(57)【要約】【課題】植物の形態を改変するための組成物及び方法を提供することである。【解決手段】化合物、それらを製造するための方法及び植物の形態を変化させるための方法が開示されている。より具体的には、トマト植物のような植物において、果実の形態を改変するためにＳＵＮ遺伝子を使用し得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリヌクレオチドであって：
（ａ）ポリペプチドをコードする配列、該配列は配列番号１、２、３、４及び５又はそれらのセグメントの少なくとも一つである；
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する（ａ）又は（ｂ）のいずれかの配列の変異体；
（ｃ）（ａ）の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する（ａ）又は（ｂ）のいずれかの配列のオルソロガス配列；
（ｄ）（ａ）の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する（ａ）又は（ｂ）のいずれかの配列のいずれかのパラロガス配列又はそれらのＩＱモチーフと７０％の同一性を有するパラロガス配列；
（ｅ）ストリンジェント条件下、（ａ）のいずれかの配列とハイブリダイズする配列；及び
（ｆ）（ａ）−（ｅ）のいずれかの配列よりコードされているポリペプチドの保存ドメインと少なくとも７０％の配列相同性を有する保存ドメインを含んでなるポリペプチドをコードする配列；
から成る群より選択され、保存ドメインは、トランスジェニック植物における該ヌクレオチドの発現を調節することにおいて及び形質を改変することにおいて、（ａ）−（ｅ）の配列のいずれかによりコードされたポリペプチドの機能に必要とされる、前記ポリヌクレオチド。
【請求項２】
該組換えポリヌクレオチドが植物内に形質転換された場合、該組換えポリヌクレオチドの発現を制御することが有効なように、該組換えポリヌクレオチドは少なくとも一つの調節エレメントに作動可能なように連結されている、請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項３】
該ポリヌクレオチドが発現ベクター内に組み込まれている、請求項２のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１のポリヌクレオチド配列に作動可能なように連結されている、一つまたはそれ以上の構成的、誘導可能又は組織特異的プロモーターを含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
該発現ベクターが培養宿主細胞内に組み込まれている、請求項３のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを発現するトランスジェニック植物であって、該トランスジェニック植物の少なくとも一部が、非トランスジェニック植物又は野生型植物と比較して改変された形質を有する、前記トランスジェニック植物。
【請求項７】
改変された形質が：ホルモンレベルに対する感受性：植物の少なくとも一部の改変された形状：改変された植物サイズ：改変された葉形：改変された野菜形状：改変された果形；少なくとも部分的な単為結実果実：増加したＳＵＮレベル及び減少したＳＵＮレベル：の一つ又はそれ以上である、請求項６のトランスジェニック植物。
【請求項８】
該改変された形質が、該単離されたポリヌクレオチドの一つの少なくとも一部の過剰発現であり、該改変された形質は単為結実果実を含んでなる、請求項６のトランスジェニック植物。
【請求項９】
該改変された形質が、該単離されたポリヌクレオチドの一つの少なくとも一部の発現であり、該改変された形質は伸長した果形を含んでなる、請求項６のトランスジェニック植物。
【請求項１０】
該植物が、タンパク質のＩＱＤファミリーからの一つまたはそれ以上のタンパク質を発現する植物である、請求項６のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
該植物が一つ又はそれ以上の裸子植物、被子植物及び蘚類から選択される、請求項６のトランスジェニック植物。
【請求項１２】
該植物が一つまたはそれ以上の農作物、観賞植物及び非栽培又は野生植物から選択される、請求項６のトランスジェニック植物。
【請求項１３】
該植物が、限定されるわけではないが、一つ又はそれ以上の：人間の食物又は動物飼料に使用される農作物、木材又はパルプ産生木、野菜、果実植物及び観賞植物を含む商業的又は農業的に関心が惹かれる植物から選択される、請求項６のトランスジェニック植物。
【請求項１４】
該植物が一つ又はそれ以上のナス科ファミリーのメンバーから選択される、請求項６のトランスジェニック植物。
【請求項１５】
該トランスジェニック植物がトマト植物である、請求項６のトランスジェニック植物。
【請求項１６】
該植物がナスである、請求項６のトランスジェニック植物。
【請求項１７】
該トランスジェニック植物がジャガイモ植物である、請求項６のトランスジェニック植物。
【請求項１８】
該トランスジェニック植物がコショウ植物である、請求項６のトランスジェニック植物。
【請求項１９】
該植物がシロイヌナズナである、請求項５のトランスジェニック植物。
【請求項２０】
該トランスジェニック植物が表１に示されているトマト植物である、請求項６のトランスジェニック植物。
【請求項２１】
該トランスジェニック植物がトマト植物準同質遺伝子系統である、請求項６のトランスジェニック植物。
【請求項２２】
非トランスジェニック又は野生型植物と比較して改変された形質を有するトランスジェニック植物を産生するための方法であって：
（ａ）（ｉ）請求項１に従ったポリヌクレオチド；及び
（ｉｉ）該ポリヌクレオチド配列に隣接する少なくとも一つの調節エレメント、該少なくとも一つの調節エレメントは標的植物中で該組換えポリヌクレオチドの発現を制御することにおいて有効である；を含んでなる発現ベクターを提供すること；
（ｂ）植物細胞内に該発現ベクターを導入し、それによりトランスジェニック植物細胞を提供すること；
（ｃ）トランスジェニック植物細胞をトランスジェニック植物に生長させ、該トランスジェニック植物が該ポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドを発現する又は抑制することを可能にすること、該ポリペプチドは、該ポリペプチドを発現しない又は抑制しない非トランスジェニック植物と比較し、植物で形質を変化させる性質を有している；及び
（ｄ）トランスジェニック植物と非トランスジェニック植物を比較することにより、改変された形質を有する少なくとも一つのトランスジェニック植物を同定すること；
の工程を含んでなる方法。
【請求項２３】
請求項２２の方法であって、さらに
（ｅ）改変された形質を有する該少なくとも一つのトランスジェニック植物をそれ自身又は別の植物とそれぞれ自家受粉又は交雑させること；及び
（ｆ）自家受粉又は交雑の結果として発生した種子から子孫植物を生長させること、こうして改変された形質を有するトランスジェニック子孫植物を作製する；
の工程を含んでなる方法。
【請求項２４】
前記請求項のいずれかの植物が作製される、請求項２２又は２３の方法。
【請求項２５】
請求項１のポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
【請求項２６】
該細胞が植物細胞である、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
請求項２６の植物細胞から生長させた植物又は植物組織。
【請求項２８】
ポリペプチドをコードする配列を含んでなる形質転換又はトランスジェニック植物、植物部位、植物種子、植物細胞又はそれらのトランスジェニック子孫であって、該ヌクレオチド配列が、配列番号１、２、３、４及び６及びそれらの組み合わせの少なくとも一つである、前記植物。
【請求項２９】
該トランスジェニック植物がナス科ファミリーから選択される、請求項２８の植物。
【請求項３０】
該植物がトマト植物である、請求項２９の植物。
【請求項３１】
該植物が表１に示されているトマト植物である、請求項２９の植物。
【請求項３２】
該植物が本明細書に記載したトマト植物準同質遺伝子系統である、請求項２８の植物。
【請求項３３】
請求項１の単離されたポリペプチドに作動可能なように連結された、植物中の発現を駆動するプロモーターを含んでなる少なくとも一つの安定に組み込まれたヌクレオチド構築物を、そのゲノム中に含んでなる形質転換植物。
【請求項３４】
実質的に図６Ｃに示した二つのＬＴＲの一部（ｍＲＮＡの５’末端のＲセグメント及びＵ５領域、及びｍＲＮＡの３’末端のＲセグメント及びＵ３領域）が隣接するｍＲＮＡ分子。
【請求項３５】
ＬＴＲ１及びＬＴＲ３が染色体７上にあり、全重複断片が隣接し、そしてすぐ隣接するＬＴＲ１及びＬＴＲ３が５ｂｐモチーフ「ＡＴＡＴＴ」である、請求項３４の分子。
【請求項３６】
完全長ＳＵＮ遺伝子を含んでなるクローン、ｐＨＸ４。
【請求項３７】
請求項３６のｐＨＸ４クローンで形質転換された植物。
【請求項３８】
ＤＥＦＬ１の上流３．２ｋｂ領域に位置するシスエレメントをさらに含む、請求項３６のクローン。
【請求項３９】
植物の少なくとも一つの形質を改変するための方法であって、自律的ロングターミナルリピートレトロエレメントにより仲介される重複事象を起こすことを含んでなり、該レトロエレメントの転位が別の遺伝子の調節配列の近傍にＳＵＮ遺伝子の配置を生じ、先祖の位置のそのパラログと比較して改変された発現を生じる、前記方法。
【請求項４０】
機能獲得型変異が自律性ＬＴＲレトロエレメントにより仲介される転位事象により生じ、該レトロエレメントの転位は、近隣遺伝子の３’形質導入、ならびに該ＳＵＮ遺伝子をレトロエレメントの上流からレトロエレメントの２０ｋｂ下流へ移動する第二の転位に関係している、請求項３９の方法。
【請求項４１】
天然に存在する果実とは異なっている形状を有する少なくとも一つの果実を有する植物を作製するための方法であって、果実の準同質遺伝子系統内にＳＵＮインバーテットリピート構築物を形質転換すること、そして該植物を生長させることを含んでなる、前記方法。
【請求項４２】
果実を生産する方法であって、ａ）請求項１の少なくとも一つのポリペプチドを有する植物を生長させること、及びｂ）該果実を収穫すること：を含んでなる、前記方法。
【請求項４３】
植物を無性で繁殖させる方法であって、請求項４２に従って生長した植物の一部を採取すること；及び該一部から小植物を得ることを含んでなる、前記方法
【請求項４４】
小植物から植物を生長させることをさらに含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
小植物から生長させた植物から果実を収穫することをさらに含んでなる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項６の植物の果実を含んでなる、食物及び食物製品。
【請求項４７】
Ｓｕｎ１６４２バックグラウンドを含んでなる準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）。
【請求項４８】
ＬＡ１５８９バックグラウンドを含んでなる準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）。
【請求項４９】
ＩＱＤ１２、ＳＤＬ１様、ＨＹＰｌ及びＨＹＰ２の最初の４１５アミノ酸をコードするヌクレオチドを含有する１７．２ｋｂ  ｐＨＸ２構築物。
【請求項５０】
ＩＱＤ１２及びＳＤＬ１様終止コドン上流の終端１８０ヌクレオチドを含有する１．４ｋｂ  ｐＨＸ４構築物。
【請求項５１】
プラスミドｐＥＫ５９及びｐＥＫ６０の全ファージサブクローン挿入物（ＮｏｔＩにより放出され、そしてクレノーを使用して平滑末端化された）を、それぞれクレノー平滑末端化ＢａｍＨＩ消化バイナリーベクターｐＣＩＢ１０Ｇ内にサブクローニングすることにより作製された形質転換構築物。
【請求項５２】
ｐＨＸ２を含んでなる、請求項５１の形質転換構築物。
【請求項５３】
ｐＨＸ４を含んでなる、請求項５１の形質転換構築物。
【請求項５４】
プライマーＥＰ５２７及びＥＰ５２８を使用して逆転写されたｍＲＮＡから増幅された、ＩＱＤ１２  ｃＤＮＡの５１２ｂｐ断片（ゲノム配列ＥＦ０９４９４０のヌクレオチド１６，１５４〜１６，６４６［配列番号２］）を、ｐＦＧＣ５９４１内へセンス及びアンチセンス方向でクローニングすることにより発生させたＲＮＡｉ：ＩＱＤ１２構築物、ｐＨＸ８。
【請求項５５】
ＩＱＤ１２  ｃＤＮＡの１．４ｋｂ断片、ＩＱＤ１２（ゲノム配列ＥＦ０９４９４０のヌクレオチド１３，４６０〜１６，２８０に対応する［配列番号２］）を過剰発現させるための方法であって：プライマーＥＰ５１９及びＥＰ５２０を使用して逆転写されたｍＲＮＡから増幅すること、及びｐＣＩＢ７１０のＣａＭＶ  ３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター及びＮＯＳターミネーター間にサブクローニングすること：を含んでなる、前記方法。
【請求項５６】
ＩＱＤ１２  ｃＤＮＡの１．４ｋｂ断片、ＩＱＤ１２（ゲノム配列ＥＦ０９４９４０のヌクレオチド１３，４６０〜１６，２８０に対応する［配列番号２］）発現のプローブラベリングのための方法であって、プライマーＣＭＥ５Ｆ及びＣＭＥ５Ｒを使用して逆転写されたｍＲＮＡから増幅することを含んでなる、前記方法。
【請求項５７】
ＩＱＤ１２  ｃＤＮＡの１．４ｋｂ断片、ＩＱＤ１２（ゲノム配列ＥＦ０９４９４０のヌクレオチド１３，４６０〜１６，２８０に対応する［配列番号２］）の発現をサイレンシングするための方法であって、プライマーＥＰ５２７及びＥＰ５２８を使用して逆転写されたｍＲＮＡから増幅することを含んでなる
【請求項５８】
プラスミドｐＨＸ８を含んでなる構築物。
【請求項５９】
ＬＡ１５８９バックグラウンドにＳｕｎ１６４２アレルを運んでいる準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）内へ形質転換されたプラスミド構築物ｐＨＸ８。
【請求項６０】
プラスミドｐＨＸ２を含んでなる構築物。
【請求項６１】
ＬＡ１５８９及びＳｕｎ１６４２バックグランド両方において、丸形果実ＮＩＬ植物を形質転換するのに有用であるプラスミド構築物ｐＨＸ２。
【請求項６２】
プラスミドｐＨＸ４を含んでなる構築物。
【請求項６３】
ＬＡ１５８９及びＳｕｎ１６４２バックグランド両方において、丸形果実ＮＩＬ植物を形質転換するのに有用であるプラスミド構築物ｐＨＸ４。
【請求項６４】
プラスミドｐＥＫ６９を含んでなる構築物。
【請求項６５】
ＬＡ１５８９及びＳｕｎ１６４２バックグランド両方に丸形果実ＮＩＬ植物を形質転換するのに有用であるプラスミド構築物ｐＥＫ６９。
【請求項６６】
Ｓｕｎ１６４２バックグラウンド又はＬＡ１５８９バックグランドに構築されたｓｕｎが異なっている植物を含んでなる準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）であって、該植物が、マーカー補助選択を使用して反復親に連続的に戻し交配することにより作製される、前記方法。
【請求項６７】
プロモーターとして使用される６．０８ｋｂ上流領域ＤＥＦＬ１。
【請求項６８】
請求項１のポリペプチドを含んでなるベクター。
【請求項６９】
請求項６８のベクターを有する、形質転換された植物細胞。
【請求項７０】
請求項６９の植物細胞を含んでなる、植物形質転換体。
【請求項７１】
該植物形質転換体がトマトである、請求項７０の植物形質転換体。
【請求項７２】
請求項７１の植物形質転換体の子孫又はクローン。
【請求項７３】
植物を生産するための方法であって、植物細胞内に請求項１のポリペプチドを導入すること、そして該植物細胞から植物形質転換体を再生することを含んでなる、前記方法。
【請求項７４】
植物の葉及び果形の少なくとも一つを改変するための方法であって、該植物内で請求項１のポリペプチドを導入すること及び発現させることを含んでなり、該ポリペプチドを発現させることは、請求項１のポリペプチドを発現しない植物と比較し、葉及び／又は果実の形状を改変する
【請求項７５】
少なくとも一つの請求項１のポリペプチドを含んでなるベクターで形質転換された、単離された宿主細胞。
【請求項７６】
植物又はそれらの一部の少なくとも一つの形質を改変するためのプロセスであって、植物又はそれらの一部におけるＳＵＮ活性を増加させることを含んでなる、前記方法。
【請求項７７】
ＳＵＮが配列番号４のアミノ酸配列、又はＳＵＮ活性を有し、配列番号４と少なくとも６０％の配列相同性のアミノ酸配列を有する、請求項７７のプロセス。
【請求項７８】
植物又はそれらの一部内に、配列番号４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列内に、又はＳＵＮ活性を有し、配列番号４と少なくとも７０％の配列相同性のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列内に突然変異を導入すること含んでなる、請求項７７のプロセス。
【請求項７９】
植物又はそれらの一部のゲノム内に、センス及びアンチセンス配向で、配列番号４のポリヌクレオチド配列又は配列番号４と少なくとも７０％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を導入することを含み、該相同ポリヌクレオチド配列はＳＵＮ活性を阻害する、請求項７７のプロセス。
【請求項８０】
配列番号４のアミノ酸配列をコードする、又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項８１】
請求項８０のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項８２】
植物の果形の決定に関与する単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドが：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列のコード領域を含んでなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列中に一つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失、付加及び／又は挿入を有する、アミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡ；及び
（ｄ）配列番号２のヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡとストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ：
の一つまたはそれ以上から選択される、前記ポリペプチド。
【請求項８３】
配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質の部分ペプチドをコードする単離されたポリペプチド。
【請求項８４】
配列番号２のヌクレオチド配列のプロモーター領域を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項８５】
請求項８２のポリペプチドを含んでなるベクター。
【請求項８６】
請求項８６のベクターを運んでいる宿主細胞。
【請求項８７】
請求項８５のベクターを運んでいる植物細胞。
【請求項８８】
請求項８７の植物細胞を含んでなる植物形質転換体。
【請求項８９】
請求項８８の植物形質転換体の子孫又はクローンである植物形質転換体。
【請求項９０】
請求項８９の植物形質転換体の繁殖材料。
【請求項９１】
植物形質転換体を産生するための方法であって、請求項８２のポリペプチドを植物細胞内に導入すること、及び該植物細胞から植物を再生することの工程を含んでなる、前記方法。
【請求項９２】
配列番号２のヌクレオチド配列と相補的である少なくとも１５の連続したヌクレオチド、又はそれらに相補的である配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９３】
植物の再生能力を増加させるための方法であって、植物の細胞中で請求項１のポリペプチドを発現させる工程を含んでなる、前記方法。
【請求項９４】
植物の少なくとも一つの形質を改変するための剤であって、活性成分として請求項１のポリペプチド、又はそれらのベクターを含んでなる、前記剤。
【請求項９５】
改変された形状を有する果実を産生する植物細胞の能力を決定するための方法であって、植物細胞中の、請求項１のポリペプチド又はそれらにより発現されたタンパク質の発現を検出することを含んでなる、前記方法。
【請求項９６】
改変された形状を有する果実を産生する植物細胞の能力を決定するための方法であって、該植物中の該ポリペプチドの発現を検出することを含んでなる、前記方法。
【請求項９７】
改変された形状を有する果実を産生する植物細胞の能力を改良するための方法であって、植物中の請求項１のポリペプチド発現により産生される少なくとも一つのタンパク質の活性を調節することを含んでなる、前記方法。
【請求項９８】
形質転換植物細胞を選択するための方法であって：
選択マーカーとして請求項１のポリペプチドを含んでなるベクターを植物細胞に導入すること；
該植物細胞を培養すること；及び
獲得した再生能力を有する植物細胞を選択すること：
を含んでなる、前記方法。
【請求項９９】
改変された形状を有する果実を産生する植物の能力を改変するための方法であって、交雑により植物中の内在性ポリペプチドを置換することを含んでなる、前記方法。
【請求項１００】
表１に示した少なくとも一つの植物。
【請求項１０１】
アンチセンス配向の単離された分子を含んでなる発現ベクターにより形質転換された植物細胞であって、該植物細胞中でのベクターの発現は、対応する野生型植物と比較して改変された果形指標を生じ、そして：（ａ）配列番号１、２、３、４又は６に示されている配列又はそれらの変異体、又は（ｂ）（ａ）と同一の配列をコードする配列、しかし、遺伝子コードの縮重に従って縮重している配列：を含んでなる、前記植物細胞。
【請求項１０２】
該分子がＳＵＮ、配列番号４である、請求項１０１の植物細胞。
【請求項１０３】
生じた植物が単子葉植物である、請求項１０１の植物細胞。
【請求項１０４】
生じた植物が双子葉植物である、請求項１０１の植物細胞。
【請求項１０５】
生じた植物がナス科植物から成る群より選択される、請求項１０１の植物細胞。
【請求項１０６】
該植物が、トマト、ジャガイモ、タバコ、ナスである、請求項１０１の植物細胞。
【請求項１０７】
請求項１０１の植物細胞を含んでなるトランスジェニック植物により産生される種子であって、植物細胞の野生型品種と比較して、娘植物の改変された果形指標を何世代にもわたって同じ特徴を示している、前記種子。
【請求項１０８】
組換えアンチセンス発現ベクターであって：（ａ）植物細胞において機能的であるプロモーター；及び（ｂ）ＳＵＮ、配列番号４を含んでなる単離された分子：を含んでなり、該分子はプロモーターにアンチセンス配向で作動可能なように連結されている、前記発現ベクター。
【請求項１０９】
対応する野生型植物と比較して改変された果形を有するトランスジェニック植物を生産する方法であって：
請求項１０８の組換えアンチセンス発現ベクターを導入することにより植物細胞を形質転換すること；
形質転換細胞から植物を生成させること；及び
改変された果形指標を示している全植物を選択すること：
を含んでなる、前記方法。
【請求項１１０】
植物の果実のサイズを改変するための方法であって：
植物細胞内に請求項１０８の組換えアンチセンス発現ベクターを導入すること；
植物細胞からトランスジェニック植物を再生させること；
導入された発現ベクターを有する植物と対応する野生型植物を比較することにより、改変された果形について全植物を評価すること：
を含んでなる、前記方法。
【請求項１１１】
該トランスジェニック植物が、対応する野生型植物を比較して増加した果形指標発育を示す、請求項１１０の方法。
【請求項１１２】
アンチセンス配向の単離されたアミノ酸配列で形質転換された植物細胞であって、該アミノ酸配列はＳＵＮ、配列番号４、又はそれらの補体、又は配列番号４と同一のアミノ酸配列をコードするが、遺伝子コードの縮重に従って縮重されている分子であり、
植物細胞中での該配列の発現は、対応する野生型植物と比較して、得られた植物に改変された果形を生じる、
前記植物細胞。
【請求項１１３】
請求項１１２に従った植物細胞を含んでなるトランスジェニック植物。
【請求項１１４】
請求項１１３のトランスジェニック植物により産生された種子であって、アンチセンス配向の単離されたヌクレオチド配列を含んでなる、前記種子。
【請求項１１５】
配列番号１を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項１１６】
配列番号２を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項１１７】
配列番号３を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項１１８】
配列番号４を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項１１９】
配列番号５を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項１２０】
配列番号６を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項１２１】
配列番号５を含んでなる、カルモジュリン結合タンパク質ＳＵＮ［ソラヌム  リコペルシクム（Solanum  lycopersicum）］。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００７年９月１９日に出願された米国仮出願第６０／９９４，３４９号の優先権を主張し、その開示は本明細書に参照文献として包含されている。
政府出資研究に関する声明
本発明は政府援助で行われ、米国国立科学財団基金ＤＢＩ  ０２２７５４１及びＤＢＩ  ０４００８１１のもと、政府は本発明に権利を有する。
本発明の技術分野及び産業的応用可能性
本発明は植物生物学の分野、及び植物の表現型を修飾するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
植物の形質を変化させることは、長年の望まれた目標であった。例えば、伸長型果実は、栽培的及び農学的観点から、トマトにおいて重要な特性である。機械的に収穫され、そして缶詰ならびにソースの製造に使用されるトマトは、典型的には伸長型及びがっしりした果実を特色とする。これらの形状特性は、機械的収穫の間にコンベヤーベルトでトマトが転がるのを妨げる。全体が矩形のトマトは、形状が丸いものよりも缶詰により適合する。さらに、新鮮な消費のための新規品種についての最近の開発により、このクラスのトマトにおける新規果形の拡大が生じた。おそらく、これらで最も有名であるのは、チェリートマト（cherry tomato ）のサイズを特色とするが、果実が丸形の代わりに卵形であるグレープトマト（grape tomato ）である。フレーバー及び芳香のごとき他の改良された品質に加えて、果実の特有の形状のため、消費者はチェリーとグレープトマトを容易に分離することができる。伸長型果形特色は、この５年の間に、グレープトマトの人気の急速な増加を疑いもなく導いている。
【０００３】
植物種における果形変異の根底にある分子的基礎は、大部分が知られていない。果実作物は、それらの野生近縁種と比較して生殖器官の形態に非常に大きな多様性を示す。トマトの野生近縁種は小さくて丸い果実を有する一方、栽培種は増大したサイズ及び、扁平、矩形でがっしりした、オックス・ハート、ピーマン、ロングペッパー（ヒハツ）及び西洋ナシ型を含む多くの多様な形状を有する。この形態学的変異は、主な並びに軽度の影響を有する遺伝子座により制御されている１−５。
【０００４】
栽培植物化アクセッションと多くの栽培種トマトを区別する、広く行き渡っている形態学的特徴は伸長型果形である。三つの主な座位がこの特色に影響する：それぞれ染色体２、８及び７に属するｏｖａｔｅ、ｆｓ８．１及びＳｕｎ。伸長型西洋ナシ形状を与えるＯＶＡＴＥは、植物生長を負に制御するタンパク質をコードしている６。座位ｆｓ８．１は、果実に伸長型のがっしりした形状を与え７、一方、ｓｕｎは果実に伸長型及び先細の形状を与える１,４,８。
【０００５】
座位ｓｕｎは主要なＱＴＬを含んでなり、そして伸長型果実Ｓ．リコペルシクム変種「Ｓｕｎ１６４２」、及び小さな丸形果実野生近縁種Ｓ．ピムピネリフォリウム、アクセッション  ＬＡ１５８９に由来するＦ２集団における伸長型果形に関連する表現型変異の５８％を説明している８。精細マッピングは、ｓｕｎがトマトゲノムの動的領域に存在し、そこで一つの大きな逆位は染色体７の短腕の半分を含んでなり、小スケールの挿入、欠失及び縦列重複がトマトクレイド中の種を区別していることを示している９。３０ｋｂと推定される一つの挿入は、それがＳｕｎ１６４２には存在するがＬＡ１５８９には存在せず、そして果形に関連しているので特に注目に値する９。
【０００６】
例えば、重複、欠失、反転及び転座のようなゲノムの構造変異は、ヒトにおいて一般的であり、これらの変異のいくつかは疾患の根底にある１０−１２。もし構造変異が５００ｂｐ−１ｋｂよりも大きいが、３−５Ｍｂよりも小さな領域を含んでなるならば、それらはコピー数変異体と名付けられる１０,１１。コピー数変異体を生じるゲノム再配列を容易にする分子メカニズムはいばしば未知であるが、非アレル相同的組換えが最も一般に提唱されている。
【０００７】
植物において、コピー数変異体の発生及び程度、及び種内の表現型多様性に影響することに役割を果たす構造変異のこの型の役割は知られていない。植物種内の構造変異についての情報の欠如は、同一種内のアセッションの全ゲノム配列情報の欠如によるものである。
【０００８】
非アレル相同的組換えに加えて、転移したエレメント（element）もゲノムの構造変異を作り出し得る１３,１４。最も注目すべきは、これらの因子が遺伝子中に入り、それによりその機能を不活性化する場合、該転移は表現型の劇的変化を導き得る。実際、宿主遺伝子活性をノックアウトする転移エレメント（transposable elememt ）の能力は、多くの種における機能的分析において広く使用されてきた。
【０００９】
宿主ゲノムのセグメントを内部に有することが発見された、転移エレメントの異常な群が最近発見された。特に注目されるのは、トウモロコシ、イネ及び多くの他の種で発見されたＨｅｌｉｔｒｏｎ及びＰａｃｋ−ＭＵＬＥ  ＤＮＡ転移エレメントである１５−２０。これらのエレメントは、宿主遺伝子及びその周囲の遺伝子断片を運び、ドメイン組み替えを介して、新規のタンパク質及びタンパク質機能を作り出す可能性がある。また、レトロエレメントの特定の型は、宿主遺伝子内へのリード−スルー転写、続いての該エレメント及びその導入されたセグメントのゲノムの他の部分への転移により新規遺伝子を作り出す可能性がある。この型の転位は植物においてしばしばあることではないが、Ｌ１レトロエレメントは、ヒトゲノムの１％までの転移に関係すると考えられている２１。新規機能を発生する能力を有する別のトランスポゾン様機構は、宿主ｍＲＮＡの偶然の逆転写、そして続いてのこれらのｃＤＮＡ分子のゲノム内へのランダム挿入を介するものである。これらのいわゆるレトロ遺伝子のほとんどは非機能性であると一般的に考えられているが、植物及び動物の両方においてかなりの表現型多様性を発生する可能性を有しており２２、進化の間に、遺伝子ファミリー拡大の一つの機構を提供している２３。
【００１０】
しかしながら、新規遺伝子の創出を介して、異なった染色体前後関係にそれらを再位置取りさせることを介してそれらの発現を変化させること、又は宿主遺伝子のサイレンシングに関与するスモールインターフェリングＲＮＡを発生させることによる１３,１４,２４、表現型変異の基礎となる転移エレメントのこれらの後者の型の潜在力にもかかわらず、転移のこれらの型の直接的結果としての、表現型における変化の文書化された例は存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Brewer, M. T., Moyseenko, J. B., Monforte, A. J. & van der Knaap, E. Morphological variation in tomato: a comprehensive study of quantitative trait loci controlling fruit shape and development. J Exp Bot 58, 1339-1349 (2007).
