(57)【要約】本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ＯＲＦ２０８６タンパク質、ナイセリア菌株から単離または組み換え的に調製され得る、交差反応性免疫原性タンパク質（その免疫原性部分、その生物学的等価物を含む）、上記のものに免疫特異的に結合する抗体および上記のものを各々コードする核酸配列、ならびにＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＢによる感染症に対して効果的な免疫原性組成物における上記のものの使用に関する。
2010512792.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドであって、
（ａ）  配列番号１−１１の奇数番号配列のいずれかと少なくとも約９５％配列同一性を有するヌクレオチド配列、または
（ｂ）  配列番号２−１２の偶数番号配列のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
を含む
ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１−１１の奇数番号配列のいずれかと少なくとも約９５％配列同一性を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１−１１の奇数番号配列のいずれかを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号２−１２の偶数番号配列のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号２−１２の偶数番号配列のうちのいずれかを含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１−５の奇数番号配列のいずれかと少なくとも約９５％配列同一性を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１−５の奇数番号配列のいずれかを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号２−６の偶数番号配列のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号２−６の偶数番号配列のうちのいずれかを含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号７−１１の奇数番号配列のいずれかと少なくとも約９５％配列同一性を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号７−１１の奇数番号配列のうちのいずれかを含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号８−１２の偶数番号配列のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号８−１２の偶数番号配列のいずれかを含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドが、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＢに対する抗体を誘導するポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドが、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＢサブファミリーＡに対する抗体を誘導するポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＢサブファミリーＢに対する抗体を誘導するポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが組換えポリヌクレオチドである、請求項１〜１６のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドが天然供給源から単離される、請求項１〜１６のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２０】
前記ベクターがプラスミドである、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
前記ベクターがファージである、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２２】
前記ベクターがバクテリオファージである、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２３】
前記ベクターが穏和ファージ（ｍｏｄｅｒａｔｅ  ｐｈａｇｅ）である、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項１９〜２３のいずれかに記載のベクターを含む、組換え細胞。
【請求項２５】
前記組換え細胞がハイブリドーマである、請求項２４に記載の組換え細胞。
【請求項２６】
前記組換え細胞がトリオーマである、請求項２４に記載の組換え細胞。
【請求項２７】
ポリペプチドであって、
（ａ）  配列番号２−１２の偶数番号配列のいずれかと少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｂ）  配列番号１−１１の奇数番号配列のいずれかと少なくとも９５％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、
（ｃ）  （ａ）もしくは（ｂ）に記載されたアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性部分、あるいは
（ｄ）  （ａ）もしくは（ｂ）に記載されたアミノ酸配列または（ｃ）に記載された免疫原性部分の少なくとも１つの生物学的等価物、
を含む
ポリペプチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、配列番号２−１２の偶数番号配列のいずれかと少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、配列番号２−１２の偶数番号配列のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが、配列番号１−１１の奇数番号配列のいずれかと少なくとも９５％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが、配列番号１−１１の奇数番号配列のいずれかの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが、配列番号２−６の偶数番号配列のいずれかと少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが、配列番号２−６の偶数番号配列のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、配列番号１−５の奇数番号配列のいずれかと少なくとも９５％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、配列番号１−５の奇数番号配列のいずれかの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが、配列番号８−１２の偶数番号配列のいずれかと少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のポリペプチド：。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが、配列番号８−１２の偶数番号配列のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが、配列番号７−１１の奇数番号配列のいずれかと少なくとも９５％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、配列番号７−１１の奇数番号配列のいずれかの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
少なくとも１種のＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、トランスフェリン結合タンパク質、または不透明タンパク質（ｏｐａｃｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｏｐｃ）をさらに含む、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓの少なくとも１種の付加的な表面抗原をさらに含み、該付加的な表面抗原が、非ＯＲＦ２０８６タンパク質である、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが、質量分析により測定される場合に、約２６，０００〜約３０，０００の分子量を有する、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが、１０％−２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で測定される場合に、約２８〜３５ｋＤａの分子量を有する、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記ポリペプチドが非脂質化タンパク質である、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが組換えタンパク質である、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが天然のＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓから単離される、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
抗体であって、
（ａ）  偶数番号の配列番号２−１２のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドと免疫特異的に結合するポリペプチド、または
（ｂ）  （ａ）に記載されたポリペプチドの少なくとも１つの免疫原性部分、または
（ｃ）  （ａ）に記載されたポリペプチドもしくは（ｂ）に記載された１つの免疫原性部分の少なくとも１つの生物学的等価物、
のいずれかを含む
抗体。
【請求項４８】
少なくとも１つの抗体がモノクローナル抗体である、請求項４７に記載の抗体。
【請求項４９】
ポリヌクレオチド、ベクター、組換え細胞、ポリペプチドまたは請求項１〜４８のいずれかに記載の抗体を含む、組成物。
【請求項５０】
前記組成物が、薬学的に許容されるバッファー、希釈剤、およびアジュバントまたは担体をさらに含む、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記組成物が担体をさらに含む、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５２】
前記組成物がアジュバントをさらに含む、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５３】
前記アジュバントが液体を含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記ポリペプチドがリポタンパク質である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５５】
前記組成物が多糖をさらに含む、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５６】
前記組成物が、前記ポリペプチドと結合体を形成する付加的なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５７】
前記付加的なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、哺乳動物において２種以上の細菌に対する免疫応答を引き起こす結合体を形成する、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記組成物が、付加的なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５９】
組成物であって、
（ａ）  配列番号１−５の奇数番号配列のいずれかと少なくとも約９５％配列同一性または配列番号２−６の偶数番号配列のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約９５％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチドと、
（ｂ）  配列番号７−１１の奇数番号配列のいずれかと少なくとも約９５％配列同一性または配列番号８−１２の偶数番号配列のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約９５％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチドと、
を含む、
組成物。
【請求項６０】
前記第１のポリヌクレオチドが、配列番号１−５の奇数番号配列のいずれかを含む、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記第２のポリヌクレオチド配列が、配列番号７−１１の奇数番号配列のいずれか含む、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６２】
組成物であって、
（ａ）  配列番号２−６の偶数番号配列のいずれかと少なくとも約９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、
（ｂ）  配列番号８−１２の偶数番号配列のいずれかと少なくとも約９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドと、
を含む
組成物。
【請求項６３】
前記第１のポリペプチドが、配列番号２−６の偶数番号配列のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記第２のポリペプチドが、配列番号８−１２の偶数番号配列のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６５】
組成物であって、
（ａ）  偶数番号の配列番号２−１２のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）  奇数番号の配列番号１−１１のいずれかの核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド、
（ｃ）  （ａ）または（ｂ）に記載されたポリペプチドの免疫原性部分、あるいは
（ｄ）  （ａ）もしくは（ｂ）に記載されたポリペプチドまたは（ｃ）に記載された免疫原性フラグメントの生物学的等価物
のいずれかを、
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓから単離および精製、または組換えにより調製するステップを含むプロセスにより調製される
組成物。
【請求項６６】
哺乳動物において免疫応答を引き起こすための薬剤の調製における、請求項４９〜６５にいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項６７】
前記組成物が非経口的に投与される、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
前記組成物が粘膜的に投与される、請求項６６に記載の使用。
【請求項６９】
哺乳動物における細菌性髄膜炎に対して効果的な薬剤における、請求項４９〜６５のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項７０】
前記組成物が非経口的に投与される、請求項６９に記載の組成物の使用。
【請求項７１】
前記組成物が粘膜的に投与される、請求項６９に記載の組成物の使用。
【請求項７２】
前記組成物が皮下または筋肉内注射により投与される、請求項６９に記載の組成物の使用。
【請求項７３】
組成物を調製する方法であって、
本明細書中で記載されるポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を宿主細胞中で発現させるステップを含む、
方法。
【請求項７４】
前記核酸配列がｉｎ  ｖｉｖｏで発現される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記核酸配列がｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記ポリペプチドを発現させるためにＰ４リーダー配列を前記核酸配列と関連付けるステップをさらに含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
抗体組成物を調製する方法であって、
本明細書中で記載されるポリペプチド、タンパク質、免疫原性部分または生物学的等価物のいずれかを含む組成物を動物に導入した後、該動物から抗体を回収するステップを含む、
方法。
【請求項７８】
哺乳動物において免疫応答を引き起こす方法であって、
請求項４９〜６５に記載の１種以上の組成物の有効量を該哺乳動物に投与するステップを含む、
方法。
【請求項７９】
前記組成物が非経口的に投与される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記組成物が粘膜的に投与される、前記の請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
哺乳動物において細菌性髄膜炎を予防または処置する方法であって、
請求項４９〜６５に記載の１種以上の組成物の有効量を該哺乳動物に投与するステップを含む、
方法。
【請求項８２】
前記組成物が非経口的に投与される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記組成物が粘膜的に投与される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記組成物が皮下または筋肉内注射により投与される、請求項８１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）（セログループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚおよび２９Ｅ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（淋菌）、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａの菌株を含むナイセリア種菌株のような菌株から単離され得るナイセリアＯＲＦ２０８６タンパク質（サブファミリーＡおよびサブファミリーＢ）、ならびに該タンパク質の免疫原性部分および／または生物学的等価物に関する。本発明はまた、前記タンパク質、免疫原性部分および／または生物学的等価物に免疫特異的に結合する抗体に関する。さらに、本発明は、上記タンパク質、免疫原性部分、生物学的等価物および／または抗体のいずれかをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。加えて、本発明は、免疫原性組成物、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによって引き起こされる髄膜炎菌感染症、特にＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＢによって引き起こされる髄膜炎菌性疾患の予防、処置および／または診断におけるそれらの使用、ならびに前記組成物の調製方法に関する。本発明は、組換え型および天然供与源由来の単離型の両方、ならびに脂質化型および非脂質化型の両方に関する。
【背景技術】
【０００２】
髄膜炎菌性髄膜炎は、抗生物質の有効性にもかかわらず、数時間以内に小児および若い成人を死に至らせることがある破壊的な疾患である。非特許文献１。髄膜炎は、激しい頭痛、発熱、食欲不振、光および音に対する不耐性、特に頸部における筋肉の硬直、ならびに重篤なケースでは、死に至る痙攣、嘔吐およびせん妄という結果になる髄膜の炎症として特徴付けられる。髄膜炎菌性髄膜炎の症状は突然現れ、ついにはその特徴的な出血性発疹を伴う髄膜炎菌性敗血症となる。もしなんらかの生存のチャンスがあるとすれば、迅速な診断および大量の抗生物質による速やかな処置が決定的である。２０００．Ｂａｎｔａｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ３０２。
【０００３】
髄膜炎菌性髄膜炎は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）によって引き起こされ、この菌は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚおよび２９Ｅを含むいくつかの病原性セログループに分類されているグラム陰性の莢膜形成菌である。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのセログループＢ株は、世界中の髄膜炎菌性疾患の主要な原因である。例えば、セログループＢが、米国および欧州在住の幼児および小児における細菌性髄膜炎の約５０％の原因であると医学文献において報告されている。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＢによって引き起こされる髄膜炎菌性疾患を予防するためのワクチンは、現在全く存在しない。
【０００４】
３０年以上前のＧｏｌｄｓｃｈｎｅｉｄｅｒらの研究以来、セログループＢ髄膜炎菌性疾患予防のための免疫原性組成物の開発は、研究者にとっての課題である。非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；および非特許文献５。第二次世界大戦後、北米から事実上消滅したセログループＡ疾患（Ａｃｈｔｍａｎ，Ｍ．１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３（５）：１８６−９２）とは異なり、セログループＢおよびＣ微生物により引き起こされる疾患は、経済的に発展した世界の多くにわたって依然として風土病のままである。疾患発生率は、風土病がまれな＜１／１００，０００から、流行病の間の高リスク個体群における２００／１００，０００までの範囲で変わる。
【０００５】
多糖結合体をベースとするワクチンが、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＡおよびＣに対して開発されてきており、疾患の予防に効果的であると思われる。現在、セログループＡ、Ｃ、Ｙ、およびＷ−１３５由来の莢膜状多糖で作られた免疫原性組成物が利用可能である。Ａｍｂｒｏｓｃｈら、１９８３，Ｉｍｍｕｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｉｄｅ−ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ６１（２）：３１７−２３。しかしながら、この免疫原性組成物は、Ｔ細胞非依存性免疫応答を引き起こし、幼い児童においては効果的でなく、髄膜炎菌性疾患の５０％以上を引き起こすセログループＢ菌株については全くカバーしない。
【０００６】
他の研究者らも、莢膜多糖を用いて免疫原性組成物の開発を試みている。最近、セログループＣ莢膜材料をタンパク質に接合させることによって調製されたセログループＣ疾患のための免疫原性組成物が、欧州において使用が認可されている。しかしながら、セログループＢ莢膜はワクチン候補として適さないかもしれない。なぜならば、莢膜多糖は、発達中のヒト神経組織上の炭水化物部分との類似性を持つポリシアル酸で構成されているからである。この糖半分は、自己抗原と認識され、したがってヒトにおいて免疫原性が乏しい。
【０００７】
外膜タンパク質（ＯＭＰ）が、セログループＢ疾患のための代替ワクチン抗原として開発されてきた。ＰｏｒＡの２つの可変領域に結合するモノクローナル抗体により、髄膜炎菌についてのセロサブタイプ判別方式が定義される。したがって、ＰｏｒＡタンパク質は、髄膜炎菌株のためのセロサブタイプ判別抗原として役立ち（Ａｂｄｉｌｌａｈら、１９８８，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ４（１）：２７−３２）、セログループＢ免疫原性組成物の成分として活発に研究されている（Ｐｏｏｌｍａｎ，１９９６，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３９７：７３−７）。なぜならば、それらは殺菌抗体を誘発することができるからである（Ｓａｕｋｋｏｎｅｎ，１９８７，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３（４）：２６１−７）。殺菌抗体は保護の指標であると考えられ、どのような新しい免疫原性組成物候補も、これらの機能的抗体を誘導するべきである。
【０００８】
ヒトならびに動物における研究は、セロサブタイプ判別抗原、ＰｏｒＡが殺菌抗体を誘導することを示す。しかしながら、ＰｏｒＡに対する免疫応答は一般に、セロサブタイプ特異的である。特に、セロサブタイプ判別データは、ＰｏｒＡで作られた免疫原性組成物が、そのような免疫原性組成物によりカバーされる各セロサブタイプについてＰｏｒＡをおそらく６〜９も要求し得ることを示す。したがって、７０〜８０％のセログループＢ菌株をカバーするために、６〜９のＰｏｒＡが必要とされるであろう。かくして、このタンパク質の可変的性質は、十分な数の髄膜炎菌セロサブタイプ臨床隔離集団から保護するために、多価ワクチン組成物を必要とする。
【０００９】
セログループＢ髄膜炎菌のための免疫原性組成物の開発は非常に困難だったので、最近いくつかのグループが、新しい免疫原性組成物候補の同定を促すため、セログループＡおよびＢ両方を代表する菌株由来のゲノムを配列決定している。Ｔｅｔｔｅｌｉｎ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７（５４５９）：１８０９−１５；非特許文献１。ナイセリアのゲノムの知識があっても、新しい免疫原性組成物候補の同定は、適切な数学的アルゴリズムが現在存在しない困難なプロセスである。実際、最近の報告は、理論的な膜貫通ドメインを含む数百のオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）の同定にもかかわらず、発現、精製、および表面反応性で機能的に活性な抗体の誘起の問題により、研究者は、セログループＢ髄膜炎菌免疫原性組成物についてわずか７つの候補にしか至っていないことを示している。上記参照。これらのうちの１つは以前から知られていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｐｉｚｚａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８１６−１８２０
【非特許文献２】Ｇｏｌｄｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９６９）１２９（６）：１３０７−２６
【非特許文献３】Ｇｏｌｄｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９６９）１２９（６）：１３２７−４８
【非特許文献４】Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９６９）１２９（６）：１３８５−９５
