(57)【要約】  本発明は、リポソーム封入蛍光分子で固体支持体上の分析物を検出および定量化するための改善された方法に関する。
2010533293.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光分子を封入しているリポソームにより、固体支持体上で、生物学的サンプル中の少なくとも１つの分析物Ａを検出および定量化するための方法であって、
１）（ａ）ｉ）少なくとも１つの分析物Ａを含むことができる前記生物学的サンプルを、液体媒体中で、蛍光分子を封入している少なくとも１つのリポソームおよび前記分析物Ａと複合体形成することができる分子にカップリングされている表面と接触させ、次いで、ｉｉ）前記媒体を、形成される可能性がある分析物Ａ／リポソーム複合体と結合することができる少なくとも１つの固定化基質を含有する固体支持体と接触させるか、
ｂ）固体支持体上に予め固定化されている前記生物学的サンプル（前記サンプルは、少なくとも１つの分析物Ａを含むことができる）を、前記蛍光分子を封入しているリポソームを含む液体媒体および前記分析物Ａと複合体形成することができる分子にカップリングされている表面と接触させるかのどちらかのステップと、
２）前記固体支持体を乾燥することによりリポソームの外側に存在する液体媒体を除去するステップと、
３）リポソームを溶解するステップと、
４）発せられる可能性のある蛍光シグナルを検出するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ステップ１）（ａ）（ｉｉ）が、
キャピラリー作用による前記固体支持体上の前記媒体の移動か、
前記固体支持体上への前記媒体の付着のどちらかにより行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ１）（ｂ）が、以下のサブステップ、すなわち、
ｉ）電気泳動により前記生物学的サンプルから少なくとも１つの分析物Ａを分離し、電子移動により固体支持体上に前記分析物Ａを固定化するサブステップと、
ｉｉ）前記分析物Ａが固定化されている前記固体支持体を、蛍光分子を封入している少なくとも１つのリポソームを含む液体媒体および前記分析物Ａと複合体形成することができる分子にカップリングされている表面と接触させるサブステップとを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ１）と２）の間に、複合体形成していないリポソームを除去するために固体支持体を洗浄する少なくとも１つのステップも含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
支持体が、ニトロセルロース膜、微量滴定プレートおよびバイオチップから選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
リポソームにカップリングされており、分析物Ａと複合体形成することができる分子が、前記分析物と複合体形成することができる一次および二次抗体、前記分析物の受容体、ポリ核酸、ペプチド核酸、レクチン、および前記分析物のための担体タンパク質またはキレートまたは合成受容体から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
蛍光分子が、フィコエリトリン、フィコシアニン、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの形態であるローダミンの水溶性誘導体、クマリンおよびそれらの誘導体、蛍光シアニン、スルホローダミン誘導体および緑色蛍光タンパク質から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
蛍光分子が、スルホローダミンおよび蛍光シアニンから選択されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
乾燥ステップ２）が、２０〜９０℃の温度にて行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
乾燥ステップ２）の時間が、１〜６０分の範囲であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ３）におけるリポソームの溶解が、支持体の追加乾燥により行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
追加乾燥の時間が、１〜１５分の範囲であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ３）における支持体の乾燥が、２０〜９０℃の温度にて、オーブン中で行われることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ４）の蛍光シグナルの検出が、少なくとも１分にわたって行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
バイオチップを読み取る際の、請求項１、２および４〜１４のいずれか一項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソーム封入蛍光分子で固体支持体上の分析物を検出および定量するための改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、脂質二重層により形成される小胞、および例えば抗体など、共有結合により小胞の外面にカップリングされている、分析物Ａと複合体形成することができる分子からなる特定の構造である。イムノアッセイの場合、これらの構造は、小胞における、最も一般的には蛍光性である着色分子、特に、スルホローダミンの封入後に比色または蛍光標識として使用される。このタイプの構造は、数千または百万の着色分子がリポソームごとに包含される限りにおいて、高い比活性を持つ標識を有することを可能にする。これらの構造は、いくつかのアッセイフォーマット：微量滴定プレート、キャピラリーおよび免疫クロマトグラフィー（「ストリップ」）で使用される。
【０００３】
分析物の微量滴定−プレートまたはキャピラリー検出は、最も一般的には、分子の蛍光特性を使用する。しかしながら、リポソーム中の分子の濃度は、蛍光の自己消光の現象が存在するほどである。したがって、蛍光を明らかにするためには、界面活性剤でリポソームを破壊することにより媒体中で分子を希釈することが必要である（ＳＩＮＧＨら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７２：６０１９〜６０２４、２０００；ＤＥＣＯＲＹら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７１（４）：１８５６〜１８６４、２００５；ＨＯら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３３０：３４２〜３４９、２００４）。
【０００４】
免疫クロマトグラフィー（すなわち、ストリップフォーマット）による分析物の検出は、医学的診断、および例えば環境中の汚染物質の検出などの新たな応用分野において使用されている技法である。このフォーマットでは、リポソーム中に封入されている分子の呈色密度のみが使用される（米国特許第４，７０３，０１７号；ＨＯおよびＨＳＵ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７５：４３３０〜４３３４、２００３；ＰＡＲＫおよびＤＵＲＳＴ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２８０：１５１〜１５８、２０００；ＡＨＮ−ＹＯＯＮら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、３７８：６８〜７５、２００４；ＡＨＮ−ＹＯＯＮら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７５：２２５６〜２２６１、２００３）。実際に、ストリップ上のサンプルの移動後に、界面活性剤を使用してリポソームを分解することができないのは、そのような行為が、キャピラリー作用によりストリップ全体にわたってシグナルが希釈される結果になるためである。したがって、分子が、ストリップフォーマットでそれらの蛍光特性のために使用されることがある場合、それらは、共有結合カップリングにより抗体に直接結合しているか（ＫＩＭら、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、３７：１８９９〜１９０４、２００３）、多糖類などのポリマーを介して抗体に結合しているか（米国特許第５，５４３，３３２号）のどちらかであるフルオロフォアである。
