(57)【要約】Ｔ細胞を共刺激する（即ち、Ｔ細胞の抗原特異的増殖を高める、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を増強する、Ｔ細胞の分化および（ａｄ）エフェクター機能を刺激する、ならびに／あるいはＴ細胞の生存を促進する）ための組成物および方法が提供される。適切な組成物には、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、その断片およびその融合タンパク質が含まれる。改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、阻害性ＰＤ−Ｉリガンドに対する低下した結合親和性を有し、Ｔ細胞を共刺激する能力を実質的に保持する。改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドを用いて、免疫応答の刺激を、それを必要とする対象において行う方法が提供される。
2010533649.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドが、野生型Ｂ７−ＤＣポリペプチドの改変体であり、
該改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドが、野生型Ｂ７−ＤＣポリペプチドと比較して、ＰＤ−１に対する減少した結合親和性を有しており、
該改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドが、Ｔ細胞の抗原特異的増殖を高め、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を増強し、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能を刺激し、またはＴ細胞の生存を促進する能力を保持する
単離された改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドまたはその共刺激性断片。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、１個または複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む、請求項１に記載の単離された改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｂ７−ＤＣポリペプチドが、ヒトＢ７−ＤＣである、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
前記１個または複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入が、Ａ’、Ｂ、Ｃ、Ｃ’、Ｃ”、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧストランド、またはそれらの任意の組合せ中にある、請求項３に記載の単離された改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド。
【請求項５】
前記置換が、野生型のマウスＢ７−ＤＣまたはヒトＢ７−ＤＣの１１１位にあるアミノ酸をセリン残基で置き換えることを含む、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
前記置換が、野生型ヒトＢ７−ＤＣの１１３位にあるアミノ酸をセリン残基で置き換えることを含む、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
前記置換が、野生型ヒトＢ７−ＤＣの５６位にあるアミノ酸をセリン残基で置き換えることを含む、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
前記置換が、野生型ヒトＢ７−ＤＣの６７位にあるアミノ酸をチロシン残基で置き換えることを含む、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
前記置換が、野生型ヒトＢ７−ＤＣの７１位にあるアミノ酸をセリン残基で置き換えることを含む、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
前記置換が、野生型ヒトＢ７−ＤＣの１０１位にあるアミノ酸をセリン残基で置き換えることを含む、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
前記置換が、野生型のマウスＢ７−ＤＣまたはヒトＢ７−ＤＣの１０５位にあるアミノ酸をアラニン残基で置き換えることを含む、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
ａ）第１の融合相手として請求項１に記載のポリペプチド、および
ｂ）第２の融合相手として第２のポリペプチド
を含み、該第１の融合相手が、該第２の融合相手に直接融合しており、または場合により、該第２の融合相手に融合しているリンカー配列に、融合している
単離された融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記第２のポリペプチドが、Ｉｇ重鎖定常領域の１つまたは複数のドメインを含む、
請求項１２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記第２のポリペプチドが、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を含む、
請求項１３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記第１のポリペプチドが、前記Ｂ７−ＤＣの細胞外ドメインまたはその共刺激性断片を含み、
前記第２のポリペプチドが、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を含む、
請求項１４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
Ｔ細胞の抗原特異的増殖を高め、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を増強し、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能を刺激し、またはＴ細胞の生存を促進する方法であって、
ａ）第１の融合相手として、単離された改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドまたはその共刺激性断片
を含み、該改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドが、野生型Ｂ７−ＤＣポリペプチドの改変体であり、
該改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドが、野生型Ｂ７−ＤＣポリペプチドと比較して、ＰＤ−１に対する減少した結合親和性を有しており、
該改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドが、Ｔ細胞の抗原特異的増殖を高め、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を増強し、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能を刺激し、またはＴ細胞の生存を促進する能力を保持しており、
ｂ）第２の融合相手として、第２のポリペプチド
を含み、
該第１の融合相手が、該第２の融合相手に直接融合しており、または場合により、該第２の融合相手に融合しているリンカー配列に、融合している、
単離された融合ポリペプチドと、Ｔ細胞を接触させる工程を含む方法。
【請求項１７】
前記第２のポリペプチドが、Ｉｇ重鎖定常領域の１つまたは複数のドメインを含む、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２のポリペプチドが、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を含む、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のポリペプチドが、Ｂ７−ＤＣの細胞外ドメインまたはその共刺激性断片を含み、
前記第２のポリペプチドが、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を含む、
請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本願は、２００７年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／９４９，７８５号の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、Ｔ細胞活性化を調節するための組成物および方法、特にＴ細胞活性化を増強するための組成物および方法に関する。
【０００３】
政府の援助
本発明は、補助金第Ｒ０１  ＣＡ８５７２１号のもと国立衛生研究所により授与された政府の援助でなされた。米国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
リンパ球の抗原特異的な活性化および増殖は、共刺激性分子からの正負双方のシグナルにより調節される。特性決定が最も広範になされたＴ細胞共刺激経路はＢ７−ＣＤ２８であり、そこではＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）が各々、刺激性ＣＤ２８受容体および阻害性ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）受容体に会合することができる。Ｔ細胞受容体を介するシグナル伝達と共に、ＣＤ２８リガンドの結合が、Ｔ細胞の抗原特異的増殖を高め、サイトカイン産生を増強し、分化およびエフェクター機能を刺激し、Ｔ細胞の生存を促進する（非特許文献１；非特許文献２および非特許文献３）。対照的に、ＣＴＬＡ−４を介するシグナル伝達は、Ｔ細胞の増殖、ＩＬ−２の産生および細胞周期の進行を阻害する負のシグナルを送ると考えられる（非特許文献４および非特許文献５）。Ｂ７ファミリーの他のメンバーには、Ｂ７−Ｈ１（非特許文献６および非特許文献７）、Ｂ７−ＤＣ（非特許文献８および非特許文献９）、Ｂ７−Ｈ２（非特許文献１０；非特許文献１１および非特許文献１２）、Ｂ７−Ｈ３（非特許文献１３）、およびＢ７−Ｈ４（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６および非特許文献１７）が含まれる。Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣは、ＰＤ−１のリガンドであり、Ｂ７−Ｈ２はＩＣＯＳのリガンドであり、Ｂ７−Ｈ３は、現在のところオーファンリガンドのままである（非特許文献１８）。
【０００５】
Ｂ７ファミリー分子は、膜近位定常ＩｇＣドメインおよび膜遠位ＩｇＶドメインを有するホモ二量体として、細胞表面上に発現する。こうしたリガンドの受容体は、共通の細胞外ＩｇＶ様ドメインを共有する。受容体−リガンド対の相互作用は、リガンドおよび受容体のＩｇＶドメインにある残基を通して主に媒介される（非特許文献１９）。一般に、ＩｇＶドメインは、各々がβストランドの層を含有する２枚のシートを有すると記載されている（非特許文献２０）。ＣＴＬＡ−４の前方および後方シートは、それぞれストランドのＡ’ＧＦＣ’ＣおよびＡＢＥＤＣ，”を含有し（非特許文献２１）、一方、Ｂ７  ＩｇＶドメインの前方および後方シートは、それぞれストランドのＡＧＦＣＣ’Ｃ”およびＢＥＤで構成される（非特許文献２２；非特許文献２３および非特許文献２４）。結晶学的解析によれば、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７結合界面は、ＭＹＰＰＰＹモチーフからなるＣＴＬＡ−４由来のＣＤＲ３類似ループと、Ｇ、Ｆ、Ｃ、Ｃ’およびＣ”のストランドにより主に形成されるＢ７上の表面との相互作用に支配されていることが明らかとなった（非特許文献２２および非特許文献２３）。アミノ酸（ａｍｍｏ  ａｃｉｄ）の相同性、変異およびコンピュータモデリングに関するデータは、このモチーフが、ＣＤ２８にとっても主要なＢ７結合部位であるという概念を支持している（非特許文献２５）。ＭＹＰＰＰＹモチーフはＩＣＯＳ中に保存されていないが、配列ＦＤＰＰＰＦを有し、類似の位置にある関連モチーフが、ＩＣＯＳがＢ７−Ｈ２に結合するための主要な決定基であることが、研究によって示された（非特許文献２６）。
【０００６】
Ｂ７−ＤＣ（別名ＰＤ−Ｌ２）は、Ｂ７ファミリーの比較的新しいメンバーであり、Ｂ７−Ｈ１（別名ＰＤ−Ｌ１）と約３４％相同性のアミノ酸配列を有する。ヒトおよびマウスのＢ７−ＤＣオルソログは、約７０％のアミノ酸同一性を共有する。Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣの転写物は、各種組織中に見出される（非特許文献６；非特許文献９および非特許文献２７）が、それらのタンパク質の発現プロファイルは全く異なる。Ｂ７−Ｈ１タンパク質の発現は、マクロファージ様細胞以外の正常組織中には本質的に見出されないが、多様な組織および細胞型において誘発することができる（非特許文献６；非特許文献２７および非特許文献２８）。対照的に、Ｂ７−ＤＣは、樹状細胞および単球だけに発現する（非特許文献８および非特許文献２８）。
【０００７】
Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣは共に、ＰＤ−１（プログラム細胞死１）に結合することが示された（非特許文献２９；非特許文献８および非特許文献９）が、これは、細胞質ドメイン中に免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を有するＣＤ２８ファミリーの遠縁メンバーである（非特許文献３０）。ＰＤ−１は、胸腺細胞のサブセット上に発現し、活性化後にＴ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞上で上方調節される（非特許文献３１）。ＰＤ−１−／−マウスの表現型から、ＰＤ−１がインビボにおける免疫応答の負の調節因子である直接的証拠が得られる。ＰＤ−１の非存在下では、Ｃ５７ＢＬ／６バックグランドのマウスは、狼瘡様の糸球体腎炎および進行性関節炎を徐々に発現する（非特許文献３２）。ＢＡＬＢ／ｃバックグランドのＰＤ−１−／−マウスは、致命的な自己免疫性拡張型心筋症を急速に発現する（非特許文献３３）。しかし、実質的証拠から、Ｂ７−ＤＣは、Ｔ細胞応答を共刺激するように機能できることが示されている。最適以下のＴＣＲシグナルの存在下、Ｂ７−ＤＣは、インビトロにおいて増加した増殖およびサイトカイン産生を刺激する（非特許文献３４）。他方、インビトロの試験によれば、Ｔ細胞応答におけるＢ７−ＤＣの負の調節的役割が示されている（非特許文献９）。こうした見掛上相反するデータは、Ｔ細胞上において、Ｂ７−ＤＣに対するＰＤ−１以外の追加の受容体が発現することにより、最も良く解釈される。
【０００８】
Ｔ細胞の抗原特異的増殖を高め、サイトカイン産生を増強し、分化およびエフェクター機能を刺激し、Ｔ細胞の生存を促進する組成物を提供すれば、有利となる。野生型Ｂ７−ＤＣと比較して、ＰＤ−１に対する低下した結合親和性を有するが、Ｔ細胞を共刺激する（即ち、Ｔ細胞の抗原特異的増殖を高め、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を増強し、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能を刺激し、またはＴ細胞の生存を促進する）能力を保持している改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドを提供すれば、それも有利となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｌｅｎｓｈｏｗら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４巻、２３３〜２５８頁（１９９６年）
【非特許文献２】Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻、３９６〜４０４頁（１９９７年）
【非特許文献３】Ｒａｔｈｍｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７巻、７８１〜８２８頁（１９９９年）
【非特許文献４】Ｋｒｕｍｍｅｌ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１８３巻、２５３３〜２５４０頁（１９９６年）
【非特許文献５】Ｗａｌｕｎａｓら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１８３巻、２５４１〜２５５０頁（１９９６年）
【非特許文献６】Ｄｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、５巻、１３６５〜１３６９頁（１９９９年）
【非特許文献７】Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９２巻、１〜９頁（２０００年）
【非特許文献８】Ｔｓｅｎｇら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９３巻、８３９〜８４６頁（２００１年）
【非特許文献９】Ｌａｔｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２巻、２６１〜２６８頁（２００１年）
【非特許文献１０】Ｗａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ、９６巻、２８０８〜２８１３頁（２０００年）
【非特許文献１１】Ｓｗａｌｌｏｗら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１１巻、４２３〜４３２頁（１９９９年）
【非特許文献１２】Ｙｏｓｈｉｎａｇａら、Ｎａｔｕｒｅ、４０２巻、８２７〜８３２頁（１９９９年）
【非特許文献１３】Ｃｈａｐｏｖａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２巻、２６９〜２７４頁（２００１年）
【非特許文献１４】Ｃｈｏｉら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７１巻、４６５０〜４６５４頁（２００３年）
【非特許文献１５】Ｓｉｃａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１８巻、８４９〜８６１頁（２００３年）
【非特許文献１６】Ｐｒａｓａｄら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１８巻、８６３〜８７３頁（２００３年）
【非特許文献１７】Ｚａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、１００巻、１０３８８〜１０３９２頁（２００３年）
【非特許文献１８】Ｄｏｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．、２８巻、３９〜４８頁（２００３年）
【非特許文献１９】Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３巻、４２７〜４３４頁（２００２年）
【非特許文献２０】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｃｌａｙ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻、３８１〜４０５頁（１９８８年）
【非特許文献２１】Ｏｓｔｒｏｖら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０巻、８１６〜８１９頁（２０００年）
【非特許文献２２】Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ、４１０巻、６０４〜６０８頁（２００１年）
【非特許文献２３】Ｓｔａｍｐｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４１０巻、６０８〜６１１頁（２００１年）
【非特許文献２４】Ｉｋｅｍｉｚｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１２巻、５１〜６０頁（２０００年）
【非特許文献２５】Ｂａｊｏｒａｔｈら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｇｒａｐｈ．  Ｍｏｄｅｌ．、１５巻、１３５〜１３９頁（１９９７年）
【非特許文献２６】Ｗａｎｄら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９５巻、１０３３〜１０４１頁（２００２年）
【非特許文献２７】Ｔａｍｕｒａ、Ｂｌｏｏｄ、９７巻、１８０９〜１８１６頁（２００１年）
【非特許文献２８】Ｉｓｈｉｄａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、８４巻、５７〜６２頁（２０００年）
【非特許文献２９】Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９２巻、１０２７〜１０３４頁（２０００年）
【非特許文献３０】Ｉｓｈｉｄａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１１巻、３８８７〜３８９５頁（１９９２年）
【非特許文献３１】Ａｇａｔａら、Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８巻、７６５〜７７２頁（１９９６年）
【非特許文献３２】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１１巻、１４１〜１５１頁（１９９９年）
【非特許文献３３】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９１巻、３１９〜３２２頁（２００１年）
【非特許文献３４】Ｔｓｅｎｇら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９３巻、８３９〜８４６頁（２００１年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、野生型Ｂ７−ＤＣと比較して、ＰＤ−１に対する低下した結合親和性を有するが、Ｔ細胞を共刺激する能力を保持している改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドを提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドをコードする核酸分子を発現するベクターを含有する細胞を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに別の目的は、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドとの接触により、Ｔ細胞を共刺激する方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、これをコードする核酸、または改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドをコードする核酸をトランスフェクトもしくは形質導入した細胞の投与を、それを必要とする哺乳動物に行う方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、抗原またはワクチンと組み合わせて改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドを投与することにより、抗原またはワクチンに対する免疫応答を増強する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
Ｔ細胞を共刺激する（即ち、Ｔ細胞の抗原特異的増殖を高める、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を増強する、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能を刺激する、ならびに／あるいはＴ細胞の生存を促進する）ための組成物および方法が提供される。適切な組成物には、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドが含まれる。改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、阻害性ＰＤ−１リガンドに対する低下した結合親和性を有し、Ｔ細胞を共刺激する能力を実質的に保持する。ある種の実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、限定されることなく、マウスまたはヒトＢ７−ＤＣのＡ’β−ストランドの３３位、Ｂβ−ストランドの３９もしくは４１位、Ｃβ−ストランドの５６もしくは５８位、Ｃ’β−ストランドの６５もしくは６７位、Ｃ”  β−ストランドの７１もしくは７２位、Ｄβ−ストランドの８４位、Ｅβ−ストランドの８８位、Ｆβ−ストランドの１０１、１０３もしくは１０５位、またはＧβ−ストランドの１１１、１１３もしくは１１６位に、置換、欠失または挿入を含有することができる。
【００１７】
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの断片および改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドを含有する融合タンパク質も、提供される。いくつかの実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの断片には、細胞外ドメインまたはその断片を含む、可溶性断片が含まれる。改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの適当な他の断片には、ＩｇＶおよびＩｇＣドメインを含有する断片、またはＩｇＶドメインだけを含有する断片が含まれる。改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドおよびその断片は、他のポリペプチドと連結して融合タンパク質を形成することができる。変異体Ｂ７−ＤＣタンパク質の全てもしくは一部を含む第１の融合相手が、（ｉ）第２のポリペプチドに直接融合している、または（ｉｉ）場合により、第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチド配列に融合している、変異体Ｂ７−ＤＣ融合ポリペプチドが提供される。該融合相手の存在は、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの溶解性、親和性および／または数価を変えることができる。ある種の実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を好ましくは有する、Ｉｇ重鎖定常領域の１つまたは複数のドメインに融合している。