【非特許文献５】Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９６９）１２９（６）：１３６７−８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、（１）複数のナイセリア菌株に対する殺菌抗体を誘導し、（２）複数の菌株の表面と反応し、（３）生菌攻撃に対する受動的保護を付与し、および／または（４）コロニー形成を妨げる、免疫原性組成物に対する要求が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の１つの実施形態は、（ａ）配列番号１−１１の奇数番号配列のいずれかと少なくとも約９５％配列同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｂ）配列番号２−１２の偶数番号配列のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のベクターを含む組換え細胞を提供する。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態は、（ａ）配列番号２−１２の偶数番号配列のいずれかと少なくとも９５％配列同一性を有するアミノ酸配列、（ｂ）配列番号１−１１の奇数番号配列のいずれかと少なくとも９５％配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に記載されたアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性部分、あるいは（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）に記載されたアミノ酸配列または（ｃ）に記載された免疫原性部分の少なくとも１つの生物学的等価物を含むポリペプチドを提供する。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態は、（ａ）偶数番号の配列番号２−１２のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドと免疫特異的に結合するポリペプチド、または（ｂ）（ａ）に記載されたポリペプチドの少なくとも１つの免疫原性部分、または（ｃ）（ａ）に記載されたポリペプチドまたは（ｂ）に記載された免疫原性フラグメントの少なくとも１つの生物学的等価物、のいずれかを含む抗体を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、組換え細胞、ポリペプチドまたは抗体を含む組成物を提供する。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態は、（ａ）配列番号１−５の奇数番号配列のいずれかと少なくとも約９５％配列同一性または配列番号２−６の偶数番号配列のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約９５％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチドと、（ｂ）配列番号７−１１の奇数番号配列のいずれかと少なくとも約９５％配列同一性または配列番号８−１２の偶数番号配列のいずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約９５％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチドと、を含む組成物を提供する。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態は、（ａ）配列番号２−６の偶数番号配列のいずれかと少なくとも約９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、（ｂ）配列番号８−１２の偶数番号配列のいずれかと少なくとも約９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドと、を含む組成物を提供する。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態は、（ａ）偶数番号の配列番号２−１２のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）奇数番号の配列番号１−１１のいずれかの核酸配列を含むポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド、（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載されたポリペプチドの少なくとも１つの免疫原性部分、あるいは（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）に記載されたポリペプチドまたは（ｃ）に記載された免疫原性フラグメントの少なくとも１つの生物学的等価物のいずれかを、ナイセリア種から単離および精製するか、または組換えにより調製するステップを含むプロセスにより調製される組成物を提供する。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態は、哺乳動物において免疫応答を引き起こすための薬剤の調製における本発明の組成物の使用を提供する。
【００２２】
本発明のさらなる実施形態は、哺乳動物における細菌性髄膜炎に対して効果的な薬剤における本発明の組成物の使用を提供する。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載されたポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を宿主細胞において発現させるステップを含む組成物を調製する方法を提供する。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中で記載されたタンパク質、免疫原性部分または生物学的等価物のいずれかを含む組成物を動物に導入した後にその動物から抗体を回収するステップを含む、抗体組成物を調製する方法を提供する。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態は、有効量の本発明の組成物の１つ以上を哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物において免疫応答を引き起こす方法を提供する。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態は、有効量の本発明の組成物の１つ以上を哺乳動物に投与すことを含む、哺乳動物における細菌性髄膜炎を予防または処置する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】異種菌株に対する殺菌抗体を誘導することができるナイセリア膜タンパク質抽出物を同定するための実験から得られたタンパク質画分の２つの主要なタンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図１Ｂ】プロテアーゼ消化および逆相Ｎ−末端配列決定によるＴＭＡＥフロースルー成分の分析による２つの主要なタンパク質の同定の実験結果を示す。
【図２】ｒＬＰ２０８６の精製スキームおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される等質性を示す。
【図３】ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよび対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＴＭＡＥフロースルー成分の分析による２つの主要なタンパク質および１つの少量タンパク質の同定の実験結果を示す。
【図４】２０８６タンパク質の組換え発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図５】本明細書中の実施例に記載されるプラスミドｐＰＸ７３４０の概略図である。
【図６】本明細書中の実施例に記載されるプラスミドｐＰＸ７３２８の概略図である。
【図７】本明細書中の実施例に記載されるプラスミドｐＰＸ７３４３の概略図である。
【図８】様々な菌株由来の２０８６遺伝子のＮ末端領域を例示する。
【図９Ａ】ナイセリア菌株中の免疫原性成分の同定における準備段階を示すフローチャートである。
【図９Ｂ】ナイセリア菌株中の免疫原性成分の同定における最終段階を示すフローチャートである。
【図１０】図１０Ａは、本明細書中の実施例に記載されるｒＰ２０８６脂質化型を発現させるためのＰ４シグナル／ＯＲＦ２０８６融合タンパク質を発現させるｐＢＡＤアラビノース誘導プロモーターの概略図である。図１０Ｂは、ＯＲＦ２０８６非脂質化型の組換え発現のためのｐＥＴ９ａ−Ｔ７ベクターの概略図である。
【図１１】図１１Ａは、ｒＬＰ２０８６タンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ  Ｂの全細胞ライゼートを表す写真である。図１１Ｂは、ｒＰ２０８６タンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ  Ｂの全細胞ライゼートを示す。
【図１２Ａ】本発明の実施に従うＯＲＦ２０８６タンパク質のサブファミリーおよびグループの構成を示す系統樹である。
【図１２Ｂ】本発明の実施に従うＯＲＦ２０８６タンパク質のサブファミリーおよびグループの構成を示す系統樹である。
【図１３】ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡ抗血清についての全細胞ＥＬＩＳＡデータのグラフである。
【図１４】ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗血清についての全細胞ＥＬＩＳＡデータのグラフである。
【図１５】ｒＬＰ２０８６混合研究−ＷＣＥ力価の結果のグラフである。
【図１６】ｒＬＰ２０８６／ｒＰｏｒＡ混合研究−ＷＣＥ力価の結果のグラフである。
【図１７】Ｐ２０８６サブファミリーＢ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ全細胞ライゼートに対するｒＬＰ２０８６マウス抗血清の反応性を示すウェスタンブロットである。
【図１８】Ｐ２０８６サブファミリーＡ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａ全細胞ライゼートに対するｒＬＰ２０８６マウス抗血清の反応性を示すウェスタンブロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
配列の概要
配列番号１  天然のリーダー配列と組み合わされた時のＣＤＣ１１３５菌株由来の成熟２０８６タンパク質についてのアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【００２９】
配列番号２  天然のリーダー配列を用いて調製されたＣＤＣ１１３５菌株由来の成熟２０８６タンパク質についてのアミノ酸配列。
【００３０】
配列番号３  Ｐ４リーダー配列と組み合わされた時のＣＤＣ１１３５由来の成熟２０８６タンパク質についてのアミノ酸配列をコードするための核酸配列。
【００３１】
配列番号４  Ｐ４リーダー配列を用いて調製されたＣＤＣ１１３５菌株由来の成熟２０８６タンパク質についてのアミノ酸配列。
【００３２】
配列番号５  ＣＤＣ１１３５菌株由来の成熟２０８６タンパク質についてのアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【００３３】
配列番号６  ＣＤＣ１１３５菌株由来の成熟２０８６タンパク質についてのアミノ酸配列。
【００３４】
配列番号７  天然のリーダー配列と組み合わされた時のＣＤＣ１１２７菌株由来の成熟２０８６タンパク質についてのアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【００３５】
配列番号８  天然のリーダー配列を用いて調製されたＣＤＣ１１２７菌株由来の成熟２０８６タンパク質についてのアミノ酸配列。
【００３６】
配列番号９  Ｐ４リーダー配列と組み合わされた時のＣＤＣ１１２７由来の成熟２０８６タンパク質についてのアミノ酸配列をコードするための核酸配列。
【００３７】
配列番号１０  Ｐ４リーダー配列を用いて調製されたＣＤＣ１１２７菌株由来の成熟２０８６タンパク質についてのアミノ酸配列。
【００３８】
配列番号１１  ＣＤＣ１１２７菌株由来の成熟２０８６タンパク質についてのアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【００３９】
配列番号１２  ＣＤＣ１１２７菌株由来の成熟２０８６タンパク質についてのアミノ酸配列。
【００４０】
発明の詳細な説明
本発明は、２０８６サブファミリーＡタンパク質および２０８６サブファミリーＢタンパク質を含むナイセリアＯＲＦ２０８６タンパク質（「２０８６タンパク質」）を提供する。２０８６タンパク質の各々は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（セログループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚおよび２９Ｅ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａの菌株を含む、天然のナイセリア菌株から単離され得るタンパク質である。２０８６タンパク質はまた、組換え技術を用いて調製されてもよい。
【００４１】
様々な実施形態によれば、本発明は、２０８６タンパク質、それらの免疫原性部分、および／またはそれらの生物学的等価物、上記のもののいずれかに免疫特異的に結合する抗体、ならびに上記のもののいずれかをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明は、組成物、免疫原性組成物、および髄膜炎菌性感染症、特にＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにより引き起こされる髄膜炎菌性疾患の予防、処置および／または診断におけるそれらの使用、ならびに前記組成物を調製するための方法を提供する。２０８６タンパク質は本明細書中で、組換え型および天然供給源由来の単離型、ならびに脂質化型および非脂質化型を含む。
【００４２】
本発明は、（１）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、および／またはＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａの菌株のような複数のナイセリア菌株に対する殺菌抗体を誘導し、（２）複数の菌株の表面と反応し、（３）生菌攻撃に対する受動的保護を付与し、および／または（４）コロニー形成を妨げる組成物、ならびに前記組成物を使用する方法および前記組成物を調製する方法を、思いがけずかつ有利に提供する。本発明の様々な実施形態が以下で説明される。
【００４３】
本明細書中で記載されるように、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから単離されたナイセリア種ＯＲＦ２０８６タンパク質（本明細書中で区別なく用いられる「２０８６タンパク質」または「ＯＲＦ２０８６」タンパク質、あるいは非脂質化タンパク質についてはＰ２０８６およびタンパク質の脂質化バージョンについてはＬＰ２０８６とも呼ばれる）をベースとした新規な免疫原性組成物候補は、抗血清の調製に伴う細胞分画、ディファレンシャル界面活性剤抽出、タンパク質精製を、複数の菌株を用いた殺菌活性アッセイと組み合わせることにより同定された。上記で引用された参照文献中で候補として開示される免疫原性組成物および診断法に代わるものとして、本発明は、タンパク質、その免疫原性部分およびその生物学的等価物のほか、前記ポリペプチド、部分、および等価物をコードする遺伝子およびそれらに免疫特異的に結合する抗体の使用による、髄膜炎菌感染の処置および／または予防のための組成物および方法に関する。
【００４４】
本明細書中で用いられるように、用語「菌株非特異的（ｎｏｎ−ｓｔｒａｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」は、１つ以上のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株（例えば、異種髄膜炎菌株）に対して効果的な免疫応答を誘発する抗原の特徴を指す。用語「交差反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ）」は、本明細書中で用いられるように、用語「菌株非特異的」と区別なく用いられる。用語「免疫原性菌株非特異的Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原」は、本明細書中で用いられるように、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから単離され得る抗原を述べるが、これは、別の細菌（例えば、淋菌のような他のナイセリア菌株）から単離することも、または組換え技術を用いて調製することもできる。
【００４５】
本発明の２０８６タンパク質は、脂質化タンパク質および非脂質化タンパク質を含む。さらに、本発明はまた、中間体化合物／組成物として各タンパク質に対応する未熟タンパク質またはプレタンパク質の使用も考慮する。
【００４６】
本発明はまた、本発明の実施に従って、上記の免疫原性薬剤に免疫特異的に結合する抗体を提供する。さらに、本発明は、上記のうちのいずれかをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。加えて、本発明は、髄膜炎菌性髄膜炎、特にセログループＢ髄膜炎菌性疾患の予防、処置および／または診断における組成物および／または免疫原性組成物およびそれらの使用、ならびに前記組成物を調製するための方法を提供する。
【００４７】
本発明の組成物は高度に免疫原性であり、殺菌抗体の産生を誘導できる。これらの抗体は、セログループ、セロタイプおよびセロサブタイプ異種髄膜炎菌株と交差反応性である。したがって、本発明の組成物は、異種ナイセリア菌株に対する殺菌抗体を誘導する能力を示すことにより、以前のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓワクチンの試みの欠陥を克服する。したがって、本発明は、他にも利点はあるが、特に従来使用されていた薬剤と比較して、保護を誘導するためにより少ない成分で調合され得る免疫原性組成物を提供する。組成物またはその中野免疫原性薬剤（例えば、ポリペプチド、免疫原性部分またはフラグメント、および生物学的等価物など、ただしこれらに限定されない）は、髄膜炎菌性感染および疾患からの免疫学的保護を引き出すため、ならびに他の病原体により引き起こされた感染および／または疾患からの免疫学的保護を引き出すため、単独で、または他の抗原もしくは薬剤と組み合わせて使用され得る。これにより、複数の菌株から保護するために必要とされる抗原の数を減らすことにより、髄膜炎菌性感染に対して使用する免疫原性組成物のデザインが単純化される。実際、精製２０８６タンパク質は、髄膜炎菌性疾患の原因となる菌株の適切な免疫原性の有効範囲を提供するために必要とされるタンパク質の数を劇的かつ予想外に低減する。２０８６タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてリポタンパク質として組換えによって発現させることができ、これは、天然の髄膜炎菌におけるよりもずっと高いレベルの野生型タンパク質である。
【００４８】
以下の公開国際特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２３６９（２００３年８月７日に国際公開第０３／０６３７６６号として公開）およびＰＣＴ／ＵＳ０４／１１９０１（２００４年１１月４日に国際公開第０４／０９４５９６号として公開）。
【００４９】
２０８６タンパク質は野生型菌株中には大量に存在しないが、これは殺菌抗体の標的である。これらの抗体は、ＰｏｒＡに応答して産生された抗体と異なり、異種セロサブタイプを発現する菌株を殺すことができる。
【００５０】
２０８６タンパク質に対する抗体はまた、髄膜炎菌による攻撃から幼若ラットを受動的に保護する。２０８６タンパク質の組換え発現により、髄膜炎菌性疾患の予防のための免疫原性組成物としての２０８６タンパク質の使用が可能になる。臨床試験における最近の髄膜炎菌性免疫原性組成物のすべては、多くの異なるタンパク質を含む複合組成物または外膜タンパク質製剤であった。セロサブタイプ特異性をもたらすＰｏｒＡタンパク質は、約７０〜８０％の疾患関連セロサブタイプの有効範囲を提供するために、免疫原性組成物中に６〜９の変異体を含有することを必要とする。対照的に、単一の２０８６タンパク質に対する抗血清単独で、西ヨーロッパおよび米国における疾病隔離集団の約６５％の原因となる６つのセロサブタイプの典型を殺すことができることが本明細書中で明確に実証される。したがって、精製２０８６タンパク質は、髄膜炎菌性疾患の原因となるセロサブタイプの十分な免疫原性組成物の有効範囲を提供するために必要とされるタンパク質の数を低減することが見込まれる。
タンパク質、免疫原性部分および生物学等価物
本発明により提供される２０８６タンパク質は、単離されたタンパク質またはポリペプチドである。用語「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、天然状態から人の手によって変更されたことを意味する。もし「単離された」組成物または物質が自然界で生ずるのであれば、それはすでにその本来の環境から変化しているかまたは取り除かれているか、あるいはその両方である。例えば、生きている動物中に天然に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドは「単離され」てはいないが、同じポリペプチドまたはポリヌクレオチドがその天然の状態の共存物質から分離されていれば、本明細書中で使用される用語「単離され」と同じく「単離され」ている。したがって、本明細書中で用いられるように、用語「単離されたタンパク質（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、天然供給源から単離されたタンパク質および組換え技術を用いて調製されたタンパク質、ならびに、他の抗原および／または例えば薬学的に許容される担体、バッファー、アジュバント等の添加物と組み合わされた時の上記のようなタンパク質を包含する。
【００５１】
本発明の実施形態によれば、２０８６タンパク質は、免疫原性、非病原および非菌株特異的であることを特徴とする。２０８６タンパク質は、高度に可変性であり、したがって、タンパク質の免疫原性を損なうことなくアミノ酸残基の挿入、置換および／または欠失を受けてもよい。２０８６タンパク質は、２つのサブファミリー、すなわちサブファミリーＡおよびサブファミリーＢに分割され得る。
【００５２】
サブファミリーＡ由来の２０８６タンパク質は、配列番号２−６の偶数番号配列のいずれかのアミノ酸配列または配列番号１−５の奇数番号配列のいずれかのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む。サブファミリーＢ由来の２０８６タンパク質は、配列番号８−１２の偶数番号配列のいずれかのアミノ酸配列または配列番号７−１１の奇数番号配列のいずれかのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む。
【００５３】
本発明のポリペプチド配列は、基準配列（例えば、偶数番号のついた配列番号２−１２）と同一、すなわち１００％同一、または、基準配列と比較して同一性の％が１００％未満であるようないくつかのアミノ酸変更を含み得る。そのような変更としては、少なくとも１つのアミノ酸欠失、同類置換もしくは非同類置換を含む置換、または挿入が含まれる。変更は、基準ポリペプチド配列のアミノ−またはカルボキシ−末端位置において生じてもよいし、あるいは基準アミノ酸配列中、または基準アミノ酸配列内の１つ以上の隣接するグループ中のアミノ酸間に個別に散在されて、それらの末端位置間のどこかで生じてもよい。
【００５４】
したがって、本発明はまた、配列表に含まれるアミノ酸配列（すなわち、偶数番号のついた配列番号２−１２）との配列同一性を有するタンパク質を提供する。本発明の様々な実施形態によれば、２０８６タンパク質は、配列番号２−１２の偶数番号アミノ酸配列のいずれかと約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％またはそれ以上の同一性より大きい配列を有する。これらは、制限なく、突然変異体および対立遺伝子変異体を含んでいる。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態において、２０８６タンパク質または他の２０８６ポリペプチド（例えば、免疫学的部分および生物学的等価物）は、髄膜炎菌の相同菌株および少なくとも１つの異種菌株に対する殺菌抗体を生成する。具体的には、２０８６ポリペプチドに対する抗体は、髄膜炎菌による鼻腔内などでの攻撃から幼若ラットを受動的に保護する。さらなる好ましい実施形態において、２０８６ポリペプチドは、相同菌株および少なくとも１つの異種菌株について幼若ラットに対し上記のような保護を発揮する。ポリペプチドは、偶数番号のついた配列番号２−１２中に示されるように、上記の配列概要から選択されればよく、あるいはポリペプチドは、列挙されたポリペプチドの任意の免疫学的フラグメントまたは生物学的等価物としてもよい。好ましくは、ポリペプチドは、上記の配列概要における偶数番号のついた配列番号２−１２のいずれかから選ばれる。
【００５６】
本発明はまた、生物学的等価物である２０８６ポリペプチドの対立遺伝子変異体または他の変異体に関する。適切な生物学等価物とは、（１）相同菌株ならびに少なくとも１つの異種ナイセリア菌株および／または淋菌株に対する殺菌抗体を誘導し、（２）相同菌株および少なくとも１つの異種ナイセリア菌株および／または淋菌株の表面と反応し、（３）生菌攻撃に対し受動的保護を付与し、および／または（４）コロニー形成を妨げる、能力を示すものである。
【００５７】
適切な生物学的等価物は、該生物学的等価物が本発明の２０８６タンパク質の１つと実質的に同じ免疫抗原特性を誘導できるという前提で、本明細書中で明記された２０８６ポリペプチド（すなわち、偶数番号のついた配列番号２−１２）の１つと少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９．９％の類似性を有する。
【００５８】
あるいは、生物学的等価物は、偶数番号のついた配列番号２−１２中の２０８６タンパク質の１つと実質的に同じ免疫抗原特性を有する。本発明の実施形態によれば、生物学的等価物は、偶数番号のついた配列番号２−１２と同じ免疫抗原特性を有する。
【００５９】
生物学的等価物は、本発明のタンパク質に対する変異体および修飾を生成することにより得られる。タンパク質に対するこれらの変異体および修飾は、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換によりアミノ酸配列を改変することによって得られる。アミノ酸配列は、実質的に同じまたは改善された品質を有するポリペプチドを作り出すために、例えば置換によって修飾される。改変を導入する好ましい手段は、部位指定突然変異誘発によりポリペプチドの核酸配列のあらかじめ決められた突然変異を作るステップを含む。
【００６０】
修飾および変更は、本発明のポリペプチドの構造中において行うことができ、さらにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫原性を有する分子を得ることができる。例えば、制限なく、ある一定のアミノ酸が、免疫原性をそれほど損失することなく配列中で、非保存的および保存的置換を含む他のアミノ酸で置換され得る。ポリペプチドの生物学的機能活性を定義するのはポリペプチドの相互作用的な能力および性質なので、いくつかのアミノ酸配列置換は、ポリペプチド配列（または、当然、その基礎をなすＤＮＡコード化配列）中で行うことができ、依然として同様な特性を有するポリペプチドを得ることができる。本発明は、本明細書中のポリペプチドの構造ならびに前記ポリペプチドをコードする核酸配列へのどのような変化も考慮し、ここで、ポリペプチドは免疫原性を保持している。当業者は、本明細書中で提供される手引きに基づいて、開示されたポリペプチドおよびポリヌクレオチドをそれに応じて容易に修飾できるであろう。
