(57)【要約】  本発明は、４０℃から１００℃より高い温度において行われる増幅反応において耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを保護する組成物、方法およびキットを提供する。前記組成物は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、および陰イオン界面活性剤または両性イオン界面活性剤を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、
（ｂ）陰イオン界面活性剤
を含む組成物。
【請求項２】
ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・フラバス、サーマス・ルバー、サーマス・サーモフィラス、バチルス・ステアロサーモフィラス、サーマス・アクアティカス、サーマス・ラクテウス、サーマス・ルーベンス、およびメタノサーマス・フェルビズスからなる群より選択される好熱細菌由来である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑである、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｔａｑが、前記組成物中に約０．１ユニット／μＬ〜約５ユニット／μＬの濃度で存在する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記陰イオン界面活性剤が、前記組成物中に約０．００１重量％〜約１重量％の濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記陰イオン界面活性剤が、ポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプルピルエーテルカリウム塩、ポリ（エチレングリコール）モノラウレート、λカラギーナン、ポリオキシエチレン（１５）ジノニルフェニルエーテルポリオキシエチレン、およびノニルノノキシノール−１５ホスファートからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記陰イオン界面活性剤が、ポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
還元剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物のｐＨを約６〜約９に維持する緩衝剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記緩衝剤がＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＴＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳまたはＴｒｉｓからなる群より選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなる群より選択されるｄＮＴＰの混合物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
組成物のｐＨを約７〜約８に維持する緩衝剤、標的ポリヌクレオチド、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなる群より選択されるｄＮＴＰの混合物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記陰イオン界面活性剤がポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩であり、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムおよび塩化リチウムからなる群より選択される塩をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ジメチルスルホキシド、ホルムアミドおよびベタインからなる群より選択されるＰＣＲの効率を増大させる試薬をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
（ａ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、
（ｂ）両性イオン界面活性剤
を含む組成物。
【請求項１７】
前記ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・フラバス、サーマス・ルバー、サーマス・サーモフィラス、バチルス・ステアロサーモフィラス、サーマス・アクアティカス、サーマス・ラクテウス、サーマス・ルーベンス、およびメタノサーマス・フェルビズスからなる群より選択される好熱菌由来である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記Ｔａｑが、前記組成物中に約０．１ユニット／μＬ〜約５ユニット／μＬの濃度で存在する、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
前記両性イオン界面活性剤が、前記組成物中に約０．００１重量％〜約１重量％の濃度で存在する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
前記両性イオン界面活性剤が式（Ｉａ）の化合物である、請求項１６に記載の組成物。
【化１】
2010512797.tif 000013
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は独立にヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルである。
【請求項２２】
前記両性イオン界面活性剤が、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラデシルアンモニオ）プロパンスルホナート、３−（４−ヘプチル）フェニル−３−ヒドロキシプロピル）ジメチルアンモニオプロパンスルホナート、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホナート、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート、３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩、３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホナート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホナートおよび３−[Ｎ，Ｎ―ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ]プロパンスルホナートからなる群より選択される化合物である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２３】
還元剤をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物のｐＨを約６〜約９に維持する緩衝剤をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２５】
前記緩衝剤がＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＴＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳまたはＴｒｉｓからなる群より選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなる群より選択されるｄＮＴＰの混合物をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物のｐＨを約７〜約８に維持する緩衝剤、標的ポリヌクレオチド、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなる群より選択されるｄＮＴＰの混合物をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記両性イオン界面活性剤が、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホナート、または３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナートであり、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムおよび塩化リチウムからなる群より選択される塩をさらに含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
ジメチルスルホキシド、ホルムアミドおよびベタインからなる群より選択されるＰＣＲの効率を増大させる試薬をさらに含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
サーマルサイクルプロセスにおいて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの不活性化を抑制する方法であって、前記サーマルサイクルプロセスにおいてＤＮＡポリメラーゼを陰イオン界面活性剤または両性イオン界面活性剤と接触させることを含む方法。
【請求項３２】
前記サーマルサイクルプロセスが、約４０℃〜約１００℃の範囲の温度で約２〜５０サイクル行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、サーマス・フラバス、サーマス・ルバー、サーマス・サーモフィラス、バチルス・ステアロサーモフィラス、サーマス・アクアティカス、サーマス・ラクテウス、サーマス・ルーベンス、およびメタノサーマス・フェルビズスからなる群より選択される好熱細菌由来である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記界面活性剤が、ポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、ポリ（エチレングリコール）モノラウレート、λカラギーナン、ポリオキシエチレン（１５０）ジノニルフェニルエーテルポリオキシエチレン、およびノニルノノキシノール−１５ホスファートからなる群より選択される陰イオン界面活性剤である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記界面活性剤が、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラデシルアンモニオ）プロパンスルホナート、３−（４−ヘプチル）フェニル−３−ヒドロキシプロピル）ジメチルアンモニオプロパンスルホナート、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホナート、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート、３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩、３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホナート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホナート、および３−[Ｎ，Ｎ―ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ]プロパンスルホナートからなる群より選択される両性イオン界面活性剤である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物のｐＨを約７〜約８に維持する緩衝剤、標的ポリヌクレオチド、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなる群より選択されるｄＮＴＰの混合物をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記両性イオン界面活性剤が、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホナートまたは３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナートであり、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑである請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記陰イオン界面活性剤がポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩であり、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
