(57)【要約】  本発明は組成物、装置、及び骨及び／又は軟骨の欠損を治療するための方法、及びそのような組成物又は装置を製造するための方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、骨及び／又は軟骨の欠損を治療するための装置及び／又は組成物であって、該組成物は、好ましくは動物由来であって、骨誘導性又は軟骨誘導性活性を有する少なくとも一つの物質と、また少なくとも一つの骨刺激性及び／又は軟骨刺激性効果を有する分化及び／又は成長因子と、少なくとも一つの充填材を備え、前記組成物は凍結乾燥した状態である組成物をもたらす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨及び／又は軟骨の欠損を治療するための組成物であって、
該組成物は、好ましくは動物由来であって、骨誘導性又は軟骨誘導性活性を有する少なくとも一つの物質を好ましくは含む少なくとも一つのコラーゲンと、
少なくとも一つの骨刺激性及び／又は軟骨刺激性効果を有する分化及び／又は成長因子と、
少なくとも一つの充填材を備え、
前記組成物は凍結乾燥した状態であることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記少なくとも一つの分化因子又は成長因子がタンパク質又はペプチド、好ましくは糖タンパク質又は糖ペプチド、好ましくはサイトカインであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記分化因子又は成長因子がヒトの分化因子又は成長因子であることを特徴とする請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
前記分化因子又は成長因子が組換えにより作製されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記分化因子又は成長因子がＴＧＦ（Transforming Growth Factor：トランスフォーミング増殖因子）ファミリーのメンバーの少なくとも一つを有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記分化因子又は成長因子がＢＭＰ（Bone Morphogenetic Proteins：骨形成タンパク質）の群のメンバーの少なくとも一つを有し、前記メンバーは好ましくはＢＭＰ−２及び／又はＢＭＰ−７であることを特徴とする請求項５記載の組成物。
【請求項７】
前記分化因子又は成長因子がＴＧＦβ（Transforming Growth Factor：トランスフォーミング増殖因子ベータ）又はＶＥＧＦ（Vascular Endothelial Growth Factor：血管内皮増殖因子）であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
コラーゲン、骨誘導性又は軟骨誘導性活性の量に関連する前記分化因子又は成長因子が、約０．００５から約５重量％の比率を有し、好ましくは約０．０１から約４重量％の比率を有することを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記分化因子又は成長因子が、約０．０５から約２重量％の比率、好ましくは約０．１から約５重量％の比率、好ましくは約０．５から約３重量％の比率を有することを特徴とする請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
好ましくは骨伝導性特性を有する少なくとも一つの足場材料をさらに備えることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記足場がコラーゲン、好ましくはＩ型コラーゲンであることを特徴とする請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
前記足場材料がセラミック、生体親和性金属及び生体親和性ポリマの群から選択される少なくとも一つであることを特徴とする請求項１０記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物は軟骨誘導性活性を有し、また前記分化因子又は成長因子はＴＧＦβであることを特徴とする請求項７記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物はさらに少なくとも一つの追加的な活性物質を備え、該活性物質は好ましくは少なくとも一つの細胞増殖抑制性及び／又は少なくとも一つの抗菌性であることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
少なくとも一つの成分をさらに備え、前記成分は、骨形成又は軟骨形成のための少なくとも一つの動員因子、少なくとも一つの接着因子、少なくとも一つの成長因子及び少なくとも一つの成熟因子の群から選択されることを特徴とする請求項１乃至１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記コラーゲンが哺乳類由来であって、好ましくはヒト、ウシ、ブタ又はウマ由来であることを特徴とする請求項１乃至１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
孔をさらに備え、該孔は好ましくは相互接続する孔、好ましくは約１００μｍから約３００μｍの範囲の直径を有する孔であって、
前記組成物は海面体様密度を有することを特徴とする請求項１乃至１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が少なくとも部分的に生体吸水性であって、好ましくは完全に生体吸水性であることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
略安定した形状の物体をさらに備えることを特徴とする請求項１乃至１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
骨及び／又は軟骨の欠損を治療するための組成物であって、
該組成物は、好ましくはヒト由来であって、骨誘導性又は軟骨誘導性活性を有する少なくとも一つの物質を好ましくは有する少なくとも一つの組換えコラーゲンを備え、
前記骨誘導性又は軟骨誘導性活性は少なくとも一つの組換え骨形成タンパク質（ＢＭＰ）であることを特徴とする組成物。
【請求項２１】
前記ＢＭＰが哺乳類由来であり、好ましくはウマ、ブタ、ウシ由来であることを特徴とする請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＢＭＰがヒト由来であることを特徴とする請求項２０又は２１記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＢＭＰがアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列はヒト由来のＢＭＰと少なくとも約７０％同一であることを特徴とする請求項２０又は２１記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＢＭＰが酵母又は細菌内で組換えにより作製されることを特徴とする請求項１乃至２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＢＭＰが細菌の大腸菌内で組換えによって作製されることを特徴とする請求項１乃至２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＢＭＰがタンパク質糖鎖付加できる細胞内で組換えにより作製されることを特徴とする請求項２０記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＢＭＰが哺乳類、鳥類、酵母及び昆虫から構成される群から選択される細胞内で作製されることを特徴とする請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
前記ＢＭＰが大腸菌、枯草菌、及びストレプトマイセス菌種の群から選択される細菌内で作製されることを特徴とする請求項２４記載の組成物。
【請求項２９】
ＢＭＰが、コラーゲンの量に関連して、約０．００５から約５重量％の割合、好ましくは約０．０１から約４重量％の割合を有することを特徴とする請求項１乃至２８のいずれかに記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＢＭＰが約０．０５から約２重量％の割合、好ましくは約０．１から約５重量％の割合、好ましくは約０．５から約３重量％の割合を有することを特徴とする請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
骨伝導性特性を有する少なくとも一つの足場材料をさらに追加的に備えることを特徴とする請求項１乃至３０のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
前記足場材料がコラーゲン、好ましくはＩ型コラーゲン、好ましくはヒトＩ型コラーゲンを備えることを特徴とする請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】
前記足場材料が少なくとも一つの物質を備え、該物質はリン酸三カルシウム、セラミック材料、生体親和性金属、及び生体親和性ポリマの群から選択されることを特徴とする請求項３２記載の組成物。
【請求項３４】
前記足場材料が、リン酸三カルシウム又はリン酸三カルシウムを有する二相物質であることを特徴とする請求項３３記載の組成物。
【請求項３５】
少なくとも一つの追加的な活性物質をさらに備え、該活性物質は好ましくは少なくとも一つの細胞増殖抑制性及び／又は少なくとも一つの抗菌性を備えることを特徴とする請求項１乃至３４のいずれかに記載の組成物。
【請求項３６】
少なくとも一つの追加的な成分をさらに備え、該成分は、骨形成又は軟骨形成のための少なくとも一つの動員因子、少なくとも一つの接着因子、少なくとも一つの成長因子及び少なくとも一つの成熟因子の群から選択される活性を有することを特徴とする請求項１乃至３５のいずれかに記載の組成物。
【請求項３７】
前記ヒトコラーゲンが組換えにより作製されたものであることを特徴とする請求項１乃至３６のいずれかに記載の組成物。
【請求項３８】
