(57)【要約】本発明は、微生物を利用したラクテート重合体またはラクテート共重合体の製造において高効率でラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換することができるクロストリジウムプロピオニウム由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの突然変異体に関する。本発明によるクロストリジウムプロピオニウム由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体が導入された組み換え大膓菌により、従来、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの大膓菌内の発現が微弱なので、円滑なラクチル−ＣｏＡ供給が困難であった問題が解決され、ラクテート重合体及びラクテート共重合体を高効率で製造することができる。
2010536338.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３の遺伝子配列においてＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃが変異された遺伝子配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素である、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体。
【請求項２】
配列番号３の遺伝子配列においてＡ１２００Ｇが変異された遺伝子配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素である、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体。
【請求項３】
配列番号３の遺伝子配列においてＡ１２００Ｇが変異され、配列番号３に対応するアミノ酸配列においてＧｌｙ３３５Ａｓｐが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素である、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体。
【請求項４】
配列番号３の遺伝子配列においてＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃが変異され、配列番号３に対応するアミノ酸配列においてＡｓｐ６５Ｇｌｙが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素である、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体。
【請求項５】
配列番号３の遺伝子配列においてＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃが変異され、配列番号３に対応するアミノ酸配列においてＡｓｐ６５Ａｓｎが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素である、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体。
【請求項６】
配列番号３の遺伝子配列においてＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃが変異され、配列番号３に対応するアミノ酸配列においてＴｈｒ１９９Ｉｌｅが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素である、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体。
【請求項７】
配列番号３の遺伝子配列においてＡ１２００Ｇが変異され、配列番号３に対応するアミノ酸配列においてＡｌａ２４３Ｔｈｒが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素である、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体。
【請求項８】
配列番号３の遺伝子配列においてＡ１２００Ｇが変異され、配列番号３に対応するアミノ酸配列においてＡｓｐ２５７Ａｓｎが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素である、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体。
【請求項９】
配列番号３の遺伝子配列においてＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃが変異され、配列番号３に対応するアミノ酸配列においてＶａｌ１９３Ａｌａが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素である、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体をコードする遺伝子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の遺伝子を含有するラクテート重合体またはラクテート共重合体合成用組み換えベクター。
【請求項１２】
上記組み換えベクターが、ラクチル−ＣｏＡを基質として利用してラクテート重合体またはラクテート共重合体を合成することができる配列番号４のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００）をさらに含有することを特徴とする、請求項１１に記載の組み換えベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の組み換えベクターで形質転換された細胞または植物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の組み換えベクターで形質転換された細胞または植物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の細胞または植物を培養または栽培する工程を含むことを特徴とする、ラクテート重合体またはラクテート共重合体の製造方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の細胞または植物を培養または栽培する工程を含むことを特徴とする、ラクテート重合体またはラクテート共重合体の製造方法。
【請求項１７】
上記培養または栽培が、ヒドロキシアルカノエートを含有する環境で行われることを特徴とする、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１８】
上記ヒドロキシアルカノエートが、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシブチレート、炭素数が６〜１４個である中間鎖長の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸、２−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカン酸、４−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシヘキサン酸、４−ヒドロキシヘプタン酸、４−ヒドロキシオクタン酸、４−ヒドロキシデカン酸、５−ヒドロキシ吉草酸、５−ヒドロキシヘキサン酸、６−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸、３−ヒドロキシ−９−デセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−５，８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸、リンゴ酸、３−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシブチレート、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシブチレート、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、ｐａｒａ−ニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシルブチレート、３，１２−ジヒドロキシドデカン酸、３，８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４，５−エポキシデカン酸、３−ヒドロキシ−６，７−エポキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−８，９−エポキシ−５，６−ｃｉｓ−テトラデカン酸、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−２−メチルブチレート、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸及び３−ヒドロキシ−２、６−ジ−メチル−５−ヘプテン酸よりなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