【非特許文献２】Grandillo, S., Ku, H. -M. & Tanksley, S. D. Characterization of fs8 1, a major QTL influencing fruit shape in tomato. Mol Breeding 2, 251-260 (1996).
【非特許文献３】Ku, H. M., Doganlar, S., Chen, K. Y. & Tanksley, S. D. The genetic basis of pear- shaped tomato fruit. Theor Appl Genet 99, 844-850 (1999).
【非特許文献４】Van der Knaap, E., Lippman, Z. B. & Tanksley, S. D. Extremely elongated tomato fruit controlled by four quantitative trait loci with epistatic interactions. Theor Appl Genet 104, 241-247 (2002).
【非特許文献５】Van der Knaap, E. & Tanksley, S. D. The making of a bell pepper-shaped tomato fruit: identification of loci controlling fruit morphology in Yellow Stuffer tomato. Theor Appl Genet 107, 139-147 (2003).
【非特許文献６】Liu, J., Van Eck, J., Cong, B. & Tanksley, S. D. A new class of regulatory genes underlying the cause of pear-shaped tomato fruit. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 13302-13306 (2002).
【非特許文献７】Ku, H. M., Grandillo, S. & Tanksley, S. D. fs8.1, a major QTL, sets the pattern of tomato carpel shape well before anthesis. Theor Appl Genet 101, 873-878 (2000).
【非特許文献８】Van der Knaap, E. & Tanksley, S. D. Identification and characterization of a novel locus controlling early fruit development in tomato. Theor Appl Genet 103, 353-358 (2001).
【非特許文献９】Van der Knaap, E., Sanyal, A., Jackson, S. A. & Tanksley, S. D. High-resolution fine mapping and fluorescence in situ hybridization analysis of sun, a locus controlling tomato fruit shape, reveals a region of the tomato genome prone to DNA rearrangements. Genetics 168, 2127-2140 (2004).
【非特許文献１０】Feuk, L., Marshall, C. R., Wintle, R. F. & Scherer, S. W. Structural variants: changing the landscape of chromosomes and design of disease studies. Hum Mol Genet 15 Spec No 1, R57-66 (2006).
【非特許文献１１】Sharp, A. J., Cheng, Z. & Eichler, E. E. Structural variation of the human genome. Annu Rev Genomics Hum Genet 7, 407-442 (2006).
【非特許文献１２】Redon, R. et al. Global variation in copy number in the human genome. Nature 444, 444-454 (2006).
【非特許文献１３】Bennetzen, J. L. Transposable elements, gene creation and genome rearrangement in flowering plants. Curr Opin Genet Dev 15, 621-627 (2005).
【非特許文献１４】Morgante, M., De Paoli, E. & Radovic, S. Transposable elements and the plant pan- genomes. Curr Opin Plant Biol 10, 149-155 (2007).
【非特許文献１５】Brunner, S., Pea, G. & Rafalski, A. Origins, genetic organization and transcription of a family of non-autonomous helitron elements in maize. Plant J 43, 799-810 (2005).
【非特許文献１６】Hoen, D. R. et al. Transposon-mediated expansion and diversification of a family of ULP-like genes. Mol Biol Evol 23, 1254-1268 (2006).
【非特許文献１７】Holligan, D., Zhang, X., Jiang, N., Pritham, E. J. & Wessler, S. R. The transposable element landscape of the model legume Lotus japonicus. Genetics 174, 2215-2228 (2006).
【非特許文献１８】Jiang, N., Bao, Z., Zhang, X., Eddy, S. R. & Wessler, S. R. Pack-MULE transposable elements mediate gene evolution in plants. Nature 431, 569-573 (2004).
【非特許文献１９】Morgante, M. et al. Gene duplication and exon shuffling by helitron-like transposons generate intraspecies diversity in maize. Nat Genet 37, 997-1002 (2005).
【非特許文献２０】Xu, J. H. & Messing, J. Maize haplotype with a helitron- amplified cytidine deaminase gene copy. BMC Genet 7, 52 (2006).
【非特許文献２１】Pickeral, O. K., Makalowski, W., Boguski, M. S. & Boeke, J. D. Frequent human genomic DNA transduction driven by LINE-I retrotransposition. Genome Res 10, 411-415 (2000).
【非特許文献２２】Wang, W. et al. High rate of chimeric gene origination by retroposition in plant genomes. Plant Cell 18, 1791-1802 (2006).
【非特許文献２３】Kong, H. et al. Patterns of gene duplication in the plant SKPl gene family in angiosperms: evidence for multiple mechanisms of rapid gene birth. Plant J 50, 873-885 (2007).
【非特許文献２４】Feschotte, C. & Wessler, S. R. Treasures in the attic: rolling circle transposons discovered in eukaryotic genomes. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 8923-8924 (2001).
【発明の概要】
【００１２】
一つの広範な側面において、特定の化合物、それらを製造するための方法、及び植物の形態を変化させるための方法が本明細書において提供される。特定の側面において、遺伝子の重複及び再位置取りが、トマトにおいて観察される新規果形表現型を即座に生じる、異常なそして複雑なレトロ転位仲介事象が本明細書において提供される。
【００１３】
広範な側面において、本明細書に記載した少なくとも一つのポリヌクレオチドを発現するトランスジェニック植物が本明細書において提供され、ここで該トランスジェニック植物の少なくとも一部は非トランスジェニック植物又は野生型植物と比較して改変された形質を有する。
【００１４】
別の広範な側面において、該改変された形質は：ホルモンレベルに対する感受性：植物の少なくとも一部の改変された形状：改変された植物サイズ：改変された葉形：改変された野菜形状：改変された果形；少なくとも部分的な単為結実果実（parthenocarpic fruit）：増加したＳＵＮレベル及び減少したＳＵＮレベル、の一つ又はそれ以上である。また、ある態様において、該改変された形質は、単離されたポリヌクレオチドの一つの少なくとも一部の過剰発現であり、該改変された形質は単為結実果実を含んでなる。また、ある態様において、該改変された形質は、単離されたポリヌクレオチドの一つの少なくとも一部の過剰発現であり、該改変された形質は伸長した果形を含んでなる。
【００１５】
別の広範な側面において、非遺伝子導入又は野生型と比較して改変された形質を有するトランスジェニック植物を生産するための方法が本明細書において提供される。
別の広範な側面において、天然に存在する果実と異なっている形状を有する少なくとも一つの果実を有する植物を作製するための方法が本明細書において提供され、該方法は、該果実の準同質遺伝子系統内にＳＵＮインバーテットリピート構築物を導入して形質転換すること、そして該植物を生長させることを含んでなる。
【００１６】
別の広範な側面において、本明細書に記載した植物の果実を含んでなる食物及び食物製品が本明細書において提供される。別の側面において、Ｓｕｎ１６４２バックグラウンドを含んでなる準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）が本明細書において提供される。別の側面において、ＬＡ１５８９バックグラウンドを含んでなる準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）が本明細書において提供される。別の側面において、ＩＱＤ１２、ＳＤＬ１様、ＨＹＰ１、及びＨＹＰ２の最初の４１５アミノ酸をコードするヌクレオチドを含有する１７．２ｋｂ  ｐＨＸ２構築物が本明細書において提供される。別の側面において、ＩＱＤ１２及びＳＤＬ１様終止コドンの上流１８０ヌクレオチドを含有する１．４ｋｂ  ｐＨＸ４構築物が本明細書において提供される。
【００１７】
別の広範な側面において、植物の葉及び果形の少なくとも一つを変化させるための方法が本明細書において提供され、植物にポリペプチドを導入すること及び発現させることを含んでなり、該ポリペプチドを発現させることは、本明細書に記載したポリペプチドの少なくとも一つを発現しない植物と比較し、葉及び／又は果実の形状を変化させる。
【００１８】
別の広範な側面において、本明細書に記載した少なくとも一つのポリペプチドを含んでなるベクターで形質転換された単離された宿主細胞が本明細書において提供される。
別の広範な側面において、植物の再生能力を増加させるための法が本明細書において提供され、該方法は、植物の細胞中で本明細書に記載した少なくとも一つのポリペプチドを発現させる工程を含んでなる。
【００１９】
別の広範な側面において、植物の少なくとも一つの形質を変化させるための剤が本明細書において提供され、該剤は本明細書に記載した少なくとも一つのポリペプチド又は活性成分としてそれらのベクターを含んでなる。
【００２０】
別の広範な側面において、変化した形状を有する果実を産生する植物細胞の能力を決定するための方法が本明細書において提供され、該方法は、本明細書に記載した少なくとも一つのポリペプチド、又は植物細胞においてそれらにより発現されるタンパク質を検出することを含んでなる。
【００２１】
別の広範な側面において、変化した形状を有する果実を産生する植物細胞の能力を決定するための方法が本明細書において提供され、該植物細胞中のポリペプチドの発現を決定することを含んでなる。
【００２２】
別の広範な側面において、変化した形状を有する果実を産生する植物細胞の能力を改良するための方法が本明細書において提供され、該植物中で本明細書に記載した少なくとも一つのポリペプチドの発現により産生される少なくとも一つのタンパク質の活性を調節することを含んでなる。
【００２３】
本発明の種々の目的及び利点は、付随する図面を照らし合わせて読み取ると、以下の好ましい態様の詳細な説明から、当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
本発明を、単に例示を目的として、添付の図面を参考にしながらここに説明する。ここで図面が具体的に参考にされるが、示されている詳細は、本発明の好ましい態様の例示的議論の目的のためのみであり、何が最も有用であるべきと信じられているか、及び本発明の原理及び概念的側面の説明を容易に理解するために示されていることが強調される。この点に関し、本発明の基本の理解に必要であるより詳細には、本発明の多様な側面を示す試みは成されておらず、図と共に行われる説明は、どのように本発明のいくつかの形態を実際に具体化するかを、当業者に明らかにしている。
【００２５】
本特許出願は、カラーで作成されている少なくとも一つの図を含む。カラーの図を含む本特許のコピーは、依頼及び必要な料金の支払い後、本特許商標事務所により提供されるであろう。
配列表は、本発明の例示的ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を提供する。該配列の使用に関連する形質は実施例に含まれている。
【図１−１】図１Ａ−１Ｃは、高分解能精細マッピングがｓｕｎを染色体７上の３０ｋｂ領域に位置づけたことを示す。
【００２６】
図１Ａは、遺伝子マッピング及び精細マッピングによりｓｕｎが二つのマーカーＬｐ８１Ｂ９−Ｆ及びＬｐ６１０２−Ｆ間の０．２ｃＭ間隔に位置していることを示す。垂直の赤い（厚い）バーは、ｓｕｎ座位を規定している。
【００２７】
図１Ｂは、該領域に広がるバクテリオファージλクローンを使用した、ｓｕｎ座位の物理地図を示す。上の部分は、Ｓ．リコペルシクムＳｕｎ１６４２ゲノムの物理地図を示し、下の部分はＳ．ピムピネリフォリウムＬＡ１５８９ゲノムを示す。物理地図の上及び下の細い線は、ファージクローンを表す。Ｓｕｎ１６４２及びＬＡ１５８９物理地図間の斜めの点線は、Ｓｕｎ１６４２及びＬＡ１５８９間の共直線性を示し、そして２４．３ｋｂ挿入がＬＡ１５８９物理地図に関してどこに起こったかも示す。ｓｕｎを包含する最も小さな領域は赤いバーにより示されており、座位に隣接する組換え限界点により規定された。それ故、ｓｕｎ座位はマーカーＬｐ８１Ｂ９−Ｆ及びＬｐ６１０２−Ｒ間のトマト染色体７の短腕に位置付けされ、組換え限界点が該座位（赤色に示されている（太線））を線引きし、それは２４．３ｋｂ重複に密接に結びつけられている。
【図１−２】図１Ｃは、染色体７ｓｕｎ座位（上)及び染色体１０先祖座位（下）の構造的構成を示す。ＩＱＤ１２（本明細書ではＳＵＮとも称される）は、その先祖位置のＲｉｄｅｒの１ｋｂ上流とは対照的に、転置したコピー中、Ｒｉｄｅｒの２０ｋｂ下流に位置している。転置した２４．３ｋｂセグメントは、ＤＥＦＬ１のイントロン中に着陸した。矢印は、予想遺伝子及び偽遺伝子の方向性を示す。濃い緑の矢印（ＨＹＰｌ、ＨＹＰ２、ＳＤＬ１様）はアプイニシオ予想遺伝子を示し、紫の矢印は再配置されたＩＱＤ１２遺伝子を示し、薄い緑の矢印はレトロエレメントＲｉｄｅｒを示し、そして黄色の矢印（上最初のボックス、第２の矢印、最後の矢印）は偽遺伝子を示す。赤い番号付けされたボックスは、Ｒｉｄｅｒのロングターミナルリピート（ＬＴＲ）を同定し、転写の順序に従って番号付けされている。染色体１０内へのＲｉｄｅｒの本来の挿入により起こされた標的部位重複（ＴＳＤ）は緑の文字で（ＧＡＣＣＴ）である；染色体７内への転置された重複により生じるＴＳＤは青い文字（ＡＴＡＴＴ）である。ＰＰＴ及びＰＰＴ＊は、レトロエレメントの第２の鎖合成に必要とされるポリプリントラクトの位置を示している。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｃは、ｓｕｎが開花後の果形に、用量依存的に影響することを示す。ｓｕｎの効果及び候補遺伝子発現は、ＬＡ１５８９バックグラウンド中のＳｕｎ１６４２アレルの存在及び不存在が異なっている準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）を使用して決定した。ｓｕｎで異なっている準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）は、授粉後５日の若い発育中の果実の果形に大きな相違を示す。これらの果実において、ＩＱＤ１２は、染色体７上のその新規位置での増加した発現のため、卵形果実においてより高いレベルで発現される。
【００２８】
図２Ａは、開花１０日前、開花時及び開花５日後の、伸長型ホモ接合体Ｓｕｎ１６４２（ｅｅ）遺伝子型及び丸型ホモ接合体ＬＡ１５８９（ｐｐ）遺伝子型からの代表的子房を示す。スケールバー；開花前、開花及び開花後の像について、それぞれ１００μｍ、５００μｍ及び５００μｍ。
【図２−２】図２Ｂは、器官長の器官幅に対する比を計算することにより決定された子房形状指標が開花１０日前では非常に類似していることを示す（ｐ＝０．６４、ｎ＝１０、遺伝子型当たりの子房）。開花時、ＮＩＬの子房形状指標は、たとえ小さくても有意差があり（ｐ＝０．０４、遺伝子型当たり、植物当たり８子房の植物ｎ＝５）、一方、果形指標は開花５日後、高度に有意な相違であった（Ｐ＜０．０００１、遺伝子型当たり、植物当たり６〜８子房の植物ｎ＝５）。
【００２９】
図２Ｃは、ｓｕｎでの５つの候補遺伝子のノーザンブロット分析を示す。総ＲＮＡは、図２Ａに示された同一発生段階の各遺伝子型の５植物の、プールされた組織から単離された。候補遺伝子の断片をノーザンブロットへ連続的にハイブリダイズさせた。ｅＩＦ４ａ６についてのシグナルが、ＲＮＡ添加対照として働いた。「前」、開花１０日前に採取された組織；「開花」、開花時に採取された組織；「後」、開花５日後に採取された組織。
【図２−３】図２Ｄは、ＩＱＤ１２及びＤＥＦＬ１転写レベルがアレル特異的及び量依存性であり、そして成熟段階果形指標と相関したことを示す。Ｓｕｎ１６４２アレルの０、１又は２コピーを有する成熟ＬＡ１５８９果実の果形指標は、グラフの上に示した。遺伝子型当たりのＩＱＤ１２及びＤＥＦＬ１の平均相対的転写レベルは、ｅＩＦ４ａ６発現レベルに基準化することにより決定し、各遺伝子型の５つの個々の植物から授粉５日後に採取した果実について計算した（ノーザンブロットは、図９Ａに示されている）。エラーバーは標準偏差を示す。記号表示「ｅｅ」は ホモ接合体Ｓｕｎ１６４２；「ｐｐ」はホモ接合体ＬＡ１５８９；「ｅｐ」はヘテロ接合体を示す。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｆは、トマト果形がＩＱＤ１２の増加した転写により制御されていることを示す。
【００３０】
図３Ａは、ｓｕｎを補足するために使用した二つのゲノム構築物間の物理的関係を示す。ゲノム領域の特徴は、図１Ｃに記載した。１７．２ｋｂ  ｐＨＸ２構築物は、ＩＱＤ１２、ＳＤＬ１様、ＨＹＰ１及びＨＹＰ２の最初の４１５アミノ酸をコードするヌクレオチド（残基４１６−４８７はこの構築物では欠失されている）を含有する。１．４ｋｂ  ｐＨＸ４構築物は、ＩＱＤ１２及びＳＤＬ１様終止コドンの上流１８０ヌクレオチドで終結している。構築物ｐＨＸ２はＤＥＬＦ１メチオニン開始コドンの−１１８４まで広がっており、一方、ｐＨＸ４はＤＥＬＦ１メチオニン開始コドンの−４４０７まで広がっている。
【００３１】
図３Ｂは、丸型果実ＬＡ１５８９遺伝子型内への該ゲノム構築物の形質転換は、ｐＨＸ２で形質転換した系統と比較し、ｐＨＸ４で形質転換したＴ１植物においてより高いレベルでＩＱＤ１２が発現されたことを示す。総ＲＮＡは、個々の形質転換された植物から５ｄｐａに集められた数個の果実から単離された。ノーザンブロットフィルターは、ＩＱＤ１２及び添加の基準化のためのｅＩＦ４ａ６の３２Ｐ−標識プローブとハイブリダイズさせた。
【図３−２】図３Ｃは、Ｔ１系統の果形指標はＩＱＤ１２転写レベルと有意に相関することを示す（ピアソン係数  ｒ＝０．８３３、Ｐ＜０．０００１）。
【００３２】
図３Ｄは、５つの独立したｐＨＸ４一次形質転換体から誘導されたホモ接合体Ｔ２植物の果形指標及びＩＱＤ１２転写レベルを示す。２〜５のホモ接合体Ｔ２植物が、自家受粉ｐＨＸ４一次形質転換体から同定された。ホモ接合性は、カナマイシン耐性遺伝子の存在について、Ｔ３種子の子孫試験により確認した。平均果形指標（カラム）及びＩＱＤ１２転写レベル（線）は、図１０Ｂに示されているノーザンブロットデータから決定した。バーは標準偏差を示す。比較のため、ＬＡ１５８９バックグラウンドの各相互ＮＩＬの４つの植物を、ＩＱＤ１２転写レベル及び果形指標比較のためにＴ２導入遺伝子ファミリーに含ませた。丸形果実を通常運ぶ系統におけるＩＱＤ１２の構成的発現は、非常に伸長した果実を導く。逆に、伸長型果実を通常運ぶ系統におけるＩＱＤ１２発現の下方調節は、丸形果実を導く。これらの結果は結論的に、ＩＱＤ１２はトマト果形を調節するために必須であり且つ十分であることを示しており、そしてそれ故ＳＵＮの根底をなしている。
【図３−３】図３Ｅは、丸形果実ＬＡ１５８９バックグラウンド中のＩＱＤ１２の構成的過剰発現は、非常に伸長した果実を生じることを示す。各果実は、Ｐ３５Ｓ：ＩＱＤ１２構築物で独立して形質転換された植物から採取された。非形質転換丸形ＮＩＬ（ＬＡ１５８９ｐｐ）からの果実が比較のため示されている。
【００３３】
図３Ｆは、伸長果実ＮＩＬ（ＬＡ１５８９ｅｅ）におけるＩＱＤ１２のＲＮＡｉ仲介ノックダウンは、果実伸長の有意な減少を起こすことを示す。各果実は、独立した一次の形質転換されたＲＮＡｉ系統を表す。非形質転換ＮＩＬ（ＬＡ１５８９ｅｅ）からの果実が比較のため示されている。（図３Ｅ）及び（図３Ｆ）のスケールバーは１ｃｍを示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｂは、ＳＵＮが植物特異的ＩＱＤファミリーのメンバーであることを示す：  図４Ａは、ＳＵＮ、ＩＱＤ１１及びＡｔＩＱＤ１２タンパク質で予想されたモチーフを示す。保存領域を同定するため、全ＩＱＤファミリーをＭＥＭＥ４８モチーフ予測プログラムにかけた。ｐ＜１．０ｅ−５を有するモチーフのみがここに示されている。モチーフは、以前に報告されている通りに番号付けする２６。イントロン位保存は連結波線で示されている。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＳＵＮ及びその最も近い関連物の系統発生関係を示す。ＩＱ６７モチーフのブートストラップ系統樹（無根）は、Clustal X (1.83)及び近隣結合法を使用した完全配列アライメント後に発生させた。シロイヌナズナ(Arabiodopsis)タンパク質ＡｔＩＱＤ１１及びＡｔＩＱＤ１２は、それぞれＡｔ５Ｇ０３９６０及びＡｔ５Ｇ１３４６０として同定された。他のアクセッションは、それらのＧｅｎＢａｎｋ、ＳＧＮ（Solanaceae Genomics Network）、又はＪＧＩ（「eugene3.00160363」  （http://genome.jgi- psf.org/Poptrl_l/Poptrl_l. home.html)）番号、及び属及び種を意味する接頭辞により同定した。Ｂｒ、ブラシカ・ラパ（Brassica rapa）亜種チネンシス（chinensis）（チンゲンサイ）；Ｇｈ、ゴシピウム・ヒルスツム（Gossypium hirsutum）（リクチワタ）；Ｈａ、ヘリアンサス・アンヌス（Helianthus annuus）（ヒマワリ）；Ｌｓ、ラクツカ・サチバ（Lactuca sativa）（レタス）；Ｎｔ、ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）（タバコ）；Ｐｔ、ポピュラス・トリコカルパ（Populus trichocarpa）（黒ハコヤナギ）；Ｓｌ、ソラリウム・リコペルシクム（Solarium lycopersicum）（トマト）；Ｓｔ、ソラリウム・ツベロスム（Solarium tuberosum）（ジャガイモ）；Ｖｖ、ビチス・ビニフェラ（Vitis vinifera）（バイングレープ）。結節点の数字は、１０００試行からのブートストラップ値を表す。５００以下の値は報告されていない。ＳＵＮに密接に関連しているタンパク質を含有するＩＱＤは、単子葉植物においては同定されなかった。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｃは、他のトマト種におけるｓｕｎ座位の存在を示す。
