(57)【要約】  本発明は、ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現する、脂肪心臓組織由来の成体幹細胞の新規な集団の単離および特性決定に関する。前記細胞集団は、損傷を受けた心筋組織を再生するために細胞療法プロトコールで使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現する、単離された哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞。
【請求項２】
さらにβ−ＭＨＣを構成的に発現する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６から選択される一以上の表面マーカーをさらに発現する、請求項１または２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４】
表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、またはＶＥＧＦＲ２の一つ、二つ、三つ、四つまたは好ましくはいずれをも発現しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
（ｉ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６の一つ、二つ、三つ、四つ、五つまたは好ましくは総てを発現し、かつ
（ｉｉ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、またはＶＥＧＦＲ２の一つ、二つ、三つ、四つまたは好ましくはいずれをも発現しない、請求項３または４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
ａ）（ｉ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５の総てを発現し、かつ
（ｉｉ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、またはＣＤ１１７のいずれをも発現しない細胞、
ｂ）（ｉ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６の総てを発現し、かつ
（ｉｉ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、またはＶＥＧＦＲ２のいずれをも発現しない細胞、ならびに
ｃ）（ｉ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６の総てを発現し、かつ
（ｉｉ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、またはＶＥＧＦＲ２のいずれをも発現しない細胞
から選択される、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記脂肪心臓組織が脂肪心外膜組織である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
前記哺乳類がヒトである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３の構成的発現がそのin vitro増殖の間、安定して維持される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
（ｉ）ａ）ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現し、
ｂ）β−ＭＨＣを構成的に発現し、
ｃ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５の総てを発現し、かつ
ｄ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、またはＣＤ１１７のいずれも発現しない
脂肪心臓組織由来の成体幹細胞、
（ｉｉ）ａ）ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現し、
ｂ）β−ＭＨＣを構成的に発現し、
ｃ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６の総てを発現し、かつ
ｄ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、またはＶＥＧＦＲ２のいずれをも発現しない
脂肪心臓組織由来の成体幹細胞、ならびに
（ｉｉ）ａ）ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現し、
ｂ）β−ＭＨＣを構成的に発現し、
ｃ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６の総てを発現し、かつ
ｄ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、またはＶＥＧＦＲ２のいずれをも発現しない
脂肪心臓組織由来の成体幹細胞
から選択される、単離された哺乳類脂肪心臓細胞由来の成体幹細胞。
【請求項１１】
ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３の構成的発現がそのin vitro増殖の間、安定して維持される、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の哺乳類脂肪心臓細胞由来の成体幹細胞の群を含む、哺乳類脂肪心臓細胞由来の成体幹細胞の単離された集団。
【請求項１３】
ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現する哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞を含んでなる組成物を得るための方法であって、
ａ）哺乳類の脂肪心臓組織サンプルの細胞懸濁液を得て、
ｂ）前記細胞懸濁液から細胞を分離し、
ｃ）前記細胞を固相支持体上の培養培地中で、前記細胞を前記固相支持体に接着させる条件下で培養し、そして
ｄ）ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現する哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞を回収すること
を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により得ることができる、ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現する哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞を含む、組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の哺乳類脂肪心臓細胞由来の成体幹細胞、または請求項１３に記載の方法により得ることができる哺乳類脂肪心臓細胞由来の成体幹細胞を培養することを含む分化細胞を得るための方法であって、前記幹細胞を好適な特定の分化培地で培養することを含む、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法により得ることができる分化細胞。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法により得ることができる分化細胞を含む、組成物。
【請求項１８】
請求項１２に記載の細胞集団、請求項１４に記載の組成物、または請求項１７に記載の組成物と、薬学上許容されるビヒクルとを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１９】
非経口投与のための、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１２に記載の細胞集団、請求項１４に記載の組成物、請求項１８〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項１７に記載の組成物を含んでなる、生体材料。
【請求項２１】
心臓組織再生のための医薬組成物の製造における、または虚血性心疾患の処置のための医薬組成物の製造における、または心筋梗塞後処置のための医薬組成物の製造における、またはうっ血性心不全の処置のための、または新脈管形成を刺激するための医薬組成物の製造における、請求項１２に記載の細胞集団、または請求項１４に記載の組成物、または請求項１７に記載の組成物の使用。
【請求項２２】
前記医薬組成物が一種類以上の異なる治療薬と同時または逐次に投与される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記細胞集団に含まれる細胞が自家のものである、請求項２０または２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
前記細胞集団に含まれる細胞が同種異系のものである、請求項２０または２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
請求項１２に記載の細胞集団、または請求項１４に記載の組成物、または請求項１７に記載の組成物を含んでなるキット。
【請求項２６】
in vitroにおいて生物学的薬剤または薬理学的薬剤に対する細胞応答を評価するための方法であって、前記薬剤を、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の複数の幹細胞を含んでなる請求項１２に記載の細胞集団、所望により特定の細胞種へ分化した請求項１４に記載の組成物、または請求項１７に記載の組成物と接触させ、そして前記培養細胞集団に対する前記薬剤の効果を評価することを含む、方法。
【請求項２７】
前記幹細胞を心筋細胞へ分化させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
増殖因子および／またはサイトカインを得るための方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の哺乳類脂肪心臓細胞由来の成体幹細胞、請求項１３に記載の方法に従って得ることができる幹細胞、または請求項１５に記載の方法に従って得ることができる分化細胞を、前記増殖因子および／またはサイトカインの発現および産生に好適な条件下で培養し、そして所望により前記増殖因子および／またはサイトカインを分離することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規な脂肪心臓組織由来の成体幹細胞集団の単離および特性決定、ならびにその潜在的治療適用に関する。具体的には、本発明は、損傷を受けた心筋組織を再生するための細胞治療プロトコールにおける前記脂肪心臓組織由来の成体幹細胞集団の使用に関する。
【０００２】
背景技術
今日、先進国において、心血管疾患を含む変性疾患が有する多大な社会的かつ経済的影響により、従来の療法を改良することができる細胞前駆体の探索を促してきた。
【０００３】
心筋梗塞の主要な帰結は心筋の一部の不可逆的欠損であり、この心筋の一部は瘢痕組織に置き換わる。この不可逆的欠損により、心筋の収縮能の低下ならびに必要な心拍出量を得るためのポンピング機能の低下を引き起こし、生き残った心筋の過負荷をもたらして、ついには心不全に至る。１９９８年、心筋梗塞からの生存者は米国だけでも７５００万人を超える。これらの生存者のうち、３０％を超える人が梗塞後１年の間に死に至っている。梗塞後の生存率は、血管新生が無いために死滅した心筋領域の大きさに大きく依存する。ヒトにおいては、左心室の大きさの４５％を超える梗塞は不可逆的な心臓性ショックを引き起こす。
【０００４】
この心筋の局部的欠損は、アポトーシスによる細胞死の増加、筋細胞の肥大、および生き残った心筋における繊維症の増大とともに残りの心筋の再編成を引き起こす。この心筋の再編成は、一般に、「リモデリング」として知られ、非常に頻繁に心不全の発症を引き起こす。こういった状況では、心臓は適切な心拍出量を維持することができず、その個体の生命力の重大かつ段階的な制限をもたらす。
【０００５】
急性心筋梗塞後、ならびにうっ血性心不全を発症した患者においては、現行の療法では重篤な難治性心室機能不全を有するこれらの患者の心筋を完全に回復させることができない。心筋の欠損に現在用いられている治療法は総て、残っている心筋の機能を保存することを目的としている。
【０００６】
前記治療法の目的は、生き残った心筋細胞（心臓の収縮細胞）の機能を保存および改善し、アポトーシスまたは壊死のいずれかによるそれらの死滅を防ぐことである。心筋梗塞のほとんどの処置は、さらなる収縮細胞の欠損を防ぐために虚血領域の血流を回復させる試みである。これらの再潅流療法には血小板溶解剤（冠動脈内に形成された血栓を溶解する）、バルーン血管形成術（遮断された動脈を物理的方法により開くため）、または静脈グラフトにより閉塞した動脈の近位部と遠位部を連結するブリッジにより遮断された領域が迂回される冠動脈バイパスの使用が含まれる。１９９８年に米国だけで５０万件を超えるバルーン血管形成術および同様の件数のバイパス手術が行われた。これらの処置は多くの場合、損傷を受けた領域に対する冠動脈流の再確立を達成し、一定時間、心筋のさらなる欠損を回避する。しかしながら、それらには、介入時にすでに死滅している組織を回復させることができるものはない。この欠損が実質的なものであれば、長期的には、慢性心不全が起こり、致命的な心不全へと進行する。
【０００７】
これまでのところ、心機能を完全に回復させる致命的心不全の処置に対する唯一の選択肢は心臓移植である。しかしながら、臓器移植はドナーの不足、高い確率の移植臓器拒絶などのいくつかの問題を有する。
【０００８】
心不全の特定の症例においては、ドナーの不足のために、移植は必要とする患者の最大５％にしか利用できない選択肢である。この治療介入の高いコストは十分に限定された障害ではないとして、生涯続く免疫抑制による重いコスト負担と、これらの患者が結果として罹患する多数の新形成がこの治療法のさらなる限定要因となる。
【０００９】
従来、唯一胚胎児発生中に分裂した心筋細胞は心筋梗塞後に不可逆的に失われると考えられていたので、比較的近年まで心臓生物学の専門家は、心臓は自己再生能を持たないと考えていた。最近の研究によれば、この概念は根本的に変化した。
【００１０】
幹細胞の適用からの心臓の再生能の原理に基づく細胞療法または心筋形成術は、心疾患の処置における有望な治療経路として認識される。ここ５年、心筋再生の方法を明らかに示した一連の研究が行われ、成体心臓に再生能を有する内在性幹細胞および／または心外性幹細胞が存在することを実証した。これに関して、移植後の心臓キメラ現象の観察は、心筋組織に定着し、心臓の運命を選定し得る細胞の存在の信頼できる試験であった[Bayes-Genis A. et al., 2002, Host-cell derived cardiomyocytes in Sex-mismatch cardiac allografts. Cardiovasc Res 2002; 404-410]。
【００１１】
この分野の研究により求められる主要な目的の一つは、心臓再生療法に安全かつ有効に適用され得る最適な種類の幹細胞を特定することである。心臓再生に好適な種類の幹細胞は十分に増殖し、完全に機能的な心筋細胞の分化能を示し、心筋組織に組み込まれて隣接する細胞と電気化学的接触を確立でき、最後に、その適用が免疫拒絶または倫理面の問題により制限されないものでなければならない。
【００１２】
幹細胞はそれらの自己維持能およびそれらの可塑性を特徴とし、後者の用語は好適な刺激下で一以上の細胞系譜へ分化するそれらの能力に関するものである。幹細胞は、基本的に細胞系譜または株、起源の器官または組織の判定基準、特定の表面マーカーの発現、転写因子および／またはタンパク質の発現、ならびに分化能、すなわち生成可能な特定の細胞の数および種類に従って分類される。
【００１３】
幹細胞としては、胚幹細胞として知られる第一段階の胚（芽細胞）発達の一つの過程で得られる幹細胞と、成体幹細胞と呼ばれる成体体細胞組織由来のものとの間に明確な区分がある。成体幹細胞は分化組織に見られる非分化細胞であり、増殖し、一以上の細胞種へ分化する能力を有する。成体幹細胞は種々の成体組織に存在し、それらの存在は骨髄、脂肪組織、血液、角膜、網膜、脳、骨格筋、歯髄、消化管上皮、肝臓、および皮膚において広く記載されている。それらの性質のため、自己成体幹細胞は免疫適合性があり、その使用に当たっての倫理的問題もない。
【００１４】
内在性心臓幹細胞が確認されている[Beltrami, A.P. et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell 114, 763-76 (2003)、 Oh, H. et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 12313-8 (2003)]にもかかわらず、損傷後の組織修復は欠如しており、代わりの成体非心臓幹細胞の集団が検討されてきた[Goldstein, G. et al. Human umbilical cord blood biology, transplantation and plasticity. Curr Med Chem 13, 1249-59 (2006)、 Orlic, D. et al. Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice. Ann N Y Acad Sci 938, 221-9; discussion 229-30 (2001)、 Pittenger, M.F. & Martin, B.J. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circ Res 95, 9-20 (2004)、 Rangappa, S., Fen, C, Lee, E.H., Bongso, A. & Sim, E.K. Transformation of adult Mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes. Ann Thorac Surg 75, 775-9 (2003)、 Zvaifler, N.J. et al. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals. Arthritis Res 2, 477-88 (2000)]。
【００１５】
成体幹細胞は、マウスからヒトまで、損傷後の様々な哺乳類の心臓で試験されてきた。マウスにおいては、骨髄由来幹細胞で大きな期待が生まれたが、このような期待はそれらの心臓再生能が限定され、議論の余地があることを示す報告[Balsam, L.B. et al. Haematopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischaemic myocardium. Nature 428, 668-73 (2004)、 Murry, C.E. et al. Haematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts. Nature 428, 664-8 (2004)]により減退した。ヒトでは、前臨床において心機能に一定の改善を示したが[Assmus, B. et al. Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE-AMI). Circulation 106, 3009-17 (2002)、 Strauer, B.E. et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation 106, 1913-8 (2002)]、より最近の臨床試験は、細胞供給後の心機能に若干の上昇を示すに過ぎないことを示す[Dohmann, H.F. et al. Multicenter Double Blind Trial of Autologous Bone Marrow Mononuclear Cell Transplantation through Intracoronary Injection post Acute Myocardium Infarction a MiHeart/AMI Study. Trials 9, 41 (20
08)]。
【００１６】
虚血性心疾患の処置にために採用される主要なアプローチとしては、筋芽細胞[Herreros J et al., 2003. Autologous intramyocardial injection of cultured skeletal muscle-derived stem cells in patients with non-acute myocardial infarction. Eur Heart J. 2003 Nov; 24(22):2012-20、 Mathur A. et al. 2004. Stem cells and repair of the heart. Lancet 2004 Jul 10-16; 364(9429):183-92]または骨髄由来幹細胞[Tomita S et al., 2002. Bone marrow stromal cells contract synchronously with cardiomyocytes in a coculture system. Jpn J Thorac Cardiovasc Surg. 2002 Aug; 50(8):321-4、 Fernandez-Aviles F et al., 2004. Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction. Circ Res. 2004 Oct 1; 95(7):742-8. Epub 2004 Sep 9]の使用に基づくものが含まれる。しかしながらやはり、それらの臨床適用を困難にする一連の大きな障害がなお存在する。
【００１７】
よって、心機能を回復させる新たな種類の成体幹細胞の探索が、重要な取り組みとして続けられている。
【００１８】
白色脂肪組織はヒトの身体で最も豊富な組織の一つであり、身体の種々の領域に存在する。この白色脂肪組織は二つの細胞集団からなり、一方は成熟脂肪細胞、他方は間質血管画分（ＳＶＦ）に容易に分離することができる。後者はヘテロであり、骨髄の場合と同様に、間質画分と、造血細胞からなる画分との二つの画分に分割することができる。間質画分は培養中に接着する繊維芽細胞様細胞からなる。この比較的均質な細胞集団は、骨髄由来間葉幹細胞のものと同一ではないが類似の特性を有する[Zuk et al., 2001. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001 Apr; 7(2):211-28]。前記細胞は、一般に、脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）と呼ばれ、容易に単離し、比較的短い倍加時間および低い老化レベルで何ヶ月も培養することができる細胞である。皮下脂肪組織由来幹細胞の場合、後者は、各細胞系譜の特異的誘導因子に応答して、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、さらには心筋細胞を含むいくつかの細胞種へ分化することができる。ＡＤＳＣは心筋修復のための自己細胞の潜在的供給源であり得ることも発表されている（ＷＯ２００６／１２７００７号公報）。
【００１９】
これまで、成体幹細胞の臨床使用は、心機能の回復に関して、ある程度の結果しか上げられていないが、臨床試験は細胞療法が安全であることを証明し、幹細胞の治療適用後に心臓が再生能を有するという「概念の実証」である。
【００２０】
よって、たとえ近年において心筋再生の知識に著しい進歩があったとしても、心臓再生療法に安全かつ有効に使用することができる成体幹細胞集団、従って、心筋組織の傷害を修復するための簡単かつ有効な方法を提供する成体幹細胞集団は見出されていない。現在のところ、有効な梗塞後療法から利益を受けることができる患者の割合は低く、従って、既存の療法の有効性の改善ならびに特に多発性梗塞を受けた患者に対して心臓傷害を回復させることができる別の方法の探索が必要である。
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、心臓脂肪組織に由来する、好ましくは、驚くことにある特定の心筋形成傾向を有する心筋の心外膜領域に由来する成体幹細胞の新規な集団に関する。具体的には、本発明は、病態生理学的状況において心臓修復に寄与するための、細胞療法プロトコールにおける前記脂肪心臓組織由来の成体幹細胞集団の使用に関する。
【００２２】
本発明は、心臓周囲の脂肪（心外膜および／または心膜脂肪組織）に存在する成体幹細胞のこの新規な集団がin vitroにおいて心筋細胞系譜へと向かうある特定の傾向を有する一連の心臓特異的マーカーを、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルおよびタンパク質レベルの双方において構成的に発現するという知見に基づく。いずれの仮説にも縛られるものではないが、この傾向はおそらくは心筋組織と緊密に接触するそれらの位置およびそれらを取り巻く環境によるものと思われる。
【００２３】
本発明者らは、この新規な細胞集団が、すでに記載されている他の幹細胞集団に比べてより良好な心筋形成能を持つ可能性がある。従って、脂肪心臓組織から単離されたこの新規な成体幹細胞集団が、心臓組織の再生、および例えば一回以上の心筋梗塞を受けた患者またはうっ血性心不全を発症した患者など、機能的心筋組織が欠損している状態における処置に有用である可能性のある細胞系試薬であることを見出した。
【００２４】
本発明者らは特に、心外膜領域の新規なヒト心臓脂肪組織由来の成体幹細胞集団をそれらの表面マーカーにより特徴づけ、心臓転写因子ＧＡＴＡ−４およびＮｋｘ２．５、β−ミオシン重鎖（β−ＭＨＣ）、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎ１）、およびα−アクチニンと呼ばれる筋節成分、ならびにそれぞれ電気化学的結合および細胞内カルシウム分布のレギュレーターであるコネキシン−４３（Ｃｘ４３）およびＳＥＲＣＡ−２心筋細胞の種々の基本成分の遺伝子（ｍＲＮＡ）およびタンパク質の発現を分析した。これらのマーカーの総ての発現を構成的に、すなわち、特定の系譜へと向かう分化のためのいずれの種類の誘導因子も培養培地に加えることなく分析した。
