(57)【要約】  【解決手段】  ＲＮＡ干渉による遺伝子発現制御が可能である、長さ約１９〜約２５ヌクレオチドの２本鎖ＲＮＡを提供する。そうした２本鎖ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡまたは遺伝子に関連する疾患または病状の治療に特に有用である。製造方法および２本鎖ＲＮＡの利用方法もまた、提供する。  【選択図】      図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
２本鎖ＲＮＡ分子を調製する方法であって、
（ａ）２若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドの第１のセットを合成する工程であって、サブストランドの前記第１のセットを結合した長さは約１９〜約２５ヌクレオチドである、前記第１のセットを合成する工程と、
（ｂ）２若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドの第２のセットを合成する工程であって、サブストランドの前記第２のセットを結合した長さは約１９〜約２５ヌクレオチドである、前記第２のセットを合成する工程と、
（ｃ）ＲＮＡサブストランドの前記合成された第１および第２のセットを、２本鎖ＲＮＡ分子が形成される条件下で結合する工程と
を有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記ＲＮＡ鎖は化学的に合成されるものである。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記ＲＮＡ鎖は酵素的に合成されるものである。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記２本鎖ＲＮＡ分子は、１つの２本鎖領域と、前記２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖の３’末端における約１〜約５ヌクレオチドの１本鎖領域とを有するものである。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、前記２本鎖ＲＮＡ分子の両方の鎖は、それぞれ、約１〜約５ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有するものである。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記２本鎖ＲＮＡ分子の両方の鎖は、それぞれ、約２ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有するものである。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、それぞれの鎖は２０〜２２ヌクレオチドの長さを有するものである。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、前記２本鎖ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの糖修飾ヌクレオチドを有するものであり、前記糖修飾ヌクレオチドの２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、Ｎ（Ｒ）２、またはＣＮから選択される基で置換され、ＲはＣ１〜Ｃ６アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃ、Ｂｒ、またはＩである。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、前記２本鎖ＲＮＡ分子は、ホスホロチオエート基を含む少なくとも１つの主鎖修飾型ヌクレオチドを有するものである。
【請求項１０】
２本鎖ＲＮＡ分子を調製する方法であって、
（ａ）約１９〜約２５ヌクレオチドの長さを有する１つのＲＮＡ鎖を合成する工程と、
（ｂ）第２のＲＮＡ鎖および第３のＲＮＡ鎖を合成する工程であって、第２のＲＮＡ鎖および第３のＲＮＡ鎖を結合した長さは約１９〜約２５ヌクレオチドとなるものである、前記第２のＲＮＡ鎖および第３のＲＮＡ鎖を合成する工程と、
（ｃ）前記合成ＲＮＡ鎖を結合する工程であって、２本鎖ＲＮＡ分子が形成され、前記２本鎖ＲＮＡ分子が１つの２本鎖領域と、前記２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖の３’末端における約１〜約５ヌクレオチドの１本鎖領域とから成るような条件下で行うものである、前記合成ＲＮＡ鎖を結合する工程と
を有する方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、前記ＲＮＡ鎖は化学的に合成されるものである。
【請求項１２】
請求項１０記載の方法において、前記ＲＮＡ鎖は酵素的に合成されるものである。
【請求項１３】
請求項１０記載の方法において、前記２本鎖ＲＮＡ分子は、１つの２本鎖領域と、前記２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖の３’末端における約１〜約５ヌクレオチドの１本鎖領域とを有するものである。
【請求項１４】
請求項１０記載の方法において、前記２本鎖ＲＮＡ分子の両方の鎖は、それぞれ、約１〜約５ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有するものである。
【請求項１５】
請求項１０記載の方法において、前記２本鎖ＲＮＡ分子の両方の鎖は、それぞれ、約２ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有するものである。
【請求項１６】
請求項１０記載の方法において、それぞれの鎖は約２０〜約２２ヌクレオチドの長さを有するものである。
【請求項１７】
請求項１０記載の方法において、前記２本鎖ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの糖修飾ヌクレオチドを有するものであり、前記糖修飾ヌクレオチドの２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、Ｎ（Ｒ）２、またはＣＮから選択される基で置換され、ＲはＣ１〜Ｃ６アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。
【請求項１８】
請求項１０記載の方法において、前記２本鎖ＲＮＡ分子は、ホスホロチオエート基を含む少なくとも１つの主鎖修飾型ヌクレオチドを有するものである。
【請求項１９】
２本鎖ＲＮＡ分子を調製する方法であって、
（ａ）２若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドの第１のセットを合成する工程であって、前記サブストランドの第１のセットを結合した長さは２５ヌクレオチドまたはそれ以下となるものである、前記第１のセットを合成する工程と、
（ｂ）２若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドの第２のセットを合成する工程であって、前記サブストランドの第２のセットを結合した長さは２５ヌクレオチドまたはそれ以下となるものである、前記第２のセットを合成する工程と、
（ｃ）ＲＮＡサブストランドの前記合成された第１および第２のセットを、２本鎖ＲＮＡ分子が形成される条件下で結合する工程と
を有する方法。
【請求項２０】
請求項２０１記載の方法において、前記２本鎖ＲＮＡ分子は、１つの２本鎖領域と、前記２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖の３’末端における約１〜約５ヌクレオチドの１本鎖領域とを有するものである。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法において、それぞれの鎖は２０〜２２ヌクレオチドの長さを有するものである。
【請求項２２】
２本鎖ＲＮＡ分子を調製する方法であって、
（ａ）２５ヌクレオチドまたはそれ以下の長さを有する１つのＲＮＡ鎖を合成する工程と、
（ｂ）第２のＲＮＡ鎖および第３のＲＮＡ鎖を合成する工程であって、前記第２のＲＮＡ鎖および第３のＲＮＡ鎖を結合した長さが、２５ヌクレオチドまたはそれ以下となるものである、前記第２のＲＮＡ鎖および第３のＲＮＡ鎖を合成する工程と、
（ｃ）合成ＲＮＡ鎖を結合する工程であって、２本鎖ＲＮＡ分子が形成され、前記２本鎖ＲＮＡ分子が１つの２本鎖領域と、前記２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖の３’末端における約１〜約５ヌクレオチドの１本鎖領域とから成るような条件下で行うものである、前記合成ＲＮＡ鎖を結合する工程と
を有する方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法において、前記２本鎖ＲＮＡ分子は、１つの２本鎖領域と、前記２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖の３’末端における約１〜約５ヌクレオチドの１本鎖領域とを有するものである。
【請求項２４】
請求項２２記載の方法において、それぞれの鎖は２０〜２２ヌクレオチドの長さを有するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年９月８日に出願された米国特許出願第６０／８２４，９５３号、「ｓｉＲＮＡおよび製造方法（ｓｉＲＮＡ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ）」に対して優先権を主張するものであり、この参照によってその全体が本願明細書に取り込まれるものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本発明の要約
本発明の一実施形態は、治療薬として有用となる可能性がある単離ｓｉＲＮＡの製造方法を提供する。特定の実施形態では、そうした方法は２若しくはそれ以上のヌクレオチド鎖の合成を含むことができる。さらなる実施形態では、前記方法は３，４若しくはそれ以上のヌクレオチドのサブストランドの合成を含むことができ、サブストランドのセットの全長は長さで約１９〜約２５ヌクレオチドである。
【０００３】
一実施形態では、２本鎖ＲＮＡ分子の調製方法は、サブストランドの第１のセットを結合した長さが約１９〜約２５ヌクレオチドとなるような、２若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドの第１のセットを合成する工程と、サブストランドの第２のセットを結合した長さが約１９〜約２５ヌクレオチドとなるような、２若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドの第２のセットを合成する工程と、結合する工程であって、長さ１９〜２５ヌクレオチドの２本鎖ＲＮＡ分子を形成し、２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖の３’末端に約１〜約５ヌクレオチドの１本鎖領域をさらに有する条件下で、合成したＲＮＡストランドの第１および第２のセットを結合するものである、前記結合する工程と、を有する。
【０００４】
他の一実施形態では、２本鎖ＲＮＡ分子の調製方法は、約１９〜約２５ヌクレオチドの長さを有する１本のＲＮＡ鎖を合成する工程と、（ｂ）第２のＲＮＡ鎖および３番目のＲＮＡ鎖を結合した長さが約１９〜約２５ヌクレオチドとなるような、第２のＲＮＡ鎖および３番目のＲＮＡ鎖を合成する工程と、２本鎖ＲＮＡ分子が形成され、前記２本鎖ＲＮＡ分子は、１つの２本鎖領域、および２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖の３’末端の約１〜約５ヌクレオチドの１本鎖領域から成るような条件下で、合成ＲＮＡ鎖を結合する工程と、を有する。
【０００５】