サーマルサイクルプロセスでＤＮＡを増幅するキットであって、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、および陰イオン界面活性剤または両性イオン界面活性剤を含むキット。
【請求項４１】
還元剤、緩衝剤、ならびにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなる群より選択されるｄＮＴＰの混合物をさらに含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記界面活性剤がポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、ポリ（エチレングリコール）モノラウレート、λカラギーナン、ポリオキシエチレン（１５０）ジノニルフェニルエーテルポリオキシエチレン、およびノニルノノキシノール−１５ホスファートからなる群より選択される陰イオン界面活性剤であり、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑである、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記界面活性剤が３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホナート、および３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナートからなる群より選択される両性イオン界面活性剤であり、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑである、請求項４１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと陰イオン界面活性剤または両性イオン界面活性剤との組成物を含む組成物、方法、およびキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
広く知られている組み換えＤＮＡ技術には、ＤＮＡの複製およびＤＮＡの増幅が含まれる。その１つの例は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）である。ＰＣＲ中に、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、低温と高温（例えば５５℃と９５℃）を繰り返す。高温にある総時間は、サイクルの総数、各サイクルにおける高温ステップでの持続時間、およびランプ速度（ｒａｍｐ ｓｐｅｅｄ）（サーマルサイクラーが各サイクルのステップ間で切り替わる速度）に依存する。これらのＤＮＡポリメラーゼは高い耐熱性を有するが、高温では時間とともに不活性化する傾向にある。さらに、これらの酵素はまた、補助因子の濃度が最適未満の状態またはｐＨレベルが最適未満の状態で水性環境に希釈された場合、および反応混合液中に化学阻害剤または生物阻害剤が存在下する場合に不活性化される恐れがある。
【０００３】
酵素を安定化させる一つの方法は、界面活性物質のような安定化剤を添加することである。界面活性物質または界面活性剤は、活性型酵素とそれらが含まれている液層環境との境界を安定化させる表面活性化合物である。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの活性は、Ｔｗｅｅｎ２０などの非イオン界面活性剤の添加により安定化される。しかしながら、使用目的によっては、Ｔｗｅｅｎ２０で安定化されたＤＮＡポリメラーゼは増幅効率が低く、非特異的産物が増幅される。したがって、溶液中で耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの安定性を改善する界面活性剤が必要性とされており、特に、現在使用されている界面活性剤にいかなる不利益も与えずに、酵素安定性を改善するような界面活性剤が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の態様には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと陰イオン界面活性剤とを含む組成物が含まれる。あるいは、この組成物は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと両性イオン界面活性剤とを含んでいてもよい。
【０００５】
本発明のさらに他の態様は、サーマルサイクルプロセスにおいて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの不活性化を抑制する方法を提供する。この方法は、サーマルサイクルプロセスにおいて、ＤＮＡポリメラーゼを陰イオン界面活性剤または両性イオン界面活性剤と接触させることを含む。
【０００６】
本発明の他の態様には、サーマルサイクルプロセスにおいて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの不活性化を抑制するキットが含まれる。このキットには、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび陰イオン界面活性剤または両性イオン界面活性剤が含まれる。
【０００７】
本発明の別の態様および特徴は、本明細書でさらに詳しく説明される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】アガロースゲルで分離したＰＣＲ断片を蛍光染色した写真画像である。一番左のレーンおよび一番右のレーンのそれぞれにはＤＮＡラダーが含まれる。「ポジティブ」とラベルされたレーンのそれぞれには、０．０００５％のＴｗｅｅｎ２０の存在下で増幅した５００ｂｐの断片が含まれる。「ネガティブ」とラベルされたレーンは、安定化界面活性剤の非存在下で行った反応を示す。「４１」とラベルされたレーンは、λカラギーナン、および左から右へ０．０５％、０．０５％、０．００５％、０．０００５％のポリ（エチレングリコール）モノラウレートを含んだ反応液中で行った反応を示す。「５９」とラベルされたレーンは、Ｍａｃｋａｎａｔｅ ＴＭ ＤＯＳ−７０を左から右へ０．０５％、０．０５％、０．００５％、０．０００５％含んだ反応液中で行った反応を示す。「６１」とラベルされたレーンは、Ｒｈｏｄａｆａｃ ＲＭ７１０を左から右へ０．０５％、０．０５％、０．００５％、０．０００５％含んだ反応液中で行った反応を示す。
【図２】アガロースゲルで分離したＰＣＲ断片を蛍光染色した写真画像である。明るいバンドは、種々の濃度の（Ａ）陰イオン界面活性剤であるポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル−３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、（Ｚ）両性イオン界面活性剤であるＣＨＡＰＳ、または（Ｔ）Ｔｗｅｅｎ２０を配合したＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼで増幅した５００ｂｐ断片に相当する。種々の配合物は、種々の濃度のＤＴＴ存在下で、右側に示した種々の期間貯蔵した。
【図３】アガロースゲルで分離したＰＣＲ断片を蛍光染色した写真画像である。「Ｌ」とラベルされたレーンには、画像の左に示すサイズの断片を有するＤＮＡラダーが含まれる。左側の３つのレーンは３５２ｂｐ断片を増幅の標的とした反応を示し、右側の３つのレーンは３６０ｂｐ断片を増幅の標的とした反応を示す。「Ｔ」とラベルされたレーンには、Ｔｗｅｅｎ２０を配合したＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼで増幅した断片が含まれる。「Ａ」とラベルされた各レーンには、陰イオン界面活性剤であるポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩を配合したＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼで増幅した断片が含まれている。「Ｒ」とラベルされたレーンには、Ｔｗｅｅｎ２０を配合した、商業的に入手可能な他のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼで増幅した断片が含まれている。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ＴａｑなどのＤＮＡポリメラーゼは、実質的に耐熱性であるが、サーマルサイクルプロセスで利用される高温において、時間とともに不活性化する。実施例に示すように、サーマルサイクルプロセスにおいて陰イオン界面活性剤または両性イオン界面活性剤のいずれかをポリメラーゼと接触させることによって、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの熱による不活性化を防止できることが分かった。したがって、本発明は、サーマルサイクルプロセスにおいて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの不活性化を抑制する組成物、方法、およびキットを提供する。最も基本的な形態として、本発明の組成物は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、および陰イオン界面活性剤または両性イオン界面活性剤のいずれかを含む。好適な組成物を以下に詳しく説明する。
【００１０】
本発明の組成物は、標的核酸の増幅に用いるサーマルサイクルプロセス（例えばＰＣＲ）において、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを保護するために利用されるであろうことが想定される。標的核酸は一般的にＤＮＡであるが、いくつかの実施形態においては、標的核酸はＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡの混合であってもよいことも想定される。ＲＮＡが鋳型や酵素として、および／または鋳型の逆転写に最適な状態で使用される場合は、当業者に既知のＤＮＡが利用されることになる。好ましくは、標的核酸はＤＮＡである。
