(57)【要約】  本発明は、インテグラーゼ融合タンパク質を第3世代レンチウイルスベクターに組み込む方法であって、(i) ベクターパッケージングプラスミドを産生細胞にトランスフェクトすること(ここで、該ベクターパッケージングプラスミドは、レンチウイルストランスファー構築体およびインテグラーゼ融合タンパク質をコードする遺伝子を含み、該遺伝子は、pol-ポリタンパク質遺伝子と融合している);(ii) 該遺伝子の転写および翻訳; および(iii) pol-ポリタンパク質からのインテグラーゼ融合タンパク質の遊離を含む方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インテグラーゼ融合タンパク質を第3世代レンチウイルスベクターに組み込む方法であって、
(i) ベクターパッケージングプラスミド(vector packaging plasmid)をレンチウイルス産生細胞にトランスフェクトすること(ここで、該ベクターパッケージングプラスミドは、インテグラーゼ融合タンパク質をコードする遺伝子を含み、該遺伝子は、pol-ポリタンパク質遺伝子と融合している);
(ii) レンチウイルスベクター粒子を産生するためのレンチウイルス産生細胞による遺伝子の転写および翻訳; および
(iii) ベクター粒子の内部における、pol-ポリタンパク質からのインテグラーゼ融合タンパク質の遊離
を含む、方法。
【請求項２】
該インテグラーゼ融合タンパク質が、メガヌクレアーゼタンパク質またはホーミングエンドヌクレアーゼタンパク質を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
該インテグラーゼ融合タンパク質が、マーカータンパク質を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
該マーカータンパク質が、mCherry、I-Ppol、N119A、R61AまたはH78Aを含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
該インテグラーゼ融合タンパク質が、治療もしくはアポトーシス誘発タンパク質を含む、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
該治療もしくはアポトーシス誘発タンパク質が、p53である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
該治療もしくはアポトーシス誘発タンパク質が、細胞毒性タンパク質である、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
該インテグラーゼ融合タンパク質が、D64Vを含む、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、外来タンパク質およびインテグラーゼ融合タンパク質を、第3世代HIV-1に基づくレンチウイルスベクターに組み込む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞内クロマチンへのウイルスcDNAの組み込みは、単純および複合(simple and complex)レトロウイルスの両方の生活環で、重要な過程である。この過程により、これらのウイルスは、長期間遺伝子導入が望まれるとき、遺伝子治療ベクターとしての魅力的な候補となる。しかしながら、レトロウイルスDNA組み込みは、挿入突然変異を引き起こし、細胞内遺伝子発現の変化を生じ得る非特異的なイベントである。最近、白血病の症例が、遺伝子治療の試験におけるレトロウイルスベクターの使用と関連付けられている。
【０００３】
非特異的なレトロウイルス組み込みから生じる問題を多少なりとも解決する1つの方法は、インテグラーゼ(IN)融合タンパク質により、標的化組み込みを追求することである。cDNA組み込みに関与するレトロウイルスインテグラーゼは、配列特異的DNA結合タンパク質と融合でき、それは、所定の染色体部位を標的化することを可能とする(Bushman, 1994; Bushman, 1995; Goulaouic & Chow, 1996)。インビトロ研究、および細胞培養アッセイで、これらのIN融合タンパク質が、IN仲介組み込みを、DNA結合タンパク質により認識される所定の部位またはその近傍へ向けることができることが示された。しかしながら、遺伝子治療グレードベクターへのIN融合タンパク質の有効な組み込みは、依然として、証明されていない。