【０００５】
ストリップフォーマットの利点である迅速に得られる結果および使いやすさは、ストリップフォーマットが「ホームテスト」応用またはフィールドにおける応用に完全に適していることを意味している。しかしながら、イムノアッセイまたは質量分析法などの他の技法に比べてその低い感度は、その使用を制限している。
【０００６】
したがって、この数年間、比色または蛍光シグナルを得るための新たな標識が、検出の感度を改善するために開発されてきた。しかしながら、今日まで、リポソームに封入されている分子の蛍光特性を使用して固体支持体上の分析物を検出するための、従来技術の知られている固体支持体上で行われる他の検出方法（比色分析、写真用フィルムにより明らかにされる可能性のあるルミネッセンスなど）の検出感度と少なくとも同等である検出感度を得ることを可能にする方法は存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，７０３，０１７号
【特許文献２】米国特許第５，５４３，３３２号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＳＩＮＧＨら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７２：６０１９〜６０２４、２０００
【非特許文献２】ＤＥＣＯＲＹら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７１（４）：１８５６〜１８６４、２００５
【非特許文献３】ＨＯら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３３０：３４２〜３４９、２００４
【非特許文献４】ＨＯおよびＨＳＵ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７５：４３３０〜４３３４、２００３
【非特許文献５】ＰＡＲＫおよびＤＵＲＳＴ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２８０：１５１〜１５８、２０００
【非特許文献６】ＡＨＮ−ＹＯＯＮら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、３７８：６８〜７５、２００４
【非特許文献７】ＡＨＮ−ＹＯＯＮら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７５：２２５６〜２２６１、２００３
【非特許文献８】ＫＩＭら、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、３７：１８９９〜１９０４、２００３
【非特許文献９】Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．、Ｉｍａｇｅ  Ｊ．Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡ、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／、１９９７〜２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明者らは、リポソームに封入されている分子の蛍光特性を活用することを可能にする、固体支持体上の分析物を検出するための新たな改善された方法を提供するという目的を自分たち自身に与えた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この方法は、膜または微量滴定プレートなどの固相上のアッセイにおける蛍光トレーサーとしてフルオロフォアを含有するリポソームの使用であって、これらの固相を乾燥した後の使用に基づいている。一般に、リポソーム中の高濃度のフルオロフォアは、蛍光の自己消光の現象、したがって、弱い蛍光シグナルを誘導する。一方、固相を徐々に乾燥することは、液体界面活性剤を添加しないリポソームの溶解、それ故に、固体支持体上のリポソームのフルオロフォア内容物の制御された拡散、したがって、自己消光現象の減少または消失さえも引き起こし、蛍光の大きな増加に反映されるであろう。
【００１１】
したがって、本発明の主題は、蛍光分子を封入しているリポソームにより、固体支持体上で、生物学的サンプル中の少なくとも１つの分析物Ａを検出するための方法であって、
１）（ａ）ｉ）少なくとも１つの分析物Ａを含むことができる前記生物学的サンプルを、液体媒体中で、蛍光分子を封入している少なくとも１つのリポソームおよび前記分析物Ａと複合体形成することができる分子にカップリングされている表面と接触させ、次いで、ｉｉ）前記媒体を、形成される可能性がある分析物Ａ／リポソーム複合体と結合することができる少なくとも１つの固定化基質を含有する固体支持体と接触させるか、
ｂ）固体支持体上に予め固定化されている前記生物学的サンプル（前記サンプルは、少なくとも１つの分析物Ａを含むことができる）を、前記蛍光分子を封入しているリポソームを含む液体媒体および前記分析物Ａと複合体形成することができる分子にカップリングされている表面と接触させるかのどちらかのステップと、
２）前記固体支持体を乾燥することによりリポソームの外側に存在する液体媒体を除去するステップと、
３）リポソームを溶解するステップと、
４）発せられる可能性のある蛍光シグナルを検出するステップとを含むことを特徴とする方法である。
【００１２】
本発明による方法のステップ２）によれば、支持体の乾燥は、リポソームの外側の液体媒体を除去させ、次いで、ステップ３）において、液体界面活性剤を添加する必要なくリポソームを溶解させ、固体支持体全体にわたるそれらの拡散を同時に防ぎながらそれらのフルオロフォア内容物を放出させるであろう。
【００１３】
したがって、この方法は、得られるシグナル、したがって、イムノアッセイ（アプローチ１）（ａ））特に、免疫クロマトグラフィーイムノアッセイの感度を増加させることを可能にするが、同時に、使用が簡単で迅速なままである。免疫ブロッティング（アプローチ１）（ｂ））の場合、この方法は、より良いバンド解像力および基準マーカーであるペルオキシダーゼで得られる感度と少なくとも同等である感度を得ることを可能にする。この方法は、リポソームの様々な集団を使用していくつかの分析物を同時に分析することも可能にし、各集団は、リポソームからなり、その表面は、特定の分析物Ａと複合体形成することができる分子にカップリングされており、それらが封入している蛍光分子の性質に応じて特定の波長で蛍光を発する。さらに、これらの２つの応用において、固体支持体を乾燥するステップは、それが含有する結果を容易に保存することを可能にするであろう。
【００１４】
本発明の別の特定の実施形態によれば、前記ステップ１）（ａ）（ｉｉ）は、
−  キャピラリー作用による前記固体支持体上の前記媒体の移動か、
−  前記固体支持体上への前記媒体の付着のどちらかにより行われる。
【００１５】
本発明のさらに別の特定の実施形態によれば、前記ステップ１）（ｂ）は、以下のサブステップ：
ｉ）電気泳動により前記生物学的サンプルから少なくとも１つの分析物Ａを分離し、電子移動により固体支持体上に前記分析物Ａを固定化するサブステップと、
ｉｉ）前記分析物Ａが固定化されている前記固体支持体を、蛍光分子を封入している少なくとも１つのリポソームを含む液体媒体および前記分析物Ａと複合体形成することができる分子にカップリングされている表面と接触させるサブステップとを含む。
【００１６】
本発明の特定の実施形態によれば、前記検出方法は、ステップ１）と２）の間に、複合体形成していないリポソームを除去するために固体支持体を洗浄する少なくとも１つのステップを含むこともある。
【００１７】
本発明によれば、固体支持体は、ニトロセルロース膜、微量滴定プレート、好ましくは、ポリスチレン製の、およびバイオチップから選択されることが好ましい。