【００３４】
図５Ａは、他の栽培変種におけるｓｕｎの分離の遺伝子分析を示す。Ｆ２集団は、ＬＡ１５８９及び図５Ｂに示したサザンブロットのレーン上に示した栽培変種間の交雑から誘導された。ｃｏｓ１０３Ｒ（図１３−表４を参照されたい）を使用したマーカー補助選択を介し、１０のホモ接合体リコペルシクム、１０のホモ接合体ピムピネリフォリウム及び１０のヘテロ接合体実生が同定され、成熟するまで生長させた。植物当たり８つの果実の平均果形指標が決定され、形状及び遺伝子型の有意な相関は、０．０１のαでのDuncanのmultiple range test 及びＡＮＯＶＡにより決定した。「＋」は、ｓｕｎでの、果形及び遺伝子型間の有意な相関を示し；「−」は相関の欠如を示す。ｏｖａｔｅアレルはゲノムＤＮＡから増幅し、ｄＣＡＰＳマーカーとして分析した（図１３−表４）。「＋」は、ｏｖａｔｅの西洋ナシ型アレルの存在を示し；「−」は、ｏｖａｔｅの丸形アレル（即ち、野生型）の存在を示す。平均果形指標は、マーカースコアの下及びサザンブロットレーンの上に示した。
【００３５】
図５Ｂは、ｓｕｎで分離するすべてのＳ．リコペルシクム系統は４．３ｋｂ  ＥｃｏＲＶ制限断片を有することを示す。サザンブロットは、ＥＰ４５及びＥＰ４６プライマーを使用してファージクローンＥＫ３６から増幅されたＰ３２標識断片とハイブリダイズさせた（図１３−表４参照）。この４．３ｋｂ  ＥｃｏＲＶ断片は重複、そしてそれ故にｓｕｎの存在を示す。HG, Howard German; BL, Banana Legs; LJ, Long John; JD, Jersey Devil; Roma, Roma VF; YS, Yellow Stuffer; H1706, Heinz 1706 。
【図５−２】図５Ｃは、ＳＵＮ遺伝子が、染色体７上に転置したセグメントを含有するトマト種において高度に発現されることを示す。４．３ｋｂ断片を有するすべてのＳ．リコペルシクム品種は高レベルでＳＵＮを発現し、一方、転置した重複がない品種においては発現が検出不能であった。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｅは、ｓｕｎ座位でのセグメント重複及び再構成のモデルを示す：  図６Ａは、染色体１０上の先祖座位のゲノム構造を示す。薄い緑のヌクレオチド配列（ＧＡＣＣＴ）は、Ｒｉｄｅｒに隣接する標的部位重複を表す。
【００３６】
図６Ｂは、染色体１０上のＲｉｄｅｒによるリード−スルー転写及びテンプレートスイッチを示す。ゲノム構造の上の赤い線及びループは、２４．３ｋｂレトロエレメントＲＮＡの形成を示す。赤のヌクレオチド（ＧＣＡＧＡ）は、テンプレートスイッチについての提案された部位を示す。染色体７上のｓｕｎ座位の配列分析は、自律性ＬＴＲレトロエレメントＲｉｄｅｒの調節下の転位仲介事象を介して、２４．３ｋｂセグメントが染色体１０から複製されることを明らかにした。Ｒｉｄｅｒの転写、リード−スルー及び３’ 形質導入、テンプレートスイッチ続いての転位は、レトロエレメントからより遠くにＩＱＤ１２を再配置する。染色体７上の別のゲノム状況（ＤＥＦＬ１のプロモーターの近傍）に転位配置されたＩＱＤ１２は、その機能が転位により無効にされた遺伝子である。
【図６−２】図６Ｃは、一つの大きなレトロエレメントの形成を示す。
【００３７】
図６Ｄは、青で示されているヌクレオチド部位（ＡＴＡＴＴ）での、染色体７内へのＲｉｄｅｒの組込みを示す。
図６Ｅは、標的部位重複（青文字ヌクレオチド、ＡＴＡＴＴ）を特色とする染色体７上のｓｕｎ座位の構造を示す。矢印は遺伝子の転写の方向を表す。黒い遺伝子矢印（ＨＹＰｌ、ＨＹＰ２）は発現される及び予測される機能的遺伝子を示し、紫の矢印（ＩＱＤ１２）は再配置された遺伝子を示し、明るい緑の矢印はレトロエレメントＲｉｄｅｒを示し、黄色の矢印（ＳＤＬ１様、ＤＥＦＬ１、右の最後の矢印）は偽遺伝子を示す。１−３で番号付けられている赤いボックスは同一のＲｉｄｅｒ  ＬＴＲを示す。
【図７−１】図７Ａ−７Ｃは、ＬＡ１５８９及びＳｕｎ１６４２準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）における、ＩＱＤ１２及びＤＥＦＬ１遺伝子の量依存性発現を示す：  図７Ａは、ｓｕｎのＳｕｎ１６４２アレルの０、１又は２コピーを有する、ＬＡ１５８９バックグラウンドのＮＩＬからのＲＮＡのノーザンブロットを示す。レーン上の植物番号は、植物番号「６」などについての系統０６Ｓ５５９−６に対応する。
【００３８】
図７Ｂは、ｓｕｎのＳｕｎ１６４２アレルの０、１又は２コピーを有する、Ｓｕｎ１６４２バックグラウンドのＮＩＬからのＲＮＡのノーザンブロットを示す。レーン上の植物番号は、植物番号「５」などについての系統０６Ｓ２２−５に対応する。
【図７−２】図７Ｃは、Ｓｕｎ１６４２バックグラウンドにｓｕｎのＳｕｎ１６４２アレルの０、１又は２コピーを有する系統における、ｅＩＦ４ａ６発現に基準化されたＩＱＤ１２及びＤＥＦＬ１の平均相対的転写レベルを示しているグラフを示す。グラフに示されているデータは図９Ｂに示したノーザンブロットからのものである。エラーバーは標準偏差を表す。グラフの上に示された平均成熟段階果形指標は、栽培種バックグラウンドにおける伸長した果形の程度がＩＱＤ１２の転写レベルと相関し、ＤＥＦＬ１の転写レベルとは逆相関していることを示している。総ＲＮＡは、レーンの上に示されている６〜１０の個々の植物の開花５日後（ｄｐａ）果実から単離した。サイズ分画したＲＮＡはHybond N メンブランに移し、放射性標識トマトＩＱＤ１２、ＤＥＦＬ１及びｅＩＦ４ａ６プローブに連続的にハイブリダイズさせた。記号「ｅｅ」はｓｕｎでのＳｕｎ１６４２アレルの２コピー；「ｐｐ」はｓｕｎでのＬＡ１５８９アレルの２コピー；「ｅｐ」は各親アレルの１コピーを示す。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｃは、５つのｐＨＸ４遺伝子導入Ｔ１由来Ｔ２ファミリーにおけるＩＱＤ１２発現のノーザンブロットを示す。発現分析は、開花後（ｄｐａ）５日目に、６〜１０の果実から単離された総ＲＮＡで実施した。ホモ接合体トランスジェニック植物は、図１０−表１に示されているヘミ接合性ｐＨＸ４  Ｔｌ系統の自家受粉子孫から同定した。選択はサザンブロットのシグナル強度に基づいており、これらのＴ２植物の各々からの４８のＴ３子孫において、ＰＣＲを介したカナマイシン遺伝子の分離を試験することにより確認した。示された各ブロットについては、トランスジェニック植物及びＮＩＬを同一の温室中で同時に生長させ、ならびにＲＮＡ抽出のための組織を同時に採取した。
【００３９】
図８Ａは、ＬＡ１５８９バックグラウンドのＮＩＬの５ｄｐａ果実におけるＩＱＤ１２発現を示しているノーザンブロットを示し、ｐＨＸ４トランスジェニックＴ１系統から誘導された個々のＴ２植物と比較されている。植物は、果実が採取された時に３ヶ月齢であった。ボックスで囲んだ植物番号は、Ｔ２ファミリーの非トランスジェニックシブ（sib）を示す。非トランスジェニック兄妹はより低いＩＱＤ１２発現及びより小さな果形指標を示し、増加したＩＱＤ１２発現及び果形指標の両方がｐＨＸ４導入遺伝子により調節されたことを示している。ファミリー０６Ｓ４９７及び０６Ｓ５００中の植物からのＲＮＡのほとんどは抽出の間に分解していた。
【００４０】
図８Ｂは、５ヶ月齢ではあるが、図８Ａと同一の植物の５ｄｐａ果実におけるＩＱＤ１２発現を示す。図８Ｂで得られた転写レベルは、図３Ｄのグラフで使用した。アステリスク（＊）で印付けられた植物番号は、植物０６Ｓ４９６の９及び０６Ｓ５０１の２２がヘテロ接合性であり、一方、植物番号０６Ｓ５００の８についてはＲＮＡ抽出の間に分解していたため、分析から除外した。図８Ａ及び８Ｂに示された、植物についての果形指標は一度に集めた。
【図８−２】図８Ｃは、２つのトランスジェニックファミリー（０６Ｓ４９７及び０６Ｓ５００）の挿し木が行われたことを示す。植物は、５ｄｐａ果実がＲＮＡ抽出のために採取された時には無性繁殖後３ヶ月であった。ＩＱＤ１２発現はＬＡ１５８９  ＮＩＬ対照の発現と比較した。これらの植物からの果形指標が記録され、ノーザンブロットのレーンの下に示されている。これらの実験の結果は、トランスジェニック的に導入されたＩＱＤ１２の発現の増加は、増加した果形指標を生じることを納得できるように示しており、この遺伝子がＳＵＮをコードすることを強く示唆する。
【図９−１】図９Ａ−９Ｅは、Ｐ３５Ｓ：ＩＱＤ１２及びＲＮＡｉ：ＩＱＤ１２トランスジェニック系統におけるＩＱＤ１２発現を示す：  図９Ａは、ＩＱＤ１２の構成的発現が栽培種（Ｓｕｎ１６４２)及び野生型（ＬＡ１５８９）バックグランドの両方において非常に伸長された果実を導くことを示す。丸型果実系統を、Ｐ３５Ｓ：ＩＱＤ１２で形質転換した。総ＲＮＡは、系統１０９−０１７、−０１９、−０２3及び０２８を除いて、５ｄｐａ果実から抽出した。後者の場合、これらの系統における不規則な果実セットのため、代わりに開花段階の花を使用した。アステリスク（＊）で印を付けたトランスジェニック系統（１００−００２及び１００−００３）は丸型果実Ｓｕｎ１６４２バックグラウンド内に形質転換されたＰ３５Ｓ：ＩＱＤ１２から得られた（重複を欠いている）。欠く系統についての果形指標はノーザンブロットの下に示されている。
【図９−２】図９Ｂは、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター調節下での、伸長した果形及びＩＱＤ１２高発現は、次世代へ伝搬することを示す。ノーザンブロット分析は、レーンの上に示されたＰ３５Ｓ：ＩＱＤ１２  Ｔ２植物の開花段階の花から単離された総ＲＮＡに対して実施した。本質的に種がない、これらの過剰発現系統を維持するため、一次形質転換体１０９−０１７、−０１９、−０２３及び０２８の花粉をＬＡ１５８９雌しべと交雑させた。ＮＤ、決定されていない。ボックスで囲んだ数字は、非トランスジェニックシブを示す。
【図９−３】図９Ｃは、転位したセグメントを運んでいるＬＡ１５８９  ＮＩＬ中のＩＱＤ１２のＲＮＡノックダウンが、丸形果実を生じることを示す。ノーザンブロットは、独立した一次トランスジェニック系統の各々からの５ｄｐａ果実中の、減少したＩＱＤ１２転写レベルを示している。各系統についての成熟果形指標はノーザンブロットの下に示されている。
【００４１】
図９Ｄは、ＩＱＤ１２転写レベル及び果形指標の減少がＴ２世代に遺伝可能であることを示す。ノーザンブロットは、ＩＱＤ１２転写レベルをノックダウンした２つのトランスジェニックファミリーと比較された、非形質転換ＮＩＬ（最初の６レーン；レーン０７Ｓ２７及び０７Ｓ２６）におけるＩＱＤ１２転写レベルを示す。総ＲＮＡは、各植物の５ｄｐａ果実から単離された。ボックスで囲んだ数字は、非トランスジェニックシブを示す。
【図９−４】図９Ｅは、ＩＱＤ１２発現を下方調節した７つの独立したＴ２ファミリーと比較した、ＮＩＬ中の成熟果形指標及びＩＱＤ１２転写レベルを示しているグラフを示す。ＩＱＤ１２転写レベルの減少は、成熟果形指標の減少を導く。トランスジェニック植物中のＩＱＤ１２の転写レベルは、ｅＩＦ４ａ６の転写レベルに対して基準化され、そしてｓｕｎのＳｕｎ１６４２アレルを運んでいるＮＩＬのレベル（「１」と設定された）に対して相対的に表現された。０．９７の果形指標値に設定された点線は、トランスジェニックＩＱＤ１２ノックダウン系列と非形質転換ＮＩＬの系列の比較を容易にするために引かれた。ＢａｒＳカラムのテータは、トランスジェニックＴ２子孫で分離した６の非トランスジェニックシブ植物からプールされた。非トランスジェニックシブ植物は３つのファミリー（１つは０７Ｓ２１から、１つは０７Ｓ２３から、０７Ｓ２４の４つ）に由来する。
【図１０】図１０は、丸型果実ＬＡ１５８９バックグラウンドの選択された形質転換体の成熟果形指標、ＩＱＤ１２転写レベル及び子孫試験をリストしている表１を示す。
【図１１】図１１は、ｓｕｎのＬＡ１５８９アレルを運んでいる丸型果実Ｓｕｎ１６４２バックグラウンドのｐＨＸ２及びｐＨＸ４一次形質転換体の成熟果形指標をリストしている表２を示す。
【図１２】図１２は、ＩＱＤ１２を過剰又は過少発現する植物の果形指標をリストしている表３を示す。
【図１３】図１３は、本明細書に記載した実施例で使用されるプライマー［配列番号１４〜１４］をそれぞれ現れる順にリストしている表４を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｃは、異なった組織におけるＳＵＮの発現を示す：  図１４Ａは、ｓｕｎ座位の遺伝子構造を示す。ＳＵＮを含む２４．７ｋｂ重複は、ＤＥＦＬ１の発現を破壊する。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、花器組織におけるＳＵＮ及びＤＥＦＬ１の発現を示す。ノーザンブロットは開花時の花器組織から単離されたＲＮＡを含有している。該ブロットはＳＵＮ、ＤＥＦＬ１及び最後に添加対照としてｅＩＦ４ａ−６と連続的に探索した。Ｓｅ、萼片；Ｐｅ、花弁；Ｓｔ、雄しべ；Ｏｖ、子房。組織は、ｓｕｎ座位が異なるＬＡ１５８９及びＳｕｎ１６４２  ＮＩＬから単離された。ｅｅ、ＳＵＮの追加のコピーを含有する；ｐｐ、ＳＵＮの追加のコピーを欠く。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、異なった組織におけるＳＵＮ及びＤＥＦＬ１の発現を示す。組織は、ｓｕｎ座位が異なるＬＡ１５８９及びＳｕｎ１６４２  ＮＩＬから単離された。ｅｅ、ＳＵＮの追加のコピーを含有する；ｐｐ、ＳＵＮの追加のコピーを欠く。Ｒ、根；Ｈ、胚軸；Ｃ、子葉；Ｌ、葉；Ｓ、生長点。重複を運んでいる系統において、ＳＵＮは萼片、子房、胚軸及び生長点で高度に発現された。先祖のＳＵＮ遺伝子は根及び低レベルで他の組織に発現される。ＤＥＦＬ１は、２４．７ｋｂ重複を欠く植物（ｐｐ、ＳＵＮの追加のコピーを欠いている）においてＳＵＮの重複コピーと同一の組織で発現される。このことは、ＤＥＦＬ１のプロモーターはＳＵＮの重複コピーの発現を駆動していることを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｃ：トマトの花及び果実発育間の果形指標及びＳＵＮ発現変化：  図１５Ａは、開花後日数の関数としての果形指標（長さ／幅比）を示す。果形変化は、グラフの上に示された果実／種子発育ランドマークと重ね合わさっている。黒三角は、ＳＵＮ遺伝子の２つのコピーを運んでいる準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）の果形指標を表し、一方、灰色の丸は、ＳＵＮの１つのコピーのみを有するＮＩＬを表す。果形指標における最も大きな相違は、果実ランドマーク３及び４で達し、ランドマーク４〜１６細胞胚及び球状胚段階と一致している。果形指標は、各ゲノム型について５で植物当たり３つの花序から集められた。示されているデータは平均±標準誤差である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＬＡ１５８９  ＮＩＬの発育中の果実におけるＳＵＮ発現を示す。ノーザンブロットを、ＬＡ１５８９ｅｅ（ＳＵＮ遺伝子の２つのコピーを運んでいる）及び  ＬＡ１５８９ｐｐ（ＳＵＮの１つのコピーを運んでいる）について実施した。総ＲＮＡは、遺伝子型当たり５つの植物のプールされた組織から抽出し、ハイブリダイゼーションをプローブとしてＳＵＮを用いて実行した。ＳＵＮ発現は、開花から始まって開花２０日後まで非常に高かった。その発現は果実の熟成及び種子発芽段階に先だった開花２５日後に劇的に低下した。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ＬＡ１５８９  ＮＩＬの花出芽におけるＳＵＮ発現を示す。ノーザンブロットは、レーンの上に示した時点（日数）での全花又は芽から単離された総ＲＮＡに対して実施した。「０」時点は開花を示し、他の値は開花前（−）又は後（＋）の日数である。ＳＵＮの２つのコピーを運んでいる系統（ＬＡ１５８９ｅｅ）において、ＳＵＮの発現は開花２日前には低いが、授粉２日後までに劇的に増加する。ＳＵＮ発現の増加は、図１５Ａに示されている果形指標の変化に先立っている。ＳＵＮの１つのコピーを運んでいる系統（ＬＡ１５８９ｐｐ）においては、ＳＵＮ発現は低いが、しかしながら、ＬＡ１５８９ｐｐにおけるＤＥＦＬ１発現はＬＡ１５８９ｅｅにおけるＳＵＮ発現と類似の動態学をたどり、ＤＥＦＬ１プロモーターがＳＵＮ発現を駆動することを示している（図１５も参照されたい）。
【図１６】図１６Ａ−１６Ｂ：小葉形状に対するＳＵＮの影響：  図１６Ａは、栽培種トマトの小葉を示す。
【００４２】
図１６Ｂは、野生近縁種Ｓ．ピムピメリフォリウム  アクセッションＬＡ１５８９の小葉を示す。示された葉は、ＳＵＮの追加のコピーを有しない（ｐｐ）、ＳＵＮの追加のコピーを有する（ｅｅ）又はＳＵＮが構成的３５Ｓプロモーター下で発現された（ｏｘ）植物からのものである。最も注目すべき特色は、ＳＵＮが発現された場合の先がとがった葉の形状及び増加した鋸歯状の縁である（ｐｐとｅｅを比較されたい）。これらの特色は、ＳＵＮが過剰発現された場合に顕著である（ｅｅとｏｘを比較されたい）。これらの結果は、果形に加え、葉形も同様に劇的に変化することを示す。
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｆは、トマトの子房、果実及び複葉葉形に対するＳＵＮの過剰発現の影響を示す。
【００４３】
図１７Ａ〜１７Ｂは、Ｓ．ピムピメリフォリウムＬＡ１５８９バックグラウンドを示す。野生型（ＬＡ１５８９ｐｐ）及び５つの独立した形質転換体の開花段階の花の子房形状（図１７Ａ）、及び果形（図１７Ｂ）。子房の非常に伸長した細長い形状、果実及び葉のねじれた形状に注目されたい。
【図１７−２】図１７Ｃは、Ｓ．ピムピメリフォリウムＬＡ１５８９バックグラウンドを示す。野生型（ＬＡ１５８９ｐｐ）及び５つの独立した形質転換体の開花段階の複葉葉形（図１７Ｃ）。子房の非常に伸長した細長い形状、果実及び葉のねじれた形状に注目されたい。  図１７Ｄは、Ｓ．リコペルシクムＳｕｎ１６４２バックグラウンドを示す。野生型（Ｓｕｎ１６４２ｐｐ）及びいくつかの独立した形質転換体の開花段階の花の子房形状（図１７Ｄ）。ＳＵＮが３５Ｓプロモーターの調節下で過剰発現された場合、果形は開花時にすでに決定されている。さらに、小葉及び複葉葉形は、ＳＵＮが過剰発現された時点ですでに非常に影響されている。葉はねじれており、そして小葉はより先がとがった形状である。
【図１７−３】図１７Ｅ〜１７Ｆは、Ｓ．リコペルシクムＳｕｎ１６４２バックグラウンドを示す。野生型（Ｓｕｎ１６４２ｐｐ）及びいくつかの独立した形質転換体の開花段階の果形（図１７Ｅ）及び複葉葉形（図１７Ｆ）。ＳＵＮが３５Ｓプロモーターの調節下で過剰発現された場合、果形は開花時にすでに決定されている。さらに、小葉及び複葉葉形は、ＳＵＮが過剰発現された時点ですでに非常に影響されている。葉はねじれており、そして小葉はより先がとがった形状である。
【図１８−１】図１８Ａ〜１８Ｃは、ｓｕｎが異なるＬＡ１５８９  ＮＩＬ果実の縦方向の細胞サイズ及び数の相違を示す：  図１８Ａは、開花５日後での果実の異なった部分の長さを示す。すべての果実部分は、ＳＵＮの存在下でより伸長される。
【００４４】
図１８Ｂは、細胞サイズは果実の遠位末端でのみ有意に異なっていることを示す。
【図１８−２】図１８Ｃは、果実長と細胞サイズの比は、果実の中隔及び近位末端は有意により多くの細胞を有することを示す。
【図１９−１】図１９Ａ〜１９Ｃは、ｓｕｎが異なるＬＡ１５８９  ＮＩＬの横方向の細胞サイズ及び数の相違を示す：  図１９Ａは、授粉５日後の果実の幅を示す。全果実及び中隔幅は、ＳＵＮ重複を運んでいるＮＩＬにおいて有意に小さいことを示す。
【図１９−２】図１９Ｂは、中隔中の細胞数はＳＵＮ重複を運んでいるＮＩＬにおいて有意に少ないことを示す。
【００４５】
図１９Ｃは、細胞サイズが中隔又は果皮において有意に差がないことを示す。図１８及び１９に示されている結果は、ＳＵＮが、果実の中隔及び近位末端において、方向性細胞分割を主に調節していることを示す。ＳＵＮの高発現は、増加した細胞分割を縦方向に導き、そして横方向の細胞分割を減少させる。このことは、該遺伝子がどこで又はいつ発現されるかに依存し、ＳＵＮが任意の植物種において任意の器官の形状に影響し得ることを示唆する。
【図２０】図２０は、Ｓ．リコペルシクムｃｖ  Ｓｕｎ１６４２ｐｐ（ＳＵＮ重複がなく、丸形果実を有する）及びＳＵＮを過剰発現させたＳｕｎ１６４２ｐｐの茎構造を示す。
【図２１】図２１は、果形指標、小葉形状指標（図１６も参照されたい）、萼片及び子房形状指標、及びより少ない程度で花弁形状指標及び種子重量の変化を示す、Ｓｕｎ１６４２及びＬＡ１５８９バックグランド両方のｓｕｎが異なる準同質遺伝子系統を示している表５を示す。果実重量、果実当たりの種子数、胚軸及び節間長は改変されなかった。ＳＵＮが果実重量に影響せず、形状にのみ影響するという事実は、該遺伝子は生長を増加させることなく、生長の方向を変えるように働くことを強く示している。再び、この発見は、ＳＵＮが任意の植物器官の生長の方向を変化させることが可能であることを示す。
【図２２】図２２は、葉形、果形、果実当たりの種子数、種子及び果実重量が、それ自身のプロモーター下でＳＵＮを発現している系統では、ＳＵＮ遺伝子重複を運んでいるＮＩＬと比較しても類似していることを示している表６を示す。このことはＳＵＮのみが植物器官の形状及び種子重量に影響し、ＤＥＦＬ１又はＨＹＰ遺伝子の一つ（仮定、図１４参照）のどちらも影響しないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
好ましい態様の詳細な説明
本発明の原理及び操作は、付随する記述を参照するとより良く理解することができる。
本発明の少なくとも一つの態様を詳細に説明する前に、本発明はその適用が以下の記述に示した詳細に限定されるわけではないことを理解すべきである。本発明は、他の態様が可能であり、又は多様な様式で実践する又は実施することが可能である。また、本明細書で用いられた成句及び用語法は、説明を目的としており、限定と見なすべきではないことを理解すべきである。
【００４７】
重要な側面において、本発明は、例えば、植物の表現型を改変するためのポリヌクレオチド及びポリペプチドに関する。本開示を通して、種々の情報源が参照され及び／又は援用される。該情報源には、例えば、科学雑誌論文、特許文献、教本、及びWorld Wide Web プラウザ−インアクティブページアドレスが含まれる。これらの情報源への参照は、それらが当業者により使用され得ることを明瞭に示しているが、本明細書で引用された情報源の一つ一つは、「参照として援用される」の具体的記述が書き留められているかいないに関わらず、それら全体が援用される。該情報源の一つ一つの内容及び教示は信頼することができ、本発明の態様を作製及び使用するために使用された。
【００４８】
