(57)【要約】  標的化学物質を生産するため、糖化とそれに続く発酵において使用される改善された前処理バイオマス生産物を生産するための方法が提供され、それは前処理バイオマス生産物からの糖化および／または発酵阻害因子の除去を含む。詳細には、本方法を用いて得られる前処理バイオマス生産物は、糖含有量の低下を伴わず、糖化および／または発酵阻害因子をほとんど含まない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
改善された前処理バイオマス生産物を調製するための方法であって、
ａ）バイオマスを備えるステップと、
ｂ）該バイオマスを適切な条件下でアンモニアを含有する水溶液と接触させ、バイオマス−水性アンモニア混合物を形成することによって前記バイオマスを前処理するステップであって、ここでアンモニアはバイオマス−水性アンモニア混合物のアルカリ性ｐＨを維持するのに少なくとも十分な濃度で存在するが、ここで該アンモニアはバイオマスの乾燥質量に対して約１２質量パーセント未満で存在し、またさらにここでバイオマスの乾燥質量はバイオマス−水性アンモニア混合物の質量に対して少なくとも約１５質量パーセントの高固体濃度であり、それにより前処理バイオマス固体生産物および１つもしくはそれ以上のインヒビター化合物を含むバイオマス前処理液が形成されるステップと、
ｃ）該バイオマス前処理液を移動させるステップと、
を含み、ここで前処理バイオマス固体生産物は低減された量のインヒビター化合物しか有せず、かつ糖含有物がごくわずかしか低下しない、方法。
【請求項２】
次の様式、すなわち
ｉ）ステップ（ｂ）の前
ｉｉ）ステップ（ｂ）における追加的成分として、または
ｉｉｉ）ステップ（ｂ）の後の洗浄ステップとして
の中の１つもしくはそれ以上において追加的水性成分を添加するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
追加的水性成分が蒸気、水、および緩衝液からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
水性成分が蒸気であり、かつステップ（ｂ）における追加的成分として添加され、ここで蒸気は前処理の間に部分凝縮し、バイオマス前処理液の一部を形成する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前処理バイオマス固体生産物を糖化し、発酵性糖を形成するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項５に記載の糖類を発酵し、標的化学物質を生産させるステップをさらに含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
液を移動させる方法が、排出、デカンティング、濾過、遠心分離、および押圧からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
バイオマス−水性アンモニア混合物のｐＨが８より大きい請求項１に記載の方法。
【請求項９】
バイオマスとアンモニアを含有する水溶液とを接触させる前に真空がバイオマスに適用される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
バイオマスの乾燥質量が、バイオマス−水性アンモニア混合物の質量に対して少なくとも約１５％〜約８０％の高固体濃度である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
バイオマスの乾燥質量が、バイオマス−水性アンモニア混合物の質量に対して少なくとも約１５％〜約６０％の高固体濃度である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アンモニアがバイオマスの乾燥質量に対して約１０質量パーセント未満で存在する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
アンモニアがバイオマスの乾燥質量に対して約６％以下の質量パーセントで存在する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
バイオマスが、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、工業固形廃棄物、工場廃棄物、木材および林業廃棄物からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
バイオマスが、スイッチグラス、紙くず、製紙汚泥、トウモロコシ粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシの皮、コーンストーバー、トウモロコシ繊維、草、小麦、麦かん、乾草、大麦、大麦わら、稲わら、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、穀物の加工から得られる成分、木、枝、根、葉、ウッドチップ、おがくず、低木およびブッシュ、野菜、果物、花、ならびに動物糞尿からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
バイオマスが、トウモロコシ穂軸、コーンストーバー、トウモロコシ繊維、トウモロコシの皮、サトウキビバガス、おがくず、スイッチグラス、麦かん、乾草、稲わら、および草からなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
バイオマスが、トウモロコシ穂軸、コーンストーバー、トウモロコシ繊維、おがくず、およびサトウキビバガスからなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
バイオマスが複数の供給原料から得られる請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
アンモニアが、アンモニアガス、水酸化アンモニウム、尿素、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
（ｂ）が約４℃〜約２００℃の温度で行なわれる請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
（ｂ）が約７５℃〜約１５０℃の温度で行なわれる請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
（ｂ）が９０℃より高く〜約１５０℃の温度で行なわれる請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
（ｂ）が最大で約２５時間行なわれる請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
（ｂ）が最大で約８時間行なわれる請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法によって生産される前処理バイオマス生産物。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法によって生産された前処理バイオマス生産物の糖化によって生産される加水分解物。
【請求項２７】
生体触媒を使用する請求項２６に記載の加水分解物の発酵によって生産される標的化学物質。
【請求項２８】
標的化学物質が、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロパンジオール、ブタンジオール、グリセリン、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、酢酸、乳酸、プロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、酪酸、グルコン酸、イタコン酸、クエン酸、コハク酸、レブリン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、メチオニン、リジン、グリシン、アルギニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、メタン、エチレン、アセトン、および工業用酵素からなる群から選択される請求項２７に記載の標的化学物質。
【請求項２９】
標的化学物質が、エタノール、ブタノール、およびプロパンジオールからなる群から選択される請求項２８に記載の標的化学物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利に関する声明
本発明は、エネルギー省によって授与された契約番号０４−０３−ＣＡ−７０２２４およびＤＥ−ＦＣ３６−０３ＧＯ１３１４６の下で、米国政府後援でなされたものであった。政府は本発明における特定の権利を有する。
【０００２】
糖化で使用される改善された前処理バイオマス生産物を生成し、高糖含有加水分解物を生産するための方法が提供される。詳細には、本方法を用いて得られる前処理バイオマス生産物は、糖化および／または発酵阻害因子（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）をほとんど含まない。
【背景技術】
【０００３】
農業残渣、木材廃棄物、林業廃棄物、製紙汚泥、および都市および産業固体廃棄物などのセルロース系およびリグノセルロース系の供給原料および廃棄物は、燃料および他の化学物質などの価値のある製品の生産を目的とした潜在的に大きい再生可能供給原料を提供する。セルロース、ヘミセルロース、グルカンおよびリグニンを含んでなる炭水化物ポリマーよりなる、セルロース系およびリグノセルロース系の供給原料および廃棄物は、一般に種々の化学的、機械的および酵素的手段によって処理されることで主にヘキソースおよびペントース糖が放出され、次いで有用な生産物に発酵されうる。
【０００４】
最初にバイオマス供給原料が処理され、糖化酵素に対するセルロース系およびリグノセルロース系材料の炭水化物ポリマーの使用がより容易になり得、それは典型的には前処理と称される。次いで、前処理バイオマスは糖化酵素の存在下でさらに加水分解され、加水分解物においてオリゴ糖および／または単糖が放出される。発酵性糖を前処理バイオマスから生産するのに使用される糖化酵素は、典型的には１つもしくはそれ以上のグリコシダーゼ、例えばセルロースを加水分解するグリコシダーゼ、ヘミセルロースを加水分解するグリコシダーゼ、および澱粉を加水分解するグリコシダーゼ、ならびにペプチダーゼ、リパーゼ、リグニナーゼおよび／またはフェルロイルエステラーゼを含む。バイオマス処理のための糖化酵素および方法については、非特許文献１にレビューされている。
【０００５】
