(57)【要約】  コーンエタノール分離法により得られた血漿因子（IV）を１〜８M尿素と混合し、因子（IV）前処理溶液を作り、第１陰イオンクロマトグラフィカラムへ流入し、その後１〜８M尿素溶液で溶離してアポＡ-１蛋白溶液を生成する。このアポＡ-１蛋白溶液を第２陰イオンクロマトグラフィカラムに流入し、０〜１M尿素溶液で溶離して純アポＡ-１蛋白を得る工程からなるアポリポ蛋白Ａ-１精製の方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)  血漿因子（IV）を１〜８M尿素と混合し、因子（IV）前処理溶液を生成すること、
b)  ステップa)により得た前処理溶液を、第1陰イオンクロマトグラフィカラムに流入し、電導度１〜４ms/cmの１〜８M尿素からなる緩衝液（I）で溶離し、アポＡ-１蛋白を主に含有する溶離剤（I）を得ること、
c)  溶離剤（I）を第２陰イオンクロマトグラフィカラムに流入し、先ず電導度１〜１５ms/cmの緩衝液（II）で溶離し、次に電導度３０〜１００ms/cmの緩衝液（III）で溶離し、純アポＡ-１蛋白を得ることからなるアポリポ蛋白Ａ-１精製の方法。
【請求項２】
血漿因子（IV）はコーンエタノール分離法により得られることを特徴とした請求の範囲第1項記載の方法。
【請求項３】
緩衝液（II）は０〜１M尿素を含有することを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】
緩衝液（III）は０〜１M尿素を含有することを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】
ステップa)とｂ)の尿素濃度は３〜８Mであることを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項６】
ステップa)とｂ)の尿素濃度は５〜７Mであることを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項７】
緩衝液（I）の電導度は２〜４ms/cmで、緩衝液（II）の電導度は７〜１５ms/cmで、緩衝液（III）の電導度は７０〜９５ms/cmであることを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項８】
緩衝液（I）の電導度は２．５〜３．６ms/cmで、緩衝液（II）の電導度は９〜１２ms/cmで、緩衝液（III）の電導度は８０〜９０ms/cmであることを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項９】
各陰イオン交換クロマトグラフィカラムは、強陰イオン交換クロマトグラフィカラムと弱陰イオン交換クロマトグラフィカラムのどちらかであることを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１０】
各陰イオン交換クロマトグラフィカラムは、QAEイオン交換カラム及びDEAEイオン交換カラムのどちらかであることを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１１】
ステップ１の因子（IV）と尿素の質量比は１：３０〜３００であることを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１２】
ステップ１の因子（IV）と尿素の質量比は１：９０〜２４０であることを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１３】
ステップ１の因子（IV）と尿素の質量比は１：１５０〜２１０であることを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１４】
ステップｂ)とｃ)の緩衝液（I）、（II）、（III）は、NaCl、ＫＣl、MgCl2、CaCl2からなる群の少なくとも１つの塩を含有することを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１５】
ステップｂ)とｃ)の緩衝液（I）、（II）、（III）はNaClを含有することを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１６】
ステップｂ)とステップｃ)の間で、因子（IV）前処理溶液を遠心分離して沈殿物を除去し、その後濾過することを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１７】