【００１１】
標的核酸を増幅する好ましい方法はＰＣＲである。ＰＣＲ増幅とは、つまり、実施される反応ステップの回数に応じて、指数関数的な量の標的核酸が生成される酵素連鎖反応である。一般的に、ＰＣＲ増幅は、約５０℃〜約９５℃の範囲の温度で、約１サイクル〜約５０サイクル行われ、より一般的には、約１０サイクル〜約４０サイクル行われる。ＰＣＲ増幅技術、およびＰＣＲの多くのバリエーションが知られており、十分に裏付けられている。本発明の組成物は、ＰＣＲやＰＣＲのバリエーションにおける耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを保護するために利用し得る。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｓａｉｋｉ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：４８７−４９１（１９８８）、米国特許第４，６８２，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号を参照のこと。
【００１２】
Ｉ．熱安定化配合物
本発明の組成物は、陰イオン界面活性剤および耐熱性ＤＮＡを含む。あるいは、組成物は、両性イオン界面活性剤および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。組成物は、さらに緩衝剤、一価の塩、二価の塩、還元剤、キレート化剤、およびｄＮＴＰの混合物を含んでいてもよい。本発明の組成物を含む反応混合物は、さらにＤＮＡ増幅反応のための反応剤を含んでいてもよい。
【００１３】
ａ．陰イオン界面活性剤
本発明の組成物は、陰イオン界面活性剤を含んでいてもよい。好適な陰イオン界面活性剤には、高温（例えば５０℃〜９５℃）で繰り返し増幅反応が行われる場合に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの不活性化を抑制する化合物が含まれる。特定の陰イオン界面活性化合物がこのように機能するかどうかを決定する方法については、実施例に詳述する。好適な陰イオン界面活性剤は、以下に詳述するもの、または当該技術分野でよく知られているものである。
【００１４】
好適な陰イオン界面活性剤は、アルキルスルファート、アルキルスルホナート、アルキルベンゼンスルホナート、α−スルホニル脂肪酸、アルキルホスファート、ジオクチルスルホスクシナート、イセチオナート、アルキルエーテルスルファート、メチルサルコシンなどからなる群より選択することができる。好適な陰イオン界面活性剤の代表的な例には、ドデシルベンゼンスルホン酸アミン、カプリレス硫酸アンモニウム、クメンスルンホン酸アンモニウム、ジヒドロキシステアリン酸アンモニウム、ドデシルベンゼンスルホン酸アンモニウム、ラウレス硫酸アンモニウム、ラウレス−１２硫酸アンモニウム、ラウレス−３０硫酸アンモニウム、ラウロイルサルコシン酸アンモニウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウリルスルホコハク酸アンモニウム、リグノスルホン酸アンモニウム、ミレス硫酸アンモニウム、ナフタレンスルホン酸アンモニウム、ノノキシノール−２０硫酸アンモニウム、ノノキシノール−３０硫酸アンモニウム、ノノキシノール−４硫酸アンモニウム、ノノキシノール−６硫酸アンモニウム、ノノキシノール−９硫酸アンモニウム、オレイン酸硫酸アンモニウム、パーフルオロオクタン酸アンモニウム、ステアリン酸アンモニウム、キシレンスルホン酸アンモニウム、ブチルナフタレンスルホナート、ブチルホスファート、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム、ステアロイル乳酸カルシウム、テトラプロピレンベンゼンスルホン酸カルシウム、カプリレス−９カルボン酸、セチルホスファート、クメンスルホン酸、セチルリン酸ＤＥＡ、ドデシルベンゼンスルホン酸ＤＥＡ、ラウリル硫酸ＤＥＡ、デセス−４ホスファート、ラウリルスルホコハク酸ジアンモニウム、ステアリルスルホコハク酸ジアンモニウム、ジアミルスルホコハク酸ナトリウム、ジシクロヘキシルスルホコハク酸ナトリウム、ジヘキシルスルホコハク酸ナトリウム、ジイソブチルスルホコハク酸ナトリウム、ジラウレス−７クエン酸塩、ジメチコノール、ジノノキシノール−４ホスファート、ジオクチルスルホコハク酸アンモニウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、セテアリルスクシンアミド酸ジナトリウム、コカミドＭＥＡ−スルホコハク酸ジナトリウム、コカミドＰＥＧ−３スルホコハク酸ジナトリウム、デセス−６スルホコハク酸ジナトリウム、デシルジフェニルエーテルジスルホン酸ジナトリウム、ドデシルオキシプロピルスルホスクシンアミド酸ジナトリウム、イソデシルスルホコハク酸ジナトリウム、ラネス−５スルホコハク酸ジナトリウム、ラウルアミドＤＥＡ−スルホコハク酸ジナトリウム、ラウルアミドＭＥＡ−スルホコハク酸ジナトリウム、ラウレススルホコハク酸ジナトリウム、ラウリルスルホコハク酸ジナトリウム、ミリストアミドＭＥＡ−スルホコハク酸ジナトリウム、オレアミドＭＥＡ−スルホコハク酸ジナトリウム、オレアミドＰＥＧ−２スルホコハク酸ジナトリウム、オレス−３スルホコハク酸ジナトリウム、ＰＥＧ−４コカミドＭＩＰＡスルホコハク酸ジナトリウム、リシノールアミドＭＥＡ−スルホコハク酸ジナトリウム、ステアリルスルホスクシンアミド酸ジナトリウム、ウンデシレンアミドＭＥＡ−スルホコハク酸ジナトリウム、ジトリデシルスルホコハク酸ナトリウム、ドデセニ���コハク酸無水物、ドデシルジフェニルエーテルジスルホン酸、ドデシルジフェニルオキシドジスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸、ジオレイン酸グリセリルＳＥ、ジステアリン酸グリセリルＳＥ、リシノール酸グリセリルＳＥ、ステアリン酸クエン酸塩グリセリル、ステアリン酸グリセリルＳＥ、ステアリン酸グリコールＳＥ、ヘキシルホスファート、イソプロピルホスファート、イソプロピルアミンドデシルベンゼンスルホナート、イソステアレス−２ホスファート、イソトリデセス−３ホスファート、イソトリデセス−６ホスファート、ラウレス−１ホスファート、ラウレス−１２カルボン酸、ラウレス−３ホスファート、ラウレス−４ホスファート、ラウレス−６ホスファート、ラウレス−７−シトラート、ラウレス−９−ホスファート、ラウリルホスファート、ラウリル硫酸リチウム、ラウレス硫酸マグネシウム、ＰＥＧ−３コカミド硫酸マグネシウム、ラウレスリン酸ＭＥＡ、ラウリル硫酸ＭＥＡ、ラウレス硫酸ＭＩＰＡ、ラウリル硫酸ＭＩＰＡ、ミリストイルサルコシン、ナフタレン−ホルムアルデヒドスルホナート、ノノキシノール−１０ホスファート、ノノキシノール−１２ホスファート、ノノキシノール−３ホスファート、ノノキシノール−４ホスファート、ノノキシノール−４スルファート、ノノキシノール−６ホスファート、ノノキシノール−７ホスファート、ノノキシノール−８ホスファート、ノノキシノール−９ホスファート、ノニルノノキシノール−１０ホスファート、ノニルノノキシノール−１５ホスファート、ノニルノノキシノール−７ホスファート、オレス−１０カルボン酸、オレス−１０ホスファート、オレス−３カルボン酸、オレス−４ホスファート、オレス−５ホスファート、オレス−６カルボン酸、オレス−７ホスファート、ＰＥＧ−２ジラウリン酸ＳＥ、ＰＥＧ−２ジオレイン酸ＳＥ、ＰＥＧ−２ジステアリン酸ＳＥ、ＰＥＧ−２ラウリン酸ＳＥ、ＰＥＧ−２オレイン酸ＳＥ、ＰＥＧ−２ステアリン酸ＳＥ、ＰＥＧ−９ステアルアミドカルボン酸、セチルリン酸カリウム、デセス−４リン酸カリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸カリウム、イソステアレス−２リン酸カリウム、ラウロイルサルコシン酸カリウム、ラウリル硫酸カリウム、オレイン酸カリウム、オレイン硫酸カリウム、パーフルオロオクタン酸カリウム、リシノール硫酸カリウム、ＰＰＧ−２ラウリン酸ＳＥ、ＰＰＧ−２オレイン酸ＳＥ、ＰＰＧ−２ステアリン酸ＳＥ、ＰＰＧ−５−セテスー１０ホスファート、ラウリン酸プロピレングリコールＳＥ、オレイン酸プロピレングリコールＳＥ、リシノール酸プロピレングリコールＳＥ、ステアリン酸プロピレングリコールＳＥ、ＰＶＭ／ＭＡ共重合体、２−エチルヘキシルリン酸ナトリウム、２−エチルヘキシル硫酸ナトリウム、オレフィンスルホン酸ナトリウム、アリルオキシヒドロキシプロピルスルホン酸ナトリウム、ベヘノイル乳酸ナトリウム、ブトキシエトキシ酢酸ナトリウム、ブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ブチルオレイン酸硫酸ナトリウム、ブチルオレイン酸スルホン酸ナトリウム、ブチルリン酸ナトリウム、カプロイル乳酸ナトリウム、カプリリルスルホン酸ナトリウム、セチル硫酸ナトリウム、クメンスルホン酸ナトリウム、デセス���酸ナトリウム、デシルジフェニルエーテルスルホン酸ナトリウム、デシル硫酸ナトリウム、ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ジイソオクチルスルホコハク酸ナトリウム、ジイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジラウレス−７クエン酸ナトリウム、ジノニルスルホコハク酸ナトリウム、ドデシルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム、ドデシルジフェニルオキシドジスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、グリセリルトリオレイン硫酸ナトリウム、ヘキサデシルジフェニルジスルホン酸ナトリウム、ヘキサデシルジフェニルオキシドジスルホン酸ナトリウム、ヘキシルジフェニルオキシドジスルホン酸ナトリウム、イセチオン酸ナトリウム、イソデシル硫酸ナトリウム、イソオクチル硫酸ナトリウム、イソステアロイル乳酸ナトリウム、イソトリデセス−１５硫酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、ラウルアミドＤＥＡ−スルホコハク酸ナトリウム、ラウレスリン酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ラウレススルホコハク酸ナトリウム、ラウレス−１０リン酸ナトリウム、ラウレス−１１カルボン酸ナトリウム、ラウレス−１２硫酸ナトリウム、ラウレス−１３酢酸ナトリウム、ラウレス−１３カルボン酸ナトリウム、ラウレス−３カルボン酸ナトリウム、ラウレス−４カルボン酸ナトリウム、ラウレス−４リン酸ナトリウム、ラウレス−６カルボン酸ナトリウム、ラウレス−７カルボン酸ナトリウム、ラウレス−７硫酸ナトリウム、ラウレス−８硫酸ナトリウム、ラウロイルグルタミン酸ナトリウム、ラウロイル乳酸ナトリウム、ラウロイル乳酸ナトリウム、ラウロイルメチルアミノプロピオン酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ラウリルリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルスルホ酢酸ナトリウム、リグニン酸ナトリウム、リグノスルホン酸ナトリウム、メタリルスルホン酸ナトリウム、メチルラウロイルタウリンナトリウム、メチルミリストイルタウリンナトリウム、メチルオレオイルタウリンナトリウム、メチルパルミトイルタウリンナトリウム、メチルステアロイルタウリンナトリウム、メチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ｍ−ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、ミレス硫酸ナトリウム、ミリストイルグルタミン酸ナトリウム、ミリストイルサルコシン酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、ノノキシノール硫酸ナトリウム、ノノキシノール−１０硫酸ナトリウム、ノノキシノール−１０スルホコハク酸ナトリウム、ノノキシノール−１５硫酸ナトリウム、ノノキシノール−４硫酸ナトリウム、ノノキシノール−５硫酸ナトリウム、ノノキシノール−６リン酸ナトリウム、ノノキシノール−６硫酸ナトリウム、ノノキシノール−８硫酸ナトリウム、ノノキシノール−９リン酸ナトリウム、ノノキシノール−９硫酸ナトリウム、オクトキシノル−２エタンスルホン酸ナトリウム、オクトキシノル−３硫酸ナトリウム、オクチル硫酸ナトリウム、オクチルフェノキシエトキシエチルスルホン酸ナトリウム、オレイン硫酸ナトリウム、オレス−７リン酸ナトリウム、オレイルリン酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム、オレイルスルホスクシンアミド酸ナトリウム、パルト���トイルサルコシン酸ナトリウム、フェニルスルホン酸ナトリウム、プロピルオレイン硫酸ナトリウム、ステアロイル乳酸ナトリウム、ステアリルスルホスクシンアミド酸ナトリウム、トリデセス硫酸ナトリウム、トリデセス−３カルボン酸ナトリウム、トリデセス−６カルボン酸ナトリウム、トリデセス−７カルボン酸ナトリウム、トリデシル硫酸ナトリウム、トリデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、キシレンスルホン酸ナトリウム、ステアロイルサルコシン、ＴＥＡ−ラウロイルグルタマート、ＴＥＡ−ラウリルスルファート、ジカルボキシエチルステアリルスルホスクシンアミド酸テトラナトリウム、ＴＩＰＡ−ラウレススルファート、トリセテアレス−４ホスファート、トリセテス−５ホスファート、トリデセス−２ホスファート、トリデセス−３ホスファート、トリデセス−５ホスファート、トリデシルホスファート、トリラウレス−４ホスファートおよびトリオクチルホスファートが含まれる。
【００１５】
さらに別の形態として、陰イオン界面活性剤は、グリコール酸エトキシラートオクチルエーテル、グリコール酸エトキシラートオレイルエーテル、グリコール酸エトキシラートラウリルエーテル、ポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、グリコール酸エトキシラート４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルエーテル、グリコール酸エトキシラートオレイルエーテル、ポリ（エチレングリコール）ｎ−アルキル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、グリコール酸エトキシラート４−ノニルフェニルエーテル、ポリ（エチレングリコール）ｎ−アルキル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、コール酸ナトリウム水和物、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物、タウロコール酸ナトリウム、グリコール酸エトキシラートオクチルエーテル、グリコール酸エトキシラートオレイルエーテル、グリコール酸エトキシラートラウリルエーテル、ポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、グリコール酸エトキシラート４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルエーテル、グリコール酸エトキシラートオレイルエーテル、ポリ（エチレングリコール）ｎ−アルキル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、グリコール酸エトキシラート４−ノニルフェニルエーテルおよびポリ（エチレングリコール）ｎ−アルキル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩からなる群より選択することができる。
【００１６】
例示的な実施形態では、陰イオン界面活性剤は、ポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、ポリ（エチレングリコール）モノラウレート、λカラギーナン、ポリオキシエチレン（１５０）ジノニルフェニルエーテルポリオキシエチレン（Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＤＭ−９７０）およびノニルノノキシノール−１５ホスファート（Ｒｈｏｄａｆａｃ ＲＭ７１０）からなる群より選択される。
【００１７】
ｂ．両性イオン界面活性剤
また、本発明の組成物は、両性イオン界面活性剤を含んでいてもよい。好適な両性イオン界面活性剤には、高温（例えば５０℃〜９５℃）で繰り返し増幅反応が行われる場合に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの不活性化を抑制する化合物が含まれる。特定の両性イオン界面活性剤化合物がこのように機能するかどうかを決定する方法については、実施例に詳述する。好適な両性イオン界面活性剤は、以下に詳述するもの、または当該技術分野でよく知られているものである。
【００１８】
ある形態では、両性イオン界面活性剤は式（Ｉａ）を含む化合物であってもよい。
【化１】
2010512797.tif 000002
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は独立に、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルである。
【００１９】
一般的に、式（Ｉａ）の化合物におけるＲ1、Ｒ2およびＲ3のそれぞれは、約１〜１０原子程度の鎖から成っているが、好ましくは約１〜７原子の鎖であり、より好ましくは１〜５原子程度の鎖であり、さらに好ましくは１〜３原子程度の鎖からなる。式（Ｉａ）の化合物についての実施形態の大部分においては、Ｒ4は約５〜３０原子程度の鎖から成っているが、好ましくは約８〜約２５原子の鎖であり、より好ましくは約１０〜約２０原子の鎖である。式（Ｉａ）の化合物の例は、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3のそれぞれが約１〜５原子の鎖であり、Ｒ4が約８〜２０原子の鎖のものであるだろう。式（Ｉａ）の化合物の他の例は、Ｒ1およびＲ2のそれぞれがメチル基であり、Ｒ3が約１〜３原子の鎖であり、Ｒ4が約１０〜１６原子鎖のものであるだろう。
【００２０】
さらなる実施形態には、式（Ｉｂ）の化合物を含む両性イオン界面活性剤が含まれる。
【化２】
2010512797.tif 000003
式中、
ｍは０〜１０の整数であり、
ｎは１〜１０の整数であり、
Ｒ4はヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルである。
【００２１】
通常、式（Ｉｂ）の化合物についての実施形態の大部分において、ｍは０〜５の整数であり、ｎは１〜８の整数であり、Ｒ4は約８〜２５原子の鎖長を有する。他の例示的な実施形態においては、ｍは０〜３の整数であり、ｎは１〜５の整数であり、Ｒ4は約１０〜２０原子の鎖長を有する。さらに他の例示的な実施形態においては、ｍは０であり、ｎは３であり、Ｒ4は約１０〜１６原子の鎖長を有する。
【００２２】
さらに他の実施形態には、化合物（Ｉｃ）を含む両性イオン界面活性剤が含まれる。
【化３】
2010512797.tif 000004
式中、
ｎは１〜１０の整数であり、
Ｒ4はヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルである。
【００２３】
一般的に、式（Ｉｃ）の化合物において、ｎは１〜８の整数であり、Ｒ4は約８〜２５原子の鎖長を有する。他の例示的な実施形態においては、ｎは１〜５の整数であり、Ｒ4は約１０〜２０原子の鎖長を有する。さらに他の例示的な実施形態においては、ｎは３であり、Ｒ4は約１０〜１６原子の鎖長を有する。
【００２４】
さらに他の実施形態においては、両性イオン界面活性剤は式（Ｉｄ）の化合物であってもよい。
【化４】
2010512797.tif 000005
式中、
ｉは８〜２５の整数であり、
ｎは１〜１０の整数である。
【００２５】
通常、式（Ｉｄ）の化合物についての実施形態の大部分においては、ｉは１０〜２０の整数であり、ｎは１〜５の整数である。例示的な実施形態においては、ｉは１０〜１６の整数であり、ｎは３である。
【００２６】
式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）または（Ｉｄ）の両性イオン界面活性剤化合物の代表的な例には、
３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラデシルアンモニオ）プロパンスルホナート（ＳＢ３−１４）、
３−（４−ヘプチル）フェニル−３−ヒドロキシプロピル）ジメチルアンモニオプロパンスルホナート（Ｃ７ＢｚＯ）、
ＣＨＡＰＳ（３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホナート）、
ＣＨＡＰＳＯ（３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート）、
３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩（ＳＢ３−１０）、
３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩（ＳＢ３−１２）、
３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホナート（ＳＢ３−１８）、
３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホナート分子内塩（ＳＢ３−８）、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホナート（ＳＢ３−１６）、および
３−[Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ]プロパンスルホナート（ＡＳＢ−１４）が含まれる。
【００２７】
式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）または（Ｉｄ）の化合物のうち、特に好ましい実施形態には、両性イオン界面活性剤ＣＨＡＰＳまたはＣＨＡＰＳＯである。ＣＨＡＰＳは下記化学構造を有する。
【化５】
2010512797.tif 000006
式中、ｎは１８〜２２の整数である。例示的実施形態においては、ｎは２０である。
【００２８】
ＣＨＡＰＳＯは下記化学構造を有する。
【化６】
2010512797.tif 000007