上記ヒドロキシアルカノエートが、３−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシブチレート、２−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、炭素数が６〜１４個である中間鎖長の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸、３−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシ吉草酸及び５−ヒドロキシ吉草酸よりなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
上記ヒドロキシアルカノエートが、３−ヒドロキシブチレートであることを特徴とする、請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
上記培養または栽培が、ヒドロキシアルカノエートを含有する環境で行われることを特徴とする、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項２２】
上記ヒドロキシアルカノエートが、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシブチレート、炭素数が６〜１４個である中間鎖長の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸、２−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカン酸、４−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシヘキサン酸、４−ヒドロキシヘプタン酸、４−ヒドロキシオクタン酸、４−ヒドロキシデカン酸、５−ヒドロキシ吉草酸、５−ヒドロキシヘキサン酸、６−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸、３−ヒドロキシ−９−デセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−５，８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸、リンゴ酸、３−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシブチレート、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシブチレート、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、ｐａｒａ−ニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシルブチレート、３、１２−ジヒドロキシドデカン酸、３、８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４、５−エポキシデカン酸、３−ヒドロキシ−６、７−エポキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−８、９−エポキシ−５、６−ｃｉｓ−テトラデカン酸、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−２−メチルブチレート、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸及び３−ヒドロキシ−２、６−ジ−メチル−５−ヘプテン酸よりなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２３】
上記ヒドロキシアルカノエートが、３−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシブチレート、２−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、炭素数が６〜１４個である中間鎖長の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸、３−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシ吉草酸及び５−ヒドロキシ吉草酸よりなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項２２に記載の製造方法。
【請求項２４】
上記ヒドロキシアルカノエートが、３−ヒドロキシブチレートであることを特徴とする、請求項２３に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を利用したラクテート重合体またはラクテート共重合体の製造において高効率でラクテート（乳酸）をラクチル−ＣｏＡに転換することができるクロストリジウムプロピオニウム（Clostridium propionicum）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの突然変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリラクテート（ポリ乳酸）（Polylactate；ＰＬＡ）は、ラクテートから由来した代表的な生分解性高分子であって、汎用高分子または医療用高分子としての応用性が高い高分子である。現在、ＰＬＡは、微生物発酵によって生産されたラクテートを重合して製造されているが、ラクテートの直接重合によっては低分子量（約１０００−５０００ダルトン）のＰＬＡだけが生成される。１００，０００ダルトン以上の分子量を有するＰＬＡを合成するためには、ラクテートの直接重合によって得られた低分子量のＰＬＡから連鎖カップリング剤(chain coupling agent)を利用してさらに分子量が大きいＰＬＡに重合する方法があるが、有機溶剤や連鎖カップリング剤の添加によって工程が複雑になり、また、これらを除去することが容易でないという短所がある。現在、商用化されている高分子量ＰＬＡの生産工程は、ラクテートをラクチドに転換した後、ラクチドリングの開環縮合反応を通じてＰＬＡを合成する方法が使用されている。
【０００３】
化学合成を通じてラクテートを利用してＰＬＡを合成する場合、ＰＬＡホモポリマーは容易に得ることができるが、多様なモノマー組成を有するＰＬＡ共重合体の合成は困難であり、商業的に効用性が非常に低下するという短所がある。
【０００４】
一方、ポリヒドロキシアルカノエート（polyhydroxyalkanoate；ＰＨＡ）は、過度な炭素源が存在し、リン、窒素、マグネシウム、酸素などの他の栄養分が足りないとき、微生物がエネルギーや炭素源貯蔵物質としてその内部に蓄積するポリエステルである。ＰＨＡは、既存の石油から由来した合成高分子と同様の物性を有し、且つ完全な生分解性を示すので、既存の合成プラスチックを代替する物質として認識されている。
【０００５】
微生物でＰＨＡを生産するためには、微生物の代謝産物をＰＨＡモノマーに転換する酵素と、ＰＨＡモノマーを利用してＰＨＡ高分子を合成するＰＨＡ合成酵素が必要である。微生物を利用してＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体を合成する場合にも、同じシステムが必要であり、元々のＰＨＡ合成酵素の基質であるヒドロキシアシル−ＣｏＡ（hydroxyacyl-CoA）を提供することができる酵素以外に、さらにラクチル−ＣｏＡ（lactyl-CoA）を提供することができる酵素が必要である。
【０００６】
これより、本発明者は、ラクチル−ＣｏＡを提供するために、クロストリジウムプロピオニウム由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼと、これを基質として利用するシュードモナス属６−１９（Pseudomonas sp.6-19）のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の変異体を使用して、ＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体を合成することに成功した（大韓民国特許出願第10-2006-0116234号）。