バイオマスの前処理の間、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの異なる成分が放出される可能性があり、それは糖類および／または酢酸、ギ酸、レブリン酸、フルアルデヒドおよびフェノール化合物などの化合物を含む副生産物を含みうる。副生産物の一部は、糖化酵素の活性ならびに／またはその後の発酵において使用される微生物の成長および代謝に作用する点で阻害因子である。これらの阻害因子は、糖化および／または発酵工程の効率を低下させうる。例えば糖類の回収による予備加水分解物（ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｅ）の生成などの追加的ステップにより、前記阻害因子を除去するためのいくつかの試みがなされている。これらの手段は、経済的でなくかつ糖類の生産低下をまねくことから不十分である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｙｎｄ  Ｌ．Ｒ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００２年）６６：５０６−５７７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、糖類の最大の保持および阻害因子の最低限の存在を有する前処理バイオマスを別々の前処理糖の流れ（予備加水分解物）を形成せずに生産する前処理方法に対する需要が存在する。これは、有用な製品を生産するための糖化とその後の発酵に用いられるより経済的かつ有効な入力バイオマスを提供することになると思われる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、改善された前処理バイオマス生産物を調製するための方法であって、
ａ）バイオマスを提供するステップと、
ｂ）前記バイオマスを適切な条件下でアンモニアを含有する水溶液と接触させ、バイオマス−水性アンモニア混合物を形成することによって前記バイオマスを前処理するステップであって、ここでアンモニアはバイオマス−水性アンモニア混合物のアルカリ性ｐＨを維持するのに少なくとも十分な濃度で存在するが、ここで前記アンモニアはバイオマスの乾燥重量に対して約１２重量パーセント未満で存在し、またさらにここでバイオマスの乾燥重量はバイオマス−水性アンモニア混合物の重量に対して少なくとも約１５重量パーセントの高固形物濃度であり、それにより前処理バイオマス固形生産物および１つもしくはそれ以上の阻害因子化合物を含有するバイオマス前処理液が形成されるステップと、
ｃ）前記バイオマス前処理液を除去するステップと、
を含み、ここで前処理バイオマス固形生産物は低減された量の阻害因子化合物および糖含有物のごくわずかな低下を有する、方法を提供する。
【０００９】
他の態様では、本方法は、次の様式、すなわち
ｉ）ステップ（ｂ）の前
ｉｉ）ステップ（ｂ）における追加的成分として、または
ｉｉｉ）ステップ（ｂ）の後の洗浄ステップとして
の中の１つもしくはそれ以上において追加的水性成分を添加するステップをさらに含む。
【００１０】
さらに、前処理バイオマス固形生産物を糖化することで、糖加水分解物が形成され、次いでそれは発酵され、標的化学物質が生産されうる。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、本方法によって前処理されたバイオマス、および本方法によって前処理されたバイオマスの糖化によって生産される加水分解物である。さらに他の態様は、本方法によって前処理されたバイオマスの糖化によって生産される加水分解物の生体触媒発酵によって生産される標的化学物質である。
【００１２】
バイオマスは、任意のセルロース系またはリグノセルロース系材料、例えば、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、工業固形廃棄物、工場廃棄物、木材および林業廃棄物、ならびにそれらの組み合わせを示す。アンモニアを含有する水溶液は、アンモニアガス、水酸化アンモニウム、尿素、およびそれらの組み合わせから得られうる。アンモニアを含有する水溶液は、少なくとも１つの追加的塩基を含みうる。さらに、本方法においては、真空が、バイオマスとアンモニアを含有する水溶液との接触前にバイオマスに適用されうる。アンモニアはまたステップ（ｃ）の前に除去され、アンモニアは前処理反応器に戻して再生されうる。アンモニアおよびバイオマスは、本方法において、約４℃〜約２００℃の間の温度で反応されうる。可塑剤、柔軟剤またはそれらの組み合わせが、本方法において使用されうる。さらに、エネルギーは、サイズを低減するため、暴露表面積を大きくするため、および／または水性アンモニアまたは糖化酵素への接近性を増大するため、ステップ（ａ）の前、間、または後のバイオマスに適用されうる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
出願人らは、本開示中にすべての引用文献の内容全体を具体的に援用する。さらに、量、濃度、または他の値もしくはパラメーターが、ある範囲、好ましい範囲、またはより高い好ましい値とより低い好ましい値のリストとして与えられる場合、これは、任意のより高い範囲限界または好ましい値と任意のより低い範囲限界または好ましい値との任意のペアから形成されるあらゆる範囲を、範囲が別々に開示されるか否かにかかわりなく具体的に開示するものとして理解されるべきである。本明細書中で数値の範囲が挙げられる場合、特に指定のない限り、同範囲は、その端点、ならびに範囲内のすべての整数および分数を含むように意図されている。本発明の範囲が範囲を規定する場合に挙げられる特定の値に限定されるようには意図されていない。
【００１４】
本発明は、前処理バイオマス生産物中の阻害因子の量を低減する、バイオマスの前処理のための方法を提供する。低減された阻害因子の存在故に、前記バイオマスから貴重な製品を生産するための糖化および発酵工程はより効率的である。貴重な化学物質を生産するための廃棄バイオマスを含む再生可能なバイオマスの効率的使用により、オイルに対する需要が低下しうる。
【００１５】
定義：
本開示では、多数の用語が使用される。以下の定義が提供される。
用語「発酵性糖」または「糖類」は、発酵工程における微生物による炭素源として使用可能なオリゴ糖および単糖を示す。
【００１６】
用語「リグノセルロース系」は、リグニンおよびセルロースの双方を含有する組成物を示す。リグノセルロース系材料はまた、ヘミセルロースを含有しうる。
【００１７】
用語「セルロース系」は、セルロースを含有する組成物を示す。
【００１８】
バイオマスの「乾燥重量」は、すべてまたは実質的にすべての水が除去されたバイオマスの重量を意味する。乾燥重量は、典型的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＡＳＴＭ）のＳｔａｎｄａｒｄ  Ｅ１７５６−０１（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｏｌｉｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍａｓｓ）またはＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｕｌｐ  ａｎｄ  Ｐａｐｅｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｉｎｃ．（ＴＡＰＰＩ）のＳｔａｎｄａｒｄ  Ｔ−４１２  ｏｍ−０２（Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｐｕｌｐ，Ｐａｐｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｐｅｒｂｏａｒｄ）に従って測定される。
【００１９】
用語「可塑剤」および「柔軟剤」は、ポリマー鎖に沿ってのまたはその間での分子間凝集力の低下を引き起こす材料を示す。かかる材料は、例えば、結晶化度を低減するか、またはリグニンおよび非リグニン炭水化物繊維（例えばセルロースまたはヘミセルロース）間の結合を破壊するように作用しうる。
【００２０】
用語「糖化」は、多糖類からの発酵性糖の生産を示す。
【００２１】
バイオマスに関連する用語「処理する」および「前処理する」は、以下のように関連している。バイオマスが反応物質で処理され、処理バイオマス生産物が形成され、それはまた、前処理バイオマスを形成するために処理するか、または前処理バイオマスを形成するために前処理すると称されうる。「前」の使用は、バイオマスを処理することがバイオマスの糖化前であることを区別する。
【００２２】
用語「前処理バイオマス」は、糖化前に前処理が施されているバイオマスを意味する。前処理工程は下記に詳述される。
【００２３】
「バイオマス」は、任意のセルロース系またはリグノセルロース系材料を示し、セルロースを含んでなる、かつ場合によりヘミセルロース、リグニン、澱粉、オリゴ糖および／または単糖をさらに含んでなる材料を含む。バイオマスは、タンパク質および／または脂質などの追加成分を含んでなる場合もある。本発明によると、バイオマスは単一のソースから誘導されうるか、またはバイオマスは２つ以上のソースから誘導される混合物を含んでなる可能性がある。すなわち、例えばバイオマスであれば、トウモロコシ穂軸とコーンストーバーまたは繊維の混合物、または草と葉の混合物を含んでなる可能性がある。バイオマスは、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固体廃棄物、産業固体廃棄物、製紙汚泥、工場廃棄物、木材および林業廃棄物を含むがこれらに限定されない。バイオマスの例として、限定はされないが、トウモロコシ粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシの皮などの作物残渣、コーンストーバー、トウモロコシ繊維、草、小麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、まぐさ、稲わら、スイッチグラス、紙くず、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、穀物の加工から得られる成分、木、枝、根、葉、ウッドチップ、おがくず、低木およびブッシュ、野菜、果物、花、ならびに動物糞尿が挙げられる。一実施形態では、本発明にとって有用なバイオマスは、比較的高い炭水化物値を有し、比較的密度が高く、かつ／または回収、運搬、保存および／または処理を行うのが比較的容易であるバイオマスを含む。本発明の一実施形態では、有用なバイオマスは、トウモロコシ穂軸、コーンストーバー、トウモロコシ繊維およびサトウキビバガスを含む。
【００２４】
本発明の目的のため「アンモニアを含んでなる水溶液」は、水性培地内でのアンモニアガス（ＮＨ３）、水酸化アンモニウムまたはアンモニウムサルフェートなどのアンモニウムイオン（ＮＨ４＋）を含んでなる化合物、尿素など、分解時にアンモニアを放出する化合物、およびこれらの組み合わせの使用を示す。
【００２５】
糖化のための「酵素共同体」は、バイオマス混合物に作用し、発酵性糖を生産することが可能な酵素の組み合わせである。典型的には、糖化酵素共同体は１つもしくはそれ以上のグリコシダーゼを含有する場合があり、グリコシダーゼは、セルロースを加水分解するグリコシダーゼ、ヘミセルロースを加水分解するグリコシダーゼおよび澱粉を加水分解するグリコシダーゼからなる群から選択されうる。糖化酵素共同体における他の酵素は、ペプチダーゼ、リパーゼ、リグニナーゼおよびフェルロイルエステラーゼを含みうる。
【００２６】
低濃度の水性アンモニアを有する高濃度バイオマスの前処理については、共同所有される同時係属中の米国特許出願公開第２００７００３１９１８Ａ１号明細書に記載されている。出願人は、驚くべきことに、糖化および／または発酵の阻害因子が、米国特許出願公開第２００７００３１９１８Ａ１号明細書に記載の方法を用いて前処理されるバイオマスから放出される一方、放出される糖類がほとんどないことを見出している。放出される糖類はわずかであると考えられる。例えば、わずかな糖の低下は、最大約１０％とする約０．０％、または約０．０１％、０．０２％、０．０４％、０．０６％、０．０７％、もしくは０．０９％である。阻害因子は、前処理バイオマス固形物から分離されうる液体画分の可溶性成分である。液体の除去により、阻害因子が除去されると共に糖の収量が実質的に低減せず、それにより改善された前処理バイオマス生産物が生産される。
