(57)【要約】  胎児の母親が妊娠中に子癇前症にかかるリスクを判定するための方法であって、（ａ）胎児に血縁のある個人からのゲノムＤＮＡサンプルを提供するステップと；（ｂ）ＰＰ１３遺伝子における１又はそれ以上の変異の存在について前記ＤＮＡを解析するステップと；（ｃ）前記変異の存在に基づいて母親のリスクを判定するステップとを含む方法。また、変異ＰＰ１３タンパク質バリアント、および天然ＰＰ１３遺伝子の特異的ゲノム配列および／またはその変異配列のためのＤＮＡプローブを含む、本発明の方法における使用のためのキットも開示される。  【選択図】  図１
2010517525.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児の母親が妊娠中に子癇前症にかかるリスクを判定する方法であって、
（ａ）前記胎児に血縁のある個人からのゲノムＤＮＡサンプルを提供するステップと；
（ｂ）ＰＰ１３遺伝子における１又はそれ以上の変異の存在について前記ＤＮＡを解析するステップと；
（ｃ）前記変異の存在に基づいて前記母親のリスクを判定するステップと；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記胎児に血縁のある前記個人が以下の、
（ａ）前記胎児の母親、または彼女の母親または父親；
（ｂ）前記胎児の父親、または彼の母親または父親；
（ｃ）前記胎児の兄弟姉妹、または前記胎児の父親もしくは母親の兄弟姉妹；
（ｄ）前記妊娠もしくは双生児妊娠の胎盤、または前記母親の以前の妊娠の胎盤；および
（ｅ）前記胎児
から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記ＰＰ１３遺伝子内の前記変異が、ＰＰ１３の以下のパラメータ：
（ａ）発現レベル；
（ｂ）アミノ酸配列；
（ｃ）翻訳後のプロセシング；
（ｄ）輸送；
（ｅ）機能喪失；および
（ｆ）機能獲得；
の１又はそれ以上に影響を与えることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記ＰＰ１３遺伝子内の前記変異が以下の、
（ａ）フレームシフト変異；
（ｂ）染色体変異；
（ｃ）点変異；および
（ｄ）ＲＮＡスプライシング
から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、ステップ（ｃ）においては、フレームシフト変異の存在が早発性の子癇前症にかかるリスクを示すことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記フレームシフト変異が２２２ｄｅｌＴ／Ｌ７４Ｗであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、前記ゲノムＤＮＡのサンプルが前記母親の妊娠前に提供されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、前記ゲノムＤＮＡのサンプルが前記母親の妊娠中に提供されることを特徴とする方法。
【請求項９】
妊婦が子癇前症にかかるリスクを判定するための方法であって、
（ａ）ＰＰ１３分子を含む母親の身体物質由来のサンプルを提供するステップと；
（ｂ）前記ＰＰ１３分子の構造を決定するステップと；
（ｃ）前記ＰＰ１３分子の構造に基づき女性のリスクを判定するステップと；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記身体物質が母親の血液、母親の唾液、母親の尿、羊水、臍帯血、絨毛膜絨毛、および胎盤組織から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法において、前記ＰＰ１３分子がＰＰ１３タンパク質であり、かつ前記ＰＰ１３分子の構造が前記ＰＰ１３分子の分子サイズまたはアミノ酸配列であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記ＰＰ１３の構造が免疫学的に、またはタンパク質化学によって決定されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記免疫学的決定がＰＰ１３および／または変異ＰＰ１３に対する特異的な抗体の使用により行なわれることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項９に記載の方法において、前記ＰＰ１３分子がＰＰ１３のｍＲＮＡまたはこれに対応するｃＤＮＡであり、かつ前記ＰＰ１３分子の構造がＰＰ１３のｍＲＮＡまたはこれに対応するｃＤＮＡの配列であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項９に記載の方法において、ステップ（ｃ）においては、フレームシフト変異による切断型ＰＰ１３の存在が早発性の子癇前症にかかるリスクを示すことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記フレームシフト変異が２２２ｄｅｌＴ／Ｌ７４Ｗであることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項９に記載の方法において、ステップ（ｃ）においては、選択的スプライシングによるスプライスバリアントＰＰ１３の存在が遅発性の子癇前症にかかるリスクを示すことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記スプライスバリアントがΔＥＸ−２であることを特徴とする方法。
【請求項１９】
変異ＰＰ１３タンパク質バリアント。
【請求項２０】
請求項１９に記載のＰＰ１３バリアントにおいて、前記変異が以下の
（ａ）フレームシフト変異；
（ｂ）点変異；および
（ｃ）選択的スプライシングによる変異
から選択されることを特徴とするＰＰ１３バリアント。
【請求項２１】
請求項２０に記載のＰＰ１３バリアントにおいて、以下の変異：
（ａ）Ｃ／Ａ置換［ｒｓ３７６４８４３］；
（ｂ）ＩＶＳ２−２２（Ａ／Ｇ）［ｒｓ２２３３７０６］；
（ｃ）ＩＶＳ２−３６（Ａ／Ｇ）；
（ｄ）２２２ｄｅｌＴ／Ｌ７４Ｗ；および
（ｅ）ΔＥＸ−２；
のうち１又はそれ以上が除外される条件とすることを特徴とするＰＰ１３バリアント。
【請求項２２】
請求項２０に記載のＰＰ１３バリアントにおいて、当該バリアントがＩＶＳ２−３６（Ａ／Ｇ）、２２２ｄｅｌＴ／Ｌ７４Ｗ（配列番号１）またはΔＥＸ−２（配列番号２）からなる群より選択されることを特徴とするＰＰ１３バリアント。
【請求項２３】
女性が子癇前症にかかるリスクの判定方法において使用するためのキットであって、
（ａ）ＰＰ１３天然遺伝子の変異配列の特異的なゲノム配列に対するＤＮＡプローブ、または
（ｂ）前記ＰＰ１３天然遺伝子の変異配列に対する抗体、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項２４】
女性が子癇前症にかかるリスクの判定方法において使用するためのキットであって、ＰＰ１３天然または組み換え型ｍＲＮＡの変異配列の特定の配列に対するＲＮＡプローブを含むことを特徴とするキット。
【請求項２５】
女性が子癇前症にかかるリスクの判定方法において使用するためのキットであって、ＰＰ１３ｃＤＮＡの変異配列の特定の配列に対するＤＮＡプローブを含むことを特徴とするキット。
【請求項２６】
