向性が異なる（コアＮ：外来タンパク質のＣ末端が外向きになる；コアＣ：外来タンパク質のＮ末端が外向きになる）。このようなタンパク質をＢ細胞ワクチンとして用いた場合、それぞれ溶媒中で最も遠くに突き出たタンパク部分が、最も強力な抗体産生応答を誘発すると予想される。したがって、外来タンパク質をコアＮ（外来タンパク質のＣ末端側が外向き）またはコアＣ（外来タンパク質のＮ末端側が外向き）と融合させることによって、異なる領域特異的抗体を誘導できる。
【００９３】
図５は、細長い構造の外来タンパク質（本明細書におけるＯｓｐＡなど）をコアＮまたはコアＣと融合することによって、外来分子の中でＣＬＰの表面から最も離れて外向きに位置する部分を調べることが可能な方法を概略的に示したものである。十分にマッピングされたＯｓｐＡのエピトープの１つは、Ｃ末端領域に位置するＬＡ２である。モノクローナル中和抗体（ＬＡ２）がこれを認識する。予想通りに、ＯｓｐＡがコアＮに融合した分割コアＯｓｐＡ  ＣＬＰ（したがって、ＯｓｐＡ  Ｃ末端が露出する）は、ＬＡ２と同等の応答を強く誘導したが、ＯｓｐＡがコアＣに融合したＣＬＰは、弱い応答しか誘導しなかった。その代わり、ＯｓｐＡの他の領域に対する反応は増強される。
【００９４】
外来タンパク質としてＯｓｐＡがコアＮに融合することによって、ＯｓｐＡＣ末端領域のＬＡ２エピトープに接触しやすくなると考えられる。一方、ＯｓｐＡがコアＣに融合することによって、これまで十分に免疫学的に特徴づけされていない領域ではあるが、ＯｓｐＡＮ末端領域に接触しやすくなると考えられる。この考察は、上記のデータ（コアＣに融合したＯｓｐＡでは、ＯｓｐＡに対する総抗体価は非常に高いが、ＬＡ２と同等の抗体の抗体価は低い）によって、見事に裏付けられている。
【００９５】
このように、分割コアシステムは、コアＮと外来タンパク質との融合、およびコアＣと外来タンパク質との融合のいずれにおいても、高い免疫増強作用を有する。
【００９６】
結合部位（コアＮまたはコアＣ）を選択することにより、誘導される抗体の種類／領域特異性を調整できる。ワクチン接種によって最良の結果を得るためには、異種外来アミノ酸配列の一方の部分がコアＮ部分に融合した分割コアワクチンと、もう一方の部分がコアＣ部分に融合した分割コアワクチンとの混合物を使用してもよい。これにより、種々のエピトープを最適に提示することができる。
【００９７】
（実施例１１）
ワクチン応用以外の意義を有する融合
このようなキャリアプラットフォームは、ペプチドおよび本明細書においては特にタンパク質や抗原ワクチンのために用いる、免疫増強作用を有する粒子状キャリアとして、直接的な意義があるものだが、それ以外にも様々な応用が考えられる。いずれの場合も、提示される多数の分子（１８０または２４０）は、互いに対称的に近接して配置される。前記分子が相互作用可能な外来分子（ワクチンは抗体と相互作用する特例である）である場合、この外来分子の複数のコピーを有する粒子は、モノマーの外来分子と比較して、大幅に親和性が増大する（免疫診断学の分野における、天然ＩｇＭペンタマーやＭＨＣテトラマーを参照）。このような相互作用可能な外来分子は、相互作用パートナーと反応できるようにＣＬＰ表面上で接触可能な状態でなければならない。従来の一続きのシステムと比較して、分割コアシステムでは、これが実質的に促進される。
【００９８】
分割コアシステムで、多くのモデル外来配列を発現したところ、分析したいずれの挿入断片もＣＬＰを形成していた。そのうちいくつかの外来配列に関して、相互作用能力が直接確認された。
【００９９】
この分割構造システムによって、ＣＬＰ表面に新たな末端が生じ、接触可能な状態になるため、さらなる誘導（派生）が可能になる。図６は、コアＮに融合したＡＣＩＤペプチドを含む分割コアダイマーを示す。ＡＣＩＤペプチドは相補的なＢＡＳＥペプチドと相互作用することが可能である。前記ＢＡＳＥペプチドが融合した分子Ｘが、ＡＣＩＤ  ＣＬＰに結合する。この分割構造システムによって、ＡＣＩＤは柔軟な構造をとることができる。一続きのコアシステムに挿入されたＡＣＩＤは、ＢＡＳＥペプチドと相互作用するが、ＡＣＩＤペプチドとＢＡＳＥペプチドが二重らせん状の強固なコイルドコイル構造を形成するため（Ｏ’Ｓｈｅａら、１９９３年）、コアキャリアの構造が不安定になり、ＣＬＰが崩壊する。一方、分割構造システムでは、ＣＬＰは安定して維持される。このカップリングを一般化することができる。ＡＣＩＤペプチド以外の相互作用可能な分子ＡをコアＮまたはコアＣと融合させてもよい。次いで、これに対応するＣＬＰが、Ａの特異的な相互作用パートナーであるＢと相互作用してもよい。このような相互作用パートナーの組み合わせとしては、Ｈｉｓ６とＮｉ−ＮＴａ、ビオチンアクセプターペプチドとストレプトアビジン、およびＺ３３と免疫グロブリンが挙げられる。