【００２５】
ヒト心外膜脂肪組織（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）および皮下脂肪組織（ｓｕｂ−ＡＤＳＣ）サンプルからの成体幹細胞の実質的に均質な集団における免疫表現型プロファイル、ならびに心臓特異的マーカーの遺伝子およびタンパク質発現の比較研究を行った。前記細胞集団の単離および増殖は、皮下脂肪由来幹細胞に関してこれまでに確立されているプロトコールに従って行った。両細胞集団間の表面抗原の発現に関しては有意な違いは見られなかったが、ベースライン条件における遺伝子発現の特性決定のための比較アッセイでは（実施例３）、前記ｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞集団は驚くことに、皮下脂肪組織由来幹細胞（ｓｕｂ−ＡＤＳＣ）においてその発現に関する隣接する心筋細胞間の電気化学的結合を担う心臓転写因子ＧＡＴＡ−４およびＣｘ４３タンパク質の遺伝子（ｍＲＮＡ）発現レベルの統計学的に有意な増加を呈したことが明らかに示された。
【００２６】
遺伝子発現分析において得られた結果を、ウエスタンブロットおよび免疫蛍光による前記心臓特異的マーカーのタンパク質レベルでの発現の研究と比較した（実施例４）。免疫蛍光アッセイの結果は、核ＧＡＴＡ−４、β−ＭＨＣ、ＳＥＲＣＡ−２、Ｃｘ４３、およびα−アクチニンの発現、ならびに心臓脂肪組織由来幹細胞（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）集団における細胞レベルでのその分布を示す。ウエスタンブロットの結果は、ｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞に対する皮下脂肪組織由来幹細胞（ｓｕｂ−ＡＤＳＣ）の発現プロファイルの比較を示し、核タンパク質ＧＡＴＡ−４とＣｘ４３の発現の差異、および後者が培養期間中どのように維持され、または増加するかが確認された。さらにβ−ミオシン重鎖（β−ＭｙｃＨＣ）の、培養期間による発現の差異も見られた。
【００２７】
ｅｐｉ−ＡＤＳＣおよびｓｕｂ−ＡＤＳＣ細胞の集団における心筋細胞系譜の特異的遺伝子の発現の比較研究の結果は、心外膜脂肪由来幹細胞（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）集団が同じ個体からの皮下脂肪由来幹細胞集団よりも大きく心臓系譜へ傾くことを示す。
【００２８】
本発明者らによりヒト心臓脂肪組織由来の成体幹細胞（心臓ＡＤＳＣ）集団を用いて行われた、初期発現およびin vitro分化実験の分析に基づくさらなる研究においては、前記心臓ＡＤＳＣが固有の心臓型表現型を持ち、脂肪細胞に分化できないが、培養においては内皮細胞系譜に分化することが示された。前記心臓ＡＤＳＣは新脈管形成促進因子を分泌し、これらの細胞をラット心筋梗塞モデルの損傷を受けた心筋に移植したところ、注入された細胞は心臓タンパク質および内皮タンパク質を発現し、血管新生を高め、梗塞の大きさを軽減することにより、in vivoにおける心機能を改善し（実施例６および７）、従って、心臓ＡＤＳＣは心筋細胞療法の妥当な候補と考えることができる。
【００２９】
よって、一つの態様において、本発明は、ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現する単離された新規な哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞に関する。特定の実施形態においては、前記単離された哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞はそのin vitro増殖中にＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的かつ安定な様式により発現する。
【００３０】
別の態様において、本発明は、前記哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞の単離された集団に関する。
【００３１】
別の態様において、本発明は、ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現する哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞を含んでなる組成物を得るための方法に関する。前記方法に従って得ることができる組成物は本発明のさらなる態様である。
【００３２】
別の態様において、本発明は、前記哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞から分化細胞を得るための方法であって、前記幹細胞を好適な特定の分化培地で培養することを含む方法に関する。前記方法に従って得ることができる分化細胞は本発明のさらなる態様である。
【００３３】
別の態様において、本発明は、前記の単離された脂肪心臓組織由来の成体幹細胞集団、前記哺乳類脂肪心臓組織由来の幹細胞を含んでなる前記組成物、または前記哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞から得ることができる前記分化細胞を含んでなる組成物と、薬学上許容されるビヒクルとを含んでなる医薬組成物に関する。
【００３４】
別の態様において、本発明は、前記の単離された脂肪心臓組織由来の成体幹細胞集団、前記哺乳類脂肪心臓組織由来の幹細胞を含んでなる前記組成物、前記哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞から得ることができる前記分化細胞を含んでなる前記組成物、または前記医薬組成物を含んでなる生体材料に関する。
【００３５】
別の態様において、本発明は、心臓組織再生のための医薬組成物の製造における、虚血性心疾患の処置のための医薬組成物の製造における、心筋梗塞後処置のための医薬組成物の製造における、うっ血性心不全の処置のための、または新脈管形成を刺激するための医薬組成物の製造における、前記の単離された脂肪心臓組織由来の成体幹細胞集団、前記哺乳類脂肪心臓組織由来の幹細胞を含んでなる前記組成物、または前記哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞から得ることができる前記分化細胞を含んでなる前記組成物の使用に関する。
【００３６】
別の態様において、本発明は、心臓組織再生のため、虚血性心疾患の処置のため、心筋梗塞後処置のため、うっ血性心不全の処置のため、または新脈管形成を刺激するための、前記の単離された脂肪心臓組織由来の成体幹細胞集団、前記哺乳類脂肪心臓組織由来の幹細胞を含んでなる前記組成物、または前記哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞から得ることができる前記分化細胞を含んでなる前記組成物の使用に関する。
【００３７】
別の態様において、本発明は、心臓組織再生のため、虚血性心疾患の処置のため、心筋梗塞後処置のため、うっ血性心不全の処置のため、または新脈管形成を刺激するための方法であって、それを必要とする被験体に治療上有効な量の脂肪心臓組織由来の成体幹細胞、前記哺乳類脂肪心臓組織由来の幹細胞を含んでなる前記組成物、前記哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞から得ることができる前記分化細胞を含んでなる前記組成物、または前記医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【００３８】
別の態様において、本発明は、前記の単離された脂肪心臓組織由来の成体幹細胞集団、前記哺乳類脂肪心臓組織由来の幹細胞を含んでなる前記組成物、または前記哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞から得ることができる前記分化細胞を含んでなる前記組成物を含むキットに関する。
【００３９】
別の態様において、本発明は、in vitroにおいて生物学的薬剤または薬理学的薬剤に対する細胞応答を評価するための方法であって、前記薬剤を所望により特定の細胞種に分化させた、単離された脂肪心臓組織由来の成体幹細胞集団、または前記哺乳類脂肪心臓組織由来の幹細胞を含んでなる前記組成物と接触させ、そして培養中の前記細胞集団に対する薬剤の効果を評価することを含む方法に関する。
【００４０】
別の態様において、本発明は、増殖因子および／またはサイトカインを得るための方法であって、前記哺乳類脂肪心臓細胞由来の成体幹細胞、または前記幹細胞から分化した細胞を、前記増殖因子および／またはサイトカインの発現および産生に好適な条件下で培養し、そして所望により前記増殖因子および／またはサイトカインを分離することを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】（Ａ）は、心外膜および皮下脂肪の抽出画分の写真を示す。（Ｂ）は、ヒト心外膜脂肪組織由来の成体幹細胞（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）の形態が観察できる顕微鏡像を示す。（Ｃ）は、ヒト皮下脂肪組織由来の成体幹細胞（ｓｕｂ−ＡＤＳＣ）の形態が観察できる顕微鏡像を示す。
【図２】フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によるヒト心外膜脂肪組織由来の成体幹細胞（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）の免疫表現型の特徴を示す。試験下の４名の患者（Ｐ１〜Ｐ４）に相当するヒストグラムを示す［図２Ａ  ｅｐｉ−ＡＤＳＣ  Ｐ１、図２Ｂ  ｅｐｉ−ＡＤＳＣ  Ｐ２、図２Ｃ  ｅｐｉ−ＡＤＳＣ  Ｐ３、および図２Ｄ  ｅｐｉ−ＡＤＳＣ  Ｐ４］。これらのヒストグラムはｙ軸に試験下のマーカーの蛍光強度を、ｘ軸に細胞数を示す。各ヒストグラムは対照マーカー（黒）および試験下のマーカー（グレー）の発現グラフを重ね合わせて示す。ｘ軸上の、対照に対する試験下マーカーの横移動の程度は、細胞サンプルが対象マーカーに関してどの程度陽性かを示す。
【図３】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる成体幹ｅｐｉ−ＡＤＳＣおよびｓｕｂ−ＡＤＳＣ細胞集団間の心臓特異的マーカーの構成遺伝子発現の比較分析を示す。転写因子ＧＡＴＡ４の発現差異（継代培養２回および継代培養５回）が見られ（図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）、継代培養５回では、ｓｕｂ−ＡＤＳＣ幹細胞に対してｅｐｉ−ＡＤＳＣ幹細胞のＣｘ４３転写物レベル（その発現はおそらくＧＡＴＡ４により誘発される）の上昇も見られる（図３Ｂおよび３Ｃ）。分析した残りの心臓遺伝子（α−アクチニン、β−ＭＨＣ、心臓トロポニンＩ、ＳＥＲＣＡ−２およびＮｋｘ２．５）に関しては、細胞の培養中、それらの発現に関して有意な違いは見られなかった。
【図４】ウエスタンブロットによるｅｐｉ−ＡＤＳＣ（Ｅ）およびｓｕｂ−ＡＤＳＣ（Ｓ）成体幹細胞集団間の心臓特異的マーカーの発現の比較分析を示す。  図４Ａは、全抽出物の比較分析を示す。  図４Ｂは、細胞質（Ｃ）および核（Ｎ）画分で行った比較分析を示す。継代培養２回（ｐ２）および継代培養５回（ｐ５）の双方において、ｓｕｂ−ＡＤＳＣ幹細胞に対してｅｐｉ−ＡＤＳＣ幹細胞によるＣｘ４３およびＧＡＴＡ−４のタンパク質発現レベルの上昇が見て取れる。また、ｅｐｉ−ＡＤＳＣ幹細胞における継代培養５回でβ−ＭＨＣの発現の差異も見られる。
【図５】免疫蛍光によるｅｐｉ−ＡＤＳＣ成体幹細胞集団における心臓特異的マーカーの発現を示す。顕微鏡写真は、心臓タンパク質：ＧＡＴＡ−４、β−ＭＨＣ（βＭＨＣ）、α−アクチニン、ＳＥＲＣＡ−２、およびコネキシン−４３（Ｃｘ４３）の発現の、特異的抗体による検出を示す。ＧＡＴＡ−４が細胞核に最も多く見られること、β−ＭＨＣが構造的によく組織化されて筋原繊維を形成していること、およびα−アクチニン、ＳＥＲＣＡ−２、およびＣｘ４３が細胞中に拡散分布していることが見て取れる。
【図６】心臓ＡＤＳＣの単離および特性決定を示す。図６ａは、開胸心臓手術の際のヒト心臓の様子を示し、近位右冠動脈の隣接部で採取した心臓脂肪組織の生検を保持する鉗子が見られる（ＡＯ：大動脈、ＬＶ：左心室）。図６ｂは、集密前の心臓ＡＤＳＣの一次培養を示す（２０倍）。図６ｃは、心臓ＡＤＳＣのフローサイトメトリーによる免疫表現型検査を用いた分析の結果を示す棒グラフである。
【図７】脂肪形成分化培地で培養した後の心臓ＡＤＳＣ（図７ａ）および皮下ＡＤＳＣ（図７ｂ）のアリザリンレッドＳ染色による脂肪形成分化分析の結果を示す。図７ｃは、アッセイした種々の細胞集団（心臓および皮下ＡＤＳＣ）に関する、処置３週間および４週間後の脂肪細胞種陽性細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。
【図８】皮下ＡＤＳＣと比較した心臓ＡＤＳＣにおける心筋形成遺伝子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示す棒グラフである。値は、ある細胞種が同じ患者由来の他の細胞種の何倍発現されるかを示す（この場合には、心臓ＡＤＳＣと皮下ＡＤＳＣの比較）。皮下ＡＤＳＣに比べ心臓ＡＤＳＣではＧＡＴＡ４およびＣｘ４３転写物の統計学的に有意な増加が見られる（ＧＡＴＡ４、ｐ＜０．００１、Ｃｘ４３、ｐ＝０．０３１）。
【図９】ウエスタンブロットおよび免疫組織蛍光によるアッセイを受けた心臓ＡＤＳＣの心臓マーカーの基礎発現を示す。図９ａは、心臓および皮下（Ｓｕｂ）ＡＤＳＣ溶解液のウエスタンブロット解析の結果を示す（成体ヒト心臓タンパク質の抽出物を対照として用いた）。図９ｂ〜９ｄは、心臓ＡＤＳＣにおけるそれぞれβ−ＭＨＣ、ＳＥＲＣＡ２および筋節α−アクチニンの発現を示す（赤）。図９ｅは、心臓ＡＤＳＣにおけるＧＡＴＡ４（緑）およびＣｘ４３（赤）の発現を示す。図９ｃおよび９ｄのパネルでは、核はＨｏｅｓｃｈｔ  ３３３４２（青）で染色した。スケールバーは５０μｍ。
【図１０】心臓ＡＤＳＣと新生児心筋細胞との同時培養を示す。心臓ｅＧＦＰ＋−ＡＤＳＣ（緑：ａ、ｅ、ｉ、ｌおよびｐ）、ｃＴｎＩ（赤：ｂ、ｆおよびｊ）、β−ＭＨＣ（青：ｃ）、ＤＡＰＩによる核の対比染色（シアン：ｄ）（青：ｇ、ｈ’、およびｓ）。（ｈ’、ｋ’、およびｏ’）それぞれｈ、ｋおよびｏにおける点線のｘｚ様式で示したもの。共焦顕微鏡で撮影した、心臓ＡＤＳＣにおける心臓マーカーの同時局在を示す画像。Ｃｘ４３（赤：ｍ）、筋節α−アクチニン（シアン：ｎ）、ＳＥＲＣＡ２（赤：ｑ）、およびＧＡＴＡ４（シアン：ｒ）。（ｄ、ｈ、ｈ’、ｋ、ｋ’、ｏ、ｏ’、およびｓ）は合成画像である。スケールバーは５０μｍ（ａ〜ｄおよびｐ〜ｓ）、２５μｍ（and〜ｈおよびｌ〜ｏ）および１０μｍ（ｉ〜ｋ）。
【図１１】心臓ＡＤＳＣが培養中に内皮細胞へ分化することを示す。図１１ａは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定された、非処理対照細胞に比べＥＧＭ−２で処理した細胞の新脈管形成促進マーカーが何倍発現されるかを示す棒グラフである。図１１ｂは、分化処理後の心臓ＡＤＳＣによるＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬの組み込みを示す。図１１ｃ〜１１ｅは、マトリゲルコーティングを伴う心臓ＡＤＳＣの培養２、４、および７時間の細管の形成を示す（１０倍）。図１１ｆおよび１１ｇは、マトリゲルでのコーティング内に形成された細管のＧＳＬＩイソレクチンＢ４染色を示す。スケールバーは５０μｍ。
【図１２】種々の心エコー機能パラメーター：内径短縮率（ＦＳ）［図１２ａ］、駆出率（ＥＦ）［図１２ｂ］、および前壁厚（ＡＷＴ）［図１２ｃ］の値を示す。
【図１３】ラット心臓の形態計測分析の結果を示す。図１３ａおよび１３ｂは、術後３０日のラット心臓の、梗塞心筋を通る断面図のマッソンのトリクローム染色の結果を示す（ｅ、対照、ｆ、処理）。図１３ｃおよび１３ｄは、対照群および細胞処理群におけるラットのＬＶの梗塞サイズ％とＬＶ壁厚を示す。
【図１４】梗塞を有するラットの心臓におけるヒト心臓ＡＤＳＣのグラフトの結果を示す。心臓および内皮のin vivo分化が見て取れる。図１４ａは、心筋に注入された心臓ｅＧＦＰ＋−ＡＤＳＣを緑で示し、注入された心臓ｅＧＦＰ＋−ＡＤＳＣがヒト起源であることを確認するためにヒト核抗原（ＨＮＡ、赤）に対する免疫染色の結果が示される。図１４ｂ〜１４ｄは、心臓ＡＤＳＣが注入された心臓の切片における、ｃＴｎＩ（ｂ）、筋節α−アクチニン（ｃ）およびＣＤ３１（ｄ）（総て赤）に対する免疫染色の結果を示す。境界領域に注射したにもかかわらず、虚血性組織中にこれらの細胞の分布が見られるのは重要なことである。スケールバーは５０μｍ。
【図１５】ｅＧＦＰ＋（ＲＯＩ１）およびバックグラウンド（ＲＯＩ２）細胞の発光スペクトルの測定結果を示す。
【図１６】梗塞心筋における、具体的には、対照心筋の境界領域（図１６ａ）および心臓ＡＤＳＣで処理された心筋（図１６ｂ）における、ＧＳＬＩイソレクチンＢ４で染色された毛細血管の毛細血管密度分析の結果を示す。図１６ｃは、梗塞の境界領域および遠位領域における、対照群および心臓ＡＤＳＣ処理群の毛細血管数／ｍｍ２を示す棒グラフである。遠位領域では有意な違いは見られなかった。スケールバーは５０μｍ。
【発明の具体的説明】
【００４２】
本発明は一般に、心外膜および／または心膜領域に存在する心臓脂肪組織由来の成体幹細胞の実質的に均質な集団に関する。本発明者らは、前記細胞集団が、起源の異なる他の幹細胞に比べて大きな心筋形成能を有する、心臓系譜への特定の傾向を有することを見出した。よって、前記細胞集団は心臓組織の再生に有用である可能性がある。特に、本発明は、病態生理学的状況において心臓の修復に寄与する細胞療法プロトコールにおける、前記脂肪心臓組織由来の成体幹細胞集団の使用に関する。前記細胞集団は、例えば心筋梗塞を受け、かつ／またはうっ血性心不全を発症した患者の処置など、心筋の収縮能の欠如が見られる状態における心筋再生のための医薬組成物または生体材料の製造に使用することができる。
【００４３】
定義
本明細書の理解を助ける目的で、いくつかの用語および表現が本発明に関して用いられる場合の意味を以下に説明する。必要であれば、さらなる定義が本説明とともに含まれる。
【００４４】
「被験体」という用語は、動物、好ましくは、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、またはマウス）および霊長類（例えば、サル、ヒト）を含む哺乳類を指す。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【００４５】
「成体幹細胞」という用語は、幹細胞の特徴を有する分化組織に存在する細胞を指す。成体幹細胞は分化組織に見られる非分化細胞であり、増殖し、一以上の細胞種へ分化する能力を有する。成体幹細胞は、種々の成体組織に存在し、それらの存在は骨髄、脂肪組織、血液、角膜、網膜、脳、骨格筋肉、歯髄、消化管上皮、肝臓、および皮膚において広く記載されている。
【００４６】
本明細書において区別なく用いられる「脂肪組織」または「脂肪組織」という用語は、細胞質中に脂質を蓄積する細胞の会合により形成された間葉組織を示す。脂肪組織は、一方では、バッファーとしての働き、内部器官ならびに身体のより外部の構造の保護および適正な位置への保持を含む機械的機能を果たし、他方では、代謝機能も果たす。哺乳類では、褐色脂肪組織または褐色脂肪と白色脂肪組織の二種類の脂肪組織に区別することができる。これらの組織は、代謝の点と、細胞組成の点とで異なる組織と認識される。新生児と月齢６か月未満の乳児においては、褐色脂肪は低温環境に曝された際の補償機構としての産熱に関与するが、成人では、この産熱は甲状腺活性により媒介される。心筋細胞の前駆（幹）細胞の供給源としての新生児褐色脂肪および再生心臓療法におけるそれらの可能性のある使用が特定されるという文献が最近発表された(Yamada et al., 2006. Cardiac progenitor cells in brown adipose tissue repaired damaged myocardium. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Apr 7; 342(2):662-70. Epub 2006 Feb 10)。白色脂肪組織で行われた一連の研究は、それが生物のあらゆる主要な機能に直接的または間接的に関与していることを示す。白色脂肪組織は、互いに相互作用するいくつかの細胞集団からなる極めてヘテロな組織である。この点で、それらの場所による細胞の生物学および可塑性の違いを考慮する必要がある。男性および女性の肥満の比較は、脂肪組織の発達がその場所によって生物に異なる影響を及ぼすことを示す。また、これらの細胞の分化能もその場所に依存する。その沈着の起源による脂肪組織の間質細胞集団の分化能間の比較試験では、マウスの場合、最大分化能を有する脂肪組織は皮下脂肪組織であることが示された(Prunet-Marcassus et al., 2006. From heterogeneity to plasticity in adipose tissues: site-specific differences. Exp Cell Res. 2006 Apr 1; 312(6):727-36. Epub 2005 Dec 28)。
【００４７】
「脂肪心臓組織」という用語は、その解剖学的場所により心外膜脂肪組織（心筋を覆う）または心膜脂肪組織（心膜領域、すなわち心臓の近傍）に区別することができる心臓脂肪組織を指す。脂肪組織は、局部的および全身的双方の作用を有する分子を生成する極めて複雑な内分泌器官であることが知られている。それらの質的な特性が類似しているにもかかわらず、現在、異なる種類の脂肪組織、特に、皮下および内蔵脂肪組織は特定のタンパク質の異なる発現プロファイルを有することが知られ、活性な生物分子の産生における示差的特徴が示唆される(Dusserre E. et al.; 2000. Differences in mRNA expression of the proteins secreted by the adipocytes in human subcutaneous and visceral adipose tissues. Biochim Biophys Acta. 2000 Jan 3; 1500(1):88-96)。
【００４８】
「構成的発現」または「基礎発現」という用語は、その発現を誘導する因子の非存在下における遺伝子の発現を表す。構成的発現遺伝子は絶え間なく転写される遺伝子と理解される。
【００４９】
「単離された」という用語は、細胞集団に関する場合、ヒトを含む動物の器官または組織から単離された、in vitroまたはin vivoでその細胞集団と一般に会合している他の細胞集団を実質的に含まない細胞集団を指す。一般に、他のものを「実質的に含まない」細胞集団は、in vitroまたはin vivoでその細胞集団と一般に会合している他の細胞集団の少なくとも５０％から、好ましくは少なくとも６０％から、より好ましくは少なくとも７０％から、さらにより好ましくは少なくとも８０％から、一層より好ましくは少なくとも９０％から、一層さらに好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、またはさらには９９％から分離されている場合に得られる。
【００５０】
「虚血性心疾患」という用語は、冠動脈が所定の心筋領域に必要な酸素を運ぶことができず、心筋の働きが困難になることから起こる疾病を指す。冠動脈の変性の最も多い原因は動脈硬化またはアテローム性動脈硬化である。これらの二つの状況は、血液供給の低下に極めて敏感な心臓の細胞に血液を届きにくくする。冠動脈性心疾患または虚血性心疾患は、心臓に達する酸素量が不十分な場合に発現する。その主要な結果は、心筋梗塞、狭心症、冠動脈不全、心筋虚血、および突然死である。
【００５１】
「心不全」、「うっ血性心不全」、または「ＣＨＦ」という用語は、心臓が身体の他の器官の必要を満たすのに十分な酸素を供給する血液を送り出すことができない慢性疾患を指す。結果として、生物の生命維持に必要な器官が十分な酸素および栄養を受け取れず、生物からの老廃物の排除がさらに遅くなる。長引けば、生命維持に必要な系が働きを停止する。心不全は一般に、基礎にある心臓の問題の徴候である。
【００５２】
「心筋梗塞」、「急性心筋梗塞」、または「ＡＭＩ」という用語は、１本または数本の冠動脈またはそれらの分岐の閉塞による心筋の一部の虚血性壊死を指す。心筋梗塞は機能的心筋細胞の欠如を特徴とし、心筋組織は不可逆的に損傷を受ける。心筋または心臓の筋肉は、進行した冠動脈疾患が存在する場合に梗塞を受け、特定の症例においては、これは冠動脈瘤内にアテローム斑が存在する、または破れる場合に起こり、血管の急な閉塞が起こる。
【００５３】
「心臓再生」、「心臓組織再生」、または「心筋再生」という用語は、増殖し、心筋細胞へ分化し、損傷を受けた心筋組織および心機能を再生することができる幹細胞の移植による心臓組織細胞の欠損の修復を指す。
【００５４】
本明細書で用いる場合、「処置する」、「処置」、および「処置すること」とは、その処置を必要とする被験体に、本発明により提供される、脂肪心臓組織由来の成体幹細胞集団を含んでなる医薬組成物の投与から得られる病態生理学的状態の改善、治癒、または軽減を指す。
【００５５】
本発明の幹細胞
本発明は、ある特定の心筋形成傾向を有する心臓脂肪組織由来の成体幹細胞の新規な集団の同定に基づくものである。従って、それらは機能的心臓組織の欠損があった病態生理学的状態において細胞療法プロトコール、特に心筋組織の修復および／または再生に寄与するための細胞療法プロトコールに使用することができる。
【００５６】
よって、一つの態様において、本発明は、ＧＡＴＡ−４および／またはコネキシン４３（Ｃｘ４３）を構成的に発現する、単離された哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞（以下、本発明の幹細胞）に関する。
【００５７】
本発明の幹細胞は、本明細書において「心臓ＡＤＳＣ」と呼ばれることもあり、心臓脂肪組織の供給源、例えば、齧歯類、霊長類など、好ましくはヒトの哺乳類の、例えば、心外膜または心膜脂肪組織、例えば、心臓脂肪組織間質画分から得られる。特定の実施形態では、本発明の幹細胞はヒト心外膜脂肪組織から得られる。
