(57)【要約】  スコパロンを有効成分として含む血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物、スコパロンの血管平滑筋細胞増殖抑制用途およびこれを用いた血管平滑筋細胞増殖の抑制方法を提供する。本発明により、スコパロンがＡＭＰＫの活性を増大させることにより、血管平滑筋細胞の増殖を抑制することが可能になることが判明された。このため、スコパロンは血管平滑筋細胞増殖抑制、特に血管再狭窄の予防または治療のための医薬の有効成分として有効に使用可能である。
2010539079.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スコパロンを有効成分として含む血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物。
【請求項２】
前記薬剤学的組成物は、血管再狭窄の予防または治療のためのものである請求項１に記載の血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明はスコパロンを有効成分として含む血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物、スコパロンの血管平滑筋細胞増殖抑制用途およびこれを用いた血管平滑筋細胞の増殖抑制方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
血管平滑筋細胞の増殖は、アテローム性動脈硬化症をはじめとする動脈硬化症症、血管再狭窄症などを含む心血管系疾患の重要な原因である (Hidde B., Restenosis: a challenge for pharmacology. Trends. Pharmacol. Sci. 2000;21(7):274-279; Nageswara RM, and Marschall SR, Circ. Res. 2007;100:460-473; Andres V, Castro C. Antiproliferative strategies for the treatment of vascular proliferative disease. Curr Vasc Pharmacol. 2003 Mar;1(1):85-98; Hao H, Gabbiani G, Bochaton-Piallat ML. Arterial smooth muscle cell heterogeneity: implications for atherosclerosis and restenosis development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003 Sep 1;23(9):1510-20)。
【０００３】
かような心血管系疾患を予防するための最良の方法は、高血圧、高脂血症、肥満、糖尿などの代謝症候群の要素を上手く管理することである。しかしながら、かような疾患が一回発病すると、薬物または手術的な方法を使用する治療が必要となる。スタチン系の薬品と抗高血圧薬剤を用いて血圧を調節するが、これは、心血管疾患の約１５−３０％しか減少できず、根本的な治療法になりえない。これまで知られている最良の治療法は、風船付きカテーテルを目詰まったり狭くなった血管中に入れた後に風船を拡張させて血管を通すことである(Hidde B., Restenosis: a challenge for pharmacology. Trends. Pharmacol. Sci. 2000;21(7):274-279)。しかしながら、血管平滑筋細胞の再増殖により風船拡張術施術後約１年以内に５０％程度の再狭窄率を示す問題が発生するため、血管平滑筋細胞の増殖を抑制することが必須的である。
【０００４】
最近、各種の代謝性疾患とミトコンドリアとの連携研究が盛んになされている。血管合併症の発病機序中に血管細胞において酸化ストレスが増大することが観察されたが、この酸化ストレスの増加はミトコンドリアの機能障害に起因するという意見が支配的である (Nageswara RM and Marschall SR, Circ. Res. 2007;100:460-473) 。ミトコンドリアは血管細胞内の種々の酸化ストレス発生システムのうち葡萄糖代謝および脂肪代謝と関連して活性酸素種を生成する機関であり、且つ、高血糖、脂肪酸、サイトカイン、成長因子などにより発生する酸化ストレスに共通して作用して血管合併症の発生を一層加速化させる恐れがあるためである。