【０００４】
以前、IN融合タンパク質は、“トランス-パッケージング”戦略(Wu et al., 1995; Fletcher et al., 1997)を用いて、レンチウイルスビリオンに組み込まれていた。この方法は、HIV-1アクセサリータンパク質であるVprが関与し、それは、Gagのp6タンパク質と相互作用することにより、ウイルスにパッケージされる(Kondo et al, 1995)。産生細胞株でのVpr融合タンパク質およびHIV-1分子クローンの共発現により、融合タンパク質の新規形成ウイルスへの組み込みを生じる(図2参照)。パッケージング後、Vprを、HIV-1プロテアーゼ(PR)により、IN融合タンパク質から遊離させる(Fletcher et al., 1997)。
【０００５】
Vpr仲介トランス-パッケージング法は、レンチウイルスベクターに基づいて、IN融合タンパク質を感染性HIV-1ビリオンにパッケージし、また、治療タンパク質を、核酸、遊離タンパク質形質導入ナノ粒子(PTN)に標的化するために使用される(Tan et al., 2006; Holmes-Son & Chow., 2002)。しかしながら、トランス-パッケージング法は、多くの欠点、例えば、トランス-パッケージタンパク質のVprからの不完全な遊離および組み込み融合タンパク質の非特異的な切断を有する。さらに、アポトーシス誘発タンパク質のPTN粒子への組み込みは、トランス-パッケージング法を用いて、失敗した(Link et al., 2006)。
【０００６】
Vpr依存性トランスパッケージング法に代わるものは、融合遺伝子をウイルスゲノムから直接提供することにより、IN融合タンパク質をビリオンに組み込むことである。HIV-1 INもしくはトリ肉腫ウイルス(ASV) IN融合タンパク質をウイルスゲノムに組み込む以前の試みは、ウイルス感染性の欠損(Bushman & Miller, 1997)またはウイルス複製の間の融合タンパク質発現の欠損(Katz et al., 1996)を生じた。
【０００７】
第3世代HIV-1由来ベクターは、それらが、分裂および非分裂細胞の両方に感染でき、長期間の遺伝子導入を与え、適度に巨大なトランスジーンカーゴを有し、相対的に、高力価を産生するのが容易であるので、遺伝子治療のための有望なツールである。第3世代HIV-1由来ベクターは、ウイルス生活環の早期過程においてのみ、それらの野生型対応物と似ており、最終的には、トランスジーン構築体の標的細胞クロマチンへの組み込みを生じる。
【０００８】
第3世代HIV-1に基づくレンチウイルス(LV)ベクターは、複製能力のないベクター粒子を産生するのに必要とされる構造および制御産物をコードする4つの異なるプラスミドの共トランスフェクションにより作製する。HIV-1アクセサリー遺伝子であるvif、vpr、vpuおよびnefは、ベクター産生のために必要ではないことが証明され、パッケージング構築体から除去した。これらの遺伝子は、インビボでのウイルス複製および病原性のために重要であるが、インビトロでのウイルス増殖または形質導入のためには重要ではない。ベクターは、標的細胞で複製されるように設計されておらず、トランスジーン組み込みまでの、およびそれらを含む工程を行うようにのみ設計されている。
【発明の概要】
【０００９】
発明の要約
本発明は、IN融合タンパク質を自己不活性化第3世代HIV-1に基づくレンチウイルスベクターに組み込むための新規方法である。これは、pol遺伝子と融合したウイルスパッケージングプラスミド(virus packaging plasmids)からの融合遺伝子の発現により、達成される。したがって、伝統的なトランスパッケージング法とは異なり、Vprからの機能的IN融合タンパク質のPR仲介遊離から独立している。
【００１０】
本発明によると、インテグラーゼ融合タンパク質を第3世代レンチウイルスベクターに組み込む方法は、
(i) ベクターパッケージングプラスミド(vector packaging plasmid)をレンチウイルス産生細胞にトランスフェクトすること(ここで、該ベクターパッケージングプラスミドは、インテグラーゼ融合タンパク質をコードする遺伝子を含み、該遺伝子は、pol-ポリタンパク質遺伝子と融合している);