女性が子癇前症にかかるリスクの判定方法において使用するためのキットであって、ＰＰ１３ｃＤＮＡまたはＲＮＡの変異配列の特定の配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡチップを含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子癇前症にかかるリスクを示すことのできるＰＰ１３の変異バリアントを同定するためのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
子癇前症（ＰＥ）として知られる妊娠疾患は全ての妊婦の５−７％に起こる望ましくない合併症であり、妊娠中の母体死亡の２番目に頻度の高い原因である（米国においては妊娠に伴う母体死亡の１８％を占める）。この疾患は、臨床症状を起こす胎盤形成および胎盤への血液／酸素／栄養素供給の障害に起因する、胎盤機能不全から生じる。
【０００３】
子癇前症は、妊娠２０週後に、以前には尿中タンパク質が無から微量であった女性が尿試験紙で≧２＋、または２４時間の蓄尿において＞３００ｍｇ／ｄＬと判定されるタンパク尿症と合わせて、以前には正常血圧であった女性が４−６時間の間隔（ある場合には４−７２時間の間隔）での２度の血圧測定により、≧９０／１４０ｍｍＨｇ（収縮期／拡張期、少なくとも１つの）の高血圧を新規に発症することとして定義される。
【０００４】
全ての子癇前症の妊娠のうち約５０％は帝王切開により分娩し、これは全人口の妊娠においてはわずかに１５−１８％であることと比較される。妊娠中に子癇前症を経験した女性は、その結果として寿命の短縮につながる循環器疾患にかかることへの９倍高いリスクを有する。ＰＥにかかる妊婦の比率は発展途上国において比較的高いが、その米国における数も高いままである（５−７％）。
【０００５】
重篤な子癇前症は、高血圧症が≧１１０／１６０ｍｍＨｇ（収縮期／拡張期、少なくとも１つの）、およびタンパク尿症が尿試験紙で≧３＋、または２４時間の蓄尿において＞３ｇｒ／ｄＬである子癇前症として定義される。極端な場合子癇前症は、母親を死亡のリスクにさらす痙攣、脳卒中、および昏睡を伴う緊急事態である子癇に変わる可能性がある。結果として、重篤な子癇前症にかかった女性は、胎盤を取り除いて母親の生命を救うため４８時間以内に分娩させられる。
【０００６】
早期の子癇前症は、疾患の重篤度が期間以前（＜妊娠３７週）の分娩を要求する、上で定義された重篤な子癇前症の形である。この疾患の形はしばしば子宮内での胎児の発育遅延（ＩＵＧＲ）を伴い、これは母親の生命だけでなく、胎児の生命も危険にさらす。ＮＩＣＨＤによると、早期の子癇前症は全てのＰＥのケースの２０−２５％を占めており、このことはその１５％が３４週以前に分娩する（すなわち負担のかかる前分娩期間を経験した後に乳児が非常に未熟な状態で出生する）１００人の妊婦のうちの１−２人を意味する。分娩が早期であるほど乳児の合併症は重篤であり、これは乳児の低出生体重、失明を含む不完全な内部器官の成熟、運動および認知障害、生涯にわたる医学的な障害、および後に高血圧、循環器疾患および糖尿病にかかるリスクの増大を合併する。３４妊娠週（ＧＷ）以前に分娩するケースのうちの１０％は、ほとんどの死亡ケースの原因である最も重篤なものであり、出生した乳児が生存する場合は６−８週の新生児集中治療室に入ることが必要である。ＮＩＣＨＤによると、これは救命の可能性および未熟児の予防のために早期発見が必須となるグループである。現在、子癇前症の唯一の治療法は母親に分娩させることであり、このような分娩が未熟な状態で行なわれた場合、新生児には低出生体重、運動および認知障害による様々な障害が表れ、かつ非常に重篤な場合には分娩中または分娩後に死亡する。子癇前症にかかるリスクを早期に同定する試みのための多数の研究が行なわれてきた。
【０００７】
この疾患は通常、妊娠の３番目の３ヶ月間に起こるが、根底にある胎盤の病理変化はかなり早期に発生する。従って、受胎前または妊娠中のいずれかにおいて子癇前症にかかるリスクを早期に発見することは、疾患の予防または症状の程度を緩和させるための手段となる。
【０００８】
１）早期発見は、女性の綿密な調査によるリスクの管理を可能にする。高リスクにある女性の有効な拡大調査は米国産科婦人科学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ）の指針（“ＡＣＯＧ指針”）に従い、高リスクのケースにおけるこの拡大調査は、結果を有意に改善する。妊娠管理プログラム（Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ）は、綿密な調査を参加する妊婦への教育および認識プログラムの提供と組み合わせることによる費用の節約を示した。利点の中には、全ての分娩中、早期ＰＥ（＜３４週）による出生の中止が全国平均の１．９６％に比べわずかに０．６％であること、全ての分娩中の未熟児分娩が全国基準の２．３％に比べ０．９％に減少したこと、および子癇前症による低出生体重が全国平均の２．９％に比べ１．３％であったことがある。綿密な調査は、妊婦が出生前に第三次レベルの医療センターに至ることを可能にする。これは地域の診療所および地方を拠点とした保健サービスの設置においては非常に重要な課題である。その他の利点には、治療や胎児の臓器の成熟を促進する出産前コルチコステロイドのような薬剤を投与するための時間を稼げることがある。綿密な調査は特定のケースにおいて、未熟新生児の重篤度を減少させるための妊娠の持続延長を可能にする。
【０００９】
２）早期発見により、リスクを予防／減少させるために胎盤に作用するとみなされる様々な予想される薬剤を用いた薬剤介入ストラテジーの展開のための長い期間が利用可能となる。治療のためのゴールドの基準は存在しないが、中でも低量アスピリン、低分子量ヘパリン、ビタミンＣおよびＥのような抗酸化剤、および硫酸マグネシウムを含む幾つかの候補が見込みを示している。これらの全ての研究においても、リスクを持つ全ての女性が治療介入の恩恵を受けられるわけではない。あるケースでは治療介入の開始が遅すぎたことが示されるが、他のケースでは、使用した薬物が適切ではなかったか、あるいは適切な時間または量において使用されなかったかを示すはっきりとした証拠がない。現在の研究は、それぞれの女性に対して、現在入手可能な予想される薬剤のリスト（いずれ入手可能になる薬剤も同様に）から最も適したものによる薬剤介入を仕立てること、および治療の効果を継続的にモニターすることが必要であることを示している。
【００１０】
３）家族歴または以前の妊娠歴に基づいた子癇前症にかかりやすい患者、特に子癇前症により子を失った患者には、妊娠計画のために妊娠前の発見が最も重要であり、上に説明したような予防的処置がとられる。体外受精プログラムに参加する女性にとって、子癇前症の増加した事前のリスクの発見は、着床の管理および子癇前症の増加した事前のリスクを伴わないであろうインプラントの選択のために有利であり得る。
【００１１】
胎盤タンパク質１３（ＰＰ１３）は１５−１６，０００ＭＷのタンパク質であり、ヒト胎盤組織から精製されるか、またはここにその内容が参照として取り込まれる米国特許第６，５４８，３０６号（Ａｄｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ）に記載された組み換え技術により調製されてよい。ＰＰ１３のアミノ酸およびＤＮＡ配列を図５に示し、アミノ酸配列を図８Ａに示す。精製されたＰＰ１３は、子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）、子癇前症、およびここにその内容が参照として取り込まれる米国特許第５，１９８，３６６号（Ｓｉｌｂｅｒｍａｎ）に記載された早期分娩のような幾つかの妊娠関連疾患を検出するためのアッセイの開発に用いられた。標識ＰＰ１３および抗ＰＰ１３ポリクローナル抗血清を用いて、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の両者が開発された。