特に明記しない限り、使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されている意味と同一の意味を有する。一般に、使用された命名法及び以下に記載されている製造又は検査法は公知であり、当該技術分野において通常用いられている。当該技術分野及び多様な一般的参考文献で提供されているような定法がこれらの方法で使用された。特に明記しない限り、本明細書中の本文の核酸配列は、左から右に読む場合、５’から３’の方向で与えられている。用語が単数形で与えられている所では、その用語の複数形により記載される本発明の側面も企図されている。使用された命名法及び以下に記載されている検査法は公知であるものであり、当該技術分野において通常用いられている。参照文献として援用された参照文献において、使用された用語及び定義に矛盾がある場合、本出願で使用された用語は、与えられた定義を有するべきである。使用された他の技術的用語は、種々の技術的辞書により例示されているように、それらが使用されている分野における通常の意味を有する。本発明者は、一つの機構又は作用の様式に制限されるのを意図していない。それらへの参照は、例示的目的のためにのみ提供されている。
【００４９】
本明細書及び付随する特許請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、状況が明瞭に指示していない限り、複数形への言及を含む。それ故、例えば、「一つの植物」への言及は、複数のこうした植物を含み、「一つのストレス」への言及は、一つ又はそれより多くのストレス及び当業者には既知であるそれらの均等物への言及などである。
【００５０】
天然に存在する又は組換えポリペプチドにせよ、「単離されたポリペプチド」とは、野生型細胞中でその天然の状態にあるポリペプチドよりも細胞中で（又は外で）より富化されており、例えば、約７％より以上富化され、約１０％より以上富化され、又は約２０％より以上富化され、又は約５０％より以上富化され、又はそれ以上富化されており、即ち、もしくは１００％に標準化された野生型と比較して：１０５％、１１０％、１２０％、１５０％又はそれ以上富化されていると表される。こうした富化は、野生型植物の天然の応答の結果ではない。もしくは又は加えて、該単離されたポリペプチドは、例えば、本明細書の種々のタンパク質精製法のいずれかにより、典型的には関連している他の細胞成分から分離される。
【００５１】
「相同性」とは、参照配列と、新規に配列決定されたクローン挿入物の少なくとも断片又はそのコードされたアミノ酸配列間の配列類似性を指す。
「ハイブリダイゼーション複合体」とは、プリン及びピリミジン間の水素結合の形成により、二つの核酸分子間の複合体を指す。
【００５２】
「同一性」又は「類似性」とは、二つのポリヌクレオチド配列間の、又は二つのポリペプチド配列間の配列類似性を示し、同一性はより厳密な比較である。句「パーセント同一性」及び「％同一性」とは、二つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列又は二つ又はそれ以上のポリペプチド配列の比較で見出された配列類似性のパーセントを指す。
【００５３】
「配列類似性」とは、二つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列間の塩基対配列のパーセント類似性（いずれかの適切な方法により決定された）を指す。二つ又はそれ以上の配列は０〜１００％類似のいずれかであることができ、又はそれらの間のいずれかの整数値である。同一性又は類似性は、比較の目的で整列することができる各配列の位置を比較することにより決定し得る。比較された配列中の位置が同一のヌクレオチド塩基又はアミノ酸により占められている場合、該分子はその位置で同一である。ポリヌクレオチド配列間の類似性又は同一性の程度は、該ポリヌクレオチド配列により共有されている位置での同一又は一致したヌクレオチドの数の関数である。ポリペプチド配列の同一性の程度は、ポリペプチド配列により共有されている位置での同一のアミノ酸の数の関数である。ポリペプチド配列の相同性又は類似性の程度は、ポリペプチド配列により共有されている位置でのアミノ酸の数の関数である。
【００５４】
「ＩＱモチーフ 」は、グルタミン残基（「Ｑ」で指定される）がすぐに続くイソロイシン残基（「Ｉ」で指定される）を含有する２０〜４０アミノ酸長のアミノ酸配列として同定され、共通配列と少なくとも５０％配列類似性を有する。
【００５５】
「アラインメント」とは、共通のコンポーネントの数（即ち、ヌクレオチド塩基又はアミノ酸残基）が容易にそして図的に同定することができるように、縦方向比較によりアラインされたＤＮＡ又はアミノ酸配列の数を示す。共通のコンポーネントの数は、配列間の相同性又は同一性に関連する。アライメントは、「保存ドメイン」及びこれらのドメイン内の相関性を同定するために使用することができる。アライメントは、当該技術分野で既知のコンピュータープログラムを用いて適切に実施することができる。
【００５６】
本明細書で使用する「保存ドメイン」又は「保存領域 」とは、異種ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の領域を示し、異なる配列間に比較的高程度の配列同一性がある。
ここに開示されているポリペプチドに関した「保存ドメイン」とは、少なくとも２６％の配列類似性、少なくとも１６％の配列同一性、好ましくは少なくとも４０％の配列同一性、好ましくは保存的置換を含んで少なくとも６５％の配列同一性、そしてより好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、及びさらにより好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも約８６％、又は少なくとも約８７％、又は少なくとも約８８％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の連続したアミノ酸残基のポリペプチドのアミノ酸残基配列同一性のような、高程度の配列相同性を示すドメインを指す。これらのパーセンテージ内の範囲は、本明細書の開示の企図された範囲内でもあることを理解すべきである。
【００５７】
断片又はドメインは、保存ドメインの外側、共通配列の外側を指すことが可能である。さらに、ポリペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの特定の断片、領域又はドメインは、もし断片、領域又はドメインのすべてのアミノ酸がポリペプチド又はタンパク質の定義された保存ドメイン（単数又は複数）の外側にあるならば、「保存ドメインの外側」であることが可能である。より少ない程度の同一性しか有していないが、匹敵する生物学的活性を有する配列は、均等物であると考えられる。
【００５８】
「相補的」とは、プリン及びピリミジン間の塩基対形成による天然の水素結合形成を指す。例えば、配列Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ（５’−＞３’）はその相補体Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ（５’−＞３’）又はＡ−Ｃ−Ｇ−Ｕ（５’−＞３’）と水素結合を形成する。二つの一本鎖分子は、部分的に相補的（もしヌクレオチド結合のいくつかのみならば）、又は「完全に相補的」（もしすべてのヌクレオチド結合ならば）と考えることができる。核酸鎖間の相補性の程度はハイブリダイゼーション及び増幅反応の効率及び強さに影響する。
【００５９】
「十分に相補的」とは、一対の配列中の、各塩基対及びその相補体間に結合が生じ、そして二つの配列が同一のヌクレオチド数を有するケースを指す。
用語「高度にストリンジェント」又は「高度にストリンジェントな条件」とは、その配列が高度に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にする条件を指し、これらの同一条件は有意に不適正なＤＮＡのハイブリダイゼーションを排除する。本発明のポリヌクレオチドと、ストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列は、例えば、アレル又はスプライス変異体を含む開示されたポリヌクレオチド配列の変異体、又はここに開示されているポリペプチドのオルソログ又はパラログをコードする配列であることができる。核酸ハイブリダイゼーション法は当業者には公知である。
【００６０】
一般に、ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション及び洗浄プロセスで使用される、温度、イオン強度及び変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度により決定される。ストリンジェンシーのさまざまな条件下でハイブリダイズする二つの核酸に対する程度は、それらの類似性の程度に相関する。それ故、植物ゲノム内のようなさまざまな起源からの（パラログの場合）、又は類似の機能を実行することができる別の植物からの（オルソログの場合）類似の核酸配列は、既知の配列にハイブリダイズするそれらの能力に基づいて単離し得る。多数の変動が条件及び手段において可能であり、それにより、核酸ハイブリダイゼーションを当該技術分野で既知の配列への類似性を有する配列を単離するために使用し得るが、本明細書で明確に開示したものに限定されるわけではない。こうしたアプローチは、例えば、開示された配列と６０％の同一性、又はより好ましくは約７０％を超える同一性、最も好ましくは７２％又はより高い同一性を有する配列のような、開示された配列と多様な程度の類似性を有するポリヌクレオチド配列を単離するために使用することができる。
【００６１】
本明細書で使用する用語「変異体」とは、それぞれ、ここに開示されたポリヌクレオチド又はポリペプチドとは、本明細書に示されたように、お互いに配列が異なったポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。
【００６２】
ポリヌクレオチド変異体に関しては、ここに開示されたポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド変異体間の相違は、前者及び後者のヌクレオチド配列が全体として密接に類似し、そして多くの領域で同一であるように、制限されている。遺伝子コードの縮重のため、前者及び後者のヌクレオチド配列間の相違はサイレントであることができ（即ち、該ポリヌクレオチドによりコードされているアミノ酸は同一である）、変異体ポリヌクレオチド配列は、ここに開示されたポリヌクレオチドと同一のアミノ酸配列をコードする。変異体ヌクレオチド配列は異なったアミノ酸配列をコードすることができ、その場合、こうしたヌクレオチド相違は、類似の開示されたポリヌクレオチド配列に関して、アミノ酸置換、付加、欠失、挿入、トランケーション又は融合を生じるであろう。これらの変異は、少なくとも一つの機能的特性を共有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド変異体を生じる。遺伝子コードの縮重は、多くの異なった変異体ポリヌクレオチドが、配列表に図示した配列に加えて同一の及び／又は実質的に類似したポリヌクレオチドをコードし得ることも指示する。
【００６３】
ここに開示されたポリペプチド及びポリペプチド変異体間の相違は、前者及び後者の配列が全体として密接に類似し、そして多くの領域で同一であるように、制限されている。ここに開示されたポリペプチド配列及び類似のポリペプチド変異体は、一つまたはそれ以上の置換、付加、欠失、融合及びトランケーション（それらは任意の組み合わせで存在することができる）によりアミノ酸配列が異なっていることができる。これらの相違はサイレント変化を生み出すことができ、機能的に均等なポリペプチドを生じる。それ故、当業者は、多様なポリヌクレオチド配列のいずれもが本発明のポリペプチド及びホモログポリペプチドをコードできることを容易に理解するであろう。ポリペプチド配列変異体は、「保存的」変化を有することができ、そこでは置換されたアミノ酸は類似の構造又は化学的性質を有する。それ故、ポリペプチドの機能活性又は生物学的活性が保持される限り、極性、電荷、溶解度、疎水性、及び／又は残基の両親媒性の類似性に基づいて、計画的アミノ酸置換を行うことができる。
【００６４】
用語「植物」は、全植物、茎栄養器官／構造（例えば、葉、茎及び塊茎）、根、花及び花器官／構造（例えば、苞葉、萼片、花弁、雄しべ、心皮、葯及び胚珠 ）、種子（胚、胚乳及び種皮を含む）及び果実（成熟子房）、植物組織（例えば、維管束組織、地下組織など）及び細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞など）及びその子孫を含む。植物は、植物細胞又は任意の植物性材料（例えば、外植片）、並びにそれらの子孫、及び細胞中の生化学的又は細胞成分又はプロセスを模倣するインビトロシステムも指す。
【００６５】
「トランスジェニック植物」とは、同一種の野生型植物、多様な栽培変種には観察されない遺伝子材料を含有する植物を指す。遺伝子材料は、導入遺伝子、挿入変異事象（例えば、トランスポゾン又はＴ−ＤＮＡ挿入変異によるような）、活性化タグ付け配列、変異配列、相同的組換え事象又はキメラ形成法により修飾された配列を含むことができる。典型的には、外来遺伝子材料がヒト操作により植物内に導入されているが、当業者が認識するような任意の方法を使用し得る。
【００６６】
トランスジェニック植物は発現ベクター又はカセットを含むことができる。発現カセットは、典型的には、ポリペプチドの発現を可能にする適切な誘導可能又は構成的調節配列に、作動可能なように（即ち、調節配列の制御下）連結されたポリペプチドコード配列を含んでなる。発現カセットは、形質転換により、又は親植物形質転換後の育種により植物内へ導入し得る。
【００６７】
「対照植物」とは、遺伝子変化又は処置の結果、又は遺伝子又は遺伝子産物の変化した発現の程度を試験するため、比較の基準として働く植物を指す。対照植物には、非処理の、又は遺伝的に改変されてない（即ち、野生型）植物が含まれる。
【００６８】
本明細書で使用する「野生型」とは、ここに開示されている転写因子の一つまたはそれ以上をノックアウトするように又は過剰発現するように遺伝的に修飾されていない細胞、組織又は植物を指す。野生型細胞、組織又は植物は、発現が改変されているか又は異所的に発現されている細胞、組織又は植物（例えば、ノックアウトされているか又は過剰発現されている）と、発現のレベル及び形質修飾の程度及び性質を比較するために使用することができる。
【００６９】
本明細書で使用する用語「生長」又は「再生」は、植物細胞、植物細胞の群、植物部位（種子を含む）又は、植物片（例えば、プロトプラスト、カルス又は組織部分から）から全植物を生長させることを意味する。
【００７０】
「形質」とは、植物又は特定の植物材料又は細胞の生理学的、形態学的、生化学的又は物理学的特性を指す。いくつかの非制限例において、この特性は、ヒトの目で見ることが可能であり（例えば、種子、植物サイズ又は果実又は野菜形状のような）、又は、生化学的技術により（例えば、種子又は葉のタンパク質、デンプン又は油の含有量を検出することによるような）、又は代謝又は生理学的プロセスを観察することにより（二酸化炭素の取り込み、変化したホルモンの発現又は抑制を観察することにより）、又は遺伝子又は複数の遺伝子の発現レベルの観察により（ノーザン分析、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ遺伝子発現アッセイ又はレポーター遺伝子発現システムを用いることにより）、又は農業的観察により（ストレス耐性、収量又は病原体耐性のような）測定することが可能である。しかしながら、いずれの技術もトランスジェニック植物中の任意の選択された化学化合物又は巨大分子の量、比較レベル又は相違を測定するために使用し得る。
【００７１】
「形質修飾」とは、野生型植物のような処置していない植物と比較した、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドを異所的に発現している植物における特性の検出可能な相違を指す。いくつかの場合において、形質修飾は定量的に評価し得る。例えば、形質修飾は野生型植物と比較して、観察された形質の少なくとも約２％のの増加又は減少（相違）、少なくとも５％の相違、少なくとも約１０％の相違、少なくとも約２０％の相違、少なくとも約３０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７０％又は少なくとも約１００％又はさらにより大きな相違を必然的に伴う。修飾形質の天然の変異があることが知られている。それ故、観察された形質修飾は、野生型植物で観察された分布と比較し、植物中の正常分布の変化を必然的に伴う。
【００７２】
用語「転写プロフィール」とは、特定の状態にある型の細胞中の遺伝子の組の発現レベルを指し、特に基準状態にある同一型の細胞中の遺伝子の同一組の発現レベルとの比較によるものである。例えば、浮遊細胞における特定遺伝子の転写プロフィールは、その遺伝子の正常レベルを有する浮遊細胞における遺伝子の同一組の発現レベルと比較して、その遺伝子を過剰発現している細胞における遺伝子の組の発現レベルである。転写プロフィールは、その発現レベルが二つの処置、及び異なった比間で有意に異なっている遺伝子のリストとして示し得る。発現レベル間の相違及び類似は、統計的及びクラスタリング手法を使用して評価及び計算することもできる。
【００７３】
ポリヌクレオチドに関する「改変された発現」は、例えば、トランスジェニック植物又は植物組織における発現のパターンが、野生型植物又は同一種の基準植物における発現パターンと異なっていることを示す。発現のパターンは、同一種の野生型植物における基準発現パターンと比較することもできる。例えば、該ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、該配列が野生型植物で発現される細胞又は組織型以外の細胞又は組織型で、又は該配列は野生型植物で発現される時間以外の時間での発現により、又はホルモン又は環境シグナルのような異なった誘導剤に応答して、又は野生型植物で観察されるレベルと比較して異なった発現レベル（より高いか又はより低い）で発現される。本用語は、検出レベル以下に発現レベルを低下させることにより又は完全に発現を無効にすることにより生み出される改変された発現も指す。生じる発現パターンは過渡的、安定的、構成的又は誘導可能であり得る。ポリペプチドに関する「改変された発現」は、さらに、ポリペプチドと外因性又は内因性変調剤との相互作用から、又はポリペプチドの化学修飾の結果としての因子との相互作用から生じる、改変された活性レベルに関連づけることもできる。
【００７４】
本明細書で使用する用語「過剰発現」は、遺伝子の任意の発育又は時間的段階での野生型植物、細胞又は組織における発現と比較して、植物、植物細胞又は植物組織における該遺伝子のより多い発現レベルを指す。過剰発現は、例えば、一つまたはそれ以上のポリペプチドをコードする遺伝子が、本明細書に記載したプロモーターの一つ（例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写開始領域）のような強い発現シグナルの制御下にある場合に生じる。過剰発現は、使用したプロモーターに依存し、植物全体で又は植物の特定の組織中で生じることができる。
【００７５】
過剰発現は、本ポリペプチドと機能的に均等な又は同一のポリペプチドの発現を通常欠いている植物細胞で起こすことができる。過剰発現は、本ポリペプチド又は機能的に均等な分子の内因性発現が常態的に起こっているが、こうした常態的発現がより低いレベルである植物細胞でも起こすことができる。過剰発現は従って、植物、細胞又は組織において、ポリペプチドの常態的より多い産生、又は「過剰産生」を生じる。
【００７６】
同様に、本明細書で使用する用語「過少発現」は、遺伝子の任意の発育又は時間的段階での野生型植物、細胞又は組織における発現と比較して、植物、植物細胞又は植物組織における該遺伝子のより多い発現レベルを指す。過少発現は、例えば、一つまたはそれ以上のポリペプチドをコードする遺伝子が、本明細書に記載したプロモーターの一つ（例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写開始領域）のような強い発現シグナルの制御下にある場合に生じる。過少発現は、使用したプロモーターに依存し、植物全体で又は植物の特定の組織中で生じることができる。
【００７７】
過少発現は、本ポリペプチドと機能的に均等な又は同一のポリペプチドの発現を通常有している植物細胞で起こすことができる。過少発現は、本ポリペプチド又は機能的に均等な分子の内因性発現が常態的に起こっているが、こうした常態的発現がより高いレベルである植物細胞でも起こすことができる。過少発現は従って、植物、細胞又は組織において、ポリペプチドの常態的より少ない、又は「低」産生を生じる。
【００７８】
従って、第一の広範な側面において、染色体７領域が本明細書において提供され、その領域は、栽培種植物内に導入された場合、遺伝的バックグラウンドが該植物中の少なくとも一つの形質を変化させる。
【００７９】
一つ又はそれ以上の形質を変化し得る植物の非制限例には、裸子植物、被子植物及び蘚類が含まれる。
非制限例には、農作物、観賞植物及び非栽培又は野生植物のような単子葉植物及び双子葉植物が含まれる。さらなる例には、農作物（特には、人間の食物又は動物飼料に使用される農作物）、木材又はパルプ産生木、野菜、果実植物及び観賞植物のような商業的又は農業的に関心が惹かれる植物が含まれる。興味ある植物の非制限例には、穀類作物（ムギ、カラスムギ、オオムギ、トウモロコシ、ライムギ、ライコムギ、イネ、キビ、アワ、ソルガム、キノア、アマランス及びソバのような）；飼料作物（飼料草本及びアルファルファ、カラスノエンドウ、クローバなどを含む飼料草本双子葉植物のような）；脂肪種子作物（綿、ベニバナ、ヒマワリ、ダイズ豆、キャノーラ、ナタネ、アマ、ピーナッツ及び油やしのような）；木の実（クルミ、カシュー、ヘーゼルナッツ、ペカン、アーモンドなどのような）；サトウキビ、ココナツ、ナツメヤシ、オリーブ、サトウダイコン、茶及びコーヒー；木材又はパルプ産生木；マメ科植物のような野菜作物（例えば、マメ、エンドウマメ、レンズマメ、アルファルファ、ピーナッツ ）、レタス、アスパラガス、アーティチョーク、セロリ、ニンジン、ダイコン、アブラナ属（例えば、キャベツ、ケール、カラシナ及び他の葉状アブラナ属、ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ、カブ、コールラビ）、食用カボチャ（例えば、キュウリ、メロン、サマースカッシュ、ウインタースカッシュ）、食用ネギ属（例えば、玉ねぎ、ニンニク、ニラ、エシャロット、チャイブ）、食用ナス科のメンバー（例えば、トマト、ナス、ジャガイモ、コショウ、ホオズキ）及び食用アカザ科のメンバー（例えば、テンサイ、フダンソウ、ホウレンソウ、キノア、アマランス）；リンゴ、セイヨウナシ、柑橘類のような果実作物（例えば、オレンジ、ライム、レモン、グレープフルーツ及びその他）、核果類（例えば、アンズ、モモ、セイヨウスモモ、ネクタリン）、バナナ、パイナップル、ブドウ、キーウィ、パパイヤ、アボカド及び液果類；及び装飾開花植物、装飾木及び灌木、装飾地表植被及び装飾草類を含む観賞植物が含まれる。双子葉植物のさらなる例には、限定されるわけではないが、キャノーラ、綿、ジャガイモ、キノア、アマランス、ソバ、ベニバナ、ダイズ豆、サトウダイコン及びヒマワリ、より好ましくはダイズ、キャノーラ及び綿が含まれる。単子葉植物のさらなる例には、限定されるわけではないが、コムギ、カラスムギ、オオムギ、トウモロコシ、ライムギ、ライコムギ、イネ、装飾及び飼料草類、ソルガム、キビ及びサトウキビ、より好ましくはトウモロコシ、コムギ及びイネが含まれる。
【００８０】
ナス科ファミリーの適したメンバーの非制限例には、商業的トマト種の生産に使用されるさまざまな遺伝子型を有していてもよいトマト植物が含まれる。適した植物はトマトペースト、ダイス及び全ピール生産への加工、露地生産のための生鮮市場トマト、露地での支柱生産、及びガラス温室のような保護生産のために使用し得る。
【００８１】
一つの特定の側面において、伸長果実トマトを生じる染色体７内への標的化部位重複の一部が提供される。このトマトマーカーＬｐ８１Ｂ９−Ｆ及びＬｐ６２０２−Ｒ間に広がる重複染色体７断片は、栽培種トマトの遺伝的バックグラウンド内に導入された場合、それにより産生される果実の果形指標を変化させることができ、一方、同時に栽培種植物の所望の表現型形質を維持している。
【００８２】
従って、別の側面において、例えば、商業的価値のあるハイブリッド種子のような果実及び種子を産生する栽培種トマト植物が提供され、該植物は、本発明の教示に従い、栽培種トマトの遺伝的バックグラウンド内に高い果形指標に関連する染色体領域を導入することにより発生される。
