(57)【要約】  本発明は有効量のポリガンマグルタミン酸を含むウイルス感染の抑制または予防用医薬組成物に関し、より一層詳しくは、呼吸器及び全身感染を誘導するウイルス、例えばインフルエンザウイルスに対する感染抑制効果を有するポリガンマグルタミン酸を有効性分として含み、ウイルスの感染を抑制して、ウイルス性疾患を予防できる医薬組成物、健康機能性食品または飼料添加剤に関する。本発明によるポリガンマグルタミン酸を有効性分として含む組成物はインフルエンザウイルス及び多様なウイルス性疾患の予防のための動物用飼料添加剤や薬品として使用可能なだけでなく、人体用医薬組成物及び健康機能性食品として使用できる効果がある。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のポリガンマグルタミン酸を含むウイルス感染の抑制またはウイルス疾患予防用医薬組成物。
【請求項２】
前記ポリガンマグルタミン酸の分子量は１ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ウイルスは呼吸器感染または全身感染を誘発できることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリガンマグルタミン酸がエタノールに希釈された形態の分散型製剤であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
有効量のポリガンマグルタミン酸を含むウイルス感染の抑制又はウイルス疾患の予防用健康機能性食品。
【請求項６】
有効量のポリガンマグルタミン酸を含むウイルス感染の抑制又はウイルス疾患の予防用飼料添加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は有効量のポリガンマグルタミン酸を含むウイルス感染の抑制または予防用医薬組成物に関し、より一層詳しくは呼吸器及び全身感染を誘導するウイルス、例えばインフルエンザウイルスに対する感染抑制効果を有するポリガンマグルタミン酸を有効成分として含み、ウイルスの感染を抑制して、ウイルス性疾患を予防できる医薬組成物、健康機能性食品及び飼料添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科(Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ)に属し、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ及びＮＳの８つのＲＮＡ断片を有しているウイルスである。基本的に脂質二重層構造を有するウイルス外皮(ｅｎｖｅｌｏｐ)及び外側の糖蛋白質によって囲まれた内部ヌクレオカプシド（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）または核蛋白質と結合されたリボ核酸(ＲＮＡ)で構成される。ウイルス外皮の内部層は主にマトリックス蛋白質で構成され、外部層は殆ど宿主から由来した脂質物質で構成される。このうち、外皮蛋白質を構成する二つの蛋白質、即ち、ヘマグルチニン(ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：以下「ＨＡ」という)及びノイラミニダーゼ(ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ：以下「ＮＡ」という)は、免疫抗体を誘導するための重要な免疫原であり、これらは抗原不連続変異及び抗原連続変異(ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｈｉｆｔ ａｎｄ ｄｒｉｆｔ)過程を介して変化する特徴を有している。このようなインフルエンザウイルスの変化は同一亜種内の他のインフルエンザウイルスに対して誘導された免疫も回避できるようにさせ、一般にインフルエンザウイルスによって誘導された免疫は短期間の内に消失されるため、シーズン毎に流行が予測されるウイルスに対して新しく免疫を誘導しなければならない。インフルエンザはＡ、Ｂ、Ｃの３グループに分類される。
【０００３】
