(57)【要約】コリネバクテリウム・グルタミカムに由来する配列番号1または配列番号2のヌクレオチド配列を有する新規のプロモーター核酸分子、該プロモーターを含む組換えベクター、該ベクターによって形質転換された宿主細胞、及び該宿主細胞を利用して関心対象の遺伝子を発現する方法を提供する。2010515453.tif 000004
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1または配列番号2のヌクレオチド配列を有するプロモーター核酸分子。
【請求項２】
標的遺伝子のコード配列に機能的に連結された請求項1記載のプロモーターを含む、組換えベクター。
【請求項３】
請求項2記載のベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項４】
コリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する、請求項3記載の宿主細胞。
【請求項５】
配列番号1として表されたプロモーターを含む組換えベクターによって形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）KCCM 10831である宿主細胞であって、該プロモーターがlysC遺伝子のコード配列に機能的に連結された、請求項4記載の宿主細胞。
【請求項６】
配列番号2として表されたプロモーターを含む組換えベクターによって形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカムKCCM 10830である宿主細胞であって、該プロモーターがlysC遺伝子のコード配列に機能的に連結された、請求項4記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項3から6のいずれか一項記載の宿主細胞を培養する段階を含む、標的遺伝子を発現する方法。
【請求項８】
標的遺伝子がlysC遺伝子である、請求項7記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に由来する新規のプロモーター核酸分子、前記プロモーターを含む組換えベクター、前記ベクターによって形質転換された宿主細胞、及び前記宿主細胞を利用して標的遺伝子を発現する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリネ型細菌は、L-リシン、L-スレオニン、及び各種核酸を含んだ飼料、医薬、及び食品のような分野で多様な用途を有する化学物質を生産する産業用微生物である。かようなコリネ型細菌を遺伝工学的、代謝工学的技術を利用して高力価菌株に開発するためには、コリネ型細菌内で、さまざまな代謝過程に関連した遺伝子の発現を選択的に調節できねばならないが、そのために有用なプロモーター配列が必須であるといえる。
【０００３】
従来、プロモーターを分離するための方法には、（1）ゲノムDNA断片を、クローニングされた断片がプロモーター活性を含む場合にだけ発現されるリポーター遺伝子の前方に、ランダムにクローニングさせるプロモーター、プローブ、ベクターの利用法、（2）遺伝子特異的プローブに基づいたハイブリダイゼーションを利用し、遺伝子ライブラリーから遺伝子及びそのプロモーターを分離する方法、（3）誘導性cDNAプローブ及び非誘導性cDNAプローブを使用した遺伝子バンクの差示的ハイブリダイゼーションなどがあった。
【０００４】
コリネ型細菌で遺伝子を発現させるためには、一般的に、その遺伝子が本来有していたプロモーターを使用するのが一般的であった（Vasicova, P., et al., J. Bacteriol., 181, 6188-6191 (1999)（非特許文献1）など）。一方、コリネ型細菌での遺伝子発現のためのプロモーター配列は、大腸菌（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis）のような他の産業用微生物とは異なり、一般的な構造が知られていなかった。従って、クロラムフェニコール（chloramphenicol）のような抗生物質耐性遺伝子のプロモーター部分を除去し、ここにコリネ型細菌から分離した染色体DNAを適切な制限酵素で切断して導入した後、これでコリネ型細菌を形質転換させて得た菌株の抗生物質耐性を測定することによって、プロモーターを開発してきた（Eikmanns, B. J., et al., Gene, 102, 93-98 (1991)(非特許文献2）、Patek, M., et al., Microbiology, 142, 1297-1309 (1996)（非特許文献3））。しかし、これまでに開発されたプロモーター配列は、遺伝子発現の選択性及び発現効率のような側面で、依然として改善の余地を残していた。
【０００５】
本発明者らは、推定プロモーター領域をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で探索および増幅し、その推定プロモーターをプロモーターが欠乏したlysC遺伝子の開始部位に導入し、リシン生合成を介してlysC活性の変動を識別して効率的なプロモーターを選択することによって、コリネバクテリウム・グルタミカム由来の新規のプロモーター核酸分子を開発した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Vasicova, P., et al., J. Bacteriol., 181, 6188-6191 (1999)
