(57)【要約】例えばサーチュイン変調化合物での治療的処置の間の対象におけるサーチュイン変調をモニタリングする方法が提供される。その方法は、対象からの生物学的試料における１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定する工程を伴う。１つ以上のサーチュインバイオマーカーを用いてサーチュインタンパク質の活性を変調する化合物を同定するための方法もまた提供される。一つの実施形態において、対象におけるサーチュイン活性を決定するための方法が提供される。かかる方法を診断および予後診断適用に使用できる。例えば、サーチュイン変調化合物での治療的処置中を含む、対象におけるサーチュイン変調をモニタリングするための方法もまた提供される。サーチュインタンパク質の活性を変調する化合物を同定するための方法もまた提供される。
2010524432.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるサーチュイン変調を検出する方法であって、該方法は該対象からの生物学的試料における、少なくとも１つのサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定する工程を含み、対照と比較した該サーチュインバイオマーカーの発現レベルの変化が、サーチュイン変調の指標である方法。
【請求項２】
前記サーチュイン変調が、サーチュイン活性化である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象が、加齢もしくはストレス、糖尿病、肥満、神経変性疾患、化学療法誘発性ニューロパチー、虚血イベントに関連するニューロパチー、眼疾患もしくは障害、心血管疾患、血液凝固障害、炎症、または潮紅に関係する疾患または障害を患っている請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記サーチュイン変調が、サーチュイン阻害である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、食欲刺激または体重増加を必要とする請求項１または４に記載の方法。
【請求項６】
前記サーチュインバイオマーカーが、表１に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記サーチュインバイオマーカーが、以下：ＭＣＰ−１、ＢＭＰ受容体１Ａ、Ｓｍｐｄｌ３ａ、ＣＤ１４、ＡｐｏＥ、ＦＡＳ、トランスサイレチン、ＦＡＢＰ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ２、アクアポリン４、Ｒｒａｄ、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ８、Ｐｐｐ１ｒ３ｇ、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩまたはＡｐｏＢのうちの少なくとも１つである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記サーチュインバイオマーカーが、ＭＣＰ−１である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記サーチュインバイオマーカーの発現レベルが、該サーチュインバイオマーカーのｍＲＮＡレベル、該サーチュインバイオマーカーのタンパク質レベルまたは該サーチュインバイオマーカーの活性を測定することにより決定される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記サーチュインバイオマーカーのｍＲＮＡレベルが、マイクロアレイまたはＰＣＲを用いて測定される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サーチュインバイオマーカーのタンパク質レベルが、該サーチュインバイオマーカーに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを用いて測定される請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記サーチュインバイオマーカーが、ＭＣＰ−１である請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
対照と比較して、前記ＭＣＰ−１の発現レベルの低下が、サーチュイン活性化の指標である請求項８または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が、哺乳動物である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物が、ヒトである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記対照が未処置対象、処置の前の対象、処置の間の初期の時点の対象、またはデータベース参照である請求項１または１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物学的試料が血液、血漿、尿、血清、唾液、細胞、組織または毛髪を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
サーチュインモジュレーターでの治療的処置をモニタリングする方法であって、サーチュインモジュレーターで処置されている対象からの生物学的試料における、少なくとも１つのサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定する工程を含む方法。
【請求項１９】
前記対象が、哺乳動物である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物が、ヒトである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物学的試料が、血液、血漿、尿、血清、唾液、細胞、組織または毛髪を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記サーチュインモジュレーターが、サーチュイン活性化化合物である請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象が、加齢もしくはストレス、糖尿病、肥満、神経変性疾患、化学療法誘発性ニューロパチー、虚血イベントに関連するニューロパチー、眼疾患もしくは障害、心血管疾患、血液凝固障害、炎症、または潮紅に関係する疾患または障害を患っている請求項１８または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記サーチュインモジュレーターが、サーチュイン阻害化合物である請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象が、食欲刺激または体重増加を必要とする請求項１８または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記サーチュインモジュレーターでの処置時のサーチュインバイオマーカーの発現レベルの変化が、前記対象における治療的サーチュイン変調の指標である請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記サーチュインバイオマーカーが、表１に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーである請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記サーチュインバイオマーカーが、以下：ＭＣＰ−１、ＢＭＰ受容体１Ａ、Ｓｍｐｄｌ３ａ、ＣＤ１４、ＡｐｏＥ、ＦＡＳ、トランスサイレチン、ＦＡＢＰ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ２、アクアポリン４、Ｒｒａｄ、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ８、Ｐｐｐ１ｒ３ｇ、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩまたはＡｐｏＢのうちの少なくとも１つである請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記サーチュインバイオマーカーが、ＭＣＰ−１である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