【００２９】
他の好適な両性イオン界面活性剤には、実施形態にもよるが、アセチル化レシチン、アプリコトアミドプロピルベタイン、ババスアミドプロピルベタイン、ベヘニルベタイン、ビス２−ヒドロキシエチルタロウグリシナート、Ｃ１２−１４アルキルジメチルベタイン、カノルアミドプロピルベタイン、カプリン酸／カプリル酸アミドプロピルベタイン、カプリロアミドプロピルベタイン、セチルベタイン、コカミドプロピルベタイン、コカミドプロピルジメチルアミノヒドロキシプロピル加水分解コラーゲン、Ｎ−[（３−コカミド）−プロピル]−Ｎ，Ｎ−ジメチルベタイン、カリウム塩、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、コカミドプロピルスルホベタイン、コカミノ酪酸、コカミノプロピオン酸、ココアンホジプロピオン酸、ココ−ベタイン、ココジメチルアンモニウム−３−スルホプロピルベタイン、ココイミノジグリシナート、ココイミノジプロピオナート、ココ／オレアミドプロピルベタイン、ココイルサルコシンアミドＤＥＡ、ＤＥＡ−ココアンホジプロピオナート、ジヒドロキシエチルタロウグリシナート、ジメチコンプロピルＰＧ−ベタイン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ラウリン酸−アミドプロピル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アンモニウムベタイン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ミリスチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アンモニウムベタイン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−パルミチル−Ｎ−（３スルホプロピル）−アンモニウムベタイン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ステアルアミドプロピル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アンモニウムベタイン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ステアリル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アンモニウムベタイン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−タロウ−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アンモニウムベタイン、カプロアンホジ酢酸ジナトリウム、カプロアンホジプロピオン酸ジナトリウム、カプリロアンホジ酢酸ジナトリウム、カプリロアンホジプロピオン酸ジナトリウム、ココアンホジ酢酸ジナトリウム、ココアンホジプロピオン酸ジナトリウム、イソステアロアンホジプロピオン酸ジナトリウム、ラウレス−５カルボキシアンホジ酢酸ジナトリウム、ラウリミノジプロピオン酸ジナトリウム、ラウロアンホジ酢酸ジナトリウム、ラウロアンホジプロピオン酸ジナトリウム、オクチルｂ−イミノジプロピオン酸ジナトリウム、オレオアンホジ酢酸ジナトリウム、オレオアンホジプロピオン酸ジナトリウム、ＰＰＧ−２−イソデセス−７カルボキシアンホジ酢酸ジナトリウム、ソイアンホジ酢酸ジナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓｏｙａｍｐｈｏｄｉａｃｅｔａｔｅ）、ステアロアンホジ酢酸ジナトリウム、トールアンホジプロピオン酸ジナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｔａｌｌａｍｐｈｏｄｉｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、タロウアンホジ酢酸ジナトリウム、タロウイミノジプロピオン酸ジナトリウム、コムギ胚芽アンホジ酢酸ジナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｗｈｅａｔｇｅｒｍａｍｐｈｏｄｉａｃｅｔａｔｅ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ−メチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アンモニウムベタイン、エルクアミドプロピルヒドロキシスルタイン、エチルヘキシルジプロピオナート、エチルヒドロキシメチルオレイルオキサゾリン、エチルＰＥＧ−１５コカミンスルファート、水素添���レシチン、加水分解タンパク質、イソステアルアミドプロピルベタイン、ラウルアミドプロピルベタイン、ラウルアミドプロピルジメチルベタイン、ラウルアミノプロピオン酸、ラウロアンホジプロピオン酸、ラウロイルリシン、ラウリルベタイン、ラウリルヒドロキシスルタイン、ラウリルスルタイン、リノレアミドプロピルベタイン、リゾレシチン、乳脂質アミドプロピルベタイン、ミリストアミドプロピルベタイン、オクチルジプロピオナート、オクチルイミノジプロピオナート、オレアミドプロピルベタイン、オレイルベタイン、４，４（５Ｈ）−オキサゾールジメタノール、２−（ヘプタデセニル）−、パルミトアミドプロピルベタイン、パルミトアミンオキシド、リシノールアミドプロピルベタイン、リシノールアミドプロピルベタイン／ＩＰＤＩ共重合体、セサミドプロピルベタイン、Ｃ１２−１５アルコキシプロピルイミノジプロピオン酸ナトリウム、カプロアンホ酢酸ナトリウム、カプリロアンホ酢酸ナトリウム、カプリロアンホヒドロキシプロピルスルホン酸ナトリウム、カプリロアンホプロピオン酸ナトリウム、カルボキシメチルタロウポリプロピルアミンナトリウム、コカミノプロピオン酸ナトリウム、ココアンホ酢酸ナトリウム、ココアンホヒドロキシプロピルスルホン酸ナトリウム、ココアンホプロピオン酸ナトリウム、ジカルボキシエチルココホスホエチルイミダゾリンナトリウム、水素添加タロウジメチルグリシン酸ナトリウム、イソステアロアンホプロピオン酸ナトリウム、ラウリミノジプロピオン酸ナトリウム、ラウロアンホ酢酸ナトリウム、オレオアンホヒドロキシプロピルスルホン酸ナトリウム、オレオアンホプロピオン酸ナトリウム、ステアロアンホ酢酸ナトリウム、トールアンホプロピオン酸ナトリウム、ソイアミドプロピルベタイン、ステアリルベタイン、タロウアミドプロピルヒドロキシスルタイン、タロウアンホポリカルボキシプロピオン酸、ラウロアンホＰＧ−酢酸リン酸クロリドトリナトリウム（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｏａｍｐｈｏ ＰＧ−ａｃｅｔａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ウンデシレンアミドプロピルベタインおよびコムギ胚芽アミドプロピルベタインが含まれる。
【００３０】
ｃ．耐熱性酵素
本発明の安定化組成物は、高温、特に、サーマルサイクルプロセス（例えばＰＣＲ）において、核酸が関与する反応を触媒する種々の酵素を含んでいてもよい。核酸を修飾、切断または合成する酵素は、本発明の組成物中で安定化されていてもよい。酵素の例には、リガーゼ、ホスホジエステラーゼ、ＤＮａｓｅ、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ、脱リン酸酵素、リン酸化酵素、末端転移酵素、逆転写酵素、制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。例示的実施形態においては、酵素は標的ポリヌクレオチド配列の増幅を触媒する耐熱性ポリメラーゼである。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが特に好ましい。
【００３１】
通常、好適な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは高温で実質的に安定であり、サーマルサイクルプロセスにおいて標的ポリヌクレオチドの増幅反応を効果的に触媒する。これに関連して、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、二本鎖核酸の効果的な変性に必要な時間、高温におかれた場合、不活性化に対して実質的に耐性を有する。本明細書における不活性化とは、酵素活性の持続的かつ完全な消失を指す。核酸の変性に必要な温度は、様々な要因（例えば、緩衝塩の濃度、変性される核酸の長さおよび変性される核酸のヌクレオチド組成）に依存するであろうことが想定されるが、温度は一般的に、約９０℃〜約１０５℃の範囲である。好適な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、それ自体は、一般的に、約９０℃から約１００℃を超える温度では不活性化されない。さらに、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはまた、一般的に、それが機能するために約４０℃より高い至適温度を有するが、その温度以下では、プライマーの鋳型ＤＮＡへのハイブリダイゼーションが促進される。例示的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、それ自体は、一般的にはＰＣＲのようなサーマルサイクル反応に利用される温度範囲全体を通して機能する。例えば、好適な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、通常約４０℃〜１１０℃の範囲の至適温度を有し、より一般的には約５０℃〜約９５℃の範囲の至適温度を有する。
【００３２】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは任意の原料から取得してもよく、未変性タンパク質または組み換えタンパク質であってもよい。代表的な耐熱性ポリメラーゼには、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、サーマス・ルバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・ラクテウス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ）、サーマス・ルーベンス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ）およびメタノサーマス・フェルビズス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）などの好熱性細菌から単離したＤＮＡポリメラーゼがある。好熱性古細菌から単離される耐熱性ポリメラーゼには、例えば、スルフォロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、スルフォロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、およびデスルフロコッカス・モビリス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）が含まれる。例示的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・アクアティカス（Ｔａｑ）から単離される。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（メリーランド州ロックヴィル）由来のもの、ならびに「Ｔ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９６９）９８：２８９−２９７」、および「Ｔ．Ｏｓｈｉｍａ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９７８）：１８９−１９６」に記載されているものを含む、多様なＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ株が当業者に既知である。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはまた様々な供給源から市販されている。
