(57)【要約】  開示は、E3ユビキチンリガーゼ阻害剤を識別すること、および細胞増殖を調節することであって、細胞とE3ユビキチンリガーゼの阻害剤が有効量とを接触することと、当該細胞とトポイソメラーゼ阻害剤の有効量とを接触することを具備することにおいて有用な方法および組成物であり、ここで、当該E3ユビキチンリガーゼ阻害剤およびトポイソメラーゼ阻害剤分子での処理は、トポイソメラーゼ阻害剤単独で処理された細胞と比較して、細胞増殖を調節する。本発明は、更に、E3ユビキチンリガーゼ阻害剤の識別および製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖を調節するための方法であって、細胞とE3ユビキチンリガーゼ阻害剤の有効量とを接触することと、並びに当該細胞とトポイソメラーゼ阻害剤の有効量とを接触することとを含み、それによって、当該E3ユビキチンリガーゼ阻害剤とトポイソメラーゼ阻害剤が、トポイソメラーゼ阻害剤単独で処理された対応する細胞に比べてより大きい程度に細胞増殖を調節する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、当該細胞がヒト細胞である方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、当該細胞が癌細胞である方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、当該癌細胞が、心臓、肺、胃腸管系、尿生殖器管、肝臓、骨、神経系、婦人科、血液学的、皮膚または副腎癌細胞である方法。
【請求項５】
請求項4に記載の方法であって、当該細胞増殖が阻害される方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、当該トポイソメラーゼ阻害剤が、カンポテシン、イリノテカン、トポテカン、ドキソルビシン、テニポシド、エトポシドおよびその類似体、誘導体および組み合わせからなる群より選択される方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、当該E３ユビキチンリガーゼの阻害剤が以下の構造を有する化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である方法：
【化１】
2010515771.tif 000020
ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロ環式アルキル、アリル、ヘテロ環式アリル、アシル、アルコキシ、アミノ、カルボキシル、ニトリル、スルファイド、スルホンまたはスルホンアミドであり、ここで各々のシクロアルキル、ヘテロ環式アルカリ、アリルおよびヘテロ環式アリルはハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、ニトリル、スルファイド、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−Ｃ６アルキル、モノまたはジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシまたはアリルまたはヘテロ環式アリルから選ばれる１〜３の基で任意に置換される；
Ｘ1およびＸ2は独立して酸素または硫黄である；および
Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アミン、アミド、ヒドロペルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アシル、カルボキシル、カルボキシレート、アリル、ヘテロ環式アリルである。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、当該E３ユビキチンリガーゼの阻害剤が、以下の構造を有する化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である方法：
【化２】
2010515771.tif 000021
ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロ環式アルキル、アリル、ヘテロ環式アリル、アシル、アルコキシ、アミノ、カルボキシル、ニトリル、スルファイド、スルホンまたはスルホンアミドであり、ここで各々のシクロアルキル、ヘテロ環式アルカリ、アリルおよびヘテロ環式アリルは、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、ニトリル、スルファイド、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−Ｃ６アルキル、モノまたはジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシまたはアリルまたはヘテロ環式アリルから選ばれる１〜３の基で任意に置換される；および
Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アミン、アミド、ヒドロペルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アシル、カルボキシル、カルボキシレート、アリル、ヘテロ環式アリルである。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、Ｒ３が水素である方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、Ｒ４が水素である方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法であって、Ｒ５が水素である方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の方法であって、Ｒ６が水素である方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の方法であって、Ｒ３およびＲ６が水素である方法。
【請求項１４】
請求項８に記載の方法であって、Ｒ４およびＲ５が水素である方法。
【請求項１５】
請求項８に記載の方法であって、当該E3ユビキチンリガーゼの阻害剤が以下の化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である方法:
【化３】
2010515771.tif 000022
ここで、Ｒ1は、アルキル、アミン、カルボン酸、アルコキシ、スルホン、スルホンアミドアリルである、および
Ｒ7は水素、ハロゲン、アルキル、アシル、カルボン酸、アルコキシ、アリル、またはヘテロ環式アリルである。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、当該E3ユビキチンリガーゼの阻害剤が化合物１；
【化４】
2010515771.tif 000023
である方法。
【請求項１７】
請求項７に記載の方法であって、当該E3ユビキチンリガーゼの阻害剤が以下の構造を有する化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である方法；
【化５】
2010515771.tif 000024
ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロ環式アルキル、アリル、ヘテロ環式アリル、アシル、アルコキシ、アミノ、カルボキシル、ニトリル、スルファイド、スルホンまたはスルホンアミドであり、ここで各々のシクロアルキル、ヘテロ環式アルカリ、アリルおよびヘテロ環式アリルはハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、ニトリル、スルファイド、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−Ｃ６アルキル、モノまたはジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシまたはアリルまたはヘテロ環式アリルから選ばれる１〜３の基で任意に置換される；および
Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アミン、アミド、ヒドロペルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アシル、カルボキシル、カルボキシレート、アリル、ヘテロ環式アリルである。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、Ｒ３が水素である方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、Ｒ４が水素である方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法であって、Ｒ５が水素である方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法であって、Ｒ６が水素である方法。
【請求項２２】
請求項１７に記載の方法であって、Ｒ３およびＲ６が水素である方法。
【請求項２３】
請求項１７に記載の方法であって、Ｒ４およびＲ５が水素である方法。
【請求項２４】
請求項１７に記載の方法であって、E3ユビキチンリガーゼの阻害剤が以下の構造を有する化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である方法；
【化６】
2010515771.tif 000025
ここで、Ｒ1は、アルキル、アシル、アミン、カルボン酸、アルコキシ、スルホン、スルホンアミドアリルまたはヘテロ環式アリルであり、および
Ｒ7は水素、ハロゲン、アルキル、アシル、カルボン酸、アルコキシ、アリル、またはヘテロ環式アリルである。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、E３ユビキチンリガーゼの阻害剤が以下；
【化７】
2010515771.tif 000026
である方法。
【請求項２６】
細胞においてトポイソメラーゼを安定化する方法であって、当該細胞とE3ユビキチンリガーゼの阻害剤の有効量とを接触することを具備する方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、当該E３ユビキチンリガーゼが以下の構造の化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である方法；
【化８】
2010515771.tif 000027
ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロ環式アルキル、アリル、ヘテロ環式アリル、アシル、アルコキシ、アミノ、カルボキシル、ニトリル、スルファイド、スルホンまたはスルホンアミドであり、ここで各々のシクロアルキル、ヘテロ環式アルカリ、アリルおよびヘテロ環式アリルはハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、ニトリル、スルファイド、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−Ｃ６アルキル、モノまたはジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシまたはアリルまたはヘテロ環式アリルから選ばれる１〜３の基で任意に置換される；
Ｘ1およびＸ2は独立して酸素または硫黄である；および
Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アミン、アミド、ヒドロペルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アシル、カルボキシル、カルボキシレート、アリル、ヘテロ環式アリルである。
【請求項２８】
E3ユビキチンリガーゼ阻害剤を識別する方法であって、当該方法が以下を具備する方法；
ａ)  試験薬剤を用意すること；
ｂ）  E3ユビキチンリガーゼをユビキチン活性化酵素、E3ユビキチンリガーゼの基質およびユビキチンと当該試験薬剤の存在または非存在において接触すること；および
ｃ）  当該基質のユビキチン化が当該試験薬剤の存在において減少するか否かを決定すること；ここで、当該基質のユビキチン化が当該試験薬剤の存在において減少した場合に、当該試験薬剤がE3ユビキチンリガーゼ阻害剤であると識別される。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、当該Ｅ３ユビキチンリガーゼがRING1、Bmi1および／またはその組み合わせである方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法であって、当該基質のユビキチン化は蛍光により決定される方法。
【請求項３１】
請求項２８に記載の方法であって、当該接触する工程は細胞内で生じる方法。
【請求項３２】
請求項２８に記載の方法であって、当該基質はRING/Bmi1複合体である方法。
【請求項３３】
請求項２８に記載の方法であって、当該基質はトポイソメラーゼである方法。
【請求項３４】
請求項２８の方法により識別された阻害性化合物。
【請求項３５】
E3ユビキチンリガーゼによる基質のユビキチン化を阻害する化合物を製造する方法であって、以下を具備する方法；
ａ）  当該方法が請求項２８に記載の方法を実施してE3ユビキチンリガーゼによるE3ユビキチンユビキチンリガーゼ基質のユビキチン化を阻害する当該試験薬剤を識別すること；および
ｂ）  当該試験薬剤を製造すること。
【請求項３６】
細胞をトポイソメラーゼ阻害剤に対して再感受性化する化合物を識別する方法であって、当該方法が以下を具備する方法；
ａ）  試験薬剤を提供すること；
ｂ）  細胞を試験薬剤の有効量と接触すること、および当該細胞をトポイソメラーゼ阻害剤の有効量と接触すること；および
ｃ）  トポイソメラーゼ阻害剤単独で処理された細胞と比較して、当該試験薬剤とトポイソメラーゼ阻害剤とでの処理が、細胞増殖を調節するか否かを決定すること；
ここで、当該細胞増殖が低下した場合に、当該試験薬剤が、細胞を当該トポイソメラーゼ阻害剤に対して再感受性化する化合物である識別する。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、当該細胞がヒト細胞である方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載の方法であって、当該細胞が癌細胞である方法。
【請求項３９】
請求項３６に記載の方法であって、当該癌細胞が心臓、肺、胃腸管系、尿生殖器管、肝臓、骨、神経系、婦人科、血液学的、皮膚または副腎癌細胞である方法。
【請求項４０】
請求項３６〜３９の何れか１項に記載の方法であって、当該細胞増殖が阻害される方法。
【請求項４１】
請求項３６に記載の方法であって、当該試験薬剤がトポイソメラーゼを安定化する方法。
【請求項４２】
請求項３６に記載の方法であって、カンポテシン、イリノテカン、トポテカン、ドキソルビシン、テニポシド、エトポシドおよびその類似体、誘導体および組み合わせからなる群より選択される方法。
【請求項４３】
請求項３６の方法により識別された阻害性化合物。 
【請求項４４】
E3ユビキチンリガーゼによる基質のユビキチン化を阻害する化合物を製造する方法であって、当該方法が、以下を具備する方法；
ａ）  請求項３６の方法を実施して、当該E3ユビキチンリガーゼによるE3ユビキチンリガーゼ基質のユビキチン化を阻害する試験薬剤を認識すること；および
ｂ）  当該試験薬剤を製造すること。
【請求項４５】
単離された二重鎖リボ核酸(dsRNA)分子であって、NM_005180.5 または NM_002931.3で示される19〜25の連続するヌクレオチドと実質的に相同な第一の鎖のヌクレオチドと、当該第一の鎖と実質的に相補的な第二の鎖とを含む分子。
【請求項４６】
単離されたdsRNA分子であって、NM_005180.5 または NM_002931.3で示される配列を含むヌクレオチドの第一の鎖と、第一の鎖に対して実質的に相補的な配列を含むヌクレオチドの第二の鎖とを含む分子。
【請求項４７】
NM_005180.5 または NM_002931.3で示される鎖を含む核酸によりコードされるタンパク質の発現を阻害する単離されたdsRNA分子であって、当該dsRNAの第一の鎖は、実質的にNM_005180.5 または NM_002931.3で示される19〜25の連続するヌクレオチドと実質的に相同であり、当該dsRNAの第二の鎖は当該第一の鎖に実質的に相補的である分子。
【請求項４８】
単離された核酸分子であって、請求項４７のdsRNAの１または両方の鎖のためのテンプレートであるヌクレオチド配列に可働的に結合されたプロモーターを含む核酸。
【請求項４９】
請求項４８の単離された核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項５０】
請求項４８に記載の核酸分子であって、プロモーターが当該ヌクレオチド配列の何れかの末端に隣接し、ここで、当該プロモーターは、各個々のDNA鎖の発現を駆動し、それによりハイブリダイズし、且つ当該dsRNAを形成する2つの相補的なRNAを生じる分子。
【請求項５１】
請求項４８のdsRNAであって、以下からなる群より選択されるdsRNA分子；
ａ）  配列番号３で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号４で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
ｂ）  配列番号５で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号６で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
ｃ）  配列番号７で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号８で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
ｄ）  配列番号９で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号１０で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;および
ｅ）  その組み合わせ。
【請求項５２】
ヌクレオチドの第一および第二の鎖を有するdsRNA分子を含む医薬組成物であって、当該dsRNA分子が以下からなる群より選択される医薬組成物；
ａ）  NM_005180.5 または NM_002931.3で示される19〜25の連続するヌクレオチドと実質的に相同なヌクレオチドの第一の鎖と、当該第一の鎖と実質的に相補的な第二の鎖を含むdsRNA分子；および
ｂ）  NM_005180.5 または NM_002931.3で示される配列を含むヌクレオチドの第一の鎖と、当該第一の鎖に実質的に相補的な配列を含むヌクレオチドの第二の鎖を含むdsRNA分子；
ｃ）  ここで、当該dsRNA分子は、NM_005180.5 または NM_002931.3に示される鎖を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現を阻害する。
【請求項５３】
請求項５２に記載の医薬組成物であって、当該dsRNA分子が以下からなる群より選択される医薬組成物；
ａ）  配列番号３で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号４で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
ｂ）  配列番号５で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号６で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
ｃ）  配列番号７で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号８で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
ｄ）  配列番号９で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号１０で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;および
ｅ）  その組み合わせ。
【請求項５４】
トポイソメラーゼを安定化する方法であって、細胞を以下からなる群より選択される標的遺伝子の一部分に実質的に相同なdsRNA分子の有効量と接触させること；
ａ）  NM_005180.5で示されるポリヌクレオチド;
ｂ）  NM_005180.5で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
ｃ）  NM_002931.3で示されるポリヌクレオチド; および
ｄ）  NM_002931.3で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｅ）  それによりトポイソメラーゼを安定化すること
を含む方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法であって、当該細胞がヒト細胞である方法。
【請求項５６】
請求項５４に記載の方法であって、当該細胞が癌細胞である方法。
【請求項５７】
請求項５４に記載の方法であって、当該癌細胞が、心臓、肺、胃腸管系、尿生殖器管、肝臓、骨、神経系、婦人科、血液学的、皮膚または副腎癌細胞からなる群より選択される方法。
【請求項５８】
請求項５４に記載の方法であって、当該当該dsRNA分子が以下からなる群より選択される方法；
ａ）  配列番号３で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号４で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
ｂ）  配列番号５で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号６で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
ｃ）  配列番号７で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号８で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
ｄ）  配列番号９で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号１０で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;および
ｅ）  その組み合わせ。
【請求項５９】
請求項１に記載の方法であって、当該E3ユビキチンリガーゼ阻害剤がDNAおよびRNAからなる群より選択される方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法であって、当該RNAがdsRNA分子である方法。
【請求項６１】
請求項６０に記載の方法であって、当該dsRNA分子が以下からなる群より選択された標的遺伝子に対して実質的に相同である方法；
ａ）  NM_005180.5で示されるポリヌクレオチド;
ｂ）  NM_005180.5で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
ｃ）  NM_002931.3で示されるポリヌクレオチド; および
ｄ）  NM_002931.3で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項６２】
請求項６０に記載の方法であって、当該dsRNA分子が以下からなる群より選択される方法；
ａ）  配列番号３で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号４で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
ｂ）  配列番号５で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号６で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
ｃ）  配列番号７で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号８で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
ｄ）  配列番号９で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号１０で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;および
ｅ）  その組み合わせ。
【請求項６３】
以下の工程を含むRNA干渉のための標的を識別するための方法；
ａ）  標的遺伝子配列としてのE3ユビキチンリガーゼを選択すること；
ｂ）  細胞を、当該標的遺伝子配列の一部分と実質的に相同なdsRNAと接触すること；および
ｃ）  dsRNAがトポイソメラーゼを安定化するか否かを決定すること。
【請求項６４】
請求項６３に記載の方法であって、当該標的遺伝子配列が以下の群より選択される方法；
ａ）  NM_005180.5で示されるポリヌクレオチド;
ｂ）  NM_005180.5で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
ｃ）  NM_002931.3で示されるポリヌクレオチド; および
ｄ）  NM_002931.3で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項６５】
