(57)【要約】  本発明は、Ｔ細胞およびその調節不全と関係する疾患を調節するために有用な方法及び組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫性疾患の治療方法であって、被検体にＣＲＴＡＭ調節因子の有効量を投与することを含み、該調節因子が活性化されたＴ細胞サブ集団におけるＣＲＴＡＭ活性を阻害するものであり、それによって疾患が治療される方法。
【請求項２】
前記被検体がヒト患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記調節因子がモノクローナル抗体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体がブロッキング抗体、非ブロッキング抗体又は枯渇抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が枯渇抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が抗体断片である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、ｓｃＦｖ、(ｓｃＦｖ)２、ｄＡｂ、相補性決定領域(ＣＤＲ)断片、線形抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディおよび抗体断片から形成される多特異性抗体からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がキメラ、ヒト化、ヒトである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記枯渇抗体が毒素を含む抗体コンジュゲートである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記毒素が、放射性同位体、酵素および小分子毒素からなる群から選択される細胞障害性剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記自己免疫性疾患が、関節リウマチ(ＲＡ)；多発性硬化症(ＭＳ)；全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)；ループス腎炎；皮膚紅班性狼瘡(ＣＬＥ)；自己免疫性肝炎；若年性関節リウマチ；感染性肝炎；原発性胆管萎縮症；乾癬；皮膚炎；アトピー性皮膚炎；全身強皮症；全身性硬化症；クローン病、潰瘍性大腸炎；呼吸窮迫症候群；成人呼吸窮迫症候群；ＡＲＤＳ；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；糸球体腎炎；ペンフィグス；マクロファージ活性化症候群；湿疹；喘息；アテローム性動脈硬化；白血球接着欠損；真正糖尿病；Ｉ型糖尿病；インスリン依存性糖尿病；アレルギー性鼻炎；臓器移植と関係する自己免疫応答；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；橋本甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年型糖尿病；サイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される急性の遅発性過敏症と関係する免疫応答；結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症；血管炎；悪性貧血(アジソン病)；白血球血管外遊出を伴う疾患；中枢神経系(ＣＮＳ)炎症性疾患；多臓器損傷症候群；溶血性貧血；クリオグロブリン血症；クームズ陽性貧血症；重症筋無力症；抗原抗体複合体媒介性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート-イートン筋無力症症候群；水疱性類天ぽうそう；ペンフィグス；自己免疫性多腺性内分泌障害；ライター症候群；全身強直性症候群；ベーチェット疾患；巨細胞動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡネフロパシー；ＩｇＭ多発性神経炎；免疫性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)および自己免疫性血小板減少からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記自己免疫性疾患が、関節リウマチ(ＲＡ)、多発性硬化症(ＭＳ)、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、皮膚紅班性狼瘡(ＣＬＥ)、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、アトピー性皮膚炎、喘息、臓器移植と関係する自己免疫応答、自己免疫性肝炎、若年性関節リウマチ、感染性肝炎、糸球体腎炎、原発性胆管萎縮症、血管炎、ペンフィグス、マクロファージ活性化症候群、アレルギー性鼻炎、１型糖尿病および２型糖尿病からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記自己免疫性疾患が活性化されたＣＤ４＋ＣＲＴＡＭ＋Ｔ細胞の存在を特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ＣＲＴＡＭ−Ｔ細胞における一又は複数のサイトカインの発現と比較した場合に、一又は複数のサイトカインの発現レベルの増加を特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ＣＲＴＡＭ−Ｔ細胞における一又は複数のサイトカインの分泌レベルと比較した場合に、一又は複数のサイトカインの分泌レベルの増加を特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記サイトカインがＩＦＮγである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記サイトカインがＩＬ２２である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記サイトカインがＩＦＮγ、ＩＬ２２又はＩＬ１７である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｔ細胞が、自己応答性である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療が、前記ＣＲＴＡＭ調節因子が投与されなかった哺乳動物被検体と比較した場合に、前記哺乳動物被検体におけるサイトカイン発現の減少を特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療が、前記ＣＲＴＡＭ調節因子が投与されなかった被検体と比較した場合に、前記被検体におけるサイトカイン分泌レベルの減少を特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記サイトカインがＩＦＮγである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記サイトカインがＩＬ２２である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記サイトカインがＩＦＮγ、ＩＬ２２又はＩＬ１７である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
疾患の治療方法であって、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性を亢進するＣＲＴＡＭ調節因子の有効量を被検体に投与することを含み、該疾患が癌、免疫不全又は感染である方法。
【請求項２６】
Ｔ細胞活性化と関連する生物学的活性の阻害方法であって、ＣＲＴＡＭ調節因子をＴ細胞と接触させ、該調節因子がＣＲＴＡＭを発現するＴ細胞の活性を阻害するものである方法。
【請求項２７】
前記調節因子がモノクローナル抗体を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗体がアフコシル化されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体がブロッキング抗体、非ブロッキング抗体又は枯渇抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が枯渇抗体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体が抗体断片である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、ｓｃＦｖ、(ｓｃＦｖ)２、ｄＡｂ、相補性決定領域(ＣＤＲ)断片、線形抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディおよび抗体断片から形成される多特異性抗体からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体がキメラ、ヒト化、ヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体が毒素を含む抗体コンジュゲートである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記毒素が放射性同位体、酵素および小分子毒素からなる群から選択される細胞障害性剤である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
Ｔ細胞活性化と関連する生物学的活性の亢進方法であって、ＣＲＴＡＭ調節因子をＣＤ４＋Ｔ細胞と接触させ、該調節因子がＣＲＴＡＭを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の活性を亢進するものである方法。
【請求項３７】
自己免疫性疾患の検出方法であって、 
(a) 被検体およびコントロールからのＴ細胞を含む第一試験試料とＣＲＴＡＭ調節因子とを接触させ、そして、(b) 該試験試料におけるＣＲＴＡＭ＋細胞の相対量が該コントロールにおけるＣＲＴＡＭ＋細胞の相対量より多いことを決定し、このとき該試験試料におけるＣＲＴＡＭ＋細胞の相対量が高い場合に、該哺乳動物被検体での自己免疫性疾患が示される、方法。
【請求項３８】
さらに、 
(c) 前記被検体からのＴ細胞を含む第二試験試料を得て、
(d) 該第二試験試料とＣＲＴＡＭ調節因子とを接触させ、そして、(e) 該第二試験試料におけるＣＲＴＡＭ＋細胞の相対量が前記第一試験試料におけるＣＲＴＡＭ＋細胞の相対量より多いことを決定し、このとき該第二試験試料におけるＣＲＴＡＭ＋細胞の相対量が高い場合に、該試験試料を採取した被検体での自己免疫性疾患の再燃が示される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
試験試料がＣＲＴＡＭ＋Ｔ細胞を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
試験試料がＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
試験試料がＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
試験試料がＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記自己免疫性疾患が、関節リウマチ(ＲＡ)；多発性硬化症(ＭＳ)；全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)；ループス腎炎；皮膚紅班性狼瘡(ＣＬＥ)；自己免疫性肝炎；若年性慢性関節リウマチ、感染性肝炎；原発性胆管萎縮症；乾癬；皮膚炎；アトピー性皮膚炎；全身強皮症；全身性硬化症；クローン病、潰瘍性大腸炎；呼吸窮迫症候群；成人呼吸窮迫症候群；ＡＲＤＳ；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；糸球体腎炎；ペンフィグス；マクロファージ活性化症候群；湿疹；喘息；アテローム性動脈硬化；白血球接着欠損；真正糖尿病；Ｉ型糖尿病；インスリン依存性糖尿病；アレルギー性鼻炎；臓器移植と関係する自己免疫応答；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；橋本甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年型糖尿病；サイトカインおよびＴリンパ球が媒介する急性の遅発性過敏症と関係する免疫応答；結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症；血管炎；悪性貧血(アジソン病)；白血球血管外遊出を伴う疾患；中枢神経系(ＣＮＳ)炎症性疾患；多器官損傷症候群；溶血性貧血；クリオグロブリン血症；クームズ陽性貧血症；重症筋無力症；抗原-抗体複合体媒介性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート-イートン筋無力症症候群；水疱性類天疱瘡；ペンフィグス；自己免疫性多腺性内分泌障害；ライター症候群；全身強直性症候群；ベーチェット疾患；巨細胞動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡネフロパシー；ＩｇＭ多発性神経炎；免疫血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)および自己免疫性血小板減少からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記自己免疫性疾患が、関節リウマチ(ＲＡ)、多発性硬化症(ＭＳ)、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、皮膚紅班性狼瘡(ＣＬＥ)、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、アトピー性皮膚炎、喘息、臓器移植と関係する自己免疫応答、自己免疫性肝炎、若年性関節リウマチ、感染性肝炎、糸球体腎炎、原発性胆管萎縮症、血管炎、ペンフィグス、マクロファージ活性化症候群、アレルギー性鼻炎、１型糖尿病および２型糖尿病からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記自己免疫性疾患が活動中の自己免疫性疾患である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記活動中の自己免疫性疾患が、活性化されたＴ細胞の存在を特徴とし、このとき該Ｔ細胞はＣＤ４＋ＣＲＴＡＭ＋Ｔ細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
さらに、前記活性化されたＴ細胞がＣＤ４＋ＣＲＴＡＭ−Ｔ細胞における一又は複数のサイトカインの発現レベルと比較した場合に、一又は複数のサイトカインの発現レベルの増加を特徴する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
さらに、前記活性化されたＴ細胞が、ＣＤ４＋ＣＲＴＡＭ−Ｔ細胞における一又は複数のサイトカインの分泌レベルと比較した場合に、一又は複数のサイトカインの分泌レベルの増加を特徴とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記サイトカインがＩＦＮγである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記サイトカインがＩＬ２２である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記サイトカインがＩＦＮγ、ＩＬ２２又はＩＬ１７である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記活性化されたＴ細胞が自己応答性である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
(1) ＣＲＴＡＭの発現、及び(2) ＣＲＴＡＭを発現しないＣＤ４＋活性化Ｔ細胞と比較して一又は複数のサイトカインの発現レベルの増加を特徴とする、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離された集団。
【請求項５４】
前記サイトカインがＩＦＮγ、ＩＬ２２又はＩＬ１７である、請求項５３に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項５５】
活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞の集団の単離方法であって、被検体からのＴ細胞の混合集団を含む試料を抗ＣＲＴＡＭ抗体と接触させ、該ＣＲＴＡＭ抗体と結合しない該混合集団のいずれかの細胞を分離することを含み、このとき該ＣＲＴＡＭ抗体が結合した活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団が該試料中に残る、方法。
【請求項５６】
さらに、前記結合したＣＲＴＡＭ抗体を、前記ＣＲＴＡＭ抗体に結合した活性化ＣＤ４＋細胞の集団から分離することを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ＣＲＴＡＭ調節因子と、自己免疫性疾患を治療するために該調節因子を投与することについての指示とを具備するキット。
【請求項５８】
前記調節因子がモノクローナル抗体を含む、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記抗体がブロッキング抗体、非ブロッキング抗体又は枯渇抗体である、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
前記抗体が枯渇抗体である、請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
前記抗体が抗体断片である、請求項５９に記載のキット。
【請求項６２】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、ｓｃＦｖ、(ｓｃＦｖ)２、ｄＡｂ、相補性決定領域(ＣＤＲ)断片、線形抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディおよび抗体断片から形成される多特異性抗体からなる群から選択される、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
前記抗体がキメラ、ヒト化、ヒトである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記枯渇抗体が毒素を含む抗体コンジュゲートである、請求項６０に記載のキット。
【請求項６５】
前記毒素が、放射性同位体、酵素および小分子毒素からなる群から選択される細胞障害性剤である、請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】
自己免疫性疾患を治療するための医薬の調製におけるＣＲＴＡＭ調節因子の使用。
【請求項６７】
前記調節因子がモノクローナル抗体を含む、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
前記抗体がブロッキング抗体、非ブロッキング抗体又は枯渇抗体である、請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
前記抗体が枯渇抗体である、請求項６８に記載の使用。
【請求項７０】
前記抗体が抗体断片である、請求項６８に記載の使用。
【請求項７１】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、ｓｃＦｖ、(ｓｃＦｖ)２、ｄＡｂ、相補性決定領域(ＣＤＲ)断片、線形抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディおよび抗体断片から形成される多特異性抗体からなる群から選択される、請求項７０に記載の使用。
【請求項７２】
前記抗体がキメラ、ヒト化、ヒトである、請求項６８に記載の使用。
【請求項７３】
前記枯渇抗体が毒素を含む抗体コンジュゲートである、請求項６９に記載の使用。
【請求項７４】
前記毒素が、放射性同位体、酵素および小分子毒素からなる群から選択される細胞障害性剤である、請求項７３に記載の使用。
【請求項７５】
自己免疫性疾患の治療に用いられるためのＣＲＴＡＭ調節因子。
【請求項７６】
前記調節因子がモノクローナル抗体を含む、請求項７５に記載の調節因子。
【請求項７７】
前記抗体がブロッキング抗体、非ブロッキング抗体又は枯渇抗体である、請求項７６に記載の抗体。
【請求項７８】
前記抗体が枯渇抗体である、請求項７７に記載の抗体。
【請求項７９】
前記抗体が抗体断片である、請求項７７に記載の抗体。
【請求項８０】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、ｓｃＦｖ、(ｓｃＦｖ)２、ｄＡｂ、相補性決定領域(ＣＤＲ)断片、線形抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディおよび抗体断片から形成される多特異性抗体からなる群から選択される、請求項７９に記載の抗体。
【請求項８１】
前記抗体がキメラ、ヒト化又はヒトである、請求項７７に記載の抗体。
【請求項８２】
前記枯渇抗体が毒素を含む抗体コンジュゲートである、請求項７８に記載の抗体。
【請求項８３】
前記毒素が、放射性同位体、酵素および小分子毒素からなる群から選択される細胞障害性剤である、請求項８２に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の説明）
本出願は、２００７年８月３０日に出願の米国仮特許出願第６０／９６９０５９号及び２００８年３月５日に出願の米国仮特許出願第６１／０３４０２１号の優先権を主張するものであり、これらは出典明記によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
（技術分野）
本発明は、概して免疫関連疾患および他の病的状態の治療の分野に関する。特に、本発明は、活性化されたＴ細胞におけるＣＲＴＡＭ発現と関係している分子事象を調節するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞とＡＰＣとの間の配位相互作用は、それらのエフェクター機能の効率的なＴＣＲ活性化および発達のために必要である(Dustin and Cooper, 2000；Friedl et al., 2005；Huppa and Davis, 2003；Krummel and Macara, 2006；Vicente-Manzanares and Sanchez-Madrid, 2004)。ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２８を含む表面コレセプターは、Ｔ細胞：ＡＰＣ接触領域の開始シグナル伝達プラットフォームを協調し、サイトカイン産生およびエフェクター機能に必要な膜動力学、細胞極性および細胞形状の変化を誘導する。多くのＴＣＲ活性化遺伝子は、その後の細胞の運命およびレパートリーの決定を制御する(Cantrell, 1996)。転写因子、例えばＴｂｘ２１／Ｔ-ｂｅｔ、Ｇａｔａ３、Ｒｏｒｃ(γｔ)およびＦｏｘｐ３の上方制御はＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ１７およびＴｒｅｇ細胞へのＴ細胞サブセット分化をそれぞれ制御する(Lee et al., 2006；Tato et al., 2006)。ＣＤ２５などの細胞表面タンパク質が上方制御されるとＩＬ２反応性となり、細胞がサイトカイン媒介性の細胞分裂が可能となる(Ma et al., 2006)。逆にいえば、ＣＴＬＡ４が上方制御されると、Ｔ細胞応答が調節され、ＴＣＲレパートリーの形成を促す(Teft et al., 2006)。したがって、ＴＣＲ活性化後の分子の発現の調節は、Ｔ細胞応答の決定に重要な役割を果たしうる。
【０００３】
Ｖ及びＣ１様Ｉｇドメインを含むタイプＩ膜タンパク質であるＣＲＴＡＭ(Du Pasquier, 2004)は、イムノグロブリンスーパーファミリーに構造的に関連する細胞表面マーカータンパク質として識別され、特定のＴ細胞上に発現される、細胞障害性又は調節性Ｔ細胞関連分子である。(Kennedy et al.；米国特許第５６８６２５７号；そして、国際公開２００６／０９８８８７)。ヒトＣＲＴＡＭ転写産物が活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫおよびＮＫＴ細胞において過渡的に検出されること、そして、ＣＲＴＡＭとそのリガンドであるＮｅｃｌ2(別名ＣＡＤＭ1)との間の相互作用は抗腫瘍免疫応答に役割を有することが報告されている(Fuchs and Colonna, 2006；Kennedy et al., 2000)。マウスＣｒｔａｍは、二重ネガティブ(ＤＮ)胸腺細胞における活性化誘導遺伝子として開示されている(Kennedy et al., 2000)。Abbas et al.(Genes Immun (2005), 6:319-331；米国公開２００７／０１８４４４４；米国公開２００７／０１８５０１７；米国公開２００６／０２６３７７４)によるマイクロアレイ分析は、ヒトのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上で上方制御される候補遺伝子としてＣＲＴＡＭを示したが、Ｔ細胞活性化の間のＣＲＴＡＭ発現の正確なＴ細胞サブ集団、性質、範囲および生理学的有意性は明らかではなかった。Ｃｒｔａｍの細胞質のＣＯＯＨ終末配列は、細胞性接着、極性および増殖を含む様々なシグナル伝達経路に伴う巨大タンパク質複合体の集合(アセンブリ)を促す、高度に保存されたクラスＩ ＰＳＤ-９５／Ｄｉｓｃｓ-ｌａｒｇｅ／ＺＯ-１(ＰＤＺ)-ドメインタンパク質相互作用モチーフを含む。Ｔ細胞では、ＳｃｒｉｂおよびＤｌｇ１を含むＰＤＺ含有タンパク質のネットワークは、Ｔ細胞腹肢(uropad)形成、移動に重要な役割があり、そして、Ｔ細胞：ＡＰＣコンジュゲート形成に関与する(Ludford-Menting et al., 2005)。ＳｃｒｉｂおよびＤｌｇ１は、ＴＣＲ契合(engagement)後に動的に制御され、ＮＦＡＴおよびサイトカイン転写活性化に作用することが示されている(Round et al., 2007；Round et al., 2005；Xavier et al., 2004)。Ｓｃｒｉｂは上皮細胞及び神経系細胞の細胞の極性を制御するシグナル伝達複合体をアセンブルするための足場として働く(Humbert et al., 2006)。ショウジョウバエでのｓｃｒｉｂｂｌｅ(ｓｃｒｉｂ)の突然変異又は上皮細胞でのＳｃｒｉｂのノックダウンにより、極性の喪失、Ｇ1からＳ期への細胞サイクルの増加および細胞増殖の増加が生じる(Bilder et al., 2000；Nagasaka et al., 2006)。しかしながら、あるとしても、その調節不全が多くの病理学的疾患の根底にある活性化されたＴ細胞(例えばＣＤ４＋細胞)においてどんな役割を果たすかは、明らかではない。Ｔ細胞は正常な生理学的関係において重要な役割を果たすので、Ｔ細胞活性の治療的な調節には、正常な免疫機能に必要である傍観者Ｔ細胞を備え(sparing)ながら、Ｔ細胞の病理学的サブセットの微調整されたターゲッティングが有効である。
【０００４】
Ｔ細胞は免疫系において中心的役割を有すること、そして、その様々な段階および様式においてＴ細胞の微妙なバランスが不適切に摂動されると、抑制されないおよび／または高められた免疫応答がある自己免疫性疾患、又は癌および不十分な免疫防御がある持続性感染を含む重篤な病的状態を引き起こされうることが認知されている。このように、多くの治療薬は、このような状態を治療するために用いられている。それにもかかわらず、これら薬剤は有効性及び安全性の特徴における理想を満たしておらず、短期及び長期の望ましくない副作用と関係していることが多いことが臨床上の経験から示されている。例えば、すべての薬剤がすべての患者において効果的であるおよび／または安全であるというわけではないことは明らかであり、したがって、例えば特定のＴ細胞サブセットをターゲティングするための微調整された手法を適用することによって、根底にある病理学的原因と限定的に関連している新規の分子体をターゲットとする新規の薬剤を開発する必要があることを示している。このような手法は、刺激を受けて対象の疾患の根本となる作用を引き起こす及び／又は対象の疾患の根本となる作用を引き起こすことが生理的に運命付けられているＴ細胞のサブセットのみに存在する及び／又は関連する標的を同定することが必要である。
治療上のターゲッティングに適切な分子には、広範なＴ細胞レパートリから、特定の免疫関連性疾患の病因又は病理に関与する最小サブ集団を区別する役割がある及び／又は示すＴ細胞の限定されたサブ集団に発現されるものが含まれる。実際、理想的には、このような分子は、限定されたＴ細胞マーカーであることに加えて、治療的介入のために標的とされうる細胞性活性と関係しているであろう。残念なことに、現在まで、このような分子に関する情報は欠いている。情報がないために、微調整されたＴ細胞の治療的調節を可能とする治療的方策を開発する妨げとなっている。上記のように、新規の治療的介入の焦点となりうるこのような分子標的及び経路を同定することが実際に必要とされている。本明細書において記述される発明は、この必要性を満たし、他の利点を提供するものである。
特許出願及び出版物を含め、本明細書中で引用されるすべての文献は出典明記によってその全体が援用される。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ＣｒｔａｍがＴ細胞の特定のサブセット(特に、ＣＤ４＋Ｔ細胞の特定のサブセット)において上方制御されるという発見、そして、Ｓｃｒｉｂ中心のシグナル伝達複合体を調整して今まで認識されなかったＴ細胞極性の後期を制御し、ＩＦＮγ、ＩＬ２２およびＩＬ１７を含む特定のサイトカインの産生を選択的に調節するという発見に少なくともある程度基づく。
細胞性タンパク質の立体組織は、細胞の極性の設立において重要な役割を果たし、細胞分裂、分化、細胞移動および器官形成のための必須形質である。抗原提示細胞(ＡＰＣ)によってＴ細胞が活性化されると、免疫学的シナプス(ＩＳ)の形成、ＴＣＲ接触領域でのシグナル伝達足場の集合の協調、アクチンおよび微小管の再編成、及び細胞間接触の初めの数時間以内での二次メッセンジャーの生成が生じる。本明細書において記述されるように、ＣＲＴＡＭはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上で上方制御され、より詳しくはそして予想外に、Ｔ細胞の活性化の異なる(初めの)段階の後に特定の活性化されたＴ細胞のサブセットにおいて上方制御され、そして、Ｓｃｒｉｂ極性タンパク質によって繋留される異なるセットのシグナル伝達分子を協調してＴ細胞活性化の後期の間に細胞の極性を調節し、細胞分裂、増殖及び適応免疫応答の選択的サイトカイン産生に影響を及ぼす。ＣＲＴＡＭ発現は、Ｔ細胞レパートリの特定のサブセットを示すことを本明細書において示す。ＣＲＴＡＭの生物学的機能は、後期活性化の間にＴ細胞に特定の活性をもたらすことと関係していることが本明細書中で示唆され、ＣＲＴＡＭ機能に対する干渉は活性化されたＴ細胞活性の修飾をもたらすことが本明細書中で示されている。ゆえに、本明細書において開示されるデータにより、活性化Ｔ細胞の重要なサブセットと特に関連し、干渉される場合には、このような活性化されたＴ細胞サブセットと関連する重要な活性が調節される、重要な分子標的／経路が明らかとなる。本発明は、ＣＲＴＡＭ関連Ｔ細胞活性を調整することによって、例えば、特定のＣＲＴＡＭ発現Ｔ細胞の存在および／または活性の選択的なターゲティングおよび／または除去によって、このような細胞の存在および／または活性を調節するために有用な方法、組成物、キットおよび製造品を提供する。
【０００６】
一態様では、本発明は、Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞などの活性化されたＴ細胞におけるＣＲＴＡＭ活性を調整するＣＲＴＡＭ調節因子を提供する。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ調節因子は、ＣＲＴＡＭへの同族リガンド(例えばＮｅｃｌ２)の結合と関係するＣＲＴＡＭ活性を調整する。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ調節因子は、ＣＲＴＡＭとＳｃｒｉｂとの間の複合体形成によって誘導されるＣＲＴＡＭ活性を調整する。本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は、ＣＲＴＡＭ-Ｓｃｒｉｂ経路の一又は複数の態様を調整してもよい。例えば、一実施態様では、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は、例えば、免疫学的シナプス、Ｔ細胞極性、Ｔ細胞活性化の維持などの形成および／または維持を含むＣＲＴＡＭおよび／またはＳｃｒｉｂ活性と関係する一又は複数の細胞性現象を調整する。例えば、一実施態様では、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は、ＣＤ４＋Ｔ細胞などの活性化されたＴ細胞におけるＣＲＴＡＭ活性を中和および／または阻害することが可能である。一実施態様では、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は、インビトロ又はインビボでの、ＣＤ４＋Ｔ細胞などの極性化された活性化Ｔ細胞の量を調整することが可能である。例えば、一実施態様では、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は、ＣＤ４＋Ｔ細胞などの活性化されたＴ細胞におけるＣＲＴＡＭ活性を中和および／または阻害して、極性化されたＴ細胞の量が低減されるようにすることが可能である。一実施態様では、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は、ＣＤ４＋Ｔ細胞などの活性化されたＴ細胞におけるＣＲＴＡＭ活性を上げることが可能である。ゆえに、例えば、一実施態様では、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は、ＣＤ４＋Ｔ細胞などの活性化されたＴ細胞におけるＣＲＴＡＭ活性を亢進して、極性化されたＴ細胞の量を増加させることが可能である。
本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は、臨床上の使用に適切な任意の様式で提供されてもよい。例えば、本発明の調節因子は、核酸又はポリペプチドの形態で提供および／または投与されてもよい。したがって、一実施態様では、核酸は、例えばＣＲＴＡＭの発現を調整することによってＣＲＴＡＭを調整することが可能な阻害性／干渉性ＲＮＡ(例えばｓｉＲＮＡ)又はアンチセンスＲＮＡをコードする。一実施態様では、核酸は、ＣＲＴＡＭ発現および／または活性を調整することが可能なマイクロＲＮＡ配列をコードするかまたは含む。一実施態様では、本発明の調節因子は、マイクロＲＮＡを干渉してＣＲＴＡＭ発現および／または活性が細胞において調節されるようにすることが可能な分子である。一実施態様では、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は、ＣＲＴＡＭ活性を中和することが可能なポリペプチドをコードする核酸を含む。例えば、ポリペプチドは少なくとも一部のＣＲＴＡＭを含むペプチドを含み、このときペプチドはＣＲＴＡＭの相互作用するパートナー(例えばその細胞外又は細胞内結合パートナー)と相互作用することが可能である。一実施態様では、調節因子ポリペプチドは、少なくとも一部の免疫グロブリン配列(例えばＩｇ Ｆｃ)に融合した少なくとも一部のＣＲＴＡＭ(例えばＮｅｃｌ２のようなＣＲＴＡＭリガンドへの結合が可能なＣＲＴＡＭの細胞外ドメインの一部)を含む融合ポリペプチドである。一実施態様では、調節因子ポリペプチドは、Ｓｃｒｉｂ結合配列を含む切断されたＣＲＴＡＭを含む。一実施態様では、調節因子ポリペプチドは、少なくとも一部の免疫グロブリン配列(例えばＩｇ Ｆｃ)に融合した少なくとも一部のＣＲＴＡＭ結合パートナー(例えばＣＲＴＡＭに結合することができるＮｅｃｌ２の一部)を含む融合ポリペプチドである。一実施態様では、調節因子ポリペプチドは、Ｉｇ Ｆｃに融合したＮｅｃｌ２の細胞外ドメインである。一実施態様では、調節因子ポリペプチドは抗体である。一実施態様では、調節因子ポリペプチドは抗ＣＲＴＡＭ抗体である。一実施態様では、調節因子ポリペプチドは抗Ｎｅｃｌ２抗体である。一実施態様では、本発明の調節因子はアプタマーを含む。
【０００７】
したがって、一実施態様では、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は、細胞(例えば活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞)に存在する場合、その細胞におけるＣＲＴＡＭの活性(遺伝子発現を含むがこれに限らない)を阻害する核酸を含む。一実施態様では、核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。他の実施態様では、核酸は、阻害性／干渉性のＲＮＡを含む。一実施態様では、阻害性／干渉性のＲＮＡは、小さい阻害性／干渉性のＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である。一実施態様では、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は抗体を含む。一実施態様では、抗ＣＲＴＡＭ抗体はモノクローナル抗体、例えばその断片であってもよい。一実施態様では、抗ＣＲＴＡＭ抗体はポリクローナル抗体であってもよい。一実施態様では、抗体は、ブロック又は非ブロック性であり、いずれの場合においても、枯渇抗体であってもよい。一実施態様では、抗体は枯渇抗体である。一実施態様では、抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、ｓｃＦｖ、(ｓｃＦｖ)２、ｄＡｂ、相補性決定領域(ＣＤＲ)断片、線形抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディおよび多特異性抗体(例えば、抗体断片から形成されるもの)であってもよい。一実施態様では、本発明の抗体は、例えばＦｃ配列突然変異、Ｆｃグリコシル化の変更(例えばアフコシル化)によってエフェクター機能が変更される。抗体エフェクター機能の変更方法は様々であり、当分野で周知である。
一実施態様では、ＣＲＴＡＭ抗体は枯渇抗体である。一実施態様では、枯渇抗体は、毒素を含む抗体コンジュゲートである。一実施態様では、毒素は、放射性同位体、酵素、小分子毒素および／または細胞障害性剤である。一実施態様では、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は、その細胞内結合パートナー(例えばＳｃｒｉｂ)とのＣＲＴＡＭ相互作用を干渉する分子を含む。例えば、このような分子は、投与される核酸、ペプチド、小分子又は抗体を含み、標的Ｔ細胞に入って細胞のＣＲＴＡＭ活性を阻害する、すなわち分子が内部移行されてもよい。一実施態様では、ペプチド又は抗体は、標的Ｔ細胞に導入される(例えば、形質移入される)核酸によってコードされる。
【０００８】
一態様では、本発明は、ＣＲＴＡＭを結合することができる結合剤を提供する。一実施態様では、このような結合剤は、試料中に存在するか又は細胞ないし組織と関連するＣＲＴＡＭを検出することが可能である任意の分子を含む。一実施態様では、このような結合剤は、Ｔ細胞のＣＲＴＡＭ＋サブ集団に対して対象の分子(例えば治療薬、毒素など)をターゲティングするために有用である。そのような一実施態様では、Ｔ細胞のＣＲＴＡＭ＋サブ集団はＣＤ４＋である。一実施態様では、結合剤は、本明細書に記載される一又は複数のＣＲＴＡＭ調節因子を含む。
一態様では、本発明は、ＣＲＴＡＭ調節因子(例えば、活性化されたＴ細胞におけるＣＲＴＡＭ活性を調節するために有用な分子)の同定方法であって、候補物質をＣＲＴＡＭ(又は本明細書中の以降に定義されるその機能的変異体)と接触させ、候補物質の有無の下で、本明細書中に記載のような一又は複数のＣＲＴＡＭ関連活性の量を測定することを含み、このとき該候補物質の有無の下でのＣＲＴＡＭ関連活性の量が異なる場合に、候補物質がＣＲＴＡＭ調節因子であることが示される方法を提供する。ＣＲＴＡＭ関連活性は、当分野で公知のいずれかの適切な定性的又は定量的な測定値によって決定されうる。ＣＲＴＡＭ関連活性には、例えばＣＤ４＋Ｔｈ１、Ｔｈ１７および／またはＣＤ８＋細胞の、例としてＩＦＮγ、インターロイキンＩＬ２２および／またはＩＬ１７などのサイトカインレベルの調節が含まれる。例えば、活性の量は、ＣＲＴＡＭによって制御される活性を有する下流の分子の活性の量によって示されてもよい。他の例では、活性の量は、細胞の表現型(例えばＴ細胞極性)の検出および／または測定によって示される。本発明の方法は、ＣＲＴＡＭアンタゴニスト又はアゴニストを同定するために用いられうる。例えば、一実施態様では、ＣＲＴＡＭ関連活性は候補物質がある場合に低い。他の実施態様では、ＣＲＴＡＭ関連活性は候補物質がある場合に高い。本発明の方法によって同定される調節因子は、本発明の方法に用いられるために必要とされるいずれかの特徴を有しうる。例えば、Ｔ細胞活性化および／またはこの活性化の維持を調整することが可能である候補が、選択されてもよい。他の例では、例えばＩＦＮγ、ＩＬ２２および／またはＩＬ１７の発現を阻害することを含む、特定のサイトカインの発現を調整することが可能であるＣＲＴＡＭアンタゴニスト調節因子が選択されてもよい。一態様では、本明細書において記述されるように、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は本発明の同定方法によって得られる。
【０００９】
本明細書において記述されるように、本発明の抗体は、本発明の方法における使用のため適切ないずれかの形態であってよい。例えば、本発明の抗体は、ヒト、ヒト化又はキメラでもよい。一実施態様では、本発明の抗体は、１７Ｂ２.７.１２.９.２.２(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６３)；３２Ｄ６.４.１.１.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６１)；３４Ｇ４.６.２.１.１.３(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６０)；６Ｅ２.２７.８.２.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６２)；又は２０Ｆ４.１.１.１.２.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６４)と称される抗体のヒト化又はキメラ形態である。一実施態様では、本発明の抗体は、１７Ｂ２.７.１２.９.２.２(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６３)；３２Ｄ６.４.１.１.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６１)；３４Ｇ４.６.２.１.１.３(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６０)；６Ｅ２.２７.８.２.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６２)；又は２０Ｆ４.１.１.１.２.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６４)と称される抗体と同じＣＲＴＡＭ上のエピトープに結合するヒト化、キメラ又はヒト抗体である。一実施態様では、本発明の抗体は、ＣＲＴＡＭ(例えば、ＣＲＴＡＭが無細胞環境に位置するか、又は細胞上にある場合(インビトロ又はインビボ))への結合について、１７Ｂ２.７.１２.９.２.２(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６３)；３２Ｄ６.４.１.１.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６１)；３４Ｇ４.６.２.１.１.３(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６０)；６Ｅ２.２７.８.２.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６２)；又は２０Ｆ４.１.１.１.２.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６４)と称される抗体と競合するヒト化、キメラ又はヒト抗体である。一実施態様では、本発明の抗体は、１７Ｂ２.７.１２.９.２.２(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６３)；３２Ｄ６.４.１.１.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６１)；３４Ｇ４.６.２.１.１.３(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６０)；６Ｅ２.２７.８.２.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６２)；又は２０Ｆ４.１.１.１.２.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６４)と称される抗体の高頻度可変領域、高頻度可変性ループおよび／または相補性決定領域(ＣＤＲ)配列の１、２、３、４、５又はすべてを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、１７Ｂ２.７.１２.９.２.２(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６３)；３２Ｄ６.４.１.１.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６１)；３４Ｇ４.６.２.１.１.３(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６０)；６Ｅ２.２７.８.２.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６２)；又は２０Ｆ４.１.１.１.２.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６４)と称される抗体の一又は両方の可変ドメイン、又はその機能的部分を含む。一実施態様では、本発明の抗体は、１７Ｂ２(配列番号：３１)と称される抗体の軽鎖を含む。一実施態様では、本発明の抗体は、１７Ｂ２(配列番号：３５)と称される抗体の軽鎖の可変領域を含む。一実施態様では、本発明の抗体は、１７Ｂ２と称される抗体の軽鎖の可変領域のＣＤＲ１(配列番号：３７)、ＣＤＲ２(配列番号：３８)又はＣＤＲ３(配列番号：３９)の少なくとも一を含む。一実施態様では、本発明の抗体は、１７Ｂ２と称される抗体の軽鎖の可変領域のＣＤＲ１(配列番号：３７)、ＣＤＲ２(配列番号：３８)およびＣＤＲ３(配列番号：３９)を含む。一実施態様では、本発明の抗体は、１７Ｂ２(配列番号：３２)と称される抗体の重鎖を含む。一実施態様では、本発明の抗体は、１７Ｂ２(配列番号：３６)と称される抗体の重鎖の可変領域を含む。一実施態様では、本発明の抗体は、１７Ｂ２と称される抗体の重鎖の可変領域のＣＤＲ１(配列番号：４０)、ＣＤＲ２(配列番号：４１)又はＣＤＲ３(配列番号：４２)の少なくとも一を含む。一実施態様では、本発明の抗体は、１７Ｂ２と称される抗体の重鎖の可変領域のＣＤＲ１(配列番号：４０)、ＣＤＲ２(配列番号：４１)およびＣＤＲ３(配列番号：４２)を含む。一実施態様では、本発明の抗体は、１７Ｂ２.７.１２.９.２.２(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６３)；３２Ｄ６.４.１.１.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６１)；３４Ｇ４.６.２.１.１.３(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６０)；６Ｅ２.２７.８.２.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６２)；又は２０Ｆ４.１.１.１.２.１(ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８４６４)と称される抗体の親和性成熟された誘導体のヒト化、キメラ又はヒトの形態である。