(ii) レンチウイルスベクター粒子を産生するためのレンチウイルス産生細胞による遺伝子の転写および翻訳; および
(iii) ベクター粒子の内部における、pol-ポリタンパク質からのインテグラーゼ融合タンパク質の遊離
を含む。
【００１１】
図面の説明
下記の図面は、本発明の態様を例示する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、パッケージングプラスミドpMDLg/pRRE (左側)およびIN融合遺伝子含有パッケージングプラスミドpMDLg/pRRE (右側)を示す。パッケージングプラスミドは、任意のIN融合タンパク質cDNAを含み得る。IN融合含有パッケージングプラスミドのクローニングのために使用される酵素部位を示す。IN: インテグラーゼ; PC: プロテアーゼ切断部位; POL: HIV-1ポリタンパク質。
【図２】図2は、IN融合タンパク質をビリオンにパッケージするために、Vpr仲介トランス-パッケージング(A)および修飾第3世代LVV産生系(B)を用いたベクター産生の概略図を示す。参照番号は、ウイルス産生の下記の段階を示す:1) ベクター産生プラスミドを、産生細胞にトランスフェクトする;2) 構造遺伝子の転写および翻訳が、産生細胞内で生じる。LTR-側面(flanked)ベクターRNA (トランスファー構築体)が、また、転写される;3) 構造タンパク質およびベクターRNAが、細胞膜上に集まる。Vpr-IN融合タンパク質は、Gagタンパク質のp6領域に結合する(A);4) ビリオンは、出芽により放出され、PR仲介タンパク質分解成熟が生じる。成熟の間、ポリタンパク質は、それらの個々の断片に切断され、機能性タンパク質を遊離する;5) 部分的な成熟後のビリオンの組成の概略図。Vpr-IN融合タンパク質の一部は、未加工であり、機能性IN融合タンパク質の一部が、遊離される(A)。(B)では、IN融合タンパク質は、pol-ポリタンパク質から効率的に遊離される:  (a) パッケージング構築体(b) Vpr-PC-IN融合タンパク質構築体(c) Env-構築体(偽型)(d) 第3世代LVVトランスファー構築体(e) RRE-発現構築体。  図面において、参照数字は、下記の構築体を示す:IN-タンパク質: (i); Vpr-PC-IN融合タンパク質: (ii); INと融合したタンパク質: (iii); ウイルスRNAゲノム(トランスファー構築体): (iv)。
【００１３】
好ましい態様の記載
本明細書で使用するインテグラーゼ融合タンパク質なる用語は、ウイルスインテグラーゼと融合したタンパク質を意味する。該タンパク質は、例えば、エンドヌクレアーゼ、例えば、I-Ppolであり得る。
【００１４】
“レンチウイルス産生細胞”なる用語は、当業者に既知である。レンチウイルス産生細胞は、レンチウイルスを産生することができる産生細胞である。本発明の方法では、インテグラーゼ融合タンパク質をコードする遺伝子(該遺伝子は、pol-ポリタンパク質と融合している)を含む、ベクターパッケージングプラスミド(vector packaging plasmid)を、レンチウイルス産生細胞にトランスフェクトする。レンチウイルス産生細胞による遺伝子の転写および翻訳は、pol-ポリタンパク質と融合したインテグラーゼ融合タンパク質を含有するレンチウイルスベクター粒子の産生を生じる。次いで、インテグラーゼ融合タンパク質を、成熟ベクター粒子の内部で、pol-タンパク質から遊離する。
【００１５】
本発明の方法で、外来タンパク質は、ウイルスpol-遺伝子内のインフレーム融合として、ベクターパッケージングプラスミドから発現する。望まれるタンパク質は、成熟したビリオンで、Polポリタンパク質から遊離される、ウイルスインテグラーゼのC末端に融合する。インテグラーゼ融合タンパク質は、ウイルスプロテアーゼにより、前駆体polポリタンパク質から切断され得る。
【００１６】