多孔質構造をさらに備え、該多孔質構造は孔、好ましくは相互接続する孔、好ましくは約１００μｍから約３００μｍの範囲の直径を有する孔を有し、
前記組成物は海面体様密度を有することを特徴とする請求項１乃至３７のいずれかに記載の組成物。
【請求項３９】
略生体吸収性であるか、或いは本来完全に生体吸収性であることを特徴とする請求項１乃至３８のいずれかに記載の組成物。
【請求項４０】
ジェル又はペースト状でもたらされることを特徴とする請求項１乃至３９のいずれかに記載の組成物。
【請求項４１】
略安定した形状の物体を備えることを特徴とする請求項１乃至４０のいずれかに記載の組成物。
【請求項４２】
骨及び／又は軟骨の欠損を治療するための組成物であって、該組成物は無菌的に調製された組換えヒトコラーゲン及び組換えヒト骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の混合物を備え、
前記コラーゲン及びＢＭＰは滅菌されていると共に、無菌的に混合され同時凍結乾燥又は同時顆粒化されていることを特徴とする組成物。
【請求項４３】
前記ＢＭＰがアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列はヒト由来のＢＭＰのアミノ酸配列と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、又は少なくとも約９５％同一であることを特徴とする請求項４２記載の組成物。
【請求項４４】
前記ＢＭＰが細菌内で作製されることを特徴とする請求項４２及び４３記載の組成物。
【請求項４５】
前記ＢＭＰが大腸菌内で作製されることを特徴とする請求項４２から４４のいずれかに記載の組成物。
【請求項４６】
前記ＢＭＰがタンパク質糖鎖付加できる細胞内で組換えにより作製されることを特徴とする請求項４２記載の組成物。
【請求項４７】
前記ＢＭＰが哺乳類、鳥類、酵母及び昆虫から構成される群から選択される細胞内で作製されることを特徴とする請求項４６記載の組成物。
【請求項４８】
ＢＭＰが、コラーゲンの量に関連して、約０．００５から約５重量％の割合、好ましくは約０．０１から約４重量％の割合を有することを特徴とする請求項４２乃至４７のいずれかに記載の組成物。
【請求項４９】
前記ＢＭＰが約０．０５から約２重量％の割合、好ましくは約０．１から約５重量％の割合、好ましくは約０．５から約３重量％の割合を有することを特徴とする請求項４８記載の組成物。
【請求項５０】
好ましくは動物由来であると共に好ましくは少なくとも一つの骨誘導性又は軟骨誘導性活性を有する少なくとも一つのコラーゲンと、骨刺激性及び／又は軟骨刺激性活性を有する少なくとも一つの分化因子又は成長因子を備える成分を混合させる段階と、
少なくとも部分的に安定した形状の、海面体状の物体を得るために前記成分を同時凍結乾燥させる段階を備えることを特徴とする請求項１乃至４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記コラーゲンが非ヒト由来であって、前記方法はさらに、混合前、前記コラーゲンをペプチターゼ、又はプロテアーゼ、好ましくはトリプシンと接触させることを特徴とする請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
混合前、前記分化因子又は成長因子を、好ましくは少なくとも一つの分離段階において濃縮する段階をさらに備えることを特徴とする請求項４２又は４３記載の方法。
【請求項５３】
混合前、少なくとも一つの足場材料を加える段階をさらに備える方法であって、前記足場材料は骨導電性特性を有すると共に、セラミック材料、生体親和性金属、生体親和性ポリマ及び生体の骨からの抽出物の群から選択され、前記抽出物は好ましくはＤＢＭ（脱灰骨基質）であり、
また前記方法はコラーゲンと共に混合、好ましくはコーティングする段階と、
好ましくは動物由来の少なくとも一つのコラーゲンと混合する段階を備え、前記コラーゲンは、骨伝導性又は軟骨伝導性、活性物質、及び／又は少なくとも一つの骨刺激性及び／又は軟骨刺激性効果を有する少なくとも一つの分化因子又は成長因子の少なくとも一つの添加物を有し、
また前記方法はさらに、少なくとも部分的に安定した形状の海面体を得るために、前記成分を同時凍結乾燥させる段階を備えることを特徴とする請求項５０乃至５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
無菌状態下で行われる請求項５０乃至５３の一つに記載の方法。
【請求項５５】
骨刺激性及び／又は軟骨刺激性効果を有する少なくとも一つの分化因子又は成長因子の使用方法であって、
前記使用方法は前記成長因子の滅菌溶液を少なくとも一つのコラーゲンの滅菌溶液で無菌的に混合し、前記コラーゲンは好ましくは動物由来であって、また好ましくは少なくとも一つの骨誘導性又は軟骨誘導性、活性物質を有し、
また、前記結果として生じた混合物をコンテナ内で同時凍結乾燥させて、手術中の移植片として単一使用することを特徴とする使用方法。
【請求項５６】
外科手術中に骨及び／又は軟骨の欠損を治療するための少なくとも一つのヒト骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の使用方法であって、該使用方法は、
外科手術中に、前記ＢＭＰを少なくとも一つのヒトコラーゲン及び少なくとも一つの足場材料に添加して混合物を得る段階と、及び
前記混合物を骨及び／又は軟骨欠損の治療用の無菌装置として提供する段階を含むことを特徴とする使用方法。
【請求項５７】
前記装置が外科的に可能な単位用量として提供されることを特徴とする請求項５６記載の使用方法。
【請求項５８】
前記組成物が凍結乾燥物、ジェル又はペーストであることを特徴とする請求項５７記載の使用方法。
【請求項５９】
骨及び軟骨の欠損を治療するための組成物を考案するための方法であって、前記方法は、
組換えヒトコラーゲンの溶液を組換えヒト骨形成タンパク質のアミノ酸配列の溶液と無菌的に混合する段階と、
前記混合物を無菌的に顆粒化又は凍結乾燥して、少なくとも部分的に安定した形状及び海面体様密度を有するジェル、ペースト又は凍結乾燥物にする段階を備えることを特徴とする方法。
【請求項６０】
前記コラーゲンの前記溶液及び前記骨形成タンパク質の前記溶液は滅菌状態であり、或いは細菌が減少した内容物を有することを特徴とする請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記混合前、好ましくは少なくとも一つの分離段階において前記コラーゲンを濃縮する段階をさらに備え、
前記コラーゲンは酸又は濃縮の前又は後に滅菌されたフィルタで処理がなされることを特徴とする請求項５９又は６０記載の方法。
【請求項６２】
混合前、セラミック材料、生体親和性金属、生体親和性ポリマ及び生体の骨からの抽出物の群から選択される少なくとも一つの足場材料を提供することをさらに備え、前記抽出物は好ましくはＤＢＭであり、
また前記方法はコラーゲンと共に足場材料を混合、好ましくはコーティングする段階をさらに備え、
また前記方法は少なくとも部分的に安定した形状の海面体を得るために前記混合物を同時凍結乾燥又は同時顆粒化させることを特徴とする請求項５９乃至６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
混合前、前記コラーゲンはフィルタ滅菌又は酸性化によって滅菌され、前記足場材料は放射線照射され、また混合は滅菌状態下において行われることを特徴とする請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
外科手術中に骨及び／又は軟骨の欠損を治療するためのキットであって、該キットは凍結乾燥、ジェル又はペースト状の無菌的に調製された混合物を備え、該混合物は組換えヒト骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及び組換えヒトコラーゲンをコンテナ内で備えることを特徴とするキット。
【請求項６５】
前記混合物が外科的に可能な単位用量内で存在することを特徴とする請求項６４記載のキット。
【請求項６６】
前記無菌混合物を追加的操作なしで移植片として直接使用するための使用説明書をさらに備えることを特徴とする請求項６４記載のキット。
【請求項６７】
骨及び／又は軟骨の欠損の治療のための外科的移植用の無菌装置であって、該無菌装置は組換えにより作製された骨刺激性及び／又は軟骨刺激性効果を有するヒト分化及び／又は成長因子の混合物と及び少なくとも一つの足場材料を備え、
前記因子はアミノ酸配列において少なくとも約７０％ヒト成長因子と同一であり、
前記装置は外科的移植の単一の要素として提供されることを特徴とする装置。
【請求項６８】
前記成長因子がグリコシル化されていることを特徴とする請求項６７記載の装置。
【請求項６９】
前記成長因子が非グリコシル化されていることを特徴とする請求項６７記載の装置。
【請求項７０】
前記成長因子が組換えにより細胞内で作製された酵母、哺乳類又は鳥類の細胞であることを特徴とする請求項６８記載の装置。
【請求項７１】
前記成長因子が組換えにより細菌内で作製されることを特徴とする請求項６９記載の装置。
【請求項７２】
前記成長因子が組換えにより大腸菌内で作製されることを特徴とする請求項６９記載の装置。
【請求項７３】
前記成長因子がＴＧＦ（Transforming Growth Factor：トランスフォーミング増殖因子）ファミリーのメンバーを備えることを特徴とする請求項１乃至７２のいずれかに記載の装置。
【請求項７４】
前記成長因子が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１６を備える骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）及びｐ１５の群から選択される少なくとも一つであることを特徴とする請求項７３記載の装置。
【請求項７５】
前記成長因子がヒトＢＭＰ−２又はヒトＢＭＰ−７であると共に、組換えにより作製され同一の性質であることを特徴とする請求項７３記載の装置。
【請求項７６】
コラーゲンをさらに備え、前記コラーゲンの量に関連して、前記分化因子又は成長因子の前記比率は、約０．００５から約５重量％の比率、好ましくは約０．０１から約４重量％の比率であることを特徴とする請求項１乃至７５のいずれかに記載の装置。
【請求項７７】