【００６１】
例えば、置換または欠失が許容されるある一定の可変領域が同定されている。２０８６共通配列は、かねて論じられたように、本発明の実施に従うタンパク質の２０８６ファミリーの保存および非保存領域を示す。
【００６２】
そのような変更を行う際、当業者に知られているどのような技術も利用できる。例えば、アミノ酸のハイドロパシック・インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を、これに限定することを意図することなく、考慮することができる。ポリペプチド上に相互作用的な生物学的機能を付与する際のハイドロパシックアミノ酸インデックスの重要性は、技術分野において一般に理解されている。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８２．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．１５７：１０５〜１３２。
【００６３】
同様なアミノ酸の置換はまた、特に、生物学的機能性等価ポリペプチドまたはそれによって作り出されたペプチドが免疫学的実施形態における使用を意図される場合、親水性に基づいて行われ得る。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号は、ポリペプチドの最大局所平均親水性が、その隣接アミノ酸の親水性により支配されるように、その免疫原性、すなわちポリペプチドの生物学的特性と相関関係にあると述べている。
【００６４】
ポリペプチドの生物学的等価物はまた、部位特異的突然変異誘発を用いて調製できる。部位特異的突然変異誘発は、第二世代ポリペプチド、すなわち基となるＤＮＡの特定の突然変異誘発を通して、その配列から誘導された生物学的機能性等価ポリペプチドまたはペプチドの調製において有用な手法である。そのような変更は、アミノ酸置換が望ましい場合に望ましいことがあり得る。この手法はさらに、１つ以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡに導入することにより、例えば、上記の問題点のうちの１つ以上を組み込んだ配列変異体の調製および試験を素早く行えるようにする。部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列、ならびに横断されている欠失接合の両側で安定な二重鎖を形成するのに十分なサイズおよび配列複雑度のプライマー配列を提供するのに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用によって、突然変異体の産生を可能にする。典型的には、改変される配列の接合部の両側に約５〜１０の残基を有する長さが約１７〜２５ヌクレオチドのプライマーが好ましい。
【００６５】
一般に、部位特異的突然変異誘発の手法は、技術的に知られている。理解されるように、この手法は典型的には、一本鎖型および二本鎖型の両方で存在し得るファージベクターを用いる。典型的には、本明細書に従う部位指定突然変異誘発は、最初に、選ばれたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチド配列の全部または一部をコードするＤＮＡ配列をその配列内に含む一本鎖ベクターを得ることにより実行される。所望の変異された配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーが（例えば、合成的に）調製される。このプライマーは次に、一本鎖ベクターにアニールされ、変異支持鎖の合成を完成するためにＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）のような酵素を用いて伸長される。かくして、１つの鎖がオリジナルの非変異配列をコードし、第２の鎖が所望の突然変異を有するヘテロ二本鎖が形成される。このヘテロ二本鎖ベクターは次に、Ｅ．ｃｏｌｉのような適切な細胞を形質転換するために用いられ、突然変異を有する組換えベクターを含むクローンが選択される。商業的に利用可能なキットには、オリゴヌクレオチドプライマーを除く必要なすべての試薬が付属している。
【００６６】
２０８６ポリペプチドとしては、偶数番号の配列番号  ２−１２の１つからのアミノ酸配列を有する２０８６タンパク質との実質的な配列類似性および／または生物学的等価性を含む任意のタンパク質またはポリペプチドが含まれる。加えて、本発明の２０８６ポリペプチドは、特定の供給源に限定されない。したがって、本発明は、各種の供給源由来のポリペプチドの一般的検出および分離に備える。また、２０８６ポリペプチドは、当業者に知られているように、本明細書中で提供される手引きに基づいて組換え的に、または技術的に知られている任意の他の合成的方法で調製され得る。
【００６７】
２０８６ポリペプチドが、さらなる構造的または機能的分析において、あるいは２０８６関連ポリペプチドおよび２０８６特異的抗体のような試薬の産生において使用するためにフラグメントに有利に切断され得ることが本発明において考慮される。これは、精製または未精製Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドを、エンドプロテイナーゼｇｌｕ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のようなペプチダーゼで処理することにより達成され得る。ＣＮＢｒによる処理は、ペプチドフラグメントを天然のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ２０８６ポリペプチドから産生できる別の方法である。組換え手法も、２０８６タンパク質の特定フラグメントを産生するために用いることができる。
【００６８】
本明細書中で用いられる用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとそれぞれ異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的な特性を保持する。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、別の基準ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列中の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変することも、改変しないこともある。ヌクレオチド変化は、以下で論じられるように、基準配列によってコードされるポリペプチド中でのアミノ酸置換、付加、欠失、融合およびトランケーションという結果になり得る。ポリペプチドの典型的な変異体は、アミノ酸配列が別の基準ポリペプチドと異なる。一般に、差異は限定されており、その結果、基準ポリペプチドおよび変異体の配列は、全体的に密接に類似しており、多くの領域において同一（すなわち、生物学的に等価）である。変異体および基準ポリペプチドは、いずれかの組み合わせで１つ以上の置換、付加、欠失だけアミノ酸配列が異なり得る。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされたものであっても、されてないものであってもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体のような自然に発生するものであることもあり、または自然に発生することが知られていない変異体であることもある。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非自然発生変異体は、突然変異誘発手法または直接合成により作られ得る。
【００６９】
当該技術において知られているように、「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、配列を比較することによって確認される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術において、「同一性」はまた、場合によっては、そのような配列のストリング間の一致によって確認される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されるような既知の方法で容易に計算できるが、それらに限定されない。同一性を確認する好ましい方法は、試験される配列間で最も大きい一致をもたらすように設計される。同一性および類似性を確認する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を確認する好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ  １９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０）が含まれるが、それらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０）から公的に利用可能である。よく知られているスミスウォーターマンアルゴリズムもまた、同一性を確認するために用いられ得る。
【００７０】
一例として、本発明のアミノ酸配列は、基準配列、偶数番号のついた配列番号２−１２と同一、すなわち１００％同一であってもよく、あるいは、本発明のアミノ酸配列は、基準配列と比較して同一性の％が１００％未満であるようないくつかのアミノ酸変更を含むこともできるが、それに限定されることを意図するものではない。そのような変更は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、保存的および非保存的置換を含む置換、または挿入からなる群から選ばれ、その場合、前記変更は、基準ポリペプチド配列のアミノ−またはカルボキシ−末端位置において生じてもよいし、あるいは基準アミノ酸配列中、または基準アミノ酸配列内の１つ以上の隣接するグループ中のアミノ酸間に個別に散在されて、それらの末端位置のどこかで生じてもよい。所与の％同一性についてのアミノ酸改変数は、偶数番号の配列番号２−１２中のアミノ酸の総数にそれぞれのパーセント同一性の数値パーセント（１００で割る）を乗じ、次にその積を偶数番号の配列番号２−１２のいずれかの中のアミノ酸の前記総数から引くことにより求められる：すなわち、
ｎａ＝ｘａ−（ｘａ・ｙ）
式中、ｎａはアミノ酸改変の数であり、ｘａは偶数番号の配列番号２−１２中のアミノ酸の総数であり、ｙは、例えば７０％については０．７０、８０％については０．８０、８５％については０．８５等であり、ｘａとｙとのどのような非整数積も、これをｘａから引く前に最も近い整数に丸められる。
【００７１】
好ましい実施形態において、上記のポリペプチドは、２０８６タンパク質の成熟プロセス型のような、偶数番号の配列番号  ２−１２中に明示されるタンパク質から選ばれる。２０８６タンパク質または等価物等は、脂質化または非脂質化され得る。
【００７２】
ＯＲＦ２０８６は、天然のＯＲＦ  ２０８６シグナル配列を持つＥ．ｃｏｌｉ菌中で発現可能である。しかしながら、タンパク質の発現を改善する手段を見出すことが望ましい。本発明の実施形態によれば、リーダー配列は、タンパク質の脂質化型を産生する。例えば、以下は、発現を増強するための、莢膜非保有ヘモフィルス・インフルエンザＰ４タンパク質のシグナル配列の使用を説明する。
【００７３】
細菌リポタンパク質のプロセシングは、シグナル配列を含む前駆体またはプロリポタンパク質の合成から始まり、それが今度は共通リポタンパク質プロセシング／修飾部位を含む。このプロリポタンパク質は当初、グラム陰性菌の内膜上またはグラム陽性菌の膜上の共通Ｓｅｃ系を通過する。ひとたびＳｅｃ系によって膜中に置かれると、プロリポタンパク質は共通部位においてシグナルペプチダーゼＩＩによって開裂され、露出されたＮ−末端システイン残基がグリセレート化およびアシル化される。Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．Ｊｕｎ；２２（３）：４５１−７１；Ｏｕｄｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．１９９３。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳｅｃＢ，ＳｅｃＡ，ａｎｄ  ＳｅｃＹ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｅｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｍｂｒａｎｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ  ｓｍａｌｌ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｍａｒ；１７５（５）：１５４３−７；Ｓａｎｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏ．２５０：６８３−９７。
【００７４】
グラム陰性菌において、外膜への脂質化タンパク質の輸送は、リポタンパク質の位置２におけるソーティングシグナルに応じて、膜特異性を有する特有のＡＢＣトランスポーター系によって媒介される。Ｙａｋｕｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０００．Ａ  ｎｅｗ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏ．Ａｐｒ；２（４）：２１２−８。
【００７５】
細菌リポタンパク質およびそれらのシグナル配列との融合が、細菌表面の組換えタンパク質を表示するために用いられてきた。米国特許第５，５８３，０３８号および同第６，１３０，０８５号。リポタンパク質シグナル配列を交換することにより、リポタンパク質の産生を増大することができる。Ｄｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｅｄ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｄｈｅｓｉｎ  Ａ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｖａｃｃｉｎｅ．Ｍａｒ  ６；１８（１７）：１８１１−２１。
【００７６】
タンパク質の細菌脂質化は、タンパク質に対する免疫学的応答を増大または修正することが知られている。Ｅｒｄｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｔｔａｃｈｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ＯｓｐＡ．  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．Ｊａｎ；６１（１）：８１−９０；Ｓｎａｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９５．細菌リポタンパク質は、Ｔ細胞独立タイプＩＩ抗原に対する体液性免疫応答におけるサイトカインに取って代わり得る。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｄｅｃ  １５；１５５（１２）：５５８２−９。しかしながら、細菌リポタンパク質発現は、プロセシングのストリンジェンシーにより複雑化され得る。Ｐｏｌｌｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８６．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  しｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｆｅｂ  ５；２６１（４）：１８３５−７；Ｌｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８７．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｏ  ｐｒｏｐｏｌｉｐｏ−ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｊｕｎ  １５；２６２（１７）：８３１８−２４；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８．Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｅｓ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ａｐｒ；２（１）：１５−２０。細菌リポタンパク質発現はまた、毒性および低発現レベルのような他の問題によって複雑化される。Ｇｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｐｌＡ  ｃａｕｓｅｓ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｗｈｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｕｇ；１４０（Ｐｔ８）：１８３９−４５；Ｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ａｎｄ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｙｍｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｏｕｔｅｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．Ｆｅｂ；６（１）：１５−２４；Ｙａｋｕｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｉｓｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｍａｙ；１７９（９）：２８５７−６２。
【００７７】
型分類不能なヘモフィルス・インフルエンザ菌は、Ｐ４と呼ばれるリポタンパク質（タンパク質“ｅ”としても知られる）を発現する。Ｐ４タンパク質の組換え型は、天然のＰ４シグナル配列を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ中で高度に発現される。米国特許第５，９５５，５８０号。天然のＰ４シグナル配列がＥ．ｃｏｌｉ中の発現ベクター中の天然のＯＲＦ２０８６シグナル配列に置換されると、ＯＲＦ２０８６発現レベルは増大される。
【００７８】
発現を増大させるために異種Ｐ４シグナル配列を用いるというこの概念は、他の細菌リポタンパク質にまで拡張可能である。特に、細菌ゲノムの分析は、関心の対象となる可能性のある多くのＯＲＦの同定につながる。Ｅ．ｃｏｌｉのような異種宿主細胞中でＯＲＦをその天然のシグナル配列によって発現させようとする試みにより、安定性、適合性等を含む各種のシグナル配列を用いる場合に固有の各種の問題を引き起こす。これらの問題を最小限にするため、Ｐ４シグナル配列が対象となる各ＯＲＦを発現させるために用いられる。上記で記載されるように、Ｐ４シグナル配列は、異種２０８６ＯＲＦの発現を改善する。発現ベクターが、対象となるＯＲＦの天然のシグナル配列を欠失させ、そしてＯＲＦにＰ４シグナル配列を結合することによって構成される。次に適切な宿主細胞が発現ベクターで形質変換、形質移入または感染させられ、ＯＲＦの発現は、ＯＲＦの天然のシグナル配列を用いた発現と比較して増大する。
【００７９】
非脂質化型は、本来のリーダー配列を欠くタンパク質によって、または宿主細胞中の脂肪酸アシル化のための部位を特定しない配列の部分で置き換えられたリーダー配列によって産生される。
【００８０】
本発明の２０８６タンパク質の様々な形態は、特にことわらない限り、本明細書中では「２０８６」タンパク質と呼ばれる。また、「２０８６ポリペプチド」は、特にことわらない限り、２０８６タンパク質ならびにその免疫原性部分または生物学的等価物を指す。
【００８１】
全長単離および精製されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質は、１０％〜２０％勾配ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で測定されると約２８〜３５ｋＤａの見掛けの分子量を有する。より具体的には、このタンパク質は、質量分析法により測定されると約２６，０００〜３０，０００ダルトンの分子量を有する。
【００８２】
好ましくは、２０８６ポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよび／または他の種により引き起こされる感染を予防または改善するために用いられる。
抗体
配列番号２−１２のアミノ酸配列を含む本発明のタンパク質、それらのフラグメント、およびそれらの類似体、またはそれらを発現させる細胞はまた、本発明のポリペプチドについて免疫特異性の抗体を産生するための免疫原として用いられる。本発明は、免疫特異性のポリペプチドに対する抗体およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在を検出し、受動的保護を提供あるいは細胞、組織抽出物、または生体液中のポリペプチドの量もしく濃度を測定するためのそのような抗体の使用を含む。
【００８３】
本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体が含まれる。ポリクローナル抗体は、抗原で免疫性化された動物の血清から得られた抗体分子の異種個体群である。モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する抗体の実質的に均質な個体群である。モノクローナル抗体は、当業者に知られている方法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７および米国特許第４，３７６，１１０号により得られ。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤおよびそれらの任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスであり得る。
【００８４】
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体およびヒト免疫グロブリン定常領域から得られた可変領域を有するもののような、その異なる部分が異なる動物種から得られる分子である。キメラ抗体およびそれらの産生方法は、技術的に知られている
【００８５】
【化１】
2010512792.tif 000003
これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８６】
抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位と一般に関連付けられる特有の決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄ抗体は、モノクローナル抗体の供給源と同じ種および遺伝子型の動物（例えば、マウス株）に、抗Ｉｄが調製されているモノクローナル抗体で免疫化することによって調製される。免疫化された動物は、これらのイソタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することにより、免疫化する抗体のイディオタイプ決定基を認識して応答する。
【００８７】
したがって、本発明のポリペプチドに対して発生したモノクローナル抗体は、適切な動物の抗Ｉｄ抗体を引き起こすように使用できる。そのような免疫化されたマウス由来の脾臓細胞は、抗Ｉｄモノクローナル抗体を分泌する抗Ｉｄハイブリドーマを産生するために使用できる。さらに、抗Ｉｄ抗体は、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）のような担体に結合させて、付加的なＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するために使用できる。これらのマウス由来の血清は、Ｒ−ＰＴＰａｓｅエピトープについて特異的な最終ｍＡｂの結合特性を有する抗抗Ｉｄ抗体を含んでいる。抗Ｉｄ抗体は、したがって、それらのイディオタイプエピトープ、すなわち、ストレプトコッカス・ピオゲネスポリペプチドのような評価されるエピトープと構造的に類似する「イディオトープ（ｉｄｉｏｔｏｐｅ）」を有する。
【００８８】
用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」はまた、無傷の分子ならびにＦａｂのようなフラグメント、一本鎖抗体および抗原に結合できる抗体の他の抗原認識フラグメントの双方を含むことを意図している。Ｆａｂフラグメントは、無傷の抗体のＦｃフラグメントを欠いており、循環からより迅速に消え、そして無傷の抗体よりも非特異的組織結合が少ないことがある（Ｗａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９８３，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５）。本発明において有用な抗体のＦａｂおよび他のフラグメントが、無傷の抗体分子のための方法に従ってＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリペプチドの検出および定量に用い得ることが理解されるであろう。
【００８９】
ａｎｔｉ−ｉｏｄｉｏｔｙｐｉｃ（「抗Ｉｄ」）抗体のような本発明の抗体は、上記で記載されたようなポリペプチドに特異的な抗体を免疫学的に有効量投与することを含む、哺乳動物宿主におけるナイセリア感染の処置または予防のための方法において用いられ得る。抗Ｉｄ抗体はまた、さらに別の動物において、いわゆる抗抗Ｉｄ抗体（ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−Ｉｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を産生する免疫応答を誘発する「免疫原」として用いられ得る。抗抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘発した当初のｍＡｂとエピトープ的に同一であり得る。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることにより、同一の特異性の抗体を発現させる他のクローンを同定することが可能である。
【００９０】
抗体は、様々なやり方、例えば、タンパク質が発現されていることの確認のため、またはタンパク質がどこで発現されているかを確認するために用いられる。標識抗体（例えば、ＦＡＣＳのための蛍光標識化）は、無傷の細菌でインキュベートすることができ、細菌表面上の標識の存在は、例えばタンパク質の位置を確認する。
【００９１】
本発明のポリペプチドに対して生成された抗体は、ポリペプチドまたエピトープ坦持フラグメント、類似体、または細胞を、常用の手順を用いて動物に投与することによって得ることができる。モノクローナル抗体の調製については、継代細胞系培養により産生された抗体を提供する任意の手法を用いることができる。
ポリヌクレオチド
本発明のタンパク質と同様に、本発明のポリヌクレオチドは、奇数番号の配列番号１−１１の基準配列のうちのいずれかと同一、すなわち１００％同一の核酸配列を含んでもよく、または、基準配列と比較していくつかのヌクレオチド改変を含んでもよい。そのような改変は、少なくとも１つのヌクレオチド欠失、転位および転換を含む置換、または挿入からなる群から選ばれ、前記改変は、基準ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置において、あるいは個別に基準アミノ酸配列中か基準アミノ酸配列内の１つ以上の隣接する群中のアミノ酸間に散在されて、それらの末端位置間のどこかで生じる。ヌクレオチド変更の数は、奇数番号の配列番号１−１１のいずれかの中のヌクレオチド総数にそれぞれのパーセント同一性（１００で割られる）を乗じ、その積を前記配列中の前記総数から引くことにより求められる。
【００９２】
