(57)【要約】本発明は、少なくとも部分的には、ＩＧＦ−１Ｒ内の異なる複数のエピトープに結合する結合分子が、１個のＩＧＦ−１Ｒエピトープに結合する結合分子と比較して、向上したＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２ブロック能力をもたらすという知見に基づいている。本発明は、例えば、単一特異性結合分子または多重特異性結合分子（例えば、二重特異性分子）の組み合わせのような、ＩＧＦ−１Ｒの複数のエピトープに結合する組成物を提供する。目的の結合分子を製造する方法、および本発明の結合分子を使用してＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達を拮抗する方法も提供する。2010538012.tif 000044
2010538012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、ＩＧＦ−１Ｒの第１のエピトープに結合し、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のうち、少なくとも１つがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする第１の結合部分と、ＩＧＦ−１Ｒの第２の異なるエピトープに結合し、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のうち、少なくとも１つがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする第２の結合部分とを、該腫瘍細胞に接触させる工程を含み、前記第１の部分および第２の部分のＩＧＦ−１Ｒへの結合は、前記第１の部分のみ、または第２の部分のみの結合よりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達をブロックし、それによって、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の生存または成長を阻害する、方法。
【請求項２】
前記第１の結合部分および第２の結合部分が、異なる機序で、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のうち、少なくとも１つがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の結合部分および第２の結合部分が、同じ結合分子中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の結合部分および第２の結合部分が、別の結合分子中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の結合部分および第２の結合部分が、ＩＧＦ−１Ｒに結合するにあたり、競合しない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＩＧＦ−１Ｒの第１のエピトープに結合し、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のうち、少なくとも１つがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、ＩＧＦ−１Ｒの第２の異なるエピトープに結合し、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のうち、少なくとも１つがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする第２の結合部分とを含む、多重特異的なＩＧＦ−１Ｒ結合分子。
【請求項７】
（ａ）第１のアロステリックなＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合し、それによってＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によってブロックする、少なくとも１つの第１のアロステリックなＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、
（ｂ）（ｉ）競合的なＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合し、それによってＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的にブロックするか、または（ｉｉ）第２のアロステリックなＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合し、それによってアロステリック効果によってＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックするが、ＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのはブロックしない、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と
を含む、多重特異的なＩＧＦ−１Ｒ結合分子。
【請求項８】
前記第１のアロステリックなエピトープが、ＩＧＦ−１ＲのＦｎＩＩＩ−１ドメインに広がり、かつＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸４３７〜５８６を含む領域内にある、請求項７に記載の結合分子。
【請求項９】
前記第１のアロステリックなエピトープが、少なくとも３個の連続したアミノ酸または連続していないアミノ酸を含み、このエピトープのアミノ酸のうち、少なくとも１個が、ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸位置４３７、４３８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６４、４６６、４６７、４６９、４７０、４７１、４７２、４７４、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８２、４８３、４８８、４９０、４９２、４９３、４９５、４９６、５０９、５１３、５１４、５１５、５３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５５１、５６４、５６５、５６８、５７０、５７１、５７２、５７３、５７７、５７８、５７９、５８２、５８４、５８５、５８６および５８７からなる群から選択される、請求項７に記載の結合分子。
【請求項１０】
前記第１のアロステリックなエピトープが、ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸４６１、４６２および４６４のうち、少なくとも１個を含む、請求項７に記載の結合分子。
【請求項１１】
前記競合的なエピトープが、ＣＲＲドメインの一部分を包含する領域内にあり、この領域が、ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基２４８〜３０３を含む、請求項７に記載の結合分子。
【請求項１２】
前記競合的なエピトープが、少なくとも３個の連続したアミノ酸または連続していないアミノ酸を含み、このエピトープのアミノ酸のうち、少なくとも１個が、ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸２４８、２５０、２５４、２５７、２５９、２６０、２６３、２６５、３０１および３０３からなる群から選択される、請求項７に記載の結合分子。
【請求項１３】
前記競合的なエピトープが、ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸２４８、２５０および２５４を含む、請求項７に記載の結合分子。
【請求項１４】
前記第２のアロステリックなエピトープが、ＩＧＦ−１ＲのＣＲＲドメインとＬ２ドメインの両方を含む領域内にあり、この領域が、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４１〜３７９を含む、請求項７に記載の結合分子。
【請求項１５】
前記第２のアロステリックなエピトープが、少なくとも３個の連続したアミノ酸または連続していないアミノ酸を含み、このアミノ酸のうち、少なくとも１個が、ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸２４１、２４８、２５０、２５１、２５４、２５７、２６３、２６５、２６６、３０１、３０３、３０８、３２７および３７９からなる群から選択される、請求項７に記載の結合分子。
【請求項１６】
前記第２のアロステリックなエピトープが、ＩＧＦ−１Ｒの２４１、２４２、２５１、２５７、２６５および２６６のアミノ酸のうち、少なくとも１個を含む、請求項７に記載の結合分子。
【請求項１７】
前記第１のアロステリックな結合部分が、Ｍ１３−Ｃ０６抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４４）またはＭ１４−Ｃ０３抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４５）に由来する、請求項７に記載の結合分子。
【請求項１８】
前記第１のアロステリックな結合部分が、Ｍ１３−Ｃ０６抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４４）またはＭ１４−Ｃ０３抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４５）のＣＤＲ１〜６を含む抗原結合部位である、請求項１７に記載の結合分子。
【請求項１９】
前記第１のアロステリックな結合部分が、ＩＧＦ−１Ｒに対する結合について、Ｍ１３−Ｃ０６抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４４）またはＭ１４−Ｃ０３抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４５）と競合する、請求項７に記載の結合分子。
【請求項２０】
前記競合的な結合部分が、Ｍ１４−Ｇ１１抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５５）に由来する、請求項７に記載の結合分子。
【請求項２１】
前記競合的な結合部分が、Ｍ１４−Ｇ１１抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５５）のＣＤＲ１〜６を含む抗原結合部位である、請求項１４に記載の結合分子。
【請求項２２】
前記競合的な結合部分が、ＩＧＦ−１Ｒに対する結合について、Ｍ１４−Ｇ１１抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５５）と競合する、請求項７に記載の結合分子。
【請求項２３】
前記第２のアロステリックな結合部分が、Ｐ１Ｅ２抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３０）またはαＩＲ３抗体に由来する、請求項７に記載の結合分子。
【請求項２４】
前記第２のアロステリックな結合部分が、Ｐ１Ｅ２抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３０）またはαＩＲ３抗体のＣＤＲ１〜６を含む抗原結合部位である、請求項２３に記載の結合分子。
【請求項２５】
前記第２のアロステリックな結合部分が、ＩＧＦ−１Ｒに対する結合について、Ｐ１Ｅ２抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３０）またはαＩＲ３抗体と競合する抗体に由来する、請求項７に記載の結合分子。
【請求項２６】
二重特異性である、請求項６〜２５のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項２７】
前記結合分子が、第１の結合特異性について多価である、請求項６〜２６のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項２８】
前記結合分子が、第２の結合特異性について多価である、請求項６〜２７のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項２９】
前記結合分子が、４つの結合部分を含む、請求項６〜２８のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項３０】
前記結合部分の少なくとも１つがｓｃＦｖ分子である、請求項６〜２９のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項３１】
前記結合分子が、２個のｓｃＦｖ分子を含む四価抗体分子である、請求項６〜３０のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項３２】
前記ｓｃＦｖ分子が、前記四価抗体分子の重鎖のＣ末端に融合している、請求項３１に記載の結合分子。
【請求項３３】
前記ｓｃＦｖ分子が、前記四価抗体分子の重鎖のＮ末端に融合している、請求項３１に記載の結合分子。
【請求項３４】
前記ｓｃＦｖ分子が、前記四価抗体分子の軽鎖のＮ末端に融合している、請求項３１に記載の結合分子。
【請求項３５】
安定化したｓｃＦｖ分子を含む、請求項６〜３４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項３６】
前記結合分子が完全ヒト型である、請求項６〜３５のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項３７】
前記結合分子が、ヒト化可変領域を含む、請求項６〜３５のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項３８】
前記結合分子が、キメラ可変領域を含む、請求項６〜３５のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項３９】
重鎖定常領域またはそのフラグメントを含む、請求項６〜３８のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項４０】
前記重鎖定常領域またはそのフラグメントが、ヒトＩｇＧ４である、請求項３９に記載の結合分子。
【請求項４１】
前記ＩｇＧ４定常領域にグリコシル化が無い、請求項４０に記載の結合分子。
【請求項４２】
前記ＩｇＧ４定常領域が、野生型ＩｇＧ４定常領域と比較して、ＥＵ付番システムによる番号でＳ２２８ＰおよびＴ２９９Ａの変異を含む、請求項４１に記載の結合分子。
【請求項４３】
Ｍ１３−Ｃ０６抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４４）に由来する２個のアロステリックな結合部分と、Ｍ１４−Ｇ１１抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５５）に由来する２個の競合的な結合部分とを含む、二重特異的なＩＧＦ−１Ｒ抗体分子。
【請求項４４】
前記競合的な結合部分が、ＩｇＧ抗体によって与えられ、前記アロステリックな結合部分が、２個のｓｃＦｖ分子によって与えられ、この２個のｓｃＦｖ分子が、前記ＩｇＧ抗体に結合しているか、または融合している、請求項４３に記載の抗体分子。
【請求項４５】
前記ＩｇＧ抗体が、Ｍ１４−Ｇ１１抗体に由来する軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、請求項４４に記載の抗体分子。
【請求項４６】
前記ＩｇＧ抗体のＶＬドメインが、配列番号９３のアミノ酸配列を含み、前記ＩｇＧ抗体のＶＨドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の抗体分子。
【請求項４７】
前記アロステリックな結合部分のｓｃＦｖ分子の片方または両方が、Ｍ１３−Ｃ０６抗体に由来する軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、請求項４４に記載の抗体分子。
【請求項４８】
前記ｓｃＦｖ分子の片方または両方が、６０〜６１℃より大きいＴ５０を有する安定化したＣ０６  ｓｃＦｖ分子である、請求項４７に記載の抗体分子。
【請求項４９】
前記ｓｃＦｖ分子の片方または両方が、従来のＣ０６  ｓｃＦｖ分子（ｐＷＸＵ０９２またはｐＷＸＵ０９０）のＴ５０よりも少なくとも２℃〜１０℃高いＴ５０を有する安定化したｓｃＦｖ分子である、請求項４７に記載の抗体分子。
【請求項５０】
（ｉ）Ｍ４、（ｉｉ）Ｌ１１、（ｉｉｉ）Ｖ１５、（ｉｖ）Ｔ２０、（ｖ）Ｑ２４、（ｖｉ）Ｒ３０、（ｖｉｉ）Ｔ４７、（ｖｉｉｉ）Ａ５１、（ｉｘ）Ｇ６３、（ｘ）Ｄ７０、（ｘｉ）Ｓ７２、（ｘｉｉ）Ｔ７４、（ｘｉｉｉ）Ｓ７７および（ｘｉｖ）Ｉ８３（Ｋａｂａｔ付番による規則）からなる群から選択される、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）内のアミノ酸位置に、１個以上の安定化する変異が存在しなければ、前記安定化したｓｃＦｖのＶＬドメインが、Ｍ１３−ＣＯ６抗体のＶＬドメイン（配列番号７８）と同一である、請求項４８に記載の抗体分子。
【請求項５１】
前記安定化する変異が、Ｍ４Ｌ、Ｌ１１Ｇ、Ｖ１５Ａ、Ｖ１５Ｄ、Ｖ１５Ｅ、Ｖ１５Ｇ、Ｖ１５Ｉ、Ｖ１５Ｎ、Ｖ１５Ｐ、Ｖ１５Ｒ、Ｖ１５Ｓ、Ｔ２０Ｒ、Ｑ２４Ｋ、Ｒ３０Ｎ、Ｒ３０Ｔ、Ｒ３０Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｇ６３Ｓ、Ｄ７０Ｅ、Ｓ７２Ｎ、Ｓ７２Ｙ、Ｔ７４Ｓ、Ｓ７７Ｇ、Ｉ８３Ｄ、Ｉ８３Ｅ、Ｉ８３Ｇ、Ｉ８３Ｍ、Ｉ８３Ｒ、Ｉ８３ＳおよびＩ８３Ｖからなる群から選択される、請求項５０に記載の抗体分子。
【請求項５２】
（ｉ）Ｓ２１、（ｉｉ）Ｗ４７、（ｉｉｉ）Ｒ８３および（ｉｖ）Ｔ１１０（Ｋａｂａｔ付番による規則）からなる群から選択されるアミノ酸位置に、１個以上の安定化する変異が存在しなければ、前記安定化したｓｃＦｖの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、Ｍ１３−ＣＯ６抗体のＶＨドメイン（配列番号１４）と同一である、請求項４８に記載の抗体分子。
【請求項５３】
前記安定化する変異が、Ｓ２１Ｅ、Ｗ４７Ｆ、Ｒ８３Ｋ、Ｒ８３ＴおよびＴ１１０Ｖからなる群から選択される、請求項５２に記載の抗体分子。
【請求項５４】
前記安定化したｓｃＦｖ分子が、ＶＬ  Ｌ１５Ｓ：ＶＨ  Ｔ１１０Ｖという変異の組み合わせを含む、請求項４８に記載の抗体分子。
【請求項５５】
前記安定化したｓｃＦｖ分子が、ＶＬ  Ｓ７７Ｇ：ＶＬ  Ｉ８３Ｑという変異の組み合わせを含む、請求項４８に記載の抗体分子。
【請求項５６】
前記安定化したｓｃＦｖ分子が、ＭＪＦ−０１４、ＭＪＦ−０１５、ＭＪＦ−０１６、ＭＪＦ−０１７、ＭＪＦ−０１８、ＭＪＦ−０１９、ＭＪＦ−０２０、ＭＪＦ−０２１、ＭＪＦ−０２２、ＭＪＦ−０２３、ＭＪＦ−０２４、ＭＪＦ−０２５、ＭＪＦ−０２６、ＭＪＦ−０２７、ＭＪＦ−０２８、ＭＪＦ−０２９、ＭＪＦ−０３０、ＭＪＦ−０３１、ＭＪＦ−０３２、ＭＪＦ−０３３、ＭＪＦ−０３４、ＭＪＦ−０３５、ＭＪＦ−０３６、ＭＪＦ−０３７、ＭＪＦ−０３８、ＭＪＦ−０３９、ＭＪＦ−０４０、ＭＪＦ−０４１、ＭＪＦ−０４２、ＭＪＦ−０４３、ＭＪＦ−０４４、ＭＪＦ−０４５、ＭＪＦ−０４６、ＭＪＦ−０４７、ＭＪＦ−０４８、ＭＪＦ−０４９、ＭＪＦ−０５０およびＭＪＦ−０５１からなる群から選択される安定化したＣＯ６  ｓｃＦｖ分子である、請求項４８に記載の抗体分子。
【請求項５７】
前記安定化したｓｃＦｖ分子が、ＭＪＦ−０４５（配列番号１２８）のアミノ酸配列を含む安定化したＣＯ６  ＶＨ／ＶＬ（Ｉ８３Ｅ）ｓｃＦｖ分子である、請求項４８に記載の抗体分子。
【請求項５８】
前記ｓｃＦｖ分子の片方または両方が、Ｇｌｙ／ＳｅｒリンカーによってＩｇＧ抗体に結合している、請求項４４に記載の抗体分子。
【請求項５９】
前記Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーまたはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーである、請求項５８に記載の抗体分子。
【請求項６０】
前記ｓｃＦｖ分子が、該ｓｃＦｖ分子のＶＬドメインを介し、前記ＩｇＧ抗体に結合するか、または融合する、請求項４４に記載の抗体分子。
【請求項６１】
前記ｓｃＦｖ分子の配向が、ＶＨ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカー→ＶＬであり、ｎが、３、４、５または６である、請求項６０に記載の抗体分子。
【請求項６２】
前記ｓｃＦｖ分子が、該ｓｃＦｖ分子のＶＨドメインを介し、前記ＩｇＧ抗体に結合するか、または融合する、請求項４４に記載の抗体分子。
【請求項６３】
前記ｓｃＦｖ分子の配向が、ＶＬ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカー→ＶＨであり、ｎが、３、４、５または６である、請求項６２に記載の抗体分子。
【請求項６４】
前記ｓｃＦｖ分子の片方または両方が、前記ＩｇＧ抗体の重鎖に結合するか、または融合し、前記二重特異性抗体の重鎖を形成する、請求項４４に記載の抗体分子。
【請求項６５】
前記ｓｃＦｖ分子のうち１つが、前記ＩｇＧ抗体の第１の重鎖に結合するか、または融合し、前記ｓｃＦｖ分子のうち１つが、前記ＩｇＧ抗体の第２の重鎖に結合するか、または融合する、請求項６４に記載の抗体分子。
【請求項６６】
前記ｓｃＦｖ分子が、前記ＩｇＧ抗体の第１および第２の重鎖のＮ末端に結合するか、または融合する、請求項６５に記載の抗体分子。
【請求項６７】
前記ＩｇＧ抗体の軽鎖が、配列番号１３０のＧ１１軽鎖配列（ｐＸＷＵ１１８）を含み、前記二重特異性抗体の重鎖が、配列番号１３３のアミノ酸配列（ｐＸＷＵ１３６）を含む、請求項６６に記載の抗体分子。
【請求項６８】
前記結合分子が、ＡＴＣＣ寄託番号ＸＸＸで寄託された細胞株によって産生される、請求項６６に記載の抗体分子。
【請求項６９】
前記ｓｃＦｖ分子が、前記ＩｇＧ抗体の前記第１および第２の重鎖のＣ末端に結合するか、または融合して、前記二重特異性抗体分子の重鎖を形成する、請求項６５に記載の抗体分子。
【請求項７０】
前記ＩｇＧ抗体の軽鎖が、配列番号１３０のＧ１１軽鎖配列（ｐＸＷＵ１１８）を含み、前記ｓｃＦｖ分子が、前記重鎖のＮ末端に結合する場合には、配列番号１３７の配列（ｐＸＷＵ１３５）を含む、請求項６９に記載の抗体分子。
【請求項７１】
前記結合分子が、ＡＴＣＣ寄託番号ＸＸＸで寄託された細胞株によって産生される、請求項６９に記載の抗体分子。
【請求項７２】
前記ｓｃＦｖ分子の片方または両方が、前記ＩｇＧ抗体の軽鎖に結合するか、または融合する、請求項４４に記載の抗体分子。
【請求項７３】
前記ｓｃＦｖ分子のうち１つが、前記ＩｇＧ抗体の第１の軽鎖に結合するか、または融合し、前記ｓｃＦｖ分子のうち１つが、前記ＩｇＧ抗体の第２の軽鎖に結合するか、または融合する、請求項７２に記載の抗体分子。
【請求項７４】
前記ｓｃＦｖ分子が、前記ＩｇＧ抗体の第１および第２の軽鎖のＮ末端に結合するか、または融合する、請求項７２に記載の抗体分子。
【請求項７５】
前記アロステリックな結合部分が、ＩｇＧ抗体によって与えられ、前記競合的な結合部分が、２個のｓｃＦｖ分子によって与えられ、この２個のｓｃＦｖ分子が、前記ＩｇＧ抗体に結合しているか、または融合している、請求項４３に記載の抗体分子。
【請求項７６】
前記ＩｇＧ抗体が、Ｍ１３−Ｃ０６抗体に由来する軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、請求項７５に記載の抗体分子。
【請求項７７】
前記ＩｇＧ抗体のＶＬドメインが、配列番号７８のアミノ酸配列を含み、前記ＩｇＧ抗体のＶＨドメインが、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項７６に記載の抗体分子。
【請求項７８】
前記ｓｃＦｖ分子の片方または両方が、Ｍ１４−Ｇ１１抗体に由来する軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、請求項７５に記載の抗体分子。
【請求項７９】
前記ｓｃＦｖ分子の片方または両方が、５０〜５１℃より大きいＴ５０を有する安定化したＧ１１  ｓｃＦｖ分子である、請求項７８に記載の抗体分子。
【請求項８０】
前記ｓｃＦｖ分子の片方または両方が、従来のＧ１１（ＶＬ／ＧＳ４／ＶＨ）ｓｃＦｖ分子（ｐＭＪＦ０６０）のＴ５０よりも少なくとも２℃〜１０℃高いＴ５０を有する安定化したｓｃＦｖ分子である、請求項７８に記載の抗体分子。
【請求項８１】
Ｌ５０および／またはＶ８３（Ｋａｂａｔ付番による規則）のアミノ酸位置に１個以上の安定化する変異が存在しなければ、前記安定化したｓｃＦｖの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、Ｍ１４−Ｇ１１抗体のＶＬドメイン（配列番号９３）と同一である、請求項７９に記載の抗体分子。
【請求項８２】
前記安定化する変異が、Ｌ５０Ｇ、Ｌ５０Ｍ、Ｌ５０ＮおよびＶ８３Ｅからなる群から選択される、請求項８１に記載の抗体分子。
【請求項８３】
Ｅ６および／またはＳ４９（Ｋａｂａｔ付番による規則）のアミノ酸位置に、１個以上の安定化する変異が存在しなければ、前記安定化したｓｃＦｖの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、Ｍ１４−Ｇ１１抗体（配列番号３２）のＶＨドメインと同一である、請求項７９に記載の抗体分子。
【請求項８４】
前記安定化する変異が、Ｅ６Ｑ、Ｓ４９ＡおよびＳ４９Ｇからなる群から選択される、請求項８３に記載の抗体分子。
【請求項８５】
前記安定化したｓｃＦｖ分子が、ＶＬ  Ｌ５０Ｎ：ＶＨ  Ｅ６Ｑという変異の組み合わせを含む、請求項７９に記載の抗体分子。
【請求項８６】
前記安定化したｓｃＦｖ分子が、ＶＬ  Ｖ８３Ｅ：ＶＨ  Ｅ６Ｑという変異の組み合わせを含む、請求項７９に記載の抗体分子。
【請求項８７】
前記安定化したｓｃＦｖ分子が、ＭＪＦ−０６０、ＭＪＦ−０８４、ＭＪＦ−０８５、ＭＪＦ−０８６、ＭＪＦ−０８７、ＭＪＦ−０９１、ＭＪＦ−０９２およびＭＪＦ−０９７からなる群から選択される、安定化したＧ１１  ｓｃＦｖ分子である、請求項７９に記載の抗体分子。
【請求項８８】
前記ｓｃＦｖ分子の片方または両方が、Ｇｌｙ／ＳｅｒリンカーによってＩｇＧ抗体に結合している、請求項７５に記載の抗体分子。
【請求項８９】
前記Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーまたはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーである、請求項８８に記載の抗体分子。
【請求項９０】
前記ｓｃＦｖ分子が、該ｓｃＦｖ分子のＶＬドメインを介し、前記ＩｇＧ抗体に結合するか、または融合する、請求項７５に記載の抗体分子。
【請求項９１】
前記ｓｃＦｖ分子の配向が、ＶＨ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカー→ＶＬであり、ｎが、３、４、５または６である、請求項９０に記載の抗体分子。
【請求項９２】
前記ｓｃＦｖ分子が、該ｓｃＦｖ分子のＶＨドメインを介し、前記ＩｇＧ抗体に結合するか、または融合する、請求項７５に記載の抗体分子。
【請求項９３】
前記ｓｃＦｖ分子の配向が、ＶＬ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカー→ＶＨであり、ｎが、３、４、５または６である、請求項９２に記載の抗体分子。
【請求項９４】
前記ｓｃＦｖ分子の片方または両方が、前記ＩｇＧ抗体の重鎖に結合するか、または融合する、請求項７５に記載の抗体分子。
【請求項９５】
前記ｓｃＦｖ分子のうち１つが、前記ＩｇＧ抗体の第１の重鎖に結合するか、または融合し、前記ｓｃＦｖ分子のうち１つが、前記ＩｇＧ抗体の第２の重鎖に結合するか、または融合する、請求項９４に記載の抗体分子。
【請求項９６】
前記ｓｃＦｖ分子が、前記ＩｇＧ抗体の第１および第２の重鎖のＮ末端に結合するか、または融合する、請求項９５に記載の抗体分子。
【請求項９７】
前記ＩｇＧ抗体の軽鎖が、配列番号１４０のＣＯ６軽鎖配列を含み、前記ｓｃＦｖ分子が、前記重鎖のＮ末端に結合する場合には、配列番号１４４の配列を含む、請求項９６に記載の抗体分子。
【請求項９８】
前記結合分子が、ＡＴＣＣ寄託番号ＸＸＸで寄託された細胞株によって産生される、請求項９６に記載の抗体分子。
【請求項９９】
前記ｓｃＦｖ分子が、前記ＩｇＧ抗体の第１および第２の重鎖のＣ末端に結合するか、または融合する、請求項９５に記載の抗体分子。
【請求項１００】
前記ＩｇＧ抗体の軽鎖が、配列番号１４０のＣＯ６軽鎖配列を含み、前記ｓｃＦｖ分子が、前記重鎖のＮ末端に結合する場合には、配列番号１４４の配列を含む、請求項９９に記載の抗体分子。
【請求項１０１】
前記結合分子が、ＡＴＣＣ寄託番号ＸＸＸで寄託された細胞株によって産生される、請求項９９に記載の抗体分子。
【請求項１０２】
前記ｓｃＦｖ分子の片方または両方が、前記ＩｇＧ抗体の軽鎖に結合するか、または融合する、請求項９５に記載の抗体分子。
【請求項１０３】
前記ｓｃＦｖ分子のうち１つが、前記ＩｇＧ抗体の第１の軽鎖に結合するか、または融合し、前記ｓｃＦｖ分子のうち１つが、前記ＩｇＧ抗体の第２の軽鎖に結合するか、または融合する、請求項１０２に記載の抗体分子。
【請求項１０４】
前記ｓｃＦｖ分子が、前記ＩｇＧ抗体の第１および第２の軽鎖のＮ末端に結合するか、または融合する、請求項１０３に記載の抗体分子。
【請求項１０５】
前記ＩｇＧ抗体が、ヒトＩｇＧ４アイソタイプの重鎖定常ドメインを含む、請求項４３〜１０４のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項１０６】
前記ＩｇＧ抗体が、ヒトＩｇＧ１アイソタイプの重鎖定常ドメインを含む、請求項４３〜１０４のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項１０７】
前記ＩｇＧ抗体が、２個以上のヒト抗体アイソタイプに由来する重鎖定常ドメイン部分のキメラである、請求項４３〜１０４のいずれか１項に記載の抗体分子。
【請求項１０８】
前記ＩｇＧ抗体が、Ｆｃ領域を含み、このＦｃ領域の残基２３３〜２３６および３２７〜３３１が、ヒトＩｇＧ２抗体に由来し、Ｆｃ領域の残りの残基が、ヒトＩｇＧ４抗体に由来する、請求項１０７に記載の抗体分子。
【請求項１０９】
前記ＩｇＧ抗体の重鎖定常領域にグリコシル化が無い、請求項１０５または１０６に記載の抗体分子。
【請求項１１０】
前記ＩｇＧ抗体が、前記全抗体のヒンジドメインにＳ２２８Ｐ、および／または前記全抗体のＣＨ２ドメインにＴ２９９Ａの変異部分を含み、該変異が、野生型ヒトＩｇＧ抗体に対するものである（ＥＵ付番システム）、請求項１０９に記載の抗体分子。
【請求項１１１】
商業的な規模で製造される場合、本質的に耐凝集性を有する、請求項６〜１０４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１１２】
ＩＧＦ−１Ｒが介在する細胞増殖を阻害する、請求項６〜１０４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１１３】
ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する、請求項６〜１０４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１１４】
ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が介在するＡＫＴリン酸化を阻害する、請求項６〜１０４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１１５】
ＡＫＴが介在する生存シグナル伝達を阻害する、請求項６〜１０４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１１６】
インビボで腫瘍の成長を阻害する、請求項６〜１０４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１１７】
ＩＧＦ−１Ｒの内在化を誘発する、請求項６〜１０４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１１８】
前記結合分子が、細胞毒性薬、治療薬、細胞増殖抑制剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医用薬剤、リンホカイン、異種抗体またはそのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびこれらの薬剤の２種以上の組み合わせからなる群から選択される薬剤にコンジュゲートしている、請求項６〜１０４のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項１１９】
前記細胞毒性薬が、放射性核種、生物毒素、酵素によって活性化する毒素、細胞増殖抑制性または細胞毒性性の治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、生体応答修飾物質、または前記細胞毒性薬の２種以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項１１８に記載の結合分子。
【請求項１２０】
請求項６〜１０４のいずれか１項に記載の結合分子と、担体とを含む組成物。
【請求項１２１】
請求項６〜１０４のいずれか１項に記載の結合分子を対象に投与して治療を行う工程を含む、過剰増殖性障害を患う対象を治療する方法。
【請求項１２２】
前記過剰増殖性障害が、癌、新生物、腫瘍、悪性腫瘍、またはその転移からなる群から選択される、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記過剰増殖性障害が、癌であり、該癌が、肉腫、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、黒色腫、白血病、胃癌、脳癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、頭頸部癌、扁平上皮細胞癌、多発性骨髄腫、リンパ腫および白血病からなる群から選択される、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
請求項６〜１０４のいずれか１項に記載の結合分子またはその重鎖または軽鎖をコードする核酸分子。
【請求項１２５】
ベクター内にある、請求項１２４に記載の核酸分子。
【請求項１２６】
請求項１２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２７】
請求項６〜１０４のいずれか１項に記載の結合分子を製造する方法であって、
（ｉ）前記結合分子が、宿主細胞の培地中に分泌されるように、請求項１２６に記載の宿主細胞を培養する工程と、
（ｉｉ）前記培地から前記結合分子を単離する工程と
を含む、方法。
【請求項１２８】
従来のｓｃＦｖ分子のＴ５０よりも少なくとも２℃〜１０℃高いＴ５０を有する、安定化したｓｃＦｖ分子。
【請求項１２９】
５０℃よりも高いＴ５０を有する、請求項１２８に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１３０】
６０℃よりも高いＴ５０を有する、請求項１２８に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１３１】
従来のｓｃＦｖ分子と比較して、１個以上の安定化する変異を含み、この変異が、（ｉ）４、（ｉｉ）１１、（ｉｉｉ）１５、（ｉｖ）２０、（ｖ）２４、（ｖｉ）３０、（ｖｉｉ）４７、（ｖｉｉｉ）５０、（ｉｘ）５１、（ｘ）６３、（ｘｉ）７０、（ｘｉｉ）７２、（ｘｉｉｉ）７４、（ｘｉｖ）７７および（ｘｖ）８３（Ｋａｂａｔ付番による規則）からなるＶＬアミノ酸位置の群から選択されるＶＬのアミノ酸位置に存在する、請求項１２８に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１３２】
前記安定化する変異が、４Ｌ、１１Ｇ、１５Ａ、１５Ｄ、１５Ｅ、１５Ｇ、１５Ｉ、１５Ｎ、１５Ｐ、１５Ｒ、１５Ｓ、２０Ｒ、２４Ｋ、３０Ｎ、３０Ｔ、３０Ｙ、５０Ｇ、５０Ｍ、５０Ｎ、５１Ｇ、６３Ｓ、７０Ｅ、７２Ｎ、７２Ｙ、７４Ｓ、７７Ｇ、８３Ｄ、８３Ｅ、８３Ｇ、８３Ｍ、８３Ｒ、８３Ｓおよび８３Ｖからなる群から選択される、請求項１３１に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１３３】
従来のｓｃＦｖ分子と比較して、１個以上の安定化する変異を含み、この変異が、（ｉ）６、（ｉｉ）２１、（ｉｉｉ）４７、（ｉｖ）４９および（ｖ）１１０（Ｋａｂａｔ付番による規則）からなるＶＨのアミノ酸位置の群から選択されるＶＨのアミノ酸位置に存在する、請求項１２８に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１３４】
前記安定化する変異が、６Ｑ、２１Ｅ、４７Ｆ、４９Ａ、４９Ｇ、８３Ｋ、８３Ｔおよび１１０Ｖからなる群から選択される、請求項１３３に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１３５】
従来のｓｃＦｖ分子と比較して、１個以上の安定化する変異を含み、この変異が、（ｉ）ＶＬのアミノ酸位置５０、（ｉｉ）ＶＬのアミノ酸位置８３、（ｉｉｉ）ＶＨのアミノ酸位置６および（ｉｖ）ＶＨのアミノ酸位置４９（Ｋａｂａｔ付番による規則）からなる群から選択されるアミノ酸位置に存在する、請求項１２８に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１３６】
従来のｓｃＦｖ分子と比較して、安定化する変異を含み、この変異が、（ｉ）ＶＬのアミノ酸位置５０、（ｉｉ）ＶＬのアミノ酸位置８３、（ｉｉｉ）ＶＨのアミノ酸位置６および（ｉｖ）ＶＨのアミノ酸位置４９（Ｋａｂａｔ付番による規則）に存在する、請求項１２８に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１３７】
前記安定化する変異が、ＶＬ  ５０Ｇ、ＶＬ  ５０Ｍ、ＶＬ  ５０Ｎ、ＶＬ  ８３Ｄ、ＶＬ  ８３Ｅ、ＶＬ  ８３Ｇ、ＶＬ  ８３Ｍ、ＶＬ  ８３Ｒ、ＶＬ  ８３Ｓ、ＶＬ  ８３Ｖ、ＶＨ  ６Ｑ、ＶＨ  ４９ＡおよびＶＨ  ４９Ｇからなる群から選択される、請求項１３５または１３６に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１３８】
前記安定化したｓｃＦｖ分子が、従来のＣ０６  ｓｃＦｖ分子（ｐＷＸＵ０９２またはｐＷＸＵ０９０）のＴ５０よりも少なくとも２℃〜１０℃高いＴ５０を有する、請求項１２８に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１３９】
ＶＬドメインの（ｉ）Ｍ４、（ｉｉ）Ｌ１１、（ｉｉｉ）Ｖ１５、（ｉｖ）Ｔ２０、（ｖ）Ｑ２４、（ｖｉ）Ｒ３０、（ｖｉｉ）Ｔ４７、（ｖｉｉｉ）Ａ５１、（ｉｘ）Ｇ６３、（ｘ）Ｄ７０、（ｘｉ）Ｓ７２、（ｘｉｉ）Ｔ７４、（ｘｉｉｉ）Ｓ７７および（ｘｉｖ）Ｉ８３（Ｋａｂａｔ付番による規則）からなる群から選択されるアミノ酸位置に、１個以上の安定化する変異が存在しなければ、前記安定化したｓｃＦｖの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、Ｍ１３−ＣＯ６抗体のＶＬドメイン（配列番号７８）と同一である、請求項１３８に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１４０】
前記安定化する変異が、Ｍ４Ｌ、Ｌ１１Ｇ、Ｖ１５Ａ、Ｖ１５Ｄ、Ｖ１５Ｅ、Ｖ１５Ｇ、Ｖ１５Ｉ、Ｖ１５Ｎ、Ｖ１５Ｐ、Ｖ１５Ｒ、Ｖ１５Ｓ、Ｔ２０Ｒ、Ｑ２４Ｋ、Ｒ３０Ｎ、Ｒ３０Ｔ、Ｒ３０Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｇ６３Ｓ、Ｄ７０Ｅ、Ｓ７２Ｎ、Ｓ７２Ｙ、Ｔ７４Ｓ、Ｓ７７Ｇ、Ｉ８３Ｄ、Ｉ８３Ｅ、Ｉ８３Ｇ、Ｉ８３Ｍ、Ｉ８３Ｒ、Ｉ８３ＳおよびＩ８３Ｖからなる群から選択される、請求項１３９に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１４１】
（ｉ）Ｓ２１、（ｉｉ）Ｗ４７、（ｉｉｉ）Ｒ８３および（ｉｖ）Ｔ１１０（Ｋａｂａｔ付番による規則）からなる群から選択されるアミノ酸位置に、１個以上の安定化する変異が存在しなければ、前記安定化したｓｃＦｖの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、Ｍ１３−ＣＯ６抗体のＶＨドメイン（配列番号１４）と同一である、請求項１３８に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１４２】
前記安定化する変異が、Ｓ２１Ｅ、Ｗ４７Ｆ、Ｒ８３Ｋ、Ｒ８３ＴおよびＴ１１０Ｖからなる群から選択される、請求項１４１に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１４３】
前記安定化したｓｃＦｖ分子が、ＶＬ  Ｌ１５Ｓ：ＶＨ  Ｔ１１０Ｖという変異の組み合わせを含む、請求項１３８に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１４４】
前記安定化したｓｃＦｖ分子が、ＶＬ  Ｓ７７Ｇ：ＶＬ  Ｉ８３Ｑという変異の組み合わせを含む、請求項１３８に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１４５】
前記安定化したｓｃＦｖ分子が、ＭＪＦ−０１４、ＭＪＦ−０１５、ＭＪＦ−０１６、ＭＪＦ−０１７、ＭＪＦ−０１８、ＭＪＦ−０１９、ＭＪＦ−０２０、ＭＪＦ−０２１、ＭＪＦ−０２２、ＭＪＦ−０２３、ＭＪＦ−０２４、ＭＪＦ−０２５、ＭＪＦ−０２６、ＭＪＦ−０２７、ＭＪＦ−０２８、ＭＪＦ−０２９、ＭＪＦ−０３０、ＭＪＦ−０３１、ＭＪＦ−０３２、ＭＪＦ−０３３、ＭＪＦ−０３４、ＭＪＦ−０３５、ＭＪＦ−０３６、ＭＪＦ−０３７、ＭＪＦ−０３８、ＭＪＦ−０３９、ＭＪＦ−０４０、ＭＪＦ−０４１、ＭＪＦ−０４２、ＭＪＦ−０４３、ＭＪＦ−０４４、ＭＪＦ−０４５、ＭＪＦ−０４６、ＭＪＦ−０４７、ＭＪＦ−０４８、ＭＪＦ−０４９、ＭＪＦ−０５０およびＭＪＦ−０５１からなる群から選択される、安定化したＣＯ６  ｓｃＦｖ分子である、請求項１３８に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１４６】
従来のＧ１１（ＶＬ／ＧＳ４／ＶＨ）ｓｃＦｖ分子（ｐＭＪＦ０６０）のＴ５０よりも少なくとも２℃〜１０℃高いＴ５０を有する安定化したｓｃＦｖ分子である、請求項１２８に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１４７】
Ｌ５０および／またはＶ８３（Ｋａｂａｔ付番による規則）のアミノ酸位置に１個以上の安定化する変異が存在しなければ、前記安定化したｓｃＦｖの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、Ｍ１４−Ｇ１１抗体のＶＬドメイン（配列番号９３）と同一である、請求項１４６に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１４８】
前記安定化する変異が、Ｌ５０Ｇ、Ｌ５０Ｍ、Ｌ５０ＮおよびＶ８３Ｅからなる群から選択される、請求項１４７に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１４９】
Ｅ６および／またはＳ４９（Ｋａｂａｔ付番による規則）のアミノ酸位置に、１個以上の安定化する変異が存在しなければ、前記安定化したｓｃＦｖの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、Ｍ１４−Ｇ１１抗体（配列番号３２）のＶＨドメインと同一である、請求項１４６に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１５０】
前記安定化する変異が、Ｅ６Ｑ、Ｓ４９ＡおよびＳ４９Ｇからなる群から選択される、請求項１４９に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１５１】
前記安定化したｓｃＦｖ分子が、ＶＬ  Ｌ５０Ｎ：ＶＨ  Ｅ６Ｑという変異の組み合わせを含む、請求項１４６に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１５２】
前記安定化したｓｃＦｖ分子が、ＶＬ  Ｖ８３Ｅ：ＶＨ  Ｅ６Ｑという変異の組み合わせを含む、請求項１４６に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１５３】
前記安定化したｓｃＦｖ分子が、ＭＪＦ−０６０、ＭＪＦ−０８４、ＭＪＦ−０８５、ＭＪＦ−０８６、ＭＪＦ−０８７、ＭＪＦ−０９１、ＭＪＦ−０９２およびＭＪＦ−０９７からなる群から選択される、安定化したＧ１１  ｓｃＦｖ分子である、請求項１４６に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１５４】
前記ｓｃＦｖ分子が、ＩＧＦ−１Ｒに対する結合特異性を有する、請求項１２８〜１５３のいずれか１項に記載のｓｃＦｖ分子。
【請求項１５５】
請求項１２８〜１５３のいずれか１項に記載の安定化したｓｃＦｖ分子を含む、多価結合分子。
【請求項１５６】
商業的な規模で製造される場合、本質的に凝集物を含まない、請求項１５５に記載の多価結合分子。
【請求項１５７】
バッファ系（例えばＰＢＳ）で少なくとも３ヶ月間インキュベートした後、本質的に凝集物を含まない、請求項１５５に記載の多価結合分子。
【請求項１５８】
融解温度（Ｔｍ）が少なくとも６０℃である、請求項１５５に記載の多価結合分子。
【請求項１５９】
請求項１２８〜１５４のいずれか１項に記載の安定化したｓｃＦｖ分子を、抗体分子の軽鎖または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に遺伝的に融合させる工程を含む、安定化した多価結合分子を製造する方法。
【請求項１６０】
請求項１２８〜１５４のいずれか１項に記載の安定化したｓｃＦｖ分子または請求項１５５に記載の多価結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１６１】
ベクター内にある、請求項１６０に記載の核酸分子。
【請求項１６２】
請求項１６１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６３】
安定化した結合分子が製造されるような条件下で、請求項１６２に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、安定化した結合分子を製造する方法。
【請求項１６４】
前記宿主細胞が商業的な規模（例えば５０Ｌ）で培養され、前記宿主細胞の培地１Ｌあたり、前記安定化した結合分子が少なくとも５ｍｇ製造される、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記宿主細胞が商業的な規模（例えば５０Ｌ）で培養され、前記宿主細胞の培地１Ｌあたり、前記安定化した結合分子が少なくとも５０ｍｇ製造される、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６６】
前記宿主細胞が商業的な規模で培養され、凝集物の形態で存在する前記結合分子が１０％以下である、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６７】
多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子であって、
（ａ）第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、
（ｂ）前記第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と
を含み、
前記多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）前記第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）前記第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）前記第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒが介在するインビトロでの腫瘍細胞の成長を阻害する、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子。
【請求項１６８】
多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子であって、
（ａ）第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、
（ｂ）前記第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と
を含み、
前記多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）前記第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）前記第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）前記第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒが介在するインビボでの腫瘍細胞の成長を阻害する、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子。
【請求項１６９】
多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子であって、
（ａ）第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、
（ｂ）前記第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と
を含み、
前記多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）前記第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）前記第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）前記第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達をブロックする、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子。
【請求項１７０】
多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子であって、
（ａ）第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、
（ｂ）前記第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と
を含み、
（ｉ）前記第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）前記第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）前記第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い結合親和性で、ＩＧＦ−１Ｒに対して結合する、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子。
【請求項１７１】
多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子であって、
（ａ）第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、
（ｂ）前記第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と
を含み、
前記多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）前記第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）前記第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）前記第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子。
【請求項１７２】
多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子であって、
（ａ）第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、
（ｂ）前記第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と
を含み、
（ｉ）前記第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）前記第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）前記第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも、血清での半減期が長い、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子。
【請求項１７３】
多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子であって、
（ａ）第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、
（ｂ）前記第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と
を含み、
前記多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）前記第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）前記第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）前記第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子。
【請求項１７４】
多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子であって、
（ａ）第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、
（ｂ）前記第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と
を含み、
前記多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）前記第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）前記第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）前記第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が介在するＡＫＴリン酸化および／またはＭＡＰＫリン酸化を阻害する、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子。
【請求項１７５】
多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子であって、
（ａ）第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、
（ｂ）前記第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と
を含み、
（ｉ）前記第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）前記第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）前記第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒ受容体に交差結合する、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子。
【請求項１７６】
多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子であって、
（ａ）第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、
（ｂ）前記第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と
を含み、
前記多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）前記第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）前記第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）前記第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒ受容体の内在化を誘発する、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子。
【請求項１７７】
多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子であって、
（ａ）第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、
（ｂ）前記第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と
を含み、
前記多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）前記第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）前記第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）前記第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、腫瘍細胞の周期の停止を誘発する、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子。
【請求項１７８】
多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子であって、
（ａ）第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、
（ｂ）前記第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と
を含み、
前記多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）前記第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）前記第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）前記第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒが介在する腫瘍細胞の成長を阻害する、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２００７年８月２８日に出願された米国特許仮出願第６０／９６６，４７５号、名称「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  Ｂｉｎｄ  Ｍｕｌｔｉｐｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ＩＧＦ−ＩＲ」の利益を主張する。本出願は、２００８年８月２８日に出願された米国特許出願第ＸＸ／ＸＸＸ，ＸＸＸ号に関連しており、この米国特許出願第ＸＸ／ＸＸＸ，ＸＸＸ号は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２００７年８月２８日に出願された米国特許仮出願第ＸＸ／ＸＸＸ，ＸＸＸ号、名称「Ａｎｔｉ−ＩＧＦ−ＩＲ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」の利益を主張する。本出願は、２００７年３月２８日に出願された米国特許出願第１１／７２７，８８７号とも関連しており、この米国特許出願第１１／７２７，８８７号は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２００６年３月２８日に出願された米国特許仮出願第６０／７８６，３４７号と、２００６年１２月２２日に出願された米国特許仮出願第６０／８７６，５５４号の利益とを主張する。上に引用した各出願の内容の全ては参照することにより本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞において、チロシンキナーゼ受容体（ＴＫ）は、細胞分裂周期、生存、アポトーシス、遺伝子発現、細胞骨格の構築、細胞の接着および細胞の移動といった多様な細胞機能を制御する細胞内シグナル伝達経路と、細胞外にある腫瘍内微細環境とを繋ぐのに重要な役割を果たす。細胞のシグナル伝達を制御する機序がよりよく理解されるにつれ、所定のリガンドの結合度で、シグナル伝達事象に関与する受容体の発現／リサイクリングや、受容体の活性化や、シグナル伝達事象に関与するタンパク質を標的とすることによって、上述の１つ以上の細胞機能を破壊する治療計画が開発され得る（Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｃｅｌｌ  ２０００．１００：５７−７０（非特許文献１））。
【０００３】
Ｉ型のインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２２１）は、チロシンキナーゼ受容体（ＲＴＫ）ファミリーに属している（Ｕｌｌｒｉｃｈら、Ｃｅｌｌ．１９９０．、６１：２０３−１２（非特許文献２））。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２は、ＩＧＦ−１Ｒの２種類の活性リガンドである。インスリン様成長因子受容体２（ＩＧＦ−２Ｒ、ＣＤ２２２）および関連するＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１〜ＩＧＦＢＰ−６）とともに、上述のタンパク質は全体としてＩＧＦ系を形成し、このＩＧＦ系は、出生前および出生後の成長、成長ホルモンへの応答性、細胞の形質転換、生存、および侵襲性で転移性の腫瘍表現型の獲得にきわめて重要な役割を果たしている（Ｂａｓｅｒｇａ、Ｃｅｌｌ．１９９４．７９：９２７−３０（非特許文献３）、Ｂａｓｅｒｇａら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９９．２５３：１−６（非特許文献４）、Ｂａｓｅｒｇａら、Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３．１０７：８７３−７７（非特許文献５））。
【０００４】
免疫組織化学的研究から、多くのヒト腫瘍で、高濃度のＩＧＦ−１Ｒが発現していることが分かった。ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍は、循環血（肝臓で作られる）中のＩＧＦ−１によってパラクリン受容体活性シグナルを受け、腫瘍中のＩＧＦ−２によってオートクリン受容体活性化シグナルを受ける。初期の臨床治験による近年のデータは、ＩＧＦ−１Ｒ経路を阻害すると、感受性腫瘍に対する臨床応答が得られる可能性を示唆している。しかし、抗体によってＩＧＦ−１Ｒの発現量が下方制御されると、患者におけるＩＧＦ−１の全身濃度が高まることが多いことが報告されている。その結果、ＩＧＦ−１Ｒ経路を完全に阻害することは実現不可能なことが多い。したがって、当該技術分野で、ＩＧＦ−１Ｒが介在する、細胞生存および新生物疾患の進行（癌およびその転移を含む）を有効にブロックすることが可能な治療方法および組成物が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｃｅｌｌ  ２０００．１００：５７−７０
【非特許文献２】Ｕｌｌｒｉｃｈら、Ｃｅｌｌ．１９９０．、６１：２０３−１２
【非特許文献３】Ｂａｓｅｒｇａ、Ｃｅｌｌ．１９９４．７９：９２７−３０
【非特許文献４】Ｂａｓｅｒｇａら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９９．２５３：１−６
【非特許文献５】Ｂａｓｅｒｇａら、Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３．１０７：８７３−７７
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、少なくとも部分的には、ＩＧＦ−１Ｒ内の異なるエピトープを認識する結合分子が、１個のＩＧＦ−１Ｒエピトープに結合する結合分子と比較して、向上したＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２ブロック能力をもたらすという知見に基づいている。本発明は、例えば、単一特異性結合分子または多重特異性結合分子（例えば、二重特異性分子）の組み合わせのような、ＩＧＦ−１Ｒの複数のエピトープに結合する組成物を提供する。目的の結合分子を製造する方法、およびこの結合分子を使用し、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達に拮抗する方法も提供している。
【０００７】
ある態様では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に関し、この方法は、ＩＧＦ−１Ｒの第１のエピトープに結合し、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のうち、少なくとも１つがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする第１の結合部分と、ＩＧＦ−１Ｒの第２の異なるエピトープに結合し、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のうち、少なくとも１つがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする第２の結合部分とを、上述の腫瘍細胞に接触させる工程を含み、上述の第１の部分および第２の部分がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、上述の第１の部分のみ、または第２の部分のみが結合するよりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達をブロックし、それにより、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の生存または成長を阻害する。
【０００８】
ある実施形態では、上述の第１の結合部分および第２の結合部分は、異なる機序で、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のうち、少なくとも１つがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする。
【０００９】
ある実施形態では、上述の第１の結合部分および第２の結合部分が、同じ結合分子中に存在する。別の実施形態では、上述の第１の結合部分と、第２の結合部分とは、別の結合分子中に存在する。
【００１０】
ある実施形態では、上述の第１の結合部分および第２の結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒに結合するにあたり、競合しない。
【００１１】
ある態様では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒの第１のエピトープに結合し、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のうち、少なくとも１つがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、ＩＧＦ−１Ｒの第２の異なるエピトープに結合し、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のうち、少なくとも１つがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする第２の結合部分とを含む、多重特異的なＩＧＦ−１Ｒ結合分子に関する。
【００１２】
ある態様では、本発明は、（ａ）第１のアロステリックなＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合し、それにより、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によってブロックする、少なくとも１つの第１のアロステリックなＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、（ｂ）（ｉ）競合的なＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合し、それにより、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的にブロックするか、または（ｉｉ）第２のアロステリックなＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合し、それにより、アロステリック効果によって、ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックするが、ＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのはブロックしない、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分とを含む、多重特異的なＩＧＦ−１Ｒ結合分子に関する。
【００１３】
ある実施形態では、上述の第１のアロステリックなエピトープが、ＩＧＦ−１ＲのＦｎＩＩＩ−１ドメインに広がりかつＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸４３７〜５８６を含む領域内にある。別の実施形態では、上述の第１のアロステリックなエピトープは、少なくとも３個の連続したアミノ酸または連続していないアミノ酸を含み、このエピトープのアミノ酸のうち、少なくとも１個が、ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸位置４３７、４３８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６４、４６６、４６７、４６９、４７０、４７１、４７２、４７４、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８２、４８３、４８８、４９０、４９２、４９３、４９５、４９６、５０９、５１３、５１４、５１５、５３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５５１、５６４、５６５、５６８、５７０、５７１、５７２、５７３、５７７、５７８、５７９、５８２、５８４、５８５、５８６および５８７からなる群から選択される。別の実施形態では、上述の第１のアロステリックなエピトープが、ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸４６１、４６２および４６４のうち、少なくとも１個を含む。
【００１４】
ある実施形態では、上述の競合的なエピトープは、ＣＲＲドメインの一部分を包含する領域内にあり、この領域が、ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基２４８〜３０３を含む。別の実施形態では、上述の競合的なエピトープは、少なくとも３個の連続したアミノ酸または連続していないアミノ酸を含み、このエピトープのアミノ酸のうち、少なくとも１個が、ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸２４８、２５０、２５４、２５７、２５９、２６０、２６３、２６５、３０１および３０３からなる群から選択される。別の実施形態では、上述の競合的なエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸２４８、２５０および２５４を含む。
【００１５】
ある実施形態では、上述の第２のアロステリックなエピトープは、ＩＧＦ−１ＲのＣＲＲドメインとＬ２ドメインの両方を含む領域内にあり、この領域が、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４１〜３７９を含む。別の実施形態では、上述の第２のアロステリックなエピトープは、少なくとも３個の連続したアミノ酸または連続していないアミノ酸を含み、このアミノ酸のうち、少なくとも１個が、ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸２４１、２４８、２５０、２５１、２５４、２５７、２６３、２６５、２６６、３０１、３０３、３０８、３２７および３７９からなる群から選択される。別の実施形態では、上述の第２のアロステリックなエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの２４１、２４２、２５１、２５７、２６５および２６６のアミノ酸のうち、少なくとも１個を含む。
【００１６】
ある実施形態では、上述の第１のアロステリックな結合部分は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４４）またはＭ１４−Ｃ０３抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４５）に由来する。別の実施形態では、上述の第１のアロステリックな結合部分は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４４）またはＭ１４−Ｃ０３抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４５）のＣＤＲ１〜６を含む抗原結合部位である。別の実施形態では、上述の第１のアロステリックな結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒに対する結合について、Ｍ１３−Ｃ０６抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４４）またはＭ１４−Ｃ０３抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４５）と競合する。
【００１７】
ある実施形態では、上述の競合的な結合部分は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５５）に由来する。別の実施形態では、上述の競合的な結合部分は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５５）のＣＤＲ１〜６を含む抗原結合部位である。別の実施形態では、上述の競合的な結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒに対する結合について、Ｍ１４−Ｇ１１抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５５）と競合する。
【００１８】
ある実施形態では、上述の第２のアロステリックな結合部分は、Ｐ１Ｅ２抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３０）またはαＩＲ３抗体に由来する。別の実施形態では、上述の第２のアロステリックな結合部分は、Ｐ１Ｅ２抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３０）抗体またはαＩＲ３抗体のＣＤＲ１〜６を含む抗原結合部位である。別の実施形態では、上述の第２のアロステリックな結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒに対するＰ１Ｅ２抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３０）抗体またはαＩＲ３抗体の結合と競合する抗体に由来する。
【００１９】
ある態様では、本発明は、二重特異性である、本発明の結合分子に関する。ある実施形態では、この結合分子は、第１の結合特異性について多価である。別の実施形態では、この結合分子は、第２の結合特異性について多価である。
【００２０】
ある実施形態では、この結合分子は、４つの結合部分を含む。
【００２１】
ある実施形態では、結合部分の少なくとも１つは、ｓｃＦｖ分子である。
【００２２】
ある実施形態では、結合分子は、２個以上のｓｃＦｖ分子を含む四価抗体分子である。このｓｃＦｖ分子は、独立して、本明細書に開示した任意のｓｃＦｖ分子から独立して選択されてもよい。
【００２３】
ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子は、上述の四価抗体分子の重鎖のＣ末端に融合している。別の実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子は、上述の四価抗体分子の重鎖のＮ末端に融合している。別の実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子は、四価抗体分子の軽鎖のＮ末端に融合している。
【００２４】
ある実施形態では、上述の結合分子は、安定化したｓｃＦｖ分子を含む。
【００２５】
ある実施形態では、結合分子は、完全ヒト型である。別の実施形態では、結合分子は、ヒト化可変領域を含む。別の実施形態では、結合分子は、キメラ可変領域を含む。
【００２６】
ある実施形態では、結合分子は、重鎖定常領域またはそのフラグメントを含む。別の実施形態では、上述の重鎖定常領域またはそのフラグメントは、ヒトＩｇＧ４である。ある実施形態では、上述のＩｇＧ４定常領域にグリコシル化が無い。ある実施形態では、上述のＩｇＧ４定常領域は、野生型ＩｇＧ４定常領域と比較して、ＥＵ付番システムによる番号でＳ２２８ＰおよびＴ２９９Ａの変異部分を含む。
【００２７】
さらに別の態様では、本発明は、２個のアロステリックな結合部分（例えば、本明細書に開示するアロステリックな結合部分のうちの任意の２個であって、例えば、Ｍ１３−Ｃ０６抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４４）に由来するアロステリックな結合部分）と、２個の競合的な結合部分（例えば、本明細書に開示する競合的な結合部分のうちの任意の２個であって、例えば、Ｍ１４−Ｇ１１抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５５）に由来する競合的な結合部分）とを含む、二重特異的なＩＧＦ−１Ｒ抗体分子に関する。
【００２８】
ある実施形態では、上述の競合的な結合部分は、ＩｇＧ抗体によって与えられ、上述のアロステリックな結合部分が、２個のｓｃＦｖ分子によって与えられ、この２個のｓｃＦｖ分子が、上述のＩｇＧ抗体に結合しているか、または融合している。特定の実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子は、独立して、本明細書に開示した任意のＣＯ６  ｓｃＦｖ分子から選択される。
【００２９】
ある実施形態では、上述のＩｇＧ抗体は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体に由来する軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む。ある実施形態では、上述のＩｇＧ抗体のＶＬドメインは、配列番号９３のアミノ酸配列を含み、上述のＩｇＧ抗体のＶＨドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。
【００３０】
ある実施形態では、上述のアロステリックな結合部分のｓｃＦｖ分子の片方または両方は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体に由来する軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む。
【００３１】
ある実施形態では、ｓｃＦｖ分子の片方または両方は、安定化したＣ０６  ｓｃＦｖ分子であり、この分子のＴ５０が６０〜６１℃より大きい。ある実施形態では、ｓｃＦｖ分子の片方または両方が、安定化したｓｃＦｖ分子であり、この分子のＴ５０が、従来のＣ０６  ｓｃＦｖ分子（ｐＷＸＵ０９２またはｐＷＸＵ０９０）のＴ５０よりも少なくとも２℃〜１０℃高い。
【００３２】
ある実施形態では、ＶＬドメインの（ｉ）Ｍ４、（ｉｉ）Ｌ１１、（ｉｉｉ）Ｖ１５、（ｉｖ）Ｔ２０、（ｖ）Ｑ２４、（ｖｉ）Ｒ３０、（ｖｉｉ）Ｔ４７、（ｖｉｉｉ）Ａ５１、（ｉｘ）Ｇ６３、（ｘ）Ｄ７０、（ｘｉ）Ｓ７２、（ｘｉｉ）Ｔ７４、（ｘｉｉｉ）Ｓ７７および（ｘｉｖ）Ｉ８３（Ｋａｂａｔ付番による規則）からなる群から選択されるＶＬのアミノ酸位置に、１個以上の安定化する変異が存在しなければ、安定化したｓｃＦｖの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、Ｍ１３−ＣＯ６抗体のＶＬドメイン（配列番号７８）と同一である。
【００３３】
ある実施形態では、上述の安定化する変異は、Ｍ４Ｌ、Ｌ１１Ｇ、Ｖ１５Ａ、Ｖ１５Ｄ、Ｖ１５Ｅ、Ｖ１５Ｇ、Ｖ１５Ｉ、Ｖ１５Ｎ、Ｖ１５Ｐ、Ｖ１５Ｒ、Ｖ１５Ｓ、Ｔ２０Ｒ、Ｑ２４Ｋ、Ｒ３０Ｎ、Ｒ３０Ｔ、Ｒ３０Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｇ６３Ｓ、Ｄ７０Ｅ、Ｓ７２Ｎ、Ｓ７２Ｙ、Ｔ７４Ｓ、Ｓ７７Ｇ、Ｉ８３Ｄ、Ｉ８３Ｅ、Ｉ８３Ｇ、Ｉ８３Ｍ、Ｉ８３Ｒ、Ｉ８３ＳおよびＩ８３Ｖからなる群から選択される。
【００３４】
ある実施形態では、（ｉ）Ｓ２１、（ｉｉ）Ｗ４７、（ｉｉｉ）Ｒ８３および（ｉｖ）Ｔ１１０（Ｋａｂａｔ付番による規則）からなる群から選択されるアミノ酸位置に、１個以上の安定化する変異が存在しなければ、安定化したｓｃＦｖの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、Ｍ１３−ＣＯ６抗体のＶＨドメイン（配列番号１４）と同一である。
【００３５】
ある実施形態では、上述の安定化する変異は、Ｓ２１Ｅ、Ｗ４７Ｆ、Ｒ８３Ｋ、Ｒ８３ＴおよびＴ１１０Ｖからなる群から選択される。別の実施形態では、上述の安定化したｓｃＦｖ分子は、ＶＬ  Ｌ１５Ｓ：ＶＨ  Ｔ１１０Ｖという変異の組み合わせを含む。別の実施形態では、上述の安定化したｓｃＦｖ分子は、ＶＬ  Ｓ７７Ｇ：ＶＬ  Ｉ８３Ｑという変異の組み合わせを含む。
【００３６】
ある実施形態では、ｓｃＦｖ分子の片方または両方は、ＭＪＦ−０１４、ＭＪＦ−０１５、ＭＪＦ−０１６、ＭＪＦ−０１７、ＭＪＦ−０１８、ＭＪＦ−０１９、ＭＪＦ−０２０、ＭＪＦ−０２１、ＭＪＦ−０２２、ＭＪＦ−０２３、ＭＪＦ−０２４、ＭＪＦ−０２５、ＭＪＦ−０２６、ＭＪＦ−０２７、ＭＪＦ−０２８、ＭＪＦ−０２９、ＭＪＦ−０３０、ＭＪＦ−０３１、ＭＪＦ−０３２、ＭＪＦ−０３３、ＭＪＦ−０３４、ＭＪＦ−０３５、ＭＪＦ−０３６、ＭＪＦ−０３７、ＭＪＦ−０３８、ＭＪＦ−０３９、ＭＪＦ−０４０、ＭＪＦ−０４１、ＭＪＦ−０４２、ＭＪＦ−０４３、ＭＪＦ−０４４、ＭＪＦ−０４５、ＭＪＦ−０４６、ＭＪＦ−０４７、ＭＪＦ−０４８、ＭＪＦ−０４９、ＭＪＦ−０５０およびＭＪＦ−０５１からなる群から独立して選択される安定化したＣＯ６  ｓｃＦｖ分子である。
【００３７】
ある実施形態では、上述の安定化したｓｃＦｖ分子は、ＭＪＦ−０４５（配列番号１２８）のアミノ酸配列を含む安定化したＣＯ６  ＶＨ／ＶＬ（Ｉ８３Ｅ）ｓｃＦｖ分子である。
【００３８】
ある実施形態では、ｓｃＦｖ分子の片方または両方は、Ｇｌｙ／ＳｅｒリンカーによってＩｇＧ抗体に結合している。別の実施形態では、上述のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーまたはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーである。
【００３９】
ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子は、このｓｃＦｖ分子のＶＬドメインを介し、上述のＩｇＧ抗体に結合するか、または融合する。ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子の配向は、ＶＨ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカー→ＶＬであり、ｎが、３、４、５または６である。別の実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子は、このｓｃＦｖ分子のＶＨドメインを介し、上述のＩｇＧ抗体に結合するか、または融合する。ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子の配向は、ＶＬ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカー→ＶＨであり、ｎが、３、４、５または６である。
【００４０】
ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子の片方または両方は、上述のＩｇＧ抗体の重鎖に結合するか、または融合し、上述の二重特異性抗体の重鎖を形成する。ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子のうち１つは、上述のＩｇＧ抗体の第１の重鎖に結合するか、または融合し、上述のｓｃＦｖ分子のうち１つは、上述のＩｇＧ抗体の第２の重鎖に結合するか、または融合する。別の実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子が、上述のＩｇＧ抗体の第１および第２の重鎖のＮ末端に結合するか、または融合する。
【００４１】
ある実施形態では、上述のＩｇＧ抗体の軽鎖は、配列番号１３０のＧ１１軽鎖配列（ｐＸＷＵ１１８）を含み、上述の二重特異性抗体の重鎖は、配列番号１３３のアミノ酸配列（ｐＸＷＵ１３６）を含む。
【００４２】
ある実施形態では、上述の結合分子は、ＡＴＣＣ寄託番号ＸＸＸで寄託された細胞株によって産生される。
【００４３】
ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子は、上述のＩｇＧ抗体の上述の第１および第２の重鎖のＣ末端に結合するか、または融合し、上述の二重特異性抗体分子の重鎖を形成する。
【００４４】
ある実施形態では、ＩｇＧ抗体の軽鎖が、配列番号１３０のＧ１１軽鎖配列（ｐＸＷＵ１１８）を含み、上述のｓｃＦｖ分子は、上述の重鎖のＮ末端に結合する場合には、配列番号１３７のアミノ酸配列（ｐＸＷＵ１３５）を含む。
【００４５】
ある実施形態では、上述の結合分子は、ＡＴＣＣ寄託番号ＸＸＸで寄託された細胞株によって産生される。
【００４６】
ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子の片方または両方は、上述のＩｇＧ抗体の軽鎖に結合するか、または融合する。
【００４７】
ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子のうち１つは、上述のＩｇＧ抗体の第１の軽鎖に結合するか、または融合し、上述のｓｃＦｖ分子のうち１つは、上述のＩｇＧ抗体の第２の軽鎖に結合するか、または融合する。ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子は、上述のＩｇＧ抗体の第１および第２の軽鎖のＮ末端に結合するか、または融合する。
【００４８】
ある実施形態では、上述のアロステリックな結合部分は、ＩｇＧ抗体によって与えられ、上述の競合的な結合部分は、２個のｓｃＦｖ分子によって与えられ、この２個のｓｃＦｖ分子が、このＩｇＧ抗体に結合しているか、または融合している。
【００４９】
ある実施形態では、上述のＩｇＧ抗体は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体に由来する軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【００５０】
ある実施形態では、上述のＩｇＧ抗体のＶＬドメインは、配列番号７８のアミノ酸配列を含み、上述のＩｇＧ抗体のＶＨドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
【００５１】
ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子の片方または両方は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体に由来する軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む。
【００５２】
ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子の片方または両方は、安定化したＧ１１  ｓｃＦｖ分子であり、この分子のＴ５０が５０〜５１℃より大きい。ｓｃＦｖ分子の片方または両方が、安定化したｓｃＦｖ分子であり、この分子のＴ５０が、従来のＧ１１（ＶＬ／ＧＳ４／ＶＨ）ｓｃＦｖ分子（ｐＭＪＦ０６０）のＴ５０よりも少なくとも２℃〜１０℃高い。
【００５３】
ある実施形態では、Ｌ５０および／またはＶ８３（Ｋａｂａｔ付番による規則）のアミノ酸位置に１個以上の安定化する変異が存在しなければ、上述の安定化したｓｃＦｖの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体のＶＬドメイン（配列番号９３）と同一である。
【００５４】
ある実施形態では、上述の安定化する変異は、Ｌ５０Ｇ、Ｌ５０Ｍ、Ｌ５０ＮおよびＶ８３Ｅからなる群から選択される。
【００５５】
ある実施形態では、Ｅ６および／またはＳ４９（Ｋａｂａｔ付番による規則）のアミノ酸位置に、１個以上の安定化する変異が存在しなければ、上述の安定化したｓｃＦｖの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体（配列番号３２）のＶＨドメインと同一である。
【００５６】
ある実施形態では、上述の安定化する変異は、Ｅ６Ｑ、Ｓ４９ＡおよびＳ４９Ｇからなる群から選択される。
【００５７】
ある実施形態では、上述の安定化したｓｃＦｖ分子は、ＶＬ  Ｌ５０Ｎ：ＶＨ  Ｅ６Ｑという変異の組み合わせを含む。
【００５８】
ある実施形態では、上述の安定化したｓｃＦｖ分子は、ＶＬ  Ｖ８３Ｅ：ＶＨ  Ｅ６Ｑという変異の組み合わせを含む。
【００５９】
ある実施形態では、上述の安定化したｓｃＦｖ分子は、ＭＪＦ−０６０、ＭＪＦ−０８４、ＭＪＦ−０８５、ＭＪＦ−０８６、ＭＪＦ−０８７、ＭＪＦ−０９１、ＭＪＦ−０９２およびＭＪＦ−０９７からなる群から選択される、安定化したＧ１１  ｓｃＦｖ分子である。
【００６０】
ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子の片方または両方は、Ｇｌｙ／ＳｅｒリンカーによってＩｇＧ抗体に結合している。
【００６１】
ある実施形態では、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーまたはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーである。
【００６２】
ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子は、このｓｃＦｖ分子のＶＬドメインを介し、上述のＩｇＧ抗体に結合するか、または融合する。
【００６３】
ある実施形態では、ｓｃＦｖ分子の配向は、ＶＨ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカー→ＶＬであり、ｎが、３、４、５または６である。
【００６４】
ある実施形態では、ｓｃＦｖ分子は、このｓｃＦｖ分子のＶＨドメインを介し、上述のＩｇＧ抗体に結合するか、または融合する。
【００６５】
ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子の配向は、ＶＬ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカー→ＶＨであり、ｎが、３、４、５または６である。
【００６６】
ある実施形態では、ｓｃＦｖ分子の片方または両方が、上述のＩｇＧ抗体の重鎖に結合するか、または融合する。
【００６７】
ある実施形態では、ｓｃＦｖ分子のうち１つが、ＩｇＧ抗体の第１の重鎖に結合するか、または融合し、ｓｃＦｖ分子のうち１つが、ＩｇＧ抗体の第２の重鎖に結合するか、または融合する。
【００６８】
ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子は、上述のＩｇＧ抗体の第１および第２の重鎖のＮ末端に結合するか、または融合する。
【００６９】
ある実施形態では、ＩｇＧ抗体の軽鎖が、配列番号１４０のＣＯ６軽鎖配列を含み、ｓｃＦｖ分子が、この抗体の重鎖のＮ末端に結合する場合には、配列番号１４４の配列を含む。
【００７０】
ある実施形態では、上述の結合分子は、ＡＴＣＣ寄託番号ＸＸＸで寄託された細胞株によって産生される。
【００７１】
ある実施形態では、上述のｓｃＦｖ分子は、上述のＩｇＧ抗体の第１および第２の重鎖のＣ末端に結合するか、または融合する。
【００７２】
ある実施形態では、ＩｇＧ抗体の軽鎖は、配列番号１４０のＣＯ６軽鎖配列を含み、ｓｃＦｖ分子は、この抗体の重鎖のＮ末端に結合する場合には、配列番号１４４の配列を含む。上述の結合分子は、ＡＴＣＣ寄託番号ＸＸＸで寄託された細胞株によって産生される。
【００７３】
ある実施形態では、ｓｃＦｖ分子の片方または両方は、ＩｇＧ抗体の軽鎖に結合するか、または融合する。ある実施形態では、ｓｃＦｖ分子のうち１つは、ＩｇＧ抗体の第１の軽鎖に結合するか、または融合し、ｓｃＦｖ分子のうち１つは、ＩｇＧ抗体の第２の軽鎖に結合するか、または融合する。ある実施形態では、ｓｃＦｖ分子は、ＩｇＧ抗体の第１および第２の軽鎖のＮ末端に結合するか、または融合する。
【００７４】
ある実施形態では、ＩｇＧ抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプの重鎖定常ドメインを含む。別の実施形態では、ＩｇＧ抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプの重鎖定常ドメインを含む。
【００７５】
ある実施形態では、ＩｇＧ抗体は、２個以上のヒト抗体アイソタイプに由来する重鎖定常ドメインの一部分を有するキメラである。
【００７６】
ある実施形態では、ＩｇＧ抗体は、Ｆｃ領域を含み、このＦｃ領域の残基２３３〜２３６および３２７〜３３１（ＥＵ付番システム）は、ヒトＩｇＧ２抗体に由来し、Ｆｃ領域の残りの残基が、ヒトＩｇＧ４抗体に由来する。
【００７７】
ある実施形態では、ＩｇＧ抗体の重鎖定常領域にグリコシル化が無い。
【００７８】
ある実施形態では、ＩｇＧ抗体は、上述の全抗体のヒンジドメインにＳ２２８Ｐの変異部分を含み、および／または上述の全抗体のＣＨ２ドメインにＴ２９９Ａの変異部分を含み、この変異が、野生型ヒトＩｇＧ抗体に対するものである（ＥＵ付番システム）。
【００７９】
ある実施形態では、上述の結合分子は、商業的な規模で製造される場合、本質的に耐凝集性を有する。
【００８０】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、ＩＧＦ−１Ｒが介在する細胞増殖を阻害する。ある実施形態では、本発明の結合分子は、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する。ある実施形態では、本発明の結合分子は、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が介在するＡＫＴリン酸化を阻害する。ある実施形態では、本発明の結合分子は、ＡＫＴが介在する生存シグナル伝達を阻害する。ある実施形態では、本発明の結合分子は、インビボで腫瘍の成長を阻害する。ある実施形態では、本発明の結合分子は、ＩＧＦ−１Ｒの内在化を阻害する。
【００８１】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、細胞毒性薬、治療薬、細胞増殖抑制剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医用薬剤、リンホカイン、異種抗体またはそのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびこれらの薬剤の２種以上の組み合わせからなる群から選択される薬剤にコンジュゲートしている。
【００８２】
ある実施形態では、本発明の結合分子において、上述の細胞毒性薬は、放射性核種、生物毒素、酵素によって活性化する毒素、細胞増殖抑制性または細胞毒性性の治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、生体応答修飾物質、または上述の細胞毒性薬の２種以上の組み合わせからなる群から選択される。
【００８３】
ある実施形態では、本発明は、本発明の結合分子と、担体とに関する。
【００８４】
ある態様では、本発明は、本発明の結合分子を対象に投与して治療を行う工程を含む、過剰増殖性障害を患う対象を治療する方法に関する。
【００８５】
ある実施形態では、本発明の結合分子において、上述の過剰増殖性障害は、癌、新生物、腫瘍、悪性腫瘍、またはその転移からなる群から選択される。ある実施形態では、上述の過剰増殖性障害は、癌であり、癌が、肉腫、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、黒色腫、白血病、胃癌、脳癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、頭頸部癌、扁平上皮細胞癌、多発性骨髄腫、リンパ腫および白血病からなる群から選択される。
【００８６】
ある実施形態では、本発明は、本発明の結合分子またはその重鎖または軽鎖をコードする核酸分子に関する。ある実施形態では、核酸分子は、ベクター内にある。ある実施形態では、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。
【００８７】
ある実施形態では、本発明は、本発明の結合分子を製造する方法に関し、この方法は、上述の結合分子が、宿主細胞の培地中に分泌するように、本発明の宿主細胞を培養する工程と、（ｉｉ）上述の培地から上述の結合分子を単離する工程とを含む。
【００８８】
さらに別の態様では、本発明は、Ｔ５０が、従来のｓｃＦｖ分子のＴ５０よりも少なくとも２℃〜１０℃高い、安定化したｓｃＦｖ分子に関する。特定の実施形態では、本発明の安定化したｓｃＦｖ分子は、ＩＧＦ−１Ｒへの結合特異性を有する。
【００８９】
ある実施形態では、上述の分子のＴ５０は、５０℃よりも高い。別の実施形態では、上述の分子のＴ５０は、６０℃よりも高い。
別の態様では、本発明の分子は、従来のｓｃＦｖ分子と比較して、１個以上の安定化する変異を含み、この変異が、（ｉ）４、（ｉｉ）１１、（ｉｉｉ）１５、（ｉｖ）２０、（ｖ）２４、（ｖｉ）３０、（ｖｉｉ）４７、（ｖｉｉｉ）５０、（ｉｘ）５１、（ｘ）６３、（ｘｉ）７０、（ｘｉｉ）７２、（ｘｉｉｉ）７４、（ｘｉｖ）７７および（ｘｖ）８３（Ｋａｂａｔ付番による規則）からなるＶＬアミノ酸位置の群から選択されるＶＬのアミノ酸位置に存在する。
【００９０】
ある実施形態では、上述の安定化する変異は、４Ｌ、１１Ｇ、１５Ａ、１５Ｄ、１５Ｅ、１５Ｇ、１５Ｉ、１５Ｎ、１５Ｐ、１５Ｒ、１５Ｓ、２０Ｒ、２４Ｋ、３０Ｎ、３０Ｔ、３０Ｙ、５０Ｇ、５０Ｍ、５０Ｎ、５１Ｇ、６３Ｓ、７０Ｅ、７２Ｎ、７２Ｙ、７４Ｓ、７７Ｇ、８３Ｄ、８３Ｅ、８３Ｇ、８３Ｍ、８３Ｒ、８３Ｓおよび８３Ｖからなる群から選択される。
【００９１】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、従来のｓｃＦｖ分子と比較して、１個以上の安定化する変異を含み、この変異が、（ｉ）６、（ｉｉ）２１、（ｉｉｉ）４７、（ｉｖ）４９および（ｖ）１１０（Ｋａｂａｔ付番による規則）からなるＶＨアミノ酸位置の群から選択されるＶＨのアミノ酸位置に存在する。
【００９２】
ある実施形態では、上述の安定化する変異は、６Ｑ、２１Ｅ、４７Ｆ、４９Ａ、４９Ｇ、８３Ｋ、８３Ｔおよび１１０Ｖからなる群から選択される。
【００９３】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、従来のｓｃＦｖ分子と比較して、１個以上の安定化する変異を含み、この変異が、（ｉ）ＶＬのアミノ酸位置５０、（ｉｉ）ＶＬのアミノ酸位置８３、（ｉｉｉ）ＶＨのアミノ酸位置６および（ｉｖ）ＶＨのアミノ酸位置４９（Ｋａｂａｔ付番による規則）からなる群から選択されるアミノ酸位置に存在する。
【００９４】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、従来のｓｃＦｖ分子と比較して、安定化する変異を含み、この変異が、（ｉ）ＶＬのアミノ酸位置５０、（ｉｉ）ＶＬのアミノ酸位置８３、（ｉｉｉ）ＶＨのアミノ酸位置６および（ｉｖ）ＶＨのアミノ酸位置４９（Ｋａｂａｔ付番による規則）に存在する。
【００９５】
ある実施形態では、上述の安定化する変異は、ＶＬ  ５０Ｇ、ＶＬ  ５０Ｍ、ＶＬ  ５０Ｎ、ＶＬ  ８３Ｄ、ＶＬ  ８３Ｅ、ＶＬ  ８３Ｇ、ＶＬ  ８３Ｍ、ＶＬ  ８３Ｒ、ＶＬ  ８３Ｓ、ＶＬ  ８３Ｖ、ＶＨ  ６Ｑ、ＶＨ  ４９ＡおよびＶＨ  ４９Ｇからなる群から選択される。
【００９６】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、安定化したｓｃＦｖ分子のＴ５０が、従来のＣ０６  ｓｃＦｖ分子（ｐＷＸＵ０９２またはｐＷＸＵ０９０）のＴ５０よりも少なくとも２℃〜１０℃高い。
【００９７】
ある実施形態では、ＶＬドメインの（ｉ）Ｍ４、（ｉｉ）Ｌ１１、（ｉｉｉ）Ｖ１５、（ｉｖ）Ｔ２０、（ｖ）Ｑ２４、（ｖｉ）Ｒ３０、（ｖｉｉ）Ｔ４７、（ｖｉｉｉ）Ａ５１、（ｉｘ）Ｇ６３、（ｘ）Ｄ７０、（ｘｉ）Ｓ７２、（ｘｉｉ）Ｔ７４、（ｘｉｉｉ）Ｓ７７および（ｘｉｖ）Ｉ８３（Ｋａｂａｔ付番による規則）からなる群から選択されるアミノ酸位置に、１個以上の安定化する変異が存在しなければ、安定化したｓｃＦｖの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、Ｍ１３−ＣＯ６抗体のＶＬドメイン（配列番号７８）と同一である。
【００９８】
ある実施形態では、上述の安定化する変異は、Ｍ４Ｌ、Ｌ１１Ｇ、Ｖ１５Ａ、Ｖ１５Ｄ、Ｖ１５Ｅ、Ｖ１５Ｇ、Ｖ１５Ｉ、Ｖ１５Ｎ、Ｖ１５Ｐ、Ｖ１５Ｒ、Ｖ１５Ｓ、Ｔ２０Ｒ、Ｑ２４Ｋ、Ｒ３０Ｎ、Ｒ３０Ｔ、Ｒ３０Ｙ、Ａ５１Ｇ、Ｇ６３Ｓ、Ｄ７０Ｅ、Ｓ７２Ｎ、Ｓ７２Ｙ、Ｔ７４Ｓ、Ｓ７７Ｇ、Ｉ８３Ｄ、Ｉ８３Ｅ、Ｉ８３Ｇ、Ｉ８３Ｍ、Ｉ８３Ｒ、Ｉ８３ＳおよびＩ８３Ｖからなる群から選択される。
【００９９】
ある実施形態では、（ｉ）Ｓ２１、（ｉｉ）Ｗ４７、（ｉｉｉ）Ｒ８３および（ｉｖ）Ｔ１１０（Ｋａｂａｔ付番による規則）からなる群から選択されるアミノ酸位置に、１個以上の安定化する変異が存在しなければ、上述の安定化したｓｃＦｖの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、Ｍ１３−ＣＯ６抗体のＶＨドメイン（配列番号１４）と同一である。
【０１００】
ある実施形態では、上述の安定化する変異は、Ｓ２１Ｅ、Ｗ４７Ｆ、Ｒ８３Ｋ、Ｒ８３ＴおよびＴ１１０Ｖからなる群から選択される。ある実施形態では、上述の安定化したｓｃＦｖ分子は、ＶＬ  Ｌ１５Ｓ：ＶＨ  Ｔ１１０Ｖという変異の組み合わせを含む。ある実施形態では、上述の安定化したｓｃＦｖ分子は、ＶＬ  Ｓ７７Ｇ：ＶＬ  Ｉ８３Ｑという変異の組み合わせを含む。
【０１０１】
ある実施形態では、上述の安定化したｓｃＦｖ分子は、ＭＪＦ−０１４、ＭＪＦ−０１５、ＭＪＦ−０１６、ＭＪＦ−０１７、ＭＪＦ−０１８、ＭＪＦ−０１９、ＭＪＦ−０２０、ＭＪＦ−０２１、ＭＪＦ−０２２、ＭＪＦ−０２３、ＭＪＦ−０２４、ＭＪＦ−０２５、ＭＪＦ−０２６、ＭＪＦ−０２７、ＭＪＦ−０２８、ＭＪＦ−０２９、ＭＪＦ−０３０、ＭＪＦ−０３１、ＭＪＦ−０３２、ＭＪＦ−０３３、ＭＪＦ−０３４、ＭＪＦ−０３５、ＭＪＦ−０３６、ＭＪＦ−０３７、ＭＪＦ−０３８、ＭＪＦ−０３９、ＭＪＦ−０４０、ＭＪＦ−０４１、ＭＪＦ−０４２、ＭＪＦ−０４３、ＭＪＦ−０４４、ＭＪＦ−０４５、ＭＪＦ−０４６、ＭＪＦ−０４７、ＭＪＦ−０４８、ＭＪＦ−０４９、ＭＪＦ−０５０およびＭＪＦ−０５１からなる群から選択される、安定化したＣＯ６  ｓｃＦｖ分子である。
【０１０２】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、Ｔ５０が、従来のＧ１１（ＶＬ／ＧＳ４／ＶＨ）ｓｃＦｖ分子（ｐＭＪＦ０６０）よりも少なくとも２℃〜１０℃高い、安定化したｓｃＦｖ分子である。
【０１０３】
ある実施形態では、Ｌ５０および／またはＶ８３（Ｋａｂａｔ付番による規則）のアミノ酸位置に１個以上の安定化する変異が存在しなければ、上述の安定化したｓｃＦｖの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体のＶＬドメイン（配列番号９３）と同一である。
【０１０４】
ある実施形態では、上述の安定化する変異は、Ｌ５０Ｇ、Ｌ５０Ｍ、Ｌ５０ＮおよびＶ８３Ｅからなる群から選択される。
【０１０５】
ある実施形態では、Ｅ６および／またはＳ４９（Ｋａｂａｔ付番による規則）のアミノ酸位置に、１個以上の安定化する変異が存在しなければ、上述の安定化したｓｃＦｖの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体（配列番号３２）のＶＨドメインと同一である。
【０１０６】
ある実施形態では、上述の安定化する変異は、Ｅ６Ｑ、Ｓ４９ＡおよびＳ４９Ｇからなる群から選択される。
【０１０７】
ある実施形態では、上述の安定化したｓｃＦｖ分子は、ＶＬ  Ｌ５０Ｎ：ＶＨ  Ｅ６Ｑという変異の組み合わせを含む。ある実施形態では、上述の安定化したｓｃＦｖ分子は、ＶＬ  Ｖ８３Ｅ：ＶＨ  Ｅ６Ｑという変異の組み合わせを含む。
【０１０８】
ある実施形態では、上述の安定化したｓｃＦｖ分子は、ＭＪＦ−０６０、ＭＪＦ−０８４、ＭＪＦ−０８５、ＭＪＦ−０８６、ＭＪＦ−０８７、ＭＪＦ−０９１、ＭＪＦ−０９２およびＭＪＦ−０９７からなる群から選択される、安定化したＧ１１  ｓｃＦｖ分子である。
【０１０９】
ある実施形態では、本発明は、本発明の安定化したｓｃＦｖ分子を含む多価結合分子に関する。
【０１１０】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、商業的な規模で製造される場合、本質的に凝集物を含まない。
【０１１１】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、バッファ系（例えばＰＢＳ）で少なくとも３ヶ月間インキュベートした後、本質的に凝集物を含まない。
【０１１２】
ある実施形態では、本発明の結合分子の融解温度（Ｔｍ）は、少なくとも６０℃である。
【０１１３】
別の態様では、本発明は、本発明の安定化したｓｃＦｖ分子を、抗体分子の軽鎖または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に遺伝的に融合させる工程を含む、安定化した多価結合分子を製造する方法に関する。
【０１１４】
ある態様では、本発明は、本発明の安定化したｓｃＦｖ分子または本発明の多価結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
【０１１５】
ある実施形態では、本発明は、安定化した結合分子が製造されるような条件下で、本発明の宿主細胞を培養する工程を含む、安定化した結合分子を製造する方法に関する。
【０１１６】
ある実施形態では、宿主細胞を商業的な規模（例えば５０Ｌ）で培養し、上述の宿主細胞の培地１Ｌあたり、上述の安定化した結合分子が少なくとも５ｍｇ製造される。
【０１１７】
ある実施形態では、宿主細胞を商業的な規模（例えば５０Ｌ）で培養し、上述の宿主細胞の培地１Ｌあたり、上述の安定化した結合分子が少なくとも５０ｍｇ製造される。
【０１１８】
ある実施形態では、宿主細胞を商業的な規模で培養し、凝集物の形態で存在する上述の結合分子が１０％以下である。
【０１１９】
さらに別の態様では、本発明は、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子に関し、この多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子が、（ａ）第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、（ｂ）上述の第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分とを含み、上述の多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）上述の第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）上述の第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）上述の第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒが介在するインビトロでの腫瘍細胞の成長を阻害する。
【０１２０】
さらに別の態様では、本発明は、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子に関し、この多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子が、第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、上述の第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分とを含み、上述の多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）上述の第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）上述の第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）上述の第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒが介在するインビボでの腫瘍細胞の成長を阻害する。
【０１２１】
さらに別の態様では、本発明は、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子に関し、この多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子が、第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、上述の第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分とを含み、上述の多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）上述の第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）上述の第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）上述の第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達をブロックする。
【０１２２】
さらに別の態様では、本発明は、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子に関し、この多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子が、第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、上述の第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分とを含み、（ｉ）上述の第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）上述の第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）上述の第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い親和性で、ＩＧＦ−１Ｒに対して結合する。
【０１２３】
さらに別の態様では、本発明は、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子に関し、この多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子が、第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、上述の第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分とを含み、上述の多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）上述の第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）上述の第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）上述の第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする。
【０１２４】
さらに別の態様では、本発明は、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子に関し、この多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子が、第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、上述の第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分とを含み、（ｉ）上述の第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）上述の第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）上述の第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも、血清での半減期が長い。
【０１２５】
さらに別の態様では、本発明は、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子に関し、この多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子が、第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、上述の第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分とを含み、上述の多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）上述の第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）上述の第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）上述の第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害する。
【０１２６】
さらに別の態様では、本発明は、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子に関し、この多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子が、第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、上述の第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分とを含み、上述の多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）上述の第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）上述の第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）上述の第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が介在するＡＫＴリン酸化および／またはＭＡＰＫリン酸化を阻害する。
【０１２７】
さらに別の態様では、本発明は、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子に関し、この多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子が、第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、上述の第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分とを含み、（ｉ）上述の第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）上述の第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）上述の第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒ受容体に交差選択的に結合する。