【０１００】
以下に他の可能なカップリングについてより詳細に説明する。
【０１０１】
ａ）  Ｈｉｓ６タグ：
Ｈｉｓ６タグは、Ｇｌｙ２リンカーを介してコアＮに融合し、Ｎｉ２＋ＮＴＡアガロースと結合する粒子を形成する。一続きのシステムの場合とは異なって、Ｈｉｓタグには自由に接触できる。一続きのコアシステムのｃ／ｅ１へ類似の配列（Ｈｉｓ７）を挿入しても、立体構造上、Ｈｉｓ６タグ残基への接触が可能でないため、タンパク質はほとんど産生されない。
【０１０２】
ｂ）  ビオチンアクセプター（ＢＡ）ペプチド：
ビオチンアクセプター（ＢＡ２３）は、１３個のアミノ酸（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨ）からなる人工ペプチドで、大腸菌ビオチンリガーゼであるＢｉｒＡによりビオチン化される。効率的なビオチン化を行うには、ビオチンアクセプターに対して自由に接触できることが必要である。分割コアシステムでは自由に接触することができるが、一続きのコアシステムでは接触できない、または限られた程度でしか接触できない。分割コア−ＢＡ融合タンパク質は、ＣＬＰを形成し、大腸菌体内でビオチン化される。このＣＬＰに提示されたビオチンに、アビジン／ストレプトアビジンまたはそれらの複合体が結合できる。
【０１０３】
ｃ）  プロテインＡのＺ３３ドメイン
黄色ブドウ球菌プロテインＡは、免疫グロブリンと高い親和性で結合する（免疫沈降で「プロテインＡセファロース」として利用されている）。プロテインＡは、構造上類似した５つのＩｇ結合ドメインで構成される。Ｚ３３は、このようなドメインの一つで、そのアミノ酸配列（全長３３個のアミノ酸）は修飾されているが、Ｉｇへの高い親和性を維持している（Ｋｄ  ４０ｎｍ）。種々のＩｇと結合するには、構造的な柔軟性も必要だが、さらに接触可能でなければならない。長いリンカー配列を介して、Ｚ３３配列をコアＮに融合した。
ＧＧＧＧＳＧＧＧＶＥＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴ−ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＥＤＰ
【０１０４】
分割コアシステムによって、ＣＬＰが形成された。ＦＩＴＣ標識免疫グロブリンを加えて、再び沈殿させたところ、粒子特有の濃度勾配画分に蛍光の一部が検出された。Ｚ３３融合の分割コアシステムではなく、野生型コアタンパク質ＣＬＰを用いたところ、このような結果は得られなかった。
【０１０５】
ｄ）  ＡＣＩＤペプチド挿入断片
一続きのコアシステムに挿入されたＡＣＩＤペプチドは、相補的ＢＡＳＥペプチド（「ベルクロペプチド」）とコイルドコイル構造を形成して、相補的ＢＡＳＥペプチドと相互作用し（Ｏ’Ｓｈｅａら、１９９３年）、元のコア構造は大幅に変化し崩壊する。これは、ＡＣＩＤペプチド自体が、コア構造にいかなる応力もかけないように柔軟な構造をとることが原因である。ＢＡＳＥペプチドを添加すると、ＡＣＩＤ配列と相互作用し、その結果、２つのペプチド配列がらせん状の強固なコイルドコイル構造をとる。ＡＣＩＤ配列が両末端を介して結合しているため、張力が発生する。片側のみ固定されたＡＣＩＤペプチドは、ＢＡＳＥペプチド、または別のパートナーに融合したＢＡＳＥペプチドを添加すると、張力を生じることなくこれらのペプチドと相互作用できるだろう。従来の一続きのコアシステムでも、ＴＥＶプロテアーゼでコアキャリアとのＣ末端連結部分を切断すると、ＡＣＩＤ融合タンパク質の粒子構造は、完全な状態で維持される。
【０１０６】
ＡＣＩＤ配列が露出した分割コアに、相補的なＢＡＳＥペプチドに結合している外来タンパク質を付加してもよい。分割コアＣＬＰに、選択された外来分子を後で付加する方法はいくつか考えられるが、この方法はそのうちの一つである。
【０１０７】