最近の研究において、ＵＣＰ−２、ＡＭＰＫ、ＰＧＣ−１などの遺伝子の過発現が高血圧誘発因子によるミトコンドリアの機能を改善させ、血管平滑筋細胞の増殖および移動を抑制することが観察されている(Lee W.J., et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25:2488-2494; Park J.Y., et al., Diabetologia 2005;48:1022-1028; Lee IK, et al., Effects of Recombinant Adenovirus-Mediated Uncoupling Protein 2 Overexpression on Endothelial Function and Apoptosis. Circ Res. 2005 Jun 10;96(11):1200-7; Kim HJ, et al., Effects of PGC-1α on TNF-α Induced MCP-1 and VCAM-1 Expression and NF-κB Activation in Human Aortic Smooth Muscle and Endothelial Cells. ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING. 2007;9(3): 301-307)。
【０００５】
血管平滑筋細胞の増殖がＡＭＰＫの活性により支配される恐れがあることが再度報告されている(Nagata D, et al., AMP-activated protein kinase inhibits Angiotensin II-stimulated vascular smooth muscle cell proliferation. Circulation. 2004;110:444-451)。ＡＭＰＫが活性化された血管平滑筋細胞は増殖が抑制され、且つ、この平滑筋細胞においては細胞増殖抑制因子であるｐ５３とｐ２１の発現が増大され、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ：cyclin-dependent kinase）の活性が減少されることが観察される(Igata M, et al., Adenosine monophosphate-activated protein kinase suppresses vascular smooth muscle cell proliferation through the inhibition of cell cycle progression. Circ Res. 2005;97(8):837-844) 。ＡＭＰＫは食餌制限や運動によりＡＭＰの相対的な比率がＡＴＰよりも高いときに活性化される一種のリン酸化酵素であって、細胞の複製を中断してそれ以上のＡＴＰの消耗を抑制する機能を持つ代謝関連の重要なタンパク質である(Hardie DG. AMP-activated protein kinase as a drug target. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2007;47:185-210) 。活性化されたＡＭＰＫは糖代謝と脂質酸化を促進させ、糖新生成と脂質の合成を抑制することが知られている。なお、ＡＭＰＫは代謝過程とは無関係に活性化されたりもするが、糖尿病治療剤として知られているメトホルミンによっても活性化され、α−リポ酸により活性されたりもする (Lee W.J., et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25:2488-2494; Lee KM, et al., Alpha-lipoic acid inhibits fractalkine expression and prevents neointimal hyperplasia after balloon injury in rat carotid artery. Atherosclerosis. 2006 Nov;189(1): 104-14) 。
【０００６】
スコパロン(scoparone; 6,7-dimethoxycoumarin)は植物から抽出されるフェノール系物質であるクマリン誘導体の一つであって、ベンゼンとピロン環が結合された構造を有している。クマリンは、ハマヨモギ、カワラヨモギ、カズザキヨモギなどから抽出される成分であって、様々な疾病の治療剤や緩和剤として使用されており、中でも、スコパロンは、ハマヨモギ(Artemisia scoparia)から主として抽出され、免疫抑制や血管弛緩、脂質降下などの効果があることが知られている。また、スコパロンは、人間の抹消単核球細胞の成長を抑制し、血管平滑筋細胞を弛緩させ、トリグリセリドとコレステロールの数値も低めることを高コレステロールモデルのウサギから確認した。さらに、スコパロンは、喘息に卓越した効果があることが報告されている。加えて、スコパロンは、血圧降下作用、利胆作用、消炎作用など様々な薬理作用があることが報告されている。なお、台湾のHuangらは、スコパロンが血管弛緩作用と免疫抑制作用を示すことを明らかにした。