【００５８】
本発明の幹細胞は自家、同種異系、または異種の細胞であり得る。特定の好ましい実施形態において、前記細胞は自家のものであり、それらが投与される被験体の心臓脂肪組織から単離される。
【００５９】
それらの起源に加え、本発明の幹細胞はＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現することを特徴とする。特定の実施形態においては、本発明の幹細胞はＧＡＴＡ−４およびＣｘ４３を構成的に発現する。
【００６０】
ＧＡＴＡ−４は、ジンクフィンガー転写因子のＧＡＴＡファミリーに属す転写因子である。このファミリーのメンバーは、数種の遺伝子のプロモーターに存在するＧＡＴＡモチーフを認識する。このタンパク質は胚発達に関与する遺伝子の調節、ならびに心臓の分化および機能に関与すると思われる。このＧＡＴＡ−４タンパク質をコードする遺伝子の突然変異は心臓中隔における欠損に関連付けられている。
【００６１】
コネキシン４３（Ｃｘ４３）は、ＧＪＡ１（ギャップ結合タンパク質）とも呼ばれ、コネキシンファミリーのメンバーである。このタンパク質は、ある細胞から別の細胞へ低分子量物質を拡散させるための経路を提供する細胞内チャネル群からなる、細胞内ギャップ結合の成分である。Ｃｘ４３タンパク質は、心臓の収縮の同期に重要な役割を果たすと思われる心臓のギャップ結合ならびに胚発達における主要なタンパク質の一つである。
【００６２】
これまでに考察されているように、骨格筋は心筋再生用の細胞を得るための可能性のある供給源であると考えられるが、骨格筋はＣｘ４３を発現せず、心筋細胞間に存在するギャップ結合が形成されない。従って、得られる筋管間と隣接する心筋の間の収縮は同期しない。この電気的結合の欠如が、いくつかの臨床系における悪性不整脈の発症を説明するものである(Herreros J et al., 2003. Autologous intramyocardial injection of cultured skeletal muscle-derived stem cells in patients with non-acute myocardial infarction. Eur Heart J. 2003 Nov; 24(22):2012-20)。
【００６３】
特定の好ましい実施形態では、本発明の幹細胞におけるＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３の構成的発現はそのin vitro増殖の間、安定して維持される。
【００６４】
本明細書において、「そのin vitro増殖の間」の細胞による遺伝子またはタンパク質の「安定な」発現という表現は、少なくとも２回のin vitro継代細胞培養中に実質的に同じレベルで維持される細胞による遺伝子またはその発現生成物（タンパク質）の発現を指す。すなわち、この細胞は、そのin vitro増殖のために、実施例１に記載のように３日または４日ごとに培養培地を交換しつつ集密前まで、３７℃、５％ＣＯ２を含む空気雰囲気下、１０％ＦＢＳ、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したα−ＭＥＭ培養培地での培養など、好適な条件下（培養培地、温度、雰囲気、希釈、培養培地変化など）でin vitro培養される。
【００６５】
本発明の幹細胞は、自家、同種異系、または異種の細胞であり得る。特定の好ましい実施形態においては、これらの細胞は自家のものであり、それらが投与される被験体の心臓脂肪組織から単離される。
【００６６】
特定の実施形態においては、本発明の幹細胞は、既に記載されている他の幹細胞集団ならびに脂肪心臓組織由来の成体幹細胞（本発明の幹細胞）と同じ被験体から得られた皮下脂肪組織由来幹細胞（ｓｕｂ−ＡＤＳＣ）に構成的には存在しないβ−ミオシン重鎖（β−ＭＨＣ）を構成的に発現する。このタンパク質は筋節（心筋細胞の収縮装置）の一部を形成するという事実により、心筋の収縮に不可欠な役割を果たしていることが知られている。
【００６７】
別の特定の実施形態においては、本発明の幹細胞は、そのin vitro培養中にＳＥＲＣＡ−２タンパク質を構成的に発現する。この筋形質タンパク質（ＳＥＲＣＡ−２）はＣａ２＋−ＡＴＰアーゼポンプであり、心筋細胞内部のカルシウムの細胞内分布の調節を担う。この機能はまた心筋の適切な収縮のための基礎でもある。
【００６８】
さらに、本発明の幹細胞はまた、ＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、およびＣＤ１１７などの一連の表面マーカー、ならびに所望によりマーカーＣＤ４５、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、およびＶＥＧＦＲ２の発現または非発現により特徴づけることができる。
【００６９】
特定の実施形態では、本発明の幹細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５から選択される一以上の表面マーカーをさらに発現することを特徴とする。すなわち、本発明の幹細胞は、表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５の少なくとも一つ、二つ、三つ、四つまたは好ましくは総てに関して陽性である。別の特定の実施形態においては、本発明の幹細胞は、表面マーカーＣＤ１６６をさらに発現することを特徴とする。従って、別の特定の実施形態においては、本発明の幹細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６から選択される１以上の表面マーカーをさらに発現することを特徴とする。すなわち、本発明の幹細胞は、表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６の少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つまたは好ましくは総てに関して陽性である。
【００７０】
別の特定の実施形態においては、本発明の幹細胞は、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７およびその組合せから選択される表面マーカーを発現しないことを特徴とする。すなわち、本発明の幹細胞は、表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、およびＣＤ１１７の少なくとも一つ、二つ、三つまたは好ましくは総てに関して陰性である。別の特定の実施形態においては、本発明の幹細胞は、表面マーカーＶＥＧＦＲ２を発現しないこと（または極めて微弱にしか発現しない）ことを特徴とする。従って、別の特定の実施形態においては、本発明の幹細胞は、表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、およびＶＥＧＦＲ２の少なくとも一つ、二つ、三つ、四つまたは好ましくは総てに関して陰性であることを特徴とする。
【００７１】
別の特定の実施形態においては、本発明の幹細胞は、その起源ならびにＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３の構成的発現に加え、（ｉ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５の総てを発現し、かつ（ｉｉ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、およびＣＤ１１７のいずれをも発現しないことを特徴とする。
【００７２】
別の特定の実施形態においては、本発明の幹細胞は、その起源ならびにＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３の構成的発現に加え、（ｉ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＤ１６６の総てを発現し、かつ（ｉｉ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、またはＶＥＧＦＲ２のいずれをも発現しないことを特徴とする。
【００７３】
別の特定の実施形態においては、本発明の幹細胞は、その起源ならびにＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３の構成的発現に加え、（ｉ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６の総てを発現し、かつ（ｉｉ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、またはＶＥＧＦＲ２のいずれをも発現しないことを特徴とする。
【００７４】
特定の実施形態においては、本発明の成体幹細胞は、
ａ）ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現し、
ｂ）β−ＭＨＣを構成的に発現し、
ｃ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５の総てを発現し、かつ
ｄ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、およびＣＤ１１７のいずれも発現しない
哺乳類、好ましくはヒトの単離された心臓脂肪(fatty (adipose))組織由来の成体幹細胞である。
【００７５】
別の特定の実施形態においては、本発明の成体幹細胞は、
ａ）ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現し、
ｂ）β−ＭＨＣを構成的に発現し、
ｃ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６の総てを発現し、かつ
ｄ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、またはＶＥＧＦＲ２のいずれをも発現しない
哺乳類、好ましくはヒトの単離された心臓脂肪(fatty (adipose))組織由来の成体幹細胞である。
【００７６】
別の特定の実施形態においては、本発明の成体幹細胞は、
ａ）ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現し、
ｂ）β−ＭＨＣを構成的に発現し、
ｃ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６の総てを発現し、かつ
ｄ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、またはＶＥＧＦＲ２のいずれをも発現しない
哺乳類、好ましくはヒトの単離された心臓脂肪(fatty (adipose))組織由来の成体幹細胞である。
【００７７】
特定の好ましい実施形態においては、本発明の幹細胞におけるＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３の構成的発現はそのin vitro増殖の間、安定して維持される。
【００７８】
目的の遺伝子およびタンパク質（例えば、ＧＡＴＡ−４、Ｃｘ４３、α−ＭＨＣ、β−アクチニンなど）の発現は、当業者に知られている常法により、核酸レベル（例えば、ｍＲＮＡレベル）またはタンパク質レベルのいずれかで測定することができる。
【００７９】
特定の実施形態においては、ある遺伝子の発現は、培養培地に特定の系譜への分化を誘導することができる成分を加えずに、すなわち、構成的発現条件下で、その遺伝子発現の分析により測定することができる。細胞における前記遺伝子の発現は、特に限定されないが、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、またはＤＮＡマイクロアレイなどの慣例技術により分析することができる。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、遺伝子が増幅される際にその定量的検出を可能とする逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の変形である。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは実施例３および６において、目的の心臓特異的タンパク質の遺伝子発現レベル（ｍＲＮＡ）を測定するために用いられる。ノーザンブロット技術は、ゲルからニトロセルロースまたはナイロン膜に総てのｍＲＮＡを転写することによってｍＲＮＡ配列の同定、位置決定、および定量を可能とする。特定のｍＲＮＡの存在は、好適なプローブとのハイブリダイゼーションにより検出される。ＤＮＡマイクロアレイ技術は、一連のＤＮＡ断片が結合される固相表面の使用に基づく。ＤＮＡを固定するために用いられる表面は極めて多様であり（例えば、ガラス、プラスチック、さらにはシリコーンチップ）、この技術はいくつかの遺伝子の発現を確認することを可能とし、多数の遺伝子の発現レベルを同時に測定することができる。
【００８０】
あるいは、タンパク質の発現を、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットまたは免疫蛍光などの免疫学的技術により分析することができる。ウエスタンブロット技術は、予め電気泳動により分離し、膜、一般にニトロセルロース膜に固定したタンパク質を、特異的抗体および例えば化学発光などの現像系とともにインキュベーションすることにより検出する技術に基づく。免疫蛍光による分析は、顕微鏡によるその発現および細胞下の位置の分析のための、目的タンパク質に特異的な抗体の使用に関する。一般に、研究下の細胞はパラホルムアルデヒドで予め固定し、非イオン界面活性剤で透過処理する。実施例４および６においては、ウエスタンブロットおよび免疫蛍光技術を用いる。ＥＬＩＳＡ技術は酵素でマークした抗原または抗体の使用に基づき、その結果得られるコンジュゲートは免疫活性と酵素活性の双方を有する。これらの成分の一つがマークされ、支持体上で不溶化されるので、この抗原−抗体反応は固定化される。従って、例えば分光測定法によって定量可能な反応を生成する特異的基質の添加により容易に現像することができる。この技術は、供試タンパク質の正確な細胞下の位置決定も分子量の決定もできないが、例えば臨床目的の体液（血清、細胞培養上清、腹水など）中の目的タンパク質の極めて特異的かつ高感度の検出を可能とする。
【００８１】
本発明の幹細胞表現型マーカーはまた、通常陽性／陰性に基づく好適ないずれかの技術により同定可能である。特定の実施形態においては、免疫組織化学プロファイルにより本発明の幹細胞をさらに特徴付けるために本発明の幹細胞においてその有無を確認しなければならない前記表現型マーカーに対する抗体、好ましくは、モノクローナル抗体を使用することができるが、当業者に公知の他の慣例技術も使用可能である。従って、特定の実施形態においては、選択された細胞におけるマーカーの存在または少なくとも一つのマーカー、好ましくはそれらの総ての検出可能な発現レベルを確認する目的で、少なくとも細胞表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５に対するモノクローナル抗体を用い、かつ、その非存在を確認するために少なくともＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、およびＣＤ１１７に対するモノクローナル抗体を用いる。別の特定の実施形態においては、選択された細胞におけるマーカーの存在または少なくとも一つのマーカー、好ましくはそれらの総ての検出可能な発現レベルを確認する目的で、少なくとも細胞表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６に対するモノクローナル抗体を用い、かつ、その非存在を確認するために少なくともＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７およびＶＥＧＦＲ２に対するモノクローナル抗体を用いる。同様に、別の特定の実施形態においては、選択された細胞におけるマーカーの有無または少なくとも一つのマーカー、好ましくはそれらの総ての検出可能な発現レベルを確認する目的で、少なくともＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、Ｄ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、Ｄ１１７、ＣＤ１６６、およびＶＥＧＦＲ２に対するモノクローナル抗体を用いる。
【００８２】
前記モノクローナル抗体は既知であるか、または当業者ならば常法によって得ることができる。本発明により提供される幹細胞の集団の免疫表現型的特性決定を行う様式は、特に限定されないが、実施例２および６に記載されている。
【００８３】
所望により、本発明の幹細胞は、特に限定されないが、その基本的特性（増殖、移動、分化転換など）に重要な遺伝子の発現を改変する、そのゲノムにおける導入遺伝子、欠失、または挿入の方法を含む常法のいずれかによって遺伝的に修飾することができる。よって、例えば、ex vivoにおいて増殖された、または損傷を受けた組織内に移植された成体幹細胞はそれらのテロメアが短くなるために老化が早いことが知られている。この現象、または他の現象を避けるため、例えば、その発現がこの、また他の望ましくない変更の作用を打ち消す遺伝子構築物を含有するレトロウイルス粒子を用いて、細胞に形質導入することは望ましいものであり得る。
【００８４】
本発明の幹細胞は増殖および自己再生能を有する。従って、それらは一度単離および同定されれば、in vitro (ex vivo)で増殖させることができる。よって、本発明の幹細胞が一度単離されれば、in vitroにおいて好適な培養培地で維持および増殖させることができる。特に限定されないが、前記培地はα−ＭＥＭ培地（イーグルの改変最小必須培地(Minimum Essential Medium eagle ilpha modification (Sigma Ref. M4526) Eagle, H. Media for animal cell culture. Tissue Culture Association Manual. 3.517-520.1976)、抗生物質およびグルタミンを含み、ウシ胎児血清（ＰＢＳ）が添加される。用いる細胞の必要に応じ、培地および／または培地添加物の濃度の変更または調節は各当業者の経験に依存する。血清は多くの場合、細胞の生存および増殖に必要な細胞成分および因子を含む。このような血清の例としては、特に限定されるものではないが、ＦＢＳ、ウシ血清（ＢＳ）、子ウシ血清（ＣＳ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、新生ウシ血清（ＮＣＳ）、ヤギ血清（ＧＳ）、ウマ血清（ＨＳ）、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ネコ血清（ＲＳ）などが挙げられる。本発明の幹細胞がヒト起源のものであれば、細胞培養培地にヒト、好ましくは自己血清を添加することも考えられる。添加物のカスケード成分を不活性化する必要が考えられる場合には、血清を熱により不活性化することができると理解される。一以上の所望の細胞の生存を促進するためには、血清濃度の調節、培養培地からの血清の除去を用いることもできる。別の実施形態においては、本発明の幹細胞は、血清が血清アルブミン、トランスフェリン、セレン、および特に限定されるものではないが、インスリン、血小板由来増殖因子、および成長因子、例えば、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む組換えタンパク質の組合せで置換された所定の組成を有する培養培地で増殖させることができる。
【００８５】
多くの細胞培養培地がすでにアミノ酸を含んでいるが、やはり、細胞を培養する前に何らかの添加を行う必要がある。このようなアミノ酸の例としては、特に限定されるものではないが、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシンなどが挙げられる。存在し得る細菌、マイコプラズマ、および／または真菌の混入を抑えるために通常、細胞培養には抗微生物剤も用いられる。用いられる抗生物質または抗真菌化合物は通常はペニシリンとストレプトマイシンの混合物であるが、例えば、アンホテリシン、アンピシリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、マイトマイシンなどの他の抗生物質または抗真菌化合物を含めることもできる。特に限定されるものではないが、Ｄ−アルドステロン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、デキサメタゾン、ｂ−エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロン、ソマトスタチン／ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）などを含むホルモンを細胞培養に添加することでもできる。
【００８６】
本発明の幹細胞の維持は、細胞を非分化型に留まらせる細胞因子を必要とする場合がある。当業者には、細胞分化を阻害する前記因子は本発明の幹細胞の分化細胞への分化を開始させる前に培養培地から除去しなければならないことが自明である。また、総ての細胞がこれらの因子を必要とするわけではないことも明らかである。実際、これらの因子は細胞の種類によっては望ましくない作用を引き起こし得る。
【００８７】
所望により、本発明の幹細胞は、細胞集団のクローニングに好適な方法を用いてクローン増殖させることができる。例としては、本発明の幹細胞の増殖された集団を物理的に回収し、個別のプレート（または「マルチウェル」プレートのウェル）に播種することができる。あるいは、本発明の幹細胞を「マルチウェル」プレートに、各ウェルに１個の細胞を入れるという操作（例えば、およそ０．１〜約１細胞／ウェルまたはさらには約０．２５〜１．５細胞／ウェル、例えば、０．５細胞／ウェル）を助ける統計学的割合でサブクローニングすることができる。当然のことながら、これらの細胞は低密度でクローニングすることができ（例えば、ペトリ皿またはその他の好適な培養基）、クローニングリングなどのデバイスを用いて他の細胞から単離することができる。クローン集団の生産はいずれの好適な培養培地で増殖させてもよい。いずれの場合でも、単離された細胞をそれらの発達表現型が評価できる時点まで培養すればよい。本発明の幹細胞を単離するための工程および方法はいずれも手作業で行うこともできるし、所望によりあるいは細胞の単離を容易にするために当業者に公知の好適なデバイスを使用することもできる。
【００８８】
一以上の細胞系譜または種類へと分化する本発明の幹細胞の能力の分析は、当業者に公知の分化の誘導の慣例の方法によって評価することができる。この目的のために、幹細胞は一般に、好適な特定の分化培地での幹細胞の培養を含む、各細胞種または系譜に好適な特定の分化プロトコールに従う。
【００８９】
脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞への特定の分化を誘導する通常のプロトコールに従い、予備的分化試験で得られた結果を分析した後、本発明者らは、本発明の幹細胞は、マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５にも陽性の他の成体間葉幹細胞集団、例えば、皮下脂肪組織由来幹細胞（ｓｕｂ−ＡＤＳＣ）に比べて分化能が減退（低下）していると考える。具体的には（実施例５）、本発明の幹細胞は皮下脂肪組織由来幹細胞に関して、これまでに確立されている脂肪形成、骨形成、および軟骨形成分化プロトコールに従い(Zuk et al., 2002. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002 Dec; 13(12):42795)、本発明の幹細胞は皮下脂肪組織由来幹細胞に比べて前記系譜への分化能が低かったことを見出した。しかしながらやはり、用いる特定の脂肪形成、骨形成、および軟骨形成系譜分化プロファイルの改変による、より高い分化能を得る可能性は無視することができない。よって、何らかの結論に結びつけようとするものではないが、本発明の幹細胞は、マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５にも陽性の他の成体間葉幹細胞集団のものとは異なる間葉系譜へ分化する特性を有すると考えるに至る証拠であると思われる。実際、本発明者らが行った付加的アッセイでは、本発明の幹細胞は脂肪細胞へ分化せず（実施例６）、皮下脂肪組織由来幹細胞（ｓｕｂ−ＡＤＳＣ）とは異なり、より低い可塑性およびより高い傾倒を示すことが確実であると思われる。
【００９０】
本発明の細胞集団
別の態様において、本発明は、ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現する哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞（本発明の幹細胞）の群を含んでなる、実質的に均質な単離された幹細胞集団（以下、「本発明の細胞集団」に関する。
【００９１】
特定の実施形態においては、本発明の細胞集団は、ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現する哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞を含んでなる。
【００９２】
別の特定の好ましい実施形態においては、本発明の細胞集団は、ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３の構成的発現がそのin vitro増殖の間、安定して維持される本発明の幹細胞を含んでなる。
【００９３】
別の特定の実施形態においては、本発明の細胞集団は、β−ＭＨＣおよび／またはＳＥＲＣＡ−２をさらに構成的に発現する本発明の幹細胞を含んでなる。
【００９４】