【００２７】
低水性アンモニア前処理
本方法で用いられる低水性アンモニア前処理においては、アンモニアの濃度は、最低限、バイオマス−水性アンモニア混合物のｐＨをアルカリ性に維持するのに十分な濃度であり、かつバイオマスの乾燥重量に対して最大で約１２重量パーセント未満である。この低いアンモニアの濃度は前処理にとって十分であり、かつ低い濃度はまたバイオマスの乾燥重量に対して約１０重量パーセント未満でありうる。バイオマスの乾燥重量に対して６パーセントまたはそれ未満の非常に低い濃度のアンモニアはまた、前処理において使用されうる。アルカリ性は、７．０を超えるｐＨを意味する。バイオマス−水性アンモニア混合物の８を超えるｐＨが特に適切である。一実施形態では、アンモニアはバイオマスの乾燥重量に対して約１０重量パーセント未満で存在する。バイオマスの乾燥重量に対して約６重量パーセント未満のアンモニアが特に適切である。
【００２８】
アンモニアを含有する水溶液は、場合により、少なくとも１つの追加的塩基、例えば水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、水酸化カルシウムおよび炭酸カルシウムを含みうる。少なくとも１つの追加的塩基は、アンモニウムと結合される量で添加され、バイオマスの乾燥重量に対して約２０重量パーセント未満の全塩基の量が形成されうる。好ましくは、第２の塩基＋アンモニアの全体は約１５重量パーセント未満の量である。追加塩基が用いられることで、例えば、バイオマス中の酸が中和され、糖化酵素における金属イオン、または発酵用成長培地における金属イオンがもたらされうる。
【００２９】
本方法では、バイオマスの乾燥重量は、バイオマス−水性アンモニア混合物の重量の少なくとも約１５％の初期濃度である。典型的には、バイオマスの乾燥重量は、バイオマス−水性アンモニア混合物の重量の少なくとも約１５％〜約８０％の初期濃度である。別の態様では、バイオマスの乾燥重量は、バイオマス−水性アンモニア混合物の重量の少なくとも約１５％〜約６０％の濃度である。バイオマス−水性アンモニア混合物中のバイオマスのパーセントは、発酵における使用のため、前処理バイオマスの糖化から得られる糖類の濃度に対する要求を最小限にするように高く保持される。高いバイオマス濃度はまた、前処理材料の全容量を減少させ、工程がより経済的なものになる。
【００３０】
バイオマスは、ソースから得られるように直接的に使用されうるか、あるいはエネルギーのバイオマスへの適用により、サイズが低減され、暴露表面積が増加し、かつ／あるいは、アンモニアおよび前処理バイオマスからの糖類の生産に使用される糖化酵素に対するバイオマス中に存在するセルロース、ヘミセルロース、および／またはオリゴ糖の可用性が高まりうる。サイズを低減し、暴露表面積を大きくし、かつ／あるいはアンモニアおよび糖化酵素に対するバイオマス中に存在するセルロース、ヘミセルロース、および／またはオリゴ糖の可用性を高めるのに有用なエネルギー手段は、限定はされないが、ミリング、クラッシング、粉砕、破砕、チョッピング、ディスクリファイニング、超音波、およびマイクロ波を含む。エネルギーのこの適用は、前処理の前、間または後になされうる。
【００３１】
低水性アンモニア溶液を伴うバイオマスの前処理は、任意の適切な容器内で実施される。典型的には、容器は圧力に耐えうるものであり、加熱のための機構を有し、かつ内容物を混合するための機構を有する。市販の容器として、例えば、Ｚｉｐｐｅｒｃｌａｖｅ（登録商標）反応器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ（Ｅｒｉｅ，ＰＡ））、Ｊａｙｇｏ反応器（一般的方法に記載；Ｊａｙｇｏ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．（Ｍａｈｗａｈ，ＮＪ））、およびスチームガン反応器（一般的方法に記載；Ａｕｔｏｃｌａｖｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ（Ｅｒｉｅ，ＰＡ））が挙げられる。同様の能力を有する多くの大型反応器が使用されうる。あるいは、バイオマスとアンモニア溶液は１つの容器内で結合され、次いで別の反応器に移動されうる。また、バイオマスは１つの容器内で前処理され、次いでスチームガン反応器（一般的方法に記載；Ａｕｔｏｃｌａｖｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ（Ｅｒｉｅ，ＰＡ））などの別の反応器内でさらに処理されうる。使用可能な特に適切な装置は共同所有される同時係属中の米国特許出願第ＣＬ３９４９号明細書に記載され、かつ米国特許出願第ＣＬ３９４９号明細書に記載の装置を使用する低いアンモニア前処理用のシステムは共同所有される同時係属中の米国特許出願第ＣＬ３９５０号明細書に記載されている。
【００３２】
バイオマスとアンモニアを含有する水溶液との接触前、真空がバイオマスを有する容器に適用されうる。バイオマスの孔から空気を排出することにより、アンモニアのバイオマスへのさらなる浸透がなされうる。真空を適用するための時間およびバイオマスに適用される負圧の量は、バイオマスのタイプに依存し、かつバイオマスの最適な前処理を行うように経験的に決定されうる（糖化後の発酵性糖の生産によって測定される）。
【００３３】
バイオマスとアンモニアを含有する水溶液との接触は、約４℃〜約２００℃の温度で行われる。４℃（この温度で注入が可能）でのバイオマスとアンモニアとの初期接触により、前処理されていない天然バイオマスの場合よりも糖化の効率が高まりうる。別の実施形態では、バイオマスの前記接触は約７５℃〜約１５０℃の温度で行われる。さらに別の実施形態では、バイオマスの前記接触は９０℃超〜約１５０℃の温度で行われる。
【００３４】
バイオマスとアンモニアを含有する水溶液との接触は、最大で約２５時間行われる。より長期間の前処理は可能であるが、実際の経済的理由から短期間が好ましい場合がある。典型的には、アンモニア接触処理の期間は約８時間以下である。
【００３５】
一実施形態では、前処理工程は、比較的高い温度で比較的短期間、例えば約１００℃〜約１５０℃で約５分間〜約２時間、実施されうる。別の実施形態では、前処理工程は、より低い温度で比較的長期間、例えば約７５℃〜約１００℃で約２時間〜約８時間、実施されうる。さらに別の実施形態では、前処理工程は、室温（約２２〜２６℃）で、約２４時間のさらにより長い期間、実施されうる。これらの中間にあたる他の温度および時間の組み合わせもまた用いられうる。
【００３６】
前処理工程においては、温度、アンモニアとの接触における時間、アンモニア濃度、１つもしくはそれ以上の追加的塩基の濃度、バイオマス濃度、バイオマスタイプおよびバイオマス粒子サイズなどの「適切な条件」は関連することから、これらの変数は最適な製品を得るために必要に応じて調整されうる。
【００３７】
可塑剤、柔軟剤、またはそれらの組み合わせ、例えばポリオール（例えばグリセロール、エチレングリコール）、ポリオールのエステル（例えばグリセロールモノアセテート）、グリコールエーテル（例えばジエチレングリコール）、アセトアミド、エタノール、およびエタノールアミンが、前処理工程（すなわちステップ（ａ））において添加されうる。可塑剤は、水性アンモニア溶液の成分、分離溶液、または乾燥成分として添加されうる。
【００３８】
前処理または前処理反応は、任意の適切な容器、例えばバッチ反応器または連続反応器において実施されうる。当業者は、より高温（１００℃超）では圧力容器が必要とされることを理解するであろう。適切な容器は、バイオマス−水性アンモニア混合物を撹拌するための手段、例えばインペラーを装備しうる。反応器の設計については、Ｌｉｎ  Ｋ．Ｈ．およびＶａｎ  Ｎｅｓｓ，Ｈ．Ｃ．（Ｐｅｒｒｙ  Ｒ．Ｈ．およびＣｈｉｌｔｏｎ  Ｃ．Ｈ．（編）、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒ'ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第５版（１９７３年）、第４章、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（ＮＹ））の中で検討されている。前処理反応は、バッチ工程または連続工程として実施されうる。
【００３９】
窒素源が発酵の間における微生物の成長に必要であり、それ故、前処理の間にアンモニアを用いることで、窒素源が提供され、かつ窒素源を伴う発酵の間に使用される成長培地を補充する必要性が低下するかまたはなくなることは当業者には周知である。もし前処理生産物のｐＨが糖化酵素の活性時でのｐＨより大きいかまたは発酵における微生物の成長に適する範囲を超える場合、酸を用いることでｐＨが低下しうる。所望のｐＨを得るのに用いられる酸の量により、糖化酵素または微生物の成長に対して阻害性を示す濃度での塩の形成がもたらされうる。所望のｐＨを得るのに必要な酸の量を減少させ、かつ本前処理工程におけるＮＨ３の原料コストを低減するため、アンモニアガスを前処理反応器から排出して再生することが可能である。典型的には、アンモニアの少なくとも一部が除去され、これによりｐＨが低下するが、それに続く発酵における使用においてこの栄養をもたらすいくらかの窒素が残存する。
【００４０】
阻害因子の放出および除去
出願人は、驚くべきことに、阻害因子が低水性アンモニアと反応されるバイオマスから放出される一方、糖類がほとんど放出されないことを見出している。阻害因子は糖化および／または発酵に対して有害な化合物であることから、前処理バイオマス生産物中に存在する阻害因子の量を低減することは望ましい。阻害因子は、バイオマスと低水性アンモニアの反応後に固形物と共に存在する液体画分の可溶化成分として見出された。阻害因子を含有するこの液体画分はバイオマス前処理液を形成する。固形物からバイオマス前処理液を除去する結果、放出された阻害因子が除去され、糖類の実質的低下を伴わずに阻害因子組成物を低減している固形物の前処理バイオマス生産物が残存する。
【００４１】
この実験結果は、実質的な可溶性糖が前処理中に放出される場合の他のタイプの前処理工程（米国特許第５７０５３６９号明細書、米国特許公開第２００５１６１０３８号明細書、および米国特許公開第２００４００１６５２５号明細書に記載のものなど）とは異なる。これらの工程では、液体は、典型的には糖類を含有する前加水分解物として回収され、かつ発酵において使用される。したがって、阻害因子もまた液体に放出される場合、それら阻害因子を除去すると共に糖類を失わない簡単な方法は存在しない。溶質分離を含む方法、例えばクロマトグラフィーであれば必要となるが、コストがかかる。
【００４２】