【０００７】
本発明者らは、血管平滑筋細胞においてＡＭＰＫの活性を促進させる物質を研究した結果、スコパロンが血管平滑筋細胞においてＡＭＰＫの活性を促進させて血管平滑筋細胞の増殖を抑制することを見出すことにより、本発明を完成するに至った。
【０００８】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
従って、本発明の目的は、スコパロンを有効成分として含む血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物、スコパロンの血管平滑筋細胞増殖抑制用途およびこれを用いた血管平滑筋細胞の増殖抑制方法を提供するところにある。
【０００９】
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、スコパロンを有効成分として含む血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物を提供する。
【００１０】
本発明の実施例によれば、スコパロンは、血管平滑筋細胞の増殖を抑制させ、風船拡張術後に生成可能な新生内膜の形成も減少させる。下記の実施例から明らかなように、スコパロンは、ＡＭＰＫを活性化させて血管平滑筋細胞の増殖を抑制し、ＡＭＰＫの上位信号伝達ネットワークに影響を及ぼすことによりＡＭＰＫの活性化とこれによるＡＣＣ２のリン酸化／活性阻害を誘発する。さらに、スコパロンは、細胞周期を抑制するタンパク質であるｐ２１、ｐ２７、ｐ５３タンパク質の発現を増大させ、細胞周期を進行させるサイクリンＤの発現を減少させる。さらに、スコパロンは、血管内におけるＲＯＳの生成を減少させ、ＲＯＳの増大に伴い発現が増大されるＶＣＡＭ−１タンパク質の発現を容量依存的に減少させることが確認された。
【００１１】
このように、スコパロンがＡＭＰＫの活性化を通じて血管平滑筋細胞の増殖を抑制することが確認されたため、スコパロンは血管平滑筋細胞の増殖を抑制するための医薬の有効成分として使用可能である。
【００１２】
本発明のスコパロンを有効成分として含有する組成物は、前記有効成分の他に、薬剤学的に適しており、且つ、生理学的に許容される補助剤を用いて製造可能であり、前記補助剤としては、賦形剤、崩壊剤、甘味剤、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤または香味剤などの可溶化剤を使用することができる。
【００１３】
本発明のスコパロンを有効成分として含有する組成物は、投与のために上述した有効成分の他にさらに薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで薬剤学的組成物として好適に製剤化可能である。
【００１４】
本発明のスコパロンを有効成分として含有する組成物の剤形としては、顆粒剤、散剤、錠剤、被覆錠、カプセル剤、座剤、灌腸剤、シロップ、汁、懸濁剤、乳剤または注射可能な液剤などが挙げられる。
【００１５】
例えば、錠剤またはカプセル剤への製剤化のために、有効成分は、エタノール、グリセロール、水などの経口、無毒性の薬剤学的に許容可能な不活性担体と結合可能である。また、必要に応じて、好適な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および発色剤もまた混合物に含有可能である。好適な結合剤は、これらに制限されることはないが、澱粉、ゼラチン、グルコースまたはβ−ラクトースなどの天然糖、トウモロコシ甘味剤、アカシア、トラガカントまたはソジウムオレートなどの天然および合成ガム、ソジウムステアレート、マグネシウムステアレート、ソジウムベンゾエート、ソジウムアセテート、ソジウムクロライドなどを含む。崩壊剤は、これらに制限されることはないが、澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどを含む。
【００１６】