上記詳述されたカップリング機構によって、カップリング構造の一方の部分を有するＣＬＰが得られる。カップリング構造のもう一方の部分に融合したタンパク質は、前記ＣＬＰに容易に結合できる。このようにして、例えば免疫系に非ペプチド様構造を提示することができる。
【０１０８】
ｅ）  異なる外来分子とコアＮおよびコアＣとの同時融合
先の実施例はいずれも、１つの外来配列をコアＮまたはコアＣに融合したものである。理論的には、２つの異なる外来分子をそれぞれコアＮとコアＣに同時に融合させることも可能である。この例としては、２つのサブユニットからなるヘテロダイマー性の外来タンパク質が考えられる。モデルタンパク質として、２つの部分に分けられたＧＦＰを使用した。第１のセグメントは、１１本のＧＦＰβ鎖のうち最初の１０本を含みコアＮと融合しており、第２のセグメントは１１番目のＧＦＰβ鎖を含みコアＣと融合している。タイプ１ベクターを用いて共発現させることによって、緑色蛍光性のＣＬＰが形成された。このようにして、コアＮおよびコアＣドメインが会合し、会合可能なＣＬＰ構造が得られた。ＧＦＰの２つの部分は互いに補いあって正しい３次元構造をとり、ＧＦＰ発色団を形成した。
【０１０９】
本実施例により、コアＮおよびコアＣと２つの異なる外来配列との同時融合が可能であり、その際、分割コアキャリア、およびコアＮとコアＣに融合した２つの異なる外来配列のいずれも機能的な構造が形成されることが示された。
【０１１０】
（実施例１２）
表面にプロテインＧのＧＢ１ドメインを提示する分割コアＣＬＰ
別の具体例は、連鎖球菌属の免疫グロブリン結合タンパク質「プロテインＧ」に存在する「ＧＢ１」ドメインのＨＢＶ分割コアシステムへの導入である。プロテインＧは、プロテインＡと機能的に関連している。プロテインＧも、複数の類似したドメインから構成される。プロテインＡと同様に、プロテインＧは免疫グロブリンと結合するが、ＩｇＧの種起源およびサブタイプに関してプロテインＡとは異なる特異性を有する。プロテインＧとプロテインＡは、このように相補的な機能を持つため、それぞれ異なる種類の免疫グロブリンと結合することを利用して免疫学的な検出試薬として市販されている。プロテインＡと同様に、プロテインＧ、およびプロテインＧ由来のＧＢ１ドメインもまた、抗体の定常（Ｆｃ）領域に結合する。一方、抗体の可変領域である抗原認識領域は、抗原と結合できるように接触しやすい状態を保っている。このようにして、多くの異なる抗体を結合させることが可能である。
【０１１１】
本実施例において、分割コアシステムへＧＢ１ドメインを導入したところ、（ｉ）ＣＬＰを形成すること、および（ｉｉ）ＧＢ１を持たないコントロールＣＬＰ以外のＣＬＰは様々な抗体と結合できることが示された。
【０１１２】
上述の実施例と同様に、ＧＢ１ドメインをコアＮまたはコアＣと遺伝子的に融合し、それぞれ融合に用いなかったコアＣ断片またはコアＮ断片と共発現させた。
【０１１３】
具体的に、ＧＢ１ドメインは、プロテインＧ前駆体タンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ；Ｐ０６６５４）の２２９位〜２８４位のアミノ酸配列に相当する。その３次元構造は、公知である（ＰＤＢ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：１ＰＧＡ；Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  Ｔ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｐ，Ｂｒｙａｎ  Ｐ，Ｇｉｌｉｌａｎｄ  ＧＬ（１９９４）  Ｔｗｏ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂ１  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＮＭＲ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：  ４７２１−４７２９参照）。
ｃｏｒｅＤ７８−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＱ−ＹＫＬＩＬＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＥＡＶＤＡＡＴＡＥＫＶＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＥＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥｄＰ
【０１１４】
上記のＧＢ１ドメインは、Ｇ４ＳＧ４ＴＱリンカーを介して、コアＮと結合している。最後から２番目のアミノ酸（Ｋ）を、Ｄ（配列中、小文字で表示）で置換した。下流のアミノ酸残基Ｅは、Ｘ線構造解析で目に見える最後のアミノ酸である。ＫからＤへ置換することによって、ヌクレオチドレベルでＢａｍＨＩ切断部位を導入できる（Ｇａｇ  ｇａｔ  ｃｃｔ  ＴＡＧ）。したがって、このＢａｍＨＩ切断部位は前述の複数のコンストラクトと同様の位置にある。
【０１１５】
他の実施例と同様、効率的に粒子が形成され、このことは、ショ糖密度勾配遠心法による沈殿、非変性アガロースゲル電気泳動による泳動挙動、および電子顕微鏡検査法により確認された。
【０１１６】
免疫グロブリンとともに粒子をインキュベートし、次いで、ショ糖密度勾配遠心法で再び沈殿させることによって、ＣＬＰをキャリアとするＧＢ１ドメインの相互作用能力が確認された。この過程で、抗体は明確に粒子と共沈した。ＳＤＳゲル電気泳動後に行ったウエスタンブロット法においてコアＮ−ＧＢ１断片が二次抗体複合体と直接反応した事実から、ＩｇＧ結合能も確認された。したがって、この修飾を加えたＧＢ１はコアＮと融合していても、効率的に再生し、そのリガンドであるＩｇＧと結合できることがわかった。
【０１１７】
粒子に結合したＧＢ１が、実際に免疫グロブリンと結合することを確認するために、対応するショ糖密度勾配画分を分取して５ｎｍの金標識抗体とインキュベートし、ショ糖密度勾配遠心法で再び沈殿させることによって非結合の抗体を除去した後、粒子画分を電子顕微鏡検査法で分析した。その結果、電子密度の高い金の粒子によって完全なＣＬＰと抗体との結合が示された。
【０１１８】
（実施例１３）
相互作用可能な外来分子を提示し、自己蛍光性のＧＦＰおよびＧＦＰ変異体を含有している分割コアＣＬＰ
実施例１１ｅ）では、ワクチン応用以外の意義を有する融合を例示するために、ＧＦＰ分子を用いた。このＧＦＰ分子は２つの部分（ＧＦＰβ１−１０およびＧＦＰβ１１）に分かれ、ＧＦＰβ１−１０がコアＮに、ＧＦＰβ１１がコアＣに融合した状態で互いに結合して天然のＧＦＰ構造（緑色蛍光性）をとり、ＣＬＰを形成した。
【０１１９】
本実施例において、さらに外来配列をＧＦＰβ１１に融合した。この外来配列は、すなわちプロテインＧのＧＢ１ドメイン、ならびにヒトＨＢＶ、アヒルＨＢＶおよびアオサギＨＢＶの表面タンパク質のｐｒｅＳドメインである。このようなことが可能であるのは、単に、分割構造システムによって新たに生じたＧＦＰβ１１のＮ末端が、分割コアＣＬＰにおける配向特異性によってＣＬＰ表面で外向きに位置しているからである。これらの発現プラスミドは、上記の方法と同様、コアＮ断片およびコアＣ断片を別々にコードする分割コアベクター（この場合既にコアＮとＧＦＰβ１−１０、およびコアＣとＧＦＰβ１１は結合している）を用いて構築した。
【０１２０】
前出のデータより、ＧＦＰβ１１セグメントのＮ末端がＣＬＰの表面から離れて外向きに位置すること、および、したがって別の外来ドメインが存在しても、コアＮ部分およびコアＣ部分の粒子構造形成能や、ＧＦＰβ１−１０部分およびＧＦＰβ１１部分の天然ＧＦＰ構造形成能は、原則として妨げられないことが予想された。図７に、本実施例の結果を概略的に示す。この図のＡ〜Ｄは、下記の通りである。
【０１２１】
Ａ．  ２つの部分で構成される融合タンパク質の基本構造。
ＧＦＰβ１−１０はコアＮと融合し、ＧＦＰβ１１はコアＣと融合している。ＧＦＰβ１１により、新たにＮ末端が生じるので、このＮ末端に別のドメイン（本図ではＧＢ１）を融合することができる。
Ｂ．  上述の通り、コアＮがコアＣと相互作用し（ＣＬＰの形成）、ＧＦＰβ１−１０がＧＦＰβ１１と相互作用する（ＧＦＰ発色団の形成）ことによって、自己蛍光性のＣＬＰが生じる。しかも、このＣＬＰは、ＧＢ１を接触可能な状態でＣＬＰ表面に提示している。
Ｃ．  様々な抗体が、Ｆｃ領域を介してＧＢ１ドメインと結合することができる。
Ｄ．  抗体はそれぞれ異なる可変領域を介して、特異的抗原と相互作用することができる。