記サーチュインバイオマーカーの発現レベルが、該サーチュインバイオマーカーのｍＲＮＡレベル、該サーチュインバイオマーカーのタンパク質レベルまたは該サーチュインバイオマーカーの活性を測定することにより決定される請求項１８または２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記サーチュインバイオマーカーのｍＲＮＡレベルが、マイクロアレイまたはＰＣＲを用いて測定される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記サーチュインバイオマーカーのタンパク質レベルが、該サーチュインバイオマーカーに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを用いて測定される請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記サーチュインバイオマーカーが、ＭＣＰ−１である請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記サーチュインモジュレーターでの処置時のＭＣＰ−１の発現レベルの低下が、治療的サーチュイン活性化の指標である請求項２９または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記生物学的試料におけるサーチュインバイオマーカーの発現レベルが、対照と比較される請求項２６または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記対照が、未処置対象、処置の前の対象、処置の間の初期の時点の対象、またはデータベース参照である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
サーチュインモジュレーターでの治療的処置の進展をモニタリングする方法であって、該方法は、
ａ）サーチュインモジュレーターを対象に投与する工程；
ｂ）該対象から生物学的試料を得る工程；および
ｃ）該生物学的試料中の少なくとも１つのサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定する工程；
を含み、対照と比較して、該生物学的試料におけるサーチュインバイオマーカーの改変された発現レベルが、該対象における治療的サーチュイン変調の指標である方法。
【請求項３８】
前記サーチュインモジュレーターを対象に時間をかけて少なくとも２回投与し、１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルを、投与の経過中に２回またはそれより多い時点で決定する請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記サーチュインバイオマーカーが、表１に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーである請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記サーチュインバイオマーカーが、以下：ＭＣＰ−１、ＢＭＰ受容体１Ａ、Ｓｍｐｄｌ３ａ、ＣＤ１４、ＡｐｏＥ、ＦＡＳ、トランスサイレチン、ＦＡＢＰ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ２、アクアポリン４、Ｒｒａｄ、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ８、Ｐｐｐ１ｒ３ｇ、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩまたはＡｐｏＢのうちの少なくとも１つである請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記サーチュインバイオマーカーが、ＭＣＰ−１である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
対照と比較して、前記ＭＣＰ−１発現レベルの低下がサーチュイン活性化の指標である請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
サーチュイン変調化合物での処置から利益を享受する対象を同定する方法であって、該対象からの生物学的試料における少なくとも１つのサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定する工程を含み、対照と比較して、該サーチュインバイオマーカーの改変された発現レベルが、サーチュイン変調化合物での処置から利益を享受する対象の指標である方法。
【請求項４４】
前記サーチュインバイオマーカーの改変された発現レベルが、サーチュイン活性化化合物での処置から利益を享受する対象の指標である請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記サーチュインバイオマーカーが、表１に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーである請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記サーチュインバイオマーカーが、以下：ＭＣＰ−１、ＢＭＰ受容体１Ａ、Ｓｍｐｄｌ３ａ、ＣＤ１４、ＡｐｏＥ、ＦＡＳ、トランスサイレチン、ＦＡＢＰ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ２、アクアポリン４、Ｒｒａｄ、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ８、Ｐｐｐ１ｒ３ｇ、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩまたはＡｐｏＢのうちの少なくとも１つである請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記サーチュインバイオマーカーが、ＭＣＰ−１である請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
対照と比較して、ＭＣＰ−１の発現レベルの増大が、サーチュイン活性化化合物での処置から利益を享受する対象の指標である請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
サーチュイン媒介疾患または障害を発症する対象の危険性を評価する方法であって、該方法は、該対象からの生物学的試料における少なくとも１つのサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定する工程を含み、対照と比較して、該サーチュインバイオマーカーの改変された発現レベルが、サーチュイン媒介疾患または障害を発症する危険性のある対象の指標である方法。
【請求項５０】
前記サーチュインバイオマーカーが、表１に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーである請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記サーチュインバイオマーカーが、以下：ＭＣＰ−１、ＢＭＰ受容体１Ａ、Ｓｍｐｄｌ３ａ、ＣＤ１４、ＡｐｏＥ、ＦＡＳ、トランスサイレチン、ＦＡＢＰ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ２、アクアポリン４、Ｒｒａｄ、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ８、Ｐｐｐ１ｒ３ｇ、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩまたはＡｐｏＢのうちの少なくとも１つである請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記サーチュインバイオマーカーが、ＭＣＰ−１である請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
サーチュイン活性を変調する化合物を同定する方法であって、該方法は、
ａ）サーチュインタンパク質を発現する細胞を被験化合物と接触させる工程；および
ｂ）該細胞における少なくとも１つのサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定する工程；
