(57)【要約】近い将来、正確かつ迅速な配列決定に対する需要が大いに拡大することは明白であり、あらゆる種類の配列決定法の改良が必要とされている。さまざまな態様において、本教示は、さまざまな実施態様において、断片の分離および／またはポリメラーゼ酵素の使用を低減および／または回避する配列決定法を提供する。さまざまな実施態様において、一本鎖鋳型に沿って二重鎖を伸長するサイクルを繰り返すことを含むが、各サイクルにおいて各別のヌクレオチドを同定することは含まない配列決定法が提供される。
2010539982.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｆ）を含む、鋳型ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列を決定する方法：
（ａ）各二重鎖が、鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、伸長可能な末端を有する開始用オリゴヌクレオチドプローブを含むプローブ−鋳型二重鎖の集団を提供する工程と、
（ｂ）前記プローブ−鋳型二重鎖集団の伸長可能な末端の少なくとも一画分に、標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブをライゲーションして、標識され伸長したプローブ−鋳型二重鎖を形成させる工程と、
（ｃ）前記プローブ−鋳型二重鎖集団であって、それにライゲーションされている標識オリゴヌクレオチド伸長用プローブを有さない集団の伸長可能な末端の少なくとも一画分に、非標識のオリゴヌクレオチド伸長用プローブをライゲーションして、標識されていない伸長したプローブ−鋳型二重鎖を形成させる工程と、
（ｄ）工程（ｂ）の後かつ工程（ｅ）の前に、前記鋳型ポリヌクレオチド中の少なくとも１個のヌクレオチドを同定する工程と、
（ｅ）標識され伸長したプローブ−鋳型二重鎖および標識されていない伸長したプローブ−鋳型二重鎖の少なくとも一画分の前記オリゴヌクレオチド伸長用プローブ部位上に伸長可能な末端を作出する工程と
（ｆ）前記鋳型ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列が決定されるまで、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）を繰り返す工程。
【請求項２】
前記鋳型ヌクレオチドの集団が微小粒子に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微小粒子が基質に結合している、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ビオチンとビオチン結合タンパク質とを含む結合によって前記微小粒子が前記基質に結合している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記微小粒子が、半固体状の支持体に固定されていない、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブ、非標識のオリゴヌクレオチド伸長用プローブ、またはその両方が、切断可能な結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
切断可能な結合がホスホロチオレート結合である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブ、前記非標識のオリゴヌクレオチド伸長用プローブ、またはその両方が、一方の末端に伸長不能部分を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチド伸長用プローブ部位上に伸長可能な末端を作出する工程が、前記オリゴヌクレオチド伸長用プローブ内にあるホスホロチオレート結合を、Ａｇ含有化合物、Ｈｇ含有化合物、Ｃｕ含有化合物、Ｍｎ含有化合物、Ｚｎ含有化合物、およびＣｄ含有化合物を１つまたはそれ以上含む切断剤によって切断する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記切断剤が、ＡｇＮＯ３を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチド伸長用プローブ部位上に伸長可能な末端を作出する工程が、最後のオリゴヌクレオチド伸長用プローブがライゲーションされた前記伸長可能な末端とは別の伸長可能な末端を作出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ａ）の前に、前記鋳型ポリヌクレオチドをブロッキング用オリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
同定する工程が、前記標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブに結合している標識を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
同定されたヌクレオチドが、前記標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブに実質的に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記同定されたヌクレオチドが、前記標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブの１残基内に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
同定する工程が、切断可能なリンカーによって、前記標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブに結合された検出可能部分を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記切断可能なリンカーがジスルフィド結合を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１つまたはそれ以上の工程が、ウシ血清アルブミンを使用して、使用するリガーゼの量を低減させ易くすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｃ）が、工程（ｅ）の前に一回またはそれ以上繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
以下の工程（ｇ）〜(i)をさらに含む、請求項１に記載の方法：
（ｇ）ライゲーションされたオリゴヌクレオチド伸長用プローブおよび前記開始用オリゴヌクレオチドプローブを前記鋳型ポリヌクレオチドから除去する工程と、
（ｈ）各二重鎖が、鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズする第二の開始用オリゴヌクレオチドプローブであって、上記の開始用オリゴヌクレオチドプローブとは異なった、伸長可能な末端を有する前記第二の開始用オリゴヌクレオチドプローブを含むプローブ−鋳型二重鎖の集団を作出する工程と
（ｉ）工程（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）を繰り返す工程。
【請求項２１】
工程（ｇ）、（ｈ）、および（ｉ）を一回またはそれ以上繰り返し、各回ごとに、前記鋳型ポリヌクレオチドの異なった配列に結合する開始用オリゴヌクレオチドプローブを使用する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも２つの識別可能に標識された伸長用プローブファミリーの第一のコレクションを用いて、鋳型ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列に関する情報を究明する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｆ）を含む方法：
（ａ）各二重鎖が、鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、伸長可能な末端を有する開始用オリゴヌクレオチドプローブを含むプローブ−鋳型二重鎖の集団を提供する工程と、
（ｂ）前記プローブ−鋳型二重鎖集団を、少なくとも２つの識別可能に標識された伸長用プローブファミリーに由来する標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブの混合物に接触させて、前記プローブ−鋳型二重鎖集団の前記伸長可能な末端の少なくとも一画分に、標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブをライゲーションし、標識され伸長したプローブ−鋳型二重鎖を形成させる工程と、
（ｃ）前記プローブ−鋳型二重鎖集団であって、それにライゲーションされている標識オリゴヌクレオチド伸長用プローブも、それにライゲーションされている第二の標識オリゴヌクレオチド伸長用プローブも有さない集団の伸長可能な末端の少なくとも一画分に、非標識のオリゴヌクレオチド伸長用プローブをライゲーションして、標識されていない伸長したプローブ−鋳型二重鎖を形成させる工程と、
（ｄ）工程（ｂ）の後かつ工程（ｅ）の前に、前記標識され伸長したプローブ−鋳型二重鎖の少なくとも一部の前記標識を検出する工程と、
（ｅ）前記標識され伸長したプローブ−鋳型二重鎖および前記標識されていない伸長したプローブ−鋳型二重鎖の少なくとも一画分の前記オリゴヌクレオチド伸長用プローブ部位上に伸長可能な末端を作出する工程と、
（ｆ）工程（ｄ）の後かつ工程（ｇ）の前に、前記標識され伸長したプローブ−鋳型二重鎖の前記鋳型ポリヌクレオチド部位にある前記ヌクレオチドの配列についての１つまたはそれ以上の可能性を、少なくとも、工程（ｄ）で検出された前記標識に基づいて消去して、可能な配列のリストを作成する工程と
（ｇ）鋳型ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列が決定されるまで、工程（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返す工程。
【請求項２３】
前記鋳型ヌクレオチドの集団が微小粒子に結合している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記微小粒子が基質に結合している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ビオチンとビオチン結合タンパク質とを含む結合によって前記微小粒子が前記基質に結合している、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記微小粒子が、半固体状の支持体に固定されていない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記標識された伸長用プローブが、ヌクレオチドを独立して選択することができない制約部位を含み、かつ、配列が異なる制約部位を有する前記標識された伸長用プローブが、コード化法に従ってプローブファミリーに割り当てられる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記鋳型ポリヌクレオチドの配列の決定が、検出された標識を、第一の標識オリゴヌクレオチド伸長用プローブファミリー、第二の標識オリゴヌクレオチド伸長用プローブファミリー、第三の標識オリゴヌクレオチド伸長用プローブファミリー、および第四の標識オリゴヌクレオチド伸長用プローブファミリーの１つに割り当てることを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
各プローブファミリーの前記標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブが、５’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−３’または３’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−５’という構造（ただし、Ｎは、任意のヌクレオシドを表し、ＮＢは、リガーゼにより伸長させることができない部分を表し、＊は、検出可能な部分を表し、ＸＹは、ＸおよびＹが、同一であっても異なっていてもよいが、独立しては選択することができない前記プローブの制約部位であり、ＸおよびＹは、少なくとも２倍縮退しており、少なくとも１つのヌクレオシド間結合が切断可能な結合であり、また、ｋが１以上１００以下である）を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
１つまたはそれ以上の標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブに結合している前記標識が、検出可能部分を組み合わせたものを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブ、前記非標識のオリゴヌクレオチド伸長用プローブ、またはその両方が、切断可能な結合を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記切断可能な結合がホスホロチオレート結合である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブ、前記非標識のオリゴヌクレオチド伸長用プローブ、またはその両方が、一方の末端に伸長不能部分を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチド伸長用プローブ部位上に伸長可能な末端を作出する工程が、前記オリゴヌクレオチド伸長用プローブ内にあるホスホロチオレート結合を、Ａｇ含有化合物、Ｈｇ含有化合物、Ｃｕ含有化合物、Ｍｎ含有化合物、Ｚｎ含有化合物、およびＣｄ含有化合物を１つまたはそれ以上含む切断剤によって切断する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
オリゴヌクレオチド伸長用プローブ部位上に伸長可能な末端を作出する工程が、最後のオリゴヌクレオチド伸長用プローブがライゲーションされた前記伸長可能な末端とは別の伸長可能な末端を作出することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ａ）の前に、前記鋳型ポリヌクレオチドをブロッキング用オリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３７】
検出工程（ｄ）が、各個別のヌクレオチドから２ビットの情報を得ることなく、前記鋳型ポリヌクレオチド中の少なくとも２個のヌクレオチドのそれぞれから実質的に同時に平均して２ビットの情報を得ることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３８】
検出工程（ｄ）が、前記鋳型中の少なくとも２個のヌクレオチドのそれぞれから同時に２ビットよりも少ない情報を得ることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３９】
前記鋳型ポリヌクレオチドの配列の決定が、
（ｉ）工程（ｆ）を２回またはそれ以上行なって作成された可能な配列の前記リストから、少なくとも２つの候補配列を作出することと
（ｉｉ）前記少なくとも２つの候補配列の一方を、前記鋳型中の前記ヌクレオチドの配列として選択すること
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項４０】
選択する工程が、
（ｉ）識別可能に標識されコード化されたプローブファミリーの第二のコレクションであって、前記プローブファミリーの前記第二のコレクションのプローブファミリーが、プローブファミリーの前記第一のコレクションにおける前記プローブファミリーとは異なってコード化されている前記第二のコレクションを用いて、前記鋳型ポリヌクレオチドについて可能な配列の第二のリストを得ることと、
（ｉｉ）プローブファミリーの名前の第二の順序付リストから、少なくとも１個の比較用配列を作出することと、
（ｉｉｉ）前記候補配列の少なくとも１つの一部を、前記比較用配列の少なくとも１つの一部位と比較することと
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で比較された前記部位に対して所定の同一性レベルを示すか、比較用配列に最も同一性が高いか、またはその両方である候補配列を、前記鋳型ポリヌクレオチド中の前記ヌクレオチドの配列として選択すること
を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
比較された前記部位が、単一のジヌクレオチドである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記検出工程が、切断可能なリンカーによって、前記標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブに結合された検出可能部分を検出することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項４３】
１つまたはそれ以上の工程が、ウシ血清アルブミンを使用して、使用するリガーゼの量を低減させ易くすることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項４４】
工程（ｃ）が、工程（ｄ）の前に一回またはそれ以上繰り返される、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照されて本明細書に組み込まれる、２００７年１０月１日出願の米国特許出願第６０／９７６，７５７号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸配列決定技術は、基礎研究から臨床診断に至る広範で多様な分野において主に重要なものである。この技術から得られる利用可能な結果には、様々な程度の特異性に関する情報などが含まれうる。例えば、有用な情報は、特定のポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドとは配列が異なっているか否かを決定すること、試料中に特定のポリヌクレオチド配列が存在するのを確認すること、部分配列情報、例えば、ポリヌクレオチド内にある一つ以上のヌクレオチドの同一性などを究明すること、ポリヌクレオチド内におけるヌクレオチドの同一性および順序を決定することなどからなり得る。
【０００３】
ＤＮＡ鎖は、一般的には四種類のサブユニット、すなわちアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミジン（Ｔ）という塩基を含むデオキシリボヌクレオチドからなる高分子である。これらのサブユニットは、デオキシリボース基の５’炭素を隣接する基の３’炭素に結びつけるホスホジエステル共有結合によって互いに結合している。ほとんどの天然型ＤＮＡは、２本のこのような鎖２本からなり、これらの鎖は逆平行の方向に配列され、相補的塩基、すなわちＡとＴおよびＧとＣの間に形成される水素結合によって一つにまとまっている。
【０００４】
ＤＮＡ配列決定は、まず、チェーン・ターミネーション法またはジデオキシヌクレオチド法（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５４６３−５４６７，１９７７）および化学分解法（Ｍａｘａｍ  ＆  Ｇｉｌｂｅｒｔ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５６０−５６４，１９７７）の開発によって、大規模に行うことが可能となったが、このうち、前者は最も広く利用され、改良され、自動化されている。特に、自動ＤＮＡ配列決定装置の開発においては、蛍光標識された連鎖停止剤の使用が極めて重要であった。上記の方法のいずれにも共通するのは、異なったサイズの標識されたＤＮＡ断片の一つ以上のコレクションを作成し、その後、それらを長さに基づいて分離し、断片の３’末端にあるヌクレオチドの同一性（チェーン・ターミネーション法）、または、断片から直前に切り離されたヌクレオチドの同一性（化学分解法については）を決定する必要があることである。
【０００５】
現在利用可能な配列決定技術によって、いくつかの完全長ゲノムの配列決定のような主な画期的な成果の達成が可能となったが、これらの技術には不都合な点がいくつかあり、いくつかの領域において改善の必要性がかなり残されている。標識ＤＮＡ断片の分離は、一般的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を利用して行われている。しかし、この工程は、数多くの状況において、配列決定の速度と精度を制限する大きなボトルネックとなっていることが分かっている。キャピラリー電気泳動法（ＣＡＥ）は、ヒトゲノムプロジェクトの完了を可能にしたブレークスルーであった（非特許文献１；日特許文献２）が、顕著な欠点がまだ存在している。例えば、ＣＡＥには、多大な時間を必要とする分離工程がまだ必要であり、また、サイズによる分別をなお含んでいるが、これは不正確となる可能性がある。
【０００６】
その他の配列決定法には、ＤＮＡ重合反応の過程で放出されるピロリン酸塩（ＰＰｉ）を検出することによるパイロシークエンス法（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）などがある（例えば、特許文献１および特許文献２参照）。パイロシークエンス法は、電気泳動的分離を必要としないものの、その広範な利用可能性を依然として制約している数多くの欠点がある（非特許文献３）。ハイブリダイゼーションによる配列決定法が、別の方法として提案されてもいる（特許文献３；特許文献４；特許文献５；非特許文献４）が、これには、極めて類似度が高い配列同士を識別する際にエラーを起こす可能性があるなど、いくつかの欠点がある。一本の鎖中の全ての塩基を標識してから、試料の流れにおいて切断される３’末端のヌクレオチドを連続的に検出する、エキソヌクレアーゼによる単一分子シークエンス法は、理論的には、長いＤＮＡ分子の配列を迅速に決定するための非常に有効な方法である（非特許文献５）。しかし、この可能性を実現するまでには、克服すべきさまざまな技術的障害が依然として存在している（非特許文献５）。
【０００７】
特定の配列変異に基づく診断検査法が、さまざまな異なった病気で既に利用されている。ヒトゲノムの配列決定は、予防的治療を含む治療法を、患者の具体的な遺伝子構造に適合させたり、特定の対立遺伝子または突然変異の同定に基づいて選択したりできるようになるオーダーメイド医療の時代の到来を告げるものであると広く考えられている。ＨＩＶなどの病原体の配列変異を迅速かつ正確に決定する必要性が高まっている。そのため、近い将来、正確かつ迅速な配列決定に対する需要が大いに拡大することは明白である。従って、あらゆる種類の配列決定法の改良が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，２１０，８９１号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２５８，５６８号明細書
【特許文献３】米国特許第５，２０２，２３１号明細書
【特許文献４】国際公開第９９／６０１７０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第００／５６９３７号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｖｅｎｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：１３０４−１３５１，２００１
【非特許文献２】Ｌａｎｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４０９：８６０−９２１，２００１
【非特許文献３】Ｆｒａｎｃａら、Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，３５（２）：１６９−２００，２００２
【非特許文献４】Ｄｒｍａｎａｃら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７７：７６−１０１，２００２
【非特許文献５】Ｓｔｅｐｈａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８６：２５５−２６７，２００１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
さまざまな態様において、本教示は、さまざまな実施態様において、断片の分離および／またはポリメラーゼ酵素の使用を低減および／または回避する配列決定法を提供する。さまざまな実施態様において、一本鎖鋳型に沿って二重鎖を伸長するサイクルを繰り返すことを含むが、各サイクルにおいて各別のヌクレオチドを同定することは含まない配列決定法が提供される。
【００１１】
さまざまな態様において、一本鎖鋳型に沿って二重鎖を伸長し、標識された伸長用プローブをライゲーションし、標識を検出するというサイクルを連続することに基づいた配列決定法が提供される。一般に、伸長は、開始用オリゴヌクレオチドと鋳型によって形成された二重鎖から開始させることができる。開始用オリゴヌクレオチドは、その末端に、標識されたオリゴヌクレオチドプローブをライゲーションすることによって伸長さて、伸長した二重鎖を形成し、次に、それが、標識されたプローブをライゲーションするサイクルを連続して行うことによって、繰り返し伸長される。それぞれのサイクルの過程で、鋳型中の一つ以上のヌクレオチドの同一性を、ライゲーションに成功した標識オリゴヌクレオチドプローブ上にあるか、それと結合している標識を同定することによって決定することができる。また、新たに付加された標識プローブの標識を、ライゲーションの前、あるいは、それに加えて、ライゲーションの後に検出することも可能である。さまざまな実施態様において、標識プローブは、ライゲーション後に検出される。
【００１２】
さまざまな実施態様において、本教示は、ライゲーションの効率を向上させ易くし、および／または配列の読み取りを増加させ易くする配列決定法を提供する。そのような方法は、相補的な標識伸長プローブが利用できないか不十分である鋳型領域を配列決定しつくすことを可能にする。さまざまな実施態様において、配列決定は、伸長可能な末端を有する開始用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした鋳型ポリヌクレオチドを含む二重鎖の集団に沿って、二重鎖を伸長させるサイクルを連続して行うことによって行われる。さまざまな実施態様において、標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブとのライゲーションを一回行うことに加えて、標識されていないオリゴヌクレオチド伸長用プローブとのライゲーションが一回以上用いられる。標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブを使用するライゲーションの過程で、プローブ−鋳型二重鎖の中には、標識されたプローブにライゲーションできないものもあり得る。そのような二重鎖の少なくとも一画分は、その後、非標識プローブとのライゲーションの過程で非標識プローブにライゲーションすることによって伸長させることができる。標識された伸長用プローブおよび／または非標識の伸長用プローブは、ホスホロチオレート結合を含んでいてもよい。そして、二重鎖の少なくとも一画分のオリゴヌクレオチド伸長プローブ部位上に、伸長可能な末端を作出することができる。さまざまな実施態様において、このような方法によって、最初のライゲーション過程において標識伸長用プローブに結合しなかった鋳型ポリヌクレオチド上での伸長が可能となる。
【００１３】
さまざまな実施態様において、微小粒子のそれぞれが、それに結合した鋳型ポリヌクレオチドのクローン集団を有するよう、微小粒子が存在するエマルジョン区画内で鋳型ポリヌクレオチドを増幅することができる。微小粒子に結合したブローブ鋳型二重鎖に沿ってシークエンシング反応を生じさせることができ、この微小粒子は、半固体状の支持体に固定されていない基質上に付着させることができる。任意のライゲーション工程の前に、ブロッキング用オリゴヌクレオチドを鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせることができる。
【００１４】
さまざまな実施態様において、識別可能に標識されたオリゴヌクレオチド伸長用プローブファミリーの少なくとも２つのコレクションを利用する配列決定法が提供される。さまざまな実施態様において、別の工程で検出された標識の同一性に基づいて配列の１つまたはそれ以上の可能性を消去する工程を含ませることによって、シーケンシングを１回行う度に、鋳型について可能な配列のリストが作成される。さまざまな実施態様において、このような工程を、鋳型ポリヌクレオチドの配列が決定されるまで繰り返す。
【００１５】
さまざまな実施態様において、プローブは、標識の有無に関わらず、末端位置（二重鎖の伸長鎖側にライゲーションされるヌクレオチドとは反対側にあるプローブ末端）に伸長不能部分を有するが、そのため、伸長した二重鎖の伸長は、一サイクルに一回しか起きない。「伸長不能」とは、修飾なしでは、その部分がリガーゼの基質として働かないことを意味する。例えば、この部分は、５’リン酸基または３’ヒドロキシル基を持たないヌクレオチド残基であってもよい。この部分は、ライゲーションを阻止する遮断基を結合させているヌクレオチドであってもよい。さまざまな実施態様において、この伸長不能部分をライゲーション後に除去して、伸長可能な末端を再生させ、後続のサイクルにおいて二重鎖を更に伸長させることができる。
【００１６】
伸長不能部分を除去することができるようにするため、さまざまな実施態様において、プローブは、実質的にはリン酸ジエステル結合を切断しない条件下で切断することができる少なくとも一つのヌクレオシド間結合を含む。このような結合を、本明細書では、「切断可能なヌクレオシド間結合」または「切断可能な結合」という。切断可能なヌクレオシド間結合を切断すると、伸長不能の部分が除去され、伸長可能なプローブ末端が再生され、および／または、修飾されると伸長可能なプローブ末端を形成することができる末端残基が残される。切断可能なヌクレオシド間結合は、プローブ内の任意の２つのヌクレオシドの間に置くことができる。さまざまな実施態様において、切断可能な結合は、新たに形成された結合から、少なくとも数ヌクレオチド離れて（すなわち、遠位に）置かれる。伸長可能な末端にライゲーションされている末端ヌクレオチドと切断可能な結合との間にある伸長用プローブ内のヌクレオチドは、鋳型と完全にハイブリダイズする必要はない。これらのヌクレオチドは「スペーサー」として役立つ可能性があり、鋳型に沿って間隔を置いて存在するヌクレオチドを、その間隔内にある各ヌクレオチドについてサイクルを実行することなしに同定することを可能にする。
【００１７】
さまざまな実施態様において、切断可能なヌクレオシド間結合および標識を、切断可能なヌクレオシド間結合の切断によって、伸長用プローブを標識部位と伸長中の核酸鎖の一部である部位とに分離できるような位置に置き、それによって、（例えば、温度を上げると）標識部分を放散させてしまうことができる。例えば、ライゲーションされたヌクレオチドとは反対側の末端で、標識を伸長用プローブに結合させることができる。いくつかの任意の方法を用いて、標識を除去することができる。
【００１８】
本発明者らは、リン酸ジエステル結合内の架橋酸素原子の一つが硫黄原子によって置換されているホスホロチオレート結合が、切断可能なヌクレオシド間結合として働くことができることを発見した。ホスホロチオレート結合内の硫黄原子は、一つのヌクレオシドの３’炭素または隣接ヌクレオシドの５’炭素のいずれと結合していてもよい。
【００１９】
該方法のさまざまな実施態様において、複数のシークエンシング反応が行われる。さまざまな実施態様において、この反応では、最初のライゲーションが起きる末端が、その鋳型で異なった位置となるよう、その鋳型のさまざまな配列にハイブリダイズする開始用オリゴヌクレオチドが用いられる。例えば、最初にライゲーションが起きる位置は、ヌクレオチドを１個ずつ増やして、互いに対して移動させる、すなわち、「位相をずらす」ことができる。すなわち、長さの同じオリゴヌクレオチドプローブによる各伸長サイクルの後も、異なった鋳型上にある開始用オリゴヌクレオチド同士の末端間に同一の相対位相が存在する。反応は、それぞれが同じ鋳型のコピーを含む別々の区画内で並行して、および／または、連続して、例えば、第一の開始用オリゴヌクレオチドを用いて配列情報を得た後に鋳型から伸長した二重鎖を除去してから、鋳型の別の配列にハイブリダイズする開始用オリゴヌクレオチドを用いてさらに反応を行なうなどすることができる。
【００２０】
さまざまな態様において、多様な核酸操作に役立つ溶液が提供される。さまざまな実施態様において、水中に１．０〜３．０％のＳＤＳ、１００〜３００ｍＭのＮａＣｌ、および５〜１５ｍＭの重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を含むか、基本的にこれらで構成される溶液が提供される。この溶液は、水中に約２％のＳＤＳ、約２００ｍＭのＮａＣｌ、および約１０ｍＭの重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を含むか、基本的にこれらで構成され得る。例えば、さまざまな実施態様において、この溶液は、水中に２％のＳＤＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、および１０ｍＭの重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を含む。さまざまな実施態様において、この溶液は、基本的に水中に２％のＳＤＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、および１０ｍＭの重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）から構成される。さまざまな実施態様において、この溶液のｐＨは２．０〜３．０、例えば、２．５である。この溶液は、例えば、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを個々の鎖に分けたり、例えば、二本鎖核酸を変性（融解）させたりするのに役立ちうる。さまざまな実施態様において、鎖は二本ともＤＮＡである。さまざまな実施態様において、鎖は二本ともＲＮＡである。さまざまな実施態様において、一方の鎖はＤＮＡであり、他方の鎖はＲＮＡである。さまざまな実施態様において、一方または両方の鎖が、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む。さまざまな実施態様において、鎖の一方または両方が、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ以外のヌクレオチドを少なくとも１つ含む。さまざまな実施態様において、鎖の一方または両方が、非天然型ヌクレオチドを含む。更にさまざまな実施態様において、１つまたはそれ以上の残基が、トリガー残基、例えば、脱塩基性残基または傷害塩基である。さまざまな実施態様において、１つまたはそれ以上の残基がユニバーサル塩基を含む。さまざまな実施態様において、鎖の一方または両方が、切断可能な結合を含む。
【００２１】
二本鎖核酸は、全て二本鎖であっても、部分的に二本鎖であってもよい。それらは溶液中で遊離していてもよく、鎖の一方または両方が、固体または半固体の支持体または基質に物理的に結合（例えば、共有結合または非共有結合）していてもよい。特に注目すべきは、これらの溶液中でインキュベートされた二本鎖核酸は、（例えば、核酸が、ポリアクリルアミドゲルなどの半固体状の支持体中に入っているか、それに結合している場合に）ゲルの層間剥離を引き起こしたり、（例えば、核酸が、ＳＡ−ビオチン結合を介して支持体または基質に結合している場合に）ストレプトアビジン（ＳＡ）−ビオチン結合などの非共有結合を壊したりするかもしれない熱または強力な変性剤がなくとも、効果的に一本鎖に分離されることである。一つの実施態様において、この溶液は、核酸の一方がＳＡ−ビオチン結合を介してビーズに結合している二本鎖核酸を分離するために用いられる。
【００２２】
さまざまな態様において、本教示は、二本鎖核酸を、上記の溶液のいずれか、例えば、約１．０〜３．０％のＳＤＳ、約１００〜３００ｍＭのＮａＣｌ、および約５〜１５ｍＭの重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を含む水溶液、例えば、１．０〜３．０％のＳＤＳ、１００〜３００ｍＭのＮａＣｌ、および５〜１５ｍＭの重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を含む水溶液と接触させる工程を含む、二本鎖核酸の鎖を分離する方法を提供する。一つの実施態様において、この溶液は、約２％のＳＤＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、および１０ｍＭの重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）、例えば、２％のＳＤＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、および１０ｍＭの重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）を含む。別の実施態様において、この溶液は、基本的には、水中に２％のＳＤＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、および１０ｍＭの重硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ４）で構成される。さまざまな実施態様において、この溶液のｐＨは２．０と３．０の間、例えば、２．５である。さまざまな実施態様において、二本鎖核酸をこの溶液中でインキュベートする。さまざまな実施態様において、この溶液で二本鎖核酸（さまざまな実施態様において、支持体または基質に結合している）を洗浄する。さまざまな実施態様において、少なくとも１０％の二本鎖核酸分子が一本鎖に分離するのに十分な時間、その二本鎖核酸分子を溶液に接触させる。さまざまな実施態様において、二本鎖核酸分子の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上が一本鎖に分離するのに十分な時間、二本鎖核酸を溶液に接触させる。例示的な実施態様において、１５秒から３時間、二本鎖核酸を溶液に接触させる。別の実施態様において、１分から１時間、二本鎖核酸を溶液と接触させる。さまざまな実施態様において、約１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間、５５分間、または６０分間、二本鎖核酸を溶液に接触させる。この方法は、インキュベーション期間の後に、溶液を除去するか、または核酸の一部または全部を溶液から除去する更なる工程を含むことができる。
【００２３】
該溶液は、本明細書中に記載された多数の配列決定方法の１以上の工程において用途が見出される。例えば、該溶液を用いて、延長されたデュプレックスを鋳型から分離することができる。該溶液は切断可能結合の切断に従って用いて、延長されたデュプレックスに付着したより長いものがない延長プローブの一部を除去することができる。また、該溶液は、三本鎖核酸のストランドを分離するにおいて、あるいは相互にハイブリダイズドした自己−相補的部分を含有する単一の核酸ストランドの二本鎖領域を分離するにおいて用途がある。
【００２４】
もう１つの局面において、少なくとも２つの区別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーのコレクションを用いて配列についての情報を得る方法が提供される。プローブファミリーにおけるプローブは、拘束されていない部分および拘束された部分を含有する。前記した方法におけるように、延長は、イニシャライジングオリゴヌクレオチドおよび鋳型によって形成されたデュプレックスから開始する。イニシャライジングオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブをその末端に連結させて、延長されたデュプレックスを形成し、次いで、それを連続的サイクルによって反復して延長することによって延長される。プローブは、延長されたデュプレックスの単一延長のみが単一のサイクルで起こるように、（デュプレックスの成長する核酸ストランドに連結されるヌクレオチドからのプローブの反対末端において）末端位置において延長可能でない部位を有する。各サイクルの間に、成功して連結されたプローブ上の、または該プローブと会合した標識が検出され、該延長可能でない部位を除去し、または修飾して、延長可能な末端が生じる。該標識は、プローブが属するプローブファミリーに対応する。
【００２５】
延長、連結、および検出の連続的サイクルは、連続的な成功して連結されたプローブが属するプローブファミリーの順序付きリストを生じさせる。プローブファミリーの順序付きリストを用いて、該配列についての情報が得られる。しかしながら、新しく連結されたプローブがいずれのプローブファミリーに属する知識は、それ自体では、鋳型中のヌクレオチドの同一性を決定するのに十分ではない。その代わり、新しく連結されたプローブがいずれのプローブファミリーに属するかの知識は、プローブの拘束された部分の配列に対する可能性としてのある種の配列を排除するが、各位置におけるヌクレオチドの同一性においての少なくとも２つの可能性を残す。かくして、新しく連結されたプローブの拘束された部分におけるヌクレオチドに対して対向する位置に位置する鋳型中のヌクレオチドの同一性に対して少なくとも２つの可能性がある（すなわち、プローブの拘束された部分中のヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド）。
【００２６】
種々の実施形態において、所望の数のサイクルを行った後に、候補配列の組が、プローブファミリー同一性の秩序立ったシリーズを用いて生じる。候補配列の該組は、目的を達成するための十分な情報を提供することができる。種々の実施形態において、１以上のさらなる工程を行って、候補配列の間から正しい配列を選択する。例えば、該配列を既知の配列のデータベースと比較することができ、データベース中の配列の１つに最も近い候補配列を正しい配列として選択する。種々の実施形態において、鋳型を、プローブファミリーの異なってコードされた組を用いる、延長、連結、検出、および切断の連続的サイクルによるもう１つのラウンドの配列決定に付し、第二のラウンドで得られた情報を用いて、正しい配列を選択する。種々の実施形態において、情報の少なくとも１つの項目を、プローブファミリー同一性の順序付きリストから得られた情報と組合せて配列を決定する。
【００２７】
種々の実施形態において、本教示は、プローブファミリーを用いて鋳型を配列決定する場合の、エラーのチェッキングを行う方法を提供する。該方法のあるものは、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）および配列決定エラーの間を識別する。
【００２８】
種々の実施形態において、本教示は、各々が注目するセグメントに対応する少なくとも２つの区別される鋳型を各断片から増幅することができるように、セグメント（例えば少なくとも２つのタグ）、少なくとも２つのプライマー結合領域（ＰＢＲ）を含有する核酸断片（例えば、ＤＮＡ断片）を提供する。「プライマー結合領域」は、オリゴヌクレオチドが増幅プライマー、配列決定プライマー、イニシャライジングオリゴヌクレオチド等として働くことができるように、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることができる核酸の部分である。かくして、プライマー結合領域は、適当な相補的オリゴヌクレオチドの選択を可能とするために公知の配列を有すべきである。本明細書、および図面で用いるように、本教示の種々の実施形態の方法で用いる核酸ストランドの部分とは、該方法の実施において、プライマーが現実に当該領域に結合するか、あるいは核酸ストランドの相補的ストランドの対応する部分に結合するかに拘わらず、プライマー結合領域ということができる。かくして、核酸の部分とは、本教示の種々の実施形態に用いる場合に、プライマーが現実にその領域に結合する（この場合、プライマーの配列は当該領域のそれと相補的なまたは実質的に相補的である）、あるいは当該領域の相補体に結合する（この場合、プライマーの配列は該プライマー結合領域と同一であるか、または実質的に同一である）に拘わらず、プライマー結合領域ということができる。注目するセグメントは、配列の情報が望まれる核酸のいずれかのセグメントである。例えば、注目する配列はタグであってよく、本開示の目的では、注目するセグメントは（本明細書中において、および他の個所において、「末端タグ」ともいわれる）タグであると推定されるであろう。しかしながら、本教示は、タグである注目するセグメントに限定されないことは理解されるべきである。種々の実施形態において、少なくとも２つのタグは対となったタグである。核酸断片は、タグの１以上の対、例えば、１以上の対となったタグ、例えば、対となったタグの２、３、４、５またはそれを超える対を含有することができる。種々の実施形態において、本教示は、そのような核酸断片を含有するライブラリー、および該鋳型およびライブラリーを作成する方法を提供する。
【００２９】
種々の実施形態において、本教示が、それに付着した核酸の少なくとも２つの区別される集団を有する微粒子、例えば、ビーズを提供し、ここに、該少なくとも２つの集団の各々は複数の実質的に同一の核酸よりなり、およびここに、該集団は単一の核酸断片からの増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）によって生産されたものである。種々の実施形態において、単一の核酸断片は５’タグおよび３’タグを含有し、ここに、該５’および３’タグは対となったタグである。単一の核酸断片が対の５’タグおよび３’タグを含有する種々の実施形態において、微粒子に付着した核酸の集団の１つは少なくとも５’タグの部分を含み、微粒子に付着した核酸の集団の１つは少なくとも３’タグの部分を含む。種々の実施形態において、集団の１つは完全な５’タグを含み、および集団の１つは完全な３’タグを含む。
【００３０】
核酸断片は、少なくとも５’タグの部分を含む領域を増幅することができ、および少なくとも３’タグの部分を含む領域を増幅して、核酸の２つの区別される集団を生じさせることができるように、その少なくとも１つが該タグの間に位置し、およびその内少なくとも２つが該タグを含有する核酸断片の部分に近接する多数のＰＢＲを含有する。種々の実施形態において、全５’タグおよび全３’タグを増幅することができる。例えば核酸断片は、５’タグに近接する第１および第２のプライマー結合部位、また、３’タグに近接する第３および第４のプライマー結合部位を含有することができる。第１および第２のプライマー結合部位に結合するプライマーを用いるＰＣＲ増幅は、５’タグを増幅させる。第３および第４の結合部位に結合するプライマーを用いるＰＣＲ増幅は、３’タグを増幅させる。プライマーは、各プライマーからの延長が、増幅すべきタグを含有するＤＮＡ断片の領域に向けて進行するように選択されるべきであるのは認識されるであろう。種々の実施形態において、第１のプライマー結合部位はタグの１つの上流に位置することができ、第２のプライマー結合部位は他のタグの下流に位置することができ、および第３のプライマー結合部位は２つのタグの間に位置することができる。第３のプライマー結合部位は、タグの１つを増幅させるＰＣＲ増幅のための順方向プライマー用の結合部位として働き、他のタグを増幅させるＰＣＲ増幅のための逆方向プライマー用の結合部位として働く。かくして、種々の実施形態において、本教示は、それに付着した核酸の少なくとも２つの区別される集団を有する微粒子、例えば、ビーズを提供し、ここに、該少なくとも２つの集団の各々は、複数の実質的に同一の核酸よりなり、およびここに、第１の区別される集団は５’タグを含み、および第２の区別される集団は３’タグを含む。
【００３１】
種々の実施形態において、本教示は、微粒子、例えば、ビーズの集団を提供し、ここに、個々の微粒子はそれに付着した核酸の少なくとも２つの区別される集団を有し、ここに、該少なくとも２つの集団の各々は複数の実質的に同一の核酸よりなり、およびここに、該集団は単一のＤＮＡ断片からの増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）によって生産されたものである。実質的に同一の集団は、例えば、５’タグおよび３’タグであり得る。提供されるさらに種々の実施形態は、そのような微粒子のアレイ、および実質的に同一の核酸の集団を配列決定することを含む配列決定の方法である。例えば、１つの実施形態において、個々の微粒子に付着した実質的に同一の核酸の２つの集団の各々は、異なる配列決定プライマーを用いることによって、集団の１つが、他の集団からの干渉なくして配列決定できるように、異なるプライマー結合領域（ＰＢＲ）を含む。もし実質的に同一の核酸の２を超える実質的に同一の集団が単一の微粒子に付着しているならば、与えられたＰＢＲに結合するプライマーが、微粒子に付着した他の実質的に同一の集団に存在するＰＢＲに結合しないように、該集団の各々はユニークな（すなわち、区別される）ＰＢＲを有することができる。かくして、該方法の種々の実施形態は、それに付着した核酸の少なくとも２つの異なる実質的に同一の集団を有する微粒子（例えば、５’タグを含有する鋳型の多数のコピーおよび３’タグを含有する鋳型の多数のコピー）を可能とし、ここに、該タグは対となったタグである。該方法の種々の実施形態によると、鋳型は、配列決定プライマーのための結合部位を供する異なるＰＢＲを含有する。従って、５’タグを含有する鋳型におけるＰＢＲに相補的な配列決定プライマーを選択することによって、３’タグを含有する鋳型もまた同一微粒子上に存在するが、３’タグを含有する鋳型からの干渉なくして、配列情報を５’タグから得ることができる。３’タグを含有する鋳型におけるＰＢＲに相補的な配列決定プライマーを選択することによって、５’タグを含有する鋳型もまた同一微粒子上に存在するが、５’タグを含有する鋳型からの干渉なくして３’タグから配列情報を得ることができる。対となったタグの双方が同一の微粒子上に存在するという事実は、５’および３’の対となったタグの配列は、もしそれらが単一の鋳型内に存在するという場合にちょうど当てはまるように相互に会合することができることを意味する。
【００３２】
また、基板に付着した微粒子のアレイも提供される。１つの実施形態において、微粒子は、一本鎖鋳型を介して基板に連結され、すなわち、１つの末端において微粒子に付着し、他の末端において基板に付着する。いずれかまたは双方の末端における付着の手段は共有結合的あるいは非共有結合的であってよい。種々の実施形態において、付着のいずれかのまたは双方の手段は、ビオチン−結合部位およびビオチンを含む。
【００３３】
また、微粒子に付着した鋳型をコピーし、所望により、コピーされた鋳型を増幅することによって生じた核酸コロニーを含むアレイも提供される。また、ブロッキングオリゴヌクレオチド、およびその使用方法、ならびにブロッキングオリゴヌクレオチドを含む組成物も提供される。
【００３４】
種々の実施形態において、例えば、実質的に平面の支持体中に、またはその上にアレイされた鋳型を配列決定するのに用いることができる自動配列決定システムが提供される。種々の実施形態において、イメージ処理方法が提供され、これはハードディスク、ＣＤ、ジップディスク、フラッシュメモリーなどのようなコンピュータ−リーダブル媒体に貯蔵することができる。ある種々の実施形態において、該システムは秒当たり４０，０００ヌクレオチドの同定またはそれ以上を達成する。ある種々の実施形態において、該システムは日（２４時間）当たり８．６ギガバイト（Ｇｂ）の配列データを生じ得る。種々の実施形態において、該システムは、日当たり４８Ｇｂの配列情報（ヌクレオチド同定）またはそれ以上を生じる。
【００３５】
種々の局面において本教示は、本教示の配列決定方法の種々の実施形態を適用することによって生じる情報を貯蔵するコンピュータ−リーダブル媒体を提供する。該情報はデータベースに貯蔵してもよい。
【００３６】
本出願とは、その全てをここに引用して援用する、種々の特許、特許出願、雑誌の論文、および他の刊行物をいう。加えて、以下の標準的な文献の研究はここに引用して援用する：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，２００２年７月現在の版；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１。本出願およびここに引用して援用するいずれかの処理の間にコンフリクトがある場合、該明細書が支配し、コンフリクトまたは不一致が存在するか否かの決定は、発明者らの裁量内のものであり、いずれの時点でおいても成すことができると理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】図１Ａは、初期化、続いての、延長、連結、および同定の２サイクルを図式的に説明する。
【００３８】
【図１Ｂ】図１Ｂは、延長が鋳型の自由末端から支持体に向けて内方に進行する実施形態における、初期化、続いての、延長、連結、および同定の２サイクルを図式的に説明する。
【００３９】
【図２】図２は、プローブの３’塩基の同一性が、フルオロフォアの色を同定することによって決定されるオリゴヌクレオチドプローブに色を帰属させるスキームを示す。
【００４０】
【図３Ａ】図３Ａは、鋳型の結合領域中の異なる位置におけるイニシャライジングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いての、延長プローブの連結から得られる延長されたデュプレックスを図式的に示す。
【００４１】
【図３Ｂ】図３Ｂは、鋳型分子の毎６番目の塩基を読むように設計された延長プローブでの延長、連結、および切断を用いることによる連続的配列の組立を図式的に示す。
【００４２】
【図４Ａ】図４Ａは、５’−Ｓ−ホスホロチオレート結合（３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’）を示す。
【００４３】
【図４Ｂ】図４Ｂは、３’−Ｓ−ホスホロチオレート結合（３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’）を示す。
【００４４】
【図５Ａ】図５Ａは、３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’ホスホロチオレート結合を有する延長プローブを用いる、５’→３’方向の配列決定のための延長、連結および切断の単一サイクルを図式的に示す。
【００４５】
【図５Ｂ】図５Ｂは、３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’ホスホロチオレートを有する延長プローブを用いる、３’→５’方向の配列決定のための延長、連結、および切断の単一サイクルを図式的に示す。
【００４６】
【図６】図６Ａないし６Ｆは、単一鋳型で行われた数回の配列決定反応のより詳細な図式的説明である。該反応は、鋳型の異なる部分に結合するイニシャライジングオリゴヌクレオチドを利用する。
【００４７】
【図７】図７は、ｄＡおよびｄＧの３’−ホスホロアミダイトのための合成スキームを示す模式図である。
【００４８】
【図８−１】図８Ａないし８Ｅは、ホスホロチオレート結合を含有する延長部ローブの成功した連結および切断の２サイクルを示すゲルシフトアッセイの結果を示す。
【００４９】
【図８−２】図８Ｆは、ＤＮＡリガーゼによる連結のメカニズムの模式図を示す。
【００５０】
【図９】図９は、縮重イノシン−含有オリゴヌクレオチドプローブの連結効率を示すゲルシフトアッセイの結果を示す。
【００５１】
【図１０】図１０は、多数の鋳型上での縮重イノシン−含有オリゴヌクレオチドプローブの連結効率を示すゲルシフトアッセイの結果を示す。
【００５２】
【図１１】図１１は、３’→５’延長のための２つのＤＮＡリガーゼ（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ）の各々の忠実度を評価するために行われた分析の結果を示す。
【００５３】
【図１２】図１２は、縮重イノシン−含有オリゴヌクレオチドプローブの連結効率を示すゲルシフトアッセイ（Ａ）、およびオリゴヌクレオチドプローブ連結におけるＴ４  ＤＮＡリガーゼの忠実度を評価するために行われた連結反応（Ｂ）の直接的配列決定分析の結果を示す。結果はパネルＣ−Ｆにおいて表化する。
【００５４】
【図１３】図１３Ａないし１３Ｃは、ビーズ−ベースの鋳型をスライド上のポリアクリルアミノゲルに包埋する場合の、イン−ゲル連結を示す実験の結果を示す。図１３Ａは、連結反応の模式図を示す。ゲル連結において、反応は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの不存在下（Ｂ）および存在下（Ｃ）で行った。
【００５５】
【図１４Ａ】図１４Ａは、蛍光標識された第２の増幅プライマーおよび過剰の鋳型を用いて、付着した第１の増幅プライマーを有するビーズ上で行ったエマルジョンＰＣＲ反応のイメージを示す。
【００５６】
【図１４Ｂ】図１４Ｂ（頂部）は、Ｃｙ３−標識オリゴヌクレオチドがそれにハイブリダイズした、付着された鋳型を持つビーズがポリアクリルアミノゲル内に固定化されたスライドの部分の蛍光イメージを示す。（このスライドは異なる実験で用いたが、ここで用いたスライドの代表である）。図１４Ｂ（底部）は、ポリアクリルアミノ溶液を包むためのテフロン（登録商標）マスクを備えたスライドの模式図を示す。
【００５７】
【図１５】図１５は、プローブの特異性および選択性の問題に取り組むために設計された標識されたオリゴヌクレオチドプローブの３つの組を示し、また、４つのスペクトルにより分解可能な標識の組のための励起および発光値も示す。
【００５８】
【図１６】図１６は、オリゴヌクレオチドプローブの４−色スペクトル同一性を確認する実験の結果を示す。４つのユニークは一本鎖鋳型集団（Ａ）を含有するスライドを、ハイブリダイゼーションに付し、４つのユニークなフルオロフォアープローブを含有するオリゴヌクレオチドプローブ混合物を用いる連結反応を明るい色下で（Ｂ）、および連結の前および後において４つのバンドパスフィルターを用いる蛍光励起でイメージした。個々の集団を偽着色した（Ｃ）。最小シグナル重複を示したスペクトル同一性を（Ｄ）にプロットする。
【００５９】
【図１７】図１７は、オリゴヌクレオチド延長プローブ連結特異性を確認する実験を示す。図１７（Ａ）は、連結の模式的概略を示す。図１７（Ｂ）は、明るい色のイメージであり、および図１７（Ｃ）は連結後にポリアクリルアミドゲルに包埋されたビーズの集団の対応する蛍光イメージである、図１７（Ｄ）は、連結の前（プレ）または後（ポスト）の各標識から検出された蛍光を示す。
【００６０】
【図１８】図１８は、オリゴヌクレオチド延長プローブの連結の特異性および選択性を確認するもう１つの実験を示す。図１８（Ａ）は、連結の模式的概略を示す。図１７（Ｂ）は、明るい色のイメージであって、図１８（Ｃ）は、連結後にポリアクリルアミドゲルに包埋されたビーズの集団の対応する蛍光イメージである。図１８（Ｄ）は予測された−対−観察された連結の頻度を示し、これは、集団における特定の延長プローブの割合に基づいて予測される頻度、および観察される頻度の間の高い相関を示す。
【００６１】
【図１９】図１９は、オリゴヌクレオチド延長プローブプールを含有する縮重および普遍的塩基を用いて、特異的かつ選択的イン−ゲル連結を供することができることを確認する実験を示す。図１９（Ａ）は、連結実験の模式的概略を示し、これは、連結に続いての４つの異なって標識された縮重イノシン−含有プローブプールを説明する。図１９（Ｂ）は、明るい光のイメージであって、図１９（Ｃ）は、連結後にポリアクリルアミドゲルに包埋されたビーズの集団の対応する蛍光イメージである。図１９（Ｄ）は、予測された−対−観察された連結頻度を示し、これは、集団における特定の延長プローブの割合に基づいて予測される頻度および観察された頻度の間の高い相関を示す。図１９（Ｅ）は、生の処理されていないデータ、およびビーズシグナル値の頂部９０％を表わす濾過されたデータの分布プロットを示す。