【００１２】
ＰＰ１３遺伝子、ＬＧＡＬＳ１３の解析は、その３イントロンおよび４エクソンを含む基本的構造を明らかにし、前記構造は着床において特に重要な糖残基に高アフィニティを有するタンパク質群であるガレクチンファミリ（Ｔｈａｎ，Ｎ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｐｌａｃｅｎｔａ  ２０：７０３−７１０；Ｔｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１（６）：１０６５−１０７８）に高い配列相同性を示す。実際にＰＰ１３は免疫組織化学により、胎盤形成に重要であることが見出された。
【００１３】
ここにその内容が参照として取り込まれる米国特許第６，７９０，６２５号は、ＰＰ１３に対するモノクローナル抗体および妊娠初期段階の間に母親の血清ＰＰ１３を測定できる固相免疫アッセイを開示している。実際に、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｆｉｒｓｔ−ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｅ−ｅｃｌａｍｐｓｉａ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｅｒｕｍ  ＰＰ−１３  ａｎｄ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｉｎ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，２７（１）ｐｐ．１３−１７では他と同様に、この特許に基づいて開発されたＥＬＩＳＡキットを使用して、子癇前症の増加リスクに対応する最初の３ヶ月間における比較的低量のＰＰ１３を非常に高い精度で示している。
【００１４】
ここにその内容が参照として取り込まれる国際公開第０４／０２１０１２号は、ＰＰ１３の濃度を含む幾つかの因子に基づいた妊娠合併症のための診断法を開示している。
【００１５】
ここにその内容が参照として取り込まれるＳｔｏｌｋ，Ｍ．Ｅｔ  Ａｌ．（２００６）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  １５ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｌ．Ｓｏｃ．ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒ，ｉｎ  Ｐｒｅｇ．，Ｖｏｌ．２５（Ｓｕｐｐｌ．１）Ｐ０２９は、ヒトガレクチン／胎盤タンパク質１３遺伝子、ＬＧＡＬＳ１３の核酸配列変異について記載している。
【００１６】
ここにその内容が参照として取り込まれるＳａｍｍａｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｗｏ  ｓｈｏｒｔｅｒ  ｓｕｂｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｐｌａｃｅｎｔａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １３  ｉｎ  ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ，ａｍｅｒｉｃａｎ  ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ｏｂｓｔｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅは、ＰＰ１３遺伝子のエクソン２を欠失したスプライスバリアントについて記載している。
【発明の概要】
【００１７】
本発明の目的は、妊婦が子癇前症にかかるリスクの判定方法を提供することである。
【００１８】
本発明の一態様によれば、
（ａ）胎児に血縁のある個人からのＰＰ１３遺伝子を含むゲノムＤＮＡサンプルを提供するステップと；
（ｂ）ＰＰ１３遺伝子における１又はそれ以上の変異の存在について前記ＤＮＡを解析するステップと；
（ｃ）前記変異の存在に基づいて母親のリスクを判定するステップとを含む、胎児の母親が妊娠中に子癇前症にかかるリスクの判定方法が提供される。
【００１９】
よく知られているように、ＰＰ１３の主要な源である胎盤の遺伝子型は胎児の遺伝子型に由来する。従って、胎盤のゲノム中のＰＰ１３遺伝子に変異が存在するリスクがあるかどうかを判定するためには、胎児の両親または兄弟姉妹の遺伝子型の判定またはハプロタイプの構築および解析、遺伝様式の調査、遺伝様式の調査（母親から子へ）、インプリンティングの証拠の同定、およびその他の遺伝的分析法を行うことが十分である。従って、本発明の方法における胎児に血縁のある個人は以下の、
（ａ）胎児の母親、または彼女の母親または父親；
（ｂ）胎児の父親、または彼の母親または父親；
（ｃ）胎児の兄弟姉妹、または胎児の父親もしくは母親の兄弟姉妹（陰性結果は確実ではないが）；
（ｄ）妊娠もしくは双生児妊娠の胎盤、または母親の以前の妊娠の胎盤；および
（ｅ）胎児それ自身；
の１又はそれ以上から選択されてよい。上記のことからゲノムＤＮＡサンプルは母親の妊娠前に提供されてよいことが理解され、従って母親の妊娠中と同様、受胎前の助言も可能になる。
【００２０】
ＰＰ１３遺伝子は、全血からのＤＮＡ抽出およびＰＣＲによる増幅に続くＭｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＳＳＣＰ／ヘテロ二本鎖分析によるスクリーニング、またはその他の関連技術のような、当業の標準的な方法を用いて解析されてよい。
【００２１】
ＰＰ１３遺伝子内の変異は、妊婦におけるＰＰ１３の表現型に影響を与える、すなわちサイレント変異ではないことが予想され得る。例えば、以下のＰＰ１３のパラメータ：
（ａ）女性の身体物質において測定されるＰＰ１３の発現レベル；
（ｂ）発現するアミノ酸配列の発現の正確さ、例えば、起こり得る１又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失、反復または置換；
（ｃ）翻訳後のプロセシング、すなわち糖鎖付加、リン酸化、メチル化など；
（ｄ）輸送、すなわちエンドソームのような、胎盤環境におけるＰＰ１３の再配置；
（ｅ）着床、母親の動脈の調節、細胞外マトリックス内の糖残基への結合、胎盤内でのカルシウム代謝、リゾホスホリパーゼ活性、リン脂質の放出またはプロスタグランジンの上昇に関する機能喪失；および
（ｆ）上記に関わる機能獲得。
の１又はそれ以上が影響され得る。
【００２２】
ゲノム変異の例は、
・エクソンまたはイントロン内のフレームシフト変異；
・ＬＧＡＬＳ１３遺伝子の発現レベル、構造、プロセシング、輸送、またはプロモータバリアントの転写活性をアッセイするための基本的なルシフェラーゼレポータの使用を含む複数の方法により評価される活性に影響し得る、前記遺伝子のプロモータまたは他のいずれの調節エレメントにおけるいずれの変異；
・ＬＧＡＬＳ１３またはその１９番染色体上の遺伝子座の機能、またはＰＰ１３に関連する全ての染色体の機能を損ない得る、いずれの拡張可能な反復変異；
・後のＲＮＡスプライシングまたはその他の現象に影響し得る、イントロン領域におけるいずれの伸展；