【００１０】
一態様では、本発明は、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子の有効量を被検体に投与することを含む、疾患、例えば自己免疫性疾患の予防又は治療のための方法を提供する。一実施態様では、被検体は、哺乳類の被検体、例えばヒト被験者である。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ調節因子はＣＲＴＡＭアンタゴニストである。
一実施態様では、本発明の方法によって治療および／または予防される疾患は、活性化されたＣＤ４＋ＣＲＴＡＭ＋Ｔ細胞の存在に特徴がある。一実施態様では、Ｔ細胞はまた、ＣＤ４＋ＣＲＴＡＭ−Ｔ細胞における発現と比較して、サイトカイン発現のレベルが高いことに特徴がある。さらに他の実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＲＴＡＭ−Ｔ細胞のサイトカイン分泌レベルと比較して、サイトカイン分泌レベルが高いことに特徴がある。一実施態様では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＩＬ２２および／またはＩＬ１７である。一実施態様では、Ｔ細胞は自己応答性である。
一実施態様では、疾患の治療又は予防の方法は、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子を投与しなかった被検体と比較して、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子の投与の後に被検体におけるサイトカイン発現が減少するという特徴を有する。他の実施態様では、また、治療又は予防は、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子を投与しなかった被検体と比較して、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子の投与の後に被検体におけるサイトカイン分泌が減少するという特徴を有する。一実施態様では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＩＬ２２および／またはＩＬ１７である。一実施態様では、Ｔ細胞は自己応答性である。
【００１１】
他の態様では、本発明は、Ｔ細胞増殖又はＴ細胞のエフェクター機能を阻害する方法を提供する。一実施態様では、Ｔ細胞は、活性化されたＴ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞である。一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞増殖またはＴ細胞のエフェクター機能の阻害方法であって、ＣＲＴＡＭ調節因子をＴ細胞と接触させることを含み、このとき該調節因子が、例えば該Ｔ細胞におけるＣＲＴＡＭへのリガンドの結合を阻害することによってＴ細胞におけるＣＲＴＡＭ活性を阻害する方法を提供する。一実施態様では、調節因子は、ブロック又は非ブロック抗体を含む、本明細書中に記載の抗体を含み、いずれの場合であっても枯渇抗体であってもよい。一実施態様では、抗体は枯渇抗体である。一実施態様では、抗体は抗体断片である。一実施態様では、抗体は毒素を含む抗体コンジュゲートである。一実施態様では、毒素は、放射性同位体、酵素、小分子毒素および／または細胞毒性活性を有する薬剤を含む。
本発明は、本明細書中に記載のようなＣＲＴＡＭ生物活性の調節が可能である本発明のＣＲＴＡＭ調節因子を使用した疾患の治療又は予防の方法を提供する。一実施態様では、調節は、細胞増殖、サイクリングおよび／または分裂；細胞接着；Ｔ細胞エフェクター機能の発達；サイトカイン産生；限定するものではないがＳｃｒｉｂ、ＰＫＣζおよびＣｄｃ４２を含む特定の分子の膜に対する細胞内動員；Ｔ細胞の最先端でのＣｄｃ４２含有複合体のアセンブリの細胞内協調；後期段階細胞骨格再編成；及びＴ細胞極性の一又は複数を含むがこれらに限定されない一又は複数の細胞事象に関連する。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ調節因子による調節は、ＣＤ４＋Ｔ細胞(例えばＴｈ１およびＴｈ１７細胞)、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の一又は複数を含むがこれらに限定されない、特定のＣＲＴＡＭ＋細胞種に影響してもよい。他の実施態様では、ＣＲＴＡＭ調節因子による調節は、ＩＦＮγ、ＩＬ２２および／またはＩＬ１７の一又は複数のサイトカインを含むがこれらに限定されないサイトカイン産生に対する効果を伴う。
【００１２】
一実施態様では、本発明の疾患の治療又は予防の方法は、本明細書中で提供されるＣＲＴＡＭ調節因子を被検体に投与することに関するＴ細胞サブ集団の枯渇を含む。一実施態様では、枯渇されたＴ細胞集団は、ＣＲＴＡＭ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞サブ集団、例えばＴｈ１および／またはＴｈ１７ Ｔ細胞サブ集団である。
一態様では、本発明は、被検体における疾患の検出又は診断の方法であって、(a) 被検体から採取した細胞(例えばＴ細胞)の第一試料とＣＲＴＡＭ調節因子(例えばＣＲＴＡＭ結合剤)とを接触させる、(b) 該試料におけるＣＲＴＡＭ＋細胞の量を該コントロール試料と比較することを含み、このとき該第一試料における量が高い場合に、該被検体での疾患が示される方法を提供する。一実施態様では、さらに、疾患の検出方法は、(c) 被検体からＴ細胞を含む第二試料を採取する、(d) ＣＲＴＡＭ調節因子(例えばＣＲＴＡＭ結合剤)を第二試料と接触させる、そして、(e) 第一および第二の試料におけるＣＲＴＡＭ＋細胞の量を比較することを含み、第二試料での量が高い場合に該被検体における疾患(例えば自己免疫性疾患)の再燃が示される。
一実施態様では、被検体からの試料(一又は複数)は、限定するものではないが、ＣＲＴＡＭ＋Ｔ細胞、例としてＣＤ４＋細胞(例えばＴｈ１又はＴｈ１７)および／またはＣＤ８＋細胞の一又は複数を含むＴ細胞を含んでもよい。一実施態様では、本発明の方法によって検出／診断される免疫学的疾患は、活動中の自己免疫性疾患である。一実施態様では、このような活動中の自己免疫性疾患は、Ｔ細胞がＣＲＴＡＭ＋である活性化されたＴ細胞の存在に特徴がある。一実施態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋である。一実施態様では、ＣＤ４＋細胞はＴｈ１又はＴｈ１７である。一実施態様では、活性化されたＴ細胞はまた、ＣＲＴＡＭ−Ｔ細胞におけるこのようなサイトカインの発現と比較して、サイトカイン発現のレベルが高いという特徴があり、一実施態様では、このような細胞はさらに、ＣＲＴＡＭ−Ｔ細胞におけるこのようなサイトカインの分泌レベルと比較して、サイトカイン分泌レベルが高いという特徴がある。一実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋(例えばＴｈ１又はＴｈ１７)である。一実施態様では、このような活性化されたＴ細胞は自己応答性である。これらの自己応答性Ｔ細胞は、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。一実施態様では、極性化されたＴ細胞(例えば、他の細胞に対する比率として)の量は、非疾患対照物と比較して増加している。一実施態様では、これらの細胞は、自己免疫性疾患の病因および／または病理学と関係している。
【００１３】
一態様では、本発明は、活性化されたＴ細胞の実質的に純粋な集団の調製、単離および／または精製のための方法を提供する。一実施態様では、集団は、ＣＲＴＡＭの発現によって特徴が表される活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一実施態様では、このようなＴ細胞は、ＣＲＴＡＭを発現していないＣＤ４＋活性化Ｔ細胞と比較して、サイトカインの発現および／または分泌のレベルが高いことを表す。一実施態様では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＩＬ２２および／またはＩＬ１７である。一実施態様では、調製、単離および／または精製の方法は、Ｔ細胞の混合集団を含むことがわかっているか又は予測される試料をＣＲＴＡＭ結合剤(例えば抗ＣＲＴＡＭ抗体)と接触させること、そしてＣＲＴＡＭ結合剤(例えばＣＲＴＡＭ抗体)を実質的に結合しない混合集団から任意の細胞を分離することを含み、これによってＣＲＴＡＭ結合剤(例えばＣＲＴＡＭ抗体)が結合した活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団が単離される。この方法はさらに、結合したＣＲＴＡＭ結合剤をＣＲＴＡＭ結合剤に結合している活性化ＣＤ４＋細胞の集団から切り離すことを含んでもよい。
一態様では、本発明は、活性化されたＴ細胞の実質的に純粋な集団を含む組成物を提供する。一実施態様では、この集団は、ＣＲＴＡＭの発現を特徴とする活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一実施態様では、このようなＴ細胞は、ＣＲＴＡＭを発現していないＣＤ４＋活性化Ｔ細胞と比較してサイトカインの発現および／または分泌のレベルが高いことを表す。一実施態様では、サイトカインは、ＩＦＮγ、ＩＬ２２および／またはＩＬ１７である。
【００１４】
他の一態様では、本発明は、疾患、例えば自己免疫性疾患を治療するための医薬の調製におけるＣＲＴＡＭ調節因子の使用を提供する。
一態様では、本発明は、疾患、例えば自己免疫性疾患の治療に使用するためのＣＲＴＡＭ調節因子を提供する。一態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化および／または機能の調節不全と関係する様々な疾患を治療するための方法に提供する。例えば、一態様では、本発明は、異常なＴ細胞活性化および／または機能と関係する疾患の治療方法であり、前記方法が本発明のＣＲＴＡＭ調節因子の有効量を被検体に投与することを含み、それによって疾患を治療する方法を提供する。一実施態様では、調節因子はＴ細胞活性化を減少させる。一実施態様では、調節因子はＴ細胞活性を減少させ、一実施態様では、その活性が自己応答性活性である。一実施態様では、調節因子は、Ｔ細胞活性化の調節不全と関係する炎症を阻害する。
一態様では、本発明は、Ｔ細胞活性(特に、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性)を上げることによって疾患を治療する方法であって、疾患を有する被検体にＣＲＴＡＭ活性を亢進するＣＲＴＡＭ調節因子の有効量を投与することを含み、それによって疾患が治療される方法を提供する。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ調節因子は、アゴニスト分子、例えばＣＲＴＡＭ-結合リガンドを含む融合ポリペプチド又はアゴニスト抗体(例えば、免疫グロブリンＦｃのような免疫グロブリン配列に融合されたＮｅｃｌ２のＣＲＴＡＭ-結合ドメインの少なくとも一部)を含む。本発明のこのような方法は、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞活性の亢進から利益を得る疾患、例えば癌、免疫不全および感染を治療するために有用である。
【００１５】
本発明のＣＲＴＡＭ調節因子が他の治療剤とともに投与される本発明の方法において、他の治療剤の投与のタイミングと比較してＣＲＴＡＭ調節因子の投与のタイミングは、治療上の利益となることが経験的及び／又は臨床的に認められるものであろう。一実施態様では、例えば、ＣＲＴＡＭ調節因子は、前記他の治療剤の投与の前に投与される。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ調節因子は、前記他の治療剤の投与に続いて投与される。他の実施態様では、ＣＲＴＡＭ調節因子は、前記他の治療剤の投与と同時に投与される。一実施態様では、前記他の治療剤は抗炎症作用を有する。一実施態様では、前記他の治療的薬剤は免疫抑制活性を有する。一実施態様では、前記他の治療的薬剤は細胞障害性活性を有する。一実施態様では、前記他の治療的薬剤は抗感染性活性を有する。一実施態様では、２の薬剤は、異なる組成物として投与される。一実施態様では、２の薬剤は、一つの組成物として投与される。
臨床的に適切又は望ましい場合、本発明の方法はさらに更なる処理工程を含みうる。例えば、一実施態様では、方法はさらに、標的細胞および／または組織が治療投薬計画の他の標準物質(例えばステロイド又は他のポリペプチド又は小分子抗炎症剤)にさらされる工程を含む。
【００１６】
上記したように、ＣＲＴＡＭ調節因子および本発明の方法は、Ｔ細胞活性の不適当な調節と関係することが疑われる又は知られている様々な疾患を治療する際に有用である。例えば、これらの疾患には、免疫学的(例えば自己免疫性)、癌又は感染が関連する疾患の分類にあるものが含まれるがこれらに限定されるものではない。一実施態様では、疾患は、組織炎症(急性又は慢性)、例えば自己免疫性疾患と関係している。また、いくつかの疾患は２以上の疾患分類の間で重なる特徴を有しうる点に注意しなければならない。
一実施態様では、自己免疫性疾患は、例えば、関節リウマチ(ＲＡ)；多発性硬化症(ＭＳ)；全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)；ループス腎炎；皮膚紅班性狼瘡(ＣＬＥ)；自己免疫性肝炎；若年性関節リウマチ；感染性肝炎；原発性胆管萎縮症；乾癬；皮膚炎；アトピー性皮膚炎；全身強皮症；全身性硬化症；クローン病、潰瘍性大腸炎；呼吸窮迫症候群；成人呼吸窮迫症候群；ＡＲＤＳ；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；糸球体腎炎；ペンフィグス；マクロファージ活性化症候群；湿疹；喘息；アテローム性動脈硬化；白血球接着欠損症；真正糖尿病；Ｉ型糖尿病；インスリン依存性糖尿病；アレルギー性鼻炎；臓器移植と関係している自己免疫応答；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；橋本甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年型糖尿病；サイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される急性かつ遅発性過敏症と関係する免疫応答；結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症；血管炎；悪性貧血(アジソン病)；白血球血管外遊出を伴う疾患；中枢神経系(ＣＮＳ)炎症性疾患；多臓器損傷症候群；溶血性貧血；クリオグロブリン血症；クームズ陽性貧血症；重症筋無力症；抗原-抗体複合体媒介性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート-イートン筋無力症症候群；水疱性類天ぽうそう；ペンフィグス；自己免疫性多腺性内分泌障害；ライター症候群；全身強直性症候群；ベーチェット疾患；巨細胞動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡネフロパシ；ＩｇＭ多発性神経炎；免疫血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)および自己免疫性血小板減少症であってもよい。 
一実施態様では、自己免疫性疾患は、より詳しくは、関節リウマチ(ＲＡ)、多発性硬化症(ＭＳ)、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、皮膚紅班性狼瘡(ＣＬＥ)、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、アトピー性皮膚炎、喘息、臓器移植と関係する自己免疫応答、自己免疫性肝炎、若年性関節リウマチ、感染性肝炎、糸球体腎炎、原発性胆管萎縮症、血管炎、ペンフィグス、マクロファージ活性化症候群、アレルギー性鼻炎、１型糖尿病および２型糖尿病であってもよい。
【００１７】
一態様では、本発明は、本発明の一又は複数のＣＲＴＡＭ調節因子と担体を含む組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬学的に許容可能である。
一態様では、本発明は、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子をコードする核酸を提供する。一実施態様では、本発明の核酸は、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)であるか又は含むＣＲＴＡＭ調節因子をコードする。一実施態様では、本発明の核酸は、抗体ないしその断片であるか又は含むＣＲＴＡＭ調節因子をコードする。一実施態様では、本発明の核酸は、ＣＲＴＡＭ発現／活性(例えばＣＲＴＡＭタンパク質のＣＲＴＡＭ遺伝子転写又は翻訳)を阻害する核酸配列、例えばｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどをコードする。
一態様では、本発明は本発明の核酸を含むベクターを提供する。
一態様では、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。ベクターは、いずれかの種類のもの、例えば発現ベクターなどの組換えベクターであってもよい。任意の様々な宿主細胞が用いられてよい。一実施態様では、宿主細胞は原核細胞、例えば大腸菌である。一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞などの哺乳類の細胞である。一実施態様では、宿主細胞は、変更したエフェクター機能を有する抗体を製造するために遺伝学的に操作されている。例えばこの細胞によって製造される抗体は、所望のエフェクター機能変更と関連したグリコシル化性質を含む(例えば、アフコシル化された抗体に観察されるように)。一実施態様では、本発明の核酸又はベクターは活性化されたＴ細胞において発現される。
【００１８】
一態様では、本発明は、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子を作製するための方法を提供する。例えば、本発明は、抗体(ないしその断片)であるか又は抗体を含むＣＲＴＡＭ調節因子の作製方法であって、該抗体(ないしその断片)をコードする本発明の組み換えベクターを好適な宿主細胞において発現させ、該抗体(ないしその断片)を回収することを含む方法を提供する。他の例では、本発明は、ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)であるか又は含むＣＲＴＡＭ調節因子の作製方法であって、該ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)をコードする本発明の組み換えベクターを好適な宿主細胞において発現させ、該ポリペプチド(例えばオリゴペプチド)を回収することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、容器と、容器内に内包される組成物とを具備し、このとき該組成物が本発明のＣＲＴＡＭ調節因子の一又は複数を含むものである製造品を提供する。一実施態様では、組成物は本発明の核酸を含む。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ調節因子を含む組成物はさらに、担体を含み、いくつかの実施態様では、その担体は薬学的に許容可能である。一実施態様では、本発明の製造品は、本明細書中に示される疾患を治療するために組成物(例えばＣＲＴＡＭ調節因子)を投与することについての指示書をさらに具備する。
一態様では、本発明は、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子の一又は複数を含む組成物を備える第一容器と、バッファを備える第二容器とを具備するキットを提供する。一実施態様では、バッファは薬学的に許容可能である。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ調節因子を含む組成物はさらに担体を含み、いくつかの実施態様では、その担体は薬学的に許容可能である。一実施態様では、キットはさらに、本明細書中に示す疾患を治療するために該組成物(例えばＣＲＴＡＭ調節因子)を投与することについての指示書を具備する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｃｒｔａｍは、より多くのＩＦＮγ、ＩＬ２２およびＩＬ１７を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞のサブ集団上でＴＣＲ活性化時に発現される。 (Ａ) 抗ＣＤ３(１０μｇ／ｍｌ)および抗ＣＤ２８(２μｇ／ｍｌ) ｍＡｂによる活性化後の脾臓ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のＣｒｔａｍ発現のフローサイトメトリー分析。 (Ｂ) Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓ナイーブＣＤ４＋(ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋)Ｔ細胞を、抗ＣＤ３(２μｇ／ｍｌ)および抗ＣＤ２８(２μｇ／ｍｌ) ｍＡｂにて活性化した。１４時間後、Ｃｒｔａｍ＋およびＣｒｔａｍ−Ｔ細胞をＦＡＣＳ分類にて精製した。分類したＣｒｔａｍ＋およびＣｒｔａｍ−Ｔ細胞を、３日間休止させ、５×１０５細胞／ｍｌの濃度で抗ＣＤ３／２８ ｍＡｂにて再刺激した。次いで、再刺激したＴ細胞上のＣｒｔａｍの発現をフローサイトメトリにて調べた。 (Ｃ) 脾臓ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３／２８ ｍＡｂにて１４時間活性化した。ｍＲＮＡは分類したＣｒｔａｍ＋およびＣｒｔａｍ−Ｔ細胞から抽出し、定量的ＴａｑＭａｎ分析(上方パネル)を行った。分類された細胞を休止させ、(Ｂ)に記載のように再刺激し、上清を４８時間目に回収し、ＥＬＩＳＡ(下方パネル)にて分析した。 (Ｄ、Ｆ、Ｇ) Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓ナイーブＣＤ４＋(ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋) Ｔ細胞を、記載されるようなＴＨ分化条件下で抗ＣＤ３／２８ ｍＡｂにて刺激した。ＴＣＲ活性化の１４時間後、Ｃｒｔａｍ＋およびＣｒｔａｍ−Ｔ細胞をＦＡＣＳ分類にて精製した。分類したＣｒｔａｍ＋およびＣｒｔａｍ−Ｔ細胞を３日間休止させ、５×１０５細胞／ｍｌの濃度で抗ＣＤ３(１０μｇ／ｍｌ)および抗ＣＤ２８(２μｇ／ｍｌ) ｍＡｂにて再刺激した。再刺激したＴ細胞の上清を４８時間目に回収し、ＥＬＩＳＡにて分析した。(Ｅ) ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴＨ１条件下で活性化した。１４時間後、Ｃｒｔａｍ−およびＣｒｔａｍ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ分類にて精製し、その後ＴＨ１条件培地中で４日間培養した。次いで、分化したＴ細胞を、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ (BD Pharmingen)の存在下で、ＰＭＡおよびイオノマイシンにて４時間再刺激した。次いで、細胞を、細胞内ＩＦＮγの免疫蛍光染色のためにＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍＴＭ Ｐｌｕｓキットを用いて固定し、透過処理した。示されるＦＡＣＳ分析は、(ＡおよびＢでは)５つおよび(Ｅでは)３つの別々の実験の代表値である。示されるＥＬＩＳＡデータは、細胞が３０匹のマウスから精製されている５つの別々の実験の代表値である。誤差バーは標準偏差(ＳＤ)を示す。ダネット法を使用してコントロールにて統計学的分析を行った。
【図２】Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞はサイトカイン産生が欠損している。 (ＡおよびＢ) １２時間活性化したＣｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−Ｔ細胞のＣｒｔａｍ発現は、フローサイトメトリ(Ａ)およびウエスタンブロット分析(Ｂ)にて分析した。 (ＣおよびＤ) ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＣｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−のマウスから精製し、ＴＨ０又はＴＨ１の条件下で活性化した。６日後、Ｔ細胞を洗浄し、再活性化し、さらに３日間通常の培地中で培養した。１０日目に、分化したＴ細胞を、ＴａｑＭａｎ分析のためにＰＭＡ／イオノマイシンにて(Ｃ)、そしてＩＦＮγの細胞内染色のためにＰＭＡ／イオノマイシンとＧｏｌｇｉＰｌｕｇにて(Ｄ)、４時間刺激した。示されるデータは２つの別々の実験の代表値である。(Ｅ) ナイーブＣｒｔａｍ＋／＋及びＣｒｔａｍ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化し、ＴＨ分化培地中で培養した。６日後に、細胞を洗浄し、計数して、５×１０５細胞／ｍｌの濃度で、抗ＣＤ３(１０μｇ／ｍｌ)および抗ＣＤ２８(２μｇ／ｍｌ) ｍＡｂにて通常の培地中で再刺激した。刺激の４８時間後上清を回収し、ＥＬＩＳＡにて分析した。 (Ｆ) ナイーブ(ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋)およびエフェクター／メモリー(ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ−)ＣＤ８＋Ｔ細胞を精製し、ナイーブＴ細胞については１×１０６細胞／ｍｌの濃度で抗ＣＤ３(１０μｇ／ｍｌ)及び抗ＣＤ２８(２μｇ／ｍｌ) ｍＡｂにて、そしてエフェクター／メモリーＴ細胞については５×１０５細胞／ｍｌの濃度で抗ＣＤ３(５μｇ／ｍｌ)および抗ＣＤ２８(２μｇ／ｍｌ) ｍＡｂにて刺激した。活性化の４０時間後にサイトカイン産生をＥＬＩＳＡにて分析した。(Ｅ)および(Ｆ)に示されるデータは、細胞がＣｒｔａｍ＋／＋(ｎ＝３)およびＣｒｔａｍ−／−(ｎ＝３)のマウスから精製し、別々に刺激されたものである、３つの別々の実験の代表値である。 (Ｇ) Ｃｒｔａｍ−／−マウスは、スピーディコンジェニック法によってＣ５７／ＢＬ-６の遺伝バックグラウンドに戻し交配した。Ｎ４世代からの１０〜１３週齢のマウス(Ｃｒｔａｍ＋／＋、ｎ＝５；Ｃｒｔａｍ−／−、ｎ＝６)に、２×１０９ＣＦＵのＣ.ローデンチウムを含む２００μｌのＰＢＳを経口的に接種した。遠位性大腸および脾臓での生きた細菌の数は、マッコンキーアガー上で感染後７および１４日目に決定した。この図では、誤差バーは標準偏差(ＳＤ)を示す。ダネット法を使用してコントロールにより統計学的分析を行った。
【図３】ＡＰＣ-ペプチド刺激に応じたＣｒｔａｍ−／−ナイーブＴ細胞の過剰増殖。(Ａ) Ｃｒｔａｍ＋／＋(白バー)及びＣｒｔａｍ−／−(黒バー)マウスからのナイーブＯＴ-ＩＩ ＴＣＲ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、被照射ＯＶＡペプチドロードしたＡＰＣにて活性化し、細胞の増殖を[３Ｈ]-チミジン取込みによって評価した。(Ｂ) 細胞分裂は、カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル(ＣＦＳＥ)標識のＯＴ−ＩＩ ＴＣＲ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞(５μＭ ＯＶＡペプチド)のフローサイトメトリー解析によってモニターした。各々の区画内の％細胞は各々の棒グラフより上に表す。(Ｃ)Ｃｒｔａｍ＋／＋及びＣｒｔａｍ−／−マウスからのナイーブＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、被照射ＯＶＡペプチドロードしたＡＰＣにて活性化し、細胞の増殖を[３Ｈ]-チミジン取込みによって評価した。(Ｄ) ＣＦＳＥ標識のＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の希釈は、刺激(１０μＭ ＯＶＡペプチド)の３日後に試験した。ＡからＤに示されるデータは３つの別々の実験の代表値である。(Ｅ) ＯＴ−ＩＩ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞のインビボ増殖の亢進。Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−からのＣＦＳＥ標識ＯＴ-ＩＩ ＴＣＲ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞(８×１０６細胞／マウス)をＢ６１２９ＳＦ２／Ｊマウスに導入し、Ｔ細胞導入の１２時間後に２０μｇのＯＶＡタンパク質を足蹠注射して抗原刺激した。レシピエントマウスの排液リンパ節は、抗原刺激の３日後に循環している細胞について分析した。このデータは４つの別々の実験の代表値である。(Ｆ) 頸部リンパ節(ＬＮ)、脾臓および血液のＢ２２０＋Ｂ細胞及び、総ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｃｒｔａｍ＋／＋(白バー)およびＣｒｔａｍ−／−(黒バー)マウス(６週齢、ｎ＝１６；１０か月齢、ｎ＝１０)から定量した。誤差バーは標準偏差(ＳＤ)を示す。ダネット法を使用してコントロールにて統計学的分析を行った。
【図４】活性化されたＣｒｔａｍ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴ細胞極性の後期の破壊。ａ−ｃ、(ＡからＣ) 抗ＣＤ３(１０μｇ／ｍｌ)およびＣＤ２８(２μｇ／ｍｌ) ｍＡｂにて１４時間刺激したものとしていない、ナイーブＣｒｔａｍ＋／＋(上パネル)又はＣｒｔａｍ−／−(下パネル)のＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｃｒｔａｍ及びタリン(Ａ)、ＣＤ３ε(Ｂ)、ＣｒｔａｍおよびＣＤ４４(Ｃ)について染色し、デコンボリューション電子顕微鏡法にて分析した。(Ｄ) デコンボリューション電子顕微鏡法(ＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ)を用いて細胞を計数することによる(ｎ＞２００)タリン、ＣＤ４４およびＣＤ３極性化の定量化。(Ｅ) ３５より多い数の２Ｄ薄板のＩｍａｒｉｓ５．５を用いた、１４時間抗ＣＤ３／２８活性化Ｔ細胞のＣｒｔａｍ、タリンおよびＣＤ４４染色の３Ｄ構築。(Ｆ) ＯＶＡペプチドパルスＤＣにて１４時間刺激したものとしていない、ナイーブＯＴ-ＩＩ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ＋／＋又はＣｒｔａｍ−／−のＣＤ４＋Ｔ細胞を、タリン、ＣＤ４４およびＣＤ３について染色し、デコンボリューション電子顕微鏡法にて分析した。(Ｇ) 活性化されたＯＴ−ＩＩ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−のＣＤ４＋Ｔ細胞(ｎ＞２００)におけるタリン、ＣＤ４４およびＣＤ３の極性化の定量化。(Ｈ) 最初のＴ細胞接触形成の分析。ＣＭＲＡ標識及びＯＶＡペプチドパルスＤＣを、ＯＴ-ＩＩ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−のＣＤ４＋Ｔ細胞とともに３０分間インキュベートし、Ｆ−アクチン(phalloidin)にて染色した。(Ｉ) 細胞は(Ｈ)に記載のように活性化し、Ｃｒｔａｍ＋／＋又はＣｒｔａｍ−／−のＯＴ-ＩＩ ＴＣＲ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の、ＯＶＡペプチドパルスＤＣとの細胞コンジュゲート形成能をフローサイトメトリーにて分析した。示されるデータは４つの別々の実験の代表値である。誤差バーは標準偏差(ＳＤ)を示す。
【図５】ＣｒｔａｍはＰＤＺタンパク質ネットワークにより細胞極性、増殖およびサイトカイン産生を制御する。(Ａ) Ｃｒｔａｍ＋／＋及びＣｒｔａｍ−／−マウスのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を示した時間の間活性化し、細胞抽出物をＳｃｒｉｂ(上パネル)又はＤｌｇ１(下パネル)に対して抗体にて免疫沈降した。次いで、免疫複合体をＣｒｔａｍに対するイムノブロッティングによって分析した。示されるデータは５つの別々の実験の代表値である。(ＢからＤ) ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３(１０μｇ／ｍｌ)および抗ＣＤ２８(２μｇ／ｍｌ) ｍＡｂにて１４時間活性化した。次いで、活性化された細胞を、Ｃｒｔａｍ、Ｓｃｒｉｂ、Ｃｄｃ４２又はＰＫＣζについて染色し、デコンボリューション電子顕微鏡法によって分析した。画像は、各々の染色について３００より多い数の細胞の代表値である。(Ｅ) ナイーブＯＴ-ＩＩ ＴＣＲ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＯＶＡペプチドにてパルス化したＤＣとともにインキュベートし、一定の時点で固定し、８ウェルのチャンバースライド上へ付着させ、各々のパネルに対し上記の特定の抗体にて染色した。画像は、各々の時点で各々の染色について５０より多い数の細胞の代表値である。
【図６】ＳｃｒｉｂとのＣｒｔａｍの相互作用は、細胞極性、増殖およびサイトカイン産生を制御するために必要である。(Ａ) ＣｒｔａｍおよびＣｒｔａｍ変異体の構造の模式的な描写。(ＢおよびＣ)Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるレトロウイルスにて再構成されたＣｒｔａｍ、Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)又はＣｒｔａｍ(ΔＥＳＩＶ)の細胞増殖及びサイトカイン産生。ＧＦＰにて再構成されたＣｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−のＣＤ４＋Ｔ細胞をコントロールとした。データは、５つの別々の実験の代表値である。(Ｄ) Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ４ Ｔ細胞にて再構成されたＣｒｔａｍ、Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)又はＣｒｔａｍ(ΔＥＳＩＶ)の極性を、ＴＣＲ再刺激の１４時間後に調べた。(ＥおよびＦ) Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＦＡＣＳ分類したＣｒｔａｍ＋及びＣｒｔａｍ−のＣＤ４ Ｔ細胞に、ＧＦＰコントロール、Ｃｒｔａｍ又はＣｒｔａｍ(ΔＥＳＩＶ)をレトロウイルスにて形質導入した。すべての形質移入細胞を３日間休止させ、２×１０５細胞／ｍｌで抗ＣＤ３(１０μｇ／ｍｌ)および抗ＣＤ２８(２μｇ／ｍｌ) ｍＡｂにて再刺激した。サイトカイン産生は、ＴＣＲ再刺激の４８時間後にＥＬＩＳＡにて分析した(Ｅ)。ＥＬＩＳＡデータは、４つの別々の実験の代表値である。誤差バーは標準偏差(ＳＤ)を示し、ダネット法を使用してコントロールにて統計学的分析を行った。Ｃｒｔａｍ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞(パネル１)又はレトロウイルスにて再構成されたＣｒｔａｍ−ＣＤ４＋Ｔ細胞(パネル２−４)のタリン極性は、抗ＣＤ３／２８のｍＡｂによる再刺激の１４時間後に分析した(Ｆ)。画像は、各々の染色について１００より多くの数の細胞の代表値である。
【図７】Ｃｒｔａｍ機能はＳｃｒｉｂにより伝達される。(ＡおよびＢ) Ｃ５７／ＢＬ６マウスからのＣｒｔａｍ＋ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＦＡＣＳ分類によって１４時間活性化したＴ細胞から精製した。分類されたＣｒｔａｍ＋ＣＤ４ Ｔ細胞を４日間増殖させ、Amaxa Nucleofectorによってコントロール又はＳｃｒｉｂ ｓｉＲＮＡ(QIAGEN)を電気穿孔した。形質移入の１２時間後、Ｓｃｒｉｂ発現をウェスタンブロッティングにて分析した(Ａ)。(Ａ)の矢印は内在性Ｓｃｒｉｂを示す。Ｔ細胞は、抗ＣＤ３およびＣＤ２８ ｍＡｂにて再刺激し、タリンについて染色した(Ｂ)。(Ｃ) コントロール又はＳｃｒｉｂ ｓｉＲＮＡを形質移入した細胞によるサイトカイン産生は、再刺激の４８時間後にＥＬＩＳＡによって分析した。示されるデータは、２つの別々の実験の代表値である。(ＤおよびＥ) ナイーブＣｒｔａｍ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞を精製し、プレートに結合した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂにて活性化した。刺激の４日後、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いてＴ細胞に、ｐＩＲＥＳ-ＧＦＰ又はｐＩＲＥＳ-Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂを電気穿孔した。Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂの発現は、ウエスタンブロット分析(Ｄ)およびフローサイトメトリ(Ｅ)にて確認した。矢頭は、差時的にグリコシル化した形態を有するＣｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂキメラを示す。(Ｄ)の矢印は内在性Ｓｃｒｉｂを示す。(Ｆ) 形質移入の１２時間後に、Ｔ細胞は抗ＣＤ３及びＣＤ２８ ｍＡｂにて８時間再刺激し、細胞を染色のために固定した。(Ｇ) 細胞培養物の上清は、ＥＬＩＳＡ分析のためにＴＣＲ刺激の４８時間後に回収した。示されるデータは、３つの別々の実験の代表値である。
【図８】ＣｒｔａｍはＴ細胞上にＴＣＲ活性化時に発現される。抗ＣＤ３(１０μｇ／ｍｌ)および抗ＣＤ２８(２μｇ／ｍｌ) ｍＡｂによる活性化後の脾臓ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞のＣｒｔａｍ発現のフローサイトメトリー解析。データは、３つの別々の実験の代表値である。
【図９】Ｃｒｔａｍ−／−マウスの生成。(Ａ) ジーンターゲッティング方策。Ｃｒｔａｍ(上)、ターゲッティングベクター(中)および標的とした対立遺伝子(下)のエキソン１を囲むゲノム構造を表す。Ｃｒｔａｍのエキソン１は、相同組み換えによってネオマイシン耐性遺伝子と置換した。矢印は、ＰＣＲ遺伝子タイピングのために使用するプライマーを示す。サザンブロッティングに用いたプローブの位置を灰色のバーで示す。(Ｂ) ＰＣＲ増幅(左)およびサザンブロット分析(右)を用いた、標的とした対立遺伝子(＋／＋：３２８ｂｐおよび−／−：１９１ｂｐ)の遺伝子タイピング。５’プローブは、＋／＋マウスでは１０．５ｋＢ、−／−マウスでは７．６ｋＢのＥｃｏＲＩ断片をハイブリダイズした。３’プローブは、＋／＋マウスでは１０．５ｋＢ、−／−マウスでは２．８ｋＢのＥｃｏＲ１断片をハイブリダイズした。(Ｃ) Ｃｒｔａｍ−／−マウスにおけるＣｒｔａｍ ｍＲＮＡ発現の欠如。Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−のマウスの脾臓の総ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、Ｃｒｔａｍ(エキソン４〜８)又はアクチンに特異的なプライマーにて増幅した。
【図１０】Ｃｒｔａｍ−／−マウスの正常なＴ細胞発達。 (Ａ) 胸腺細胞サブセット、ＣＤ４−ＣＤ８−(ＤＮ)、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋ＣＤ８＋(ＤＰ)を、Ｃｒｔａｍ＋／＋(白バー)およびＣｒｔａｍ−／−(黒バー)のマウス(６週齢、ｎ＝１６)から定量化した。(Ｂ) ＯＴ−ＩＩ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ＋／＋(白バー)およびＣｒｔａｍ−／−(黒バー)のマウス(６週齢、ｎ＝１０)からの胸腺細胞サブセットを定量化した。 (ＣおよびＤ) 脾臓および血液からの総ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ２２０＋Ｂ細胞、ＣＤ４＋ナイーブ(ＣＤ６２Ｌｈｉ)、ＣＤ４＋エフェクター(ＣＤ４４ｈｉＣＤ４５ＲＢｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ)、ＣＤ４＋メモリー(ＣＤ４４ｈｉＣＤ４５ＲＢｌｏＣＤ６２Ｌｌｏ)、ＣＤ８＋ナイーブ(ＣＤ６２Ｌｈｉ)、およびＣＤ８＋エフェクター(ＣＤ４３-１Ｂ１１ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ)Ｔ細胞は、Ｃｒｔａｍ＋／＋(白バー)およびＣｒｔａｍ−／−(黒バー)のマウス(６週齢、ｎ＝１６)から定量化した。代表的なフローサイトメトリー分析を上部に示す。誤差バーは標準偏差(ＳＤ)を示す。Ｔ＝総細胞；Ｎ＝ナイーブ細胞；Ｅ＝エフェクター細胞；Ｍ＝メモリー細胞。
【図１１】ＴＣＲ刺激に応答したＣｒｔａｍ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ分泌の減少。 ナイーブ野生型及びＣｒｔａｍ−／−ＣＤ４ Ｔ細胞を精製し、ＴＨ１分化培地中でプレートに結合させた抗ＣＤ３(１〜１０μｇ／ｍｌ)および抗ＣＤ２８(２μｇ／ｍｌ) ｍＡｂにて刺激した。６日後に、細胞を洗浄し、計数し、５×１０５細胞／ｍｌの濃度で、抗ＣＤ３(１〜１０μｇ／ｍｌ)および抗ＣＤ２８(２μｇ／ｍｌ) ｍＡｂにて通常の培地中で再刺激した。刺激の４８時間後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡにて分析した。この実験は、２つの別々の実験の代表値である。誤差バーは標準偏差(ＳＤ)を示す。ダネット法を使用してコントロールにて統計学的分析を行った。
【図１２】ＩＬ２３処置によるＩＬ２２の減少。ナイーブＣｒｔａｍ＋／＋及びＣｒｔａｍ−／−のＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化し、組み換えマウスＩＬ２３(１０ｎｇ／ｍｌ、eBioscience)、抗ＩＦＮγ ｍＡｂ(５μｇ／ｍｌ、BD Pharmingen)および抗ＩＬ４ ｍＡｂ(５μｇ／ｍｌ、BD Pharmingen)を含むＴＨ１７分化培地中で培養した。６日後に、細胞を洗浄し、計数し、通常の培地中で再刺激した。刺激の４８時間後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡにて分析した。示されるデータは、細胞は精製され、Ｃｒｔａｍ＋／＋(ｎ＝３)およびＣｒｔａｍ−／−(ｎ＝３)のマウスから独立して刺激されている３つの別々の実験の代表値である。誤差バーは標準偏差(ＳＤ)を示す。ダネット法を使用してコントロールにて統計学的分析を行った。