このように、分割コアＧＦＰ−ＧＢ１  ＣＬＰは、間接蛍光抗体法で通常用いられる蛍光標識二次抗体の代わりになり得る。図７は、チューブリンの蛍光標識への応用を、２つの異なる細胞を用いて示したものである。抗体が抗原と結合することを利用して、他へ応用することも同様に可能である。
【０１２２】
ショ糖密度勾配遠心法による沈殿、および非変性アガロースゲル電気泳動の泳動挙動により、さらなる修飾を加えたこれらの断片を大腸菌で効率的に共発現させること、およびこれらの断片からＣＬＰを形成することが実際に可能であることがわかった。さらに、このＣＬＰが典型的なＧＦＰ蛍光を示したことから、ＧＦＰ部分同士も正しく結合していた。本実施例によって、ＧＢ１部分もまたＣＬＰ表面で正しく折りたたまれ、接触可能な状態であることが示された。
【０１２３】
自己蛍光性のＧＢ１提示ＣＬＰの、抗原に結合した抗体に対する結合能を調べるために、ＨｅＬａ（ヒト）細胞またはＬＭＨ（ニワトリ）細胞を膜透過処理した後、チューブリンに対するマウス一次抗体でインキュベートした。一方は、従来通り化学蛍光標識（Ｃｙ２）二次抗体（ヤギ抗マウス抗体）で、もう一方は、自己蛍光性のＧＢ１提示分割コアＣＬＰで上記細胞をインキュベートし、その後洗浄した。最後に、細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
【０１２４】
いずれの場合も、同等の蛍光画像が得られた（予想通り、核を除いて細胞質が染色された）。したがって、ＧＢ１ドメインは、チューブリンに結合した抗チューブリン一次抗体と結合することが可能であったと考えられる。
【０１２５】
このように、自己蛍光性のＧＢ１提示分割コアＣＬＰを、抗原に結合した一次抗体を検出するために従来から使用されている蛍光標識二次抗体複合体の代わりとして使用してもよい。以上の結果から、ＧＢ１ドメインがＩｇＧとの相互作用能を維持していることが実証され、これにより、ＧＢ１ドメインが正しく折りたたまれていると考えられる。さらに、自己蛍光性のＧＢ１提示ＣＬＰを一般的な検出試薬として（蛍光標識二次抗体と同等に）使用できることも実証された。
【０１２６】
部位特異的突然変異誘発法によって、吸光および発光スペクトルを変更する公知の変異を本発明のＧＦＰコンストラクトへ導入し、色の異なるＧＦＰ変異体を有する同様のコンストラクトを得た。具体的には、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）変異体とシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）変異体を調製した。いずれの変異体も、それぞれ特有の吸光度スペクトルを示すＣＬＰを形成した。このように、種々の発色団の特性を有する、ＧＢ１提示分割コアＧＦＰ  ＣＬＰを生成することが可能であり、このＣＬＰは、マルチカラー免疫蛍光法への応用に適している。
【０１２７】
分割コアシステムによって、さらに相互作用可能な外来分子を表面に提示する、自己蛍光性のＣＬＰを調製できる。この外来分子がＧＢ１である場合、免疫グロブリンが標的抗原と結合していても、その免疫グロブリンと特異的に相互作用することができる。この結果、ワクチン応用以外の新たな応用として、自己蛍光性のＣＬＰを用いて、種々の抗原を蛍光によって直接検出することができる。このような自己蛍光性の、相互作用可能な分割コアＣＬＰは、診断上および分析的な応用に特に適している。
【０１２８】
プロテインＧに存在するＧＢ１以外の外来ドメインを提示する自己蛍光性の分割コアＣＬＰ
上記の結果は、２つの部分からなるＧＦＰが付加された分割コアＣＬＰ上に、さらに付加した外来ドメイン（ＧＢ１）を機能的な状態（つまり、特定のリガンドであるＩｇＧと相互作用することができる状態）で提示できることを示す。しかし、６０個未満のアミノ酸からなるＧＢ１は、比較的小さなドメインである。この手法を一般化できることを確認するために、ＧＢ１をヒトＨＢＶ（ＨＢＶ）、アヒルＨＢＶ（ＤＨＢＶ）またはアオサギＨＢＶ（ＨＨＢＶ）に存在するエンベロープタンパク質のｐｒｅＳドメインで置換した同様のコンストラクトをそれぞれ調製した。このドメインは、それぞれのウイルスが天然標的細胞（つまり対応する宿主動物の肝細胞）に特異的に結合するのを媒介する。