を含み、対照と比較して、該被験化合物の存在下での該サーチュインバイオマーカーの発現レベルの変化が、サーチュイン活性を変調する化合物の指標である方法。
【請求項５４】
前記サーチュインバイオマーカーが、表１に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーである請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記サーチュインバイオマーカーが、以下：ＭＣＰ−１、ＢＭＰ受容体１Ａ、Ｓｍｐｄｌ３ａ、ＣＤ１４、ＡｐｏＥ、ＦＡＳ、トランスサイレチン、ＦＡＢＰ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ２、アクアポリン４、Ｒｒａｄ、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ８、Ｐｐｐ１ｒ３ｇ、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩまたはＡｐｏＢのうちの少なくとも１つである請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記サーチュインバイオマーカーが、ＭＣＰ−１である請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
対象におけるサーチュイン媒介疾患または障害を処置する方法であって、
ａ）サーチュイン変調化合物を該対象に投与する工程；および
ｂ）少なくとも１つのサーチュインバイオマーカーの発現レベルを時間をかけてモニタリングして該対象における処置の経過が改変されたかどうかを決定する工程；
を含む方法。
【請求項５８】
前記サーチュイン変調化合物の投与の前に、少なくとも１つのサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定してサーチュイン変調化合物での処置から利益を享受する対象を同定する工程をさらに含む請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記サーチュインバイオマーカーが、表１に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーである請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記サーチュインバイオマーカーが、以下：ＭＣＰ−１、ＢＭＰ受容体１Ａ、Ｓｍｐｄｌ３ａ、ＣＤ１４、ＡｐｏＥ、ＦＡＳ、トランスサイレチン、ＦＡＢＰ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ２、アクアポリン４、Ｒｒａｄ、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ８、Ｐｐｐ１ｒ３ｇ、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩまたはＡｐｏＢのうちの少なくとも１つである請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記サーチュインバイオマーカーが、ＭＣＰ−１である請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
サーチュインバイオマーカーの発現レベルを検出するためのキットであって、サーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定するための少なくとも１つの成分および少なくとも１つのサーチュイン変調化合物を含むキット。
【請求項６３】
前記サーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定するための成分が、以下：該サーチュインバイオマーカーに結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、サーチュインバイオマーカーｍＲＮＡを特異的に増幅するＰＣＲプライマーのセットまたはポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのフラグメントに結合したサーチュインバイオマーカーをコードする該少なくとも１つのフラグメントを含む固体支持体；のうちの少なくとも１つである請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
以下：検出標識、バッファーまたは使用のための説明書；のうちの１つ以上をさらに含む請求項６２に記載のキット。
【請求項６５】
サーチュインタンパク質を発現する細胞系をさらに含む請求項６２に記載のキット。
【請求項６６】
生物学的試料中のサーチュイン活性のレベルを決定する方法であって、該生物学的試料中の少なくとも１つのサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定する工程を含む方法。
【請求項６７】
対象におけるサーチュイン変調を検出する方法であって、該方法は、該対象からの生物学的試料におけるＦＧＦ２１の発現レベルを決定する工程を含み、対照と比較して、該ＦＧＦ２１の発現レベルの変化がサーチュイン変調の指標である方法。
【請求項６８】
サーチュインモジュレーターでの治療的処置をモニタリングするための方法であって、該方法は、サーチュインモジュレーターで処置されている対象からの生物学的試料におけるＦＧＦ２１の発現レベルを決定する工程を含み、ここで該サーチュインモジュレーターでの処置時のＦＧＦ２１の発現レベルの変化が該対象における治療的サーチュイン変調の指標である方法。
【請求項６９】
サーチュインモジュレーターでの治療的処置の進展をモニタリングする方法であって、該方法は、
ａ）サーチュインモジュレーターを対象に投与する工程；
ｂ）該対象から生物学的試料を得る工程；および
ｃ）該生物学的試料におけるＦＧＦ２１の発現レベルを決定する工程；
を含み、対照と比較して、該生物学的試料におけるＦＧＦ２１の改変された発現レベルが、該対象における治療的サーチュイン変調の指標である方法。
【請求項７０】
サーチュイン変調化合物での処置から利益を享受する対象を同定する方法であって、該方法は、該対象からの生物学的試料におけるＦＧＦ２１の発現レベルを決定する工程を含み、対照と比較して、ＦＧＦ２１の改変された発現レベルが、サーチュイン変調化合物での処置から利益を享受する対象の指標である方法。
【請求項７１】
サーチュイン媒介疾患または障害を発症する対象の危険性を評価する方法であって、該方法は、該対象からの生物学的試料におけるＦＧＦ２１の発現レベルを決定する工程を含み、対照と比較して、ＦＧＦ２１の改変された発現レベルが、サーチュイン媒介疾患または障害を発症する危険性のある対象の指標である方法。
【請求項７２】
サーチュイン活性を変調する化合物を同定する方法であって、該方法は、
ａ）サーチュインタンパク質を発現する細胞を被験化合物と接触させる工程；および
ｂ）該細胞におけるＦＧＦ２１の発現レベルを決定する工程；
を含み、対照と比較して、該被験化合物の存在下でのＦＧＦ２１の発現レベルの変化が、サーチュイン活性を変調する化合物の指標である方法。
【請求項７３】
対象におけるサーチュイン媒介疾患または障害を処置するための方法であって、
ａ）サーチュイン変調化合物を該対象に投与する工程；および
ｂ）ＦＧＦ２１の発現レベルを経時的にモニタリングして該対象における処置の経過が改変されたかどうかを決定する工程；
を含む方法。
【請求項７４】
前記サーチュイン変調化合物の投与の前にＦＧＦ２１の発現レベルを決定して、該サーチュイン変調化合物での処置から利益を享受する対象を同定する工程をさらに含む請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞が、組織培養細胞である請求項５３または７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞が、サーチュインタンパク質を過剰発現する請求項５３または７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記サーチュインタンパク質が、ＳＩＲＴ１である請求項５３または７２に記載の方法。
【請求項７８】
少なくとも１つのさらなるサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定またはモニタリングする工程をさらに含む請求項６７〜７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