インフルエンザウイルスはひどい風邪を誘発するが、これは急性呼吸器疾患(ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ)であり１〜５日の潜伏期を経た後、症状が現れる。殆どの感染者は、初期には症状が現れず、しかし後に主に熱が出て悪寒、痛み、食欲不振などの症状を引き起こす。一部においては、ウイルス性肺炎、及び細菌性肺炎などが誘発されて死亡にまで至る。過去２５０年の間に少なくとも十回程主要インフルエンザパンデミック(ｍａｊｏｒ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｐａｎｄｅｍｉｃ)があり、２〜３年毎にｔｙｐｅＡウイルスによるインフルエンザが流行している。インフルエンザは呼吸器に感染するため、その感染性が非常に高くて不顕性感染率が高くて、一度に多くの人々に感染する。主に５〜９才の子供と５５才以上の老人にしばしば発生し、秋から春の間によく発生する。インフルエンザの感染を制御するのが困難であり、不顕性感染が多いため患者を隔離する必要がない。インフルエンザワクチンは多様なタイプを混合した不活性化ワクチンであり、ある程度の副作用があって、３〜６ヶ月しか持続しないため、子供と老弱者のような危険性が高い人に毎年接種する。
【０００４】
ポリガンマグルタミン酸(γ-ＰＧＡ)は微生物によって生産される粘液性物質である。ポリガンマグルタミン酸(ＰＧＡ)はわらを利用した韓国の伝統豆醗酵食品であるチョングッチャンス、日本の伝統豆醗酵食品である納豆、ネパールの伝統豆醗酵食品であるキネマ（Ｋｉｎｅｍａ）などから分離されたバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌株から生産される。バシラス属菌株から生産されるポリガンマグルタミン酸(γ-ＰＧＡ)は、食用、水溶性、マイナスイオン性及び生分解性高分子物質で、吸湿剤、保湿剤及び化粧品の原料物質として利用可能である。最近、ポリガンマグルタミン酸(γ-ＰＧＡ)を利用した難分解性重合体の代替商品素材、エステル化反応による耐熱性プラスチックの開発と水溶性繊維及び膜生産などに関する研究が先進国を中心に活発に進められている。
【０００５】
本発明者は高分子量のポリガンマグルタミン酸(ＰＧＡ)を生産する好塩性菌株である枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）チョングッチャン菌株を使用してポリガンマグルタミン酸(ＰＧＡ)を生産する方法に関する特許(韓国登録特許第５００，７９６号)を獲得し、その他にポリガンマグルタミン酸(ＰＧＡ)を含む坑癌組成物、免疫アジュバント及び免疫増強剤に関する特許(韓国登録特許第４９６，６０６号、韓国登録特許第５１７，１１４号、韓国登録特許第４７５，４０６号)を獲得した。
【０００６】
そこで、本発明者は人体に対する副作用や害がなく、かつ呼吸器または全身感染を誘発するウイルス、例えばインフルエンザウイルスに対する感染抑制効果を有する飼料添加剤、健康機能性食品及び医薬組成物を開発に鋭意努力し、ポリガンマグルタミン酸を投与した家畜にウイルスを感染させた結果、ウイルス感染を抑制できることを確認して、本発明を完成に至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国登録特許第４７５，４０６号
【特許文献２】韓国登録特許第４９６，６０６号
【特許文献３】韓国登録特許第５００，７９６号
【特許文献４】韓国登録特許第５１７，１１４号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、インフルエンザウイルスの如く呼吸器及び全身感染を誘発するウイルスに対する感染抑制効果を有するポリガンマグルタミン酸を有効性分として含み、ウイルスの感染を抑制し、これにより病気を予防できる医薬組成物、健康機能性食品及び飼料添加剤を提供するところにある。
【課題を達成するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は有効量のポリガンマグルタミン酸を含むウイルス感染抑制またはウイルス疾患予防用医薬組成物を提供する。
【００１０】
さらに本発明は、有効量のポリガンマグルタミン酸を含むウイルスの感染抑制または予防用健康機能性食品を提供する。
【００１１】
また本発明は、有効量のポリガンマグルタミン酸を含むウイルスの感染抑制または予防用飼料添加剤を提供する。
本発明の他の特徴及び具現例は次の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ウイルスを感染させたマウスの感染経過日数による生存個体数変化を示したグラフである。
【図２】ウイルスを感染させたマウスの感染経過日数による死亡個体数変化を示したグラフである。
