(57)【要約】  本発明は、実験試料、および既知の標的コピー数を含む、少なくとも２つの標準対照試料からの初期信号データを収集および処理することによって、実験試料中の標的を定量化するための方法およびソフトウェアアプリケーションを提供する。本発明は、この点において、実験試料中の標的コピー数の定量化を可能とする。【選択図】  図１
2010538612.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実験試料中の標的を定量化する方法であって、
ａ）ｉ）実験試料、および異なる既知の標的コピー数を含む、少なくとも２つの標準対照試料からの、複数の時間間隔で検出されたアッセイ信号レベルを含む、初期信号データであって、実験曲線および少なくとも２つの標準対照曲線としてプロットすることが可能である、初期信号データと、
ｉｉ）ｉ）時間ゼロにおける初期信号値と、ｉｉ）閾値勾配とを有する、閾値信号線であって、バックグラウンドレベル以上であり、前記実験曲線、および前記少なくとも２つの標準対照曲線のうちの２つ以上と交差する、閾値信号線と、を提供する工程と、
ｂ）前記初期信号データおよび前記閾値信号線を処理し、実験交差時間値、および少なくとも２つの標準対照交差時間値を生成する工程と、
ｃ）前記少なくとも２つの標準対照交差時間値、および前記既知の標的コピー数を処理し、前記既知の標的コピー数に対する前記交差時間値のログ／ログプロット、または線形／ログプロットに対する座標を含む、ログプロットデータを生成する工程と、
ｄ）前記ログプロットデータを処理し、前記ログプロットデータに適合した、得られた勾配を記述する勾配方程式を生成する工程と、
ｅ）前記勾配方程式で前記実験交差時間値を処理し、前記実験試料に対する定量化された標的コピー数を生成する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記閾値勾配はゼロであるか、または前記閾値勾配は負である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アッセイ信号レベルは、核酸検出アッセイによって生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸検出アッセイは、侵襲的開裂アッセイを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸検出アッセイは、等温条件下で実行される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記標的は、核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸配列は、マイクロＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
実験試料中の標的を定量化する方法であって、
ａ）ｉ）初期信号データを受けるように構成される、ユーザインターフェースと、
ｉｉ）標的定量化ソフトウェアアプリケーションを格納している、コンピュータシステムと、を提供する工程と、
ｂ）前記ユーザインターフェースから前記コンピュータシステムに、前記初期信号データを送信する工程であって、前記初期信号データは、実験試料、および異なる既知の標的コピー数を含む、少なくとも２つの標準対照試料からの、複数の時間間隔で検出されたアッセイ信号レベルを含み、前記信号データは、実験曲線および少なくとも２つの標準対照曲線としてプロットすることが可能である、工程と、
ｃ）前記標的定量化ソフトウェアアプリケーションで、前記信号データを処理する工程であって、前記標的定量化ソフトウェアが、
ｉ）ｉ）時間ゼロにおける初期信号値と、ｉｉ）閾値勾配とを有する閾値信号線を生成し、前記閾値信号線は、バックグラウンドレベル以上であり、前記実験曲線、および前記少なくとも２つの標準対照曲線のうちの２つ以上と交差する、
ｉｉ）前記信号データおよび前記閾値信号線を処理し、実験交差時間値、および少なくとも２つの標準対照交差時間値を生成する、
ｉｉｉ）前記少なくとも２つの標準対照交差時間値、および前記既知の標的コピー数を処理し、前記既知の標的コピー数に対する前記交差時間値のログ／ログプロット、または線形／ログプロットに対する座標を含む、ログプロットデータを生成する、
ｉｖ）前記ログプロットデータを処理し、前記ログプロットデータに適合する、得られた勾配を記述する勾配方程式を生成する、および
ｖ）前記勾配方程式で前記実験交差時間値を処理し、前記実験試料に対する定量化された標的コピー数を生成する、ように処理する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項９】
前記閾値勾配はゼロであるか、または前記閾値勾配は負である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アッセイ信号レベルは、核酸検出アッセイによって生成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸検出アッセイは、侵襲的開裂アッセイを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸検出アッセイは、等温条件下で実行される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的は、核酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸配列は、マイクロＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
実験試料中の標的を定量化するためのシステムであって、
ａ）実験試料、および異なる既知の標的コピー数を含む、少なくとも２つの標準対照試料からの、複数の時間間隔におけるアッセイ信号レベルを検出し、初期信号データを生成するように構成される、装置と、
ｂ）ｉ）前記初期信号データを処理し、実験曲線および少なくとも２つの標準対照曲線としてプロットすることが可能である信号データを生成する、
ｉｉ）ｉ）時間ゼロにおける初期信号値と、ｉｉ）閾値勾配とを有する閾値信号線を生成し、前記閾値信号線は、バックグラウンド以上であり、前記実験曲線、および前記少なくとも２つの標準対照曲線のうちの２つ以上と交差する、
ｉｉｉ）前記信号データおよび前記閾値信号線を処理し、実験交差時間値、および少なくとも２つの標準対照交差時間値を生成する、
ｉｖ）前記少なくとも２つの標準対照交差時間値、および前記既知の標的コピー数を処理し、前記既知の標的コピー数に対する前記交差時間値のログ／ログプロット、または線形／ログプロットに対する座標を含む、ログプロットデータを生成する、
ｖ）前記ログプロットデータを処理し、前記ログプロットデータに適合する、得られた勾配を記述する勾配方程式を生成する、および
ｖｉ）前記勾配方程式で前記実験交差時間値を処理し、前記実験試料に対する定量化された標的コピー数を生成する、ように構成される、標的定量化ソフトウェアアプリケーションと、
ｃ）前記標的定量化ソフトウェアアプリケーションを格納する、コンピュータシステムであって、コンピュータメモリとコンピュータプロセッサとを備える、コンピュータシステムと、
を備える、前記システム。
【請求項１６】
前記アッセイ信号レベルは、核酸検出アッセイによって生成される、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記核酸検出アッセイは、侵襲的開裂アッセイを含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記核酸検出アッセイは、等温条件下で実行されるように構成される、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１９】
前記標的は、核酸配列を含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２０】
前記核酸配列は、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む、請求項１９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、２００７年９月７日出願の米国仮出願第６０／９７０，７０７号に対して優先権を主張する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、実験試料中の標的を定量化するための方法およびソフトウェアアプリケーションに関する。好ましくは、標的は、核酸検出アッセイによって検出される核酸配列である。
【背景技術】
【０００３】
核酸の定量化は、生物学および医学の分野において重要な役割を果たす。例えば、核酸の定量化は、癌の診断および予後診断、ならびにウイルスの診断、ならびに治療効果（例えば、ＨＣＶおよびＨＩＶに対する）の判断において重要である。ＨＣＶ  ＲＮＡ定量化は、ＩＦＮを服用している患者にとって重要である。ＩＦＮ療法の効果は、ＩＦＮ療法中にウイルスの量を監視することによって、直接見いだすことができる。これにより、各患者の臨床状態に適合した、より効果的なＩＦＮ療法が可能となる。標的核酸の定量化は、将来の疾病の診断にとって重要である。例えば、早期診断は、外部刺激に起因する疾病の場合、外部刺激に応答するｍＲＮＡの発現レベルを検査することによって達成することができる。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応を、核酸定量化に採用することができる。しかしながら、ＰＣＲが採用される場合、増幅した核酸の絶対量は、増幅が開始された時に存在していた標的核酸の量を正確に反映しない。最初に、ＰＣＲによって増幅される生成物の量は、概して、サイクル毎に指数関数的に増加するが、増加率は低下し、次いで、増幅した生成物の量がある一定のレベルを超えた時に停止する。したがって、増幅した生成物の最終量は、反応が開始された時の標的核酸の量にかかわらず一定である。この現象は、プラトー効果と呼ばれ、ＰＣＲによって増幅した生成物を定量化する際に考慮されるべきである。
【０００５】