【００１８】
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドおよび改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質をコードする核酸、ならびにベクター中にこのような核酸を含有する宿主細胞も、提供される。
【００１９】
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドおよび改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質を含有する免疫原性組成物も、提供される。免疫原性組成物は、抗原、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド源、ならびに場合によりアジュバントおよび標的指向分子を含む。適切な抗原には、ウイルス、細菌、寄生生物、環境性および腫瘍の抗原が含まれる。
【００２０】
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドおよび改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質を使用して、Ｔ細胞を共刺激する方法も、提供される。Ｔ細胞は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで、改変体Ｂ７−ＤＣ組成物で共刺激することができる。改変体Ｂ７−ＤＣ組成物を用いるＴ細胞の共刺激は、Ｔ細胞の抗原特異的活性化の前、間または後に行うことができる。
【００２１】
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質およびそれらをコードする核酸の治療的使用が、提供される。改変体Ｂ７−ＤＣ組成物は、癌、およびウイルス感染症を含む感染性疾患に対する免疫応答を刺激するために、使用することができる。改変体Ｂ７−ＤＣ組成物は、免疫抑制対象の免疫応答を刺激するためにも、使用することができる。ある種の実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣ組成物は、ワクチンと共に投与される。
【００２２】
本発明の１つまたは複数の実施形態に関する詳細は、付属の図面および下記の説明において提示される。本発明の他の特徴、目的および利点は、この記載および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ヒトＢ７−ＤＣ（ｈＢ７−ＤＣ）の全長未成熟アミノ酸配列（配列番号１）を示す描写である。ヒトＢ７−ＤＣのシグナル配列は、この全長未成熟アミノ酸配列の最初の１９アミノ酸を含有する。
【図２】マウスＢ７−ＤＣ（ｍＢ７−ＤＣ）の全長未成熟アミノ酸配列（配列番号２）を示す描写である。マウスＢ７−ＤＣのシグナル配列は、この全長未成熟アミノ酸配列の最初の１９アミノ酸を含有する。
【図３】図１に示すアミノ酸配列を有する全長未成熟ヒトＢ７−ＤＣポリペプチド（配列番号１）をコードする、ヌクレオチド配列（配列番号３）を示す描写である。ヒトＢ７−ＤＣのシグナル配列は、この全長未成熟核酸配列の最初の５７ヌクレオチドによりコードされる。
【図４】図２に示すアミノ酸配列を有する全長未成熟マウスＢ７−ＤＣポリペプチド（配列番号２）をコードする、ヌクレオチド配列（配列番号４）を示す描写である。マウスＢ７−ＤＣのシグナル配列は、この全長未成熟核酸配列の最初の５７ヌクレオチドによりコードされる。
【図５】マウスおよびヒトＢ７分子の構造志向的な配列整列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を示す図である。この整列には、ヒトＣＤ８６（ｈＣＤ８６）（配列番号５）、ヒトＣＤ８０（ｈＣＤ８０）（配列番号６）、ヒトＢ７−Ｈ１（ｈＢ７−Ｈ１）（配列番号７）、マウスＢ７−Ｈ１（ｍＢ７−Ｈ１）（配列番号８）、ヒトＢ７−Ｈ２（ｈＢ７−Ｈ２）（配列番号９）、ヒトＢ７−Ｈ３（ｈＢ７−Ｈ３）（配列番号１０）、ヒトＢ７−ＤＣ（ｈＰＤ−Ｌ２）（配列番号１１）およびマウスＢ７−ＤＣ（ｍＰＤ−Ｌ２）（配列番号１２）のＮ末端ＩｇＶドメイン由来の配列を包含する。ＣＤＳ０およびＣＤ８６のＸ線構造中に観察したβストランドは、（Ａ’〜Ｇ）と標識されており、Ｂ７ファミリー共通に最もよく保存されている残基位置（例えば、大型疎水性、荷電／極性、またはシステインの残基）には、陰影を付けてある。潜在的なＮ連結グリコシル化部位は、箱囲いしてある。イタリックで示したＣＤ８６残基は、ホモ二量体結晶界面の形成に関与し、ＣＤ８０内に保存されており、太字イタリックで示した残基は、複合体構造中のＣＴＬＡ−４結合に関与する。変異原性試験に基づいてＰＤ−１結合に最も重要である、ｍＢ７−Ｈ１およびｍＢ７−ＤＣ内の残基位置は、下線を引き、太字で示してある。変異誘発した際にＰＤ−１に対するアビディティの増加を示した、ｍＢ７−Ｈ１内の残基は、丸囲いしてある。残基番号は、ｍＢ７−Ｈ１（上側の番号）およびｍＢ７−ＤＣ（下側の番号）内の位置を示す。
【図６】Ｂ７−ＤＣのＰＤ−１に対する結合の表面プラズモン共鳴分析の結果を示す線グラフである。このグラフは、野生型Ｂ７−ＤＣＩｇおよびＫ１１３Ｓ  Ｂ７−ＤＣＩｇ改変体の固定化されたＰＤ−１Ｉｇに対する結合の結果を示す。データは、秒単位の時間の関数としての応答単位（ＲＵ）により報告されている。
【図７】野生型および改変体Ｂ７−ＤＣＩｇ融合タンパク質のＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞に対する結合を示す一連のグラフである。Ｂ７−ＤＣＩｇ融合タンパク質は、示した野生型または改変体Ｂ７−ＤＣ改変体融合タンパク質と共に、次いでＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧと共にインキュベートし、ＦＡＣＳにより分析した。媒体単独およびヒトＩｇＧを陰性対照として用い、抗ヒトＰＤ−１抗体を陽性対照として用いた。グラフは、放射蛍光レベルの関数としての細胞数を表示している。グラフの右側および左側の数字は、示した組成物の結合について、それぞれ陽性および陰性と見なされた細胞百分率を表す。
【図８】野生型および改変体Ｂ７−ＤＣ分子のＴ細胞共刺激に対する効果を示すグラフである。図８Ａのデータは、９６ウェルプレートのウェル底部上に表示濃度で被覆した抗ＣＤ３  ｍＡｂの存在下、示した野生型（−◇−）または改変体（−■−Ｄ１１１；−×−Ｋ１１３）Ｂ７−ＤＣ  Ｉｇ融合タンパク質で刺激した後のＴ細胞増殖を表す。Ｔ細胞増殖は、抗ＣＤ３  ｍＡｂ濃度（μｇ／ｍｌ）の関数としての３Ｈ−チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）（×１０３ｃｐｍ）の取込みとして測定した。ヒトＩｇ（ｈＩｇ）（−○−）およびＰＢＳ単独（−▲−）を、共刺激性分子に対する陰性対照として用いた。データは、３実験の代表的な１実験を表す。図８Ｂのデータは、示したＩｇ融合タンパク質（■野生型；□Ｄ１１１；□Ｋ１１３）および抗ＣＤ３の存在下、４８または７２時間培養したＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌（ｎｇ／ｍｌ）を表す。ヒトＩｇ（□）およびＰＢＳ（□）を、陰性対照として用いた。データは、３実験の代表的な１実験を表す。
【図９】抗ＣＤ３  ｍＡｂの存在下、示した野生型（−●−）または改変体（−△−Ｄ１１１；−×−Ｋ１１３）Ｂ７−ＤＣ  Ｉｇ融合タンパク質とインキュベーションした後のＰＤ−１−／−Ｔ細胞の増殖を示す線グラフである。Ｔ細胞増殖は、抗ＣＤ３  ｍＡｂ濃度（μｇ／ｍｌ）の関数としての３Ｈ−チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）（×１０３ｃｐｍ）の取込みとして測定した。ヒトＩｇ（−■−）およびＰＢＳ（−○−）を、陰性対照として用いた。データは、３実験の代表的な１実験を表す。
【図１０】同系の免疫応答性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）における、擬似（ｍｏｃｋ）トランスフェクト（−□−）したかのいずれかである、または野生型Ｂ７−ＤＣ（−■−）もしくはＫ１１３Ｓ  Ｂ７−ＤＣ（−●−）でトランスフェクトした、ＥＧ７マウス腫瘍細胞の増殖（ｍｍ単位の平均腫瘍直径）を時間（日）の関数として示す線グラフである。
【図１１】免疫欠損ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスにおける、擬似トランスフェクト（−□−）した、または野生型Ｂ７−ＤＣ（−■−）もしくはＫ１１３Ｓ  Ｂ７−ＤＣ（−●−）でトランスフェクトしたかのいずれかである、ＥＧ７マウス腫瘍細胞の増殖（ｍｍ単位の平均腫瘍直径）を時間（日）の関数として示す線グラフである。
【図１２】同系の免疫応答性マウス（ＤＢＡ／２）における、擬似トランスフェクト（−□−）した、または野生型Ｂ７−ＤＣ（−■−）もしくはＫ１１３Ｓ  Ｂ７−ＤＣ（−●−）でトランスフェクトしたかのいずれかである、Ｐ８１５マストロサイトーマ（ｍａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）マウス腫瘍細胞の増殖（ｍｍ単位の平均腫瘍直径）を時間（日）の関数として示す線グラフである。
【図１３】免疫欠損ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスにおける、擬似トランスフェクト（−□−）した、または野生型Ｂ７−ＤＣ（−■−）もしくはＫ１１３Ｓ  Ｂ７−ＤＣ（−●−）でトランスフェクトした、Ｐ８１５マストロサイトーマ（ｍａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）マウス腫瘍細胞の増殖（ｍｍ単位の平均腫瘍直径）を時間（日）の関数として示す線グラフである。
【図１４】同系の免疫応答性マウス（ＤＢＡ／２）におけるＰ８１５マストロサイトーマ（ｍａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）マウス腫瘍細胞の増殖（ｍｍ単位の平均腫瘍直径）に対する、野生型Ｂ７−ＤＣＩｇの腹腔内注射の効果を時間（日）の関数として示す線グラフである。マウスには、対照Ｉｇ（−□−）または野生型Ｂ７−ＤＣＩｇ（−■−）の０．１ｍｇを、３日目および８日目に腹腔注入した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
Ｉ．定義
本明細書で使用する場合、用語「単離された」とは、対象化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）が天然に存在する環境とは異なる環境中にある、例えば、ペプチドを自然中には見出されない濃度に濃縮することなどにより、自然環境から分離されている該化合物を表現することを意図している。「単離された」とは、対象化合物が実質的に富化されている、および／または対象化合物が部分的もしくは実質的に精製されている試料内にある化合物を包含することを意図している。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」とは、改変（例えば、リン酸化またはグリコシル化）に関係なく、任意の長さのアミノ酸連鎖を指す。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「共刺激性ポリペプチド」とは、Ｔ細胞上の細胞表面分子と相互作用した際、Ｔ細胞応答を増強し、Ｔ細胞増殖を増強し、Ｔ細胞によるサイトカインの産生および／または分泌を増強し、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能を刺激し、あるいは共刺激性ペプチドと接触していないＴ細胞に比して、Ｔ細胞の生存を促進するポリペプチドである。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「改変体」ポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列の少なくとも１つの変化を含有する。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸配列の変化」は、例えば、１個または複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入でもよい。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「ベクター」とは、別のＤＮＡセグメントを挿入することにより、挿入セグメントの複製を起こし得る、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。本明細書に記載のベクターは、発現ベクターでもよい。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「発現ベクター」とは、１つまたは複数の発現制御配列を含むベクターである。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御し、調節するＤＮＡ配列である。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」とは、発現制御配列が、対象コード配列の発現を有効に制御するように、遺伝子（ｇｅｎｔｉｃ）構築体中に組み込まれていることを意味する。
【００３３】
本明細書で使用する場合、ポリペプチドの「断片」とは、全長タンパク質中のより短いポリペプチドである、該ポリペプチドの任意のサブセットを指す。一般に、断片の長さは、アミノ酸５個以上である。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「数価」とは、１分子当たり利用可能な結合部位の数を指す。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「保存的」アミノ酸置換とは、置換されたアミノ酸が、類似の構造的または化学的性質を有する置換である。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「非保存的」アミノ酸置換とは、置換されたアミノ酸の電荷、疎水性または嵩が、有意に変化している置換である。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「単離核酸」とは、哺乳類ゲノム中で当該核酸の片側または両側に通常は隣接している核酸（例えば、非Ｂ７−ＤＣタンパク質をコードする核酸）を含む、哺乳類ゲノム中に存在する他の核酸分子から分離されている核酸を指す。
【００３８】
核酸に関して本明細書で使用する場合、「単離された」という用語は、任意の非天然核酸配列も包含するが、その理由は、このような非天然配列が、自然には見出されず、天然に存在するゲノム中で直接隣接配列を有していないからである。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」とは、組換え発現ベクターを導入できる原核性および真核性の細胞を指す。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「形質転換された」および「トランスフェクトされた」とは、当技術分野で公知の多くの技法によって、細胞中に核酸（例えば、ベクター）を導入することを包含する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」とは、抗原結合部位を含む、無傷な分子ならびにその断片の双方を包含することを意図している。こうしたものには、無傷な抗体のＦｃ断片を欠いたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。
【００４２】
用語「個体」、「宿主」、「対象」および「患者」は、本明細書では互換的に使用され、それだけに限らないが、ネズミ、サル、ヒト、家畜哺乳動物、スポーツ哺乳動物および愛玩哺乳動物を含めた哺乳動物を指す。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「有効量」または「治療有効量」とは、治療している炎症反応または自己免疫疾患状態の１つまたは複数の症状を治療、抑制または緩和するのに十分な用量、あるいはそうでない場合、所望の薬理学的および／または生理学的効果を提供するのに十分な用量を意味する。正確な用量は、対象依存性の変数（例えば、年齢、免疫系の健全性など）、疾患、および施している治療などの多様な要因に従って変動する。
【００４４】
ＩＩ．組成物
Ａ．単離Ｂ７−ＤＣポリペプチド
１．改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド
単離Ｂ７−ＤＣポリペプチドを本明細書で開示する。Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、任意起源の種でもよい。一実施形態では、Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、哺乳動物種に由来する。好ましい実施形態では、Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、マウスまたはヒトが起源である。マウスＢ７−ＤＣの全長未成熟アミノ酸配列（配列番号２）は、図２に描写されている。マウスＢ７−ＤＣのシグナル配列は、その全長未成熟アミノ酸配列の最初の１９アミノ酸を含有する。ヒトＢ７−ＤＣの全長未成熟アミノ酸配列（配列番号１）は、図１に描写されている。ヒトＢ７−ＤＣのシグナル配列は、その全長未成熟アミノ酸配列の最初の１９アミノ酸を含有する。本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」とは、改変（例えば、リン酸化またはグリコシル化）に関係なく、長さ任意のアミノ酸の鎖を指す。
【００４５】
一実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、野生型Ｂ７−ＤＣと同じ活性、実質的に同じ活性、または異なる活性を有する。実質的に同じ活性とは、それがＴ細胞を共刺激する能力を保持していることを意味する。
【００４６】
本明細書に開示するポリペプチドは、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドを包含する。本明細書で使用する場合、「改変体」ポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列の少なくとも１つの変化を含有する。アミノ酸配列の変化は、例えば、１個または複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入でもよい。
【００４７】
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失または挿入の任意の組合せを有することができる。一実施形態では、単離したＢ７−ＤＣ改変体ポリペプチドは、そのアミノ酸配列が、野生型Ｂ７−ＤＣポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５または１００％の同一性を共有するように、整数個のアミノ酸変化を有する。好ましい実施形態では、Ｂ７−ＤＣ改変体ポリペプチドは、野生型マウスまたは野生型ヒトＢ７−ＤＣポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５または１００％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する。
【００４８】
配列同一性百分率は、コンピュータプログラムまたは直接の配列比較を用いて計算することができる。２種の配列間の同一性を決定する好ましいコンピュータプログラム法には、それだけに限らないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮが挙げられる（例えば、Ｄ．  Ｗ．  Ｍｏｕｎｔ、２００１年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮのプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の提供源から公的に入手できる。同一性を決定するために、周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムも使用し得る。
【００４９】
アミノ酸配列を比較する例示的なパラメーターには、次のもの：１）Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３〜４５３頁（１９７０年））、２）Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  ＨｅｎｔｉｋｏｆｆのＢＬＯＳＳＵＭ６２の比較行列（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９巻、１０９１５〜１０９１９頁（１９９２年））、３）ギャップペナルティー＝１２、および４）ギャップ長ペナルティー＝４が含まれる。これらのパラメーターを用いた有用なプログラムは、「ギャップ」プログラムとして公的に入手できる（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。上記のパラメーターは、ポリペプチド比較用のデフォルトパラメーターである（末端ギャップにはペナルティーがない）。
【００５０】
代替法として、ポリペプチドの配列同一性は、次の等式を用いて計算することができる。即ち、％同一性＝（同一残基数）／（アミノ酸残基の整列長）×１００。この計算の場合、整列長には、内部ギャップは含まれるが、末端ギャップは含まれない。
【００５１】
Ｂ７−ＤＣポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、「保存的」または「非保存的」でもよい。本明細書で使用する場合、「保存的」アミノ酸置換は、置換アミノ酸が、類似の構造的または化学的性質を有する置換であり、「非保存的」アミノ酸置換は、置換アミノ酸の電荷、疎水性または嵩が、有意に変化している置換である。非保存的置換は、（ａ）置換域におけるペプチド骨格の構造、例えば、シートもしくは螺旋立体構造としての構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩を維持する上で効果がより有意に異なる。
【００５２】
保存的アミノ酸置換の例には、当該置換が以下の５群：１）小型脂肪族で非極性またはやや極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、２）極性で負荷電の残基およびそのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）、極性で正荷電の残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、大型脂肪族で非極性の残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）、ならびに大型芳香族の残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）のうち、１つの群に入る置換が含まれる。非保存的アミノ酸置換の例は、１）親水性残基、例えば、セリルもしくはスレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニルに代わって（もしくは、によって）置換される、２）システインもしくはプロリンが、他の任意の残基に代わって（もしくは、によって）置換される、３）正の電荷を持った側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニルもしくはヒスチジルが、負の電荷を持った残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルに代わって（もしくは、によって）置換される、または４）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有していない残基、例えば、グリシンに代わって（もしくは、によって）置換される、置換である。
【００５３】
Ｂ７ファミリー分子は、Ｂ７−ＤＣを含め、膜近位定常ＩｇＣドメインおよび膜遠位ＩｇＶドメインを有するホモ二量体として、細胞表面上に発現する。こうしたリガンドの受容体は、共通の細胞外ＩｇＶ様ドメインを共有する。受容体−リガンド対の相互作用は、リガンドおよび受容体のＩｇＶドメインにある残基を通して主に媒介される。一般に、ＩｇＶドメインは、各々がβストランドの層を含有する２枚のシートを有すると説明されている。こうしたβストランドは、Ａ’、Ｂ、Ｃ、Ｃ’、Ｃ”、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧと呼称される。一実施形態では、Ｂ７−ＤＣ改変体ポリペプチドは、こうしたβストランドの１つまたは複数内に任意の可能な組合せで、アミノ酸変化（即ち、置換、欠失または挿入）を含有する。別の実施形態では、Ｂ７−ＤＣ改変体は、Ａ’、Ｃ、Ｃ’、Ｃ”、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧのβストランド内に、１つまたは複数のアミノ酸変化（即ち、置換、欠失または挿入）を含有する。好ましい実施形態では、Ｂ７−ＤＣ改変体は、Ｇのβストランド内に、１つまたは複数のアミノ酸変化を含有する。
【００５４】
マウスＢ７−ＤＣまたはヒトＢ７−ＤＣに関しては、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、限定することなく、Ａ’β−ストランドの３３位、Ｂβ−ストランドの３９もしくは４１位、Ｃβ−ストランドの５６もしくは５８位、Ｃ’β−ストランドの６５もしくは６７位、Ｃ”  β−ストランドの７１もしくは７２位、Ｄβ−ストランドの８４位、Ｅβ−ストランドの８８位、Ｆβ−ストランドの１０１、１０３もしくは１０５位、またはＧβ−ストランドの１１１、１１３もしくは１１６位に、置換、欠失または挿入を含有することができる。
【００５５】
一実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、３３位における置換（例えば、３３位におけるアスパラギン酸の代わりにセリン置換）、３９位における置換（例えば、３９位におけるセリンの代わりにチロシン置換）、４１位における置換（例えば、４１位におけるグルタミン酸の代わりにセリン置換）、５６位における置換（例えば、５６位におけるアルギニンの代わりにセリン置換）、５８位における置換（例えば、５８位におけるセリンの代わりにチロシン置換）、６５位における置換（例えば、６５位におけるアスパラギン酸の代わりにセリン置換）、６７位における置換（例えば、６７位におけるセリンの代わりにチロシン置換）、７１位における置換（例えば、７１位におけるグルタミン酸の代わりにセリン置換）、７２位における置換（例えば、７２位におけるアルギニンの代わりにセリン置換）、８４位における置換（例えば、８４位におけるリシンの代わりにセリン置換）、８８位における置換（例えば、８８位におけるヒスチジンの代わりにアラニン置換）、１０１位における置換（例えば、１０１位におけるアルギニンの代わりにセリン置換）、１０３位における置換（例えば、１０３位におけるロイシンの代わりにアラニン置換）、１０５位における置換（例えば、１０５位におけるイソロイシンの代わりにアラニン置換）、１１１位における置換（例えば、１１１位におけるアスパラギン酸の代わりにセリン置換）、１１３位における置換（例えば、１１３位におけるリシンの代わりにセリン置換）、または１１６位における置換（例えば、１１６位におけるスレオニンの代わりにチロシン置換）を含有する。