ＨＢＶでは１０８個のアミノ酸、ＤＨＢＶおよびＨＨＢＶでは約１６０個のアミノ酸からなるｐｒｅＳドメインは、ＧＢ１より明らかに大きく、さらに、それらの配列は互いに異なり、またＧＢ１とも異なる。ＧＢ１と同様に、３つのドメインをそれぞれ分割コア−ＧＦＰ融合タンパク質に挿入した（図７参照；ＧＢ１を対応するｐｒｅＳドメインで置き換える）。ショ糖密度勾配遠心法による沈殿、非変性アガロースゲル電気泳動の泳動挙動、および電子顕微鏡検査法で確認したところ、３つの分割コア−ＧＦＰ融合タンパク質はすべて効率的にＣＬＰを形成していた。各ＣＬＰは、特有のＧＦＰ蛍光を示した（つまり、ＧＦＰ部分同士が結合して、ＧＦＰの正しい３次元構造をとっていた）。さらに、ＨＢＶ−ｐｒｅＳ  ＣＬＰおよびＤＨＢＶ−ｐｒｅＳ  ＣＬＰは、ＨＢＶ  ｐｒｅＳおよびＤＨＢＶ  ｐｒｅＳに対するモノクローナル抗体と反応した。アオサギＨＢＶ  ｐｒｅＳに対するモノクローナル抗体は現在入手できない。
【０１２９】
別の応用としては、特定のウイルスに対する細胞レセプターを同定することを含む。１つの粒子当たりのｐｒｅＳドメインの数が多い（２４０）ので、前記レセプターに対するＣＬＰの親和性は、著しく増大していると考えられる。よって、レセプターは安定した結合状態を保つことができるので、この方法で同定することが可能になる。ＣＬＰのＧＦＰ蛍光により、蛍光顕微鏡検査法またはＦＡＣＳを用いて、レセプターを有する細胞が識別される。このような細胞から得られる可溶化されたレセプター分子をＣＬＰとインキュベートした後、ショ糖密度勾配遠心法で沈殿させることよって、レセプター分子は粒子特有の濃度勾配画分に蓄積すると考えられる。
【０１３０】
（実施例１４）
ＯｓｐＡがコアＮに融合した分割コアＯｓｐＡ  ＣＬＰによって誘導されるＯｓｐＡに対する防御抗体は、ＬｉｐＯｓｐＡで誘導される場合より高い抗体価を示し、ＯｓｐＡがコアＣに融合した分割コアＯｓｐＡ  ＣＬＰで誘導される場合の抗体価は低い。
図５に示すように、外来タンパク質をコアＮとコアＣのいずれに結合させるかによって、提示される外来タンパク質の配向性に狙い通りに影響を与えることができる。したがって、ＯｓｐＡの場合には、モノクローナル抗体ＬＡ−２が認識する公知のＣ末端中和エピトープ（コアＮに融合する場合）、およびいかなる公知の中和エピトープも含まないＮ末端ＯｓｐＡ領域（コアＣに融合する場合）のいずれかが、特に良好に提示される。図４に示すように、いずれの分割コア−ＯｓｐＡ  ＣＬＰ（グループ２はコアＮに融合したＯｓｐＡ、グループ６はコアＣに融合したＯｓｐＡ）も、ＯｓｐＡに対する総抗体価を示した。しかし、ＬＡ−２と同等の抗体の割合は、構造から予想された通り、コアＮに融合した場合の方が実質的に高い。
【０１３１】
しかし、これはｉｎ  ｖｉｔｒｏのデータである。誘導された抗体の防御能力を直接ｉｎ  ｖｉｖｏで測定するために、確立されたモデルマウスを用いて、人工的に誘発したボレリア・ブルグドルフェリ感染に対する中和能力をそれぞれの免疫血清について測定した（Ｎａｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒｏｐｅａｎ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００５；  ｐｐ．  ６５５−６６５参照）。適当な免疫血清をＳＣＩＤマウスの腹腔内に接種し、それぞれ２時間後に各マウスに１０３個のスピロヘータを皮下接種して免疫応答を惹起した。これにより、通常、免疫防御されていないマウスは感染し、関節炎様の症状が現われる。左右の脛骨足根骨の関節の診察所見より、この症状を半定量化できる。単に正常マウス血清を接種したマウス群（３匹）をネガティブコントロールとした。公知の中和抗体であるＬＡ２精製モノクローナル抗体を接種したマウス群とＬｉｐＯｓｐＡで誘導される抗体を接種したマウス群（各群６匹）をポジティブコントロールとした。被検群（同様に各群６匹）には、ＯｓｐＡがコアＮに融合した分割コアＯｓｐＡ、またはＯｓｐＡがコアＣに融合した分割コアＯｓｐＡで得られた免疫血清を接種した。群間差を定量化するために、ＬＡ２に関しては、まず５μｇ、次いで１μｇで受動免疫を行い、ＬｉｐＯｓｐＡ、またはＯｓｐＡがコアＮに融合した分割コアＯｓｐＡでワクチン接種した動物から得られる免疫血清に関しては、上記ＬＡ２量に相当する量で受動免疫を行った。図８にこの結果を示す。