さらなる実施形態では、２本鎖ＲＮＡ分子の調製方法は、サブストランドの第１のセットを結合した長さが２５ヌクレオチドまたはそれ以下となるような、２若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドの第１のセットを合成する工程と、サブストランドの第２のセットを結合した長さが２５ヌクレオチドまたはそれ以下となるような、２若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドの第２のセットを合成する工程と、２本鎖ＲＮＡ分子が形成する条件下で、合成したＲＮＡサブストランドの第１および第２のセットを結合する工程と、を有する。
【０００６】
他の一実施形態では、２本鎖ＲＮＡ分子の調製方法は、２５ヌクレオチドまたはそれ以下の長さを有する１本のＲＮＡ鎖を合成する工程と、第２のＲＮＡ鎖および３番目のＲＮＡ鎖を結合した長さが２５ヌクレオチドまたはそれ以下であるような、第２のＲＮＡ鎖および３番目のＲＮＡ鎖を合成する工程と、２本鎖ＲＮＡ分子を形成し、前記２本鎖ＲＮＡ分子は１つの２本鎖領域、および２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖の３’末端に約１〜約５ヌクレオチドの１本鎖領域とから成るような条件下で、合成ＲＮＡ鎖を結合する工程と、を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
本発明の性質および有用性のより完全な理解のために、添付の図と関連させて以下の詳細な説明への参照をすべきである。
【図１】図１は、２本のＲＮＡ鎖の合成および結合によって調整した、ＶＥＧＦを標的とする特異的なｓｉＲＮＡ（Ｃａｎｄ５）、および３本のＲＮＡ鎖の合成および、リガーゼ無しで（Ｃａｎｄ５  ｍｉｘｔｕｒｅ）またはリガーゼ有りで（Ｃａｎｄ５  ｍｉｘｔｕｒｅ−ｌｉｇａｔｅｄ）の結合によって調整した、ＶＥＧＦを標的とする特異的なｓｉＲＮＡの、様々な濃度での２９３細胞に対する有効性を比較した棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本願明細書の組成物および方法の記述に先立って、本発明は、記述した特定の処理、組成物、または方法論に限定されることなく、それらは変化させることができることを理解されたい。また、記述に用いる用語は、特定の説明または実施形態を記述する目的のためだけのものであり、添付の請求項のみによって限定される本発明の範囲を限定する意図は無いことを理解されたい。特に定義しない限り、本願明細書で用いる全ての技術的および科学的用語は、当業者が通常理解するのと同等の意味を有する。本願明細書に記述するものと類似または同等のあらゆる方法および材料を、本発明の実施形態の実施または試験に用いることが可能ではあるが、好ましい方法、装置、および材料はここに記述するものである。本願明細書で言及する全ての刊行物は、参照によってその全体が取り込まれるものである。本願明細書のいかなる箇所も、先行発明によるそれらの開示に対して先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。
【０００９】
また、文脈が特に明確に示さない限り、本願明細書および添付の請求項で用いる場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数形への言及を含むことにも留意されたい。従って、例えば、「分子（ａ  「ｍｏｌｅｃｕｌｅ」）」への言及は、１若しくはそれ以上の分子および当業者の知るその同等物への言及である、などである。本願明細書で用いる場合、「約」という用語は、用いられる値の数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。従って、約５０％とは、４５％〜５５％の範囲を意味する。
【００１０】
特に示さない限り、本願明細書での全ての核酸配列は５’から３’の方向で与える。また、核酸配列中の全てのデオキシリボ核酸は大文字で表記（例えば、デオキシチミジンは「Ｔ」）し、核酸配列中のリボ核酸は小文字で表記（例えば、ウリジンは「ｕ」）する。
【００１１】
ＲＮＡ干渉（本願明細書では以降「ＲＮＡｉ」と表記）は、多くの真核生物で保存されている転写後遺伝子制御方法である。ＲＮＡｉは、細胞内に存在する、短い（すなわち、<３０ヌクレオチド）２本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子によって誘導される。それらの、「短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）」または「ｓｉＲＮＡ」と呼ばれる短いｄｓＲＮＡ分子は、１ヌクレオチドの精度内でｓｉＲＮＡと配列相同性を有するメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡｓ」）の破壊を引き起こす。ｓｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを切断する「ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体」または「ＲＩＳＣ」へ結合すると考えられている。ｓｉＲＮＡは、複数回働く酵素と同様に、明らかに再利用され、１つのｓｉＲＮＡ分子は約１０００分子のｍＲＮＡの切断を誘導可能である。従って、ｓｉＲＮＡを介したｍＲＮＡのＲＮＡｉ分解は、現在使用可能な標的遺伝子の発現抑制技術よりも有効である。
【００１２】
長さ２１および２２ヌクレオチドで、短い３’オーバーハングを有する合成ｓｉＲＮＡは、ショウジョウバエ細胞溶解物中の標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを誘導可能である。哺乳類培養細胞もまた、合成ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ分解を示し、最近では、合成ｓｉＲＮＡによって誘導したＲＮＡｉ分解が生きたマウスで示された。ｓｉＲＮＡが誘導するＲＮＡｉ分解の治療上の可能性は最近のいくつものインビトロ実験で示されており、それには、ｓｉＲＮＡによるＨＩＶ−１感染の抑制、および神経毒性のポリグルタミン病タンパク質発現の減少が含まれる。参照によってその全体が本願明細書に取り込まれるところの、２００２年１１月４日出願になる米国特許第７，１４８，３４２号明細書に説明されている通り、ｓｉＲＮＡによるＶＥＧＦの阻害もまた示されている。
【００１３】
本発明の一観点は、所与のｍＲＮＡを標的とし、長さ約１７ヌクレオチド〜約２９ヌクレオチド、好ましくは長さ約１９〜約２５ヌクレオチドの短い２本鎖ＲＮＡを含む単離ｓｉＲＮＡを提供する。前記ｓｉＲＮＡは、標準的なワトソン−クリック塩基対相互作用（本願明細書では以降「塩基対」と表記）によって共にアニーリングした、センスＲＮＡおよび相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を含む。一実施形態では、以下により詳細に記述する通り、前記センス鎖は、標的ｍＲＮＡ中に含まれる標的配列と同一の核酸配列を含む。さらなる実施形態では、本発明の２本鎖ＲＮＡ分子の配列は、標的特異的なＲＮＡｉおよび／またはＤＮＡメチル化を仲介するために、核酸標的分子との十分な同一性を有する必要がある。好ましくは、前記配列は、前記ＲＮＡ分子の２本鎖部分に、所望の標的分子に対して少なくとも５０％、特に少なくとも７０％の同一性を有する。より好ましくは、ＲＮＡ分子の２本鎖部分の同一性は、少なくとも８５％、および最も好ましくは１００％である。予定する核酸標的分子、例えばｍＲＮＡ標的分子に対する、２本鎖ＲＮＡ分子の同一性は、以下のように決定することができる。
【数１】
2010502230.tif 000002
ここでＩはパーセント表示での同一性、ｎはｄｓＲＮＡの２本鎖部分および標的の同一なヌクレオチドの数、ＬはｄｓＲＮＡの２本鎖部分および標的のオーバーラップした配列の長さ、である。あるいは、標的配列に対する２本鎖ＲＮＡ分子の同一性は、３’オーバーハング、特に１〜３ヌクレオチドの長さを有するオーバーハングを含めて定めることもまたできる。この場合、配列同一性は標的配列に対して、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、および最も好ましくは少なくとも８５％である。例えば、３’オーバーハングのヌクレオチドおよび、２本鎖の５’および／または３’末端の２ヌクレオチドまでは、活性の著しい損失が無ければ変更することができる。
【００１４】
本発明のセンスおよびアンチセンス鎖は、相補的な２つの１本鎖ＲＮＡ分子を有することが可能であり、または２つの相補的部分が塩基対形成し、１本鎖「ヘアピン」領域で共有結合した１分子を有することが可能である。いかなる理論で確かめる望みも無しに、後者のタイプのｓｉＲＮＡ分子のヘアピン領域は「ダイサー（ｄｉｃｅｒ）」タンパク質（またはその同等物）によって細胞内で切断され、塩基対形成した２つの個別のＲＮＡ分子によるｓｉＲＮＡを形成すると考えられている。
【００１５】
本願明細書で用いる場合、「単離（する）」とは、人間による発明によって自然状態から改変または取り出したことを意味する。例えば、生物中に自然に存在するｓｉＲＮＡは「単離」されておらず、合成ｓｉＲＮＡ、または自然状態で共存する物質から部分的または完全に分離したｓｉＲＮＡは「単離」されている。単離ｓｉＲＮＡは十分に精製した形態で存在可能であり、または例えばｓｉＲＮＡを注入した細胞といった非自然的環境で存在可能である。
【００１６】
本発明のＲＮＡ分子の標的遺伝子は、病状と関連させることができる。例えば、前記遺伝子は病原体遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子、腫瘍関連遺伝子、または自己免疫疾患関連遺伝子とすることができる。標的遺伝子は、遺伝子組換え細胞または遺伝子改変生物で発現する異種遺伝子とすることもまたできる。そうした遺伝子の機能を決定、または調節、特に阻害することで、農業分野、または医療または獣医学分野での重要な情報および治療上の便益を得ることができる。好ましい実施形態では、ＶＥＧＦ（参照によってその全体が本願明細書に取り込まれるところの、米国特許第７，１４８，３４２号明細書を参照）、ＨＩＦ−１α（参照によってその全体が本願明細書に取り込まれるところの、米国公開第２００４０１８０３５７（１０／６９９，５５７）号パンフレットを参照）、ＩＣＡＭ−１（参照によってその全体が本願明細書に取り込まれるところの、米国公開第２００４０２２０１２９（１０／７５９，８７８）号パンフレットを参照）、アンジオポエチン１、アンジオポエチン２、およびＴｉｅ２（参照によってその全体が本願明細書に取り込まれるところの、米国公開第２００４０２４８１７４（１０／８２７，７５９）号パンフレットを参照）、およびＣ３を含む補体（参照によってその全体が本願明細書に取り込まれるところの、米国出願第２００４０２２０１２９（１０／７５９，８７８）号を参照）から、標的遺伝子を選択する。
【００１７】
遺伝子は、当該技術分野で周知の技術を用いて、さらに選択的スプライシング型を解析することも可能である。そうした技術は、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＲＴ−ＰＣＲ）、ノザンブロッティング、およびｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼイションを含む。ｍＲＮＡ配列の解析技術は、例えば、参照によってその開示内容の全体が本願明細書に取り込まれるところの、Ｂｕｓｔｉｎｇ  ＳＡ（２０００），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２５：１６９−１９３、に記述されている。選択的スプライシングｍＲＮＡｓの典型的な同定技術もまた、以下に記述する。
【００１８】