液状溶液として製剤化される組成物において許容可能な薬剤学的担体としては、滅菌 および生体に適したものであって、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、靜菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。さらに、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸剤、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当該分野における適切な方法によりRemington’s Pharmaceutical Science、Mack Publishing Company、Easton PAに開示されている方法を用いて各疾患によってまたは成分によって好適に製剤化することができる。
【００１７】
また、本発明は、血管平滑筋細胞増殖抑制用医薬の製造のためのスコパロンの用途を提供する。
【００１８】
前記血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物は、このような医薬の製造のために使用可能である。
【００１９】
さらに、本発明は、哺乳動物に治療上有効量のスコパロンを有効成分として含む薬剤学的組成物を投与することを含む血管平滑筋細胞の増殖抑制方法を提供する。
【００２０】
本発明において、前記血管平滑筋細胞増殖抑制は、血管平滑筋細胞の増殖の減少および予防を含む。
【００２１】
本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物は、血管平滑筋細胞の増殖により誘発される疾患であるアテローム性動脈硬化症をはじめとする動脈硬化症症、血管再狭窄症(Hidde B., Restenosis: a challenge for pharmacology. Trends. Pharmacol. Sci. 2000;21(7):274-279; Nageswara RM, and Marschall SR, Circ. Res. 2007;100:460-4;, Andres V, Castro C. Antiproliferative strategies for the treatment of vascular proliferative disease. Curr Vasc Pharmacol. 2003 Mar;1(1):85-98; Hao H, Gabbiani G, Bochaton-Piallat ML. Arterial smooth muscle cell heterogeneity: implications for atherosclerosis and restenosis development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003 Sep 1;23(9):1510-20)などを含む心血管系疾患の予防または治療のために使用可能である。
【００２２】
このため、本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制用薬学的組成物は、１種またはそれ以上の心血管系疾患の治療剤も含むことができる。例えば、スコパロンは当業界における周知の高脂血症治療剤または血圧降下剤などと併用可能である。
【００２３】
本発明のスコパロンを有効成分として含有する組成物は、靜脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、腹腔内、胸骨内、けい皮、鼻側内、吸入、局所、直腸、経口、眼球内または皮内経路を通じて通常の方式により投与可能である。
【００２４】
本発明のスコパロンを有効成分として含有する組成物の治療上有効量とは、血管平滑筋細胞の増殖を抑制する効果を奏するのに求められる量を意味する。このため、疾患の種類、疾患の軽重度、組成物に含有されている有効成分および他の成分の種類および含量、剤形の種類および患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、同時に使用される薬物をはじめとする様々な因子によって調節可能である。成人にスコパロンを１日につき１回ないし数回投与時、例えば、１０ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇの容量にて投与することが好ましい。
【００２５】
〔発明の効果〕
本発明により、スコパロンがＡＭＰＫの活性を増大させることにより、血管平滑筋細胞の増殖を抑制することが可能になることが判明された。このため、スコパロンは血管平滑筋細胞増殖抑制、特に血管再狭窄の予防または治療のための医薬の有効成分として有効に使用可能である。
【００２６】
〔図面の簡単な説明〕
（図１）ＰＤＧＦまたはＴＮＦ−αと一緒にスコパロンを濃度別に処理した場合、血管平滑筋細胞の増殖がスコパロンの濃度に依存的に有意に減少することを示すグラフである。