【００５６】
しかし、列挙したアミノ酸位置における置換は、任意のアミノ酸またはアミノ酸類縁体を用いてなし得ることが理解されている。例えば、列挙した位置における置換は、天然に存在するアミノ酸（例えば、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、システイン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、ロイシン、バリン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、セリン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシン）のいずれでもなし得る。
【００５７】
本明細書に記載の置換は、マウスおよびヒトのＢ７−ＤＣに関するが、当業者であれば、他の種（例えば、ラット、ハムスター、モルモット、アレチネズミ、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウシまたはヒト以外の霊長類）由来の対応するポリペプチドに同等な変化を容易になし得ることに留意する。
【００５８】
２．改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの性質
開示した単離Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、Ｔ細胞を共刺激することができる。「共刺激性ポリペプチド」は、Ｔ細胞上の細胞表面分子と相互作用した際、Ｔ細胞応答を増強し、Ｔ細胞増殖を増強し、Ｔ細胞によるサイトカインの産生および／または分泌を増強し、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能を刺激し、あるいは共刺激性ペプチドと接触していないＴ細胞に比して、Ｔ細胞の生存を促進するポリペプチドである。この相互作用から生じるＴ細胞応答は、共刺激性ポリペプチドの非存在下における応答より通常大きい。共刺激性ポリペプチドの非存在下におけるＴ細胞の応答は、無応答のこともあれば、共刺激性ポリペプチドの存在下における場合より、有意に低い応答のこともある。Ｔ細胞の応答は、エフェクター（例えば、ＣＴＬもしくは抗体産生Ｂ細胞）応答、１つもしくは複数のエフェクター（例えば、ＣＴＬもしくは抗体産生Ｂ細胞）応答を補助するヘルパー応答、または抑制的応答のこともある。
【００５９】
本明細書に開示する改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、対応する野生型Ｂ７−ＤＣポリペプチドの結合親和性と比較して、ＰＤ−１に対する低下した結合親和性を有する。改変体の結合親和性は、対応する野生型ポリペプチドの結合親和性と比較して、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％または９９％超低下している。
【００６０】
２分子間の結合親和性を測定する方法は、当技術分野で周知である。ＰＤ−１に対するＢ７−ＤＣ改変体ポリペプチドの結合親和性を測定する方法には、それだけに限らないが、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、表面プラズモン共鳴、蛍光異方性、アフィニティクロマトグラフィーおよび親和性選択質量分析が挙げられる。
【００６１】
それに加え、ＰＤ−１に対する低下した結合親和性を有する、開示の改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、実質的な共刺激活性を保持する。例えば、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、対応する野生型Ｂ７−ＤＣポリペプチドが示す共刺激活性レベルの少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、９０％、１００％または１００％超を有することができる。
【００６２】
Ｔ細胞の共刺激性を測定する方法は、当技術分野で周知であり、Ｔ細胞の増殖、ならびに、それだけに限らないが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γを含む、サイトカインの分泌の測定を包含する。Ｔ細胞の増殖は、それだけに限らないが、細胞計数、標識ヌクレオチド（［３Ｈ］ＴｄＲおよびＢｒｄＵなど）の取込みによるＤＮＡ合成の測定、およびテトラゾリウム塩を用いた代謝活性の測定を含む、多くの方法により測定することができる。サイトカインの分泌を測定する方法には、それだけに限らないが、ＥＬＩＳＡが挙げられる。
【００６３】
３．改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの断片
本明細書に開示するＢ７−ＤＣポリペプチドは、全長ポリペプチドでもよく、または全長Ｂ７−ＤＣポリペプチドの断片でもよい。本明細書で使用する場合、Ｂ７−ＤＣの断片とは、全長タンパク質中のより短いポリペプチドである、該ポリペプチドの任意のサブセットを指す。
【００６４】
一実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの断片は、Ｔ細胞を共刺激する能力を保持する断片である。全長Ｂ７−ＤＣの断片である改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、全長改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの共刺激活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％または１００％超さえを有している。
【００６５】
ヒトおよびマウスのＢ７−ＤＣタンパク質は、短い細胞質内ドメイン、単一の膜貫通型ドメインおよび細胞外ドメインを含有する。細胞外ドメインは、２つのＩｇドメイン、即ち膜近位ＩｇＣドメインおよび膜遠位ＩｇＶドメインを含有する。改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの有用な断片は、可溶性断片を包含する。可溶性Ｂ７−ＤＣ断片は、産生細胞から流出し、分泌し、またはそうでなければ抽出し得る、Ｂ７−ＤＣの断片である。一実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの断片は、Ｂ７−ＤＣの全細胞外ドメインを含む。Ｂ７−ＤＣの細胞外ドメインは、マウスもしくはヒトＢ７−ＤＣまたはその共刺激性断片の約２６個から約２２６個までのアミノ酸を含む。別の実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの断片は、Ｂ７−ＤＣのＩｇＣおよびＩｇＶドメインを含む。別の実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの断片は、Ｂ７−ＤＣのＩｇＶドメインを含む。
【００６６】
一実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの断片は、ＰＤ−１に対する結合親和性にとって重要なポリペプチド領域を含有し得る。こうしたポリペプチド断片は、ＰＤ−１に結合するために競合し、天然のＢ７−ＤＣのＰＤ−１との結合を防止するのに、有用となり得る。ＰＤ−１との結合のために競合することによって、こうした断片は、Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣのＰＤ−１との相互作用の阻害が、そうでない場合には起こる免疫応答の抑制も阻害し得るので、免疫応答の増強に有用となり得る。ＰＤ−１に競合的に結合し得る、マウスまたはヒトＢ７−ＤＣのポリペプチド断片は、例えば、６７〜７１位、１０１〜１０５位または１１１〜１１３位のアミノ酸を含有することができる。Ｂ７−ＤＣのＰＤ−１との結合は、該断片の非存在下でのＢ７−ＤＣのＰＤ−１との結合レベルに比較して、通常、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％または９５％超、阻害される。
【００６７】
４．改変された改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、正常な細胞環境においてポリペプチド中に存在し得る化学成分による改変、例えば、リン酸化、メチル化、アミド化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、スモイル化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）およびユビキチル化を受け得る。改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、それだけに限らないが、放射性同位体および蛍光化合物を含め、直接的または間接的のいずれかで検出可能シグナルを供与できる標識でも改変し得る。
【００６８】
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、細胞環境においてはポリペプチドに通常付加されない化学成分によっても改変し得る。このような改変物は、選択された側鎖または末端残基と反応できる有機誘導体化剤と、該ポリペプチドの標的アミノ酸残基を反応させることにより、その分子中に導入し得る。別の改変は、該タンパク質の環化である。
【００６９】
ポリペプチドの化学的誘導体の例には、コハク酸または他のカルボン酸の無水物で誘導体化したリシニル残基およびアミノ末端残基が含まれる。環状カルボン酸無水物による誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。アミノ含有残基を誘導体化する適切な他の試薬には、メチルピコリニミデートなどのイミドエステル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。カルボキシル側鎖基のアスパルチルまたはグルタミルは、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）（１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなど）との反応により、選択的に改変し得る。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニアとの反応により、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換することができる。ポリペプチドは、１個または複数のＬ−アミノ酸に代わって置換される、１個または複数のＤ−アミノ酸も含み得る。
【００７０】
５．改変体Ｂ７−ＤＣ融合ポリペプチド
本明細書で開示する改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、他のポリペプチドと連結して融合タンパク質を形成し得る。変異体Ｂ７−ＤＣタンパク質の全てもしくは一部を含む第１の融合相手が、（ｉ）第２のポリペプチドに直接融合している、または（ｉｉ）場合により、第２のポリペプチドに融合したリンカーペプチド配列に融合している、変異体Ｂ７−ＤＣ融合ポリペプチドが提供される。該融合相手の存在は、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの溶解性、親和性および／または数価を変えることができる。本明細書で使用する場合、「数価」とは、１分子当たり利用可能な結合部位の数を指す。本明細書に記載の改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質は、上記したようなアミノ酸変化（即ち、置換、欠失もしくは挿入）、Ｂ７−ＤＣの断片、および／または改変の任意の組合せを包含する。一実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質は、第１の結合相手として、Ｂ７−ＤＣタンパク質の細胞外ドメイン、またはその共刺激性断片を含む。別の実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質は、第１の結合相手として、Ｂ７−ＤＣタンパク質のＩｇＶおよびＩｇＣドメインを含む。別の実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質は、第１の結合相手として、Ｂ７−ＤＣタンパク質のＩｇＶドメインを含む。
【００７１】
第２のポリペプチド結合相手は、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドに対してＮ末端側またはＣ末端側にあってもよい。好ましい実施形態では、第２のポリペプチドは、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドに対してＣ末端側にある。
【００７２】
融合タンパク質の結合相手として常套的に使用される多数のポリペプチド配列が、当技術分野で周知である。有用なポリペプチド結合相手の例には、それだけに限らないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｍｙｃ、ヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）、Ｆｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）、マルトースＥ結合タンパク質およびプロテインＡが挙げられる。一実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を好ましくは有する、Ｉｇ重鎖定常領域の１つまたは複数のドメインに融合している。
【００７３】
Ｂ．単離核酸分子
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドをコードする単離核酸配列が、本明細書で開示される。本明細書で使用する場合、「単離核酸」とは、哺乳類ゲノム中で当該核酸の片側または両側に通常は隣接している核酸（例えば、非Ｂ７−ＤＣタンパク質をコードする核酸）を含む、哺乳類ゲノム中に存在する他の核酸分子から分離されている核酸を指す。核酸に関して本明細書で使用する場合の「単離された」という用語は、任意の非天然核酸配列も包含するが、その理由は、このような非天然配列が、天然には見出されず、天然に存在するゲノム中には直接隣接配列を有していないからである。
【００７４】
単離核酸分子は、例えばＤＮＡ分子でもよいが、但し、天然に存在するゲノム中でそのＤＮＡ分子に直接隣接して通常見出される核酸配列の一方が、除去されているか存在しないことを条件とする。したがって、単離核酸分子には、限定することなく、他の配列から独立した個別分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学合成核酸、またはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理で生成するｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片）、ならびにベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスもしくはヘルペスウイルス）中に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれる組換えＤＮＡも含まれる。それに加え、単離核酸には、ハイブリッドまたは融合核酸の一部である組換えＤＮＡ分子などの操作された核酸も含むことができる。数百から数百万の他の核酸中、例えば、ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡ制限酵素消化物を含有するゲルスライス内に存在する核酸は、単離核酸と見なされない。
【００７５】
核酸は、センスもしくはアンチセンス配向を取ることもでき、またはＢ７−ＤＣポリペプチドをコードする基準配列に相補的になることもできる。基準配列には、例えば、図１に提示したアミノ酸配列（配列番号１）を有する全長未成熟Ｂ７−ＤＣをコードする、図３に提示のヒトＢ７−ＤＣのヌクレオチド配列（配列番号３）、および図２に提示したアミノ酸配列（配列番号２）を有する全長未成熟Ｂ７−ＤＣをコードする、図４に提示のマウスＢ７−ＤＣのヌクレオチド配列（配列番号４）が含まれる。
【００７６】
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類縁体でもよい。核酸類縁体は、塩基部、糖部またはリン酸塩骨格において改変することができる。このような改変は、例えば、その核酸の安定性、ハイブリッド形成または溶解性を改善することができる。塩基部における改変は、デオキシチミジンに対するデオキシウリジン、およびデオキシシチジンに対する５−メチル−２’−  デオキシシチジンまたは５−ブロモ−２’−  デオキシシチジンを包含することができる。糖部の改変は、リボース糖の２’ヒドロキシの改変による２’−Ｏ−メチル  糖または２’−Ｏ−アリル糖の形成を包含することができる。デオキシリボースリン酸塩骨格は、各塩基部が６員モルホリノ環に連結しているモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸塩骨格が偽ペプチド骨格に置き換えられ、４種の塩基は保持されているペプチド核酸を生成するように、改変することができる。例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７年）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７巻、１８７〜１９５頁およびＨｙｒｕｐら（１９９６年）Ｂｉｏｏｒｇａｎ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．４巻、５〜２３頁を参照されたい。それに加え、デオキシリン酸塩骨格は、例えば、ホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエート骨格、ホスホラミダイト、またはアルキルホスホトリエステル骨格で置き換えることができる。
【００７７】
Ｃ．ベクターおよび宿主細胞
上記のような核酸は、細胞中で発現させるためにベクター中に挿入することができる。本明細書で使用する場合、「ベクター」とは、別のＤＮＡセグメントを挿入することにより、挿入セグメントの複製を起こし得る、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、発現ベクターでもよい。「発現ベクター」とは、１つまたは複数の発現制御配列を含むベクターであり、「発現制御配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御し、調節するＤＮＡ配列である。
【００７８】
ベクター中の核酸は、１つまたは複数の発現制御配列に作動可能に連結することができる。本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」とは、発現制御配列が、対象コード配列の発現を有効に制御するように、遺伝子構築体中に組み込まれていることを意味する。発現制御配列の例には、プロモーター、エンハンサーおよび転写終結領域が挙げられる。プロモーターは、転写が開始する点の上流にある（一般に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位近傍）、通常ヌクレオチド１００個以内のＤＮＡ分子の領域で構成された発現制御配列である。コード配列をプロモーターの制御下に置くためには、当該ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位を、プロモーターから下流のヌクレオチド１個と約５０個の間に配置することが必要である。エンハンサーは、時間、位置およびレベルによって発現特異性をもたらす。プロモーターと異なり、エンハンサーは、転写部位から様々な距離に位置するときに機能することができる。エンハンサーは、転写開始部位から下流に位置することもできる。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写できるとき、細胞中で「作動可能に連結され」、発現制御配列の「制御下」にあり、その後ｍＲＮＡは、コード配列がコードするタンパク質に翻訳することができる。
【００７９】
適切な発現ベクターには、限定することなく、プラスミド、ならびに例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスから誘導されるウイルスベクターが挙げられる。多数のベクターおよび発現系が、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）などの企業から市販されている。
【００８０】
発現ベクターはタグ配列を含むことができる。タグ配列は、コードされるポリペプチドとの融合体として通常発現される。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかの位置を含め、ポリペプチド内の任意の箇所に挿入することができる。有用なタグの例には、それだけに限らないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、Ｆｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）、マルトースＥ結合タンパク質およびプロテインＡが挙げられる。一実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に対応するアミノ酸配列を好ましくは有する、Ｉｇ重鎖定常領域の１つまたは複数のドメインをコードする核酸を含有するベクター中に存在している。
【００８１】
発現させようとする核酸（ｍｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を含有するベクターは、宿主細胞中に移入することができる。用語「宿主細胞」とは、組換え発現ベクターを導入できる原核性および真核性の細胞を包含することを意図している。本明細書で使用する場合、「形質転換された」および「トランスフェクトされた」とは、多くの技法の１つによって、細胞中に核酸分子（例えば、ベクター）を導入することを包含する。特定の技法に限定されないが、多数のこうした技法が当技術分野内で十分に確立されている。原核細胞は、例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウム媒介形質転換により、核酸で形質転換することができる。核酸は、哺乳類細胞中に、例えば、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションを含む技法によって、トランスフェクトすることができる。宿主細胞（例えば、原核細胞またはＣＨＯ細胞などの真核細胞）は、本明細書に記載の改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドを産生するために、使用することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞（例えば、抗原提示細胞）は、本明細書に開示する改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドを発現して、Ｔ細胞に提示するために、使用することができる。
【００８２】
Ｄ．抗体
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ならびにその生成および使用の方法は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６巻、４９５〜４９７頁（１９７５年）；米国特許第４３７６１１０号；Ｈａｒｔｌｏｗ，  Ｅら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８８年）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８０年）；Ｈ．  Ｚｏｌａら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ内、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８２年））に記載されている。
【００８３】
免疫アッセイ法は、Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．  Ｅ．ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９１年（または現行版）；Ｂｕｔｔ，  Ｗ．  Ｒ．（編）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：  Ｔｈｅ  Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｔ、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８４年；Ｂｉｚｏｌｌｏｎ，  Ｃｈ．  Ａ．編、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８４年；Ｂｕｔｌｅｒ，  Ｊ．  Ｅ．、ＥＬＩＳＡ（２９章）、ｖａｎ  Ｏｓｓ，  Ｃ．  Ｊ．ら（編）、ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ内、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４年、７５９〜８０３頁；Ｂｕｔｌｅｒ，  Ｊ．  Ｅ．（編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９９１年；Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｂ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９８６年３月；Ｗｏｒｋ，  Ｔ．  Ｓ．ら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＹ、（１９７８年）（Ｃｈａｒｄ，  Ｔ．による章、「Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ  Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」）に記載されている。
【００８４】