請求項６３に記載の方法であって、当該トポイソメラーゼが、ヒトトポイソメラーゼI、ヒトトポイソメラーゼIIα、ヒトトポイソメラーゼIIβおよびその組み合わせからなる群より選択される。
【請求項６６】
請求項６３に記載の方法であって、当該細胞がトポイソメラーゼ阻害剤の有効量と接触され、細胞増殖が調節される方法。
【請求項６７】
請求項２８に記載の方法であって、当該試験薬剤がdsRNA分子である方法。
【請求項６８】
請求項６７に記載の方法であって、当該dsRNA分子が、以下からなる群より選択される標的遺伝子の一部分と実質的に相同である方法；
ａ）  NM_005180.5で定義されるポリヌクレオチド;
ｂ）  NM_005180.5で定義されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
ｃ）  NM_002931.3で定義されるポリヌクレオチド; および
ｄ）  NM_002931.3で定義されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項６９】
請求項６７に記載の方法であって、当該dsRNAが以下からなる群より選択される方法；
ａ）  a dsRNAａ）  配列番号３で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号４で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
ｂ）  配列番号５で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号６で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
ｃ）  配列番号７で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号８で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
ｄ）  配列番号９で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号１０で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;および
ｅ）  その組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本出願を通して、種々の出版物が括弧内に引用されている。本発明に関する技術の状況をより十分に記載するために、これらの出版物の全体における開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［発明の背景］
DNAトポイソメラーゼは、正常な細胞周期を通じてDNA鎖の切断および再結合を触媒することにより、DNAのトポロジーにおける高次構造上の変化を調節する核酵素である。それらは、複製および転写の間のねじれのストレスを開放する。
【０００３】
５つのヒトDNAトポイソメラーゼは、以下のように同定され、特徴付けられている：トポイソメラーゼＩ（TOPI）、トポイソメラーゼIIα（TOPIIα）、トポイソメラーゼIIβ（TOPIIβ）、トポイソメラーゼIIIα（TOP3α）およびトポイソメラーゼIIIβ（TOP3β）。TOPIは、二重鎖DNA分子における一本鎖を可逆的に切断する一方で、TOPIIは両方のDNA鎖を切断し、再結合する。これらの反応は、「切断可能な複合体」として知られる一過性の反応中間体を経て生じると思われ、当該酵素（または酵素サブユニット）はチロシンに関連する共有結合と、DNA基質のバックボーンの切断されたリン酸ジエステルを形成する。
【０００４】
現在のところ、TOPI、TOPIIαおよびTOPIIβは、抗腫瘍剤のための重要な分子標的であることが示されている(Gurrieri, C., et al., J Natl Cancer Inst, 2004. 96(4):269-79)。過去数年間で、トポイソメラーゼは、癌治療のための重要な化学療法の標的になっている。カンプトセシン（CPT）およびその誘導体は、TOPI-DNA複合体のレベルで特異的に作用し、DNA切断を刺激することが報告されている。他の薬剤、例えば、β-ラパコーン(β-lapachone)は、トポイソメラーゼI−DNA複合体の形成を阻止することにより作用する。幾つかの新規化合物が開発されており、これらはTOPIまたはTOPIIα／IIβアイソフォームの何れかを標的とできる、またはトポイソメラーゼの３つ全てを標的にできる。
【０００５】
上で記載した通り、TOPIはDNAトポロジーにおける変化を、可逆性の酵素-DNA切断複合体の形成を介して触媒する。TOPIを標的とする抗腫瘍薬、例えば、カンプトセシン（CPT）およびその誘導体は、TOP-DNA複合体を固定化し、結果として細胞周期の停止を誘発して細胞死を招く細胞障害性のDNA障害を生じる。
【０００６】
CPTが媒介するTOPI-DNA複合体の安定化は、TOPIプロテアソームが媒介する分解も誘導し、これは、トポイソメラーゼ阻害剤が媒介する細胞死を妨げる（Gambacorta, M., et al., Am J Pathol, 1996. 149(6): p. 2023-35 and Koken, M.H., et al., 10(7): p. 1315-24）。乳癌および直腸癌細胞株においては、CPT誘導性のTOPI分解とCPT耐性の程度の間に関連性がある。例えば、乳癌細胞株ZR-75-1は、CPTに対して非常に高い感受性があり、CPT誘導性TOPI分解において完全に欠損し、一方で、乳癌細胞株BT474は、CPTに対して非感受性であり、有効なCPT誘導性TOPI分解を示す(Zhang, P., et al., Int J Cancer, 2000. 85(5): p. 599−605)。薬物耐性の発現におけるユビキチン媒介の分解に重要な役割を支持しているので、プロテアソームの阻害は、TOPIのCPT誘導性分解と、CPT誘導性細胞毒性およびアポトーシスに対して選択的に感受性化されたBT474細胞を消失する(Zhang, P., et al., Int J Cancer, 2000. 85(5): p. 599-605)。
【０００７】
ヒトTOPIIアイソザイム、TOPIIαおよびTOPIIβは、アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、テニポシド(VM26,  Alexis Corp.)などおよびエピポドフィロトキシン、例えば、エトポシド(VP-16)(Sigma, イスラエル)などにより、癌細胞において標的とされる。
【０００８】
TOPII阻害剤は、２つの異なる機序で作用する。第１の機序は、TOPI阻害剤(例えば、VP-16)と同様であり(Gurrieri, C., et al., J Natl Cancer Inst, 2004. 96(4): p. 269-79)、一方では、第２の機序(例えば、ICRF-193)は、共有結合の三元の複合体を捕獲することなしにTOPIIの触媒活性を阻害する(Yu, J.H., et al., Cancer Res., 2004. 64(3): p. 928-33 and Son, S.H., et al., Cancer Gene Ther, 2004. 5: p. 5)。トポイソメラーゼIIの大抵の阻害剤は、ライゲーション工程を阻害し、DNAと当該酵素の間の切断可能な複合体の安定化を導く。殆どの酵素阻害剤は、当該酵素の活性部位または近くのアロステリック部位に結合することにより機能し、正常な基質の反応を阻害する。トポイソメラーゼIIの阻害は２つの部分を含む：当該阻害剤の芳香族部分はDNA塩基対間にインターカレートし、一方で、別の、より極性の部分はトポイソメラーゼと相互作用する。
【０００９】
多くのトポイソメラーゼII阻害剤（例えば、ドキソルビシンおよびエトポシドなど）は古典的な競合的阻害剤としてよりも毒物として作用するために、それらの作用は細胞における当該酵素の濃度に依存する。相対的により高い濃度のトポイソメラーゼIIを含む急速な増殖性の細胞は、これらの薬剤に対してより感受性が高く見える。他方、分化型の細胞は、相対的に低い濃度のトポイソメラーゼIIを有し、これらの阻害剤の作用に対してかなり高い耐性をもつ。
【００１０】
TOPIと同様に、TOPII-DNA-薬物複合体は、薬物耐性の出現に対して寄与するプロテアソームの媒介する分解に影響され易くなる(Le, X.F., et al., Oncogene, 1998. 16(14): p. 1839-49 and He, D., et al., Chin Med J (Engl), 2003. 116(9): p. 1394-8)。プロテアソームの阻害は、TOPIIに方向付ける薬物に対する固体の腫瘍の耐性を回避する(He, D., et al., Cancer Res., 1997. 57(10): p. 1868-72)。生理学的な細胞の状態、例えば、これに限定するものではないが、グルコースの欠乏および低酸素は、固体の腫瘍の薬物耐性において役割を果たす(Melnick, A. and J.D. Licht, Blood, 1999. 93(10): p. 3167-215)。これらの腫瘍に特異的な状態はTOPIIαレベルの減少を引き起こし、TOPIIを標的とする薬物、例えば、エトポシドおよびドキソルビシンなどに対する耐性を細胞に与える(Piazza, F., C. Gurrieri, & P.P. Pandolfi, Oncogene, 2001. 20(49): p. 7216-22)。
【００１１】
トポイソメラーゼ阻害剤の治療学的な効果を高めるために有用なアプローチおよび組成物を開発することを継続する必要性が残っている。
【００１２】
［発明の概要］
本発明は、細胞増殖を調節するための方法であって、細胞とE3ユビキチンリガーゼ阻害剤の有効量とを接触することと、並びに当該細胞とトポイソメラーゼ阻害剤の有効量とを接触することとを含み、それによって、当該E3ユビキチンリガーゼ阻害剤とトポイソメラーゼ阻害剤が、トポイソメラーゼ阻害剤単独で処理された対応する細胞に比べてより大きい程度に細胞増殖を調節する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、更に、細胞においてトポイソメラーゼを安定させる方法であって、当該細胞をE３ユビキチンリガーゼの阻害剤の有効量と接触することを含む方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、E3ユビキチンリガーゼ阻害剤を識別する方法であって、以下を含む方法を提供する；
試験薬剤を用意すること；
E3ユビキチンリガーゼを、ユビキチン活性化酵素、E3ユビキチンリガーゼの基質およびユビキチンを当該試験薬剤の存在または不在において接触すること；並びに、
当該試験薬剤の存在下において、当該基質のユビキチン化が減少するか否かを判断すること；
ここで、当該基質のユビキチン化が当該試薬剤の存在下で減少した場合には、当該試験薬剤がE3ユビキチンリガーゼ阻害剤であるとして識別される。
【００１５】
本発明は、更に、上述の方法により識別された阻害性の化合物を提供する。
【００１６】
本発明は、更に、E3ユビキチンリガーゼによる基質のユビキチン化を阻害する化合物の製造方法であって、当該方法が；上述に記載した通りの方法を実施し、E3ユビキチンリガーゼによるE3ユビキチンリガーゼ基質のユビキチン化を阻害する試験薬剤を識別すること；および
当該薬剤を製造すること；
を含む方法を提供する。
【００１７】
本発明は更に、トポイソメラーゼ阻害剤に対する細胞の再感受性化する化合物を識別する方法であって、当該方法が
試験薬剤を用意すること；
細胞を試験薬剤の有効量と接触すること、および当該細胞とトポイソメラーゼ阻害剤の有効量と接触すること；並びに
トポイソメラーゼ阻害剤単独で処理された細胞と比較して、当該試験薬剤とトポイソメラーゼ阻害剤とでの処理が、細胞増殖を調節するか否かを識別すること；ここにおいて、当該細胞増殖が減少した場合に、当該試験薬剤を、当該トポイソメラーゼ阻害剤に対して細胞を再感受性化する化合物として識別する；
を有する方法を提供する。
【００１８】
本発明は、更に、上記方法により識別された阻害性の化合物を提供する。
【００１９】
本発明は、また、E3ユビキチンリガーゼによる基質のユビキチン化を阻害する化合物を製造する方法であって、
上述の方法を実施し、E3ユビキチンリガーゼによるE3ユビキチンリガーゼ基質のユビキチン化を阻害する試験薬剤を識別すること；および
当該試験薬剤と製造すること；
を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明は更に、単離された二重鎖リボ核酸(dsRNA)分子であって、NM_005180.5 または NM_002931.3に示される19〜25の連続するヌクレオチドと実質的に相同な第一の鎖のヌクレオチドと、当該第一の鎖に実質的に相補的な第二の鎖を含む分子を提供する。
【００２１】
本発明は、単離されたdsRNA分子であって、NM_005180.5 または NM_002931.3に示される配列を含むヌクレオチドの第一の鎖と、当該第一の鎖と実質的に相補的な配列を含むヌクレオチドを含むヌクレオチドの第二の鎖を含む分子を提供する。
【００２２】
本発明は、更に、NM_005180.5 または NM_002931.3 で示される鎖を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現を阻害する単離されたdsRNA分子を提供するものであり、ここで、当該dsRNAの第一の鎖は、NM_005180.5 or NM_002931.3 に示される19〜25の連続するヌクレオチドと実質的に相同であり、当該dsRNAの第二の鎖は、当該第一の鎖と実質的に相補的である。
【００２３】
本発明はまた、上述のdsRNAの１または両方の鎖のテンプレートであるヌクレオチド配列に可働的に結合されたプロモーターを含む単離された核酸分子を提供する。
【００２４】
本発明は、更に、上述の当該単離された核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【００２５】
本発明は、また、第一および第二の鎖のヌクレオチドを有するdsRNA分子を含む医薬組成物を提供するものであり、当該dsRNA分子は以下からなる群より選択される：
NM_005180.5 または NM_002931.3 に示される19〜25の連続するヌクレオチドと実質的に相同な第一の鎖のヌクレオチドと当該第一の鎖と実質的に相補的な第二の鎖とを含むdsRNA；および
NM_005180.5 or NM_002931.3 に示される配列を含む第一の鎖のヌクレオチドと、当該第一の鎖のヌクレオチドと実質的に相補的な配列を含む第二の鎖のヌクレオチドとを含むdsRNA；
ここで、当該dsRNA分子は、NM_005180.5 または NM_002931.3 に示される鎖を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現を阻害する。
【００２６】
本発明は、更に、トポイソメラーゼを安定化する方法であって、細胞を、以下からなる群より選択された標的遺伝子の一部分に対して実質的に相同であるdsRNAの有効量と接触して、当該トポイソメラーゼを安定化することを含む方法を提供する：
NM_005180.5で定義されるポリヌクレオチド;
NM_005180.5で定義されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
NM_002931.3で定義されるポリヌクレオチド; および
NM_002931.3で定義されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００２７】
本発明は更に、以下の工程を含むRNA干渉のための標的を識別するための方法を提供する；
標的遺伝子配列としてのE3ユビキチンリガーゼを選択すること；
細胞を、当該標的遺伝子配列の一部分と実質的に相同なdsRNAと接触すること；および
dsRNAがトポイソメラーゼを安定化するか否かを決定すること。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】図１Aは、Bmil、X63またはX165を標的とするRNAiオリゴマーでトランスフェクトされた、または製造者(Synvolux Therapeutics, B.V., NL)の説明書に従ってセイントレッド試薬(SaintRed reagent)を用いてRNAi、ScでトランスフェクトされたHeLa細胞を示す。細胞をDMSO、0.1μMのCPTまたは1μMのVM26の存在下で培養し、アラバマブルーで染色した。１Aは、染色された細胞のイメージを示し、一方で、１Bは、異なる条件における細胞増殖を図表にし、比較し、RNAiを使用するBmi1の阻害がHeLa細胞におけるVM26およびCPTで誘導される毒性を増加したことを示す。
【図１Ｂ】図１Bは、Bmil、X63またはX165を標的とするRNAiオリゴマーをトランスフェクトされた、または製造者(Synvolux Therapeutics, B.V., NL)の説明書に従ってセイントレッド試薬(SaintRed reagent)を用いてRNAi、ScをトランスフェクトされたHeLa細胞を示す。細胞をDMSO、0.1μMのCPTまたは1μMのVM26の存在下で培養し、アラバマブルーで染色した。１Aは、染色された細胞のイメージを示し、一方で、１Bは、異なる条件における細胞増殖を図表にし、比較し、RNAiを使用するBmi1の阻害がHeLa細胞におけるVM26およびCPTで誘導される毒性を増大したことを示す。
【図２】図２は、スクランブルされたRNAiコントロール(Sc)またはBmilを標的とするX63 RNAiでトランスフェクトされたHT29細胞を示す。Bmi1のサイレンシングは、HT29細胞におけるCPTおよびVM26の毒性効果を増大した。
【図３】図３は、スクランブルされたRNAIコントロール(Sc)またはBmi1を標的とするX63およびX165 RNAiオリゴマーでトランスフェクトされ、且つVM26で処理されたHeLa細胞におけるTOPIおよびTOPIIαレベルのイムノブロットを示す。
【図４】図４は、スクランブルされたRNAIコントロール(Sc)で、MG132のあり若しくはなし、またはBim1を標的とするX63 RNAiオリゴマーでトランスフェクトされ、且つCPTで処理されたHeLa細胞におけるTOPIおよびTOPIIβレベルのイムノブロットを示す。
【図５】図５は、スクランブルされたRNAiコントロール(Sc)またはBmi1を標的とするX63 RNAiオリゴマーでトランスフェクトされ、且つVM26で、MG132あり若しくはなしで、時間の長さを変化させて処理されたHeLa細胞におけるTOPIIαレベルのドットブロットを示す。
【図６Ａ】図６AおよびBは、スクランブルされたRNAIコントロール(Sc)またはBmi1を標的とするX63 RNAiオリゴマーでトランスフェクトされ、且つ低グルコース条件で処理されたHeLa細胞(A)およびHT29細胞におけるTOPI、TOPIIαおよびBmi1レベルのイムノブロットを示す。
【図６Ｂ】図６AおよびBは、スクランブルされたRNAIコントロール(Sc)またはBmi1を標的とするX63 RNAiオリゴマーでトランスフェクトされ、且つ低グルコース条件で処理されたHeLa細胞(A)およびHT29細胞におけるTOPI、TOPIIαおよびBmi1レベルのイムノブロットを示す。
【図７Ａ】図７A、BおよびCは、スクランブルされたRNAiコントロール(Sc)、Bmi1を標的とするX63 RNAiオリゴマー、RING1を標的とするX154 オリゴマー、またはRING1Bを標的とするX96オリゴマーでトランスフェクトされ、且つVM26で処理されたHeLa細胞におけるTOPI、TOPIIα(A)、RING1(B)およびRING1B(C)レベルのイムノブロットを示す。
【図７Ｂ】図７A、BおよびCは、スクランブルされたRNAiコントロール(Sc)、Bmi1を標的とするX63 RNAiオリゴマー、RING1を標的とするX154 オリゴマー、またはRING1Bを標的とするX96オリゴマーでトランスフェクトされ、且つVM26で処理されたHeLa細胞におけるTOPI、TOPIIα(A)、RING1(B)およびRING1B(C)レベルのイムノブロットを示す。
【図７Ｃ】図７A、BおよびCは、スクランブルされたRNAiコントロール(Sc)、Bmi1を標的とするX63 RNAiオリゴマー、RING1を標的とするX154 オリゴマー、またはRING1Bを標的とするX96オリゴマーでトランスフェクトされ、且つVM26で処理されたHeLa細胞におけるTOPI、TOPIIα(A)、RING1(B)およびRING1B(C)レベルのイムノブロットを示す。
【図７Ｄ】図７Dは、異なる条件における細胞増殖を図表にし、比較する。細胞は、トリプリケートでトランスフェクトした。
【図８Ａ】図８は、スクランブルRNAiコントロール(Sc)またはBmi1を標的とするX63 RNAiオリゴマーでトランスフェクトされ、且つDMSOまたは濃度を変更したVM26で処理されたA549 (A および B)、HeLA(C)、DU145(D)およびMDA-MB-231細胞(E)の生存度を示す。細胞は、トリプリケートでトランスフェクトした。
【図８Ｂ】図８は、スクランブルRNAiコントロール(Sc)またはBmi1を標的とするX63 RNAiオリゴマーでトランスフェクトされ、且つDMSOまたは濃度を変更したVM26で処理されたA549 (A および B)、HeLA(C)、DU145(D)およびMDA-MB-231細胞(E)の生存度を示す。細胞は、トリプリケートでトランスフェクトした。
【図８Ｃ】図８は、スクランブルRNAiコントロール(Sc)またはBmi1を標的とするX63 RNAiオリゴマーでトランスフェクトされ、且つDMSOまたは濃度を変更したVM26で処理されたA549 (A および B)、HeLA(C)、DU145(D)およびMDA-MB-231細胞(E)の生存度を示す。細胞は、トリプリケートでトランスフェクトした。
【図８Ｄ】図８は、スクランブルRNAiコントロール(Sc)またはBmi1を標的とするX63 RNAiオリゴマーでトランスフェクトされ、且つDMSOまたは濃度を変更したVM26で処理されたA549 (A および B)、HeLA(C)、DU145(D)およびMDA-MB-231細胞(E)の生存度を示す。細胞は、トリプリケートでトランスフェクトした。
【図８Ｅ】図８は、スクランブルRNAiコントロール(Sc)またはBmi1を標的とするX63 RNAiオリゴマーでトランスフェクトされ、且つDMSOまたは濃度を変更したVM26で処理されたA549 (A および B)、HeLA(C)、DU145(D)およびMDA-MB-231細胞(E)の生存度を示す。細胞は、トリプリケートでトランスフェクトした。
【図９】図９は、蛍光に基づくアッセイを使用してRING1/Bmi1の自己ユビキチン化の例を示す。
【図１０Ａ】図１０は、化合物１およびTOPII薬(A)または非TOPII薬(B)で処理した後のA549細胞の生存度を示す。
【図１０Ｂ】図１０は、化合物１およびTOPII薬(A)または非TOPII薬(B)で処理した後のA549細胞の生存度を示す。
【図１１】図１１は、化合物１によるHeLa細胞におけるTOPIIαの薬物誘導性の分解の阻害を示す。
【図１２】図１２は、化合物１によるHeLa細胞におけるRING1-BII1ユビキチン化活性の阻害を示す。
【図１３Ａ】図１３は、種々の癌細胞における化合物１のLD50を示す。
【図１３Ｂ】図１３は、種々の癌細胞における化合物１のLD50を示す。
【００２９】
［発明の詳細な説明］
この発明は、細胞を有効量のE3ユビキチンリガーゼ阻害剤と接触すること、および前記細胞を有効量のトポイソメラーゼ阻害剤と接触することで前記E3ユビキチンリガーゼ阻害物質および前記トポイソメラーゼ阻害剤が細胞増殖を前記トポイソメラーゼ阻害剤のみで処理される対応する細胞に比べてより大きい程度に調節することを含む細胞増殖を調節する方法を提供する。
【００３０】
当該方法の１つの態様において、前記細胞はヒト細胞である。当該細胞は癌細胞であってもよい。癌細胞は、心臓、肺、胃腸、泌尿生殖管、肝、骨、神経系、婦人科学、血液学、皮膚または副腎である。
【００３１】
当該方法のある態様において、細胞増殖が阻害される。前記方法の更に別の態様において、トポイソメラーゼ阻害剤はカンプトシン（camptothecin）、イリノテカン（irinotecan）、トポテカン（topotecan）、ドキオルビカン（doxorubicin）、テニポシド（teniposide）、エトポシド（etoposide）およびその類似物、誘導体および組合せからなる群から選ばれる。
【００３２】
当該方法の別の態様において、E3ユビキチンリガーゼの阻害剤は、以下の構造を有する化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である：
【化１】
2010515771.tif 000002
【００３３】
ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロ環式アルキル、アリル、ヘテロ環式アリル、アシル、アルコキシ、アミノ、カルボキシル、ニトリル、スルファイド、スルホンまたはスルホンアミドであり、ここで各々のシクロアルキル、ヘテロ環式アルカリ、アリルおよびヘテロ環式アリルはハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、ニトリル、スルファイド、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−Ｃ６アルキル、モノまたはジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシまたはアリルまたはヘテロ環式アリルから選ばれる１〜３の基で任意に置換される；
Ｘ1およびＸ2は独立して酸素または硫黄である；および
Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アミン、アミド、ヒドロペルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アシル、カルボキシル、カルボキシレート、アリル、ヘテロ環式アリルである。