【０００７】
しかしながら、ラクチル−ＣｏＡ供給酵素であるクロストリジウムプロピオニウム由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼを大膓菌で非常に強力なプロモーターによって高発現させる場合、深刻な代謝障害を起こし、細胞成長が止まると報告されている（Selmer et al., Eur. J. Biochem., 269: 372, 2002）。また、クロストリジウムプロピオニウム由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子のコドン使用頻度（codon usage）は、大膓菌のものとは非常に異なるので、正常に発現されるにあたって多くの困難があり得る。すなわち、既存のシステムより効率的にラクテート重合体及びラクテート共重合体を合成するためには、細胞成長を大きく阻害しない程度に高発現され、ラクチル−ＣｏＡを円滑に供給するプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの導入が非常に重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】大韓民国特許出願第10-2006-0116234号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Selmer et al., Eur. J. Biochem., 269: 372, 2002
【非特許文献２】Neumann et al., EMBO J., 1: 841(1982)
【非特許文献３】HaeJin Song, Master’s Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004
【非特許文献４】Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44: 1337-1347
【非特許文献５】Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180: 6459, 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の主な目的は、ラクチル−ＣｏＡを効率的に供給することができる単量体供給酵素を提供し、ラクテート重合体またはラクテート共重合体を高効率で製造することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、クロストリジウムプロピオニウム由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの変異体を使用する場合、細胞成長を大きく阻害することなく、効率的にラクチル−ＣｏＡを供給することによって、ラクテート重合体(PLA)またはラクテート共重合体(PLA copolymer)を高効率で製造することができることを発見し、それにより本発明を完成するように至った。
【００１２】
したがって、本発明は、上記本発明の目的を達成するために、配列番号３の遺伝子配列においてＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃが変異された遺伝子配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素であるプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体及び上記プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体をコードする遺伝子を提供する。
【００１３】
また、配列番号３の遺伝子配列においてＡ１２００Ｇが変異された遺伝子配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素であるプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体及び上記プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体をコードする遺伝子を提供する。
【００１４】
また、配列番号３の遺伝子配列においてＡ１２００Ｇが変異され、配列番号３に対応するアミノ酸配列においてＧｌｙ３３５Ａｓｐが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素であるプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体及び上記プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体をコードする遺伝子を提供する。
【００１５】
また、配列番号３の遺伝子配列においてＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃが変異され、配列番号３に対応するアミノ酸配列においてＡｓｐ６５Ｇｌｙが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素であるプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体及び上記プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体をコードする遺伝子を提供する。
【００１６】
配列番号３の遺伝子配列においてＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃが変異され、配列番号３に対応するアミノ酸配列においてＡｓｐ６５Ａｓｎが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素であるプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体及び上記プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体をコードする遺伝子を提供する。
【００１７】
また、配列番号３の遺伝子配列においてＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃが変異され、配列番号３に対応するアミノ酸配列においてＴｈｒ１９９Ｉｌｅが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素であるプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体及び上記プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体をコードする遺伝子を提供する。
【００１８】
また、配列番号３の遺伝子配列においてＡ１２００Ｇが変異され、配列番号３に対応するアミノ酸配列においてＡｌａ２４３Ｔｈｒが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素であるプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体及び上記プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体をコードする遺伝子を提供する。
【００１９】
また、配列番号３の遺伝子配列においてＡ１２００Ｇが変異され、配列番号３に対応するアミノ酸配列においてＡｓｐ２５７Ａｓｎが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素であるプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体及び上記プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体をコードする遺伝子を提供する。
【００２０】
また、配列番号３の遺伝子配列においてＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃが変異され、配列番号３に対応するアミノ酸配列においてＶａｌ１９３Ａｌａが変異された、遺伝子配列及びアミノ酸配列を有するラクチル−ＣｏＡ供給酵素であるプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体及び上記プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体をコードする遺伝子を提供する。