一例として、それに限定されることを意図することなく、奇数番号の配列番号１−１１のいずれかの核酸配列、その縮退変異体またはそのフラグメントと少なくとも９５％同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓポリヌクレオチドであり、ここでポリヌクレオチド配列は、奇数番号の配列番号１−１１の核酸配列のポリヌクレオチド領域全体にわたり最高ｎｎの核酸変更を含むことができ、ｎｎは、改変の最大数であり、次式により計算される：
ｎｎ＝ｘｎ−（ｘｎ・ｙ）、
式中、ｘｎは、奇数番号の配列番号１−１１のいずれかの核酸の総数であり、ｙは、０．９５の値を有し、ｘｎとｙとのどのような非整数積も、そのような積をｘｎから引く前に最も近い整数に丸められる。当然、ｙは、９５％について０．９５の値等を有することもできる。偶数番号配列配列番号２−１２のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の改変は、このコーディング配列中にナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を作り出し、それによって、そのような改変に続いてポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを改変することがある。
【００９３】
本発明のある一定の実施形態は、２０８６タンパク質に対して作られた２０８６タンパク質および抗体をコードするポリヌクレオチド（本明細書中では、「２０８６ポリヌクレオチド」または「ＯＲＦ２０８６ポリヌクレオチド」と呼ばれる）に関する。好ましい実施形態において、本発明の単離ポリヌクレオチドは、奇数番号の配列番号１−１１のうちの１つ、その縮退変異体、またはそのフラグメントから選ばれるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。本明細書中で定義されるように、「縮退変異体（ｄｅｇｅｎａｒａｔｅ  ｖａｒｉａｎｔ）」は、遺伝コードの縮退により奇数番号の配列番号１−１１（およびそのフラグメント）中に示されるヌクレオチド配列とは異なるポリヌクレオチドと定義されるが、奇数番号の配列番号１−１１中に示されるヌクレオチド配列によりコードされるものと同じ２０８６タンパク質（例えば、偶数番号配列配列番号２−１２）を依然としてコードする。
【００９４】
他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、奇数番号の配列番号１−１１のうちの１つ、その縮退変異体、またはそのフラグメントから選ばれるヌクレオチド配列に対する補体である。さらに他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡからなる群から選ばれ、異種ヌクレオチドをさらに含み得る。
【００９５】
２０８６ポリヌクレオチドが、天然の、合成または半合成の供給源から得られること、さらに、ヌクレオチド配列が、天然に生じる配列であり得ること、あるいは、もし常にそのような配列を含む核酸分子が上記のように２０８６免疫原性ポリペプチドとして発現させられ得るのであれば、ヌクレオチド配列が、そのような天然に生じる配列への一もしくは複数塩基置換、欠失、挿入および逆位を含む突然変異に関連し得ることが理解されるであろう。核酸分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖、線状または共有結合環状形であり得る。ヌクレオチド配列は、それに隣接して配置された発現制御配列を有することがあり、そのような制御配列は通常、異種供給源から導かれる。一般に、本発明の核酸配列の組換え発現は、核酸配列の末端において、ＴＡＡのような停止コドン配列を用いる。
【００９６】
本発明はまた、低減されたストリンジェンシー条件下、好ましくはストリンジェントな条件下、そして最も好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるたポリヌクレオチドにハイブリダイズできるポリヌクレオチドも含む。ストリンジェンシー条件の例は、以下のストリンジェンシー条件表に示してあり、高度にストリンジェントな条件とは、例えば、少なくとも条件Ａ〜Ｆと同じくらいストリンジェントな条件であり、ストリンジェントな条件とは、例えば、少なくとも条件Ｇ〜Ｌと同じくらいストリンジェント条件であり、低減されたストリンジェンシー条件とは、例えば、少なくとも条件Ｍ〜Ｒと同じくらいストリンジェントな条件である。
【００９７】
【表１−１】
2010512792.tif 000004
【００９８】
【表１−２】
2010512792.tif 000005
【００９９】
【表１−３】
2010512792.tif 000006
ｂｐＩ：ハイブリッド長は、ハイブリダイズしているポリヌクレオチドのハイブリダイズされた領域について予想される長さである。ポリヌクレオチドを、未知の配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、ハイブリッド長は、ハイブリダイズしているポリヌクレオチドの長さであると仮定される。既知配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズされる場合、ハイブリッド長は、ポリヌクレオチドの配列を一直線に並べ、最適配列相補性の１つ以上の領域を同定することによって確認できる。
【０１００】
バッファーＨ：ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５  ＭＮａＣｌ、１０  ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．４である）は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーにおいて、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５  ｍＭクエン酸ナトリウムである）の代わりに使用でき、洗浄は、ハイブリダイゼーション完了後に１５分間実行される。
【０１０１】
ＴＢ〜ＴＲ：長さが５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０ＥＣ低くあるべきであり、ここで、Ｔｍは、以下の式に従って決定される。長さが１８塩基対未満のハイブリッドについては、Ｔｍ（ＥＣ）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。長さが１８〜４９塩基対のハイブリッドについては、Ｔｍ（ＥＣ）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、ここでＮは、ハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーションバッファ中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣについての［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。
【０１０２】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件の付加的な例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｃｈｐｔｅｒｓ  ９  ａｎｄ  １１，ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．１０  ａｎｄ  ６．３−６．４に提供されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
本発明はまた、これらのポリヌクレオチドに完全に相補的なポリヌクレオチドを提供し、またアンチセンス配列も提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドとも呼ばれる本発明のアンチセンス配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を妨げる内部生成配列および外部投与発現の両方を含む。本発明のアンチセンス配列は、例えば、約１５〜２０塩基対を含む。アンチセンス配列は、例えば、上流の非翻訳配列に結合するプロモーターを妨げることにより、またはリボソームの結合を妨げることにより本発明のポリペプチドをコードする転写産物の翻訳を妨げることにより、転写を阻害するように設計することができる。
【０１０４】
本発明のポリヌクレオチドは、多くのやり方で（例えば、化学合成により、ＤＮＡライブラリから、生物体それ自体から）調製され、様々な形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブ、プライマー）を取ることができる。用語「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」としては、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに修飾されたバックボーンを含むそれらの類似物が含まれる。
【０１０５】
本発明のさらなる実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡライブラリのようなＤＮＡライブラリを含む。
融合タンパク質
本発明はまた、融合タンパク質に関する。「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、２つの、しばしば無関係な、融合遺伝子またはそのフラグメントによりコードされたタンパク質を意味する。例えば、免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分を別の免疫原性タンパク質またはその部分と共に含む融合タンパク質である。多くの場合、免疫グロブリンＦｃ領域を融合タンパク質の一部として使用することは、治療および診断での使用に有利であり、例えば、改善された薬物動態学特性という結果になる（例えば、欧州特許出願公開第０２３２２６２号参照）。他方、用途によっては、融合タンパク質が発現され、検出され、精製された後に、Ｆｃ部分を欠失させることができることが望ましいであろう。本発明の２０８６ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの組換え産生に用いられ、ポリヌクレオチドは、それ自体で、成熟ポリペプチドのためのコード配列、あるいは、リーダーまたは分泌配列、プレもしくはプロないしはプレプロタンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするコード配列のような、他のコード配列を持つリーディングフレーム中の成熟ポリペプチドのためのコード配列を含み得る。例えば、２０８６ポリペプチドまたは融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされ得る（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｅｎｔｚら、１９８９参照）。したがって、発現産物のＨｉｓタグ精製を可能にする融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの調製が本発明の実施において考慮される。ポリヌクレオチドはまた、転写された、非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルのような、非コーディング５’および３’配列を含み得る。そのような融合ポリペプチドは、形質変換／形質移入されたまたは感染させられたもしくは以下に記載されるように組換えＤＮＡクローニングビークルで感染させられた宿主細胞により産生されることができ、そのような融合ペプチドはその後、宿主細胞から単離され、他の宿主細胞タンパク質を実質的に含まない融合ポリペプチドを提供することができる。
免疫原性組成物
本発明の１つの態様は、少なくとも１つの２０８６タンパク質または前記タンパク質をコードする核酸を含む免疫原性組成物を提供する。上記のものは、（１）複数の菌株への殺菌抗体を引き出し、（２）複数の菌株の表面と反応し、（３）生菌攻撃に対する受動的保護を付与し、および／または、（４）コロニー形成を防止する能力を有する。そのような免疫原性組成物の製剤は、当業者によく知られている。ある一定の実施形態において、本発明の組成物は、薬学的に許容される担体および／または希釈剤を含む。適切な薬学的に許容される担体および／または希釈剤としては、あらゆるすべての従来の溶媒、分散媒、フィラー、固体担体、水溶液、コーティング、抗菌性および抗真菌性薬剤、等張性および吸収遅延薬剤等が含まれる。適切な薬学的に許容される担体としては、例えば、１つ以上の水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセリロール、エタノール等、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。薬学的に許容される担体はさらに、湿潤または乳化剤、防腐剤またはバッファーのような抗体の保存期間または有効性を向上する少量の補助物質をさらに含み得る。薬学的に許容される担体の調製および使用は、技術的によく知られている。いずれかの従来の培地または薬剤が活性成分と不和合である限りを除き、本発明の免疫原性組成物におけるそれらの使用は考慮される。本発明のある一定の実施形態によれば、薬学的に許容される担体は、担体タンパク質である。
担体タンパク質
担体タンパク質は、好ましくは非毒性かつ非反応原性であり、さらに十分な量および純度で入手可能なタンパク質である。担体タンパク質は、標準の接合手順に適用できるべきである。本発明の特定の実施形態において、ＣＲＭ１９７が担体タンパク質として用いられる。
【０１０６】
ＣＲＭ１９７１９７（Ｗｙｅｔｈ，Ｓａｎｆｏｒｄ，ＮＣ）は、カザアミノ酸および酵母抽出物をベースとする培地中で生育されたコリネバクテリウム・ジフテリア菌株Ｃ７（β１９７）の培養物から単離されたジフテリア毒素の非毒性変異体（すなわち、トキソイド）である。ＣＲＭ１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈降、およびイオン交換クロマトグラフィーによって精製される。ＣＲＭ１９７を得る別の方法は、米国特許第４，９２５，７９２号に記載される。代わりに、ＣＲＭ１９７は、米国特許第５，６１４，３８２号に従って組換え的に調製される。他のジフテリアトキソイドも、担体タンパク質としての使用に適する。
【０１０７】
他の実施形態において、本発明の担体タンパク質は、酵素的に不活性なストレプトコッカルＣ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）（例えば、米国特許第６，２７０，７７５号、同第６，３５５，２５５号、および同第６，９５１，６５３号に記載される１つ以上のＳＣＰ変異体）である。
【０１０８】
他の適切な担体タンパク質としては、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（例えば、国際公開第２００４／０８３２５１号に記載されるＣＴ  Ｅ２９Ｈ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＴ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＴ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤｎａＫタンパク質、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の外毒素Ａのような不活性化された細菌毒素が含まれる。外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン毒素（例えば、米国特許第５，５６５，２０４号）、ニューモリシントキソイド（例えば、国際公開第２００５／１０８５８０号）肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質（ＰｓａＡ）、またＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄのような細菌外膜タンパク質もまた用いられる。ミコバクテリアｈｓｐ−７０のような細菌熱ショックタンパク質もまた用いられる。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓタンパク質ＳｄｒＧ、ＳｉｔＣおよびフェロクロム結合タンパク質、ならびにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓタンパク質ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢおよびＦｎｂＡのような他のタンパク質もまた用いられる。オボアルブミン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーザ（ＧＳＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ガラクトキナーザ（ｇａｌＫ）、ユビキチン、β−ガラクトシダーゼ、インフルエンザＮＳ１タンパク質、またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）のようなさらに他のタンパク質もまた、担体タンパク質として用いられる。例えばロタウイルスＶＰ６またはバクテリオファージＱβ由来のウイルス様粒子もまた用いられる。
アジュバント
本明細書中で記載されるような免疫原性組成物はまた、ある一定の実施形態において、１つ以上のアジュバントを含む。アジュバントは、免疫原または抗原と共に投与された時に、免疫応答を増大させる物質である。いくつかのサイトカインおよびリンホカインは、免疫調整活性を有することが示されており、したがってアジュバントとして有用であり、インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（例えば、米国特許第５，７２３，１２７号参照）、１３、１４、１５、１６、１７および  １８（ならびにその突然変異体）；インターフェロン−α、βおよびγ；顆粒状マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（例えば、米国特許第５，０７８，９９６号およびＡＴＣＣ受入番号３９９００参照）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ならびに腫瘍壊死因子αおよびβが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で記載される免疫原性組成物と共に有用な他のアジュバントとしては、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＥＴＳを制限無く含むケモカイン；セレクチン、例えば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンのような接着分子；ムチン様分子、例えば、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１；ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５のようなインテグリンファミリーの一つ；ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭｓ、例えば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３、ＣＤ２およびＬＦＡ−３のような免疫グロブリンスーパーファミリーの一つ；ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌのような共刺激分子；血管成長因子、神経成長因子、神経芽細胞成長因子、表皮成長因子、Ｂ７．２、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１、ならびに血管内皮成長因子を含む成長因子；Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、およびＤＲ６を含む受容体分子；ならびにカスパーゼ（ＩＣＥ）が含まれる。
【０１０９】
免疫応答を強化するために用いられる適切なアジュバントは、制限なく、ＭＰＬ（登録商標）（３−Ｏ−デアシル化モノホスホリル脂質Ａ，Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）をさらに含み、これは米国特許第４，９１２，０９４号に記載される。合成脂質Ａ類似体またはアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）あるいはその誘導体または類似物も、アジュバントとしての使用に有用であり、これらは、Ｃｏｒｉｘａ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）から利用可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載される。１つのそのようなＡＧＰは、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル−アミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、これも、５２９として知られている（以前は、ＲＣ５２９として知られていた）。この５２９アジュバントは、水性形態（ＡＦ）または安定エマルション（ＳＥ）として配合される。
【０１１０】
さらに他のアジュバントとしては、Ｎ−アセチル−ムラニル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）のようなムラミルペプチド；ＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号）（５％スクワレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５を含み（種々の量のＭＴＰ−ＰＥを任意に含み））、モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子状に処方される）、およびＳＡＦ（１０％スクワレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロンエマルションに微小液滴化されるか、より大きい粒径のエマルションを生成するために渦撹拌される）のような水中油型エマルション；不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムのようなアルミニウム塩（みょうばん）；アンフィゲン（Ａｍｐｈｉｇｅｎ）、アブリジン、Ｌ１２１／スクワレン、Ｄ−ラクチド−ポリアクチド／グリコシド；プルロニックポリオール；死菌Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ；米国特許第５，０５７，５４０号に記載のＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ．）、米国特許第５，２５４，３３９号に記載のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のようなサポニン；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；細菌リポ多糖；ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドのような合成ポリヌクレオチド（例えば、米国特許第６，２０７，６４６号）；欧州特許第１，２９６，７１３号および同第１，３２６，６３４号に記載のＩＣ−３１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ  ＡＧ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）；百日咳毒素（ＰＴ）またはその突然変異体、コレラ毒素またはその突然変異体（例えば、国際出願第００／１８４３４号、同第０２／０９８３６８号および同第０２／０９８３６９号）；あるいはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９；例えば、国際出願第９３／１３３０２号および同第９２／１９２６５号参照、が含まれる。
投与様式
そのような免疫原性組成物は、非経口的に、例えば、皮下注射か筋肉内注射により、ならびに経口的または鼻腔内的に投与され得る。筋肉内免疫化の方法は、ＷｏｌｆｆらおよびＳｅｄｅｇａｈらにより記載されている。他の投与様式は、例えば、経口製剤、肺製剤、座薬、および経皮適用を用いるが、それらに限定されない。経口製剤としては、例えば、製薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常用いられる賦形剤が含まれるが、それらに限定されない。
【０１１１】
本発明の免疫原性組成物は、ＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激性複合体）、ＩＳＣＯＭＳ含有ＣＴＢ、リポソームの形態で送達されるか、あるいは吸着に適したサイズの微小球を形成するためにアクリレートまたはポリ（ＤＬ−ラクチド−グリコシド）のような化合物中にカプセル化され得る。本発明のタンパク質はまた、油性エマルションに組み入れられ得る。
多重抗原
本発明のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび等価物を含む免疫原性薬剤は、免疫原性組成物中の唯一の能動免疫原として投与されてもよく、代わりに、組成物は、他のＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐ．免疫原性ポリペプチド、または１つ以上の他の微生物病原体（例えば、ウイルス、プリオン、細菌、真菌、ただしこれらに限定されない）の免疫学的活性なタンパク質もしくは莢膜多糖を含む他の能動免疫原を含んでもよい。組成物は、選ばれた徴候について要求されるように、１つ以上の所望のタンパク質、フラグメントまたは製薬化合物を含み得る。同様に、免疫原性組成物中に１つ以上の核酸を使用する本発明の組成物は、上記のように、同じ多様なタンパク質群をコードする核酸も含み得る。
【０１１２】
任意の多重抗原または多価免疫原性組成物が本発明により考慮される。例えば、本発明の組成物は、粘膜送達に適した形態で、２つ以上の２０８６タンパク質の組み合わせ、２０８６タンパク質と１つ以上のＰｏｒＡタンパク質との組み合わせ、２０８６タンパク質と髄膜炎菌セログループＡ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５多糖および／または多糖結合体との組み合わせ、２０８６タンパク質と髄膜炎菌および肺炎球菌組み合わせとの組み合わせ、または上記のいずれかの組み合わせを含み得る。当業者は、そのような多重抗原または多価免疫学的組成物を容易に配合できるであろう。
【０１１３】
本発明はまた、病原体に対し有用な任意の組成物を本発明の組成物の中でまたは本発明の組成物と共に組み合わせることができる、多重免疫化処方計画も考慮する。例えば、制限無く、患者は、多重免疫化処方計画の一環として、本発明の免疫原性組成物およびＳ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して免疫化するための別の免疫学的組成物を投与され得る。当業者は、多重免疫化処方計画を開発および実施するために、本発明の免疫原性組成物と併用するための免疫原性組成物を容易に選択することができるであろう。
【０１１４】
本発明の特定の実施形態は、Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の予防または改善のための組成物中でまたは処置処方計画の一環として、１つ以上の本発明のポリペプチドまたはそれをコードする核酸の使用に関する。２０８６ポリペプチドまたは２０８６ポリヌクレオチドを、Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染に対して使用するための任意の免疫原性組成物と組み合わせることができる。また、２０８６ポリペプチドまたは２０８６ポリヌクレオチドを、任意の他のタンパク質または多糖ベースの髄膜炎菌ワクチンと組み合わせることができる。