別の特定の実施形態においては、本発明の細胞集団は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５から選択される一以上の表面マーカーをさらに発現する本発明の幹細胞を含んでなる。特定の実施形態においては、本発明の細胞集団は、表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５の少なくとも一つ、二つ、三つ、四つまたは好ましくは総ての有意な発現を有する。別の特定の実施形態においては、本発明の幹細胞は表面マーカーＣＤ１６６をさらに発現することを特徴とする。よって、別の特定の実施形態においては、本発明の幹細胞は、表面マーカーＣＤ２９、Ｄ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６の少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つまたは好ましくは総ての有意な発現を有する。本明細書において「有意な発現」とは、その細胞集団では、これらの細胞の少なくとも３０％、好ましくは４０％、５０％、６０％、７０％、より好ましくは８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、フローサイトメトリーによりバックグラウンドシグナルを超えて測定される特異的細胞表面マーカーに対するシグナルを示すことを意味する。
【００９５】
別の特定の実施形態においては、本発明の細胞集団は、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、およびＣＤ１１７から選択される表面マーカーの一つ、二つ、三つまたはいずれをも発現しない本発明の幹細胞を含んでなる。特定の実施形態においては、本発明の細胞集団は、表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、およびＣＤ１１７の少なくとも一つ、二つ、三つまたは好ましくは総ての有意な発現を欠いている。別の特定の実施形態においては、本発明の幹細胞は、表面マーカーＶＥＧＦＲ２を発現しない（または極めて微弱にしか発現しない）ことを特徴とする。よって、別の特定の実施形態においては、本発明の幹細胞は、表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、およびＶＥＧＦＲ２の少なくとも一つ、二つ、三つ、四つまたは好ましくは総ての有意な発現を欠いている。本明細書において「有意な発現を欠いている」とは、その細胞集団において、これらの細胞の３０％未満、好ましくは２０％、１５％または１０％未満、より好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満が、フローサイトメトリーによりバックグラウンドシグナルを超えて測定される特異的細胞表面マーカーに対するシグナルを示すことを意味する。
【００９６】
別の特定の実施形態においては、本発明の細胞集団は、それらの起源ならびにＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３の構成的発現に加え、（ｉ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５の総てを発現し、かつ（ｉｉ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、およびＣＤ１１７のいずれをも発現しないことを特徴とする本発明の幹細胞を含んでなる。
【００９７】
別の特定の実施形態においては、本発明の細胞集団は、それらの起源ならびにＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３の構成的発現に加え、（ｉ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＤ１６６の総てを発現し、かつ（ｉｉ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、またはＶＥＧＦＲ２のいずれをも発現しないことを特徴とする本発明の幹細胞を含んでなる。
【００９８】
別の特定の実施形態では、本発明の細胞集団は、それらの起源ならびにＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３の構成的発現に加え、（ｉ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６の総てを発現し、かつ（ｉｉ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、またはＶＥＧＦＲ２のいずれをも発現しないことを特徴とする本発明の幹細胞を含んでなる。
【００９９】
別の特定の実施形態においては、本発明の細胞集団は、ａ）ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現し、ｂ）β−ＭＨＣを構成的に発現し、ｃ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の総てを発現し、かつｄ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６およびＣＤ１１７のいずれをも発現しない、哺乳類、好ましくはヒトの単離された心臓脂肪(fatty (adipose))組織由来の成体幹細胞を含んでなる。
【０１００】
別の特定の実施形態においては、本発明の細胞集団は、ａ）ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現し、ｂ）β−ＭＨＣを構成的に発現し、ｃ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６の総てを発現し、かつｄ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、またはＶＥＧＦＲ２のいずれをも発現しない、哺乳類、好ましくはヒトの単離された心臓脂肪(fatty (adipose))組織由来の成体幹細胞を含んでなる。
【０１０１】
別の特定の実施形態においては、本発明の細胞集団は、ａ）ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現し、ｂ）β−ＭＨＣを構成的に発現し、ｃ）表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６の総てを発現し、かつｄ）表面マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、またはＶＥＧＦＲ２のいずれをも発現しない哺乳類、好ましくはヒトの単離された心臓脂肪(fatty (adipose))組織由来の成体幹細胞を含んでなる。
【０１０２】
別の特定の実施形態においては、本発明の細胞集団は、齧歯類、霊長類などの哺乳類、好ましくはヒトの心臓脂肪組織、例えば、心外膜または心膜から得られた本発明の幹細胞を含んでなる。特定の実施形態においては、本発明の細胞集団は、ヒトの心外膜脂肪組織から得られた本発明の幹細胞を含んでなる。
【０１０３】
別の特定の実施形態においては、本発明の細胞集団は、心臓脂肪組織の間質画分から得られた本発明の幹細胞を含んでなる。
【０１０４】
別の特定の実施形態においては、本発明の細胞集団は、自家、同種異系、または異種起源の本発明の幹細胞を含んでなる。特定の好ましい実施形態においては、前記細胞は自家のものであり、それらが投与される被験体の心臓脂肪組織から単離される。
【０１０５】
所望により、本発明の細胞集団は、移植用細胞バンクに見出すことができる。特定の実施形態においては、前記細胞バンクは、重要な抗原の少なくとも一以上の遺伝子、すなわち、組織適合性抗原をコードする遺伝子（例えば、ヒト集団に存在する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の対立遺伝子）に関して同型接合性の複数の本発明の幹細胞を含んでなる。このバンクから、細胞移植または埋植を必要とする被験体のＭＨＣの対立遺伝子と適合する組織適合性抗原の一以上の対立遺伝子に関して同型接合性の本発明の細胞を選択することができる。
【０１０６】
所望により、本発明の細胞集団は、再構成後のその生存力に影響なく、支障もない条件下で冷凍して、維持することができる。
【０１０７】
本発明の幹細胞を含んでなる組成物を得るための方法
別の態様において、本発明は、ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現する哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞を含んでなる組成物を得るための方法であって、
ａ）哺乳類の脂肪心臓組織サンプルの細胞懸濁液を得て、
ｂ）前記細胞懸濁液から細胞を分離し、
ｃ）前記細胞を固相支持体上の培養培地中で、前記細胞を前記固相支持体に接着させる条件下で培養し、そして
ｄ）ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３を構成的に発現する哺乳類脂肪心臓組織由来の成体幹細胞を回収すること
を含む方法（以下、本発明の方法）に関する。
【０１０８】
脂肪心臓組織サンプルは、脂肪心外膜組織または脂肪心膜組織、好ましくは心外膜脂肪組織から得ることができる。前記脂肪心臓組織サンプルは齧歯類、霊長類などの哺乳類、好ましくはヒト由来のものである。哺乳類の前記脂肪心臓組織サンプルは当業者に公知の常法により得ることができる。特定の実施形態においては、前記脂肪心臓組織サンプルは脂肪組織の間質画分から抽出される。脂肪心臓組織の好適な供給源は近位右冠動脈付近の領域または大動脈周辺の心臓基部であり、そこからの脂肪心臓組織は慣例の心臓手術に際して得ることができる。実施例１はヒト脂肪心臓（特に心外膜）組織サンプル取得の形式を詳細に示す。
【０１０９】
抽出された脂肪心臓組織サンプルを洗浄し、切断して小断片とし、細胞懸濁液を得るためにこれを酵素的に消化し（または他の慣例手段による）、遠心分離にかけ、得られた細胞ペレットを好適な培地（例えば、血清、グルタミン、および抗生物質を添加したα−ＭＥＭ培地を含んでなる培養培地）に再懸濁させ、固相支持体（例えば、プラスチック、培養プレート、培養フラスコなど）に、細胞をその固相支持体に接着させる条件下（例えば、３７℃、５％ＣＯ２を含む空気雰囲気）で播種し、細胞が接着したことが認められたところで（培養条件にもよるが、例えば、およそ２４時間後）培養培地を除去し、接着した細胞を洗浄した後、それらのin vitro増殖を行う。この目的で、接着細胞（本発明の幹細胞）を好適な培養培地（例えば、血清、グルタミン、および抗生物質を添加したα−ＭＥＭ培地）の存在下、好適な条件下（例えば、３７Ｃ、５％ＣＯ２を含む空気雰囲気）で培養し、このような条件で集密前まで（例えば、およそ８０％の集密度になるまで）、定期的に培養培地の総てまたは一部を交換しつつ（例えば、３日または４日おき）培養維持する。これらの細胞は、その分析を可能とする量の細胞材料（すなわち、最小数の細胞）となるまで、繰り返し培養（継代培養）することができる。特定の実施形態においては、前記細胞は少なくとも２回培養され（すなわち、それらは２回の継代培養を受け）、一般には３回、４回、５回、またはそれを超える。特定の実施形態においては、前記細胞は２回培養したが（継代培養２回）、別の特定の実施形態においては、好適な希釈率で５回培養した（すなわち、継代培養５回まで（３〜４か月））。このような操作により、固相支持体（例えば、培養プレート）から剥離した後に本発明の幹細胞５〜６×１０３／ｃｍ２の細胞密度が得られる。両場合とも（継代培養２回および５回）、ＧＡＴＡ−４およびＣｘ４３の発現を分析したところ、これらの細胞（本発明の幹細胞）のin vitro培養中、前記心臓特異的マーカーの構成的発現が実質的に安定に維持されることが認められた。実施例１および６は、ヒト脂肪心外膜組織からの本発明の幹細胞の取得、同定、特性決定、および単離を詳細に示している。
【０１１０】
これまでに記載してきた本発明の方法に従って得ることができる、結果としての本発明の幹細胞を含んでなる組成物は本発明のさらなる態様である。
【０１１１】
分化細胞
別の態様において、本発明は、本発明の幹細胞を好適な特定の分化培地で培養することを含む、分化細胞を得るための方法に関する。特定の実施形態において、前記特定の分化培地は、心筋形成系譜へと分化させるための特定の培地である。別の特定の実施形態では、前記特定の分化培地は、内皮系譜へと分化させるための特定の培地である。別の特定の実施形態においては、前記特定の分化培地は、脂肪形成、骨形成または軟骨形成系譜へと分化させるための特定の培地である。前記特定の分化培地は当業者に公知である。
【０１１２】
前記細胞分化法から得ることができる分化細胞（以下、本発明の分化細胞）は、本発明のさらなる態様である。特定の実施形態においては、本発明の分化細胞は心筋細胞、骨細胞、または軟骨細胞である。
【０１１３】
別の態様において、本発明はまた、本発明の分化細胞と好適な培地を含んでなる組成物に関する。
【０１１４】
医薬組成物
別の態様において、本発明は、治療上有効な量の本発明の細胞集団、または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物、または本発明の分化細胞と薬学上許容されるビヒクルを含んでなる組成物を含んでなる医薬組成物（以下、本発明の医薬組成物）に関する。
【０１１５】
本明細書において「治療上有効な量」とは、所望の治療効果が得られるよう本発明の医薬組成物が含まなければならない、本発明の細胞集団、または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物、または本発明の分化細胞を含んでなる組成物中に存在する本発明の幹細胞の量を指し、このような治療上有効な量は一般に、他の因子の中でも、細胞の固有の特徴および求める所望の治療効果により決定される。投与しなければならない本発明の細胞の治療上有効な量は一般に、他の因子の中でも、処置される疾病の病期、被験体固有の特徴、罹患領域によって異なる。このため、本明細書に述べられている用量は、当業者にとっての指針としてだけ考慮すべきであり、当業者はこれまでに記載されている因子に応じてその用量を調整しなければならない。限定されるものではないが例として、本発明の医薬組成物はおよそ１×１０５〜１×１０９の間、好ましくは１×１０６〜１×１０８の間、より好ましくは１×１０７、および５×１０７の間の本発明の幹細胞を含有する１回量として投与することができる（なお、この幹細胞は部分的または完全に分化していてもよく、あるいはその組合せであってもよい）。この用量は、患者の症状および進行によって、数日、数週間、または数ヶ月の間隔で繰り返すことができ、各場合で専門家が確定しなければならない。
【０１１６】
本発明の細胞集団または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物中に含まれる本発明の幹細胞、ならびに前記組成物中に含まれる本発明の分化細胞は、自家、同種異系、または異種の細胞であり得る。特定の好ましい実施形態においては、前記細胞は自家のものであり、それらが投与される被験体の心臓脂肪組織から単離され、そして、前記細胞に対する抗原応答および／または免疫応答に関連する潜在的合併症を軽減する。
【０１１７】
所望により、本発明の細胞集団または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物中に含まれる本発明の幹細胞は、これまでに述べられているように、有効性を高めるため、罹患率を軽減するため、または方法を容易にするために細胞集団を富化する目的の抗体による陽性および／または陰性細胞の選択を用いて精製することができる。
【０１１８】
本発明によれば、本発明の細胞集団または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物中に含まれる本発明の幹細胞、ならびに本発明の分化細胞は、さらなる処理無しに、またはこれらの細胞を精製、刺激、またはそれ以外の付加的変更のための付加的方法の後に患者に投与することができる。例えば、ある被験体から得られた本発明の幹細胞を、投与前に培養した後にそれを必要とする別の被験体に投与することができる。本発明の細胞集団または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物、または本発明の分化細胞はまた、他の細胞集団から単離して、または他の細胞集団とともに、例えば、心臓脂肪組織の間質画分の残りの成分とともに投与することができる。特定の実施形態においては、心臓脂肪組織の回収は患者のベッドの隣で行う。患者の臨床状態を測定するために血流動態対照を使用することができる。本明細書に記載の本発明によれば、本発明の医薬組成物は、心臓脂肪組織が抽出された後間もなく患者に投与することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、本発明の細胞集団または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物を単離するために心臓脂肪組織を処理し、薬学上好適なビヒクル中にそれを入れた後すぐに投与することができる。別の実施形態においては、送達時間は患者のアベラビリティーおよび心臓脂肪組織を処理し、本発明の細胞集団を単離するのに必要な時間によって異なる。
【０１１９】
「薬学上許容されるビヒクル」という用語は、動物、より具体的にはヒトにおけるその使用に関して、連邦政府または州政府の規制当局により認可されていなければならないか、または米国薬局方もしくは欧州薬局方または別の一般に認知されている薬局方に挙げられていなければならないビヒクルを指す。
【０１２０】
「ビヒクル」という用語は、本発明の細胞集団または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物の細胞がそれとともに投与されなければならない希釈剤、コアジュバント、賦形剤、または担体を指し、明らかに前記ビヒクルは前記細胞と適合しなければならない。限定されるものではないが、前記ビヒクルの例として、所望により血清、好ましくは自家血清を添加した、任意の生理学上適合するビヒクル、例えば、等張溶液（例えば、無菌生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル乳酸塩溶液、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭなど）、あるいはまた固体、半固体、ゼラチン性、または粘稠な支持手段、例えば、コラーゲン、コラーゲン−グリコサミノグリカン、フィブリン、ポリ塩化ビニル、ポリアミノ酸、例えば、ポリリジン、またはポリオルニチン、ヒドロゲル、アガロース、デキストラン硫酸シリコーンが挙げられる。所望により、この支持手段はまた、特定の実施形態においては、増殖因子またはその他の薬剤も含み得る。支持体が固体、半固体、またはゼラチン性である場合、細胞をビヒクルの液相に導入し、その後、それがより固相となるように処理することができる。ビヒクルが固相構造を持つ本発明のいくつかの実施形態では、このビヒクルは損傷部の形状に応じて形成させることができる。
【０１２１】
所望により、本発明の医薬組成物はまた、必要に応じ、医薬組成物中に含まれる、細胞の所望の治療効果を高める、制御する、またはそうでなければ指示する(direct)ための添加剤、および／または補助物質もしくは薬学上許容される物質、例えば、緩衝剤、界面活性剤、補助溶媒、保存剤なども含むことができる。また、金属キレート剤を添加することもできる。本発明の医薬組成物の液体媒体中の細胞の安定性は、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などの付加的物質の添加により改善することができる。本発明の医薬組成物に使用可能な薬学上許容される物質は当業者に一般に知られており、細胞組成物の調製に通常用いられている。好適な医薬ビヒクルの例は、例えばE.W. Martin により"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。前記ビヒクルについてさらに詳細には、いずれかの薬学技術の手引き(Galenic larmacy)に見出すことができる。
【０１２２】
本発明の医薬組成物は、単離および増殖した後の、治療上有効な量の本発明の細胞集団または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物、または本発明の分化細胞を含んでなる組成物、好ましくは、本発明の実質的に均質な細胞集団を、被験体に適切な投与形を提供するのに適当な量の好適なビヒクルとともに含む。
【０１２３】
本発明の医薬組成物は、選択された投与形態に応じて処方される。この処方は投与様式に対して調整される。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、液体投与形またはゲル様式、例えば、処置を必要とする被験体に注射または潅流させるための懸濁液の形態で調製される。特に限定されるものではないが、例としては、被験体、例えばヒトへの非経口投与、好ましくは静脈内、腹腔内、皮下投与などのための、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの等張溶液、または他のいずれかの好適な薬学上許容されるビヒクルといった薬学上許容される賦形剤を伴う無菌懸濁液中の本発明の医薬組成物の処方物が挙げられるが、他の投与経路も可能である。
【０１２４】
本発明の医薬組成物の、それを必要とする被験体への投与は、慣例手段により行われる。特定の適用では、前記医薬組成物は、シリンジ、カテーテル、トロカール、カニューレなどの好適なデバイスを用いて被験体に静脈内投与することができる。いずれの場合でも、本発明の医薬組成物は、細胞組成物の投与に好適で、当業者に公知の器具、装置およびデバイスを用いて投与される。
【０１２５】
特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物は静脈内に投与され、例えば標準的な末梢静脈カテーテル、中心静脈カテーテル、または肺動脈カテーテルなどの標準的なデバイスを介した静脈内投与を含む。細胞の流動は患者の血管内に配置した遠位および近位グローブを連続的に膨らませたり、しぼませたりすることにより制御することができる。
【０１２６】
別の特定の実施形態においては、効果を与えたい部位への本発明の医薬組成物の直接投与が有利であり得る。よって、所望により、本発明の医薬組成物は、例えば好適なカニューレ、カテーテルなどの好適なデバイスの挿入により、または動脈もしくは静脈潅流（逆流機構を含む）により、または本明細書で述べられている、もしくは当技術分野で公知のその他の手段により、罹患器官または組織の外表に直接適用（例えば注射などによる）して所望の器官または組織に直接投与（埋植、移植など）することができる。好ましい実施形態においては、本発明の医薬組成物は、例えば、冠動脈内注射またはカテーテルによる経心筋注射などにより心筋の損傷を受けた領域に直接投与される。具体的には心臓の損傷を受けた領域、特に梗塞領域で有効成分を放出するように設計されたカテーテルが記載されている（例えば、米国特許第６，１０２，９２６号公報、同第６，１２０，５２０号公報、同第６，２５１，１０４号公報、同第６，３０９，３７０号公報、同第６，４３２，１１９号公報、および同第６，４８５，４８１号公報参照）。用いられる投与系としては、例えば、心臓内位置特定のためのセンサーおよびそのセンサーの位置に所望の有効成分を所望の量で投与するための放出系を含む、選択的薬剤の心臓内投与のための装置を含み得る。
【０１２７】
所望により、本発明の医薬組成物は、当業者に公知の慣例の方法により適用されるまで保存することができる。この医薬組成物はまた、心筋梗塞後処置および／またはうっ血性心不全に有用な付加的薬剤とともに併用療法を含む有効形態で保存すること、もできる。短期保存（６時間未満）では、本発明の医薬組成物は室温で、または栄養溶液を添加して、または添加せずに、密閉容器中この温度で保存することができる。中期保存（４８時間未満）は２〜８℃が好ましく、本発明の医薬組成物は細胞の接着を防ぐ材料からなるか、またはそのような材料でコーティングされた容器に等浸透圧緩衝溶液を含む。さらに長期の保存は、好ましくは好適な低温保存および細胞機能の保持を促す条件での保存により行われる。
【０１２８】
特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物を併用療法で用いる。特定の実施形態においては、前記医薬組成物は、心筋梗塞後処置および／またはうっ血性心不全用の付加的医薬組成物と組み合わせて投与される。従って、本発明の細胞集団に含まれる本発明の幹細胞は、単独処置として使用することもできるし、または例えば、冠動脈バイパス、血管形成術（ステント有りまたは無し）、新脈管形成促進剤の投与、心室補助装置の埋植、血栓溶解薬、抗血小板凝集薬（アセチルサリチル酸および／またはクロピドグレル）、抗高血圧薬（アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）、アンギオテンシンＩ受容体アンタゴニスト（ＡＲＡ−ＩＩ）、β受容体遮断薬、利尿薬、抗脂質血症薬、ジゴキシン、硝酸、および／またはカルシウム拮抗薬の投与などの心血管疾患、特に、虚血性心疾患の処置のための他の慣例処置と併用することもできる。
【０１２９】
特定の実施形態においては、虚血性心疾患患者、特に心筋梗塞を受け、かつ／または慣例の処置に応答しないうっ血性心不全に罹患している患者に併用療法を行う。
【０１３０】
本発明の医薬組成物は、これまでに記載したように、心筋梗塞後処置および／またはうっ血性心不全に有用な付加的薬剤との併用療法で使用することができる。前記付加的医薬品は同じ医薬組成物の一部をなしていてもよいし、あるいはまたそれらは本発明の医薬組成物の投与と同時または連続的に（適当な時間をあけて逐次に）投与するための個別の組成物の形態で提供することもできる。特定の実施形態においては、前記付加的医薬組成物は、本発明の細胞集団を含んでなる医薬組成物と同時に投与するか、または適当な時間をあけて、任意の順序で逐次に投与する（すなわち、まず本発明の医薬組成物を投与した後に他の付加的薬剤を投与してもよいし、あるいはまず虚血性心疾患の処置のための他の医薬組成物、または虚血性心疾患の処置のための他の付加的薬剤もしくは他の医薬組成物を投与した後に本発明の医薬組成物を投与してもよい）。あるいは、これらの２成分のいずれも同じ組成物に混合し、一緒に投与してもよい。別の実施形態においては、本発明の医薬組成物と、虚血性心疾患の処置のための他の付加的薬剤または他の医薬組成物とを同時に投与する。
【０１３１】