例えば、選択的スプライシングｍＲＮＡの同定に、所与の疾患遺伝子に関連する核酸配列を含むデータベースを利用可能である。そうしたデータベースは、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｅｍｂａｓｅ，およびＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＡＰ）データベースを含む。例えば、ＣＧＡＰデータベースは、様々な種類のヒト癌の発現配列タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｓ：ＥＳＴｓ）を含む。標的遺伝子のｍＲＮＡまたは遺伝子配列は、そうしたデータベースを検索して、それらの遺伝子の選択的スプライシングｍＲＮＡｓを表すＥＳＴｓが見付かるかどうかを決定するのに用いることが可能である。
【００１９】
「ＲＮＡｓｅプロテクション」と呼ばれる技術もまた、選択的スプライシングｍＲＮＡｓを同定するのに用いることが可能である。ＲＮＡｓｅプロテクションでは、遺伝子配列を合成ＲＮＡへ転写して、それを、例えば血管新生領域の、またはその近傍の組織細胞など、他の細胞由来のＲＮＡとハイブリダイズする。ハイブリダイズしたＲＮＡは次に、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのミスマッチを認識する酵素と共にインキュベートする。予想より小さなフラグメントは、選択的スプライシングｍＲＮＡｓの存在を示唆する。選択的スプライシングｍＲＮＡｓと推測されるものを、当業者に周知の方法でクローニングおよび配列決定する。
【００２０】
選択的スプライシングｍＲＮＡｓの同定には、ＲＴ−ＰＣＲもまた利用可能である。ＲＴ−ＰＣＲでは、当業者に周知の方法を用いて、病変組織のｍＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡへ変換する。次に、３’非転写配列に位置するフォワード・プライマー、および５’非転写配列に位置するリバース・プライマーを用いたＰＣＲで、ｃＤＮＡのコード配列全体を増幅する。例えば、アガロースゲル電気泳動などによって、増幅産物のサイズを通常のスプライシングｍＲＮＡであると期待される産物のサイズと比較するなどして、選択的スプライシング型について増幅産物を解析可能である。増幅産物のサイズのいかなる変化も、選択的スプライシングを示唆する可能性がある。
【００２１】
突然変異遺伝子のｍＲＮＡ産物もまた、選択的スプライシング型の同定について上述した技術によって容易に同定可能である。本願明細書で用いる場合、「突然変異」遺伝子またはｍＲＮＡは、既知の配列と異なる遺伝子またはｍＲＮＡを含む。従って、それら遺伝子の対立遺伝子型、およびそれらのｍＲＮＡ産物は、本発明の目的に従えば「突然変異」と考える。
【００２２】
所与のｍＲＮＡは、それらに対応する選択的スプライシング型、コグネイト、または突然変異型に共通な標的配列を含む可能性があると理解される。従って、そうした共通の標的配列を含む１つのｓｉＲＮＡは、共通の標的配列を含む異なるＲＮＡ種の、ＲＮＡｉを介した分解を誘導する可能性がある。
【００２３】
ｓｉＲＮＡは、部分的に精製したＲＮＡ、十分に精製したＲＮＡ、合成ＲＮＡ、または組換えで作製したＲＮＡ、さらには付加、欠失、置換、および／または１若しくはそれ以上のヌクレオチドの改変によって、自然に存在するのとは異なる改変ＲＮＡもまた含むことが可能である。そうした改変は、ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ分解から保護する修飾を含めて、ｓｉＲＮＡの（両）末端、またはｓｉＲＮＡ内部の１若しくはそれ以上のヌクレオチドへの非ヌクレオチド材料の付加を含むことが可能である。
【００２４】
ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖は、３’ オーバーハングを含むこともまた可能である。本願明細書で用いる場合、「３’オーバーハング」とは、ＲＮＡ２重鎖の３’末端から伸びた少なくとも１つの対形成しないヌクレオチドのことを言及する。
【００２５】
従って一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡは、長さ１〜約６ヌクレオチド（リボ核酸またはデオキシリボ核酸を含む）の、好ましくは長さ１〜約５ヌクレオチドの、より好ましくは長さ１〜約４ヌクレオチドの、または長さ約１〜約３ヌクレオチドの、および特に好ましくは長さ約２〜約４ヌクレオチドの、およびより好ましくは長さ約２ヌクレオチドの、３’オーバーハングを少なくとも１つ有する。
【００２６】
ｓｉＲＮＡ分子の両鎖が３’オーバーハングを有する一実施形態では、それぞれの鎖のオーバーハングの長さは同じまたは異なることが可能である。最も好ましい実施形態では、３’オーバーハングはｓｉＲＮＡの両鎖に存在し、長さは２ヌクレオチドである。例えば、本発明のｓｉＲＮＡのそれぞれの鎖は、ジチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’オーバーハングを有することが可能である。
【００２７】
本発明のｓｉＲＮＡの安定性を高めるために、３’オーバーハングを分解に対して安定化させることもまた可能である。一実施形態では、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドといったプリンヌクレオチドの含有によってオーバーハングを安定化する。あるいは例えば、２’−デオキシチミジンは耐性があり、ＲＮＡｉ分解の有効性に影響しない。特に、２’−デオキシチミジン中の２’水酸基を除くと、組織培地中での３’オーバーハングのヌクレアーゼ耐性が著しく強まる。
【００２８】
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡはＡＡ（Ｎ１９）ＴＴまたはＮＡ（Ｎ２１）の配列を有し、ここでＮは任意のヌクレオチドである。それらのｓｉＲＮＡは約３０〜７０％ＧＣを含み、好ましくは約５０％Ｇ／Ｃを含む。ｓｉＲＮＡのセンス鎖配列は、それぞれ（Ｎ１９）ＴＴまたはＮ２１（すなわち、位置３〜２３）である。後者の場合、ｓｉＲＮＡのセンス側３’末端はＴＴに変換する。この配列変換の根拠は、センスおよびアンチセンス鎖の３’オーバーハングに関して対称的な２重鎖を形成するためである。次に、ＲＮＡ鎖のアンチセンス鎖は、センス鎖の位置１〜２１に相補的に合成する。
【００２９】
それらの実施形態の２３−ｎｔのセンス鎖の第１の位置は、アンチセンス鎖によって配列特異的に認識されないため、アンチセンス鎖の３’末のヌクレオチド残基は恣意的に選択可能である。しかし、アンチセンス鎖の最後から第２のヌクレオチド（いずれの実施形態でも２３−ｎｔのセンス鎖の第２の位置に相補的）は、標的配列に相補的である。
【００３０】
他の一実施形態では、ｓｉＲＮＡはＮＡＲ（Ｎ１７）ＹＮＮという配列を有し、ここでＲはプリン（例えばＡまたはＧ）およびＹはピリミジン（例えばＣまたはＵ／Ｔ）である。従って、この実施形態のそれぞれの２１−ｎｔのセンスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖は、プリンヌクレオチドで始まる。ｐｏｌIIIプロモーターからのＲＮＡｓ発現は、最初に転写するヌクレオチドがプリンである場合にのみ効率的であると信じられているため、そうしたｓｉＲＮＡは標的部位への変更なしに、ｐｏｌIII発現ベクターで発現することが可能である。
【００３１】
ｓｉＲＮＡは、あらゆる標的ｍＲＮＡ配列（「標的配列」）中の約１９〜２５の連続したヌクレオチドのあらゆる範囲を標的とすることが可能である。ｓｉＲＮＡの標的配列の選択技術は、例えば、参照によってその開示内容の全体が本願明細書に取り込まれるところの、Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，の「ｓｉＲＮＡユーザーガイド（「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」）」改訂版に与えられている。「ｓｉＲＮＡユーザーガイド」はＤｒ．Ｔｈｏｍａｓ  Ｔｕｓｃｈｌ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＡＧ  １０５，Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７０７７  Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，ドイツ、によって維持されているワールド・ワイド・ウェブ上のウェブサイトで入手可能であり、Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトへアクセスして「ｓｉＲＮＡ」というキーワードで検索すれば見つけられる。従って、本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ中のいずれかの連続した約１９〜約２５ヌクレオチドの範囲と同一の核酸配列を有する。
【００３２】
標的ｍＲＮＡ上の標的配列は、標的ｍＲＮＡに対応する所与のｃＤＮＡ配列から選択可能であり、好ましくは開始コドンの下流（すなわち、３’方向へ）５０〜１００ｎｔで始まる。しかし、標的配列は５’または３’非転写領域中、または開始コドン近傍領域中に位置することも可能である（例えば、以下の表１中の配列ＩＤ番号：７３および７４の標的配列を参照のこと。そこはＶＥＧＦ１２１ｃＤＮＡの５’末端の１００ｎｔの範囲内である）。
【００３３】
例えば、ＶＥＧＦ１２１ｃＤＮＡ配列中の適切な標的配列は以下の通りである。
【化１】
2010502230.tif 000003
従って、この配列を標的とし、それぞれの鎖に３’ｕｕオーバーハングを有する本発明のｓｉＲＮＡは以下の通りである（オーバーハングは太字で示した）。
【化２】
2010502230.tif 000004
同じ配列を標的とし、しかしそれぞれの鎖に３’ＴＴオーバーハングを有する本発明のｓｉＲＮＡは以下の通りである（オーバーハングは太字で示した）。
【化３】
2010502230.tif 000005
好ましくは、ｓｉＲＮＡは、適切に保護したリボヌクレオシドフォスフォアミダイトおよび標準的なＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて化学的に合成する。ｓｉＲＮＡは、２つの別の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的領域を有する１つのＲＮＡ分子として、合成可能である。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の市販業者は、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，米国コロラド州）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（米国イリノイ州ＲｏｃｋｆｏｒｄのＰｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，米国ヴァージニア州）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，米国マサチューセッツ州）、およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，イギリス）、を含む。
【００３４】
一実施形態では、約１９〜約２５、例えば約１９〜約２３ヌクレオチドの長さをそれぞれが有する２つのＲＮＡ鎖を合成する工程であって、前記ＲＮＡ鎖は２本鎖ＲＮＡ分子を形成可能であり、好ましくは少なくとも１本の鎖が１〜５ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有するものである、前記合成する工程と、２本鎖ＲＮＡ分子が形成され、それは標的特異的な核酸修飾、特にＲＮＡ干渉および／またはＤＮＡメチル化を仲介可能であるような条件下での合成ＲＮＡ鎖の結合の工程と、によって２本鎖ＲＮＡ分子を調製することができる。
【００３５】