【図３】ウイルスを感染させたマウスの肺組織におけるウイルス力価変化を感染経過日数により示したグラフである。
【図４】ウイルスを感染させたマウスの感染経過日数による体重減少率を示したグラフである。
【図５】ポリガンマグルタミン酸処理によるマクロファージでのＩＦＮ-β増加を確認したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は一側面において有効量のポリガンマグルタミン酸を含むウイルス感染の抑制またはウイルス疾患予防用医薬組成物に関する。
【００１４】
本発明において、ウイルスに対する感染抑制及び疾患予防効果を有する前記ポリガンマグルタミン酸は、分子量１０ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａのポリガンマグルタミン酸を用いるのが望ましく、より一層望ましくは３，０００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａの高分子量ポリガンマグルタミン酸を用いる。
【００１５】
本発明において、前記ウイルスは呼吸器感染または全身感染を誘発できるウイルスであってもよく、前記ウイルスは、好ましくはインフルエンザウイルスである。
【００１６】
本発明のウイルス感染抑制及びウイルス疾患予防用組成物は、前記インフルエンザウイルスによるパンデミックインフルエンザ、インフルエンザ、風邪、咽喉炎、気管支炎、または肺炎に対する予防用として用いられる。
【００１７】
本発明のウイルス感染予防用医薬組成物１００重量部に対し０.２〜２重量部のポリガンマグルタミン酸を含有するのが望ましく、ポリガンマグルタミン酸が０.２重量部未満で含まれている場合、ウイルス感染抑制効果を期待できなく、２重量部を超えて含まれている場合、含有量増加による感染抑制効果の増加を期待できないだけでなく高い経費がかかり、非経済的である。
【００１８】
前記ポリガンマグルタミン酸を０.１〜２.０重量部含む組成物は、エタノールを含む液状製剤で製造する場合、人間を含む動物の個体別散布または大規模集団防疫に使われる分散型に製剤可能である。前記分散型製剤に使われるエタノールの含有量が５０％を超える場合、ポリガンマグルタミン酸が沈殿の恐れがあり、１％未満の場合、粘度が増加して、分散できない恐れがあり、１〜５０％で添加されるのが望ましい。
本発明は他の側面において、有効量のポリガンマグルタミン酸を含むウイルス感染予防用健康機能性食品に関する。
【００１９】
本発明の健康機能性食品は、粉末、顆粒、錠剤、カプセルまたは飲み物の形態で製造可能であり、香味剤、天然炭水化物、ビタミン、鉱物、ミネラル、風味剤、着色剤、総量剤、安定剤、及び防腐剤などを含んでもよい。
【００２０】
本発明はまた他の側面において、有効量のポリガンマグルタミン酸を含むウイルス感染予防用飼料添加剤に関する。
【００２１】
本発明による飼料添加剤は家畜のウイルスによる感染性疾患を効果的に予防でき、本発明の飼料添加剤は家畜に与えられ、牛、豚、ウサギ、馬、ヤギ、犬、猫、及び鹿などの哺乳動物と、ニワトリ、鴨、七面鳥、及びウズラなどの家禽類に与えられる。
【００２２】
本発明の飼料添加剤１００重量部に対し０.２〜２.０重量部のポリガンマグルタミン酸を含むのが望ましく、ポリガンマグルタミン酸が０.２重量部未満で含まれている場合、ウイルス予防効果を期待できなく、２.０重量部を超えて含まれている場合、含有量増加による感染抑制効果の増加を期待できないだけでなく高い経費がかかり、非経済的である。
【実施例】
【００２３】
以下本発明を実施例によって、より一層詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されないということは当業界において通常の知識を有するた者には自明であろう。
【００２４】
［実施例１］
超巨大ポリガンマグルタミン酸の製造及び分子量測定
ポリガンマグルタミン酸生産用基本培地(５％のＬ-グルタミン酸が添加されたＧＳ培地、Ｇｌｕｃｏｓｅ５％、(ＮＨ４)２ＳＯ４１％、ＫＨ２ＰＯ４０.２７％、ＮＡ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ０.４２％、ＮＡＣｌ０.０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０.３％、ｐＨ６.８)３Ｌを含む５Ｌの容量の醗酵機に、枯草菌チョングッチャン(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ、ＫＣＴＣ ０６９７ＢＰ)菌株の培養液を１％接種して、攪拌速度１５０ｒｐｍ、空気注入速度１ｖｖｍにして、３７℃で７２時間培養した。培養が終わった培養液をフィルタープレスを使用して菌体を除去してポリガンマグルタミン酸含有試料液を取得した。