因子（IV）前処理溶液は６，０００〜１０，０００rpmの速度で遠心分離され、孔径０．２〜０．６μm.の濾過膜で濾過されることを特徴とした請求の範囲第１６項記載の方法。
【請求項１８】
ステップｂ)、ステップｃ)間で、ほとんどの不純物を電導度４．５〜７０s/cmの緩衝液（IV）で溶離することを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１９】
緩衝液（IV）は０〜１M尿素を含有することを特徴とした請求の範囲第１８項記載の方法。
【請求項２０】
緩衝液（IV）は、NaCl、ＫＣl、MgCl2、CaCl2からなる群の少なくとも１つの塩を含有することを特徴とした請求の範囲第１８項記載の方法。
【請求項２１】
緩衝液（IV）はNaClを含有することを特徴とした請求の範囲第１８項記載の方法。
【請求項２２】
緩衝液（I）、（II）、（III）のpＨは７．２〜８．５であることを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２３】
緩衝液（I）、（II）、（III）はトリス緩衝液からなることを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２４】
緩衝液（I）、（II）、（III）のpＨは７．５〜８であることを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２５】
緩衝液（I）、（II）、（III）のpＨは７．８であることを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２６】
ステップｃ)後に、純アポＡ-１蛋白の限外濾過、純アポＡ-１蛋白へ安定剤の付加、又は純アポＡ-１蛋白の凍結乾燥のうち少なくとも一つの処理を行うことを特徴とした請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２７】
請求の範囲第１項記載の方法で得られるアポリポ蛋白Ａ-１。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛋白精製、特にアポＡ-１の精製に関する。
【背景技術】
【０００２】
高比重リポ蛋白（HDL）は血液中の重要なリポ蛋白である。コレステロール逆転送系（RCT）と呼ばれるプロセスに関与し、これを介して組織細胞内のコレステロールは肝臓に輸送され無害な物質に代謝されることで、動脈硬化症（AS）の発症や進行を防いでいる。アポリポ蛋白Ａ-１(アポＡ-１)は高比重リポ蛋白（HDL）中の主要となるアポリポ蛋白である。アポＡ-１は、血中HDLの生理機能に密接に関与しており、またHDLの抗動脈硬化機能の主要な担い手である。更に、近年の研究結果によれば、アポＡ-１欠損は動脈硬化の進行や炎症の増悪を引き起こす可能性がある。また、アポＡ-１は低比重リポ蛋白（LDL）を減少させ、プラークを除去する。更に、最近の研究結果によれば、アポＡ-１は薬に抗炎症効果や肝標的機能を持たす上で有望である。
【０００３】
通常、超高速遠心分離、有機溶媒沈殿や高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）などの方法がアポＡ-１を精製するのに用いられる。しかし、これらの方法には低収益、高コスト、不安定さや生産性が非常に少ないなどの特有の欠陥がある。アポＡ-１を商業生産するには、これらの方法は適さない。
【０００４】
一方で、血漿分離後に出来る因子の一つである血漿因子（IV）は市場利用するには有効な製品が精製されないため、常に廃棄されている。本発明は、大規模な生産に適しており、また血漿因子（IV）より高純度のアポＡ-１を作るものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明によれば、尿素はイオン交換クロマトグラフィでのアポＡ-１の動きに大きな影響を及ぼすことが分かった。アポＡ-１が尿素に結合していない時は、陰イオン交換カラムに非常に容易に吸収され、カラムから溶出することは比較的難しい。しかし、アポＡ-１が尿素に結合している場合は、陰イオン交換カラムから溶出することは非常に簡単である。それゆえ、本発明は２つの異なる溶離プロファイルを使いながら２本の交換カラムによりアポＡ-１を精製する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明はアポリポ蛋白Ａ-１を精製する方法で、次のステップからなる。a)（コーンエタノール分離方法により作られた）血漿因子（IV）を１〜８Mの尿素液と混合し、因子（IV）前処理溶液を作る。ｂ）ステップa)で作られた前処理溶液を第１陰イオンクロマトグラフィーカラムに流入し、アポＡ-１蛋白を得るために１〜８M尿素液で溶離する。ｃ) ステップｂ)で作られたアポＡ-１蛋白溶液を第２陰イオンクロマトグラフィーカラムに流入し、純アポＡ-１蛋白を得るために０〜１M尿素溶液で溶離する。