抗イディオタイプ抗体は、例えば、Ｉｄｉｏｔｙｐｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８４年；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ７９巻、１９８４年；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０巻、１９８６年；Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１９巻、１９８５年；Ｂｏｎａ，  Ｃ．ら、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３３〜８１頁（１９８１年）；Ｊｅｒｍｅ，  Ｎ  Ｋ、Ａｎｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２５Ｃ巻、３７３〜３８９頁（１９７４年）；Ｊｅｒｎｅ，  Ｎ  Ｋ、Ｉｄｉｏｔｙｐｅｓ−−Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｉｄｅ内、Ｗｅｓｔｅｎ−Ｓｃｈｎｕｒｒ，  Ｉ．編、Ｅｄｉｔｉｏｎｅｓ  Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、１９８２年；Ｕｒｂａｉｎ，  Ｊ．ら、Ａｎｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３Ｄ巻、１７９頁〜（１９８２年）；Ｒａｊｅｗｓｋｙ，  Ｋ．ら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１巻、５６９〜６０７頁（１９８３年）に記載されている。
【００８５】
既知のＢ７ファミリータンパク質には存在しないＢ７−ＤＣの新規エピトープと反応性のある、モノクローナルおよびポリクローナル抗体が、本明細書に記載されている。該抗体は、異種、同種、同系、またはヒト化もしくはキメラ抗体などのそれらの改変体でもよい。抗Ｂ７−ＤＣ抗体のイディオタイプに特異的な抗イディオタイプ抗体も、含まれている。用語「抗体」とは、抗原結合部位を含み、Ｂ７−ＤＣエピトープに結合できる、無傷な分子ならびにその断片の双方を包含することを意図している。こうしたものには、無傷な抗体のＦｃ断片を欠き、循環血中からより迅速に消失し、無傷抗体より低い非特異的組織結合性を有し得る、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる（Ｗａｈｌら、Ｊ．  Ｎｕｃ．  Ｍｅｄ．２４巻、３１６〜３２５頁（１９８３年））。Ｆｖ断片も含まれる（Ｈｏｃｈｍａｎ，  Ｊ．ら（１９７３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２巻、１１３０〜１１３５頁；Ｓｈａｒｏｎ，  Ｊ．ら（１９７６年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５巻、１５９１〜１５９４頁）。こうした各種の断片は、プロテアーゼ切断または化学切断などの従来技法を用いて生成される（例えば、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１２１巻、６６３〜６９頁（１９８６年）を参照されたい）。
【００８６】
ポリクローナル抗体は、ウサギ、ヤギ、げっ歯類などの免疫動物の血清として得られ、さらなる処理をせずに直接使用し得る、または硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフィーなどの従来からの富化もしくは精製方法を受け得る。
【００８７】
免疫原は、完全なＢ７−ＤＣタンパク質、またはその断片もしくはその誘導体を含み得る。好ましい免疫原は、ヒトＢ７−ＤＣの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の全部または一部であって、これらの残基が、天然Ｂ７−ＤＣ上に見出される、グリコシル化などの翻訳後改変を含有するものを含む。細胞外ドメインを含む免疫原は、当技術分野で公知の多様な方法、例えば、従来の組換え法を用いたクローン化遺伝子の発現、起源細胞、多量のＢ７−ＤＣを発現する細胞集団などからの単離で生成される。
【００８８】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５〜９７頁（１９７５年））により紹介された手順、およびその改変法（上記参考文献を参照されたい）などの従来式ハイブリドーマ技術を用いて生成し得る。動物、好ましくはマウスに、上記のような免疫原を用いた免疫付与により、プライム化することによって、プライム化したその動物中に所望の抗体応答を誘発させる。プライム化を受けた動物のリンパ節、脾臓または末梢血のＢリンパ球は、一般に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの融合促進剤の存在下、骨髄腫細胞と融合される。多くのマウス骨髄腫細胞系、即ちＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−ｋ０Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４またはＨＬ１−６５３骨髄腫系（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．から入手可能）のいずれでも、このような使用に利用できる。その後のステップには、未融合の骨髄腫親細胞およびドナーリンパ球細胞が結局は死滅する一方、ハイブリドーマ細胞だけが生き残るような選択培地中での増殖が含まれる。こうしたハイブリドーマ細胞をクローニングし、増殖させ、その上清を、例えば、Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質を用いた免疫アッセイ法により、所望の特異性がある抗体の有無についてスクリーニングする。陽性クローンは、例えば限界希釈によりサブクローニングし、モノクローナル抗体を単離する。
【００８９】
こうした方法に従って生成したハイブリドーマは、当技術分野で公知の技法（全般的には、Ｆｉｎｋら、Ｐｒｏｇ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．、９巻、１２１〜３３頁（１９８４年）を参照されたい）を用いて、インビトロまたはインビボ（腹水中）で増殖させることができる。一般に、個々の細胞系は、培養で増殖させ、単一のモノクローナル抗体を高濃度に含有する培地を、デカンテーション、ろ過または遠心により採集することができる。
【００９０】
該抗体は、通常の多量体構造の代わりに、１本鎖抗体またはｓｃＦｖとして産生し得る。１本鎖抗体は、対象Ｉｇ由来の超可変領域を含み、無傷Ｉｇのサイズの一部分でありながら、その元のＩｇの抗原結合部位を再現する（Ｓｋｅｒｒａ，  Ａ．ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、１０３８〜１０４１頁；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．ら（１９８９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １７８巻、４９７〜５１５頁；Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｇ．ら、（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ、３４９巻、２９３〜２９９頁）。好ましい実施形態では、該抗体は、従来の分子生物学技法を用いて産生される。
【００９１】
Ｅ．免疫原組成物
ワクチンは、癌細胞および感染細胞を消滅させるために、強いＴ細胞応答を必要とする。本明細書に記載の改変Ｂ７−ＤＣ改変体（複数）は、ワクチンの成分として投与することにより、Ｔ細胞に共刺激性シグナルを与えることができる。本明細書に開示するワクチンには、抗原、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド源、ならびに場合によりアジュバントおよび標的指向分子が含まれる。改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド源には、任意の改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドもしくは改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質をコードする核酸、またはＢ７−ＤＣポリペプチドもしくは改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質を発現するベクターを含有する宿主細胞が挙げられる。
【００９２】
１．抗原
抗原は、ペプチド、タンパク質、多糖類、糖類、脂質、核酸またはそれらの組合せでもよい。抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、植物、原虫、真菌、組織、または癌もしくは白血病細胞などの形質転換細胞に由来することができ、細胞全体、またはその免疫原成分、例えば、細胞壁成分もしくはその分子成分でもよい。
【００９３】
適切な抗原は、当技術分野で公知であり、商業的な政府および科学機関から入手できる。一実施形態では、抗原は、不活化または弱毒化した有機体全体である。こうした有機体は、ウイルス、寄生生物および細菌などの感染性有機体の場合もある。こうした有機体はまた、腫瘍細胞の場合もある。該抗原は、腫瘍またはウイルスもしくは細菌の源に由来する、精製または部分精製ポリペプチドのこともある。該抗原は、異種発現系中でポリペプチド抗原をコードするＤＮＡの発現により、産生される組換えポリペプチドでもよい。該抗原は、抗原タンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡでもよい。該ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡなどのベクターＤＮＡの形態を取り得る。
【００９４】
抗原は、単一抗原として供与されてもよく、または組合せで供与されてもよい。抗原はまた、ポリペプチドまたは核酸の複合混合物として供与されてもよい。
【００９５】
ｉ．ウイルス抗原
ウイルス抗原は、それだけに限らないが、以下のウイルス科のいずれかからのウイルスを含む、任意のウイルスから単離することができる。即ち、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ、Ｂａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ、Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ、Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスなどのＣｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｅｌｔａｖｉｒｕｓ、Ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓ、Ｅｎａｍｏｖｉｒｕｓ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、マールブルグウイルスおよびエボラウイルス（例えば、ザイール、レストン、象牙海岸またはスーダン株））、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、１型デング熱ウイルス、２型デング熱ウイルス、３型デング熱ウイルスおよび４型デング熱ウイルス）、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（例えば、１型、３型、４型、５型および６型ヒトヘルペスウイルス、ならびにサイトメガロウイルス）、Ｈｙｐｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、Ａ型、Ｂ型およびＣ型インフルエンザウイルス）、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、麻疹、ムンプスおよびヒト呼吸器合胞体ウイルス）、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルスおよびアフトウイルス）、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ワクシニアおよび天然痘ウイルス）、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ロタウイルス）、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型およびＨＩＶ２型などのレンチウイルス）、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど）、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）、ならびにＴｏｔｉｖｉｒｉｄａｅである。適切なウイルス抗原には、デング熱プロテインＭ、デング熱プロテインＥ、デング熱Ｄ１ＮＳ１、デング熱Ｄ１ＮＳ２およびデング熱Ｄ１ＮＳ３の全部または一部も含まれる。
【００９６】
ウイルス抗原は、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、即ち１型および２型単純疱疹、肝炎ウイルス、例えばＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス、パラインフルエンザ、水疱帯状疱疹、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇｌａｖｉｒｕｓ）、エプスタイン−バー、ロタウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、馬脳炎、日本脳炎、黄熱病、リフトバレー熱、およびリンパ球性脈絡髄膜炎などの特定株に由来し得る。
【００９７】
ｉｉ．細菌抗原
細菌抗原は、それだけに限らないが、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｔｙｐｅ  Ｂ（ＨＩＢ）、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  Ａ、ＢおよびＣ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ならびにＴｒｅｐｏｎｅｍａ、ＶｉｂｒｉｏおよびＹｅｒｓｉｎｉａを含む任意の細菌に由来することができる。
【００９８】
ｉｉｉ．寄生生物抗原
寄生生物抗原は、それだけに限らないが、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓおよびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉｉ由来の抗原など、寄生生物から得ることができる。こうした抗原には、スポロゾイト周囲タンパク、スポロゾイト表面タンパク、肝臓ステージ（ｌｉｖｅｒ  ｓｔａｇｅ）抗原、頂端膜付随タンパクまたはメロゾイト表面タンパクの全部または一部などの胞子虫抗原、プラスモジウム抗原が含まれる。
【００９９】
ｉｖ．アレルゲンおよび環境抗原
該抗原は、アレルゲンまたは環境抗原、それだけに限らないが、花粉アレルゲン（木、薬草、海草および草の花粉アレルゲン）、昆虫アレルゲン（吸入物、唾液および毒液のアレルゲン）、毛およびふけの動物アレルゲン、ならびに食物アレルゲンなどの天然に存在するアレルゲンに由来する抗原などでもよい。木、草および薬草の重要な花粉アレルゲンは、即ちカバノ木（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノ木（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）およびオリーブ（Ｏｌｅａ）、シーダー（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａおよびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、プラタナス（Ｐｌａｔａｎｕｓ）を含む、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｏｌｅａｌｅｓ、Ｐｉｎａｌｅｓおよびｐｌａｔａｎａｃｅａｅの分類学の目、即ちＬｏｌｉｕｍ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｈｏｌｃｕｓ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、ＳｅｃａｌｅおよびＳｏｒｇｈｕｍ各属の草を含むＰｏａｌｅｓ目、即ちＡｍｂｒｏｓｉａ属、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ属およびＰａｒｉｅｔａｒｉａ属の薬草を含むＡｓｔｅｒａｌｅｓ目およびＵｒｔｉｃａｌｅｓ目に由来する。使用し得る他のアレルゲン抗原には、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属およびＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ属のイエダニ、貯蔵ダニ、例えばＬｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ、ＧｌｙｃｙｐｈａｇｕｓおよびＴｙｒｏｐｈａｇｕｓのアレルゲン、ゴキブリ、ミジおよびノミ、例えばＢｌａｔｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ、ＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓおよびＣｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓのアレルゲン、ネコ、イヌおよびウマなどの哺乳類、鳥類のアレルゲン、ハチ（ｂｅｅ）（Ａｐｉｄａｅ超科）、ハチ（ｗａｓｐ）（Ｖｅｓｐｉｄｅａ超科）およびアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ超科）を含む分類学のＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ目のアレルゲンなどの針刺しまたは咬み付き昆虫由来のものを含む毒液アレルゲンが含まれる。使用し得るさらに他のアレルゲン抗原には、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ属およびＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ属などの真菌の吸入アレルゲンが含まれる。
【０１００】
ｖ．腫瘍抗原
該抗原は、腫瘍抗原でもよく、それには、それだけに限らないが、α−アクチニン−４、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ−８、β−カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ−１、２および３、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、トリオースホスフェートイソメラーゼ（ｉｓｏｍｅｒａｓ）、Ｂａｇｅ−１、Ｇａｇｅ３、４、５、６、７、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ−Ｋ−ｍｅｌ、Ｌａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−Ａ１、２、３、４、６、１０、１２、Ｍａｇｅ−Ｃ２、ＮＡ−８８、ＮＹ−Ｅｓｏ−１／Ｌａｇｅ−２、ＳＰ１７、ＳＳＸ−２、およびＴＲＰ２−Ｉｎｔ２、ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５（５８）、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ（ＬＡＧＥ）、ＳＣＰ−１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、ＰＲＡＭＥ、ｐ５３、Ｈ−Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、テロメラーゼ、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトプロテイン、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３（ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ付随タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰおよびＴＰＳなどの腫瘍関連抗原または腫瘍特異抗原が含まれる。
【０１０１】
２．標的指向分子
抗原提示細胞の主要型（Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ））のうち、ＤＣは、最も効力があり、全ての抗原特異的免疫応答の開始を担っている。したがって、ＤＣを標的にすることは、抗原の送達および抗原の応答を増強する機会をもたらす。
【０１０２】
樹状細胞は、結合抗原のエンドサイトーシスを媒介できるいくつもの細胞表面受容体を発現する。全身に分布する抗原提示細胞上の取込み作用性表面分子を外因性抗原の標的とすることにより、抗原の取込みが促進され、したがって免疫付与、即ちワクチン接種における主要な律速段階が克服される。
【０１０３】
樹状細胞標的化分子には、樹状細胞の表面上に示されるエピトープを認識し、それに結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはそれらの断片が挙げられる。樹状細胞標的化分子には、樹状細胞上の細胞表面受容体に結合するリガンドも挙げられる。このような一受容体のレクチンＤＥＣ−２０５は、体液性（抗体に依拠）および細胞性（ＣＤ８  Ｔ細胞）応答の双方を２〜４桁引き上げるために、インビトロおよびマウス中で使用されてきた（Ｈａｗｉｇｅｒら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９４巻（６号）、７６９〜７９頁（２００１年）；Ｂｏｎｉｆａｚら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９６巻（１２号）、１６２７〜３８頁（２００２年）；Ｂｏｎｉｆａｚら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９９巻（６号）、８１５〜２４頁（２００４年））。これらの実験では、抗原が抗ＤＥＣ２０５重鎖に融合され、組換え抗体分子が、免疫付与に使用された。
【０１０４】
マンノース特異的レクチン（マンノース受容体）およびＩｇＧ  Ｆｃ受容体を含む、各種の他のエンドサイトーシス性受容体も、このように標的とされ、抗原提示効率を同様に増強してきた。標的にし得る他の適切な受容体には、それだけに限らないが、ＤＣ−ＳＩＧＮ、３３Ｄ１、ＳＩＧＬＥＣ−Ｈ、ＤＣＩＲ、ＣＤ１１ｃ、熱ショックタンパク受容体およびスカベンジャー受容体が挙げられる。
【０１０５】
標的にし得る他の受容体には、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）が含まれる。ＴＬＲは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識し、それに結合する。ＰＡＭＰは、樹状細胞の表面上でＴＬＲを、および内部でシグナルを標的とすることにより、ＤＣの抗原取込み、成熟化およびＴ細胞刺激能を潜在的に高める。粒子表面に結合され、または共封入されるＰＡＭＰには、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ（細菌性）、２本鎖ＲＮＡ（ウイルス性）、リポ多糖（細菌性）、ペプチドグリカン（細菌性）、リポアラビノマンニン（細菌性）、ザイモサン（酵母）、ＭＡＬＰ−２などのマイコプラズマリポタンパク質（細菌性）、フラゲリン（細菌性）、ポリ（イノシン−シチジル）酸（細菌性）、リポテイコ酸（細菌性）またはイミダゾキノリン（合成）が挙げられる。
【０１０６】
３．アジュバント
場合により、本明細書に記載のワクチンは、アジュバントを含んでもよい。アジュバントは、それだけに限らないが、以下の１種または複数でもよい。即ち、オイル乳濁液（例えば、フロイントのアジュバント）、サポニン製剤、ウィロソームおよびウイルス様粒子、細菌および微生物誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ＡＤＰリボシル化毒素および解毒誘導体、ミョウバン、ＢＣＧ、無機物含有組成物（例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などの無機塩）、生体接着剤および／または粘液性接着剤、微粒子、リポソーム、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤、ポリホスファゼン、ムラミルペプチド、イミダゾキノロン化合物、ならびに界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイル乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアンおよびジニトロフェノール）である。
【０１０７】
アジュバントには、サイトカイン、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子および腫瘍壊死因子などの免疫調節剤も含み得る。改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド以外に、Ｂ７ファミリーの他のポリペプチドを含む、他の共刺激性分子も投与し得る。このようなタンパク質性アジュバントは、全長ポリペプチドもしくはその活性断片として、またはプラスミドＤＮＡなどのＤＮＡの形態で与えてもよい。
【０１０８】
Ｆ．医薬組成物
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドおよび融合タンパク質をコードする核酸、ならびにそれを含有するベクターを含む医薬組成物が、提供される。医薬組成物は、経口、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）もしくは皮下注射）、経皮（受動的に、またはイオン導入もしくはエレクトロポレーションを用いて）、経粘膜（鼻、膣、直腸もしくは舌下）の投与経路による、または生体侵食可能な（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）インサートを用いる投与に合わせてもよく、各投与経路のための適当な剤形に処方することができる。好ましい実施形態では、該ペプチドは、特に非経口注射のために水溶液で投与される。一般に、医薬組成物は、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、融合タンパク質もしくはそれらをコードする核酸または誘導体生成物の有効量、ならびに医薬として許容可能な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、助剤および／または担体を含めて提供される。このような組成物には、様々な緩衝剤内容物（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；界面活性剤ならびに可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）などの添加物、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）および膨張性物質（例えば、ラクトース、マンニトール）；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒状調製物中、またはリポソーム中へ当該物質を導入したものが含まれる。ヒアルロン酸も使用し得る。このような組成物は、本タンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度およびインビボ消失速度に影響を及ぼし得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版（１９９０年、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．１８０４２）１４３５〜１７１２頁を参照されたい。該組成物は、液状形態に調製してもよく、または乾燥粉末形態（例えば、凍結乾燥）にしてもよい。