・ヘテロ接合性欠失（ＬＯＰ）を導き、かつ遺伝様式を変化させるいずれの変異；
・脆弱な遺伝子領域を導き得る反復変異、またはその他の切断変異；
・反転、転位、またはその他の作用に関する染色体変異；
・エクソン、またはイントロンレベルにおける単一ヌクレオチド点変異（ＳＮＩＰＳ）；
・メチル化による遺伝子の全体的制御；および
・反転、転位などに関する変異；
等を含んでよい。
【００２３】
変異のタイプは、女性が子癇前症にかかるリスクにあるかどうかだけでなく、どのタイプの子癇前症にかかるリスクにあるかを判定するために使用できる。例えば、早発性の子癇前症にかかった女性にみつけられた一フレームシフト変異は２２２ｄｅｌＴ／Ｌ７４Ｗと名付けられた。この変異のＤＮＡ配列（配列番号１１）を図７に示す。この変異においてはｂｐ＃２２２（＝Ｔ）が欠失し、そのためにアミノ酸＃７４がＬからＷに変化している。図８Ｃ（配列番号１）に示すように、この変異は末端に変化をもたらし、かつ切断されたＰＰ１３分子の１０１アミノ酸の産生をもたらす。従って、２２２ｄｅｌＴ／Ｌ７４Ｗタイプのフレームシフト変異の存在は早発性の子癇前症にかかる増大したリスクを示す。同様に、ＰＰ１３遺伝子のその他の変異が同定されてよく、これは子癇前症の特異的なタイプと関連してよい。本発明はまた、誘導、発現、およびＤＮＡからＲＮＡを通して機能性／機能障害性タンパク質を導く下流ステップを調節し得る、ＬＧＡＬＳ１３遺伝子のいずれの調節性領域（プロモータを含む）の同定を含む。
【００２４】
本発明の方法に従い、変異の存在に基づいて母親が子癇前症にかかるリスクを判定するためのアルゴリズムが開発されてよい。例えば、ＰＰ１３遺伝子内の特定の変異について両親共にホモ接合性である場合、胎児もまた１００％の確率で前記変異を有し得ることから、母親が前記変異の同一性に基づいた子癇前症の特定のタイプにかかるリスクが判定できる。別のケースでは、ＰＰ１３遺伝子内の特定の変異について両親共にヘテロ接合性である場合、胎児は２５％の確率で前記変異を有し得ることから、母親が前記変異の同一性に基づいた子癇前症の特定のタイプにかかるリスクが判定できる。前記アルゴリズムはまた、解析に影響するいずれの特異的な遺伝様式、またはインプリンティングを考慮してよい。
【００２５】
本発明の別の態様によれば、
（ａ）母親の身体物質由来のＰＰ１３分子のサンプルを提供するステップと；
（ｂ）前記ＰＰ１３分子の構造を決定するステップと；
（ｃ）前記ＰＰ１３分子の構造に基づき女性のリスクを判定するステップとを含む、妊婦が子癇前症にかかるリスクの判定方法が提供される。
【００２６】
身体物質の限定されない例は、母親の血液、母親の唾液、母親の尿、羊水、臍帯血、絨毛膜絨毛、および胎盤組織を含む。
【００２７】
本発明の一態様によれば、ＰＰ１３分子はＰＰ１３タンパク質であり、ＰＰ１３分子の構造はＰＰ１３分子の分子サイズまたはアミノ酸配列である。ＰＰ１３タンパク質の構造は例えば、平均的な当業者に公知の免疫学的に、またはタンパク質化学により決定されてよい。例えば、天然野生型ＰＰ１３および／または特定の変異ＰＰ１３タンパク質に対する特異的な抗体が、天然ＰＰ１３および／または変異ＰＰ１３それぞれの存在を決定するために使用されてよい。
【００２８】
本発明のこの態様の別の実施形態において、ＰＰ１３分子はＰＰ１３のｍＲＮＡまたはこれに対応するｃＤＮＡであり、ＰＰ１３分子の構造はＰＰ１３のｍＲＮＡまたはこれに対応するｃＤＮＡの配列である。ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの配列は、ＰＣＲ増幅のような当業における標準法を用いて決定されてよい。
【００２９】
本発明のこの態様の別の実施形態において、ＬＧＬＡＳ１３のＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡにおける多型性は、
ａ．指定されたマイクロチップと、以下の全てのタイプ：ＳＮＩＰＳのアイソフォーム、フレームシフト変異、マイクロサテライトまたはフットプリントまたはプロモータ活性化／抑制化またはＲＮＡスプライスまたは上に列挙したようなその他のいずれの変異の形とのオーバーレイ；
ｂ．上に列挙したような患者の組織または体液との反応；
ｃ．蛍光、比色、ランタニド、またはその他のいずれの検出法および／または増幅光学法（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｖｉｓｕａｌ  ｍｅｔｈｏｄ）による変異の存在およびその性質の検出；および
ｄ．シグナルプロセシングのソフトウェアおよび解釈；
に対して使用される。
【００３０】
本発明の以前の態様にあるように、女性が子癇前症にかかるリスクは変異ＰＰ１３分子の同一性に依存し得る。例えば、変異ＰＰ１３分子がフレームシフト変異の結果として見出される場合、これは子癇前症、あるケースでは特定のタイプの子癇前症にかかるリスクを示していると考えられる。上記の２２２ｄｅｌＴ／Ｌ７４Ｗ変異の例を上げると、ｍＲＮＡがこのような欠失をもつと判定することは、早発性の子癇前症にかかるリスクを示していると考えられる。以下に述べるように本発明の発明者は、上記の変異遺伝子によりコードされるＰＰ１３由来のポリペプチドの単離に成功した。さらに、天然野生型ＰＰ１３に対する特異的なモノクローナル抗体は変異ＰＰ１３ポリペプチドを認識しないことが示された。従って、変異ＰＰ１３に対する特異的な抗体が調製されてよく、早発性の子癇前症にかかるリスクを判定するための変異分子を同定するために使用されてよい。
【００３１】
ＰＰ１３分子内の可能な変異の別の例は、選択的スプライシングによる変異である。ＰＰ１３遺伝子は３個のイントロンにより連結された４個のエクソンよりなる。天然ＰＰ１３分子の転写においてイントロンは切除され、続いてエクソンがスプライスされて、図５（配列番号６）に示される１３９アミノ酸のＰＰ１３タンパク質をコードするｍＲＮＡを生じる。しかしながら選択的スプライス部位におけるスプライシングは、天然の長さとは異なる長さのＰＰ１３タンパク質をコードする、ＲＮＡのスプライスバリアントを生じる。このような変異の一例にΔＥＸ−２スプライスバリアントがあり、これは図６（配列番号２）に見られ得るように大部分のエクソン２、およびエクソン３の小部分を欠損している。結果として１３９に代わり１０９アミノ酸のタンパク質を生じる（図６、８Ｂ）。このスプライスバリアントは、遅発性の子癇前症にかかった女性由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得られた。従って、ΔＥＸ−２スプライスバリアントの存在の決定により、遅発性の子癇前症にかかる増大したリスクを示すことができる。
【００３２】
本発明のさらなる態様において、変異ＰＰ１３タンパク質バリアントが提供される。バリアントを生じる変異は様々なタイプであってよく、フレームシフト変異、点変異、染色体変異、および選択的スプライシングによる変異を含む。
【００３３】
本発明のこの態様の一実施形態において、以下の変異：
（ａ）ａ−９８Ｃ／Ａ置換［ｒｓ３７６４８４３］；
（ｂ）ＩＶＳ２−２２（Ａ／Ｇ）［ｒｓ２２３３７０６］；
（ｃ）ＩＶＳ２−３６（Ａ／Ｇ）；
（ｄ）２２２ｄｅｌＴ／Ｌ７４Ｗ；および
（ｅ）ΔＥＸ−２
のうち１又はそれ以上が除外される。
【００３４】
本発明のこの態様の別の実施形態において、バリアントはＩＶＳ２−３６（Ａ／Ｇ）、２２２ｄｅｌＴ／Ｌ７４Ｗ（配列番号１）またはΔＥＸ−２（配列番号２）からなる群より選択される。
【００３５】