【００８３】
第一の側面において、（ａ）ポリペプチドをコードする配列、該配列は、配列番号１、２、３、４及び５又はそれらのセグメントの少なくとも一つである；（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する（ａ）又は（ｂ）の配列のいずれかの変異体；（ｃ）（ａ）の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する（ａ）又は（ｂ）の配列のいずれかのオルソロガス配列；（ｄ）（ａ）の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する（ａ）又は（ｂ）の配列のいずれかのパラロガス配列又はそれらのＩＱモチーフと７０％同一性を有するパラロガス配列；（ｅ）ストリンジェント条件下、（ａ）の配列とハイブリダイズする配列；及び（ｆ）（ａ）−（ｅ）の配列のいずれかによりコードされているポリペプチドの保存ドメインと少なくとも７０％配列相同性有する保存ドメインを含んでなるポリペプチドをコードする配列；を含む単離されたポリヌクレオチドが本明細書において提供され、該保存ドメインは、ヌクレオチドの発現を調節すること及びトランスジェニック植物の形質を変化させることにおいて、（ａ）−（ｅ）の配列のいずれかによりコードされているポリペプチドの機能のために必要とされる。
【００８４】
一つの態様において、組換えポリヌクレオチドが植物内に形質転換された場合、該組換えポリヌクレオチドの発現を制御することが有効なように、該組換えポリヌクレオチドは少なくとも一つの調節エレメントに作動可能なように連結されている。ある態様において、該ポリヌクレオチドは発現ベクター内に組み込まれている。
【００８５】
また、ある態様において、上記のようにポリヌクレオチド配列に作動可能なように連結されている、一つまたはそれ以上の構成的、誘導可能又は組織特異的プロモーターを含んでなるポリヌクレオチドが本明細書において提供される。ある態様において、該発現ベクターは培養宿主細胞内に組み込まれている。
【００８６】
別の側面において、本明細書に記載した少なくとも一つのポリヌクレオチドを発現するトランスジェニック植物が本明細書において提供され、該トランスジェニック植物の少なくとも一部は、非トランスジェニック植物又は野生型植物と比較して改変された形質を有する。
【００８７】
ある態様において、改変された形質は：ホルモンレベルに対する感受性：植物の少なくとも一部の改変された形状：改変された植物サイズ：改変された葉形：改変された野菜形状：改変された果形；少なくとも部分的な単為結実果実：増加したＳＵＮレベル及び減少したＳＵＮレベル、の一つ又はそれ以上である。また、ある態様において、該改変された形質は、単離されたポリヌクレオチドの一つの少なくとも一部の過剰発現であり、該改変された形質は単為結実果実を含んでなる。また、ある態様において、該改変された形質は、単離されたポリヌクレオチドの一つの少なくとも一部の過剰発現であり、該改変された形質は伸長した果形を含んでなる。
【００８８】
さらなる側面において、トランスジェニック植物が本明細書において提供され、該植物は、タンパク質のＩＱＤファミリーからの一つまたはそれ以上のタンパク質を発現する。こうしたトランスジェニック植物は一つ又はそれ以上の裸子植物、被子植物及び蘚類から選択し得る。
【００８９】
ある態様において、該植物は、限定されるわけではないが、一つまたはそれ以上の農作物、観賞植物及び非栽培又は野生植物を含む単子葉植物及び双子葉植物から選択される。
ある態様において、該トランスジェニック植物はナス科ファミリーから選択される。ある態様において、該トランスジェニック植物はトマト植物である。ある態様において、該トランスジェニック植物は本明細書に記載したトマト植物準同質遺伝子系統である。
【００９０】
別の側面において、非トランスジェニック又は野生型植物と比較して改変された形質を有するトランスジェニック植物を産生するための方法が本明細書において提供され、該方法は：（ａ）（ｉ）本明細書に記載したポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ポリヌクレオチド配列に隣接する少なくとも一つの調節エレメント、該少なくとも一つの調節エレメントは標的植物中で該組換えポリヌクレオチドの発現を制御することにおいて有効である；を含んでなる発現ベクターを提供すること；（ｂ）植物細胞内に該発現ベクターを導入し、それによりトランスジェニック植物細胞を提供すること；（ｃ）トランスジェニック植物細胞をトランスジェニック植物に生長させ、トランスジェニック植物が該ポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドを発現する又は抑制することを可能にすること、該ポリペプチドは、該ポリペプチドを発現しない又は抑制しない非トランスジェニック植物と比較し、植物の形質を変化させる性質を有している；及び（ｄ）トランスジェニック植物と非トランスジェニック植物を比較することにより、改変された形質を有する少なくとも一つのトランスジェニック植物を同定すること；を含む。
【００９１】
ある態様において、該方法は；（ｅ）改変された形質を有する該少なくとも一つのトランスジェニック植物をそれ自身又は別の植物とそれぞれ自家受粉又は交雑させること；及び（ｆ）自家受粉又は交雑の結果として発生した種子から子孫植物を生長させること；をさらに含み、こうして改変された形質を有する遺伝子導入子孫植物を作製すること。
【００９２】
別の側面において、本明細書に記載した少なくとも一つのポリヌクレオチドを有する形質転換された細胞が本明細書において提供される。ある態様において、細胞は植物細胞である。こうした植物細胞から生長させた植物又は植物組織も本明細書において提供される。
【００９３】
別の側面において、ポリペプチドをコードする配列を含んでなる形質転換又はトランスジェニック植物、植物部位、植物種子、植物細胞又はそれらのトランスジェニック子孫が本明細書において提供され、該ヌクレオチド配列は、配列番号１、２、３、４及び６及びそれらの組み合わせの少なくとも一つである。ある態様において、トランスジェニック植物は、限定されるわけではないが、トマト植物のようなナス科ファミリーから選択される。ある態様において、該植物は本明細書に記載したトマト植物準同質遺伝子系統である。
【００９４】
別の側面において、そのゲノム中に、本明細書に記載した単離されたポリペプチドの少なくとも一つに作動可能なように連結された、植物中の発現を駆動するプロモーターを含んでなる少なくとも一つの安定に組み込まれたヌクレオチド構築物を含んでなる形質転換植物が本明細書において提供される。
【００９５】
別の側面において、実質的に図６Ｃに示されている二つのＬＴＲの一部（ｍＲＮＡの５’末端のＲセグメント及びＵ５領域、及びｍＲＮＡの３’末端のＲセグメント及びＵ３領域）が隣接するｍＲＮＡ分子が本明細書において提供される。別の側面において、ＬＴＲ１及びＬＴＲ３が染色体７上にあり、全重複断片が隣接し、そしてすぐに隣接するＬＴＲ１及びＬＴＲ３が５ｂｐモチーフ「ＡＴＡＴＴ」である分子が本明細書において提供される。
【００９６】
別の側面において、完全長ＳＵＮ遺伝子を含んでなるクローン、ｐＨＸ４が本明細書において提供される。
別の側面において、ｐＨＸ４クローンで形質転換された植物が本明細書において提供される。
【００９７】
別の側面において、ＤＥＦＬ１の上流３．２ｋｂ領域に位置するシスエレメントをさらに含むクローンが本明細書において提供される。
別の側面において、植物の少なくとも一つの形質を改変するための方法が本明細書において提供され、自律的ロングターミナルリピートレトロエレメントにより仲介される重複事象を起こすことを含んでなり、該レトロエレメントの転位が別の遺伝子の調節配列の近傍にＳＵＮ遺伝子の配置を生じ、先祖の位置のそのパラログと比較して改変された発現を生じる。ある態様において、機能獲得型変異が自律性ＬＴＲレトロエレメントにより仲介される転移事象により生じ、該レトロエレメントの転位は、近隣遺伝子の３’形質導入、ならびに該ＳＵＮ遺伝子をレトロエレメントの上流からレトロエレメントの２０ｋｂ下流へ移動する第二の転位に関係している。
【００９８】
別の側面において、天然に存在する果実とは異なっている形状を有する少なくとも一つの果実を有する植物を作製するための方法が本明細書において提供され、果実の準同質遺伝子系統内にＳＵＮインバーテットリピート構築物を形質転換すること、そして該植物を生長させることを含んでなる。
【００９９】
別の側面において、果実を生産する方法が本明細書において提供され、ａ）本明細書に記載した少なくとも一つのポリペプチドを有する植物を生長させること、及びｂ）該果実を収穫すること：を含んでなる。
【０１００】
別の側面において、植物を無性で繁殖させる方法が本明細書において提供され、生長した植物の一部を採取すること；及び該一部から小植物を得ることを含んでなる。本方法はさらに、小植物から植物を生長させることを含んでなることが可能である。また、ある態様において、本発明は小植物から生長させた植物から果実を収穫することをさらに含むことが可能である。
【０１０１】
別の側面において、本明細書に記載した植物の果実を含んでなる食物及び食物製品が本明細書において提供される。
別の側面において、Ｓｕｎ１６４２バックグラウンドを含んでなる準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）が本明細書において提供される。
【０１０２】
別の側面において、ＬＡ１５８９バックグラウンドを含んでなる準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）が本明細書において提供される。
別の側面において、ＩＱＤ１２、ＳＤＬ１様、ＨＹＰｌ及びＨＹＰ２の最初の４１５アミノ酸をコードするヌクレオチドを含有する１７．２ｋｂ  ｐＨＸ２構築物が本明細書において提供される。
【０１０３】
別の側面において、ＩＱＤ１２及びＳＤＬ１様終止コドン上流の終端１８０ヌクレオチドを含有する１．４ｋｂ  ｐＨＸ４構築物が本明細書において提供される。
別の側面において、プラスミドｐＥＫ５９及びｐＥＫ６０の全ファージサブクローン挿入物（ＮｏｔＩにより放出され、そしてクレノーを使用して平滑末端化された）を、それぞれクレノー平滑末端化ＢａｍＨＩ消化バイナリーベクターｐＣＩＢ１０Ｇ内にサブクローニングすることにより作製された形質転換構築物が本明細書において提供される。ある態様において、該形質転換構築物はｐＨＸ２を含んでなる。ある態様において、該形質転換構築物はｐＨＸ４を含んでなる。
【０１０４】
別の側面において、プライマーＥＰ５２７及びＥＰ５２８を使用して逆転写されたｍＲＮＡから増幅された、ＩＱＤ１２  ｃＤＮＡの５１２ｂｐ断片（ゲノム配列ＥＦ０９４９４０のヌクレオチド１６，１５４〜１６，６４６［配列番号２］）を、ｐＦＧＣ５９４１内へセンス及びアンチセンス方向でクローニングすることにより発生させたＲＮＡｉ：ＩＱＤ１２構築物、ｐＨＸ８が本明細書において提供される。
【０１０５】
別の側面において、ＩＱＤ１２  ｃＤＮＡの１．４ｋｂ断片、ＩＱＤ１２（ゲノム配列ＥＦ０９４９４０のヌクレオチド１３，４６０〜１６，２８０に対応する［配列番号２］）を過剰発現させるための方法が本明細書において提供され、プライマーＥＰ５１９及びＥＰ５２０を使用して逆転写されたｍＲＮＡから増幅すること、及びｐＣＩＢ７１０のＣａＭＶ  ３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター及びＮＯＳターミネーター間にサブクローニングすること：を含んでなる。
【０１０６】
別の側面において、ＩＱＤ１２  ｃＤＮＡの１．４ｋｂ断片、ＩＱＤ１２（ゲノム配列ＥＦ０９４９４０のヌクレオチド１３，４６０〜１６，２８０に対応する［配列番号２］）発現のプローブラベリングのための方法が本明細書において提供され、プライマーＣＭＥ５Ｆ及びＣＭＥ５Ｒを使用して逆転写されたｍＲＮＡから増幅することを含んでなる。
【０１０７】
別の側面において、ＩＱＤ１２  ｃＤＮＡの１．４ｋｂ断片、ＩＱＤ１２（ゲノム配列ＥＦ０９４９４０のヌクレオチド１３，４６０〜１６，２８０に対応する［配列番号２］）の発現をサイレンシングするための方法が本明細書において提供され、プライマープライマーＥＰ５２７及びＥＰ５２８を使用して逆転写されたｍＲＮＡから増幅することを含んでなる。
【０１０８】
別の側面において、プラスミドｐＨＸ８を含んでなる構築物が本明細書において提供される。
別の側面において、ＬＡ１５８９バックグラウンドにＳｕｎ１６４２アレルを運んでいる準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）内へ形質転換されたプラスミド構築物ｐＨＸ８が本明細書において提供される。
【０１０９】
別の側面において、プラスミドｐＨＸ２を含んでなる構築物が本明細書において提供される。
別の側面において、ＬＡ１５８９及びＳｕｎ１６４２バックグランド両方に丸形果実ＮＩＬ植物を形質転換するのに有用であるプラスミド構築物ｐＨＸ２が本明細書において提供される。
【０１１０】
別の側面において、プラスミドｐＨＸ４を含んでなる構築物が本明細書において提供される。
別の側面において、ＬＡ１５８９及びＳｕｎ１６４２バックグランド両方に丸形果実ＮＩＬ植物を形質転換するのに有用であるプラスミド構築物ｐＨＸ４が本明細書において提供される。
【０１１１】
別の側面において、プラスミドｐＥＫ６９を含んでなる構築物が本明細書において提供される。
別の側面において、ＬＡ１５８９及びＳｕｎ１６４２バックグランド両方に丸形果実ＮＩＬ植物を形質転換するのに有用であるプラスミド構築物ｐＥＫ６９が本明細書において提供される。
【０１１２】
別の側面において、Ｓｕｎ１６４２バックグラウンド又はＬＡ１５８９バックグランドに構築されたｓｕｎが異なっている植物を含んでなる準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）が本明細書において提供され、該植物は、マーカー補助選択を使用して反復親に連続的に戻し交配することにより作製する。
【０１１３】
別の側面において、プロモーターとして使用される６．０８ｋｂ上流領域ＤＥＦＬ１が本明細書において提供される。
別の側面において、少なくとも一つの本明細書に記載したポリペプチドを含んでなるベクターが本明細書において提供される。別の側面において、こうしたベクターを有する形質転換された植物細胞が本明細書において提供される。別の側面において、こうした植物細胞を含んでなる植物形質転換体が本明細書において提供される。別の側面において、植物形質転換体はトマトである。別の側面において、こうした植物形質転換体の子孫又はクローンが本明細書において提供される。
【０１１４】
別の側面において、植物を生産するための方法が本明細書において提供され、植物細胞内に少なくとも一つの本明細書に記載したポリペプチドを導入すること、そして該植物細胞から植物形質転換体を再生することを含んでなる。
【０１１５】
別の側面において、少なくとも一つの植物の葉及び果形を改変するための方法が本明細書において提供され、該植物内で該ポリペプチドを導入すること及び発現させることを含んでなり、該ポリペプチドを発現させることは、本明細書に記載した少なくとも一つのポリペプチドを発現しない植物と比較し、葉及び／又は果実の形状を改変する。
【０１１６】
別の側面において、少なくとも一つの本明細書に記載したポリペプチドを含んでなるベクターで形質転換された単離された宿主細胞が本明細書において提供される。
別の側面において、植物又はそれらの一部の少なくとも一つの形質を改変するためのプロセスが本明細書において提供され、植物又はそれらの一部におけるＳＵＮ活性を増加させることを含んでなる。ある態様において、ＳＵＮは配列番号４のアミノ酸配列、又はＳＵＮ活性を有し、配列番号４と少なくとも６０％の配列相同性のアミノ酸配列を有する。ある態様において、該プロセスは、植物又はそれらの一部内に、配列番号４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列に、又はＳＵＮ活性を有し、配列番号４と少なくとも７０％の配列相同性のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列に突然変異を導入することを含んでなる。
【０１１７】
ある態様において、該プロセスは、配列番号４のポリヌクレオチド配列又は配列番号４と少なくとも７０％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を、センス及びアンチセンス方向で植物又はそれらの一部のゲノム内に導入することを含み、該相同ポリヌクレオチド配列はＳＵＮ活性を阻害する。
【０１１８】
別の側面において、配列番号４のアミノ酸配列をコードする、又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチド配列が本明細書において提供される。別の側面において、こうしたポリヌクレオチドを含んでなるベクターが本明細書において提供される。
【０１１９】
別の側面において、植物の果形の決定に関与する単離されたポリペプチドが本明細書において提供され、該ポリペプチドは：（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡ；（ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列のコード領域を含んでなるＤＮＡ；（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列に一つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡ；及び（ｄ）配列番号２のヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡとストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ：の一つまたはそれ以上から選択される。    
【０１２０】
別の側面において、配列番号４又は６の少なくとも一つの配列を含んでなるタンパク質の部分ペプチドをコードする単離されたポリペプチドが本明細書において提供される。
別の側面において、配列番号２のヌクレオチド配列のプロモーター領域を含んでなる単離されたポリペプチドが本明細書において提供される。別の側面において、一つ又はそれ以上の配列番号２、４又は６を有するこうしたポリペプチドを含んでなるベクターが本明細書において提供される。別の側面において、こうしたベクターを運んでいる宿主細胞が本明細書において提供される。別の側面において、こうしたベクターを運んでいる植物細胞が本明細書において提供される。別の側面において、こうした植物細胞を含んでなる植物形質転換体が本明細書において提供される。別の側面において、こうした植物形質転換体の子孫又はクローンである植物形質転換体が本明細書において提供される。別の側面において、こうした植物形質転換体の繁殖材料が本明細書において提供される。
【０１２１】
別の側面において、植物形質転換体を産生するための方法が本明細書において提供され、該方法は、本明細書に記載した少なくとも一つのポリペプチドを植物細胞内に導入すること、及び該植物細胞から植物を再生することの工程を含んでなる。
【０１２２】
別の側面において、配列番号２のヌクレオチド配列と相補的である少なくとも１５の連続したヌクレオチド、又はそれらに相補的である配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドが本明細書において提供される。
【０１２３】
別の側面において、植物の再生能力を増加させるための方法が本明細書において提供され、該方法は、植物の細胞中で本明細書に記載した少なくとも一つのポリペプチドを発現させる工程を含んでなる。
【０１２４】
別の側面において、植物の少なくとも一つの形質を改変するための剤が本明細書において提供され、該剤は、活性成分として本明細書に記載した少なくとも一つのポリペプチド、又はそれらのベクターを含んでなる。
【０１２５】
別の側面において、改変された形状を有する果実を産生する植物細胞の能力を決定するための方法が本明細書において提供され、該方法は、植物細胞中の、本明細書に記載した少なくとも一つのポリペプチド又はそれらにより発現されたタンパク質の発現を検出することを含んでなる。
【０１２６】
別の側面において、改変された形状を有する果実を産生する植物細胞の能力を決定するための方法が本明細書において提供され、該植物中の該ポリペプチドの発現を検出することを含んでなる。
【０１２７】
別の側面において、改変された形状を有する果実を産生する植物細胞の能力を改良するための方法が本明細書において提供され、植物中の本明細書に記載した少なくとも一つのポリペプチドの発現により産生される少なくとも一つのタンパク質の活性を調節することを含んでなる。
【０１２８】
別の側面において、形質転換植物細胞を選択するための方法が本明細書において提供され：（ａ）選択マーカーとして本明細書に記載した少なくとも一つのポリペプチドを含んでなるベクターを植物細胞に導入すること；（ｂ）該植物細胞を培養すること；及び（ｃ）獲得した再生能力を有する植物細胞を選択すること：を含んでなる。
【０１２９】
別の側面において、改変された形状を有する果実を産生する植物の能力を改変するための方法が本明細書において提供され、交雑により植物中の内在性ポリペプチドを置換することを含んでなる。
【０１３０】
別の側面において、アンチセンス配向の単離された分子を含んでなる発現ベクターにより形質転換された植物細胞が本明細書において提供され、植物細胞中でのベクターの発現は、対応する野生型植物と比較して改変された果形指標を生じ、該分子は：（ａ）配列番号１、２、３、４又は６に示されている配列又はそれらの変異体、又は（ｂ）（ａ）  と同一の配列をコードする配列、しかし、遺伝子コードの縮重に従って縮重している配列：を含んでなる。ある態様において、該分子はＳＵＮ、配列番号４である。
【０１３１】
別の側面において、植物細胞を含んでなるトランスジェニック植物により産生される種子が本明細書において提供され、該種子は、植物細胞の野生型品種と比較して、娘植物の改変された果形指標を何世代にもわたって同じ特徴を示している。
【０１３２】
別の側面において、組換えアンチセンス発現ベクターが本明細書において提供され：（ａ）植物細胞において機能的であるプロモーター；及び（ｂ）ＳＵＮ、配列番号４を含んでなる単離された分子：を含んでなり、該分子はプロモーターにアンチセンス配向で作動可能なように連結されている。別の側面において、対応する野生型植物と比較して改変された果形を有するトランスジェニック植物を生産する方法が本明細書において提供され：（ａ）組換えアンチセンス発現ベクターを導入することにより植物細胞を形質転換すること；（ｂ）形質転換細胞から植物を生成させること；及び（ｃ）改変された果形指標を示している全植物を選択すること：を含んでなる。
【０１３３】
別の側面において、植物の果実のサイズを改変するための方法が本明細書において提供され：（ａ）植物細胞内に組換えアンチセンス発現ベクターを導入すること；（ｂ）植物細胞からトランスジェニック植物を再生させること；（ｃ）導入された発現ベクターを有する植物と対応する野生型植物を比較することにより、改変された果形について全植物を評価すること：を含んでなる。ある態様において、該トランスジェニック植物は、対応する野生型植物を比較して増加した果形指標発育を示す。
【０１３４】
別の側面において、アンチセンス配向の単離されたアミノ酸配列で形質転換された植物細胞が本明細書において提供され、該アミノ酸配列はＳＵＮ、配列番号４、又はそれらの補体、又は配列番号４と同一のアミノ酸配列をコードするが、遺伝子コードの縮重に従って縮重されている分子であり、植物細胞中での該配列の発現は、対応する野生型植物と比較して、得られた植物に改変された果形を生じる。
【０１３５】
別の側面において、本明細書に記載した植物細胞を含んでなるトランスジェニック植物が本明細書において提供される。
別の側面において、本明細書に記載したトランスジェニック植物により産生された種子が本明細書において提供され、該種子は、アンチセンス配向の単離されたヌクレオチド配列を含んでなる。
【０１３６】