前記成長因子が約０．０５から約２重量％の比率、好ましくは約０．１から約５重量％の比率、好ましくは約０．５から約３重量％の比率であることを特徴とする請求項７６記載の装置。
【請求項７８】
少なくとも一つの足場材料を備え、好ましくは骨伝導性活性を有する足場材料を備えることを特徴とする請求項６７乃至７７のいずれかに記載の装置。
【請求項７９】
前記足場材料がアミノ酸配列を有するコラーゲンであって、前記コラーゲンはヒトコラーゲンに略同一であることを特徴とする請求項７８記載の装置。
【請求項８０】
前記コラーゲンが組換えにより作製されることを特徴とする請求項７９記載の装置。
【請求項８１】
前記足場材料が、セラミック、生体親和性金属及び生体親和性ポリマの群から選択される少なくとも一つであることを特徴とする請求項７７記載の装置。
【請求項８２】
少なくとも一つの追加的な活性物質をさらに備え、該活性物質は、少なくとも一つの細胞増殖抑制剤及び／又は少なくとも一つの抗菌剤の群から選択されることを特徴とする請求項６７乃至８１のいずれかに記載の装置。
【請求項８３】
少なくとも一つの成分をさらに備え、前記成分は、骨形成又は軟骨形成のための動員因子、接着因子、成長因子及び成熟因子の群から選択されることを特徴とする請求項６７乃至８２のいずれかに記載の装置。
【請求項８４】
前記同時凍結乾燥又は同時顆粒化される物が、孔を有する安定した形状の海面体であることを特徴とする請求項６７乃至８３のいずれかに記載の装置。
【請求項８５】
前記孔が、１００μｍから約３００μｍの範囲の直径を有し、
前記混合物が外科用海面体様密度及び安定形状を有することを特徴とする請求項８４記載の装置。
【請求項８６】
前記混合物が少なくとも部分的に生体吸収性であって、好ましくは完全に生体吸収性であることを特徴とする請求項６７乃至８５のいずれかに記載の装置。
【請求項８７】
前記混合物が無菌又は滅菌成分から無菌的に調整されることを特徴とする請求項６７乃至８６いずれかに記載の装置。
【請求項８８】
クローズドコンテナをさらに備えることを特徴とする請求項６７乃至８７のいずれかに記載の装置。
【請求項８９】
前記混合物が無菌的にコンテナ内で凍結乾燥されることを特徴とする請求項８８記載の装置。
【請求項９０】
前記コンテナが、凍結乾燥の間、溶媒分子の一方向性の継代の能力がある物質で無菌的に覆われることを特徴とする請求項８９記載の装置。
【請求項９１】
前記足場材料がヒト組換えコラーゲンを備えることを特徴とする請求項７８記載の装置。
【請求項９２】
前記コラーゲンがＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンの少なくとも一つから選択されることを特徴とする請求項９１記載の装置。
【請求項９３】
前記足場材料が鉱物を備えることを特徴とする請求項７８記載の装置。
【請求項９４】
前記鉱物がリン酸三カルシウム、セラミック材料、生体親和性金属、及び生体親和性ポリマの群から選択されることを特徴とする請求項９３記載の組成物。
【請求項９５】
前記コラーゲンが架橋結合することを特徴とする請求項９１記載の装置。
【請求項９６】
前記コラーゲンが共有結合的に前記成長因子に結合し、該成長因子は架橋結合タンパク質として用いられることが一般に知られている任意の試薬を有することを特徴とする請求項９１記載の装置。
【請求項９７】
前記コラーゲンが共有結合的に前記成長因子に結合し、前記装置が無菌的に凍結乾燥されると共に、骨及び／又は軟骨の欠損の治療のため患者内に移植片として用いられることを特徴とする請求項６７乃至９６のいずれかに記載の装置。
【請求項９８】
前記装置は、別の同一に構成された成長因子及び非共有結合的に結合される成長因子を前記患者に移植した後の早い時点で一気に放出される共有結合的結合成長因子と比較して、前記装置は前記患者への移植に続いて、共有結合的結合成長因子をゆっくりと放出しながら略代謝されることを特徴とする請求項９７記載の装置。
【請求項９９】
前記共有結合的に結合した装置は、前記コラーゲン及び骨及び／又は軟骨刺激性因子を二座の低分子架橋結合試薬に接触させることにより得られ、前記試薬はタンパク質及びペプチド化学試薬に通常用いられる、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）、無水コハク酸、ジイソシアン酸、活性化及び適切に保護されたアミノ酸、二重に活性化されたポリエチレングリコール、及び活性化されたカーボンハイドレートの群から選択され、前記試薬の前記コラーゲンへの定量結合を獲得することを特徴とする請求項９７記載の装置。
【請求項１００】
前記試薬のコラーゲンへの定量結合に続いて、前記装置は以下の段階によりさらに準備がなされ、前記段階は、
加工されたコラーゲンを過剰の試薬を透析により除去する段階であって、前記コラーゲンは骨誘導性、軟骨誘導性、骨伝導性及び軟骨伝導性の群から選択される生物活性を有するタンパク質特性を保持し、
また前記段階はさらに、前記加工されたコラーゲンを架橋結合に適切な時間成長因子と共に混合する段階と、
凍結乾燥する段階であって、
また前記段階は無菌的に行われることを特徴とする請求項９７乃至９９のいずれかに記載の装置。
【請求項１０１】
無菌の材料を備え、細菌が減少した内容物を有することを特徴とする請求項９７乃至１００のいずれかに記載の装置。
【請求項１０２】
前記足場からの前記成長因子の放出を遅らせることができる少なくとも一つの追加的な成分をさらに備え、
前記成分は好ましくはフィブリン等の血漿タンパク質であることを特徴とする請求項９１記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ドイツ特許出願番号第１０  ２００７  ０１２  ２７６．６号（２００７年３月８日にドイツ特許庁に出願）、米国仮特許出願番号第６０／９９３，１４６号（２００７年９月１０日に米国特許商標局に出願）、及び国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００１６０４に関するものであり、その夫々の内容は全体において本明細書に組み込まれるものとする。
本発明は組成物、装置、及びそれらの製造方法、及び骨及び／又は軟骨の欠損を治療するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
天然骨は無機成分、有機成分、及び水の組み合わせで構成されている。無機成分とは例えばヒドロキシアパタイトであって、天然骨の約７０％を構成する。I型コラーゲン等の有機成分は、天然骨の約２０％を構成し、また水は約１０％を構成する。例えば骨芽細胞等の骨形成細胞は、有機成分を作製、分泌又は結合する。さらに、非コラーゲンタンパク質、特に、オステオカルシン、オステオネクチン、オステオポンチン、サイトカイン、成長促進因子、プロテオグリカン及び脂肪は天然骨に存在している。
【０００３】
天然骨は、常に分解及び再生、すなわち再構成されている。骨形成、すなわち骨再生は、骨そのものから起こる。これは例えば骨折の治癒の間に観察される通りである。したがって、天然骨は新たな機能的な骨を発生させる能力を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら多数の場合において、生体の骨の再生は制限されている。これは例えば、骨の欠損範囲、又は例えば代謝障害等の様々な機能障害によって引き起こされる。骨の欠損の治療は、例えば整形外科において、顎、歯及び手の修復、事故に関連する手術、及び顔面手術等の重要な分野に依然留まっている。
【０００５】
骨の欠損は、例えば嚢胞、萎縮、又は腫瘍により引き起こされる様々な原因を有する。複雑な粉砕骨折、先天性の奇形、及び移植片の緩みもまた骨の欠損を引き起こすものである。好適な材料を用いる骨の欠損の再構築に、ますます注目が集まっている。
【０００６】
販売中の骨移植片代替製品は、Medtronic Sofamor Danek社（ミネアポリス、ミネソタ州）製のInfuse（登録商標）、及びStryker Corporation社（カラマズー、ミシガン州）製のOP-1（登録商標）パテを含む。これらの製品は、ウシのコラーゲン足場及びヒト組換え骨形成タンパク質（ｒｈＢＭＰ）をバイアル内に別々に有するキットとして販売されている。
【０００７】
Infuse（登録商標）は、移植前に海面体上でふやかされたｒｈＢＭＰ−２を用いる。OP-1（登録商標）パテは二つの要素としてもたらされる。すなわち、一つはウシのコラーゲンの乾燥粉末を１グラム含むバイアル、他方はカルボキシメチルセルロースの乾燥粉末のパテ状添加剤を含むバイアルである。両要素は移植片を産生するために生理食塩水で結合されなければならない。OP-1（登録商標）パテの添付文書によると、OP-1（登録商標）パテで治療された患者の９６％が製品への免疫反応を示した。
【０００８】
これらの製品の夫々を用いて、ｒｈＢＭＰ成分は足場に適応され、これは外科的な治療の間に実行される。ｒｈＢＭＰ溶液を足場表面に適応することは、ｒｈＢＭＰの不均一な分散を結果的にもたらす可能性がある。すなわち、足場の特定の領域において、ｒｈＢＭＰの濃度は足場の他の領域よりも高くなる。さらに、外科医は手術室で製品を組み立てる必要があるので、処置から処置への間、感染及び投薬量が一貫しないという危険が存在する。
【０００９】
高い骨誘導性及び軟骨誘導性活性を有する滅菌された同種の装置及び組成物、及び骨及び／又は軟骨の欠損を治療するための方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ある実施形態において、骨及び／又は軟骨の欠損を治療するための組成物であって、該組成物は、好ましくは動物由来であって、骨誘導性又は軟骨誘導性活性を有する少なくとも一つの物質を好ましくは含む少なくとも一つのコラーゲンと、少なくとも一つの骨刺激性及び／又は軟骨刺激性効果を有する分化及び／又は成長因子と、少なくとも一つの充填材を備え、前記組成物は凍結乾燥した状態である組成物がもたらされる。一般に、前記少なくとも一つの分化因子又は成長因子がタンパク質又はペプチド、好ましくは糖タンパク質又は糖ペプチド、好ましくはサイトカインであり、例えば前記分化因子又は成長因子がヒトの分化因子又は成長因子である。関連する実施形態において、前記分化因子又は成長因子が組換えにより作製される。一般に、前記分化因子又は成長因子がＴＧＦ（Transforming Growth Factor：トランスフォーミング増殖因子）ファミリーのメンバーの少なくとも一つを有する。例えば、前記分化因子又は成長因子がＢＭＰ（Bone Morphogenetic Proteins：骨形成タンパク質）の群のメンバーの少なくとも一つを有し、前記メンバーは好ましくはＢＭＰ−２及び／又はＢＭＰ−７である。