【００３４】
前記方法の付加的な態様において、Ｅ３ユビキチンリガーゼの阻害剤は、以下の構造を有する化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である：
【化２】
2010515771.tif 000003
【００３５】
ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロ環式アルキル、アリル、ヘテロ環式アリル、アシル、アルコキシ、アミノ、カルボキシル、ニトリル、スルファイド、スルホンまたはスルホンアミドであり、ここで各々のシクロアルキル、ヘテロ環式アルカリ、アリルおよびヘテロ環式アリルは、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、ニトリル、スルファイド、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−Ｃ６アルキル、モノまたはジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシまたはアリルまたはヘテロ環式アリルから選ばれる１〜３の基で任意に置換される；および
Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アミン、アミド、ヒドロペルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アシル、カルボキシル、カルボキシレート、アリル、ヘテロ環式アリルである。
【００３６】
前記方法の態様において、Ｒ3はハロゲン、Ｒは4ハロゲン、Ｒ5はハロゲン、Ｒ6はハロゲン、Ｒ3およびＲ6はハロゲン、またはＲ4およびＲ5はハロゲンである。
【００３７】
前記方法の更に別の態様において、Ｅ３ユビキチンリガーゼの阻害剤は以下の化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である：
【化３】
2010515771.tif 000004
【００３８】
ここで、Ｒ1は、アルキル、アミン、カルボン酸、アルコキシ、スルホン、スルホンアミドアリルである、および
Ｒ7は水素、ハロゲン、アルキル、アシル、カルボン酸、アルコキシ、アリル、またはヘテロ環式アリルである。
【００３９】
前記方法の１つの態様において、Ｅ３ユビキチンリガーゼの阻害剤は化合物１：
【化４】
2010515771.tif 000005
【００４０】
である。
【００４１】
前記方法の付加的な態様において、Ｅ３ユビキチンリガーゼの阻害剤は構造：
【化５】
2010515771.tif 000006
【００４２】
ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロ環式アルキル、アリル、ヘテロ環式アリル、アシル、アルコキシ、アミノ、カルボキシル、ニトリル、スルファイド、スルホンまたはスルホンアミドであり、ここで各々のシクロアルキル、ヘテロ環式アルカリ、アリルおよびヘテロ環式アリルはハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、ニトリル、スルファイド、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−Ｃ６アルキル、モノまたはジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシまたはアリルまたはヘテロ環式アリルから選ばれる１〜３の基で任意に置換される；および
Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5およびＲ6はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、アミン、アミド、ヒドロペルオキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アシル、カルボキシル、カルボキシレート、アリル、ヘテロ環式アリルである；
を有する化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である。
【００４３】
前記方法の１つの態様において、Ｒ3はハロゲン、Ｒは4ハロゲン、Ｒ5はハロゲン、Ｒ6はハロゲン、Ｒ3およびＲ6はハロゲン、またはＲ4およびＲ5はハロゲンである。
【００４４】
前記方法の付加的な態様において、Ｅ３ユビキチンリガーゼの阻害剤は構造：
【化６】
2010515771.tif 000007
【００４５】
ここで、Ｒ1は、アルキル、アシル、アミン、カルボン酸、アルコキシ、スルホン、スルホンアミドアリルまたはヘテロ環式アリルであり、および
Ｒ7は水素、ハロゲン、アルキル、アシル、カルボン酸、アルコキシ、アリル、またはヘテロ環式アリルである、
を有する化合物または当該化合物の塩もしくは鏡像異性体である。
【００４６】
本発明の１つの態様において、E3ユビキチンリガーゼの阻害剤は、
【化７】
2010515771.tif 000008
【００４７】
である。
【００４８】
本発明は、更に、細胞においてトポイソメラーゼを安定化する方法であって、当該細胞とE3ユビキチンリガーゼの阻害剤の有効量とを接触することを具備する方法を提供する。本方法において、当該E3ユビキチンリガーゼは、上述の通りの構造を有する化合物である。
【００４９】
本発明は、E3ユビキチンリガーゼ阻害剤を識別する方法であって、試験薬剤を用意すること；E3ユビキチンリガーゼをユビキチン活性化酵素、E3ユビキチンリガーゼの基質およびユビキチンと当該試験薬剤の存在または非存在において接触すること；および当該基質のユビキチン化が当該試験薬剤の存在において減少するか否かを決定することを含む方法を提供するものであり、ここで、当該基質のユビキチン化が当該試験薬剤の存在において減少した場合に、当該試験薬剤がE3ユビキチンリガーゼ阻害剤であると識別される。
【００５０】
当該方法の１態様において、E3ユビキチンリガーゼはRING1、Bmi1および／またはその組み合わせである。
【００５１】
当該方法の更なる態様において、当該基質のユビキチン化は蛍光により決定される。
【００５２】
当該方法の更なる態様において、当該接触する工程は細胞内で生じる。
【００５３】
当該方法の更なる態様において、当該基質はRING/Bmi1複合体である。
【００５４】
当該方法の１態様において、当該基質はトポイソメラーゼである。
【００５５】
本発明は、更に、上述の当該方法により識別された阻害性化合物を提供する。
【００５６】
本発明は、更に、E3ユビキチンリガーゼによる基質のユビキチン化を阻害する化合物を製造する方法であって、当該方法が上述の通りの方法を実施してE3ユビキチンリガーゼによるE3ユビキチンユビキチンリガーゼ基質のユビキチン化を阻害する当該試験薬剤を識別すること；および
当該試験薬剤を製造すること；
を含む方法が提供される。
【００５７】
本発明は、更に、細胞をトポイソメラーゼ阻害剤に対して再感受性化する化合物を識別する方法であって、当該方法が；
試験薬剤を提供すること；
細胞を試験薬剤の有効量と接触すること、および当該細胞をトポイソメラーゼ阻害剤の有効量と接触すること；および
トポイソメラーゼ阻害剤単独で処理された細胞と比較して、当該試験薬剤とトポイソメラーゼ阻害剤とでの処理が、細胞増殖を調節するか否かを決定すること；
ここで、当該細胞増殖が低下した場合に、当該試験薬剤が、細胞を当該トポイソメラーゼ阻害剤に対して再感受性化する化合物である識別する；
を含む方法を提供する。
【００５８】
当該方法の１つの態様において、当該細胞はヒト細胞である。当該細胞は癌細胞であってもよい。当該癌細胞は、心臓、肺、胃腸管系、尿生殖器管、肝臓、骨、神経系、婦人科、血液学的、皮膚または副腎癌細胞であってもよい。
【００５９】
当該方法のもう一つの態様において、当該細胞増殖は阻害される。
【００６０】
当該方法の１つの態様において、当該試験薬剤はトポイソメラーゼを安定化する。
【００６１】
当該方法の更なる態様において、当該トポイソメラーゼ阻害剤は、カンポテシン(camptothecin)、イリノテカン(irinotecan)、トポテカン(topotecan)、ドキソルビシン(doxorubicin)、テニポシド(teniposide)、エトポシド(etoposide)およびその類似体、誘導体および組み合わせからなる群より選択される。
【００６２】
本発明は更に、上述の方法により識別された阻害性化合物を提供する。
【００６３】
本発明は、また、E3ユビキチンリガーゼによる基質のユビキチン化を阻害する化合物を製造する方法であって、当該方法が、上述の方法を実施して、当該E3ユビキチンリガーゼによるE3ユビキチンリガーゼ基質のユビキチン化を阻害する試験薬剤を認識すること；および
当該試験薬剤を製造すること
を含む方法を提供する。
【００６４】
本発明は、更に、単離された二重鎖リボ核酸(dsRNA)分子であって、NM_005180.5 または NM_002931.3で示される19〜25の連続するヌクレオチドと実質的に相同な第一の鎖のヌクレオチドと、当該第一の鎖と実質的に相補的な第二の鎖とを含む分子を提供する。
【００６５】
本発明はまた、単離されたdsRNA分子であって、NM_005180.5 または NM_002931.3で示される配列を含むヌクレオチドの第一の鎖と、第一の鎖に対して実質的に相補的な配列を含むヌクレオチドの第二の鎖とを含む分子を提供する。
【００６６】
本発明は、更に、単離されたdsRNA分子であって、NM_005180.5 または NM_002931.3で示される鎖を含む核酸によりコードされるタンパク質の発現を阻害するdsRNA分子を提供するものであり、ここで、当該dsRNAの第一の鎖は、実質的にNM_005180.5 または NM_002931.3で示される19〜25の連続するヌクレオチドと実質的に相同であり、当該dsRNAの第二の鎖は当該第一の鎖に実質的に相補的である。
【００６７】
本発明はまた、単離された核酸分子であって、上述のdsRNAの１または両方の鎖のためのテンプレートであるヌクレオチド配列に可働的に結合されたプロモーターを含む核酸を提供する。
【００６８】
本発明は更に、上述の単離された核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【００６９】
当該方法の１態様において、プロモーターは、当該ヌクレオチド配列の何れかの末端に隣接するものであり、ここで、当該プロモーターは、各個々のDNA鎖の発現を駆動し、それによりハイブリダイズし、且つ当該dsRNAを形成する2つの相補的なRNAを生じる。
【００７０】
本方法の１態様において、当該dsRNA分子は以下からなる群より選択される；
配列番号３で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号４で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
配列番号５で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号６で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
配列番号７で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号８で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;
配列番号９で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号１０で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子;および
その組み合わせ。
【００７１】
本発明は、また、ヌクレオチドの第一および第二の鎖を有するdsRNA分子を有する医薬組成物を提供するものであり、ここで、当該dsRNA分子は、以下からなる群より選択される；
NM_005180.5 または NM_002931.3で示される19〜25の連続するヌクレオチドと実質的に相同なヌクレオチドの第一の鎖と、当該第一の鎖と実質的に相補的な第二の鎖を含むdsRNA分子；および
NM_005180.5 または NM_002931.3で示される配列を含むヌクレオチドの第一の鎖と、当該第一の鎖に実質的に相補的な配列を含むヌクレオチドの第二の鎖を含むdsRNA分子；
ここで、当該dsRNA分子は、NM_005180.5 または NM_002931.3に示される鎖を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現を阻害する。
【００７２】
当該方法の１つの態様において、当該dsRNA分子は、上述の群より選択される。
【００７３】
本発明は更に、トポイソメラーゼを安定化する方法であって、細胞を以下からなる群より選択される標的遺伝子の一部分に実質的に相同なdsRNA分子の有効量と接触させ、それによりトポイソメラーゼを安定化することを含む方法を提供する；
NM_005180.5で示されるポリヌクレオチド;
NM_005180.5で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
NM_002931.3で示されるポリヌクレオチド; および
NM_002931.3で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
当該方法の１つの態様において、当該細胞はヒト細胞である。当該細胞は、癌細胞であってもよい。当該癌細胞は、心臓、肺、胃腸管系、尿生殖器管、肝臓、骨、神経系、婦人科、血液学的、皮膚または副腎癌細胞からなる群より選択される。
【００７４】
当該方法のもう一つの態様において、当該当該癌細胞は、心臓、肺、胃腸管系、尿生殖器管、肝臓、骨、神経系、婦人科、血液学的、皮膚または副腎癌細胞からなる群より選択される。
【００７５】
当該方法のもう一つの態様において、当該E3ユビキチンリガーゼ阻害剤は、DNAおよびRNAからなる群より選択される。当該RNAは、dsRNA分子であってよい。当該dsRNA分子は、以下からなる群より選択される標的遺伝子の一部分に対して実質的に相同であってもよい：
NM_005180.5で示されるポリヌクレオチド;
NM_005180.5で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
NM_002931.3で示されるポリヌクレオチド; および
NM_002931.3で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００７６】
当該方法のもう一つの態様において、当該dsRNA分子は、上述の群から選択される。
【００７７】
本発明は更に、以下の工程を含むRNA干渉のための標的を識別する方法を提供する：
標的遺伝子配列としてE3ユビキチンリガーゼを選択すること；
細胞を当該標的遺伝子配列の一部分に対して実質的に相同なdsRNAと接触すること；
当該dsRNAがトポイソメラーゼを安定化するか否かを決定すること。
【００７８】
当該方法の１つの態様において、当該標的遺伝子配列は、以下からなる群より選択される：
NM_005180.5で示されるポリヌクレオチド;
NM_005180.5で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
NM_002931.3で示されるポリヌクレオチド; および
NM_002931.3で示されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００７９】
当該方法のもう一つの態様において、当該トポイソメラーゼは、トポイソメラーゼI、ヒトトポイソメラーゼIIα、ヒトトポイソメラーゼIIβおよびその組み合わせからなる群より選択される。
【００８０】
当該方法のもう一つの態様において、当該細胞はトポイソメラーゼ阻害剤の有効量と接触され、細胞増殖が調節される。
【００８１】
当該方法の１つの態様において、当該試験薬剤はdsRNA分子である。当該dsRNA分子は、以下からなる群より選択される標的遺伝子の一部分と実質的に相同であってもよい；
NM_005180.5で定義されるポリヌクレオチド;
NM_005180.5で定義されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
NM_002931.3で定義されるポリヌクレオチド; および
NM_002931.3で定義されるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００８２】
当該方法の更なる態様において、当該dsRNA分子は上述の群から選択される。
【００８３】
本発明は更に、癌を有する対象を治療する方法であって、請求項６１の医薬組成物の有効量を、トポイソメラーゼ阻害剤の有効量と共に癌を有する対象に対して投与することを具備する方法を提供する。
【００８４】
当該方法の１つの態様において、当該治療は、癌細胞の増殖を調節する。当該調節は、細胞死を増大することを含んでよい。当該治療は、当該トポイソメラーゼ阻害剤に対する感受性を増大してもよい。
【００８５】
当該方法の更なる態様において、当該トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシン(Camptothecin)、カンプト(Campto)、カンプトさー(Camptosar)、ハイカムチン(Hycamtin)、ドキソルビシン(Doxorubicin)、テニポシド(Teniposide)、アドリアマイシン(Adriamycin)、ベペシド(VePesid)、エトポシド(etoposide)、その類似体、誘導体および組み合わせからなる群より選択される。
【００８６】
本発明は、更に、肺癌を有する対象を治療する方法であって、上述の医薬組成物の有効量を肺癌を有する対象に投与することを含む方法を提供する。
【００８７】
当該方法のもう一つの態様において、当該医薬組成物のdsRNA分子は以下からなる群より選択される:
NM_005180.5で示される19〜25の連続するヌクレオチドに対して実質的に相同なヌクレオチドの第一の鎖と、当該第一の鎖に実質的に相補的な第二の鎖を含むdsRNA分子；および
NM_005180.5で示される配列を含むヌクレオチドの第一の鎖と、当該第一の鎖に実質的に相補的な第二の鎖を含むdsRNA分子；
ここで、当該dsRNA分子は、NM_005180.5で示される鎖を含む核酸分子によりコードされるタンパク質の発現を阻害する。
【００８８】
請求項６９の方法、ここにおいて、当該dsRNA分子は、以下からなる群より選択される：
配列番号３で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号４で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子：
配列番号５で示される配列を含む第一の鎖と、配列番号６で示される配列を含む第二の鎖とを有するdsRNA分子：および
その組み合わせ。
【００８９】
本発明はまた、以下からなる群より選択される標的遺伝子の一部分に対して実質的に相同なdsRNA分子の有効量：
NM_005180.5で定義されるポリヌクレオチド;
NM_005180.5で定義されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
NM_002931.3で定義されるポリヌクレオチド;
NM_002931.3で定義されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
癌を有する哺乳類に対して前記化合物を投与するための指導手段(instruction means)；
を含むキットを提供する
当該キットの１つの態様において、当該dsRNA分子は、上述の群から選択される。
【００９０】
当該キットのもう一つの態様において、当該キットは、更にトポイソメラーゼ阻害剤の有効量を含む。
【００９１】
定義
他に記載がない限り、ここにおいて使用される用語は、当該技術分野の当業者による慣用的な使用に従って理解されるべきである。以下に提供される用語の定義に加えて、分子生物学の一般的な用語の定義は、また以下に見出されてもよい：Rieger et al., 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5th Ed., Berlin: Springer-Verlag; and in Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement)。
【００９２】
ここで使用される場合、単一型の「１の」(「a」)、「１の」(「an」)および「当該」(「the」)は、他の指示のない限り複数への言及も含む。例えば、標的細胞(「a」 target cell)は、１または１以上の標的細胞を含む。
【００９３】
「対象」により、生物が意味され、これは、移植される細胞のドナーまたはレシピエントまたは当該細胞自身である。「対象」はまた、生物（哺乳類またはヒトを含む）をも指し、それに対して本発明の核酸分子が投与され得る。１つの態様において、対象は哺乳類または哺乳類細胞である。哺乳類は、これに限定するものではないが、ヒト、家畜、スポーツ（競技用・娯楽用）動物、げっ歯類およびペットを含む。他の態様において、態様は、ヒト対象またはヒト細胞である。
【００９４】
ここで使用される場合、物質の「有効量」または「十分な量」は、有益または所望の結果、臨床学的結果を含む結果およびそれ自体、を生ずるために十分な量であり、「有効量」はそれが適用される状況に依存する。有効量は１または１以上の投与において投与されてよい。１つの側面において、当該用語「有効量」は、細胞、組織または対象に対して、弾独で投与される、または追加の治療薬と組み合わせで投与される場合の阻害性化合物の量をいい、癌または当該疾患の進行を防ぐまたは改善するために有効である。もう一つの側面において、有効量は、トポイソメラーゼの分解を安定化する阻害性化合物の量をいう。治療学的に有効な用量は、更に、症状の改善、例えば、関連のある医学的な状態の治療、治癒、予防または改善、そのような状態の治療、治癒、予防または改善の率の増大を生ずるのに十分な化合物の量をいう。個体に対して単独で投与される活性成分が適用される場合、治療学的に有効な用量は、成分単独の量をいう。組み合わせで投与される場合、治療学的に有効な用量は、連続的または同時に組み合わせで投与されるにせよ、当該治療学的効果を生じる当該活性成分の組み合わされた量をいう。
【００９５】
ここで使用される場合、用語「発現を阻害するために十分な量」は、標的遺伝子から産生されるmRNAまたはタンパク質のレベルまたは安定性を減少するのに十分なdsRNAの濃度または量をいう。ここで使用される場合、「発現を阻害すること」は、標的遺伝子から産生されるタンパク質および／またはmRNAのレベルをなくす、または観察可能に減少することをいう。特異性は、当該細胞の他の遺伝子における明白な影響なく当該標的遺伝子を阻害する能力をいう。阻害の結果は、当該細胞または生物(例えば、例において以下に示される)の外面的な性質の試験により、またはRNA溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイでの遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合吸着アッセイ(ELISA)、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ(RIA)、他のイムノアッセイ、および蛍光標示式細胞分析(FACS)などの生化学的技術により確認することが可能である。細胞株または生物全体におけるRNAに媒介される阻害について、遺伝子発現は、そのタンパク質産生物が容易にアッセイできるレポーターまたは薬物耐性遺伝子を使用することにより都合よくアッセイすることが可能である。そのようなレポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼ(AP)、ベータガラクトシダーゼ(LaZ)、ベータグルコロニダーゼ(GUS)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、ルシフェラーゼ(Luc)、ノパリンシンターゼ(NOS)、オクトピンシンターゼ(OCS)、およびその誘導体を含む。複数選択可能なマーカーは、アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノスリシン(phosphinothricin)、ピューロマイシン(puromycin)、およびテトラサイクリンに対する耐性を与えるものが入手可能である。
【００９６】
当該アッセイに依存して、遺伝子発現の量の定量化が、本発明に従い処理されない細胞と比較して、10%, 25%, 35%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% または 99%よりも大きい阻害の程度を決定することを可能にする。インジェクトされた物質のより低い容量とdsRNAの投与後のより長い時間は、細胞のより小さいフラクションにおける阻害を生じ得る(例えば、標的細胞の少なくとも10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75%, 90%, 若しくは 95%または95%以上)。細胞における遺伝子発現の定量化は、標的mRNAまたは標的タンパク質の翻訳の蓄積のレベルでの阻害と同様な量を示し得る。例として、阻害の効率は、細胞における遺伝子産生の量をアッセイすることにより決定することが可能であり：mRNAは阻害性のdsRNAのために使用される領域の外側のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブを使用して決定することが可能であり、または転写されたポリペプチドは、当該領域のポリペプチド配列に対して生じる抗体で検出することが可能である。
【００９７】