【図１３】ＴＣＲ活性化後のＣｒｔａｍ−／−ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の過剰増殖。 (Ａ) Ｃｒｔａｍ＋／＋(黒色)およびＣｒｔａｍ−／−(灰色)のマウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、プレートに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ｍＡｂにて活性化した。細胞増殖は[３Ｈ]-チミジン取込みによって分析した。 (Ｂ) 細胞分裂は、活性化の３日後にフローサイトメトリによってＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞にてモニターした。 (ＣおよびＤ) Ｃｒｔａｍ＋／＋(黒色)およびＣｒｔａｍ−／−(灰色)のマウスからのナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞にて同じ実験を行った。ここで示されるデータは、４つの別々の実験の代表値である。 (Ｅ) Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、プレートに結合させた抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ ｍＡｂにて活性化した。ＣｒｔａｍｈｉおよびＣｒｔａｍ−ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＦＡＣＳ分類にて精製した。４日後に、細胞をプレートに結合させたｍＡｂにて再刺激し、細胞増殖を[３Ｈ]-チミジン取込みによって分析した。ここで示されるデータは、２つの別々の実験の代表値である。この図の誤差バーは標準偏差(ＳＤ)を示す。ダネット法を使用してコントロールにて統計学的分析を行った。(Ｆ) Ｃ５７ＢＬ／６(ＣＤ４５.２＋)および同族のＢ６.ＳＪＬ(ＣＤ４５.１＋)のマウスから精製したＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４＋ナイーブ脾臓Ｔ細胞を、プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂにて刺激した。１４時間後に、Ｃ５７ＢＬ／６(ＣＤ４５.２＋)マウスからのＣｒｔａｍｈｉ ＣＤ４ Ｔ細胞および同族のＢ６.ＳＪＬ(ＣＤ４５.１＋)マウスからのＣｒｔａｍ−ＣＤ４ Ｔ細胞を、制限されたＦＡＣＳ分類にて精製した。４日間静止させた後、Ｃｒｔａｍｈｉ ＣＤ４５.２＋およびＣｒｔａｍ−ＣＤ４５.１＋のＴ細胞をＣＦＳＥにて標識し、単一集団又は混合集団として３日間以上プレートに結合したｍＡｂにて再刺激した。細胞をＣＤ４５.２について染色し、ＦＡＣＳ分析によってＣＦＳＥ希釈を調べた。ここで示されるデータは、２つの別々の実験の代表値である。 (Ｇ) Ｃ５７ＢＬ／６(ＣＤ４５.２＋)および同族のＢ６.ＳＪＬ(ＣＤ４５.１＋)のマウスから精製したＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４＋ナイーブ脾臓Ｔ細胞を、ＴＨ１条件培地中で、プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂにて刺激した。１４時間後に、Ｃ５７ＢＬ／６(ＣＤ４５.２＋)マウスからのＣｒｔａｍｈｉ ＣＤ４ Ｔ細胞および同族のＢ６.ＳＪＬ(ＣＤ４５.１＋)マウスからのＣｒｔａｍ−ＣＤ４ Ｔ細胞を、制限されたＦＡＣＳ分類にて精製した。細胞生存率を上げるために、細胞を、２０ｐｓｉ外筒圧および１秒につき２０００イベントで分類し、ＢＤ ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ細胞分類器を使用して常に４℃に保った。分類された細胞を休止させ、ＴＨ１条件培地中で培養した。７２時間後に、細胞を、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ(BD Biosciences)の存在下で、ＰＭＡとイオノマイシンとで４時間再刺激した。刺激された細胞は、抗ＣＤ４５.２ ｍＡｂにて染色し、細胞内ＩＦＮ染色のために透過処理した。ここで示されるデータは、２つの別々の実験の代表値である。
【図１４】Ｃｒｔａｍはレトロウイルスにて再構成したＣｒｔａｍ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＳｃｒｉｂ ＰＤＺ３及び相当するＣｒｔａｍ表面発現と相互に作用する。 (Ａ) ｐＣＤＮＡ４-Ｃｒｔａｍ-Ｆｌａｇを２９３細胞に形質移入し、細胞抽出物をＧＳＴ−Ｓｃｒｉｂ−ＰＤＺ１、ＧＳＴ-Ｓｃｒｉｂ-ＰＤＺ２、ＧＳＴ-Ｓｃｒｉｂ-ＰＤＺ３、ＧＳＴ-Ｓｃｒｉｂ-ＰＤＺ４又はＧＳＴ−Ｅｒｂｂ２ｉｐ(Ｅｒｂｉｎ)-ＰＤＺ１と共にインキュベートした。抗Ｆｌａｇ Ｍ２アガロースビーズを用いた免疫複合体は、抗ＧＳＴ(上パネル)又は抗Ｃｒｔａｍ(下パネル)抗体によるイムノブロッティングによって分析した。 (Ｂ) ＣＲＴＡＭ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ｅＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｔａｍ、ｅＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)又はｅＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｔａｍ(ΔＥＳＩＶ)にてレトロウイルスを用いて再構成した。Ｃｒｔａｍ、Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)およびｅＧＦＰ-ＩＲＥＳ-Ｃｒｔａｍ(ΔＥＳＩＶ)の表面発現は、フローサイトメトリによって調べた。
【図１５】ＣｒｔａｍのＰＤＺ-結合モチーフは細胞増殖の制御に必要である。 ＯＶＡペプチド／ＡＰＣ刺激に応答した、ＯＴ−ＩＩ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるレトロウイルス再構成Ｃｒｔａｍ、Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)又はＣｒｔａｍ(ΔＥＳＩＶ)の細胞増殖。ＧＦＰにて再構成したＯＴ−ＩＩ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞をコントロールとした。データは、５つの別々の実験の代表値である。誤差バーは標準偏差(ＳＤ)を示す。ダネット法を使用してコントロールにて統計学的分析を行った。
【図１６】Ｃｒｔａｍの細胞内ドメインはＴ細胞極性を制御し、Ｃａｄｍ１およびＣｒｔａｍの増殖および相互作用はさらにＣＤ４Ｔ細胞のサイトカイン産生を亢進しうる。(Ａ) 抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８(１０:２ｍｇ／ｍｌ) ｍＡｂにて１４時間刺激したもの又は刺激しない、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗Ｃａｄｍ１ウサギポリクローナルＡｂ(ＧＮＥ)とタリン又はＣｒｔａｍにて染色し、デコンボリューション電子顕微鏡法によって分析した。(Ｂ) ＣｒｔａｍおよびＣｒｔａｍ(ΔＥＣＤ)変異体の構造。(Ｃ) ナイーブＣｒｔａｍ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞を精製し、プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂにて活性化した。刺激の４日後に、Ｔ細胞を、ＧＦＰ又はＦｌａｇ-Ｃｒｔａｍ(ΔＥＣＤ)をコードするレトロウイルスベクターにて再構成した。ＧＦＰ又はＣｒｔａｍ(ΔＥＣＤ)にて再構成したＣｒｔａｍ−／−ＣＤ４Ｔ細胞の極性は、ＴＣＲ再刺激の８時間後に調べた。(Ｄ) Ｃｒｔａｍ又はＦｌａｇ−Ｃｒｔａｍ(ΔＥＣＤ)を形質移入させたＣｒｔａｍ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞増殖を[３Ｈ]-チミジン取込みによって評価した。ＧＦＰを形質移入したＣｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−のＣＤ４＋Ｔ細胞をコントロールとした。(Ｅ) ＴＣＲ刺激の４８時間後にサイトカインをＥＬＩＳＡによって分析した。 (Ｆ) ナイーブＣｒｔａｍ＋／＋及びＣｒｔａｍ−／−のＣＤ４＋Ｔ細胞を精製し、プレートに結合させたｍＡｂとプレートに結合させたＣａｄｍ１(ＥＣＤ)-Ｆｃ(１μｇ／ｍｌ)又はヒトのＩｇＧ１(１μｇ／ｍｌ)にて活性化し、４８時間目にサイトカインを測定した。Ｎ＝２つの別々の実験。
【図１７】Ｃｒｔａｍは、ＴＣＲ活性化後のＣＤ８＋Ｔ細胞において急速に上方制御され、最適なＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ２２産生のために必要であるが、細胞溶解活性には必要でない。 (Ａ) Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−のマウスからナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を精製し、プレートに結合させた抗ＣＤ３／２８ ｍＡｂにて活性化し、示された時点でフローサイトメトリによって分析した。示されるデータは、２つの別々の実験の代表値である。 (Ｂ) ＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋マウスを、２０μｇのＯＶＡタンパク質を含む３０μｌのＰＢＳを左の足蹠に注射して抗原刺激した。免疫したマウスの左足の排液リンパ節および右足のコントロールリンパ節を、Ｃｒｔａｍ発現について分析した。データは、各々の時点での３匹のマウスの代表値である。 (Ｃ) Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−のマウスからナイーブ(ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋)およびエフェクター／メモリー(ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ−)ＣＤ８＋Ｔ細胞を精製し、プレートに結合させた抗ＣＤ３／２８ ｍＡｂにて刺激した。刺激の４０時間後にＥＬＩＳＡによってサイトカイン産生を分析した。データは、５つの別々の実験の代表値である。 (Ｄ) ＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ−／−及びＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ＋／＋のマウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞を、プレートに結合させた抗ＣＤ３／２８ ｍＡｂにて５日間活性化した。ＣＤ８＋Ｔ細胞芽細胞を、１０μＭのＯＶＡ２５７−２６４パルス化標的細胞(ＥＬ４)と共にインキュベートし、グランザイムＢの産生をＥＬＩＳｐｏｔによって分析した。画像は、３通りの反応物を有する２つの別々の実験の代表値である。ライカＭ６５５オペレーティング顕微鏡を用いたグランザイムＢ染色細胞の定量化を右に示す。 (Ｅ) ＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ−／−及びＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ＋／＋のマウスからの５日目のＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ及び抗ＣＤ１０７ ｍＡｂの存在下でペプチドパルス化ＥＬ４にて４時間、又は通常の培養培地中で１６時間、再活性化した。活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞表面上の４時間目のＣＤ１０７と１６時間目のＦａｓＬの発現をフローサイトメトリによって分析した。示されるデータは、２つの別々の実験の代表値である。ダネット法を使用してコントロールにて統計学的分析を行った。 (Ｆ) ＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ−／−及びＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ＋／＋のマウスからの５日目のＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０μＭのＯＶＡ２５７−２６４にてパルス化した５１Ｃｒ標識ＥＬ４にて再活性化した。インキュベートの４時間後に５１Ｃｒ−放出アッセイを行った。データは、３通りの反応物を有する２つの別々の実験の代表値である。
【図１８】ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣｒｔａｍ発現は活性化に制御される。ＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋マウスを、２０μｇのＯＶＡタンパク質を含む３０μｌのＰＢＳを左足の足蹠に注射して抗原刺激した。免役したマウスからの左足の排液リンパ節および右足のコントロールリンパ節を、ＣＤ６９発現について分析した。データは、各々の時点での３匹の別々のマウス小野代表値である。
【図１９】Ｃｒｔａｍは最適なＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ２２産生に必要である。ＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−のマウスからナイーブおよびエフェクター／メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を精製し、１０μＭのＯＶＡ２５７−２６４にてパルス化した被照射ＡＰＣにて４０時間刺激した。ＥＬＩＳＡによってサイトカイン産生を分析した。データは、２つの別々の実験の代表値である。
【図２０】５日目のＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞における正常なＴＣＲ／ＣＤ３発現。ＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ−／−及びＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ＋／＋のマウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞を、プレートに結合させた抗ＣＤ３／２８ ｍＡｂにて５日間活性化した。表面ＣＤ３およびＴＣＲ発現を、抗ＣＤ３およびクラスＩ ｉＴＡｇ ＭＨＣテトラマー(ＯＶＡペプチド、Beckman Coulter)染色によって調べた。データは、４つの別々の実験の代表値である。
【図２１】ＣｒｔａｍはＳｃｒｉｂによりＴ細胞極性の後期と選択的なサイトカイン産生を維持する。 (Ａ) Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−のマウスからナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を精製し、プレートに結合させた抗ＣＤ３／２８ ｍＡｂにて１６時間刺激した。細胞抽出物を抗Ｓｃｒｉｂ ｍＡｂ(Ｈ-３００、Santa Cruz Biotechnology、[ＳＣＢ])にて免疫沈降した。免疫複合体は、Ｃｒｔａｍ(１７Ｂ２、ＧＮＥ)、Ｃｄｃ４２(Ｂ-８、ＳＣＢ)、ＰＫＣζ(Ｈ-１、ＳＣＢ)およびＳｃｒｉｂ(Ｈ-３００)に対する抗体を用いたイムノブロッティングによって分析した。 (Ｂ) ＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−のＣＤ８＋Ｔ細胞は、３７℃のインキュベーター中で１４時間かけてペプチド／ＡＰＣにて活性化した。活性化したＴ細胞は、室温で１０〜２０分かけてＰｏｌｙ−Ｄ−リジンをコートしたカバーグラス(ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔＴＭ)上へ付着させ、固定し、抗Ｃｒｔａｍ ｍＡｂ(１７Ｂ２、Genentech)又は抗ＣＤ３ ｍＡｂ(BD Pharmingen)にて染色し、０．２％トリトンＸ−１００にて透過処理し、そして、Santa Cruz Biotechnologyの抗Ｓｃｒｉｂ(Ｈ−３００)、抗Ｃｄｃ４２(Ｂ−８)又は抗ＰＫＣζ(Ｈ−１)抗体にて染色した。 (Ｃ) ＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−のＣＤ８＋Ｔ細胞(ｎ＞２００)のＣＤ３極性の定量化。 (Ｄ) ＧＦＰコントロール、Ｃｒｔａｍ又はＣｒｔａｍ(ΔＥＳＩＶ)にて再構成したＣｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞の極性は、再刺激の１４時間後に調べた。 (Ｅ) Ｃｒｔａｍ(青)又はＣｒｔａｍ(ΔＥＳＩＶ)(赤)にて再構成したＣｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞のサイトカイン産生はＴＣＲ刺激の４８時間後に分析した。ＧＦＰにて再構成したＣｒｔａｍ＋／＋(白)又はＣｒｔａｍ−／−(緑)のＴ細胞をＤおよびＥにおいてコントロールとした。データは３つの別々の実験の代表値である。スライドはデコンボリューション顕微鏡法(Delta Vision)によって分析した。
【図２２】Ｔ細胞極性の後期の維持はＣｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞において破壊される。(Ａ) ＣＤ８＋Ｔ細胞は、３７℃のインキュベーター中で１６時間かけて、プレートに結合させた抗ＣＤ３／２８ ｍＡｂにて活性化した。活性化されたＴ細胞は、培地をゆっくりとピペッティングすることによってプレートから洗い流した。溶出された細胞をＰｏｌｙ−Ｄ−リジンでコートしたカバーグラス(BD BioCoatTM)に室温で１０〜２０分間かけて付着させ、固定及び染色の手順を行った。 (B) Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−のＣＤ８＋Ｔ細胞(ｎ＞２００)におけるＣＤ３極性化の定量化。スライドは、デコンボリューション顕微鏡(Delta Vision)によって分析した。
【図２３】Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞における細胞極性と初期活性化は、ＴＣＲ活性化の３０分後では正常である。(Ａ) １０μｌの抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ａｂをコートしたダイナビーズを、Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−マウスの１×１０６ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞と共に３７℃のインキュベーター中で３０分間インキュベートし、細胞をＰｏｌｙ−Ｄ−リジンコートしたカバーグラス(BD BioCoatTM)に室温で１０〜２０分間かけて付着させた。付着しなかった細胞はリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)にて洗い落とし、細胞を４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳにて固定し、抗Ｃｒｔａｍ ｍＡｂ(１７Ｂ２、Genentech)、又は抗ＣＤ３ ｍＡｂ(BD Pharmingen)にて染色し、０．２％トリトンＸ−１００にて透過処理し、Santa Cruz Biotechnologyの抗ペリセントリン(BD Pharmingen)、抗ＰＫＣθ(Cell Signaling)、抗Ｓｃｒｉｂ(Ｈ−３００)又は抗ＰＫＣζ(Ｈ−１)抗体にて染色した。最終の洗浄の後、染色した細胞を、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ抗−ｆａｄｅ試薬(Invitrogen)にてマウントした。画像は、各々の実験条件につき５０より多い数の細胞の代表である。スライドは、ライカＳＰ５共焦点顕微鏡によって分析した。(Ｂ) Ｃｒｔａｍ−／−及びＣｒｔａｍ＋／＋マウスからのナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞は、プレートに結合させた抗ＣＤ３／２８ ｍＡｂにて活性化した。表面ＣＤ２５およびＣＤ６９発現は活性化の６時間後に調べた。データは、５つの別々の実験の代表値である。
【図２４】ＳｃｒｉｂおよびＰＫＣζは、Ｔ細胞極性の後期を維持するために必要であり、そのＴ細胞極性の後期は順に、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ２２調節のために必要である。(Ａ−Ｇ) Ｃｒｔａｍ＋／＋マウスからの５日目のＣＤ８＋Ｔ細胞芽細胞に、既に記載されるように(Yeh et al., Cell 132(5): 846-859(2008)、コントロール、Ｓｃｒｉｂ(Ａ、Ｂ、Ｃパネル２およびＤ)又はＰＫＣζ(Ｃパネル３、Ｅ−Ｇ) ｓｉＲＮＡ(QIAGEN)を電気穿孔した。ＳｃｒｉｂおよびＰＫＣζ発現は、形質移入の１２時間後にウェスタンブロッティングによって分析し(ＡおよびＥ)、Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ｍＡｂにて８時間再刺激し、細胞を固定し、図に示すようにＳｃｒｉｂおよび／またはＰＫＣζに加えてＣｒｔａｍおよびタリンについて染色した。コントロール、Ｓｃｒｉｂ又はＰＫＣｚ ｓｉＲＮＡを形質移入した細胞によるサイトカイン産生を、再刺激の４８時間後にＥＬＩＳＡによって分析した(ＤおよびＧ)。 (Ｈ−Ｊ) ｐＩＲＥＳ-ＧＦＰ又はｐＩＲＥＳ-Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂは、Ｃｒｔａｍ−／−マウスからの５日目のＣＤ8＋Ｔ細胞芽細胞に電気穿孔した。Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂの発現は、ウェスタンブロッティング(Ｈ)およびフローサイトメトリーによって確認した(図２７)。この図の灰色の矢印は内在性Ｓｃｒｉｂタンパク質を示し、アスタリスクはＣｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂキメラを示す。Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂ発現細胞における細胞極性を、再刺激の８時間後に調べ(Ｉ)、これらの細胞によるサイトカイン産生は再刺激の４８時間後にＥＬＩＳＡによって分析した(Ｊ)。データは、２つの別々の実験の代表値である。画像は、各々の染色について調べた５０よりも多い数の細胞の代表である。
【図２５】タリン極性化はＳｃｒｉｂおよびＰＫＣｚノックダウンＣＤ８＋Ｔ細胞において維持されない。図２４Ｂ及び２４Ｆに示す、再活性化の８時間後のコントロール、Ｓｃｒｉｂ(Ａ)又はＰＫＣζ(Ｂ) ｓｉＲＮＡを形質移入したＣｒｔａｍ＋／＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のタリン極性化の定量化(ｎ＞５０)。
【図２６】ＳｃｒｉｂおよびＰＫＣζノックダウンＣＤ８＋Ｔ細胞における正常な初期Ｔ細胞極性および活性化。(Ａ) コントロール、Ｓｃｒｉｂ又はＰＫＣζ ｓｉＲＮＡを形質移入させたＣｒｔａｍ＋／＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ａｂをコートしたダイナビーズにて３０分間再活性化し、そして、抗ＣＤ３および抗ＰＫＣθ染色のために固定した。(ｎ＞５０)。 (Ｂ) コントロール、Ｓｃｒｉｂ又はＰＫＣζ ｓｉＲＮＡを形質移入したＣｒｔａｍ＋／＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、プレートに結合させた抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ａｂにて８時間活性化し、表面ＣＤ２５およびＣＤ６９発現をフローサイトメトリによって調べた。
【図２７】細胞表面でのＣｒｔａｍ(ＤＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂキメラの発現。 ｐＩＲＥＳ-ＧＦＰ又はｐＩＲＥＳ-Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂを、Ｃｒｔａｍ−／−マウスからの５日目のＣＤ８＋Ｔ細胞芽細胞に電気穿孔した。Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂの発現は、フローサイトメトリによって評価した。
【図２８】Ｃｒｔａｍが媒介するＣＤ８ Ｔ細胞応答は、Ｌ.モノサイトゲネス感染の間の宿主抵抗性に必要である。  (Ａ) Ｌ.モノサイトゲネス感染の１日前に、Ｒａｇ２−／−マウスに１×１０７のＣＤ８＋Ｃｒｔａｍ−／−又はＣｒｔａｍ＋／＋Ｔ細胞を静脈内注射した。マウスの生存率は２週間毎日追った。 (Ｂ) 生存しているマウスを１４日目に安楽死させ、それらの脾臓の全体の形態を示した。 (Ｃ) 生存しているマウスの脾臓の細菌負荷は、ブレーンハートインフュージョン(ＢＨＩ)寒天プレート上のコロニー数により測定し、定量化した。 (Ｄ) ５日目の感染したマウスの血清を採取し、ＥＬＩＳＡによって分析した。 (Ｅ) ５日目の感染したマウスからの１×１０７／ｍｌ脾細胞を、１×１０８ＣＦＵ／ｍｌの熱殺菌したＬ.モノサイトゲネス(ＨＫＬＭ)の有無のもとでインキュベートした。４８時間後、サイトカイン産生をＥＬＩＳＡによって分析した。 (Ｆ) ５日目の感染したマウスから精製したＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｌ.モノサイトゲネス感染ＩＣ-２１標的細胞と３時間インキュベートし、特定のグランザイムＢスポットをライカＭ６５５顕微鏡によって計数した。データは、３つの別々の実験の代表値である。ダネット法を使用してコントロールにて統計学的分析を行った。
【図２９】Ｌ.モノサイトゲネス感染後の再構成されたＲａｇ２−／−マウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の試験。(Ａ) Ｌ.モノサイトゲネス感染の１日前に、Ｒａｇ２−／−マウスに１×１０７のＣＤ８＋Ｃｒｔａｍ−／−又はＣｒｔａｍ＋／＋Ｔ細胞を静脈内注射した。血液中の再構成されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、感染の日(０日目)と１４日目に調べた。 (Ｂ) 脾臓のＣＤ８＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリによって５日目に調べた。各個体のマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、右パネルに示す。ダネット法を使用してコントロールにて統計学的分析を行った。
【図３０】ヒトＣＲＴＡＭアミノ酸配列。(Ａ)はシグナル配列を有するヒトＣＲＴＡＭのアミノ酸配列(配列番号：１)を示す。(Ｂ)はシグナル配列を欠くヒトＣＲＴＡＭのアミノ酸配列(配列番号：２)を示す。
【図３１】マウスＣＲＴＡＭアミノ酸配列。(Ａ)はシグナル配列を有するマウスＣＲＴＡＭ(ＮＭ＿０１９４６５)のアミノ酸配列(配列番号：３)を示す。(Ｂ)はシグナル配列を欠くマウスＣＲＴＡＭ(ＮＭ＿０１９４６５)のアミノ酸配列(配列番号：４)を示す。
【図３２】ヒトＮｅｃｌ２(Ｃａｄｍ１)アミノ酸配列。(Ａ)はシグナル配列を有するヒトＮｅｃｌ２(Ｃａｄｍ１)(ＮＭ＿０１４３３３)のアミノ酸配列(配列番号：５)を示す。(Ｂ)はシグナル配列を欠くヒトＮｅｃｌ２(Ｃａｄｍ１)(ＮＭ＿０１４３３３)のアミノ酸配列(配列番号：６)を示す。
【図３３】マウスＮｅｃｌ２(Ｃａｄｍ１)アミノ酸配列。(Ａ)はシグナル配列を有するマウスＮｅｃｌ２(Ｃａｄｍ１)(ＮＭ＿２０７６７５)のアミノ酸配列を示す(配列番号：７)。(Ｂ)はシグナル配列を欠くマウスＮｅｃｌ２(Ｃａｄｍ１)(ＮＭ＿２０７６７５)のアミノ酸配列(配列番号：８)を示す。
【図３４】抗ＣＲＴＡＭ抗体アミノ酸配列。(Ａ)はハムスター−マウスキメラ抗ＣＲＴＡＭ抗体(１７Ｂ２)の軽鎖のアミノ酸配列(配列番号：３１)を示す。可変ドメインに下線を引き(配列番号：３５)、各々のＣＤＲ１(配列番号：３７)、ＣＤＲ２(配列番号：３８)およびＣＤＲ３(配列番号：３９)を囲みで示す。(Ｂ)はハムスター−マウスキメラ抗ＣＲＴＡＭ抗体(１７Ｂ２)の重鎖のアミノ酸配列(配列番号：３２)を示す。可変ドメインを下線で示し(配列番号：３６)、各々のＣＤＲ１(配列番号：４０)、ＣＤＲ２(配列番号：４１)およびＣＤＲ３(配列番号：４２)を囲みで示す。
【図３５】抗ＣＲＴＡＭ抗体軽鎖核酸配列。ハムスター−マウスキメラ抗ＣＲＴＡＭ抗体(１７Ｂ２)の軽鎖の核酸配列を示す(配列番号：３３)。開始および停止コドンを下線で示し、成熟軽鎖の第一コドンを囲みで示す。
【図３６】抗ＣＲＴＡＭ抗体重鎖核酸配列。ハムスター−マウスキメラ抗ＣＲＴＡＭ抗体(１７Ｂ２)の重鎖の核酸配列を示す(配列番号：３４)。開始および停止コドンを下線で示し、成熟重鎖の第一コドンを囲みで示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、方法、組成物、キットおよび製造品を活性化されたＴ細胞のＣＲＴＡＭを調整することによって様々な疾患を診断して、治療することに提供する。これらの方法、組成物、キットおよび製造品の詳細は、本願明細書において提供される。
一般的な技術
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技術範囲内の分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を使用して行う。このような技術は、例えば以下のような文献に十分に明記されている。"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)；"Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)；"Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)；"Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)；"Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates)；"PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994)；"A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988)。
【００２１】
Ｉ．定義
ＣＲＴＡＭ調節の前後関係において本明細書中で用いられる、「疾患」又は「疾患」は、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子及び／又は方法による処置から利益を得る任意の状態である。これには、問題とする疾患又は疾病に哺乳動物がかかりやすくなる病理学的症状を含む慢性及び急性の疾病又は疾患を含む。本明細書中で処置される疾患又は疾病の限定するものではない例には、炎症性(例えば、自己免疫性)、及び他の免疫学的疾患／疾病が含まれる。
本明細書中の「自己免疫性疾患」は、個体自身の組織から生じる又は個体自身の組織に対する非悪性の疾患又は疾病である。本明細書中の自己免疫性疾患は特に、悪性又は癌性の疾患又は状態、特にＢ細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄芽球性白血病を除外する。自己免疫性疾患又は疾病の例には、限定するものではないが、炎症性反応、例えば乾癬及び皮膚炎(例えばアトピー性皮膚炎)を含む炎症性皮膚病；全身強皮症及び硬化症；炎症性腸疾患(例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎)と関係する応答；呼吸窮迫症候群(成人呼吸窮迫症候群；ＡＲＤＳを含む)；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；アレルギー性状態、例えば湿疹及び喘息及び、Ｔ細胞の浸潤及び慢性炎症性応答を伴う他の状態；アテローム性動脈硬化；白血球接着欠損症；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)；真正糖尿病(例えばＩ型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病)；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年型糖尿病；及び一般的に結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症及び血管炎に見られるサイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性かつ遅発性過敏症と関係する免疫応答；悪性貧血(アジソン病)；白血球血管外遊出を伴う疾患；中枢神経系(ＣＮＳ)炎症性疾患；多臓器損傷症候群；溶血性貧血(クリオグロビン血症又はクームズ陽性貧血症を含むがこれに限らない)；重症筋無力症；抗原抗体複合体媒介性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート-イートン筋無力症症候群；水疱性類天ぽうそう；ペンフィグス；自己免疫性多腺性内分泌障害；ライター症候群；全身強直性症候群；ベーチェット疾患；巨細胞動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡネフロパシ；ＩｇＭ多発性神経炎；免疫性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)又は自己免疫性血小板減少などが含まれる。
【００２２】
また、本発明は活動中の自己免疫性疾患に関する。活動中である自己免疫性疾患は、被検体の免疫系が自己応答性の状態である疾患、つまり、被検体自身の免疫系の細胞が被検体自身の組織及び／又は器官を攻撃するために動員される疾患である。活動中の自己免疫性疾患を有する被検体は概して、疾患の対応する症状を表す。活動中の自己免疫性疾患を有する哺乳類の被検体は再燃しうる。この再燃は、高められた疾患活動性の期間又は対応する症状の再発の期間である。再燃は、重症の感染、アレルギー性反応、身体的ストレス、感情的な外傷、手術又は環境因子に応答して発生しうる。
上記の通り、本明細書中に記述される炎症性疾患(例えば自己免疫性疾患又は自己免疫関連状態)を治療する際に、被検体は、第二治療薬、例えば免疫抑制剤(すなわち消炎剤)と組み合せた、複数剤併用療法などで、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子にて治療されてもよい。ＣＲＴＡＭ調節因子は、免疫抑制剤と同時、順に又は交替して投与されてよい。免疫抑制剤は、当分野で定められている用量と同じか又はそれより少ない用量で投与されてよい。適切な補助免疫抑制剤は、治療する疾患の種類並びに患者の病歴を含む多くの因子に依存するであろう。
【００２３】
ここで用いる「免疫抑制剤」は、患者の免疫系及び／又は炎症性応答を抑制する又は遮断するように働く物質を指す。これは、サイトカイン産生を抑制する、自己抗原の発現を下方制御又は抑制する、あるいはＭＨＣ抗原を遮断する物質を含む。そのような薬剤の例として、２-アミノ-６-アリル-５-代替ピリミジン(米国特許第４６６５０７７号参照)、アザチオプリン(又はアザチオプリンに副作用がある場合にはシクロホスファミド)；ブロモクリプチン；グルタルアルデヒド(米国特許第４１２０６４９号に記載のように、ＭＨＣ抗原を遮断する)；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣフラグメントに対する抗イデオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；サイトカイン又はサイトカインレセプターアンタゴニスト、例として抗インターフェロン-γ、-β、又は-α抗体；抗腫瘍壊死因子α抗体；抗腫瘍壊死因子β抗体；抗インターロイキン２抗体及びＩＬ-２レセプター抗体；抗-Ｌ３Ｔ４抗体；異種性抗リンパ球グロブリン；ｐａｎ-Ｔ抗体、好ましくは、抗-ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(１９９０年７月２６日公開の国際公開第９０／０８１８７号)；ＴＧＦ-β；ストレプトドルナーゼ(streptodornase)；宿主由来のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアニン(deoxyspergualin)；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター (米国特許第５１１４７２１号)；Ｔ細胞レセプターフラグメント(Offner et al., Science 251:430-432 (1991)；国際公開第９０／１１２９４号；及び国際公開第９１／０１１３３号)；及びＴ１０Ｂ９などのＴ細胞レセプター抗体 (欧州特許第３４０１０９号)を含む。
【００２４】
本明細書中で交換可能に用いられる、「細胞障害性又は調節性のＴ細胞関連分子」、「クラスＩ ＭＨＣ制限Ｔ細胞関連分子」及び「ＣＲＴＡＭ」(上又は下の場合において、又は、その何か組合せにおいて)なる用語は、天然配列ポリペプチド、ポリペプチド変異体及び、野生型のＣＲＴＡＭと同様な様式で活性化されたＴ細胞活性を調節することができる天然配列ポリペプチド及びポリペプチド変異体の断片を包含する。本明細書中で記述されるＣＲＴＡＭポリペプチドは、ヒト組織種又は他の供給源などの様々な供与源から単離されるものであっても、又は組換え又は合成方法によって調製されるものであってもよい。また、「ＣＲＴＡＭ」、「ＣＲＴＡＭポリペプチド」、「ＣＲＴＡＭタンパク質」及び「ＣＲＴＡＭ分子」は、本明細書中で開示されるＣＲＴＡＭポリペプチドの変異体を含む。本発明の「ＣＲＴＡＭ調節因子」は、ＣＲＴＡＭの通常の生物学的機能／活性を調整する分子である。
「天然配列ＣＲＴＡＭポリペプチド」は、天然由来の対応するＣＲＴＡＭポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一実施態様では、天然配列ＣＲＴＡＭポリペプチドは、配列番号：１(図３０Ａ参照)又は２(図３０Ｂ参照)のアミノ酸配列を含む。このような天然配列ＣＲＴＡＭポリペプチドは、自然から単離されてもよいし又は組換え又は合成手段によって生産されてもよい。本明細書中で用いる「ＣＲＴＡＭポリペプチド」及び「ＣＲＴＡＭタンパク質」なる用語は具体的に、天然に生じる切断型、さもなければ翻訳後に修飾された形態の特定のＣＲＴＡＭポリペプチド、天然に生じる変異体型(例えばオルターナティブスプライス変異体)及びポリペプチドの天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。ここで使用しているように、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は交換可能に用いられるが、「ペプチド」なる用語が概して、２００より少ない隣接するアミノ酸を含むポリペプチドを指す場合を除く。
【００２５】
ここで使用される「ベクター」という用語は、それが結合している他の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味するものである。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントが結合されうる円形の二本鎖ＤＮＡループを意味する。他の型のベクターはファージベクターである。他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへ結合させうる。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製することができる(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する。更に、所定のベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターはここでは「組換え発現ベクター」(又は単に「組み換えベクター」)と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」を相互交換可能に使用する場合が多い。
【００２６】
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に標識とコンジュゲートによるなどしてさらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ-Ｌ-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。更に、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体又は半固体担体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有する有機キャップ基部分又はアミンで置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。またポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み得、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
ここで使用される「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
【００２７】
本明細書中で用いる「宿主細胞」(又は「組み換え宿主細胞」)なる用語は、遺伝的に改変されている細胞、又は組み換えプラスミドないしベクターなどの外因性ポリヌクレオチドの導入によって遺伝的に改変されうる細胞を指す。このような用語が特定の被検体の細胞だけでなくこのような細胞の後代(プロジェニー)も指すことは理解されるであろう。突然変異又は環境の影響の何れかによってある種の修飾が後の世代中に生じるので、このような後代は、実際には親細胞と同一でないが、本明細書中で用いる「宿主細胞」なる用語の範囲内に包含されるものである。
ＣＲＴＡＭ「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」はＣＲＴＡＭポリペプチドの形態を指す。これは、それぞれの完全長分子の膜貫通及び細胞質のドメインを基本的に欠くものである。
「ＣＲＴＡＭリガンド」なる用語は、限定するものではないが、単離されるか及び／又は精製されるか、合成及び／又は組み換えに限らず天然のＣＲＴＡＭリガンド、天然のＣＲＴＡＭリガンド(例えば他の哺乳動物から)のホモログ、抗体、このような分子の部分、及びＣＲＴＡＭを結合する他の物質を指す。ＣＲＴＡＭリガンドなる用語は、ＣＲＴＡＭ活性のインヒビター又はプロモーターである物質、並びに結合するがインヒビター又はプロモーター活性を欠いている物質を包含する。ＣＲＴＡＭリガンドの例としては、限定するものではないが、Ｃａｄｍ１とも称されるネクチン様タンパク質２(Ｎｅｃｌ２)が含まれる。
【００２８】
ＣＲＴＡＭ機能／活性に関連して本明細書中で用いられる「アンタゴニスト」なる用語、及び「ＣＲＴＡＭアンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、そして天然配列ＣＲＴＡＭポリペプチドのＣＲＴＡＭリガンドへの結合をブロックする任意の分子、及び／又は天然配列ＣＲＴＡＭポリペプチドの質的生物学的活性(本明細書中で定義されるもの)を一部ないし完全にブロックないし中和する(「阻害する」とも総称される)か又は低減する任意の分子が含まれる。適切なＣＲＴＡＭアンタゴニスト分子には、特に限定するものではないが、本明細書中に記載されるＣＲＴＡＭ調節因子、例えば、抗体断片、本明細書中の天然配列ＣＲＴＡＭポリペプチドの変異体及び融合などの他のポリペプチド、ペプチド及び非ペプチド(有機)の小分子、阻害性及びアンチセンスポリヌクレオチド分子を含む、遮断性抗ＣＲＴＡＭ抗体を含む調節因子が含まれる。一実施態様では、ＣＲＴＡＭアンタゴニストには、天然のＣＲＴＡＭポリペプチドを特異的に結合し、ＣＲＴＡＭリガンドへのその結合をブロックすることができる抗体断片を含む抗ＣＲＴＡＭ抗体が含まれる。
ＣＲＴＡＭ機能／活性に関連して本明細書中で用いられる「ＣＲＴＡＭブロック抗体」又は「遮断抗体」は、天然配列ＣＲＴＡＭポリペプチドのＣＲＴＡＭリガンドへの結合をブロックすることができる抗体、及び／又は天然配列ＣＲＴＡＭポリペプチドの生物学的活性(本明細書中で定義されるもの)を一部ないし完全にブロックないし中和する(「阻害する」とも総称される)か又は低減する抗体を指す。遮断抗体は本明細書中で定義される枯渇抗体であってもよい。
【００２９】
本明細書中で用いる「ＣＲＴＡＭ結合剤」なる用語は、ＣＲＴＡＭを結合することができる、タンパク質などの分子を指す。一実施態様では、結合剤は、ＣＲＴＡＭリガンドを結合するＣＲＴＡＭの能力を干渉することなくＣＲＴＡＭを結合する。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ結合剤はＣＲＴＡＭ非遮断抗体である。
ＣＲＴＡＭ機能／活性に関連して用いられる「ＣＲＴＡＭ非ブロック抗体」又は「非遮断抗体」は、天然配列ＣＲＴＡＭポリペプチドを結合することができるが、天然配列ＣＲＴＡＭポリペプチドへのＣＲＴＡＭリガンドの結合を干渉又は遮断しない抗体を指す。しかしながら、結合により、ＣＲＴＡＭ非遮断抗体は、ＣＲＴＡＭ分子を発現する細胞の枯渇又は欠失を媒介することができる。一実施態様では、非遮断抗体はＣＲＴＡＭ細胞外ドメインを結合する。ゆえに、一実施態様では、ＣＲＴＡＭ非遮断抗体は、ＣＲＴＡＭリガンド結合を干渉せず、ＣＲＴＡＭを発現するＴ細胞の枯渇を誘導することができる。非遮断抗体は、本明細書中で定義される枯渇抗体でもよい。
【００３０】
本明細書中で用いる「枯渇」は細胞の除去、枯渇又は欠失を指す。一実施態様では、枯渇された細胞は、特定のＴ細胞群の一部、例えば活性化されたＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞群の一部である。通常は、枯渇される細胞は特定の細胞表面マーカーを発現する。マーカーは、ＣＤ４又はＣＤ８単独、又はＣＲＴＡＭと組み合わせてもよい。一実施態様では、表面マーカーはＣＲＴＡＭである。
本明細書中で用いる「枯渇抗体」は、抗原標的を含む細胞に結合することにより抗原又は細胞の機能を阻害する、又は細胞の死を生じさせる抗体を指す。一実施態様では、本発明の枯渇抗体は、ＣＲＴＡＭを結合し、ＣＲＴＡＭへのＣＲＴＡＭリガンドの結合をブロックしてもしなくてもよい。ゆえに、枯渇抗体は具体的に、本明細書中で定義されるように、遮断抗体及び非遮断抗体を含む。特定の実施態様では、枯渇抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞の縮み、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成(アポトーシス性本体と呼ばれる)などの標準的なアポトーシスアッセイにより決定される、例えばＴ細胞のプログラムされた細胞死又はアポトーシスを誘発しうる。「細胞死を誘発する」枯渇抗体は、生存可能な細胞を生存不能にするものである。一実施態様では、細胞はＣＲＴＡＭ＋細胞である。インビトロでの細胞死を補体及び免疫エフェクター細胞の不在下で決定し、よって抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)又は補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)によって誘発された細胞死を区別することができる。つまり、細胞死のアッセイは、熱で不活性化した血清を用いて(即ち、補体の不在下において)、免疫エフェクター細胞の不在下で実行することができる。抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子が細胞死を誘発することができるか否かを決定するために、処理しない細胞と比較して、ヨウ化プロピジウム(ＰＩ)、トリパンブルー(Moore等, Cytotechnology 17:1-11 (1995)参照)、又は７ＡＡＤの取り込みによって評価される膜完全性の欠損が評価されうる。一実施態様では、細胞死誘発抗体は、ＣＲＴＡＭ＋細胞を枯渇するものである。
一実施態様では、本発明の枯渇抗体は、ＣＲＴＡＭを結合し、毒素コンジュゲートを含むものであり、この毒素は、抗体コンジュゲートを結合する細胞の枯渇を誘導する。また、本発明の枯渇抗体は、コンジュゲートされた毒素又は細胞障害性剤により細胞死を誘導してもよい。