【非特許文献２】Eikmanns, B. J., et al., Gene, 102, 93-98 (1991)
【非特許文献３】Patek, M., et al., Microbiology, 142, 1297-1309 (1996)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来する新規のプロモーター核酸分子を提供することである。
【０００８】
また、本発明の目的は、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来する新規のプロモーター核酸分子を含む組換えベクターを提供することである。
【０００９】
また、本発明の目的は、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来する新規のプロモーター核酸分子を含む組換えベクターによって形質転換された宿主細胞を提供することである。
【００１０】
また、本発明の目的は、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来する新規のプロモーター核酸分子を含む組換えベクターによって形質転換された宿主細胞を使用し、標的遺伝子を発現する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記のような目的を達成するために、本発明は、配列番号1または配列番号2のヌクレオチド配列で構成されるプロモーターポリヌクレオチドを提供する。
【００１２】
本発明によるプロモーター核酸分子のヌクレオチド配列は、最近のさまざまな研究技法、例えば、定向進化法または部位特異的突然変異のような方法を介して、一定程度変形が可能である。本技術分野の当業者であるならば、かかる人為的な変形によって、70%以上の相同性が保持されるヌクレオチド配列が、本発明で目的とする遺伝子発現のためのプロモーター活性を保有する限り、本発明のヌクレオチド配列に由来するプロモーターと均等であるということを容易に理解するであろう。
【００１３】
従って、本発明のプロモーター核酸分子は、配列番号1または配列番号2のヌクレオチド配列と70%以上の相同性をもってプロモーターとして使われうるヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１４】
本発明で使われる「相同性」という用語は、野生型核酸配列との類似度合いを意味し、本発明は、本発明による新規のプロモーターのヌクレオチド配列と、望ましくは75%以上、さらに望ましくは85%以上、さらに一層望ましくは90%以上、最も望ましくは95%以上同一でありえるDNA配列を含むことができる。かような相同性の比較は、肉眼や購入容易な比較プログラムを利用して行うことができる。市販されているコンピュータプログラムは、2つ以上の配列間の相同性を百分率（%）で計算でき、相同性（%）は、隣接した配列に対して計算されうる。
【００１５】
また、本発明のプロモーター核酸分子は、前記のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むグループのうちから選択されたコリネバクテリウム・グルタミカム由来のプロモーター核酸分子を含むことができる。
【００１６】
本発明で使われる「相補的」という用語は、ヌクレオチドまたは核酸、例えば、二重鎖DNA分子の2個の鎖間、またはオリゴヌクレオチドプライマーと配列分析されたり増幅される単一鎖の核酸テンプレートのプライマー結合部位間のハイブリダイゼーションまたは塩基対形成が可能であるということを意味する。
【００１７】
また、本発明のコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するプロモーター核酸分子は、前記のコリネバクテリウム・グルタミカム由来のプロモーター核酸分子と機能的に同じ作用を行う当該機能的等価物を含む。前記の機能的等価物には作用性断片が含まれ、一つ以上の核酸塩基が置換、欠失、挿入、またはそれらの組み合わせによって変異された変異体を含むことができる。
【００１８】
本発明のコリネバクテリウム・グルタミカム由来のプロモーター核酸分子は、コリネ型細菌由来のプロモーターであって、望ましくは、原核細胞、特に、大腸菌及びコリネ型細菌での遺伝子発現のためのプロモーターとして有用である。
【００１９】
本発明で使われる「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写が開始されるためにRNAポリメラーゼが結合するDNA上の部位であって、mRNA転写開始部位の上流、すなわち、5'前側に位置する。
【００２０】
望ましくは、本発明の配列番号1または配列番号2のプロモーターは、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032のおよそ3,000個の遺伝子の全体ゲノム発現量を介して選別した新規のプロモーターであるNCgl1504の配列（配列番号11）を有する遺伝子、及びNCgl1305の配列（配列番号12）を有する遺伝子のプロモーターでありうる。
【００２１】