【００６２】
【図２０】図２０は、イニシャライジングオリゴヌクレオチド（プライマー）の鋳型へのハイブリダイゼーションおよびストリッピングの順次のサイクルで検出されたシグナルを示すチャートである。図面に示すように、最小のシグナル損失が１０サイクルにわたって起こった。
【００６３】
【図２１】図２１は、例えば、実質的に平面の支持体中に、またはその上にアレイされた鋳型からの配列情報を集めるのに用いることができる自動配列決定システムの写真である。また、該システムの種々の構成要素の操作を制御し、収集されたイメージデータを処理し、貯蔵し、ユーザーのインターフェイスを提供するなどのための専属コンピュータが示される。図面の下部は、重力泡変位を達成する向きのフローセルの拡大図を示す。
【００６４】
【図２２】図２２は、実質的に平面の支持体中に、またはその上にアレイされた鋳型を配列決定するのに用いることができる高スループット自動配列決定機器の模式図を示す。
【００６５】
【図２３】図２３は、整列不一致の分布プロットを示し、これは、３０フレームにわたる最小不一致を説明する。
【００６６】
【図２４】図２４ＡないしＩは、種々の異なる図中のフローセルまたはその部分の模式図を示す。
【００６７】
【図２５Ａ】図２５Ａは、長さが２ヌクレオチドである拘束された部分を含む部分的に拘束されたプローブを含むプローブファミリーのコレクションについての例示的なコーディングを示す。
【００６８】
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、プローブファミリーのコレクション（上方パネル）および連結、検出、おおよび切断のサイクル（下方パネル）を示す。
【００６９】
【図２６】図２６は、長さが２ヌクレオチドである拘束された部分を含む部分的に拘束されたプローブを含むプローブファミリーのもう１つのコレクションについての例示的コーディングを示す。
【００７０】
【図２７Ａ】図２７Ａないし図２７Ｃは、表１に定義されるプローブファミリーの２４コレクションを模式的に定義するための方法の種々の実施形態を表わす。
【図２７Ｂ】図２７Ａないし図２７Ｃは、表１に定義されるプローブファミリーの２４コレクションを模式的に定義するための方法の種々の実施形態を表わす。
【図２７Ｃ】図２７Ａないし図２７Ｃは、表１に定義されるプローブファミリーの２４コレクションを模式的に定義するための方法の種々の実施形態を表わす。
【００７１】
【図２８】図２８は、プローブが、長さが２ヌクレオチドである拘束された部分を含むプローブファミリーのコレクションを示す。
【００７２】
【図２９Ａ】図２９Ａは、拘束された部分の３ヌクレオチド長を持つプローブを含むプローブファミリーのコレクションのための拘束された部分を作り出すのに用いることができるダイアグラムを示す。
【００７３】
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、プローブファミリーの２４コレクションからの拘束された部分３ヌクレオチド長を持つプローブを含むプローブファミリーのコレクションのための拘束された部分を作り出すために用いることができるマッピングスキームのダイアグラムを示す。
【００７４】
【図３０】図３０は、プローブファミリーのコレクションを用いて配列決定が行われる方法を示す。プローブファミリーの組を用いる実施形態が描かれる。
【００７５】
【図３１Ａ】図３１Ａないし３１Ｃは、候補配列を作成するためのプローブファミリーの第１のコレクション、および解読するためのプローブファミリーの第２のコレクションを用いて配列決定が行われる方法を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ａないし３１Ｃは、候補配列を作成するためのプローブファミリーの第１のコレクション、および解読するためのプローブファミリーの第２のコレクションを用いて配列決定が行われる方法を示す。
【図３１Ｃ】図３１Ａないし３１Ｃは、候補配列を作成するためのプローブファミリーの第１のコレクション、および解読するためのプローブファミリーの第２のコレクションを用いて配列決定が行われる方法を示す。
【００７６】
【図３２】図３２は、プローブファミリーのコレクションを用いて配列決定が行われる方法を示す。
【００７７】
【図３３】図３３Ａは、それに付着したビーズを持つスライドの模式図を示す。ＤＮＡ鋳型がビーズに付着されている。図３３Ｂは、スライドに付着されたビーズの集団を示す。下方パネルは、白色光（左側）下、および蛍光顕微鏡観察下でのスライドの同一領域を示す。上方パネルは、一定範囲のビーズの密度を示す。
【００７８】
【図３４】図３４Ａないし３４Ｃは、核酸の個々の集団としての核酸断片（鋳型）に存在する対となったタグの双方のタグを増幅させ、および増幅プロセスを介してそれらを微粒子に捕捉するためのスキームを示す。
【００７９】
【図３５−１】図３５Ａおよび３５Ｂは、図３５のスキームのためのプライマーの設計および増幅の詳細を示す。核酸断片（鋳型）の双方のストランドを明瞭性のために示す。同一の配列を有するプライマーおよびプライマー結合領域を同一の色で提示する。例えば、Ｐ１は暗い青色で表わされ、これは、微粒子上におよび溶液中に存在するプライマーＰ１が、鋳型の示されたストランドに対応して着色された部分と同一の配列を有することを示す。Ｐ１で標識された鋳型の暗い青色領域は、対応するプライマー（Ｐ１）が、事実、他のストランドの相補的部分に結合し、プライマーＰ１と同一の配列を有するが、プライマー結合領域ということができる。
【００８０】
【図３５−２】図３５Ｃおよび３５Ｄは、各々、図３５Ａおよび３５Ｂの方法によって生じた微粒子に付着した第１および第２のタグの配列決定を示す。
【００８１】
【図３６】図３６Ａは、ライブラリーのメンバーに共通する、鋳型の順方向アダプター、逆方向アダプター、および内部アダプター部分にハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを示す、対となった−末端ライブラリーからの鋳型分子を描く。該図面の下方部分は、アダプターおよびブロッキングオリゴヌクレオチドのための例示的な配列を示す。図３６Ａないし３６Ｃ中の「ｄｄＢａｓｅ」は、ジオキシヌクレオシドを示す。「ユニークなＤＮＡ配列」は、配列決定されるべき標的領域を表わす。図３６Ｂは、ライブラリーのメンバーに共通する、鋳型分子の順方向アダプター、逆方向アダプター、および内部アダプター部分にハイブリダイズしたブロッカーオリゴヌクレオチドを示す、断片ライブラリーからの鋳型分子を描く。該図面の下方部分は、アダプターおよび相補的ブロッキングオリゴヌクレオチドについての例示的な配列を示す。図３６Ｃは、鋳型分子がローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を受けたライブラリーからの分子を描く。ＲＣＡは、鋳型分子（２）のユニークな部分、ならびにアダプター領域（１）およびパッドロック領域（３）の多数のコピーを作り出す。該図面は、ライブラリーのメンバーに共通する、鋳型のアダプターおよびパッドロック部分にハイブリダイズしたブロッキングオリゴヌクレオチドを示す。
【００８２】
【図３７】図３７は、数個のパッドロックプローブの配列およびＲＣＡを用いる鋳型分子の合成に続いてパッドロック領域をブロックするであろうオリゴヌクレオチドについての例示的な配列を示す。
【００８３】
【図３８】図３８は、半−固体媒体（ゲル−フリーの微粒子アレイ）を用いることなく基板上で作成した微粒子のアレイを示す。
【００８４】
【図３９】図３９は、ゲル−フリーの微粒子アレイを用いる連結―ベースの配列決定の結果を示す。
【００８５】
【図４０】図４０は、表面に位置する微粒子の模式図を示し、鋳型延長から得られるであろう接触パッチおよび核酸コロニーの予測されるサイズを説明する。
【００８６】
【図４１】図４１は、単一鋳型上で行われた配列決定反応の模式図を示す。
【００８７】
【図４２Ａ】図４２ＡないしＥは、標識された延長プローブでの１ラウンドの連結、続いての、単一ビーズに付着された多数の鋳型上での未標識延長プローブでの多数ラウンドの連結を用いる配列決定反応を描く。
【図４２Ｂ】図４２ＡないしＥは、標識された延長プローブでの１ラウンドの連結、続いての、単一ビーズに付着された多数の鋳型上での未標識延長プローブでの多数ラウンドの連結を用いる配列決定反応を描く。
【図４２Ｃ】図４２ＡないしＥは、標識された延長プローブでの１ラウンドの連結、続いての、単一ビーズに付着された多数の鋳型上での未標識延長プローブでの多数ラウンドの連結を用いる配列決定反応を描く。
【図４２Ｄ】図４２ＡないしＥは、標識された延長プローブでの１ラウンドの連結、続いての、単一ビーズに付着された多数の鋳型上での未標識延長プローブでの多数ラウンドの連結を用いる配列決定反応を描く。
【図４２Ｅ】図４２ＡないしＥは、標識された延長プローブでの１ラウンドの連結、続いての、単一ビーズに付着された多数の鋳型上での未標識延長プローブでの多数ラウンドの連結を用いる配列決定反応を描く。
【００８８】
【図４３Ａ】図４３Ａは、２つの異なる連結プロトコルのためのプライマーおよびプライマー／プローブ連結産物のゲルシフトアッセイからの結果を示す。
【００８９】
【図４３Ｂ】図４３Ｂは、７サイクルの連結をライブラリーについて行った実験からの結果を示す。サイクル当たり１連結（１５℃における４０分間の合計連結時間）でのプロトコルを用いる結果を、サイクル当たり４連結（１５℃における５０分間の合計連結時間）を用いる結果と比較した。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
種々の実施形態の記載
記載の理解を容易とするために、以下の定義を供する。一般に、定義されていない用語には、当該分野で一般的に認められたその意味または複数の意味が与えられると理解されるべきである。
【００９１】
本明細書中で用いるように、「脱塩基残基」は、得られるヌクレオチドがヌクレオシドまたはヌクレオチドに特徴的な水素結合にもはや参加しないように、窒素性塩基の除去、または窒素性塩基の十分な部分の除去後に残るヌクレオシドまたはヌクレオチドの部分の構造を有する残基である。脱塩基残基は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドから窒素性塩基を除去することによって生じさせることができる。しかしながら、用語「脱塩基」は、残基の構造的特徴をいうのに用いることができ、残基が生じた方法から独立している。用語「脱塩基残基」および「脱塩基部位」は、プリンまたはピリミジン塩基を欠如する核酸内の残基をいうのに本明細書中で用いられる。
【００９２】
本明細書中で用いるように、「脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼ」とは、ポリヌクレオチド中の脱塩基残基の５’側、３’側、および３’および５’双方の側いずれかで結合を切断する酵素をいう。種々の実施形態において、ＡＰエンドヌクレアーゼはＡＰリアーゼである。ＡＰエンドヌクレアーゼの例は、限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶＩＩＩおよびそのホモログ、およびＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＩＩおよびそのホモログを含む。特異的酵素、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩ、Ｅｎｄｏ  Ｖ等のようなエンドヌクレアーゼへの言及は、ホモログであるとして、および損傷した塩基の除去、および／または脱塩基残基または他のトリガー残基を含有するＤＮＡの切断に関して、同様な生化学的活性を保有するものとして、当該分野で認識される他の種からのホモログを含むことを意図するのは理解されるべきである。
【００９３】
本明細書中で用いるように、用語「アレイ」とは、支持体マトリックス上に、または中に分布した存在のコレクションをいう；種々の実施形態において、個々の存在は、種々の技術のいずれかによってアレイの区別される特徴の同定を可能とするのに十分に相互から一定距離間で間隔が設けられる。該存在は、例えば、核酸分子、核酸分子のクローン集団、（所望により、それに付着した核酸分子のクローン集団を有してもよい）微粒子等であってよい。動詞として用いる場合、用語「アレイする」およびその変形とは、アレイ、例えば、分布する存在を支持体マトリックス上にまたは中に形成するためのいずれのプロセスもいう。
【００９４】
「損傷した塩基」は、それを、ＤＮＡグリコシラーゼによるＤＮＡからの除去のための基板とするような方法で、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔから異なるプリンまたはピリミジン塩基である。ウラシルは、本教示の目的では損傷した塩基と考えられる。種々の実施形態において、損傷した塩基はヒポキサンチンである。
【００９５】
ポリヌクレオチドの集団の１つであるポリヌクレオチド中の位置に関して、「縮重した」は、その位置を専有するヌクレオシドの部分を形成する塩基の同一性が、集団の異なるメンバーの間で変化することを意味する。かくして、該集団は、その配列が縮重位置において異なる個々のメンバーを含有する。用語「位置」とは、一般に、５’または３’末端に関して、ポリヌクレオチド中の各ヌクレオシドに帰属される数値をいう。例えば、延長プローブの３’末端におけるヌクレオシドには位置１を帰属させることができる。かくして、構造３’−ＸＸＸＮＸＸＸＸ−５’の延長プローブのプールにおいてＮは位置４にある。位置４は、もし、該プールの異なるメンバーにおいて、Ｎの同一性が変化し得るのであれば、縮重していると考えられる。延長プローブのプールは、位置Ｎにおいて縮重しているともいわれる。位置は、もしそれがｋの異なる同一性のいずれかを有するヌクレオシドによって専有され得るならば、ｋ−倍縮重しているといわれる。例えば、２つの異なる塩基のいずれかを含むヌクレオシドによって専有され得る位置は２−倍縮重している。
【００９６】
「配列についての情報の決定」は「配列決定」を含み、また、配列についての１以上の可能性の排除のような他のレベルの情報も含む。ポリヌクレオチドについての配列決定の実行は、典型的には、完全に相補的な（１００％相補的な）ポリヌクレオチドの配列に関する同等な情報を生じさせ、かくして、完全に相補的なポリヌクレオチドについて直接的に行われた配列決定と同等であることを注記する。
【００９７】
複数のエレメント、例えば、オリゴヌクレオチドプローブ分子またはその部分中のヌクレオシドに関して、「独立した」は、各エレメントの同一性が他のエレメントのいずれかの同一性を限定せず、またはその同一性によって限定されず、例えば、各エレメントの同一性が他のエレメントのいずれかの同一性に関係することなく選択されることを意味する。かくして、１以上のエレメントの同一性を知ることは、他のエレメントのいずれかの同一性に関するいずれの情報も提供しない。例えば、配列ＮＮＮＮ中のヌクレオシドは、もし各Ｎの同一性が、いずれかの他のＮの同一性とは無関係にＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得るならば独立している。
【００９８】
「連結」は、鋳型−駆動反応において、２以上の核酸、例えば、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドの末端の間で共有結合または連結を形成することを意味する。該結合または連結の性質は広く変化してもよく、連結は酵素的にまたは化学的に行ってもよい。
【００９９】
用語「微粒子」は、本明細書中においては、５０ミクロン以下、種々の実施形態においては、１０ミクロン以下の最も小さい断面寸法を有する粒子をいうのに用いられる。種々の実施形態において、最も小さな断面の寸法はほぼ３ミクロン以下、ほぼ１ミクロン以下、ほぼ０．５ミクロン以下、例えば、ほぼ０．１、０．２、０．３または０．４ミクロンである。ミクロン粒子は限定されるものではないがガラス（例えば、制御孔ガラス）、シリカ、ジルコニア、架橋されたポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、二酸化チタン、ラテックス、ポリスチレンなどを含めた、種々の無機または有機材料で作成することができる。例えば、種々の適当な材料および他の考慮については米国特許第６，４０６，８４８号参照。Ｄｙｎａｌ，オスロ，ノルウェーから入手可能なＤｙｎａビーズは、本教示の方法の種々の実施形態で用いられる商業的に入手可能な微粒子の例である。磁気的に応答性の微粒子を用いることができる。種々の実施形態において、微粒子の種々の実施形態の磁気的応答性は、増幅後の微粒子−付着鋳型の容易な収集および濃縮を可能とし、および更なる工程（例えば、洗浄、試薬の除去等）を容易とする。種々の実施形態において、異なる形状を有する微粒子（例えば、いくつかの球形および他の非球形）の集団が使用される。
【０１００】
用語「ミクロスフィア」または「ビーズ」は、本明細書中においては、５０ミクロン以下、種々の実施形態においては、１０ミクロン以下の直径を有する実質的に球形の微粒子をいうのに用いられる。種々の実施形態において、直径はほぼ３ミクロン以下、ほぼ１ミクロン以下、ほぼ０．５ミクロン以下、例えばほぼ０．１、０．２、０．３または０．４ミクロンである。種々の実施形態にいて、単分散ミクロスフィアの集団が用いられ、すなわちミクロスフィアは実質的に均一のサイズのものである。例えば、微粒子の直径は５％未満、例えば、２％以下、１％以下などの変動の係数を有することができる。しかしながら、種々の実施形態において、微粒子の集団の変動の係数は５％以上、例えば、５％、５％および１０％の間（包括的）、包括的に１０％および２５％の間、等である。種々の実施形態において、微粒子の混合された集団が用いられる。例えば、その各々が５％未満の変動の係数を有する２つの集団の混合物を用いることができ、その結果、単分散でない混合集団がもたらされる。例として、１ミクロンおよび３ミクロンの直径を有するミクロスフィアの混合物を使用することができる。種々の実施形態において、単分散でない集団のミクロスフィアに付着した鋳型を用いて配列決定を行う場合に、ミクロスフィアのサイズによって更なる情報が提供される。例えば、鋳型の異なるライブラリーを異なるサイズのミクロスフィアに付着させることができる。また、より少ない鋳型分子をより小さな粒子に付着させることができるので、シグナルの強度は変化し得、これは、多重配列決定を容易とすることができる。
【０１０１】
本明細書中で用いるように、用語「核酸配列」は、核酸物質それ自体をいうことができ、特異的核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子を生化学的に特徴付ける配列の情報（すなわち、５つの塩基の文字Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵの中から選択される文字の連続）に制限されない。本明細書中で示される核酸分子は、特に断りのない限り、５’→３’向きで提示される。
【０１０２】
「ヌクレオシド」は、糖分子に連結された窒素性塩基を含む。本明細書中で用いるように、該用語は、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２に記載された２’−デオキシおよび２’−ヒドロキシル形態の天然ヌクレオシド、およびヌクレオシドアナログを含む。例えば、天然ヌクレオシドは、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジンを含む。ヌクレオシド「アナログ」とは、例えば、一般に、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）によって記載された修飾された塩基部位および／または修飾された糖部位を有する合成ヌクレオシドをいう。そのようなアナログは結合特性を高め、縮重を低下させて特異性を高める等のために設計された合成ヌクレオシドを含む。ヌクレオシドアナログは２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−プロミニルウリジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシンン、Ｏ（６）−メチルグアニン、２−チオシチジン等を含む。ヌクレオシドアナログは、本明細書中で述べられた普遍的塩基のいずれも含むことができる。
【０１０３】
用語「生物」は、本明細書中においては、複製でき、かつ配列決定のために興味がある核酸を含むいずれの生きたまたは生きていない存在も示すために用いられる。それはプラスミド；ウイルス；原核生物、古細菌および真核生物細胞、細胞系、真菌、原生動物、植物、動物等を含む。
【０１０４】
プローブおよび鋳型ポリヌクレオチドの突出ストランドに関して「完全にマッチしたデュプレクッス」は、二本鎖構造の各ヌクレオシドが、反対ストランド上のヌクレオシドとのワトソン−クリック塩基対合を受けるように、１からの突出ストランドが他方とで二本鎖構造を形成することを意味する。該用語は、そのような対合が水素結合の形成を含むか否かに拘わらずプローブの縮重を低下させるのに使用することができる、デオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を持つヌクレオシド等のようなヌクレオシドアナログの対合も含む。
【０１０５】
用語「複数」は１を超えることを意味する。
【０１０６】
用語「多形」には当該分野におけるその通常の意味が与えられ、同一種の個体内でのゲノム配列の差をいう「単一ヌクレオチド多形」（ＳＮＰ）とは、単一位置における多形をいう。
【０１０７】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、または「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオシド間連結によって接合された（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはそのアナログを含めた）ヌクレオシドの線状ポリマーをいう。典型的には、ポリヌクレオチドは少なくとも３つのヌクレオシドを含む。種々の実施形態において、延長プローブ中の１以上のヌクレオシドは普遍的塩基を含む。通常、オリゴヌクレオチドは、サイズが、数個のモノマー単位、例えば、３ないし４から、数百のモノマー単位までの範囲である。オリゴヌクレオチドのようなポリヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような文字の配列によって表わされる場合は常に、特に断りのない限り、該ヌクレオチドは左側から右側に５’→３’の順序であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、および「Ｔ」はチミジンを示すと理解されるであろう。文字Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、当該分野で標準的なように、塩基それ自体、ヌクレオシド、または該塩基を含むヌクレオチドをいうのに用いることができる。
【０１０８】
天然に生じるポリヌクレオチドにおいては、ヌクレオシド間連結は、典型的には、ホスホジエステル結合であり、サブユニットを「ヌクレオチド」という。しかしながら、ホスホロチオレート結合のような他のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドプローブは種々の実施形態で用いられる。非―ホスホジエステル結合を持つそのようなオリゴヌクレオチドプローブをなすサブユニットの１以上は、ホスフェート基を含まなくてもよいのは認識されるであろう。ヌクレオチドのそのようなアナログは本明細書中で用いられる用語「ヌクレオチド」の範囲内に入ると考えられ、ホスホジエステル結合ではない１以上のヌクレオシド間結合を含む核酸は、依然として、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」等と言われる。種々の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのようなポリヌクレオチドはＡＰエンドヌクレアーゼ感受性部位を含有する結合を含む。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、脱塩基残基、ＤＮＡグリコシラーゼによる除去のため基質である損傷された塩基を含有する残基、あるいはＡＰエンドヌクレアーゼによる切断のための基質であるもう１つの残基または結合を含有することができる。もう１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、二糖ヌクレオシドを含有する。
【０１０９】
用語「プライマー」とは、標的とハイブリダイズすることによって、標的ポリヌクレオチドまたは「鋳型」に結合する。典型的には、長さが約１０ないし１００ヌクレオチドの間の短いポリヌクレオチドをいう。種々の実施形態において、プライマーは、適当な酵素、補因子、ヌクレオシドのような基質、オリゴヌクレオチドなどの存在下で起こり得る、標的に相補的なポリヌクレオチドの鋳型−指向性合成のための開始点を提供する。プライマーは、典型的には、それから延長が起こり得る末端を提供する。（例えば、「合成による配列決定」、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅等における）ＤＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼ酵素によって触媒される合成用のプライマーの場合には、プライマーは、典型的には、遊離３’ＯＨ基を有するか、それを有するように修飾することができる。典型的には、ＰＣＲ反応は、増幅されるべき領域の範囲を定める、「上流」（または「順方向」）プライマーおよび「下流」（または「逆方向」）プライマーを含めた、プライマーの対（第１および第２の増幅プライマー）を使用する。延長、連結（および所望により切断）の連続サイクルによる合成用のプライマーの場合には、プライマーは、典型的には、ＤＮＡリガーゼのための基質として働く遊離５’ホスフェート基または３’ＯＨ基を有するか、あるいはそれを有するように修飾することができる。
【０１１０】
本明細書中で用いるように、「プローブファミリー」とは、その各々が同一標識を含むプローブの群をいう。
【０１１１】
本明細書中で用いるように、ポリヌクレオチドに関して、「配列の決定」、「ヌクレオチド配列の決定」、「配列決定」等の用語は、ポリヌクレオチドの部分的ならびに十分な配列の情報の決定を含む。すなわち、該用語は配列の比較、フィンガープリンティング、および同様なレベルの標的ポリヌクレオチドについての情報、ならびに注目する領域内の標的ポリヌクレオチドの各ヌクレオシドの迅速な同定および順序付けを含む。種々の実施形態において、「配列の決定」は単一ヌクレオチドの同定を含み、他方、種々の実施形態において、１を超えるヌクレオチドが同定される。種々の実施形態において、単一サイクルにおいていずれかのヌクレオチドを同定するのにそれ自体では不十分な配列情報が集められる。ヌクレオシド、ヌクレオチド、および／または塩基の同定は、本明細書中においては同等と考えられる。ポリヌクレオチドについての配列の決定の実行は、典型的には、完全に相補的な（１００％相補的な）ポリヌクレオチドの配列に関する同等な情報を生じて、かくして、完全に相補的なポリヌクレオチドについて直接的に実行される配列の決定と同等である。
「０１１３」
本明細書中で用いるように、「配列決定反応」とは、延長、連結、および検出のサイクルの組をいう。延長されたデュプレックスが鋳型から除去され、かつサイクルの第２の組が該鋳型で行われる場合、サイクルの各組は、別々の配列決定反応と考えられるが、得られる配列の情報は組合わせて、単一の配列を生じさせることができる。
【０１１２】
「半―固体」とは、本明細書中で用いるように、固体および液体成分を含む圧縮可能なマトリックスをいい、ここに、該液体は固体マトリックスエレメントの間にポア、空間または他の間隙を占有する。例示的な半−固体マトリックスは、ポリアクリルアミド、セルロース、ポリアミド（ナイロン）、および架橋されたアガロース、デキストランおよびポリエチレングリコールから作成されたマトリックスを含む。半−固体支持体は、第２の支持体、例えば、該半−固体支持体を支持する、基板ともいわれる、実質的に平面上の剛直な支持体上に供することができる。
【０１１３】
「支持体」とは、本明細書中で用いるように、その上または中に核酸分子、微粒子等が固定化することができる、すなわち、それらが共有結合または非共有結合により付着することができ、あるいはその中または上でそれらが自由に拡散し、あるいは相互に対し移動するのを大いにまたは完全に妨げられるように部分的にまたは完全に包埋することができるマトリックスをいう。
【０１１４】
「トリガー残基」は、核酸中に存在する場合、切断剤（例えば、酵素、硝酸銀など）、あるいは剤の組合せによって、トリガー残基を含まないそうでなければ同一の核酸よりも、該核酸を切断（例えば、核酸骨格の切断）に対してより感受性とし、および／または該核酸をそのような切断に対してより感受性とする残基を生じさせる修飾に感受性である残基である。かくして、核酸中のトリガー残基の存在の結果、該核酸中の切断可能な結合の存在をもたらすことができる。例えば、脱塩基残基はトリガー残基である。というのは、核酸中の脱塩基残基の存在は、該核酸を、ＡＰエンドヌクレアーゼのような酵素による切断に対して感受性とするからである。損傷した塩基を含有するヌクレオシドはトリガー残基である。というのは、核酸中に損傷した塩基を含むヌクレオシドの存在もまた、該核酸を、例えば、ＤＮＡグリコシラーゼによる損傷した塩基の除去の後に、ＡＰエンドヌクレアーゼのような酵素による切断に対して感受性とするからである。切断部位はトリガー残基および隣接残基の間の結合におけるものであってもよく、あるいはトリガー残基から除去された１以上の残基である結合におけるものであってよい。例えば、デオキシイノシンはトリガー残基である。というのは、核酸中のデオキシイノシンの存在は、該核酸を、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶおよびそのホモログによる切断に対してより感受性とするからである。そのような酵素はデオキシイノシンに対して３’側の第２のホスホジエステルを切断する。本明細書中に開示されたプローブのいずれも１以上のトリガー残基を含有することができる。トリガー残基は、リボースまたはデオキシリボース部位を含むことができるが、その必要はない。種々の実施形態において、切断剤は、トリガー残基の不存在下において、核酸を実質的に切断しないが、同一条件下でトリガー残基を含有する核酸に対して有意な切断活性を呈するものであり、その条件は、該核酸を修飾して、それを切断剤に対して感受性とする剤の存在を含むことができる。例えば、種々の実施形態において、もし切断剤が、それらの内１つがトリガー残基を含有し、それらの他方がトリガー残基を含有しない以外は、長さおよび組成が同一である核酸を含有する組成物に存在すればトリガー残基を含有する核酸が切断されるであろう尤度は、トリガー残基を含有しない核酸が切断されるであろう尤度と同程度に大きな、少なくとも：１０；２５；５０；１００；２５０；５００；１０００；２５００；５０００；１０，０００：２５，０００：５０，０００；１００，０００；２５０；０００：５００，０００；１，０００，０００以上であり、例えば、トリガー残基を含有しないが、その他は同一である核酸の切断の尤度に対するトリガー残基を含有する核酸の切断の尤度の比率は、１０および１０６の間、あるいはそのいずれかの積分サブ範囲である。該比率は、特定の核酸、ならびにトリガー残基の位置およびヌクレオチドの関係に依存して変化し得るのは認識されるであろう。
【０１１５】
種々の実施形態において、もしトリガー残基を含有する核酸が、該核酸を切断剤による切断に際して感受性であるようにするために修飾する必要があれば、その様な修飾は、適当な修飾剤の存在下で容易に起こり、例えば、該修飾は合理的な収率にて、かつ合理的な時間で起こる。例えば、種々の実施形態において、トリガー残基を有する核酸の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％は、例えば、２４時間内に、１２時間内に、および／または１分未満ないし４時間内に修飾される。
【０１１６】
種々の適当なトリガー残基、および対応する切断試薬が本明細書中で例示される。本明細書中に記載されたものに対して同様な活性を有するいずれのトリガー残基および切断試薬を使用することもできる。当業者であれば、特定のトリガー残基および切断試薬の組合せが本教示で用いるのに適しているか否か、例えば、切断の効率およびスピード、トリガー残基を有する核酸についての切断剤の選択性等が本教示の方法で用いるのに適しているか否かを決定することができるだろう。「トリガー残基」は、切断に対する増大した感受性を付与するトリガー残基の能力は、一般に、トリガー残基が見出される特定の配列との関係に有意に依存しないが、前記したように、該関係は修飾および／または切断に対する感受性に何らかの影響を有し得る点で、制限酵素部位の部分を単純に形成するヌクレオチドから区別されることを注記する。もちろん、周囲のヌクレオチドに依存して、トリガー残基が制限部位の部分を形成することができる。かくして、ほとんどの場合において、共に制限酵素であって、非−配列特異的切断能力を有しない酵素の使用は排除されないが、切断剤は制限酵素ではない。
【０１１７】
「普遍的塩基」は、本明細書中で用いるように、天然に生じる核酸において典型的には見出される１を超える塩基と「対合」することができ、かくして、デュプレックス中のそのような天然に生じる塩基に代えて置換することができる塩基である。該塩基は、天然に生じる塩基の各々と対合できるのは必要でない。例えば、ある種の塩基は、プリンのみと、またはプリンと選択的に、またはピリミジンのみと、またはピリミジンと選択的に対合する。ある種の普遍的塩基（十分に普遍的塩基）は、天然に生じる核酸において典型的には見出される塩基のいずれかと対合することができ、かくして、デュプレックスにおけるこれらの塩基のいずれかに代えて、置換することができる。該塩基は、天然に生じる塩基の各々と同等に対合できる必要は無い。もしプローブミックスが、天然に生じるヌクレオチドの全てと対合しない普遍的塩基を（１以上の位置において）含むプローブを含有するならば、普遍的塩基の少なくとも１つがＡと対合し、普遍的塩基の少なくとも１つがＧと対合し、普遍的塩基の少なくとも１つがＣと対合し、および普遍的塩基の少なくとも１つがＴと対合するように、特定のプローブ中のその位置において２以上の普遍的塩基を利用するのが望ましいだろう。
【０１１８】
多数の普遍的塩基が当該分野で公知であり、限定されるものではないが、ヒポキサンチン、３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、４−ニトロベンズイミダゾール、５−ニトロインダゾール、８−アザ−７−デアザアデニン、６Ｈ，８Ｈ，３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン（Ｐ．Ｋｏｎｇ  Ｔｈｏｏ  Ｌｉｎ．およびＤ．Ｍ．Ｂｒｏｗｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８９，１７，１０３７３−１０３８３）、２−アミノ−６−メトキシアミノプリン（Ｄ．Ｍ．ＢｒｏｗｎおよびＰ．Ｋｏｎｇ  Ｔｈｏｏ  Ｌｉｎ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅｒｃｈ，１９９１，２１６，１２９−１３９）等を含む。ヒポキサンチンは１つの十分に普遍的な塩基である。ヒポキサンチンを含むヌクレオシドは、限定されるものではないが、イノシン、イソイノシン、２’−デオキシイノシン、および７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシンを含む。
【０１１９】
例えば、Ｌｏａｋｅｓ，Ｄ．およびＢｒｏｗｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４０３９−４０４３，１９９４；Ｏｈｔｓｕｋａ，Ｅ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（５）：２６０５−２６０８，１９８５；Ｌｉｎ，Ｐ．Ｋ．Ｔ．およびＢｒｏｗｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（１９）：５１４９−５１５２，１９９２；Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６９（６４８０）：４９２−４９３，１９９４；Ｒａｈｍｏｎ，Ｍ．Ｓ．およびＨｕｍａｙｕｎ，Ｎ．Ｚ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３７７（２）：２６３−８，１９９７；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．，ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８（１５）：２９１１−２９１４，２０００；Ａｍｏｓｏｖａ，Ｏ．，ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１０）：１９３０−１９３４，１９９７；およびＬｏａｋｅｓ，Ｂ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１２）：２４３７−４７，２００１の関連部分に記載されているように、更なる普遍的塩基が知られている。普遍的塩基は反対に位置した塩基とで水素結合を形成することができるが、必ずしもその必要は無い。普遍的塩基はワトソン−クリックまたは非−ワトソン−クリック相互作用（例えば、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ相互作用）を介して水素結合を形成することができる。
【０１２０】
種々の実施形態において、普遍的塩基を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いるよりはむしろ、脱塩基残基を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いる。脱塩基残基は、４つの天然に生じるヌクレオチドのいずれかの反対の位置を占めることができ、かくして、普遍的塩基を含むヌクレオチドと同一の機能を発揮する。種々の実施形態において、脱塩基残基に隣接する結合はＡＰエンドヌクレアーゼによって切断されるが、脱塩基残基は、他の切断可能な結合（例えば、ホスホロチオレート）が存在し、かつ他の切断剤が用いられる実施形態においては、（すなわち、普遍的塩基の機能を発揮するために）ここに記載するような用途のものでもある。
【０１２１】
種々の実施形態の詳細な記載
Ａ．延長、連結および切断の連続的サイクルによる配列決定
本教示の種々の局面の全体的スキームは、図１Ａに図式的に示される。図１Ａを参照し、未知の配列のポリヌクレオチド領域５０、および結合領域４０を含むポリヌクレオチド鋳型２０が支持体１０に付着されている。結合領域４０の末端側端部におけるヌクレオチド４１、およびポリヌクレオチド領域５０の基部側端部におけるヌクレオチド５１は相互に対して隣接している。結合領域４０とハイブリダイズして、結合領域４０における位置でデュプレックスを形成するイニシャライジングオリゴヌクレオチド３０が提供される。イニシャライジングオリゴヌクレオチド３０は、本明細書中においては、「プライマー」とも言われ、結合領域４０は「プライマー結合領域」と言うこともできる。デュプレックスは完全にマッチしたデュプレックスであってもよいが、その必要は無い。イニシャライジングオリゴヌクレオチドは延長可能な末端３１を有する。図１Ａにおいて、イニシャライジングオリゴヌクレオチドは、延長可能な末端３１がヌクレオチド４１と反対側に位置するように、結合領域に結合する。しかしながら、イニシャライジングオリゴヌクレオチドは、後にさらに議論するように、結合領域において他の個所で結合することができよう。長さＮの延長オリゴヌクレオチドプローブ６０は、イニシャライジングオリゴヌクレオチドに隣接する鋳型にハイブリダイズしている。延長オリゴヌクレオチドプローブの末端ヌクレオチド６１は、延長可能な末端３１に連結される。
【０１２２】
末端ヌクレオチド６１は、ポリヌクレオチド領域５０中の最初の未知のヌクレオチドに対して相補的である。従って、末端ヌクレオチド６１の同一性はヌクレオチド５１の同一性を特定する。種々の実施形態において、ヌクレオチド５１は、末端ヌクレオチド６１として、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴを有することが知られている延長プローブに会合した標識（示さず）を検出することによって同定される。標識は検出に続いて除去される。図２は、異なる標識、例えば、異なる色のフルオロフォアを、異なる３’末端ヌクレオチドを有する延長プローブに帰属させるためのスキームを示す。
【０１２３】
連結および検出に続いて、もしプローブ６０がその様な末端を既に有しているのではなければ、延長プローブ６０上で延長可能なプローブ末端を生じさせる。種々の実施形態においては、やはり長さＮの第２の延長プローブ７０は、延長プローブ６０に隣接する鋳型にアニールされ、プローブ６０の延長可能な末端に連結される。延長プローブ７０の末端ヌクレオチド７１の同一性は、ポリヌクレオチド５０中の反対に位置したヌクレオチド５２の同一性を特定する。末端ヌクレオチド７１は、従って、延長プローブの「配列決定部分」を構成し、それにより、そのハイブリダイゼーション特異性が、鋳型中の１以上のヌクレオチドの同一性をいずれから決定する基礎として用いられるプローブの部分が意味される。典型的には、延長プローブ中の更なるヌクレオチドは鋳型とハイブリダイズするだろうが、その同一性が特定の標識と関連するプローブ中のヌクレオチドのみを用いて、鋳型中のヌクレオチドを同定するのは認識されよう。
【０１２４】
種々の実施形態において、延長可能な末端の作成は、以下でさらに記載するように、ヌクレオシド間結合の切断を含む。種々の実施形態において、切断は標識も除去する。切断は、延長プローブ（示さず）から多数のヌクレオチドＭを除去する。従って、各サイクルにおいてデュプレックスはＮ−Ｍヌクレオチドによって延長され、鋳型中のＮ−Ｍの間隔で位置するヌクレオチドが同定される。与えられた鋳型の多数のコピーは、典型的には、単一の支持体に付着され、配列決定反応はこれらの鋳型に対して同時に行われるであろうことは理解されるべきである。
【０１２５】
当業者によって認識されるように、鋳型、イニシャライジングオリゴヌクレオチド、延長プローブ、プライマー等への言及は、一般に、単一分子よりはむしろ関連領域内で実質的に同一である核酸分子の集団またはプールを意味する。かくして、例えば、「鋳型」は、一般に、複数の実質的に同一の鋳型分子を意味し；「プローブ」は、一般に、複数の実質的に同一のプローブ分子などを意味する。１以上の位置において縮重しているプローブの場合には、特定のプローブを含むプローブ分子の配列は縮重位置において異なり、すなわち、特定のプローブを構成するプローブ分子の配列は非縮重位置においてのみ実質的に同一であり得ることは認識されるだろう。記載の目的では、単数の形態は、実質的に同一の分子の単一分子および集団を含むと理解されるべきである。単一の核酸分子（すなわち、１つの分子）を言うことが意図される場合、用語「鋳型分子」、「プローブ分子」、「プライマー分子」等が用いられるだろう。ある場合には、実質的に同一の核酸分子の集団の複数の性質が明示的に示されるだろう。
【０１２６】
実質的に同一の核酸分子の集団は、化学的合成、細胞中での生物学的合成、１以上の出発核酸分子からのイン・ビトロでの酵素的増幅等を含めた種々の公知の方法のいずれかを用いて得ることができ、あるいは生産することができる。例えば、当該分野でよく知られた方法を用い、それを適当な発現ベクター、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡプラスミドに挿入し、それを、次いで、細胞、例えば、細菌細胞に導入し、その中でそれが複製することによって、注目する核酸をクローン化することができる。次いで、注目する核酸のプラスミドＤＮＡまたはＲＮＡ含有コピーを細胞から単離する。ウイルス、細胞などから単離されたゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡの逆転写によって生産されたｃＤＮＡもまた、クローニングまたはイン・ビトロ増幅の中間工程の無い、実質的に同一の核酸分子（例えば、その配列が決定されるべき鋳型ポリヌクレオチド）の集団の源でもあり得る。
【０１２７】
集団のメンバーは１００％同一である必要はなく、例えば、ある数の「エラー」が合成の間に起こり得ることは理解されるであろう。種々の実施形態において、集団の鋳型の少なくとも５０％は、参照核酸分子（すなわち、配列の比較のための基礎として用いられる規定された配列の分子）に対して少なくとも９０％、および／または少なくとも９５％である。種々の実施形態において、集団のメンバーの少なくとも１つの６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％以上の、参照核酸分子に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、および／または少なくとも９９％以上同一である。種々の実施形態において、参照核酸分子に対する集団のメンバーの少なくとも９５％、および／または少なくとも９９％のパーセント同一性は、少なくとも９８％、９９％、９９．９％以上である。パーセント同一性は、２つの最適に整列された配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が双方の配列で起こって、マッチした位置の数が得られる位置の数を決定し、マッチした位置の数を位置の合計数で割り、次いで、結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算することができる。ある実施形態においては、鋳型、プローブ、プライマー等のような核酸分子は、鋳型、プローブ、またはプライマー機能を発揮しない部分も含有するより大きな核酸分子の部分であってもよいのは認識されるだろう。その場合、集団の個々のメンバーはその部分に関して実質的に同一である必要はない。
【０１２８】
Ｍａｃｅｖｉｃｚは、図１Ａに示すように、ビーズのような支持体に鋳型が付着され、支持体に対して末端側に位置する鋳型の端部に向けて延長が進行する方法を教示する。かくして、結合領域は、未知の配列よりも支持体に対してより近くに位置し、延長されたデュプレックスは支持体から離れる方向に成長する。しかしながら、発明者等は、予期せぬことに、該方法は、支持体に対して末端側である鋳型の端部に結合領域が位置し、延長が支持体に向けて内方に進行する代替アプローチを用いて有利に実行することができるのを発見した。この実施形態は図１Ｂに描かれており、そこでは、種々のエレメントは図１Ａにおけるようにナンバリングされている。発明者等は、支持体に向けての鋳型の末端側端部から「内方」への配列決定は優れた結果を提供すると判断した。特に、ビーズのような支持体に向けての鋳型の末端側端部からの配列決定の結果、支持体から外方への配列決定よりも高い連結効率をもたらす。
【０１２９】
種々の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、所定の長さの全ての可能な配列のオリゴヌクレオチドを含む混合物として鋳型に適用される。例えば、（ｋ＝６である（Ｎ）ｋと表わすこともできる）構造ＮＮＮＮＮＮの長さが６ヌクレオチドの全ての可能な配列（ヘキサマー）を含有するプローブの混合物は、４６（４０９６）のプローブ種を含有するであろう。一般に、プローブは構造Ｘ（Ｎ）ｋＮ＊のものであり、ここに、Ｎはいずれかのヌクレオチドを表し、ｋは１および１００の間であり、＊は標識を表し、およびＸは、その同一性が標識に対応するヌクレオチドを表わす。種々の実施形態において、ｋは１および１００の間、１および５０の間、１および３０の間、１および２０の間、例えば、４および１０の間である。ヌクレオチドの１以上は普遍的塩基を含むことができる。一般に、プローブはＮによって表わされる位置において４−倍縮重しているか、あるいはＮによって表わされる１以上の位置において縮重−低下ヌクレオチドを含む。もし所望であれば、混合物を、相補的配列と完全にマッチしたそのデュプレックスが同様な安定性または結合の自由エネルギーを有するプローブのサブセット（「ストリンジェンシークラス」）に分けることができる。該サブセットは、別々のハイブリダイゼーション反応で用いることができる。
【０１３０】
プローブ混合物の複雑性（すなわち、異なる配列の数）は、いわゆる縮重−低下ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの使用を含めた多数の方法によって低下させることができる。例えば、８ヌクレオチドの全ての可能な配列を含有するプローブのライブラリーは４８プローブを含有するであろう。位置の内２つにおいて普遍的塩基を用いることによって、長さのような、オクタマーライブラリーの種々の望ましい特徴を維持しつつ、プローブの数は４６まで低下させることができる。適当な普遍的塩基は、限定されるものではないが、先に述べた、あるいは先に引用した文献中に記載された普遍的塩基のいずれかを含む。
【０１３１】
実施形態に依存して、以下にさらに記載するように、オリゴヌクレオチドプローブによって、延長されたデュプレックスまたはイニシャライジングオリゴヌクレオチドは５’→３’方向または３’→５’方向いずれかに延長することができる。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは、鋳型とで完全にマッチしたデュプレックスを形成する必要はない。例えば、鋳型中の単一ヌクレオチドは各延長サイクルにおいて同定される種々の実施形態において、完全な塩基対合は、その特定のヌクレオチドを同定するのに必要とされるに過ぎない。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは延長されたデュプレックスに酵素的に連結される実施形態において、完全な塩基対合、すなわち、適切なワトソン−クリック塩基対合は、連結されるプローブの末端ヌクレオチド、および鋳型中のその相補体の間で必要とされる。一般に、その様な実施形態において、プローブのヌクレオチドの残りは、次の連結が鋳型に沿って所定の部位、または塩基の数で起こるであろうことを確実とする「スペーサー」として働く。すなわち、それらの対合、またはその欠如は、更なる配列の情報を提供しない。同様に、塩基同定のためのポリメラーゼ延長に依拠する実施形態において、プローブはスペーサーとして主として働き、従って、鋳型に対する特異的ハイブリダイゼーションは臨界的でない。
【０１３２】
前記した方法は配列の部分的決定、すなわち、鋳型中で相互から間隔が設けられた個々のヌクレオチドの同定を可能とする。種々の実施形態において、より多くの完全な情報を集めるためには、複数の反応が行われ、そこでは、各反応は異なるイニシャライジングオリゴヌクレオチドｉを利用する。イニシャライジングオリゴヌクレオチドｉは、結合領域の異なる部分に結合する。種々の実施形態において、イニシャライジングオリゴヌクレオチドは、異なるイニシャライジングオリゴヌクレオチドの延長可能な末端が、結合領域にハイブリダイズした場合に、相互から１ヌクレオチドだけ食い違っているような位置において結合する。例えば、図３に示すように、配列決定反応１．．．Ｎが行われる。イニシャライジングオリゴヌクレオチドｉ１．．．ｉｎは同一の長さを有し、それらの末端ヌクレオチド３１、３２、３３などが、結合領域４０において、連続する隣接位置４１、４２、４３等にハイブリダイズするように結合する。延長プローブｅ１．．．ｅｎは、かくして、鋳型の連続した隣接領域において結合し、イニシャライジングオリゴヌクレオチドの延長可能な末端に連結される。ｉｎに連結されたプローブｅｎの末端ヌクレオチド６１は、ポリヌクレオチド領域５０のヌクレオチド５５、すなわち、鋳型中の最初の未知のポリヌクレオチドに対して相補的である。延長、連結、および検出の第２のサイクルにおいて、プローブｅ１２の末端ヌクレオチド７１は、ポリヌクレオチド領域５０のヌクレオチド５６、すなわち、未知の配列の第２のヌクレオチドに対して相補的である。同様に、イニシャライジングオリゴヌクレオチドｉ２、ｉ３、ｉ４等で初期化されたデュプレックスに連結された延長プローブの末端ヌクレオチドは、未知の配列５０の第３、第４、および第５のヌクレオチドに対して相補的であろう。イニシャライジングオリゴヌクレオチドは、それに対して段々近くなるよりはむしろポリヌクレオチド５０から段々さらに離れる領域に結合することができるのは認識されるだろう。
【０１３３】
延長プローブの非−末端ヌクレオチドのスペーサー機能は、いずれかの与えられた鋳型で行われるべき対応して多数のサイクルを必要とすることなく、イニシャライジングオリゴヌクレオチドが結合する位置からかなり除去される鋳型中の位置における配列情報の獲得を可能とする。例えば、長さＮのプローブの連結の連続サイクル、続いての、延長プローブから単一末端ヌクレオチドを除去するための切断によって、Ｎ−１ヌクレオチドの間隔のヌクレオチドを連続ラウンドで同定することができる。例えば、鋳型中の位置１、Ｎ、２Ｎ−１、３Ｎ−２、４Ｎ−３、および５Ｎ−４におけるヌクレオチドは、鋳型中の位置１におけるヌクレオチドが、イニシャライジングオリゴヌクレオチドの鋳型への結合によって形成されたデュプレックス中の延長可能なプローブ末端に連結されるヌクレオチドに反対のヌクレオチドである場合に、６サイクルで同定することができる。同様に、もし切断が長さＮの延長プローブから２つのヌクレオチドを除去するならば、Ｎ−２ヌクレオチドだけ相互から離れた位置におけるヌクレオチドは連続ラウンドで同定することができる。例えば、鋳型中の位置、Ｎ−１、２Ｎ−３、３Ｎ−５、４Ｎ−７におけるヌクレオチドは６サイクルで同定することができる。かくして、もしプローブが長さが８ヌクレオチドであって、２つのヌクレオチドが各サイクルで除去されるならば、位置１、７、１３、１９、および２５におけるヌクレオチドが同定される。かくして、鋳型中の最初のヌクレオチドから距離Ｘのヌクレオチドを同定するのに必要なサイクルの数はＸ／Ｍのオーダーであり、ここに、Ｍは、Ｘのオーダーよりはむしろ、切断に続いてそのままである延長プローブの長さである。
【０１３４】
例えば、図３Ｂに描かれたスキームは、鋳型の毎６番目の塩基を読むように設計された延長プローブでの延長、連結、および切断を用いる正味の結果を示す。結合領域内で食い違った位置に結合する６つのイニシャライジングオリゴヌクレオチドを用いて鋳型を系列的にストリッピングし、および配列決定し、結果を合わすことによって、全ての鋳型塩基が規定された長さにわたって解明される。例えば、もし１０の系列的連結が６つの反応の各々について行われるならば、得られる読みの長さは６０の順次の塩基対であり、他方、もし１５の系列的連結が各反応で行われるならば、得られる読みの長さは９０の順次の塩基対であろう。
【０１３５】
いずれかの理論によって拘束されるつもりはないが、発明者等は、このアプローチとは対照的に、合成方法による殆どの系列的配列決定は、結局は長い読みの長さについて潜在的能力を制限するエラーの蓄積と戦っていることを示唆する。本明細書中に記載された方法のあるものの有利な特徴は、与えられた数のサイクル（ｙ）の後に、ｎ＊ｙ−（ｎ−１番目の）番目の塩基（例えば、１５サイクル後のこれまでの例における７１番目の塩基、または切断部位の３’側の６つの塩基を持つプローブを用いる２０サイクル後の１１５番目の塩基）に到達するように、（プローブ中の切断可能な部位の位置に依存して）それらは、毎ｎ番目の塩基の同定を可能とすることである。ｎ−１、ｎ−２などの位置におけるイニシャライジングオリゴヌクレオチドを「リセットする」能力は、与えられた読みの長さについて系列的エラーの蓄積を（脱ディフェージングまたはアトリションを介して）大いに最小化する。というのは、鋳型から延長されたストランドをストリップし、新しいイニシャライジングオリゴヌクレオチドをハイブリダイズするプロセスはバックグラウンドシグナルをゼロに効果的にリセットするからである。例えば、合成によるポリメラーゼベースの配列決定、および本明細書中に記載された連結ベースのアプローチを比較し、もし各延長サイクルにおけるノイズに対するシグナルの比率が９９：１であるならば、ポリメラーゼベースのアプローチについての１００サイクル後の該比率は３７：６３であって、リガーゼベースの方法については、８５：１５であろう。リガーゼベースの方法についての正味の結果は、ポリメラーゼベースの方法よりも大きな読みの長さにおける大きな増加である。
【０１３６】
もし鋳型中の各先行するヌクレオチドについてサイクルを実行する必要があれば要求されたであろうよりも少数のサイクルを用いてヌクレオチドを同定する能力は、多数の理由で重要である。特に、該方法における各工程は１００％効率で起こるのではないようである。例えば、いくつかの鋳型は延長プローブに対して成功して連結できず；いくつかの延長プローブは切断されないだろう、などである。かくして、各サイクルにおいて、鋳型の異なるコピーに対して起こる反応は徐々にディフェーズされたようになり、それから有用かつ正確な情報を獲得することができる鋳型の数は低下する。かくして、イニシャライジングオリゴヌクレオチドの延長可能な末端から数個を超える位置離れて位置するヌクレオチドを読むのに必要なサイクルの数を最少化するのが特に望ましい。しかしながら、延長プローブの長さを増加させる結果、潜在的に、プローブ混合物のより大きな複雑性がもたらされ、これは、各個々のプローブ配列の効果的な濃度を減少させる。本明細書中に記載されるように縮重−低下ヌクレオチドを用いて、複雑性を低下させることができるが、その結果、減少したハイブリダイゼーション強度および／または減少した連結効率がもたらされるであろう。発明者等は、これらの競合する因子のバランスを用いて、結果を最適化することができるのを認識した。かくして、種々の実施形態において、長さが８ヌクレオチドの延長プローブは、選択された位置における縮重−減少ヌクレオチドで持って読まれる。加えて、発明者等は、適当な切断可能結合および切断の条件および時間の選択を用いて、切断工程の効率（すなわち、各切断工程において成功して切断される結合のパーセンテージ）、および適当な結合のためのその特異性を最適化することができるのを認識した。
【０１３７】
Ｂ．オリゴヌクレオチド延長プローブの設計
本発明者等は、オリゴヌクレオチド延長プローブにおける特定の位置及び特に数における縮重−低下ヌクレオシド（例えば、普遍的塩基を含むヌクレオシド）を利用するのが特に有利であろうことを認識した。例えば、種々の実施形態において、（Ｘから数えて）位置６以上におけるヌクレオチドのほとんどまたは全ては普遍的塩基を含む。例えば、位置６以上におけるヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％は普遍的塩基を含むことができる。ヌクレオチドは、全て、同一の普遍的塩基を含む必要はない。種々の実施形態において、ヒポキサンチンおよび／またはニトロ−インドールが普遍的塩基として用いられる。例えば、イノシンのようなヌクレオシドを用いることができる。
【０１３８】