本発明のこの態様はまた、前記バリアントに特異的に結合する抗体、前記バリアントをコードする核酸配列およびこれらの配列を含むベクタを含む。
【００３６】
本発明のさらなる態様によれば、
（ａ）ホスト細胞内にＰＰ１３バリアントを発現させるステップと；
（ｂ）前記ホスト細胞を破壊して細胞の内容物を遠心分離するステップと；
（ｃ）遠心分離されたペレットを、高濃度の変性剤を含む緩衝液中に再懸濁するステップと；
（ｄ）再懸濁ペレットを、ＰＰ１３を結合できるアフィニティカラムにロードするステップと；
（ｅ）前記アフィニティカラムを変性剤の勾配により洗浄するステップと；
（ｆ）カラムよりＰＰ１３を可溶型で溶出するステップと；
を含む、変異ＰＰ１３タンパク質バリアントを可溶型で精製する方法が提供される。
【００３７】
細菌ホスト内に外来性タンパク質を発現させることにより、発現されたタンパク質がしばしば「封入体」中の不溶性の形で産生されることはよく知られている。このことは要求されるタンパク質が、有用な可溶性の形で産生されることを妨げる。このことはまた、ＰＰ１３の様々なタンパク質バリアントの発現に対しても事実であった。ここで本発明は、可溶性タンパク質を得るためのバリアントの精製法を見出した。前記方法では尿素の使用が例示されているが、塩酸グアニジンのようなその他のタンパク質変性剤も使用されてよい。
【００３８】
本発明のその他の態様は、体外受精または体外診断またはライブ（ｌｉｖｅ）、または体外予後診断または治療の成功へと応用された、ＰＰ１３のレパートリをそれ自体において、または子癇前症との関連において多様化し得る発現、活性様式、または子孫への伝達過程またはその他の方法のいずれかを調節するための手段として、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡまたは低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡまたは（ｍｉ）ＲＮＡを含むがこれらに限定されないＲＮＡによる手段の使用を含む。
【００３９】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法における使用のための診断キットを含む。このようなキットは、
ａ．ＰＰ１３天然遺伝子の特定のゲノム配列および／またはその変異配列に対するＤＮＡプローブを含む、女性が子癇前症にかかるリスクの判定方法において使用するためのキット
ｂ．ＰＰ１３天然配列および／またはその変異配列に対する抗体を含む、女性が子癇前症にかかるリスクの判定方法において使用するためのキット
ｃ．ＰＰ１３天然ｍＲＮＡの特定の配列および／またはその変異配列に対するＲＮＡプローブを含む、女性が子癇前症にかかるリスクの判定方法において使用するためのキット
ｄ．ＰＰ１３のｃＤＮＡの特定の配列および／またはその変異配列に対するＤＮＡプローブを含む、女性が子癇前症にかかるリスクの判定方法において使用するためのキット
ｅ．ＰＰ１３のｃＤＮＡまたはＲＮＡの特定の配列および／またはその変異配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡチップを含む、女性が子癇前症にかかるリスクの判定方法において使用するためのキット
を含んでよい。
【００４０】
本発明に従い、ＬＧＡＬＳ１３遺伝子は以下の分析方法：
（ａ）バイオインフォマティクス
ｉ）プロモータ予測
ｉｉ）系統的保存／フットプリント
ｉｉｉ）多型性スペクトル（ＳＮＰ、マイクロサテライトなど）
（ｂ）遺伝的変異のスクリーニング
ｉ）民族的な頻度
ｉｉ）ハプロタイプの構築および分析
ｉｉｉ）初期妊娠損失（すなわちＰＯＣ）の頻度−（？生存率への影響）
（ｃ）伝達についての研究
ｉ）伝達様式の調査（母から子へ）
ｉｉ）インプリンティングの証拠
（ｄ）メチル化についての研究
ｉ）遺伝子の全体的制御についての調査
（ｅ）選択されたＬＧＡＬＳ１３配列バリアントの性質決定
（ｆ）鋳型のゲノム性質の完全決定
（ｇ）調査された拡張イントロン領域
（ｈ）マイクロサテライトのような多型性マーカーが利用できる場合、エクソン２のＬＯＨについての探索
（ｉ）「タイプ」２２２ｄｅｌＴバリアントに対する対立遺伝子特異的アッセイの開発
（ｊ）２２２ｄｅｌＴバリアントおよびその他のいずれの可能性のある切断バリアントを同定するためのＰＴＴの使用の検討
（ｋ）エクソン３における配列バリアント［可能な遺伝子変換現象］の特徴付けにはどの方法が最も適するかについての調査
（ｌ）ＲＮＡの抽出および調製
（ｍ）ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）へのクローニング
ｉ）ＰＣＲおよびゲル精製
ｉｉ）Ａ−テーリング
ｉｉｉ）ライゲーション
ｉｖ）コンピテント細胞の調製
ｖ）形質転換
ｖｉ）クローン選択
ｖｉｉ）ミニプレップ
（ｎ）ｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃルシフェラーゼレポータ（プロモータバリアントの転写活性のアッセイのため）
ｉ）ベクタの調製（消化、精製、脱リン酸化、ライゲーション）
ｉｉ）形質転換
ｉｉｉ）マキシプレップ
（ｏ）バリアントおよび野生型対立遺伝子を表すコンストラクト［ルシフェラーゼレポータベクタ中の］が、ＦｕＧｅｎｅ  ６をトランスフェクション試薬として用い、変化した転写活性について調査され得る。
（ｐ）細胞培養
（ｑ）トランスフェクトされた細胞は、回収前に外部刺激［例えば不定のエストロゲン濃度、一過性の低酸素など］を受け、発光法によりルシフェラーゼ活性について分析される。
（ｒ）自動シークエンス（クローンの確認、メチル化状態など）
（ｓ）定量的調査はエクソンバリアントの解析（ミニ遺伝子システムによる）を含むが、リアルタイムＰＣＲは、４個の同定されたイントロン配列バリアントが遺伝子のスプライシングに影響するか否かについての調査に使用され得る。
（ｔ）統計解析
の１又はそれ以上により特徴付けられてよい。
【００４１】
本発明のその他の態様は、以下の詳細な記述により明らかになり得る。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
本発明の理解のため、およびそれが実際にはどのように実行され得るかを理解するために、ここで好ましい実施形態をそれに限定されない例としてのみの目的で、付随する図への参照と共に記述する。
【００４３】
【図１】図１は、変異ＰＰ１３分子がＰＰ１３遺伝子からどのように生じるかを例示する模式図である。
【図２】図２は、クローニングおよび大腸菌での発現により、ＰＰ１３タンパク質が変異ｃＤＮＡからどのように調製されるかを例示する模式図である。
【図３】図３は、ＰＰ１３の天然および変異バリアントにより作られるバンドを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図４】図４Ａ，４Ｂ，および４Ｃは、特異的な抗ＰＰ１３抗体（４Ａおよび４Ｂ）またはコントロールの抗ヒスチジン抗体（４Ｃ）を用いた、ＰＰ１３の天然または変異バリアントに対する抗体希釈の作用を表す抗体結合のプロットである。
【図５】図５は、天然組み換えＰＰ１３（ｒＰＰ１３）のＤＮＡ（配列番号３および４）およびアミノ酸（配列番号５−８）配列である。
【図６】図６は、ΔＥＸ−２ＰＰ１３スプライスバリアントのＤＮＡ（配列番号９および１０）およびアミノ酸（配列番号２）配列である。
【図７】図７は、２２２ｄｅｌＴ／Ｌ７４Ｗ変異のＤＮＡ（配列番号１１）配列である。下線で示すヌクレオチドの間にＴの欠失が生じる。