本発明において、「NCgl1504の配列を有する遺伝子」及び「NCgl1305の配列を有する遺伝子」は、それぞれコリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032菌株由来の配列番号11及び配列番号12のヌクレオチド配列を有するだけではなく、コリネバクテリウム（corynebacterium）属に属する微生物に存在する遺伝子であって、前記NCgl1504またはNCgl1305の遺伝子産物と実質的に同じ産物を発現する遺伝子を意味する。本発明で「NCgl1504遺伝子」及び「NCgl1305遺伝子」という用語は、それぞれ「NCgl1504の配列を有する遺伝子」及び「NCgl1305の配列を有する遺伝子」と同じ意味として使われる。本発明において、「実質的に同一」というのは、各遺伝子産物と同種類の活性及び調節メカニズムを有することを意味する。本発明において、望ましくは、NCgl1504の配列を有する遺伝子は、配列番号11のヌクレオチド配列を有する遺伝子であり、NCgl1305の配列を有する遺伝子は、配列番号12のヌクレオチド配列を有する遺伝子である。
【００２２】
本発明のプロモーター核酸分子は、標準的な分子生物学技術を利用して分離または作製することができる。例えば、適切なプライマー配列を利用し、PCRを介して分離できる。また、自動化されたDNAシンセサイザーを利用する標準的な合成技術を利用して作製することもできる。
【００２３】
本発明はまた、配列番号1または配列番号2のヌクレオチド配列で構成されたプロモーター及び前記プロモーターに機能的に連結された標的遺伝子のコード配列を含む組換えベクターを提供する。
【００２４】
本発明で使われる「ベクター」という用語は、適切な宿主内でDNAの発現を行うために適切な調節配列に機能的に連結された、DNA配列を含有するDNA構築物を意味する。適切な調節配列は、転写を行うためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレータ配列、適切なmRNAリボゾーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または単に、潜在的なゲノム挿入物でありうる。ベクターが適切な宿主を形質転換させれば、ベクターは、宿主ゲノムと関係なく複製して機能できたり、または一部の場合には、ゲノムそれ自体に挿入されて統合されうる。本発明で使われる「機能的に連結された」という用語は、発現が必要な遺伝子とその調節配列が互いに機能的に結合され、遺伝子発現を可能にする方式で連結されることをいう。
【００２５】
コリネバクテリウム・グルタミカム由来のプロモーター核酸分子を含む本発明の組換えベクターは、標的遺伝子を組換え的に生産するために多様なタンパク質をコードする遺伝子に機能的に連結されうる。本発明のベクターを使用して発現させるのに有利な標的遺伝子としては、アスパルテートキナーゼをコードするlysC、ジヒドロジピコリネートリダクターゼをコードするdapBなどがあるが、必ずしもそれらに制限されるものではない。
【００２６】
本発明で標的遺伝子は、アスパルテートキナーゼをコードするlysCでありうる。望ましくは本発明で、アスパルテートキナーゼをコードするlysC遺伝子（Ikeda et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Feb；58（2）：217-23 A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generate a new L-lysine-producing mutant）は、配列番号13の塩基配列を有する。
【００２７】
本発明で組換えベクターは、標的遺伝子であるlysCのコード配列（配列番号13）に機能的に連結された配列番号1のプロモーターを含むpDZ-NCgl1504-lysCでありうる。また、本発明で組換えベクターは、標的遺伝子であるlysCのコード配列（配列番号13）に機能的に連結された配列番号2のプロモーターを含むpDZ-NCgl1305-lysCでありうる。
【００２８】
本発明はまた、配列番号1または配列番号2のヌクレオチド配列で構成されたプロモーターを含む組換えベクターによって形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２９】
本発明による形質転換された宿主細胞は、標的タンパク質の発現のために、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のプロモーター核酸分子と標的タンパク質をコードする遺伝子とが機能的に連結するように作製された組換えベクターによって宿主細胞、例えば原核細胞、望ましくは大腸菌及びコリネ型細菌、さらに望ましくはコリネ型細菌を形質転換させたものでありうる。
【００３０】
本発明で「コリネ型細菌」は、コリネバクテリウムまたはブレビバクテリウム（brevibacterium）属の菌株、特に、コリネバクテリウム・グルタミカム、さらに具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032でありうる。本発明のコリネ型細菌は、例えば、他のコリネバクテリウム属菌株、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）FERM BP-1539、ブレビバクテリウム・フラブム（Brevibacterium flavum）ATCC 14067、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム（Brevibacterium lactofermentum）ATCC 13869、及びそれらから作製されたL-アミノ酸生産突然変異体、またはコリネバクテリウム・グルタミカムKFCC 10881、コリネバクテリウム・グルタミカムKFCC 11001などを含むことができる。