発明者等は、長さが６よりも大きなヌクレオチドである延長プローブを用いて優れた結果を達成できることを認識し、ここに、延長可能なプローブ末端に連結されるべきヌクレオチドから数えて、プローブの基部側末端から６以上の位置におけるヌクレオチドの１以上は縮重−低下ヌクレオチドであり、例えば、普遍的塩基を含み（すなわち、もしほとんどの基部側ヌクレオチドが位置１と考えられるならば、６以上の位置におけるヌクレオチドの１以上は普遍的塩基を含む）、例えば、オクタマープローブの場合における６以上の位置におけるヌクレオチドの１、２、または３は普遍的塩基を含む。例えば、３’→５’方向に配列決定するためには、構造３’−ＸＮＮＮＮｓＩＮＳ−５’を有するプローブを用いることができ、ここに、ＸおよびＮはいずれかのヌクレオチドを表し、「ｓ」は切断可能な結合を表わし、従って、切断は３’末端から数えて５番目および６番目の残基の間で起こり、種々の実施形態においては、切断可能な結合および５’末端の間の残基の少なくとも１つはＸの同一性に対応する標識を有する。もう１つの設計は３’−ＸＮＮＮＮｓＮＩＩ−５’である。なおもう１つのプローブの設計は３’−ＸＮＮＮＮｓＩＩＩ−５’である。この設計は、１０２４の異なる種の中程度の複雑性を持つプローブ混合物を生じ、重要なアデニル化産物の形成を妨げるのに十分長く（実施例１参照）、および切断後に残る得られた延長産物が修飾されていないＤＮＡよりなるという利点を有する。１つの欠点は、このプローブは一度に５塩基のみだけプローブを延長させることである。読みの長さはサイクルの数の延長の長さ倍の関数であるので、延長長さ上の各さらなる塩基は、１×サイクル数だけ読みの長さを増加させる潜在能力を有する（例えば、２０サイクルを用いれば２０塩基）。もう１つのプローブの設計は、切断に続いて延長プローブの末端で１以上のイノシン（または他の普遍的塩基）を残して、６塩基以上の延長されたデュプレックスを生じさせる。例えば、プローブ３’−ＸＮＮＮＮＩｓＩＩ−５’では、デュプレックスは一度に６塩基だけ延長され、接合において５’イノシンを残す。これらの設計の各々の種々の実施形態において、切断可能な結合および５’末端の間の残基の少なくとも１つは、Ｘの同一性に対応する標識を有する。種々の実施形態において、延長可能なプローブ末端に連結されるべきヌクレオチドと反対側の末端から数えて、プローブの末端側末端から３番目のヌクレオチドは普遍的塩基を含む（すなわち、もし末端側末端が位置Ｋと考えられるならば、位置Ｋ−２におけるヌクレオチドは普遍的塩基を含む）。
【０１３９】
種々の実施形態において、ロックされた核酸（ＬＮＡ）塩基は、イニシャライジングオリゴヌクレオチドプローブ、延長プローブ、または双方における１以上の位置で用いられる。ロックされた核酸は、例えば、米国特許第６，２６８，４９０号；Ｋｏｓｈｋｉｎ，ＡＡ，ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５４：３６０７−３６３０，１９９８；Ｓｉｎｇｈ，ＳＫ，ら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，４：４５５−４５６，１９９８に記載されている。ＬＮＡは、標準的なホスホルアミダイト化学を用いて自動ＤＮＡ合成器によって合成することができ、やはり天然にヌクレオチド／またはヌクレオチドアナログを含有するオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。それらは以下に記載するもののような標識で合成することもできる。
【０１４０】
Ｃ．鋳型、ライブラリー支持体、ブロッカー、およびそれらの調製および使用のための方法
本教示は、核酸の鋳型および支持体を調製するための種々の方法を提供する。種々の実施形態において、連結―ベースの配列決定で用いるための、または他の目的のライブラリーが提供される。種々の実施形態において、ブロッカーオリゴヌクレオチド、および他の目的のためのオリゴヌクレオチドの連結、検出、および切断の連続サイクルによる配列決定の関係でそれらを用いる方法が提供される。
【０１４１】
発明者等は、配列決定すべき鋳型は、例えば、微粒子のような支持体、または増幅プライマーの対の１つがＰＣＲ反応を行うに先立って付着されるゲルマトリックスのような種々の半−固体支持体材料を用いることによって、支持体それ自体上にまたは中に合成するのが望ましいだろうことを認識した。このアプローチは、鋳型分子を合成の後に支持体に付着させる別の工程での必要性を回避する。かくして、異なる配列の複数の鋳型種が便宜には平行して増幅することができる。例えば、以下に記載する方法によれば、微粒子上での合成の結果、個々の微粒子の集団がもたらされ、各々は、それに付着した特定の鋳型分子（またはその相補体）の複数のコピーを持ち、ここに、各微粒子に付着した鋳型分子は、配列において、他の微粒子に付着した鋳型分子から異なる。支持体の各々は、かくして、それに付着した鋳型のクローン集団を有し、例えば、支持体Ａはそれに付着した鋳型Ｘの多数のコピーを有し；支持体Ｂはそれに付着した鋳型Ｙの多数のコピーを有し；支持体Ｃはそれに付着した鋳型Ｚの多数のコピーを有し、などである。「鋳型のクローン集団」、「核酸のクローン集団」などとは、注目する単一の鋳型分子（出発鋳型）から出発する増幅の連続ラウンドによって生じた種々の実施形態において、実質的に同一の鋳型分子の集団を意味する。実質的に同一の鋳型分子は、出発鋳型に対して、またはその相補体に対して実質的に同一であってよい。
【０１４２】
増幅は、典型的には、ＰＣＲを用いて行われるが、他の増幅方法を用いることもできる（後記参照）。クローン集団のメンバーは１００％同一である必要はなく、例えば、ある数の「エラー」が、合成の間に、例えば、増幅の間に起こり得るのは理解されるだろう。種々の実施形態において、クローン集団の数の少なくとも５０％は出発鋳型分子（またはその相補体）に対して少なくとも９０％同一であり、種々の実施形態においては、少なくとも９５％同一である。種々の実施形態において、集団のメンバーの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％以上は、出発鋳型分子（またはその相補体）に対して少なくとも９０％同一であり、種々の実施形態において、少なくとも９５％同一であり、および種々の実施形態において、少なくとも９９％同一である。種々の実施形態において、出発鋳型分子（またはその相補体）に対する集団のメンバーの少なくとも９５％、種々の実施形態においては、少なくとも９９％のパーセント同一性は少なくとも９８％、９９％、９９．９％以上である。
【０１４３】
増幅プライマーは、種々の技術のいずれかを用いて支持体に付着させることができる。例えば、プライマーの１つの末端（５’末端）を、結合対の１つのメンバー（例えば、ビオチン）で機能性化することができ、支持体は、結合対の他のメンバー（例えば、ストレプトアビジン）で機能性化することができる。いずれの同様な結合対も用いることができる。例えば、規定された配列の核酸タグを支持体に付着させても良く、相補的核酸タグを有するプライマーを、支持体に付着した核酸タグにハイブリダイズさせることができる。種々のリンカーおよび架橋剤を用いることもできる。
【０１４４】
ＰＣＲを実行するための方法は、当該分野でよく知られており、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，９６５，１８８号、およびＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．およびＤｖｅｋｓｌｅｒ，ＧＳ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００３に記載されている。微粒子上で核酸を増幅する方法は当該分野でよく知られており、かつ記載されており、例えば、標準ＰＣＲは、マイクロタイタ皿のウエル中で、あるいはそれに付着したプライマーを持つビーズ（例えば、実施例１２のように調製されたビーズ）上のチューブ中で行うことができる。ＰＣＲは便宜な増幅方法であるが、当該分野で公知の多数の他の方法のいずれを用いることができる。例えば、多重ストランド変位増幅、ヘリカーゼ変位増幅（ＨＤＡ）、ニックトランンソレーションＱベータレプリカーゼ増幅、ローリングサークル増幅、および他の等温増幅方法などを用いることができる。
【０１４５】
鋳型分子は種々の源のいずれかから得ることができる。例えば、ＤＮＡは、対象から得ることができ、またはそれに由来し得る試料から単離することができる。用語「試料」は、配列決定が行われるべき鋳型のいずれかの源を示すために広い意味で用いられる。フレーズ「から由来する」は、対象から直接的に得られた試料および／または該試料中の核酸をさらに処理して、鋳型分子を得ることができるのを示すのに用いられる。試料の源は、いずれかのウイルス、原核生物、古細菌、または真核生物種のものであって良い。種々の実施形態において、源はヒトである。試料は、例えば、血液または他の体液含有細胞；精子；バイオプシー試料などであってよい。注目するいずれかの生物からのゲノムまたはミトコンドリアＤＮＡを配列決定してもよい。ｃＤＮＡを配列決定してもよい。ＲＮＡは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのような当該分野で公知の方法を用い、ｃＤＮＡを生じる第１の逆転写によって配列決定してもよい。異なる試料および／または対象からのＤＮＡの混合物を合わせてもよい。試料は、種々の方法のいずれかで処理してもよい。核酸は、公知の方法を用いて試料から単離し、精製し、および／または増幅することができる。もちろん、完全に人工的な合成核酸、生物に由来しない組換え核酸を配列決定することもできる。
【０１４６】
鋳型は二本鎖または一本鎖形態で供することができる。典型的には、鋳型が二本鎖形態で最初に供される場合、２つのストランドは引き続いて分離され（例えば、ＤＮＡは変性され）２つのストランドの１つのみが増幅されて、例えば、微粒子に付着された、半−固体支持体中にまたは上に固定化されたなどの鋳型分子の局所化されたクローン集団を生じさせる。
【０１４７】
鋳型は、種々の更なる方法で選択し、または処理することができる。例えば、メチル−感受性制限酵素（例えば、ＭｓｐＩ）での処理に付されたＤＮＡから得られた鋳型を用いることができる。ＤＮＡ断片を結果としてもたらせるその様な処理は、増幅に先立って行うことができる。メチル化塩基を含有する断片は、増幅されない。低メチル化鋳型から得られた配列の情報を、低メチル化のための選択に付されていない同一源に由来する鋳型から得られた配列情報と比較することができる。
【０１４８】
鋳型は、ライブラリーに挿入し、またはライブラリーに供し、またはライブラリーから由来することができる。例えば、低メチル化ライブラリーは当該分野で公知である。ライブラリーへの鋳型の挿入は、鋳型の末端への更なるヌクレオチド配列、例えば、タグ、プライマーまたはイニシャライジングオリゴヌクレオチドのための結合部位などの便宜な連接を可能とする。例えば、ある戦略は、複数の結合部位、例えば、増幅プライマーのための結合部位、イニシャライジングオリゴヌクレオチドのための結合部位、捕獲剤結合部位などを有するタグの付加を可能とする。
【０１４９】
種々の適当なライブラリーが当該分野で知られている。例えば、特定の注目するライブラリー、およびそれらの構築のための方法がＵＳＳＮ  １０／９７８，２２４、ＰＣＴ出願ＷＯ２００５０４２７８１およびＷＯ２００５０８２０９８、およびＳｈｅｎｄｕｒｅ，Ｊ．，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９（５７４１）：１７２８−３２，２００５、Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ，２００５年８月４日（ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ．ｏｒｇ）に記載されている。もちろん、その様なライブラリーを作成する他の方法を用いることもできるのは理解されるだろう。特に注目するある種のライブラリーは、その各々が、配列決定工程で用いられる増幅および／または配列決定プライマーに対して相補的な配列によって分離された注目する２つの核酸セグメントを含有する複数の核酸断片（典型的には、ＤＮＡ）を含有し、すなわち、これらの配列はプライマー結合領域（ＰＢＲ）として働く。特に注目する実施形態において、核酸セグメントは、天然に生じるＤＮＡの連続ピースの部分である。例えば、セグメントは、前記した文献に記載されているように、ゲノムＤＮＡの連続ピースの５’および３’末端からのものであってよい。そのような核酸セグメントは、本明細書中においては、前記した文献と合致する方法では、「タグ」または「末端タグ」と言われる。単一の連続核酸から、例えば、その５’および３’末端から由来する２つのタグは、「対となったタグ」、「対合タグ」、または「ジタグ」と言われる。「対となったタグ」は、例え単数形で用いられても、２つのタグを含むと認識される。対となったタグのタグが、予め規定されたサイズの限定内にあるように誘導されるＤＮＡの連続ピースを選択することによって、２つのタグを分離する距離が拘束される。
【０１５０】
配列決定および／または増幅プライマーに対して相補的な配列によって分離されるのに加えて、ライブラリーの核酸断片は、典型的には、タグに近接する配列決定および／または増幅プライマーに対して相補的な配列をやはり含有し、すなわち、第１のそのような配列は、断片の５’末端により近いタグに対して５’側に位置させることができ、および第２のそのような配列は、断片の３’末端により近く位置するタグに対して３’側に位置させることができる。タグが由来する連続核酸に存在する２つのタグの位置は、種々の実施形態において、ライブラリーのＤＮＡ断片におけるタグの位置に対応し得るが、その必要はないことを注記する。
【０１５１】
核酸断片およびタグは一定範囲の異なるサイズを有することができる。典型的には、核酸断片は、例えば、長さが８０および３００ヌクレオチドの間、例えば、長さが１００ないし２００、１００ないし１５０の間、ほぼ１５０ヌクレオチド、長さがほぼ２００ヌクレオチドなどとすることができる。タグは、例えば、長さが１５ないし２５ヌクレオチドの間、例えば、長さがほぼ１７ないし１８ヌクレオチドとすることができる。これらの長さは例示であって、限定する意図ではないことを注記する。より短い、より長い断片および／またはタグを用いることができることを注記する。
【０１５２】
単一の連続核酸から対合したタグを得ることは、ライブラリーの構築のための便宜な方法を提供するが、対合タグの１つの局面は、それらが、それらが元来由来する核酸中で一定距離（「分離距離」）だけ相互から分離されているという事実であり、ここに、該分離距離が所定の範囲の距離内に入ることにも注意すべきである。タグが、所定の範囲内に入る分離距離だけ分離されている事実は、タグの配列が、参照配列（例えば、参照ゲノム配列）に対して整列されるのを可能とする。いずれかの理論に拘束されるつもりはないが、これは、ゲノム再配列決定のようなある種の適用において有利であり得るが、ここに、それは、参照ゲノムに対して配列の正確な設置を依然として可能としつつ、より短い読みの長さの使用を可能とする。対となったタグの５’および３’タグは核酸、例えば、ゲノムＤＮＡのより大きなピースのセグメントを表し（すなわち、それらは該セグメントの配列を有し）、そのセグメントは、例えば、ゲノムＤＮＡのピース内でＤＮＡの天然に生じるピースにおいて相互から予め定義された距離内に位置する。例えば、種々の実施形態において、対となったタグの５’および３’タグは、ＤＮＡの天然に生じるピースにおいて、相互から５００までのヌクレオチド内に、相互から１ｋＢまで内に、相互から２ｋＢまで内に、相互から５ｋＢまで内に、相互から１０ｋＢまで内に、相互から２０ｋＢまで内に位置するＤＮＡセグメントを表わす。種々の実施形態において、対となったタグの５’および３’タグは、ＤＮＡの天然に生じるピースにおいて、５００ヌクレオチドおよび２ｋＢの間だけ離れて、例えば、７００ヌクレオチドおよび１．２ｋＢの間だけ離れて位置する。対となったタグの２つのタグを分離する正確な距離は、かなり重要と言うのではなく、典型的には、知られていないことを注記する。加えて、タグは核酸のより大きなピースから元来は得られるが、その元来の配列の関係で、あるいはライブラリー断片、ライブラリー断片からの増幅産物、配列決定すべき鋳型などに存在するかに拘わらず、用語「タグ」は、タグの配列を有するいずれの核酸セグメントにも適用される。
【０１５３】
核酸断片（例えば、ライブラリー分子）は以下の構造を有する。
【０１５４】
リンカー１−タグ１−リンカー３−タグ２−リンカー２
【０１５５】
タグ１およびタグ２は対となったタグの５’および３’タグであり得る。タグのいずれかは、５’タグまたは３’タグであり得る。リンカー１およびリンカー２は、１以上のプライマーのためのプライマー結合領域を含有する。種々の実施形態において、リンカー１および２は、各々、増幅プライマーのためのＰＢＲ、および配列決定プライマーのためのＰＢＲを含有する。各リンカーにおけるプライマーは、配列決定プライマーＰＢＲが増幅プライマーＰＢＲに対して内部に位置するように入れ子とすることができる。リンカー３は、タグ１およびタグ２の配列決定を可能とするための１以上の配列決定プライマー用のＰＢＲを含有することができる。核酸断片のライブラリーに関して用いられる用語「リンカー」とは、ライブラリーの多数の核酸断片に、例えば、ライブラリーの実質的全ての断片に存在する核酸配列を言う。リンカーは、ライブラリーの構築の間に連結機能を現実には発揮してもしなくてもよく、与えられたライブラリーのほとんどまたは全てのメンバーに共通する定義された配列であると単純に考えることができる。そのような配列は、「普遍的配列」とも言われる。かくして、リンカーまたはその部分に対して相補的な核酸はライブラリーの多数のメンバーにハイブリダイズすることができ、ライブラリー中のほとんどまたは全ての分子のための増幅プライマーまたは配列決定プライマーとして用いることができる。
【０１５６】
種々の実施形態において、核酸断片は、以下の構造を有する。
【０１５７】
リンカー１−タグ１−内部アダプター−タグ２−リンカー２
【０１５８】
タグ１およびタグ２およびリンカー１およびリンカー２は前記したようにＰＢＲを含有する。内部アダプターは、後にさらに記載されるように、ＩＡおよびＩＢと言うことができる２つのプライマー結合領域を含有する。これらのＰＢＲは、それに付着した核酸の２つの区別される実質的に同一の集団を有する微粒子を生じさせるのに用いられるものであり、ここに、集団の１つの核酸はタグ１を含み、他の集団の核酸はタグ２を含む。核酸の２つの区別される集団は少なくとも部分的に異なる配列を有し、例えば、それらはタグ領域の配列において異なる。内部アダプターは、２つのプライマー結合領域の間にスペーサー領域を含有することができる。スペーサー領域は脱塩基残基を含有してもよく、これは、ポリメラーゼがスペーサーを通じて延長するのを妨げるであろう。もちろん、スペーサーを通じてのポリメラーゼ延長を妨げるであろういずれかの他のブロッキング基を含有するスペーサー領域を用いることができよう。
【０１５９】
種々の実施形態において、核酸断片は１以上の更なるタグ（例えば、２、４、６等）および１以上の更なる内部アダプターを含む。例えば、核酸断片は以下の構造を有することができる。
【０１６０】
リンカー１−タグ１−内部アダプター１−タグ２−リンカー２−タグ３−内部アダプター２−タグ４−リンカー３
【０１６１】
核酸断片およびそのような断片のライブラリー、核酸の２以上の実質的に同一の集団を含有する微粒子、およびそのような微粒子のアレイの種々の実施形態を、本明細書中に記載される連結―ベースの配列決定方法以外の広く種々の配列決定方法で用いることができるのを注記する。例えば、ＦＩＳＳＥＱ、パイロ配列決定等のような配列決定方法を用いることができる。例えば、ＷＯ２００５０８２０９８参照。もちろん、連結―ベースの方法を、有利には、使用することができる。本明細書中に記載された連結―ベースの方法の関係では、用語「配列決定プライマー」は、「イニシャライジングオリゴヌクレオチド」を意味するものと理解することができる。
【０１６２】
種々の実施形態において、配列決定すべき鋳型は、エマルジョンの（「リアクター」とも呼ばれる）個々の水性区画においてＰＣＲによって合成される。種々の実施形態において、該区画は、各々、それに付着された適当な第１の増幅プライマー、鋳型の第１のコピー、第２の増幅プライマー、およびＰＣＲ反応で必要な成分（例えば、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、補因子等）を有する水のような適当な支持体を含有する。エマルジョンを調製するための方法は、例えば、米国特許第６，４８９，１０３号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）；第５，８３０，６６３号（Ｅｍｂｌｅｔｏｎ）；および米国公開番号２００４０２５３７３１（Ｇｈａｄｅｓｓｙ）に記載されている。微粒子に付着した鋳型のクローン集団を生じさせるためのエマルジョンの個々の区画内でＰＣＲを実行する方法（「エマルジョンＰＣＲ」）は、例えば、Ｄｒｅｓｓｍａｎ，Ｄ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１００（１５）：８８１７−８８２２，２００３、およびＰＣＴ公開ＷＯ２００５０１０１４５に記載されている。
【０１６３】
前記文献に記載された方法、またはその修飾を用いて、配列決定のために微粒子に付着させた鋳型のクローン集団を作ることができる。種々の実施形態において、ＰＣＲに適した短い（＜５００ヌクレオチド）鋳型は、異なる標的配列（鋳型）の集団の各末端に普遍的アダプター配列を（例えば、連結によって）付着させることによって作成される。（この文脈における普遍的とは、同一アダプター配列を各鋳型に付着させて、ＰＣＲ増幅プライマーの単一の対を用いて増幅することができる「適合した」鋳型を作成することを意味する）。バルクＰＣＲ反応は、適合させた鋳型、１つの遊離増幅プライマー、それに付着された第２の増幅プライマーを持つ微粒子、および他のＰＣＲ試薬（例えば、ポリメラーゼ、補因子、ヌクレオチド等）で調製される。水性ＰＣＲ反応を、（軽質鉱油および界面活性剤を含有する）油相と１：２の比率で混合する。この混合物を渦巻かせて、油中水中型エマルジョンを作成する。１ミリリットルが、エマルジョン内に４×１０９を超える水性区画（各々は潜在的ＰＣＲリアクター）を作り出すのに十分である。エマルジョン試料のアリコットを、マイクロタイタープレート（例えば、９６ウエルプレート、３８４ウエルプレート等）のウエルに分注し、熱的サイクルを行って、微粒子上で固相ＰＣＲ増幅を達成する。クローン性を確実とするために、リアクターが１を超えるビーズまたは鋳型分子を稀にしか含有しないように、微粒子および鋳型濃度を注意深く制御する。例えば、種々の実施形態において、リアクターの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上は単一のビーズおよび単一の鋳型を含有する。鋳型の各クローン集団のメンバーは、かくして、微粒子へのその付着の結果として相互に近接して空間的に局所化される。一般に、鋳型の付着点は、粒子の表面に実質的に均一に分布することができる。増幅手法に続いてそれに付着した鋳型のクローン集団（典型的には、鋳型の多くの、数千ないし数百万のコピー）を有する微粒子は、鋳型増幅を受けていると言われる。
【０１６４】
ＰＣＲエマルジョン方法を用いて、個々の微粒子が、それに付着された対となったタグの５’タグおよび３’タグを含有する増幅された核酸断片の区別される集団を有する微粒子の集団を生じさせるのは特に興味深い。言い換えれば、個々の粒子が、増幅されかつそれに付着された前記したもののようなライブラリーからの異なる核酸断片を有する微粒子の集団を生じさせるのは特に興味深い。
【０１６５】
（例えば、先に述べた文献に記載された）エマルジョン中でＤＮＡを増幅するための当該分野で公知の方法は、大きな核酸分子の増幅、およびこれらの分子の微粒子への付着を達成するその能力の点で制限される。例えば、ＰＣＲ効率は、より長いアンプリコンに従って指数関数的に減少するのは示されている。ＰＣＲ効率のこの減少は、前記したもののような、対となったタグおよびプライマー結合部位を含有する核酸断片をＰＣＲエマルジョンで増幅し、そのような増幅を介して微粒子に付着させることができる効率を低下させる。かくして、対となったタグの第１および第２のタグを含有する実質的に同一の核酸断片の単一の集団がＰＣＲエマルジョンにおいて増幅され、その様な増幅を介してビーズに付着される方法は、多数の制限に悩んでいる。
【０１６６】
種々の実施形態において、対となったタグの５’および３’タグを含有する単一の核酸断片が増幅を介して微粒子に付着される場合に生起する対となったタグの情報を依然として保持しつつ、より小さなアンプリコンを用いるアプローチが提供される。種々の実施形態において、それに付着された核酸の少なくとも２つの区別される集団を有する微粒子、例えば、ビーズが用いられ、ここに、少なくとも２つの集団の各々は、複数の実質的に同一の核酸よりなり、およびここに、実質的に同一の核酸の第１の集団は注目する第１の核酸セグメント、例えば、５’タグを含み、核酸の第２の集団は、注目する第２の核酸セグメント、例えば、３’タグを含む。微粒子および増幅試薬の存在下で、ＰＣＲエマルジョンの単一のリアクター中で、２つの増幅反応を順次に、あるいは種々の実施形態においては、同時に行うことができるように、核酸の第１および第２の集団は、２つのタグを含有し、また、タグに近接し、それを分離する、適切に位置したプライマー結合部位を含有する単一のより大きな核酸断片から増幅される。微粒子は、それに付着した、プライマーの２つの異なる集団を有し、その１つは、核酸断片中のタグの１つに対して外部にあるプライマー結合領域に配列において対応し、その他方は核酸断片中の他のタグに対して外部にあるプライマー結合領域に、配列において、対応し、すなわち、プライマー結合領域は２つのタグに近接する。
【０１６７】
また、各々がタグの１つを含有する核酸断片の部分を増幅する、２つの別々のＰＣＲ反応を実行できるように、２つのタグの間に位置したプライマー結合領域に結合するプライマーも提供される。増幅された核酸セグメントは、相互に異なるさらなるプライマー結合領域を含有する。これらのさらなるプライマー結合領域は核酸断片に存在し、増幅プライマーのためのＰＢＲに対して内部に位置しており、すなわち、それらは入れ子となっている。これらのさらなるＰＢＲは、２つの異なる配列決定プライマーのための結合領域として働く。かくして、２つの異なる配列決定プライマーの１つまたは他方を、それに結合した実質的に同一の核酸セグメントの２つの集団を有する微粒子に適合することによって、２つの核酸セグメントの一方または他方のいずれかを、他の核酸セグメントの存在による干渉なくして配列決定することができる。核酸セグメントの各々は、それがそれから増幅される核酸セグメントよりも有意に短く、かくして、対となったタグとタグの間の会合を依然として維持しつつ、対となったタグを含有する断片のライブラリーを用いてエマルジョン−ベースのＰＣＲを実行することができる効率を改良する。
【０１６８】
前記した方法は、同一配列を有する核酸の部分が同一の色に帰属される図３４および３５の種々のパネルを参照することによって良好に理解することができる。先の記載は、図３４及び３５に合致すると解釈されるべきである。図３４Ａおよび３５Ａは、更なる詳細を供する図３５Ａに関して同一の工程を示す。図３４Ａおよび３５Ａに示すように、２つのタグ（タグ１およびタグ２）を含有する対合−末端ライブラリー断片は、内部アダプターカセット（ＩＡ−ＩＢ）およびユニークなフランキングリンカー配列（Ｐ１およびＰ２）で組み立てられ、すなわち、Ｐ１およびＰ２は相互から区別される。内部アダプターカセットおよびフランキングリンカー配列の双方は、ＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定の双方を供するヌクレオチド配列を含有する。ＰＣＲプライマー領域は、ネステッドＤＮＡ配列決定プライマーの使用を可能とするように設計される。ＤＮＡ捕獲微粒子（ビーズ）は、ユニークなフランキングリンカー配列と同一である２つのオリゴヌクレオチド配列を付着させることによって生じる。ＰＣＲ増幅のために、Ｐ１およびＰ２配列を有するオリゴヌクレオチドと結合したＤＮＡ捕獲微粒子は、単一のジ−タグライブラリー断片（すなわち、対となったタグの５’タグおよび３’タグを含有するライブラリー断片）および溶液−ベースのＰＣＲプライマーを含有する方法にシードされる。
【０１６９】
溶液−ベースのフランキングリンカー配列（Ｐ１およびＰ２）は、内部アダプタープライマー（ＩＡおよびＩＢ）と比較して制限された量で加えられ、ＰＣＲ−生成タグ産物の効果的な駆動−対−ビーズ増幅を促進するように働くであろう（すなわち、［Ｐ１＜＜ＩＢ］，［Ｐ２＜＜ＩＡ］）。もし所望であれば、プライマーの量の制御は、適切には、核酸の集団が、実質的に同数の核酸を含有するのを確実とすることができ、例えば、個々の微粒子上のほぼ半分の核酸は第１の集団に属し、個々の微粒子上のほぼ半分の核酸は第２の集団に属する。かくして、非対照ＰＣＲの形態を使用して、望むならば、異なる集団の比率を制御することができる。
【０１７０】
増幅の間に、図３４Ｂおよび３５Ｂ（ここに、図３５Ｂは、再度、図３４Ｂに対して更なる詳細を提供する）に示すように、単一の対合−末端ライブラリー断片は、４つのオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１、Ｐ２、ＩＡおよびＩＢ）の存在下で、２つのユニークなＰＣＲ産物を生じるであろう。１つの集団はＰ１およびＩＡが近接するタグ１を含有し、第２の集団はＰ２およびＩＶが近接するタグ２を含有する。
【０１７１】
以下の増幅微粒子は、最初のライブラリー断片から生じたタグ１およびタグ２に対応する２つのユニークなＰＣＲ集団が負荷されるであろう。各タグは、かくして、図３４Ｃ、３５Ｃおよび３５Ｄに示すように、各タグの系列的配列決定を可能とするようにプライミング領域のユニークな組を含有する。図３５Ｃおよび３５Ｄは、異なる配列決定プライマーを用いるタグ１および２の順次の配列決定を示す。種々の配列決定の方法のいずれも用いることができる。
【０１７２】
前記方法を用いて、それに付着した核酸配列の２を超える区別される集団、例えば、４、６、８、１２、１６、２０の集団を有する微粒子を作成することができ、ここに、集団は２、３、４、６、８、１０の対合タグを含む。各集団は、２つのタグの場合に前記したように、各配列にユニークなプライマー結合領域を提供することによって個々に配列決定することができる。
【０１７３】
種々の実施形態において、図３４および３５に示され、かつ前記された構造を有する核酸断片、その様な断片のライブラリー、それに付着されたそのような断片からの核酸断片を有する微粒子、個々の微粒子が、他の微粒子のそれとは配列が異なるそれに付着した核酸の集団を有するそのような微粒子の集団、微粒子のアレイ、核酸断片から核酸セグメント（タグ）を増幅するための増幅プライマー、微粒子に付着された核酸セグメントを配列決定するための配列決定プライマー、断片、ライブラリーおよび微粒子を作成するための方法、および微粒子に付着された核酸を配列決定する方法が含まれる。種々の局面において、所望により、増幅、配列決定などでいうような１以上の酵素、緩衝液、または他の試薬も含有する、前記成分のいずれかの組合せを含有するキットが提供される。
【０１７４】
所望であれば、種々の方法を用いて、それに付着された鋳型を有する微粒子を豊富化することができる。例えば、ハイブリダイゼーション−ベースの方法を用いることができ、ここに、微粒子に付着された増幅産物（鋳型）の部分に対して相補的なオリゴヌクレオチド（捕獲試薬）が、もう１つの（種々の実施形態においてはより大きな）微粒子、マイクロタイターウエルまたは他の表面のような捕獲体に付着される。増幅産物の部分を標的領域ということができる。標的領域は、例えば、未知の配列を有する鋳型の部分の１つの末端において、増幅の間に鋳型に組み込むことができる。例えば、相補的部分が増幅された鋳型に存在するように、標的領域は、微粒子に付着されない増幅プライマーに存在させることができる。かくして、多数の異なる鋳型は、単一の捕獲剤が多数の異なる鋳型にハイブリダイズし、捕獲剤として単一のオリゴヌクレオチド配列のみを用いて多数の微粒子の捕獲を可能とするように、同一の標的領域を含むことができる。増幅に付された微粒子は、ハイブリダイゼーションが起こり得る条件下で捕獲剤に曝露される。その結果、それに付着された増幅鋳型を有する微粒子は、捕獲剤を介して捕獲体に付着される。付着されていない微粒子は次いで除去され、保持された微粒子は（例えば、温度を上昇させることによって）放出される。粒状捕獲体を用いる種々の実施形態において、ハイブリダイゼーション後にそれに付着された微粒子と共に捕獲体よりなる凝集体が、例えば、グリセロールのような種々の溶液中での遠心によって、付着された微粒子を欠如する粒状捕獲体から、および捕獲体に付着されていない微粒子から分離される。また、サイズ、密度などに基づく分離の他の方法を用いることもできる。ハイブリダイゼーションは、豊富化のために用いることができる多数の方法の唯１つである。例えば、（例えば、合成の間に）鋳型に組み込むことができる多数の異なるリガンドのいずれかに対して親和性を有する捕獲剤を用いることができる。豊富化の多数のラウンドを用いることができる。
【０１７５】
図１４Ａは、油中水型エマルジョンの区画のイメージを示し、そこでは、蛍光標識された第２の増幅プライマーおよび過剰の鋳型を用い、それに付着した第１の増幅プライマーを有するビーズ上でＰＣＲ反応が行われる。水性リアクターは散漫な遊離プライマーから弱く蛍光を発し、他方、ビーズは固相増幅の結果としてビーズ上に蓄積するプライマーから強く蛍光を発する（すなわち、蛍光プライマーは、第１の増幅プライマーを介してビーズに付着される増幅される鋳型に組み込まれる）。ビーズシグナルは、異なるサイズのリアクターにおいて均一である。
【０１７６】
増幅に続き、微粒子は（例えば、磁気粒子の場合には磁石を用いることによって）収集され、本明細書中に記載された延長、連結、および切断の反復サイクルによる配列決定のために用いられる。種々の実施形態において、微粒子は、以下に記載されるように、配列決定に先立って半固体支持体中でまたは上でアレイされる。実施例１２、１３、１４、および１５は、（ｉ）微粒子上での鋳型の合成のための、それに付着された増幅プライマーを有する微粒子の調製（実施例１２）；（ｉｉ）ＰＣＲを行うための複数のリアクターを含むエマルジョンの調製（実施例１３）；（ｉｉｉ）エマルジョンの区画におけるＰＣＲ増幅（実施例１３）；（ｉｖ）エマルジョンの破壊および微粒子の回収（実指例１３）；（ｖ）それに付着されたクローン鋳型集団を有する微粒子の豊富化（実施例１４）；（ｖｉ）半固体ポリアクリル支持体のための基板として働かせるガラススライドの調製（実施例１５）；および（ｖｉｉ）基板上のアクリルアミドに包埋された、それに付着された鋳型を有する微粒子のアレイを形成する、微粒子と未重合アクリルアミドの混合（実施例１５）で用いることができる代表的かつ非実現的方法の更なる方法を提供する。実施例１５は、半固体支持体でＰＣＲを行う場合にある方法を用いられる、ポリメラーゼトラッピングのためのプロトコルも記載する。当業者であれば、これらの方法での多数の変形を用いることができるのを認識するであろう。
【０１７７】
種々の実施形態において、それに固定化された適当な増幅プライマーを有するゲルのような半固体支持体において、鋳型がＰＣＲによって増幅される。ＰＣＲ反応に必要な鋳型、さらなる増幅プライマーおよび試薬は、半固体支持体内に存在する。増幅プライマーの対の一方または双方は、適当な連結部位、例えば、アクリダイト基を介して半固体支持体に付着される。付着は重合の間に起こり得る。更なる試薬（例えば、鋳型、第２の増幅プライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、補因子など）を、半固体支持体の形成に先立って（例えば、ゲル形成に先立って液体中に）存在させることができるか、あるいは１以上の試薬をその形成後にその半固体支持体に拡散することができる。半固体支持体のポアサイズを、その様な拡散を可能とするように選択する。当該分野でよく知られているように、ポリアクリルアミドゲルの場合には、主として、アクリルアミドモノマーの濃縮によって、および架橋剤によって幾分程度は低いが、ポアサイズが決定される。同様な考慮が、他の半固体支持体材料の場合に適用される。所望のポアサイズを達成するための適切な架橋剤および濃度を選択することができる。種々の実施形態において、カチオン性脂質、ポリアミン、ポリカチオン等のような添加材を重合に先立って溶液に含ませ、これは、微粒子を囲うイン−ゲルマトリックスまたは凝集体を形成する。米国特許第５，７０５，６２８号、第５，８９８，０７１号、および第６，５３４，２６２号に開示された方法を用いることもできる。例えば、種々の「クラウディング試薬」を用いて、クローンＰＣＲのためのビーズ近くにＤＮＡを密集させることができる。ＳＰＲＩ（登録商標）磁気ビーズ技術および／または条件を使用することができる。例えば、１０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下での有効なＰＣＲ増幅を示す米国特許第５，６６５，５７２号参照。種々の実施形態において、増幅（例えば、ＰＣＲ）、連結または双方の方法を、ベタイン、ポリエチレングリコール、ＰＶＰ−４０などのような試薬の存在下で実施する。これらの試薬はエマルジョンに存在する溶液に加えることができ、および／または半固体支持体に拡散することができる。
【０１７８】
半固体支持体は、実質的に平面状の剛直な基板上に位置させ、または組み立てることができる。ある種々の実施形態において、基板は、例えば、ほぼ４００ないし９００ｎｍの間の、典型的な標識（例えば、蛍光標識、量子ドット、プラズモン共鳴粒子、ナノクラスター）の励起および検出で用いられる励起および発光波長の放射に対して透明である。ガラス、プラスチック、石英等の材料が適する。半固体支持体を基板に付着させることができ、所望によりいずれかを用いて基板に固定することができる、基板は接着または接合を高める物質、シラン、ポリリシンなどで被覆しても被覆しなくてもよい。米国特許第６，５１１，８０３号は、半固体支持体におけるＰＣＲを用いて鋳型のクローン集団を合成するための方法、実質的に平面状の基板等上で半固体支持体を調製するための方法を記載する。同様な方法を本教示で用いることができる。基板は、半固体基板の形成に先立って液体を含有するためのウエルまたは窪みを有することができる。種々の実施形態において、隆起したバリアーまたはマスクをこの目的で用いることができる。
【０１７９】
前記アプローチは、クローン鋳型の空間的に局所化された集団を生じさせるためのエマルジョン中のリアクターの使用に対する代替法を提供する。クローン集団は、例えば、イメージングによって、新しく連結された延長プローブを検出する目的で、配列決定の間に各集団からシグナルを獲得することができるように、半固体支持体中に区別される位置で存在させる。種々の実施形態において、２以上の区別されるクローン集団が単一の核酸断片から増幅され、半固体において区別される位置で混合物として存在させる。例えば、区別される位置が５’タグを含有する断片および３’タグを含有する断片を含有するように、混合物中のクローン集団の各々はタグを含むことができる。５’タグおよび３’タグを含むクローン鋳型は、それらが相互に独立して配列決定できるように、異なる配列決定プライマーを含有する。このアプローチは、微粒子上で実質的に同一な核酸の多数の集団を生産し、および単一の微粒子から対となったタグの双方のメンバーについての配列決定情報を得るための前記したアプローチと同一である。
【０１８０】
一般に、該方法のいずれかで用いられる半固体支持体は、厚みが約１００ミクロン以下の、例えば、約５０ミクロンの厚み以下、例えば、包括的に、約２０および４０ミクロンの間の厚みの層を形成する。実質的に平面状の表面を有するカバースリップまたは他の同様な物体を、種々の実施形態においては、重合に先立って、半固体支持体材料の頂部において、均一なゲル層を生じさせるのを助ける。例えば、実質的に平面状の、および／または厚みが実質的に均一なゲル層を形成することができる。
【０１８１】
なお種々の実施形態において、前記方法に対する修飾が用いられ、そこでは、鋳型は、それに付着された適当な増幅プライマーを有する微粒子上でＰＣＲによって合成され、ここに、微粒子は鋳型合成に先立って半固体支持体中でまたは上で固定化され、すなわち、それらが半固体支持体中に十分にまたは部分的に包埋される。一般に、微粒子は下に存在する基板上に静止できるが、それらは半固体支持体材料によって完全に囲われる。微粒子は、かくして、半固体支持体が破壊されるのでなければ、相互に対して実質的に固定された位置に留まる。このアプローチは、クローン鋳型の空間的に局所化された集団を生じさせるためのエマルジョンの使用に対するもう１つの代替法を提供する。微粒子は、半固体支持体の形成に先立って液体と混合することができる。種々の実施形態において、微粒子は実質的に平面状の基板上にアレイすることができ、重合、架橋などに先立って液体を微粒子アレイに加えることができる。微粒子はそれに付着した第１の増幅プライマーを有する。第２の増幅プライマーは、半固体支持体に付着させることができるが、その必要はない。更なる試薬（例えば、鋳型、第２の増幅プライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、補因子等）を、半固体支持体の形成に先立って（例えば、ゲル形成に先立って液体中に）存在させることができるか、あるいはこれらの試薬の１以上をゲル形成後に半固体支持体に拡散させることができる。半固体基板は、一般に、前記したように、例えば、ガラススライド上に形成される。
【０１８２】
種々の実施形態において、鋳型合成に続いて、（例えば、磁気粒子の場合には磁石を用いることによって）、付着されたクローン鋳型集団を便宜には回収することができるように、ゲルを可溶化（例えば、消化または脱重合または溶解）させることができる。可溶化、消化、脱重合、溶解等することができるゲルを、本明細書中においては、「可逆的」と言う。慣用的なポリアクリルアミド重合は、重合を開始させるための適当な触媒（例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ））と共に、架橋剤としてのＮ−Ｎ’メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）を用いることを含む。可逆的ゲルを生じさせるためには、Ｎ−Ｎ’ジアリルタルタルジアミド（ＤＡＴＤ）のような代替架橋剤を用いることができる。この化合物は構造的にはＢＩＳと同様であるが、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムを含有する溶液中で過ヨウ素酸によって切断することができるシス−ジオール基を保有する（Ａｎｋｅｒ，Ｈ．Ｓ．：Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．Ｌｅｔｔ．，７：２９３，１９７０）。かくして、ＤＡＴＤゲルは、容易に可溶化させることができる。架橋剤としてＤＡＴＤを用いて作成されたゲルは高度に透明であって、ガラスによく結合する。可逆的ゲルを形成するＤＡＴＤ−様特性を持つもう１つの架橋剤はエチレンジアクリレートである（Ｃｈｏｕｌｅｓ，Ｇ．Ｌ．およびＺｉｍｍ，Ｂ．Ｓ．：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３：３３６−３３９，１９６５）。Ｎ，Ｎ’−ビスアクリリルシスタミン（ＢＡＣ）は、可逆的ポリアクリルアミドゲルを形成するのに用いることができるもう１つの架橋剤である。過ヨウ素酸塩に溶解するゲルを形成するのに用いることができるもう１つの架橋剤は、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビス−アクリルアミド（ＤＨＥＢＡ）である。可逆的半固体支持体を形成する種々の他の材料のいずれを用いることもできる。例えば、（ＢＡＳＦから入手可能な）プルロニクス（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）のような熱−可逆的ポリマーを用いることができる。プルロニクスは、ポリ（エチレンオキサイド）−ポリ（プロピレンオキサイド）−ポリ（エチレンオキサイド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）トリブロックコポリマーのファミリーである（Ｎａｃｅ，Ｖ．Ｍ．，ら，Ｎｏｎｉｏｎｉｃ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，１９９６）。これらの材料は上昇した温度（例えば、室温を超える温度）で半固体（ゲル）となり、冷却に際して液化する。種々の方法を用いて、プルロニクスを化学的に誘導体化して、それに対するプライマーの付着を容易とすることができる（例えば、Ｎｅｆｆ，Ｊ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，４０：５１１，１９９８；Ｐｒｕｄ‘ｈｏｍｍｅ，ＲＫ，ら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１２：４６５１，１９９６）。
【０１８３】
可溶化の後に、微粒子を集め、延長、連結、および切断の反復サイクルを用いる配列決定に付すことができる。配列決定に先立ち、微粒子は、例えば、それらを第１の半固体支持体中または上に存在させたときのそれよりも高い密度にて、第２の半固体支持体中または上にアレイすることができる。半固体支持体は、実質的に平面状かつ剛直な基板、例えば、ガラススライドによって典型的にはそれ自体支持される。
【０１８４】
かくして、２つの一般的アプローチを用いて、半固体支持体中または上に包埋されたクローン鋳型集団を担持する微粒子のアレイを有する半固体支持体を生じさせることができる。第１のアプローチは、（例えば、エマルジョン−ベースのＰＣＲによって）半固体支持体に存在しない微粒子上で増幅を行い、次いで、微粒子を半固体支持体中または上に固定化することを含む。第２の一般的アプローチは、半固体支持体中または上に微粒子を固定化し、次いで、増幅を行うことを含む。いずれの場合においても、微粒子のクランピングを低下させ、および／または実質的に単一の焦点面において微粒子を整列させるための手法を使用するのが望ましいだろう。例えば、ポリアクリルアミドゲルに粒子を固定化する場合、モノマーおよび架橋剤の濃度は、粒子が完全な重合に先立って溶液の底まで沈み、従って、それらが下に存在する平面状基板上に沈降し、かくして、単一の平面に配置されるように選択される。種々の実施形態において、カバースリップのような実質的に平面状の表面を有する物体を、アクリルアミドは「サンドイッチ」構造の２つの層の間に捕獲されるように、微粒子を含有する液状アクリルアミド（または半固体支持体を形成することができる他の材料）の頂部に置かれる。次いで、重力の作用によって、微粒子が下方に沈み、カバースリップ（または実質的に平面状の表面を有する他の物体）上に静止するように、サンドイッチをひっくり返す。重合の後、カバースリップを除去する。微粒子は、かくして、半固体支持体の表面近くに（例えば、表面に接して）、実質的に単一の平面に包埋される。
【０１８５】
前記したように半固体マトリックスに微粒子のような支持体を固定化するよりはむしろ、種々の実施形態において、それらを固定化し、その結果、「無ゲル」または「低ゲル」微粒子アレイがもたらされるように半固体支持体を用いることなく、微粒子を実質的に平面状の剛直な基板に共有結合により、または非共有結合により付着させる。ガラス、プラスチック、石英、シリコン等のような基板へ微粒子を付着させるための方法が当該分野で知られている。基板は、付着を容易とする材料（例えば、種々のポリマーのいずれか）または剤で被覆し（例えば、スピンコーティングし）、あるいは機能性化してもしなくてもよい。コーティングは薄いフイルム、自己−組立単層等であってよい。微粒子、微粒子に付着した部位、あるいは微粒子の付着したオリゴヌクレオチド（例えば、鋳型）のいずれかを基板に付着させることができる。種々の実施形態において、基板はシラン化剤で処理せず、あるいはもしそのように処理するならば、処理は効果的なシラン化をもたらさず、例えば、シラン化は、本明細書中に記載された連結―ベースの配列決定の多数サイクルの間に起こるもののような、引き続いての操作および／または液体との接触に対して安定な方法で、平坦なガラス表面にポリアクリルアミド層によって固定化された微粒子のアレイの形成を可能とするには効果的でなく、ここに、この関係での「安定な」は、ゲルが典型的には、該操作および／または液体との接触の間に基板に固定されたままであり、有意に歪み、脱着し、または薄片に裂けることはないことを意味する。発明者らは、微粒子アレイを作成するためのゲルのような半固体媒体の使用の回避は、多数の利点を提供できることを認識した。例えば、（ｉ）試薬の拡散はより迅速であり、連結されていないプローブ、酵素等のような望まない種の除去は半固体媒体の不存在下でより速く；（ｉｉ）アクリルアミドのようなゲルは、有効なシアン化の不存在下で基板に安定に固定されたままでなくてもよく；（ｉｉｉ）重合は酸素のような環境の特徴に対して感受性であり；かくして、重合工程の排除は、アレイ製造プロセスにおいて不一致の潜在的源を除去し；（ｉｖ）半固体媒体の不存在は、単一の焦点面に微粒子がより多く入るのを容易とし；（ｖ）半固体媒体に包埋された場合より基板に付着された場合に微粒子は所定の位置により安定に固定され、これは特に、重合が危うくされるものである。
【０１８６】
一般的に、微粒子または他の支持体もしくは基材へのこのような核酸の結合を容易にするために、当該分野で公知である広範な種々の方法のいずれかが使用されて、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブ、テンプレートなどの核酸を修飾できる。加えて、支持体もしくは基材などへの微粒子の結合を容易にするために、当該分野で公知である広範な種々の方法のいずれかが使用されて、微粒子または他の支持体を修飾でき、核酸へのこれらの結合を容易にする。所望の官能基の結合を容易にする表面の化学的性質を有するミクロスフェアが利用可能である。これらの表面の化学的性質のいくつかの例には、脂肪族アミンおよび芳香族アミンを含むアミノ基、カルボン酸、アルデヒド、アミド、クロロメチル基、ヒドラジン、ヒドロキシル基、スルホン酸、および硫酸が含まれるがこれらに限定されない。これらの基は、核酸中に存在する基と反応してもよいし、または核酸が反応基の結合によって修飾されてもよい。加えて、多数の安定な二官能性基が当該分野で周知であり、これには、ホモ二官能性およびヘテロ二官能性のリンカーが含まれる。例えば、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍのウェブサイトで閲覧可能なＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ（もともとは１９９４〜９５  Ｐｉｅｒｃｅカタログにて公開）およびＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９６を参照のこと。米国特許第６，６３２，６５５号もまた参照のこと。
【０１８７】
一般的に、結合対を形成するように互いに対して親和性を示す任意の対の分子は、微粒子またはテンプレートを基材に結合させるために使用されてもよい。結合対の第１のメンバーは、基材に共有結合的または非共有結合的に結合され、結合対の第２のメンバーは、微粒子またはテンプレートに共有結合的または非共有結合的に結合される。説明の目的のために、結合対の第１のメンバー、すなわち、基材に結合する結合パートナーは、本明細書ではＢＰ１と称し、結合対の第２のメンバー、すなわち、微粒子またはテンプレートに結合される結合パートナーは（ＢＰ２）と称する。第１の結合パートナー（ＢＰ１）はリンカーを介して基材に結合されてもよい。第２の結合パートナー（ＢＰ２）はリンカーを介して微粒子またはテンプレートに結合されてもよい。例えば、１つのアプローチに従うと、スライドまたは他の適切な基材は、アミン反応基で修飾される（例えば、アミン反応基を含むＰＥＧリンカーを使用する）。このアミン反応基は水性条件下で（例えば、ｐＨ  ８．０で）、アミンと、例えば、任意のタンパク質、例えば、ストレプトアビジン中のリジンと反応する。従って、アミンを有する部分で官能基化された微粒子は、基材上に固定化されるようになる。アミンを有する部分は、タンパク質、または適切に官能基化された核酸、例えば、ＤＮＡテンプレートであり得る。複数の部分がビーズに結合され得る。例えば、ビーズは、ＮＨＳエステルと反応してビーズに基材に結合させる、ビーズに結合されたタンパク質を有してもよく、ビーズが基材に結合された後で配列決定可能である、ビーズに結合されたＤＮＡテンプレートもまた有してもよい。一方の末端にアミン反応性ＮＨＳ部分を有するポリマーテザーを有する、適切にコートされたスライドは、例えば、Ｓｃｈｏｔｔ  Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ，Ｓｃｈｏｔｔ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＮＹ  １０５２３から市販されている。種々の実施形態において、コートされたスライド（例えば、ビオチンコートされたスライド）は、Ａｃｃｅｌｒ８  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯから市販されている。彼らのＯｐｔｉＣｈｅｍ（商標）技術は、基材に微粒子を結合させるための単なる１つの方法を表しているに過ぎない。例えば、米国特許第６，８４４，０２８号を参照のこと。種々の実施形態において、微粒子は、例えば、ビオチン−ジデオキシＡＴＰおよび／またはビオチン−デオキシＡＴＰを伴う末端転移酵素の使用によって、ビーズ上のポリヌクレオチドをビオチンで官能基化することによって、次いで、これらをストレプトアビジンコートしたスライド（例えば、Ａｃｃｅｌｒ８  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯから市販されている）（米国特許第６，８４４，０２８号を参照のこと）などの基材と、ビオチン−ストレプトアビジン結合の形成を促進する条件化で接触させることによって、基材に結合される。１つの実施形態において、ストレプトアビジンは、ＰＥＧリンカーを使用して基材に結合されてもよい。１つの実施形態において、微粒子結合ポリヌクレオチドは、それらの合成後にビオチンで官能基化される。別の実施形態において、ビオチンは、増幅の間に、例えば、エマルジョンＰＣＲを実施するときにビオチン化プライマーを使用することによって、合成の間にポリヌクレオチドに取り込まれる。例えば、第１のプライマーＰ１は微粒子に共有結合的または非共有結合的に結合される。微粒子に結合されていない第２のプライマーＰ２はビオチン部分を含み、その結果、得られるＰＣＲ産物はビオチンを含む。
【０１８８】
種々の局面において、そこに核酸テンプレートが結合されている微粒子を捕捉し、基材の表面、例えば、ガラススライドなどの実質的に平面である強固な基材、例えば、ガラススライドなどにそれらをつなぎ止める方法が提供される。特定の関心対象である１つの実施形態において、テンプレートがビオチン部分を含む、テンプレートの異なるクローン集団がそこに結合されている微粒子の集団が製造される（例えば、エマルジョンＰＣＲを使用する）。ビオチンは、増殖後に標準的な方法を使用してテンプレートに結合されてもよい。次いで、微粒子は、ビオチン結合部分、例えば、そこに結合したストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質を有する、ガラススライドなどの実質的に平面である強固な基材と接触される。テンプレート分子上のビオチンはビオチン結合部分に結合し、従って、ビオチンおよびビオチン結合タンパク質を含む連結を介して基材に微粒子を結合させる。このように、基材への微粒子の結合は間接的であってもよく、ここでは、テンプレートがテザーとして働いている。１つの実施形態において、テンプレート分子の一方の末端は、ビーズに結合されたビオチン結合部分に結合されており、テンプレート分子の他方の末端は、基材に結合されたビオチン結合部分に結合されている。
【０１８９】
種々の実施形態において、一本鎖テンプレートの一方の末端は微粒子に結合されており、一本鎖テンプレートの他方の末端は基材に結合されている。従って、１つの実施形態において、一本鎖テンプレートの３’末端と５’末端の両方が、基材に微粒子を結合するように働く連結に関与しており、ここで、第１の連結は微粒子とテンプレートの間であり、第２の連結はテンプレートと基材の間である。生じる構造は、熱に対して、およびハイブリッドした核酸が解離を引き起こす傾向がある他の条件に対して安定である。
【０１９０】
実施例１６に記載されているように、ストレプトアビジンコートされた微粒子に結合されたテンプレートが、エマルジョンＰＣＲの間のそれらの合成後にビオチン化可能であること、および得られるビオチン化テンプレートが、ストレプトアビジンコートされた基材に効率的かつ堅固に結合されることが発見された。１つの実施形態において、ビオチン−ストレプトアビジン結合は、本発明の方法において２つの段階で使用される：（ｉ）ビオチン化プライマーはテンプレート増幅の前に（例えば、エマルジョンＰＣＲの前に）ストレプトアビジンコートされた微粒子に結合される（ｉｉ）増幅後、遊離の末端（すなわち、微粒子に結合していない末端）がビオチン化されている微粒子結合テンプレートは、ストレプトアビジンコートされた基材に結合され、それによって、同様に微粒子を基材に固定する。選択的に、工程（ｉ）の後で、エマルジョンＰＣＲ（または他の増幅方法）に供された微粒子の集団は、増幅を受けた微粒子について富化可能である。工程（ｉｉ）の前、かつ選択的に富化の後で、微粒子は、露出したストレプトアビジンを有する微粒子表面の任意の部分を覆うために、ビオチン化オリゴヌクレオチドとともにインキュベート可能である。これらの方法は、半固形培地が不要な、基材の表面に安定に結合された微粒子のアレイを生じる。特定の興味深い実施形態において、基材は、ガラススライドなどのような実質的に平面である強固な基材である。ビオチン／ストレプトアビジン相互作用が本発明では例示される一方で、ストレプトアビジンはビオチンに結合する多数のタンパク質のうちの１例に過ぎず、これらのいずれかが本発明の教示の種々の実施形態において使用可能であることが認められる。例えば、アビジンは、細菌のストレプトアビジンと同様に、高い親和性および選択性でビオチンに結合する卵白タンパク質である。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎはその糖質部分を取り除くように処理されたアビジンの誘導体である。ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎはｐＨ９より上でビオチン化分子に対する親和性が減少したアビジン誘導体である。結果的に、ビオチン化分子は中性ｐＨで結合が許容され、ｐＨ〜１０で遊離されることが可能である。ＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎおよびＣａｐｔＡｖｉｄｉｎは、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、オンライン版（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｂｅｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｓｅｃｔｉｏｎｓ／０７０６．ｈｔｍｌ；２００６年４月１７日閲覧）に記載されており、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから市販されている。種々の実施形態において、適切なプローブには、特異的かつ高い親和性の相互作用を示す分子の対が含まれるがこれに限定されない。例えば、特定の結合対のメンバーは、抗体および抗原、受容体および受容体のリガンド（例えば、小分子またはペプチド）、金属および金属結合剤（例えば、Ｎｉ＋および６Ｘ  Ｈｉｓタグ）などであり得る。種々の実施形態において、微粒子は上記の方法のいずれかを使用して機材に結合され、種々の実施形態において、微粒子がそこに結合した異なるテンプレートを有する、基材に結合した微��子を含むアレイが提供される。
【０１９１】