【００２１】
また、本発明は、上記遺伝子のうちいずれか１つを含有するラクテート重合体またはラクテート共重合体合成用組み換えベクターを提供する。
【００２２】
より好ましくは、本発明は、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体をコードする遺伝子のうちいずれか１つ、及びラクチル−ＣｏＡを基質として利用してラクテート重合体またはラクテート共重合体を合成することができる配列番号４のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００）を含有するラクテート重合体またはラクテート共重合体合成用組み換えベクターを提供する。
【００２３】
また、本発明は、上記組み換えベクターのうちいずれか１つで形質転換された細胞または植物を提供し、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を有しない細胞または植物を前述した組み換えベクターのうちいずれか１つで形質転換させることによって得られる細胞または植物も本発明の範囲に含まれる。
【００２４】
また、本発明は、上記細胞または植物を培養または栽培することを特徴とするラクテートホモ重合体またはラクテート共重合体の製造方法を提供する。上記培養または栽培は、ラクテート共重合体を製造するために、ヒドロキシアルカノエートを含有する環境で行われることができ、このようなヒドロキシアルカノエートとして、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシブチレート、炭素数が６〜１４個である中間鎖長の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸、２−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシヘキサデカン酸、４−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシヘキサン酸、４−ヒドロキシヘプタン酸、４−ヒドロキシオクタン酸、４−ヒドロキシデカン酸、５−ヒドロキシ吉草酸、５−ヒドロキシヘキサン酸、６−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸、３−ヒドロキシ−９−デセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−５、８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸、リンゴ酸、３−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル、３−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル、３−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシブチレート、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシブチレート、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、ｐａｒａ−ニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシルブチレート、３、１２−ジヒドロキシドデカン酸、３、８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸、３−ヒドロキシ−４、５−エポキシデカン酸、３−ヒドロキシ−６、７−エポキシドデカン酸、３−ヒドロキシ−８、９−エポキシ−５、６−ｃｉｓ−テトラデカン酸、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸、３−ヒドロキシ−２−メチルブチレート、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸、３−ヒドロキシ−２、６−ジ−メチル−５−ヘプテン酸などが使用されることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
上記ヒドロキシアルカノエートとして、３−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシブチレート、２−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、炭素数が６〜１４個である中間鎖長の（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸、３−ヒドロキシ吉草酸、４−ヒドロキシ吉草酸、５−ヒドロキシ吉草酸などが好ましくて、３−ヒドロキシブチレート（３−ＨＢ）がさらに好ましい（図１参照）。
【００２６】
したがって、本発明のラクテート重合体またはラクテート共重合体は、ポリラクテート、ポリ（ヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−３−ラクテート）、ポリ（第１ヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−第２ヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（第１ヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−第２ヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−第３ポリヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−ラクテート）などを使用することができるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
上記ラクテート共重合体としては、例えば、ポリ（４−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（４−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（ＭＣＬ（中間鎖長；medium chain length）３−ヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ＭＣＬ３−ヒドロキシアルカノエート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート−ｃｏ−ラクテート）、ポリ（３−ヒドロキシプロピオネート−ｃｏ−ラクテート）などを例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
本発明において、ベクターは、適当な宿主内でＤＮＡを発現させることができる適当な発現調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または単純に潜在的ゲノム挿入物であることができる。適当な宿主で形質転換されれば、ベクターは、宿主ゲノムと関係なく複製し機能することができるか、または一部の場合には、ゲノムその自体に統合されることができる。プラスミドが現在ベクターの最も通常的に使用される形態なので、本発明において、「プラスミド」及び「ベクター」は、時々に相互交換的に使用される。しかし、本発明は、当業界に知られた、または知られるようになることと同等な機能を有するベクターの他の形態をも含む。
【００２９】
「発現調節配列（expression control sequence）」という表現は、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコード配列の発現に必須なＤＮＡ配列を意味する。このような調節配列は、転写を実施するためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位(RBS)をコードする配列、及び転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適した調節配列は、プロモーター、任意のオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞に適した調節配列には、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーがこれに含まれる。プラスミドにおいて遺伝子の発現量に最も影響を及ぼす因子は、プロモーターである。高発現用のプロモーターとして、ＳＲαプロモーター、サイトメガロウイルス由来プロモーターなどが好ましく使用されることができる。