前記サーチュインバイオマーカーが、表１に列挙される少なくとも１つのバイオマーカーである請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記サーチュインバイオマーカーが、以下：ＭＣＰ−１、ＢＭＰ受容体１Ａ、Ｓｍｐｄｌ３ａ、ＣＤ１４、ＡｐｏＥ、ＦＡＳ、トランスサイレチン、ＦＡＢＰ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ２、アクアポリン４、Ｒｒａｄ、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ８、Ｐｐｐ１ｒ３ｇ、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩまたはＡｐｏＢのうちの少なくとも１つである請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＦＧＦ２１の発現レベルにおける増大が、サーチュイン活性化の指標である請求項６７〜６９または７２のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記サーチュイン変調が、サーチュイン活性化である請求項６７〜６９のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
前記サーチュインモジュレーターまたはサーチュイン変調化合物が、サーチュイン活性化化合物である請求項６８〜７０、７２または７３のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
前記対象が、加齢もしくはストレス、糖尿病、肥満、神経変性疾患、化学療法誘発性ニューロパチー、虚血イベントに関連するニューロパチー、眼疾患もしくは障害、心血管疾患、血液凝固障害、炎症、または潮紅に関係する疾患または障害を患っている請求項６７〜７３のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
前記対象が、哺乳動物である請求項６７〜７３のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
前記哺乳動物が、ヒトである請求項８５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００７年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／９１８，７３５号への優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
加齢は、２型糖尿、癌、心血管性、代謝性および神経変性疾患を含む種々の主要な疾患に関する主要な危険性因子である。カロリー摂取の制限（カロリー制限）のような寿命を延ばす操作は、これらの代謝変化を防御または遅延させ、様々な生物における多くの疾患に対する抵抗性を付与することができる（非特許文献１）。さらに最近では、無脊椎動物およびげっ歯類における加齢を変調させる具体的な遺伝的経路が同定されている（非特許文献２）。これらの経路内の単一遺伝子における変化によって、劇的な寿命の増大が引き起こされることが可能となり、、これらの長期間生存生物は、加齢性疾患にかかりにくい。寿命を調節する多くの遺伝子は、進化的に保存されている。
【０００３】
遺伝子のサイレント情報調節因子（ＳＩＲ）ファミリー（またはサーチュイン）は、古細菌から種々の真核生物におよぶ生物のゲノムに存在する遺伝子の高度に保存された群を表す。コードされたＳＩＲタンパク質は、遺伝子サイレンシングの調節からＤＮＡ修復までの多様な過程に関与する。ＳＩＲ遺伝子ファミリーのメンバーによりコードされるタンパク質は、２５０アミノ酸コアドメインにおける高度な配列保存を示す。このファミリーにおける十分に特徴付けされた遺伝子は、出芽酵母（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＩＲ２であり、これは酵母接合型、テロメア位置効果および細胞加齢を特定する情報を含有するＨＭ遺伝子座のサイレンシングに関与する。酵母Ｓｉｒ２タンパク質は、ヒストンデアセチラーゼのファミリーに属する。ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）におけるＳｉｒ２相同体、ＣｏｂＢは、ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）依存性ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼとして機能する。
【０００４】
Ｓｉｒ２タンパク質は、補助基質としてＮＡＤを用いるクラスＩＩＩデアセチラーゼである。その他のデアセチラーゼとは異なり、その多くが遺伝子サイレンシングに関与するＳｉｒ２は、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）のようにクラスＩおよびＩＩヒストンデアセチラーゼ阻害剤に対して感受性が低い。
【０００５】
Ｓｉｒ２によるアセチル−リジンの脱アセチル化は、ニコチンアミドおよび新規アセチルＡＤＰリボース化合物を生成するＮＡＤ加水分解に緊密に共役する。Ｓｉｒ２のＮＡＤ依存性デアセチラーゼ活性は、酵母においてその生物学的役割を細胞代謝と結びつけることができる機能に必須である。哺乳動物Ｓｉｒ２相同体はＮＡＤ依存性ヒストンデアセチラーゼ活性を有する。Ｓｉｒ２媒介機能についてのほとんどの情報は、酵母における研究によってもたらされる。
【０００６】
生化学的研究により、Ｓｉｒ２はヒストンＨ３およびＨ４のアミノ末端尾部を容易に脱アセチル化することができ、その結果１−Ｏ−アセチルＡＤＰリボースおよびニコチンアミドの形成に至る。ＳＩＲ２のさらなるコピーを有する株は、ｒＤＮＡサイレンシングの増大および３０％の寿命延長を示す。最近では、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ＳＩＲ２相同体、ｓｉｒ−２．１およびキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ｄＳｉｒ２遺伝子のさらなるコピーがこれらの生物における寿命を大きく延ばすことが示されている。これは加齢に関するＳＩＲ２依存性調節経路が進化の初期に生じ、よく保存されていることを意味する。今日では、Ｓｉｒ２遺伝子は、生物の健康およびストレス抵抗性を強化するように進化して、逆境を生き抜く機会を増やすと考えられている。
【０００７】
７０歳を超えてのカロリー制限は、哺乳動物の健康を改善し、寿命を延ばすことが分かっている。後生動物の寿命と同様、酵母の寿命もまた低グルコースのようなカロリー制限に類似する介入により延長される。ＳＩＲ２遺伝子を欠如する酵母およびハエの双方は、カロリーを制限された場合に長くは生存しないという発見により、ＳＩＲ２遺伝子がこの食事療法の有利な健康効果を媒介するという証拠が提供される。さらに、酵母グルコース応答性ｃＡＭＰ（アデノシン３’５’一リン酸）依存性（ＰＫＡ）経路の活性を低減させる変異は、野生型細胞において寿命を延ばすが、変異体ｓｉｒ２株では、ＳＩＲ２がカロリー制限経路の重要な下流構成成分である可能性があることを実証する。
【０００８】
最近では、ＳＩＲタンパク質の多くの小型分子活性化因子および阻害剤が報告されており（例えば特許文献１および特許文献２、ならびにＰＣＴ公開特許文献３および特許文献４参照）、これらの化合物に関する多くの使用が同定されている。例えばＳＩＲタンパク質の小型分子活性化因子は、酵母および培養ヒト細胞において寿命を延ばし、ヒト細胞におけるＳＩＲタンパク質活性を活性化することが示された（前出）。加えて、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）およびキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）において小型分子ＳＩＲ活性化因子はカロリー制限を模倣し、寿命を延ばすことが示された（前出）。したがって、ＳＩＲタンパク質の活性化因子は、真核細胞におけるカロリー制限の効果を擬似し、卒中発作、心血管疾患、関節炎、高血圧またはアルツハイマー病のような加齢性疾患を処置するのに有用であり得る（前出）。加えて、ＳＩＲタンパク質の小型分子活性化因子、レスベラトロール、ブテイン、フィセチン、ピセアタンノールおよびクエルセチンは、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）における脂肪動員を促進し、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）における脂肪蓄積を防御し、哺乳動物細胞における脂肪動員を刺激し、哺乳動物細胞における脂質生成を阻害することが示されている（例えば特許文献５およびＰＣＴ公開特許文献６参照）。同様にＳＩＲタンパク質の阻害剤、ニコチンアミドは脂肪蓄積を促進することが示された（前出）。加えて、レスベラトロールは、インスリン抵抗性細胞において少なくとも部分的にインスリン感受性を回復させることが示された（前出）。したがって、ＳＩＲタンパク質の活性化因子は、インスリン抵抗性障害を処置または防御するのにも有用であり得て、体重減少または体重増加の防御に関係する使用が示唆されている（前出）。