【００２５】
前記試料液に２Ｎ硫酸溶液を添加後１０℃で１２時間静置させてポリガンマグルタミン酸沈殿物を取得した。これを十分量の蒸留水で洗浄した後、ヌッチェ式ろ過機を利用してポリガンマグルタミン酸を取得した。前記取得したポリガンマグルタミン酸をＧＰＣ(Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ)を利用して、分子量を測定した結果、１〜１５，０００ｋＤａのポリガンマグルタミン酸が生成されたのを確認し、分子量別に分離して、７，０００ｋＤａの平均分子量を有するポリガンマグルタミン酸を利用して、次の実施例に使った。
【００２６】
［実施例２］
ポリガンマグルタミン酸の経口投与毒性試験結果
ポリガンマグルタミン酸の経口投与時安全性を確認するためにＧＬＰ(Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ)の認証を受けた安全性評価研究機関である（株）バイオトクステックにポリガンマグルタミン酸のラットを利用した単回経口投与毒性試験を依頼した。試験はＧＬＰ規定及び試験基準と（株）バイオトクステックの標準作業手順で(ＳＯＰｓ)を遵守して行われた。
【００２７】
ラットは６週齢、雄１０匹(体重１５９.７６〜１７７.２７g)と雌１０匹(体重１２１.６０〜１３８.８０ｇ)を用いて、個体別ポリガンマグルタミン酸の投与液量は絶食後投与当日の体重を基準として算出した。全てのラットは投与前に飲水は自由摂取させ、約１６時間絶食させた後、経口投与用ゾンデを付けた使い捨て注射器(５ｍＬ)を利用して、胃内に単回強制経口投与し、投与後約４時間で飼料を与えた。
【００２８】
予備試験において１００ｍｇ／ｍＬ濃度のポリガンマグルタミン酸を２０ｍＬ／ｋｇの投与容量でラット雄・雌各２匹に単回経口投与した結果、死亡例が見られなかったため、２０００ｍｇ／２０ｍＬ／ｋｇの単一容量を設定した。対照群には試験物質投与群と同じ液量の賦形剤を投与した。投与液量は２０ｍＬ／ｋｇにした。
【００２９】
その結果、表１に示したように、観察期間の間ポリガンマグルタミン酸経口投与による死亡例及び一般症状は見られなかった。観察期間の間、ラットの体重は雄・雌対照群及び試験物質投与群において順調な増加が見られた。解剖検査結果、雄・雌対照群と試験物質投与群における肉眼的な異常所見は見られなかった。以上のようにポリガンマグルタミン酸をラットに単回経口投与した結果、試験物質による一般症状及び死亡例が見られなかったため、ポリガンマグルタミン酸の致死量は雄・雌各２０００ｍｇ／ｋｇ以上であると判断された。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
［実施例３］
ポリガンマグルタミン酸によるインフルエンザウイルスに対する免疫増強効果１
本実施例においては、ポリガンマグルタミン酸の鳥インフルエンザに対する特異的感染抑制効果を調べるために、インフルエンザウイルスを感染させた実験動物の斃死とウイルスの増殖及び抗体生産を確認した。
【００３２】
(１)ウイルスの準備
病原体として使用されたインフルエンザウイルスは韓国忠北大学医科大学微生物学実験室チョヨンギ教授から分譲を受けた、マウスにおいて高病原性を示すＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株(Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４(Ｈ１Ｎ１))をＭａｄｉｎ-Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ (ＭＤＣＫ) ｃｅｌｌで増幅した後、実験に使用し、実験動物は６週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスを用いた。
【００３３】
分譲されたウイルスの純粋分離は次のように実施した。
はじめに、分離したウイルスを抗生剤が入っているＰＢＳに希釈して、１０日齢になった白色産卵鶏の有精卵に接種した後、３７℃で４８時間静置培養した後、有精卵の尿膜液を取って、増幅されたウイルスを使用した。