リアルタイムＰＣＲとして既知の技術は、標的配列定量化に広く採用される。この技術において、標的核酸の連続希釈物を調製し、各試料をＰＣＲに供し、次いで、経時変化をリアルタイムで測定する。プラトー効果のレベルに到達する前に、増幅が指数関数的に発生する領域において、所与の量の増幅した生成物が得られる、閾値サイクル（Ｃｔ値）が決定される。決定された値を、縦軸上にプロットし、核酸の量を、横軸上にプロットする。このようにして、検量線が作成される。対象となる未知試料を、同一条件下でＰＣＲに供し、Ｃｔ値を決定する。これにより、未知試料中の核酸の量の定量化が可能となる。リアルタイム検出のための装置は、概して高価である。一般的に市販されているサーマルサイクラを使用して、この技術を実行する場合、所与の量の増幅した生成物が生成される閾値サイクルを決定するために、試料を、サイクル毎に分析しなければならない。したがって、この技術は、多大な労力を必要とする。
【０００６】
定量的競合ＰＣＲもまた、広く採用される技術である。この技術において、標的核酸の配列と同様の配列を有する競合核酸が、段階的に希釈され、結果物は、定量化される標的核酸を含有する試料に添加される。添加された競合核酸の量に応じて、添加された競合核酸からの増幅した生成物の量に対する、標的核酸からの増幅した生成物の量の比が決定される。その結果、添加された標的核酸からの増幅した生成物の量が、競合核酸からの増幅した生成物の量と等しくなる点が、標的核酸の量を表す。この技術は比較的単純であるが、各プライマに対する競合体を調製する必要性により、作業が複雑になる。加えて、標的核酸の増幅効率が、競合核酸の増幅効率とは異なり得るという問題がある。
【０００７】
上記を考慮すると、試料中の核酸および他の標的を定量化するための、比較的単純かつ安価な方法が必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、実験試料、および既知の標的コピー数を含む、少なくとも２つの標準対照試料からの初期信号(シグナル)データを収集および処理することによって、実験試料中の標的を定量化するための方法およびソフトウェアアプリケーションを提供する。特定の実施形態では、初期信号データは、実験曲線（例えば、Ｓ字形曲線または他の曲線）、および少なくとも２つの標準対照曲線（例えば、Ｓ字形曲線または他の曲線）としてプロットすることが可能である。ある実施形態では、初期信号データは閾値信号線で処理され、対照および実験交差時間値を生成し、それらは、ログ(ｌｏｇ)／ログプロット、または線形／ログプロットに対する座標を含むログプロットデータを生成するために、さらに処理することができる。いくつかの実施形態では、ログプロットデータは処理され、実験時間値で使用することができる勾配方程式を生成し、実験試料中の標的コピー数を定量化してもよい。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）実験試料、および異なる既知の標的コピー数を含む、少なくとも２つの標準対照試料からの、複数の時間間隔で検出されるアッセイ信号レベルを含む、初期信号データであって、実験曲線および少なくとも２つの標準対照曲線としてプロットすることが可能である、初期信号データと、ｉｉ）ｉ）時間ゼロにおける初期信号値と、ｉｉ）閾値勾配とを有する、閾値信号線であって、バックグラウンドレベル以上であり、実験曲線、および少なくとも２つの標準対照曲線のうちの２つ以上と交差する、閾値信号線とを提供する工程と、ｂ）初期信号データおよび閾値信号線を処理し、実験交差時間値、および少なくとも２つの標準対照交差時間値を生成する工程と、ｃ）少なくとも２つの標準対照交差時間値、および既知の標的コピー数を処理し、既知の標的コピー数に対する交差時間値のログ／ログプロット、または線形／ログプロットに対する座標を含む、ログプロットデータを生成する工程と、ｄ）ログプロットデータを処理し、ログプロットデータに適合した、得られた勾配を記述する勾配方程式を生成する工程と、ｅ）勾配方程式で実験交差時間値を処理し、実験試料に対する定量化された標的コピー数を生成する工程とを含む、実験試料中の標的を定量化するための方法を提供する。
【００１０】
他の実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）初期信号データを受けるように構成される、ユーザインターフェースと、ｉｉ）標的定量化ソフトウェアアプリケーションを格納している、コンピュータシステムとを提供する工程と、ｂ）ユーザインターフェースからコンピュータシステムに、初期信号データを送信する工程であって、初期信号データは、実験試料、および異なる既知の標的コピー数を含む、少なくとも２つの標準対照試料からの、複数の時間間隔で検出されたアッセイ信号レベルを含み、信号データは、実験曲線および少なくとも２つの標準対照曲線としてプロットすることが可能である、工程と、ｃ）標的定量化ソフトウェアアプリケーションで、信号データを処理する工程であって、標的定量化ソフトウェアが、ｉ）ｉ）時間ゼロにおける初期信号値と、ｉｉ）閾値勾配とを有する閾値信号線を生成し、閾値信号線は、バックグラウンドレベル以上であり、実験曲線、および少なくとも２つの標準対照曲線のうちの２つ以上と交差する、ｉｉ）信号データおよび閾値信号線を処理し、実験交差時間値、および少なくとも２つの標準対照交差時間値を生成する、ｉｉｉ）少なくとも２つの標準対照交差時間値、および既知の標的コピー数を処理し、既知の標的コピー数に対する交差時間値のログ／ログプロット、または線形／ログプロットに対する座標を含む、ログプロットデータを生成する、ｉｖ）ログプロットデータを処理し、ログプロットデータに適合する、得られた勾配を記述する勾配方程式を生成する、およびｖ）勾配方程式で実験交差時間値を処理し、実験試料に対する定量化された標的コピー数を生成する、ように処理する工程とを含む、実験試料中の標的を定量化するための方法を提供する。
【００１１】
さらなる実施形態では、本発明は、ａ）実験試料、および異なる既知の標的コピー数を含む、少なくとも２つの標準対照試料からの、複数の時間間隔におけるアッセイ信号レベルを検出し、初期信号データを生成するように構成される、装置と、ｂ）ｉ）初期信号データを処理し、実験曲線および少なくとも２つの標準対照曲線としてプロットすることが可能である信号データを生成する、ｉｉ）ｉ）時間ゼロにおける初期信号値と、ｉｉ）閾値勾配とを有する閾値信号線を生成し、閾値信号線は、バックグラウンド以上であり、実験曲線、および少なくとも２つの標準対照曲線のうちの２つ以上と交差する、ｉｉｉ）信号データおよび閾値信号線を処理し、実験交差時間値、および少なくとも２つの標準対照交差時間値を生成する、ｉｖ）少なくとも２つの標準対照交差時間値、および既知の標的コピー数を処理し、既知の標的コピー数に対する交差時間値のログ／ログプロット、または線形／ログプロットに対する座標を含む、ログプロットデータを生成する、ｖ）ログプロットデータを処理し、ログプロットデータに適合する、得られた勾配を記述する勾配方程式を生成する、およびｖｉ）勾配方程式で実験交差時間値を処理し、実験試料に対する定量化された標的コピー数を生成するように構成される、標的定量化ソフトウェアアプリケーションと、ｃ）標的定量化ソフトウェアアプリケーションを格納する、コンピュータシステムであって、コンピュータメモリとコンピュータプロセッサとを備える、コンピュータシステムとを備える、実験試料中の標的を定量化するためのシステムを提供する。
【００１２】
特定の実施形態では、本発明は、標的定量化ソフトウェアアプリケーションを格納している、コンピュータメモリ装置を提供し、標的定量化ソフトウェアアプリケーションは、ａ）初期信号データを処理し、実験曲線および少なくとも２つの標準対照曲線としてプロットすることが可能である信号データを生成し、初期信号データは、実験試料、および異なる既知の標的コピー数を含む、少なくとも２つの標準対照試料からの、複数の時間間隔で検出されたアッセイ信号レベルを含み、ｂ）ｉ）時間ゼロにおける初期信号値と、ｉｉ）閾値勾配とを有する閾値信号線を生成し、閾値信号線は、バックグラウンド以上であり、実験曲線、および少なくとも２つの標準対照曲線のうちの２つ以上と交差する、ｃ）信号データおよび閾値信号線を処理し、実験交差時間値、および少なくとも２つの標準対照交差時間値を生成する、ｄ）少なくとも２つの標準対照交差時間値、および既知の標的コピー数を処理し、既知の標的コピー数に対する交差時間値のログ／ログプロット、または線形／ログプロットに対する座標を含む、ログプロットデータを生成する、ｅ）ログプロットデータを処理し、ログプロットデータに適合する、得られた勾配を記述する勾配方程式を生成する、およびｆ）勾配方程式で実験交差時間値を処理し、実験試料に対する定量化された標的コピー数を生成するように構成される。
【００１３】
ある実施形態では、本発明は、ａ）実験試料および少なくとも２つの標準対照試料を、核酸検出アッセイにかける工程であって、少なくとも２つの標準対照試料は、異なる既知の標的コピー数を含む、工程と、ｂ）ｉ）実験試料、ｉｉ）少なくとも２つの標準対照試料、およびｉｉｉ）少なくとも２つの内部色素対照試料から、アッセイ信号レベルを検出する工程であって、アッセイ信号レベルは、生信号データを生成するために、複数の時間間隔で検出される、工程と、ｃ）生信号データを正規化し、ｉ）正規化された実験信号データ、ｉｉ）正規化された標準対照信号データ、およびｉｉｉ）正規化された内部色素対照信号値を生成する工程と、ｄ）正規化された実験信号データおよび正規化された標準対照信号データを処理し、実験曲線および少なくとも２つの標準対照曲線としてプロットすることが可能である、信号データを生成する工程と、ｅ）時間ゼロにおける初期信号値と閾値勾配とを有する、少なくとも１つの閾値信号線を決定する工程であって、閾値信号線は、ｉ）正規化された内部色素対照値以上である、ｉｉ）実験曲線と交差する、およびｉｉｉ）少なくとも２つの標準対照曲線のうちの２つ以上と交差する、工程と、ｆ）信号データおよび閾値信号線を処理し、実験交差時間値および少なくとも２つの標準対照交差時間値を生成する工程と、ｇ）少なくとも２つの標準対照交差時間値、および既知の標的コピー数を処理し、既知の標的コピー数に対する交差時間値のログ／ログプロット、または線形／ログプロットに対する座標を含む、ログプロットデータを生成する工程と、ｈ）ログプロットデータを処理し、ログプロットデータに適合する、得られた勾配を記述する勾配方程式を生成する工程と、ｉ）勾配方程式で実験交差時間値を処理し、実験試料に対する定量化された標的コピー数を生成する工程とを含む、実験試料中の標的を定量化するための方法を提供する。
【００１４】
他の実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）実験試料、および異なる既知の標的コピー数を含む、少なくとも２つの標準対照試料からの、複数の時間間隔で検出されたアッセイ信号レベルを含む、初期信号データであって、実験曲線および少なくとも２つの標準対照曲線としてプロットすることが可能である、初期信号データと、各々が、ｉ）時間ゼロにおける初期信号値と、ｉｉ）閾値勾配とを有する、複数の異なる閾値信号線であって、閾値信号線の各々は、バックグラウンドレベル以上であり、実験曲線、および少なくとも２つの標準対照曲線のうちの２つ以上と交差する、複数の異なる閾値信号線とを提供する工程と、ｂ）初期信号データおよび複数の閾値信号線を処理し、異なる閾値信号線の各々に対する実験交差時間値および標準対照交差時間値を生成する工程と、ｃ）標準対照交差時間値および既知の標的コピー数を処理し、複数の異なる閾値信号線の各々に対するログプロットデータを生成する工程であって、ログプロットデータは、既知の標的コピー数に対する交差時間値のログ／ログプロット、または線形／ログプロットに対する座標を含む、工程と、ｄ）ログプロットデータを処理し、ログプロットデータに適合する、複数の得られた勾配を記述する複数の勾配方程式を生成する工程であって、複数の得られた勾配の各々は、適合値（例えば、Ｒ２値）を有する、工程と、ｅ）複数の勾配方程式のうちの少なくとも１つで実験交差時間値を処理し、実験試料に対する定量化された標的コピー数を生成する工程とを含む、実験試料中の標的を定量化するための方法を提供する。
【００１５】
特定の実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）初期信号データを受けるように構成される、ユーザインターフェースと、ｉｉ）標的定量化ソフトウェアアプリケーションを格納している、コンピュータシステムとを提供する工程と、ｂ）ユーザインターフェースからコンピュータシステムに、初期信号データを送信する工程であって、初期信号データは、実験試料、および異なる既知の標的コピー数を含む、少なくとも２つの標準対照試料からの、複数の時間間隔で検出されたアッセイ信号レベルを含み、信号データは、実験曲線および少なくとも２つの標準対照曲線としてプロットすることが可能である、工程と、ｃ）標的定量化ソフトウェアアプリケーションで信号データを処理する工程であって、標的定量化ソフトウェアが、ｉ）ｉ）時間ゼロにおける初期信号値と、ｉｉ）閾値勾配とを有する複数の異なる閾値信号線を生成し、閾値信号線の各々は、バックグラウンドレベル以上であり、実験曲線、および少なくとも２つの標準対照曲線のうちの２つ以上と交差する、ｉｉ）信号データおよび複数の閾値信号線を処理し、異なる閾値信号線の各々に対する実験交差時間値、および標準対照交差時間値を生成する、ｉｉｉ）標準対照交差時間値および既知の標的コピー数を処理し、複数の異なる閾値信号線の各々に対するログプロットデータを生成し、ログプロットデータは、既知の標的コピー数に対する交差時間値のログ／ログプロット、または線形／ログプロットに対する座標を含む、ｉｖ）ログプロットデータを処理し、ログプロットデータに適合する、複数の得られた勾配を記述する複数の勾配方程式を生成し、複数の得られた勾配の各々は、適合値（例えば、Ｒ２値）を有する、およびｖ）複数の勾配方程式のうちの少なくとも１つで実験交差時間値を処理し、実験試料に対する定量化された標的コピー数を生成する、ように処理する工程とを含む、実験試料中の標的を定量化するための方法を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、ａ）実験試料、および異なる既知の標的コピー数を含む、少なくとも２つの標準対照試料からの、複数の時間間隔におけるアッセイ信号レベルを検出し、初期信号データを生成するように構成される、装置と、ｂ）ｉ）初期信号データを処理し、実験曲線および少なくとも２つの標準対照曲線としてプロットすることが可能である信号データを生成する、ｉｉ）ｉ）時間ゼロにおける初期信号値と、ｉｉ）閾値勾配とをそれぞれ有する、複数の異なる閾値信号線を生成し、閾値信号線の各々は、バックグラウンド以上であり、実験曲線、および少なくとも２つの標準対照曲線のうちの２つ以上と交差する、ｉｉｉ）信号データおよび複数の閾値信号線を処理し、異なる閾値信号線の各々に対する実験交差時間値および標準対照交差時間値を生成する、ｉｖ）標準対照交差時間値および既知の標的コピー数を処理し、複数の異なる閾値信号線の各々に対するログプロットデータを生成し、ログプロットデータは、既知の標的コピー数に対する交差時間値のログ／ログプロット、または線形／ログプロットに対する座標を含む、ｖ）ログプロットデータを処理し、ログプロットデータに適合する、複数の得られた勾配を記述する複数の勾配方程式を生成し、複数の得られた勾配の各々は、適合値（例えば、Ｒ２値）を有する、およびｖｉ）複数の勾配方程式のうちの少なくとも１つで、実験交差時間値を処理し、実験試料に対する定量化された標的コピー数を生成するように構成される、標的定量化ソフトウェアアプリケーションと、ｃ）標的定量化ソフトウェアアプリケーションを格納する、コンピュータシステムであって、コンピュータメモリとコンピュータプロセッサとを備える、コンピュータシステムとを備える、実験試料中の標的を定量化するためのシステムを提供する。
【００１７】
他の実施形態では、本発明は、標的定量化ソフトウェアアプリケーションを格納しているコンピュータメモリ装置を提供し、標的定量化ソフトウェアアプリケーションは、ａ）初期信号データを処理し、実験曲線および少なくとも２つの標準対照曲線としてプロットすることが可能である、信号データを生成し、初期信号データは、実験試料、および異なる既知の標的コピー数を含む、少なくとも２つの標準対照試料からの、複数の時間間隔で検出されたアッセイ信号レベルを含む、ｂ）各々が、ｉ）時間ゼロにおける初期信号値と、ｉｉ）閾値勾配とを有する、複数の異なる閾値信号線を生成し、閾値信号線の各々は、バックグラウンド以上であり、実験曲線、および少なくとも２つの標準対照曲線のうちの２つ以上と交差する、ｃ）信号データおよび複数の閾値信号線を処理し、異なる閾値信号線の各々に対する実験交差時間値および標準対照交差時間値を生成する、ｄ）標準対照交差時間値および既知の標的コピー数を処理し、複数の異なる閾値信号線の各々に対するログプロットデータを生成し、ログプロットデータは、既知の標的コピー数に対する交差時間値のログ／ログプロット、または線形／ログプロットに対する座標を含む、ｅ）ログプロットデータを処理し、ログプロットデータに適合する、複数の得られた勾配を記述する複数の勾配方程式を生成し、複数の得られた勾配の各々は、適合値（例えば、Ｒ２値）を有する、およびｆ）複数の勾配方程式のうちの少なくとも１つで実験交差時間値を処理し、実験試料に対する定量化された標的コピー数を生成するように構成される。
【００１８】
ある実施形態では、本発明は、ａ）実験試料および少なくとも２つの標準対照試料を、核酸検出アッセイにかける工程であって、少なくとも２つの標準対照試料は、異なる既知の標的コピー数を含む、工程と、ｂ）ｉ）実験試料、ｉｉ）少なくとも２つの標準対照試料、およびｉｉｉ）少なくとも２つの内部色素対照試料から、アッセイ信号レベルを検出する工程であって、アッセイ信号レベルは、生信号データを生成するために、複数の時間間隔で検出される、工程と、ｃ）生信号データを正規化し、ｉ）正規化された実験信号データ、ｉｉ）正規化された標準対照信号データ、およびｉｉｉ）正規化された内部色素対照信号値を生成する工程と、ｄ）正規化された実験信号データおよび正規化された標準対照信号データを処理し、実験曲線および少なくとも２つの標準対照曲線としてプロットすることが可能である、信号データを生成する工程と、ｅ）時間ゼロにおける初期信号値と閾値勾配とをそれぞれ有する、複数の閾値信号線を決定する工程であって、閾値信号線の各々は、ｉ）正規化された内部色素対照値以上である、ｉｉ）実験曲線と交差する、およびｉｉｉ）少なくとも２つの標準対照曲線のうちの２つ以上と交差する、工程と、ｆ）信号データおよび複数の閾値信号線を処理し、異なる閾値信号線の各々に対する実験交差時間値および標準対照交差時間値を生成する工程と、ｇ）標準対照交差時間値および既知の標的コピー数を処理し、複数の異なる閾値信号線の各々に対するログプロットデータを生成する工程であって、ログプロットデータは、既知の標的コピー数に対する交差時間値のログ／ログプロット、または線形／ログプロットに対する座標を含む、工程と、ｈ）ログプロットデータを処理し、ログプロットデータに適合する、複数の得られた勾配を記述する複数の勾配方程式を生成する工程であって、複数の得られた勾配の各々は、適合値（例えば、Ｒ２値）を有する、工程と、ｉ）複数の勾配方程式のうちの少なくとも１つで、実験交差時間値を処理し、実験試料に対する定量化された標的コピー数を生成する工程とを含む、実験試料中の標的を定量化するための方法を提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの勾配方程式は、複数の得られた勾配のいずれかの最良適合値を有する。他の実施形態では、複数の異なる閾値信号線は、少なくとも２つの異なる閾値信号線である（例えば、少なくとも２、３、４、…１０…１５…２５…１００…１０００…１０，０００…。コンピュータによって生成され得る、全ての考えられる閾値信号線）。
【００２０】
ある実施形態では、閾値勾配はゼロ（水平線）である。さらなる実施形態では、閾値勾配は負（下方傾斜線）である。特定の実施形態では、閾値勾配は正（上方傾斜線）である。
【００２１】
特定の実施形態では、実験試料中の定量化された標的コピー数は、アッセイ信号レベルが最初に実験試料から検出される時間から、約１５０秒以下の時間内に生成される（例えば、約７５秒…約１００秒…約１２５秒…または約１５０秒以内）。いくつかの実施形態では、実験試料中の定量化された標的コピー数は、アッセイ信号レベルが最初に実験試料から検出される時間から、約４５分以下の時間内に生成される（例えば、約５分…約１５分…約３０分…または約４５分以内）。ある実施形態では、実験試料中の定量化された標的コピー数は、アッセイ信号レベルが最初に実験試料から検出される時間から、約２分から約３５分の間に生成される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、アッセイ信号レベルは、核酸検出アッセイによって生成される。他の実施形態では、核酸検出アッセイは、侵襲的開裂アッセイを含む。さらなる実施形態では、核酸検出アッセイは、等温条件下で実行されるか、実行されるように構成される。特定の実施形態では、標的は、核酸配列を含む。さらなる実施形態では、核酸配列は、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。他の実施形態では、核酸配列は、マイクロＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、アッセイ信号レベルは、タンパク質、炭水化物、または小分子検出アッセイ（例えば、曲線にプロットすることが可能である、経時的にデータを生成することが可能な）によって生成される。