【０００９】
酵母Ｓｉｒ２のヒトオルソログ（サイレント接合型情報調節２）、ＳＩＲＴ１はＮＡＤ＋依存性デアセチラーゼである。ＳＩＲＴ１タンパク質は、核に局在し、非常に多くのタンパク質と相互作用し、脱アセチル化する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０１３６５３７号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／００９６２５６号明細書
【特許文献３】国際公開第２００５／００２５５５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００５／００２６７２号パンフレット
【特許文献５】米国特許公開第２００５／０１７１０２７号明細書
【特許文献６】国際公開第２００５／０６５６６７号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｃｕｒｔｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．４：５６９−５ｙ７８０（２００５）
【非特許文献２】Ｋｅｎｙｏｎ，Ｃ．、Ｃｅｌｌ．１２０：４４９−４６０（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
運悪く、サーチュインタンパク質の活性を増大させる治療薬のインビボ効果をモニタリングするのは困難である。したがってインビボでサーチュイン活性を決定し、治療的介入時にサーチュイン変調をモニタリングするために使用できる新規サーチュインバイオマーカーが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（要旨）
本明細書では、対象におけるサーチュイン活性を決定するための方法を提供する。かかる方法を診断および予後診断適用に使用できる。例えば、サーチュイン変調化合物での治療的処置中を含む、対象におけるサーチュイン変調をモニタリングするための方法もまた提供される。サーチュインタンパク質の活性を変調する化合物を同定するための方法もまた提供される。
【００１４】
１つの態様では、本発明は、対象からの生物学的試料中の１つ以上のサーチュインバイオマーカー（表１に例を示す）の発現レベルを決定する工程を含む、対象におけるサーチュインタンパク質の変調を検出するための方法を提供し、ここで対照と比較して１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルの変化は、対象におけるサーチュイン変調を示す。
【００１５】
特定の実施態様では、サーチュイン変調は、サーチュイン活性化でよい。対象のサーチュイン活性のレベルが低い場合、またはサーチュイン活性における増大が対象に有利であろう場合に、サーチュイン活性化は有利であり得る。例えば、加齢もしくはストレス、糖尿病、肥満、神経変性疾患、化学療法誘発性ニューロパチー、虚血イベントに関連するニューロパチー、眼疾患もしくは障害、心血管疾患、血液凝固障害、炎症、または潮紅に関係する疾患または障害を患う対象はサーチュイン活性化化合物での処置から利益を享受し得る。
【００１６】
特定の実施態様では、サーチュイン変調は、サーチュイン阻害であり得る。対象のサーチュイン活性のレベルが高い場合、または対象がサーチュイン活性の低下を必要とする場合、サーチュイン阻害は、有利であり得る。例えば、食欲刺激または体重増加を必要とする対象は、サーチュイン阻害化合物での処置から利益を享受し得る。
【００１７】
特定の実施態様では、表１にて示される少なくとも１、２、３、４、５、１０またはそれより多いサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定できる。
【００１８】
特定の実施態様では、以下のうちの少なくとも１つのサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定する：ＭＣＰ−１、ＢＭＰ受容体１Ａ、Ｓｍｐｄｌ３ａ、ＣＤ１４、ＡｐｏＥ、ＦＡＳ、トランスサイレチン、ＦＡＢＰ１（肝臓）、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ２、アクアポリン４、Ｒｒａｄ、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ８、Ｐｐｐ１ｒ３ｇ、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＢまたはＦＧＦ２１。特定の実施態様では、ＭＣＰ−１の発現レベルを決定する。特定の実施態様では、ＦＧＦ２１の発現レベルを決定する。
【００１９】
特定の実施態様では、１つ以上のサーチュインバイオマーカーのｍＲＮＡレベルを測定することにより、１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを決定する。特定の実施態様では、マイクロアレイチップを用いて１つ以上のサーチュインバイオマーカーのｍＲＮＡレベルを測定する。特定の実施態様では、ＰＣＲ、例えば定量的リアルタイムＰＣＲを用いて１つ以上のサーチュインバイオマーカーのｍＲＮＡレベルを測定する。
【００２０】
特定の実施態様では、１つ以上のサーチュインバイオマーカーのタンパク質レベルを測定することにより、１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを決定する。特定の実施態様では、抗体（例えばイムノブロッティング、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ等）、質量分析またはゲル電気泳動を用いて１つ以上のサーチュインバイオマーカーのタンパク質レベルを決定する。
【００２１】
特定の実施態様では、１つ以上のサーチュインバイオマーカーの活性レベルを測定することにより、１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを決定する。
【００２２】
特定の実施態様では、対照と比較して１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルの変化は、該対象における治療的サーチュイン変調の指標である。特定の実施態様では、対照と比較してＭＣＰ−１発現レベルの低下はサーチュイン活性化を示す。特定の実施態様では、対照と比較してＦＧＦ２１発現レベルにおける増大はサーチュイン活性化を示す。
【００２３】
特定の実施態様では、対照は未処置個体、処置前の対象、処置の間の初期の時点の対象、またはデータベース参照でよい。
【００２４】
特定の実施態様では、生物学的試料は血液、尿、血清、唾液、細胞、組織および／または毛髪を含むことができる。
【００２５】
特定の実施態様では、対象は、例えばヒトのような哺乳動物でよい。
【００２６】
別の態様では、本発明は、サーチュインモジュレーターで処置されている対象からの生物学的試料中の１つ以上のサーチュインバイオマーカー（表１に例を示す）の発現レベルを決定する工程を含む、サーチュインモジュレーターでの治療的処置をモニタリングするための方法を提供し、ここで対照と比較して１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルの変化は対象における治療的サーチュイン変調を示す。
【００２７】
特定の実施態様では、サーチュインモジュレーターは、サーチュイン活性化化合物である。特定の実施態様では、サーチュインモジュレーターは、サーチュイン阻害化合物である。
【００２８】
特定の実施態様では、サーチュインモジュレーターでの処置時のＭＣＰ−１の発現レベルにおける低下は、治療的サーチュイン活性化を示す。特定の実施態様では、サーチュインモジュレーターでの処置時のＦＧＦ２１の発現レベルにおける増大は、治療的サーチュイン活性化を示す。