（図２）風船拡張術実施２週後のラットの頚動脈の切断面を示す顕微鏡写真（×１００）である。
（図３）スコパロンがＡＭＰＫとＡＣＣリン酸化に及ぼす影響を示すウェスタンブロット写真である。
（図４）スコパロンが細胞増殖と関連するタンパク質であるｐ５３、ｐ２１、ｐ２７およびサイクリンＤの発現に及ぼす影響を示すウェスタンブロット写真である。
（図５）スコパロンがＪＮＫおよびＥｒｋのリン酸化に及ぼす影響を示すウェスタンブロット写真である。
（図６）スコパロンがＲＯＳ生成阻害に及ぼす影響を示す蛍光顕微鏡写真である。
（図７）スコパロンがＶＣＡＭ−１タンパク質の発現に及ぼす影響を示すウェスタンブロット写真である。
（図８）転写因子ＡＰ−１およびＮＦ−ｋＢのＤＮＡ結合活性に及ぼす影響を示すゲル遅延分析の結果である。
【００２７】
〔発明を実施するための形態〕
＜血管平滑筋細胞の分離および培養＞
Sprague-Dawley白鼠の胸部大動脈から血管平滑筋細胞を分離して２０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地において培養した。血管平滑筋細胞の特異性はα−アクチン単一クローン抗体（Sigma, St Louis, Missouri, USA）により染色して確認した。この実験例においては、５−６回に亘って継代培養した血管平滑筋細胞を使用した。培養された血管平滑筋細胞を６０ｍｍ組織培養皿に８０−９０％程度満たして０.５％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ培地において２４時間かけて培養して細胞を休止期状態にした。
【００２８】
＜実施例１：スコパロンによる血管平滑筋細胞の増殖抑制効果確認＞
一次培養された血管平滑筋細胞を９６ウェル培養皿に培養し、４０％生長したときに０．５％ＦＢＳ含有培地に交換し、２４時間かけて培養して細胞を休止期状態にした。その後、２０ｎｇ／ｍｌの血小板由来成長因子（platelet derived growth factor：ＰＤＧＦ）や１０ｎｇ／ｍｌの腫瘍怪死因子（ＴＮＦ−α）と一緒に０、５、１０、２０、または５０μＭのスコパロンを処理し、３７℃において４８時間反応させた。細胞の数はＷＳＴ細胞計数キット（ＷＡＫＯ、日本）を用いて計数した。細胞増殖確認用試薬（ＷＳＴ）を処理し、４時間さらに反応させた後、ＥＬＩＳＡリーダーにより４５０ｎｍにおける吸光度を測定して細胞の増殖力を調査した。図１から明らかなように、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）またはＴＮＦ−αの処理は血管平滑筋細胞の増殖を増大させたが、スコパロンを一緒に処理した場合、血管平滑筋細胞の増殖が容量依存的に有意に減少された。
【００２９】
＜実施例２：白鼠における血管平滑筋細胞の増殖抑制効果確認＞
スコパロンが風船拡張術施行後に新生内膜の形成を抑制するかどうか確認するためにスコパロン含有食餌を供給したSprague-Dawley白鼠により実験した。
【００３０】
実験対象としては、体重３００ｇ前後の雄性Sprague-Dawley白鼠を使用した。正常対照群、高脂肪食（２０％脂肪、０．０５％コレステロール）のみをする陰性対照群、および高脂肪食餌に１０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのスコパロンを含む食餌を供給した実験群（各群当たりに４匹）を温度が２２℃に維持され、１２時間の周期に明暗が調節される条件下において飼育した。陰性対照群と実験群は風船拡張術実施３日前から上記のように定められた食餌を開始し、風船拡張術実施後に２週間同じ食餌を供給した。２週後に頚動脈を分離してヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色により新生内膜の形成を確認した。図２は、風船拡張術実施２週後のラットの頚動脈の切断面を示す顕微鏡写真（×１００）である。図２のａは正常対照群、図２のｂは陰性対照群、図２のｃは１０ｍｇ／ｋｇスコパロン投与群、図２のｄは１００ｍｇ／ｋｇスコパロン投与群のＨ＆Ｅ染色結果を示す。図２から明らかなように、陰性対照群に比べてスコパロン投与群の新生内膜の形成が減少され、増大につれてさらに新生内膜形成の減少率が増大した。このため、前記実験結果から、スコパロンが血管平滑筋細胞の増殖を抑制することにより風船拡張術施術後の血管再狭窄を予防または治療することができるということを確認することができる。
【００３１】
＜実験例１：スコパロンがＡＭＰＫ、ＡＣＣのリン酸化に及ぼす影響確認＞