【０１２８】
さらに別の態様では、本発明は、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子に関し、この多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子が、第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、上述の第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分とを含み、上述の多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）上述の第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）上述の第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）上述の第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒ受容体の内在化を誘発する。
【０１２９】
さらに別の態様では、本発明は、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子に関し、この多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子が、第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、上述の第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分とを含み、上述の多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）上述の第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）上述の第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）上述の第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、腫瘍細胞の周期の停止を誘発する。
【０１３０】
さらに別の態様では、本発明は、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子に関し、この多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子が、第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部分と、上述の第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープとは重複しない第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する、少なくとも１つの第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分とを含み、上述の多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、（ｉ）上述の第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、（ｉｉ）上述の第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子、または（ｉｉｉ）上述の第１の単一特異性結合分子および第２の単一特異性結合分子の組み合わせよりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒが介在する腫瘍細胞の成長を阻害する。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】ＩＧＦ−１Ｒの構造模式図。ＦｎＩＩＩ−２ドメインは、ジグザグ線で示されるように、タンパク質分解によってインビボで処理されるループ構造を含む。膜貫通領域は、図のリン脂質の二層を貫通するらせんループとして示されている。ＩＧＦ−１Ｒ内にあるＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合位置は、星印で示されている。それぞれのＩＧＦ−１Ｒヘテロダイマー分子に、１つのみのＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２分子が結合することが示されている。
【図２】ＩＧＦ−１Ｒの成熟ポリペプチド配列（配列番号２）。
【図３】Ｍ１３−Ｃ０６の元々の改変されていないＶＨ領域およびＶＬ領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。（ａ）（配列番号１３）は、Ｍ１３−Ｃ０６のＶＨ領域の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（ｂ）（配列番号７７）は、Ｍ１３−Ｃ０６のＶＬ領域の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（ｃ）（配列番号１４）は、Ｍ１３−Ｃ０６のＶＨ領域のアミノ酸配列を示す。（ｄ）（配列番号７８）は、Ｍ１３−Ｃ０６のＶＬ領域のアミノ酸配列を示す。
【図４】Ｍ１３−Ｃ０６の最適化されたＶＨ領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。（ａ）（配列番号１８）は、Ｍ１３−Ｃ０６の配列が最適化されたＶＨ領域の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（ｂ）（配列番号１４）は、Ｍ１３−Ｃ０６の最適化されたＶＨ領域のアミノ酸配列を示す。
【図５】Ｍ１４−Ｃ０３の元々の改変されていないＶＨ領域およびＶＬ領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。（ａ）（配列番号２５）は、Ｍ１４−Ｃ０３の重鎖可変領域（ＶＨ）の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（ｂ）（配列番号８７）は、Ｍ１４−Ｃ０３の軽鎖可変領域（ＶＬ）の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（ｃ）（配列番号２６）は、Ｍ１４−Ｃ０３の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を示す。（ｄ）（配列番号８８）は、Ｍ１４−Ｃ０３の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を示す。
【図６】Ｍ１４−Ｃ０３の最適化されたＶＨ領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。（ａ）（配列番号３０）は、Ｍ１４−Ｃ０３の配列が最適化されたＶＨ領域の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（ｂ）（配列番号２６）は、Ｍ１４−Ｃ０３の配列が最適化されたＶＨ領域のアミノ酸配列を示す。
【図７】Ｍ１４−Ｇ１１の元々の改変されていないＶＨ領域およびＶＬ領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。（ａ）（配列番号３１）は、Ｍ１４−Ｇ１１の重鎖可変領域（ＶＨ）の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（ｂ）（配列番号９２）は、Ｍ１４−Ｇ１１の軽鎖可変領域（ＶＬ）の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（ｃ）（配列番号３２）は、Ｍ１４−Ｇ１１の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を示す。（ｄ）（配列番号９３）は、Ｍ１４−Ｇ１１の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を示す。
【図８】Ｍ１４−Ｇ１１の最適化された重鎖可変領域（ＶＨ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。（ａ）（配列番号３６）は、Ｍ１４−Ｇ１１の最適化されたＶＨ領域の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（ｂ）（配列番号３２）は、Ｍ１４−Ｇ１１の配列が最適化されたＶＨ領域のアミノ酸配列を示す。
【図９】Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２の改変されていないＶＨ領域およびＶＬ領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。（ａ）（配列番号６２）は、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２のＶＨ領域の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（ｂ）（配列番号１１７）は、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２のＶＬ領域の単鎖ＤＮＡ配列を示す。（ｃ）（配列番号６３）は、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２のＶＨ領域のアミノ酸配列を示す。（ｄ）（配列番号１１８）は、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２のＶＬ領域のアミノ酸配列を示す。
【図１０】本発明の結合分子で使用する、定常ドメインのアミノ酸配列。（ａ）（配列番号１）は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。（ｂ）（配列番号１２２）は、重鎖ａｇｌｙ．ＩｇＧ４．Ｐ定常領域のアミノ酸配列を示す。
【図１１】ＩＧＦ−１Ｒ抗体が結合するエピトープの交差競合分析。＋＋＋＋＋  ＝  自身に対する抗体結合競争率（９０〜１００％）、＋＋＋＋  ＝  競争率７０〜９０％、＋＋＋  ＝  競争率５０〜７０％、＋＋  ＝  競争率３０〜５０％、＋  ＝  競争率１０〜３０％、＋／−  ＝  競争率０〜１０％、Ｎ／Ａ  ＝  結果は得られていない。
【図１２】ＳＰＲアッセイにおける、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに結合するＭ１３．Ｃ０６抗体の例（図１２Ａ）、およびｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃコントロールに結合するＭ１３．Ｃ０６抗体の例（図１２Ｂ）を、ＩＧＦ−１Ｒ変異タンパク質ＳＤ００６に対する抗体の結合（図１２Ｃ；結合ポジティブ）、およびＳＤ０１５に対する抗体の結合（図１２Ｄ；結合ネガティブ）と比較した。
【図１３】ＳＰＲに基づく競合アッセイにおいて、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｇ１１は、お互いに交差的にブロックしない。可溶性のＭ１４−Ｇ１１およびＭ１３−Ｃ０６を、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ溶液に滴定した後、固定したＭ１３−Ｃ０６（図１３Ａ）または固定したＭ１４−Ｇ１１（図１３Ｂ）を含有するセンサーチップ表面に注入した。（ａ）ＩＧＦ−１存在下、および（ｂ）ＩＧＦ−２存在下、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｇ１１のセンサーチップ表面にＩＧＦ−１Ｒが結合する際のＳＰＲシグナルの低下を、それぞれ図１３Ｃおよび図１３Ｄに示している。
【図１４】Ｍ１３−Ｃ０６抗体、Ｍ１４−Ｃ０３抗体、Ｍ１４−Ｇ１１抗体、Ｐ１Ｅ２および／またはαＩＲ３抗体による、ビオチン化ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するヒトＩＧＦ−１  Ｈｉｓの結合阻害（図１４Ａ）またはヒトＩＧＦ−２  Ｈｉｓの結合阻害（図１４Ｂ）。
【図１５】ヒトＩＧＦ−１  Ｈｉｓがビオチン化ｈＩＧＦ−１Ｒに結合するのを検出するＥＬＩＳＡアッセイ（図１５Ａ；ヒトＩＧＦ−１  Ｈｉｓを、ＰＢＳＴで段階的に希釈し（丸）、２μＭのＭ１３−Ｃ０６を含有するＰＢＳＴで段階的に希釈する（四角）、および１個のモノクローナル抗体と比較した場合の、抗体の組み合わせのＩＧＦ−１（図１５Ｂ）またはＩＧＦ−２（図１５Ｃ）のブロック性能。
【図１６】変異がＭ１３−Ｃ０６のｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃへの結合に影響を与えた残基は、相同性ＩＲ細胞外領域の構造にマッピングされた。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基４１５、４２７、４６８、４７８および５３２の変異は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体の結合性に検出可能なほどの影響を与えなかった。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基４６６、４６７、５３３、５６４および５６５の変異は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体の結合性をわずかに低下させる影響を与えた。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基４５９、４６０、４６１、４６２、４６４、４８２、４８３、４９０、５７０および５７１の変異は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体の結合性を強く低下させる影響を与えた。変異分析の結果の集計は、表７を参照。
【図１７】変異がＭ１４−Ｇ１１のｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃへの結合に影響を与える残基は、ヒトＩＧＦ−１Ｒの最初の３つの細胞外領域にマッピングされた。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基２８、２２７、２３７、２８５、２８６、３０１、３２７および４１２の変異は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体の結合に検出可能なレベルの影響を与えなかった。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基２５７、２５９、２６０、２６３および２６５の変異は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体の結合を少し低下させる影響を与えた。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基２５４の変異は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体の結合を中程度に低下させた。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基２４８および２５０の変異は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体の結合を強力に低下させた。変異分析の結果の集計は、表７を参照。
【図１８】変異がαＩＲ３およびＰ１Ｅ２のｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃへの結合に影響を与える残基は、ヒトＩＧＦ−１Ｒの最初の３つの細胞外領域にマッピングされた。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基２８、２２７、２３７、２８５、２８６、３０１、３２７および４１２の変異は、抗体の結合に検出可能なレベルの影響を与えなかった。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基２５７、２６３、３０１、３０３、３０８、３２７および３８９の変異は、抗体の結合を少しだけ低下させた。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基２４８および２５４は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体の結合を中程度に低下させた。ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基２６５の変異は、抗体の結合を強力に低下させた。変異分析の結果の集計は、表７を参照。
【図１９】相乗効果による抗ＩＧＦ−１Ｒ阻害のモデル。１個のエピトープの場合（ＢおよびＣ）と比較して、複数のエピトープ（Ｄ）に個々の抗体が結合することによって、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が介在するシグナル伝達が相乗効果によって阻害される。
【図２０】別個のＩＧＦ−１Ｒエピトープの標的化を組み合わせ、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２によって刺激される腫瘍細胞の成長阻害率の増加。等モル量のＣ０６抗体およびＧ１１抗体（１００、１０および１ｎＭ（図２０Ａ）および１ｕＭ〜０．１５ｎＭ（図２０Ｂ））を用い、血清を含まない条件下で、ＢＸＰＣ３細胞の成長阻害率の増加がみられた。ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２を追加した１０％血清中で、Ｈ３２２Ｍ細胞の成長阻害率の増加もみられた（図２０Ｃ）。
【図２１】第１の結合特異性を有するｓｃＦｖ分子が、異なる結合特異性を有する二価ＩｇＧ抗体に融合したものを含む、本発明の四価二重特異性結合分子の例。二重特異性結合分子を作成するために、ｓｃＦｖ分子を、二価抗体の重鎖のＣ末端、または軽鎖または重鎖のＮ末端に結合させるか、または融合させることができる。好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ分子は、安定化した分子である。
【図２２】本発明の二重特異性結合分子例が結合した後の、相乗効果による抗ＩＧＦ−１Ｒ阻害モデル。二重特異性抗体が、複数のエピトープ（Ｂ）に結合すると、１個のエピトープに結合する場合（Ａ）と比較して、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が介在するシグナル伝達を相乗効果によって阻害する。
【図２３】ＩｇＧ様Ｎ−二重特異性抗体およびＣ−二重特異性抗体の模式図。安定になるように遺伝子操作された抗Ｅｐ−１  ｓｃＦｖは、それぞれ２５アミノ酸または１６アミノ酸の可とう性Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーを用いて、全長重鎖のアミノ末端またはカルボキシル末端に遺伝的に接続している。全長抗体は、Ｅｐ−２に対して特異性を有する。好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ分子の少なくとも１つが、安定化したｓｃＦｖ分子である。特定の実施形態では、ｓｃＦｖ分子は、抗体の重鎖のＣ末端またはＮ末端、または抗体の軽鎖のＮ末端に融合しているか、または結合していてもよい。Ｅｐ＝エピトープ。
【図２４】図２４のＡ〜Ｄは、実施例１で説明する、Ｃ０６  ｓｃＦｖのアセンブリに使用する工程およびＰＣＲ産物の模式図。
【図２５】従来のＣ０６（ＶＬ／ＧＳ３ＶＨ）ｓｃＦｖ（ｐＸＷＵ０９２）の単鎖ＤＮＡ配列（配列番号１２３、図２５Ａ）およびアミノ酸配列（配列番号１２４、図２５Ｂ）。精製しやすくするために、ＭｙｃタグおよびＨｉｓタグの配列ＤＤＤＫＳＦＬＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＳＡＶＤＨＨＨＨＨＨを、ｓｃＦｖのＣ末端に付け加えた。
【図２６】従来のＣ０６（ＶＨ／ＧＳ３／ＶＬ）ｓｃＦｖ（ｐＸＷＵ０９０）の単鎖ＤＮＡ配列（配列番号１２５、図２６Ａ）およびアミノ酸配列（配列番号１２６、図２６Ｂ）。精製しやすくするために、ＭｙｃタグおよびＨｉｓタグの配列ＤＤＤＫＳＦＬＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＳＡＶＤＨＨＨＨＨＨＨを、ｓｃＦｖのＣ末端に付け加えた。
【図２７】熱攻撃アッセイの結果。ここで、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを含有する従来のＣ０６（ＶＨ／ＧＳ３／ＶＬ）ｓｃＦｖ（●）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーを含有する従来のＣ０６（ＶＨ／ＧＳ４／ＶＬ）ｓｃＦｖ（○）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを含有する従来のＣ０６（ＶＬ／ＧＳ３／ＶＨ）ｓｃＦｖ（■）、および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーを含有する従来のＣ０６（ＶＬ／ＧＳ４／ＶＨ）ｓｃＦｖ（□）の熱安定性を比較する。ｓｃＦｖ分子の５０％が、ＩＧＦ−１Ｒに対する結合活性を保持している温度（℃）（Ｔ５０）を図に示す。
【図２８】安定化した抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｃ０６（Ｉ８３Ｅ）ｓｃＦｖの単鎖ＤＮＡ配列（配列番号１２７、図２８Ａ）およびアミノ酸配列（配列番号１２８、図２８Ｂ）。精製しやすくするために、ＭｙｃタグおよびＨｉｓタグの配列ＤＤＤＫＳＦＬＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＳＡＶＤＨＨＨＨＨＨを、ｓｃＦｖのＣ末端に付け加えた。
【図２９】抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｇ１１軽鎖の単鎖ＤＮＡ配列（配列番号１２９、図２９Ａ）およびアミノ酸配列（配列番号１３０、図２９Ｂ）。図２９Ａにイタリック文字で示した配列は、シグナルペプチドＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ（配列番号１３１）をコードするＤＮＡ配列を示す。
【図３０】Ｎ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（ｐＸＷＵ１３６）の重鎖の単鎖ＤＮＡ配列（配列番号１３２、図３０Ａ）およびアミノ酸配列（配列番号１３３、図３０Ｂ）。図３０Ａにイタリック文字で示した配列は、シグナルペプチドＭＧＷＳＬＩＬＬＦＬＶＡＶＡＴＲＶＬＳ（配列番号１３４）をコードするＤＮＡ配列を示す。安定になるように遺伝子操作された抗ＩＧＦ−１Ｒ  ｓｃＦｖ（ＭＪＦ−０４５）は、ＶＬ→ＶＨの配向で示され、（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）４（配列番号１３５）リンカーを介し、抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｇ１１重鎖のＮ末端に付け加えられている。
【図３１】Ｃ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（ｐＸＷＵ１３５）の重鎖の単鎖ＤＮＡ配列（配列番号１３６、図３１Ａ）およびアミノ酸配列（配列番号１３７、図３１Ｂ）。図３１Ａにイタリック文字で示した配列は、シグナルペプチドＭＧＷＳＬＩＬＬＦＬＶＡＶＡＴＲＶＬＳ（配列番号１３４）をコードするＤＮＡ配列を示す。安定になるように遺伝子操作された抗ＩＧＦ−１Ｒ  ｓｃＦｖ（ＭＪＦ−０４５）は、配向がＶＬ→ＶＨであることが示され、Ｓｅｒ（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３（配列番号１３８）リンカーを介し、抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｇ１１重鎖のＣ末端に付け加えられている。
【図３２】抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｃ０６軽鎖の単鎖ＤＮＡ配列（配列番号１３９、図３２Ａ）およびアミノ酸配列（配列番号１４０、図３２Ｂ）。図３２Ａにイタリック文字で示した配列は、シグナルペプチドＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ（配列番号１３１）をコードするＤＮＡ配列を示す。
【図３３】Ｎ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の重鎖の単鎖ＤＮＡ配列（配列番号１４１、図３３Ａ）およびアミノ酸配列（配列番号１４２、図３３Ｂ）。図３３Ａにイタリック文字で示した配列は、シグナルペプチドＭＧＷＳＬＩＬＬＦＬＶＡＶＡＴＲＶＬＳ（配列番号１３４）をコードするＤＮＡ配列を示す。抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｇ１１  ｓｃＦｖは、配向がＶＬ→ＶＨであることが示され、（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）４（配列番号１３５）リンカーを介し、抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｃ０６重鎖のＮ末端に付け加えられている。
【図３４】Ｃ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の重鎖の単鎖ＤＮＡ配列（配列番号１４３、図３４Ａ）およびアミノ酸配列（配列番号１４４、図３４Ｂ）。図３４Ａにイタリック文字で示した配列は、シグナルペプチドＭＧＷＳＬＩＬＬＦＬＶＡＶＡＴＲＶＬＳ（配列番号１３４）をコードするＤＮＡ配列を示す。抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｇ１１  ｓｃＦｖは、ＶＬ→ＶＨの配向で示され、Ｓｅｒ（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）３（配列番号１３８）リンカーを介し、抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｃ０６重鎖のＣ末端に付け加えられている。
【図３５】安定した遺伝子操作が行われたＣ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（ｐＸＷＵ１３５／ｐＸＷＵ１１８）の精製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図３５Ａ）および分析ＳＥＣ溶出プロフィールの分析結果（図３５Ｂ）。
【図３６】安定した遺伝子操作が行われたＮ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（ｐＸＷＵ１３６／ｐＸＷＵ１１８）の精製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図３６Ａ）および分析ＳＥＣ溶出プロフィールの分析結果（図３６Ｂ）。
【図３７】Ｎ末端抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体と呼ぶ）の模式図。ｓｃＦｖは、Ｃ０６  ＭＡｂに由来し、ＩｇＧ１抗体は、Ｇ１１抗体に由来していた。
【図３８】Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の分析結果。Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体のタンパク質精製物（図３８Ａ）およびＣ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体のタンパク質精製物（図３８Ｂ）を、非還元条件下および還元条件下で、４〜２０％  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘ（Ｒ）Ｇｅｌ中で処理した。Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１ＲおよびＣ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ（各３０μｇ）を、分析用ＳＥＣカラムに通した（図３８Ｃ）。タンパク質の分子量標準に基づき、約２００ｋＤａの予想分子量でＢｓＡｂが溶出した。
【図３９】Ｎ末端二重特異性抗体およびＣ末端二重特異性抗体およびＧ１１  ＩｇＧ１コントロール抗体の１０℃での近紫外線（図３９Ａ）および遠紫外線（図３９Ｂ）のＣＤスペクトル、およびＤＳＣスキャン結果（図３９Ｃ）。近紫外ＣＤ領域では非常に感度が低いため、信号対雑音比および電位ドリフト（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｄｒｉｆｔ）を理解し、タンパク質ではない第２のＰＢＳベースラインを測定し、第１のＰＢＳベースラインを用いて補正し、プロットして示した（図３９Ａおよび図３９Ｂ）。Ｇ１１  ＩｇＧ１は、ヒトＩｇＧ１で一般的な、伝統的な３つの遷移状態を示した。Ｎ末端ＢｓＡｂおよびＣ末端ＢｓＡｂも、ＣＨ２、ＣＨ３およびＦａｂドメインの３つの遷移状態を示し、さらに、安定化したＣ０６  ｓｃＦｖドメインのアンフォールディングから生じる、さらに１つの遷移状態を示す。
【図４０】ＩＴＣによって、Ｃ０６抗体およびＧ１１抗体、ならびにＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに一緒に取り込まれる能力を示す（図４０Ａ）。図４０Ａ：Ｃ０６  ＭＡｂを最初に注入し、その後にＧ１１  ＭＡｂを注入した場合の、ＩＴＣセルでの熱容量の生データプロット。図４０Ｂ：図４０Ａの生データを、ＭＡｂ滴定の結合エンタルピーに変換したもの。図４０Ｃ：Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（上側）およびＣ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体をｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）を含有する溶液にして注入した場合の、ＩＴＣセルでの熱容量の生データプロット。図４０Ｄ。図４０Ｃの生データを、ＢｓＡｂ滴定の結合エンタルピーに変換したもの。
【図４１】ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）と、Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体との間の平衡状態での溶液結合実験。この実験で、Ｃ０６およびＧ１１のＭＡｂおよびＦａｂをコントロールとして使用した。図４１Ａ：Ｃ０６を捕捉試薬として用いた、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００での溶液結合実験。図４１Ｂ：Ｇ１１を捕捉試薬として用いた、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００での溶液結合実験。
【図４２】抗体Ｃ０６およびＧ１１、Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を用いた、ＩＧＦ−１ＲリガンドのブロッキングＥＬＩＳＡ。図４２Ａ：ＩＧＦ−１のブロッキングＥＬＩＳＡ。図４２Ｂ：ＩＧＦ−２のブロッキングＥＬＩＳＡ。
【図４３】阻害性抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体であるＣ０６およびＧ１１が、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２をアロステリックにブロックする性質および競合的にブロックする性質の区別。図４３Ａ：競合的な阻害剤であるＧ１１を、種々のＩＧＦ−１濃度でＩＧＦ−１ブロックアッセイに加えた結果。図４３Ｂ：アロステリックな阻害剤であるＣ０６を、種々のＩＧＦ−１濃度でＩＧＦ−１ブロックアッセイに加えた結果。
【図４４】阻害ＥＬＩＳＡアッセイを用いた、複数のＩＧＦ−１濃度およびＩＧＦ−２濃度で、Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体のリガンドブロック性。図４４Ａ：Ｃ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を用いた、ＩＧＦ−１のブロッキング。図４４Ｂ：Ｃ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を用いた、ＩＧＦ−２のブロッキング。図４４Ｃ．Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を用いた、ＩＧＦ−１のブロッキング。図４４Ｄ．Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を用いた、ＩＧＦ−２のブロッキング。
【図４５】ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）と、Ｃ０６およびＧ１１のＭＡｂとから形成される複合体（図４５Ａ）またはＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（図４５Ｂ）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および静的光散乱法による、分子量の決定。
【図４６】Ｈ３２２Ｍ  ＮＳＣＬＣ細胞において、ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害し（図４６Ａ）、２４時間でＩＧＦ−１Ｒの分解を誘発する（図４６Ｂ）。
【図４７】ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、２４時間でＩＧＦ−１Ｒの内在化を誘発し（図４７Ａ）、ｐ−ＥＲＫを阻害する（図４７Ｂ）。
【図４８】ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、Ｈ３２２Ｍ  ＮＳＣＬＣ細胞（図４８Ａ）、Ａ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞（図４８Ｂ）、およびＢｘＰＣ３細胞（図４８Ｃ）において、ｐ−ＡＫＴを阻害する。
【図４９】ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、無血清培地（ＳＦＭ）において、ＩＧＦによる以下の細胞の成長を阻害する。ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞（図４９Ａ）、Ｈ３２２Ｍ  ＮＳＣＬＣ細胞（図４９Ｂ）、Ａ４３１癌細胞（図４９Ｃ）、およびＡ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞（図４９Ｄ）。
【図５０】ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、１０％ＦＢＳにおいて、ＩＧＦによる以下の細胞の成長を阻害する。ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞（図５０Ａ）、Ａ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞（図５０Ｂ）、ＳＪＳＡ−１骨肉腫細胞（図５０Ｃ）、およびＨＴ−２９直腸癌細胞（図５０Ｄ）。
【図５１】ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、１０％ＦＢＳにおいて、血清による以下の細胞成長を阻害する。Ａ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞（図５１Ａ）およびＨ３２２Ｍ  ＮＳＣＬＣ細胞（図５１Ｂ）。
【図５２】ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、ＩＧＦによって誘発されるＢｘＰＣ３膵臓癌細胞の細胞周期を阻害する。ＩＧＦ刺激なし（図５２Ａ）または１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２（図５２Ｂ）を加えた状態。
【図５３】ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、ＡＤＣＣ活性を誘発しない（図５３Ａ）が、Ａ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞のコロニー形成を阻害する（図５３Ｂ）。
【図５４】骨肉腫ＳＪＳＡ−１モデルにおいて、Ｃ０６およびＧ１１を組み合わせると、腫瘍成長の阻害度が高まった。
【図５５】Ｈ３２２Ｍ非小細胞肺癌細胞株に対する抗体の結合の、細胞によるフローサイトメトリー分析。抗−ヒトＦａｂ抗体（図５５Ａ）または抗−ヒトＦｃｇａｍｍａ抗体（図５５Ｂ）のいずれかを、抗体の結合を検出するためのＰＥコンジュゲート型の第２の試薬として用い、フローサイトメトリーを行った。
【図５６】１回腹膜内（ＩＰ）投与をした後の、腫瘍を有していないメスＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスにおける、Ｃ０６、Ｇ１１、Ｃ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（図５６Ａ）およびＮ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（図５６Ｂ）の血清濃度−時間プロフィール。
【図５７】ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）と、血清から希釈したＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体との平衡状態での溶液結合実験。図５７Ａおよび図５７Ｂは、Ｃ０６  ＭＡｂを捕捉試薬として用い、血清から希釈したＣ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（図５７Ａ）またはＮ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（図５７Ｂ）を用いた溶液結合実験を示す。図５７Ｃおよび図５７Ｄは、Ｇ１１  ＭＡｂを捕捉試薬として用い、ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（図５７Ａ）またはＮ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（図５７Ｂ）を用いた溶液結合実験を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１３２】
Ｉ．  （Ｉ．定義）
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つ以上の物体を指すことを注記しておく。例えば、「（１つの）ＩＧＦ−１Ｒ抗体」は、１つ以上のＩＧＦ−１Ｒ抗体をあらわすと理解される。このように、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上の」「少なくとも１つの」は、本明細書では同じ意味で使用することができる。
【０１３３】
本明細書で使用するとき、用語「結合分子」は、目的の標的分子（例えば抗原）に結合する（例えば、特異的に結合するか、または選択的に結合する）分子を指す。特定の実施形態では、本発明の結合分子は、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する結合部位を含む、ポリペプチドである。本発明の範囲内にある結合分子としては、小分子、核酸、ペプチド、ペプチド模倣物、デンドリマー、および本明細書に記載のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する他の分子が挙げられる。他の実施形態では、本発明の結合分子は、ポリペプチド、小分子、核酸、ペプチド、ペプチド模倣物、デンドリマー、またはＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する他の分子である結合部分を含む。
【０１３４】
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」は、１種類の「ポリペプチド」並びに複数の「ポリペプチド」（例えば、ダイマーポリペプチドまたはマルチマーポリペプチドの場合）も含むことを意味しており、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）で直線状に結合したモノマー（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２個以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指すものではない。したがって、２個以上のアミノ酸の１つ以上の鎖を指すために用いる、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれる。用語「ポリペプチド」を、これらの用語の代わりに用いてもよいし、同じ意味で用いてもよい。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドを発現後に改変（限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基の誘導体化、タンパク質分解による開裂、または非天然アミノ酸による改変）した産物も指している。ポリペプチドは、天然の生物供給源に由来するものであってもよく、組み換え技術によって産生してもよいが、設計した核酸配列から翻訳する必要はない。化学合成を含む任意の様式でポリペプチドを作成することができる。
【０１３５】
本発明のポリペプチドは、アミノ酸数が約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、または２，０００以上であってもよい。ポリペプチドは、特定の三次元構造を有していてもよいが、必ずしもその構造を有していなくてもよい。特定の三次元構造を有するポリペプチドは、折りたたみ構造と呼ばれ、特定の三次元構造をとらず、異なるさまざまな配置をとるポリペプチドは、ほどけた構造と呼ばれる。本明細書で使用するとき、糖タンパク質という用語は、少なくとも１個の炭水化物部分に連結したタンパク質を指し、その炭水化物部分は、アミノ酸残基（例えば、セリン残基またはアスパラギン残基）の酸素または窒素を含有する側鎖を介してそのタンパク質と結合する。
【０１３６】
ポリペプチドまたはフラグメント、改変体、またはその誘導体の「単離物」は、自然環境に存在しないポリペプチドを指す。特定の精製レベルが必要とされるわけではない。例えば、ポリペプチドの単離物は、元々の環境または天然環境から取り出されてもよい。宿主細胞で発現する、組み換えによって産生したポリペプチドおよびタンパク質は、任意の好適な技術によって分離され、分画され、または部分的または実質的に精製された天然ポリペプチドまたは組み換えポリペプチドと同様に、本発明では単離されたものであると考える。好ましくは、本発明のポリペプチドは、単離されている。
【０１３７】
本明細書で使用するとき、所定のタンパク質「に由来する」という用語は、ポリペプチドの起源が何であるかを示す。ある実施形態では、特定のポリペプチド原料に由来するポリペプチドまたはアミノ酸の配列は、可変領域の配列（例えば、ＶＨまたはＶＬ）であるか、これに関連する配列（例えば、ＣＤＲ領域またはフレームワーク領域）である。ある実施形態では、特定のポリペプチド原料に由来するアミノ酸配列は、連続していない。例えば、ある実施形態では、１個、２個、３個、４個、５個または６個のＣＤＲが、１つの抗体原料に由来する。ある実施形態では、特定のポリペプチド原料またはアミノ酸配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、原料の配列またはその一部分と本質的に同じアミノ酸配列を有する。この一部分は、少なくとも３〜５アミノ酸、５〜１０アミノ酸、少なくとも１０〜２０アミノ酸、少なくとも２０〜３０アミノ酸、または少なくとも３０〜５０アミノ酸で構成されているか、または当業者が、他の方法を用いて、原料の配列に由来することを確認可能である。
【０１３８】
上述のポリペプチドのフラグメント、誘導体、類似体または改変体、およびこれらの任意の組み合わせも、本発明のポリペプチドに含まれる。本発明の結合分子を指す場合、用語「フラグメント」、「改変体」、「誘導体」および「類似体」には、対応する分子の結合性を少なくともいくらか保持した任意のポリペプチドが含まれる。本発明のポリペプチドのフラグメントとしては、本明細書の他の部分で記載される特定の抗体フラグメント以外にも、タンパク質分解フラグメント、欠失フラグメントが挙げられる。本発明の結合分子の改変体としては、上述のフラグメントが挙げられ、アミノ酸の置換、欠失または挿入によってアミノ酸配列が改変されたポリペプチドも含む。改変体は、天然物であってもよいし、非天然のものであってもよい。非天然の改変体は、当該技術分野で既知の突然変異技術で作成してもよい。ポリペプチド改変体は、アミノ酸同類置換を含んでもよいし、同類置換ではないアミノ酸の置換、欠失または付加を含んでもよい。
【０１３９】
「アミノ酸の同類置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基は、当該技術分野で定義されている。この分類には、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷をもたない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝を有する側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、ポリペプチドのアミノ酸残基が、同じ側鎖のグループの別のアミノ酸残基と置き換えられていてもよい。別の実施形態では、アミノ酸の鎖は、側鎖のグループの順序および／または組成が異なる、構造的に類似した鎖と置き換えられていてもよい。または、別の実施形態では、ポリペプチド全体にわたって、または一部分に無作為に変異が導入されていてもよい。
【０１４０】
本発明のポリペプチドは、標的分子（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ）に特異的に結合する、少なくとも１つの結合部位または結合部分を含む結合分子である。例えば、ある実施形態では、本発明の結合分子は、免疫グロブリン抗原結合部位を含むか、または、リガンド結合に関与する受容体分子の一部分を含む。本発明は、これらの結合分子に関するか、またはこれらの結合分子をコードする核酸分子に関する。ある実施形態では、結合分子は、少なくとも２個の結合部位を含む。ある実施形態では、結合分子は、２個の結合部位を含む。ある実施形態では、結合分子は、３個の結合部分を含む。別の実施形態では、結合分子は、４個の結合部分を含む。別の実施形態では、結合分子は、５個の結合部分を含む。別の実施形態では、結合分子は、６個の結合部分を含む。
【０１４１】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、モノマーである。別の実施形態では、本発明の結合分子は、マルチマーである。例えば、ある実施形態では、本発明の結合分子は、ダイマーである。ある実施形態では、本発明のダイマーは、ホモダイマーであり、２個の同じモノマーサブユニットを含む。別の実施形態では、本発明のダイマーは、ヘテロダイマーであり、少なくとも２個の異なるモノマーサブユニットを含む。ダイマーのサブユニットは、１個以上のポリペプチド鎖を含んでいてもよい。例えば、ある実施形態では、ダイマーは、少なくとも２個のポリペプチド鎖を含む。ある実施形態では、ダイマーは、２個のポリペプチド鎖を含む。別の実施形態では、ダイマーは、３個のポリペプチド鎖を含む。別の実施形態では、ダイマーは、４個のポリペプチド鎖を含む（例えば、抗体分子の場合）。別の実施形態では、ダイマーは、５個のポリペプチド鎖を含む。別の実施形態では、ダイマーは、６個のポリペプチド鎖を含む。
【０１４２】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、一価であり、すなわち、１個の標的結合部位を含む（例えば、ｓｃＦｖ分子の場合）。一価の結合分子の場合、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも２個の異なるエピトープに結合する本発明の組成物は、少なくとも２個のこのような結合分子を含み、それぞれの結合分子は、ＩＧＦ−１Ｒの異なるエピトープに対する特異性を有する。ある実施形態では、本発明の結合分子は、多価であり、すなわち、２個以上の標的結合部位を含む。別の実施形態では、結合分子は、少なくとも２個の結合部位を含む。ある実施形態では、結合分子は、２個の結合部位を含む。ある実施形態では、結合分子は、３個の結合部位を含む。別の実施形態では、結合分子は、４個の結合部位を含む。別の実施形態では、結合分子は、４個よりも多い結合部位を含む。
【０１４３】
本明細書で使用するとき、用語「価数」は、結合分子中の結合可能な部位の数を指す。結合分子は、「一価」であり、１個の結合部位を有していてもよく、または結合分子は、「多価」（例えば、二価、三価、四価またはそれ以上の価数）であってもよい。それぞれの結合部位は、１個の標的分子または標的分子の特異的な部位（例えば、エピトープ）に特異的に結合する。結合分子が、２個以上の標的結合部位を含む場合（すなわち、多価結合分子）、それぞれの標的結合部位は、同じ分子または異なる分子に特異的に結合してもよい（例えば、異なるＩＧＦ−１Ｒ分子に結合してもよく、または同じＩＧＦ−１Ｒ分子の異なるエピトープに結合してもよい。
【０１４４】
本明細書で使用するとき、「結合部分」、「結合部位」または「結合ドメイン」は、結合分子のうち、目的の標的分子（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ）に特異的に結合する部分を指す。結合ドメインの例としては、抗体の抗原結合部位、抗体の可変ドメイン（例えば、ＶＬドメインまたはＶＨドメイン）、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメインまたは酵素ドメインが挙げられる。ある実施形態では、結合分子は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な、少なくとも１個の結合部位を有する。特定の実施形態では、結合部位は、単一のＩＧＦ−１Ｒ結合特異性を有する。他の実施形態では、結合部位は、２種類以上の結合特異性を有していてもよい（例えば、少なくとも１種類の結合特異性は、ＩＧＦ−１Ｒ結合特異性である）。例えば、結合分子は、二重特異性を有する１個の結合部位を有していてもよい。
【０１４５】
用語「結合特異性」または「特異性」は、結合分子が、所与の標的分子またはエピトープに特異的に結合する（例えば、免疫的に反応する）能力を指す。特定の実施形態では、本発明の結合分子は、２種類以上の結合特異性を有する（すなわち、１個以上の異なる抗原に存在する２個以上の異なるエピトープに同時に結合する）。結合分子は、「単一特異性」であって、１種類の結合特異性を有していてもよく、または結合分子は、「多重特異性」（例えば、二重特異性または三重特異性であるか、またはそれ以上の多重特異性）を有して、２種類以上の結合特異性を有していてもよい。例示的な実施形態では、本発明の結合分子は、「二重特異性」であり、２種類の結合特異性を含む。したがって、ＩＧＦ−１Ｒ結合分子が「単一特異性」又は「多重特異性」（例えば、「二重特異性」）であるかは、結合分子が反応する異なるエピトープの数が参照される。例示的な実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、１個以上のＩＧＦ−１Ｒ分子の異なるエピトープに対して特異性を有していてもよい。
【０１４６】
ある実施形態では、結合分子は、二重の結合特異性を有していてもよい。本明細書で使用するとき、用語「二重結合特異性（ｄｕａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」または「二重特異性（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」は、結合分子が、１個以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。例えば、結合分子は、ある標的分子の２個以上の異なるエピトープ（例えば、２個以上の重複しないエピトープまたは連続していないエピトープ）に特異的に結合する少なくとも１個の結合部位を有する、結合特異性を有していてもよい。したがって、二重結合特異性を有する結合分子は、２個以上のエピトープに交差反応するとされる。
【０１４７】
本発明の所与の結合分子は、特定の結合特異性に対し、一価であっても多価であってもよい。例えば、ＩＧＦ−１Ｒ結合分子が単一特異性である場合、その結合特異性は、エピトープに特異的に結合する１箇所の結合部位を含んでいてもよく（すなわち、「一価の単一特異性」結合分子）、このような結合分子を、ＩＧＦ−１Ｒの異なるエピトープに対して少なくとも１種類の結合特異性を有する第２の結合分子と組み合わせて使用してもよい。ある実施形態では、単一特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、同じエピトープに特異的に結合する２個の結合ドメインを含んでいてもよい。このような結合分子は、二価であり、単一特異性である。他の実施形態では、結合分子が多重特異性である場合、その結合特異性の１種類以上には、同じエピトープに特異的に結合する２個以上の結合ドメインを含んでいてもよい（すなわち、「多価結合特異性」）。例えば、二重特異性分子は、二価である第１の結合特異性（すなわち、第１のエピトープに結合する２個の結合部位）と、二価である第２の結合特異性（すなわち、第２の異なるエピトープに結合する２個の結合部位）とを含んでいてもよい。別の実施形態では、二重特異性分子は、一価である第１の結合特異性（すなわち、第１のエピトープに結合する１個の結合部位）と、一価または二価である第２の結合特異性とを含んでいてもよい。
【０１４８】
本明細書に開示の結合分子は、抗原のエピトープまたは抗原の一部分（例えば、この結合分子が認識するか、または特異的に結合する標的ポリペプチド（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ））の観点から記載されてもよく、または特定されてもよい。結合分子の結合部位または結合分子の一部分と特異的に相互作用する標的ポリペプチドの一部分は、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的ポリペプチドは、１個のエピトープを含んでいてもよいが、典型的には、少なくとも２個のエピトープを含んでおり、抗原の大きさ、構造および種類によって、任意の数のエピトープを含んでいてもよい。さらに、標的ポリペプチドにある「エピトープ」は、ポリペプチドではない要素であってもよく、ポリペプチドではない要素を含んでいてもよいことを注記しておく。例えば、「エピトープ」は、炭水化物側鎖を含んでいてもよい。抗体のペプチドエピトープまたはポリペプチドエピトープとして最も小さいものは、アミノ酸数が約４〜約５個のものであると考えられる。ペプチドエピトープまたはポリペプチドエピトープは、好ましくは、アミノ酸数が少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも９個、最も好ましくは、少なくとも約１５〜約３０個である。ＣＤＲは、三次元形状で抗原ペプチドまたは抗原ポリペプチドを認識することができるため、エピトープを成すアミノ酸は、連続している必要はなく、いくつかの場合では、同じペプチド鎖にさえ存在していなくてもよい。本発明では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体が認識するペプチドエピトープまたはポリペプチドエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸を連続して、または非連続で少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、さらに好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、または約１５〜約３０個含有する。
【０１４９】
「特異的に結合する」とは、一般的に、結合分子が、分子内にある結合部位（例えば、抗原結合ドメイン）を介して抗原結合領域でエピトープに結合し、その結合が、結合部位とエピトープとの間にある程度の相補性をもたらすことを意味する。この定義によれば、結合分子が、無関係なエピトープと結合するよりも、結合部位でエピトープと選択的に結合する場合、その結合分子は、エピトープに「特異的に結合する」と言う。結合分子が多重特異性である場合、結合分子は、この結合分子の別の結合部位（例えば、抗原結合ドメイン）を介し、第２のエピトープ（すなわち、第１のエピトープと無関係のエピトープ）に特異的に結合してもよい。
【０１５０】
「選択的に結合する」とは、結合分子が、あるエピトープに対し、関連するエピトープ、同様のエピトープ、同種のエピトープ、または類似のエピトープに結合するよりも容易に、結合部位を介して特異的に結合することを意味する。したがって、所与のエピトープに「選択的に結合する」抗体は、抗体が関連するエピトープと交差反応する場合であっても、関連するエピトープよりも、所与のエピトープに結合する可能性が高いであろう。
【０１５１】
本明細書で使用するとき、用語「交差反応性」は、ある抗原に特異的な抗体が、第２の抗原と反応する性質を指し、２種類の異なる抗原基質間の関連性の尺度である。したがって、ある抗体が、それを誘導したエピトープ以外のエピトープに結合する場合、その抗体は、交差反応性である。交差反応性のエピトープは、一般的に、誘導エピトープと同じ相補性構造の多くを含有しており、ある場合には、元々のエピトープよりも実際には良好に適合することもある。
【０１５２】
例えば、特定の抗体は、同一ではないエピトープ、例えば、参照エピトープと少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の同一性を有するエピトープ（当該技術分野で既知の方法および本明細書に記載の方法で算出）に結合するという点で、ある程度の交差反応性を有する。抗体が、参照エピトープと９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同一性を有するエピトープ（当該技術分野で既知の方法および本明細書に記載の方法で算出）には結合しない場合、そのエピトープは、交差反応性がほとんどないか、全くないと言うことができる。ある抗体が、そのエピトープの任意の他の類似体、オルソログ、またはホモログに結合しない場合、その抗体は、特定のエピトープに「きわめて特異的」であると考えてもよい。
【０１５３】
本明細書で使用するとき、用語「親和性」は、個々のエピトープが、結合分子の結合部位と結合する強さの測定値を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）の２７〜２８ページ参照。好ましい結合親和性としては、解離定数すなわちＫｄが、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満の結合親和性が挙げられる。
【０１５４】
本明細書で使用するとき、用語「結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）」は、結合分子（例えば抗体）の集合体と、抗原との複合体の全体的な安定性を指す。すなわち、結合分子の混合物と抗原との機能的な結合強度である。例えば、Ｈａｒｌｏｗの２９〜３４ページを参照。結合活性は、集合体に含まれる個々の結合分子と、特異的なエピトープとの親和性に関係があり、結合分子および抗原の価数にも関係がある。例えば、二価モノクローナル抗体と、きわめて繰り返しの多いエピトープ構造を有する抗原（例えば、ポリマー）との相互作用は、結合活性が高い相互作用である。
【０１５５】
特定の実施形態では、本発明の結合分子の結合部分は、抗原結合部位である。抗原結合部位は、ポリペプチドによって異なる可変領域から作られる。ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、少なくとも２個の抗原結合部位を含む。本明細書で使用するとき、用語「抗原結合部位」は、抗原（例えば、細胞表面または抗原の可溶性形態）に特異的に結合する（免疫的に反応する）部位を含む。抗原結合部位は、免疫グロブリンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、これらの可変領域から作られる結合部分が、抗体の特異性を決定づける。ある実施形態では、本発明の抗原結合部位は、１個の抗体分子の少なくとも１個の重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲを含む（例えば、当該技術分野で知られているか、または本明細書に記載する配列）。別の実施形態では、本発明の抗原結合部位は、１個以上の抗体分子に由来する、少なくとも２箇所のＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合部位は、１種以上の抗体分子に由来する、少なくとも３箇所のＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合部位は、１種以上の抗体分子に由来する、少なくとも４箇所のＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合部位は、１種以上の抗体分子に由来する、少なくとも５箇所のＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の抗原結合部位は、１種以上の抗体分子に由来する、少なくとも６箇所のＣＤＲを含む。少なくとも１箇所のＣＤＲを含み（例えば、ＣＤＲ１〜６）、目的の抗原結合分子に含まれ得る結合部位の例は、当該技術分野で既知であり、分子の例を本明細書に記載している。
【０１５６】
本発明の好ましい結合分子は、ヒトアミノ酸配列に由来するフレームワークと、定常領域のアミノ酸配列とを含む。しかし、結合ポリペプチドは、別の哺乳動物種に由来するフレームワーク、および／または定常領域の配列を含んでいてもよい。例えば、マウスの配列を含む結合分子は、特定の用途に適している場合がある。ある実施形態では、目的の結合分子に、霊長類のフレームワーク領域（例えば、非ヒト霊長類）、重鎖部分および／またはヒンジ部分が含まれていてもよい。ある実施形態では、結合ポリペプチドのフレームワーク領域に、１個以上のマウスアミノ酸が存在してもよい。例えば、ヒトフレームワークアミノ酸配列または非ヒト霊長類フレームワークアミノ酸配列が、１個以上のアミノ酸復帰突然変異を含んでいてもよく、対応するマウスアミノ酸残基が存在し、および／または出発原料であるマウス抗体では見られなかった異なるアミノ酸残基に変異した箇所を１箇所以上含んでいてもよい。本発明の好ましい結合分子は、マウス抗体よりも免疫原性が低い。
【０１５７】
「融合」タンパク質またはキメラタンパク質は、第１のアミノ酸配列が、天然では結合していない第２のアミノ酸配列に結合している配列を含む。このアミノ酸配列は、通常は、合わさって融合ポリペプチドをもたらす別個のタンパク質に存在してもよく、または、このアミノ酸配列は、同じタンパク質に存在するが、融合ポリペプチドでは新しい配列で配置されていてもよい。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって作成されてもよく、またはペプチド領域が所望の関係性でコードされるポリヌクレオチドを作成し、翻訳することによって作成されてもよい。
【０１５８】
用語「異種」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用される場合、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、比較対象となる残りの部分とは別個の部分に由来するものであることを意味する。例えば、異種ポリヌクレオチドまたは異種抗原は、異なる種、ある個体の異なる細胞型、または別個の個体の同じ細胞型または異なる細胞型に由来していてもよい。
【０１５９】
用語「受容体結合ドメイン」または「受容体結合部分」は、本明細書で使用するとき、少なくとも定性的な受容体結合能力を保持しており、好ましくは、対応する未処理のリガンドの生体活性を保持している、任意の未処理の（ｎａｔｉｖｅ）リガンドまたは任意の領域またはその誘導体を指す。
【０１６０】
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書では同じ意味で使用する。抗体または免疫グロブリンは、少なくとも重鎖可変領域を含み、通常は、少なくとも重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２版．１９８８）を参照。
【０１６１】
以下に詳細に説明するように、用語「免疫グロブリン」は、生化学分野で区別可能な種々のポリペプチド群を含む。当業者は、重鎖が、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）またはエプシロン（ε）に分類され、その中にいくつかの副分類がある（例えば、γ１〜γ４）ことを知っているであろう。この鎖の性質から、抗体の「種類」を、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ  ＩｇＧまたはＩｇＥと決定する。免疫グロブリンの副分類（アイソタイプ）は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などがあり、これらの性質は十分に調べられており、機能的な特徴も十分に知られている。これらの分類およびアイソタイプを改変したものも、本発明の開示内容を鑑みれば、当業者は容易に理解でき、したがって、これらの改変物も、本発明の範囲に含まれる。すべての分類の免疫グロブリンが本発明の範囲に入ることは明らかであるので、以下の議論は、一般的に、ＩｇＧ群の免疫グロブリン分子について記載する。ＩｇＧに関して言うと、標準的な免疫グロブリン分子は、２個の同一の軽鎖ポリペプチドと、２個の同一の重鎖ポリペプチドとを有しており、軽鎖ポリペプチドの分子量は、約２３，０００ダルトンであり、重鎖ポリペプチドの分子量は、５３，０００〜７０，０００である。これらの４本の鎖は、典型的には、ジスルフィド結合で「Ｙ」字型に接続しており、「Ｙ」の２つに分かれた根元部分で軽鎖が重鎖を覆うように位置し、可変領域まで続いている。
【０１６２】
軽鎖は、カッパ（κ）またはラムダ（λ）に分類される。κ軽鎖またはλ軽鎖に、それぞれの分類の重鎖が結合し得る。一般的に、軽鎖と重鎖とは、共有結合で互いに結合しており、ハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子操作された宿主細胞が免疫グロブリンを作成するとき、２個の重鎖の「尾」にあたる部分は、ジスルフィド共有結合で互いに結合しているか、または非共有結合で結合している。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ字の２つに分かれた末端にあるＮ末端から、それぞれの鎖の底部にあるＣ末端まで続いている。
【０１６３】
構造同一性および機能同一性によって、軽鎖も重鎖もいくつかの領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は、機能を示すために用いられる用語である。この観点では、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）の鎖部分が、抗原の認識性および特異性を決定づけていることを理解されたい。これとは逆に、軽鎖定常領域（ＣＬ）および重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）は、例えば、分泌、経胎盤移行、Ｆｃ受容体の結合、補体結合などの重要な生物学的性質をになっている。定常領域の付番は慣習的に、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端に近いところから順に、遠ざかる方向に番号が大きくなる。Ｎ末端部分は、可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域であり、ＣＨ３領域およびＣＬ領域は、実際には、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【０１６４】
上に示したように、可変領域によって、抗体が抗原を選択的に認識し、抗原のエピトープに特異的に結合する。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセット（例えば、ある場合には、ＣＨ３ドメイン）を組み合わせ、三次元抗原結合部位を形作る可変領域を形成する。この４つの要素からなる抗体構造によって、Ｙの２つに分かれた部分の末端に抗原結合部位が形成される。  さらに具体的には、抗原結合部位は、それぞれのＶＨ鎖およびＶＬ鎖にある３個のＣＤＲによって構造が決まる。いくつかの場合、例えば、ラクダ科の動物に由来する特定の免疫グロブリン分子、またはラクダ由来免疫グロブリンから合成した分子、完全な免疫グロブリン分子は、重鎖のみで、軽鎖を有していない場合がある。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）を参照。
【０１６５】
本明細書で使用するとき、用語「可変領域のＣＤＲアミノ酸残基」は、配列または構造に基づく方法によって特定されるような、ＣＤＲすなわち相補性決定領域のアミノ酸を含む。本明細書で使用するとき、用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの可変領域にある、連続していない抗原結合部位を指す。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２、６６０９−６６１６（１９７７）およびＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）、およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）、およびＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）に記載されており、この定義には、互いに比較した場合、重複するアミノ酸残基またはアミノ酸残基のサブセットが含まれる。上に引用した参考文献によって定義されるＣＤＲを含むアミノ酸残基を、比較のために表１に記載している。好ましくは、用語「ＣＤＲ」は、配列比較に基づき、Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲである。
【０１６６】
表１：ＣＤＲの定義
2010538012.tif 000003
１残基の番号は、Ｋａｂａｔらの命名法（前出）による。
２残基の番号は、Ｃｈｏｔｈｉａらの命名法（前出）による。
３残基の番号は、ＭａｃＣａｌｌｕｍらの命名法（前出）による。
【０１６７】
本明細書で使用するとき、用語「可変領域フレームワーク（ＦＲ）のアミノ酸残基」は、Ｉｇ鎖のフレームワーク領域にあるアミノ酸を指す。用語「フレームワーク領域」または「ＦＲ領域」は、本明細書で使用するとき、可変領域の一部分であるが、ＣＤＲの一部分ではないアミノ酸残基を含む（例えば、ＣＤＲのＫａｂａｔの定義を用いる）。したがって、可変領域のフレームワークは、アミノ酸長が１００〜１２０であるが、ＣＤＲの外側にあるアミノ酸のみを含む。重鎖可変領域の特定の例と、Ｋａｂａｔらによって定義されるＣＤＲとについて、フレームワーク領域１は、アミノ酸１〜３０を包含する可変領域のドメインに対応しており、フレームワーク領域２は、アミノ酸３６〜４９を包含する可変領域のドメインに対応しており、フレームワーク領域３は、アミノ酸６６〜９４を包含する可変領域のドメインに対応しており、フレームワーク領域４は、アミノ酸１０３から可変領域の末端までを包含する可変領域のドメインに対応している。軽鎖のフレームワーク領域は、軽鎖の可変領域の各ＣＤＲによって同様に分割されている。同様に、ＣｈｏｔｈｉａらによるＣＤＲの定義、またはＭｃＣａｌｌｕｍらによるＣＤＲの定義を用い、フレームワーク領域の境界は、上述のそれぞれのＣＤＲ末端によって分割されている。好ましい実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔで定義されるとおりである。
【０１６８】
自然発生抗体では、各抗原結合部位に存在する６個のＣＤＲは、短く、抗体が水性環境で三次元構造をとる際、抗原結合領域を形成するように特定的に配置された非連続的なアミノ酸配列である。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのそれ以外のアミノ酸の配列は、分子間でほとんど変わらず、この領域は、フレームワーク領域と呼ばれている。フレームワーク領域は、主にβシート構造をとり、ＣＤＲは、ループ構造をとり、βシート構造に接続しているか、ある場合には、β構造の一部を形成している。したがって、フレームワーク領域は、共有結合以外の鎖間相互作用によってＣＤＲを鎖の中で正しい位置に配置する足場の役割を果たす。所定の位置に配置されたＣＤＲによって抗原結合領域が形成され、この抗原結合領域が、免疫反応性の抗原に存在するエピトープと相補的な表面を形作る。この相補的な表面によって、抗体と、免疫反応性エピトープとの非共有結合が促進される。当業者は、ＣＤＲの位置を簡単に特定することができる。
【０１６９】
Ｋａｂａｔらは、任意の抗体に適用可能な、可変領域の配列の付番システムも定義している。当業者は、配列以外の実験データを使わずに、この「Ｋｏｂａｔ付番」システムを任意の可変領域の配列に明確にあてはめることができる。本明細書で使用するとき、「Ｋａｂａｔ付番法」は、Ｋａｂａｔらが、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）で発表した方法を指す。他の意味であると明記されていない限り、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体の可変領域、または抗原結合性を保持したフラグメント、改変体または誘導体の付番は、Ｋａｂａｔ付番システムによるものである。
【０１７０】
本明細書で使用するとき、用語「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリンの重鎖のうち、パパイン開裂部位のすぐ上流にあるヒンジドメイン（すなわち、重鎖定常領域の第１残基を１１４とすると、ＩｇＧの残基２１６）から、抗体のＣ末端までの部分を指す。したがって、全Ｆｃ領域は、ヒンジドメイン、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を少なくとも含む。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、少なくとも２個の別個の重鎖部分を含むダイマーである。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、少なくとも２個の重鎖部分を含み、この重鎖部分が、（例えば、Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーまたは他のペプチドリンカーを介して）融合しているか、または結合している単鎖Ｆｃ領域（「ｓｃＦｃ」）である。ｓｃＦｃ領域は、２００８年５月１４日に出願した、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６２６０号に詳しく記載されており、この内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１７１】
本明細書で使用するとき、用語「Ｆｃドメインの一部分」または「Ｆｃの一部分」は、ＦｃドメインまたはＦｃ領域に由来するアミノ酸配列を含む。Ｆｃの一部分を含むポリペプチドは、ヒンジ（例えば、上側、中央部、および／または下側のヒンジドメイン）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはその改変体またはフラグメントのうち、少なくとも１つを含む。ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、ヒンジドメインの一部分と、ＣＨ２ドメインとを少なくとも含む、少なくとも１つのＦｃ領域を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ１ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む、少なくとも１つのＦｃ領域を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ１ドメインと、ヒンジドメインの一部分と、ＣＨ３ドメインとを含む、少なくとも１つのＦｃ領域を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含む、少なくとも１つのＦｃ領域を含む。ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えば、ＣＨ２ドメインのすべてまたは一部分）を欠いた、少なくとも１つのＦｃ領域を含む。本明細書で記載しているように、任意のＦｃ領域を、天然の免疫グロブリン分子の未処理のＦｃ領域に由来するアミノ酸配列を変えるように改変してもよいことは、当業者には理解されるであろう。
【０１７２】
本発明のポリペプチドのＦｃ領域は、異なる免疫グロブリン分子（例えば、２個以上の異なるヒト抗体アイソタイプ）に由来していてもよい。例えば、ポリペプチドのＦｃ領域は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子に由来するキメラヒンジ領域とを含んでいてもよい。別の例では、Ｆｃ領域は、一部分がＩｇＧ１分子に由来し、一部分がＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含んでいてもよい。別の例では、Ｆｃ領域は、一部分がＩｇＧ１分子に由来し、一部分がＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジ領域を含んでいてもよい。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、第１の抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）に由来するヒンジドメインと、異なるヒト抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ４）に由来するＣＨ２ドメインとを含んでいてもよい。別の実施形態では、Ｆｃ領域は、第１の抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）に由来するＣＨ２ドメインと、異なるヒト抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ４）に由来するＣＨ３ドメインとを含んでいてもよい。別の実施形態では、Ｆｃ領域の残基２３３〜２３６および３２７〜３３１が、ヒトＩｇＧ２抗体に由来し、Ｆｃ領域の残りの残基が、ヒトＩｇＧ４抗体に由来する。キメラＦｃ領域の例は、例えば、ＰＣＴ出願公開番号第ＷＯ／１９９９／５８５７２号に記載されており、この内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１７３】
重鎖定常領域のアミノ酸位置（ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインのアミノ酸位置を含む）は、本明細書では、ＥＵインデックス付番システムによって付番する（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、第５版、１９９１を参照）。対照的に、軽鎖定常領域（例えば、ＣＬドメイン）のアミノ酸位置は、本明細書では、Ｋａｂａｔインデックス付番システムによって付番する（Ｋａｂａｔら、上述を参照）。
【０１７４】
結合分子の例としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合性フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリから作成したフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示するＩＧＦ−１Ｒ抗体の抗−Ｉｄ抗体）が挙げられる。ＳｃＦｖ分子は、当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。Ｉｇ重鎖を含む本発明の結合分子は、いかなる型のものであってもよく（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、いかなる分類のものであってもよく（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、いかなる副分類の免疫グロブリン分子であってもよい。
【０１７５】
結合分子は、可変領域を単独で含んでもよいし、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの全体または一部分と組み合わせて含んでもよい。可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域との任意の組み合わせを含む、抗原結合性を保持したフラグメントも、本発明に含まれる。本発明の結合分子は、鳥および哺乳動物を含む任意の動物の抗体であってもよく、この抗体に由来するものであってもよい。好ましくは、抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ロバ抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、モルモット抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体、ウマ抗体またはニワトリ抗体である。別の実施形態では、可変領域は、コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）由来（例えば、サメ由来）であってもよい。本明細書で使用するとき、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリから単離した抗体、または１種以上のヒト免疫グロブリンについて遺伝子組み換えし、内因性免疫グロブリンを発現しない動物由来の抗体（例えば、後述の、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるもの）が含まれる。
【０１７６】
用語「フラグメント」は、インタクトなポリペプチドまたは完全ポリペプチドよりも含まれるアミノ酸残基が少ない、ポリペプチド（例えば、抗体または抗体鎖）のある部分または一部を指す。用語「抗原結合性を保持したフラグメント」は、抗原に結合するか、またはインタクトな抗体（すなわち、由来となるインタクトな抗体）と抗原への結合が競合的である（すなわち、特異的な結合である）、免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチドフラグメントを指す。本明細書で使用するとき、抗体分子の「フラグメント」という用語には、抗体の抗原結合性フラグメント、例えば、抗体の軽鎖（ＶＬ）、抗体の重鎖（ＶＨ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、および単一ドメイン抗体フラグメント（ＤＡｂ）を含む。フラグメントは、例えば、インタクトな抗体または全抗体または抗体鎖を化学物質または酵素によって処理することによって得てもよく、または組み替え手段によって得てもよい。
【０１７７】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、定常領域（例えば、重鎖定常領域）を含む。ある実施形態では、このような定常領域は、野生型定常領域と比べると、改変されている。すなわち、本明細書に開示した本発明のポリペプチドは、３種類の重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）および／または軽鎖定常領域ドメイン（ＣＬ）のうち、１つ以上に変更部または改変部を含んでいてもよい。改変の例としては、１つ以上のドメインでの１つ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換が挙げられる。他の改変された定常領域は、グリコシル化しないか、または改変されたグリカン構造（例えば、フコシル化していないグリカン）を有していてもよい。エフェクター機能を最適化するか、減らすか、または完全になくし、半減期を高めるなどのために、このような変更がなされてもよい。
【０１７８】
特定の実施形態では、本発明の結合分子は、結合分子の１つ以上の結合部位に結合した重鎖部分を含む。本明細書で記載する場合、用語「重鎖部分」は、免疫グロブリン重鎖の定常領域に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１領域、ヒンジ（例えば、上側、中央部、および／または下側のヒンジ領域）領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、またはその改変体またはフラグメントのうち、少なくとも１つを含む。例えば、本発明で使用する結合ポリペプチドは、ＣＨ１領域を含むポリペプチド鎖を含んでもよく、ＣＨ１領域と、ヒンジ領域の少なくとも一部分と、ＣＨ２領域とを含むポリペプチド鎖を含んでもよく、ＣＨ１領域と、ＣＨ３領域とを含むポリペプチド鎖を含んでもよく、ＣＨ１領域と、ヒンジ領域の少なくとも一部分と、ＣＨ３領域とを含むポリペプチド鎖を含んでもよく、ＣＨ１領域と、ヒンジ領域の少なくとも一部分と、ＣＨ２領域と、ＣＨ３領域とを含むポリペプチド鎖を含んでもよい。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３領域を含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明で使用する結合ポリペプチドは、ＣＨ２領域の数なくとも一部分（例えば、ＣＨ２領域全体または一部分）が欠失していてもよい。上述のように、上述の領域（例えば、重鎖部分）が、天然の免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように改変されていてもよいことも当業者は理解するであろう。結合分子がマルチマーである特定の実施形態では、マルチマーの１個のポリペプチド鎖にある重鎖部分は、そのマルチマーの第２のポリペプチド鎖にある重鎖部分と同一である。または、ある実施形態では、本発明のモノマーを含有する重鎖部分は、同一ではない。例えば、それぞれのモノマーは、異なる標的結合部位を含んでいてもよく、例えば、二重特異性抗体を形成してもよい。
【０１７９】
本明細書に開示した方法で使用する、結合ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来していてもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子由来のＣＨ１領域と、ＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域とを含んでいてもよい。別の例では、重鎖部分は、一部分がＩｇＧ１分子由来で、一部分がＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域を含んでもよい。別の例では、重鎖部分は、一部分がＩｇＧ１分子由来で、一部分がＩｇＧ４分子由来のキメラヒンジを含んでもよい。
【０１８０】
本明細書で使用するとき、用語「軽鎖部分」は、免疫グロブリンの軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖部分は、ＶＬ領域またはＣＬ領域のうち、少なくとも１つを含む。
【０１８１】
すでに示したように、種々の分類の免疫グロブリンの定常領域のサブユニット構造および三次元配置は、十分に知られている。本明細書で使用するとき、用語「ＶＨ領域」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変領域を含み、「ＣＨ１領域」は、免疫グロブリン鎖の第１の（最もアミノ末端に近い）定常領域を含む。ＣＨ１領域は、ＶＨ領域に隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対して、アミノ末端である。
【０１８２】
本明細書で使用するとき、用語「ＣＨ１ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端にある）定常領域ドメインを含み、例えば、ＥＵ位置で１１８〜２１５に広がっている。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端に隣接しており、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の一部分を形成していない。ある実施形態では、本発明の結合分子は、免疫グロブリン重鎖分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子またはＩｇＧ４分子）に由来するＣＨ１ドメインを含む。
【０１８３】
本明細書で使用するとき、用語「ＣＨ２ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の一部分を含み、例えば、ＥＵ位置で２３１〜３４０に広がっている。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接な対を作らないという点で、固有のドメインである。むしろ、２個のＮが結合した分枝炭水化物鎖は、インタクトな未処理ＩｇＧ分子の２個のＣＨ２領域の間に入る。ある実施形態では、本発明の結合分子は、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）に由来するＣＨ２ドメインを含む。別の実施形態では、本発明の改変されたポリペプチドは、ＩｇＧ４分子（例えば、ヒトＩｇＧ４分子）に由来するＣＨ２ドメインを含む。例示的な実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ２ドメイン（ＥＵで位置２３１〜３４０）またはその一部分を含む。
【０１８４】
本明細書で使用するとき、用語「ＣＨ３ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の一部分を含み、ほぼ残基１１０からＣＨ２ドメインのＮ末端にまで広がっている（例えば、ほぼ３４１〜４４６ｂの位置（ＥＵ付番システム））。ＣＨ３ドメインは、典型的には、抗体のＣ末端部分を形成する。しかし、いくつかの免疫グロブリンでは、ＣＨ３ドメインからさらなるドメインが広がり、分子のＣ末端部分を形成していることもある（例えば、ＩｇＭのμ鎖にあるＣＨ４ドメイン、およびＩｇＥのε鎖）。ある実施形態では、本発明の結合分子は、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）に由来するＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、ＩｇＧ４分子（例えば、ヒトＩｇＧ４分子）に由来するＣＨ３ドメインを含む。
【０１８５】
本明細書で使用するとき、用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１領域をＣＨ２領域に接続する重鎖分子の一部分を含む。このヒンジ領域は、約２５残基を有し、可とう性であり、これにより、２個のＮ末端にある抗原結合領域を独立して動かすことができる。ヒンジ領域は、上側、中央部および下側の３つの別個な領域に分けることができる（Ｒｏｕｘら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３（１９９８））。
【０１８６】
本明細書で使用するとき、用語「エフェクター機能」は、Ｆｃ領域またはその一部分が、免疫系のタンパク質および／または細胞に結合し、種々の生体効果を媒介する機能を指す。エフェクター機能は、抗原依存性であってもよく、または抗原非依存性であってもよい。エフェクター機能の低下とは、抗体の可変領域（またはそのフラグメント）の抗原結合活性を維持しつつ、１つ以上のエフェクター機能が低下することを指す。エフェクター機能（例えば、Ｆｃ受容体または相補性タンパク質へのＦｃの結合）の向上または低下は、フォールディング状態の変化（例えば、一重フォールディング、二重フォールディングなどに変化）の観点であらわすことができ、例えば、当該技術分野でよく知られているアッセイを用いて結合活性の変化率（％）を決定し、この結合活性変化率に基づいて、算出することができる。
【０１８７】
本明細書で使用するとき、用語「抗原依存性のエフェクター機能」は、通常は、ある抗体が、対応する抗原に結合した後に誘発されるエフェクター機能を指す。典型的な抗原依存性のエフェクター機能としては、相補性タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）に結合する能力が挙げられる。例えば、Ｆｃ領域に相補性のＣ１成分が結合すると、従来の相補系が活性化され、オプソニン化が起こり、細胞病原体が溶解する。このプロセスは、補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣＣ）と呼ばれる。さらに、補体が活性化すると、炎症反応が刺激され、この事象は、自己免疫過敏にも関与している場合がある。
【０１８８】
他の抗原依存性のエフェクター機能は、抗体が、Ｆｃ領域を介し、細胞の特定のＦｃ受容体（「ＦｃＲ」）に結合することによって起こる。異なる種類の抗体に特異的な多くのＦｃ受容体があり、例えば、ＩｇＧ（γ受容体またはＩｇγＲ）、ＩｇＥ（ε受容体またはＩｇεＲ）、ＩｇＡ（α受容体またはＩｇαＲ）およびＩｇＭ（μ受容体またはＩｇμＲ）が挙げられる。細胞表面で、抗体がＦｃ受容体に結合することにより、多くの重要かつ多様な生体応答が引き起こされる。このような生体応答には、免疫複合体のエンドサイトーシス、抗体でコーティングされた粒子または微生物の巻き込みおよび破壊（抗体依存性の食作用またはＡＤＣＰと呼ばれる）、免疫複合体のクリアランス、抗体でコーティングされた標的細胞がキラー細胞によって溶解すること（抗体依存性細胞が介在する細胞障害作用またはＡＤＣＣ）、免疫メディエータの放出、免疫系細胞の活性化の制御、胎盤通過、および免疫グロブリンの産生制御が挙げられる。
【０１８９】
本明細書で使用するとき、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または免疫反応性部位は、第１の種から得られるか、または第１の種に由来し、定常領域（インタクトなままであってもよく、本発明によって部分的に改変されてもよいし、改変されてもよい）が、第２の種から得られる任意の抗体を意味するのに使われる。好ましい実施形態では、標的結合領域または標的結合部位は、非ヒト由来であり（例えば、マウスまたは霊長類）、定常領域は、ヒトである。
【０１９０】
本明細書で使用するとき、用語「ｓｃＦｖ分子」は、１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）またはその一部分と、１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）またはその一部分とからなる結合分子を含み、各可変ドメイン（またはその一部分）は、同じ抗体に由来するか、または異なる抗体に由来する。ｓｃＦｖ分子は、好ましくは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にｓｃＦｖリンカーを含む。ｓｃＦｖ分子は、当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号、Ｈｏら、１９８９．Ｇｅｎｅ７７：５１；Ｂｉｒｄら、１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３；Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏら、１９９１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０１１７；Ｍｉｌｅｎｉｃら、１９９１．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１：６３６３；Ｔａｋｋｉｎｅｎら、１９９１．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：８３７に記載されている。ｓｃＦｖ分子のＶＬドメインおよびＶＨドメインは、１個以上の抗体分子に由来している。本発明のｓｃＦｖ分子の可変領域が、由来となる抗体分子とはアミノ酸配列が異なるように改変されていてもよいことも当業者は理解するであろう。例えば、ある実施形態では、ヌクレオチドまたはアミノ酸が置換され、アミノ酸残基で同類置換または保存的変更がなされてもよい（例えば、ＣＤＲおよび／またはフレームワークの残基において）。この変更に加えて、またはこの変更に代えて、当該技術分野で認識されている技術を用い、抗原結合性を最適化させるために、ＣＤＲアミノ酸残基を変異させてもよい。本発明の結合分子は、抗原に対する結合性を維持している。
【０１９１】
「ｓｃＦｖリンカー」は、本明細書で使用するとき、ｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインの間に存在する部分である。ｓｃＦｖリンカーは、好ましくは、ｓｃＦｖ分子を抗原結合性を有する構造に維持する。ある実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、ｓｃＦｖリンカーペプチドを含むか、ｓｃＦｖリンカーペプチドからなる。特定の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーペプチドは、ｇｌｙ−ｓｅｒ結合ペプチドを含むか、またはｇｌｙ−ｓｅｒ結合ペプチドからなる。他の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、ジスルフィド結合を含む。
【０１９２】
本明細書で使用するとき、用語「ｇｌｙ−ｓｅｒ結合ペプチド」は、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドを指す。ｇｌｙ／ｓｅｒ結合ペプチドの例は、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。ある実施形態では、ｎ＝１である。ある実施形態では、ｎ＝２である。別の実施形態では、ｎ＝３である。好ましい実施形態では、ｎ＝４である（すなわち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４）。別の実施形態では、ｎ＝５である。さらに別の実施形態では、ｎ＝６である。ｇｌｙ／ｓｅｒ結合ペプチドの別の例は、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。ある実施形態では、ｎ＝１である。ある実施形態では、ｎ＝２である。好ましい実施形態では、ｎ＝３である。別の実施形態では、ｎ＝４である。別の実施形態では、ｎ＝５である。さらに別の実施形態では、ｎ＝６である。
【０１９３】
本明細書で使用するとき、用語「ジスルフィド結合」は、２個の硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸であるシステインは、チオール基を含み、このチオール基は、第２のチオール基とジスルフィド結合を形成することができ、また第２のチオール基と架橋することができる。最も天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１領域とＣＬ領域とは、ジスルフィド結合で接続しており、２個の重鎖は、Ｋａｂａｔ付番システムによると、対応する２３９および２４２の位置で２個のジスルフィド結合で接続している（ＥＵ付番号システムでは、２２６または２２９）。
【０１９４】
本明細書で使用するとき、用語「従来のｓｃＦｖ分子」は、安定化したｓｃＦｖ分子ではない、ｓｃＦｖ分子を指す。例えば、典型的な従来のｓｃＦｖ分子には、安定化する変異が存在せず、（Ｇ４Ｓ）３リンカーによってＶＨドメインとＶＬドメインとが結合している。
【０１９５】
本発明の「安定化したｓｃＦｖ分子」は、従来のｓｃＦｖ分子と比較した場合、少なくも１箇所が変更または改変されたｓｃＦｖ分子であり、この変更または改変によって、ｓｃＦｖ分子が安定化している（すなわち、従来のｓｃＦｖ分子と比較した場合）。本明細書で使用するとき、用語「安定化する変異」は、ｓｃＦｖ分子のタンパク質および／またはｓｃＦｖ分子を含む大きなタンパク質の安定性（例えば、熱安定性）を高める変異を含む。ある実施形態では、安定化する変異は、不安定化する要因となるアミノ酸を、タンパク質の安定性を高めるアミノ酸（本明細書中、「安定化するアミノ酸」）に交換する置換を含む。ある実施形態では、安定化する変異は、ｓｃＦｖリンカーの長さを最適化したものである。ある実施形態では、本発明の安定化したｓｃＦｖ分子は、１個以上のアミノ酸置換を含む。例えば、ある実施形態では、安定化する変異は、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を含み、この置換が、ｓｃＦｖ分子のＶＨとＶＬとの境界面の安定性を高めるものである。ある実施形態では、このアミノ酸は、上述の境界面に含まれる。別の実施形態では、上述のアミノ酸は、ＶＨとＶＬとの境界面の骨格となるアミノ酸である。別の実施形態では、安定化する変異は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの境界面にある２個以上のアミノ酸を一緒に変える、ＶＨドメインまたはＶＬドメインの少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む。別の実施形態では、安定化する変異は、少なくとも１個のシステイン残基が、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、ＶＨドメインのアミノ酸とＶＬドメインのアミノ酸とを繋ぐ少なくとも１個のジスルフィド結合によって結合するように、導入された（すなわち、ＶＨドメインまたはＶＬドメインのうち、１個以上が遺伝子操作された）ものである。特定の好ましい実施形態では、本発明の安定化したｓｃＦｖ分子は、ｓｃＦｖリンカーの長さを最適化し、かつ少なくとも１個のアミノ酸残基が置換され、および／またはＶＨドメインおよびＶＬドメインが、ＶＨドメインのアミノ酸とＶＬドメインのアミノ酸とを繋ぐ少なくとも１個のジスルフィド結合によって結合したものである。ある実施形態では、ｓｃＦｖ分子に１個以上の安定化する変異を同時にほどこすと、従来のｓｃＦｖ分子と比較して、ｓｃＦｖ分子のＶＨドメインおよびＶＬドメインの熱安定性が高まる。ある実施形態では、安定化したｓｃＦｖ分子の集合は、同じ安定化する変異を含むか、または安定化する変異がいくつか組み合わさっている。他の実施形態では、この集合の個々の安定化したｓｃＦｖ分子は、異なる安定化する変異を含む。安定化する変異の例は、米国特許出願第１１／７２５，９７０号に詳細に記載されており、その内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１９６】
本明細書に使用する場合、用語「タンパク質の安定性」は、環境条件（例えば、高温または低温）に応答して、タンパク質の１つ以上の物理的性質の維持の、当該技術分野で認識されている尺度を指す。ある実施形態では、この物理的性質は、タンパク質の共有結合の構造の維持である（例えば、タンパク質分解による開裂、望ましくない酸化または脱アミド化が起こらないこと）。別の実施形態では、この物理的性質は、適切に折りたたまれた状態でタンパク質が存在することである（例えば、可溶性または不溶性の凝集物または沈着物が存在しないこと）。ある実施形態では、タンパク質の安定性は、タンパク質の生物物理学的性質をアッセイすることによって測定される。生物物理学的性質としては、例えば、熱安定性、ｐＨによるアンフォールディングプロフィール、安定にグリコシル化を起こさせないようにすること、可溶性、生化学的機能、（例えば、タンパク質（例えば、リガンド、受容体、抗原など）または化学部分などに結合する能力）、および／またはこれらの組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、生化学的機能は、相互作用の結合親和性によって示される。ある実施形態では、タンパク質の安定性の尺度は、熱安定性である（すなわち、熱的攻撃に対する抵抗性）。安定性は、当該技術分野で既知の方法および／または本明細書に記載の方法を用いて測定することができる。
【０１９７】
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子操作した抗体」は、重鎖または軽鎖の可変領域または両鎖の可変領域が、既知の特異性を有する抗体の１つ以上のＣＤＲと少なくとも部分的に交換することによって改変され、必要な場合、フレームワーク領域も部分的に交換し、配列を変化させる、抗体を指す。ＣＤＲは、フレームワーク領域の由来である抗体と同じ分類またはさらに同じ副分類の抗体由来であってもよいが、ＣＤＲは、異なる分類の抗体由来であること、好ましくは、異なる種類の抗体由来であることが想定される。既知の特異性を有する非ヒト抗体由来の１個以上の「ドナー」ＣＤＲが、ヒト重鎖フレームワーク領域または軽鎖フレームワーク領域にグラフト結合するように遺伝子操作された抗体は、「ヒト化抗体」と呼ばれる。ある可変領域の抗原結合性を他の領域に移すために、すべてのＣＤＲを、ドナー可変領域由来の完全なＣＤＲと交換することは必須ではない。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要な残基のみを移すだけでよい場合がある。この説明は、例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号および同第６，１８０，３７０号に記載されており、機能的な遺伝子操作された抗体またはヒト化抗体を得ることは、通常の実験を行うことによって、または試行錯誤によって、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１９８】
本明細書で使用するとき、用語「適切に折りたたまれたポリペプチド」は、ポリペプチドに含まれるすべての機能的な領域が、明確に活性であるようなポリペプチド（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体）を含む。本明細書で使用するとき、用語「不適切に折りたたまれたポリペプチド」は、ポリペプチドの機能的な領域のうち、少なくとも１つでも活性でないポリペプチドを含む。ある実施形態では、適切に折りたたまれたポリペプチドは、少なくとも１個のジスルフィド結合で接続したポリペプチド鎖を含む。逆に、不適切に折りたたまれたポリペプチドは、少なくとも１個のジスルフィド結合で接続していないポリペプチドを含む。
【０１９９】
用語「ポリヌクレオチド」は、単一の核酸並びに複数個の核酸も含むことを意図しており、核酸分子の単離物または構築物を指す（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ））。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合を含んでいてもよいし、一般的ではない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）でみられるようなアミド結合）を含んでいてもよい。用語「核酸」は、任意の１個以上の核酸部分を指し、例えば、ポリヌクレオチド中に存在するＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡフラグメントを指す。核酸またはポリヌクレオチドの「単離物」とは、天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。例えば、ベクターに含まれるＩＧＦ−１Ｒ結合分子をコードする組み換えポリヌクレオチドは、本発明の目的では単離物と考える。ポリヌクレオチドの単離物の例をさらに挙げると、異種宿主細胞中に存在する組み換えポリヌクレオチド、または溶液中で（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドがある。ＲＮＡ分子の単離物としては、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物が挙げられる。本発明のポリヌクレオチド単離物または核酸単離物には、合成によって作られたそのような分子も含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーターのような制御因子であってもよいし、このような制御因子を含んでいてもよい。
【０２００】
本明細書で使用するとき、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）はアミノ酸には変換されないが、コード領域の一部であると考えてよい。一方、任意のフランキング配列（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなど）は、コード領域の一部分ではない。本発明の２箇所以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物（例えば、単一のベクター）に存在してもよく、別個のポリヌクレオチド構築物（例えば、別個の（異なる）ベクター）に存在してもよい。さらに、ベクターは、１箇所のコード領域を含んでいてもよいし、２箇所以上のコード領域を含んでいてもよい。例えば、１個のベクターが、免疫グロブリンの重鎖可変領域をコードし、それとは別に軽鎖可変領域をコードしてもよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、異種コード領域をコードしてもよく、ＩＧＦ−１Ｒ結合分子またはそのフラグメント、改変体または誘導体をコードする核酸に融合していてもよく、融合していなくてもよい。異種コード領域としては、限定されないが、同定または精製を容易にし得る分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメイン（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ）またはタグのような特殊な要素またはモチーフが挙げられる。
【０２０１】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、ＤＮＡ分子である。ＤＮＡである場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常は、プロモーターおよび／または他の転写制御要素または翻訳制御要素を含んでいてもよく、これらの要素は、１箇所以上のコード領域と作動可能に連結している。作動可能な連結とは、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）を作るためのコード領域が、制御配列の影響下または制御下で遺伝子産物を発現するような様式で、１つ以上の制御配列と連結していることである。プロモーター機能が誘発されることによって、所望な遺伝子産物をコードするｍＲＮＡが転写される場合、２個のＤＮＡフラグメントが結合することによって、発現制御配列が、遺伝子産物を直接的に発現させる性質を妨害しない場合、またはＤＮＡテンプレートの転写を妨害しない場合、２個のＤＮＡフラグメント（例えば、ポリペプチドコード領域と、この領域に連結するプロモーター）は、「作動可能に連結して」いる。したがって、プロモーターによって、ポリペプチドをコードする核酸を転写させることが可能な場合、このプロモーター領域は、この核酸と作動可能に連結している。プロモーターは、所定の細胞内でのみＤＮＡを実質的に転写する、細胞特異的なプロモーターであってもよい。プロモーター以外の転写制御要素（例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写停止シグナル）は、ポリヌクレオチドと作動可能に連結し、細胞特異的な転写に直接かかわることができる。好適なプロモーターおよび他の転写制御領域を、本明細書に開示している。
【０２０２】
種々の転写制御領域は、当業者に既知である。転写制御領域としては、限定されないが、脊椎動物の細胞で機能する転写制御領域（例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター部分およびエンハンサー部分（ＩＥ期プロモーター、イントロン−Ａと組み合わせる）、サルウイルス４０（初期プロモーター）およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物の遺伝子に由来するもの、例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ−グロブリンや、真核細胞で発現する遺伝子を制御可能な他の配列が挙げられる。好適な転写制御領域のさらなる例としては、組織特異的なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘発性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘発されるプロモーター）が挙げられる。
【０２０３】
同様に、当業者にとって、種々の転写制御要素が既知である。転写制御要素の例としては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび停止コドン、およびピコルナウイルスに由来する要素（特に、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。
【０２０４】
他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。
【０２０５】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする別のコード領域と連結していてもよく、この別のコード領域によって、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが分泌する。シグナル仮説によれば、哺乳動物の細胞で分泌したタンパク質は、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有しており、成長したタンパク質鎖が、粗面小胞体から外に運ばれると、この部分は、成熟タンパク質から開裂する。当業者ならば、脊椎動物の細胞で分泌したポリペプチドは、一般的に、ポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチドが融合しており、完全なポリペプチドまたは「全長」ポリペプチドが開裂し、ポリペプチドの分泌物または「成熟」形態を生成することを知っている。特定の実施形態では、未処理のシグナルペプチド（例えば、免疫グロブリンの重鎖シグナルペプチドまたは軽鎖シグナルペプチド）を使用するか、またはポリペプチドに作動可能に連結し、ポリペプチドを分泌させる能力を保持した、この配列の機能的誘導体を使用する。あるいは、異種哺乳動物のシグナルペプチドまたはその機能的誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列と置換してもよい。
【０２０６】
本明細書で使用するとき、核酸またはポリペプチド分子について記載する場合、用語「遺伝子操作された」は、合成手段によって（例えば、組み換え技術、インビトロペプチド合成によって、ペプチドの酵素カップリングまたは化学カップリングによって、またはこれらの技術のいくつかの組み合わせによって）操作された核酸またはポリペプチド分子を指す。
【０２０７】
本明細書で使用するとき、用語「接続して」、「融合して」または「融合」は、同じ意味で使用される。これらの用語は、化学的なコンジュゲーションまたは組み換え手段を含むいかなる手段であってもよいが、２個以上の要素または成分が一緒になることを意味する。「フレーム内で融合」は、２個以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、元々のＯＲＦの正しい翻訳リーディングフレームを維持するような様式で接続して、長くなった連続ＯＲＦを得ることを指す。したがって、組み換え融合タンパク質は、元々のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２個以上の部分（この部分は、通常は天然では接続していない）を含有する、１個のタンパク質である。リーディングフレームは、融合した部分全体に連続的に作成されるが、各部分は、例えば、フレーム内のリンカー配列によって物理的または空間的に分割されていてもよい。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、フレーム内で融合していてもよいが、「融合した」ＣＤＲが、連続ポリペプチドの一部分として一緒に翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって分割されていてもよい。
【０２０８】
ポリペプチドの文脈で、「直鎖状配列」または「配列」は、ポリペプチド中のアミノ酸の順序を、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって示すものであり、この配列で互いに隣接する残基は、ポリペプチドの一次構造では連続している。
【０２０９】
用語「発現」は、本明細書で使用するとき、遺伝子が、生化学物質（例えば、ＲＮＡまたはポリペプチド）を産生するプロセスを指す。このプロセスは、細胞内で遺伝子が機能的に存在するような明らかな徴候を含む（限定されないが、遺伝子ノックダウン、および一過性発現および安定な発現）。限定されないが、遺伝子を、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意のＲＮＡ産物に転写すること、および上述のｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳することが挙げられる。最終的な所望の生成物が生化学物質である場合、発現は、この生化学物質と任意の前駆体を作出することを含む。遺伝子の発現によって「遺伝子産物」が得られる。本明細書で使用するとき、遺伝子産物は、核酸（例えば、遺伝子の転写によって産生するメッセンジャーＲＮＡ）であってもよく、転写物から翻訳されるポリペプチドであってもよい。本明細書で記載の遺伝子産物は、転写後に改変（例えば、ポリアデニル化）した核酸、または翻訳後に改変（例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットと結合、タンパク質開裂など）したポリペプチドを含む。