ここで使用される場合、「治療」または「治療学的な」および文法的に関連する用語は、何れも疾患の何れかの結果を改善する、例えば、生存率の延長、病的状態の減少、および／または代替的な治療様式の副産物である副作用の減少、疾患の完全な撲滅は必要とされない。一つの側面において、当該阻害性化合物の投与は、寧ろ、細胞死を増加する、またはトポイソメラーゼ阻害剤に対する反応における障害により化学療法の効能を改善する。もう一つの側面において、当該阻害性化合物はトポイソメラーゼを安定化する。
【００９８】
ここで使用される「トポイソメラーゼの安定化」は、当該阻害性化合物で処理されていない対象に比較して、標的遺伝子によりコードされるタンパク質またはRNAレベルを増大することをいう。タンパク質またはRNAレベルの増大は、転写または翻訳の増加、分解率の減少、またはこれらの因子の組み合わせのために生じ得る。１つの側面において、当該阻害性化合物は、当該トポイソメラーゼの分解率を減少する。
【００９９】
ここで使用される「トポイソメラーゼ」は、DNAのトポロジーにおいて作用する酵素をいう。５つのヒトDNAトポイソメラーゼが同定され、特徴付けられている：トポイソメラーゼ(TOPI)I、トポイソメラーゼIIα(TOPIIα)、トポイソメラーゼIIβ(TOPIIβ)、トポイソメラーゼIIIα(TOP3α)、およびトポイソメラーゼIIIβ(TOP3β)。何れのヒトまたは哺乳類のトポイソメラーゼも、当該阻害性の化合物の投与により安定化されてよい。１つの側面において、当該阻害性の化合物はTOPI、TOPII(αおよび／またはβ)またはその組み合わせを安定化する。
【０１００】
ここで使用される場合、「トポイソメラーゼ阻害剤」は、１または１以上のトポイソメラーゼ酵素の生物学的活性を低下する化合物である。トポイソメラーゼ阻害剤は典型的に癌の治療に使用されるが、それらは他の治療学的適用も有する。何れのトポイソメラーゼ阻害剤も、本発明の当該阻害性化合物と組み合わせて使用され得る。トポイソメラーゼ阻害剤の非限定的な例は、カプトテシン、イリノテカン、トポテカン、ドキソルビシン、テニポシド、エトポシドおよびその類似体、誘導体および組み合わせを含む。トポイソメラーゼ阻害剤は、多くの種類の癌に対して有効であるようであり、これらに限定するものではないが、それらは心臓、肺、胃腸管、非尿生殖管、肝、骨、神経系、婦人科学、血液学(例えば、急性リンパ性白血病または非リンパ性白血病)、皮膚、副腎、乳房、前立腺、精巣、リンパ腫、および多形性グリア芽細胞腫を含む。それらは他の治療、例えば、本発明の阻害性の化合物、化学療法、放射線、光力学的治療(photodynamic therapy)、免疫療法、骨髄移植、遺伝子治療、ホルモン療法、プロトン療法、標的療法、およびワクチン療法などと組み合わせて投与され得る。
【０１０１】
ここで使用される「E3ユビキチンリガーゼ」は、標的タンパク質におけるリジン残基に対してユビキチンを共有結合性に結合し、それによりプロテアソームによる分解のために当該標的タンパク質を標識するタンパク質またはマルチタンパク質複合体である。当該E3リガーゼはE3酵素からユビキチン分子を受け取り、それを当該標的タンパク質に移行できる、或いは当該E2酵素および基質の両方と相互作用できるが、それ自身はユビキチンを受け取らない。マルチタンパク質複合体である場合、当該用語「E3ユビキチンリガーゼ」はその複合体における何れのタンパク質に対しても同等に適用される。
【０１０２】
ここで使用される場合、当該用語「阻害性(の)化合物」は、タンパク質および非タンパク質分子の両方を含む。幾つかの態様において、当該阻害剤は小分子である。好ましくは、当該阻害剤は全身性の毒性を避けるために十分な特異性を有する化合物である。他の態様において、当該阻害剤はヌクレオチドである。
【０１０３】
ここにおいて使用される際、それが１または１以上のE3ユビキチンリガーゼである場合、E3ユビキチンリガーゼ化合物は「阻害性化合物」または「E3ユビキチンリガーゼ阻害剤」である。当該化合物が、当該阻害性化合物の不在において観察されるのに比較して当該リガーゼの発現または活性を減少する場合、それはE3ユビキチンリガーゼの阻害剤である。一つの側面において、当該化合物は、E3ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子の阻害剤である。他の側面において、それはリガーゼ自身の阻害剤である。一つの態様において、化合物が当該阻害性化合物の不在において観察されるのに比較してトポイソメラーゼ阻害剤の存在において細胞障害または細胞死を増大する場合、当該化合物はE3ユビキチンリガーゼの阻害剤である。細胞死または障害は、例えば、アポトーシスのレベル、抗腫瘍活性または腫瘍転移(顕微鏡または顕微鏡によるアッセイにより確認される通り)を試験することにより評価することが可能である。もう一つの態様において、それがトポイソメラーゼの分解を安定化する場合には当該化合物はE3ユビキチンリガーゼの阻害剤である。
【０１０４】
ここに開示される化合物の塩および立体異性体、エナンチオマーを含む、は本発明の範囲内である。
【０１０５】
ここに用いられる「塩」としては酸または塩基塩の化合物を作ることによって変更されるインスタント化合物の塩である。塩は、薬学的に容認できる。薬学的容認可能塩の例は、限定されないが、アミンのような塩基残留物の鉱物または有機酸塩；カルボン酸のような産生残留物のアルカリまたは有機塩を含む。塩は、有機または無機酸を用いて作ることができる。そのような酸塩は、塩化物、臭化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、スルホン酸塩、ギ酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、芳香族酸塩、サルチル酸塩、アスコルビン酸塩等である。カルボン酸塩はアルキレン土類金属、ナトリウム、カリウムまたはリチウムである。
【０１０６】
ここで用いる「アルキル」としては、規定数の炭素原子を有する両枝分かれおよび直鎖飽和脂肪族炭化水素基を含むことを意図する。したがって、“Ｃ1−Ｃnアルキル”としてのＣ1−Ｃnは１，２…、または直線もしくは枝分かれ配列のｎ炭素を含むことを規定し、かつ特にメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等を含む。例えば“Ｃ1−Ｃ6アルキル”としてのＣ1−Ｃ6は、直線もしくは枝分かれ配列で１，２，３，４，５、または６炭素を含む個々の部分を含むことを規定する。“アルコキシ”は、Ｃx−Ｏ−Ｃy、ここでｘおよびｙは独立して炭素１から６である、のような酸素ブリッジを通してコアに付けられた炭素原子の表示数のアルカリ部分を表わす。
【０１０７】
用語「シクロアルキル」は、３〜８総炭素原子のアルカンの環状リングまたはこの範囲内（すなわちシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルまたはシクロオクチル）の幾つかの数を意味するべきである。
【０１０８】
もし、炭素原子の数なしが明記されるならば、用語「アルキレン」は少なくとも炭素−炭素二重結合を含む非芳香族炭化水素基、直線もしくは枝分かれと呼ばれ、非芳香族炭素−炭素二重結合の最大可能な数まで存在してもよい。
【０１０９】
用語「アルキニル」は少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む、直線もしくは枝分かれ炭化水素基と呼ばれ、非芳香族炭素−炭素三重結合の最大可能な和まで存在してもよい。したがって、「Ｃ2−Ｃ6アルキニル」は２，３，４，５または６炭素原子、例えば１つの炭素−炭素三重結合有するか、または４もしくは５炭素原子、炭素−炭素三重結合を２つまでもしくは６炭素原子を有し、かつ炭素−炭素三重結合を３つまでを有するアルキニル基基を意味する。アルキニル基は、エチニル、プロピニル、およびブチニルを含む。アルキルに関して前述したように、アルキニル基の直線または枝分かれ部分は三重結合を含んでもよいし、もし置換アルキニル基が示されるならば、置換されてもよい。
【０１１０】
ここで用いられるアルキルの異なる態様において、アルキルはＣ１−Ｃ６アルキルである。ここで用いられるアルケニルの異なる態様において、アルケニルはＣ２−Ｃ６アルケニルである。ここで用いられるアルキニルの異なる態様において、アルキニルはＣ１−Ｃ６アルケニルである。
【０１１１】
ここで用いる「アリル」としては、各リングで１０原子までの幾つかの安定なモノ環式、二環式、三環式炭素リングを意味することを意図し、少なくとも１つのリングは芳香族である。そのようなアリル要素の例は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロ−ナフチル、インダニル、ビフェニル、フェナントリル、アントリルまたはアセナフチルを含む。この場合、アリル置換基は二環式であり、かつ１つのリングは非芳香族であり、結合が芳香族リングを経由することを理解する。
【０１１２】
ここで用いられる用語「ヘテロ環式アリル」は、各リングで１０原子までの安定なモノ環式、二環式を表し、少なくとも１つのリングは芳香族であり、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選ばれる１〜４のヘテロ原子を含む。この定義の範囲内のヘテロアリル基は限定されないが：ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリニル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソオキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、キノオキサリニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、アジリジニル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒヂロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリニル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ヂヒドロキニリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、アクリジニル、カルバゾリル、ソノリニル、キノオキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニルベンゾフラニル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、テトラーヒドロキノリンを含む。この場合、ヘテロアリル置換基は二環式であり、かつ１つのリングは非芳香族マタハヘテロ原子を含み、結合が芳香族リングを経由、またはリングを含むヘテロ原子を経由することを理解する。もし、ヘテロアリルが窒素原子を含めば、その相当するＮ−酸化物はまたこの定義によって包含する。
【０１１３】
ここで用いられる用語「ヘテロ環」または「ヘテロ環式アルキル」は、Ｏ，ＮおよびＳからなる群から選ばれる１〜４ヘテロ原子を含む５−〜１０−部分からなる非芳香族リングを意味することを意図し、二環式基を含む。それゆえ、「ヘテロ環式アルキル」は限定されない次の：インダゾリル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルフォリニル、チオモルホリニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピペロジニル、テトラヒドロチオフェニル等を含む。ヘテロ環が窒素を含めば、その相当Ｎ−酸化物もまたこの定義の包含することを理解する。
【０１１４】
アリキル、アルキレン、アルキニル、環式アルキル、アリル、へテロ環式アリルおよびヘテロ環式アルキル置換基は、特別に規定されない他の点なしで、置換されるか未置換されてもよい。例えば、（Ｃ1−Ｃ7）アルキルはＯＨ，ハロゲン、アルコキシ、モノ−またはジアルキルアミノ、またはモノホリニル、ピペリジニル等のようなヘテロ環式アルキルから選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよい。「ハロゲン化」Ｃ1−Ｃ6アルキルは直線または枝分かれ配列の１〜６炭素を有する基を含むことを規定され、各炭素は独立してＣ1−Ｃ6のそれぞれまたはＣ1−Ｃ6の幾つかに１，２または３のハロゲンで置換されることができる。本発明の化合物において、アルキル、アルケニル、環式アルキル、ヘテロ環式アルキル、アリルおよびヘテロ環式アリル基は、１つ以上の水素原子を代替非水素基で置き換えることによって更に置換することができる。これらは、限定されないが、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミニ、カルボキシ、シアノおよびカルバモイルを含む。
【０１１５】
用語「置換する」は指定される置換基による置換の多様な度合を含むことを思うべきである。多数置換基部分が開示または請求される場合、置換化合物は１つ以上の開示もしくは請求される置換基部分、単一もしくは複数で独立して置換することができる。独立して置換されるとは、２つ以上の置換基が同じもしくは異なることができることを意味する。
【０１１６】
本発明の化合物上の置換基および置換パターンは、化学的に安定であり、かつ容易に入手可能な出発材料からその業界で知られた技術で容易に合成できる化合物、同様にそれらの方法は以下に示す、を提供するために当業者によって選択できる。置換基が１以上の基でそれ自身置換されるならば、安定な構造がもたらす限り、これらの多数基は同じ炭素または異なる炭素上であってもよい。
【０１１７】
本発明の態様において、未置換、置換芳香族環は６部分からなる環を含む。１態様において、環はＣ1−Ｃ10アルキル、アルケニルまたはアルキニルによって置換され、それぞれ直線もしくは枝分かれであってもよく、かつそれぞれそれら自身１以上のアミノ基で置換されてもよい。
【０１１８】
１態様において、本発明のアルキル、アルケニルまたはアルキニル、アルキレンまたはアルキレン基は１，２，３，４，５，６，７，８，９または１０炭素原子を有する。
【０１１９】
本発明の化合物の選択において、当業者は種々の置換基、すなわちＲ1，Ｒ2およびＲ3は化学構造連結性のよく知られた原理にしたがって選ぶべきであることを認識するであろう。
【０１２０】
ここで開示される種々の要素の全ての組合せは本発明の範囲内である。
【０１２１】
ここで使用される場合、用語「接触する」および「投与する」は交換可能に使用され、本発明の阻害性化合物がインビトロ、インビボまたはエキソビボの何れかで細胞に対して送達され、遺伝子をサイレンシングする工程をいう。
【０１２２】
「調節する(modulate)」および「調節(modulation)」により、当該標的遺伝子の発現、またはRNA分子または１若しくは１以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードするRNA分子等価物のレベル、または１若しくは１以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が上方調節(up regulated)または下方調節(down regulated)され、それにより発現、レベルまたは活性が当該分子の不在において観察されるよりも増大または減少することを意味する。例えば、当該用語「調節する(modulate)」は「阻害する」を意味することが可能であり、本発明の範囲において、調節の好ましい形態は阻害であるが、当該文言「調節(modulate)」の使用はこの定義に限定されるものではない。
【０１２３】
「阻害する」により、RNA若しくは１または１以上の遺伝子産物をコードするRNA等価物のレベル若しくはその発現産物のレベルが、本発明の核酸分子の不在において観察されるよりも下位に減少されることを意味する。１つの態様において、siRNA分子での阻害は、RNAi反応を媒介できない不活性または減弱された分子の存在において観察されるレベルを好ましくは下回る。
【０１２４】
用語「抗体」は、単数のイムノグロブリン遺伝子または複数のイムノグロブリン遺伝子または抗原若しくはエピトープに特異的に結合することの可能なそのフラグメントに由来する、それらの後に作られる、またはそれらにより実質的にコードされるペプチド若しくはポリペプチドを含む(Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273; and Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97を参照されたい)。当該用語抗体は、抗原に結合する部分、即ち、「抗原結合部位」(例えば、フラグメント、部分列、相補性決定領域(CDRs)など)を含み、抗原に結合する能力を保持し、（ｉ）Fabフラグメント、VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価のフラグメント；（ｉｉ）F(ab')2フラグメント、当該ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合される2つのFabフラグメントを含む二価のフラグメント；（ｉｉｉ）VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一のアームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント；（v）dAbフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)、これはVHドメインからなる；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域(CDR)を含む。単一鎖抗体も、用語「抗体」に参照することにより含まれる。
【０１２５】
用語「遺伝子」は生物学的機能に関連する核酸の何れのセグメントに対しても言及するために広く使用される。従って、遺伝子は、それらの発現のためのコーディング配列および／または調節性配列を含む。例えば、「遺伝子」は発現性mRNA、機能性RNAまたは調節性配列を含む特異的部分をいう。「遺伝子」はまた、非発現DNAセグメント、例えば、他のタンパク質のための認識配列を形成するセグメントを含む。「遺伝子」は種々の供給源から得ることが可能であり、それらは問題の供給源からクローニングすること、または公知若しくは予測される配列情報から合成することを含み、および所望のパラメータを有するように設計された配列を含んでもよい。当該用語「遺伝子」は転写産物(例えば、メッセージ)の生成に関連するDNAのセグメントを含む核酸配列を含み、それは次に翻訳されてポリペプチド鎖を生じ、または遺伝子転写物、再生または安定性を制御する。遺伝子は、当該コーディング領域に先行するおよび続く領域、例えば、リーダーおよびトレーラー、プロモーターおよびエンハンサー、並びに適用可能であれば、個々のコーディングセグメント(エクソン)の間の介在配列(intervening sequences; イントロン)を含んでもよい。
【０１２６】
「標的遺伝子」により、RNAをコードする核酸、例えば、これに限定するものではないが、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸配列を意味する。当該標的遺伝子は、細胞、内因性遺伝子、導入遺伝子または外因性遺伝子、例えば、病原体、例えば、ウイルスなど、その感染後に当該細胞に存在する遺伝子などに由来する遺伝子であってよい。当該標的遺伝子に接触する細胞は、何れの生物、より好ましくは動物、最も好ましくはヒトに由来する、またはそれに含まれる。非限定的な動物の例は、脊椎動物および無脊椎動物を含む。本発明と関連して、「遺伝子」または「標的遺伝子」は多くE3ユビキチンリガーゼ、例えば、しかしながらこれらに限定されるものではないが、Bmi1およびRING1などである。
【０１２７】
用語「天然に生じる」は、人工的に生産されたものとは異なるような自然界で見出され得る物体を記載するために使用される。例えば、(ウイルスを含む)生物において存在するタンパク質またはヌクレオチド配列であり、天然の供給物から単離され得る、および実験室において人により故意に修飾されていないものは天然に生じるものである。
【０１２８】
用語「単離された」は、その本来の環境、例えば、それが天然に生じている場合、天然の環境から動かされた物質を含む。例えば、生きている動物において存在する天然に生じたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されておらず、しかしながら、自然の系統において同時に存在する物質の幾つかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部分であってもよく、および／またはそのようなポリヌクレオチド若しくはポリペプチドは組成物の一部分であってもよく、およびそのようなベクターまたは組成物がその自然の環境の一部分ではないものに更に単離される。ここで使用される場合、単離された物質または組成物はまた「精製された」組成物であってもよく、即ち、それは絶対的な純度が要求されるわけではなく；寧ろ、それは相対的な定義として意図される。ライブラリーから得られた個々の核酸は電気泳動的な均質性にまで慣習的に精製され得る。代替的な側面において、当該発明は、ゲノムDNAから、ライブラリーにおける他の配列から、または他の環境から、少なくとも１、２、３、４、５または５以上の大きさのオーダーで精製された核酸を提供する。
【０１２９】
用語「ゲノム」は、生物の完全に遺伝学的な物質をいう。
【０１３０】
「標的部位」により、「標的にされる」標的RNA内の配列、またはそのアンチセンス領域内に配列を含むsiRNA構築物により媒介される切断を意味し、当該標的配列に対して相補的である。
【０１３１】
用語「形質転換」は、宿主細胞のゲノムに核酸フラグメントを移入し、結果として遺伝学的に安定な遺伝的体質を生じることをいう。「宿主細胞」は、外因性の核酸分子により形質転換された、または形質転換が可能な細胞である。変換された核酸フラグメントを含む宿主細胞は「遺伝子組み換え」細胞と称し、遺伝子組み換え細胞を含む生物を「遺伝子組み換え生物」と称する。
【０１３２】
用語「細胞のトランスフェクション」は、追加のDNAの組み込みによる新しい核酸物質の細胞による獲得をいう。従って、トランスフェクションは、物理的または化学的な方法を使用して細胞に核酸を挿入することをいう。幾つかのトランスフェクション技術が当業者に知られており、それらは以下を含む：リン酸カルシウムDNA共沈殿(calcium phosphate DNA co-precipitation)；DEAEデキストラン(DEAE-dextran)；エレクトロポレーション(electroporation)；陽イオン性リポソーム媒介トランスフェクション(cationic liposome-mediated transfection)；およびタングステン粒子促進微小粒子衝撃(tungsten particle-facilitated microparticle bombardment (Johnston (1990))。リン酸ストロンチウムDNA共沈殿もまたトランスフェクション法である。
【０１３３】
用語「細胞の形質導入」はDNAまたはRNAウイルスを使用し、細胞に核酸を移入する方法をいう。細胞への移入のためのRNAウイルス(即ち、レトロウイルス)は、ここでは化学的なレトロウイルスの形質導入という。当該レトロウイルス内に含まれる外因性の核酸物質は当該形質導入された細胞のゲノムに組み込まれる。キメラDNAウイルス(例えば、治療学的薬剤をコードするcDNAを有するアデノウイルス)を形質導入された細胞は、そのゲノムに組み込まれた外因性の核酸分子を有することはないが、当該細胞内の染色体外に保持される外因性の核酸物質を発現することが可能であろう。
【０１３４】
用語「形質転換された」、「形質導入された」、「遺伝子組み換え」および「組み換え」は、異種性の核酸分子が導入された宿主細胞または生物をいう。当該核酸分子は当該分野に一般的に公知およびサンブルック(Sambrook, infra.)に記載されるゲノムに安定に組み込まれ得る。PCRの公知の方法は、しかしこれに限定するものではないが、対のプライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、変性プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的にミスマッチなプライマーなどを使用する方法を含む。例えば、「形質転換された」、「形質転換された」および「遺伝子組み換え」細胞は、トランスフォーム過程を経ており、それらの染色体に組み込まれた外来性遺伝子を含む。用語「非形質転換の」はトランスフォーム過程を経ていない正常な細胞をいう。
【０１３５】
用語「遺伝子サイレンシング」は、遺伝子発現、例えば、導入遺伝子、異種性遺伝子および／または内因性遺伝子発明などの抑制をいう。遺伝子サイレンシングは、転写に影響する過程および／または転写後の機序に影響する過程を経て媒介されてもよい。幾つかの態様において、遺伝子サイレンシングは、siRNAがRNA干渉を経る配列特異的な様式において問題の遺伝子のmRNAの分解を阻害する際に生じる。幾つかの態様において、遺伝子サイレンシングは、アレル特異的であってもよい。「アレル特異的」遺伝子サイレンシングは、遺伝子の１のアレルを特異的にサイレンシングすることをいう。
【０１３６】
用語「RNA干渉」(RNAi)は、siRNAにより惹起される、配列特異的な転写後の遺伝子サイレンシングをいう。RNAiは、ショウジョウバエ、線虫、菌類および植物などの多くの生物体において見られ、抗ウイルス性の防御、トランスポゾン活性の調節、および遺伝子発現の制御に関与すると考えられている。RNAiの間、siRNAは、結果として生じる遺伝子発現の配列特異的な阻害により標的mRNAの分解を誘導する。
【０１３７】