種々の実施形態において、ゲルを含まない微粒子アレイの形成は、そこに結合された多数のコピーのテンプレート（例えば、少なくとも数千コピー、典型的には数百万コピーのそこに結合したテンプレート）を有する微粒子を、そこに結合された多数のコピーのテンプレートを含まない微粒子から分離するように働く。１つの実施形態において、基材はそこに結合した第１の結合パートナー（ＢＰ１）を有し、ここで、微粒子に結合したテンプレート分子は第２の結合パートナー（ＢＰ２）を有し、ここで、ＢＰ１およびＢＰ２は互いに特異的に結合し、すなわち、これらは特異的結合対のメンバーである。ゲルを含まない微粒子アレイが上記のように形成される場合、そこにＢＰ２が結合されているテンプレートを有する微粒子のみが基材に結合されるようになる。別の実施形態において、基材はそこに結合した第１の反応性部分（Ｒ１）を有し、ここで、微粒子に結合したテンプレート分子は第２の反応性部分（Ｒ２）を含み、ここで、Ｒ１およびＲ２は互いに反応して共有結合を形成する。ゲルを含まない微粒子アレイが上記のように形成される場合、そこにＢＰ２またはＲ２が結合されているテンプレートを有する微粒子のみが基材に結合されるようになる。結合または反応が起こることを可能にした後で、未結合の微粒子は、例えば、穏やかな振盪および／または洗浄によって除去することができる。本発明の方法は、典型的には、そこに結合されたテンプレートの異なるクローン集団を有する微粒子を含み、およびまた、そこに結合されたテンプレートの複数のコピーを有さないいくつかの微粒子もまた含む、微粒子の集団に適用される。例えば、この方法は、実質的なテンプレート増幅を受けていない微粒子から、テンプレート増幅を受けている（例えば、エマルジョンＰＣＲの間）微粒子を分離するために使用されてもよい。１つの実施形態において、この方法は以下の工程を包含する：（ｉ）特異的結合対の第１のメンバーまたはそれに結合した反応性部分を有する基材を提供する工程；（ｉｉ）特異的結合対の第２のメンバーまたはそれに結合した反応性部分を含むテンプレートの複数のコピーを、少なくとも微粒子のいくつかが有する微粒子の集団と基材を、（結合対のメンバー間または反応性部分間のいずれかで）結合が起こるための適切な条件下で接触させる工程；および（ｉｉｉ）未結合の微粒子を取り除く工程。強力な非共有結合的結合を形成する特異的結合パートナー（例えば、ストレプトアビジンおよびビオチン）は、富化を達成するために特に関心が高いものである。別の実施形態において、相補的オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションが使用される。例えば、１つの実施形態において、エマルジョンＰＣＲの間にテンプレートに取り込まれる遊離のＰＣＲプライマー（遊離のＰＣＲプライマーは微粒子に結合されていないものである）の一部に相補的であるように選択されるオリゴヌクレオチドが基材に結合される。増幅が成功した場合には、遊離のプライマーは微粒子上のみ存在するので、テンプレート増幅が成功した微粒子のみが基材に結合されるようになる。リガーゼは、ハイブリダイゼーション事象の品質をチェックするために、およびビーズ上のテンプレートの３’末端にビオチン化スプリントまたはプライマーを共有結合的に連結するために使用されてもよい。例えば、以下の一続きの工程が実行可能である。ここでは、「ビーズ」は微粒子を表し、Ｐ２は増幅プライマー配列の少なくとも一部を表し、「ｄｓ」は「二本鎖」を意味し、「アレイ」は、増幅が成功した微粒子がビオチンを介してそこに結合されるようになることが可能である基材をいう。二本鎖テンプレートが結合している微粒子が提供される。第１の工程において、未結合テンプレートが、例えば、温度を上昇させることによって取り除かれる。第２の工程において、一本鎖伸長を有する二本鎖核酸はテンプレートにハイブリダイズされる。二本鎖核酸は、ビオチンがテンプレートに安定して連結可能である架橋またはスプリントとして働く。一本鎖伸長を有さない二本鎖核酸の鎖は、一本鎖伸長に対して反対側の末端にビオチン部分が結合している。第３の工程において、リガーゼが存在する。ビオチンを含む二本鎖核酸は、首尾よいハイブリダイゼーションが起こった場合にテンプレートにライゲーションされ、従って、ビオチンをテンプレートに安定に連結する。第４の工程において、テンプレートにライゲーションされなかったスプリントの鎖が、例えば、温度を上昇させることによって取り除かれる。基材または支持体に結合したストレプトアビジンとのビオチンの相互作用は、微粒子のアレイの創造を生じる。
ビーズ  テンプレート  ［Ｐ２］−ＡＣＧＴＴＧＧＧＧＣＴＡ
↓（１）ビーズからの未結合テンプレートの融解
ビーズ−テンプレート［Ｐ２］−ＡＣＧＴＴＧＧＧＧＣＴＡ
↓（２）テンプレートＰ２にｄｓＤＮＡ−ビオチンスプリントをハイブリダイズする
ビーズ−テンプレート［Ｐ２］−ＡＣＧＴＴＧＧＧＧＣＴＡｐＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ビオチン−アレイ
ＴＧＣＡＡＣＣＣＣＧＡＴ  ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
↓（３）ｄｓＤＮＡ−ビオチンをＰ２にライゲーションする
ビーズ  テンプレート［Ｐ２］−ＡＣＧＴＴＧＧＧＧＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−ビオチン−アレイ
ＴＧＣＡＡＣＣＣＣＧＡＴ  ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
↓（４）ビーズに結合していないＤＮＡを融解して除く
ビーズ  テンプレート［Ｐａ］−ＡＣＧＴＴＧＧＧＧＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−ビオチン−アレイ
【０１９２】
本発明の方法は、そこに複数のテンプレートが結合されていないか、またはそこに実質的にわずかなテンプレートが結合されている微粒子から、そこに複数のテンプレートが結合された微粒子を分離するために使用することができ、ここで、このテンプレートは、増幅または合成の後で微粒子に結合される。分離される微粒子は、微粒子に結合したテンプレートの増幅もしくは合成が起こるか、または増幅したテンプレートの複数コピーが微粒子に結合されるようになってもよい、任意の型の条件に供されてもよい。増幅方法は、ＰＣＲ増幅、ローリングサークル増幅、または任意の他の型の核酸増幅であってもよい。この方法は、本教示の種々の局面および実施形態の他の方法および組成物のいずれかと組み合わせることができ、および／またはこれらとともに使用することができる。接触工程は、典型的には液体媒体中で行われる。種々の実施形態において、接触工程の間に、微粒子を含む液体が、特異的結合対またはそれに結合した反応性部分を有する基材を横切って流れることが許容される。基材は、例えば、液体の入口および液体の出口を有するフローセルなどのチャンバーに配置されてもよい。微粒子は、基材に結合した微粒子が所望の密度または数に達するまで、基材の上を流されてもよい。密度または数の変化は経時的にモニターされてもよい（例えば、画像処理によって）。これらの方法の様々な実施形態が、エマルジョンＰＣＲの間に実質的なテンプレート増幅を受けていない微粒子から、エマルジョンＰＣＲの間にテンプレート増幅を受けた微粒子を分離するために使用することができる。これらの方法は、テンプレート増幅を受けた微粒子について富化する。基材に結合した微粒子に結合したテンプレートは、種々のさらなる反応または操作に供することができる。例えば、これらは、例えば、本明細書に記載されるようなライゲーションに基づく配列決定を使用するか、またはＦＩＳＳＥＱ、ピロシークエンシングなどの他の配列決定法を使用して、配列決定することができる。例えば、本明細書に記載される配列決定法のいずれかの実施形態が、半固形培地を使用することなく、および／または半固形培地の非存在下で、基材に結合される微粒子に結合されたテンプレート上で実施可能である。
【０１９３】
微粒子が基材または半固形培地に結合されている実施形態のいずれかにおいて、例えば、微粒子は、引き続き遊離され、必要に応じて、取り除くことができる（例えば、線上によって）。微粒子を遊離するための適切な方法は、これらがそれによって基材または半固形培地に結合する、特定の共有結合的または非共有結合的な結合に依存する。ＤＮＡテンプレートに有意な損傷を与えず、または基材もしくは半固形培地からのその遊離を生じる限り、任意の適切な方法が使用可能である。例えば、種々の実施形態において、微粒子は、切断可能なリンカー、例えば、ジスルフィド結合またはエステル結合を含むものによって、基材または半固形培地に結合される。
【０１９４】
種々の実施形態において、微粒子は、半固形培地に安定に結合されているテンプレートのクローン集団のアレイを生成するために使用される。この方法において、１つ以上のテンプレート分子が結合している微粒子は、基材上に配置された半固形培地、例えば、実質的に平面である強固な基材上に配置されたポリアクリルアミドゲルの存在下でインキュベートされ、テンプレートは、半固形培地中で固定化され、および／または半固形培地に結合されたプライマーにハイブリダイズされる。次いで、プライマーは伸長され（例えば、ＤＮＡポリメラーゼを使用する）、半固形培地中に結合され、および／または半固形培地で固定化された相補的テンプレートの合成を生じる。微粒子は、例えば、インキュベーションのストリンジェンシーを上昇させることによって（例えば、温度を上昇させることによって）遊離され、その結果、２つの相補的テンプレート鎖が分離される。微粒子を遊離させる方法は、例えば、そこに結合したテンプレートを切断することによる方法もまた含み、またはさもなくば、テンプレートから微粒子を脱離させることもまた使用できる。
【０１９５】
このプロセスは、微粒子が結合したテンプレートのコピーまたは「インプリント」を半固形培地に転写する。このプロセスの効率は、微粒子に結合したテンプレート分子の数で除算した、微粒子から半固形培地にコピーされるテンプレート分子の数として定義され得る。幾何学的および物理学的な配慮に基づき、かついかなる場合においても本教示を限定するものではないが、そこに結合した２００ｂｐサイズの約１５０，０００個のテンプレート分子が結合している直径１μｍの微粒子は、図４０に示されるように、直径約５００ｎｍの接触パッチを有する。接触パッチとは、培地の表面上に配置され、またはそこに部分的に包埋された微粒子に対して十分に密接して近接しており、その結果、微粒子に結合しているものに対して相補的なテンプレートが、半固形培地または基材の中またはその上に配置されているプライマーを伸長することによって合成可能である、半固形培地または基材の領域をいう。具体的には、１ミクロン直径のビーズは３．１×１０６ｎｍ２の面積を有し、その結果、ビーズ上の１５０，０００個のＤＮＡ分子が２０．９ｎｍ２の平均面積または４．５７ｎｍの平均距離を与える。Ｂ−ＤＮＡの直径は約１．９ｎｍであり、２００ｂｐ  Ｂ−ＤＮＡは６８ｎｍ長である。それゆえに、６８ｎｍの分離のための１ミクロンビーズの接触パッチは半径２５２ｎｍまたは面積１９９，０００ｎｍ２である。ＤＮＡ分子あたり２０．９ｎｍ２では、パッチは９５００分子，すなわち、ビーズの底の半分の分子の数の約１３％まで多くを含むことが予想される。
【０１９６】
選択的に、半固形培地と結合したままであるテンプレートの増幅の１回以上のラウンドを実施する。種々の実施形態において、増幅はローリングサークル増幅である（ＲＣＡ；米国特許第５，８５４，０３３号；同第６，１４３，４９５号）。ＲＣＡを実施する前に、以下を含む工程を実施してもよい：（ｉ）テンプレートの２つの隣接していない領域への環化可能プローブ（「パドロック」プローブ）のハイブリダイゼーション、（ｉｉ）ポリメラーゼを使用する、生じるギャップの充填、および（ｉｉｉ）末端のライゲーション。ＲＣＡにおける使用のためのテンプレート分子は、配列決定される部分に加えて、環化可能プローブに対して相補的な領域を含むべきである。
【０１９７】
プライマー伸長および選択的な増幅は、半固形培地に結合しているか、またはその中に固定化されている「スポット」のアレイまたは核酸「コロニー」を生じる。コロニーは、微粒子が沈着した場所に対応する位置に位置付けされる。多くのまたは大部分のコロニーがテンプレートの単一のクローン集団から、または、種々の実施形態において、２個または数個までのテンプレートのクローン集団からなる（微粒子がそこに結合した２個以上の異なるテンプレートを有する場合）。同様のアプローチは、基材上に配置された半固形培地ではなく基材それ自体にプライマーを結合させることによって、半固形培地の使用を伴うことなく、ガラススライドなどの基材上で直接的に核酸コロニーのアレイを生成するために使用することができる。
【０１９８】
いかなる理論によっても束縛されることは望まないが、上記のような微粒子を使用して核酸コロニーのアレイを形成することは、多数の利点を提供する。微粒子は、アレイを形成するためのそれらの使用の前に、テンプレートの増幅、および任意に、富化に供することができ、その結果、各核酸スポットは、単一のテンプレートの増幅からではなく、単一の微粒子に由来するテンプレートの複数コピーの増幅から生じる。さらに、互いに対して密接に近接している半固形培地の表面上に配列可能な微粒子の使用は、半固形培地の表面の効率的な使用を提供し、さらに、検出の間に互いから容易に区別可能である別個のスポットを生じる。スポットは、典型的には、微粒子よりもサイズが小さく、これらを互いからより明確に区別することを可能にする。例えば、粒子と平らな表面とのあいだの接触点の２５０ｎｍ以内に配置された１ミクロン直径の粒子上のＤＮＡが平らな表面に結合されるようになりかつコピーされる場合、粒子を遊離した後に、結果は表面の５００ｎｍ直径上のＤＮＡのパッチである。２つの１ミクロンのビーズが接触している場合、これらが残すＤＮＡパッチの中心は１ミクロン離れており、パッチの最も近接した端の間で５００ｎｍの間隔で離れている。ガラススライドなどの小さな基材の表面上に数百万個の微粒子を充填する能力があるので、このプロセスは、隣接するコロニーからの干渉なしで容易に画像化され、そして複数の配列決定サイクルを超えて、容易かつ信頼性のある検出を可能にするために十分な数のテンプレート分子を含む、テンプレートコロニーの高密度アレイを達成するための効率的な方法を提供する。
【０１９９】
基材に結合した微粒子に結合したテンプレートは、種々のさらなる反応または操作に供することができる。これらは、例えば、本明細書に記載されるようなライゲーションに基づく配列決定を使用するか、またはＦＩＳＳＥＱ、ピロシークエンシングなどの他の配列決定法を使用して、配列決定することができる。例えば、本明細書に記載される配列決定法のいずれかの実施形態が、半固形培地中の核酸コロニー中に存在するテンプレート上で実施することができ、ここで、コロニーは、上記のような微粒子を使用して形成される。
【０２００】
本明細書に記載される方法に従って形成される微粒子または核酸コロニーのアレイは、一般的にはランダムであり得る。本明細書で使用される場合、「ランダムなパターンの」または「ランダム」という用語は、支持体上の実体（特徴）の、秩序立っていない、非デカルト分布（言い換えれば、グリッドのｘ軸およびｙ軸に沿ったあらかじめ決定した点もしくは位置においては、または所定の時計の位置、放射状パターンの中心からの度もしくは半径においては配列されない）をいい、これは、意図的な設計（またはこのような設計が達成されてもよいプログラム）を通して、または個々の実体の配置によって達成されるのではない。このような「ランダムなパターンの」または「ランダム」な実体のアレイは、実体のプールを含む溶液、エマルジョン、エアロゾル、蒸気、または乾燥調製物を、支持体の上または中に、落下させ、スプレーし、プレートし、広げ、分配することなどによって、および支持体の中または上の特定の部位までこれらを方向付けるための任意の様式で、干渉することなく、支持体の上または中にこれらを定着させることによって達成されてもよい。例えば、実体は、半固形支持体の前駆体（例えば、アクリルアミドモノマー）を含む溶液中に懸濁されてもよい。次いで、溶液は第２の支持体上に分配され、半固形支持体は第２の支持体を形成する。実体は半固形支持体の中または上に包埋される。当然、ランダムではないアレイもまた使用可能である。微粒子の密接な充填は、微粒子の規則的なグリッド様アレイまたはそこから合成された核酸コロニーを生じてもよい。一般的に、本発明で使用されるアレイを形成するための方法は、例えば、ポリヌクレオチドの合成が、基材上の所定の位置での個々のヌクレオチドサブユニットの連続的適用によって起こる方法とは区別される。
【０２０１】
図１４Ｂ（上）は、その上にポリアクリルアミドゲルを有するスライド（１インチ×３インチ）の蛍光画像を示す。ビーズに結合されたテンプレートにハイブリダイズされた蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを有するビーズ（１ミクロン直径）がゲル中に固定化されている。この画像は、スライドあたり約２億８０００万個のビーズを画像化するために十分なビーズ表面密度（すなわち、ビーズが配置されている領域中の、基材の単位面積あたりのビーズの数）を示す。表面密度および画像化可能な領域は、単一のスライド上で少なくとも５億個のビーズを画像化するために十分である。例えば、図１４Ｂ（下）は、ビーズがポリアクリルアミドゲルなどの半固体支持体層中に包埋される明確な領域を取り囲むテフロン（登録商標）マスクを有するスライドの概略図を示す。このマスクの領域は８６４ｍｍ２である。５億個のビーズでは、表面密度はｍｍ２あたり５７８，０００個のビーズである。１ミクロンビーズの密接に充填された六角形のアレイは、ｍｍ２あたり１，１５５，０００個のビーズを与え、理論的な最大密度の５２％を有するアレイを生じる。より小さな数およびより大きな数のビーズ、およびより大きなまたはより小さなビーズ表面密度が使用可能であることが理解される。
【０２０２】
微粒子は、多数の方法で定義可能である種々の密度で、実質的に平面である半固形支持体の中もしくは上に、または別の支持体もしくは基材上に整列されてもよい。例えば、密度は、実質的に平面であるアレイの単位面積あたりの微粒子（例えば、球形の微粒子）の数によって表現されてもよい。種々の実施形態において、実質的に平面であるアレイの単位面積あたりの微粒子の数は、六角形アレイ中の微粒子の数の少なくとも８０％である（「六角形アレイ」とは、米国特許第６，４０６，８４８号に記載されるように、アレイ中のすべての微粒子が、等しい面積の少なくとも６つの他の隣接する微粒子と接触している、微粒子の実質的に平面であるアレイを意味する）。しかし、種々の実施形態において、微粒子の密度はより低く、例えば、実質的に平面であるアレイの単位面積あたりの微粒子の数は、六角形アレイ中の微粒子の数の８０％未満、７０％未満、６０％未満、または５０％未満である。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、種々の実施形態において、例えば、酵素、プライマー、補因子などの試薬の十分な拡散を可能にするために、および特定の試薬が微粒子に対して示差的な親和性を有するか、またはその中に包括される場合に起こり得る試薬の分配効果を回避するために、より低い密度で、例えば、これらの順番で利用することが望ましくあり得る。このような効果は、アレイ上の異なる位置で異なる反応条件を生じる可能性があり、これらの試薬によってアレイ上の特定の位置への接近を妨害さえする可能性がある。これらの問題は、反応がフローセル中で行われる場合には悪化する可能性がある。試薬が方向性の様式でフローセルを通して移動するからである。種々の実施形態において、混合装置、例えば、機械的または音響的手段によって液体の混合を達成する装置が、フローセルのチャンバー内に含まれる。多数の適切な混合装置が当該分野において公知である。
【０２０３】
種々の実施形態において、配列決定法は、微粒子のアレイまたはテンプレートそれ自邸のアレイであり得る、ランダムアレイと非ランダムアレイの両方を含むすべての型のアレイ形式で配列されたテンプレートを使用して実施することができる。例えば、その上にテンプレートが配列された支持体は、米国特許第５，６４１，６５８号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ００１８９５７に記載されている。アレイは、フィルター、メンブレン（例えば、ナイロン）、金属表面などのような広範な種々の基材上に配置されてもよい。伸長、ライゲーション、および切断の反復サイクルによる配列決定がその上で実施可能であるアレイ形式のさらなる例は、光ファイバー束の個々の光ファイバーの末端または遠位端でのウエル中に配置されたビーズのアレイである。例えば、以下の米国公開公報および特許：例えば、６，０２３，５４０；６，４２９，０２７、２００４０１８５４８３、２００２１８７５１５、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／０５０２５、およびＰＣＴ  ＵＳ９８／０９１６３、およびＰＣＴ公開ＷＯ００３９５８７において記載されているビーズアレイおよび「アレイのアレイ」を参照のこと。テンプレートが結合されているビーズは、そこに記載されているように配列することができる。増幅は、アレイの形成前に実施される種々の実施形態においてである。このような基材上で形成されるアレイは必ずしも実質的に平面である必要はない。
【０２０４】
種々の実施形態において、ＰＣＲは、基材または支持体に結合したオリゴヌクレオチドを含むアレイ上で実施される（例えば、米国特許第５，７４４，３０５号；同第５，８００，９９２号；同第６，６４６，２４３号および関連特許（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）；ＰＣＴ公開ＷＯ２００４０２９５８６；ＷＯ０３０６５０３８；ＷＯ０３０４０４１０（Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ）を参照のこと）。一般的に、このようなオリゴヌクレオチドは、遊離の３’末端または５’末端を有する。所望される場合、末端は、例えば、すでに存在していない場合に、３’末端にリン酸基またはＯＨ基を加えることによって修飾することができる。支持体または基材に結合されたオリゴヌクレオチドに相補的な領域を含むテンプレート分子は、そのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、ＰＣＲがアレイ上でインサイチュに実施され、アレイ上の各位置でクローンテンプレート集団を生じる。アレイに結合されたオリゴヌクレオチドは、増幅プライマーの１つとして働いてもよい。次いで、テンプレートは、本明細書に記載されるライゲーションに基づく方法を使用して配列決定される。配列決定はまた、米国公開番号２００３００６８６２９に記載されるようなアレイ中のテンプレート上で実施することができる。
【０２０５】
基材上のＤＮＡアレイの調製のためのなお他の方法が使用可能である。例えば、末端アルデヒド基で修飾されたアルカンチオールが、金表面上で自己集合単層（ＳＡＭ）を調製するために使用できる。単層のアルデヒド基は、シッフ塩基を形成するために、アミン修飾オリゴヌクレオチドまたは他のアミンを有する生体分子と反応させてもよく、次いで、これは、シアノヒドリドホウ酸ナトリウムを用いる処理によって安定な二級アミンに還元されてもよい（ＰｅｅｌｅｎおよびＳｍｉｔｈ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２１（１）：２６６−７１、２００５）。次いで、テンプレートのＰＣＲ増幅が実施可能である。種々の実施形態において、そこに結合したテンプレートのクローン集団を有する微粒子は、微粒子またはテンプレート上のアミン基、または粒子に結合したオリゴヌクレオチドを、表面と反応させることによってこのような表面に結合させてもよい。
【０２０６】
クローンテンプレート集団が結合している微粒子を得るためのなお別の方法は、米国特許第５，６０４，０９７号に記載されている「固相クローニング」アプローチであり、これは、同じ配列のポリヌクレオチドのみが任意の特定の微粒子に結合されるように、微粒子上でポリヌクレオチドを分類するためのオリゴヌクレオチドタグを利用する。
【０２０７】
種々の実施形態において、伸長、ライゲーション、および切断の反復サイクルによる配列決定は、各クローン集団が支持体の空間的に離れた領域に局在するように、配列決定試薬（例えば、伸長プローブ、リガーゼ、ホスファターゼなど）を、支持体の中またはその上に固定化されたテンプレートのクローン集団を有するゲルなどの半固体支持体に拡散させることによって実施される。種々の実施形態において、テンプレートは、上記のような半固体支持体に直接的に結合される。しかし、種々の実施形態において、テンプレートは、微粒子などの第２の支持体上に固定化され、次には、これもまた上記のように、微粒子が半固体支持体の中またはその上に固定化される。
【０２０８】
実施例１に記載されるように、本発明者らは、堅固なライゲーションおよび切断が、ポリアクリルアミドゲル中に固定化されているビーズに結合されたテンプレート上で実施可能であることを示した。種々の実施形態において、以下の工程を包含する、第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドにライゲーションする方法が提供される：（ａ）半固体支持体の中またはその上に固定化された第１のポリヌクレオチドを提供する工程；（ｂ）第１のポリヌクレオチドを、第２のポリヌクレオチドおよびリガーゼと接触させる工程；ならびに（ｃ）ライゲーションのための適切な条件下で、リガーゼの存在下で第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを保持する工程。適切な条件には、使用される特定のリガーゼのために適切な緩衝液、補因子、温度、時間などの提供が含まれる。種々の実施形態において、半固体支持体は、アクリルアミドゲルなどのゲルである。種々の実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ビーズなどの支持体への結合の結果として半固体支持体の中またはその上に固定化されており、このビーズは、例えば、支持体マトリックスに部分的にまたは完全に包埋されることによって、半固体支持体の中またはその上に、ビーズ自体が固定化されている。種々の実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、アクリダイト部分などの結合を介して半固体支持体に直接的に結合されてもよい。この結合は共有結合的または非共有結合的であり得る（例えば、ビオチン−アビジン相互作用を介する）。米国特許第６，５１１，８０３号は、支持体、例えば、ポリアクリルアミドに核酸分子を結合するために使用され得る種々の方法を記載している。
【０２０９】
種々の実施形態において、以下の工程を包含する、ポリヌクレオチドを切断する方法が提供される：（ａ）半固体支持体の中またはその上に固定化されている、切断可能な結合を含んでいるポリヌクレオチドを提供する工程；（ｂ）切断剤とポリヌクレオチドを接触させる工程；および（ｃ）切断のために適切な条件下で切断剤の存在下でポリヌクレオチドを保持する工程。適切な条件には、特定の切断剤のために適切な緩衝液、温度、時間などの提供が含まれる。種々の実施形態において、種々の実施形態において、このポリヌクレオチドは、ビーズなどの支持体への結合の結果として半固体支持体の中に固定化されており、このビーズは、それ自体が半固体支持体中に固定化されている。種々の実施形態において、このポリヌクレオチドは、アクリダイト部分などの結合を介して半固体支持体に直接的に結合されてもよい。この結合は共有結合的または非共有結合的であり得る（例えば、ビオチン−アビジン相互作用を介する）。理解されるように、本明細書に記載される方法の多くに従って調製されるＤＮＡテンプレートは、典型的には、配列決定される領域を含み、３’末端と５’末端のいずれかまたは両方に保存性のプライミング領域もまた含む（ＰＢＲ）。「保存性」または「共通の」領域とは、配列決定される異なる領域を含む複数のテンプレートに対して共通である配列をいい、すなわち、テンプレートは、それらの配列が一部違っていたとしても、同一である部分もまた含む。テンプレートはまた、１つ以上の保存性の内部のアダプター配列を含んでもよい。さらに、ＤＮＡテンプレートのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、これらの保存性配列のさらなるコピーを生成するのみならず、ＲＣＡプローブからの保存性配列のさらに別の領域のコピーもまた導入する。結果として、配列決定されるライブラリー分子の部分（「標的領域」「目的のセグメント」などと称する）は、実際のテンプレート核酸の半分未満を表す可能性がある。本教示は、一本鎖である場合、これらの公知の／共通の非標的領域が配列決定プローブを隔離することができ、配列決定プライマー（例えば、初期化オリゴヌクレオチド）のミスプライミングの潜在的な部位であるという認識を包含する。種々の実施形態において、ポリヌクレオチドテンプレートに存在する非標的配列に対して相補的であるブロッキングヌクレオチドが提供される。本明細書で使用される場合、「ブロッキングヌクレオチド」とは、テンプレート中の非標的配列に安定にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、ここで、非標的配列は、配列決定のために適切な条件下で、異なる標的領域を含む複数のテンプレートに共通である。非標的領域は、初期化オリゴヌクレオチドが結合する領域から離れている。種々の実施形態において、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしているポリヌクレオチドテンプレートが提供される。
【０２１０】
種々の実施形態において、テンプレートはエマルジョンＰＣＲを使用して合成される。
【０２１１】
種々の実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、図３６Ｂに示されるように、フラグメントライブラリーのメンバーであり、フォワードアダプターまたはリバースアダプターを含む。第１のブロッキングオリゴヌクレオチドはフォワードアダプターに相補的であり、第２のブロッキングオリゴヌクレオチドはリバースアダプターに相補的である。種々の実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、図３６Ａに示されるように、対合末端ライブラリーのメンバーであり、フォワードアダプターまたはリバースアダプターを含み、内部アダプターもまた含む。第１のブロッキングオリゴヌクレオチドはフォワードアダプターに相補的であり、第２のブロッキングオリゴヌクレオチドはリバースアダプターに相補的であり、そして第３のブロッキングオリゴヌクレオチドは内部アダプターに相補的である。種々の実施形態において、テンプレートは、図３６Ｃおよび３７に示されるように、ＲＣＡを使用して増幅され、アダプター領域およびパドロック領域を含む。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、テンプレートに存在しているようなアダプター領域およびパドロック領域に相補的である。ＲＣＡにおいて、パドロックプローブはポリメラーゼによってコピーされ、その相補物を産生することが理解される。従って、テンプレートに存在するＲＣＡ相補物をブロックするために、パドロックプローブと同じ配列がブロッキングオリゴヌクレオチドとして使用される。特定のオリゴヌクレオチドの種々の実施形態が、それらの相補物とともに図３６および３７に示されるが、ブロッキングヌクレオチドの配列が、変動する可能性があるテンプレートに存在する特定の保存性配列に相補的であるように選択されることが認識される。種々の実施形態において、図３６または３７に示されたものとは１個、２個、３個、４個、または５個を超えないヌクレオチドで配列が異なっているオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【０２１２】
例えば、種々の実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、上述の問題またはこれらの共通の配列の多くのコピーの存在に起因して生じ得る他の問題に対抗するために、例えば、テンプレートの複雑さを減少させるツールとして作用すること、潜在的なミスプリンティング部位を除去すること、および／またはテンプレートの標的領域への伸長オリゴヌクレオチドの接近を容易にすることによって、使用できる。種々の実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列決定効率の増加、例えば、より高いシグナル対ノイズ比を提供する。
【０２１３】
ブロッキングオリゴヌクレオチドは、典型的には、配列決定プライマーのアニーリング前に一本鎖テンプレートＤＮＡにハイブリダイズされ、これらの領域を、配列決定プライマー（例えば、ライゲーションに基づく配列決定における初期化プライマー）またはプローブ（例えば、ライゲーションに基づく配列決定における伸長プローブ）のいずれかとの引き続くハイブリダイゼーションから保護する。これらは、典型的には、ライゲーション、検出（および切断、例えば、伸長オリゴヌクレオチドが切断される種々の実施形態において）の連続的なサイクルの間に存在するままである。種々の実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはリガーゼのための基質ではなく、例えば、これらは、典型的なポリメラーゼ酵素またはリガーゼ酵素によって酵素的に伸長可能ではない。種々の実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’ヒドロキシル基および５’リン酸を欠いている。これらの基は存在しなくてもよく、もしくは合成後に除去されてもよく、またはオリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端は、伸長もしくはライゲーションの基質ではない部分でキャップまたはブロックされてもよい。種々の実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’末端ジデオキシヌクレオシドを含む。種々の実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、末端の３’末端ジデオキシシトシン（３’ｄｄＣ）を含む。種々の実施形態において、対のタグライブラリーとの使用のためのパドロックプローブは、個別に（タグ１のみ、タグ２のみ）または両方のタグにわたって（タグ１−内部−タグ２）単一タグのＲＣＡを可能にするように設計される（図３７）。
【０２１４】
ブロッキングオリゴヌクレオチドは、保存性領域よりも短くあり得、すなわち、これらは、保存性領域の一部のみに対して相補性であり得る。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、保存性領域に完全に相補性である必要はない。典型的には、これらは、保存性領域のすべてまたは一部に対して、少なくとも８０％、および／または少なくとも９０％の相補性である。ブロッキングオリゴヌクレオチドのサイズは、ブロックされる共通の配列の長さに依存して変化してもよい。典型的な長さは、１０ヌクレオチドから５０ヌクレオチドの間である。ブロックされる保存性領域の一部に各々相補性である２個以上のブロッキングオリゴヌクレオチドが、単一のより長いオリゴヌクレオチドの代わりに使用されてもよい。
【０２１５】
ブロッキングオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、ライゲーションに基づく配列決定における特定の使用を見い出し得る。従って、本明細書に記載される任意の方法は、初期化ヌクレオチドとのテンプレートの接触の前に、プローブ−テンプレート二重鎖を形成もしくは提供する前に、および／または伸長した二重鎖を形成する前に、１種以上のブロッキングオリゴヌクレオチドとテンプレートオリゴヌクレオチドを接触させる工程を含んでもよい。しかし、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ＦＩＳＳＥＱ、ピロシークエンシングなどのような他の配列決定法を実施するときにもまた使用されてもよい。
Ｄ．異なる初期化オリゴヌクレオチドを使用する再初期化を伴う配列決定
【０２１６】
種々の実施形態において、第１の初期化オリゴヌクレオチドを伸長することによって生成される伸長鎖は、十分な回数のサイクル後にテンプレートから取り出され、第２の初期化オリゴヌクレオチドは、結合領域にアニーリングされ、続いて、伸長、ライゲーション、および検出のサイクルが行われる。このプロセスは、任意の数の異なる初期化オリゴヌクレオチドを用いて反復される。例えば、伸長プローブが切断される種々の実施形態において、使用される異なる初期化オリゴヌクレオチドの数（および従って反応の数）は、プローブの遠位部分の遊離後テンプレートにハイブリダイズしたままである伸長プローブの部分の長さに等しくあり得る。従って、種々の実施形態に従って、配列情報（例えば、各ヌクレオチドの順序および同一性）は、各サイクルで連続するヌクレオチドが同定されるならば、必要とされるよりも実質的に少ないサイクルを使用してさらに深く配列情報を読み取りながら、単一の支持体に結合しているテンプレートから得ることができる。
【０２１７】
初期化オリゴヌクレオチドが同じテンプレートに連続的に結合している種々の実施形態は、テンプレートを複数のアリコートに分割することを必要としているアプローチを超えた、特定の利点を有し得る。例えば、同じテンプレートに初期化オリゴヌクレオチドを適用することは、複数のアリコートから得られるデータを追跡し、その後にそれらを合わせる必要性を回避する。個々の支持体の位置があらかじめ定められるように、支持体がランダムな様式で配列される種々の実施形態において、支持体の各々がそこに結合した同じ配列のテンプレートを有する複数の支持体からの部分的な配列情報を、高い信頼性で合わせることは困難であるかまたは不可能である。
Ｅ．単一のテンプレート上での各サイクルにおける複数のヌクレオチドの同定
【０２１８】
Ｍａｃｅｖｉｃｚは、伸長、ライゲーション、および検出の各サイクルにおけるテンプレート中の単一のヌクレオチドの同定を教示している。しかし、本発明者らは、これらの方法が、各サイクルにおけるテンプレート中の複数のヌクレオチドの同定を可能にするように改変され得ることを認識している。この場合、伸長プローブは標識され、その結果、種々の実施形態において、伸長した二重鎖に隣接する２つ以上の連続したヌクレオチドの同定が標識から決定できる。換言すれば、伸長プローブの配列決定部分は、単一のヌクレオチドより大きく、典型的には、近位のヌクレオチド、じかに隣接するヌクレオチド、およびおそらく、種々の実施形態において、１つ以上の付加的な連続するヌクレオチドを含み、これらのすべてが、テンプレートに特異的にハイブリダイズする。例えば、塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴを同定するための４種の標識を使用するのではなく、１６通りの可能なジヌクレオチド、ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＡＴ、ＧＡ、ＧＧ、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＣ、ＣＴ、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、およびＴＴを同定するために、１６種類の区別可能に標識されたプローブまたはプローブの組み合わせが使用される。各々区別可能に標識された伸長プローブの配列決定部分は、これらのジヌクレオチドの１つに対して相補的である。より多くの標識を利用する同様の方法は、各サイクルにおけるより長いヌクレオチド配列の同定を可能にする。
Ｆ．標識
【０２１９】
「標識」という用語は、プローブと結合しているか、またはプローブに付着している任意の検出可能な部分または複数の検出可能な部分を示すために広い意味で本明細書では使用され、これにより、異なる種のプローブ（例えば、異なる末端ヌクレオチドを有するプローブ）が互いに区別可能であり得る。従って、標識と特異的な検出可能な部分との間で１対１の対応が存在する必要はない。例えば、複数の検出可能な部分が、単一のプローブに結合でき、このプローブを、異なる検出可能な部分またはそれに結合した検出可能な部分のセットを有するプローブから区別することが可能であるシグナルの組み合わせを生じる。例えば、検出可能な部分の組み合わせは、米国特許第６，６３２，６０９号およびＳｐｅｉｃｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：３６８−３７５，１９９６に記載されている「コンビナトリアル多色コーディング（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  Ｃｏｄｉｎｇ）」と呼ばれる標識スキームに従って使用することができる。
【０２２０】
プローブは、蛍光または化学発光部分、比色部分、基質と接触したときに検出可能なシグナルを生成する酵素部分などの直接的または間接的な結合を含む、種々の方法で標識することができる。Ｍａｃｅｖｉｃｚは、プローブが、例えば、Ｍｅｎｃｈｅｎら、米国特許第５，１８８，９３４号；Ｂｅｇｏｔら、ＰＣＴ出願  ＰＣＴ／ＵＳ９０１０５５６５によって開示されるような蛍光色素で標識され得ることを教示している。本明細書において使用される「蛍光色素」および「蛍光団」という用語は、所定の励起波長で光エネルギーを吸収し、異なる波長で光エネルギーを放射する部分をいう。種々の実施形態において、プローブの所定の混合物との使用のために選択される標識は、スペクトル的に分解可能である。本明細書で使用される場合、「スペクトル的に分解可能」とは、操作条件下で、標識のスペクトル特性、特に、蛍光発光波長に基づいて標識が区別が可能であり得ることを意味する。例えば、１つ以上の末端ヌクレオチドの同一性は、最大光放射強度の異なる波長、またはおそらく、異なる波長の強度の比に相関し得る。標識を検出および同定するために使用される標識のスペクトル特性は、本明細書では「色」と称する。標識は、頻繁に、特定のスペクトル特性、例えば、単一の検出可能な部分からなる標識の場合における最大発光強度の周波数、または複数の検出可能な部分からなる標識の場合における発光ピークの周波数に基づいて同定されることが理解される。
【０２２１】
種々の実施形態において、スペクトル的に分解可能な４種の蛍光色素の各々と、プローブの４種の可能な末端ヌクレオチドとの間で１対１の対応を可能にする４種のプローブが提供される。スペクトル的に分解可能な色素のセットは、米国特許第４，８５５，２２５号および同第５，１８８，９３４号；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５５６５；およびＬｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈｓ，２０：２４７１−２４８３（１９９２）において開示されている。種々の実施形態において、ＦＩＴＣ、ＨＥＸ（商標）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、およびＣｙ５からなるセットが使用される。多数の適切な蛍光色素が、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲから市販されている。蛍光色素の特定の例には以下が含まれるがこれらに限定されない：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０）、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ−Ｓ、ＢＯＤＩＰＹ色素（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５）、ＣＡＬ色素、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ）、カスケードイエロー（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ）、シアニン色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５）、ダンシル、ダポキシル、ジアルキルアミノクマリン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−フルオレセイン、ＤＭ−ＮＥＲＦ、エオシン、エリスロシン、フルオレセイン、ＦＡＭ、ヒドロキシクマリン、ＩＲＤｙｅ（ＩＲＤ４０、ＩＲＤ７００、ＩＲＤ８００）、ＪＯＥ、リサミン  ローダミンＢ、マリンブルー、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、オイスター色素、パシフィックブルー、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ロドール（Ｒｈｏｄｏｌ）グリーン、２’，４’，５’，７’−テトラ−ブロモスルホン−フルオレセイン、テトラメチル−ローダミン（ＴＭＲ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テキサスレッド、テキサスレッド−Ｘ。さらなる説明については、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、第９版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと。
【０２２２】
ある蛍光基は、それ自体が直接的に検出可能であるものではなく、非放射性蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の過程で別の基にエネルギーを移動し、第２の基が検出されるシグナルを産生する。クエンチャーの使用もまた、本教示の種々の実施形態の範囲内にある。「クエンチャー」という用語は、密接に近接して配置されたときに励起された蛍光標識のエネルギーを吸収し、かつ可視光の放射なしでエネルギーを消散することが可能な部分をいう。クエンチャーの例には以下が含まれるがこれらに限定されない：ＤＡＢＣＹＬ（４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）スクシンイミジルエステル、ジアリールローダミンカルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＱＳＹ−７）、および４’，５’−ジニトロフルオレセインカルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＱＳＹ−３３）（以上すべてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓより入手可能）、クエンチャー１（Ｑ１；Ｅｐｏｃｈより入手可能）、または「ブラックホールクエンチャー」ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、およびＢＨＱ−３（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．より入手可能）。
【０２２３】
適切な検出可能な部分には、例えば、オリゴヌクレオチドプローブに直接的に結合可能であり、次いでプローブに結合されるポリマーマトリックスに包埋されるか、および／またはそれと結合する、上述のもの、スペクトル的に分解可能な量子ドット、金属ナノ粒子、ナノクラスターなど、およびその組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。上述のように、検出可能な部分は、それら自体が直接的に検出可能である必要はない。例えば、これらは、検出される基質上で作用してもよく、またはこれらは、検出可能になるために修飾を必要としてもよい。
【０２２４】
上記のように、種々の実施形態において、標識は複数の検出可能な部分からなる。これらの検出可能な部分から合わせたシグナルは、プローブを同定するために使用される色を産生する。例えば、特定の配列の「パープル」プローブは、そこに「ブルー」および「レッド」の検出可能な部分を結合することによって構築することができる。種々の実施形態において、明確な色は、同じ配列を有するが、異なる検出可能な部分で標識された２種のプローブを合わせて混合プローブを産生することによって生成することができる。従って、特定の配列の「パープル」プローブは、その配列を有する２種のプローブを構築することによって産生することができる。「レッド」検出可能部分は第１の種に結合され、「ブルー」検出可能部分は第２の種に結合される。これらの２つの種のアリコートが混合される。パープルの様々な色調が、異なる比率でアリコートを混合することによって産生可能である。このアプローチは多数の利点を提供する。第１に、より少数の検出可能な部分を使用して複数の区別できるプローブの産生を可能にする。第２に、混合プローブの使用は、特定の検出可能な部分と、特定のヌクレオチドの間の相互作用から生じ得る偏りの減少を補助し得る、ある程度の冗長性を提供し得る。
【０２２５】
種々の実施形態において、検出可能な部分は、ライゲーションおよび検出の後で検出可能な部分の除去を可能にする切断可能な結合によって、オリゴヌクレオチド伸長プローブ中のヌクレオチドに結合される。種々の異なる切断可能な結合のいずれかが使用され得る。本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドプローブ中の検出可能な部分およびヌクレオチドの状況において、「切断可能な結合」とは、ヌクレオチドに検出可能な部分を結合させ、所望される場合に、それが結合しているヌクレオチドまたは核酸分子を本質的に変化させることなく、ヌクレオチドから検出可能な部分を除去するように切断可能である、化学的部分をいう。切断は、結合の性質に依存して、例えば、酸もしくは塩基処理によって、または結合の酸化もしくは還元によって、または光処理によって（光切断）達成され得る。切断可能な結合および切断剤の例は、Ｓｈｉｒｎｋｕｓら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：２５９３−２５９７；Ｓｏｕｋｕｐら、１９９５，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．６：１３５−１３８；Ｓｈｉｍｉｋｕｓら、１９８６，ＤＮＡ  ５：２４７−２５５；ならびにＨｅｒｍａｎおよびＦｅｎｎ、１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８４：５８４−５８８に記載されている。より一般的には、「切断可能な結合」とは、２つの分子または実体を一緒に結合するために使用可能であり、かつ容易に切断可能であり、それによって、例えば、分子または実体の安定性と一致する条件下で、それらの構造を実質的に変化させることなく、分子または実体の分離を可能にする部分をいう。
【０２２６】
例えば、米国特許第６，５１１，８０３号に記載されているように、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などのチオール化合物還元剤を使用して、ジスルフィド結合を還元し、それによって切断することができる。結合体化のために利用可能であるスルフヒドリル（ＳＨ）基を有する蛍光団（例えば、ＳＨ基を有するシアニン５またはシアニン３蛍光団；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ−ＤｕＰｏｎｔ）が、反応性アリールアミノ基を有するヌクレオチド（例えば、ｄＣＴＰ）が同様に利用可能である。反応性ピリジルジチオールは、スルフヒドリル基と反応して、ジチオスレイトールなどの還元剤で切断可能なスルフヒドリル結合を与える。ＮＨＳ−エステルヘテロ二官能性架橋剤（Ｐｉｅｒｃｅ）は、反応性アリールアミノ基を含むデオキシヌクレオチドをピリジルジチオール基に結合するために使用することができ、次には、ＳＨまたは蛍光団と反応性であり、本教示の方法の種々の実施形態において有用である、ジスルフィド結合を有する、切断可能なヌクレオチド−蛍光団複合体を生じる。種々の実施形態において、ヌクレオチドと蛍光団の間のシス−グリコール結合は過ヨウ素酸によって切断できる。種々の切断可能な結合が、米国特許第６，６６４，０７９号および同第６，６３２，６５５号、米国出願公開２００３０１０４４３７、ＷＯ  ０４／１８４９７およびＷＯ  ０３／４８３８７に記載されている。
【０２２７】
種々の実施形態において、光（光退色）などの電磁エネルギーへの曝露によって検出不可能にされ得る検出可能な部分が使用される。
【０２２８】
例えば、切断可能な結合によってプローブに結合されている標識を有するか、または光退色され得る標識を有する伸長プローブを利用する種々の実施形態において、配列決定法は、典型的には、ライゲーションおよび標識検出が実施された後で、１サイクル以上の切断または光退色の工程を含む。上述のように、オリゴヌクレオチド伸長プローブに存在する切断可能な結合の切断は、完了まで進めなくてもよい（すなわち、新たにライゲーションしたプローブの１００％未満が、これらがライゲーションしたサイクル中で切断されてもよい）。このようなプローブは、一般的には、伸長可能でない末端を含むか、またはキャップされているので、これらは連続的サイクルには寄与しない。しかし、プローブの切断の失敗は、標識が、プローブがライゲーションされたテンプレート分子と結合したままであることを意味し、このことは、引き続くサイクルにおいてノイズを増加し得るバックグラウンドシグナル（すなわち、バックグラウンド蛍光）の一因となる。標識を除去するか、または標識を検出不能にするために、切断または光退色の工程を組み入れることは、このバックグラウンドを減少し、シグナル対ノイズ比を改善する。切断または光退色は、すべてのサイクルと同頻度で、またはより少ない頻度で、例えば、１回おき、３回に１回、または５回に１回、またはそれ以上のサイクルで実施することができる。種々の実施形態において、切断可能なリンカーの切断を達成するための任意のさらなる工程を実際に追加することは必要ではない。例えば、ＤＴＴなどの切断剤は、洗浄緩衝液中にすでに存在していてもよく、これは、ライゲーションされていない伸長プローブを除去するために使用され得る。
Ｇ．切断可能な結合
【０２２９】
本発明者らは、少なくとも１種のホスホロチオレート結合を有する伸長プローブが、伸長、ライゲーション、検出、および切断の連続サイクルによる配列決定のための方法の実施において特に有用であることを発見した。このような結合においては、ホスホジエステル結合の架橋酸素原子の１つが硫黄原子によって置き換えられている。ホスホロチオレート結合は、図４Ａに示されるような５’−Ｓ−ホスホロチオレート結合（３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’）または図４Ｂに示されるような３’−Ｓ−ホスホロチオレート結合（３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’）のいずれかであり得る。３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’または３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’として表される結合中のリン原子は、図４Ａおよび４Ｂに示されるように２つの架橋していない酸素原子に結合されてもよい（典型的なホスホジエステル結合と同様に）ことが理解される。種々の実施形態において、リン原子は、種々の他の原子または基のいずれか、例えば、Ｓ、ＣＨ３、ＢＨ３などに結合することができる。従って、種々の局面において、本教示は、ホスホロチオレート結合を含む、標識オリゴヌクレオチドプローブを提供する。プローブは、本明細書に記載される配列決定法における特定の用途を見い出す一方で、これらはまた、様々な他の目的のために使用されてもよい。例えば、種々の実施形態は、（ｉ）５’−Ｏ−Ｐ−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｎ）ｋＮＢ＊−３’型のオリゴヌクレオチド；および（ｉｉ）５’−ＮＢ＊（Ｎ）ｋ−Ｓ−Ｐ−Ｏ−Ｘ−３’型のオリゴヌクレオチドを提供する。これらの各々において、プローブＮは任意のヌクレオチドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能ではない部分を表し、＊は検出可能な部分を表し、Ｘはヌクレオチドを表し、そしてｋは、１から１００までの間である。種々の実施形態において、ｋは、１から５０までの間、１から３０までの間、１から２０までの間、例えば、４から１０までの間であり、但し、検出可能な部分が、ＮＢの代わりのまたはＮＢに追加する（Ｎ）ｋの任意のヌクレオチド上に存在するという条件である。これらのプローブのいずれかの末端ヌクレオチドは、リン酸基またはヒドロキシル基を含んでもよいし、含まなくてもよい、さらに、リン原子は、一般的には、種々の実施形態において、２つの付加的な（架橋していない）酸素原子に結合されることが理解される。
【０２３０】
５’−Ｓ−ホスホロチオレートまたは３’−Ｓ−ホスホロチオレート結合を含むオリゴヌクレオチドを合成するための方法は当該分野において公知であり、特定のこれらの方法が、自動固相オリゴヌクレオチド合成に受け入れ可能である。合成手順は、例えば、以下に記載されている：Ｃｏｏｋ，ＡＦ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，９２：１９０−１９５，１９７０；Ｃｈｌａｄｅｋ，Ｓ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，９４：２０７９−２０８４，１９７２；Ｒｙｂａｋｏｖ，ＶＮ，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９：１８９−２０１，１９８１；Ｃｏｓｓｔｉｃｋ，Ｒ．およびＶｙｌｅ，ＪＳ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ＣＨｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，９９２−９９２，１９８８；Ｍａｇ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９（７）；１４３７−１４４１，１９９１；Ｘｕ，Ｙ，およびＫｏｏｌ，ＥＴ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６（１３）：３１５９−３１６４，１９９８；Ｃｏｓｓｔｉｃｋ，Ｒ．およびＶｙｌｅ，ＪＳ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３０：４６９３−４６９６，１９８９；Ｃｏｓｓｔｉｃｋ，Ｒ．およびＶｙｌｅ，ＪＳ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：８２９−８３５，１９９０；Ｓｕｎ，ＳＧおよびＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉ，ＪＡ，Ｎｕｃｌ．Ｎｕｃｌ．，１６：１５４３−１５４５，１９９７；Ｓｕｎ  ＳＧ，ら、ＲＮＡ，３：１３５２−１３６３，１９９７；Ｖｙｌｅ，ＪＳ，ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３３：３０１７−３０２０，１９９２；Ｌｉ，Ｘ．，ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１：２１２３−２２１２９，１９９４；Ｌｉｕ，ＸＨおよびＲｅｅｓｅ，ＣＢ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，３７：９２５−９２８，１９９６；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ＬＢら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１８：１０３４１−１０３５０，１９９６；ならびにＳａｂｂａｇｈ，Ｇ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２（２）：４９５−５０１，２００４。さらに、本発明者らは、新規な合成法を開発した。例えば、図７は、ｄＡの３’−ホスホロアミダイトの合成スキームを示す。同様のスキームが、ｄＧの３’−ホスホロアミダイトの合成のために使用されてもよい。これらのホスホロアミダイトは、例えば、ＤＮＡ合成装置を使用して、プリンヌクレオチドと結合した３’−Ｓ−ホスホロチオレートを含むオリゴヌクレオチドを合成するために使用されてもよい。
【０２３１】