本発明の医薬組成物の投与前および投与中には患者を測定することができる。医薬組成物の投与後、有害な作用が生じた場合には、およそ２４時間の測定期間が必要な患者もある。機能的改善を評価するために追跡調査が奨励される。
【０１３２】
本発明の細胞集団を含んでなる生体材料
別の態様において、本発明は、本発明の細胞集団を含んでなる生体材料（以下、本発明の生体材料）に関し、前記組成物は本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物、または本発明の分化細胞を含んでなる組成物、または本発明の医薬組成物を含んでなる。
【０１３３】
組織工学は、接着および増殖能を有する細胞をコーティングした、生物内への埋植に好適な生体適合性構造からなる生体材料を、損傷を受けた組織に移植することからなる。前記構造は、とりわけ、縫合糸、マトリックス、膜、フォーム、ゲル、およびセラミックスであり得る。例えば金属などの無機材料、フィブリン、またはアルギン酸塩などの天然ポリマー、ポリヒドロキシ、例えばポリグリコール酸（ＰＧＡ）などの合成ポリマーおよびそのコポリマー（例えば、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）など）を含む種々の材料がマトリックスおよびその他の生体適合性構造の構築に用いられていることが知られている。好ましい実施形態においては、前記ポリマーは生分解性であり、従って、経時的に分解し、このポリマー構造は完全に細胞に取って代わられる。特定の実施形態においては、本発明の生体材料は、一種類以上の生分解性ポリマーと、本発明の細胞集団、または本発明の分化細胞とを含んでなる組成物、または本発明の医薬組成物とを含んでなる生体適合性構造を含む、またはそれらからなる。
【０１３４】
別の特定の実施形態においては、前記ポリマー構造は生物活性分子、すなわち、細胞と特異的に相互作用することができる分子で、または細胞の接着および増殖の程度を高める目的でより良い接着特性を有する別のポリマーによりコーティングすることができる。
【０１３５】
病状の処置のための薬剤の製造における、本発明の細胞集団、または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物、または本発明の分化細胞を含んでなる組成物の使用
本発明者らは、本発明の細胞集団ならびに本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物が、すでに記載されている種々の起源の他の幹細胞集団よりも良好な心筋形成能を有すること、従って、本発明の細胞集団ならびに本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物が、心臓組織の再生および／または、例えば、１回以上の心筋梗塞を受けた患者またはうっ血性心不全を発症した患者など、機能的心筋組織が欠損している状態（虚血性心疾患）の処置、ならびに新脈管形成を刺激するのが適当な状態における新脈管形成の刺激に有用な可能性のある細胞系試薬であることを見出した。
【０１３６】
従って、別の態様において、本発明は、心臓組織の再生用医薬組成物の製造における、虚血性心疾患の処置用医薬組成物の製造における、または心筋梗塞後の処置用医薬組成物の製造における、またはうっ血性心不全の処置のための、または新脈管形成を刺激するための医薬組成物の製造における、本発明の細胞集団、または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物、または本発明の分化細胞を含んでなる組成物の使用に関する。
【０１３７】
別の態様において、本発明は、心臓組織の再生のための、または虚血性心疾患の処置のための、または心筋梗塞後の処置のための、またはうっ血性心不全の処置のための、および／または新脈管形成を刺激するための、本発明の細胞集団、または本発明の幹細胞を含んでなる組成物、または本発明の分化細胞を含んでなる組成物に関する。
【０１３８】
心臓組織を再生するため、または虚血性心疾患、心筋梗塞後、もしくはうっ血性心不全の処置のため、または新脈管形成を刺激するためには、本発明の細胞集団を含んでなる本発明の医薬組成物、または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物、または本発明の分化細胞を含んでなる組成物といった治療上有効な量の前記医薬組成物を、処置を必要とする被験体に投与する。これまでに述べたように、本発明の幹細胞（本発明の細胞集団中に存在する）は心臓脂肪組織に由来し、ＧＡＴＡ−４および／またはＣｘ４３、好ましくは双方を構成的に発現する。Ｃｘ４３タンパク質は、心筋細胞を電気的に結合するギャップ結合における主要タンパク質の一つである。従って、本発明の幹細胞がＣｘ４３を構成的に発現するという事実は、本発明の幹細胞を含んでなる細胞集団の移植後の、既存の心臓組織との良好な電気的結合を示唆する。
【０１３９】
本発明の幹細胞、本発明の細胞集団、または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物、または本発明の分化細胞を含んでなる組成物は、虚血心臓組織を再生することができる好適な数の細胞を得るため、または一回以上の心筋梗塞の後に心臓の機能を改善するために使用することができる。特定の実施形態においては、前記改善は、本発明の細胞集団中に存在する本発明の幹細胞の、心筋細胞、平滑筋、および／または血管内皮組織への分化によるものである。これまでに記載したように、本発明の医薬組成物の、それを必要とする被験体への投与は慣例の手段により行うことができる。特定の実施形態においては、前記医薬組成物は、それを必要とする被験体の損傷を受けた心筋領域に、例えば、冠動脈内注射またはカテーテルによる経心筋注射によって直接投与することができる。
【０１４０】
本発明の幹細胞、本発明の細胞集団、または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物、または本発明の分化細胞を含んでなる組成物は、新脈管形成が必要とされ得る病状において新脈管形成を刺激することができる好適な数の細胞を得るために使用することができる。
【０１４１】
本発明の幹細胞または本発明の分化細胞の使用に基づく、心臓組織再生のため、または虚血性心疾患の処置のため、または心筋梗塞後処置のため、またはうっ血性心不全の処置のため、または新脈管形成を刺激するための方法
本発明はまた、心臓組織の再生、例えば、１回以上の心筋梗塞を受けた患者またはうっ血性心不全を発症した患者など、機能的心筋組織が欠損している病状（例えば、虚血性心疾患）の処置に関する。同様に、本発明はまた、新脈管形成が適当であるか、または望ましい状況においてそれを刺激することに関する。
【０１４２】
よって、別の態様において、本発明は、それを必要とする被験体に治療上有効な量の本発明の幹細胞、本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物、本発明の分化細胞を含んでなる組成物、または本発明の医薬組成物を投与することを含む、心臓組織再生のため、虚血性心疾患の処置のため、心筋梗塞後処置のため、うっ血性心不全の処置のため、または新脈管形成の刺激のための方法に関する。
【０１４３】
これまでに述べたように、心臓組織を再生するため、虚血性心疾患、心筋梗塞後、もしくはうっ血性心不全の処置のため、新脈管形成の刺激のために、本発明の幹細胞、本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物、本発明の分化細胞を含んでなる組成物、または本発明の医薬組成物が、処置を必要とする被験体に治療上有効な量で、当業者に公知の常法により（例えば、冠動脈注射、経心筋注射などによる心筋の損傷を受けた領域への直接注射により）投与される。
【０１４４】
キット
別の態様において、本発明は、本発明の幹細胞、本発明の細胞集団、本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物、または本発明の分化細胞を含んでなる組成物を含んでなるキットに関する。本発明の幹細胞および細胞集団、ならびに本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物、および本発明の分化細胞を含んでなる組成物はこれまでにすでに記載されている。前記キットの一部をなす、本発明の細胞集団または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物中に存在する本発明の幹細胞は、前記組成物中に存在する本発明の分化細胞の場合と同様に、同種異系または異種起源であり得る。
【０１４５】
前記キットは診断目的および／またはin vitro研究のために使用可能であり、従って、このような目的では、所望により、本発明の幹細胞は無限に増殖することができるように不死化することができる。
【０１４６】
よって、特定の実施形態においては、本発明の幹細胞は、不死化された本発明の幹細胞、好ましくは可逆的に不死化された幹細胞を得る目的で、不死化の方法、例えば、可逆的不死化の方法を受ける。この意味で本明細書において「不死化」または「不死化された」という用語は、老化に入ることなく培養で無限に増殖する細胞、または細胞を作出するための方法を指す。本発明によれば、不死化とは、細胞が特に腫瘍細胞の増殖特徴の点で腫瘍細胞様のいくつかの態様で振る舞うように細胞培養物が形質転換される方法を指す。よって、「可逆的に不死化された細胞」とは、ある時点で、後に逆不死化方法を用いて非不死化状態に戻り得る不死化状態にある細胞を指す。特定の実施形態では、本発明の幹細胞は、（ａ）本発明の不死化幹細胞を得る目的で、本発明の幹細胞を、癌遺伝子（または癌遺伝子の組合せ）を含む「除去可能なポリヌクレオチド」を含んでなるベクターで形質転換すること、（ｂ）前記本発明の不死化幹細胞を増殖させること、および（ｃ）本発明の細胞の機能的特性を維持する本発明の不死化幹細胞のクローン細胞株を選択することを含む方法により可逆的に不死化され、所望により、この癌遺伝子（または癌遺伝子の組合せ）は本発明の不死化幹細胞から除去することができる。例として、細胞集団は個々の過剰発現の手段またはＳＶ４０ラージＴ抗原、テロメラーゼ触媒サブユニットであるＢｍｉ−１などのいくつかの癌遺伝子との組合せで不死化することができる。これらの癌遺伝子の過剰発現は、レコンビナーゼ標的でフランキングする手段（例えば、ｌｏｘＰ標的を認識するＣｒｅレコンビナーゼの導入）、およびさらに不死化細胞の破壊を可能とするチミジンキナーゼの自殺遺伝子を付加することにより逆転させることができる。
【０１４７】
in vitroにおいて生物学的薬剤または薬理学的薬剤に対する細胞応答を評価するための方法
別の態様において、本発明は、in vitroにおいて生物学的薬剤または薬理学的薬剤に対する細胞応答を評価するための方法であって、前記薬剤を、本発明の複数の幹細胞を含んでなる本発明の細胞集団、または所望により特定の細胞種へ分化し、本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物、または本発明の分化細胞を含んでなる組成物と接触させ、そして前記培養細胞集団に対する前記薬剤の効果を評価することを含む方法に関する。
【０１４８】
例としては、生物学的薬剤または薬理学的薬剤に対する細胞応答は、（ａ）個体または個体群から本発明の細胞集団または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物を単離し、（ｂ）所望により、前記細胞集団または本発明の方法に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物中に存在する本発明の幹細胞の総てまたは一部を特定の細胞種または系譜へ分化させ、（ｃ）工程（ａ）または（ｂ）から得られた細胞をin vitroで培養増殖させ、（ｄ）所望により、工程（ｃ）で増殖させた細胞を特定の細胞種へ分化させ、（ｅ）培養で工程（ｃ）または（ｄ）から得られた細胞集団を１以上の生物学的薬剤または薬理学的薬剤と接触させ、そして（ｆ）培養細胞集団に対する前記薬剤の効果を評価することを含む工程によりin vitroで評価することができる。
【０１４９】
特定の実施形態においては、本発明の細胞集団または本発明の工程に従って得ることができる本発明の幹細胞を含んでなる組成物中に存在する本発明の幹細胞は、心筋細胞へ分化させる。分化工程は本発明の細胞集団の単離［工程（ｂ）］の後またはそのin vitro増殖［工程（ｄ）］の後のいずれかに行うことができる。
【０１５０】
増殖因子および／またはサイトカインを得るための方法
別の態様において、本発明は、本発明の幹細胞または本発明の分化細胞を、前記増殖因子および／またはサイトカインの発現および産生に好適な条件下で培養し、そして所望により前記増殖因子および／またはサイトカインを分離することを含む、増殖因子および／またはサイトカインを得るための方法に関する。前記条件は当業者に公知であるか、または当業者ならば本明細書に含まれる情報を鑑みて容易に導き出すことができる。
【０１５１】
以下の実施例は本発明を例示するものであって、その限定的な意味において考えるべきでない。
【実施例】
【０１５２】
実施例１
ｓｕｂ−ＡＤＳＣおよびｐｉ−ＡＤＳＣ成体幹細胞の細胞単離とその集団の培養
一つの同じ個体の心外膜および皮下起源のヒト脂肪サンプルから実質的に均質な幹細胞の二つの集団を単離し、それらの両表現型および心臓特異的マーカーの基礎発現を比較した。
【０１５３】
材料および方法
心外膜および皮下脂肪サンプルの取得
心外膜および皮下脂肪サンプルを４名の患者（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４）からインフォームド・コンセントを取得した後の慣例の心臓手術で得て、それら各々から各種の脂肪サンプルを抽出した。心臓手術に際しては、まず、胸骨が露出するまで皮膚および皮下組織を切開した。この過程で露出した胸部皮下組織から、外科用鉗子を用いて脂肪断片（２〜５ｇ前後）を得た。次に、胸骨正中切開および心膜切開を行い、その後、心臓を露出させた。大動脈周辺の心臓の基部から心外膜脂肪組織（０．５〜２ｇ前後）を得た。この脂肪組織は外科用鉗子により選り分け、通常の外科用メスを用いて切除した。この研究はサンタ・クレウ・イ・サン・パウ病院(Santa Creu i Sant Pau Hospital)の倫理委員会により認可されたものであった。
【０１５４】
心外膜および皮下脂肪サンプルからのｅｐｉ−ＡＤＳＣおよびｓｕｂ−ＡＤＳＣ細胞集団の単離
両種の脂肪サンプル（心外膜および皮下）をＰＢＳバッファー(Gibco Invitrogen Corp.)で繰り返し洗浄し、存在する血管を切除した後、メスを用いて切断して小断片とした。
【０１５５】
次に、これらの脂肪組織断片を、３７℃で３０分、攪拌しながら、α−ＭＥＭ(Gibco Invitrogen Corp)中０．０５％のＩＩ型コラゲナーゼ溶液で酵素的に消化した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン(Gibco Invitrogen Corp)および１％ペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco ivitrogen Corp)を添加したα−ＭＥＭ培地を加えることで反応を停止させた。次に、この懸濁液を室温で１０分間、１，２００ｇで遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを、１０％ＦＢＳ、１ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したα−ＭＥＭ完全培養培地に再懸濁させ、培養容器に播種した（３７℃、５％ＣＯ２を含む空気雰囲気下）。２４時間後にこの培養培地を除去し、接着した細胞をＰＢＳで洗浄した。
【０１５６】
予め単離した細胞のin vitro増殖
接着した細胞を、３７℃、５％ＣＯ２を含む空気雰囲気下、１０％ＦＢＳ、１ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したα−ＭＥＭ培地の存在下で培養した。細胞を同じ条件下で、培養培地を３日または４日おきに交換しつつ、およそ８０％の集密度になるまで（集密前）培養維持した。細胞は集密前に達した際に１：３希釈で継代培養５回まで（３〜４か月））繰り返し継代培養し、これはトリプシン／ＥＤＴＡの溶液により培養プレートから剥離した後に５〜６×１０３細胞／ｃｍ２に相当した。
【０１５７】
結果
同じ個体からの成体心外膜脂肪組織由来幹細胞集団および成体皮下脂肪組織由来幹細胞集団を播種し、in vitroで培養増殖させた。図１Ａは、心外膜および皮下脂肪の抽出画分を示す。ヒト心外膜成体脂肪組織由来幹細胞（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）の形態は図１Ｂに示され、ヒト成体皮下脂肪組織由来幹細胞（ｓｕｂ−ＡＤＳＣ）の形態は図１Ｃに示される。
【０１５８】
実施例２
ｅｐｉ−ＡＤＳＣ成体幹細胞集団の免疫表現型的特性決定
心外膜脂肪組織由来幹細胞（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）集団の特性決定を行う目的で、種々の表面マーカーの発現をフローサイトメトリーにより分析し、得られた結果を皮下脂肪組織から単離された細胞集団（ｓｕｂ−ＡＤＳＣ）のものと比較した。
【０１５９】
材料および方法
フローサイトメトリー
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４として識別される患者の４サンプルから単離された心外膜脂肪組織由来の四つの細胞集団（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞）でフローサイトメトリーにより免疫表現型分析を行い、それらをｓｕｂ−ＡＤＳＣ細胞の代表的サンプルと比較した。Ｐ１およびＰ２  ｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞は３〜４週間培養（低継代培養）した後に特性決定を行い、Ｐ３およびＰ４  ｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞は９〜１２週間培養（高継代培養）した後に特性決定を行った。
【０１６０】
これらの細胞を４℃にてＰＢＳで洗浄し、培養条件下で５分間、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ(Gibco)でプレートから剥離した。トリプシンの作用が遮断されたところで、細胞を低温条件下、１，４００ｒｐｍで５分間遠心分離した。これらの細胞を冷却した染色バッファー（１％ＦＣＳを含む１×ＰＢＳ）中で染色工程が完了するまで維持した。染色は種々の表面抗原：ＣＤ３、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２ｅ、ＣＤ６２１、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ９５、ＣＤ１０２、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３／２、ＣＤ５９、ＣＤ２３５ａ、ＨＬＡＩ、ＨＬＡＩＩ、ＮＧＦＲ、およびβ２−ミクログロブリンに特異的な抗体（総てSerotecから）により実施した。
【０１６１】
細胞膜におけるこれらの抗原の存在を示すため、染色バッファーで１／５０希釈したフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とフィコエリトリン（ＰＥ）の２種類の蛍光団を、遮光、４℃下で２０分間用いた。これらのサンプルをＣｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  ＸＬサイトメーターにて特殊なソフトウエア（ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３ソフトウエア）により分析した。
【０１６２】
結果
図２は、得られたｅｐｉ−ＡＤＳＣサンプルの免疫表現型プロファイルの陽性結果を示す。分析に用いた統計パラメーターは「陽性％」であった。このパラメーターは、対照に対してそれを陽性とみなす獲得式において許容される細胞のパーセンテージを評価する。ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓプログラムは数値の差し引きを統計学的に実行し、「陽性細胞パーセンテージ」パラメーターが３０％を超える値を陽性結果としてみなす。
【０１６３】
よって、フローサイトメトリーによる免疫表現型プロファイルの分析結果は、９０％を超えるマーカー試験が両細胞集団（ｅｐｉ−ＡＤＳＣおよびｓｕｂ−ＡＤＳＣ）で同様の発現を有する個とを示す。具体的には、ｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞集団は、ｓｕｂ−ＡＤＳＣ細胞集団の場合と同様に、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＨＬＡ−Ｉ、およびβ２−ミクログロブリンに対して極めて陽性であった（表１）。ｓｕｂ−ＡＤＳＣの残りの陰性特異的マーカーはｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞に関しても陰性である。しかしながらやはり、細胞表面マーカーＣＤ５４の発現に関しては違いが検出され、ｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞の場合では陽性であり、ｓｕｂ−ＡＤＳＣ細胞では陰性であった。
【０１６４】
【表１】
2010535468.tif 000002
【０１６５】
実施例３
ｓｕｂ−ＡＤＳＣおよびｅｐｉ−ＡＤＳＣ幹細胞の集団における心臓特異的マーカーの遺伝子発現の比較試験
心臓特異的マーカーβ−ＭＨＣ、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、ＳＥＲＣＡ−２、筋節α−アクチニンおよびコネキシン−４３の基礎発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ技術により分析した。
【０１６６】
材料および方法
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
単離された細胞の全ＲＮＡを、製造業者の指示に従いＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット(Amersham)を用いて抽出した。２μｇの全ＲＮＡを用い、５０℃で１０分間、Ｓｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットをランダムヘキサマー(Bio-Rad Laboratories)とともに用いる逆転写反応によりｃＤＮＡを分析した。ｃＤＮＡが得られたところで、総てのＰＣＲ反応物を、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターキット(Applied Biosystems)にて、総ての供試遺伝子に特異的なＦＡＭ（登録商標）でマーキングしたプライマーを用いて調製した。用いたプライマーは、ＧＡＴＡ−４（Ｈｓ００１７１４０３＿ｍ１）、Ｎｋｘ２．５（Ｈｓ００２３１７６３＿ｍ１）、筋節α−アクチニン（Ｈｓ００２４１６５０＿ｍ１）、β−ＭＨＣ（Ｈｓ００１６５２７６＿ｍ１）、コネキシン−４３（Ｈｓ００７４８４４５＿ｓ１）、ＳＥＲＣＡ−２（Ｈｓ００５４４８７７＿ｍ１）、ｃＴｎＩ（Ｈｓ００１６５９５７＿ｍ１）およびＧＡＰＤＨ（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）(Applied Biosystems)であり、反応条件は、総てのプライマーに関して、５０℃２分、９５℃１０分、そして９５℃１５秒と６０℃１分４０回とした。最後に増幅をＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステム(Applied Byosistems)により分析した。この遺伝子発現を定量するため、得られたデータをＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳソフトウエアプログラムで分析した。サンプルは総て２回分析した。Ｃｔ（ΔＣｔ）比較法を用いた。Ｃｔは、内部参照対照として構成的発現遺伝子ＧＡＰＤＨを用いて各分析遺伝子の相対的発現を算出するための、基本レベルを超える最初の蛍光増強が検出されるＰＣＲサイクルである。
【０１６７】
結果
表２および図３Ａに示されるように、同じ個体から抽出されたｓｕｂ−ＡＤＳＣ細胞に比べ、ｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞集団の心臓転写因子ＧＡＴＡ−４に関する遺伝子レベルの統計学的に有意な上昇（ｐ＜０．００１）が継代培養２回で検出された。これに対し、残りの心臓特異的マーカー（α−アクチニン、β−ＭＨＣ、ｃＴｎＩ、Ｃｘ４３、ＳＥＲＣＡ−２、およびＮｋｘ２．５）の遺伝子発現に関しては、この２種類の供試細胞集団間での有意差は検出されなかった（図３Ａ）。継代培養５回でＧＡＴＡ−４の発現の差は増大し（ｐ＜０．００１）、Ｃｘ４３の転写レベルに関しても有意差が検出される（ｐ＝０．０３１）ことを指摘しておくべきである（図３Ｂおよび３Ｃ）。これらの結果は心外膜脂肪由来幹細胞（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）集団は、同じ個体の皮下脂肪由来細胞（ｓｕｂ−ＡＤＳＣ）集団に比べて、心臓系譜へより大きく傾くことを示す。
【０１６８】
【表２】
2010535468.tif 000003
【０１６９】
実施例４
ｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞およびｓｕｂ−ＡＤＳＣ細胞におけるタンパク質レベルでの心臓特異的マーカー発現の比較研究
心臓特異的マーカーβ−ＭＨＣ、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、心臓トロポニンＩ、ＳＥＲＣＡ−２、筋節α−アクチニン、およびコネキシン−４３の基礎発現を、免疫蛍光およびウエスタンブロット技術によりタンパク質レベルで分析した。
【０１７０】
材料および方法
ウエスタンブロット