【００３１】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、又は他の挿入剤(intercalating agent)、酵素及びその断片、例えば核酸溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素及び例えばその断片及び／又は変異体を含むように意図されている。他の細胞障害性剤が下記に記載されている。
【００３２】
「抗体」(Ａｂ)及び「免疫グロブリン」(Ｉｇ)は、類似の構造的特徴を有する糖タンパク質を意味する。抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体と、一般に抗原特異性を欠く抗体様分子の双方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系では低レベルで、骨髄腫では高レベルで産出される。
「抗体」及び「免疫グロブリン」なる用語は、最も広義で相互に交換可能に使用され、モノクローナル抗体(例えば、全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば、所望の生物活性を示す限り二重特異性抗体)が含まれ、さらにある種の抗体断片(ここに詳細に記載されるもの)も含まれ得る。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化及び／又は親和成熟したものであってよい。
「抗ＣＲＴＡＭ抗体」又は「ＣＲＴＡＭに結合する抗体」は、抗体がＣＲＴＡＭをターゲッティングする際に診断用及び／又は治療用の薬剤として有用である程度に十分な親和性を有してＣＲＴＡＭを結合することが可能である抗体を指す。好ましくは、関係がなくＣＲＴＡＭでないタンパク質への抗ＰＲＯ抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)によって測定するところの、ＣＲＴＡＭへの抗体の結合のおよそ１０％未満である。ある実施態様では、ＣＲＴＡＭに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０．１ｎＭの解離定数(Ｋｄ)を有する。ある実施態様では、抗ＣＲＴＡＭ抗体は、異なる種のＣＲＴＡＭポリペプチド間で保存されるＣＲＴＡＭのエピトープに結合する。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、実質的にインタクトな形態の抗体を指し、以下に定義するような抗体断片は意味しない。この用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００３３】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｃ領域」という用語は、インタクトな抗体のパパイン消化で生じ得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は変異体Ｆｃ領域である。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基、又は約位置Ｐｒｏ２３０からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸展すると定義される。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般的に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、場合によってはＣＨ４ドメインを含む。ここで「Ｆｃ領域鎖」とは、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖のうちの一つを意味する。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。ある実施態様では、二本鎖Ｆｖ種は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。集合的に、Ｆｖの６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００３４】
またＦａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ（ａｂ'）２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、２つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で２つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは二価でも二特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134；及びHollinger et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134に記載されている。
【００３５】
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる可能性がある変異、例えば自然に生じる突然変異を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」との形容は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。ある実施態様では、このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、この選択プロセスは、雑種細胞クローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの、唯一のクローンの選択とすることができる。重要なのは、選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的への親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多選択性抗体の生成等が可能になること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることである。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、それらが他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。
【００３６】
「モノクローナル」との形容は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作製することができ、それらの技術には、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)；Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling et al.: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)；Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5);1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee et al., J. Immounol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004))、並びに、ヒト免疫グロブリン座位の一部又は全部、或るいはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物にヒト又はヒト様抗体を生成する技術(例えば、国際公開第９８／２４８９３号；国際公開第９６／３４０９６号；国際公開第９６／３３７３５号；国際公開第９１／１０７４１号；Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)；Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号; Marks et al., Bio.Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)参照)が含まれる。
【００３７】
ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。また次の文献とそこに引用されている文献を参考のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
【００３８】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含むもの、及び／又はここに開示されたヒト抗体を作製する任意の技術を使用して製造されたものである。そのような技術には、ファージディスプレイのようなヒト由来組み合わせライブラリーのスクリーニング（Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)及びHoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)参照）；ヒトモノクローナル抗体産生のためのヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株の使用(Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)参照)；及び内因性の免疫グロブリンを産生しない、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）におけるモノクローナル抗体の生成(Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)参照)が含まれる。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト動物由来の抗原結合残基を含むヒト化抗体を除く。
「親和成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じさせる、その一又は複数のＣＤＲにおいて一又は複数の改変を持つものである。一実施態様では、親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られている手順によって生産される。Marks et al., Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和成熟について記載している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘導は、Barbas et al., Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al., Gene, 169：147-155(1995)；Yelton et al., J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al., J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins et al., J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
【００３９】
「小分子」又は「有機小分子」は、本明細書において５００ダルトン以下の分子量を有する有機分子と定義される。
「ＣＲＴＡＭ結合オリゴペプチド」又は「ＣＲＴＡＭに結合するオリゴペプチド」は、ＣＲＴＡＭを標的とした診断薬及び／又は治療薬として有用な程度にＣＲＴＡＭと十分な親和性で結合可能なオリゴペプチドである。ある実施態様では、関連のない非ＣＲＴＡＭタンパク質へのＣＲＴＡＭ結合オリゴペプチドの結合の程度は、ＣＲＴＡＭへのＣＲＴＡＭ結合オリゴペプチドの結合の約１０％より低く、その程度は例えば表面プラズモン共鳴アッセイにより測定される。ある実施態様では、ＣＲＴＡＭ結合オリゴペプチドは、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。
「ＣＲＴＡＭ結合有機分子」又は「ＣＲＴＡＭに結合する有機分子」は、ＣＲＴＡＭを標的とした診断薬及び／又は治療薬として有用な程度にＣＲＴＡＭと十分な親和性で結合可能な有機分子である。ある実施態様では、関連のない非ＣＲＴＡＭタンパク質へのＣＲＴＡＭ結合有機分子の結合の程度は、ＣＲＴＡＭへのＣＲＴＡＭ結合有機分子の結合の約１０％より低く、その程度は例えば表面プラズモン共鳴アッセイにより測定される。ある実施態様では、ＣＲＴＡＭ結合有機分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００４０】
標的ポリペプチドに結合する任意の分子の解離定数（Ｋｄ）は、便宜上表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定され得る。そのようなアッセイは、２５℃で、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した標的ポリペプチドＣＭ５チップと共に、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いてもよい。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。標的ポリペプチドを１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。標的ポリペプチドの注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈した結合分子(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。Chen, Y. et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照のこと。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる抗体の結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【００４１】
本明細書中で用いる、ＣＲＴＡＭ機能／活性に関して使用する「調節」又は「ＣＲＴＡＭ生物活性の調節」は、例えば、(i)ＣＲＴＡＭ＋細胞を伴う免疫応答の一部である細胞の現象、及び(ii)ＣＲＴＡＭ抗体(例えばアンタゴニスト抗体)を含むＣＲＴＡＭ調節因子によって調節される細胞性現象の調節を指す。この調節はＴ細胞活性化の初期の後に起こり、概して細胞の活性化の初めの数時間の間のＴ細胞細胞骨格の再構成を含む。この初めの再構成の間、Ｗａｓ／Ｗａｓｐ、Ｖａｖ１／Ｖａｖ、Ｗａｓｆ２／ＷＡＶＥ２及びＨｃｌｓ１／ＨＳ１のような細胞骨格調節因子は、初期Ｔ細胞微小管及びアクチン再構成で役割を果たす。他の初期現象としては、限定するものではないが、抗原提示細胞(ＡＰＣ)によるＴ細胞活性化；免疫学的シナプスの形成；Ｔ細胞抗原レセプター(ＴＣＲ)接触領域でのシグナル伝達足場の調整された集合；免疫学的シナプス及び脂質ラフトへのＳｃｒｉｂ及びＤｌｇ１の動員；ＣＤ３からのＳｃｒｉｂ及びＤｌｇ１の極性化；アクチン重合の初期；及び細胞間接触後の二次メッセンジャを生成する細胞骨格再構成の一又は複数などがある。Ｔ細胞活性化の後期は、ＣＲＴＡＭ発現が上方制御される間の初期Ｔ細胞活性化に続き起こる。ＣＲＴＡＭ調節因子によるこの後期の調節は、細胞増殖；サイクリング又は分裂；細胞接着；Ｔ細胞エフェクター機能の発達；サイトカイン産生；Ｓｃｒｉｂ腫瘍-抑制遺伝子、ＰＫＣζ及びＣｄｃ４２の一又は複数を含むがこれらに限定されるものではない、特定の分子の膜への細胞内動員；Ｔ細胞の先端でのＣｄｃ４２含有複合体の集合の細胞内配位；後期段階細胞骨格再構成及びＴ細胞極性の一又は複数を含むがこれらに限定されない、様々なＴ細胞活性化現象に影響しうる。ＣＲＴＡＭ調節はまた、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞の一又は複数を含むがこれらに限定されない、特定のＣＲＴＡＭ＋細胞種に影響しうる。ＣＲＴＡＭ調節因子による調節は、例えば、サイトカイン、ＩＦＮγ、ＩＬ２２及び／又はＩＬ１７の一又は複数を含むがこれらに限定されないサイトカインの産生への影響を含む。
【００４２】
本明細書中で用いる「ＣＲＴＡＭ＋細胞」は、その表面上に天然配列ＣＲＴＡＭを有する又は発現する細胞を指す。ある実施態様では、ＣＲＴＡＭ＋細胞は、Ｔ細胞活性化の後期のＴ細胞である。ＣＲＴＡＭ＋細胞には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞が含まれるがこれらに限定されない。ある実施態様では、ＣＲＴＡＭ＋細胞は、ＩＦＮγ、ＩＬ２２及び／又はＩＬ１７を含むがこれらに限定されないサイトカインを生産している細胞である。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ＋細胞はまた、ＣＤ４＋である。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ＋細胞はまた、ＣＤ８＋である。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ＋細胞は、活性化されたＣＤ4＋Ｔ細胞である。
【００４３】
「抗体依存性細胞障害活性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)を発現する非特異的な細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞上に結合した抗体を認識して、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞が媒介する反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲIIIのみを発現する一方、単球はＦｃγＲI、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes et. Al., PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。
【００４４】
「Ｆｃレセプター」もしくは「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを表すために用いる。一実施態様では、ＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。一実施態様では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスを含み、それらの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされたものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)、ＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主として細胞質領域は異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質領域にチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ；ITAM)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質領域にチロシン依存性免疫受容体阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ；ITIM)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)；Capel 等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；de Haas 等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に総説されている。他のＦｃＲ、ここでは、将来的に同定されるものも含めて、「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、また、該用語には、母性ＩｇＧｓが胎児に受け継がれる要因となっている新生児性受容体「ＦｃＲｎ」も含まれる(Guyer 等, J. Immunol. 117:587 (1976)及び Kim 等, J. Immunol.24:249 (1994))。
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を指す。補体活性化の経路は、補体活性化経路は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と複合体化した分子(例えば抗体)に結合することにより開始される。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されるようなＣＤＣアッセイが行われてもよい。
【００４５】
「免疫エフェクター細胞」は、抗原を結合して、免疫応答を媒介することが可能な細胞を指す。これらの細胞には、Ｔ細胞(例えばＣＤ４＋、ＣＤ８＋)、Ｂ細胞、単核細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞及び細胞障害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)が含まれるがこれらに限定されない。一実施態様では、免疫エフェクター細胞は活性化された細胞を含む。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ＋細胞は免疫エフェクター細胞である。
「ナイーブな」免疫エフェクター細胞は、その細胞を活性化することが可能な抗原に曝されたことがない免疫エフェクター細胞である。ナイーブな免疫エフェクター細胞の活性化には、増殖して抗原特異的なアーム化されたエフェクターＴ細胞に分化するために、専門のＡＰＣによる同時刺激シグナルの同時運搬とペプチドＭＨＣ複合体の認識との両方を必要とする。
自己免疫性疾患などの疾患の「病態」は、患者の良好な健康を含む全ての現象を含む。これには、限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞増殖（好中球、好酸球、単球、リンパ球性の細胞）、抗体生産、自己抗体生産、補体の生産、正常に機能している隣接細胞への干渉、サイトカイン又は他の分泌物の異常なレベルでの放出、あらゆる炎症性又は免疫性応答の抑制又は悪化、炎症性細胞の組織空間への浸潤（好中球、好酸球、単球、リンパ球性の細胞）等が含まれる。
本明細書中で用いる「自己応答」なる用語は、自己免疫性疾患を有する哺乳動物の免疫系の細胞の状態を指す。本明細書において記述されるように、免疫系の自己応答性Ｔリンパ球は一般に自己免疫性疾患の病態に伴われる。自己応答性のＴ細胞は、Ｂ細胞自己抗体産生の誘導、マクロファージの活性化、サイトカインｍＲＮＡ発現の亢進及び分泌されたサイトカインレベルの亢進の一又は複数が含まれるがこれらに限定されない自己免疫性の応答の開始及び永続化に貢献する様々な事象を促しうる。
【００４６】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)のような糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子、例えばＮＧＦ-α；血小板増殖因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β、−γ；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばマクロファージ−ＣＳＦ(Ｍ−ＣＳＦ)；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)；及び顆粒球−ＣＳＦ(Ｇ−ＣＳＦ)；ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２のインターロイキン(ＩＬ)；ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合は、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００４７】
「単離された」核酸分子は、同定され、核酸の天然源に通常付随している少なくとも一の汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるコードされたポリペプチドを通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
単離された抗体を含む「単離された」ポリペプチドとは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、ポリペプチドは、(１)ローリー法で測定した場合９５％を超える化合物、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動)により均一になるまで充分なほど精製される。化合物の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された化合物、例えば抗体又は他のポリペプチドには、組換え細胞内のインサイツでの化合物が含まれる。しかしながら、通常は、単離された化合物は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００４８】
ここで用いられているように、「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列(即ち「異種」)と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列を含む。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ(ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む)、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
ここで用いる「実質的に類似」、「実質的に等しい」なる用語は、当業者が２つの数値の差異に、該値によって測定される生物学的性質上わずかに又は全く生物学的有意差がないと認められるほど、２つの数値が有意に類似していることを意味する。前記２つの値間の差異は、好ましくは約５０％以下、好ましくは約４０％以下、好ましくは約３０％以下、好ましくは約２０％以下、及び／又は好ましくは約１０％以下である。
「アゴニスト」は最も広い意味で用いられ、限定するものではないがＣＲＴＡＭ及びＮｅｃｌ２(Ｃａｄｍ１)などのポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全に模倣する又は亢進する、もしくはポリペプチドをコードする核酸の転写又は翻訳を部分的又は完全に増加するあらゆる分子が含まれる。例示的なアゴニスト分子には、これに限定されないが、アゴニスト抗体、ポリペプチド断片、オリゴペプチド、有機分子（小分子を含む）及びＣＲＴＡＭ結合配列を含む融合ポリペプチドが含まれる。
【００４９】
「診断」なる用語は、分子又は病的状態、疾患又は状態の同定又は分類を指すために用いられる。例えば、「診断」は特定のタイプの狼瘡状態、例えばＳＬＥなどの自己免疫性疾患の存在、段階及び／又は程度、ないしは種類／サブタイプの同定を指してもよい。また、「診断」は、例えば組織／臓器の関与により(例えばループス腎炎)、分子の特徴により(例えば特定の遺伝子又は核酸領域内の遺伝子バリエーション(一又は複数)に特徴を有する患者サブ集団)、狼瘡の特定のサブタイプの分類を指してもよい。
ここで使用される「治療」とは、治療される個体又は細胞の自然の経過を変化させる試みにおける臨床的介入を意味し、臨床病理経過中又は予防のために実施することができる。治療の所望する効果には、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾病の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の低減、疾病の進行速度の低減、病状の回復又は緩和、及び寛解の達成又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の方法及び組成物は疾患又は障害の発達を遅らせるために有用である。
本発明の関係において用いられる「防止」、「阻害」及び「予防」なる用語には、病理学的状態、疾患又は状況の発生が完全に又は部分的に妨害される状態、病理学的状態、疾患又は状況の開始が部分的に、又は、完全に遅発性である、又は、既存の病理学的状態、疾患又は状態の刺激は部分的に又は完全に遅れる状態、又は、既存の病理学的状態、疾患又は状況の刺激が完全に又は部分的に逆転される状態が含まれる。既存の病理学的状態、疾患又は状況が完全に又は部分的に逆転されうることが予測されるが、この定義の下では必要条件ではない。
本明細書中で用いる「寛解」とは、よくなる又は改善されると定義される。
【００５０】
「有効量」とは、所望される治療的又は予防的結果を達成するのに必要な期間、必要な用量での有効量を意味する。個体に所望する反応を引き出すための治療薬剤の「治療的有効量」は、病状、年齢、性別、個体の体重、及び抗体の能力等の要因に応じて変わり得る。また、治療的有効量とは、治療薬剤の任意の毒性又は有害な影響を、治療的に有益な効果が上回る量でもある。「予防的有効量」は、所望する予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を意味する。必ずではないが、典型的には、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に患者に使用されるために、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
「個体」、「被検体」又は「患者」は脊椎動物である。特定の実施態様では、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、これに限定されないが、家畜動物(ウシなど)、スポーツ用動物、愛玩動物(ネコ、イヌ及びウマなど)、霊長類(ヒト及び非ヒト霊長類を含む)及び齧歯類(例えばマウス及びラット)が含まれる。特定の実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【００５１】
「試験試料」なる用語は、病理学的状態、疾患又は状況(例えば自己免疫性疾患)があることが疑われる被検体からの試料を指す。試験試料は、血液、血清、骨髄などを含むが、これらに限定されない被検体の様々な供与源を起源としうる。
「コントロール」なる用語は、試験試料においてポジティブな結果と相関させるためにネガティブな結果が期待されるネガティブコントロールを指す。本発明に適切であるコントロールとしては、ＣＲＴＡＭを発現する活性化されたＴ細胞を欠いていることがわかっている試料、ＣＲＴＡＭを発現している活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞を欠いていることが知られている試料、及び関連する病理学的状態、疾患又は状況がないことが知られている被検体から得られる試料が挙げられるが、これらに限定されるものではない。加えて、コントロールは、試験試料に含まれる細胞と同じ起源を有する正常細胞を含む試料であってもよい。当業者は、本発明の使用に適切な他のコントロールを理解するであろう。
「医薬」は、病理学的状態、疾患及び／又は状況を治療するために活性な薬剤である。一実施態様では、病理学的状態、疾患及び／又は状況は、本明細書中に示した自己免疫性疾患、又はその症状又は副作用である。
【００５２】
ＩＩ．本発明の組成物および方法
抗ＣＲＴＡＭ抗体およびその断片を含む本発明のＣＲＴＡＭ調節因子を用いて、ＣＲＴＡＭ＋細胞が関与する生物学的活性を調整することができる。一実施態様では、この方法を用いて、必要とする被検体にＣＲＴＡＭ調節因子の有効量を投与することによって、自己免疫性疾患などの疾患を治療するかまたは予防してもよい。ゆえに、本明細書中のＣＲＴＡＭ調節因子(例えばＣＲＴＡＭアンタゴニスト)を用いて、ＣＲＴＡＭ調節因子によって調節されるＣＲＴＡＭ＋細胞が関与する生物学的活性に関連する前記のような疾患を治療するかまたは予防してもよい。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ調節因子はアンタゴニスト抗ＣＲＴＡＭ抗体ないしその断片を含み、ブロック抗体として作用しうる。
他の実施態様では、ＣＲＴＡＭ調節因子はブロック抗体ないしその断片を含み、ＣＲＴＡＭ＋細胞の枯渇を誘導しうる。細胞表面分子に対する抗体は、特定のリンパ球サブセットを枯渇させるかまたは取り除く際に、又は細胞機能を阻害するために有効であることが示されている。例えば、細胞表面レセプターであるＣＤ４５ＲＢに対するモノクローナル抗体を用いると、対応するＣＤ４５ＲＢ抗原を有するレセプターを発現しているＴ細胞クローンの機能が低減するおよび／または該クローンが実際に減少すると考えられている(Lazarovits, et al.の米国特許第７１６０９８７号)。このような抗体は、メモリーＴ細胞の貯蔵を破壊することなく、炎症性及び細胞障害性のＴ細胞媒介性免疫応答を選択的に阻害することができるようである。この種類の抗体は、全体の免疫抑制作用を有するというよりむしろ特定のＴ細胞集団に作用する能力と、組織ないし臓器の移植直後及び直前や自己免疫性疾患の急性期の間など、抗原への曝露と同時に抗体が投与される場合に特定の抗原に対して長期耐性を与える能力を有する。一実施態様では、本発明の抗体は、全体の免疫抑制効果を有するよりはむしろ、特定のＴ細胞サブ集団に作用することができる。一実施態様では、Ｔ細胞サブ集団は、ＣＲＴＡＭ＋Ｔ細胞サブ集団、例えば活性化されたＣＤ４＋ＣＲＴＡＭ＋Ｔ細胞サブ集団を含む。
【００５３】
抗ＣＲＴＡＭ抗体およびその断片を含む本発明のＣＲＴＡＭ調節因子を用いて、このようなＣＲＴＡＭ調節因子によって枯渇されるＣＲＴＡＭ＋細胞を枯渇させることができる。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ＋細胞は細胞障害性Ｔ細胞又は免疫エフェクター細胞である。一実施態様では、この方法を用いて、必要とする被検体にＣＲＴＡＭ調節因子の有効量を投与することによって、自己免疫性疾患などの疾患を治療するかまたは予防してもよい。ゆえに、本明細書中のＣＲＴＡＭ調節因子を用いて、ＣＲＴＡＭ＋細胞の枯渇によって改善されうる前記疾患を治療するかまたは予防してもよい。ＣＲＴＡＭ調節因子は抗ＣＲＴＡＭ抗体ないしその断片を含んでよく、非ブロック抗体として作用しうる。
本明細書中の方法の一実施態様では、抗ＣＲＴＡＭ抗体などのＣＲＴＡＭ調節因子以外の医薬は、疾患を治療または予防するために、被検体に投与されない。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ調節因子とともに有効量の第二医薬が被検体に投与されてもよい(ＣＲＴＡＭ調節因子(例えば抗ＣＲＴＡＭ抗体)が第一医薬である場合)。第二医薬は、一又は複数の医薬であってもよく、例えば、免疫抑制剤、サイトカイン抗体などのサイトカインアンタゴニスト、増殖因子、ホルモン、インテグリン、インテグリンアンタゴニスト又は抗体、又はこれらのいずれかの組合せも含まれる。このような第二医薬の種類は、様々な要因、例えば免疫疾患の種類、免疫疾患の重症度、被検体の状態や年齢、用いた第一医薬の種類や用量に応じて異なる。
【００５４】
本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は、自己免疫性疾患の診断及び予後のアッセイ、並びに画像法に特に有用である。一実施態様では、アッセイは、抗ＣＲＴＡＭ抗体ないしその断片を使用して実行される。また、本発明は、ＣＲＴＡＭタンパク質の検出および定量化に有用な様々な免疫学的アッセイを提供する。これらのアッセイは当分野で周知の様々な免疫学的アッセイの範囲内、例えば限定するものではないが、様々な種類のラジオイムノアッセイ、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、酵素結合免疫蛍光アッセイ(ＥＬＩＦＡ)などで実行される。さらに、限定するものではないが例えば標識したＣＲＴＡＭ抗体を用いたラジオシンチグラフィ画像法など、ＣＲＴＡＭ発現に特徴がある自己免疫性疾患の検出が可能な免疫学的画像法も、本発明によって提供される。このようなアッセイは、ＣＲＴＡＭ発現を特徴とする自己免疫性疾患の検出、モニターおよび予後において臨床的に有用である。
本発明の他の態様は、ＣＲＴＡＭを発現する細胞を識別する方法に関する。ＣＲＴＡＭの発現性質により、自己免疫性疾患などの疾患のためのの診断用マーカーとなる。したがって、ＣＲＴＡＭ発現の状態は、疾患の進行したステージへの罹患率、進行の速度、および／または活動中の疾患(例えば活動中の自己免疫性疾患)の急性かつ重篤な症状の出現、すなわち再燃を含む、様々な要因を予測するために有用な情報を提供する。
【００５５】
一実施態様では、本発明は、自己免疫性疾患などの疾患を検出する方法を提供する。例えば、被検体とコントロールからの試験試料を、それぞれ例えば抗ＣＲＴＡＭ抗体ないしその断片と接触させる。一実施態様では、試験試料は、特定の細胞表面マーカー、限定するものではないがＣＲＴＡＭ＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の一又は複数を有するＴ細胞、例えば活性化されたＴ細胞を含む。一実施態様では、試験試料は、活性化されたＣＲＴＡＭ＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞であるＴ細胞を含む。ＣＲＴＡＭ＋細胞の量を計測し、コントロールと比較して試験試料中の細胞が相対的に高い場合に、試験試料を採取した被検体に疾患(例えば自己免疫性疾患)があることを表す。さらに、検出の方法は、被検体からＴ細胞を含む第二試験試料を得、第二試験試料と元の試験試料を抗ＣＲＴＡＭ抗体と接触させ、元の試験試料と比較して第二試験試料におけるＣＲＴＡＭ＋細胞の量が相対的に高いことを検出する工程を含み、このとき相対的に量が高い場合に、試験試料を採取した被検体の疾患(例えば自己免疫性疾患)の再燃を表す。
他の実施態様では、本発明の方法によって検出される自己免疫性疾患は活動中の自己免疫性疾患である。いくつかの実施態様では、方法は、活動中の自己免疫性疾患の再燃を検出するために使用される。自己免疫性疾患の最初の検出後、自己免疫性疾患を有することが明らかである被検体から更なる試験試料を得てもよい。初めの試料が採取された後、数時間、数日、数週間又は数か月に更なる試料が採取されてもよい。当業者は、第２、第３、第４、第５、第６などの試料を含む、更なる試料を得るための適切なスケジュールを理解するであろう。最初の試験試料と更なる試料(一又は複数)(と場合によって本明細書に記載したコントロール)を例えば抗ＣＲＴＡＭ抗体と接触させる。ＣＲＴＡＭ＋細胞の量を計測し、最初の試験試料と比較してその後の試験試料中の細胞が相対的に高い場合に、試験試料を採取した被検体に活動中の自己免疫性疾患の再燃があることを表す。
【００５６】
本発明は、組織又は他の生体試料、例えば血清、精液、骨、前立腺、尿、細胞調製物などにおけるＣＲＴＡＭの存在を検出するためのアッセイを提供する。また、ＣＲＴＡＭの検出方法は周知であり、例えば、免疫沈降、免疫組織化学分析、ウエスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡなどが含まれる。例えば、生体試料中のＣＲＴＡＭタンパク質の存在の検出方法は、まず、例えば抗ＣＲＴＡＭ抗体、そのＣＲＴＡＭ反応性の断片又は抗ＣＲＴＡＭ抗体の抗原結合領域を含む組み換えタンパク質と試料を接触させ、次いで、試料中のＣＲＴＡＭタンパク質の結合を検出することを含む。
他の態様では、本発明は、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞の単離された集団を提供する方法を提供する。活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞の単離方法は、抗ＣＲＴＡＭ抗体などの、ＣＲＴＡＭ結合分子(例えば、本明細書中に記載のＣＲＴＡＭ調節因子)と、被検体のＴ細胞の混合集団を含む生体試料を接触させる工程を含む。試料は、当分野で公知の方法によって被検体から採取されてよい。Ｔ細胞の混合物を含む試料は、ＣＲＴＡＭに特異的に結合する分子と接触させる。一実施態様では、分子は抗ＣＲＴＡＭ抗体ないしその断片である。ＣＲＴＡＭを発現する任意の細胞はＣＲＴＡＭ結合分子と結合し、それによってＣＲＴＡＭを発現しない細胞と区別され、分離と単離が可能となるであろう。結合した細胞から結合分子を分離する方法は当分野で公知である。例えば、抗体は、低ｐＨ溶液への短時間の曝露によって、または、キモトリプシンなどのプロテアーゼにて細胞から分離されてもよい。あるいは、ＣＲＴＡＭ＋細胞集団の単離は、識別および分離を促すコンジュゲートされた標識の使用によって達成されてもよい。このような標識の例には、磁気ビーズ；アビジン又はストレプトアビジンに対する親和性により識別又は分離されうる、ビオチン；蛍光標示式細胞分取器(ＦＡＣＳ、下記参照)により識別又は分離されうる、蛍光色素などが含まれる。技術がＣＲＴＡＭ＋細胞を過度に害しない限り、いずれの技術も単離に用いられうる。このような方法の多くが当分野で公知である。
【００５７】
一実施態様では、ＣＲＴＡＭ結合分子は固体支持体に付着される。いくつかの適切な固体支持体には、ニトロセルロース、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空糸膜、磁気ビーズ、プラスチックシャーレが含まれる。例えば、結合分子は、ファルマシアセファロース６ ＭＢマクロビーズに共有結合されうる。天然の細胞混合物との固相に連結される結合分子の培養の正確な条件及び持続時間は、周知のように、用いるシステムに特異的ないくつかの因子に依存するであろう。 
結合分子に結合されている細胞は、残りの細胞懸濁物から固体支持体を物理的に分離することによって、細胞懸濁液から取り除かれる。例えば、固体支持体がＣＲＴＡＭ＋細胞を結合するために十分な時間の経過後、結合していない細胞は、生理的バッファにて溶出され、洗い流されうる。 
主に固相及び結合分子の性質に応じて、結合した細胞は任意の適切な方法によって固相から分離される。例えば、結合した細胞は、十分な撹拌によってプラスチックシャーレから溶出させることができる。あるいは、結合した細胞は、「固相と抗体との間に酵素的に「ニックを入れる」又は酵素の作用を受ける「スペーサー」配列を消化することによって溶出させることができる。アガロースビーズ結合した適切なスペーサー配列は例えばPharmaciaから市販されている。 
次いで、細胞の溶出され濃縮された分画は、遠心分離法によってバッファにて洗浄され、当分野で公知の方法に従って後の使用のために低温で生きた状態で保存されてもよい。
【００５８】
ＩＩＩ．活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞の集団
他の態様では、本発明は、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞の単離された集団に関し、例えば、その単離された集団中のＴ細胞の大多数又は実質的にすべては後期活性化である。一実施態様では、単離された集団は、(１)ＣＲＴＡＭの発現及び(２)ＣＲＴＡＭを発現していないＣＤ４＋活性化Ｔ細胞と比較してサイトカインｍＲＮＡ発現のレベルが高いことを特徴とする。さらにまた、サイトカインｍＲＮＡ過剰発現細胞は、高いサイトカイン分泌レベルを表してもよい。他の実施態様では、サイトカインは、好ましくはＩＦＮγ、ＩＬ２２および／またはＩＬ１７である。
他の実施態様では、単離された集団は、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞が単離された細胞の天然の集団より、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の割合を多く含むように精製される。活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞の精製された集団は、活性化Ｔ細胞の特徴的な抗原を発現するＴ細胞の集団を含む細胞の天然の混合物を、抗原の細胞外部分に特異的に結合する分子と接触させることによって単離されてもよい。このような技術はポジティブ選択として知られている。分子に対する活性化されたＴ細胞の結合によって、Ｔ細胞は、抗原を発現しない汚染細胞から十分に区別され、汚染細胞からＴ細胞を単離することが可能となる。概して、そして、好ましくは、抗原はＣＲＴＡＭを含む。 
汚染細胞から活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞を分離するために用いられるＣＲＴＡＭ結合分子は、単離されるべき活性化ＣＤ４＋細胞に発現されるＣＲＴＡＭに特異的に結合する任意の分子であってよい。分子は、本明細書中に記載の例えば抗体ないしその断片であってよい。一実施態様では、分子は、ＣＲＴＡＭブロック抗体又はＣＲＴＡＭ非ブロック抗体である。
一実施態様では、本発明によって提供される活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離された集団は、本明細書で定義される一又は複数のＣＲＴＡＭ＋細胞を含む。
【００５９】
ＩＶ．調節因子抗体
一実施態様では、本発明は、治療用および／または診断用の薬剤としての本明細書中で使用が見られるＣＲＴＡＭ調節因子抗体を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、多特異的抗体及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。抗体の生成、識別、特徴付け、修飾及び製造の態様は後述の通りであり、米国特許公開番号２００５／００４２２１６のパラグラフ５２２〜５６３、６０４〜６０８及び６１７〜６８８に記載されるように、当分野で十分に確立されている。
【００６０】
(i) 抗原調製 
場合によって他の分子にコンジュゲートした可溶性抗原ないしはその断片は、抗体を生成するための免疫原として用いられうる。レセプターなどの膜貫通分子のために、その断片(例えばレセプターの細胞外ドメイン)が免疫原として用いられうる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫源として用いてもよい。このような細胞は、天然の供与源(例えば癌細胞株)から得られてもよいし、膜貫通分子を発現するように組換え体技術によって形質転換されている細胞であってもよい。抗体を調製するために有用な他の抗原及びその形態は当分野の技術者に明らかであろう。 
【００６１】