【０１３２】
ＯｓｐＡがコアＣに融合した分割コアＯｓｐＡにより得られた免疫血清は、ＬＡ２と同等の抗体の割合が低いため、その抗体価とは無関係に、ＯｓｐＡがコアＮに融合した分割コアＯｓｐＡにより得られた免疫血清と同量の血清を用いた。１３、１７、２１、２８、３５、４５、および５２日目に、関節炎スコアを測定した。図８に５２日目の結果をまとめた。
【０１３３】
予想通りに、正常マウス血清を接種した動物は、すべて関節炎を発症した。モノクローナル抗体ＬＡ−２の接種量を５μｇから１μｇに減らすと、感染防御される動物の割合は４／６匹から１／６匹に減少した。一方、ＬｉｐＯｓｐＡ免疫血清では、６匹中５匹の動物が感染防御された。ＯｓｐＡがコアＮに融合した分割コアＯｓｐＡにより得られた免疫血清で受動免疫したところ、低用量でもすべての動物（６／６匹）が感染防御された。コアＣに融合したＯｓｐＡにより得られた免疫血清は、非常に低い防御作用しか示さなかった（高用量で４／６匹、低用量で１／６匹）。
【０１３４】
ＯｓｐＡがコアＮに融合した分割コアＯｓｐＡ  ＣＬＰによって産生されるＬＡと同等の抗体は、抗体価が高く、ｉｎ  ｖｉｖｏでの防御能力を有する。その防御能力は、ＬｉｐＯｓｐＡで誘導された抗体を上回る。ＯｓｐＡがコアＣに融合した分割コアＯｓｐＡ  ＣＬＰによって誘導される抗ＯｓｐＡ抗体は、総抗体価は高いが、そのうちＬＡ−２と同等の抗体の割合が低いため、低い中和能力しか持たない。このように、外来抗原をコアＮに融合すると、コアＣに融合した場合とは定量的に明確に異なる免疫応答を示す。
【０１３５】
（実施例１５）
マラリア病原体である熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）
分割コアシステムを用いた全長ＣＳＰは、従来の一続きのコアシステムを用いたＣＳＰの免疫優性の繰り返し配列より、広範囲にわたって強力な免疫応答を誘導する。
【０１３６】
先に示したように、全長３１９個のアミノ酸を含む完全長のＣＳＰは、分割コアシステムにおいてのみ発現およびＣＬＰの形成が可能であり、これは従来の一続きのシステムでは不可能だった。従来の一続きのシステムでも、システインに富んだＣ末端ドメインを持たない切断型ＣＳＰ（以下、短鎖ＣＳＰ）を調製することは可能だったが、このタンパク質は、数日後に沈殿する傾向がはっきりと見られた（これは分割コアシステムでは見られなかった）。この事実は、分割コアシステムを用いたＣＳＰが優れたタンパク質化学的性質を有することを立証するものである。
【０１３７】
ＣＳＰの特異性は、テトラペプチドであるＮＡＮＰモチーフおよびＮＶＤＰモチーフによる多重繰り返し構造（本明細書に用いた全長ＣＳＰには、２４個のＮＡＮＰモチーフと３個のＮＶＤＰモチーフが存在する）が存在することである。これらのモチーフは公知の免疫抗原で、従来の一続きのコアシステムに基づいた試験的なワクチンはこれまで報告されている。よって、これに対応する従来のコンストラクトを免疫原性に関する比較実験用に調製した。このコンストラクトは、コアアミノ酸Ｄ７８とＳ８１との間に繰り返し配列ＮＡＮＰＮＶＤＰ（ＮＡＮＰ）３ＮＶＤＰを含み、挿入断片が小さいため予想通りにＣＬＰを形成した。前記コンストラクトを用いて、免疫原性実験を行い、全長ＣＳＰおよびＣ末端切断型短鎖ＣＳＰと比較した。それぞれ同量（２０μｇ／マウス）のＣＬＰで、マウスを免疫した。免疫の２、４、６および８週間後に産生された抗体量をＥＬＩＳＡにより測定した。続いて追加免疫を（初回と同様に）行い、追加免疫の２、４および６週間後に抗体価を再び測定した。キャリアに対するＢ細胞応答性を調べるために、検体（抗原）として組換えＣＳＰ（大腸菌で産生させた融合タンパク質）、ＮＡＮＰペプチドとＮＶＤＰペプチド、および組換えＨＢｃＡｇを用いた。ＥＬＩＳＡプレートに抗原を固定し、２倍階段希釈した免疫血清を用いて分析した。図９に、バックグラウンドより高いシグナルが得られた最大希釈倍率を示す。
【０１３８】
以上より、以下の結論が導かれる。
【０１３９】
ａ）  組換えＣＳＰに対するＢ細胞応答性
３つのいずれの免疫抗原を用いた場合も、ＣＳＰに対して非常に強力な反応を示した。ただし、免疫抗原として全長ＣＳＰを用いた場合の反応は他よりさらに４倍高く（抗体価：繰り返し構造含有ＣＳＰと切断型ＣＳＰの１：３×１０５に対して、１：１２×１０６）、これは、免疫血清を１２００万倍希釈（！）しても、ＣＳＰタンパク質を認識できることを示す。