また、前記分化因子又は成長因子がＴＧＦβ（Transforming Growth Factor：トランスフォーミング増殖因子ベータ）又はＶＥＧＦ（Vascular Endothelial Growth Factor：血管内皮増殖因子）である。
【００１１】
特定の実施形態における組成物は、コラーゲン、骨誘導性又は軟骨誘導性活性の量に関連する前記分化因子又は成長因子を有し、その比率は約０．００５から約５重量％の比率を有し、好ましくは約０．０１から約４重量％である。例えば、前記分化因子又は成長因子が、約０．０５から約２重量％の比率、好ましくは約０．１から約５重量％の比率、好ましくは約０．５から約３重量％の比率を有する。組成物は、好ましくは骨伝導性特性を有する少なくとも一つの足場材料を備える。例えば、前記足場はコラーゲン、好ましくはＩ型コラーゲンである。また、或いはさらに、前記足場材料はセラミック、生体親和性金属及び生体親和性ポリマの群から選択される少なくとも一つである。また、或いはさらに、足場材料は生体の骨の抽出物であって、好ましくは脱灰骨基質（ＤＢＭ）である。また、前記組成物は、ＴＧＦβ等の軟骨導入性質を有する成長因子である。
【００１２】
特定の実施形態において、前記組成物はさらに少なくとも一つの追加的な活性物質を備え、該活性物質は好ましくは少なくとも一つの細胞増殖抑制性及び／又は少なくとも一つの抗菌性である。例えば、組成物は少なくとも一つの成分をさらに備え、前記成分は、骨形成又は軟骨形成のための少なくとも一つの動員因子、少なくとも一つの接着因子、少なくとも一つの成長因子及び少なくとも一つの成熟因子の群から選択される。
一般に、コラーゲンは哺乳類由来であって、好ましくはヒト、ウシ、ブタ又はウマ由来である。通常、組成物は孔をさらに備え、この孔は好ましくは相互接続する孔、好ましくは約１００μｍから約３００μｍの範囲の直径を有する孔であって、前記組成物は海面体様密度を有する。孔は凍結乾燥過程、温度勾配を越えた氷晶のトンネリング、或いは造粒過程から生じることができる。一般に、前記組成物が少なくとも部分的に生体吸水性であって、好ましくは完全に生体吸水性である。組成物はジェル、ペースト又は凍結乾燥の形状で調製される。したがって、組成物は略安定した形状の物体をさらに備える。
【００１３】
他の実施形態において、本発明は骨及び／又は軟骨の欠損を治療するための組成物であって、該組成物は、好ましくはヒト由来であって、骨誘導性又は軟骨誘導性活性を有する少なくとも一つの物質を好ましくは有する少なくとも一つの組換えコラーゲンを備え、前記骨誘導性又は軟骨誘導性活性は少なくとも一つの組換え骨形成タンパク質（ＢＭＰ）である。一般に、ＢＭＰは哺乳類由来であり、好ましくはウマ、ブタ、ウシ由来である。例えば、ＢＭＰはヒト由来である。同様に、ＢＭＰはアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列はヒト由来のＢＭＰと少なくとも約７０％同一である。ある実施形態におけるＢＭＰは、酵母又は細菌内で組換えにより作製される。例えば、ＢＭＰは細菌の大腸菌内、枯れ草菌内、又はストレプトマイセス菌種内で組換えによって作製される。また、ＢＭＰはタンパク質糖鎖付加できる細胞内で組換えにより作製される。例えば、ＢＭＰは哺乳類、鳥類、酵母及び昆虫から構成される群から選択される細胞内で作製される。
【００１４】
特定の実施形態において、ＢＭＰは、コラーゲンの量に関連して、約０．００５から約５重量％の割合、好ましくは約０．０１から約４重量％の割合を有する。ＢＭＰが約０．０５から約２０重量％の割合、好ましくは約０．１から約５重量％の割合、好ましくは約０．５から約３重量％の割合を有する。
特定の実施形態において、骨伝導性特性を有する少なくとも一つの足場材料をさらに追加的に備える。例えば、足場材料はコラーゲン、好ましくはＩ型コラーゲン、好ましくはヒトＩ型コラーゲンを備える。また、コラーゲンはＩＩＩ型である。足場材料は少なくとも一つの物質を備え、前記物質はリン酸三カルシウム、セラミック材料、生体親和性金属、及び生体親和性ポリマの群から選択される。例えば、足場材料は、リン酸三カルシウム又はリン酸三カルシウムを有する二相物質である。これらのセラミックは、セラミックの技術において通常の知識を有する者にとって周知であるように、異なる焼結温度で作られる。組成物は、少なくとも一つの追加的な活性物質をさらに備え、該活性物質は好ましくは少なくとも一つの細胞増殖抑制性及び／又は少なくとも一つの抗菌性を備えることができる。例えば、組成物は少なくとも一つの追加的な成分をさらに備え、前記成分は、骨形成又は軟骨形成のための少なくとも一つの動員因子、少なくとも一つの接着因子、少なくとも一つの成長因子及び少なくとも一つの成熟因子の群から選択される活性を有する。一般に、ヒトコラーゲンは組換えによって調製される。
通常、組成物は多孔質構造をさらに備え、前記多孔質構造は孔、好ましくは相互接続する孔、好ましくは約１００μｍから約３００μｍの範囲の大きさの直径を有する孔を有し、前記組成物は海面体様密度を有する。組成物は「不織」材料であるので、孔は凍結乾燥又は造粒過程から生じる。
通常、組成物は略生体吸収性であるか、或いは本来完全に生体吸収性である。組成物は凍結乾燥、ジェル、ペースト状で提供される戸共に、略安定した形状の物体である。
【００１５】
したがって、本発明の実施形態は、骨及び／又は軟骨の欠損を治療するための組成物であって、該組成物は無菌的に調製された組換えヒトコラーゲン及び組換えヒト骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の混合物を備え、前記コラーゲン及びＢＭＰは滅菌されていると共に、無菌的に混合され同時凍結乾燥または同時顆粒化されている。例えば、ＢＭＰはアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列はヒト由来のＢＭＰのアミノ酸配列と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、又は少なくとも約９５％同一である。ある実施形態におけるＢＭＰは、細菌内で作製され、例えばＢＭＰは大腸菌内で作製される。さらに、ＢＭＰはタンパク質糖鎖付加できる細胞内で組換えにより作製される。例えば、ＢＭＰは哺乳類、鳥類、酵母及び昆虫から構成される群から選択される細胞内で作製される。ＢＭＰは、コラーゲンの量に関連して、約０．００５から約５重量％の割合、好ましくは約０．０１から約４重量％の割合を有する。例えば、ＢＭＰは約０．０５から約２重量％の割合、好ましくは約０．１から約５重量％の割合、好ましくは約０．５から約３重量％の割合を有する。
【００１６】
さらなる実施形態中の発明により、上記の組成物のいずれかを製造する方法がもたらされる。この方法は、好ましくは動物由来であると共に好ましくは少なくとも一つの骨誘導性又は軟骨誘導性活性を有する少なくとも一つのコラーゲンと、骨刺激性及び／又は軟骨刺激性活性を有する少なくとも一つの分化因子又は成長因子を備える成分を混合させる段階と、少なくとも部分的に安定した形状の、海面体状の物体を得るために前記成分を同時凍結乾燥させる段階を備える。コラーゲンが非ヒト由来である実施形態において、方法はさらに、混合前、前記コラーゲンをペプチターゼ、又はプロテアーゼ、好ましくはトリプシンと接触させる。方法は、混合前、前記分化因子又は成長因子を好ましくは少なくとも一つの分離段階において濃縮する段階をさらに備える。方法の関連する実施形態は、混合前、少なくとも一つの足場材料を加える段階をさらに備える方法であって、前記足場材料は骨導電性特性を有すると共に、セラミック材料、生体親和性金属、生体親和性ポリマ及び生体の骨からの抽出物の群から選択され、前記抽出物は好ましくはＤＢＭ（脱灰骨基質）であり、また前記方法はコラーゲンと共に混合、好ましくはコーティングする段階と、好ましくは動物由来の少なくとも一つのコラーゲンと混合する段階を備え、前記コラーゲンは、骨伝導性又は軟骨伝導性、活性物質、及び／又は少なくとも一つの骨刺激性及び／又は軟骨刺激性効果を有する少なくとも一つの分化因子又は成長因子の少なくとも一つの添加物を有し、また前記方法はさらに、少なくとも部分的に安定した形状の海面体を得るために、前記成分を同時凍結乾燥させる段階を備える。上記に関連する方法は無菌状態下で行われる。
【００１７】
また、本明細書中にもたらされるのは骨刺激性及び／又は軟骨刺激性効果を有する少なくとも一つの分化因子又は成長因子の使用方法であって、前記使用方法は前記成長因子の滅菌溶液を少なくとも一つのコラーゲンの無菌又は滅菌溶液で無菌的に混合し、前記コラーゲンは好ましくは動物由来であって、また好ましくは少なくとも一つの骨誘導性又は軟骨誘導性、活性物質を有し、また、前記結果として生じた混合物をコンテナ内で同時凍結乾燥させて、手術中の移植片として単一使用する。
さらに本明細書中にもたらされるのは、外科手術中に骨及び／又は軟骨の欠損を治療するための少なくとも一つのヒト骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の使用方法であって、該使用法は外科手術中に、前記ＢＭＰを少なくとも一つのヒトコラーゲン及び少なくとも一つの足場材料に添加して混合物を得ること、及び前記混合物を骨及び／又は軟骨欠損の治療用の無菌装置として提供することを含む。上記の使用方法は装置の形状であって、これは外科的に可能な単位容量として提供される。組成物は凍結乾燥物、ジェル又はペーストである。
【００１８】
本明細書中の他の実施形態は、骨及び軟骨の欠損を治療するための組成物を考案するための方法であって、前記方法は、組換えヒトコラーゲンの溶液を組換えヒト骨形成タンパク質のアミノ酸配列の溶液と無菌的に混合する段階と、前記混合物を無菌的に顆粒化又は凍結乾燥して、少なくとも部分的に安定した形状の形及び海面体様密度を有するジェル、ペースト又は凍結乾燥物にする段階を備える。通常、コラーゲンの前記溶液及び前記骨形成タンパク質の前記溶液は細菌が減少した内容物を有し、或いは滅菌状態である。したがって、方法は混合前、好ましくは少なくとも一つの分離段階において前記コラーゲンを濃縮する段階をさらに備え、前記コラーゲンは酸又は濃縮の前又は後に滅菌されたフィルタで処理がなされる。さらに方法は、混合前、セラミック材料、生体親和性金属、生体親和性ポリマ及び生体の骨からの抽出物の群から選択される少なくとも一つの足場材料を提供することをさらに備え、前記抽出物は好ましくはＤＢＭであり、また前記方法はコラーゲンと共に足場材料を混合、好ましくはコーティングする段階をさらに備え、また前記方法は少なくとも部分的に安定した形状の海面体を得るために前記混合物を同時凍結乾燥又は同時顆粒化させる。混合前、前記コラーゲンはフィルタの滅菌又は酸性化によって滅菌され、前記足場材料は放射線照射され、また混合は滅菌状態下において行われる。