【図８】図８Ａ，８Ｂ，および８Ｃは、天然ｒＰＰ１３（配列番号６）、ΔＥＸ−２ＰＰ１３バリアント（配列番号２）および２２２ｄｅｌＴ／Ｌ７４Ｗバリアント（配列番号１）それぞれのアミノ酸配列である。後者のバリアントにおける欠失は、末端領域（下線で示す）から終止コドン（＃）までに２８の新規アミノ酸を作り出すフレームシフトの原因となる。
【図９Ａ】図９は、８０例の初期（＜妊娠期間（ＧＡ）３４週）の子癇前症および〜１００のコントロールからなる初妊婦の南アフリカコホートにおける多型性の解析であり、図９Ａは多型性頻度の解析である。３個の新規なＳｅｒ；３個の欠失した、および２個の新規なＣｙｓ；除去されたＥ７５ＣＨＯ結合部位。
【図９Ｂ】図９は、８０例の初期（＜妊娠期間（ＧＡ）３４週）の子癇前症および〜１００のコントロールからなる初妊婦の南アフリカコホートにおける多型性の解析であり、図９Ｂは、エクソン３．１ＳＳＣＰ／ヘテロ二本鎖のゲルである。３個の新規なＳｅｒ；３個の欠失した、および２個の新規なＣｙｓ；除去されたＥ７５ＣＨＯ結合部位。
【図９Ｃ】図９は、８０例の初期（＜妊娠期間（ＧＡ）３４週）の子癇前症および〜１００のコントロールからなる初妊婦の南アフリカコホートにおける多型性の解析であり、図９Ｃは、ｄｅｌＴ２２２／−電気泳動図である。３個の新規なＳｅｒ；３個の欠失した、および２個の新規なＣｙｓ；除去されたＥ７５ＣＨＯ結合部位。
【図９Ｄ】図９は、８０例の初期（＜妊娠期間（ＧＡ）３４週）の子癇前症および〜１００のコントロールからなる初妊婦の南アフリカコホートにおける多型性の解析であり、図９Ｄは、ｄｅｌＴと野生型とのアラインメントである。３個の新規なＳｅｒ；３個の欠失した、および２個の新規なＣｙｓ；除去されたＥ７５ＣＨＯ結合部位。
【図９Ｅ】図９は、８０例の初期（＜妊娠期間（ＧＡ）３４週）の子癇前症および〜１００のコントロールからなる初妊婦の南アフリカコホートにおける多型性の解析であり、図９Ｅは、野生型遺伝子に対する様々な変異体の相対的な位置である。３個の新規なＳｅｒ；３個の欠失した、および２個の新規なＣｙｓ；除去されたＥ７５ＣＨＯ結合部位。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
１．２２２ｄｅＩＴ／Ｌ７４ＷおよびΔＥＸ−２ＰＰ１３バリアントのクローニング、発現および精製（図２）
【００４５】
Ａ．２２２ｄｅｌＴ／Ｌ７４Ｗ変異バリアントのためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
【００４６】
ＰＰ１３遺伝子の多型性解析、および多型性の発生と子癇前症の発生との関連に基づいて２２２ｄｅｌＴ７Ｌ７４Ｗ（ここでは切断型とも称される）の配列をＰＣＲ技術により作製するため、野生型ＰＰ１３の配列（図５）を鋳型として使用した。２個のプライマが以下の配列：センスプライマ：ＣＧＡＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＡＣＣＣＧＴＧＣ（配列番号１２）およびアンチセンスプライマ：ＴＡＡＧＴＣＧＡＧＣＴＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＣＡＣ（配列番号１３）、によりデザインされた。
【００４７】
センスおよびアンチセンスプライマそれぞれに、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩの制限酵素部位の配列が導入された。プライマは両者ともＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓにより合成された。
【００４８】
切断型ＰＰ１３ＤＮＡの配列を増幅するため、１ｎｇの野生型ＰＰ１３ＤＮＡ（プラスミド中）を鋳型として使用した。０．１−１μＭの上記の特異的プライマ、１ＵのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２００μＭ  ｄＮＴＰミックスおよびＰｆｕＤＮＡポリメラーゼＸ１０バッファを使用した。ＰＣＲを以下の高温サイクル：９４℃２分、９４℃３０秒、６０℃３０秒および７２℃１分、３５を超えるサイクル、において行った。最終伸長を７２℃４分で行い、アガロースゲルによる分析で予想された２８８ｂｐのサイズが明らかになったＰＣＲ産物を、使用まで４℃で保存した。
【００４９】
Ｂ．ΔＥＸ−２バリアントのためのＰＣＲ
【００５０】
子癇前症の胎盤由来のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、ＰＰ１３のエクソン２が欠失した（ここではスプライス型とも称される）配列（３０アミノ酸の欠失）が明らかになった。欠失型ＰＰ１３バリアントのヌクレオチド配列解析に基づき、完全長ＤＮＡの隣接部位に対する一組のプライマをデザインした。２個のプライマが以下の配列：センスプライマ：５’−ＣＧＡＴＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＡＣＣＣＧＴＧＣ−３’（配列番号１４）およびアンチセンスプライマ：５’−ＴＡＡＧＴＣＧＡＧＣＴＣＡＴＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＴＧＡＧＧ−３’（配列番号１５）、によりデザインされた。プライマは両者ともＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓにより合成された。
【００５１】
欠失型ΔＥＸ−２ＰＰ１３ＤＮＡの配列を増幅するため、１ｎｇの欠失型ＰＰ１３ＤＮＡを鋳型として使用し、０．１−１μＭの上記の特異的プライマ、１ＵのＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２００μＭのｄＮＴＰミックスおよびＰｆｕＤＮＡポリメラーゼＸ１０バッファを使用した。ＰＣＲを以下の高温サイクル：９４℃２分、９４℃３０秒、５５℃３０秒および７２℃１分、３５を超えるサイクル、において行った。最終伸長ステップを７２℃４分で行い、アガロースゲルによる分析で予想された３３８ｂｐのサイズが明らかになったＰＣＲ産物を、使用まで−２０℃で保存した。得られたＰＣＲ断片をｐＵＣ５７−Ｔクローニングベクタ（Ｔ−Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＃１２１２ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓｅ）に挿入し、インサートを含むクローンを選択し、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（レホボト、イスラエル）のＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓにおいて自動ＤＮＡシークエンシングによりシークエンスした。
【００５２】
２．−切断型およびスプライス型ＤＮＡの発現ベクタ中へのクローニング
【００５３】
Ａ−ライゲーション：切断型およびスプライス型ＰＰ１３ＤＮＡのＰＣＲ産物を、ライゲーションに先立ちＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて精製した。精製されたＰＰ１３ＤＮＡ産物（１μｇ）および発現ベクタｐＱＥ３０（０．５μｇ、Ｑｉａｇｅｎ）を、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ（各２０Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ−ＮＥＢ）により、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ＢａｍＨＩ中およびＮＥＢｕｆｆｅｒ  ＳａｃＩ中でそれぞれ消化した。消化したＰＣＲ産物ＤＮＡと５０ｎｇの消化したｐＱＥ−３０の、１００ＵのＴ４リガーゼ（ＮＥＢ）およびＴ４リガーゼ緩衝液を用いた２時間２２℃によるライゲーションのために、３：１，１：１および１：３のインサート：ベクタの比を使用した。