【００３４】
次に、６ｗｅｌｌ細胞培養プレートでペニシリンとストレプトマイシンと５％牛胎児血清(ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ)を含むａｌｐｈａ-ＭＥＭ(ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ)培地で増殖したＭＤＣＫ ｃｅｌｌをＰＢＳで３度洗浄してペニシリンとストレプトマイシン(以下、Ｐ／Ｓ)は含むがＦＢＳを含まない培地で希釈して、各ｗｅｌｌにウイルスを希釈して感染させた後、５％二酸化炭素が充填した３７℃細胞培養器で１時間培養した。ＦＢＳを含まず、０.１％ＴＰＣＫ(Ｎ-ａｌｐｈａ-ｔｏｓｙｌ-Ｌ-ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ ｋｅｔｏｎｅ) ｔｒｅａｔｅｄ-ｔｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡとＰ／Ｓを含むalpｈａ-ＭＥＭ培地を各ｗｅｌｌに入れて細胞培養器で培養した。培養２４時間後、細胞培養プレートをＰＢＳで洗浄して培地を含んでいる０.１％ｎｏｂｌｅ ａｇａｒを使用して固定した。
【００３５】
培養されたプラークを予め準備されたＭＤＣＫ ｃｅｌｌが培養された２４ｗｅｌｌプレートに各ｗｅｌｌ当たり１個のプラークを接種してＦＢＳを含まず、０.１％ＴＰＣＫ ｔｒｅａｔｅｄ-ｔｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡとＰ／Ｓを含むａｌｐｈａ-ＭＥＭ培地を各ｗｅｌｌに入れて細胞培養器で培養した。４８時間後、各ｗｅｌｌの培地を取って、遠心分離して上清を前記と同じ方法で準備されたＭＤＣＫ ｃｅｌｌフラスコに感染させた後３６時間乃至４８時間培養して得られた培養液を遠心分離して、上清をマイクロチューブに移して−８０℃の低温冷凍庫に動物実験前まで保管した。
【００３６】
(２)動物実験
まず対照群(実験群３)としてはインフルエンザウイルスを単独で鼻腔投与したマウスを用いて、実験群１はポリガンマグルタミン酸(γ-ＰＧＡ)を投与した後、翌日インフルエンザウイルスを投与してウイルスに対する免疫を増加させて、感染を抑制した。実験群１のマウスはジエチルエーテルを使用して、３０秒間麻酔した後、最終濃度０.５％のポリガンマグルタミン酸(７，０００ｋＤａ)３０μＬを各マウスの鼻腔に投与した。翌日同じ量のポリガンマグルタミン酸と共にインフルエンザウイルスを同時に投与した。
実験群２は実験群１のウイルス感染した日にポリガンマグルタミン酸と共にインフルエンザウイルスを同時に投与したマウスを実験群として用いた。実験群の編成は表２に示す。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
ウイルスの感染は実験動物にジエチルエーテルを使用して３０秒間麻酔した後、ウイルス３０μＬを各マウスに鼻腔を通して投与し、ウイルス量Ａの投与グループは２.５×１０５ＥＩＤ５０ウイルスを投与し、ウイルス量Ｂの投与グループは１.２５×１０５ＥＩＤ５０を投与した。
【００３９】
その結果、図１に示したように、対照群(実験群３)はウイルス投与後７日目に全体が斃死した。ポリガンマグルタミン酸と同時に投与した実験群においては実験群１のウイルス量Ａを投与したグループで１２日目に２匹が斃死した。ポリガンマグルタミン酸を１日前に投与した実験群１ではウイルス投与後２週以上生存した。これはポリガンマグルタミン酸を予め投与するのが、免疫力を誘導してウイルス感染を抑制して、同時に投与しても個体の生存に役立つことを示す。
【００４０】
ウイルスを鼻腔投与した後、一週間後に３日間隔(ウイルス投与後７日目、１０日目及び１３日目)でグループ毎にマウスを１匹ずつ安楽死させて、肺組織と血清を採取した。
各実験群毎の経過日数によるマウス肺組織におけるインフルエンザウイルスの力価(ｔｉｔｅｒ)は、下記のＨＡ(Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ)テスト法で測定した。
【００４１】
斃死したマウスを含み、該当日のマウスをジエチルエーテルを使用して、３０秒間麻酔し、胸腔を切除して肺組織を取得して、液体窒素を利用して急速凍結させ、力価測定前まで−８０℃で保管した。抗生剤が入っているＰＢＳ(５００μＬ)に採取された肺組織を浸漬し、高圧湿潤蒸気滅菌された小さい金属ビーズと共に組織粉砕機に入れて３分間粉砕した。組織粉砕物は遠心分離して、上清を取得し、１０進希釈して、各希釈液を白色産卵鶏の産卵１０日目の有精卵に接種した。
【００４２】
接種した有精卵を３７℃で４８時間培養後尿膜液を得た。得られた尿膜液を９６ｗｅｌｌの丸い底プレートの最初のｗｅｌｌに５０μＬ入れてそれぞれ次のｗｅｌｌで同一大きさのＰＢＳで２進希釈して、最後のｗｅｌｌの希釈後、５０μＬは捨てた。最後に０.５％ニワトリの赤血球を含んでいるＰＢＳをｗｅｌｌに５０μＬずついれて室温で４０分間反応させた。
【００４３】
各力価は１０進希釈された接種液２００μＬで計算された値で、ｌｏｇ１０Ｎ=１０ＮでＮ値を表記した。
【００４４】
【表３】
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【００４５】
その結果、表３に示したように、ウイルス投与７日後、対照群である実験群３のウイルス量Ａを投与した群は力価５.３、ウイルス量Ｂを投与した群は力価５を示し、全部斃死したため増加や減少傾向は見られなかった。実験群１のウイルス量Ｂを投与した群においては時間の経過と共に次第に力価が減少する傾向を示した。しかし、実験群２は微弱な減少傾向を示した。これでポリガンマグルタミン酸の投与が個体マウスの高病原性のウイルスの克服に効果があることが明らかになった。また、減少傾向は、ポリガンマグルタミン酸で先に免疫刺激を与えたグループの減少傾向がより大きいことからポリガンマグルタミン酸の免疫刺激がウイルスに抵抗する効果をもたらしたと考えられる。
【００４６】
各グループ毎の経過日数によるマウス血清における抗体力価測定は下記のＨＩ(Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ)テスト法で測定した。
【００４７】
全ての血清はＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅから抽出したＲＤＥ(ｒｅｃｅｐｔｏｒ-ｄｅｓｔｒｏｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ)を血清サンプル体積対比１：３で処理した後(例とえば、血清１０μＬにＲＤＥ３０μＬ添加)、３７℃培養器で１８〜２０時間培養した。血清内の非特異的な受容体の活性を不活化したサンプルを９６ｗｅｌｌ丸底プレートで２５μＬずつ順次２進希釈した。次に血清サンプルに同一体積の４ＨＡＵウイルスを入れて、３７℃培養器で３０分間反応させて、最後に０.５％ニワトリ赤血球を含むＰＢＳを５０μＬずついれた後、室温で４０分間反応させた。
【００４８】
【表４】
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【００４９】
その結果、表４に示したように、ポリガンマグルタミン酸と同時にウイルスを投与した実験群においてウイルスに対する抗体力価が増加した。実験群２は１３日目抗体が現れ始め、１５日目まで増加することが明らかになった。実験群１は１５日目にウイルスに対する抗体が現れ始めた。対照群は７日目に全部斃死をしたため、７日目の標本だけ測定した。しかし、ウイルスに対する抗体は現れなかった。ウイルス投与する前日にポリガンマグルタミン酸で免疫刺激を与えたグループにおいては抗体生成が遅れたもののポリガンマグルタミン酸とウイルスを同時投与のみを行ったグループよりも強い抗体生成を示した。
【００５０】
この結果から、本発明によるポリガンマグルタミン酸がインフルエンザウイルスに対する免疫増強効果を示し、感染を抑制することが分かった。
【００５１】
［実施例４］
ポリガンマグルタミン酸によるインフルエンザウイルスに対する免疫増強効果２
本実施例ではポリガンマグルタミン酸が鳥インフルエンザウイルスに対する特異的感染抑制効果を示すのか調べるために実験動物におけるインフルエンザウイルス感染による斃死とウイルスの増殖及び抗体生産を確認した。
【００５２】
病原体として使用したインフルエンザウイルスは韓国忠北大学微生物学実験室チェヨンギ教授から分譲を受けた、ｍｏｕｓｅにおいて高病原性を示すＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株(Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４(Ｈ１Ｎ１))をＭａｄｉｎ-Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ (ＭＤＣＫ) ｃｅｌｌで増幅した後、実験に使用し、実験動物としては６週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスを用いた。