【００３３】
当業者に理解されるように、例えばＴａｑとＰｆｕの組み合わせのような、２種またはそれ以上の上記耐熱性ポリメラーゼの組み合わせもまた本発明の方法に用いることができる。
【００３４】
ｄ．界面活性剤と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせ
本発明の組成物には、上記ａ．に記載の陰イオン界面活性剤または当業者に既知である他の陰イオン界面活性剤と、上記ｃ．に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼまたは当業者に既知である任意の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとの任意の組み合わせが含まれる。あるいは、本発明の組成物には、上記ｂ．に記載の両性イオン界面活性剤または当業者に既知である両性イオン界面活性剤と、上記ｃ．に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼまたは当業者に既知である任意の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとの任意の組み合わせが含まれる。陰イオン界面活性剤または両性イオン界面活性剤と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせの例を、表Ａに示した。
【表１】
2010512797.tif 000008
【００３５】
所与のＤＮＡ増幅反応の触媒に用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの濃度は、反応パラメーターに応じて変化することがある。一般的に、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ配合物は、約０．１ユニット／μＬ〜約５ユニット／μＬで提供される。増幅反応混合液中でのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの濃度は、約０．０１ユニット／μＬ〜約０．１ユニット／μＬの範囲であってもよい。
【００３６】
本発明の組成物中に存在する陰イオン界面活性剤または両性イオン界面活性剤の量は変化することがある。通常、使用量は一般的に、希望する結果（例えばＤＮＡポリメラーゼの不活性化を抑制すること）を得るのに効果的な量である。界面活性剤は例えば、約０．０００５重量％〜約２重量％の濃度で組成物中に存在し、好ましくは約０．００１重量％〜約１重量％、より好ましくは約０．００５重量％〜約０．１重量％の濃度で存在する。
【００３７】
ｅ．追加試薬
界面活性剤（陰イオン界面活性剤または両性イオン界面活性剤）および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに加え、本発明の組成物は、さらに緩衝剤、一価の塩、二価の塩、還元剤、キレート化剤、およびｄＮＴＰの混合物を含んでいてもよい。本発明の組成物を含む反応混合液は、さらにＤＮＡ増幅反応のための反応剤を含んでいてもよい。
【００３８】
好適な緩衝剤には、サーマルサイクルプロセスで利用される当業者に既知の緩衝剤が含まれる。実施形態に応じて、緩衝剤は保存バッファーであっても、反応バッファーであってもよい。実施形態にかかわらず、一般的に緩衝剤は、組成物のｐＨを約４．０〜約９．５に維持するものであり、より一般的には約６．０〜約９．０に維持し、さらにより一般的には約７．０〜約８．０に維持する。代表的な緩衝剤の例には、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＴＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳまたはＴｒｉｓバッファーが含まれる。保存バッファーは、さらにグリセロール、ポリエチレングリコールおよび／またはＢＳＡなどの保存溶液を含んでいてもよい。
【００３９】
組成物はまた、塩を含んでいてもよい。ある実施形態においては、塩は一価の塩であってもよい。一価の塩には、塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは塩化リチウムが含まれる。あるいは、塩は二価の塩であってもよい。好適な二価の塩の代表的な例には、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムが含まれる。
【００４０】
組成物は、さらに還元剤を含んでいてもよい。好適な還元剤には、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール、ホウ化水素ナトリウム、シュウ酸または水素化アルミニウムリチウムが含まれる。還元剤の濃度は、一般的に酵素組成物に添加される量よりも高くてもよい。他の実施形態では、組成物はキレート化剤を含んでいてもよい。好適なキレート化剤の例には、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡが含まれる。
【００４１】
他の実施形態においてが、組成物はさらにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰから選択されるｄＮＴＰの混合物を含んでいてもよい。
【００４２】
組成物を含む反応混合液はまた、ＤＮＡ増幅反応のための反応剤を含んでいてもよい。一般的なＤＮＡ増幅反応物のための反応剤には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに加えて、標的ポリヌクレオチド、ｄＮＴＰの混合物および一対のオリゴヌクレオチドプライマーが含まれるだろう。反応混合液は、酵素活性を最適にするための追加の緩衝剤、一価の塩および二価の塩を含んでいてもよい。任意に、混合液はまたＰＣＲ効果を増加させる試薬を含んでいてもよい。そのような試薬の好適な例には、ジメチルスルホキシド、ホルムアミドおよびベタインが含まれる。
【００４３】
ＩＩ．キット
本発明はまた、サーマルサイクルプロセスにおける耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの不活性化、特に熱による不活性化を抑制するキットを意図している。そのようなキットには例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、および陰イオン界面活性剤または両性イオン界面活性剤が含まれていてもよい。キットはさらに還元剤、緩衝剤、ｄＮＴＰの混合物、および核酸を増幅するためのサーマルサイクル反応に必要な本発明の組成物およびその他の成分の使用方法の説明書を含んでいてもよい。キットはコントロール試験キットの形であってもよい。すなわち、使用者の要望に適したパッケージ化されたコレクションまたは組み合わせ、および関連する任意の分析機器の形であってもよい。もちろんキットにはまた、適切な包装、容器、ラベル、緩衝液、および核酸を増幅するためのサーマルサイクル反応のコントロールが含まれる。
【００４４】
定義
本発明の理解を容易にするため、以下にいくつかの用語を定義する。
【００４５】
別途記載のない限り、本明細書に記載のアルキル基は、好ましくは主鎖に１個〜８個の炭素原子を含む低級アルキル基であり、炭素数の上限は２０である。アルキル基は直鎖であっても、分枝鎖であっても、環状であってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基およびヘキシル基などが含まれる。
【００４６】
別途記載のない限り、本明細書に記載のアルケニル基は、好ましくは主鎖に２個〜８個の炭素原子炭素原子を含んだ低級アルケニル基であり、炭素数の上限は２０である。アルケニルは直鎖であっても、分枝鎖であっても、環状であってもよく、エテニル基、プロペニル基、イソプロペニル基、ブテニル基、イソブテニル基、ヘキセニル基などが含まれる。
【００４７】
別途記載のない限り、本明細書に記載のアルキニル基は、好ましくは主鎖に２個〜８個の炭素原子を含んだ低級アルキニル基であり、炭素数の上限は２０である。アルキニル基は直鎖であっても分枝鎖であってもよく、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、イソブチニル基、ヘキシニル基などが含まれる。
【００４８】
本明細書で、単独または他の基の一部として使用される用語「アリール」または「アリ（ａｒ）」は、任意に置換されていてもよい同素環式芳香族を意味し、好ましくはフェニル、ビフェニル、ナフチル、置換フェニル、置換ビフェニルまたは置換ナフチルなどの環部分に６〜１２個の炭素を含む単環式の基または二環式の基である。より好ましいアリールは、フェニルおよび置換フェニルである。
【００４９】
核酸の「増幅」とは、酵素に触媒される方法により、核酸の塩基配列の、１つから多数の追加コピーを複製することを指す。好ましくは、増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して行われる。当該技術分野では様々な増幅方法が既知であり、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲプロトコール「Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｅｄ．ｌｎｎｉｓ他、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９０」に記載されている。ＰＣＲおよび他のプライマー伸長法において、プライマーとは、ポリメラーゼ連鎖反応などで鋳型核酸にアニーリングしてポリメラーゼの開始点を与えるような特定の配列を有する短いオリゴヌクレオチドを指す。
【００５０】
「相補的」とは、塩基対合（５’−ＡＧＴ−３’は相補的配列３’−ＴＣＡ−５’と対合する）による核酸配列の自然な結合を指す。２本の１本鎖分子間での相補性は、一部の核酸ペアだけが相補的である場合は部分的である場合があり、すべての塩基対が相補的であれば完全である場合がある。
【００５１】
用語「ｄＮＴＰ」とは、デオキシヌクレオシド三リン酸を指す。プリン塩基（Ｐｕ）には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、ならびにこれらの誘導体および類似物質が含まれる。ピリミジン塩基（Ｐｙ）には、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）ならびにこれらの誘導体および類似物質が含まれる。これらの誘導体および類似物質の例には、例示を目的とするものであって限定を目的とするものではないが、レポーター基、ビオチン化、アミン修飾、放射標識化、アルキル化などにより修飾されたもの、およびホスホロチオネート、亜リン酸エステル、環状原子で修飾した誘導体なども含まれる。レポーター基は、フルオレセイン、ルミノールなどの化学発光基、遅延蛍光により探知可能なＮ−（ヒドロキシエチル）エチレンジアミントリ酢酸のようなテルビウム配位子などの蛍光基であってもよい。