【００１８】
本発明によれば、リポソームにカップリングされており、分析物Ａと複合体形成することができる分子は、前記分析物と複合体形成することができる一次および二次抗体、前記分析物の受容体、ポリ核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ペプチド核酸、レクチン、および前記分析物のための担体タンパク質または化学分子（キレート、合成受容体）から選択されることが好ましい。これらのリポソームは、それらが封入している蛍光分子の性質に応じて様々な波長で蛍光を発することができる。
【００１９】
本発明によれば、リポソーム封入蛍光分子は、以下のフルオロフォア：フィコエリトリン、フィコシアニン、フルオレセインおよびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などのその誘導体、ローダミンならびにスルホローダミンおよびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などのその誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によりＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）という商品名で販売されている製品、例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０−Ｘ、６３３、６４７、６６０、６８０、７００、７５０および７９０などのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの形態であるローダミンの水溶性誘導体、クマリンおよび７−アミノクマリンなどのそれらの誘導体、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社により基準品Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７として販売されているものなどの蛍光シアニン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）としても知られているスルホローダミン１０１スルホニルクロリドなどのスルホローダミン誘導体、Ｆｌｕｏｒｏｐｒｏｂｅｓ（登録商標）という商品名で販売されている染料、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰと略されることが多い）などから選択されることが好ましい。本発明によれば、スルホローダミンおよびＣｙ５（登録商標）などの蛍光シアニンが特に好ましい。
【００２０】
本発明によれば、固体支持体から液体を除去するステップ２）は、好ましくは、約２０〜９０℃の範囲である温度にて、さらにより好ましくは、約４０℃の温度にて固体支持体を乾燥することにより行われる。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態によれば、乾燥ステップ２）は、約２０〜９０℃の温度にて、好ましくは約４０℃の温度にてオーブン中で行われる。
【００２２】
本発明によれば、乾燥ステップ２）の時間は、リポソームの外側の支持体上に存在する液体媒体の量により異なることがある。この時間は、支持体を完全に乾燥するのに必要な時間に対応していなければならないが、リポソームの溶解を引き起こしてはならない。指示としては、この時間は、約１〜６０分の範囲であってよく、乾燥時間は、約５分であることが好ましい。
【００２３】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、ステップ２）における支持体の乾燥は、約５分にわたって、約４０℃の温度にて、オーブン中で行われる。
【００２４】
ステップ３）におけるリポソームの溶解は、いずれの適当な技術手段によっても行うことができるが、ただし、この手段は、支持体のいかなる再加湿も引き起こさないこととする（熱的、物理的または化学的手段）。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態によれば、リポソーム溶解ステップ３）は、支持体の追加乾燥により行われる。この場合、この追加乾燥ステップは、一般的に、リポソームの外側に存在する液体媒体を除去するのに必要とされる最初の乾燥ステップ２）よりも急速である。この時間は、約１〜１５分の範囲であってよく、ステップ３）における追加乾燥時間は、約１分であることが好ましい。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態によれば、追加乾燥ステップ３）は、約２０〜９０℃の温度にて、好ましくは約４０℃の温度にてオーブン中で行われる。
【００２７】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、ステップ３）における支持体の乾燥は、約１分にわたって、約４０℃の温度にて、オーブン中で行われる。
【００２８】
本発明によれば、固体支持体上に固定化される１つまたは複数の基質は、アッセイされる前記分析物Ａまたはその類似体もしくはフラグメント、抗分析物Ａ抗体、および例えばマウス、ヒト、ラット、ヤギなどからの免疫グロブリンに対する抗体から選択されることが好ましい。
【００２９】
分析物Ａの検出は、固体支持体上のリポソームにより発せられる可能性がある蛍光シグナルを読み取ることにより行われる。発せられる蛍光を読み取るための時間が長ければ長いほど、蛍光シグナルは増加し、それによって、検出限界を高めることを可能にする。したがって、得られる結果による読み取り時間および望ましい検出限界を調節することが可能である。本発明による方法の好ましい実施形態によれば、ステップ４）の蛍光シグナルの検出は、少なくとも１分にわたって、さらにより好ましくは、１〜５分の範囲にわたって行われる。例えば、スルホローダミンがフルオロフォアとして使用される場合、６００ｎｍにおける読み取り時間は、約１〜５分の範囲であってよい。
【００３０】
上記のアレンジメントに加えて、本発明は、固体支持体上の、イムノアッセイにおけるリポソーム封入分子の蛍光の増加に対する乾燥の効果を証明する非限定的な実施例、および添付の図１〜１４にも言及している、後に続くさらなる説明から浮かび上がるであろう他のアレンジメントも含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】リポソームの蛍光に対する乾燥の効果を示す図である。
【図２】免疫測定フォーマットでのストリップテストを概略的に示す図である。
【図３】免疫測定フォーマットでのストリップテストにおけるリポソームの蛍光に対する乾燥の効果を示す図である。
【図４】免疫測定フォーマットでのストリップテストにおける、比色または蛍光測定でリポソームついて得られる検出限界を示す図である。
【図５】免疫測定フォーマットでのストリップテストにおけるリポソームついて得られる蛍光シグナルの定量化を示す図である。
【図６】競合フォーマットでのストリップテストを概略的に示す図である。
【図７】競合フォーマットでのストリップテストにおけるリポソームの蛍光に対する乾燥の効果を示す図である。
【図８】免疫ブロッティングテストにおけるリポソームの蛍光に対する乾燥の効果を示す図である。
【図９】免疫ブロッティングテストにおけるルミネッセンス測定（写真用フィルムにより明らかにされるかされない）または蛍光測定でリポソームについて得られる検出限界を示す図である。
【図１０】ポリスチレン微量滴定プレートでのテストにおけるリポソームの蛍光に対する乾燥の効果を示す図である。
【図１１】ポリスチレン微量滴定プレートでのテストにおけるリポソームの蛍光に対する乾燥の効果を示す図である。
【図１２】ポリスチレン微量滴定プレートでのテストにおけるリポソームについて得られる蛍光シグナルの定量化を示す図である。
【図１３】免疫測定フォーマットでのストリップテストにおいて得られるリポソーム蛍光の結果の写真である。図１３Ａ：リポソームの溶解は、リポソームの外側に存在する液体媒体を除去するために支持体を乾燥するステップ２）を完全に行う前に行われた（本発明の一部ではない比較方法）。図１３Ｂ：リポソームの溶解は、リポソームの外側に存在する液体媒体を除去するために支持体を乾燥するステップ２）を行った後に行われた（本発明による方法）。