成句「小干渉RNA(small interfering RNA)」または「短干渉RNA(short interfering RNA)」または「siRNA」は、ヌクレオチドのRNA二重鎖をいう、または幾つかの代替的な側面において、問題の核酸、例えば、遺伝子に対して標的化されたRNAの単一分子(これは、幾つかの態様において、ループなどの二次構造を有する)をいう。「RNA二重鎖」は、RNA分子の少なくとも2つの領域の間で相補的に対になることにより形成される構造をいう。従って、「RNA二重鎖」は、1、2、3または3以上のRNA分子を含み得る。siRNAは、当該siRNAの二重鎖部分のヌクレオチド配列が標的遺伝子のヌクレオチド配列に対して相補的である遺伝子に対して「標的化」される。従って、標的遺伝子の配列を使用することにより、何れのsiRNAもルーチン的に設計され、且つ製造される。幾つかの態様において、当該に重鎖siRNAの長さは少なくとも30ヌクレオチド未満である。幾つかの態様において、二重鎖siRNAの長さは30ヌクレオチドよりも長い。幾つかの態様において、当該二重鎖は、長さが40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11または10または10よりも少ないヌクレオチドであってよい。幾つかの態様において、当該二重鎖の長さは19〜25ヌクレオチド長である。当該siRNAのRNA二重鎖部分は、ヘアピン構造の部分であってもよい。１つの側面において、本発明のsiRNAにヘアピン構造がない。当該二重鎖部分に加えて、当該ヘアピン構造が二重鎖を形成する２つの配列の間に位置するループ部分を含んでもよい。当該ループは、長さを変えてもよい。幾つかの態様において、当該ループは、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 または 13 または13以上のヌクレオチド長である。当該ヘアピン構造は、また3'または5'オーバーハング部分を含んでもよい。幾つかの態様において、当該オーバーハングは、0, 1, 2, 3, 4 または 5ヌクレオチド長の3'または5'オーバーハングである。当該siRNAは核酸配列によりコードされてもよく、当該核酸配列はプロモーターも含み得る。当該核酸配列は、またポリアデニル化シグナルを含んでもよい。幾つかの態様において、当該ポリアデニル化シグナルは、合成された最小のポリアデニル化シグナルである。当該siRNAは全体的に、または一部分において、合成ヌクレオチド、天然の塩基または修飾塩基を含むことが可能である。
【０１３８】
ここで使用される場合、「可働的に結合(Operably linked)」は、2または2以上の核酸(例えば、DNA)セグメントの間の機能的な関係をいう。典型的には、それは、転写された配列に対する転写性調節性配列の機能的な関係をいう。仮にそれが適切な宿主細胞または他の発現系においてコーディング配列の転写を刺激または調節する場合、例えば、プロモーターは、コーディング配列、例えば、本発明の核酸など、に対して可働的に結合される。一般的に、転写される配列に対して可働的に結合されたプロモーター転写調節配列は、当該転写配列に対して物理的に連続しており、即ち、それらはcis作用(cis-acting)である。しかしながら、幾つかの転写調節配列、例えば、エンハンサーなどは、物理的な連続またはそれらにより転写が強められるコーディング配列のごく近くに隣接して位置する必要はない。
【０１３９】
「ベクター」は、細胞に感染し、トランスフェクトし、一次的または永続的に形質導入できる核酸を含む。ベクターが、裸の核酸であっても、タンパク質または脂質と複合化された核酸であってもよいことは認められているだろう。当該ベクターは、任意にウイルス性または細菌性核酸および／またはタンパク質および／または膜(例えば、細胞膜、ウイルス性の脂質エンベロープなど)を含む。これに限定されるものではないが、ベクターは、レプリコン(例えば、RNAレプリコン、バクテリオファージなど)を含み、それに対して、DNAフラグメントが結合してもよく、複製されてもよい。従って、ベクターは、これに限定されるものではないが、RNA、自律自己複製環状または線状DNA若しくはRNA(例えば、プラスミド、ウイルスなど、例えば、米国特許No. 5,217,879を参照されたい)を含み、発現および非発現プラスミドの両方を含む。あるベクターは、それらが可働的に結合された遺伝子の発現に方向付けられることが可能である。そのようなベクターはここでは「発現ベクター」と称される。
【０１４０】
リコンビナント微生物または細胞培養物が「発現ベクター」の宿主であると記載されるとき、これは、染色体外の環状および線状DNAと、当該宿主染色体に組み込まれているDNAの両方を含む。ベクターが宿主細胞により維持されているとき、当該ベクターは有糸分裂の間ずっと当該細胞により安定に複製されてもよく、或いは当該宿主のゲノムに組み込まれてもよい。
【０１４１】
プラスミドは、最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に使用されてもよい。しかしながら、本発明は、等価の機能を与える発現ベクターの他の形態、例えば、ウイルス性ベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなど)を含むことを意図する。
【０１４２】
ここで使用される場合、用語「プロモーター」は細胞、例えば、植物細胞または動物細胞、におけるコーディング配列の転写を駆動することの可能な全ての配列を含む。従って、本発明の構築物におけるプロモーターは、cis作用転写制御要素および調節性配列を含み、これらは遺伝子の転写のタイミングおよび／または速度を制御または調節することに関与する。例えば、プロモーターは、cis作用転写制御要素であり得、エンハンサー、プロモーター、転写終結区、複製開始点、染色体性組込配列、5'および3'非翻訳領域、またはイントロン配列を含み、これらは転写制御に関与する。これらのcis作用配列は、典型的にタンパク質または他の生体分子と相互作用し、転写を実行(開始または停止、制御、調節など)する。「構成」プロモーターは、発生または細胞分化の殆どの環境条件および状態下で連続して発現を駆動するものである。「誘導可能」または「調節可能」なプロモーターは、環境の条件または発生の条件の影響下で本発明の核酸の発現を方向付ける。
【０１４３】
「組織特異的」なプロモーターは特定の細胞または組織または器官においてのみ活性な転写制御要素である。組織特異的な調節は、問題の組織に特異的なタンパク質をコードする遺伝子が発現されることを保証するある内因性因子により達成される。そのような因子は、哺乳類において存在し、それにより特定の組織が発生することを可能にすることが知られている。
【０１４４】
用語「過剰発現」は、正常または非遺伝子組み換え細胞または生物における発現のれべるを超える、遺伝子組み換え細胞または生物における発現のレベルをいう。
【０１４５】
成句「核酸」または「核酸配列」はオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含み、またはこれらの何れかのフラグメント、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNA(例えば、mRNA、rRNA、tRNAなど)であってよく、一本鎖若しくは二本鎖であってもよく、センス鎖またはアンチセンス鎖であってもよく、ペプチド核酸(PNA)であってもよく、何れのDNA様若しくはRNA様物質、天然起源若しくは合成起源であってもよく、例えば、iRNA、リボヌクレオタンパク質(例えば、iRNPなど)を含んでもよい。当該用語は、核酸、即ち、オリゴヌクレオチドを包含し、天然ヌクレオチドの公知の類似体、天然に生じる核酸、合成核酸および組み換え核酸を含む。当該用語は、合成バックボーンを有する核酸様構造をも包含する(例えば、Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156を参照されたい)
「アミノ酸」または「アミノ酸配列」はオリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列またはそのフラグメント、一部分またはこれらの何れかのサブユニット、および天然に生じた分子または合成分子を含む。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合により、または修飾されたペプチド結合により、即ち、アイソスター、互いに結合されたアミノ酸を含み、且つ20遺伝子にコードされるアミノ酸以外の修飾アミノ酸を含んでもよい。用語「ポリペプチド」はまたペプチドおよびポリペプチドフラグ綿度、モチーフなどを含んでもよい。当該用語はグリコシル化ポリペプチドも含む。本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、全ての「ミメティック」および「ペプチドミメティック」形態を含み、更に詳しくは以下に記載するとおりである。
【０１４６】
ここで使用される場合、用語「組み換え」は、その天然環境においては隣接しない核酸が、「バックボーン」核酸に対して隣接する核酸を含み得る。一つの側面において、核酸は、核酸「バックボーン分子」の集合における5％または5％以上の数の核酸挿入を意味する。本発明に従うと「バックボーン分子」は、核酸、例えば、発現ベクター、自己複製核酸、ウイルス、組み込み核酸および、目的の核酸挿入を維持またはマニピュレートするために使用される他のベクターまたは核酸を含む。
【０１４７】
一つの側面において、豊富な核酸は、組み換えバックボーン分子の集合における50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%または99%以上の数の核酸挿入を表す。
【０１４８】
「組み換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、組み換えDNA技術により産生された、例えば、所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外因性のDNA構築物により形質転換された細胞から産生された、ポリペプチドまたはタンパク質をいう。「合成」ポリペプチドまたはタンパク質は、化学合成により製造されたものであり、詳しくは以下に記載するとおりである。
【０１４９】
プロモーターで転写を開始するRNAポリメラーゼがコーディング配列をmRNAに転写するであろう場合に、プロモーター配列はコーディング配列に「可働可能に結合」し得る。
【０１５０】
「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリでオキシヌクレオチドまたは2つの相補的なポリでオキシヌクレオチド鎖の何れも含み、これらは化学的に合成されてもよい。そのような合成オリゴヌクレオチドは、5'リン酸を持たず、従って、キナーゼの存在においてATPでリン酸を付与することなしに他のオリゴヌクレオチドと結合されない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントと結合し得る。
【０１５１】
2つの核酸またはポリペプチドに関連して、成句「実質的に相同な」は、以下に詳細を示すような最大の一致について比較および整列し、何れかの公知の配列比較アルゴリズムの１つを使用した場合に、または視覚的な試験により、例えば、少なくとも約50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%または99%よりも高いヌクレオチドまたはアミン酸残基(配列)同一性を有する2または2以上の配列をいうことが可能である。
【０１５２】
当該ポリペプチドが本質的にその機能的特性を保持する条件で、特に、そのような配列が当該分枝の活性部位ではない部位で生じた場合に、「実質的に相同な」アミノ酸配列は、また、1または1以上の保存的または非保存的なアミノ酸配列、欠失または挿入により参照配列とは異なる配列を含み得る。保存的なアミノ酸置換は、例えば、1つのアミノ酸が他の同じ分類のアミノ酸と置換される(例えば、1つの疎水性アミノ酸の置換、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン、またはもう他の例は、1つの極性アミノ酸の置換、例えば、アルギニンのリジンでの、グルタミン酸のアスパラギン酸での、グルタミンのアスパラギン酸での置換)。1または1以上のアミノ酸が、例えば、ポリペプチドから欠失してもよく、それによりその生物学的活性に顕著な変化を伴わないポリペプチドの置換の修飾が得られる。
【０１５３】
「変異体」は、1または1以上の塩基対、コドン、イントロン、エクソンまたはアミン酸残基(それぞれ)で修飾されたぽりヌクレオチドまたはポリペプチドであり、天然に生じた配列のポリペプチドの生物学的活性が依然として保持されているものを含む。変異体は、多くの手段により産生することが可能であり、例えば、エラー・プローンRCR(error-prone PCR)、混合(shuffling)、オリゴヌクレオチド指向性突然変異生成(oligonucleotide-directed mutagenesis)、アッセンブリPCR(assembly PCR)、性的PCR突然変異生成(sexual PCR mutagenesis)、インビボ突然変異生成(in vivo mutagenesis)、カセット突然変異生成(cassette mutagenesis)、帰納的アンサンブル突然変異生成(recursive ensemble mutagenesis)、指数アンサンブル突然変異生成(exponential ensemble mutagenesis)、部位特異性突然変異生成(site-specific mutagenesis)、遺伝子リアッセンブリ(gene reassembly)、GSSMおよびその何れかの組み合わせなどの方法を含む。
【０１５４】
「ハイブリダイゼーション」は、塩基の対合を経て核酸鎖を相補鎖と結合する方法を含む。ハイブリダイゼーション反応は、感応性且つ選択的であり、それにより目的の特定の配列が低濃度で存在するサンプル中でさえ同定され得る。ストリンジェントな条件は、例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液における塩またはホルムアミドの濃度により、またはハイブリダイズ温度により定義され得るものであり、これらは当業者に周知である。例えば、厳密性(stringency)は、塩の濃度を低下すること、ホルムアミドの濃度が上昇すること、またはハイブリダイゼーション温度が上昇すること、ハイブリダイゼーションの時間を変化させることにより増大するが、詳しくは以下に記載するとおりである。代替的な側面において、本発明の核酸は、先に記載の種々の厳密性条件下でハイブリダイズするそれらの能力により定義される。
【０１５５】
一般的に、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにはより高い温度が必要となり、対してより短いプローブはより低い温度が必要である。相補鎖がそれらの融解温度より下の環境で存在する場合、ハイブリダイゼーションは一般的に変性される核酸配列の再アニールの能力に依存する。プローブとハイズリダイズ可能な配列との間の望まれる相同性の程度が高くなるほど、使用し得る相対的な温度は高くなる。結果的に、より高い相対温度が、より高いストリンジェントな反応条件を作り出す傾向があり、他方でより低い温度ではより低い条件となる。ハイブリダイゼーション反応の厳密性の更なる詳細および説明については以下を参照されたい；see Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)。  
「ストリンジェントな条件」または「高いストリンジェント条件」は、ここで定義される場合、しかしながらこれに限定するものではないが、（１）洗浄のための低いイオン強度および高い温度、例えば、50℃で0.015 M 塩化ナトリウム／0.0015 M クエン酸ナトリウム／0.1% ドデシル硫酸ナトリウムの使用するもの；および／または（２）ハイブリダイゼーション中のホルムアミドなどの変性剤、例えば、42℃で、0.1% ウシ血清アルブミン／0.1% フィコール／0.1% ポリビニルピロリドン／750 mM 塩化ナトリウム、75 mM クエン酸ナトリウムを含む50 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.5) を含む50% (v/v) ホルムアミドの使用ものである。「中程度のストリンジェント条件」は、これに限定されるものではないが、次により記載され；Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989；および洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度およびSDSの%)の使用を含み、上述の条件よりも低いストリンジェントである。中程度のストリンジェント条件の例は、37℃で、20% ホルムアミド、5ｘSSC (150 mM NaCl, 15 mM クエン酸三ナトリウム)、50 mM リン酸ナトリウム(pH 7.6)、5ｘデンハート溶液、10% 硫酸デキストランおよび20 mg/mL 変性断片化サケ精子DNAを含む溶液で一晩インキュベートし、次に約37-50℃で1ｘSSC当該フィルタを洗浄する。当業者は、例えば、プローブの長さなどの因子を適応するための必要性によりどのように温度、イオン強度などを調節するのかは認識できるであろう。
【０１５６】
「相補性」または「相補的な」により、伝統的なワトソン-クリックまたは非伝統的な種類の方法若しくは正確な対合の何れかにより、核酸が他の核酸配列と水素結合を形成し、それによりオリゴヌクレオチドとDNAまたはRNA標的との間で安定且つ特異的な結合を生じることが可能なことを意味する。特に、プリンは、ピリミジンで塩基対を形成し、シトシンと対合されたグアニン(G:C)、DNAの場合にはチミジンと対合されたアデニン(A:T)またはRNAの場合にはウラシルと対合されたアデニン(A:U)の組み合わせを形成する。各々が、互いに実質的に相補的である少なくとも1の領域を有する条件では、2つのポリヌクレオチドが互いに完全に相補的でない場合でさえも、互いにハイブリダイズすることは理解される。ここで使用される場合、用語「実質的に相補的な」は、2つの核酸が、それらのヌクレオチドが少なくとも80％で相補的であることを意味する。好ましくは、当該2つの核酸配列が、少なくとも85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%または99%よりも高く相補的である。或いは、「実質的に相補的」は、2つの核酸配列が高いストリンジェント条件下でハイブリダイズできること意味する。ここで使用される場合、用語「実質的に相同」は、2つの核酸配列が少なくとも80%の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、2つの核酸配列は、少なくとも85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%または100%の配列同一性を有する。
【０１５７】
「薬学的賦形剤」は、アジュバント、担体、pH調整剤および緩衝剤、張性調整剤、湿潤剤、保存剤などの物質を含む。
【０１５８】
「薬学的に許容される」は、非毒性、不活性および／またはヒト若しくは他の哺乳類に生理学的に適合性の成分をいう。
【０１５９】
「薬学的に許容される製剤」または「医薬組成物」により、それらの所望の活性のために最も適した身体の部位に本発明の阻害性化合物の有効な分布を可能にする組成物または製剤を意味する。
【０１６０】
「全身性投与」により、インビボ系での血流における化合物の吸収または蓄積と、それに続く全身に亘る分布を意味する。
【０１６１】
本発明のsiRNA分子は、個体に対して以下に対応する用量で投与することが可能である：体重1kg当たり約0.01μg - 100 mg、好ましくは体重1kg当たり約0.01μg - 10 mg、より好ましくは体重1kg当たり約0.01 μg - 1 mgおよび最も好ましくは体重1kg当たり約0.01μg - 0.1 mg。
【０１６２】
遺伝子の抑制
本発明は、動物細胞における遺伝子抑制または遺伝子サイレンシングする方法を提供する。本発明の１つの側面において、当該遺伝子は転写性である。本発明の１つの側面において、当該動物は哺乳類、例えば、ヒトである。
【０１６３】
本発明は、特に、遺伝子発現をサイレンシングまたは抑制するために使用することが可能なsiRNAを提供する。ここで提供されるものは遺伝子抑制の組成物および方法であり、そこにおいて標的配列特異的なsiRNAは標的配列と相互作用し、遺伝子発現を抑制する。本発明の１つの側面において、遺伝子抑制は転写性の遺伝子発現である。特にsiRNAが、宿主細胞の核膜に入り、特異的に目的の配列を標的化する。マーカーまたはレポーター遺伝子および化合物が遺伝子発現をモニターするために使用され得る。これらに限定されるものではないが、コンピューターに基づく方法を含む当該分野において公知の他の方法およびアッセイが遺伝子発現をモニターするために使用され得る。転写または遺伝子発現における何れかの量の減少が本発明の範囲内であり、約1%〜100%のどの程度における減少も含まれる。
【０１６４】
標的配列
ここで提供される遺伝子サイレンシングの方法の１つの側面において、標的配列が同定される。標的配列は、siRNAにより標的化、認識および／または結合される配列である。標的配列は、これらに限定するものではないが、核酸およびタンパク質またはそれらの誘導体、変異体またはその一部分を含む。本発明の１つの側面において、標的配列はプロモーター、イントロンおよびエクソン配列を含む。本発明の１つの側面において、当該標的配列はE3ユビキチンリガーゼをコードする。他の側面において、E3ユビキチンリガーゼはBmi1および／またはRING1である。更なる側面において、当該E3ユビキチンリガーゼはsiRNAにより標的化される。
【０１６５】
プロモーターは、これらに限定するものではないが、最初期(CMV immediate early)、HSVチミジンキナーゼ(HSV thymidine kinase)、初期および後期SV40(early and late SV40)、レトロウイルスからのLTR(LTRs from retrovirus)、並びにマウスメタロチオネインI(mouse metallothionein I)、熱ショックタンパク質、並びにレトロウイルスからのLTR(LTRs from retroviruses)を含む。原核細胞または真核細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を調節するための他の公知のプロモーターも使用されてよい。
【０１６６】
本発明のもう一つの側面において、当該標的配列は、レポーターまたはマーカー遺伝子を含む。当該レポーターまたはマーカー遺伝子は遺伝子発現をモニターするために使用される。特に、当該レポーターまたはマーカー遺伝子は、遺伝子抑制またはサイレンシングをモニターするために使用される。本発明の１つの側面において、当該レポーター遺伝子は緑色蛍光タンパク質である。レポートまたはマーク機能を有する何れの化合物、標識または遺伝子もここで提供される方法において使用され得る。
【０１６７】
本発明のもう一つの側面において、標的配列は、例えば、ベクターにより宿主細胞のゲノムに挿入される。核酸配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般的には、当該配列は、挿入断片およびベクターの設計に続いて、当該ベクターの所望の位置に適切な制限エンドヌクレアーゼをライゲーションされる。或いは、当該挿入断片およびベクターの両方における平滑末端が結合される。クローニング技術の多様性が当該技術において公知であり、例えば、以下に記載される：Ausubel and Sambrook。そのような手順および他の手順は当業者の視野内にあると思われる。
【０１６８】
当該ベクターは、プラスミド、ウイルス性粒子またはファージの形態にあってよい。他のベクターは、染色体性、非染色体性および合成DNA配列、SV40の誘導体；細菌性プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組み合わせから誘導されたベクター、例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよびオーエスキー病などのウイルスDNAを含む。原核生物および真核生物の宿主との使用のためのベクターの種々のクローニングおよび発現は、例えば、Sambrookにより記載される。
【０１６９】
使用され得る特定の細菌性ベクターは、商業的に入手可能なプラスミドを含み、それは周知のクローニングベクターpBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, DR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 および pCM7の遺伝子要素を含む。特に真核生物のベクターはpSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, および pSVL (Pharmacia)を含む。しかしながら、何れの他のベクターも、当該宿主細胞において複製可能であり、且つ生存可能である限り使用されてよい。
【０１７０】
siRNAと標的配列の入手
本発明の核酸は、siRNAおよびそれらをコードする核酸を含み、例えば、cDNAライブラリーのクローニングおよび発現、メッセンジャー若しくはゲノムDNAのPCRによる増幅などにより製造、単離および／または操作され得る。本発明の方法の実行において、相同的な遺伝子は、ここで記載された通りに、テンプレート核酸を操作することにより修飾され得る。本発明は、当該技術分野において公知の何れの方法またはプロトコールまたは装置との協同において実行されてよく、それらは科学文献および特許文献において十分に記載されている。
【０１７１】
本発明の実行のために使用される核酸は、RNA、iRNA、siRNA、アンチセンス核酸、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、ウイルスまたはそのバイブリッドの何れであろうとも、種々の供給源から単離され、遺伝子操作され、増幅および／または発現／組み換えにより産生されてもよい。これらの核酸から産生された組み換えポリペプチドは、個々に単離されても、クローニングされても、所望の活性が試験されてもよい。何れの組み換え発現系が使用されてもよく、そこには、細菌性、哺乳類、酵母、昆虫または植物細胞の発現系が含まれる。