【００５３】
動物実験は次のように行った。
対照群(実験群１)はインフルエンザウイルスを単独で投与し、実験群２は２回にかけてポリガンマグルタミン酸を投与した後、インフルエンザウイルス投与した群であり、実験群３はポリガンマグルタミン酸とインフルエンザウイルスを同時に投与した。
【００５４】
インフルエンザウイルスとポリガンマグルタミン酸は実験マウスの鼻腔を通して投与し、ジエチルエーテルで３０秒間麻酔した後投与し、ポリガンマグルタミン酸の場合、該当体積の最終濃度０.５％ｙ-ＰＧＡ(７、０００ｋＤａ)を３０μＬを各マウスに鼻腔を通して投与し、ウイルスは１０４ＥＩＤ５０(３０μＬ)を投与した。
【００５５】
実験群３は実験群２のウイルス感染した日にポリガンマグルタミン酸と共にインフルエンザウイルスを同時に投与したマウスを実験群として使用した。
【００５６】
斃死率を測定するためのマウスを各群当たり６匹、経過日数毎のウイルス変化量を測定するためのマウス１８匹、対照群は１５匹を実験に使用し、病原性観察指標で体重変化率を測定するために経過日数毎及びグループ毎の体重変化をモニタリングした。
【００５７】
その結果、図２に示したように、対照群(実験群１)においてウイルス投与して一週間経過した後、１匹が死んでから、９日目３匹、１２日目には深刻な病原性を示すマウス２匹が残った。残りの実験群は１２日に弱い発病症状を示し、１２日以上生存した。
【００５８】
ウイルスを鼻腔投与した後、一週間後に２日間隔(ウイルス投与後１日、３日、５日、７日、９日、１２日)で実験群当たり２匹ずつ安楽死して、各マウスの肺組織と血清を採取した。
【００５９】
各実験群毎の経過日数によるマウス肺組織におけるインフルエンザウイルスの力価(ｔｉｔｅｒ)は実施例２と同じＨＡ(Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ)テスト法で測定した。
【００６０】
その結果、図３に示したように、各力価は１０進希釈された接種液２００μＬで計算された値で、ｌｏｇ１０Ｎ=１０ＮでＮ値を表記した。ウイルスの力価は実験群１及び実験群３においてウイルス投与後５日目に最高値の５.５を示した。
【００６１】
ウイルス投与前ポリガンマグルタミン酸で免疫刺激した実験群２はウイルス投与後初日に比較的低いウイルス力価を示して、５日目まで増加して５日目以後減少傾向に変わり７日以後には急激に減少し、１２日目にウイルスがそれ以上検出されなかった。ウイルス投与日にポリガンマグルタミン酸と同時に投与した実験群３はウイルス投与後５日目に対照群と同じ力価を示したが、５日目以後減少傾向に変わり、実験群２と共にウイルス投与後７日目に急激に減少し、１２日目にウイルスがそれ以上検出されなかった。これは投与したポリガンマグルタミン酸が、個体マウスのウイルスへの抵抗を助けていることを意味しており、さらに増加した免疫力によって、個体マウスのウイルス感染を抑えている。
【００６２】
病原性指標として、体重変化率を測定するために、経過日数毎及びグループ毎の体重変化をモニタリングした(図４)。それぞれの値はウイルス投与前の体重に対する減少率をパーセントで表記した。
【００６３】
対照群(実験群１)にウイルス投与後、５日目以後体重減少が急激に進行し始め、７日目以後には致死率２０％を超えることが示された。他の２つのグループはウイルス投与後７日目まで体重減少を示したが、７日目以後には体重が増加傾向に変わると共に回復を示した。これはウイルス投与後の斃死進行状態及び肺組織におけるウイルス力価と、相関関係があることが分かる。
【００６４】
この結果から、本発明によるポリガンマグルタミン酸がインフルエンザウイルスに対する免疫増強効果を示し、感染を抑制することが分かった。
【００６５】
［実施例５］
ポリガンマグルタミン酸(γ-ＰＧＡ)によるマクロファージにおけるＩＦＮ-β分泌誘導
本発明のγ-ＰＧＡの免疫系の１次的な免疫反応、ウイルス抑制活性に主要な役割を果たすマクロファージ(ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ)の活性化に及ぼす影響を確認した。
【００６６】
マクロファージの活性化に対する指標としてマクロファージが分泌する主要なサイトカインとして、先天免疫（ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）の反応を媒介するインターフェロンベータ(ＩＦＮ-β)の分泌を調べた。