【図１４】微量滴定プレートでのテストにおける蛍光シグナルの質に対する、リポソーム溶解ステップ（ステップ３）中のリポソームの外側の液体媒体の存在または非存在の効果を示す図である。この図において、ウェルの左側のカラムは、本発明の方法によりリポソームの外側の液体媒体の除去後に乾燥することにより溶解ステップを受けたウェルに対応し（ｉ）、ウェルの中央のカラムは、リポソームが、本発明によらない比較方法により液体媒体の存在下で熱ショックにより溶解されたウェルに対応し（ｉｉ）、ウェルの右側のカラムは、本発明によらない比較方法により液体媒体の存在下での超音波処理により溶解されたウェルに対応する（ｉｉｉ）。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
しかしながら、これらの実施例は、純粋に本発明の例示のために示されており、決していかなる制限にもならないことが理解されるべきである。
【実施例１】
【００３３】
リポソームの蛍光に対する乾燥の効果の証明
ａ）フルオロフォアを含有するリポソームの調製
ａ−１）フルオロフォアを含有するリポソームの調製
リポソームは、５：５：０．５：０．２５のモル比でジパルミトイル−ｓｎ−３−グリセロホスホコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ．）、ジパルミトイル−ｓｎ−３−グリセロホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）およびジパルミトイル−ｓｎ−３−グリセロホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）からなる脂質の混合物から調製した。
【００３４】
この脂質混合物合計１００μｍｏｌを、６：６：１のモル比のクロロホルム、イソプロピルエーテルおよびメタノールからなる溶媒の混合物１０ｍｌに溶かした。窒素下で６０℃にてこの溶液を超音波処理した後に、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４中１５０ｍＭのフルオロフォア（スルホローダミンまたはＣｙ５（登録商標））１．５ｍｌを添加した。窒素下で６０℃にて６分にわたって超音波処理した後に、有機溶媒を、ロータリーエバポレーターを使用して４５℃にて真空下で蒸発させた。リポソームの懸濁液に対応するゲルは、このようにして得られた。０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４中１５０ｍＭのフルオロフォア（スルホローダミンまたはＣｙ５（登録商標））３ｍｌをこの溶液に添加した後に、超音波処理を、窒素下で６０℃にて５分にわたって行った。
【００３５】
ａ−２）リポソームの抽出
均一サイズ（０．４μｍ）のリポソームの溶液を得るために、リポソーム溶液を、水浴中で６０℃にてインキュベートし、細孔サイズを減少させながら（１．２μｍのフィルターを３回通過、次いで、０．４μｍのフィルターを３回通過）ポリカーボネート膜に通して押し出した。このようにして得られたリポソーム溶液を、４℃にて３０分にわたって４５，０００ｒｐｍで遠心分離した。リポソームを含有するペレットを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌに取り、次いで、遊離（非封入）スルホローダミンを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５ゲル上で排除クロマトグラフィーを行うことにより除去した。このクロマトグラフィーが終わったら、リポソーム溶液を、４℃にて３０分にわたって４５，０００ｒｐｍで遠心分離した。このようにして得られたペレットを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ４ｍｌに取り、暗所で４℃にて保存した。
【００３６】
ｂ）リポソームの蛍光に対する乾燥の効果の証明
フルオロフォアとしてスルホローダミンかＣｙ５（登録商標）のどちらかを含むリポソームを、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．１％  ＢＳＡ＋０．５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０＋０．０１％  ＮａＮ３中で１／５０、１／５００および１／５０００まで希釈した。
【００３７】
希釈液の各々５μ１を、カードボード支持体に結合している膜上に付着させ、次いで、蛍光を、それぞれスルホローダミンおよびＣｙ５（登録商標）について５３５ｎｍおよび６２５ｎｍの励起フィルター、およびそれぞれスルホローダミンおよびＣｙ５（登録商標）について６００ｎｍおよび６７０ｎｍの発光フィルターでＩｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４０００ＭＭ（Ｋｏｄａｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を使用して１分にわたって測定した。ストリップを、４０℃にてオーブン中で５分にわたって乾燥し、蛍光を、再び測定した。
【００３８】
結果を添付の図１に示す。
【００３９】
図１の凡例：
Ａ＝スルホローダミン
Ｂ＝Ｃｙ５（登録商標）。
【００４０】
図１で観察されるように、乾燥は、蛍光を大きく増加させる。
【実施例２】
【００４１】
免疫測定フォーマットでのストリップテストにおけるリポソームの使用
ａ）免疫測定アッセイの原理
図２は、テストラインが、固定化抗分析物抗体からなり、コントロールラインが、固定化抗マウス免疫グロブリン抗体からなる「免疫測定」アッセイの原理を概略的に示している。免疫クロマトグラフィーテストを行うのに使用されるストリップは、カードボード支持体に結合している３つの構成成分（サンプルパッド、ニトロセルロース膜および吸収バッド）からなる。探索される分析物がサンプル中に存在する場合、分析物は、まず、サンプルに添加されたリポソームと複合体形成し（前記リポソームの外面に結合しているマウス抗分析物抗体を介して）、次いで、次に、ストリップ上を移動する間に、テストライン上に固定化されている他の抗分析物抗体に結合するであろう。テストの正しい機能は、非複合体リポソームの外面に付着しているマウス抗分析物抗体の、固定化抗マウス免疫グロブリン抗体との結合によってコントロールラインにおいて検証される。サンプル中の探索されている分析物の存在は、テストラインにおけるシグナルの出現に反映されるであろう。逆に、サンプル中の分析物の非存在は、テストラインにおけるシグナルの非存在に反映されるであろう。
【００４２】
ｂ）免疫測定フォーマットにおけるストリップテストの調製
ｂ−１）免疫リポソームの調製
ｂ−１−１）スクシンイミジルアセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）によるリポソームの誘導
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中１０ｍｇ／ｍｌのＳＡＴＰの溶液１７μｌを、実施例１で前に記載されているように調製したスルホローダミンを含むリポソームの溶液３００μｌに添加した。２０℃にて１時間にわたってインキュベートした後に、反応を、１Ｍトリス／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７  １００μｌを添加することにより停止させた。１５分後、反応しなかったＳＡＴＰを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌを使用するＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５ゲルによる排除クロマトグラフィーにより除去した。リポソームに対応する分画を混ぜ、４℃にて３０分にわたって４５，０００ｒｐｍで遠心分離した。得られたペレットを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ２２５μｌに取り、ＳＡＴＰのチオール基を、１Ｍヒドロキシルアミン、ｐＨ７  ２５μｌを添加することにより脱保護した。