【０１０９】
１．経口送達
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、融合タンパク質およびそれらをコードする核酸は、経口送達用に処方することができる。経口固体剤形は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版１９９０年（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．１８０４２）の８９章に全般的に記載されている。固体剤形には、錠剤、カプセル、丸薬、トローチもしくはロゼンジ、カシェ、小丸薬、散剤または顆粒剤が含まれる。リポソームまたはプロテイノイド封入も、本組成物を処方するために使用し得る（例えば、米国特許第４９２５６７３号に報告されているプロテイノイドミクロスフェアとして）。リポソーム封入を使用してもよく、リポソームは、各種ポリマーで誘導体化し得る（例えば、米国特許第５０１３５５６号）。治療薬に対して可能な固体剤形に関する記載は、Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｋ．によりＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、Ｇ．  Ｓ．  Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｔ．  Ｒｈｏｄｅｓ編１０章、１９７９年中に示されている。一般に、製剤は、胃環境に対する保護および生物活性物質の腸内放出を可能にする、ＡＢＣ輸送体リガンド（またはその化学改変体）および不活性成分を含む。
【０１１０】
別の実施形態は、医薬として許容可能な乳濁液、溶液、懸濁液およびシロップを含め、不活性希釈剤；湿潤剤、乳化剤および懸濁剤などの助剤；ならびに甘味剤、香味剤および芳香剤を含む他の成分を含有し得る、経口投与用液体剤形を提供する。
【０１１１】
ポリペプチド拮抗剤は、その誘導体の経口送達が効果的となるように化学改変をしてもよい。一般に、想定される化学改変は、その成分分子自体への少なくとも１つの部分の結合であり、該部分は、（ａ）タンパク質分解の阻害、および（ｂ）胃または腸からの血流中への取込みを可能にする。また、その１つまたは複数の成分の総合的安定性の増加、および体内循環時間の増加も望ましい。ＰＥＧ化は、医薬用途にとって好ましい化学改変である。使用し得る他の部分には、プロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロリン、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカン（ｔｉｏｘｏｃａｎｅ）が挙げられる［例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（１９８１年）「Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ」、Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ内、Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ編（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）３６７〜３８３頁およびＮｅｗｍａｒｋら（１９８２年）Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４巻、１８５〜１８９頁を参照されたい］。
【０１１２】
経口製剤の場合、放出箇所は、胃、小腸（十二指腸、空腸（ｊｅｊｕｎｅｍ）もしくは回腸）、または大腸のこともある。当業者は、胃の中では溶解しないが、十二指腸または腸の他箇所で当該物質を放出する製剤を利用できる。好ましくは、その放出は、ペプチド（もしくは誘導体）の保護、または腸内などの胃環境を過ぎた後のペプチド（もしくは誘導体）放出のいずれかにより、胃環境の悪影響を回避することになる。
【０１１３】
十分な胃耐性を確実にするために、少なくともｐＨ５．０に対して不透過性のコーティングが必須である。腸溶コーティングとして使用される一般性のより高い不活性成分の例は、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓおよびシェラックである。これらのコーティング剤は、混合フィルムとして使用し得る。
【０１１４】
コーティング剤またはコーティング剤の混合物は、胃に対する保護を意図していない錠剤上にも使用することができる。これには、糖衣剤、または錠剤をより飲み込みやすくするコーティング剤を含むことができる。カプセルは、乾燥治療薬（即ち、粉末）の送達のためのハードシェル（ゼラチンなど）からなることができ、液剤にはソフトゼラチンシェルを使用し得る。カシェのシェル材料は、厚澱粉または他の食べられる紙でもよい。丸薬、ロゼンジ、成形錠剤または粉薬錠剤には、水分集合技法（ｍｏｉｓｔ  ｍａｓｓｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用することができる。
【０１１５】
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質、またはそれ（もしくは誘導体）をコードする核酸は、粒径約１ｍｍの顆粒またはペレット形態の微細な多粒子として、製剤中に含めることができる。当該物質のカプセル投与のための製剤は、散剤、軽度圧縮プラグ、または錠剤にさえもし得る。こうした治療薬は、圧縮成形により調製できる。
【０１１６】
着色剤および／または香味剤も、含めてもよい。例えば、ｓＨ４拮抗剤（または誘導体）は、製剤化した（リポソームまたはミクロスフェア封入などにより）後、着色剤および香味剤を含んだ清涼飲料などの食用品内にさらに含有させてもよい。
【０１１７】
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質、またはそれ（もしくは誘導体）をコードする核酸の容量を、不活性物質で希釈する、または増加させてもよい。こうした希釈剤には、炭水化物、殊にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、改変デキストランおよび澱粉が挙げられ得る。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを含む、ある種の無機塩も、充填剤として使用し得る。いくつかの市販希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ  １５００、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓおよびＡｖｉｃｅｌｌである。
【０１１８】
治療剤を固体剤形とした製剤中に、崩壊剤を含めてもよい。崩壊剤として使用される物質には、それだけに限らないが、澱粉系の市販崩壊剤Ｅｘｐｌｏｔａｂを含む澱粉が挙げられる。デンプングリコール酸ナトリウム、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナイトは、全て使用し得る。崩壊剤はまた、不溶性の陽イオン交換樹脂でもよい。粉末状ガムは、崩壊剤および結合剤として使用してもよく、それには、寒天、カラヤまたはトラガカントなどの粉末状ガムを含むことができる。アルギン酸およびそのナトリウム塩も、崩壊剤として有用である。
【０１１９】
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質、またはそれ（もしくは誘導体）をコードする核酸を一緒にして、硬い錠剤を形成するために、結合剤を使用してもよく、それには、アカシア、トラガカント、澱粉およびゼラチンなどの天然物由来物質が挙げられる。他の結合剤には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は共に、アルコール性の溶液中で使用して、該ペプチド（または誘導体）を顆粒化することができる。
【０１２０】
製剤化工程中の粘着を防止するために、ｓＨ４拮抗剤（または誘導体）の製剤中に、減摩剤を含めてもよい。滑剤は、該ペプチド（または誘導体）と金型壁との間の層として使用してもよく、こうした滑剤には、それだけに限らないが、マグネシウム塩およびカルシウム塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、液状パラフィン、植物油およびワックスを挙げることができる。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、各種分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ４０００および６０００などの可溶性滑剤も、使用し得る。
【０１２１】
製剤化中に薬物の流動性を改善して、圧縮成形中の再配列を補助し得る流動促進剤を、添加してもよい。流動促進剤には、澱粉、タルク、焼成シリカおよびシリコアルミン酸塩水和物を含み得る。
【０１２２】
該ペプチド（または誘導体）の水性環境中への溶解を補助するために、界面活性剤を湿潤剤として添加してもよい。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびジオクチルスルホン酸ナトリウムなどの陰イオン界面活性剤を含み得る。陽イオン界面活性剤を使用してもよく、それには、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトミウム（ｂｅｎｚｅｔｈｏｍｉｕｍ）を含めることができる。界面活性剤として製剤中に含め得る、潜在的な非イオン界面活性剤のリストは、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン水素化ひまし油１０，５０および６０、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート２０，４０，６０，６５および８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、該タンパク質または誘導体の製剤中に、単独または様々な比率の混合物として存在することができる。
【０１２３】
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質、またはそれ（もしくは誘導体）をコードする核酸の取込みを潜在的に増強する添加剤は、例えば、脂肪酸のオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸である。
【０１２４】
制御放出経口製剤が望ましい場合もある。改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質、またはそれ（もしくは誘導体）をコードする核酸は、拡散、浸出いずれかの機構で放出を可能にする不活性マトリックス、例えばガムの中に導入することができる。徐々に変質するマトリックスも、製剤中に導入し得る。いくつかの腸溶性コーティングも遅延放出効果を有する。別形態の制御放出は、Ｏｒｏｓ治療システム（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）に基づく方法による。即ち、水が、浸入して、浸透圧作用により単一の小開口部から薬物を押し出すことを可能にする、半透膜中に薬物を内包させる。
【０１２５】
他のコーティング剤も製剤中に使用し得る。こうしたものには、コーティングパン中で施し得る多様な糖類が含まれる。改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質、またはそれ（もしくは誘導体）をコードする核酸は、フィルムコート錠中にも供与でき、この場合に使用される物質は、２群に分けられる。第１群は、非腸溶性物質であり、これには、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロビドンおよびポリエチレングリコールが挙げられる。第２群は、通常フタル酸のエステルである腸溶性物質からなる。
【０１２６】
最適なフィルムコートを供与するために、物質の混合物を使用し得る。フイルムコーティングは、パンコーターもしくは流動床中で、または圧縮コーティングにより実施し得る。
【０１２７】
２．非経口送達
本発明による非経口製剤には、滅菌した水性または非水性の溶液、懸濁液または乳濁液が含まれる。非水性の溶媒または媒体の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびコーンオイルなどの植物油、ゼラチン、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。このような剤形は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの助剤も含有し得る。該剤形は、例えば、細菌保持フィルターを通すろ過、その組成物中への殺菌剤の導入、その組成物の照射、またはその組成物の加熱によって、滅菌し得る。該剤形は、使用直前に、滅菌水または他の滅菌注射可能な媒体を用いても、製造することができる。
【０１２８】
３．粘膜送達
直腸または膣投与用組成物は、好ましくは、活性物質以外に、ココアバターまたは坐薬用ワックスなどの賦形剤を含有し得る坐薬である。鼻または舌下投与用組成物も、当技術分野で周知の標準的賦形剤を用いて調製される（以下参照）。
【０１２９】
４．肺送達
ｓＨ４拮抗剤（またはその誘導体）の肺送達も、本発明において想定されている。改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質、またはそれ（もしくは誘導体）をコードする核酸は、吸入しながら哺乳動物の肺に送達され、肺上皮層を通過して血流へ入る（例えば、Ａｄｊｅｉら（１９９０年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７巻、５６５〜５６９頁；Ａｄｊｅｉら（１９９０年）Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ６３巻、１３５〜１４４頁（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔら（１９８９年）Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １３巻（補遺５）、１４３〜１４６頁（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄら（１９８９年）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第３巻、２０６〜２１２頁（α１−抗トリプシン）；Ｓｍｉｔｈら（１９８９年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８４巻、１１４５〜１１４６頁（α１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎら（１９９０年）「Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ  Ｋｅｙｓｔｏｎｅ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓら（１９８８年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４０巻、３４８２〜３４８８頁（インターフェロンγおよび腫瘍壊死因子α）ならびにＰｌａｔｚらの米国特許第５２８４６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）を参照されたい）。全身作用薬を肺送達する方法および組成物は、Ｗｏｎｇらの米国特許第５４５１５６９号に記載されている。
【０１３０】
治療薬製品の肺送達用に設計された広範囲の機械的装置が、それだけに限らないが、ネブライザー、定量吸入器および粉末吸入器を含めて使用できるが、それらは全て当業者が熟知しているものである。本発明の実施に適切な市販装置のいくつかの具体例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）、Ａｃｏｒｎ  ＩＩネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．）、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器（Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、Ｎ．Ｃ．）およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）である。
【０１３１】
このような装置は全て、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質、またはそれ（もしくは誘導体）をコードする核酸の投薬に適した製剤の使用を必要とする。通常は、各製剤は、使用する装置の種類に特有であり、治療に有用な普通の希釈剤、助剤および／または担体の他に、適当な噴射剤物質の使用を含み得る。リポソーム、マイクロカプセルもしくはミクロスフェア、包接錯体、または他種類の担体の使用も、想定されている。化学改変ペプチドも、化学改変のタイプまたは使用する装置の種類に応じて異なる製剤に調製し得る。
【０１３２】
ジェット式、超音波式いずれかのネブライザーとの使用に適した製剤は、通常、溶液１ｍＬ当たり生物活性タンパク質約０．１〜２５ｍｇの濃度で、水に溶解したペプチド（または誘導体）を含む。製剤は、緩衝剤および単純糖（例えば、目的はタンパク質の安定化および浸透圧の調節）も含み得る。ネブライザー製剤は、エアロゾル形成時の溶液の霧化で起こるペプチド（または誘導体）の表面誘発凝集を減少させるまたは防止するために、界面活性剤も含み得る。
【０１３３】
定量吸入装置との使用に適した製剤には、一般に、界面活性剤の補助で噴射剤中に懸濁したペプチド（または誘導体）を含有する微細粉末が含まれる。噴射剤は、この目的に使用される従来の任意の物質でもよく、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンまたはそれらの組合せを含む、クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボンまたは炭化水素などである。適切な界面活性剤には、ソルビタントリオレエートおよび大豆レシチンが含まれる。オレイン酸も、界面活性剤として有用になり得る。
【０１３４】
粉末吸入装置から投薬するための製剤は、ペプチド（または誘導体）を含有する微細乾燥粉末を含み、ラクトース、ソルビトール、スクロースまたはマンニトールなどの増量剤も、装置からの粉末の散布を促進する量で、例えば製剤重量の５０〜９０％で含んでもよい。改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質、またはそれ（もしくは誘導体）をコードする核酸は、遠位肺へ最も有効に送達するために、最も有利には、平均粒径が１０ｍｍ未満（またはミクロン）、最も好ましくは０．５〜５ｍｍの粒子形態で調製すべきである。
【０１３５】
５．ポリマーマトリックス
非生分解性、生分解性双方のマトリックスは、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質、またはそれらをコードする核酸の送達のために使用できるが、生分解性マトリックスが好ましい。こうしたものは、天然または合成のポリマーでもよいが、合成ポリマーは、分解および放出プロファイルの特性決定がより良好なために好ましい。該ポリマーは、放出が望ましい期間に基づいて選択される。いくつかの場合には、線形放出が最も有用になり得るが、他の場合には、パルス放出または「バルク放出」の方が有効な結果をもたらし得る。該ポリマーは、ヒドロゲルの形態を取ってもよく（通常、最大約９０重量％の水を吸収したとき）、場合により多価のイオンまたはポリマーで架橋することができる。
【０１３６】
送達のために使用できる代表的な合成ポリマーには、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキサイド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリルエステルおよびメタクリルエステルのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシエチルセルロース、セルローストリアセテート、硫酸セルロースナトリウム塩、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（アクリル酸オクタデシル）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキサイド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレンおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。
【０１３７】
非生分解性ポリマーの例には、エチレンビニルアセテート、ポリ（メス）アクリル酸、ポリアミド、それらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。生分解性ポリマーの例には、合成ポリマーとして、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（ブチックアシッド（ｂｕｔｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）などと、天然ポリマーとして、アルギネートならびにデキストランおよびセルロースを含む他の多糖類、コラーゲン、それらの化学的誘導体（化学基、例えばアルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者が常套的に行う他の改変）、アルブミンおよび他の親水性タンパク質、ゼインおよび他のプロラミンならびに疎水性タンパク質、それらのコポリマーおよび混合物とが挙げられる。一般に、こうした物質は、インビボで酵素的加水分解または水への曝露のいずれかにより、表面またはバルク侵食によって分解する。
【０１３８】
特に興味ある生体接着性ポリマーには、Ｈ．  Ｓ．  Ｓａｗｈｎｅｙ，  Ｃ．  Ｐ．  Ｐａｔｈａｋ  ａｎｄ  Ｊ．  Ａ．  Ｈｕｂｅｌｌ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９３年、２６巻、５８１〜５８７頁に記載されている生体侵食可能なヒドロゲル、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ酸無水物、ポリアクリル酸、アルギネート、キトサン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）およびポリ（アクリル酸オクタデシル）が挙げられる。
【０１３９】
そのマトリックスは、ミクロスフェアなどの微粒子の形態を取ることができ、ペプチドは、固体ポリマーマトリックスまたはマイクロカプセル内に分散し、コアは、ポリマーシェルとは異なる物質からなり、ペプチドは、性質が液体または固体でもよいコア中に分散または懸濁している。本明細書で特に明記しない限り、微粒子、ミクロスフェアおよびマイクロカプセルは、互換的に使用される。あるいは、ポリマーは、ナノメーターから４センチメーターの範囲にある薄板もしくは薄膜、粉砕もしくは他の標準技法で生成する粉末、またはヒドロゲルなどのゲルとしてさえも成形し得る。
【０１４０】
該マトリックスは、溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出、および当業者に公知の他の方法によって形成することができる。
【０１４１】
生体侵食可能なミクロスフェアは、薬物送達用のミクロスフェアを作製するために開発された方法のいずれを用いても調製できるが、そのような方法は、例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｒ，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５巻、１３〜２２頁（１９８７年）；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６巻、２７５〜２８３頁（１９８７年）およびＭａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．  ３５巻、７５５〜７７４頁（１９８８年）に記載されている。その方法の選定は、ポリマーの選定、サイズ、外形および所望の結晶化度に依存するが、それに関しては、例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ４巻、３２９〜３４頁（１９９０年）；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．  ４５巻、１２５〜１３４頁（１９９２年）およびＢｅｎｉｔａら、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ７３巻、１７２１〜１７２４頁（１９８４年）に記載されている。例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら（１９９０年）、ＢｅｎｉｔａおよびＪａｆｆｅの米国特許第４２７２３９８号に記載の溶媒蒸発では、ポリマーを揮発性有機溶媒中に溶解する。可溶形態をした、または微粒として分散したアナゴニスト（ａｎａｇｏｎｉｓｔ）は、ポリマー溶液に添加し、その混合物を、ポリ（ビニルアルコール）などの界面活性剤を含有する水性相中に懸濁させる。生成した乳濁液を、有機溶媒の大部分が蒸発するまで攪拌すると、固体ミクロスフェアが後に残る。一般に、ポリマーは塩化メチレンに溶解することができる。サイズ（１〜１０００ミクロン）および形態が異なるミクロスフェアは、ポリエステルおよびポリスチレンなどの比較的安定なポリマーに有用であるこの方法により、得ることができる。しかし、ポリ酸無水物などの不安定ポリマーは、水に曝されるために分解する場合がある。このようなポリマーの場合、ホットメルトカプセル充填および溶媒除去が好ましいこともある。
【０１４２】