【０１１５】
２０８６ポリペプチド、フラグメントおよび等価物は、接合免疫原性組成物の一部として用いることができ、その場合、１つ以上のタンパク質またはポリペプチドは、いくつかのセロタイプに対しておよび／またはいくつかの疾患に対して免疫原性特性を有する組成物を生成するために、担体タンパク質に接合する。代わりに、２０８６ポリペプチドの１つが、他の免疫原性ポリペプチドのための担体タンパク質として用いられ得る。
【０１１６】
本発明はまた、哺乳動物における免疫応答を引き起こす方法に関し、この方法は本発明の免疫原性組成物を前記哺乳動物に提供するステップを含む。この免疫原性組成物は、そのような組成物中に含まれる免疫学的有効量のポリペプチドがＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に対して所望の免疫応答を引き起こすように、処置される動物またはヒトにおいて抗原性の組成物である。好ましい実施形態は、ヒトにおけるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染の改善または予防を含む処置のための方法に関し、この方法は、免疫学的有効量の組成物をヒトに投与するステップを含む。
【０１１７】
本明細書中で用いられるように、文言「免疫学的有効量」は、処置された個体の免疫系に細菌感染の臨床的衝撃を低減する応答を少なくとも引き起こさせるのに十分な単一用量か、一連の用量の一環としての、哺乳動物宿主（好ましくはヒト）への投与を意味する。これは、細菌負荷の最小限の減少から細菌感染の予防にまで及び得る。理想的には、処置された個体は、細菌感染のより深刻な臨床的徴候を示さない。投薬量は、個体の特定の条件に応じて変わり得る。この量は、常用の試行により、さもなければ当業者に既知の手段により決定できる。
【０１１８】
本発明の別の特定の態様は、本発明のタンパク質、またはその免疫原性部分を発現させるベクターまたはプラスミドを免疫原性組成物として用いることに関する。したがって、さらなる態様として、本発明は、哺乳動物において免疫応答を引き起こす方法を提供し、この方法は、少なくとも１つの単離２０８６ポリペプチドを発現させるベクターまたはプラスミドを哺乳動物に提供するステップを含む。本発明のタンパク質は、生きたベクターを用いて、特に、異物ポリペプチドとしてポリペプチドまたは免疫原性部分の発現に必要な遺伝物質を含んでいる、生きた組換え細菌、ウイルスまたは他の生きた薬剤を用いて哺乳動物に送達され得る。
【０１１９】
本発明のさらなる実施によれば、哺乳動物において細菌性髄膜炎を診断するための方法が提供され、この方法は、哺乳動物または該哺乳動物の組織試料中の免疫複合体の存在を検出するステップを含み、前記哺乳動物または組織試料は、偶数番号配列配列番号２−１２のいずれかのアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体を含む抗体組成物と接触させられ、哺乳動物または組織サンプルは、免疫複合体の形成に適した条件下で抗体組成物と接触させられる。
ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター
特にｉｎ  ｖｉｔｏｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ細胞アッセイのための好ましいベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、および望ましい細胞指向性を持つ他の組換えウイルスのようなウイルスベクターである。したがって、２０８６タンパク質またはその免疫原性フラグメントをコードする核酸は、ウイルスベクターを用いてまたはＤＮＡの直接導入により、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで導入され得る。標的組織中での発現は、ウイルスベクターまたは受容体リガンドにより、または組織特異性プロモーターを用いて、あるいはその両方により、トランスジェニックベクターを特定の細胞特定に向けることにより行われ得る。標的遺伝子送達は、国際公開第９５／２８４９４号に記載され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１２０】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏターゲティングおよび療法手順において一般的に用いられるウイルスベクターは、ＤＮＡベースのベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターを調製し、使用する方法は、技術的に知られている（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９２，７：９８０−９９０）。好ましくは、ウイルスベクターは複製欠陥性であり、すなわち、それらのウイルスベクターは、標的細胞中で自律的に複製できない。好ましくは、複製欠陥性ウイルスは最小のウイルスであり、すなわち、そのウイルスは、ウイルス粒子を産生するゲノムを被包するのに必要なそのゲノム配列のみを保持する。
【０１２１】
ＤＮＡウイルスベクターとしては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、乳頭腫ウイルス、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等のような、ただしこれらに限定されない弱毒性または欠陥ＤＮＡウイルスが含まれる。ウイルス遺伝子を完全にまたはほぼ完全に欠く欠陥ウイルスが好ましい。欠陥ウイルスは、細胞内への導入後に感染性はない。欠陥ウイルスベクターの使用は、ベクターが他細胞に感染し得るという不安なしに、特定の局部的領域における細胞への投与ができる。したがって、特定の組織を特異的に標的とし得る。具体的なベクターの例としては、各々が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、欠陥ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９１，２：３２０−３３０）、糖タンパク質Ｌ遺伝子を欠く欠陥ヘルペスウイルスベクター、または他の欠陥ヘルペスウイルスベクター（国際公開第９４／２１８０７号および同９２／０５２６３号）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．により記載されたベクターのような、弱毒アデノウイルスベクター（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９２，９０：６２６−６３０；Ｌａ  Ｓａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２５９：９８８−９９０も参照）；および欠陥アデノ随伴ウイルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．，１９８７，６１：３０９６−３１０１；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．，１９８９，６３：３８２２−３８２８；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８８，８：３９８８−３９９６）が含まれるが、それらに限定されない。
【０１２２】
Ａｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ；ＡＡＶベクター）、Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｓｙｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ；レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶベクター、およびレンチウイルスベクター）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（レトロウイルスおよびバキュロウイスルベクター）、Ｇｅｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．（Ｓｈａｒｏｎ  Ｈｉｌｌ，ＰＡ；アデノウイルスおよびＡＡＶベクター）、Ｇｅｎｖｅｃ（アデノウイルスベクター）、ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ；アデノウイルスベクター）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、およびヘルペスウイルスベクター）、Ｎｏｒｇｅｎ（アデノウイルスベクター）、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ；レンチウイルスベクター）、およびＴｒａｎｓｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ；アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、およびレンチウイルスベクター）を含む様々な企業がウイルスベクターを商業的に製造しているが、これらに限定されるものではない。
【０１２３】
アデノウイルスベクター。アデノウイルスは、本発明の核酸を各種の細胞型に効率的に送達するように修飾され得る真核ＤＮＡウイルスである。アデノウイルスの様々なセロタイプが存在する。これらのセロタイプのうち、本発明の範囲内で、２型または５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）あるいは動物起源アデノウイルス（国際公開第９４／２６９１４号参照）の使用が優先される。本発明の範囲内で用いられ得るそれらの動物起源アデノウイルスとしては、イヌ、ウシ、マウス（例：Ｍａｖ１，Ｂｅａｒｄら、Ｖｉｒｏｌｏｙ，１９９０，７５−８１）、ヒツジ、ブタ、トリ、およびサル（例：ＳＡＶ）起源が含まれる。好ましくは、動物起源アデノウイルスは、イヌアデノウイルス、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルス（例えば、マンハッタンまたはＡ２６／６１株、ＡＴＣＣ  ＶＲ−８００）である。様々な複製欠陥アデノウイルスおよび最小アデノウイルスベクターが記載されている（国際公開第９４／２６９１４号、同第９５／０２６９７号、同第９４／２８９３８号、同第９４／２８１５２号、同第９４／１２６４９号、同第９５／０２６９７号、同第９６／２２３７８号）。本発明による複製欠陥組換えアデノウイルスは、当業者に知られている任意の手法で調製され得る（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ，１９９１，１０１：１９５；欧州特許出願公開第１８５５７３号；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９８４，３：２９１７；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９７７，３６：５９）。組換えアデノウイルスは、当業者に周知の標準的分子生物学的手法を用いて回収および精製される。
【０１２４】
アデノ随伴ウイルス。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、それらが感染する細胞のゲノムに安定的かつ部位特異的なやり方で同化できる比較的小サイズのＤＮＡウイルスである。これらのウイルスは、細胞の成長、形態、または分化へのどのような効果も引き起こすことなく広範囲の細胞に感染することができ、ヒトの病理学に関与しないと思われる。ＡＡＶゲノムは、クローン化され、配列決定され、特性決定されている。遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで転移するためのＡＡＶ由来ベクターの使用が記載されている（国際公開第９１／１８０８８号および同第９３／０９２３９号；米国特許第４，７９７，３６８号および同第５，１３９，９４１号；欧州特許出願公開第４８８５２８号参照）。本発明による複製欠陥語組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域により隣接された対象となる核酸配列を含むプラスミドを、ＡＡＶキャプシド形成遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を持つプラスミドと、ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）で感染させた細胞系に同時形質移入することにより調製できる。産生されたＡＡＶ組換え体は次に、標準的手法によって精製される。
【０１２５】
レトロウイルスベクター。本発明の別の実施において、例えば、各々が参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第５，３９９，３４６号；Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ，１９８３，３３：１５３；米国特許第４，６５０，７６４および同第４，９８０，２８９号、Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．，１９８８，６２：１１２０；米国特許第５，１２４，２６３号；欧州特許出願公開第４５３  ２４２号および同第１７８  ２２０号；Ｂｅｒｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．，１９８５，７：２３５；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８５，３：６８９；国際公開第９５／０７３５８号；およびＫｕｏら、Ｂｌｏｏｄ，１９９３，８２：８４５に記載されるように、核酸をレトロウイルスベクターに導入できる。レトロウイルスは、分裂細胞に感染する組込みウイルスである。レトロウイルスゲノムは、２つのＬＴＲ、キャプシド形成配列および３つのコード化領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。組換えレトロウイルスベクターにおいて、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は一般に、全部または部分的に欠失され、対象となる異種核酸配列で置き換えられる。これらのベクターは、ＨＩＶ、ＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー白血病ウイルス」）、ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）およびフレンドウイルスのような、異なる型のレトロウイルスから構築できる。適切なパッケージング細胞系が先行技術において記載されており、特に細胞系ＰＡ３１７（米国特許第４，８６１，７１９号）；ＰｓｉＣＲＩＰ細胞系（国際公開第９０／０２８０６号）およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞系（国際公開第８９／０７１５０号）である。加えて、組換えレトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するためのＬＴＲ内の修飾、ならびにｇａｇ遺伝子の一部を含み得る広いキャプシド形成配列も含み得る（Ｂｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．，１９８７，６１：１６３９）。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に知られている標準的手法により精製される。
【０１２６】
レトロウイルスベクターは、感染性粒子として機能するように、または単一ラウンドの形質移入を受けるように構成され得る。前者の場合、ウイルスは、発がん性形質転換の原因となるものを除くその遺伝子すべてを保持し、異種遺伝子を発現させるように修飾される。非感染性ウイルスベクターは、ウイルスパッケージングシグナルを抹消するが、異種遺伝子およびパッケージングシグナルを含むように設計された同時導入ウイルスをパッケージするために必要な構造遺伝子を保持するように操作される。したがって、産生されるウイルス粒子は、付加的なウイルスを産生することができない。
【０１２７】
レトロウイルスベクターはまた、ＤＮＡウイルスにより導入されてもよく、それにより、１サイクルのレトロウイルス複製が可能になり、形質移入効率が増幅される（国際公開第９５／２２６１７号、同第９５／２６４１１号、同第９６／３９０３６号および同第９７／１９１８２号参照）。
【０１２８】
レンチウイルスベクター。本発明の別の実施において、レンチウイルスベクターは、脳、網膜、筋肉、肝臓および血液を含むいくつかの組織型における導入遺伝子の直接送達および持続的発現のための薬剤として用いられ得る。ベクターは、これらの組織中の分裂および非分裂細胞を効率的に形質導入し、対象となる遺伝子の長期発現をもたらし得る。概要については、Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９８，９：４５７−６３を参照、また、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，１９９８，７２：９８７３−８０も参照されたい。レンチウイルスパッケージング細胞系は、利用可能であり、当該技術分野において一般に知られている。レンチウイルスパッケージング細胞系は、遺伝子治療のための高力価レンチウイルスベクターの産生を容易にする。一つの例が、少なくとも３ないし４日間、１０６ＩＵ／ｍＬより大きい力価のウイルス粒子を生成できるテトラサイクリン誘導ＶＳＶ−Ｇプソイド型レンチウイルスパッケージング細胞系である（Ｋａｆｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，１９９９，７３：５７６−５８４）。誘導細胞系により産生されたベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで非分裂細胞を効率的に形質導入するために必要に応じて濃縮され得る。
【０１２９】
非ウイルスベクター。本発明の別の実施において、ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏでリポフェクションにより裸のＤＮＡとして、または他の形質移入促進薬剤（ペプチド、ポリマー等）を用いて導入され得る。合成カチオン性脂質は、マーカーをコードする遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ形質移入のためのリポソームを調製するために用いられ得る（Ｆｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８７，８４：７４１３−７４１７；Ｆｅｌｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｉｎｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，３３７：３８７−３８８；Ｍａｃｋｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５：８０２７−８０３１；Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２５９：１７４５−１７４８）。核酸の転移に有用な脂質化合物および組成物は、国際出願第９５／１８８６３号、同第９６／１７８２３号、および米国特許第５，４５９，１２７号に記載される。ターゲティングの目的で、脂質を他の分子に化学的に結合させることができる（上記、Ｍａｃｋｅｙ，ｅｔ  ａｌ．参照）。標的ペプチド、例えば、ホルモンまたは神経伝達物質、および抗体のようなタンパク質、または非ペプチド分子を、リポソームに化学的に結合させることができるであろう。
【０１３０】
カチオン性オリゴペプチド（例えば、国際公開第９５／２１９３１号）、ＤＮＡ結合タンパク質から誘導されたペプチド（例えば、国際公開第９６／２５５０８号）、またはカチオン性ポリマー（例えば、国際公開第９５／２１９３１号）のような他の分子もまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで核酸の形質移入を促進するのに有用である。
【０１３１】
ベクターを裸のＤＮＡプラスミドとしてｉｎ  ｖｉｖｏで導入することも可能である。ワクチン目的または遺伝子治療のための裸のＤＮＡベクターは、技術的に知られている方法、例えば、電気穿孔法、顕微注射、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体の使用により所望の宿主細胞に導入され得る（例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７：９６３−９６７；Ｗｕ  ａｎｄ  ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，２６３：１４６２１−１４６２４；カナダ特許出願公開第２，０１２，３１１号；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８：２７２６−２７３０）。受容体媒介ＤＮＡ送達方法もまた用いられ得る（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１９９２，３：１４７−１５４；Ｗｕ  ａｎｄ  ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，２６２：４４２９−４４３２）。米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号は、哺乳動物における、形質移入助長薬剤の無い、外因性ＤＮＡ配列の送達を開示している。最近、エレクトロトランスファー（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｆｅｒ）と呼ばれる比較的低電圧、高効率のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＤＮＡ転移手法が記載されている（Ｍｉｒら、Ｃ．Ｐ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８８，３２１：８９３；国際公開第９９／０１１５７号；同第９９／０１１５８号；同第９９／０１１７５号）。したがって、本発明の付加的な実施形態は、ヒトにおける免疫応答を引き起こす方法に関し、この方法は、本発明の２０８６ポリペプチドをコードするある量のＤＮＡ分子を、任意に形質導入促進薬剤と共に、前記ヒトに投与するステップを含み、前記ポリペプチドは、発現された場合に免疫原性を保持し、免疫原性組成物中に組み込まれてヒトに投与された場合に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのようなＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐ．病原体にその後ヒトが感染した際に、増大した疾患を引き起こすことなく保護を提供する。形質移入促進薬剤は、技術的に知られており、参照により本明細書に組み込まれるブピビカイン、ならびに他の局部麻酔薬（例えば、米国特許第５，７３９，１１８号参照）およびカチオン性ポリアミン（国際公開第９６／１００３８号に公開される）を含む。
【０１３２】
本発明はまた、抗体に関し、この抗体は、上記で記載されるように２０８６ポリペプチドに特異的な、モノクローナル抗体かポリクローナル抗体であり得る。そのような抗体は、当業者によく知られた方法により産生され得る。
細菌発現系およびプラスミド
本発明はまた、ベクターまたはプラスミドのような組換えＤＮＡ分子を提供し、これは、プロモーター配列およびイニシエーター配列ならびに本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する発現制御配列を含み、ヌクレオチド配列は、プロモーターおよびイニシエーター配列に対して３’に位置する。さらに別の態様において、本発明は、プロモーター配列およびイニシエーター配列を有する発現制御配列、ならびに２０８６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する、２０８６ポリペプチドを発現することができる組換えＤＮＡクローニングビヒクルを提供し、ヌクレオチド配列は、プロモーターおよびイニシエーター配列に対し３’に位置する。さらなる態様において、上記で記載されるような組換えＤＮＡクローニングビークルおよび／または組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞が提供される。適切な発現制御配列および宿主細胞／クローニングビークルの組み合わせは、技術的によく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に例証として記載されている。
【０１３３】
ひとたび本発明の所望のポリペプチドを発現する組換えＤＮＡクローニングビークルおよび／または宿主細胞が、対応する２０８６ポリヌクレオチドを含有するプラスミドにより形質転換、形質移入または感染させることにより構築されたら、クローニングビークルまたは宿主細胞は、ポリペプチドが発現されるような条件下で培養される。ポリペプチドは次に、当業者によく知られた手法により、汚染宿主細胞成分を実質的に含まずに単離される。
【０１３４】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例中で開示される手法が、本発明の実施においてうまく機能することが本発明者らに発見された手法を代表するものであり、したがって本発明の実施のための好ましい態様を構成することが当業者により理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、開示される特定の実施形態において多くの変更がなされ、それでもなお本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく同様なまたは類似の結果を得ることができると理解するべきである。
【実施例】
【０１３５】
（実施例１）
異種菌株に対する殺菌抗体を引き出すことが可能なナイセリア膜タンパク質抽出物の同定：
以下の表ＩＩを参照すると、ＬＯＳ（脂質オリゴ糖）除去外膜タンパク質調製物は、殺菌抗体を引き出すことが示されている。これらの抗体は、それぞれの菌株のＰｏｒＡに向けられることが多くある。セログループＢ髄膜炎菌株８５２９（Ｂ：１５：Ｐ１．７ｂ，３）由来のＬＯＳ除去外膜調製物は、このように普通ではない。なぜならば、それらの調製物は、いくつかの異種菌株に対する殺菌抗体を引き出すからである。
【０１３６】
【表２】
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異種殺菌抗体を引き出す原因となる抗原の単離および特性決定を容易にするため、本発明者らは、どの界面活性剤が抗原を最適に抽出したかを同定しようと努めた。
菌株および培養条件
凍結したガラスびんからのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株８５２９を、ＧＣプレート上に筋状に塗った。（髄膜炎菌株８５２９は、Ｔｈｅ  ＲＩＶＭ，Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから受領した）。プレートを、３６Ｃ／５％ＣＯ２で７．５時間インキュベートした。いくつかのコロニーを用い、５０ｍＬの修正フランツ培地＋ＧＣサプリメントを含むフラスコに接種した。フラスコを３６℃にてエアシェーカー中でインキュベートし、２００ＲＰＭで４．５時間撹拌した。５ｍＬを用いて、４５０ｍＬの修正フランツ培地＋ＧＣサプリメントを含むフェルンバッハフラスコに接種した。フラスコを３６℃にてエアシェーカー中でインキュベートし、１００ＲＰＭで１１時間撹拌した。４５０ｍＬ全部を用いて、１０Ｌ発酵槽中の８．５Ｌの修正フランツ培地＋ＧＣサプリメントに接種した。
修正フランツ培地の組成：
グルタミン酸                          １．３ｇ／Ｌ