【００１９】
本明細書注に記載の本発明のさらに他の実施形態において、外科手術中に骨及び／又は軟骨の欠損を治療するためのキットが提供され、このキットは凍結乾燥物、ジェル又はペースト状の無菌的に調製された混合物を備え、該混合物は組換えヒト骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及び組換えヒトコラーゲンをコンテナ内で備える。例えば、キットは混合物が外科的に可能な単位用量内で存在するものである。関連する実施形態において、キットはさらに、無菌混合物を追加的操作なしで移植片として直接使用するための使用説明書をさらに備える。
【００２０】
本明細書中の本発明の実施形態は、骨及び／又は軟骨の欠損の治療のための外科的移植用の無菌装置を提供し、該無菌装置は組換えにより作製された骨刺激性及び／又は軟骨刺激性効果を有するヒト分化及び／又は成長因子の混合物と及び少なくとも一つの足場材料を備え、前記因子はアミノ酸配列において少なくとも約７０％ヒト成長因子と同一であり、前記装置は外科的移植の単一の要素として提供される。ある実施形態において、成長因子はグリコシル化されている。また、成長因子は組換えにより細胞内で作製された酵母、哺乳類又は鳥類の細胞である。例えば、成長因子は非グリコシル化されており、成長因子は組換えにより細菌内、例えば大腸菌内で作製される。
一般に、装置内の成長因子は、ＴＧＦ（Transforming Growth Factor：トランスフォーミング増殖因子）ファミリーのメンバーを備える。例えば、成長因子はＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１６を備える骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）及びｐ１５の群から選択される少なくとも一つである。ある特定の実施形態において、成長因子はヒトＢＭＰ−２又はヒトＢＭＰ−７であると共に、組換えにより作製され同一の性質である。一般に、コラーゲンをさらに備える装置の実施形態において、前記コラーゲンの量に関連して、前記分化因子又は成長因子の前記比率は、約０．００５から約５重量％の比率、好ましくは約０．０１から約４重量％の比率である。例えば、成長因子は約０．０５から約２重量％の比率、好ましくは約０．１から約５重量％の比率、好ましくは約０．５から約３重量％の比率である。
【００２１】
関連する実施形態における装置は少なくとも一つの足場材料を備え、好ましくは骨伝導性活性を有する足場材料を備える。例えば、足場材料はアミノ酸配列を有するコラーゲンであって、前記コラーゲンはヒトコラーゲンに略同一である。さらに、コラーゲンは組換えにより作製される。また或いはさらに、足場材料は、セラミック、生体親和性金属及び生体親和性ポリマの群から選択される少なくとも一つである。装置はさらに、少なくとも一つの追加的な活性物質を有し、該活性物質は、少なくとも一つの細胞増殖抑制剤及び／又は少なくとも一つの抗菌剤の群から選択される。また、装置は、少なくとも一つの成分をさらに備え、前記成分は、骨形成又は軟骨形成のための動員因子、接着因子、成長因子及び成熟因子の群から選択される。一般に、装置は同時凍結乾燥又は同時顆粒化されると共に、孔を有する海面体状の安定した形状の物体である。孔は、１００μｍから約３００μｍの範囲の直径を有し、前記混合物が外科用海面体様密度及び安定形状を有する。関連する実施形態における装置の混合物は、少なくとも部分的に生体吸収性であって、好ましくは完全に生体吸収性である。混合物は通常、無菌又は滅菌成分から無菌的に調整される。様々な実施形態における装置はクローズドコンテナ内にもたらされる。特定の実施形態において、装置は無菌的にコンテナ内で凍結乾燥される。例えば、コンテナは、凍結乾燥の間、溶媒分子の一方向性の継代の能力がある物質で無菌的に覆われる
通常、足場材料はヒト組換えコラーゲンを備える。例えば、コラーゲンはＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンの少なくとも一つから選択される。また或いはさらに、足場材料は鉱物を備える。例えば、鉱物はリン酸三カルシウム、セラミック材料、生体親和性金属、及び生体親和性ポリマの群から選択される。特定の実施形態において、装置は架橋結合タンパク質として用いられることが一般に知られている任意の試薬を有する架橋結合するコラーゲンを有する。例えば、コラーゲンは共有結合的に内部でそれ自身に架橋結合しているか、或いはコラーゲンは成長因子に共有結合的に結合している。したがって、コラーゲンは溶液内で共有結合的に成長因子に架橋結合して基質を得る。そして、骨及び／又は軟骨の欠損を治療のため、基質は無菌的に凍結乾燥されると共に、患者内で移植片として用いられる。
【００２２】
したがって、別の同一に構成された成長因子及び非共有結合的に結合される成長因子を患者へ移植した後の早い時点で一気に放出される共有結合的結合成長因子と比較して、基質はＢＭＰ−２またはＢＭＰ−７等の共有結合的結合成長因子をゆっくりと放出しながら略代謝される。共有結合的に架橋結合したコラーゲンは、前記コラーゲン及び骨及び／又は軟骨刺激性因子を二座の低分子架橋結合試薬に接触させることにより得られ、前記試薬はタンパク質及びペプチド化学試薬に通常用いられる、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）、無水コハク酸、ジイソシアン酸、活性化及び適切に保護されたアミノ酸、二重に活性化されたポリエチレングリコール、及び活性化されたカーボンハイドレートの群から選択され、前記試薬の前記コラーゲンへの定量結合を獲得する。したがって、装置は、試薬のコラーゲンへの定量結合に続いて、前記装置は以下の段階によりさらに準備がなされ、前記段階は、加工されたコラーゲンを過剰の試薬を透析により除去する段階であって、前記コラーゲンは、骨誘導性、軟骨誘導性、骨伝導性及び軟骨伝導性の群から選択される生物活性を有するタンパク質特性を保持し、また前記段階はさらに、前記加工されたコラーゲンを架橋結合に適切な時間成長因子と共に混合する段階と、及び凍結乾燥する段階であって、また前記段階は無菌的に行われる。上記の実施形態中の装置は、無菌の材料を含むので、装置は細菌が減少した内容物を有する。
【００２３】
さらに他の実施形態において、装置は足場、例えばコラーゲンからの成長因子の放出を遅らせる少なくとも一つの追加的な成分を備える。追加的な成分は、非共有結合的親和性により成長因子の放出を遅らせる。例えば追加的な成分は、フィブリン又はグロブリン等の血漿タンパク質である。関連する実施形態において、追加的な成分はヒト由来であって、及び／又は組換えによって作製される。
【００２４】
骨及び軟骨の欠損の治療における問題は、骨の欠損を補修するために現在用いられている特定の合成材料は不完全に吸収される、或いは非生体吸収性であることである。これらは例えば多孔質のリン酸カルシウムセラミック等のセラミック材料を含む。このような材料は有益な骨伝導性特性を有している。すなわち、材料は基質を作る構造（ガイド構造）を有する再生骨組織に十分な機械的安定性をもたらすことができる。骨再生細胞は骨伝導性特性を有する材料に結合し、そしてこの材料の周囲又は内部の骨基質を沈殿させる。しかし、セラミック材料は体内で不変の状態で残り、結果として成長し過ぎて新たに再生した骨が貫通する。
【００２５】
生体吸収性を有する骨代替材料は、ポリラクチド及びポリグリコリド等の合成ポリマを含む。このような合成材料は、通常加水分解によって生体内で分解される。これらの材料の分解は、乳酸またはグリコール酸等の酸性の副生成物の放出をもたらすことが可能である。これらは不要な体内における局所的な高酸性化を引き起こす。
【００２６】
骨の欠損を修復するために現在用いられる骨代替材料は、天然骨の抽出物を含む。生体の骨は例えば、ウシの骨、ブタの骨、又はウマの骨である。脱灰化された骨は、無機部分（鉱質部分）が除去され、残りの有機基質は生体の内因性コラーゲンを他の追加的なタンパク質とともに略保持する生体の骨である。抽出物は本来の骨の機能的特性の一部を保持する。さらに、これらの骨の抽出物は骨の欠損の修復を促進することがわかっている。
【００２７】
骨代替材料及びそれらの製造方法は、例えばＷＯ９１／０６３２４  Ａ１及びＷＯ９３／２０８５７  Ａ１に示されていると共に、市販の製品のＣＯＬＬＯＳＳ（登録商標）及びＣＯＬＬＯＳＳ（登録商標）Ｅである。これらは夫々、ウシの骨及びウマ（Ｅ）の骨の抽出物である。これらの製品は、保持されると共にコラーゲンに結合される内因性成長及び分化因子と結合する動物由来のＩ型コラーゲンを含む。
【００２８】
ＣＯＬＬＯＳＳ（登録商標）及びＣＯＬＬＯＳＳ（登録商標）Ｅは凍結乾燥された抽出物の形状でもたらされる。これらの商品は骨伝導性及び骨誘導性活性を示すと共に、幹細胞に接触した場合さらなる分化活性を有する。本明細書中に用いられる「骨誘導性」という用語は、物質又は材料が骨の再生（骨再生）を開始すると共に、骨の再生を刺激（骨刺激）し、これにより骨の成長を促進する。再生活性は生体内で行われると共に生体外の細胞培養においても行われる。一定の状況下において、これらの特性を有する材料は、通常の骨成長と比較して再生過程を増進させるよう操作可能である。しかし、上記製品夫々の骨伝導性効果は、一定の適用には十分ではない。
【００２９】
同様の考察が軟骨の欠損及び軟骨の欠損のための治療薬に当てはまる。本明細書中で用いられる「軟骨誘導性」という用語は、物質又は材料が軟骨の再生（軟骨再生）を開始すると共に、軟骨の再生を刺激（軟骨刺激）し、これにより軟骨の成長を促進する。
【００３０】