ホットメルトカプセル充填では、まずポリマーを溶融した後、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質、またはそれらをコードする核酸の固体粒子と混合する。混合物を、シリコン油などの非混和性溶媒中に懸濁し、攪拌を継続しながら、ポリマーの融点より５℃まで高く加熱する。乳濁液が安定化した後、ポリマー粒子が固化するまで冷却する。生成したミクロスフェアを、石油エーテルを用いたデカンテーションで洗浄することにより、自由流動性の粉末が得られる。１〜１０００ミクロンの間の直径を有するミクロスフェアをこの方法で得ることができる。この技法で調製したスフェアの外表面は、普通、平滑で緻密である。この手順は、水に不安定なポリマーに有用であるが、分子量が１０００〜５００００の間のポリマーに使用が限られる。溶媒除去は、主としてポリ酸無水物との使用に設計されたものである。この方法では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質、またはそれらをコードする核酸を、塩化メチレンなどの揮発性有機溶媒における選定ポリマーの溶液中に分散または溶解する。次いで、混合物をシリコン油などの油中に懸濁し攪拌することにより、乳濁液が形成される。２４時間以内に、溶媒が油相中に拡散し、乳濁液滴が、固体のポリマーミクロスフェアに硬化する。溶媒蒸発と異なり、この方法は、融点が高く、分子量範囲が広いポリマーからミクロスフェアを作製するために、使用することができる。１〜３００ミクロンの間の直径を有するミクロスフェアをこの手順で得ることができる。スフェアの外部形態は、使用するポリマーの種類に強く依存する。噴霧乾燥では、ポリマーを塩化メチレンに溶解する（０．０４ｇ／ｍｌ）。このポリマー溶液中に、既知量の活性薬物を懸濁（不溶であれば）または共溶解（可溶であれば）する。次いで、溶液または分散液を噴霧乾燥する。Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚの米国特許第４８６１６２７号によれば、二重壁ミクロスフェアを調製することができる。
【０１４３】
アルギネートもしくはポリホスファジンまたは他のジカルボン酸ポリマーなどのゲル型ポリマーで作製するヒドロゲルミクロスフェアは、ポリマーを水溶液中に溶解し、当該物質を懸濁して混合液中に導入し、窒素ガスジェットを備えた微小滴形成装置からポリマー混合液を押し出すことにより、調製することができる。生成したミクロスフェアは、例えば、Ｓａｌｉｂら、Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ  ４０巻１１Ａ号、１２３０頁（１９７８年）に記載のように、ゆっくりと攪拌している硬化用イオンバス中に落とす。キトサンミクロスフェアは、酸性溶液中にポリマーを溶解し、トリポリホスフェートで架橋することにより、調製することができる。例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のミクロスフェアは、酸溶液中にポリマーを溶解し、鉛イオンでミクロスフェアを沈殿させることにより、調製される。アルギネート／ポリエチレンイミド（ＰＥＩ）は、アルギネートマイクロカプセル上のカルボキシル基の量を減少させて調製することができる。
【０１４４】
フィルム、コーティング、ペレット、スラブおよび装置を含めた他の送達系は、標準的な複合物作製法だけでなく、溶媒または溶融キャスト法および押出し法を用いても、作製することができる。そのポリマーは、Ｓａｗｈｎｅｙらが記載するようにまずモノマーおよびペプチドを混合し、モノマーをＵＶ光で重合することにより、生成することができる。重合は、インビトロならびにインビボで実施することができる。
【０１４５】
ＩＩ．製造法
Ａ．改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドを生成する方法
単離した改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、例えば、化学合成または宿主細胞内での組換え産生により、得ることができる。共刺激性ポリペプチドを組換え産生するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有した核酸を使用して、細菌性または真核性宿主細胞（例えば、昆虫、酵母または哺乳動物の細胞）を形質転換、形質導入またはトランスフェクトすることができる。一般に、核酸構築体は、共刺激性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、作動可能に連結した調節配列を含む。調節配列（本明細書では、発現制御配列とも呼称される）は、通常、遺伝子産物をコードせず、代わりに、それらが作動可能に連結されている核酸配列の発現に影響を及ぼす。
【０１４６】
ポリペプチドを発現し、産生する有用な原核系および真核系は、当技術分野で周知であり、例えば、ＢＬ−２１などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株およびＣＨＯ細胞などの培養哺乳動物細胞を包含する。
【０１４７】
真核性宿主細胞では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドを発現させるために、多くのウイルスベースの発現系を利用することができる。ウイルスベースの発現系は、当技術分野で周知であり、それだけに限らないが、バキュロウイルス、ＳＶ４０、レトロウイルスまたはワクシニアに基づくウイルスベクターを包含する。
【０１４８】
共刺激性改変体ポリペプチドを安定に発現する哺乳動物細胞系は、適当な制御要素および選択可能なマーカーを有する発現ベクターを用いて作製することができる。例えば、真核性発現ベクターのｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびｐ９１０２３（Ｂ）（Ｗｏｎｇら、（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８巻、８１０〜８１５頁を参照されたい）は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−１細胞、ヒト胚性腎２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＭＤＣＫ細胞およびヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）中に、共刺激性改変体ポリペプチドを発現するために適切である。エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム、または塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストランもしくは適切な他のトランスフェション法の後、安定な細胞系を選択することができる（例えば、Ｇ４１８、カナマイシンまたはハイグロマイシンに対する抗生物質耐性により）。トランスフェクト細胞は、対象ポリペプチドを発現するように培養でき、そのポリペプチドを、例えば細胞培養上清または溶解細胞から回収することができる。あるいは、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、（ａ）増幅した配列をｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの哺乳動物発現ベクター中に連結し、（ｂ）小麦胚抽出物またはウサギ網状赤血球溶解物を用いて、インビトロで転写し、翻訳することにより、産生することができる。
【０１４９】
共刺激性改変体ポリペプチドは、例えば、ＤＥＡＥイオン交換、ゲルろ過およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を用いて、単離することができる。例えば、細胞培養上清または細胞質抽出物中の共刺激性ポリペプチドは、プロテインＧカラムを用いて単離することができる。いくつかの実施形態では、共刺激性改変体ポリペプチドは、親和性マトリックス上にそのポリペプチドを捕捉することを可能にする、アミノ酸配列を含有するように「操作」することができる。例えば、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、ポリヒスチジンまたはＦｌａｇ（商標）（Ｋｏｄａｋ）などのタグを使用して、ポリペプチドの精製を補助することができる。このようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかの位置を含め、ポリペプチド内の任意の箇所に挿入することができる。有用になり得る他の融合体には、アルカリホスファターゼなどのポリペプチドの検出を補助する酵素が含まれる。免疫アフィニティクロマトグラフィーも、共刺激性ポリペプチドの精製に使用することができる。
【０１５０】
Ｂ．単離核酸分子を生成する方法
単離核酸分子は、限定することなく、通常の分子クローニング法および核酸化学合成法を含む標準法を含む標準的技法によって、生成することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、共刺激性改変体ポリペプチドをコードする単離核酸を得ることができる。ＰＣＲは、標的核酸を酵素的に増幅する技法である。通常、対象領域の複数の末端またはさらに遠方の配列情報を用いて、増幅しようとする鋳型の反対鎖と配列が同じオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。ＰＣＲは、ＤＮＡならびにＲＮＡの特異的配列を、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡの配列を含めて増幅するために、使用することができる。プライマーは、通常、長さが１４〜４０ヌクレオチドであるが、長さが１０ヌクレオチドから数百ヌクレオチドに及ぶことができる。全般的なＰＣＲ技法は、例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５年に記載されている。鋳型源としてＲＮＡを使用する場合、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成するために、逆転写酵素を使用することができる。リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自立配列複製または核酸配列ベース増幅も、単離核酸を得るために使用することができる。例えば、Ｌｅｗｉｓ（１９９２年）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  １２巻、１頁；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７巻、１８７４〜１８７８頁およびＷｅｉｓｓ（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４巻、１２９２〜１２９３頁を参照されたい。
【０１５１】
単離核酸は、単一核酸分子として、または一連のオリゴヌクレオチド（即ち、３’から５’方向への自動化ＤＮＡ合成のためのホスホラミダイト技術を用いて）としてのいずれかで、化学的に合成することができる。例えば、所望の配列を含有しており、各対が、そのオリゴヌクレオチド対をアニールした際に二重鎖が形成されるように、相補性の短鎖セグメント（例えば、約１５ヌクレオチド）を含有した、１対または複数対の長鎖オリゴヌクレオチド（例えば、＞１００ヌクレオチド）を合成することができる。ＤＮＡポリメラーゼを使用して、そのオリゴヌクレオチドを伸長させ、オリゴヌクレオチド１対当たり単一の２本鎖核酸分子を生成することができ、次いでそれをベクター中に連結することができる。単離核酸は、変異誘発によっても得ることができる。Ｂ７−ＤＣコード核酸は、ＰＣＲを介したオリゴヌクレオチド指定変異誘発および／または部位指定変異誘発を含む標準的技法を用いて、変異させることができる。Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．８章、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９２年を参照されたい。改変できるアミノ酸位置の例には、本明細書に記載の位置が含まれる。
【０１５２】
ＩＩＩ．使用法
Ａ．Ｔ細胞の共刺激
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドもしくはＢ７−ＤＣ融合タンパク質をコードする核酸、または改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドを発現する細胞は、Ｔ細胞を共刺激する（即ち、Ｔ細胞の抗原特異的増殖を高める、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を増強する、Ｔ細胞の分化およびエフェクター機能を刺激する、ならびに／あるいはＴ細胞の生存を促進する）ために使用することができる。
【０１５３】
Ｂ７−ＤＣは、免疫受容抑制性チロシンモチフィニツ（ｍｏｔｉｆｉｎｉｔｓ）細胞質ドメインを有するＣＤ２８相同体である、ＰＤ−１（プログラム細胞死１）に結合することができる（Ｉｓｈｉｄａら（１９９２年）ＥＭＢＯ  Ｊ．１１巻、３８８７〜３８９５頁）。ＰＤ−１は、胸腺細胞のサブセット上に発現し、活性化後のＴ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞上で上方調節される（Ａｇａｔａら（１９９６年）Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８巻、７６５〜７７２頁）。ＰＤ−１は、インビボにおける免疫応答の負の調節因子として現れる。例えば、Ｃ５７ＢＬ／６バックグランドのＰＤ−１−／−マウスは、狼瘡様の糸球体腎炎および進行性関節炎を徐々に発現した（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９９９年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１巻、１４１〜１５１頁）。それに加え、ＢＡＬＢ／ｃバックグランドのＰＤ−１−／−マウスは、致命的な自己免疫性拡張型心筋症を急速に発現した（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（２００１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１巻、３１９〜３２２頁）。しかし、証拠から、Ｂ７−ＤＣは、Ｔ細胞応答を共刺激するように機能できることも示されている。最適以下のＴＣＲシグナルの存在下、Ｂ７−ＤＣは、インビトロにおいて増加した増殖およびサイトカイン産生を刺激することができる。したがって、Ｂ７−ＤＣは、ＰＤ−１以外のＴ細胞受容体にも結合するように現れる。下記の実施例に記載した実験では、Ｂ７−ＤＣおよび本明細書に記載のＢ７−ＤＣの改変体の共刺激活性は、ＰＤ−１受容体によって媒介されないことが示されている。
【０１５４】
本明細書に記載のＢ７−ＤＣ改変体は、野生型Ｂ７−ＤＣと比較して、ＰＤ−１に対する低下した結合性を示すが、Ｔ細胞を共刺激する能力を保持している。したがって、本明細書に記載のＢ７−ＤＣ改変体は、Ｔ細胞を共刺激する能力を保持し、ＰＤ−１との結合によりＴ細胞活性化を抑制する能力が低下している。そのため、こうしたＢ７−ＤＣ改変体は、Ｔ細胞の共刺激にとって野生型Ｂ７−ＤＣより有利である。ＰＤ−１に対する親和性が低下した改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドおよび改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質を用いて、Ｔ細胞応答を刺激する方法が、本明細書に開示されている。該方法は、単離された改変体共刺激性ポリペプチドをＴ細胞と接触させることを含み得る。この接触は、インビトロ、エクスビボまたはインビボ（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒト以外の霊長類、またはヒト）でもよい。
【０１５５】
接触は、Ｔ細胞の活性化の前、間または後で行うことができる。通常、改変体共刺激性ポリペプチドとＴ細胞の接触は、活性化と実質的に同時にすることができる。活性化は、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と結合する抗体、またはＴＣＲと物理的に会合するＣＤ３複合体のポリペプチドの１つに、Ｔ細胞を曝すことによりなし得る。あるいは、Ｔ細胞は、例えばＡＰＣ［例えば、嵌合樹状細胞（本明細書では樹状細胞と呼称する）、マクロファージ、単球もしくはＢ細胞］上のアロ抗原（例えば、ＭＨＣアロ抗原）、または上記ＡＰＣのいずれかによるタンパク抗原のプロセシングで産生され、ＡＰＣ表面上のＭＨＣ分子によりＴ細胞へ提示される抗原性ペプチドのいずれかに曝すことができる。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞でもよい。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、単離された改変体共刺激性ポリペプチドは、Ｔ細胞に直接投与することができる。あるいは、マクロファージ、単球、嵌合樹状細胞（本明細書では樹状細胞と呼称する）またはＢ細胞などのＡＰＣを、改変体共刺激性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する核酸で形質転換、形質導入またはトランスフェクトすることができ、Ｔ細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクトしたそのＡＰＣに接触させることができる。形質転換、形質導入またはトランスフェクトしたその細胞は、形質転換、形質導入またはトランスフェクトする前に、投与する対象または別の対象（例えば、同種の別の対象）から取得した細胞または細胞の子孫でもよい。
【０１５７】
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、開示したアミノ酸変化体、ポリペプチド断片、融合タンパク質およびそれらの組合せのいずれをも含め、本明細書に記載するそうしたいずれでもよい。
【０１５８】
活性化がインビトロであれば、改変体Ｂ７−ＤＣ分子を、適当な培養器の床、例えばプラスチック製マイクロタイタープレートのウェルに結合することができる。
【０１５９】
単離された改変体共刺激性ポリペプチドのインビトロ適用は、例えば、免疫機構の科学的基礎研究において、またはＴ細胞機能もしくは例えば受動免疫治療の研究に使用する活性化Ｔ細胞の産生のために、有用となり得る。さらに、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、Ｔ細胞を取得した対象における興味ある抗原に対する免疫性を試験するように設計した、インビトロアッセイ（例えば、Ｔ細胞増殖アッセイ）に添加することもできる。このようなアッセイに改変体共刺激性ポリペプチドを添加すれば、より強力で、したがってより検出しやすいインビトロ応答が得られると予想される。その上、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードする核酸で形質転換、トランスフェクトまたは形質導入したＡＰＣは、（ａ）他分子の共刺激活性を試験するアッセイにおける陽性対照として、または（ｂ）Ｔ共刺激の阻害に有用な化合物（例えば、自己免疫疾患もしくは臓器移植片拒絶の治療に潜在的に有用な化合物）を求めるスクリーニングアッセイにおいて、使用することもできる。
【０１６０】
Ｂ．Ｂ７−ＤＣ改変体の治療的使用
１．治療すべき病態
本明細書に示す改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドは、免疫応答刺激性治療薬としてインビボおよびエクスビボで一般に有用である。一般に、本明細書に記載の組成物は、対象の免疫系が免疫応答を高める任意の疾患もしくは障害を有する、またはその素因を有する対象の治療に有用である。改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドのＴ細胞共刺激能のために、開示する組成物は、Ｔ細胞が関わる免疫応答の刺激または増強に有用となる。したがって、好ましい実施形態では、治療または予防すべき疾患の種類は、悪性腫瘍、または細胞内に侵入し、即ち細胞傷害性Ｔリンパ球の攻撃を受ける細菌、ウイルス、原虫、蠕虫もしくは他の微生物病原体が起こす慢性感染性疾患である。本明細書に記載の改変体Ｂ７−ＤＣ組成物を用いるＴ細胞の共刺激は、免疫抑制を特徴とする病態の治療または予防にも有利である。
【０１６１】
ｉ．ウイルス感染症
ウイルス感染症は、主にＴ細胞によって一掃されるので、Ｔ細胞活性の増加は、感染性ウイルス病原体のより迅速または徹底的な一掃が、動物またはヒト対象にとって有益である状況では、治療的に有用となる。したがって、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドおよび改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質は、それだけに限らないが、免疫不全症（例えば、ＨＩＶ）、パピローマ（例えば、ＨＰＶ）、ヘルペス（例えば、ＨＳＶ）、脳炎、インフルエンザ（例えば、ヒトＡ型インフルエンザウイルス）および感冒（例えば、ヒトライノウイルス）のウイルス感染症を含む、局所的または全身的ウイルス感染症の治療のために投与することができる。例えば、Ｂ７−ＤＣ組成物要素の医薬製剤は、疱疹病変もしくは帯状疱疹などのウイルス性皮膚病、または陰部疣贅を治療するために、局所的に投与することができる。改変体Ｂ７−ＤＣ組成物の医薬製剤は、それだけに限らないが、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、感冒または脳炎を含む全身性ウイルス疾患を治療するためにも、投与することができる。
【０１６２】
ｉｉ．癌
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質およびそれらをコードする核酸は、腫瘍免疫の誘発に有用となり得る。例えば、それだけに限らないが、肉腫、メラノーマ、リンパ腫、白血病、神経芽細胞腫を含む腫瘍細胞、または癌腫細胞は、本明細書に記載の改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドまたは改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質をコードする核酸を保持するように、操作することができ、次いで対象における腫瘍特異的寛容を妨害するために、対象へ投与することができる。顕著なことには、Ｂ７陰性マウス腫瘍細胞におけるＢ７−１の異所性発現は、マウスにおける腫瘍拒絶および腫瘍の侵害に対する長期防御を伴うＴ細胞媒介特異免疫を誘発することが示された（Ｌ．  Ｃｈｅｎら、上記；Ｓ．  Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、上記；Ｓ．  Ｂａｓｋａｒら、上記）。Ｂ７関連因子を利用した腫瘍または癌細胞の遺伝子治療処置は、動物実験（Ｋ．  Ｄｕｎｕｓｓｉ−Ｊｏａｎｎｏｐｏｕｌｏｓら（１９９７年）Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．  １９巻、３５６〜３４０頁；Ｋ．  Ｈｉｒｏｉｓｈｉら（１９９９年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ６巻、１９８８〜１９９４頁；Ｂ．  Ｋ．  Ｍａｒｔｉｎら（１９９９年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６２巻、６６６３〜６６７０頁；Ｍ．  Ｋｕｉｐｅｒら（２０００年）Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ４６５巻、３８１〜３９０頁を参照）、またはヒトの第１相臨床実験（Ｈ．  Ｌ．  Ｋａｕｆｍａｎら（２０００年）Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １１巻、１０６５〜１０８２頁）においてモデル化し得るが、そこでは遺伝子移入治療にＢ７−１またはＢ７−２を使用している。このような方法は、各種の腫瘍または癌細胞を扱う使用に適合し得ることは理解される。それに加え、腫瘍免疫は、免疫細胞を直接刺激する改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドおよび改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質の投与によっても、実現し得る。
【０１６３】
治療し得る悪性腫瘍は、本明細書では、腫瘍が由来する組織の胚性起源に従って分類される。癌腫は、皮膚、または内臓および腺の上皮層などの内胚葉性または外胚葉性組織から生じる腫瘍である。発現頻度がより少ない肉腫は、骨、脂肪および軟骨などの中胚葉性結合組織に由来する。白血病およびリンパ腫は、骨髄の造血細胞の悪性腫瘍である。白血病が単一細胞として増殖するのに対し、リンパ腫は腫瘍塊として増殖する傾向がある。悪性腫瘍は、身体の多数の器官または組織に出現し得、癌を定着させる。
【０１６４】
提供される組成物および方法で治療できる癌の種類には、それだけに限らないが、以下のもの、即ち、膀胱、脳、乳房、子宮頚部、結腸直腸、食道、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、すい臓、前立腺、皮膚、胃、子宮などが挙げられる。投与は、存在する腫瘍または感染症の治療に限らず、個体におけるそのような疾患を発現する危険性の防止または低下、即ち予防的使用のために、使用することもできる。予防的ワクチン接種の潜在的候補者には、癌発症の危険性が高い、即ちある種の癌に関する個人的または家系的病歴のある個人が挙げられる。
【０１６５】
ｉｉｉ．免疫抑制病態
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドおよび改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質は、それだけに限らないが、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連複合体、他のウイルスまたは環境誘発病態、およびある種の先天性免疫不全症を含む、免疫抑制を特徴とする病状の治療に使用することができる。改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドおよび改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質は、免疫抑制薬（例えば、ある種の化学療法剤）の放射線療法の使用で傷害を受けた免疫機能を高めるためにも、用いることができ、したがってこのような薬物または放射線療法と共に投与すると、特に有用となり得る。
【０１６６】
２．ワクチンにおけるＢ７−ＤＣ改変体の使用
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質および／またはそれらをコードする核酸は、単独または他の任意の適切な治療との組合せで投与し得る。一実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質および／またはそれらをコードする核酸は、ワクチン組成物と共に、またはその成分として投与し得る。ワクチン組成物の適切な成分は、上記したとおりである。本明細書に記載の改変体Ｂ７−ＤＣ組成物は、ワクチン投与の前、それと同時、またはその後に投与することができる。一実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣ組成物は、ワクチン投与と同時に投与される。