【００３１】
本明細書で使われる用語「形質転換」は、DNAを宿主に導入してDNAが染色体外因子として、または染色体への挿入によって複製可能になることを意味する。
【００３２】
本発明で宿主細胞は、配列番号1のヌクレオチドで構成されたプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結されたlysC（配列番号13）を含む組換えベクターによって形質転換されたコリネバクテリウム属細菌でありうる。望ましくは前記宿主細胞は、コリネバクテリウム・グルタミカム（受託番号KCCM 10831）でありうる。
【００３３】
本発明で宿主細胞は、配列番号2のヌクレオチドで構成されたプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結されたlysC（配列番号13）を含む組換えベクターによって形質転換されたコリネバクテリウム属細菌でありうる。望ましくは前記宿主細胞は、コリネバクテリウム・グルタミカム（受託番号KCCM 10830）でありうる。
【００３４】
本発明はまた、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来するプロモーター核酸分子を含む組換えベクターによって形質転換された宿主細胞を培養する段階を含む、標的遺伝子を発現する方法を提供する。
【００３５】
本発明の組換えベクターで、配列番号1または配列番号2のプロモーターに機能的に連結された標的遺伝子は、リシン、スレオニンのような最終産物の生合成経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子でありうる。本発明で、「標的遺伝子を発現する」ということは、前記標的遺伝子がコードするタンパク質が関与する生合成経路の最終産物を生産することを意味できる。従って、本発明で標的遺伝子を発現する方法は、前記標的遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換された宿主細胞を培養し、前記標的遺伝子がコードするタンパク質が関与する生合成経路の最終産物を生産する方法でありうる。
【００３６】
本発明で最終物質は、リシンでありうる。すなわち、本発明は、リシンの生合成と関連するタンパク質をコードするlysC、及びその遺伝子に機能的に連結された配列番号1または配列番号2のプロモーターを含む組換えベクターによって形質転換された宿主細胞を培養する段階を含むリシン生産方法を提供できる。
【００３７】
本発明によるリシン生産方法で形質転換された宿主細胞は、標的遺伝子である配列番号13のlysCに機能的に連結された配列番号1または配列番号2のプロモーターを含む組換えベクターによって形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカムKCCM 10831またはコリネバクテリウムKCCM 10830でありうる。
【００３８】
形質転換された宿主細胞（形質転換体）の培養は、本発明が属する技術分野で公知の一般的な方法によって実施されうる。それら公知の培養方法は、文献（Chmiel(Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)；及びStorhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))に記述されている。
【００３９】
培養に使われる培地は、適切な方式で特定菌株の要件を充足せねばならない。コリネバクテリア菌株に係る培養培地は、例えば、Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for Bacteriology, Washington D. C., USA, 1981に開示されている。使われうる炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フラクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物；大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油のようなオイル及び脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノレン酸のような脂肪酸；グリコール、エタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸が含まれる。それらの物質は、個別的にまたは混合物として使われうる。使われうる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液、大豆ミール、及び尿素無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も、個別的にまたは混合物として使用できる。使われうるリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウム、または相応するナトリウム含有塩が含まれる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有しなければならない。最後に、前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が使われうる。また、培養培地に適切な前駆体が加えられうる。上記の原料は、培養過程で培養物に適切な方式によって回分式にまたは連続式に添加されうる。