【０２１０】
本明細書で使用するとき、用語「治療する」または「治療」は、治療のための処置、および予防または防止のための手段を指し、望ましくない生理学的変化または障害（例えば、癌の進行または広がり）を予防するか、または遅らせる（弱める）ことを目的としている。有益な臨床結果または望ましい臨床結果としては、限定されないが、検出できるかできないかを問わず、症状の軽減、疾患の軽症化、疾患状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患の進行を遅らせるか、弱めること、疾患状態の改善または緩和、および回復（部分的または全体的に）が挙げられる。「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存時間と比較して、生存時間が伸びることを意味し得る。治療が必要な対象としては、すでに、ある状態や障害に罹患しているもの、およびその状態または障害になるおそれがあるもの、またはその状態または障害を予防すべきものが挙げられる。
【０２１１】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後、または治療が望ましい任意の対象、特に哺乳動物の対象を意味する。哺乳動物対象としては、ヒト、家畜動物、農場の動物、および動物園の動物、スポーツ用動物、またはペット用動物（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などが挙げられる。
【０２１２】
本明細書で使用するとき、「結合分子を投与することが有益な対象」および「治療が必要な動物」といった句は、例えば、結合分子によって認識される抗原を検出するために（例えば、診断手順で）結合分子を投与することが有益な対象（例えば、哺乳動物対象）、および／または所与の標的タンパク質に特異的に結合する結合分子で治療する（すなわち、癌のような疾患を緩和または予防する）ことが有益な対象（例えば、哺乳動物対象）を含む。本明細書に詳細に記載しているように、結合分子は、複合体ではない形態で使用してもよく、（例えば、薬物、プロドラッグまたは同位体との）複合体の形態で使用してもよい。
【０２１３】
「過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害」とは、悪性あるいは良性の、あらゆる形質転換した細胞および組織、およびすべての癌細胞および癌組織を含む、あらゆる新生物細胞の成長および増殖を意味する。過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害としては、限定されないが、前癌病変、異常な細胞成長、良性の腫瘍、悪性の腫瘍および「癌」が挙げられる。本発明の特定の実施形態では、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害、例えば、前癌病変、異常な細胞成長、良性の腫瘍、悪性の腫瘍および「癌」は、ＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞、ＩＧＦ−１Ｒを過剰発現する細胞、またはＩＧＦ−１Ｒを異常なレベルで発現する細胞を含む。
【０２１４】
過剰増殖性疾患、過剰増殖性障害および／または過剰増殖状態のさらなる例としては、限定されないが、良性あるいは悪性の、以下の場所にある新生物が挙げられる。前立腺、結腸、腹部、骨、胸、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭、首、神経（中枢神経系および末梢神経系）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部または尿生殖路。このような新生物は、特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰に発現するか、または異常なレベルで発現する。
【０２１５】
他の過剰増殖性障害としては、限定されないが、上に列挙した臓器系に存在する、高ガンマグロブリン血、リンパ球増殖障害、タンパク異常血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、および新生物以外の任意の他の過剰増殖性疾患が挙げられる。本発明の特定の実施形態では、この疾患は、ＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰に発現するか、または異常なレベルで発現する細胞を含む。
【０２１６】
本明細書で使用するとき、用語「腫瘍」または「腫瘍組織」は、過剰な細胞分化から生じた異常な組織の塊を指し、特定の場合、ＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰に発現するか、または異常なレベルで発現する細胞を含む組織を指す。腫瘍または腫瘍組織は、異常な成長特性を有する新生物細胞であり、体内で有用な機能をもたない「腫瘍細胞」を含む。腫瘍、腫瘍組織および腫瘍細胞は、良性または悪性であり得る。腫瘍または腫瘍組織は、「腫瘍に関連する腫瘍ではない細胞」、例えば、腫瘍または腫瘍組織を供給する血管を形成する血管細胞を含み得る。腫瘍ではない細胞は、腫瘍細胞によって複製され、成長するように誘発され得、例えば、腫瘍または腫瘍組織における血管形成の誘発がその例である。
【０２１７】
本明細書で使用するとき、用語「悪性細胞」は、良性ではない腫瘍または癌を指す。本明細書で使用するとき、用語「癌」は、細胞死の制御がはずれたか、または制御不能になったことを特徴とする悪性細胞を含む、ある種の過剰増殖性疾患を暗示する。癌の例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ球の悪性細胞が挙げられる。癌のさらに特定の例を、以下に示し、以下のものが挙げられる。有棘細胞癌（例えば、扁平上皮細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺の有棘細胞癌を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸の癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｒｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、膠芽細胞腫、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肛門癌、陰茎癌、および頭頸部癌。用語「癌」は、原発性の悪性細胞または腫瘍（例えば、他の元々の悪性細胞または腫瘍がある位置以外の、対象の体内の位置に移動していないもの）、および二次的な悪性細胞または腫瘍（例えば、他の元々の腫瘍がある位置とは異なる第２の場所に、悪性細胞または腫瘍細胞が転移し、移動して生じるもの）を含む。本発明の治療方法の助けとなる癌は、ＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰に発現するか、または異常なレベルで発現する細胞を含む。
【０２１８】
癌または悪性細胞の他の例としては、限定されないが、小児急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟部組織の肉腫、エイズ関連リンパ腫、エイズ関連悪性細胞、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨肉腫、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、乳癌、腎盂および尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、脳の星状細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝臓癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹グリオーマ、小児小脳星状細胞腫、小児の脳の星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視経路の膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児のテント上未分化神経外胚葉性および松果体腫瘍、小児原発性肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児の視経路および視床下部の膠腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、直腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、膵島細胞癌、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連腫瘍、膵外分泌部の腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性の乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸のカルチノイド腫瘍、胃腸の腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、有毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内黒色腫、島細胞癌、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇及び口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、男性の乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性の原発不明扁平上皮頸癌、転移性の原発性扁平上皮頸癌、転移性扁平上皮頸癌（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ）、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫、骨髄形成異常症候群、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、妊娠期の非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌（Ｎｏｎｍｅｌａｎｏｍａ  Ｓｋｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平上皮頸癌（Ｏｃｃｕｌｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、骨／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣境界型腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、紫斑、上皮小体癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫／多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盤および尿管の癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮頸癌、胃癌、���ント上未分化神経外胚葉性および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行上皮癌、移行性の腎盂および尿管の癌、栄養膜腫瘍、尿管および腎盤細胞の癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣の癌、視路および視床下部グリオーマ、外陰部の癌、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、ウィルムス腫、および上に列挙した臓器に存在する任意の他の過剰増殖性疾患、新生物が挙げられる。
【０２１９】
本発明の方法を使用し、前癌状態を治療することができ、新生物または悪性細胞（限定されないが、上述の障害が挙げられる）に進行するのを予防することができる。このような用途が示されるのは、新生物または癌に進行することが知られているか、または疑わしい状況であり、特に、過形成、化生からなる新生物性ではない細胞成長、または最も特定的には、形成異常が起こっている状況である（このような異常な成長状態の概説としては、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｇｅｌｌ、Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２ｄ  Ｅｄ．、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ｐｐ．６８−７９（１９７６）を参照。ＩＧＦ−１Ｒを発現し始めるか、過剰に発現し始めるか、または異常なレベルで発現し始めるこのような状態は、本発明の方法で治療するのに特に好ましい。
【０２２０】
過形成は、細胞増殖が制御されている一種の形態であり、細胞の構造または機能が顕著に変わることなく、組織または臓器の細胞数が増加することを含む。本発明の方法で治療可能な過形成障害としては、限定されないが、脈管濾胞性縦隔リンパ節増殖、好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症、非定型メラニン細胞過形成、基底細胞過形成、良性巨大リンパ節増殖、セメント質過形成、先天性副腎過形成、先天性脂腺増生症、嚢胞性増殖、乳房嚢胞性過形成、義歯性線維症、導管過形成、子宮内膜過形成、線維筋過形成、局所性上皮肥厚、歯肉増殖、炎症性線維性過形成、炎症性乳頭状過形成、血管内乳頭状内皮過形成、結節性前立腺過形成、結節性再生過形成、偽上皮腫性増殖、老年性脂腺増生症、ならびに疣贅性肥厚が挙げられる。
【０２２１】
化生は、細胞増殖が制御されている一種の形態であり、成熟細胞または完全に分化したある種の細胞が、別の種類の成熟細胞に変わったものである。本発明の方法で治療可能な化生としては、限定されないが、原因不明骨髄様化生、アポクリン化生、非定型化性（ａｔｙｐｉｃａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）、自己実質化生、結合組織化生、上皮化生、腸上皮化生、化生性貧血、変形骨化、形成異常性ポリープ、骨髄化生、原発性骨髄様化生、二次性骨髄様化生、扁平化生、羊膜の扁平化生、および症候性骨髄化生が挙げられる。
【０２２２】
形成異常は、頻繁に起こる癌の前兆であり、主に上皮に生成する。形成異常は、新生物性ではない細胞成長の中で、もっとも障害の大きな形態であり、個々の細胞の均一性が失われており、構造上の配置も乱れている。形成異常細胞は、異常に大きく、深く染色される核を有し、多態性を呈する。形成異常は、慢性的に刺激または炎症が起こる場所で特徴的に生じる。本発明の方法で治療可能な形成異常としては、限定されないが、無汗性外胚葉性形成異常、前後形成異常、窒息性胸郭形成異常、心房指（ａｔｒｉｏｄｉｇｉｔａｌ）形成異常、気管支肺形成異常症、終脳形成異常、子宮頸部形成異常、軟骨外胚葉性形成異常、鎖骨頭蓋骨形成不全、先天性外胚葉性形成異常、頭蓋骨幹形成異常、頭蓋骨手根骨足根骨形成不全、頭蓋骨幹端形成異常、ぞうげ質形成異常症、骨幹形成異常、外胚葉性形成異常、エナメル質形成異常、脳−眼球形成異常（ｅｎｃｅｐｈａｌｏ−ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、足根骨肥大、多発性骨端形成異常、点状骨端形成異常、上皮形成異常、顔面指趾生殖器形成異常、家族性顎骨の線維性形成障害、家族性白色襞性形成異常、線維筋性形成異常、線維性骨形成異常、開花性骨形成異常症、遺伝性腎性−網膜性形成異常（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｒｅｎａｌ−ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、発汗性外胚葉性形成異常、無汗性外胚葉形成異常症、リンパ球減少性胸腺形成異常、乳房形成異常、顎顔面形成異常、骨幹端形成異常、モンディーニ型内耳形成異常、単発性線維性形成異常、粘膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼脊椎形成異常、歯牙形成不全、眼下顎四肢形成不全、根尖性セメント質形成異常症、多発性線維性骨形成異常、偽軟骨発育不全脊椎骨端形成異常、網膜形成異常、中隔−視覚形成異常症、脊椎骨端形成異常、および心室橈骨形成異常が挙げられる。
【０２２３】
本発明の方法で治療可能なさらなる前腫瘍性障害としては、限定されないが、良性の異常増殖障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞状態、組織肥大、腸ポリープ、結腸ポリープ、および食道形成異常）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、および日光性角化症が挙げられる。
【０２２４】
好ましい実施形態では、本発明の方法を用い、過剰増殖性細胞の成長（例えば、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞の増殖をインビトロまたはインビボで）を阻害し、癌の進行および／または転移（特に、上に列挙したもの）を抑制する。
【０２２５】
さらなる過剰増殖性疾患、過剰増殖性障害および／または過剰増殖性状態としては、以下の進行および／または転移が挙げられるが、これらに限定されない。悪性腫瘍および関連する障害（例えば、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄性白血病（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病を含む））、ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（顆粒球性白血病）および慢性リンパ性白血病）を含む）、真性赤血球増加、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、Ｈ鎖病、および固形腫瘍（これらは、以下が挙げられるが、これらに限定されない：肉腫および癌（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮性肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫、頚部癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫（ｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、聴神経鞘腫（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｍａ）、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽腫、ならびに網膜芽腫））。
【０２２６】
（ＩＩ．ＩＧＦ系）
ＩＧＦ系は、細胞増殖、分化、アポトーシスおよび細胞の形質転換の制御に重要な役割を果たしており（Ｊｏｎｅｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖ．１９９５．１６：３−３４）、腫瘍細胞が、ＩＧＦ系の１つ以上の要素を産生することが示されている。ＩＧＦ系は、インスリン様成長因子受容体１（ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２２１）、インスリン様成長因子受容体２（ＩＧＦ−２Ｒ、ＣＤ２２２）という互いに関連しない２種類の受容体と、インスリン様成長因子１の２種類のリガンド（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）と、数種類のＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１〜ＩＧＦＢＰ−６）とで構成されており、これらのタンパク質は、ＩＧＦ１Ｒから離れた位置での細胞内シグナル伝達に関与しており、インスリン受容体基質（ＩＲＳ）ファミリー、ＡＫＴ、ラパマイシンの標的（ＴＯＲ）およびＳ６キナーゼを含む。さらに、大きなＩＧＦＢＰプロテアーゼの群（例えば、カスパーゼ、メタロプロテイナーゼ、前立腺特異抗原）は、ＩＧＦに結合したＩＧＦＢＰを加水分解し、ＩＧＦを遊離させ、このＩＧＦが、ＩＧＦ−１ＲおよびＩＧＦ−２Ｒと相互作用する。ＩＧＦ系は、インスリンおよびインスリン受容体（ＩｎｓＲ）とも密接に関連がある（Ｍｏｓｃｈｏｓら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２００２．６３：３１７−３２、Ｂａｓｅｒｇａら、Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３．１０７：８７３−７７、Ｐｏｌｌａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ．２００４．４．４：５０５−５１６）。
【０２２７】
（ａ）ＩＧＦ−１
ＩＧＦ−１は、血中ホルモンであり、組織成長因子であるという両方の特性を有する。循環血中に存在するＩＧＦ−１のほとんどは肝臓で作られるが、現在では、ＩＧＦ−１が、オートクリンおよびパラクリンの作用機序が重要な他の臓器で合成されることも分かっている。ＩＧＦ−１のシグナル伝達によって、細胞の増殖が刺激され、細胞の生存期間が延びる。循環血中ＩＧＦ−１濃度が正常値よりも高くなると、乳癌（Ｈａｎｋｉｎｓｏｎら、Ｌａｎｃｅｔ  １９９８．３５１：１３９３−６）、前立腺癌（Ｃｈａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８．２７９：５６３−６）、肺癌（Ｙｕら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９９．９１：１５１−６）、および結腸直腸癌（Ｍａら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９９．９１：６２０−５）などのいくつかの一般的な癌にかかる危険性が上昇することが、多くの疫学的研究から分かってきている。
【０２２８】
（ｂ）ＩＧＦ−２
循環血中ＩＧＦ−２濃度が高まると、子宮内膜癌のリスクが高まることも分かっている（Ｊｏｎａｔｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ＆  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．２００４．１３：７４８−５２）。ＩＧＦ２も、肝臓で発現し、肝外部位でも発現する。インビトロ試験では、腫瘍細胞がＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２を産生し得ることが示されたが、トランスレーショナル研究では、腫瘍においてＩＧＦ−２の方が関連性が高く、一般的に、発現されるＩＧＦであることが示された。この事象は、腫瘍において、エピジェネティックな変化によって、サイレンシングされたＩＧＦ−２アリルがインプリンティング消失（ＬＯＩ）する結果、ＩＧＦ−２遺伝子の両アレルが発現することによるものである（Ｆｉｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００４．４：１４３−５３、Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉら、Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．２００３．３５：６９４−０４、Ｄｅ  Ｓｏｕｚａら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．ら、１９９７．  １１：６０−７）。この結果、癌細胞へのＩＧＦ−２供給量が増加し、腫瘍成長を支える微細環境へのＩＧＦ−２供給量が増加する。
【０２２９】
（ｃ）ＩＧＦ−１Ｒ
ＩＧＦ１もＩＧＦ２も、ＩＧＦ−１Ｒのリガンドであり、ＩＧＦ−１Ｒは、細胞表面チロシンキナーゼシグナル伝達分子である。ＩＧＦ−１Ｒは、当技術分野では、ＣＤ２２１  およびＪＴＫ１３の名称でも知られている．  ＩＧＦ−１Ｒに対してリガンドが結合した後、増殖および細胞生存を促す細胞内シグナル伝達経路が活性化する。ＩＧＦ−１Ｒの最初のリン酸化標的としては、ＩＲＳタンパク質、およびその下流にあるシグナル伝達分子（ホスファチジルイノシトール  ３−キナーゼ、ＡＫＴ、ＴＯＲ、Ｓ６キナーゼおよびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ））が挙げられる。
【０２３０】
ＩＧＦ−１Ｒは、ＩｎｓＲと構造的にきわめて関連性がある（Ｐｉｅｒｒｅ  Ｄｅ  Ｍｅｙｔｓ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２００２、１：７６９−８３）。  ＩＧＦ−１Ｒは、キナーゼ領域でＩｎｓＲとの配列同一性が８４％であり、一方、膜近傍領域での同一性は６１％であり、Ｎ末端領域での同一性は４４％である（Ｕｌｒｉｃｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９８６、５：２５０３−１２、Ｂｌａｋｅｓｌｅｙら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．、１９９６．７：１５３−５６）。ＩＧＦ−１ＲとＩｎｓＲとの同一性が高いにもかかわらず、両者の生体での役割は全く異なっていることを示唆する証拠がある。ＩｎｓＲは、グルコース輸送や、グリコーゲンおよび脂肪の生合成のような生理学的機能を制御する鍵物質であるのに対し、ＩＧＦ−１Ｒは、細胞の成長および分化を強く制御する物質である。ＩｎｓＲとは対照的に、ＩＧＦ−１Ｒは、組織に偏在的に発現し、組織内で、成長ホルモン（ＧＨ）の制御下（これはＩＧＦ−１を調製する）、組織成長に何らかの役割を果たす。  ＩＧＦ−１Ｒ活性化によって、正常な細胞成長が促進されることが分かっているが、実験で得られた証拠からは、ＩＧＦ−１Ｒが絶対要件ではないことが示唆されている（Ｂａｓｅｒｇａら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９９．２５３：１−６、Ｂａｓｅｒｇａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９９．１０７：８７３−７７）。癌細胞で、ＩＧＦ−１Ｒの活性化は、生存の促進、増殖に関するシグナル伝達に加え、細胞の移動性および侵襲性に関与していることも分かっている（Ｒｅｉｓｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００１．２０：４９０−５００、Ｎｏｌａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９７．７２：８２８−３４、Ｓｔｒａｃｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９．２６４：２１５４４−４９、Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００１．２０：７３１８−２５）。
【０２３１】
ＩＧＦ−１Ｒは、以下に含むが、それに特定されない多くの腫瘍細胞に発現される。膀胱腫瘍（Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．３４：８０３（２００３））；脳腫瘍（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８：１８２２（２００２））；乳房の腫瘍（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３０：３０７（１９９４）およびＨｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ．３６：４４８−４４９（２００５））；直腸腫瘍、例えば、腺癌、転移癌および腺腫（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．３０：１１２８（１９９９）、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ．Ａｒｃ．４４３：１３９（２００３）、およびＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：８４３（２００４））；胃腫瘍（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２１：７５５（２００４））；腎腫瘍、例えば、明細胞、嫌色素性細胞、乳頭状ＲＣＣ（Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１２２：９３１−９３７（２００４））；肺腫瘍（Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．３４：８０３−８０８（２００３））およびＪ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌ．１１９：６６５−６６８（１９９３））；卵巣腫瘍（Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．３４：８０３−８０８（２００３））；膵臓腫瘍、例えば、膵管腺癌（Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｓｃｉ．４８：１９７２−１９７８（２００３）およびＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：３２３３−３２４２（２００５））；および前立腺腫瘍（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：２９４２−２９５０（２００２））。
【０２３２】
ＩＧＦ−１Ｒの分子構造は、２つの細胞外αサブユニット（１３０〜１３５ｋＤ）と、細胞質のキナーゼ触媒領域を含む２つの膜貫通型βサブユニット（９５ｋＤ）とで構成されている。ＩＧＦ−１Ｒは、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）と同様に、ジスルフィド結合で結合した共有結合ダイマー（α２β２）構造を有するという点で他のＲＴＫ群とは異なっている（Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｊ．およびＣｚｅｃｈ，Ｍ．Ｐ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：５０３８−５０４５（１９９２））。ＩＧＦ−１Ｒ細胞外領域は、以下の順序で結合した６個のタンパク質ドメインからなっている。Ｎ−末端にあるロイシンに富む繰り返しドメイン（Ｌ１）；システインに富む繰り返しドメイン（ＣＲＲ）；第２のロイシンに富む繰り返しドメイン（Ｌ２）；およびＦｎＩＩＩ−１、ＦｎＩＩＩ−２およびＦｎＩＩＩ−３で示される３種類のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（図１を参照）。
ヒトＩＧＦ−１Ｒ  ｍＲＮＡの核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０００８７５（ｇｉ  ｜１１９２２０５９３）で入手可能である。前駆体のポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０００８６６（ｇｉ  ４５５７６６５）で入手可能である。アミノ酸１〜３０は、ＩＧＦ−１Ｒシグナルペプチドをコードすることが報告されており、アミノ酸３１〜７４０は、ＩＧＦ−１Ｒ  αサブユニットをコードすることが報告されており、アミノ酸７４１〜１３６７は、ＩＧＦ−１Ｒ  βサブユニットをコードすることが報告されている。成熟ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドは、ＩＧＦ１−Ｒシグナルペプチドを含んでいない。したがって、本明細書のＩＧＦ−１Ｒアミノ酸の付番は、図２（配列番号２）で示したヒトＩＧＦ−１Ｒの成熟形態のアミノ酸配列を指す。この配列のドメインの構造を表２に示す。
【０２３３】
表２
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【０２３４】
（ＩＩＩ．ＩＧＦ−１Ｒ結合部分）
本発明の結合分子のＩＧＦ−１Ｒ結合部分は、１つ以上の出発物質または親物質である抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する抗原認識部位、全可変領域または１個以上のＣＤＲ（例えば、６個のＣＤＲ）を含んでいてもよい。親抗体は、天然の抗体または抗体フラグメント、ならびに天然のＩＧＦ−１Ｒ抗体から改変された抗体または抗体フラグメントを含んでいてもよい。結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒの標的分子に特異的であることが知られているＩＧＦ−１Ｒ抗体または抗体フラグメントの配列を用い、ｄｅ  ｎｏｖｏで構築される抗ＩＧＦ−１Ｒに由来するものであってもよい。親抗体に由来し得る配列としては、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域、および／またはＣＤＲ、フレームワーク領域またはこれらのそれ以外の一部分が挙げられる。
【０２３５】
特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒ、または上述のフラグメントまたは改変体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合し（すなわち、無関係なエピトープに結合したり、エピトープに無作為に結合したりするよりも、あるエピトープに容易に結合し）は、ＩＧＦ−１Ｒ、または上述のフラグメントまたは改変体の少なくとも１つのエピトープに選択的に結合し（すなわち、あるエピトープに対し、関連するエピトープ、同様のエピトープ、同種のエピトープ、または類似のエピトープに結合するよりも容易に結合し）、ＩＧＦ−１Ｒ、または、それ自体が上述のフラグメントまたは改変体の特定のエピトープに特異的または選択的に結合する参照抗体の結合を競合的に阻害するか、またはＩＧＦ−１Ｒ、または上述のフラグメントまたは改変体の少なくとも１つのエピトープに、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）が、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満で結合する。
【０２３６】
特定の態様では、ＩＧＦ−１Ｒ結合部分は、マウスＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントよりも、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに選択的に結合する。別の特定の態様では、ＩＧＦ−１Ｒ結合部分は、１つ以上のＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント（例えば、１つ以上の哺乳動物ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド）に選択的に結合するが、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）ポリペプチドには結合しない。ある実施形態では、本発明の結合分子の結合部分は、ＩｎｓＲと交差反応しない。
【０２３７】
特定の実施形態では、結合部分は、５×１０−２秒−１以下、１０−２秒−１以下、５×ｌ０−３秒−１以下、またはｌ０−３秒−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントまたは改変体に結合する。または、ＩＧＦ−１Ｒ結合部分は、５×１０−４秒−１以下、１０−４秒−１以下、５×１０−５秒−１以下、または１０−５秒−１以下、５×１０−６秒−１以下、１０−６秒−１以下、５×１０−７秒−１以下、または１０−７秒−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントまたは改変体に結合する。他の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ結合部分は、１０３Ｍ−１秒−１以上、５×１０３Ｍ−１秒−１以上、１０４Ｍ−１秒−１以上、または５×１０４Ｍ−１秒−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントまたは改変体に結合する。または、ＩＧＦ−１Ｒ結合部分は、１０５Ｍ−１秒−１以下、５×１０５Ｍ−１秒−１以下、１０６Ｍ−１秒−１以下、または５×１０６Ｍ−１秒−１以下、または１０７Ｍ−１秒−１以下の結合速度（ｋ（ｏｎ））で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントまたは改変体に結合する。
【０２３８】
種々の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒ活性を拮抗する作用がある。特定の実施形態では、例えば、腫瘍細胞で発現するＩＧＦ−１Ｒに対し、ＩＧＦ−１Ｒ結合部分が結合すると、以下の活性のうち、少なくとも１つを示す。インスリン成長因子（例えば、ＩＧＦ−１、またはＩＧＦ−２、またはＩＧＦ−１とＩＧＦ−２の両方）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害する；ＩＧＦ−１Ｒの内在化を促進し、シグナル変換能を阻害する；ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する；ＩＧＦ−１Ｒシグナル変換経路の下流にある分子（例えば、Ａｋｔまたはｐ４２／４４  ＭＡＰＫ）のリン酸化を阻害する；腫瘍細胞の増殖を阻害する；腫瘍細胞の運動を阻害する；および／または腫瘍細胞の転移を阻害する。
【０２３９】
ある実施形態では、結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体分子の重鎖または軽鎖にＣＤＲを少なくとも１箇所含む。別の実施形態では、結合部分は、１種以上の抗体分子に由来する、少なくとも２箇所のＣＤＲを含む。別の実施形態では、結合部分は、１種以上の抗体分子に由来する、少なくとも３箇所のＣＤＲを含む。別の実施形態では、結合部分は、１種以上の抗体分子に由来する、少なくとも４箇所のＣＤＲを含む。別の実施形態では、結合部分は、１種以上の抗体分子に由来する、少なくとも５箇所のＣＤＲを含む。別の実施形態では、結合部分は、１種以上の抗体分子に由来する、少なくとも６箇所のＣＤＲを含む。本発明の目的のＩＧＦ−１Ｒ結合部分（または結合分子）に含まれ得るＣＤＲの例を本明細書に記載している（例えば、表３および表４を参照）。
【０２４０】
目的のＩＧＦ−１Ｒ抗体分子（または結合部分）に、少なくとも１箇所のＣＤＲが含み得る抗体分子の例を本明細書に記載している。特定の実施形態では、重鎖および／または軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を調査し、当該技術分野で周知の方法によって、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を特定してもよい（例えば、他の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列と比較し、配列の超可変性を決定する）。一般的な組み換えＤＮＡ技術を用い、１つ以上のＣＤＲをフレームワーク領域に挿入してもよい（例えば、ヒトフレームワーク領域に挿入し、非ヒト抗体をヒト化する）。フレームワーク領域は、天然のものであっても、またはコンセンサスフレームワーク領域であってもよく、好ましくは、ヒトフレームワーク領域である（例えば、ヒトフレームワーク領域のリストは、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照）。好ましくは、フレームワーク領域とＣＤＲとを組み合わせて作成したポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド（例えばＩＧＦ−１Ｒ）の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、１つ以上のアミノ酸置換を、フレームワーク領域内で実施してよく、好ましくは、このアミノ酸置換によって、抗原への抗体の結合性が高まる。さらに、この方法を使用し、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域にあるシステイン残基のアミノ酸を置換するか、または欠失させ、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠いた抗体分子を作成してもよい。ポリヌクレオチドに対する他の改変も本発明に包含され、当該技術分野の技術の範囲内である。
【０２４１】
ある実施形態では、本発明は、結合分子または結合部分をコードするポリヌクレオチドの単離物を与える。このポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、核酸から本質的になるか、または核酸からなり、この重鎖可変領域の少なくとも１個のＣＤＲ、またはこの重鎖可変領域の少なくとも２個のＣＨ−ＣＤＲが、本明細書に開示したモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２またはＶＨ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である。したがって、本発明の結合部分（または結合分子）は、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含んでいてもよい。あるいは、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２またはＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示したモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である。したがって、この実施形態によれば、重鎖可変領域（例えば、本発明の結合分子または結合部分の重鎖可変領域）は、表３に示したポリペプチド配列に関連する、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２またはＶＨ−ＣＤＲ３のポリペプチド配列を有する。
【０２４２】
表３  ：  ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列＊
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＊Ｋａｂａｔシステムで決定した（上述）。
Ｎ  ＝ヌクレオチド配列、Ｐ＝  ポリペプチド配列。
【０２４３】
当該技術分野で知られているように、２個のポリペプチド間または２個のポリヌクレオチド間の「配列同一性」は、片方のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアミノ酸配列または核酸配列と、第２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列とを比較することによって決される。本明細書で記載する場合、任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％同一であることは、当該技術分野で既知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェアを用いて決定することができる（例えば、限定されないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１））。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所同一性アルゴリズムを使用し、２個の配列間の同一性が最も良好な部分を見つける。特定の配列が、例えば、本発明の参照配列と９５％同一であることを決定するために、ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意のほかの配列アラインメントプログラムを用いる場合、言うまでもなく、参照ポリペプチド配列の全長にわたって同一性の％を算出し、参照配列の全アミノ酸数の５％までの同一性ギャップを許容するようにパラメーターを設定する。
【０２４４】
特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含む結合分子または結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。特定の実施形態では、ＶＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、このヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を変えることなく、配列が変更されている。例えば、所与の種でのコドン使用頻度を改良し、スプライス部分を除去するか、または制限酵素部位を除去するように、この配列が変更されてもよい。このような配列最適化法は、実施例に記載されており、周知であり、当業者が一般的に実施している方法である。
【０２４５】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、この核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなるポリヌクレオチド単離物を与える。ここで、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域またはＶＨ−ＣＤＲ３領域は、表３に示したＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２またはＶＨ−ＣＤＲ３の群と同一のポリペプチド配列を有する。したがって、本発明の結合部分（または結合分子）は、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含んでいてもよい。特定の実施形態では、上述のポリペプチドがコードするＶＨを含む結合分子または結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２４６】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含むか、またはこのＶＨから本質的になるか、またはこのＶＨからなる抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはこのようなモノクローナル抗体または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。
【０２４７】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含むか、またはこのＶＨから本質的になるか、またはこのＶＨからなる抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、または選択的に結合し、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合するか、または選択的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）は、約５×１０−２Ｍ以下、約１０−２Ｍ以下、約５×１０−３Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ以下、約１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１４Ｍ以下、約１０−１４Ｍ以下、約５×１０−１５Ｍ以下または約１０−１５Ｍ以下である。
【０２４８】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、ＶＬから本質的になるか、ＶＬからなる、ポリヌクレオチドの単離物を提供する。ここで、軽鎖可変領域の少なくとも１箇所のＶＬ−ＣＤＲ、または軽鎖可変領域の少なくとも２個のＶＬ−ＣＤＲが、本明細書に開示したモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である。あるいは、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示したモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である。したがって、この実施形態によれば、軽鎖可変領域（例えば、本発明の結合分子または結合部分の軽鎖可変領域）は、表４に示したポリペプチド配列に関連する、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３のポリペプチド配列を有する。
【０２４９】
表４  ：  参照ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列＊
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＊Ｋａｂａｔシステムで決定した（上述）。
ＰＮ＝ポリヌクレオチド配列、ＰＰ＝ポリペプチド配列。
【０２５０】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、核酸から本質的になるか、または核酸からなる、ポリヌクレオチド単離物を与える。ここで、ＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域またはＶＬ−ＣＤＲ３領域は、表４に示したＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３の群と同一である。したがって、本発明の結合部分（または結合分子）は、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含んでいてもよい。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含む結合分子（または結合部分）は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２５１】
さらなる態様では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、核酸から本質的になるか、または核酸からなる、ポリヌクレオチド単離物を与える。ここで、ＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域またはＶＬ−ＣＤＲ３領域は、表４に示したＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を有する。したがって、本発明の結合部分（または結合分子）は、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含んでいてもよい。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含む結合分子または結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２５２】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含むか、またはこのＶＬから本質的になるか、またはこのＶＬからなる抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはこのようなモノクローナル抗体または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。
【０２５３】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のＶＨポリペプチドを含むか、このＶＨポリペプチドから本質的になるか、またはこのＶＨポリペプチドからなる、抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、または選択的に結合し、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合するか、または選択的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）は、約５×１０−２Ｍ以下、約１０−２Ｍ以下、約５×１０−３Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約１０−１２Ｍ以下、約５×１０−１３Ｍ以下、約１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１４Ｍ以下、約１０−１４Ｍ以下、約５×１０−１５Ｍ以下または約１０−１５Ｍ以下である。
【０２５４】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８および６３からなる群から選択される参照ＶＨポリペプチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるＶＨをコードする核酸を含むか、またはこの核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。したがって、本発明の結合部分（または結合分子）は、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含んでいてもよい。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含む結合分子または結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２５５】
別の態様では、本発明は、配列番号４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８および６３からなる群から選択されるポリペプチド配列を有するＶＨをコードする核酸配列を含むか、またはこの核酸配列から本質的になるか、またはこの核酸配列からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。したがって、本発明の結合部分（または結合分子）は、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含んでいてもよい。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含む結合分子または結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２５６】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号３、８、１３、１８、１９、２４、２５、３０、３１、３６、３７、４２、４７、５２、５７および６２からなる群から選択される参照核酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるＶＨをコードする核酸を含むか、またはこの核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。したがって、本発明の結合部分（または結合分子）は、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含んでいてもよい。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含む結合分子または結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２５７】
別の態様では、本発明は、本発明のＶＨをコードする核酸配列を含むか、またはこの核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。ここで、ＶＨのアミノ酸配列は、配列番号４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８および６３からなる群から選択される。さらに、本発明は、本発明のＶＨをコードする核酸配列を含むか、またはこの核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。ここで、この核酸の配列は、配列番号３、８、１３、１８、１９、２４、２５、３０、３１、３６、３７、４２、４７、５２、５７および６２からなる群から選択される。したがって、本発明の結合部分（または結合分子）は、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含んでいてもよい。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含む結合部分または結合分子は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２５８】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含むか、このＶＨから本質的になるか、またはこのＶＨからなる、抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはこのようなモノクローナル抗体または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害するか、またはこのようなモノクローナル抗体が、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。
【０２５９】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含むか、またはこのＶＨから本質的になるか、またはこのＶＨからなる抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合するか、または選択的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）は、約５×１０−２Ｍ以下、約１０−２Ｍ以下、約５×１０−３Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約１０−１２Ｍ以下、約５×１０−１３Ｍ以下、約１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１４Ｍ以下、約１０−１４Ｍ以下、約５×１０−１５Ｍ以下または約１０−１５Ｍ以下である。
【０２６０】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号６８、７３、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１０８、１１３および１１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む参照ＶＬポリペプチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるＶＬをコードする核酸を含むか、またはこの核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号６７、７２、７７、８２、８７、９２、９７、１０２、１０７、１１２および１１７からなる群から選択される参照核酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるＶＬをコードする核酸を含むか、またはこの核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。したがって、本発明の結合部分（または結合分子）は、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含んでいてもよい。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含む結合部分または結合分子は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２６１】
別の態様では、本発明は、配列番号６８、７３、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１０８、１１３および１１８からなる群から選択されるポリペプチド配列を有するＶＬをコードする核酸配列を含むか、またはこの核酸配列から本質的になるか、またはこの核酸配列からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。さらに、本発明は、本発明のＶＬをコードする核酸配列を含むか、またはこの核酸から本質的になるか、またはこの核酸からなるポリヌクレオチドの単離物を含む。ここで、この核酸の配列は、配列番号６７、７２、７７、８２、８７、９２、９７、１０２、１０７、１１２および１１７からなる群から選択される。したがって、本発明の結合部分（または結合分子）は、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含んでいてもよい。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含む結合分子または結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２６２】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含むか、またはこのＶＬから本質的になるか、またはこのＶＬからなる抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはこのようなモノクローナル抗体または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。
【０２６３】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のポリヌクレオチドがコードするＶＨを含むか、またはこのＶＨから本質的になるか、またはこのＶＨからなる抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合するか、または選択的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）は、約５×１０−２Ｍ以下、約１０−２Ｍ以下、約５×１０−３Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約１０−１２Ｍ以下、約５×１０−１３Ｍ以下、約１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１４Ｍ以下、約１０−１４Ｍ以下、約５×１０−１５Ｍ以下または約１０−１５Ｍ以下である。
【０２６４】
上述のいずれのポリヌクレオチドも、例えば、コードされたポリペプチド、本明細書に記載の抗体の定常領域、または本明細書に記載の他の異種ポリペプチドを分泌させるシグナルペプチドをコードする、さらなる核酸を含んでもよい。
【０２６５】
さらに、本明細書の他の部分で詳細に記載するように、本発明は、上述の１つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物を含む。ある実施形態では、本発明は、第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドとを含む組成物を含み、第１のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＶＨポリペプチドをコードし、第２のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＶＬポリペプチドをコードする。特に、ＶＨポリヌクレオチドおよびＶＬポリヌクレオチドを含むか、これらのポリヌクレオチドから本質的になるか、またはこれらのポリペプチドからなる組成物。ここで、ＶＨポリヌクレオチドおよびＶＬポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４および６８、８および７３、１４および７８、２０および８３、２６および８８、３２および９３、３８および９８、４３および１０３、４８および１０８、５３および１０３、５８および１１３、ならびに６３および１１８からなる群から選択される参照ＶＬおよび参照ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一なポリペプチドをコードする。または、それぞれ、配列番号３および６７、８および７２、１３および７７、１８および７７、１９および８２、２４および８２、２５および８７、３０および８７、３１および９２、３６および９２、３７および９７、４２および１０２、４７および１０７、５８および１０２、５７および１１２、ならびに６２および１１７からなる群から選択される参照ＶＬおよび参照ＶＬ核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一なＶＬポリヌクレオチドを含むか、これらのポリヌクレオチドから本質的になるか、またはこれらのポリペプチドからなる組成物。特定の実施形態では、上述のポリヌクレオチドがコードするＶＨおよびＶＬを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒに選択的に結合する。
【０２６６】
このポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の方法で製造されてもよい。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知の場合、抗体をコードするポリヌクレオチドを、化学合成によって得たオリゴヌクレオチドからアセンブリしてもよく（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載）、簡単に説明すると、抗体をコードする配列の一部分を含有するオーバーラッピングオリゴヌクレオチドを合成する工程と、このオリゴヌクレオチドをアニーリングし、接続する工程と、接続したオリゴヌクレオチドをＰＣＲによって増幅させる工程とを含む。
【０２６７】
あるいは、ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするポリヌクレオチド、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体は、好適な供給源から得た核酸から作成してもよい。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンは入手できないが、抗体分子の配列は分かっている場合、この抗体をコードする核酸を化学合成してもよく、または好適な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリ、またはこのライブラリから作成したｃＤＮＡライブラリ、またはこの抗体または他のＩＧＦ−１Ｒ抗体を発現する任意の組織または細胞（例えば、抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞）から単離した核酸、好ましくは、ｐｏｌｙ  Ａ＋ＲＮＡ）から、上述の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって得てもよいし、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローン化し、例えば上述の抗体または他のＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするＤＮＡライブラリから得たｃＤＮＡクローンを特定することによって得てもよい。ＰＣＲによって作成された、増幅された核酸を、当該技術分野で周知の任意の方法を用い、この核酸を複製可能なクローン化ベクターへクローン化してもよい。
【０２６８】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を決定したら、ヌクレオチド配列を操作する技術分野で周知の方法（例えば、組み換えＤＮＡ技術、部位特異的な変異、ＰＣＲなど）を用い、そのヌクレオチド配列を操作し（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）およびＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９８）に記載されている方法を参照（この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる））、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作成してもよい（例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入を行う）。
【０２６９】
ＩＧＦ−１Ｒ結合分子をコードするポリヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよく、改変されたＲＮＡまたはＤＮＡであってもよく、改変されていないＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。例えば、ＩＧＦ−１Ｒ結合分子をコードするポリヌクレオチドは、単鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、単鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ、単鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、単鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとを含むハイブリッド分子で構成されていてもよく、このハイブリッド分子は、単鎖であってもよく、さらに典型的には二本鎖であってもよく、単鎖領域と二本鎖領域との混合物であってもよい。それに加え、ＩＧＦ−１Ｒ結合分子をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含むか、またはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三本鎖領域で構成されていてもよい。ＩＧＦ−１Ｒ結合分子をコードするポリヌクレオチドは、安定性または他の理由のために、１箇所以上の改変された塩基を含有していてもよく、または改変されたＤＮＡ骨格またはＲＮＡ骨格を含有していてもよい。「改変された」塩基としては、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンのような一般的ではない塩基が挙げられる。ＤＮＡおよびＲＮＡに対し、種々の改変がなされてもよい。このように、「ポリヌクレオチド」は、化学的に改変された形態、酵素によって改変された形態、または代謝によって改変された形態を包含する。
【０２７０】
免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリンの重鎖部分または軽鎖部分）に由来するポリペプチドの非天然改変体をコードするポリヌクレオチドの単離物は、免疫グロブリンのヌクレオチド配列に対し、１個以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入し、１個以上の置換、付加または欠失が、コードされるタンパク質に導入されることによって作成してもよい。突然変異は、部位特異的な変異およびＰＣＲによる変異のような標準的な技術によって導入してもよい。好ましくは、アミノ酸の同類置換は、１つ以上の非必須アミノ酸残基で行われる。
【０２７１】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体を構成するポリペプチドの単離物、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン分子に由来する、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗原結合領域をコードするアミノ酸配列）を含む。所定のタンパク質「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドの起源が何であるかを示す。特定の場合、特定のポリペプチド原料または原料のアミノ酸配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸の配列は、原料の配列またはその一部分と本質的に同一のアミノ酸配列を有し、この部分は、少なくとも１０〜２０アミノ酸、少なくとも２０〜３０アミノ酸、または少なくとも３０〜５０アミノ酸で構成されているか、または当業者が、他の方法を用いて、原料の配列に由来することを同定可能である数のアミノ酸で構成される。
【０２７２】
ある実施形態では、本発明は、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、ＶＨから本質的になるか、またはＶＨからなるポリペプチドの単離物を提供する。ここで、重鎖可変領域の少なくとも１箇所のＶＨ−ＣＤＲ、または重鎖可変領域の少なくとも２箇所のＶＨ−ＣＤＲが、本明細書に開示したモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２またはＶＨ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である。あるいは、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示したモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２またはＶＨ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である。このように、この実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、表３（前出）に示す群に関連するＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３のポリペプチド配列を含む。表３には、Ｋａｂａｔシステムで定義されたＣＨ−ＣＤＲが示されているが、他のＣＤＲの定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムで定義されたＶＨ−ＣＤＲも、本発明に含まれる。特定の実施形態では、ＶＨを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２７３】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、ＶＨから本質的になるか、またはＶＨからなるポリペプチドの単離物を提供する。ここで、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、表３に示したＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３と同一のポリペプチド配列を有する。特定の実施形態では、ＶＨを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２７４】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、ＶＨから本質的になるか、またはＶＨからなるポリペプチドの単離物を提供する。ここで、ＶＨ−ＣＤＲ１領域、ＶＨ−ＣＤＲ２領域およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、表３に示したＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３と同一のポリペプチド配列を有するが、任意の１つのＶＨ−ＣＤＲで、１個、２個、３個、４個、５個または６個のアミノ酸が置換されている。さらに大きなＣＤＲ（例えば、ＶＨ−ＣＤＲ−３）では、ＶＨ−ＣＤＲを含むＶＨが、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する限り、ＣＤＲ内でさらに置換されていてもよい。特定の実施形態では、アミノ酸置換は、同類置換である。特定の実施形態では、ＶＨを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２７５】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８および６３からなる群から選択される参照ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるＶＨポリペプチドを含むか、またはこのＶＨポリペプチドから本質的になるか、またはこのＶＨポリペプチドからなるポリペプチドの単離物を含む。特定の実施形態では、ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２７６】
別の態様では、本発明は、配列番号４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８および６３からなる群から選択されるＶＨポリペプチドを含むか、またはこのＶＨポリペプチドから本質的になるか、またはこのＶＨポリペプチドからなるポリペプチドの単離物を含む。特定の実施形態では、ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２７７】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のＶＨポリペプチドを含むか、このＶＨポリペプチドから本質的になるか、またはこのＶＨポリペプチドからなる、抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはこのようなモノクローナル抗体または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。
【０２７８】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のＶＨポリペプチドを含むか、このＶＨポリペプチドから本質的になるか、またはこのＶＨポリペプチドからなる、抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、選択的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合するか、または選択的に結合し、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）は、約５×１０−２Ｍ以下、約１０−２Ｍ以下、約５×１０−３Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約１０−１２Ｍ以下、約５×１０−１３Ｍ以下、約１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１４Ｍ以下、約１０−１４Ｍ以下、約５×１０−１５Ｍ以下または約１０−１５Ｍ以下である。
【０２７９】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、ＶＬから本質的になるか、またはＶＬからなるポリペプチドの単離物を提供する。ここで、軽鎖可変領域の少なくとも１箇所のＶＬ−ＣＤＲ、または重鎖可変領域の少なくとも２箇所のＶＬ−ＣＤＲが、本明細書に開示したモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である。あるいは、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示したモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３の参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である。このように、この実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、表４（前出）に示す群に関連するＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３のポリペプチド配列を含む。表４には、Ｋａｂａｔシステムで定義されたＣＬ−ＣＤＲが示されているが、他のＣＤＲの定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａシステムで定義されたＶＬ−ＣＤＲも、本発明に含まれる。特定の実施形態では、ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２８０】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、ＶＬから本質的になるか、またはＶＬからなるポリペプチドの単離物を提供する。ここで、ＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、表４に示したＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３と同一のポリペプチド配列を有する。特定の実施形態では、ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２８１】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、ＶＬから本質的になるか、またはＶＬからなるポリペプチドの単離物を提供する。ここで、ＶＬ−ＣＤＲ１領域、ＶＬ−ＣＤＲ２領域およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、表４に示したＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３と同一のポリペプチド配列を有するが、任意の１つのＶＬ−ＣＤＲで、１個、２個、３個、４個、５個または６個のアミノ酸が置換されている。さらに大きなＣＤＲでは、ＶＬ−ＣＤＲを含むＶＬが、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する限り、ＣＤＲ内でさらに置換されていてもよい。特定の実施形態では、アミノ酸置換は、同類置換である。特定の実施形態では、ＶＬを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２８２】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号６８、７３、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１０８、１１３および１１８からなる群から選択されるＶＬポリペプチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるＶＬポリペプチドを含むか、またはこのＶＬポリペプチドら本質的になるか、またはこのＶＬポリペプチドからなるポリペプチドの単離物を含む。特定の実施形態では、ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２８３】
別の態様では、本発明は、配列番号６８、７３、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１０８、１１３および１１８からなる群から選択されるＶＨポリペプチドを含むか、またはこのＶＨポリペプチドから本質的になるか、またはこのＶＨポリペプチドからなるポリペプチドの単離物を含む。特定の実施形態では、ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２８４】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のＶＬポリペプチドを含むか、このＶＬポリペプチドから本質的になるか、またはこのＶＬポリペプチドからなる、抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１およびＭ１２−Ｇ０４からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、またはハイブリドーマが産生するＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される参照モノクローナル抗体を基準とし、これと同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはこのようなモノクローナル抗体または抗体フラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。
【０２８５】
特定の実施形態では、上述の１つ以上のポリヌクレオチドがコードするＶＬを含むか、またはこのＶＬから本質的になるか、またはこのＶＬからなる抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合するか、または選択的に結合するか、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合するか、または選択的に結合するか、親和性を特徴づける解離定数（ＫＤ）は、約５×１０−２Ｍ以下、約１０−２Ｍ以下、約５×１０−３Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約５×１０−４Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約５×１０−５Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約５×１０−８Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約５×１０−９Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約５×１０−１０Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約５×１０−１１Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、約５×１０−１２Ｍ以下、約１０−１２Ｍ以下、約５×１０−１３Ｍ以下、約１０−１３Ｍ以下、約５×１０−１４Ｍ以下、約１０−１４Ｍ以下、約５×１０−１５Ｍ以下または約１０−１５Ｍ以下である。
【０２８６】
他の実施形態では、本発明は、ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドを含むか、これらのポリペプチドから本質的になるか、またはこれらのポリペプチドからなる、結合部分または結合分子に関する。ここで、ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドは、それぞれ、配列番号４および６８、８および７３、１４および７８、２０および８３、２６および８８、３２および９３、３８および９８、４３および１０３、４８および１０８、５３および１０３、５８および１１３，ならびに６３および１１８からなる群から選択されるＶＬポリペプチドおよびＶＬポリペプチドの参照アミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である。特定の実施形態では、ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合性を保持したフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０２８７】
上述のポリペプチドは、さらなるポリペプチドを含んでいてもよい（例えば、コードされるポリペプチドを直接分泌させるシグナルペプチド、本明細書に記載の抗体定常領域、または本明細書に記載の異種ポリペプチド）。
【０２８８】
さらに、本明細書の他の箇所で詳細に記載しているように、本発明は、上述のポリペプチドを含む結合部分または結合分子を含む。
【０２８９】
本明細書に開示するＩＧＦ−１Ｒ抗体ポリペプチドを、天然の結合ポリペプチドに由来するアミノ酸配列とは異なるように改変してもよいこと当業者は理解するであろう。例えば、所定のタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、原料の配列に類似していてもよく、例えば、特定の同一性を有していてもよく、例えば、原料の配列との同一性が６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％であってもよい。
【０２９０】
さらに、「非必須」アミノ酸領域で同類置換または変化が生じるように、ヌクレオチドまたはアミノ酸を置換、欠失または挿入してもよい。例えば、所定のタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸の配列は、１個以上の個々のアミノ酸の置換、挿入または欠失、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個またはそれ以上の個々のアミノ酸の置換、挿入または欠失がある以外は、原料の配列と同一であってもよい。他の実施形態では、所定のタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下の個々のアミノ酸の置換、挿入または欠失がある以外は、原料の配列と同一であってもよい。特定の実施形態では、所定のタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、原料の配列に対し、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、または１〜２０個の個々のアミノ酸の置換、挿入または欠失があってもよい。
【０２９１】
本発明の特定のＩＧＦ−１Ｒ結合部分または結合分子は、ヒトアミノ酸配列を含むヒトポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列から本質的になるか、またはこのアミノ酸配列からなる。しかし、特定のＩＧＦ−１Ｒ抗体のポリペプチドは、別の哺乳動物種に由来する１個以上の連続したアミノ酸を含む。例えば、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体は、霊長類の重鎖部分、ヒンジ部分、または抗原結合領域を含んでもよい。別の例では、１個以上のマウスに由来するアミノ酸が、非マウス抗体のポリペプチド（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の抗原結合部位）中に存在してもよい。別の例では、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の抗原結合部位は、完全にマウスである。特定の治療用途では、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、またはその改変体または類似体は、抗体が投与される動物において免疫原性でないように設計されている。
【０２９２】
特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ結合部分または結合分子は、通常は、抗体と結合しないアミノ酸配列または１個以上の部分を含む。改変の例は、以下に詳細に説明される。例えば、本発明の単鎖Ｆｖ抗体フラグメントは、可とう性リンカー配列を含んでいてもよく、または、機能的な部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素または標識）を付加するように改変されていてもよい。
【０２９３】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合部分または結合分子は、融合タンパク質を含むか、融合タンパク質から本質的になるか、または融合タンパク質からなってもよい。融合タンパク質は、例えば、少なくとも１つの標的結合部位を有する免疫グロブリンの抗原結合領域と、少なくとも１つの異種部分（すなわち、天然では接続していない部分）とを含むキメラ分子である。このアミノ酸配列は、通常は、合わさって融合ポリペプチドをもたらす別個のタンパク質に存在してもよく、または、このアミノ酸配列は、同じタンパク質に存在するが、融合ポリペプチドでは新しい配列で配置されていてもよい。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって作成されてもよく、またはペプチド領域が所望の関係性でコードされるポリヌクレオチドを作成し、翻訳することによって作成されてもよい。
【０２９４】
用語「異種」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用される場合、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、比較対象となる残りの部分とは別個の部分に由来するものであることを意味する。例えば、本明細書で使用するとき、ＩＧＦ−１Ｒ結合部分に融合する「異種ポリペプチド」は、同じ種類の免疫グロブリンではないポリペプチドに由来するか、または異なる種類の免疫グロブリンまたは免疫グロブリンではないポリペプチドに由来する。
【０２９５】
「アミノ酸の同類置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基と交換したものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基は、当該技術分野で定義されている。この分類には、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷をもたない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝を有する側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。このように、免疫グロブリンポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖のグループの別のアミノ酸残基と交換される。別の実施形態では、アミノ酸の鎖は、側鎖のグループの順序および／または組成が異なる、構造的に類似した鎖と交換されていてもよい。
【０２９６】
あるいは、別の実施形態では、免疫グロブリンのコード配列全体または一部分に、無作為に変異が導入されてもよく（例えば、飽和突然変異誘発）、本明細書に開示した診断方法および治療方法で使用するために、得られた変異体を、ＩＧＦ−１Ｒ抗体に組み込んでもよく、所望の抗原（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ）に結合する能力についてスクリーニングしてもよい。
【０２９７】
さらに他の実施形態では、本発明の範囲内にある結合部分または結合分子としては、核酸、ペプチド、ペプチド模倣物、デンドリマー、および本明細書に記載のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する他の分子が挙げられる。ある実施形態では、結合分子は、核酸、ペプチド、ペプチド模倣物、デンドリマー、または本明細書に記載のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する他の分子である結合部位を含む。例えば、本発明の結合分子または結合部分としては、本明細書に記載のＩＧＦ−１Ｒエピトープに対し、高親和性で結合可能な核酸分子（例えば、小分子ＲＮＡまたはアプタマー）が挙げられる。所望の特異性を有する核酸分子を選別する方法またはスクリーニングする方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８（１９９０）、ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５（１９９０）、米国特許第５，５８２，９８１号、ＰＣＴ出願公開ＷＯ  ００／２００４０号、米国特許第５，２７０，１６３号、ＬｏｒｓｃｈおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３：９７３（１９９４）、Ｍａｎｎｉｒｏｎｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：９７２６（１９９７）、Ｂｌｉｎｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：３６０６−３６１０（１９９９）、ＨｕｉｚｅｎｇａおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４：６５６−６６５（１９９５）、ＰＣＴ出願公開ＷＯ  ９９／５４５０６号、ＷＯ  ９９／２７１３３号、ＷＯ  ９７／４２３１７号および米国特許第５，７５６，２９１号を参照）。当該技術分野でよく知られているスクリーニング方法の例は、ＳＥＬＥＸ法である（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ、例えば、米国特許第５，２７０，１６３号および第５，５６７，５８８号を参照。この内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０２９８】
別の実施形態では、本発明の結合分子または結合部分は、模倣物（例えば、ペプチド模倣物）である。当該技術分野では、種々の構造を有する多くのペプチド模倣物が知られている。例えば、ＷＯ  ００／６８１８５号には、特定のタンパク質のらせん部分を模倣したペプチド模倣物が開示されている。別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の結合ポリペプチド（例えば、抗体）の結合部位（例えば、ＣＤＲ、抗原結合部位またはパラトープ）の三次元構造を模倣した化合物または分子に関する。本明細書で使用するとき、用語「模倣する」は、模倣物の原子と、抗原結合部位またはエピトープの原子との間で、イオン力、共有結合力、ファンデルワールス力または他の力が類似しているか、電荷の相補性が類似しているか、または静電的に相補性を有しているような、模倣物の原子の三次元位置、および／または模倣物が、本明細書に記載の結合ポリペプチドとして、抗原のエピトープ（例えば、ＩＧＦ−１Ｒエピトープ）と似た結合親和性を有するような、模倣物の原子の三次元位置、および／または模倣物が、インビトロまたはインビボで、抗原の機能に対し、よく似た効果を示すような、模倣物の原子の三次元位置を意味する。結合部位を模倣する化合物または模倣物を単離する方法またはスクリーニングする方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、抗イディオタイプ抗体を使用することが可能であり、この抗イディオタイプ抗体は、本明細書に記載のＩＧＦ−１Ｒ結合ポリペプチド上にある固有のイディオタイプ決定基を認識する。このような決定基は、結合ポリペプチド内にある、特定のＩＧＦ−１Ｒに結合する結合部位（例えば、抗体の超可変領域）に位置している。目的の結合ポリペプチドで動物を免疫化し、結合部位のイディオタイプ決定基を認識する抗体を作成するように、抗イディオタイプ抗体を調製してもよい。第１の結合部位に合わせて作られた抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第１の結合部位が結合するエピトープのイメージである結合部位を有する。免疫化された動物の抗イディオタイプ抗体を用いて、同じイディオタイプを有する他の抗体を免疫化に使用する抗体として、同じものであると識別することができる。２種類の抗体のイディオタイプが同一であるとは、その２個の抗体が、同じエピトープを認識するという点では同じであるということを示す。したがって、抗イディオタイプ抗体を用いて、同じエピトープ結合特異性を有する他の抗体を特定することができる。抗イディオタイプ抗体が、第１の結合ポリペプチドが結合するエピトープのイメージであるため、そして、抗イディオタイプ抗体が、抗原として有効に働くため、この抗イディオタイプ抗体を使用し、小化学分子、ペプチドまたは他の分子のコンビナトリアルライブラリ（例えば、ペプチドファージディスプレイライブラリ）から模倣物を単離することができる（例えば、Ｓｃｏｔｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｓｃｏｔｔら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５：４０−４８（１９９２）；Ｂｏｎｎｙｃａｓｔｌｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５８：７４７−７６２（１９９６）、この内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）���例えば、ペプチドまたは拘束ペプチド模倣物（脂質、炭水化物または他の部分を有するものを含む）をクローン化してもよい（Ｈａｒｒｉｓら、ＰＮＡＳ、９４：２４５４−２４５９（１９９７）を参照）。
【０２９９】
当該技術分野でよく知られた技術を用い、本明細書に開示した結合分子の核酸配列およびアミノ酸配列をもとに、および結合分子のＸ線結晶学またはＮＭＲで決定した結合分子のアミノ酸の三次元配置または三次元構造をもとに、化合物または模倣物を設計することができる（例えば、米国特許第５，６４８，３７９号；Ｃｏｌｍａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、３：１６８７−１６９６（１９９４）；Ｍａｌｂｙら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅら、２：７３３−７４６（１９９４）；ＭｃＣｏｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６８：５７０−５８４（１９９７）；Ｐａｌｌａｇｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４：３７８２−３７９４（１９９５）を参照。これらの内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）。したがって、結合部位とＩＧＦ−１Ｒエピトープの２つの分子を含む結晶において、またはこの２つの分子を含有する溶液において、結合部位とＩＧＦ−１Ｒエピトープとの相互作用を分析することによって、本明細書に記載した結合部位または結合部分（例えば、パラトープ）の三次元構造を模倣する模倣物または分子を設計することができる。模倣物の原子と、抗原結合または部分の原子との間で、イオン力、共有結合力、ファンデルワールス力または他の力が類似しているか、または電荷の相補性が類似しているような原子の三次元位置によって、純粋な合成結合分子を設計することができる。これらのの模倣物を、抗原のエピトープに対する高い結合親和性、およびインビトロおよびインビボでのＢ細胞の機能の阻害性について、スクリーニングしてもよい。
【０３００】
（ＩＶ．ＩＧＦ−１Ｒエピトープ）
（Ａ．結合を競合的に阻害するエピトープ）
特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒのエピトープに競合的に結合し、リガンド（例えば、ＩＧＦ１および／またはＩＧＦ２）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的にブロックし得る。このような結合特異性は、本明細書で「競合的に結合する部分」と呼ばれる。ある実施形態では、競合的に結合する部分は、ＩＧＦ−１（ＩＧＦ−２ではない）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的にブロックする。別の実施形態では、競合的に結合する部分は、ＩＧＦ−２（ＩＧＦ−１ではない）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的にブロックする。さらに別の実施形態では、競合的に結合する部分は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的にブロックする。
【０３０１】
結合分子は、リガンド（例えば、ＩＧＦ）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを、リガンドの濃度に依存する様式で、阻害するか、またはブロックする（例えば、立体的にブロックする）程度まで、エピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する場合、リガンドが結合するのを「競合的に阻害する」か、または「競合的にブロックする」と言われる。例えば、生化学的に測定する場合、所与の濃度の結合分子で競合的に阻害しようとしても、リガンドの濃度を高めることによって結合分子が負けてしまい、この場合には、リガンドが標的分子（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ）に結合する方が、結合分子が標的分子に結合するのよりも勝ってしまうことがある。いかなる特定の理論にも束縛されないが、結合分子が結合するエピトープが、リガンドの結合部位にあるか、またはリガンドの結合部位に近い場合に、競合が起こり、リガンドの結合が抑えられると考えられる。競合による阻害は、当該技術分野で周知の方法、および／または、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイを含む実施例に記載の方法で決定されてもよい。ある実施形態では、本発明の結合分子は、リガンドが所与のエピトープに結合するのを、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する。
【０３０２】
競合的なエピトープの例は、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８〜３０３にあるＣＲＲ領域の中央領域およびＣ末端領域を包含する領域にあるエピトープである。ＩＧＦ−１Ｒのこのエピトープは、Ｌ１領域のＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２リガンド結合部位に隣接している（三次元空間で）。このエピトープに競合的に結合する抗体の例は、Ｍ１４−Ｇ１１と呼ばれるヒト抗体である。Ｍ１４−Ｇ１１抗体は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的にブロックすることが分かっている。Ｍ１４−Ｇ１１のＦａｂ抗体フラグメントを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）に２００６年８月２９日に寄託されており、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５５が与えられている。
【０３０３】
したがって、特定の実施形態では、本発明の組成物で使用する結合部分は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体と同じエピトープに競合的に結合し得る。例えば、結合部分は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体を交差的にブロックする（すなわち、Ｍ１４−Ｇ１１抗体と競合的に結合する）抗体に由来していてもよく、またはＭ１４−Ｇ１１抗体の結合を他の方法で妨害する抗体に由来していてもよい。他の実施形態では、結合部分は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体自体、またはそのフラグメント、改変体または誘導体を含んでいてもよい。他の実施形態では、結合部分は、抗原結合領域、可変領域（ＶＬまたはＶＨ）、またはこれらのＣＤＲを含んでいてもよい。例えば、競合的に結合する部分は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体の６個のＣＤＲ（すなわちＣＤＲ１〜６）をすべて含んでいてもよく、またはＭ１４−Ｇ１１抗体に由来する６個のＣＤＲのうち、６個より少ないＣＤＲ（例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のＣＤＲ）を含んでいてもよい。ある例示的な実施形態では、競合的な結合特異性は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体に由来するＣＤＲ−Ｈ３を含む。
【０３０４】
ＩＧＦ−１Ｒの競合的なエピトープに結合する他の抗体を、当該技術分野で認識されている方法で特定してもよい。例えば、シグナル配列を含んでいない全長ＩＧＦ−１Ｒの種々のフラグメントまたは全長ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体が製造されたら、抗体または抗原結合性を保持したフラグメントが、ＩＧＦ−１Ｒのどのアミノ酸またはエピトープに結合するかは、本明細書に記載のエピトープマッピングプロトコル、および当該技術分野で既知の方法で決定してもよい（例えば、「Ｃｈａｐｔｅｒ  １１  −  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｖ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）に記載されているような、二重抗体−サンドイッチＥＬＩＳＡ）。さらなるエピトープマッピングプロトコルは、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）に記載されており、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。エピトープマッピングは、市販の手段（すなわち、ＰｒｏｔｏＰＲＯＢＥ，Ｉｎｃ．（ウィスコンシン州ミルウォーキー））で行ってもよい。さらに、ＩＧＦ−１Ｒの競合的なエピトープに結合するように産生された抗体を、インスリン成長因子（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、またはＩＧＦ−１とＩＧＦ−２との両方）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する能力についてスクリーニングすることができる。実施例に詳細に記載する方法にしたがって、上述の性質および他の性質について、抗体をスクリーニングすることができる。
【０３０５】
他の実施形態では、競合的にＩＧＦ−１Ｒに結合する部分は、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８〜３０３に広がる（境界部のアミノ酸を含む）配列の少なくとも約４〜５個のアミノ酸を含むか、またはこれらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなる競合的なエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する。例えば、ある実施形態では、競合的にＩＧＦ−１Ｒに結合する部分は、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８〜３０３に広がる配列の少なくとも約７個、少なくとも９個、または少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含む。所与のエピトープのアミノ酸は、連続的であっても直鎖状であり得るが、必ずしもそうでなければならないわけではない。特定の実施形態では、競合的なエピトープは、細胞表面で発現するＩＧＦ−１ＲのＣＲＲ領域とＬ２領域との境界に形成される非直鎖状エピトープ、または例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合する可溶性フラグメントとしての非直鎖状エピトープを含むか、これらの非直鎖状エピトープから本質的になるか、またはこれらの非直鎖状エピトープからなる。このように、特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒの競合的なエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８〜３０３に広がる配列の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個、または少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個または４５個の連続したアミノ酸または非連続アミノ酸を含むか、これらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなる。非連続アミノ酸の場合、アミノ酸から、タンパク質が折りたたまれることによってエピトープを形成する。
【０３０６】
他の実施形態では、結合部分が結合する競合的なエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの連続したアミノ酸または非連続アミノ酸の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個、およびＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸番号２４８、２５０、２５４、２５７、２５９、２６０、２６３、２６５、３０１および３０３からなる群から選択されるエピトープのアミノ酸のうち、少なくとも１つから本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなる。
【０３０７】
他の実施形態では、本発明の結合部分が結合するアミノ酸は、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８〜３０３に広がるエピトープ中に存在する。ある実施形態では、本発明の結合部分が結合するエピトープは、変異してしまうと、抗体の親和性が失われるか、または大きく低下する（例えば、親和性において、１００分の１未満）、少なくとも１個のアミノ酸を含む（例えば、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８および／または２５０）。  別の実施形態では、エピトープは、変異してしまうと、受容体に対する抗体の親和性の低下率が中程度である（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤと比較して、１０倍≧ＫＤ≧１００倍）、ＩＧＦ−１Ｒの１個以上のアミノ酸を含んでもよい。さらに他の実施形態では、エピトープは、変異してしまうと、野生型ＩＧＦ−１Ｒと比較して、抗体の親和性が少し低下する（例えば、２．５≧ＫＤ≧１０ｎＭ）、ＩＧＦ−１Ｒの１個以上のアミノ酸を含んでもよい（例えば、ＩＧＦ−１Ｒの残基２５４、２５７、２５９、２６０、２６３、２６５、３０１または３０３のうち１つ以上）。好ましい実施形態では、本発明の結合部分に結合するエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８、２５０および／または２５４のうち任意の１個、任意の２個、または３個すべてを含む。特に好ましい実施形態では、競合的に結合する部分は、３種類のアミノ酸２４８、２５０および２５４すべてを含むエピトープに結合し、これらのアミノ酸残基を同時に認識する。
【０３０８】
（Ｂ．結合をアロステリック効果によって阻害するエピトープ）
特定の実施形態では、結合部分は、アロステリックなエピトープに結合し、ＩＧＦリガンドがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害してもよい。このような結合特異性は、本明細書で「アロステリックな結合部位」と呼ばれる。ある実施形態では、アロステリックな結合部位は、ＩＧＦ−１（ＩＧＦ−２ではない）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によってブロックする。別の実施形態では、アロステリックな結合部位は、ＩＧＦ−２（ＩＧＦ−１ではない）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によってブロックする。さらに別の実施形態では、アロステリックな結合部位は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのアロステリック効果によってブロックする。
【０３０９】
結合部位は、リガンド（例えば、ＩＧＦ１および／またはＩＧＦ２）が、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのを、結合分子の濃度によらない形式で、阻害するか、またはブロックする程度まで、エピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する場合、リガンドが結合するのを「アロステリック効果によって阻害する」または「アロステリック効果によってブロックする」と言われる。例えば、リガンドの濃度が高くなっても、阻害力に影響を与えない（例えば、ＩＣ５０、つまり結合分子のリガンド最大阻害値の５０％まで阻害値が低下する濃度）。任意の特定の理論によって束縛されないが、アロステリック効果による阻害は、アロステリックなエピトープに結合分子が結合することによって、標的分子（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ）に構造変化または力学的変化が誘発され、これによって標的に対するリガンドの親和性が低下する場合に起こると考えられる。アロステリック効果による阻害は、当該技術分野で周知の方法、および／または、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイを含む実施例に記載の方法で決定することができる。ある実施形態では、結合分子は、リガンドが所与のエピトープに結合するのを、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、アロステリック効果によって阻害し得る。
【０３１０】
（ｉ）ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の結合をアロステリック効果によってブロックするエピトープ