(ii) ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、関連する抗原とアジュバントを複数回の皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生されることが好ましい。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲへ、関連する抗原をコンジュゲートさせるために有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物を、同じ抗原であるが異なるタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なる架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートにより追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００６２】
(iii) モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスター又はマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００６３】
好適な骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくはハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【００６４】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性な抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、インビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィーのような常套的なイムノグロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好適な供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外ではイムノグロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体の組み換え産生を以下に詳細に記載する。
【００６５】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
また、ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(ＣＨ及びＣＬ)のコード配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾することができる。
典型的には、前記の非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
一実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化を阻害するためのＣＲＴＡＭに対するモノクローナル抗体の作製方法を提供する。
【００６６】
(iv) ヒト及びヒト化抗体
ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００６７】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好適な方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
あるいは、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及びDuchosal等 Nature 355:258 (1992)を参照されたい。また、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリからも得られる(Hoogenboom等, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Vaughan等 Nature Biotech 14:309 (1996))。抗体ファージディスプレイライブラリからのヒト抗体の生成は以下に更に記載する。
【００６８】
(v) 抗体断片
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。以下の実施例に記載のような他の実施態様では、Ｆ(ａｂ')２は、Ｆ(ａｂ')２分子のアセンブリを促すように、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成される。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号を参照のこと。
【００６９】
(vi) 多重特異性抗体
多重特異性抗体は、通常異なる抗原に由来する少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する。このような分子は通常２つの異なるエピトープを結合するだけであるが(すなわち二重特異性抗体、ＢｓＡｂ)、本明細書中で用いられる場合には三重特異性抗体などの更なる特異性を有する抗体がこの表現に包含される。ＢｓＡｂの例には、ＣＲＴＡＭに対する一アームと、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３及びＣＲ４の群から選択されるマクロファージレセプターなどの、免疫複合体クリアランスに働く他のタンパク質に対する他のアームとを有するものが含まれる。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が抗体の最適な収率をもたらす態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな(フレキシビリティ)が与えられる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００７０】
この手法の一実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
国際公開第９６／２７０１１号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体の定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００７１】
二重特異性抗体には、交差結合又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの一抗体はアビジンにカップリングし、他方の抗体はビオチンにカップリングしていてもよい。例えば、このような抗体は、望ましくない細胞へ免疫系細胞を標的化するため(米国特許第４６７６９８０号)、そしてＨＩＶ感染の治療のため(国際公開９１／００３６０、国際公開９２／２００３７３)に提唱されている。ヘテロコンジュゲート抗体は従来のいずれかの交差結合法を用いて作製されてもよい。好適な交差結合剤は当分野で周知であり、多くの交差結合技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００７２】
Ｆａｂ'-ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収することもできるし、化学的に結合して二重特異性抗体を形成させることもできる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二特異性より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。さらに、同じ抗原に対して１より多い結合特異性を有する多価(例えば二価)抗体も本発明の範囲内である。
【００７３】
(vii) エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、抗体の有効性を向上させることは望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性(ＡＤＣＣ)を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes,  B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【００７４】
(viii) 抗体−サルベージレセプター結合エピトープ融合
本発明のある実施態様では、例えば腫瘍浸透性を増大させるためにインタクト抗体よりも抗体断片を使用することが望ましい。この場合、その血清半減期を増大させるために抗体断片を改変することが望ましい。これは、例えば、抗体断片にサルベージレセプター結合エピトープを組み込むことにより(例えば、抗体断片中の適当な領域の突然変異により、あるいはついで抗体断片の何れかの末端又は中央に、例えばＤＮＡ又はペプチド合成により融合されるペプチドタグ内にエピトープを組み込むことにより)、達成しうる。
サルベージレセプター結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の一又は複数の任意のアミノ酸残基が抗体断片の類似位置に転移している領域を構成する。更により好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の３以上の残基が転移する。またより好ましくは、エピトープはＦｃ領域の(例えばＩｇＧの)ＣＨ２ドメインから得られ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、又はＶＨ領域、又はそのような領域の一より多くに転移する。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから得られ、抗体断片のＣＬ領域又はＶＬ領域、又はその両方に転移する。
【００７５】
(ix) 抗体の他の共有的修飾
抗体の共有的修飾は本発明の範囲内にある。それらは、適当であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又は化学的切断によりなされうる。抗体の共有的修飾の他のタイプは、選択される側鎖又はＮないしＣ末端の残基と反応できる有機誘導体化剤と抗体の標的とするアミノ酸領域を反応させることにより分子中に導入される。共有的修飾は米国特許第５５３４６１５号に記載されており、出典明記によって特別に本明細書中に援用される。抗体の共有結合的修飾の好適なタイプは、ポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることを含む。
【００７６】
(x) 合成抗体ファージライブラリからの抗体の産生
ある実施態様では、本発明は特有のファージディスプレイアプローチ法を使用して新規な抗体を産生し選択する方法を提供する。該アプローチ法は、単一フレームワーク鋳型に基づく合成抗体ファージライブラリの産生、可変ドメイン内の十分な多様性の設計、多様化した可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、抗原を標的とする高親和性を持つ候補抗体の選択、及び選択された抗体の単離を含む。
ファージディスプレイ法の詳細は例えば２００３年１２月１１日公開の国際公開第０３／１０２１５７号に見出すことができ、この開示内容の全体は出典明記によって特別に本明細書中に援用される。
【００７７】
一態様では、本発明において使用される抗体ライブラリは抗体可変ドメインの少なくとも一のＣＤＲにおいて溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置を変異させることによってつくることができる。ＣＤＲの幾らか又は全てをここに提供した方法を使用して変異させることができる。ある実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成することにより、多様な抗体ライブラリをつくることが好ましい。
例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３の溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置に変異を有する抗体可変ドメインのライブラリをつくることができる。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及び／又はＣＤＲＬ３に変異を有する他のライブラリをつくることができる。これらのライブラリは所望の親和性の結合体をつくるために互いに関連させて使用することもできる。例えば、標的抗原への結合についての重鎖ライブラリの一又は複数回の選択後に、軽鎖ライブラリを結合体の親和性を増加させるために更なる選択回数に対して重鎖結合体の集団中に置き換えることができる。
【００７８】
好ましくは、ライブラリは重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域における変異アミノ酸での元のアミノ酸の置換によりつくられる。得られたライブラリは複数の抗体配列を含み得、ここで配列多様性は主として重鎖配列のＣＤＲＨ３領域にある。
一態様では、ライブラリはヒト化抗体４Ｄ５配列、又はヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列の態様でつくり出す。好ましくは、ライブラリはＤＶＫコドンセットによってコードされるアミノ酸で重鎖の少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられ、ここでＤＶＫコドンセットはこれらの位置の各一に対して変異アミノ酸セットをコードするために使用される。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの一例は配列(ＤＶＫ)７を含む。ある実施態様では、ライブラリはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)６(ＮＮＫ)を含む。他の実施態様では、ライブラリはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)５(ＮＮＫ)を含む。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの他の例は配列(ＮＮＫ)６を含む。好適なオリゴヌクレオチド配列の他の例はここに記載された基準に従って当業者によって決定することができる。
【００７９】
他の実施態様では、異なったＣＤＲＨ３設計を使用して高親和性結合体を単離し様々なエピトープに対して結合体を単離する。このライブラリにおいて産生されたＣＤＲＨ３の長さの範囲は１１から１３アミノ酸であるが、これとは異なった長さも産生することができる。Ｈ３多様性はＮＮＫ、ＤＶＫ及びＮＶＫコドンセットを使用し、並びにＮ及び／又はＣ末端での多様性をより制限して、拡張することができる。
多様性をＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２においてまた生じさせることができる。ＣＤＲ-Ｈ１及びＨ２多様性の設計は、過去の設計よりも天然の多様性により密に適合する多様性に焦点を当てる変更をした上で、上述の天然抗体レパートリーを模倣するターゲティング方策に従う。
【００８０】
ＣＤＲＨ３での多様性に対しては、複数のライブラリを、異なった長さのＨ３と別個に構築し、ついで、標的抗原に対する結合体を選択するために組み合わせる。複数のライブラリをプールし、過去に記載され以下に記載されたような固体支持体選別及び溶液選別方法を使用して選別することができる。複数の選別方策を用いることができる。例えば、一つの変異は固体に結合した標的での選別を含み、融合ポリペプチド上に存在しうるタグ(例えば抗ｇＤタグ)の選別が続く。別法として、ライブラリは固体表面に結合した標的で先ず選別することができ、溶出した結合体がついで標的抗原の濃度を減少させた溶液相結合を使用して選別される。異なった選別法を併用することにより高度に発現した配列のみの選択の最小化がもたらされ、多くの異なった高親和性クローンの選択をもたらす。
標的抗原に対する高親和性結合体はライブラリから単離することができる。Ｈ１／Ｈ２領域における多様性の制限は約１０４から１０５倍縮重を減少させ、より多くのＨ３多様性を許容することによりより多くの高親和性結合体をもたらす。ＣＤＲＨ３において異なったタイプの多様性を持つライブラリを利用することにより(例えばＤＶＫ又はＮＶＴを利用して)標的抗原の異なったエピトープに結合しうる結合体の単離をもたらす。
【００８１】
上述のプールされたライブラリから単離された結合体において、軽鎖において制限された多様性を提供することによって親和性を更に改善することができることが発見された。軽鎖多様性はこの実施態様では以下のように生成される。ＣＤＲＬ１においては：アミノ酸位置２８がＲＤＴによってコードされる；アミノ酸位置２９がＲＫＴによってコードされる；アミノ酸位置３０がＲＶＷによってコードされる；アミノ酸位置３１がＡＮＷによってコードされる；アミノ酸位置３２がＴＨＴによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置３３がＣＴＧによってコードされる；ＣＤＲＬ２においては：アミノ酸位置５０がＫＢＧによってコードされる；アミノ酸位置５３がＡＶＣによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置５５がＧＭＡによってコードされる；ＣＤＲＬ３においては：アミノ酸位置９１がＴＭＴ又はＳＲＴ又はその両方によってコードされる；アミノ酸位置９２がＤＭＣによってコードされる；アミノ酸位置９３がＲＶＴによってコードされる；アミノ酸位置９４がＮＨＴによってコードされる；アミノ酸位置９６がＴＷＴ又はＹＫＧ又は両方によってコードされる。
【００８２】
他の実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域に多様性を持つライブラリ又はライブラリ群が作製される。この実施態様では、ＣＤＲＨ３における多様性は様々な長さのＨ３領域を用い、主にコドンセットＸＹＺ及びＮＮＫ又はＮＮＳを用いてつくり出される。ライブラリは個々のオリゴヌクレオチドを使用して形成しプールすることができ、又はオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリのサブセットを形成することができる。この実施態様のライブラリは固体に結合した標的に対して選別することができる。多重選別から単離されたクローンをＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異性及び親和性についてスクリーニングすることができる。特異性については、クローンを所望の標的抗原並びに他の非標的抗原に対してスクリーニングすることができる。標的ＮＲＰ１抗原に対する結合体をついで溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイ又はスポット競合アッセイでの親和性についてスクリーニングすることができる。高親和性結合体は上に記載したようにして調製されたＸＹＺコドンセットを使用してライブラリから単離することができる。これらの結合体は抗体又は抗原結合断片として細胞培養物中に高収量で直ぐに産生されうる。
ある実施態様では、ＣＤＲＨ３領域の長さに大なる多様性を持つライブラリを作成することが望まれる場合がある。例えば、約７から１９アミノ酸の範囲のＣＤＲＨ３領域を持つライブラリを作成することが望ましい場合がある。
【００８３】
これらの実施態様のライブラリから単離された高親和性結合体は細菌及び真核生物細胞培養で高収量で直ぐに産生される。ベクターはｇＤタグ、ウイルスコートタンパク質成分配列のような配列を直ぐに除去し、及び／又は定常領域配列に加えて完全長抗体又は抗原結合断片を高収量で生産するように設計することができる。
ＣＤＲＨ３での変異を持つライブラリを、例えばＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２のような他のＣＤＲの変異型を含むライブラリと組み合わせることができる。よって、例えば、一実施態様では、ＣＤＲＨ３ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置２８、２９、３０、３１、及び／又は３２に変異アミノ酸を持つヒト化４Ｄ５抗体配列の形態において作りだしたＣＤＲＬ３ライブラリと組み合わせられる。他の実施態様では、ＣＤＲＨ３に対する変異のライブラリは変異ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリと組み合わせることができる。一実施態様では、ＣＤＲＨ１ライブラリは位置２８、３０、３１、３２及び３３に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５配列を用いてつくり出される。ＣＤＲＨ２ライブラリは予め定まったコドンセットを使用して位置５０、５２、５３、５４、５６及び５８に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５の配列を用いてつくり出すことができる。
【００８４】
(xi) 抗体変異体
ファージライブラリから生成される新規の抗体は、さらに修飾して、親抗体よりも改善した物理学的、化学的及び／又は生物学的特性を有する抗体変異体を生成することができる。使用するアッセイが生物学的活性アッセイである場合、抗体変異体は、選択したアッセイにおいて、該アッセイにおける親抗体の生物学的活性よりも少なくともおよそ１０倍良好な、好ましくは少なくともおよそ２０倍良好な、より好ましくは少なくともおよそ５０倍良好な、時には少なくともおよそ１００倍又は２００倍良好な生物学的活性を有する。例えば、抗ＣＲＴＡＭ抗体変異体は、親抗体の結合親和性より、少なくともおよそ１０倍強力な、好ましくは少なくともおよそ２０倍強力な、より好ましくは少なくともおよそ５０倍強力な、時には少なくともおよそ１００倍又は２００倍強力な、ＣＲＴＡＭに対する結合親和性を有することが好ましい。
【００８５】
抗体変異体を産生するためには、親抗体の高頻度可変領域の一又は複数中に一又は複数のアミノ酸修飾(例えば置換)が導入される。別法として、又は加えて、フレームワーク領域残基の一又は複数の修飾(例えば置換)を親抗体に導入することができ、これらにより第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗体変異体の結合親和性が改善される。修飾するためのフレームワーク領域残基の例には、抗原に非共有的に結合するもの(Amit等, Science 233:747-753 (1986))；ＣＤＲと相互作用し／そのコンホメーションに影響を及ぼすもの(Chothia等 J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；及び／又はＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの(欧州特許第２３９４００号Ｂ１)が含まれる。ある実施態様では、そのようなフレームワーク領域残基の一又は複数の修飾により第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗原の結合親和性が向上する。例えば、約１から約５のフレームワーク残基を本発明のこの実施態様において修飾することができる。しばしば、これは、高頻度可変領域が何ら改変されていない場合でさえ、前臨床試験に使用するのに適した抗体変異体を生じるのに十分でありうる。しかしながら、通常は、抗体は更なる高頻度可変領域の改変を含む。
【００８６】
改変される高頻度可変領域残基は、特に親抗体の出発結合親和性が、無作為に生産された抗体変異体を直ぐにスクリーニングすることができるものである場合には、無作為に変化させることができる。
そのような抗体変異体を産生するための一つの有用な方法は、「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」(Cunningham及びWells Science 244:1081-1085 (1989))と呼ばれる。ここで、高頻度可変領域残基の一又は複数が、第二の哺乳動物種由来の抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼすためにアラニン又はポリアラニンによって置換される。ついで置換に対する機能的感受性を示す高頻度可変領域残基は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の置換を導入することにより洗練される。従って、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異の種類自体は予め決める必要はない。このようにして産生されるａｌａ変異体をここに記載したその生物活性についてスクリーニングされる。
通常は、「好ましい置換」の項目名で以下に示されているもののような保存的置換で始める。そのような置換が生物活性(例えば結合親和性)の変化を生じるならば、次の表において「例示的置換」と命名され、又はアミノ酸クラスを参照して以下に更に記載されるより実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされる。
【００８７】
例示的／好適な置換：
2010538018.tif 000002
【００８８】
抗体の生物学的性質の更により実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋コンホメーション、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持して、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile；
(２)中性の親水性：cys, ser, thr；
(３)酸性：asp, glu；
(４)塩基性：his, lys, arg；
(５)鎖配向に影響する残基：gly, pro；及び
(６)芳香族：trp, tyr, phe。
【００８９】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを必要とする。
他の実施態様では、修飾のために選択された部位がファージディスプレイを使用して亜親和性成熟される(上を参照)。
【００９０】
アミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、親抗体の先に調製された変異体又は非変異体型のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発を含む。変異体を作製するための好ましい方法は部位特異的突然変異誘発(例えばKunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)を参照)である。
ある実施態様では、抗体変異体は単一の高頻度可変領域残基が置換されたものである。他の実施態様では、親抗体の高頻度可変領域残基の２又はそれ以上が置換され、例えば約２から約１０の高頻度可変領域置換である。
【００９１】
通常、改善された生物学的性質を有する抗体変異体は親抗体の重鎖又は軽鎖の何れかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に対する同一性又は類似性は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入し最大の配列同一性パーセントを達成した後に親抗体残基と同一(つまり同じ残基)又は類似(つまり共通の側鎖特性に基づく同じグループのアミノ酸残基、上を参照)である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとしてここで定義される。可変ドメインの外側の抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸展、欠失、又は挿入は何れも配列同一性又は類似性に影響を及ぼすものとはみなされない。
抗体変異体の産生後に、親抗体に対するその分子の生物活性が決定される。上に述べたように、これは抗体の結合親和性及び／又は他の生物活性を決定することを含みうる。本発明の好適な実施態様では、抗体変異体のパネルを調製し、抗原ないしその断片に対する結合親和性についてスクリーニングする。この最初のスクリーニングから選択される抗体変異体の一又は複数は場合によっては一又は複数の更なる生物活性アッセイにかけて、結合親和性が向上した抗体変異体が例えば前臨床研究に確かに有用であることが確認される。
【００９２】
このように選択された抗体変異体は、しばしば抗体の意図される用途に応じて更なる修飾を受けることができる。そのような修飾は以下に詳細を記載したもののようなアミノ酸配列の更なる改変、異種ポリペプチドに対する融合及び／又は共有的修飾を含む。アミノ酸配列改変については例示的な修飾を上に詳細に説明した。例えば、抗体変異体の正しいコンホメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基はまた一般にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し異常な架橋を防止することができる。逆に、システイン結合を抗体に加えてその安定性をかいぜんすることができる(特に抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合)。他のタイプのアミノ酸変異体は改変されたグリコシル化パターンを有する。これは抗体に見出される一又は複数の糖鎖部分を欠失させ、及び／又は抗体中に存在していない一又は複数のグリコシル化部位を加えることによって達成することができる。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とはアスパラギン残基の側鎖への糖鎖部分の付着を意味する。トリペプチド配列アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である)がアスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的付着に対する認識配列である。よって、ポリペプチドにおいてこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると潜在的なグリコシル化部位をつくる。Ｏ結合グリコシル化はヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニン(但し５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた使用できる)への糖Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つの付着を意味する。抗体へのグリコシル化部位の付加は、それが上述のトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位に対する)の一又は複数を含むようにアミノ酸配列を改変することにより簡便に達成される。改変はまた元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によって行うこともできる(Ｏ結合グリコシル化部位の場合)。
【００９３】
(xii) 抗体の組換え製造
抗体の組換え製造のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、従来の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である(例えば米国特許第５５３４６１５号に記載されており、出典明記によって特別に本明細書中に援用される)。
【００９４】
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【００９５】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【００９６】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【００９７】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)；ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【００９８】
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980)、米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００９９】
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された細胞の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される抗体に応じて利用可能である。
【０１００】
(xiii) 抗体複合体
他の態様では、本発明は、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む、抗体コンジュゲート又はイムノコンジュゲートに関する。
このようなイムノコンジュゲートの生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。
抗体及び細胞障害性薬のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣｌ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098 (1987)に記載されているように調製することができる。炭素-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合(コンジュゲート)のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。当業者は、本発明のコンジュゲートに適切な更なるカップリング剤を理解するであろう。
他の実施態様では、組織の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用して循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートされた「リガンド」(例えばアビジン)を投与してもよい。
【０１０１】
ＣＲＴＡＭ
Ｖ．ＣＲＴＡＭ調節因子ポリペプチド
一態様では、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子はポリペプチドを含む。一実施態様では、調節因子ポリペプチドは活性化されたＴ細胞におけるＣＲＴＡＭ活性を中和する。一実施態様では、調節因子ポリペプチドは活性化されたＴ細胞におけるＳｃｒｉｂ活性を中和する。一実施態様では、ポリペプチドは、ＣＲＴＡＭ-Ｓｃｒｉｂ相互作用と関係する生物学的活性が阻害されるように、ＣＲＴＡＭ又はＣＲＴＡＭと相互作用する細胞内分子に、好ましくは特異的に結合する。一実施態様では、調節因子ポリペプチドは活性化されたＴ細胞におけるＣＲＴＡＭ活性を刺激する。一実施態様では、ポリペプチドは、ＣＲＴＡＭと関係する生物学的活性が模倣されるかまたは亢進されるように、ＣＲＴＡＭに、好ましくは特異的に結合する。一実施態様では、ポリペプチドは、ＣＲＴＡＭ細胞外分子と関係する生物学的活性が模倣されるかまたは亢進されるように、ＣＲＴＡＭと相互作用する細胞外分子に、好ましくは特異的に結合する。ポリペプチドは、公知のペプチド合成方法を用いて化学的に合成されてもよいし、組み換え技術を用いて調製され精製されてもよい。一実施態様では、ＣＲＴＡＭ調節因子ポリペプチドは、少なくともおよそ５アミノ酸長、あるいは少なくともおよそ６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００アミノ酸長又はそれ以上であり、該ポリペプチドはＣＲＴＡＭ活性を調節することができる。これらのポリペプチドは、周知の技術を使用して過度な実験を行うことなく識別されてもよい。この点に関して、ポリペプチド標的に特異的に結合することができるオリゴペプチドについてのオリゴペプチドライブラリをスクリーニングするための技術は当分野で周知であることは明らかである(例えば米国特許第５５５６７６２号、同第５７５０３７３号、同第４７０８８７１号、同第４８３３０９２号、同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、同第５６６３１４３号；ＰＣＴ国際公開８４／０３５０６および国際公開８４／０３５６４；Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)；Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)；Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)；Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988)（Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378）；Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624；Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581；Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668を参照のこと)。
【０１０２】
この点において、バクテリオファージ(ファージ)ディスプレイは、大きなオリゴペプチドライブラリを検索して、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるこれらライブラリのメンバーを同定することを可能にするよく知られた技術の一つである。ファージディスプレイは、様々なポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に融合タンパク質として表示されることによる技術である(Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386)。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体(又はランダムクローンｃＤＮＡ)の大きなライブラリを標的分子に高い親和性で結合するこれらの配列について素早く効果的に分類することができる点にある。ファージ上でのペプチドライブラリ(Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378)又はタンパク質ライブラリ(Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624；Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581；Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363)のディスプレイは、特異的に結合する特性を有するものについて無数のポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている(Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668)。ランダム突然変異体のファージライブラリの分類は、多数の変異体を構築して増殖させる方法、標的レセプターを用いた親和性精製の方法、及び結合増強の結果を評価する手段を必要とする。米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号および同第５６６３１４３号。
【０１０３】
ほとんどのファージディスプレイ法は繊維状ファージを使用していたが、λファージディスプレイシステム(国際公開９５／３４６８３；米国特許第５６２７０２４号)、Ｔ４ファージディスプレイシステム(Ren et al., Gene, 215: 439 (1998)；Zhu et al., Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998)；Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997)；Ren et al., Gene, 195(2): 303-311 (1997)；Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996)；Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995))、及びＴ７ファージディスプレイシステム(Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993)；米国特許第５７６６９０５号)も知られている。
現在、基礎的なファージディスプレイ構想の多くの他の改良及び変形が開発されている。これらの改良は、選択された標的分子への結合についてペプチドライブラリをスクリーニングするための、及びこれらのタンパク質が有しうる所望の特性についてのスクリーニング能を有する機能性タンパク質をディスプレイするためのディスプレイシステムの能力を増強する。
【０１０４】
ファージディスプレイ反応のための組み換え反応手段について記載があり(国際公開９８／１４２７７)、ファージディスプレイライブラリは二分子相互作用(国際公開９８／２０１６９；国際公開９８／２０１５９)、及び拘束性へリックスペプチドの特性(国際公開９８／２００３６)を分析及び制御するために使用されている。国際公開９７／３５１９６は、リガンドが標的分子に結合しうる第一の溶液、及び親和性リガンドが標的分子に結合しない第二の溶液とファージディスプレイライブラリを接触させて、結合リガンドを選択的に単離する、親和性リガンドの単離方法を記載する。国際公開９７／４６２５１は、親和性精製抗体でランダムファージディスプレイライブラリをバイオパニングし、次いで結合ファージを単離し、続いてマイクロプレートのウェルでマイクロパニングして高親和性結合ファージを単離する方法を記載する。黄色ブドウ球菌(Staphlylococcus aureus)タンパク質Ａの親和性タグとしての使用も報告されている(Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187)。国際公開９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリでもよいコンビナトリアルライブラリを用いて酵素特異性を識別するための基質サブトラクションライブラリの使用を記載している。ファージディスプレイに用いる洗浄剤における使用に適した酵素を選択する方法は国際公開９７／０９４４６に記載される。特異的に結合するタンパク質を選択する更なる方法は、米国特許第５４９８５３８号、同第５４３２０１８号および国際公開９８／１５８３３において記述される。
【０１０５】
ペプチドライブラリを生成し、これらライブラリをスクリーニングする方法は、米国特許第５７２３２８６号、同第５４３２０１８号、同第５５８０７１７号、同第５４２７９０８号、同第５４９８５３０号、同第５７７０４３４号、同第５７３４０１８号、同第５６９８４２６号、同第５７６３１９２号および同第５７２３３２３号にも開示されている。
調節因子ポリペプチドの生成、識別、特徴付け、修飾及び製造の方法は、例えば米国特許公開番号２００５／００４２２１６のパラグラフ６０４〜６０８、６１４〜６８８に記載されるように、当分野で十分に確立されている。
【０１０６】
ＶＩ．ＣＲＴＡＭ調節因子小分子
一実施態様では、ＣＲＴＡＭ調節因子小分子は、ＣＲＴＡＭ活性を調節する、本明細書で定義されるようなオリゴペプチド又は抗体以外の有機分子である。ＣＲＴＡＭ調節因子小分子は、公知の方法を用いて同定され、化学的に合成されてよい(例としてＰＣＴ国際公開００／００８２３および国際公開００／３９５８５参照)。ＣＲＴＡＭ調節因子有機小分子は通常、およそ２０００ダルトン未満の大きさ、あるいはおよそ１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満の大きさであり、このような有機小分子は周知の技術を使用して過度の実験を行うことなく同定されてよい。この点に関して、ポリペプチド標的に結合することができる分子について有機小分子ライブラリをスクリーニングするための技術は当分野で周知である(例としてＰＣＴ国際公開００／００８２３および国際公開００／３９５８５参照)。ＣＲＴＡＭ調節因子有機小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール類、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバミン酸エステル、炭酸塩、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホン酸塩、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホン酸塩、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物、酸クロリド等であってよい。
【０１０７】
ＶＩＩ．核酸を含むＣＲＴＡＭ調節因子
一態様では、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は核酸分子を含む。例えば、核酸分子は、センス／アンチセンスオリゴヌクレオチド、抑制性／干渉性ＲＮＡ(例えば低分子抑制性／干渉性ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ))、又はアプタマーを含んでいてもよい。これらの核酸修飾因子をスクリーニングし、同定し、作製するための方法は当該分野で知られている。
例えば、ｓｉＲＮＡは、伝統的なアンタゴニスト、例えば小分子又は抗体が機能していない箇所で遺伝子発現を調節可能であることが証明されている。(Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003))。インビトロ合成された二重鎖で、３０より少ないヌクレオチド長(例えば、約１５〜２５、１７〜２０、１８〜２０、１９〜２０、又は２１〜２３ヌクレオチド)のＲＮＡは、干渉性ＲＮＡ(ｉＲＮＡ)として作用可能で、また遺伝子発現を特異的に阻害可能である(例えば、Fire A., Trends in Genetics  (1999), 391; 806-810；米国特許出願第０９／８２１８３２号、同０９／２１５２５７号；米国特許第６５０６５５９号；ＰＣＴ／ＵＳ０１／１０１８８；欧州特許出願第００１２６３２５号を参照)。これらのｉＲＮＡは、それらの標的ＲＮＡの分解を調節することにより、少なくとも部分的に作用すると考えられる。しかしながら、それらは３０ヌクレオチド長以下であるため、細胞の抗ウイルス防御機構を惹起しない。このような機構には、インターフェロンの生成、宿主細胞タンパク質合成の一般的活動停止が含まれる。実際に、ｓｉＲＮＡは合成され、ついでＤＮＡベクター内でクローン化可能である。このようなベクターを形質移入し、高レベルでｓｉＲＮＡを発現させることができる。高レベルのｓｉＲＮＡ発現は、細胞内に生成されるタンパク質の量を有意に低減させるか、又は「ノックダウン」するのに使用され、よって、タンパク質の過剰発現が病的疾患に関連していると考えられる細胞状況において有用である。