他の一実施形態では、複数のＲＮＡ鎖を合成する工程と、標的特異的な核酸修飾、特にＲＮＡ干渉および／またはＤＮＡメチル化を仲介可能な２本鎖ＲＮＡ分子が形成される条件下での前記複数の鎖を結合する工程と、によって２本鎖ＲＮＡ分子を調製することができる。一実施形態では、３本のＲＮＡ鎖を合成し、１本のＲＮＡ鎖は約１９〜約２５ヌクレオチドの長さを有し、２本目のＲＮＡ鎖、第１のサブストランド、は約１〜約２４ヌクレオチドの長さを有し、３本目のＲＮＡ鎖、第２のサブストランド、は約１〜約２４ヌクレオチドの長さを有し、ＲＮＡサブストランドを結合するとそれらが約１９〜約２５ヌクレオチドの全長を有するようにすることができる。例えば、１本のＲＮＡ鎖は約１９ヌクレオチドからの長さを有し、第１のＲＮＡサブストランドは２ヌクレオチドの長さを有し、第２のＲＮＡサブストランドは約１７ヌクレオチドの長さを有する。さらなる例では、１本のＲＮＡ鎖は約１９ヌクレオチドの長さを有し、第２のＲＮＡ鎖は３ヌクレオチドの長さを有し、３番目のＲＮＡストランドは約１６ヌクレオチドの長さを有する。
【００３６】
好ましい一実施形態では、それぞれ異なる長さの３本のＲＮＡ鎖の合成によって、２本鎖ＲＮＡ分子を調製することができ、例えば、１本のＲＮＡ鎖は約２１ヌクレオチドの長さを有し、第２のＲＮＡ鎖は約１０ヌクレオチドの長さを有し、３番目のＲＮＡ鎖は約１１ヌクレオチドの長さを有する。合成した３本のＲＮＡ鎖は、２本鎖ＲＮＡ分子が形成され、ＲＮＡ鎖のそれぞれの３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有するような条件下で、結合する。追加的な実施形態では、最も短い２本のＲＮＡ鎖を連結するリガーゼを加えることができる。
【００３７】
他の一実施形態では、複数のＲＮＡサブストランドを合成する工程と、標的特異的な核酸修飾、特にＲＮＡ干渉および／またはＤＮＡメチル化を仲介可能な２本鎖ＲＮＡ分子が形成される条件下での前記複数の鎖を結合する工程と、によって２本鎖ＲＮＡ分子を調製することができる。例えば、４若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドを合成し、ＲＮＡ干渉が可能な２本鎖分子を形成するよう結合して、２本鎖分子を形成するサブストランドの結合後の２本の鎖のそれぞれの全長が約１９〜約２５ヌクレオチドの長さを有するようにすることができる。
【００３８】
一実施形態では、２本鎖ＲＮＡ分子の調製方法は、２若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドの第１のセットを合成する工程であって、サブストランドの第１のセットを結合した長さは約１９〜約２５ヌクレオチドとするものである、前記第１のセットを合成する工程と、２若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドの第２のセットを合成する工程であって、サブストランドの第２のセットを結合した長さは約１９〜約２５ヌクレオチドとするものである、前記第２のセットを合成する工程と、合成ＲＮＡストランドの第１および第２のセットを、２本鎖ＲＮＡ分子が形成する条件下で結合する工程と、を有する。
【００３９】
さらなる一実施形態では、２本鎖ＲＮＡ分子の調製方法は、約１９〜約２５ヌクレオチドの長さを有する１本のＲＮＡ鎖を合成する工程と、第２および３番目のＲＮＡ鎖を合成する工程であって、第２のＲＮＡ鎖および３番目のＲＮＡ鎖を結合した長さは約１９〜約２５ヌクレオチドとするものである、前記第２および３番目のＲＮＡ鎖を合成する工程と、２本鎖ＲＮＡ分子が形成され、前記２本鎖ＲＮＡ分子は、１つの２本鎖領域、および２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖の３’末端の約１〜約５ヌクレオチドの１本鎖領域から成るような条件下で、合成ＲＮＡ鎖を結合する工程と、を有する。
【００４０】
一実施形態は、サブストランドの第１のセットを結合した長さが約１９〜約２５ヌクレオチドとなるような、２若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドの第１のセットを合成する工程と、サブストランドの第２のセットを結合した長さが約１９〜約２５ヌクレオチドとなるような、２若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドの第２のセットを合成する工程と、合成したＲＮＡサブストランドの第１および第２のセットを、２本鎖ＲＮＡ分子が形成する条件下で結合する工程と、を有する。
【００４１】
一実施形態では、２本鎖ＲＮＡ分子の調製方法は、サブストランドの第１のセットを結合した長さが約１９〜約２５ヌクレオチドとなるような、２若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドの第１のセットを合成する工程と、サブストランドの第２のセットを結合した長さが約１９〜約２５ヌクレオチドとなるような、２若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドの第２のセットを合成する工程と、合成したＲＮＡサブストランドの第１および第２のセットを、２本鎖ＲＮＡ分子が形成する条件下で結合する工程と、を有する。
【００４２】
他の一実施形態では、２本鎖ＲＮＡ分子の調製方法は、約１９〜約２５ヌクレオチドの長さを有する１本のＲＮＡ鎖を合成する工程と、（ｂ）第２のＲＮＡ鎖および３番目のＲＮＡ鎖を結合した長さが約１９〜約２５ヌクレオチドとなるような、第２のＲＮＡ鎖および３番目のＲＮＡ鎖を合成する工程と、２本鎖ＲＮＡ分子が形成され、前記２本鎖ＲＮＡ分子は、１つの２本鎖領域、および２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖の３’末端の約１〜約５ヌクレオチドの１本鎖領域から成るような条件下で、合成ＲＮＡ鎖を結合する工程と、を有する。
【００４３】
さらなる実施形態では、２本鎖ＲＮＡ分子の調製方法は、サブストランドの第１のセットを結合した長さが２５ヌクレオチドまたはそれ以下となるような、２若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドの第１のセットを合成する工程と、サブストランドの第２のセットを結合した長さが２５ヌクレオチドまたはそれ以下となるような、２若しくはそれ以上のＲＮＡサブストランドの第２のセットを合成する工程と、２本鎖ＲＮＡ分子が形成する条件下で、合成したＲＮＡサブストランドの第１および第２のセットを結合する工程と、を有する。
【００４４】
他の一実施形態では、２本鎖ＲＮＡ分子の調製方法は、２５ヌクレオチドまたはそれ以下の長さを有する１本のＲＮＡ鎖を合成する工程と、第２のＲＮＡ鎖および３番目のＲＮＡ鎖を結合した長さが２５ヌクレオチドまたはそれ以下であるような、第２のＲＮＡ鎖および３番目のＲＮＡ鎖を合成する工程と、２本鎖ＲＮＡ分子を形成し、前記２本鎖ＲＮＡ分子は１つの２本鎖領域、および２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖の３’末端に約１〜約５ヌクレオチドの１本鎖領域とから成るような条件下で、合成ＲＮＡ鎖を結合する工程と、を有する。
【００４５】
前述の実施形態のそれぞれでは、サブストランドは少なくとも長さ２ヌクレオチドであり、長さ２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２、または２３ヌクレオチドとすることができる。
【００４６】
前述のそれぞれの方法では、ＲＮＡ鎖またはサブストランドは化学的、または酵素的に合成することができる。２本鎖ＲＮＡ分子は、１つの２本鎖領域、および２本鎖ＲＮＡ分子の少なくとも一方、または両方の３’末端に約１〜約５ヌクレオチドの１本鎖領域を有する。例えば、好ましい実施形態では、２本鎖ＲＮＡ分子の両方の鎖のそれぞれは、約１〜約３ヌクレオチド、好ましくは約２ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する。前述の方法のそれぞれでは、それぞれの鎖は１９〜約２５ヌクレオチド、好ましくは約２０〜２２ヌクレオチドの長さを有する。
【００４７】
２本鎖ＲＮＡ分子は、少なくとも１つの糖修飾ヌクレオチドを有し、前記糖修飾ヌクレオチドの２’−水酸基は、Ｈ，ＯＲ，Ｒ，ｈａｌｏ，ＳＨ，ＳＲ，ＮＨ２，ＮＨＲ，Ｎ（Ｒ）２，またはＣＮから選択した活性基によって置換し、ここでＲはＣ１〜Ｃ６のアルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基、およびｈａｌｏはＦ，Ｃ，Ｂｒ，またはＩである。２本鎖ＲＮＡ分子は、ホスホロチオエート基を含む主鎖修飾型ヌクレオチドを少なくとも１つ有する。
【００４８】
他の一実施形態では、２本鎖ＲＮＡ分子の調製方法は、哺乳動物の標的ｍＲＮＡまたは標的遺伝子配列を選択する工程と、第１のＲＮＡ鎖が標的配列中の連続したヌクレオチドに相補的であるように、約１９〜約２５ヌクレオチドの長さを有する第１のＲＮＡ鎖を合成する工程と、第２および３番目のＲＮＡ鎖が第１のＲＮＡ鎖の約１６〜約２４ヌクレオチドに対して相補的であるように、第２のＲＮＡ鎖を合成し、３番目のＲＮＡ鎖を合成する工程と、２本鎖ＲＮＡ分子が、長さ約１６〜約２４ヌクレオチドの１つの２本鎖領域、および１つまたは２つのそれぞれの長さが約１〜約３ヌクレオチドの１本鎖３’オーバーハング領域から成るように、前記２本鎖ＲＮＡ分子を形成するのに適した条件下で合成したＲＮＡ鎖を結合する工程と、を有する。
【００４９】
ＲＮＡ分子の合成方法は当該技術分野で周知である。それについては特に、Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９９８）に記述されている化学的合成方法に言及する。１本鎖ＲＮＡｓは、合成ＤＮＡテンプレート、または組換えバクテリアから単離したＤＮＡプラスミドからの酵素による転写によってもまた、調製が可能である。典型的には、Ｔ７，Ｔ３またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｍｉｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｕｈｌｅｍｂｅｃｋ（１９８９））といった、ファージＲＮＡポリメラーゼを用いる。
【００５０】
あるいは、適切なプロモーターを用いて環状または直線状の組換えＤＮＡプラスミドからｓｉＲＮＡを発現させることもまたできる。本発明のｓｉＲＮＡをプラスミドから発現するのに適したプロモーターは、例えば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌIIIプロモーター配列、およびサイトメガロウイルス・プロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は当該技術分野の範囲内である。本発明の組換えプラスミドは、特定の組織または特定の細胞内環境でｓｉＲＮＡを発現するための、誘導性または調節性プロモーターもまた有することが可能である。
【００５１】
ｓｉＲＮＡは、標準的技術によって培養細胞発現系から単離することが可能であり、またはインビボで血管新生領域またはその近傍の細胞内で発現させることも可能である。本発明のｓｉＲＮＡをインビボで細胞へ輸送するための組換えプラスミドの利用については、以下でより詳細に議論する。
【００５２】
本発明のｓｉＲＮＡは、２つの別の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的領域を有する１つのＲＮＡ分子として、組換えプラスミドから発現することが可能である。
【００５３】