特定の例示的な実施形態では、本発明の結合部分は、ＩＧＦ−１ＲのＦｎＩＩＩ−１領域全体に広がる領域およびＩＧＦ−１Ｒの残基４４０〜５８６を含む領域に位置する、アロステリックなエピトープに結合する結合部分を含む。この領域内にあるエピトープにアロステリックに結合する抗体の例は、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３と命名されたヒト抗体である。Ｍ１３−Ｃ０６抗体も、Ｍ１４−Ｃ０３抗体も、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によってブロックすることが実施例で示されている。Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３の全長抗体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）に２００６年３月２８日に寄託され、それぞれＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４４およびＰＴＡ−７４４５が与えられている。したがって、特定の実施形態では、本発明の組成物で使用する結合部分は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体またはＭ１４−Ｃ０３抗体と同じアロステリックなエピトープに結合し得る。例えば、結合特異性は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体またはＭ１４−Ｃ０３抗体を交差的にブロックする（これらの抗体と競合する）抗体によるものであってもよいし、またはＭ１３−Ｃ０６抗体またはＭ１４−Ｃ０３抗体の結合を他の方法で妨害する抗体によるものであってもよい。他の実施形態では、結合部分は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体自体またはＭ１４−Ｃ０３抗体自体を含んでいてもよく、またはそのフラグメント、改変体または誘導体を含んでいてもよい。他の実施形態では、結合部分は、抗原結合領域、可変領域（ＶＬおよび／またはＶＨ）、またはこれらのＣＤＲを含んでいてもよい。例えば、アロステリックな結合部分は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体またはＭ１４−Ｃ０３抗体の６個のＣＤＲ（すなわちＣＤＲ１〜６）をすべて含んでいてもよく、またはＭ１３−Ｃ０６抗体またはＭ１４−Ｃ０３抗体に由来する６個のうち、それより少ない数のＣＤＲ（例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のＣＤＲ）を含んでいてもよい。ある例示的な実施形態では、アロステリックな結合特異性は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体またはＭ１４−Ｃ０３抗体に由来するＣＤＲ−Ｈ３を含む。
【０３１１】
特定の実施形態では、アロステリックなＩＧＦ−１Ｒ結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒの残基４４０〜５８６に広がる配列の少なくとも約４〜５個のアミノ酸、ＩＧＦ−１Ｒの残基４４０〜５８６に広がる配列の少なくとも７個、少なくとも９個、または少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含むか、またはこれらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなるアロステリックなエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する。所与のエピトープのアミノ酸は、連続的であっても直鎖状であってもよいが、必ずしもそうでなければならないわけではない。
【０３１２】
特定の実施形態では、アロステリックなエピトープは、細胞表面で発現するＩＧＦ−１ＲのＬ２領域および／またはＦｎＩＩＩ−１領域に位置する非直鎖状エピトープ、または例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合する可溶性フラグメントとしての非直鎖状エピトープを含むか、これらの非直鎖状エピトープから本質的になるか、またはこれらの非直鎖状エピトープからなる。このように、特定の実施形態では、アロステリックなエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの残基４４０〜５８６に広がる配列の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個、または少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、またはそれ以上の連続したアミノ酸または非連続アミノ酸を含むか、これらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなり、非連続アミノ酸は、タンパク質が折りたたまれることによってエピトープを形成する。
【０３１３】
別の実施形態では、結合部分が結合するアロステリックなエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの連続したアミノ酸または非連続アミノ酸の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個を含むか、これらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなり、さらにＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸番号４３７、４３８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６４、４６６、４６７、４６９、４７０、４７１、４７２、４７４、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８２、４８３、４８８、４９０、４９２、４９３、４９５、４９６、５０９、５１３、５１４、５１５、５３３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５５１、５６４、５６５、５６８、５７０、５７１、５７２、５７３、５７７、５７８、５７９、５８２、５８４、５８５、５８６および５８７からなる群から選択されるエピトープのアミノ酸のうち、少なくとも１つから本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなる。
【０３１４】
他の実施形態では、本発明の結合部分が結合するエピトープは、ＩＧＦ−１ＲのＦｎＩＩＩ−１表面にある、残基４６２〜４６４から半径１４Å以内にある残基から選択される、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１個のアミノ酸を含む（例えば、残基Ｓ４３７、Ｅ４３８、Ｅ４６９、Ｎ４７０、Ｅ４７１、Ｌ４７２、Ｋ４７４、Ｓ４７６、Ｙ４７７、Ｉ４７８、Ｒ４７９、Ｒ４８８、Ｅ４９０、Ｙ４９２、Ｗ４９３、Ｐ４９５、Ｄ４９６、Ｅ５０９、Ｑ５１３、Ｎ５１４、Ｖ５１５、Ｋ５４４、Ｓ５４５、Ｑ５４６、Ｎ５４７、Ｈ５４８、Ｗ５５１、Ｒ５７７、Ｔ５７８、Ｙ５７９、Ｋ５８２、Ｄ５８４、Ｉ５８５、Ｉ５８６およびＹ５８７）。他の実施形態では、本発明の結合部分は、ＩＧＦ−１Ｒの残基４４０〜５８６に含まれる残基から選択され、この部分が変異してしまうと、抗体の親和性が失われるか、または大きく低下する（例えば、親和性において１００分の１未満）、少なくとも１個のアミノ酸に結合する（例えば、ＩＧＦ−１Ｒの残基４５９、４６０、４６１、４６２、４６４、４８０、４８２、４８３、４９０、５３３、５７０または５７１）。さらに他の実施形態では、エピトープは、この部分が変異してしまうと、野生型ＩＧＦ−１Ｒと比較して、受容体に対する抗体の親和性が少し低下する（２．５≧ＫＤ≧１０ｎＭ）、ＩＧＦ−１Ｒの１個以上のアミノ酸を含んでもよい（例えば、ＩＧＦ−１Ｒの残基４６６、４６７、４７８、５３３、５６４、５６５または５６８）。特に好ましい実施形態では、本発明の結合部位に結合するエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの残基４６１、４６２および４６４のうち任意の１個、任意の２個、または３個すべてを含む。
【０３１５】
（ｉｉ）ＩＧＦ−１をアロステリック効果によってブロックするが、ＩＧＦ−２はアロステリック効果によってブロックしないエピトープ
アロステリックなエピトープの別の例は、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合ポケットからわずかに離れて回転した受容体表面にある、ＩＧＦ−１ＲのＣＲＲ領域の表面に位置している。エピトープは、ＣＲＲ領域およびＬ２領域の両方を含む大きな領域に広がっている可能性がある。ある実施形態では、アロステリックなエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４１〜３７９を含む領域内にある。特定の実施形態では、アロステリックなエピトープは、ＩＧＦ−１ＲのＣＲＲ領域の残基２４１〜２６６を含む領域内、またはＩＧＦ−１ＲのＬ２領域の残基３０１〜３０８および３２７〜３７９を含む領域内にある。エピトープにアロステリックに結合する抗体の例は、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３と命名された抗体である。Ｐ１Ｅ２抗体も、αＩＲ３抗体も、ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によってブロックする（ＩＧＦ−２はブロックしない）ことが実施例で示されている。ある実施形態では、Ｐ１Ｅ２抗体は、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２マウスハイブリドーマが発現するマウス抗体に由来するマウスのＶＨおよびＶＬを含み、ヒトＩｇＧ４Ｐａｌｇｙ／κ定常領域（例えば、Ｓ２２８ＰおよびＴ２９９Ａの置換を含むＩｇＧ４定常領域（ＥＵ付番による変換））に融合した、キメラ抗体である。全長マウス抗体Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２を発現するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣに２００６年７月１１日に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３０が与えられている。
【０３１６】
したがって、特定の実施形態では、本発明の組成物で使用する結合部分は、Ｐ１Ｅ２抗体またはαＩＲ３抗体と同じアロステリックなエピトープに結合し得る。例えば、結合特異性は、Ｐ１Ｅ２抗体またはαＩＲ３抗体の結合を交差的にブロックする（これらの抗体と競合する）抗体によるものであってもよいし、またはＰ１Ｅ２抗体またはαＩＲ３抗体の結合を他の方法で妨害する抗体によるものであってもよい。他の実施形態では、結合特異性は、Ｐ１Ｅ２抗体自体またはαＩＲ３抗体自体のいずれかを含んでいてもよく、またはそのフラグメント、改変体または誘導体を含んでいてもよい。他の実施形態では、結合部分は、抗原結合領域、可変領域（ＶＬおよび／またはＶＨ）、またはこれらのＣＤＲを含んでいてもよい。例えば、アロステリックな結合部分は、Ｐ１Ｅ２抗体またはαＩＲ３抗体の６個のＣＤＲをすべて含んでいてもよく、またはＰ１Ｅ２抗体またはαＩＲ３抗体に由来する６個より少ないＣＤＲ（例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のＣＤＲ）を含んでいてもよい。ある例示的な実施形態では、アロステリックな結合特異性は、Ｐ１Ｅ２抗体またはαＩＲ３抗体に由来するＣＤＲ−Ｈ３を含む。
【０３１７】
ＩＧＦ−１Ｒのアロステリックなエピトープに結合する他の抗体は、当該技術分野で認識されている方法（例えば、上述の方法）で特定することができる。さらに、ＩＧＦ−１Ｒのアロステリックなエピトープに結合する抗体が製造されたら、この抗体を、インスリン成長因子（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、またはＩＧＦ−１とＩＧＦ−２との両方）がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害する能力についてスクリーニングしてもよい。実施例に詳細に記載する方法にしたがって、上述の性質および他の性質について、抗体をスクリーニングすることができる。
【０３１８】
さらに他の実施形態では、アロステリックにＩＧＦ−１Ｒに結合する部分は、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４１〜２６６に広がる配列の約４〜５個のアミノ酸、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４１〜２６６に広がる配列の少なくとも約７個、少なくとも９個、または少なくとも約１５〜約２５個のアミノ酸を含むか、またはこれらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなる競合的なエピトープに特異的に結合するか、または選択的に結合する。エピトープのアミノ酸は、連続的であっても直鎖状であってもよいが、必ずしもそうでなければならないわけではない。特定の実施形態では、アロステリックなエピトープは、細胞表面で発現するＩＧＦ−１ＲのＣＲＲ領域の細胞外表面に存在する非直鎖状エピトープ、または例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合する可溶性フラグメントとしての非直鎖状エピトープを含むか、これらの非直鎖状エピトープから本質的になるか、またはこれらの非直鎖状エピトープからなる。このように、特定の実施形態では、アロステリックなエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４１〜３７９に広がる配列の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約２５個、または少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、または少なくとも２５個の連続したアミノ酸または非連続アミノ酸（例えば、残基２４１〜２６６または３０１〜３０８または３２７〜３７９）を含むか、これらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなり、非連続アミノ酸は、タンパク質が折りたたまれることによってエピトープを形成する。
【０３１９】
他の実施形態では、結合部分が結合するアロステリックなエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの連続したアミノ酸または非連続アミノ酸の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個の連続したアミノ酸または非連続アミノ酸を含むか、これらのアミノ酸から本質的になるか、またはこれらのアミノ酸からなり、ここで、エピトープの少なくとも１個のアミノ酸（好ましくは、エピトープのすべてのアミノ酸）は、２４１、２４８、２５０、２５１、２５４、２５７、２６３、２６５、２６６、３０１、３０３、３０８、３２７および３７９からなる群から選択される。
【０３２０】
他の実施形態では、本発明の結合部分が認識するエピトープは、変異してしまうと、抗体の親和性が失われるか、または大きく低下する（例えば、親和性において１００分の１未満）、ＩＧＦ−１Ｒの２４１〜２６６の１個以上のアミノ酸を含む（例えば、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８、２５４または２６５の少なくとも１個またはすべて）。別の実施形態では、エピトープは、変異してしまうと、受容体に対する抗体の親和性の低下率が中程度である（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤと比較して、１０倍≧ＫＤ≧１００倍）、ＩＧＦ−１Ｒの１個以上のアミノ酸を含んでもよい（例えば、ＩＧＦ−１Ｒの残基２５４および／または２５７）。さらに他の実施形態では、エピトープは、変異してしまうと、野生型ＩＧＦ−１Ｒと比較して、受容体に対する抗体の親和性が少し低下する（２．５≧ＫＤ≧１０ｎＭ）、ＩＧＦ−１Ｒの１個以上のアミノ酸を含んでもよい（例えば、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４８、２６３、３０１、３０３、３０８、３２７または３７９のうち、１個以上）。特に好ましい実施形態では、エピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの残基２４１、２４２、２５１、２５７、２６５および２６６のうち、任意の１個、任意の２個、任意の３個、任意の４個、任意の５個、または６個すべてを含む。
【０３２１】
（Ｃ．他のＩＧＦ−１Ｒエピトープ）
特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒに結合する部分は、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される抗体と同じエピトープに結合し得る。本発明のある例示的な実施形態では、本発明の結合分子のＩＧＦ−１Ｒに結合する部分は、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される親抗体であるマウス抗体に由来する。Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１抗体、２０Ｃ８．３Ｂ８抗体およびＰ１Ａ２．２Ｂ１１抗体を発現するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣにそれぞれ２００６年３月２８日、２００６年６月１３日、および２００６年３月２８日に寄託され、それぞれＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４５８、ＰＴＡ−７７３２およびＰＴＡ−７４５７が与えられている。全長２０Ｄ８．２４Ｂ１１抗体および全長Ｐ１Ｇ１０．２Ｂ８抗体を発現するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣにそれぞれ２００６年３月２８日および２００６年７月１１日に寄託され、それぞれＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４５６およびＰＴＡ−７７３１が与えられている。
【０３２２】
さらに他の実施形態では、本発明の組成物で使用する結合部分は、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される任意の抗体からなる群から選択される抗体を交差的にブロックする（すなわち、Ｍ１４−Ｇ１１抗体と競合的に結合する）抗体に由来していてもよく、またはＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される抗体の結合を他の方法で妨害してもよい。他の実施形態では、結合部分は、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される抗体、またはそのフラグメント、改変体または誘導体を含んでいてもよい。他の実施形態では、結合部分は、抗原結合領域、可変領域（ＶＬおよび／またはＶＨ）、またはこれらのＣＤＲを含んでいてもよい。例えば、結合部分は、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される抗体の６個のＣＤＲ（すなわちＣＤＲ１〜６）をすべて含んでいてもよく、またはＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される抗体に由来する６個より少ないＣＤＲ（例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のＣＤＲ）を含んでいてもよい。ある例示的な実施形態では、結合特異性は、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２およびＰ１Ｇ１０．２Ｂ８からなる群から選択される抗体に由来するＣＤＲ−Ｈ３を含む。
【０３２３】
（Ｖ．ＩＧＦ−１Ｒの異なるエピトープに結合する結合分子を含む組成物）
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒの異なるエピトープに結合する結合分子を含む組成物を与える。特定の実施形態では、本発明の組成物は、異なるＩＧＦ−１Ｒ結合特異性を有する、２個のＩＧＦ−１Ｒ結合部位またはＩＧＦ−１Ｒ結合部分を含む。他の実施形態では、本発明の結合組成物は、複数のＩＧＦ−１Ｒ結合特異性を有する１個のＩＧＦ−１Ｒ結合分子（すなわち、多重特異性のＩＧＦ−１Ｒ結合分子）を含む。好ましい実施形態では、本発明の結合組成物が、ＩＧＦ−１Ｒに結合すると、ＩＧＦ−１Ｒに対して単一の特異性を有する１個の結合分子を用いる場合に比べ、ＩＧＦ−１Ｒのシグナル伝達が低下する。例えば、特定の実施形態では、本発明の組成物によって、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２が介在するシグナル伝達を相乗効果によって低下させることができ、および／または腫瘍細胞の増殖を相乗効果によって低下させることができる。このような組成物によって、ＩＧＦリガンドが強くブロックされ、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達をブロックすることによって効果的に阻害可能な腫瘍細胞の集合にまで適用を拡大することができる。
【０３２４】
特定の実施形態では、本発明の結合組成物または結合分子は、第１および第２の結合分子または結合部分を含んでおり、これらの結合分子または結合部分は、独立して、上に開示した任意の結合分子または結合部分から選択される。特定の実施形態では、第１および第２の結合部分がＩＧＦ−１Ｒに結合すると、第１の結合部分を単独で用いる場合、または第２の結合部分を単独で用いる場合よりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達をブロックする。本明細書で使用するとき、結合分子がＩＧＦ−１Ｒに結合するという観点で、用語「よりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達をブロックする」は、ＩＧＦ−１Ｒの第１のエピトープに結合する第１の結合部分（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のうち、少なくとも１つがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする部分）と、ＩＧＦ−１Ｒの第２の異なるエピトープに結合する第２の結合部分（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のうち、少なくとも１つがＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする部分）とが、第１の結合部分単独、または第２の結合部分単独で結合する場合よりも高い程度に、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達をブロックする状況を指す。ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達の阻害は、多くの異なる様式で測定することができ、例えば、腫瘍の成長度が下方修正されること（例えば、腫瘍の成長が遅れること）、腫瘍が小さくなるか、または転移が減ること、癌の臨床的な機能障害または症状が軽減するか、最低限のものになること、この治療をしない場合に予想される対象の生存期間よりも、生存期間が長くなること、投与前には腫瘍ができていなかった動物で、腫瘍の成長を予防すること（すなわち、予防的投与）が挙げられる。本明細書で使用するとき、用語「下方修正する」「下方修正すること」または「下方修正」は、特定のプロセスが起こる速度を下げること、特定のプロセスを阻害すること、特定のプロセスを逆行させること、および／または特定のプロセスが開始するのを予防することを指す。したがって、特定のプロセスが腫瘍の成長または転移である場合、用語「下方修正」としては、限定されないが、腫瘍の成長および／または転移の発生する速度を下げること、腫瘍成長および／または転移を阻害すること、腫瘍の成長および／または転移を逆行させること（腫瘍が小さくなること、および／または根絶することを含む）、および／または腫瘍の成長および／または転移を予防することが挙げられる。
【０３２５】
ある実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達が、より大きくブロックされる場合、相加効果が観察される。用語「相加効果」は、本明細書で使用するとき、第１の結合部分および第２の結合部分の結合効果を組み合わせた合計が、第１の結合部分のみ、または第２の結合部分のみが結合する場合に観察された効果とほぼ等しい状況を指す。相加効果は、典型的には、ＩＧＦ−１Ｒに対する、第１の結合部分または第２の結合部分のモル比（単独の場合）が、ＩＧＦ−１Ｒに対する、第１の結合部分および第２の結合部分のモル比（合わせたもの）とほぼ同じである条件下で測定される。
【０３２６】
ある実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達が、より大きくブロックされる場合、相乗効果が観察される。用語「相乗効果」は、本明細書で使用するとき、第１の結合部分および第２の結合部分が結合して生じる相加効果よりも大きく、第１の結合部分のみ、または第２の結合部分のみが結合する場合に生じた効果を超える効果を指す。相乗効果は、典型的には、ＩＧＦ−１Ｒに対する、第１の結合部分または第２の結合部分のモル比（単独の場合）が、ＩＧＦ−１Ｒに対する、第１の結合部分および第２の結合部分のモル比（合わせたもの）とほぼ同じである条件下で測定される。本発明の実施形態は、第１のＩＧＦ−１Ｒ結合部位および第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部位を用いることによって、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達の下方修正において、相乗効果を得る方法を含む。ここで、上述の効果は、対応する相加効果よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％大きい。
【０３２７】
ある実施形態では、相乗効果は、半有効原理に基づくＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの組み合わせ指数（ＣＩ）法を用いて測定される（Ｃｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５：２４３４−２４３９（１９８５）を参照）。この方法は、種々の濃度の細胞毒性で、２種類の薬物の相乗効果、相加性、または拮抗作用の程度を算出するものである。ＣＩが１未満の場合、２種類の薬物に相乗効果が存在する。ＣＩが１の場合、相加効果はあるが、相乗効果はない。ＣＩ値が１より大きいことは、拮抗作用があることを示す。ＣＩ値が小さくなるほど、相乗効果は大きくなる。別の実施形態では、相乗効果は、部分阻害濃度（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＩＣ）を用いて決定される。この部分値は、組み合わせにおいて作用する薬物のＩＣ５０を、その薬物が単独で作用する場合のＩＣ５０の関数としてあらわすことによって決定される。２種類の相互作用する薬物の場合、それぞれの薬物のＦＩＣ値の合計は、相乗的な相互作用の測定値をあらわす。ＦＩＣが１未満の場合、２種類の薬物に相乗効果が存在する。ＦＩＣ値が１であるとは、相加効果が存在することを示す。ＦＩＣの値が小さくなるほど、相乗効果が大きくなる。
【０３２８】
特定の代わりの実施形態では、２種類の別個の化合物（例えば、別個の結合部分）を組み合わせると、それぞれの化合物の飽和濃度または飽和投薬量を使用した場合に可能な効果よりも大きな変化が観察されるときに、相乗効果が観察される。個々の結合分子自体が、完全な効果を発揮することができない場合（例えば、薬物の濃度をどこまで高くしても、下方修正率１００％には到達しない）、このような相乗効果が起こり得る。この状況で、相乗効果は、ＥＣ５０値またはＩＣ５０値を分析することによっても、十分につかめることはできない。２種類の化合物（例えば、結合部分）を組み合わせることにより、１種類の化合物で可能なレベルよりも大きく下方修正する場合、強力な相乗効果があると認識される。
【０３２９】
特定の実施形態では、本発明の結合組成物は、ＩＧＦ−１Ｒの細胞外領域にある２個以上の異なるエピトープ（例えば、２個以上の重複しないエピトープ）を標的としてもよい。ある実施形態では、本発明の結合組成物は、第１のＩＧＦ−１Ｒエピトープに結合する第１の結合分子と、第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープに結合する第２の結合分子とを含んでいてもよい。当業者は、この第１および第２のＩＧＦ−１Ｒエピトープが、同じＩＧＦ−１Ｒ分子にあってもよく、または異なるＩＧＦ−１Ｒ分子にあってもよいことを理解するであろう。
【０３３０】
ある実施形態では、本発明の結合組成物は、２個以上の異なるエピトープに結合し、これらのエピトープは、独立して、Ｌ１ドメインにあるエピトープ、ＣＲＲドメインにあるエピトープ、Ｌ２ドメインにあるエピトープ、Ｆｎ−１ドメインにあるエピトープ、Ｆｎ−２ドメインにあるエピトープ、Ｆｎ−３ドメインにあるエピトープからなる群から選択される。例えば、本発明の結合組成物は、Ｌ２ドメインにある第１のエピトープと、ＣＲＲドメインにある第２のエピトープに結合してもよい。別の実施形態では、本発明の結合組成物は、同じドメイン内にある２個以上のエピトープに結合してもよい。さらに別の実施形態では、本発明の結合組成物は、２個以上のエピトープのうち、少なくとも１つが２個以上のドメインに形成されているようなエピトープ（例えば、Ｌ２ドメインとＣＲＲドメインとの結合界面にあるエピトープ）に結合してもよい。
【０３３１】
ある実施形態では、本発明の組成物は、ＩＧＦ−１Ｒの２個の異なるエピトープを標的とする１個以上の結合分子を含み、結合部分が、それぞれのエピトープに結合する場合、それぞれのエピトープは、異なる機序によってＩＧＦ−１Ｒのシグナル伝達を阻害する。ある実施形態では、本発明の結合組成物は、アロステリックなエピトープおよび競合的なエピトープを標的としてもよい。
【０３３２】
本発明の結合組成物は、ＩＧＦ−１Ｒ内にある競合的なエピトープに結合してもよいし、またはＩＧＦ−１Ｒ内にあるアロステリックなエピトープに結合してもよい。本明細書で使用するとき、用語「競合的なエピトープ」は、結合分子がエピトープに存在すると、受容体に対するリガンドの結合（例えば、ＩＧＦ−１Ｒに対する、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２の結合）を競合によって阻害するエピトープを指す。競合的なエピトープは、一般的に、受容体のリガンド結合部位にある。ＩＧＦ−１Ｒの競合的なエピトープの例は、ＩＧＦ−１結合部位およびＩＧＦ−２結合部位の近くにあるＣＲＲドメインの内面にあるエピトープである（図１を参照）。このエピトープに結合すると、ＩＧＦ−１の結合およびＩＧＦ−２の結合を競合によって阻害する。本明細書で使用するとき、「アロステリックなエピトープ」は、結合分子がエピトープに結合すると、受容体に対するリガンドの結合をアロステリック効果によって阻害するエピトープを指す。アロステリックなエピトープは、一般的に、リガンド結合部位から離れた受容体内部の位置にある。ＩＧＦ−１Ｒのアロステリックなエピトープの例は、ＣＲＲ／Ｌ２領域の露出面にあるエピトープである（図１を参照）。このエピトープに結合すると、ＩＧＦ−１をアロステリック効果によってブロックするが、ＩＧＦ−２の結合にはほとんど影響を与えない。アロステリックなエピトープの別の例は、ＦｎＩＩＩ−１ドメインの外面にあるエピトープである（図１を参照）。このエピトープに結合すると、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方をアロステリック効果によってブロックする。
【０３３３】
ある実施形態では、本発明の結合組成物は、ＩＧＦ−１Ｒの２種類の異なるエピトープを標的とする１個以上の結合分子を含み、第１のエピトープに結合する結合部分は、第２のエピトープに結合する第２の結合部分と交差的にブロックしない（すなわち、競合しない）。
【０３３４】
（Ａ．複数の結合分子の組み合わせ）
本発明の特定の態様では、阻害性を有し、異なるＩＧＦ−１Ｒ結合特異性を有する抗ＩＧＦ−１Ｒ結合分子の組み合わせ（例えば、２個以上の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、抗体フラグメント、抗体の改変体、アプタマーまたはその誘導体）を含む組成物が与えられる。例えば、本発明の組成物は、第１のＩＧＦ−１Ｒ結合特異性を示す第１の抗ＩＧＦ−１Ｒ結合分子と、第２のＩＧＦ−１Ｒ結合特異性を示す第２の抗ＩＧＦ−１Ｒ結合分子とを含んでいてもよい。好ましい実施形態では、上述の第１の結合特異性と、第２の結合特異性とは、ＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメインに存在する重複しないエピトープに結合するものである。この組成物の結合分子を、別個に対象に投与してもよいし、組み合わせて投与してもよい。この組成物によって、従来の組成物よりも、リガンドのブロック効果を高める（例えば、濃度が低くする）ことができる。他の実施形態では、この組成物によって、腫瘍細胞の増殖を相乗効果によって低下させることができる。
【０３３５】
本発明の組成物における結合分子の組み合わせは、本明細書に開示した結合分子の任意の組み合わせを含んでいてもよいことを当業者は理解するであろう。例えば、本発明の組成物は、少なくとも第１の結合分子と第２の結合分子との組み合わせを含み、この結合分子が、独立して、本明細書に開示した任意の結合分子から選択されてもよい。好ましくは、結合分子の組み合わせは、アロステリックな結合部分を含む第１の結合分子と、競合的な結合部分を含む第２の結合分子とを含む。ある実施形態では、この組み合わせは、アロステリックな結合部分を含む第１の抗体またはｓｃＦｖ分子（例えば、本明細書に開示した、安定化したｓｃＦｖ分子のうち、任意のもの）と、競合的な結合部分を含む第２の抗体またはｓｃＦｖ分子とを含む。
【０３３６】
本発明の結合分子は、一価であってもよい。すなわち、１個の標的結合部位を含んでいてもよい（例えば、ｓｃＦｖ分子の場合）。または、本発明の結合分子は、２個以上の標的結合部位を含んでいてもよい。ある実施形態では、結合分子は、少なくとも２個の結合部位を含んでいる。ある実施形態では、結合分子は、３個の結合部位を含んでいる。別の実施形態では、結合分子は、４個の結合部位を含んでいる。別の実施形態では、結合分子は、４個よりも多い数の結合部位を含んでいる。
【０３３７】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、モノマーである。別の実施形態では、本発明の結合分子は、マルチマーである。例えば、ある実施形態では、本発明の結合分子は、ダイマーである。ある実施形態では、本発明のダイマーは、ホモダイマーであり、２個の同一のモノマーサブユニットを含む。別の実施形態では、本発明のダイマーは、ヘテロダイマーであり、少なくとも２個の異なるモノマーサブユニットを含む。ダイマーのサブユニットは、１個以上のポリペプチド鎖を含んでいてもよい。例えば、ある実施形態では、ダイマーは、少なくとも２個のポリペプチド鎖を含む。ある実施形態では、ダイマーは、２個のポリペプチド鎖を含む。別の実施形態では、ダイマーは、４個のポリペプチド鎖を含む（例えば、抗体分子の場合）。
【０３３８】
（Ｂ．多重特異性結合分子）
他の態様では、本発明は、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子（例えば、２種類以上のＩＧＦ−１Ｒ結合特異性を示す多重特異性抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、抗体の改変体、抗体フラグメント、またはアプタマー）を含む組成物を与える。本発明の多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、２種類以上の異なるＩＧＦ−１Ｒ結合特異性を有している。例えば、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、第１のＩＧＦ−１Ｒ結合特異性と、第２のＩＧＦ−１Ｒ結合特異性とを有していてもよい。好ましい実施形態では、この結合特異性は、ＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメインに存在する重複しないエピトープを認識する。ある実施形態では、本発明の多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、同じＩＧＦ−１Ｒ分子内に存在する重複しないエピトープに結合してもよい。他の実施形態では、多重特異性ＩＧＦ−１Ｒは、別個のＩＧＦ−１Ｒ分子内に存在する重複しないエピトープに結合してもよい。特定の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、上述の組み合わせの１つで使用する、少なくとも１種類の（好ましくは２種類の）抗体に由来する結合特異性を有する。他の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、上で特定した結合分子のいずれかが、異なる特異性を有する第２の結合部分に結合しているか、または融合しているものを含む。
【０３３９】
特定の態様では、本発明の多重特異性結合分子は、所与の参照単一特異性抗体よりも大きな結合活性で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチド改変体に特異的に結合する。結合分子および参照抗体の見かけ結合活性（ａｐｐａｒｅｎｔ  ａｖｉｄｉｔｙ）を、当該技術分野で知られている任意の方法または実施例に記載した方法を用いて測定してもよい（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ分析）。具体的な実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、参照抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも低いｋ（ｏｆｆ）で（例えば、２分の１未満、５分の１未満、１０分の１未満、５０分の１未満または１００分の１未満）、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド、またはそのフラグメントまたは改変体に結合する。他の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、参照抗体の結合速度（ｋ（ｏｎ））よりも大きいｋ（ｏｎ）で（例えば、２倍、５倍、１０倍、５０倍または１００倍）、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド、またはそのフラグメントまたは改変体に結合する。
【０３４０】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、多重特異性である（すなわち、第１の標的ＩＧＦ−１Ｒ分子またはこの標的分子のエピトープに結合する少なくとも１種類の第１の結合特異性と、第２の異なる標的ＩＧＦ−１Ｒ分子、または第１の標的ＩＧＦ−１Ｒ分子の第２の異なるエピトープに結合する少なくとも１種類の第２の結合特異性とを有する）。特定の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子（例えば、二重特異性結合分子）は、上述の結合特異性から独立して選択される少なくとも２種類の結合特異性を有する。本発明の結合分子は、細胞表面に存在するＩＧＦ−１Ｒまたは可溶性ＩＧＦ−１Ｒに結合してもよい。
【０３４１】
ある実施形態では、本発明の結合分子としては、細胞表面のＩＧＦ−１Ｒに対する少なくとも１つの結合部分と、可溶性ＩＧＦ−１Ｒ分子に対する少なくとも１つの結合部分とを含む分子が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、細胞表面のＩＧＦ−１Ｒ分子に結合する２個の結合部分を有する。
【０３４２】
本発明の多重特異性結合分子が、本明細書に開示した結合部分の任意の組み合わせを含んでいてもよいことは、当業者に理解されるであろう。例えば、特定の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、第１の結合部分と、第２の結合部分とを少なくとも含んでおり、第１および第２の結合部分は、独立して、本明細書に開示した寄託済抗体に由来する結合部分から選択されてもよい。他の実施形態では、この１つ以上の結合部分は、本明細書に開示した任意のｓｃＦｖ分子（例えば、任意の安定化したｓｃＦｖ分子）から独立して選択されるｓｃＦｖ分子である。他の実施形態では、この１つ以上の結合部分は、本明細書に開示した抗体から独立して選択される抗体である。この抗体は、任意のＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４）を有するか、またはグリコシル化状態（例えば、グリコシル化状態またはグリコシル化されていない状態）であってもよい。
【０３４３】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、少なくとも１種類の阻害性のＩＧＦ−１Ｒ結合特異性または結合部分と、少なくとも１種類のアロステリックなＩＧＦ−１Ｒ結合特異性または結合部分とを含む。例えば、好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的にブロックする、少なくとも１種類の競合的な結合特異性または結合部分と、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によってブロックする、少なくとも１種類のアロステリックな結合特異性または結合部分とを含む。
【０３４４】
別の実施形態では、本発明の結合分子は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によってブロックする少なくとも１種類のアロステリックな結合特異性または結合部分と、ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によってブロックする（が、ＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのはブロックしない）少なくとも１種類のアロステリックな結合特異性または結合部分とを含む。
【０３４５】
ある実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子（例えば、２個以上のエピトープ（例えば、２個以上の抗原、または同じ抗原にある２個以上のエピトープ）に対する結合特異性を有する、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメインを欠いた抗体、または融合タンパク質）である。二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、２個の異なる標的部位（例えば、同じＩＧＦ−１Ｒ分子にある部位、または異なるＩＧＦ−１Ｒ分子にある部位）に結合することができる。例えば、本発明の二重特異性分子は、２個の異なるエピトープ（例えば、同じＩＧＦ−１Ｒ抗原にあるエピトープ、または２種類の異なるＩＧＦ−１Ｒ抗原にあるエピトープ）に結合してもよい。
【０３４６】
ある実施形態では、二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、本明細書に開示する標的ポリペプチド（つまり、ＩＧＦ−１Ｒ）にある少なくとも１つのエピトープに特異的な、少なくとも１つの結合領域を有する。ある実施形態では、二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ＩＧＦ−１Ｒにある競合的なエピトープに対する、少なくとも１つの結合特異性または結合部分と、ＩＧＦ−１Ｒにあるアロステリックなエピトープに対する、少なくとも１つの結合特異性とを有する。二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、本明細書に開示する標的ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの第１のエピトープに特異的な、２つの標的結合特異性または結合部分と、標的ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの第２のエピトープに特異的な２つの標的結合ドメインとを有する四価抗体であってもよい。したがって、四価の二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、それぞれの特異性について二価であってもよい。
【０３４７】
本発明の多重特異性結合分子は、それぞれの特異性について一価であってもよく、またはそれぞれの特異性について多価であってもよい。ある実施形態では、本発明の二重特異性結合分子は、第１のＩＧＦ−１Ｒ分子と反応する１個の結合部位と、第２の標的ＩＧＦ−１Ｒ分子と反応する１個の結合部位とを含んでいてもよい（例えば、二重特異性抗体分子、融合タンパク質またはミニボディ）。別の実施形態では、本発明の二重特異性結合分子は、第１のＩＧＦ−１Ｒ分子と反応する２個の結合部位と、第２の標的ＩＧＦ−１Ｒ分子と反応する２個の結合部位とを含んでいてもよい（例えば、二重特異性ｓｃＦｖ２四価抗体、四価ミニボディまたはダイアボディ）。
【０３４８】
別の実施形態では、二重特異性結合分子が結合可能な第１および第２のＩＧＦ−１Ｒ分子は、同じ細胞または同じ細胞種にある。本発明の二重特異性結合分子は、同じ細胞の第１の受容体および第２の受容体を架橋することによって、この第１および第２の受容体の片方または両方に関連する活性（例えば、シグナル変換活性）を阻害してもよく、または受容体の下方調整能または内在化能を高めてもよい。
【０３４９】
ある実施形態では、本発明の多重特異性ＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、ＩＧＦ−１Ｒ以外の抗原に対する結合部分を含んでいてもよい。例えば、本発明の多重特異性結合分子は、薬物または毒素に特異的な結合部分を有していてもよい。別の例示的な実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、ＩＧＦ−２Ｒまたはインスリン受容体に対する結合部分を含んでいてもよい。
【０３５０】
多重特異性分子を製造する方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、組み換え技術を用い、多重特異性分子（例えば、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、タンデム型ｓｃＦｖなど）を製造してもよい。多重特異性分子を製造する技術の例は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２４８：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｐｐ  ２２７−２４２  ＵＳ  ２００３／０２０７３４６  Ａ１およびこれらの引用文献）。ある実施形態では、多重特異性マルチマー分子は、例えば、ＵＳ  ２００３／０２０７３４６  Ａ１号または米国特許第５，８２１，３３３号またはＵＳ  ２００４／００５８４００号に記載されるような方法を用いて調製する。
【０３５１】
（ＶＩ．結合分子の例示的な形態）
（Ａ  単一特異性結合分子）
（ｉ）ＩＧＦ−１Ｒ抗体
特定の実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、抗体であるか、または結合分子内に１個以上の結合部分として抗体を含む。本発明の抗体は、抗体合成分野で既知の任意の方法によって製造することができ、特に、化学合成によって、好ましくは、本明細書に記載の組み換え発現技術によって製造することができる。例えば、当業者に周知の技術を用い、抗体を産生する細胞株を選択し、培養してもよい。このような技術は、種々の実験マニュアルおよび主要な刊行物に記載されている。この観点で、以下に記載する本発明で使用するのに好適な技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されており、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる（補足事項を含む）。
【０３５２】
本発明のさらに他の実施形態は、内因性免疫グロブリンを産生することができないトランスジェニック動物（例えば、マウス）で、ヒト抗体または実質的にヒトである抗体を作成することを含む（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、第５，９３９，５９８号、第５，５９１，６６９号および第５，５８９，３６９号を参照、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。例えば、キメラ変異マウスおよび生殖細胞系変異マウスにおける、抗体の重鎖結合領域のホモ接合体欠失によって、内因性抗体の産生が完全に阻害されることが記載されている。ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを上述の生殖細胞系変異マウスに移すと、抗体チャレンジの際にヒト抗体が産生する。ＳＩＣＤマウスを用いてヒト抗体を作成する別の好ましい手段は、米国特許第５，８１１，５２４号に開示されており、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。これらのヒト抗体に関連する遺伝物質を本明細書に記載のように単離し、操作してもよいことが理解されるであろう。
【０３５３】
別の実施形態では、リンパ球を、マイクロマニピュレーションおよび単離された可変領域によって選択することができる。例えば、末梢血の単核細胞を免疫化した哺乳動物から単離し、インビトロで約７日間培養することができる。この培養物をスクリーニングし、このスクリーニング基準を満たす特異的なＩｇＧを調べることができる。ポジティブウェルから得た細胞を単離することができる。個々のＩｇを産生するＢ細胞をＦＡＣＳで単離するか、または相補性による溶血プラークアッセイで特定することによって単離することができる。Ｉｇを産生するＢ細胞を、管でマイクロマニピュレーションし、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を、例えばＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅させることができる。ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を、抗体発現ベクターにクローン化し、細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）に移して発現させることができる。
【０３５４】
特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体の可変領域も、定常領域も完全ヒト型である。全ヒト抗体は、当該技術分野で既知の技術を用いて、および本明細書に記載したように製造することができる。例えば、特定の抗原に対する全ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、抗原を産生し、内因性遺伝子座が無効化するように改変されたトランスジェニック動物に抗原を投与することによって調製することができる。このような抗体を製造するのに使用可能な技術の例は、米国特許第６，１５０，５８４号、第６，４５８，５９２号、第６，４２０，１４０号に記載されている。他の技術は、当該技術分野で既知である。全ヒト抗体は、同様に、本明細書の他の箇所で詳細に記載しているように、種々のディスプレイ技術、例えば、ファージディスプレイまたは他のウイルスディスプレイシステムで製造することができる。
【０３５５】
目的のエピトープに対するポリクローナル抗体を、当該技術分野でよく知られているさまざまな手順で作成することができる。例えば、目的のエピトープを含む抗原を、種々の宿主動物（限定されないが、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、ハムスター、ヤギ、ロバなど）に投与し、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘発させることができる。種々のアジュバントを使用し、宿主の種類に応じて、免疫反応を高めてもよい。アジュバントの例としては、限定されないが、Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱物のゲル、表面活性基質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および有用な可能性を秘めたヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍが挙げられる。このようなアジュバントは、当該技術分野でよく知られている。
【０３５６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換えおよびファージディスプレイ技術の使用、またはこれらの組み合わせを使用することを含む、当該技術分野で既知の多くの技術で調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の技術および以下の文献の教示を含むハイブリドーマ技術を用いて製造することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  （１９８８）；  Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１（１９８１）（この参考文献の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用するとき、ハイブリドーマ技術で製造された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核細胞クローン、原核細胞クローン、またはファージクローンを含む１個のクローンに由来する抗体を指し、製造される方法は問わない。したがって、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術で製造された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、エピトープ認識領域を増やすために、ＩＧＦ−１Ｒノックアウトマウスを用いて調製することができる。モノクローナル抗体は、本明細書に記載するようなハイブリドーマの使用、および組み換えファージディスプレイ技術を含む、当該技術分野で既知の多くの技術を用いて調製することができる。
【０３５７】
当該技術分野で認識されたプロトコルを用い、一例では、関連する抗原（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ精製物、またはＩＧＦ−１Ｒを含む細胞または細胞抽出物）およびアジュバントを、動物に複数回皮下注射または腹腔内注射することによって、抗体を生じさせる。この免疫法は、典型的には、脾細胞またはリンパ球が活性化し、抗原反応性の抗体が産生することを含む免疫応答を誘発する。得られた抗体を動物の血清から集め、ポリクローナル調製物を得るが、多くは、均質な調製物であるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を得るために、脾臓、リンパ節または末梢血から個々のリンパ球を単離することが望ましい。好ましくは、リンパ球は、脾臓に由来する。この周知のプロセス（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））では、抗原を注射した哺乳動物に由来する、比較的寿命の短いリンパ球または致死性のリンパ球を、不死化した腫瘍細胞系（例えば、骨髄腫細胞系）と融合し、不死化し、Ｂ細胞を遺伝的にコードした抗体を産生可能なハイブリッド細胞、すなわち「ハイブリドーマ」を産生する。得られたハイブリッドを選択し、１種類の遺伝子株に分け、希釈し、１種類の抗体をつくるのに特異的な遺伝子を含む個々の株を再び成長させる。これらの株は、所望の抗原に対して均質な抗体を産生し、純粋な１つの系統の遺伝子を有するため、「モノクローナル」と呼ばれる。
【０３５８】
このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、好適な培地、好ましくは、融合していない親細胞である骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１種以上の基質を含有する培地に播種し、成長させる。当業者は、ハイブリドーマを作成し、選抜し、成長させるための試薬、細胞系および培地は、多くの供給業者から入手可能であり、標準的なプロトコルが十分に確立されていることを理解している。一般的に、ハイブリドーマ細胞を成長させる培地は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体を製造するという観点でアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞で産生したモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロアッセイで決定する。ハイブリドーマ細胞が、所望の特異性、親和性および／または活性を有する抗体を産生することが特定されたら、クローンを限界希釈手順によってサブクローン化し、標準的な方法で成長させてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ５９−１０３（１９８６））。さらに、サブクローンから分泌したモノクローナル抗体を、従来の精製手順（例えば、タンパク質−Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析法または親和性クロマトグラフィー）によって、培地、腹水または血清から分離してもよいことも理解されるであろう。
【０３５９】
当業者は、抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡが、ファージディスプレイライブラリのような抗体ライブラリに由来するものであってもよいことを理解するであろう。特に、抗体ライブラリのレパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えば、ヒトまたはマウス）から発現した抗原結合領域を示すために、このようなファージを利用することができる。目的の抗原に結合する抗原結合領域を発現するファージは、抗原を用いて（例えば、標識した抗原を用いるか、または固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗体を用いて）選択し、または特定することができる。これらの方法で使用するファージは、典型的には、Ｆａｂ、Ｆｖ  ＯＥ  ＤＡＢ（軽鎖または重鎖に由来する個々のＦｖ領域）を有するファージから発現するｆｄ結合領域およびＭ１３結合領域を含むか、またはファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかが組み換えによって融合した、ジスルフィドによって安定化したＦｖ抗体領域を含む糸状ファージである。方法の例は、例えば、欧州特許第３６８  ６８４  Ｂ１号；米国特許第５，９６９，１０８号、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＣｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１（２０００）；Ｎａｇｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）；Ｈｕｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：２６８２（２００１）；Ｌｕｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３（２００２）に記載されており、これらの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。種々の刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））には、大量のファージライブラリを構築するために、チェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）、およびコンビナトリアル感染およびインビボ組み換え法によって高親和性を有するヒト抗体の製造法が記載されている。別の実施形態では、リボソームディスプレイを、ディスプレイプラットフォームとしてバクテリオファージの代わりに用いてもよい（例えば、Ｈａｎｅｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７（２０００）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：３７５０（２００１）；またはＩｒｖｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１（２００１）を参照）。さらに別の実施形態では、細胞表面ライブラリをスクリーニングして抗体を調べてもよい（Ｂｏｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１０７０１（２０００）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２１１（２０００））。さらに別の例示的な実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ１およびＣＤＲ  Ｈ２のような所定の相補性決定領域において、合成多様性を有するヒトドナーに由来する免疫グロブリン配列を組み合わせることによって、高親和性ヒトＦａｂライブラリを設計する（例えば、Ｈｏｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３：３４４−３４８（２００５）、この内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）。上述の手順は、モノクローナル抗体を単離し、クローン化するための従来のハイブリドーマ技術にとって代わるものである。
【０３６０】
ファージディスプレイ法では、抗体の機能的領域をファージ粒子表面に提示し、このファージ粒子は、上述の機能的領域をコードするポリヌクレオチド配列を有している。例えば、ＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列を増幅するか、または他の方法で動物のｃＤＮＡライブラリ（例えば、ヒトまたはマウスのリンパ組織のｃＤＮＡライブラリ）または合成ｃＮＤＡライブラリから単離する。特定の実施形態では、ＰＣＲによって、ＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするＤＮＡをｓｃＦｖリンカーによって接続し、ファージミドベクター（例えば、ｐ  ＣＡＮＴＡＢ  ６またはｐＣｏｍｂ  ３  ＨＳＳ）にクローン化する。このベクターをＥ．ｃｏｌｉに電気穿孔し、Ｅ．ｃｏｌｉをヘルパーファージで感染させる。この方法で使用するファージは、典型的には、ｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージであり、ＶＨ領域またはＶＬ領域は、通常は、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかが組み換えによって融合している。目的の抗原（すなわち、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメント）に結合する抗原結合領域を発現するファージは、抗原を用いて（例えば、標識した抗原を用いるか、または固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗体を用いて）選択し、または特定することができる。
【０３６１】
抗体を製造するのに使用可能なファージディスプレイ法のさらなる例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９０／０２８０９号；ＷＯ９１／１０７３７号；ＷＯ９２／０１０４７号；ＷＯ９２／１８６１９号；ＷＯ９３／１１２３６号；ＷＯ９５／１５９８２号；ＷＯ９５／２０４０１号；および米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号および第５，９６９，１０８号に開示されており、これらの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０３６２】
上述の引用文献に記載されているように、ファージを選択した後、ファージから得られる抗体コード領域を単離し、全抗体（ヒト抗体または任意の他の所望な抗原結合性を保持したフラグメントを含む）を作成し、任意の所望の宿主（哺乳動物の細胞、昆虫の細胞、植物細胞、酵母および微生物を含む）で発現させることができる。例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組み換えによって産生する技術は、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（この参考文献は、参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示されている方法のような、当該技術分野で既知の方法を用いて実施することができる。
【０３６３】
単鎖Ｆｖおよび抗体を産生するのに使用可能な技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載されている技術が挙げられる。
【０３６４】
インビボでのヒトでの抗体の使用、およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの使用で、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を使用することが好ましい場合もある。
【０３６５】
完全ヒト抗体は、ヒト患者を治療するには、特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを用いる上述のファージディスプレイ法を含む、当該技術分野で既知の種々の方法で製造することができる。さらに、米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ出願公開ＷＯ９８／４６６４５号、ＷＯ９８／５０４３３号、ＷＯ９８／２４８９３号、第ＷＯ９８／１６６５４号、ＷＯ９６／３４０９６号、ＷＯ９６／３３７３５号およびＷＯ９１／１０７４１号も参照（この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０３６６】
ヒト抗体は、機能的な内因性免疫グロブリンを発現することはできず、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現可能なトランスジェニックマウスを用いて産生することができる。例えば、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子複合体を、無作為に導入してもよいし、またはマウスＥＳ細胞への相同組み換えによって導入してもよい。あるいは、ヒトの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子に加え、ヒトの可変領域、定常領域および多様な領域を、マウスＥＳ細胞に導入してもよい。マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の遺伝子は、相同組み換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に、または同時に機能を失わせてもよい。特に、ＪＨ領域のホモ接合体欠失によって、内因性抗体の産生が抑えられる。改変されたＥＳ細胞の数を増やし、胚盤胞に微量注入し、キメラマウスを産生する。次いで、キメラマウスを繁殖させ、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産生する。トランスジェニックマウスを、選択した抗原（例えば、所望の標的ポリペプチド全体または一部分）を用いて通常の様式で免疫化する。免疫化したトランスジェニックマウスから、従来のハイブリドーマ技術を用いて、所定の抗原に結合性のモノクローナル抗体を得ることができる。トランスジェニックマウスによって得られたヒト免疫グロブリンのトランス遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再編成され、その後、クラススイッチが起こり、体細胞変異が起こる。したがって、この技術を用い、治療に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するこの技術の概説は、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生する技術、およびこのような抗体を産生するプロトコルのさらなる詳細は、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９８／２４８９３号；ＷＯ９６／３４０９６号；ＷＯ９６／３３７３５号；米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；および第５，９３９，５９８号を参照（この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フレモント）およびＧｅｎＰｈａｒｍ（カリフォルニア州サンノゼ）のような企業と交渉し、上述の技術と似た技術を用い、所定の抗原に対するヒト抗体を得ることができる。
【０３６７】
所定のエピトープを認識する完全ヒト抗体を、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技術を用いて作成することができる。このアプローチでは、所定の非ヒトモノクローナル抗体（例えばマウス抗体）を使用し、同じエピトープを認識する全ヒト抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８）。さらに、米国特許第５，５６５，３３２号も参照）。
【０３６８】
さらに、本発明の標的ポリペプチドに対する抗体を使用し、当該技術分野で周知の技術を用い、標的ポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を作成することができる（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ  ＆  Ｂｏｎａ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７（５）：４３７−４４４（１９８９）およびＮｉｓｉｎｏｆｆ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照）。例えば、本発明のポリペプチドに結合するか、ポリペプチドのマルチマー化および／または本発明のポリペプチドがリガンドに結合することを競合的に阻害するか、またはアロステリック効果によって阻害する抗体を使用し、ポリペプチドのマルチマー化および／または結合領域を「模倣する」抗イディオタイプを作成し、その結果、ポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、中和することができる。このような中和能を有する抗イディオタイプまたは抗イディオタイプのＦａｂフラグメントを、ポリペプチドを中和する治療法に使用することができる。例えば、このような抗イディオタイプ抗体を使用し、所望の標的ポリペプチドおよび／またはそのリガンド／受容体に結合し、その生体活性を失わせることができる。
【０３６９】
（ｉｉ  単鎖結合分子）
他の実施形態では、本発明の結合分子は、単鎖結合分子（例えば、単鎖可変領域またはｓｃＦｖ）であってもよく、または結合部分として、上述の単鎖結合分子を含んでいてもよい。好ましくは、単鎖結合分子は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。あるいは、単鎖抗体を産生するために記載された技術（米国特許第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５５４（１９８９））を適用し、単鎖抗体を産生することができる。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントをアミノ酸架橋で結合し、単鎖抗体を得ることによって作成される。Ｅ  ｃｏｌｉの機能的なＦｖ領域をアセンブリする技術も使用してもよい（Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０３７０】
特定の実施形態では、本発明の結合分子は、ｓｃＦｖ分子（例えば、ｓｃＦｖリンカーによって結合したＶＨドメインおよびＶＬドメイン）であるか、またはこのようなｓｃＦｖ分子を含む。ｓｃＦｖ分子は、従来のｓｃＦｖ分子であってもよく、または安定化したｓｃＦｖ分子であってもよい。安定化する変異、ジスルフィド結合を含むか、またはｓｃＦｖまたはｓｃＦｖを含む結合分子の安定性を高める（例えば、熱安定性を高める）最適化したリンカーを含む、安定化したｓｃＦｖは、米国特許出願第１１／７２５，９７０号に詳細に記載されており、この全ての内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。他の実施形態では、本発明の結合分子は、ｓｃＦｖ分子を含むポリペプチドである。本発明の安定化したｓｃＦｖ分子が、第２の分子に融合している場合、第２の分子によって、この融合タンパク質に結合特異性が付与され得る。安定化したｓｃＦｖ分子は、熱安定性が改良されている（例えば、融解温度（Ｔｍ）の値が、５４℃よりも高い（例えば、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃またはそれ以上）であるか、またはＴ５０値が、３９℃よりも高い（例えば、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃または８０℃よりも高い）。ある好ましい実施形態では、安定化したｓｃＦｖ分子のＴ５０は、５０℃よりも高い。別の好ましい実施形態では、安定化したｓｃＦｖ分子のＴ５０は、６０℃よりも高い。
【０３７１】
本発明のｓｃＦｖ分子の安定性は、当該技術分野で既知の方法を用いて決定することができ、既知の方法としては、例えば、米国特許出願第１１／７２５，９７０号（米国特許公開番号第２００８／００５０３７０号）に記載される方法が挙げられ、この内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０３７２】
本発明のｓｃＦｖ分子、または本発明のｓｃＦｖ分子を含む融合タンパク質の安定性は、従来の（安定化していない）ｓｃＦｖ分子、または従来のｓｃＦｖ分子を含む結合分子の生物物理学的性質（例えば、熱安定性）を参照して評価することができる。ある実施形態では、本発明の結合分子は、コントロール結合分子（例えば、従来のｓｃＦｖ分子）よりも、約０．１℃、約０．２５℃、約０．５℃、約０．７５℃、約１℃、約１．２５℃、約１．５℃、約１．７５℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃または約１０℃高い熱安定性を有する。
【０３７３】
ある実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１３５）からなるか、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１３５）配列を含む。他のリンカーの例は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３配列（配列番号１８５）および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号１８４）配列を含むか、またはこれらの配列からなる。本発明のｓｃＦｖリンカーは、長さがさまざまであり得る。ある実施形態では、本発明のｓｃＦｖリンカーは、約５アミノ酸長〜約５０アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のｓｃＦｖリンカーは、約１０アミノ酸長〜約４０アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のｓｃＦｖリンカーは、約１５アミノ酸長〜約３０アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のｓｃＦｖリンカーは、約１７アミノ酸長〜約２８アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のｓｃＦｖリンカーは、約１９アミノ酸長〜約２６アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のｓｃＦｖリンカーは、約２１アミノ酸長〜約２４アミノ酸長である。
【０３７４】
特定の実施形態では、本発明の安定化したｓｃＦｖ分子は、ＶＬドメインのアミノ酸と、ＶＨドメインのアミノ酸とを繋ぐ、少なくとも１個のジスルフィド結合を含む。ジスルフィド結合させるには、システイン残基が必要である。本発明のｓｃＦｖ分子に、ジスルフィド結合が含まれて得、例えば、ＬＶのＦＲ４とＶＨのＦＲ２とを繋いでもよく、またはＶＬのＦＲ２とＶＨのＦＲ４とを繋いでもよい。ジスルフィド結合の位置の例としては、Ｋａｂａｔ付番により、ＶＨの４３、４４、４５、４６、４７、１０３、１０４、１０５および１０６と、ＶＬの４２、４３、４４、４５、４６、９８、９９、１００および１０１が挙げられる。システイン残基を変異させるアミノ酸位置の組み合わせ例は、ＶＨ４４−ＶＬ１００、ＶＨ１０５−ＶＬ４３、ＶＨ１０５−ＶＬ４２、ＶＨ４４−ＶＬ１０１、ＶＨ１０６−ＶＬ４３、ＶＨ１０４−ＶＬ４３、ＶＨ４４−ＶＬ９９、ＶＨ４５−ＶＬ９８、ＶＨ４６−ＶＬ９８、ＶＨ１０３−ＶＬ４３、ＶＨ１０３−ＶＬ４４およびＶＨ１０３−ＶＬ４５である。ある実施形態では、ジスルフィド結合は、ＶＨのアミノ酸４４とＶＬのアミノ酸１００とを繋ぐ。
【０３７５】
ある実施形態では、本発明の安定化したｓｃＦｖ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にアミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１３５）を有するｓｃＦｖリンカーを含み、ＶＨドメインとＶＬドメインとが、ＶＨのアミノ酸位置４４とＶＬのアミノ酸位置１００とを繋ぐジスルフィド結合で接続している。
【０３７６】
他の実施形態では、本発明の安定化したｓｃＦｖ分子は、ｓｃＦｖの可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）内に、１個以上の（例えば、２個、３個、４個、５個またはそれ以上の）安定化する変異を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示した任意のＶＨドメインまたはＶＬドメインに、安定化する変異が導入されている（例えば、Ｍ１３−ＣＯ６抗体に由来するＶＬドメイン（配列番号７８）またはＭ１４−Ｇ１１抗体に由来するＶＬドメイン（配列番号９３）、またはＭ１３−ＣＯ６抗体に由来するＶＨドメイン（配列番号１４）またはＭ１４−Ｇ１１抗体に由来するＶＨドメイン（配列番号３２））。
【０３７７】
ある実施形態では、安定化する変異は、（ａ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置３のアミノ酸（例えば、グルタミン）を、例えば、アラニン、セリン、バリン、アスパラギン酸またはグリシンで置換；（ｂ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置４６のアミノ酸（例えば、セリン）を、例えば、ロイシンで置換；（ｃ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置４９のアミノ酸（例えば、セリン）を、例えば、チロシンまたはセリンで置換；（ｄ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置５０のアミノ酸（例えば、セリンまたはバリン）を、例えば、セリン、スレオニンおよびアルギニン、アスパラギン酸、グリシンまたはリジンで置換；（ｅ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置４９のアミノ酸（例えば、セリン）およびＶＬのＫａｂａｔでの位置５０のアミノ酸（例えば、セリン）を、それぞれ、チロシンおよびセリン、チロシンおよびスレオニン、チロシンおよびアルギニン、チロシンおよびグリシン、セリンおよびアルギニン、またはセリンおよびリジンで置換；（ｆ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置７５のアミノ酸（例えば、バリン）を、例えば、イソロイシンで置換；（ｇ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置８０のアミノ酸（例えば、プロリン）を、例えば、セリンまたはグリシンで置換；（ｈ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置８３のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）を、例えば、セリン、アラニン、グリシンまたはスレオニンで置換；（ｉ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置６のアミノ酸（例えば、グルタミン酸）を、例えば、グルタミンで置換；（ｊ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置１３のアミノ酸（例えば、リジン）を、例えば、グルタメートで置換；（ｋ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置１６のアミノ酸（例えば、セリン）を、例えば、グルタメートまたはグルタミンで置換；（ｌ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置２０のアミノ酸（例えば、バリン）を、例えば、例えば、イソロイシンで置換；（ｍ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置３２のアミノ酸（例えば、アスパラギン）を、例えば、セリンで置換；（ｎ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置４３のアミノ酸（例えば、グルタミン）を、例えば、リジンまたはアルギニンで置換；（ｏ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置４８のアミノ酸（例えば、メチオニン）を、例えば、イソロイシンまたはグリシンで置換；（ｐ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置４９のアミノ酸（例えば、セリン）を、例えば、グリシンまたはアラニンで置換；（ｑ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置５５のアミノ酸（例えば、バリン）を、例えば、グリシンで置換；（ｒ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置６７のアミノ酸（例えば、バリン）を、例えば、イソロイシンまたはロイシンで置換；（ｓ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置７２のアミノ酸（例えば、グルタミン酸）を、例えば、アスパルテートまたはアスパラギンで置換；（ｔ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置７９のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）を、例えば、セリン、バリンまたはチロシンで置換；および（ｕ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置１０１のアミノ酸（例えば、プロリン）を、例えば、アスパラギン酸で置換、からなる群から選択される。
【０３７８】
別の実施形態では、安定化する変異は、（ａ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置４のアミノ酸（例えば、メチオニン）を、例えば、ロイシンで置換；（ｂ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置１１のアミノ酸を、例えば、グリシンで置換；（ｃ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置１５のアミノ酸（例えば、バリン）を、例えば、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、アスパラギン、プロリン、アルギニンまたはセリンで置換；（ｄ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置２０のアミノ酸を、例えば、アルギニンで置換；（ｅ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置２４のアミノ酸を、例えば、リジンで置換；（ｆ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置３０のアミノ酸（例えば、アルギニン）を、例えば、アスパラギン、スレオニンまたはチロシンで置換；（ｇ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置４７のアミノ酸（例えば、スレオニン）を、例えば、セリンで置換；（ｈ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置５０のアミノ酸を、例えば、グリシン、メチオニンまたはアスパラギンで置換；（ｉ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置５１のアミノ酸（例えば、アラニン）を、例えば、グリシンで置換；（ｊ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置６３のアミノ酸を、例えば、セリンで置換；（ｋ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置７０のアミノ酸を、例えば、グルタミン酸で置換；（ｌ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置７２のアミノ酸（例えば、セリン）を、例えば、アスパラギンまたはチロシンで置換；（ｍ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置７４のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸）を、例えば、セリンで置換；（ｎ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置７７のアミノ酸を、例えば、グリシンで置換；（ｏ）ＶＬのＫａｂａｔでの位置８３のアミノ酸（例えば、イソロイシン）を、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、メチオニン、アルギニン、セリンまたはバリンで置換；（ｐ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置６のアミノ酸を、例えば、グルタミンで置換；（ｑ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置２１のアミノ酸を、例えば、グルタミン酸で置換；（ｒ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置４７のアミノ酸（例えば、トリプトファン）を、例えば、フェニルアラニンで置換；（ｓ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置４９のアミノ酸を、例えば、アラニンで置換；（ｔ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置８３のアミノ酸（例えば、アルギニン）を、例えば、リジンまたはスレオニンで置換；および（ｕ）ＶＨのＫａｂａｔでの位置１１０のアミノ酸（例えば、スレオニン）を、例えば、バリンで置換、からなる群から選択される。
【０３７９】
さらに別の実施形態では、ｓｃＦｖ分子は、従来のｓｖＦｖ分子と比較して、安定化する変異を含み、この変異は、（ｉ）ＶＬのアミノ酸位置５０、（ｉｉ）ＶＬのアミノ酸位置８３、（ｉｉｉ）ＶＨのアミノ酸位置６および（ｉｖ）ＶＨのアミノ酸位置４９に存在する（Ｋａｂａｔ付番による規則）。別の実施形態では、この安定化する変異は、６Ｑ、２１Ｅ、４７Ｆ、４９Ａ、４９Ｇ、８３Ｋ、８３Ｔおよび１１０Ｖからなる群から選択される。
【０３８０】
ある実施形態では、本発明は、配列番号１２３、１２５または１２７からなる群から選択される参照ポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一なポリヌクレオチドがコードする配列を含む、安定化したｓｃＦｖ分子を与える。他の例示的な実施形態では、安定化したｓｃＦｖ分子は、配列番号１２４、１２６または１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、上述の安定化したｓｃＦｖ分子は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０３８１】
タンパク質の安定性を同じように高めるために、上述のいずれの安定化する変異も、他のｓｃＦｖではない結合分子（例えば、本明細書に開示した任意のＩＧＦ−１Ｒ結合分子）の適切な可変領域（ＶＬまたはＶＨ）に導入してもよいことが、当業者に理解されるであろう。例えば、上に開示した１つ以上の安定化する変異を、Ｆａｂ分子または全長ＩｇＧ抗体分子のＶＬドメインまたはＶＨドメインの等価なアミノ酸位置（Ｋａｂａｔ付番による）に導入し、分子の安定性を高めてもよい。
【０３８２】
（ｉｉｉ  単一ドメイン結合分子）
特定の実施形態では、結合分子は、単一ドメイン結合分子（例えば、単一ドメイン抗体、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）とも呼ばれる）であるか、単一ドメイン結合分子を含む。単一ドメイン分子の例としては、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）単離物（すなわち、軽鎖可変ドメインを含まない重鎖可変ドメインのみ）、および抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）単離物（すなわち、重鎖可変ドメインを含まない軽鎖可変ドメインのみ）が挙げられる。本発明の結合分子で使用する単一ドメイン抗体の例としては、例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）、およびＤｕｍｏｕｌｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１：５００−５１５（２００２）に記載されるラクダ重鎖可変ドメイン（アミノ酸残基約１１８〜１３６）が挙げられる。単一ドメイン抗体のマルチマーも、本発明の範囲に含まれる。他の単一ドメイン抗体としては、サメ抗体（例えば、サメＩｇ−ＮＡＲ）が挙げられる。サメＩｇ−ＮＡＲは、１種類の可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲ）および５種類のＣ型定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲ）のホモダイマーを含み、その多様性は、５〜２３残基長の長いＣＤＲ３領域に集中している。ラクダ種（例えば、ラマ）では、重鎖可変領域（ＶＨＨと呼ばれる）が、抗原結合領域全体を形成している。ラクダ科のＶＨＨ可変領域と、従来の抗体から誘導された重鎖可変領域（ＶＨ）との大きな違いは、（ａ）ＶＨが軽鎖と接触する表面には、対応するＶＨＨの領域と比較して疎水性のアミノ酸が多いこと、（ｂ）ＶＨＨの方がＣＤＲ３が長いこと、（ｃ）ＶＨＨのＣＤＲ１とＣＤＲ３との間で頻繁にジスルフィド結合が発生することである。単一ドメイン結合分子の製造方法は、米国特許第６．００５，０７９号および第６，７６５，０８７号に記載されており、この両者の内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０３８３】
（ｉｖ  ミニボディ）
特定の実施形態では、本発明の結合分子は、ミニボディであるか、ミニボディを含む。ミニボディは、当該技術分野で記載の方法を用いて製造することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１号を参照）。特定の実施形態では、ミニボディは、天然または非天然の（例えば、変異した）重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメイン、またはこれらの組み合わせの２個の相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含む結合分子である。このようなミニボディの例は、Ｐｅｓｓｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：３６７−３６９（１９９３）に記載されている。別のミニボディの例は、ＣＨ３ドメインまたは全Ｆｃ領域に結合しているか、または融合しているｓｃＦｖ分子を含む。ミニボディのマルチマーも本発明の範囲に含まれる。
【０３８４】
（ｖ．免疫グロブリンではない結合分子）
特定の実施形態では、本発明の結合分子は、免疫グロブリンではない結合分子であるか、または免疫グロブリンではない結合分子に由来する１個以上の結合部分を含む。本明細書で使用するとき、用語「非免疫グロブリン結合分子」は、結合部分に、免疫グロブリン以外のポリペプチドに由来する部分（例えば、足場タンパク質またはフレームワーク）を含む結合分子であるが、所望な結合特異性を提供するために、遺伝子操作をしていてもよい（例えば、突然変異）。
【０３８５】
免疫グロブリン結合分子は、免疫グロブリン以外の免疫グロブリンスーパーファミリー由来の結合部分を含み得る（例えば、Ｔ細胞受容体または細胞接着タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ−４、Ｎ−ＣＡＭ、テロキン））。このような結合分子は、免疫グロブリンの折りたたみ構造を保持し、ＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合可能な結合部分を含む。他の実施形態では、本発明の非免疫グロブリン結合分子は、免疫グロブリンの折りたたみ構造に基づかないタンパク質トポロジーを有する（例えば、アンキリン繰り返しタンパク質またはフィブロネクチン）が、標的（例えば、ＩＧＦ−１Ｒエピトープ）に特異的に結合可能な結合部位も含む。
【０３８６】
非免疫グロブリン結合分子は、人工的に多様化させた結合部位を有する結合分子ライブラリから、標的に結合する改変体を選別するか、または単離することによって同定してもよい。多様化させたライブラリは、完全に無作為なアプローチを用いて作成してもよく（例えば、エラープローンＰＣＲ、エクソンシャッフリング、または定方向進化）、または当該技術分野で認識された設計方法を使って作成してもよい。例えば、結合部位が、同族の標的分子と相互作用するときに、通常関与するアミノ酸の位置は、縮重コドン、トリヌクレオチド、ランダムペプチド、または結合部位をコードする核酸の中の対応する位置に完全なループを挿入することによって、ランダム化してもよい（例えば、米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号を参照）。アミノ酸の位置は、標的分子との複合体で、結合部位の結晶構造を観察することによって特定することができる。ランダム化する候補となる位置は、ループ、平坦な表面、らせん、および結合部位の結合空洞が挙げられる。特定の実施形態では、多様化の候補になりそうな結合部位に存在するアミノ酸は、免疫グロブリンの折りたたみ構造との同一性によって特定してもよい。例えば、フィブロネクチンのＣＤＲ様ループに含まれる残基をランダム化し、フィブロネクチン結合分子のライブラリを作成してもよい（例えば、Ｋｏｉｄｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８４：１１４１−１１５１（１９９８）を参照）。結合部位のうち、ランダム化可能な他の部分としては、平坦な表面が挙げられる。ランダム化した後、多様化させたライブラリを選択またはスクリーニングし、所望の結合特性を有する（例えば、上述のＩＧＦ−１Ｒエピトープに対して特異的に結合する）結合分子を得てもよい。例えば、当該技術分野で認識されている方法（例えば、ファージディスプレイ、イーストディスプレイ、またはリボソームディスプレイ）で、選択してもよい。
【０３８７】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、フィブロネクチン結合分子に由来する結合部分を含む。フィブロネクチン結合分子（例えば、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型のフィブロネクチン領域を含む分子）は、ＣＤＲ様のループ形状をとり、これは、免疫グロブリンとは違い、これは鎖内ジスルフィド結合にはよらない。フィブロネクチン結合ポリペプチドの製造方法は、例えば、ＷＯ  ０１／６４９４２号および米国特許第６，６７３，９０１号、第６，７０３，１９９号、第７，０７８，４９０号および第７，１１９，１７１号に記載されており、この内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０３８８】
別の実施形態では、本発明の結合分子は、アフィボディ由来の結合部位を含む。アフィボディは、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＳＰＡ）の免疫グロブリン結合領域に由来する（例えば、Ｎｏｒｄら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：７７２−７７７（１９９７）を参照）。本発明で利用するアフィボディ結合部位は、ＳＰＡの領域（例えば、領域Ｂ）に由来する、ＳＰＡに関連するタンパク質（例えば、タンパク質Ｚ）を突然変異させ、ＩＧＦ−１Ｒエピトープへの結合親和性を有するＳＰＡ関連ポリペプチド変異体を選択することによって合成してもよい。アフィボディ結合部位を製造する他の方法は、米国特許第６，７４０，７３４号および同第６，６０２，９７７号およびＷＯ００／６３２４３号に記載されており、これらの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０３８９】
別の実施形態では、本発明の結合分子は、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）由来の結合部位を含む。アンチカリン（リポカリンとしても知られる）は、多様なβ−バレルタンパク質を有する群であり、バレル／ループ領域で標的分子に結合する機能がある。リポカリン結合部位は、バレルのストランドに接続するループ配列をランダム化することによって、ＩＧＦ−１Ｒエピトープに結合するように遺伝子操作されてもよい（例えば、Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ、１０：２３−３３（２００５）；Ｂｅｓｔｅら、ＰＮＡＳ、９６：１８９８−１９０３（１９９９）を参照）。本発明の結合分子で利用するアンチカリン結合部位は、Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａのビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）のアミノ酸位置２８〜４５、５８〜６９、８６〜９９および１１４〜１２９を含む直鎖状ポリペプチド配列の配列位置に対応する４箇所の部分で突然変異を起こしたリポカリン群のポリペプチドから得てもよい。アンチカリン結合部位を製造する他の方法は、ＷＯ９９／１６８７３号およびＷＯ０５／０１９２５４号に記載されており、これらの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０３９０】
別の実施形態では、本発明の結合分子は、システインに富むポリペプチド由来の結合部位を含む。本発明を実施するのに利用するシステインに富む領域は、典型的には、α−らせん、β−シート、またはβ−バレルの構造をとらない。典型的には、ジスルフィド結合によって、この領域の三次元構造への折りたたみが促進される。通常は、システインに富む領域は、少なくとも２個のジスルフィド結合を有しており、さらに典型的には、少なくとも３個のジスルフィド結合を有している。システインに富むポリペプチドの例は、Ａ領域のタンパク質である。Ａ領域（「相補性の繰り返し（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｔｙｐｅ  ｒｅｐｅａｔ）」と呼ばれることもある）は、約３０〜５０個または約３０〜６５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、この領域は、約３５〜４５個のアミノ酸を含み、ある場合には、約４０個のアミノ酸を含む。３０〜５０個のアミノ酸の中に、システイン残基は約６個存在する。この６個のシステインのうち、ジスルフィド結合は、典型的には、Ｃ１とＣ３との間、Ｃ２とＣ５との間、Ｃ４とＣ６との間に存在する。Ａ領域は、リガンド結合部位を構成する。この領域のシステイン残基は、ジスルフィド結合によって、小さくまとまった、安定で機能的に独立した部分を形成する。この繰り返しがクラスターになってリガンド結合領域を作り、異なるクラスターができることによって、リガンド結合に対する特異性が付与され得る。Ａ領域を含むタンパク質の例としては、例えば、相補性成分（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９およびＦａｃｔｏｒ  Ｉ）、セリンプロテアーゼ（例えば、エンテロペプチダーゼ、マトリプターゼおよびコリン）、膜貫通タンパク質（例えば、ＳＴ７、ＬＲＰ３、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６）およびエンドサイトーシス受容体（例えば、Ｓｏｒｔｉｌｉｎ関連受容体、ＬＤＬ−受容体、ＶＬＤＬＲ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ２およびＡｐｏＥＲ２）が挙げられる。所望の結合特異性を有するＡ領域タンパク質を製造する方法は、例えば、ＷＯ０２／０８８１７１号およびＷＯ０４／０４４０１１号に開示されており、これらの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０３９１】
他の実施形態では、本発明の結合分子は、リピートタンパク質の結合部位を含む。リピートタンパク質は、小さな（例えば、約２０〜約４０個のアミノ酸残基）構造単位または構造の繰り返しが連続した複製物を含有し、これらが合わさって連続的な領域を形成するタンパク質である。リピートタンパク質は、このタンパク質中の繰り返し数を調節することによって、特定の標的結合部位に合うように改変することができる。リピートタンパク質の例としては、設計されたアンキリンリピートタンパク質（すなわち、ＤＡＲＰｉｎ）（例えば、Ｂｉｎｚら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２：５７５−５８２（２００４）を参照）、またはロイシンに富むリピートタンパク質（すなわち、ＬＲＲＰ）（例えば、Ｐａｎｃｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４３０：１７４−１８０（２００４）を参照）が挙げられる。今までに分かっていることは、アンキリン繰り返し単位の三次元構造は、β−ヘアピン構造の後に、２個の逆行性のα−らせんがあり、繰り返し単位と次の繰り返し単位を接続するループへと続く構造であるということである。アンキリン繰り返し単位を構成する領域は、この繰り返し領域を、広がった構造や曲がった構造になるように繋ぎ合わせることによって作られる。ウミヤツメおよび他の無顎類の適応免疫系の一部から得られるＬＲＲＰ結合部位は、それらがリンパ球の成熟期にロイシンに富む一組の繰り返し遺伝子を再び組み合わせることによって形成されるという点で、抗体に類似する。ＤＡＲｐｉｎ結合部位またはＬＲＲＰ結合部位を製造する方法は、ＷＯ０２／２０５６５号およびＷＯ０６／０８３２７５に記載されており、これらの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０３９２】
本発明の結合分子で利用可能な他の非免疫グロブリン結合部位としては、Ｓｒｃ同一性領域（例えば、ＳＨ２領域またはＳＨ３領域）、ＰＤＺ領域、β−ラクタマーゼ、高親和性プロテアーゼ阻害剤、または小分子ジスルフィド結合足場タンパク質（例えば、サソリの毒素など）に由来する結合部位が挙げられる。これらの分子に由来する結合部位を製造する方法は、当該技術分野で開示されており、例えば、Ｐａｎｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：２１６６６−２１６７４（２００２）、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：１７０−１７５（１９９９）；Ｌｅｇｅｎｄｒｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、１１：１５０６−１５１８（２００２）；Ｓｔｏｏｐら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１：１０６３−１０６８（２００３）；およびＶｉｔａら、ＰＮＡＳ、９２：６４０４−６４０８（１９９５）を参照。さらに他の結合部位は、ＥＧＦ様領域、Ｋｒｉｎｇｌｅ領域、ＰＡＮ領域、Ｇｌａ領域、ＳＲＣＲ領域、Ｋｕｎｉｔｚ／Ｂｏｖｉｎｅ膵臓トリプシン阻害領域、Ｋａｚａｌ型セリンプロテアーゼ阻害領域、Ｔｒｅｆｏｉｌ（Ｐ型）領域、フォンウィルブランド因子Ｃ型領域、Ａｎａｐｈｙｌａｔｏｘｉｎ様領域、ＣＵＢ領域、サイログロブリンＩ型繰り返し、ＬＤＬ受容体Ａ型領域、Ｓｕｓｈｉ領域、Ｌｉｎｋ領域、トロンボスポンジンＩ型領域、免疫グロブリン様領域、Ｃ型レクチン領域、ＭＡＭ領域、フォンウィルブランド因子Ａ型領域、Ｓｏｍａｔｏｍｅｄｉｎ  Ｂ領域、ＷＡＰ型の４つのジスルフィドコアを有する領域、Ｆ５／８  Ｃ型領域、Ｈｅｍｏｐｅｘｉｎ領域、Ｌａｍｉｎｉｎ型のＥＧＦ様領域、Ｃ２領域、および当業者に既知の他の領域、およびこれらの誘導体および／または改変体からなる群から選択される結合領域に由来してもよい。
【０３９３】
（ｖｉ．結合分子フラグメント）
特記しない限り、本明細書で使用するとき、結合分子について記載する「フラグメント」は、抗原結合性を保持したフラグメント（すなわち、抗原に特異的に結合する、結合の一部分）を指す。ある実施形態では、本発明の結合分子は、抗体フラグメントであるか、そのような抗体フラグメントを含む。特定のエピトープを認識する抗体フラグメントを、既知の技術によって作成してもよい。例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、免疫グロブリン分子を組み換え操作するか、またはパパイン（Ｆａｂフラグメントを得る）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを作成する）のような酵素を用い、タンパク質分解によって開裂させて作成してもよい。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域と、軽鎖定常領域と、重鎖のＣＨ１領域とを含有する。
【０３９４】
（Ｂ．多重特異性結合分子）
本発明の多重特異性結合分子は、少なくとも２個の結合部位または結合部分を含んでいてもよく、この結合部位または結合部分のうち、少なくとも１つは、上述の単一特異性結合分子またはその結合部分のうち１つに由来するか、またはこのような単一特異性結合分子またはその結合部分を含む。特定の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子の少なくとも１つの結合部位は、抗体の抗原結合領域または抗原結合性を保持した抗体フラグメントである（例えば、上述の抗体または抗原結合性を保持したフラグメント）。
【０３９５】
（（ｉ）二重特異性抗体）
特定の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、二重特異性である。二重特異性結合分子は、二価であってもよく、これより多い価数を有していてもよい（例えば、三価、四価、六価など）。二重特異性の二価抗体、および製造方法は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；同第５，８０７，７０６号；同第５，８２１，３３３号；および米国特許出願公開第２００３／０２０７３４号および同第２００２／０１５５５３７号に記載されており、上述の各出願の内容の全ては、参照することにより本明細書に組み込まれる。二重特異性の四価抗体、および製造方法は、例えば、ＷＯ０２／０９６９４８号およびＷＯ００／４４７８８号に記載されており、上述の両出願の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。一般的に、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／１７７１５号；ＷＯ９２／０８８０２号；ＷＯ９１／００３６０号；ＷＯ９２／０５７９３号；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２０号；同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照。
【０３９６】
本発明の二重特異性抗体は、単一特異性結合分子のいずれも（例えば、上述の抗体のいずれか）を含み得、または上に開示した結合部分のいずれをも含んでいてもよい。例えば、特定の実施形態では、二重特異性抗体は、本明細書に開示した寄託済抗体のいずれかを第１の結合部分として含み、本明細書に開示した任意のｓｃＦｖ分子を第２の結合部分として含んでいてもよい。但し、この第１および第２の結合部分は、異なる結合特異性を有している。ある実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、Ｍ１３．Ｃ０６  ＩｇＧ抗体の可変領域に由来する１つ以上のｓｃＦｖ分子（例えば、１つ以上の安定化したｓｃＦｖ分子）に結合しているか、または融合しているＭ１４．Ｇ１１  ＩｇＧ抗体を含んでいてもよい。別の例示的な実施形態では、二重特異性抗体は、Ｍ１４．Ｇ１１抗体の可変領域に由来するｓｃＦｖ分子（例えば、安定化したｓｃＦｖ分子）に結合しているか、または融合しているＭ１３．Ｃ０６  ＩｇＧ抗体を含んでいてもよい。上述の二重特異性抗体のＭ１４．Ｇ１１  ＩｇＧ抗体またはＭ１３．ＣＯ６  ＩｇＧ抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）の重鎖定常領域を含んでいてもよい。特定の実施形態では、重鎖定常領域は、完全にグリコシル化されている。他の実施形態では、重鎖定常領域は、グリコシル化されない（例えば、ＩｇＧ抗体は、「ａｇｌｙ」抗体、例えば、Ｉｇｌｙ  ＩｇＧ１抗体またはａｇｌｙ  ＩｇＧ４抗体である）。ある実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｍ１４．Ｇ１１  ＩｇＧ抗体またはＭ１３．Ｃ０６  ＩｇＧ抗体の重鎖の成熟Ｎ末端に結合しているか、または融合している。他の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ抗体の重鎖の成熟Ｃ末端に結合しているか、または融合している。さらに他の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｍ１４．Ｇ１１  ＩｇＧ抗体またはＭ１３．Ｃ０６  ＩｇＧ抗体の軽鎖の成熟Ｎ末端に結合しているか、または融合している。特定の実施形態では、ｇｌｙ／ｓｅｒに結合しているペプチド（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号１８４）リンカー）を使用し、上述の二重特異性抗体のＩｇＧ抗体にｓｃＦｖを接続してもよい。
【０３９７】
さらなる例示的な実施形態では、本発明は、配列番号１３２、１３６、１４１または１４３からなる群から選択される参照ポリヌクレオチドと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一なポリヌクレオチドがコードする重鎖を含む二重特異性結合分子を与える。他の例示的な実施形態では、二重特異性分子は、配列番号１３３、１３７、１４２または１４４からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一な重鎖を含む。特定の実施形態では、二重特異性アミノ酸は、配列番号１２９または配列番号１３９の参照ポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一なポリヌクレオチドがコードする軽鎖をさらに含む。他の例示的な実施形態では、二重特異性分子は、配列番号１３０および配列番号１４０と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一な軽鎖をさらに含む。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するか、または選択的に結合する。
【０３９８】
（（ｉｉ）ｓｃＦｖを含有する多重特異性結合分子）
ある実施形態では、本発明の多重特性分子は、少なくとも１個のｓｃＦｖ分子（例えば、本明細書に記載の任意のｓｃＦｖ分子）を含む多重特異性結合分子である。他の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、２個のｓｃＦｖ分子を含む（例えば、二重特異性ｓｃＦｖ（Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ））。このｓｃＦｖ分子は、同じであってもよく、異なっていてもよい。特定の実施形態では、ｓｃＦｖ分子は、従来のｓｃＦｖ分子である。他の実施形態では、ｓｃＦｖ分子は、上述の安定化したｓｃＦｖ分子である。特定の実施形態では、多重特異性結合分子は、上述の結合分子のいずれかから選択される任意の親結合分子に、ｓｃＦｖ分子（例えば、安定化したｓｃＦｖ分子）を接続することによって作成されてもよく、ここで、上述のｓｃＦｖ分子と、上述の親結合分子とは、異なるＩＧＦ−１Ｒ結合部分を有している（例えば、競合的な結合部分とアロステリックな結合部分）。例えば、本発明の結合部分は、第１の結合特異性を有するｓｃＦｖ分子が、第２のｓｃＦｖ分子またはｓｃＦｖではない結合分子（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体）に接続し、第２のＩＧＦ−１Ｒ結合特異性が付与されたものである。ある実施形態では、本発明の結合分子は、安定化したｓｃＦｖ分子が融合している天然の抗体である。
【０３９９】
安定化したｓｃＦｖ分子は、親結合分子に接続しており、安定化したｓｃＦｖ分子は、接続によって、好ましくは、この結合分子の熱安定性が少なくとも約２〜３℃高くなる。ある実施形態では、本発明のｓｃＦｖを含有する結合分子は、従来の結合分子と比較して、熱安定性が１℃高くなっている。別の実施形態では、本発明のｓｃＦｖを含有する結合分子は、従来の結合分子と比較して、熱安定性が２℃高くなっている。別の実施形態では、本発明のｓｃＦｖを含有する結合分子は、従来の結合分子と比較して、熱安定性が４℃、５℃、６℃高くなっている。
【０４００】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、安定化した「抗体」または「免疫グロブリン」分子であり、例えば、天然の抗体または天然の免疫グロブリン分子（または抗原結合性を保持したフラグメント）であるか、または抗体分子と同じ様式で抗原に結合し、本発明のｓｃＦｖ分子を含む遺伝子操作された抗体分子である。本明細書で使用するとき、用語「免疫グロブリン」は、２個の重鎖と２個の軽鎖の組み合わせを有するポリペプチドを含み、任意の関連する特定の免疫反応性を有していても、有していなくてもよい。
【０４０１】
ある実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、少なくとも１個のｓｃＦｖ（例えば、２個、３個または４個のｓｃＦｖ、例えば、安定化したｓｃＦｖｓ）が、抗体の重鎖のＣ末端に接続しており、ｓｃＦｖと抗体とは、異なる結合特異性を有している。別の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、少なくとも１個のｓｃＦｖ（例えば、２個、３個または４個のｓｃＦｖ、例えば、安定化したｓｃＦｖｓ）が、抗体の重鎖のＮ末端に接続しており、ｓｃＦｖと抗体とは、異なる結合特異性を有している。別の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、少なくとも１個のｓｃＦｖ（例えば、２個、３個または４個のｓｃＦｖまたは安定化したｓｃＦｖｓ）が、抗体の軽鎖のＮ末端に接続しており、ｓｃＦｖと抗体とは、異なる結合特異性を有している。別の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、少なくとも１個のｓｃＦｖ（例えば、２個、３個または４個のｓｃＦｖまたは安定化したｓｃＦｖｓ）が、抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端に接続しており、少なくとも１個のｓｃＦｖ（例えば、２個、３個または４個のｓｃＦｖまたは安定化したｓｃＦｖｓ）が、重鎖のＣ末端に接続しており、ｓｃＦｖは、異なる結合特異性を有している。
【０４０２】
（（ｉｉｉ）多価ミニボディ）