【００６７】
このためにＢａｌｂ／ｃマウスのマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４.７(ＡＴＣＣ ＴＩＢ-７１)をＤＭＥＮ(１００Ｕ／ｍＬペニシリン-ストレプトマイシン、１０％ＦＢＳ添加)培地に浮遊させた後、６ｗｅｌｌプレートに５×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで分注して、１２時ＣＯ２培養器で培養した後、γ-ＰＧＡ(７，０００ｋＤａ)をそれぞれ０.１％、０.５％濃度でＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地に希釈して１２時間培養した。
【００６８】
刺激のための培養が進められる間、３時間おき（３、６、１２、２４時間）に、各ｗｅｌｌの培養上清液を回収し、回収した上清液の体積程培養液を補充した。回収された培養上清液に存在するＩＦＮ-βの分泌量をＥＬＩＳＡキット(ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ)を利用して測定した。
【００６９】
ＩＦＮ-βの抗マウス単クローン抗体でコーティングされた９６ウェルプレートにＩＦＮ-β標準溶液１００μＬと培養上清液１００μＬを入れて常温で１時間反応させた。その後、洗浄緩衝液(２５０μＬ／ｗｅｌｌ)で３回洗浄した後、第１次抗体であるビオチン化抗マウスＩＦＮ-β各々のポリクローナル抗体１００μＬを添加して、１時間常温で反応させた後、洗浄緩衝液(２５０μＬ／ｗｅｌｌ)で３回洗浄した。以降、第２次抗体であるアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（ａｖｉｄｉｎ-ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を１００μＬ加え、常温で１時間反応させて３回洗浄した後、ＴＭＢ発色溶液で１５分間反応させた後、５０μＬの停止溶液(ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ)で発色を停止させた。さらに、４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーで測定してそれぞれＩＦＮ-βの量を分析した。
【００７０】
その結果、図５に示したように、γ-ＰＧＡと共に培養されたマクロファージが６時間以後からインターフェロンベータの分泌を始め、時間経過と共に分泌量が増加することが分かり、γ-ＰＧＡの濃度増加に伴ってインターフェロンベータの分泌量も増加を示しγ-ＰＧＡ濃度依存的な反応をすることが分かった。
【００７１】
γ-ＰＧＡがマクロファージ刺激剤として優秀な効果を有することを確認できた、マクロファージ活性化において濃度依存傾向が示された。
【００７２】
これらのことから本発明によるγ-ＰＧＡが、免疫反応及びウイルス成長抑制に重要な役割を果たすマクロファージの活性化指標である、マクロファージが分泌するＩＦＮ-βの分泌を誘導することが確認できた。
【産業上利用の可能性】
【００７３】
以上のとおり、詳細に説明して立証したように、本発明によるポリガンマグルタミン酸を有効性分として含む組成物は、インフルエンザウイルス及び多様なウイルス性疾患の予防のための動物用飼料添加剤や薬品で使用可能なだけでなく、人体用医薬組成物及び健康機能性食品として使用できるという効果がある。
【００７４】
以上で本発明内容の特定部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者において、このような具体的技術は単に望ましい実施様態に過ぎなく、これによって、本発明の範囲が制限されるのではない点は明らかであろう。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とその等価物によって定義される。本発明の単なる変形や変更はこの分野の通常の知識を有するた者によって容易に実施でき、このような変形や変更は全て本発明の範囲に含まれるものと見られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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