【００２３】
ある実施形態では、複数の時間間隔は、規則的間隔の時間間隔である（例えば、１秒毎…５秒毎…３０秒毎…１分毎…５分毎）。他の実施形態では、複数の時間間隔は、少なくとも５つの時間間隔を含む（例えば、少なくとも７…１５…２５…５０…１００…２００…４００…６００…８００…１０００…５０００時間間隔）。特定の実施形態では、タイマー間隔は、５〜３０秒毎である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、実験試料中の標的の量は未知である。特定の実施形態では、少なくとも２つの標準対照試料は、少なくとも約１０倍、互いと異なる既知の標的コピー数を含む（例えば、それらは、１０倍…１５倍…２０倍…５０倍…１００倍…またはそれ以上異なる）。他の実施形態では、少なくとも２つの標準対照試料は、２〜１００個以上の標準対照試料を含む（例えば、２…５…１０…２５…５０…または１００個の標準対照試料）。
【００２５】
ある実施形態では、少なくとも２個、３個、４個、またはそれ以上の実験試料が、共に分析される。他の実施形態では、複数の実験試料が採用され、これらの試料は、互いに４、５、または６ログだけ、コピー数が異なるが、うまく定量化される（例えば、方法のダイナミックレンジにより、大きく異なるコピー数を有する実験試料を、共に分析することが可能となる）。
【００２６】
いくつかの実施形態では、閾値信号線は、実験曲線、および少なくとも２つの標準対照曲線のうちの２つ以上と、これらの曲線の直線部において交差する。特定の実施形態では、初期信号データは、正規化された信号データを含む（例えば、信号を正規化するように構成されるアッセイ信号読み取り装置によって自動的に、または内部信号対照試料からの信号によってアッセイ信号を除することによって、正規化される）。さらなる実施形態では、初期信号データは、内部信号対照試料からの、複数の時間間隔において検出されたアッセイ信号レベルをさらに含む。さらなる実施形態では、初期信号データは、その内部信号対照試料または他の内部信号対照試料に基づいて正規化される。
【００２７】
特定の実施形態では、勾配方程式は、線形回帰を使用して生成される。他の実施形態では、勾配は、最良適合勾配である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、初期信号データは、少なくとも１つの追加の実験試料からの、複数の時間間隔において検出されたアッセイ信号レベルをさらに含む。他の実施形態では、工程のいずれか、全て、またはいくつかにおける処理は、コンピュータによって、または部分的にコンピュータによって実行される（例えば、コンピュータのプロセッサによって）。特定の実施形態では、工程のいずれか、全て、またはいくつかにおける処理は、少なくとも部分的に手作業で実行される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明は、ａ）標的定量化ソフトウェアアプリケーションを格納している、コンピュータシステムであって、コンピュータシステムは、コンピュータメモリとコンピュータプロセッサとを備え、標的定量化ソフトウェアは、出力結果を生成するように構成される、コンピュータシステムと、ｂ）標的定量化ソフトウェアアプリケーションからの出力結果を表示するように構成される、スクリーンを備える、ユーザインターフェースであって、出力結果は、スクリーン上に同時に表示され、出力結果は、ｉ）経時的に信号を表示する第１のグラフであって、Ａ）正規化された標準対照試料に基づく、少なくとも２つの曲線と、Ｂ）少なくとも２つの曲線（および実験試料に基づく、少なくとも１つの曲線）と交差する、閾値信号線とを含む、第１のグラフと、ｉｉ）経時的に信号を表示する第２のグラフであって、第１のグラフ上の閾値信号線が少なくとも２つの曲線と交差する位置によって決定される、データ点に適合する、得られた勾配を含む、第２のグラフとを含む、ユーザインターフェースとを備える、単一スクリーン上に同時に出力結果を表示するためのシステムを提供する。
【００３０】
特定の実施形態では、出力結果は、ｉｉｉ）プレート表示をさらに含み、プレート表示は、複数の試料ウェルの視覚的表示を提供し、複数の試料ウェルの少なくとも一部は、正規化された標準対照試料を含む。ある実施形態では、出力結果は、統計要約ボックスをさらに含み、統計要約ボックスは、以下のうちの少なくとも１つを含む：Ａ）閾値信号線に対する初期信号値、Ｂ）閾値信号線に対する閾値勾配、またはＣ）正規化された標準対照試料からの数値。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の方法およびソフトウェアアプリケーションを実行するための、例示的な一実施形態のフローチャートを示す。
【図２Ａ】二重に処理された、異なる標的コピー数を有する複数の標準対照試料からの、２４９個の時間間隔（１１秒間隔）からの正規化された信号データを示す。図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは、時間間隔１〜２９に対するデータを示し、図２Ｄ、２Ｅ、および２Ｆは、時間間隔３０〜５８に対するデータを示し、図２Ｇ、２Ｈ、および２Ｉは、時間間隔５９〜８７に対するデータを示し、図２Ｊ、２Ｋ、および２Ｌは、時間間隔８８〜１１６に対するデータを示し、図２Ｍ、２Ｎ、および２Ｏは、時間間隔１１７〜１４５に対するデータを示し、図２Ｐ、２Ｑ、および２Ｒは、時間間隔１４６〜１７４に対するデータを示し、図２Ｓ、２Ｔ、および２Ｕは、時間間隔１７５〜２０３に対するデータを示し、図２Ｖ、２Ｗ、および２Ｘは、時間間隔２０４〜２３２に対するデータを示し、図２Ｙ、２Ｚ、および２ＡＡは、時間間隔２３３〜２４９に対するデータを示す。
【図２Ｂ】図２Ａの続きである。
【図２Ｃ】図２Ｂの続きである。
【図２Ｄ】図２Ｃの続きである。
【図２Ｅ】図２Ｄの続きである。
【図２Ｆ】図２Ｅの続きである。
【図２Ｇ】図２Ｆの続きである。
【図２Ｈ】図２Ｇの続きである。
【図２Ｉ】図２Ｈの続きである。
【図２Ｊ】図２Ｉの続きである。
【図２Ｋ】図２Ｊの続きである。
【図２Ｌ】図２Ｋの続きである。
【図２Ｍ】図２Ｌの続きである。
【図２Ｎ】図２Ｍの続きである。
【図２Ｏ】図２Ｎの続きである。
【図２Ｐ】図２Ｏの続きである。
【図２Ｑ】図２Ｐの続きである。
【図２Ｒ】図２Ｑの続きである。
【図２Ｓ】図２Ｒの続きである。
【図２Ｔ】図２Ｓの続きである。
【図２Ｕ】図２Ｔの続きである。
【図２Ｖ】図２Ｕの続きである。
【図２Ｗ】図２Ｖの続きである。
【図２Ｘ】図２Ｗの続きである。
【図２Ｙ】図２Ｘの続きである。
【図２Ｚ】図２Ｙの続きである。
【図２ＡＡ】図２Ｚの続きである。
【図３Ａ】３個の実験試料（Ｂ４、Ｅ４、およびＦ４）からの、２４９個の時間間隔（１１秒間隔）からの正規化された信号データを示す。図３Ａは、時間間隔１〜４４に対するデータを示し、図３Ｂは、時間間隔４５〜９０に対するデータを示し、図３Ｃは、時間間隔９１〜１３６に対するデータを示し、図３Ｄは、時間間隔１３７〜１８２に対するデータを示し、図３Ｅは、時間間隔１８３〜２２８に対するデータを示し、図３Ｆは、時間間隔２２９〜２４９に対するデータを示す。
【図３Ｂ】図３Ａの続きである。
【図３Ｃ】図３Ｂの続きである。
【図３Ｄ】図３Ｃの続きである。
【図３Ｅ】図３Ｄの続きである。
【図３Ｆ】図３Ｅの続きである。
【図４】正規化された信号データから生成された曲線を示す。図４Ａは、正規化された標準対照信号データから生成された曲線を示し、図４Ｂは、正規化された実験信号データから生成された曲線を示す。
【図５】図５Ａは、閾値信号線（水平線として表される）を追加し、正規化された標準対照信号データから生成された曲線を示し、図５Ｂは、閾値信号線（水平線として表される）を追加し、実験信号データから生成された曲線を示す。
【図６】標的コピー数に対する時間値のログ／ログプロットにおける標準対照交差時間値、およびログ／ログプロット上の値に適合する勾配（および勾配方程式）を示す。
【図７】標的定量化ソフトウェアアプリケーションからの出力結果を表示する、実施例２からのスクリーンショットを示し、ｉ）ほとんどの曲線と交差する閾値信号線を示す、経時的に信号を表示する第１のグラフと、ｉｉ）（ログ−ログベースで）経時的に信号を表示する第２のグラフであって、第１のグラフが曲線と交差する閾値信号線の位置によって決定されたデータ点に適合する、得られた勾配を含む、第２のグラフと、ｉｉｉ）各試料ウェルの色素および内容物（例えば、対照ウェルの試料番号および内容物）を示すプレート表示を含む。
【図８】プレート表示が示されず、閾値信号線がより高いレベルで示されることを除いて、図７と同一のスクリーンショットを示す。閾値信号線をより高いレベルに設定することによって、得られた勾配に対して異なるＲ２が生成される。
【図９】２つの閾値信号線が示され、並んで示される２つの得られた勾配を生成することを除いて、図８と同一のスクリーンショットを示す。右上隅のパネルに見られるように、２つの得られた勾配は、異なるＲ２値を有する。ある実施形態では、ユーザは、最高のＲ２値を有する得られた勾配を使用することを選択する。
【図１０】閾値信号線が負（下方）の勾配を有することを除いて、図８と同一のスクリーンショットを示す。図に示すように、この負の勾配は、示される曲線の全てと交差する。ゼロ勾配（水平）の閾値信号線ではなく負の勾配を使用することによって、異なるＲ２値が生成され、例えば最高値を選択するために、得られた他のＲ２値と比較することができる。
【図１１】閾値信号値の勾配が変更され、得られた勾配適合が、ログ−ログではなくログ−線形でプロットされることを除いて、図８と同一のスクリーンショットを示す。