本方法では、放出される阻害因子が可溶化され、バイオマス前処理液が形成される場合の液体は、異なる方法で提供されうる水性成分である。水性成分は、前処理工程の任意の段階で添加されうる。水性成分は、アンモニア添加の前、間または後に添加される任意の水に基づく成分でありうる。例えば、バイオマスがバイオマスおよび水性アンモニア混合物の重量に対して約１５重量パーセントの固形物濃度で前処理される場合、水は水性アンモニアの添加前にバイオマスに添加されうるか、または水性アンモニアは１５パーセントの最終バイオマス濃度にするのに十分な希釈物でありうる。いずれの場合であっても、この濃度では、液体画分がバイオマスおよび水性アンモニア混合物中に存在する可能性が高い。液体はまた、バイオマスが、前処理されているバイオマスのタイプに依存し、２０重量パーセントもしくはそれ以上である場合、存在しうる。蒸気が添加され、バイオマスおよび水性アンモニア混合物の温度が上昇する場合、蒸気の部分的凝縮が追加的な水性成分を提供しうる。添加される蒸気の量および液体画分をもたらす凝縮量は、バイオマス、水性アンモニア、および反応容器の初期温度、ならびに前処理における最終温度を含む因子に依存することになる。当業者は、凝縮蒸気の使用条件下での寄与度を容易に判定するであろう。その他としてまたはそれに加え、例えば、水がバイオマスに水性アンモニアとの反応後に添加され、かつ放出される阻害因子がこの添加される水に可溶化する場合での洗浄ステップがありうる。
【００４３】
可溶化された阻害因子は、低水性アンモニアで処理されたバイオマスから放出される、糖化および／または発酵に対して有害な任意の化合物でありうる。発酵の阻害因子である酢酸およびアセトアミドが実質的部分としてバイオマス前処理液中に存在した。これらの化合物は、バイオマス試料から潜在的には放出されうる酢酸およびアセトアミドの理論量の約１０％を示すレベルで液中に見出された。酢酸およびアセトアミドは、細菌細胞の一部のタイプの強力な成長阻害因子である。例えば、酢酸は、一般に発酵製品中で成長される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の阻害因子である。別の例が、エタノール生産のための発酵において使用される細菌ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）である。
【００４４】
当業者に周知の方法、例えば、脱液、デカンティング、遠心分離、吸引、および／または濾過により、バイオマス前処理液は除去され、それは前処理固形物から分離されうる。さらに、バイオマスは押圧により、液をその除去において放出しうる。バイオマスを押圧し、液体を除去する場合、バイオマスをコンパクト化せず、糖化の間によりよい性能を発揮させることは好ましい。
【００４５】
バイオマス前処理液の除去後、残存する前処理バイオマス生産物は、糖化、または同時糖化および発酵（ＳＳＦ）において使用される。バイオマスから十分な量の糖類を得るため、バイオマスは水性アンモニア溶液で１回もしくはそれ以上の回数前処理されうる。同様に、糖化反応は１回もしくはそれ以上の回数行われうる。前処理および糖化工程の双方は所望される場合に繰り返され、より高収量の糖類が得られうる。前処理および糖化工程の性能を別々にまたは併せて評価するため、初期バイオマスから誘導可能な糖類の理論収量が決定され、測定された収量と比較されうる。
【００４６】
糖化：
次いで、本方法に従って調製される改善された前処理バイオマスは糖化酵素共同体の存在下でさらに加水分解され、加水分解物におけるオリゴ糖および／または単糖が放出される。糖化酵素およびバイオマス処理のための方法については、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００２年）６６：５０６−５７７頁）中でレビューされている。
【００４７】
糖化に先立ち、前処理バイオマスを処理し、糖化酵素共同体の酵素が活性を示すようにｐＨ、組成または温度を変更しうる。ｐＨは、固体または液体形態での酸の添加を通じて変更されうる。あるいは、二酸化炭素（ＣＯ２）は、発酵から回収されうるものであり、使用によりｐＨが低下しうる。例えば、ＣＯ２は、発酵槽から回収され、フラッシュタンク内のヘッドスペースの前処理生産物に供給されるか、または、十分な液体が存在する場合、所望されるｐＨが得られるまでｐＨを監視しながら、前処理バイオマスを介して泡立たせられる場合がある。下記のとおり、温度は糖化酵素の活性に適合する温度に誘導されうる。糖化にて用いられる酵素の活性にとって必要な任意の共同因子が追加されうる。
【００４８】
糖化酵素共同体は、主に、二糖、オリゴ糖、および多糖のエーテル結合を加水分解する群「グリコシダーゼ」より選択される（がこれらに限定されない）１つもしくはそれ以上の酵素を含んでなり、酵素分類として、一般群「加水分解酵素」（ＥＣ３．）のＥＣ３．２．１．ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に加え、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １（１９９３年）、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２（１９９４年）、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３（１９９５）、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４（１９９７年）およびＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ５［各々、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９４年）２２３：１−５頁、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５年）２３２：１−６頁、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６年）２３７：１−５頁、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７年）２５０：１−６頁、およびＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９年）２６４：６１０−６５０頁］）において見出される。本方法において有用なグリコシダーゼを、それらが加水分解するバイオマス成分によって分類してもよい。本方法において有用なグリコシダーゼは、セルロースを加水分解するグリコシダーゼ（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ）、ヘミセルロースを加水分解するグリコシダーゼ（例えば、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノキシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ）、および澱粉を加水分解するグリコシダーゼ（例えば、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ）を含む。さらに、ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．ｘ．ｙ）、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．ｘおよび３．１．４．ｘ）、リグニナーゼ（ＥＣ１．１１．１．ｘ）、ならびにフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）などの糖化酵素共同体に他の活性を付加することで多糖のバイオマスの他の成分からの放出を促進することは有用でありうる。多糖を加水分解する酵素を生産する微生物が、異なる基質特異性を有する数種の酵素または酵素群によって触媒される、セルロース分解などの活性を示すことが多いことは当該技術分野で周知である。したがって、微生物由来の「セルラーゼ」は、酵素群を含んでなる場合があり、それらのすべてはセルロース分解活性に寄与しうる。セルラーゼなどの商用または非商用の酵素製剤は、酵素を得るのに用いられる精製スキームに依存し、極めて多数の酵素を含んでなる場合がある。したがって、本方法の糖化酵素共同体は「セルラーゼ」などの酵素活性を含んでなる場合があるが、この活性は２種以上の酵素によって触媒されうると理解されている。
【００４９】
糖化酵素は、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ））およびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）など、商用的に入手可能である。さらに、糖化酵素は、組換え微生物の使用を含む生物学的に生産されうる。
【００５０】
当業者であれば、共同体中で使用するための酵素の有効量を決定しかつ最適な酵素活性のための条件を調節する方法を知るであろう。当業者であれば、共同体中で必要とされる酵素活性のクラスを最適化しかつ選択された条件下での所定の前処理生産物の最適な糖化を得る方法も知るであろう。
【００５１】
好ましくは、糖化反応は、糖化酵素における最適な温度およびｐＨでまたはそれらの近傍で行われる。本方法における糖化酵素共同体の場合に用いられる最適な温度は約１５℃〜約１００℃の範囲である。別の実施形態では、最適な温度は約２０℃〜約８０℃の範囲である。ｐＨ最適値は約２〜約１１の範囲でありうる。別の実施形態では、本方法において糖化酵素共同体の場合に用いられるｐＨ最適値は約４〜約１０の範囲である。
【００５２】
約数分〜約１２０時間、および好ましくは約数分〜約４８時間で糖化を行ってもよい。反応における時間は、酵素濃度および比活性、ならびに用いられる基質および温度およびｐＨなどの環境条件に依存することになる。当業者であれば、特定の基質および糖化酵素共同体の場合に用いられるべき温度、ｐＨおよび時間の最適な条件を容易に決定できる。
【００５３】
糖化をバッチ式または連続方法で行ってもよい。さらに、糖化を１工程または多数の工程で行ってもよい。例えば、糖化に必要な異なる酵素は異なる最適なｐＨまたは温度を示しうる。ある温度およびｐＨで酵素を用いて一次処理を行った後、異なる温度および／またはｐＨで異なる酵素を用いて二次または三次（またはさらなる）処理を行ってもよい。さらに、順次工程で異なる酵素を用いた処理は、同じｐＨおよび／または温度で、あるいは、より高いｐＨおよび温度で安定でかつより活性のあるヘミセルラーゼ、次いでより低いｐＨおよび温度で活性のあるセルラーゼの使用など、異なるｐＨおよび温度で行われうる。
【００５４】
糖化後のバイオマスからの糖類の可溶化の度合いを、単糖およびオリゴ糖の放出の測定により監視してもよい。単糖およびオリゴ糖を測定するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、１，３−ジニトロサリチル（ＤＮＳ）酸アッセイ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｌ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５９年）３１：４２６−４２８頁）を用いて還元糖の濃度を測定してもよい。あるいは、本明細書中の「一般的方法」の項に記載のように、適切なカラムを使用し、ＨＰＬＣにより糖類を測定してもよい。
【００５５】
発酵