【０１６７】
本明細書に記載の改変体Ｂ７−ＤＣ組成物は、感染性病原体へのその後の曝露に対して対象に抵抗性を付与する予防的ワクチンと共に、または、癌を有する対象における腫瘍抗原としてもしくはウイルス感染している対象におけるウイルス抗原としてなどの既存抗原に対し、対象の免疫応答を開始もしくは増強するために使用できる治療的ワクチンと共に、投与してもよい。
【０１６８】
予防的、治療的または脱感作免疫応答の望ましい結果は、疾患に従って、当技術分野で周知の原理に従って変化し得る。例えば、感染性病原体に対する免疫応答は、感染性病原体のコロニー形成および複製を完全に防止し、「無菌免疫」および任意の疾患症状の欠如に影響し得る。しかし、感染性病原体に対するワクチンは、症状の数、重度もしくは期間を低減させた場合、症状のある集団における個体数を減少させた場合、または感染性病原体の伝染を減少させた場合に有効と見なし得る。同様に、癌、アレルゲンまたは感染性病原体に対する免疫応答は、疾患を完全に治療することもあり、症状を緩和することもあり、または疾患に対する総合的治療介入の一側面となることもある。例えば、癌に対する免疫応答の刺激は、外科的、化学療法的、放射線医学的、ホルモン的および他の免疫的な手法と組み合わせることにより、治療に影響し得る。
【０１６９】
Ｃ．改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドの投与法
いくつかのインビボ手法では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドまたは改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質自体が、治療有効量で対象に投与される。通常、該ポリペプチドは、医薬として許容可能な担体中に懸濁することができる。医薬として許容可能な担体は、ヒトへの投与に適切な、生体適合性の媒体（例えば、生理食塩水）である。治療有効量とは、治療される動物に医学的に望ましい結果（例えば、Ｔ細胞応答の増強）を生むことができる、改変体共刺激性ポリペプチドの量である。改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドおよびＢ７−ＤＣ融合タンパク質は、経口もしくは静脈内注入により投与し、または皮下、筋肉内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内もしくは肺内に注射することができる。改変体共刺激性ポリペプチドは、適当なリンパ系組織（例えば、脾臓、リンパ節または粘膜関連リンパ系組織）に直接、送達させることができる。
【０１７０】
Ｄ．核酸および細胞の投与法
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸は、それを必要とする対象に投与することができる。核酸の送達には、「外来」核酸の細胞内導入、および最終的には生存動物中への導入を含む。遺伝子治療に対するいくつかの一般戦略が、研究され、広範に総説されてきた（Ｙａｎｇ，  Ｎ−Ｓ、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２巻、３３５〜３５６頁（１９９２年）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｗ．  Ｆ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６巻、８０８〜８１３頁（１９９２年）；Ｍｉｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｓ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３５７巻、４５５〜４６０頁（１９９２年）；Ｃｒｙｓｔａｌ，  Ｒ．  Ｇ．、Ａｍｅｒ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ９２巻（補遺６Ａ）、４４Ｓ〜５２Ｓ頁（１９９２年）；Ｚｗｉｅｂｅｌ，  Ｊ．  Ａ．ら、Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ６１８巻、３９４〜４０４頁（１９９１年）；ＭｃＬａｃｈｌｉｎ，  Ｊ．  Ｒ．ら、Ｐｒｏｇ．  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ３８巻、９１〜１３５頁（１９９０年）；Ｋｏｈｎ，  Ｄ．  Ｂ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ７巻、１７９〜１９２頁（１９８９年））。
【０１７１】
一手法には、培養時の一次細胞に核酸を移入した後、エクスビボで形質転換したその細胞の宿主への全身または特定の器官もしくは組織中への自家移植が含まれる。一実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドをコードする核酸を含有するベクターが、それを必要とする対象に投与される細胞中にトランスフェクトされる。好ましい実施形態では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドをコードする核酸を含有するベクターを含んだ細胞は、抗原提示細胞である。
【０１７２】
エクスビボ法は、例えば、対象から細胞を採集するステップ、細胞を培養するステップ、細胞に発現ベクターを形質導入するステップ、および本明細書に示す改変体共刺激性ポリペプチドの発現に適切な条件下で細胞を維持するステップを含むことができる。こうした方法は、分子生物学の技術分野で公知である。形質導入ステップは、例えば、リン酸カルシウム、リポフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス感染およびバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）遺伝子移入を含む、エクスビボ遺伝子治療に使用される任意の標準手段によって実現することができる。あるいは、リポソームまたはポリマー微粒子を使用することができる。首尾よく形質導入された細胞は、次いで、例えば、コード配列または薬物耐性遺伝子の発現について選択することができる。次いで、その細胞を致死的に照射し（望ましい場合）、対象中へ注射または移植することができる。
【０１７３】
いくつかのエクスビボ法では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を患者または適切なドナーから抜き取り、活性化刺激剤（上記を参照）および改変体共刺激性ポリペプチド（可溶型か、固体（ｓｏｌｄ）支持体に結合しているかを問わず、標準的手順によって）にエクスビボで曝すことができる。次いで、高度に活性化したＴ細胞を含有するＰＢＭＣを、同じまたは異なる患者に導入することができる。
【０１７４】
代替的なエクスビボ戦略では、改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドをコードする核酸で、対象から得た細胞をトランスフェクトまたは形質導入することを含むことができる。次いで、トランスフェクトまたは形質導入済み細胞を対象に戻すことができる。このような細胞は、通常、造血性細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞またはＢ細胞）であるが、２０それらはまた、対象中で生存している限り改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド源として作用する、繊維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、角質細胞または筋細胞を限定なしに含む、広範囲の種類のいずれでもよい。上記ＡＰＣを含む造血性細胞の使用は、そうした細胞が、通常、とりわけリンパ系組織（例えば、リンパ節または脾臓）にホーミングすると予想されるので、特に有用になることができ、こうして改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドを、その効果（即ち、免疫応答の増強）を発揮する部位で高濃度に産生することができる。それに加え、ＡＰＣを使用する場合、外因性の改変体共刺激性分子を発現するＡＰＣが、関与Ｔ細胞へアロ抗原または抗原ペプチドを提示する同一のＡＰＣとなり得る。改変体Ｂ７−ＤＣは、ＡＰＣにより分泌され、またはその表面上に発現することができる。
【０１７５】
核酸治療は、哺乳動物の体細胞性組織または器官内にインビボで機能活性なＤＮＡを直接移入することにより、実現することができる。例えば、Ｂ７−ＤＣ変異体ポリペプチドをコードする核酸は、リンパ系組織へ直接、投与することができる。あるいは、リンパ系組織特異的ターゲティングを、Ｂ細胞、Ｔ細胞、または樹状細胞特異的なＴＲＥなどのリンパ系組織特異的な転写調節エレメント（ＴＲＥ）を用いて、実現することができる。リンパ系組織特異的ＴＲＥには、例えば、当技術分野で公知のものが含まれる［例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９２年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２巻、１０４３〜１０５３頁；Ｔｏｄｄら（１９９３年）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７７巻、１６６３〜１６７４頁およびＰｅｎｉｘら（１９９３年）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７８巻、１４８３〜１４９６頁を参照されたい］。
【０１７６】
ＤＮＡ移入は、下記の多くの手法を用いて実現することができる。こうした系は、ＤＮＡを発現するトランスフェクト済みクローンを選択するための選択マーカー（例えばＧ４１８抵抗性）の使用により、続いて、適当な免疫アッセイにおける当該産物に対する抗体を用いた、Ｂ７−Ｈ４発現産物の存在の検出（誘導系の場合は誘導因子で処理した後）により、インビトロでの首尾よい発現について試験することができる。ＤＮＡの取込み、プラスミドへの組込みおよび組込み済みプラスミドの安定性を含む、この手順の効率は、既知の方法を用いたプラスミドＤＮＡの線状化、および高分子量哺乳類ＤＮＡを「担体」として用いた共トランスフェクションにより、改善することができる。
【０１７７】
当技術分野で報告されている首尾よい「遺伝移入」の例には、（ａ）プラスミドＤＮＡのマウス筋肉組織中への直接注射による、マーカー遺伝子を無期限発現に導く（Ｗｏｌｆｆ，  Ｊ．  Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７巻、１４６５頁（１９９０年）；Ａｃｓａｄｉ，  Ｇ．ら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ３巻、７１頁（１９９１年））、（ｂ）レトロウイルスベクターは、血管組織のインビボおよびインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）感染に有効であること、（ｃ）レトロウイルス調製物の肝臓内への門脈注射および直接注射は、遺伝子移入およびインビボ発現を起こしたこと（Ｈｏｒｚａｇｌｏｕ，  Ｍ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５巻、１７２８５頁（１９９０年）；Ｋｏｌｅｋｏ，  Ｍ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２巻、２７頁（１９９１年）；Ｆｅｒｒｙ，  Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８巻、８３８７頁（１９９１年））、（ｄ）組換えアデノウイルスの肺組織内への気管内注入は、肺呼吸上皮における外来遺伝子のインビボ遺伝子移入および長期発現に有効であったこと（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，  Ｍ．  Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２巻、４３１頁（１９９１年））、（ｅ）単純疱疹ウイルスベクターは、脳組織中へのインビボ移入を実現したこと（Ａｈｍａｄ，  Ｆ．ら編、Ｍｉａｍｉ  Ｓｈｏｒｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ−Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ、１巻、Ｂｏｅｒｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｅｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＵＳＡ、１９９１年）が含まれる。
【０１７８】
レトロウイルス媒介ヒト治療は、アンホトロフィックな（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ）複製欠損レトロウイルス系を利用する（Ｔｅｍｉｎ，  Ｈ．  Ｍ．、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １巻、１１１頁（１９９０年）；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４９８０２８９号；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４６５０７６４号；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第５１２４２６３号；Ｗｉｌｌｓ，  Ｊ．  Ｗ．  米国特許第５１７５０９９号；Ｍｉｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｄ．、米国特許第４８６１７１９号）。このようなベクターを使用して、機能的ＤＮＡをヒトの細胞または組織内に、例えば、アデノシンデアミナーゼ遺伝子をリンパ球内に、ＮＰＴ−ＩＩ遺伝子および腫瘍壊死因子に関する遺伝子を腫瘍浸潤リンパ球内に導入してきた。レトロウイルス媒介遺伝子送達には、一般に、遺伝子移入のために標的細胞の増殖が必要である（Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｄ．  Ｇ．ら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０巻、４２３９頁（１９９０年）。この条件は、本ＤＮＡ分子を導入しようとする好ましい標的細胞のうちの特定のもの、即ち、増殖活発な腫瘍細胞によって満たされる。多くの方法のいずれかを用いたプラスミドによる、およびレトロウイルスベクターによるトランスフェクションを使用した嚢胞性線維症の遺伝子治療は、Ｃｏｌｌｉｎｓらの米国特許第５２４０８４６号により記載されている。
【０１７９】
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸分子は、当技術分野で周知のように、複製欠損レトロウイルスを生成するパッケージング細胞系を用いて、レトロウイルスベクター中にパッケージングし得る（例えば、Ｃｏｎｅ，  Ｒ．  Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１巻、６３４９〜６３５３頁（１９８４年）；Ｍａｎｎ，  Ｒ．  Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ  ３３巻、１５３〜１５９頁（１９８３年）；Ｍｉｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５巻、４３１〜４３７頁（１９８５年）；Ｓｏｒｇｅ，  Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４巻、１７３０〜１７３７頁（１９８４年）；Ｈｏｃｋ，  Ｒ．  Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２０巻、２５７頁（１９８６年）；Ｍｉｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ６巻、２８９５〜２９０２頁（１９８６年）を参照されたい）。遺伝子移入に効率的で安全な、より新しいパッケージング細胞系も、記載されている（Ｂａｎｋら、米国特許第５２７８０５６号）。
【０１８０】
この手法は、選定した組織または器官にレトロウイルスベクターを送達するために、部位特異的様式で利用することができる。したがって、例えばカテーテル送達システムを使用することができる（Ｎａｂｅｌ，  Ｅ  Ｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４巻、１３４２頁（１９８９年））。レトロウイルスベクターまたはリポソームベクターのいずれかを用いるこのような方法は、発現させようとする核酸を、血管壁に、または腫瘍の血流中に送達するのに特に有用である。
【０１８１】
他のウイルスベクターも、組換えアデノウイルス（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，  Ｍ．  Ｓ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ内、Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｂ  Ｎら編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９０年、１６７９頁；Ｂｅｒｋｎｅｒ，  Ｋ．  Ｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６巻、６１６  ９１９１９８８）、Ｓｔｒａｕｓｓ，  Ｓ．  Ｅ．、Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，  Ｈ  Ｓ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８４年、１１章内）、神経細胞特異的な送達および持続のための単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）を含めて使用し得る。ヒト遺伝子治療にとってのアデノウイルスの利点には、組換えが稀であり、このようなウイルスに関係するヒトの悪性疾患は知られておらず、アデノウイルスゲノムは、サイズが７．５ｋｂまでの外来遺伝子を受け容れるように操作できる２本鎖ＤＮＡであり、さらに生のアデノウイルスは安全なヒトワクチン有機体であるという事実が含まれる。アデノ随伴ウイルスも、ヒトの治療にとって有用である（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，  Ｒ．  Ｊ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０巻、３９４１頁（１９９１年）。
【０１８２】
開示するＤＮＡ分子を発現でき、本治療状況、特にヒトに有用な別のベクターは、ワクシニアウイルスであり、これは非複製的にすることができる（米国特許第５２２５３３６号、第５２０４２４３号、第５１５５０２０号、第４７６９３３０号、Ｓｕｔｔｅｒ，  Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９９２年）８９巻、１０８４７〜１０８５１頁；Ｆｕｅｒｓｔ，  Ｔ．  Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９８９年）８６巻、２５４９〜２５５３頁；Ｆａｌｋｎｅｒ，  Ｆ．  Ｇ．ら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８７年）１５巻、７１９２頁；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，  Ｓら、Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．（１９８５年）５巻、３４０３〜３４０９頁）。組換えワクシニアウイルスおよび異種ＤＮＡを含有する他のウイルス、ならびに免疫およびＤＮＡ治療におけるそれらの使用に関する説明は、Ｍｏｓｓ，  Ｂ．、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．  （１９９３年）３巻、８６〜９０頁；Ｍｏｓｓ，  Ｂ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｙ（１９９２年）２０巻、３４５〜３６２頁；Ｍｏｓｓ，  Ｂ．、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２年）１５８巻、２５〜３８頁；Ｍｏｓｓ，  Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１年）２５２巻、１６６２〜１６６７頁；Ｐｉｃｃｉｎｉ，  Ａら、Ａｄｖ．  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．（１９８８年）３４巻、４３〜６４頁；Ｍｏｓｓ，  Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆ  Ａｎａｌ（１９８３年）３巻、２０１〜２１３頁に総説されている。
【０１８３】
裸のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはウイルスベクター以外に、操作された細菌もベクターとして使用し得る。サルモネラ、ＢＣＧおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＬＭ）を含む多くの細菌株（Ｈｏｉｓｅｔｈ  ＆  Ｓｔｏｃｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ２９１巻、２３８〜２３９頁（１９８１年）；Ｐｏｉｒｉｅｒ，  Ｔ  Ｐら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６８巻、２５〜３２頁（１９８８年）；（Ｓａｄｏｆｆ，  Ｊ．  Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０巻、３３６〜３３８頁（１９８８年）；Ｓｔｏｖｅｒ，  Ｃ．  Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１巻、４５６〜４６０頁（１９９１年）；Ａｌｄｏｖｉｎｉ，  Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１巻、４７９〜４８２頁（１９９１年）；Ｓｃｈａｆｅｒ，  Ｒ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４９巻、５３〜５９頁（１９９２年）；Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ，  Ｇ．ら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８０巻、２２０９〜２２１８頁（１９９４年））。こうした有機体は、ワクチンベクターとして使用するための２つの有望な特性：（１）経口ワクチン送達の可能性を示す腸感染経路、および（２）単球／マクロファージに感染することによる、専門的ＡＰＣにとっての抗原の標的化を示す。
【０１８４】
インビボでのウイルス媒介遺伝子移入の他に、当技術分野で周知の物理的手段も、ＤＮＡの直接移入のために使用できるが、それには、プラスミドＤＮＡの投与（Ｗｏｌｆｆら、１９９０年、上記）、および粒子衝突（ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）媒介遺伝子移入（Ｙａｎｇ，  Ｎ．  −Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７巻、９５６８頁（１９９０年）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｒ．  Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８巻、２７２６頁（１９９１年）；Ｚｅｌｅｎｉｎ，  Ａ．  Ｖ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２８０巻、９４頁（１９９１年）；Ｚｅｌｅｎｉｎ，  Ａ．  Ｖ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２４４巻、６５頁（１９８９年）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，  Ｓ．  Ａ．ら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ２７巻、１１頁（１９９１年））が含まれる。さらに、インビトロで細胞中に遺伝子を移入する周知の手段であるエレクトロポレーションを用いて、ＤＮＡ分子をインビボで組織に移入することができる（Ｔｉｔｏｍｉｒｏｖ，  Ａ．  Ｖ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １０８８巻、１３１頁（１９９１年））。
【０１８５】
「担体媒介遺伝子移入」も、記載されている（Ｗｕ，  Ｃ．  Ｈ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４巻、１６９８５頁（１９８９年）；Ｗｕ，  Ｇ．  Ｙ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３巻、１４６２１頁（１９８８年）；Ｓｏｒｉａｎｏ，  Ｐ．ら、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０巻、７１２８頁（１９８３年）；Ｗａｎｇ，  Ｃ−Ｙ．ら、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４巻、７８５１頁（１９８２年）；Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｊ．  Ｍ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７巻、９６３頁（１９９２年））。好ましい担体は、標的指向リポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ，  Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０巻、１０６８頁（１９８３年）；Ｓｏｒｉａｎｏら、上記）であり、脂質二重層中にアシル化ｍＡｂを組み入れることができる免疫リポソームなどがある（Ｗａｎｇら、上記）。アシアログリコプロテイン／ポリリシン（Ｗｕら、１９８９年  上記）などのポリカチオンを使用してもよく、そのコンジュゲートは、標的組織を認識する分子（例えば、肝臓に対するアシアロオロソムコイド）およびトランスフェクトしようとするＤＮＡに結合するためのＤＮＡ結合性化合物を含む。ポリリシンは、損傷を与えずにＤＮＡに結合するＤＮＡ結合性分子の例である。次いで、このコンジュゲートをプラスミドＤＮＡと複合する。