細胞を冷ＰＢＳバッファーで繰り返し洗浄し、溶解バッファー［２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、１％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ（塩化フェニルメチルスルホニル）、１μｇ／ｍｌアプロチニンおよび１ｎｇ／ｍｌロイペプチン］中、４℃で３０分間ホモジナイズした。ＳＤＳ溶解画分を、４℃１０分、１３，０００ｒｐｍで遠心分離により得た。全抽出物のタンパク質濃度を、標品としてＢＳＡを用い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＤＣプロテインキット(BioRad)により測定した。５０μｇのタンパク質を直径０．４５ｍｍのニトロセルロース膜に移し、種々の分析心臓特異的マーカーに対して特異的な抗体を用いて現像した：Ｃｘ４３（１／１００）(BD Transduction Laboratories)、ＧＡＴＡ−４（１／１００）、ＳＥＲＣＡ−２（１／１００）、抗心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）（１／１００）（前者の三つはSanta Cruz Biotechnology）、β−ＭＨＣ（１／１０）(Chemicon)、および筋節α−アクチニン（１／１００）(Sigma)）。対応する特異的バンドを観察するために、製造業者の指示に従い化学発光検出系(Pierce)を用いた。
【０１７１】
免疫蛍光
共焦顕微鏡(FluoroDish, WPI Inc.)による検査専用の、０．１７ｍｍガラス底を有する３５ｍｍプレートで培養した細胞をＰＢＳバッファーで繰り返し洗浄し、ＰＢＳで調製した４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）を用い、室温で１５分間固定した。次に、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）／０．１％サポニンを用い、室温で３０分間、これらの細胞に透過処理を施した。最後に、これらの細胞を種々の分析心臓特異的マーカーに対して特異的な抗体とともにインキュベートした：Ｃｘ４３（１／１００）(BD Transduction Laboratories)、ＧＡＴＡ−４（１／１００）、ＳＥＲＣＡ−２（１／１００）、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）（１／１００）（Santa Cruz Biotechnology）、β−ＭＨＣ（無希釈）(Chemicon)および筋節α−アクチニン（１／１００）(Sigma)）、最後に蛍光共焦顕微鏡(Leica)下で分析した。
【０１７２】
結果
タンパク質レベルでの前記マーカー発現の研究の結果は、その遺伝子発現分析で得られた結果を補足する。
【０１７３】
培養培地に付加的な心臓形成刺激または因子が存在しない場合には、ｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞だけが継代培養２回と継代培養５回の双方でＣｘ４３およびＧＡＴＡ−４を発現したことが見出された（図４Ａおよび４Ｂ）。ｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞におけるＣｘ４３およびＧＡＴＡ−４の発現レベルの増加は、それらのin vitro増殖期を通じて見られた（継代培養２回〜継代培養５回）。
【０１７４】
両細胞集団で、継代培養２回においては、カルシウムＳＥＲＣＡ−２ポンプおよびβ−ＭＨＣのタンパク質レベルでの発現が見られないことを指摘しておくべきである。しかしながら、両細胞集団とも、継代培養５回ではβ−ＭＨＣおよびＳＥＲＣＡ−２の発現の増加が検出され（図４および５）、ｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞は、一つの同じ個体からのｓｕｂ−ＡＤＳＣ細胞で見られたものよりも大きなβ−ＭＨＣ発現増加を有する（図４）。
【０１７５】
このタンパク質レベルでの発現差異の存在は、この二つの供試細胞集団間で、転写物翻訳工程またはｍＲＮＡを成熟タンパク質へ翻訳する工程の調節機構の違いによるものである可能性がある。
【０１７６】
分析した残りの遺伝子／タンパク質に関しては、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲとウエスタンブロットおよび免疫蛍光試験により得られた結果の間で高い一致度を有する。
【０１７７】
実施例５
脂肪心外膜組織由来幹細胞（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）の分化能の分析
心外膜脂肪由来幹細胞（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）の脂肪形成、骨形成および軟骨形成系譜への分化能を分析した。
【０１７８】
材料および方法
ｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞の骨形成、脂肪形成、および軟骨形成系譜への分化
骨形成分化、脂肪形成分化および軟骨形成分化の各細胞系譜に特異的な分化プロトコールを用いた。
【０１７９】
骨形成分化
骨細胞への分化誘導は、皮下脂肪組織由来幹細胞および他の細胞種に関してすでに確立されているプロトコールに従って行った(Zuk et al., 2002. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002 Dec; 13(12):4279-95)。
【０１８０】
細胞を１週間培養維持（ＤＭＥＭ培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン(Gibco)、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco)）した後、ＤＭＥＭ(BE12-614F Cambrex, Biowhitaker)、１０％ＦＢＳ(5253 Linus Cultek)、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン(Gibco)、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco)、１００ｎＭデキサメタゾン(Sigma)、５０μＭアスコルビン酸−２−リン酸(Sigma)および１０ｍＭβ−グリセロホスフェート(Sigma)からなる特異的分化培地で２週間培養することにより、骨細胞への分化を誘導した。
【０１８１】
脂肪形成分化
脂肪細胞への分化誘導は、皮下脂肪組織由来幹細胞および他の細胞種に関してすでに確立されているプロトコールに従って行った(Zuk et al., 2002, 前掲、 Awad et al., 2003. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 2003 Dec; 9(6):1301-12)。
【０１８２】
細胞を１週間培養維持（ＤＭＥＭ培地、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン(Gibco)、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco)）した後、２種類の培地（培地Ａおよび培地Ｂ）に変更することにより、脂肪細胞への分化を誘導した。これらの培地の組成を以下に明示する。
【０１８３】
培地Ａ：ＤＭＥＭ(BE12-614F Cambrex, Biowhitaker)、１０％ＦＢＳ(5253 Linus Cultek)、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン(Gibco)、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco)、１μＭデキサメタゾン(Sigma)、０．２ｍＭインドメタシン(Sigma)、１０μｇ／ｍｌインスリン(Sigma)、および０．５ｍＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン(Sigma)
培地Ｂ：ＤＭＥＭ(BE12-614F Cambre, Biowhitaker)、１０％ＦＢＳ(5253 Linus Cultek)、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン(Gibco)、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco)、および１０μｇ／ｍｌインスリン(Sigma)
【０１８４】
軟骨形成分化
軟骨細胞への分化誘導は、皮下脂肪組織由来幹細胞および他の細胞種に関してすでに確立されているプロトコールに従って行った(Zuk et al., 2002, 前掲)。分化は、培地交換と細胞を低酸素状態に置くという組合せにより誘導した。
【０１８５】
予備誘導：クローンを円錐底９６ウェルプレート内で遠心分離し、細胞凝集物を、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で２４時間増殖させた。
【０１８６】
誘導：これらのクローンを、ＤＭＥＭ(BE12-614F Cambrex, Biowhitaker)、１％ＦＢＳ(5253 Linus Cultek)、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン(Gibco)、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco)、６．２５μｇ／ｍｌインスリン(Sigma)、１０μｇ／ｍＬ  ＴＧＦＢ−１(R&D)および５０ｎＭアスコルビン酸２−リン酸(Sigma)からなる特定の培地で．３日おきに培地を交換しつつ、２０日間維持した。
【０１８７】
骨細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞へ分化したｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞の染色
各分化に好適な異なる染色プロトコールを用いた。
【０１８８】
骨形成分化に関する染色：
細胞を４℃で５分間、５０％エタノールで固定した。染色は蒸留水中１％アリザリンレッド（ｐＨ＝４．１）を用い、室温で攪拌しながら４５分間行った。分化した、従って、周囲にカルシウムの生成を示すコロニーは強い赤色に染まる。
【０１８９】
脂肪形成分化に関する染色：
細胞を室温で２０分間、ＰＢＳ中３７％ホルムアルデヒドの１：１０希釈液（ｐＨ７．４）で固定した。染色はオイルレッド（１００ｍｌイソプロパノール中０．３ｇオイルレッド、蒸留水で１：２希釈）を用い、室温で２０分間インキュベートして行った。分化した細胞の液胞に蓄積した脂質が赤く染まる。
【０１９０】
軟骨形成分化に関する染色：
細胞を室温で１時間、４％ホルムアルデヒドの希釈液で固定した。染色は、「酸性アルコール」（蒸留水中、７０％エタノール、１％ＨＣｌ）中アルシアンブルーの０．１％希釈液を用い、室温で１時間インキュベートして行った。洗浄後、染色を４％ＰＦＡで再び固定した。分化細胞は青色に染まる。
【０１９１】
結果
脂肪形成、骨形成および軟骨形成系譜に特異的な染色の結果の分析は、心臓の脂肪組織、特に心外膜領域由来の幹細胞（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）は、皮下脂肪組織由来幹細胞（ｓｕｂ−ＡＤＳＣ）よりも有意に染色が悪いことを示す。強い色が現れるほど分化程度が高いことを示すので、心臓脂肪組織由来幹細胞（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）は、皮膚脂肪組織由来幹細胞（ｓｕｂ−ＡＤＳＣ）よりも脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞への分化能が低いという結論が得られる。
【０１９２】
実施例６
ヒト心臓脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）の単離および特性決定
１．材料および方法
１．１  心臓脂肪組織および細胞培養物の採集
心臓手術を受けた患者から心肺バイパスを始める前に心臓脂肪組織生検サンプルを得た。心外膜脂肪組織生検サンプル（平均約０．５〜１．０ｇ）は心臓に近い、大動脈周辺から採取した。インフォームド・コンセントが得られた１１７名の患者（６７．５±９．２歳）からの心臓脂肪組織生検を用い、本研究を行った。この研究はサンタ・クレウ・イ・サン・パウ病院(Santa Creu i Sant Pau Hospital)の倫理委員会により認可されたものであった。
【０１９３】
サンプルをMartinez-Estrada, O.M., et al., Human adipose tissue as a source of Flk-1+ cells: new method of differentiation and expansion. Cardiovasc Res 65, 328-33 (2005)により記載されているように処理および単離した。接着細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco Invitrogen Corp., Grand Island, NY, USA)を添加したα−ＭＥＭ培地で集密前まで増殖させ、通常の条件で培養した。
【０１９４】
１．２  クローン原性アッセイ
クローン原性アッセイはMcFarland [McFarland, D.C. Preparation of pure cell cultures by cloning. Methods Cell Sci 22, 63-6 (2000)]により記載されているプロトコールに従って行った。要するに、細胞をプレートに４００細胞／１００ｃｍ２の密度で播種し、個々のクローンを直径数ミリメートル（ｍｍ）に達するまで発達させた。次に、培地を除去し、コロニーの周囲にクローニングリングを置いた。２０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したα−ＭＥＭ完全培地をクローニングリング内に加え、これらのプレートを通常の条件で培養した。
【０１９５】
１．３  奇形腫の評価
ヒト心臓ＡＤＳＣの催奇形能を評価するため、１２週齢の４匹のＳＣＩＤマウス（ＣＢ１７×Ｃ５７Ｂ１／６）（３０ｇ、Charles River Laboratories Inc. Wilmington, MA, USA）で皮下および筋肉内注射（１．５×１０６細胞）を行った。腫瘍形成を評価するために毎週、動物を検査した。細胞の注射から４か月後に、皮膚、骨格筋、肝臓、および脾臓を採取し、それらの組織学的分析のために処理した。
【０１９６】
１．４  脂肪形成および骨形成分化アッセイ
増殖させた一次細胞培養物に対して脂肪形成および骨形成能を決定するアッセイを行った。これまでに記載されているように[Phillis, B.D., et al. Modification of d-amphetamine-induced responses by baclofen in rats. Phychopharmacology (Ber1) 153, 277-84 (2001)、 Roura, s. et al. Effect of aging on the pluripotential capability of human CD105+ mesenchymal stem cells. Eur J Heart Fail 8, 555-63 (2006)]を分化およびアリザリンレッドＳ染色アッセイを行った。
【０１９７】
１．５  フローサイトメトリー
継代培養２回で細胞を採取し、ＣＤ１０５(Serotec)、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１０６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１３３、およびＶＥＧＦＲ２(BD Pharmingen)に特異的なモノクローナル抗体で免疫染色を行った。各抗原のフローサイトメトリーレベルを、特異的抗体とＩｇＧイソ型対照(Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA)の間の比率により定義した（１＝差無し）。Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメトリー(Beckman Coulter, Miami, FL, USA)を用いて総てのデータを得、Ｅｘｐｏ３２プログラム(Beckman Coulter)を用いて分析を行った。
【０１９８】
１．６  免疫抑制アッセイ
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）増殖に対する心臓ＡＤＳＣの作用を分析するため、２×１０５ＰＢＬを含む心臓ＡＤＳＣを好適な刺激（ＰＨＡ５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で５×１０３プレートに播種した。ドナーＬ１００６０５（ＣＭＤＬ）の皮下ＡＤＳＣを免疫抑制対照としてプレートに播種した。刺激から４日後、ＢｒｄＵを２４時間培地に加え、製造業者の指示(Cell Dliferation ELISA BrdU, Roche)に従い、ＥＬＩＳＡにより増殖を調べた。試験は３回行った。前駆細胞無しのＰＢＬ増殖に関するデータを示す。
【０１９９】
１．７  ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現の分析
４名の異なる患者の継代培養２回で、製造業者の指示に従いQuickPrep全ＲＮＡ抽出キット(Amersham, Freiburg, Germany)を用い、心臓ＡＤＳＣの全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡからｃＲＮＡを調製し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２．０チップとハイブリダイズさせ、示差的に発現した遺伝子を調べるため分析した。ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイを、これまでに記載されているように[Virtaneva, K. et al. Expression profiling reveals fundamental biological differences in acute myeloid leukemia with isolated trisomy 8 and normal cytogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 1124-9 (2001)]、Instituto de Investigacion en Biomedicina (Institute of Biomedical Research) (Barcelona, Spain)において、製造業者のプロトコールに従い(Affymetrix, Santa Clara, CA)、Grupo de Genomica Funcional (Functional Genomic Group)により処理した。発現シグナルをＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナーでスキャンした。
【０２００】
データの統計分析はＲを用いて行った。まず、データを、Ｒで実行されるｇｃＲＭＡアルゴリズムを用いて処理せずにノーマライズし、次に、ＦＬＵＳＨ[Calza, S. et al. Filtering genes to improve sensitivity in oligonucleotide microarray data analysis. Nucleic Acids Res 35, e1O2 (2007)]を用いてフィルタリングし、関連のある変化をＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎ[Reich, M. et al. GenePattern 2.0. Nat Genet 38, 500-1 (2006)]を用いて抽出した。得られた結果を、ＧＥＯデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/; registration ID: GDS2366)から得られた非分化皮下脂肪由来細胞に対する公開アレイにものと比較した。このため、このアレイの各セットをパーセンテージ範囲の戦略で分類し（両試験を同じプラットフォームで行った）、その後、このパーセンテージ範囲をこれらの二つの試験間で比較した。強度値の代わりにパーセンテージ範囲を用いることで、ハイブリダイゼーションに存在した可能性がある系統的なバイアスを防ぐことができる。
【０２０１】
１．８  定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
これまでに説明したように心臓および皮下ＡＤＳＣの全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡ２ｍｇからランダムヘキサマー(Qiagen)とＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット(BioRad Laboratories)を製造業者の指示に従ってｃＤＮＡを合成した。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲプロトコールの詳細を以下に記載する。
【０２０２】
要するに、２５ｍｌのＴａｑＭａｎ  ２Ｘ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘと、Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)とから入手したＦＡＭでマーキングした各２ｍｌのプローブ／プライマー：ＧＡＴＡ４（Ｈｓ００１７１４０３＿ｍ１）、コネキシン４３（Ｃｘ４３）、Ｈｓ００７４８４４５＿ｓ１）、ＳＥＲＣＡ２（Ｈｓ００５４４８７７＿ｍ１）、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎ−Ｉ）（Ｈｓ００１６５９５７＿ｍ１）、筋節α−アクチニン（Ｈｓ００２４１６５０＿ｍ１）、β−ミオシン重鎖（β−ＭＨＣ）（Ｈｓ００１６５２７６＿ｍ１）、ＶＣＡＭ−１（Ｈｓ００３６５４８６＿ｍ１）、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）（Ｈｓ００１６９７９５＿ｍ１）、ＶＥ−カドヘリン（Ｈｓ００１７４３４４＿ｍ１）、ＣＤ３４（Ｈｓ００９９０７３２＿ｍ１）、ＥＧＲ−３（Ｈｓ００２３１７８０＿ｍ１）、ＣＤ１０２（ＨｓＯＯ１６８３８４＿ｍ１）、ＣＤ３６（Ｈｓ００１６９６２７＿ｍ１）、ＶＥＧＦ−Ａ（Ｈｓ００１７３６２６＿ｍ１）、ＥＧＲ−１（Ｈｓ００１５２９２８＿ｍ１）、ＣＤ３１（Ｈｓ００１６９７７７＿ｍ１）、ＳＤＦ−１（Ｈｓ００９３０４５５＿ｍ１）、ＣＸＣＲ−４（Ｈｓ００２３７０５２＿ｍ１）およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）（Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）とを含んだ最終量５０μｌで、２ｍｌのｃＤＮＡを用いるＰＣＲにより増幅を行った。
【０２０３】
データを採取し、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００（ＡＢＩ）配列検出システムで分析した。各サンプルを２回分析した。Δ閾値サイクル法（Ｃｔ）（Ｃｔは、最初のレベルを超える指標蛍光の増強が初めて検出されるＰＣＲサイクルである）を用い、すでに記載されているように[Pfaffl, M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 29, e45 (2001)]、内部標準としてＧＡＰＤＨを用いて、各遺伝子の発現の相対量を算出した。
【０２０４】
１．９  タンパク質抽出およびウエスタンブロット
タンパク質抽出物を既に記載されている方法[Roura, S. et al. Idiopathic dilated  cardiomyopathy exhibits defective vascularization and vessel formation. Eur J Heart Fail 9, 995-1002 (2007)]に従い、取得した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いたＢｉｏ−Ｒａｄ  ＤＣプロテインアッセイ(Bio-Rad)によりタンパク質レベルをノーマライズし、これらのサンプルを５〜１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。これらのタンパク質をニトロセルロース膜(Bio-Rad)に転写し、それぞれＧＡＴＡ４（１：５００）、ＳＥＲＣＡ２（１：１００）、α−アクチン（１：３００）、ｃＴｎＩ（１：３００）(Santa Cruz Biotech.)、Ｃｘ４３（１：５００）(BD Transduction, Lexington, KY, USA)、β−ＭＨＣ（１：１０）(Chemicon, Temecula, CA, USA)、および筋節α−アクチン（１：５００）(Sigma, St. Louis, MO, USA)に特異的なモノクローナル抗体（ＡｃＭ）を用いて検査した。増強化学発光検出系(Amersham Biosciences)を用いてタンパク質バンドを観察した。
【０２０５】
１．１０  免疫蛍光染色
これらの細胞に透過処理を施し、５％正常ヤギ血清中で３０分間ブロッキングし、抗ＧＡＴＡ４、抗ＳＥＲＣＡ２、抗−ｃＴｎＩ（２μｇ／ｍｌ）(Santa Cruz Biotechnology)、抗α筋節アクチン（１：５００希釈）(Sigma)、抗β−ＭＨＣ（無希釈）(Chemicon)、および抗Ｃｘ４３（２．５μｇ／ｍｌ）(BD Transduction)抗体を用い、室温で１時間マーキングした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（５μｇ／ｍｌ）(Molecular Probes)とコンジュゲートされた二次抗体を適用し、共焦レーザー走査顕微鏡(Leica TCS SP5)でシグナルを観察した。