【０１７２】
或いは、これらの核酸は、インビトロで周知の化学合成技術、例えば、Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; U.S. Patent No. 4,458,066に記載された技術により合成されてもよい。或いは、核酸は商業的供給源から入手することも可能である。
【０１７３】
クローニング、DNA単離、増幅および精製のための標準的な技術、DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応のための標準的な技術
、および種々の分離技術は公知のものであり、一般的に当業者に使用されている。多くの標準的技術は以下に記載されている；Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes , Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993); Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Ed.) 1979 Meth Enzymol. 68; Wu et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 and 101; Grossman and Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (Ed.) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old and Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; and Setlow and Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York。使用される略語および命名法は、当該分野における標準的であると思われ、ここで引用される文献などの専門雑誌において一般的に使用される。
【０１７４】
本発明の方法を実行するために使用される核酸の入手および操作のための他の有用な手段は、ゲノムサンプルからのクローニング、所望に応じて、ゲノムクローンまたはcDNAクローンからのスクリーニングおよび再クローニング、挿入、単離または増幅のためのものでもある。本発明の方法において使用される核酸の供給源は、ゲノムまたはcDNAライブラリーを含み、例えば、哺乳類人工染色体(mammalian artificial chromosomes (MACs))、例えば、米国特許Nos. 5,721,118; 6,025,155を参照されたい；ヒト人工染色体(human artificial chromosomes)、例えば、Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335を参照されたい；酵母人工染色体(yeast artificial chromosomes (YAC))；細菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes (BAC))；P1 人工染色体(P1 artificial chromosomes)、Woon (1998) Genomics 50:306-316を参照されたい；P1由来ベクター(P1-derived vectors (PACs))、Kern (1997) Biotechniques 23:120-124を参照されたい；コスミド、組み換えウイルス、ファージまたはプラスミドに含まれる。
【０１７５】
本発明の実行において、本発明の核酸または本発明の修飾核酸は、増幅により複製され得る。増幅はまた、本発明の核酸のクローニングまたは修飾のために使用され得る。従って、本発明は、本発明の核酸を増幅するための増幅用プライマー配列対を提供する。当業者は、これらの配列の何れか部分または全長のための増幅用プライマー配列対を設計することが可能である。
【０１７６】
増幅反応は、また、サンプル中の核酸の量を定量するために(例えば、細胞サンプルにおけるメッセージの量など)、当該核酸を標識(例えば、アレイまたはブロットにそれを適用するため)、当該核酸を検出するために、またはサンプル中の特定の核酸の量を定量するために使用され得る。本発明の１つの側面において、細胞またはcDNAライブラリーから単離されたメッセージは増幅される。
【０１７７】
当業者は、適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択および設計することが可能である。増幅方法も、当該技術分野において周知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、PCR(例えば、PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) and PCR Strategies (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y.,などを参照されたい)、リガーゼ連鎖反応(LCR) (例えば、Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117を参照されたい)；転写増幅(例えば、Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173を参照されたい)；および自己維持配列複製(self-sustained sequence replication (例えば、Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874を参照されたい)；Qβレプリカーゼ増幅(Q Beta replicase amplification (例えば、Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491を参照されたい), 自動Qβレプリカーゼ増幅アッセイ(automated Q-beta replicase amplification assay (例えば、Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271を参照されたい))および他のRNAポリメラーゼ媒介技術(RNA polymerase mediated techniques (例えば、NASBA, Cangene, Mississauga, Ontarioを参照されたい))；更に、以下も参照されたい；Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; 米国特許Nos. 4,683,195 および 4,683,202；並びにSooknanan (199
5) Biotechnology 13:563-564。
【０１７８】
細胞
本発明はまた、その遺伝子発現が本発明の方法または組成物を使用してサイレンシングされた細胞を提供する。本発明の１つの側面において、細胞は、転写性にサイレンシングされた遺伝子発現を有する。遺伝子が転写性にサイレンシングされた当該細胞は動物細胞を含む。動物細胞は、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞を含む。例示的な動物細胞は、インビトロ、エキソビボまたはインビボの何れかのCHO、COS、HeLa、HT29または何れかのマウスまたはヒト細胞株を含む。適切な宿主の選択は、当業者の能力で行なえる。
【０１７９】
適切である場合、宿主細胞は慣習的な栄養性培地で培養でき、それはプロモーターの活性化、形質転換体の選択、本発明の遺伝子の増幅のために適切であるように修飾される。
【０１８０】
適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度にまでの当該宿主株の増殖に続き、選択されたプロモータが適切な手段(例えば、温度移行または化学的誘導など)により誘導され、当該細胞は、siRNAとの相互作用が可能な更なる期間に亘って培養されてよい。
【０１８１】
他の側面において、遺伝子がサイレンシングされた当該細胞が宿主動物に存在する。
【０１８２】
siRNA
ここにおいて提供される方法において使用されるsiRNAは、ここで記載されるように、種々の供給源から得られ得る。siRNAは、約1〜約200ヌクレオチド、約5 〜約100 ヌクレオチド、約10 〜約 50 ヌクレオチド、約15 〜約30 ヌクレオチド、または約 19 〜約25 ヌクレオチドを含み得る。
【０１８３】
本発明のdsRNAは、1または1以上の鎖の重合されたリボヌクレオチドを含んでもよい；それは、当該リン酸-糖バックボーンまたは当該ヌクレオシドの何れかに対する修飾を含んでもよい。例えば、天然のRNAのホスホジエステル結合は、修飾されて少なくとも1の窒素または硫黄へテロ原子を含んでもよい。RNA構造における修飾は、特異的な遺伝的阻害を可能にするように、同時にdsRNAにより生じる幾つかの生物における遺伝子的パニック反応を避けるように、目的に合わせてよい。同様に、塩基が、アデノシンデアミナーゼの活性を妨げるために修飾されてもよい。RNAは酵素学的に、または一部／全体的に有機合成により産生されてもよく、何れの修飾されたリボヌクレオチドはインビトロ酵素学的合成または有機合成により導入できる。
【０１８４】
二重鎖構造は、単一の自己相補的なRNA鎖により形成されてもよく(即ち、ヘアピンループの形成)または2つの相補的なRNA鎖により形成されてもよい。RNA二重鎖形成は、当該細胞の内部または外部の何れかで惹起されてよい。当該RNAは、細胞当たり少なくとも１コピーを送達することが可能な量で導入されてよい。より高い用量の二重鎖物質はより効果的な阻害を得られる。
【０１８５】
ここで提供される本発明の1つの側面において、siRNAは、標的配列と完全な相同性を有し、標的特異的な反応を齎す。本発明のもう一つの側面において、siRNAは約99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 92%, 91%, 90%, 88%, 86%, 84%, 82%, 80%, 78%, 76%, 74%, 72%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, または 5%の相同性を標的配列と有する。本発明のもう一つの側面において、siRNAは、1よりも多くの標的配列を標的化し、およびマーカーまたはレポーター遺伝子を標的化する。配列同一性(即ち、相同性)の程度は、何れかのコンピュータプログラムおよび関連するパラメータ、ここで記載されるもの、例えば、BLAST 2.2.2. または FASTA バージョン3.0t78などを含むものを、デフォルトパラメータと共に使用して決定されてよい。配列同一性を決定する目的のために、DNA配列をRNA配列と比較した場合、チミジンヌクレオチドは、ウラシルヌクレオチドと等価である。
【０１８６】
相同性または配列同一性は、配列分析ソフトウェア(例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)を使用して測定することが可能である。そのようなソフトウェアは、種々の欠失、置換および他の修飾について相同性の程度を割り当てることにより同様な配列に対応する。用語「相同性」および「同一性」は、2または2以上の核酸またはポリヌクレオチド配列に関連において、同じであるか、または何れかの数の配列比較アルゴリズムを使用する、または手作業でアラインメントおよび視覚検査による測定するときの比較ウインドウまたは指示領域に亘り最大の一致について比較および整列された場合に同じである記載されたパーセンテージを有するアミノ酸残基または配列である2または2以上の配列をいう。配列比較のために、１つの配列を参照配列として作用させてもよく、本発明発の配列に対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用した場合、試験および参照配列はコンピュータに入力され、配列のコーディネートを設計し、必要であれば、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用することが可能であり、或いはパラメータが指定されてもよい。当該配列比較アルゴリズムを次に、プログラムパラメータに基づいて参照配列と比較した試験配列について配列同一性のパーセンテージを算定する。
【０１８７】
siRNAの核への侵入
本発明の一側面において、ターゲット配列特異的siRNAは、核膜に侵入(通過)するよう設計され、これによって遺伝子発現がサイレンシングされる。本発明の方法および組成物の様々な側面において、核への侵入は、核膜を通る巨大分子輸送プロセス、核酸を核内に輸送可能なベクターによって達成され、例えば、レンチウイルスベクターといったウイルスベクター、核輸送介在ペプチド、エレクトロポレーション、脂質小胞、MPGまたはこれらの組み合わせ、当該分野で既知の全ての技術(例えば、Morris, M. C., Vidal, P., Chaloin, L., Heitz, F. & Divita, G. A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells. Nucleic Acids Res 25, 2730-6 (1997)参照)、当該分野で既知のいずれかの形質移入薬剤(例えば、Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986))によって達成できる。
核膜を通る巨大分子輸送プロセスは当該分野で既知であり、核移入または核移出のいずれかを介在する可溶性輸送受容体が多く同定されている。これらの受容体の大部分は、1つの大きなタンパク質のファミリーに属し、その全ては、タンパク質移入受容体インポーチンβ(importinβ）(カリオフェリンβ(karyopherinβ)としても知られる)との相同性を共有している。このファミリーのメンバーは、それらが積荷を運ぶ方向に基づいて、インポーチンまたはエクスポーチン(exportin)と分類されている。最近までに、当該ファミリーは、酵母サッカロマイセス・セレビジエにおいて14のメンバーを含み、ヒトにおいて少なくとも22のメンバーを含んでいる。
巨大分子輸送組成物として、インポーチンβ(カリオフェリンβとしても知られる)を含むことに加えて、本発明のある側面は、SV40 T抗原核局在シグナル、ヒトLEDGF/p75タンパク質、ヌクレオポリン(nucleoporins)及び輸送因子またはいずれかのその他の巨大分子輸送プロセスを含み得る(例えば、Yasuhara, Exp Cell Res. 2004 Jul 1;297(1):285-93; Maertens, J Biol Chem. 2004 May 25; Zolotukhin, J Virol. 1999 Jan;73(1):120-7参照)。
遺伝子サイレンシングの適用
本発明は、疾病治療のための、ターゲット配列または遺伝子の遺伝子発現を阻害する組成物または方法を提供する。本発明による組成物または方法を使用して阻害できる対象となる遺伝子は、癌に関与する遺伝子または癌治療への応答に関与する遺伝子を含むが、これらに限定されない。一側面において、癌治療への応答に関与する遺伝子は、E3ユビキチンリガーゼ(例えば、Bmi1および/またはRING1であるが、こられに限定されない)をコードする。したがって、本発明は、また、癌治療への応答に関与する遺伝子をターゲットとするsiRNAを提供する。本願によって提供される方法は、インビトロ、エクスビボ又はインビボで実施されてよい。
本発明の一側面において、siRNAは、E3ユビキチンリガーゼをサイレンシングする。別の側面において、siRNAは、E3ユビキチンリガーゼであるBmi1および/またはRING1をサイレンシングする。ヒトBmi1のヌクレオチド配列は、NM_005180.5に見つかり、ヒトRING1のヌクレオチド配列は、NM_002931.3に見つかる。したがって、例示的なsiRNAは、(a)配列番号:3に示される配列を含む第1の鎖と、配列番号:4に示される配列を含む第2の鎖とを有するdsRNA分子;(b)配列番号:5に示される配列を含む第1の鎖と、配列番号:6に示される配列を含む第2の鎖とを有するdsRNA分子;(c)配列番号:7に示される配列を含む第1の鎖と、配列番号:8に示される配列を含む第2の鎖とを有するdsRNA分子;(d)配列番号:9に示される配列を含む第1の鎖と、配列番号:10に示される配列を含む第2の鎖とを有するdsRNA分子;および(e)これらの組み合わせ、から成る群から選択されるsiRNAを含む。その他の例示的なsiRNA配列は、以下の表に示される配列(これらは、本願に示されるように、遺伝子サイレンシング活性が容易に試験される)ならびにBmi1およびRING1の断片である。
【表１−１】
2010515771.tif 000009
【表１−２】
2010515771.tif 000010
【表１−３】
2010515771.tif 000011
【表１−４】
2010515771.tif 000012
【表２−１】
2010515771.tif 000013
【表２−２】
2010515771.tif 000014
【表２−３】
2010515771.tif 000015
【表２−４】
2010515771.tif 000016
【０１８８】
疾病治療
本発明は、疾病に関与する遺伝子発現をサイレンシングする組成物および方法を提供し、より好ましくは、疾病の治療に関与する遺伝子発現をサイレンシングする組成物および方法を提供する。多くの症状は、それらが関与する遺伝子(すなわち、治療すべき疾病の原因となるまたは原因の一部となる遺伝子)を有する。その他の症状において、遺伝子の発現は、化学療法といった療法に対する反応に影響する。本願によって教示されるsiRNAといった阻害性化合物は、ターゲット遺伝子の発現を阻害し、それによって疾病の病徴を軽減または治療様式に対する応答性を増大させるために使用できる。本願によって教示される阻害性化合物は、トポイソメラーゼ阻害剤と組み合わせて、癌といった疾病を治療するために使用できる。
【０１８９】
阻害性化合物は、トポイソメラーゼ阻害剤の前に、後にまたは同時に投与することができる。阻害性化合物およびトポイソメラーゼ阻害剤の繰り返される投与もまた意図される。
【０１９０】
試験化合物の単一または複数回の投与は、静脈内、腹腔内、腫瘍内、皮下または皮内を含むがこれらに限定されない、任意の都合よい様式の投与を使用して行うことができる。
【０１９１】
阻害性化合物およびトポイソメラーゼ阻害剤は、異なる部位に、且つ、異なる投与計画で投与することができる。本発明の併用療法の増強された治療効果は、従来の抗癌剤の非常に毒性のある療法に対する、有望な代替となることを意味する。同様に、阻害性化合物およびトポイソメラーゼ阻害剤の増強された効果は、これらの化学療法剤の有効性の改良に加えて、低い用量によるこれらの薬剤の投与を可能とし、これによって、対象における副作用の誘導を低減し、および/または、トポイソメラーゼ阻害剤に対する耐性の発生率を低下させまたは当該耐性の発生を遅延もしくは予防する。
【０１９２】
上述の方法を使用した癌の治療のための用量および投与プロトコールは、方法およびターゲットとする癌に応じて変化し、一般に、当該分野にて認識されている多数のその他の因子に依存するだろう。
【０１９３】
本方法によって治療される対象は、トポイソメラーゼ阻害剤による治療に感受性がある腫瘍を有する対象を含む。そのような腫瘍は、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経中枢、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、上皮小体、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺および子宮の癌であり得る。本方法の化合物によって治療される腫瘍は、中枢神経系の新生物:多形膠芽腫、星状細胞腫、乏突起細胞腫、上衣および脈絡叢腫瘍(ependymal and choroids plexus tumors)、松果体部腫瘍、神経細胞腫瘍、髄芽細胞腫、シュワン腫、髄膜腫、髄膜肉腫:眼の新生物:基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫;内分泌腺の新生物:脳下垂体の新生物、甲状腺の新生物、副腎皮質の新生物、神経内分泌系のシステムの新生物、胃腸膵内分泌系の新生物、性腺の新生物;頭頚部の新生物:頭頸部癌、口腔、咽頭、喉頭、歯原性腫瘍:胸部の新生物:肺大細胞癌、小肺細胞癌(small cell lung carcinoma)、非小肺細胞癌、胸部の新生物、悪性中皮腫、胸腺腫、胸部の原発性胚細胞腫瘍(primary germ cell tumors of the thorax);消化管の新生物:食道の新生物、胃の新生物、肝臓の新生物、胆嚢の新生物、外分泌腺の膵臓の新生物、小腸、虫垂および腹膜の新生物結腸および直腸の腺癌、肛門の新生物;尿生殖路の新生物:腎細胞癌、腎盂および尿管の新生物、膀胱の新生物、尿道の新生物、前立腺の新生物、陰茎の新生物、精巣の新生物;女性生殖器の新生物:陰門および膣の新生物、頚部の新生物、子宮体の腺癌、卵巣癌、婦人科学的肉腫;乳房の新生物;皮膚の新生物:基底細胞癌、扁平上皮癌、皮膚線維肉腫、メルケル細細胞腫瘍;悪性黒色腫;骨および軟繊維の新生物:骨原性肉種、悪性線維性組織球腫、クロンドロ肉腫(chrondrosarcoma)、ユーイング肉腫、原始神経外胚葉性腫瘍、血管肉腫;細網内皮系の新生物:骨髄異形成症候群、急性骨髄白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、HTLV−1及びＴ細胞白血病/リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、毛様細胞性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、マスト細胞白血病;子供の新生物:急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、骨腫瘍、横紋筋肉腫、リンパ腫、腎臓および肝臓腫瘍を含むが、これらに限定されない。
剤形および送達方法は、一般に、治療する部位および疾病に応じて最適化される。例示的な剤形は、非経口投与(例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与または皮下投与)に適したものを含むが、これらに限定されず、ミセル、リポソーム又は薬剤放出カプセル(徐放性となるよう設計された生物適用性コーティング内に取り込まれた活性薬剤)に封入された剤形;摂取可能な剤形;クリーム、軟膏及びゲルといった局所使用のための剤形;および、吸入剤、エアロゾル及びスプレーと言ったその他の剤形を含む。本発明の化合物の用量は、治療が必要な程度および重症度、投与された組成物の活性、対象の健康状態、および当業者に周知のその他の考慮すべき事項に従って、変化するだろう。
医薬組成物
本願に記載される阻害性化合物は、投与に適した医薬組成物に取り込ませることができる。そのような組成物は、典型的に、薬剤および医薬的に許容可能な担体を含む。補助的な活性化合物もまた、組成物に取り込ませることができる。
【０１９４】
様々な医薬組成物ならびにその製造および使用のための技術は、本願の開示に照らせば当業者に既知であろう。適した医薬組成物および関連する管理上の技術の詳細なリストについては、本願の詳細な教示が参照されてよく、更に、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (Lippincott, Williams & Wilkins 2003)といったテキストによって補われてよい。
【０１９５】
医薬的に許容可能な材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤またはカプセル化材は、対象となる化学物質を、一臓器または身体の部分から、別の臓器または身体の部分に運びまたは輸送することに関与する。それぞれの担体は、製剤のその他の成分に適合し且つ患者に有害ではないという意味で、「許容可能」でなくてはならない。医薬的に許容可能な担体としての役割を果たし得る材料のいくつかの例は、糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびショ糖;デンプン、例えば、コーンスターチおよびじゃが芋澱粉;セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース;粉末状トラガカントゴム;麦芽;ゼラチン;タルク;賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐薬ワックス;油、例えば、落花生油、綿実油、サフラワー油、胡麻油、オリーブオイル、トウモロコシ油および大豆油;グリコール、例えば、プロピレングリコール;ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール;エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル;寒天;緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム;アルギン酸;パイロジェンフリー水;等張食塩水;リンガー溶液;エチルアルコール;リン酸緩衝液;および医薬製剤に使用されるその他の非毒性適合物質を含む。湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、並びに、着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味料、調味料および香料、防腐剤および酸化防止剤もまた、組成物中に存在し得る。
【０１９６】