特定の態様において、本明細書に記載した配列は、天然に存在する形態の任意のトマト種、特定的には、Ｓ．リコペルシクム果実トマト植物種から、又は天然、合成、半合成又は組換えからの任意の起源からのものであることができる。本発明の配列は、本アミノ酸配列の断片も含むことができる。
【実施例】
【０１３７】
一つの特定の側面に従うと、伸長果実トマトに由来する遺伝子の重複及び再配置を介して、改変された発現を含むゲノムを有する栽培種トマト植物が本明細書において提供される。伸長果実トマトは、高い果形指標（即ち、果実の高さはその幅よりも大きい）を有する果実により特徴付けられる。本明細書でＩＱＤ１２及び／又はＳＵＮと同定された重複／再配置遺伝子は、染色体７上の重複断片として現れる染色体１０の一部を含んでいる。ＳＵＮ遺伝子が、野生型トマト植物と比べて、所望の伸長形質に関与している。
【０１３８】
別の側面に従うと、増大した果形指標により特徴付けられる果実を有するトマト植物を発生させる方法が本明細書において提供され、該方法は、伸長果実トマトに由来する構築物をトマト植物のゲノムに導入する工程を含んでなり、該構築物は、染色体７上で重複した、伸長果実トマトの染色体１０の一部を含んでいる。
【０１３９】
このようであるので、改変された果形指標特性の証拠は、以下の実施例の節でさらに例示され及び記述されるように、少なくともＳＵＮ遺伝子を含む構築物のいずれかの栽培品種内へのそれらの導入を受け継ぐことができる。
【０１４０】
また、好ましい態様におけるさらなる特色に従うと、該構築物は本明細書に記載したプロモーターのような調節エレメントを含むことにも注目すべきである。
記載された好ましい態様におけるさらなる特色に従うと、栽培種植物の果実は、平均伸長長さ−幅縦横比により特徴付けられる。ある態様において、該植物は、トマト、ジャガイモ、コショウ、ナス、ペチュニアなどを含む、ナス科ファミリーの植物である。
【０１４１】
本発明は、少なくとも一部、植物果実のサイズ及び形状の変化は、ＳＵＮ発現のレベルを変化させることにより達成し得るという発見に基づいている。
一つの具体的側面は、核酸発現ベクターをコードするＳＵＮにより形質転換されたトランスジェニック植物細胞であり、植物細胞における核酸配列の発現は、該植物細胞の対応する野生型品種と比較した場合、得られた植物の果形に変化を生じる。一つの態様において、ＳＵＮコード核酸配列は、ソラヌム  リコペルシクムからのＳＵＮである。
【０１４２】
別の具体的側面は、核酸発現ベクターをコードするＳＵＮアンチセンスにより形質転換されたトランスジェニック植物細胞であり、植物細胞における核酸配列の発現は、該植物細胞の対応する野生型品種と比較した場合、得られた植物の改変された果形を生じる。一つの態様において、ＳＵＮアンチセンスコード核酸配列は、ソラヌム  リコペルシクムからのＳＵＮである。
【０１４３】
別の具体的側面は、本明細書に記載したトランスジェニック植物、植物部位又は種子のいずれかにより産生された農業産物である。
別の具体的側面は、以下に記載した単離されたＳＵＮである。一つの態様において、ＳＵＮは配列番号４である。本発明の別の側面は、核酸をコードする単離されたＳＵＮであり、該ＳＵＮは本明細書に記載したＳＵＮをコードする。
【０１４４】
別の具体的側面は、単離された組換えアンチセンス発現ベクターであり、（ａ）プロモーター、該プロモーターは植物細胞中で機能的である；及び（ｂ）ソラヌム  リコペルシクムＳＵＮアンチセンスコード核酸を含んでなり、該プロモーターは、ＳＵＮアンチセンスコード核酸に作動可能なように連結されており、そしてＲＮＡ産物がヌクレオチド配列中で相補的であり、及びＳＵＮをコードするｍＲＮＡにストリンジェント様式でハイブリダイズ可能なように、アンチセンスコード核酸は該プロモーターに関連して配向されており、該ＳＵＮアンチセンスコード核酸は、宿主細胞の対応する野生型品種と比較して、配列番号４の少なくとも１５の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含んでなる。
【０１４５】
別の具体的側面は、対応する野生型植物と比較して改変された果形を有するトランスジェニック植物を産生する方法であり：（ａ）ＳＵＮをコードする核酸ベクターを導入することにより植物細胞を形質転換すること；（ｂ）形質転換された植物細胞から植物を産生すること：を含んでなる。
【０１４６】
別の具体的側面は、植物の果形を改変するための方法であり、該方法は（ａ）ＳＵＮをコードする核酸ベクターを植物細胞内に導入すること；（ｂ）植物細胞をトランスジェニック植物に再生すること；及び（ｃ）核酸分子を導入することにより得られた植物と対応する野生型植物のサイズを比較することにより果形の変化を評価すること：を含んでなる。
【０１４７】
記載された好ましい態様におけるさらなる特色に従うと、栽培種トマト植物の果実は、平均伸長長さ−幅縦横比により特徴付けられる。記載された好ましい態様におけるさらなる特色に従うと、栽培種トマト植物の果実は、１より大きな平均果形指標により特徴付けられる。
【０１４８】
記載された好ましい態様におけるさらなる特色に従うと、該伸長果実トマトはＳ．リコペルシクムである。
記載された好ましい態様におけるさらなる特色に従うと、該栽培種トマトは、商業的トマト種の生産に使用される遺伝子型の範囲から選択される。
【０１４９】
記載された好ましい態様におけるさらなる特色に従うと、トマト植物に由来するトマト果実が特許請求される。記載された好ましい態様におけるさらなる特色に従うと、トマト果実に由来するトマト製品が特許請求される。
【０１５０】
記載された好ましい態様におけるさらなる特色に従うと、少なくとも一つの親が該トマト植物である交雑に由来するトマト種子が特許請求される。
記載された好ましい態様におけるさらなる特色に従うと、特許請求された該トマト種子はハイブリッドトマト種子である。
【０１５１】
特に明記しない限り、本明細書で使用されたすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により共通に理解されているものと同一の意味を有する。本明細書に記載したものと類似の又は均等な方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができ、適した方法及び材料は以下に記載されている。矛盾が生じた場合、定義を含んで本特許明細書が支配するであろう。加えて、該材料、方法及び実施例は例示のためであり、制限を意図していない。
【０１５２】
ここで図１Ａを参照すると、トマト果形座位ｓｕｎの精細マッピングは、それが染色体７上の０．２ｃＭ間隔に位置していたことを示した。隣接する細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを使用するファイバー−蛍光インサイツハイブリダイゼーション（Fibre-FISH）実験は、伸長果実遺伝子型Ｓｕｎ１６４２における物理的距離が丸形果実ＬＡ１５８９９よりもおよそ３０ｋｂより大きかったことを示した。しかしながら、これらの二つのＢＡＣクローンは、このギャップにまたがる公的に入手可能なゲノムラージインサートライブラリーからの追加のクローンのどれも、トマトゲノム適用の終点を表さなかった。
【０１５３】
該領域をクローン化するため、丸形果実ＬＡ１５８９及び伸長果実Ｓｕｎ１６４２親トマトの両方からバクテリオファージラムダゲノムライブラリーを構築した。これらのライブラリーを、最初にファイバー−ＦＩＳＨで使用したＢＡＣクローンの末端から誘導したプローブで、続いて回収されたファージクローンの末端でスクリーニングした（図１Ｂ）。
【０１５４】
オーバーラップファージクローンの比較配列解析は、該座位でのＬＡ１５８９及びＳｕｎ１６４２間のサイズ相違は、Ｓｕｎ１６４２には存在するが、ＬＡ１５８９には存在しない２４．３ｋｂセグメントの挿入によるものであったことを示した（図１Ｂ、１Ｃ）。
【０１５５】
遺伝子分析は、該挿入が果形表現型と完全に同時に調和したことを示した（図１Ｂ）。この結果は、２４．３ｋｂ挿入が、ｓｕｎにより仲介される伸長した果形の分子基盤をなす原因突然変異であったことを強く暗示する。挿入されたセグメントの起源を決定するため、２４．３ｋｂセグメントの一部を包含する１つのファージクローン末端を制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブとして使用し、Ｓｕｎ１６４２ｘＬＡ１５８９Ｆ２子孫からのゲノムＤＮＡを含有するマッピングフィルターの組にハイブリダイズさせた。データは、ＬＡ１５８９はこの配列のただ１つのコピーを含有するが、一方、Ｓｕｎ１６４２は２つのコピーを含有することを示した。これらの２つのトマトアクセッションに共有されているコピーは染色体１０に位置付けされた（図５参照）。
【０１５６】
従って、該データは、染色体７上に挿入されたセグメントは染色体１０を起源とするという概念を強く支持する。発明者はここで、続いてＳ．リコペルシクム栽培変種ハインツ（Heinz）１７０６２５から構築したＢＡＣライブラリーをスクリーニングし、配列分析のために祖先の位置から１つのクローン、ＨＢａ０７２Ｄ０８を選択した。データは、染色体７内に挿入された完全２４．３ｋｂセグメントが染色体１０上に存在することを示した（図１Ｃ）。しかしながら、興味深いことに、ヌクレオチドレベルではほぼ１００％同一性にもかかわらず、該２４．３ｋｂ重複はその祖先コピーとは完全に共線的ではなく、そして別の再配列を含んでいた（図１Ｃ）。３−ｂｐミスマッチ（再配列に加えて）を有するこの再配列のブレイクポイントは、染色体７及び１０パラログ性セグメントをお互いに区別する、唯一のヌクレオチド配列特色であった。
【０１５７】
ｓｕｎでの重複はレトロ転位事象の結果であった
重複及びその祖先の近同一性は、このコピー数変異体の形成を生じる配列特色は、保存されそして認識可能であろうことを可能にする。染色体７及び１０ゲノム配列の詳細な検査は、コピア様自律性レトロエレメントが両方のゲノム位置に存在し、重複の分子基盤をなすであろことを示唆した。染色体１０レトロエレメントエレメントには同一の３９８ｂｐ末端反復配列（ＬＴＲ）（図１Ｃ、１及び２として赤（ダークボックス）で示されている)、及びシグネチャー「ＧＡＣＣＴ」の５ｂｐ標的部位重複（ＴＳＤ）が隣接し、それは両方ともＬＴＲレトロエレメント転移の特色である。興味深いことに、染色体７領域は、３つの同一３９８ｂｐＬＴＲを有する。２つのＬＴＲ（ＬＴＲ１及び２）はコアレトロエレメントに隣接し、一方、１つのＬＴＲ（ＬＴＲ３）はさらに上流であった（図１Ｃ）。
【０１５８】
染色体７上のＬＴＲ１及びＬＴＲ３には完全重複断片が隣接する。推定される組込みの部位及びすぐに隣接するＬＴＲ１及びＬＴＲ３、５ｂｐモチーフ「ＡＴＡＴＴ」は、転移事象のＴＳＤによく似ている（図１Ｃ）。セグメント重複を欠くＬＡ１５８９において、「ＡＴＡＴＴ」モチーフの単一コピーしか観察されず、それは完全エレメントの組み込みがこの５ｂｐモチーフで生じているという観察を支持する。ＬＴＲレトロエレメントの典型的な別の特色は、第二のＬＴＲのすぐ上流に位置するポリプリントラクト（ＰＰＴ）である（図１Ｃ）。ＰＰＴは、ｃＤＮＡの第二の鎖合成の開始、ならびに続いてのｃＤＮＡからのＰＰＴの切断に重要である。コアレトロエレメントのＰＰＴは、ＬＴＲ２の３ヌクレオチド上流から始まる１５ｂｐ領域であった。ＬＴＲ２の上流ＰＰＴと７０％同一であった推定ＰＰＴは、ＬＴＲ３のすぐ上流に観察された（図１Ｃ中のＰＴＴ＊）。それ故、推定ＰＰＴは、コアエレメントの転位間に実際のＰＴＴ＊として働きそうであり、宿主ＤＮＡと会合する。この実際のＰＴＴ＊は、二本鎖ｃＤＮＡ合成そして続いての染色体７内へ１つの単一断片としての完全レトロエレメントの組込みを許容するであろう。総合すれば、染色体７及び１０上の配列特色は、重複がＬＴＲレトロエレメントにより仲介される転移事象を介して生じることを強く示唆する。
【０１５９】
この新規コピア様自律性エレメントは、それがゲノムを横切り、そしてその移動が宿主ゲノムのセグメントに沿ってもたらされたので「Ｒｉｄｅｒ」と名付けられた。
ｓｕｎでの候補遺伝子
ｓｕｎの果形表現型は完全に挿入されたセグメントと関係があった（図１Ｂ）。次ぎに、伸長された果形が転位した断片上に存在する遺伝子によるものなのか、又は既存の座位の破壊によるものなのかが考えられた、ＢＬＡＳＴ探索と組み合わされたＦＧＥＮＥＳＨを使用するアブイニシオ遺伝子予測は、染色体７及び１０領域で共有される４つの推定遺伝子を同定した。重複に存在するのはＬＴＲエレメントＲｉｄｅｒに加えて、ＩＱＤ１２、ＳＤＬ１様及びＨＹＰｌ及びＨＹＰ２によりコードされた２つの仮定的遺伝子であった。加えて、染色体７上の第5番目の遺伝子ＤＥＦＬ１は、この遺伝子内へのＲｉｄｅｒの転位後に最も破壊されているようであった（図１Ｃ）。ＩＱＤ１２は、カルモジュリン結合活性を有するＩＱ６７モチーフ含有植物タンパク質のメンバー、シロイヌナズナＩＱＤ１２に最も類似していた２６。ＩＱＤ１２は６エクソンを含んでなり、その全てが転位した断片上に存在した。ＳＤＬ１様はニコチアナ・プルムバギニフォリアＳＤＬ１遺伝子２７及びシロイヌナズナＥＬＤ１２８と高度な配列類似性を有していた。ＳＤＬ１様は親染色体１０上で１１エクソンを含む遺伝子をコードしていたが、転位した断片上ではエクソン１及び上流プロモーターを欠いていた。ＳＤＬ１様遺伝子の転位したコピーは、多分機能的ではなくそしてｓｕｎ、ＨＹＰ１、ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ１の基礎をなすものではないようであり、外側の器官境界形成を調節するシロイヌナズナタンパク質、ＣＵＣ１２９と弱い類似性を有する３５０アミノ酸のポリペプチドをコードすることが予想される単一エクソン遺伝子であることを発明者は信じている。ＨＹＰ２も単一エクソン遺伝子であり、４８７アミノ酸タンパク質をコードすることが予想された。ＨＹＰ２に最もよくヒットしたのは、未知の機能のソラリウム・ツベロスム（Solarium tuberosum）（ジャガイモ）タンパク質（GenBank アクセッション AY737314）であった。
【０１６０】
Ｒｉｄｅｒは、ｃＤＮＡ合成及び宿主ゲノムにおける組込みに必要とされるインテグラーゼコアドメイン及び逆転写酵素タンパク質を含有する１３０７アミノ酸タンパク質をコードする単一エクソンレトロエレメントであった。該座位の５番目の遺伝子は、２つのエクソンをから成り、そして分泌型デフェシンタンパク質をコードするＤＥＦＬ１であった。この遺伝子のイントロン内への転位は、Ｓｕｎ１６４２中のＤＥＦＬ１は不活性化されていることを強く示唆した（図１Ｃ）。植物デフェンシンは、抗菌及び殺虫性特質を有していることが報告されており、シロイヌナズナにおいて３１７までのメンバーを有するラージ遺伝子ファミリーのメンバーである３０、３１。植物発育における役割は、この大ファミリーのいずれのメンバーについても記載されていない。
【０１６１】
均一バックグラウンドにおける果形に対するｓｕｎ座位の影響を試験するため、候補遺伝子の一つの発現における相違が表現型の根底にあるのかどうかを確認するため、一組のｓｕｎにおいて異なっている準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）を発生させた。ＬＡｌ５８９バックグラウンドのＮＩＬの発育分析は、子房形状相違は、開花１０日前の花芽では無視できることを示した（図２Ａ及び２Ｂ）。
【０１６２】
開花時、子房形状はわずかではあるが有意差を示し始めた。しかしながら、形状の最も有意な相違は、開花５日後の発育中の果実で観察された（図２Ａ及び２Ｂ）。この結果は、ｓｕｎにより仲介される形状変化は、主として授粉及び受精に続いて明らかにされることを示しており、親遺伝子型の以前の分析８と一致する。子房及び果実発育間の５つの候補遺伝子の発現分析は、重複を欠いているＮＩＬと比較し、染色体７上に転位したコピーを有するＮＩＬにおけるＩＱＤ１２のより高い転写レベルを明らかにした（図２Ｃ）。ＩＱＤ１２の最も高い転写レベルは、開花５日後の若い発育中の果実において観察された。しかしながら、破壊された遺伝子ＤＥＦＬ１の転写レベルもＮＩＬにおいて有意に異なっており、ＩＱＤ１２とは本質的に逆である発現パターンを示した：ＩＱＤ１２が発現された時、ＤＥＦＬ１は発現されず、逆の場合も同じ（図２Ｃ）。
【０１６３】
逆転写ＰＣＲ分析は、重複を運ぶＮＩＬにおけるＤＥＦＬ１転写物の検出に失敗した。この発見は、この遺伝子内へのＲｉｄｅｒの転位の結果、ＤＥＦＬ１機能が破壊されたことを強く示す。Ｒｉｄｅｒにより転位された他の遺伝子、ＳＤＬ１様、ＨＹＰ１及びＨＹＰ２の転写レベルは、変化しないか又は検出不能であり、ＳＵＮ遺伝子の候補とはあまり思われなかった。
【０１６４】
ｓｕｎにより調節された果形表現型は量依存性であり、例えば、ｓｕｎ座位がヘテロ接合であったＮＩＬ植物は両親の中間の果形表現型を示し、それは機能獲得型変異を示す（図２Ｄ）。ＩＱＤ１２及びＤＥＦＬ１の転写レベルが量的効果により影響されるかどうかを探究するため、Ｓｕｎ１６４２又はＬＡ１５８９アレル又はヘテロ接合体について、個々の植物ホモ接合体の発育中の果実から総ＲＮＡを単離した。ノーザンブロット分析は、転位した断片についてホモ接合性の個体において、ヘテロ接合性植物におけるよりもおよそ２倍高くＩＱＤ１２が発現されたことを示した。同様に、転位した断片を欠くホモ接合性個体において、ヘテロ接合体よりもおよそ２倍高くＤＥＦＬ１が発現されたことを示した（図２Ｄ）。
【０１６５】
Ｓｕｎ１６４２バックグラウンドのＮＩＬにおいて、果形とＩＱＤ１２及びＤＥＦＬ１の発現レベルに同様の量的効果があったことも観察された（図７）。
従って、ただ一つの遺伝子が両方のホモ接合体状況において発現され、ＩＱＤ１２及びＤＥＦＬ１の発現が相互に排他的でありそして量依存性であったことを示している。さらに、これらの結果は、転位事象がＩＱＤ１２を、発育中の果実において高レベルのＤＥＦＬ１発現を通常与える因子のシス制御制御下のゲノム環境に置くことを示唆する。
【０１６６】
果形表現型の相補性
ＩＱＤ１２を包含するゲノム断片が、果実の伸長表現型を与えることができるかどうかを決定するため、２つのオーバーラップしているＳｕｎ１６４２λ遺伝子クローンからの全挿入物をアグロバクテリウム・ツメファシエンス  バイナリーベクター内にサブクローン化し、ＬＡ１５８９及びＳｕｎ１６４２バックグラウンドの丸形果実ＮＩＬを形質転換した。
これらの２つのクローン、ｐＨＸ２及びｐＨＸ４は、先祖遺伝子と共有されているプロモーター及びＬＴＲを含むが、異なった５’ならびに３’エンドポイントを含有する完全長ＩＱＤ１２遺伝子を有する（図３Ａ）。
【０１６７】
ＬＡ１５８９バックグラウンドにおいて、ｐＨＸ４構築物を有する一次植物形質転換体（Ｔ１）のほとんどは、非常に高いレベルでＩＱＤ１２を発現し、一方、この遺伝子は、ｐＨＸ２一次形質転換体においては非常に低く発現されるか、又は全く発現されない（図３Ｂ及び図１０−表１）。
【０１６８】
さらに、ｐＨＸ４形質転換Ｔ１植物は、有意に大きな果形指標を示し、一方、ｐＨＸ２構築物で形質転換された植物は示さない。回帰分析は、ＩＱＤ１２転写レベル、及び順にｐＨＸ４構築物での形質転換と相関する果形指標間に極めて有意な相関があることが確認された（図３Ｃ）。Ｓｕｎ１６４２バックグラウンドの丸形果実ＮＩＬの同一構築物での形質転換は類似の結果を生じた：ｐＨＸ４で形質転換された系統は、対照系統と比較してより大きな果形指標を示したが、一方、ｐＨＸ２を運んでいる系統もどれもが有意に伸長された果実を示さなかった（図１１−表２）。
【０１６９】
ＩＱＤ１２の増加した発現及び増加した果形指標は、Ｔ２世代に遺伝され、そしてｐＨＸ４構築物の存在と同時分離された（図３Ｄ及び図８Ａ）。ＩＱＤ１２の転写レベル及びＴ２植物ホモ接合体の果形指標を、ＮＩＬのｐＨＸ４導入遺伝子と比較した。これらの結果は、大部分のトランスジェニック植物ファミリーについて、果形指標及びＩＱＤ１２転写レベルが、転位セグメントを運んでいるＮＩＬにより示されるレベルまで回復されたことを示した（図３Ｄ、図１０、図１３）。
【０１７０】
それ故、ｐＨＸ４で形質転換された植物から得られたデータは、トマトの果形の調節は、ＩＱＤ１２の転写レベルで制御されていることを示す。加えて、ＤＥＦＬ１の上流３．２ｋｂ領域中に位置する重要なシスエレメントは、この領域がＩＱＤ１２を発現するｐＨＸ４形質転換体中に存在し、そしてこの遺伝子を認識可能なレベルでは発現しないｐＨＸ２形質転換体が存在しないので、発育中の果実において高レベルのＩＱＤ１２発現を駆動するのに十分であった（図３Ａ〜３Ｃ）。
【０１７１】
また、ｐＨＸ２及びｐＨＸ４形質転換体からの結果は、ＳＤＬ１様及びＨＹＰｌ遺伝子は、これらの遺伝子が果形に影響しないｐＨＸ２構築物上に存在するので、果形に影響することにおいての候補ではありそうもないことを示した（図３Ｂ、３Ｃ）。
【０１７２】
転写レベル及び果形指標は、ｐＨＸ４を運んでいるトランスジェニック系統において有意に増加したが、転位したセグメントを運んでいるＮＩＬのレベルまでは完全には回復されなかった。それ故、この構築物の５’エンドポイントを超えたＤＥＦＬ１  ５’上流領域中の追加のシスエレメントが果形表現型の完全な回復に必要であるか、又は他の遺伝子が必要とされる可能性がある（図３Ｄ及び図８）。
【０１７３】
ＩＱＤ１２単独でトマト果実に伸長形状を与えるのに十分かどうかを決定するため、この遺伝子を丸形果実ＬＡ１５８９において過剰発現させ、転位セグメントを運びそして伸長果実を示すＬＡ１５８９での発現をノックダウンするためのＲＮＡインターフェランス（ＲＮＡｉ）戦略を使用した。構成的ＣａＭＶ  ３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターの調節下のＩＱＤ１２で形質転換した１３のＬＡ１５８９系統の内６が非常に伸長された果実を生じ、ＩＱＤ１２を高レベルで発現した（図３Ｅ；図１２−表３、図９Ａ）。
【０１７４】
ＩＱＤ１２を過剰発現したトランスジェニック系統において果実及び種子のセットが有意に減少したので、これらの系統は、トランスジェニック花粉を野生型ＬＡ１５８９雌しべの授粉に使用することにより維持された。生じたＴ２植物は、非常に伸長した果形及び付随するＩＱＤ１２の高レベルの発現が、導入遺伝子の存在下で次世代に遺伝されたことを示した（図３Ｂ、図１３−表３）。
【０１７５】
ＩＱＤ１２インバーテットリピート構築物で、転位セグメントを運ぶＮＩＬを形質転換するＲＮＡｉ戦略を使用する相補性実験は、１４の一次Ｔ１形質転換体の内の７つにおいて、減少した果形指標及び減少したＩＱＤ１２発現を生じた（図３Ｆ、図１３−表４、図９Ｃ）。
【０１７６】
これらの形質転換体の３つについて、果形表現型は丸形果実非形質転換ＮＩＬと本質的に区別できなかった（図１２−表３）。
より丸い果実を生じる７つの一次トランスジェニック植物の子孫試験及び非形質転換ＮＩＬとの比較は、ＩＱＤ１２転写レベルの減少がより丸い果実を生じることを確認し、それは導入遺伝子の存在に依存していた（図１２−表３、図９Ｄ、９Ｅ）。
【０１７７】
これらの結果は、非常に増強されたＩＱＤ１２の転写レベルは、ｓｕｎ座位により調節される果形表現型を制御し得ることを示す。ＩＱＤ１２は、ｓｕｎ座位により制御されたトマト果実に伸長された表現型を与えた（ＩＱＤ１２遺伝子をＳＵＮと新たに命名した）。
【０１７８】
ＳＵＮは植物で観察されるタンパク質のＩＱＤファミリーのメンバーである
ＩＱＤファミリーの最も際立った特徴は、すべてのメンバーにより共有され、現在まで植物にのみ観察されている６７アミノ酸のドメイン、ＩＱ６７ドメインである２６。このファミリー元祖メンバーのＩＱ６７ドメイン、ＡｔＩＱＤ１はカルモジュリンに結合することが示されており、そして核に局在する３２。ＡｔＩＱＤ１の過剰発現はシロイヌナズナにおいて増加したグルコシノレートレベルを導いた３２。共有ドメイン構造及び系統発生解析に基づくと、ＳＵＮは、サブファミリーＩＩケレイドでクラスター化したＩＱ６７ドメイン含有タンパク質のサブグループの一部であるＡｔＩＱＤ１２（図４）に最も密接に相関する２６。しかしながら、イントロン位置の保存の基準を使用すると、ＳＵＮは、同一サブファミリーＩＩのメンバーであるＡｔＩＱＤ１１（図４Ａ）に最も密接に相関する。ＳＵＮ同様、ＡｔＩＱＤ１１は６エクソンを有し、タンパク質の一部をコードしない第一のエクソンを含んでいる。しかしながら、Abel et al２６により注目されているように、シロイヌナズナＩＱＤ１２はＩＱ６７ドメイン内に位置する高度に保存されたイントロンを欠く唯一のＩＱ６７ドメインメンバーであるので、この遺伝子は異常なゲノム構造を示す。それ故、このファミリーの分岐の後でシロイヌナズナＩＱＤ１２遺伝子からのイントロン除去が生じた、及びＳＵＮ及びＡＵＱＤ１２が共通の先祖配列を共有することができる可能性がある。アミノ酸レベルでのその最も近い類似性のため、ＳＵＮはシロイヌナズナＩＱＤ１２のトマトオルソログでありうると考えられた。植物ＥＳＴ及びゲノムデータベース検索は、ＳＵＮに最も相関する他のＩＱ６７ドメイン含有タンパク質を同定した。しかしながらこれらのいずれもイネを含む植物の単子葉植物のメンバーには相当しない。これらのタンパク質のＩＱ６７ドメインを使用して構築された系統樹は、２つのクラスターを示した；シロイヌナズナＩＱＤ１１及び他のＩＱＤ１２を含有するもの（図４Ｂ）。ＩＱＤ１１クレイド中の一つのトマトメンバー及びＩＱＤ１２クレイド中の２つのメンバーが同定された。加えて、ＳＵＮの近いホモログがジャガイモにおいて見出された（ＢＱｌ  １６２３１）。