ある実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、第１の結合特異性を有する少なくとも１個のｓｃＦｖフラグメントと、第２の結合特異性を有する少なくとも１個のｓｃＦｖとを有する多価ミニボディである。好ましい実施形態では、少なくとも１個のｓｃＦｖ分子が安定化している。二重特異性の二価ミニボディ構築物の例は、ＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ３ドメインが、そのＮ末端で接続ペプチドと融合しており、この接続ペプチドが、そのＮ末端でＶＨドメインと融合しており、このＶＨドメインが、そのＮ末端で（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１８２）可とう性リンカーに融合しており、この可とう性リンカーが、そのＮ末端でＶＬドメインと融合しているものである。特定の実施形態では、多価ミニボディは、二価、三価（例えば、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ））、二重特異性（例えば、ダイアボディ）または四価（例えば、テトラボディ）であってもよい。
【０４０３】
別の実施形態では、本発明の結合分子は、ｓｃＦｖ四価ミニボディであり、このｓｃＦｖ四価ミニボディのそれぞれの重鎖部分は、結合特異性が異なる第１および第２のｓｃＦｖフラグメントを含有している。好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ分子の少なくとも１個は安定化している。上述の第２のｓｃＦｖフラグメントは、第１のｓｃＦｖフラグメントのＮ末端に接続していてもよい（例えば、二重特異性ＮＨ  ｓｃＦｖ四価ミニボディまたは二重特異性ＮＬ  ｓｃＦｖ四価ミニボディ）。または、第２のｓｃＦｖフラグメントは、第１のｓｃＦｖフラグメントを含有する重鎖部分のＣ末端に接続していてもよい（例えば、二重特異性Ｃ−ｓｃＦｖ四価ミニボディ）。二重特異性四価ミニボディの第１の重鎖部分の第１および第２のｓｃＦｖフラグメントが、同じ標的ＩＧＦ−１Ｒ分子に結合する場合、この二重特異性四価ミニボディの第２の重鎖部分の第１および第２のｓｃＦｖフラグメントのうち、少なくとも１つは、同じ標的ＩＧＦ−１Ｒ分子に結合してもよいし、または異なる標的ＩＧＦ−１Ｒ分子に結合してもよい。
【０４０４】
（（ｉｖ）多重特異性ダイアボディ）
他の実施形態では、本発明の結合分子は、多重特異性ダイアボディである。ある実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、二重特異性ダイアボディであり、このダイアボディの各アームは、タンデム型ｓｃＦｖフラグメントを含む。好ましい実施形態では、ｓｃＦｖフラグメントのうち、少なくとも１つが安定化している。ある実施形態では、二重特異性ダイアボディは、第１の結合特異性を有する第１のアームと、第２の結合特異性を有する第２のアームとを備えていてもよい。別の実施形態では、ダイアボディの各アームは、第１の結合特異性を有する第１のｓｃＦｖフラグメントと、第２の結合特異性を有する第２のｓｃＦｖフラグメントとを備えていてもよい。特定の実施形態では、多重特異性ダイアボディは、全Ｆｃ領域またはＦｃの一部分（例えば、ＣＨ３ドメイン）に直接融合することができる。
【０４０５】
（（ｖ）ｓｃＦｖ２四価抗体）
他の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、ｓｃＦｖ分子を含有するｓｃＦｖ２四価抗体の各重鎖部分を有する、ｓｃＦｖ２四価抗体である。このｓｃＦｖ分子は、独立して、本明細書に開示したｓｃＦｖ分子のいずれかから選択されてもよい。好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ分子の少なくとも１個が安定化されている。ｓｃＦｖフラグメントは、重鎖部分の可変領域のＮ末端に結合していてもよい（例えば、二重特異性ＮＨ  ｓｃＦｖ２四価抗体または二重特異性ＮＬ  ｓｃＦｖ２四価抗体）。または、ｓｃＦｖフラグメントは、ｓｃＦｖ２四価抗体の重鎖部分のＣ末端に結合していてもよい。ｓｃＦｖ２四価抗体の各重鎖部分は、可変領域と、同じ標的ＩＧＦ−１Ｒ分子またはエピトープまたは異なる標的ＩＧＦ−１Ｒ分子またはエピトープに結合しているｓｃＦｖフラグメントとを有していてもよい。二重特異性ｓｃＦｃ２四価抗体の第１の重鎖部分のｓｃＦｖフラグメントおよび可変領域が、同じ標的分子またはエピトープに結合する際には、二重特異性四価ミニボディの第２の重鎖部分の第１および第２のｓｃＦｖフラグメントのうち、少なくとも１つは、異なる標的分子またはエピトープに結合している。
【０４０６】
（（ｖｉ）多重特異性結合分子のフラグメント）
特定の実施形態では、本発明の結合分子は、多重特異性であってもよい。本発明の多重特異性結合分子は、二重特異性Ｆａｂ２分子または多重特異性（例えば、三重特異性）Ｆａｂ３分子を含む。例えば、多重特異性結合分子のフラグメントは、異なる特異性を有するＦａｂ分子またはｓｃＦｖ分子が化学結合したマルチマー（例えば、ダイマー、トリマー、またはテトラマー）を含んでいてもよい。
【０４０７】
（（ｖｉｉ）タンデム型可変ドメイン結合分子）
他の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、タンデム型抗原結合部位を含む結合分子を含んでいてもよい。例えば、可変ドメインは、少なくとも２個（例えば、２個、３個、４個またはそれ以上）の可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）が直接融合しているか、または並んで結合するように遺伝子操作された抗体の重鎖と、少なくとも２個（例えば、２個、３個、４個またはそれ以上）の可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）が直接融合しているか、または並んで結合するように遺伝子操作された抗体の軽鎖とを含んでいてもよい。ＶＨドメインは、対応するＶＬドメインと相互作用し、一連の抗原結合部位を形成し、結合部位の少なくとも２つは、ＩＧＦ−１Ｒの異なるエピトープに結合する。例えば、結合部位の１つが、上述の競合的なエピトープと交差反応し、別の抗原結合部位が、上述のアロステリックなエピトープと交差反応してもよい。タンデム型可変ドメイン結合分子は、２個以上の重鎖または軽鎖を含んでいてもよく、価数が大きい（例えば、二価または四価）。タンデム型可変ドメイン結合分子の製造方法は、当該技術分野で知られており、例えば、ＷＯ  ２００７／０２４７１５を参照。
【０４０８】
（（ｖｉｉｉ）二重特異性結合分子）
他の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、二重結合特異性を有する１個の結合部位を含んでいてもよい。例えば、本発明の二重特異性結合分子は、上述の競合的なエピトープおよび上述のアロステリックなエピトープと交差反応する結合部位を含んでいてもよい。別の実施形態では、本発明の二重特異性結合分子は、上述の任意の２個のアロステリックエピトープと交差反応する結合部位を含んでいてもよい（例えば、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２をアロステリック効果によってブロックする、アロステリックなエピトープと、ＩＧＦ−１をアロステリック効果によってブロックするが、ＩＧＦ−２はアロステリック効果によってブロックしない、アロステリックなエピトープ）。二重特異性結合分子を製造する、当該技術分野で認識されている方法は、当該技術分野で知られている。例えば、二重特異性結合分子は、両方の第１のエピトープと結合する結合分子をスクリーニングすることによって単離し、この単離した結合分子について、第２のエピトープに結合する能力によってカウンタースクリーニングしてもよい。
【０４０９】
（（ｉｘ）多重特異性融合タンパク質）
別の実施形態では、本発明の多重特異性結合分子は、多重特異性融合タンパク質である。本明細書で使用するとき、句「多重特異性融合タンパク質」は、融合タンパク質（上に定義したもの）のうち、上述の少なくとも２種類の結合特異性を有する融合タンパク質のことをいう。多重特異性融合タンパク質は、例えば、本質的に、ＷＯ  ８９／０２９２２（１９８９年４月６日公開）、ＥＰ  ３１４，３１７（１９８９年５月３日公開）、米国特許第５，１１６，９６４号（１９９２年５月２日登録）に開示されているような、ヘテロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーの構造になっていてもよい。好ましい多重特異性融合タンパク質は、二重特異性である。特定の実施形態では、多重特異性融合タンパク質の結合特異性のうち、少なくとも１つは、ｓｃＦｖ（例えば、安定化したｓｃＦｖ）を含む。
【０４１０】
通常の組み換えＤＮＡ技術によって、種々の他の多価抗体構築物が当業者によって開発されており、例えば、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；欧州特許出願番号第１８４，１８７号；欧州特許出願番号第１７１，４９６号；欧州特許出願番号第１７３，４９４号；ＰＣＴ国際出願第ＷＯ  ８６／０１５３３号；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願番号第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１-１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９-３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１-３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４-２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：９９９-１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６-４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３-１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２-１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２-５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；Ｂｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３-４０６０；およびＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９，ｐｐ．２９３−９９（１９９１））に記載されている。好ましくは、非ヒト抗体は、非ヒト抗原結合ドメインにヒト定常ドメインを結合させることによって、「ヒト化」されている（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，ｐｐ．６８５１−５５（１９８４））。
【０４１１】
多価抗体構築物を調製するのに使用可能な他の方法は、以下の刊行物に記載されている。Ｇｈｅｔｉｅ，Ｍａｒｉａ−Ａｎａら（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９７：１３９２−１３９８；Ｗｏｌｆｆ，Ｅｄｉｔｈ  Ａ．ら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５；Ｇｈｅｔｉｅ，Ｍａｒｉａ−Ａｎａら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：７５０９−７５１４；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｃ．ら（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９７（４）：５４２−５４７；Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ，Ａｎｅｔａら（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：４７−６６；Ｃｏｌｏｍａ  Ｍ．Ｊ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：１５９−１６３；Ｚｕｏ，Ｚｈｕａｎｇら（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（補遺）１３（５）：３６１−３６７；Ｓａｎｔｏｓ  Ａ．Ｄ．ら（１９９９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５：３１１８ｓ−３１２３ｓ；Ｐｒｅｓｔａ，Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｇ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：２３７−２５６；ｖａｎ  Ｓｐｒｉｅｌ，Ａｎｎｅｍｉｅｋら（２０００）Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１（８）３９１−３９７。
【０４１２】
（Ｃ．改変された結合分子）
特定の実施形態では、本発明の結合分子の少なくとも１つ（例えば、本発明の多重特異性結合分子、または本発明で組み合わせて使用する単一特異性結合分子）は、１箇所以上で改変されていてもよい。本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子の改変された形態を、当該技術分野で既知の技術を用い、前駆体または親抗体から製造することができる。
【０４１３】
特定の実施形態では、本発明の改変されたＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、天然のポリペプチドではみられない、さらなる特徴を示すように改変されたポリペプチドである。ある実施形態では、結合分子の１つ以上の残基は、機能的な側鎖を反応させることによって化学的に誘導体化してもよい。ある実施形態では、結合分子は、２０種類の標準的なアミノ酸の誘導体のうち、天然に存在する１つ以上の誘導体を含むように改変されていてもよい。例えば、４−ヒドロキシプロリンが、プロリンと置換されてもよく、５−ヒドロキシリジンが、リジンと置換されてもよく、３−メチルヒスチジンが、ヒスチジンと置換されてもよく、ホモセリンが、セリンと置換されてもよく、オルニチンが、リジンと置換されてもよい。
【０４１４】
ある実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、１つ以上のドメインを部分的または完全に欠いた合成定常領域（「ドメインを欠いた結合分子」）を含む。特定の実施形態では、適合するように改変された抗体は、ＣＨ２領域が完全に除去された（△ＣＨ２構築物）、領域を欠いた構築物または改変体を含む。他の実施形態では、短い結合ペプチドを、上述の除去された領域の代わりに使い、可変領域の可とう性および移動の自由度を上げてもよい。当業者は、ＣＨ２領域が、抗体の異化速度を制御するという性質によって、このような構築物が特に好ましいことを理解するであろう。領域を欠いた構築物は、ＩｇＧ１ヒト定常領域をコードするベクターを用いて誘導されてもよい（例えば、ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２号およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号）。このベクターは、ＣＨ２領域を欠き、領域を欠いたＩｇＧ１定常領域を発現するベクターを提供するように遺伝子操作される。  
【０４１５】
ある実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、モノマーサブユニットと結合可能な限り、数個または１個のアミノ酸を欠いているか、または数個または１個のアミノ酸が置換された免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２領域の所定領域にある１個のアミノ酸の変異でも、Ｆｃ結合性を大幅に低下させ、腫瘍の局在化を高めるのに十分な場合がある。同様に、制御されるべきエフェクター機能（例えば、相補性結合）を制御する１つ以上の定常領域の一部分が単純に失われていることも望ましい場合がある。このような定常領域の部分的な欠失によって、目的のインタクトな定常領域に関連する他の望ましい機能はそのままで、抗体の所定の性質（血清での半減期）が高められ得る。さらに、暗に示されているように、開示した抗体の定常領域は、１つ以上のアミノ酸の変異または置換によって合成され、得られた構築物のプロフィールを高め得る。この観点で、改変された抗体の構造および免疫プロフィールを実質的に維持したままで、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって付与される活性を失なわせ得る。さらに他の実施形態は、１個以上のアミノ酸を定常領域に付加し、エフェクター機能のような望ましい特性を高めるか、または細胞毒素または炭水化物への結合力を高めたものである。このような実施形態では、所定の定常領域ドメインに由来する特定の配列を挿入するか、または複製することが望ましい場合がある。
【０４１６】
本発明は、本明細書に記載の結合部分（例えば、抗体分子のＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の改変体（誘導体を含む）を含むか、これらの改変体から本質的になるか、またはこれらの改変体からなる、結合分子も与え、この結合部分またはそのフラグメントは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドまたはそのフラグメントまたは改変体に免疫特異的に結合する。当業者に既知の標準的な技術を用い、ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするヌクレオチド配列に変異（限定されないが、アミノ酸置換が起こる、部位特異的な変異およびＰＣＲによる変異）を導入することができる。好ましくは、改変体（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域のＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ領域のＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２またはＶＬ−ＣＤＲ３を標準とし、これに対してアミノ酸の置換が５０個未満、４０個未満、３０個未満、２５個未満、２０個未満、１５個未満、１０個未満、５個未満、４個未満、３個未満、または２個未満のアミノ酸をコードする。「アミノ酸の同類置換」は、アミノ酸残基が、同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基と置換されたものである。同じ電荷を側鎖に有するアミノ酸残基は、当該技術分野で定義されている。この分類には、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷をもたない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝を有する側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。あるいは、コード配列全体または一部分に、無作為に変異が導入されてもよく（例えば、飽和突然変異誘発）、得られた変異体の生体活性をスクリーニングし、活性（例えば、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドに結合する能力）を保持した変異体を特定することができる。
【０４１７】
例えば、本発明の結合分子（例えば、抗体分子）のフレーム領域のみ、またはＣＤＲ領域のみに変異を導入することが可能である。導入された変異は、サイレント変異であってもよく、中立的なミスセンス変異であってもよく（すなわち、抗体が抗原に結合する能力が全くないか、ほとんどない）、実際に、いくつかの変異は、アミノ酸配列を全く変えない。これらの種類の変異は、コドンの用法を最適化するか、またはハイブリドーマの抗体産生を高めるのに有用な場合がある。コドンを最適化した、本発明のＩＧＦ−１Ｒ領域をコードするコード領域は、本明細書の他の部分に開示している。あるいは、中立的ではないミスセンス変異は、結合分子が抗原に結合する能力を変え得る。例えば、抗体において、ほとんどのサイレント変異および中立的なミスセンス変異の位置は、フレームワーク領域内にある可能性が高く、一方、ほとんどの中立的ではないミスセンス変異は、ＣＤＲ内にある可能性が高いが、必ずそうでなければならないというわけではない。当業者は、例えば、抗原への結合活性を変更しないか、または結合活性を変更する（例えば、抗体への結合活性を高めるか、または抗体特異性を変える）といった所望の性質を有する変異分子を設計し、試験することができる。突然変異させた後、コードされたタンパク質を通常の方法で発現させることができ、このコードされたタンパク質の機能的活性および／または生体活性（例えば、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに免疫特異的に結合する能力）を、本明細書に記載の技術を用いて決定することができ、当該技術分野で既知の技術を一般的な方法で改変することによって決定することができる。
【０４１８】
（（ｉ）共有結合）
本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、例えば、結合分子に分子を共有結合させて、結合分子が、共有結合によって、関連するエピトープに特異的に共有結合するのを妨害されないように、改変してもよい。例えば、限定されないが、本発明の結合分子は、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による開裂、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などによって改変してもよい。任意の多くの化学修飾は、限定されないが、特異的な化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などの既知の技術によって行われてもよい。さらに、誘導体は、１個以上の標準的ではないアミノ酸を含有してもよい。
【０４１９】
本明細書の他の箇所で詳細に記載しているように、本発明の結合分子は、組み換えによって、異種ポリペプチドにＮ末端またはＣ末端で融合していてもよく、または化学的（共有結合または非共有結合を含む）にポリペプチドまたは他の組成物にコンジュゲートしていてもよい。例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的なＩＧＦ−１Ｒ抗体は、検出アッセイで標識として有用な分子に組み換えによって融合していてもよく、またはコンジュゲートしていてもよく、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または毒素のようなエフェクター分子に組み換えによって融合していてもよく、またはコンジュゲートしていてもよい。例えば、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９２／０８４９５号；ＷＯ９１／１４４３８号；ＷＯ８９／１２６２４号；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ３９６，３８７号を参照。
【０４２０】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、ペプチド結合または改変されたペプチド結合で接続したアミノ酸で構成されていてもよく（すなわち、ペプチドアイソスター）、２０遺伝子でコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含有していてもよい。ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体は、天然のプロセスによって（例えば、翻訳後の処理）、または当該技術分野で周知の化学修飾技術によって、改変されていてもよい。このような改変は、基本的な書籍、さらに詳細なモノグラフ、およびに多くの研究論文に十分に記載されている。ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体のどの場所で改変を行ってもよい（ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ酸末端またはカルボキシル末端、または炭水化物のような部分を含む）。ＩＧＦ−１Ｒに特異的な所与の抗体のいくつかの部位で、同じ部分の改変が同程度または種々の程度で行われてもよいことが理解されるであろう。さらに、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な所与の抗体は、多くの改変部を含有していてもよい。ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体は、例えば、ユビキチン化の結果、分枝していてもよく、分枝しているか、または分枝していない環状であってもよい。ＩＧＦ−１Ｒに特異的な環状の抗体、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な分枝した抗体、およびＩＧＦ−１Ｒに特異的な環状で分枝した抗体は、翻訳後の天然のプロセスで生じてもよく、または合成法によって製造してもよい。改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合による架橋形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解による開裂、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、トランスファー−ＲＮＡが介在する、タンパク質へのアミノ酸付加（例えば、アルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２ｎｄ  Ｅｄ．、（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照）。
【０４２１】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ結合分子と、異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質も与える。抗体が融合する異種ポリペプチドは、機能的に有用な場合があり、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチドを発現する細胞に標的化するのに有用である。ある実施形態では、本発明の融合タンパク質は、本発明の結合分子の任意の１つ以上の結合部位のアミン酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含むか、またはこれらのポリペプチドと異種ポリペプチド配列とから本質的になるか、またはこれらのポリペプチドと異種ポリペプチド配列とからなる。別の実施形態では、本明細書に開示した診断方法および治療方法に使用する融合タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子のＶＨ−ＣＤＲのうち任意の１個、２個、３個のアミノ酸配列、またはＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子のＶＬ−ＣＤＲのうち任意の１個、２個、３個のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含み、このポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とから本質的になり、またはこのポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とからなる。ある実施形態では、融合タンパク質は、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子のＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含み、融合タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１個のエピトープに特異的に結合する。別の実施形態では、融合タンパク質は、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、またはそのフラグメント、改変体または誘導体の少なくとも１つのＶＨ領域のアミノ酸配列、および本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、またはそのフラグメント、改変体または誘導体の少なくとも１つのＶＬ領域のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含む。好ましくは、融合タンパク質のＶＨ領域およびＶＬ領域は、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する、１個のもととなる結合分子に対応している。さらに別の実施形態では、本明細書に開示の診断方法および治療方法で使用する融合タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、またはそのフラグメントまたは改変体のＣＨ  ＣＤＲの任意の１個、２個、３個またはそれ以上のアミノ酸配列、およびＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体、またはそのフラグメントまたは改変体のＶＬ  ＣＤＲの任意の１個、２個、３個またはそれ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含む。好ましくは、ＶＨ−ＣＤＲまたはＶＬ−ＣＤＲのうち、２個、３個、４個、５個、６個またはそれ以上は、本発明の１種類のもととなる結合分子に対応している。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子も、本発明に包含される。
【０４２２】
文献に報告されている融合タンパク質の例としては、Ｔ細胞受容体の融合物（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２９３６−２９４０（１９８７））；ＣＤ４（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：６８−７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ  ９：３４７−３５３（１９９０）；およびＢｙｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６６７−６７０（１９９０））；Ｌ−セレクチンの融合物（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１−２２２９（１９９０）；およびＷａｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：１６４−１６７（１９９１））；ＣＤ４４の融合物（Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ  ６１：１３０３−１３１３（１９９０））；ＣＤ２８およびＢ７の融合物（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０（１９９１））；ＣＴＬＡ−４の融合物（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１−５６９（１９９１））；ＣＤ２２の融合物（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ  ６６：１１３３−１１４４（１９９１））；ＴＮＦ受容体の融合物（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３−２８８６（１９９１）；およびＰｅｐｐｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３−１４８９（１９９１））；およびＩｇＥ受容体の融合物（Ｒｉｄｇｗａｙ  ａｎｄ  Ｇｏｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１１５、Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．１４４８（１９９１））が挙げられる。
【０４２３】
本明細書の他の箇所で記載したように、本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、または抗原結合性を保持したフラグメント、その改変体または誘導体を、ポリペプチドのインビボでの半減期を延ばすため、または当該技術分野で既知の免疫アッセイで使用するために、異種ポリペプチドに融合してもよい。例えば、ある実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子にＰＥＧをコンジュゲートし、インビボでの半減期を高めることができる。Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６（２００１）；Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１（２００２）；またはＷｅｉｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０：５１２（２００２）。
【０４２４】
さらに、本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子を、精製または検出を容易にするために、マーカー配列に融合してもよい。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチドである（例えば、特に、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．，９１３１１）で提供されるタグ、あるいはそれ以外であり、その多くは市販されている）。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されているように、例えば、ヘキサヒスチジンによって、融合タンパク質を簡便に精製することができる。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定されないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））、「フラッグ」タグおよび「ｍｙｃ」タグが挙げられる。
【０４２５】
融合タンパク質は、当該技術分野で周知の方法を用いて調製することができる（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号および第５，２２５，５３８号を参照）。融合を生じさせる正確な位置は、その融合タンパク質の分泌特性または結合特性を最適化するために実験的に選択されてもよい。次いで、融合タンパク質をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトし、発現させる。
【０４２６】
本発明の結合分子は、ＩＧＦ−１Ｒが細胞に与える影響を減らすか、または阻害するために（例えば、腫瘍細胞の増殖を阻害するため、または過剰増殖性障害の進行を治療するか、または遅らせるために）、単独で投与してもよく、さらなる治療薬（例えば、生物製剤または化学治療薬）と組み合わせて投与してもよい。
【０４２７】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子を、コンジュゲートしていない形態で使用してもよく、または、例えば、分子の治療性能を高めるため、標的の検出を促進するため、または患者の撮像または治療のために、種々の分子のうち少なくとも１つとコンジュゲートさせてもよい。本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、精製操作が行われる場合、精製の前または後に、標識化してもよく、コンジュゲートさせてもよい。
【０４２８】
特に、本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子を、治療薬、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医用薬剤またはＰＥＧにコンジュゲートさせてもよい。
【０４２９】
当業者は、このコンジュゲートを、コンジュゲートするために選択した薬剤に依存する種々の技術でアセンブリしてもよいことを理解するであろう。例えば、ビオチンとのコンジュゲートは、例えば、結合ポリペプチドと、ビオチンの活性化エステル（例えば、ビオチン  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）とを反応させることによって調製される。同様に、蛍光マーカーとのコンジュゲートは、カップリング剤（例えば、本明細書に列挙したもの）存在下で調製されてもよく、またはイソシアネート（好ましくは、フルオレセイン−イソチオシアネート）との反応によって調製されてもよい。本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子のコンジュゲートも、類似の様式で調製される。
【０４３０】
本発明は、本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子が、診断薬または治療薬にコンジュゲートしたものを含む。ＩＧＦ−１Ｒ抗体を、例えば、所与の治療法および／または予防法の効力を判断するための臨床的な試験手順の一部分として、例えば、神経疾患の発症または進行を監視するための診断に使用することができる。ＩＧＦ−１Ｒ結合分子を、検出可能な物質にカップリングさせることによって、検出しやすくすることができる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子発生トモグラフィーを用いて陽電子を発生する金属、および放射性ではない常磁性金属イオンが挙げられる。例えば、本発明の診断薬として使用する抗体にコンジュゲート可能な金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げられる。
【０４３１】
ＩＧＦ−１Ｒ結合分子を、化学発光性化合物にカップリングすることによって、検出可能になるように標識してもよい。化学発光性タグをつけたＩＧＦ−１Ｒ抗体の存在は、一連の化学反応中に生じる発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識となる化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【０４３２】
ＩＧＦ−１Ｒ結合分子を検出可能になるように標識する１つの方法は、これらの物質を酵素に結合し、結合した生成物に酵素免疫測定（ＥＩＡ）を用いる方法である（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．、「Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７（１９７８））；Ｖｏｌｌｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編）、Ｅｎｚｙｍｅ  免疫アッセイ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８０）；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ら（編）、Ｅｎｚｙｍｅ  免疫アッセイ、Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ、Ｔｏｋｙｏ（１９８１））。ＩＧＦ−１Ｒ結合分子に結合する酵素は、例えば、分光光度法、蛍光分析法または視覚的な方法によって検出可能な化学部分を生成するような様式で、適切な基質（好ましくは、発色性基質）と反応する。抗体を検出可能になるように標識するのに使用可能な酵素としては、限定されないが、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。さらに、酵素に発色性の基質を用いた比色分析によって検出してもよい。基質の酵素反応度と、同様に調製した標準物質の酵素反応度とを視覚的に比較して、検出してもよい。
【０４３３】
種々の免疫アッセイを用い、検出を行なうことができる。例えば、ＩＧＦ−１Ｒ結合分子を放射性物質で標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を通して結合分子を検出することが可能となる（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９８６年３月）、この内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）。放射性同位体は、限定されないが、γカウンタ、シンチレーションカウンタ、またはオートラジオグラフィーを含む手段で検出することができる。
【０４３４】
ＩＧＦ−１Ｒ結合分子を、蛍光を発光する金属（例えば、１５２Ｅｕまたは他のランタノイド種）で検出可能になるように標識してもよい。ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート化基を用い、上述の金属を結合分子に接続してもよい。
【０４３５】
種々の部分を結合分子にコンジュゲートする技術は、周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ｐｐ．６２３−５３（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．３０３−１６（１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照。
【０４３６】
特に、本明細書に開示する診断方法および治療方法で使用する結合分子は、細胞毒素（例えば、放射性同位体、細胞毒性の薬物、または毒素）治療薬、細胞増殖抑制剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医用薬剤、免疫学的に活性なリガンド（例えば、リンホカイン、または得られた分子が、新生物性細胞およびエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の両方に結合する他の抗体）、またはＰＥＧにコンジュゲートさせてもよい。別の実施形態では、本明細書に開示する診断方法および治療方法で使用する結合分子は、腫瘍の血管新生を減らす分子にコンジュゲートさせてもよい。他の実施形態では、本明細書で開示した組成物は、薬物またはプロドラッグに結合した、結合分子を含んでいてもよい。本発明のさらに他の実施形態は、特定の生物毒素またはその細胞毒性を保持したフラグメント（例えば、リシン、ゲロニン、緑膿菌外毒素、またはジフテリア毒素）にコンジュゲートした、結合分子の使用を含む。どのコンジュゲートしていない結合分子またはコンジュゲートした結合分子を使用するかの選択は、癌の種類およびステージ、補助治療（例えば、化学療法または外部放射線）の使用、および患者の状態によって変わる。当業者は、本明細書の教示から、このような選択を簡単に行うことができることを理解するであろう。
【０４３７】
以前の研究で、同位体標識された抗−腫瘍抗体を使用し、動物モデル（ある場合には、ヒト）の固体腫瘍およびリンパ腫／白血病の細胞を首尾よく破壊できたことを理解するであろう。放射性同位体の例としては、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅおよび１８８Ｒｅが挙げられる。放射性核種は、電離放射線を発生し、核ＤＮＡの鎖を複数箇所破壊し、細胞を死に至らしめることによって作用する。治療用コンジュゲートで使用する同位体は、典型的には、経路長の短い高エネルギーのα粒子またはβ粒子を発生する。このような放射性核種は、コンジュゲートが付着しているか、または入り込んでいる細胞に近い位置にある細胞（例えば、新生物性細胞）を死滅させる。放射性核種は、局在化していない細胞にはほとんど影響を与えないか、全く影響を与えない。放射性核種は、本質的に、非免疫原性である。
【０４３８】
放射性標識したコンジュゲートを本発明と組み合わせて使用する場合、結合分子は、直接標識されていてもよく（例えば、ヨウ素化によって）、またはキレート化剤を用いて間接的に標識されていてもよい。本明細書で使用するとき、「間接的に標識する」および「間接的な標識アプローチ」という句は、両方とも、キレート化剤が、結合分子に接続しており、少なくとも１つの放射性核種が、キレート化剤と会合していることを意味する。このようなキレート化剤は、ポリペプチドと放射性同位体の両方に結合するため、典型的には、二官能キレート化剤と呼ばれる。特に好ましいキレート化剤は、１−イソチオシクマートベンジル−３−メチルジオテレントリアミン五酢酸（１−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｃｍａｔｏｂｅｎｚｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ  ｄｉｏｔｈｅｌｅｎｅ  ｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（「ＭＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体およびシクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸（「ＣＨＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体である。他のキレート化剤は、Ｐ−ＤＯＴＡ誘導体およびＥＤＴＡ誘導体を含む。間接的に標識するのに特に好ましい放射性核種としては、１１１Ｉｎおよび９０Ｙが挙げられる。
【０４３９】
本明細書で使用するとき、「直接標識する」および「直接標識アプローチ」という句は、両方とも、放射性核種が、ポリペプチドに直接共有結合していることを意味する（典型的には、アミノ酸残基を介して）。さらに特定的には、この結合技術は、ランダム標識および部位特異的な標識を含む。部位特異的な標識の場合、標識は、ポリペプチドの特定の場所（例えば、コンジュゲートのＦｃ部分にのみ存在する、Ｎに結合した糖残基）に結合する。さらに、種々の直接的な標識技術およびプロトコルが、本発明に適合する。例えば、テクネチウム−９９で標識したポリペプチドは、リガンド交換プロセスによって調製してもよく、過テクネチウム酸塩（ｐｅｒｔｅｃｈｎａｔｅ）（ＴｃＯ４−）をスズイオン溶液で還元し、還元したテクネチウムをＳｅｐｈａｄｅｘカラムでキレート化し、結合ポリペプチドをこのカラムに入れることによって調製してもよく、またはバッチ標識技術（例えば、過テクネチウム酸塩と、ＳｎＣｌ２のような還元剤と、ナトリウム−カリウムフタル酸溶液のようなバッファ溶液と、抗体とをインキュベートすること）によって調製してもよい。いかなる場合でも、ポリペプチドを直接的に標識するのに好ましい放射性核種は、当該技術分野で周知であり、直接的に標識するのに特に好ましい放射性核種は、チロシン残基によって共有結合した１３１Ｉである。本明細書に開示する方法で使用する結合分子を、例えば、放射性ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウム、および化学酸化剤（例えば、次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴなど）または酵素による酸化剤（例えば、ラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびグルコース）を用いて誘導してもよい。
【０４４０】
キレート化剤およびキレート化コンジュゲートに関する特許は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｇａｎｓｏｗの米国特許第４，８３１，１７５号は、多置換ジエチレントリアミン五酢酸キレート化剤およびこのキレート化剤を含むタンパク質コンジュゲート、およびこれらの調製方法に関するものである。  Ｇａｎｓｏｗの米国特許第５，０９９，０６９号、第５，２４６，６９２号、第５，２８６，８５０号、第５，４３４，２８７号および第５，１２４，４７１号も、多置換ＤＴＰＡキレート化剤に関するものである。これらの特許は、参照することにより本明細書に組み込まれる。適する金属キレート化剤の他の例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸、１−オキサ−４，７，１２，１５−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−四酢酸などである。シクロヘキシル−ＤＴＰＡまたはＣＨＸ−ＤＴＰＡは、特に好ましく、以下で詳細に例示している。他の適合するキレート剤は、まだ発見されていないものも含め、当業者にとっては簡単に分かるものであり、明らかに本発明の範囲に含まれる。
【０４４１】
米国特許第６，６８２，１３４号、第６，３９９，０６１号、および第５，８４３，４３９号（この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）のキレート化を促進するのに使用される、特定の二官能キレート化剤を含む適合するキレート化剤は、好ましくは、三価金属に高い親和性を示し、腫瘍／非腫瘍比率が高く、骨への吸収量が低く、標的部位（例えば、Ｂ細胞リンパ腫の腫瘍部位）での放射性核種のインビボでの保持量が高いように選択される。しかし、これらの特性すべてを有しているか、または有していない他の二官能キレート化剤が、当該技術分野で既知であり、腫瘍治療に有益な場合がある。
【０４４２】
本明細書の教示によって、診断および治療のために、結合分子を異なる放射性標識にコンジュゲートしてもよいことも理解されるであろう。この目的のために、上述の米国特許第６，６８２，１３４号、第６，３９９，０６１号および第５，８４３，４３９号は、治療用抗体を投与する前に、腫瘍を「造影」するための、放射性標識した治療用コンジュゲートを開示している。「Ｉｎ２Ｂ８」コンジュゲートは、ヒトＣＤ２０抗原に特異的なマウスモノクローナル抗体２Ｂ８を含み、この抗原が、二官能キレート化剤（すなわち、ＭＸ−ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸））で１１１Ｉｎに接続しており、ＭＸ−ＤＴＰＡは、１−イソチオシアネートベンジル−３−メチル−ＤＴＰＡおよび１−メチル−３−イソチオシアネートベンジル−ＤＴＰＡの１：１混合物を含む。１１１Ｉｎは、検出可能な毒性がない状態で、約１〜約１０ｍＣｉを安全に投与できるため、診断に用いる放射性核種として特に好ましい。撮像データは、一般的に、その後の９０Ｙ標識した抗体の分布を予測するデータである。ほとんどの撮像試験では、５ｍＣｉの１１１Ｉｎで標識した抗体を使用する。この線量は、安全であり、これより低い線量の場合よりも撮像効率が高まり、抗体を投与してから３〜６日後に最適な画像が得られるからである。例えば、Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：３３２８（１９８５）およびＣａｒｒａｇｕｉｌｌｏら、Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：６７（１９８５）を参照。
【０４４３】
上述のように、種々の放射性核種が、本発明に適用可能であり、種々の環境下でどの放射性核種が最も適しているかを、当業者は容易に決定することができる。例えば、１３１Ｉは、標的に対する免疫治療に使用する、周知の放射性核種である。しかし、１３１Ｉを臨床で使用する有用性は、体内の半減期が８日間であること、血中および腫瘍部位の両方でヨード化抗体が脱ハロゲン化すること、腫瘍内部で局所的に沈着することによって最適状態からはずれ得る発光特性（例えば、大きなγ成分）を含む、いくつかの因子によって制限されてしまっている。優れたキレート化剤が出現し、金属キレート化基をタンパク質に接続する機会が増え、１１１Ｉｎおよび９０Ｙのような他の放射性核種を利用する機会も増えた。９０Ｙには、放射性免疫治療に適用する場合、９０Ｙの半減期が６４時間であり、例えば、１３１Ｉとは異なり、腫瘍を抗体に蓄積させるのに十分なほど長いこと、９０Ｙは、高エネルギーのβ線のみを発生し、崩壊時にγ線を発生しないこと、組織での範囲が、１００〜１，０００個分の細胞の直径分であることといった、いくつかの利点がある。さらに、透過性の放射線が少ないため、外来患者に９０Ｙ標識した抗体を投与することができる。さらに、細胞を死滅させるのに、標識した抗体の内在化を必要とせず、電離放射線を局所的に照射し、標的分子が存在しない隣接する腫瘍細胞も死滅させる。
【０４４４】
結合分子（例えば、結合ポリペプチド）にコンジュゲートするのに好ましいさらなる薬剤は、細胞毒性薬であり、特に、癌治療で使用される細胞毒性薬である。本明細書で使用するとき、「細胞毒または細胞毒性薬」は、細胞の成長および増殖に悪影響を与え、細胞または悪性細胞の量を減らすか、これらの細胞を阻害し、またはこれらの細胞を破壊する任意の薬剤である。細胞毒の例としては、限定されないが、放射性核種、生物毒素、酵素によって活性化する毒素、細胞増殖抑制薬または細胞毒性薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンドおよび生体応答修飾物質（例えばサイトカイン）が挙げられる。免疫反応性の細胞または悪性細胞の成長を遅らせるか、または弱める任意の細胞毒は、本発明の範囲に含まれる。
【０４４５】
細胞毒の例としては、一般的に、細胞増殖抑制剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗増殖剤、チューブリン結合剤、ホルモンおよびホルモンアンタゴニストなどが挙げられる。本発明に適合する細胞増殖抑制剤の例としては、アルキル化基質（例えば、メクロレタミン、トリエチレンホスホラミド、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファランまたはトリアジコン）が挙げられ、さらに、ニトロソウレア化合物（例えば、カルムスチン、ロムスチンまたはセムスチン）が挙げられる。他の好ましい細胞毒性薬としては、例えば、マイタンシノイド系薬物が挙げられる。他の好ましい細胞毒性薬としては、例えば、アントラサイクリン系薬物、ビンカ薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、プテリジン系薬物、ジイネンおよびポドフィロトキシンが挙げられる。細胞毒性薬のうち、特に有用なものとしては、例えば、アドリアマイシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ドキソルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、ミトラマイシン、ストレプトニグリン、ジクロロメトトレキサート、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン−Ｄ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、フトラフール、６−メルカプトプリン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン、またはポドフィロトキシン誘導体（例えば、エトポシドまたはエトポシドホスフェート）、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン、ビンデシン、ロイロシンなどが挙げられる。本明細書の教示に適合するさらに他の細胞毒は、タキソール、タキサン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、およびこれらの類似体またはホモログが挙げられる。コルチコステロイド（例えばプレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、ヒドロキシプロゲステロンまたはメドロプロゲステロン）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール）、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（例えばテストステロン）、およびアロマターゼ阻害剤（例えば、アミノグルテチミド）のようなホルモンおよびホルモンアンタゴニストも、本明細書の教示に適合している。当業者は、本発明のコンジュゲートを調製するのに便利な反応を起こさせるために、所望の化合物になるように化学的に改変することができる。
【０４４６】
特に好ましい細胞毒の一例は、カリケアマイシン、エスペラミシンまたはジネミシンを含む、抗腫瘍抗生物質であるエンジイン系誘導体である。これらの毒素は、特に強力であり、核ＤＮＡを開裂させ、細胞死を導く作用がある。インビボで開裂し、多くの不活性で免疫原性のポリペプチドフラグメントを与えるタンパク質毒素とは異なり、カリケアマイシン、エスペラミシンおよび他のエンジイン系毒素は、本質的に免疫原性をもたない小分子である。これらの非ペプチド毒素は、モノクローナル抗体および他の分子を標識するのにすでに使用した技術によって、ダイマーまたはテトラマーに化学的に結合する。これらの結合技術は、構築物のＦｃ部分にのみ存在する、Ｎに結合した糖残基を介する、部位特異的な結合を含む。このような部位特異的に結合させる方法は、構築物が結合する際に、結合にともなう影響を減らすことができるという利点を有する。
【０４４７】
すでに示唆したように、コンジュゲートを調製するのに適合する細胞毒は、プロドラッグを含み得る。本明細書で使用するとき、用語「プロドラッグ」は、医用薬剤として活性な基質の前駆体または誘導体であり、親薬物と比較して、腫瘍細胞への細胞毒性は低く、酵素によって活性化されるか、またはさらに活性な親形態へと変換可能な形態を指す。本発明に適合するプロドラッグとしては、限定されないが、細胞毒性を有さず、さらに活性が高い薬物へと変換可能な、リン酸を含有するプロドラッグ、チオリン酸を含有するプロドラッグ、硫酸を含有するプロドラッグ、ペプチドを含有するプロドラッグ、β−ラクタムを含有するプロドラッグ、場合により置換されたフェノキシアセトアミドを含有するプロドラッグ、または場合により置換されたフェニルアセトアミドを含有するプロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンのプロドラッグが挙げられる。本発明で使用する、プロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞毒性薬のさらなる例は、上述の化学療法薬を含む。他の細胞毒の中で、本明細書に開示した結合分子が、リシンサブユニットＡ、アブリン、ジフテリア毒素、ボツリヌス菌、シアンジノシン（ｃｙａｎｇｉｎｏｓｉｎ）、サキシトキシン、志賀毒素、破傷風、テトロドトキシン、トリコテセン、ベルルクロゲンまたは毒性の酵素のような細胞毒素と会合するか、またはコンジュゲートしてもよいことも理解されるであろう。好ましくは、このような構築物は、抗体−毒素構築物を直接発現させる遺伝子操作技術を用いて作成する。本明細書に開示した結合分子と会合可能な他の生体応答修飾物質は、サイトカイン（例えば、リンホカインおよびインターフェロン）を含む。本開示の観点から、当業者は、従来の技術を用いてこのような構築物を容易に合成できると考えられる。
【０４４８】
本明細書に開示した結合分子と会合させるか、またはコンジュゲートさせるのに使用可能な適切な別の種類の細胞毒は、腫瘍細胞または免疫反応性細胞に直接有効な、放射性増感作用を有する薬物である。このような薬物は、電離放射線への感度を高め、放射線治療の効力を高める。腫瘍細胞に内在化した結合分子コンジュゲートは、放射線増感作用を最大にする核の近くに放射線増感剤を送達する。放射線増感剤が接続した本発明の結合分子のうち、結合していないものは、血中で迅速に除去され、残った放射性増感剤が標的腫瘍内に局在化し、正常な組織への取り込みは最小限ですむ。血中から迅速に除去された後、補助的な放射線療法を、以下の３つの方法のいずれかで投与する。（１）腫瘍に対し、特異的に直接外部から照射、（２）腫瘍に放射性物質を直接移植する、または（３）同じ標的抗体を用いて全身的に放射線免疫治療する。このアプローチをさらに有望な方法に変えた方法は、放射線増感させた免疫複合体に、治療用放射性同位体を取り付ける方法であり、患者には１種類の薬物を投与すればよく、簡便な方法である。
【０４４９】
特定の実施形態では、結合分子（例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）の安定性または効力を高める部分をコンジュゲートしてもよい。例えば、ある実施形態では、本発明の結合分子にＰＥＧをコンジュゲートし、インビボでの半減期を高めることができる。Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６（２００１）；Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１（２００２）；またはＷｅｉｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０：５１２（２００２）。
【０４５０】
本発明は、結合分子を診断薬または治療薬にコンジュゲートしたものも含む。結合分子を、例えば、所与の治療法および／または予防法の効力を判断するための臨床的な試験手順の一部分として、腫瘍の発生または進行を監視する診断に使用することができる。結合分子を、検出可能な物質にカップリングさせることによって、検出しやすくすることができる。検出可能な基質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子発生トモグラフィーを用いて陽電子を発生する金属、および放射性ではない常磁性金属イオンが挙げられる。例えば、本発明の診断薬として使用する抗体にコンジュゲート可能な金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げられる。
【０４５１】
結合分子を、化学発光性化合物にカップリングすることによって、検出可能になるように標識してもよい。化学発光性タグをつけたＩＧＦ−１Ｒ抗体の存在は、一連の化学反応中に生じる発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識となる化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。結合分子を検出可能になるように標識する１つの方法は、これらの物質を酵素に結合し、結合した生成物に酵素免疫測定（ＥＩＡ）を用いる方法である（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．、「Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７（１９７８））；Ｖｏｌｌｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編）、Ｅｎｚｙｍｅ  免疫アッセイ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８０）；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ら（編）、Ｅｎｚｙｍｅ  免疫アッセイ、Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ、Ｔｏｋｙｏ（１９８１））。結合分子に結合する酵素は、例えば、分光光度法、蛍光分析法または視覚的な方法によって検出可能な化学部分を生成するような様式で、適切な基質（好ましくは、発色性基質）と反応する。抗体を検出可能になるように標識するのに使用可能な酵素としては、限定されないが、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。さらに、酵素に発色性の基質を用いた比色分析によって検出してもよい。基質の酵素反応度と、同様に調製した標準物質の酵素反応度とを視覚的に比較して、検出してもよい。
【０４５２】
種々の免疫アッセイを用い、検出を行ってもよい。例えば、上述の結合分子を放射性物質で標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用して癌の抗原を検出することも可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９８６年３月））を参照。この内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）。放射性同位体は、限定されないが、γカウンタ、シンチレーションカウンタ、またはオートラジオグラフィーを含む手段で検出することができる。
【０４５３】
結合分子を、１５２Ｅｕまたは他のランタノイド種などの蛍光を発光する金属で検出可能になるように標識してもよい。ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート化基を用い、上述の金属を抗体に接続してもよい。
【０４５４】
種々の部分を結合分子にコンジュゲートする技術は、周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ｐｐ．６２３−５３（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．３０３−１６（１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照。
【０４５５】
（（ｉｉ）免疫原性の低下））
特定の実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子またはその一部分を、当該技術分野で認識されている技術を用いて改変し、免疫原性を低下させる。例えば、結合分子またはその一部分は、ヒト化されていてもよく、霊長類化されていてもよく、脱免疫化されていてもよい。ある実施形態では、キメラ結合分子を作成してもよく、または結合分子は、キメラ抗体分子の少なくとも一部分を含んでいてもよい。このような場合、非ヒトＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、典型的には、マウス結合分子または霊長類結合分子であり、親結合分子の抗原結合性を保持しているか、実質的に保持しているが、ヒトでの免疫原性は構築されていない。これらの抗体作成は、（ａ）完全な非ヒト可変領域をヒト定常領域にグラフト結合してキメラ抗体を作成する方法；（ｂ）重要なフレームワーク残基を保持した状態、または保持していない状態で、１つ以上の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部分をヒトフレームワークおよび定常領域にグラフト結合する方法；または（ｃ）完全な非ヒト可変領域を移植するが、表面残基を交換することによって、ヒトに似た部分で「覆ってしまう」方法を含む種々の方法で達成してもよい。このような方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８９）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、および米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１９０，３７０号に開示されており、これらの内容は全て、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０４５６】
ある実施形態では、本発明の結合分子（例えば、抗体）またはその一部分は、キメラであってもよい。キメラ結合分子は、結合分子の異なる部分が、異なる動物種に由来する結合分子である（例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域とを含む抗体）。キメラ抗体を産生する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および第４，８１６３９７号を参照（この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。「キメラ抗体」を製造するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））を使用し、上述の分子を合成してもよい。例えば、マウスＩＧＦ−１Ｒ抗体分子のうち、ある結合特異性をコードする遺伝子配列を、適切な生体活性を有するヒト抗体分子に由来する配列と融合したものを使用してもよい。本明細書で使用するとき、キメラ抗体は、異なる部分が、異なる動物種に由来するものである分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域とを含む抗体（例えば、ヒト化抗体）である。
【０４５７】
別の実施形態では、本発明の結合分子またはその一部分は、霊長類化されている。抗体を霊長類化する方法は、Ｎｅｗｍａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４５５−１４６０（１９９２）に開示されている。特に、この技術によって、サル可変領域とヒト定常領域とを含む霊長類化抗体が得られる。この参考文献の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。さらに、この技術は、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、第５，６９３，７８０号および第５，７５６，０９６号にも記載されており、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０４５８】
別の実施形態では、本発明の結合分子（例えば、抗体）またはその一部分は、ヒト化されている。ヒト化結合分子は、非ヒト種の抗体に由来する１つ以上の相補性決定量基（ＣＤＲ）を有する所望の抗原に結合する、非ヒト種の抗体に由来する結合特異性を有し、ヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する結合分子である。抗原への結合性を変更する（好ましくは、高める）ために、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基が、ＣＤＲ供与抗体に由来する対応する残基と置換していることが多い。これらのフレームワークの置換は、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデリングし、抗原への結合に重要なフレームワーク残基を特定すること、および配列を比較し、特定の位置にある一般的ではないフレームワーク残基を特定することのような、当該技術分で周知の方法によって同定される（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）を参照。この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。例えば、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号および第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーファリング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））およびチェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当該技術分野で既知の種々の技術を用い、抗体をヒト化することができる。
【０４５９】
脱免疫化によって、結合分子の免疫原性を低下させてもよい。本明細書で使用するとき、用語「脱免疫化」は、Ｔ細胞エピトープを改変するように抗体を変えることを含む（例えば、ＷＯ９８５２９７６Ａ１号、ＷＯ００３４３１７Ａ２号を参照）。例えば、原料抗体由来のＶＨ配列およびＶＬ配列を分析し、それぞれのＶ領域から得たヒトＴ細胞エピトープ「マップ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびその配列内の他の鍵となる残基に対するエピトープの位置を示す。最終的な抗体の活性が変わってしまう危険性を低く保ちつつ、代替的なアミノ酸置換を特定するために、Ｔ細胞エピトープマップから得た個々のＴ細胞エピトープを分析する。アミノ酸置換の組み合わせを含む、代わりとなるさまざまなＶＨ配列およびＶＬ配列を設計し、この配列は、本明細書に開示した診断方法および治療方法で使用するさまざまな結合ポリペプチド（例えば、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメント）を組み込んだものであり、次いで、この配列の機能を試験する。典型的には、１２〜２４の抗体改変体を作成し、試験する。改変したＶ領域およびヒトＣ領域を含む、完全な重鎖および軽鎖の遺伝子を発現ベクターにクローン化し、その後、全抗体を産生させるために、プラスミドを細胞株に導入する。次いで、この抗体を適切な生化学アッセイおよび生物アッセイで比較し、最適な改変体を特定する。
【０４６０】
（（ｉｉｉ）エフェクター機能、およびＦｃの改変）
本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、１つ以上のエフェクター機能に介在する定常領域を含むことができる。例えば、抗体の定常領域に、相補的なＣ１要素が結合すると、補体系が活性化し得る。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解にとって重要である。さらに、補体が活性化すると、炎症反応が刺激され、この事象は、自己免疫過敏にも関与する場合がある。さらに、抗体は、種々の細胞で、Ｆｃ領域を介して受容体に結合し、抗体のＦｃ領域にあるＦｃ受容体結合部位は、細胞のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。異なる種類の抗体に特異的な多くのＦｃ受容体が存在する（ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（ε受容体）、ＩｇＡ（α受容体）およびＩｇＭ（μ受容体）を含む）。抗体が、細胞表面でＦｃ受容体に結合すると、それは、抗体でコーティングされた粒子の飲み込みおよび破壊、免疫複合体のクリアランス、抗体でコーティングされた標的細胞をキラー細胞で溶解（抗体依存性の、細胞が介在する細胞毒性、すなわちＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症メディエーターの放出、胎盤通過、および免疫グロブリンの産生制御を含む、重要で多様な多くの生体反応を引き起こす。
【０４６１】
本発明の特定の実施形態は、あるＩＧＦ−１Ｒ結合分子を含み、そこでは、免疫原性はほぼ同じの改変していない全抗体と比較して、所望の生化学的特徴（例えば、エフェクター機能を低下させる、非共有結合によって二量化する性質、腫瘍部位に局在する能力が高い、血清半減期が短い、または血清半減期が長いこと）提供するように、１つ以上の定常領域の少なくとも１個のアミノ酸を欠いているか、または改変されている。例えば、本明細書に記載の診断方法および治療方法で使用する特定の抗体は、免疫グロブリン重鎖に似たポリペプチド鎖を含むが、１つ以上の重鎖領域の少なくとも一部分を欠いた、領域を欠いた抗体である。例えば、特定の抗体では、改変した抗体の１つの定常領域が全体的に失われ、例えば、ＣＨ２領域のすべてまたは一部分が失われる。
【０４６２】
特定のＩＧＦ−１Ｒ結合分子では、Ｆｃ部分は、当該技術分野で既知の技術を用い、エフェクター効果が低下するように変異されていてもよい。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活化（点変異または他の手段による）によって、循環するように改変されて結合分子へのＦｃ受容体の結合が低下し、それによって、腫瘍の局在化を高めることができる。他の場合、本発明にしたがって定常領域を適切に改変すると、補体結合を抑え、血清での半減期を短くし、結合した細胞毒の非特異的な結合を減らすことができる。定常領域を改変する他の方法を利用し、抗原の特異性または抗体の可とう性を高めることによって、局在化を高めるジスルフィド結合を改変してもよいし、またはオリゴ糖部分を改変してもよい。得られた生理学的プロフィール、バイオアベイラビリティ、および改変による他の生化学効果（例えば、腫瘍の局在化、生体内分布および血清での半減期）を容易に測定することができ、過度な実験を行うことなく、周知の免疫技術で定量化することができる。
【０４６３】
特定の実施形態では、本発明の結合ポリペプチドで使用するＦｃドメインは、Ｆｃ改変体である。本明細書で使用するとき、用語「Ｆｃ改変体」は、Ｆｃドメインの由来となる野生型Ｆｃドメインと比較して、少なくとも１個のアミノ酸が置換されているＦｃドメインを指す。例えば、Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体に由来する場合、このヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃ改変体は、上述のＦｃドメインに対し、少なくとも１個のアミノ酸が置換されている。
【０４６４】
Ｆｃ改変体のアミノ酸置換は、Ｆｃドメイン内の任意の位置（すなわち、ＥＵ規則による、任意のアミノ酸位置）にあってもよい。ある実施形態では、Ｆｃ改変体は、ヒンジドメインまたはその一部分にあるアミノ酸が置換したものである。別の実施形態では、Ｆｃ改変体は、ＣＨ２ドメインまたはその一部分にあるアミノ酸が置換したものである。別の実施形態では、Ｆｃ改変体は、ＣＨ３ドメインまたはその一部分にあるアミノ酸が置換したものである。別の実施形態では、Ｆｃ改変体は、ＣＨ４ドメインまたはその一部分にあるアミノ酸が置換したものである。
【０４６５】
本発明の結合ポリペプチドは、エフェクター機能および／またはＦｃＲ結合を改良する（例えば、低下または向上させる）ことが知られている、当該技術分野で認識されているＦｃ改変体を使用してもよい。上述のＦｃ改変体としては、例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ８８／０７０８９Ａ１号、ＷＯ９６／１４３３９Ａ１号、ＷＯ９８／０５７８７Ａ１号、ＷＯ９８／２３２８９Ａ１号、ＷＯ９９／５１６４２Ａ１号、ＷＯ９９／５８５７２Ａ１号、ＷＯ００／０９５６０Ａ２号、ＷＯ００／３２７６７Ａ１号、ＷＯ００／４２０７２Ａ２号、ＷＯ０２／４４２１５Ａ２号、ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２号、ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２号、ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２号、ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２号、ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２号、ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２号、ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２号、ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２号、ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２号、ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１号、ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２号、ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２号、ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２号、ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１号、ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２号およびＷＯ０６／０８５９６７Ａ２号または米国特許第５，６４８，２６０号；第５，７３９，２７７号；第５，８３４，２５０号；第５，８６９，０４６号；第６，０９６，８７１号；第６，１２１，０２２号；第６，１９４，５５１号；第６，２４２，１９５号；第６，２７７，３７５号；第６，５２８，６２４号；第６，５３８，１２４号；第６，７３７，０５６号；第６，８２１，５０５号；第６，９９８，２５３号；第７，０８３，７８４号（それぞれの内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）で開示した、いずれかのアミノ酸置換が挙げられる。
【０４６６】
好ましい実施形態では、結合ポリペプチドは、Ｆｃドメイン内の「１５Åの定常領域」にある、ＥＵアミノ酸位置にアミノ酸置換を含む、Ｆｃ改変体を含んでいてもよい。この１５Åの領域は、Ｆｃ領域のＥＵ位置２４３〜２６１、２７５〜２８０、２８２〜２９３、３０２〜３１９、３３６〜３４８、３６７、３６９、３７２〜３８９、３９１、３９３、４０８および４２４〜４４０にある残基を含む。
【０４６７】
特定の実施形態は、抗原とは独立した抗体のエフェクター機能を変えるような、特に、抗体の循環血半減期を変えるような、アミノ酸置換を含むＦｃ改変体を含む本発明の結合ポリペプチドである。このような結合ポリペプチドは、上述の置換がない結合ポリペプチドと比較すると、ＦｃＲｎに対する結合を高めるか、または低下させ、したがって、それぞれ、血清半減期を伸ばすか、または短くする。ＦｃＲｎに対する親和性を高めたＦｃ改変体は、血清半減期が長くなっていることが予想され、このような分子は、哺乳動物を治療する用途で、投与するポリペプチドの半減期が長いことが好ましい場合（例えば、慢性疾患または慢性障害を治療する場合）に有用である。対照的に、Ｆｃ改変体のＦｃＲｎ結合親和性が低下することによって、半減期が短くなることが予想され、この分子も、例えば、循環時間が短いことが有益である場合（例えば、インビボでの診断造影、または原料ポリペプチドが、長期間循環血に存在すると、毒による副作用を有している状況）の、哺乳動物への投与に有用である。ＦｃＲｎ結合親和性が低いＦｃ改変体は、胎盤を通過する可能性が少なく、妊婦の疾患または障害を治療するのにも有用である。それに加え、ＦｃＲｎ結合親和性が低いことが望ましい他の用途としては、脳、腎臓および／または肝臓への局在化が望ましい用途が挙げられる。ある例示的な実施形態では、本発明の改変したポリペプチドは、脈管構造から腎臓糸球体の上皮を通る量が減少する。別の実施形態では、本発明の改変したポリペプチドは、脳から血液脳関門（ＢＢＢ）を通って脈管性間隙に入る量が減少する。ある実施形態では、ＦｃＲｎ結合を改変した結合ポリペプチドは、Ｆｃドメインの「ＦｃＲｎ結合ループ」内に１個以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。ＦｃＲｎ結合ループは、アミノ酸残基２８０〜２９９を含む（ＥＵ付番による）。他の実施形態では、ＦｃＲｎ結合親和性を改変した本発明の結合ポリペプチドは、１５ÅのＦｃＲｎ「定常ゾーン」内に１個以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。本明細書で使用するとき、１５ÅのＦｃＲｎの「定常ゾーン」は、位置２４３〜２６１、２７５〜２８０、２８２〜２９３、３０２〜３１９、３３６〜３４８、３６７、３６９、３７２〜３８９、３９１、３９３、４０８、４２４、４２５〜４４０（ＥＵ付番による）にある残基を含む。好ましい実施形態では、ＦｃＲｎ結合親和性を改変した本発明の結合ポリペプチドは、位置２５６、２７７〜２８１、２８３〜２８８、３０３〜３０９、３１３、３３８、３４２、３７６、３８１、３８４、３８５、３８７、４３４および４３８のいずれか１つに、１個以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。ＦｃＲｎ結合親和性を改変するアミノ酸置換の例は、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０５／０４７３２７号に開示されており、この内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０４６８】
他の実施形態では、本明細書に記載の診断方法および治療方法で使用する特定の結合分子は、定常領域（例えば、ＩｇＧ４重鎖定常領域）を有しており、この分子は、グリコシル化を減らすか、または完全になくすように改変されている。例えば、本発明の結合ポリペプチドは、結合ポリペプチドのグリコシル化を変更するアミノ酸置換を含むＦｃ改変体も含む。例えば、このＦｃ改変体は、グリコシル化（例えば、Ｎで結合したグリコシル化またはＯで結合したグリコシル化）を減らすか、または野生型Ｆｃドメインの糖型を改変したものを含んでいてもよい（例えば、低フコースグリカンまたはフコースを含まないグリカン）。例示的な実施形態では、Ｆｃ改変体は、アミノ酸位置２９７（ＥＵ付番）で通常みられるような、Ｎで結合したグリカンのグリコシル化を減らしている。別の例示的な実施形態で、Ｆｃ改変体は、アミノ酸位置２９７（ＥＵ付番）に、低フコースグリカンを含むか、またはフコースを含まないグリカンを含む。別の実施形態では、結合ポリペプチドは、グリコシル化モチーフ付近またはグリコシル化モチーフ（例えば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含有する、Ｎで結合したグリコシル化モチーフ）内に、アミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、結合ポリペプチドは、アミノ酸位置２２８または２９９（ＥＵ付番）にアミノ酸置換を有するＦｃ改変体を含む。さらに具体的な実施形態では、結合分子は、Ｓ２２８ＰおよびＴ２９９Ａ（ＥＵ付番）に変異を含む、ＩｇＧ４定常領域を含む。
【０４６９】
グリコシル化を減らすか、またはグリコシル化を改変するアミノ酸置換の例は、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０５／０１８５７２号に開示されており、この内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、グリコシル化が起こらないように改変されている。この結合分子を、「ａｇｌｙ」結合分子（例えば、「ａｇｌｙ」抗体）と呼んでもよい。理論によって束縛されないが、「ａｇｌｙ」抗体は、インビボでの安全性および安定性が改良されていると考えられる。例示的なａｇｌｙ結合分子は、ＦＣエフェクター機能を欠いたＩｇＧ４抗体の非グリコシル化Ｆｃ領域（「ＩｇＧ４．Ｐ」）を含み、それによって、Ｆｃを介してＩＧＦ−１Ｒを発現する通常の重要臓器への毒性を除去する。具体的な実施形態では、本発明のａｇｌｙ結合分子は、配列番号：１３２に記載される（ＩｇＧ４．Ｐ）定常領域を含んでよい（図１０（ｂ）参照）。
【０４７０】
（ＶＩＩ．結合分子を作成する方法）
周知のように、ＲＮＡは、例えば、イソチアン酸グアニジニウムによる抽出、沈殿、次いで遠心分離またはクロマトグラフィーのような標準的な技術で、元々のハイブリドーマ細胞から単離されるか、または他の形質転換された細胞から単離される。所望な場合、ｍＲＮＡは、オリゴ−ｄＴセルロースを用いたクロマトグラフィーのような標準的な技術を用い、全ＲＮＡから単離してもよい。好適な技術は、当該技術分野でよく知られている。
【０４７１】
ある実施形態では、本発明の結合分子の別個の鎖（例えば、抗体の軽鎖および重鎖）をコードするｃＤＮＡは、周知の方法にしたがって、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを用い、同時に作成してもよいし、別個に作成してもよい。コンセンサス定常領域プライマーによって、または公開されている重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列に基づいて、さらに特異的なプライマーによってＰＣＲを開始してもよい。上述のように、ＰＣＲを使用し、結合分子の別個の鎖をコードするＤＮＡクローンを単離してもよい。この場合、コンセンサスプライマーまたはこれより同一性の高いプロープ（例えば、マウス定常領域のプローブ）によって、ライブラリをスクリーニングしてもよい。当該技術分野で既知の技術を用い、ＤＮＡ（典型的にはプラスミドＤＮＡ）を細胞から単離し、例えば、上述の参考文献に詳細を記載した、組み換えＤＮＡ技術に関する標準的な周知の技術にしたがって、制限マッピングを行い、配列を決定してもよい。もちろん、本発明の方法にしたがって、単離プロセスまたはその後の分析プロセスの任意の時間に、ＤＮＡを合成してもよい。本発明の結合分子を得るために、遺伝子物質の単離物を操作した後に、典型的には、ＩＧＦ−１Ｒ結合分子をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入し、宿主細胞に導入し、この宿主細胞を、所望の性質を有するＩＧＦ−１Ｒ結合分子を作成するために使用することができる。
【０４７２】
結合分子（例えば、本明細書に記載の標的分子（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ）に結合する抗体の重鎖または軽鎖）を組み換えによって発現させるためには、この結合分子をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを構築する必要がある。本発明の結合分子（または、その重鎖または軽鎖の一部分）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、結合分子を産生するベクターを、当該技術分野で周知の組み換えＤＮＡ技術によって産生してもよい。したがって、ヌクレオチド配列をコードする結合分子を含むポリヌクレオチドを発現させることによって、タンパク質を調製する方法を、本明細書に説明する。当該技術分野で周知の方法を使用し、配列および適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルをコードする抗体を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロでの組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボでの遺伝子組み換えが含まれる。このように、本発明は、本発明の結合分子、またはその鎖またはドメインをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結した、複製可能なベクターを与える。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み（例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ８６／０５８０７号；ＰＣＴ出願公開ＷＯ８９／０１０３６号；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照）、結合分子をコードするヌクレオチド（またはその鎖またはドメイン）を、完全な結合分子を発現するベクターにクローン化し得る。
【０４７３】
本発明の結合分子がダイマーである場合、宿主細胞を、本発明の２種類の発現ベクターと一緒にトランスフェクトしてもよい。ここで、第１のベクターは、第１のポリペプチドモノマーをコードし、第２のベクターは、第２のポリペプチドモノマーをコードする。この２種類のベクターは、上述のモノマーを同じ量で発現可能な、同一の選択可能なマーカーを含有していてもよい。あるいは、モノマーを両方ともコードする１種類のベクターを使用してもよい。モノマーが、抗体の軽鎖および重鎖である実施形態では、毒性のない重鎖が過剰量作られてしまうのを防ぐために、軽鎖は、重鎖の前に配置される方が有利である（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。結合分子のモノマーをコードする配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含んでいてもよい。用語「ベクター」または「発現ベクター」は、本明細書では、宿主細胞に導入され、宿主細胞で所望の遺伝子を発現するためのビヒクルとして、本発明にしたがって使用されるベクターを意味する。当業者が知っているように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から簡単に選択することができる。一般的に、本発明に適合するベクターは、選択マーカーと、所望の遺伝子のクローン化を容易にする適切な制限部位とを含み、真核細胞または原核細胞に入り込み、および／または複製する能力を有する。
【０４７４】
本発明のために、多くの発現ベクター系が使用可能である。例えば、ある種のベクターに、動物ウイルス（例えば、ウシパピローマウウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルス）に由来するＤＮＡ要素を利用する。それ以外には、内部にあるリボソーム結合部位を用いたポリシストロニック系の使用を含む。さらに、トランスフェクトされた宿主細胞を選択可能な１個以上のマーカーを導入することによって、ＤＮＡを染色体に組み込んだ細胞を、選択してもよい。このマーカーは、栄養要求性宿主への栄養要求性、殺生物剤への耐性（例えば、抗生物質）、または銅のような重金属への耐性を与え得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現するＤＮＡ配列に直接結合しているか、または同時形質転換によって同じ細胞に導入されてもよい。ｍＲＮＡの合成を最適化するために、さらなる要素が必要となることもある。これらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナル、および転写プロモーター、エンハンサー、および停止シグナルを含み得る。特に好ましい実施形態では、クローン化された可変領域の遺伝子を、上述のように合成した、重鎖および軽鎖の定常領域遺伝子（好ましくは、ヒト）とともに、発現ベクターに挿入する。ある実施形態では、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の特許品であるＮＥＯＳＰＬＡという発現ベクター（米国特許第６，１５９，７３０号に開示されている）を用いて行う。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーと、マウスβグロビン主要プロモーターと、ＳＶ４０由来複製物と、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列と、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのエクソン１およびエクソン２と、ジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子と、リーダー配列とを含んでいる。このベクターは、可変領域および定常領域の遺伝子を組み込み、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、次いでＧ４１８を含有する培地で選択し、メトトレキサートで増幅させると、抗体をきわめて高レベルで発現することが分かっている。もちろん、真核細胞での発現を誘発可能な任意の発現ベクターを本発明に使用してもよい。好適なベクターの例としては、限定されないが、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能）、およびプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）から入手可能）が挙げられる。一般的に、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖が、例えばロボットによるシステムによって行われるような、日常の実験である場合、多くの形質転換細胞が、好適に高レベルで発現するものについてスクリーニングされる。ベクター系は、米国特許第５，７３６，１３７号および第５，６５８，５７０号にも教示があり、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。この系は、例えば、３０ｐｇ／細胞／日を超える高い発現濃度を提供する。ベク��ー系の他の例は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
【０４７５】
他の好ましい実施形態では、本発明の結合分子を、２００２年１１月１８日に出願した米国特許出願第２００３−０１５７６４１  Ａ１号（この内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示したポリシストロニック構築物を用いて発現させてもよい。これらの新規発現系で、目的の複数の遺伝子産物（例えば、抗体の重鎖および軽鎖）を、１個のポリシストロニック構築物から作成し得る。これらの系には、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用し、真核細胞を宿主として、比較的高濃度のＩＧＦ−１Ｒ結合分子を得ることが有利である。適合するＩＲＥＳ配列は、米国特許第６，１９３，９８０号に開示されており、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。当業者は、このような発現系を使用し、この出願で開示されているＩＧＦ−１Ｒ抗体の全範囲を効果的に作成し得ることを理解するであろう。
【０４７６】
さらに一般的には、ＩＧＦ−１Ｒ抗体のモノマーサブニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列を調製したら、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。プラスミドを宿主細胞に導入する操作は、当業者に周知の種々の技術で行うことができる。  この操作としては、限定されないが、トランスフェクション（電気泳動および電気穿孔を含む）、原形質融合、リン酸カルシウム沈殿法、エンベロープＤＮＡを用いた細胞融合、微量注入、およびインタクトなウイルスに感染させる方法が挙げられる。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ編、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２（１９８８）を参照。  典型的には、宿主細胞へのプラスミドの導入は、電気穿孔によって行う。発現構築物を含む宿主細胞を、結合分子を産生するのに適した条件下で成長させ、結合分子の合成についてアッセイする。アッセイ技術の例としては、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学的方法などが挙げられる。
【０４７７】
発現ベクターを、従来の技術で宿主細胞に移し、トランスフェクト下細胞を従来の技術で培養し、本明細書で記載の方法で使用する抗体を産生する。このように、本発明は、本発明の結合分子（またはそのモノマーまたは鎖）をコードするポリヌクレオチドが、異種プロモーターに作動可能に連結した宿主細胞を含む。二本鎖結合分子またはダイマー結合分子を発現するのに好ましい実施形態では、以下に詳細を説明するように、結合分子の鎖を別個にコードするベクターを、宿主細胞で一緒に発現させ、完全な結合分子を発現させてもよい。
【０４７８】
本明細書で使用するとき、「宿主細胞」は、組み換えＤＮＡ技術を用い、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするようにて構築されたベクターを含む細胞を指す。組み換え宿主から抗体を単離するプロセスを説明する際に、用語「細胞」および「細胞培養物」は、他の意味であると明確に示されていない限り、抗体の起源を示すという同じ意味で用いる。言い換えると、「細胞」からポリペプチドを回収することは、全細胞を沈降させて回収するか、または培地と懸濁した細胞の両方を含む細胞培養物から回収することを意味し得る。
【０４７９】
種々の宿主−発現ベクター系を利用し、本明細書に記載の方法で使用する抗体分子を発現させることができる。このような宿主−発現系は、目的のコード配列を産生し、精製するビヒクルをあらわすとともに、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換するか、またはトランスフェクトし、目的の抗体分子を系中で発現させる細胞をあらわす。このような宿主−発現系としては、限定されないが、抗体をコードする配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクトした細菌類（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体をコードする配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス）；組み換えウイルス発現ベクターに感染した植物細胞系（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）、または抗体をコードする配列を含む組み換えプラスミド発現ベクターで形質転換されたもの（例えば、Ｔｉプラスミド）；または哺乳動物細胞に由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する、組み換え発現構築物を含む哺乳動物系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＬＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）が挙げられる。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌細胞、さらに好ましくは、全組み換え抗体分子を特異的に発現する真核細胞を、組み換え抗体分子を発現するのに使用する。例えば、哺乳動物の細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ））を、ヒトサイトメガロウイルスに由来する主要な前初期遺伝子プロモーター要素のようなベクターと組み合わせると、抗体を有効に発現する系になる（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０４８０】
タンパク質を発現させるのに使用する宿主細胞は、哺乳動物に由来するものが多く、当業者は、所望な産物を発現させるのに最も適した特定の宿主細胞株を選ぶ能力を有すると考える。宿主細胞株の例としては、限定されないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲ  ｍｉｎｕｓ）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶＩ誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（幼若ハムスターの腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。ＣＨＯ細胞が特に好ましい。宿主細胞株は、典型的には、商業的なサービス機関であるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能であり、または公開されている文献から入手可能である。
【０４８１】
さらに、挿入した配列の発現を調節するか、または望ましい特定の様式で遺伝子産物を改変し、加工する宿主細胞株を選択してもよい。このような改変（例えば、グリコシル化）およびタンパク質産物の加工（例えば、開裂）は、タンパク質の機能にとって重要な場合がある。異なる宿主細胞は、翻訳後の処理、およびタンパク質および遺伝子産物の改変の際に、特徴的かつ特異的な機序を有する。発現した異種タンパク質を正しく改変し、処理するために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写物の適切な処理、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための機序を有する真核宿主細胞を使用してもよい。
【０４８２】
長期間にわたって、組み換えタンパク質を高濃度で産生するために、安定して発現することが好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株を遺伝子操作によって作出することができる。ウイルス由来の複製物を含有する発現ベクターを用いるよりも、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写停止コドン、ポリアデニル化部位など）によって制御されたＤＮＡと、選択可能なマーカーとを用いて宿主細胞を形質転換することができる。異種ＤＮＡを導入した後、遺伝子操作した細胞を栄養分が豊富な培地で１〜２日間成長させ、選択性を有する培地に移すことができる。組み換えプラスミドの選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、これにより、細胞は、染色体にプラスミドを安定に組み込み、成長して遺伝子座を形成し、これを細胞株へクローン化し、数を増やすことができる。この方法は、抗体分子を安定に発現する細胞株を遺伝子操作するのに有利に使用することができる。
【０４８３】
多くの選択系を使用することができ、限定されないが、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２−２０３４（１９９２））およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７  １９８０）の遺伝子を、それぞれ、ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞またはａｐｒｔ細胞に使用してもよい。さらに、代謝拮抗物質への耐性を、以下の遺伝子を選択する基準として使用してもよい：ｄｈｆｒ、メトトレキサートへの耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５６７−３５７０（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、ミコフェノール酸への耐性を付与する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、アミノ酸配糖体Ｇ−４１８への耐性を付与する（Ｇｏｄｓｐｉｅｌら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３））；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３年５月）；およびｈｙｇｒｏ、ハイグロマイシンへの耐性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４）。組み換えＤＮＡ技術の分野で一般的に知られており、使用可能な方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；および第１２章および第１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されており、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０４８４】
ベクターの増幅によって、抗体分子の発現濃度を高めることができる（概説として、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｖｏｌ．３．（１９８７）を参照）。抗体を発現するベクター系のマーカーが、増幅可能な性質を有している場合、宿主細胞培養物中に存在する組成物の量が多くなると、マーカー遺伝子の複製物の数も増える。増幅した領域が抗体遺伝子と関係があるため、抗体の産生量も増える（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０４８５】
インビトロでの産生は、生産規模を増大して、所望のポリペプチドを大量に得ることができる。組織培養条件での哺乳動物細胞の培養技術は、当該技術分野で既知であり、例えば、空気揚水反応機または連続的な撹拌反応器での均一懸濁培養、例えば、中空繊維、マイクロカプセル、寒天マイクロビーズまたはセラミックカートリッジに細胞を固定するか、または封入しての培養が挙げられる。必要な場合、および／または所望な場合、一般的なクロマトグラフィー法（例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースによるクロマトグラフィー、または（免疫）親和性クロマトグラフィー）によって、ポリペプチドの溶液を精製してもよい。特定の実施形態では、本発明の結合分子は、商業的なスケール（例えば、大きさが２５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、１０００Ｌ、またはそれ以上の細胞培養物またはバイオリアクター）で製造した場合、高収率で得られる。例えば、本発明の結合分子は、宿主細胞によって製造され、宿主細胞の培地１Ｌあたり、少なくとも５ｍｇ（例えば、少なくとも１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５ｇまたは５ｇ）の結合分子が製造される。
【０４８６】
好ましくは、本発明の結合分子は、凝集物を形成する傾向はない。凝集は、限定されない多くの生化学的技術または生物物理学的技術によって測定することができる。例えば、本発明の組成物の凝集は、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ））を用いて評価することができる。ＳＥＣは、分子を大きさによって分ける。カラムをポリマーゲルの半固体ビーズで満たし、イオンおよび小分子は、内部に入り込むが、大きな分子は入り込まない。タンパク質の組成物をカラム上面に置くと、小さく折りたたまれたタンパク質（すなわち、凝集していないタンパク質）は、大きなタンパク質凝集物に対するよりも、大量の溶媒に分散される。その結果、大きな凝集物は、カラムをすばやく通過し、この様式で、この混合物を成分に分離するか、または画分に分けることができる。それぞれの画分を、ゲルから溶出させた状態で、別個に定量することができる（例えば、光散乱によって）。したがって、本発明の組成物の凝集率（％）は、あるフラクションの濃度と、ゲルに入れたタンパク質の合計濃度とを比較することによって決定することができる。安定した組成物は、本質的に１個の画分としてカラムから溶出し、溶出プロフィールまたはクロマトグラムで本質的に１個のピークであらわれる。
【０４８７】
好ましい実施形態では、ＳＥＣを、インライン光散乱法（ｉｎ−ｌｉｎｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）（例えば、伝統的な光散乱法または動的光散乱法）と組み合わせて用い、組成物の凝集率（％）を決定する。特定の好ましい実施形態では、静的光散乱法を使用し、分子の形状または溶出位置とは独立して、それぞれのフラクションまたはピークの質量を測定する。他の好ましい実施形態では、動的光散乱法を使用し、組成物の流体力学的な大きさを測定する。タンパク質の安定性を評価する他の方法の例としては、高速ＳＥＣ（例えば、Ｃｏｒｂｅｔｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２３（８）：１８８８−９４，  １９８４を参照）。
【０４８８】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ結合分子をコードする遺伝子を、非哺乳動物細胞（例えば、細菌または昆虫細胞または酵母または植物細胞）から発現させてもよい。核酸を取り出すことが容易な細菌類としては、腸内細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ；ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅが挙げられる。細菌で発現する場合、異種ポリペプチドは、典型的には、封入体の一部分になることも理解されるであろう。この異種ポリペプチドを単離し、精製し、次いで、機能的な分子にアセンブリしなければならない。四価形態の結合分子が望ましい場合、サブユニットが四価結合分子になるように自己集合させる必要がある（例えば、四価抗体（ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号））。
【０４８９】
細菌系では、発現する抗体分子の目的とする用途によって、有利に、多くの発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体分子の医薬組成物を製造するために、大量のタンパク質を産生しなければならない場合、高濃度の融合タンパク質産物を発現し、精製が簡単になベクターが望ましい場合がある。このようなベクターとしては、限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３）、抗体をコードする配列は、融合タンパク質が産生するように、ベクターのフレーム内に、ｌａｃＺコード領域とともに個々に接続していてもよい）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））などが挙げられる。ｐＧＥＸベクターを使用し、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）で異種ポリペプチドを融合タンパク質として発現させてもよい。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンマトリックス−寒天ビーズに吸着させ、結合させ、遊離グルタチオン存在下で溶出させることによって、溶解した細胞から簡単に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計されており、その結果、クローン化した標的遺伝子産物が、ＧＳＴ部分から放出されるようになっている。
【０４９０】
原核生物だけでなく、真核微生物も使用してよい。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（一般的なパン用酵母）は、最も一般的に使用される真核微生物であるが、多くの他の株も一般的に利用可能である（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）。
【０４９１】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓで発現させる場合、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ  ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ  １０：１５７（１９８０））が一般的に使用される。このプラスミドは、ＴＲＰ１２遺伝子を含有しており、この遺伝子によって、トリプトファンで成長する能力を欠いた酵母の変異株の選択マーカーを提供する。例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５（１）：２３−３３（１９７７））。この酵母宿主細胞のゲノムの特徴であるｔｒｐｌ変異の存在によって、トリプトファンが存在しない状態で成長させることによる形質転換を有効に検出する環境を提供する。
【０４９２】
昆虫系では、典型的には、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、異種遺伝子を発現するベクターとして用いられる。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で成長する。抗体をコードする配列を、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下で、このウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローン化してもよい。
【０４９３】
本発明の抗体分子が組み換えによって発現したら、免疫グロブリン分子を精製する分野で既知の任意の方法（例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に、プロテインＡの後で、特異的な抗原に対する親和性、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の差による方法、またはタンパク質を精製する任意の他の標準的な技術）によって精製してもよい。または、結合分子（例えば、抗体）の親和性を高める好ましい方法は、ＵＳ  ２００２  ０１２３０５７  Ａ１号に開示されている。
【０４９４】
（ＶＩＩＩ．ＩＧＦ−１Ｒの異なるエピトープに結合する結合分子を含む組成物を使用する方法）
本発明の結合分子は、細胞におけるＩＧＦ−１Ｒが介在する効果（例えば、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞のような、細胞の増殖）を減らすか、または阻害する。別の実施形態では、本発明の結合分子は、細胞（例えば、ＩＧＦ−１Ｒを発現する腫瘍細胞）における、ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達を阻害する。ＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達の阻害は、１つ以上のシグナル伝達経路の活性化を決定することによって、または細胞増殖のような、下流にあたる活性化の測定値を決定することによって、測定することができる。このような測定は、当該技術分野で知られている標準的な方法または本明細書（例えば、実施例）に記載の方法によって行うことができる。
【０４９５】
例えば、ある実施形態では、本発明の結合分子は、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒリン酸化、ＡＫＴまたはＭＡＰＫのリン酸化、ＡＫＴが介在する生存シグナルの伝達を減らすか、または阻害する。別の実施形態では、本発明の結合分子は、腫瘍細胞の成長を、例えば、インビトロまたはインビボで阻害する。さらに別の実施形態では、本発明の結合分子は、ＩＧＦ−１Ｒの内在化を誘発する。
【０４９６】
ある実施形態では、本発明の結合分子は、ＩＧＦ−１Ｒが介在する細胞活性化のパラメーターを、結合分子に存在する個々の結合部分のものよりも（例えば、その結合特異性を有するモノクローナル抗体よりも）高い程度に阻害するか、または（ｉ）第１の結合部分を含む第１の単一特異性結合分子、および（ｉｉ）第２の結合部分を含む第２の単一特異性結合分子を含む組み合わせよりも高い程度に阻害する。