【発明の効果】
【０００７】
この方法は高い生産性、低コスト及び工業的生産に適するなどの利点を有する。更に、この方法は血漿因子（IV）を未加工材料として用いるため、血漿成分を完全使用することが出来る。
本発明で作られる純アポＡ-１は動脈硬化治療、抗炎症治療、抗毒素治療、肝標的薬剤などに適応する上で有望である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】血漿因子（IV）からアポ蛋白Ａ-１を精製する工程を示したフローチャートである。
【図２】第１実施例の第１イオン交換クロマトグラフィの溶離工程を示している。
【図３】第１実施例の第１イオン交換クロマトグラフィで採られたサンプルのSDS-PAGE電気泳動の結果を示している。
【図４】第１実施例の第２イオン交換クロマトグラフィで採られたサンプルのSDS-PAGE電気泳動の結果を示している。
【図５】第４実施例で採られたサンプルのSDS-PAGE電気泳動の結果を示している。
【図６】第２実施例で採られたサンプルのSDS-PAGE電気泳動の結果を示している。
【図７】第３実施例で採られたサンプルのSDS-PAGE電気泳動の結果を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明による具体例の工程は図１に示されており、図１は血漿因子（IV）からアポＡ-１を製造する工程を示したフローチャートである。
【００１０】
（１）血漿因子（IV）の前処理
該因子（IV）はコーンエタノール分離方法（Cohn, E.J. ; Strong, L.E. ; Huges, W.L. 等、血清と血漿蛋白（IV）の調合と特性。生物組織と液体を蛋白因子及びリポ蛋白成分に分離するシステム。Amer
Chem Soc. １９６４年 ６８:４５９〜４７５）により得る。因子（IV）は緩衝液で溶解し、ある一定量の尿素を溶液に加えて完全に混合する。この工程で、アポＡ-１が尿素に結合するが、この結合は可逆的である。加える尿素の濃度は１〜８M、好ましくは３〜７M、更に好ましくは５〜６Mである。因子（IV）と尿素の質量比は１：３０〜３００、好ましくは１：９０〜２４０、更に好ましくは１：１５０〜２１０である。
【００１１】
この分野で通常使用される緩衝液、即ち、トリス緩衝液、リン酸緩衝液又はHEPES緩衝液が選択可能であるが、トリス緩衝液が望ましい。緩衝液のpＨは７．２〜８．５であるが、７．５〜８が好ましく、７．８が更に良い。
【００１２】
別の実施例では、因子（IV）は低温（０〜４℃）で溶解される。
【００１３】
別の実施例では、前処理溶液は沈殿物を除去するために遠心分離され、その後濾過される。遠心分離回転数は６，０００〜１０，０００rpmであるが、８，０００rpmが好ましい。また、濾過膜の孔径は０．２〜０．６μｍであるが、０．４５μｍが好ましい。
【００１４】
（２）第１DEAE陰イオン交換クロマトグラフィ
工程（１）で作られた溶液をDEAE（ジエチルアミノエタノール）陰イオン交換カラムに流入し、アポＡ-１を含有する溶液中の蛋白をカラム上に吸着させる。具体的には、工程（１）で作られたアポＡ-１溶液を水で１〜１０倍、好ましくは３〜７倍に希釈する。希釈後、溶液を陰イオン交換カラムに０．５〜１．５ml/min、好ましくは０．８〜１．２ml/minの流速で流入する。
【００１５】
その後、蛋白は2つの溶離ステップを経て溶離される。第1ステップでは、カラムの溶離に低電導度の緩衝液が用いられる。アポＡ-１はこの時点ではカラムに弱く吸着しており、アポＡ-１を主に含有する蛋白が最初に溶離される。第2ステップでは、カラムを溶離するのに高電導度の緩衝液が用いられ、主に不純物を含有する蛋白が溶離される。
【００１６】
アポＡ-１を溶離する溶離剤は１〜８Mの尿素、好ましくは３〜７M、更に好ましくは５〜６Mの尿素を含有している。電導度は１〜４ms/cm、好ましくは２〜３．８ms/cm、更に好ましくは２．５〜３．６ms/cmである。溶離剤中に塩を含んでもよいが、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2に限定されるものではない。NaClが好ましい。
【００１７】