本発明のｓｉＲＮＡを発現するのに適したプラスミドの選択、ｓｉＲＮＡ発現のための核酸配列のプラスミドへの挿入方法、および興味のある細胞への組換えプラスミドの輸送方法は、当該技術分野の範囲内である。例えば、参照によってそれらの開示内容の全体が本願明細書に取り込まれるところの、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：４４６〜４４８；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ＴＲ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０〜５５３；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７〜５００；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：９４８〜９５８；Ｌｅｅ  ＮＳ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００〜５０５；およびＰａｕｌ  ＣＰ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５〜５０８、を参照のこと。
【００５４】
本発明のｓｉＲＮＡを発現する核酸配列を有するプラスミドは、以下の実施例７に記述する。ｐＡＡＶｓｉＲＮＡと呼ぶそのプラスミドは、ヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御下でポリＴ終止配列と操作可能な関係であるセンスＲＮＡ鎖コード配列、およびヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御下でポリＴ終止配列と操作可能な関係であるアンチセンスＲＮＡ鎖コード配列と、を有する。ｐＡＡＶｓｉＲＮＡプラスミドは最終的に、本発明のｓｉＲＮＡを発現する同一の核酸配列を有する組換えアデノ関連ウイルスベクターの作製に用いることを意図している。
【００５５】
本願明細書で用いる場合、「ポリＴ終止配列と操作可能な関係である（ｉｎ  ｏｐｅｒａｂｌｅ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｏｌｙＴ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、センスまたはアンチセンス鎖をコードする核酸配列が、ポリＴ終止シグナルの５’側に直接隣接していることを意味する。プラスミドからのセンスまたはアンチセンス配列の転写の間、ポリＴ終止シグナルは転写を終了させるように働く。
【００５６】
本願明細書で用いる場合、プロモーターの「制御下で」とは、センスまたはアンチセンス鎖をコードする核酸配列がプロモーターの３’側に位置して、センスまたはアンチセンスのコード配列の転写をプロモーターが開始可能であることを意味する。
【００５７】
本発明のｓｉＲＮＡは、インビボで血管新生領域またはその近傍の細胞内で組換えウイルスベクターから発現させることもまた可能である。本発明の組換えウイルスベクターは、本発明のｓｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡ配列の発現に適したプロモーターをコードする配列を有する。適切なプロモーターは、例えば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌIIIプロモーター配列およびサイトメガロウイルス・プロモーターを含む。他の適切なプロモーターの選択は当該技術分野の範囲内である。本発明の組換えウイルスベクターは、特定の組織内または特定の細胞内環境中でのｓｉＲＮＡ発現のための誘導性または調節性プロモーターもまた有することが可能である。本発明のｓｉＲＮＡをインビボの細胞へ輸送する組換えウイルスベクターの利用については、以下により詳細に議論する。
【００５８】
本発明のｓｉＲＮＡは、２つの別の、相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的領域を有する１つのＲＮＡ分子として、のいずれによっても組換えウイルスベクターから発現可能である。
【００５９】
発現させるｓｉＲＮＡ分子のコード配列を挿入可能なあらゆるウイルスベクター、例えば、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ＡＶ）；アデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ：ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス、およびそれらに類するものに由来するベクターを利用可能である。ウイルスベクターの向性は、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質または他の表面抗原によるベクターのシュードタイピングで改変することもまた可能である。例えば、本発明のＡＡＶベクターを、水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ、およびそれらに類するものの表面タンパク質でシュードタイピングすることが可能である。
【００６０】
本発明での利用に適した組換えウイルスベクターの選択、ｓｉＲＮＡ発現のための核酸配列のベクターへの挿入方法、および興味のある細胞へのウイルスベクターの輸送方法は、当該技術分野の範囲内である。例えば、参照によってそれらの開示内容の全体が本願明細書に取り込まれるところの、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ  Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１〜３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ  ＭＡ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８〜６１４；Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＤ（１９９０），Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．１：５〜１４；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ＷＦ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５〜３０、を参照のこと。
【００６１】
好ましいウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶ由来のものである。特に好ましい実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡプロモーター、またはサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ＣＭＶ）プロモーターを含む組換えＡＡＶベクターから、２つの別の、相補的な１本鎖ＲＮＡ分子として発現させる。
【００６２】
本発明のｓｉＲＮＡを発現する適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターの作製方法、および標的細胞へのベクターの輸送方法は、Ｘｉａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６〜１０１０に記述されている。
【００６３】
本発明のｓｉＲＮＡを発現する適切なＡＡＶベクター、組換えＡＡＶベクターの作製方法、および標的細胞へのベクターの輸送方法は、参照によってそれらの開示内容の全体が本願明細書に取り込まれるところの、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６〜３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ  ＫＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０〜５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；国際公開第９４／１３７８８号パンフレット；および国際公開第９３／２４６４１号パンフレット、に記述されている。本発明の組換えＡＡＶベクターの作成方法の一例を、以下の実施例７に記述する。
【００６４】
所与の標的配列を含むｓｉＲＮＡがＲＮＡｉを介した標的ｍＲＮＡの分解を引き起こす能力は、細胞内のＲＮＡまたはタンパク質の量を計測する標準的技術を用いて評価することが可能である。例えば、ｓｉＲＮＡを培養細胞へ輸送することが可能で、標的ｍＲＮＡ量は、ノザンブロッティングまたはドットブロット技術、または定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定可能である。あるいは、培養細胞内の標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の量は、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティングによって測定可能である。本発明のｓｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の量に対する効果測定に適した細胞培養系は、以下の実施例１に記述する。
【００６５】
所与の標的配列を含むｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉを介した標的ｍＲＮＡの分解は、動物モデルでもまた評価可能である。例えば、ＲＯＰまたはＣＮＶマウスの血管新生領域を、ｓｉＲＮＡ投与の前後で測定することが可能である。ｓｉＲＮＡ投与によるそれらモデルの血管新生領域の減少は、標的ｍＲＮＡの抑制を示唆する。
【００６６】
好ましい一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１、またはＦｌｋ−１／ＫＤＲのｍＲＮＡ、またはそれらの選択的スプライシング型、突然変異型またはコグネイトを標的とし、ＲＮＡｉを介したそれらの分解を引き起こす。本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの分解は、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１、またはＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子の機能的な遺伝子産物の生成を減少させる。従って、本発明は、標的ｍＲＮＡを分解するために有効な量の本発明のｓｉＲＮＡの対象への投与を含む、対象中のＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１、またはＦｌｋ−１／ＫＤＲの発現抑制方法を提供する。ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１、およびＦｌｋ−１／ＫＤＲ遺伝子の産物は血管形成の開始および維持に必要なため、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを介した分解による、対象中での血管形成阻害方法もまた提供する。
【００６７】
他の好ましい一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、ヒトＨＩＦ−１α遺伝子またはその選択的スプライシング型、突然変異型またはコグネイトを標的とし、ＲＮＡｉを介したそれの分解を引き起こす。本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの分解は、ＨＩＦ−１α遺伝子の機能的な遺伝子産物の生成を減少させる。従って、本発明は、標的ｍＲＮＡを分解するために有効な量の本発明のｓｉＲＮＡの対象への投与を含む、対象中のＨＩＦ−１αの発現抑制方法を提供する。ＨＩＦ−１α遺伝子の産物は血管形成の開始および維持に必要なため、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを介した分解による、対象中での血管形成阻害方法もまた提供する。
【００６８】