治療製剤は、溶解し、腫瘍部位に治療組成物を送達することができる任意の経路によって投与できる。潜在的に有効な投与経路は、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、組織内、同所的(orthotopic)投与等を含むが、これらに限定されない。静脈注射のための一製剤は、保存静菌水(preserved bacteriostatic water)の、無菌非保存水(sterile unpreserved water)の、および/または、0.9%の注射用の無菌塩化ナトリウムUSPを含むポリ塩化ビニル又はポリエチレンのバッグにて希釈される溶液中の治療組成物を含む。治療タンパク質製剤は、好ましくは減圧下で、凍結乾燥し、無菌粉末として保存することができ、その後、注射に先立ち、静菌水(例えば、ベンジルアルコール防腐剤を含む)または滅菌水にて再構築することができる。
患者の治療
本発明の遺伝子サイレンシング法および組成物は、患者の治療に使用できる。一側面において、ターゲット配列は患者のゲノムに組み込まれることができ、患者は、ターゲット配列特異的siRNAにて治療され得る。インビボで細胞を形質移入する方法(例えばプロトコール)及び組成物(例えば製剤)は、本願で議論されるように、既知である。
上述の治療的アプローチは、広範囲の外科、化学療法または放射線治療レジメンの任意の1つと組み合わせることができる。一実施態様において、阻害性化合物は、トポイソメラーゼ阻害剤と組み合わせることができ、任意にその他の治療レジメンを含むことができる。本発明の治療的アプローチは、化学療法(またはその他の治療)の用量の低減および/または投与頻度の低下を可能とし、全ての患者にとって、特に化学療法剤の毒性に十分耐性がない患者にとって利点となる。
特定の阻害性化合物またはそのような化合物の組み合わせの抗腫瘍活性は、単独でまたはトポイソメラーゼ阻害剤との組み合わせで、または、低濃度のグルコースの存在下で、様々なインビトロおよびインビボアッセイシステムを使用して評価することができる。治療活性を評価するインビトロアッセイは、細胞増殖アッセイ、軟寒天アッセイおよび腫瘍促進活性を示すその他のアッセイ、および、阻害性化合物がトポイソメラーゼの分解を低下させる程度を決定できる分解アッセイ、および、化合物がトポイソメラーゼDNA複合体を安定化させる程度を決定できる結合アッセイを含む。
【０１９７】
インビボで、阻害の効果は、適切な動物モデルで評価することができる。例えば、異種前立腺癌モデル(xenogenic prostate cancer models)を使用することができ、このモデルでは、ヒト前立腺癌外植片または継代された異種移植片組織が、ヌードまたはSCIDマウスといった免疫を損なった動物に導入される(Klein et al. , 1997, Nature Medicine 3: 402-408)。例えば、PCT特許出願WO98/16628および米国特許6,107,540は、一次腫瘍の発生、微小癌組織の転移、後期段階の疾病の特徴である骨芽細胞の転移の形成を要約できるヒト前立腺癌の様々な異種移植片モデルを記載している。効果は、腫瘍形成の阻害、腫瘍退行または転移等を測定するアッセイを使用して予測できる。
【０１９８】
アポトーシスの促進を評価するインビボアッセイは、阻害性化合物の評価に役立つ。一実施態様において、阻害性化合物で治療した腫瘍を有するマウスからの異種移植片は、アポトーシス性病巣の存在について試験することができ、治療を行っていないコントロール異種移植片を有するマウスと比較できる。アポトーシス性病巣が治療を受けたマウスの腫瘍にて見つかる程度は、阻害性化合物とトポイソメラーゼ阻害剤との組み合わせの治療的効果の指標を提供する。
【０１９９】
動物(例えば犬、げっ歯動物)における腫瘍の予防または治療に対して効果的であると決定される化合物は、ヒトにおける腫瘍の治療に有用である可能性がある。ヒトにおける腫瘍の治療に関する当業者は、動物研究で得られたデータに基づいて、用量およびヒトへの化合物の投与経路がわかるだろう。一般に、ヒトにおける用量および投与経路は、体表面積に適合させた場合に、動物のそれらと同等であると予想される。
【０２００】
阻害性化合物を使用したスクリーニング
本発明はまた、阻害性化合物を使用し、および、基質（例えばトポイソメラーゼ、しかしこれに限定されない）のE3リガーゼユビキチン化に対する効果を試験する、スクリーニング方法を提供する。
【０２０１】
一実施態様において、方法は、試験薬剤をE3ユビキチンリガーゼと組み合わせて使用して、試験基質のユビキチン化を調節する化合物を同定することを含む。方法は、試験化合物の存在下および非存在下での、E3ユビキチンリガーゼ基質のユビキチン化の決定;およびE3ユビキチンリガーゼの活性が、コントロールペプチドの存在下における活性と比較して、試験化合物の存在下で変更される場合に、ユビキチン化の調節に有効であるとする、試験化合物の選択を含む。決定の工程は、ユビキチン化の量および／またはユビキチン化の速度を測定することを含むことができる。ユビキチン化は、蛍光(例えば、FRETの使用、但しこれに限定されない)の使用を含む、多くの既知の方法のうちのいずれかを使用して決定することができる。選択の工程は、基質のユビキチン化が試験化合物の存在下で減少する場合に有効であるとして、試験化合物を選択することを含み得る。方法は、細胞内で、または無細胞の環境で行うことができる。ある実施態様において、試験化合物はdsRNAである。
【０２０２】
本発明では、更に、E3ユビキチンリガーゼによる基質のユビキチン化を調節する化合物を作製する工程であって、本願に記述される方法を実行し、E3ユビキチンリガーゼの基質のユビキチン化を調節する化合物を同定し、および前記化合物を製造することを含む工程が意図される。
【０２０３】
キット
本発明は、細胞、阻害性化合物、ターゲット配列、形質移入剤、誘導剤、 (本発明の方法に関する）説明書、治療剤(例えばトポイソメラーゼ阻害剤、しかしこれに限定されない)またはこれらの任意の組み合わせを含む、本発明の組成物および方法を含むキットを提供する。
【０２０４】
典型的に、そのようなキットは、キャリア、パッケージまたは容器を含むことができ、これらは、バイアル、チューブ等といった1以上の容器を収容するよう仕切られており、当該容器のそれぞれは、本方法で使用される個別の要素の1つを含む。例えば、容器は、検出可能なようにラベルされている阻害性化合物、またはそのようにラベルされることができる阻害性化合物を含み得る。そのような阻害性化合物は、それぞれ、E3ユビキチンリガーゼタンパク質もしくはE3ユビキチンリガーゼ遺伝子またはメッセージに特異的な、抗体またはポリヌクレオチドであり得る。方法が、ターゲット核酸を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、キットは更に、ターゲット核酸配列の増幅のためのヌクレオチドを含む容器および/またはリポーター分子(例えば酵素、蛍光分子またはアイソトープラベル)に結合する、リポーター手段(例えばビオチン結合蛋白質、例えばアビジンまたはストレプトアビジン)を含む容器を有することができる。
【０２０５】
一実施態様において、キットは、E3ユビキチンリガーゼを標的とする1以上のsiRNAを含む。一実施態様において、E3ユビキチンリガーゼは、Bmi1および/またはRING1である。
【０２０６】
本発明のキットは、典型的に、上述の容器、および、1以上のその他の容器であって、商業上および使用者の見地から望ましい材料（緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器および使用のための説明書を伴う添付文書を含む）を含む容器を含むだろう。
【０２０７】
ラベルは、組成物が特定の療法または非治療的適用に使用されることを示すために容器に提示することができ、また、上述のようにインビボまたはインビトロの何れかの使用のための指示を示すことができる。指示またはその他の情報はまた、キットに含まれる添付物に含むことができる。
【０２０８】
本発明は、更に、以下の例を参照して記述されるだろう;しかしながら、本発明は、そのような例に限定されないと理解される。
【０２０９】
本願を通して、様々な刊行物が参照される。全ての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、Genbank配列、ウェブサイトおよび開示全体を通して参照されるその他の公開された材料、ならびにそれらの刊行物中で引用される参照物は、それらの全体が本願に援用される。以下の例は、本発明に対する特許請求の範囲を限定することを意図せず、むしろ特定の実施態様の例示であると意図される。当業者が考える例示的方法におけるあらゆる変化は、本発明の範囲に属すと意図される。
【０２１０】
[例]
例1
E3ユビキチンリガーゼのサイレンシングは薬剤毒性を増大する
77の候補遺伝子を特異的に標的とするRNAiオリゴマーを設計した。重要なE3ユビキチンリガーゼのサイレンシングは、薬剤毒性を増大させるとの仮定の下、1つの遺伝子当たり2つのRNAiオリゴマーを、HeLa細胞における毒性アッセイにて試験した。オリゴマーはIDT DNA (IL USA)から入手した。スクリーニングを、半毒性濃度のCPT (Camptothecin, Sigma, Israel)、TOPI薬剤およびVM26 (Teniposide, Alexis Biochemicals Corp., CA, U.S.A.)、TOPII薬剤の存在下、行った。
【０２１１】
HeLa細胞には、SaintRed試薬(Synvolux Therapeutics, B.V., NL)を説明書に従って用いて、RNAiオリゴマーを形質移入した。形質移入から32時間後、細胞を、半毒性濃度の約0.1μMのCPTまたは約1μMのVM26で更に16時間処理し、その後、培地を交換した。細胞の生存度を、AlamarBlue試薬(Roche, Germany)を使用して、24時間後に決定した。20%の毒性の増大を効果の基準として使用して、24の候補RNAiオリゴマーを、最初の毒性スクリーニングにて同定した(データは示さず)。
【０２１２】
候補RNAiオリゴマーの、薬剤誘導TOPIまたはTOPII(αおよびβ)分解に対する効果が検討された。1つの候補(Bmi1)が、毒性および分解の両アッセイにて有効に阻害されることが示された。
【０２１３】
Bmi1は、2つの異なるRNAiオリゴマー(X63およびX165と名付けられる、以下の表に示される配列)によって有効に抑制された。
【表３】
2010515771.tif 000017
【０２１４】
追跡実験では、SaintRedを説明書に従って使用して、HeLa細胞に100nMのX63またはX165を形質移入した。形質移入後24時間において、細胞を、DMSO、0.1μMのCPTまたは1μMのVM26で16時間処理し、その後培地を交換した。更に24時間後、細胞の生存度を、AlamarBlue試薬(Roche, Germany)を用いて視覚的に検出し(図1A)、細胞数を定量した(図1B)。X63またはX165のいずれかの投与は、HeLa細胞において、VM26およびCPTに誘導される毒性を増大させた(図1A及び1B)。
【０２１５】
同様の結果が、HT29結腸癌細胞株にて得られた(図2)。この実験では、細胞を、10%FCSを含むMcCoy's5A培地で増殖させ、同濃度のsiRNA、CPTおよびVM26で処理し、1を超える細胞株にて、Bmi1のサイレンシングが、VM26およびCPTの毒性効果を増大させることが示された。
【０２１６】
例2
Bmi1のsiRNAサイレンシングは、TOPIおよびTOPIIαの分解を安定化させた
例1に記載される条件を使用して、HeLa細胞に、Bmi1 X63およびX165 RNAiオリゴマーまたはスクランブル（scrambled）RNAiオリゴマーを形質移入した。形質移入から48時間後、細胞を、100μMのVM26で0、3又は5時間処理し、または、25μMのCPTの存在下0、4.5または6時間処理した。スクランブルオリゴマーで処理した細胞の一部を、25μMのプロテアーゼ阻害剤MG132(Sigma, Israel)で処理した。細胞を回収し、アルカリ抽出し、S7 DNAse(Roche, Germany)で処理して、DNAからTOPIIを取り出した。
【０２１７】
その後、TOPIIα、TOPIIβおよびTOPIの量を、特異的抗TOPIIおよび抗TOPI抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA. U.S.A.)による免疫ブロットでアッセイした(図3及び4)。ウエスタンアッセイの一般的なプロトコールは、以前に記述されるとおりである。簡潔には、ニトロセルロース膜を、5%の無脂肪牛乳を含むTBS-T(0.5%［v/v］Tween 20を補ったTBS)中で0.5-1時間ブロッキングし、一次抗体とともに1時間インキュベートし、TBS-Tで各々5分間で4回洗浄し、その後、ホースラディシュペルオキシダーゼ(Amersham Bioscience UK)が結合された二次抗体とともに60分間インキュベートした。その後、上記のように膜を洗浄した。抗原および抗体の複合体の可視化は、HRPを基質として、化学発光試薬(SuperSignal West Pico Chemiluminescent, PIERCE, IL, U.S.A.) を使用して行った。
【０２１８】
Bmi1が抑制された細胞において、薬剤誘導型毒性に対する増大した感受性とTOPI/TOPIIαの安定化との間で相関があった。RNAiオリゴマーによるBmi1のサイレンシングは、MG132による処理と同様に(図4)、VM26誘導型TOPIIα分解(図3)およびCPT誘導型TOPI分解(図4)を安定化した。
【０２１９】
例3
Bmi1のsiRNAサイレンシングは、TOPIIα-DNA分解を安定化した
例1に記載されるように、コントロール(スクランブル)またはX63 Bmi1 RNAiオリゴマーをHeLa細胞に形質移入した。図5に示されるように、形質移入の24時間後、様々な時間で、DMSO、100μMのVM26および25μMのMG132で細胞を処理した。
【０２２０】
細胞を回収し、ゲノムDNAを単離し、以前に記述されるように、塩化セシウムカラムで分離した (Desai, S.D., et al., Cancer Res., 2001. 61(15): p. 5926-32)。簡潔には、細胞を、10mMのTris-HCl（pH7.5）および1mMのEDTAに1%のサルコシル(sarkosyl)を含む、サルコシル溶解緩衝液にて溶解した。次に、細胞を、18ゲージの針に5回通過させ、得られた細胞抽出物を、1.5ｇ/ml塩化セシウム密度遠心分離カラムの上部に乗せ、~438,000ｇで~5時間遠心分離した。この工程は、DNAを何れかの遊離タンパク質から分離するよう設計されており、トポイソメラーゼおよびゲノムDNAを含む共有結合複合体は、ゲノムDNAとともにカラムの底にペレットとして沈殿するのに対し、遊離したトポイソメラーゼはカラム上部に残る。ペレット化したDNAを回収し、例2に一般に記載されるように、等量のDNAに共有結合したTOPIIαの量を、ドットブロット法にて決定した。
【０２２１】
VN26処理の30分後、TOPIIαは、コントロールおよびBmi1 RNAiオリゴマーで処理した両細胞においてDNAと複合体を形成したようであった(図5)。コントロールRNAiで処理した細胞では、TOPIIαは、VM26処理の6時間後に分解し;プロテアーゼ阻害剤MG132による処理はこの分解を阻害した(図5)。対照的に、X63 Bmi1 RNAiは、薬剤処理の6時間後にTOPIIα-DNA複合体を安定化した(図5)。
【０２２２】
例4
Bmi1のsiRNAサイレンシングは、低グルコース条件においてTOPIおよびTOPIIαの分解を安定化させた
HeLaおよびHT29細胞株を、本質的に例1に記述されるとおりに、コントロールおよびX63 Bmi1 RNAiオリゴマーで処理した。形質移入から4時間後、組織培養培地を、標準濃度のまたは低濃度のグルコースのどちらかを含む(または本質的にグルコースを含まない)新鮮な培地に取替え、更に44時間培養した。
【０２２３】
細胞を回収し、本質的に例2に記述されるとおりに、細胞抽出物を免疫ブロットで分析した。
【０２２４】
低グルコース培地で培養した細胞ではTOPIIαのレベルは低下した一方、Bmi1 X63 RNAiオリゴマーは、この低下を抑制した(図6A及びB)。同様の結果が、HeLaおよびHT29の両細胞株で観察された(それぞれ図6A及びB)。TOPIレベルは、HeLa細胞株では、低グルコース条件による影響を受けなかった(図6A)。
【０２２５】
例5
RING1のsiRNAサイレンシングはTOPIIα分解を安定化させた
RING1は、例1において候補として同定された。RING1のサイレンシングは、TOPIIαの薬剤誘導型分解を阻害したが、RING1Bでは阻害しなかった。
【０２２６】
HeLa細胞に、本質的に例1に記述されるとおりに、スクランブルオリゴマー、Bmi1 X63オリゴマー、RING1 X154オリゴマー、RING1 X155オリゴマーまたはRING1B X96オリゴマーを形質移入した。
【０２２７】
オリゴマーの配列は以下の通りである。
【表４】
2010515771.tif 000018
【０２２８】
形質移入から48時間後、細胞を、表示される時間に100μMのVM26で処理した。細胞を回収し、アルカリ抽出し、S7 DNAseで処理してDNAからTOPIIαを取り出した。TOPIIαおよびTOPIの量を、本質的に例2に記述されるとおりに、免疫ブロットによってアッセイした。RING1およびRING1Bのレベルもまた、ウエスタンブロットによって分析した。異なる条件における細胞生存を定量化した。
【０２２９】
TOPIのレベルは、様々な処理の間において一貫性が維持された一方、TOPIIαのレベルは、スクランブルおよびX96処理において低下し、X63およびX154処理細胞において、相対的に一定に維持された(図7A)。
【０２３０】
RNAiによるRING1およびRING1Bのサイレンシングは、ウエスタンブロット分析によって確認した(それぞれ図7B及び7C)。RING1Bは、H2Aのユビキチン化においてPRC1の触媒サブユニットである(RING1は異なる)ことに留意される(Xiao, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2003. 100(6): p. 3239-44. Epub 2003 Mar 10)。
【０２３１】
予想通り、2つの異なるRNAiオリゴマーX154およびX155によるRING1のサイレンシングは、HeLa細胞におけるVM26誘導型毒性を増大させた(図7D)。
【０２３２】
例6
Bmi1のsiRNAサイレンシングおよびトポイソメラーゼ処理は、相乗的に様々な癌細胞の生存度を低下させる
A549およびHeLa細胞をDMEMおよび10%FBSとともに培養した。DU145細胞をMEM-Eagleおよび10%FBSとともに培養した。-MDA-MB-231細胞をRPMIおよび10%FBSとともに培養した。
【０２３３】
細胞に、Bmi1を標的化するRNAi(X63)およびコントロールRNAi(Sc)を例1に記述されるとおりに形質移入した。形質移入から24時間後、細胞を、DMSOとともに(コントロール)、または、様々な濃度のTOPII薬剤VM26とともに、16時間処理した。更に24時間(図8A（A549）、C(HeLa)、D(DU145)およびE(MDA-MB-231)）または48時間(図8B(A549))培養した後、WST-1(Roche, Germany)を説明書に従って用いて、細胞の生存度を測定した。実験は三重で行った。
【０２３４】
Bmi1タンパク質レベルの減少は、Bmi1特異的抗体を用いた免疫ブロットによって確認し、Bmi1発現が抑制されたことが示された(A、DおよびE挿入されるパネル参照)。
【０２３５】
Bmi1タンパク質レベルが異なる種の癌細胞にて低下しただけでなく、siRNA処理は、VM26を投与した場合、相乗的に細胞死を誘導した。そのうえ、徐々に、siRNA処理は、トポイソメラーゼ処理を欠いた場合において細胞死を誘導した(図8A及びBにて0マイクロMのVM26を比較)。
【０２３６】
例7
RING1/Bmi1ユビキチン化活性の修飾因子の同定
Bmi1との複合体としてのE3リガーゼRING1のユビキチン化活性を測定するアッセイを行う。商業的に利用できるユビキチン誘導体は蛍光ドナー分子として利用でき、一方、フルオロフォア融合抗体は、フルオロフォアアクセプターとして使用される。基質タンパク質のユビキチン化は、ドナーの励起後、ドナー(ユビキチン結合)フルオロフォアから放出される光子によって励起される(抗原-抗体相互作用により、基質タンパク質に特異的に結合した)アクセプター抗体の発光によって検出される。ユビキチンの連結は、効果的なエネルギー移動に十分な距離に両フルオロフォアを接近させるため、この反応は、均一な反応条件において行うことができる。ユーロピウムクリプタートドナーフルオロフォアは、ほとんどの通常のフルオロフォアに比べて、非常に長い期間蛍光を発するため、環境から生じる可能性のある自己蛍光分子による干渉を除去する時間分解型の様式で検出される反応が可能となる。
【０２３７】
あるいは、ポリユビキチン鎖を、フルオロフォア同士の接近を誘導する手段として使用できる。この検出方法では、ビオチン-ユビキチンが反応に添加され、ストレプトアビジン−フルオロフォアアクセプター分子が、先に記載された抗体と置き換えられる。
【０２３８】
次の試薬をアッセイに使用できる:
1.  E1ユビキチン活性化酵素(0.6 mg/ml, 6μM, Proteologics, Israel)
2.  UBCH5a-(Cat # E2616 (50μM), Boston Biochem Inc., MA, U.S.A.)
3.  組換えRING1/Bmi1タンパク質複合体（GST，またはその他の固有のエピトープタグ， Proteologics, Israel）
4.  ユビキチン1mg/ml溶液(HPLC水中)
5.  ユビキチン-クリプタート - (cat# 61UBIKLB, CisBio, MA, U.S.A.)
6.  鎖伸長を検出する場合、(任意)ビオチン-ユビキチン(または同様のタグ)
7.  抗GST-XL665-(cat# 61GSTXLB, CisBio, MA, U.S.A.,または、RING1/Bmi1中のエピトープタグに対応する同様の試薬)
8.  (任意)ストレプトアビジン-XL665-(cat# 61SAXLB, CisBio, MA, U.S.A.-(または相当する試薬),鎖伸長を検出する場合)
9.  オボアルブミン100mg/ml溶液(HPLC水中)
10.  ATP - 0.1 M
11.  MgCl2 - 1 M, Sigma
12.  EDTA- 0.5 M, pH=8.
13.  Tris 1M pH = 7.6 - Sigma Biotechnology Grade
14.  Tween 20 - 6% 溶液(HPLC水中)
15.  KF緩衝液(0.8M KF; 2mg/ml BSA; および200mMリン酸緩衝液, pH = 7.0)
16.  DTT - 0.1M溶液(HPLC水中)。
【０２３９】
次の溶液を用意する:希釈緩衝剤(25mM Tris, pH=7.6; 0.006% Tween 20; 0.1mM DTT;及び0.5mg/mlオバルブミン); 3X反応混合物(15nM E1ユビキチンリガーゼ活性化酵素(Proteologics, Israel); 6mMATP, 15m MgCl2; 105nMユビキチンクリプタート; 840nmユビキチン(あるいは、鎖伸長を検出する場合、ユビキチン/ビオチン-ユビキチンの混合物が使用される);および300nM UBCH5a); 2X RING1/Bmi1溶液(冷却した希釈化緩衝剤中の0-100nMのRING1/Bmi1); 試験化合物溶液(試験化合物は、6% DMSOおよび6% PEG-400中に典型的に10-50μMに希釈する); 抗体溶液(抗体(例えば抗GST-XL665抗体(CysBio,France))をKF緩衝液中に1:50に希釈する)。反応混合物は、冷却した希釈化緩衝液中で作製し、氷上に維持する。試験化合物溶液は室温に維持する。
反応は、Costar PS black 96ウェルプレートで行い、BMG RubStarプレートリーダー（または同等のもの）を使用して検出する。
【０２４０】
簡潔には、5μlの試験化合物溶液を各々のウェルに添加する。15μlの2X RING1/Bmi1溶液または希釈緩衝液(ネガティブコントロール)もまた、各々のウェルに添加する。その溶液を振盪して混合し、室温で10分インキュベートする。10μlの3X反応混合物を各々のウェルに添加し、振盪により混合し、37℃で1時間インキュべートする。反応は、各々のウェルに10μlの0.5M EDTAを添加することにより停止する。30μlの抗体溶液を各々のウェルに添加し、振盪により混合し、室温で2時間インキュベートする。
【０２４１】
反応は、RubyStarプレートリーダーで読み取る。反応混合物を310nmで励起し、50μ秒の遅延期間で、620および665nmで放射を取り込む。活性は、アクセプターの放射(665nm)とドナーの放射(620nm)との比x10,000によって測定される。
【０２４２】
異なる濃度のRING1/Bmi1を使用し、上述の方法に記述されるとおりに反応を行った。インキュベーション時間は、37℃で30、60および120分とした。アッセイの結果は図9に示され、このアッセイが、RING1/Bmi1複合体の自己-ユビキチン化の試験により、試験化合物がBmi1との複合体におけるRING1のユビキチン化活性を調節するかどうかを決定することに有用であることが実証された。化学ライブラリー由来の試験化合物は、スクリーニングの際に、異なる濃度にてアッセイに添加される。
【０２４３】
試薬の代替となるセットを、RING1/Bmi1ユビキチン化アッセイに使用できる:
1.  E1ユビキチン活性化酵素(0.6 mg/ml, 6μM, Proteologics, Israel)
2.  UBCH5a (cat # UW9050-0100, Biomol, PA, U.S.A)
3.  組換えRING1/Bmi1タンパク質複合体(GST,またはその他の固有のエピトープタグ, Proteologics, Israel)
4.  抗FLAG-クリプタート(cat# 61FG2KLB, CisBio, MA, U.S.A.)
5.  抗FLAG-XL665-(cat # 61FG2XLB, CisBio, MA, U.S.A.)