【０２０６】
１．１１  心臓ＡＤＳＣの同時培養
心臓ＡＤＳＣを、これまでに記載されているように[Gandia, C. et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial  infarction.  Stem Cells 26, 638-45 (2008)]、ウイルス形質導入によりｅＧＦＰでマーキングした。新生ラットの心筋細胞を、これまでに記載されているように[Fukuhara, S. et al. Direct cell-cell interaction of cardiomyocytes is key for bone marrow stromal cells to go into cardiac lineage in vitro. J Thorac Cardiovasc Surg 125, 1470-80 (2003)]、新生ラット（１〜３日齢）からの酵素的分散により単離した。実験のため、これらの心筋細胞を、２％ゼラチンでコーティングしたプレート上、５％ＦＢＳ、１０％ウマ血清(Invitrogen)、１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１００μＭシトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド(Sigma)を添加した４：１  ＤＭＥＭ：Ｍ−１９９(Sigma)中、５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で維持した。その後、ｅＦＰ＋ＡＤＳＣとこれらの新生児心筋細胞を１：２５の比率で混合し、それらを細胞密度５×１０４細胞で播種した。これらの細胞を一体として、３７℃、空気中５％ＣＯ２で３０日間、一緒に培養（同時培養）した。
【０２０７】
１．１２  内皮分化アッセイ
心臓ＡＤＳＣを増殖させ、これまでに記載されているように[Heydarkhan-Hagvall, S. et al. Human adipose stem cells: a potential cell source for cardiovascular tissue engineering. Cells Tissues Organs 187, 263-74 (2008)、 Liu, J.W. et al. Chraracterization of endothelial-like cells derived from human mesenchymal stem cells. J Thromb Haemost 5, 826-34 (2007)]、内皮分化を分析した。内皮分化を評価するためにＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ（１０μｇ／ｍｌ、Biomedical Technologies）の組み込みを用いた。
【０２０８】
１．１３  血管構造のin vitro形成
管形成を誘導するため、心臓ＡＤＳＣを、１％ＥＣＭａｔｒｉｘ（商標）(Chemicon International)でコーティングしたプレート上に２６，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、ビオチン化ＧＳＬＩイソレクチンＢ４（グリフォニア・シンプリシフォリア(Griffonia simplecifolia)Ｉ  Ｂ４レクチン）(Vector Labs)を用い、２時間目、４時間目、および７時間目に管形成を確認した。マーキングされた細胞の検出のために、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８コンジュゲートストレプトアビジン（５μｇ／ｍｌ）(Molecular Probes)を用いた。
【０２０９】
１．１４  心臓ＡＤＳＣの管形成能
酸素正常状態（２１％Ｏ２）、軽度低酸素状態（５％Ｏ２）および重度低酸素状態（１％Ｏ２）で２４時間培養した継代培養２回の１０，０００細胞／ｃｍ２から細胞馴化培地を得た。新脈管形成サイトカイン濃度を、マルチプレックスイムノアッセイ(Procarta Cytokine Assay Kit, Panomics)を用いて分析した。細胞馴化培地中の分析サイトカインは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦＢＢ、およびｂＦＧＦであった。結果は、培地の採取時に１０６細胞により分泌された因子の平均±ｓ．ｄ．（ｐｇ）として表した。
【０２１０】
２．結果
２．１  心臓ＡＤＳＣの単離および特性決定
幹（前駆）細胞集団は、心臓手術を受けた患者の総ての心臓脂肪組織サンプルにおいて十分単離され、単層培養で増殖され、特性決定された（図６）。記載の条件で培養３日後に、結合した繊維芽細胞と類似の細長い細胞が見られた（図６ｂ）。
【０２１１】
これらの細胞はクローン原性があり、倍加時間（Ｔｄ）はおよそ５日であり、ＣＩＤマウスにおいて奇形腫の形成を誘発しない（データは示されていない）。心外膜脂肪組織由来幹細胞（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）を脂肪形成および骨形成培地で培養しても、脂質滴の細胞内蓄積も、細胞外のカルシウム沈着も起こらなかった（図７ａ）が、これに対して、皮下脂肪組織由来幹細胞（ｓｕｂ−ＡＤＳＣ）は脂肪形成系譜を容易に獲得した（図７ｂ）。
【０２１２】
単離された心臓ＡＤＳＣを免疫表現型的に特徴付けるため、表面マーカープロファイルを調べた。９０％を超える細胞が間葉幹細胞（ＭＳＣ）型パターンを発現した。前記細胞はＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ２９およびＣＤ９０に関して強い陽性であり、ＣＤ１０６、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４、およびＣＤ１３３ならびにＶＥＧＦＲ２に関しては弱い陽性または陰性であった（図６ｃ）。
【０２１３】
さらに、心臓ＡＤＳＣは、末梢血リンパ球増殖を部分的に阻害（４２％の増殖減）することができるが、これは心臓ＡＤＳＣの軽度の免疫抑制能を示す。
【０２１４】
２．２  心臓ＡＤＳＣの筋形成系譜分化
心臓ＡＤＳＣの遺伝子発現プロファイルを分析するためにマイクロアレイＧｅｎｅＣｈｉｐ分析を行った。これらの結果をＧＥＯデータベースから得られた非分化皮下脂肪組織由来細胞の遺伝子発現と比較した。検討したおよそ２２，０００の遺伝子のうち、皮下脂肪組織由来幹細胞に比べて心臓ＡＤＳＣ内のいくつかの心臓マーカーで異なる発現が見られた（表３）。
【０２１５】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（図８）を用いたところ、単離された皮下脂肪組織幹細胞に比べて心臓ＡＤＳＣで、隣接する心筋細胞間の電気化学的結合を担うタンパク質であるＧＡＴＡ４転写因子とコネキシン４３（Ｃｘ４３）の極めて高い発現が検出された。ＳＥＲＣＡ２、ｃＴｎＩ、筋節α−アクチニンおよびβ−ＭＨＣの転写物レベルは両細胞集団で類似していた。
【０２１６】
タンパク質レベルにおいて、最初の培養培地で、心臓ＡＤＳＣはβ−ＭＨＣ、ＳＥＲＣＡ２、筋節α−アクチン、Ｃｘ４３、およびＧＡＴＡ４（図９ａ）ならびに微量のＴｂｘ５を発現した（データは示されていない）。これらの結果はウエスタンブロット（図９ａ）および免疫蛍光（図９ｂ〜９ｅ）により確認した。見て取れるように、β−ＭＨＣ繊維すでに所定の細胞質分布を発現する（図９ｂ）。これに対し、皮下ＡＤＳＣはβ−ＭＨＣ、Ｃｘ４３、ｃＴｎＩ、およびＧＡＴＡ４の非存在、および筋節α−アクチンの低発現を示した（図９ａ）。
【０２１７】
ヒト心臓ＡＤＳＣと、新生ラット心筋細胞との同時培養は、分析したヒト細胞の心臓形成能を示した。β−ＭＨＣ（図１０ｃ）、筋節α−アクチン（図１０ｎ）、Ｃｘ４３（図１０ｍ）、ＳＥＲＣＡ２（図１０ｑ）、およびＧＡＴＡ４（図１０ｒ）の強度ならびに傾向は培養で増強され、新生児心筋細胞において観察されるものに匹敵した。さらに重要なことに、この同時培養は、非刺激培養では見られない重要な筋節タンパク質であるトロポニンＩの発現を刺激した（図１０ｂ、１０ｆ、および１０ｊ）。トロポニンＩ細胞質における再配列も、培養心筋細胞で見られる継代培養筋節構造に似ていた。
【０２１８】
２．３  培養内皮系譜における心臓ＡＤＳＣの分化
これまでに述べたように、心臓ＡＤＳＣで行ったＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ分析およびその非分化皮下脂肪組織由来細胞との比較は、心臓ＡＤＳＣにおける新脈管形成促進遺伝子の、より大きなパーセンテージ範囲での発現を示した。さらに、新脈管形成阻害剤の発現はもっぱら低かった（表４）。
【０２１９】
ヒト心臓ＡＤＳＣの内皮系譜能を調べるため、細胞をＥＧＭ−２分化培地で培養した。処理および非処理（対照）細胞の内皮転写物レベルを比較したところ、内皮マーカーＣＤ３４、ＶＥＧＦ−α、ＶＣＡＭ−１、ＶＥ−カドヘリン、ＥＲＧ−１、ＥＲＧ−３、ＣＤ３１、およびＳＤＦ−１の発現の増加が示された（図１１）。内皮前駆細胞の移動に有益であり、管形成を促進するＳＤＦ−１因子は１２０倍の発現増加を受け[Yamaguchi, J. et al. Stromal cell-derived factor-1 effects on ex vivo expanded endothelial progenitor cell recruitment for ischemic neovascularization. Circulation 107, 1322-8 (2003)、 Zhang, M. et al. SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction. Faseb J 21, 3197-207 (2007)]、一方、ＣＤ３１、ＥＲＧ１、およびＥＲＧ３はそれぞれ１５倍、１０倍、および１６倍を超えて増加した。さらに、これらの細胞の内皮分化をまた、Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬの急速取り込みおよび代謝により示した[Voyta, J.C. et al. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J Cell Biol 99, 2034-40 (1984）（図１１ｂ）。
【０２２０】
さらに、心臓ＡＤＳＣの内皮系譜への分化能を確認するため、機能新脈管形成アッセイを行った。マトリゲルコーティングおよび通常の条件で細胞を培養した後、管構造が形成された。これらの構造はすぐに発達して管ネットワークを形成し、その組織化とその径を成長させる（図１１ｃ〜１１ｅ）。それらをまた、特異的内皮マーカーＧＳＬＩイソレクチンＢ４を検出するために染色した（図１１ｆおよび１１ｇ）。
【０２２１】
２．４  心臓ＡＤＳＣは新脈管形成促進因子を分泌する
心臓ＡＤＳＣは心筋虚血において注射された際に宿主組織でこれらの因子を分泌することができるか否か、従って、血管形成を促進することができるか否かを調べるため、低酸素条件で新脈管形成促進因子のin vitro分泌を分析した。酸素正常状態では、細胞は有意な量のＩＬ−６（５３．６７７±２４．６１３ｐｇ／ｍｌ／１０６細胞）およびＶＥＧＦ（３．２０１±１．０１１ｐｇ／ｍｌ／１０６細胞）と、若干量のｂＦＧＦ（１６１．０±３１．２ｐｇ／ｍｌ／１０６細胞）およびＴＮＦ−α（５９．１±１６．０ｐｇ／ｍｌ／１０６細胞）を分泌した。ＩＬ−１βまたはＰＤＧＦＢＢの発現は検出されなかった。軽度低酸素状態（５％Ｏ２）および重度低酸素状態（１％Ｏ２）では、ＶＥＧＦ分泌の著しい増加（９２％、ｐ＝０．０４）があり、ＩＬ−６、ｂＦＧＦ、およびＴＮＦ−α濃度はおよそ２０％増加した。ＩＬ−１βおよびＰＤＧＦＢＢレベルは依然として検出できなかった。
【０２２２】
実施例７
心臓ＡＤＳＣ移植は心筋梗塞後の心機能を改善する
１．  材料および方法
１．１  心筋梗塞モデルおよび細胞移植
１．１．１  ラット
この研究には、合計１６匹の雄ヌードラット（２００−２５０ｇ、ＮＩＨ−Ｆｏｘｎ１ｒｎｖ、Charles River Laboratories Inc. Willmington, MA, USA）を用いた。これまでに記載されているように、左冠動脈を結紮した[Gandia, C. et al. Human dental pulp stem cells improve left left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infraction. Stem Cells 26, 638-45 (2008)]。これらのラットに挿管し、Ｏ２／Sevorane混合物で麻酔をかけ、人工呼吸器(Harvard Apparatus model 683 small animal ventilator)を装着し、開胸後、ＬＡＤ冠動脈を６−０  proleneで永久結紮することにより急性心筋梗塞を引き起こした。切開部を３−０絹縫合糸で縫い合わせた。１週間後、これらのラットに麻酔をかけ、胸骨正中切開により再び開き、ハミルトンシリンジを用いて梗塞の境界領域の５ヶ所に５μｌ量の５回の注射により心筋内移植を行った（生理食塩水中に懸濁した１０６心臓ＧＦＰ−ＡＤＳＣ細胞または等量の生理食塩水）。
【０２２３】
細胞の注射からおよそ３０日後に、停止液（６８．４ｍＭ  ＮａＣｌ、５９ｍＭ  ＫＣｌ、１１．１ｍＭグルコース、１．９ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２９．７ｍＭ  ＢＤＭ（２，３−ブタンジオン−モノオキシム）、１，０００Ｕヘパリン）を用いて心臓を拡張期に停止させ、それらの心臓を切開し、固定し、ＰＢＳ中３０％スクロース中で低温保存し、ＯＣＴ(Sakura, Torrance, California, USA)に包埋し、すぐにイソペンタン中で凍結し、液体窒素で冷却した。組織ブロックは、薄片に切るまで−８０℃で保存した。
【０２２４】
総ての工程において、the Institute of Laboratory Animal Researchのthe Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsの基準（ＮＩＨ公開番号８６−２３、１９９６年改定）を用いた。
【０２２５】
１．１．２  心エコー検査
心臓機能を評価するために、従前に記載されているように、ラットにおいて経胸壁心エコー検査を行った[Friedrich, J. et al. 31P nuclear magnetic resonance spectroscopic imaging of regions of remodeled myocardium in the infarcted rat heart. Circulation 92, 3527-38 (1995)]。１０Ｈｚ線形ネットワーク変換器を備えた心エコーシステム(General Electric)を使用し、初期レベル（梗塞の１日前に）と細胞移植後１５日および３０日の時点において測定を行った。中央乳頭の二次元（２−Ｄ）Ｍ−モード心エコー検査を胸骨傍短軸像で行った。機能パラメーターは、慣例法を用いて５回の連続した心周期で計算した[Litwin, S. E., Katz, S. E., Morgan, J. P. & Douglas, P. S. Serial echocardiographic assessment of left ventricular geometry and function after large myocardial infraction in the rat. Circulation 89, 345-54 (1994)]。
【０２２６】
拡張期および収縮期の前壁および後壁（ＡＷおよびＰＷ）の径、ＬＶの拡張末期径（ＬＶＤｄ）および収縮末期径（ＬＶＤｄ）、拡張末期面積（ＥＤＡ）、ならびに収縮末期面積（ＥＳＡ）を定量した。ＡＷおよびＰＷの変化は、それぞれ（ＡＷｓ／ＡＷｄ−１）×１００および（ＰＷｓ／ＰＷｄ−１）×１００として計算した。短縮率（ＦＳ）は、［（ＬＶＤｄ−ＬＶＤｓ）／ＬＶＤｄ］×１００として計算し、駆出率（ＥＦ）は、［（ＬＶＥＤＶ−ＬＶＥＳＶ）／ＬＶＥＤＶ］×１００として計算した。
【０２２７】
１．２  形態計測
１．２．１  ラット
ラット心臓を横方向に三つの部位に切断した：頂部、中央部（結紮を含む）、および基部。測定では、中央部の部位の１０μｍ厚凍結切片（２００μｍ離れた６切片）を連続的にマッソン・トリクローム染色し、画像解析ソフトウェア(ImageJ, NIH)を用いて形態計測パラメーターを決定した。梗塞サイズは、全ＬＶ壁表面における平均瘢痕面積の割合として測定した。梗塞の厚さは、部分心内膜梗塞面積を合計することによって計算した[Takagawa, J. et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area-and length-based approaches. J Appl Physiol 102, 2104-11 (2007)]。切片は総て盲検とし、Leica社製ステレオスコープ（Ｌｅｉｃａ  ＴＬ  ＲＣＩ）を用いて写真撮影した。
【０２２８】
１．２．２  免疫蛍光組織学
ラット心臓の凍結切片において二重免疫染色を行った。これらの組織をＣＤ３１（１：２５）(Abcam)および筋節α−アクチン（希釈度１：５００）(Sigma)またはｃＴｎＩ（２μｇ／ｍｌ）(Santa Cruz Biotechnology)に対する一次抗体とともにインキュベートした。ラット心臓におけるヒト細胞の免疫組織学的検出では、組織切片を抗ヒト核抗原抗体（ＨＮＡ、Chemicon）とともにインキュベートした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（５μｇ／ｍｌ）(Molecular Probes)とコンジュゲートした二次抗体を用いた。組織切片を４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール(4,6-diamidino-2-phenylyndole)（ＤＡＰＩ、Sigma）で対比染色し、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５を用いて分析した。
【０２２９】
１．２．３  毛細血管密度
梗塞の境界領域および梗塞の遠位心筋における毛細血管密度を決定するために、心臓切片をビオチン化ＧＳＬＩイソレクチンＢ４(Vector Labs)を用いて染色した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８と、コンジュゲートしたストレプトアビジンとを検出系として用いた。４対照動物および５処理動物において毛細血管を少なくとも１２の無作為に選択した視野（六つの境界領域＋六つの遠位領域）内で計数した。これらの結果を組織表面１ｍｍ２当たりの平均毛細血管数として表した。２名の独立した観察者は処置を知らされず、対照群および処理群を分析し、級間相関係数（ＣＨＦ）は境界領域では０．８２１（ｐ＜０．００１）、遠位領域では０．７４３（ｐ＜０．００１）であった。調査者らが得た値は同じような値であったということを考慮に入れて、各項目の最終結果は平均±ＳＥＭとした。
【０２３０】
１．２．４  統計分析
切片は総て盲検とし、計数し、調査者らの２名が考察した。群間の多重比較のために分散分析（二元配置ＡＮＯＶＡ）によってＦＳ、ＥＦおよびＡＷＴデータの統計的有意性を評価し、グリーンハウスの修正を適用した。対照群と細胞とのＭＩ中および３０日後（表５）の心エコーパラメーターならびに形態計測値を総てｔ検定により比較した。これらの結果は平均±ＳＥＭとして示した。境界領域および遠位領域における対照群と細胞との毛細血管密度の違いもｔ検定を用いて比較した。ｐ＜０．０５の値は群間で有意であると考察した。記述統計をＳＰＳＳにより行った。
【０２３１】
２．  結果
２．１  心臓ＡＤＳＣ移植は心筋梗塞後の心機能を改善する
ヌードラットにおいて初期レベルで、心筋梗塞（ＭＩ）後に、および細胞の注射後３０日まで対照群および心臓ＡＤＳＣ群の心エコーパラメーターを得た（表５）。初期レベルとＭＩ後では、分析した心エコーパラメーターの値が処理動物と非処理動物でよく似ており、これにより組織損傷が同程度であることが分かる。ＭＩ後、ＭＩ〜３０日間の処理群において有意な機能改善が認められた（表５）。対照群の展開は、左心室（ＬＶ）のリモデリングにより心機能パラメーターの進行性低下を示し、ＬＶの径ならびに拡張末期および収縮末期面積により判定した（表５）。左室内径短縮率（ｐ＝０．０２４）および駆出率（ｐ＝０．００３）については、二元配置ＡＮＯＶＡシステムを用いて対照群と細胞で処理した群との間に有意差が認められた（図１２ａおよび１２ｂ）。さらに、前壁は、心臓ＡＤＳＣ処理の３０日後に有意に厚くなっていた（ｐ＝０．０１４）（図１２ｃ）。心臓の運動性についてのビデオ録画では、心臓ＡＤＳＣ群において収縮性の改善を示したが、対照群では示さなかった。
【０２３２】
２．２  心臓ＡＤＳＣ移植は梗塞サイズを軽減する
ＭＩラットモデルにおいてマッソン・トリクローム染色した断面図を用いて、形態計測パラメーターを測定した。ＬＡＤ結紮後に中程度の瘢痕が生じ（ＬＶ領域のおよそ２０％）、心臓ＡＤＳＣの有益な効果は極めて著しいものであった。繊維性瘢痕組織領域の割合は、対照動物と比較すると処理動物において７５％低く、ＬＶ壁は処理動物において４５％厚かった。よって、心臓ＡＤＳＣは、心臓ＡＤＳＣの注射から３０日後に組織病理学により測定される梗塞サイズを効果的に軽減する。
【０２３３】
２．３  ヒト心臓ＡＤＳＣ移植片およびin vivo分化
ヒト心臓ＡＤＳＣのグラフをｅＧＰＦ落射蛍光追跡により分析し、ヒト起源をＨＮＡ（ヒト核抗原）検出（赤色シグナル）によって示した（図１４ａ）。加えて、染色分離についてのスペクトル分析(λ調査)によってｅＧＦＰの特異的シグナルも確認した（図１５）。注射が梗塞の境界領域に対して行われることとは関係なく、前記細胞が組織の瘢痕領域内に均一に存在していたことが観察されるのは興味深く、そしてこのことにより、前記細胞がとりわけ必要になる可能性がある場所へと移動する前記細胞の能力が示される（図１４ｂ）。宿主組織における注入細胞およびそれらの移植片の心臓および内皮分化レベルを分析するために、心臓マーカー（筋節α−アクチニンおよびトロポニンＩ）および内皮マーカー（ＣＤ３１）についての二重免疫染色を行った。心臓ｅＧＦＰ＋−ＡＤＳＣはトロポニンＩの発現も示し（図１４ｂ）、筋節α−アクチニンについて陽性であった（図１４ｃ）。ＣＤ３１の発現は心臓ｅＧＰＦ＋−ＡＤＳＣにおいても観察され、このような心臓ｅＧＰＦ＋−ＡＤＳＣは管状構造を形成する組織全体に配置されており、そしてこのことにより、これらの細胞が新たな血管の形成に寄与することが示唆される（図１４ｄ）。
【０２３４】
２．４  心臓ＡＤＳＣによる毛細血管密度の増加
最後に、ＧＳＬＩイソレクチンＢ４を用いて、繊維性組織の境界領域における毛細血管密度および心臓ＡＤＳＣ移植後の時間を評価した。図１６ｃに示すように、境界領域における毛細血管密度は、心臓ＡＤＳＣを受けた動物において、対照動物よりも１．６倍高く（ｐ＝０．００３）（図１６ａおよび１６ｂ）、また遠位領域において毛細血管密度の増加傾向（ｐ＝０．０５７）も認められた。管腔に血液細胞が存在することからこれらの血管が機能し得ることが分かる。
【０２３５】
３．  考察
本明細書に添付する実施例１〜７において示す結果は、心臓脂肪組織由来の成体幹細胞（心臓ＡＤＳＣ）の新規な集団が同定され、特徴づけられたということを明らかに示している。前記心臓ＡＤＳＣは、脂肪組織に由来し、間葉幹細胞（ＭＳＣ）のように脂肪細胞へは分化しないが、ＭＳＣに類似した表面マーカーを発現し、コロニー形成能力を維持し、そしてこのことはより低い可塑性およびより高い指定条件を示している。さらに、心臓ＡＤＳＣはいくつかの必須心筋形成マーカー、例えばＧＡＴＡ４、Ｃｘ４３、β−ＭＨＣ、筋節α−アクチニン、またはＳＥＲＣＡ２を発現する。心臓および皮下ＡＤＳＣにおける遺伝子発現および心筋形成タンパク質の比較では、これらのタンパク質の発現が心臓ＡＤＳＣにおいてかなり高いことが示された。これらの結果は、新規心臓ＡＤＳＣは、脂肪細胞環境に存在するにもかかわらず、心臓ホメオスタシスにおいて機能を果たし得ることを示唆している。心臓周囲の脂肪は心筋組織を新しくするための細胞の保留としても機能し得る、しかし、梗塞後に危険にさらされた状態となった大量の心筋は、組織修復についてのホメオスタシス能力を超える。
【０２３６】
心臓ＡＤＳＣが新生児ラット心筋細胞の影響を受けている場合には、心筋形成マーカーの発現は顕著に上方調節される（α−アクチニン筋節、β−ＭＨＣ、ＳＥＲＣＡ２）か、または新たに活性化される（トロポニンＩ）。以前の研究により、新生児心筋細胞が心臓分化を刺激するのに利用する機構が、分化因子の分泌、細胞間の相互作用ならびに電気的および機械的刺激であり得ることが証明されている。さらに、マトリゲルでまたは内皮分化培地で心臓ＡＤＳＣを培養することで、管状構造が形成され、Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬが組み込まれ、そして内皮マーカーの発現が増強された。in vivo試験でも、心臓細胞系譜への心臓ＡＤＳＣの分化能が証明された。心臓ＡＤＳＣを梗塞心筋へ移植した場合には、前記心臓ＡＤＳＣは、筋節α−アクチニン、ｃＴｎＩおよびＣＤ３１を発現し、心筋に効果的に移植されることが観察された。それらの分化は、細胞相互作用と組織の電気的および機械的影響とにより誘導された。細胞移植は心機能の改善をもたらし、細胞で処理した動物における駆出率、短縮率およびＬＶ壁厚は有意に増加した。心臓ＡＤＳＣの有益な効果は、骨髄細胞[Agbulut, O. et al. Comparison of human skeletal myoblasts and bone marrow-derived CD133+ progenitors for the repair of infarcted myocardium. J Am Coll Cardiol 44, 458-63 (2004)]および成体心臓幹細胞[Beltrami, A. P. et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell 114, 763-76 (2003)]（駆出率の改善はそれぞれ７および９．７％であった）、または臍帯血単核細胞[Henning, R. J. et al. Human umbilical cord blood mononuclear cells for the acute myocardial infarction treatment. Cell Transplant 13, 729-39 (2004)]（これらを梗塞心筋に移植した場合には駆出率の２７％低下を示した）で観察されるもの以上であった。