【図１２】各々が比較することができる異なるＲ２値を有する、７つの得られた勾配と共に、７つの異なる傾斜した閾値信号値が示されることを除いて、図８と同一のスクリーンショットを示す。このスクリーンショットは、例えば、検索コンピュータソフトウェアが、データ点の２つ以上（例えば、全て）の間で、最高のＲ２値を有する結果となる勾配を生成する１つの閾値を見つけるために、異なる閾値の多く（例えば、数千個または数百万個）を試すことによって機能することができることを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、実験試料、および既知の標的コピー数を含む、少なくとも２つの標準対照試料からの初期信号データを収集および処理することによって、実験試料中の標的を定量化するための方法およびソフトウェアアプリケーションを提供する。特定の実施形態では、初期信号データは、実験曲線および少なくとも２つの標準対照曲線としてプロットすることが可能である。ある実施形態では、初期信号データは、閾値信号線で処理され、ログ／ログプロット、または線形／ログプロット（または同様のプロット）に対する座標を含む、ログプロットデータを生成するためにさらに処理することができる、対照および実験交差時間値を生成する。いくつかの実施形態では、ログプロットデータは、実験的時間値と共に用いて、実験試料中の標的コピー数を定量化するために使用することができる勾配方程式を生成するために、処理されてもよい。
【００３３】
Ｉ．例示的な標的配列定量化方法およびアプリケーション
図１は、閾値信号線および標準対照曲線から生成されたログ／ログプロットを採用する核酸検出アッセイおよび方法を使用して、標的配列を実験試料中で定量化することができる方法の例示的な実施形態を示す。この例示的な実施形態において、核酸検出アッセイは、曲線に適合するように、局所線形モデルまたは他のモデルを使用して適合することができる経時的データを生成することができるアッセイである（例えば、ＩＮＶＡＤＥＲ検出アッセイまたは他の開裂に基づくアッセイ）。図１中の１０個の例示的な工程に関して以下に説明する。
【００３４】
図１：工程１
図１の工程１において、実験および対照試料の両方において標的配列を検出するために、核酸検出アッセイを採用する。核酸検出アッセイは、標的が検出された時に信号を生成し、それは経時的に測定することができる。採用される核酸検出アッセイ（例えば、ＩＮＶＡＤＥＲ検出アッセイ）はまた、曲線（例えば、Ｓ字形またはＳ字様曲線）に適合することができる経時的データを生成することができるアッセイである。ある実施形態では、核酸検出アッセイは、等温条件下で実行される。実験および標準対照試料は、検出前または検出中にＰＣＲ増幅をしてもよい。生成される信号を検出するために装置が採用される（例えば、複数の試料中の蛍光信号を読み取り、記録するように構成される装置）。装置は、各試料中の種々の時点における信号を検出および記録するように設定される（例えば、５秒毎、１０秒毎、３０秒毎、または毎分）。
【００３５】
少なくとも２つの標準対照試料を採用し、各々は、異なる既知の量の標的配列を含む。ある実施形態では、２個〜１０個の間の対照試料が採用される。好ましくは、標的を有しない標準対照試料も含まれる。いくつかの実施形態では、標準対照試料中の標的コピー数は、数百から数百万個、およびそれらの間の値に及ぶ。好ましくは、対照試料は、約１０倍、互いに異なる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、標準対照試料の各々は、対照試料と同一（またはほぼ同一）の標的コピー数を含む、対応する内部色素対照試料を有するが、それは核酸検出アッセイの実施に必要な構成要素を欠いている。標的を有しない標準対照試料が採用される、ある実施形態では、標的を有しない、対応する内部色素対照試料もまた採用される。好ましくは、内部色素対照試料は、標準対照試料中に使用されるものとは異なる色素を採用する。概して、内部色素対照試料は、核酸検出アッセイによって生成されたバックグラウンド信号を測定する働きをする。例えば、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイが採用される場合、内部色素対照試料は、ＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチドを欠いている場合があるが、それでもなお、標準対照試料中の色素とは異なる色素と結合したプローブオリゴヌクレオチド、開裂酵素、およびＦＲＥＴカセットを含有する。ある実施形態では、標準対照試料の各々および内部色素対照試料の各々の複製物が採用される。ある実施形態では、例えば、相対的定量化を可能にするために、第２の内部ハウスキーピングタイプの配列が検出される。
【００３７】
検出される標的配列は、例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、ウイルス配列、または他の病原体関連配列を含む、望ましい任意の標的配列であってもよい。ある実施形態では、標的配列は、ＨＣＶ、ＨＰＶ、またはＨＩＶ等の癌関連遺伝子またはウイルス配列である。採用される色素または他の標識は、例えば、ＦＡＭ、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ内部正規化色素、Ｃｙ３、Ｃｙ５、および当該技術分野で既知の他の色素を含む、任意の好適な色素または標識であってもよい。
【００３８】
図１：工程２
概して、図１の工程２Ａに示すように、信号を正規化することができない装置上で、結果が得られた場合、正規化された信号は、内部色素対照試料からの対応する信号で、標準対照試料および実験試料からの信号を除することによって得ることができる。工程２Ｂに示すように、信号を自動的に正規化することができる装置上で、結果が得られた場合、正規化された結果を得るために必要な追加の処理はない。標準対照試料に対する正規化された結果の一例を図２に示し、実験試料に対する正規化された結果の一例を図３に示す。
【００３９】
図１：工程３
ある実施形態では、正規化された標準対照および実験試料は、信号対時間の方法でＸ−Ｙグラフ上にプロットされる。
【００４０】
図１：工程４
次いで、正規化された標準対照および実験試料信号は、任意の数の既知の数学方程式（例えば、かかる目的に使用することができる、よく知られている数学方程式は約５０個ある）を使用して、曲線に適合することができる。好ましくは、この機能は、かかる曲線を生成するように構成される、コンピュータプログラムによって実行される。ある実施形態では、曲線を生成するために、２つの信号データ点の各々を線に適合させる方程式が採用されるが、他の実施形態では、スプライン補間が採用される。信号データを曲線に適合させる一例を図４に示し、標準対照曲線は図４Ａに示し、実験曲線は図４Ｂに示す。
【００４１】
図１：工程５
次いで、ある実施形態では（他の実施形態では必要ないが）、例えば、試料位置ＩＤまたは他の関連データを使用して、標準対照曲線を実験曲線と区別するための方法が採用される。
【００４２】
図１：工程６
次に、閾値信号線を決定する（例えば、ソフトウェアアプリケーションによって自動的に、あるいはユーザによって）。便宜上、図５に示すように、この閾値信号線は、標準対照および実験曲線グラフ上に水平線として描写することができる。他の非水平線（例えば、傾斜した閾値および／または曲線状の線）を採用してもよいことに留意されたい。閾値信号線は、実際には線として示されなくてもよく（例えば、コンピュータスクリーン上に）、代わりに、線が描写されユーザに提示されれば（例えば、コンピュータスクリーン上に）、線を記述する方程式として、コンピュータメモリ内に表されてもよいことを理解されたい。ある実施形態では、閾値信号線は曲線（すなわち、直線ではない）である。
【００４３】
閾値信号線は、時間ゼロにおいて初期信号値を有する。たとえ現時点で線がゼロに戻って描写されても（例えば、約１５秒経ってから最初の読み取りを行う場合でも）、閾値信号線は、どの信号値が時間ゼロにおける線に対して存在しているのかを決定するために、Ｙ軸に到達するまで後方に延長され得る。閾値信号線はまた、ゼロ（水平線）、負（下方傾斜線）、または正（上方傾斜線）であり得る勾配を有する。信号線は、直線であってもよく、または曲線であってもよい。表示された閾値線は、ユーザによって任意の所望の位置または勾配に移動されてもよい。
【００４４】
閾値信号線は、１）バックグラウンドレベル以上（例えば、正規化された内部色素対照値以上）である、２）実験曲線と交差する、および３）標準対照曲線のうちの少なくとも２つと交差する、任意のレベルに設定することができる。ある実施形態では、追加の基準が採用されてもよい。例えば、閾値信号線は、標準対照曲線が２つ以上存在する場合に、２つ以上の標準対照曲線と交差するように選択されてもよい。ある実施形態では、閾値信号線は、標準対照曲線の全てまたはほとんどと交差するように選択される。他の実施形態では、複数の実験曲線が存在する場合、閾値信号線は、これらの曲線のうちの少なくとも２つ、および好ましくは、これらの曲線の全てと交差するように選択される。
【００４５】
特定の実施形態では、閾値信号線は、二重の標準対照曲線（二重の試料が分析される場合）の間の任意の変動性が最小限に抑えられるように選択される。他の実施形態では、閾値信号線は、ほとんど、または全ての曲線（例えば、対象となる曲線）の直線部が交差されるように選択される。ある実施形態では、複数の閾値信号線が、残りの工程で選択および採用される。いくつかの実施形態では、複数の閾値信号線は、結果として生じるＲ２値が比較され得るように選択される（例えば、使用者またはコンピュータソフトウェアによって）。特定の実施形態では、より高いＲ２値（例えば、１．０に最も近い）をもたらす閾値信号線が、未知試料中のコピー数を計算するために使用する値として選択される。Ｒ２は、曲線における点の全てまたはそのサブセットを使用して測定されてもよい。例えば、いずれかに極端のデータ点は、最良適合計算に含まれないように除外されてもよい。これは、例えば、最も正確な予測が特定の濃度範囲内の試料のサブセットに望ましい場合に使用される。
【００４６】
ある実施形態では、傾斜した閾値信号線が採用される。特定の実施形態では、傾斜した閾値信号線は、曲線（例えば、対照および実験曲線の両方）の多くまたは全てが交差するように採用される。いくつかの実施形態では、以下に説明するように、得られた交点は、ログ／ログチャートではなくログ／線形チャート（コピー数対時間）上にプロットされる。
【００４７】
図１：工程７