ホスホロチオレート結合は、種々の金属含有試薬を使用して切断することができる。金属は、例えば、Ａｇ、Ｈｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｚｎ、またはＣｄであり得る。種々の実施形態において、この試薬は、Ａｇ＋、Ｈｇ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｚｎ＋＋、またはＣｄ＋のアニオンを提供する水溶性の塩である（他の酸化状態のイオンを提供する塩もまた使用できる）。Ｉ２もまた使用可能である。種々の実施形態において、硝酸銀（ＡｇＮＯ３）などの銀を含有する塩またはＡｇ＋イオンを供給する他の塩が使用される。適切な条件には、例えば、５０ｍＭ  ＡｇＮＯ３、約２２〜３７℃で１０分間以上、例えば、３０分間が含まれる。種々の実施形態において、ｐＨは、４．０から１０．０の間、５．０から９．０の間、約６．０から８．０の間、および／または約７．０である。例えば、Ｍａｇ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９（７）：１４３７−１４４１，１９９１を参照のこと。例示的なプロトコルは実施例１に提供される。
【０２３２】
５’→３’方向の配列決定が、３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’結合を含む伸長プローブを使用して実施され得る。図５Ａは、５’−Ｏ−Ｐ−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−ＮＮＮＮＮＢ＊−３’型の伸長プローブを使用するハイブリダイゼーション、ライゲーション、および切断の単一サイクルを示し、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能ではない部分を表し（例えば、ＮＢは３’ヒドロキシル基を欠いているか、またはブロッキング部分が結合しているヌクレオチドである）、＊は検出可能な部分を表し、そしてＸは、その同一性が検出可能な部分に一致するヌクレオチドを表す。種々の実施形態において、多数のブロッキング部分のいずれかが、複数のライゲーションを妨害するように３’末端ヌクレオチドに結合可能である。例えば、ヌクレオチドの糖部分に、例えば、２’位または３’位にかさ高い基を結合することは、ライゲーションを妨害する。蛍光標識は、適切なかさ高い基として働き得る。
【０２３３】
未知の配列の結合領域４０およびポリヌクレオチド領域５０を含むテンプレートは、支持体、例えば、ビーズに結合される。種々の実施形態において、例えば、図５Ａを参照すると、結合領域は、支持体の結合点から反対のテンプレートの末端に位置する。伸長可能な末端（この場合、遊離の３’ＯＨ基）を有する初期化オリゴヌクレオチド３０は、結合領域４０にアニーリングされる。伸長プローブ６０は、ポリヌクレオチド領域５０でテンプレートにハイブリダイズする。ヌクレオチドＸは、テンプレート中の未知のヌクレオチドＹと相補的塩基対を形成する。伸長プローブ６０は、初期化オリゴヌクレオチドにライゲーションされる（例えば、Ｔ４リガーゼを使用する）。ライゲーション後、伸長プローブ６０に結合された標識が検出される（示さず）。標識は、ヌクレオチドＸの同一性に一致する。従って、ヌクレオチドＹは、ヌクレオチドＸに対して相補的であるヌクレオチドとして同定される。次いで、伸長プローブ６０は、ホスホロチオレート結合で切断され（例えば、ＡｇＮＯ３またはＡｇ＋イオンを供給する別の塩を使用する）、伸長二重鎖を生じる。切断は、伸長二重鎖の３’末端において、リン酸基を遊離する。ホスファターゼ処理を使用して、伸長二重鎖上で伸長可能なプローブ末端を生成する。このプロセスを、所望のサイクルの回数反復する。
【０２３４】
種々の実施形態において、３’→５’方向の配列決定が、３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’結合を含む伸長プローブを使用して実施され得る。図５Ｂは、５’−ＮＢ＊−ＮＮＮＮ−Ｓ−Ｐ−Ｏ−Ｘ−３’型の伸長プローブを使用するハイブリダイゼーション、ライゲーション、および切断の単一サイクルを示し、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能ではない部分を表し（例えば、ＮＢは５’リン酸基を欠いているか、またはブロッキング部分が結合しているヌクレオチドである）、＊は検出可能な部分を表し、そしてＸは、その同一性が検出可能な部分に一致するヌクレオチドを表す。
【０２３５】
未知の配列の結合領域４０およびポリヌクレオチド領域５０を含むテンプレートは、支持体、例えば、ビーズに結合される。種々の実施形態において、例えば、図５Ｂを参照すると、結合領域は、支持体の結合点から反対のテンプレートの末端に位置する。伸長可能な末端（この場合、遊離の５’リン酸基）を有する初期化オリゴヌクレオチド３０は、結合領域４０にアニーリングされる。伸長プローブ６０は、ポリヌクレオチド領域５０でテンプレートにハイブリダイズする。ヌクレオチドＸは、テンプレート中の未知のヌクレオチドＹと相補的塩基対を形成する。伸長プローブ６０は、初期化オリゴヌクレオチドにライゲーションされる（例えば、Ｔ４リガーゼを使用する）。ライゲーション後、伸長プローブ６０に結合された標識が検出される（示さず）。標識は、ヌクレオチドＸの同一性に一致する。従って、ヌクレオチドＹは、ヌクレオチドＸに対して相補的であるヌクレオチドとして同定される。次いで、伸長プローブ６０は、ホスホロチオレート結合で切断され（例えば、ＡｇＮＯ３またはＡｇ＋イオンを供給する別の塩を使用する）、伸長二重鎖を生じる。切断は、伸長二重鎖の５’末端において、伸長可能な一リン酸基を遊離し、それゆえに、伸長可能な末端を生成するために追加の工程を実施する必要はない。このプロセスを、所望のサイクルの回数反復する。
【０２３６】
このスキームの多数のバリエーションが使用可能であることが理解される。例えば、プローブは、６ヌクレオチドより短くてもまたは長いてもよく；標識は３’末端ヌクレオチド上にある必要はなく；Ｐ−Ｓ結合が任意の２つのヌクレオチド間に位置してもよいなどである。種々の実施形態において、伸長、ライゲーション、検出、および切断の連続サイクルは、隣接して位置するヌクレオチドの同定を生じる。しかし、伸長プローブの遠位末端（ライゲーションが起こる位置の反対側の末端）に近接してＰ−Ｓ結合を配置することによって、連続して同定されるヌクレオチドは、上記のように、および図１および６に示されるように、テンプレートに沿った間隔で間隔が空けられる。
【０２３７】
図６Ａ〜６Ｆは、単一のテンプレート上で連続的に実施される数回の配列決定反応のより詳細な模式図である。配列決定は、３’−Ｓ−Ｐ−５’結合を含む伸長プローブを使用して、３’→５’方向で実施される。各配列決定反応は、複数サイクルの伸長、ライゲーション、検出、および切断を含む。反応は、テンプレートの異なる部分に結合する初期化オリゴヌクレオチドを利用する。伸長プローブは８ヌクレオチド長であり、プローブの３’末端から数えて６番目と７番目の間に位置するホスホロチオレート結合を含む。ヌクレオチド２〜６は、各反応がテンプレートに沿った間隔で間隔の空いた複数のヌクレオチドの同定を可能にするように、スペーサーとして働く。一連の複数の反応を実施すること、および各反応から得られた部分的な配列情報を適切に合わせることによって、テンプレートの部分の完全な配列が決定される。
【０２３８】
図６Ａは、伸長可能な二重鎖を供給するために、テンプレート中のアダプター配列（上記ではアダプター領域と称する）にハイブリダイズされる第１の初期化オリゴヌクレオチド（図６Ａ〜６Ｆにおいてはプライマーと称する）を使用する初期化を示す。図６Ｂ〜６Ｄは、テンプレートのすべての６番目の塩基が読まれる、ヌクレオチド同定のいくつかのサイクルを示す。図６Ｂにおいて、テンプレート配列中の第１の未知のヌクレオチドに相補的な３’末端ヌクレオチドを有する第１の伸長プローブがテンプレートに結合し、プライマーの伸長可能な末端にライゲーションされる。伸長プローブに結合された標識は、３’末端ヌクレオチドとしてＡを有するプローブを同定し、従って、テンプレート配列中の第１の未知のヌクレオチドをＴと同定する。図６Ｃは、ホスホロチオレート結合におけるＡｇＮＯ３を用いる伸長オリゴヌクレオチドの切断、および標識が結合する伸長プローブの部分の遊離を示す。図６Ｄは、伸長、ライゲーション、および切断のさらなるサイクルを示す。プローブは５ヌクレオチド長のスペーサーを含むので、配列決定反応はテンプレート中のすべての６番目のヌクレオチドを同定する。
【０２３９】
所望の回数のサイクル後に、第１の初期化オリゴヌクレオチドを含む伸長鎖が取り除かれ、第１の初期化オリゴヌクレオチドが結合した部分とは異なる、結合領域の異なる部分に結合する第２の初期化オリゴヌクレオチドがテンプレートにハイブリダイズされる。図６Ｅは、初期化が第２の初期化オリゴヌクレオチドを用いて実施され、続いて、数サイクルのヌクレオチドの同定が行われる、第２の配列決定反応を示す。図６Ｆは、第３の初期化オリゴヌクレオチドを使用する初期化、続いて、数サイクルのヌクレオチドの同定を示す。第２の初期化オリゴヌクレオチドからの伸長は、第１の配列決定反応において同定されたヌクレオチドから異なる「フレーム」におけるすべての６番目の塩基の同定を可能にする。
【０２４０】
ホスホロチオレート結合を含む伸長プローブは種々の実施形態において使用されるが、種々の切断可能な結合が有利に利用されてもよい。例えば、天然に存在する核酸において見い出されるＯ−Ｐ−Ｏ結合に対する多数のバリエーションが知られている（例えば、Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，８：１１５７−１１７９，２００１を参照のこと）。Ｐ−Ｏ結合を含むそこに記載されている任意の構造は、切断可能なＰ−Ｓ結合を含むように修飾することができる。例えば、ＮＨ−Ｐ−Ｏ結合はＮＨ−Ｐ−Ｓ結合に変更することができる。
【０２４１】
種々の実施形態において、伸長プローブは、任意に、修飾剤によるトリガー残基の修飾後に、切断剤またはその組み合わせによる切断に対して核酸を感受性にさせるトリガー残基を含む。特に、本発明者らは、ＤＮＡ修復に関与する酵素が、伸長、ライゲーション、検出、および切断の連続サイクルによる配列決定のための方法の実施における使用のために有利な切断試薬であることを発見した。一般的に、伸長プローブにおける損傷した塩基または塩基が脱落した残基などのトリガー残基の存在は、任意に、ＤＮＡグリコシラーゼによる修飾後に、１種以上のＤＮＡ修復酵素による切断に対してプローブを感受性にする可能性がある。従って、ＡＰホスファターゼなどのＤＮＡ修復に関与する酵素による切断のための基質である結合を含む伸長プローブは、本開示において有用であり得る。ＤＮＡグリコシラーゼなどのＤＮＡ修復に関与する酵素による修飾のための基質である残基を含む伸長プローブもまた、本開示において有用であり得、ここで、この修飾は、ＡＰエンドヌクレアーゼによる切断に対してプローブを感受性にする。種々の実施形態において、伸長プローブは、塩基が脱落した残基を含み、すなわち、これは、プリンまたはピリミジン塩基を欠いている。塩基が脱落した残基と隣接するヌクレオシドの間の結合は、ＡＰエンドヌクレアーゼによる切断に対して感受性であり、従って、切断可能な結合である。種々実施形態において、塩基が脱落した残基は２’デオキシリボースを含む。種々の実施形態において、伸長プローブは損傷した塩基を含む。損傷した塩基は、ＤＮＡグリコシラーゼなどの、損傷した塩基を除去する酵素のための基質である。損傷した塩基の除去後、生じた塩基が脱落した残基と隣接するヌクレオシドの間の結合は、ＡＰエンドヌクレアーゼによる切断に対して感受性であり、従って、本明細書では、切断可能な結合であると見なされる。
【０２４２】
多くの異なるＡＰエンドヌクレアーゼが、本開示における切断剤として有用である。塩基が脱落した残基に隣接する結合を切断するメカニズムに基づいて、２つの主要なクラスのＡＰエンドヌクレアーゼが区別されてきた。Ｅ．ｃｏｌｉのエンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｎｄｏ  ＩＩＩ）およびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩ）ならびにヒトホモログｈＮＴＨｌ、ＮＥＩＬｌ、ＮＥＩＬ２、およびＮＥＩＬ３などのクラスＩ  ＡＰエンドヌクレアーゼは、ＡＰ残基の３’部位でＤＮＡを切断し、３’末端リン酸を有する５’部分および５’末端リン酸を有する３’部分を生じるＡＰリアーゼである。Ｅ．ｃｏｌｉのエンドヌクレアーゼＩＶ（Ｅｎｄｏ  ＩＶ）およびエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｘｏ  ＩＩＩ）などのクラスＩＩ  ＡＰエンドヌクレアーゼは、ＡＰ部位のＤＮＡ  ５’を切断し、これは、得られるフラグメントの末端において３’ＯＨおよび５’デオキシリボースリン酸部分を生じる。クラスＩおよびクラスＩＩ  ＡＰエンドヌクレアーゼ、ならびにこれらがＤＮＡから損傷した塩基を除去し、および／または塩基が脱落した残基を含むＤＮＡを切断する条件のさらなる議論については、例えば、Ｄｏｕｂｌｉｅ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１（２８），１０２８４−１０２８９，２００４；Ｈａｌｔｉｗａｎｇｅｒ，Ｂ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，３４５，８５−８９，２０００；Ｌｅｖｉｎ，Ｊ．およびＤｅｍｐｌｅ，Ｂ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ，１８（１７），１９９０ならびに前述のすべての参考文献を参照のこと。当業者は、これらの酵素の種々のホモログが、他の生物（例えば、酵母）に存在し、本開示において有用であり得ることを理解している。
【０２４３】
特定の酵素は、これらが、損傷した塩基を除去してＡＰ残基を生成するグリコシラーゼ活性を有することと、グリコシラーゼ活性によって生成したＡＰ部位に対して３’であるホスホジエステルバックボーンを切断するリアーゼ活性もまた示すことの両方の点で二機能性である。従って、これらの二重活性酵素は、ＡＰエンドヌクレアーゼとＤＮＡグリコシラーゼの両方である。例えば、Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩは、Ｎ−グリコシラーゼとＡＰ−リアーゼの両方として作用する。Ｎ−グリコシラーゼ活性は、二本鎖ＤＮＡから損傷したピリミジンを遊離し、プリンが脱落した（ＡＰ部位）を生成する。ＡＰ−リアーゼ活性は、ＡＰ部位に対して３’および５’を切断して、５’リン酸および３’リン酸を遊離する。エンドヌクレアーゼによって認識され、除去される損傷した塩基には、尿素、５，６−ジヒドロキシチミン、チミングリコール、５−ヒドロキシ−５−ヒダントン、ウラシルグリコール、６−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロチミン、およびメチルタートロニルウレアが含まれる。例えば、Ｄｉｚｄａｒｏｇｌｕ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，１２１０５−１２１１１，１９９３、およびＨａｔａｈｅｔ，Ｚ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１８８１４−１８８２０，１９９４；Ｊｉａｎｇ，Ｄ．，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（５１），３２２２０−３２２２９，１９９７；Ｊｉａｎｇ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔ．，１７９（１１），３７７３−３７８２，１９９７を参照のこと。
【０２４４】
Ｆｐｇ（ホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ）（８−オキソグアニン  ＤＮＡグリコシラーゼとしてもまた知られる）もまた、Ｎ−グリコシラーゼとＡＰ−リアーゼの両方として作用する。Ｎ−グリコシラーゼ活性は、二本鎖ＤＮＡから損傷したプリンを遊離し、プリンが脱落した（ＡＰ部位）を生成する。ＡＰ−リアーゼ活性は、ＡＰ部位に対して３’および５’を切断し、それによって、ＡＰ部位を除去し、１塩基のギャップを残す。Ｆｐｇによって認識されかつ除去される損傷したいくつかの塩基には、７，８−ジヒドロ−８−オキソグアニン（８−オキソグアニン）、８−オキソアデニン、Ｆａｐｙ−グアニン、ｍｅｔｈｙ−ｆａｐｙ−グアニン、ｆａｐｙ−アデニン、アフラトキシンＢ１−ｆａｐｙ−グアニン、５−ヒドロキシ−シトシン、および５−ヒドロキシ−ウラシルが含まれる。例えば、Ｔｃｈｏｕ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１５３１８−１５３２４，１９９４；Ｈａｔａｈｅｔ，Ｚ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１８８１４−１８８２０，１９９４；Ｂｏｉｔｅｕｘ，Ｓ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，５，３１７７−３１８３，１９８７；Ｊｉａｎｇ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（５１），３２２２０−３２２２９，１９９７；Ｊｉａｎｇ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔ．，１７９（１１），３７７３−３７８２，１９９７を参照のこと。
【０２４５】
多数のＡＰエンドヌクレアーゼおよびＡＰエンドヌクレアーゼが、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡから市販されている。
【０２４６】
種々の実施形態において、ＡＰエンドヌクレアーゼによる切断のための基質である部位を含む伸長プローブが、ホスホロチオレート結合を含む伸長プローブのための上記のような配列決定法において、または配列決定法ＡＢ（以下を参照のこと）において使用される。これらの方法のいずれかにおいて、成長している核酸鎖への伸長プローブのライゲーション後に、伸長プローブは、ＡＰエンドヌクレアーゼを使用して切断され、標識を含むプローブの部分を除去する。
【０２４７】
特定のＡＰエンドヌクレアーゼに依存して、および配列決定が３’→５’方向で実施されるかまたは５’→３’方向で実施されるかに依存して、伸長した二重鎖上の伸長可能なプローブ末端を生成するために、切断後にポリヌクレオチドキナーゼまたはホスファターゼで伸長した二重鎖を処理することが必要であり得るか、または所望され得る（伸長可能なプローブ末端の描写については図５Ａおよび５Ｂを参照のこと）。従って、本発明の方法の種々の実施形態において、伸長可能な末端は、ポリヌクレオチドキナーゼまたはホスファターゼを用いる処理によって生成される。当業者は、適切な緩衝液が種々の酵素のために利用され、さらなる洗浄の工程が、酵素を除去するために含まれてもよく、これらの方法において次の工程のための適切な条件を提供することを理解している。
【０２４８】
種々の実施形態において、伸長可能なプローブは、ＤＮＡグリコシダーゼによる除去のための基質である損傷した塩基を含む。広範な細部傷害性および変異原性のＤＮＡ塩基が異なるＤＮＡグリコシラーゼによって除去され、これは、ＤＮＡへの損傷後の塩基切除修復経路を開始する（Ｋｒｏｋａｎ，Ｈ．Ｅ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，３２５（Ｐｔ  １）：１−１６，１９９７）。ＤＮＡグリコシラーゼは、損傷した塩基とデオキシリボースの間のＮ−グリコシド（ｇｌｙｃｏｓｙｄｉｃ）結合を切断し、従って、遊離の塩基を放出し、プリンが脱落した／ピリミジンが脱落した（ＡＰ）部位を残す。種々の実施形態において、伸長プローブはウラシル残基を含み、これは、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）によって除去される。ＵＤＧは、現在までに研究されたすべての生物において見い出されており、これらの酵素の多数のメンバーが当該分野において公知であり、本教示において有用であり得る（Ｆｒｅｄｅｒｉｃａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９，２３５３−２５３７，１９９０；Ｋｒｏｋａｎ、前出）。例えば、哺乳動物細胞は、少なくとも４種類の型のＵＤＧを含む：ミトコンドリアＵＮＧ１および核ＵＮＧ２、ＳＭＵＧ１、ＴＤＧ、およびＭＢＤ４である（Ｋｒｏｋａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，８９３５−８９４８，２００２）。ＵＮＧ１およびＵＮＧ２は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｕｎｇによって代表される高度に保存性のファミリーに属する。
【０２４９】
伸長プローブが損傷した塩基を含む種々の実施形態において、伸長可能なプローブ末端への伸長プローブのライゲーション後に、伸長した二重鎖は、損傷した塩基を除去するグリコシラーゼと接触され、それによって、塩基が脱落した残基を産生する。グリコシラーゼによる除去に供される損傷した塩基を含む伸長プローブは、「切断可能な結合を含むように容易に修飾可能である」と見なされている。次いで、伸長した二重鎖は、ＡＰエンドヌクレアーゼと接触され、これは、上記のように、塩基が脱落した残基と、隣接するヌクレオシドの間の結合を切断する。種々の実施形態において、ＤＮＡグリコシラーゼとＡＰエンドヌクレアーゼの両方である二重活性酵素が、これらの両方の反応を実施するために使用される。種々の実施形態において、損傷した塩基を含む伸長した二重鎖は、ＤＮＡグリコシラーゼおよびＡＰエンドヌクレアーゼと接触される。これらの酵素は、種々の実施形態において、組み合わせて、または連続的に（すなわち、グリコシラーゼ、続いて、エンドヌクレアーゼ）使用することができる。
【０２５０】
種々の実施形態において、伸長プローブは、デオキシイノシンであるトリガー残基を含む。上記と同様に、デオキシイノシン３’エンドヌクレアーゼとも呼ばれる、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）、およびそのホモログは、デオキシイノシン残基に対して３’である第２のホスホジエステル結合においてデオキシイノシンを含む核酸を切断し、３’ＯＨおよび５’リン酸末端を残す。従って、この結合は、伸長プローブ中で切断可能な結合として働く。Ｅｎｄｏ  Ｖおよびその切断特性は当該分野において公知である（Ｙａｏ，Ｍ．およびＫｏｗ  Ｙ．Ｗ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，３０６７２−３０６７３（１９９６）；Ｙａｏ，Ｍ．およびＫｏｗ  Ｙ．Ｗ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２８６０９−２８６１６（１９９５）；Ｈｅ，Ｂ．ら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，４５９，１０９−１１４（２０００））。デオキシイノシンに加えて、Ｅｎｄｏ  Ｖはまた、デオキシウリジン、デオキシキサントシン、およびデオキシオキサノシンも認識する（Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ，Ｔ．ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２（１３），３２（１３）（２００４））。ｍＥｎｄｏ  Ｖなどの哺乳動物ホモログもまた、切断活性を示す（Ｍｏｅ，Ａ．ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１（１４），３８９３−３９００（２００４））。Ｅｎｄｏ  Ｖは、種々の実施形態において、デオキシイノシンを含むプローブのための切断剤として使用されるが、他の切断試薬もまた、デオキシイノシンを含むプローブを切断するために使用され得る。例えば、損傷した塩基として、ヒポキサンチンが適切なＤＮＡグリコシラーゼによる除去に供されてもよく、次いで、塩基が脱落した残基を含む、得られる伸長プローブは、エンドヌクレアーゼによる切断に供される。
【０２５１】
デオキシイノシンがトリガー残基として使用される場合、プローブ中の別の箇所、特に、伸長可能なプローブ末端にライゲーションされる末端と、トリガー残基の間の位置にあるデオキシイノシンの使用を回避することが望ましくあり得ることが理解される。従って、プローブが１つ以上のユニバーサル塩基を含む場合、デオキシイノシン以外のヌクレオシドが使用されてもよい。トリガー残基を含む核酸を、特定の切断剤による切断に対して感受性にするトリガー残基が伸長プローブ中で使用される場合、同じ切断剤による切断を誘発する他の残基をプローブ中に（またはその伸長プローブとともに配列決定反応において使用される他のプローブ中に）含めることを回避することが望ましくあり得ることもまた理解される。
【０２５２】
トリガー残基を含む核酸を切断する任意の酵素の使用が、本教示の種々の実施形態において提供される。さらなる酵素が、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標），Ｉｎｃ．などの酵素の供給業者のカタログを熟読することによって同定され得る。Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ、２００５版（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ  ０１９３８−２７２３）は、参照により本明細書に援用され、本発明の方法は、そこに開示されている、トリガー残基を含む核酸を切断する任意の酵素、またはこのような酵素のホモログの使用を意図する。他の有用な酵素には、例えば、ｈＯＧＧ１およびそのホモログが含まれる（Ｒａｄｉｃｅｌｌａ，ＪＰら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４（１５）：８０１０−５，１９９７）。
【０２５３】
損傷した塩基、塩基が脱落した残基などのトリガー残基を含むオリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該分野において公知である。ＡＰエンドヌクレアーゼの基質である部位を含むオリゴヌクレオチド、例えば、塩基が脱落した残基を含むオリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該分野において公知であり、一般的に、自動固相オリゴヌクレオチド合成装置に受け入れ可能である。種々の実施形態において、塩基が脱落した残基の所望の位置においてウリジンを含むオリゴヌクレオチドが合成される。次いで、オリゴヌクレオチドは、ウラシルを除去するＵＤＧなどの酵素で処理され、それによって、オリゴヌクレオチド中でウリジンがどこに存在しても、塩基が脱落した残基を産生する。
【０２５４】
種々の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、Ｎａｕｗｅｌａｅｒｔｓ，Ｋ．ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，３１（２３），２００３に記載されるようなジサッカリドヌクレオシドを含む。ライゲーション後、伸長した二重鎖は、過ヨウ素酸（ＮａＩＯ４）を使用して切断され、続いて、塩基（例えば、ＮａＯＨ）を用いる処理を行い、遊離の３’ＯＨおよびＰＳ−ＯＰＯ３Ｈ２基を生じる。配列決定が、３’→５’で実施されるかまたは５’→３’で実施されるかに依存して、伸長可能な末端を生成するために、ポリヌクレオチドキナーゼまたはホスファターゼを用いて伸長した二重鎖を処理することが必要であり得るか、または所望され得る。種々の実施形態において、伸長可能な末端は、ポリヌクレオチドキナーゼまたはホスファターゼを用いる処理によって生成される。
【０２５５】
ジサッカリドを含むポリヌクレオチドは、塩基が脱落した残基を含むと見なされている。例えば、１つのヌクレオチドの３’ＯＨと、次のヌクレオチドの５’リン酸基の間に挿入されたリボース残基を含むポリヌクレオチドは、塩基が脱落した残基を含むと見なされている。
キャッピング
【０２５６】
ある場合において、伸長可能な末端を有するプローブのすべてよりも少ないプローブが、伸長、ライゲーション、および切断の各サイクルにおいて首尾よいライゲーション反応に関与する。このようなプローブが後に続くサイクルに関与するのであれば、各ヌクレオチド同定工程の正確さは徐々に減少することが理解される。本発明者らは、ホスホロチオレート結合を含む伸長プローブの使用が、高い効率でライゲーションを可能にすることを示してきたので、種々の実施形態において、将来のサイクルに関与することからライゲーションを受けないこれらの伸長可能な末端を保護するために、キャッピング工程が含まれる。３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’ホスホロチオレート結合を含む伸長プローブを使用する５’→３’方向で配列決定の場合、キャッピングは、例えば、ライゲーションまたは検出工程の後で、ＤＮＡポリメラーゼおよび伸長可能でない部分、例えば、ジデオキシヌクレオチドまたはブロッキング部分が結合しているヌクレオチドなどの鎖終始ヌクレオチドを用いて、ライゲーションしていない伸長可能な末端を伸長することによって実施されてもよい。３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’ホスホロチオレート結合を含む伸長プローブを使用する３’→５’方向で配列決定の場合、キャッピングは、例えば、ライゲーションまたは検出の後で、ホスファターゼでテンプレートを処理することによって実施されてもよい。他のキャッピング方法もまた使用されてもよい。
Ｈ．オリゴヌクレオチドプローブファミリーを使用する配列決定
【０２５７】
「方法Ａ」と集合的に呼ばれる上記の配列決定法において、任意の特定の伸長プローブに結合された標識と、プローブの近位末端（すなわち、伸長された二重鎖の伸長可能なプローブ末端にライゲーションされる末端）における１つ以上のヌクレオチドの同定との間に、直接的かつ公知の対応が存在している。それゆえに、新たにライゲーションされた伸長プローブの標識を同定することは、テンプレート中の１つ以上のヌクレオチドを同定するために十分である。種々の局面において、「方法ＡＢ」と集合的に呼ばれる配列決定法が提供され、これもまた、伸長、ライゲーション、および、種々の実施形態において、ヌクレオチドの同定に異なるアプローチを採用する、切断を含む。
【０２５８】
種々の実施形態において、少なくとも２種の区別可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブファミリーのコレクションを使用する、配列決定法ＡＢが提供される。各プローブファミリーは、標識、例えば、「レッド」、「ブルー」、「イエロー」、「グリーン」に基づく名称が割り当てられている。上記の方法と同様に、伸長は、初期化ヌクレオチドとテンプレートによって形成された二重鎖から開始する。初期化オリゴヌクレオチドは、その末端にオリゴヌクレオチドプローブをライゲーションすることによって伸長されて、伸長した二重鎖を形成し、次いで、これは、首尾よいライゲーションのサイクルによって反復して伸長される。プローブは、末端の位置に（二重鎖の成長している核酸鎖にライゲーションされるヌクレオチドから反対側のプローブの末端において）伸長可能でない部分を有し、その結果、単一のサイクルにおいて、伸長した二重鎖の単一の伸長のみが起こる。各サイクルの間、首尾よくライゲーションされたプローブ上のまたはそれに結合した標識が検出され、伸長可能でない部分は、伸長可能な末端を生成するために、除去または修飾される。標識の検出は、プローブが属するプローブファミリーの名称を同定する。
【０２５９】
伸長、ライゲーション、および検出の首尾よいサイクルは、順序付けられた一連の標識名を生じる。標識は、連続する位置においてテンプレートにハイブリダイズする、首尾よくライゲーションしたプローブが属するプローブファミリーに対応する。これらのプローブは、ライゲーションの後で、テンプレート中の異なるヌクレオチドの反対側に位置する近位末端を有する。従って、プローブのファミリー名の順序と、テンプレート中のヌクレオチドの順序の間には対応がある。
【０２６０】
例えば、切断可能な結合が、伸長プローブ中の近位のヌクレオシドと、隣接するヌクレオシドの間に位置している、種々の実施形態において、プローブファミリー名の順序立てたリストが、伸長、ライゲーション、検出、および単一の初期化オリゴヌクレオチドから開始する切断の連続サイクルによって得られてもよい。なぜなら、伸長したオリゴヌクレオチドプローブは、各サイクルにおいて１つのヌクレオチドによって伸長されるからである。切断可能な結合が他の２つのヌクレオシド間に位置している場合、プローブファミリー名の順序立てたリストが、複数の配列決定反応から得られた結果から集められ、ここで、結合反応中に異なる位置にハイブリダイズする初期化オリゴヌクレオチドが、配列決定法Ａについて記載されたのと同様に、使用される。
【０２６１】
新たにライゲーションされたプローブが属するプローブファミリーがどれであるかを知ることは、テンプレート中のヌクレオチドの同一性を決定するためには、それ自体で十分ではない。その代わりに、プローブファミリー名を決定することは、プローブの少なくとも一部の配列についての可能性として、ヌクレオチドの特定の組み合わせを除外するが、各ヌクレオチドの同一性についての少なくとも２つの可能性は放置している。従って、追加の情報の非存在下でのプローブファミリー名の知見は、新たにライゲーションされたプローブ中のヌクレオチドに対して反対側の位置に配置されているテンプレート中のヌクレオチドの同一性について、少なくとも２つの可能性を開いたままにする。従って、伸長、ライゲーション、検出、（および任意に、切断）の任意の単一サイクルは、それ自体が、テンプレート中の任意のヌクレオチドを同定するのではない。しかし、これは、テンプレートについての１つ以上の可能性のある配列の除外を可能にし、それによって、配列に関する情報を提供する。種々の実施形態において、以下に記載されるようなプローブまたはプローブファミリーの適切な設計を用いて、テンプレートの配列は、なお決定することができる。種々の実施形態において、従って、配列決定法ＡＢは２つの相を含む：プローブファミリー名の順序立てたリストが得られる第１の相、およびテンプレートの配列を決定するために順序立てたリストを解読する第２の相である。
【０２６２】
他に示されない限り、配列決定法ＡおよびＡＢは、一般的に、プローブを合成するため、テンプレートを調製するため、ならびに伸長、ライゲーション、および検出の工程を実施するために、同様の方法を利用する。
配列決定法ＡＢのためのオリゴヌクレオチド伸長プローブおよびプローブファミリーの特徴
【０２６３】
配列決定法ＡＢにおける使用のためのプローブファミリーは、各プローブファミリーが、異なる配列の複数の標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含み、そして配列中の各位置において、プローブファミリーは、その位置において異なる塩基を有する少なくとも２つのプローブを含むという点で特徴付けられる。各プローブファミリー中のプローブは同じ標識を含む。種々の実施形態において、プローブは、切断可能なヌクレオシド間の結合を含む。この切断可能な結合は、プローブ中の任意の場所に位置することが可能である。種々の実施形態において、プローブは、一方の末端においてリガーゼによって伸長可能でない部分を有する。種々の実施形態において、プローブは、切断可能な結合と、リガーゼによって伸長可能でない部分の間の位置において標識され、その結果、伸長可能なプローブ末端へのプローブのライゲーション後の切断可能な結合の切断は、伸長可能なプローブ末端にライゲーションされる未標識部分、および未標識部分にはもはや結合しない標識部分を生じる。
【０２６４】
種々の実施形態において、各プローブファミリーにおけるプローブは、少なくともｊ個のヌクレオシドＸを含み、ここで、ｊは少なくとも２であり、各Ｘは、プローブファミリーの中のプローブの間で少なくとも２倍の縮重である。各プローブファミリーにおけるプローブは、少なくともｋ個のヌクレオシドＮをさらに含み、ここでｋは少なくとも２であり、Ｎは任意のヌクレオシドを表す。一般的に、ｊ＋ｋは、１００またはそれ以下であり、典型的には、３０以下である。ヌクレオシドＸはプローブ中のどこでも位置することができる。ヌクレオシドＸは連続する位置に局在する必要はない。同様に、ヌクレオシドＮは、連続する位置に局在する必要はない。換言すれば、ヌクレオシドＸおよびＮは散在可能である。それにも関わらず、ヌクレオシドＸは５’→３’配列を有すると見なすことができ、ヌクレオシドが連続的である必要はないという理解を伴う。例えば、構造ＸＡＮＸＧＮＮＸＣＮのプローブ中のヌクレオシドＸは、配列ＡＧＣを持っていると見なされる。同様に、ヌクレオシドＮは１つの配列を有すると見なすことができる。
【０２６５】
ヌクレオチドＸは、同一でありまたは異なり得るが、独立して選択されない。すなわち、各Ｘの同一性は、プローブ中の他の１つ以上のヌクレオシドＸの同定により制限されている。従って、一般的には、ヌクレオシドＸの特定の組み合わせのみが、任意の特定のプローブ中に、および任意の特定のプローブファミリーのプローブの中に存在している。換言すれば、各プローブにおいて、ヌクレオシドＸの配列は、長さｊのすべての可能な配列のサブセットを表すことができるのみである。従って、Ｘの１つ以上のヌクレオチドの同定は、他のヌクレオシドの１つ以上について可能性のある同一性を制限する。
【０２６６】
種々の実施形態において、ヌクレオシドＮは、独立して選択され、かつＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴ（または任意に、縮重度の減少したヌクレオチド）であり得る。種々の実施形態において、ヌクレオシドＮの配列は、１つ以上のＮが縮重度の減少したヌクレオチドであること以外は、長さｋのすべての可能な配列を表す。従って、プローブは２つの部分を含み、そのうち、ヌクレオシドＮからなる部分は非制約部分と呼ばれ、ヌクレオシドＸからなる部分は制約部分と呼ばれる。上記の通り、これらの部分は、連続するヌクレオシドを必要とはしない。制約部分および非制約部分を含むプローブは、本明細書では、部分的に制約されたプローブと呼ばれる。種々の実施形態において、制約部分中の１つ以上のヌクレオシドが、プローブの近位末端、すなわち、伸長可能なプローブ末端にライゲーションされるヌクレオシドを含む末端にあり、これは、オリゴヌクレオチドプローブの５’または３’のいずれかの末端であり得る。
【０２６７】
任意のオリゴヌクレオチドプローブの制約部分は特定の配列のみを有することができるので、プローブの制約部分における１つ以上のヌクレオシドの同一性を知ることは、１つ以上の他のヌクレオシドに関する情報を提供する。この情報は、１つ以上の他のヌクレオシドを正確に同定するために十分であるかもしれないし、そうでないかもしれないが、これは、制限部分における１つ以上の他のヌクレオシドの同定のために１つ以上の可能性を除去するためには十分である。配列決定法ＡＢの特定の種々の実施形態において、プローブの制約部分における１つのヌクレオシドの同一性を知ることは、制約部分における他のヌクレオシドの各々を正確に同定するために、すなわち、制約部分を含むヌクレオシドの同一性および順序を決定するために十分である。
【０２６８】
上述したシークエンシング方法においてのように、鋳型に相補的である伸長プローブ中のもっとも近位のヌクレオチドは、（伸長、ライゲーションおよび検出の第一サイクルにおいて）開始オリゴヌクレオチドの伸長可能末端に、そして、続く伸長、ライゲーションおよび検出のサイクルにおいて、伸長したオリゴヌクレオチドプローブの伸長可能末端にライゲートされる。検出によって、新たにライゲートされたプローブが属するプローブファミリー名が決定される。プローブの拘束部分中の各位置が、少なくとも二重縮重であるので、プローブファミリー名は、それ自身内で、拘束部位における任意のヌクレオチドを同定はしない。しかしながら、拘束部位の配列が、長さｊの全ての可能性のある配列のサブセットの１つであるので、プローブファミリーを同定することは、拘束部位の配列に対するある可能性を排除する。プローブの拘束部位は、その配列決定部位を構成する。したがって、それが属するプローブファミリーを同定することによって、プローブの拘束部位中の１つまたはそれ以上のヌクレオシドの同定のために、１つまたはそれ以上の可能性を削除することは、伸長プローブがハイブリッド結合する鋳型中のヌクレオチドの同定のための１つまたはそれ以上の可能性を削除する。種々の実施様態において、部分的に拘束されたプローブは、任意の２つのヌクレオシド間に、切断可能な結合を含む。
【０２６９】
種々の実施様態において、部分的に拘束されたプローブは、一般構造（Ｘ）ｊ（Ｎ）ｋを有し、式中Ｘはヌクレオシドを表し、（Ｘ）ｊは、異なる塩基対特異性を有する少なくとも２つのヌクレオシドのいずれかであり得るように、各位置で少なくとも二重縮重であり、Ｎは任意のヌクレオシドを意味し、ｊは少なくとも２、ｋは１〜１００の間であり、そして少なくとも１つのＮ、またはプローブ末端でのＸ以外のＸは検出可能部分を含む。種々の実施様態において、各プローブ中、（Ｎ）ｋ中の１つまたはそれ以上の位置が、縮重減少ヌクレオチドによって占有されうることを除いて、（Ｎ）ｋは長さｋのすべての可能性のある配列を表すことができるように、（Ｎ）ｋは独立して、各位置にて四重縮重であり、（Ｘ）ｊ中のヌクレオシドは、同一であるか、または異なるが、独立して選択はされない。言い換えると、各プローブ中、（Ｘ）ｊは長さｊの全ての可能性のある配列のサブセットを表すことのみ可能である。したがって、（Ｘ）ｊ中の１つまたはそれ以上のヌクレオチドの同一性は、他のヌクレオシドの１つまたはそれ以上に関する可能な同一性を制限する。したがって、プローブは、（Ｎ）ｋが非拘束部位であり、（Ｘ）ｊが拘束部位である、２つの部位を含む。
【０２７０】
特定の種々の実施様態において、部分的に拘束されたプローブは、構造５’−（Ｘ）ｊ（Ｎ）ｋＮＢ＊−３’または３’−（Ｘ）ｊ（Ｎ）ｋＮＢ＊−５’を有し、式中、検出可能な部分が、ＮＢの代わりに、または加えて、プローブ末端でのＸではない任意のヌクレオチドＸまたはＮ上に存在しうるという条件で、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能ではない部分を表し、＊は検出可能部分を表し、（Ｘ）ｊは、各位置において、少なくとも二重縮重である、プローブの拘束部分であり、（Ｘ）ｊ中のヌクレオシドは、同一であるか、または異なりうるが、独立して選択はされず、少なくとも１つのヌクレオシド間結合が切断可能な結合であり、ｊは少なくとも２、およびｋは１〜１００の間である。切断可能な結合は、（Ｘ）ｊ中の２つのヌクレオシド間、（Ｘ）ｊ中のもっとも遠位なヌクレオチド間、および（Ｎ）ｋ中のもっとも近位ヌクレオシド、（Ｎ）ｋ内のヌクレオシド間、または（Ｎ）ｋおよびＮＢ中の末端ヌクレオシド間でありうる。種々の実施様態において、切断可能な結合は、ホスホロチオレート結合である。
【０２７１】
またさらに種々の実施様態において、プローブは、構造５’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−３’または３’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−５’を有し、式中、検出可能部分が、ＮＢの代わりに、または加えて、プローブ末端でのＸ以外の任意のヌクレオチドＸまたはＮ上に存在しうるという条件で、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ＮＢは、リガーゼによって伸長可能ではない部分を表し、＊は検出可能部位を表し、ＸＹは、ＸおよびＹが、同一であるか、または異なるが、独立して選択されはしないヌクレオシドを表すプローブの拘束部位であり、ＸおよびＹは少なくとも二重縮重であり、少なくとも１つのヌクレオシド間結合は切断可能な結合であり、ｋは１〜１００両端を含む間である。種々の実施様態において、切断可能な結合はホスホロチオレート結合である。構造５’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−３’を有するプローブは、５’→３’方向でのシークエンシングのために利用される。構造３’−（ＸＹ）（Ｎ）ｋＮＢ＊−５’を有するプローブは、３’→５’方向でのシークエンシングのために利用される。
【０２７２】
プローブの種々の実施様態の構造は、以下のようにさらに詳細に表わされる。５’→３’方向でのシークエンシングのために、式中、検出可能部分が、ＮＢの代わりに、または加えて、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上に存在しうるという条件で、Ｎが任意のヌクレオチドを表し、ＮＢがリガーゼによって伸長可能ではない部分を表し、＊が検出可能な部分を表し、（Ｘ）ｊが、各位置にて少なくとも二重縮重であるプロ―ブの拘束された部位であり、（Ｘ）ｊ中のヌクレオシドが、同一であるか、または異なりうるが、独立して選択はされえず、ｊは少なとも２、（ｋ＋ｉ）は１〜１００の間、ｋは１〜１００の間、ｉは０〜９９の間である、構造５’−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ（Ｎ）ｋ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｎ）ｊＮＢ＊−３’を有する部分的に拘束プローブ。種々の実施様態において、（Ｘ）ｊは、ＸおよびＹが少なくとも二重縮重であり、同一であるか、または異なるが、独立して選択されないヌクレオチドを表す、（ＸＹ）である。種々の実施様態において、ｉは０である。
【０２７３】
種々の実施様態において、５’→３’方向でのシークエンシングのためのプローブは、構造５’−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｎ）ｉＮＢ＊−３’を有し、式中、検出可能部分が、ＮＢの代わりに、または加えて、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上に存在しうるという条件で、Ｎは任意のヌクレオシドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能ではない部分を表し、＊は検出可能部分を表し、（Ｘ）ｊは、各位置で少なくとも二重縮重であるプローブの拘束された部位であり、（Ｘ）ｊ中のヌクレオチドは、同一であるか、または異なりうるが、独立して選択されず、ｊは少なくとも２、ｉは１〜１００の間である。種々の実施様態において、（Ｘ）ｊは（ＸＹ）であり、そこで位置ＸおよびＹは少なくとも二重縮重であり、ＸおよびＹは同一であるか、または異なるが、独立して選択されないヌクレオシドを表す。種々の実施様態において、５’→３’方向でのシークエンスのためのプローブは、構造５’−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｘ）ｋ（Ｎ）ｉＮＢ＊−３’を有し、式中、検出可能部分が、ＮＢの代わりに、または加えて、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上に存在しうるという条件で、Ｎはヌクレオシドを表し、ＮＢはリガーゼによって伸長可能ではない部分を表し、＊は検出可能部分を表し、（Ｘ）ｊ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｘ）ｋは、各位置にて少なくとも二重縮重であるプローブの拘束された部位であり、（Ｘ）ｊ−Ｏ−Ｐ−Ｓ−（Ｘ）ｋ中の位置は、少なくとも二重縮重であり、同一であるか、または異なりうるが、独立して選択はされず、ｊおよびｋは両方少なくとも１であり、（ｊ＋ｋ）は少なくとも２（たとえば２、３、４または５）であり、ｉは１〜１００の間である。種々の実施様態において、ｊおよびｋは両方１である。
【０２７４】
３’→５’方向でのシークエンシングのために、式中、検出可能部分が、ＮＢの代わりに、または加えて、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上に存在しうるという条件で、Ｎが任意のヌクレオシドを表し、ＮＢがリガーゼによって伸長可能ではない部分を表し、＊が検出可能部分を表し、（Ｘ）ｊは、各位置で少なくとも二重縮重であるプローブの拘束された部位であり、（Ｘ）ｊ中のヌクレオシドが同一であるか、または異なりうるが、独立して選別されず、ｊが少なくとも２、（ｋ＋ｉ）が１〜１００の間、ｋが１〜１００の間、およびｉが０〜９９の間である、構造５’−ＮＢ＊（Ｎ）ｉ−Ｓ−Ｐ−Ｏ−（Ｎ）ｋ−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ−３’を有する部分的に拘束されたプローブ。種々の実施様態において、（Ｘ）ｊは、ＸおよびＹが少なくとも二重縮重であり、同一であるか、または異なるが、独立して選択されないヌクレオシドを表す、（ＸＹ）である。種々の実施様態において、ｉは０である。
【０２７５】
種々の実施様態において、３’→５’方向でのシークエンシングのためのプローブは、構造５’−ＮＢ＊（Ｎ）ｉ−Ｓ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ−３’を有し、式中、検出可能部分が、ＮＢの代わりに、または加えて、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上に存在しうるという条件で、Ｎが任意のヌクレオシドを表し、ＮＢがリガーゼによって伸長可能ではない部分を表し、＊が検出可能部分を表し、（Ｘ）ｊは、各位置で少なくとも二重縮重であるプローブの拘束された部位であり、（Ｘ）ｊ中のヌクレオシドが、同一であるか、または異なりうるが、独立して選別されず、ｊは少なくとも２、ｉは１〜１００の間である。種々の実施様態において、（Ｘ）ｊは、ＸおよびＹが少なくとも二重縮重であり、同一であるか、または異なるが、独立して選択されないヌクレオシドを表す、（ＸＹ）である。種々の実施様態において、ｊは、任意の部分的に拘束されたプローブにおいて、２〜５の間、たとえば２、３、４または５である。
【０２７６】
種々の実施様態において、３’→５’方向でのシークエンシングのためのプローブは、構造５’−ＮＢ＊（Ｎ）ｉ−Ｓ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｋ−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ−３’を有し、式中、検出可能部分が、ＮＢの代わりに、または加えて、（Ｎ）ｉの任意のヌクレオシド上に存在しうるという条件で、Ｎが任意のヌクレオシドを表し、ＮＢがリガーゼによって伸長可能ではない部分を表し、＊が検出可能部分を表し、−（Ｘ）ｋ−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｉは各位置で、少なくとも二重縮重であるプローブの拘束された部位であり、−（Ｘ）ｋ−Ｏ−Ｐ−Ｏ−（Ｘ）ｊ中のヌクレオシドは同一であるか、または異なりうるが、独立して選択されず、ｊおよびｋは両方とも少なくとも１であり、（ｊ＋ｋ）は少なくとも２（たとえば、２、３、４または５）、ｉは１〜１００の間である。種々の実施様態においてｊ＝１およびｋ＝１である。
【０２７７】
たとえば切断可能な結合が、（Ｘ）ｊ中のもっとも近位なヌクレオシドと、（Ｘ）ｊ中の次にもっとも近位なヌクレオシド間に局在する種々の実施様態において、プローブファミリー名の規則リストは、伸長されたオリゴヌクレオチドプローブが各サイクル内で、１つのヌクレオチドによって伸長されるので、単一の開始ヌクレオチドから始まる、伸長、ライゲーション、検出および開裂の連続するサイクルによって得ることができる。たとえば、切断可能な結合が、他のヌクレオシド２つの間に局在する種々の実施様態において、プローブファミリー名の規則リストは、シークエンシング方法Ａに関して記述したように、結合反応内で、異なる部位にハイブリッド結合するオリゴヌクレオチドが利用される、多数のシークエンシング反応から得られる結果より組み立てられる。
【０２７８】
上記のもの以外の多数の構造の任意を有するプローブを、シークエンシング方法ＡＢにて用いることができることが理解されるであろう。たとえば、プローブは、拘束ヌクレオシドＸおよびＹが近接していないＸＮＹ（Ｎ）ｋ、またはＩがユニバーサル塩基であるＸＮＹ（Ｎ）ｋのような構造を有しうる。（Ｎ）ｋＸ（Ｎ）ｉ、（Ｎ）ｉＸ（Ｎ）ｊＹ（Ｎ）ｋＺ（Ｎ）ｉ、（Ｎ）ｉＸ（Ｎ）ｊＹＩＺ（Ｎ）Ｉおよび（Ｎ）ｉＸ（Ｎ）ｊＹ（Ｎ）ｋＺ（Ｉ）Ｉは、さらなる可能性を表している。上述したプローブでのように、これらのプローブは、切断可能な結合、検出可能部分、およびリガーゼによって伸長可能ではない１つの末端での部分を含む。種々の実施様態において、プローブは、リガーゼによって伸長可能ではない部位からはプローブの反対の末端で、ヌクレオチドに結合する検出可能な部分を含まない。任意のこれらの構造、または他を有するプローブを含むプローブファミリーは、各プローブファミリーが、異なる配列の標識された多数のプローブを含み、配列中の各位置で、プローブファミリーが、その位置で異なる塩基を有する少なくとも２つのプローブを含む、という基準を満足させる。種々の実施様態において、各プローブ中のヌクレオシドの総数は、１００またはそれ以下、たとえば３０またはそれ以下である。
【０２７９】
オリゴヌクレオチド伸長プローブファミリーのコード化
種々の実施様態において、シークエンシング方法は、コード化されたプローブファミリーを利用する。語句「コード化（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」は、定義された配列の組のメンバーである配列を有する部位を含むプローブが、標識で標識化されるように、定義された配列の組の１つを有する部位を含むプローブと特定の標識を関連付けるスキームをさす。一般的に、コード化は、各区別可能な標識が、異なる群のプローブに結合し、各プローブが、（検出可能な部位の組み合わせを含みうる）ただ単一の標識によって標識されるように、多数の検出可能な標識のそれぞれを１つまたはそれ以上のプローブに関連付ける。種々の実施様態において、各プローブ群中のプローブはそれぞれ、同一の定義された配列の組のメンバーである配列を有する部位を含む。部位は、単一のヌクレオシドであってよく、または長さにして多数のヌクレオシド、たとえば長さにして、２、３、４、５またはそれ以上のヌクレオシドであってよい。部位の長さは、単にプローブの全長の小さな断片を構築してもよく、または全プローブまで構築してもよい。定義された配列の組は、単一の配列のみを含んでよく、または部位の長さに応じて、任意の数の異なる配列を含んでよい。たとえば、部位は単一ヌクレオシドである場合、定義された配列の組は、ほぼ４つの要素（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）を有しうる。部位が長さにして２つのヌクレオシドである場合、定義された配列の組は、１６までの要素（ＡＡ、ＡＧ、ＡＣ、ＡＴ、ＧＡ、ＧＧ、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＣ、ＣＴ、ＴＡ，ＴＧ、ＴＣ、ＴＴ）を有しうる。一般的に、定義された配列の組は、可能性ある配列の総数より少ない要素を含み、コード化は、２つ以上の定義された配列の組を利用する。
【０２８０】
種々の実施様態において、本明細書で記述したシークエンシング方法Ａは一般的に、プローブ中の近位ヌクレオシド（すなわち、伸長可能なプローブ末端にライゲートするヌクレオシド）と標識の同一性の間に直接対応が存在する、単純なコード化を有するプローブの組を利用する。近位ヌクレオシドは、鋳型中でハイブリッド結合するヌクレオチドに相補的であり、したがって、新規にライゲートされるプローブ中の近位ヌクレオシドの同一性は、伸長された二本鎖中の反対の位置に局在する鋳型中のヌクレオチドの同一性を決定する。一般的な意味において、本明細書で記述した他のシークエンシング方法で利用されるプローブは、構造Ｘ（Ｎ）ｋを有し、式中、長さｋのすべての可能性のある配列が、プローブを構築するオリゴヌクレオチドプローブ分子のプール中で表されるように、Ｘは近位ヌクレオシドであり、各ヌクレオシドＮは四重縮重である。したがって、たとえば、いくつかのオリゴヌクレオチドプローブ分子は、位置ｋ＝１にてＡを含み、他は位置ｋ＝１にてＧを含み、他は位置ｋ＝１にてＣを含み、他は位置ｋ＝１にてＴを含み、他の位置ｋにても同様であり、（Ｎ）ｋ中Ｘに隣接するヌクレオシドは、位置ｋ＝１を占めると考えられ、（Ｎ）ｋ中の次のヌクレオシドは、位置ｋ＝２を占めると考えられるなどである。しかしながら、任意の該オリゴヌクレオチドプローブにおいて、Ｘは単一の塩基対特異性のみを表し、典型的には、特定のヌクレオシド同一性、たとえばＡ、Ｇ、ＣまたはＴに相当する。したがって、Ｘは典型的に、特定のプローブを構築するプローブ分子のプール中、一様にＡ、Ｇ、ＣまたはＴである。図２は、構造Ｘ（Ｎ）ｋを有するプローブに対する好適なコード化を示している。本コード化にしたがって、Ｘ＝Ｃを有するプローブは、標識「赤色（ｒｅｄ）」を割り当てられ、Ｘ＝Ａを有するプローブは標識「黄色（ｙｅｌｌｏｗ）」を割り当てられ、Ｘ＝Ｇを有するプローブは、標識「緑色（ｇｒｅｅｎ）」を割り当てられ、Ｘ＝Ｔを有するプローブは、標識「青色（ｂｌｕｅ）」を割り当てられる。したがって、プローブの配列決定部位とその標識間の１対１対応が存在する。
【０２８１】
新規にライゲートされた伸長プローブの標識の同一性が、伸長プローブ中のもっとも近位のヌクレオシドの同一性に対応する、上記アプローチが、標識の同一性が、伸長プローブ中のもっとも近位のヌクレオシドのみの同一性に一致せず、伸長プローブ中のもっとも近位の２またはそれ以上のヌクレオシドの配列に応答するコード化を含むように広がることが理解され、それによって伸長、ライゲーションおよび検出（典型的にはその後開裂）の単一サイクル中で、鋳型中の多数のヌクレオチドの同一性が決定可能である。しかしながら、そのようなコード化はまた、鋳型中反対に位置する相補的ヌクレオチドの同一性が同定可能であるように、オリゴヌクレオチド伸長プローブ中の単一配列と標識を関連付ける。たとえば、上述したように、単一サイクル中２つのヌクレオチドを同定するために、それぞれ相当する標識（すなわち１６の区別可能な標識）を有する、１６の異なるオリゴヌクレオチドプローブが必要となる。
【０２８２】
種々の実施様態において、シークエンシング方法ＡＢは、標識のプローブとの関連付けに対して他のアプローチを利用する。標識の同一性と、プローブの配列決定部位の配列間の１対１対応ではなく、同一の標識を、異なる配列決定部位を有する多数のプローブに割り当てる。プローブは部分的に拘束され、プローブの拘束部位は、その配列決定部位である。したがって、同一の標識が、それぞれ異なる配列での拘束部位を有する、多数の異なるプローブに割り当てられ、ここで、配列は、定義された組の配列の１つである。上述したように、同一の標識を含むプローブは、「プローブファミリー（ｐｒｏｂｅ  ｆａｍｉｌｙ）」を構成する。本方法は、それぞれ異なる配列での拘束部位を有する多数のプローブを含む、そのようなプローブファミリーの多数を利用し、そこで、配列は定義された組の配列の１つである。
【０２８３】
多数のプローブファミリーは、プローブファミリーの「コレクション（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）」として言及される。プローブファミリーのコレクション中の各プローブファミリー内のプローブは、コレクション内の他のプローブファミリーに対して使用される標識とは区別可能である標識で標識化される。種々の実施様態において、各プローブファミリーは、その固有の定義された組の配列を有する。種々の実施様態において、各プローブファミリー中のプローブの拘束部位は、同一の長さであり、種々の実施様態において、プローブファミリーのコレクション内のプローブファミリーの拘束部位は、同一の長さのものである。種々の実施様態において、プローブファミリーのコレクション内のプローブファミリーに対する定義されたファミリーの組の組み合わせには、拘束部位の長さのすべての可能性のある配列が含まれる。種々の実施様態において、プローブファミリーのコレクションは、４つの区別可能な標識化プローブファミリーを含み、またはからなる。種々の実施様態において、プローブの拘束部位は、長さにして２ヌクレオシドである。