培養された血管平滑筋細胞を６０ｍｍ組織培養皿に８０−９０％程度満たした後、０．５％ＦＢＳを含む培地において２４時間放置して細胞を休止期状態にした。スコパロンを処理しなかった群を対照群とし、実験群は５０μｇのスコパロンをそれぞれ１、２、４、６、１２時間かけて処理した５群に分けた。各群からＲＩＰＡ緩衝溶液を用いて全体タンパク質を分離した。分離したタンパク質を緩衝溶液と混ぜて５分間沸騰した後、氷上において冷却した。ソジウムドデシルスルファートポリアクリアミドゲルにおいて電気泳動してタンパク質をサイズ別に分離した後にＰＶＤＦメンブレインに移し、ｐＡＣＣ、ｐＡＭＰＫ、ＡＭＰＫに対するモノクローナル抗体と反応させてタンパク質の発現とリン酸化を確認した。
【００３２】
図３から明らかなように、血管平滑筋細胞にスコパロンを処理した結果、ＡＭＰＫのリン酸化された形態とそれによるＡＣＣのリン酸化された形態が時間依存的に増大した。
【００３３】
＜実験例２：スコパロンが細胞増殖と関連するタンパク質の発現に及ぼす影響確認＞
培養された血管平滑筋細胞を６０ｍｍ組織培養皿に８０−９０％程度満たした後、０．５％ＦＢＳを含む培地において２４時間放置して細胞を休止期状態にした。スコパロンを処理しなかった群を対照群とし、実験群は５０μｇのスコパロンをそれぞれ２、４、６、１２、２４時間かけて処理した５群に分けた。各群からＲＩＰＡ緩衝溶液を用いて全体タンパク質を分離した。分離したタンパク質を緩衝溶液と混ぜて５分間沸騰した後、氷上において冷却させた。ソジウムドデシルスルファートポリアクリアミドゲルにおいて電気泳動してタンパク質をサイズ別に分離した後にＰＶＤＦメンブレインに移し、ｐ５３、ｐ２７、ｐ２１、サイクリンＤに対する抗体と反応させてタンパク質の発現を確認した。
【００３４】
図４から明らかなように、血管平滑筋細胞にスコパロンを処理した結果、細胞周期に関連するｐ５３、ｐ２７、ｐ２１の発現が時間依存的に増大した。スコパロンを処理し、時間が経過するに伴い細胞周期を抑制するタンパク質であるｐ２１、ｐ２７の発現量が増大することを確認することができ、２４時間後に最も高い発現量を示した。なお、ｐ５３の場合には処理後２時間から４時間目に最も高い発現を示した。細胞周期を進行するサイクリンＤの場合にはスコパロンの処理によって減少されることを確認することができた。
【００３５】
＜実験例３：スコパロンがＪＮＫおよびＥｒｋリン酸化に及ぼす影響確認＞
スコパロンの信号伝達経路を調べるために、ＪＮＫとＥｒｋのリン酸化を確認した。
【００３６】
培養された血管平滑筋細胞を６０ｍｍ組織培養皿に８０−９０％程度満たした後、０．５％ＦＢＳを含む培地において２４時間放置して細胞を休止期状態にした。スコパロンを処理しなかった群を対照群とし、実験群は５０μｇのスコパロンをそれぞれ１５分、３０分、４５分、６０分、９０分間処理した５群に分けた。各群からＲＩＰＡ緩衝溶液を用いて全体タンパク質を分離した。分離したタンパク質を緩衝溶液と混ぜて５分間沸騰した後、氷上において冷却した。ソジウムドデシルスルファートポリアクリアミドゲルにおいて電気泳動してタンパク質をサイズ別に分離した後にＰＶＤＦメンブレインに移し、ｐＪＮＫ、ＪＮＫ、ｐＥｒｋおよびＥｒｋに対する抗体と反応させてタンパク質の発現およびリン酸化を確認した。
【００３７】
時間が経過するに伴い、ＪＮＫのリン酸化は次第に増大されることを確認した。Ｅｒｋのリン酸化は４５分において最も多く行われることを確認して、スコパロンによる細胞周期の調節にＪＮＫとＥｒｋのリン酸化が関与することを予想することができた。
【００３８】
図５は、スコパロンがＪＮＫおよびＥｒｋのリン酸化に及ぼす影響を示すウェスタンブロット写真である。
【００３９】
＜実験例４：スコパロンがＲＯＳ生成に及ぼす影響確認＞
６ウェル細胞培養皿に９０％程度生長したときに０．５％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地において２４時間かけて培養した。腫瘍怪死因子（ＴＮＦ−α）およびスコパロンを処理しなかった群を対照群とし、実験群は腫瘍怪死因子（ＴＮＦ−α）を含む培地においてそれぞれ０μＭ、１００μＭ、２００μＭのスコパロンを処理した３群に分けた。各群を１時間かけて培養した後、ＲＯＳに敏感な蛍光プローブである２’,７’−ジクロロフルオレシンジアセテート（ＤＣＦ−ＤＡ；Invitrogen）を４０μｍｏｌ／Ｌ添加して３０分間培養した。４８８ｎｍ波長において刺激され、５１５ｎｍ波長において発散されるAxioCam MRc5 Carl Zeiss蛍光顕微鏡（Thornwood,ＮＹ）を用いてＲＯＳの生成を確認した。図６から明らかなように、スコパロン処理群において増大されたＲＯＳの発現が減少されることを確認することができた。
【００４０】