【００５２】
本明細書で、単独または他の基の一部として使用される用語「複素環」または「複素環式の」という用語は、任意に置換されていてもよい、完全に飽和した、または不飽和の、単環式または二環式の、少なくとも１つの環中に少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族基または非芳香族基を意味し、好ましくはそれぞれの環中に５個または６個の炭素原子を有する。
【００５３】
複素環基は、環中に１個または２個の酸素原子、１個または２個の硫黄原子および／または１個〜４個の窒素原子を有することが好ましく、炭素またはヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合していてもよい。複素環基の例には、フリル基、チエニル基、ピリジル基、オキサゾリル基、ピロリル基、インドリル基、キノリニル基またはイソキノリニル基などが含まれる。置換基の例には、１つまたは複数の以下の群：ヒドロカルビル基、置換ヒドロカルビル基、ケト基、水酸基、保護水酸基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、アルケノキシ基、アルキノキシ基、アリールオキシ基、ハロゲン基、アミド基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、チオール基、ケタール基、アセタール基、エステル基およびエーテル基が含まれる。
【００５４】
本明細書で、単独または他の基の一部として使用される用語「芳香族複素環」とは、少なくとも１つの環中に少なくとも１つのヘテロ原子を有する任意に置換されていてもよい芳香族基を意味し、好ましくは、それぞれの環は５個または６個の原子を有する。芳香族複素環は、好ましくは環中に１個または２個の酸素原子、１個または２個の硫黄原子および／または１個〜４個の窒素原子を有し、炭素やヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合していてもよい。芳香族複素環の例には、フリル基、チエニル基、ピリジル基、オキサゾリル基、ピロリル基、インドリル基、キノリニル基またはイソキノリニル基などが含まれる。置換基の例には、１つまたは複数の以下の基：ヒドロカルビル基、置換ヒドロカルビル基、ケト基、水酸基、保護水酸基、アシル基、アシロキシ基、アルコキシ基、アルケノキシ基、アルキノキシ基、アリールオキシ基、ハロゲン基、アミド基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、チオール基、ケタール基、アセタール基、エステル基およびエーテル基などが含まれる。
【００５５】
本明細書で使用される用語「炭化水素」および「ヒドロカルビル」は、炭素および水素のみから成る有機化合物または遊離基をいう。これらの部分には、アルキル、アルケニル、アルキニルおよびアリール部分が含まれる。これらの部分にはまた、他の脂肪族炭化水素基またはアルカリール、アルケンアリールおよびアルキンアリールなどの環状炭化水素基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニルおよびアリール部分も含まれる。別途記載のない限り、これらの部分は、好ましくは１個〜２０個の炭素原子を含む。
【００５６】
「ポリメラーゼ」は、鋳型ＤＮＡに沿って鋳型に相補的にオリゴヌクレオチドを伸長する触媒であり、通常はタンパク質酵素である。「ポリメラーゼ」は、その分子が適切な鋳型核酸分子にハブリダイズした場合に、ヌクレオシド三リン酸を取り込んで核酸分子の３’水酸基を伸長することができる酵素である。ポリメラーゼ酵素については、参照により本明細書に組み込まれている「Ｗａｔｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、３ｒｄ Ｅｄ．、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ、Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．（１９７７）」、および他の同様なテキストに論じられている。
【００５７】
本明細書に記載の「置換ヒドロカルビル」部分とは、炭素以外の少なくとも１つの原子で置換されたヒドロカルビル部分のことであり、炭素鎖原子が窒素、酸素、ケイ素、リン、ホウ素、硫黄またはハロゲン原子などのヘテロ原子で置換された部分を含む。これらの置換基には、ハロゲン基、炭素環基、アリール基、複素環基、アルコキシ基、アルケンオキシ基、アルキンオキシ基、アリールオキシ基、水酸基、保護水酸基、ケト基、アシル基、アシルオキ基シ、ニトロ基、アミノ基、アミド基、ニトロ基、シアノ基、チオー基、ケタール基、アセタール基、エステルおよびエーテルが含まれる。
【００５８】
以下の実施例には、本発明の好ましい実施形態を説明したものが含まれる。以下の実施例に開示された技術が、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らにより見出された技術であることを当業者なら理解するであろう。しかしながら、当業者は、本発明の開示に照らして、開示されている特定の実施形態において、本発明の精神および範囲から逸脱することなく多くの変更を加えることができ、それによっても同様または類似した結果を得ることができることを理解するであろう。したがって、添付の図面に記載または示される全ての事項は例示を目的とするものであり、限定的な意味ではないと解釈される。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例は発明の様々な反復を説明する。
【００６０】
実施例１．界面活性剤のスクリーニング
ＰＣＲアッセイにより、界面活性剤の４７の潜在的候補について、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを安定化する能力についてスクリーニングした。試験した各界面活性剤の最終濃度は５％、０．５％、０．０５％、０．００５％、０．０００５％であった。フォワードプライマー（５'−ＴＧＧＡＴＡＣＣＣＧＴＣＧＴＧＧＣＴＣＴＡＡＴＴ−３'；配列番号1）、およびリバースプライマー（５’−ＣＴＴＣＴＴＴＣＧＴＣＣＣＣＧＴＣＡＧＧＣＴＧＡ−３’；配列番号２）は、λＤＮＡの５００ｂｐ断片を増幅するよう設計された。１０μＬの反応液のそれぞれには以下が含まれる。
１０×ＰＣＲバッファー  １μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ  ０．２μＬ
１０μＭ フォワードプライマー  １μＬ
１０μＭ リバースプライマー  １μＬ
約５ｎｇ／μＬ λＤＮＡ  １μＬ
１０×界面活性剤（５０％、５％、０．５％、０．０５％、０．００５％）  １μＬ
ｄＨ2Ｏ  ４．７μＬ
５Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ  ０．１μＬ
【００６１】
サイクルのパラメーターは、９４℃で１５分；９４℃で３０秒および７０℃で３０秒を３０サイクル；４℃での保持である。試験した一連の界面活性剤のそれぞれには、０．０００５％のＴｗｅｅｎ２０を含むポジティブコントロール反応、および界面活性剤を含まないネガティブコントロール反応が含まれていた。各反応液のアリコートを、アガロースゲル電気泳動により分離した。代表的なゲルを図１に示す。増幅産物は、ポジティブコントロールの反応液、および界面活性剤ノニルノノキシノール−１５ホスファート（Ｒｈｏｄａｆａｃ ＲＭ７１０）を低濃度添加した反応液に認められた。
【００６２】
これらのスクリーニング反応により、次の７つの界面活性剤、３−[（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸水和物（ＣＨＡＰＳ）、３−（[３−コールアミドプロピル]ジメチルアンモニオ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、ポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、ポリ（エチレングリコール）モノラウレート、λカラギーナン、ポリオキシエチレン（１５０）ジノニルフェニルエーテルポリオキシエチレン（Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＤＭ−９７０）およびノニルノノキシノール−１５ホスファート（ＲｈｏｄａｆａｃＲＭ７１０）が、ＰＣＲをサポートするということが明らかになった。
【００６３】
実施例２．ＤＴＴによるＴａｑ配合物の安定化
Ｔｗｅｅｎ２０、陰イオン界面活性剤または両性イオン界面活性剤のいずれかを配合したＴａｑの長期安定性を、２種のＤＴＴ濃度において比較した。Ｔａｑを、０．０１％もしくは０．１％のＴｗｅｅｎ２０、０．１％もしくは１％のポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、または１％のＣＨＡＰＳと配合した。各配合物を、０．０２ｍＭのＤＴＴまたは０．２ｍＭのＤＴＴ存在下で、２５℃で６日〜４０日の期間貯蔵した。−２０℃での保存に相当する計算上の期間は、約１．５年〜約１０年の範囲であった（図２参照）。様々な配合物がＰＣＲをサポートする能力について、実施例１の記載と同様にＰＣＲアッセイにより評価した。実施例１と同様のプライマーおよび反応条件を用いた。
【００６４】
各反応液のアリコートをアガロースゲル電気泳動により分離した。代表的なゲル画像を図２に示す。いずれのＤＴＴ濃度においても、Ｔｗｅｅｎ２０を含む配合物は、基本的には貯蔵時間に影響されなかった。両性イオン界面活性剤（Ｚ）を含む配合物は、高濃度のＤＴＴ存在下においても実質的にＰＣＲをサポートすることができた。より高濃度のＤＴＴの存在下では、全ての陰イオン界面活性剤（Ａ）を含む配合物は、試験した全ての期間においてＰＣＲをサポートすることができた。これらのデータは、ＤＴＴの追加により、陰イオン界面活性剤または両性イオン界面活性剤を含む配合物がさらに安定化されることを示唆している。
【００６５】
実施例３．Ｔｗｅｅｎ２０、または陰イオン界面活性剤を配合した調整物による増幅効率
Ｔｗｅｅｎ２０または陰イオン界面活性剤であるポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩の存在下におけるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる増幅効率を、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、ＭｓｅＩ消化ヒトゲノムＤＮＡまたは完全ヒトゲノムＤＮＡにおける４つの異なる断片を増幅して比較した。１４−３−３、ＣＤ１４Ｆ、ＨＯＸＡ２、およびＰＧＫ１の増幅に使用されたプライマーを表１に示す。各反応液は、Ｔｗｅｅｎ２０またはポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、１×ＲＯＸ（リファレンス色素）、０．８×ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ、および０．４μＭプライマーを配合した１×Ｊｕｍpｓｔａｒｔ Ｔａｑ Ｒｅａｄｙ ｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含んでいた。鋳型は、反応液が２５ｎｇ、２．５ｎｇ、０．２５ｎｇの完全ＤＮＡ、または４００ｎｇ、４０ｎｇ、４ｎｇの消化ＤＮＡを含むように段階希釈した。サイクルプロフィールは、９５℃で３分；９５℃で３０秒、５５℃で６０秒、および７２℃１２０秒を３５サイクルであった。