バイオマスから放出された発酵性糖の適切な微生物による使用により、標的化学物質を生産してもよい。糖化後であるが発酵に先立ち、糖化混合物を例えば蒸発により濃縮することで、発酵性糖の濃度が増加しうる。場合により、糖化生産物中の液体は、バッチ式または連続的な方法で固体から分離されうる。場合により、液体または糖化生産物全体は、発酵に先立ち殺菌されうる。ｐＨについては、発酵の間に用いられる微生物および糖化の間に用いられるｐＨに依存し、発酵に適するｐＨに調節されうる。さらに、糖化混合物に微生物の成長にとって必要な追加の栄養を補充することが可能である。補充物は、例えば、酵母抽出物、特定のアミノ酸、リン酸塩、窒素源、塩、および微量元素を含みうる。抗生物質など、特定の生体触媒によって作製される特定の生産物の生産にとって必要な成分もまた含まれることで、酵素触媒反応において必要とされるプラスミドまたは共同因子の維持が可能である。さらに追加の糖類が含まれることで、全糖濃度が増加しうる。糖化混合物は発酵培養液の成分として用いられ、例えば最終培地の約１００％〜約１０％を構成しうる。
【００５６】
温度および／またはヘッドスペースガスもまた、発酵微生物にとって有用な条件に応じて調節されうる。発酵は好気性または嫌気性でありうる。発酵は、糖化に続いて行われうるか、または同時糖化および発酵（ＳＳＦ）により、糖化と同時に行われうる。ＳＳＦにより、糖化によってもたらされる糖レベルが低く保持され、それにより、起こり得る糖化酵素の生産物の阻害が低下し、汚染微生物における糖の使用可能性が低下し、かつ前処理されたバイオマスの単糖および／またはオリゴ糖への変換が改善される可能性がある。
【００５７】
生体触媒を使用した発酵によって生産されうる標的化学物質は、例えば、酸、アルコール、アルカン、アルケン、芳香族化合物、アルデヒド、ケトン、生体高分子、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、および医薬品を含む。アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロパンジオール、ブタンジオール、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、およびソルビトールを含むがこれらに限定されない。酸は、酢酸、乳酸、プロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、酪酸、グルコン酸、イタコン酸、クエン酸、コハク酸およびレブリン酸を含む。アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、メチオニン、リジン、グリシン、アルギニン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンを含む。追加の標的化学物質は、メタン、エチレン、アセトンおよび工業用酵素を含む。
【００５８】
標的化学物質への糖類の発酵が、単一または多段階の発酵において、１つもしくはそれ以上の適切な生体触媒により行われうる。生体触媒は、細菌、糸状真菌および酵母より選択される微生物でありうる。生体触媒は、野生型微生物または組換え微生物である場合があり、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ジモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）を含む。別の実施形態では、生体触媒は、組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ジモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クロストリジア・サーモセルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリチクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、およびピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）よりなる群から選択されうる。
【００５９】
標的化学物質を生産するための発酵にて用いられる多数の生体触媒については記載がなされており、他のものは発見されるか、突然変異によって生産されるか、または組換え手段によって設計されうる。本システムを使用した、前処理バイオマスの糖化から生産される発酵性糖を用いる任意の生体触媒を使用し、発酵による生産が知られている標的化学物質が作製されうる。
【００６０】
特に、エタノールおよびブタノールを含む生物燃料を生産する生体触媒が重要である。たとえば発溶媒性（ｓｏｌｖｅｎｔｏｇｅｎｉｃ）クロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）によるアセトン、ブタノールおよびエタノール（ＡＢＥ発酵）への炭水化物の発酵については周知である（ＪｏｎｅｓおよびＷｏｏｄｓ（１９８６年）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５０：４８４−５２４頁）。クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）の変異株を用いる、高レベルのブタノールを生産し、さらにアセトンおよびエタノールを生産するための発酵方法が、米国特許第５，１９２，６７３号明細書に記載されている。高レベルのブタノールを生産し、さらにアセトンおよびエタノールを生産するためのクロストリジウム・バイジェリンキー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）の変異株の使用については、米国特許第６，３５８，７１７号明細書に記載されている。共同所有される同時係属中の特許出願、国際公開第２００７／０４１２６９号パンフレットおよび国際公開第２００７／０５０６７１号パンフレットは、遺伝子操作された微生物宿主内での１−ブタノールおよびイソブタノールのそれぞれの生産について開示している。共同所有される同時係属中の米国特許出願第１１／７４１８９２号明細書および米国特許出願第１１／７４１９１６号明細書は、遺伝子操作された微生物宿主内での２−ブタノールの生産について開示している。イソブタノール、１−ブタノールまたは２−ブタノールは、開示される方法に従う、微生物宿主による、本システムを用いて生産される加水分解物の発酵から生産されうる。
【００６１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の遺伝子組換え株は、エタノール生産用の生体触媒としても用いられている（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄら、（２００２年）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：６２６３−６２７２頁）。エタノールの生産を改善しているジモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の遺伝子組換え株については、米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１Ａ１号明細書に記載されている。アルコール発酵菌（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）のさらに改変されたエタノール生産株およびエタノール生産のためのその使用については、共同所有される同時係属中の米国特許出願第６０／８４７８１３号明細書および米国特許出願第６０／８４７８５６号明細書においてそれぞれ記載されている。エタノールは、開示される方法に従う、アルコール発酵菌（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）による、本システムを用いて生産される加水分解物の発酵から生産されうる。発酵性糖に対する、除去された阻害因子を含有する前処理液を有する前処理バイオマスの糖化、それに続く糖類の標的化学物質への発酵については、エタノールへの糖類の発酵における、生体触媒としてアルコール発酵菌（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を使用する前処理トウモロコシ穂軸からのエタノールの生産についての本明細書中の実施例４に例示される。
【００６２】
乳酸は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え株（Ｚｈｏｕら、（２００３年）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：３９９−４０７頁）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の天然株（米国特許出願公開第２００５／０２５０１９２号明細書）、および糸状菌（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（ＴａｙおよびＹａｎｇ（２００２年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８０：１−１２頁）による発酵において生産されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え株は、１，３プロパンジオール（米国特許第６，０１３，４９４号明細書、米国特許第６，５１４，７３３号明細書）およびアジピン酸（Ｎｉｕら、（２００２年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１８：２０１−２１１頁）を生産するための発酵における生体触媒として用いられている。酢酸は、組換えクロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）（Ｃｈｅｒｙａｎら、（１９９７年）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１−３３頁）および新規に同定された酵母株（Ｆｒｅｅｒ、（２００２年）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：２７１−２７５頁）を用いた発酵により作られている。組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌によるコハク酸の生産については、米国特許第６，１５９，７３８号明細書中で、および変異組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によるものについてはＬｉｎら、（２００５年）Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．７：１１６−１２７頁中で記載されている。ピルビン酸は、トルロプシス・グラブラータ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ）変異酵母（Ｌｉら、（２００１年）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５５：６８０−６８５頁）および変異大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｙｏｋｏｔａら、（１９９４年）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：２１６４−２１６７頁）により生産されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え株は、パラ−ヒドロキシケイ皮酸（米国特許出願公開第２００３／０１７０８３４号明細書）およびキナ酸（米国特許出願公開第２００６／０００３４２９号明細書）を生産するための生体触媒として用いられている。