骨由来の成分、骨由来の走化性成分、骨由来の接着成分、及び骨由来の成長因子を含む骨組織の成長の複合体は、ＷＯ９１／０６３２４  Ａ１（米国特許第５，９３２，２０７号（１９９９年８月３日発行）に対応する）に示されており、これは全体を参照することにより本明細書に組み込まれることとする。この特許により、接着成分、フィブロネクチン、テネイシン、サイトタクチン、ラミニン、コンドロイチン、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩＩ型、Ｎ−ＣＡＭ型、Ｌ−ＣＡＭ型コラーゲン、及びインテグリンの例を示すが、複合体の骨伝導性効果と共に骨誘導性効果を増加させる充填物質を備えていない。
【００３１】
骨形成組成物はChen et alによる文献（米国特許第５，７０７，９６２号（１９９８年１月１３日発行）及び米国特許番号第６，１８０，６０６号（２００１年１月３０日発行））に示されている。骨形成装置はOpperman et alによる文献（米国特許第５，９５８，４４１号（１９９９年９月２８日発行）及び米国特許第６，５５１，９９５号（２００３年４月２２日発行））に示されている。
【００３２】
本明細書中にもたらされる組成物及び装置は、例えば動物由来のコラーゲンといった骨誘導性及び／又は骨伝導性特性を有する構造的成分を備える。本明細書中にもたらされる組成物内及び装置内に含まれる動物由来のコラーゲンは制限されるものではない。本明細書中の装置及び組成物のある実施形態において、組成物のコラーゲンはヒト由来であって、少なくとも一つのヒト由来の骨誘導性又は軟骨誘導性活性物質を備える。代替可能な実施形態において、コラーゲンは、例えばウシ、ブタ、又はウマ由来である、非ヒト動物由来のものである。
【００３３】
装置及び組成物はさらに、少なくとも一つの分化及び／又は成長因子の少なくとも一つの添加剤をさらに備え、この添加剤は骨刺激性及び／又は軟骨刺激性活性を有する。これらの分化及び／又は成長因子は例えば、サイトカイン、糖タンパク質又は糖ペプチド等のタンパク質又はペプチドである。
【００３４】
特定の実施形態において、分化及び／又は成長因子は基本的にヒトの分化及び／又は成長因子であると共に、ヒトコラーゲンと結合している。代替可能な実施形態において、ヒトの分化因子又は成長因子は装置内で異種由来のコラーゲン、すなわち、ウシ、ブタ、又はウマ由来の非ヒト動物由来のコラーゲンと結合されている。
【００３５】
一般に、ヒト又は動物由来の分化因子又は成長因子は組換えによって調製される。「組換え」という用語は、例えば微生物等の遺伝子改変生物の操作によって調製されたタンパク質のことを言う。
【００３６】
本発明にしたがって、分化因子又は成長因子をコードするポリヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ分子に用いられ、適切な宿主細胞内の分化因子又は成長因子の発現を方向付ける。生物活性ヒト分化因子又は成長因子を発現させるため、分化因子又は成長因子をコードするヌクレオチド配列、又は機能的に同等の物が適切な発現ベクター内に挿入される。すなわちこのベクターとは、挿入されたコード配列の転写及び翻訳を抑制する成分をコードする必要な核酸を含むものである。
【００３７】
当業者にとって周知である方法は、分化因子又は成長因子をコードする配列又は翻訳制御を含む発現ベクターを構築するのに利用される。これらの方法は生体内組換えＤＮＡ技術、合成技術及び生体内組換え又は遺伝子組換えを含む。欠失、添加、又は代替の導入は、例えばＰＣＲ法による変異原性を用いる当技術分野における任意の周知の技術を用いて達成される。このような技術はSambrook et al.による「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（Cold Spring Harbor Press、プレーンビュー、ニューヨーク州、１９８９年発行）及びAusubel et al.による「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons、ニューヨーク、ニューヨーク州、１９８９年発行）に述べられている。
【００３８】
様々な発現ベクター／宿主系は、配列をコードするヒトの分化因子又は成長因子を含むとともに発現させるために用いられる。これら発現ベクター／宿主系は、組み換えバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドＤＮＡ発現因子によって形質転換した細菌、酵母菌発現ベクターによって形質転換した酵母菌、ウィルス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス）に感染した昆虫細胞系、ウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワー・モザイク・ウィルス、ＣａＭＶ、タバコ・モザイク・ウィルス、ＴＭＶ）を導入された植物細胞系、又は細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉ、ｐＢＲ３２２、又はｐＥＴ２５ｂプラスミド）によって形質転換した植物細胞系、又は動物細胞系などの微生物を含むが、これらに限定されるわけではない。あるいは、分化因子又は成長因子のアミノ酸配列の全体又は一部を合成するために、化学的な方法が用いられる。例えば、ペプチド合成は様々な固相法（Roberge et al., Science 269: 202, 1995）を用いて実行可能であり、自動合成は例えば、４３１Ａペプチドシンセサイザー（カリフォルニア州フォスター市のApplied Biosystems から入手可）をApplied Biosystemsの取扱説明書に従って用いることによって達成可能である。
【００３９】
他の実施形態における分化因子又は成長因子は、少なくともＴＧＦ（トランスフォーミング増殖因子）と同じファミリーに属さなければならない。ＴＧＦファミリーの増殖因子は、例えば、ＴＧＦ−βファミリーなどの様々なサイトカインを含み、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーのサイトカインは、例えば、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７などのＢＭＰファミリー（形態形成タンパク質）を含む。特定の実施形態においては、分化及び／又は成長因子は例えば、ポリラクチドによって粒状にされたＢＭＰである。
【００４０】
ヒト由来及びウシ由来のＢＭＰ組成物、ＢＭＰ組成物及び因子を単離する工程が米国特許第４，６１９，９８９号（Urist、発行日：１９８６年１０月２８日）に示される。
【００４１】
ＢＭＰ−２に関しては、ＢＭＰ−２の核酸配列、アミノ酸の配列、構造、及び、組成物、そして製造方法が米国特許第５，６３１，１４２号（Wang et al、発行日：１９９７年５月２０日）に示されている。精製ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４タンパク質及びその製造工程は米国特許第２００７／００２６４３７号（Wang et al、発行日：２００７年２月１日）に示される。組み換え型ＢＭＰ−２の製造方法は、米国特許第２００４００１８５９５号（Rainer et al、公開日：２００４年１月２９日）に記載されている。組み換え型ヒトＢＭＰ−２もShenandoah Biotechnology 社（ペンシルバニア州ウォーリック）から市販されている。
【００４２】
精製ＢＭＰ−７タンパク質及びその製造方法が、米国特許第５，３６６，８７５号（Wonzney et al、発行日：１９９４年１１月２２日）に示されている。ＢＭＰ−７タンパク質をコードするＤＮＡ配列については、米国特許第５，１４１，９０５号（Rosen et al、発行日１９９２年８月２５日）に示されている。組み換え型ヒトＢＭＰ−７もShenandoah Biotechnology 社（ペンシルバニア州ウォーリック）から市販されている。
【００４３】
上記引用文献の各々は全体として参照することにより本発明に組み込まれるものとする。
【００４４】
本記載の組成物及び装置に用いられるさらなる好適な分化因子又は成長因子としては、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＩＧＦ１（インスリン様成長因子１）、ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）、及び、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）が含まれる。さらに、上記の分化因子または成長因子の任意の機能的な切片が用いられる。「機能的な切片」という言葉は、修正された構造及び／又は配列の分子のことを言い、上記の分化因子又は成長因子と同じ生物学的機能をもたらすものである。機能的な切片は、決失、追加、置換、又は他の修正といった自然発生的な変化または人工的な変化を含むタンパク質を備える。機能的な切片は、別の哺乳類種の成長因子の対応する１つの領域別に、上記分化因子又は成長因子の任意の１つの領域に対して自然発生した配列を有するタンパク質によって例示される。哺乳類種はウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ネズミ及びウマなどの種を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
「ほぼ同一」という言葉は、本明細書中においては、第二アミノ酸配列中の整列アミノ酸残基と同一の効果的な又は最小のアミノ酸残基を含む第一アミノ酸配列について言及するために用いられるものであり、これによって、第一及び第二アミノ酸配列が共通した構造ドメイン及び／又は共通した機能的活性を有することが可能となる。例えば、少なくとも約６０％、又は６５％の同一性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する共通した構造ドメインを含むアミノ酸配列が挙げられる。
【００４６】
配列間の配列同一性の計算は以下のように行われる。２つのアミノ酸配列の同一性の割合を決定するために、配列は最適な比較目的のために並べられる（例えば、最適な配列のために第一及び第二アミノ酸配列のうちの１つまたは両方にギャップを導入可能である）。対応するアミノ酸の位置又はヌクレオチドの位置のアミノ酸残基が、その後比較される。第一配列の位置が第二配列の対応する位置と同じアミノ残基又はヌクレオチドによって占められる場合、タンパク質はその位置で同一である。２つの配列の同一性の割合は、２つの配列の最適な並びに対して導入されるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一位置の数の関数で表わされる。