【０４９７】
本発明のある実施形態は、有効量の本明細書に記載の本発明の結合分子または組成物を、過剰増殖性疾患または障害（例えば、癌、悪性細胞、腫瘍またはその転移）を患っている動物、または上述の疾患にかかる恐れがあると診断された動物に投与する工程を含む、この動物において、上述の疾患または障害を治療する（例えば、上述の疾患または障害の進行を遅らせるか、少なくとも１つの症状を軽減するか、拡大率を小さくする）方法を与える。
【０４９８】
本明細書に開示した治療方法で使用されるＩＧＦ−１Ｒまたはその改変体に特異的に結合する本発明の結合分子は、細胞の過剰増殖に関与する細胞活性（例えば、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害に関連することの多い、血管新生の変更または異常な血管新生パターンを誘発する細胞活性）を停止させ、低下させ、抑止させるか、または阻害する治療薬として調製され、使用することができる。
【０４９９】
本発明の結合分子は、標識されていない形態またはコンジュゲートされていない形態で使用してもよく、標識されていない形態で使用してもよく、または放射能標識および生化学的な細胞毒のような細胞毒性部分にカップリングし、または結合して、治療効果を発揮する薬剤を製造してもよい。
【０５００】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ（例えば、ヒトＩＧＦ−１Ｒ）に特異的に結合するか、または選択的に結合する抗体または免疫特異性のフラグメントを有効量投与する工程を含むか、この工程から本質的になるか、またはこの工程からなる、例えば、腫瘍の成長を阻害することによって、哺乳動物の種々の過剰増殖性障害を治療する方法を提供する。
【０５０１】
本発明は、さらに具体的には、本発明の結合分子を、過剰増殖性障害を治療する（例えば、腫瘍の形成、腫瘍の成長、腫瘍の侵襲性、および／または転移の発生を阻害するか、または予防する）ことが必要な動物（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）に有効量投与する工程を含むか、この工程から本質的になるか、またはこの工程からなる、動物において、哺乳動物の過剰増殖性障害を治療する方法である。
【０５０２】
他の実施形態では、本発明は、過剰増殖性障害を治療する（例えば、腫瘍の形成、腫瘍の成長（例えば、細胞増殖）、腫瘍の侵襲性、および／または転移の発生を阻害するか、または減らす）ことが必要な哺乳動物（例えば、ヒト患者）に、医薬的に許容される担体と、本発明の結合分子（例えば、本発明の多重特異性結合分子）、または結合分子の組み合わせ（例えば、異なるＩＧＦ−１Ｒエピトープに結合する２個以上の単一特異性結合分子とを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物を有効量投与する工程を含む、動物の過剰増殖性障害を治療する方法を含む。
【０５０３】
他の実施形態では、本発明は、過剰増殖性障害を治療する（例えば、腫瘍の形成、腫瘍の成長、腫瘍の侵襲性、および／または転移の発生を阻害する）ことが必要な動物（例えば、ヒト患者）に、医薬的に許容される担体と、本発明の結合分子（例えば、本発明の多重特異性結合分子）、または結合分子の組み合わせ（例えば、異なるＩＧＦ−１Ｒエピトープに結合する２個以上の単一特異性結合分子とを含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなる組成物を有効量投与する工程を含み、この組成物には、結合分子を改変するさらなる部分（例えば、炭水化物部分）が含まれていてもよく、これによって、改変されていないタンパク質よりも、改変された標的タンパク質に対し、結合分子が高親和性で結合するような、動物の過剰増殖性障害を治療する方法を含む。あるいは、結合分子は、改変していない形態の標的タンパク質には全く結合しない。
【０５０４】
より具体的には、本発明は、癌を治療することが必要なヒトに、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子（例えば、本発明の多重特異性結合分子）、または結合分子の組み合わせ（例えば、異なるＩＧＦ−１Ｒエピトープに結合する２個以上の単一特異性結合分子）と、医薬的に許容される担体とを含む組成物を有効量投与する工程とを含む、ヒトの癌を治療する方法を与える。治療対象となる癌の種類としては、胃癌、腎癌、脳癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌および前立腺癌が挙げられる。
【０５０５】
（ＩＸ．ＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子および核酸増幅アッセイを用いる診断方法）
本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子または組成物を、診断目的で使用し、ＩＧＦ−１Ｒの異常な発現および／または異常な活性に関連する疾患、障害および／または状態を検出し、診断し、または監視することができる。ＩＧＦ−１Ｒの発現量は、腫瘍組織および他の新生物状態では増える。
【０５０６】
ＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子は、哺乳動物（好ましくはヒト）の過剰増殖性障害を診断し、治療し、予防し、および／または予後を判断するのに有用である。このような障害としては、限定されないが、癌、新生物、腫瘍および／または本明細書の他の部分に説明したものが挙げられ、特に、ＩＧＦ−１Ｒに関連する癌、例えば、癌が、胃癌、腎癌、脳癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌および前立腺癌が挙げられる。
【０５０７】
例えば、本明細書で開示しているように、ＩＧＦ−１Ｒの発現は、少なくとも、胃、腎臓、脳、膀胱、結腸、肺、乳房、膵臓、卵巣および前立腺の腫瘍組織に関係がある。したがって、本発明の結合分子を利用し、高濃度のＩＧＦ−１Ｒを発現している特定の臓器を検出することができる。これらの診断アッセイは、インビボまたはインビトロで行われてもよく、例えば、血液サンプル、生検組織または剖検組織で行われてもよい。
【０５０８】
このように、本発明は、癌および他の過剰増殖性障害の診断に有用な診断方法を提供し、それは、個体由来の組織または他の細胞または身体中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質または転写物の発現濃度を測定する工程と、測定した発現濃度と、正常な組織または体液の標準的なＩＧＦ−１Ｒ発現濃度とを比較し、標準値と比較して発現濃度が高くなっていることが、障害の指標となる工程が含まれる。
【０５０９】
一実施形態は、液体サンプルまたは組織サンプル中の異常な過剰増殖性細胞（例えば、前癌細胞または癌細胞）の存在を検出する方法を提供し、それは、個体の組織サンプルまたは体液サンプル中のＩＧＦ−１Ｒの発現をアッセイする工程と、そのサンプルのＩＧＦ−１Ｒ発現の存在または発現濃度と、標準的な組織サンプルまたは体液サンプル中のＩＧＦ−１Ｒ発現の存在または発現濃度とを比較する工程とを含み、ＩＧＦ−１Ｒの発現を検出すること、またはＩＧＦ−１Ｒの発現濃度が標準値よりも高いことは、異常な過剰増殖性細胞の成長の指標である。
【０５１０】
さらに具体的には、本発明は、体液サンプルまたは組織サンプル中の異常な過剰増殖性細胞の存在を検出する方法を提供し、それは、（ａ）本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的な抗体を用い、個体の組織サンプルまたは体液サンプル中のＩＧＦ−１Ｒの発現をアッセイする工程と、（ｂ）そのサンプルのＩＧＦ−１Ｒ発現の存在または発現濃度と、標準的な組織サンプルまたは体液サンプル中のＩＧＦ−１Ｒ発現の存在または発現濃度とを比較する工程とを含み、ＩＧＦ−１Ｒの発現を検出すること、またはＩＧＦ−１Ｒの発現濃度が標準値よりも高いことは、異常な過剰増殖性細胞の成長の指標である。
【０５１１】
癌についていえば、比較的高濃度のＩＧＦ−１Ｒタンパク質が、個体の生検組織に存在することは、腫瘍または他の悪性細胞の成長の指標となる場合があり、このような悪性細胞または腫瘍の発生を前もって診断する指標となる場合があり、または実際の臨床症状が起こる前に、疾患を検出する手段を提供することがある。この種類の診断の信頼性が高まれば、医療従事者は、予防的な測定または初期の積極的な治療に利用することができ、それによって、癌の発生またはさらなる進行を抑えることができる。
【０５１２】
本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子を使用し、当業者に既知の従来からある免疫組織学法を用い、生体サンプルのタンパク質濃度をアッセイすることができる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照）。タンパク質の発現を検出するのに有用な他の抗体に基づく方法としては、酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のような免疫アッセイが挙げられる。好適な抗体アッセイ用標識は、当該技術分野で既知であり、酵素標識、例えば、グルコースオキシダーゼ；放射性同位体、例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）およびテクネチウム（９９Ｔｃ）；発光標識、例えばルミノール；蛍光標識、例えば、フルオレセインおよびローダミン、およびビオチンが挙げられる。好適なアッセイは、本明細書の他の箇所で詳細に説明する。
【０５１３】
本発明のある態様は、動物（好ましくは、哺乳動物、最も好ましくは、ヒト）において、異常なＩＧＦ−１Ｒ発現に関連する過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害をインビボで検出するか、または診断する方法である。ある実施形態では、診断は、（ａ）対象に、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する本発明の結合分子を標識化したものを有効量投与する工程（例えば、非経口、皮下、または腹腔内）と、（ｂ）投与した後に、標識された結合分子が、対象において、ＩＧＦ−１Ｒを発現する場所に優先的に濃縮することが可能なように（そして標識された分子のうち、結合していないものがバックグラウンド濃度にまで排泄されることが可能なように）、所定時間待つ工程と、（ｃ）バックグラウンド濃度を決定する工程と、（ｄ）対象において、標識された分子を検出する工程とを含み、標識された分子が、バックグラウンド濃度よりも高濃度で検出されることは、その対象が、ＩＧＦ−１Ｒの異常な発現に関連する特定の疾患または障害を患っていることを示す。バックグラウンド濃度は、標識された分子の検出量と、特定の系ですでに決定した標準的な値とを比較する方法を含む、種々の方法によって決定することができる。
【０５１４】
対象の体の大きさ、および使用する造影システムによって、診断用画像を得るのに必要な造影部分の量が決まることは、当該技術分野で理解されるであろう。放射性同位体部分の場合、ヒト対象では、注入する放射能の量は、通常は、例えば、９９Ｔｃを５〜２０ｍＣｉである。標識された結合分子（例えば、抗体または抗体フラグメント）は、特定のタンパク質を含有する細胞の所定位置に優先的に蓄積する。インビボでの腫瘍の造影は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ａｎｄ  Ｂ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｄｓ．、Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２）に記載されている。
【０５１５】
使用する標識の種類および投与態様を含むいくつかの変数によって変わるが、投与後に、標識された分子が対象の所定部位で優先的に濃縮されるのにかかる時間、標識された分子のうち、結合していない分子がバックグラウンド濃度まで戻るのにかかる時間は、６〜４８時間、または６〜２４時間、または６〜１２時間である。別の実施形態では、投与後の時間間隔は、５〜２０日、または７〜１０日である。
【０５１６】
標識された分子の存在は、インビボスキャニングの分野で既知の方法を用い、患者の内部で検出することができる。これらの方法は、使用する標識の種類によって変わる。当業者は、特定の標識を検出するのに適した方法を決定することができる。本発明の診断方法で使用可能な方法およびデバイスとしては、限定されないが、コンピュータ断層造影法（ＣＴ）、陽電子放射断層法（ＰＥＴ）、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）および超音波造影法のような全身スキャンが挙げられる。
【０５１７】
特定の実施形態では、結合分子は、放射性同位体で標識されており、放射線に応答する手術装置を用い、患者内部で検出する（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態では、結合分子は、蛍光化合物で標識されており、蛍光に応答するスキャン装置を用い、患者内部で検出する。別の実施形態では、結合分子は、陽電子を発生する金属で標識されており、陽電子発生トモグラフィーを用いて患者内部で検出される。さらに別の実施形態では、結合分子は、常磁性標識で標識されており、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）を用いて患者内部で検出される。
【０５１８】
ＩＧＦ−１Ｒの発現をインビボで造影するための抗体の標識またはマーカーとしては、Ｘ線造影、核磁気共鳴映像法（ＮＭＲ）、ＭＲＩ、ＣＡＴ−スキャンまたは電子スピン共鳴造影法（ＥＳＲ）で検出可能なものが挙げられる。Ｘ線造影の場合、好適な標識としては、バリウムまたはセシウムのような放射性同位体が挙げられ、これらの同位体は、検出可能な放射線を発生するが、対象にとって明らかに有害なものではない。ＮＭＲおよびＥＳＲに好適なマーカーとしては、検出可能な特徴的なスピンを有するもの、例えば、重水素が挙げられ、このマーカーは、関連するハイブリドーマに提供する栄養物を標識することによって、抗体に組み込まれてもよい。ヒトでの診断のために、ＩＧＦ−１Ｒの濃度上昇を検出するためにインビボ造影を用いる場合、本明細書の他の部分で説明したようなヒト抗体または「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましい場合がある。
【０５１９】
上述の例と関連する実施形態では、すでに診断がついた疾患または障害の監視は、その疾患または障害の診断方法のいずれか１つを、例えば、最初の診断から１カ月後、６カ月後、１年後などに繰り返すことによって行われる。
【０５２０】
ある障害（腫瘍を含む）が、従来の方法ですでに診断されている場合、本明細書に開示した検出不法は、予後の指標として有用である。ＩＧＦ−１Ｒの発現量が高い状態が続く患者は、ＩＧＦ−１Ｒの発現量が標準値に近いレベルまで下がっている患者と比較して、臨床結果が悪くなる。
【０５２１】
「腫瘍に関連するＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの発現濃度をアッセイすること」とは、第１の生体サンプルで、直接的に（例えば、全タンパク質レベルを決定するか、または概算することによって）、または相対的に（例えば、第２の生体サンプルの癌に関連するポリペプチド濃度と比較することによって）、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの濃度を定性的または定量的に測定するか、または概算することを意味する。好ましくは、第１の生体サンプルでのＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの発現濃度を測定するか、または概算し、標準的なＩＧＦ−１Ｒポリペプチド濃度と比較し、この標準は、その障害を患っていない個体から得た第２の生体サンプルから得るか、またはその障害を患っていない個体の集合から得た値を平均することによって決定してもよい。当該技術分野で理解されるように、ＩＧＦ−１の「標準」値が既知である場合、比較のために、その値を標準として繰り返し用いてもよい。
【０５２２】
「生体サンプル」とは、個体、細胞株、組織培養物、またはＩＧＦ−１Ｒを発現する可能性がある他の細胞供給源から得た任意の生体サンプルを意味する。ここで示されるように、生体サンプルとしては、体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、およびＩＧＦ−１Ｒを発現する可能性がある他の組織供給源が挙げられる。哺乳動物から組織生検および体液を得る方法は、当該技術分野で周知である。
【０５２３】
さらなる実施形態では、本発明の結合分子を使用し、ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子産物または保存された改変体またはペプチドフラグメントを定量的または定性的に検出することができる。この操作は、例えば、蛍光標識された抗体と、光学顕微鏡、フローサイトメトリーまたは蛍光分析による検出とを組み合わせた、免疫蛍光技術によって達成されてもよい。
【０５２４】
上述の方法を用いて診断および／または予防可能な癌としては、限定されないが、胃癌、腎癌、脳癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌および前立腺癌が挙げられる。
【０５２５】
（Ｘ．免疫アッセイ）
本明細書に開示したＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子を、当該技術分野で既知の任意の方法で、免疫特異的な結合についてアッセイすることができる。使用可能な免疫アッセイとしては、限定されないが、数例を挙げると、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ酵素免疫吸着法、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、相補体固定アッセイ、免疫放射定量測定アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイのような技術を用いる、競合的なアッセイ系および非競合的なアッセイ系が挙げられる。このようなアッセイは、一般的なものであり、当該技術分野で周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｖｏｌ．１（１９９４）を参照。この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。免疫アッセイの例を、以下に簡単に示す（限定する意図はない）。
【０５２６】
免疫沈降プロトコルは、一般的に、細胞の集合を、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を追加したＲＩＰＡバッファ（１％  ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％  ナトリウムデオキシコレート、０．１％  ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％  トラシロール）のような溶解バッファに溶解させる工程と、目的の結合分子を細胞溶解物に加える工程と、４℃で所定時間（例えば、１〜４時間）インキュベートする工程と、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に加える工程と、４℃で約１時間以上インキュベートする工程と、ビーズを溶解バッファで洗浄する工程と、ビーズをＳＤＳ／サンプルバッファに再び懸濁させる工程とを含む。目的の結合分子が特定の抗原を免疫沈降させる能力を、例えば、ウェスタンブロット分析によって評価してもよい。当業者は、抗原に対する結合分子の結合性を高めるように、およびバックグラウンドを下げる（例えば、セファロースビーズを用いて、細胞溶解物をあらかじめきれいにしておく）ようにパラメーターを変えてもよいことを理解するであろう。免疫沈降プロトコルに関するさらなる記載は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｖｏｌ．１（１９９４）の１０．１６．１を参照。
【０５２７】
ウェスタンブロット分析は、一般的に、タンパク質サンプルを調製し、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量によって、８％−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で電気泳動させる工程と、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルから、ニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンのような膜に移す工程と、ブロッキング溶液（例えば、３％  ＢＳＡまたは脱脂乳を含むＰＢＳ）で膜をブロックする工程と、膜を洗浄バッファ（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０）で洗浄する工程と、ブロッキングバッファで希釈した一次結合分子（目的の結合分子）で膜をブロックする工程と、膜を洗浄バッファで洗浄する工程と、酵素基質（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２ｐまたは１２５１）にコンジュゲートした二次結合分子（一次抗体を認識する抗体、例えば、抗−ヒト抗体）をブロッキングバッファで希釈し、この液で膜をブロックする工程と、膜を洗浄バッファで洗浄する工程と、抗原の存在を検出する工程とを含む。当業者は、検出されるシグナルを高めるように、バックグラウンドノイズを減らすようにパラメーターを変えてもよいことを理解するであろう。ウェスタンブロットに関するさらなる記載は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｖｏｌ．１（１９９４）の１０．８．１を参照。
【０５２８】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程と、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングする工程と、検出可能な化合物、例えば、酵素基質（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）にコンジュゲートした目的の結合分子をウェルに加える工程と、所定時間インキュベートする工程と、抗原の存在を検出する工程とを含む。ＥＬＩＳＡでは、目的の結合分子は、検出可能な化合物にコンジュゲートしている必要はなく、その代わりに、検出可能な化合物にコンジュゲートした二次結合分子（目的の結合分子を認識する結合分子）をウェルに加えてもよい。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、結合分子をウェルにコーティングしてもよい。この場合、コーティングされたウェルに目的の抗原を加えた後、検出可能な化合物にコンジュゲートした二次結合分子を加えてもよい。当業者は、検出されるシグナルを高めるように、当該技術分野で既知のＥＬＩＳＡの他の改変例になるようにパラメーターを変えてもよいことを理解するであろう。ＥＬＩＳＡに関するさらなる記載は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１（１９９４）の１１．２．１を参照。
【０５２９】
抗原に対する結合分子の結合親和性、および結合分子−抗原相互作用の解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）は、競合結合アッセイによって決定することができる。競合結合アッセイの例は、標識されていない抗原を多く含む状態で、標識された抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）を、目的の結合分子とともにインキュベートし、標識された抗原に結合した結合分子を検出することを含むラジオイムノアッセイである。特定の抗原に対する、目的の結合分子の親和性および結合解離速度は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット分析によって得たデータから決定することができる。第２の結合分子との競合は、ラジオイムノアッセイを用いて決定してもよい。この場合、抗原を、標識されていない抗原を多く含む状態で、標識された（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）にコンジュゲートした化合物目的の抗体とともにインキュベートする。
【０５３０】
さらに、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子は、癌抗原遺伝子産物またはその保存された改変体またはペプチドフラグメントを系中で検出するために、免疫蛍光法、免疫電子顕微鏡または非免疫アッセイで使用する場合のように、組織学的に使用されてもよい。系中での検出は、組織学的標本を患者から取り出す工程と、この標本に、標識されたＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子を適用する（好ましくは、標識された抗体（またはフラグメント）を生体サンプルの上に置くことによって適用する）工程とによって行われてもよい。この手順を用いることによって、ＩＧＦ−１Ｒタンパク質、またはその保存された改変体またはペプチドフラグメントの存在だけではなく、試験組織での分布も決定することができる。本発明を用いて、当業者は、系中で検出するために、種々の組織学的方法（例えば、染色手順）を改変してもよいことを容易に理解するであろう。
【０５３１】
ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子産物またはその保存された改変体またはフラグメントの免疫アッセイおよび非免疫アッセイは、典型的には、サンプル（例えば、生体液、組織抽出物、集めたばかりの細胞、またはＩＧＦ−１Ｒまたはその保存された改変体またはペプチドフラグメントに結合可能な、検出可能に標識された結合分子が存在する状態で、培地でインキュベートした細胞溶解物）をインキュベートする工程と、当該技術分野で周知のいずれかの技術によって、結合した結合分子を検出する工程とを含む。
【０５３２】
生体サンプルを、固相支持体または担体（例えば、ニトロセルロース）、または細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定可能な他の固体支持体と接触させ、固定させてもよい。次いで、支持体を好適なバッファで洗浄した後、検出可能に標識されたＩＧＦ−１Ｒ特異的な結合分子で処理してもよい。固相支持体を、バッファでもう一度洗浄し、結合していない抗体を除去してもよい。場合により、その後に結合分子を標識する。固体支持体に結合した標識の量を、従来の手段で検出してもよい。
【０５３３】
「固相支持体または担体」とは、抗原または抗体が結合可能な任意の支持体を意味する。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロースおよび改変セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩およびマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のために、ある程度可溶性であってもよいし、不溶性であってもよい。支持体材料は、カップリングした分子が抗原または抗体と結合可能な、任意実際に可能な構造であってもよい。したがって、支持体の構造は、球形（例えばビーズ）であってもよく、円筒形（試験管の内側表面のような形）であってもよく、棒の外側表面のような形であってもよい。あるいは、支持体の表面は、シート状、試験片状などのように、平坦であってもよい。  好ましい支持体としては、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者は、結合分子または抗原を結合させるのに好適な多くの他の担体を知っており、通常の実験によってこれを確認するであろう。
【０５３４】
所与の多くのＩＧＦ−１Ｒ特異的な結合分子の結合活性を、周知の方法で決定してもよい。当業者は、通常の実験によって、操作条件と、操作条件を決定するための最適なアッセイ条件を決定することができる。
【０５３５】
結合分子−抗原相互作用の親和性を測定するのに利用可能な種々の方法が存在するが、速度定数を決定する方法は、比較的少ない。ほとんどの方法は、結合分子または抗原を標識することによる方法であり、必然的に測定方法が複雑になり、定量の際に誤差が出てしまう。
【０５３６】
ＢＩＡｃｏｒｅで行われるような表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、抗体−抗原相互作用の親和性を測定する従来の方法に比べて、以下に示す多くの利点を有する。（ｉ）抗体または抗原を標識する必要がない。（ｉｉ）抗体を前もって精製しておく必要がなく、細胞培養物の上澄みを直接使用することができる。（ｉｉｉ）リアルタイムで測定が可能。異なるモノクローナル抗体の相互作用を迅速に半定量的に比較することができ、多くの評価目的にも十分である。（ｉｖ）二重特異性表面を作成することができ、一連の異なるモノクローナル抗体を、同一条件下で簡単に比較することができる。（ｖ）分析手順が完全に自動化されており、ユーザの手をわずらわせることなく、多くの測定を行うことができる。ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＢ（１９９８に増刷）、ＢＩＡＣＯＲＥコード番号ＢＲ−１００１−８６；ＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＢ（１９９８に増刷）、ＢＩＡＣＯＲＥコード番号ＢＲ−１００１−８４。
【０５３７】
ＳＰＲによる結合試験は、結合対の片方をセンサー表面に固定しておくことが必要である。固定した物質をリガンドと呼ぶ。溶液中に存在する方を検体と呼ぶ。いくつかの場合には、リガンドは、別の固定された分子への結合を介し、センサー表面に間接的に接続する。この別の固定された分子を、捕捉分子と呼ぶ。ＳＰＲの応答は、検体が結合したり、解離したりするときに、検出器表面で質量濃度が変化することを反映している。
【０５３８】
ＳＰＲの原理に基づいて、リアルタイムＢＩＡｃｏｒｅ測定は、発生した相互作用を直接モニタリングする。この技術は、速度パラメーターを決定するのに適している。競合的な親和性の順位付けは、きわめて簡単な操作であり、センサーグラムのデータから、速度および親和性定数を誘導することができる。
【０５３９】
リガンド表面に、検体を何回かに分けて注入する場合、得られたセンサーグラムを、３つの重要な段階に分けることができる。（ｉ）サンプルを注入する際に、検体とリガンドとが会合する段階、（ｉｉ）サンプルを注入する際の、平衡状態または定常状態（この状態では、検体の結合速度は、複合体の解離速度とつりあっている）、（ｉｉｉ）バッファを流している間に、表面から検体が解離する段階。
【０５４０】
会合段階および解離段階からは、検体−リガンド相互作用の速度論に関する情報が得られる（複合体の生成速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）の比率、ｋｄ／ｋａ＝ＫＤ）。平衡段階からは、検体−リガンド相互作用の親和性に関する情報が得られる（ＫＤ）。
【０５４１】
ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアは、数値積分法およびグローバルフィッティングのアルゴリズムを用い、曲線のフィッティングを容易にする包括的なソフトウェアである。単純なＢＩＡｃｏｒｅ観察によって、データを好適に分析し、相互作用の分離速度および親和性定数を得ることができる。この技術で測定可能な親和性の範囲は、ｍＭからｐＭまでの非常に広い範囲である。
【０５４２】
エピトープの特異性は、結合分子の重要な特徴である。ＢＩＡｃｏｒｅを用いたエピトープマッピングは、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡまたは他の表面吸着法を用いた従来の技術とは対照的に、抗体を標識したり、精製したりする必要がなく、一連の数種類のモノクローナル抗体を用いた複数箇所での特異性試験を可能にする。さらに、大量の検体を自動的に処理することができる。
【０５４３】
ペアワイズ結合実験（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）は、２種類のＭＡｂが、同じ抗原に同時に結合する能力を試験する。別個のエピトープに向けられる結合分子は、独立して結合し、同じエピトープまたは密接に関連するエピトープに向けられるＭＡｂは、互いの結合を妨害しあう。このようなＢＩＡｃｏｒｅを用いた結合実験は、実施が簡単である。
【０５４４】
例えば、第１の結合分子に結合する捕捉分子を使用した後、抗原および第２の結合分子を連続して加えてもよい。センサーグラムでは、以下のことが明らかになる。１．どのくらいの量の抗原が第１の結合分子に結合するか、２．第２の結合分子が、表面に接続した抗原にどの程度結合するか、３．第２の結合分子が結合しない場合、ペアワイズ試験の順序を入れ替えると、結果が変わるかどうか。
【０５４５】
ペプチド阻害は、エピトープマッピングに使用する別の技術である。この方法は、ペアワイズ抗体結合試験と協働して使用することができ、抗原の一次配列が分かっている場合に、エピトープの機能と構造とを関連づけることができる。異なる結合分子が、固定された抗原に結合するのを阻害するかについて、ペプチドまたは抗原フラグメントが試験される。所与の結合分子の結合を妨害するペプチドは、この結合分子で規定されるエピトープに構造的に関連していると予想される。
【０５４６】
（ＸＩ．医薬組成物および投与方法）
ＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子を調製する方法、および処置の必要な対象に投与する方法は、周知であり、当業者によって簡単に決定される。結合分子の投与経路は、例えば、経口、非経口であってもよいし、吸入または局所投与によるものであってもよい。非経口という用語は、本明細書で使用するとき、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、または膣内投与を含む。これらのすべての投与形態が、本発明の範囲に含まれることは明らかであるが、１つの投与形態は、注射用溶液、特に静脈注射用または動脈注射用の溶液または液滴となるであろう。通常は、注射に適した医薬組成物は、バッファ（例えば、酢酸バッファ、リン酸バッファまたはクエン酸バッファ）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）を含み得、場合により、安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含んでいてもよい。しかし、本明細書の教示に適合する他の方法で、結合分子を、有害な細胞の集合場所に直接送達し、治療薬が罹患組織に届く量を増やしてもよい。
【０５４７】
非経口投与用製剤は、滅菌の水溶液または非水溶液、懸濁物およびエマルションを含む。非推計溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油）、および注射用の有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルションまたは懸濁物が挙げられる（塩水および緩衝化媒体を含む）。本発明では、医薬的に許容される担体は、限定されないが、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは、０．０５Ｍのリン酸バッファ、または０．８％塩水を含む。他の一般的な非経口ビヒクルとしては、リン酸ナトリウム溶液、Ｒｉｎｇｅｒデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化Ｒｉｎｇｅｒ溶液、または固定油が挙げられる。静脈用ビヒクルとしては、流体および栄養分補給剤、電解質補給剤（例えば、Ｒｉｎｇｅｒデキストロース系のもの）などが挙げられる。防腐剤、および例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤および不活性ガスなどの他の添加物が存在してもよい。
【０５４８】
さらに具体的には、注射に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物、およびその場で滅菌中佐溶液または分散物を調製するための滅菌粉末を含む。このような場合、組成物は、滅菌でなければならず、シリンジで容易に取り扱える程度に流体でなければならない。製造条件下、および貯蔵条件下で、安定でなければならず、好ましくは、細菌類および真菌類のような微生物が混入しないように防腐処理がされている。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体のポリエチレングリコールなど）、ならびにこれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。例えば、レシチンのようなコーティングを使用することによって、分散物の場合には所望の粒径を維持することによって、界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。本明細書で開示した治療方法で使用するのに好適な配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、第１６版（１９８０）に記載されている。
【０５４９】
種々の抗菌剤および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどを用い、微生物の作用を防ぐことができる。多くの場合、等張性薬剤（例えば、糖類、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウム）を組成物に含むことが好ましい。吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物に加えることによって、注射用組成物の吸収を遅らせることができる。
【０５５０】
いかなる場合でも、滅菌注射溶液は、所望な量の適切な溶媒中、活性化合物（例えば、本発明の結合分子）自体を、本明細書に列挙した１つ以上の成分と組み合わせ、必要な場合には、滅菌濾過することによって調製することができる。一般的に、分散物は、活性化合物を滅菌ビヒクルに組み合わせることによって調製され、分散物には、塩基性分散媒体と、上に列挙した必要な他の成分とを含有する。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、減圧乾燥および凍結乾燥であり、活性成分と、あらかじめ滅菌濾過しておいた溶液から得た所望な成分とを含む粉末を得る。注射用製剤を加工し、容器（例えば、アンプル、袋、瓶、シリンジまたはバイアル）に入れ、当該技術分野で既知の方法にしたがって無菌状態で密閉する。  さらに、製剤を包装し、同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２５９，３３７（ＵＳ−２００２−０１０２２０８  Ａ１、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されるようなキットの形態で販売してもよい。このような製造物品には、好ましくは、この組成物が、自己免疫障害または新生物性障害を患う患者、またはこのような障害を患うおそれがあると診断された患者の治療に有用であることを示すラベルまたは添付物が入っていてもよい。
【０５５１】
本明細書に記載の過剰増殖性障害を治療するのに有効な本発明の組成物の投薬量は、投与手段、標的部位、患者の生理的な状態、患者がヒトであるか動物であるか、投薬中の他の医用薬剤、予防であるか治療であるかを含む多くの異なる因子によってさまざまである。通常は、患者はヒトであるが、トランスジェニック動物を含む非ヒト哺乳動物を治療してもよい。治療に使う投薬量は、当業者がよく知っている安全性および効力を最適化する一般的な方法を用いて決めてもよい。
【０５５２】
抗体または抗体フラグメントを用いて過剰増殖性障害を治療する場合、投薬量は、例えば、宿主の体重１ｋｇあたり、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）であり得る。例えば、投薬量は、体重１ｋｇあたり、１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇであってもよく、または１〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであってもよい。上述の範囲に含まれる中間的な値も、本発明の範囲に入ることを意図している。対象に、このような投薬量を毎日、１日おき、週に１回、または経験的な判断によって決定した任意の他の間隔で投与してもよい。治療の例には、長期間にわたる複数回の投与、例えば、少なくとも６カ月にわたる投与も当然含む。治療計画のさらなる例には、２週間に１回、または１カ月に１回、または３〜６カ月に１回の投与も含む。投薬計画の例としては、１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇを毎日連続投与、３０ｍｇ／ｋｇを１日おきに投与、または６０ｍｇ／ｋｇを週に１回投与する計画も含まれる。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与されるそれぞれの抗体の投薬量は、上に記載の範囲内である。
【０５５３】
本明細書に開示したＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子を、複数回投与してもよい。１種類の投薬の間隔は、週に１回、月に１回、または年に１回であってもよい。投薬間隔は、不規則であってもよく、患者の標的ポリペプチドまたは標的分子の血中濃度を測定することによって調整してもよい。いくつかの方法では、投薬量は、血漿ポリペプチド濃度が１〜１０００μｇ／ｍｌになるように、いくつかの場合、２５〜３００μｇ／ｍｌになるように調節する。あるいは、結合分子を徐放性配合物として投与してもよい。この場合、必要とされる投与頻度はより少なくなる。投薬量および投薬頻度は、患者における抗体の半減期によって変わる。結合分子の半減期は、安定なポリペプチドまたは安定な部分（例えば、アルブミンまたはＰＥＧ）に融合させることによって長できる。一般的に、ヒト化抗体は、半減期が最も長く、次いでキメラ抗体および非ヒト抗体である。ある実施形態では、本発明の結合分子は、コンジュゲートしていない形態で投与されてもよい。別の実施形態では、本明細書に開示した方法で使用する結合分子は、コンジュゲートした形態で複数回投与されてもよい。さらに別の実施形態では、本発明の結合分子は、コンジュゲートしていない形態で投与し、次いでコンジュゲートしている状態で投与してもよいし、逆の順序で投与してもよい。
【０５５４】
投薬量および投薬頻度は、治療であるか予防であるかによっても変わり得る。予防用途の場合、抗体またはその混合物を含む組成物を、まだその疾患の症状が出ていない、または前症状患者に投与し、その疾患への抵抗力をつける。このような場合の量は、「予防に効果的な投薬量」と定義される。この用途でも、正確な量は、患者の健康状態および全身の免疫状態によって変わるが、一般的には、１回の投薬あたり０．１〜２５ｍｇであり、特に、１回の投薬あたり０．５〜２．５ｍｇである。長期間にわたって、比較的不定期に、比較的少ない量を投与する。中には、残りの人生ずっと患者に投与し続ける場合もある。
【０５５５】
治療用途の場合、比較的多い量（例えば、結合分子（例えば、抗体）を１回の投薬あたり約１〜４００ｍｇ／ｋｇ、放射線免疫複合体の場合、５〜２５ｍｇ、細胞毒−薬物コンジュゲート分子の場合には、これより多い量）を比較的短い間隔で、疾患の進行が遅くなるか、または抑えられるまで、好ましくは、患者が疾患の症状が部分的または完全に軽快したと申告するまで、必要な回数投与する必要がある場合がある。その後、予防計画に沿って患者に投与してもよい。
【０５５６】
ある実施形態では、対象を、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントをコードする核酸分子（例えば、ベクターに入っている）で治療してもよい。ポリペプチドをコードする核酸の投薬量は、患者あたり、ＤＮＡ約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇである。感染ウイルスベクターの投薬量は、１回の投薬あたり、ビリオンを１０〜１００、またはそれ以上である。
【０５５７】
治療薬を、予防および／または治療のために、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、経鼻または筋肉に投与してもよい。いくつかの方法では、ＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞が集まっている特定の組織に薬剤を直接注射する（例えば、頭蓋内注射）。抗体を投与する場合、筋肉内注射または静脈内注射が好ましい。いくつかの方法では、特定の治療用抗体を、頭蓋に直接注射する。いくつかの方法では、抗体を徐放性組成物または徐放性デバイスとして投与する（例えば、ＭｅｄｉｐａｄＴＭデバイス）。
【０５５８】
ＩＧＦ−１Ｒ結合分子は、場合により、治療（例えば、予防または治療）の必要な障害または状態に有効な他の薬剤と組み合わせて投与される。
【０５５９】
９０Ｙ標識した結合ポリペプチドの効果的な１回の投薬量（すなわち、治療に有効な量）は、約５〜約７５ｍＣｉ、さらに好ましくは約１０〜約４０ｍＣｉである。１３１Ｉ標識した抗体を、骨髄を切除しないで投薬する１回の有効投薬量は、約５〜約７０ｍＣｉ、さらに好ましくは約５〜約４０ｍＣｉである。骨髄を切除して投薬する場合（すなわち、骨髄の自己移植が必要な場合）の、１３１Ｉ標識した抗体の有効投薬量は、約３０〜約６００ｍＣｉ、さらに好ましくは約５０〜約５００ｍＣｉ未満である。キメラ抗体と組み合わせる場合、対応するマウス抗体よりも血中半減期が長いため、１３１Ｉ標識したキメラ抗体を、骨髄を切除しないで投薬する１回の有効投薬量は、約５〜約４０ｍＣｉ、さらに好ましくは、約３０ｍＣｉ未満である。例えば、１１１Ｉｎ標識の造影基準は、典型的には、約５ｍＣｉ未満である。
【０５６０】
１３１Ｉおよび９０Ｙについてきわめて多くの臨床例が得られているが、他の放射性標識も当該技術分野で知られており、同様の目的で使用される。さらなる他の放射性同位体も造影に使用される。例えば、本発明の範囲で適合するさらなる放射性同位体としては、限定されないが、１２３Ｉ、１２５Ｉ、３２Ｐ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１Ｋｒ、８７Ｓｒ、１１３Ｉｎ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２２５Ａｃ、２１１Ａｔおよび２１３Ｂｉが挙げられる。この観点で、α放射体、γ放射体およびβ放射体のいずれも本発明に適している。さらに、本開示の観点から、当業者は、過度の実験をすることなく、選択した一連の治療にどの放射性核種が適しているのかを簡単に決定することができるであろう。この目的のために、臨床診断で既に使用されているさらなる放射性核種としては、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａおよび１１１Ｉｎが挙げられる。標的への免疫治療で使用するために、種々の放射性核種で抗体を標識する（Ｐｅｉｒｅｒｓｚら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６５：１１１−１２５（１９８７））。これらの放射性核種としては、あまり頻度は高くないが、１８８Ｒｅおよび１８６Ｒｅ、および１９９Ａｕおよび６７Ｃｕが挙げられる。  米国特許第５，４６０，７８５号は、このような放射性同位体に関するさらなるデータを提供しており、この内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０５６１】
本明細書に開示したＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子を、コンジュゲートした形態で使用するか、またはコンジュゲートしていない形態で使用するかによらず、本発明の主な利点は、この化合物を骨髄抑制状態の患者、特に、放射線治療または化学療法のような補助療法を受けているか、または過去に受けた患者に使用可能であることが理解されるであろう。すなわち、この分子が、有益な送達プロフィールを有しているため（すなわち、血清残存時間が比較的短い、結合親和性が高い、局所性が高い）、骨髄予備能が低い患者および骨髄毒性に感受性が高い患者を治療するのに特に有用である。この観点から、この分子が固有の送達プロフィールを有しているため、骨髄抑制状態の癌患者に対し、放射能標識したコンジュゲートを投与することがきわめて有効である。このように、本明細書で開示したＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子は、外部からの放射線照射または化学療法のような補助療法を過去に受けた患者に、コンジュゲートしている形態またはコンジュゲートしていない形態で有用である。他の好ましい実施形態では、本発明の結合分子（コンジュゲートしている形態またはコンジュゲートしていない形態）を、化学治療薬を用いた化学療法との組み合わせ治療で使用してもよい。当業者は、このような治療計画で、開示した抗体または他の結合分子と、１つ以上の化学治療薬とを連続的に、同時に、一緒に、またはともに投与すしてもよい。本発明のこの態様で特に好ましい実施形態は、放射能標識した結合ポリペプチドの投与を含む。
【０５６２】
ＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子を前段落で説明したように投与することができるが、他の実施形態では、コンジュゲートしているか、またはコンジュゲートしていない結合分子を、第１の治療薬として、それ以外の健康な患者に投与してもよいことを強調しておく。このような実施形態では、結合分子を、骨髄予備能が正常または平均的な患者、および／または外部からの放射線照射または化学療法のような補助療法を受けたことがなく、現在受けていない患者に投与してもよい。しかし、上述のように、本発明の所定の実施形態は、骨髄抑制状態の患者に、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントを投与する工程、または放射線治療または化学療法のような１つ以上の補助療法と組み合わせて、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子を投与する（すなわち、組み合わせ治療）工程を含む。本明細書で使用するとき、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子を、補助療法とあわせて、または補助療法と組み合わせて投与するとは、補助療法の投与または適用と、開示した結合分子の投与または適用とを連続的に、同時に、一緒に、またはともに行うことを意味する。当業者は、組み合わせ治療の種々の要素の投与または適用を、全体的な治療が有効に働くように時間を調節してもよいことを理解するであろう。例えば、本明細書に記載の放射免疫複合体を投与してから数週間以内に、化学治療薬を、標準的な、周知の一連の治療形態で投与してもよい。逆に、細胞毒にコンジュゲートした結合分子を、静脈内投与した後、腫瘍部位に局所的に外側から放射線を照射してもよい。さらに他の実施形態では、１回の通院で、結合分子を、１つ以上の選択した化学治療薬と同時に投与してもよい。当業者（例えば、経験豊富な癌専門医）は、選択した補助療法および本明細書の教示に基づいて、過度な実験をすることなく、有効な組み合わせ治療計画を作ることができる。
【０５６３】
この観点で、結合分子（細胞毒を含んでいても、含んでいなくてもよい）と、化学治療薬との組み合わせを、患者にとって有益な治療になるように、任意の順序、任意の期間で投与してもよい。すなわち、化学治療薬と、ＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子とを、任意の順序で、または同時に投与してもよい。所定の実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子を、すでに化学療法を受けた患者に投与する。さらに他の実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体を、化学治療薬を用いた治療と実質的に同時に、または同時に投与する。例えば、患者は、化学療法を受けている最中に、結合分子を摂取してもよい。好ましい実施形態では、結合分子を、任意の化学治療薬または治療から１年以内に投与する。他の好ましい実施形態では、ポリペプチドを、任意の化学治療薬または治療から１０カ月、８カ月、６カ月、４カ月、または２カ月以内に投与する。さらに他の好ましい実施形態では、結合分子を、任意の化学治療薬または治療から４週間、３週間、２週間、または１週間以内に投与する。さらに他の実施形態では、結合分子を、任意の化学治療薬または治療から５日、４日、３日、２日または１日以内に投与する。２種類以上の薬剤または治療を、数時間以内または数分以内（すなわち、実質的に同時に）患者に投与してもよいことも理解されるであろう。
【０５６４】
さらに、本発明によれば、骨髄抑制状態の患者とは、血球数が低下している任意の患者も意味する。当業者は、骨髄抑制状態の臨床的な指標として従来から使用してきたいくつかの血球数のパラメーターが存在し、患者がどの程度の骨髄抑制状態にあるかを簡単に測定することができることを理解するであろう。骨髄抑制状態の測定法として受け入れられている方法の例は、Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｃｏｕｎｔ（ＡＮＣ）または血小板の計測法である。このような骨髄抑制状態または部分的な骨髄抑制状態は、種々の生化学的な障害または疾患の結果として起こることもあり、化学療法または放射線治療の結果として起こることが多い。この観点で、当業者は、一般的な化学療法を受けた患者で、典型的には、骨髄予備能が低下するということを理解するであろう。上述のように、このような対象は、死亡率や罹患率を高める貧血または免疫抑制状態といった受け入れられない副作用のために、最適量の細胞毒（すなわち、放射性核種）を用いて治療することができない場合が多い。
【０５６５】
より具体的には、コンジュゲートされたか、またはコンジュゲートされていない本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体結合分子を使用し、ＡＮＣが約２０００／ｍｍ３未満、または血小板数が１５０，０００／ｍｍ３未満の患者を有効に治療することができる。さらに好ましくは、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子を使用し、ＡＮＣが約１５００／ｍｍ３未満、または約１０００／ｍｍ３未満、さらに好ましくは約５００／ｍｍ３未満の患者を有効に治療することができる。同様に、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子を使用し、血小板数が約７５，０００／ｍｍ３未満、または約５０，０００／ｍｍ３未満、さらに約１０，０００／ｍｍ３未満の患者を有効に治療することができる。さらに一般的な意味で、当業者は、患者が骨髄抑制状態にある場合、政府の実施ガイドラインおよび手順を用い、容易に決定することができる。
【０５６６】
上述のように、多くの骨髄抑制状態の患者は、化学療法、移植による放射線治療または外部からの放射線治療を含む一連の治療を受けている。外部からの放射線治療の場合、この外部の放射線源は、悪性細胞に局所的に照射するものである。移植による放射線治療の場合、手術によって、放射性試薬を悪性細胞に入れ、疾患部位に選択的に照射する。いかなる場合でも、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子を使用して、原因にかかわらず、骨髄抑制状態を示す患者の障害を治療することができる。
【０５６７】
この観点では、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子を、任意の化学治療薬または薬剤と合わせて、または組み合わせて使用し（例えば、組み合わせ治療計画を提供し）、インビボで新生物細胞の成長を止めるか、成長を遅らせるか、成長を阻害するか、または成長を制御してもよいことも理解されるであろう。上述のように、このような薬剤は、骨髄予備能を低下させることが多い。このような患者の新生物を積極的に治療可能な利点を有する本発明の化合物の骨髄毒性を減らすことによって、骨髄予備能の低下を、全体的または部分的に相殺し得る。他の実施形態では、本明細書に開示した、放射能標識した免疫複合体を、放射性核種に対する新生物細胞の感受性を高める放射線増感剤として有効に使用することができる。例えば、放射能標識した結合分子が、血流にほとんど存在しなくなった後、腫瘍部位には治療に有効な濃度でとどまっている時点で、放射線増感剤を投与してもよい。
【０５６８】
本発明のこのような態様では、本発明に適合する化学治療薬の例としては、アルキル化剤、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、プロカルバジン、メトトレキサートおよびプレドニゾンが挙げられる。これらの４種類の薬物の組み合わせであるＭＯＰＰ（メクレタミン（ｍｅｃｈｌｅｔｈａｍｉｎｅ）（ナイトロジェンマスタード）、（オンコビン）、プロカルバジンおよびプレドニゾン）は、さまざまなリンパ腫を治療するのにきわめて有効であり、本発明の好ましい実施形態を成す。耐ＭＯＰＰ性の患者では、ＡＢＶＤ（例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ））、ＣｈｌＶＰＰ（クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）、ＣＡＢＳ（ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ））、ＭＯＰＰ＋ＡＢＶＤ、ＭＯＰＰ＋ＡＢＶ（ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびビンブラスチン）またはＢＣＶＰＰ（カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、シクロホスファミド、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）の組合せが使用できる。Ａｒｎｏｌｄ  Ｓ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｅ  Ｍ．Ｎａｄｌｅｒ，Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７７４−１７８８（Ｋｕｒｔ  Ｊ．Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒら編、第１３版、１９９４）およびＶ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１５：８６７−８６９（１９９７）、および標準的な投薬および計画に関する引用文献。これらの治療をそのまま用いてもよいし、本発明の１つ以上のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体または免疫特異的なフラグメントと組み合わせて、特定の患者の必要に応じて変更して使用してもよい。
【０５６９】
本発明において有用なさらなる治療法は、シクロフォスファミドもしくはクロラムブシルのような単一のアルキル化剤、またはＣＶＰ（シクロフォスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）、ＣＨＯＰ（ＣＶＰおよびドキソルビシン）、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロフォスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）、ＣＡＰ−ＢＯＰ（ＣＨＯＰ＋プロカルバジンとブレオマイシン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（ＣＨＯＰ＋メトトレキサート、ブレオマイシンおよびロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ））、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、エトポシドおよびロイコボリン＋標準的ＭＯＰＰ）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキサートおよびロイコボリン）およびＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、ビンクリスチン、固定服用量プレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）などの組合せの使用を含む。当業者は上述のそれぞれの治療法について容易に標準的な投薬量および投薬計画を決定できるであろう。ＣＨＯＰは、ブレオマイシン、メトトレキサート、プロカルバジン、ナイトロジェンマスタード、シトシンアラビノシッドおよびエトポシドと組み合わせても用いられている。他の適合する化学療法剤としては、限定されないが、２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ）、２’−デオキシコフォルマイシンおよびフルダラビンが挙げられる。
【０５７０】
悪性度が中程度から高度の患者については、寛解していないか、または再発している場合、サルベージ治療が使用される。サルベージ治療は、シトシンアラビノシド、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシドおよびイホスファミドなどの薬剤を単独で、または組み合わせて使用する。ある種の新生物障害の再発した形態または進行中の形態では、以下のプロトコルを使用することが多い。ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メトトレキサートおよびエトポシド）、ＭＩＭＥ（メチル−ギャグ（ｍｅｔｈｙｌ−ｇａｇ）、イホスファミド、メトトレキサートおよびエトポシド）、ＤＨＡＰ（デクサメタゾン、高用量シタラビンおよびシスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレディゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｉｓｏｌｏｎｅ）、ＨＤシタラビン、シスプラチン）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロフォスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾンおよびブレオマイシン）、およびＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビンおよびプレドニゾン）。いずれも、周知の投薬速度および投薬計画で行う。
【０５７１】
本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子と組み合わせて使用する化学治療薬の量は、対象によってさまざまであり、または当該技術分野で知られている方法にしたがって投与されてもよい。  例えば、Ｂｒｕｃｅ  Ａ  Ｃｈａｂｎｅｒら、Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １２３３−１２８７（Ｊｏｅｌ  Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎら編、第９版（１９９６）を参照）。
【０５７２】
別の実施形態では、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子を、生物製剤と組み合わせて投与する。癌治療に有用な生物製剤は、当該技術分野で知られており、本発明の結合分子を、例えば、このような既知の生物製剤と組み合わせて投与してもよい。
【０５７３】
例えば、ＦＤＡは、乳癌の治療に、以下の生物製剤を承認している。ハーセプチン（Ｒ）（トラスツズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州南サンフランシスコ；ＨＥＲ２陽性の乳癌において抗腫瘍活性を有するヒト化モノクローナル抗体）；Ｆａｓｌｏｄｅｘ（Ｒ）（フルベストラント、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ（デラウエア州ウィルミントン）；乳癌治療に使用するエストロゲン受容体アンタゴニスト）；Ａｒｉｍｉｄｅｘ（Ｒ）（アナストロゾール、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ；エストロゲンを作るのに必要なアロマターゼをブロックする非ステロイド系アロマターゼ阻害剤）；Ａｒｏｍａｓｉｎ（Ｒ）（エキセメスタン、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．（ニューヨーク州ニューヨーク）；乳癌治療に使用する不可逆性ステロイド系アロマターゼ不活化剤）；Ｆｅｍａｒａ（Ｒ）（レトロゾール、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ニュージャージー州イーストハノーバー）；ＦＤＡが承認した乳癌治療用の非ステロイド系アロマターゼ阻害剤）；およびＮｏｌｖａｄｅｘ（Ｒ）（タモキシフェン、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ；ＦＤＡが承認した乳癌治療用の非ステロイド系抗エストロゲン薬）。本発明の結合分子を組み合わせてもよい他の生物製剤としては、以下のものが挙げられる。ＡｖａｓｔｉｎＴＭ（ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；最初にＦＤＡが承認した、血管形成を阻害するように設計された治療薬）；およびＺｅｖａｌｉｎ（Ｒ）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ（マサチューセッツ州ケンブリッジ；放射能標識したモノクローナル抗体、現時点では、Ｂ細胞リンパ腫の治療薬として承認されている）。
【０５７４】
これに加え、ＦＤＡは、直腸癌の治療に、以下の生物製剤を承認している。ＡｖａｓｔｉｎＴＭ；ＥｒｂｉｔｕｘＴＭ（セツキシマブ、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（ニューヨーク州ニューヨーク）、およびＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ（ニューヨーク州ニューヨーク）；これは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対するモノクローナル抗体である）；Ｇｌｅｅｖｅｃ（Ｒ）（メシル酸イマチニブ；タンパク質キナーゼ阻害剤）；およびＥｒｇａｍｉｓｏｌ（Ｒ）（塩酸レバミゾール、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＬＰ（ニュージャージー州タイタスビル）；ＦＤＡによって１９９０年に承認された免疫修飾物質、Ｄｕｋｅｓ’  ｔａｇｅ  Ｃ結腸癌患者の外科切除後に、５−フルオロウラシルと組み合わせた治療のアジュバントとして）。
【０５７５】
非ホジキンリンパ腫の治療で使用する場合、現時点で承認されている治療薬としては、以下のものが挙げられる。Ｂｅｘｘａｒ（Ｒ）（トシツモマブおよびヨウ素  Ｉ−１３１トシツモマブ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，  ＮＣ；放射能活性分子（ヨウ素Ｉ−１３１）に結合したマウスモノクローナル抗体（トシツモマブ）が関与する多段階治療）；Ｉｎｔｒｏｎ（Ｒ）Ａ（インターフェロンα−２ｂ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニュージャージー州ケニルワース；アントラサイクリンを含有する組み合わせ化学療法（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン［ＣＨＯＰ］）と組み合わせて使用する、小胞非ホジキンリンパ腫の治療で承認されたインターフェロンの一種）；Ｒｉｔｕｘａｎ（Ｒ）（リツキシマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ミナミサンフランシスコ）、およびＢｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）；非ホジキンリンパ腫の治療で承認されたモノクローナル抗体；Ｏｎｔａｋ（Ｒ）（デニロイキンジフチトクス、Ｌｉｇａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）；インターロイキン−２に遺伝的に融合したジフテリア毒素のフラグメントからなる融合タンパク質）；およびＺｅｖａｌｉｎ（Ｒ）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ；Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の治療でＦＤＡが承認した、放射能標識したモノクローナル抗体）。
【０５７６】
白血病の治療で使用する場合、本発明の結合分子と組み合わせて使用可能な生物製剤の例としては、以下のものが挙げられる。Ｇｌｅｅｖｅｃ（Ｒ）；Ｃａｍｐａｔｈ（Ｒ）−１Ｈ（アレムツズマブ、Ｂｅｒｌｅｘ  ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニアシュウリッチモンド）；慢性リンパ性白血病の治療で使用するモノクローナル抗体の一種）。さらに、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（オブリメルセン、Ｇｅｎｔａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニュージャージー州バークレーヘイツ（Ｂｅｒｋｌｅｙ  Ｈｅｉｇｈｔｓ））；白血病を治療するための開発において、使用可能なＢＣＬ−２アンチセンス治療（例えば、単独で、またはフルダラビンおよびシクロホスファミドのような１つ以上の化学治療薬と組み合わせて）を、特許請求の範囲に記載の結合分子とともに投与してもよい。
【０５７７】
肺癌を治療する場合、生物製剤の例としては、ＴａｒｃｅｖａＴＭ（エルロチニブＨＣＬ、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（ニューヨーク州メルビル）；ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）の経路を標的とするように設計された小分子）が挙げられる。
【０５７８】
多発性骨髄腫を治療する場合、生物製剤の例としては、Ｖｅｌｃａｄｅ（Ｒ）Ｖｅｌｃａｄｅ（ボルテゾミブ、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）；プロテアソーム阻害剤）が挙げられる。さらなる生物製剤としては、Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄ（Ｒ）（サリドマイド、Ｃｌｅｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニュージャージー州ウォレン）；免疫修飾剤、骨髄腫細胞の成長および生存を阻害する能力、抗血管形成能力を含む複数の作用を有すると考えられている）が挙げられる。
【０５７９】
他の生物製剤の例としては、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ニューヨーク州ニューヨーク）で開発されたＭＯＡＢ  ＩＭＣ−Ｃ２２５が挙げられる。
【０５８０】
すでに記載したように、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子またはその組み合わせを、哺乳動物の過剰増殖性障害をインビボで治療するための医用薬剤として有効な量で投与してもよい。この観点で、開示した結合分子を、投与しやすく、活性薬剤の安定性を高めるように配合してもよいことが理解されるであろう。好ましくは、本発明の医薬組成物は、医用薬剤として許容される、毒性のない滅菌担体（例えば、生理食塩水、非毒性バッファ、防腐剤など）を含む。本発明の適用のために、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子、またはその組み換え体の医用薬剤（コンジュゲートしていない状態で、または治療薬とコンジュゲートした状態）として有効な量とは、標的に有効に結合させ、利益を得る（例えば、疾患または障害の症状を軽減し、または基質または細胞を検出する）のに十分な量である。腫瘍細胞の場合、結合分子は、好ましくは、新生物細胞または免疫反応性細胞（例えば、新生物細胞に関連する血管細胞）で、所定の免疫反応性の抗原と相互作用し、これらの細胞の死滅率を高めることができる。もちろん、本発明の医薬組成物を、医用薬剤として有効量の結合分子を提供するような用量で、１回または複数回投与してもよい。
【０５８１】
本開示の範囲内で、本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な結合分子を、治療効果または予防効果を得るのに十分な量で、上述の治療方法にしたがって、ヒトまたは他の動物に投与することができる。本発明のＩＧＦ−１Ｒに特異的な抗体結合分子を、既知の技術に従って、本発明の抗体と、従来の医薬的に許容される担体または希釈剤とを混合することによって調製される従来の投薬形態で、ヒトまたは他の動物に投与することができる。医薬的に許容される担体または希釈剤の形態および性質が、組み合わせる活性成分の量、投与経路および他の周知の変数によって示されることを、当業者は理解するであろう。当業者は、本発明の１種以上の結合分子を含む混合物が、特に有効であると判明し得ることも理解するであろう。  
【０５８２】
本発明の実施は、他の意味であると示されていない限り、細胞生物学、細胞培養学、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の一般的な技術を利用しており、これらの技術は、当該技術分野の専門技術の範囲内である。このような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｍａｎｉａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編（１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；論文Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ、Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕら編）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ、Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編（１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８６）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）を参照。
【０５８３】
抗体の遺伝子操作に関する一般的な原理は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版、Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に記載されている。タンパク質の遺伝子操作に関する一般的な原理は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．ら編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．（１９９５）に記載されている。抗体および抗体−ハプテン結合の一般的な原理は、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ（１９８４）；およびＳｔｅｗａｒｄ，Ｍ．Ｗ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，（ニューヨーク州ニューヨーク）（１９８４）に記載されている。さらに、当該技術分野で既知の免疫学の標準的な方法、および特定的にではなく記載されている方法は、一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓら（編）、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ−Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）  ａｎｄ  Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（編）、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）に記載されている。
【０５８４】
免疫学の一般的な原理を記載している標準的な参考文献としては、以下のものが挙げられる。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．ら編、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｂｕｒｄｅｎ，Ｒ．ら編、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１３、Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４）、Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  ｅｄ．Ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｊ．ＫｉｎｄｔおよびＢａｒｂａｒａ  Ａ．Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ  ＆  Ｃｏ．（２０００）；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．、Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，Ｊ．およびＭａｌｅ  Ｄ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６ｔｈ  ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ（２００１）；Ａｂｂａｓ  Ａ．、Ａｂｕｌ，Ａ．およびＬｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｅｄ．５、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）；ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｎ（２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ（２００３）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）。
【０５８５】
上に引用した参考文献、およびそこに引用されている参考文献はすべて、その内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。さらに、本発明のさらなる態様を、配列リスト部分および図面に記載している。
【実施例】
【０５８６】
（実施例１  Ｍ１３．Ｃ０６抗体は、他の阻害性の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体とは別個のエピトープを認識する）
交差競合による抗体結合試験を行い、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙのＩＧＦ−１Ｒ抗体結合エピトープと、他のＩＧＦ−１Ｒ抗体とを比較した。Ｓｅｅ，  Ｆｉｇｕｒｅ  １１．    Ｕｎｌａｂｅｌｅｄ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｅｒｅ  ａｎａｌｙｚｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ  ｗｉｔｈ  ｆｉｖｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌａｂｅｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＩＧＦ−１Ｒ．使用した５種類の標識された抗体は、ビオチン標識されたＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（「Ｂｉｏｔｉｎ−Ｃ０６」）、ビオチン標識されたＭ１４−Ｇ１１（「Ｂｉｏｔｉｎ−Ｇ１１」）、ゼノン標識したＰ１Ｂ１０−１Ａ１０（「Ｚｅｎｏｎ−Ｏ」）、ゼノン標識した２０Ｃ８−３Ｂ４（「Ｚｅｎｏｎ−Ｍ」）またはゼノン標識したＩＲ３抗体（「Ｚｅｎｏｎ−ＩＲ３」）であった。図１１を参照。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（番号２１３３５）製ビオチン化キットで、抗体をビオチンで標識した。ゼノン標識は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製ＺｅｎｏｎマウスＩｇＧ標識キット（Ｚ２５０００）で行った。
【０５８７】
この分析結果から、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体およびＭ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、ＩＧＦ−１Ｒの同じ領域または類似した領域に結合し、試験したすべての他の抗体とは異なっていることが分かる。特に、ビオチン標識されたＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、標識されていないＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙまたは標識されていないＭ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙがＩＧＦ−１Ｒに結合するのと、効果的に競合した。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、十分に研究され尽くしたＩＲ３抗体とは交差競合しないことも注目に値する。したがって、この２種類の抗体は、特に、異なるＩＧＦ−１Ｒエピトープに結合する。
【０５８８】
（実施例２  Ｍ１３．Ｃ０６抗体が、ＦｎＩＩＩ−１ドメインのＮ末端に結合し、ＩＧＦ−１Ｒに対する、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の結合親和性をアロステリック効果によって低下させる）
ａ．方法：
ｉ．Ｍ１３−Ｃ０６抗体存在下、および非存在下での、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒの結合実験
数種類の構築物を使用し、ＩＧＦ−１Ｒ受容体またはインスリン受容体、ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−９０２）−Ｈｉｓ１０（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０と示されている、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ製）、ヒトＩＮＳＲ（２８−９５６）−Ｈｉｓ１０（ＩＮＳＲと示されている、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ製）、ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）−Ｆｃ（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃと示されている、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ製）、ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃ（ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃと示されている、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ製）およびマウスＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）−Ｆｃ（ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃと示されている、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ製）に対する抗体／ＩＧＦ−１の結合を観察した。「Ｈｉｓ１０」は、構築物のＣ末端に１０のヒスチジン残基タグがあることを示している。「Ｆｃ」は、Ｃ末端にあるヒトＩｇＧ１−Ｆｃ  タグを示す。
【０５８９】
ヒトＩＧＦ−１をＭｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用い、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１の親和性を決定した。ビオチン標識した抗−Ｈｉｓ  Ｔａｇ抗体（ビオチン−ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ  カタログ番号３４４４０）を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＡチップ（カタログ番号ＢＲ−１０００−３２）表面にＨＢＳ−ＥＰバッファとともに５００ｎＭで注入し、飽和状態で固定した。それぞれのセンサーグラムで、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０を、ビオチン−ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ表面に４０ｎＭタンパク質２０μＬを２μＬ／分で注入し、捕捉した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０を注入した後、流速を２０μＬ／分まで上げた。ＩＧＦ−１を含有する注入液１３０μＬを再び注射し、成長ホルモンとこの受容体との相互作用を観察した。ＩＧＦ−１を６４ｎＭから０．４ｎＭまで段階的に希釈して、濃度に依存する結合速度曲線を作成した。それぞれの注入後に、１０ｍＭアセテート（ｐＨ４．０）を２０μＬ／分で３回、１０μＬ注入して再生した。それぞれの曲線について、リファレンスは、（１）ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ抗体を加えない状態で、ストレプトアビジン表面で得たデータと、（２）１回目にｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０を注入した後、ＨＢＳ−ＥＰバッファを２回目に注入するときに得たデータの２つであった。ＩＧＦ−１の一連の濃度は、製造業者のＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアに入っている１：１結合モデルに合わせた。２セットのデータを得た。うち１つは、試験バッファ中、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０注入バッファ中、およびＩＧＦ−１注入バッファ中に４００ｎＭ  Ｍ１３−Ｃ０６が存在しない場合、もう１つは、４００ｎＭ  Ｍ１３−Ｃ０６が存在する場合であった。
【０５９０】
ｉｉ．ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒ／Ｍ１３−Ｃ０６抗体の産生分複合体のプルダウン分析およびウェスタンブロット分析
１．５ｍＬのエッペンドルフ管中、プロテインＡ／Ｇビーズ（３００μＬ、Ｐｉｅｒｃｅ  カタログ番号２０４２２）を再び懸濁させ、１×ＰＢＳで洗浄し、１．０ｍｇのＭ１３−Ｃ０６と合わせ、ロータリーシェーカーで、室温で２時間混合した。別の管に、１２μｇのｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）および４６０ｎｇのヒトＩＧＦ−１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  カタログ番号ＧＦ００６）を室温で１時間混合した（タンパク質：タンパク質比率は１：１）。Ｍ１３−Ｃ０６が結合したプロテインＡ／ＧをＰＢＳで洗浄し、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０／ＩＧＦ−１混合物を室温で３０分間インキュベートした。タンパク質が結合したプロテインＡ／ＧをＰＢＳで洗浄した後、結合したタンパク質を１００ｍＭ  グリシン３００μＬ（ｐＨ３．０）で溶出させた。ネガティブコントロールには、１２μｇのヒトＩＧＦ−１Ｒ（１−９０２）−Ｈｉｓ１０を加えなかった。抗−ヒトＩＧＦ−１抗体（ウサギ抗−ヒトＩＧＦ−１ビオチン、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  カタログ番号Ｉ７６６１−０１Ｂ）および抗−ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体（ＩＧＦ−１Ｒα  １Ｈ７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  カタログ番号ｓｃ−４６１）を一次抗体として用い、次いで、ＨＲＰ標識したストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  カタログ番号７１００−０５）およびＨＲＰ標識したヤギ抗−マウスＩｇＧ（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  カタログ番号Ｉ１９０４−４０Ｊ）を二次抗体として用い、上述の溶出したタンパク質をウェスタンブロットで検出した。ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒ／Ｍ１３−Ｃ０６が三成分複合体を形成する能力を示すために、この実験で使用するＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１Ｒの濃度は、これらのタンパク質の通常の生理的濃度（特に血清中のＩＧＦ−１濃度）よりも十分に過剰な濃度にし（１５倍を超える濃度）、ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＧＦ−１の平衡解離定数を測定した。  例えば、Ｈａｎｋｉｎｓｏｎら、１９９７年を参照。
【０５９１】
ｉｉｉ．ＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃの構築、および全長受容体の細胞外領域との競合的な抗体結合試験
ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合領域、ヒトＩＧＦ−１ＲのＬ１−ＣＲ−Ｌ２（残基１〜４６２）の構築方法は、文献で公開されている（ＭｃＫｅｒｎ  １９９７）。この情報を利用し、本願発明者らは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ残基１〜４６２（Ｎ末端にシグナル配列を有する）を、社内のＰＶ９０ベクターにサブクローン化し、全長ヒト細胞外領域（残基１〜９０３、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ）を得た。ＣＨＯでの発現は、文献に記載されている方法を用いて行った（Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙ  ２００３）。ＣＨＯ上澄みを、他のＦｃ−融合タンパク質について文献に記載されているようにプロテインＡ親和性カラムに通し、タンパク質を精製した（Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ２００６）。このタンパク質構築物を、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃと称する。
【０５９２】
Ｍ１３−Ｃ０６抗体、Ｍ１４−Ｃ０３抗体およびＭ１４−Ｇ１１抗体が、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃおよび全長細胞外領域構築物ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに結合する能力を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を用いてＳＰＲで決定した。この装置を２５℃に設定し、試験バッファは、ＨＢＳ−ＥＰ（ｐＨ７．２）（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００１−８８）であった。標準的なＮＨＳ／ＥＤＣ−アミン反応化学を用い、Ｂｉａｃｏｒｅが提供しているプロトコルにしたがって、全ヒト抗体、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｄｅ  ＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐ表面に約１０，０００ＲＵで固定した。固定化のために、抗体を１０ｍＭ  酢酸バッファ（ｐＨ４．０）で約４０μｇ／ｍＬに希釈した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−ＦｃおよびｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃが、それぞれヒト抗体に結合し、解離する相対速度を調べるために、述のＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐ表面に、それぞれの受容体構築物を徐々に濃度を上げながら注入した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの濃度は、１．０ｎＭ〜１００ｎＭであり、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃの濃度は、１．０ｎＭ〜２μＭであった。すべての抗体表面は、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）を用いて信頼性高く再生させた。再生を繰り返しても、いずれの抗体表面も活性低下はみられなかった。流速は、２０μＬ／分であった。
【０５９３】
ｂ．結果
ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２の結合を、Ｍ１３−Ｃ０６が阻害することは、すでに記載した。飽和条件にしても、ほとんどの抗体は、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２がｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに結合するのを、完全には阻害しない。特に、Ｍ１３−Ｃ０６の場合、本願発明者らは、リガンド結合の阻害は、競合的ではなく、アロステリック効果によるものであるという仮説をたてた。この仮説を検証するために、本願発明者らは、４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６抗体存在下（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０の抗体の親和性の約４０００倍を超える濃度）、および非存在下での、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１の親和性を決定した。ＳＰＲを用い、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０を抗−Ｈｉｓ  Ｔａｇ抗体でチップ表面に固定し、ＩＧＦ−１の濃度を増加させて（６４ｎＭまで）注入した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１の結合は、４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６が存在しても存在しなくても明らかであった。（データは示していない。表面プラズモン分解は、ＩＧＦ−１が、４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６が存在しても存在しなくても、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に結合していることを示す）。ＳＰＲ結合時間は、１４００〜１８００秒であり、解離時間は、１８００〜３０００秒であった。Ｍ１３−Ｃ０６が存在しない状態で、ＩＧＦ−１は、ＫＤ＝１７ｎＭ（ｋａ＝２．４×１０−５／Ｍ＊ｓ）でｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に結合した。４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６が存在する状態で、ＩＧＦ−１は、ＫＤ＝５９ｎＭ（ｋａ＝７．１×１０−４／Ｍ＊ｓ）でｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に結合した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１の結合解離定数は、Ｍ１３−Ｃ０６存在下では約１／３倍に低下し、このことは、Ｍ１３−Ｃ０６が、受容体に対するリガンドの親和性をアロステリック効果によって低下させていることを示唆している。
【０５９４】
Ｍ１３−Ｃ０６が、ＩＧＦ−１がｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に結合するのと直接的に競合しないということの証拠は、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１およびＭ１３−Ｃ０６の見かけ親和性よりもかなり高い濃度のＭ１３−Ｃ０６を用い、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０およびＩＧＦ−１を一緒に免疫沈降させることによって得た。ウェスタンブロット分析により、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０と混合したＩＧＦ−１の約７０〜１００％が、Ｍ１３−Ｃ０６と一緒に減っており、このことは、Ｍ１３−Ｃ０６およびＩＧＦ−１が、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０と合わさって三成分複合体を形成することが可能であることを示している（データは示していない）。これらの結果は、通常の血清ＩＧＦ−１濃度で、ＩＧＦ−１の結合をＭ１３−Ｃ０６がアロステリック効果によって阻害することを示しており、Ｍ１３−Ｃ０６の結合部位は、ＩＧＦ−１Ｒリガンド結合ポケットとは重複していないことを示唆している。
【０５９５】
次に、本願発明者らは、Ｍ１３−Ｃ０６が、ＩＧＦ−１Ｒの推定リガンド結合領域（Ｌ１−ＣＲ−Ｌ２）に結合するかどうかを観察した。本願発明者らは、Ｎ末端の３つの領域（残基１〜４６２）が、ＩｇＧ１−Ｆｃに融合している欠失受容体を作成し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用い、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１の結合能力と、全長受容体の細胞外領域構築物ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの結合能力とを比較した。Ｍ１４−Ｇ１１は、上述の欠失受容体に対し、同等の結合性を示したが、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３の結合性は顕著に低下した（データは示していない。ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）ＦｃおよびｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃ欠失体に対する、表面に固定したＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１の結合性を、濃度範囲２□Ｍ、１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭおよび１ｎＭで試験した）。ＳＰＲ結合時間は、４８０〜９６０秒であり、解離時間は、９６０〜１１７０秒であった。Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３の両方で、結合が残っていることは明らかであった。しかし、このデータは、ＩＧＦ−１Ｒ領域にある抗体残基のエピトープのうち、少なくとも良好な一部分が、リガンド結合領域の外側にあることを示唆している。
【０５９６】
結論として、Ｍ１３−Ｃ０６抗体は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを、成長因子結合部位で競合的に相互作用することによってブロックするのではなく、ＦｎＩＩＩ−１に結合し、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２の結合およびシグナル伝達をアロステリック効果によって阻害することが示された。ＦｎＩＩＩ−１は、ＩＧＦ−１ＲおよびＩＮＳＲの受容体ホモダイマー化を促進すると考えられており（ＭｃＫｅｒｎ  ２００６）、リガンドに結合すると、四次構造の変化を経て、活性シグナルが膜貫通領域を通ってＣ末端チロシンキナーゼ領域に伝わる。この実施例で得たデータから、Ｍ１３−Ｃ０６抗体が、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２によって誘発される構造変化を阻害し、その下流にある受容体シグナル伝達を阻害することが示唆される。
【０５９７】
（実施例３．  Ｍ１３．Ｃ０６抗体の予備的なエピトープマッピング）
ａ．方法
ｉ．エピトープマッピング変異  
マウスＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６の結合親和性が、ＢｉａｃｏｒｅおよびＦＲＥＴを用いた結合実験（実施例５（第ＩＩＩ部））において、顕著に低下するか、検出不可能になったという結果に基づいて、ＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６抗体のエピトープの性能を探るために、変異を選択した。マウスＩＧＦ−１ＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとは、一次配列の同一性が９５％である。ヒトＩＧＦ−１Ｒと、ヒトＩＮＳＲは、同一性が５７％である（類似性は７３％）。細胞外ドメインにおいて、マウスＩＧＦ−１ＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとで異なる残基は３３種類である（表５）。これらの残基のうち、ＩＮＳＲ細胞外領域内にある相同性の位置が、最近のＩＮＳＲ結晶構造に基づいて溶媒にさらされる位置であるため、２０残基を変異標的とした（ｐｄｂコードは２ＤＴＧ、ＭｃＫｅｒｎ  ２００６）。接近可能な表面の面積を、プローブ半径１．４Åを用い、ＳｔｒｕｃＴｏｏｌｓ（ｈｔｔｐ：／／ｍｏｌｂｉｏ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｔｒｕｃｔｂｉｏ／ｂａｓｉｃ．ｈｔｍｌ）で算出した。ＩＮＳＲの構造には存在しない４個の残基も突然変異のために選択した。それは、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２の結合にとって重要であることが示されている、ＦｎＩＩＩ−２領域の構造化されていないループ領域に存在するからである（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ２００１；  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ２００４）。エピトープマッピング試験で選択した２４種類の突然変異のリストを表６に示す。
【０５９８】
表５：ヒトＩＧＦ−１ＲとマウスＩＧＦ−１Ｒとのアミノ酸の相違点
各残基の位置での溶媒接近可能性を、相同性のＩＮＳＲ細胞外領域の公的に利用可能な構造に基づいて決定した。太字／イタリックで示した残基は、その表面積のうち、３０％を超える部分が溶媒にさらされていることを示しており、突然変異を生成し、Ｍ１３−Ｃ０６のＩＧＦ−１Ｒエピトープについてスクリーニングした。
2010538012.tif 000018
【０５９９】
ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＴＭ部位特異的変異キットを用い、製造業者のプロトコルにしたがって、野生型ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ  ＰＶ−９０プラスミドを突然変異させることによって、２４種類の変異エピトープマッピングライブラリを構築した。それぞれの変異（または、ライブラリのうち、ＳＤ００４、ＳＤ０１１、ＳＤ０１４、ＳＤ０１６およびＳＤ０１９の場合、２箇所の変異）をＰＶ−９０ベクターに組み込み、これを社内のＤＮＡ配列決定装置で確認した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてプラスミドをｍｉｎｉｐｒｅｐ処理し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−Ｆｒｅｅ  Ｍａｘｉｋｉｔを用いてプラスミドをｍａｘｉｐｒｅｐ処理した。ＰｏｌｙＦｅｃｔトランスフェクションキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、それぞれの変異プラスミド２００μｇをＨＥＫ２９３  Ｔ細胞  １００ｍＬに２×１０６細胞／ｍＬで一過性にトランスフェクトし、可溶性タンパク質を培地に分泌させた。細胞を、ＤＭＥＭ（Ｉｖｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％  ＦＢＳ（低ＩｇＧウシ血清、２０ｍＬのプロテインＡカラムを通すことによって、ウシＩｇＧをさらに減らしたもの）に入れ、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。７日後、１２００ｒｐｍで遠心分離して、それぞれのＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体を含む上澄みを集め、０．２μｍフィルターで濾過した。１．２ｍＬのプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムを１×ＰＢＳで平衡状態にしておき、このカラムに上澄みを通すことによって、それぞれの変異体を親和性精製した。０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ３．０）を用いて、上述のカラムから変異体を溶出させ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−８０で中和し、ＶｉｖａＳｐｉｎ  ６  ＭＷＣＯ  ３０，０００遠心濃縮装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号ＶＳ０６２１）で、体積が約３００μＬになるまで濃縮した。
【０６００】
ｉｉ．ＩＧＦ−１Ｒ変異のウェスタンブロット分析
ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体サンプルを、Ｘｃｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＥＩ０００１）を用い、標準的な製造者のプロトコルにしたがって、４〜２０％  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＥＣ６０２８）で処理した。ｉＢｌｏｔ  Ｄｒｙ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＩＢ１００１）およびＴｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｔａｃｋｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＩＢ３０１０−０１または３０１０−０２）を用い、標準的な製造業者のプロトコルにしたがって、サンプルをニトロセルロースに移した。４℃で、ＰＢＳＴ２５ｍｌおよび脱脂粉乳５ｍｇ／ｍｌ中、膜を一晩ブロックした。ブロックした後、室温で、ＰＢＳＴ  ２５ｍｌで膜を５分間、１回洗浄した。ＰＢＳＴ  １０ｍｌ中、濃度１：１００で一次抗−ＩＧＦ−１Ｒβ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  カタログ番号ｓｃ−９０３８）とともに膜を室温で１時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳＴ  ２５ｍｌで膜を５分間、３回洗浄した。検出のために、ＰＢＳＴ  １０ｍｌ中、濃度１：１０００で、膜をＨＲＰコンジュゲート型ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−Ｆｃ二次抗体（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  カタログ番号Ｉ１９０４−４０Ｊ）とともに室温で１時間インキュベートした。室温で、ＰＢＳＴ  ２５ｍｌで膜を５分間、３回洗浄した後、ＰＢＳＴ  ２５ｍｌで２０分間洗浄した。Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号ＲＰＮ２１０８）を用い、標準的な製造業者のプロトコルにしたがって、タンパク質のバンドを検出した。
【０６０１】
ｉｉｉ．ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体ライブラリのＢｉａｃｏｒｅ分析
ｍＩＧＦ−１Ｒ−ＦｃおよびｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃは両方とも、２箇所の別個のホモダイマー領域（ＩＧＦ−１ＲおよびＩｇＧ１−Ｆｃ）を組み込むことによって、きわめて多価な性質が誘発されたため、上述のＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１のセンサーチップ表面に対し、高い見かけ親和性で結合する。Ｍ１３−Ｃ０６に対するｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの実際の高い結合親和性および、Ｍ１３−Ｃ０６に対するｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの低い結合親和性を区別するために、Ｍ１３−Ｃ０６センサーチップ表面で受容体−Ｆｃ融合物を捕捉した後、可溶性Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂと結合させた。受容体−Ｆｃ構築物を親和性精製し、濃縮したものを６０μＬ、流速１μＬ／分で注入することによって、Ｍ１３−Ｃ０６チップ（上述のように調製）表面で捕捉した。その後、受容体−Ｆｃ結合工程が終了したら、流速を５μＬ／分に上げた。各受容体−Ｆｃ構築物を結合させた後、濃度が１０ｎＭ、３ｎＭおよび１ｎＭのＭ１３−Ｃ０６  Ｆａｂを注入した（５０μＬ）。各センサーグラムが終了したら、流速を３０μＬ／分に上げ、チップ表面に０．１Ｍグリシン（ｐＨ２）を１０μＬ、２回注入することによってチップ表面を再生した。
【０６０２】
ｉｖ．ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体をスクリーニングするための、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ｔｒ−ＦＲＥＴ）アッセイ
変異受容体を、０．２５〜０．５μｇ（２５μＬ）から始めて段階的に希釈し、３８４ウェルマイクロタイタープレート（白色、Ｃｏｓｔａｒ製）中、０．０５μｇ  ＩＧＦ１Ｒ−Ｈｉｓ１０−Ｃｙ５（１２．５μＬ）および０．００３７５μｇ  Ｅｕ：Ｃ０６（１２．５μＬ）と混合した。ＩＧＦ１Ｒ−Ｈｉｓ１０−Ｃｙ５のコンジュゲートレベルは、６．８：１（Ｃｙ５：ＩＧＦ１Ｒ−Ｈｉｓ１０）であり、Ｅｕ−Ｃ０６のコンジュゲートレベルは、１０．３：１（Ｅｕ：Ｃ０６）であった。各サンプルについて、合計体積は５０μＬであった。プレート攪拌器で、プレートを室温で１時間インキュベートした。Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２蛍光プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、ＬＡＮＣＥプロトコルを用い、励起波長３４０ｎｍ、発光波長６６５ｎｍで蛍光を測定した。全データを、１箇所での結合モデルに適合させ、ここから、対応するＩＣ５０値を決定した。
【０６０３】
本願発明者らは、マウスＩＧＦ−１Ｒが、Ｍ１３−Ｃ０６抗体に結合しないことを利用し、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ内のマウス変異のライブラリを設計し、ＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６の結合部位の位置を調べた。試験したｈＩＧＦ−１Ｒの種々の変異箇所を表６に示す。ウェスタンブロット分析を用い、各ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体の発現を確認し、ポジティブコントロールとしてｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ精製物を用い、標準曲線を作成し、各変異タンパク質の相対濃度を概算した（データは示していない）。
【０６０４】
表６：Ｍ１３−Ｃ０６に対するＩＧＦ−１Ｒの結合に対する変異の影響
ＳＤ０１５は、２種類のアッセイ法で、Ｍ１３−Ｃ０６に対する結合性をほとんど示さないか、または全く示さない唯一の残基であったため、太字である。ＮＤ＝判定できず。
2010538012.tif 000019
【０６０５】
ＳＰＲおよびｔｒ−ＦＲＥＴを使用し、ＩＧＦ−１Ｒ−ＦｃがＭ１３−Ｃ０６に結合するのを阻害する変異体をスクリーニングした。ＳＤ０１５変異体を除き、すべてのＩＧＦ−１Ｒ変異構築物が、ＳＰＲ実験で、Ｍ１３−Ｃ０６への結合活性を示すか、またはＭ１３−Ｃ０６  Ｆａｂへの結合活性を示した。図１２、表６を参照、データは示されていない（競合的な阻害分析を用い、標識していないｈＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ（ＳＤＷＴ）、マウスＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ（ｍＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ）および変異ｈＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ構築物の濃度を上げることによって、Ｃｙ５標識したＩＧＦ１Ｒに結合するＥｕ−Ｍ１３−Ｃ０６を交換するための結合曲線を確立した）。
【０６０６】
ｔｒ−ＦＲＥＴを用いて決定したＩＣ５０値およびＳＰＲを用いて決定した相対結合強度には、ウェスタンブロットによる表現および定量化に自然発生する偏差が存在するため、ある程度偏差が存在する。しかし、ＳＤ０１５は、両アッセイでＭ１３−Ｃ０６に対して実質的に結合しなかった唯一の変異体であり、ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃコントロールの結果と匹敵する結果であった。Ｈｉｓ４６４は、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ欠失構築物（すなわち、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃ）のＣ末端に対し、一次アミノ酸配列でＣ末端に位置する２個のアミノ酸である。Ｍ１３−Ｃ０６が、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）欠失体に対する結合活性を残していることは、Ｍ１３−Ｃ０６の結合エピトープが、残基Ｖａｌ４６２−Ｈｉｓ４６４を少なくとも包含するエピトープに結合していることを示唆している。Ｍ１３−Ｃ０６のエピトープは、構造的に独立していないことを示唆する証拠があるため、抗体−エピトープ結合の相互作用に、他の残基も関与していると考えられる。しかし、特に、残基Ｖａｌ４６２およびＨｉｓ４６４は、ＦｎＩＩＩ−１領域の外側表面にある残基であると予想される（図１）。
【０６０７】
Ｍ１３−Ｃ０６エピトープ範囲の特徴（すなわち、４６２−４６４の周囲にあるどの残基が、抗体の結合および活性に重要なのか）を調べる試みにおいて、構造モデリングアプローチを利用した。ヒトＩＧＦ−１Ｒと、ヒトＩＮＳＲとは、同一性が５７％であり（類似性は７３％）、同様の三次構造を有している。タンパク質抗原：抗体結合表面のＸ線結晶構造の以前の分析は、この結果から、平均結合表面が７００Å２（平方オングストローム）であり、結合エピトープからの平均半径が１４Åであることを示唆している（Ｄａｖｉｅｓ  １９９６）。ＩＮＳＲの相同性細胞外領域（ｐｄｂコードは２ＤＴＧ、（ＭｃＫｅｒｎ  ２００６））のＸ線結晶構造を用い、本願発明者らは、ＩＧＦ−１Ｒ残基のＶ４６２からＨ４６４を、ＩＮＳＲの残基Ｌ４７２からＫ４７４に対してマッピングすることにより、残基４６２〜４６４の１４Å以内にあり、ＦｎＩＩＩ−１領域の表面にある残基を算出した。１４Å以内にある任意の原子と原子との距離にカットオフ値を適用し、平均距離は、各曲面パッチにあるそれぞれの残基とＬ４７２およびＬ４７４のＣα−Ｃα距離から算出した。算出した平均距離を、Ｃα−Ｃα距離が１４Åよりも大きい残基については、１４Åであるとし、側鎖は、１４Åのカットオフの範囲内である。Ｍ１３−Ｃ０６の結合および活性にとって重要であると考えられる残基を表７に列挙している。