他の好ましい一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、ヒトＩＣＡＭ−１遺伝子またはその選択的スプライシング型、突然変異型またはコグネイトを標的とし、ＲＮＡｉを介したそれの分解を引き起こす。本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの分解は、ＩＣＡＭ−１遺伝子の機能的な遺伝子産物の生成を減少させる。従って、本発明は、標的ｍＲＮＡを分解するために有効な量の本発明のｓｉＲＮＡの対象への投与を含む、対象中のＩＣＡＭ−１の発現抑制方法を提供する。ＩＣＡＭ−１遺伝子の産物は血管形成の開始および維持に必要なため、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを介した分解による、対象中での血管形成阻害方法もまた提供する。
【００６９】
他の好ましい一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、ヒトＡｎｇ１、Ａｎｇ２、またはＴｉｅ２遺伝子またはそれらの選択的スプライシング型、突然変異型またはコグネイトを標的とし、ＲＮＡｉを介したそれらの分解を引き起こす。本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの分解は、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、またはＴｉｅ２遺伝子の機能的な遺伝子産物の生成を減少させる。従って、本発明は、標的ｍＲＮＡを分解するために有効な量の本発明のｓｉＲＮＡの対象への投与を含む、対象中のＡｎｇ１、Ａｎｇ２、またはＴｉｅ２の発現抑制方法を提供する。Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、またはＴｉｅ２遺伝子の産物は血管形成の開始および維持に必要なため、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを介した分解による、対象中での血管形成阻害方法もまた提供する。
【００７０】
他の好ましい一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、ヒト補体遺伝子またはそれの選択的スプライシング型、突然変異型またはコグネイトを標的とし、ＲＮＡｉを介したそれの分解を引き起こす。本発明のｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの分解は、補体遺伝子の機能的な遺伝子産物の生成を減少させる。従って、本発明は、標的ｍＲＮＡを分解するために有効な量の本発明のｓｉＲＮＡの対象への投与を含む、対象中の補体の発現抑制方法を提供する。
【００７１】
本願明細書で用いる場合、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」とは、ヒトまたはヒト以外の動物を含む。好ましくは、対象はヒトである。
【００７２】
本願明細書で用いる場合、ｓｉＲＮＡの「有効な量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、ＲＮＡｉを介した標的ｍＲＮＡ分解を引き起こすのに十分な量、または対象中の血管形成の進行を阻害するのに十分な量のことを言う。
【００７３】
ＲＮＡｉを介した標的ｍＲＮＡの分解は、上述したｍＲＮＡまたはタンパク質の単離および定量化の標準的技術を用いて、対象の細胞中の標的ｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することで検出可能である。
【００７４】
本発明のｓｉＲＮＡは、半化学量論的量の標的ｍＲＮＡを分解可能であることが理解される。いかなる理論で確かめる望みも無しに、本発明のｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの分解を触媒的方法で引き起こすものと信じられる。
【００７５】
本発明のｓｉＲＮＡの有効な量は、血管新生領域またはその近傍の細胞内濃度で約１ナノモラー（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭを含む。より多いまたは少ないｓｉＲＮＡ量も投与可能であると考える。
【００７６】
一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡの有効量は、ｓｉＲＮＡ約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇを含む。さらなる実施形態では、有効量はｓｉＲＮＡを約０．２ｍｇ〜約１０ｍｇである。追加的な実施形態では、好ましくはｓｉＲＮＡの有効量は、ｓｉＲＮＡを約０．５〜約５ｍｇである。さらに好ましい実施形態は、約１．５ｍｇ、２．５ｍｇ、または約３ｍｇのｓｉＲＮＡを含む、約１ｍｇ〜約３ｍｇの有効量を提供する。
【００７７】
疾患治療のためには、本発明のｓｉＲＮＡは、本発明のｓｉＲＮＡとは異なる医薬品と共に対象へ投与可能である。あるいは、対象疾患の治療のために設計された他の治療方法と組み合わせて、本発明のｓｉＲＮＡを対象へ投与可能である。例えば、癌治療または癌転移予防のために現在導入される治療方法（例えば、放射線治療、化学療法、および手術）と組み合わせて、本発明のｓｉＲＮＡを投与可能である。癌治療では、本発明のｓｉＲＮＡは好ましくは、放射線治療と組み合わせて、または、シスプラチン、カルボプラチン、シクロフォスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、またはタモキシフェンといった化学療法薬と組み合わせて、対象へ投与する。
【００７８】
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、裸のｓｉＲＮＡとして、デリバリー試薬と共に、またはｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミドまたはウイルスベクターとして、いずれによっても対象へ投与可能である。
【００７９】
本発明のｓｉＲＮＡと共に投与するのに適切なデリバリー試薬は、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｒｅａｇｅｎｔ；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；またはポリカチオン（例えば、ポリリシン）、またはリポソーム、を含む。好ましいデリバリー試薬はリポソームである。
【００８０】
リポソームは、網膜組織または腫瘍組織といった特定の組織へのｓｉＲＮＡ輸送を助けることが可能であり、ｓｉＲＮＡの血中半減期を増加させることもまた可能である。使用に適切なリポソームは、中性または負に帯電したリン脂質、およびコレステロールといったステロールを含む標準的な小胞形成脂質で形成する。脂質の選択は、望みのリポソームのサイズ、および血流中でのリポソームの半減期といった要素を考慮して決定する。リポソーム調製の様々な方法が知られており、例えば、参照によってその全体が本願明細書に取り込まれるところの、Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７、および米国特許第４，２３５，８７１号、４，５０１，７２８号、４，８３７，０２８号、および５，０１９，３６９号明細書に記述されている。
【００８１】
好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡを封入するリポソームは、治療が必要な部位またはその近傍の特定の細胞または組織へリポソームを向かわせることが可能なリガンド分子を有する。例えば、腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原に結合するモノクローナル抗体といった、腫瘍または血管内皮細胞に多く見られる受容体へ結合するリガンドが好ましい。
【００８２】
特に好ましくは、ｓｉＲＮＡを封入するリポソームは、単核マクロファージおよび網膜内皮系による排除を避けるために、例えば、構造表面へのオプソニン化阻害部分結合を有する修飾を施す。一実施形態では、本発明のリポソームはオプソニン化阻害部分およびリガンドを共に有することが可能である。
【００８３】
本発明のリポソーム調製に用いるオプソニン化阻害部分は、典型的には、リポソーム膜へ結合した大きな親水性ポリマーである。本願明細書で用いる場合、オプソニン化阻害部分がリポソーム膜へ「結合」するとは、例えば、脂溶性アンカーを膜そのものへ挿入する、または膜脂質の活性基へ結合するなどにより、オプソニン化阻害部分が化学的または物理的に前記膜へ付着する場合である。それらオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えば、参照によりその開示内容の全体が本願明細書に取り込まれるところの米国特許第４，９２０，０１６号明細書に記述されている通り、マクロファージ−単球系（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ：「ＭＭＳ」）および網膜内皮系（ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍ：「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを著しく減少させる保護的表面層を形成する。従って、オプソニン化阻害部分で修飾したリポソームは、非修飾リポソームと比較して血中により長く残留する。このため、そうしたリポソームは時に「ステルス（「ｓｔｅａｌｔｈ」）」リポソームと呼ばれる。
【００８４】
ステルスリポソームは、多孔質の、または「漏れ易い（「ｌｅａｋｙ」）」微小血管系
によって血液供給されている組織へ蓄積することで知られている。従って、例えば固形腫瘍など、そういった微小血管系欠損によって特徴付けられる標的組織は、それらのリポソームを効率的に蓄積する；Ｇａｂｉｚｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，ＵＳＡ，１８：６９４９〜５３を参照のこと。さらに、ＲＥＳによる取り込みの減少は、肝臓および脾臓への大幅な蓄積を防ぐことで、ステルスリポソームの毒性を低下させる。従って、オプソニン化阻害部分で修飾した本発明のリポソームは、ｓｉＲＮＡを癌細胞へ輸送可能である。
【００８５】
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、好ましくは、平均分子量が約５００〜約４０，０００ダルトンの、およびより好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの水溶性ポリマーである。そうしたポリマーは、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ：ＰＰＧ）の誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはＰＰＧ；ポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドンといった合成ポリマー；直線状、分岐、または樹状ポリアミドアミン；ポリアクリル酸；例えば、カルボキシル基またはアミノ基を化学的に結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトールなどのポリアルコール、さらには、ガングリオシドＧＭ１といったガングリオシド、を含む。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、またはメトキシＰＰＧの共重合体、またはそれらの誘導体もまた、適切である。さらには、オプソニン化阻害ポリマーは、ＰＥＧおよび、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロック共重合体とすることが可能である。オプソニン化阻害ポリマーは、例えば、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナンなどアミノ酸またはカルボン酸を含む天然多糖；アミノ化多糖またはオリゴ糖（直線状または分岐）；または、例えば、生成物がカルボキシル基とつながっている炭酸誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖またはオリゴ糖、とすることもまた可能である。