不純物を溶離する溶離剤は０〜１Mの尿素を含有するが、０Mが好ましい。電導度は４．５〜１００ms/cmである。溶離剤中に塩を含んでもよいが、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2に限定されるものではない。NaClが好ましい。
【００１８】
この分野で通常使用される緩衝液が用いられる。即ち、トリス緩衝液、リン酸緩衝液又はHEPES緩衝液、好ましくはトリス緩衝液を用いる。緩衝液のpＨは７．２〜８．５、好ましくは７．５〜８、更に好ましくは７．８である。
【００１９】
ステップ１で作られた因子前処理溶液のカラムへの流速は０．５〜１．５ml/min、好ましくは０．８〜１．２ml/minである。因子（IV）とカラムの体積比率は１：５〜５０、好ましくは１：１５〜４０、更に好ましくは１：２０〜３０である。
【００２０】
（３）第２DEAE陰イオン交換クロマトグラフィ
アポＡ-１、尿素及び僅かな不純物を含有する、第1DEAE陰イオン交換クロマトグラフィ工程で得られたアポＡ-１溶液を、水で希釈し低電導にして、第２DEAEカラムへ流入する。
【００２１】
蛋白は第２DEAEカラムに吸着し、尿素は溶液中に残留し流出物として除去する。そして、蛋白は二つの溶離工程を経て溶離される。第１工程では、比較的低電導度の緩衝液がカラムを溶離するのに使用される。アポＡ-１はカラムに強力に吸着し、不純物はカラムから溶離する。第２工程では、高電導度の緩衝液がカラムを溶離するのに使用され、高純度のアポＡ-１が溶離する。
【００２２】
不純物を溶離する溶離剤の電導度は１〜２０ms/cm、好ましくは７〜１５ms/cm、更に好ましくは９〜１２ms/cmである。０〜１Mの尿素が溶離剤に存在してもよいが、０M濃度が好ましい。溶離剤中に塩を含んでもよいが、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2に限定されるものではない。NaClが好ましい。
【００２３】
アポＡ-１を溶離する溶離剤の電導度は５０〜１００ms/cm、好ましくは７０〜９５ms/cm、更に好ましくは８０〜９０ms/cmである。０〜１Mの尿素が溶離剤中に存在してもよいが、０M濃度が好ましい。溶離剤中に塩を含んでもよいが、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2に限定されるものではない。NaClが好ましい。
【００２４】
別の実施例では、アポＡ-１と僅かな量の不純物が第２DEAEカラムに吸着した後に、３ms/cm/minの電導勾配を適用し蛋白を溶離する。溶離剤の電導度を１ms/cmから１００ms/cmに上昇させる。純アポＡ-１は電導度が３０ms/cmと６０ms/cmの時に溶離し、収集される。
【００２５】
この分野で通常使用される緩衝液が用いられる。即ち、トリス緩衝液、リン酸緩衝液又はHEPES緩衝液、好ましくはトリス緩衝液を用いる。緩衝液のpＨは７．２〜８．５、好ましくは７．５〜８、更に好ましくは７．８である。
【００２６】
本発明においては、後処理法も実施され、ステップ（３）で得られた純アポＡ-１溶液を処理する。この方法は、限外濾過工程、安定剤付加工程、凍結乾燥工程を含む。後処理工程を経て、最後に凍結乾燥されたアポＡ-１を得る。
【００２７】
この分野でよく適用される限外濾過が、アポＡ-１溶液の調整やその溶液を最適pＨや蛋白濃度に調整するのに用いられる。限外濾過には、分子量カットオフ値５，０００のミリポアPES限外濾過膜が使用され、作業温度は４℃、作業気圧は０．３Mpa以下とする。
【００２８】
加える安定化剤はこの分野でよく使用されているものであり、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、グリコール酸セルロースナトリウム、ショ糖、ソルビトールなどであるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
この分野でよく用いられる凍結乾燥法が使用される。製品は−３６℃以下で３〜４時間冷凍され、その後７〜９Paの真空下で凍結乾燥される。冷トラップの温度は約−５５℃で、その次に、約１５時間、棚の温度を４０℃とする。
【００３０】
本発明で用いられるクロマトグラフィカラムはこの分野でよく使用されるものの中から選らんでもよく、クロマトグラフィ媒体はQAE（第4級アミン）又はDEAE陰イオン交換クロマトグラフィ媒体でもよいが、好ましくはDEAEである。
【００３１】