正確なサイズのインテグラーゼ融合タンパク質のベクター粒子へのパッケージングは、重大な非特異的分解なしに生じ得る。インテグラーゼ融合タンパク質は、巨大なGag-Pol-ポリタンパク質の一部として、新規ビリオンに組み込まれるので、また、治療タンパク質、例えば、細胞毒性タンパク質をビリオンにパッケージすることも可能であり得る。この方法のさらなる利点は、ビリオン由来IN融合タンパク質が、ウイルスプレインテグレーション複合体(PIC)の一部を形成するため、それらが、細胞核へ輸送されることである。しかしながら、追加のプロテアーゼ切断部位が、インテグラーゼ遺伝子の3'末端と外来タンパク質をコードする遺伝子の5'末端間に導入されると、パッケージされたタンパク質は、ベクターの脱外皮後、標的細胞のサイトゾル中で遊離され得る。本発明の方法の重要な1つの適用は、使用者が、遺伝子治療グレード第3世代レンチウイルスベクターに関して、インビトロおよびインビボで、トランスジーン組み込みに向けられる異なるIN融合タンパク質の能力を研究するのを可能にすることである。本発明はまた、外来タンパク質のさまざまなほ乳類細胞への一過的送達のために、およびIN融合タンパク質を細胞核へ直接標的化するために使用し得る。これは、インビボでのメガヌクレアーゼ仲介相同的組み換え、またはアポトーシス誘発タンパク質の機能性を研究するための重要な適用であり得る。
【００１７】
望まれるIN融合タンパク質を有する(ウイルスインテグラーゼの代わりに)IN融合タンパク質ベアリングLVベクターを作製した。タンパク質を、LVXベクターにパッケージし、それは、野生型ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)インテグラーゼから構成されていた。HIV-1インテグラーゼを、そのC末端から、ホーミングエンドヌクレアーゼ I-PpoI、I-PpoIのN119AもしくはH78A突然変異型、赤色蛍光タンパク質mCherry、またはアポトーシス誘発細胞内シグナル伝達タンパク質p53と融合させた。インテグラーゼはまた、I-Ppolの他の突然変異型、例えば、R61Aと融合し得る。さらに、INは、他のホーミングエンドヌクレアーゼもしくはメガヌクレアーゼタンパク質、または治療もしくは細胞毒性特性を有する他のタンパク質と融合し得る。
【００１８】
I-PpoIは、ヒトゲノム中に天然の標的を有し、28S rRNA遺伝子内のこの十分に保存された配列を認識し、切断することができる。ヒト細胞で、I-PpoIの構成的な発現は、減少した細胞生存を生じるか、または直接的な細胞毒性を示すことが報告されている。I-PpoIにおけるN119A突然変異は、酵素触媒活性の劇的な減少を引き起こすが、DNA結合および特異性のために重要な領域には局在しないことが報告されている。H78A突然変異は、野生型タンパク質と比較して、約50%のI-PpoI活性の減少を引き起こす。
【００１９】
下記の実施例は、本発明を例示する。
【実施例】
【００２０】
IN融合タンパク質の第3世代LVベクターへの組み込み
機能性IN融合タンパク質が、最初に、該タンパク質をHIV-1 Vprへ融合する必要なしに、第3世代レンチウイルスベクターにパッケージされ得るか否かを評価するために、pol-ポリタンパク質遺伝子内に、異なるIN融合タンパク質cDNAのインフレーム融合を含んだ、HIV-1ベクターパッケージングプラスミドpMDLg/pRRE版を構築した(図1)。INのN末端断片は、クローン化戦略で修飾されていなかったので、逆転写酵素とインテグラーゼ遺伝子間の天然のプロテアーゼ切断部位(PC)を保存した。ウイルスは、4プラスミドの共トランスフェクションにより作製し(Follenzi & Naldini, 2002)、そのうちの1つは、野生型INの代わりに、pol-ポリタンパク質遺伝子内に異なるIN融合cDNAを含んでいた(図1)。
【００２１】
また、欠損INを含むLV (レンチウイルス)ベクターを、パッケージングプラスミドを用いることにより作製した(ここで、不活性化D64V点突然変異が、INコード領域に導入された)。これらのベクターは、IN融合タンパク質の酵素活性を評価するときのコントロールとして使用するために作製した。IN融合タンパク質のベクターへの正確なパッケージングは、ウエスタンブロッティングにより証明した。すべての融合タンパク質は、正確なサイズで、多くは非分解性のものとして、LV (レンチウイルス)ベクターにパッケージされた。ウイルスは、標準的なベクター作製プロトコールに対する修飾なしに、十分な力価で作製された(Follenzi & Naldini, 2002)。
【００２２】