【００６３】
プロピオン酸を生産するための発酵においては、プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）の変異体が用いられており（ＳｕｗａｎｎａｋｈａｍおよびＹａｎｇ（２００５年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１：３２５−３３７頁）、酪酸についてはクロストリジウム・チロブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）により作られている（ＷｕおよびＹａｎｇ（２００３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８２：９３−１０２頁）。プロピオン酸塩およびプロパノールについては、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）株１７ｃｒ１（Ｊａｎｓｓｅｎ、（２００４年）Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８２：４８２−４８６頁）によるトレオニンからの発酵により作られている。酵母様の黒酵母（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）を用い、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の変異体（Ｓｉｎｇｈら、（２００１年）Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．３９：１１３６−４３頁）によりグルコン酸が作られている（アナンタシアジス（Ａｎａｎｔａｓｓｉａｄｉｓ）ら、（２００５年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１：４９４−５０１頁）。５−ケト−Ｄ−グルコン酸がグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）の変異体により作られ（Ｅｌｆａｒｉら、（２００５年）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．６６：６６８−６７４頁）、イタコン酸がアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）の変異体により生産され（ＲｅｄｄｙおよびＳｉｎｇｈ（２００２年）Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８５：６９−７１頁）、クエン酸がアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）変異株により生産され（Ｉｋｒａｍ−Ｕｌ−Ｈａｑら、（２００５年）Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．９６：６４５−６４８頁）、かつキシリトールがカンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＦＴＩ  ２００３７により生産された（ＭｕｓｓａｔｔｏおよびＲｏｂｅｒｔｏ（２００３年）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９５：３３１−３３７頁）。４−ヒドロキシバレレートを含有するバイオポリエステルは、大量の３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸も含有するものであり、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）およびラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）の組換え体により生産された（Ｇｏｒｅｎｆｌｏら、（２００１年）Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２：４５−５７頁）。Ｌ−２，３−ブタンジオールが組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により作られた（Ｕｉら、（２００４年）  Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：５３３−５３７頁）。
【００６４】
発酵によるアミノ酸の生産は、栄養要求株およびコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびセラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）のアミノ酸類似体−耐性菌を用いて行われている。例えば、ヒスチジン類似体に耐性を示す株を用いたヒスチジンの生産が日本特許出願公開第５６００８５９６号公報に、組換え株を用いた同生産が欧州特許第１３６３５９号明細書に記載されている。トリプトファン類似体に耐性がある株を使用するトリプトファンの生産については、日本特許第４７００４５０５号公報および日本特許第５１０１９０３７号公報に記載されている。イソロイシン類似体に耐性がある株を使用するイソロイシンの生産については、日本特許第４７０３８９９５号公報、日本特許第５１００６２３７号公報、日本特許第５４０３２０７０号公報に記載されている。フェニルアラニン類似体に耐性がある株を使用するフェニルアラニンの生産については、日本特許第５６０１００３５号公報に記載されている。成長にフェニルアラニンを必要とし、チロシンに耐性を示す株（Ａｇｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ  ５０（１）Ｒ７９−Ｒ８７（１９７６年））または組換え株（欧州特許第２６３５１５号明細書、欧州特許第３３２２３４号明細書）を用いたチロシンの生産、およびＬ−アルギニン類似体に耐性を示す株を用いたアルギニンの生産（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７２年）３６：１６７５−１６８４頁、日本特許出願公開第５４０３７２３５号公報および日本特許出願公開第５７１５０３８号公報）が記載されている。フェニルアラニンは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）株ＡＴＣＣ３１８８２、３１８８３、および３１８８４内での発酵によっても生産された。組換えコリネフォルム細菌におけるグルタミン酸の生産が、米国特許第６，９６２，８０５号明細書に記載されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異株によるトレオニンの生産が、ＯｋａｍｏｔｏおよびＩｋｅｄａ（２０００年）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ．８９：８７−７９頁に記載されている。メチオニンが、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｌｉｕｍ）の変異株によって生産された（Ｋｕｍａｒら、（２００５年）Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．９６：２８７−２９４頁）。
【００６５】
有用なペプチド、酵素、および他のタンパク質もまた、生体触媒（例えば、米国特許第６，８６１，２３７号明細書、米国特許第６，７７７，２０７号明細書、米国特許第６，２２８，６３０号明細書）によって作られている。
【００６６】
本発明の方法はまた、バイオマスからの１，３−プロパンジオールの生産において使用されうる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組換え株は発酵における生体触媒として使用され、１，３プロパンジオールが生産されている（米国特許第６０１３４９４号明細書、米国特許第６５１４７３３号明細書）。共同所有される同時係属中の米国特許出願第１１／４０３０８７号明細書の実施例１０に記載のように、本システムを用いて前処理されるバイオマスは糖化可能であり、糖化後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の使用によって１，３−プロパンジオールが生産される。
【００６７】
生体触媒による発酵にて生産される標的化学物質は、当該技術分野で既知の様々な方法を用いて回収されうる。生産物は、遠心分離、濾過、精密濾過、およびナノ濾過により、他の発酵成分から分離されうる。生産物は、イオン交換、溶媒抽出、または電気透析により抽出されうる。凝集剤を使用することで、生産物の分離が促進される。具体例として、バイオ生産された１−ブタノールは、ＡＢＥ発酵についての当該技術分野で既知の方法を用いて発酵培地から単離されうる（例えば、Ｄｕｒｒｅ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８頁（１９９８年）、Ｇｒｏｏｔら、Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５頁（１９９２年）、およびそれらの中の参考文献を参照）。例えば、遠心分離、濾過、デカンテーションまたは同類のものにより、固体が発酵培地から除去されうる。次いで、１−ブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液体−液体抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、または透析蒸発などの方法を用いて発酵培地から単離されうる。発酵媒体からの１，３プロパンジオールの精製が、例えば、反応混合物に有機溶媒、蒸留、およびカラムクロマトグラフィーによる抽出を施すことにより実施されうる（米国特許第５，３５６，８１２号明細書）。この方法にとって特に良好な有機溶媒はシクロヘキサンである（米国特許第５，００８，４７３号明細書）。アミノ酸は、イオン交換樹脂吸着および／または結晶化などの方法により発酵培地から回収されうる。
【実施例】
【００６８】
一般的方法および材料
以下の略語が使用される。すなわち、「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィー、「Ｃ」は摂氏、「ｋＰａ」はキロパスカル、「ｍ」はメートル、「ｍｍ」はミリメートル、「ｋＷ」はキロワット、「μｍ」はマイクロメートル、「μＬ」はマイクロリットル、「ｍＬ」はミリリットル、「Ｌ」はリットル、「ｍｉｎ」は分、「ｍＭ」はミリモル、「ｃｍ」はセンチメートル、「ｇ」はグラム、「ｋｇ」はキログラム、「ｗｔ」は重量、「ｈｒ」は時間、「ｔｅｍｐ」もしくは「Ｔ」は温度、「ｔｈｅｏｒｅｔ」は理論、「ｐｒｅｔｒｅａｔ」は前処理、「ＤＷＢ」はバイオマス乾燥重量、「ＡＳＭＥ」はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ（米国機械学会）、「ｓ．ｓ．」はステンレス鋼である。
【００６９】