＜実験例５：スコパロンがＶＣＡＭ−１発現に及ぼす影響確認＞
培養された血管平滑筋細胞を６０ｍｍ組織培養皿に８０−９０％程度満たした後、０．５％ＦＢＳを含む培地において２４時間放置して細胞を休止期状態にした。スコパロンおよび腫瘍怪死因子ＴＮＦ−αを処理しなかった群を対照群とし、実験群は腫瘍怪死因子ＴＮＦ−αを含む培地においてそれぞれ０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭのスコパロンを２４時間かけて処理した５群に分けた。５０μｇのスコパロンをそれぞれ１５分、３０分、４５分、６０分、９０分間処理した５群に分けた。各群からＲＩＰＡ緩衝溶液を用いて全体タンパク質を分離した。分離したタンパク質を緩衝溶液と混ぜて５分間沸騰した後に氷上において冷却した。ソジウムドデシルスルファートポリアクリアミドゲルにおいて電気泳動してタンパク質をサイズ別に分離した後、ＰＶＤＦメンブレインに移し、ＶＣＡＭおよびＰＡＩ−１に対する抗体と反応させてタンパク質の発現を確認した。メンブレインを抗アクチン抗体とさらに反応させて一定量のタンパク質を使用したかを確認した。
【００４１】
ＲＯＳの増加は動脈硬化症の主な原因となる物質であるＶＣＡＭ−１タンパク質の発現を格段に増大させるが、血管平滑筋細胞にスコパロンを処理する場合、図７から明らかなように、増加されたＶＣＡＭ−１の発現が容量依存的に減少される。
【００４２】
＜実験例６：スコパロンがＡＰ−１およびＮＦκＢのＤＮＡ結合活性に及ぼす影響確認＞
細胞周期調節タンパク質またはケモカインなどのタンパク質はそれぞれの転写因子により調節される。このため、細胞周期調節タンパク質の発現を調節する転写因子であるＡＰ−１とケモカインの発現を調節する転写因子であるＮＦ−ｋＢのＤＮＡ結合活性をゲル遅延分析法（ＥＭＳＡ）を用いて確認した。
【００４３】
血管内皮細胞を０．５％ＦＢＳを含有する培地において２４時間かけて培養した。スコパロンおよび腫瘍怪死因子ＴＮＦ−αを処理しなかった群を対照群とし、実験群は１０ｎｇの腫瘍怪死因子ＴＮＦ−αを含む培地においてそれぞれ０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭのスコパロンを２４時間かけて処理した５群に分けた。核酸抽出物を血管平滑筋細胞から分離し、ＡＰ−１とＮＦ−ｋＢに対する放射線標識されたプローブルによりラベリングした後、タンパク質−ＤＮＡ反応を２０分間室温において行った。反応をさせた後、サンプルを４％天然ポリアリールアミドゲルに搬入し、１５０ボルトにおいて２時間かけて電気泳動を行った後に分析した。
【００４４】
その結果、図８から明らかなように、ＴＮＦ−αによって増加されていたそれぞれの転写因子のＤＮＡ結合はスコパロンを処理することにより濃度依存的に減少し、スコパロンの抑制物質であるＣｏｍｐＣ(Competitor、ＡＭＰＫ阻害剤、ＭＥＲＣＫ、Ｃａｔ．＃１７１２６０)を処理すると、平滑筋細胞の増殖抑制がさらに修復されることを確認することができた。
【００４５】
本発明により、スコパロンがＡＭＰＫの活性を増大させることにより、血管平滑筋細胞の増殖を抑制することが可能になることが判明された。このため、スコパロンは血管平滑筋細胞増殖抑制、特に血管再狭窄の予防または治療のための医薬の有効成分として有効に使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ＰＤＧＦまたはＴＮＦ−αと一緒にスコパロンを濃度別に処理した場合、血管平滑筋細胞の増殖がスコパロンの濃度に依存的に有意に減少することを示すグラフである。
【図２】風船拡張術実施２週後のラットの頚動脈の切断面を示す顕微鏡写真（×１００）である。
【図３】スコパロンがＡＭＰＫとＡＣＣリン酸化に及ぼす影響を示すウェスタンブロット写真である。
【図４】スコパロンが細胞増殖と関連するタンパク質であるｐ５３、ｐ２１、ｐ２７およびサイクリンＤの発現に及ぼす影響を示すウェスタンブロット写真である。
【図５】スコパロンがＪＮＫおよびＥｒｋのリン酸化に及ぼす影響を示すウェスタンブロット写真である。
【図６】スコパロンがＲＯＳ生成阻害に及ぼす影響を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図７】スコパロンがＶＣＡＭ−１タンパク質の発現に及ぼす影響を示すウェスタンブロット写真である。
【図８】転写因子ＡＰ−１およびＮＦ−ｋＢのＤＮＡ結合活性に及ぼす影響を示すゲル遅延分析の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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