【００２９】
特定の実施態様では、その方法はさらに、例えばサーチュインモジュレーターの投与に応答した１つ以上のサーチュインバイオマーカー（表１に例を示す）の発現レベルに基づいて対象に投与されるサーチュインモジュレーターの用量を調整する工程を含むことができる。
【００３０】
別の態様では、本発明は：（ｉ）サーチュインモジュレーターを対象に投与する工程；（ｉｉ）該対象から生物学的試料を入手する工程；および（ｉｉｉ）試料中の１つ以上のサーチュインバイオマーカー（表１に例を示す）の発現レベルを決定する工程；を含む、サーチュインモジュレーターでの治療的処置の進展をモニタリングするための方法を提供し、ここで対照と比較して、１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルの変化は、該対象における治療的サーチュイン変調を示す。
【００３１】
特定の実施態様では、サーチュインモジュレーターを対象に、経時的に少なくとも２回投与することができ、１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルを投与の経過中に２回またはそれより多い時点で決定する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、対象からの生物学的試料中の１つ以上のサーチュインバイオマーカー（表１に例を示す）の発現レベルを決定する工程を含む、サーチュイン変調化合物での処置から利益を享受する対象を同定する方法を提供し、ここで対照と比較して、１つ以上のサーチュインバイオマーカーの改変された発現レベルは対象がサーチュイン変調化合物での処置から利益を享受できることを示す。
【００３３】
特定の実施態様では、対照と比較して、対象からの生物学的試料中の１つ以上のサーチュインバイオマーカーの改変された発現レベルは、治療的サーチュイン活性化を示す。特定の実施態様では、対照と比較してＭＣＰ−１の発現レベルにおける低下は治療的サーチュイン活性化を示す。特定の実施態様では、対照と比較してＦＧＦ２１の発現レベルにおける増大は、治療的サーチュイン活性化を示す。
【００３４】
別の態様では、本発明は、対象からの生物学的試料中の１つ以上のサーチュインバイオマーカー（表１に例を示す）の発現レベルを決定する工程を含む、サーチュイン媒介疾患または障害を発症する対象の危険性を評価する方法を提供し、ここで対照と比較して、１つ以上のサーチュインバイオマーカーの改変された発現レベルは、対象がサーチュイン媒介疾患または障害を発症する危険性のあることを示す。
【００３５】
別の態様では、本発明は：（ｉ）サーチュイン変調化合物を対象に投与する工程；および（ｉｉ）１つ以上のサーチュインバイオマーカー（表１に例を示す）の発現レベルを経時的にモニタリングして、対象における処置の経過が改変されたかどうかを決定する工程；を含む、対象におけるサーチュイン媒介疾患または障害を処置するための方法を提供する。特定の実施態様では、その方法はさらにサーチュイン変調化合物の投与の前に１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定して、サーチュイン変調化合物での処置から利益を享受する対象を同定する工程を含む。
【００３６】
別の態様では、本発明は：（ｉ）サーチュインタンパク質を発現する細胞を被験化合物と接触させる工程；および（ｉｉ）１つ以上のサーチュインバイオマーカー（表１に例を示す）の発現レベルを決定する工程；を含む、サーチュインタンパク質を変調する化合物を同定するための方法を提供し、ここで対照と比較して、被験化合物の存在下で１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルの変化は、被験化合物がサーチュインタンパク質を変調することを示す。特定の実施態様では、細胞は、組織培養細胞でよい。特定の実施態様では、細胞は、ＳＩＲＴ１のようなサーチュインタンパク質を過剰発現できる。
【００３７】
特定の実施態様では、サーチュインタンパク質を活性化する被験化合物を同定できる。その他の実施態様では、サーチュインタンパク質を阻害する被験化合物を同定できる。特定の実施態様では、被験化合物は小型分子である。
【００３８】
特定の実施態様では、ＳＩＲＴ１のようなヒトサーチュインタンパク質のモジュレーターを同定できる。
【００３９】
特定の実施態様では、表１にて示される少なくとも１、２、３、４、５、１０またはそれより多いサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定する。
【００４０】
特定の実施態様では、以下のうち、少なくとも１つのサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定する：ＭＣＰ−１、ＢＭＰ受容体１Ａ、Ｓｍｐｄｌ３ａ、ＣＤ１４、ＡｐｏＥ、ＦＡＳ、トランスサイレチン、ＦＡＢＰ１（肝臓）、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ２、アクアポリン４、Ｒｒａｄ、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ８、Ｐｐｐ１ｒ３ｇ、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＢまたはＦＧＦ２１。特定の実施態様では、ＭＣＰ−１の発現レベルを決定する。特定の実施態様では、ＦＧＦ２１の発現レベルを決定する。
【００４１】
特定の実施態様では、１つ以上のサーチュインバイオマーカーのｍＲＮＡ、タンパク質および／またはタンパク質活性レベルを測定することにより、１つ以上のバイオマーカーの発現レベルを決定する。
【００４２】
特定の実施態様では、細胞は、ヒト細胞のような哺乳動物細胞である。細胞は、培養物中に懸濁された単離された細胞であるか、または非ヒト生物のような生物全体に存在し得る。
【００４３】
特定の実施態様では、サーチュインタンパク質を変調する化合物を同定するための方法は、さらに以下のうちの１つ以上を含むことができる：（ｉ）多量の化合物もしくはその類似体の量を調製する工程；（ｉｉ）動物における有効性および毒性に関して化合物もしくはその類似体の治療的プロファイリングを行う工程；（ｉｉｉ）化合物もしくはその類似体を医薬用処方に処方する工程；（ｉｖ）適当な動物毒性プロフィールを有する化合物もしくはその類似体の医薬製剤を製造する工程；または（ｖ）適当な動物毒性プロフィールを有する化合物もしくはその類似体の医薬製剤を医療機関に販売する工程。
【００４４】
別の態様では、本発明は、１つ以上のサーチュインバイオマーカー（表１に例を示す）の発現レベルを決定するための少なくとも１つの構成成分および少なくとも１つのサーチュイン変調化合物を含む、サーチュインバイオマーカーの発現レベルを検出するためのキットを提供する。
【００４５】
特定の実施態様では、１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベル決定するための構成成分は、サーチュインバイオマーカーに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。特定の実施態様では、１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベル決定するための構成成分は、サーチュインバイオマーカーｍＲＮＡを特異的に増幅するＰＣＲプライマーのセットである。特定の実施態様では、１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベル決定するための構成成分は、そこに結合したサーチュインバイオマーカーをコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのフラグメントを含む固体支持体（例えばマイクロアレイチップ）である。
【００４６】
特定の実施態様では、キットは、さらに以下のうちの１つ以上を含む：検出標識、バッファー、もしくは使用のための説明書、またはサーチュインタンパク質を発現する細胞系。
【００４７】
別の態様では、本発明は、生物学的試料中の少なくとも１つのサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定することを含む、生物学的試料中のサーチュイン活性のレベルを決定するための方法を提供する。
【００４８】