【０１７９】
他のトマト種においてのｓｕｎの存在
次ぎに、より古いアクセッション（ヘアールーム）ならびに他のより最近のトマト導入物で観察された果形表現型にｓｕｎ座位が役割を果たしているかどうかを決定した。開放授粉したヘアールーム品種の起源は明らかでないが、いくつかはヨーロッパに起源しているようである。ヘアールームSpitze はルーマニアからもたらされたようであり、一方、Howard German は「古い国」からのようであり、おそらくドイツ起源である。Roma VF は１９６３にヘアールームRoma のバーティシリウム及びフサリウム耐性バージョンとして導入され、イタリアを起源とする。Banana Legs、Long John、Jersey Devil及びYellow Stufferはより最近の導入であるが、しばしばヘアールーム及び開放授粉品種とリストされる。Ｓｕｎ１６４２、Ｍ８２、ＴＡ４９６及びハインツ（Heinz）１７０６は、実験プロセシングトマト種を代表する。これらの遺伝子型は、トマト遺伝子移入系統（Ｍ８２）３３、ラージＥＳＴコレクション（ＴＡ４９６）３４の構築に使用され又はトマトゲノム配列決定プロジェクト（Heinz l706; SGN, www.sgn.cornell.edu）２５のリソースであった。
【０１８０】
これらのアクセッションがｓｕｎを運んでいるかどうかを決定するため、すべての品種をＳ．ピムピネリフォリウムＬＡ１５８９と交雑した。マーカー補助選択を介して、ｓｕｎでのホモ接合体Ｓ．リコペルシクム、ヘテロ接合体及びホモ接合体ＬＡ１５８９を、生じたＦ２集団の各々から同定した。これらの植物の成熟果実の形状を分析し、形状及びマーカースコアの相関を評価した（図５Ａ）。
【０１８１】
結果は、ｓｕｎで果形が分離した品種（「＋」で示されている）は、ｓｕｎで果形が分離しなかった品種（「-」で示されている）と比較してより大きな果形指標を示した（図５Ａ）。さらに、重複から誘導されたプローブを使用するサザンブロットハイブリダイゼーションは、ｓｕｎで果形が分離している品種（図５Ａ）はＳＵＮの転位したコピーを運んでいた（図５Ｂ）。
【０１８２】
発現解析は、重複を有する遺伝子型が、高レベルでＳＵＮを発現し、一方、重複した遺伝子を欠く遺伝子型はＳＵＮを発現しないことを裏付けた（図５Ｃ）。
伸長した果形を調節する別の座位であるｏｖａｔｅについてのこれらの品種の遺伝子型同定は、Long John、Roma VF及びHeinz 1706 が伸長した西洋ナシ型形状を果実に与えるアレルを運んでいることを示した。より伸長が少ない丸形品種、M82及びYellow Stufferにおける果形は、それぞれ、ｓｕｎの伸長型アレル又はｏｖａｔｅも運んでいなかった。それ故、成熟果実の果形指標に基づくと、より伸長された果実を示している品種はｓｕｎを運んでおり、一方、より伸長が少ない形状の果実はｏｖａｔｅを運んでいる。丸形又はわずかに卵形形状果実を生じるアクセッション、M82及びYellow Stufferは、どちらの座位も運んでおらず、一方、最も極めて伸長したトマト果実を運んでいるLong John は、伸長形状ｓｕｎとｏｖａｔｅアレルの両方を有する（図５Ａ）。これらの結果は、ｓｕｎ座位を生じさせる転位セグメントは伸長果実を運んでいる品種のサブセットに存在し、そのいくつかは及び現代型であるヘアールームなどであった。それ故、一度ｓｕｎ座位が生じたら、それは生殖質を介してまさに広がり、現在まで維持されていた。
【０１８３】
議論
本明細書で提供されるのは、ヘアールーム及びトマトの現代品種に観察される伸長果実表現型を生じる異常な突然変異事象の証拠である。該突然変異は、別のゲノム状況内へのＳＵＮの重複の結果であった。トマト染色体７上のＳＵＮの新規の位置は、子房及び果実の発育中にこの遺伝子の高い発現を可能にし、それは伸長した果形を生じる。植物において、表現型の変化を生じるコピー数変異体を生じる転位は現在まで記載されていない。
【０１８４】
染色体７上のＳＵＮはＤＥＦＬ１のプロモーターの下流に位置される。異なったプロモーター長を有するゲノム構築物での形質転換は、実際、ＤＥＦＬ１プロモーターがＳＵＮの転写のためのエンハンサーとして働くことを暗示する。
【０１８５】
ＬＴＲはプロモーター及びエンハンサー活性を運ぶことが知られており、ＲｉｄｅｒのＬＴＲがＳＵＮ転写のエンハンサーとして働くことはありそもなく、なぜなら、このＬＴＲは植物を形質転換する両方のゲノム構築物上に存在し、そしてそれらの一つのみが果形表現型の相補性を生じるからである。
【０１８６】
機能獲得型変異は、自律性ＬＴＲレトロエレメントＲｉｄｅｒによる転位事象から生じる。コアレトロエレメントの転位は、近隣遺伝子の３’形質導入ならびにＳＵＮをＲｉｄｅｒの数ｋｂ上流からこの自律性エレメントの２０ｋｂ下流へ移動させる第二の再配列に関係していた。該転位がどのように遺伝子の導入及び生じた第二の再配列と関係しているかを説明するため、モデルを図６Ａに記載した。
【０１８７】
染色体１０上のＲｉｄｅｒの転写は、すべてのＬＴＲレトロエレメントのようにＬＴＲ１で始まる。典型的には、転写はＬＴＲ２で停止するであろう：それに代わり、転写リードスルーは、第二のＬＴＲを通過して起こり、はるかに超えて隣接するゲノム領域内に続く（図６Ｂ）。ＳＤＬ１様遺伝子の第一のイントロンにおいて、ＲＮＡポリメラーゼがＩＱＤ１２の領域３’に切り替える。おそらく、これら２つの領域がお互いに近接しているので、こうしたテンプレートスイッチが必要とされるのであろう。ブレイクポイント両側にある５ｂｐ直接リピート配列「ＧＣＡＧＡ」は、ここがテンプレートスイッチが起こる場所であることを示唆する。その後、転写物の伸長がＬＴＲ１での終結まで続き（図６Ｂ）、２つのＬＴＲの一部、ｍＲＮＡの５’末端のＲセグメント及びＵ５領域及びｍＲＮＡの３’末端のＲセグメント及びＵ３領域が隣接するラージｍＲＮＡ分子が生じる３７（図６Ｃ）。ラージｍＲＮＡの逆転写、続いてのＰＰＴ＊で開始される第二鎖合成は、３つの同一ＬＴＲを有する２４．３ｋｂエレメントを生じる；全エレメントが隣接するＬＴＲｌ及びＬＴＲ３及び内部又は単独ＬＴＲとしてのＬＴＲ２（図６Ｄ）。この巨大なエレメントは次ぎに染色体７内に挿入され（図６Ｄ）、ｓｕｎ座位で観察されるゲノム構造を生じる（図６Ｅ）。
【０１８８】
証拠のいくつかの系統は、提案された転位機構と一致する。第一に、２４．３ｋｂ重複断片はＲｉｄｅｒの２つのＬＴＲにより囲まれており、Ｒｉｄｅｒが該重複中に直接的に含まれていることを示唆している（図６Ｃ）。第二に、２つのシグネチャーＴＳＤ配列「ＡＴＡＴＴ」は２つの外側ＬＴＲ（ＬＴＲ１及びＬＴＲ３）に隣接されており、全断片が単一転位事象により移動したことを強く示唆している（図６Ｃ−６Ｅ）。転位のこの説明は、染色体１０上のレトロエレメントの元々のＴＳＤ、「ＧＡＣＣＴ」がコピーされ、現在、染色体７上のＬＴＲ２及びＬＴＲ３の境をなしている（図６Ｅ）。また、このモデルは、ＩＱＤ１２及びＳＤＬ１様遺伝子のイントロンの保持を説明し、なぜなら、それらはＲｉｄｅｒに関してアンチセンス配向であるからである。それ故、該イントロンは認識されず、ＲＮＡ合成後に、スプライシング機構により除去される。Ｒｉｄｅｒの３’遺伝子の導入及び続いての転位事象は非常に異常であり、なぜなら、２つの隣接するＬＴＲの一部は逆転写及びＬＴＲレトロトランスポゾンの二本鎖ＤＮＡ
に絶対的に必要とされるからである３７。それ故、ＬＴＲの一部がＲＮＡ分子に隣接されない限り、このエレメントは転位について競合的ではあり得ない。それ故、テンプレートスイッチを介してＲｉｄｅｒで起こるように、もし形質導入が別のＬＴＲで終結すれば、ＬＴＲ２を通過するＬＴＲレトロエレメントの転写は、有効なトランスポゾンのみを生じるであろう。転写リードスルー及び３’形質導入、続いての転位の成功は、転写が特定の部位で終わる必要のない非ＬＴＲレトロエレメントにおいてより普通に観察される。
【０１８９】
第二の部位への３’形質導入及び転位の例は、ある種のＬ１仲介レトロ転位事象で観察されている３８−４０。実際、ヒトにおいて、ゲノム配列の１％は非ＬＴＲエレメントにより仲介されるこうした機構により形質導入されてきたと推定された２１。Ｒｉｄｅｒの転位に多分最も類似している３’形質導入事象の興味ある例は、非ＬＴＲ  ＳＶＡレトロトランスポゾンにより仲介される４１。アシルマロニル縮合酵素１をコードするヒトＡＭＡＣｌの重複は、３’配列形質導入機構を介してこのエレメントにより仲介され、ＳＶＡエレメントの下流に位置するプロモーターを含む全遺伝子が複製され、ＳＶＡレトロエレメントに沿って、３つの異なった染色体領域内に挿入される４１。さらに、重複された３つのＡＭＡＣ１遺伝子の２つは、本来の遺伝子と比べて異なった組織中で異なって発現され、そしてそれ故、そのレトロ転位後に、ＡＭＡＣ１重複物の各々に対して新規機能性を作り出されている４１。しかしながら、Ｒｉｄｅｒにより仲介された形質導入及び転位事象は、もしこれらのエレメントが適切な転位のために隣接するＬＴＲを必要とするならば、ＬＴＲレトロエレメントについては非常に希である。
【０１９０】
本明細書に開示したごとく、クローン化ＳＵＮはトマトにおいて伸長した形状を調節している主たる遺伝子の１つである。ＳＵＮは、裸子植物から被子植物さらに蘚類までの多様な植物種に見出される、Ｑ６７ドメイン含有タンパク質をコードする２６、３２。さらに、ＳＵＮは他のアクセッションにおいて果形を制御し、それ故トマト生殖質において重要な突然変異を示す。タンパク質のこのファミリーの元祖メンバーはシロイヌナズナＩＱＤｌタンパク質である。ＩＱＤ１はグルコシノレート産生に役割を果たし、カルモジュリンを結合し、そして核に局在化している３２。他のシロイヌナズナメンバーの機能は知られていない。グルコシノレートはナス科種によっては産生されず、それ故、ＳＵＮはトマトにおいてこれらの代謝物の産生に影響しそうもない。しかしながら、ＡｔＩＱＤ１は、ＣＹＰ７９Ｂ3及びＣＹＰ７９Ｂ２を含むいくつかのチトクロムＰ４５０遺伝子の転写制御に役割を果たしているとも考えられている３２，４２。ＣＹＰ７９Ｂ３はＣＹＰ７９Ｂ２と一緒になって、トリプトファンのインドール−３−アセトアルドキシム（ＩＡＯｘ）への変換を、シロイヌナズナにおけるトリプトファン依存性オーキシン生合成において触媒する４３−４５。ＡｔＩＱＤ１がオーキシン生合成のホメオスタティックコントロールにおいて役割を果たしているかどうかは明らかではないが、ＡｔＩＱＤ１の過剰及び過少発現は、植物の生長をわずかに妨害する３２。二次代謝物ならびに植物ホルモンの産生及び感受性を調節することは、植物生長を同調させるため及び環境及び発育圧力に応答するために植物が使用する共通の戦略である。ＩＱＤタンパク質ファミリーは植物系列に広く存在しているので、これらのタンパク質は、生活環において重要な役割を果たすことができ、他の種において植物形態の多様性に影響することができる。それらの多様なアミノ酸配列タンパク質構造は、それらの進化間に持続する広範な選択圧力を暗示することができる２６。それ故、ＩＱＤ遺伝子は、各植物種に特異的な選択圧力に応答するための新規機能に進化することができる。
【０１９１】
トマトにおいて、ＳＵＮの過剰発現は非常に伸長した、そしてしばしば種なし果実を生じる。これらの特色は、胚珠においてオーキシン産生を調節する発現から生じる、単為結実の及び伸長した及び先のとがった果実を思い出させる。
【０１９２】
ＳＵＮが過剰発現された場合の非常に伸長した果形及び適切な種子発育の欠如は、その潜在的生化学的機能に加え、このタンパク質がオーキシンのレベル又は果実中の分布に影響できることを示唆する（図３Ｅ）。結果として、形状変化におけるＳＵＮの関与はオーキシンホメオスタシスの調節を介しており、それにより果実のパターン形成に影響している。
【０１９３】
実施例−方法
植物材料
果形座位を説明している組換え体を同定するための高分解能スクリーニングは以前に記載されている９。Ｓｕｎ１６４２及びＬＡ１５８９バックグランド両方のｓｕｎで異なる準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）は、マーカー補助選択を使用し、反復親へ連続的に戻し交配することにより構築した。
【０１９４】
種々の構築物を運んでいる一次形質転換体（Ｔ１）は、Ralph M. Parsons Foundation Plant Transformation Facility, College of Agricultural and Enviromental Sciences, University of California（Davis, USA）にて、アグロバクテリウム仲介形質転換を介して発生させた。
【０１９５】
Ｔ２トランスジェニック体の選択は、サザンブロット分析により実施され、ホモ接合性は、ＫαｎＲ特異的プライマーＥＰ５５１及びＥＰ５５２（ｐＨＸ４トランスジェニック系統０６Ｓ４９６−５０１及びＰ３５Ｓ：ＩＱＤ１２０７Ｓ１５−１８）を使用して、又はＲＮＡｉベクター、ｐＦＧＣ５９４１においてカルコンシンターゼイントロンを増幅するプライマーＥＰ６８７及びＥＰ６８８を使用して子孫を遺伝子型同定することにより確認した。
【０１９６】
プライマー配列は図１３−表４に掲げられており、配列番号１４〜４１を示している。この実施例で使用した植物は、２５〜３２℃、４０〜６０％湿度及び高圧ナトリウムランプから２００μＭ−１ｍ−１ｓの光を供給して温室ないで生長させた。Wooster, Ohio, USA．で２００５年の夏の間に野外で生長させた、図５に示されている植物からＲＮＡを集めた。
【０１９７】
顕微鏡法
子房は開花１０日前に採取した。固定し、ＬＲホワイトレジンに包埋し、切片化し（５μｍ）、そしてトルイジンブルーで染色した。発育している子房はデジタルカメラ（Optronics 60806, Olympus America Inc. USA）を連結したLeica DM IRB 光学顕微鏡（Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Germany）で可視化した。
【０１９８】
新鮮な開花段階子房及び５ｄｐａ果実は、縦方向に分割し、付属デジタル顕微鏡カメラ  （SPOT RT KE, Diagnostic Instruments, Inc. USA）を備えたLeica MZFLIII 解剖顕微鏡を使用して写真を撮った。
【０１９９】
ファージライブラリーの構築及びスクリーニング
バクテリオファージλゲノムライブラリーを、Stratagene（La Jolla, CA）からのλ FixII Gigapack III XLキットの成分を使用し、ベクターλ Fix（登録商標）II中で構築した。Ｓｕｎ１６４２及びＬＡ１５８９の部分Ｓａｗ３ＡＩ消化ゲノムＤＮＡを、Ｘｈｏｌ消化ラムダFIX IIベクター内にライゲートした。ライブラリー構築の完全詳細はStockinger Lab Web site (http://www.oardc.ohio-state.edu/stockingerlab/)から入手可能である。ファージライブラリーをスクリーニングするため、及び染色体ウォークを開始させるために使用した第一のプローブは、ゲノムウォーキングアプローチ及びGenomeWalker キット (Clontech, California, USA)の成分を使用して、ＢＡＣ及びＬｐ８１Ｂ９−Ｆから発生させた。これらのＢＡＣ上の情報及び末端配列についてはVan der Knaap et al., ９を参照されたい。プライマーＥＰ８及びＥＰ９で増幅した断片はＢＡＣ及びＬｐ８１Ｂ９−Ｆからおよそ２ｋｂを地図作製した（図１３−表４、プライマー配列について）。
【０２００】
Ｓｕｎ１６４２ファージクローンＥＫ３６は両方の親ライブラリーのスクリーニング後に回収した。ギャップの他の末端には、ＢＡＣ及びＬｐ６１０２−Ｆがゲノム中に多コピーで存在し９、それ故、ゲノムライブラリースクリーニングに使用できなかった。代わりに、ゲノム中で独特に表現されるＬｅ３３０１−Ｒ９をファージライブラリースクリーニングに使用し、両方のライブラリーから同定されたいくつかのクローンを生じた。これらのスクリーニングに続いて、領域がカバーされるまで、オーバーラップしているファージクローンの独特な末端配列からの３２Ｐ標識プローブで連続的にスクリーニングした。
【０２０１】
ラージ挿入クローンの配列決定及びｓｕｎ座位コンティグの構築
最少にオーバーラップしているλクローンが同定され、全挿入物をｐＧＥＭ１１ｆｚ（＋）ベクターのＮｏｔＩ部位内にサブクローン化した。ショットガンライブラリーをプラスミド挿入物から発生させ、Ｍ１３フォワード及びＭ１３リバースプライマーを使用して配列決定した；全ての手順の完全詳細はStockinger Lab Web site (http://www.oardc.ohio-state.edu/stockingerlab/）から入手可能である。祖先座位に対応するＢＡＣクローンＨＢａ０７２Ｄ０８は、重複上に位置付けられたＥＫ３６のファージクローン末端を使用してHeinz l706 ライブラリー２５から同定した（プライマーＥＰ４５及びＥＰ４６、図１３−表４）。
【０２０２】
Purdue Genomics Core Facility, Purdue University で配列決定されたクローン、ＥＫ５８を除いて、配列決定は、Genome Sequencing Center, Washington University in St. Louis, Missouri, USA で実施した。ＢＡＣ  ＨＢａ０７２Ｄ０８クローンはショットガンサブクローン化し、配列決定し、セントルイスのGenome Sequencing Center, Washington University で仕上げして完了した。すべてのファージクローン挿入物配列の仕上げは、Molecular and Cellular Imaging Center at Ohio State University, Wooster, Ohio on the ABI Prism 3100 Applied Biosystem, Foster City, USAで、配列決定鋳型としてラージクローン又はサブクローンを使用し、プライマーウォーキングにより行った。シークエンサー４．１．４（Gene Code Corporation, USA)を使用し、そして手作業で補正及び編集し、クローン当たり一つのコンティグに配列を組み立てた。組み立てた配列中の疑わしい塩基判定は、ゲノムＤＮＡ鋳型を使用するＰＣＲ増幅及びＰＣＲ産物の配列決定によりチェックした。
【０２０３】
オーバーラップしているクローンの配列は、Ｓｕｎ１６４２及びＬＡ１５８９に存在する２つのアレルについての単一コンティグ代表物に組み立てた。一つの例外はＳｕｎ１６４２コンティグ中のおよそ３ｋｂのギャップであった（寄託されたEF094940 GenBank配列中の２７，７５５〜３０，６０１のヌクレオチド）。この領域は、祖先染色体１０座位と１００％同一性のためファージライブラリーから回収されなかった。この例において、ギャップの配列は、祖先バージョンを含む染色体１０  ＨＢａ０７２Ｄ０８  ＢＡＣ配列から推論した。これらのヌクレオチド配列が転位した染色体７重複に存在することを確認するため、プローブとしてこの領域にわたるＰＣＲ増幅断片（プライマーＥＰ２９3及びＥＰ２９４）を使用して、サザンブロットハイブリダイゼーションを実施した（図１３−表４）。このセグメントはギャップに位置付けされ、Ｓｕｎ１６４２ＤＮＡ及びＳｅａｌ及びＸｂａｌで消化された、サザンブロット上の期待されるサイズの２つのバンドを示した（データは示されていない）。ファイバーＦＩＳＨ実験で使用したオーバーラップファージクローンも、クローン間の距離は、染色体１０座位の完全配列に基づいて予測されたものであったことを示した（データは示されていない）。
【０２０４】
配列アノテーション
組立後、配列を、アブイニシオ遺伝子予測プログラムＦＧＥＮＥＳＨ（http://www.softberry.com/berry.phtml）を使用して分析した。ＮＣＢＩ  （http://www.ncbi.nln.nih.gov) 及びＴＩＧＲ（http://www.tigr.org）データベースを使用するゲノム配列の最終アノテーションは、Dr. Robin BuellのグループにおいてＴＩＧＲで行われた。配列決定され領域中の反復エレメントはそれらの反復特色及びトランスポサーゼコード配列の存在により同定された。具体的には、１ｋｂウィンドウを使用し、トマトゲノム配列に対するＢｌａｓｔ検索において、配列をクエリーとして使用した。トマトゲノム配列は、SOL Genomics Network（http://www.sgn.cornell.edu/) (27 Mb total size）からダウンロードした。検索において５つの又はそれ以上のヒットを有するゲノム断片を、末端配列、末端インバーテットリピート、直接リピート及び標的部位重複を含む、転位可能エレメントに関係する特色を手作業で試験した。全てのゲノム配列は、自律性トランスポゾンに関連するタンパク質のためのＮＣＢＩ重複性タンパク質データベース（２００７年２月１５日）に対して検索した。Ｒｉｄｅｒはこの領域で唯一の自律性エレメントであった。
【０２０５】
植物形質転換のための構築物
形質転換構築物ｐＨＸ２及びｐＨＸ４は、それぞれプラスミドｐＥＫ５９及びｐＥＫ６０の全ファージサブクローン挿入物を、クレノー平滑末端化ＢａｍＨＩ消化バイナリーベクターｐＣＩＢ１０Ｇ４６内にサブクローニングすることにより作製した（ＮｏｔＩにより放出され、そしてクレノーを使用して平滑末端化した）。クローンのエンドポイントは、図３Ａに示されている。
【０２０６】
ＲＮＡｉ：ＩＱＤ１２構築物、ｐＨＸ８は、逆転写されたｍＲＮＡから、プライマーＥＰ５２７及びＥＰ５２８を使用して増幅されたＩＱＤ１２ｃＤＮＡの５１２ｂｐ断片（ゲノム配列ＥＦ０９４９４０のヌクレオチド１６，１５４〜１６，６４６）をｐＦＧＣ５９４１４７内へのセンス及びアンチセンス配向でのクローン化により発生させた。
【０２０７】
ＩＱＤ１２を過剰に発現させるため、ＩＱＤ１２ｃＤＮＡの１．４ｋｂ断片（ゲノム配列ＥＦ０９４９４０のヌクレオチド１３，４６０〜１６，２８０に対応する）プライマーＥＰ５１９及びＥＰ５２０を使用して逆転写されたｍＲＮＡから増幅し、ＣａＭＶ  ３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターとｐＣＩＢ７１０４６のＮＯＳターミネーター間にサブクローン化してｐＥＫ６７を生成させた。プロモーター、挿入物及びターミネーターはＫｐｎｌ及びＸｂａＩにより該ベクターから放出させ、バイナリーベクターｐＣＩＢ１０Ｇの対応する部位内にサブクローン化してｐＥＫ６９を作製した。プラスミド構築物は、エレクトロポレーションを使用してアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＬＢＡ４４０４内に導入した。ＬＡ１５８９バックグラウンドのＳｕｎ１６４２アレルを運んでいるＮＩＬをプラスミドｐＨＸ８で形質転換した。プラスミド構築物、ｐＨＸ２、ｐＨＸ４及びｐＥＫ６９はＬＡｌ５８９及びＳｕｎ１６４２バックグランド両方の丸形果実ＮＩＬ植物を形質転換するために使用した。
【０２０８】
ノーザン及びサザンブロット分析
ＲＮＡ抽出のための組織を採取し、液体窒素で即時に凍結した。開花１０日前の花芽は以下のように同定した。解剖顕微鏡を使用し、萼片が残っている花芽分裂組織をちょうど囲った花芽を花序上に定めた。同じ花序で、上向きに４〜５の芽（より古い芽）を数え、様式及び開花するおよそ１０日前に起こる胚珠開始段階を記録した。開花５日後の果実を集めるため、最近開いた花（２４時間以内）を手で受粉して十分な種子及び果実のセットを確実にし、発育中の果実を５日後に採取した。総ＲＮＡは、Trizol（登録商標）試薬（Invitrogen Inc. USA）を使用し、製造元の推奨に従って単離した。各サンプルからの１０μｇの総ＲＮＡを、１．２％アガロースホルムアルデヒドゲルでサイズ分画した後、Hybond Nメンブランフィルターに移した。ノーザン及びサザンブロットハイブリダイゼーションの詳細なプロトコールはhttp://www.oardc.ohio-state.edu/stockingerlab/に見ることができる。遺伝子特異的プローブは、以前に記載したように９、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰの存在下、３サイクルＰＣＲ工程を使用して発生させた。