システイン                            ０．０２
リン酸水素二ナトリウム・７水和物        １０
塩化カリウム                          ０．０９
塩化ナトリウム                        ６
塩化アンモニウム                      １．２５
透析酵母抽出物（ＹＥ）                ４０ｍｌ
（５容量のｄＨ２Ｏに対して一晩透析し、次いでオートクレーブした２５％ＹＥ溶液）
ＧＣサプリメント１００Ｘ、フィルタ殺菌
デキストロース                        ４００ｇ／Ｌ
グルタミン酸                          １０
コカルボキシラーゼ                    ０．０２
硝酸第二鉄                            ０．５
以下のパラメータを発酵中制御した：温度＝３６℃；ｐＨ＝７．４；溶存酸素＝２０％。数滴のＰ−２０００消泡剤を添加して発泡を制御した。培養物を定常期まで生育させた。細胞を、ＯＤ６５０＝５．２５において遠心分離により収集した。一般に、全部で１００〜３００グラムの湿潤細胞ペーストが、〜８．５Ｌの培養物から収集される。
異種殺菌抗体を引き出す髄膜炎菌由来の外膜タンパク質画分の部分的精製：
湿重量１００グラムの細胞を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１ｍＮ  Ｎａ２ＥＤＴＡで湿重量の５倍の体積に縣濁させ、そしてチャンバを備える１１０Ｙマイクロフルイダイザーを約１８，０００ｐｓｉで通過させて溶解させた。細胞ライゼートを清澄にし、３００，０００×ｇで１時間の遠心分離により細胞エンベロープを単離した。細胞エンベロープを、同じバッファーでホモジナイザーを用いて縣濁し、続いて上記のように遠心分離して２回洗浄した。次に細胞エンベロープを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１ｍＮ  ＭｇＣｌ２中の１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ３２０ｍＬで抽出した。以下の表ＩＩＩを参照すると、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４を用いた逐次ディファレンシャル界面活性剤抽出、続いてのマウスの免疫化の結果により、Ｔｒｉｔｏｎ抽出物が、対象となる候補を最適に抽出したと確認することができた。次に、表ＩＩＩに列記された５つの菌株のうち４つに対して殺菌抗体応答を引き出すこのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００抽出物を、ＢｉｏＲａｄ  Ｒｏｔｏｐｈｏｒユニット中での調製用等電点分離（ＩＥＦ）により分画した。両性電解質濃度は、１％ｐＨ４〜６と混合された１％ｐＨ３〜１０であった。表ＩＩＩに示されるように、いくつかの画分は、異種殺菌性応答を引き出すことが見出された。ＩＥＦから得られた画分は、５．５〜７．８のｐＨ範囲で集束したものであり、殺菌アッセイにより確認されるように大部分の菌株に対する異種応答を引き出した。プールしたＩＥＦ画分を濃縮し、両性電解質をエタノール沈降により除去した。約５．５〜７．８のｐＨ範囲で得られたタンパク質のいくらかを陰イオン交換カラムに吸着させ、吸着タンパク質および非吸着タンパク質でマウスを免疫化した後に得られる殺菌活性を比較することにより、さらなる精製が達成された。表ＩＩを再度参照すると、多くのタンパク質が陰イオン交換樹脂に吸着された一方、カラムにより吸着されなかったタンパク質はより多くの異種殺菌抗体を引き出した。
【０１３７】
【表３】
2010512792.tif 000008
ＮＴ：試験せず
＊臨床分離株５３９は、同じ発生から単離された８５２９の相同菌株である。
【０１３８】
図１Ａに示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認されるように、非吸着画分中に２つの主要タンパク質が存在した。これらのタンパク質を同定するため、２種類の分析を実行した。一方の分析は、限定タンパク質分解（図１Ａおよび図１Ｂ参照）を実行し、続いてペプチドの単離および直接的タンパク質配列決定を行うものであった。他方の分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行し、続いてゲル切り出し、タンパク質分解消化、およびＬＳ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィータンデム質量分析）を行い、（図３参照）対象となる調製物の成分についての質量スペクトル情報を得ることであった。（後に本節中で説明されるペプチドマッピングおよび配列決定方法を参照）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ａ  Ｓａｎｇｅｒゲノム配列は、ＺａｕｇｕｒｓｋｙおよびＲｕｓｓｅｌ，２００１，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３１：６３６−６５９に記載される方法およびアルゴリズムを用いて分析した。このマイニング分析により、１２，０００以上の考え得るオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がもたらされた。上述の直接配列データおよび質量スペクトルデータは、非吸着画分の主要成分が、Ｓａｎｇｅｒデータベースの分析中に存在するいくつかのＯＲＦの生成物であることを示した。この方法論により同定された３つの主なタンパク質は、ＯＲＦ４４３１、５１６３および２０８６に対応する（図１Ｂおよび３参照）。
【０１３９】
ＯＲＦ４４３１は、画分中で同定された最も支配的なタンパク質であったが、組換え脂質化４４３１に対するマウス抗体は殺菌性ではなく、動物モデルにおいて防御応答をもたらさなかった。ＯＲＦ５１６３の付加的な分析は進行中である。
【０１４０】
本明細書中で記載される調製物の２番目に支配的な成分は、ＯＲＦ２０８６の生成物に対応する。
免疫原性方法：
抗血清の調製：
言及される場合を除き、タンパク質組成物／ワクチンは、２５μｇの総タンパク質で製剤し、２０μｇＱＳ−２１をアジュバントとした。０．２ｍＬの用量を皮下（臀部）注射により、６〜８週齢雌スイスウェブスターマウスに０週目および４週目に投与した。０週目および４週目に血液を採取し、最終瀉血を６週目に実行した。
殺菌アッセイ：
殺菌アッセイは、本質的に記載されたように実行した（Ｍｏｕｎｔｚｏｕｒｏｓ  ａｎｄ  Ｈｏｗｅｌｌ，２０００，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８（８）：２８７８−２８８４参照）。ＳＢＡについての補体媒介抗体依存性の殺菌力価は、アッセイに導入された標的分子の≧５０％を致死させる試験血清の最高希釈の逆数として表した（ＢＣ５０力価）。
２０８６タンパク質の同定に用いた方法：
臭化シアン開裂およびフラグメントの直接的配列決定：
陰イオン交換非吸着画分（ＡＥＵＦ）の臭化シアン開裂。ＡＥＵＦを９０％冷エタノールにより沈降させ、７０％蟻酸中の１０ｍｇ／ｍＬ臭化シアンを用いて１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に可溶化した。反応は、暗所において室温で夜通し実行した。開裂生成物を高速真空によって乾燥させ、ペレットを、ＨＥ／０．１％還元ＴＸ−１００で可溶化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてＮ末端アミノ酸配列決定を用いて、この画分の成分を同定した。
成分を同定するためのプロテアーゼ消化／逆相／Ｎ末端配列決定：
ＡＥＵＦを、ＧｌｕＣ（Ｖ８）、ＬｙｓＣまたはＡｒｇＣで消化した。タンパク質と酵素の比は、３０μｇタンパク質と１μｇ酵素であった。消化は夜通し３７℃にて実行した。消化されたタンパク質混合物（３０μｇ）を、７ミクロンＡｑｕａｐｏｒｅ  ＲＦ−３００カラムに通し、０．１％トリフルオロ酢酸中の１０〜９５％アセトニトリルの勾配で溶出し、ピークを手作業で収集した。無タンパク質ブランクも走らせ、これからのピークを試料クロマトグラムから減じた。試料ランにおいてのみ生じるピークを質量分析器により分析し、明確な質量を与える試料をＮ末端アミノ酸配列決定について分析した。
Ｎ末端アミノ酸配列決定：
ブロットから切り出されたバンドの場合、タンパク質試料を、ＳＤＳゲルからＰＶＤＦ膜に移し、アミドブラック（脱イオン水中の１０％酢酸、０．１％アミドブラック）で染色し、１０％酢酸中で脱色した。次に所望のタンパク質バンドを、メタノールで洗浄した円刃刀またはミニ−Ｅｘａｃｔｏナイフを用いて全１０レーンから切り出し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７７Ａタンパク質シークエンサーの反応カートリッジに入れた。溶液中の試料の直接配列決定の場合、Ｐｒｏｓｏｒｂカートリッジを集め、ＰＶＤＦを６０μＬのメタノールで湿らせた。ＰＶＤＦを５０μＬの脱イオン水で洗浄し、試料（５０μＬ）をＰＶＤＦに置いた。５０μＬの脱イオン水を使用して試料を洗浄した後、Ｐｒｏｓｏｒｂ  ＰＶＤＦを押し抜き、乾燥し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７７Ａタンパク質シークエンサーの反応カートリッジに入れた。両方の方法について、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｎ末端シークエンサーを、最適ブロット条件下で１２サイクル以上（１サイクル  ブランク、１サイクル  標準、および所望の残基同定のための１０サイクル以上）走らせ、ＰＴＨ−アミノ酸検出をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  １２０Ａ  ＰＴＨアナライザーで行った。サイクルは、アナログチャートレコーダーおよび計測器ソフトウェアを介してデジタル式の両方で収集した。アミノ酸の帰属は、アナログおよびデジタルデータの両方を使用して、ＰＴＨ−アミノ酸の標準セットとアナライザー上でのそれら個々の保持時間の比較により行った（システイン残基は変換中に破壊され、検出されなかった）。複数の配列情報を単一の残基から得ることが可能であり、一次対二次帰属はシグナル強度に基づいて行われた。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
ＩＥＦにより精製されたタンパク質試料を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によりさらに分析した。タンパク質は、クーマシーブルー染色により視覚化し、対象となるバンドを手動で切り出し、その後還元し、アルキル化し、そして自動ｉｎ−ｇｅｌトリプシン消化ロボット（１）を用いてｉｎ  ｓｉｔｕでトリプシンにより消化（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）した。消化後、ペプチド抽出物を、Ｓａｖａｎｔ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ，Ｈｏｌｄｂｒｏｏｋ，ＮＹ）を使用して、最終容積１０〜２０μＬに濃縮した。
【０１４１】
ペプチド抽出物を、自動マイクロエレクトロスプレイ逆相ＨＰＬＣで分析した。簡単に言えば、マイクロエレクトロスプレイインターフェースは、１０ｕｍＣ１８逆相ビーズ（ＹＭＣ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）で長さ１０ｃｍに充填した、Ｐｉｃｏｆｒｉｔ石英ガラススプレイニードル、長さ５０ｃｍ、ＩＤ７５ｕｍ、８ｕｍオリフィス直径（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）で構成された。Ｐｉｃｏｆｒｉｔニードルは、質量分析器の前に位置する手製基部に保持された光ファイバーホルダー（Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）に取り付けた。カラムの後部を、チタンユニオンを介して配管し、エレクトロスプレイインターフェースに電気的接続を供給した。ユニオンを、ある長さの石英ガラスキャピラリー（ＦＳＣ）管と共に、ＨＰＬＣ溶媒ポンプ（ＡＢＩ  １４０Ｃ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）に連結されたＦＡＭＯＳオートサンプラー（ＬＣ−Ｐａｃｋｉｎｇｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）に連結した。ＨＰＬＣ溶媒ポンプは、５０μＬ／分の流量を送達し、これをＰＥＥＫマイクロタイトスプリッティングティー（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏａｋ  Ｈａｒｂｏｒ，ＷＡ）を使用して２５０ｎＬ／分に低下させ、ＦＳＣ移送ラインを用いてオートサンプラーに送った。ＬＣポンプおよびオートサンプラーは各々、それらの内部ユーザープログラムを使用して制御された。試料をプラスチック製オートサンプラーバイアルに入れ、密封し、５μＬ試料ループを使用して注入した。
マイクロキャピラリーＨＰＬＣ−質量分析：
ｉｎ−ｇｅｌ消化物由来の抽出ペプチドを、マイクロエレクトロスプレイＨＰＬＣシステムにより０〜５０％溶媒Ｂの５０分間勾配（Ａ：０．１Ｍ  ＨＯＡｃ、Ｂ：９０％  ＭｅＣＮ／０．１Ｍ  ＨＯＡｃ）を用いて分離した。ペプチド分析は、スプレイ電位１．５ｋＶで作動し、加熱キャピラリー温度１５０℃を使用したＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱイオントラップ質量分析器（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で行った。データは、機器と共に提供されたデータ取得ソフトウェアを使用して、自動ＭＳ／ＭＳモードで得た。取得方法は、１ＭＳスキャン（３７５〜１２００ｍ／ｚ）、続いてＭＳスキャン中の最も豊富な３種のイオンのＭＳ／ＭＳスキャンを包含した。動的排除関数および同位体排除関数を使用して分析されるペプチドイオンの数を増加させた（設定：３ａｍｕ＝排除幅、３分＝排除期間、３０秒＝排除前期間、３ａｍｕ＝同位体排除幅）。ＭＳ／ＭＳデータの自動分析は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの完全ゲノム由来のタンパク質データベース（Ｓａｎｇｅｒより）を使用して、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓデータ解析パッケージに含まれたＳＥＱＵＥＳＴコンピュータアルゴリズム（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して実行した。研究の結果を図３に示す。
（実施例２）
組換え脂質化Ｐ２０８６（ＲＬＰ２０８６）のクローニング：
Ａ．）天然のリーダー配列：
供給源物質：
ＯＲＦ２０８６遺伝子を、８５２９と呼ばれるセログループＢ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株の臨床分離菌からＰＣＲにより増幅させた。この菌株のセログループ、セロタイプおよびセロサブタイプは、括弧内に示される；８５２９（Ｂ：１５、Ｐ１：７ｂ、３）。この髄膜炎菌株は、Ｔｈｅ  ＲＩＶＭ，Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから得た。
ＰＣＲ増幅およびクローニング戦略：
ＯＲＦ２０８６の目視検査は、この遺伝子が潜在的なリポタンパク質シグナル配列を有することを示した。特許権によって保護されている隠れマルコフモデルリポタンパク質アルゴリズム（Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用した付加的な解析は、ＯＲＦ２０８６がリポタンパク質シグナル配列を含むことを確認した。より自然に近い立体配座でＰ２０８６を組換え発現させるために、オリゴヌクレオチドプライマーは、リポタンパク質シグナル配列を持つ全長遺伝子を増幅するように設計し、そしてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ａ  ＯＲＦ２０８６のＳａｎｇｅｒ配列の分析に基づいた。２０８６遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［ＡＢＩ２４００サーマルサイクラー，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ］によりＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株８５２９から増幅した。正しいサイズの増幅産物を結合し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。プラスミドＤＮＡを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで制限消化し、ゲル精製し、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に結合した。
【０１４２】
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを、β−シアノエチルホスホルアミダイト・ケミストリー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）を使用して、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓオリゴヌクレオチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）で合成した。
天然のリーダー配列を使用したｒＬＰ２０８６タンパク質発現：
図５を参照すると、プラスミドｐＰＸ７３４０をＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ宿主細胞（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に形質転換／形質移入、または感染させた。１つの形質転換体を選択し、２％グルコース、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）、およびテトラサイクリン（１２μｇ／ｍＬ）を含有するテリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）５０ｍＬに接種した。一晩培養した培養物のＯＤ６００は６．０であった。一晩培養した培養物を、１％グリセロールおよび同じ抗生物質を含有するテリフィックブロス１リットルで希釈した。出発ＯＤ６００は、０．４であった。２時間後、ＯＤ６００は１．６であり、誘導前試料を採取した。ＯＤ６００＝１に等価の細胞は遠心分離し、上澄みを除去した。全細胞ペレットを１５０μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーおよび１５０μＬの２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファーに再懸濁した。ＩＰＴＧを添加し、最終濃度１ｍＭとした。３．５時間後、記載されるように誘導後試料を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図４参照）。
ｒＬＰ２０８６の精製：
ｒＬＰ２０８６を、ディファレンシャル界面活性剤抽出後にＥ．ｃｏｌｉから可溶化した。天然環境にあるＰ２０８６とは異なり、ｒＬＰ２０８６は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１２によって著しく可溶化されなかった。ｒＬＰ２０８６のバルクをサルコシルで可溶化し、それはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおける相互作用とは異なってＥ．ｃｏｌｉの外膜成分と相互作用することを示唆した。ひとたび可溶化されると、ｒＬＰ２０８６は天然タンパク質と同様に精製され、その中に混在する多くのＥ．ｃｏｌｉタンパク質はアニオン交換樹脂にｐＨ＝８で吸着させることにより除去した。その理論的ｐＩより２分の１ｐＨ単位上であるにもかかわらず、ｒＬＰ２０８６はｐＨ８で吸着されないままであった。それ以上の精製は、ｐＨ４．５におけるカチオン交換樹脂へのｒＬＰ２０８６の吸着により達成された。
【０１４３】
ｒＬＰ２０８６の均一性をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の図２に示す。ｒＬＰ２０８６の質量はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析により２７，８３６であると確認された。この質量は理論的質量の２７，１００と７３６異なり、これは細菌リポタンパク質に共通なＮ末端脂質修飾の質量に近似する。天然およびｒＬＰ２０８６は共に外膜リポタンパク質であると考えられる。Ｎ末端配列決定の試みは妨げられ、このことは末端修飾と一致する。
精製方法：
Ｐ２０８６を発現するＢＬＲ  ＤＥ３  ｐＬｙｓＳ細胞の凍結ペレットを、２０ｍＬ／ｇ細胞湿重量で１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１μｇ／ｍＬ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）ｐＨ７．４（ＨＥＰ）に再懸濁し、マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙ）により溶解した。細胞ライゼートは１５０，０００×ｇで１時間遠心分離した。ペレットはＨＥＰで２回洗浄し、２回遠心分離し、得られた膜ペレットは一晩凍結した。該ペレットは１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ／１ｍＭ  ＭｇＣｌ２／１％ＴＸ−１００  ｐＨ７．４で３０分間可溶化し、続いて１５０，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。これを３回繰り返した。膜ペレットは上記のように５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２  ｐＨ８で２回洗浄し、続いて５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４  ｐＨ８および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４／０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８のそれぞれで２回洗浄した。
【０１４４】
次にｒＬＰ２０８６を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／１％サルコシル  ｐＨ８で可溶化した。このサルコシル抽出物を１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４（Ｚ３−１４）に調整し、３０倍過剰の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／１％Ｚ３−１４に対して２回透析した。透析したｒＬＰ２０８６抽出物は９０％エタノールで沈殿させ、残存するサルコシルを除去し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／１％Ｚ３−１４  ｐＨ８（ＴＥＺ）で可溶化した。不溶な物質は遠心分離により除去し、上澄みは陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを通し、ｒＬＰ２０８６を非結合画分に集めた。次に非結合画分を３０倍過剰の２５ｍＭ  ＮａＡｃ／１％Ｚ３−１４ｐＨ４．５に対して２回透析し、カチオン交換クロマトグラフィーカラムを通した。ｒＬＰ２０８６は０〜０．３Ｍ  ＮａＣｌ勾配で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）により分析した。ｒＬＰ２０８６プールはレーザーデンシトメトリーにより８４％純粋であることが確認された。
ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢに対する抗血清の表面反応性および殺菌活性：
表ＶＩＩを参照すると、サブファミリーＢ菌株８５２６由来の精製ｒＬＰ２０８６に対する抗血清は、全細胞ＥＬＩＳＡにより試験した１０種の２０８６サブファミリーＢ菌株すべてに対して表面反応性を示した。殺菌活性は異種セロサブタイプ抗原、ＰｏｒＡを発現する１０種の２０８６サブファミリーＢ菌株のうち９種に対して検出された。これらの菌株は西ヨーロッパ、アメリカ、オーストラリア、およびニュージーランド全体にわたってセログループＢ髄膜炎菌性疾患を引き起こす代表的な菌株である。殺菌アッセイで致死されなかった唯一の菌株、８７０２２７は、全細胞ＥＬＩＳＡにより抗ｒＬＰ２０８６（サブファミリーＢ）血清と強く反応し、この菌株がＰ２０８６に共通のエピトープを持つタンパク質を発現することを示した。
【０１４５】
表ＶＩＩに挙げた２０８６サブファミリーＡ菌株も同様に、全細胞ＥＬＩＳＡにより表面反応性を試験した。これらの菌株３種の中の２種は非常に低レベルの反応性を有することが分かり、いくつかの２０８６サブファミリーＡ菌株はｒＬＰ２０８６サブファミリーＢに対して産生された抗体と交差反応性ではない可能性があることを示した。菌株８５２９から２０８６サブファミリーＢ遺伝子を同定するために使用されるＰＣＲ増幅手順もまた、菌株８７０４４６、ＮＭＢおよび６５５７に対して実行した。２０８６サブファミリーＢのＰＣＲ増幅産物は全く検出されなかった。
免疫原性方法：
抗血清の調製：
ワクチンを、前に実施例１に記載されるように製剤した。しかしながら、１０μｇ投与量を使用した。
全細胞酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ全細胞懸濁液を、無菌０．０１Ｍ  ホスフェート、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ、０．００２Ｍ  ＫＣｌ（ＰＢＳ）中、６２０ｎｍにおける吸光度０．１に希釈した。この懸濁液から、０．１ｍＬをＮｕｎｃ  Ｂａｃ  Ｔ９６ウェルプレート（Ｃａｔ＃  ２−６９６２０）の各々のウェルに添加した。細胞は室温で３日間、プレート上で乾燥し、その後覆い、反転させ、４℃で保存した。プレートは洗浄バッファー（０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１３９Ｍ  ＮａＣｌ／ＫＣｌ、０．１％ドデシルポリ（オキシエチレレングリコールエーテル）ｎ  ｎ＝２３（Ｂｒｉｊ−３５（登録商標）、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅから入手可能）、ｐＨ７．０〜７．４）で３回洗浄した。抗血清の希釈物を、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／アジドで調製し、そして０．１ｍＬを被覆したプレートに移した。プレートを２時間３７℃でインキュベートした。プレートは洗浄バッファーで３回洗浄した。ヤギ−抗マウスＩｇＧ  ＡＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）をＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で１：１５００に希釈し、０．１ｍＬを各々のウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートは（上記のように）洗浄した。基質溶液は、１Ｍ  ジエタノールアミン／０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中にｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を１ｍｇ／ｍＬに溶解することにより調製した。基質はウェルあたり０．１ｍＬでプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。反応は５０μＬ／ウェルの３Ｎ  ＮａＯＨで停止させ、プレートは、６９０ｎｍを基準として、４０５ｎｍで読み取った。