本発明は更に下記実施例でその詳細を述べる。これらの実施例は本発明を説明するために用いるのであって、発明の範囲を限定するものではない。下記実施例中の実験において、条件が特定されていない場合は、一般的なものか、又は製造者により考えられることを意味する。別段の特定がなければ、下記比率は質量比である。
【００３２】
別段の定義がなければ、専門用語又は技術用語の定義はこの分野で通常の能力を有する当業者に一般的に理解されているものである。
【実施例】
【００３３】
（実施例１）  アポＡ-１の精製
初期材料は、０．２gの血漿因子（IV）、５mlのDEAE陰イオン交換カラム（GE ヘルスケア社製）2本、精製及び電導度測定装置、詳しくはAKTA エクスプローラ １００（GE ヘルスケア社製）である。
【００３４】
（１）血漿因子（IV）の前処理
０．２gの因子（IV）を１００mlのトリス緩衝液（pＨ７．８、４℃）に溶解する。尿素を加え、最終濃度が６mol/Lとなる溶液を作り、完全に混和する。溶液を８，０００rpmで遠心分離して沈殿物を取り除き、０．４５μmのフィルターで濾過する。
【００３５】
（２）第１DEAE陰イオン交換クロマトグラフィ
第１DEAEカラムを６mol/Lの尿素を含有するトリス緩衝液（pＨ７．８）で平衡化する。ステップ（１）で作った溶液をDEAEカラムへ１ml/minの流速で流入する。６mol/Lの尿素濃度のトリス緩衝液（pＨ７．８、電導度３．５ms/cm）を用いカラムを溶離する。アポＡ-１が溶離される。溶離量は２０mlである。４つの異なったトリス緩衝液（pＨ７．８で、夫々の電導度が４．３ms/cm、５．４ms/cm、６．７ms/cm、５９．２ms/cmのもの）がカラム溶離に用いられ、不純物が溶離される。溶離工程とSDS-PAGE電気泳動の結果を図２、図３に夫々示す。図2のx座標はクロマトグラフィ工程の溶離量を示し、ｙ座標は溶離における蛋白濃度を示す。符号１〜９はサンプルが採られた箇所を示す。図３で示される通り、サンプルはSDS-PAGE電気泳動で測定される。矢印はアポＡ-１の位置を示している。
【００３６】
（３）第２DEAE陰イオンクロマトグラフィ
アポＡ-１、尿素、及び僅かな不純物を含有するステップ（２）の溶離されたアポＡ−１（pＨ７．８、電導度３．５ms/cm）は水で５倍に希釈され、第２DEAEカラムへ１０ml/minの流速で流入される。アポＡ-１と僅かな不純物はカラムへ吸着され、尿素は溶液中に残留し、流出物として除去される。
【００３７】
尿素を含まないトリス緩衝液（pＨ７．８ 、電導度１１．７ms/cm）を用いカラムを溶離し、不純物をカラムから溶離する。その後、尿素を含まないトリス緩衝液（pＨ７．８、電導度８５．２ms/cm）を用いカラムを溶離し、アポＡ-１を溶離する。
【００３８】
SDS-PAGE電気泳動の結果は、この工程で純アポＡ-１が得られていることを示す（図４）。サンプル１は流入処理中のカラム流出液中の蛋白である。サンプル２は蛋白マークである。符号３〜５は第1溶離処理中に収集されたサンプルを示し、主に不純物からなる。符号６〜１０は第２溶離処理中に収集されたサンプルを示し、主にアポＡ-１からなる。サンプル６、７は５倍に希釈され、サンプル８は１０倍に希釈される。矢印はアポＡ-１蛋白の位置を示している。
【００３９】
（実施例２）  アポＡ-１の精製
０．２gの血漿因子（IV）及び装置は実施例１と同様である。
【００４０】
（１）血漿因子（IV）の前処理
０．２gの因子（IV）を１００mlのトリス緩衝液（pＨ７．８、４℃）に溶解する。尿素を加え、最終濃度が６mol/Lとなる溶液を作り、溶液を完全に混合する。溶液を８，０００rpmで遠心分離して沈殿物を取り除き、０．４５μmのフィルターで濾過する。
【００４１】
（２）第１DEAE陰イオン交換クロマトグラフィ
第１DEAEカラムを１mol/Lの尿素を含有するトリス緩衝液（pＨ７．８）で平衡化する。ステップ（１）で作った溶液をDEAEカラムへ１ml/minの流速で流入する。１mol/Lの尿素濃度のトリス緩衝液（pＨ７．８、電導度３．５ms/cm）を用いてカラムを溶離する。アポＡ-１が溶離され、溶離量は２０mlである。トリス緩衝液（pＨ７．８、電導度５９．２ms/cm）を用いてカラムを溶離し、不純物を溶離する。
【００４２】
（３）第２DEAE陰イオン交換クロマトグラフィ
手順は実施例1と同様である。精製結果は図5に示す。サンプル１は事前処理後の血漿因子（IV）の上澄み液である。サンプル４から８は精製処理で収集されたアポＡ-１である。サンプル１０は精製処理中に収集された不純物である。矢印はアポＡ-１蛋白の位置を示す。
【００４３】
（実施例３）  アポＡ-１の精製