IN分子の単一型を有するベクターに加えて、IN融合タンパク質および欠損もしくは野生型IN含有パッケージングプラスミドを用いたベクターを作製した。不活性(D64V突然変異)IN突然変異体およびIN融合タンパク質の混合多量体は、IN融合タンパク質単独よりも、構造的により安定であり、トランスジーン組み込みの触媒において、潜在的により有効であり得る。作製した異なるIN修飾第3世代LVベクターを、表2に示す。
【００２３】
インビトロ研究
異なるIN融合タンパク質含有ベクターの考え得る細胞毒性効果を評価するために、ヒト胚性腎細胞293およびHeLa細胞に、ベクターLV-INIPpoI、LV-INN119A、LV-GFPおよびLV-D64Vを用いて、感染多重度(M.O.I.) = 1で形質導入した。細胞の形態を、2-5日間、追跡した。MOI = 1での細胞のトランスフェクションは、感染の2日後、HeLa細胞の約55-95%で、GFP発現を生じた。2日目に、LV-GFP、LV-D64VおよびLV-INN119Aで感染させた細胞は、正常に見えたが、LV-INIPpoIで感染させた細胞は、すでに死に始めていた。3日目に、LV-INIPpoI感染細胞の多くは、培養プレートから剥がれて死に、核内(intranuclearly)送達活性化エンドヌクレアーゼI-PpoIの細胞毒性効果を確認した。LV-INIPpoIプレートに残った細胞は、GFPネガティブであり、したがって、ベクターを形質導入されていなかった。
【００２４】
非細胞毒性IN融合タンパク質を有するLVベクターの機能性は、トランスジーン組み込みを触媒するそれらの能力により評価した。ベクターLV INmCherryはまた、IN-mCherry融合タンパク質により放出された赤色蛍光により特徴づけられた。融合タンパク質INを含むすべての産生されたベクターは、インビトロ研究で、ベクタートランスジーンの組み込みを触媒することができた。
【００２５】
DNA構築体
IN融合cDNAを、最初に、pBluescript IIにクローン化した。IN cDNAを、プライマー5'INおよび3'INを用いて、PCRにより増幅した。プライマー3'INは、INの終止コドンを欠失し、PCR断片にインフレームXbaI部位を導入するように設計した。プライマー5'Ppoおよび3'Ppoを、I-PpoIを増幅させるために使用した。プライマー5'Ppoは、I-PpoIのN末端のNLS配列の開始コドンを欠失し、それを、SpeI部位に変換するように設計した。プライマー3'Ppoは、終止コドンで終止するI-PpoI cDNAの一部、およびプラスミドのBspEI部位で終止するpMDLg/pRREの配列を含むように設計した。プライマーpRSETフォワードおよび3'mCherry BspEIを、pRSET-B-mCherryからmCherryを増幅するために使用し、それらは、I-PpoIのためのプライマーと同じ制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいた。プライマーp53(SpeI;NLS)フォワードおよびp53(NotI;BspeI,STOP)を、プラスミドp53pBacCapIRed (Hanna-Riikka Kaerkkaeinen)から、p53のcDNAを増幅するために使用した。上記のI-PpoIおよびmCherryで使用されたものと同じ制限部位を含むことに加えて、プライマーp53(SpeI;NLS)は、また、NLS配列をp53 PCR産物に導入した。PCRで使用したオリゴヌクレオチドは、Oligomer Oy, Helsinkiから購入し、配列は、表1で示す。
【００２６】
PCR断片を、Charge Switch (登録商標) PCR Clean Up Kit (Invitrogen)で精製し、平滑末端を、pBluescript IIのEcoRV部位にライゲート/サブクローン化し、融合パートナーI-PpoI (pBS-IPpoI)、mCherry (pBS-mCherry)およびHIV-1インテグラーゼ(pBS-IN)を含むプラスミドを得た。pBS-IPpoIを、SpeIで消化し、生じた断片を、PureLink Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen)でゲル抽出した。pBS-INを、XbaIで線状化し、精製した。I-PpoI断片を、pBS-INのXbaI部位にライゲートし、プラスミドpBS-INIPpoIを得た。IN-mCherry融合は、I-PpoIに関して記載したとおり、作製した。精製したp53 PCR断片を、SpeIおよびNotIで消化し、同じ酵素で消化したpBS-INにライゲートした。