【０１８６】
トランスフェクションまたはマイクロインジェクションに使用されるプラスミドＤＮＡは、当技術分野で周知の方法、例えば、Ｑｕｉａｇｅｎ手順（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いた後、本明細書に例示した方法などの既知の方法を用いたＤＮＡ精製を使用して、調製し得る。
【０１８７】
Ｅ．投与量
改変体Ｂ７−ＤＣポリペプチド、改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質、Ｂ７−ＤＣポリペプチドおよび改変体Ｂ７−ＤＣ融合タンパク質をコードする核酸については、さらなる研究が行われるにつれて、多様な患者の多様な病態を治療するための適当な投与量レベルに関して、情報が明らかとなり、また、当業者であれば、受容者の治療状況、年齢および健康状態を考慮して、適切な投薬を確かめることができる。選択される投与量は、所望の治療効果、投与経路、および所望の治療期間に依存する。一般に、１日当たり０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルが、哺乳動物に投与される。一般に、静脈内注射または注入の場合、投与量がより少なくなり得る。
【実施例】
【０１８８】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによって、さらに理解を深め得る。
【０１８９】
（実施例１）
Ｂ７−ＤＣの分子モデリングおよび三次元での配列分析
材料および方法：
ヒトＢ７−Ｈ１（ｈＢ７−Ｈ１）、マウスＢ７−Ｈ１（ｍＢ７−Ｈ１）、ヒトＢ７−ＤＣ（ｈＢ７−ＤＣ）およびマウスＢ７−ＤＣ（ｍＢ７−ＤＣ）のＩｇ  Ｖ型ドメインの分子モデルを、ＣＤ８０／ＣＴＬＡ−４およびＣＤ８６／ＣＴＬＡ−４複合体の構造に見られるようなヒトＣＤ８０およびＣＤ８６のＸ線座標に基づいて、ホモロジー（または比較）モデリングにより生成した。まず、ＣＤ８０およびＣＤ８６のＶドメインを最適に重ね合わせ、Ｂ７ファミリーメンバーの配列をこの重ね合せに基づいて整列させた。重ね合せおよび初期整列は、ＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）の配列−構造整列機能を用いて実施した。次いで、整列を、Ｉｇコンセンサス位置を合わせ、標的配列中の他の保存された疎水性残基をＸ線構造のコア位置に位置付けるように、手操作で調整した。したがって、整列配列中の対応残基は、大まかに等価な空間位置を占めていると予測された。この種の構造情報を考慮することは、この事例のように同一性が低い場合、配列同一性だけより、信頼性のより高い整列規準である。整列領域では、２種の構造鋳型ＣＤ８０およびＣＤ８６に対して比較されたＢ７配列の平均同一性は、わずかに約１６％であった。モデル構築の基礎となる、構造指向的配列整列の最終版は、図５に示されている。整列に続いて、４種のモデルのコア領域は、構造鋳型からＭＯＥで自動的に組み立てられ、ループ領域の挿入および欠失は、セグメント合致手順を適用してモデル化した（Ｌｅｖｉｔｔ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２６巻、５０７〜５３３頁（１９９２年）およびＦｅｃｈｔｅｌｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２５３巻、１１４〜１３１頁（１９９５年））。側鎖の置換は、高分解能タンパク質データバンク構造に見られる、好ましい回転異性体のコンホメーションを用いて実施した（Ｐｏｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９３巻、７７５〜７９１頁（１９８７年）およびＢｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２８巻、２３５〜２４２頁（２０００年））。各事例において、１２種の中間モデルを生成し、平均座標を計算し、さらに得られた構造に対して、各モデルの分子内接触および立体化学が妥当になるまで、タンパク質力場を用いてエネルギー最小化を行った（Ｅｎｇｈ  ａｎｄ  Ｈｕｂｅｒ、Ａｄａ  Ｃｒｙｓｔ．、Ａ４７巻、３９２〜４００頁（１９９１年））。溶媒接近可能表面の計算（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｃｒｙｓｔ．、１６巻、５４８〜５５８頁（１９８３年））を含むモデルのグラフ分析および残基マッピング研究は、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて実施した。
【０１９０】
結果：
ＣＤ８０およびＣＤ８６のＶ領域は、限られた配列同一性しか共有しない（約２０％）が、それらの三次元構造は、個々の結晶学的解析研究で明らかなように非常に類似している。ＣＤ８０／ＣＤ８６に見られるコアまたはＩｇスーパーファミリーコンセンサス残基の多くの位置も、Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣを含む他のＢ７ファミリーメンバーにおいて、保存されており、または保存的に置換されている（図５）。
【０１９１】
マウスおよびヒトのＢ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣ分子の分子モデルが、構築された。これらのモデルから、Ｖ領域では、Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣは、Ｂ７ファミリー全体の平均値より高い配列同一性、即ち約３４％を共有することが判明した。Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣは共にＰＤ−１に結合するので、残基保存は、その受容体結合構造の形成にとって重要となり得る。したがって、こうしたモデルを用いて、タンパク質表面上に露出している保存残基の推定分布を比較した。これらの分子モデルの並列比較によって、Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣのＢＥＤ面上では表面残基の相当な保存が明らかとなり、マウスタンパク質よりヒトタンパク質で顕著であった。対照的に、反対のＡ’ＧＦＣＣ’Ｃ”面は、さほど残基保存を示さなかった。この結果は、ＣＤ８０、ＣＤ８６双方の対応するＡ’ＧＦＣＣ’Ｃ”面がＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合部位を含有するので、やや意外であった。
【０１９２】
（実施例２）
受容体結合部位の変異誘発分析
材料および方法：
マウスおよび細胞系：
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）雌性マウスを国立癌研究所（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から購入した。ＰＤ−１欠損（ＰＤ−１−／−）マウスを以前に記載されたように生成した（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０巻、１５６３〜１５７２頁（１９９８年））。融合タンパク質を分泌する、安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞クローンを、１％の透析したウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を補給したＣＨＯ−ＳＦＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持した。リンパ球およびＣＯＳ細胞を、１０％ＦＢＳ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを補給した、ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖させた。
【０１９３】
部位指定変異誘発：
Ｂ７−ＤＣＩｇの全ての改変体は、鋳型としてＢ７−ＤＣＩｇ  ｃＤＮＡを用いた２段階ＰＣＲ法を用いて構築した。所望の変異をコードするために、重複オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、２つの５’および３’隣接プライマーを、各々ＥｃｏＲ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩ制限酵素部位を含有するように設計した。ｃＤＮＡの適当な領域は、対応する重複および隣接プライマーを用いて増幅した。５’および３’隣接プライマーを用いて、重複配列を有する断片を一緒に融合し、増幅した。ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩで消化し、ＥｃｏＲ  Ｉ／Ｂｇｌ  ＩＩで消化したｐＨＩｇベクター中に連結した。所望の変異が導入されたことを確認するために、各改変体は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて配列決定した。プラスミドをＣＯＳ細胞中にトランスフェクトし、無血清上清を採集し、インビトロ結合アッセイのために使用し、またはＢＩＡｃｏｒｅ分析および機能分析のためにプロテインＧカラム上で単離した。
【０１９４】
Ｉｇ融合タンパク質：
マウスＩｇＧ２ａのＦｃ部分に連結したマウスＰＤ−１の細胞外ドメインを含有する融合タンパク質（ＰＤ−１  Ｉｇ）を、安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞中で産生し、既述したように（Ｗａｎｄら、上記）プロテインＧアフィニティカラムにより単離した。全ＲＮＡをマウス脾臓細胞から単離し、Ｂ７−ＤＣ  ｃＤＮＡを逆転写ＰＣＲにより取得した。マウスＢ７−ＤＣＩｇを、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３部分とフレーム内で連結したマウスＢ７−ＤＣの細胞外ドメインを含む、キメラｃＤＮＡを含有するプラスミドでＣＯＳ細胞を一時的にトランスフェクトすることにより、調製した。ヒトＢ７−ＤＣＩｇを、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３部分とフレーム内で連結したヒトＢ７−ＤＣの細胞外ドメインを含む、キメラｃＤＮＡを含有するプラスミドでＣＯＳ細胞を一時的にトランスフェクトすることにより、調製した。トランスフェクトしたＣＯＳ細胞は、無血清ＤＭＥＭ中で培養し、濃縮上清を、初期結合アッセイ用のＩｇ融合タンパク質源として使用した。Ｉｇタンパク質を、既述したように（Ｗａｎｄら、上記）、ＢＩＡｃｏｒｅ分析および機能分析のためにプロテインＧカラム上でさらに単離した。
【０１９５】
ＥＬＩＳＡ：
Ｂ７−ＤＣＩｇに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡを確立した。マイクロタイタープレートを２ｆｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で終夜４℃で被覆した。ウェルをブロッキングバッファー（ＰＢＳ中１０％ＦＢＳ）で１時間ブロックし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄した。ＣＯＳ細胞培養上清を添加し、室温で２時間インキュベートした。標準曲線を作成するために、既知濃度の単離Ｂ７−ＤＣＩｇも、各プレート上の個々のウェルに添加した。徹底的な洗浄後、１：２０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＴＡＧＯ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｇａｍｅ、ＣＡ）を添加し、その後ＴＭＢ基質で発現した後、０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加で反応を停止させた。吸光度をマイクロタイタープレートリーダー上で４０５ｎｍで測定した。改変体融合タンパク質の濃度は、Ｂ７−ＤＣＩｇの標準曲線の直線範囲と比較することにより、決定した。三つ組のウェルのテータを収集し、平均値からの標準偏差は＜１０％であった。実験は、少なくとも３回繰り返した。
【０１９６】
変異体および野生型のＢ７−ＤＣＩｇ融合ポリペプチドがＰＤ−１と結合する能力は、捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。組換えＰＤ−１Ｉｇ融合タンパク質を、マイクロタイタープレート上に５μｇ／ｍｌで終夜４℃で被覆した。プレートをブロックし、洗浄し、ＣＯＳ細胞培地を添加し、室温で２時間インキュベートした。徹底的な洗浄後、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧを添加した後、ＴＭＢ基質を添加し、吸光度を４０５ｎｍで測定した。
【０１９７】
フローサイトメトリー：
ヒト胚性腎２９３細胞を、全長マウスＰＤ−１  ｃＤＮＡのＣ末端とフレーム内でＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質ｃＤＮＡ）を融合することにより構築した、ＰＤ−１  ＧＦＰベクターでトランスフェクトした。その細胞をトランスフェションから２４時間後に採集し、４５分間氷上のＣＯＳ細胞培地中で、野生型Ｂ７−ＤＣＩｇを用いて力価を予め決定した等量の融合タンパク質と共に、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取）バッファー（ＰＢＳ、３％ＦＢＳ、０．０２％ＮａＮ３）中でインキュベートした。ヒトＩｇを含有する無関係な融合タンパク質を、陰性対照として使用した。細胞を洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート（ＰＥ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）と共にさらにインキュベートし、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いたＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）上で分析した。ＧＦＰ陽性細胞は、ＦＬ１でゲート（ｇａｔｅ）した。
【０１９８】
表面プラズモン共鳴分析：
野生型および改変体の単離Ｂ７−ＤＣポリペプチドの親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）３０００計器（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上で分析した。融合タンパク質以外の全ての試薬を購入し、予備ろ過し、ＢＩＡｃｏｒｅから脱気した。全ての実験は、操作バッファーとして０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を用いて２５℃で行った。手短に言えば、ＰＤ−１Ｉｇを、ＢＩＡｃｏｒｅ手順に従ったアミンカップリングによって、ＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ）上にまず固定化した。ＣＭ５チップのフローセルは、１：１ＥＤＣ：ＮＨＳ［Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド］混合物を７分間注入後、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中で希釈したＰＤ−１Ｉｇの２０μｇ／ｍｌを１０μｌ／分で注入することにより、誘導体化した。ＰＤ−１Ｉｇは、２０００ＲＵで固定化した。この後、残存する活性化カルボキシル基を１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）でブロックした。対照フローセルは、ＰＤ−１Ｉｇの代わりに操作バッファーだけを代用して上記と同様に調製した。融合タンパク質は、３．７５、７．５、１５、３０および６０μｇ／ｍｌの濃度系列に操作バッファー中で希釈した。該タンパク質は、２０μｌ／分の流速で３分間注入し、解離データのために、バッファーを表面上に５分間流した。フローセルは、１０ｍＭ  ＮａＯＨの３０秒パルス１回で再生した。データ解析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアパッケージ３．１（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて行った。
【０１９９】
結果：
分子モデルを補助にして、Ｂ７−ＤＣのＶドメインを重要な残基について走査した。ＢＥＤおよびＡ’ＧＦＣＣ’Ｃ”の両面上にある保存残基および非保存残基を、部位特異的変異誘発のために選定した。マウス分子中の残基を、選定した変異タンパク質の機能研究が後で可能になるように、変異させた。得られた改変体ポリペプチドの結合特性は、特異的なＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析により、ＰＤ−１との結合性について評価した。ｍＢ７−ＤＣを改変体合計１７種調製し、試験した。その結果は表１にまとめてある。ｍＢ７−ＤＣ内の特定残基は、変異によって、ＦＡＣＳによる結合減少が少なくとも５０％、またはＥＬＩＳＡによって減少が少なくとも１桁起こった場合にのみ、リガンド−受容体相互作用にとって重要であると見なした。
【０２００】
これらの残基の約半数の変異は、ｍＰＤ−１に対する結合性を有意に失った。特に、ｍＢ７−ＤＣ残基のＥ７１、Ｉ１０５、Ｄ１１１およびＫ１１３は、ｍＰＤ１に対する結合性にとって重要であると確認された。ｍＢ７−ＤＣ中の残基Ｓ５８の変異は、ＥＬＩＳＡで決定した場合、ｍＰＤ−１に対する結合性を増加させた。したがって、この残基は、必ず受容体−リガンド界面に近接しており、置換に対するある程度の寛容を有するだけでなく、結合相互作用の潜在的な最適化も有している。
【０２０１】
ヒトＢ７−ＤＣの改変体も、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析を用いてＰＤ−１に対する結合性について試験した。ｈＢ７−ＤＣ残基のＫ１１３およびＤ１１１の変異は、ＰＤ１に対する結合性にとって重要であると確認された。ＦＡＣＳ分析の結果は、図７に示してある。
【０２０２】
【表１】
2010533649.tif 000003
反対のＡ’ＧＦＣＣ’Ｃ”面上の等価領域に位置付けられたＰＤ−１結合部位。結合部位領域の位置付けから、変異がＰＤ−１結合性に負（または正）に影響する残基は、両リガンドにおいて干渉性表面を形成できることが明らかになった。結合にとって重要な残基と重要でない一部の残基との近接性からも、観察された効果が、特異的であって、全体的構造変化の結果ではないことが示唆された。重要な残基位置の比較によって、ｍＢ７−ＤＣにおける推定結合部位の位置は、ＣＤ８６およびＣＤ８０におけるＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４結合部位に密接に対応することが確認された。
【０２０３】
野生型および変異体タンパク質のＰＤ−１との結合に関する表面プラズモン共鳴分析は、ＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡ分析の結果と大体一致していた。野生型Ｂ７−ＤＣタンパク質は、２２７ＲＵのＲｍａｘを有しており、Ｂ７−ＤＣ改変体Ｋ１１３は、ＰＤ−１に全く結合しなかった（図６）。こうしたデータは、野生型Ｂ７−ＤＣが、変異体Ｋ１１３より大きな、ＰＤ−１に対する定常状態親和性を有することを実証した。Ｂ７−ＤＣ  Ｋ１１３改変体は、野生型Ｂ７−ＤＣと比較して遅いオンおよびオフ速度を示し、またはそのような速度を全く示さなかった。
【０２０４】
（実施例３）
Ｂ７−ＤＣ改変体の共刺激性機能
材料および方法：
Ｔ細胞の増殖およびサイトカインアッセイ：
野生型Ｂ６マウスまたはＰＤ−１−／−マウスのＴ細胞を、既述したように（Ｗａｎｇら、上記）、ナイロンウールカラム（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて単離した。富化Ｔ細胞を、融合または対照ポリペプチド５μｇ／ｍｌの存在下、抗ＣＤ３  ｍＡｂ（クローン１４５−２Ｃ１１、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で予備被覆した平底９６ウェルマイクロプレート中で、３×１０５細胞／ウェルで培養した。Ｔ細胞の増殖は、３日培養の最後の１２時間中における１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−ＴｄＲを取り込むことによって、決定した。３Ｈ−ＴｄＲの取込みは、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  Ｔｒｉｌｕｘ液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて計数した。サイトカインを検出するために、培養上清を様々な時点で収集し、ＩＦＮ−γの濃度を、製造業者の教示（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に従ったサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
【０２０５】
結果：
選定した改変体の共刺激能も試験した。Ｂ７−ＤＣ改変体のＫ１１３およびＤ１１１が、分析用に選択された。Ｋ１１３およびＤ１１１は共に、ＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡの両アッセイにおいてＰＤ−１に対する最小限の結合性を示した（表１）。図８Ａおよび８Ｂに示すように、これらの改変体は、野生型Ｂ７−ＤＣと比較して、Ｔ細胞の増殖およびＩＦＮ−ｙの産生を依然として共刺激することができた。
【０２０６】
Ｂ７−ＤＣは、未知の受容体を介してＴ細胞の増殖を共刺激し得るが、以上の知見は、未確認の共刺激性受容体（複数可）およびＰＤ−１の統合的刺激効果と解釈することができる。したがって、Ｂ７−ＤＣ改変体の共刺激効果をＰＤ−１欠損Ｔ細胞において試験した。野生型および改変体のＢ７−ＤＣポリペプチドは、ＰＤ−１＋／＋細胞と同様に、またはそれより良好にＰＤ−１−／−Ｔ細胞の増殖を共刺激した（図８Ａと比較した図９）。したがって、以上の観察は、Ｂ７−ＤＣが、非ＰＤ−１受容体を介してＴ細胞の増殖を共刺激することを強く示唆している。
【０２０７】
（実施例４）
免疫適格および免疫不全の同系マウスにおける腫瘍細胞の増殖に対する野生型および改変体Ｂ７−ＤＣの効果
上記の実施例は、抑制的受容体のプログラム死−１（ＰＤ−１）に対する結合性を失ったＢ７−ＤＣ変異体が、Ｔ細胞に対する共刺激機能を保持していることを示す。これらの結果は、Ｂ７−ＤＣ変異体が、抗腫瘍免疫応答の増強に適用し得ることを示している。したがって、Ｂ７−ＤＣおよびＢ７−ＤＣ改変体が、まるごとの動物において抗腫瘍免疫を刺激する能力を調べた。点変異をコードするｃＤＮＡを含有したプラスミドＫ１１３Ｓ  Ｂ７−ＤＣを、エレクトロポレーションによってマウス腫瘍系ＥＧ７中にトランスフェクトした。Ｋ１１３Ｓ  Ｂ７−ＤＣを安定に発現するＥＧ７細胞系を樹立した。ＥＧ７トランスフェクタントの亜系ＥＧ７／Ｋ１１３Ｓの細胞表面におけるＢ７−ＤＣの発現は、Ｂ７−ＤＣに特異的なモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリー分析で示された。ＥＧ７細胞を、陰性対照としての親プラスミド（偽物）または追加対照としての野生型Ｂ７−ＤＣを含有するプラスミド（ＥＧ７／Ｗｔ  Ｂ７−ＤＣ）のいずれかでトランスフェクトした。偽物トランスフェクトＥＧ７細胞（ｍｏｃｋ  ＥＧ７  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ）は、検出可能なＢ７−ＤＣを発現しないが、ｗｔ  Ｂ７−ＤＣ安定トランスフェクタントは、Ｋ１１３Ｓ  Ｂ７−ＤＣで安定にトランスフェクトされた細胞と同等量のＢ７−ＤＣを発現する。
【０２０８】
免疫適格な同系のＣ５７ＢＬ／６マウス１０匹にＥＧ７／Ｋ１１３Ｓ細胞を皮下接種すると、結節としての腫瘍の一時的増殖が誘発された。しかし、これらの腫瘍は急速に消失した。２０日目に、全ての腫瘍が完全に消失した。対照的に、偽物ＥＧ７系の接種は、次第に増殖する腫瘍を誘発し、最終的に３０〜４０日でマウスが死んだ。Ｗｔ  Ｂ７−ＤＣ系の細胞によるマウスの接種も、次第に増殖する腫瘍を誘発した。しかし、その増殖は、偽物ＥＧ７系より遥かに遅かった（図１０）。
【０２０９】
以上の結果は、腫瘍細胞上のＫ１１３Ｓ  Ｂ７−ＤＣの発現が、免疫適格マウスにおいて腫瘍の消失を誘発することを示唆するが、この効果が免疫系に媒介されているか否かは不明である。これを確認するために、Ｋ１１３Ｓ  Ｂ７−ＤＣ細胞を免疫欠損ヌードマウスの皮下に導入した。その結果は、ＥＧ７／Ｋ１１３Ｓ細胞が、偽物系およびＷｔ  Ｂ７−ＤＣ系の細胞と類似の増殖速度を有しており、腫瘍は消失しなかった（図１１）。したがって、以上の結果は、腫瘍消失が免疫系に媒介され、Ｋ１１３Ｓ  Ｂ７−ＤＣの発現が、強い免疫応答を刺激することを実証している。
【０２１０】
Ｋ１１３Ｓ  Ｂ７−ＤＣによる抗腫瘍免疫の刺激が、ＥＧ７腫瘍細胞に限らないことを実証するために、安定にトランスフェクトされたマウスＰ８１５肥満細胞腫細胞を用いて同様な実験を行った。対照細胞系を樹立するために、Ｋ１１３Ｓ  Ｂ７−ＤＣ、親プラスミドならびにＷｔ  Ｂ７−ＤＣを含有するプラスミドも、トランスフェクトした。類似のレベルのＢ７−ＤＣを発現する腫瘍細胞の亜系を、上記のような特異抗体を用いたフローサイトメトリー分析の後に選択した。ＥＧ７／Ｋ１１Ｓ腫瘍系と同様に、免疫適格な同系のＤＢＡ／２マウス１０匹にＰ８１５／Ｋ１１３Ｓ細胞を皮下接種すると、一時的増殖が誘発され、全ての腫瘍は急速に消失した。偽物をトランスフェクトしたＰ８１５細胞の接種は、次第に増殖する腫瘍を誘発したが、Ｐ８１５／Ｗｔ  Ｂ７−ＤＣ細胞の注射も、次第に増殖する腫瘍を誘発した。しかし、その増殖は、偽物Ｐ８１５系より遥かに遅かった（図１２）。これらの腫瘍系を免疫欠損ｎｕ／ｎｕマウスに接種すると、類似の速度で腫瘍の増殖が誘発された（図１３）ため、Ｂ７−ＤＣトランスフェクタントの増殖抵抗性には、免疫系が役割を演じていることが支持された。
【０２１１】
（実施例５）
マウスにおける腫瘍増殖に対するＢ７−ＤＣＩｇの治療効果
腫瘍増殖に対するＢ７−ＤＣタンパク質の治療効果を決定するために、免疫適格なマウス中で樹立したＰ８１５腫瘍を有するマウスを、Ｂ７−ＤＣＩｇ融合タンパク質で処置した。ｗｔ  Ｐ８１５細胞をマウス中に接種すると、次第に増殖する腫瘍を誘発した。Ｂ７−ＤＣＩｇを０．１ｍｇマウスの腹腔内に３日目および８日目に注射すると、腫瘍の増殖が阻害された（図１４）。
【０２１２】
別途明記しない限り、本明細書に使用する全ての技術用語および科学用語は、開示した発明が属する技術分野の技術者が通常理解している意味と同じ意味を有する。
【０２１３】
当業者であれば、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの等価形態を認識され、または単なる常套的実験を用いて、それらを確かめることができる。このような等価形態は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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