【００３０】
本発明のＤＮＡ配列を発現させるために、非常に多様な発現調節配列のうちいずれのものでもベクターに使用されることができる。有用な発現調節配列の例として、例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコードタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他のグリコール分解酵素に対するプロモーター、ホスファターゼのプロモーター；例えばＰｈｏ５、酵母アルファ−交配システムのプロモーター並びに原核細胞または真核細胞またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節するものとして知られる異なる構成因子または誘導因子のその他の配列、及びこれらの様々な組合が含まれる。
【００３１】
核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置されるとき、「作動可能に連結（operably linked）」される。適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）は、調節配列に結合されるとき、遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であることができる。例えば、前駆配列（pre-sequence）または分泌リーダー（leader）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加する前駆タンパク質(pre-protein)として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されるか；またはリボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されるか；またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また、分泌リーダーの場合、接触し、リーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは、コード配列に接触する必要がない。これら配列の連結は、便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）によって行われる。このような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（oligonucleotide adaptor）またはリンカー（linker）を使用する。
【００３２】
本発明において使用される用語「発現ベクター」は、通常、異種のＤＮＡ断片が挿入された組み換えキャリア（recombinant carrier）であって、一般的に、二重鎖のＤＮＡ断片を意味する。ここで、異種のＤＮＡは、宿主細胞で天然的に発見されないＤＮＡである異形ＤＮＡを意味する。発現ベクターは、宿主細胞内にあれば、宿主染色体ＤＮＡと関係なく複製することができ、複数のベクターのコピー及びその挿入された（異種）ＤＮＡが生成されることができる。
【００３３】
当業界に周知のように、宿主細胞で形質感染遺伝子の発現水準を高めるためには、当該遺伝子が選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び翻訳発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは、発現調節配列及び当該遺伝子は、細菌選択マーカー及び複製起点（replication origin）を一緒に含んでいる１つの発現ベクター内に含まれるようになる。発現宿主が真核細胞の場合には、発現ベクターは、真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含まなければならない。
【００３４】
本発明において、組み換えベクターとしては、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミドベクター、ＹＡＣ（Yeast Artificial Chromosome）ベクターなどを含む多様なベクターが導入されることができる。例えば、プラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たり数百個のプラスミドベクターを含むように複製が効率的に行われるようにする複製起点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞が選ばれるようにする抗生剤耐性遺伝子及び（ｃ）外来ＤＮＡ断片が挿入されることができる制限酵素切断部位を含む構造を有することができる。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用すれば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ligation）することができる。
【００３５】
本発明による組み換えベクターは、適切な宿主細胞中で通常の方法によって形質転換することができる。宿主細胞としては、バクテリア、酵母、かびなどが可能であるが、これらに限定されるものではない。本発明に好ましく使用される宿主細胞は、原核細胞であり、大膓菌が好ましい。適当な原核宿主細胞の例として、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０９、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５ａ、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０１、Ｅ.ｃｏｌｉ Ｋ１２菌株２９４、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株Ｗ３１１０、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株Ｘ１７７６、Ｅ.ｃｏｌｉ ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｅ.ｃｏｌｉ Ｂなどを含む。しかし、ＦＭＢ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８及びＮＭ５３９のようなＥ.ｃｏｌｉ菌株及び他の原核生物の種及び属なども使用されることができる。前述のＥ.ｃｏｌｉに加えて、アグロバクテリウムＡ４のようなアグロバクテリウム属菌株、枯草菌（Bacillus subtilis）のようなバシラス属（bacilli）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）または セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）のような他の腸内細菌及び多様なシュードモナス（Pseudomonas）属菌株が宿主細胞として利用されることができ、本発明は、上記記述した例示に制限されるものではない。
【００３６】
また、原核細胞の形質転換は、Sambrook et al., supraの1.82セクションに記述されたカルシウムクロライド法を使用して容易に達成されることができる。選択的に、電気穿孔法（Neumann et al., EMBO J., 1: 841(1982))も、このような細胞を形質転換するのに使用されることができる。
【００３７】
本発明による転換酵素の遺伝子及び合成酵素の遺伝子を含有する植物体を製造するための、植物体の形質感染は、アグロバクテリウム、ウイルスベクターなどを利用した通常の方法によって達成することができる。例えば、本発明による遺伝子を含有する組み換えベクターでアグロバクテリウム属微生物を形質転換させた後、上記形質転換されたアグロバクテリウム属微生物を対象植物の組職などに感染させて、形質感染された植物を得ることができる。さらに具体的に、（ａ）対象植物の外植体（explant）を前培養（pre-culture）した後、これを上記形質転換されたアグロバクテリウムと共培養して外植体を形質感染させる段階；（ｂ）形質感染された外植体をカルス誘導培地で培養し、カルス(callus)を得る段階；及び（ｃ）得られたカルスを切断し、これを新芽誘導培地で培養し、新芽を形成させる段階を経て形質感染された植物を製造することができる。
【００３８】