次いで、関連した標準対照および実験曲線の各々が閾値と交差する時間値を決定するために、閾値信号線（または値）が使用される。これは、例えば、標準対照曲線（例えば、図５Ａ）および実験曲線（例えば、図５Ｂ）のグラフを使用し、閾値がどの時点で各曲線と交差するかを見ることによって、達成することができる。これはまた、交点を自動的に計算するソフトウェアアプリケーションを使用して、達成することができる。この決定の結果は、例えば、標準対照曲線の各々に対する標的コピー数、および標準対照曲線および実験曲線が閾値と交差する時間値を記載する表に示すことができる。
【００４８】
図１：工程８
次いで、各標準対照曲線に対する交差時間値は、ログ／ログプロットまたはログ／線形プロット（コピー数対時間）で、各標準対照の標的コピー数に対してプロットすることができ、概して線形の勾配に整合することができるログプロットデータを生成する。好ましくは、プロットは、コピー数をＸ軸にとり、時間をＹ軸にとって生成される。グラフ上にプロットされる６個の標準対照の一例を図６に示す。
【００４９】
図１：工程９
次に、工程８からのプロットされたデータ点間の勾配に対する最良適合を決定するために、標準線形回帰法が採用される。この勾配の決定によって、勾配を記述する勾配方程式、および得られた勾配に対するＲ２値が生成される。ある実施形態では、閾値信号線（勾配方程式によって記述され得る）は、複数のＲ２値が決定されるように、多くの異なる位置で試験される（例えば、コンピュータによって自動的に）。ある実施形態では、実験試料中のコピー数の決定に使用するために、最高の（例えば、１．０に最も近いか、または等しい）Ｒ２値を有する閾値信号線が選択される（例えば、以下の工程１０に使用される）。
【００５０】
図１：工程１０
実験試料に対して決定された交差時間値（工程７からの）を、工程９において決定された勾配方程式に当てはめることにより、実験試料中の標的コピー数の逆算が可能となる。試料がリアルタイムで読み取られる、ある実施形態（例えば、コンピュータソフトウェアに支援される実施形態）では、一度所与の実験試料（または全ての実験試料）に対して標的コピー数が決定されると、データ収集は停止することができる（例えば、一度応答が達成されると、試料の信号読み取りを継続する必要はない）。これは、リアルタイム読み取りを停止することによって、余分な時間およびリソースを節約することができるため、有用である（例えば、別の組の試料が、読み取り装置にロードされ得る）。これは、所与の閾値に対してある特定のＲ２値が達成される場合等、応答が迅速に達成される場合に（例えば、１０〜２０分）、ソフトウェアが、傾斜した閾値を含む複数の閾値信号線を使用するように構成される場合に特に有用である。
【００５１】
複数の閾値信号線が採用される、ある実施形態では、ソフトウェアは、一度特定のＲ２値が閾値のいずれかに基づいて達成されると、実験的コピー数の結果を報告するように構成されてもよい。他の実施形態では、複数の閾値信号値（例えば、採用される全て、または得られた勾配に対する最小Ｒ２値を満たす全ての値）の使用により、さまざまな結果を実験（未知）試料に関して報告することが可能となる。例えば、複数の閾値信号値が採用される場合、５つの閾値信号値が、．９８より高いＲ２値を有する結果となる勾配を生成する可能性がある。これらの５つの結果は、２９、３６、３８、４２、および４５個の試料中の実験的コピー数をもたらし得る。次いで、これにより、ソフトウェアが実験試料に対する範囲を報告することが可能となる（例えば、未知試料中の２９〜４５個のコピー）。同様に、範囲の生成は、例えば、血液検査等において設定される限度（例えば、ＦＤＡによって義務づけられた限度）と併用されてもよい。特定の標的の標的コピー数をあまりに多く有する任意の特定の血液試料は、「不合格」とみなされ得る（例えば、切り捨て範囲が３０であり、２９〜４５の範囲が報告される場合、他のより高いＲ２値レベルに閾値を設定することによって試料が「合格」したとしても、この試料は不合格とみなされる）。したがって、いくつかの実施形態では、手順を選択するために、最低の予測コピー数の結果が使用される。他の実施形態では、最小量の標的が必要とされる場合、システムは、曲線の各々が、手順の選択において所定のコピー数以上の結果を報告することを必要とする。
【００５２】
ＩＩ．迅速定量結果
本発明の方法およびアプリケーションにより、実験試料中のコピー数の驚くほど迅速な定量が可能となる。当該技術分野で既知の方法は、信頼できる定量結果を提供するために、１時間または数時間を要する場合が多い。しかしながら、本発明により、信頼できる定量結果が、数秒または数分で測定される時間値において達成されることが可能となる。例えば、特定の実施形態では、実験試料中の定量化された標的コピー数は、アッセイ信号レベルが最初に実験試料から検出される時間から約１５０秒以下の時間内に生成される（例えば、約７５秒…約１００秒…約１２５秒…または約１５０秒内）。いくつかの実施形態では、実験試料中の定量化された標的コピー数は、アッセイ信号レベルが最初に実験試料から検出される時間から約４５分以下の時間内に生成される（例えば、約５分…約１５分…約３０分…または約４５分内）。ある実施形態では、実験試料中の定量化された標的コピー数は、アッセイ信号が最初に実験試料から検出される時間から約２分から約３５分の間に生成される。
【００５３】
多くの実験試料に対してかなり初期に発生する場合が多いが、一度少なくとも２つの標準対照のＳ字状曲線および実験曲線が閾値信号線を通過すると、信頼できる定量情報を生成することができるため、迅速定量化は、本発明の方法を用いて達成され得る。例えば、図５は、実施例１からの標準対照および実験曲線を示す。実験試料Ｂ４（図５Ｂに示す）は、約１１０秒で閾値を通過するのが見られる。図５Ａに示すような標準対照曲線の３つは全て、約１２０〜１３０秒で閾値を通過する。その結果、実験試料Ｂ４中の標的コピー数は、実験試料中の初期の信号検出から約１３０秒後に計算され得る。閾値信号線が図５に示す１．６よりも低く設定された場合、この迅速定量は、Ｂ４試料に対してさらに低減され得る。例えば、閾値は、１．０（バックグラウンド信号を表す）より高い任意の値に設定され得、それでもなお３つの標準対照曲線およびＢ４実験曲線の各々と交差する。例えば、閾値信号線は、約１．１に設定され得、それにより、定量結果が約１０５〜１１０秒で達成されることが可能となる。
【００５４】
ある実施形態では、閾値信号線は、より多くの曲線がより早く交差されることが可能となり得る、非水平勾配（例えば、下方勾配）として設定される。かかる実施形態では、対象となる曲線が水平の閾値信号線に到達するのを待つ必要なく、迅速定量結果を得ることができる。かかる実施形態では、結果は、２０分以下、あるいは１５分以下（例えば、１２〜１５分の間、または５〜１０分の間、または１〜５分の間）で達成され得る。
【００５５】
好ましくは、本発明の方法は、信号検出装置に動作可能に(機能的に)接続されるコンピュータ上のソフトウェアアプリケーションに統合される。この点で、曲線は、自動的に（かつ迅速に）生成され得、一度必要曲線が閾値信号線を通過すると、実験試料中の最終定量コピー数を迅速に計算することができ（例えば、１秒以下）、それにより、ユーザが可能な限り迅速に定量コピー数を有することが可能となる。
【００５６】
ＩＩＩ．例示的な核酸検出アッセイ
本発明の方法およびシステムは、曲線に適合することができる経時的結果を生成することができる、任意の核酸検出アッセイで採用されてもよい。例えば、本発明の方法、システム、およびアプリケーションは、酵素ミスマッチ開裂法（例えば、Ｖａｒｉａｇｅｎｉｃｓ、米国特許第６，１１０，６８４号、第５，９５８，６９２号、第５，８５１，７７０号（その全体が参照として本明細書に組み込まれる））、ポリメラーゼ連鎖反応、分枝ハイブリダイゼーション法（例えば、Ｃｈｉｒｏｎ、米国特許第５，８４９，４８１号、第５，７１０，２６４号、第５，１２４，２４６号、および第５，６２４，８０２号（その全体が参照として本明細書に組み込まれる））、ローリングサークル複製（例えば、米国特許第６，２１０，８８４号、第６，１８３，９６０号、および第６，２３５，５０２号（その全体が参照として本明細書に組み込まれる））、ＮＡＳＢＡ（例えば、米国特許第５，４０９，８１８号（その全体が参照として本明細書に組み込まれる））、分子ビーコン技術（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号（その全体が参照として本明細書に組み込まれる））、Ｅセンサ技術（Ｍｏｔｏｒｏｌａ、米国特許第６，２４８，２２９号、第６，２２１，５８３号、第６，０１３，１７０号、および第６，０６３，５７３号（その全体が参照として本明細書に組み込まれる））、サイクリングプローブ技術（例えば、米国特許第５，４０３，７１１号、第５，０１１，７６９号、および第５，６６０，９８８号（その全体が参照として本明細書に組み込まれる））、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ信号増幅法（例えば、米国特許第６，１２１，００１号、第６，１１０，６７７号、第５，９１４，２３０号、第５，８８２，８６７号、および第５，７９２，６１４号（その全体が参照として本明細書に組み込まれる））、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒｎａｙ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８，１８９−９３（１９９１））、ＦＵＬＬ−ＶＥＬＯＣＩＴＹアッセイ、およびサンドイッチハイブリダイゼーション法（例えば、米国特許第５，２８８，６０９号（その全体が参照として本明細書に組み込まれる））が挙げられるがこれに限定されない、検出アッセイに使用されてもよい。
【００５７】