【００８６】
好ましくは、オプソニン化阻害部分は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはそれらの誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾したリポソームは時に「ＰＥＧ化リポソーム（「ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ」）と呼ばれる。
【００８７】
オプソニン化阻害部分は、数多くの周知技術のうちいずれによってもリポソーム膜へ結合可能である。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをフォスファチジルエタノールアミン脂溶性アンカーへ結合し、次にそれを膜へ結合することが可能である。同様に、デキストランポリマーは、テトラヒドロフランおよび水の６０℃で３０：１２の比率での混合溶液およびＮａ（ＣＮ）ＢＨ３を用いた還元的アミノ化によって、ステアリルアミン脂溶性アンカーでの誘導体化が可能である。
【００８８】
本発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えプラスミドは上述した。そうした組換えプラスミドは、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｒｅａｇｅｎｔ；リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン；ポリカチオン（例えばポリリシン）またはリポソームを含む適切なデリバリー試薬と共に、または直接投与することもまた可能である。本発明のｓｉＲＮＡを発現する組換えウイルスベクターもまた上述したが、患者体内の血管新生領域へのそれらベクターの輸送方法は当該技術分野の範囲内である。
【００８９】
本発明のｓｉＲＮＡは、血管新生領域またはその近傍の組織細胞へｓｉＲＮＡを輸送する適切なあらゆる手段によって、対象へ投与可能である。例えば、ｓｉＲＮＡは、遺伝子銃、エレクトロポレーション、または他の適切な非経口的または腸内投与経路によって投与可能である。
【００９０】
適切な腸内投与経路は、経口、直腸、または鼻腔内投与を含む。
【００９１】
適切な非経口的投与経路は、血管内投与（例えば、静脈内ボーラス注射、静脈注射、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および血管系へのカテーテル滴下）；組織周辺または組織内投与（例えば、腫瘍周辺および腫瘍内注射、硝子体内注射、網膜内注射または網膜下注射）；皮下注入を含む皮下注射および皮下デポジション（浸透圧ポンプによるものなど）；例えばカテーテルまたは他の投与器具（例えば、角膜ペレットまたは坐薬、点眼薬容器、または多孔質、非多孔質、またはゲル状の材料を含むインプラント）による、血管新生部位またはその近傍領域への直接的な（例えば局所的な）適用；および吸入剤、を含む。適切な投与器具は、参照によってその開示内容の全体が本願明細書に取り込まれるところの、米国特許第５，９０２，５９８号および第６，３７５，９７２号明細書に記述されている眼内インプラント、および米国特許第６，３３１，３１３号明細書に記述されている生分解性眼内インプラント、を含む。そうした眼内インプラントは、Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ）およびＯｃｕｌｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）から入手可能である。
【００９２】
好ましい一実施形態では、ｓｉＲＮＡの注射または注入は、血管新生部位またはその近傍にて行う。より好ましくは、当該技術分野の範囲内にあるように（参照によってその開示内容の全体が本願明細書に取り込まれるところの、Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌ．  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３０：４２１〜４２９、を参照）、例えば下瞼または結膜円蓋へ液体またはゲル状にて、ｓｉＲＮＡを目へ局所的に投与する。
【００９３】
そうした実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡは、約５マイクロリットル〜約７５マイクロリットル、たとえば約７マイクロリットル〜約５０マイクロリットル、好ましくは約１０マイクロリットル〜約３０マイクロリットルの量を目へ局所的に投与する。７５マイクロリットル以上の量のｓｉＲＮＡの目への局所的滴下は、こぼれる、および溢れることで目からｓｉＲＮＡが失われる結果となる可能性があることが理解される。従って、できる限り少量で高濃度（例えば１００〜１０００ｎＭ）のｓｉＲＮＡを投与するのが好ましい。
【００９４】
特に好ましい非経口的投与経路は眼内投与である。本発明のｓｉＲＮＡの眼内投与は、投与経路がｓｉＲＮＡの目への進入を許す限りにおいて、注射または直接的な（例えば、局所的な）目への投与によって達成可能である。上述した目への局所的投与経路に加えて、適切な眼内投与経路は、硝子体内、網膜内、網膜下、テノン下、眼窩周辺または後方、角膜を貫いた、および鞏膜を貫いた、投与を含む。そうした眼内投与経路は当該技術分野の範囲内である；参照によってその開示内容の全体が本願明細書へ取り込まれるところの、上記Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，２００２、およびＢｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．７：１７６３〜１７６９、およびＡｍｂａｔｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２１：１４５〜１５１、を参照のこと。
【００９５】
本発明のｓｉＲＮＡは１回または複数回に分けて投与可能である。本発明のｓｉＲＮＡの投与が注入による場合、時間の長い１回の投与とすることが可能であり、または複数回の注入によって輸送可能である。組織への直接的な試薬の注射は、血管新生部位またはその近傍の組織へ行うのが好ましい。血管新生部位またはその近傍の組織への試薬の複数回の注射が特に好ましい。
ｓｉＲＮＡは、血管新生部位またはその近傍への１度の注射またはデポジション（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）などによって、対象へ１回投与することが可能である。あるいは、ｓｉＲＮＡは対象へ毎日または毎週複数回投与可能である。例えば、ｓｉＲＮＡは約３〜約２８週間、より好ましくは約７〜約１０週間の期間中、週１回ｓｉＲＮＡを対象へ投与することが可能である。好ましい投薬計画では、７週間の間、週１回、血管新生部位（例えば、硝子体内）またはその近傍へ注射する。ウェットＡＲＭＤまたは糖尿病性網膜症といった慢性の血管新生病を患う対象に対しては、本発明のｓｉＲＮＡの無期限の定期的投与が必要であることが理解される。
【００９６】
投薬計画が複数回の投与を含む場合、対象へのｓｉＲＮＡ投与の有効量は、投薬計画全体を通してのｓｉＲＮＡ投与全量を含むことが可能であることが理解される。
【００９７】
本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、対象への投与前に、当該技術分野で既知の技術に従って、医薬品組成物として製剤化する。本発明の医薬品組成物は、少なくとも無菌およびパイロジェンフリーであることで特徴付けられる。本願明細書で用いる場合、「医薬品製剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）」は、ヒトおよび獣医学での使用のための製剤を含む。本発明の医薬品組成物の調製方法は、当該技術分野の範囲内であり、例えば、参照によってその開示内容の全体が本願明細書に取り込まれるところの、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ペンシルバニア州、Ｅａｓｔｏｎ、に記述されている。
【００９８】
本発明の医薬品製剤は、本発明のｓｉＲＮＡ（例えば、重量で０．１〜９０％）またはその生理学的に許容可能な塩と生理学的に許容可能な担体溶剤とを混合したものを含有する。好ましい生理学的に許容可能な担体溶剤は、水、緩衝用水、食塩水（例えば、生理食塩水、またはハンクス液またはアール液といった平衡塩類溶液）、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸、およびそれらに類するものである。
【００９９】
本発明の医薬品組成物は、標準的な医薬品賦形剤および／または添加剤もまた含有可能である。適切な医薬品賦形剤は、安定化剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、バッファー、およびｐＨ調整剤を含む。適切な添加剤は、生理学的に生体適合性のバッファー（例えば、塩酸トロメタミン）、キレート剤の添加（例えば、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミドなど）、またはカルシウムキレート複合体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）、または、選択的に、カルシウムまたはナトリウム塩の添加（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、または乳酸カルシウム）を含む。本発明の医薬品組成物は、液体形態での使用のためにパッケージ化可能であり、または凍結乾燥することが可能である。
【０１００】
目への局所的投与のためには、標準的な眼内デリバリー試薬を使用可能である。例えば、局所的眼内デリバリーのための本発明の医薬品組成物は、上述の食塩水、角膜透過促進剤、不溶性粒子、ワセリンまたは他のゲル性軟膏、目への滴下において粘性増加する高分子、または粘膜付着性高分子、を含有可能である。好ましくは、眼内デリバリー試薬は角膜透過性を増加し、または粘性効果を通して、または角膜上皮を覆うムチン層との物理化学的相互作用の確立によって、ｓｉＲＮＡの眼内前方への保持力を延長する。
【０１０１】
局所的眼内デリバリーのための適切な不溶性粒子はリン酸カルシウム粒子を含み、これは、参照によってその開示内容の全体が本願明細書へ取り込まれるところの、Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第６，３５５，２７１号明細書に記述されている。目への滴下において粘性増加する適切な高分子は、ポロキサマー４０７（例えば、濃度２５％）といったポリエチレンポリオキシプロピレン・ブロック共重合体、酢酸フタル酸セルロース（例えば、濃度３０％）、またはＧｅｌｒｉｔｅ（登録商標）（ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ、デルウェア州、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎから入手可能）といった低アセチルジェランガム、を含む。適切な粘膜付着性高分子は、カルボキシル基、水酸基、アミドおよび／または硫酸基といった複数の親水性官能基を有する親水コロイドを含む；例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアクリル酸、高分子量ポリエチレングリコール（例えば、>２００，０００の平均分子量）、デキストラン、ヒアルロン酸、ポリガラクツロン酸、およびキシロカン、である。適切な角膜透過促進剤は、シクロデキストリン、塩化ベンザルコニウム、ポリオキシエチレングリコールラウリルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５）、ポリオキシエチレングリコールステアリルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標）７８）、ポリオキシエチレングリコールオレイルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標）９８）、エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ：ＥＤＴＡ）、ジギトニン、タウロコール酸ナトリウム、サポニン、およびＣｒｅｍａｐｈｏｒ  ＥＬといったポリオキシエチル化ひまし油、を含む。