本発明において、「外植体」という用語は、植物体から切断した組職の断片を示し、子葉（cotyledon）または胚軸（hypocotyl）を含む。本発明の方法に使用される植物の外植体としては、子葉または胚軸を使用することができ、植物の種子を消毒し洗浄した後、ＭＳ培地で発芽させて得た子葉を使用することがより好ましい。
【００３９】
本発明において利用可能な形質感染対象植物としては、タバコ、トマト、唐辛子、豆、稲、とうもろこしなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、形質転換に使用される植物が有性繁殖植物であるとしても、組職培養などによって無性的に繰り返し生殖させることができることは当業者に自明であろう。
【発明の効果】
【００４０】
以上説明したように、本発明によるクロストリジウムプロピオニウム由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体が導入された組み換え大膓菌により、従来、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼの大膓菌内の発現が微弱なので、円滑なラクチル−ＣｏＡ供給が困難であった問題が解決され、ラクテート重合体またはラクテート共重合体を高効率で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ブドウ糖、３ＨＢ及びラクテートを利用してラクテート共重合体Ｐｏｌｙ（３ＨＢ−ｃｏ−ｌａｃｔａｔｅ）を細胞内で合成する経路を模式的に示す図である。
【図２】本発明のＰｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９由来ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子とクロストリジウムプロピオニウム由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体遺伝子を含有する組み換え発現ベクターを作製する過程を図式化した図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、ただ本発明をさらに具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００４３】
本発明者の以前発明（大韓民国特許出願第10-2006-0116234号）において、ラクテート重合体及びラクテート共重合体の合成時に必要な単量体であるラクチル−ＣｏＡを提供するために、クロストリジウムプロピオニウム由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣＰ−ＰＣＴ）とＰＨＡ合成酵素が一緒に発現されるオペロン形態の常時的発現システムを構築した。より具体的に説明すれば、次の通りである。
【実施例】
【００４４】
実施例１−１：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニング及び発現ベクターの製造
本発明で使用されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９（ＫＣＴＣ１１０２７ＢＰ）由来ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９）遺伝子を分離するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９の全体ＤＮＡを抽出し、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子配列（HaeJin Song, Master’s Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004）に基づく配列番号５及び６の塩基配列を有するプライマーを作製し、ＰＣＲを行い、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子を得た。
【００４５】
配列番号５：５’−ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＡＡ ＴＣＡ ＡＡＴ ＣＡＴ ＧＡＧ ＴＡＡ ＣＡＡ ＧＡＧ ＴＡＡ ＣＧ−３’
配列番号６：５’−ＣＡＣ ＴＣＡ ＴＧＣ ＡＡＧ ＣＧＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＧＣ ＡＣＧ ＴＡＣ−３’
【００４６】
ＰＣＲ反応物をアガロースゲル電気泳動した結果、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子に該当する１．７ｋｂｐの大きさの遺伝子断片を確認した。
【００４７】
ｐＳＹＬ１０５ベクター（Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44: 1337-1347）でＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６由来のＰＨＢ生産オペロンが含有されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ認識部位に挿入することによって、ｐＲｅＣＡＢ組み換えベクターを製造した。
【００４８】
ｐＲｅＣＡＢベクターは、ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）と単量体供給酵素（ｐｈａＡＲＥ及びｐｈａＢＲＥ）がＰＨＢオペロンプロモーターによって定常的に発現され、大膓菌でも正しく作動すると知られている（Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44: 1337-1347）。ｐＲｅＣＡＢベクターをＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩで切断してＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６  ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）を除去した後、上記で得たｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子をＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ組み換えベクターを製造した。
【００４９】
ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位が各々両端に１つずつ含まれたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素遺伝子断片を作るために、まず、内在しているＢｓｔＢＩ部位をＳＤＭ（site directed mutagenesis）方法でアミノ酸の変換なしに除去し、ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位を追加するために、配列番号７と８、配列番号９と１０及び配列番号１１と１２の塩基配列を有するプライマーを利用してオーバーラッピングＰＣＲを行った。
【００５０】
配列番号７：５’−ＡＴＧ ＣＣＣ ＧＧＡ ＧＣＣ ＧＧＴ ＴＣＧ ＡＡ−３’
配列番号８：５’−ＣＧＴ ＴＡＣ ＴＣＴ ＴＧＴ ＴＡＣ ＴＣＡ ＴＧＡ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＧＴ ＣＴＣ ＴＣ−３’
配列番号９：５’−ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＡＡ ＴＣＡ ＡＡＴ ＣＡＴ ＧＡＧ ＴＡＡ ＣＡＡ ＧＡＧ ＴＡＡ ＣＧ−３’
配列番号１０：５’−ＣＡＣ ＴＣＡ ＴＧＣ ＡＡＧ ＣＧＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＧＣ ＡＣＧ ＴＡＣ−３’
配列番号１１：５’−ＧＴＡ ＣＧＴ ＧＣＡ ＣＧＡ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＣＧ ＣＴＴ ＧＣＡ ＴＧＡ ＧＴＧ−３’
配列番号１２：５’−ＡＡＣ ＧＧＧ ＡＧＧ ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＧ−３’
【００５１】
上記作製したｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ組み換えベクターのｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子の塩基配列は、シークエンシングを通じて確認して配列番号１３に示し、これによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１４に示した。