【表２】
2010512797.tif 000009
【００６６】
表２は種々の鋳型を用いた各増幅産物のＣｔ値（蛍光が特定の閾値を越えるサイクル）を示している。（プライマーの対ごとの）「鋳型を含まない」コントロール反応液は増幅産物を生成しなかった。一般的に、Ｔｗｅｅｎ２０を含む増幅反応混合物と比べて、陰イオン界面活性剤（ポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩）の添加により、より高希釈で、より低いＣｔ値となる。
【表３】
2010512797.tif 000010
【００６７】
増幅の効率は、段階希釈した鋳型の増幅プロットの勾配（希釈効率）に基づいており、効率の割合も表２に示す。各アンプリコンにおいて、陰イオン界面活性物質配合物は、相当するＴｗｅｅｎ２０配合物よりも効率が高かった。両方の界面活性剤配合物に対して効率が計算できた３種のアンプリコンのうち、陰イオン界面活性物質サンプルの効率は、消化ＤＮＡおよび完全ＤＮＡに対して、それぞれ平均６７．３％および平均８４．７％であった。一方、Ｔｗｅｅｎ２０サンプルの効率は、消化ＤＮＡおよび完全ＤＮＡに対して、それぞれ平均４３．７％および平均３１％であった。
【００６８】
効率への希釈効果という性質を調査する目的で個々の反応効率を計算した。反応効率は、Ｃｔ直後のサイクルの蛍光測定を用いた各反応の蛍光の倍率変化により算出された（効率＝合計（Ｆｃ／Ｆｃ−1）ｎ／２ｎ。ここでＦｃはサイクルｃにおける蛍光、Ｆｃ−1はサイクルｃ−１における蛍光、ｎは使用されたサイクル比である。）。可能な場合は、３つのサイクル比を用いて反応効率を計算した。表３に示すように、増幅効率の割合は配合および初期鋳型濃度には依存しなかった。これらのデータは、効率が、初期のプライミングおよび／またはプライマーの伸長に依存していたことを示唆している。すなわち、より少量の鋳型を用いた反応では、Ｔｗｅｅｎ２０の存在下において、陰イオン界面活性物質存在下よりもプライミングまたは開始の効率が低かった。しかし、いったんその増幅プロセスが開始すると、反応効率は界面活性剤に依存しなかった。
【表４】
2010512797.tif 000011
【００６９】
実施例４．陰イオン界面活性剤は増幅特異性を改善する
陰イオン界面活性剤であるポリ（エチレングリコーエル）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩の存在下における増幅により、非特異的産物の生成がより少なくなるかどうかを調べるため、Ｔｗｅｅｎ２０を含む配合物と陰イオン界面活性剤を含む配合物とを比較した。プライマー（表４参照）は、ヒトのゲノムＤＮＡの３５２ｂｐ断片（ＢｓｒＧＩＯ）および３６０ｂｐ断片（ＳｃａＩＯ）を増幅するよう設計された。反応液（５０μＬ）には、０．５μｇのＨＥＫ２９３ゲノムＤＮＡ、５０ｐｍｏｌのプライマー、１×ＰＣＲバッファー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．０５Ｕ／μＬのＴａｑおよび４％のＤＭＳＯが含まれる。サーマルサイクルのパラメーターは、９４℃で２分；９４℃で２０秒、５８℃で３０秒および７２℃で８０秒を３０サイクル；７２℃で１０分間の最後の伸長；４℃での保持であった。
【表５】
2010512797.tif 000012
【００７０】
各サンプルのアリコートをアガロースゲルで泳動した（図３）。陰イオン界面活性剤配合物を用いた反応（レーンＡ）においては、標準Ｔｗｅｅｎ２０配合物を用いた反応（レーンＴ、Ｒ）と比べて、非特異的な二次的増幅産物が少なかった。この結果により、鋳型、プライマー、界面活性剤および酵素を含む多分子複合体が存在し、陰イオン界面活性剤が鋳型／プライマーおよび界面活性剤のクーロン反発力を増加させるという可能性がある。
【図３】
2010512797.tif 000014
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年8月20日(2009.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に
（ａ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、
（ｂ）陰イオン界面活性剤
からなる組成物。
【請求項２】
ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・フラバス、サーマス・ルバー、サーマス・サーモフィラス、バチルス・ステアロサーモフィラス、サーマス・アクアティカス、サーマス・ラクテウス、サーマス・ルーベンス、およびメタノサーマス・フェルビズスからなる群より選択される好熱細菌由来である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｔａｑが、前記組成物中に０．１ユニット／μＬ〜５ユニット／μＬの濃度で存在する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記陰イオン界面活性剤が、前記組成物中に０．００１重量％〜１重量％の濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記陰イオン界面活性剤が、ポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプルピルエーテルカリウム塩、ポリ（エチレングリコール）モノラウレート、λカラギーナン、ポリオキシエチレン（１５０）ジノニルフェニルエーテルポリオキシエチレン、およびノニルノノキシノール−１５ホスファートからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記陰イオン界面活性剤が、ポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
還元剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物のｐＨを６〜９に維持する緩衝剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記緩衝剤がＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＴＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳおよびＴｒｉｓからなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなる群より選択されるｄＮＴＰの混合物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
組成物のｐＨを７〜８に維持する緩衝剤、標的ポリヌクレオチド、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなる群より選択されるｄＮＴＰの混合物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記陰イオン界面活性剤がポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩であり、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムおよび塩化リチウムからなる群より選択される塩をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ジメチルスルホキシド、ホルムアミドおよびベタインからなる群より選択されるＰＣＲの効率を増大させる試薬をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
サーマルサイクルプロセスにおいて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの不活性化を抑制する方法であって、前記サーマルサイクルプロセスにおいてＤＮＡポリメラーゼを陰イオン界面活性剤と接触させることを含む方法。
【請求項１７】
前記サーマルサイクルプロセスが、４０℃〜１００℃の範囲の温度で２〜５０サイクル行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、サーマス・フラバス、サーマス・ルバー、サーマス・サーモフィラス、バチルス・ステアロサーモフィラス、サーマス・アクアティカス、サーマス・ラクテウス、サーマス・ルーベンス、およびメタノサーマス・フェルビズスからなる群より選択される好熱細菌由来である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記界面活性剤が、ポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、ポリ（エチレングリコール）モノラウレート、λカラギーナン、ポリオキシエチレン（１５０）ジノニルフェニルエーテルポリオキシエチレン、およびノニルノノキシノール−１５ホスファートからなる群より選択される陰イオン界面活性剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物のｐＨを７〜８に維持する緩衝剤、標的ポリヌクレオチド、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなる群より選択されるｄＮＴＰの混合物をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記陰イオン界面活性剤がポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩であり、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
サーマルサイクルプロセスでＤＮＡを増幅するキットであって、実質的に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと陰イオン界面活性剤とからなるキット。
【請求項２４】
還元剤、緩衝剤、ならびにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなる群より選択されるｄＮＴＰの混合物をさらに含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記界面活性剤がポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、ポリ（エチレングリコール）モノラウレート、λカラギーナン、ポリオキシエチレン（１５０）ジノニルフェニルエーテルポリオキシエチレン、およびノニルノノキシノール−１５ホスファートからなる群より選択される陰イオン界面活性剤であり、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑである、請求項２４に記載のキット。
【国際調査報告】
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