０．２gの血漿因子（IV）及び装置は実施例1と同様である。
【００４４】
（１）血漿因子（IV）の前処理
０．２gの因子（IV）を１００mlのトリス緩衝液（pＨ7.8、４℃）に溶解する。尿素を加え、最終濃度が６mol/Lとなる溶液を作り、溶液を完全に混合する。溶液を８，０００rpmで遠心分離して沈殿物を取り除き、０．４５μmのフィルターで濾過する。
【００４５】
（２）第１DEAE陰イオン交換クロマトグラフィ
第１DEAEカラムを８mol/Lの尿素を含有するトリス緩衝液（pＨ７．８）で平衡化する。ステップ（１）で作った溶液をDEAEカラムへ１ml/minの流速で流入する。８mol/Lの尿素濃度のトリス緩衝液（pＨ７．８、電導度３．５ms/cm）を用いカラムを溶離する。アポＡ-１が溶離され、溶離量は２０mlである。トリス緩衝液（pＨ７．８、電導度５９．２ms/cm）を用いカラムを溶離し、不純物を溶離する。
【００４６】
（３）第２DEAE陰イオン交換クロマトグラフィ
手順は実施例1と同様である。精製結果は図７に示す。
【００４７】
（実施例４）  アポＡ-１のパイロット規模精製
初期材料は、６０gの血漿因子（IV）、１，５００mlイオン交換カラム（上海浙江省クロマトグラフィ機器コーポレーション製）２本、陰イオン交換媒体、詳しくはDEAEセファロースFF(GE Healthcare社製)、ポンプ及びUV測定器（上海浙江省クロマトグラフィ機器コーポレーション製）、そして電導度測定器、詳しくはAKTA エクスプローラ１００（GE Healthcare社製）である。
【００４８】
（１）血漿因子（IV）の事前処理
６０gの因子（IV）を１００mlのトリス緩衝液（pＨ７．８、４℃）に溶解する。尿素を加え、最終濃度が６mol/Lとなる溶液を作り、溶液を完全に混合する。溶液を８，０００rpmで遠心分離して沈殿物を取り除き、０．４５μmのフィルターで濾過する。
【００４９】
（２）第１DEAE陰イオン交換クロマトグラフィ
第１DEAEカラムを６mol/Lの尿素を含有するトリス緩衝液（pＨ７．８）で平衡化する。ステップ（１）で作った溶液をDEAEカラムへ１０ml/minの流速で流入する。６mol/Lの尿素濃度のトリス緩衝液（pＨ７．８、電導度３．７ms/cm）を用いカラムを溶離する。アポＡ-１が溶離され、溶離量は１０Lである。トリス緩衝液（pＨ７．８、電導度８０．３ms/cm）を用いてカラムを溶離し、不純物を溶離する。
【００５０】
（３）第２DEAE陰イオンクロマトグラフィ
アポＡ-１、尿素、及び僅かな不純物を含有するステップ（２）で溶離したアポＡ−１（pＨ７．８、電導度３．７ms/cm）を水で5倍に希釈し、第２DEAEカラムへ１０ml/minの流速で流入する。アポＡ-１及び僅かな不純物はカラムに吸着され、尿素は溶液中に残留し、流出物として除去される。
【００５１】
尿素を含まないトリス緩衝液（pＨ７．８ 、電導度１２．２ms/cm）を用いカラムを溶離し、不純物をカラムから溶離する。その後、尿素を含まないトリス緩衝液（pＨ７．８、電導度５０．４ms/cm）を用いカラムを溶離し、アポＡ-１を溶離させる。
【００５２】
SDS-PAGE電気泳動の結果は、図５に示されている。この結果から、純アポＡ-１がパイロット規模の処理でも得られることがわかる。
【００５３】
（実施例５）  アポＡ-１の蛋白定量
実施例１で精製したアポＡ-１蛋白を（有）上海サンバイオテック社製のアポＡ-１免疫比濁測定キットで定量した。
【００５４】
１０μlの精製蛋白を１mlのアポＡ-１抗血清に加えた後、３７℃で１５分間培養する。培養後、溶液を５０５nmの吸光度で検出する。結果は、この蛋白がアポＡ-１であることを示している。
【００５５】
（実施例６）  アポＡ-１の蛋白定量
実施例５で記載の方法を用いて、実施例２及び実施例３でそれぞれ作ったアポＡ-１蛋白と実施例４で作ったアポＡ-１蛋白を（有）上海サンバイオテック社製のアポＡ-１免疫比濁測定キットで定量した。
【００５６】
同様な結果が得られている。
【００５７】
更に、この技術分野で能力を有する者が、ここで記載された具体案を本発明の精神と範囲を逸脱しない範囲で変更することが考えられる。従って、先の記載は単に説明であり、本発明の精神と範囲は次のクレームにより規定される。
【図１】
2010513480.tif 000002
【図２】
2010513480.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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