【００４３】
ｂ−１−２）Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）によるマウス抗体の修飾
ＤＭＦ中１ｍｇ／ｍｌのＳＭＣＣの溶液を、２０：１のモル比で、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４中の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）に対するマウスモノクローナル抗体の溶液に添加した。２０℃にて１時間にわたってインキュベートした後に、反応を、１５分にわたって、１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７を添加することにより停止させた。このようにして誘導された抗体を、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌでのＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ２５ゲル上の排除クロマトグラフィーにより精製し、抗体−ＳＭＣＣを含有する分画を、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。
【００４４】
ｂ−１−３）リポソームの抗体とのカップリング
リポソームの抗体とのカップリングは、抗体−ＳＭＣＣ ５００μｇを４℃にて一夜にわたって脱保護したリポソーム−ＳＡＴＰ（２５０μｌ）と一緒にインキュベートすることにより行った。カップリングしなかった抗体を、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌを使用するＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＣＩ−４Ｂゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）での排除クロマトグラフィーによりリポソームから分離した。リポソームに対応する分画を集め、４℃にて３０分にわたって４５，０００ｒｐｍで遠心分離した。得られたペレットを、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１％  ＮａＮ３  ５００μｌに取り、暗所で４℃にて保存した。
【００４５】
ｂ−２）ストリップの調製
ニトロセルロース膜上の検出ゾーンは、試薬の２つのライン：自動ディスペンサー（ＢｉｏＤｏｔ  ＡｉｒＪｅｔ（登録商標）３０５０、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用する、１μｌ／ｃｍでの、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中５００μｇ／ｍｌの抗マウス免疫グロブリン抗体の付着に対応するコントロールライン、および１μｌ／ｃｍでの、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中１ｍｇ／ｍｌの抗黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）抗体の沈着に対応するテストラインからなる。
【００４６】
膜を、オーブン中で４０℃にて１時間にわたって乾燥し、次いで、かき混ぜながら周囲温度にて３０分にわたって、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．５％ウシアルブミン（ＢＳＡ）で飽和させた。次いで、膜を、かき混ぜながら周囲温度にて５分にわたって超純水で２回洗浄し、次いで、かき混ぜながら周囲温度にて１５分にわたって、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．１５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０と一緒にインキュベートした。膜を、オーブン中で４０℃にて１５分にわたって乾燥し、次いで、サンプルパッドを、膜の下部に結合させ、吸収パッドを、膜の上部に結合させた。最後に、ストリップを、このようにして調製された膜を、プログラム可能な裁断機（Ｇｕｉｌｌｏｔｉｎｅ  Ｃｕｔｔｉｎｇ（登録商標）ＣＭ４０００、ＢｉｏＤｏｔ  Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ）を使用して５ｍｍの幅に切断することにより得た。
【００４７】
ｃ）免疫測定フォーマットでのストリップテストにおける蛍光に対する乾燥の効果の証明
パラグラフｂ−１）で前に得られたスルホローダミンおよび抗ＳＥＢモノクローナル抗体を含むリポソームを、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１％  ＮａＮ３中で１／５００まで希釈した。ＳＥＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）についての濃度範囲（１０；５；２．５；１．２５；０．６；０．３；０．１５；０．０８；０．０４；０．０２および０ｎｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．１％  ＢＳＡ＋０．５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０＋０．０１％  ＮａＮ３中で調製した。
【００４８】
リポソーム１０μｌと一緒に、ＳＥＢの濃度の各々１００μｌを、微量滴定プレートウェル中に沈着させた。暗所で周囲温度にてかき混ぜながら、１０分にわたってインキュベートした後に、パラグラフｂ−１）に記載されているように調製したストリップ（テストラインに固定化されている第２の抗ＳＥＢモノクローナル抗体を含む）を、垂直にウェルに入れると（溶液と接触しているサンプルパッド）、移動がキャピラリー作用により起こった。溶液がストリップ上を完全に移動した後に、これらをウェルから取り出した。
【００４９】
蛍光は、５３５ｎｍの励起フィルターおよび６００ｎｍの発光フィルターでＩｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ（登録商標）４０００ＭＭ（Ｋｏｄａｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を使用して１分にわたって測定した。ストリップを、サンプルパッドおよび吸収パッドから取り除いた後に、オーブン中で４０℃にて５分にわたって乾燥し（ステップ２および３）、蛍光を、前と同じ条件下で測定した。
【００５０】
結果を図３に示す。
【００５１】
結果は、乾燥が、テストラインおよびコントロールラインにおいて蛍光シグナルを得ることを可能にすることを示している。さらに、テストラインにおけるシグナルは、ＳＥＢの濃度と共に増加し、免疫測定フォーマットの原理と一致している。
【００５２】
この実験は、液体を除去し、次いで、乾燥することが、ストリップテストにおける蛍光標識としてリポソームを使用するのに不可欠であることを証明している。
【００５３】
ｄ）免疫測定フォーマットでの比色測定または蛍光測定でリポソームについて得られる検出限界の比較
フルオロフォアとしてのスルホローダミンおよび抗ＳＥＢモノクローナル抗体を含むリポソームを、パラグラフｂ−１）で前に記載されているように調製し、次いで、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１％  ＮａＮ３中で１／５０まで希釈した。ＳＥＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）についての濃度範囲も、パラグラフｃ）で上記に記載されているように調製した。
【００５４】
リポソームをＳＥＢの様々な濃度と接触させること、次いで、キャピラリー作用による移動は、パラグラフｃ）で前に記載されているように行った。
【００５５】
溶液がストリップ上を完全に移動した後に、サンプルパッドおよび吸収パッドを取り除き、ストリップを、４０℃にて５分にわたって乾燥し（ステップ２および３）、蛍光を、パラグラフｃ）で前に記載されているように測定し、次いで、これらの同じストリップを、比色シグナルを測定するためにＥｐｓｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（登録商標）１６４０ＸＬスキャナーでスキャンした。