【００４７】
配列の比較及び２つの配列間の同一性割合の決定は、数学的なアルゴリズムを用いて達成される。２つのアミノ酸配列の同一性の割合は初期設定のパラメータを用いるアライメント・ソフトウェア・プログラムを利用して決定される。好適なプログラムは、例えば、CLUSTAL W （Thompson et al, Nuc. Acids Research 22:4673, 1994, www.ebi.ac.uk/clustalw）、BL2SEQ（Tatsusova and Madden, FEMS Microbiol. Lett. 174:247, 1999, www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html）、SAGA（Notredame and Higgins, Nuc. Acids Research 24:1515, 1996, igs-server.cnrs-mrs.fr/~cnotred）、及び、DIALIGN（Morgenstern et al., Bioinformatics 14:290, 1998, bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/dialign）を含む。
【００４８】
特定の実施形態において、本明細書で提供される装置又は組成物を操作することによって活性剤をゆっくりと継続して放出させる。例えば、装置又は組成物は、分化因子又は成長因子の組成物からの放出を遅らせることができる少なくとももう１つの成分をさらに備える。この放出遅延成分は、例えば、プロタミンや血漿タンパク質（グロブリン、アルブミン、又はフィブリン）などの非特異的結合が十分に可能な「粘着性の」タンパク質である。プロタミンは魚の精子から抽出したアルカリ性のタンパク質で、約５０００ダルトンの重さの分子を有する。放出遅延成分の別の実施形態において、成長因子又は分化因子は、例えばタンパク質架橋剤｛かきょう ざい｝によってコラーゲンに共有結合される。
【００４９】
本明細書中に記載の特定の実施形態において、装置及び組成物は少なくとも１つの添加剤（Filler）又は充填剤をさらに備える。充填剤又は添加剤は、さらなる機械的安定性及び／又は構造、あるいは形状の安定性を組成物に与えるなど複数の用途を有する。一般的に、充填剤は骨伝導性を有するとともに、細胞増殖及び／又は細胞分化用にさらなる表面を提供するものである。
【００５０】
コラーゲン及び少なくとも１つの骨伝導性又は軟骨伝導性の活性物質などの充填剤を含む装置または組成物は、組成物中の各成分の特定量に対して製造される。コラーゲン量に対しては、骨伝導性又は軟骨伝導性活性物質は、約０．００５重量パーセントから約５．０重量パーセント、例えば、約０．０１〜約４．０重量パーセント含まれている。他の実施形態においては、添加物は約０．０５〜２．０重量パーセント、例えば、約０．１〜５．０重量パーセント、又は約０．５〜約３．０重量パーセント含まれる。
【００５１】
充填剤は典型的にはＩ型コラーゲンなどのコラーゲンである。コラーゲンは皮膚、腱、及び／又は骨組織から採取される。特定の実施形態において、コラーゲンはヒト由来のものではなく、腱はウマなどの動物の腱である。他の実施形態においては、コラーゲンは組み換え技術で作製されたコラーゲンであり、例えば、組み換え技術で作製されたヒトコラーゲンである。さらに、非コラーゲン充填剤は本明細書中に記載の組成物及び装置の範囲内である。このような充填剤は、一般的に骨伝導性又は軟骨伝導性活性物質に対するコラーゲンと同じ量及び割合で本明細書中に記載の装置に含まれる。
【００５２】
本明細書中に記載の組成物及び装置に好適な別の充填剤は、セラミック材料、生体親和性金属、及び、生体親和性ポリマを備える。セラミック材料は、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、硫酸カルシウム、ＣＭＣ（カルボキシルメチルセルロース）、セファロース、ポリアリレート、及び上記材料の混合物を含む。特定の実施形態において、充填剤はβ−リン酸三カルシウムである。上記のような充填剤は、残りの要素の総体積に関連して、少なくとも５０体積パーセント、少なくとも８０体積パーセント、少なくとも９５体積パーセント、少なくとも９９体積パーセント、本明細書中に記載の組成物及び装置中に存在する。
【００５３】
上記材料のイオノゲン要素は、イオン化されるか又はイオン化が可能なイオン交換体中の固定された原子群で、天然骨及び無機骨といった主な要素を構成するため、それゆえに安定した生体模倣材料である。したがって、セラミック充填剤は有用である。
【００５４】
セラミック材料は市販されているＯＳＳＡＰＬＡＳＴ（登録商標、ドイツ・シュトゥットガルトのＯＳＳＣＵＲ社から市販されている）という製品中の1つの充填剤として用いられる。この製品は生体吸収性を有する粒状のβ−リン酸三カルシウムを含み、β−リン酸三カルシウムは相互接続した多孔質体で、大きな比表面積を有する。
【００５５】
充填剤は生体親和性金属によってさらに実証される。生体親和性金属の例としては、マグネシウム、チタニウム、及びタンタルがある。さらに、マグネシウムもまた生体吸収性を有する。生体親和性ポリマの例としては、ポリラクチド及びポリグリコリドなどの合成ポリマを含む。他の実施形態における添加剤は、天然骨の派生物、例えば、脱塩骨基質（ＤＢＭ）である。
【００５６】
特定の実施形態において、添加剤は本明細書に記載の組成物及び／又は装置に骨伝導性又は軟骨伝導性活性をさらに与える。これら添加剤は、ロイコトリエン、サイトタクチン、テネイシン、ラミニン、フィブロネクチン、及び、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−β１、ＦＧＦ、及びＰＤＧＦなどのサイトカインを含む。
【００５７】
この装置及び組成物の製造方法の実施形態において、コラーゲンを先に修飾することによって、添加剤がコラーゲン基質に添加される。例えば、添加剤がコラーゲンと共有結合架橋するようにコラーゲンは化学的に修飾される。別の実施形態においては、充填剤はコラーゲン基質を準備する前に添加されるものであるか、又は対応するコラーゲン基質中の自然に発生する因子である。すなわち、コラーゲン及び充填剤はそれらが供給される工程によって結合される。例えば、成長因子は生体源、例えば、天然骨から抽出される。この実施形態において、骨伝導性又は軟骨伝導性の充填剤はコラーゲンを伴って天然の型で存在する。
【００５８】
骨の欠損及び軟骨の欠損の治療に関連して、さらなる所望の効果を提供する１以上の物質が、本明細書に記載の装置及び組成物の他の実施形態において加えられる。このような物質には、例えば、細胞増殖抑制薬又は抗生物質製剤、又は両者の組み合わせがある。
【００５９】
他の実施形態において、本装置または組成物は動員因子、例えば走化性物質（ケモタキシン又はロイコトリエンなど）をさらに備える。動員因子は組成物のヒト細胞（間充織幹細胞、軟骨前駆幹細胞、繊維芽細胞、及び／又は血小板）への浸潤を誘発する。あるいは、これらの物質はコラーゲンに加えられるか、又は補充される。
【００６０】
他の実施形態において、組成物中に含まれるコラーゲンは少なくとも１つの接着因子、例えば、サイトタクチン、テネイシン、ラミニン、フィブロネクチンをさらに備える。このような物質は、本明細書の組成物又は装置中の補充細胞又は移動性細胞を、適用位置（埋め込み位置）で固定するように機能する。
【００６１】
特定の実施形態において、上記因子はコラーゲン中に自然に見られ、充填剤は精製可能、或いは、上記複数の因子の混合物である複合物中で獲得可能である。組成物又は装置のコラーゲン成分は、骨及び／又は軟骨再生のために生体内に取り込まれる充填剤の骨伝導性特性の大部分を含むことが可能である。上記の一連の自然発生的な充填剤は、組成物中の他の活性物質の存在により１以上の活性物質の活動の部分的損失又は大部分の損失が補われるほどの、重複活性機能又は余分な活性機能を有することが可能である。
【００６２】
動物由来のコラーゲンは、例えば、ＯＳＳＡＣＵＲ社（ドイツ、オーバーシュテンフェルト）のＣＯＬＬＯＳＳ（登録商標）（ウシ）及びＣＯＬＬＯＳＳ（登録商標）Ｅ（ウマ）のように、分離した形で市販されている。このような製品は天然の活性物質を含んでいるため、コラーゲン及び活性物質の組み合わせは天然の機能的な単位をもたらし、その組成物は骨及び／又は軟骨の再生が誘発される生体内の環境に特定の方式で対応する。
【００６３】
天然骨からコラーゲンを抽出する方法は広く周知である。コラーゲンは以下に例示する手順により天然骨から抽出される。この手順とは、天然骨を粉砕する工程、有機溶媒で抽出することによって油脂を除去する工程、酸処理、例えば、塩酸によって脱塩する工程、キレート剤（例えばエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、又は２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１、３−プロパンジオール（ＴＲＩＳ）又はそれらの組み合わせ）でインキュベートする工程、及び、グアジニン、例えば、塩酸グアジニンで抽出し、その後に抽出物を精製する工程、この抽出物をインプランティングに適切な構造体に物理的に形成する工程である。必要な工程又は付属的な工程は典型的な手順の範囲内であるため、上記の１以上の工程が省略可能であることは、生物学の当業者にとって想到しうることである。
【００６４】
特定の実施形態において、組成物又は装置は、多孔質構造又は多孔質形状である。他の実施形態においては、装置及び組成物はほぼ海綿体様密度を有する。例えば、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）などのセラミック材料のような上記の充填剤は、組成物又は装置の孔の程度を決定する。
【００６５】
特定の実施形態において、孔とは相互接続する孔である。すなわち、充填剤の個々の粒子間、及び粒子内部に孔の構造が配される。多孔質装置又は多孔質組成物は、埋め込みの対象受容体の細胞から本装置及び組成物の多孔（例えば、骨細胞及び／又は軟骨細胞、又はそれらの前駆細胞）にまで細胞を浸潤させる際に有用である。