【００４０】
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物、またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方式で使用して、培養物のpHを調節できる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して、気泡生成を抑制できる。好気状態を維持するために、培養物内に酸素または、例えば空気などの酸素含有ガスを注入する。培養物温度は、20℃ないし45℃、望ましくは25℃ないし40℃である。培養は、所望の標的物質の生成量が最大に得られるまで続ける。かかる目的で、普通10ないし160時間で達成される。
【００４１】
本発明を以下の実施例を介してさらに詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を例示的に実施するためのものであり、本発明の範囲がそれらの実施例によって限定されるものではない。
【発明の効果】
【００４２】
本発明により、関心対象の遺伝子の効率的な発現において使用するために、コリネバクテリウム・グルタミカム由来の新規のプロモーター核酸分子配列が提供される。
【００４３】
本発明の上記またはその他の目的、特徴、およびその他の利点は、添付の図面と組み合わせて、以下の詳細な説明からさらに明確に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の態様によるプロモーター探索ベクターの作製方法を示した模式図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４５】
実施例1: 新規のプロモーター配列を含有する組換えベクターの作製
1. コリネバクテリウム・グルタミカム由来の新規のプロモーター候補遺伝子の選定
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032を5リットル発酵槽で培養した後で菌体を収集した。前記菌体を対象に、ゲノムDNAチップ（Genomictree（株）、韓国、cDNAチップ）を介して、およそ3,000個の遺伝子のmRNA発現度を調べた。全体遺伝子のうち、総ゲノム発現量の0.88%、0.43%を占めているNCgl1504及びNCgl1305の遺伝子を、本願発明の新規のプロモーターのための候補遺伝子に選定した。
【００４６】
2. 推定プロモーター部位DNA断片の増幅
コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム遺伝子の塩基配列は、すでに明白に解明されており、公開されている（Appl. Microbiol. Biotechnol., 62(2-3), 99-109(2003)：GenBank Accession No. NC＿003450）。米国国立衛生研究所（NIH）GenBankから、タンパク質の遺伝子情報（NCgl1504、NCgl1305）を確保した。各タンパク質のオープンリーディングフレーム（ORF）の上流に位置した推定プロモーター（配列番号1：NCgl1504のプロモーター、配列番号2：NCgl1305のプロモーター）を増幅するために、報告された塩基配列に基づいて、制限酵素EcoRV／BamHIとNdeI切断部位とを含むプライマー1〜4を合成した。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032菌株の染色体DNAをテンプレートとして、それぞれプライマー1と2（配列番号3と4）、及びプライマー3と4（配列番号5と6）を利用し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）［Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual(1989), Cold Spring Harbor Laboratories］（PCR条件：変性＝94℃、1分／アニーリング＝55℃、1分／重合＝72℃、30秒、30回）によって、NCgl1504遺伝子及びNCgl1305遺伝子の推定プロモーター部位を増幅して準備した。
【００４７】
3. プロモーター活性測定のための染色体挿入用組換えベクターの作製
上記で準備されたNCgl1504及びNCgl1305の推定プロモーター部位の活性を、コリネバクテリウムの染色体上で測定するために、大腸菌クローニング用ベクターpACYC177（New England Biolab, GenBank accetion ＃X06402）を基本ベクターとして使用してCheiljedang Corporationにより開発された染色体挿入用ベクターpDZ（大韓民国特許出願第1-2006-089672号）を利用した。コリネバクテリウムの染色体に余分の遺伝子を挿入するために、対象になる遺伝子であるlysCの開始部位前に、配列番号1及び配列番号2の新規プロモーターをそれぞれ挿入し、pDZ-Ncgl1504-lysCとpDZ-Ncgl1305-lysCとのベクターをそれぞれ得た。