【０１０２】
固体組成物としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム、およびそれらに類する、標準的な非毒性固体担体を使用可能である。
【０１０３】
例えば、経口投与のための医薬品固体組成物は、１０〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の本発明の１若しくはそれ以上のｓｉＲＮＡ、および上に挙げた担体および賦形剤の
いずれでも、含有可能である。エアロゾル（吸入）投与のための医薬品組成物は、上述のリポソームへ封入した１若しくはそれ以上の本発明のｓｉＲＮＡを重量で０．０１〜２０％、好ましくは重量で１％〜１０％、および推進剤、を含有可能である。望むならば、担体もまた含ませることが可能である；例えば、鼻腔内投与のためのレシチンである。
【実施例１】
【０１０４】
２つの異なるｓｉＲＮＡ製造方法を評価し、結果として得られたｓｉＲＮＡの有効性試験を行った。具体的には、それぞれの方法でＣａｎｄ５二重鎖を作製し、ヒト胎生期腎細胞（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ２９３  ｃｅｌｌ）中でそれら産物のＶＥＧＦ阻害活性の試験を行った。
【０１０５】
３種の異なる１本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを調製した。それらは、Ｃａｎｄ５のセンス鎖の塩基対１〜１０をコードする１０塩基対（ｂａｓｅ  ｐａｉｒ：ｂｐ）のオリゴヌクレオチド；Ｃａｎｄ５のセンス鎖の塩基対１１〜２１をコードする１１塩基対のオリゴヌクレオチド；およびＣａｎｄ５のアンチセンス鎖全体をコードするオリゴヌクレオチド、を含む。第１の方法では、オリゴヌクレオチドを等モル比で混合し、９５℃で２分間過熱後、室温まで冷却した。第２の方法では、上述の方法同様にオリゴヌクレオチドを混合および過熱するが、しかし、冷却後に混合液へＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加して、サンプルを室温で１時間、次に６５℃で１５分間、インキュベートした。
【０１０６】
それぞれの方法の結果として得られる産物が、培養細胞中のＶＥＧＦタンパク質量を減少させる能力を評価した。ヒト胎生期腎細胞へ、それぞれの産物を一過性に導入した。ＶＥＧＦの転写および翻訳を誘導するために、デスフェリオキサミンを添加して細胞に低酸素状態を生じさせた。導入後４８時間で培養液を採取し、ＥＬＩＳＡを実行して分泌されたＶＥＧＦタンパク質量を定量化した。両方の合成方法はＣａｎｄ５二重鎖の形成を許し、結果として得られたＣａｎｄ５は用量依存的にＶＥＧＦタンパク質を減少させた。
【０１０７】
細胞培養。ヒト胎生期腎細胞（ＡＴＣＣ，ヴァージニア州、Ｍａｎａｓｓａｓ）を、１０％ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ；ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カンザス州、Ｌｅｎｅｘａ）および細胞培養成長汚染物質の予防に用いる抗生−抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ，カリフォルニア州、Ｃａｒｌｓｂａｄ）を加えたダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ；Ｃｅｌｌｇｒｏ，ヴァージニア州、Ｈｅｒｎｄｏｎ）中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１０８】
ｓｉＲＮＡおよびオリゴヌクレオチド。全てのｓｉＲＮＡｓおよびオリゴヌクレオチドはＤｈａｒｍａｃｏｎ（コロラド州、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）にて合成した。完全に合成したＣａｎｄ５  ｓｉＲＮＡは、インビトロの有効性試験でポジティヴコントロールとして用いた。センス鎖の配列は、５’−ＡＣＣＵＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣｄＴｄＴ−３’（配列ＩＤ番号：６）、一方、アンチセンス鎖の配列は５’−ＧＵＧＣＵＧＧＣＣＵＵＧＧＵＧＡＧＧＵｄＴｄＴ−３’（配列ＩＤ番号：７）である。
【０１０９】
強化緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＥＧＦＰ）を標的とするｓｉＲＮＡは、ネガティヴコントロールとして用いた。このｓｉＲＮＡのセンス鎖の配列は、５’−ＧＧＣＵＡＣＧＵＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡｄＴｄＴ−３’（配列ＩＤ番号：８）、およびアンチセンス鎖の配列は、５’−ＵＧＣＧＣＵＣＣＵＧＧＡＣＧＵＡＧＣＣｄＴｄＴ−３’（配列ＩＤ番号：９）である。
【０１１０】
３種の異なる１本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。１つはＣａｎｄ５のセンス鎖の塩基対１〜１０をコードする５’−ＡＣＣＵＣＡＣＣＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：１０；１つはＣａｎｄ５のセンス鎖の塩基対１１〜２１をコードする５’−ＧＧＣＣＡＧＣＡＣｄＴｄＴ−３’（配列ＩＤ番号：１１）；および１つはＣａｎｄ５のアンチセンス鎖をコードする５’−ＧＵＧＣＵＧＧＣＣＵＵＧＧＵＧＡＧＧＵｄＴｄＴ−３’（配列ＩＤ番号：７）、である。
【０１１１】
Ｃａｎｄ５  ＲＮＡ前駆体オリゴヌクレオチドの混合。３種のＲＮＡオリゴヌクレオチドのそれぞれは、等モル量で混合した。それを次に攪拌し、９５℃で２分間過熱し、室温まで冷却した。結果として得られた「Ｃａｎｄ５混合物（Ｃａｎｄ５  Ｍｉｘｔｕｒｅ）」は、インビトロ試験に直接用いる（以下を参照）、または使用前にセンス鎖の構成要素の連結を促進するためにさらに手を加えた。追加的に手を加えた点は、１０μＬの「Ｃａｎｄ５混合物」、０．５μＬのＴ４リガーゼ（５Ｕ／μＬ、Ａｍｂｉｏｎ，テキサス州、Ａｕｓｔｉｎ）、１．５μＬの１０×ライゲーションバッファー、および３μＬの水のコーミングを含む。サンプルは室温で１時間インキュベートし、次にリガーゼを不活性化するために６５℃で追加的に１５分間インキュベートした。結果として得られた産物は、「Ｃａｎｄ５混合物−連結型（Ｃａｎｄ５  Ｍｉｘｔｕｒｅ−ｌｉｇａｔｅｄ）」と呼ぶ。
【０１１２】
ｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよびインビトロでの低酸素状態の誘導。２９３細胞は、２４穴プレート中、ＣＯ２を５％，３７℃にてオーバーナイトでインキュベートした。約２４時間のインキュベーション後、細胞が７０％コンフルエント程度であれば、Ｃａｎｄ５混合物またはＣａｎｄ５混合物−連結型の一定量を、リン酸カルシウム（ＣａＰｉ）試薬と共に添加した。Ｃａｎｄ５二重鎖、「Ｃａｎｄ５混合物」、または「Ｃａｎｄ５混合物−連結型」は、２０μＬの２５０ｍＭ塩化カルシウム溶液へ添加した。ｓｉＲＮＡ／塩化カルシウムの混合物を、２０μＬの２×ハンクス液（Ｈａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳ）へ、ボルテックスで攪拌しながら１滴ずつ加えた。ｓｉＲＮＡ／ＣａＣｌ２／ＨＢＳの混合物を培地（３００μＬ／ウェル）へ直接添加した。３７℃で４時間インキュベーションした後、培養液を除去し、細胞は１０％ＤＭＳＯを含む無血清培地でさらにインキュベートした（３００μＬ／ウェル、室温で１〜２分間）。この培地を次に除去し、細胞へ再び５００μＬ／ウェルの成長培地を加えた。ｓｉＲＮＡ希釈の最終濃度は１００ｐＭ、１ｎＭ、および２５ｎＭとした。ネガティヴコントロールには、ｓｉＲＮＡを含まないトランスフェクション試薬、または２５ｎＭの濃度の非特異的なｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ）を含めた。細胞中でのＶＥＧＦの転写および翻訳を促進するために、デスフェリオキサミン（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ）を最終濃度１３０μＭで、トランスフェクションを行った４時間後に培養細胞へ添加し、低酸素状態を誘導した。アッセイは、３倍のサンプルを調製して複数のプレートで行った。
【０１１３】
ＶＥＧＦタンパク質の定量化。トランスフェクションの約４８時間後、解析のために各ウェルから細胞上清を採取した。ＶＥＧＦタンパク質の定量化には、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネソタ州、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）を製造者のプロトコルに従って使用した。それぞれのサンプルから１００μＬを解析した。ＥＬＩＳＡの結果は、ＡＤ３４０  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて４５０ｎｍで読み取った。
【０１１４】
結果およびディスカッション。図１に示すように、デスフェリオキサミン処理した２９３細胞ではヒトＶＥＧＦタンパク質が上方制御された。低酸素状態の誘導によるｈＶＥＧＦの増加は、Ｃａｎｄ５（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、「Ｃａｎｄ５混合物」、および「Ｃａｎｄ５混合物−連結型」によって処理した細胞では著しく減少した。効果は用量依存的であった。非特異的ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ；２５ｎＭ  ＮＣ）、またはｓｉＲＮＡを加えないモックインキュベーションでは、ｈＶＥＧＦ量に影響は無かった。Ｃａｎｄ５は、「Ｃａｎｄ５混合物」および「Ｃａｎｄ５混合物−連結型」と比較して、より良好な抑制を示した。
いずれの方法も、トータルでＣａｎｄ５のセンスおよびアンチセンス鎖をコードする３つのＲＮＡオリゴヌクレオチドの等モル比での合成および結合を含むが、しかし、本発明で考案した方法は非等モル比での複数のオリゴヌクレオチドの合成および結合を含む可能性がある。上述の１方法では、混合、９５℃での加熱、室温への冷却によって、オリゴヌクレオチドを結合した。上述の他の方法では、センス鎖の構成要素の連結は、混合物へ続いてリガーゼを添加することにより促進した。
【０１１５】
いずれの方法もＣａｎｄ５二重鎖形成を許し、このことは混合物による低酸素２９３細胞中のヒトＶＥＧＦタンパク質の抑制能力から明らかであるが、しかし、いずれの混合物もＣａｎｄ５二重鎖ほど効果的ではなかった。このことは、前記２つの方法の産物はＣａｎｄ５二重鎖ほど質が高くはなかったことによるものであろう。加えて、リガーゼなしとリガーゼ有りの混合物との間では同等の有効性が見られたことから、リガーゼの添加は２重鎖形成には寄与しないことが示唆される。
【０１１６】
本発明は特定の好ましい実施形態への参照と共に少なからず詳細に記述されているものの、別の方法も可能である。従って、添付の請求項の精神および範囲は、本願明細書に含まれる記述および好ましい方法に限定されるべきではない。
【図１】
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【国際調査報告】
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