Ｂ．）Ｐ４リーダー配列：
ＰＣＲ増幅およびクローニング法：
ｒＬＰ２０８６発現を最適化するために、２０８６遺伝子を型分類不能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＰ４シグナル配列の後にクローニングした（Ｇｒｅｅｎら、１９９１）。リポタンパク質クローニングに使用されたプライマーが表ＩＶに列挙してあり、化合物番号：５６５８、５６６０、６４７３、６５４３および６３８５によって識別される。ＯＲＦ２０８６は、以下の化合物番号５６５８および５６６０を持つプライマーを使用してＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＢ菌株８５２９から増幅された。ＯＲＦ２０８６は、以下の化合物番号６３８５および５６６０を持つプライマーを使用してＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＢ菌株ＣＤＣ１５７３から増幅された。ＯＲＦ２０８６は、以下の化合物番号６４７３および６５４３を持つプライマーを使用してＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＢ菌株２９９６から増幅された。Ｎ末端（５’）プライマーは、２０８６遺伝子の成熟領域（システインのすぐ下流のアミノ酸位置３のセリン残基において開始）に相同であるように設計した。制限部位ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＴＣ）はそれぞれのＮ−末端プライマーの５’末端に組み込まれ、アミノ酸位置２において成熟タンパク質にグリシン残基が挿入された。Ｃ末端（３’）プライマーは２０８６遺伝子のＣ−末端に相同であるように設計され、終止コドンおよびクローニングのためにＳｐｈＩ部位を含有した。各Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｂ菌株から増幅されたフラグメントを、中間ベクターにクローニングし、配列分析によってスクリーニングした。
【０１４６】
正しいクローン由来のプラスミドＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，（ＮＥＢ））で消化した。ｐＬＰ３３９という名称のベクター（出願者の譲受人により供給された）を発現ベクターとして選択した。このベクターは、ｐＢＡＤ１８−Ｃｍバックボーン（Ｂｅｃｋｗｉｔｈら、１９９５）を使用し、Ｐ４リポタンパク質シグナル配列および型分類不能なヘモフィルス  インフルエンザのＰ４遺伝子（Ｇｒｅｅｎら、１９９１）を含有する。ｐＬＰ３３９ベクターは、制限酵素ＢａｍＨＩにより部分的に消化され、その後ＳｐｈＩで消化された。増幅された２０８６フラグメント（ＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩ）は各々別個にｐＬＰ３３９ベクター（部分的ＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩ）に結合された。このクローニング戦略は、成熟２０８６遺伝子をＰ４リポタンパク質シグナル配列の後に配置する。ＢａｍＨＩ部位はＰ４シグナル配列と２０８６遺伝子間のクローニング接合部に残る（図７に示したプラスミド構築物を参照されたい）。以下のものはＢａｍＨＩクローニング接合部における配列の例である：
［Ｐ４シグナル配列］−ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ−［残存２０８６成熟核酸配列］
［Ｐ４シグナル配列］−Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ−［残存２０８６成熟アミノ酸配列］
図７を参照すると、各増幅されたフラグメントはＰ４リーダー配列を含有する改変ｐＢＡＤ１８−Ｃｍベクターにクローニングされた。発酵はｒＰ４ＬＰ２０８６（組換えＰ４脂質化２０８６）を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬＲ  ｐＰＸ７３４３で行い、付加的グルコースの添加により細胞密度増大を試みた。発酵装置は、１％グルコースを補足したＳａｍｂｒｏｏｋの完全Ｍ９最小培地１０Ｌで満たした。
【０１４７】
発酵装置中のグルコースの初期濃度は４５ｇ／Ｌであった。初期ＯＤが約０．２５になるように発酵装置に菌を接種した。約ＯＤ２５で、付加的な２０ｇ／Ｌグルコースを添加した。培養物はＯＤ６３．４、グルコース枯渇において１％アラビノースで誘導した。発酵は、誘導後３時間まで継続した。試料は誘導後ｔ＝０、１、２、３に保存し、タンパク質はＢＳＡを用いて定量した。ｔ＝３において、タンパク質収量は約０．３５ｇ／Ｌ、そして７％総細胞タンパク質であった。約１０Ｌの培養物から全部で８９５グラムの湿細胞ペーストが採取された。
【０１４８】
ｒＰ４ＬＰ２０８６の精製は、上記の実施例２、節Ａに記載のものと同じ方法を使用して行った。
【０１４９】
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを、−シアノエチルホスホルアミダイト・ケミストリー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）を使用して、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓオリゴヌクレオチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）で合成した。ＯＲＦ２０８６遺伝子ファミリーのＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは表ＩＶに挙げられ、それは本発明のプライマーの非限定的な例を示す。
【０１５０】
【表４】
2010512792.tif 000009
（実施例３）
非脂質化成熟２０８６タンパク質の発生遺伝学：
２０８６タンパク質の免疫原性をさらに評価するため、Ｐ２０８６の非脂質化型のクローニングおよび発現を行った。
ＯＲＦ２０８６のＰＣＲ遺伝子増幅：
様々な染色由来の２０８６遺伝子が、参照により本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２３６９号（２００３年８月７日、国際公開第０３／０６３７６６号として公開）、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／１１９０１号（２００４年１１月４日、国際公開第０４／０９４５９６号として公開）に記載されるように、プライマーで増幅され得る。
【０１５１】
これらのプライマーの特徴としては、各プライマーにおける合成ＢｇｌＩＩ制限部位、化合物番号６４０６および６４７４における合成ＮｄｅＩ制限部位が含まれ、そして３種すべてのリーディングフレームの停止コドンは化合物番号５１３５および６６０５に存在する。プライマー番号６４０６および６４７４は、第２のアミノ末端コドン（ＡＣＧ）に融合したＡＴＧ（Ｍｅｔ）を持つ２０８６遺伝子を増幅し、成熟２０８６ポリペプチドの単一アミノ酸置換（ＴＧＣ  Ｃｙｓを置換）を表す。
【０１５２】
ＰＣＲクローニングベクターは、ＴＯＰＯ−ＰＣＲ２．１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡであった。
【０１５３】
非脂質化２０８６タンパク質を発現するために使用されたベクターはＮｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのｐＥＴ９ａであった。
【０１５４】
Ｅ．ｃｏｌｉクローニング菌株は、Ｔｏｐ１０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡであった。
【０１５５】
Ｅ．ｃｏｌｉ発現菌株は、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ，Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩであった。
【０１５６】
クローニング目的のための培地は、グリセロールの代わりの１％無菌グルコース、および適切な抗生物質（アンピシリンまたはカナマイシン）を含む、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、によるテリフィックブロス液または寒天培地であった。
【０１５７】
プラスミド精製は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により行った。
非脂質化２０８６発現のための産生菌株または細胞系統の調製：
２０８６遺伝子は、髄膜炎菌株８５２９に由来する染色体ＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［ＡｍｐｌｉＴａｑ  ａｎｄ  ＡＢＩ２４００サーマルサイクラー，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ］により増幅した。２０８６遺伝子のＰＣＲ増幅は、それぞれの反応において化合物番号６４７４および５１３５によって同定された２種のオリゴヌレオチドプライマーを使用した。増幅された２０８６ＰＣＲ産物はＴＯＰＯ−ＰＣＲ２．１クローニングベクターに直接クローニングし、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２０μｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを補ったテリフィックブロス寒天培地で選択した。白色コロニーを選択し、培養した。プラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して調製し、該プラスミドをＰＣＲフラグメントインサートに関してスクリーニングした。ＰＣＲインサートプラスミドを、ＤＮＡ配列決定にかけた（ＡＢＩ３７７シークエンサーでのＢｉｇ  Ｄｙｅ化学，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。
【０１５８】
適切なＤＮＡ配列を示すプラスミドを、ＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、ＢｇｌＩＩフラグメントを、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ  ＩＩ精製キット（Ｂｉｏ１０１、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してゲル精製した。精製ＢｇｌＩＩフラグメントを、発現ベクターｐＥＴ９ａのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ｐＥＴ９ａ／２０８６クローンは３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補ったテリフィックブロスプレート上で選択した。カナマイシン耐性クローンを培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐプラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドはＢａｍＨＩ部位における２０８６遺伝子の適切な配向に関してスクリーニングした。適切に配置されたプラスミドは、２０８６遺伝子のアミノ末端へのＴ７−抗原の融合物（ｒＰ２０８６Ｔ７）を表す。これらのｒＰ２０８６Ｔ７遺伝子融合物を、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換し、テリフィックブロス／Ｋａｎプレート上で選択し、テリフィックブロスで培養し、ｒＰ２０８６Ｔ７融合タンパク質を発現するように１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）により誘導した。ｒＰ２０８６Ｔ７融合タンパク質は高レベルで発現された。
【０１５９】
次に、これらの融合プラスミドをＮｄｅＩ制限消化にかけ、それによりＴ７抗原を欠失し、ベクターにより提供されたＡＴＧスタートに成熟２０８６遺伝子を直接連結する。これらのＮｄｅＩ欠失プラスミドを、Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、テリフィックブロス／Ｋａｎプレート上で選択した。候補クローンを培養し、ミニプレッププラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡをＤＮＡ配列決定にかけ、欠失および２０８６遺伝子配列の完全性を確認した。これらのプラスミドはｐＰＸ７３２８と呼ぶプラスミドマップによって表される（図６）。適切なＤＮＡ配列を表すプラスミドを、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換し、テリフィックブロス／Ｋａｎプレート上で選択し、テリフィックブロスで培養し、ＩＰＴＧにより２０８６タンパク質を発現するように誘導した。ｐＥＴ９ａベクターは、Ｔ７タグが除去されると、菌株ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに成熟２０８６タンパク質を発現できなかった。
非脂質化２０８６タンパク質の産生：
精製プラスミドＤＮＡを用い、発現菌株ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換した。プラスミドを持つＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞は、カナマイシン耐性で、１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加により高レベルのＰｏｒＡタンパク質を発現するように誘導することができる。ｒＰ２０８６Ｔ７融合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞系統ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中に不溶性封入体として、全タンパク質の約４０％において発現させることができる。この精製融合タンパク質は、マウスを免疫するために用いられ、異種髄膜炎菌株に対する有意レベルの殺菌抗体を生成した（表Ｖ参照）。
２０８６非脂質化遺伝子変異誘発：
ＰＣＲプライマー変異誘発は２０８６遺伝子の５’末端で行われた。成熟ｒＰ２０８６Ｔ７の高発現レベルを示しつつＴ７−タグを除去できるかどうかを確かめるための発現研究が進行中である。
非脂質化ｒＰ２０８６Ｔ７の精製：
非脂質化ｒＰ２０８６Ｔ７を発現するＥ．ｃｏｌｉＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ＳＣ  ｐＨ７．４中で、マイクロフルイダイザーにより溶解した。細胞ライゼートを１８，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。封入体ペレットを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ｐＨ８で３回洗浄し、都度２４，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。次に封入体ペレットを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４  ｐＨ８で２回洗浄し、都度２４，０００ｘｇで１５分間遠心分離した。続いて封入体ペレットを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／４Ｍ  尿素  ｐＨ８で２時間可溶化し、その後不溶性物質を遠心分離により除去した。上澄み（可溶化ｒＰ２０８６Ｔ７）を４つの等しい試料に分けた。保存溶液を使用して、１つは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／２５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２Ｍ  尿素  ｐＨ８（界面活性剤を含まない）に調整し、１つは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／２５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２Ｍ  尿素／１％水素化Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ｐＨ８（ＴＸ−１００）に調整し、１つは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／２５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２Ｍ  尿素／１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２  ｐＨ８（Ｚ３−１２）に調整し、そして１つは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／２５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２Ｍ  尿素／１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４  ｐＨ８（Ｚ３−１４）に調整した。尿素を除去するために、尿素を含まないそれぞれのバッファーに対して試料を透析した。次に尿素を含まずに６０ｍＭ  ＮａＣｌを含むそれぞれのバッファーに対して試料を透析し、ＮａＣｌ濃度を減少させた。不溶性物質は２，０００ｘｇで１５分間遠心分離することにより除去し、得られた上澄み（再生ｒＰ２０８６Ｔ７）をその後の実験に使用した。ｒＰ２０８６Ｔ７の均一性は、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびレーザーデンシトメトリーを使用して測定し、９１〜９５％であることが見出された。
【０１６０】
免疫原性手順−実施例２に記載の通り
この精製融合タンパク質を使用してマウスを免疫化し、異種髄膜炎菌株に対する有意レベルの殺菌抗体を生成した。（以下の表Ｖ参照）：
【０１６１】
【表５】
2010512792.tif 000010
（＊  ｒＬＰ２０８６によるマウスの免疫化によって生成された陽性対照血清）
（実施例４）
ＯＲＦ２０８６のキメラクローンの開発
菌株ＣＤＣ−１５７３由来の２０８６タンパク質Ｎ末端領域は、菌株８５２９および２９９６由来の２０８６遺伝子には存在しない反復部分を含有する（図８参照）。この反復部分は、Ｅ．ｃｏｌｉベースの２つの発現系（ｐＥＴおよびｐＢＡＤ）由来の高レベルの組換え２０８６タンパク質発現に関与すると考えられる。ｐＥＴおよびｐＢＡＤ発現系におけるＣＤＣ−１５７３  ２０８６遺伝子由来の組換えタンパク質発現レベルは、同じ系を使用した菌株８５２９および２９９６による２０８６遺伝子由来の組換え体発現レベルに比較して有意に良好であった。３種すべての菌株に由来する２０８６遺伝子のＮ末端領域は、この反復部分以外は比較的相同である。したがって、ｐＥＴおよびｐＢＡＤ系を使用した場合、菌株８５２９および２９９６由来の２０８６遺伝子にＣＤＣ−１５７３Ｎ末端を融合することにより、これらの遺伝子から発現される組換え２０８６タンパク質レベルが増大すると考えることは妥当である。
材料および方法：
菌株８５２９および２９９６由来の染色体ＤＮＡを精製し、キメラ２０８６遺伝子のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。化合物番号６７２１および５１３５を持つＰＣＲプライマーを使用して菌株８５２９由来のキメラ２０８６遺伝子を増幅し、化合物番号６７２１および６６０５を持つＰＣＲプライマーを使用して、菌株２９９６由来のキメラ２０８６遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＣＲ２．１  ＴＯＰＯベクターに直接クローニングし、次にＤＮＡ配列分析によりスクリーニングして、無傷のキメラ２０８６遺伝子を同定した。次にその遺伝子をＢｇｌＩＩによりＰＣＲ２．１ベクターから開裂し、ＢｇｌＩＩフラグメントをｐＥＴ９ａプラスミドのＢａｍＨＩ部位に挿入した。プラスミドインサートが適切な配向であることをスクリーニングした後、ＮｄｅＩ消化にかけた。線状ＮｄｅＩフラグメントは自己連結し、ｐＥＴ９ａベクターによって与えられたＴ７−タグ配列を含有する小ＮｄｅＩフラグメントの欠失が達成された。この欠失は、キメラ２０８６遺伝子の５’末端にＴ７プロモーターを直接結合する。ＮｄｅＩ欠失プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、カナマイシン耐性コロニーをＩＰＴＧ誘導によるキメラ２０８６タンパク質発現に関してスクリーニングした。
【０１６２】
初期の研究は、ｐＥＴ９ａ系で発現される場合、菌株２９９６由来のキメラ２０８６遺伝子は、天然の２９９６／２０８６遺伝子に比較して２倍の組換えタンパク質を発現することを示す。ｐＢＡＤ系は現在のところ試験されていない。
【０１６３】
ただ１回の実験が行われただけであるが、データは、キメラ２０８６遺伝子に由来する、増大した用途があることを示唆する。菌株８５２９および２９９６由来２０８６遺伝子に対するＣＤＣ−１５７３Ｎ−末端融合物の生成により、増大した組換え２０８６タンパク質発現がもたらされる。
（実施例５）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株の２０８６ＰＣＲスクリーニング：
臨床分離菌間の２０８６遺伝子の保存を確かめるために、８８のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株にＰＣＲ増幅を行った。
【０１６４】
ＯＲＦ２０８６の当初のＰＣＲ同定は、化合物番号：４６２３、４６２４および４６２５により同定された表ＩＶ（先の実施例２参照）に列挙されるプライマーを使用した。これらのプライマーは、ＳａｎｇｅｒのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＡ配列に基づいて設計された。多数の菌株のスクリーニングを容易にするため、内部プライマーが２０８６遺伝子に関して設計された。全部で８８のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株を、化合物番号５００５および５００７により同定された、新規に設計された内部２０８６プライマーを用いて、ＰＣＲによりスクリーニングした。これらのプライマーを用い、本出願人らは、８８のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株の中の６３（約７０％）を同定することができた（表ＶＩ−Ａ参照）。
【０１６５】
ＳａｎｇｅｒのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＡ配列およびＴＩＧＲのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓセログループＢ配列中の２０８６遺伝子を囲む伸長領域を調べ、並べた。プライマーは、２０８６遺伝子の上流および下流領域に対応するように設計した。目的は、配列比較のためにこれらのプライマーを使用して、多様なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株から全長２０８６遺伝子より大きいものを増幅することであった。化合物Ｎｏ．６４７０および６４７２を使用した１種の菌株（６５７７）のＰＣＲ増幅は、低収率の産物という結果になった。菌株６５５７増幅産物をクローニングし、プラスミドＤＮＡを配列分析にかけた。結果は、以前見られたよりも配列可変性の大きい新型の２０８６遺伝子を示した。菌株６５５７由来の２０８６遺伝子は、配列決定された他の菌株に対してアミノ酸レベルで約７５％同一であった。興味深いことに、菌株６５５７は、上述の２０８６ＰＣＲスクリーニングにより以前陰性とされた菌株３０％の中の１種であった。
【０１６６】
菌株６５５７内のＣ末端可変領域に特異的な内部プライマーが設計された。これらのプライマーを使用して、２０８６ＰＣＲスクリーニングによる試験で以前陰性とされた約３０％の菌株中のより可変性の２０８６遺伝子をスクリーニングした。これらの新規に同定された内部２０８６プライマー（化合物番号６４９５および６４９６により識別）を使用して、入手可能なすべてのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株（ｎ＝８８）をＰＣＲによりスクリーニングした。２０８６に関してＰＣＲにより以前陰性とされた約３０％のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株だけがこのスクリーニングでＰＣＲ陽性であった。以前のＰＣＲ陰性（約３０％）菌株から増幅された遺伝子の組は、新型２０８６遺伝子または２０８６遺伝子の第２ファミリーを表すべきであり、本明細書では２０８６サブファミリーＡと呼ぶ。８５２９由来のプライマーにより約７０％の菌株から増幅された２０８６遺伝子の組は、本明細書ではサブファミリーＢと呼ぶ。
【０１６７】
ＰＣＲ増幅研究に使用されるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株は、以下の表、表ＶＩ  Ａおよび表ＶＩ  Ｂから選択された。表に列挙された菌株は、前に本明細書中で開示されたものに加えて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株の例として提供されるが、それらに限定されない。表ＶＩ  Ａに列挙された菌株は、２０８６タンパク質サブファミリーＡに分類され、表ＶＩ  Ｂに列挙された菌株は、２０８６タンパク質サブファミリーＢに分類される。各表中に列挙された菌株は、セロサブタイプにより分類される。菌株は表中に示すような以下の４つの供与源から入手可能である：ＭＰＨＬ−Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ；ＲＩＶＭ，Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ，ＩＡ；およびＷａｌｔｅｒ  Ｒｅｅｄ  Ａｒｍｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．
【０１６８】
【表６Ａ】
2010512792.tif 000011
【０１６９】
【表６Ｂ−１】
2010512792.tif 000012
【０１７０】
【表６Ｂ−２】
2010512792.tif 000013
その他の菌株は、感染した個体から分離菌として容易に入手可能である。
（実施例６）
髄膜炎菌株に対するｒＬＰ２０８６抗血清の反応性：
以下の表、表ＶＩＩは、上述のｒＬＰ２０８６の交差反応性および交差保護能力を示す。表に示すように、ｒＬＰ２０８６は、全細胞ＥＬＩＳＡ（ＷＣＥ）力価、殺菌アッセイ（ＢＣＡ）および幼若ラット（ＩＲ）アッセイを含む、多様な手法を使用して処理および分析して、２０８６タンパク質に対して引き起こされたポリクローナル抗体の細菌表面反応性を確認した。
【０１７１】
【表７】
2010512792.tif 000014
＋  菌血病において１０分の１減少より大
−  菌血病において１０分の１減少より小
（実施例７）
ＯＲＦ２０８６タンパク質を発現させるための種々の構築物を調製した。以下の表、表ＶＩＩＩは、例を示し、本発明の実施を例示するために提供されるｒ２０８６構築物表であるが、それらに限定されない。
【０１７２】
【表８】
2010512792.tif 000015
（実施例８）
ＬＯＳ除去外膜タンパク質を用いたさらなる研究から、異種セロサブタイプを発現する菌株に殺菌抗体を誘導することができる、ＰｏｒＡ以外の外膜タンパク質（単数または複数）を産生する付加的な菌株を同定した。以下に、本発明の一実施態様による付加的なタンパク質、具体的には髄膜炎菌免疫原性組成物に必要なタンパク質の数を減少させることができる外膜リポタンパク質を同定するためのさらなる研究を記載する。これらのさらなる研究は、以前の実施例に記載された研究を補足する。