【００５６】
結果を図４に示す。
【００５７】
結果は、蛍光シグナルについて得られた検出限界が、約２０ｐｇ／ｍｌであり、一方、比色シグナルについては約３００ｐｇ／ｍｌであることを示している。
【００５８】
したがって、乾燥方法による蛍光シグナルの使用は、同じ条件下で同じ試薬を使用して、検出限界を１５倍まで高めることを可能にする。
【００５９】
ｅ）免疫測定フォーマットでのストリップテストにおける蛍光シグナルの定量化の例
フルオロフォアとしてのスルホローダミンおよび抗ＳＥＢモノクローナル抗体を含むリポソームを調製し、パラグラフｃ）で前に記載されているように１／５００まで希釈した。ＳＥＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）についての濃度範囲も、パラグラフｃ）で前に記載されているように調製した。
【００６０】
リポソームをＳＥＢの様々な濃度と接触させること、次いで、キャピラリー作用による移動は、パラグラフｃ）で前に記載されているように行った。
【００６１】
溶液がストリップ上を完全に移動した後に、蛍光を、パラグラフｃ）で前に記載されているように１分にわたって測定した。サンプルパッドおよび吸収パッドを取り除き、次いで、ストリップを、４０℃にて５分にわたって乾燥し（ステップ２および３）、蛍光を、パラグラフｃ）で前に記載されているように１分および５分にわたって測定した。各濃度に対応する蛍光シグナルを定量化するために、同じストリップのテストラインとコントロールラインの間に位置する同じ寸法のゾーンの蛍光シグナルを、テストラインの蛍光シグナルから減じた。すべてのこれら定量化は、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．、Ｉｍａｇｅ  Ｊ．Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡ、ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／、１９９７〜２００６）を使用して行った。
【００６２】
結果を図５に示す。
【００６３】
結果は、長時間にわたって蛍光を測定することが、蛍光シグナルを増加させ、それによって、検出限界を高めることを可能にすることを示している。したがって、読み取り時間は、得られる結果および望ましい検出限界に従って調節することができる。
【実施例３】
【００６４】
競合フォーマットでのストリップテストにおけるリポソームの使用
ａ）競合フォーマットの原理
図６は、テストラインが、固定化分析物またはその固定化類似体からなり、コントロールラインが、固定化抗マウス免疫グロブリン抗体からなる「競合」アッセイの原理を概略的に示している。探索される分析物がサンプル中に存在する場合、分析物は、まず、免疫リポソームの外面に付着しているマウス抗分析物抗体と結合し、したがって、結合部位が占有されているためにストリップ上を移動中にテストラインに固定化されている分析物またはその類似体ともはや結合することができないであろう。したがって、サンプル中の探索されている分析物の存在は、テストラインにおけるシグナルの減少または完全消失に反映されるであろう。逆に、探索されている分析物がサンプル中に存在しない場合、これは、リポソームを、テストラインに固定化されている分析物またはその類似体に結合させ、したがって、テストラインにおけるシグナルの存在に反映されるであろう。すべての場合において、コントロールラインにおけるシグナルは、免疫リポソームの外面に付着しているマウス抗分析物抗体を介するリポソームの固定化抗マウス免疫グロブリン抗体との結合によって最大で不変のままである。
【００６５】
ｂ）ストリップテストの調製
ｂ−１）免疫リポソームの調製
リポソームは、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４中の抗ミクロシスチンＬＲマウスモノクローナル抗体の溶液を使用したことを除いて、実施例２のパラグラフｂ−１）で前に記載されているように調製する。
【００６６】
ｂ−２）ストリップの調製
使用されるストリップは、テストラインが、１μｌ／ｃｍでの、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中５μｇ／ｍｌのウシアルブミンにカップリングされているミクロシスチンＬＲの付着に対応していることを除いて、実施例２のパラグラフｂ−２）で前に記載されているように調製する。
【００６７】
ｃ）競合フォーマットでのストリップテスト
このようにして得られたフルオロフォアとしてのスルホローダミンおよび抗ミクロシスチンＬＲマウスモノクローナル抗体を含むリポソームを、実施例２のパラグラフｃ）で前に記載されているように１／５００まで希釈した。ミクロシスチンＬＲ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）についての濃度範囲（３；１．５；０．７５；０．３８；０．１９；０．０９および０ｎｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．１％  ＢＳＡ＋０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０＋０．０１％  ＮａＮ３中で調製した。
【００６８】
リポソーム１０μｌと一緒に、ミクロシスチンＬＲの濃度の各々１００μｌを、微量滴定プレートウェル中に付着させた。１０分にわたってインキュベートした後に、ストリップ（テストラインに固定化されているＢＳＡにカップリングされているミクロシスチンと一緒に）を、垂直にウェルに入れた。溶液がストリップ上を完全に移動した後に、サンプルパッドおよび吸収パッドを取り除き、ストリップを、４０℃にて５分にわたって乾燥し（ステップ２および３）、蛍光を、実施例２のパラグラフｃ）で前に記載されているのと同じ条件下で１分にわたって測定した。
【００６９】
結果を図７に示す。
【００７０】
結果は、リポソームが、使用される検出フォーマットに関係なく使用することができることを示している。蛍光シグナルは、ミクロシスチンの濃度と反比例しており、競合フォーマットと一致している。
【実施例４】
【００７１】
膜上のリポソームの他の応用：ウェスタンブロッティング
プリオンタンパク質を検出するためのマウス脳抽出物か、全精製マウス免疫グロブリンもしくはＦ（ａｂ’）２フラグメントの形態の精製マウス免疫グロブリンのいずれかのサンプルを使用した。マウス脳抽出物を、β−メルカプトエタノール２．５％を含有するＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ６．８、＋０．１％  ＳＤＳ＋１０％グリセロール＋０．３％ブロモフェノールブルー）中で１／５０、１／１００、１／２００および１／４００まで希釈した。免疫グロブリンを、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中で１μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌまで希釈した。
【００７２】
脳抽出物は、１２％ポリアクリルアミドゲル上にロードし（１５μｌ／希釈液）、免疫グロブリンは、６％ポリアクリルアミドゲル上にロードした（１５μｌ／希釈液）。それらは、二つ組でロードした。電気泳動を、Ｔｒｉｓ／グリシン泳動緩衝液で２００ボルトにて１時間にわたって行った。
【００７３】
ポリアクリルアミドゲル中に存在する分子の電子移動は、１時間にわたって１００ボルトにてＴｒｉｓ／ＣＡＰＳ緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ）中のＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）という商品名で販売されているＰｏｌｙＶｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ＤｉＦｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ）膜上で行った。