硫酸、水酸化アンモニウム、酢酸、アセトアミド、酵母抽出物、グルコース、キシロース、ソルビトール、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、リン酸およびクエン酸を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【００７０】
Ｊａｙｇｏ反応器
Ｊａｙｇｏ反応器は、Ｈａｓｔｅｌｌｏｙ（登録商標）Ｃ−２２合金製の１３０リットル（直径約５１ｃｍ×長さ９１ｃｍ）の水平のパドル型反応器（Ｊａｙｇｏ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．（Ｍａｈｗａｈ，ＮＪ））である。反応器は約１７７℃（８６２ｋＰａ）に加熱可能な蒸気ジャケットを装備する。バイオマスを最高で前処理温度まで速やかに誘導するため、直接蒸気注入も用いる。蒸気圧を調節および制御し、所望の前処理温度を維持する。極めて多くのポートにより、他の溶媒および温液の注入が可能になる。
【００７１】
大型バレルピストン反応器
ピストンを装備した５．１ｃｍ×６８．６ｃｍのステンレス鋼バレルで水平方向に構成される（ＡＳＭＥコードがスタンプされた）大型バレルピストン反応器を組み立てた。ピストンを４つのＯリングでバレルに密封し、吐出行程中、ピストンの裏側を窒素で加圧した。６８．６ｃｍのバレルに８つの複数の使用ポート（４つはそれぞれ頂部および底部表面沿い）を装備し、真空の適用、水性アンモニアの注入、蒸気の注入およびバレル内部の温度を測定するための熱電対の挿入を可能にした。反応器バレルに、バレルのさらなる加熱のための蒸気ジャケットを装備した。反応器バレルを、１５．２ｃｍ×６１ｃｍのステンレス鋼フラッシュタンクに垂直方向に直接装着した。バレルを、円錐状ノズルおよびシート端部剪断弁装置により、フラッシュタンクから隔てた。端部の弁を剪断するダイの直径は３．５ｃｍであった。円錐状ノズルおよびシートに対する背圧は調整可能であり、大部分の試験を、端部剪断弁のコーン部に接続された１０．２ｃｍ直径のエアシリンダへの約１３８ｋＰａ（ゲージ圧）の背圧を用いて実施した。端部剪断弁のコーン部は最大で１．６ｃｍ後方移動でき、粒子のフラッシュタンクへの排出を可能にした。固形物がタンクの底部におけるドーム状端部フランジのボルトを緩めることによって容易に除去される場合、端部剪断弁の出口にあるエルボーが前処理固形物をフラッシュタンクの底部へと下方誘導した。フラッシュタンクに対して上部にあるドーム状フランジにフラッシュタンクの軸に対して直角に機械加工されたスロットに適合する特別な出口を組み込んだことで、放出された蒸気のコーナ軌跡周辺から出口フィッチングへの移動が引き起こされ、それは同伴されるバイオマス粒子および水滴のベントコンデンサへのキャリーオーバーの防止に役立った。３つの電気バンドヒーター（６０℃に設定）および絶縁部をフラッシュタンクに沿って追加し、熱で前処理された固形物の加熱容器へのフラッシュを可能にし、商業用工程のシミュレーションが改善された。
【００７２】
フェドバッチ糖化反応器
この反応器は、共同所有される同時係属中の米国特許出願第ＣＬ３８７３号明細書により詳細に記載されている。
【００７３】
フェドバッチ糖化反応器は、循環ポンプ、酸および塩基用ポンプ、ソレノイド弁、温度制御用熱交換器、蒸気供給、プロセス水、空気供給制御弁および濾過、背圧制御弁、ならびに排気フィルタを有する、ＢｉｏＳｔａｔ  ＥＤデータ制御ユニットおよびそれに関連する制御モジュールによって制御される１５Ｌの発酵糖（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ））である。発酵糖に２つの１１．４ｃｍ直径の３枚羽根高効率Ｌｉｇｎｔｎｉｎ  Ａ−３１０インペラーを装備した。底部インペラーを反応器底部から７．６ｃｍの所に位置づけ（底部を貫通する駆動シャフトにおけるシャフトの底部近傍に大型シール装置が存在することから、それをより近い任意の場所に位置させることができなかった）、上部インペラーを反応器底部から２２．９ｃｍの所に位置づけた。発酵糖容器は、１９．０ｃｍの直径および５５．９ｃｍの最大高さを有する。４つの取り外し可能なバッフルを設置し、その各々は１．６ｃｍの幅および４８．３ｃｍの長さを有し、容器底部から頂部の約７．６ｃｍ以内に延在した。ＡＰＶローブポンプ（モデルＭ１／０２８／０６）、１〜１／２−ｉｎ（３．８１ｃｍ）のフレキシブルホースおよびＴｅｆｌｏｎサイトフローインジケータ（ｓｉｇｈｔ  ｆｌｏｗ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）で構成されるポンプアラウンドループ（ｐｕｍｐ  ａｒｏｕｎｄ  ｌｏｏｐ）を、発酵槽システム上の頂部および底部ポートに垂直に配置した（ｐｌｕｍｂｅｄ）。ポンプアラウンドループを、ＣＦ８Ｍボディ、３１６ｓ．ｓ．ボール、およびＰＴＦＥシートと共に、１〜１／２−ｉｎ（３．８１ｃｍ）のＶａｌｍｉｃｒｏおよびＳＶＦフルポートボールバルブを有する発酵容器から隔てた。さらに、Ｖポート剪断弁（Ｔｒｉａｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ）を、ボールバルブに先行し、ローブポンプの下流に位置づけることで、発酵糖の頂部ポートからポンプを隔てた。再循環サイクル中、この弁を最大６０°まで徐々に閉じることで、再循環する前処理固形物のさらなる剪断をもたらした。
【００７４】
分析法
固形物中のグルコースおよびキシロースの定量
各初期バイオマス試料中のグルコースおよびキシロースの量を、当該技術分野で周知の方法、例えばＡＳＴＭＥ１７５８−０１「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｂｙ  ＨＰＬＣ」を使用して測定した。
【００７５】
可溶性糖、アセトアミド、乳酸および酢酸含有量の測定
糖化液中または発酵培養液中の可溶性糖（グルコース、セロビオース、キシロース、ガラクトース、アラビノースおよびマンノース）、酢酸およびエタノールを、適切な保護カラムを有するＢｉｏ−Ｒａｄ  ＨＰＸ−８７ＰおよびＢｉｏ−Ｒａｄ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を使用し、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  １１００、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ））によって測定した。試料のｐＨを測定し、必要に応じ硫酸を用いて５〜６に調節した。次いで、試料を直接に０．２μｍのシリンジフィルターを通してＨＰＬＣバイアルに通過させた。ＨＰＬＣの稼動条件は以下の通りであった。
ＨＰＸ−８７Ｐ（炭水化物用）：
注入容量：１０〜５０μＬ、濃度および検出器の限界に依存
移動相：ＨＰＬＣグレードの水、０．２μｍに濾過および脱気
流速：０．６ｍＬ／分
カラム温度：８０〜８５℃、ガードカラム温度＜６０℃
検出器温度：可能な限り主カラム温度に近い
検出器：屈折率
実行時間：３５分間のデータ収集に加え、実行後の１５分間（後の溶出化合物のために可能な調節を行う）
Ｂｉｏｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ（炭水化物、酢酸およびエタノール用）
注入容量：濃度および検出器限界に依存して５〜１０μＬ
移動相：０．２μｍで濾過され、脱気された０．０１Ｎ硫酸
流速：０．６ｍＬ／分
カラム温度：５５℃
検出器温度：可能な限りカラム温度に近づける
検出器：屈折率
実行時間：２５〜７５分間のデータ収集
実行後、試料中の濃度を各化合物における標準曲線から判定した。
【００７６】
実施例１
低温前処理後における糖類の弱い可溶化
全粒または粉砕トウモロコシ穂軸（約１３ｋｇ、乾燥重量基準）をＪａｙｇｏ反応器に負荷した。穂軸を、プレートＣ−２９７５を装備するディスクリファイナーに通過させることによって粉砕した（一般的方法）。生産された粉砕穂軸を１．２７ｃｍのスクリーンに通過させた。保持された任意の切片を、再びディスクリファイナーに０．５ｃｍのより小さい間隙で通過させた。反応器に真空を適用し、希釈水酸化アンモニウム溶液を注入することで、表３に示すように所望の最終アンモニア濃度（２％もしくは６％  ＮＨ３重量／乾燥バイオマス重量）および乾燥バイオマスの濃度（３０％もしくは４０％  乾燥バイオマス重量／全バイオマス−水性アンモニア混合物重量）が得られた。全粒穂軸の場合、初期アンモニア濃度は６％（重量／乾燥バイオマス重量）でありかつ乾燥バイオマス濃度は４０％であった。粉砕穂軸の場合、初期アンモニア濃度は２％（重量／乾燥バイオマス重量）でありかつ乾燥バイオマス濃度は３０％であった。真空を解放し、全粒トウモロコシ穂軸試料に対して９３℃および粉砕トウモロコシ穂軸試料に対して８５℃の温度まで浸漬しながら、蒸気をジャケットに適用して穂軸を加熱した。加熱速度を高める目的で、短時間の増加した撹拌器速度（最大９６ｒｐｍ）を適用した。浸漬した穂軸の温度を、３２ｒｐｍで常に混合しながら、全粒穂軸においては８時間または粉砕穂軸においては４時間保持し、次いで連続混合しながら一晩冷却しておいた。反応器からの前処理バイオマスの除去前、反応器を９０℃、真空下に置き、アンモニアを前処理バイオマスから揮散させた。
【００７７】
全粒穂軸の前処理バイオマス混合物の固相および液相の組成物を一般的方法に記載のように分析した結果を表１に示す。量は初期バイオマス中の理論量の％として示され、ここで酢酸およびアセトアミドは併せてバイオマス中のアセチルに対応する。グルコースおよびキシロースが主に固形物中（それぞれセルロースおよびヘミセルロース中）に残されると共に、ごく少量の可溶性オリゴマーが液体中で測定された。供給原料アセチルの全部が、酢酸またはアセトアミドのいずれかとして液相中に見出された。
【００７８】
【表１】
2010536376.tif 000002
【００７９】
粉砕穂軸の前処理バイオマス混合物の固相および液相の組成物を一般的方法に記載のように分析した結果を表２に示す。量は初期バイオマス中の理論量の％として示され、ここで酢酸およびアセトアミドは併せてバイオマス中のアセチルに対応する。全粒穂軸前処理バイオマスと同様、グルコースおよびキシロースが主に固形物中（それぞれセルロースおよびヘミセルロース中）に残されると共に、ごく少量の可溶性オリゴマーが液体中で測定された。また、供給原料アセチルの全部が、酢酸またはアセトアミドのいずれかとして液相中に見出された。
【００８０】
【表２】
2010536376.tif 000003
【００８１】
実施例２
高温前処理後における糖類の弱い可溶化
実施例１に記載のように調製した粉砕トウモロコシ穂軸（１３ｋｇ、乾燥基準）をＪａｙｇｏ反応器に負荷した。反応器に対して真空を引いた後、２％アンモニア（ｗｔ／ｗｔ乾燥バイオマス）および３０％バイオマスの乾燥重量濃度を与えるのに適切な強度の水酸化アンモニウム溶液を反応器にポンピングすると共に、室温、３２ｒｐｍで混合した。次いで、反応器の内容物を、低圧のジャケット蒸気を使用して９５℃に加熱した。一旦反応器が９５℃に達すると、直接蒸気注入を用いて反応器の内容物を１４５℃に加熱した。反応器が１４５℃に達すると、反応器の内容物を、ジャケット蒸気および部分的な直接蒸気注入を用いてその温度で２０分間保持した。２０分後、反応器に至る通気口上で真空を引き、シュレッダーモーターを５分間作動させた。１時間後、ジャケットに対して冷却水を作動させた。Ｊａｙｇｏ反応器の内容物を３３℃〜３７℃の間に冷却し、次いで反応器をＣＯ２を用いて１３８ｋＰａまで加圧した。加圧されたＣＯ２雰囲気を３０分間維持した。反応器の内容物の最終温度は２７℃〜３１℃の間であった。浸漬／前処理されたバイオマスのｐＨは約７．５であった。