【００５２】
上記遺伝子塩基配列の類似性を分析した結果、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ６１−３（Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180: 6459, 1998）由来ｐｈａＣ１と８４．３％の相同性を有し、アミノ酸配列相同性は、８８．９％であって、上記２つの合成酵素が非常に類似の酵素であることを確認し、これを通じて、本発明で得たｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素が、Ｔｙｐｅ II ＰＨＡ合成酵素であることを確認した。
【００５３】
実施例１−２：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９由来ＰＨＡ合成酵素の基質特異的変異体の製造
多様な種類のＰＨＡ合成酵素のうち、タイプII ＰＨＡ合成酵素は、比較的炭素数が多い基質を重合させるＭＣＬ−ＰＨＡ（medium-chain-length ＰＨＡ）合成酵素として知られていて、このＭＣＬ−ＰＨＡ合成酵素は、ラクテート共重合体の生産に非常に有用なものと期待されている。本発明で獲得したｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素と非常に相同性が高いＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６１−３由来ｐｈａＣ１合成酵素は、タイプ II合成酵素であるが、比較的広範囲の基質特異性を有すると報告されていて（Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180: 6459, 1998）、ＳＣＬ−ＰＨＡ（short-chain-length ＰＨＡ）の生産に適した突然変異体に関する研究結果が報告されている（Takase et al., Biomacromolecules, 5: 480, 2004）。これに基づいて、本発明では、ＳＣＬ活性に影響を及ぼすアミノ酸部位３ヶ所を、アミノ酸配列分析を通じて探索し、配列番号１５乃至２０のプライマーを使用したＳＤＭ方法を利用して下記表１のようなｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素変異体を製造した。
【００５４】
【表１】
2010536338.tif 000003
【００５５】
配列番号１５：５’−ＣＴＧ ＡＣＣ ＴＴＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＡＣＣ ＧＴＧ ＣＴＴ ＧＡＴ ＡＣＣ ＡＣＣ−３’
配列番号１６：５’−ＧＧＴ ＧＧＴ ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＡＡ ＧＧＴ ＣＡＧ−３’
配列番号１７：５’−ＣＧＡ ＧＣＡ ＧＣＧ ＧＧＣ ＡＴＡ ＴＣＡ ＴＧＡ ＧＣＡ ＴＣＣ ＴＧＡ ＡＣＣ ＣＧＣ−３’
配列番号１８：５’−ＧＣＧ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＧＡ ＴＧＣ ＴＣＡ ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＧＣ ＴＣＧ−３’
配列番号１９：５’−ＡＴＣ ＡＡＣ ＣＴＣ ＡＴＧ ＡＣＣ ＧＡＴ ＧＣＧ ＡＴＧ ＧＣＧ ＣＣＧ ＡＣＣ−３’
配列番号２０：５’−ＧＧＴ ＣＧＧ ＣＧＣ ＣＡＴ ＣＧＣ ＡＴＣ ＧＧＴ ＣＡＴ ＧＡＧ ＧＴＴ ＧＡＴ−３’
【００５６】
実施例１−３：クロストリジウムプロピオニウム由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ突然変異体ライブラリの作製及びスクリーニング
本実施例では、ラクテート重合体及び共重合体合成の時に必要な単量体であるラクチル−ＣｏＡを提供するために、クルロストリディユムプロピオニクム由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣＰ−ＰＣＴ）を使用し、その遺伝子配列を配列番号３に示した。ｃｐ−ｐｃｔは、クロストリジウムプロピオニウムの染色体ＤＮＡを配列番号２１及び２２のプライマーを利用してＰＣＲして得られた断片を使用し、この時、元々野生型ＣＰ−ＰＣＴに存在するＮｄｅＩサイトをクローニングの促進のためにＳＤＭ方法を利用して除去した。
【００５７】
配列番号２１：５’−ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＡＴ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＧＴ ＴＣＣ ＣＡＴ ＴＡＴ ＴＡＣ ＣＧＣ ＡＧＡ ＴＧＡ−３’
配列番号２２：５’−ＧＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＴＡ ＧＧＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＴＴＣ ＣＴＴ ＣＡＧ ＡＣＣ ＣＡＴ ＴＡＡ ＧＣＣ ＴＴＣ ＴＧ−３’
【００５８】
また、ＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位を追加するために、配列番号２３と２４の塩基配列を有するプライマーを利用してオーバーラッピングＰＣＲを行った。
【００５９】
配列番号２３：５’−ａｇｇ ｃｃｔ ｇｃａ ｇｇｃ ｇｇａ ｔａａ ｃａａ ｔｔｔ ｃａｃ ａｃａ ｇｇ−３’
配列番号２４：５’−ｇｃｃ ｃａｔ ａｔｇ ｔｃｔ ａｇａ ｔｔａ ｇｇａ ｃｔｔ ｃａｔ ｔｔｃ ｃ−３’
【００６０】
ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素ＳＣＬ変異体であるｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００を含有するｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢベクターをＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断し、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６由来の単量体供給酵素（ｐｈａＡＲＥ及びｐｈａＢＲＥ）を除去した後、上記ＰＣＲクローニングしたＣＰ−ＰＣＴ遺伝子をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ組み換えベクターを製造した。
【００６１】
実施例２：クロストリジウムプロピオニウム由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ突然変異体ライブラリの作製及びスクリーニング
ＣＰ−ＰＣＴが大膓菌で高発現される場合、深刻な代謝障害を起こし、毒性を現わすことが知られているが、全般的に、組み換えタンパク質の発現に広く使用されるｔａｃプロモーターやＴ７プロモーターを使用したＩＰＴＧによる発現誘導タンパク質製造システムにおいては、誘導剤の添加と同時に、組み換え大膓菌がすべて死滅した。このため、弱く発現されるが、微生物の成長によって持続的に発現される常時的発現システムを使用してラクテート重合体及びラクテート共重合体の合成に成功した。ｃｐ−ｐｃｔに無作為的突然変異を導入するために、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ（大韓民国特許出願第10-2006-0116234号）を鋳型にし、配列番号１及び配列番号２のプライマーを利用してＭｎ２＋が添加され、ｄＮＴＰｓの濃度差異が存在する条件下でエラープローンPCR（Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ）を実施した（図２）。
【００６２】
配列番号１：５’−ｃｇｃ ｃｇｇ ｃａｇ ｇｃｃ ｔｇｃ ａｇｇ−３’
配列番号２：５’−ｇｇｃ ａｇｇ ｔｃａ ｇｃｃ ｃａｔ ａｔｇ ｔｃ−３’
【００６３】