【０６０８】
表７  Ｍ１３−Ｃ０６の結合および活性にとって重要であると考えられる、ＩＧＦ−１Ｒ内の残基
残基４６２および４６４は、ＩＧＦ−１Ｒ結合エピトープの中心であると予想されるため、イタリックで示している。実験データは、Ｍ１３−Ｃ０６の結合に対する、これらの残基の重要性を示している。
2010538012.tif 000020
【０６０９】
公開されている研究結果は、残基４４０〜５８６を認識する抗体は、ＩＧＦ−１の結合に対し、阻害効果とアゴニスト効果の両方を有することが示し得ることを示している（Ｓｏｏｓ  １９９２、Ｋｅｙｎａｎｆａｒ  ２００７）。４４０〜５８６は、Ｌ２およびＦｎＩＩＩ−１の全体をあらわし、抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体に接近可能な重複していない表面であると考える箇所が多く存在する。この実施例は、ＩＧＦ−１Ｒの阻害性エピトープが、特定の残基にマップされた最初の例を与えるものである。ＩＮＳＲの最近の構造は、インスリンがインスリン受容体に結合するのを阻害することが知られている抗−ＩＮＳＲ抗体とともに結晶化させたものであった（Ｓｏｏｓ  １９８６；ＭｃＫｅｒｎ  ２００６）。ＩＧＦ−１ＲのＨｉｓ４６４と相同性の残基（ＩＮＳＲのＫ４７４）は、この抗体がＩＮＳＲと結合する表面の一部分である。Ｍ１３−Ｃ０６が、ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを、アンタゴニストである抗−ＩＮＳＲ抗体が阻害する機序と同様の阻害機序を有する可能性がある。
【０６１０】
（実施例４．抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を用いた交差ブロック試験）
ａ．材料
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体であるＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＰ１Ｅ２を、すでに記載されているようにサブクローン化し、発現させ、精製した（米国特許出願番号第１１／７２７，８８７号、この内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）。市販の阻害性を有するＩＧＦ−１Ｒ抗体（αＩＲ３（Ｊａｃｏｂｓら、１９８６））は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カタログ番号ＧＲ１１ＬＳＰ５）から購入した。Ｎ末端にオクタヒスチジンタグを有するヒトＩＧＦ−１およびヒトＩＧＦ−２は、Ｐｉｃｈｉａで組み換えて作成し、Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースで精製した。Ｃ末端に１０−ヒスチジンタグを含有する可溶性の組み換えヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外領域構築物は、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１−９０２）−Ｈｉｓ１０と呼ばれ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号３０５−ＧＲ−０５０）から購入した。ヒトおよびマウスのＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質を構築し、標準的なプロテインＡクロマトグラフィー法を用いて精製した。
【０６１１】
ｂ．方法
（ｉ）抗体：抗体の交差ブロック試験
種々の抗体が、Ｍ１３−Ｃ０６またはＭ１４−Ｇ１１がｈＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする能力を、抗体およびｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃのビオチン化態様を用いて決定した。簡単に説明すると、９６ウェルの透明ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）１ウェルあたり、１×ＰＢＳ中、２μｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ  ５０μＬを用い、室温で２時間コーティングした（ＲＴ、振とうせず）。プレートを１×ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ溶液を用いて２〜８℃で一晩ブロックした。プレートを洗浄し、ビオチン化Ｍ１３−Ｃ０６またはビオチン化Ｍ１４−Ｇ１１（８０ｎｇ／ｍＬ）および阻害性を有する抗体の混合物１００μＬとともに、室温で１時間インキュベートした。阻害性を有する抗体を、４０μｇ／ｍＬから３ｎｇ／ｍＬまで段階的に希釈した（５倍希釈）。ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  カタログ番号２１３３５）を用い、製造業者のプロトコルにしたがって、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｇ１１をビオチン化した。コントロールも、ＩＧＦ−１Ｒに特異的ではないＩｇＧ４アイソタイプコントロール抗体をビオチン化Ｍ１３−Ｃ０６またはビオチン化Ｍ１４−Ｇ１１とともに段階希釈することによって行った。プレートを洗浄し、１００μＬ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰ（ブロッキングバッファで１：４０００希釈、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  カタログ番号７１００−０５）とともに室温で１時間振とうした。プレートを洗浄し、１００μＬ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ、カタログ番号５３−００−０１）をウェルに加えた。Ｗａｌｌａｃ  １４２０−０４１  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒプレートリーダーを用い、５分ごとに吸光度６５０ｎｍで測定することによって、ビオチン化Ｍ１３−Ｃ０６またはビオチン化Ｍ１４−Ｇ１１の存在を検出した。
【０６１２】
種々の抗体が、マウスαＩＲ３をブロックする能力を、「Ｚｅｎｏｎ−Ｆａｂ−ＨＲＰ」標識したαＩＲ３およびｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを用いて決定した。αＩＲ（ＩｇＧ１）を、製造業者の記載にしたがって、Ｚｅｎｏｎ（Ｒ）−Ｆａｂ−ＨＲＰ標識した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号Ｚ２５０５４）。簡単に説明すると、９６ウェルの透明ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）１ウェルあたり、１×ＰＢＳ中、２μｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ  ５０μＬを用い、室温で２時間コーティングした（ＲＴ、振とうせず）。プレートを１ＸＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ溶液を用いて２〜８℃で一晩ブロックした。プレートを洗浄し、Ｚｅｎｏｎ標識したαＩＲ３（４０ｎｇ／ｍＬ）および阻害性を有する抗体の混合物１００μＬとともに、室温で１時間インキュベートした。阻害性を有する抗体を、４０μｇ／ｍＬから３ｎｇ／ｍＬまで段階的に希釈した（５倍希釈）。コントロールは、ＩＧＦ−１Ｒに特異的ではないＩｇＧ４アイソタイプコントロール抗体をＺｅｎｏｎ標識したαＩＲ３とともに段階希釈することによって行った。プレートを洗浄し、１００μＬ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ、カタログ番号５３−００−０１）をウェルに加えた。Ｗａｌｌａｃ  １４２０−０４１  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒプレートリーダーを用い、５分ごとに吸光度６５０ｎｍで測定することによって、Ｚｅｎｏｎ標識したαＩＲ３を検出した。
【０６１３】
（ｉｉ）ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２リガンド：抗体の交差ブロック試験
ｈＩＧＦ−１Ｒ−ＨｉｓがＭ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｇ１１に結合するのをＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がブロックする能力について、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００を用いたＳＰＲによって決定した。製造業者（Ｂｉａｃｏｒｅ）の標準的なＮＨＳ／ＥＤＣ化学プロトコルを用い、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｇ１１（４０μｇ／ｍＬ）の１０ｍＭ酢酸混合物（ｐＨ４．０）を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｄｅ  ＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐ（カタログ番号ＢＲ−１０００−１４）表面に、約２，０００ＲＵで固定した。固定した抗体表面に対するｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓの結合を、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が阻害する能力について試験するために、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が５００ｐＭ〜４μＭ存在する条件下、４０ｎＭ  ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ  １６０μＬをセンサチップ表面に２０μＬ／分で注入した。さらに、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体であるＭ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｇ１１、およびその抗体Ｆａｂを用い、これらの物質が、上述のセンサチップ表面に対するＩＧＦ−１Ｒの結合をブロックする能力について調べた。同様の抗体を段階的に希釈し（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ存在下）、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のブロック実験に使用した。０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．０）１０μＬを３回注入して、再生した。各抗体に対する、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ結合率１００％は、注入してから６０秒以内に、物質の移動を制限した条件下で、ベースラインと比較したシグナル上昇によって決定した。溶液中にＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が存在する条件下で、６０秒間でのシグナル低下度を、抗体が結合するのをリガンドがブロックするのを示す測定値として用いた。
【０６１４】
（ｉｉｉ）１種類の抗体および抗体の組み合わせによる、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２リガンドのブロッキング
ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎを用い、製造業者が提供するプロトコルにしたがってビオチン化した（Ｐｉｅｒｃｅ  カタログ番号２１３３５）。５μｇ／ｍｌのビオチン化したヒトＩＧＦ−１Ｒ  Ｆｃ（ＮＢ１２４５３−９）を、ＳｉｇｍａＳｃｒｅｅｎのストレプトアビジンコーティングされた９６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ５４３２−５ＥＡ）のウェルに１００μＬ／ウェルで加え、２〜８℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴで４回洗浄した。ヒトＩＧＦ−１  Ｈｉｓ（ＮＢ１２１１１−８５）を、ＰＢＳＴ、１．０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中、３２０ｎＭになるように調製した。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体であるＭ１３−Ｃ０６（ＮＢ１１０５４−８２）、Ｍ１４−Ｃ０３（ＮＢ１１０５５−１４７）、Ｍ１４−Ｇ１１（ＮＢ１１０１６−１２０）、Ｐ１Ｅ２（ヒトＩｇＧ４ａｇｌｙ／κ定常ドメインに融合したＰ１Ｅ２ハイブリドーマ細胞株で発現する抗体に由来する、マウスＶＨおよびマウスＶＬを含む、ＤＥ１２  Ｃｈｉｍｅｒａ）およびαＩＲ３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号ＧＲ１１ＬＳＰ５）を、３２０ｎＭ  ＩＧＦ−１  Ｈｉｓ溶液で段階的に希釈した。Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３の場合、１．３μＭ〜１０ｐＭ、Ｍ１４−Ｇ１１の場合５．２μＭ〜１０ｐＭ、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３の場合、２．６μＭ〜１０ｐＭで希釈した。ヒトＩＧＦ−２  Ｈｉｓ（ＮＢ１２１１０−１０）を、ＰＢＳＴ、１．０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中、３２０ｎＭになるように調製した。３２０ｎＭ  ＩＧＦ−２  Ｈｉｓ溶液を用い、この抗体を段階的に希釈した（Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３の場合、１．３μＭ〜５ｐＭ、Ｍ１４−Ｇ１１およびαＩＲ３の場合５．２μＭ〜５ｐＭ、Ｐ１Ｅ２の場合、５．２μＭ〜２０ｐＭ）。プレートに、希釈物１００μＬ／ウェルを２つ組で加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。次いで、このプレートを２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴで４回洗浄した。ＨＲＰにコンジュゲートした抗−Ｈｉｓ  Ｔａｇ抗体（Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ  ＨＲＰコンジュゲート、ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１０１４９９２）をＰＢＳＴで１：１０００に希釈し、１００μＬ／ウェルでプレートに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。次いで、このプレートを２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μＬ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ、カタログ番号５３−００−０１）をプレートに加え、所望の反応が観察されたら、１％リン酸を１００μＬ／ウェルで１回加えた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで決定し、結果を正規化し、抗体濃度をｌｏｇでプロットした。
【０６１５】
ｃ．結果
（ｉ）抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体の交差ブロック性
ＩＧＦ−１Ｒ  ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、抗体が、別の抗体を交差的にブロックする能力について、全ての抗体を試験した（表８）。Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３は、このアッセイで互いに交差的にブロックしたが、このアッセイでＰ１Ｅ２、αＩＲ３またはＭ１４−Ｇ１１に対しては交差的にブロックしなかった。Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３は、両方とも、このアッセイで、標識したαＩＲ３およびＭ１４−Ｇ１１を競合によって交差的にブロックすることができる。Ｍ１４−Ｇ１１は、αＩＲ３に対して中程度の交差ブロック活性を示し、このことは、Ｍ１４−Ｇ１１のエピトープが重複している可能性があるが、αＩＲ３およびＰ１Ｅ２のエピトープと同じではないことを示唆している。
【０６１６】
表８．抗体の交差ブロック実験の結果のまとめ
2010538012.tif 000021
＋＋＋＋＋  ＝  自身に対して抗体結合が競合する（９０〜１００％）
＋＋＋＋  ＝  競合率７０〜９０％
＋＋＋  ＝  競合率５０〜７０％
＋＋  ＝  競合率３０〜５０％
＋  ＝  競合率１０〜３０％
＋／−  ＝  競合率０〜１０％
Ｎ／Ａ  ＝  結果は得られていない
【０６１７】
ＳＰＲに基づくアッセイを用い、同様の交差ブロック試験の結果を得た（図１３Ａ、１３Ｂ）。この交差ブロック試験は、ＩＧＦ−１Ｒ濃度４０ｎＭ（ＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｇ１１の親和性の約４００倍）で行った。したがって、それぞれの抗体が、自身を完全に交差ブロックすることが可能な濃度は、抗体／ＩＧＦ−１Ｒが量論量での測定値であるはずである。Ｍ１３−Ｃ０６も、Ｍ１４−Ｇ１１も、それぞれ４０ｎＭおよび８０ｎＭの濃度で、およびＦａｂ濃度で自身の交差ブロックが飽和状態に達した（図１３Ａ、１３Ｂ、Ｆａｂのデータは示していない）。このデータは、両抗体が、ＩＧＦ−１Ｒホモダイマーの２つの部位を認識していることを示唆している。２つの部位が存在するが、それぞれの抗体のエピトープは、受容体のホモダイマーの性質に起因して２つあると考えられる、分子に存在する特定の構造部位に特有のものであると考えられる。サイズ排除／静的光散乱法による分析実験を行い、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ細胞外ドメイン構築物が、溶液中でホモダイマーであることを示した。
【０６１８】
（ｉｉ）リガンド：抗体の交差ブロック性
ＳＰＲアッセイにおいて、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方とも、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓが、Ｍ１３−Ｃ０６表面およびＭ１４−Ｇ１１表面に結合する能力を低下させた（図１３Ｃおよび１３Ｄ）。Ｍ１３−Ｃ０６表面にＩＧＦ−１Ｒが結合する能力の低下は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が飽和濃度の状態でも、ほんの約２０〜２５％であり、このことは、このリガンドが、Ｍ１３−Ｃ０６に対するＩＧＦ−１Ｒの親和性をアロステリック効果によって低下させていることを示唆している。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の阻害曲線で、Ｍ１４−Ｇ１１表面に対するＩＧＦ−１Ｒの結合が飽和状態に達することはなく、このことは、直接的な抗体／リガンドの競合も可能であることを示唆している。この受容体に対するＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の結合の量論量は、受容体内に可能な結合部位が２個存在する場合であっても、１：１である。これらの部位の１つにリガンドが結合すると、受容体の反対側にある第２の部位を認識する能力がなくなると考えられる。ＩＧＦ−１の量論量の結果は、公開済の研究結果と一致している（Ｊａｎｎｓｏｎ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）８１８９−８１９７）。
【０６１９】
（ｉｉｉ）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２をブロックする特性
５種類の抗体（Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ）が、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害する能力について、ＥＬＩＳＡ系競合アッセイで試験した。Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを両方ともブロックした（図１３Ａ〜Ｄ）。飽和濃度のＭ１３−Ｃ０６またはＭ１４−Ｃ０３が存在する条件下でさえ、このアッセイにおいて、リガンドの濃度を上げることによって、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２は、部分的に結合した。さらに、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３の阻害曲線の中間点（ＩＣ５０）は、このアッセイにおけるＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の濃度には依存しなかった。両方の結果から、リガンドのブロッキングはアロステリック効果による機序であることが示唆される。飽和濃度のＭ１３−Ｃ０６またはＭ１４−Ｃ０３が存在する状態、および存在しない状態で、ヒトＩＧＦ−１  Ｈｉｓを滴定すると、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するリガンドの見かけ親和性が失われていることが示された。このデータから、Ｍ１３−Ｃ０６抗体が存在すると、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するヒトＩＧＦ−１  Ｈｉｓの親和性がほぼ１／５０倍に低下することが示唆される（図１４Ａ）。Ｐ１Ｅ２もαＩＲ３も、ＩＧＦ−１をアロステリック効果によってブロックするが、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−２の結合にはほとんど影響を与えない（図１３Ａ〜Ｄ）。αＩＲ３に関するこれらの結果は、公開されている結果と一致している（Ｊａｃｏｂｓ  １９８６）。Ｍ１４−Ｇ１１は、競合的な様式で、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方をブロックすると考えられる（図１３Ａ〜Ｄ）。Ｍ１４−Ｇ１１のＩＣ５０は、アッセイで使用するＩＧＦ−１の濃度に依存する。飽和濃度のＭ１４−Ｇ１１は、両リガンドを１００％ブロックするが、Ｍ１４−Ｇ１１の濃度がＩＣ５０より高くなると、アロステリックなブロッカーになる。
【０６２０】
固有で重複しないエピトープと、抗体とを組み合わせると、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のブロック性能（ＩＣ５０）が高まり、リガンドを見かけ上完全にブロックする（図１５Ｂおよび１５Ｃ）。Ｍ１３−Ｃ０６は、リガンド結合部位とは反対側にあり、遠く離れたＦｎＩＩＩドメイン上にある大きな表面に結合していることが分かっており、このことは、アロステリック効果によるブロック機序と一致している。Ｍ１４−Ｇ１１およびαＩＲ３は、ＣＲＲドメインおよびＬ２ドメインに存在する重複する表面に結合する。Ｍ１４−Ｇ１１のエピトープは、リガンド結合部位と直接隣接したＣＲＲドメイン表面にあり、このことは、見かけ挙動が競合的なリガンドブロック挙動であることと一致している。αＩＲ３のエピトープは、リガンド結合部位に垂直な表面にあり、このことは、このエピトープがアロステリックなブロック強度を示すことと一致している。アロステリックな阻害剤Ｍ１３−Ｃ０６と、競合的な阻害剤Ｍ１４−Ｇ１１またはアロステリックな競合剤αＩＲ３とを組み合わせると、それぞれの抗体個別のＩＣ５０値よりも低い値で、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を見かけ上１００％ブロックした。このデータは、阻害性の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の組み合わせによる相乗的な活性を示しており、このデータを表９および表１０に示している。
【０６２１】
表９．抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体であるＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１およびαＩＲ３のＩＧＦ−１ブロック性およびＩＧＦ−１Ｒ阻害率
2010538012.tif 000022
【０６２２】
表１０．抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体であるＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１およびαＩＲ３のＩＧＦ−２ブロック性およびＩＧＦ−１Ｒ阻害率
2010538012.tif 000023
【０６２３】
（実施例５  ＩＧＦ−１Ｒのアロステリック効果による抗体阻害剤および競合的な抗体阻害剤の残基特異的なエピトープマッピング）
ａ．方法
ｉ．エピトープマッピング変異
ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＴＭ部位特異的変異キットを用い、製造業者のプロトコルにしたがって、野生型ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ  ＰＶ−９０プラスミドを突然変異させることによって、４６種類の変異エピトープマッピングライブラリを構築した。それぞれの変異（または、２箇所の変異）をＰＶ−９０ベクターに組み込み、これをＤＮＡ配列決定装置で確認した。ＤＮＡ産生のために、プラスミドをＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１８２５８−０１２）に形質転換し、３７℃で一晩培養し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてプラスミドをｍｉｎｉｐｒｅｐ処理し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−Ｆｒｅｅ  Ｍａｘｉｋｉｔを用いてプラスミドをｍａｘｉｐｒｅｐ処理した。ＰｏｌｙＦｅｃｔトランスフェクションキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、それぞれの変異プラスミド２００μｇをＨＥＫ２９３  Ｔ細胞  １００ｍＬに２×１０６細胞／ｍＬで一過性にトランスフェクトし、可溶性タンパク質を培地に分泌させた。細胞を、ＤＭＥＭ（Ｉｖｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％  ＦＢＳ（低ＩｇＧウシ血清、２０ｍＬのプロテインＡカラムを通すことによって、ウシＩｇＧをさらに減らしたもの）に入れ、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。７日後、１２００ｒｐｍで遠心分離して、それぞれのＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体を含む上澄みを集め、０．２μｍフィルターで濾過した。１．２ｍＬのプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムを１×ＰＢＳで平衡状態にしておき、このカラムに上澄みを通すことによって、それぞれの変異体を親和性精製した。０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ３．０）を用いて、上述のカラムから変異体を溶出させ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−８０で中和し、ＶｉｖａＳｐｉｎ  ６  ＭＷＣＯ  ３０，０００遠心濃縮装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号ＶＳ０６２１）で、体積が約３００μＬになるまで濃縮した。
【０６２４】
ｉｉ．ＩＧＦ−１Ｒ変異のウェスタンブロット分析
ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異体サンプルを、Ｘｃｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＥＩ０００１）を用い、標準的な製造者のプロトコルにしたがって、４〜２０％  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＥＣ６０２８）で処理した。ｉＢｌｏｔ  Ｄｒｙ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＩＢ１００１）およびＴｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｔａｃｋｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＩＢ３０１０−０１または３０１０−０２）を用い、標準的な製造業者のプロトコルにしたがって、サンプルをニトロセルロースに移した。４℃で、ＰＢＳＴ２５ｍｌおよび脱脂粉乳５ｍｇ／ｍｌ中、膜を一晩ブロックした。ブロックした後、室温で、ＰＢＳＴ  ２５ｍｌで膜を５分間、１回洗浄した。ＰＢＳＴ  １０ｍｌ中、濃度１：１００で一次抗−ＩＧＦ−１Ｒβ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  カタログ番号ｓｃ−９０３８）とともに膜を室温で１時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳＴ  ２５ｍｌで膜を５分間、３回洗浄した。  検出のために、ＰＢＳＴ  １０ｍｌ中、濃度１：１０００で、膜をＨＲＰコンジュゲート型ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−Ｆｃ二次抗体（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  カタログ番号Ｉ１９０４−４０Ｊ）とともに室温で１時間インキュベートした。室温で、ＰＢＳＴ  ２５ｍｌで膜を５分間、３回洗浄した後、ＰＢＳＴ  ２５ｍｌで２０分間洗浄した。Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号ＲＰＮ２１０８）を用い、標準的な製造業者のプロトコルにしたがって、タンパク質のバンドを検出した。
【０６２５】
ｉｉｉ．ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ変異ライブラリの表面プラズモン分析
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、２５℃に設定したＢｉａｃｏｒｅ  ３０００を用いて行った。ｍＩＧＦ−１Ｒ−ＦｃおよびｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１を固定した研究グレードのＣＭ５センサーチップ表面に対し、高い見かけ親和性で結合する。標準的な製造業者のプロトコルを用い、それぞれの抗体（１０ｍＭ  アセテート（ｐＨ４．０）で１００μｇ／ｍＬ）を、ＥＤＣ／ＮＨＳで活性化したセンサーチップ表面に注入することによって、抗体センサーチップ表面を調製した。ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃが、抗体表面に結合する能力は、タンパク質の見かけ結合活性が高い結果であった。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃタンパク質およびｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃタンパク質は、２個の別個のホモダイマー領域（ＩＧＦ−１ＲおよびＩｇＧ１−Ｆｃ）が組み込まれているため、両方ともオリゴマー化する。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対する抗体の高い実際の結合親和性と、ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対する抗体の低い結合親和性を区別するために、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｇ１１のセンサーチップ表面で受容体−Ｆｃ融合物を捕捉した後、抗体（αＩＲ３およびＰ１Ｅ２）または抗体Ｆａｂ（Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１）を注入して加えた。受容体−Ｆｃ構築物を親和性精製し、濃縮したものを６０μＬ、流速１μＬ／分で注入することによって、抗体表面で捕捉した。その後、受容体−Ｆｃ結合工程が終了したら、流速を５μＬ／分に上げた。各受容体−Ｆｃ構築物を結合させた後、Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂ抗体またはαＩＲ３抗体を１０ｎＭ、３ｎＭ、または１ｎＭで含む溶液、またはＭ１４−Ｃ０３  Ｆａｂ、Ｍ１４−Ｇ１１  ＦａｂまたはＰ１Ｅ２抗体を３０ｎＭ、１０ｎＭまたは３ｎＭで含む溶液を注入した（５０μＬ）。抗体の注入が完了してから７分間、解離を測定した。最後に、流速を３０μＬ／分に上げ、チップ表面に０．１Ｍグリシン（ｐＨ２）を１０μＬ、２回注入することによってチップ表面を再生した。
【０６２６】
ｂ．結果
ｉ．予備的なエピトープマッピング−エピトープの位置を決定
１９種類の変異体を予備的に構築し、阻害性を有する抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体のエピトープの位置を決定した。Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１が、マウスＩＧＦ−１Ｒに対してほとんど活性を示さないという結果から、本願発明者らは、阻害性を有する抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体のエピトープの位置を決定可能なヒトＩＧＦ−１Ｒの限定的な変異のセットを特定した。マウスＩＧＦ−１ＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとは、一次配列の同一性が９５％である。細胞外領域において、マウスＩＧＦ−１ＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとで異なる残基は３３種類である。これらの残基のうち、ＩＮＳＲ細胞外領域内にある相同性の位置が、最近のＩＮＳＲ血漿構造に基づいて溶媒にさらされる位置であるため、２０残基を変異標的とした（ｐｄｂコードは２ＤＴＧ、ＭｃＫｅｒｎ  ２００６）。接近可能な表面の面積を、プローブ半径１．４Åを用い、ＳｔｒｕｃＴｏｏｌｓ（ｈｔｔｐ：／／ｍｏｌｂｉｏ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｔｒｕｃｔｂｉｏ／ｂａｓｉｃ．ｈｔｍｌ）で算出した。変異箇所が、一次配列でお互いにくっついている４つの変異対を特定した。これらの場合、それぞれの対は、１個の構築物の中で２箇所が変異していた。したがって、２０残基の位置は、１６種類の変異構築物をもたらした。ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２の結合にとって重要であることが示されている、ＦｎＩＩＩ−２領域の構造化されていないループ領域に存在する４個の残基を選択して突然変異を生成させた（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ２００１；  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ２００４）。これらの位置のうち２つは、一次配列で近い位置にあり、１個の変異構築物内で組み合わされ得る。１９種類の予備的な変異体（ＳＤ００１〜ＳＤ０１９）の最終的なリストを表１１に示す。表１１に示した残基の付番は、３０残基のＩＧＦ−１Ｒシグナルペプチドが開裂したものであることを前提としている。１００  ｍＬのＨＥＫ２９３細胞で、１週間一過性トランスフェクトすることによって、それぞれの構築物を、構築し、プロテインＡクロマトグラフィーで精製した。変異ＩＧＦ−１Ｒ構築物の精製物を濃縮し、ウェスタンブロット分析によって、発現／折りたたみについてアッセイした。すべての変異構築物について、発現量は１０〜３０μｇであった。
【０６２７】
それぞれの変異ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ機能構築物との相互作用について、表面プラズモン分解（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用い、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３をアッセイした。このアッセイの変数としての、ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合構築物の濃度の不確かさを除去するために、それぞれの変異構築物を、Ｍ１３−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１を約１０，０００ＲＵで固定した研究グレードのＣＭ５センサーチップで捕捉した。抗体が、捕捉した変異ＩＧＦ−１Ｒ構築物に結合するのを視覚的に見やすくするために、本願発明者らは、酵素によって誘導したＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３およびＭ１４−Ｇ１１の抗原結合フラグメント（Ｆａｂｓ）を使用した。
【０６２８】
上述の予備的な１９種類の変異構築物の中で、ＳＤ０１５（Ｅ４６４Ｈ）のみが、Ｍ１３−Ｃ０６  ＦａｂおよびＭ１４−Ｃ０３  Ｆａｂが、ＩＧＦ−１Ｒに結合する能力に影響を与えた。残基４６４がヒスチジンに変異すると、両方のＦａｂとの結合反応が完全に抑えられる。他の変異ＩＧＦ−１Ｒ構築物は、すべて、匹敵する平衡解離定数であった（Ｍ１３−Ｃ０６  ＦａｂおよびＭ１４−Ｃ０３  Ｆａｂの場合、それぞれ、ＫＤ＝１ｎＭおよび５ｎＭ）。これらの実験では、Ｍ１３−Ｃ０６抗体およびＭ１４−Ｃ０３抗体のエピトープを、ＦｎＩＩＩ−１領域表面に局在化する。上述の２種類の抗体のＶＨ  ＣＤＲ領域は、きわめてよく似ており（３８残基のうち、２６残基が同一である）、ＶＬ領域のＣＤＲ領域は無関係であり、抗原認識能力がＶＨに強く偏っていると示唆する。驚くべきことではないが、上述の２種の抗体は、互いに効率よく交差的にブロックする。Ｓｏｏｓらは、ＩＲ／ＩＧＦ−１Ｒキメラを用いて、２番目のロイシンに富む繰り返し領域（Ｌ２）および１番目のＩＩＩ型フィブロネクチン領域（ＦｎＩＩＩ−１）内にある１つ以上のエピトープが受容体の阻害可能性につながることを示している（Ｓｏｏｓ  １９９２）。この範囲は、残基３３３〜６０９の合計２７６残基に広がっている。対照的に、本明細書に記載した詳細なエピトープマッピング試験は、エピトープが、複数の重複しない残基に広がっており、ＦｎＩＩＩ−１ドメイン内の１個の残基Ｅ４６４が、抗体の結合にとって特に重要であることを示している。
【０６２９】
１９種類の変異体のうち、ＳＤ００８（Ｓ２５７Ｆ）およびＳＤ０１２（Ｅ３０３Ｇ）の変異のみが、それぞれ、システインに富む繰り返し（ＣＲＲ）領域およびＬ２領域にあり、Ｍ１４−Ｇ１１  Ｆａｂが、ヒトＩＧＦ−１Ｒを認識する能力を弱めた（表１１）。両方の場合で、変異によって、ＫＤ測定値に基づく親和性が、ほぼ１／３倍に低下した。他の変異ＩＧＦ−１Ｒ構築物は、ＳＤ０１５も含めてすべて、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３に対して反応性を示さず、野生型の親和性を有するＭ１４−Ｇ１１  Ｆａｂ（ＫＤ  約４〜６ｎＭ）に結合した。
【０６３０】
αＩＲ３およびＰ１Ｅ２も、予備的な変異ライブラリに対してスクリーニングした。これらの両抗体は、野生型ヒトＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃと比較して、ＳＤ０１２に対する親和性が同様に低下した。しかし、ＳＤ００８への結合力の低下は、Ｐ１Ｅ２のみであった（表１１）。
【０６３１】
ｉｉ．詳細なエピトープマッピング：Ｍ１３−Ｃ０６抗体およびＭ１４−Ｃ０３抗体のエピトープの残基特異的な定義
Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３のエピトープが、ＩＧＦ−１ＲのＦｎＩＩＩ−１領域に局在化しているという予備的なＩＧＦ−１Ｒ変異ライブラリの結果に基づいて、ＩＧＦ−１Ｒの元々の変異部分であり、この部分によって抗体の結合力が失われるＥ４６４Ｈの周囲にある表面を調べるように、第２の変異体群を設計した。三次元でＥ４６４と近いという観点で、全部で２１の変異残基を選択した（残基４６４での元々のヒスチジン変異以外の異なる変異を含む）。インスリン受容体の三次元構造を用い、４６４の周囲にある残基の近さを概算した。一次配列で隣接している変異について、７対の残基を特定した。これらの残基対の変異は、同時に行われ、二箇所に変異がある物質を提供する。したがって、この第２の変異体群は、表２０にＳＤ１０１〜ＳＤ１１４で列挙された１４種類の構築物からなった。
【０６３２】
この１４種類の変異構築物の発現、精製および品質制御は、予備的な第１の変異体群（ＳＤ００１〜ＳＤ０１９）の場合と同様に行った。１４種類の構築物は、ウェスタンブロットによれば、十分に発現し、折りたたみ構造であった（ＳＤ１１４を除く）。ＳＤ１１４は、発現量が非常に少なく、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３またはＭ１４−Ｇ１１を用いたＢｉａｃｏｒｅ実験でも反応しなかった。この変異体は、完全に異なるエピトープを認識している。したがって、変異構築物のデータからは除外した。他の１３種類の構築物は、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３のエピトープについて、位置を残基特異的に特定することができた。残基特定結果を表１１に列挙している。  まとめると、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３のエピトープは、ほぼ同じであり、ＦｎＩＩＩ−１領域に完全に含まれている。最も重要な（おそらく中心となる）残基は、４６１および４６２であった。残基４６１および４６２に変異を含むＳＤ１０３は、Ｍ１３−Ｃ０６  ＦａｂおよびＭ１４−Ｃ０３  Ｆａｂに対し、全く反応せず、Ｍ１３−Ｃ０６表面およびＭ１４−Ｃ０３表面に対し、全く反応しない。Ｍ１４−Ｇ１１表面に対するＳＤ１０３の結合は、任意の他のＦｎＩＩＩ−２変異構築物と異なっておらず、この結合性が完全に失われることは、エピトープ特異性によるものであることを示す。ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の親和性を完全になくすか、または大きく減らす（親和性において、１／１００倍よりも大きい低下）他の変異は、ＩＧＦ−１Ｒの残基４５９、４６０、４６４、４８０、４８２、４８３、５７０および５７１にあることが分かっている。野生型ヒトＩＧＦ−１Ｒに対し、抗体の親和性を少しだけ低下させる（２．５≧ＫＤ≧１０ｎＭ）変異は、残基４６６、４６７、５６４、５６５にあることが分かっている。これらの残基の位置を、相同性ＩＲ構造の表面とマッピングした（図１６、ＭｃＫｅｒｎら、２００６）。
【０６３３】
エピトープの位置および表面積の大きさに基づくと、Ｍ１３−Ｃ０６およびＭ１４−Ｃ０３が、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをアロステリック効果によって阻害することは驚くにあたらない。このエピトープは、既知のリガンド結合表面とは反対の受容体面にある（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ２００１、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ２００４）。公開されている研究結果から、残基４４０〜５８６を認識する抗体は、ＩＧＦ−１の結合に対し、阻害効果とアゴニスト効果の両方を有することが示されている（Ｓｏｏｓ  １９９２、Ｋｅｙｎａｎｆａｒ  ２００７）。ＩＧＦ−１Ｒの内部で、アミノ酸残基４４０〜５８６は、Ｌ２およびＦｎＩＩＩ−１のすべてをあらわし、抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体に接近可能な、オーバーラッピング面ではないと思われる箇所が多く存在する。本願発明者らの研究は、本願発明者らが知る限り、阻害性を有するエピトープを、残基に特異的な分解能で、受容体上の特定の領域に局在化する最初の研究である。インスリン受容体（ＩＲ）の最近の構造は、インスリンがインスリン受容体に結合するのを阻害することが知られている抗−ＩＮＳＲ抗体とともに結晶化させたものであった（ＭｃＫｅｒｎ  ２００６）。ＩＧＦ−１ＲのＨｉｓ４６４と相同性の残基（ＩＲのＫ４７４）は、この抗体がＩＲと結合する表面の一部分である。Ｍ１３−Ｃ０６が、ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを、アンタゴニストである抗−ＩＮＳＲ抗体が阻害する機序と同様の阻害機序を有する可能性がある。Ｂｉａｃｏｒｅの結果に基づき、Ｍ１３−Ｃ０６は、結合速度を下げることによって、ＩＧＦ−１を阻害すると考えられる（おそらくＩＧＦ−２も）。この抗体は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が、受容体結合部位に近づくことを困難にする構造で、受容体の細胞外領域を捕捉すると考えられる。
【０６３４】
ｉｉｉ．詳細なエピトープマッピング−Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３抗体エピトープの残基特異的な定義
Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３のエピトープが、ＩＧＦ−１ＲのＣＲＲ領域およびＬ２領域に局在化しているという予備的なＩＧＦ−１Ｒ変異ライブラリの結果に基づいて、ＩＧＦ−１Ｒの元々の変異部分であり、この部分によって抗体の結合力が失われるＳ２５７ＦおよびＥ３０３Ｇの周囲にある表面を調べるように、第３の変異体群を設計した。三次元でＳ２５７ＦおよびＥ３０３Ｇと近いという観点で、全部で２１の変異残基を選択した（残基２５７での元々のフェニルアラニン変異以外の異なる変異を含む）。インスリン受容体の三次元構造を用い、Ｓ２５７およびＥ３０３の周囲にある残基の近さを概算した。一次配列で隣接している変異について、２対の残基を特定した。これらの残基対の変異は、同時に行われ、二箇所に変異がある物質を提供する。したがって、この第２の変異体群は、表１１にＳＤ２０１〜ＳＤ２１３で列挙された１３種類の構築物からなる。
【０６３５】
この１３種類の変異構築物の発現、精製および品質制御は、予備的な第１の変異体群（ＳＤ００１〜ＳＤ０１９）の場合と同様に行った。これらの構築物は、ウェスタンブロットによれば、すべて十分に発現し、折りたたみ構造であった（ＳＤ２１３を除く）。ＳＤ２１３のデータは、受容体の折りたたみ状態の周囲が不明確なので、除外した。他の１２種類の構築物は、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３のエピトープについて、位置を残基特異的に特定することができる。残基特定結果を表１１に列挙している。Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３のエピトープは、異なっている。驚くべきことではないが、Ｍ１４−Ｇ１１は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を両方とも競合的に阻害する薬剤であることが示されたが、Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３は、ＩＧＦ−１の結合のみをアロステリック効果によって阻害することが示された。Ｍ１４−Ｇ１１のエピトープは、リガンド結合に影響を与えることが知られている残基と直接接している表面の、ＣＲＲ領域の中心部に近い位置にある（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ２００１、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ２００４）。Ｍ１４−Ｇ１１の結合力が失われる状況は、位置２４８および２５０で見られた。残基２５４での変異は、受容体に対する抗体の親和性の低下率が中程度であった（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤに対して１０倍≧ＫＤ≧１００倍）。残基２５７、２５９、２６０、２６３、２６５および３０３を含む、主にＣＲＲでの多くの他の変異は、受容体に対するＭ１４−Ｇ１１の親和性を少しだけ低下させる（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤに対して２．５倍≧ＫＤ≧１０倍）。これらの残基の位置を、ＩＧＦ−１Ｒの最初の３種類の細胞外ドメインの公開済構造の表面とマッピングした（図１７、（Ｇａｒｒｅｔｔ  １９９８））。
【０６３６】
Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３のエピトープは、互いによく似ており、小さな部分が少しだけ異なっている。これらのエピトープは、主に、ＣＲＲ領域のＭ１４−Ｇ１１のエピトープと重なる残基にあるが、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合ポケットからわずかに離れて回転した位置に、受容体表面が存在している。さらに、ＣＲＲ領域のＣ末端の残基と、Ｌ２領域にある残基（Ｍ１４−Ｇ１１の結合に影響を与える部分とは離れている）は、αＩＲ３の親和性のみを少しだけ低下させることが分かった（表１１）。ＩＧＦ−１Ｒに対するＰ１Ｅ２の結合は、残基２５４および２６５の変異によって失われ、低下率は中程度であり（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤに対して１０倍≧ＫＤ≧１００倍）、残基２４８および３０３の変異によって、少しだけ低下する（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤに対して２．５倍≧ＫＤ≧１０倍）。ＩＧＦ−１Ｒに対するαＩＲ３の結合は、残基２４８および２６５の変異によって失われ、残基２５４の変異によって、低下率は中程度であり（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤに対して１０倍≧ＫＤ≧１００倍）、残基２６３、３０１、３０３、３０８、３２７および３７９の変異によって、少しだけ低下する（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤに対して２．５倍≧ＫＤ≧１０倍）。ＩＧＦ−１Ｒに対するＰ１Ｅ２およびαＩＲ３の結合に影響を与える残基の位置（２個の抗体に対する影響の平均）を、ＩＧＦ−１Ｒの最初の３つの細胞外領域の構造とマッピングした（図１８、（Ｇａｒｒｅｔｔ  １９９８））。αＩＲ３およびＰ１Ｅ２は、同じアロステリック効果を有していると考えられ、文献に最近記載された２個の抗体の結合特性をＩＧＦ−１のみがブロックすると考えられる（Ｋｅｙｈａｎｆａｒ  ２００７）。残基２４１、２４２、２５１および２６６が、これらの抗体が受容体に結合する能力に影響を与えることが示された。本願発明者らのデータは、この文献と一致しており、残基２５７および２６５も重要であることが示唆された。
【０６３７】
Ｍ１４−Ｇ１１エピトープ（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を競合的にブロックする）とＰ１Ｅ２／αＩＲ３エピトープとの主な違いは、ＩＧＦ−１Ｒ結合部位に隣接した領域であるということである。残基２４８、２５０および２５４を同時に認識する能力は、Ｍ１４−Ｇ１１が、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の結合を両方とも競合的にブロックすることを規定する因子であると思われる。Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３の両方は、Ｄ２５０Ｓの変異には全く影響を与えず、Ｍ１４−Ｇ１１がこの受容体に結合する力を完全に失わせる。ＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１４−Ｇ１１の結合は、ＩＧＦ−１結合部位に近いＣＲＲ領域の内側にある変異によって弱められ（残基２５９および２６０、図１７および１８）、この抗体が、リガンドが受容体に結合するのをどのようにして立体的にブロックし、競合的にブロックするのかを説明している。これらの位置での変異は、Ｐ１Ｅ２またはαＩＲ３の結合には全く影響を与えなかった。Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３の親和性は、ＩＧＦ−１が結合する溝部分のわずかに外側の表面にある変異によって弱められる（図１７および１８）。したがって、Ｍ１４−Ｇ１１によって特異的に認識され、リガンドの結合を競合的にブロックすると考えられる残基は、Ｄ２５０、Ｅ２５９およびＳ２６０である。
【０６３８】
αＩＲ３およびＭ１４−Ｇ１１がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを弱める残基の変異は、ＣＲＲ領域の中心部からＬ２領域にのびている。これらの残基が、平均抗体エピトープ領域を記載する公開済の結果に基づいて、抗体と同時に直接的に結合するということは考えにくい（Ｄａｖｉｅｓ  １９９６）。最近のデータから、繰り返しタンパク質の安定性および折りたたみは、ほとんどの球状領域で異なっていることが示されている（Ｋａｊａｎｄｅｒ  ２００５）。繰り返し領域は、単離されたαらせんのらせん−コイル変換と同様に、共同的ではない折りたたみ／ほどけ反応を受ける構造を伸ばす傾向がある。単純に考えると、球状領域は、一般的に、共同して折りたたまれ、１個のもともと折りたたまれていた状態または変性状態のいずれかで存在する。球状領域の構造は、変異によって、領域全体がほどけてしまわないかぎり、１個の変異によって部分的に破壊されない。対照的に、折りたたまれた繰り返し領域は、変異があると、折りたたまれていない元々の状態に徐々に戻る。このように、抗体の結合に影響を与えるＩＧＦ−１ＲのＣＲＲ領域またはＬ２領域の表面に沿った変異は、この領域の最終的な構造（または順序）を変えることによってこのような現象を引き起こし得る。この機序は、部分的なＣＲＲ領域またはＬ２領域の構造を抗体が安定化すると、ＣＲＲ領域とリガンドとの力学的な結合反応が影響を受けることがあることを説明している。この現象は、リガンドの結合を抗体が立体的にブロックする（Ｍ１４−Ｇ１１）のでない限り、アロステリックな様式で起こると予想される（Ｐ１Ｅ２およびαＩＲ３で観察した場合）。
【０６３９】
表１１  ＩＧＦ−１Ｒ変異体の全リスト、およびこの変異体が抗体の結合に与える影響
2010538012.tif 000024
2010538012.tif 000025
ａ効果なし（ＮＥ）：測定したＫＤが、ＷＴ  ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの２．５倍以内である；弱い（Ｗ）：測定したＫＤが、ＷＴよりも２．５〜１０倍大きい；中程度（Ｍ）：測定したＫＤが、ＷＴよりも１０〜１００倍大きい；強い（Ｓ）：抗体に対する結合が、変異によって失われた；ｎｄ：判定していない。＊「折りたたみに影響を受けた」は、おそらく、受容体の「折りたたみ」が「影響を受けた」ために、変異受容体の発現が弱められ、タンパク質が、異常な様式で挙動することを暗示している。
【０６４０】
結論として、ＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメインの表面にある２個の別個のエピトープによって、受容体を阻害可能であることが示された。これらの２個のエピトープに関する、新しい残基特異的なエピトープマッピングによる情報は、４６種類の１個のＩＧＦ−１Ｒ変異または２個のＩＧＦ−１Ｒ変異に基づいた。第１のエピトープは、ＦｎＩＩＩ−１にあり、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の結合をアロステリック効果によってブロックする。第２のエピトープは、ＣＲＲ領域にあり、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２の推定結合部位に近い。本願発明者らは、この領域にある抗体エピトープのわずかな違いによって、１個のリガンド（ＩＧＦ−１）の結合をアロステリック効果によってブロックする能力と、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方を競合的にブロックする能力とに分かれることを発見した。両リガンドを競合的にブロックするために標的にすべき特定の残基を、最初に特定した。
【０６４１】
（実施例６．リガンドを用いた、別個のＩＧＦ−１Ｒエピトープの組み合わせ標的化−抗体をブロックすると、腫瘍細胞の成長阻害率が高まる）
ａ．方法
異なるＩＧＦ−１Ｒエピトープに結合する抗体は、個々の抗体自体と比較した場合、腫瘍細胞の成長阻害度が高いであろうことが推察された（図１９）。したがって、抗体が、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２による腫瘍細胞の成長をブロックする能力を、細胞生存アッセイを用いて試験した。ＢｘＰＣ３（ヒト膵腺癌）およびＨ３２２Ｍ（ヒト非小細胞肺腫瘍）（ＡＴＣＣ）の腫瘍株をＡＴＣＣから購入した。細胞株を、ＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ）および１０％ウシ胎児血清（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ，ＵＳＡ））を含む完全成長培地で成長させた。トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）を用い、培養容器から接着した細胞をはがした。リン酸緩衝化塩水（ｐＨ７．２）を、ＭｅｄｉａＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ，ＵＳＡ）から得た。９６ウェルの底が透明なプレートを発光アッセイ用にＷａｌｌａｃ  Ｉｎｃから購入した。細胞が８０％の単一層になるまで成長させ、トリプシン処理し、洗浄し、再び懸濁させ、ＢｘＰＣ３細胞およびＨ３２２Ｍ細胞の場合、８ｘ１０３細胞／ウェルを、０．５％成長培地２００μｌを入れた９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、培地を無血清培地（ＳＦＭ）１００μｌと交換し、段階的に希釈した４倍濃度の抗体５０μｌを加えた。３７℃でさらに３０分間インキュベートした後、最終濃度である１倍濃度になるように、４倍濃度のＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２  ５０μｌを加えた。すべての処理を３つ組で行った。細胞をさらに７２時間インキュベートした後、溶解し、ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯＴＭ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，２８００  Ｗｏｏｄｓ  Ｈｏｌｌｏｗ  Ｒｄ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１  ＵＳＡ）を用い、存在するＡＴＰの量を決定した。試薬とＳＦＭとの１：１混合物を２００μｌ／ウェルで加えた。Ｗａｌｌａｃ（マサチューセッツ州ボストン）プレートリーダーで発光を検出した。阻害率は、［１−（Ａｂ−ＳＦＭ）／（ＩＧＦ−ＳＦＭ）］×１００％で算出した。  アイソタイプの一致した抗体であるＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４）をネガティブコントロール（“ｃｔｒ”または“ｃｔｒｌ”）として使用した。
【０６４２】
ｂ．結果
代謝活性測定で得た細胞ＡＴＰを相対的に比較することによって、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（Ｃ０６）およびＭ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（Ｇ１１）の抗−ＩＧＦ１−Ｒ抗体が、インビトロで細胞の成長を阻害する能力を間接的に測定した。Ｃ０６およびＧ１１は両方とも、無血清条件下、用量に依存する様式で、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２によって刺激されるＢｘＰＣ３膵臓腫瘍細胞株の成長を阻害した（図２０Ａ）。重要なことに、等モル量のＣ０６抗体およびＧ１１抗体と接触させた細胞は、それぞれの抗体単独と接触させた場合と比較して、１０ｎＭおよび１ｎＭで、大幅に改善した成長の阻害がみられた（図２０Ａ）。Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせを、種々の濃度の抗体（１ｕＭ〜０．１５ｎＭ）で試験する実験によって、上述の結果をさらに確認した。図２０Ｂは、等モル量のＣ０６抗体およびＧ１１抗体を組み合わせると、それぞれの抗体を対応する抗体濃度で単独で用いて観察される場合と比較して、５００ｎＭおよび５ｎＭで、大幅に改善した成長の阻害がみられた。
【０６４３】
膵臓癌細胞株（ＢｘＰＣ３）を用いて観察した阻害を、他の腫瘍細胞にも適用できるかどうかを示すために、非小細胞肺癌に由来するＨ３２２Ｍ細胞株で、Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせを評価した。図２０Ｃは、１０％ウシ胎児血清存在下、標準的な細胞培養条件で成長させたＨ３２２Ｍで観察した効果の例を示している。Ｃ０６／Ｇ１１抗体を組み合わせると、いずれかの抗体を単独で使用した場合と比較して、大幅に改善した細胞成長の阻害がみられた。
【０６４４】
（実施例７．別のＩＧＦ−１Ｒエピトープと、四価二重特異性抗体とを組み合わせて標的化する）
異なる結合特異性を有する２個の単一特異性抗体の結合部位を組み合わせ、組み合わせた場合に、抗ＩＧＦ−１Ｒ性が高まるか、または相乗効果をおこす四価二重特異性抗体を設計することができる。本発明の四価二重特異性結合分子の例は、第１の結合特異性を有するｓｃＦｖ分子と、第２の結合特異性を有する二価抗体とを含む（図２１を参照）。ｓｃＦｖ分子を、二価抗体の重鎖のＣ末端、または二価抗体の軽鎖（ＮＬ）または重鎖（ＮＨ）のＮ末端に結合するか、または融合し、二重特異性結合分子を得てもよい。本発明に記載の方法を用い、安定化したｓｃＦｖが、単に二価抗体のヒンジ領域またはＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインに融合した四価二重特異性抗体を遺伝子操作することも可能である。この抗体は、全長Ｆｃ領域またはＣＨ２ドメインを欠いたＦｃ領域を含んでいてもよい。他の例示的な実施形態では、２つ以上のｓｃＦｖドメインを、重鎖または軽鎖の同じ末端に融合してもよい。好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ分子のうち、少なくとも１つは、安定化したｓｃＦｖ分子である。ｓｃＦｖ分子は、ＰＣＲによる突然変異生成によって、ＶＨ  ４４とＶＬ  １００との間にジスルフィド結合を導入し、および／またはｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインとの間に長さを最適化したリンカー（例えば、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ４）（配列番号１３５）を導入することによって、安定化させることができる。
【０６４５】
特定の例示的な実施形態では、四価二重特異性抗体は、Ｍ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（Ｇ１１）の可変領域に由来する、安定化したｓｃＦｖ分子に結合しているか、または融合しているＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（Ｃ０６）抗体を含んでいてもよい。あるいは、四価二重特異性抗体は、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（Ｃ０６）の可変領域に由来する、安定化したｓｃＦｖ分子に結合しているか、または融合しているＭ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（Ｇ１１）抗体を含んでいてもよい。例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号１８４）リンカーを使用し、抗体の重鎖の成熟Ｎ末端またはＣ末端、または抗体の軽鎖のＮ末端に、（ＰＣＲ増幅を介して）ｓｃＦｖを接続してもよい。
【０６４６】
ｓｃＦｖをコードするＰＣＲ産物を精製し、重鎖または軽鎖の全長前駆ポリペプチド配列を含有する哺乳動物ベクター（例えば、ｐＮ５ＫＧ１）に接続してもよい。哺乳動物発現ベクターｐＮ５ＫＧ１は、転写活性のある組み込み事象を選択するために、翻訳が不十分な、改変された（イントロンを含有する）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有しており、メトトレキサートで増幅させるために、マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含有している（Ｂａｒｎｅｔｔら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．（Ｉｍａｎａｋａ，Ｈ．Ｙ．Ｗ．ａ．Ｔ．編）、ｐｐ．２７−４０、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９５））。接続した混合物を使用し、コンピテント細胞であるＥ．ｃｏｌｉ株ＴＯＰ  １０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を形質変換させた。Ｅ．ｃｏｌｉのコロニーがアンピシリン薬物耐性になるように形質変換し、挿入物の存在についてスクリーニングする。ＤＮＡ配列分析を用い、最終構築物の正しい配列を確認してもよい。
【０６４７】
プラスミドＤＮＡを使用し、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を、抗体たんぱく質を一過性発現するように形質変換する。１×ＰＢＳ  ０．４ｍＬ中で、プラスミドＤＮＡ  ２０μｇを、４×１０６細胞と混合する。混合物を０．４ｃｍのキュベット（ＢｉｏＲａｄ）に入れ、氷上に１５分間放置する。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ電気穿孔装置（ＢｉｏＲａｄ）を用い、６００ｕＦ、３５０Ｖで細胞を電気穿孔した。Ｔ−２５フラスコに、１００ｕＭ  ヒポキサンチンおよび１６ｕＭ  チミジンを含むＣＨＯ−ＳＳＦＭ  ＩＩ培地を入れ、これに細胞を入れ、３７℃で４日間インキュベートした。
【０６４８】
このＣＨＯ発現系で生成された四価二重特異性抗体を含む上澄みを集め、ウェスタンブロットによって生化学的に特性決定し、ＥＬＩＳＡによって抗原への結合性を試験した。次いで、インビトロ細胞生存アッセイまたはインビボ腫瘍成長阻害アッセイを用い、抗体を試験することができる。例えば、腫瘍細胞株ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２１８）およびヒト結腸癌細胞株Ｍｅ１８０（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  ３３）、ヒト子宮頸部上皮癌細胞株およびＭＤＡ２３１（Ｄｒ．Ｄａｊｕｎ  Ｙａｎｇ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）、ヒト乳癌細胞株を、１０％  ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１×非必須アミノ酸、０．５ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＭＥＭ−Ｅａｒｌｅｓで培養する。腫瘍細胞株をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシン消化によって細胞をはがした。遠心分離によって細胞を集め、完全培地に再縣濁させ、計測し、９６ウェル組織培養プレートに、ＷｉＤｒおよびＭｅ１８０の場合、５０００細胞／ウェル、ＭＤＡ２３１の場合、１５００細胞／ウェルで接種する。
【０６４９】
四価二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体によって、単一特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体よりも高い腫瘍細胞殺傷効果が得られ得る。例えば、四価二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体を、ＩＧＦ−１Ｒのアロステリックなエピトープまたは競合的なエピトープに結合し、ＩＧＦ−１Ｒの内在化を誘発することができる（図２２Ａの結合事象１を参照）。または、四価二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、２個以上のエピトープに結合し（図２２Ｂの結合事象２を参照）、ＩＧＦ−１Ｒの内在化をもっと誘発することができる。
【０６５０】
（実施例８．抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の、安定になるような遺伝子操作、分子生物学、およびタンパク質発現）
図２３は、本発明の抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ様二重特異性抗体（「ＢｓＡｂ」）の模式図を示す。この抗体は、ＩＧＦ−１Ｒに存在するエピトープ（例えば、Ｅｐ−１）に結合し、可とう性リンカーを介し、第２の別個のエピトープ（例えば、Ｅｐ−２）に特異的に結合する全長抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のアミノ末端（Ｎ−ＢｓＡｂ）またはカルボキシ末端（Ｃ−ＢｓＡｂ）に遺伝学的に接続している、安定化したｓｃＦｖから構成されている。図２３に示した例では、ｓｃＦｖの配向は、ＶＬ→ＶＨであるが、ｓｃＦｖは、ＶＨ→ＶＬの形態で機能するように設計されていてもよい。
【０６５１】
ｉ．発現構築物
一般的に、別記がない限り、以下の実施例に記載するｓｃＦｖおよび抗体の重鎖の発現構築物は、アミノ酸配列ＭＧＷＳＬＩＬＬＦＬＶＡＶＡＴＲＶＬＳ（配列番号１３４）を有するＮ末端シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んだ。抗体の軽鎖の発現構築物は、アミノ酸配列ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ（配列番号１３１）をコードするヌクレオチド配列を含んだ。ｓｃＦｖ分子の発現構築物は、精製しやすくするために、配列ＤＤＤＫＳＦＬＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＳＡＶＤＨＨＨＨＨＨを含むＣ末端を含んだ。
【０６５２】
ｂ．抗ＩＧＦ−１Ｒ  ｓｃＦｖおよびＦａｂタンパク質の調製
抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｃ０６  ｓｃＦｖをサブクローン化し、米国特許出願第２００７０２４３１９４号に記載されるプラスミドによる２段階ＰＣＲ増幅プロトコルを用い、アセンブリした。所定のリンカーを用い、以下の４種類のＣ０６  ｓｃＦｖを以下に示す配向で調製した。（１）ＶＨ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー（配列番号１８５）→ＶＬ（ＶＨ／ＧＳ３／ＶＬ）、（２）ＶＨ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー（配列番号１３５）→ＶＬ（ＶＨ／ＧＳ４／ＶＬ）、（３）ＶＬ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー（配列番号１８５）→ＶＨ（ＶＬ／ＧＳ３／ＶＨ）、および（４）ＶＬ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー（配列番号１３５）→ＶＨ（ＶＬ／ＧＳ４／ＶＨ）。図２４は、Ｃ０６  ｓｃＦｖを２段階ＰＣＲでアセンブリするためのプロトコルの模式図を示す。この構築で使用するオリゴヌクレオチドを、表１２に示す。一例として、まず、ｓｃＦｖの５’側の半分と３’側の半分の２個の別個のＰＣＲ産物を作成することによって、Ｃ０６（ＶＬ／ＧＳ３／ＶＨ）ｓｃＦｖを構築した。この２種類の半分を、第２のＰＣＲ反応で、共通の（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１８５）重複領域で結合させた。簡単に説明すると、Ｃ０６（ＶＬ／ＧＳ３／ＶＨ）ｓｃＦｖの５’側の半分を、順方向５’ＶＬプライマー０９２−Ｆ１と、逆方向３’ＶＬプライマー０９２−Ｒ２とを用いてＰＣＲで作成した。ここで、順方向５’ＶＬプライマー０９２−Ｆ１は、ｇｐＩＩＩリーダー配列の一部分をコードする２８塩基と、その後に、Ｃ０６  Ｎ末端可変軽鎖ドメインに相補的な配列を有する２２塩基とで構成されており、逆方向３’ＶＬプライマー０９２−Ｒ２は、Ｃ０６  Ｃ末端可変軽鎖ドメイン遺伝子に相補的な配列を有する２２塩基と、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１８５）リンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列とで構成されている。Ｃ０６（ＶＬ／ＧＳ３／ＶＨ）ｓｃＦｖの３’側の半分を、順方向の５’ＶＨプライマー０９２−Ｆ２と、逆方向の３’ＶＨプライマー０９２−Ｒ１を用いたＰＣＲで作成した。順方向の５’ＶＨプライマー０９２−Ｆ２は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１８５）リンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列と、Ｃ０６  Ｎ末端重鎖可変ドメイン遺伝子に相補的な配列を有する２２塩基とで構成されており、逆方向の３’ＶＨプライマー０９２−Ｒ１は、Ｃ０６  Ｃ末端重鎖可変ドメイン遺伝子に相補的な配列を有する２２塩基と、その後に、Ｍｙｃタグをコードするヌクレオチド配列とで構成されている。次いで、第２のＰＣＲ反応で、上述の２個のすでに合成した５’側の遺伝子の半分フラグメントおよび３’側の遺伝子の半分フラグメントを用い、最後にＣ０６（ＶＨ／ＧＳ３／ＶＬ）ｓｃＦｖをアセンブリした。それぞれのフラグメントは、重複する（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１８５）リンカーペプチドを含有しており、５’順方向プライマーＧｅｎｅＩＩＩ−Ｆは、固有のＮｄｅ  Ｉエンドヌクレアーゼ部位の後に、ｇｐＩＩＩリーダー配列のＮ末端部分をコードする配列を含有しており、３’逆方向プライマーＩＥＨ０８３−Ｒは、Ｓａｌ  Ｉ部位と、Ｍｙｃタグをコードする配列とを含有している。
【０６５３】
予想どおりの大きさに対応するＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動で分割し、切断し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡ抽出キットを用い、製造業者の指示にしたがって精製した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）。精製したＰＣＲ産物を、Ｎｄｅ  ＩおよびＳａｌ  Ｉで消化し、誘導型ａｒａ  Ｃプロモーター制御下、組み換えタンパク質を発現するように改変されたＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターのＮｄｅ  Ｉ／Ｓａｌ  Ｉ部位にクローン化した。この発現ベクターは、Ｃ０６  ｓｃＦｖの開始コドンと重複する固有のＮｄｅ  Ｉ部位をコードする改変部と、Ｃ末端にＨｉｓタグと、その後ろに停止コドンとを含んでいた。ゲル精製したＰＣＲ産物を、Ｎｄｅ  Ｉ／Ｓａｌ  Ｉで消化した発現プラスミドに接続し、接続した混合物の一部分を用い、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質変換した。アンピシリン薬物耐性を有するコロニーをスクリーニングし、ＤＮＡ配列分析によって、Ｃ０６（ＶＬ／ＧＳ３／ＶＨ）ｓｃＦｖをコードする最終的なプラスミドｐＸＷＵ０９２の正しい配列を確認した。ｓｃＦｖ構築物は、ｇＩＩＩシグナルペプチドを含有しており、末端にｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ６検出タグを含有していた。
【０６５４】
表１２に列挙したオリゴヌクレオチドを用い、図２４に示したスキームにしたがって、上述の方法と同様の様式で、残りの３種類の抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｃ０６  ｓｃＦｖを調製した。プラスミドｐＸＷＵ０９０は、Ｃ０６（ＶＨ／ＧＳ３／ＶＬ）ｓｃＦｖをコードし、ｐＸＷＵ０９１は、Ｃ０６（ＶＨ／ＧＳ４／ＶＬ）ｓｃＦｖをコードし、プラスミドｐＸＷＵ０９３は、Ｃ０６（ＶＬ／ＧＳ４／ＶＨ）ｓｃＦｖをコードするものであった。例として挙げたｓｃＦｖｓ  Ｃ０６（ＶＬ／ＧＳ３／ＶＨ）ｓｃＦｖ（ｐＸＷＵ０９２）およびＣ０６（ＶＨ／ＧＳ３／ＶＬ）ｓｃＦｖ（ｐＸＷＵ０９０）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、図２５Ａおよび２５Ｂ、図２６Ａおよび２６Ｂに示している。
【０６５５】
表１２．従来のＣ０６  ｓｃＦｖのＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチド
2010538012.tif 000026
【０６５６】
従来のＣ０６  ｓｃＦｖを発現させるために、米国特許出願第１１／７２５，９７０号（この内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されているように、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．カタログ番号２７３２５）の新しく単離したコロニーをプラスミドｐＸＷＵ０９０、ｐＸＷＵ０９１、ｐＸＷＵ０９２およびｐＸＷＵ０９３で形質変換させ、集め、培養上澄み液またはペリプラズム抽出物を調製した。Ｃ０６  ＩｇＧを酵素で消化することによって、Ｃ０６  ＦＡｂを調製した。ＦＡｂ精製物を、約２ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。Ｆａｂ濃度を、ε２８０ｎｍ＝１．５ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１を用いて決定した。
【０６５７】
ｃ．従来のＣ０６  ｓｃＦｖ抗体の熱安定性
安定性スクリーニング法として、米国特許出願第１１／７２５，９７０号に記載の熱攻撃試験を用い、熱攻撃後に、Ｃ０６（ＶＬ／ＧＳ３／ＶＨ）ｓｃＦｖ分子およびＣ０６（ＶＨ／ＧＳ３／ＶＬ）ｓｃＦｖ分子の５０％が、抗原結合活性を保持している温度を決定した。
【０６５８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．カタログ番号２７３２５）を、誘導型ａｒａ  Ｃプロモーター制御下、種々のＣ０６  ｓｃＦｖをコードするプラスミドｐＸＷＵ０９０、ｐＸＷＵ０９１、ｐＸＷＵ０９２およびｐＸＷＵ０９３で形質変換させた。形質変換体を、ＳＢ（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ、Ｃａ．カタログ番号Ｓ０１４０）に、０．６％グリシン、０．６％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、０．０２％アラビノースおよび５０μｇ／ｍｌカルベニシリンからなる発現培地で、３０℃で一晩成長させた。遠心分離によって細菌をペレット状にし、上澄みをさらに処理するために集めた。
【０６５９】
熱攻撃後、遠心分離によって凝集物を除去し、処理して透明になった上澄みに残った可溶性ｓｃＦｖサンプルについて、関連する可溶性ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ抗原に対する結合をＤＥＬＦＩＡアッセイによって調べた。９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ、カタログ番号４３７１１１）を、ＰＢＳ中、可溶性ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ抗原１μｇ／ｍｌを用いて、４℃で一晩コーティングし、振とうしながら、ＤＥＬＦＩＡアッセイバッファ（ＤＡＢ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＢＳＡ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．０１％  ＮａＮ３、ｐＨ７．４）を加え、室温で１時間処理してブロックした。このプレートを、ＢＳＡ（洗浄バッファ）を用いず、ＤＡＢで３回洗浄し、試験サンプルをＤＡＢで希釈し、最終濃度が１００μｌになるようにプレートに加えた。このプレートを振とうしながら、室温で１時間インキュベートし、洗浄バッファで３回洗浄し、結合していないｓｃＦｖ分子および機能的に不活性なｓｃＦｖ分子を除去した。結合したｓｃＦｖは、１ウェルあたり、２５０ｎｇ／ｍｌのＥｕ標識した抗Ｈｉｓ６抗体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ、カタログ番号ＡＤ０１０９）を含有するＤＡＢ１００μｌを加え、振とうしながら、室温で１時間インキュベートすることによって検出した。このプレートを洗浄バッファで３回洗浄し、１ウェルあたり、１００μｌのＤＥＬＦＩＡ増幅溶液（ＤＥＬＦＩＡ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ、カタログ番号４００１−００１０）を加えた。１５分間インキュベートした後、ｉｃｔｏｒ  ２（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いたヨーロッパ法（Ｅｕｒｏｐｉｕｍ  ｍｅｔｈｏｄ）によってプレートを計測した。Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）を用いて、種々の勾配を有するＳ字用量−応答曲線をモデルとしてデータを分析した。熱変成曲線の中点から得られた値を、Ｔ５０値と呼ぶが、この値は、生物物理学的に誘導したＴｍ値と等価であるとは解釈されない。
【０６６０】
このアッセイから得た結果から、Ｃ０６（ＶＬ／ＧＳ３／ＶＨ）のＴ５０値が５７．４６℃であり、Ｃ０６（ＶＨ／ＧＳ３／ＶＬ）のＴ５０値は、これよりわずかに低い５５．７１℃であると決定された（図２７）。リンカーの長さだけが異なる構築物のＴ５０値には、意味のある差はなく、Ｃ０６（ＶＬ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ＝３または４（配列番号１８５または１３５）→ＶＨ）ｓｃＦｖという２種類の配向を観察すると、Ｃ０６（ＶＨ→（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ＝３または４（配列番号１８５または１３５）→ＶＬ）ｓｃＦｖよりもわずかに熱的に安定であり、遺伝子操作によってさらに安定化させるため、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー（配列番号１８５）を含有するＣ０６（ＶＬ／ＧＳ３／ＶＨ）（プラスミドｐＸＷＵ０９２）を選択した。
【０６６１】
ｄ．熱安定性が改良したＣ０６  ｓｃＦｖ分子の構築
従来のＣ０６（ＶＬ／ＧＳ３／ＶＨ）ｓｃＦｖ（ｐＸＷＵ０９２）を、表１３に列挙したオリゴヌクレオチドを用いて交換し、所望のアミノ酸を含有する個々の改変体およびライブラリを設計した。表１３では、それぞれのオリゴヌクレオチドは、Ｋａｂａｔ付番システムによるＶＨまたはＶＬの位置での、所望のアミノ酸置換を参照して命名されている。
【０６６２】
表１３．改変体Ｃ０６（ＶＬ／ＧＳ３／ＶＨ）ｓｃＦｖを構築するためのオリゴヌクレオチドおよび原理
2010538012.tif 000027
「原理」は、使用した設計方法を指す。この方法は、米国特許出願第１１／７２５，９７０号に詳しく記載されている。省略語は、以下のとおりである。「ＣＯＭＰ」−コンピュータによる分析、「ＣＯＶＡＲ」−共分散分析、「ＣＯＮＳ」−コンセンサススコアリング、「ＤＥＧＥＮ」−縮重コドン、不明瞭な塩基は、以下の省略語を使用する。Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｂ＝ＣまたはＧまたはＴ（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６１（１）：１３−７（１９８６））。
【０６６３】
突然変異生成反応を行い、個々の形質変換させたコロニーを、深底９６ウェル皿に入れ、処理し、米国特許出願第１１／７２５，９７０号に詳しく記載されている方法にしたがってスクリーニングした。形質変換体を、ＳＢ（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ、Ｃａ．カタログ番号Ｓ０１４０）に、０．６％グリシン、０．６％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、０．０２％アラビノースおよび５０μｇ／ｍｌカルベニシリンからなる発現培地で、３０℃または３２℃で一晩成長させた。
【０６６４】
熱攻撃アッセイを用い、それぞれのライブラリを２個組でスクリーニングした。１個の複製物を処理条件で処理し、第２の上澄みを未処理の標準物質として使用した。熱攻撃後、凝集した物質を遠心分離によって除去し、実施例３に記載したように、可溶性ＩＧＦ−１Ｒ  ＦｃのＤＥＬＦＩＡによってアッセイした。
【０６６５】
Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅソフトウェア（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＡ．）を用い、アッセイデータを加工し、それぞれのクローンについて、参照温度でのＤＥＬＦＩＡ計測数を基準とし、チャレンジ温度で観察したＤＥＬＦＩＡ計測数の比率としてあらわした。親プラスミドの観測値の２倍以上の比率を再現性よく与えるクローンは、ヒットとした。これらのポジティブなクローンに由来するプラスミドＤＮＡを、ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で単離し、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０を再び形質変換させ、第２の熱攻撃アッセイおよびＤＮＡ配列の決定で確認した。
【０６６６】
上述のアッセイの生データおよび確認結果を表１４に示す。本発明の多くの安定化したｓｃＦｖ分子は、従来のＣ０６  ｓｃＦｖ（ｐＸＷＵ０９２）と比較して、結合の活性が改善した（Ｔ５０＞５８℃）。特に、ライブラリの位置ＶＬ４（Ｍ４Ｌ）、ライブラリの位置ＶＬ１５（Ｖ１５Ｎ、Ｖ１５Ｓ、Ｖ１５Ｄ、Ｖ１５Ｉ、Ｖ１５Ｒ、Ｖ１５ＡおよびＶ１５Ｐ）、ライブラリの位置ＶＬ２４（Ｑ２４Ｋ）、ライブラリの位置ＶＬ３０（Ｒ３０Ｔ）、ライブラリの位置ＶＬ５１（Ａ５１Ｇ）、ライブラリの位置ＶＬ７２（Ｓ７２Ｎ）およびライブラリの位置ＶＬ８３（Ｉ８３Ｍ、Ｉ８３Ｖ、Ｉ８３Ｇ、Ｉ８３Ｄ、Ｉ８３Ｑ、Ｉ８３ＥおよびＩ８３Ｓ）に由来するＣ０６  ｓｃＦｖ改変体のＴ５０値は、従来のＣ０６  ｓｃＦｖよりも熱安定性（ΔＴ５０値）が＋３℃〜＋７℃高くなっていた。ライブラリの位置ＶＨ４７（Ｗ４７Ｆ）、ライブラリの位置ＶＨ８３（Ｒ８３ＫおよびＲ８３Ｔ）およびライブラリの位置ＶＨ１１０（Ｔ１１０Ｖ）に由来するＣ０６  ｓｃＦｖ改変体のＴ５０値は、従来のＣ０６  ｓｃＦｖよりも熱安定性が＋４℃〜＋６℃高くなっていた。ライブラリの位置ＶＬ７２（Ｓ７２ＹおよびＳ７２Ｎ）に由来するＣ０６  ｓｃＦｖ改変体のＴ５０値は、それぞれ、従来のＣ０６  ｓｃＦｖよりも熱安定性が＋２℃〜＋５℃高くなっていた。
【０６６７】
安定化する変異ＶＬ  Ｄ７０ＥおよびＶＬ  Ｔ７４Ｓを含有する２種類のＣ０６  ｓｃＦｖ改変体は、ＰＣＲエラーまたはオリゴヌクレオチドプライマーの変異によって偶然に生じたものであり、それぞれ、従来のＣ０６  ｓｃＦｖよりも熱安定性が＋４℃および＋５℃高く、この改変体も含め、さらに分析を行った。
【０６６８】
表１４．Ｃ０６のＶＨおよびＶＬのライブラリ位置、ライブラリ組成、およびスクリーニング結果
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＊ＰＣＲの結果生じた、標的としていない変異
【０６６９】
熱安定性がさらに高い組み合わせを特定するために、安定化する変異であるＶＬ  Ｖ１５Ｎ、ＶＬ  Ｖ１５Ｓ、ＶＬ  Ｔ２０Ｒ、ＶＬ  Ｒ３０Ｎ、ＶＬ  Ｒ３０Ｙ、ＶＬ  Ｇ６３Ｓ、ＶＬ  Ｓ７２Ｎ、ＶＬ  Ｓ７２Ｙ、ＶＬ  Ｓ７７Ｇ、ＶＬ  Ｉ８３Ｇ、ＶＬ  Ｉ８３ＱおよびＶＨ  Ｔ１１０Ｖの種々の置換列からなるプラスミドを構築した。個々の形質変換させたコロニーを、深底９６ウェル皿に入れ、処理し、上述の方法にしたがってスクリーニングした。１個の安定化する変異を含有するＣ０６  ｓｃＦｖタンパク質と、安定化する変異を組み合わせて含むＣ０６  ｓｃＦｖタンパク質について、以下の性質を調べた。（１）Ｔ５０熱攻撃アッセイでの熱安定性、および（２）バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）による、ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対する解離速度（解離定数、すなわちｋｄ）。解離速度を分析するために、ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆｃを、プロテインＡバイオセンサ表面に固定した。３０種類のクローンから得たＣ０６  ｓｃＦｖ改変体を含む培養物の上澄みを、抗原結合性についてスクリーニングし、その後に解離定数分析を行った。固定したＩＧＦ−１Ｒ  Ｆｃに、３００秒かけてｓｃＦｖを結合させた。その後、解離速度を６００秒間アッセイした。製造業者が提供しているソフトウェアを用いて解離定数（ｋｄ）を算出し、この解離速度を、従来のＣ０６  ｓｃＦｖのｋｄと比較した。表１５は、Ｔ５０熱攻撃アッセイおよび解離速度分析の結果をまとめたものである。従来のＣ０６  ｓｃＦｖと比較して、熱安定性が＋８℃〜＋１０℃高い、個々の安定化する変異、および安定化する変異を組み合わせを特定した。ＶＬ１５およびＶＨ１１０の位置で変異を組み合わせたＣ０６（ＶＬ  Ｌ１５Ｓ：ＶＨ  Ｔ１１０Ｖ）、およびＶＬ７７およびＶＬ８３の位置で変異を組み合わせたＣ０６（Ｓ７７Ｇ：Ｉ８３Ｑ）のＴ５０値は、従来のＣ０６  ｓｃＦｖと比較して、熱安定性（Ｔ５０）が＋８〜１０℃高くなっていた。
【０６７０】
安定になるように遺伝子操作されたすべてのＣ０６  ｓｃＦｖを試験し、従来のＣ０６  ｓｃＦｖ（ｐＸＷＵ０９２）と比較して、解離速度は２倍未満になっていた。安定性（高いＴ５０値）および解離速度の性質に基づき、安定になるように遺伝子操作されたＣ０６  ｓｃＦｖであるＭＪＦ０４５を、安定な抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の構築、および産生のための例として選択した。
【０６７１】
表１５．安定化したＣ０６  ｓｃＦｖタンパク質のアミノ酸置換、熱攻撃アッセイから得たＴ５０の結果、および解離速度の決定
Ｔ５０が６６℃以上のタンパク質は、太字で示している。
2010538012.tif 000029
【０６７２】
ｅ．安定化した抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の産生
本発明の安定化したＣ０６  ＶＬ  Ｉ８３Ｅ  ｓｃＦｖ（ＭＪＦ０４５）を用い、図２３に示すような、Ｎ末端ｓｃＦｖ融合物およびＣ末端ｓｃＦｖ融合物として、二重特異性抗体を構築した。Ｃ０６  ＭＪＦ０４５  ｓｃＦｖのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ図２８Ａおよび図２８Ｂに示す。
【０６７３】
ｉ．Ｎ末端抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の構築
上の実施例４に記載のＭＪＦ０４５  Ｃ０６  ｓｃＦｖ  ＤＮＡを用い、米国特許出願第１１／７２５，９７０号に記載されている方法と似た方法を用い、Ｎ末端抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を構築した。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号１８４）リンカーを用い、安定化したＣ０６  ｓｃＦｖを、Ｇ１１  ＩｇＧ  ｌｙｓ（−）重鎖の成熟アミノ末端に接続した。まず、米国特許出願第２００７０２４３１９４号に記載されている抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｇ１１プラスミドから、Ｇ１１  ＩｇＧ  ｌｙｓ  （−）配列をコードするＭｌｕ  Ｉ＋ＢａｍＨ  Ｉ  ＤＮＡフラグメントをサブクローン化することによって、中間体のＮ末端抗ＩＧＦ−１ｒ  ＢｓＡｂの重鎖ベクターを構築した。中間体ベクターであるｐＸＷＵ１１７は、合成によって得た重鎖リーダー配列と、Ｇ１１  ＩｇＧ  ｌｙｓ（−）配列と、その後に、ＩｇＧ１  ＣＨ３のカルボキシ末端にＢａｍＨ  Ｉ部位とを含有していた。次に、表１６に記載したオリゴヌクレオチドプライマーを用い、２段階ＰＣＲ増幅プロトコルを用いて、ＭＪＦ０４５  Ｃ０６  ｓｃＦｖをサブクローン化し、改変した。簡単に説明すると、第１の反応では、安定化したＣ０６  ｓｃＦｖ（ＭＪＦ０４５）をテンプレートとして用い、順方向５’Ｃ０６  ｓｃＦｖ  ＶＬ  ＰＣＲプライマー１３６−Ｆと、逆方向３’Ｃ０６  ｓｃＦｖ  ＶＨプライマー１３６−Ｒ２とを用いて、ＰＣＲ産物を得た。ここで、順方向５’Ｃ０６  ｓｃＦｖ  ＶＬ  ＰＣＲプライマー１３６−Ｆは、Ｍｌｕ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位と、その後に、重鎖シグナルペプチドの最後の３つのアミノ酸をコードする配列と、その後に、Ｃ０６  ｓｃＦｖ  ＶＬのアミノ末端に相補的な配列とを含んでいた。１３６−Ｒ２は、Ｃ０６  ｓｃＦｖ  ＶＨのカルボキシ末端に相補的な配列と、その後に、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号１８４）リンカーの一部分をコードするヌクレオチド配列とを含んでいた。ＰＣＲサイクルを数回繰り返した後、第２の逆方向プライマー１３６−Ｒ１ａをＰＣＲ混合物に加え、さらに２０サイクル反応させた。ここで、逆方向プライマー１３６−Ｒ１ａは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号１８４）リンカーに相補的な配列と、Ｇ１１  ＶＨのＮ末端に相補的な配列と、その後に、内部Ｎｈｅ  Ｉ部位とを含んでいた。
【０６７４】
得られたＰＣＲフラグメントをＭｌｕ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼおよびＮｈｅ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化し、Ｍｌｕ  Ｉ／Ｎｈｅ  Ｉで消化した中間体ベクターｐＸＷＵ１１７に接続した。これにより、安定化したＣ０６  ｓｃＦｖが、２５アミノ酸（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号１８４）リンカーを介し、Ｇ１１抗体ＶＨドメインのアミノ末端に融合した産物が得られた。このコンジュゲートした混合物を利用し、コンピテント細胞であるＥ．ｃｏｌｉ株ＴＯＰ  １０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を形質変換させた。Ｅ．ｃｏｌｉのコロニーがアンピシリン薬物耐性になるように形質変換し、挿入物の存在についてスクリーニングした。ＤＮＡ配列分析を用い、安定になるように遺伝子操作したＣ０６  ｓｃＦｖおよびＧ１１  ＩｇＧを含むＮ末端抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体をコードする最終構築物ｐＸＷＵ１３６の正しい配列を確認した。使用したＧ１１の軽鎖（ｐＸＷＵ１１８）は、抗ＩＧＦ−１ＲのＮ二重特異性抗体およびＣ二重特異性抗体の中で一般的なものであり、図２９ＡにはＤＮＡ配列、図２９Ｂにはアミノ酸配列を示している。安定化したＭＪＦ０４５  ｓｃＦｖを含むＮ末端抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の重鎖ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列（ｐＸＷＵ１３６）を、それぞれ図３０Ａおよび図３０Ｂに示す。
【０６７５】
表１６．安定化したＣ０６  ｓｃＦｖを有する、Ｎ末端抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を構築するためのオリゴヌクレオチド
制限エンドヌクレアーゼ部位は、下線で示した部位である。
2010538012.tif 000030
【０６７６】
ｉｉ．Ｃ末端抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の構築
上の実施例４に記載のＭＪＦ０４５  Ｃ０６  ｓｃＦｖ  ＤＮＡを用い、米国特許出願第１１／７２５，９７０号に記載されている方法と似た方法を用い、Ｃ末端抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を構築した。Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１３８）リンカーを用い、安定化したＣ０６  ｓｃＦｖを、Ｇ１１  ＩｇＧ重鎖のカルボキシ末端に接続した。まず、米国特許出願第２００７０２４３１９４号に記載されている抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｇ１１プラスミドから、Ｇ１１  ＩｇＧ配列をコードするＤＮＡフラグメントをＰＣＲで作成し、サブクローン化することによって、中間体のＣ末端抗ＩＧＦ−１ｒ  ＢｓＡｂの重鎖ベクターを構築した。ＰＣＲ反応は、ＩｇＧ  ＣＨ１定常ドメインに相補的な配列と、クローニングのためのＡｇｅ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位とを含む順方向５’−プライマーＭＢ−０４Ｆ（表１７）と、ＩｇＧ重鎖のカルボキシ末端に相補的な配列と、その後に、フレーム内に、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１３８）リンカーの一部分をコードし、内部にＢａｍＨ  Ｉ部位を含む配列と、その後に、Ｄｒａ  ＩＩＩ部位および末端Ｂｇｌ  ＩＩ部位（表１７）とを含む逆方向３’−プライマー１０６ｍＲ２とを含み、Ｇ１１重鎖をテンプレートとして含んでいた。得られたＰＣＲ産物から、ＩｇＧ重鎖遺伝子の３’末端にある既存の停止コドンを除去し、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１３８）リンカーの一部分をコードするヌクレオチドを加え、このすぐ後に、ＢａｍＨ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位、Ｄｒａ  ＩＩＩ部位を含み、末端にＢｇｌ  ＩＩ部位を含んでいた。ＰＣＲフラグメントを、Ａｇｅ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼおよびＢｇ  ｌＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、Ａｇｅ  Ｉ／ＢａｍＨ  Ｉで消化して改変したｐＶ９０ベクターに接続した。これにより、中間体ベクターｐＸＷＵ１０６ｍ２が得られた。このベクターは、合成によって得た重鎖リーダー配列と、Ｇ１１  ＩｇＧ配列と、内部にＢａｍＨ  Ｉ部位を含有するＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１３８）リンカーの一部分をコードする配列と、その後に、Ｄｒａ  ＩＩＩ部位を含んでいた。
【０６７７】
次いで、安定化したＣ０６  ｓｃＦｖ（ＭＪＦ０４５）から得たＤＮＡ配列を、順方向５’ＶＬ  ＰＣＲプライマー１３５−Ｆ（ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位、次いで、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１３８）リンカーペプチドの残りの一部分をコードする配列と、Ｃ０６  ｓｃＦｖ  ＶＬのアミノ末端とを含んでいる）と、逆方向３’ＶＨ  ＰＣＲプライマー１３５−Ｒ（Ｃ０６  ｓｃＦｖ  ＶＨのカルボキシ末端と、停止コドンと、次いで、ＤｒａＩＩＩ部位とを含んでいる）を用い、ＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲ産物をゲルで単離し、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼおよびＤｒａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＢａｍＨＩ／ＤｒａＩＩＩで消化した中間体ベクターｐＸＷＵ１０６ｍ２に接続した。これにより、安定化したＣ０６  ｓｃＦｖが、１６アミノ酸Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１３８）リンカーを介し、Ｇ１１抗体ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に融合した産物が得られた。このコンジュゲートした混合物を利用し、コンピテント細胞であるＥ．ｃｏｌｉ株ＴＯＰ  １０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を形質変換させた。Ｅ．ｃｏｌｉのコロニーがアンピシリン薬物耐性になるように形質変換し、挿入物の存在についてスクリーニングした。ＤＮＡ配列分析を用い、安定になるように遺伝子操作したＣ０６  ｓｃＦｖおよびＧ１１  ＩｇＧを含むＣ末端抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体をコードする最終構築物ｐＸＷＵ１３５の正しい配列を確認した。
【０６７８】
表１７．安定化したＣ０６  ｓｃＦｖを有する、Ｃ末端抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を構築するためのオリゴヌクレオチド
制限エンドヌクレアーゼ部位は、下線で示した部位である。
2010538012.tif 000031
【０６７９】
使用したＧ１１の軽鎖（ｐＸＷＵ１１８）は、抗ＩＧＦ−１ＲのＮ二重特異性抗体およびＣ二重特異性抗体の中で一般的なものであり、図２９ＡにはＤＮＡ配列、図２９Ｂにはアミノ酸配列を示している。安定化したＭＪＦ０４５  ｓｃＦｖを含むＣ末端抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の重鎖ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列（ｐＸＷＵ１３５）を、それぞれ図３１Ａおよび図３１Ｂに示す。
【０６８０】
ｆ．代替の抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の構築
表１５に列挙したような、安定になるように遺伝子操作したＣ０６  ｓｃＦｖ分子をコードするプラスミドを用い、上述の方法と似た方法を用い、Ｎ末端抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を構築することができる。表１８には、プラスミドの名称と、Ｃ０６  ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬの安定化する変異（Ｋａｂａｔ付番システムによる）とを列挙している。ＶＨおよびＶＬの変異の位置は、Ｃ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＮ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の両方について、図３０Ｂ（Ｎ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体）および図３１Ｂ（Ｃ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体）を配列基準とし、配列の付番にしたがって、全長重鎖配列の中に示している。
【０６８１】
表１８．抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を構築するのに使用した、抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｃ０６  ｓｃＦｖにある、安定化するアミノ酸残基
ＶＨおよびＶＬの安定化する変異の位置は、Ｋａｂａｔ付番号システムによる（Ｋａｂａｔ：）。ＶＨおよびＶＬの変異の位置も、図３０Ｂ（Ｎ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体）および図３１Ｂ（Ｃ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体）をそれぞれ配列基準とし、Ｃ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（Ｃ：）およびＮ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（Ｎ：）の両方について、配列の付番にしたがって、全長重鎖配列の中に示している。
2010538012.tif 000032
ｗｔ＝野生型の配列
【０６８２】
ｇ．熱安定性が改良したＧ１１  ｓｃＦｖ分子の構築
上述の方法および米国特許出願第１１／７２５，９７０号に記載されている方法と似た方法を用い、Ｇ１１  ＩｇＧから調製したｓｃＦｖを、安定になるように遺伝子操作することによって、抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を設計することができる。安定になるように遺伝子操作したＧ１１  ｓｃＦｖを用い、図２３に示すような、Ｎ末端ｓｃＦｖ融合物およびＣ末端ｓｃＦｖ融合物として、全長Ｃ０６  ＩｇＧ重鎖のアミノ末端およびカルボキシ末端にｓｃＦｖを融合させることによって、二重特異性抗体を構築することができる。Ｃ０６軽鎖は、抗ＩＧＦ−１ＲのＮ二重特異性抗体およびＣ二重特異性抗体の中で一般的なものであり、図３２ＡにはＤＮＡ配列、図３２Ｂにはアミノ酸配列を示している。Ｇ１１  ｓｃＦｖおよびＣ０６  ＩｇＧから構築した、抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｎ−二重特異性抗体をコードする重鎖ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の例を、それぞれ図３３Ａおよび図３３Ｂに示す。Ｇ１１  ｓｃＦｖおよびＣ０６  ＩｇＧから構築した、抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｃ−二重特異性抗体をコードする重鎖ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の例を、それぞれ図３４Ａおよび図３４Ｂに示す。
表１９に列挙したオリゴヌクレオチドを用い、従来のＧ１１（ＶＬ／ＧＳ４／ＶＨ）ｓｃＦｖ（ｐＭＪＦ０６０）から、所望のアミノ酸を交換した個々の改変体およびライブラリを、設計した。表１９には、各オリゴヌクレオチドの名称は、ＶＨおよびＶＬの所定の位置での望ましいアミノ酸置換（Ｋａｂａｔ付番システムによる）を参照する。
【０６８３】
表１９．Ｇ１１（ＶＬ／ＧＳ４／ＶＨ）ｓｃＦｖ改変体を構築するための、オリゴヌクレオチドおよび原理
2010538012.tif 000033
「原理」は、使用した設計方法を指す。この方法は、米国特許出願第１１／７２５，９７０号に詳しく記載されている。省略語は、以下のとおりである。「ＣＯＭＰ」−コンピュータによる分析、「ＣＯＶＡＲ」−共分散分析、「ＣＯＮＳ」−コンセンサススコアリング、「ＤＥＧＥＮ」−縮重コドン、不明瞭な塩基は、以下の省略語を使用する。Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｂ＝ＣまたはＧまたはＴ（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６１（１）：１３−７（１９８６））。
【０６８４】
突然変異生成反応を行い、個々の形質変換させたコロニーを、深底９６ウェル皿に入れ、処理し、米国特許出願第１１／７２５，９７０号に詳しく記載されている方法にしたがってスクリーニングした。形質変換体を、ＳＢ（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｈａｌｆ  Ｍｏｏｎ  Ｂａｙ、Ｃａ．カタログ番号Ｓ０１４０）に、０．６％グリシン、０．６％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、０．０２％アラビノースおよび５０μｇ／ｍｌカルベニシリンからなる発現培地で、３０℃または３２℃で一晩成長させた。
【０６８５】
熱攻撃アッセイを用い、それぞれのライブラリを２個組でスクリーニングした。１個の複製物を処理条件で処理し、第２の上澄みを未処理の標準物質として使用した。熱攻撃後、凝集した物質を遠心分離によって除去し、実施例８ｃに記載したように、可溶性ＩＧＦ−１Ｒ  ＦｃのＤＥＬＦＩＡによってアッセイした。
【０６８６】
Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅソフトウェア（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＡ．）を用い、アッセイデータを加工し、それぞれのクローンについて、標準温度でのＤＥＬＦＩＡ計測数を基準とし、チャレンジ温度で観察したＤＥＬＦＩＡ計測数の比率としてあらわした。親プラスミドの観測値の２倍以上の比率を再現性よく与えるクローンは、ヒットとした。これらのポジティブなクローンに由来するプラスミドＤＮＡを、ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で単離し、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０を再び形質変換させ、第２の熱攻撃アッセイおよびＤＮＡ配列の決定で確認した。
【０６８７】
上述のアッセイの生データおよび確認結果を表２０に示す。本発明の多くの安定化したｓｃＦｖ分子は、従来のＧ１１  ｓｃＦｖ（ｐＭＪＦ０６０）と比較して、結合の活性が改善した（Ｔ５０＝５０℃）。特に、ライブラリの位置ＶＬ５０（Ｌ５０Ｇ、Ｌ５０Ｅ、Ｌ５０Ｍ、Ｌ５０Ｎ）、ライブラリの位置ＶＬ８３（Ｖ８３Ｅ）、ライブラリの位置ＶＨ６（Ｅ６Ｑ）およびライブラリの位置ＶＨ５０（Ｓ４９Ａ、Ｓ４９Ｇ）に由来するＣ０６  ｓｃＦｖ改変体のＴ５０値は、従来のＧ１１  ｓｃＦｖよりも熱安定性（ΔＴ５０値）が＋２℃〜＋６℃高くなっていた。
【０６８８】
表２０．Ｇ１１のＶＨおよびＶＬのライブラリ位置、ライブラリ組成、およびスクリーニング結果
2010538012.tif 000034
【０６８９】
熱安定性がさらに高い組み合わせを特定するために、安定化する変異の２種類の置換列からなるプラスミドを構築した。個々の形質変換させたコロニーを、深底９６ウェル皿に入れ、処理し、上述の方法にしたがってスクリーニングした。１個の安定化する変異を含有するＣ０６  ｓｃＦｖタンパク質と、安定化する変異を組み合わせて含むＧ１１  ｓｃＦｖタンパク質について、Ｔ５０熱攻撃アッセイでの熱安定性を調べた。表２１は、Ｔ５０熱攻撃アッセイの結果をまとめたものである。個々の安定化する変異、および安定化する変異を組み合わせたものは、従来のＧ１１  ｓｃＦｖと比較して、熱安定性が＋２℃〜＋１０℃高くなっていることが分かった。ＶＬ５０およびＶＨ６の位置で変異を組み合わせたＧ１１（ＶＬ  Ｌ５０Ｎ：ＶＨ  Ｅ６Ｑ）、およびＶＬ８３およびＶＨ６の位置で変異を組み合わせたＧ１１（ＶＬ  Ｖ８３Ｅ：ＶＨ  Ｅ６Ｑ）のＴ５０値は、従来のＧ１１  ｓｃＦｖと比較して、熱安定性（Ｔ５０）が＋４〜１０℃高くなっていた。
【０６９０】
表２１．安定化したＧ１１  ｓｃＦｖタンパク質のアミノ酸置換、熱攻撃アッセイから得たＴ５０
Ｎ／Ａ＝適用できなかった
2010538012.tif 000035
【０６９１】
表２２には、プラスミドの名称と、Ｇ１１  ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬの安定化する変異（Ｋａｂａｔ付番システムによる）とを列挙している。ＶＨおよびＶＬの変異の位置は、Ｃ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＮ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の両方について、図３３Ｂ（Ｎ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体）および図３４Ｂ（Ｃ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体）を配列基準とし、配列の付番にしたがって、全長重鎖配列の中に示している。
【０６９２】
表２２．抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を構築するのに使用した、抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｇ１１６  ｓｃＦｖにある、安定化するアミノ酸残基
ＶＨおよびＶＬの安定化する変異の位置は、Ｋａｂａｔ付番号システムによる（Ｋａｂａｔ：）。ＶＨおよびＶＬの変異の位置も、図３０Ｂ（Ｎ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体）および図３１Ｂ（Ｃ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体）をそれぞれ配列基準とし、Ｃ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（Ｃ：）およびＮ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（Ｎ：）の両方について、配列の付番にしたがって、全長重鎖配列の中に示している。ｗｔ＝野生型。
2010538012.tif 000036
【０６９３】
ｈ．ＣＨＯ細胞における、抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の安定な発現、抗体の精製および特性決定
プラスミドＤＮＡであるｐＸＷＵ１３５、ｐＸＷＵ１３６およびｐＸＷＵ１１８を利用し、抗体タンパク質を安定に産生するために、ＤＨＦＲを欠いたＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を形質変換した。２ｍＭグルタミンを含有し、１０％の透析した胎児ウシ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を追加したアルファマイナスＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ  ｍｉｎｕｓ  ＭＥＭ  ｍｅｄｉｕｍ）中で形質変換した細胞を成長させ、蛍光標識した抗体を用いて、安定なバルク培養保存液として濃縮し、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を繰り返した（Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２７７（１−２）：１４１−５５（２００３））。ＦＡＣＳを使用し、個々の細胞株も作成した。細胞保存液または細胞株を、無血清状態に適応させ、抗体を産生させるためにスケールアップした。
【０６９４】