【００２７】
IN-I-PpoI融合遺伝子を有する第3世代レンチウイルスパッケージングプラスミドpMDLg/pRREを構築するために、pBS-INIPpoIを、最初に、AflIIおよびBspEIで消化し、ゲル抽出し、精製した。pMDLg/pRREを、AflIIおよびBspEIで開裂し、その結果生じた多くの野生型IN配列を欠いたプラスミド断片を、ゲル抽出し、精製した。IN-I-PpoI遺伝子断片を、AflIIおよびBspEIで切断したpMDLg/pRREにライゲートし、プラスミドpMDLg/pRRE-Ppoを作製した(図1)。IN-mCherryおよびIN-p53遺伝子融合を含むパッケージングプラスミドを、それらの親pBluescriptプラスミドから、IN-I-PpoIに関してすでに記載したpMDlg/pRREにクローン化した。I-PpoI遺伝子内にN119A突然変異を含むプラスミドpMDLg/pRRE-N119Aは、QuikChangeR II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene La Jolla, CA)およびオリゴヌクレオチド(oligos)N119AフォワードおよびN119Aリバースを用いて、部位特異的突然変異誘発により作製した。I-PpoI遺伝子内にH78A突然変異を含むプラスミドpMDLg/pRRE-H78Aは、プライマーH78Aフォワードおよびリバースを用いて、同様に作製した。IN遺伝子がその活性を無くすように突然変異させたさらなるpMDLg/pRREパッケージングプラスミドを作製した。このD64V突然変異は、オリゴヌクレオチドD64VフォワードおよびD64Vリバースを用いて、部位特異的突然変異誘発により、同様に作製した。クローンは、シークエンシングにより証明した。
【００２８】
IN修飾HIV-1に基づくレンチウイルスベクターの作製
水ほう性口内炎ウイルスエンベロープ(VSV-G)偽型第3世代HIV-1に基づくLVベクターを、プラスミドpMDLg/pRREの使用での修飾を有する、293T細胞の標準的なリン酸カルシウム仲介トランスフェクション(Follenzi & Naldini, 2002)により作製した。作製されたすべてのウイルスに関して、4つの第3世代LVパッケージングプラスミドのうちの3つは、常に同じであり(pRSV-Rev、pMD2GおよびpLV-1)、トランスジーンとして、GFP cDNAを含んでいた。使用した第4の第3世代コアパッケージングプラスミドは、修飾IN融合含有pMDLg/pRREプラスミド、野生型IN含有pMDLg/pRREプラスミドまたは不活性IN包含pMDLg/pRRE-D64Vであった。ベクターは、上記の3つの修飾pMDLg/pRREプラスミドのうちの1つを用いて同時に、またはIN融合含有pMDLg/pRREプラスミドと野生型pMDLg/pRREプラスミドもしくはpMDLg/pRRE-D64Vを、1:1の割合で混合することにより作製した。これは、融合タンパク質インテグラーゼおよび野生型INもしくは不活性インテグラーゼ突然変異体を、同じウイルス中に、IN融合タンパク質と共にパッケージする(作製した異なるLVベクターに関する表5を参照)。ウイルス力価は、HIV-1カプシド(CA; p24)抗原に対する酵素結合免疫吸着法により、および機能的力価をHeLa細胞でのGFP発現として決定することにより、評価した。
【００２９】
ウエスタンブロット
異なるINタンパク質のLVベクターへの正確な組み込みは、ウエスタンブロットにより証明した。INタンパク質は、NIH AIDS Research & Reference Reagent Programから入手した、HIV-1インテグラーゼ、アミノ酸23-34に対する抗血清(カタログ番号757)を用いて検出した。使用した二次抗体は、Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) - AP Conjugate (BIO-RAD)であった。
【００３０】
細胞培養
ヒト胚性腎293T細胞(HEK 293T/17 ATCC(登録商標) Number CRL-11268(商標))およびHeLa細胞(ATCC(登録商標) Number: CCL-2(商標))を、5% CO2含有湿潤雰囲気下、37℃で、10%ウシ胎仔血清(FBS)を補充したDMEMで培養した。