アプタマーは、過剰に安定化したＣＲＴＡＭタンパク質等、標的分子に結合可能な核酸分子である。アプタマーの産生及び治療的用途は、当該分野で十分に確立されている。例えば、加齢黄斑変性の治療に対しては、Macugen(登録商標)(Eyetech, New York)の治療効果、及び米国特許第５４７５０９６号を参照。
アンチセンス技術は、当該分野で十分に確立されている。この技術に関するさらなる詳細は、以下に提供する。
【０１０８】
ＶＩＩＩ．製剤
本発明に従って使用されるＣＲＴＡＭ調節因子の治療用製剤は、所望の純度を有するＣＲＴＡＭ調節因子を、任意の製薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、保存用に調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、アセテート、トリス、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンズエトニウムクロリド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；トレハロース及び塩化ナトリウム等の等張化剤(tonicifiers)；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類；ポリソルバート等の界面活性剤；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はトゥイーン(TWEEN)(登録商標)、プルロニクス(PLURONICS)(登録商標)、又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１０９】
また、ここでの製剤は、治療される特定の兆候に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補活性を持つものを含みうる。例えば、ＣＲＴＡＭ調節因子に加えて、付加的な修飾因子、例えば過剰に安定化したＣＲＴＡＭタンパク質上の異なるエピトープに結合する第２の抗体、又はいくつかの他の標的に対する抗体を、一つの製剤に含めることが望ましい場合がある。あるいは又は付加的に、組成物は免疫抑制剤をさらに含有してもよい。このような分子は、意図する目的に有効な量で組合せて、適切に存在している。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中又はマクロエマルションにおいて、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに封入されていてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
【０１１０】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド類(米国特許第3,773,919号)、Ｌグルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-ビニルアセテート、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(登録商標)(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
インビボ投与に用いる製剤は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。
【０１１１】
本明細書中に開示されるＣＲＴＡＭ調節因子抗体は、標的細胞／組織への運搬のために適切な任意の形態に調製されうる。例えば、抗体はイムノリポソームとして調製されてもよい。「リポソーム」は、哺乳動物への薬剤の運搬のために有用である様々な種類の脂質、リン脂質および／または界面活性剤からなる小さい小胞(ベシクル)である。リポソームの構成成分は、一般に二重層で配列されており、生物学的膜の脂質配列と似ている。抗体を含むリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；米国特許第４４８５０４５号および同第４５４４５４５号；及び１９９７年１０月２３日に公開の国際公開９７／３８７３１に記載されるように、当分野で公知の方法によって調製される。循環時間が長いリポソームは、米国特許第５０１３５５６号において開示される。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
【０１１２】
ＩＸ．本発明のＣＲＴＡＭ調節因子の例示的用途
本発明のＣＲＴＡＭ調節因子には種々の非治療的用途がある。調節因子は、ＣＲＴＡＭ発現疾患の(例えば、ラジオイメージングにおける)染色又は検出に有用である。また、細胞の集団において細胞性事象を調節するために、抗体、オリゴペプチド及び有機小分子は、例えば、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおいて、インビトロでのＣＲＴＡＭの検出及び定量化のために、細胞からＣＲＴＡＭを精製又は免疫沈降するのに有用である。
試料中の特定の表面マーカーによる細胞の測定は、本明細書において記述される技術によって実行されてもよい。いくつかの実施態様では、測定は、適切なプロセッサによって実行されるソフトウエアプログラムを使用して行われてもよい。適切なソフトウェアおよびプロセッサは当分野で周知であり、市販されている。プログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピーディスク、ハードドライブ、ＤＶＤ又はプロセッサに付属のメモリーなどの有形のメディアに格納されたソフトウェアに組み込まれていてよいが、当分野の技術者は、プログラム全体又はその一部がプロセッサ以外のデバイスによって選択的に実行されてよく、及び／又はファームウェアに組み込まれていてもよく、及び／又は周知の方法でハードウェアに割り当てられていてもよい。
【０１１３】
概して、特定の細胞表面マーカーを有する細胞の量の測定および被検体が自己免疫性疾患を有するか否かの決定の後に、測定結果、所見、診断、予測および／または治療提案は、記録され、例えば、技術者、医師および／または患者に伝えられる。ある実施態様では、コンピュータを用いて、患者および／または主治医など、対象とする患者に前記のような情報を伝えるであろう。いくつかの実施態様では、結果又は診断が伝えられる国又は管轄区域とは異なる国又は管轄区域においてアッセイは実行されるであろうし、アッセイの結果が分析されるであろう。
一実施態様では、本明細書中の表面マーカーの一又は複数を有する試験被検体において測定される細胞の量に基づく診断、予測および／または治療提案は、アッセイが完了した後できるだけ早く被検体へ伝えられ、診断および／または予測がなされる。結果および／または関連した情報は、被検体を治療する医師によって被検体に伝えられてもよい。あるいは、結果は、文書、電子メール又は電話などの電子的な通信手段を含む、いずれかの伝達手段で試験被検体に直接伝えられてもよい。伝達は、電子メール通信の場合など、コンピュータを用いて容易であろう。ある実施態様では、診断試験及び／又は試験から結論づけられる結論及び／又は試験に基づく治療提案の結果を含む通信は、コンピュータハードウェアと遠隔通信分野の当業者に公知であるソフトウェアとを組み合わせて用いて被検体になされ、自動的に伝達されてもよい。健康管理のための通信システムの一例は米国特許第６２８３７６１号に記載されているが、本発明は、この特定の通信システムを利用する方法に限られない。本発明の方法のある実施態様では、試料のアッセイ、疾患の診断及びアッセイ結果又は診断の伝達を含む方法の工程のすべて又は一部は、異なる(例えば外国の)管轄区域で行われてもよい。本発明のＣＲＴＡＭ調節因子抗体は、本明細書中の「抗体」の定義によって包含される異なる形態であってもよい。ゆえに、抗体には、完全長又はインタクトな抗体、抗体断片、天然配列の抗体又はアミノ酸変異体、ヒト化、キメラ又は融合抗体およびその機能的断片が含まれる。
【０１１４】
本発明は、ＣＲＴＡＭ調節因子と担体を含む組成物を提供する。さらなる実施態様では、組成物は、免疫抑制剤などの他の治療薬と組み合わせて、ＣＲＴＡＭ調節因子を含んでもよい。また、本発明は、ＣＲＴＡＭ調節因子と担体を含む製剤を提供する。一実施態様では、製剤は、薬学的に許容可能な担体を含む治療的製剤である。
ＣＲＴＡＭ調節因子、例えば本発明の抗体は、例えばインビトロ、エクスビボ及びインビボの治療方法で使われてもよい。本発明の調節因子は、インビボ、エクスビボ、及び／又はインビボで特定の抗原を部分的又は完全に遮断するためのアンタゴニストとして使用できる。さらに、本発明の少なくともいくつかの調節因子は、他の種からの抗原活性を不活性化することができる。したがって、本発明の調節因子は、例えば抗原を含む細胞培養物における、ヒト被検体における、又は本発明の調節因子が交差反応する抗原を有する他の哺乳類被検体(例えばチンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザル、アカゲザル、ブタ、又はマウス)における、特定の抗原活性を阻害するために使用できる。一実施態様では、本発明の調節因子は、調節因子を、抗原活性が阻害されるように抗原と接触させることによって、抗原活性を阻害するために使用することができる。一実施態様では、抗原はヒトＣＲＴＡＭである。
【０１１５】
一実施態様では、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は、ＣＲＴＡＭ＋Ｔ細胞活性が有害である疾患を患っている被検体においてＣＲＴＡＭを阻害するための方法で使用することができ、当該方法は、本発明の調節因子を、被検体のＣＲＴＡＭ活性が阻害されるように被検体に投与することを含んでなる。一実施態様では、被検体はヒト被検体である。あるいは被検体は、本発明の調節因子によって調節される活性を有するＣＲＴＡＭを発現している哺乳類であってもよい。さらに被検体は、(例えばＣＲＴＡＭの投与、又はＣＲＴＡＭトランス遺伝子の発現によって)ＣＲＴＡＭが導入されている哺乳動物であってもよい。本発明の調節因子は、治療目的でヒト被検体に投与できる。さらに本発明の調節因子は、調節因子が獣医用又はヒト疾病の動物モデルとして交差反応するＣＲＴＡＭを発現している非ヒト哺乳動物(例えば霊長類、ブタ、又はマウス)に投与することができる。後者の動物モデルは、本発明の調節因子の治療有用性を評価(例えば投与の用量及び時間経過を試験)するのに役立ちうる。本発明の調節因子は、限定するものではないが炎症性疾患、自己免疫疾病及び他の免疫性疾患を含むＣＲＴＡＭ＋Ｔ細胞の発現及び／又は活性の異常と関連する疾患、障害又は症状を治療する、抑制する、その進行を遅らせる、その再発を防止／遅らせる、改善する、又は防ぐために使用できる。
ある実施態様では、細胞障害性剤とコンジュゲートした抗体を含むイムノコンジュゲートが患者に投与される。ある実施態様では、結合する抗原及び／又はイムノコンジュゲートは細胞によって内部移行され、その結果、結合する標的細胞を殺す際のイムノコンジュゲートの治療的効果が増す。一実施態様では、細胞障害性剤は、標的細胞内の核酸を標的とするか又は干渉する。このような細胞障害性剤の例には、本明細書中で述べたいずれかの化学療法剤(例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシン)、放射性同位体、酵素又は小分子毒素が含まれる。
【０１１６】
一実施態様では、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は、インビトロ、エクスビボ及び／又はインビボでのＣＲＴＡＭと関連する生物学的活性を模倣する又は亢進するアゴニストとして使用される。さらに、少なくとも、本発明のいくつかの調節因子は、他の種においてＣＲＴＡＭと関連する生物学的活性を模倣してもよいし、亢進してもよい。したがって、本発明の調節因子を用いて、ＣＲＴＡＭを有し、本発明の調節因子が交差反応する、例えば細胞培養物、ヒト被検体又は他の哺乳動物被検体(例えばチンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザル及びアカゲザル、ブタ、又はマウス)における、ＣＲＴＡＭと関連する生物学的活性を模倣又は亢進することができる。一実施態様では、本発明の調節因子は、ＣＲＴＡＭと関連する生物学的活性が模倣されるか又は亢進されるように、ＣＲＴＡＭと調節因子を接触させることによって、ＣＲＴＡＭと関連する生物学的活性を模倣又は亢進するために用いられうる。一実施態様では、調節因子は、単離されたＮｅｃｌ２(Ｃａｄｍ１)ないしその断片、又はＮｅｃｌ２(Ｃａｄｍ１)のポリペプチド融合、又はＮｅｃｌ２(Ｃａｄｍ１)の断片のポリペプチド融合を含む。一実施態様では、調節因子は、Ｎｅｃｌ２の細胞外ドメインのＩｇＧのＦｃ断片との融合である。
一実施態様では、本発明のＣＲＴＡＭ調節因子は、ＣＲＴＡＭ＋Ｔ細胞の活性が有益である疾患を患っている被検体においてＣＲＴＡＭと関連する生物学的活性を模倣又は亢進するための方法で使用することができ、当該方法は、本発明の調節因子を、ＣＲＴＡＭと関連する生物学的活性が模倣又は亢進されるように被検体に投与することを含んでなる。一実施態様では、被検体はヒト被検体である。あるいは被検体は、本発明の調節因子によって調節される活性を有するＣＲＴＡＭを発現する哺乳類であってもよい。さらに被検体は、(例えばＣＲＴＡＭの投与、又はＣＲＴＡＭトランス遺伝子の発現によって)ＣＲＴＡＭが導入されている哺乳類であってもよい。本発明の調節因子は、治療目的でヒト被検体に投与できる。さらに、本発明の調節因子は、調節因子が獣医用又はヒト疾病の動物モデルとして交差反応するＣＲＴＡＭを発現する非ヒト哺乳類(例えば霊長類、ブタ、又はマウス)に投与することができる。後者の動物モデルは、本発明の調節因子の治療有用性を評価(例えば投与の用量及び時間経過を試験)するのに役立ちうる。本発明の調節因子は、限定するものではないが癌、免疫不全及び感染を含むＣＲＴＡＭ＋Ｔ細胞の発現及び／又は活性と関連する疾患、障害又は症状を治療する、抑制する、その進行を遅らせる、その再発を防止／遅らせる、改善する、又は防ぐために使用できる。
【０１１７】
本発明の調節因子は、治療において単独、又は他の組成物と組み合わせて使われてもよい。例えば、本発明の調節因子、例えば抗体又はポリペプチドは、他の抗体、及び／又はアジュバント／治療薬(例えばステロイド)と同時に投与してもよい。例えば、本発明の抗体又はポリペプチドは、治療計画において、例えば炎症性疾患、自己免疫性及び他の免疫学的疾患、並びに癌、免疫不全及び感染を含む、本明細書に記載されるいずれかの疾病の治療において、抗炎症薬及び／又は消毒薬と組み合わせてもよい。上記の併用治療には、併用投与(２以上の薬剤が同じか又は別の製剤に包含される)及び別々の投与、別々の場合には、本発明の抗体又はポリペプチドは補助治療(一又は複数)の前及び／又はその後に投与することができる。
本発明の調節因子(及び補助治療薬)は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下的な投与を含む。さらに、調節因子は、特に調節因子の用量を減少して、パルス注入によって好適に投与される。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって投与することができる。
本発明の調節因子組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与される。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個体の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、及び医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、対象の疾患を予防するか又は治療するために現在用いられる一つ以上の薬剤と調節因子とを調製する。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中の本発明の調節因子の量、疾患又は治療の種類、及び上記の他の因子に依存する。これらは一般的に、本明細書中に記載されるように同じ用量及び投与経路で、又は本明細書中に記載される用量のおよそ１〜９９％で、又は経験的／臨床的に適切であることが決定される任意の用量及び経路で用いられる。
【０１１８】
疾患の予防又は治療のために、本発明の調節因子の好適な用量は(単独で用いる場合、又は化学療法剤などの他の薬剤と組み合わせて用いる場合)、治療する疾患の種類、調節因子の種類、疾患の重症度及び経過、調節因子を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び調節因子への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。調節因子は一時的又は一連の治療にわたって好適に個体に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ)の抗体が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による個体投与の初期候補用量である。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体の用量の例は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。ゆえに、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量を(又はそれらを組み合わせて)個体に投与してもよい。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は３週ごとに投与してもよい(例えば患者に約２〜約２０、例えば約６用量の抗体が投与される)。初期の比較的高い負荷用量の後、一又は複数の比較的低い用量が投与されてもよい。例示的用量計画は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量の後、約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量の抗体が投与されることを含む。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
【０１１９】
患者へのポリペプチド調節因子(例えば、ポリペプチド、抗体等)の投与の他に、本発明では、遺伝子治療による調節因子投与が考察されている。ＣＲＴＡＭ調節因子を含む／コードする核酸のこのような投与は、「治療的有効量のＣＲＴＡＭ調節因子の投与」なる表現に含まれる。細胞内抗体を生じせしめるための遺伝子治療の使用に関連しては例えば１９９６年３月１４日に公開された国際公開第９６／０７３２１号を参照。
核酸(場合によってはベクター内に含まれたもの)を患者の細胞に入れるためにインビボ及びエキソビボという２つの主要なアプローチ法がある。インビボ送達では、核酸が患者に、通常はＣＲＴＡＭ調節因子が必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ治療では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、改変された細胞を患者に直接又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜内にカプセル化して投与する(米国特許第４８９２５３８号及び同５２８３１８７号参照)。核酸を生細胞に導入するために利用可能な様々な技術がある。該技術は、核酸が培養細胞にインビトロで移入されるか、又は意図している宿主の細胞にインビボで移入されるかに応じて変わる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
一実施態様では、インビボ核酸移入技術には、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ随伴ウイルス)、及び脂質ベースの系(例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである)の形質移入を含む。現在知られている遺伝子作製及び遺伝子治療プロトコルの概説については、Anderson et al., Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公開第９３／２５６７３号とそこに引用された参考文献も参照。
【０１２０】
Ｘ．製造品及びキット
本発明の他の実施態様は、ＣＲＴＡＭ調節因子を用いた疾患の治療に有用な物質を含有する製造品である。この製造品は容器と容器に付与又は添付されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてよい。容器は、症状の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明のＣＲＴＡＭ調節因子である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の疾患の治療のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、患者に組成物を投与する際の注意書きをさらに含む。製造品はさらに、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１２１】
種々の目的に有用なキットも提供される。インビトロにおけるＣＲＴＡＭの検出及び定量化、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットのための本発明のＣＲＴＡＭ調節因子を含むキットを提供することもできる。製造品と同様、キットも容器と容器に付与又は添付されるラベル又は能書を含んでなる。容器には少なくとも１つの本発明のＣＲＴＡＭ調節因子を含有する組成物が収容されている。希釈液及びバッファー、コントロール抗体等を収容する付加的な容器を具備していてもよい。ラベル又は能書は、組成物についての記載、並びに意図するインビトロ又は検出での使用に関する注意書きを提供するものである。
【０１２２】
ＸＩ．ポリペプチド又は核酸を含むＣＲＴＡＭ調節因子−特定の形態と用途
一実施態様では、本発明の核酸には、内在性ＣＲＴＡＭ核酸に結合可能な、又はＣＲＴＡＭポリペプチドをコードする一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドが含まれる。本発明によると、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＲＴＡＭ ＤＮＡのコード領域の少なくとも断片を含む。そのような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、Stein及びCohen（Cancer Res. 48:2659, 1988）及び van der Krol等（BioTechniques 6:958, 1988）に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の未熟終止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。そのような方法は、本発明に含まれている。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、活性化されたＴ細胞におけるＣＲＴＡＭタンパク質の発現を阻止するのに用いられ得る。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、国際公開９１／０６６２９に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドを更に含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（つまり、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【０１２３】
アンチセンス結合の好適な遺伝子内部位には、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始／開始コドン（５'-ＡＵＧ／５'-ＡＴＧ）又は終結／停止コドン（５'-ＵＡＡ、５'-ＵＡＧ及び５-ＵＧＡ／５'-ＴＡＡ、５'-ＴＡＧ及び５'-ＴＧＡ）を含む領域が含まれる。これらの領域は翻訳開始又は終結コドンから何れかの方向（つまり５'又は３'）に約２５から約５０の近接ヌクレオチドを包含するｍＲＮＡ又は遺伝子の一部を意味する。アンチセンス結合のための他の例示的な領域には、イントロン；エキソン；イントロン-エキソン接合部；翻訳開始コドンと翻訳終結コドンの間の領域であるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は「コード領域」；５'-５'トリホスフェート結合を介してｍＲＮＡの５'−最末端残基に結合したＮ７-メチル化グアノシン残基を含み、５'キャップ構造自体と同様にキャップに隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むｍＲＮＡの５'キャップ；翻訳開始コドンから５'方向のｍＲＮＡの部分で、ｍＲＮＡ又は遺伝子上の対応するヌクレオチドの翻訳開始コドンと５'キャップ部位の間のヌクレオチドを含む５'の未翻訳領域（５'ＵＴＲ）；及び翻訳終結コドンから３'方向のｍＲＮＡの部分で、ｍＲＮＡ又は遺伝子上の対応するヌクレオチドの３'末端と翻訳停止コドンの間のヌクレオチドを含む、３'未翻訳領域（３'ＵＴＲ）が含まれる。
ＣＲＴＡＭポリペプチドの発現を阻害するのに有用なアンチセンス化合物の特定の例には、修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには骨格にリン原子を保持しているものと骨格にリン原子を有していないものが含まれる。この明細書の目的のために、また当該分野でしばしば引用されるように、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を持たない修飾オリゴヌクレオチドはまたオリゴヌクレオシドであると考えることができる。例示的な修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えばホスホロチオネート、キラルホスホロチオネート、ホスホロジチオネート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネートで、３'-アルキレンホスホネート、５'-アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むもの、ホスフィネート、ホスホルアミデートで、３'-アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むもの、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート及びボラノ-ホスフェートで通常の３'-５'結合を持つもの、これらの２'-５'結合類似体、及び一又は複数のヌクレオチド間結合が３'から３'、５'から５'又は２'から２'結合である逆転された極性を持つものが含まれる。逆転した極性を持つ例示的なオリゴヌクレオチドは単一の３'から３'結合を最も３'側のヌクレオチド間結合、つまり、非塩基性(abasic)でありうる単一の逆転ヌクレオシド残基（核酸塩基がないか、又はその代わりにヒドロキシル基を有する）を含む。様々な塩、混合された塩及び遊離の酸形態がまた含まれる。リン含有結合の調製を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許３６８７８０８；４４６９８６３；４４７６３０１；５０２３２４３；５１７７１９６；５１８８８９７；５２６４４２３；５２７６０１９；５２７８３０２；５２８６７１７；５３２１１３１；５３９９６７６；５４０５９３９；５４５３４９６；５４５５２３３；５４６６６７７；５４７６９２５；５５１９１２６；５５３６８２１；５５４１３０６；５５５０１１１；５５６３２５３；５５７１７９９；５５８７３６１；５１９４５９９；５５６５５５５；５５２７８９９；５７２１２１８；５６７２６９７及び５６２５０５０が含まれ、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。
【０１２４】
リン原子をそこに含まない例示的な修飾オリゴヌクレオチド骨格は短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は一又は複数の短鎖ヘテロ原子又は複素環ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のものが含まれる。このようなオリゴヌクレオチドの調製を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許５０３４５０６；５１６６３１５；５１８５４４４；５２１４１３４；５２１６１４１；５２３５０３３；５２６４５６２；５２６４５６４；５４０５９３８；５４３４２５７；５４６６６７７；５４７０９６７；５４８９６７７；５５４１３０７；５５６１２２５；５５９６０８６；５６０２２４０；５６１０２８９；５６０２２４０；５６０８０４６；５６１０２８９；５６１８７０４；５６２３０７０；５６６３３１２；５６３３３６０；５６７７４３７；５７９２６０８；５６４６２６９及び５６７７４３９が含まれ、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。
他の例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、糖とヌクレオシド間結合の双方、つまりヌクレオチド単位の骨格が新規な基と置換される。ベース単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。一つのそのようなオリゴマー化合物である、優れたハイブリダイゼーション特性を持つことが示されているオリゴヌクレオチド擬態体はペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格はアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置き換えられている。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許５５３９０８２；５７１４３３１；及び５７１９２６２が含まれ、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。ＰＮＡ化合物の更なる教示はNielsen等, Science, 1991, 254, 1497-1500に見出すことができる。
例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドはホスホロチオネート骨格及び／又はヘテロ原子骨格、特に-ＣＨ２-ＮＨ-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ３)-Ｏ-ＣＨ２-［メチレン(メチルイミノ)又はＭＭＩ骨格として知られる］、-ＣＨ２-Ｏ-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ３)-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-、及び上で参照した米国特許第５４８９６７７号に記載された-Ｏ-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-ＣＨ２-［ここで天然ホスホジエステル骨格は-Ｏ-Ｐ-Ｏ-ＣＨ２-と表される］及び上で参照された米国特許第５６０２２４０号のアミド骨格を含む。また好ましいものは上で参照した米国特許第５０３４５０６号のモルホリノ骨格構造を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１２５】
修飾オリゴヌクレオチドはまた一又は複数の置換糖部分を含みうる。例示的なオリゴヌクレオチドは２'位に次のものの一つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ-アルキル、Ｓ-アルキル、又はＮ-アルキル；Ｏ-アルケニル、Ｓ-アルケニル又はＮ-アルケニル；Ｏ-アルキニル、Ｓ-アルキニル又はＮ-アルキニル；又はＯ-アルキル-Ｏ-アルキルを含み、ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルでありうる。特に好ましいものはＯ[(ＣＨ２)ｎＯ]ｍＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、Ｏ(ＣＨ２)ｎＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＮＨ２、及びＯ(ＣＨ２)ｎＯＮ[(ＣＨ２)ｎＣＨ３]２であり、ここでｎ及びｍは１から約１０である。他の例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは２'位に次のものの一つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ-アルカリル又はＯ-アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善する基、オリゴヌクレオチドの薬理的性質を改善する基、及び同様な性質を持つ他の置換基。ある修飾は２'-メトキシエトキシ(２'-Ｏ-(２-メトキシエチル)又は２'-ＭＯＥとしても知られている２'-Ｏ-ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３)（Martin等, Helv. Chim. Acta., 1995, 78, 486-504）、つまりアルコキシアルコキシ基を含む。更に好適な修飾は、２'-ジメチルアミノオキシエトキシ、つまり２'-ＤＭＡＯＥとしても知られているＯ(ＣＨ２)２ＯＮ(ＣＨ３)２基、及び２'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（２'-Ｏ-ジメチルアミノエトキシエチル又は２'-ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、つまり２'-Ｏ-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ２)を含む。
更なる修飾は、２'-ヒドロキシル基が糖環の３'又は４'炭素原子に結合され二環糖部分を形成する固定核酸(Locked Nucleic Acids: ＬＮＡｓ)を含む。結合はｎが１又は２である２'酸素原子と４'炭素原子を架橋するメチレン（-ＣＨ２-）ｎ基であってもよい。ＬＮＡｓ及びその製造方法は国際公開９８／３９３５２及び国際公開９９／１４２２６に記載されている。
他の修飾は２'-メトキシ(２'-Ｏ-ＣＨ３)、２'-アミノプロポキシ(２'-ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２)、２'-アリル(２'-ＣＨ２-ＣＨ=ＣＨ２)、２'-Ｏ-アリル(２'-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ=ＣＨ２)及び２'-フルオロ(２'-Ｆ)を含む。２'-修飾はアラビノ（上）位置又はリボ（下）位置においてでありうる。２'-アラビノ修飾は２'-Ｆである。同様の修飾はまたオリゴヌクレオチドの他の位置、特に３'末端ヌクレオチドの糖の３'位又は２'−５'結合オリゴヌクレオチド及び５'末端ヌクレオチドの５'位になすことができる。オリゴヌクレオチドはまたペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖擬態体を有しうる。そのような修飾糖構造の調製を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許４９８１９５７；５１１８８００；５３１９０８０；５３５９０４４；５３９３８７８；５４４６１３７；５４６６７８６；５５１４７８５；５５１９１３４；５５６７８１１；５５７６４２７；５５９１７２２；５５９７９０９；５６１０３００；５６２７０５３；５６３９８７３；５６４６２６５；５６５８８７３；５６７０６３３；５７９２７４７；及び５７００９２０が含まれ、その各々は出典明示により全体がここに取り込まれる。
【０１２６】
オリゴヌクレオチドにはまた核酸塩基（当該分野ではしばしば単に「塩基」と称される）の修飾又は置換が含まれうる。ここで使用される場合、「未修飾の」又は「天然の」核酸塩基にはプリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）及びピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、他の合成及び天然核酸塩基、例えば５-メチルシトシン（５-me-Ｃ）、５-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２-アミノアデニン、６-メチル及び他のアデニン及びグアニンのアルキル誘導体、２-プロピル及び他のアデニン及びグアニンのアルキル誘導体、２-チオウラシル、２-チオチミン及び２-チオシトシン、５-ハロウラシル及びシトシン、５-プロポニル（-Ｃ≡Ｃ-ＣＨ３又はＣＨ２-Ｃ≡ＣＨ）ウラシル及びシトシン及び他のピリミジン塩基のアルキル誘導体、６-アゾウラシル、シトシン及びチミン、５-ウラシル（プソイドウラシル）、４-チオウラシル、８-ハロ、８-アミノ、８-チオール、８-チオアルキル、８-ヒドロキシル及び他の８-置換アデニン類及びグアニン類、５-ハロ、特に５-ブロモ、５-トリフルオロメチル及び他の５-置換ウラシル類及びシトシン類、７-メチルグアニン及び７-メチルアデニン、２-Ｆ-アデニン、２-アミノ-アデニン、８-アザグアニン及び８-アザアデニン、７-デアザグアニン及び７-デアザアデニン及び３-デアザグアニン及び３-デアザアデニンが含まれる。更なる修飾核酸塩基には、三環系ピリミジン類、例えばフェノキサジンシチジン(１Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾキサジン-２(３Ｈ)-オン)、フェノチアジンシチジン(１Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾチアジン-２(３Ｈ)-オン)、Ｇ-クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば９-(２-アミノエトキシ)-Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾキサジン-２(３Ｈ)-オン）、カルバゾールシチジン(２Ｈ-ピリミド[４,５-ｂ]インドール-２-オン)、ピリドインドールシチジン(Ｈ-ピリド[３',２'：４,５]ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン-２-オン)が含まれる。修飾核酸塩基にはまたプリン又はピリミジン塩基が他の複素環で置き換えられているもの、例えば７-デアザ-アデニン、７-デアザグアノシン、２-アミノピリジン及び２-ピリドンが含まれうる。更なる核酸塩基には米国特許第３６８７８０８号に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, ８５８-８５９頁, Kroschwitz, J.I.編 John Wiley ＆ Sons, 1990に開示されているもの、及びEnglisch等, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30,613に開示されているものが含まれる。これらの核酸塩基のある種のものは本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらには、５-置換ピリミジン、６-アザピリミジン及びＮ-２、Ｎ-６及びＯ-６置換プリンで、２-アミノプロピルアデニン、５-プロピニルウラシル及び５-プロピニルシトシンを含むものが含まれる。５-メチルシトシン置換は０．６−１．２℃だけ核酸二重安定性を増大させることが知られており（Sanghvi等, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278）、例えば２'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合には、例示的な塩基置換である。修飾核酸塩基の製造を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許��６８７８０８；並びに米国特許４８４５２０５；５１３０３０２；５１３４０６６；５１７５２７３；５３６７０６６；５４３２２７２；５４５７１８７；５４５９２５５；５４８４９０８；５５０２１７７；５５２５７１１；５５５２５４０；５５８７４６９；５５９４１２１；５５９６０９１；５６１４６１７；５６４５９８５；５８３０６５３；５７６３５８８；６００５０９６；５６８１９４１及び５７５０６９２が含まれ、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。
【０１２７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取り込みを亢進する一又は複数の部分又はコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に結合させることを含む。本発明の化合物は第１級又は第２級ヒドロキシル基のような官能基に共有結合したコンジュゲート基を含みうる。本発明のコンジュゲート基には、介入物（インターカレーター）、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬理的性質を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態学的性質を増強する基が含まれる。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール、脂質、カチオン脂質、リン脂質、カチオン性リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料が含まれる。この発明の文脈における薬理学的性質を増強する基には、オリゴマー取り込みを改善し、分解に対するオリゴマーの耐性を亢進し、及び／又はＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを補強する基が含まれる。この発明の文脈における薬物動態学的性質を増強する基には、オリゴマー取り込み、分散、代謝又は排出を改善する基が含まれる。コンジュゲート部分には限定されるものではないが、脂質分子、例えばコレステロール部分（Letsinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556)、コール酸（Manoharan等, Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1063）、チオエーテル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール（Manoharan等, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660-306-309; Manoharan等, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser等, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基（Saison-Behmoaras等, EMBOJ., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov等, FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk等, Biochimie, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール又はトリエチル-アンモニウム１,２-ジ-Ｏ-ヘキサデシル-rac-グリセロ-３-Ｈ-ホスホナート（Manoharan等, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea等, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Manoharan等, Nucleosides ＆ Nucleotides, 1995, 14, 969-973）、又はアダマンタン酢酸（Manoharan等、Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishra等, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドはまた活性な薬物物質、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(Ｓ)-(＋)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２,３,５-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤又は抗生物質にコンジュゲートすることができる。オリゴヌクレオチド-薬剤コンジュゲート及びその製造方法は米国特許出願第０９／３３４１３０号（１９９９年６月１５日出願）及び米国特許４８２８９７９；４９４８８８２；５２１８１０５；５５２５４６５；５５４１３１３；５５４５７３０��５５５２５３８；５５７８７１７；５５８０７３１；５５８０７３１；５５９１５８４；５１０９１２４；５１１８８０２；５１３８０４５；５４１４０７７；５４８６６０３；５５１２４３９；５５７８７１８；５６０８０４６；４５８７０４４；４６０５７３５；４６６７０２５；４７６２７７９；４７８９７３７；４８２４９４１；４８３５２６３；４８７６３３５；４９０４５８２；４９５８０１３；５０８２８３０；５１１２９６３；５２４１１３６；５０８２８３０；５１１２９６３；５２１４１３６；５２４５０２２；５２５４４６９；５２５８５０６；５２６２５３６；５２７２２５０；５２９２８７３；５３１７０９８；５３７１２４１；５３９１７２３；５４１６２０３；５４５１４６３；５５１０４７５；５５１２６６７；５５１４７８５；５５６５５５２；５５６７８１０；５５７４１４２；５５８５４８１；５５８７３７１；５５９５７２６；５５９７６９６；５５９９９２３；５５９９９２８及び５６８８９４１に記載され、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。
【０１２８】