【００８２】
前処理バイオマス混合物の固相および液相の組成物を一般的方法に記載のように分析した結果を表３に示す。量は初期バイオマス中の理論量の％として示され、ここで酢酸およびアセトアミドは併せてバイオマス中のアセチルに対応する。実施例１における低温前処理バイオマスと同様、グルコースおよびキシロースが主に固形物中（それぞれセルロースおよびヘミセルロース中）に残されると共に、ごく少量の可溶性オリゴマーが液体中で測定された。また、供給原料アセチルの全部が、酢酸またはアセトアミドのいずれかとして液相中に見出された。
【００８３】
【表３】
2010536376.tif 000004
【００８４】
実施例３
前処理液が発酵阻害因子を含有する
一連の前処理を、以下のように（一般的方法に記載の）大型バレルピストン反応器内で実施した。蒸気をバレルのジャケットに添加し、（一般的方法に記載の）大型バレルピストン反応器のバレルを約１３０℃に予熱した。フラッシュレシーバーをバンドヒーターで約６０℃に予熱した。全粒トウモロコシ穂軸を、約０．９５ｃｍのジョー間隔を有するジョークラッシャー（２．２ｋＷモーター）、その後にデランパー（ｄｅｌｕｍｐｅｒ）（１．５ｋＷモーター、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｍｉｌｌｅｒ  Ｉｎｃ．（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，ＮＪ））で加工した後、１．９ｃｍの米国標準スクリーンを装備したＳｗｅｃｏ製スクリーンでスクリーニングし、全粒穂軸をより小さい断片に粉砕した。これらの粉砕穂軸（１７５ｇ、乾燥重量基準）を、穂軸をピストンを取り出した反応器の端部に手作業で入れることにより、大型バレルピストン反応器に負荷した。ピストンを元に戻し、端部に差し込んだ。真空を反応容器およびフラッシュレシーバーに適用し、１０ｋＰａ未満に降圧し、希釈水酸化アンモニウム溶液を反応器に注入し、６ｇ／１００ｇバイオマス乾燥重量のアンモニア濃度および４５ｇ／１００ｇ全バイオマス−水性アンモニア混合物のバイオマス乾燥重量濃度を得た。一旦アンモニアを負荷すると、蒸気を反応器に注入し、温度を１４５℃にした。混合物を、温度を監視し、必要に応じて蒸気を添加することにより、この温度で１０分間保持し、次いでピストンを駆動することによって予熱したフラッシュタンクに排出した。フラッシュレシーバーが約５９℃に達するまでフラッシュタンクに対して真空を引いた。シリーズＡにおいては１２のかかる前処理を実施し、シリーズＢにおいては１３のかかる前処理を実施した。固形物を、フラッシュタンクの底部を取り出すことによって採取した。任意の過剰な液体を固形物から排出し、各前処理のシリーズから回収したすべての液体を共にプールした。この液体を、一般的方法に記載のように、糖含有物、酢酸およびアセトアミドについて分析した。表４および５に示されるように、液体は糖類が非常に少ない一方、より多量の酢酸およびアセトアミドを含有した。
【００８５】
【表４】
2010536376.tif 000005
【００８６】
【表５】
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【００８７】
実施例４
除去される液体中に阻害因子を伴う前処理バイオマスからの糖化加水分解物を使用するエタノールの生産
蒸気をバレルのジャケットに添加し、（一般的方法に記載の）大型バレルピストン反応器のバレルを約１３０℃に予熱した。フラッシュレシーバーをバンドヒーターで約６０℃に予熱した。粉砕穂軸を以下のように調製した。全粒トウモロコシ穂軸を、約０．９５ｃｍのジョー間隔を有するジョークラッシャー（２．２ｋＷモーター）、その後にデランパー（ｄｅｌｕｍｐｅｒ）（１．５ｋＷモーター、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｍｉｌｌｅｒ  Ｉｎｃ．（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，ＮＪ））で処理し、その後に１．９ｃｍの米国標準スクリーンを装備するＳｗｅｃｏスクリーンでスクリーニングし、全粒穂軸をより小さい切片に粉砕した。これらの加工済み穂軸（１７５ｇ、乾燥重量基準）を、穂軸をピストンを取り出した反応器の端部に手作業で入れることにより、大型バレルピストン反応器に装入した。ピストンを元に戻し、端部に差し込んだ。真空を反応容器およびフラッシュレシーバーに適用し、１０ｋＰａ未満に降圧し、希釈水酸化アンモニウム溶液を反応器に注入し、６ｇ／１００ｇバイオマス乾燥重量のアンモニア濃度および４５ｇ／１００ｇ全バイオマス−水性アンモニア混合物のバイオマス乾燥重量濃度を得た。一旦、アンモニアを装入すると、蒸気を反応器に注入し、温度を１４５℃にした。混合物を、温度を監視し、必要に応じて蒸気を添加することにより、この温度で１０もしくは２０分間保持し、次いでピストンを駆動することによって予熱したフラッシュタンクに排出した。フラッシュレシーバーが約５９℃に達するまでフラッシュタンクに対して真空を引いた。遊離液体を、フラッシュレシーバーからの回収時、前処理固形物から分離し、糖化のために再び添加しなかった。合計１７のかかる前処理を実施した。４つの前処理から得られる前処理穂軸を糖化のためにプールし、フェドバッチ糖化のための初期加水分解物を提供した。残りの１３のランから得られる前処理穂軸をフェドバッチ糖化での使用のためにプールした。
【００８８】
フェドバッチ糖化を開始するため、一般的方法に記載のフェドバッチ糖化反応器にまず加水分解物を装入し、反応器容積を第１のインペラーの底部に至るまで満たした。この加水分解物を、前処理穂軸を２．８Ｌの振とうフラスコ内で糖化することによって調製した。これらの振とうフラスコに、４６５ｇの前処理固形物、ＤＩ水１０００ｍｌ、ならびに、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼおよびアラビノフラノシダーゼを含む、２８．４ｍｇのＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰ／ｇセルロースおよび４．２ｍｇ活性タンパク質／ｇセルロースのヘミセルラーゼ酵素共同体（Ｄｉｖｅｒｓａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））での酵素を装入した。酵素添加前、ｐＨを８．５％Ｈ３ＰＯ４で５に調整した。振とうフラスコを回転振とう器内、５０℃および１５０ｒｐｍで４８時間維持し、その時点で加水分解物をフェドバッチ反応器に装入した。
【００８９】
一旦、初期加水分解物を装入すると、前処理バイオマス−アンモニア混合物の第１の一定分量（約７００ｇ）を反応器に添加した。ｐＨを８．５％Ｈ３ＰＯ４の添加によって設定値５．５で維持した。一旦、ｐＨを設定値に再調整してから、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼおよびアラビノフラノシダーゼを含む、２８．４ｍｇのＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰ／ｇセルロースおよびヘミセルラーゼ酵素共同体（Ｄｉｖｅｒｓａ）の４．２ｍｇ活性タンパク質／ｇセルロースを添加した。前処理バイオマス−アンモニア混合物、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼおよびヘミセルラーゼ酵素共同体のさらなる一定分量を、ｔ＝４、８、１２、２２、２６、３０および３４時間に添加した。ポンプアラウンドループを概して酵素添加の約１時間後に開始し、約１時間から最大で２２時間の固形物添加の間、実行した。２６時間および３０時間の添加後、ポンプを酵素添加の約５０分後開始し、３０分間実行した。３４時間の添加後、ポンプを酵素添加の約３時間後に開始し、３０分間実行した。また、ポンプをｔ＝２９、３３、４７および４９時間に３０分間実行した。全糖化時間は１２０時間であった。この時点で、加水分解物は、約６０ｇ／Ｌの単量体グルコース、２５ｇ／Ｌの単量体キシロースおよび１０ｇ／Ｌの酢酸を含有した。
【００９０】
この加水分解物を、アルコール発酵菌（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＷ８００またはＺＷ６５８（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８）の発酵に使用した。ＺＷ６５８は、エタノールへのキシロース発酵のために改変されているアルコール発酵菌（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の株であり、参照として本明細書に援用される共同所有される同時係属中の米国特許出願第６０／８４７８１３号明細書に記載されている。ＺＷ６５８は、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする４つのキシロース利用遺伝子を有する２つのオペロン、ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔを連続転位事象を介してＺＷ１（ＡＴＣＣ＃３１８２１）のゲノムに統合し、その後にキシロースを含有する選択培地に適応させることによって作成した。ＺＷ８００は、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼをコードする遺伝子が不活性化されたＺＷ６５８株であり、また共同所有される同時係属中の米国特許出願第６０／８４７８１３号明細書に記載されている。
【００９１】
発酵を、５００ｍｌの初期作動容積（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）を有する１リットルの滅菌発酵槽（ＢＩＯＳＴＡＴ（登録商標）  Ｂ−ＤＣＵシステム、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢＢＩ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ））内で実施した。接種材料を、添加後の培養液中でＯＤ６００が約１であるように、１０％（ｖ／ｖ）のレベルで発酵糖に添加した。加水分解物は、水との均衡状態で、８０％または４０％（ｖ／ｖ）で存在した。さらなるグルコースおよびキシロースを添加し、培養液中の最終濃度をそれぞれ９２ｇ／Ｌおよび８２ｇ／Ｌにした。また、培養液に１０ｍＭソルビトールおよび１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを補充した。発酵を、１５０ｒｐｍで撹拌しながら、３３℃、ｐＨ５．８で７２時間実施した。ＺＷ８００株における最終のエタノール滴定濃度は、４０％加水分解物中で８ｇ／Ｌ、８０％加水分解物中で７ｇ／Ｌであった。ＺＷ６５８においては、最終エタノール滴定濃度は、４０％加水分解物中で８ｇ／Ｌ、８０％加水分解物中で６．５ｇ／Ｌであった。
【国際調査報告】
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