6.  オボアルブミン100mg/ml溶液(HPLC水中)
7.  ATP - 0.1M
8.  MgCl2 - 1M, Sigma
9.  EDTA - 0.5M, pH = 8.
10.  Tris 1M pH = 7.6 - Sigma Biotechnology Grade
11.  Tween20-6%溶液(HPLC水中)
12.  KF緩衝液(HPLC水中1.6M塩化カリウム)
13.  DTT-0.1M溶液(HPLC水中)
次の溶液を用意する:希釈緩衝剤(25mM Tris, pH = 7.6; 0.006% Tween 20; 0.1mM DTT;および0.5 mg/mlオバルブミン); 4X反応混合物; (8mM ATP, 20mM MgCl2; 1000nM FLAG-ユビキチン(Boston Biochem Inc., MA, U.S.A.); 400nM UBC5A); 4X E1溶液(冷却した希釈化緩衝液中20nM E1); 4X RING1A/GST-Bmi1溶液(冷却した希釈化緩衝剤中80nM RING1/Bmi1、氷上に維持); 試験化合物溶液(試験化合物は、4% DMSOおよび4% PEG-400中に室温で希釈); 抗体溶液(1.4% (v/v)抗FLAG-XL665, 1%(v/v)抗FLAG-ユーロピウムクリプタート; 50%(v/v) 1.6M KF; 47.6%(v/v)希釈化緩衝液)。反応混合物は、冷却した希釈化緩衝液中で作製し、氷上に維持する。試験化合物溶液は室温に維持する。
反応は、Costar PS black 96ウェルプレートで行い、BMG RubStarプレートリーダー(又は同等のもの)を使用して検出する。
【０２４４】
簡潔には、11μlの試験化合物溶液を各々のウェルに添加する。11μlの4X RING1/Bmi1溶液または希釈緩衝液剤(ネガティブコントロール)もまた、各々のウェルに添加する。その溶液を振盪して混合し、室温で10分インキュベートする。11μlの4X反応混合物を各々のウェルに添加し、振盪により混合し、37℃で1時間インキュベートする。反応は、各々のウェルに11μlの0.5M EDTAを添加することにより停止する。22μlの抗体溶液を各々のウェルに添加し、振盪により混合し、室温で2時間インキュベートする。
【０２４５】
反応は、RubyStarプレートリーダーで読み取る。反応混合物を310nmで励起し、50μ秒の遅延期間で、620および665nmで放射を取り込む。活性は、アクセプターの放射(665nm)とドナーの放射(620nm)との比x10,000によって測定される。
【０２４６】
例8
トポイソメラーゼユビキチン化の修飾因子の同定
Bmi1との複合体としてのE3リガーゼRING1の活性による、TOPIIαのユビキチン化を測定するアッセイを行う。商業的に利用できるユビキチン誘導体は蛍光ドナー分子として利用でき、一方、フルオロフォア融合抗体は、フルオロフォアアクセプターとして使用される。基質タンパク質のユビキチン化は、ドナーの励起後、ドナー(ユビキチン結合)フルオロフォアから放出される光子によって励起される(抗原-抗体相互作用により、基質タンパク質に特異的に結合した)アクセプター抗体の発光によって検出される。ユビキチンの連結は、効果的なエネルギー移動に十分な距離に両フルオロフォアを接近させるため、この反応は、均一な反応条件において行うことができる。ユーロピウムクリプタートドナーフルオロフォアは、ほとんどの通常のフルオロフォアに比べて、ずっと長い期間蛍光を発するため、環境から生じる可能性のある自己蛍光分子による干渉を除去する時間分解型の様式で検出される反応が可能となる。
【０２４７】
あるいは、ポリユビキチン鎖を、フルオロフォア同士の接近を誘導する手段として使用できる。この検出方法では、ビオチン-ユビキチンが反応に添加され、ストレプトアビジン-フルオロフォアアクセプター分子が、先に記載された抗体と置き換えられる。
【０２４８】
次の試薬をアッセイに使用できる：
1.  E1ユビキチン活性化酵素(0.6mg/ml,6μM, Proteologics, Israel)
2.  UBCH5a- (Cat# E2616 (50μM), Boston Biochem Inc., MA, U.S.A.)
3.  RING1/Bmi1 (Proteologics, Israel)
4.  ユビキチン1mg/ml溶液(HPLC水中)
5.  ユビキチン-クリプタート-(cat# 61UBIKLB,CisBio, MA, U.S.A.)-鎖伸長を検出する場合、(任意)ビオチン-ユビキチン(又は同様のタク゛)
6.  抗FLAG-XL665-(cat # 61FG2XLB, CisBio, MA, U.S.A.,またはトポイソメラーゼIIα中のエピトープタグに対応する同様の試薬)
7.  (任意)ストレプトアビジン-XL665-(cat# 61SAXLB, CisBio, MA, U.S.A.-(または相当する試薬),鎖伸長を検出する場合)
8.  プラスミド-pcDNA3.1、または等価物(Invitrogen, CA, U.S.A.)
9.  オボアルブミン100mg/ml溶液(HPLC水中)
10.  ATP - 0.1 M
11.  MgCl2 - 1M, Sigma
12.  EDTA - 0.5M, pH = 8.
13.  Tris 1M pH = 7.6 - Sigma Biotechnology Grade
14.  Tween 20-6%溶液(HPLC水中)
15.  KF緩衝液(0.8M KF; 2mg/ml BSA;および200mMリン酸緩衝液, pH = 7.0)
16.  DTT-0.1M溶液(HPLC水中)。
【０２４９】
次の溶液を用意する:希釈緩衝剤(25mM Tris, pH = 7.6; 0.006% Tween 20; 0.1mM DTT;および0.5 mg/mlオバルブミン); 3X反応混合物(15nM E1ユビキチンリガーゼ活性化酵素(Proteologics, Israel); 6mM ATP, 15m MgCl2; 105nMユビキチンクリプタート; 840nmユビキチン(あるいは、鎖伸長を検出する場合、ユビキチン/ビオチン-ユビキチンの混合物が使用される);および300nM UBCH5a); 2X RING1/Bmi1/トポイソメラーゼ溶液(冷却した希釈化緩衝剤中の0-100nMのRING1/Bmi1(Proteologics, Israel); 0.4 mg/mlプラスミド;及び60nMトポイソメラーゼ(Proteologics, Israel));試験化合物溶液(試験化合物は、6% DMSOおよび6% PEG-400中に希釈する); 抗体溶液(抗体(例えば抗FLAG-XL665抗体)をKF緩衝液中に1:50に希釈する)。反応混合物は、冷却した希釈化緩衝液中で作製し、氷上に維持する。試験化合物溶液は室温に維持する。
反応は、Costar PS black 96ウェルプレートで行い、BMG RubStarプレートリーダー(または同等のもの)を使用して検出する。
【０２５０】
簡潔には、5μlの試験化合物溶液を各々のウェルに添加する。15μlの2X RING1/Bmi1/トポイソメラーゼ溶液または希釈緩衝液 (ネガティブコントロール)もまた、各々のウェルに添加する。その溶液を振盪して混合し、室温で10分インキュベートする。10μlの3X反応混合物を各々のウェルに添加し、振盪により混合し、37℃で1時間インキュべートする。反応は、各々のウェルに10μlの0.5M EDTAを添加することにより停止する。30μlの抗体溶液を各々のウェルに添加し、振盪により混合し、室温で2時間インキュベートする。
【０２５１】
反応は、RubyStarプレートリーダーで読み取る。反応混合物を310nmで励起し、50μ秒の遅延期間で、620および665nmで放射を取り込む。活性は、アクセプターの放射(665nm)とドナーの放射(620nm)との比x10,000によって測定される。
【０２５２】
異なる濃度のRING1/Bmi1を使用し、当該反応を上述の方法において記載したとおりに実施した。インキュベーション時間は37℃で30、60および120分であった。当該アッセイの結果を図９に示すが、これは、RING1/Bmi1複合体の自己ユビキチン化を試験することにより、試験化合物がBmi1との複合体におけるRING1のユビキチン化活性を調節するかどうかを決定するために有用であることを示す。化学的なライブラリーからの試験化合物を種々の濃度でスクリーニングの間のアッセイに追加する。
【０２５３】
代替的な試薬セットをRing1/Bmi1ユビキチン化アッセイのために使用してよい；
1.E1ユビキチン活性化酵素(0.6 mg/ml, 6μM, Proteologics, Israel)
2.UBCH5a (cat # UW9050-0100, Biomol, PA, U.S.A)
3.組み換えRing1/Bmi1タンパク質複合体(GST, または他の独特のエピトープ-タグ, Proteologics, Israel)
4.抗FLAGクリプタート(cat# 61FG2KLB, CisBio, MA, U.S.A.)
5.抗FLAG-XL665 - (cat # 61FG2XLB, CisBio, MA, U.S.A.)
6.卵白アルブミン100 mg/ml溶液、HPLC水中
7.ATP - 0.1M
8.MgCl2 - 1M, Sigma
9.EDTA - 0.5M, pH=8. 
10.Tris 1M pH=7.6 - Sigma Biotechnology Grade
11.Tween 20 - 6%の溶液、HPLC水中
12.KF 緩衝液 (HPLC水中の1.6M フッ化カリウム)
13.DTT - 0.1M 溶液、HPLC水中。
【０２５４】
以下の溶液を調製する；希釈緩衝液(25 mM Tris, pH = 7.6; 0.006% Tween 20; 0.1 mM DTT; および 0.5 mg/ml 卵白アルブミン); 4X 反応混合物(8 mM ATP, 20 mM MgCl2; 1000nM FLAG-ユビキチン(Boston Biochem Inc., MA, U.S.A.); 400nM UBC5A); 4X E1 溶液(冷たい希釈緩衝液中で20nMのE1); 4X RING1A/GST-BMI1 溶液(冷たい希釈緩衝液中で80nMのRING1A/BMI1,および氷上で保持する);試験化合物溶液(当該試験化合物、室温で、4% DMSOおよび4% PEG-400を残して保持する)；抗体溶液(1.4% (v/v)抗-FLAG-XL665, 1% (v/v)抗FLAG 抗−FLAG-クリプタートユーロピウム; 50% (v/v) 1.6M KF; 47.6% (v/v) 希釈緩衝液)。当該反応混合物は、冷たい希釈緩衝液中で調製し、氷上で維持した。当該試験化合物は室温で維持する。
【０２５５】
当該反応は、コースター・PS・ブラック(Costar PS black)、96ウェル皿において実施され、BMG・ルビースター・プレート中で実施し、BMG・ルビースター・プレート・リーダー(または等価物)を使用して検出される。
【０２５６】
手短に11μlの試験化合物溶液を各ウェルに添加する。11μlの4X RING1/Bmi1溶液または希釈緩衝液(陰性対照)を各ウェルに添加する。当該溶液を振盪により混合し、室温で10分間インキュベートする。11μlの4X 反応混合物を各ウェルに添加し、振盪により混合し、37℃で1時間インキュベートする。反応を11μlの0．5M EDTAを各ウェルに添加することにより停止する。22μlの抗体溶液を各ウェルに添加し、振盪により混合し、インキュベートを2時間室温で行う。
【０２５７】
反応をルビースタープレートリーダー中で読む。当該反応混合物を310nmで励起し、発光を620nmと665nmで50μsecの遅れで集める。活性をアクセプター(665nm)の発光のドナーの発光(620nm)に対する比X10,000で測定する。
【０２５８】
例９
化合物１およびTOPII薬物は共同的に作用してA549細胞の生存度を減少する
A549細胞をDMEMおよび10%のFBSで培養した。当該細胞を異なる濃度の化合物1で、TOPII薬物、VM26 (図10A)またはTOPII 薬物なし、Taxol(登録商標) (paclitaxel) (Sigma, Israel) (図10B)ありまたはなしで処理した。
【化８】
2010515771.tif 000019
【０２５９】
化合物１ (cat# ST024375, TimTec Inc., DE, U.S.A.)。
【０２６０】
処理後72時間、当該細胞の生存度をWST-1試薬(Roche, Germany)を用いて試験した。化合物1はVM26、抗TOPII薬物の有効性を10倍増大したが、タキソール、非TOOPII薬物との共同効果は有していない。
【０２６１】
例１０
HeLa細胞における化合物1によるTOPIIα分解の阻害
HeLa細胞はDMEMおよび10%FBSと培養した。当該細胞を1時間溶媒 (50% DMSO, 50% PEG400)または50μM または100μM の化合物1で処理し、次に100μMのVM26でインキュベートした。
【０２６２】
次に当該細胞を採集し、アルカリ抽出し、S7 DNASe (Roche, Germany)で処理し、当該DNAからTOPIIを放出した。TOPIIαの量は、特異的抗体(Santa-Cruz)でのイムノブロットによりアッセイした。
【０２６３】
当該化合物1はHeLa細胞におけるTOPIIαの薬物誘導分解を阻害した(図11)。
【０２６４】
例１１
化合物1はHeLa細胞におけるRing1-Bmi1 ユビキチン化活性を阻害する
HeLa細胞をDMEMおよび10%FBSで培養した。当該細胞をHA-ユビキチン、Bmi1-フラッグおよびRING1Aをコードするプラスミドでトランスフェクトした。他に断りのない限り、リポフェクチミン2000トランスフェクション試薬(Lipofectamine2000 transfection reagent ((Invitrogen, CA, U.S.A.))を使用して指示する。
【０２６５】
トランスフェクションの24時間後、当該細胞を6時間溶媒(50% DMSO, 50% PEG400) または100μM 化合物１で処理した。
【０２６６】
当該細胞を採集し、フラッグ-Bmi1を抗フラッグ抗体(Sigma Israel)との免疫沈降法を行った。ユビキチン化Bmi1の量をイムノブロットにより抗HA抗体(Roche, Germany)でアッセイした。
【０２６７】
化合物1(図12)はHeLa細胞でのRing1-Bmi-1 ユビキチン化活性の有意な阻害を示す。
【０２６８】
例１２
種々の癌細胞での化合物1のLD50
549細胞(肺癌)およびHeLa細胞(卵巣癌)をDMEMおよび10%のFBS(図13A)で培養した。MDA-MB-231 およびMDA-MB-468細胞(乳癌), HCT116細胞(大腸癌)およびPanc02.03 細胞(膵臓癌)をRPMI および10% FBS (図13B)で培養した。当該細胞を異なる濃度の化合物1で処理した。当該細胞の生存度をWST-1試薬(Roche, Germany)を使用して処理後72時間試験した。当該LD50はプリズムソフトウェア(Prism software (Graphpad, CA, U.S.A.))を使用して算出した。
【０２６９】
考察
上記の例は、siRNAによるBmi1またはRING1AのサイレンシングがVM26(テノポシド, TOPII 薬物)で誘導されるTOPIIα分解を阻害し、毒性試験でのその効果を増大することを示す。Bmi1およびRING1Aはポリコーム抑制複合体(Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1))と称されるタンパク質複合体の成分である。ワンらは(Wang, H., et al. 2004. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431:873-8.)、ヒストンH2Aユビキチンリガーゼとして機能するRing1A (RNF1), Ring1B (RNF2), Bmi1 および HPH2よりなるPRC1様複合体を同定した。Ring1A, Ring1BおよびBmi1は、全てRINGドメイン(E3ユビキチンリガーゼドメインの特性を示す)を含む。彼らはこれらの3つのタンパク質単独の各々をH2Aユビキチン化アッセイで試験し、Ring1BのみがH2Aユビキチン化活性を有することを明らかにした。これらの結果に基づいて、彼らは、当該Ring1bがこの複合体でのユビキチンリガーゼ触媒タンパク質であることを報告した。カオらは(Cao, R., et al. 2005. Role of Bmi-1 and Ring1A in H2A ubiquitylation and Hox gene silencing. Mol Cell. 20:845-54.)、Bmi1およびRing1Aの両方がRing1B H2Aユビキチン化活性の効果を増大することを示した。
【０２７０】
驚くべきことに、ワンらの文献とは対照的に、我々はRing1A単独でE3ユビキチンリガーゼ活性を有することを見出し、且つRing1A-Bmi1組み換えタンパク質複合体が細胞なしのアッセイにおいてTOPIIαをユビキチン化することを示した。これらの結果は、薬物で誘導されるTOPIIα分解におけるBmi1およびRing1A siRNAの安定化効果と共に、Ring1A-Bmi1複合体がTOPIIαユビキチンリガーゼとして機能することを示唆した。ウェイらはRing1B活性におけるBmi1の効果について同様な観察を報告しているが、彼らはRing1Aはこの活性に影響しないと報告している(Wei,J.,et.al. 2006. Role of Bmi1 in H2A ubiquitylation and Hox gene silencing. J Biol Chem. 281:22537-44.)。ファンらは、E3リガーゼRing1Bは不活性化 X 染色体(Xi)に富むことを報告した(Fang et al., 2004. Ring1b-mediated H2A ubiquitination associates with inactive X chromosomes and is involved in initiation of X inactivation. J Biol Chem. 279:52812-5)。デ・ナポールズらの他の研究において(de Napoles, M., et al., 2004. Polycomb group proteins Ring1A/B link ubiquitylation of histone H2A to heritable gene silencing and X inactivation. Dev Cell. 7:663-76.)、胎児マウス幹細胞でのRing1A, Ring1B および H2A ユビキチン化の間の関連を見出した。彼らは、Ring1B null胎児幹細胞における全体的なH2Aユビキチン化の広範囲な結合を報告した。不活性化X染色体においてXi, H2Aユビキチン化はRing1A または Ring1B null 細胞においては維持されたが、Ring1A/Ring1B ダブルノックアウト細胞では維持されなかったdことはそれらの活性における重複性を示唆していた。この研究は、XiにおけるH2AがRing1AおよびRing1Bの直接のユビキチン化の標的であることを示すには及ばなかった。ウェイらは、Ring1Bが当該複合体から脱落した場合、当該H2aユビキチン化活性は劇的に低下したが、Bmi1、Ring1aおよびHPH2を含む複合体はバックグラウンドレベルより高い幾らかの残りの活性を示したことを報告した。この残りの活性が、Xiにおいて、H2Aユビキチン化がRing1AまたはRing1B null 細胞においては維持されたが、Ring1A/Ring1Bダブルノックアウト細胞においては維持されなかったというデ・ナポールズらの観察を説明できる。PRC1複合体はまた、Cullin3/SPOPユビキチンE3リガーゼと一緒の安定したX染色体不活性化に関連する。
【０２７１】
(Hernandez-Munoz, I., et al., 2005. Stable X chromosome inactivation involves the PRC1 Polycomb complex and requires histone MACROH2A1 and the CULLIN3/SPOP ubiquitin E3 ligase. Proc Natl Acad Sci U S A. 102:7635-40.)。PRC1複合体がXiに対して補充され、Bmi1はCullin3/SPOPユビキチンE3リガーゼに対して結合し、Cullin3/SPOP複合体によりH2A変異体であるMacroH2Aのユビキチン化を可能にする。これらの結果は、Xi-H2aユビキチン化におけるRing1AおよびRing1Bの効果の一部が他のE3ユビキチンリガーゼにより媒介される可能性を生ずる。
【０２７２】
例９は、SiRNAによるRING1A-Bmi1のサイレンシングの効果がRING1B-Bmi1ユビキチン化活性を阻害する小分子により擬態され得ることを示す。
【０２７３】
化合物１はHeLa細胞におけるVM26誘導性TOPIIα分解およびRing1A-Bmi1ユビキチン化活性を阻害する。このsiRNAの結果との合致において、化合物1は、VM26、TOPII薬物、との共同的な作用を示し、A549肺癌細胞の生存度を減少する。これらの結果は更にBmi1およびRing1Aのターゲティングが抗TOPII薬物の効果を増大することを証明する。タキソール(登録商標)(パクリタキセル)、TOPIIと関連しない癌薬剤、との共同作用を示さなかったことから、化合物1の効果は経路依存性であるように見える。
【０２７４】
RNAiによるBmi1のサイレンシングが癌細胞株の特定の細胞死を促進するが、初代正常細胞には促進しないことが示された(Liu, L., et al., 2006. Loss of the human polycomb group protein BMI1 promotes cancer-specific cell death. Oncogene. 25:4370-5.)。胆管上皮細胞でのBmi1のRNAによるサイレンシングは、P161NK4aの発現の増加を誘導し、増殖を減少し、細胞老化を増大した(Sasaki, M., et al., 2006. Decreased expression of Bmi1 is closely associated with cellular senescence in small bile ducts in primary biliary cirrhosis. Am J Pathol. 169:831-45.)。PcG経路の活性化は、ヒトカルシノーマの高い悪性作用と機能作用的に関連し、インビボの増殖およびヒト前立腺癌の転移のために必須である。化学的に修飾された分解耐性の安定なsiRNAで処理されたPC-3由来の前立腺癌細胞のヒト接着性培養物のBmi1のサイレンシングは低い悪性とより遅い増殖の腫瘍を創り出した(Berezovska, O.P., et al., 2006. Essential role for activation of the Polycomb group (PcG) protein chromatin silencing pathway in metastatic prostate cancer. Cell Cycle. 5:1886-901.)。
【０２７５】
癌細胞の成長におけるBmi1の役割との合致において、我々は、化合物1が9〜79のLD50範囲で癌細胞を殺すことを見出している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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