与えられた化合物の全ての位置を一様に修飾する必要はなく、実際、一を超える上述の修飾を単一化合物中に又はオリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシドにさえ導入することができる。本発明はまたキメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。本発明の文脈における「キメラ」アンチセンス化合物又は「キメラ」は、それぞれが少なくとも一のモノマー単位、つまりオリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドからなる２以上の化学的に区別される領域を含むアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的にはオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対する増大した耐性、増大した細胞性取り込み、及び／又は標的核酸に対する増大した結合親和性を付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾されている少なくとも一の領域を含む。オリゴヌクレオチドの更なる領域はＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブロッドを切断可能な酵素の基質となりうる。例を挙げると、ＲＮアーゼＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。故に、ＲＮアーゼＨの活性化はＲＮＡ標的の開裂を生じ、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効果を大きく向上させる。従って、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオネートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、キメラオリゴヌクレオチドが使用される場合、より短いオリゴヌクレオチドで同等の結果をしばしば得ることができる。本発明のキメラアンチセンス化合物は上述の二以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド擬態体の複合構造体として形成されてもよい。例示的なキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性を付与するために３'末端に少なくとも一の２'修飾糖（好ましくは２'-Ｏ-(ＣＨ２)２-Ｏ-ＣＨ３）とＲＮアーゼＨ活性を付与するために少なくとも４の隣接した２'-Ｈ糖を持つ領域を含む。このような化合物はまた当該分野においてハイブリッド又はギャプマー(gapmers)とも呼ばれている。例示的なギャプマーは少なくとも４の隣接した２'-H糖を持つ少なくとも一の領域で分離した３'末端と５'末端２'修飾糖（好ましくは２'-Ｏ-(ＣＨ２)２-Ｏ-ＣＨ３）の領域を持ち、ホスホロチオネート骨格結合を含んでもよい。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許第５０１３８３０；５１４９７９７；５２２０００７；５２５６７７５；５３６６８７８；５４０３７１１；５４９１１３３；５５６５３５０；５６２３０６５；５６５２３５５；５６５２３５６；及び５７００９２２が含まれ、これらのそれぞれが出典明示によりここに取り込まれる。
本発明において使用されるアンチセンス化合物は固相合成のよく知られた技術によって簡便かつ常套的に製造することができる。そのような合成のための装置は、例えばApplied Biosystems (Foster City, Calif.)を含む幾つかのメーカーによって販売されている。当該分野で知られているそのような合成のための任意の他の手段を付加的に又は別に使用してもよい。オリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオネート及びアルキル化誘導体を調製するために類似の技術を使用することはよく知られている。本発明の化合物は、また、取り込み、分散及び／又は吸収を補助するための他の分子、分子構造又は化合物混合物、例えばリポソーム、レセプター標的分子、経口、直腸、局所適用又は他の製剤と、混合、カプセル化、コンジュゲート又はその他、組み合わされてもよい。そのような取り込み、分散及び／又は吸収を補助する製剤の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許第５１０８９２１；５３５４８４４；５４１６０１６；５４５９１２７；５５２１２９１；５５４３１５８；５５４７９３２；５５８３０２０；５５９１７２１；４４２６３３０；４５３４８９９；５０１３５５６；５１０８９２１；５２１３８０４；５２２７１７０；５２６４２２１；５３５６６３３；５３９５６１９；５４１６０１６；５４１７９７８；５４６２８５４；５４６９８５４；５５１２２９５；５５２７５２８；５５３４２５９；５５４３１５２；５５５６９４８；５５８０５７５；及び５５９５７５６が含まれ、これらのそれぞれが出典明示によりここに取り込まれる。
【０１２９】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、国際公開９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤及びアルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４-媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。例示的な方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ-ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（国際公開９０／１３６４１参照）を含む。
【０１３０】
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。一般には、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しないのが好ましい。
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
【０１３１】
アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、通常は少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈の「約」という用語は、参照ヌクレオチド配列長にその参照長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。
【０１３２】
また、ＣＲＴＡＭ調節因子ポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が細胞内に導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
【０１３３】
生細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでのトランスフェクション及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介トランスフェクションである（Dzau等, Trends  in Biotechnology 11, 205-210(1993)）。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいてインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシス技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコルの概説については、Anderson等, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
本発明のＣＲＴＡＭ調節因子ポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングの診断に使用でき、このＣＲＴＡＭポリペプチドは、その他の組織と比較して１つの組織において、好ましくは同じ組織型の正常組織に比較して疾患性組織において特異的に発現する。
【０１３４】
この発明は、ＣＲＴＡＭを調節するものを同定するための化合物をスクリーニングする方法を含む。アンタゴニスト薬候補に関するスクリーニングアッセイは、ＣＲＴＡＭポリペプチドと結合又は複合化する、さもなければＣＲＴＡＭポリペプチドと他の細胞タンパク質の相互作用を妨害する化合物、例えば、細胞からのＣＲＴＡＭポリペプチドの発現を阻害するものを含む化合物を同定するように設計されている。そのようなスクリーニングアッセイには、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングを施すことができるアッセイが含まれ、それらアッセイを特に小分子薬剤候補の同定に適したものにする。
このアッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、そして細胞ベースアッセイを含む、当該分野で良く特徴付けられている種々の形式で行うことができる。
アンタゴニストに関する全てのアッセイは、薬候補をＣＲＴＡＭポリペプチドと、これら両成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間にわたって接触させることを必要とする点で共通である。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ＣＲＴＡＭポリペプチド又は薬候補が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をＣＲＴＡＭポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきＣＲＴＡＭポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体の使用によって検出できる。
【０１３５】
候補化合物が相互作用するがＣＲＴＡＭポリペプチドにと結合しない場合、ＣＲＴＡＭとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィーのカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans Proc.Natl. Acad. Sci. USA,89:5789-5793 (1991)に開示されているようにして、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London),340,:245-246(1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKERTM）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０１３６】
ＣＲＴＡＭと他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、ＣＲＴＡＭと細胞内又は細胞外成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で調製される。候補化合物の結合阻害能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなくコントロール反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
アンタゴニストを検定するために、ＣＲＴＡＭポリペプチドを、特定の活性についてスクリーニングされる化合物とともに細胞に添加してもよく、ＣＲＴＡＭポリペプチド存在下で対象とする活性を阻害する当該化合物の能力が、当該化合物がＣＲＴＡＭポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。ＣＲＴＡＭポリペプチドは、放射活性等で標識でき、レセプター分子に結合したＣＲＴＡＭポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。
【０１３７】
ある潜在的なＣＲＴＡＭポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、三重螺旋形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、成熟ＣＲＴＡＭタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の５'コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重螺旋−Lee等, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooney等, Science, 241: 456 (1988); Dervan等, Science, 251: 1360 (1991)参照）、それによりＣＲＴＡＭポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてｍＲＮＡ分子のＣＲＴＡＭポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)）。また上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＣＲＴＡＭポリペプチドの産生を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１３８】
潜在的アンタゴニストは、ＣＲＴＡＭポリペプチドの活性部位、タンパク質相互作用部位、又は他の関連結合部位に結合し、それによりＣＲＴＡＭポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的開裂により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、国際公開 ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照。
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスティン(Hoogsteen)塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのかなり大きな伸張を必要とする。さらなる詳細は、例えば、上掲のＰＣＴ公報、国際公開９７／３３５５１を参照。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【０１３９】
一実施態様では、内部移行する抗体が好ましい。抗体は、抗体の細胞への運搬を促す特定の特徴を有するか、又はその特徴を有するように修飾されていてよい。これを達成するための技術は当分野で公知である。さらに他の実施態様では、抗体は、抗体を発現することができる核酸を標的細胞に導入することによって標的細胞内で発現されうる。例として、米国特許第６７０３０１９号；同第６３２９１７３号；及び国際公開２００３／０７７９４５を参照のこと。リポフェクション又はリポソームも抗体を細胞に運搬するために使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が一般には有用である。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。
標的細胞への調節因子ポリペプチドの移入は当分野で公知の方法によって亢進されうる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔ由来のもの又はアンテナペディアホメオドメインタンパク質などの特定の配列は、細胞膜を介して異種タンパク質を効率よく取り込ませることができる。例としてChen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), 96:4325-4329を参照。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害性薬又は他の免疫抑制剤のようなその機能を高める薬剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【受託番号】
【０１４０】
以下のハイブリドーマ細胞株をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA(ATCC)に寄託した：
抗体名称              ATCC番号        寄託日        
34G4.6.2.1.1.3        PTA-8460        2007年5月24日
32D6.4.1.1.1          PTA-8461        2007年5月24日
6E2.27.8.2.1          PTA-8462        2007年5月24日
17B2.7.12.9.2.2       PTA-8463        2007年5月24日
20F4.1.1.1.2.1        PTA-8464        2007年5月24日
【０１４１】
以下に本発明の方法と組成物を例示する。上記の一般的な記載により様々な他の実施態様が実施可能であることは理解されるであろう。実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１４２】
実験手順
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６マウスはJackson Laboratory (Bar Harbor, Maine)から購入した。Ｃｒｔａｍ-ノックアウトマウスは、およそ５００の分泌型膜貫通タンパク質の機能を分析するために、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈとＬｅｘｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ(The Woodlands, TX)との協同で生産された。以下、特定のターゲッティング方策について説明する。 
【０１４３】
免疫蛍光顕微鏡法
Ｔ細胞極性について調べるために、刺激していないナイープＣＤ４＋Ｔ細胞又は１４時間活性化させたＴ細胞を、４％パラホルムアルデヒドにて固定し、抗Ｃｒｔａｍハムスターポリ血清(polysera)、抗ＣＤ４４ ｍＡｂ(BD Pharmingen)又は抗ＣＤ３ ｍＡｂ(BD Pharmingen)にて染色し、０．２％トリトンＸ−１００にて透過処理し、Santa Cruz Biotechnologyの抗ＰＫＣζ(Ｈ−１)抗体、抗Ｃｄｃ４２(Ｂ−８)抗体、抗Ｓｃｒｉｂ(Ｈ−３００)抗体、抗ＰＫＣθ抗体(Cell Signaling)又は抗タリン抗体(Sigma)にて染色した。スライドは、デコンボリューション顕微鏡法(Delta Vision)にて分析した。染色の３Ｄモデルは、Ｉｍａｒｉｓ５．５を使用して再編成した。 
Ｔ細胞と樹状(ＤＣ)細胞との間の相互作用を評価するために、ＤＣは、ＣＤ１１ｃマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)にて確実に精製し、０．５Ｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＲＡ(Molecular Probes)にて標識した。５ＭのＯＶＡ３２３−３３９と共に１時間インキュベートした後に、ＤＣは、ポリＤ−リジン−コートカバーグラス(BD BioCoatTM)上で、Ｃｒｔａｍ＋／＋ＯＴ-ＩＩ ＴＣＲｔｇマウスおよびＣｒｔａｍ−／−ＯＴ−ＩＩ ＴＣＲｔｇマウスのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞は、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳにて固定し、０．２％トリトンＸ−１００にて透過処理し、Ｆ−アクチンについてファロイジン(Molecular Probes)にて染色した。ＤＡＰＩを含有するマウント培地(Vector Laboratories)を用いてＤＮＡを視覚化した。
【０１４４】
レトロウイルスの再構成
野生型Ｃｒｔａｍ, ΔＩＣＤ(アミノ酸１−３１６)、ΔＥＣＤ(アミノ酸２５１−３９３)又はΔＥＳＩＶ変異体のためのレトロウイルスコンストラクトは、下流の内部リボソーム導入部位プロモーター作動型ｅＧＦＰもコードしていた(Pear et al., 1993)。精製されたＣｒｔａｍ−／−ＯＴ−ＩＩ ＴＣＲｔｇ ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化し、レトロウイルスＤＮＡを形質移入したナツメヤシ細胞の上清にてスピン形質移入(spin-transfect)した(１８００ｒｐｍで９０分)。ｅＧＦＰ＋細胞はＣｒｔａｍ発現の相対的なレベルに基づいて分類した。分類された細胞は２日後に再刺激した。Ｔ細胞極性は再刺激後１４時間に試験したのに対して、チミジン取込みおよびサイトカイン産生は４８時間後に測定した。
【０１４５】
フローサイトメトリーおよび増殖アッセイ
単一細胞浮遊液は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、ＣＤ４４、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＢ又はＣＤ６９(BD Pharmingen)に対するモノクローナル抗体(ｍＡｂ)、Ｃｒｔａｍに対するハムスターポリセラ又はＣｒｔａｍ ｍＡｂ(１７Ｂ２、Genentech)にて染色した。Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−マウスの脾臓からのマイクロビーズ濃縮ナイーブＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞(２×１０４)は、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ε ｍＡｂおよび２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ ｍＡｂ又は照射を受けた５μＭのＯＶＡ３２３−３３９パルス化抗原提示細胞にてコートした平底ＭａｘｉＳｏｒｐ表面マイクロプレート(Nunc)にて培養した。４２時間後、[３Ｈ]チミジン(１μＣｉ／ウェル)を加え、プレートを８時間後に回収した。カルボキシフルオセインジアセタート-スクシンイミジルエステル(ＣＦＳＥ)標識のために、細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＴＭ ＣＦＳＥ細胞増殖キット(Molecular Probes, Portland, Oregon)により５μＭ ＣＦＳＥにて標識し、ＦＡＣＳｃａｎ分析のために増殖細胞を回収した。 
【０１４６】
ウェスタンブロッティング 
ＣｒｔａｍおよびＰＤＺを含有するタンパク質の相互作用を評価するために、マイクロビーズ精製ＣＤ４＋Ｔ細胞は、プレートに結合している抗ＣＤ３ε(１０μｇ／ｍｌ)および抗ＣＤ２８(２μｇ／ｍｌ) ｍＡｂにて刺激し、全細胞抽出物は抗Ｓｃｒｉｂ抗体(Ｋ-２１、Santa Cru)を使用して免疫沈降し、免疫複合体は抗Ｃｒｔａｍ ｍＡｂ(６Ｅ２、Genentech)又は抗Ｓｃｒｉｂ Ａｂ(Ｈ-３００、Santa Cruz)によるイムノブロッティングにて分析した。対照実験は、免疫沈降について抗Ｄｌｇ１ Ａｂ(Ｈ-６０、Santa Cruz)を使用して行った。プルダウン実験では、Ｆｌａｇタグ付加Ｃｒｔａｍを２９３細胞において発現させ、細胞溶解物を様々なＧＳＴ−ＰＤＺタンパク質と共に４℃で終夜インキュベートした(Zhang et al., 2006)。Ｃｒｔａｍ-Ｆｌａｇは抗Ｆｌａｇ Ｍ２アガロースビーズ(Sigma)を使用して免疫沈降させ、免疫複合体は抗ＧＳＴ(GE Healthcare Bio-Sciences)又は抗Ｃｒｔａｍ(６Ｅ２) ｍＡｂによるイムノブロッティングにて分析した。
【０１４７】
Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂキメラレセプター構築
Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂキメラを生成するために、完全長ＭｍＳｃｒｉｂ ｃＤＮＡをナイーブマウスＴ細胞のｍＲＮＡからクローニングし、ＢａｍＨＩ部位を使用してＣｒｔａｍ(ΔＩＣＤ、ａａ１−３１６)のＣ末端に融合した。Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂキメラは、さらにｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰベクターにサブクローニングした。４μｇのプラスミドＤＮＡを、マウスＴ細胞Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット(Amaxa)およびＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ(program X-01)を用いた５×１０６Ｔ細胞によるエレクトロポレーションに用いた。
【０１４８】
Ｃｒｔａｍ(ΔＥＣＤ)ＦＬＡＧエピトープタグ付加変異体レセプター構築
Ｃｒｔａｍ(ΔＥＣＤ)Ｆｌａｇエピトープタグ付加変異体を生成するために、内在性Ｃｒｔａｍシグナル配列はＦｌａｇペプチドのＮ末端に融合し、Ｃｒｔａｍ(ａａ２５１−３９３)の膜貫通および細胞内ドメインはＦｌａｇペプチドのＣ末端に融合した。このコンストラクトは、ＧＦＰをコードするレトロウイルスベクターにおいて発現させた。
【０１４９】
Ｃａｄｍ１(ＥＣＤ)-Ｆｃ構築
Ｃａｄｍ１(ＥＣＤ)-Ｆｃを生成するために、Ｃａｄｍ１のＥＣＤ(ａａ１−３７４)は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ-ドメインに融合させた。このコンストラクトはＣＨＯ細胞においてプラスミドベクターから過渡的に発現させた。  
【０１５０】
Ｓｃｒｉｂ ｓｉＲＮＡ
この試験に用いたｓｉＲＮＡを以下に挙げる。ＭｍＳｃｒｉｂ１、標的配列AGGGAAGACGGTGAAAGTGAA(配列番号：９) (QIAGEN, cat. # S101411851)；ＭｍＳｃｒｉｂ２、標的配列CCGGATGGCTTCACACAGCTA(配列番号：１０) (QIAGEN, cat. # S101411858)；ＭｍＳｃｒｉｂ３、標的配列CGGAACGATATTCCTGAGATA(配列番号：１１) (QIAGEN, cat. # S101411865)；ＭｍＳｃｒｉｂ４、標的配列CTGGAGGGACTTACCCACCTA(配列番号：１２)(QIAGEN, cat. # S101411872);Ｃｔｒｌ-ＡｌｌＳｔａｒｓ1(QIAGEN, cat. # S103650318)。形質移入のために用いたｓｉＲＮＡの濃度は、合計１μｇのＳｃｒｉｂ ｓｉＲＮＡ混合物および１μｇのコントロールｓｉＲＮＡに対して各々０．２５μｇとした。エレクトロポレーションの条件は、マウスｔ細胞Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット(Amaxa)を用いた上記のものと同じとする。
【０１５１】
Ｃｒｔａｍ欠陥マウスの作製
Ｃｒｔａｍ-ノックアウトマウスは、およそ５００の分泌型膜貫通タンパク質の機能を分析するために、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈとＬｅｘｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ(The Woodlands, TX)との協同で作製された。Ｃｒｔａｍ欠陥マウスは、図９Ａに記述される方策を用いて、Lexicon Genetics Inc(The Woodlands, TX)によって作製された。ターゲッティングベクター、ｐＫＯＳ-１１は、相同組み換えによってマウスＣｒｔａｍ遺伝子座のエキソン１をネオマイシン耐性カセットに置換した。ターゲッティングコンストラクトを１２９系統胎仔幹(ＥＳ)細胞に電気穿孔し、標的クローンを識別した。標的ＥＳクローンはＣ５７ＢＬ／６の胚盤胞に微量注入し、生じてた雄キメラを雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに交雑してＦ１Ｃｒｔａｍ＋／−ヘテロ接合の生殖細胞系マウスを生成した。ヘテロ接合体を交雑して、Ｆ２野生型、ヘテロ接合体およびホモ接合体マウスを作製する。
これらの試験に使用したマウスは、以下のプライマーを用いたＰＣＲにより尾部ＤＮＡにて遺伝子タイピングを行った。野生型３２８ｂｐ断片とノックアウト１９１ｂｐ断片を生成する、5'-GACACAGGCAAGGTCACAGA-3'(配列番号：１３)と5'-AGAGTAACTGCCCTTGGACGTG-3'(配列番号：１４)又は5'-GCAGCGCATCGCCTTCTATC-3'(配列番号：１５)。反応は、ＲｅｄＭｉｘ(Sigma)を用いてマウスＤＮＡ(２００ｎｇ)を含有した。反応は以下の通りに増幅した。変性９４℃で４分、９５℃で１分、６０℃で３０秒及び７２℃で１分を３０サイクル、そして７２℃で１０分の最終伸展。ゲノムサザンブロッティングに用いたプローブは、以下のプローブを用いたＰＣＲによりＣ５７ＢＬ-６ゲノムＤＮＡにより調製した。３９２ｂｐの５'プローブを生成する、5'-GTCTGCCAAGTTCCTTGTACAC-3'(配列番号：１６)と5'-ACTGGGCTCTCACTTCTTAATC-3'(配列番号：１７)及び、３６７ｂｐの３'プローブを生成する、5'-TTGGTTTTGGGAGCTTAATTCT-3'(配列番号：１８)と5'-GTATAGAGCTCAGGGAATTGAA-3'(配列番号：１９)。プローブは、ＰＣＲ ＤＩＧプローブ合成キット(Roche Molecular Biochemicals)を使用して標識した。電気穿孔したＤＮＡ断片は陽性荷電のナイロン製メンブランへ移し、ＤＩＧ洗浄およびブロックバッファセット(Roche Molecular Biochemicals)および抗ジゴキシゲニン-ＡＰ Ｆａｂ断片を用いてゲノム断片を確認した。
【０１５２】
逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応
Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−マウスの脾臓からのＲＮＡはＴＲＩＺＯＬ試薬(Invitrogen Life Technologies)を用いて抽出され、製造業者のプロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲ(Invitrogen)のためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ-Ｓｔｒａｎｄ合成システムを用いることによってオリゴｄ(Ｔ)１６にて逆転写した。ｃＤＮＡは、４９８ｂｐ断片を生成する、プライマー5'-GGCAGAATGGAGAGAAATCG-3'(配列番号：２０)と5'-CCAGTGTGAGCAGCAGGATA-3'(配列番号：２１)を用いてＣｒｔａｍの増幅のための鋳型として用いた。従来のＰＣＲ反応は、９５℃２分の開始変性工程の後に、９４℃１分、６０℃３０秒、７２℃１分を３０サイクル、そして７２℃７分の最終伸展工程にて行った。
【０１５３】
ＥＬＩＳＡ
ＩＦＮγ、ＩＬ４、ＩＬ２２およびＩＬ１７産生のために、活性化Ｔ細胞からの上清は刺激の４８時間後に回収した。ＩＦＮγおよびＩＬ１７の濃度は、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  マウスイムノアッセイ(R&D Systems)にて決定し、ＩＬ４は、ＢＤ ＯｐｔＥＩＡセット(BD Bioscience)にて決定し、ＩＬ２２は前記のように決定した(Zheng et al., 2007)。分析は、製造業者のプロトコールに従って、４５０ｎｍにセットしたマイクロプレート読み取り機と５４０ｎｍにセットした波長補正を用いて読み取った。
【０１５４】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のインビトロ分化
Ｃ５７ＢＬ／６ Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−マウスのマウス脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を使用してネガティブに濃縮し、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞(ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋)はＣＤ６２Ｌマイクロビーズを使用してポジティブに選択した。Ｔ細胞は前記のように(Batten et al., 2006)培養した。精製したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞(１×１０６細胞／ｍｌ)は、プレートに結合した抗ＣＤ３(１０μｇ／ｍｌ)及び抗ＣＤ２８(２μｇ／ｍｌ)にて、ＴＨ１条件[組み換えマウスＩＬ１２(３．５ｎｇ／ｍｌ、R&D Systems)及びラット抗マウスＩＬ４ ｍＡｂ(５μｇ／ｍｌ、BD Pharmingen)]、ＴＨ２条件[組み換えマウスＩＬ４(３．５ｎｇ／ｍｌ、R&D Systems)、ハムスター抗マウスＩＦＮγｍＡｂ(５μｇ／ｍｌ、BD Pharmingen)およびラット抗マウスＩＬ１２ ｍＡｂ(５μｇ／ｍｌ、BD Pharmingen)]、又はＴＨ１７条件[抗ＩＦＮγ ｍＡｂ、抗ＩＬ４ ｍＡｂおよびｈｓＴＧＦβ１(１ｎｇ／ｍｌ、R&D Systems)と組み換えマウスＩＬ６(１０ｎｇ／ｍｌ、R&D Systems)又は組み換えマウスＩＬ２３(１０ｎｇ／ｍｌ、eBioscience)]の下で活性化した。１４時間活性化したＣ５７ＢＬ／６ ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣｒｔａｍ発現について染色し、ＦＡＣＳ分類にてＣｒｔａｍ＋又はＣｒｔａｍ−のＴ細胞を精製した。次いで、高度に精製したＣｒｔａｍ＋およびＣｒｔａｍ−のＴ細胞は開始分化条件下にて５日より長い期間培養した。分化したＴ細胞を洗浄し、計数して、サイトカイン産生の分析のためにプレートに結合した抗ＣＤ３(１０μｇ／ｍｌ)および抗ＣＤ２８(２μｇ／ｍｌ)にて再刺激した。 
【０１５５】
ＴａｑＭａｎリアルタイム定量反応
Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を１４時間活性化した。Ｃｒｔａｍ＋およびＣｒｔａｍ−Ｔ細胞はＦＡＣＳ分類にて精製した。ＲＮＡはＴＲＩＺＯＬ試薬(Invitrogen Life Technologies)を用いて抽出され、製造業者のプロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲ(Invitrogen)のためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ-Ｓｔｒａｎｄ合成システムを用いてオリゴｄ(Ｔ)１６にて逆転写した。ｃＤＮＡは、対象の遺伝子の増幅のための鋳型として用いた。リアルタイム定量反応は、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ試薬キット(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いることにより、５０ｐｍｏｌの各々のプライマーと１０ｐｍｏｌのＦＡＭ−およびＴＡＭＲＡ−標識プローブを含む２０μｌの総反応量にて行った。試料は、ＴａｑＭａｎアッセイＰＣＲ条件については製造業者のプロトコールに従って、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システム計測器(PE Applied Biosystems)を用いて４０サイクルの増幅に供した。遺伝子発現は２−ΔＣｔとして表し、値は任意の単位(ハウスキーピング遺伝子との相対、ＲＰＬ-１９レベル)として表した。ＴａｑＭａｎ反応に使用したプライマーを以下に挙げる。ＩＦＮ：フォワード、5'-TCTACCTCAGACTCTTTGAAGTCTTG-3'(配列番号：２２)、リバース、5'-GGTGTGATTCAATGACGCTTAT-3'(配列番号：２３)およびプローブ、5'-AAGACAATCAGGCCATCAGCAACAAC-3'(配列番号：２４)；ＩＬ２２：フォワード、5'-GACAGGTTCCAGCCCTACA-3'(配列番号：２５)、リバース、5'-GAGCTGATTGCTGAGTTTGG-3'(配列番号：２６)およびプローブ、5'-CAGGAAAGGCACCACCTCCTGC-3'(配列番号：２７)；ＩＬ２：フォワード、5'-AAAGGGCTCTGACAACACATT-3'(配列番号：２８)、リバース、5'-TCAGAAAGTCCACCACAGTTG-3'(配列番号：２９)およびプローブ、5'-TGACTCATCATCGAATTGGCACTCA-3'(配列番号：３０)。
【０１５６】
ＦＡＣＳに基づくコンジュゲーションアッセイ
ＡＰＣとして用いた精製されたＤＣは、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＲＡ(Molecular Probes)にて標識し、様々な濃度のＯＶＡ３２３−３３９にてパルスした。Ｃｒｔａｍ＋／＋ＯＴ-ＩＩ ＴＣＲｔｇおよびＣｒｔａｍ−／−ＯＴ−ＩＩ ＴＣＲｔｇマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ５-クロロメチルフルオレセインジアセタート(CMFDA, Molecular Probes, Eugene, OR)にて標識した。ＤＣおよびＴ細胞は、５×１０６細胞／ｍｌの濃度で、氷令のＤＭＥＭの中に再懸濁された。コンジュゲートアッセイのために、等数の樹状細胞およびＴ細胞を共に加え、室温で一時的にペレット状にし、３７℃で１０分間インキュベートした細胞は０．５％のパラホルムアルデヒドにて固定した。赤、緑、及び赤／緑の現象の相対的な割合はフローサイトメトリーで測定した。
【０１５７】
結果
Ｃｒｔａｍは活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセット上に過渡的に発現される
マウスＣｒｔａｍに対するｍＡｂの生成により、Ｃｒｔａｍが静止ナイーブＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上には発現されないが、ＴＣＲ活性化後に上方制御されたことが確認された(図１Ａ及び図８)。表面Ｃｒｔａｍの発現は、ＴＣＲ活性化後の６時間以内にＣＤ８＋Ｔ細胞において検出され、７２時間までに下方制御された。反対に、Ｃｒｔａｍは、ＴＣＲ活性化後１２時間にＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセット上で上方制御され(活性化の方法に応じておよそ１０〜４０)、２４時間以内に下方制御された。ペプチド／ＡＰＣ刺激に応答したＯＴ−ＩＩ ＴＣＲトランスジェニックＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣｒｔａｍ発現の動態は、抗ＣＤ３媒介性ＴＣＲ活性化と比較して、２４時間後にピークに達したが、ＣＤ４＋Ｔ細胞のサブ集団上では同様に上方制御された(データは示さない)。Ｃｒｔａｍ＋およびＣｒｔａｍ−Ｔ細胞がＣＤ６９活性化抗原を発現したので(データは示さない)、ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＣｒｔａｍが上方制御されなかったことはＴＣＲ活性化の欠如のためではなかった。
いくつかの他の証拠から、Ｃｒｔａｍの有無が２つの異なる細胞集団を特徴付けることが示唆された。第一に、Ｃｒｔａｍは、ＣＤ４＋Ｃｒｔａｍ−Ｔ細胞でなく、分類されたＣＤ４＋Ｃｒｔａｍ＋のＴＣＲ再刺激により一様に上方制御された(図１Ｂ)。第二に、分類された１４時間活性化されたＣｒｔａｍ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のＧｅｎｅＣＨＩＰおよび定量的ＴａｑＭａｎ分析により、Ｃｒｔａｍ−ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、ＩＦＮγおよびＩＬ２２のｍＲＮＡレベルが高いことが明らかとなった(図１Ｃ上方パネルおよびデータは示さない)。対照的に、ＩＬ２、ＩＬ４およびＩＬ１３のｍＲＮＡのレベルは同程度であった(図１Ｃ上方パネルおよびデータは示さない)。第三に、分類されたＣｒｔａｍ＋又はＣｒｔａｍ−のＣＤ４＋Ｔ細胞の再刺激により、Ｃｒｔａｍ＋Ｔ細胞は、再刺激したＣｒｔａｍ−Ｔ細胞より多くのＩＦＮγ及びＩＬ２２を分泌したが、ＩＬ２タンパク質はそうではなかったことが明らかとなった(図１Ｃ下パネル)。ＩＦＮγおよびＩＬ２２がＴＨ１およびＴＨ１７細胞機能と関係しているので、我々はさらに、Ｃｒｔａｍ＋およびＣｒｔａｍ−細胞がＴＨ分化条件下で異なるか否かを分析した。ＴＨ１条件下のＣＤ４＋Ｔ細胞の分化により、Ｃｒｔａｍ＋Ｔ細胞がより多くの細胞内ＩＦＮγを分泌し産生することが明らかとなった(図１Ｄおよび１Ｅ)。同様に、ＴＨ１７条件下で分化した場合に、Ｃｒｔａｍ＋Ｔ細胞は実質的により多くのＩＬ２２およびＩＬ１７を製造した(図１Ｆ)。対照的に、ＴＨ２分化条件下ではＣｒｔａｍ＋およびＣｒｔａｍ−細胞の間でＩＬ４の相違は検出されなかった(図１Ｇ)。まとめると、これらのデータは、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセット上のＣｒｔａｍ発現が、ＴＣＲ活性化に続くＩＦＮγ、ＩＬ２２およびＩＬ１７サイトカインの合成能及び分泌能の拡大と関係していることを示唆する。
【０１５８】
Ｃｒｔａｍ−／−Ｔ細胞はＩＦＮγおよびＩＬ２２産生を低減した
さらにＣｒｔａｍの生理機能を調査するために、Ｃｒｔａｍ欠陥マウスを、相同組み換えによって作製した(図９Ａ)。ジーンターゲッティングはＤＮＡレベルで確認され(図９Ｂ)、ｍＲＮＡの欠如はＲＴ−ＰＣＲによって確認され(図９Ｃ)、タンパク質の欠如は活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のウェスタンブロット分析とフローサイトメトリーによって裏付けられた(図２Ａおよび２Ｂ)。Ｃｒｔａｍ−／−マウスが予想されるメンデル比で生まれた。胸腺発達上の欠損はＣｒｔａｍ−／−マウスにおいて検出されず(図１０Ａ)、ＯＴ−ＩＩ ＴＣＲトランスジェニック胸腺細胞のポジティブ選択は正常であった(図１０Ｂ)。６週齢のＣｒｔａｍ−／−マウスからの脾臓および血液における絶対数の免疫細胞は、野生型同腹仔と同程度であった(図１０Ｃおよび１０Ｄ)。
野生型マウスから単離されたＣＤ４＋Ｃｒｔａｍ−Ｔ細胞の性質と一致して、ＴＨ１分化条件下でのナイーブＣＤ４＋Ｃｒｔａｍ−／−Ｔ細胞の分析により、ＴＣＲ活性化Ｃｒｔａｍ−／−ＴＨ１細胞におけるＩＦＮγｍＲＮＡレベルとＩＦＮγの細胞内染色の減少が明らかとなった(図２Ｃおよび２Ｄ)。さらに、ＩＦＮγの減少は、ＣＤ４＋Ｃｒｔａｍ＋／＋Ｔ細胞と比較した場合、一次及び二次の両ＴＣＲ刺激後にＩＦＮγ分泌が減少したことに裏付けられた(図２Ｅおよび図１１)。また、ＩＬ２２の減少は、ＩＬ１７ほどではないが、ＴＨ１７関与条件(ＴＧＦβおよびＩＬ６)下のＣＤ４＋Ｃｒｔａｍ−／−Ｔ細胞において観察された(図２Ｅ)。ＩＬ１７でなくＩＬ２２の少量の減少は、細胞がＩＬ２３と共にインキュベートされた場合、つまり、一次Ｔ細胞活性化の間に選択的にＩＬ２２を誘導する条件で観察された(Zheng et al., 2007)(図１２)。対照的に、ＴＨ２条件下で分化したＣｒｔａｍ−／−Ｔ細胞においてＩＬ４産生の相違は観察されなかった(図２Ｅ)。したがって、Ｃｒｔａｍの欠損により、ＩＦＮγ(ＴＨ１関連サイトカイン)並びにＩＬ２２及びＩＬ１７(ＴＨ１７関連サイトカイン)の分泌が減少した。同様に、ＴＣＲ活性化により、ＣＤ８＋Ｃｒｔａｍ−／−ナイーブ及びエフェクター／メモリー集団においてＩＦＮγ分泌が減少した(図２Ｆ)。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＩＦＮγはシトロバクター・ローデンチウム(非侵襲性の付着性かつ消失性の細菌(Eckmann, 2006；Mundy et al., 2005))に対する宿主防衛に必要であるので、我々は、Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−にＣ.ローデンチウムを経口接種し、接種後７及び１４日後の細菌負荷を分析した。Ｃｒｔａｍ−／−ＴＨ１細胞のインビトロ欠損と同様に、Ｃｒｔａｍ−／−マウスは、７日目に結腸細菌負荷に１ログより大きな増加を示し、感染後７及び１４日後に脾臓病原負荷に２ログ以下の増加を示した(図２Ｇ)。まとめると、これらのデータは、Ｃｒｔａｍ欠損はＩＦＮγ、ＩＬ２２およびＩＬ１７産生の選択的な欠損と関係しており、経口Ｃ. ローデンチウム感染に対する宿主抵抗性を損なわせることを示唆する。
【０１５９】
Ｃｒｔａｍ−／−Ｔ細胞はＴＣＲが媒介する増殖の増加を示す
ＩＦＮγ及びＩＬ２２の分泌の減少とは異なり、ＯＶＡペプチドにてパルスした放射線照射したＡＰＣにて刺激した場合、Ｃｒｔａｍ＋／＋Ｔ細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩＩ-制限ＯＴ-ＩＩ ＴＣＲを発現するナイーブＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｃｒｔａｍ−／−Ｔ細胞は、[３Ｈ]-チミジン取込の増加を示した(図３Ａ)。さらに、亢進した細胞増殖は、抗原投与後にＣＦＳＥ標識Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞の希釈の増加に裏付けられた(図３Ｂ)。ペプチド／ＡＰＣ刺激に対する応答時(図３Ｃおよび３Ｄ)及びＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が抗ＣＤ３及びＣＤ２８ ｍＡｂにより刺激を受けた場合(図１３Ａ−Ｄ)に、ＯＴ−Ｉ ＴＣＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞について同様な結果が得られた。Ｃｒｔａｍ＋およびＣｒｔａｍ−細胞の分析は、同種の結果を示した。ＴＣＲ再刺激により分類されたＣｒｔａｍ−Ｔ細胞は、分類されたＣｒｔａｍ＋Ｔ細胞と比較して、[３Ｈ]-チミジン取込みの増加とＣＦＳＥ希釈の増加を示した(図１３Ｅおよび１３Ｆ)。Ｃｒｔａｍ＋とＣｒｔａｍ−Ｔ細胞との増殖の相違が外的因子、例えばＩＦＮγの間接的な抗増殖効果(Gajewski and Fitch, 1988)によるものではなかったことを確認するために、ＣＦＳＥ標識のＣＤ４５.２＋Ｃｒｔａｍ＋とＣＤ４５.２−Ｃｒｔａｍ−Ｔ細胞を混合して、抗ＣＤ３およびＣＤ２８ ｍＡｂにより共に活性化した。同時にインキュベートしたにもかかわらず、Ｃｒｔａｍ−Ｔ細胞は依然として、Ｃｒｔａｍ＋Ｔ細胞より早く増殖し、Ｃｒｔａｍ＋Ｔ細胞より少ないＩＦＮγを合成した(図１３Ｆおよび１３Ｇ)。したがって、Ｃｒｔａｍ＋とＣｒｔａｍ−Ｔ細胞との増殖の相違は、Ｃｒｔａｍの直接的な内因性の機能によるものであった。 