【００６６】
本組成物又は装置の孔、又は充填剤の孔は、それぞれ少なくとも直径約１００μｍ、特に直径約１００μｍから３００μｍである。特定の実施形態においては、本組成物又は装置の孔、又は充填剤の孔は、それぞれ直径が約２００μｍである。
【００６７】
特定の実施形態において、本発明の組成物及び装置は少なくとも部分的には生体吸収性を有する。関連する実施形態において、本発明の組成物及び装置は完全な生体吸収性を有する。移植片を埋め込んだ後、骨又は軟骨の欠損を治療する移植片は、新しい骨又は新しい軟骨と完全に取って替えられる。
【００６８】
他の実施形態において、本発明の組成物は凍結乾燥物で、例えば、同時凍結乾燥物である。凍結乾燥物の利点は以下の実施例に記載されている。
【００６９】
他の実施形態において、本発明の組成物はほぼ形状が安定しており、例えば、多孔性海綿状構造体は十分な機械的安定性を有し、埋め込みに関係する機械的操作に耐える。上記のような組成物は骨又は軟骨再生のための骨伝導性／軟骨伝導性特性を備える。
【００７０】
一般的に、本明細書に記載の組成物及び／又は装置は、無菌式手順又は滅菌式手順によって作製され、滅菌式手順で包装される。さらに、本装置は単一装置であり、操作の必要がないため、追加的な準備をすることなく骨欠損又は軟骨欠損の治療のために本装置を直接埋め込むことが可能である。
【００７１】
本発明の他の様態は、本発明に記載の組成物を製造する新しい方法を提供することである。この方法は、コラーゲン（例えば、ヒト由来のコラーゲン、組み換え型コラーゲン、又は動物由来のコラーゲンで、少なくとも骨伝導性／軟骨伝導性の活性物質を含む）を調整する段階と、このコラーゲンを骨伝導性効果及び／又は軟骨伝導性効果を有する少なくとも１つの分化因子または成長因子の添加物と（場合によっては他の物質とも）混合させる段階と、このような成分を同時凍結乾燥させて少なくとも１つの部分的に安定した海綿体を形成する段階を含む。
【００７２】
本発明の方法に関する特定の実施形態において、コラーゲンを少なくとも１つの添加物と混合させる前に、コラーゲンは少なくとも１つのペプチダーゼ、例えば、トリプシンなどのエンドペプチダーゼで処理される。エンドペプチダーゼで処理することによって、所望でないタンパク質又はペプチド、例えば、（活性物質を含む又は含まない）コラーゲン中に見られるテロペプチドが、このコラーゲン切片から除去される。一般的に、本明細書に記載の治療に用いられるトリプシンなどのエンドペプチダーゼは、コラーゲン分画の骨伝導性活性に影響を与える前に激減するか又は完全に除去される程度の量が準備される。生物学の当業者は、エンドペプチダーゼの適切な濃度、及びコラーゲン切片の活動に影響を与えない程度の混合物の処置時間を決定する。他の実施形態において、コラーゲン、例えばＩ型コラーゲンは、エンドペプチダーゼによって消化されない。
【００７３】
方法に関する他の実施形態においては、コラーゲンを１以上の別の化合物と混合させる前に濃縮する。コラーゲンを別の成分と混合させる前にコラーゲンを濃縮することは、結果として生じる同時凍結乾燥された海綿体の特性に関して、特定の条件下において有利である。コラーゲン切片を追加した骨伝導性活性物質及び／又は軟骨伝導性活性物質で濃縮することによって、添加物の活性物質とともにコラーゲン切片を有する装置全体の活性物質の濃度が非常に高くなる。これにより、例えば、海綿体などの組成物の全体積の範囲内で活性物質は十分な濃度に達する。
【００７４】
内在性の又は追加された骨伝導性活性物質又は軟骨伝導性活性物質を有する混合物の濃縮は、生物学の当業者にとって周知の方法によって実施される。例えば、濃縮は少なくとも１つの遠心分離工程、適切な細胞膜を介する少なくとも１つの分離工程、及び／又は重力手段による少なくとも１つの沈殿工程を含む。典型的な濃縮の一つは、ＣＯＬＬＯＳＳ（登録商標）Ｅのタンパク質を含む懸濁液を、１．５ｍｇ／ｇタンパク質から２．０ｍｇ／ｇタンパク質を含む懸濁液の乾燥物質含有量（ＴＳ）で濃縮することである。この方法は結果として、２．０ｍｇ／ｇタンパク質から２０．０ｍｇ／ｇタンパク質を含む懸濁液中でＴＳの含有量が増えることになる。
【００７５】
一般的に、生じた海綿体によって、海綿体を形成する生体活性物質の均一な分配が使用者にもたらされる。通常は、充填剤は生体材料よりも多くの海綿体を構成する。コラーゲン及び分化因子又は成長因子などの追加物質から得られる生体材料は、充填剤料の粒子間のその塊を覆うのみである。
【００７６】
特定の実施形態において、コラーゲンは上記のような骨伝導性特性を有する多孔質充填剤と混合される。骨伝導性特性を有するコラーゲンを得るための典型的な工程は、骨伝導性特性を有する上記充填剤をコラーゲンと混合させる工程を含む。この混合工程中、コラーゲンは骨伝導性特性を有する多孔質充填剤の外表面及び内表面上のコーティングとして用いられる。さらなる工程は、骨伝導性特性を有するコラーゲン、すなわち、骨伝導性／骨刺激性効果又は軟骨伝導性／軟骨刺激性効果を有するコラーゲンを獲得するために、結果として生じる混合物を凍結乾燥する工程を含む。この方法はさらに、骨伝導性活性物質又は軟骨伝導性活性物質、及び／又は骨刺激性効果及び／又は軟骨刺激性効果を有する少なくとも１つの分化因子または成長因子を備える１つのコラーゲンを提供する。その結果生じる混合物は最終的に同時凍結乾燥され、十分に安定した海綿体を形成する。
【００７７】
一般的に、上記の方法は無菌環境下で実施され、本発明に従って無菌又は滅菌済の装置又は組成物をもたらす。他の実施形態において、様々な滅菌方法を用いて無菌又は滅菌済の組成物を得ることができる。ある実施形態において、本発明の方法を用いる前に、本発明の組成物の個々の各成分が、例えば、バクテリアやウィルスを除去するために無菌状態で濾過されるなどして滅菌される。別の実施形態では、この方法は無菌方式で組成物又は装置を包装する段階をさらに含み、これによって無菌組成物又は装置、滅菌済の組成物又は装置が提供される。
【００７８】
本明細書に記載の本発明による組成物の特徴は、本発明の方法及び本発明の使用方法を、それぞれ明確に特徴付けている。
【００７９】
本明細書で提供される装置において、以下に示されるように、少なくとも１つのコラーゲンを備える、骨刺激性効果及び／又は軟骨刺激性効果を有する少なくとも１つの分化因子及び／又は成長因子が存在することにより、複数の利点がもたらされることとなる。上記物質の各々は、本発明の装置の骨形成特性又は軟骨形成特性を誘導すると共に増幅する。さらに、コラーゲンを有する成長因子が存在することで、組成物の現在の形状安定性が増幅する。本明細書に記載の組成物は、成長因子によって与えられる骨誘導性効果及び骨伝導性効果の相互作用、及び充填剤によってもたらされる形状安定性／支持機能によって最適化される。他の実施形態においては、非骨誘導性の充填剤の追加に起因する組成物の骨誘導性効果の減少は、比較的少量の添加剤を組成物に加えることによって補償或いは克服される。
【００８０】
さらに、製造工程における同時凍結乾燥によって、最終的な組成物が作製される。すなわち、組成物の成分はすでに混合され、使用準備の整った装置を形成する。他の実施例では、例えば外科医が使用しやすい、使用準備の整った装置が提供される。組成物が無菌方式で作製されるため、骨欠損又は軟骨欠損を修復する手術中に組成物を無菌包装から直接取り出したり、使用したりすることが可能である。
【００８１】
本発明は先に十分に記載されてきたが、以下の実施例及び請求項によってさらに実証されるものとする。なお、これらの実施例及び請求項は実例となるものであり、これ以上の限定を意味するわけではない。当業者は、わずかな日常的な実験を用い、本明細書に記載の特定の手順に相当する多くの手順を識別するとともに解明することができる。本出願で引用される付与済みの特許及び公開特許出願を含むすべての参考文献の内容は、参照されることにより本明細書に組み込まれるものとする。
【００８２】
（実施例）
＜実施例１：本発明による組成物の作製＞
以下の方法を用いて本発明の組成物を作製する。
【００８３】
ＣＯＬＬＯＳＳ（登録商標）Ｅという製品は、ウマの骨組織のコラーゲン抽出物であり、上記の如く市販されている。この製品を作る方法は先に記載されており、ＷＯ９３／２０８５７Ａ１号に示されている。なお、この文献は参照することにより全体として本発明に組み込まれるものとする。Ｓｐｉｎｅ（３０：８９０−８９５，２００５年）も参照されたい。この物質は、Ｉ型コラーゲンの基質中にある自然に結合した因子の活性物質の複合体を含む。
【００８４】
ＣＯＬＬＯＳＳ（登録商標）Ｅは水性懸濁液の形で市販されており、この懸濁液は少なくとも１つの分離工程を行うことによって濃縮される。その濃縮によって得られた懸濁液はその後、添加物及び組成物の要素と混合される。均一な混合物を得た後で、この混合物の要素を同時凍結乾燥させ、多孔質で安定した海綿体が得られる。
【００８５】
滅菌済の又は無菌の装置を得るために、製造工程中の全体の工程は無菌条件下で実施され、組成物の個々の成分は製造工程前に事前に無菌方式で濾過される。
【００８６】
＜実施例２＞
本発明の組成物は以下の要素から準備される。
【００８７】
【表１】
2010538691.tif 000002
【００８８】
本発明の装置及び組成物が存在する特定の実施形態における物質のさらなる実施例は、コラーゲン及び／又はセラミックで同時凍結乾燥されたＢＭＰ、スペーサー（グロブリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、プロタミン及びフィブリン）を用いてコラーゲンと結合したＢＭＰ、及びプロタミン、グロブリン、フィブリン、アルブミン及びＢＭＰを有するコラーゲンの懸濁液を備え、この懸濁液はその後凍結乾燥される。
【００８９】
ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７又は本装置及び組成物中の他の成長因子は、例えば、組み換え技術によって作製されたヒトタンパク質である。用いられるＩ型コラーゲンは、例えば組み換え型ヒトコラーゲンである。生体異物のタンパク質の抗原活性が激しいため、組み換え型のヒトＢＭＰ−２及び組み換え型のヒトコラーゲンを用いることは人間に投与する際に有用である。
【国際調査報告】
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2010538691.tif 000004
2010538691.tif 000005