【００５４】
Ｂ−形質転換：Ｍ１５（ｐＲＥＰ４）細胞（Ｑｉａｇｅｎ）をライゲーション混合物により形質転換した。１０μｌのライゲーション混合物を１００μｌのコンピテントＭ１５（ｐＲＥＰ４）細胞に加えて１０分間氷中に置き、その後４２℃の水槽に５０秒間移した。熱ショックの後、混合物を氷上にさらに２分間置き、９００μｌのＬＢ培地を形質転換反応に加え、約２２５ｒｐｍにて振とうしながら３７℃で６０分間インキュベートした。１０−１００μｌの細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）および２５μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＬＢ寒天プレートにまき、３７℃で一晩培養した。
【００５５】
Ｃ−陽性コロニのスクリーニング：プレート上で増殖した２０個の単一コロニを採取し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（μｇ／ｍｌ）を含む２ｍｌのＬＢ培地中で、２２５ｒｐｍにて振とうしながら３７℃で、一晩培養した。各コロニ培養からプラスミドＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により精製した。ＰＰ１３ＤＮＡインサートの存在を、ＰＣＲにより以下：１ｎｇのＤＮＡ鋳型、０．１−１μＭの切断型ＰＰ１３およびスプライス型バリアントに特異的な各プライマ、および１０ｍｌのＰＣＲ用ｘ２  ｒｅａｄｙ  ｍｉｘ  （Ｂｉｏ−Ｌａｂ  Ｌｔｄ）から構成されるＰＣＲ反応（２０μｌ量）、のように試験した。ＰＣＲの条件は上記の通りである。ＰＣＲ産物は１．５％アガロースにおいて分離し、ＤＮＡバンドはＬＡＳ−３０００  ｉｍａｇｅ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｆｕｊｉ）により可視化した。ＰＣＲ産物の算出されたサイズに従い、可能性のある陽性クローン（４）を選択した。各クローンの最終的なＤＮＡ配列は、ｍｕｌｔｉ−ｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｕｎｉｔ  （Ｒａｐｐａｐｏｒｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  -  Ｔｅｃｈｎｉｏｎ、ハイファ）において行なわれたシークエンシングにより決定された。
【００５６】
３．−切断型およびスプライス型ＰＰ１３の発現
【００５７】
確認された配列解析に基づいて１個の陽性クローンがタンパク質発現のために選択され、アンピシリンおよびカナマイシンを含む２０ｍｌのＬＢ培地中に、振とうしながら３７℃、一晩で植菌した。培養物を１：５０にて抗生剤を含むＬＢ培地中に混合し、３７℃でＯＤ６００が０．６になるまで増殖させた。タンパク質の発現は、１ｍＭのイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド−ＩＰＴＧにより、３時間誘導した。細菌細胞は、４℃における４０００ｇｘ２０分の遠心分離により回収した。細胞ペレットは、使用まで−８０℃で保存した。組み換えタンパク質の分子量を決定するため、一定分量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により試験した。
【００５８】
４．切断型およびスプライス型ＰＰ１３の精製
【００５９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づき、組み換え体の切断型ＰＰ１３を封入体中にトラップされるように局在させた。可溶性ポリペプチドを得るために用いられた方法は、以下の通りである。
【００６０】
細胞ペレットを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、およびプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）、１０％グリセロールを含む溶解緩衝液に再懸濁し、０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）と共に４℃で１時間インキュベートした。細胞は氷上で２００Ｗ、６ｘ１０秒の超音波処理により破壊するか、あるいはｍｉｎｉｃｅｌｌ  Ｆｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓ  （Ｔｈｅｒｍｏ）中で１０００ＰＳｉの圧力を適用することにより破壊した。可溶性タンパク質を廃棄し、封入体（０．７５ｇｒ）を含むペレットを結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、６Ｍ尿素、ＰＭＳＦ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（プロテアーゼ阻害剤−Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１０％グリセロール）中に再懸濁した。室温での１時間のインキュベーションの後、２０，０００ｇにおける２０分間の遠心分離（ＳＳ３４ローター、Ｓｏｒｖａｌ−ＲＣ）により不溶性タンパク質を廃棄した。可溶性の画分を０．４５μｍポアサイズのフィルタに通してろ過し、室温で予め１時間平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）１ｍｌと混合した。結合した組み換え体の切断型ＰＰ１３のリフォールディングは、段階的線形（ｓｔｅｐ−ｗｉｓｅ  ｌｉｎｅａｒ）の６−０Ｍ尿素勾配を用いたカラム上で行なった。最初にＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムを１０ｍｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、６Ｍ尿素、ＰＭＳＦ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１０％グリセロール）で洗浄し、続いて前記カラムを１０ｍｌのリフォールディング緩衝液（４，２，１，０．５および０Ｍ尿素を含む洗浄緩衝液）で洗浄した。結合した組み換え体ＰＰ１３を、５ｍｌの溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５Ｍイミダゾール、ＰＭＳＦ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１０％グリセロール）により溶出した。組み換え体の切断型ＰＰ１３タンパク質をＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ−８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して透析し、同量の６０％グリセロールを含んだＴＢＳで希釈し、使用までに−８０℃で保存した。タンパク質の濃度をブラッドフォードアッセイにより決定し、さらなる分析のために−２０℃で保存した。
【００６１】