【０２８４】
区別可能な標識化プローブファミリーの、広く多様な、異なってコード化されたコレクションは、上記基準を満足させ、種々の方法の実施様態を実施するために使用されてよい。種々の実施様態において、部分的に拘束されたプローブを含む、４つの区別可能に標識化されたプローブファミリーに対する典型的なコード化を、図２５Ａにて示している。図２５Ａにて描写したように、拘束部位は、プローブ内の２つのほとんどの３’ヌクレオシドからなる。プローブファミリーは、「赤色」、「黄色」、「緑色」および「青色」で標識される。各プローブファミリー内のプローブは、その配列が、定義された組の配列の１つである拘束された部位を含み、定義された組は、各プローブファミリーに対して異なる。たとえば、各配列の３’末端にて開始し、これはプローブの近位末端であるとみなされるが、「赤色」プローブファミリーに対する定義された組の配列は、｛ＣＴ、ＡＧ、ＧＡ、ＴＣ｝であり、「黄色」プローブファミリーに対する定義された組の配列は、｛ＣＣ、ＡＴ、ＧＧ、ＴＡ｝であり、「緑色」プローブファミリーに対する定義された組の配列は、｛ＣＡ、ＡＣ、ＧＴ、ＴＧ｝であり、「青色」プローブファミリーに対する定義された組の配列は、｛ＣＧ、ＡＡ、ＧＣ、ＴＴ｝である。種々の実施様態において、各定義された組は、他の組の１つ内に存在する任意のメンバーを含まない。プローブファミリーのコレクション内のプローブファミリーに対する定義された配列の組の組み合わせには、長さ２のすべての可能性ある配列、すなわちすべての可能性のあるジヌクレオシドが含まれうる。プローブファミリーの本コレクションの他の特徴は、種々の実施様態でみられるが、しかし必須ではないが、プローブの拘束部位中の各部位が、四重縮重であること、すなわち、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれかによって占有されうることである。プローブファミリーの本コレクションの他の特徴は、種々の実施様態でみられるが、しかし必須ではないが、定義された配列の各組内で、単一の配列のみが、任意の位置、すなわちもっとも近位の位置、または他の任意の部位にて、任意の特定のヌクレオシドを有することである。種々の実施様態において、定義された配列の各組内で、単一の配列のみが、拘束部位内で、部位２またはそれ以上にて任意の特定のヌクレオシドを有し、これは、もっとも近位のヌクレオシドが位置１であるとみなされる。たとえば、赤色プローブファミリーに対する定義された組の配列において、単一の配列のみが、位置２にてＴを有し、単一の配列のみが、位置２にてＧを有し、単一の配列のみが、位置２にてＡを有し、単一の配列のみが位置２にて配列Ｃを有する。
【０２８５】
図２５Ａにて描写したような、任意の特定のコード化を考えると、１つのプローブファミリー内のプローブの拘束部位内の、１つまたはそれ以上のヌクレオシドの同一性を知ることによって、そのプローブの拘束部位内の他のヌクレオチドについての情報が得られる。もっとも一般的な意味において、プローブファミリー内のプローブの拘束部位内の１つまたはそれ以上のヌクレオシドの同一性を知ることによって、そのプローブファミリーに対する定義された組の配列が、その位置におけるその同一性のあるヌクレオシドを有する配列を含まないであろうことから、他の位置の１つでの、ヌクレオシドに対する１つまたはそれ以上の可能性のある同一性を排除するための十分な情報が得られる。典型的に、プローブファミリー内のプローブの拘束部位内の１つまたはそれ以上のヌクレオシドの同一性を知ることによって、多数のヌクレオシド、たとえばそれぞれ他のヌクレオシドに対する１つまたはそれ以上の可能性のある同一性を排除するために十分な方法が得られる。種々の実施様態において、プローブファミリー内のプローブの拘束部位内の１つまたはそれ以上のヌクレオシドの同一性を知ることによって、プローブ内の他のヌクレオシドそれぞれに対する、すべての、ただし１つの可能性を排除する。たとえば、図２５Ａにて示されたコード化されたプローブファミリーの場合、プローブが赤色ファミリーのメンバーであると知られている場合、およびもっとも近位のヌクレオシドがＣであるとも知られている場合、隣接ヌクレオシドはＴに違いない。同様に、プローブが緑色ファミリーのメンバーであると知られている場合、およびもっとも近位のヌクレオシドがＧであるとも知られている場合、隣接ヌクレオシドはＴに違いない。したがって、拘束部位内の１つのヌクレオシドの同一性を知ることは、１つを除く他のヌクレオシドに対するすべての可能性を排除するのに十分であり、それによって、他のヌクレオシドの同一性は完全に特定される。また、拘束部位の各部位におけるヌクレオシドは、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴでありうるので、プローブの拘束部位内の少なくとも１つのヌクレオシドの同一性を知ることなしに、それが属しているプローブファミリーの名前を知ることのみに基づいて、プローブ内の任意の特定のヌクレオシドの同一性についてすべての情報を得ることは不可能である。図２５Ｂは、シークエンシング方法ＡＢを用いた、プローブファミリーのコレクションの種々の実施様態（上パネル）、およびライゲーション、検出および開裂のサイクル（下パネル）を示している。
【０２８６】
本発明者らは、長さにして２ヌクレオシドであり、図２５Ａにて描写したプローブファミリーのコレクションの有益な特徴を有する、拘束部位を含むプローブファミリーの、考案された２４のコレクションを所有している。これらのプローブファミリーは、そのプローブが属しているプローブファミリーの名前を知ること、およびプローブ内の１つのヌクレオシドの同一性を知ることが、拘束部位内での他のヌクレオシドを正確に同定するために十分であるように、最大限有益である。これはすべてのプローブに対して、および各拘束部位内のすべてのヌクレオシドに対しての場合である。２４のプローブファミリーのコレクションのそれぞれに対するコード化スキームを表１にて示している。表１は、各プローブファミリーのコレクションに対して、１から２４の範囲のコード化ＩＤを割り当てている。種々の実施様態において、各コード化は、シークエンシング方法ＡＢでの利用のために、一般構造（ＸＹ）Ｎｋのプローブファミリーのコレクションの拘束部位を定義し、それによって、コレクションそれ自身を定義する。表１において、コード化ＩＤ下、カラム内の値１は、そのコード化にしたがって、それぞれ第一および第二カラムにて示したように、ヌクレオシドＸおよびＹを含むプローブが、第一プローブファミリーに割り当てられることを示唆しており、（ｉｉ）コード化ＩＤ下、カラム内の値２は、そのコード化にしたがって、それぞれ第一および第二カラムにて示したように、ヌクレオシドＸおよびＹを含むプローブが、第二プローブファミリーに割り当てられることを示唆しており、（ｉｉｉ）コード化ＩＤ下、カラム内の値３は、そのコード化にしたがって、それぞれ第一および第二カラムにて示したように、ヌクレオシドＸおよびＹを含むプローブが、第三プローブファミリーに割り当てられることを示唆しており、（ｉｖ）コード化ＩＤ下、カラム内の値４は、そのコード化にしたがって、それぞれ第一および第二カラムにて示したように、ヌクレオシドＸおよびＹを含むプローブが、第四プローブファミリーに割り当てられることを示唆している。値１、２、３および４はそれぞれ、標識を表す。たとえば、コード化９は、図２５Ａにて描写したプローブファミリーのコレクションを定義し、そこで、１は青色を、２は緑色を、３は赤色を、そして４は黄色を表す。標識に対する値の割り当ては、任意であり、たとえば１は等しく緑色、赤色または黄色を表しうることが理解されるであろう。値１、２、３および４と標識間の関連付けを変えることによって、各プローブファミリー内のプローブの組は変えないが、異なる標識を各プローブファミリーに単に関連付ける。
【０２８７】
【表１】
2010539982.tif 000003
【０２８８】
プローブファミリーのコレクションの種々の実施様態を定義するために、表１の利用をさらに図示するため、コード化１７を考える。本コード化にしたがって、拘束部位ＡＡ、ＧＣ、ＴＧおよびＣＴを有するプローブを標識１（たとえば赤色）に割り当て、拘束部位ＣＡ、ＡＣ、ＧＧおよびＴＴを有するプローブを標識２（たとえば黄色）に割り当て、拘束部位ＴＡ、ＣＣ、ＡＧおよびＧＴを有するプローブを標識３（たとえば緑色）に割り当て、拘束部位ＧＡ、ＴＣ、ＣＧおよびＡＴを有するプローブを標識４（たとえば青色）に割り当てる。えられたプローブファミリーのコレクションを図２６にて描写している。
【０２８９】
図２７Ａ〜２７Ｃは、プローブファミリーのコレクションの２４の種々の実施様態を概略的に定義するための他の方法を表している。本方法は、図２７Ａにてのようにダイアグラムを利用する。そのようなダイアグラム内の第一カラムは、第一塩基を表す。各標識は、４つの異なる塩基配列に結合し、それぞれは、第一カラムからの塩基と、選択した標識のカラムからの塩基とを並列させることによって得られる。たとえば、頭書き「第一塩基（Ｆｉｒｓｔ  ｂａｓｅ）」を持つカラム内にＡが存在する場合、配列ＡＡを有する拘束部位のあるプローブが、プローブファミリー１（標識１）に割り当てられ、配列ＡＣを有する拘束部位のあるプローブが、プローブファミリー２（標識２）に割り当てられ、配列ＡＧを有する拘束部位のあるプローブが、プローブファミリー３（標識３）に割り当てられ、配列ＡＴを有する拘束部位のあるプローブが、プローブファミリー４（標識４）に割り当てられる。プローブファミリーに対する割り当ては、Ｃ、ＧまたはＴで始まる拘束部位を持つプローブに対しても、同様の様式で実施される。したがって、図２７Ａにて示したような塩基をもって充填されたダイアグラムは、図２７Ｂで示したコード化に翻訳され、そこで、組｛ＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＴＴ｝中で拘束部位を有するプローブは、プローブファミリー１に割り当てられ、組｛ＡＣ、ＣＡ、ＧＴ、ＴＧ｝中で拘束部位を有するプローブは、プローブファミリー２に割り当てられ、組｛ＡＧ、ＣＴ、ＧＣ、ＴＡ｝中で拘束部位を有するプローブは、プローブファミリー３に割り当てられ、組｛ＡＴ、ＣＧ、ＧＡ、ＴＣ｝中で拘束部位を有するプローブは、プローブファミリー４に割り当てられる。図２７Ｃは、プローブファミリーのコレクションの２４の種々の実施様態のそれぞれを産出するために、図２７Ａでのダイアグラムの影付き部位の位置に挿入されうるダイアグラムである。シークエンシング方法ＡＢでのプローブファミリーのコレクションの種々の実施様態を用いる方法をさらに以下で記述している。
【０２９０】
表１にて定義された、コード化されたプローブファミリーの２４のコレクションは、シークエンシング方法ＡＢにて使用するための、プローブファミリーのコレクションの種々の実施様態のみを表している。広く種々の他のコード化スキーム、プローブファミリー、プローブ構造を、同一の基本的な原則を用いることで使用可能であり、そこで、拘束部位内の１つまたはそれ以上のヌクレオシドの同一性の理解と一緒に、プローブファミリー名を知ることによって、１つまたはそれ以上の他のヌクレオシドについての情報が得られる。プローブファミリーの好ましいコレクションと比べて、（ｉ）少なくともいくつかのプローブに関して、プローブファミリー名およびヌクレオシド同一性を知ることによって、得られる情報量がより少ないこと、または（ｉｉ）少なくともいくつかのプローブに関して、プローブファミリー名を知ることによって得られる情報量がより多いことから、プローブファミリーのあまり好ましくないコレクションは、一般的により優先度が低い。
【０２９１】
一般的に、あまり好ましくないプローブファミリーのコレクションを、好ましいプローブファミリーのコレクションを使用する方法と同様の様式で、シークエンシング方法ＡＢを実施するために使用してよい。しかしながら、解読のために必要な段階は異なりうる。たとえば、いくつかの状況において、候補配列を互いに比較することは、少なくとも１つの配列の１つの部位を決定するために十分でありうる。
【０２９２】
長さにして２ヌクレオシドである拘束部位を含む、好ましさが少ないプローブファミリーのコレクションを、図２８に示している。本コード化にしたがって、組｛ＡＡ、ＡＣ、ＧＡ、ＧＣ｝中に拘束部位を有するプローブをプローブファミリー１に割り当て、組｛ＣＡ、ＣＣ、ＴＡ、ＴＣ｝中に拘束部位を有するプローブをプローブファミリー２に割り当て、組｛ＡＧ、ＡＴ、ＧＧ、ＧＴ｝中に拘束部位を有するプローブをプローブファミリー３に割り当て、組｛ＣＧ、ＣＴ、ＴＧ、ＴＴ｝中に拘束部位を有するプローブをプローブファミリー４に割り当てる。本プローブファミリーのコレクション中、プローブファミリーの名前を知ることによって、その標識が、プローブファミリーの名前を決定するために検出された、新規にライゲートされた伸長プローブ中の近位ヌクレオシドの反対に位置する鋳型中のヌクレオチドの同一性に対する特定の可能性を排除する。たとえば、プローブファミリー名が１である場合、新規にライゲートされた伸長プローブ中の近位ヌクレオシドは、ＡまたはＧに違いなく、それによって、鋳型中の相補的ヌクレオチドはＴまたはＣに違いない。拘束部位中の各位置における少なくとも２つの可能性が存在することから、プローブファミリーの好ましいコレクションを利用するときの状況と比べて、ヌクレオチドは正確には同定できないが、いずれかの可能性を排除するために十分な情報が、単一のサイクルから得られる。
【０２９３】
種々の実施様態において、拘束部位が長さにして３ヌクレオシドである、部分的に拘束されたプローブが利用される。その拘束部位が、長さ３の全ての可能性のある配列を含むプローブを含むように、好ましいように、プローブファミリーのコレクションは、４３＝６４の異なるプローブを含むべきである。図２９Ａは、拘束部位３ヌクレオシド長（トリヌクレオシド）のプローブを含む、プローブファミリーのコレクションに対して、拘束部位を産出するために使用可能であるダイアグラムを示している。本図は、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴを示唆する４つの列の組、プローブファミリー名１、２、３および４の４カラムを示している。４列の各組は、ヌクレオシド同一性内部を含むボックスの反対側である。トリヌクレオシドに対してプローブファミリーを決定するために、トリヌクレオシド中の最後のヌクレオシドを含むボックスがまず選択される。そのボックスに近接する４つの列内で、トリヌクレオシド中の第一ヌクレオシドを同定している文字で標識された列を選択する。その列内で、トリヌクレオシドの第二ヌクレオシドを含むカラムを選択する。トリヌクレオシドが、カラムの頂点にて示唆されるプローブファミリーに割り当てられる。たとえば、以下の手順によって、トリヌクレオシド「ＴＣＧ」を、プローブファミリーに割り当てるために起こる。最後のヌクレオシドが「Ｇ」であるので、留意が、「Ｇ」を含んでいるボックスの反対に位置する４列の組、すなわち第三の列組に確認される。最初のヌクレオシドが「Ｔ」であるので、考慮はさらに、４の組における最後の列に制限される。プローブファミリー割り当ては、中間ヌクレオシドを含むカラムの表題によって決定される。中間ヌクレオシドが「Ｃ」であるので、トリヌクレオシドは、プローブファミリー１に割り当てられる。同様の処理によって、以下のプローブファミリー割り当て、ＡＡＡ＝１、ＡＴＡ＝２、ＡＧＡ＝３、ＧＴＡ＝４、ＧＡＧ＝１、ＴＧＧ＝２などが得られる。処理を、全ての可能性のあるトリヌクレオシドがプローブファミリーに割り当てられるまで続ける。
【０２９４】
図２９Ｂは、拘束部位３ヌクレオシド長を持つプローブを含む、プローブファミリーのコレクションに対して、さらなる拘束部位を構築するための手順を示している。本手順は、上述したプローブファミリーの２４の好ましいコレクションのそれぞれから、そのようなコレクションを構築するために使用され、そこで、拘束部位は、長さにして２ヌクレオシドであり、コレクションは４つのプローブファミリーを含む。プローブファミリーの好ましいコレクションを表している典型的ダイアグラムを、本図の上部で示している。本ダイアグラムのカラムは、上ダイアグラム内の各カラムに割り当てられた色にしたがって、図の下部分のカラムに直接マッピングされる。したがって、上ダイアグラム中のカラムは、左から右に、青色、緑色、黄色および赤色である。下ダイアグラム中のカラム１下の項目は、上ダイアグラム中のカラムに従って４ヌクレオシドの各組にて、上から下へ、青色、緑色、黄色および赤色である。下ダイアグラム中のカラム２、３および４は、カラム１内の４ヌクレオシドの各組を、次第に下方に動かすことによって作成する。
【０２９５】
「プローブファミリー」が、それぞれ同一の標識で、多数の異なるプローブを含む、単一の「スーパー−プローブ（ｓｕｐｅｒ−ｐｒｏｂｅ）」であると見なすことができることが理解されるであろう。この場合、プローブを構築するプローブ分子は一般的に、プローブの任意の部位にわたって、本質的に同一の分子の集団ではない。語句「プローブファミリー」は、任意の限定的な効果を意味しているのではなく、そのような「スーパー−プローブ」を構築しうるプローブの特徴を記述するのに便宜的に利用している。
【０２９６】
解読
上述したように、少なくとも２つの区別可能な標識化プローブファミリーを含むプローブファミリーのコレクションを用いる、伸長、ライゲーション、検出および開裂の連続サイクルによって、単一のシークエンシング反応、または鋳型中の異なる部位から順序付きリストへ開始される多重シークエンシング反応中で決定される組立てプローブファミリーのいずれかから、プローブファミリー名の順序付きリストが産出される。実施されるサイクル数は、望む配列の長さにおよそ等しいべきである。順序付きリストは、相当量の情報を含むが、対象の配列をすぐに産出しうる形態ではない。その少なくとも１つが、配列に関する追加情報の少なくとも１つのアイテムを集めることを含む、さらなる段階を、対象の配列を表す可能性のある配列を得るために実施しなければならない。対象の配列を表す可能性のある配列が、「正確な（ｃｏｒｒｅｃｔ）」配列として本明細書で言及され、プローブファミリーの順序付きリストから、正確な配列を抽出する工程が、「解読（ｄｅｃｏｄｉｎｇ）」として呼ばれる。上述したような「順序付きリスト（ｏｒｄｅｒｅｄ  ｌｉｓｔ）」内の要素が、リスト内の要素と、鋳型中のヌクレオチド間の一致を含む、情報コンテンツが維持されるという条件、および再配列、断片化および／または置換が、解読工程の間に正しく考慮される（以下で考察している）という条件で、リストの作成の間、またはその後に、再配列されうることが理解されるであろう。語句「順序付きリスト（ｏｒｄｅｒｅｄ  ｌｉｓｔ）」はしたがって、そのような再配列化された、断片化された、および／または置換されたバージョンが、本質的に同一の情報コンテンツを含むという条件で、上述のように作成した順序付きリストの再配列化された、断片化された、および／または置換されたバージョンを含むことが意図されている。
【０２９７】
順序付きリストは、様々なアプローチを用いて解読可能である。これらのアプローチのいくつかは、プローブファミリー名の順序付きリストから、少なくとも１つの候補配列の組を産出することを含む。候補配列の組は、目的を達成するために十分な情報を提供しうる。種々の実施様態において、１つまたはそれ以上の追加段階を実施して、候補配列の中から、または候補配列を比較した配列の組から、対象の配列を表す可能性のある配列を選択するために実施する。たとえば、１つのアプローチにおいて、少なくとも１つの候補配列の少なくとも位置部位を、少なくとも１つの他の配列と比較する。正確な配列が、比較に基づいて選択される。種々の実施様態において、解読には、方法を繰り返すこと、およびプローブファミリーのもともとのコレクションからは異なって解読されるプローブファミリーのコレクションを用いて、プローブファミリー名の第二順序付きリストを得ること、が含まれる。プローブファミリーの第二順序リストからの情報を使用して、正確な配列を決定する。種々の実施様態において、異なって解読されたプローブファミリーのコレクションを用いて、伸長、ライゲーションおよび検出のわずか１サイクルから得た情報は、正確な配列の選択を許可するために十分である。言い換えれば、異なって解読されたプローブファミリーを用いて同定した第一プローブファミリーが、どの候補配列が正確であるかを決定するために十分な情報を提供する。
【０２９８】
他の解読アプローチには、任意の利用可能なシークエンシング方法、たとえばシークエンシング方法Ａの単一サイクルによって、鋳型中の少なくとも１つのヌクレオチドを特異的に同定することが含まれる。１つまたはそれ以上のヌクレオチド（類）についての情報は、プローブファミリー名の順序付きリストを解読するために、「鍵（ｋｅｙ）」として利用する。種々の実施様態において、配列決定される鋳型の部位には、その配列が未知の領域に加えて、公知の配列の領域が含まれてよい。シークエンシング方法ＡＢを、未知の配列と、公知の配列の少なくとも１つのヌクレオチド両方を含む鋳型の位置部位に適用する場合、公知の配列を、プローブファミリー名の順序付きリストを解読するために、「鍵」として利用可能である。以下の項目では、候補配列を作成するプロセスを記述する。続く項目では、公知の配列と比較することによって、候補配列の第二組と比較することによって、そして公知のヌクレオチド同一性を利用することによって、正確な配列を選択するために、候補配列を利用することを記述する。
【０２９９】
候補配列の作成
配列決定されるべき鋳型の領域が、伸長、ライゲーションおよび開裂の連続するサイクルによって産出される、伸長される二本鎖に相補的であることが理解されるであろう。したがって、伸長された二本鎖に対する候補配列を産出することは、配列決定されるべき鋳型の領域に対する候補配列を作成することと等価である。実際に、配列決定されるべき鋳型の領域に対する候補配列を作成可能であり、または伸長した二本鎖に対する候補配列を作成し、配列決定されるべき鋳型の領域に対する候補配列を決定するために、それらの相補物をとることが可能である。後者のアプローチを本明細書で記述する。プローブファミリー名のリストから候補配列を作成するために、プローブファミリーのリストの第一メンバーを考慮する。そのプローブファミリーに結合した拘束された部位の組が、拘束された部位の長さに等価な長さまで、配列中の初期ヌクレオチドに対する可能性を制限する。たとえば、拘束された部位がジヌクレオチドである場合、伸長した二本鎖中の最初のジヌクレオチドに対する可能性のある配列は、そのプローブファミリー内に収まるプローブ内で発生する、拘束された領域のものに制限される（したがって、配列決定されるべき鋳型の領域内の第一ジヌクレオチドに対する可能性のある配列は、そのプローブファミリー内に収まるプローブ内で発生する拘束された部位に相補的である組み合わせのものに制限される）。第一ジヌクレオチドに対する可能性が、典型的にはコンピュータによって、再コード化される。同様に、伸長した二本鎖中の第二ジヌクレオチド（すなわち、第一ジヌクレオチドからの１つのヌクレオチドオフセットであるジヌクレオチド）に対する可能性のある配列は、第二プローブファミリー内に収まるプローブ内で発生する拘束された部位のものに制限され（したがって、鋳型内の第二ジヌクレオチド、すなわち、第一ジヌクレオチドからの１つのヌクレオチドオフセットであるジヌクレオチドに対する可能性のある配列は、第二プローブファミリー内に収まるプローブ内で発生する拘束された部位に相補的である、組み合わせのものに制限される）。第二ジヌクレオチドに対する可能性のある配列がまた再コード化される。続くジヌクレオチドに対する可能性が同様に、決定されるべき配列の望む長さに一致するジヌクレオチドに対して、可能性が再コード化されるまで、またはリスト内にプローブファミリーがなくなるまで、再コード化される。
【０３００】
再コード化可能性の工程の代表的な例を、図３０で描写しており、そこで、プローブファミリー名のリストが、図２５Ａで示したプローブファミリーコレクションを用いて作成されたことが推定されている。図３０のもっとも左のカラムが、上から下の順で、プローブファミリーのリストを示している。黄色、緑色、赤色、青色。リスト内の各プローブファミリーに相当するジヌクレオチドに対する配列可能性が、図の右側に示されている。ヌクレオチド位置を、配列可能性の上に示している。配列は位置１にて始まっており、したがって、第一ジヌクレオチドは、位置１および２を占有し、第二ジヌクレオチドは、位置２および３を占有し、などである。黄色プローブファミリーに関して、可能性は、図３０で示したように、ＣＣ、ＡＴ、ＧＧおよびＴＡである。緑色プローブファミリーに関して、可能性は、ＣＡ、ＡＣ、ＧＴおよびＴＧである、などである。各ジヌクレオチドの可能性のある配列を再コード化する工程は、望む配列の長さに達するまで続けられる。
【０３０１】
可能性を何組か生成後、配列の５′末端位にあると仮定され、図３０において１位として示される、候補配列中の１番目のヌクレオチドの正体ついて、第１の仮定を行う。第１の仮定は、１番目のヌクレオチドがＡである、１番目のヌクレオチドがＧである、１番目のヌクレオチドがＣである、または１番目のヌクレオチドがＴである、とすることができる。
【０３０２】
隣接するジヌクレオチドが重複している、すなわち、第１のジヌクレオチドの２番目のヌクレオチドは、第２のジヌクレオチドの１番目のヌクレオチドでもあることから、それぞれのジヌクレオチドの可能な配列は、隣接するジヌクレオチドの可能な配列によって限定されることが観察される。例えば、１番目のヌクレオチドがＣであると仮定した場合、第１のジヌクレオチドはＣＣでなければならない。第１のジヌクレオチドがＣＣである場合、第２のジヌクレオチドは、その１位がＣでなければならない。１位にＣを有する第２のジヌクレオチドについて唯一可能な配列はＣＡであるので、第２のジヌクレオチドがＣＡでなければならないことは明白である。したがって、最初の３ヌクレオチドはＣＣＡでなければならない。同様に、第３のジヌクレオチドは、第２のジヌクレオチドの可能な配列によって限定される。第２のジヌクレオチドがＣＡである場合、第３のジヌクレオチドは、その１位にＡを有するのが唯一の可能性であるので、ＡＧでなければならない。したがって、最初の４ヌクレオチドはＣＣＡＧである。このプロセスを続け、その結果最初の５ヌクレオチの配列は５′−ＣＣＡＧＣ−３′となった。したがって、ＣＣＡＧＣが第１の候補配列である。
【０３０３】
第２の候補配列は、１番目のヌクレオチドがＡであるという仮定から生成する。この仮定によると、第１のジヌクレオチドはＡＴになる。第１のジヌクレオチドのＡＴ配列に整合的である、第２のジヌクレオチドについて唯一可能な配列はＴＧである。第２のジヌクレオチドのＴＧ配列に整合的である、第３のジヌクレオチドについて唯一可能な配列はＧＡである。第３のジヌクレオチドのＧＡ配列に整合的である、第４のジヌクレオチドについて唯一可能な配列はＡＡである。これらのジヌクレオチドを組み立てて全長の候補配列にするとＡＴＧＡＡになる。同様に、１番目のヌクレオチドがＧであると仮定すると、候補配列はＧＧＴＣＧになり、１番目のヌクレオチドがＴであると仮定すると、候補配列はＴＡＣＴＴになる。したがって、４つの候補配列が生成し、それぞれの候補配列は、配列中の１番目のヌクレオチドであると仮定した異なるヌクレオチドで開始している。
【０３０４】
仮定を立てるのが、他のヌクレオチドの１つではなく１番目のヌクレオチドでなければならない必要はない。例えば、仮定は４番目のヌクレオチドの正体についても同等に首尾よく行うことができ、その場合、鋳型に沿って「後方に」（すなわち、３′→５′方向に）移動することにより、候補配列が生成するはずである。例えば、４番目のヌクレオチドをＴと仮定すると、第４のジヌクレオチドはＴＴでなければならず、第３のジヌクレオチドはＣＴでなければならず、第２のジヌクレオチドはＡＣでなければならず、そして第１のジヌクレオチドはＣＣでなければならない（ヌクレオチドは、５′→３′の配向で記載しているが、そのヌクレオチドの正体は配列を３′→５′に移動しながら生成する）。種々の実施形態において、仮定は配列の中間の任意のヌクレオチドについて行うことができ、ジヌクレオチドの正体は５′→３′方向と３′→５′方向の両方に移動することによって生成する。当然のことながら、ヌクレオチドの１つを仮定しなければ、それぞれのヌクレオチドの正体は、それぞれの位置をＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴが占め得るため、完全に未決定のままになる。
【０３０５】
プローブファミリーの推奨コレクションを用いる場合、任意の単一のヌクレオチド（例えば、１番目のヌクレオチド）の正体について仮定すると、唯一の候補配列が生成する。しかし、プローブファミリーの推奨度がより低いコレクションを用いる場合、２つ以上のヌクレオチドの正体を仮定することが必要であり得る。すなわち、１番目のヌクレオチドの正体を仮定することとでは、残りの配列を全体的に特定できない。例えば、プローブファミリーの推奨度がより低いコレクションは、規定配列がＡＡおよびＡＣであるメンバーを含むファミリーを含み得る。そのような場合、１番目のヌクレオチドをＡと仮定すると、２番目のヌクレオチドとして２つの可能性が残る。プローブファミリーの推奨度がより低いコレクションを用いたシークエンシングについて以下でさらに考察する。当然のことながら、制約部分が不連続なヌクレオチドからなる場合、上記のアプローチは、軽微な修正を加えて、なお使用することができる。
【０３０６】
候補配列と既知配列との比較による配列同定
一般に、上記の通り伸長した二本鎖の候補配列を決定した場合、シークエンシングしたい鋳型の領域に対応する候補配列を、その相補鎖を取ることにより得る。ある場合には、候補配列自体によって、目的達成のために十分な情報が提供される。例えば、シークエンシングの目的が、単に特定の配列である可能性を排除することである場合、候補配列をその可能性と比較することで十分であるはずである。図３０に示す候補配列により、シークエンシングしたい領域が例えばポリＡ尾部の一部ではないことを決定できるとはずである。より長い配列により、シークエンシングしたい領域がベクターの一部ではないことを確認できることもあり得る。
【０３０７】
多くの場合、正しい配列を明確に決定することが望ましいと思われる。種々の実施形態において、正しい配列は、シークエンシングしたい鋳型の領域に対する候補配列と、既知配列のセットを比較することにより同定される。既知配列のセットは、例えば、対象とする生物に特定の既知配列のセットであってよい。例えば、ヒトＤＮＡについてシークエンシングしたい場合、候補配列をヒトゲノムドラフト配列と比較することができる。公に入手可能なヒトゲノム配列リソースの案内としてＵＲＬがｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｕｉｄｅ／ｈｕｍａｎ／であるウェブサイトを参照されたい。他の例として、感染性媒介物（例えば対象から単離した細菌またはウイルス）由来である核酸についてシークエンシングする場合、細菌またはウイルスの変異株の配列を含むデータベースを用いて検索することができる。そのような生物特異的なデータベースの多くは、当技術分野で公知の、完全な配列または部分的な配列のいずれかを含み、さらにシークエンシングの努力が増進するに従って入手可能になると思われる。いくつかの代表的な例として、マウスに関するデータベース（例えば、ＵＲＬがｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｓｅｑ／ＭｍＨｏｍｅ．ｈｔｍｌであるウェブサイトを参照されたい）、ヒト免疫不全ウイルスに関するデータベース（例えば、ＵＲＬがｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｉｖ−ｄｂ／ｍａｉｎｐａｇｅ．ｈｔｍｌであるウェブサイトを参照されたい）、マラリア種の熱帯熱マラリア原虫に関するデータベース（例えば、ＵＲＬがｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ｅｄｂ２／ｐｆａｌ／ｈｔｍｌｓ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌであるウェブサイトを参照されたい）などが挙げられる。もちろん、生物特異的な配列セットを使用する必要はない。ＧｅｎＢａｎｋ（ＵＲＬがｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／であるウェブサイト）などの、さまざまな生物およびウイルスの由来の配列を含むデータベースを用いて検索してもよい。鋳型の由来である生物またはウイルス由来の任意の配列までデータベースに含まれている必要はない。一般に、配列はゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ＥＳＴなどであってよい。複数の配列を検索することができる。
【０３０８】
検索は簡単に行うだけで目的を達成するのに十分であり得る。例えば、ウイルスの核酸を患者から単離した場合、候補配列を、そのウイルスの既知配列のセットと比較することで、たとえ合致配列を検査しなくても、ウイルスの核酸がそのウイルス由来の配列を含むか含まないかを決定することができる。合致が存在すれば、患者がそのウイルスに感染していることが確認され、一方、合致がなければ、患者はそのウイルスに感染していないことが確認されることになる。
【０３０９】
種々の実施形態において、既知配列のセットは、より狭い範囲の配列を含み、シークエンシングを行う目的に特に合わせたものであってよい。したがって、シークエンシングしたい核酸についての情報を、既知配列のセットの選択に用いることができる。例えば、鋳型が特定の遺伝子配列を表わすことが分かっている場合、既知配列は、遺伝子の別の対立遺伝子、対象とする所定の遺伝子座にある配列の突然変異型および野生型などを表わすものであってよい。候補配列が正しいかどうかを決定するために、候補配列と既知配列の１つを比較することだけが必要であり得る。例えば、種々の実施形態において、鋳型は対象とする領域を含むＤＮＡを増幅させることにより得る（例えば、対象とする領域に近接するプライマーを使用する）。対象とする領域は、突然変異または多型、例えば特定の疾患に関連する突然変異または多型が存在し得る部位を包囲するものであってよい。鋳型が、特定の対象とする領域由来の配列を表わすことが分かっている場合、候補配列をその領域の参考配列の１つ、例えば、その配列由来の野生型または突然変異型と比較することだけが必要である。つまり、鋳型の配列の一部または全部が分かっていれば、複数の既知配列との比較を行う必要がない。その代わり、既知配列の全部または一部を含む候補配列を正しいものとして選択する。例えば、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子における突然変異は、乳がんのリスク増加に関連することが知られており、対象がそのような変異体を保有するかどうかを決定することに非常に関心が持たれている。鋳型が、ＢＲＣＡ１遺伝子由来の配列を含むことが分かっている場合、例えば、その遺伝子の一部を包囲している対象とする領域に近接するプライマーを用いて鋳型のクローン集団を作製した場合、候補配列は、正しい配列を決定するために、ＢＲＣＡ１配列の野生型または突然変異型と比較することだけが必要である。
【０３１０】
より一般的な場合、候補配列と既知配列のセットとの比較により、任意の候補配列に類似した任意の既知配列が同定される。候補配列が十分な長さであるならば、２つ以上の候補配列と同一である、または酷似している配列がデータベースに含まれる見込みは非常に小さい。つまり、候補配列が十分に長ければ、それらの２つ以上を既知配列のセットが表わすことはないと思われる。候補配列は、「合致」とみなされる任意の配列と比較する。一般に、存在する合致を証明するために必要な、同一性の程度に対する閾値を設定することが望ましい。例えば、候補配列と既知配列が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または、まさに１００％同一である場合に、既知配列を合致しているとみなす。一般に、同一率は、長さが少なくとも１０ヌクレオチド、例えば１０〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、２５〜３０ヌクレオチドなどのウィンドウで評価する。ウィンドウの長さは、さまざまな異なる規準に従って選択することができ、その基準としては、複数の既知配列中の配列数、複数の既知配列の同一性または供給源などが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、候補配列をＧｅｎＢａｎｋなどの大規模なデータベース中の配列と比較する場合、より少ない配列を含むデータベースを使用する際よりも長い配列を使用することが望ましいことがある。種々の実施形態において、配列は、必ずしもお互いが隣接していない複数の異なるウィンドウにわたって比較する。種々の実施形態において、ウィンドウの複合長は、少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、例えば、１０〜１５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、２５〜３０ヌクレオチドなどである。時には、既知配列のセット中の複数の配列が合致する。その配列は、例えば、鋳型の由来である生物と同じ生物中に見られる相同遺伝子、異なる生物由来の相同遺伝子、擬似遺伝子、ｃＤＮＡ、およびゲノム配列などを表わすことがある。
【０３１１】
一般に、既知配列のセット中の配列に最も酷似している候補配列を、正しいものとして選択する。種々の実施形態において、例えば、シークエンシング方法の誤り率が高い傾向があり得ると考える理由がある場合、データベースから一致する配列を正しいとして選択することが好ましいことがある。例えば、誤り率があらかじめ決定した閾値を超えることが分かっている場合、データベースから正しい配列として選択することが好ましい。
【０３１２】
多数の候補配列について見られる合致の見込みを確実なものにするために必要な長さは、種々の考察事項に左右され、その考察事項としては、特定の既知配列のセット、合致を承認するための閾値などが挙げられるが、それらに限定されない。一般に、長さが約２５〜２６ヌクレオチドである配列は、一般的な生物のゲノム中で一度表わされるのみである。したがって、およそこの長さである候補配列が、正しい配列を同定するのに十分である。一般に、候補配列は、長さが少なくとも１０ヌクレオチドであるべきであり、種々の実施形態において、長さが少なくとも１５、少なくとも２０ヌクレオチド、例えば、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４５〜５０、またはさらに長いものであるべきである。
【０３１３】
候補配列の第１セットと候補配列の第２セットとの比較による配列同定
種々の実施形態において、第１のコード化によってコード化した第１のプローブファミリーのコレクションを用いたプローブファミリーの第１の順序付きリストの生成、そこからの候補配列の第１セットの生成、次いで、第２のコード化によってコード化した第２のプローブファミリーのコレクションを用いた同じ鋳型からの第２の順序付きリストの生成、そこからの候補配列の第２セットの生成によって、解読を行う。２つのシークエンシング反応の間に、新しく合成されたＤＮＡ鎖を鋳型から取り除く、または同一配列の鋳型を、第２のプローブファミリーのコレクションを用いてシークエンシングする。何セットかの候補配列を比較する。当然のことながら、どちらのプローブファミリーのコレクションを使用したかにかかわらず、候補配列の１つが正しい配列であり、一方他の配列は正しくない（または、せいぜい部分的に正しい）ことになる。したがって、候補配列の各セットは、正しい配列を含むが、ほとんどの場合、任意の所定の候補配列の組内の正しい配列以外の候補配列は、他の候補配列の組に見られる正しい配列以外の候補配列とは異なる。したがって、２セットの候補配列を単純に比較することにより、正しい配列を決定することができる。別々にコード化した２つのプローブファミリーのコレクションを用いて長さが等しい候補配列を生成する必要はない。種々の実施形態において、第２のプローブファミリーのコレクションを用いて生成した候補配列は、２ヌクレオチドという短さであってよく、同等に、第２のプローブファミリーのコレクションを用いて生成したプローブファミリーの順序付きリストは、１要素の短さ（すなわち、ライゲーションと検出の単一サイクル）であってよい。
【０３１４】
図３１Ａ〜３１Ｃは、識別可能に標識した２つの推奨プローブファミリーを用いた候補配列の生成および解読の例を示す。図３１Ａは、第１のコード化によってコード化した、推奨のプローブファミリーのコレクションを示す。図３１Ｂは、プローブファミリーの順序付きリスト、黄色、緑色、赤色、青色からの４つの候補配列の生成を示し（「２３１４」と表わすことができる。ここで、赤色＝１、黄色＝２、緑色＝３、および青色＝４）、ここで正しい配列はＣＡＧＧＣ（太字で示す）であると仮定される。図３１Ｃは、第２のコード化によってコード化した、推奨のプローブファミリーのコレクションを示す。鋳型内の第１のジヌクレオチドがＣＡであるので、黄色プローブファミリー内の最上部のプローブが、伸長の第１サイクルの伸長終点にライゲーションする。この結果、第１のジヌクレオチドの候補配列は以下のセット、ＣＡ、ＴＣ、ＧＧ、ＡＴになる。第１のプローブファミリーのコレクションを用いて生成した候補配列の中で、ＣＡＧＧＣ配列だけがこれらのジヌクレオチドのいずれにもある。したがって、これが正しい配列である。一般に、第１および第２のプローブファミリーのコレクションは、以下の基準を満たすことが好ましい。第１および第２のプローブファミリーのコレクションを比較した際、（ｉ）第１のコレクション内の各プローブファミリー内の４つのプローブの内３つが、第２のコレクション内の新規プローブファミリーに割り当てられること、および（ｉｉ）再度割り当てられた３つのプローブそれぞれが、第２のコレクション内の異なるプローブファミリーに割り当てられるべきであること。
【０３１５】
プローブファミリーの順序付きリストを解読するための正体が既知であるヌクレオチドの使用
上記の通り、候補配列は、伸長した２本鎖または鋳型内の単一ヌクレオチドの正体を仮定することにより生成する。使用した特異的なプローブファミリーのコレクションによって、少なくとも４つの候補配列を生成することが必要であるのが一般的である。しかし、多数の候補配列の生成は、鋳型内の（したがって、同様に伸長した２本鎖中の）少なくとも１つのヌクレオチドの正体が分かっていれば避けられる。その場合、単一の候補配列の生成だけが必要になる。候補配列の生成方法は、上記と同一である。鋳型内の少なくとも１つのヌクレオチドの正体は、任意のシークエンシング方法を用いて決定してよく、そのシークエンシング方法としては、シークエンシング方法Ａ、識別可能に標識したヌクレオチドおよびポリメラーゼなどのセットを用いた初期化オリゴヌクレオチドからのプライマー伸長などが挙げられるが、それに限定されない。当然ながら、鋳型内の１つまたは複数のヌクレオチドは、まずシークエンシング方法ＡＢ以外のシークエンシング方法を用いてシークエンシングすることができ、次いで初期化オリゴヌクレオチドおよび任意の伸長産物を取り除いてよく、同じ鋳型を、シークエンシング方法ＡＢを用いたシークエンシングに供する（または逆）。
【０３１６】
他のアプローチは、その配列を決定したい部分に加えて、１つまたは複数の正体が分かっている既知ヌクレオチドを含む鋳型を単純にシークエンシングすることである。例えば、鋳型の、初期化オリゴヌクレオチドが結合する領域と、未知配列がある領域の間の部分に、１つまたは複数の正体が分かっているヌクレオチドを含めてよい。鋳型のこの部分をシークエンシング方法ＡＢに供すことにより、配列中の１つまたは複数のヌクレオチドの正体があらかじめ決定され、したがって正しい配列であると思われる単一の候補配列の生成に使用することができる。
【０３１７】
したがって上記の方法は、（ｉ）正体が分かっているヌクレオチドに隣接した鋳型内のヌクレオチドの正体を、どの正体が既知ヌクレオチドの正体と整合性があるか、および、近位にあるヌクレオチドが、正体が分かっているヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの反対側にライゲーションする、プローブの制約部分の可能な配列を決定することにより割り当てるステップと、（ｉｉ）続くヌクレオチドの正体を、どの正体が、近位にあるヌクレオチドが、続くヌクレオチドの反対側にライゲーションする、プローブの制約部分の可能な配列と整合性があるかを決定することにより割り当てるステップと、（ｉｉｉ）配列が決定されるまでステップ（ｉｉ）を振り返るステップとを含む。伸長した２本鎖とシークエンシングしたい鋳型の領域との間に正確な一致があるので、これらのステップは、伸長した２本鎖について同じステップを行うのと同等であることが理解されるであろう。
【０３１８】
推奨度がより低いプローブファミリーを用いたシークエンシング
推奨度がより低いプローブファミリーのコレクションは、推奨プローブファミリーのコレクションのやり方と同様の形で、シークエンシング方法ＡＢの実施に用いてよい。しかし、結果は多くの点で異なることがある。例えば、配列の特定の部位は、候補配列から、追加の情報を必要とせずに完全に同定することができる。図３２は、図２８で示した通りにコード化した、推奨度がより低いプローブファミリーのコレクションを用いたシークエンシングの例を示す。シークエンシングは、概して推奨プローブファミリーのコレクションについて記載した通りに進行する。対象とする鋳型は「ＧＣＡＴＧＡ」の配列を有し、その結果プローブファミリーの順序付きリストによると「１２３４１」になる。１位のヌクレオチドをＡと仮定すると、候補配列として「ＡＣＡＴＧＡ」が得られる。しかし、推奨プローブファミリーのコレクションを用いた場合とは異なり、標識「１」は１番目のヌクレオチドとしてＡを有する２つの異なるジヌクレオチド、すなわち「ＡＡ」および「ＡＧ」と関連付けられるので、２番目のヌクレオチドとして２つの可能性がある。したがって、１位のヌクレオチドをＡと仮定すると、第２の候補配列として「ＡＣＡＴＧＣ」が得られる。１位のヌクレオチドをＧと仮定すると候補配列として「ＧＣＡＴＧＡ」が得られ、同様に候補配列として「ＧＣＡＴＧＣ」も得られる。標識「１」は１位にＣまたはＴを有するジヌクレオチドのいずれとも関連付けられないので、「Ｃ」または「Ｔ」で始まる候補配列は生成しない。図３２は、互いに整列させた４つの候補配列を示す。全ての候補配列の中間の４ヌクレオチドがＣＡＴＧであることが観察される。したがって、正しい配列は２位〜５位にＣＡＴＧを含まなければならない。これらのヌクレオチドだけを対象とする場合、さらなる解読ステップを実施する必要はない。
【０３１９】
上記のように、プローブファミリーのコレクションは４つの異なるプローブファミリーからなる必要はないが、３以上、最大４Ｎの任意の数からなってよく、ここでＮは制約部位の長さである。しかし、４つよりも少ないファミリーを用いる場合、５つ以上の候補配列を生成する必要があることがあり、一方５つ以上のプローブファミリーを用いる場合、追加の標識が必要になる。これらの理由および他の理由から、４つのプローブファミリーからなるコレクションが好ましい。
【０３２０】
候補配列を互いに比較することによるシークエンシング
種々の実施形態において、対象とする配列の一部または全部を、候補配列を互いに比較することにより決定する。一般に、そのような比較は、どの候補配列がその全長にわたって正しいかを決定するのに十分でない。しかし、２つまたは複数の候補配列が同一である、または配列の一部にわたって十分類似している場合、この情報は、上記の部分内の鋳型内のヌクレオチドの配列を明確に同定するために十分であり得る。
【０３２１】
所望であれば、鋳型を、二者択一的にコード化したプローブファミリーを用いて１回または複数回の追加回数、シークエンシングして、同定された配列を伴う追加部分を得ることができる。これらの部分は、合わせて所望の長さの配列を組み立てることができる。
【０３２２】
プローブファミリーを用いた誤り訂正
同じＤＮＡ配列の全部または一部を表わす多数の鋳型についてシークエンシングすること、および配列を整列させることが望ましいことも多い。鋳型が、対象とする領域の一部しか含まない場合、より長い配列を、重複断片を組み立てることにより得る。例えば、生物のゲノムをシークエンシングする時、一般にＤＮＡを断片化し、十分な断片をシークエンシングして、各一続きのＤＮＡをいくつかの（例えば４〜１２）異なる断片で表わす。重複配列を組み立ててより長い配列にするためのコンピュータソフトウェアは、当業者に公知である。
【０３２３】
従来のシークエンシング方法を用いる時、領域内の単一の位置にある、他の断片と異なる断片の１つ（異常断片と見なされる）を除いた多数の断片が、領域全体に完全に整列する場合が頻繁にある。孤立した相違がシークエンシングの誤りを表わすのか、または本当の相違（例えば、単一のヌクレオチド多型）がその位置に存在するかどうかを決定することが不確定になり得る。
【０３２４】
種々の態様において、本教示は、配列決定方法ＡＢを用いて、エラーチェックを行う方法を提供する。本方法によると、ＤＮＡの同一伸長を表すフラグメントからなるテンプレートは、上記したように、識別できるようにラベル付けされたプローブ分類の収集物を用いて配列決定され、各テンプレートに対するプローブ分類の順序付きリストを与えることになる。プローブ分類の順序付きリストが、一列に並べられる。ある単一位置において他のフラグメントとは異なっている１つのリストを除いて、リスト中で所定の長さ、例えば１０、１５、２０または２５あるいはそれ以上の元素に亘り、幾つかのリストが完全に並べられると、その差は、配列決定エラーとされる。もし実際の多型性が存在する場合には、変則的フラグメントから生じた順序付きプローブリストは、２つ以上の隣接位置において、他のフラグメントから生じた順序付きプローブリストとは異なることになる。
【０３２５】
例えば、表１中の符号化４を用いたプローブ分類の好ましい収集物を用いた配列決定方法ＡＢを、５’−ＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧ−３’配列からなるテンプレートに適用すると、下に示すように、“２３３２４３２２１３２４４４１４２”というプローブ分類の次のような順序付きリストが、生じる。
【０３２６】
２３３２４３２２１３２４４４１４２
【０３２７】
ＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧ
【０３２８】
実際のＳＮＰ（例えば、下線のヌクレオチドが、多型性サイトを表しているＣＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧ）が、ある場合には、リスト：２３３２４３３３１３２４４４１４２（そこでは、下線は、ＳＮＰの結果として生じる変化を示している）中の２つの連続した元素に、変化が生じる。プローブ分類の順序付きリストとＳＮＰを含む配列の間の対応は、以下に示される：
【０３２９】
２３３２４３３３１３２４４４１４２
【０３３０】
ＣＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧ
【０３３１】
しかし、結紮された伸展プローブに関連したラベルを同定するときのエラーは、プローブ分類の順序付きリストにおける単一エラーを生じまたその点から前方への生成する候補配列に変化を生じる。例えば、第７結紮の伸展プローブ２３３２４３３２１３２４４４１４２（そこでは、下線数字は、同定を誤ったラベルを表している）と関連したラベルを決定するときのエラーは、ＣＡＧＡＣＧＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＡＣ（そこでは、下線部分は、配列決定エラーの結果として生じる変化を示している）に対する生成する候補配列を変化させる。プローブ分類の順序付きリストと配列の間の対応は、以下に示される：
【０３３２】
２３３２４３３２１３２４４４１４２
【０３３３】
ＣＡＧＡＣＧＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＡＣ
【０３３４】
３塩基４ラベルスキームを用いると、ＳＮＰを含むフラグメントは、変則的フラグメントに対するプローブ分類の順序付きリストにおいて、３つの連続した差を生じ、一方、配列決定エラーは、ただ１つの差を生じる。例えば、図２９中に示されているように符号化されたプローブ分類の収集物を使用すると、ＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧ配列に対するプローブ分類同一性の順序付きリストは、以下に示される：
【０３３５】
２３２２２２４１３２４１２２４４
【０３３６】
ＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧ
【０３３７】
ＳＮＰを含む変則的フラグメント、例えばＣＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧは、以下に示すように、ＳＮＰを含まないフラグメントから生じる順序付きリストに対して、３つの連続的位置で異なっているプローブ分類の順序付きリストを生じる：
【０３３８】
２３２２２１３３３２４１２２４４
【０３３９】
ＣＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧ
【０３４０】
配列エラーは、プローブ分類の順序付きリスト中での単一差においてのみ生じ、また前のエラーの点とは完全に異なって生じた候補配列を生じることになる。
【０３４１】
このように、フラグメント（変則的フラグメント）から生じたプローブ分類の順序付きリストが、ＤＮＡの同一伸長を表すが、単一の分離された位置における他の順序付きリストとは異なる他のフラグメントから生じるプローブ分類の順序付きリストと一致するとき、差を含む順序付きリストは、配列決定エラー（プローブ分類の誤同定）を表しているようである。フラグメント（変則的フラグメント）から生じたプローブ分類の順序付きリストが、ＤＮＡの同一伸長を表すが、２つ以上の連続位置における他の順序付きリストとは異なる他のフラグメントから生じるプローブ分類の順序付きリストと一致するとき、変則的フラグメントは、ＳＮＰを含んでいそうである。種々の態様において、プローブ分類の順序付きリストの位置合わせた部分は、長さで少なくとも３または４元素であり、種々の態様において、それは、長さで少なくとも６，８またはそれ以上の元素である。種々の態様において、位置合わせた部分は、少なくとも６６％同一であり、少なくとも７０％同一であり、少なくとも８０％同一であり、少なくとも９０％同一であり、またはそれ以上、例えば１００％同一である。
【０３４２】
同様に、フラグメントに対する候補配列が、配列の第１部分に亘りＤＮＡの同一伸長を表すが、配列の第２部分に亘って他のフラグメントに対する候補配列とは実質的に異なる他のフラグメントに対する候補配列と一致するとき、配列決定エラーが、起こりそうである。フラグメントに対する候補配列が、配列の２つの部分に亘りＤＮＡの同一伸長を表すが、単一位置において異なる他のフラグメントに対する候補配列と一致するとき、変則的フラグメントは、ＳＮＰを含んでいそうである。種々の態様において、候補配列の位置合わせた部分は、長さで少なくとも４ヌクレオチドである。種々の態様において、位置合わせた部分は、少なくとも６６％同一であり、少なくとも７０％同一であり、少なくとも８０％同一であり、少なくとも９０％同一であり、またはそれ以上、例えば１００％同一である。
【０３４３】
種々の態様においては、（ａ）配列決定方法ＡＢを用いた複数のテンプレートを配列し、そこでは、該テンプレートは、単一核酸配列の重なりフラグメントを表すことを特徴とする工程と；（ｂ）工程（ａ）で得られた配列を一列に並べる工程と；（ｃ）もし配列が、第１部分に亘り実質的に同一でありまた第２部分に亘り実質的に異なり、各部分が、少なくとも３ヌクレオチドの長さを持つ場合に、配列間の差が、配列決定エラーを表すことを決定する工程と；からなることを特徴とする配列エラーからの単一ヌクレオチド多型性の識別方法が、提供される。種々の態様においては、（ａ）単一核酸配列の重なりフラグメントを表す複数のテンプレートを用いて配列決定方法ＡＢを行うことにより複数のプローブ分類の順序付きリストを取得する工程と；（ｂ）該リストが少なくとも９０％同一である位置合わせた範囲を得るために、工程（ａ）で得られたプローブ分類の順序付きリストを一列に並べる工程と；（ｃ）もし該リストが、位置合わせた部分内において唯１つの位置においてのみ異なる場合に、プローブ分類の順序付きリスト間の差が、配列決定エラーを表すことを決定する工程と；または（ｄ）該リストが、位置合わせた部分内において２つ以上の連続位置において異なる場合に、プローブ分類の順序付きリスト間の差が、単一ヌクレオチド多型性を表すことを決定する工程と；からなることを特徴とする配列エラーからの単一ヌクレオチド多型性の識別方法が、提供される。
非局在化情報収集
【０３４４】
当業界で公知のように、「ビット」（２進数）は、塩基２中の１桁数字のことであり、換言すれば、１またはゼロであり、またデジタルデータの最小単位を表す。ヌクレオチドは、４つの異なる同一性のいずれかを持つことができるので、ヌクレオチドの同一性の特定は、２ビットを必要とすることが、理解されよう。例えば、Ａ，Ｇ，ＣおよびＴは、それぞれ、００、０１、１０および１１として表現できる。識別可能にラベル付けされた４つのプローブ分類があるから、識別可能にラベル付けされたプローブ分類の好ましい収集における１つのプローブ分類の名前を特定することは、２ビットを必要とする。
【０３４５】
配列の大抵の従来の形式および配列決定法Ａにおいて、各ヌクレオチドは、明確な単位として同定されかつ１つのヌクレオチドに対応する情報が、一度に集められる。各検出工程は、単一ヌクレオチドから２ビットの情報を取得する。対照的に、配列決定方法ＡＢは、各検出において複数のヌクレオチドの各々から２ビット未満の情報を取得し、一方、プローブ分類の好ましい収集物が使用されるときには、検出工程について２ビットの情報をさらに必要とする。プローブ分類の順序付きリスト中の各プローブ分類は、プローブの配列決定部分の長さにより決められる正確な数字を用いて、テンプレート中の少なくとも２個のヌクレオチドの同一性を表現する。例えば、表１中の符号化４により符号化されるプローブ分類の収集物を用いて、５’−ＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧ−３’配列から得られるプローブ分類の順序付きリストを考える。
【０３４６】
２３３２４３２２１３２４４４１４２
【０３４７】
ＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧ
【０３４８】
ジヌクレオチドＣＡは、プローブ分類２のプローブ中に存在する特定部分の１つであるから、プローブ分類２は、リスト中の第１プローブ分類である。ジヌクレオチドＡＧは、プローブ分類３のプローブ中に存在する特定部分の１つであるから、プローブ分類３は、リスト中の第２プローブ分類である。上述したように、４つのプローブ分類が、あるから、各プローブ分類の同一性は、２ビットの情報を表している。このようにして、各検出工程は、２ヌクレオチドについての２ビット情報を集め、その結果、各ヌクレオチドから平均１ビットの情報を得る。
【０３４９】
種々の実施態様において、配列を決定する方法であって、該方法が、伸展、結紮および検出の多サイクルを含み、かつ該検出工程は、各個別のヌクレオチドから２ビットの情報を得ることも無く、テンプレート中の少なくとも２つのヌクレオチドの各々から平均２ビットの情報を同時に取得することを含むことを特徴とする方法が、提供される。種々の実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブ分類の第１収集物を用いて、テンプレートポリヌクレオチド中のヌクレオチド配列を決定する方法であって、該方法が、（ａ）伸展、結紮および検出の連続サイクルを行う工程であって、各個別のヌクレオチドから２ビットの情報を得ることも無く、各サイクル中にテンプレート中の少なくとも２つのヌクレオチドの各々から平均２ビットの情報を同時に取得することを特徴とする工程と；（ｂ）配列を決定するために、工程（ａ）で得られた情報を、少なくとも１ビットの追加の情報と組み合わせる工程と；を含むことを特徴とする方法が、提供される。種々の実施態様において、少なくとも１ビットのヌクレオチドの追加の情報は、テンプレート中のヌクレオチドの同一性と、候補配列を少なくとも１つの公知の配列と比較することにより得られる情報と、オリゴヌクレオチドプローブ分類の第２収集物を用いる方法を反復することにより得られる情報とを含む。