その後、無作為的突然変異が含まれたＰＣＲ断片を増幅するために、上記配列番号１及び配列番号２のプライマーを利用して一般条件でＰＣＲした。ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素ＳＣＬ変異体であるｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３００を含有するｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴベクターをＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断して野生型ｃｐ−ｐｃｔを除去した後、上記増幅された突然変異ＰＣＲ断片をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入させたライゲーション混合物（ligation mixture）を作製して、Ｅ.ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、〜１０５程度規模のＣＰ−ＰＣＴライブラリを作製した（図２）。上記作製されたＣＰ−ＰＣＴライブラリは、高分子検出培地（ＬＢ寒天、グルコース２０ｇ／Ｌ、３ＨＢ  １ｇ／Ｌ、ナイルレッド０．５μｇ／ｍＬ）で３日間生育させた後、高分子生成の可否を確認するスクリーニング作業を行い、〜８０余個体の候補を１次選定した。これらの候補を高分子が生成される条件で４日間液体培養（ＬＢ寒天、グルコース２０ｇ／Ｌ、３ＨＢ  １ｇ／Ｌ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、３７℃）し、ＦＡＣＳ（Florescence Activated Cell Sorting）分析し、最終２個体を選定した。また、これらの突然変異体が含まれた組み換え発現ベクターを大膓菌で回収した後、再びＥ.ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入し、高分子生産収率を確認し、ＣＰ−ＰＣＴ変異体を有する組み換えベクターで形質転換された大膓菌が野生型ＣＰ−ＰＣＴが含まれた組み換え発現ベクターで形質転換された大膓菌より優れていることを確認した。
【００６４】
実施例３：クロストリジウムプロピオニウム由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ突然変異体を利用したＰＬＡ共重合体の製造
実施例２で最終選別された突然変異体の活性を定量的に分析するために、これらの突然変異体が含有された組み換え発現ベクター（図２）で形質転換されたＥ.ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９をブドウ糖（２０ｇ／Ｌ）と３ＨＢ（２ｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ培地で３７℃で４日間フラスコ培養した。培養菌体を遠心分離を通じて回収し、１００℃の乾燥機で２４時間乾燥した後、ガスクロマトグラフィ分析を行い、細胞内の合成された高分子含量を測定した（表２）。
【００６５】
【表２】
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【００６６】
ガスクロマトグラフィー分析の結果、本発明で製造したＣＰ−ＰＣＴ突然変異体が含まれた組み換え発現ベクターは、野生型ＣＰ−ＰＣＴ含有ベクターであるｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴベクターに比べてＰＬＡ共重合体合成能が２〜８倍程度優れていることを確認した。これは、ＣＰ−ＰＣＴ突然変異体が野生型ＣＰ−ＰＣＴより高分子合成の単量体であるラクチル−ＣｏＡ及び３ＨＢ−ＣｏＡを効率的に供給するからである。
【００６７】
上記作製されたＣＰ−ＰＣＴ変異体の突然変異部位を探すために、ＣＰ−ＰＣＴ変異体の遺伝子塩基配列を分析した。その結果は、下記表３に示された通りである。
【００６８】
【表３】
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【００６９】
ＣＰ−ＰＣＴ変異体の遺伝子塩基配列を分析した結果、変異体５１２では、１個の核酸置換が、変異体５２２では、４個の核酸置換が発生した。しかし、これらの核酸置換は、いずれもアミノ酸置換を起こさないサイレント変異（silent mutation）であることを確認した。すなわち、本発明で作製したＣＰ−ＰＣＴ変異体の単量体供給能力向上は、酵素のアミノ酸置換による活性増加でなく、大膓菌内での発現量変化によるものと推測される。これより、一般的な大膓菌での野生型ＣＰ−ＰＣＴとＣＰ−ＰＣＴ変異体の遺伝子配列のコドン使用頻度を分析した（表４）。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
上記表４から明らかなように、変異体５２２に存在するＡ１１２５Ｇを除いたすべての核酸置換が大膓菌のコドン使用頻度の側面において有利な変化であることを確認した。すなわち、本発明で作製したＣＰ−ＰＣＴ変異体は、大膓菌のコドン使用頻度に有利な核酸置換によって活性化形態の酵素発現量が増加し、これより、ＰＬＡ共重合体の生産に必要な単量体供給能力が向上したものと認められる。
【００７２】
実施例４：クロストリジウムプロピオニウム由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ突然変異体を利用したＰＬＡ共重合体の製造
実施例２で最終選別された突然変異体（５１２、５２２）についてさらに実施例２に記載の態様でランダム変異導入法（random mutagenesis）を行い、下記のようなＣＰ−ＰＣＴ変異体５３１〜５３７及び５４０を得た。
【００７３】
ＣＰ−ＰＣＴ変異体を定量的に分析するために、これらの突然変異体が含有された組み換え発現ベクター（図２）で形質転換されたＥ.ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９をブドウ糖（２０ｇ／Ｌ）と３ＨＢ（２ｇ／Ｌ）が含まれたＰ−Ｒｉｃｈ  ＭＲ培地で３０℃で４日間フラスコ培養した。培養菌体を遠心分離を通じて回収し、１００℃で乾燥機で２４時間乾燥した後、ガスクロマトグラフィー分析を行い、細胞内の合成された高分子含量を測定した。突然変異部位を探すための遺伝子塩基配列の分析結果及び生成された高分子含量結果を各々表５及び表６に示した。
【００７４】
上記実験において、Ｐ−ｒｉｃｈ  ＭＲの組成は、１リットル当たりＫＨ２ＰＯ４、２２ｇ；（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、３ｇ；クエン酸塩（Citrate）、０．８ｇ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．７ｇ；及び微量金属溶液（Trace metal solution）、５ｍＬであり、微量金属溶液の組成は、１リットル当たりＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｇ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２５ｇ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１ｇ；ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇ；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２ｇ；Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・７Ｈ２Ｏ、０．２３ｇ；（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、０．１ｇ；及び３５％ＨＣｌ、１０ｍＬであった。
【００７５】
【表５】
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【００７６】
【表６】
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【００７７】
上記表６の結果から明らかなように、本発明で製造したＣＰ−ＰＣＴ変異体は、野生型に比べてラクテートのモル％が画期的に増加し、また、変異体５３１、５３３、５３５、５３７及び５４０が含まれた組み換え発現ベクターは、野生型ＣＰ−ＰＣＴ含有ベクターに比べてＰＬＡ共重合体合成能が優れていることを確認した。
【００７８】
本発明はこれらの実施例に関連して示されかつ記述される一方で、添付の特許請求の範囲によって定義される発明の精神及び範囲から離れることなしに、発明の形態及び詳細における多様な変更が成され得ることを当業者は理解する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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