バイオリアクターで１０日間反応させ、Ｃ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（ｐＸＷＵ１３５／ｐＸＷＵ１１８）の上澄み５０Ｌを集め、限外濾過によってあらかじめきれいにしておいた。プロテインＡセファロースＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、上澄みから二重特異性抗体を捕捉した。この二重特異性抗体を、０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）を用い、プロテインＡから溶出させ、Ｔｒｉｓ塩基で中和し、さらに精製することなく、ＰＢＳで透析した。ＥｎｄｏＳａｆｅ（Ｒ）ＰＴＣキット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）を用いた、定量的なカイネティック比色ＬＡＬ分析によって、内毒素濃度を測定した。四価モノマー抗体産物の純度および割合を、それぞれ、４〜２０％  Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除ＨＰＬＣ分析で評価した。このプロセスによって、Ｃ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、２８９ｍｇ得られ、濃度５．４ｍｇ／ｍｌ、純度９６．７％であり、残留する内毒素の濃度は、０．６７ＥＵ／ｍｇタンパク質であった。
【０６９５】
図３５Ａは、安定になるように遺伝子操作されたＣ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（ｐＸＷＵ１３５／ｐＸＷＵ１１８）の精製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。還元条件下のレーンは、重鎖タンパク質および軽鎖タンパク質の推定サイズを示す。重要なことに、顕著な量の分解した低分子副生成物または望ましくない低分子副生成物は、検出されなかった。
【０６９６】
図３５Ｂは、安定になるように遺伝子操作されたＣ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（ｐＸＷＵ１３５／ｐＸＷＵ１１８）の精製物のＳＥＣ溶出プロフィールの分析結果を示す。この分析から、安定になるように遺伝子操作されたＣ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の純度は、本質的に９６．７％を超えており、この抗体は、モノマーであり、これより高次の分子量種は含まれていない。
【０６９７】
バイオリアクターで１０日間反応させ、Ｃ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（ｐＸＷＵ１３５／ｐＸＷＵ１１８）の上澄み２５Ｌを集め、を集め、限外濾過によってあらかじめきれいにしておいた。Ｎ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を、Ｃ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重結合性抗体について上に記載したように精製した。四価モノマー抗体産物の純度および割合を、それぞれ、４〜２０％  Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除ＨＰＬＣ分析で評価した。このプロセスによって、Ｎ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、１４０１ｍｇ得られ、濃度９．２ｍｇ／ｍｌ、純度９７．３％であり、残留する内毒素の濃度は、０．０９ＥＵ／ｍｇタンパク質であった。
【０６９８】
図３６Ａは、安定になるように遺伝子操作されたＮ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（ｐＸＷＵ１３６／ｐＸＷＵ１１８）の精製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。還元条件下のレーンは、重鎖タンパク質および軽鎖タンパク質の推定サイズを示す。ここでも、顕著な量の分解した低分子副生成物または望ましくない低分子副生成物は、検出されなかった。
【０６９９】
図３６Ｂは、安定になるように遺伝子操作されたＮ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（ｐＸＷＵ１３６／  ｐＸＷＵ１１８）の精製物のＳＥＣ溶出プロフィールの分析結果を示す。この分析から、安定になるように遺伝子操作されたＣ−抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の純度は、本質的に９７．３％であり、この抗体は、モノマーであり、これより高次の分子量種は含まれていない。
【０７００】
（実施例９．抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の生化学的な特性決定）
ａ．Ｇ１１κ軽鎖およびＧ１１  ＩｇＧ重鎖骨格が、Ｎ末端またはＣ末端で、安定化したＣ０６  ｓｃＦｖに融合している、Ｎ末端抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＢｓＡｂおよびＣ末端抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＢｓＡｂの精製および生化学的／生物物理学的な特性決定
二重特異性ＩｇＧ様抗体（「ＢｓＡｂ」）は、抗体操作分野での産物の産生および品質の問題を幅広く満たす（Ｄｅｍａｒｅｓｔ，Ｓ．Ｊ．、Ｇｌａｓｅｒ，Ｓ．Ｍ．（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．５，Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  Ｉｓｓｕｅ））。ここで、Ｎ末端Ｇ１１  ＩｇＧ１／Ｃ０６  ｓｃＦｖ  ＩｇＧ二重特異性抗体およびＣ末端Ｇ１１  ＩｇＧ１／Ｃ０６  ｓｃＦｖ  ＩｇＧ二重特異性抗体（Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体と呼ぶ、図３７）を構築するために、安定化したＣ０６  ｓｃＦｖを使用すると、取扱いしやすく、高品質で安定な組み換えタンパク質が得られる。
【０７０１】
ｉ．方法
ＢｓＡｂの発現：ＢｓＡｂ重鎖および軽鎖を個々に含有する社内の哺乳動物発現ベクターを、実施例８ｅに記載したように、および米国特許出願第１１／７２５，９７０に記載したように、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ  ＤＧ４４にトランスフェクトした。Ｎ末端ＢｓＡｂおよびＣ末端ＢｓＡｂを産生するＣＨＯ細胞株を、文献に記載されているように単離した（Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙ，Ｓ．Ｃ．Ｇ．、Ｃｈｉａｎｇ，Ｇ．Ｇ．、Ｓｚｉｌｖａｓｉ，Ａ．，Ｍｏｈａｎ，Ｓ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｒ．Ｉ．，ＭａｃＬｅａｎ，Ａ．，Ｓｉｓｋ，Ｗ．およびＴｈｉｌｌ，Ｇ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７７，１４１−１５５）。Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の両方を発現する大スケールのＣＨＯ細胞培養のための方法は、上の実施例８ｅに記載されており、米国特許出願第１１／７２５，９７０に記載されている。ＭＡｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡ親和性樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、あらかじめ中性ｐＨにしておき、この樹脂で捕捉することによって、ＣＨＯ細胞の上澄みから、Ｎ末端ＢｓＡｂおよびＣ末端ＢｓＡｂを分離した。捕捉した物質を、カラム容積の５倍量の０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、タンパク質を、０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）で溶出させた。タンパク質溶出液を、１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基ですぐに中和し、ＰＢＳで透析した。吸光係数１．６Ｌｃｍｇ−１を用い、ＵＶ−Ｖｉｓでタンパク質濃度を決定した。ＥｎｄｏＳａｆｅ（Ｒ）ＰＴＳ  ＬＡＬシステム（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）を用いて、内毒素濃度を測定した。Ｇ１１  ＩｇＧ１抗体を発現するプラスミドを、ＢｓＡｂを産生する前駆体として製造した。Ｇ１１  ＩｇＧ１細胞株を集め、ＢｓＡｂについて記載したように製造時にスケールアップし精製プロトコルは同じであった。
【０７０２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）：Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析ＳＥＣクロマトグラフィーを用い、純度を調べた。各ＢｓＡｂ（５μｇ／ウェル）を、約０．１Ｍ  β−メルカプトエタノール存在下（還元条件下）、および非存在下（非還元条件下）で、Ｎｏｖｅｘ（Ｒ）ＳＤＳ添加用バッファと混合した。サンプルを９５℃で約１０分間加熱し、ＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋＴＭ  Ｍｉｎｉ  ＣｅｌｌおよびＴｒｉｓ−グリシン操作バッファを用い、Ｎｏｖｅｘ（Ｒ）４〜２０％  Ｔｒｉｓグリシンゲルに入れ、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示にしたがって操作した。
【０７０３】
分析ＳＥＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムを用い、１０ｍＭ  ホスフェート、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  ナトリウムアジド、ｐＨ６．８で平衡状態にしたＢｉｏＳｅｐ  ３０００  ３００×７．８ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）ＳＥＣカラムで行った。タンパク質３０〜１００μｇを０．５ｍＬ／分でカラムに入れた。溶出したタンパク質を２８０ｎｍのＵＶ吸収によって検出した。
【０７０４】
円偏光二色性（ＣＤ）分光法：ＣＤ測定は、温度制御のために熱電ペルチェ素子を取り付け、熱を放出させるために外側から水浴につけたＪａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計を用いて行った。近紫外線および遠紫外線でのスキャンは、１μＭタンパク質を用い、それぞれ１ｃｍおよび０．１ｃｍのキュベットを使って行った。スペクトル範囲は、近紫外線の場合、１９７〜２６０ｎｍであり、遠紫外線の場合、２５０〜３２０ｎｍであった。応答時間２秒、データ間隔０．１ｎｍ、幅２ｎｍ（近紫外線）および１ｎｍ（遠紫外線）、連続モード（１００ｎｍ／分）で、１０℃でスキャンした。すべての測定を「高感度」モードで行った。ＰＢＳを用いてバックグラウンドスキャンを行い、すべてのタンパク質のスペクトルのベースラインを補正した。
【０７０５】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）：自動化キャピラリーＤＳＣ（ｃａｐＤＳＣ、ＭｉｃｒｏＣａｌ、ＬＬＣ）を用い、ＤＳＣスキャンを行った。自動付属装置を用いて、９６ウェルプレートから、タンパク質溶液およびリファレンス溶液を自動的にサンプリングした。それぞれのタンパク質をスキャンする前に、２種類のバッファをスキャンし、差分を算出するためのベースラインを規定した。タンパク質を含むすべての９６ウェルプレートを装置内で６℃に保存した。濃縮したＧ１１  ＩｇＧ１タンパク質（３．９ｍｇ／ｍＬ）およびＮ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（それぞれ、９．２ｍｇ／ｍＬおよび５．４ｍｇ／ｍＬ）をＰＢＳで透析した。次いで、サンプルをＰＢＳで、Ｇ１１  ＩｇＧ１濃度が１．０ｍｇ／ｍＬになり、両ＢｓＡｂが１．３ｍｇ／ｍＬになるまで希釈した後、熱量計で等モル量のタンパク質が得られるように実験した。サンプルおよびリファレンスのキャピラリーをＰＢＳで透析し、２種類のバックグラウンドスキャンを行った後、サンプルキャピラリー中の各タンパク質と、不リファレンスキャピラリーのＰＢＳ透析物のスキャンを行った。低フィードバックモード（ｌｏｗ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｍｏｄｅ）で、２℃／分で、１０〜１００℃までスキャンした。製造業者から供給されたＯｒｉｇｉｎソフトウェアを用い、スキャン結果を分析した。次いで、リファレンスのベースラインスキャン結果を引き、三次多項式を用い、ゼロではないタンパク質スキャンベースラインを補正した。
【０７０６】
ｉｉ．結果
実施例８ｅに記載した方法、および米国特許出願第１１／７２５，９７０に記載した方法で、Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を、ＣＨＯ細胞で作成した。それぞれのＢｓＡｂについて、２個の別個のバッチで作成した。１つめは、トランスフェクトされた安定なバルクＣＨＯ細胞保存液から、２つめは、ＢｓＡｂを発現するように選択されたＣＨＯ細胞株から、作成した。安定なバルクプールから精製した物質から、高品質のＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（５Ｌから２０．４ｍｇ）およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（４Ｌから５．６ｍｇ）を得て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣクロマトグラフィー分析によれば、モノマー純度は９８％より高かった（すなわち、非還元条件下でのＢｓＡｂの場合、２００ｋＤａの１個のバンド、還元条件下で、分離した重鎖および軽鎖の場合、それぞれ７５ｋＤａおよび２５ｋＤａのバンド、図３８Ａ、３８Ｂ）。安定なバルク培養物から得たＢｓＡｂは、タンパク質の分子量標準に基づいて、約２００ｋＤａの予想通りの時間に、分析用ＳＥＣカラムから両方とも１本のピークとして高純度で溶出した（図３８Ｃ）。Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を産生するように選択されたＣＨＯ細胞株を、それぞれ２５Ｌおよび５０Ｌまでスケールアップした。両方の製造によって、非還元型および還元型のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析、およびＳＥＣ分析に基づいて、正しい分子量の物質を純度約９７％で得た。５０Ｌの培養物から、Ｃ末端ＢｓＡｂを２８９ｍｇ得て、２５Ｌの培養物から、Ｎ末端ＢｓＡｂを１．４ｇ得た。
【０７０７】
ＢｓＡｂを用いて円偏光二色性（ＣＤ）を測定すると、タンパク質が適切に折りたたまれていることが分かる。Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の遠紫外線ＣＤスペクトルは、ｓｃＦｖを欠いたＧ１１  ＩｇＧ１タンパク質のスペクトルと非常に似ている（図３９Ａ）。この現象は、親分子であるＧ１１  ＩｇＧ１分子のドメインに適したβ−シート傾向を有する、さらなるＩｇが折りたたまれたタンパク質ドメインを、さらなるｓｃＦｖに単に加えただけだと予想される。Ｎ末端ＩＧＦ−１ＲのスペクトルとＣ末端ＩＧＦ−１Ｒのスペクトルが、２１７ｎｍでわずかに異なるのは、融合タンパク質内で、大部分を占めるＧ１１  ＩｇＧ１のＣ型のＩｇ折りたたみ構造と、ｓｃＦｖのＶ型の別のＩｇ折りたたみ構造とで、全体的な平均構造に小さな差があり、この差を反映したものである。近紫外ＣＤスペクトルの信号対雑音比が小さいが、Ｇ１１  ＩｇＧ１およびＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ  ＢｓＡｂおよびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ  ＢｓＡｂのスペクトルは、どれも非常によく似ている（図３９Ｂ）。ＮＵＶシグナルの大部分は、Ｖ型のＩｇ折りたたみ構造およびＣ型のＩｇ折りたたみ構造で正準であり、不変である内部のＴｒｐ残基から生じるものであり、正準なＩｇ折りたたみ構造の内部にあるジスルフィド結合に隣接する同じ位置に埋め込まれている。Ｇ１１  ＩｇＧ１およびＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体のＮＵＶスペクトルは、それぞれの分子に含まれるタンパク質ドメインの性質に基づいて予想されるように、すべてよく似ている。
【０７０８】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）試験によって、Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体にあるすべてのドメインが、適切に折りたたまれており、理想的な（高温での）熱によるアンフォールディング性を有していることが示された。親分子であるＧ１１  ＩｇＧ１分子、およびＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、複数のドメインを有するタンパク質である（図３９Ｃ）。研究により、ＩｇＧ１分子は、３種類の別個のアンフォールディング遷移状態を示すことが多く、１個のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインでそれぞれ１つ、１個の大きくて明らかにＦａｂの４種類のドメインのいくつかが合わさった遷移状態（ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１およびＣＬ、Ｇａｒｂｅｒ，Ｅ．，Ｄｅｍａｒｅｓｔ，Ｓ．Ｊ．（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３５５，７５１−７５７）であることが分かっている。Ｇ１１  ＩｇＧ１は、ヒトＩｇＧ１の場合、伝統的な３つの遷移状態を示す（図３９Ｃ）。Ｎ末端ＢｓＡｂおよびＣ末端ＢｓＡｂも、ＣＨ２、ＣＨ３およびＦａｂドメインの３つの遷移状態を示し、さらに、安定化したＣ０６  ｓｃＦｖドメインのアンフォールディングから生じる、さらに１つの遷移状態を示している（図３９Ｃ）。Ｇ１１  ＩｇＧ１、およびＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体のアンフォールディング曲線は、それぞれ３つ、４つの遷移状態にフィットし、そのデータを表２３に示す。Ｃ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体のＩｇＧ遷移状態は、Ｇ１１  ＩｇＧ１で観察された遷移状態とほぼ同一であり、このことは、安定化したＣ０６  ｓｃＦｖと、融合タンパク質のＩｇＧ１部分との相互作用がほとんどないことを示唆している。さらに、安定化したＣ０６  ｓｃＦｖは、ＴＭが６６℃の１個の遷移状態を有し、アンフォールディングの相対エンタルピーが大きい（表２３）。このｓｃＦｖで測定した１個のアンフォールディング遷移状態から、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、ほぼ同じ温度でアンフォールディングされるか、または一緒にフォールディングされることが示唆される。ｓｃＦｖのＴＭ測定値が高いことから、熱安定性、特に、ｓｃＦｖの熱安定性は、生成物の品質上の問題を引き起こすとは考えられない。Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体のデータは、Ｃ末端ＢｓＡｂの実測値と似ているが、Ｃ０６  ｓｃＦｖのＴＭは、わずかに高めであり、Ｇ１１  ＦａｂのＴＭは、わずかに低めである（表２３）。このデータから、融合タンパク質のｓｃＦｖ領域とＦａｂ領域との間の相互作用は非常に弱いが、生成物の品質上の問題を引き起こすとは考えられない。
【０７０９】
Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ＾２タンパク質の精製物について、２〜８℃で３ヶ月間、ＰＢＳ中で凝集物が蓄積するかどうか監視した。この条件で保存することは、タンパク質試薬なら一般的なことである。多くのタンパク質（特に、安定性が低いか、または可溶性のもの）は、溶液を所定時間保存すると、可溶性の凝集物が蓄積することが分かっている。ここで集めたデータから、Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、きわめて安定であり、３ヶ月の間、実質的に凝集物の徴候はみられなかった（検出限界未満）（表２４）。
【０７１０】
表２３：ＤＳＣで測定した場合の、Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体、およびＧ１１  ＩｇＧ１コントロールタンパク質の熱力学的アンフォールディングパラメータ
2010538012.tif 000037
ａＣ０６  ｓｃＦｖは、本願発明者らのＢＩＩＢプラットフォーム設計／スクリーニング技術を用い、Ｉｌｅ  ８３がＧｌｕに変異した結果（Ｉ８３Ｅ）、安定化された。
【０７１１】
表２４：分析用ＳＥＣで測定した場合の、２〜８℃で３ヶ月間、ＰＢＳ中でのＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の安定性試験
Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、それぞれ、４．５ｍｇ／ｍＬおよび１．７ｍｇ／ｍＬに維持した。
2010538012.tif 000038
【０７１２】
ｂ．（ｉ）等温滴定熱量法（ＩＴＣ）によって測定した、Ｃ０６およびＧ１１  ＭＡｂのＩＧＦ−１Ｒへの結合、および（ｉｉ）Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体のＩＧＦ−１Ｒへの結合
受容体に複数個の阻害性エピトープを組み込むことによって、ＩＧＦ−１Ｒの阻害度を高めるという仮説が成り立つには、それぞれのエピトープが、他の阻害性エピトープを妨害することなく、阻害性の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体によって組み込むことができる必要がある。等温滴定熱量法（ＩＴＣ）を使用し、受容体の異なるエピトープを認識する、阻害性のＣ０６およびＧ１１  ＭＡｂのＩＧＦ−１Ｒへの結合を測定した。実験から、Ｃ０６およびＧ１１  ＭＡｂを、受容体に一緒に組み込むことができることは明らかである。さらに、ＩＴＣ実験を行い、Ｃ末端ＢｓＡｂおよびＮ末端ＢｓＡｂが、ＩＧＦ−１Ｒと強く結合し、予想通りの量論量で受容体を飽和させることが示された。
【０７１３】
ｉ．方法
抗体。Ｃ０６抗体およびＧ１１抗体、およびｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）細胞外ドメインのタンパク質を、米国出願第２００７／０２４３１９４号に記載されるように、製造し、精製した。
【０７１４】
等温滴定熱量法（ＩＴＣ）。Ｃ０６  ＭＡｂ（１００μＭ）、Ｇ１１  ＭＡｂ（６７μＭ）およびｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）（５μＭ）を、抗体／受容体結合実験に使用した。試薬は、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で一緒に透析した。ＰＢＳ透析液を用いて希釈することによって、タンパク質溶液の濃度を上に列挙したように調節した。ＢｓＡｂｓを用いた実験では、２５μＭ  Ｃ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ＾２、３０μＭ  Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ＾２、および２．５μＭ  ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）を使用した。ＭＡｂ結合実験のために、タンパク質溶液を上述のように調製した。すべてのＩＴＣ実験は、ＩＴＣ２００マイクロ熱量計（ＭｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ）で２５℃で行った。それぞれの反応で、反応セルをｈＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）で満たした。ＭＡｂまたはＢｓＡｂがｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に結合するのを観察するために、シリンジをＭＡｂまたはＢｓＡｂに満たし、Ｃ０６  ＭＡｂの場合、１５×１．５μＬを注入し、Ｇ１１  ＭＡｂの場合、１８×２．０μＬを注入し、Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の場合、２０×１．８μＬを注入し、反応セルに滴定した。ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体。それぞれの注入間隔は４分間にして、その間に平衡化させた。初期の遅れは６０秒であった。ＭｉｃｒｏＣａｌ（Ｏｒｉｇｉｎ）によって供給されたＩＴＣデータ分析ソフトウェアを用い、データの数値積分を行った。注入して結合させている間の平均放出熱／吸収熱の違いと、受容体ＩＧＦ−１Ｒが抗体またはリガンドで飽和したときの平均希釈熱とに基づいて、ΔＨＡ°（Ｔ）値を算出した。２５℃で、Ｃ０６およびＧ１１  ＭＡｂ、およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体がＩＧＦ−１Ｒに結合する際の結合親和性は、ＭＡｂｓおよびＣ−ｔｅｒｍ．ＢｓＡｂが、すべての受容体結合部位で飽和状態になる滴定領域で複数の遷移点が存在しないことによって示されるように、ＩＴＣでは高すぎて測定できなかった。
【０７１５】
ｉｉ．結果
等温滴定熱量法を用い、阻害性の抗ＩＧ−１Ｒ  ＭＡｂ、Ｃ０６およびＧ１１が、重複しないエピトープを介して受容体に一緒に組み込まれることが示された。まず、可溶性組み換えＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメインを含有する溶液にＣ０６を滴定し、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）は、典型的な抗体結合曲線を示している（図４０Ａ、４０Ｂ）。ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー／静的光散乱法の両方によって、ダイマーであることが分かった（データは示していない）。ダイマー受容体および二価ＭＡｂは、両方とも、２個の結合部位になり得る部位を含有している。結合の量論量は、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）とＭＡｂとの間の結合部位の当モル数に基づいて予想されるとおり、１：１であった。その後、約２倍過剰のＣ０６  ＭＡｂ存在下、Ｇ１１  ＭＡｂをｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）を含有する溶液に滴定した（図４０Ａ、４０Ｂ）。Ｃ０６  ＭＡｂが存在しても、Ｇ１１  ＭＡｂが受容体に強く組み込まれるのを妨害しなかった。Ｇ１１  ＭＡｂがｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に結合する量論量も、１：１であった。この実験から、Ｃ０６およびＧ１１  ＭＡｂは、ＩＧＦ−１Ｒに一緒に組み込むことができる。
【０７１６】
次に、Ｃ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に滴定した（図４０Ｃ、４０Ｄ）。両方のＢｓＡｂは、受容体に強く結合し、１：１のモル比で飽和状態になった。Ｃ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、結合エンタルピーがきわめて大きく（−５４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、表２５）、Ｃ０６抗体およびＧ１１抗体で測定したエンタルピーの組み合わせに基づいて予想される値よりもかなり大きい。Ｃ０６およびＧ１１  ＭＡｂと同様に、受容体が飽和状態になる繊維領域での滴定点は非常に少なく、このことは、結合が非常に強いことを示唆している（図４０Ｄ）。Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体も、大きなエンタルピーを示した（−４３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、表２５）が、Ｃ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の値よりも小さかった。さらに、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に対するＮ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体ｔｏ  ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）の親和性を規定する遷移領域で、多くの湾曲する点（さらなる滴定点）が存在していた。これにより、見かけ平衡解離定数ＫＤが１１ｎＭであるという測定値が得られた（図４０Ｄ、表２５）。これらの結果から、Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の結合親和性は、Ｃ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の結合親和性よりも低くあり得ることが示唆される。
【０７１７】
ＩＴＣ実験の興味深い態様は、ＢｓＡｂのＩｇＧ１部分にあるＣ０６  ｓｃＦｖまたはＧ１１  Ｆｖのどちらが、受容体に対する結合を互いに遮断しているのかを区別することができないことである。これらが１００％相互に排他的であったとしても、この分子の２個の活性端で観察される量論量は、１：１のままである。しかし、２個の分子の結合親和性の差と、Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の見かけ親和性が弱いということを組み合わせると、Ｎ末端ＢｓＡｂは、すべての結合部位を用いて、ＩＧＦ−１Ｒに完全に結合できることはないと考えられる。結合部分（すなわち、Ｃ０６  ｓｃＦｖおよびＧ１１抗体のＦｖ）は、２個の四価形態で同じであるが、この２個の形態の相対位置／空間は、顕著に異なっている。ｓｃＦｖとＦｖとの間の立体障害によって、Ｃ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体とＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体との結合性にわずかな差が生じると考えることができる。
【０７１８】
表２５：ＩＧＦ−１Ｒが、Ｃ０６およびＧ１１  Ｍａｂに、個々に結合する場合、および組み合わせて結合する場合の熱力学的パラメータ、およびＩＴＣを用いて測定した、Ｃ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の結合パラメータ
2010538012.tif 000039
ａ親和性が高すぎて、正確に測定できない。
ｂ２個の別個の測定値の平均。
【０７１９】
ｃ．溶液系表面プラズモン共鳴を用いた、ＩＧＦ−１Ｒが、（ｉ）Ｃ０６およびＧ１１のＦａｂに、（ｉｉ）Ｃ０６およびＧ１１のＭＡｂに、（ｉｉｉ）Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体に結合する際の量論量および親和性の決定
Ｃ０６およびＧ１１  ＭＡｂは、ＩＧＦ−１Ｒ上にある、異なる重複しないエピトープに結合する。受容体の第１のＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン（ＦｎＩＩＩ−１）ドメインの表面にＣ０６、システインに富む領域（ＣＲＲ）の表面にＧ１１。溶液相結合実験を行い、すべての可能性のある４箇所の結合部位（それぞれのエピトープについて２箇所）を用い、Ｎ末端ＢｓＡｂおよびＣ末端ＢｓＡｂが、ＩＧＦ−１Ｒに結合する能力を観察した。
【０７２０】
ｉ．方法
表面プラズモン共鳴を用い、ＩＧＦ−１Ｒに対するＦａｂ、ＭＡｂおよびＢｓＡｂの結合を平衡状態にする。すべての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて行った。Ｃ０６およびＧ１１  ＭＡｂを、製造業者が提供している標準的なアミン化学プロトコルを用い、標準的なＣＭ５チップ表面に固定した。上述のＭＡｂが高濃度で固定された状態で、低濃度のｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）（＜５０ｎＭ）を流し、線形の物質移動限定結合曲線を導き出した。初期結合速度Ｖｉ（ＲＵ／ｓ）は、チップ表面を流れるｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）溶液の濃度と線形の相関関係にあった。ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）（実施例９ｂ）と、Ｆａｂｓ／ＭＡｂｓ／ＢｓＡｂとの結合の結合定数および量論量を、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）および抗体の混合物を、Ｃ０６またはＧ１１を含有するセンサーチップ表面に流すことによって決定することができる。Ｃ０６およびＧ１１のセンサーチップ表面で、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）および抗体を含む溶液中で、結合していないｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）の濃度を測定する。抗体とｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）との平衡解離定数ＫＤおよび結合量論量を、以下の式を用い、結合していないｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）の濃度によって決定する。
2010538012.tif 000040
式中、Ｖｉ＝初期結合速度、ｍ＝ＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）濃度に依存する標準曲線の傾き、［ＩＧＦ−１］ｆ＝結合していないＩＧＦ−１の濃度、［ＩＧＦ−１］ｔ＝ＩＧＦ−１合計濃度、［Ａｂ］ｔ＝Ｆａｂ／ＭＡｂ／ＢｓＡｂの合計濃度（Ｄａｙ，Ｅ．Ｓ．，Ｃａｃｈｅｒｏ，Ｔ．Ｇ．，Ｑｉａｎ，Ｆ．，Ｓｕｎ，Ｙ．，Ｗｅｎ，Ｄ．，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｍ．，Ｈｓｕ，Ｙ．−Ｍ．，Ｗｈｉｔｔｙ，Ａ．（２００５）。“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ  ａｎｄ  ＡＰＲＩＬ  ｆｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＴＮＦ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＢＡＦＦＲ／ＢＲ３  ａｎｄ  ＢＣＭＡ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４４：  １９１９−１９３１。
【０７２１】
ｉｉ．結果
平衡状態にある溶液相の表面プラズモン共鳴実験を行い、四価ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の４種類すべての結合部位が、適切なエピトープに結合する能力を調べた。それぞれのエピトープに対する結合を試験するために、Ｃ０６およびＧ１１を、異なるセンサーチップ表面に固定し、これを用いて、それぞれ、ｓＩＧＦ−１Ｒ（−１９０３）上にあるＦｎＩＩＩ−１エピトープおよびＣＲＲエピトープが取り除かれるかどうかをプローブした。Ｃ０６表面およびＧ１１表面に対する、可溶性ＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメインの結合を、種々の量のＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体存在下で試験した（図４１Ａ、４１Ｂ）。Ｃ０６およびＧ１１のＭＡｂおよびＦａｂをコントロールとして使用し、抗体：受容体の量論量が、それぞれ、１：１および２：１であることが分かった。Ｃ０６のＭＡｂおよびＦａｂは、Ｇ１１表面がｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に結合するのを阻害せず、Ｇ１１のＭＡｂおよびＦａｂは、Ｃ０６表面がｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に結合するのを阻害しないことを注記しておくことは重要であり、このことは、それぞれの表面によって、上述の表面が、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）上にあるエピトープに接近する性質を排他的に測定することができることを示している。
【０７２２】
この実験の結果から、Ｃ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体のｓｃＦｖアームの両方が、それぞれのＣＲＲエピトープおよびＦｎＩＩＩ−１エピトープに、Ｇ１１およびＣ０６のＭＡｂで観察された親和性と同じ親和性で結合することができることを示す（図４１Ａ、４１Ｂ）。Ｃ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体抗体の阻害曲線は、Ｃ０６  ＭＡｂ  対  Ｃ０６表面およびＧ１１  ＭＡｂ  対  Ｇ１１表面で観察した阻害曲線と同じである。ＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）に対する、ＭＡｂおよびＣ末端ＢｓＡｂの結合量論量は、受容体がホモダイマーであるという事実に基づいて予想されるとおり、１：１である（表２６）。Ｃ０６およびＧ１１のＦａｂは、それぞれのエピトープに対する結合の量論量は、２：１を示し、これも予想されたとおりである（表２６）。Ｆａｂは、低い見かけ親和性を示し、すでに速度論的なｂｉａｃｏｒｅ実験によって測定した親和性と実質的に同一である（表２６）。
【０７２３】
Ｃ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体で観察された結果とは異なり、Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の結果から、上述の分子のＩｇＧ１部分のＣ０６  ｓｃＦｖおよびＧ１１  Ｆｖによる結合は、互いに排他的ではないことが示唆される。Ｎ末端ＢｓＡｂは、受容体を（両方のエピトープ）で飽和状態にし、見かけ量論量は、１．５：１である。この値は、ＭＡｂおよびＦａｂで観察された値の中間である（図４１Ａ、４１Ｂ、表２６）。
【０７２４】
結論として、平衡状態での溶液相表面プラズモン共鳴実験から、Ｎ末端ＢｓＡｂとＣ末端ＢｓＡｂとは、明らかに異なる結合性能を示すことが示される。Ｃ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、理想的な挙動を示し、４つすべての結合部位を、ＢｓＡｂの他の結合部位で結合することによって妨害されることなく、受容体に独立して組み込むことができる。それとは異なり、Ｎ末端ＢｓＡｂは、溶液中で、４つすべての結合部分をＩＧＦ−１Ｒに組み込むことはできない。Ｎ末端形態では、Ｃ０６  ｓｃＦｖとＧ１１  Ｆｖとが非常に近い位置にあり、立体的に障害になっているという可能性がある。
【０７２５】
表２６：Ｃ０６およびＧ１１のＭＡｂおよびＦａｂをコントロールとして使用した、ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の速度論的親和性および平衡状態での（液相）親和性の測定値
2010538012.tif 000041
ａＵＳ  ＰＣＴ  ２００７／０２４３１９４：抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体およびその用途に記載
ｂ複合体／多相での結合速度論。
【０７２６】
ｄ．溶液系表面プラズモン共鳴を用いた、ＩＧＦ−１Ｒが、（ｉ）Ｃ０６およびＧ１１のＦＡｂに、（ｉｉ）Ｃ０６およびＧ１１のＭＡｂに、（ｉｉｉ）Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体に結合する際の量論量および親和性の決定
上述の実施例４に記載したように、重複しないエピトープを認識する、複数の阻害性抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を組み合わせると、１個のモノクローナル抗体では達成できない高いレベルでリガンドをブロックすることができる。２種類の阻害性抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の活性を１個のタンパク質構築物内で組み合わせるために、本願発明者らは、Ｇ１１抗体の競合的なリガンドブロック挙動と、Ｃ０６抗体のアロステリックなブロック活性とを組み合わせた、四価二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）を作成した。ＢｓＡｂは、ＩｇＧ１形態で、Ｃ０６抗体に由来する安定化したｓｃＦｖ形態が、Ｇ１１抗体のＮ末端またはＣ末端に組み換えによって融合したものからなる（図３７）。米国特許出願第２００８／００５０３７０号「Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」に記載されているように、ｓｃＦｖの安定化は、高品質の四価ＩｇＧ様二重特異性抗体または多価抗体を製造することを可能にするプロセスである。この実施例のデータは、Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、１個のモノクローナル抗体よりも高い程度に、リガンドをブロックすることを示している。
【０７２７】
ｉ．方法
リガンドのブロック性。実施例４に記載の、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２をブロックするＥＬＩＳＡを用い、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２をブロックするＭＡｂおよびＢｓＡｂの能力を決定した。このアッセイ中のＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の濃度は、それぞれ３２０ｎＭおよび６４０ｎＭであった。Ｃ０６およびＧ１１のＭＡｂ、およびＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体のブロック能力の、リガンド濃度に対する依存性を観察するために、異なるリガンド濃度でアッセイを行った。２０ｎＭ、８０ｎＭ、３２０ｎＭまたは１３００ｎＭのＩＧＦ−１、または４０ｎＭ、１６０ｎＭ、６４０ｎＭまたは２６００ｎＭのＩＧＦ−２を用い、個々のブロッキングＥＬＩＳＡを行った。ＩＧＦ−２は、受容体への親和性がわずかに低いため、ＩＧＦ−２濃度は、高めであった。ＥＬＩＳＡ曲線の線形領域内に入るように、本願発明者らは、ＩＧＦ−１に匹敵する結果を得るために、ＩＧＦ−１ブロッキングＥＬＩＳＡよりも高い濃度のＩＧＦ−２で、アッセイを行う必要があった。
【０７２８】
ｉｉ．結果
Ｃ０６抗体およびＧ１１抗体、およびＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を、ＩＧＦ−１は３２０ｎＭ、ＩＧＦ−２は６４０ｎＭの濃度で使用し、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２のブロッキングＥＬＩＳＡ（図４２Ａ〜Ｂ）で同時に試験した。Ｎ末端ＢｓＡｂおよびＣ末端ＢｓＡｂは、より親和性が高い抗体であるＣ０６に匹敵する、約１ｎＭのＩＣ５０値を有していた。Ｃ０６抗体およびＧ１１抗体の両方は、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が、１００ｎＭ未満の濃度ではＩＧＦ−１Ｒに結合するのを完全には妨害しなかった（図４２Ａ〜Ｂ）。Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は両方とも、低い濃度（１０ｎＭ未満、図４２Ａおよび４２Ｂ）でも、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が、上述の受容体に結合するのを完全に排除することができた。
【０７２９】
アッセイで使用するリガンド濃度が高くなると、ヒト抗体Ｃ０６は、ＩＧＦ−１ブロック活性をいくらか失う（すなわち、ＩＧＦ−１Ｒに結合可能なＩＧＦ−１の割合は、受容体がＣ０６で飽和状態にある場合、リガンド濃度が上がるにつれて、上がっていく、図４３Ａ）。これは、Ｃ０６が、純粋にアロステリックな阻害剤だからである。Ｇ１１抗体は、リガンド濃度の上昇に対して異なる応答をする。競合的な阻害剤として、ヒト抗体Ｇ１１は、受容体に結合するリガンドと直接競合しなければならない。リガンド濃度が高くなるにつれて、Ｇ１１抗体の見かけの効力は低下する（図４３Ｂ）。リガンド存在下、アロステリックな部位で受容体に結合する能力と、アロステリックな機序および競合的な機序の両方を用いて阻害する能力とを組み合わせることによって、ＢｓＡｂは、リガンドの濃度に関係なくＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が、受容体に結合することを完全に妨害することができる（図４４Ａ〜Ｄ）。さらに、Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ＾２抗体およびＣ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ＾２抗体の両方で測定したＩＣ５０値は、アッセイで使用したリガンドの濃度とは無関係であり、このアッセイでＣ０６抗体について測定したＩＣ５０値と等価である。
Ｃ末端ＩＧＦ−１Ｒ  ＢｓＡｂ：ＩＣ５０  ＩＧＦ−１ブロッキング＝２．０±０．３
Ｃ末端ＩＧＦ−１Ｒ  ＢｓＡｂ：ＩＣ５０  ＩＧＦ−２ブロッキング＝１．７±０．２
Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ  ＢｓＡｂ：ＩＣ５０  ＩＧＦ−１ブロッキング＝１．４±０．２
Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ  ＢｓＡｂ：ＩＣ５０  ＩＧＦ−２ブロッキング＝２．７±０．９。
【０７３０】
これらの結果から、Ｃ０６およびＧ１１の阻害性エピトープの両方を認識する能力によって、Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、すべてのリガンド濃度で、標準的なヒト抗体Ｃ０６およびＧ１１よりも大きくリガンドをブロックする。
【０７３１】
ｅ．Ｃ０６およびＧ１１のＭＡｂ、およびＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体による、ＩＧＦ−１Ｒの架橋
ＩＧＦ−１Ｒに対して異なる阻害性抗体を識別し得る特徴の１つは、細胞表面にある受容体と架橋する能力である。多くの受容体チロシンキナーゼファミリーの成員は、リガンドが介在するホモ二量化またはヘテロ二量化を介して、シグナル伝達する。しかし、ＩＧＦ−１Ｒ（およびインスリン受容体）は、この機序でシグナル伝達しない。ＩＧＦ−１Ｒは、構成的なホモダイマーであり、シグナル伝達は、二量化とは無関係の、リガンド結合による構造変化に依存する。
【０７３２】
ＩＧＦ−１Ｒのいくつかの抗体は、内在化および分解を介し、受容体を下方制御する能力を示している。架橋は、細胞表面のタンパク質内在化の効率と関係があることが多い（例えば、ＦｃεＲＩは、架橋によって内在化する）。このように、架橋は、細胞表面のタンパク質（この場合、ＩＧＦ−１Ｒ）に対する抗体の活性に顕著な影響を与えることがある。さらに、細胞表面にあるＩＧＦ−１Ｒの架橋度は、抗体が介在しており、この架橋度は、ＦｃγＲ受容体または相補体に対する、抗体のＦｃ領域の結合に影響を与え、宿主の免疫系に対する抗体の活性に影響を与え得る。
【０７３３】
ここで、本願発明者らは、ＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメインの可溶性態様とともにインキュベートした場合、Ｃ０６およびＧ１１のＭＡｂによって、溶液中で異なる大きさのＩＧＦ−１Ｒ／ＭＡｂ免疫複合体が得られることを示している。本願発明者らは、Ｃ０６およびＧ１１のＭＡｂを、ＩＧＦ−１Ｒを含む溶液に同時に導入することによって得られる複合体も観察する。最後に、本願発明者らは、Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体によって形成される免疫複合体の性質も観察する。
【０７３４】
ｉ．方法
インライン静的光散乱法を用いる、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。（ｉ）Ｃ０６ＭＡｂ、（ｉｉ）Ｇ１１  ＭＡｂおよび（ｉｉｉ）ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）、（ｉｖ）Ｃ０６  ＭＡｂおよびｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）の二元混合物、または（ｖ）Ｇ１１  ＭＡｂおよびｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）の二元混合物、または（ｖｉ）Ｃ０６  ＭＡｂ、Ｇ１１  ＭＡｂおよびｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）の三元混合物を用いて、ＳＥＣサンプルを調製した。すべてのサンプルには、各タンパク質が２５μｇ含まれており、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で最終容積が５０μＬになるまで希釈した後、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムを用い、１０ｍＭ  ホスフェート、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  ナトリウムアジド、ｐＨ６．８で平衡状態にしたＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ  ＸＬ、５ｍｍ、２５０Å分析用ＳＥＣカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＳＥＭカラムに注入した。ＳＥＣカラムから溶出する物質の光散乱データを、インライン屈折率測定器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を取り付けたｍｉｎｉＤＡＷＮ静的光散乱検出器で集めた。光散乱データを、製造業者から提供されたＡＳＴＲＡ  Ｖソフトウェアで分析した。
【０７３５】
さらなるＳＥＣサンプルを、（ｉ）Ｃ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）、（ｉｉ）Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ  ＢｓＡｂ、および（ｉｉｉ）ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）；または、（ｉｖ）Ｃ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ  ＢｓＡｂおよびｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）の複合体、または（ｖ）Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ  ＢｓＡｂおよびｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）の複合体を用いて調製した。実験で使用するｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）およびＢｓＡｂの量は、それぞれ、３０μｇおよび４５μｇである。すべてのサンプルは、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で最終容積が５０μＬになるまで希釈した後、ＳＥＣ／静的光散乱分析を行った。
【０７３６】
ｉｉ．結果
ＳＥＣ／静的光散乱法によって、Ｃ０６およびＧ１１のＭＡｂの単離物と、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）単離物は、すべてのタンパク質が、予想通りの分子量を表すことを示す（抗体について、１５０ｋＤａ、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）について、約２５０ｋＤａ、図４５Ａ）。Ｇ１１  ＭＡｂとｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）とで形成される複合体は、分子量の実測値８４０ｋＤａに基づき、４分子体をとりやすいと考えられる（Ｇ１１  ＭＡｂが２分子、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）が２分子）（図４５Ａ）。Ｃ０６  ＭＡｂは、可溶性ＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメインと、もっと大きな複合体を形成する（２ＭＤａ、図４５Ａ）。Ｃ０６およびＧ１１  ＭＡｂが、可溶性受容体細胞外ドメインに同時に導入され、四元混合物を形成する場合、この免疫複合体の平均的な大きさは、劇的に増加し、１０ＭＤａよりも大きくなり、本願発明者らの測定可能な範囲を大きく超える（図４５Ａ）。このことは、細胞表面に存在するＩＧＦ−１Ｒに対する重複しないエピトープを認識する２個の抗体を加えることによって、新規な架橋が生成し、潜在的に下方制御する方向に進む可能性がある。
【０７３７】
Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の混合物と、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）とを、ＳＥＣ／静的光散乱法でも試験した（図４５Ｂ）。単離の状態で、ＢｓＡｂｓおよびｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）は、すべて、予想通りの分子量を示している（ＢｓＡｂの場合、約２１０ｋＤａ、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）の場合、約２５０ｋＤａ）。興味深いことに、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）と複合体を形成すると、ＢｓＡｂは、Ｇ１１  ＭＡｂで測定した場合と同様サイズの複合体を生じる（Ｃ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ  ＢｓＡｂ／ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）複合体の場合、約１．０ＭＤａ、Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ  ＢｓＡｂ／ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）複合体の場合、約１．３ＭＤａ）。ＢｓＡｂｓとｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）とがよく似た分子量を有するため、本願発明者らは、この試験だけでは、免疫複合体の実際の組成（すなわち、免疫複合体のＢｓＡｂ  対  ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）分子の数）が、Ｇ１１  ＭＡｂで観察した場合と似ているかどうかを決定することができなかった。
【０７３８】
結論として、本願発明者らは、Ｃ０６およびＧ１１のＭＡｂｓによって、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）タンパク質との非常に異なる免疫複合体が得られ、ＭＡｂの組み合わせによって三元混合物が得られ、それによって免疫複合体の大きさが非常に大きくなることを示す。Ｃ０６抗体およびＧ１１抗体を二重特異性形態に変換しても、ＢｓＡｂに対してＩＧＦ−１Ｒが結合した際に、免疫複合体の複雑さおよび大きさが増加していくわけではない。興味深いことに、おそらく立体構造の影響に起因して、ＢｓＡｂによって形成される複合体は小さく、別のＧ１１  ＭＡｂで観察されたものと似ている。
【０７３９】
（実施例１０．ＩＧＦ−１Ｒの２個の異なるエピトープを標的とするＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の機能活性）
この実施例でまとめた実験結果から、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の２個の異なるエピトープに対する二重特異性抗体が、１種類の特異性を有する抗体よりも生体活性が高く、インビボでの抗腫瘍活性が改良しているという生物学的な原理および概念の証明が得られる。
【０７４０】
Ｃ０６およびＧ１１は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の結合をブロックするＩＧＦ−１Ｒに存在する別個の２個のエピトープを、それぞれ、アロステリック効果による機序、および競合的な機序で標的とする２個の阻害性抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体である。Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせによって、リガンドのブロック性が高まり、腫瘍細胞の成長阻害度が高まる。したがって、２種類の二重特異性抗体Ｎ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（Ｇ１１  ＩｇＧ１骨格を有し、Ｉ８３Ｅ変異を有するＣ０６  ｓｃＦｖを用いた、Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ＾２）およびＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（Ｇ１１  ＩｇＧ１骨格を有し、Ｉ８３Ｅ変異を有するＣ０６  ｓｃＦｖを用いた、Ｃ末端ＩＧＦ−１Ｒ）を、ＩＧＦ−１Ｒ上に存在するＣ０６エピトープおよびＧ１１エピトープの両方を標的とする１個の二重特異性分子として構築した。Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせによるＩＧＦ−１Ｒの２個の別個の阻害性エピトープ、または１個の二重特異性薬剤、Ｎ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を標的とする生物学的効果を、以下のアッセイで評価し、本明細書に記載の実施例にまとめた。ＩＧＦ−１Ｒリン酸化の阻害；ＩＧＦ−１Ｒ下方制御の誘発；ＡＫＴおよびＭＡＰＫの阻害；ＳＦＭおよび血清での細胞成長阻害、±ＩＧＦ；ＡＤＣＣ活性；足場に依存しない成長の阻害；ＳＪＳＡ−１腫瘍のインビボでの成長阻害；およびマウスでのＰＫ試験。
【０７４１】
ａ．Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせ、または１個の薬剤の二重特異性抗体を用い、ＩＧＦ−１Ｒの２個の別個の阻害性エピトープを標的にすると、１個のモノクローナル抗体よりも効果的に、ＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害した
２種類のＩＧＦ−１Ｒエピトープを標的とすることがＩＧＦ−１Ｒリン酸化に与える影響について、Ｃ０６／Ｇ１１の組み合わせ、またはＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を用いて細胞を処理して、評価した。簡単に説明すると、ヒト非小細胞肺癌に由来するＨ３２２Ｍ細胞を、１２ウェル培養プレートに播種し、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、番号３０００Ａ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で一晩成長させた。細胞を無血清条件下に２４時間おき、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭのＣ２Ｂ８（抗ＣＤ２０、ＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、Ｃ０６、Ｇ１１、Ｃ０６／Ｇ１１の組み合わせ、またはＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体で、３７℃で１時間処理し、１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１および１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−２（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号２９１−Ｇ１、番号２９２−Ｇ２）で２０分間刺激した。細胞溶解バッファ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｒ６０ＴＸ−３）で細胞タンパク質を抽出した。溶解物中のタンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２３２２７）で測定し、等量のタンパク質をＮＵＰＡＧＥ  ４〜１２％  Ｔｒｉｓ−Ｂｉｓゲルで分離し、Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ膜（孔径０．４５μｍ）に移した。抗−ホスホ−ＩＧＦ−１Ｒ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号３０２１および３０２４）および抗−全−ＩＧＦ−１Ｒ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号３０２７）でブロットをプローブで調べ、ヤギ抗−ウサギ−ＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１１−０３５−００３）で検出した。Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３４０９５）でブロットを染色し、ＢｉｏＲａｄ’ｓ  ＶｅｒｓａＤｏｃ  ５０００造影システムで、化学発光画像を捕捉した。図４６Ａに示されるように、Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせ、およびＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、Ｃ０６単独またはＧ１１単独よりも、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を強く阻害した。興味深いことに、Ｇ１１およびＣ０６を組み合わせると、１個の抗体よりも、ＩＧＦ−１Ｒ全体を効果的に下方制御するが、Ｃ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせと比べて、ＩＧＦ−１Ｒを下方制御するのにそれほど効果的ではないと考えられる。Ｃ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、上述の組み合わせと匹敵するレベルでＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害しつつ、ウェスタンブロットで決定されるような受容体の下方制御は同程度ではないという事実は、ＩＧＦ−１Ｒリン酸化に対するＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の阻害活性が高いことが、すでに示したＩＧＦ１／２リガンドのブロック度が増加していること主に起因していることを示す。Ａ５４９非小細胞肺癌細胞およびＮ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体についても同様の結果が見られ、（データは示していない）、２個の１種類の抗体の組み合わせまたは１個の二重特異性抗体を用い、��ＧＦ−１Ｒの２個のエピトープを標的にすると、腫瘍細胞において、１個のモノクローナル抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体よりも効果的に、ＩＧＦ−１Ｒを活性化することができることを示唆している。
【０７４２】
ｂ．Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせ、または１個の薬剤の二重特異性抗体を用い、ＩＧＦ−１Ｒの２個の別個の阻害性エピトープを標的にすると、ＩＧＦ−１Ｒの下方制御を効率よく誘発した
実施例１０ａに示すように、細胞を抗体で処理すると、１時間以内に、Ｇ１１およびＣ０６の組み合わせによって、１個の抗体よりも、ＩＧＦ−１Ｒ全体を効果的に下方制御した。本願発明者らは、Ｃ０６／Ｇ１１の組み合わせおよびＢｓＡｂの、所定の実験時間中に、ＩＧＦ−１Ｒの塊を分解する能力についてさらに観察した。Ｈ３２２Ｍ細胞を１２ウェル培養プレートに播種し、１５μｇ／ｍｌのＣ０６、Ｇ１１、Ｃ０６とＧ１１との組み合わせ、Ｃ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体またはＮ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体で、１時間、４時間または２４時間処理した。細胞タンパク質を抽出し、ＮＵＰＡＧＥ  ４〜１２％  Ｔｒｉｓ−Ｂｉｓゲルで分離し、実施例１０ａに示すようにＮｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ膜に移した。ブロットを抗−全−ＩＧＦ−１Ｒでプローブし、二次抗体を抗−ウサギ−ＩｇＧ−ＨＲＰに接続し、Ｐｉｅｒｃｅ製のＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔで染色した。図４６Ｂは、処理１時間後に、Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせ、およびＮ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、１個の抗体より効果的にＩＧＦ−１Ｒの分解を促進し、その一方、Ｃ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、１個の抗体で処理するのと同程度まで、ＩＧＦ−１Ｒを分解した。しかし、抗体を加えて４時間後および２４時間後、すべての抗体の処理で、細胞の大部分のＩＧＦ−１Ｒが分解され、１個の抗体、すなわちＣ−ＢｓＡｂで処理した細胞と、Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせ、すなわちＮ−ＩＧＦ−１Ｒで処理した細胞との間で、残留ＩＧＦ−１Ｒの量はほとんど変わらなかった。
【０７４３】
さらに、本願発明者らは、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別法）によって、種々の抗体処理条件を用い、ＩＧＦ−１Ｒ内在化速度を試験した。Ｈ３２２Ｍ細胞を、１０％  ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で４８時間成長させた。次いで、細胞を１００ｎＭのＣ２Ｂ８（アイソタイプネガティブコントロール）、Ｃ０６、Ｇ１１、Ｃ０６とＧ１１との組み合わせ、Ｎ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を用い、氷上で１時間インキュベートし、細胞表面のＩＧＦ−１Ｒを抗体で標識させた。内在化を防ぐために、氷上で、細胞サンプルを各抗体で染色し、このときをゼロ時間とした（ｔ＝０）。このサンプルを１００％Ａｂに結合したコントロールとして使用した。抗体で染色した細胞の残りを、成長培地で１時間、４時間または２４時間培養した。それぞれのインキュベート時間が終了したら、細胞解離バッファ（Ｇｉｂｃｏ，  ｃａｔａｌｏｇ  ＃１３１５１−０１４）で細胞をフラスコから取り出し、氷上で、０．１％ナトリウムアジド／１％ＢＳＡ  ＰＢＳ溶液（ＦＡＣＳバッファ）を加えて内在化を止めた。ＦＡＣＳバッファ中、ＰＥ標識した二次Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ、カタログ番号１０９−１１６−０８８；２．５μｇ／ｍｌ）で細胞を１時間染色し、細胞表面に残った抗体を検出した。細胞を２％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＥＭＳ）；カタログ番号１５７１０）で固定した。次いで、サンプルをＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）で処理し、蛍光平均（ＭＦＩ）を決定した。処理から１時間後、４時間後、または２４時間後に、細胞表面に残った各抗体で標識したＩＧＦ−１Ｒのフラクションを、ゼロ時間でのＭＦＩを基準とし、各時間点でのＭＦＩの割合として算出した。図４７Ａに示したように、Ｃ０６とＧ１１との組み合わせによって、受容体の内在化速度がわずかに速くなり、一方、全体的には、すべてのＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ＩＧＦ−１Ｒの内在化をきわめて効率よく誘発し、抗体で処理して２４時間後には、表面ＩＧＦ−１Ｒの減少率が７０％を超えた。まとめると、これらの試験から、Ｇ０６とＧ１１との組み合わせは、モノクローナル抗体よりも効率よくＩＧＦ−１Ｒを下方制御するが、モノクローナル抗体および二重特異性抗体を含むすべての抗体が、最終的には、ＩＧＦ−１Ｒをきわめて効果的に下方制御（内在化し、分解）することができる。
【０７４４】
ｃ．Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせ、または１個の薬剤の二重特異性抗体を用い、ＩＧＦ−１Ｒの２個の別個の阻害性エピトープを標的にすると、１個のモノクローナル抗体よりも効率よく、ＡＫＴ生存シグナル伝達経路およびＭＡＰＫ増殖シグナル伝達経路の両方を阻害した
下流にあるシグナル伝達事象（例えば、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのリン酸化）に与える影響について、Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせ、またはＩＧＦ−１Ｒの２個のエピトープを標的とする二重特異性抗体を用いて試験した。０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭのＣ２Ｂ８、Ｃ０６、Ｇ１１、Ｃ０６／Ｇ１１の組み合わせ、またはＮ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体で、細胞を１時間処理した後、実施例１０ａに示すように、１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１およびＩＧＦ２で２０分間刺激した。ＡＫＴのリン酸化は、製造業者のプロトコルにしたがって、ｐ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ  ４７３）ＭＳＤキット（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｋ１５１００Ｄ）を用いて定量化した。簡単に説明すると、ＭＳＤキットで細胞を細胞溶解バッファに溶解し、電極で、抗−ホスホ−ＡＫＴ抗体でコーティングしたプレートに、等量のタンパク質を加え、ＭＳＤ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ試薬で標識した抗−全ＡＫＴ抗体を用い、リン酸化ＡＫＴを検出し、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００で、電気化学発光を読み取った。式［１−（Ａｂ−ＳＦＭ）／（ＩＧＦ−ＦＭ）］×１００％によって、阻害率を算出した。図４８に示すように、Ｈ３２２Ｍ細胞（図４８Ａ）、Ａ５４９細胞（図４８Ｂ）およびＢｘＰＣ３細胞（図４８Ｃ、膵臓癌）において、Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせ、Ｃ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＮ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体で、すべて、ＡＫＴリン酸化の阻害度が高くなった。Ａ５４９細胞では、Ｎ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、Ｃ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体よりもわずかに活性が低いことが示され、このことは、異なる構造を有する２つの二重特異性抗体が、異なる機能を有し得ることを示唆している。ＥＲＫリン酸化を決定するために、実施例１０Ａに記載したのとよく似たプロトコルにしたがって、抗−ホスホ−ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号９１０１）および全ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号９１０２）を用いたウェスタンブロッティングを実施した。図４７Ｂから、ＥＲＫのリン酸化が、Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせ、およびＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体によって、Ｃ０６単独またはＧ１１単独よりも効果的に阻害されることが分かった。Ｃ０６／Ｇ１１の組み合わせ、またはＮ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体で、ＩＧＦ−１Ｒの２個のエピトープを標的にすると、ＥＲＫのリン酸化の阻害度が高まるという同様の結果が、ＢｘＰＣ３細胞で観察された。これらの結果は、二重特異性抗体または抗体の組み合わせを用いて、ＩＧＦ−１Ｒに存在する２個の別個のエピトープを標的にすると、ＩＧＦ−１Ｒ経路に感受性の腫瘍において、ＩＧＦ−１Ｒの下流にあるシグナル伝達（例えば、ＡＫＴ生存シグナル伝達および／またはＥＲＫ増殖シグナル伝達）を強力に阻害し、抗腫瘍活性を高めることを支持している。
【０７４５】
ｄ．Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせ、または１個の薬剤の二重特異性抗体を用い、ＩＧＦ−１Ｒの２個の別個の阻害性エピトープを標的にすると、１個のモノクローナル抗体よりも、種々の腫瘍の細胞成長阻害度が高まった
本願発明者らは、細胞生存アッセイを用い、異なる成長条件下で、モノクローナル抗体Ｃ０６およびＧ１１の影響と比較して、Ｃ０６／Ｇ１１の組み合わせ、Ｎ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、異なる由来を有する腫瘍の細胞成長に与える影響を調べた。
【０７４６】
まず、膵臓癌ＢｘＰＣ３細胞、非小細胞肺癌Ｈ３２２Ｍ細胞およびＡ５４９細胞、および扁平上皮癌Ａ４３１細胞を、９６ウェル培養プレートに、５０００〜８０００細胞／ウェルで播種し、血清を含む通常の培地で一晩成長させ、無血清培地に細胞を移し、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭのＣ２Ｂ８、Ｃ０６、Ｇ１１、Ｃ０６／Ｇ１１の組み合わせ、またはＮ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を追加した培地で培養し、１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を加え、さらに３日間培養した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７１）でＡＴＰ濃度を測定することによって、細胞の生存率を決定した。図４９から、ＢｘＰＣ３細胞（図４９Ａ）、Ｈ３２２Ｍ細胞（図４９Ｂ）、Ａ４３１細胞（図４９Ｃ）およびＡ５４９細胞（図４９Ｄ）において、Ｎ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体、Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせは、すべて、Ｃ０６単独およびＧ１１単独と比較して、抗腫瘍成長活性が高くなった。興味深いことに、試験したほとんどの細胞株で、Ｎ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、Ｃ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体よりもわずかに活性が低いことが示され、この２種類の二重特異性分子の構造−機能相関関係における可能性のある差を再び強調しておく。
【０７４７】
さらに生理学的に関連のある条件下で、抗体の抗腫瘍細胞成長効果をさらに試験するために、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭの種々の抗体、および２００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１およびＩＧＦ２を追加した培地を含有する１０％血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ  カタログ番号ＳＨ３００７１．０３）で細胞を３日間成長させた後、上述のように細胞生存率を決定した。図５０に示しているように、ＢｘＰＣ３細胞（図５０Ａ）、Ａ５４９細胞（図５０Ｂ）、骨肉腫ＳＪＳＡ−１細胞（図５０Ｃ）および結腸癌ＨＴ−２９細胞（図５０Ｄ）で、ＩＧＦ−１Ｒ＾２およびＣ０６／Ｇ１１の組み合わせの活性が、同程度高くなった。さらに、上述の血清を含有する細胞成長条件で、細胞培地にＩＧＦ１またはＩＧＦ２を追加せずに抗体を試験した。図５１は、ＩＧＦ−１Ｒ２およびＣ０６／Ｇ１１の組み合わせが、Ａ５４９細胞（図５１Ａ）およびＨ３２２Ｍ細胞（図５１Ｂ）の血清による細胞成長において、Ｃ０６単独およびＧ１１単独と比較して、抗腫瘍細胞成長活性が高いことを示している。一貫して、Ｃ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、試験した種々の腫瘍細胞において、Ｎ−ＩＧＦ−１Ｒ＾２よりも抗腫瘍活性が高く、特にＨ３２２Ｍ細胞およびＡ５４９細胞で顕著であった。
【０７４８】
まとめると、これらの結果から、Ｃ０６およびＧ１１を組み合わせて、または二重特異性抗体を用いて、ＩＧＦ−１Ｒに存在する２個の別個のエピトープを標的にすると、種々の細胞成長条件下で、１個のモノクローナル抗体と比較して、抗腫瘍細胞成長活性が高まったことが分かる。
【０７４９】
ｅ．Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせ、または１個の薬剤の二重特異性抗体を用い、ＩＧＦ−１Ｒの２個の別個の阻害性エピトープを標的にすると、腫瘍細胞の周期を止めた
ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達は、細胞の生存および細胞周期の進行にとって重要である。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ＩＧＦによって誘発される腫瘍細胞の細胞周期の進行に与える影響を、ＦＡＣＳによる分析を用いて評価した。ＢｘＰＣ３細胞を、６ウェルプレートに４×１０５細胞／ウェルで播種し、５％  ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で一晩培養した。次いで、細胞を無血清条件下に２４時間おき、１５μｇ／ｍｌのＣ２Ｂ８、Ｃ０６、Ｇ１１、Ｃ０６／Ｇ１１の組み合わせ、またはＮ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体存在下、１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ  １およびＩＧＦ−２でさらに２４時間処理した。プレートから細胞をはがし、あらかじめ冷却しておいた７０％エタノールで固定した。固定した細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｐ３５６６）染色溶液（２０μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中）を用い、室温で３０分間染色した後、ＤＮＡ成分をＦＡＣＳ分析した。ＦｌｏｗＪｏ  ７．７．２ソフトウェアを用い、Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期の細胞の相対的な割合をヒストグラムで算出した。図５２は、無血清状態では（図５２Ａ）、６０％を超える細胞がＧ０／Ｇ１期であるが、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２による刺激（図５２Ｂ）で、Ｇ０／Ｇ１期の細胞の割合は、約４０％にまで顕著に低下し、Ｓ期の細胞の割合が約２倍に増えた。すべての抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、Ｓ期の細胞の割合を減らしつつ、Ｇ０／Ｇ１期の細胞の割合を増やすことによって、ＩＧＦ刺激の影響を逆行させることができた。Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせ、およびＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、Ｓ期へと進む腫瘍細胞の細胞周期の進行をブロックし、Ｇ０／Ｇ１期で細胞周期を止めることに最も有効であると考えられる。
【０７５０】
ｆ．Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせ、または１個の薬剤の二重特異性抗体を用い、ＩＧＦ−１Ｒの２個の別個の阻害性エピトープを標的にすると、ＡＤＣＣ活性を誘発しない
Ｍ１３−Ｃ０６は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示さないことが分かっていた。Ｃ０６／Ｇ１１の組み合わせ、および二重特異性抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ＡＤＣＣを誘発する能力を５１Ｃｒ放出ＡＤＣＣアッセイで試験した。ＩＧＦ−１Ｒ発現量が多い３２２Ｍ細胞を、５１Ｃｒで１時間標識し、次いで、洗浄し、組み込まれていない５１Ｃｒを除去した。標識化した標的細胞を、２０μｇ／ｍｌのＣ０６、Ｇ１１、Ｎ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が入ったウェルに１×１０４細胞／ウェルで加えた。エフェクター細胞を０．１〜１０のＥ：Ｔ比で加えた。３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで４時間インキュベートした後、標的細胞から放出された５１Ｃｒを、Ｉｓｏｄａｔａ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて測定した。自然放出は、培地のみを含む標的細胞からのものであり、最大放出は、洗剤であるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００存在下で、標的細胞からのものであった。以下の式を用いて、細胞溶解率（％）を算出した。（ｃｐｍサンプル放出−ｃｐｍ自然放出）  ／  （ｃｐｍ最大放出  −  ｃｐｍ  自然放出）。図５３Ａに示しているように、Ｃ０６、Ｇ１１、Ｎ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体のすべての抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ネガティブコントロール抗体としてよく似た活性を示し、細胞溶解率は２０％未満であった。一方、ポジティブコントロールである抗−ＥＧＦＲ抗体は、Ｅ：Ｔ比１０で、細胞溶解が誘発され、約６０％の細胞溶解率であった。このデータは、二重特異性抗体またはＣ０６／Ｇ１１の組み合わせを用い、ＩＧＦ−１Ｒの２個のエピトープを標的にすると、モノクローナル抗体Ｃ０６およびＧ１１のＩｇＧ１態様で観察されるのと同様に、ＡＤＣＣ活性を促進しないことが示されている。この結果は、すべての上述の抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、ＩＧＦ１−Ｒの下方制御を効率よく誘発し、効率的な抗体−ＮＫ細胞の組み込みのために、不十分な表面受容体を生じるという事実と一致している。この結果は、上述の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の抗腫瘍活性が、受容体のシグナル伝達をブロックする能力および生体機能に依存し、ＡＤＣＣには依存しないことを明確に示している。
【０７５１】
ｇ．Ｃ０６およびＧ１１の組み合わせ、または１個の薬剤の二重特異性抗体を用い、ＩＧＦ−１Ｒの２個の別個の阻害性エピトープを標的にすると、足場に依存しない腫瘍細胞の成長阻害度が高まった
足場に依存しない成長は、新生物の形質変換の特徴である。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、足場に依存しない成長を阻害する能力を評価するために、軟質寒天コロニー形成アッセイを２４ウェル培養プレートで行った。まず、０．６％寒天（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ５４３１−２５０Ｇ）の底部層を、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｒ１１４５）で調製し、１０％胎児ウシ血清（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３０００Ａ）を注ぎ、固化させた。次いで、１０％  ＦＢＳおよび１５μｇ／ｍｌのＣ０６、Ｇ１１、Ｎ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体、Ｃ０６／Ｇ１１の組み合わせまたはＣＥ９．１（抗−ＣＤ４、ＩｇＧ１アイソタイプネガディブコントロール抗体、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）を含有する培地中、０．３％寒天の上部層と、５００００細胞／ウェルのＡ５４９細胞とを混合し、これを３８〜４２℃に温度を制御した状態で注いだ。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで２〜３週間インキュベートした後、３０μｍより大きいコロニーを自動化哺乳動物細胞コロニーカウンタ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｏｐｔｒｏｎｉｘ  ＧＥＬＣＯＵＮＴ）で計測した。図５３Ｂは、それぞれの抗体処理条件で得られたコロニーの数を示し、軟質寒天中、すべての抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、足場に依存しない腫瘍細胞の成長を強く阻害したが、Ｎ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ０６／Ｇ１１の組み合わせは、Ｃ０６単独またはＧ１１単独と比較して、阻害効果はわずかに高かった。この結果から、ＩＧＦ−１Ｒの２個のエピトープを組み合わせて標的にすると、モノクローナル抗体よりも、インビボでの腫瘍の形成および成長を有効に阻害することが示唆される。
【０７５２】
ｈ．Ｃ０６およびＧ１１を組み合わせて、ＩＧＦ−１Ｒの２個の別個の阻害性エピトープを標的にすると、インビボで腫瘍の成長がより大きく阻害された
ＳＪＳＡ−１骨肉腫モデルを用い、Ｍ１３−Ｃ０６およびＧ１１を組み合わせて、または１種類の薬剤として、抗腫瘍活性をインビボで試験した。５×１０６  ＳＪＳＡ−１細胞を２０％マトリゲルに入れ、ヌードマウス（８〜１０週齢）の脇腹領域に皮下注射した。１５日目に、腫瘍のあるマウスを無作為に４つのグループに分けた（ｎ＝８）。治療開始時に、各グループの平均腫瘍容積は、約１５０ｍｍ３であった。マウスに、１週間に１回、合計３回、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４Ｐ．ａｇｌｙ（１５ｍｇ／ｋｇ）、Ｇ１１．Ｇ４Ｐ．ａｇｌｙ  （１５ｍｇ／ｋｇ）、Ｃ０６．Ｇ４Ｐ．ａｇｌｙとＧ１１．Ｇ４Ｐ．ａｇｌｙ（１５ｍｇ／ｋｇ＋１５ｍｇ／ｋｇ）、またはコントロール抗体ＩＤＥＣ１５１（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。週に２回腫瘍を測定し、腫瘍の大きさは、Ｖ＝Ｌ＊Ｗ２／２で算出した。図５４は、異なる治療計画での腫瘍成長曲線を示す。Ｍ１３−Ｃ０６およびＧ１１は、両方とも、コントロールＩＤＥＣ１５１と比較して、１種類の薬剤としても、腫瘍の成長を顕著に低下させることが示されたが、Ｃ０６とＧ１１とを組み合わせると、Ｃ０６単独またはＧ１１単独よりも、腫瘍の成長が顕著に強く阻害された。ＳＪＳＡ−１肉腫モデルおよび他のモデルにおいて、二重特異性抗体の抗腫瘍活性をインビボで試験し、Ｇ１１単独およびＣ０６単独の場合よりも、Ｃ０６とＧ１１とを組み合わせた方が良好であると予想される。
【０７５３】
ｉ．フローサイトメトリーによって、Ｃ０６およびＧ１１のモノクローナル抗体が、ヒト癌細胞に結合するのを、Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、ヒト癌細胞に結合するのと比較する
ヒト癌細胞株に対する抗体の結合について、生物学的関連性および治療学的関連性が潜在的に大きくなるシステムに対し、細胞によるフローサイトメトリー分析を行い、二重特異性抗体の生物物理学的特性をさらに分析した。関連するモノクローナル抗体と比較した場合に、ヒト癌細胞株の複合体表面に存在する標的抗原およびエピトープに対する二重特異性抗体の結合特性の分析によって、この二重特異性抗体の固有の特異性をさらに規定する機会が与えられる。
【０７５４】
細胞株。この試験で分析した細胞株は、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（ＮＣＩから得た、ヒト非小細胞肺癌細胞株）、ＮＣＩ−ＭＣＦ−７（ＮＣＩから得た、ヒト乳腺腺癌細胞株）およびＡ４３１（ＡＴＣＣから得た、ヒト上皮癌）であった。細胞を、分析２４時間前に継代し、通常の過程で、８０％コンフルエントの状態にしておいた。ＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ  番号１１８７５）および１０％胎児ウシ血清（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ）を含有する完全成長培地で、全ての細胞株を成長させた。細胞株は、通常の過程で、継代数は２０を超えないようにした。
【０７５５】
ヒト癌細胞に対する抗体の結合の、フローサイトメトリー分析。細胞解離バッファ（Ｇｉｂｃｏ  カタログ番号１３１５１−０１４）で細胞をはがし、計測し、洗浄し、５×１０６細胞／ｍｌになるように調節した。細胞（２．５×１０５；５０ｕＬ）を、丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  番号３７９９）の各ウェルに加えた。精製した抗体を、濃度３００ｎＭから始め、ＦＡＣＳバッファで段階的に３．２倍希釈（ｈａｌｆ−ｌｏｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）した。アッセイ中使用したＦＡＣＳバッファは、５％  ＦＢＳを含有するＰＢＳ（Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まない）であった。サンプルを氷上で３０分間インキュベートし、２００ｕＬ  ＦＡＣＳバッファで３回洗浄し、４℃で１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。Ｃ２Ｂ８（リツキシマブ、ＩｇＧ１）をネガティブコントロールとして使用した。上澄みを吸引し、ＰＥがコンジュゲートした親和性精製済Ｆ（ａｂ’）２フラグメントに特異的なヤギ抗−ヒト−ＩｇＧ二次検出抗体１００μｌ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ、カタログ番号１０９−１１６−０９７；１：２００希釈で使用）またはＰＥがコンジュゲートした親和性精製済Ｆｃに特異的なマウス抗−ヒト−ＩｇＧ二次検出抗体（Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  カタログ番号Ｉ−１２７；５ｕＬ／１×１０６細胞に希釈）を、ＦＡＣＳバッファでそれぞれの対応するウェルに加えた。サンプルを氷上でさらに３０分間インキュベートし、光があたらないように覆った。細胞を上述のように洗浄し、死んだ細胞を除外するために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有するＦＡＣＳバッファ１００μｌに再び懸濁させた（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５１−６６２１１Ｅまたは５５６４６３；ＦＡＣＳバッファで最終的に１：５００で使用）。ＦＡＣＳＡｒｒａｙフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用い、サンプルを３つ組で分析し、サンプルあたり５０００個の生存細胞のデータを集めた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン５．０を用い、データを分析した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，１１４５２  Ｅｌ  Ｃａｍｉｎｏ  Ｒｅａｌ，番号２１５、米国カリフォルニア州サンディエゴ  ９２１３０）。
【０７５６】
結果。抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（Ｃ末端形態およびＮ末端形態）、および関連するモノクローナル抗体が、ヒト癌細胞株に結合するのを、フローサイトメトリーで分析した。Ｃ０６モノクローナル抗体およびＧ１１モノクローナル抗体は、非小細胞肺癌の細胞株Ｈ３２２Ｍ（図５５）に対し、顕著に用量依存性の結合を示し、観察した両抗体の結合の最大半量は、１ｎＭ未満であった（図５５Ａ：Ｃ０６  ＥＣ５０  ０．２０ｎＭ、Ｒ２  ０．９８；Ｇ１１  ＥＣ５０  ０．４４ｎＭ、Ｒ２  ０．９９；図５５Ｂ：Ｃ０６  ＥＣ５０  ０．２５ｎＭ、Ｒ２  ０．９７；Ｇ１１  ＥＣ５０  ０．７２ｎＭ、Ｒ２  ０．７５）。Ｎ末端二重特異性抗体であるＧ１１−Ｃ０６ｓｃＦｖ（Ｎ−ｔｅｒｍ）は、このアッセイで、Ｃ０６モノクローナル抗体およびＧ１１モノクローナル抗体の両方とよく似た細胞結合特異性を示した（図５５Ａ：Ｇ１１−Ｃ０６ｓｃＦｖ（Ｎ−ｔｅｒｍ）ＥＣ５０  ０．４７ｎＭ、Ｒ２  ０．９７；図５５Ｂ：Ｇ１１−Ｃ０６ｓｃＦｖ（Ｎ−ｔｅｒｍ）ＥＣ５０  ０．４８ｎＭ、Ｒ２  ０．９６）。しかし、Ｃ末端二重特異性抗体であるＧ１１−Ｃ０６ｓｃＦｖ（Ｃ−ｔｅｒｍ）は、１種類のモノクローナル抗体（Ｃ０６およびＧ１１）だけではなく、Ｎ末端二重特異性抗体とも比較して、全体的に顕著に大きな結合性を示した。ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株およびＡ４３１ヒト小細胞肺癌細胞株の分析でも、同様の結果が得られた（データは示されていない）。
【０７５７】
結合の測定値が、第２の試薬が、モノクローナルに結合する能力と、二重特異性抗体に結合する能力との差を反映してしまう可能性、または異なる二重特異性抗体の形態（例えば、Ｎ末端融合物  対  Ｃ末端融合物）に結合する能力を反映してしまう可能性を除外するため、ヒトＦａｂまたはヒトＦｃγのいずれかに対する独立した第２の試薬を用い、モノクローナル抗体および二重特異性抗体の結合を評価した（それぞれ、図５５Ａおよび５５Ｂ）。対応するモノクローナル抗体だけではなく、Ｎ末端二重特異性抗体とも比較して、Ｃ末端二重特異性抗体の結合性が高くなっていることを、二次試薬を用いて観察した。したがって、この結果は、実測値の差が、腫瘍細胞に対する抗体の結合の差を反映しており、一次モノクローナル抗体および二重特異性抗体に対する二次抗体試薬の結合の差を反映しているという結論を支持している。
【０７５８】
これらの結果から、Ｇ１１−Ｃ０６ｓｃＦｖ（Ｃ−ｔｅｒｍ）二重特異性抗体が、二重特異性抗体が誘導されるいずれかのモノクローナル抗体の結合とは明確に異なる様式でヒト癌細胞に結合していることを示す。それに加えて、Ｎ末端二重特異性抗体と比較した場合の、Ｃ末端二重特異性抗体の結合特性の差は、二重特異性抗体の特定の構造が、ヒト癌細胞の結合に影響を与えることを示している。
【０７５９】
（実施例１１．マウスにおける、インビボでのＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の活性）
ａ．薬理学的速度論
単回投薬の薬理学的速度論（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）（ＰＫ）に関する試験を行ない、異種移植モデルでの効力試験のために、用量を選択する目的で腫瘍ではないマウスで二重特異性Ａｂの安定性を評価した。ＣＢ１７  ＳＣＩＤメスマウスに、７．４ｍｇ／ｋｇのＧ１１、１０ｍｇ／ｋｇのＣ０６、Ｎ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体またはＣ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を投薬した。投薬後の種々の時間点で、マウスを殺し、心臓穿孔によって採血し、血清を回収するために分離した。試験すべき時間点は、投薬後の以下の時間点である。０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、６時間および２４時間、２日、４日、７日、９日、１１日および１４日。血清サンプルを採取したらすぐ凍結させ、後で抗体が存在するかどうかをＥＬＩＳＡで試験した。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｅｒｍａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．、カタログ番号３４５５）を、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０４０−０１）で、４℃で一晩コーティングし、次いで、ＰＢＳ中、１％の脱脂粉乳および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で、室温で１時間ブロックした。血清サンプルを段階的に希釈し、コーティングしたプレートに入れ、１時間インキュベートし、検出抗体であるヤギ抗−ヒトκ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  カタログ番号２０６０−０５）で、室温でさらに１時間インキュベートした。既知の濃度のコントロール抗体を、正常なマウス血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カタログ番号Ｓ−２５）で１：２５に段階的に希釈し、標準曲線を作成した。インキュベートの間に洗浄した。ＴＭＢ基質（３．３’，５．５’−テトラメチルベンジジン、ＫＩＲＫＥＧＡＡＲＤ  ＆  ＰＥＲＲＹ  ＬＡＢＳ、カタログ番号５０−７６−００）を加えることによってプレートを染色し、Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。マイクロプレートリーダ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用い、各ウェルのＯＤ（光学密度）を４５０ｎｍで測定した。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏを用いてデータを分析し、マウス血清中のヒト抗体の濃度を、標準曲線から決定した。図５６は、１回投薬した後１４日間の、マウス血清中のＧ１１、Ｃ０６、Ｃ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の濃度（図５６Ａ）およびＮ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の濃度（図５６Ｂ）を示す。このデータは、Ｎ−ＩＧＦ−１Ｒ  ＢｓＡｂ分子およびＣ−ＩＧＦ−１Ｒ  ＢｓＡｂ分子は共に、両方ともインビボで非常に安定であり、Ｇ１１およびＣ０６とよく似た速度で排泄される。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ＰＫ分析に基づいて、Ｃ０６、Ｇ１１、Ｃ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＮ−ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の半減期（Ｔ１／２）は、それぞれ、約１８．８、約１０．６、約１１および約７．５日である。長い半減期は、ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、ＩｇＧと同様に、インビボ効力試験に適した薬物動態を有しており、モノクローナル抗体と似た投薬計画での癌治療用途で有望であることを示唆している。
【０７６０】
ｂ．結合活性の調節
１つ以上のｓｃＦｖ部分を抗原認識ドメインとして使用する、ＩｇＧに似たＢｓＡｂを製造する研究が多く報告されている（Ｑｕ，Ｂｌｏｏｄ，１１１：２２１１−２２１９（２００８）；Ｌｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：１９６６５−１９６７２（２００６））。この研究では、ＢｓＡｂ物質は、標的に対する活性を失なうか、またはインビトロ腫瘍細胞増殖／活性アッセイを用いて見出されるインビボでの分子活性を繰り返さない。ここで、本願発明者は、Ｇ１１  ＩｇＧ１骨格が、安定化したＣ０６  ｓｃＦｖに融合した抗−ＩＧＦ−１Ｒ  ＢｓＡｂが、マウスにＩＰ注射してから１週間の間に、Ｃ０６エピトープおよびＧ１１エピトープの両方と結合する能力について試験した。
【０７６１】
ｉ．方法
表面プラズモン共鳴を用い、ＩＧＦ−１Ｒの複数のエピトープに対する、平衡状態にあるＢｓＡｂ（血清中）の結合。すべての実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて行った。Ｃ０６およびＧ１１のＭＡｂを、製造業者が提供する標準的なアミン化学プロトコルを用い、標準的なＣＭ５チップ表面の２個の異なるフローセル表面に別個に固定した。これらの高くＭｂの固定濃度において、低濃度のｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）が流れ（５０ｎＭ未満）は、初期の結合速度Ｖｉ（ＲＵ／ｓ）が、チップ表面を流れるｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）溶液の濃度と線形の相関関係にある、線形の物質移動限定結合曲線をもたらした。ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）と、Ｎ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体との結合の量論量は、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）およびＢｓＡｂ（血清から段階的に希釈）の混合物を、Ｃ０６  ＭＡｂ、Ｇ１１  ＭＡｂを含有するセンサーチップ表面、または標準的なＮＨＣ／ＥＤＣ固定化化学を用いて活性化した後、エタノールアミンでブロックしたブランク表面に流すことによって決定した。Ｃ０６およびＧ１１のセンサーチップ表面で、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）およびＢｓＡｂを含む溶液中で、結合していないｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）の濃度を測定する。ＢｓＡｂと各ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）エピトープとの結合量論量ｎを、以下の式を用い、結合していないｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）の濃度によって決定した。
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式中、Ｖｉ＝初期結合速度、ｍ＝ＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）濃度に依存する標準曲線の傾き、［ＩＧＦ−１Ｒ］ｆ＝結合していないＩＧＦ−１の濃度＝Ｖｉ／ｍ、［ＩＧＦ−１Ｒ］ｔ＝ＩＧＦ−１合計濃度、および［ＢｓＡｂ］ｔ＝ＢｓＡｂの合計濃度（Ｄａｙ  ２００５）。ＢｓＡｂのストック濃度（血清中）を、ＢｓＡｂ  ＰＫの実施例に記載しているように、ＥＬＩＳＡで決定した。
【０７６２】
ｉｉ．結果
どちらかのＢｓＡｂを１０ｍｇ／ｋｇマウスに注射し、このマウスから集めた血清中の、インタクトな／活性なＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の量を、溶液Ｂｉａｃｏｒｅ測定を用いて、１時間、６時間、２４時間および１６８時間に評価した。Ｇ１１エピトープおよびＣ０６エピトープの両方に対して全能力で結合する能力について、ＢｓＡｂの活性を測定した。ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）（３０ｎＭ、社内の細胞外ドメイン試薬）を使用したそれぞれの血清サンプルを、３０ｎＭ  ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）溶液で段階的に希釈した。Ｃ０６を固定したセンサーチップ上およびＧ１１を固定したセンサーチップ上に上述のサンプルを流し、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）がセンサーチップ表面に結合する能力をＢｓＡｂがブロックする能力を検出した。ＰＫ試験の２週間の期間は、血清の濃度が、本願発明者らのＢｉａｃｏｒｅ法を用いて結合活性／量論量を正確に決定できる濃度よりも下がっていることが予想されるため、活性を測定しなかった。
【０７６３】
Ｃ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、１週間にわたって、血清中を循環した後も、完全な活性を保持していると考えられた。図５７に示しているように、Ｃ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＮ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は両方とも、すべての時間点で似た阻害曲線を示しており、ＩＧＦ−１Ｒに対する二重特異性抗体の精製物の量論量および親和性を調べた上述の実施例で測定した曲線と似ている。この曲線の傾きは、実験誤差の範囲内ですべて同様であり、生成物の分解傾向も見られなかった（表２６）。Ｃ末端ＢｓＡｂは、完全に活性であると考えられ（すなわち、もっと低い濃度（Ｃ−ｔｅｒｍ．四価分子の４つの結合部位が活性である濃度）でも、ｓＩＧＦ−１Ｒ（１−９０３）を阻害することができる、表２６）。Ｎ末端ＢｓＡｂの量論量は、１：１（すなわち、ｎ＝１．０）を示さず、Ｃ０６表面およびＧ１１表面に対し、それぞれｎ＝１．３および１．６であった（表２６）。興味深いことに、この結果は、上の実施例のタンパク質精製物で得た結果の繰り返しであり、このことは、Ｎ−ｔｅｒｍ．ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の精製物でさえ、そのすべての結合部位に完全に組み込まれることはないということを示唆している。したがって、タンパク質精製物の活性に基づくと、Ｎ末端ＢｓＡｂ分子は、一連の試験時間の間に、検出できるインビボでの活性の低下を示さない。結論として、安定化したＣ０６  ｓｃＦｖを含有するＮ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体およびＣ末端ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体は、血清中で１週間経過した後も、マウスにおいて完全な活性を保持していると考えられる。
【０７６４】
表２６．Ｃ０６エピトープまたはＧ１１エピトープのいずれかに結合するＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の平衡状態での（溶液相）量論量の測定
2010538012.tif 000043
【０７６５】
（実施例１２．二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を用いる、ヒト癌の治療）
この実施例は、上皮および非上皮（例えば、肉腫、リンパ腫）の悪性細胞を標的とする二重特異性抗−ＩＧＦ−１Ｒ抗体（ＩＧＦ−１Ｒ＾２）を用いる、癌（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ発現が、ｍＲＮＡまたはタンパク質の濃度で検出可能な過剰増殖性障害）を治療する方法を記載している。
【０７６６】
腫瘍を患っているマウスを、２種類の抗ＩＧＦ１−１Ｒ抗体（Ｃ０６およびＧ１１）で治療すると、Ｃ０６単独またはＧ１１単独と比較した場合、抗腫瘍活性が高まる。この観察結果と、インビトロで示された生体活性の向上に基づき、この実施形態で記載した抗ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（Ｎ態様およびＣ態様）は、複数の上皮、非上皮（例えば、肉腫）および悪性血液疾患（例えば、リンパ腫、多発性骨髄腫）において、１種類の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Ｃ０６およびＧ１１を含む）と比較して、抗腫瘍活性が高くなることを示すことが予期される。
【０７６７】
ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体の抗腫瘍活性の向上が、ＩＧＦ−１Ｒ経路に感受性の腫瘍（腫瘍の成長および生存のために、ＩＧＦ−２／ＩＧＦ−１Ｒオートクリン軸に依存するものを含む）において予期される。ＩＧＦ−１Ｒ経路に感受性の腫瘍の例としては、乳癌、非小細胞肺癌（腺腫内癌および非腺腫内癌）、小細胞肺癌、前立腺癌、直腸癌、頭頸部癌（扁平上皮）、肝細胞癌、膵癌、胃腸癌、腎細胞癌、腎芽細胞腫、膀胱癌、黒色腫、副腎皮質癌、多形性膠芽腫、肉腫（７０種類を超える異なる型、Ｅｗｉｎｇ肉腫、脂肪肉腫、滑膜肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、線維肉腫、神経芽細胞腫、頭蓋咽頭腫）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫（Ｂ細胞およびＴ細胞）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）および他の白血病（Ｂ細胞およびＴ細胞）およびホジキン病が挙げられる。ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、１種類の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体に対して高く応答することが知られている種類の腫瘍だけではなく、モノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体治療にわずかに応答するか、または応答がより少ない種類の腫瘍にも、より大きな抗腫瘍活性を示すことも予期される。ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、多くの腫瘍のＡｋｔ生存経路を有効に阻害する能力は、この実施例で記載したＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体が、強力なＡｋｔ阻害剤であり、癌治療において、他の態様のＡｋｔ拮抗作用よりも、好ましいアンタゴニストになり得ることを示す。
【０７６８】
特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体（−Ｃ末端および−Ｎ末端）を精製し、注射に適した医薬ビヒクルを用いて配合する。過剰増殖性障害のヒト患者は、静脈内注入によってＩＧＦ−１Ｒ二重特異性抗体を体重１ｋｇあたり１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｋｇ／ｍｇの範囲で複数回投薬される。疾患が進行しているか、または死が観察されるまで、１週間に１回、または２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回投薬を行う。投薬間隔は、一連の治療中に診断する予後指標によってさまざまに変わり得る。それぞれの適応症のための治療標準（化学療法、放射線治療、他の標的化治療、外科的切除）の前、指示と同時、または指示の後に抗体を投与してもよい。以下のうちの１つ以上のパラメータ、すなわちＣＴスキャンで測定した腫瘍の縮小／新しい病変（腫瘍）の発生回数の減少、ＦＤＧ−ＰＥＴスキャンで測定した糖吸収に与える影響（代謝応答）、疾患の予後を評価するのに使用する予後バイオマーカーの調節）を評価することによって、治療が抗腫瘍応答もたらしたかどうかを決めるために、患者を観察する。
【０７６９】
（等価物）
当業者は、過度ではない通常の実験を行うことによって、本発明に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を見出すであろう。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
2010538012.tif 000045
【図２】
2010538012.tif 000046
【図３】
2010538012.tif 000047
【図４】
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【図５】
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【図６】
2010538012.tif 000050
【図７】
2010538012.tif 000051
【図８】
2010538012.tif 000052
【図９】
2010538012.tif 000053
【図１０】
2010538012.tif 000054
【図１１】
2010538012.tif 000055
【図１２】
2010538012.tif 000056
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2010538012.tif 000059
【図１６】
2010538012.tif 000060
【図１７】
2010538012.tif 000061
【図１８】
2010538012.tif 000062
【図１９】
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【図２０】
2010538012.tif 000064
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2010538012.tif 000070
【図２７】
2010538012.tif 000071
【図２８】
2010538012.tif 000072
【図２９】
2010538012.tif 000073
【図３０Ａ−１】
2010538012.tif 000074
【図３０Ａ−２】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ−１】
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【図３１Ａ−２】
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【図３１Ｂ】
2010538012.tif 000079
【図３２】
2010538012.tif 000080
【図３３Ａ−１】
2010538012.tif 000081
【図３３Ａ−２】
2010538012.tif 000082
【図３３Ｂ】
2010538012.tif 000083
【図３４Ａ−１】
2010538012.tif 000084
【図３４Ａ−２】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
2010538012.tif 000087
【図３６】
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【図３７】
2010538012.tif 000089
【図３８】
2010538012.tif 000090
【図３９】
2010538012.tif 000091
【図４０Ａ】
2010538012.tif 000092
【図４０Ｂ】
2010538012.tif 000093
【図４０Ｃ】
2010538012.tif 000094
【図４０Ｄ】
2010538012.tif 000095
【図４１Ａ】
2010538012.tif 000096
【図４１Ｂ】
2010538012.tif 000097
【図４２】
2010538012.tif 000098
【図４３】
2010538012.tif 000099
【図４４Ａ】
2010538012.tif 000100
【図４４Ｂ】
2010538012.tif 000101
【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５７Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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