好ましくは、核酸検出アッセイは、等温条件下で実行されるように構成される。かかる核酸検出アッセイの一例は、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ等の侵襲的開裂アッセイである。ＩＮＶＡＤＥＲアッセイにおいて、核酸またはオリゴヌクレオチド（プローブオリゴヌクレオチドおよびＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド）の２つの鎖が両方とも、以下に記載するような重複する侵襲的開裂構造を形成するように、標的核酸鎖にハイブリダイズする時に、侵襲的開裂は発生し得る。開裂剤（例えば、５’ヌクレアーゼ）および上流オリゴヌクレオチド（ＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド）の相互作用を通じて、開裂剤は、特異的な断片が生成される方法で、内部部位において下流オリゴヌクレオチド（プローブ）を開裂するように製造することができる。かかる実施形態は、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と呼ばれており、米国特許第５，８４６，７１７号、第５，９８５，５５７号、第５，９９４，０６９号、第６，００１，５６７号、および第６，０９０，５４３号、国際公開第ＷＯ９７／２７２１４号、国際公開第ＷＯ９８／４２８７３号、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  １７：２９２（１９９９）、Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ＵＳＡ，  ９７：８２７２（２０００）に記載され、その各々は、全ての目的でその全体が参照として本明細書に組み込まれる。ＩＮＶＡＤＥＲアッセイは、構造特異的酵素による特異的な構造の酵素的開裂による、プローブの標的へのハイブリダイゼーションを検出する。
【００５８】
ＩＮＶＡＤＥＲアッセイは、重複オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによって形成される複合体を開裂するために、構造特異的酵素（例えば、ＦＥＮエンドヌクレアーゼ）を使用することによって、特異的ＤＮＡおよびＲＮＡ配列を検出する。上昇した温度およびプローブのうちの１つの過剰によって、複数のプローブが、温度サイクルなしで存在する各標的配列に対して開裂されることが可能となる。次いで、いくつかの実施形態では、これらの開裂されたプローブは、第２の標識プローブ（例えば、ＦＲＥＴカセット）の開裂を促す。二次プローブオリゴヌクレオチドは、内部色素によって消光されるフルオレセインで標識された５’−末端であってもよい。開裂時、脱消光されたフルオレセインで標識された生成物は、標準的な蛍光プレートリーダを使用して検出されてもよい。
【００５９】
ＩＮＶＡＤＥＲアッセイは、ゲノムＤＮＡを含む非増幅および増幅ＲＮＡおよびＤＮＡにおける特異的突然変異およびＳＮＰを検出することができる。ある実施形態では、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイは、２つのカスケード反応工程（一次および二次反応）を使用し、両方は、標的特異的信号を生成し、次いでそれを増幅する。以下の考察における対立遺伝子は、全ての遺伝的変異に適用するものではないが、便宜上、野生型（ＷＴ）および変異型（ＭＴ）という用語を用いて記載する。一次反応において、ＷＴ一次プローブおよびＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチドは、標的核酸に縦一列でハイブリダイズし、重複構造を形成する。不対の「フラップ」は、ＷＴ一次プローブの５’末端上に含まれる。構造特異的酵素（例えば、ＣＬＥＡＶＡＳＥ酵素、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、重複を認識し、不対のフラップを開裂し、それを標的特異的生成物として放出する。二次反応において、この開裂された生成物は、ＷＴ蛍光共鳴エネルギー移動（ＷＴ−ＦＲＥＴ）プローブに対するＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチドとしての機能を果たし、この場合もやはり構造特異的酵素によって認識される構造を形成する。単一ＦＲＥＴプローブ上の２つの色素が、開裂によって分離される場合、バックグラウンド蛍光以上の検出可能な蛍光信号が生成される。その結果、この第２の構造の開裂は、蛍光の増加をもたらし、ＷＴ対立遺伝子（またはアッセイが、検出可能な信号を生成するために、突然変異対立遺伝子に対して構成される場合、突然変異対立遺伝子）の存在を示す。好ましい実施形態では、異なる標識（例えば、発光または励起波長の差によって分解可能な、または時間分解蛍光検出によって分解可能な）を有するＦＲＥＴプローブが、検出される各対立遺伝子または遺伝子座に対して提供され、異なる対立遺伝子または遺伝子座が、単一反応において検出することができる。かかる実施形態では、一次プローブセットおよび異なるＦＲＥＴプローブは、単一アッセイにおいて組み合わされてもよく、同一試料中の各対立遺伝子または遺伝子座からの信号の比較が可能となる。
【００６０】
一次プローブオリゴヌクレオチドおよび標的ヌクレオチド配列が、開裂部位において完全に一致しない場合、重複構造は形成されず、開裂は抑制される。使用する構造特異的酵素（例えば、ＣＬＥＡＶＡＳＥＶＩＩＩ酵素、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、非重複構造よりも効率的に（例えば、少なくとも３４０倍）重複構造を開裂し、対立遺伝子の優れた識別が可能となる。
【００６１】
ＩＮＶＡＤＥＲアッセイにおいて、プローブは、温度サイクルなしで回転することができ、１標的当たり多くの信号を生成する（すなわち、線形信号増幅）。同様に、各標的特異的生成物により、多くのＦＲＥＴプローブの開裂が可能となる。一次ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ反応は、検出される標的ＤＮＡ（またはＲＮＡ）に向けられる。ＩＮＶＡＤＥＲおよび一次プローブがモル過剰に供給されるため、標的ＤＮＡまたはＲＮＡは、第１の侵襲的開裂における限定的構成要素である。第２の侵襲的開裂において、限定されるのは放出されたフラップである。これらの２つの開裂反応が連続して実行される時、複合反応からの蛍光信号は、標的ＤＮＡ量に対して直線的に蓄積する。
【００６２】
ＩＶ．遺伝子型決定アプリケーション
試料中のコピー数を決定するために本発明の方法、システム、およびソフトウェアアプリケーションを使用することに加えて、本発明は、遺伝子型決定にも有用である。かかる使用の例示的な一実施形態は、ＩＮＶＡＤＥＲ検出アッセイでの使用である。遺伝子型決定ＩＮＶＡＤＥＲ反応において、開裂の塩基において異なり、標的の塩基変化または遺伝子型に対応する２つのプローブは、２つの異なる５’−フラップをプローブに結合させることによって、使用することができる。５’−フラップの開裂後、ＦＲＥＴカセットの二次開裂は、ＦＲＥＴカセットに対する侵襲的オリゴとして開裂されたフラップを使用することによって得ることができる。ＦＲＥＴカセットは、遺伝子型に特異的な開裂した一次プローブに対応する、異なる色素（例えば、ＦＡＭおよびＲＥＤ）で標識される。
【００６３】
典型的な遺伝子型決定リアルタイムＩＮＶＡＤＥＲアッセイは、時間の関数としてＦＡＭおよびＲＥＤ蛍光信号を監視(モニター)することによって、実行されてもよい。バックグラウンドレベル以上の各色素に対する閾値が割り当てられ、各試料が各色素に対する閾値を超える時点が決定される。ＦＡＭ対ＲＥＤの閾値時間の散布図をプロットすることにより、未知試料の遺伝子型を決定するために使用することができる散布図が得られる。低いＦＡＭ時間および高いＲＥＤ時間を有する試料は、ＦＡＭプローブまたは対立遺伝子に対応し、高いＦＡＭ時間および低いＲＥＤ時間を有する試料は、ＲＥＤプローブまたは対立遺伝子に対応する。同様に、中程度のＦＡＭおよびＲＥＤ時間を有する試料（すなわち、散布図の中央に該当する）は、ヘテロ接合試料である。この同一の方法は、他の核酸検出アッセイにも採用することができる。
【００６４】
実験
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および態様を明示し、さらに説明するために提供し、本発明の範囲を限定すると解釈されるものではない。
【００６５】
以下の実験の開示において、以下の略語が適用される。Ｎ（規定）、Ｍ（モルの）、ｍＭ（ミリモルの）、μＭ（マイクロモルの）、ｍｏｌ（モル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、μｍｏｌ（マイクロモル）、ｎｍｏｌ（ナノモル）、ｐｍｏｌ（ピコモル）、ｇ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、ｎｇ（ナノグラム）、ｌまたはＬ（リットル）、ｍｌ（ミリリットル）、μｌ（マイクロリットル）、Ｃ（摂氏温度）、およびＲ２（Ｒ２）。
【実施例】
【００６６】
実施例１
閾値およびログ／ログプロットを使用した標的配列定量化
本実施例は、検出曲線を生成することができる核酸検出アッセイを使用し、標準対照曲線から生成された閾値およびログ／ログプロットを採用する方法を使用した、３個の未知実験試料中の標的配列のコピー数の定量化に関して記載する。本実施例における標的配列は、マイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−２１であり、核酸検出アッセイは、ＦＡＭ標識を有するＦＲＥＴカセットを採用する、ＩＮＶＡＤＥＲ核酸検出アッセイであった。
【００６７】
採用した７個の既知の基準は、以下の標的コピー数を有した。１）６×１０６個、２）８５７，１４３個、３）１２２，４４９個、４）１７，４９３個、５）２，４９９、６）３５７個、および７）５１個。
【００６８】
ピペット操作エラーの機械ノイズに起因する信号変動を考慮して、正規化色素標識オリゴヌクレオチドを反応物に添加した。この色素標識オリゴヌクレオチドは、ＩＮＶＡＤＥＲ反応を阻害せず、または該反応において機能せず、ＩＮＶＡＤＥＲ反応ＦＲＥＴカセットに使用される色素とスペクトル的に異なり、区別される。内部正規化色素（２５ｎＭ）として、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ標識オリゴヌクレオチド（Ｔ１０）を使用し、全ての反応物のウェルに含めた。試験した３個の実験試料は、Ｂ４、Ｅ４、およびＦ４と名づけられた。これらの試料を、ＦＡＭ標識ＦＲＥＴおよび内部Ｙｅｌｌｏｗ色素で処理した。
【００６９】
最初に、表１に示すパラメータを使用して、基準および実験の両方にＰＣＲを実行した。
【表１】
2010538612.tif 000003
【００７０】
次いで、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ試薬（例えば、プローブオリゴ、ＩＮＶＡＤＥＲオリゴ、ＦＲＥＴカセット、および開裂酵素）を実験、標準対照、および内部対照試料に添加した。５０℃で反応を行い、２４９回のサイクルに対して、１１秒毎に蛍光信号を読み取った。