【００４８】
NCgl1504及びNCgl1305の推定プロモーター部位をlysC遺伝子に挿入した組換えベクターを作製するために、次のような過程を経た。まず、配列番号13のlysCを増幅するために、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032菌株の染色体DNAをテンプレートとして、プライマー5と6（配列番号7と8）及びプライマー7と8（配列番号9と10）を使用し、PCR（変性＝94℃、1分／アニーリング＝55℃、1分／重合＝72℃、30秒：30回）を行った。TOPO Cloning Kit（Invitrogen）を利用して増幅されたlysC断片を制限酵素EcoRVとクレノウとで消化し、平滑末端化した2つの断片をライゲーションし、pCR2.1-lysCをクローニングした。その後、制限酵素EcoRVとlysC遺伝子との増幅時に使用したプライマーに存在するNdeIで、pCR.2.1-lysC及びNCgl1504またはNCgl1305のプロモーター部位を切断した後、DNAリガーゼを利用し、前記切断部位に新規の配列番号1または配列番号2のプロモーターをそれぞれクローニングした。このようにクローニングされた断片をさらにpDZベクターに移し、図1に図示されたように、pDZ-Ncgl1504-lysCとpDZ-Ncgl1305-lysCのベクターを作製した。
【００４９】
実施例2: 新規のプロモーター配列を含む組換え菌株による形質転換
L-リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKFCC 10881を電気パルス法によって、上記で作製された組換えベクターpDZ-NCgl1504-lysCまたはpDZ-NCgl1305-lysCで形質転換させた後（Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999)52:541-545による形質転換法を利用）、カナマイシン（kanamycin）25mg／Lを含有した選別培地（肉汁抽出物（beef extract）10g／L、ペプトン10g／L、酵母抽出物5g／L、塩化ナトリウム5g／L、BHI（Brain Heart Infusion）3.7g／L、ソルビトール9.1g／L）で、染色体上の同遺伝子との相同性によって挿入された菌株を選別した。ベクターの染色体挿入が成功するか否かは、X-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド）を含んだ固体培地で青色を示すか否かで確認した。一次染色体挿入された菌株を栄養培地で振盪培養（30℃、8時間）した後、それぞれ10-4から10-10まで希釈し、X-galを含んでいる固体培地にプレーティングした。ほとんどのコロニーが青色を示す一方、低い割合で示される白色コロニーを選別することによって、クロスオーバーによって挿入された染色体上のベクター配列が除去された菌株を選別した。以上のように選別された菌株は、最終的に抗生物質カナマイシンに対する感受性の確認を介して、遺伝子構造確認過程を経て最終選定した。lysC遺伝子のプロモーターがNcgl1504に代替された菌株はCA01-0037、lysC遺伝子のプロモーターがNcgl1305に代替された菌株はCA01-0036と命名し、2006年12月28日に、韓国微生物保存センターに寄託し、それぞれ受託番号KCCM 10831及びKCCM 10830を付与された。
【００５０】
実施例3：コリネバクテリウムでのプロモーター配列の発現活性
獲得された形質転換菌株は、プロモーター配列の活性測定のために、以下のような方法で培養した。
【００５１】
培地［ブドウ糖20g、硫酸アンモニウム5g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO47H2O 0.5g、ビオチン150μg、チアミン塩酸塩1.5mg、カルシウムパントテン酸3mg、ニコチンアミド3mg（蒸留水1リットル基準）、pH7.2］25mlの入った250mlコーナーバッフル・フラスコに、形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカム菌株を20分の1の割合でそれぞれ播種し、30℃で培養中期（OD600＝10）まで振盪培養（200rpm）した。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、100mM Tris-Hcl緩衝液（pH7.0）に懸濁した後、超音波破砕法で細胞を破壊し、さらに高速遠心分離して上澄み液を得た。前記方法で得られた上澄み液からタンパク質1mgずつ取り、lysC酵素活性を測定した（Black & Wright（1955b））。その結果、下記の表に示されているように、NCgl1504及びNCgl1305のプロモーターでそれぞれプロモーターが代替された菌株で、lysCの活性の変化が確認された。
【００５２】
（表１）リシン添加によるプロモーター活性比較
2010515453.tif 000003
【図１】
2010515453.tif 000005
【配列表】
2010515453000001.app
【国際調査報告】
2010515453.tif 000006
2010515453.tif 000007
2010515453.tif 000008