本方法の実施には、特記しない場合、当業者の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を用いる。かかる技術は文献において十分に説明される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４６８３１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４および１５５巻（Ｗｕら編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８６）を参照のこと。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１−１】処置後に指示された時点で上方または下方のいずれかに２倍を超える発現の変化を実証するインビトロ研究（新たに単離されたヒトＷＢＣを使用）およびインビボ研究（マウスモデルを使用）から同定されたサーチュインバイオマーカーの一覧を提供する表１を示す。ヒトＷＢＣをレスベラトロールまたは化合物２で処理した；マウスモデルをレスベラトロールまたは化合物１で処置した。＊＊＊で標識されたバイオマーカーは、その発現が双方の化合物での処置時に上方または下方に２倍を超えて変化したのみならず（すなわちマウス組織では化合物１およびレスベラトロール、またはヒトＷＢＣに関して化合物２およびレスベラトロール）、最も堅調な、または再現性のある応答を実証したものである。好ましいバイオマーカーはヒトＷＢＣ実験において実験の間中、低い変動性で最高の倍変化をしたか、またはマウスインビボ実験において目的の組織において最高の倍変化を実証したかのいずれかであった。「上方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが増大した；「下方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが低下した；「／」：変化はなかった；インビボマウス研究に関して２週の時点は実際にはの１６日間であった。
【図１−２】処置後に指示された時点で上方または下方のいずれかに２倍を超える発現の変化を実証するインビトロ研究（新たに単離されたヒトＷＢＣを使用）およびインビボ研究（マウスモデルを使用）から同定されたサーチュインバイオマーカーの一覧を提供する表１を示す。ヒトＷＢＣをレスベラトロールまたは化合物２で処理した；マウスモデルをレスベラトロールまたは化合物１で処置した。＊＊＊で標識されたバイオマーカーは、その発現が双方の化合物での処置時に上方または下方に２倍を超えて変化したのみならず（すなわちマウス組織では化合物１およびレスベラトロール、またはヒトＷＢＣに関して化合物２およびレスベラトロール）、最も堅調な、または再現性のある応答を実証したものである。好ましいバイオマーカーはヒトＷＢＣ実験において実験の間中、低い変動性で最高の倍変化をしたか、またはマウスインビボ実験において目的の組織において最高の倍変化を実証したかのいずれかであった。「上方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが増大した；「下方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが低下した；「／」：変化はなかった；インビボマウス研究に関して２週の時点は実際にはの１６日間であった。
【図１−３】処置後に指示された時点で上方または下方のいずれかに２倍を超える発現の変化を実証するインビトロ研究（新たに単離されたヒトＷＢＣを使用）およびインビボ研究（マウスモデルを使用）から同定されたサーチュインバイオマーカーの一覧を提供する表１を示す。ヒトＷＢＣをレスベラトロールまたは化合物２で処理した；マウスモデルをレスベラトロールまたは化合物１で処置した。＊＊＊で標識されたバイオマーカーは、その発現が双方の化合物での処置時に上方または下方に２倍を超えて変化したのみならず（すなわちマウス組織では化合物１およびレスベラトロール、またはヒトＷＢＣに関して化合物２およびレスベラトロール）、最も堅調な、または再現性のある応答を実証したものである。好ましいバイオマーカーはヒトＷＢＣ実験において実験の間中、低い変動性で最高の倍変化をしたか、またはマウスインビボ実験において目的の組織において最高の倍変化を実証したかのいずれかであった。「上方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが増大した；「下方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが低下した；「／」：変化はなかった；インビボマウス研究に関して２週の時点は実際にはの１６日間であった。
【図１−４】処置後に指示された時点で上方または下方のいずれかに２倍を超える発現の変化を実証するインビトロ研究（新たに単離されたヒトＷＢＣを使用）およびインビボ研究（マウスモデルを使用）から同定されたサーチュインバイオマーカーの一覧を提供する表１を示す。ヒトＷＢＣをレスベラトロールまたは化合物２で処理した；マウスモデルをレスベラトロールまたは化合物１で処置した。＊＊＊で標識されたバイオマーカーは、その発現が双方の化合物での処置時に上方または下方に２倍を超えて変化したのみならず（すなわちマウス組織では化合物１およびレスベラトロール、またはヒトＷＢＣに関して化合物２およびレスベラトロール）、最も堅調な、または再現性のある応答を実証したものである。好ましいバイオマーカーはヒトＷＢＣ実験において実験の間中、低い変動性で最高の倍変化をしたか、またはマウスインビボ実験において目的の組織において最高の倍変化を実証したかのいずれかであった。「上方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが増大した；「下方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが低下した；「／」：変化はなかった；インビボマウス研究に関して２週の時点は実際にはの１６日間であった。
【図１−５】処置後に指示された時点で上方または下方のいずれかに２倍を超える発現の変化を実証するインビトロ研究（新たに単離されたヒトＷＢＣを使用）およびインビボ研究（マウスモデルを使用）から同定されたサーチュインバイオマーカーの一覧を提供する表１を示す。ヒトＷＢＣをレスベラトロールまたは化合物２で処理した；マウスモデルをレスベラトロールまたは化合物１で処置した。＊＊＊で標識されたバイオマーカーは、その発現が双方の化合物での処置時に上方または下方に２倍を超えて変化したのみならず（すなわちマウス組織では化合物１およびレスベラトロール、またはヒトＷＢＣに関して化合物２およびレスベラトロール）、最も堅調な、または再現性のある応答を実証したものである。好ましいバイオマーカーはヒトＷＢＣ実験において実験の間中、低い変動性で最高の倍変化をしたか、またはマウスインビボ実験において目的の組織において最高の倍変化を実証したかのいずれかであった。「上方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが増大した；「下方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが低下した；「／」：変化はなかった；インビボマウス研究に関して２週の時点は実際にはの１６日間であった。
【図１−６】処置後に指示された時点で上方または下方のいずれかに２倍を超える発現の変化を実証するインビトロ研究（新たに単離されたヒトＷＢＣを使用）およびインビボ研究（マウスモデルを使用）から同定されたサーチュインバイオマーカーの一覧を提供する表１を示す。ヒトＷＢＣをレスベラトロールまたは化合物２で処理した；マウスモデルをレスベラトロールまたは化合物１で処置した。＊＊＊で標識されたバイオマーカーは、その発現が双方の化合物での処置時に上方または下方に２倍を超えて変化したのみならず（すなわちマウス組織では化合物１およびレスベラトロール、またはヒトＷＢＣに関して化合物２およびレスベラトロール）、最も堅調な、または再現性のある応答を実証したものである。好ましいバイオマーカーはヒトＷＢＣ実験において実験の間中、低い変動性で最高の倍変化をしたか、またはマウスインビボ実験において目的の組織において最高の倍変化を実証したかのいずれかであった。「上方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが増大した；「下方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが低下した；「／」：変化はなかった；インビボマウス研究に関して２週の時点は実際にはの１６日間であった。