【０３５０】
このようにして、該方法は、個別のヌクレオチドから２ビットの情報を取得しないが、平均２ビットの情報は、各サイクル中のテンプレートから集められるが、プローブ分類の好ましい収集物を用いるときには、非局在化した方法で集められる。２つまたは３つのプローブ分類の収集物を用いる場合には、２ビット未満の情報が、各サイクルの間に集められる。
【０３５１】
非局在化情報収集物は、上述したものなどのエラーチェック法の適用を可能にすることを含む多数の利点を持っている。さらに、テンプレート中の各ヌクレオチドは、種々の実施の態様において１度以上質問されるから、非局在化情報収集物は、特定のヌクレオチドに関連した蛍光プローブを検出する組織的バイアスを避けることができる。
【０３５２】
これまで記述したプローブ分類およびプローブ分類の収集物は、プローブの伸展、結紮および分裂の連続サイクルを含む方法に加えて、種々の配列決定方法中に使用可能である。種々の実施態様において、プローブが切れやすい連鎖を随意的に含んでいないことを特徴とする上述したような配列と構造を持つプローブ分類とプローブ分類の収集物が、提供される。例えば、該プローブは、リン酸ジエステル骨格連鎖のみを含むことができ、ならびに／あるいはトリガー残基を含んでいなくてもよい。種々の実施態様において、プローブ分類は、伸展および結紮の連続サイクルを用いているが、各サイクル中には分裂を含まない配列決定を行うために使用される。例えば、プローブ分類は、ＷＯ２００５０２１７８６中に記載されている方法などの結紮ベースの方法において使用できる。そのような方法でプローブ分類を使用するために、例えばＷＯ２００５０２１７８６に開示されているような開裂可能な連鎖によって取り付けるべきであり、その結果、核酸の切れやすい連鎖を開裂することなく、それを除去できる。そのような方法は、例えば、ＷＯ２００５０２１７８６中に記載されている結紮カセットよりむしろプローブ分類を用いてまたその後プローブ分類のリストを結集して、多重反応を平行にまたは連続して行うことにより、プローブ分類の順序付きリストを生成するために使用できる。該リストは、上記したように解読されている。
Ｉ．キット
【０３５３】
本方法の種々の実施態様を実行するために、種々のキットが、提供される。該キットの幾つかは、リン酸チオールエステル連鎖を含む伸展オリゴヌクレオチドプローブを包含している。該キットは、さらに、１つ以上の初期化オリゴヌクレオチドを含んでいる。該キットは、リン酸チオールエステル連鎖を開裂するために適した開裂試薬、例えば硝酸銀および開裂を行うための適当な緩衝剤を含んでいてもよい。該キットの幾つかは、損傷した塩基または失歩の残基を含むヌクレオシドなどのトリガー残基からなる伸展オリゴヌクレオチドプローブを含む。さらに、該キットは、１つ以上の初期化オリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。該キットは、ヌクレオシドと隣接する失歩の残基との間の連鎖を開裂するために適した開裂試薬および／またはポリヌクレオチド、例えばＤＮＡグリコシラーゼから損傷した塩基を除去するために適した試薬を含んでいてもよい。該キットの幾つかは、ジサッカライドヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含みまた開裂試薬として、過ヨウ素酸塩を含んでいる。種々の実施態様において、該キットは、識別可能に標識を付けられたオリゴヌクレオチドプローブ分類の収集物を含んでいる。
【０３５４】
さらに、該キットは、結紮試薬（例えば、リガーゼ、緩衝液など）および本方法の種々の実施態様を実施するための取り扱い説明書を含んでいる。使用してもよい他の酵素用の適当な緩衝剤、例えば、ホスファターゼ、ポリメラーゼなどを含んでいてもよい。ある場合においては、これらの緩衝剤は、同一であってもよい。該キットは、テンプレートを固定するための磁性ビーズなどの支持体も含んでいてもよい。ＰＣＲ増幅を行うためのプライマーを用いて、該ビーズを機能化してもよい。他の任意の成分は、洗浄溶液；ＰＣＲ増幅用のテンプレートを挿入するためのベクター；増幅プライマー、南京錠プローブ、熱安定性ポリメラーゼ、ヌクレオチドなどのＰＣＲ試薬；エマルジョン調製用試薬；ゲル調製用試薬などを含む。
【０３５５】
該キットの種々の実施態様において、リン酸チオールエステル連鎖からなる蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、設けられ、その結果、プローブの異なった端末ヌクレオチドに対応するプローブが、明確にスペクトル的に解析可能な蛍光染料を運んでいる。種々の実施態様において、スペクトル的に解析可能な４つの蛍光染料の各々とプローブの４つの可能な末端ヌクレオチドの間の１対１対応を可能にするそのような４つのプローブが、提供される。
【０３５６】
該キットは、オリゴヌクレオチドおよび／または対末端あるいはフラグメントライブラリを生成するために適したベクターを含んでいてもよい。該キットは、該ライブラリのメンバーであるテンプレート分子の相補的に共通な部分である１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。
【０３５７】
該キット中または該キット上には、識別子、例えばバーコード、無線周波数ＩＤタグなどが、存在してもよい。例えば、品質制御、在庫管理、ワークステーション間の追尾、移動などの目的のために、該キットを一意的に確認するために、該識別子を使用することができる。
【０３５８】
一般的に、キットは、個々の試薬の幾つかを分離して収納するように、１つ以上のうつわまたは容器を含んでいてもよい。該キットは、商業販売のために相対的に密閉状態で個々の容器を封入するための手段、例えば、取り扱い説明書、発泡スチレンなどの包装材料を封入してもよいプラスチックボックスなどを、含んでいてもよい。
Ｊ．平行配列決定および自動配列決定システム
【０３５９】
高処理能力法で効率的に配列決定を行うために、上述したように、複数の支持体（例えば、ビーズ）を作り、その結果、各支持体が、そこに付帯された特定の配列のテンプレートを持つことが望ましく、またここに記載された該方法を、各支持体に付帯されたテンプレート上で同時に行うことが、望ましい。このアプローチの種々の実施態様において、複数の支持体が、スライドなど平面基板中または上に配列される。種々の実施態様において、該支持体は、ゲルなどの半固体媒体中にまたは上に配列される。該支持体を、ランダムに配列してもよく、すなわち、基板上の各支持体の位置は、あらかじめ決められていない。該支持体を、規則的に間隔を空けて置く必要はなく、あるいは列および段などの規則的な配置で位置決めする必要はない。種々の実施態様において、多くのまたは大抵の支持体からの個別の信号を検出できるように、該支持体は、ある密度で配列される。ある種々の実施態様において、該支持体は、単一焦点面において、主として分配される。例えば、品質管理の目的のために、そこに付帯された同一配列のテンプレートを有する多重支持体を含んでいてもよい。配列決定反応は、各支持体に付帯されたテンプレート上で平行して行われる。
【０３６０】
種々の画像モダリティを含む種々の手段のいずれかを用いて、信号を収集してもよい。検出前に基板（例えば、基板上に置かれた半固体支持体で埋め込まれている）上で配列されているミクロ粒子上で配列決定を行う種々の実施態様において、画像形成装置は、１ミクロン以下の解像度を持っている。例えば、充分な解像度を有するＣＣＤカメラまたはマイクロアレースキャナーと適合する走査型顕微鏡を使用することができる。種々の実施態様において、蛍光検出用に設けられた顕微鏡に付帯されたフローセルまたは流体工学ワークステーションを経由して、ビーズを通過させることができる。信号を収集する他の方法は、光ファイバーの束を含む。適当な画像取得および処理ソフトウエアを使用してもよい。
【０３６１】
種々の実施態様において、マイクロ流体装置中で、配列決定を行う。例えば、付帯されたテンプレートを有するビーズを、そこを流れる装置および試薬中に搭載する。例えば、ＰＣＲを用いたテンプレート合成を、該装置中でも行うことができる。米国特許第６６３２６５５は、適当なマイクロ流体装置の例を記載している。
【０３６２】
種々の実施態様において、複数のテンプレートから平行に、すなわち実質的に同時に配列情報を集めるために使用できる種々の自動化配列決定システムが、提供される。種々の実施態様において、テンプレートは、実質的に平坦な基板上に配列される。図２１は、該システムの１つの写真である。該写真の上部に示されているように、該システムは、ＣＣＤカメラ、蛍光顕微鏡、移動台、ペルチエフローセル、温度制御器、流体処理装置および専用のコンピュータを含む。これらの部品の種々の置換を行うことができることは、理解されよう。例えば、他の画像捕捉装置を使用できる。このシステムのさらなる詳細を、実施例９中に提供する。
【０３６３】
ここに記載した結紮ベースの方法および限定するものではないが、合成（例えば、Ｍｉｔｒａ  ＲＤら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，ｍ３２０（１）：５５−６５，２００３）による蛍光内配列（ＦＩＳＳＥＱ）などの合成方法による配列決定とを含む種々の配列決定方法を実行するために、自動化配列決定システムおよび関連画像処理装置およびソフトウエアを使用できることは、理解されよう。ここに記載された結紮ベースの配列決定方法に対する場合のように、半固体支持体中またはその上で直接に不動態化されたテンプレート上で、半固体支持体中またはその上でマイクロ粒子上に不動態化されたテンプレート上で、基板に対して直接付帯されたテンプレート上などで、ＦＩＳＳＥＱを実行してもよい。
【０３６４】
該システムの種々の実施態様の１つの態様は、フローセルである。一般的に、該フローセルは、流体が流れることが可能な入力および出力ポート有する室を含んでいる。種々のフローセルおよび材料およびそれらの製造方法の考察に対しては、例えば、米国特許第６４０６８４８および第６６５４５０５およびＰＣＴ公報ＷＯ第９８０５３３００を参照のこと。流体の流れは、フローセル中に置かれた構成要素（例えば、テンプレート、マイクロ粒子、検体など）に試薬を添加可能にしまたそれから試薬を除去可能にする。
【０３６５】
種々の実施態様において、配列決定システム中での使用のための適当なフローセルは、流体が基板の表面に亘って流れるように基板、例えばスライドなどの実質的に平坦な基板を搭載できる位置を含んでおり、また照射、励起、信号取得などを可能にする窓を含んでいる。該方法の種々の実施態様に従って、マイクロ粒子などの構成要素は、基板がフローセル内に置かれる前に、典型的に基板上に配置される。
【０３６６】
種々の実施態様において、該フローセルのトップから空気バブルの脱出を可能にするフローセルは、垂直に配向される。流体経路が、フローセルの底からトップに続くように、例えば、入力ポートが、該セルの底にあり、かつ出力ポートが、該セルのトップにあるように、フローセルが、配列される。導入されるバブルが、浮揚性であるから、照明窓を曇らせることなく、それらは、出力ポートへ迅速に浮揚する。ガスバブルが、液体の密度に対して低い密度のおかげで、流体の表面に上昇することが可能であるこのアプローチは、ここでは、「重力によるバブル置換」とされている。種々の実施態様において、重力によるバブル置換を可能にするように配向されるフローセルからなる配列システムが、設けられる。種々の実施態様において、そこへ直接または間接に（例えば、基板に対して共有結合的または非共有結合的に連結されて）付着されているか、基板に接着しているまたは添加されている半固体支持体中または半固体支持体上で不動化されているマイクロ粒子を有する基板が、フローセル内で垂直に搭載され、すなわち、基板の最大平面が、接地面に対して垂直である。種々の実施態様において、支持体または基板中もしくは基板上でマイクロ粒子が不動化されるので、それらは、互いに関して実質的に固定された位置に残ることになり、それは、画像の連続取得および画像登録を有利にする。
【０３６７】
図２４Ａ〜図２４Ｊは、種々の方位におけるフローセルまたはその一部の概略図を示している。該フローセルは、限定するものではないが、分析方法（例えば、配列決定、交雑検定などの核酸分析方法；タンパク質分析方法、結合検定、選別検定など）を含む種々の目的のいずれかに使用可能である。合成を行うために、例えば、組み合わせライブラリを発生させるためにも、該フローセルは、使用してもよい。
【０３６８】
図２２は、自動化配列決定システムの種々の実施態様の概略図を示している。該フローセルは、温度制御され自動化された台（実施例９に記載したものと同様）上に搭載されかつ多ポートバルブを有するシリンジポンプなどの流体処理システムに付帯されている。該台は、１つのフローセルを撮像可能なように、複数のフローセルを収容し、一方伸展、結紮および開裂などの他の工程は、他のフローセル上で行われる。このアプローチは、処理能力を増加させるが、高価な光学システムの利用を最大にする。
【０３６９】
バブルを検出しかつ試薬使用をモニターするために、流体ラインには、光学センサーおよび／または伝導度センサーが、設けられている。流体工学システム中の温度制御およびセンサーは、試薬が、長期の安定のため適当な温度に維持されるが、アニール工程、結紮工程および開裂工程の間の温度変動を避けるために、試薬が、フローセルに入るに従って作用温度にまで昇温されることを、確かなものとする。種々の実施態様において、負荷におけるエラーを避けるために、試薬は、キット中にあらかじめ包装される。
【０３７０】
該光学系は、４つのカメラを含んでおり、各カメラは、４つのフィルターセットの１つを経由して１つの画像を取得する。光退色の効果を削減するために、照明光学系は、画像処理される領域のみを照明するように設計され、視野の端の多重照明を回避することになる。無限修正された顕微鏡対物レンズおよび標準ビームスプリッターおよびフィルターから、該画像処理光学系を構築してもよい。画像を取得するために、２０００×２０００ピクセルＣＣＤカメラを使用できる。該システムは、光学系に対して適当な機械的支持体を組み入れている。照明強度をモニターできかつ分析ソフトウエアによって、後日の使用のために、記録できる。
【０３７１】
複数の画像（例えば、１８００以上の非重なり画像視野）を迅速に取得するために、種々の実施態様におけるシステムは、迅速自動フォーカスシステムを使用している。画像自身の分析に基づく自動フォーカスシステムは、当業界で公知である。一般的に、これらは、フォーカス時に少なくとも５フレームを必要としている。ピント合わせ画像を取得する（光退色を増加させる）ために必要な過剰の照明という観点から、このことは、遅くかつコスト高である。種々の実施態様において、自動フォーカスシステムを使用でき、例えば、機械システムが対応できるほど早く焦点合わせ可能な独立光学系に基づいたシステムを使用できる。そのようなシステムは、当業界では公知であり、例えば、ＣＤスピンに従ってリアルタイムでサブミクロンの焦点合わせを維持する民生用ＣＤプレーヤに使用される焦点合わせシステムを含む。
【０３７２】
種々の実施態様において、該システムは、遠隔操作される。特定のプロトコルを実行するためのスクリプト（台本）を中央のデータベース中に貯蔵しかつ各配列操作に対してダウンロードしてもよい。サンプルトラッキングの完全性およびサンプルの最終データとの関連性を維持するために、サンプルにバーコードを付けることもできる。中央でのリアルタイムのモニタリングは、プロセスエラーの迅速な解決を可能にする。種々の実施態様において、装置により集められる画像は、中央の多テラバイト貯蔵システムおよびひと揃いの１つ以上のプロセッサに、アップロードされる。中央データベースからのトラッキングデータを用いて、プロセッサは、画像を解析し、かつシーケンスデータおよび随意的に、例えば装置の性能を追跡するために、背景の蛍光レベルおよびビード密度などのプロセス数的指標を発生する。
【０３７３】
制御ソフトウエアは、ポンプ、台、カメラ、フィルター、温度制御を、正確に順序付けし、画像データに注釈を付け、記憶するために使用される。例えば、オペレータが装置をセットアップしかつ維持することを補佐するために、ユーザインターフェースが提供され、かつ種々の実施態様において、該台を、装填／非装填スライドに向けておよび流体ラインの準備に向けて位置決めする機能を含む。例えば、温度、台の位置、現在のフィルターの構造、運転プロトコルの状態などの種々の運転パラメータを、オペレータに示すための表示機能が、含まれていてもよい。種々の実施態様において、試薬ロットおよびサンプルＩＤなどのトラッキングデータを記録するためのデータベースへのインターフェースが、含まれている。
Ｋ．画像およびデータ処理方法
【０３７４】
種々の態様において、コンピュータ読み取り媒体上に収納されたコンピュータコード（すなわちソフトウエア）として少なくとも部分的に実行される種々の画像およびデータ処理方法が、提供される。さらなる詳細は、実施例９および実施例１０中に提示されている。さらに、一般的に、配列決定方法Ａよび配列決定方法Ｂは、含まれる処理工程、例えば、多重配列決定反応に集められるデータのトラックを維持すること、そのようなデータのまとめ、候補配列の生成、配列比較の実行など工程を実行するための適当なコンピュータソフトウエアを、通常は採用している。
Ｌ．配列情報を記憶するコンピュータで読み取り可能な媒体
【０３７５】
種々の態様において、該配列決定方法の種々の実施態様を用いることにより生じる情報を収納するコンピュータで読み取り可能な媒体が、提供される。情報は、生データ（すなわち、さらに処理されまたは分析されなかったデータ）、処理されまたは分析されたデータなどを含む。データは、画像、数字などを含む。該情報は、データベース、すなわち典型的には容易な検索のために整理された、例えば、コンピュータメモリ中に収納された情報（例えばデータ）の収集物中に収容してもよい。情報は、例えば配列および配列に関するいかなる情報、例えば、配列の部分、参照配列との配列の比較、配列解析の結果、多型性情報（例えば、特定のテンプレートが、多型性を含んでいるかどうか）または突然変異体情報などのゲノムの情報、連鎖情報（すなわち、例えば染色体中の他の核酸配列に関する核酸配列の物理的位置に関連する情報）、疾患関連情報（すなわち、患者の身体上の特色、例えば、患者の対立遺伝子に対する疾患の存在または疾患への可能性）などを含む。該情報は、サンプルＩＤ、患者ＩＤなどに関連していてもよい。限定されるものではないが、サンプルの源、サンプルに対して行われる処理工程、情報の解釈、サンプルまたは患者の特性などを含めたサンプル、患者などに関するさらなる情報を含んでいてもよい。種々の実施態様において、例えば、コンピュータで読み取り可能な媒体上に収納されているコンピュータで読み取り可能なフォーマット中の前述の情報のいずれかの受領を含む方法が、提供される。さらに、該方法は、情報に基づいた診断情報、予後情報または予測情報を提供する工程、またはコンピュータで読み取り可能な媒体上に収納された情報を、第三者へ単純に提供する工程を含んでいてもよい。
Ｍ．結紮効率の増加のための未標識伸展プローブの使用
【０３７６】
図４１は、Ａ欄で記述した発明された配列決定方法の種々の実施態様を描写しており、そこでは、テンプレートポリヌクレオチドの個体群が、アダプターオリゴヌクレオチド配列を経由してマイクロ粒子に貼り付けされる。伸展工程中に使用される伸展プローブは、５つのランダムベース（ｎ）と３つの普遍的基底部（ｚ）とから成っている。
【０３７７】
蛍光標識は、５’末端において、伸展プローブに貼り付けされる。該標識は、プローブ中の１つの固定された位置を報告する。ここで、スペクトル的に解析可能な４つの蛍光染料の各々とプローブの４つの可能な末端ヌクレオチドの間の１対１対応が、図示されているが、該対応は、１対１である必要はない。点線で示された分割されやすい連鎖は、所定の位置のヌクレオチドと普遍的基底部の間に置かれている。
【０３７８】
テンプレートポリヌクレオチドを相補するプローブは、配列決定プライマーの５’末端に結紮されており、その結果、伸展された２本鎖となる。結紮と検出の後に、伸展プローブは、普遍的基底部を除去してかつ結紮の次のサイクルに使用できる遊離リン酸塩を離して、分割されやすい連鎖において開裂される。伸展、結紮、検出および開裂の反復サイクルは、望ましい配列読み取り長さが、達成されるまで、配列決定らせん構造の３’→５’方向において、２本鎖を伸展する。
【０３７９】
種々の実施態様において、２本鎖は、サイクル当たり５ヌクレオチドだけ伸展する。２５ベース読み取り長さの生成は、伸展、結紮、検出および開裂の５サイクルが、バックグラウンド上での信号を生成する大多数のマイクロ粒子で支持されていることを要求している。このことを達成するためには、１サイクル当たり、ほぼ８０％の伸展プライマーを結紮しなければならない。標準条件下では、少なくとも８０％の結紮効率の達成は、高処理能力配列決定プラットフォームに対して理想的でない多くの時間を取ることになる。
【０３８０】
結紮を行うために必要な時間の量を有意に増加させることなく結紮効率を増加させることは、配列決定に役立ち、かつ全ゲノム配列決定などの高処理能力応用に対して、特に有用であろう。
【０３８１】
本発明者らは、種々の実施態様において、全結紮時間を有意に増加させることなく結紮効率を増加させる方法を開発してきた。該方法の一般的スキームは、本出願で前述の配列決定方法と類似している。すなわち、テンプレートのポリヌクレオチドに沿った配列決定は、伸展工程の間に標識づけられた伸展プローブを用いて、伸展、結紮、検出および開裂の多重サイクルによって行われる。全スキームの種々の実施態様は、図４１Ａ〜図４１Ｅ中に概略的に描写されている。
【０３８２】
単一のマイクロ粒子は、典型的には、１０、０００から２０、０００の間のテンプレートポリヌクレオチド分子に付着できる。図４１Ａは、各テンプレートポリヌクレオチド分子に結合した初期化オリゴヌクレオチドプライマーを用いて示された多重のテンプレートポリヌクレオチド分子を有する単一ビーズの表示である。該初期化オリゴヌクレオチドプライマーの各々は、５’末端に遊離リン酸塩を持っており、またプライマーは、ビーズ近辺のテンプレートポリヌクレオチドの末端近くを結合している。遊離リン酸塩基は、端末における初期化オリゴヌクレオチドプライマーの伸展を促進している。
【０３８３】
その後、標識づけられた伸展プローブは、各サイクルの伸展工程の間に添加される。初期化オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に直接隣接している領域においてテンプレートを相補する配列を有するものは、プライマーに結紮され、伸展された２本鎖を生じる。標識づけられた伸展プローブは、リン酸塩基が存在しないために、非伸展性末端を持っている。
【０３８４】
各マイクロ粒子上のテンプレートポリヌクレオチドの全てが、必ずしも、伸展工程（図４２Ｂ参照）の間に標識づけられた伸展プローブと伸展された２本鎖を形成するものではないことが、理解されよう。単一結紮反応後、初期化オリゴヌクレオチドプライマーの伸展は、所定のビーズ上のテンプレートポリヌクレオチドの小集団に沿って起きたであろう（図４２Ｂ中の‘４２０４’参照）。初期化オリゴヌクレオチドプライマーの結紮および伸展は、テンプレートポリヌクレオチド残基上では起こらなかったであろう（図４２Ｂ中の‘４２０６’参照）。
【０３８５】
標識づけられた伸展プローブを用いた結紮反応後、フリーの未結紮プローブが、洗浄される。伸展プローブと関連した標識は、その後検出され、プローブ配列に関する情報およびそれ故テンプレート配列についての情報を提供する。
【０３８６】
種々の実施態様において、各サイクルにおいて、第２の結紮反応が、行われる。この追加の結紮反応は、第１結紮反応中に使用された標識付き伸展プローブと同じサイズの未標識伸展プローブを用いて行われる。該未標識伸展プローブは、該標識付き伸展プローブと同じ位置に、分離されやすい連鎖を含んでいる。このように、図４１中の標識付き伸展プローブが、第１結紮反応中に使用された場合、第２結紮反応中で使用される未標識伸展プローブは、長さで８ヌクレオチドになり、また伸展プローブの５’端末から離れた第３および第４ヌクレオチドの間に、分離されやすい連鎖を持つことになる。標識付き伸展プローブと同様に、該未標識伸展プローブは、５’端末には、非伸展性末端を持つことになる。種々の実施態様において、未標識プローブは、異なった全サイズを持つことになるが、分離されやすい連鎖と結紮される端末の間の距離は、例えば、２本鎖が同じ数のヌクレオチドにより伸展されるように、実質的に同じとなる。
【０３８７】
標識付き伸展プローブを用いた結紮反応（以下「標識付き結紮」として示す）は、高忠実度条件の下に行われるのに反して、未標識伸展プローブを用いた結紮反応（以下「未標識結紮」として示す）は、低忠実度条件の下で行われる。すなわち、標識付き結紮は、テンプレート配列を相補するプローブのみが、オリゴヌクレオチドプライマーに結紮されるように、行われる。未標識結紮中の条件の低い厳格性が、テンプレート配列を完全には相補しないプローブが、プライマーに結紮されることを可能にする。
【０３８８】
図４２Ｃ中で描写したように、標識付き伸展プローブの非伸展性末端のために、未標識伸展プローブは、第１結紮反応において標識付き伸展により既に伸展されなかった２本鎖にのみ、結紮可能である（２本鎖に結紮される未標識伸展プローブの例に対する‘４２０８’参照）。このようにして、１未満のプローブが、所定のサイクル中に所定の２本鎖上に結紮する。
【０３８９】
フリーのプローブを洗浄後、各ビーズ上のテンプレートポリヌクレオチド分子は、図４２Ｄ中の描写に類似する。プライマーの幾つかは、標識付き伸展プローブ（‘４２１０’）に結紮されてきたが、他のプライマーは、未標識伸展プローブ（‘４２１２’）に結紮されてきた。残りのプライマーは、いずれかの種類の伸展プローブ（‘４２１４’）に結紮されなかった。伸展可能な末端が、将来のサイクルに関わらないように、また配列決定の読み取りの位相逸脱の原因を避けるために、未結紮プライマー（‘４２１４’）は、脱ホスホリル化される。２本鎖に結紮された伸展プローブの端末は、脱ホスホリル化処理によっては影響を受けない。
【０３９０】
最後に、分離されやすい連鎖における全ての伸展プローブ上で開裂が、行われる（図４２Ｂ〜図４２Ｄ中の‘４２０２’）。分離されやすい連鎖が、それらが標識付き伸展プローブ中にあるのと同じ未標識伸展プローブ内相対的位置に置かれているから、同じ数のヌクレオチドが、開裂後２本鎖中に残留する。このようにして、標識付きプローブまたは未標識プローブが、結紮されようとも、２本鎖は、同数のヌクレオチドにより、伸展されてきた。
【０３９１】
伸展プローブの開裂は、伸展された初期化オリゴヌクレオチドの５’末端に遊離リン酸塩基を離すことにより、またこれらの末端を、伸展、結紮、検出および開裂の反復サイクルに使用可能にさせることにより、伸展可能な末端を発生させる。配列読み取りを望みの長さに伸ばすために、追加のサイクルを実施可能である。
【０３９２】
配列決定方法において、本出願で前述したように、テンプレートポリヌクレオチドを、リセットすることができ、また、目標配列の全てのベースを同定できるように、該プロセスは、プローブの読み取りフレームをシフトする初期化オリゴヌクレオチドプライマーの使用を反復した。
【０３９３】
各伸展工程中での結紮の効率は、プライマーの伸展可能な末端に直接接している領域に、テンプレートを合わせる特定のプローブ種のプローブプール中での有用性によって、影響される。該プール中での不充分に表示されたプローブ種が、所定のサイクルの伸展工程中に使い尽くされてもよい。
【０３９４】
低忠実度ハイブリッド形成を可能にする条件で、未標識の結紮が、行われるので、テンプレートを正確には相補しないプローブ種を、初期化オリゴヌクレオチドプライマーに、または伸展された２本鎖に、結紮することができる。このことが、プローブプール中での幾つかの配列の消耗の問題を克服するのに役立っている。これらの工程で使用される未標識伸展プローブは、配列決定には貢献しないから、低忠実度ハイブリッド形成は、配列読み取りの完全性には影響しない。
【０３９５】
種々の態様において、未標識結紮反応は、多数サイクルを経由して、多くのテンプレート分子に沿った伸展を可能にする。未標識結紮がない場合には、テンプレートポリヌクレオチドを相補するプローブが、使用できない場合には、テンプレートポリヌクレオチドに沿った伸展は、止まる。種々の実施態様において、本教示は、この行き詰まりの削減および／または克服に役立つことが可能な方法を提供する。多くのテンプレート分子に沿った連続伸展の場合には、多くのマイクロ粒子が、バックグラウンド上に蛍光信号を発して、以後のサイクルに使用される。幾つかの態様において、これが、全体の結紮効率を増加させる。
【０３９６】
種々の実施態様において、標識付き結紮反応後および各サイクル中での開裂工程前に、１つ以上の未標識結紮反応が、行われる。開裂工程までは、伸展可能な末端の発生は、起こらないから、各サイクルの間に、所定のテンプレートプライマーまたはテンプレート伸展プライマー２本鎖に対して、せいぜい１つの伸展プローブを結紮できる。プローブプールが、各結紮反応間に満たされるので、多重結紮反応は、プローブプール中の幾つかの種の枯渇の潜在的問題の克服に役立つこともできる。
【０３９７】
種々の実施態様において、標識付き結紮反応は、１５℃で４０分間行われ、また３つの未標識結紮反応は、各々１５℃で４０分間同じサイクルで行われる。さらなる種々の実施態様において、２０分の標識付き結紮反応を１５℃で行い、また各１０分の３つの標識付き結紮反応を、同一のサイクル中で行ってもよい。結紮反応の温度は、１５℃である必要はない。結紮温度は、１２℃、１３℃、１４℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃または２５℃などの使用されるリガーゼに対して適した他の温度のいずれでもよい。また、該温度は、結紮反応の間中一定である必要はない。種々の実施態様において、２０分の標識付き結紮反応を１５℃で行い、また未標識結紮反応は、同一のサイクル中で１５℃から４０℃で反復して傾斜した温度で行われる。
【０３９８】
種々の実施態様において、未標識結紮工程の間に、高濃度のリガーゼを使用することにより、低忠実度を誘導する。種々の実施態様において、標識付き結紮反応は、Ｔ４リガーゼの１００Ｕ／ｍＬの濃度で行われ、また未標識結紮反応は、Ｔ４リガーゼの２００Ｕ／ｍＬの濃度で行われる。
【０３９９】
結紮効率に影響する他の因子は、テンプレートポリヌクレオチドに対するプローブの近接性である。リガーゼは、２重螺旋のＤＮＡ中のリン酸化状態に対するＴ４リガーゼの高親和性と一致するところの、リガーゼ／プローブ混合物の添加後すぐに伸展するプライマーのリン酸エステル末端に結合するようである。いかなる理論に結ばれるという期待も無く、リガーゼが、プライマーのリン酸塩末端に結合した後、リガーゼは、テンプレートへのプローブの接近を立体的に遮る。多重結紮反応の間での暖かい緩衝液を用いた洗浄により結合したリガーゼを除去することが、結紮反応を加速する。
【０４００】
種々の実施態様において、リガーゼの使用量を削減するのに役立つ１つ以上の結紮反応において、添加物が含まれる。該添加物は、ウシ血清アルブミンであってもよく、またそれは、結紮工程以外の工程中に含まれていてもよい。
【０４０１】
検出工程は、標識付き結紮反応後すぐに行う必要はない。標識付き結紮反応後かつ開裂前のいずれかの工程で、それを行うことができる。１つの未標識結紮反応が、使用される場合、標識付き結紮反応後および／または未標識結紮反応後に、検出を行うことができる。２つの未標識結紮反応を使用する場合には、標識付き結紮反応後および／または第２の未標識結紮後に、検出を行うことができる。３つの未標識結紮反応を使用する場合には、標識付き結紮反応後、第１未標識結紮反応後、第２未標識結紮反応後、および／または第３未標識結紮反応後に、検出を行うことができる。各サイクル中に、同じ工程で検出を行う必要はない。また、所定のサイクル間に１度以上検出を行うことができ、あるいは該サイクルの全体または一部の間に、マイクロ粒子を連続して撮像できる。
【０４０２】
上述した未標識結紮反応を用いる方法は、本出願で以前に記載した配列決定方法のいずれかを用いて、使用できる。
【０４０３】
標識付き伸展プローブに貼り付けされる標識は、蛍光を発する必要はない。基板に接触したときに検出可能な信号を発生する蛍光性または化学発光性部分、比色部分、酵素部分の直接または間接貼り付けを含めた種々の方法で、プローブに標識を貼り付けることができる。
【０４０４】
種々の実施態様において、標識の位置は、１つのプローブから次のプローブへ矛盾のないものである。それにもかかわらず、標識は、プローブの５’末端の最端末に貼り付ける必要はない。分割されやすい連鎖と末端の５’端末の間のいかなる位置にあるプローブに、標識を貼り付けることができる。
【０４０５】
種々の実施態様において、標識は、標識付き伸展プローブの３’末端または分割されやすい連鎖と３’末端の間のどこかに貼り付けられる。種々の実施態様において、初期化オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端は、伸展プローブに結紮され、かつ伸展は、５’→３’方向で起きる。
【０４０６】
種々の実施態様において、伸展プローブは、図４１中に描写されている異なった数のランダムベースおよび／または異なった数の普遍的ベースからなっている。該伸展プローブは、８ヌクレオチドより長くてもよく、あるいはそれより短くてもよい。
【０４０７】
種々の実施態様において、標識付き伸展プローブおよび未標識伸展プローブ上の分割されやすい連鎖は、チオリン酸エステル連鎖である。種々の金属含有薬剤を用いて、チオリン酸エステル連鎖を開裂することができる。該金属は、例えばＡｇ，Ｈｇ，Ｃｕ，Ｍｎ，ＺｎまたはＣｄであってもよい。種々の実施態様において、該薬剤は、Ａｇ＋，  Ｈｇ＋＋，Ｃｕ＋＋，Ｍｎ＋＋，Ｚｎ＋またはＣｄ＋アニオンを提供する水溶性塩である（他の酸化状態のイオンを与える塩も使用可能である）。Ｉ２も使用できる。Ａｇ＋イオンを与える硝酸銀（ＡｇＮＯ３）または他の塩などの銀含有塩も使用してもよい。適当な条件は、例えば、２２〜３７℃、１０分以上例えば３０分で、５０ｍＭのＡｇＮＯ３を含む。種々の実施態様において、ｐＨは、１以上で、約４．０から約１０．０の間、約５．０から約９．０の間、約６．０から約８．０の間で例えば約７．０である。例えば、Ｍａｇ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９（７）：１４３７−１４４１，１９９１を参照のこと。典型的なプロトコルは、実施例１中に提供されている。
【０４０８】
種々の実施態様において、上に考察した１つの薬剤による開裂も、伸展可能な末端を発生させるが、種々の実施態様において、開裂後の別の工程を、伸展可能な末端を発生させるために使用してもよい。種々の実施態様において、伸展プローブの末端を、非伸展性にする特性は、リン酸エステル基の不存在であり、伸展可能な末端を発生させることは、リン酸エステル基を添加することからなる。
【０４０９】
１サイクルの間に結紮を受けていないプライマーまたは伸展されたプライマーは、将来のサイクルにおけるそれらの伸展を避けるために、また配列読み取りの位相の逸脱の発生を避けるために、キャップされる。３’−Ｏ−Ｐ−Ｓ−５’チオリン酸エステル連鎖を含む伸展プローブを用いて、５’→３’方向での配列決定を行うとき、例えば、結紮工程または検出工程に続いて、ＤＮＡポリメラーゼおよび非伸展部分、例えば、ジデオキシヌクレオチドまたは貼り付けられたブロック部分を有するヌクレオチドを用いて、非結紮伸展可能末端を伸展することにより、キャッピングを行ってもよい。３’−Ｓ−Ｐ−Ｏ−５’チオリン酸エステル連鎖を含む伸展プローブを用いて、３’→５’方向での配列決定を行うとき、例えば、結紮工程または検出工程に続いて、例えば、ホスファターゼを用いてテンプレートを処理することにより、キャッピングを行ってもよい。他のキャッピング方法も、用いてもよい。
【０４１０】
図４１および図４２Ａ〜図４２Ｄは、テンプレートの５’端末におけるビーズに貼り付けられかつテンプレートの近接端に結合された初期化オリゴヌクレオチドプライマーを有するテンプレートを描写している。種々の実施態様において、テンプレートは、それらの３’端末において、マイクロ粒子に貼り付けられている。種々の実施態様において、初期化オリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレートの遠心端に結合している。プライマーが、テンプレートの遠心端に結合しかつテンプレートが、５’端末におけるビーズに貼り付けられている場合には、プライマーの伸展は、５’→３’方向で起きる。プライマーが、テンプレートの遠心端に結合しかつテンプレートが、３’端末におけるビーズに貼り付けられている場合には、プライマーの伸展は、３’→５’方向で起きる。プライマーが、テンプレートの遠心端に結合している両方の場合には、テンプレートの遠心端からビーズ近くの近接端に向かう方向で、伸展が進行する。
【０４１１】
本出願の発明の詳細な説明のＣ項で考察したように、ＰＣＲエマルジョンの方法またはゲルなどの半固体支持体中での方法を含めた多数の方法で、テンプレートを調製してもよい。さらに、種々のサンプル源および種などから、テンプレートを由来することができる。
【０４１２】
種々の実施態様において、マイクロ粒子は、初期化オリゴヌクレオチドプライマーに結合しており、それらは、その後、テンプレートをビーズに拘束する。ビオチンおよびビオチン結合蛋白を含む連鎖により、ビーズを、初期化オリゴヌクレオチドプライマーに、またはテンプレートに貼り付けることができる。テンプレートは、片末端にビオチン部分を含むことができ、またマイクロ粒子に、ビオチン結合蛋白を設けてもよい。
【０４１３】
種々の実施態様において、伸展工程および結紮工程の前に、オリゴヌクレオチドプライマーをブロッキングして、テンプレートを接触させる。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、テンプレート中のアダプターおよびパドロック領域などの共通の配列に結合する。種々の実施態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、例えば、テンプレート複雑性削減ツールとして作用することにより、潜在的なミスプライミングサイトを除去することにより、および／またはテンプレートの目標領域への伸展オリゴヌクレオチドの接近を有利にすることにより、これらの共通の配列の多くのコピーの存在により生じる問題に対抗する。ブロッキングオリゴヌクレオチドが、酵素で伸展しないように、ブロッキングオリゴヌクレオチドを作ってもよい。
ビオチンおよびビオチン結合蛋白を含む連鎖によって、テンプレートの個体群に貼り付けられたマイクロ粒子を、基板に貼り付けてもよい。ビオチン結合蛋白を、基板に貼り付けてもよい。種々の実施態様において、ビオチンおよびビオチン結合蛋白を含む連鎖によって、単一螺旋のテンプレートは、マイクロ粒子を基板に拘束する。ストレプトアビジンを、ビオチン結合蛋白またはアビジン類の他のメンバーとして使用してもよい。いかなる蛋白およびその結合パートナーも、潜在的に使用できる。
【０４１４】
本教示の態様は、以下の例に照らしてさらに理解されるだろうし、それらは、網羅的でなく、また本教示の範囲を限定するものとして、決して解釈するべきではない。
【実施例】
【０４１５】
実施例１：ホスホロチオレートオリゴヌクレオチドの効率的な分割処理（クリービッジ）と連結処理（ライゲーション）
【０４１６】
本実施例は、３’−Ｓホスホロチオレート連鎖を含む伸展オリゴヌクレオチドの効率的な連結分割処理法を示す実験を説明するものである。
材料と方法
連結シーケンスプロトコル
【０４１７】
テンプレート準備：環状オリゴヌクレオチドによる配列処理可能性を査定し、本方法の所定局面における変動の影響を探索するため、モデルとなる２組のビーズ式テンプレートを作成準備した。本実施例として説明する多様な実験例において、環状オリゴヌクレオチドの連結分割処理の伸展ストランド操作は、３’(R)５’方向に行った。それゆえ、連結処理効率を査定するため、モデルとなるテンプレートを、５’末端のビーズに結合し、３’末端の同じ結合域に設定した。片方の組は、二重鎖ビオチン連鎖経由でステプタビジン被膜された磁気ビーズ（１ミクロン）に結合された短（７０ｂｐ）オリゴヌクレオチドで形成した。それら短テンプレート集団の各自は、同等プライマー結合域（４０ｂｐ）と３’末端の独自配列域（３０ｂｐ）とで構成されている。それら短オリゴヌクレオチドのテンプレート集団を、連結シーケンシング処理テンプレート１―７（ＬＳＴ１―７）と呼ぶ。
【０４１８】
ビーズ式テンプレート集団の２番目の組は、（ヒトｐ５３エキシン由来の）１８３ｂｐスペーサ配列を各テンプレート集団に挿入することにより作成された長ＰＣＲ生成ＤＮＡ断片（２３２ｂｐ）で構成した。テンプレートは、短テンプレート集団と同じ３０の塩基独特の３’末端配列を含む、二重鎖ビオチン含有の順方向プライマーと逆方向プライマーとで増幅した。さらに、水酸化ナトリウム含有バッファー剤でストランドの１つを溶解することにより、テンプレートを１本鎖形状にした。それら長テンプレート集団は、別の同時係属出願に記載されている短フラグメント末端対ライブラリから生成された種を模倣できるよう構成したものであり、長ＬＳＴ１―７と呼ぶ。
【０４１９】
プライマーハイブリッド化：２．５μＬの１００μＭ  ＦＡＭ標識プライマーを、１００μＬの１Ｘ  Ｋｌｅｎｏｗバッファー剤と予備混合した。この溶液に、バッファー剤を取り除いた後、テンプレートを伴って３０μＬアリコット量の磁気ビーズ（１０６／μＬ）を添加し、その後、溶液を十分に混合処理した。テンプレート／プライマーのハイブリッド化処理（ハイブリッド化処理は、６５℃で２分間、４０℃で２分間、氷で２分間で実行した）をして、プライマー／バッファーを除去した後、３ＸＷａｓｈ―１Ｅバッファー剤を使ってビーズを洗浄し、３００μＬ（１０６／ｍＬ）のＴＥＮＴバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＥＤＴＡ、３０ｍＭのＮａＯＡｃ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ―１００を含む）内に再懸濁させた。
【０４２０】
連結処理１：ハイブリッド化されたＬｉｇＳｅｑ−ＦＡＭを伴った２．５Ｘ１０６  ＬＳＴ７のビーズを、１μＬの１００μＭ―ＬＳＴ７−１ノナマー、４μＬの５ＸＴ４リガーゼバッファー剤（インビトロゲン）、１４μＬのＨ２Ｏ、１μＬのＴ４リガーゼ（１ｕ／μＬ、インビトロゲン）の混合物内で３７℃で３０分間培養した。
【０４２１】
分割処理１：ビーズを、１００μＬのＬＳＷａｓｈ１（１ＸＴＥ、３０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む）で３回洗浄した。この溶液の１０μＬアリコット量を取り出して分析のため取り置いた。その後、ビーズ（１Ｘ）を、１００μＬの３０ｍＭ酢酸ナトリウム内で洗浄した。この溶液に、５０μＬの５０ｍＭＡｇＮＯ３を添加し、それら混合物を３７℃で２０分間培養した。その後、ＡｇＮＯ３を除去し、ビーズを１００μＬの３０ｍＭ酢酸ナトリウム内で１回洗浄した。さらに、ビーズを１００μＬのＬＳＷａｓｈ１で３回洗浄した後、９０μＬのＷａｓｈ（ＴＥＮＴバッファー剤）内に再懸濁させた。この溶液の１０mＬアリコット量を取り出して分析のため取り置いた。
【０４２２】
連結処理２：ＴＥＮＴバッファー剤を除去した後、ビーズを１４μＬのＨ２０内に再懸濁させ、１μＬの１００μＭ―ＬＳＴ７−５ノナマー、４μＬの５Ｘ  Ｔ４リガーゼバッファー剤（インビトロゲン）、１μＬのＴ４リガーゼ（１ｕ／μＬ、インビトロゲン）の混合物で３７℃で３０分間培養した。
【０４２３】
分割処理２：ビーズを、１００μＬのＬＳＷａｓｈ１（１ＸＴＥ、３０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む）で３回洗浄し、４５μＬのＷａｓｈ１Ｅ内に再懸濁させた。この混合液の１５μＬアリコット量を取り出して分析のため取り置いた。その後、ビーズを１００μＬの３０ｍＭ酢酸ナトリウム内で１回洗浄し、５μＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウム内で再懸濁させた。さらに、ビーズに５０μＬの５０ｍＭ  ＡｇＮＯ３を添加し、それら混合物を３７℃で２０分間培養した。その後、ＡｇＮＯ３を除去し、ビーズを１００μＬの３０ｍＭ酢酸ナトリウム内で１回洗浄した。そして、ビーズを１００μＬのＬＳＷａｓｈ１で３回洗浄した後、３０μＬのＷａｓｈ１Ｅ内に再懸濁させた。この混合液の２０μＬアリコット量を取り出して分析のため取り置いた。
【０４２４】
実験処理は、図８を参照すればよりいっそう理解できるであろう。図８の上側部分に示すのは、実験手順の概要である。初期化オリゴヌクレオチド（プライマー）をハイブリッド処理して、ビオチン連鎖でビーズに接合されたテンプレート（ＬＳＴ７で示す）を形成した。初期化オリゴヌクレオチドは、５’燐酸塩を含んでおり、その３’末端を燐光ＦＡＭ標識した。２つのノナマー（九量体）オリゴヌクレオチドプローブ（第１の分割可能オリゴと第２の分割可能オリゴ）を、内部ホスホロチオレートチミダイン基（ｓＴ）を含むよう合成した（下線で示す）。第１の分割可能プローブは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使ってプライマー伸展末端を連結処理し、硝酸銀を使って分割処理をした。分割処理により、伸展プローブの端末５ヌクレオチドが除去され、プライマー連結を維持するプローブの部分に伸展末梢部が形成された。第２の分割可能プローブも、連結処理により伸展末梢部を形成し、同様に分割処理を行った。
【０４２５】
連結処理や分割処理の過程をモニターするために、蛍光細管式電気泳動ゲルシフト検査を実施した。この検査において、プライマーがハイブリッド化されて、テンプレートストランドが形成されるため、５’燐酸塩は、オリゴヌクレオチド製プローブの連結処理用基質として作用した（フルオロフォアは流動性細管ゲル電気泳動のためのリポータの役目をする）。各工程終了後に、一定量のビーズを分析のため取り置いた。オリゴヌクレオチド製プローブの連結処理に続いて、磁石を使って磁気ビーズを回収し、プライマーと連結処理したプローブからなる連結処理種を、熱変性によりテンプレートビーズから取り出し、標識サイズ基準の自動ＤＮＡシーケンシング器（ＡＢＩ３７３０）を使って蛍光細管電気泳動処理した（リサミンラダー、サイズ幅１５〜１２０ヌクレオチド、クロマトグラフ上ではオレンジ色ピーク群として表示、図８を参照）。標準的なゲルシフトにおいては、ポテンシャルピークは、ｉ）プライマーピーク（プライマー伸展の不足または非伸展に起因する）、ii）アデニル酸塩ピーク（ＤＮＡリガーゼ動作による非生成結合節の５’末端での残留アデノシンの付加に起因する。図８Ｆのメカニズムを参照、また、Ｌｅｈｍａｎ，Ｉ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８６：７９０〜７９７、１９７４、を参照のこと）、iii）達成ピーク（オリゴ製プローブの付着に起因する）。連結処理効率の調べるのにゲルシフト検査を使用する長所とは、ピークの区域が各種の濃縮に直接に相関することである。
【０４２６】
図８Ａに示すのは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼとフォスフォジエステル連鎖（図８Ａの左側部に図示）のみを含む正整合プローブを使って行った制御連結処理である。オレンジ色ピークは、サイズマーカーを示している。左側の青色ピークは、連結処理のない状態でのプライマーの位置を示す。正整合プローブの連結処理の結果、左側へのシフトが発生する（矢印）。図８Ｂに示すのは、内部Ｔチオール酸塩基（図８Ｂの左側部に表示）を含むプローブを使って同じ条件で実施した連結処理である。結果、制御プローブによる処理と同じシフトが表れた（矢印）。その後、連結処理されたホスホロチオレートブローブを含むビーズ連鎖テンプレートを、適度なプローブ分割が起こるよう硝酸銀で培養した。ゲルシフト分析の結果、左方向にシフトした４ｂｐ分割生成物の出現から効率的な分割処理効果が確認された（図８Ｃ参照）。期待される分割生成物を、図８Ｃの左側部に示す。次に、分割されたビーズ式テンプレートを、連結処理の第２段階で処理した結果、右方向にシフトした１３ｂｐ伸展生成物の出現から生産的な連結処理効果が確認された（図８Ｄ参照）。期待される分割生成物を、図８Ｄの左側部に示す。第２段階の分割処理も、（図８Ｅに示す）期待される左方向にシフトした８ｂｐ分割生成物の例のごとく、効率的な複数回の分割処理工程が可能であることを示している。それら処理の結果から、ホスホロチオレート連鎖を含むプローブの連結処理と分割処理が成功裏に行われることが判明した。
【０４２７】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使った別の実験例でも高い達成率が確認されたが、本実施例においての連結処理が１００％達成には至っていないのは事実である（下記を参照）。連結処理の達成は望ましいものではあるが、必須要件ではない。例えば、上記で説明した連結処理の後に、５’フォスフォターゼによる処理を行って、未連結処理の５’末端に効果的な「キャップ処理」を施すことも可能である。その場合でも、しかしながら、連結処理可能な分子の消耗のせいで、実施可能な連結処理の連続処理回数には制限がある。所定回数の連続連結処理においては、読み取り長さは、それぞれ連結処理／分割処理サイクル完了後に保持されているプローブ長、および、連続処理回数に依存するものであり、各サイクルに続いてはプライマーの除去とプライマーのハイブリッド化の処理が行われ、プライマー結合サイトが異なる部分に結合されるが、所定のテンプレートで実施可能であって、「リセット」数と呼ぶこともできる。このことは、プローブの５’末端に向けて位置する分割可能連鎖を有する長いブローブを使用する場合には問題となる。本発明者らの経験では、ヘキサマー製プローブは、オクタマーやそれ以上の重合体のプローブよりも、非連結可能なアデニル酸化生成物の量が多くなる。そのため、オクタマーやそれ以上の重合体のプローブでは、連結処理がほぼ達成される（下記を参照）。加えて、ヘキサマー製プローブの５’末端に蛍光片を添加すれば、連結処理の効率が低下する。ただし、オクタマー製プローブへ蛍光片を添加しても、効果はないかわずかである。そのため、オクタマーやそれ以上の重合体のプローブの使用が好ましいと考えられる。
【０４２８】
ホスホロチオレート連鎖と退化低減ヌクレオチドを含むプローブの連結処理や分割処理の追加的実施例（下記に説明）では、連結処理した伸展プローブの３’末端の特性や選択性、ゲル内連結分割処理、信号の最小損失でのプライマーのハイブリッド化と除去の連続サイクル、３’→５’伸展のためのＴ４またはＴａｑリガーゼの１００％忠実性、連結処理された伸展プローブの４色スペクトル分解能を確認した。本方法を実施するため、自動システムも製作した。
実施例２：退化低減ヌクレオチドを含むホスホロチオレートオリゴヌクレオチドの効率的な分離処理と連結処理
【０４２９】
伸展オリゴヌクレオチオの忠実度（フィデリティ）およびそれに続く連結処理の効率性への影響は、プローブ長さの考察に関係する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼの忠実度に関しては、接合部後側の第５塩基以下では急激に低下することが判明している（Ｌｕｏｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ，２４：３０７１〜３０７８、３０７９〜３０８５、１９９６）。新規の連結接合部の５’側で整合不良が発生した場合には、消耗により連結処理効率が低下するが、背景信号の位相ずれや上昇（合成法によるポリメラーゼ由来シーケンシング操作で見られる重要な障害）は起こらない。
【０４３０】
プローブ組は、非特定のＤＮＡのデノボ配列を実現するため、どのようなＤＮＡ配列のハイブリッド化処理も可能である。しかしながら、標識プローブ組の複雑度は、４倍縮退化塩基の長さと倍数に連れて指数的に大きくなる。加えて、複雑プローブ組は、全プローブ種の状態をほぼ等価に維持しつつ合成処理するには課題があり、純化が困難である。また、各種の濃縮度を一定に保つには、プローブ混合における濃縮度を高くする必要がある。この複雑性に対する１つの対策法として、４倍縮退塩基に代えて、所定位置では、デオキシイノシンなどの万能塩基からなるヌクレオチドの使用が挙げられる。
【０４３１】
１２個のオクタヌクレオチド製プローブを、４倍縮退塩基（Ｎ；Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの等モル量）と、オクタマー内の多様な位置での万能塩基イノシン（Ｉ）で作成した（イノシンは、二座水素をＢ−ＤＮＡの４つのカノニック塩基のいずれかと結合可能にし、イノシン塩基対の安定性の順序はＩ：Ｃ＞Ｉ：Ａ＞Ｉ：Ｔ≒Ｉ：Ｇである）。これらプローブ設定を評価する１つの目的は、イノシン塩基の存在下での効率的連結処理を支援を維持しつつ、オクタマーの複雑度をいかに低くするかを判定することである。
【０４３２】
研究当初においては、数個のオリゴヌクレオチド製プローブを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使って連結処理してビーズ式テンプレート（長ＬＳＴ１）を作成した。連結処理と同時に、フルオロフォア標識プライマー（３’ＦＡＭプライマー）は、連結処理されたオリゴヌクレオチド製プローブの量と比例して右側にシフトする。プローブ設定ＮＩ８−９では、プローブの効率的な連結処理のせいで、プライマー集団の９９％超程度が右側へシフトして、最も高い達成率を示した（図９参照）。それらの反応は２５℃で実行したが、反応温度を３７℃に上げると、連結処理の効率が低下し、達成率はいっそう変動が大きくなった。
【０４３３】
データ検査をより詳細にすると、接合部の３’側の前から５つのヌクレオチド内のイノシン塩基の数が少ないプローブ（下線で示す）では、連結処理の効率がより高いことが判明した。連結処理の効率に関するさらなる審査およびポテンシャルシーケンシングコンテキスト効果を評価するため、連結処理接合部の前から５つの塩基３’内の残留単鎖イノシンを有する４個のオリゴヌクレオチド製プローブを、全テンプレートでスクリーン検査した。図１０に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使った複数テンプレートの選択プローブ組成でのゲルシフト検査にて評価した連結処理達成を示す。上記の当初試験からのデータから、連結接合部の前から５つの３’位置内に残留イノシンがあると（下線で示す）、連結処理効率つまり達成率が配列依存し変動することが判明した。オリゴヌクレオチド製プローブ設定ＮＩ８−９で、試験した全テンプレートで９９％超の達成率が観察され、オクタマーの効率的な連結処理が一貫して確認された。
【０４３４】
他の規定に制限されない場合、データ結果（アデニレート中間生成物の存在を含む）から、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのための核ＤＮＡ結合サイト内の不要なイノシン塩基対は、酵素結合や続く連結処理を劣化させるに十分なＤＮＡプロテイン複雑性を不安定にすることが判明した。しかしながら、そのような不安定化イノシン塩基対が連結処理されたオリゴヌクレオチド製プローブの忠実度に影響するかどうかは、興味ある問題として残る。
実施例３：プローブ連結処理の忠実度
【０４３５】
Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼなどのバクテリアＮＡＤ依存性リガーゼを検査し、ニッククロージャ動作しない３’側で整合不良がある連結処理接合部でのシーケンシング忠実度が高いことが記録された、ただし、５’側の整合不良は許容度はわずかである（Ｌｕｏｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ，２４：３０７１〜３０７８、３０７９〜３０８５、１９９６年）。他方、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼではそれほど厳密ではなく、接合部の３’側と５’側の両方とも整合不良が存在した。それゆえ、本発明者らのシステムのコンテキストにおいて、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼとの比較で、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼのプローブ連結処理の忠実度を評価することは重要である。
【０４３６】
本発明者らは、標準的なＡＢＩシーケンシング技術を使って連結処理されたオリゴヌクレオチドのシーケンシング忠実度を評価するための２つの方法を開発した。第１の方法は、連結生成物をクローン作成および配列作成のためのものである。この方法では、連結処理伸展生成物をアダプタ配列に付加し、クローン化し、バクテリア内に転移した。個別クローンを、取り出して、シーケンシング処理して、連結処理接合部の各位置での整合不良の発生頻度の定量評価を行った。第２の方法は、連結処理生成物のシーケンシングを直接に設定するものである。この場合、１本鎖連結生成物を、ビーズ式テンプレートから変性させて、補助プライマーを使って直接にシーケンシング処理する。その結果、精度の低い位置では、生成配列トレスに多数の重複ピークが出現し、その位置でのシーケンシング忠実度を示す定性結果値を提供できた。
【０４３７】
第１の方法を、Ｔ４とＴａｑのＤＮＡリガーゼによるプローブ連結処理の相関忠実度を判断するのに利用した。単鎖ビーズ式テンプレート集団（ＬＳＴ１）をハイブリッド化して、開始オリゴヌクレオチドとして使用する万能シーケンシングプライマーを形成した。次に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１Ｘ１０６ビーズにつき１５Ｕ）とＴａｑＤＮＡリガーゼ（１Ｘ１０６ビーズにつき６０Ｕ）を使って、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｎ７Ａ、３’ＡＮＮＮＮＮＮＮ５’、２０００ｐモル）の存在下で溶液由来の連結処理反応を３７℃で３０分間行った（図１１の表Ａを参照）。連結処理生成物を、クローン処理およびシーケンシング処理して、各ＤＮＡリガーゼの連結処理接合部の３’側（位置１〜８）のポテンシャル忠実度を測定した（図１１、表Ｂと表Ｃを参照）。結果から、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの前から５番目までの位置での忠実度はＴａｑＤＮＡリガーゼのものと同じであったが、位置６〜８での忠実度は低いことが判明した。さらに、３個の変性イノシン含有プローブ（３’−ＮＮＮＮＮＩＩＩ−５’、３’−ＮＮＮＮＮＩＮＩ−５’、３’−ＮＮＮＩＮＮＮＩ−５’）のための全７つのテンプレート（ＬＳＴ１−７）の連結処理接合部でのＤＮＡ配列を判断するためのクローン実験を続いて実行することにより、結果数値を立証した。研究の結果、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでは、位置６〜８の連結処理接合部でのシーケンシング忠実度は低いが、検査した全テンプレートでの前から５番目までの位置での忠実度は高いことが確認された（データは表示せず）。
【０４３８】
直接シーケンシング方法は、変性イノシン含有プローブでＴ４ＤＮＡリガーゼの忠実度を判断するのに使用した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼとビーズ式テンプレートを有するオリゴヌクレオチドプローブを、２５℃と３７℃での連結処理反応で検査した。オリゴヌクレオチドプローブの連結処理効率は、ゲルシフト法を使って測定した（図１２、表Ａを参照）。ＡＢＩ３７３０Ｘ１ＤＮＡ分析器を使って連結処理反応の直接シーケンシングを行って、オリゴヌクレオチドプローブ連結処理でのＴ４ＤＮＡリガーゼの忠実度を測定した（図１２、表Ｂを参照）。正整合オリゴプローブと２個の代表変性イノシン含有オリゴプローブ（ＮＩ８〜９、ＮＩ８〜１１）の連結処理のの結果、達成率が９９％超で、整合不良（シーケンシングトレスの複数ピークの不在）の発生頻度は非常に低かった。これらデータから、プローブの連結処理が効率よく行われ。シーケンシング忠実度も高いことが判明した。