【００７１】
標準対照および内部対照からの結果（内部色素対照に基づいて正規化された）を図２Ａ〜２２Ｄに示す。３個の実験試料に対する結果（内部色素対照に基づいて正規化された）を図３Ａ〜３Ｅに示す。次いで、図２および３からの正規化された結果を、Ｘ−Ｙグラフ中にプロットした（蛍光対時間）。次いで、各２つのデータ点を１つの線に適合させるプログラムを使用して、図２および３からの正規化されたプロットを曲線に適合させた。この結果を図４に示す。便宜上、標準対照曲線を図４Ａに示し、実験曲線を図４Ｂに示す。
【００７２】
次に、閾値信号線を決定した。閾値信号線は、図４に示す曲線グラフ上に描写することができる。閾値信号線は、以下の例示的な基準に基づいて蛍光信号レベルに設定する。第１に、正規化された内部色素対照（Ｙｅｌｌｏｗ内部色素を有する試料）によって表されるバックグラウンドよりも大きい信号レベルに、閾値を設定する。本実施例では、それら自体によって、得られる生の数値を割ることにより、１．０の値が得られるため、内部色素対照からの正規化された信号は、１．０である。次に、閾値信号線がバックグラウンドより上（本実施例では１．０より上）にある標準対照および実験曲線の全てと交差するように、閾値信号線を設定する。本実施例では、実験試料Ｆ４のみが、最大で１．７に及んだ。したがって、この曲線および全ての他の曲線と交差するために、約１．７以下になるように閾値を選択する。採用され得るが本実施例では閾値に影響を及ぼさない別のパラメータは、各基準に対する２つの二重曲線間の変動を最小限に抑える閾値を選択することである。上記の基準を考慮すると、本実施例に対する閾値信号線は、１．０〜約１．７の間の範囲に設定され得る。しかしながら、選択的に採用される１つの追加のパラメータは、ほとんど、または全ての曲線の信号増加部分が交差されるように閾値を設定している。本実施例では、基準および未知曲線の全ての信号増加部分が、曲線における非飽和点において交差されたことを確実にするために、最終閾値を約１．６に設定した。図５は、標準対照曲線（図５Ａ）および実験曲線（図５Ｂ）の両方に対して、約１．６に設定された水平線として描写される、閾値信号線を示す。
【００７３】
一度閾値信号線を設定すると、これにより、標準対照曲線の各々が閾値信号線と交差する時点の決定が可能となる。本実施例では、閾値信号線が以下の表２に示す時点で標準対照曲線と交差することを決定した。
【表２】
2010538612.tif 000004
【００７４】
驚くべきことに、６個の基準の各々に対する平均交差時間値は、ログ対ログフォーマットにおいて基準の標的コピー数に対してプロットして、概して線形の勾配を生成できることがわかった。特に、各標準対照に対するコピー数および時間（ログフォーマットにおける）は、グラフ上に最初にプロットされる（図６の６つのデータ点を参照）。次に、これらのデータ点間の勾配に対する最良適合を決定するために、標準線形回帰法を使用した。（図６を参照）。この勾配は、線形回帰に基づいて決定される勾配方程式によって記述される。本実施例では、勾配は、以下の勾配方程式によって記述される：ｙ＝１１６４７Ｘ−０．３４５３。
【００７５】
次に、閾値信号線がどこで実験曲線と交差するかを決定した。本実施例では、閾値信号線は、以下の表３に示す時点で３個の実験曲線と交差することを決定した。
【表３】
2010538612.tif 000005
【００７６】
上記で決定した勾配方程式（ｙ＝１１６４７Ｘ−０．３４５３）、および表３に示される交差時間点を方程式中のＸとして使用することにより、実験試料中に存在するｍｉＲ−２１のコピー数の逆算が可能となった。３個の実験試料の各々に対する計算された量を表３に示す。
【００７７】
実施例２
代替閾値による標的配列定量化
実施例１と同様の方法で本実施例を実行した。本実施例では、全てのデータは、ｍｉＲ−２１（ＦＡＭ）またはＵ６  ｓｎＲＮＡ（ＲＯＸ）に対する既知のコピー数に対応する。ＦＡＭデータは、各レベルに対して重複してｍｉＲ−２１に対応する。標的レベル（すなわち、コピー数）を図７のプレート表示に次の通りに示す：６，０００，０００、１，２００，０００、２４０，０００、４８，０００、９，６００、１，９２０、３８４、および０。ＲＯＸデータは、各レベルに対して重複してＵ６および／またはＵ２４  ｓｎＲＮＡに対応し、標的レベル（すなわち、コピー数）は次の通りである：３６，０００，０００、７，２００，０００、１，４４０，０００、２８８，０００、５７，６００、１１，５２０、２，３０４、および０。
【００７８】
本実施例は、異なる閾値信号値の選択が、本発明の方法およびアプリケーションの実施形態によって生成される結果、および結果の質にどのような影響を及ぼし得るかを示す。図７は、標準対照曲線を表示するスクリーンショットを示す。ほとんどの曲線と交差する水平の信号閾値も示す。図７の右下隅に示す第２のグラフ上に、交差時間点をプロットする（ログ−ログで）。これらの交差時間点を、特定のＲ２値を有する得られた勾配に適合させる。各試料ウェルの色素および内容物（例えば、対照ウェルの試料番号および内容物）を示すプレート表示も、図７の左下パネルに示す。図８に示すように、閾値信号値はより高く調整することができ、Ｒ２のリアルタイム変化が可能となる。図８のスクリーンの閾値レベルは、図７のスクリーンの閾値レベルよりも不良な適合を有する（Ｒ２がより低い）。
【００７９】
場合によっては、単一の（線形）閾値は、試料曲線の全てと交差することができず、局部的にのみ適用可能となる。かかる場合において、図９に示すように、２つ以上の閾値をシステムに追加し、各々を調整し、別々に適用することができる。ある実施形態では、アプリケーションおよび方法により、閾値信号線の勾配が完全に調整可能となる。例えば、下方に傾斜した閾値信号線を水平の閾値信号線の代わりに使用することができる。図１０に示すように、閾値信号線はここで、より高いＲ２を有し（図７の最良適合の水平閾値と比較して）、ここで試料曲線の全てと交差し、各試験試料中の標的の量の予測に有用となる。加えて、ログ−ログ「最良適合」チャート（右下）をログ−線形にすることができ、多くの場合、さらに良好な適合（例えば、Ｒ２値）、または少なくとも（図１１のスクリーンに示すように）最良適合閾値に対するはるかに大きい勾配をもたらし、それは、必要な総実行時間を大幅に減少させることを意味する。
【００８０】
最後に、図１２は、７つの異なる傾斜した閾値信号値を７つの得られた勾配と共に示し、各々が比較することができる異なるＲ２値を有することを除いて、図８と同一のスクリーンショットを示す。このスクリーンショットは、例えば、検索コンピュータソフトウェアが、最高のＲ２値を有する結果として得られる勾配を生成する１つの閾値を見つけるように、異なる閾値の多く（例えば、数千個または数百万個）を試すことによって機能することができることを図示する。
【００８１】
上記明細書で言及された全ての刊行物および特許は、参照として本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法およびシステムの種々の修正および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して説明してきたが、特許請求の範囲に記載する本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際には、分子生物学、数学、または関連分野の当業者には明らかである、本発明を実行するための記載された方法の種々の変更は、以下の特許請求の範囲内にあるよう意図される。
【図１】
2010538612.tif 000006
【図２Ａ】
2010538612.tif 000007
【図２Ｂ】
2010538612.tif 000008
【図２Ｃ】
2010538612.tif 000009
【図２Ｄ】
2010538612.tif 000010
【図２Ｅ】
2010538612.tif 000011
【図２Ｆ】
2010538612.tif 000012
【図２Ｇ】
2010538612.tif 000013
【図２Ｈ】
2010538612.tif 000014
【図２Ｉ】
2010538612.tif 000015
【図２Ｊ】
2010538612.tif 000016
【図２Ｋ】
2010538612.tif 000017
【図２Ｌ】
2010538612.tif 000018
【図２Ｍ】
2010538612.tif 000019
【図２Ｎ】
2010538612.tif 000020
【図２Ｏ】
2010538612.tif 000021
【図２Ｐ】
2010538612.tif 000022
【図２Ｑ】
2010538612.tif 000023
【図２Ｒ】
2010538612.tif 000024
【図２Ｓ】
2010538612.tif 000025
【図２Ｔ】
2010538612.tif 000026
【図２Ｕ】
2010538612.tif 000027
【図２Ｖ】
2010538612.tif 000028
【図２Ｗ】
2010538612.tif 000029
【図２Ｘ】
2010538612.tif 000030
【図２Ｙ】
2010538612.tif 000031
【図２Ｚ】
2010538612.tif 000032
【図２ＡＡ】
2010538612.tif 000033
【図３Ａ】
2010538612.tif 000034
【図３Ｂ】
2010538612.tif 000035
【図３Ｃ】
2010538612.tif 000036
【図３Ｄ】
2010538612.tif 000037
【図３Ｅ】
2010538612.tif 000038
【図３Ｆ】
2010538612.tif 000039
【図４】
2010538612.tif 000040
【図５】
2010538612.tif 000041
【図６】
2010538612.tif 000042
【図７】
2010538612.tif 000043
【図８】
2010538612.tif 000044
【図９】
2010538612.tif 000045
【図１０】
2010538612.tif 000046
【図１１】
2010538612.tif 000047
【図１２】
2010538612.tif 000048
【国際調査報告】
2010538612.tif 000049
2010538612.tif 000050