【００７４】
膜を回収し、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ＰＢＳ）中、次いで、エタノール中、最後に、５分にわたる水中の素早い浸漬によりすすいだ。膜を、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０＋５％  ＢＳＡ中で３０分にわたって飽和させた。膜を、２回の短い洗浄（１０秒）、次いで、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０による５分の洗浄によりすすいだ。
【００７５】
マウス脳抽出物に対応する膜を、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０＋１％  ＢＳＡ中で４μｇ／ｍｌまで希釈された抗プリオンタンパク質抗体と一緒に周囲温度にて３０分にわたってプレインキュベートし、次いで、素早い浸漬と、続く、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０中の５および１０分にわたる２回の洗浄によりすすいだ。
【００７６】
次いで、脳抽出物および免疫グロブリンに対応する膜を、周囲温度にて２０分にわたって、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０＋３％  ＢＳＡ中で１／１０００まで希釈されたペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）にカップリングされている抗マウス免疫グロブリン抗体か、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０＋３％  ＢＳＡ中で１／５００まで希釈されている、スルホローダミンを含有し抗マウス免疫グロブリン抗体にカップリングされているリポソームのどちらかと一緒にインキュベートした。続いて、膜を、素早い浸漬と、続く、５分にわたる１回の洗浄およびＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中の１０分にわたる２回の洗浄によりすすいだ。最後に、膜を、１分にわたってＰＢＳ中ですすいだ。
【００７７】
続いて、リポソームに対応する膜を、４０℃にて５分にわたって乾燥し（ステップ２および３）、蛍光を、１分（図８）および５分（図９）にわたって測定した。
【００７８】
ペルオキシダーゼに対応する膜を、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ）に浸漬し、次いで、プラスチックフィルムの下に置き、ルミネッセンスを、Ｋｏｄａｋ（登録商標）２０００  ＭＭイメージステーションを使用し、励起または発光フィルターなしに、１分（図８）および５分（図９）にわたって読み取った。この測定後、ルミネッセンスも、従来の手順による写真用フィルムを使用して明らかにされた（図９）。
【００７９】
結果を図８および９に示す。
【００８０】
図８（０〜２５００のシグナルスケール）に示すように、リポソーム溶解に先立って膜を乾燥することは、良質の局在的な蛍光シグナルを得て、それによってストリップで得られる結果を確認するのに不可欠である。
【００８１】
図９「リポソーム」（０〜１６，０００のシグナルスケール）に示すように、リポソームは、写真用フィルムにより明らかにされるルミネッセンスの感度（図９「ペルオキシダーゼ写真用フィルム」、Ｉｍａｇｅ  Ｊにより処理される写真用フィルムのスキャン）と少なくとも同等であり、Ｋｏｄａｋ（登録商標）ステーションを使用して測定される発光で得られる感度（図９「ペルオキシダーゼＫｏｄａｋ（登録商標）ステーション」、０〜１６０のシグナルスケール）よりもかなり高い感度を得ることを可能にする。さらに、抗体により明らかにされる様々な分子に対応するバンドは、免疫リポソームについてはかなり少ない拡散であり、その分析を容易にし、前記分析をより正確にする。
【実施例５】
【００８２】
微量滴定プレートにおけるリポソームの使用
ウェルが、黒い壁であるが透明な底を有するポリスチレン微量滴定プレート（Ｃｏｌｓｔａｒ）を使用した。これらのプレートのポリスチレンは、高いタンパク質吸着能力を有する。
【００８３】
０．０５Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４中１ｍｇ／ｍｌのニュートラアビジン（Ｐｉｅｒｃｅにより販売されているアビジン類似体）の溶液１μｌを、ウェルの底に付着させた。湿性チャンバー内で２０℃にて１６時間にわたってインキュベートした後に、ニュートラアビジン溶液を除去し、プレートを、０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（洗浄用緩衝液）で洗浄した。
【００８４】
プレート上の吸着部位を、０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１％  ＢＳＡ＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１％  ＮａＮ３の溶液（希釈緩衝液）３００μｌをウェル中に付着させることにより飽和させた。リン酸塩緩衝液でプレートを洗浄した後に、１μｇ／ｍｌのビオチニル化した第１の抗エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）抗体４０μｌを、２０℃にて３０分にわたって、ウェル中に付着させた。
【００８５】
並行して、希釈緩衝液中のある範囲のＳＥＢ（１０；３．３３；１．１１；０．３７；０．１２；０．０４１および０ｎｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中で１／５００まで希釈されたリポソーム（スルホローダミンＢを含有する）と混ぜ、第２の抗ＳＥＢ抗体をカップリングさせた。２０℃にて３０分にわたってインキュベートし、洗浄用緩衝液でプレートを洗浄した後に、これらの溶液４０μｌを、２０℃にて３０分にわたってウェル中に付着させた。続いて、プレートを洗浄し、次いで、０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  １００μｌを付着させ、蛍光を、１分にわたってＫｏｄａｋ（登録商標）Ｓｔａｔｉｏｎ（５３５ｎｍの励起フィルターおよび６００ｎｍの発光フィルター）で測定した（図１０Ａ）。この読み取りの後に、ウェルを、空にし、プレートを、オーブン中で４０℃にて１０分にわたって乾燥した。さらなる読み取りを、１分にわたってＫｏｄａｋ（登録商標）Ｓｔａｔｉｏｎで行い（図１０Ｂ）、各ウェルの蛍光を、ＰＣＯ１６００カメラ（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｌｉｎｅｓ）に連結されている倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（登録商標）ＩＸ７１）を使用し、５秒（図１１Ａ）および１５秒（図１１Ｂ）にわたって測定し、それによって、５秒（黒三角）および１５秒（黒四角）におけるＳＥＢの濃度（ｎｇ／ｍｌ）の関数として測定された蛍光の量（任意の単位）を表す曲線（図１２）をプロットすることを可能にした。
【００８６】
図１０の結果は、他の固体支持体に関して、乾燥が、蛍光シグナルの出現を観察するために必要であることを示している。
【００８７】
さらに、図１１の結果は、蛍光シグナルが、スポットに完全に局在していることを示している。最後に、図１２の結果は、得られるシグナルが、定量化可能であり、サンプル中に存在する分析物の量に比例していることを示している。すべてのこれらの知見は、数千のスポットからなり、ポリヌクレオチドか、ペプチドもしくはタンパク質のどちらかを分析するバイオチップについてリポソームの使用を想定することを可能にする。
【００８８】
したがって、本発明の主題は、バイオチップを読み取るための、上記で定義されているような検出および定量化方法の使用でもある。
【実施例６】
【００８９】
支持体を乾燥し、リポソームを溶解するために使用される手順の重要性の証明
ａ）ストリップテストにおけるリポソームの使用