また、適合形質移入ＣＦＳＥ標識Ｃｒｔａｍ−／−ＯＴ−ＩＩＴＣＲ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が、Ｃｒｔａｍ＋／＋ＯＴ−ＩＩ ＴＣＲ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、ＯＶＡ免疫化に応答して細胞分裂の増加を示したので、インビトロ過剰増殖はインビボでも観察された(図３Ｅ)。次に、成長したＣｒｔａｍ−／−マウスは、その野生型同腹仔と比較して、Ｂ細胞でなく、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を周辺リンパ節および血液に集積した(図３Ｆ)。まとめると、これらのデータは、Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞がＴＣＲ活性化に応答して循環および増殖を増やしたことを示す。
【０１６０】
ＣｒｔａｍはＴ細胞極性の後期を制御する
Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−Ｔ細胞のＴＣＲ媒介性シグナル伝達経路の生化学的分析により、Ｃｒｔａｍの喪失は、Ｃｒｔａｍが発現されない間はＴ細胞活性化の最初の段階のシグナル伝達過程に影響しなかったが、おそらくＴＣＲ結合後６〜１８時間以内に上方制御を有する細胞性工程に影響したことが明らかとなった(データは示さない)。Ｔ細胞活性化の後期の間にあるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の分析により、Ｃｒｔａｍ、タリンおよびＣＤ３が、Ｔ細胞活性化の１４時間後に同時に存在し、ＣＤ４４に対して非対称的に極性化していたことが明らかとなった(図４Ａ、パネル４−６；図４Ｂ、パネル３−４；図４Ｃ、パネル４−６)。ＣＤ３／タリンおよびＣＤ４４のこの非対称性極性化はＣｒｔａｍによるものであった。Ｃｒｔａｍ−／−Ｔ細胞では、ＣＤ３、タリンおよびＣＤ４４は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂの同時架橋の１４時間後に複数の非極性化限局性集合物として検出された(図４Ａ、パネル１１、図４Ｂ、パネル７および図４Ｃ、パネル１１)。１条件につき２００より多くの量の細胞は、Ｔ細胞活性化の後期の間にＣｒｔａｍ−／−Ｔ細胞が効率的にタリン、ＣＤ４４及びＣＤ３を極性化することができないことを示した(図４Ｄ)。さらに、２次元のスラット画像の再構成による三次元モデルの構築により、ＴＣＲ活性化後のＣｒｔａｍ＋／＋Ｔ細胞におけるＣｒｔａｍ／タリンの限局性同時局在(図４Ｅ、パネル３)とＣＤ４４の非対称性極性化(パネル４)、並びにＴＣＲ活性化後のＣｒｔａｍ−／−Ｔ細胞におけるタリン(パネル５)とＣＤ４４(パネル６)の非対称性極性化の喪失が確認された。ＯＶＡペプチドパルスＡＰＣを用いた活性化の１４時間後のナイーブＯＴ−ＩＩ ＴＣＲ＋Ｃｒｔａｍ−／−Ｔ細胞において、タリン(図４Ｆ、パネル４)、ＣＤ４４(パネル５)およびＣＤ３(パネル６)の極性化が同様に欠損していたことが観察できた(図４Ｇ)。共焦点電子顕微鏡法及びＦＡＣＳベースのコンジュゲートアッセイによって評価したところ、このＴ細胞活性化の後期に観察された欠損とは異なり、ＯＴ−ＩＩ ＴＣＲ＋ＣＤ４＋Ｃｒｔａｍ−／−Ｔ細胞は、ＯＶＡ抗原パルスＤＣと初めの３０分以内に相互作用することができた(図４Ｈおよび４Ｉ)。したがって、ＴＣＲ活性化の６〜１２時間後の間の上方制御の動態と一致して、Ｃｒｔａｍは、Ｔ細胞：ＡＰＣコンジュゲート形成、アクチン重合、微小管形成中心(ＭＴＯＣ)の再編成又は早期ＴＣＲ媒介性シグナル伝達の最初の段階の間での役割はないが、Ｔ細胞活性化の後期のＴ細胞極性を定着させるために必要である。
【０１６１】
ＣｒｔａｍはＳｃｒｉｂ含有複合体を集積して、後期Ｔ細胞極性およびサイトカイン産生を制御する
ヒトＳｃｒｉｂのＰＤＺドメインの研究により、保存されたＣ末端認識モチーフ([Ｄ／Ｅ][Ｔ／Ｓ]Ｘ[ＬＩＶ]ＣＯＯＨ)が明らかとなった。このモチーフは、Ｓｃｒｉｂと相互作用しうるＣｒｔａｍ(ＥＳＩＶＣＯＯＨ)を含む多くの多様なタンパク質にみられる(Tonikian et al., 2007)。ＣｒｔａｍがＴ細胞形態を制御するメカニズム(一又は複数)を定めるために、我々は、静止及び活性化Ｔ細胞のＣｒｔａｍと共免疫沈降するＳｃｒｉｂおよびＤｌｇ１の能力を分析した(図５Ａ)。Ｃｒｔａｍは、Ｄｌｇ１でなくＳｃｒｉｂにおいて検出され、ＴＣＲ活性化の１４時間後に免疫沈降した。Ｓｃｒｉｂ内の第３のＰＤＺドメインがＣｒｔａｍとの相互作用に十分であったのでこの相互作用は直接的であった(図１４Ａ)。共焦点電子顕微鏡法により、ＳｃｒｉｂがこのＴＣＲ活性化の後期の間にＣｒｔａｍ及びＣＤ３と共に局在していたことが明らかとなった(図５Ｂ、パネル１−３およびデータは示さない)。ＳｃｒｉｂがＣｄｃ４２ ＧＴＰａｓｅ／β-ＰＩＸグアニンヌクレオチド交換因子依存的な経路により星状細胞の極性化を制御するので(Audebert et al., 2004；Osmani et al., 2006)、我々は、Ｃｒｔａｍ／ＳｃｒｉｂがＣｄｃ４２およびＰＫＣζ局在化を制御するか否かを分析した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＴＣＲ活性化により、Ｃｒｔａｍ、Ｓｃｒｉｂ、Ｃｄｃ４２およびＰＫＣζの極性化された共局在が生じた(図５Ｂ−Ｄ、パネル１−３)。逆に、Ｃｒｔａｍが欠如すると、ＳｃｒｉｂおよびＣｄｃ４２の極性化と共局在が欠如した(図５Ｂ−Ｄは、パネル４−６)。まとめると、我々の研究は、Ｔ細胞極性の早期及び後期を制御した異なるシグナル伝達機構の存在を示唆した。
類似又は異なる分子複合体がＴ細胞極性の早期及び後期の調節に関与しているか否かを決定するために、我々は、ＣＤ３、タリンおよびＣＤ４４の局在化を分析し、ＯＶＡ３２３−３３９パルスＡＰＣを提示した場合、ＯＴＩＩ ＴＣＲ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用して、Ｔ細胞活性化の初期に関与する分子(ＰＫＣθ)とＣｒｔａｍ／ＰＫＣζ複合体の細胞内局在化を比較した(図５Ｅ)。ＣＤ３、タリンおよびＣＤ４４がＴ細胞活性化後の１２時間の間ずっとキャップド(capped)構造を維持しているのに対して(図５Ｅ、初めの３列)、シグナル伝達タンパク質の異なるモジュールはＴＣＲ結合後の初期(＜２時間)及び後期(＞６時間)の間、ＣＤ３と共に局在していた。以前の報告と一致して、ＰＫＣθはＣＤ３と共に素早く局在するが(パネル２５、３２および３９)(Monks et al., 1997)、Ｔ細胞活性化の４時間後までに消失した(パネル４６)。比較すると、ＰＫＣζはＴ細胞活性化の初めの４時間以内にＣＤ３と共に局在していなかったのに対して(パネル１２、１９、２６、３３、４０および４７)、Ｃｒｔａｍが現れるとＴ細胞活性化の８時間後にＣｒｔａｍと共にＰＫＣζが局在した(パネル５４)。したがって、シグナル伝達タンパク質の異なるモジュールは、Ｔ細胞活性化の初期及び後期の間に、ＣＤ３およびタリンと共に局在している。
【０１６２】
後期Ｔ細胞局性におけるＣｒｔａｍ：Ｓｃｒｉｂ相互作用の必要性とＩＦＮγ／ＩＬ２２産生
Ｓｃｒｉｂ極性化および亢進した細胞増殖においてＣｒｔａｍに必要な構造上の基準を定めるために、我々は、Ｃｒｔａｍ、細胞内ドメイン全体を欠く(ΔＩＣＤ)Ｃｒｔａｍ又はＳｃｒｉｂとの相互作用に必要なＣ末端の４つのアミノ酸を欠く(ΔＥＳＩＶ)Ｃｒｔａｍのレトロウイルス伝達を、Ｃｒｔａｍ−／−又はＯＴ−ＩＩ ＴＣＲ＋ＣＤ４＋Ｃｒｔａｍ−／−Ｔ細胞において用いた(図６Ａ)。ＣｒｔａｍがＣｒｔａｍ−／−Ｔ細胞に観察された増殖の亢進を逆転させたのに対して、タンパク質再構築のレベルが同程度であるにもかかわらず、Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)もＣｒｔａｍ(ΔＥＳＩＶ)も過剰増殖の表現型を逆転させなかった(図６Ｂ、図１４Ｂおよび１５)。これらのデータはショウジョウバエおよび上皮細胞のＳｃｒｉｂの喪失によって観察される増加した細胞性増殖と一致している(Bilder et al., 2000；Nagasaka et al., 2006)。増殖表現型と同様に、完全長ＣｒｔａｍのみがＩＦＮ産生、ＩＬ２２産生およびタリン極性化を回復させた(図６Ｃおよび６Ｄ)。Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)もＣｒｔａｍ(ΔＥＳＩＶ)も、サイトカイン欠損又はタリン極性化を回復させなかった。さらに、Ｃｒｔａｍ、Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)又はＣｒｔａｍ(ΔＥＳＩＶ)の発現はＩＬ４産生に対して影響を及ぼさなかった。ゆえに、Ｔ細胞活性化後のＣｒｔａｍの上方制御は、Ｓｃｒｉｂとの相互作用によりＴ細胞極性を調節し、次に、細胞増殖および選択的なサイトカイン産生を制御する。
Ｃｒｔａｍ単独の発現がＩＦＮおよびＩＬ２２分泌に十分であったか否かを決定するために、我々は、野生型マウスのナイーブＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｃｒｔａｍ−Ｔ細胞を分類して、レトロウイルス的にＣｒｔａｍ、Ｃｒｔａｍ(ΔＥＳＩＶ)又はコントロールベクターを伝達した。野生型マウスの分類されたＣｒｔａｍ−Ｔ細胞における野生型Ｃｒｔａｍの発現は、ＩＬ４でなくＩＦＮγおよびＩＬ２２の産生を、分類されたＣｒｔａｍ＋Ｔ細胞にみられるのと同程度のレベルにするのに十分であった(図６Ｅ)。Ｃｒｔａｍ(ΔＥＳＩＶ)がＩＦＮγ又はＩＬ２２を産生させることができなかったので、この機能の獲得はＳｃｒｉｂと相互作用するＣｒｔａｍの能力によるものであった。ＩＦＮγおよびＩＬ２２産生の獲得と一致して、分類されたＣｒｔａｍ−Ｔ細胞において野生型Ｃｒｔａｍが発現されると、Ｓｃｒｉｂとの相互作用を必要とする作用であるタリンの極性化が生じた(図６Ｆ)(パネル４)。したがって、Ｃｒｔａｍの発現は、野生型マウスから単離されたＣｒｔａｍ−Ｔ細胞を誘導して細胞増殖を制御し、細胞極性を定着させ、特にＩＦＮγおよびＩＬ２２産生を誘導しうる。
さらに、Ｃｒｔａｍ機能におけるＳｃｒｉｂの重要性を証明するために、我々は、Ｓｃｒｉｂ ｓｉＲＮＡをＣ５７／ＢＬ６マウスのＦＡＣＳ分類されたＣｒｔａｍ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に導入した。Ｓｃｒｉｂタンパク質の減少はウェスタンブロッティングにて確認した(図７Ａ)。Ｓｃｒｉｂタンパク質のノックダウンにより、ＴＣＲ活性化の８時間後にタリン極性化が消失し(図７Ｂ)、ＴＣＲ活性化後にＩＬ４でなくＩＦＮγおよびＩＬ２２の産生が阻害された(図７Ｃ)。最後に、Ｃｒｔａｍ-Ｓｃｒｉｂ相互作用の重要性を証明するために、我々は、天然のＩＣＤを欠くＣｒｔａｍの細胞外ドメインと膜貫通ドメインからなり、Ｓｃｒｉｂからなる細胞質ドメインに融合させた、Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂと称するキメラレセプターを発現させた。Ｃｒｔａｍ−／−Ｔ細胞におけるＣｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂの発現は、ウエスタンブロット分析(図７Ｄ)およびＦＡＣＳ染色(図７Ｅ)にて確認した。Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂの発現は、タリン極性化を回復させ(図７Ｆ、パネル５)、ＩＬ４でなくＩＦＮγ及びＩＬ２２の産生を選択的に増加させた(図７Ｇ)。まとめると、これらの結果により、Ｃｒｔａｍ：Ｓｃｒｉｂ相互作用がＴ細胞細胞骨格極性および選択的サイトカイン産生の後期を制御することの重要性が浮き彫りとなった。
【０１６３】
Ｃｒｔａｍの細胞外ドメインはサイトカイン産生を制御する
また、ＳｃｒｉｂのＣｒｔａｍのＩＣＤとの相互作用がＣｒｔａｍ機能に重要であったのに対して、我々はＣｒｔａｍの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)の貢献を評価した。Ｃｒｔａｍは細胞接着分子(Ｃａｄｍ１、別名Ｎｅｃｌ２)を結合し、次に、ホモタイプ相互作用により自身を、そしてヘテロタイプ相互作用によりＣａｄｍ３／Ｎｅｃｌ１を結合しうる(Galibert et al., 2005；Shingai et al., 2003)。Ｃｒｔａｍとは異なり、Ｃａｄｍ１は静止ナイーブＴ細胞上に低レベルで発現され、その発現はＴＣＲ活性化の１４時間後にさらに下方制御された(データは示さない)。さらに、共焦点電子顕微鏡法により、Ｃａｄｍ１は静止及び活性化Ｔ細胞上に広く分配されていたが、ＴＣＲ活性化の１４時間後にはタリンともＣｒｔａｍとも局在していなかったことが明らかとなった(図１６Ａ)。ＣｒｔａｍのＥＣＤの貢献を評価するために、我々は、ＥＣＤを欠いているが、Ｃｒｔａｍの膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインをコードする(ａａ２５１−３９３)ＣｒｔａｍのＦＬＡＧ-エピトープタグ付加変異体を発現させた(図１６Ｂ)。ＥＣＤを欠いているにもかかわらず、Ｃｒｔａｍ−／−Ｔ細胞でのＣｒｔａｍ(ΔＥＣＤ)の発現は、ＴＣＲ活性化の８時間後にＣＤ３、タリン、Ｓｃｒｉｂ、Ｃｄｃ４２およびＰＫＣζとの極性能を維持していた(図１６Ｃ、パネル１６−２０)。さらに、Ｃｒｔａｍ(ΔＥＣＤ)は、Ｃｒｔａｍ−／−Ｔ細胞において観察されるＴＣＲ媒介性の過剰増殖の表現型を部分的に逆転させた(図１６Ｄ)。驚くべきことに、Ｃｒｔａｍ(ΔＥＣＤ)の発現は、ＩＦＮγ又はＩＬ２２の産生を完全に回復させることができなかった(図１６Ｅ)。したがって、ＣｒｔａｍのＥＣＤは、正常な細胞分裂の制御およびＴ細胞極性の後期の設立に重要ではないが、ＩＦＮγ又はＩＬ２２の産生に関与するようであった。
さらに、サイトカイン産生におけるＣｒｔａｍのＥＣＤの貢献を調べるために、Ｃｒｔａｍ＋／＋ナイーブＴ細胞を、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合したＣａｄｍ１のＥＣＤ(ａａ１−３７４)をコードするＣａｄｍ１(ＥＣＤ)-Ｆｃ融合タンパク質の有無の下で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂにて活性化させた(図１６Ｆ)。Ｃａｄｍ１(ＥＣＤ)-Ｆｃを同時インキュベートすると、ＴＣＲ活性化Ｃｒｔａｍ＋／＋Ｔ細胞においてＩＬ２ではなくＩＦＮγおよびＩＬ２２の産生が増大した。対照的に、Ｃａｄｍ１(ＥＣＤ)-Ｆｃは、Ｃｒｔａｍ−／−Ｔ細胞上のサイトカイン産生に対して影響を及ぼさなかった。Ｃａｄｍ１およびＣａｄｍ３の発現はＣｒｔａｍ−／−Ｔ細胞では影響がなかったので(データは示さない)、Ｃｒｔａｍ＋／＋Ｔ細胞におけるＣａｄｍ１(ＥＣＤ)-ＦｃによるＩＦＮγ及びＩＬ２２産生の増大はおそらくＣａｄｍ１：Ｃｒｔａｍ相互作用によって媒介されるのであろう。まとめると、これらのデータは、ＩＦＮγおよびＩＬ２２産生の選択的な調節におけるＣｒｔａｍのＥＣＤへのＣａｄｍ１のリガンド結合による機能的貢献と、細胞の極性の定着及び細胞分裂の制御の際のＣｒｔａｍの膜貫通ドメインおよびＩＣドメインの貢献を特徴付けるものである。
【０１６４】
活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＣｒｔａｍが均一に上方制御される
細胞極性の設立は、非対称性細胞分裂、細胞移動、器官発達および組織形態形成において必要である。活性化されたＣＤ８＋細胞障害性リンパ球(ＣＴＬ)は、細胞溶解プログラム及び炎症誘発性サイトカインの分泌による細胞内病原体のクリアランス及び腫瘍根絶において重要な役割を果たす。抗原とのナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞との遭遇により、細胞増殖及び細胞障害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)への分化に必要な細胞性タンパク質の組織化された時空間再編成と関係しているＴ細胞抗原レセプター(ＴＣＲ)活性化が開始される。後述するように、我々はここで、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化によりＣｒｔａｍ(クラスＩ制限Ｔ細胞関連分子)が上方制御され、抗リステリア免疫に重要なＴ細胞極性の後期を維持するＳｃｒｉｂｂｌｅ含有シグナル伝達複合体を編成することを示す。
ＣＤ４＋Ｔ細胞のように、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＴＣＲ接触部位で免疫学的シナプス(ＩＳ)を組織し、そして、末梢ＳＭＡＣ(ｐＳＭＡＣ)に属するタリンとＣＤ１１ａを含有する接着リングから空間的に切り離される中枢の超分子活性化複合体(ｃＳＭＡＣ)内のＣＤ３ζ、Ｌｃｋ及びＰＫＣθを分離する。標的細胞を認識すると、標的細胞に対して微小管形成中心(ＭＴＯＣ)およびゴルジ体の迅速な極性化が起こる。ＭＴＯＣ再配向により微小管に沿って接触部位への溶解顆粒の移動が促され、シグナル伝達分子パッチと接着リングとの間の特定の部位への、パーフォリン及びグランザイムＢなどのリソソーム内容物の放出が集中する。標的細胞のサイトゾルに格納されたエフェクターメディエータが取り込まれると、カスパーゼ依存性経路によって最終的に標的細胞死が生じる。したがって、細胞溶解反応は、ＣＤ８＋Ｔ細胞における細胞タンパク質の適切な時空間的再編成を必要とする。
上記のように、我々は、ＩＦＮγ、ＩＬ１７およびＩＬ２２の産生を選択的に増やすためにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットにおけるＴ細胞極性を維持する際のＣｒｔａｍの重要な役割を示した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞とは異なり、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞はＴ細胞抗原レセプター活性化後にＣｒｔａｍを均一に上方制御する。ＲＴ−ＰＣＲおよびＦＡＣＳ分析にて測定されたように(図１７Ａ)、ＣｒｔａｍはナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞において発現されなかったのに対して、プレートに結合した抗ＣＤ３／２８ ｍＡｂとの共架橋により２時間以内にＣｒｔａｍが上方制御され、６〜１２時間でピークに達し、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞では７２時間までに消失した(図１７Ａ)。ＯＴ−１ ＴＣＲトランスジェニックマウスの左の足蹠にオバルブミン抗原を投与したところ、右の膝窩リンパ節ではなく、左から単離したＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣｒｔａｍが同様に上方制御された(図１７Ｂ)。Ｃｒｔａｍの最大の上方制御が３６時間までに達成され９６時間までに消失したのに対して、ＣＤ６９の最大の上方制御が４８時間に達成され９６時間の時点でも維持されたので、Ｃｒｔａｍの上方制御のインビボ動態は、ＣＤ６９とは異なっていた(図１８)。したがって、ＣｒｔａｍはナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞上の初期活性化抗原である。
我々は、ナイーブおよびエフェクター／メモリーＣＤ８＋Ｃｒｔａｍ−／−Ｔ細胞がＩＦＮγ産生を低減したことを示したが、これらの細胞はまた、抗ＣＤ３／２８ ｍＡｂ又はＯＶＡパルスＡＰＣとのＴＣＲ結合後にＴＮＦα及びＩＬ２２の産生の減少を示した(図１７Ｃおよび１９)。また、Ｃｒｔａｍ＋／＋ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較すると、ＴＣＲ活性化Ｃｒｔａｍ−／−においてＩＦＮγおよびＴＮＦαのｍＲＮＡレベルが減少していたので、調節は転写レベルにあった(データは示さない)。対照的に、ＩＬ２産生の相違は、Ｃｒｔａｍ＋／＋とＣｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞との間で検出されなかった。また、標的細胞の細胞溶解はＣＤ８＋Ｔ細胞の重要なエフェクター機能を表すので、我々は、Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−のＣＤ８＋芽細胞のグランザイムＢ分泌能、ＣＤ１０７の上方制御で測定される脱顆粒、ＦａｓＬの上方制御、及びペプチドロードしたＥＬ４標的細胞を殺す能力を分析した。各々のこれらの細胞溶解パラメータにおいて、または、Ｃｒｔａｍ＋／＋とＣｒｔａｍ−／−のＣＤ８＋芽細胞との間のＴＣＲ発現において、相違は観察されなかった(図１７Ｄ−Ｆおよび２０)。まとめると、これらのデータは、Ｃｒｔａｍが細胞溶解機能でなく、最適なＩＮＦγ、ＴＮＦおよびＩＬ２２の転写と分泌に必要なことを示す。
【０１６５】
ＣｒｔａｍはＳｃｒｉｂによる選択的サイトカイン産生とＴ細胞極性の後期を維持する
ＣｒｔａｍはＳｃｒｉｂ、Ｃｄｃ４２およびＰＫＣζからなるシグナル伝達複合体を調整して、ＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットにおけるＩＦＮγ、ＩＬ１７およびＩＬ２２の産生を制御するので、我々は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のこのような複合体の集積能を分析した。活性化されたＣｒｔａｍ＋／＋ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＳｃｒｉｂの免疫沈降から、Ｃｒｔａｍ、Ｃｄｃ４２およびＰＫＣζも含有する複合体が明らかとなった。ＳｃｒｉｂとのＣｒｔａｍ、Ｃｄｃ４２およびＰＫＣζの共沈は、活性化されたＣｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞では検出されなかった(図２１Ａ)。この生化学的関係は、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の共焦点顕微鏡的研究によりさらに裏付けられた。Ｃｒｔａｍは、ＯＶＡ／ＡＰＣによる活性化の１６時間後にＣＤ８＋Ｔ細胞においてＳｃｒｉｂ、ＰＫＣζおよびタリンと共に局在化した(図２１Ｂ、パネル７−９、１３−１５、１９−２１)。加えて、ＣｒｔａｍはＣＤ３とも共に局在化し、ペリセントリン染色によって決定されるように、両者は微小管形成中心面に方向付けられていた(図２１Ｂ、パネル１−３、図２１Ｃおよび図２２、パネル１−３)。また、活性化Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＣｒｔａｍ、Ｃｄｃ４２およびＰＫＣζがＳｃｒｉｂと共免疫沈降できなかったことは、レセプター活性化の１６時間後のペリセントリンのランダムな分配、並びにＳｃｒｉｂ、ＰＫＣζおよびＣＤ３の極性化の欠如に裏付けられた(図２１Ｂ、パネル４−６、１０−１２、１６−１８、２２−２４、図２１Ｃおよび図２２、パネル４−６)。プレートに結合した抗ＣＤ３／２８ ｍＡｂによって活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞についても同様なデータが得られた(図２２Ａ−Ｂ)。活性化の１４＋時間後に観察されたこれらの相違とは異なり、Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＭＴＯＣ再配向と、ＣＤ３及びＰＫＣζのＴ細胞極性化の初期は、ＴＣＲ結合の３０分後に乱されなかった(図２３Ａ)。加えて、Ｃｒｔａｍの欠如は、初期の活性化抗原−ＣＤ２５およびＣＤ６９の上方制御に影響しなかった(図２３Ｂ)。
ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ２２を選択的に上方制御するＣｒｔａｍの能力並びにＴ細胞極性を維持するＣｒｔａｍの能力は、Ｓｃｒｉｂとの相互作用能を必要とした。変異体Ｃｒｔａｍ[Ｃ末端ＰＤＺ結合ＥＳＩＶモチーフを欠き、Ｓｃｒｉｂと相互作用することができないＣｒｔａｍ(ΔＥＳＩＶ)と称される]の発現は、選択的なＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ２２の産生を回復させることができず、更に、Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＴ細胞極性を維持させることができなかった(図２１Ｄ−Ｅ)。
【０１６６】
ＳｃｒｉｂおよびＰＫＣζはＴ細胞極性の後期を維持するために必要とされ、次に、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ２２の調節に必要とされる
選択的サイトカイン調節及び細胞極性の維持にもＳｃｒｉｂの存在を必要とした。Ｓｃｒｉｂ ｓｉＲＮＡによるＣＤ８＋Ｔ細胞のＳｃｒｉｂタンパク質のノックダウンにより、Ｓｃｒｉｂ発現が有意に減少した(図２４Ａ)。Ｃｒｔａｍ、ＳｃｒｉｂおよびタリンはコントロールｓｉＲＮＡにて形質移入された活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞において共に局在するのに対して(図２４Ｂ、パネル１および３、図２４Ｃ、パネル１および図２５Ａ)、タリン、ＣｒｔａｍおよびＳｃｒｉｂはＳｃｒｉｂ ｓｉＲＮＡにて形質移入された細胞に広く分配されていた(図２４Ｂ、パネル２および４、図２４Ｃ、パネル２および図２５Ａ)。Ｓｃｒｉｂ発現が低減していたＴＣＲ活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞もまた、ＩＬ２レベルに影響することなく、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ２２の産生を選択的に少なくした(図２４Ｄ)。
また、同様な条件がＰＫＣζについても観察された。ＰＫＣζ ｓｉＲＮＡによるＣＤ８＋Ｔ細胞のＰＫＣζタンパク質のノックダウンによりＰＫＣζ発現が有意に減少し(図２４Ｅ)、これと関連して、Ｃｒｔａｍ、Ｓｃｒｉｂおよびタリンの共局在の欠失(図２４Ｂ、パネル３、図２４Ｆおよび図２５Ｂ)と、ＩＦＮγ、ＴＮＦおよびＩＬ２２の産生の選択的な減少が生じた(図２４Ｇ)。逆にいえば、ＴＣＲ活性化及びＣＤ２５又はＣＤ６９の３０分後にＣＤ３及びＰＫＣθの極性化が検出されたように、Ｓｃｒｉｂ又はＰＫＣζのノックダウンは初期Ｔ細胞極性に影響しなった(図２６ＡおよびＢ)。したがって、Ｃｒｔａｍ複合体−ＳｃｒｉｂおよびＰＫＣζに関与する特定のシグナル伝達タンパク質の各々は、Ｔ細胞極性の後期および選択的なサイトカイン産生を維持するために機能的に必要である。
Ｓｃｒｉｂ及び細胞極性を選択的なサイトカイン産生と関連づけするために、我々は、Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞において、単にＳｃｒｉｂからなる細胞質ドメインを有するキメラレセプターを発現させた(図２４Ｈおよび図２７)。Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＣｒｔａｍ(ＤＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂが発現すると、タリンとキメラレセプターとの共局在及び極性化と、更にはＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ２２産生の選択的増大が生じる(図２４Ｉ−Ｊ)。したがって、細胞極性の維持とＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生との間には直接的な関連が存在する。
【０１６７】
Ｃｒｔａｍが媒介するＣＤ８Ｔ細胞応答はリステリア・モノサイトゲネス感染の間の宿主耐性に必要である
Ｃｒｔａｍは複数の細胞系統(ＣＤ４＋Ｔのサブセット、ナチュラルキラー及びＮＫＴ細胞を含む)に発現されるので、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣｒｔａｍによる細胞極性の維持の生物学的重要性を決定するために、ｒａｇ２−／−マウスにＣｒｔａｍ＋／＋又はＣｒｔａｍ−／−のＣＤ８＋Ｔ細胞を形質移入し、細胞内Ｇｒａｍ陽性細菌であるリステリア・モノサイトゲネスに対する免疫性について分析した。Ｃｒｔａｍ＋／＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を投与したすべてのマウスは、２．５×１０５ＣＦＵのＬ.モノサイトゲネス(ＡＴＣＣ株４３２５１)の急性感染を生き延びた(図２８Ａおよび２９)。対照的に、Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞を投与したマウスの８０％は、Ｔ細胞再生にもかかわらずＬ.モノサイトゲネス感染のため死亡した。Ｃｒｔａｍ＋／＋Ｔ細胞を再生した非感染マウスと比較して、Ｃｒｔａｍ＋／＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を再生した感染マウスの脾臓が肥大していたのに対して、Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞を再生した感染マウスの脾臓は複数の壊死点を示した(図２８Ｂ)。同様に、Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞を再生した脾臓の細菌負荷は、Ｃｒｔａｍ＋／＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を再生したマウスから単離された脾臓よりおよそ１０１０高かった(図２８Ｃ)。Ｃｒｔａｍ＋／＋およびＣｒｔａｍ−／−のＣＤ８＋Ｔ細胞の再生の程度は、適切に形質移入したマウスの血液及び脾臓の両方に匹敵した(図２９ＡおよびＢ)。Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞を再生したマウスの血清ＩＦＮγおよびＴＮＦαのレベルは、Ｃｒｔａｍ＋／＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を再生したマウスより実質的に少なく、感染させたｒａｇ２−／−マウスのレベルと同程度であった(図２８Ｄ)。また、感染させたＣｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞再生マウスから単離された脾細胞の想起応答は、ＩＬ２ではなく、ＩＮＦγ、ＴＮＦαおよびＩＬ２２の分泌レベルを、Ｃｒｔａｍ＋／＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を再生したマウスより少なくした(図２８Ｅ)。最後に、Ｃｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞芽細胞の正常なインビトロＣＴＬ活性と一致して、感染５日目のマウスから単離されたＣｒｔａｍ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞も、Ｌ.モノサイトゲネス感染ＩＣ−２１標的細胞に対して正常なグランザイムＢ分泌を示した(図２８Ｆ)。したがって、Ｃｒｔａｍは、Ｌ.モノサイトゲネスに対する防御ＣＤ８＋Ｔ細胞性免疫に必要である。
【０１６８】
考察
細胞活性化後の初めの数時間の間のＴ細胞細胞骨格の再編成は、細胞性極性、ＭＴＯＣ再編成、二次メッセンジャーの効率的で維持された生成およびその後のＴ細胞エフェクター機能の設立に重要である。細胞骨格再構成の初期が、Ｔ細胞活性化の初めの１時間以内に、ＰＫＣ、Ｖａｖ１／Ｖａｖ、Ｗａｓ／Ｗａｓｐ、Ｗａｓｆ２／ＷＡＶＥ２及びＨｃｌｓ１／ＨＳ１のＩＳへの動員を伴うのに対して(Fischer et al., 1998；Gomez et al., 2006；Holsinger et al., 1998；Monks et al., 1997；Nolz et al., 2006；Zhang et al., 1999；Zipfel et al., 2006)、ここでの我々の研究により、Ｃｒｔａｍ、Ｓｃｒｉｂ、ＰＫＣζ及びＣｄｃ４２が関与する、Ｔ細胞活性化後のおよそ６時間以降のＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットにおける細胞極性の後期以降が重要であることが明らかとなった。さらに、我々の研究は、ＣｒｔａｍがＣ末端モチーフを介してＳｃｒｉｂを結合し、次に、ＰＫＣζおよびＣｄｃ42が関与する複合体を構成することを示す。Ｃｒｔａｍ-Ｓｃｒｉｂ相互作用は、この分子複合体のアセンブル、及びＴ細胞活性化の初期を越えたＴ細胞極性の維持のために必要である。Ｃｒｔａｍ−及びｃｒｔａｍ−／−Ｔ細胞は、Ｔ細胞：ＡＰＣコンジュゲートの形成、Ｆアクチン形成、ＭＴＯＣ再構成、並びにＣｒｔａｍ＋又はＣｒｔａｍ＋／＋Ｔ細胞と区別がつかないＣＤ３、タリン、ＣＤ４４およびＰＫＣθの分離及び極性化を有する、細胞骨格再構成の正常な初期を構築する。しかしながら、Ｃｒｔａｍ−Ｓｃｒｉｂ相互作用がない場合、Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化の開始後６時間以降にＣＤ３、タリン及びＣＤ４４の極性化及び分離を維持することができない。したがって、異なるシグナル伝達機構がＴ細胞極性の開始と維持に関与する。
ＣｒｔａｍによるＴ細胞極性の維持の延長は、ＩＬ４又はＩＬ２でなく、ＩＬ１７ほどではなくＩＦＮγ及びＩＬ２２のＴＣＲ媒介産生及び細胞増殖の正常な制御と非常に関連している。後期Ｔ細胞極性を構築することができないＣｒｔａｍ変異体を発現しているＴ細胞又は分類されたＣｒｔａｍ−Ｔ細胞は、増殖率の増加を示し、Ｃｒｔａｍ＋Ｔ細胞よりＩＦＮγおよびＩＬ２２の分泌が少ない。Ｃｒｔａｍ−およびＣｒｔａｍ−／−Ｔ細胞それぞれと比較して、Ｃｒｔａｍ＋およびＣｒｔａｍ＋／＋細胞においてＩＦＮγ及びＩＬ２２のｍＲＮＡが増大しているので、ＩＦＮγ及びＩＬ２２に対するＣｒｔａｍによる選択的誘導は、少なくともこれら遺伝子の転写活性化に関連するようである。我々はＩＬ４及びＩＬ２を含むサイトカインの分泌に対するＣｒｔａｍの作用を観察しなかったが、ＩＬ４及びＩＬ２の調節について記載されているように(Huse et al., 2006; Mohrs et al., 2005)、転写後、翻訳後又は分泌経路に対するＣｒｔａｍによる更なる作用は排除できない。
【０１６９】
Ｃｒｔａｍは、タンパク質-タンパク質相互作用を制御するための足場タンパク質として役立つタンパク質のＳｃｒｉｂｂｌｅファミリー(Ｓｃｒｉｂｂｌｅ、ＤｌｇおよびＬｇｌ)のメンバーである、Ｓｃｒｉｂと直接相互作用する(Humbert et al., 2006)。ショウジョウバエおよび上皮細胞では、これらの遺伝子が欠失すると、尖端タンパク質および接着ジャンクションの誤った局在、細胞増殖の亢進、分化能の低下及び細胞の形質転換に対する閾値の低下が生じる。ショウジョウバエにおけるＳｃｒｉｂの構造-機能分析から、原形質膜へのＳｃｒｉｂの局在の際のＬＲＲドメインの重要な役割が示されたが、そのＰＤＺドメインは有隔ジャンクションでのまだ同定されていないタンパク質との相互作用を媒介する(Zeitler et al., 2004)。さらに、Ｓｃｒｉｂの変異分析により、上皮の極性および細胞増殖の制御が密接に関連しているようである。我々の研究は、後期Ｔ細胞極性のための同種の調節経路、細胞増殖の制御と、ＣｒｔａｍおよびＳｃｒｉｂによるＩＦＮγおよびＩＬ２２の産生を示す。ＣｒｔａｍのＣ末端でのＳｃｒｉｂ相互作用部位の突然変異は、ＩＬ４に対して明白な作用を及ぼすことなく、ＩＦＮγおよびＩＬ２２の産生に対して選択的な作用を有する。さらに、ｓｉＲＮＡを用いてＳｃｒｉｂをノックダウンすると、ＴＣＲ活性化の８時間後にＴ細胞はタリンを極性化することができず、ＩＬ４でなく、ＩＦＮγ及びＩＬ２２の産生を低減する。最後に、Ｃｒｔａｍ-Ｓｃｒｉｂ相互作用の重要性は、Ｃｒｔａｍ(ΔＩＣＤ)：Ｓｃｒｉｂキメラが有するタリン極性化回復能とＩＦＮγ及びＩＬ２２の産生の選択的増大能により明確に示される。したがって、Ｔ細胞極性の後期の維持および選択的なサイトカイン産生に対するＣｒｔａｍの機能的作用は、Ｓｃｒｉｂとの結合にひどく依存する。Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ調節βＰＩＸ−ＧＩＴ複合体を含む様々なエフェクタータンパク質と相互作用するＳｃｒｉｂ複合体の能力(Audebert et al., 2004)により、ＣｒｔａｍがＣｄｃ４２およびＰＫＣζを含む下流のシグナル伝達経路を活性化しておよび／または安定させること、そしてＩＬ４ではなくＩＦＮγおよびＩＬ２２の産生に選択的に寄与することを可能にしうる。また、興味深いことに、非対称性Ｔ細胞分裂の間のＴ細胞極性の構築が、異なるメモリーおよびエフェクターＴ細胞運命の生成と最近関連づけられた(Chang et al., 2007)。エフェクター／メモリーＴ細胞の数がＣｒｔａｍ−／−マウスにおいて損なわれないので、Ｃｒｔａｍの欠如はこの後者の工程に影響を与えるとは思えない。
【０１７０】
後期Ｔ細胞極性の維持、細胞分裂の制御およびＩＦＮγ／ＩＬ２２産生のためのＣｒｔａｍ−Ｓｃｒｉｂ相互作用の必要性とは異なり、極性および増殖に必要ではないが、ＣｒｔａｍのＥＣＤはＩＦＮγ／ＩＬ２２産生の調節に関与する。ＣｒｔａｍのリガンドであるＣａｄｍ1の関与が、Ｃｒｔａｍ−／−でなくＣｒｔａｍ＋／＋のＴ細胞におけるＴＣＲ媒介性ＩＦＮγ／ＩＬ２２産生を増大させる。ＣｒｔａｍのリガンドであるＣａｄｍ１はＴ細胞領域(zone)内のマウスＤＣのサブセット並びに上皮細胞で発現しているので(Galibert et al., 2005; Shingai et al., 2003)、これらの微小環境内のＣｒｔａｍに結合するＣａｄｍ１の関与はＣｒｔａｍ＋Ｔ細胞の機能的プログラムに影響を及ぼすようである。Ｃａｄｍ１を発現する細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＬ２２ ｍＲＮＡの発現とナチュラルキラー細胞応答を増大させる(Boles et al., 2005; Galibert et al., 2005)。ＣｒｔａｍがＩＦＮγおよびＩＬ２２を優先的に誘導するので、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣａｄｍ１：Ｃｒｔａｍ相互作用はＴＨ１およびＴＨ１７の生態に影響しうる。
現在のところ我々の研究はＴ系統関与におけるＣｒｔａｍの役割を示さないが、細胞骨格再構成とＴ細胞分化との関連は、いくつかの観察によって示唆された。ＩＳ内のＴＣＲとのＩＦＮγＲの共局在性は、ＴＨ１系統関与と関係し、ＴＨ２分化によって阻害される(Maldonado et al., 2004)。ヒトでは、ＷＡＳタンパク質を欠損するＴ細胞が不完全な細胞骨格再構成を表すだけでなく、ＩＬ４、ＩＬ５又はＩＬ１０ではなく、ＴＣＲ媒介性ＩＦＮγおよびＩＬ２の転写活性化の選択的な欠如を示す(Trifari et al., 2006)。また、細胞内の細胞骨格再構成に加え、ＴＣＲシグナルの強度および継続時間は、ＴＨ１細胞とＴＨ２細胞の間で異なり、Ｔ系統関与に影響する(Iezzi et al., 1999)。ＴＨ１分化は刺激の継続時間の短縮又は同時刺激の要求の低下により誘導されうるのに対して、ＩＬ４分泌は長いＴＣＲトリガーを必要とする(Holzer et al., 2003; Iezzi et al., 1999)。非常に低い抗原用量と非常に高い抗原用量がＴｈ２様細胞に有利に働くことを示すものもある(Hosken et al., 1995)。ＴＣＲ活性化開始の１４時間後のＣｒｔａｍ＋Ｔ細胞の、Ｃａｄｍ１を発現又は上方制御する特定の細胞との結合により、Ｔ細胞分化及び機能が更なるレベルの調節を受けうる。
【０１７１】
活性化されたＴ細胞のすべての集団が上方制御されたマーカーを発現していた、ＣＤ６９及びＣＤ２５などの他の活性化マーカーとは異なり、活性化された(ＣＤ６９およびＣＤ２５) ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットのみがＣｒｔａｍを発現する。Ｔ細胞がＣｒｔａｍを上方制御することができないことは、おそらく、Ｔ細胞活性化に続く確率的現象を反映する。現在我々はナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣｒｔａｍ発現に影響する他の指示的シグナルを除外することができないが、Ｃｒｔａｍは、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の架橋により生体外で成熟ＣＤ４＋胸腺細胞のサブセット上でも同様に上方制御されるので(データは示さない)、細胞が胸腺を出るとこの指示的モデル(instructional model)とは相反する。それにもかかわらず、活性化されたＴ細胞がその細胞表面上にＣｒｔａｍを獲得すると、Ｃｒｔａｍによるシグナル伝達は、Ｔ細胞分化の間にＩＦＮγ及びＩＬ２２を取り巻くＤＮＡ及びクロマチン構造のエピジェネティックな変化に影響しうる多くのメカニズムの一つを表しうる。分類されたＣｒｔａｍ＋Ｔ細胞がＣｒｔａｍを均一に上方制御することができることと、分類されたＣｒｔａｍ−Ｔ細胞がＴ細胞活性化のその後の工程でＣｒｔａｍを上方制御できないことは、Ｃｒｔａｍが初期Ｔ細胞分化の可塑性に影響しうるという考えと一致している。ＣｒｔａｍのリガンドであるＮｅｃｌ２がＴ細胞領域(ｚｏｎｅ)内のＣＤ１１ｃｂｒｉｇｈｔＣＤ１１ｂ−ＣＤ８＋マウス樹状細胞(ＤＣ)のサブセット並びに上皮細胞で発現されるので(Galibert et al., 2005; Shingai et al., 2003)、これらの微小環境内でのＣｒｔａｍに結合するＮｅｃｌ２の貢献はＣｒｔａｍ＋Ｔ細胞の分化プログラムに影響しうる。Ｎｅｃｌ２を発現する細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＬ２２ ｍＲＮＡの発現とナチュラルキラー細胞応答を増大させる(Boles et al., 2005; Galibert et al., 2005)。ＣｒｔａｍがＩＦＮγおよびＩＬ２２を優先的に誘導するので、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＮｅｃｌ２：Ｃｒｔａｍ相互作用はＴＨ１およびＴＨ１７生態に影響しうる。さらに、Ｃｒｔａｍ発現を表すレポーターマウスを用いた更なる研究により、ＴＨサブセットの分化、輸送および維持でのＣｒｔａｍの役割の分析が可能となるであろう。まとめると、我々のデータは、ＣｒｔａｍがＳｃｒｉｂを介して分子足場を組織し、従来では認識されなかったＴ細胞活性化の後期を制御するという考えを裏付けるものであり、Ｔ細胞活性化の初めの数時間を超えて伝達されるシグナルが、ＤＮＡおよびクロマチン構造のエピジェネティックな変化に影響し続け、Ｔ細胞機能に影響することを示すものである。さらに、様々な病理学的疾患と関連した重要な生物学的機能を有する活性化されたＴ細胞の制限されたサブセットとＣＲＴＡＭ発現との密接な関連は、治療的介入のための実行可能な標的としてのＣＲＴＡＭを暗示するものである。
【０１７２】
文献の一部列挙
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【図１Ａａｎｄ１Ｂ】
2010538018.tif 000003
【図１Ｃ】
2010538018.tif 000004
【図１Ｄ−１Ｇ】
2010538018.tif 000005
【図２Ａ−２Ｄ】
2010538018.tif 000006
【図２Ｅ−２Ｇ】
2010538018.tif 000007
【図３Ａ−３Ｄ】
2010538018.tif 000008
【図３Ｅ】
2010538018.tif 000009
【図３Ｆ】
2010538018.tif 000010
【図４Ａａｎｄ４Ｂ】
2010538018.tif 000011
【図４Ｃａｎｄ４Ｄ】
2010538018.tif 000012
【図４Ｅａｎｄ４Ｆ】
2010538018.tif 000013
【図４Ｇ−４Ｉ】
2010538018.tif 000014
【図５Ａ−５Ｄ】
2010538018.tif 000015
【図５Ｅ】
2010538018.tif 000016
【図６Ａ−６Ｃ】
2010538018.tif 000017
【図６Ｄ−６Ｆ】
2010538018.tif 000018
【図７Ａ−７Ｄ】
2010538018.tif 000019
【図７Ｅ−７Ｇ】
2010538018.tif 000020
【図８】
2010538018.tif 000021
【図９Ａ−９Ｃ】
2010538018.tif 000022
【図１０Ａ−１０Ｄ】
2010538018.tif 000023
【図１１】
2010538018.tif 000024
【図１２】
2010538018.tif 000025
【図１３Ａ−１３Ｄ】
2010538018.tif 000026
【図１３Ｅ−１３Ｇ】
2010538018.tif 000027
【図１４Ａａｎｄ１４Ｂ】
2010538018.tif 000028
【図１５】
2010538018.tif 000029
【図１６Ａ−１６Ｃ】
2010538018.tif 000030
【図１６Ｄ−１６Ｆ】
2010538018.tif 000031
【図１７Ａ−１７Ｃ】
2010538018.tif 000032
【図１７Ｄ−１７Ｆ】
2010538018.tif 000033
【図１８】
2010538018.tif 000034
【図１９】
2010538018.tif 000035
【図２０】
2010538018.tif 000036
【図２１Ａａｎｄ２１Ｂ】
2010538018.tif 000037
【図２１Ｃ−２１Ｅ】
2010538018.tif 000038
【図２２Ａａｎｄ２２Ｂ】
2010538018.tif 000039
【図２３Ａ】
2010538018.tif 000040
【図２３Ｂ】
2010538018.tif 000041
【図２４Ａ−２４Ｄ】
2010538018.tif 000042
【図２４Ｅ−２４Ｇ】
2010538018.tif 000043
【図２４Ｈ−２４Ｊ】
2010538018.tif 000044
【図２５Ａａｎｄ２５Ｂ】
2010538018.tif 000045
【図２６Ａ】
2010538018.tif 000046
【図２６Ｂ】
2010538018.tif 000047
【図２７】
2010538018.tif 000048
【図２８Ａ−２８Ｄ】
2010538018.tif 000049
【図２８Ｅａｎｄ２８Ｆ】
2010538018.tif 000050
【図２９Ａａｎｄ２９Ｂ】
2010538018.tif 000051
【図３０Ａａｎｄ３０Ｂ】
2010538018.tif 000052
【図３１Ａａｎｄ３１Ｂ】
2010538018.tif 000053
【図３２Ａａｎｄ３２Ｂ】
2010538018.tif 000054
【図３３Ａａｎｄ３３Ｂ】
2010538018.tif 000055
【図３４Ａ】
2010538018.tif 000056
【図３４Ｂ】
2010538018.tif 000057
【図３５】
2010538018.tif 000058
【図３６】
2010538018.tif 000059
【配列表】
2010538018000001.xml
【国際調査報告】
2010538018.tif 000080
2010538018.tif 000081
2010538018.tif 000082