【００３１】
要約すると、本発明は、IN融合タンパク質の活性を、とりわけ、不必要なHIV-1由来アクセサリータンパク質、例えば、VifおよびVprが存在しない第3世代LVベクターに関して、研究するのを可能にする。該方法の1つの利点は、等モル量のIN融合タンパク質を産生し、他のgag-pol遺伝子産物と共に、ベクター粒子にパッケージすることであり、一方で、Vpr仲介トランス-パッケージング戦略の使用は、異種タンパク質の低い組み込みを生じ得る。この方法を用いて、IN融合タンパク質は、ウイルスプロテアーゼにより、天然のRT-IN間で、前駆体Polポリタンパク質から切断され、それは、前駆体タンパク質からのパッケージタンパク質の正確な遊離を促進し得る。
【００３２】
Vpr仲介トランス-パッケージングは、毒性タンパク質をビリオンへパッケージングするのに適当ではなく、一方で、Pol融合としての活性エンドヌクレアーゼタンパク質の発現が、ベクター産生細胞にとって有害ではないが、効率的にベクター導入細胞を殺すことが本明細書に示されている。本発明はまた、細胞毒性もしくはアポトーシス誘発タンパク質を含む外来タンパク質を、HIV-1ベクター粒子にパッケージするために使用し得る。例えば、メガヌクレアーゼ仲介相同的組み換え(HR)のインビボ研究は、活性なメガヌクレアーゼタンパク質および望まれる相同性領域包含直線状トランスジーンカセットを細胞に形質導入する可能性により、促進され得る。本発明を用いてメガヌクレアーゼ仲介HRを研究する1つの利点は、ウイルスPICの一部として、タンパク質およびDNA基質の核局在である。異なるIN融合タンパク質組み込み戦略の主な特徴は、表4に要約する。
【００３３】
本発明の方法を用いて、成功するベクター組み込みは、パッケージされる外来タンパク質のアミノ酸配列に依存し得る。本発明の方法を用いて、Pol-ポリタンパク質中の巨大な融合タンパク質は、粒子形成またはベクター力価の減少なしに、ベクター粒子により許容される。Vpr結合法を用いて、75 kDaのサイズまでの外来タンパク質のPTNsへのトランス-パッケージングが達成された(Link et al, 2006)。これは、外来タンパク質を受容するレンチウイルス由来粒子の能力の柔軟性を反映し得る。本発明の方法を用いて、87 kDaのサイズのIN-P53融合タンパク質をLVベクター粒子に組み込むことが可能である。
【００３４】
本発明は、完全長IN融合タンパク質を第3世代レンチウイルスベクターにパッケージングする柔軟性を示す。本発明のタンパク質パッケージング法により、第3世代レンチウイルスベクターに関して、安全な染色体部位へトランスジーン組み込みを標的化するIN融合タンパク質の能力を研究することが可能となる。
【００３５】
表1(下記)は、融合タンパク質の構築および部位特異的突然変異誘発で使用されるPCRプライマーのDNA配列を示す。表1において、a: 制限部位は、下線が引かれ、右側に示した制限酵素と同一であり; b: 太字は、I-PpoIおよびIN cDNAsに導入されるヌクレオチド置換を示し; そしてc: イタリック体は、I-PpoIおよびp53の5'プライマーに加えた核局在シグナルを示す。
【００３６】
表1
【表１】
2010517555.tif 000002
【００３７】
表2(下記)は、異なるIN修飾を含むベクターを示す。ベクターは、個々に、または任意の組合わせで混合して、使用し得る。
【００３８】
表2
【表２】
2010517555.tif 000003
【００３９】
表3は、IN融合タンパク質をHIV-1由来ベクターもしくはウイルスに組み込むための異なる方法の比較である。Env、ウイルスエンベロープタンパク質; VSV-G、水ほう性口内炎ウイルスGタンパク質; PR、レンチウイルスプロテアーゼ; PC、プロテアーゼ切断部位; LVV、レンチウイルスベクター。
【００４０】
表3
【表３】
2010517555.tif 000004
【表４】
2010517555.tif 000005
【００４１】
参照
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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