【０２３７】
心臓ＡＤＳＣが虚血組織で生存し、新脈管形成に利益をもたらすことができるか否かを確認するために、細胞を中度および重度の低酸素状態で培養し、新脈管形成促進因子の培地への分泌を分析した。これらの結果により、正常酸素状態と比較して、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−β、ｂＦＧＦ、およびＩＬ−６レベルが増加することが分かった。動脈硬化症患者に１種の新脈管形成因子を供給した場合、新血管新生反応は中等度でしかないことは報告されている。この結果について考えられる理由は、血管網の形成およびその拡大は、相乗的に作用する複数の因子の作用を必要とする工程であるということである。そのため、ベースライン条件において心臓ＡＤＳＣにより新脈管形成促進因子の組合せを分泌させることおよび低酸素状況においてそれらを増加させることにより、これらの細胞は、心筋虚血におけるそれらの注入に潜在的に有用なものとなる。実際に、梗塞心臓への心臓ＡＤＳＣ移植後に毛細血管密度の明らかな増加が認められた。こうした総ては、これらの細胞（心臓ＡＤＳＣ）が心筋虚血においてパラ分泌効果を与え、新たな血管の形成に利益をもたらし得ることを全体的に示唆している。多数の毛細血管は心筋における酸素制限を改善し、その結果、ラットにおいて４３％という梗塞サイズの有意な軽減に寄与する。さらに、ＳＤＦ−１を増加させることにより心筋細胞の生存を改善し、梗塞後の新血管新生を誘導することができるということを示す報告もある[Penn, M. S. & Mangi, A. A. Genetic enhancement of stem cell engraftment, survival, and efficacy. Circ Res 102, 1471-82  008]。そのため、心臓ＡＤＳＣのin vivo内皮細胞系譜の証明およびin vitro内皮分化後に観察されるＳＤＦ−１の相当な過剰発現から、ＳＤＦ−１には心筋細胞に対する心臓保護効果だけでなく新脈管形成効果もあり得ることが示唆される。
【０２３８】
心臓ＡＤＳＣを梗塞の境界領域に注射しても、これらの細胞は繊維性瘢痕内に存在することが観察されるはずである。これは、前記細胞がとりわけ必要になる可能性がある虚血領域に向かって注射部位から移動する前記細胞の能力を示している。他の幹細胞系譜を用いた以前の試験でも同様の結果を示しているが、それらの結果は低酸素状態におけるＶＥＧＦの走化性効果による細胞移動反応により説明されている[Gandia, C. et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells 26, 638-45 (2008)、 Matsushita, K. et al. The role of vascular endothelial growth factor in human dental pulp stem cells: induction of chemotaxis, proliferation, and differentiation and activation of the AP-1-dependent signaling pathway. J Dent Res 79, 1596-603 (2000)]。同じ傾向の証拠として、ニワトリ胚で行われた研究では、心外傷がヒト臍帯血由来幹細胞の誘引に対する強い刺激であることが示されている[Torre-Perez, N. et al. Migration and differentiation of human umbilical cord stem cells after heart injury in chicken embryos. Stem Cells Dev (2008)]。
【０２３９】
心臓脂肪組織は、心臓の周囲に緊密に配置されており、心臓ＡＤＳＣへの接近性が障害である。これらの心臓ＡＤＳＣの単離のための心臓脂肪生検を得るために左側開胸を容易に行うことができたが、このアプローチは、安定した虚血患者における冠動脈バイパス手術前に利用することができたが、心筋梗塞の緊急時に臨床的に適用されるとは思われない。しかしながら、心臓ＡＤＳＣが、他の種類の間葉幹細胞に関して記載されている免疫抑制能力と同様の免疫抑制能力を有するという事実から、これらの細胞を将来において同種異系治療に使用するという可能性が生まれる。
【０２４０】
要約すれば、それぞれに内皮および心臓になる可能性を有する新規な種類の幹（前駆体）細胞を記載しており、これらの細胞はin vitroおよびin vivoで心臓細胞系譜へと分化することができ、ＭＩ後に損傷を受けた心筋にそれらを注入すると、有益な機能的かつ病理組織学的な効果を与える。いずれの理論にも縛られるものではないが、リモデリング減衰の二重機構がある可能性があり、その機構では前記細胞は失われた心筋細胞および内皮細胞を置き換える可能性を有し、新脈管形成の促進においてパラ分泌効果も与えると考えられる。これらの特性とともに、免疫抑制能力、そして催奇形性がないことから、心臓ＡＤＳＣは、損傷を受けた心筋を再生するための細胞療法におけるそれらの将来の使用の安全かつ有望な候補となる。
【０２４１】
【表３】
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【０２４２】
【表４】
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【０２４３】
【表５】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年1月11日(2010.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明者らは特に、心外膜領域の新規なヒト心臓脂肪組織由来の成体幹細胞集団をそれらの表面マーカーにより特徴づけ、心臓転写因子ＧＡＴＡ−４およびＮｋｘ２．５、β−ミオシン重鎖（β−ＭＨＣ）、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎ１）、および筋節α−アクチニンと呼ばれる筋節成分、ならびにそれぞれ電気化学的結合および細胞内カルシウム分布のレギュレーターであるコネキシン−４３（Ｃｘ４３）およびＳＥＲＣＡ−２心筋細胞の種々の基本成分の遺伝子（ｍＲＮＡ）およびタンパク質の発現を分析した。これらのマーカーの総ての発現を構成的に、すなわち、特定の系譜へと向かう分化のためのいずれの種類の誘導因子も培養培地に加えることなく分析した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
遺伝子発現分析において得られた結果を、ウエスタンブロットおよび免疫蛍光による前記心臓特異的マーカーのタンパク質レベルでの発現の研究と比較した（実施例４）。免疫蛍光アッセイの結果は、核ＧＡＴＡ−４、β−ＭＨＣ、ＳＥＲＣＡ−２、Ｃｘ４３、および筋節α−アクチニンの発現、ならびに心臓脂肪組織由来幹細胞（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）集団における細胞レベルでのその分布を示す。ウエスタンブロットの結果は、ｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞に対する皮下脂肪組織由来幹細胞（ｓｕｂ−ＡＤＳＣ）の発現プロファイルの比較を示し、核タンパク質ＧＡＴＡ−４とＣｘ４３の発現の差異、および後者が培養期間中どのように維持され、または増加するかが確認された。さらにβ−ミオシン重鎖（β−ＭｙｃＨＣ）の、培養期間による発現の差異も見られた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
【図１】（Ａ）は、心外膜および皮下脂肪の抽出画分の写真を示す。（Ｂ）は、ヒト心外膜脂肪組織由来の成体幹細胞（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）の形態が観察できる顕微鏡像を示す。（Ｃ）は、ヒト皮下脂肪組織由来の成体幹細胞（ｓｕｂ−ＡＤＳＣ）の形態が観察できる顕微鏡像を示す。
【図２】フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によるヒト心外膜脂肪組織由来の成体幹細胞（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）の免疫表現型の特徴を示す。試験下の４名の患者（Ｐ１〜Ｐ４）に相当するヒストグラムを示す［図２Ａ  ｅｐｉ−ＡＤＳＣ  Ｐ１、図２Ｂ  ｅｐｉ−ＡＤＳＣ  Ｐ２、図２Ｃ  ｅｐｉ−ＡＤＳＣ  Ｐ３、および図２Ｄ  ｅｐｉ−ＡＤＳＣ  Ｐ４］。これらのヒストグラムはｙ軸に試験下のマーカーの蛍光強度を、ｘ軸に細胞数を示す。各ヒストグラムは対照マーカー（黒）および試験下のマーカー（グレー）の発現グラフを重ね合わせて示す。ｘ軸上の、対照に対する試験下マーカーの横移動の程度は、細胞サンプルが対象マーカーに関してどの程度陽性かを示す。
【図３】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる成体幹ｅｐｉ−ＡＤＳＣおよびｓｕｂ−ＡＤＳＣ細胞集団間の心臓特異的マーカーの構成遺伝子発現の比較分析を示す。転写因子ＧＡＴＡ４の発現差異（継代培養２回および継代培養５回）が見られ（図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）、継代培養５回では、ｓｕｂ−ＡＤＳＣ幹細胞に対してｅｐｉ−ＡＤＳＣ幹細胞のＣｘ４３転写物レベル（その発現はおそらくＧＡＴＡ４により誘発される）の上昇も見られる（図３Ｂおよび３Ｃ）。分析した残りの心臓遺伝子（筋節α−アクチニン、β−ＭＨＣ、心臓トロポニンＩ、ＳＥＲＣＡ−２およびＮｋｘ２．５）に関しては、細胞の培養中、それらの発現に関して有意な違いは見られなかった。
【図４】ウエスタンブロットによるｅｐｉ−ＡＤＳＣ（Ｅ）およびｓｕｂ−ＡＤＳＣ（Ｓ）成体幹細胞集団間の心臓特異的マーカーの発現の比較分析を示す。図４Ａは、全抽出物の比較分析を示す。図４Ｂは、細胞質（Ｃ）および核（Ｎ）画分で行った比較分析を示す。継代培養２回（ｐ２）および継代培養５回（ｐ５）の双方において、ｓｕｂ−ＡＤＳＣ幹細胞に対してｅｐｉ−ＡＤＳＣ幹細胞によるＣｘ４３およびＧＡＴＡ−４のタンパク質発現レベルの上昇が見て取れる。また、ｅｐｉ−ＡＤＳＣ幹細胞における継代培養５回でβ−ＭＨＣの発現の差異も見られる。
【図５】免疫蛍光によるｅｐｉ−ＡＤＳＣ成体幹細胞集団における心臓特異的マーカーの発現を示す。顕微鏡写真は、心臓タンパク質：ＧＡＴＡ−４、β−ＭＨＣ（βＭＨＣ）、筋節α−アクチニン、ＳＥＲＣＡ−２、およびコネキシン−４３（Ｃｘ４３）の発現の、特異的抗体による検出を示す。ＧＡＴＡ−４が細胞核に最も多く見られること、β−ＭＨＣが構造的によく組織化されて筋原繊維を形成していること、およびα−アクチニン、ＳＥＲＣＡ−２、およびＣｘ４３が細胞中に拡散分布していることが見て取れる。
【図６】心臓ＡＤＳＣの単離および特性決定を示す。図６ａは、開胸心臓手術の際のヒト心臓の様子を示し、近位右冠動脈の隣接部で採取した心臓脂肪組織の生検を保持する鉗子が見られる（ＡＯ：大動脈、ＬＶ：左心室）。図６ｂは、集密前の心臓ＡＤＳＣの一次培養を示す（２０倍）。図６ｃは、心臓ＡＤＳＣのフローサイトメトリーによる免疫表現型検査を用いた分析の結果を示す棒グラフである。
【図７】脂肪形成分化培地で培養した後の心臓ＡＤＳＣ（図７ａ）および皮下ＡＤＳＣ（図７ｂ）のアリザリンレッドＳ染色による脂肪形成分化分析の結果を示す。図７ｃは、アッセイした種々の細胞集団（心臓および皮下ＡＤＳＣ）に関する、処置３週間および４週間後の脂肪細胞種陽性細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。
【図８】皮下ＡＤＳＣと比較した心臓ＡＤＳＣにおける心筋形成遺伝子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示す棒グラフである。値は、ある細胞種が同じ患者由来の他の細胞種の何倍発現されるかを示す（この場合には、心臓ＡＤＳＣと皮下ＡＤＳＣの比較）。皮下ＡＤＳＣに比べ心臓ＡＤＳＣではＧＡＴＡ４およびＣｘ４３転写物の統計学的に有意な増加が見られる（ＧＡＴＡ４、ｐ＜０．００１、Ｃｘ４３、ｐ＝０．０３１）。
【図９】ウエスタンブロットおよび免疫組織蛍光によるアッセイを受けた心臓ＡＤＳＣの心臓マーカーの基礎発現を示す。図９ａは、心臓および皮下（Ｓｕｂ）ＡＤＳＣ溶解液のウエスタンブロット解析の結果を示す（成体ヒト心臓タンパク質の抽出物を対照として用いた）。図９ｂ〜９ｄは、心臓ＡＤＳＣにおけるそれぞれβ−ＭＨＣ、ＳＥＲＣＡ２および筋節α−アクチニンの発現を示す（赤）。図９ｅは、心臓ＡＤＳＣにおけるＧＡＴＡ４（緑）およびＣｘ４３（赤）の発現を示す。図９ｃおよび９ｄのパネルでは、核はＨｏｅｓｃｈｔ  ３３３４２（青）で染色した。スケールバーは５０μｍ。
【図１０】心臓ＡＤＳＣと新生児心筋細胞との同時培養を示す。心臓ｅＧＦＰ＋−ＡＤＳＣ（緑：ａ、ｅ、ｉ、ｌおよびｐ）、ｃＴｎＩ（赤：ｂ、ｆおよびｊ）、β−ＭＨＣ（青：ｃ）、ＤＡＰＩによる核の対比染色（シアン：ｄ）（青：ｇ、ｈ’、およびｓ）。（ｈ’、ｋ’、およびｏ’）それぞれｈ、ｋおよびｏにおける点線のｘｚ様式で示したもの。共焦顕微鏡で撮影した、心臓ＡＤＳＣにおける心臓マーカーの同時局在を示す画像。Ｃｘ４３（赤：ｍ）、筋節α−アクチニン（シアン：ｎ）、ＳＥＲＣＡ２（赤：ｑ）、およびＧＡＴＡ４（シアン：ｒ）。（ｄ、ｈ、ｈ’、ｋ、ｋ’、ｏ、ｏ’、およびｓ）は合成画像である。スケールバーは５０μｍ（ａ〜ｄおよびｐ〜ｓ）、２５μｍ（and〜ｈおよびｌ〜ｏ）および１０μｍ（ｉ〜ｋ）。
【図１１】心臓ＡＤＳＣが培養中に内皮細胞へ分化することを示す。図１１ａは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定された、非処理対照細胞に比べＥＧＭ−２で処理した細胞の新脈管形成促進マーカーが何倍発現されるかを示す棒グラフである。図１１ｂは、分化処理後の心臓ＡＤＳＣによるＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬの組み込みを示す。図１１ｃ〜１１ｅは、マトリゲルコーティングを伴う心臓ＡＤＳＣの培養２、４、および７時間の細管の形成を示す（１０倍）。図１１ｆおよび１１ｇは、マトリゲルでのコーティング内に形成された細管のＧＳＬＩイソレクチンＢ４染色を示す。スケールバーは５０μｍ。
【図１２】種々の心エコー機能パラメーター：内径短縮率（ＦＳ）［図１２ａ］、駆出率（ＥＦ）［図１２ｂ］、および前壁厚（ＡＷＴ）［図１２ｃ］の値を示す。
【図１３】ラット心臓の形態計測分析の結果を示す。図１３ａおよび１３ｂは、術後３０日のラット心臓の、梗塞心筋を通る断面図のマッソンのトリクローム染色の結果を示す（ｅ、対照、ｆ、処理）。図１３ｃおよび１３ｄは、対照群および細胞処理群におけるラットのＬＶの梗塞サイズ％とＬＶ壁厚を示す。
【図１４】梗塞を有するラットの心臓におけるヒト心臓ＡＤＳＣのグラフトの結果を示す。心臓および内皮のin vivo分化が見て取れる。図１４ａは、心筋に注入された心臓ｅＧＦＰ＋−ＡＤＳＣを緑で示し、注入された心臓ｅＧＦＰ＋−ＡＤＳＣがヒト起源であることを確認するためにヒト核抗原（ＨＮＡ、赤）に対する免疫染色の結果が示される。図１４ｂ〜１４ｄは、心臓ＡＤＳＣが注入された心臓の切片における、ｃＴｎＩ（ｂ）、筋節α−アクチニン（ｃ）およびＣＤ３１（ｄ）（総て赤）に対する免疫染色の結果を示す。境界領域に注射したにもかかわらず、虚血性組織中にこれらの細胞の分布が見られるのは重要なことである。スケールバーは５０μｍ。
【図１５】ｅＧＦＰ＋（ＲＯＩ１）およびバックグラウンド（ＲＯＩ２）細胞の発光スペクトルの測定結果を示す。
【図１６】梗塞心筋における、具体的には、対照心筋の境界領域（図１６ａ）および心臓ＡＤＳＣで処理された心筋（図１６ｂ）における、ＧＳＬＩイソレクチンＢ４で染色された毛細血管の毛細血管密度分析の結果を示す。図１６ｃは、梗塞の境界領域および遠位領域における、対照群および心臓ＡＤＳＣ処理群の毛細血管数／ｍｍ２を示す棒グラフである。遠位領域では有意な違いは見られなかった。スケールバーは５０μｍ。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
結果
表２および図３Ａに示されるように、同じ個体から抽出されたｓｕｂ−ＡＤＳＣ細胞に比べ、ｅｐｉ−ＡＤＳＣ細胞集団の心臓転写因子ＧＡＴＡ−４に関する遺伝子レベルの統計学的に有意な上昇（ｐ＜０．００１）が継代培養２回で検出された。これに対し、残りの心臓特異的マーカー（筋節α−アクチニン、β−ＭＨＣ、ｃＴｎＩ、Ｃｘ４３、ＳＥＲＣＡ−２、およびＮｋｘ２．５）の遺伝子発現に関しては、この２種類の供試細胞集団間での有意差は検出されなかった（図３Ａ）。継代培養５回でＧＡＴＡ−４の発現の差は増大し（ｐ＜０．００１）、Ｃｘ４３の転写レベルに関しても有意差が検出される（ｐ＝０．０３１）ことを指摘しておくべきである（図３Ｂおよび３Ｃ）。これらの結果は心外膜脂肪由来幹細胞（ｅｐｉ−ＡＤＳＣ）集団は、同じ個体の皮下脂肪由来細胞（ｓｕｂ−ＡＤＳＣ）集団に比べて、心臓系譜へより大きく傾くことを示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
【表２】
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【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０４】
１．９  タンパク質抽出およびウエスタンブロット
タンパク質抽出物を既に記載されている方法[Roura, S. et al. Idiopathic dilated  cardiomyopathy exhibits defective vascularization and vessel formation. Eur J Heart Fail 9, 995-1002 (2007)]に従い、取得した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いたＢｉｏ−Ｒａｄ  ＤＣプロテインアッセイ(Bio-Rad)によりタンパク質レベルをノーマライズし、これらのサンプルを５〜１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。これらのタンパク質をニトロセルロース膜(Bio-Rad)に転写し、それぞれＧＡＴＡ４（１：５００）、ＳＥＲＣＡ２（１：１００）、α−アクチン（１：３００）、ｃＴｎＩ（１：３００）(Santa Cruz Biotech.)、Ｃｘ４３（１：５００）(BD Transduction, Lexington, KY, USA)、β−ＭＨＣ（１：１０）(Chemicon, Temecula, CA, USA)、および筋節α−アクチニン（１：５００）(Sigma, St. Louis, MO, USA)に特異的なモノクローナル抗体（ＡｃＭ）を用いて検査した。増強化学発光検出系(Amersham Biosciences)を用いてタンパク質バンドを観察した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
１．１０  免疫蛍光染色
これらの細胞に透過処理を施し、５％正常ヤギ血清中で３０分間ブロッキングし、抗ＧＡＴＡ４、抗ＳＥＲＣＡ２、抗−ｃＴｎＩ（２μｇ／ｍｌ）(Santa Cruz Biotechnology)、抗α筋節アクチニン（１：５００希釈）(Sigma)、抗β−ＭＨＣ（無希釈）(Chemicon)、および抗Ｃｘ４３（２．５μｇ／ｍｌ）(BD Transduction)抗体を用い、室温で１時間マーキングした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（５μｇ／ｍｌ）(Molecular Probes)とコンジュゲートされた二次抗体を適用し、共焦レーザー走査顕微鏡(Leica TCS SP5)でシグナルを観察した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１６】
タンパク質レベルにおいて、最初の培養培地で、心臓ＡＤＳＣはβ−ＭＨＣ、ＳＥＲＣＡ２、筋節α−アクチニン、Ｃｘ４３、およびＧＡＴＡ４（図９ａ）ならびに微量のＴｂｘ５を発現した（データは示されていない）。これらの結果はウエスタンブロット（図９ａ）および免疫蛍光（図９ｂ〜９ｅ）により確認した。見て取れるように、β−ＭＨＣ繊維すでに所定の細胞質分布を発現する（図９ｂ）。これに対し、皮下ＡＤＳＣはβ−ＭＨＣ、Ｃｘ４３、ｃＴｎＩ、およびＧＡＴＡ４の非存在、および筋節α−アクチニンの低発現を示した（図９ａ）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１７】
ヒト心臓ＡＤＳＣと、新生ラット心筋細胞との同時培養は、分析したヒト細胞の心臓形成能を示した。β−ＭＨＣ（図１０ｃ）、筋節α−アクチニン（図１０ｎ）、Ｃｘ４３（図１０ｍ）、ＳＥＲＣＡ２（図１０ｑ）、およびＧＡＴＡ４（図１０ｒ）の強度ならびに傾向は培養で増強され、新生児心筋細胞において観察されるものに匹敵した。さらに重要なことに、この同時培養は、非刺激培養では見られない重要な筋節タンパク質であるトロポニンＩの発現を刺激した（図１０ｂ、１０ｆ、および１０ｊ）。トロポニンＩ細胞質における再配列も、培養心筋細胞で見られる継代培養筋節構造に似ていた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２８】
１．２．２  免疫蛍光組織学
ラット心臓の凍結切片において二重免疫染色を行った。これらの組織をＣＤ３１（１：２５）(Abcam)および筋節α−アクチニン（希釈度１：５００）(Sigma)またはｃＴｎＩ（２μｇ／ｍｌ）(Santa Cruz Biotechnology)に対する一次抗体とともにインキュベートした。ラット心臓におけるヒト細胞の免疫組織学的検出では、組織切片を抗ヒト核抗原抗体（ＨＮＡ、Chemicon）とともにインキュベートした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（５μｇ／ｍｌ）(Molecular Probes)とコンジュゲートした二次抗体を用いた。組織切片を４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール(4,6-diamidino-2-phenylyndole)（ＤＡＰＩ、Sigma）で対比染色し、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５を用いて分析した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３２】
２．２  心臓ＡＤＳＣ移植は梗塞サイズを軽減する
ＭＩラットモデルにおいてマッソン・トリクローム染色した断面図を用いて、形態計測パラメーターを測定した。ＬＡＤ結紮後に中程度の瘢痕が生じ（ＬＶ領域のおよそ２０％）、心臓ＡＤＳＣの有益な効果は極めて著しいものであった。繊維性瘢痕組織領域の割合は、対照動物と比較すると処理動物において７５％低く、ＬＶ壁は処理動物において４５％厚かった。よって、心臓ＡＤＳＣは、心臓ＡＤＳＣの注射から３０日後に組織病理学により測定される梗塞サイズを効果的に軽減する（図１３）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
心臓ＡＤＳＣが新生児ラット心筋細胞の影響を受けている場合には、心筋形成マーカーの発現は顕著に上方調節される（筋節α−アクチニン、β−ＭＨＣ、ＳＥＲＣＡ２）か、または新たに活性化される（トロポニンＩ）。以前の研究により、新生児心筋細胞が心臓分化を刺激するのに利用する機構が、分化因子の分泌、細胞間の相互作用ならびに電気的および機械的刺激であり得ることが証明されている。さらに、マトリゲルでまたは内皮分化培地で心臓ＡＤＳＣを培養することで、管状構造が形成され、Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬが組み込まれ、そして内皮マーカーの発現が増強された。in vivo試験でも、心臓細胞系譜への心臓ＡＤＳＣの分化能が証明された。心臓ＡＤＳＣを梗塞心筋へ移植した場合には、前記心臓ＡＤＳＣは、筋節α−アクチニン、ｃＴｎＩおよびＣＤ３１を発現し、心筋に効果的に移植されることが観察された。それらの分化は、細胞相互作用と組織の電気的および機械的影響とにより誘導された。細胞移植は心機能の改善をもたらし、細胞で処理した動物における駆出率、短縮率およびＬＶ壁厚は有意に増加した。心臓ＡＤＳＣの有益な効果は、骨髄細胞[Agbulut, O. et al. Comparison of human skeletal myoblasts and bone marrow-derived CD133+ progenitors for the repair of infarcted myocardium. J Am Coll Cardiol 44, 458-63 (2004)]および成体心臓幹細胞[Beltrami, A. P. et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell 114, 763-76 (2003)]（駆出率の改善はそれぞれ７および９．７％であった）、または臍帯血単核細胞[Henning, R. J. et al. Human umbilical cord blood mononuclear cells for the acute myocardial infarction treatment. Cell Transplant 13, 729-39 (2004)]（これらを梗塞心筋に移植した場合には駆出率の２７％低下を示した）で観察されるもの以上であった。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
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【国際調査報告】
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