スルホローダミンおよび抗ＳＥＢモノクローナル抗体を含むリポソームを、実施例２のパラグラフｂ−１）で前に記載されているように調製した。続いて、これらのリポソームを、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１％  ＮａＮ３中で１／５００まで希釈した。２濃度（５および０ｎｇ／ｍｌ）のエンテロトキシンＢ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．１％  ＢＳＡ＋０．５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０＋０．０１％  ＮａＮ３中で調製した。ＳＥＢの各濃度１００μｌを、リポソーム１０μｌと一緒に微量滴定プレートウェル中に付着させた。１０分にわたってインキュベートした後に、ストリップ（テストラインに固定化されている第２の抗ＳＥＢモノクローナル抗体と一緒に）を、ウェルに垂直に入れた。２つのストリップを、エンテロトキシンＢの各濃度について調製した。溶液がストリップ上を完全に移動した後に、サンプルパッドおよび吸収パッドを、濃度の各々のストリップのうちの１つから取り除き、ストリップを、４５分にわたって４０℃にて乾燥した。
【００９０】
濃度の各々の他のストリップについては、パッドを取り除かず、ストリップを、４５分にわたって４０℃にてオーブン中で乾燥させた。ストリップのための乾燥時間は、膜単独を乾燥するより（約５分）もパッドを乾燥するのにかなり時間がかかることから、前よりも長かった。
【００９１】
次いで、蛍光を、実施例２）ｃ）で上記に前に示されているのと同じ条件下で読み取った。
【００９２】
結果を添付の図１３に示すが、左側の２つのストリップについて得られた結果（図１３Ａ）は、パッドが乾燥ステップの前に取り除かれなかったストリップについて得られたものであり、一方、右側の２つのストリップについて得られた結果（図１３Ｂ）は、パッドが乾燥ステップの前に取り除かれたストリップについて得られたものである。
【００９３】
これらの結果は、リポソーム溶解が、たとえリポソームの外側に存在する液体媒体が完全に除去されなくても起こる場合に、ストリップ上にシグナルの制御されない拡散が存在することを示している。この現象は、不均一な乾燥に起因する。このことは、ストリップがパッドよりも素早く乾燥し、それによって、リポソームの溶解およびパッドから生じる液体の移動を引き起こし、ストリップ上で遊離フルオロフォアの制御されない拡散を引き起こすことが原因である。
【００９４】
ｂ）微量滴定プレートにおけるリポソームの使用
この試験を行うために、ウェルが、黒い壁であるが透明な底を有するポリスチレン微量滴定プレート（Ｃｏｓｔａｒ）を使用した。これらのプレートのポリスチレンは、高いタンパク質吸着能力を有する。０．０５Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４中１ｍｇ／ｍｌの濃度のＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ社、ＵＳＡにより販売されているアビジン類似体）の溶液１μｌを、ウェルの底に付着させた。湿性チャンバー内で２０℃にて１６時間にわたってインキュベートした後に、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）溶液を除去し、プレートを、０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．０１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（洗浄用緩衝液）で洗浄した。
【００９５】
プレート上の吸着部位を、０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１％ウシアルブミン＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１％  ＮａＮ３の溶液（希釈緩衝液）３００μｌをウェル中に付着させることにより飽和させた。洗浄用緩衝液でプレートを洗浄した後に、１μｇ／ｍｌのビオチニル化した第１の抗エンテロトキシンＢ抗体４０μｌを、２０℃にて３０分にわたってウェル中に付着させた。並行して、希釈緩衝液中のある範囲のエンテロトキシンＢ（１０；５；２．５；１．２５；０．６；０．３および０ｎｇ／ｍｌ）を、スルホローダミンＢ（上記の実施例２のステップｂ−１）で調製したような）を含有し、０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中で１：５００まで希釈したリポソームと混ぜ（ｖ／ｖ）、これに、第２の抗エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）抗体を、実施例２、ステップｂ−１−２）およびｂ−１−３）で上記に記載されているようにカップリングさせた。２０℃にて３０分にわたってインキュベートし、洗浄用緩衝液でプレートを洗浄した後に、これらの溶液４０μｌを、２０℃にて３０分にわたってウェル中に付着させた。各濃度を、３つの別々のウェル中に付着させた。続いて、プレートを洗浄し、同じ濃度に対応する３つのウェルを、別々に処理した：
ｉ）１つのウェルは、空のままにしておいた（本発明の方法による、免疫リポソームの外側の液体媒体の非存在下での続く乾燥によるリポソーム溶解のため）、
ｉｉ）０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ４０μｌを、第２のウェルに、１００℃にて添加した（熱ショックによるリポソーム溶解を行い、次いで、緩衝液の存在下でそれらを乾燥するため：本発明の１部ではない比較方法）、
ｉｉｉ）第３のウェルは、その中に０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４、＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ４０μｌを付着させた後に、１０秒にわたって超音波を受けた（緩衝液の存在下で乾燥ステップの前に超音波の作用によるリポソーム溶解を行うため：本発明の１部ではない比較方法）。
【００９６】
次いで、すべてのウェルを、オーブン中で４０℃にて３時間にわたって乾燥した。緩衝液４０μｌを含有するウェルを完全に乾燥するためには、以前（実施例５）よりも長い乾燥時間が必要である。各ウェルの蛍光を、ｐｃｏ．１６００カメラ（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｌｉｎｅ社により販売されている）に連結されている倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１）を使用して５秒にわたって測定した。
【００９７】
結果を添付の図１４に示す。
【００９８】
この図において、
−  左側のウェルのカラムは、本発明の方法により、免疫リポソームの外側に存在する液体媒体の除去後に乾燥ステップを受けたウェルに対応し（ｉ）、
−  ウェルの中央のカラムは、液体媒体中の熱ショックによるリポソーム溶解後に乾燥されたウェルに対応し（ｉｉ）、
−  右側のウェルのカラムは、液体媒体中の超音波処理によるリポソーム溶解後に乾燥されたウェルに対応している（ｉｉｉ）。
【００９９】
得られた結果は、リポソーム溶解が、それ自体で局在的な蛍光シグナルを得るには十分でないことを示している。実際に、液体媒体中の熱ショックまたは超音波によるリポソーム溶解が、蛍光シグナルの大きな減少または完全な消失さえも引き起こし、一方、液体媒体の非存在下でリポソームを乾燥することは、きわめて局在的な蛍光シグナルを得ることを可能にすることが図１４で観察される。
【０１００】
結論として、蛍光シグナルを明らかにするステップは、リポソーム溶解を液体のない環境、すなわち、フルオロフォアの拡散を許さない環境で行うために、リポソーム溶解に使用される処理とは関係なく、使用される固体支持体に適しているプロトコルおよび処理に従って行われるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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