【０１７３】
複数菌株に対する免疫および殺菌アッセイと共に、細胞下分画、ディファレンシャル界面活性剤抽出、等電点分離法、およびイオン交換クロマトグラフィーを使用して、対象となる小グループのタンパク質を同定した。主成分の直接配列決定は、Ｎ末端が遮断されていることを示した。内部タンパク質配列は、化学的およびタンパク質分解消化に由来するポリペプチドの直接配列決定により得た。グループＡ髄膜炎菌株のゲノム配列は、Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒからダウンロードし、既存および本出願者らが所有するアルゴリズムを使用して本出願者らのバイオインフォマティックグループが分析し、検索データベースを調製した。ペプチド配列データは、ＯＲＦ２０８６が関心のあるものであることを示した。このｏｒｆに基づいたプライマーを使用して、菌株８５２９からＰ２０８６遺伝子をＰＣＲした。遺伝子配列の分析、Ｎ末端が遮断されているという事実、およびその細胞下局在は、Ｐ２０８６が脂質化外膜タンパク質（ＬＰ２０８６）であることを示した。ｒＬＰ２０８６−８５２９および別の髄膜炎菌株由来の変異体は、Ｈ．インフルエンザＰ４シグナル配列を使用してＥ．ｃｏｌｉ中でリポタンパク質として組換え発現された。これらの組換えタンパク質を、ディファレンシャル界面活性剤抽出によりＥ．ｃｏｌｉ膜から単離し、イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製し、マウスを免疫するために使用した。マウス抗ＬＰ２０８６血清は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのいくつかの異なるセロサブタイプ株に対する殺菌活性の促進が可能であった。多くのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株由来のＰ２０８６遺伝子のさらなる分析は、これらの配列がサブファミリーＡおよびサブファミリーＢと呼ばれる２種のグループに分類されることを示した。（図１２参照）。サブファミリーＢタンパク質に対して誘導された抗血清はサブファミリーＢタンパク質を発現する９種の菌株、およびサブファミリーＡタンパク質を発現する１種の菌株に対して殺菌性であった。サブファミリーＡ抗血清はサブファミリーＡ系統に対して殺菌性であった。１種のｒＰｏｒＡと１種のｒＬＰ２０８６の混合物は、いずれかのタンパク質だけによって誘導されたもの以上の広いワクチン適用範囲を持つ相補的抗体を誘導した。
【０１７４】
これらの観察は以下の結論に至る。ｒＬＰ２０８６抗原は、異種ＰｏｒＡおよび異種Ｐ２０８６タンパク質を発現する髄膜炎菌株に対して殺菌抗体を誘導することができる。抗原のＰ２０８６ファミリーは、単独または別の髄膜炎菌抗原との組み合わせのいずれかで、有用なワクチンであるか、または免疫原性であり得る。
【０１７５】
以下、先の研究について詳細に説明する。可溶性外膜タンパク質（ｓＯＭＰｓ）の複合体混合物は、異種ＰｏｒＡタンパク質を発現する菌株に対してＰｏｒＡ非依存的殺菌抗体を誘導することが見出された。ディファレンシャル界面活性剤抽出、等電点分離法およびイオン交換クロマトグラフィー、続くマウス免疫化の工程を使用して免疫学的に活性な成分を追跡した。
【０１７６】
各ステップで、髄膜炎菌性疾患の世界的疫学を代表するセロサブタイプ抗原を含有するいくつかの菌株に対して、血清は表面反応性および殺菌活性についてアッセイされた。
【０１７７】
この分離および免疫化の工程を使用して、グループＢ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに関する新規な交差反応性免疫原性候補を同定した。
【０１７８】
ＰｏｒＡ欠乏菌株の調製−ｐｏｒＡ染色体座位を、菌株２９９６由来のプラスミドｐＰＸ７０１６にクローニングした。プラスミド内では、ｐｏｒＡプロモーター、Ｓ／Ｄボックスおよび初めの３８のＮ末端コドンが欠失し、自己含有ＫａｎＲ発現カセットにより置換されている。該プラスミドは制限酵素で線状にされ、セロサブタイプ菌株ＰＩ：５，２；ＰＩ：９；ＰＩ：７，１６；ＰＩ：１５；ＰＩ：４；ＰＩ：３＆ＰＩ：１０に自然に形質転換された。カナマイシン耐性形質転換体を選択し、ＥＬＩＳＡにおいてセロサブタイプ特異的モノクローナル抗体によりＰｏｒＡの損失をスクリーニングした。
【０１７９】
殺菌アッセイ：Ｍｏｕｎｔｚｏｕｒｏｓ，Ｋ．Ｔ．ａｎｄ  Ｈｏｗｅｌｌ，Ａ．Ｐ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｍｅｄｉｃａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｇｒｏｕｐ  ｂ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００；３８：２８７８−２８８４を参照されたい。
【０１８０】
全細胞酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ全細胞懸濁液を、滅菌０．０１Ｍホスフェート、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ、０．００２Ｍ  ＫＣｌ（ＰＢＳ）中で、６２０ｎｍにおける光学密度度０．１に希釈した。この懸濁液から、Ｎｕｎｃ  Ｂａｃ  Ｔ９６ウェルプレート（Ｃａｔ＃２−６９６２０）の各ウェルに０．１ｍＬ添加した。細胞を３７℃で一晩、プレート上で乾燥させ、その後被覆し、反転させ、４℃で保存した。プレートは、洗浄バッファー（０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１３９Ｍ  ＮａＣｌ／ＫＣｌ、０．１％  Ｂｒｉｊ−３５、ｐＨ７．０〜７．４）で３回洗浄した。抗血清の希釈物は、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／アジドで調製し、０．１ｍＬを被覆プレートに移し、３７℃で２時間インキュベートした。プレートは洗浄バッファー中で３回洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）をＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で１：１５００に希釈し、０．１ｍＬを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートを（上記の通り）洗浄した。基質溶液は、ジエタノールアミンで、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を１ｍｇ／ｍｌに希釈することにより調製した。ウェルあたり０．１ｍＬの基質をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。反応は５０ｕｌ／ウェルの３Ｎ  ＮａＯＨで停止し、６９０ｎｍを参照として４０５ｎｍでプレートを読んだ。
【０１８１】
組換えＰｏｒＡ誘導：ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ９ａ菌株を、Ｋａｎ−３０および２％グルコースを補ったハイソイ（ＨｙＳｏｙ）ブロス（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）中で、３７℃で一晩培養した。翌朝、Ｏ／Ｎ培養物をハイソイブロス、Ｋａｎ−３０および１％グリセロールで希釈し、３７℃で１時間培養した。これらの培養物にＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭで添加することにより誘導した。培養物はさらに２〜３時間培養し、その後採取した。
【０１８２】
組換えＰｏｒＡ精製：ｒＰｏｒＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ封入体から８Ｍ尿素で可溶化し、尿素を全く含まないバッファーに対して透析して再生した。再生されたｒＰｏｒＡを透析ろ過により濃縮し、バッファーはＧ２５カラムでＮａＰＯ４  ｐＨ６に交換した。次に、透析したｒＰｏｒＡをカチオン交換カラム（Ｓ  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）に流し、１Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。
【０１８３】
菌株８５２９（Ｐ１．７−２，３）のｓＯＭＰｓは、異種セロサブタイプを発現する菌株に対し、マウスにおいてＰｏｒＡ非依存性殺菌活性を誘導する。以下の表、表ＩＸは、調べた菌株における殺菌活性を示す。
【０１８４】
【表９−１】
2010512792.tif 000016
【０１８５】
【表９−２】
2010512792.tif 000017
ｓＯＭＰｓの調製：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ膜を、ＴＸ−１００、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４，およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４＋０．５Ｎ  ＮａＣｌで抽出した。上記のｓＯＭＰを、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４／０．５Ｍ  ＮａＣｌ抽出物中で可溶化した。抽出は当業者に周知の技術、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３５５，２５３号を使用して実行する。
【０１８６】
免疫原性：雌スイスウェブスターマウスを、０週目および４週目に２０ｕｇ  ＱＳ−２１をアジュバントとして添加した２５ｕｇ総タンパク質量で免疫化した。瀉血およびデータ分析を６週目に行った。
【０１８７】
１  殺菌性（ＢＣ５０）力価（生細胞数を５０％減少させる抗血清の希釈度の逆数として表される）。０週目の正常マウス血清のＢＣ５０力価は＜２５であった。
【０１８８】
２  ＮＳＴ＝セロタイプ分類不能
以下の表、表Ｘはおよび表ＸＩは、サブファミリーＡおよびサブファミリーＢ両方の組換え脂質化Ｐ２０８６（ｒＬＰ２０８６）の精製および特徴の概要を示す。
サブファミリーＡ  ｒＬＰ２０８６精製
【０１８９】
【表１０】
2010512792.tif 000018
サブファミリーＢ  ｒＬＰ２０８６精製
【０１９０】
【表１１】
2010512792.tif 000019
精製法：すべての変異体は、ＴＸ−１００によりＥ．ｃｏｌｉ膜から可溶化された（サルコシルまたは尿素で可溶化されたｒＬＰ２０８６−８５２９を除く）。さらなる精製は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはＮａＰＯ４バッファー中でアニオン交換（ＴＭＡＥ）、サイズ排除および／またはカチオン交換（Ｓ  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）クロマトグラフィーの組み合わせにより行った。
【０１９１】
１  菌株８５２９由来のＰ２０８６と比較したアミノ酸相同性
２  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびコロイド状クーマシー染色バンド（Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ染色）のレーザーデンシトメトリーにより確認した純度
同種および異種菌株に対して試験された、サブファミリーＢメンバー、ｒＬＰ２０８６−８５２９の免疫原性。
【０１９２】
以下の表ＸＩＩは、同種および異種菌株に対して試験された、サブファミリーＢメンバー、ｒＬＰ２０８６−８５２９の免疫原性を示す。
【０１９３】
【表１２】
2010512792.tif 000020
ワクチン接種手順：６〜８週齢雌スイスウェブスターマウスを、０週目および４週目に１０ｕｇ  ｒＬＰ２０８６−８５２９＋２０ｕｇ  ＱＳ−２１で免疫化した。データ分析は６週目の瀉血により行った。
【０１９４】
ａ  ｒＬＰ２０８６−８５２９と比較したＰ２０８６のアミノ酸相同性
ｂ  吸光度＝０．１における希釈度の逆数として表したエンドポイント力価
ｃ  生細胞数を５０％減少させる抗血清の希釈度の逆数として表したＢＣ５０力価。０週目の正常マウス血清のＢＣ５０力価は＜１０であった。
【０１９５】
表ＸＩＩＩは、同種および異種菌株に対して試験した、サブファミリーＢメンバー、ｒＬＰ２０８６−２９９６の免疫原性を示す。
【０１９６】
【表１３】
2010512792.tif 000021
ワクチン接種手順：６〜８週齢雌スイスウェブスターマウスを、０週目および４週目に１０ｕｇ  ｒＬＰ２０８６−２９９６＋２０ｕｇ  ＱＳ−２１で免疫化した。データ分析は６週目の瀉血で行った。
【０１９７】
ａ  ｒＬＰ２０８６−２９９６と比較したＰ２０８６のアミノ酸相同性
ｂ  吸光度＝０．１における希釈度の逆数として表したエンドポイント力価
ｃ  生細胞数を５０％減少させる抗血清の希釈度の逆数として表した殺菌性（ＢＣ５０）力価。０週目の正常マウス血清のＢＣ５０力価は＜１０であった。
【０１９８】
以下の表ＸＩＶは、ｒＬＰ２０８６およびｒＰｏｒＡに対する抗血清は、混合され殺菌活性をアッセイした場合に相補的であることを示す。
【０１９９】
【表１４】
2010512792.tif 000022
ワクチン接種手順：６〜８週齢雌スイスウェブスターマウスを、０週目および４週目に１０ｕｇ  ｒＬＰ２０８６−８５２９／２０ｕｇ  ＱＳ−２１か、１５ｕｇ  ｒＰｏｒＡ／１００ｕｇ  ＭＰＬのいずれかで免疫化した。データ分析は、６週目の瀉血に関して実行した。
【０２００】
ａ  生細胞数を５０％減少させる抗血清の希釈度の逆数として表した殺菌性（ＢＣ５０）力価。０週目の正常マウス血清のＢＣ５０力価は＜１０であった。
【０２０１】
以下の表ＸＶは、ｒＬＰ２０８６サブファミリーと２種のｒＰｏｒＡとの混合物がマウスに殺菌抗体を誘導することを示す。
【０２０２】
【表１５】
2010512792.tif 000023
ワクチン接種手順：６〜８週齢雌スイスウェブスターマウスを、０週目および４週目に各タンパク質１０ｕｇ＋２０ｕｇ  ＱＳ−２１で免疫化した。データ分析は６週目の瀉血で行った。
【０２０３】
ａ  生細胞数を５０％減少させる抗血清の希釈度の逆数として表した殺菌性（ＢＣ５０）力価。０週目の正常マウス血清のＢＣ５０力価は＜１０であった。
【０２０４】
ｂ  ＳｆＡ−サブファミリーＡ、ＳｆＢ−サブファミリーＢ
ｃ  適切な１価対照：ｒＬＰ２０８６−８５２９、ｒＬＰ２０８６−２９９６、ｒＰ１．５−１，２−２またはｒＰ１．２２−１，１４−１抗血清
以下に上記の研究の結果を概説する。抗ｒＬＰ２０８６抗血清は、１３／１６の試験菌株に対して殺菌性である。異なるセロサブタイプを発現する１１種の菌株は抗Ｐ２０８６血清により致死する。抗ｒＬＰ２０８６血清の殺菌活性は抗ｒＰｏｒＡ血清に相補的である。Ｐ２０８６とＰｏｒＡとの混合物は、マウスに相補的殺菌抗体を誘導する。ディファレンシャル界面活性剤抽出、精製および免疫、ならびに多くの菌株に対する機能的抗体アッセイを使用して、新規ワクチン候補を同定することができる。Ｐ２０８６は、Ｐ２０８６およびｒＰｏｒＡの両方において異種の菌株に対し殺菌抗体を誘導するワクチン候補として同定されている。したがって、タンパク質の２０８６ファミリーは、単独で、または別の髄膜炎菌抗原と組み合わせて有用なワクチンであり得る。
（実施例９）
変化するセログループの髄膜炎菌株を、ＯＲＦ２０８６遺伝子の存在についてＰＣＲによりスクリーニングした。結局、１００種以上の髄膜炎菌株をスクリーニングした。
【０２０５】
Ｃ末端可変領域に特異的な２組の内部ＰＣＲプライマーを利用して、サブファミリーＡおよびＢ遺伝子配列を識別した。約３５０ｂｐのＰＣＲ増幅産物の存在は、２０８６遺伝子配列が染色体上に存在することを示した。すべての菌株は、予想されたサイズの単一のＰＣＲ産物を生じた。全長ＯＲＦ２０８６遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、整列させ（ＤＮＡＳｔａｒ  ＭｅｇＡｌｉｇｎ）、系統樹を調製するために使用した。
【０２０６】
２０８６遺伝子は、ｐＢＡＤアラビノース誘導性プロモーター系においてｒＬＰ２０８６リポタンパク質として組換え発現され、またはＩＰＴＧ誘導性ｐＥＴ系においてｒＬＰ２０８６非脂質化タンパク質として組換え発現された。これらの組換えタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂにおいて発現させた。精製組換えタンパク質を使用してマウスを免疫化し、マウス抗血清を、その血清ＩｇＧ力価および多様な髄膜炎菌株に対する殺菌活性についてアッセイした。
【０２０７】
ＯＲＦ２０８６を、以下のものうちの１つからＰＣＲにより増幅した：全髄膜炎菌細胞、精製染色体ＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ鋳型。
【０２０８】
ＯＲＦ２０８６遺伝子をベクターｐＬＰ３３９にクローニングし、これはヘモフィルスＰ４リーダー配列をＯＲＦ２０８６遺伝子の５’末端に融合する。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬＲは、ｐＢＡＤ／ＯＲＦ２０８６クローン由来のｒＰ２０８６の脂質化型の組換え発現のための宿主菌株として使用した。（図１０Ａ参照）。ｐＢＡＤアラビノース誘導性プロモーターは、Ｐ４シグナル／ＯＲＦ２０８６融合タンパク質の発現を操作して、ｒＰ２０８６の脂質化型を発現させる。シグナル配列を欠くＰ２０８６遺伝子を、高活性Ｔ７ファージプロモーターの後にｐＥＴ９ａベクターにクローニングされた。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）は、ｐＥＴ９ａ／ＯＲＦ２０８６クローン由来のＯＲＦ２０８６の非脂質化型の組換え発現のための宿主菌株として使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１におけるＤＥ３溶原菌は、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下で、ＩＰＴＧの添加によりに誘導されてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現することができる。ＷＣＥ；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔ．，４８（１９８７）３６７−３７１およびＢＣＡ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８（２０００）２８７８−２８８４を参照されたい。
【０２０９】
遺伝子、ＯＲＦ２０８６は、異なるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株からクローニングおよび配列決定された。ヌクレオチド配列を整列させ（ＤＮＡＳｔａｒ  ＭｅｇＡｌｉｇｎ）、系統樹調製に使用した。この樹は、ＯＲＦ２０８６遺伝子ヌクレオチド配列の２種の異なるサブファミリーを明らかにする。２つの遺伝子サブファミリーは、それらの５’末端において類似するが、それらの３’末端近くではかなりの変化を含む。かなりの変動性があると考えられるが、遺伝子のある種の重要な領域は、異なる菌株間で高度に相同性である。理論により拘束されることを意図することなく、これらの保存された領域は、タンパク質に対して機能的連続性を提供することができ、そしてワクチン標的として利用されることになる交差防御エピトープを表し得る。
【０２１０】
２０８６遺伝子は、いくつかのセログループＢ髄膜炎菌株からクローニングされ、脂質化シグナル配列を伴って、またはそれを伴わずに発現された。Ｔ７−タグに融合された非脂質化型は、最高レベルで発現した。Ｔ７−タグ配列は、ｍＲＮＡに安定性を提供し、翻訳されたポリペプチドのレベルを有意に向上し得る。この融合タンパク質は、封入体内に沈着すると考えられ、公知のプロトコルにより容易に精製および再生できる。Ｐ２０８６の脂質化型および非脂質化型は、全細胞タンパク質の約５〜８％で発現され、全タンパク質の約５０％としてｒＰ２０８６を発現するＴ７−タグ融合物を例外とする。タンパク質の非脂質化型は、可溶性で細胞質中に局在すると考えられる。タンパク質の脂質化型は、膜画分に結合すると考えられ、界面活性剤により可溶化される。天然の脂質化型のタンパク質は、抗原提示に関して優れた三次構造を有することができ、および／または付着した脂質は、より強い免疫原性反応を刺激するアジュバントとして作用し得る。
【０２１１】
試験したすべてのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＢ菌株は、１つ２０８６様遺伝子を有すると考えられる。２０８６遺伝子の少なくとも２種のファミリーが提示される。２０８６ホモログは、ＰＣＲスクリーニングにより以下のものに同定されている：
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＡ、Ｂ、Ｃ，Ｗ１３５、Ｙ
Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＦＡ１０９０
いくつかのＯＲＦ２０８６遺伝子は、クローニングされ、組換え発現されている
Ｐ２０８６の脂質化バージョンは、種々の髄膜炎菌株から発現された。
【０２１２】
これらの組換えタンパク質は精製され、マウスに予防接種するために使用されている。
【０２１３】
結果として生じる抗血清は殺菌性である。
【０２１４】
Ｐ２０８６の非脂質化バージョンは、様々な菌株から発現された。
【０２１５】
ｒＬＰ２０８６は、ｒＰ２０８６より強い免疫反応を一貫して誘発する。
【０２１６】
ｒＬＰ２０８６はまた、同種および異種髄膜炎菌株の両方に対して高められた殺菌活性を示す。
（実施例１１）
【０２１７】
以下は、Ｐ２０８６が髄膜炎菌株において発現され、そしていくつかの菌株においてＰ２０８６発現の付加的な具体例を提供することをさらに示す。
【０２１８】
細胞ライゼートを、ＳＤＳ試料バッファーに再懸濁されたプレート培養物由来の細胞で調製し、９８℃で４分間加熱し。試料を、ウェルあたり約３０〜５０ｕｇ総タンパク質で、１０〜２０％プレキャストゲル（ＩＣＮ）に負荷し、１７５Ｖで流した。ゲルをニトロセルロース膜に移し、次にそれを３０分間、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（Ｂｌｏｔｔｏ）中の５％粉末ミルクでブロッキングした。使用した一次抗体は、マウスにおいて個々のｒＬＰ２０８６変異体に対して誘導されたポリクローナル抗血清のプールであった。
【０２１９】
図１７および１８を参照すると、ウェスタンブロットは、Ｐ２０８６サブファミリーＡおよびＢ全細胞ライゼートに対するｒＬＰ２０８６マウス抗血清の反応性を示す。サブファミリーＡ細胞ライゼートブロットの場合、使用される抗血清は、ｒＬＰ２０８６−２９９６、−８７０４４６および−２５０７７１に対して誘導され、ｒＬＰ２０８６−２５０７７１はＢｌｏｔｔｏで１／５００に希釈され、他はＢｌｏｔｔｏで１／１０００に希釈された。サブファミリーＢ細胞ライゼートブロットの場合、使用される抗血清は、ｒＬＰ２０８６−８５２９（Ｂｌｏｔｔｏで１／１０００に希釈）、−ＣＤＣ１５７３、−Ｍ９８２および−８８００４９（これら３種はＢｌｏｔｔｏで１／５００に希釈）に対して誘導された。一次抗血清およびブロットを、４℃で一晩インキュベートした。ブロットを洗浄し、ヤギ抗マウスＡＰ二次をＢｌｏｔｔｏで１／５００に希釈して添加し、ブロットを３０分間室温でインキュベートした。洗浄後、ブロットをＢＣＩＰ／ＮＢＴ膜ホスファターゼ基質系（ＫＰＬ）を使用して展開した。
参考文献一覧
本明細書中で参照した参考文献が以下に記載され、それらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：
【０２２０】
【化２】
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【０２２１】
【化３】
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【０２２２】
【化４】
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【０２２３】
【化５】
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【０２２４】
【化６】
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【０２２５】
【化７】
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【０２２６】
【化８】
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【０２２７】
【化９】
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【０２２８】
【化１０】
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【０２２９】
【化１１】
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【０２３０】
【化１２】
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【０２３１】
【化１３】
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本発明は今や十分に説明されているが、本明細書中で示された本発明の趣旨または範囲を逸脱することなく、本発明に対し多くの変更および修正を行い得ることが当業者には明らかであろう。上記は、本発明の好ましい実施態様をいくつかの考え得る代替案と共に説明している。しかしながら、これらの実施態様は、単に例のためであり、本発明はそれらに限定されない。
【図１Ａ】
2010512792.tif 000036
【図１Ｂ】
2010512792.tif 000037
【図２】
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【図３】
2010512792.tif 000039
【図４】
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【図５】
2010512792.tif 000041
【図６】
2010512792.tif 000042
【図７】
2010512792.tif 000043
【図８】
2010512792.tif 000044
【図９Ａ】
2010512792.tif 000045
【図９Ｂ】
2010512792.tif 000046
【図１０】
2010512792.tif 000047
【図１１】
2010512792.tif 000048
【図１２Ａ】
2010512792.tif 000049
【図１２Ｂ】
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【図１３】
2010512792.tif 000051
【図１４】
2010512792.tif 000052
【図１５】
2010512792.tif 000053
【図１６】
2010512792.tif 000054
【図１７】
2010512792.tif 000055
【図１８】
2010512792.tif 000056
【配列表】
2010512792000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年11月12日(2009.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2010512792.tif 000069
2010512792.tif 000070
2010512792.tif 000071
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2010512792.tif 000073