【０２０９】
ハイブリダイゼーション後、フィルターを高ストリンジェンシー、０．ＩＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で２０分で洗浄した。ブロットをphosphorimagerスクリーンに暴露し、Storm 840スキャナー（GE Life Sciences, USA）を使用して可視化した。遺伝子発現の定量化のため、シグナルをImageQuant 5.0（Molecular Dynamic System Inc. USA)で定量し、トマトｅＩＦ４ａ６遺伝子の発現に規格化した。プローブ鋳型の増幅に使用したプローブサイズ及びプライマーは図１３−表４にリストされている。
【０２１０】
アミノ酸アライメント及びＳＵＮの系統発生
トマトＩＱＤ１２／ＳＵＮ密接に相関している遺伝子は、Solanaceae Genomics Network (SGN), www.sgn.cornell.edu; Joint Genome Institute, http://genome.jgi- psf.org/; and NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov．を含む公的データベースに対してＴＢＬＡＳＴＮファンクションを使用するＢＬＡＳＴ検索により同定した。アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)ＩＱ６７モチーフ含有遺伝子がＮＣＢＩ２６から直接検索された。配列アライメントにはClustalX (vl.83)を使用した。無根系統樹もClustalXを使用して発生させた；ブートストラップ値は１０００試行を表す。MEME v3.5.4（http://meme.sdsc.edu/meme/meme.html）を、ＩＱＤ１２／ＳＵＮ及び３３のＩＱ６７アラビドプシス・タリアナ  ホモログ２６におけるモチーフを予測するために使用した。１．０ｅ−５より小さなｐ値を有するモチーフのみが示されている。
【０２１１】
異なった組織におけるＳＵＮの発現
図１４Ａは、ｓｕｎ座位での遺伝子構造を示す。ＳＵＮを含む２４．７ｋｂ重複はＤＥＦＬ１の発現を破壊した。図１４Ｂは、花組織におけるＳＵＮ及びＤＥＦＬ１の発現を示す。ノーザンブロットは開花時に花器官から単離されたＲＮＡを含む。ブロットはＳＵＮ、ＤＥＦＬ１そして最後に添加対照としてのｅＩＦ４ａ−６で連続的に探索した。Ｓｅ、萼片；Ｐｅ、花弁、Ｓｔ、雄しべ；Ｏｖ、子房。組織は、ｓｕｎ座位が異なるＬＡ１５８９及びＳｕｎ１６４２ＮＩＬから単離された、ｅｅ、ＳＵＮの追加のコピーを含有する；ｐｐ、ＳＵＮの追加のコピーを欠く。
【０２１２】
図１４Ｃは、異なった組織におけるＳＵＮ及びＤＥＦＬ１の発現を示す。組織は、ｓｕｎ座位が異なるＬＡ１５８９及びＳｕｎ１６４２  ＮＩＬから単離された。ｅｅ、ＳＵＮの追加のコピーを含有する；ｐｐ、ＳＵＮの追加のコピーを欠く。Ｒ、根；Ｈ、胚軸；Ｃ、子葉；Ｌ、葉；Ｓ、生長点。重複を運んでいる系統において、ＳＵＮは萼片、子房、胚軸及び生長点で高度に発現された。先祖のＳＵＮ遺伝子は根及び低レベルで他の組織に発現される。ＤＥＦＬ１は、２４．７ｋｂ重複を欠く植物（ｐｐ、ＳＵＮの追加のコピーを欠いている）においてＳＵＮの重複コピーと同一の組織で発現される。このことは、ＤＥＦＬ１のプロモーターはＳＵＮの重複コピーの発現を駆動していることを示す。
【０２１３】
トマトの花及び果実発育間の果形指標及びＳＵＮ発現変化
図１５Ａは、開花後日数の関数としての果形指標（長さ／幅比）を示す。果形変化は、グラフの上に示された果実／種子発育ランドマークと重ね合わさっている。黒三角は、ＳＵＮ遺伝子の２つのコピーを運んでいる準同質遺伝子系統（ＮＩＬ）の果形指標を表し、一方、灰色の丸は、ＳＵＮの１つのコピーのみを有するＮＩＬを表す。果形指標における最も大きな相違は、果実ランドマーク３及び４で達し、ランドマーク４〜１６細胞胚及び球状胚段階と一致している。果形指標は、各ゲノム型について５で植物当たり３つの花序から集められた。示されているデータは平均±標準誤差である。
【０２１４】
図１５Ｂは、ＬＡ１５８９  ＮＩＬの発育中の果実におけるＳＵＮ発現を示す。ノーザンブロットを、ＬＡ１５８９ｅｅ（ＳＵＮ遺伝子の２つのコピーを運んでいる）及び  ＬＡ１５８９ｐｐ（ＳＵＮの１つのコピーを運んでいる）について実施した。総ＲＮＡは、遺伝子型当たり５つの植物のプールされた組織から抽出し、ハイブリダイゼーションをプローブとしてＳＵＮを用いて実行した。ＳＵＮ発現は、開花から始まって開花２０日後まで非常に高かった。その発現は果実の熟成及び種子発芽段階に先だった開花２５日後に劇的に低下した。
【０２１５】
図１５Ｃは、ＬＡ１５８９  ＮＩＬの花出芽におけるＳＵＮ発現を示す。ノーザンブロットは、レーンの上に示した時点（日数）での全花又は芽から単離された総ＲＮＡに対して実施した。「０」時点は開花を示し、他の値は開花前（−）又は後（＋）の日数である。ＳＵＮの２つのコピーを運んでいる系統（ＬＡ１５８９ｅｅ）において、ＳＵＮの発現は開花２日前には低いが、授粉２日後までに劇的に増加する。ＳＵＮ発現の増加は、図１５Ａに示されている果形指標の変化に先立っている。ＳＵＮの１つのコピーを運んでいる系統（ＬＡ１５８９ｐｐ）においては、ＳＵＮ発現は低いが、しかしながら、ＬＡ１５８９ｐｐにおけるＤＥＦＬ１発現はＬＡ１５８９ｅｅにおけるＳＵＮ発現と類似の動態学をたどり、ＤＥＦＬ１プロモーターがＳＵＮ発現を駆動することを示している（図１４も参照されたい）。
【０２１６】
小葉形状に対するＳＵＮの影響
図１６Ａは、栽培種トマトの小葉を示す。図１６Ｂは、野生近縁種Ｓ．ピムピメリフォリウム  アクセッションＬＡ１５８９の小葉を示す。示された葉は、ＳＵＮの追加のコピーを有しない（ｐｐ）、ＳＵＮの追加のコピーを有する（ｅｅ）又はＳＵＮが構成的３５Ｓプロモーター下で発現された（ｏｘ）植物からのものである。最も注目すべき特色は、ＳＵＮが発現された場合の先がとがった葉の形状及び増加した鋸歯状の縁である（ｐｐとｅｅを比較されたい）。これらの特色は、ＳＵＮが過剰発現された場合に顕著である（ｅｅとｏｘを比較されたい）。これらの結果は、果形に加え、葉形も同様に劇的に変化することを示す。
【０２１７】
トマトの子房、果実及び複葉葉形に対するＳＵＮの過剰発現の影響
図１７Ａ〜１７Ｃは、Ｓ．ピムピメリフォリウムＬＡ１５８９バックグラウンドを示す。野生型（ＬＡ１５８９ｐｐ）及び５つの独立した形質転換体の開花段階の花の子房形状（図１７Ａ）、果形（図１７Ｂ）及び複葉葉形（図１７Ｃ）。子房の非常に伸長した細長い形状、果実及び葉のねじれた形状に注目されたい。
【０２１８】
図１７Ｄ〜１７Ｆは、Ｓ．リコペルシクムＳｕｎ１６４２バックグラウンドを示す。野生型（Ｓｕｎ１６４２ｐｐ）及びいくつかの独立した形質転換体の開花段階の花の子房形状（図１７Ｄ）、果形（図１７Ｅ）及び複葉葉形（図１７Ｆ）。ＳＵＮが３５Ｓプロモーターの調節下で過剰発現された場合、果形は開花時にすでに決定されている。さらに、小葉及び複葉葉形は、ＳＵＮが過剰発現された時点ですでに非常に影響されている。葉はねじれており、そして小葉はより先がとがった形状である。
【０２１９】
ｓｕｎが異なるＬＡ１５８９  ＮＩＬ果実の縦方向の細胞サイズ及び数の相違
図１８Ａは、開花５日後での果実の異なった部分の長さを示す。すべての果実部分は、ＳＵＮの存在下でより伸長される。図１８Ｂは、細胞サイズは果実の遠位末端でのみ有意に異なっていることを示す。図１８Ｃは、果実長と細胞サイズの比は、果実の中隔及び近位末端は有意により多くの細胞を有することを示す。それ故、ＳＵＮの影響は、主として果実の中隔における増加した細胞分裂に対するものであり、それにより果実長を増加させている。
【０２２０】
ｓｕｎが異なるＬＡ１５８９  ＮＩＬの横方向の細胞サイズ及び数の相違
図１９Ａは、授粉５日後の果実の幅を示す。全果実及び中隔幅は、ＳＵＮ重複を運んでいるＮＩＬにおいて有意に小さいことを示す。図１９Ｂは、中隔中の細胞数はＳＵＮ重複を運んでいるＮＩＬにおいて有意に少ないことを示す。図１９Ａ〜図１９Ｃは、細胞サイズは中隔又は果皮において有意差がないことを示す。図１８Ａ〜１８Ｃ及び図１９Ａ〜１９Ｃに示されている結果は、ＳＵＮが、果実の中隔及び近位末端において、方向性細胞分割を主に調節していることを示す。ＳＵＮの高発現は、増加した細胞分割を縦方向に導き、そして横方向の細胞分割を減少させる。このことは、該遺伝子がどこで又はいつ発現されるかに依存し、ＳＵＮが任意の植物種において任意の器官の形状に影響し得ることを示唆する。
【０２２１】
図２０は、Ｓ．リコペルシクムｃｖ  Ｓｕｎ１６４２ｐｐ（ＳＵＮ重複がなく、丸形果実を有する）及びＳＵＮを過剰発現させたＳｕｎ１６４２ｐｐの茎構造を示す。
丸形果実トマト（ｐｐ、対照）及び過剰発現体（３５Ｓ：：ｓｕｎ）の第６葉でのトマト茎の断面。切片は手切断し、そしてトルイジンブルーで染色した。維管束の木部組織が青く染まっている。対照植物における三角形茎形状と比較し、過剰発現している系統により示される丸形茎形状に注目されたい。髄細胞（茎の中心）を犠牲にした、過剰発現させた系統における木部の拡大も注目されたい。それ故、栽培種バックグラウンドにおいて、ＳＵＮの過剰発現は、茎構造の改変を導き、そして細胞同一性を変化させ、そこでは髄細胞が木部細胞になる。
【０２２２】
図２１−表５は、果形指標、小葉形状指標（図１６も参照されたい）、萼片及び子房形状指標、及びより少ない程度で花弁形状指標及び種子重量の変化を示す、Ｓｕｎ１６４２及びＬＡ１５８９バックグランド両方のｓｕｎが異なる準同質遺伝子系統を示している表５を示す。果実重量、果実当たりの種子数、胚軸及び節間長は改変されなかった。ＳＵＮが果実重量に影響せず、形状にのみ影響するという事実は、該遺伝子は生長を増加させることなく、生長の方向を変えるように働くことを強く示している。再び、この発見は、ＳＵＮが任意の植物器官の生長の方向を変化させることが可能であることを示す。
【０２２３】
図２２−表６は、葉形、果形、果実当たりの種子数、種子及び果実重量が、それ自身のプロモーター下でＳＵＮを発現している系統では、ＳＵＮ遺伝子重複を運んでいるＮＩＬと比較しても類似していることを示している表６を示す。このことはＳＵＮのみが植物器官の形状及び種子重量に影響し、ＤＥＦＬ１又はＨＹＰ遺伝子の一つ（仮定、図１４参照）のどちらも影響しないことを示す。
【０２２４】
追加のトマト品種及び他の植物におけるＳＵＮの発現
発明者は、３００を超えるトマト品種がＳＵＮ遺伝子を運んでいることも確立し、そして果実発育を通したその発現パターンを研究した。
【０２２５】
シロイヌナズナにおけるＳＵＮ発現
発明者は、シロイヌナズナにおいてもトマト遺伝子を発現させた。
他の植物におけるＳＵＮ発現
ＳＵＮは、全ての植物中で働く構成的プロモーターを使用し、シロイヌナズナに加えて他の植物においても発現し得る。
【０２２６】
明瞭さのために別述の態様の状況で記載された本発明の特定の特色は、単一の態様と組み合わせて提供することが可能であることが認識される。逆に、簡潔さのために単一の態様の状況で記載された本発明の多様な特色は、別々に又は任意の適した副次的組み合わせで提供することができる。
【０２２７】
本発明は、それらの具体的態様に関連して記載されてきたが、多くの改変、修飾及び変更は当業者には明らかになるであろう。従って、添えられた特許請求の範囲の精神及び広範な範囲内に含まれるすべてのこうした改変、修飾及び変更を包含することが意図される。本明細書で述べられたすべての出版物、特許及び特許出願は、各個々の出版物、特許及び特許出願が具体的に及び個別に本明細書に引用により組み込まれるものとして示されているのと同一の程度で、その全体が本明細書に参照文献として組み込まれる。加えて、本出願のいずれの参照文献の引用及び同定が、こうした参照文献が本発明の従来の技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。
【０２２８】
配列表は本発明の例示のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を提供する。該配列の使用に関連する形質は実施例に含まれている。
ヌクレオチド配列のGenBank 寄託番号EF094939 ［配列番号１］：ファイルBAC_72D08_Lycopersicum_es 、染色体１０上の配列に対応する。
ヌクレオチド配列のGenBank 寄託番号EF094940 ［配列番号２］：ファイル  sunLesc_Lycopersicu_escul 、いくつかの栽培種トマト（重複を運ぶ品種）におけるｓｕｎ座位の全配列に対応する。
【０２２９】
EF094940 ［配列番号２］におけるＳＵＮエクソン／イントロン位は以下の通りである。
ＥＸＯＮ  ゲノム座標  ｍＲＮＡ座標
エクソン1            13386-13522            1-137
イントロン1           13523-13964
エクソン２           13965-14051            138-224
イントロン２          14052-14135
エクソン３          14136-14447             225-536
イントロン３           14448-15013
エクソン４          15014-15238             537-761
イントロン４            15239-15386
エクソン５          15387-15518             762-893
イントロン５            15519-15685
エクソン６          15686-16858             894-2066
ヌクレオチド配列のGenBank 寄託番号EF094941 ［配列番号３］：ファイルsunLpip_Lycopersicum_pimp 、野生種中のｓｕｎ座位の配列に対応する。
ＳＵＮ遺伝子アミノ酸配列［配列番号４］：
MGKRRNWFTFVKRLFIPETESTADQKKPKRWRCCFLRKFKLRKCPAITSAPQQTLPEAKGTPQQTLTEAKEQQRKHAFAVAIATAAAAEAAVAAANAAADVIRLTDAPSEFKRKRKQAAIRIQSAYRAHLAQKALRALKGVVKLQAVIRGEIVRGRLIAKLKFMLPLHQKSKTRVNQIRVPTFEDHHDKKLINSPREIMKAKELKLKCKSLSTWNFNLASEQDSEALWSRREEAIDKREHLMKYSFSHRERRNDQTLQDLLNRKQNRRSYRIDQLVELDAPRKAGLLEKLRSFTDSNVPLTDMDGMTQLQVRKMHRSDCIEDLHSPSSLPRRSFSNAKRKSNVDDNSLPSSPIFPTYMAATESAKAKTRSNSTAKQHLRLHETLSGQHSPYNLKISSWRLSNGEMYDSARTSRTSSSYMLI
植物内に形質転換された場合に伸長果実を生じるクローンのＤＮＡ配列表。遺伝子、イントロン、プロモーター及び他の可能な制御領域を含有するＤＮＡ配列は、EU491503_suncdna ［配列番号５］及びSunLesc.txt/genbank ［配列番号４、７、８、９、１０、１０、１１、１２、１３］に示されている。
【０２３０】
ｐＨＸ４に包含されている構築物（ＥＫ６０）：ｎｔ  ７３０５−２１３７１［配列番号６］、トマト植物内に形質転換された場合に伸長果実表現型を与える。高められた転写のための調節エレメントは７３０５から１０５２８ｎｔに位置する。ＳＵＮの全プロモーターは７３０５−１３３８６にまたがる。ＳＵＮのコード領域はｎｔ１３９７４のエクソン２から始まる。ＳＵＮの３’ ＵＴＲはｎｔ１６２０４のエクソン６から始まる。ＳＵＮの３’下流領域はｎｔ１６８５８−２１３７１にまたがる。
【図３−３】
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【図３−４】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５−２】
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【図１５Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図５−１】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
2010538679000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年9月30日(2010.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリヌクレオチドであって：
（ａ）ポリペプチドをコードする配列であって、該配列は配列番号１、２、４、５及び６の少なくとも一つ又はそれらのセグメントである上記配列；
（ｂ）（ａ）の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する（ａ）又は（ｂ）のいずれかの配列の変異体；
（ｃ）（ａ）の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する（ａ）又は（ｂ）のいずれかの配列のオルソロガス配列；
（ｄ）（ａ）の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する（ａ）又は（ｂ）のいずれかの配列のいずれかのパラロガス配列又はそれらのＩＱモチーフと７０％の同一性を有するパラロガス配列；
（ｅ）ストリンジェント条件下、（ａ）のいずれかの配列とハイブリダイズする配列；及び
（ｆ）（ａ）−（ｅ）のいずれかの配列よりコードされているポリペプチドの保存ドメインと少なくとも７０％の配列相同性を有する保存ドメインを含むポリペプチドをコードする配列；
から成る群より選択され、保存ドメインは、トランスジェニック植物における該ヌクレオチドの発現を調節することにおいて及び形質を改変することにおいて、（ａ）−（ｅ）の配列のいずれかによりコードされたポリペプチドの機能に必要とされる、前記ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを発現するトランスジェニック植物であって、該トランスジェニック植物の少なくとも一部が、非トランスジェニック植物又は野生型植物と比較して改変された形質を有する、前記トランスジェニック植物。
【請求項３】
改変された形質が、
ホルモンレベルに対する感受性、植物の少なくとも一部の改変された形状、改変された植物サイズ；改変された葉形；改変された野菜形状、改変された果形；少なくとも部分的な単為結実果実、増加したＳＵＮレベル；及び減少したＳＵＮレベル；該単離されたポリヌクレオチドの一つの少なくとも一部の過剰発現であって、該改変された形質は単為結実果実を含む上記過剰発現；及び該単離されたポリヌクレオチドの一つの少なくとも一部の発現であって、該改変された形質は伸長した果形を含む上記一部の発現
の一つ又はそれ以上である、請求項２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
非トランスジェニック又は野生型植物と比較して改変された形質を有するトランスジェニック植物を産生するための方法であって：
（ａ）（ｉ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；及び
（ｉｉ）該ポリヌクレオチド配列に隣接する少なくとも一つの調節エレメントであって、該少なくとも一つの調節エレメントは標的植物中で該組換えポリヌクレオチドの発現を制御することにおいて有効である少なくとも一つの調節エレメント；を含む発現ベクターを提供すること；
（ｂ）植物細胞内に該発現ベクターを導入し、それによりトランスジェニック植物細胞を提供すること；
（ｃ）トランスジェニック植物細胞をトランスジェニック植物に生長させ、該トランスジェニック植物が該ポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドを発現する又は抑制することを可能にすることであって、該ポリペプチドは、該ポリペプチドを発現しない又は抑制しない非トランスジェニック植物と比較し、植物で形質を変化させる性質を有していること；及び
（ｄ）トランスジェニック植物と非トランスジェニック植物を比較することにより、改変された形質を有する少なくとも一つのトランスジェニック植物を同定すること；
の工程を含む方法。
【請求項５】
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列が、配列番号１、２、４、５、及び６、並びにそれらの組み合わせの少なくとも一つである前記ヌクレオチド配列を含む、形質転換されたかもしくはトランスジェニックである、植物、植物の部位、植物の種子、植物の細胞又は植物のトランスジェニック子孫。
【請求項６】
該トランスジェニック植物が以下の特徴：
（ｉ）該トランスジェニック植物がナス科ファミリーのメンバーから選択されること；
（ｉｉ）該トランスジェニック植物がトマト植物であること；及び
（ｉｉｉ）該トランスジェニック植物がトマト植物準同質遺伝子系統である；
の一つ又はそれ以上を含む、請求項２又は５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７】
天然に存在する果実とは異なっている形状を有する少なくとも一つの果実を有する植物を作製するための方法であって、果実の準同質遺伝子系統をＳＵＮインバーテットリピート構築物により形質転換すること、そして該植物を生長させることを含む、前記方法。
【請求項８】
植物の葉及び果形の少なくとも一つを改変するための方法であって、該植物において請求項１に記載のポリペプチドを導入すること及び発現させることを含み、該ポリペプチドを発現させることは、請求項１に記載のポリペプチドを発現しない植物と比較し、葉及び／又は果実の形状を改変する、前記方法。
【請求項９】
植物の少なくとも一つの形質を改変するための剤であって、活性成分として請求項１に記載のポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む、前記剤。
【請求項１０】
アンチセンス配向の単離された分子を含む発現ベクターにより形質転換された植物細胞であって、該植物細胞中でのベクターの発現は、対応する野生型植物と比較して改変された果形指標を生じ、そして
当該分子は、（ａ）配列番号１、２、４もしくは６に示されている配列、又はその変異体、又は（ｂ）（ａ）と同一の配列をコードする配列であるが、しかし、遺伝子コードの縮重に従って縮重している配列：を含む、前記植物細胞。
【請求項１１】
以下の特徴：
（ｉ）該分子がＳＵＮ、配列番号４であること；
（ｉｉ）生じた植物がナス科植物から成る群より選択されること；及び
（ｉｉｉ）該植物が、トマト、ジャガイモ、タバコ、ナスであること；
の一つ又はそれ以上を含む、請求項１０に記載の植物細胞。
【請求項１２】
請求項１０に記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物により産生される種子であって、植物細胞の野生型品種と比較して、娘植物の改変された果形指標を何世代にもわたって同じ特徴を示している、前記種子。
【請求項１３】
配列番号１；配列番号２；配列番号４；配列番号５；又は配列番号６を一つ又はそれ以上含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
ホルモンの発現又は代謝のレベルを植物において制御する方法であって、ＳＵＮの発現を植物において制御することを含む方法。
【請求項１５】
トランスジェニック植物がナス科ファミリーから選択される、請求項５に記載の植物。
【請求項１６】
植物がトマト植物である、請求項１５に記載の植物。
【請求項１７】
植物がトマト植物準同質遺伝子系統である、請求項５に記載の植物。
【請求項１８】
配列番号１、２、４、５、及び６を一つ又はそれ以上含むマーカー。
【請求項１９】
ホルモンがオーキシンである請求項１４に記載の方法。
【国際調査報告】
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