【０１４０】
ｂ）  ペプチドＮＡＮＰおよびＮＶＤＰ繰り返し構造に対するＢ細胞応答性
予想された通り、ＮＡＮＰペプチドに対する反応は、すべてのコンストラクトで類似している。繰り返し構造において頻度の低いＮＶＤＰペプチドに対する反応は、いずれの場合も同程度であるが、全長ＣＳＰのコンストラクトでは、初回免疫後（追加免疫なし）でも、明らかに他より高い（抗体価：他の１：５×１０３に対して１：２．５×１０４）。
【０１４１】
ｃ）  繰り返し構造の中にないＣＳＰ配列に対するＢ細胞応答性
短鎖ＣＳＰおよび全長ＣＳＰのみが、ペプチドＣＳＰ１２（ＥＥＰＳＤＫＨＩＥＱＹＬＫＫＩＱＮＳＬＳ；分割コア全長コンストラクトの２４６位〜２６４位）およびＣＳＰ８（ＧＮＧＩＱＶＲＩＫＰＧＳＡＮＫＰＫＤＥＬＤ；分割コア全長コンストラクトの２７４位〜２９４位）に対する応答を誘導する。一続きのコアシステムを用いた繰り返し構造のペプチドで免疫を行っても、該ペプチドにはＣＳＰ８およびＣＳＰ１２の配列が存在しないため、対応する応答は見られないと考えられる。この結果は、とりわけ分割コアシステムを用いたときのみ全長ＣＳＰを産生できるという点で重要である。このように、分割コアシステムを用いることにより、ワクチン接種による防御作用に関わるエピトープを付加し取り扱うことができる。
【０１４２】
ｄ）  コアキャリアに対するＢ細胞応答性
分割コアシステムの短鎖ＣＳＰおよび全長ＣＳＰのいずれの場合も、コアキャリアに対する反応は、一続きのシステムの繰り返し構造ペプチドの場合に対して約１／２５と非常に弱い（抗体価：一続きのシステムの１：３×１０６に対して、１：１．２５×１０５）。また、外来タンパク質に対する所望の反応は、一続きのコアシステムの繰り返し構造ペプチドを用いた場合と比較して、少なくとも同程度（短鎖ＣＳＰを用いた場合）、あるいはより高い（全長ＣＳＰを用いた場合）。このため、挿入された外来配列に対する特異的免疫原性は、分割コアシステムにおいて切断型ＣＳＰを用いる方が、また特に全長ＣＳＰを用いる方が、実質的に高くなる。さらに、コアキャリアに対して強力な応答が生じると、抗ＨＢｓＡｇ陽性者（感染者およびワクチン接種による抗ＨＢｓＡｇ陽性者）の鑑別診断がより困難になる。したがって、コアキャリアに対する応答は低いことが望ましい。
【０１４３】
ｅ）  分割コアシステムの全長ＣＳＰによるＴ細胞の活性化
特異的に免疫したマウスの脾細胞を、組換えＨＢｃＡｇもしくは公知のＴ細胞ペプチド（ＨＢｃ１２０−１４０）で、または組換えＣＳＰもしくはＣＳＰペプチドであるＮＡＮＰおよびＣＳＰ８で刺激し、ＩＬ−２産生量を測定することによって、Ｔ細胞応答が誘導されるかどうかを確認した。いずれのコンストラクトで免疫した場合も、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｃ１２０−１４０、組換えＣＳＰおよびＮＡＮＰにより活性可能なＴ細胞が出現した。しかし、分割コアシステムの全長ＣＳＰで免疫したマウスの脾細胞のみが、ＣＳＰ８ペプチドの刺激によってＩＬ−２を産生することができた。
【０１４４】
したがって、全長ＣＳＰのコンストラクトは、Ｔ細胞レベルにおいても、一続きの繰り返し構造ペプチドのみを含有するコンストラクトより広い範囲にわたって応答を誘発する。
【図１】
2010502658.tif 000003
【図２】
2010502658.tif 000004
【図３】
2010502658.tif 000005
【図４】
2010502658.tif 000006
【図５】
2010502658.tif 000007
【図６】
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【図７】
2010502658.tif 000009
【図８】
2010502658.tif 000010
【図９】
2010502658.tif 000011
【配列表】
2010502658000001.app
【国際調査報告】
2010502658.tif 000012
2010502658.tif 000013
2010502658.tif 000014
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