【０４３９】
さらなる試験例として、単鎖ビーズ式テンプレート集団（ＬＳＴ１）をハイブリッド化して、開始オリゴヌクレオチドとして使用する５’ホスフェートを含む万能シーケンシングプライマーを形成した。次に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（２５０、０００ビーズにつき１Ｕ）を使って、変性イノシン含有オリゴヌクレオチドプローブ（３’ＮＮＮＮＮiii５’または３’ＮＮＮＮＮiＮi５’または３’ＮＮＮｉＮＮＮi５’、６００ｐモル）の存在下で溶液由来の連結処理反応を３７℃で３０分間行った。連結処理生成物をクローン処理し、クローンを取り出してシーケンシング処理した。シーケンシング忠実度は、連結処理接合部の各位置でのクローン数を算定することにより判断した。結果を、図１２の表Ｃ〜表Ｆに示す。これら研究の結果から、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの変性イノシン含有プローブの３’→５’連結処理での忠実度は前から１〜５番目までの位置では高い値であることが判明した。
実施例４：ゲル内の連結処理と分割処理
【０４４０】
オリゴヌクレオチドサイクル連結処理の方法を研究、開発、最適化するための当初の実施例は、上記で説明したビーズ式テンプレートを溶液内で使用した実験例であった。実験例の第２組では、ビーズ式テンプレートをスライド板上のポリアクリルアミドゲル内に載置して、連結処理と分離処理を実行した。
【０４４１】
スライド板は、５％ポリアクリルアミドと共に、それぞれに１本鎖ＤＮＡテンプレートのクローン集団が結合された百万単位のビーズを混合し、ガラス製スライド板上に重合形成させて作成した。ビーズ含有のポリアクリルアミド溶液を収容するのに、テフロン（登録商標）製マスクを使用した。図１４（天側部）に示すのは、Ｃｙ３標識プライマーをハイブリッド化してポリアクリルアミドゲル内に不導態化した、結合されたテンプレートのビーズが存在するスライド板の一部の蛍光画像である。（このスライド板は、ある実験で使用されたものであり、ここでは、スライド板の代表として表示する。）図１４（底側部）に示すのは、ポリアクリルアミド溶液を収容するためのテフロン（登録商標）マスクを装備したスライド板の概略図である。
【０４４２】
スライド板を手で所定の溶液に浸す、あるいは、スライド板を自動層流セル内に配置することにより、スライド板に反応処理を施した。その当初研究から、効率的なゲル内連結処理が、そのスライド板のポリアクリルアミドマトリクス内に不動態化されたビーズに結合したテンプレート上で行えることが判明した。図１５に示す実験例では、１本鎖ＤＮＡテンプレートのビーズが、アクリルアミドとＤＡＴＤを含有するスライド板上で不動態化されている。重合処理の後、万能３’フルオロフォア標識５’ホスホリレート製プライマー（Ｓｅｑプライマー）をゲル内で拡散し、ハイブリッド処理を施した（表Ａ）。次にスライド板を、不要なｓｅｑプライマーを除去するため洗浄し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ）とオリゴヌクレオチドプローブを有する連結処理カクテル液を塗布し、３７℃で３０分間培養した。その後スライド板を、アクリルアミドポリマーを消費、かつ、ビーズ式テンプレート集団を排出できるよう、バッファー含有過沃素酸ナトリウム（０．１Ｍ）内で培養した。連結処理生成物を、熱処理テンプレートストランドから変性させ、回収して、上記で説明したゲルシフト検査により分析した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの存在下におけるオクタマー製プローブで行うゲル内連結処理から、効率的に連結処理されたビーズ式テンプレート集団において、ゲル内オリゴヌクレオチド連結処理の効率が９９％超であることが判明した（表Ｃ）。
実施例５：４色検査
【０４４３】
検査効率を最大にするためには、その塩基添加生成物に対する固有の標識を有する１組のオリゴヌクレオチドプローブを用意するのが望ましい。このことは、図１５に概略的に示すような適当な励起放出フィルターを装備した自動シーケンシング器では実現されている。プローブの特性や選択性の問題を表面化するため、３組のオクタマープローブを準備した。第１の組は、それぞれ異なる３’塩基と５’染料標識を備えた４つの個別のテンプレート集団に補足して、４個のオクタマーからなる。第２の組は、それぞれ個別の３’塩基と５’染料を有する７個の個別オクタマーからなる。第３の組は、それぞれ異なる５’染料標識で同定された固有３’末端を有する４個の変性イノシン含有オクタマー製のプローブに対応している。
【０４４４】
４色スペクトル認識を確実にするため、４個の固有テンプレート集団を検査するのにプローブ組＃１を利用した（図１６参照）。４個のビーズ結合した固有の１本鎖テンプレート集団を有するスライド板を準備し、ポリアクリルアミド内に載置した（表Ａ）。各ビーズには、テンプレートのクローン集団が備わる。５’燐酸塩を含む万能シーケンシングプライマーに現場ハイブリッド処理を施し、４個の固有のフルオロフォアプローブ（Ｃｙ５、ＣＡＬ６１０、ＣＡＬ５６０、ＦＡＭ；各１００ｐモル）とＴ４  ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／スライド板）を含むオリゴヌクレオチドプローブ混合物を使って連結処理反応を行った。スライド板は、３７℃で３０分間培養し、不要なプローブを除去するため洗浄した。次に、スライド板を白色光で撮像し、４つのバンドパスフィルター（ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ＴｘＲｅｄ、Ｃｙ５）で蛍光励起して白色画像（表Ｂ）を作成した。蛍光撮像は、連結処理の前後で行った。各プローブ集団を疑似着色し（表Ｃ）、画像スペクトル同定値をプロット処理し、信号重畳を最小限にした（表Ｄ）。
実施例６：ゲル内連結処理の特性と選択性の説明
【０４４５】
３’末端の特性を確認するため、プローブ組＃２を使って単鎖テンプレート集団を検査した（図１７参照）。ポリアクリルアミドゲル内に載置した単鎖テンプレート集団（ＬＳＴ１．Ｔ）を有するビーズからスライド板を準備し、万能シーケンシングプライマーで現場ブリッド処理を施した（表４）。ゲル内連結処理反応は、それぞれ３’塩基により区別される４個の５’末端標識プローブからなるオリゴヌクレオチドプローブ混合物を使ってＴ４  ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／スライド板）で行った。スライド板は、３７℃で３０分間培養し、不要なプローブ集団を除去するため洗浄した。次に、スライド板を白色光で撮像し、４つのバンドパスフィルター（ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ＴｘＲｅｄ、Ｃｙ５）で蛍光励起して塩基画像（表Ｂ）を作成した。連結処理の前後で行った蛍光撮像の結果、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでのゲル内連結処理の後にスペクトル重複が不在の単鎖ＦＡＭ由来プローブ集団（青色点）の存在が確認できた（表Ｃ、表Ｄ）。これらデータから、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼのプローブ特性は厳密ではなく、連結処理接合部の３’末端塩基により決定されることが判明した。
【０４４６】
さらに、３’末端の特性および選択性を立証するため、プローブ組＃２を使って、量が異なっており、単鎖塩基差を有するビーズ式テンプレート集団の混合物を特定した。図１８の表Ａに示すように、それぞれ４つのテンプレート集団の１つを含み、それに結合した単鎖ヌクレオチド多形現象（ＬＳＴ１；Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）を有するビーズの混合物からスライド板を準備した。ビーズを、スライド板上のポリアクリルアミドゲル内に載置した。表Ｄに概略的に示すように、ビーズ式テンプレート集団は多様な異なる頻度で使用した。次に、スライド板を、万能シーケンシングプライマーで現場ブリッド処理を施した。ゲル内連結処理反応は、それぞれ３’塩基により区別される等モル量（各１００ｐモル）の４個の５’末端標識プローブからなるオリゴヌクレオチドプローブ混合物とＴ４  ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／スライド板）を使って行った。スライド板は、３７℃で３０分間培養し、不要なプローブ集団を除去するため洗浄した。次に、スライド板を白色光で撮像し、４つの個別のバンドパスフィルター（ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ＴｘＲｅｄ、Ｃｙ５）で蛍光励起して塩基画像（表Ｂ）を作成した。個別のプローブ画像は、重ねてから疑似着色した（表Ｃ）。蛍光画像を一覧表示するため、ビーズ呼出ソフトを利用した。この結果は表Ｄに示すが、観察した連結処理頻度（Ｏｂｓ）が期待される頻度（Ｅｘｐ）と相関関係を有することが確認できる。これらデータから、複数のテンプレートの存在下における連結処理後には、プローブ特性や選択性が高いことが判明し、かつ、単鎖ヌクレオチド多形現象（ＳＮＰｓ）、つまり、連結処理による集団の各自の遺伝的ＤＮＡの伸展形の単鎖ヌクレオチド塩基内で発生する変位を検出する能力が確認できた。
実施例７：４色変性イノシン含有伸展プローブを使った連結処理の特性と選択性の説明
【０４４７】
４色変性イノシン含有オリゴヌクレオチドプローブのプールからプローブ連結処理の特性や選択性を判断するため、プローブ組＃３を使って、別の組の実験を行った。その結果を図１９に示す。上記で説明したように、ビーズ式スライド板を作成したが、本例では、ビーズ上の異なる量の４つの個別の１本鎖テンプレート集団を準備し、万能シーケンシングプライマーで現場ハイブリッド処理を施した（表Ａ）。ゲル内連結処理反応は、５つの変性塩基（Ｎ；複雑性４５＝１０２４）、２つの万能塩基（Ｉ、イノシン）、特定の５’フルオロフォア（Ｇ−Ｃｙ５、Ａ−ＣＡＬ６１０、Ｔ−ＣＡＬ５６０、Ａ−ＦＡＭ；各６００ｐモル）に対応する３’末端の周知の単鎖ヌクレオチドからなるオクタマーで構成されるプローブプールを使って行った。スライド板は、３７℃で３０分間培養し、不要なプローブ集団を除去するため洗浄した。次に、スライド板を白色光で撮像し、４つのバンドパスフィルター（ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ＴｘＲｅｄ、Ｃｙ５）で蛍光励起して塩基画像（表Ｂ）を作成した。個別のプローブ画像は、重ねてから疑似着色した（表Ｃ）。蛍光画像を一覧表示し、ビーズ呼出ソフトを利用して各連結処理生成物の頻度を一覧表示しているが（表Ｄ）、ビーズ信号値の上側９０％を表すフィルター処理データと未処理の生データのスペクトル拡散図を表Ｅに示す。データから、観察した連結処理頻度（Ｏｂｓ）が各テンプレートの周知の濃度に基づいた期待される頻度（Ｅｘｐ）と相関関係を有することが判る。これにより、変性万能塩基含有プローブプールは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの特定選択的ゲル内連結処理を実行するのに利用可能であることが確認できる。
実施例８：ゲル内の初期化オリゴヌクレオチドのハイブリッド化と除去のサイクル処理の説明
【０４４８】
自動フローセル（下記を参照）内に搭載された顕微鏡用スライド板上のゲル内に不動態化されたテンプレートでの実験から、最小限の信号ロスでスライド板のゲル内の配置されたビーズに、初期化オリゴヌクレオチドをアニール処理しストリップ処理する複数サイクル操作を施すことが可能であることが判明した。使用したのは、Ａ４４塩基蛍光標識初期化オリゴヌクレオチドである。初期化オリゴヌクレオチドは、図２０ではプライマーとして示す。上記で説明したように、ポリメラーゼ由来の合成体シーケンシング処理手順の大きな短所の１つは、それぞれのテンプレートストランドで発生する正負両方向の位相ずれの現象である。正方向位相ずれは、ヌクレオチドの生長ストランドとの関係不良の場合に発生し、その結果、特定のストランドの塩基配列が残りのテンプレートから得られる配列よりも前にずれて、ｎ＋１塩基コール単位の位相ズレとなる。より一般的な負方向位相ズレは、ストランドが完全に伸展していない場合に発生し、その結果、背景塩基コールが生長ストランドより遅れる（ｎ−１）。伸展生成物を効率的にストリップ処理し、個別位置の初期化オリゴヌクレオチドのハイブリッド化によりテンプレートを「リセット」処理する能力は、信号消耗なし、または、わずかの消耗にて読み取り長さを長くすることができる。
実施例９：自動シーケンシングシステム
【０４４９】
本実施例では、１個またはそれ以上の数のテンプレートから配列情報を収集するのに使用できる自動シーケンシングシステムのいくつかの事例を説明する。実施例において、テンプレートは、顕微鏡用ガラススライド板などのほぼ平坦な基板上に配置されるものとする。例えば、基板上に配列されたビーズにテンプレートを接合しても構わない。本システムの写真を、図２１に示す。本システムは、自動オートフォーカスステージを有するＣＣＤカメラを（横側に）備えたオリンパス製エピフルオロセント顕微鏡本体を基本設計としている。回転ホルダー内の４つのフィルターキューブ体のおかげで、多様な励起放射波長域での４色検出を可能にしている。ステージ上には、スライド板などの基板を受容できるよう開閉可能な、ペルチェ温度制御装置を有するフローセル（ゲルなどの半個体支持体を収容する区域の端部周辺を密閉するためのガスケットを備える）が搭載されている。フローセルの縦方向構造は、フローセル上端部からの気泡の脱出を可能にしている。各洗浄工程の前に全部の試薬を排出できるよう、セルには空気がめいっぱい充填されている。フローセルは、４つの異なる標識プローブ混合物、分割処理用試薬、所望の試薬、酵素平衡バッファー剤、洗浄バッファー剤、空気を単一出口からフローセルへ配出するための、２個の９ポート式Ｃａｒｖｏ製シリンジポンプを備えた液体処理器に接続されている。システムの運転は完全に自動化されており、複数のＩ／Ｏ端子を有する専用コンピュータを使った制御ソフトによるプログラム化も可能である。１．３メガ画素冷却ＣＣＤとしてＣｏｏｋｅ製のセンシカムカメラを利用しているが、これより感度の高いまたは低いカメラの利用も可能である（例えば、４メガ画素、８メガ画素など）。フローセルには、１ミクロン特色サイズの０．２５ミクロンのステージが備わっている。
実施例１０：画像の作成と処理法
【０４５０】
本実施例では、それに接合された標識核酸を有するビーズ配列から画像を作成し処理する代表的方法を説明する。正確な特徴認識とアラインメントがあれば、各撮影画像の信頼性高い分析が容易となる。特徴は、各ビーズの最も密度の高い画像以外の画像を捨去することにより認識可能である。所定画像のピクセル値はヒストグラムに分布させるが、背景部分の画素は廃棄して、残りのピクセル値を保存するのである。ビーズ全部がほぼ同じ濃度である一様な画像の場合、アルゴリズムを使えばピクセル値の下位から８０〜９０％を排除することができる。ゆえに、上位１０〜２０％のピクセル値の画素をスキャンして、４画素半径範囲のローカル最大値で認識する。その範囲域での平均濃度は、ペリメータの平均濃度と同じように記録しておく。それら値から、通常の分布範囲が判定でき、分布範囲外の値を有する画素は排除する。当初に無視した画素のパーセンテージ、円形区域の大きさ、通常の分布域内の可能ビーズを除去するカットオフ値は、すべてパラメータに置き換えれば、必要なときに調整可能である。アラインメントは、アラインメント組内の各画像の特徴マトリクスの作成により実現できる。結果となるマトリクスから、最適アラインメントを特定するための最大頻度のｘ、ｙ座標のオフセット値を検出する。
【０４５１】
ビーズ画像は、伸展プローブ追加の前にＣｙ５チャンネル（シーケンシングプライマーに対応する）で収集される。それら画像は、各ビーズの蛍光単位（ＲＦＵ値）としてポテンシャル座標と生信号強度をマーキングする特徴マップを作成するのに使用する。続く各二重鎖伸展で、Ｃｙ３標識ヌクレオチドの添加の前後両方で組の画像を獲得する。それら画像を配列してオリジナルのＣｙ５画像を作成し、ＲＦＵ値を各ビーズに割り当てて記録する。ベースライン修正を行うには、各塩基添加の非標識画像（伸展前）と標識画像（蛍光添加）間の濃度差を差し引けばよい。そして、このベースライン減算値を各特徴のＣｙ５画像の濃度で正規化して、ビーズの伸展の有無を判断する基準値を作成するのである（例えば、ビーズに接合された二重鎖が伸展している場合はビーズ伸展が行われたと判断する）。本方法を使えば、スライド１枚につき画像が約１３００枚にて、画像１枚につき何千単位の特徴を分析することが可能となり、実験毎の５〜１００百万個のテンプレート種を分析できる。またアルゴリズムは、さらに効率を増加させるために、後日ＭＡＴＬＡＢやＣ＋から簡単に入手できるよう設定されている。
実施例１１：ビーズのアラインメントとトラッキングおよび配列復号
【０４５２】
本実施例では、それに接合された標識核酸を有するビーズの配列からの画像処理、および、入手データからの配列判断のための代表的方法を説明する。
【０４５３】
画像分析は、ビーズの大きさに適合した直径のゼロ積分円形トップハットカーネルを使って画像を畳込むことから開始する。これにより、背景画像は自動的にゼロへと正規化されるが、ローカル極大値から個別のビーズの中心は認識される。極大値は配置されるが、その他のローカル極大値から離反した値をアラインメント点として使用する。各画像のアラインメント点は、時系列で演算される。各画像対においては、アラインメント点を比較して、全部の普通アラインメント点の変位平均値に基づいて変位ベクトルを算定する。これにより、低画素分解能での対画像変位値が獲得できる。
【０４５４】
画像がＮ枚の場合、Ｎ＊（Ｎ−１）／２の対画像変位値が存在するが、このうちのＮ−１だけが独立数であって、残りの値は独立値群から算出できる。例えば、画像１と画像２間および画像１と画像３間の変位値の測定から、画像２と画像３間の変位差が判断できる。画像２と画像３間の変位測定値が判断数値と同じでない場合には、測定値が不一致であるといえる。この不一致の度合を数量単位として使えば、アラインメントのアルゴリズムの作用の善し悪しを計測することができる。本発明者らの当初試験における、各面での０．１画素よりわずかに小さな不一致数値を提示する（図２３を参照）。
【０４５５】
画像の時系列のアラインメントの完了後の、個別のビーズのトラッキング方法は２種類ある。ほとんどのビーズが別のビーズに接触していなくてもビーズの濃度が低い場合は、各ビーズの光学的質量中心を特定して、ビーズ周囲の区域の積分してビーズ濃度を算定する。ビーズの濃度がほとんどのビーズが接触するほど高すぎる場合は、その周囲の暗い背景範囲からの各ビーズの特定が不可能となる。しかしながら、低画素分解能で全画像をアラインメントすれば、同時期での隣接画素との相関性を演算することにより、同じビーズに属する画素を特定することができる。高い相関性の画素対は、十分に同じビーズに割り当てことが可能となる。同様の技法を、ＤＮＡシーケンシングゲルでのレーントラッキングに適用することも可能である（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ａ．Ｐ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ７  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９３）。全４色時系列でのビーズのトラッキングが完了すると、プローブオリゴヌクレオチドの３’塩基に対応する色を認知することにより、配列を復号処理できる。
実施例１１：処理能力算定
【０４５６】
一般的に、シーケンシングシステムの処理能力は、システムが作成可能な一日あたりの画像枚数と、画像毎の配列データのヌクレオチド（塩基）の数とで基本的に決まる。演算の基本は、カメラの１００％利用に基づく。各ビーズを４色で撮影して１個の塩基の特性を判定できると仮定すると、１つのカメラによる４枚の画像、２つのカメラによるそれぞれ２枚の画像、４つのカメラによる各１枚の画像のいずれの利用も可能である。４つのカメラによる撮影の場合、その他の場合よりも処理能力がきわめて高くなるため、実施例におけるシステムではその方法を採用している。
【０４５７】
本発明者らの当初試験から、画素濃度が、ビーズ１個について５０画素、つまり５．４平方ミクロンであるとき、標準的画像分析のためには十分な濃度であることが判明した。４メガ画素ＣＣＤカメラ（市販）を使えば、各ＣＣＤフレームで約８０、０００個のビーズが撮影できる（本発明者らの最近の画像データに基づく）。別個のカメラを４枚の画像を撮影して、フローセル上での次のフィールドへ移動するのに、わずか１．５秒しかかからない。ビーズの７５％から有益な情報が得られるとすると、収集できる生配列データはおよそ８０、０００ビーズ＊０．７５／１．５＝４０、０００塩基／秒である。
【０４５８】
カメラ利用を１００％に維持する場合の１つの主要な問題点は、時間の同期であり、フローセル全部を撮影するのに必要な時間中に連結処理／分割処理化学の１サイクルを完遂しなければならない。伸展、分割、連結のサイクルに要する時間の合理的な算定値は、１１／２時間（５、４００秒）である。この５、４００秒では、フローセルでの十分なサイズであるおよそ１５ｍｍＸ４５ｍｍの面積の１、８００画像フィールドをカバーできる。４つのカメラを採用したシステムの処理能力のひかえめな算定値は、フローセルが１５ｍｍＸ４５ｍｍの場合、毎秒４０、０００塩基となる。この数値は、本発明者らが同じ装置で実験した結果である、約６５０塩基読み取り長（毎秒２０塩基）で、１日につき２８運転数の能力では、およそ２、０００台分のＡＢＩ３７３０ｘｌシーケンシング処理器の処理能力と等しい。ビーズ濃度を２．５倍にして画像１枚につき２００、０００にすると、処理能力の増加は毎秒１００、０００塩基となり、ＡＢＩ３７３０ｘｌ装置のおよそ５、０００台分に匹敵する。この処理能力による１日の全処理能力は、１日につき約８．６Ｇｂであり、１２Ｘヒトゲノム配列に必要な時間は約４．２日となる。
【０４５９】
ここで説明したシーケンシング方法は、さまざまの異なるシーケンシング装置や画像撮影処理方法などを利用して実行可能である。例えば、米国特許第６、４０６、８４８号、第６、６５４、５０５号、ＰＣＴ公報第ＷＯ９８０５３３００を参照のこと。
実施例１２：テンプレート合成体のための微細粒子の作成方法
【０４６０】
本実施例で説明するのは、それに接合した増幅プライマーによる微細粒子（本実施例では磁気ビーズ）のプロトコル作成方法であり、各粒子に接合したテンプレート分子のクローン集団を形成できるようテンプレートの増幅（例えば、ＰＣＲにより）を可能にする方法である。一般的に、クローンＰＣＲ反応においては、増幅ビーズには１個のプライマーが必要である。プライマーは、共有結合し、あるいは、ビオチン標識化し、ビーズ表面のストレプタビジンに接合される。それに接合されたテンプレート分子のクローン集団を有するビーズを作成するのに、実施例１３で説明するようなエマルジョンＰＣＲ反応などの標準的なＰＣＲ反応（例えば、ミクロ滴定プレートやチューブなど）から作成可能である。
【０４６１】
材料
１ｘＴＥ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、  １ｍＭ  ＥＤＴＡ
１ｘＰＣＲバッファー剤：（サーモポリバッファー、ＮＥＢ）
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．８)
１０ｍＭ  ＫＣｌ
１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４ 
２ｍＭ  ＭｇＳＯ４
０．１％  トリトンＸ−１００
１Ｍ  ベタイン（１ＸＰＣＲ−Ｂバッファー剤にだけ添加）
１Ｘ結合洗浄バッファー剤
５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１Ｍ  ＮａＣｌ
【０４６２】
ＤＮＡ捕捉プライマー（２０ｍｅｒ、５００μＭストック）
【０４６３】
二本鎖ビオチン−（ＨＥＧ）５−ＰＩ：５’−二本鎖ビオチン−（ＨＥＧ）５−ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＴＡＧ  ＣＧＡ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＴＡ―３’
【０４６４】
（ＨＥＧ）５＝ヘキサエチレングルコールリンカー、１８カーボン含有スペーサ、使用可能な複数の異なるスペーサ片の１つ。例えば、ビーズ表面からオリゴのＰ１プライマー部分を持ち上げるのに、スペーサ追加は有効である。本文で説明したプライマーのいずれかで、スペーサ片を作成することも可能である。
【０４６５】
着色ストック磁気ビーズ（直径１μｍ）＝１０ｍｇ／ｍｌ（７〜１２Ｘ１０６ビーズ／μｌ）
【０４６６】
方法
５０μｌのビーズを除去（約４５０Ｘ１０６ビーズ）。
２００μｌの１ＸＴＥバッファー剤を添加、よく混合、マグネットで分離。
１Ｘを２００μｌの１ＸＴＥバッファー剤で洗浄。マグネットで分離。
１００μｌのＢ／Ｗバッファー液内に再懸濁。
３μｌのＰ１オリゴを添加（５００μＭストック＝１５００ｐモル）。
ＲＴで３０分間超回転。
３Ｘを２００μｌの１ＸＴＥバッファー剤で洗浄。
５０μｌ（開始量）の１ＸＴＥバッファー液内に再懸濁。
使用前のＤＮＡ獲得ビーズを４℃または氷上で保管。ビーズは１週間以内に使用のこと（保存期間が１週間超になると、ビーズが集塊する恐れあり）。
実施例１３：エマルジョン液内の微細粒子のＰＣＲ反応方法
【０４６７】
本実施例の方法は、それに接合されたクローンテンプレートで微細粒子を作成するため、エマルジョン液内の微細粒子をＰＣＲ処理するのに利用できる。微細粒子（以下、ＤＮＡビーズと呼ぶ）は、最初に、第１プライマー（Ｐ１）で機能化する。第２プライマー（Ｐ２）は、ＰＣＲ反応の際には水性相状態である。必要とあれば、例えば、水性相において低濃度（１／２０倍程度）のＰ１の追加も可能である。これにより、追加増幅のための基板の役目をするテンプレートの水性相における生長が迅速になる。溶液中のＰ１の減少につれて、微細粒子に接合したＰ１利用の反応が加速される。Ｐ１＿Ｐ２  ｄｅｇｅｎ１０は、オリゴヌクレオチド集団に４１０の複雑性をもたせる１本が約１０変性塩基（オリゴヌクレオチド合成中に結合）、および、ＰＣＲによる増幅を可能にするためＰ１とＰ２にハイブリッド化する配列を有するオリゴヌクレオチド製テンプレート（１００ｂｐ）である。
【０４６８】
エマルジョンプロトコル（１μｍビーズ）
油性相の作成：
Ｓｐａｎ８０（７％）
Ｔｗｅｅｎ８０（０．４％）
軽鉱物油内で作成。
新鮮な油性相のみを使用のこと。
油性相総量＝４５０μｌ
【０４６９】
水性相の作成：（およそ液粒数２Ｘ１０９、液粒１つにつき１１５ｆＬを作成）
【数１】
2010539982.tif 000004
エマルジョンへ添加まで、水性相チューブを氷に転送する。
ＩＫＡ渦回転器に接続された泡状アダプタ内にクリオバイアルを縦に置く。渦回転器は、２５００ｒｐｍに設定する。
水性相のアリコット量（３アリコット、各８５μｌ＝２５５μｌ）を攪拌中の油性相に加える。
チップをチューブ内に載置して、チップの水性相を攪拌油性相とゆっくり調合することにより、単拡散した水性相を攪拌２ｍｌクリオバイアルに添加する。残りの残りの水性相分は２Ｘ添加作業を繰り返す。
エマルジョン攪拌を２５００ｒｐｍで２４分間続ける。
約１００μｌアプリコット量のエマルジョンを９６ウェルプレートに転送する（全部＝４ウェル）。残りの水性相のアプリコット量（６５μｌ）を溶液由来ＰＣＲ制御反応のための別途ウェル内に加える。
プレートを密封してから、次の項で説明するサイクル動作を開始する。
【０４７０】
エマルジョン増幅（１μｍビーズ）
１．１μｍビーズエマルジョン用のＰＣＲサイクル動作パラメータ（プライマーＴｍｓ＝６２Ｃ）
プログラム：ＤＴＢ−ＰＣＲ
９４Ｃ、２分  ｎ＝１
９４Ｃ、１５秒
５７Ｃ、３０秒  ｎ＝１００
７０Ｃ、６０秒
５５Ｃ、５分  ｎ＝１
１０Ｃ、時間は自由
２．サイクル時間は約６時間
３．サイクル動作後のエマルジョンの観察。合格エマルジョンは、一定したアンバー色で、可視できる水性相の分離がない。「ブレーク（溶液脱）」状態のエマルジョンは、チューブの底では明白な水性相状態である。水性相が集塊すると、ビーズ集団クローンができない。
４．明るいフィールド顕微鏡で、サイクル動作後のエマルジョンを検査する。２μｌのエマルジョンを取り出してガラススライド板上に載せる。２２Ｘ６０ｍｍカバーガラスでエマルジョンサンプルを覆う。
５．２０Ｘ対物レンズにてエマルジョンを目視する。大多数の液粒は単ビーズ構成になっており、ビーズは単拡散状態であるのが好ましい。
注意：エマルジョンサンプル内に、数多くの複数ビーズ液粒が含まれている場合には、１．５ｍｌ  ｅｐｐｅｎｄｏｌｆチューブ内にエマルジョン反応物を貯蔵して、６０００ｒｐｍで１５秒間回転させる。そして、チューブの底部に集積したビーズ懸濁物を排除する。このビーズ集団は、自由ビーズと、単ビーズ滴粒よりも重い複数ビーズ滴粒とで構成されているため、短い回転処理の後にチューブの底部に沈殿する。このようなビーズ集団はクローンできないので、次の処理の前に取り除く必要がある。上記の工程４と工程５を繰り返してエマルジョンを再検査し、エマルジョンサンプル内の単ビーズを含む液粒の性能を確認する。
６．次の項で説明するプロトコルを使ってエマルジョンを分解（ブレーク）する。
III．エマルジョンのブレークとメルト（１μｌビーズ）
【０４７１】
ビーズのブレークと洗浄（ＢＢＷ）
バッファー剤
２％  ＴｒｉｏｎＸ−１００  ２％  Ｔｗｅｅｎ２０；  １０ｍＭ  ＥＤＴＡ
メルト溶液  １００ｍＭ  ＮａＯＨ
１ＸＴＥ：  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）  １ｍＭ  ＥＤＴＡ
１Ｘ結合洗浄（Ｂ／Ｗ）バッファー剤
５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ
１Ｍ  ＮａＣｌ
１．１．５ｍｌの単ｅｐｐｅｎｄｏｌｆチューブに各組のエマルジョン（４アプリコット量）を貯蔵する。
２．８００μｌＢＢＷバッファーを添加する。反応チューブを１０秒間渦回転させてエマルジョンをブレークする。
３．８０００ｒｐｍで２分間回転させる。
４．上側の８００μｌを除去する（主に油性相分）。ＤＮＡビーズは、チューブの底部でペレット化する。
５．ＢＢＷを８００μｌ追加して、８０００ｒｐｍで２分間回転させる。上側の６００μｌを除去する。
６．洗浄分交換のため、磁石を使って６００μｌの１ＸＴＥで追加２Ｘを洗浄する。
８．５０μｌのメルト溶液をペレット状ビーズに添加し、素早いピペット操作にてサンプルを再懸濁させる。チューブを継続的に揺らしながら、メルト溶液内でビーズを室温で５分間培養する。
９．メルト溶液を除去するため磁石内にチューブを載置する。第２ストランドを完全に除去できるよう、１００μｌのメルト溶液で１Ｘを洗浄する。
１０．１ＸＴＥでペレット状ビーズ２Ｘを洗浄し、４℃で保管する場合には２０μｌのＴＥバッファー剤で、または、次の工程で濃縮を行う場合には、２０μｌの１ＸＢ／Ｗバッファー剤で懸濁する。ビーズの集塊がみられる場合は、１ＸＰＣＲ−Ｂバッファー剤に交換する。
１１．濃縮プロトコルで作業を続ける（オプション）。
実施例１４：クローンテンプレートを有する微細粒子の濃縮方法
接合されているビーズ集団
【０４７２】
本実施例では、例えば、その上でＰＣＲエマルジョン内でのテンプレート増幅が首尾良く行われる微細粒子の濃縮方法を説明する。本方法により、捕捉オリゴヌクレオチドを含む大きな微細粒子の使用が可能となる。捕捉オリゴヌクレオチドは、テンプレートのヌクレオチド域を補足するヌクレオチド域からなる。
【０４７３】
１．エマルジョン濃縮（１μｍ）
Ａ．濃縮ビーズの作成（捕捉全体）
【０４７４】
濃縮ビーズ：
Ｓｐｈｅｔｏｔｅｃｈ製ストレプタビジン被膜ポリスチレンビーズ（約６．５μｍ）
ビーズストック（０．５％ｗ／ｖ）：３３、１２５ビーズ／μｌ
プロトコル毎：（３３、１２５ビーズ／μｌ）（８００μｌ）＝２６．５Ｘ１０６ビーズ
【０４７５】
使用法
エマルジョン毎に１１９、０００、０００ビーズ、推定エマルジョンクローン度（２％）：エマルジョン毎に約３Ｍテンプレート正方向ビーズ。推定テンプレート塩基性エマルジョンビーズ毎に２〜３濃縮ビーズ＝エマルジョン反応物毎に１０、０００、０００濃縮ビーズを添加する。
【０４７６】
濃縮オリゴヌクレオチド（捕捉剤）
Ｐ２濃縮（３５ｍｅｒ、Ｔｍ＝７３Ｃ）
５’―二重鎖ビチオン−１８−炭素スペーサ−ｔｔａｇｇａｃｃｇｔｔａｔａｇｔｔａｇｇｔｇａｔｇｃａｔｔａｃｃｃｔｇ３’
（または）
Ｐ２濃縮（例えば、３５ｍｅｒ、Ｔｍ＝５２Ｃ以下）
５’−二重鎖ビチオン−１８−炭素スペーサ−ｇｇｔｇａｔｇｃａｔｔａｃｃｃｔｇ３’
【０４７７】
グルセロール溶液−６０％（ｖ／ｖ）
６ｍｌ  グルセロール
４ｍｌ  無ヌクレーゼＨ２Ｏ
１．８００μｌのビーズを取り出し、１３０００ｒｐｍで１分間延伸分離してＢ／Ｗバッファーに交換する。５００μｌのＢ／Ｗバッファーで１Ｘを洗浄し、１００μｌのＢ／Ｗバッファー内に再懸濁する。
２．２０μｌの濃縮オリゴを添加する（５００μＭストック＝１０、０００ｐモル／ｒｘｎ）。
３．ビーズ反応物を、室温で１時間回転させる。
４．５００μｌの１ＸＴＥバッファーで３Ｘを洗浄する。１３０００ｒｐｍで１分間延伸分離して、洗浄間にビーズをペレット化する。
５．２５μｌのＢ／Ｗバッファー内でビーズを再懸濁する。濃度＝１Ｍ濃縮ビーズ／μｌ。
注意：４つの濃縮エマルジョン集団を２０〜３０μｌの１ＸＢ／Ｗバッファー液内に貯蔵することにより、約４０Ｍテンプレートポジティブビーズを作成できる。その後、複数のスライド板を送り出せる。
【０４７８】
Ｂ．濃縮方法
１．エマルジョン由来ビーズ（２０μｌ）を含むチューブに、２０μｌの濃縮ビーズを添加する。穏やかなピペット操作でビーズ混合物を再懸濁させる（または、推定テンプレートポジティブエマルジョンビーズに対して２〜３濃縮ビーズへ上昇させるような比率を利用する）。
２．ビオチニレートＰ２濃縮プライマーで被膜された濃縮ビーズを使用する場合は、ビーズ混合物を６５℃で２分間培養する。１０分間チューブを氷に転送する。
注意：当初試験の結果、１００サイクルＰＣＲ（例えば、Ｐ２ＰＣＲ）のプライマー配列を含む濃縮ビーズを使用すると、プライマー：ダイマー種を含むビーズをテンプレートのない液粒状のビーズに変える能力のせいで、濃縮処理の効率が落ちることが判明した。上記で説明したＰ２濃縮プライマーを備えた濃縮ビーズを使用する場合は、この短ビーズのＴｍが低下するためビーズ混合物を５０℃で２分間培養する。
３．３００μｌの６０％グリセロール溶液が充填された１．５ｍｌｅｐｐｅｎｄｏｌｆチューブにビーズ混合物を挿入配置する。
４．１３、０００ｒｐｍで１分間延伸分離操作を行う。
５．回転の後、ネガティブビーズはチューブの底部でペレット状態となる。接合テンプレートビーズを含む濃縮ビーズは、グリセロール相の上側に浮遊する。上位相ビーズ集団を収集し、別のきれいな１．５ｍｌｅｐｐｅｎｄｏｌｆチューブの転送する。
注意：チューブの底部でペレット状態のビーズ（テンプレートのないビーズ）を洗浄し、そのテンプレートポジティブビーズで説明したのと同じ洗浄処理の後、磁石を使って分析することができる。
６．上位相からのビーズに、１ｍｌの無ヌクレーゼＨ２０を加えてグリセロール濃度を希釈させる。穏やかなピペット操作によりビーズ混合物を再懸濁する。１３、０００ｒｐｍで１分間回転させる。
７．回転動作の後、懸濁物を除去し、１００μｌのＴＥで２Ｘを洗浄する。
８．１００μｌのメルト溶液を洗浄したペレット状ビーズに添加する。室温で５分間チューブを回転させる。
９．追加の１００μｌのメルト溶液を加えて、磁石を使ってテンプレートビーズを分離する。
１０．濃縮ビーズからＤＮＡビーズを分別できるよう、磁石と１００μｌのＴＥとで２Ｘを洗浄することにより、非磁性の濃縮ビーズを除去する。
１１．テンプレートビーズを１０〜２０μｌの１ＸＴＥ内で懸濁する。ビーズの集塊がみられる場合には、１ＸＰＣＲ−Ｂバッファー液で希釈する。
１２．テンプレート含有ビーズは、他の濃縮集団と共に貯蔵でき、次の実施例で説明するような、スライド板上への搭載が可能となる。
実施例１５：半固相支持体の内側または上側にて不動態化された微細粒子配列の作成方法
【０４７９】
本実施例では、テンプレートが接合された微細粒子が、スライド板上に配置された半固相支持体内に不動態化されている（例えば、埋め込まれている）ようなスライド板の作成方法を説明する。そのようなスライド板は、ポロニースライドとも呼ばれる。本実施例で使用する半固相支持体は、ポリアクリルアミド製である。１つの方法プロトコルとして、増幅向上のためテンプレートの近辺にポリメラーゼ分子をトラップする方法がある。
スライド板の作成
【０４８０】
ガラス製スライド板：結合シラン処理
結合シラン処理により、アクリルアミドゲルのガラススライド板への結合が簡単に行える。スライド板は、使用の前に予め結合シランにより前処理しておく必要がある。
【０４８１】
注意
＊＊結合シラン溶液は、化学容器に保管する。
＊＊結合シランは、刺激性がある。溶液を準備する際には容器内で作業すること。
＊＊ストック結合シラン溶液が期限切れでないことを確認する。
＊＊作業棚への送出入の際、スライド板の表に触れないようにする。
結合シラン溶液の作成
１．下記の材料を、１−Ｌプラスチック製容器に入れる。
１Ｌ  ｄＨ２Ｏ、  １本  攪拌棒
次に、２２０μｌの濃縮酢酸を添加する（ｐＨ３．５を達成する）。４ｍｌの結合シランを加えて、混合溶液を攪拌棒で１５分間超攪拌する。
スライド板処理
２．上下逆のプラスチック製３８４ウェルプレートに、スライド板を載せる（同じ方向に向ける）。
３．ｄＨ２Ｏでリンスしてスライド板を洗浄し、完全な排水を行う。
４．１００％エタノールで洗浄し、完全な排水を行う。
５．再度、ｄＨ２Ｏでリンスして、完全な排水を行い、換気付きティシュ培養容器内に収容し、ＵＶ光で保護する。洗浄したスライド板は十分に乾燥させること（約３０分間）。
６．プレートをプラスチック容器に収容して、結合シラン溶液でスライド板を覆う。
７．１時間ほど溶液とスライド間で反応させる。ガラス上の結合シランの膜が均等になるよう、容器を断続的に攪拌する。
８．培養処理の後、３Ｘスライド板をｄＨ２Ｏで洗浄する。
９．１００％エタノールで１Ｘをリンスして、完全な排水を行う。
１０．使用の前に、スライド板は完全に乾燥させる。
１１．結合シラン処理済みのスライド板は、乾燥機内に保管する。
Ｂ．アクリルアミド被膜スライド板（小型マスク）
【０４８２】
無タップ式プロトコル
１．全部の試薬を氷の上に載置する。冷却試薬を１．５ｍｌのｅｐｐｅｎｄｏｌｆチューブに添加する。
【数２】
2010539982.tif 000005
続いて、ビーズが分散するよう混合液をよく攪拌する。
スライド毎に１７μｌを載せ、ガラスカバーで覆う。
重合処理を、上下逆にして室温で６０分間行う。
清浄な刃物でカバーを取り除く。
スライド板を浸漬し、１Ｅバッファー液内で２Ｘを１５分間洗浄する（不要なビーズを除去する）。
埋め込みビーズ搭載のスライド板は、ＩＥ液内に４℃で保管可能である。
２．フルオロフォア標識シーケンシングプライマーをハイブリッド化して、埋め込みビーズ集団を形成する。１ＸＰＣＲ−Ｂバッファー液を入れたコプリン容器にすばやく浸漬させて、１Ｅ液から１ＸＰＣＲ−Ｂバッファー液までスライドの平衡化処理を行う。
３．１．５ｍｌのｅｐｐｅｎｄｏｌｆチューブ内で、１〜６μｌ（１００μＭストック）のプライマーを９９μｌの１ＸＰＣＲバッファー液に添加する。アクリルアミドマトリクス上に、１００μｌのプライマー溶液を滴下してガラスカバー片または密閉用ガスケットで覆う。
４．＜ＤＥＶＩＮ＞プログラムを使ってスライドを加熱し、プライマーを埋め込みビーズにハイブリッド処理する（６５℃、２分間、３０℃までのアニール処理はゆるやかに行う）。２Ｘスライド板をＩＥ液で２分間洗浄する。これで、スライド板は、連結処理のためのシーケンシング操作の準備が完了した。
【０４８３】
タッピングプロトコル
１．１Ｍ／μｌのｓｓＤＮＡテンプレートビーズを準備する。（ポロニースライド板は、スライド毎４〜５Ｍビーズで作成する。）
２．ビーズ混合物を３０μｌの１ＸＰＣＲバッファー液内で再懸濁する。
３．１μｌのシーケンシング用プライマーを添加し（１００μＭストック）、よく混合する。
４．６５℃で２分間加熱する。
５．５分間氷で冷やす。
６．８０μｌの１ＸＴＥ液で３Ｘを洗浄する。
７．磁石を使って全部のｓｏｌｎを除去する。
８．下記で説明するように、試薬を添加する。
【数３】
2010539982.tif 000006
次に、ビーズが分散するよう混合液をよく攪拌する。  
スライド毎に１７μｌを載せ、ガラスカバーで覆う。
９．ＭＪリサーチＴｅｒａｄＰＣＲ装置の＜Ｐｏｌ−１＞サイクル方法を使って、好ましくは上下逆にして、重合処理を行う。
１０．清浄な刃物でカバーを取り除く。スライド板を浸漬し、１Ｅバッファー液内で２Ｘを１０分間洗浄する（不要なビーズを除去する）。
１１．これで、ポロニースライド板は、連結処理シーケンシングを行える準備が完了した。
１２．埋め込みビーズ搭載のポロニースライド板は、ＩＥ液内に４℃で保管可能である。
実施例１６：個体支持体に接合された微細粒子配列の作成方法
【０４８４】
本実施例では、その上に接合されたテンプレートを有する微細粒子が個体支持体に接合されているようなスライド板の作成方法を説明する。
１．反応性ＮＨＳのポリマーテザーから作成されたガラス製スライド板は、−２０℃で保管されている（スライドＨ、製品番号１０７０９３６、Ｓｃｈｏｔｔ  Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ社（Ｓｃｈｏｔｔ社北アメリカ部門）、ＮＹ州エルムスフォード）。
２．乾燥剤の元、使用の前にスライド板の室温で平衡処理を行う。
３．５０ｍｌｓの１ＸＰＢＳ（３００ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ８．７）でスライド板を５分間洗浄する。２Ｘの洗浄を繰り返す。
４．溶液からスライド板を取り出し、接着ガスケットで覆う（サンプル搭載が可能となる）。
５．別のチューブにて、１〜４億個のプロテイン塗布またはＤＮＡ塗布のビーズを１ＸＰＢＳ溶液（ｐＨ８．７）内でアリコット滴定する。ＤＮＡは、シーケンスできるＤＮＡテンプレートで構わない。またＤＮＡに、ＮＨＳと反応するアミンリンカーなどを内包させることも可能である。
６．ビーズサンプル３Ｘを、バッファー交換により１ＸＰＢＳ液（ｐＨ８．７）で洗浄する。
７．ビーズサンプルを１２５ｍｌの１ＸＰＢＳ液（ｐＨ８．７）内に再懸濁する。
８．スライド表面での均等な膜ができるよう、ビーズ溶液をスライドガスケットに貼付する。
９．スライド板を暗室内に収容して、室温で１〜２時間程度培養のための反応を起こさせる。
１０．培養処理の後、不要なビーズ溶液を除去し、スライド板を５０ｍｌの１ＸＴＥ液に移す（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）。
１１．洗浄毎１５分間だけ均等に攪拌して、５０ｍｌの１ＸＴＥ液でスライド５Ｘを洗浄する。
１２．数週間、スライドを１ＸＴＥ液内で４℃で保管する。
１３．必要とあれば、ビーズ集団を、フルオロフォア系染料に補完的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを接合させて、白色光（ＷＬ）を使って、あるいは、蛍光を使って、フィールド画像分析法で検査することができる。連結処理用シーケンシングにて、ＤＮＡテンプレートをシーケンシング処理できる。
【０４８５】
図３３Ａに示すのは、それに接合されたビーズを有するスライド板の概略図である。ＤＮＡテンプレート分子の小さな集団のみがスライド板に接合できる事実に注意してほしい。実際に使用したのは、１ミクロンのビーズである（ダイナビオテック社のＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙｏｎｅＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｂｅａｄｓ、製品６５０．０１）。しかしながら、様々なタイプのビーズの使用も可能である。
【０４８６】
図３３Ｂに示すのは、スライドに接合されたビーズの分布である。下側の図には、白色光式（左側）および蛍光式顕微鏡下のスライドの同じ区域が表示されている。上側には、ビーズの密度範囲が図示されている。
実施例１７：無ゲルビーズ配列を使ったオリゴヌクレオチドの伸展処理と連結処理によるシーケンシング
【０４８７】
本実施例では、ビオチンとストレプタビジンの相互反応による、基板（ガラススライド板）に接合された微細粒子の配列を作成する方法を説明し、連結処理、分離処理、検出のサイクル動作による満足できるシーケンシングを説明する。それに接合されたビオチンレート化テンプレートを有する微細粒子を、エマルジョンＰＣＲから作成し、前に説明した半個体相媒体の存在なしで、ＰＥＧ含有連鎖経由でストレプタビジンで機能化した基板に接合した。本方法では、増幅処理前にビオチレート化プライマーが接続されたストレプタビジン被膜ビーズを採用した。生産的なテンプレート増幅が完了した粒子の濃縮の後、テンプレートはビオチレート処理される。続いて、それに接合したビオチレートテンプレートを有する微細粒子を、ストレプタビジン被膜スライドと伴に培養する。それゆえ、本方法では、ビオチンとストレプタビジンの連鎖を２回利用した。その他の方法として、プライマーを微細粒子に連鎖する、または、増幅したテンプレートを基板に連鎖する方法も利用可能である。
材料と方法：
ＢＡＣ―Ｅｃｏ（ｖ２．１）ビーズの作成
【０４８８】
ＭｙＯｎｅストレプタビジン（１ミクロン）に、ビオチニレート化Ｐ１プライマー（図を参照）で被膜し、エマルジョンＰＣＲを使って、ＢＡＣ−Ｅｃｏ（ｖ２．１）ライブラリからのそれに接合されたテンプレートを有するビーズ集団を作成した。エマルジョンをブレーク処理し、ビーズは純化してから、標準方法でエキソヌクレーゼで処理した。次に、完全伸展したＰＣＲ生成物を含むビーズを、Ｐ２濃縮オリゴで覆われた濃縮ビーズへの結合（図を参照）により濃縮した。溶液中での濃縮ビーズの挙動を改善するため、ビオチニレート化Ｐ１オリゴでビーズを培養処理し、ストレプタビジン被膜からのビーズ露出部分を覆った。
ＢＡＣ−Ｅｃｏ（ｖ２．１）ビーズのスライド上への着床
【０４８９】
ｓｓＤＮＡを含む濃縮されたＢＡＣ−Ｅｃｏ（ｖ２．１）ビーズを、ストレプタビジン被膜されたＯｐｔｉ−Ｃｈｅｍスライド板（アクセル８テクノロジー社製）上に着床させた。この準備工程で、ビオチン片をＤＮＡテンプレート分子の３’末端に共有結合させるため、末端トランファラーゼ（ニューイングランドバイオラボ社製）とビオチン１１−ｄｄＡＴＰ（パーキンエルマー社製）でビーズを培養処理した。ビーズを、同じ数のＭｙＯｎｅカルボキシル酸ビーズ（ダイナル社製）と混合し、５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０００５％Ｔｒｉｏｎ  Ｘ−１００、１０％ＰＥＧ８０００（アメリカアナリチカル社製）からなる着床バッファー液に入れた。懸濁物をＣｏｖａｒｉｓ  Ｓ２音波破砕器を使って簡単に音波破砕し、ストレプタビジン被膜されたＯｐｔｉ−Ｃｈｅｍスライド板（アクセル８テクノロジー社製）上に着床させた。スライド板は、ＴＥバッファー液で３回洗浄し、使用前に圧縮空気で乾燥した。次に、スライド板上に水性層が形成でき、蒸発が削減できるよう、ＬｉｆｔｅｒＳｌｉｐ（エリーサイエンティック社製）で懸濁物を覆った。スライド板を、高湿度チェンバー内で室温で４５分間培養し、端部での蒸発を低減するとともに、ビーズを板表面に沈積させ結合させた。ＴＥバッファー液で満たされたトレイ内でスライド板を上下逆にして浸漬させることにより、カバー片を取り除いた。やさしく約１分間攪拌すれば、カルボキシル酸ビーズのほとんどを除去できる（別の実施例で説明した）。次に、スライド板をアセトン液に浸漬し、圧縮空気を使って乾燥した。
【０４９０】
無ゲルスライド板でのサイクル連結処理シーケンシングにおいて使用した試薬は、リセットバッファー液以外は、アクリルアミド系ゲルの場合の同じ試薬を使った。無ゲルアレイでは、１０ｍＭのＮａＯＨと０．１％のドデカネスルフォン酸ナトリウム（Ｆｌｕｋａ）を含むアルカリン系リセットバッファー液を使った。図３８と図３９で示すように、３００画面の無ゲル配列（約１８Ｘ１８ｍｍ）には、濃縮されたＢＡＣ−Ｅｃｏライブラリビーズが配置されており、小型の自動式フローセル装置に入力し、５０回のアルカリンリセット処理を施したので、無ゲル環境におけるビーズの安定性が確実となった。５０サイクルのフロー操作の後の無ゲル配列は、１画面につき２６、０００以上のビーズで埋まった（４Ｍ画素カメラ）。続いて、無ゲル配列に連結分割サイクルのシーケンシングを行った。サイクル１のデータ評価の結果、各蛍光チャンネルの高ＲＦＵ値で証明されるように、２塩基４色プローブ組での連結処理の高効率が判明した（図３９）。続いて、ビーズ集団を戻して、スペクトル純度グラフにプロットしたが、Ｓａｔａｙ分析や濃度分布評価からシーケンシング能力が高いことが判った。
実施例１８：別の連結処理プロトコルを使った連結処理の効率向上
【０４９１】
本実施例では、１サイクルにつき２回またはそれ以上の連結処理反応を使った、連結処理生成物を増加させる方法を説明する。連結処理反応の後に残っている未処理のプライマーを逆ホスホリレート化し、３’Ｓホスホロチオレート連鎖を含む伸展オリゴヌクレオチドを分割処理する。このプロトコルにより、１番目の連結処理反応では標識プローブと結合しないテンプレート分子に沿って伸展するため、連結処理生成物の量を増やすことができる。
【０４９２】
１番目の連結処理は、高忠実度の反応条件下で蛍光系標識プローブで行われ、その連結処理の後、残りの自由プローブが排出される。そして、１回またはそれ以上の数の追加連結処理が、低忠実度の反応条件下で非標識プローブで行われる。連結処理での密度が増すため、低忠実度となるのである。低忠実度に結果、プローブがテンプレートハイブリッド化のためのテンプレート配列に完全に整合しなくなり、プローブプールに完全整合プローブがない場合でも、テンプレート伸展が起こる。しかも、各プローブ種の消耗が発生する連結処理中に、プローブプールの補給が行われる。
【０４９３】
低忠実度での連結処理中に使用されるプローブは非標識であって検知されないため、その使用が配列読み取りの精度に影響することはない。
材料
標識連結処理材料−第１回目処理
５０ユニット  インビトロジェンＨ．Ｃ．  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（５００μｌフローセル内）
５３μＭ  標識プローブ
１Ｘインビトロジェン  Ｔ４リガーゼバッファー剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％ポリエチレングリコール８０００）
１３３ｍＭ  ＮａＯＡｃ
非標識連結処理材料−第２回目〜第４回目処理
１００ユニット  インビトロジェンＨ．Ｃ．  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（５００μｌフローセル内）
５３μＭ  非標識プローブ
１Ｘインビトロジェン  Ｔ４リガーゼバッファー剤
１３３ｍＭ  ＮａＯＡｃ
ＴＭＡＸ
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓアセテート、ｐＨ７．４
５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
方法
【０４９４】
テンプレート作成の条件とプロトコル、プライマーハイブリッド処理、分割処理は、実施例１で説明したとおりである。
プローブ連結処理
１．スライド板をリセットし、プライマーをハイブリッド化し、オリゴヌクレオチドをブロックする。
２．標識プローブの連結処理をする。
３．温度を１５℃に設定する。
４．標識連結処理混合物を追加し、１５℃で２０分間保持する。
５．ＴＭＡＸ１Ｘでリンスする。
６．ＴＭＡＸを添加し、温度を４０℃に設定する。
７．ＴＭＡＸ５Ｘで洗浄する。
８．温度を１５℃に設定する。
９．ＴＭＡＸ５Ｘで洗浄する。
１０．スライド板を撮影する。
１１．非標識連結処理１を行う。
１２．温度を１５℃に設定する。
１３．標識連結処理混合物を追加し、１５℃で１０分間保持する。
１４．ＴＭＡＸ１Ｘでリンスする。
１５．ＴＭＡＸを添加し、温度を４０℃に設定する。
１６．ＴＭＡＸ５Ｘで洗浄する。
１７．非標識連結処理２を行う（工程３の反復）。
１８．非標識連結処理３を行う（工程３の反復）。
１９．ホスファターゼで処理し、分割処理を行う。
２０．次の連結処理サイクルを開始する。
結果
【０４９５】
上記の追跡連結処理プロトコルにより、結果として、同様のプロトコルと比較して、１サイクルにつき１回の連結処理でも連結処理生成物が増加した。
【０４９６】
連結処理の効率をモニターするため、蛍光ゲルシフト試験を採用し、実施例１で説明したとおりに実行した。図４３Ａに示すのは、２つの異なる連結処理プロトコルによるプライマーとプライマー／プローブ連結処理生成物のゲルシフト試験の結果である。左側のピークは、連結処理しない場合のプライマーの位置を示す。プローブの連結処理を行うと右へのシフトが発生し、連結処理生成物は右側のピークで表される。１５℃での２０分の単発連結処理を行うと、プライマーの約５０％に連結処理が施される、一方、同じ条件で各５分の４回の連結処理を行うと、ほぼ８０％が連結処理に関わる。
【０４９７】
それらの結果は、他の複数サイクルでも維持された。図４３Ｂに示すのは、７サイクルの連結処理をライブラリで行った実験結果であって、サイクル毎に１回連結処理するプロトコル（全連結処理時間は１５℃で４０分）の結果と、サイクル毎に４回連結処理するプロトコル（全連結処理時間は１５℃で５０分）の結果とを比較している。４つの染料から蛍光するライブラリビーズの信号強度が、点線に分けた軸に沿って示されている。ビーズでの強度が大きくなるにつれ、原点から遠ざかる。サイクル毎に１回の連結処理する第５番目のサイクルでは、背景付近では信号発生するビーズの数が少なくなる。他方、サイクル毎に４回の連結処理をすると、７サイクル以後はかなりの数のビーズが背景以上の信号を保持する。
【０４９８】
それらに限定されるものではないが、特許、特許出願、記事、書籍、約定、ウェブページを含む本出願に記載された文献や似かよった材料は、そのような文献や似かよった材料の形式に関係なく、全体が参考例として表現的に収録されているものである。収録した文献や似かよった材料の１つまたはそれ以上のものが、それらに限定されるものではないが、定義用語、頭語使用法、説明技法などを含む本出願と異なる、あるいは、否定するような場合でも、本発明が支配する。
【０４９９】
本文で使われている段落の表題は、単に構成目的のためであって、説明されている事項を制限しているなど解釈されるものではない。
【０５００】
本発明の教示は、さまざまな実施例や試験例に関連して説明しているが、本表示がそのような実施例や試験例に限定されることを意図するものではない。反対に、本教示はその他の別例、修正例、類似例をも含むということは、当業者にとっては認識できよう。
【０５０１】
本教示は、特定の説明実施例に関連付けて開示記述されているが、形態や詳細のさまざまな変更が、請求項の精神や範囲を逸脱することなく行えることも理解できよう。それゆえ、本教示の範囲や精神に基づく全ての実施例およびその類似例は、請求範囲である。本教示の請求項や、方法、装置、検査の説明と図示は、特に記載されていない限り、要項の説明順序に制限されるかのように読むべきではない。
【０５０２】
例えば、当業者にとっては、ここで説明した教示のさまざまな実施例には多くの類似例があることが、認識、あるいは、普通の実験以上の実験を使うことなく確認できるであろう。本教示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ、付随の請求項内に記述されているものである。下記の請求項における「ａ」「ａｎ」「ｔｈｅ」などの語彙は、その逆となるものではなく、あるいは、文章から明らかである限り、１または１以上の数を意味する。１つのグループの１つまたはそれ以上の数のメンバー間における「ｏｒ」を含む請求項または説明内容は、そのグループの１つまたはそれ以上の数または全部のメンバーが存在する、採用される、あるいは、それと逆となるものではなく所定の生成物または処理法に関連する、あるいは、文章から明白である場合に満足されるものとする。請求項の「随意に」の使用は、随意の特徴が存在する実施例やそれが不在の実施例が請求項に含まれることを意味する。
【０５０３】
本教示が、提示されている請求項の１つまたはそれ以上の請求項からの１つまたはそれ以上の限定、要素、条項、説明用語などが別の請求項に導入されているような、すべての変更例、組み合わせ例、置換例を含むことも理解すべきである。特に、別の請求項に依存する請求項は、元の請求項に依存する他の請求項でみられる１つまたはそれ以上の限定を含めるような変更が可能である。
【０５０４】
加えて、特定の除外例が明確に記載されていない場合でも、１つまたはそれ以上の実施例が請求項からの明確に除外できることも理解すべきである。なお、仕様書および／または請求項には、シーケンシングで使用する試薬（例えば、テンプレート、プローブ、プローブ群など）が開示されているが、そのような開示は、ここに記載の特定の方法、あるいは、本仕様書に記載されている限り、当業者のいずれかが理解できる限り、当技術分野で周知のその他方法に従ったそれら試薬を使ったシーケンシングの方法を含むことも理解する必要がある。また、仕様書および／または請求項には、シーケンシング方法が示されているが、ここに開示されている１つまたはそれ以上の試薬を、当業者のいずれかが理解できる限り、あるいは、そのような方法での試薬の使用法が本仕様書からは明らかに除外されている限り、その方法内で使うことも可能である。さらに、本仕様書または請求項にはシーケンシングにおいて使用する特定の構成体も記載されているが、本教示が試薬を作成する方法を含むことも理解できよう。なお「構成体」という用語は、テンプレートや、それに接合されたテンプレートを含む微細粒子や、ライブラリなど、シーケンシングで使うアイテムとして幅広い意味で使われる。さらにまた、図面は本仕様書の重要な部分であって、例えば、それに接合されているテンプレートを有する微細粒子などの図面に示されている構成や、図面に開示されている方法も本教示に含まれる。
【０５０５】
本文では範囲が決められており、その端も含まれる。さらにまた、本文に記載されている限り、または、それから明白である限り、当業者のいずれかの理解がある限り、範囲として表現した値は、本文に記載の限り、その範囲の最低値の１／１０単位までの、特定の値または記述の範囲内のサブレンジ値をいうことも理解すべきである。
【図３Ａ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２４Ｇ】
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【図２４Ｈ】
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【図２４Ｉ】
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【図２７Ｃ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
2010539982.tif 000070
【図４２Ｃ】
2010539982.tif 000071
【図４２Ｄ】
2010539982.tif 000072
【図４２Ｅ】
2010539982.tif 000073
【図４３Ａ】
2010539982.tif 000074
【図４３Ｂ】
2010539982.tif 000075
【国際調査報告】
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