５．組み換え体の切断型およびスプライス型ＰＰ１３バリアントの性質決定
【００６２】
Ａ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【００６３】
組み換え体の切断型およびスプライス型ＰＰ１３バリアント（１−５μｇ）を５％β−メルカプトエタノール存在下でサンプル緩衝液に再懸濁し、９５℃で５分間煮沸した。タンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、１２０ボルトで約２時間分離した。タンパク質バンドの可視化のため、ゲルをＨ２Ｏで分間洗浄し、ＧｅｌＣｏｄｅ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）により１時間染色した。染色されたＰＰ１３が十分に明瞭になるまで、微量の染色試薬をＨ２Ｏによる数回の洗浄によって除去した。ＰＰ１３タンパク質バリアントのおおよその分子サイズを標準タンパク質の分子量により決定した。前記標準タンパク質を同じゲルにて平行に分離し、そのアミノ酸組成に基づいて算出したタンパク質の分子サイズと比較した。ゲルを図３に示す。
【００６４】
天然の野生型ＰＰ１３の分子サイズは最大（約１６−１７ｋＤａ）で、スプライス型（約１４−１５ｋＤａ）および切断型（約１２−１３ｋＤａ）バリアントがそれに続くことが観察され得る。
【００６５】
Ｂ．酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
【００６６】
ＥＬＩＳＡ試験は、抗ＰＰ１３モノクローナル抗体による切断型組み換えＰＰ１３の認識を試験するために使用した。簡単に述べると、マイクロプレートウェルに１−１０μｇ／ｍｌの組み換え野生型、切断型およびスプライス型のＰＰ１３を３７℃で２時間コーティングし、続いて非制限の結合部位を炭酸緩衝液中の１％ウシ血清アルブミン−ＢＳＡにより１時間ブロッキングした。コーティングされたタンパク質は、段階希釈した以下のモノクローナル抗体：クローン２７−２−３、２１５−２８−３、および５３４−１６、および抗ヒスチジン（コントロール）、と共に４℃で、一晩インキュベートした。非結合抗体は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝食塩水で洗浄した。続いてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧを結合抗体の検出に使用し、ＨＲＰの基質としてＴＭＢを用いた。得られた酵素産物の吸光度をＥＬＩＳＡリーダーにより、６５０ｎｍにおいて測定した。３０分後に反応を停止させ、吸光度を４５０対６５０ｎｍにおいて再測定した。結果を図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃに示す。
【００６７】
野生型ＰＰ１３は特異的抗ＰＰ１３抗体に反応するが、切断型およびスプライス型バリアントは反応しないことが観察され得る（図４Ａおよび４Ｂ）。全てのＰＰ１３タンパク質は、コントロール抗ヒスチジン抗体に反応した（図４Ｃ）。このことは、最初の３ヶ月間において、子癇前症の高いリスクをもつ女性の身体物質中のＰＰ１３の測定量は低いという観察に対する説明となる。
【００６８】
Ｃ．ドットブロット分析
【００６９】
野生型、切断型およびスプライス型ＰＰ１３をニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏｒａｄ）に吸収させ、非制限の結合部位をトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ８．０中の５％ミルクで１時間ブロッキングした。メンブレンを抗ＰＰ１３モノクローナル抗体（クローン２７−２−３、２１５−２８−３、および５３４−１６）と共に３７℃で２時間インキュベートし、遊離の抗体をＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。結合した抗ＰＰ１３抗体の検出のため、二次抗体であるＨＲＰ酵素結合ヤギ抗マウスＩｇＧをメンブレンに添加し、室温（ＲＴ）で９０分間インキュベートした。続いて、遊離の過剰な抗体を上記の洗浄により廃棄した。高感度化学発光（ＥＣＬ）試薬をＨＲＰの基質として使用することによりシグナルを可視化、捕獲し、ＬＡＳ３０００  ＩＭＡＧＥ  ＳＹＳＴＥＭ（ＦＵＪＩ）を用いて分析した。
【００７０】
Ｄ．２２２ｄｅｌｔＴ７／Ｌ７４Ｗ変異
【００７１】
以下、２２２ｄｅｌｔＴ７／Ｌ７４Ｗ変異の同定および分析について、図９Ａ−９Ｅへの参照と共に記載する。
【００７２】
ＰＣＲのためのイントロンのオリゴヌクレオチドプライマを、４個の各ＬＧＡＬＳ−１３遺伝子エクソンの隣接部位、同様に５’および３’非翻訳領域の短い部分の隣接部位に対してデザインした。産生した各アンプリコンを、Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＳＳＣＰ／ヘテロ二本鎖分析に供した（図９Ｂ）。さらに、立体構造バリアントを自動シークエンシングにより、かつそれが適切な場合には制限酵素分析により特徴付けた。イントロンバリアントの遺伝子型を、初妊婦患者の小グループ内で同定した（ｎ＜２０）。
【００７３】
同定された欠失をさらに、早期（ＧＡ＜３４週）の子癇前症にかかった初妊婦患者、その乳児、および健康な母親および血縁のない新生児を含む〜１００個人の対応するコントロール群による大きなコホート（ｎ＞８０）内で特徴付けた。分析結果を以下の表に要約する（図９Ａ）。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
このコホート内で４個の配列バリアントが同定された。大部分の子癇前症患者はＰＰ１３遺伝子内に１−２の変異を有していた。中でも切断型ＰＰ１３に付随する２２２ｄｅｌｔＴ／Ｌ７４Ｗ変異は、子癇前症の６％（コントロール内での１％に比べ、ヘテロ接合体の５％、およびホモ接合体の１％）、およびその乳児の８％（コントロール内での４％に比べ）に見出され、早期（ＧＡ＜３４週）子癇前症対コントロールの間の比較的高い比率、および新生児への伝達経路に対する推定される父性の寄与が推測された。
【００７６】
エクソン２のスプライスバリアント（変異ＩＶＳ２−２２Ａ＞ＧおよびＩＶＳ２−３６Ａ＞Ｇ））の発生に決定的であり得るエクソン２および３の間での点変異は、子癇前症例のみ（各１５％および２８％）に見られ、かつヘテロ接合体の形のみであり、かつ新生児においてもやや高い頻度で検出される（各１９％および３７％）。
【００７７】
欠失（Ｔ）フレームシフト変異（２２２ｄｅｌｔＴ／Ｌ７４Ｗ）は子癇前症患者および子のエクソン３において検出され、数例において父性の寄与が推測された。前記変異は、野生型ＰＰ１３よりも３８または３７アミノ酸ほど短い、新規な２８または２７のＣ末端領域を作り出すと予想される。
【００７８】
変異体エクソン３．１ＳＳＣＰ／ヘテロ二本鎖を、野生型に対してゲルに流した（図９Ｂ）。変異体ｄｅｌＴ２２２／−は、電気泳動図（図９Ｃ）を用いて分析した。Ｌｇａｌｓ１３ｗｔおよびＬｇａｌｓ１３ｄｅｌＴのアミノ酸配列のアラインメントを図９Ｄに示す。ｄｅｌＴフレームシフトは、野生型ペプチドより３７ＡＡ短い新規な２７ＡＡ末端領域（下線で示す）を作り出す。図９Ｅは、野生型遺伝子に対する様々な変異体の相対的位置を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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