【図１−７】処置後に指示された時点で上方または下方のいずれかに２倍を超える発現の変化を実証するインビトロ研究（新たに単離されたヒトＷＢＣを使用）およびインビボ研究（マウスモデルを使用）から同定されたサーチュインバイオマーカーの一覧を提供する表１を示す。ヒトＷＢＣをレスベラトロールまたは化合物２で処理した；マウスモデルをレスベラトロールまたは化合物１で処置した。＊＊＊で標識されたバイオマーカーは、その発現が双方の化合物での処置時に上方または下方に２倍を超えて変化したのみならず（すなわちマウス組織では化合物１およびレスベラトロール、またはヒトＷＢＣに関して化合物２およびレスベラトロール）、最も堅調な、または再現性のある応答を実証したものである。好ましいバイオマーカーはヒトＷＢＣ実験において実験の間中、低い変動性で最高の倍変化をしたか、またはマウスインビボ実験において目的の組織において最高の倍変化を実証したかのいずれかであった。「上方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが増大した；「下方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが低下した；「／」：変化はなかった；インビボマウス研究に関して２週の時点は実際にはの１６日間であった。
【図１−８】処置後に指示された時点で上方または下方のいずれかに２倍を超える発現の変化を実証するインビトロ研究（新たに単離されたヒトＷＢＣを使用）およびインビボ研究（マウスモデルを使用）から同定されたサーチュインバイオマーカーの一覧を提供する表１を示す。ヒトＷＢＣをレスベラトロールまたは化合物２で処理した；マウスモデルをレスベラトロールまたは化合物１で処置した。＊＊＊で標識されたバイオマーカーは、その発現が双方の化合物での処置時に上方または下方に２倍を超えて変化したのみならず（すなわちマウス組織では化合物１およびレスベラトロール、またはヒトＷＢＣに関して化合物２およびレスベラトロール）、最も堅調な、または再現性のある応答を実証したものである。好ましいバイオマーカーはヒトＷＢＣ実験において実験の間中、低い変動性で最高の倍変化をしたか、またはマウスインビボ実験において目的の組織において最高の倍変化を実証したかのいずれかであった。「上方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが増大した；「下方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが低下した；「／」：変化はなかった；インビボマウス研究に関して２週の時点は実際にはの１６日間であった。
【図１−９】処置後に指示された時点で上方または下方のいずれかに２倍を超える発現の変化を実証するインビトロ研究（新たに単離されたヒトＷＢＣを使用）およびインビボ研究（マウスモデルを使用）から同定されたサーチュインバイオマーカーの一覧を提供する表１を示す。ヒトＷＢＣをレスベラトロールまたは化合物２で処理した；マウスモデルをレスベラトロールまたは化合物１で処置した。＊＊＊で標識されたバイオマーカーは、その発現が双方の化合物での処置時に上方または下方に２倍を超えて変化したのみならず（すなわちマウス組織では化合物１およびレスベラトロール、またはヒトＷＢＣに関して化合物２およびレスベラトロール）、最も堅調な、または再現性のある応答を実証したものである。好ましいバイオマーカーはヒトＷＢＣ実験において実験の間中、低い変動性で最高の倍変化をしたか、またはマウスインビボ実験において目的の組織において最高の倍変化を実証したかのいずれかであった。「上方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが増大した；「下方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが低下した；「／」：変化はなかった；インビボマウス研究に関して２週の時点は実際にはの１６日間であった。
【図１−１０】処置後に指示された時点で上方または下方のいずれかに２倍を超える発現の変化を実証するインビトロ研究（新たに単離されたヒトＷＢＣを使用）およびインビボ研究（マウスモデルを使用）から同定されたサーチュインバイオマーカーの一覧を提供する表１を示す。ヒトＷＢＣをレスベラトロールまたは化合物２で処理した；マウスモデルをレスベラトロールまたは化合物１で処置した。＊＊＊で標識されたバイオマーカーは、その発現が双方の化合物での処置時に上方または下方に２倍を超えて変化したのみならず（すなわちマウス組織では化合物１およびレスベラトロール、またはヒトＷＢＣに関して化合物２およびレスベラトロール）、最も堅調な、または再現性のある応答を実証したものである。好ましいバイオマーカーはヒトＷＢＣ実験において実験の間中、低い変動性で最高の倍変化をしたか、またはマウスインビボ実験において目的の組織において最高の倍変化を実証したかのいずれかであった。「上方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが増大した；「下方」：処置時にバイオマーカーの発現レベルが低下した；「／」：変化はなかった；インビボマウス研究に関して２週の時点は実際にはの１６日間であった。
【図２】１日あたりの指示された用量でレスベラトロールまたは化合物１で処置された動物の３日肝臓試料におけるＦＧＦ２１発現を示す。ｙ軸はＦＧＦ２１  ｍＲＮＡレベルを説明し、ｘ軸は薬物なし（ベヒクル）、レスベラトロール（１０００ｍｇ／ｋｇ）または化合物１（１００ｍｇ／ｋｇ）で処置されたマウスに関する結果を表示する。
【図３】組織培養細胞におけるＳＩＲＴ１の過剰発現に応答したＦＧＦ２１遺伝子発現を描く。ｙ軸は定量ＰＣＲにより決定されたＦＧＦ２１  ｍＲＮＡレベルを説明し、ｘ軸はＧＦＰ発現対照プラスミド、ＳＩＲＴ１発現プラスミド１μｇまたはＳＩＲＴ１発現プラスミド５μｇでトランスフェクトされた細胞に関する結果を表示する。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
１．定義
本明細書で使用される際には、以下の用語および語句は以下に示す意味を有するものとする。特記しない場合、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者に一般的に理解されるものと同一の意味を有する。
【００５１】
単数形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに特に指図しない限り、複数の意味を含む。
【００５２】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」なる用語はさらなる要素が含まれ得る、包括的な、開放的な感覚の意味で用いられる。
【００５３】
「発現レベル」なる用語は、サーチュインバイオマーカーに関連して用いられる場合、遺伝子転写物蓄積、タンパク質蓄積またはバイオマーカーの検出可能な生物学的活性のような、バイオマーカーの遺伝子またはタンパク質発現データに反映されるか、またはそれから導き出せる量を指す
「含む」なる用語は、「限定するものではないが含むこと」を意味するために用いられる。「含む」および「限定するものではないが含むこと」は互換的に用いられる。
【００５４】
「哺乳動物」なる用語は当該分野において公知であり、代表的な哺乳動物には、ヒト、霊長類、家畜動物（ウシ、ブタ等を含む）、愛玩動物（例えばイヌ、ネコ等）およびげっ歯類（例えばマウスおよびラット）が含まれる。
【００５５】
「変調する」または「変調」なる用語は、サーチュインタンパク質の活性に関連して用いられる場合、上方調節（例えば活性化または刺激）、下方調節（例えば阻害または抑制）またはサーチュインタンパク質の少なくとも１つの活性の質におけるその他の変化を指す。
【００５６】
「サーチュイン活性化化合物」は、サーチュインタンパク質のレベルを増大させる、および／またはサーチュインタンパク質の少なくとも１つの活性を増大させる化合物を指す。サーチュイン活性化化合物は、サーチュインタンパク質のレベルを増大させる、および／またはサーチュインタンパク質の少なくとも１つの活性を増大させる化合物を指す。１つの代表的な実施態様では、サーチュイン活性化化合物は、少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％以上のサーチュインタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を増大させることができる。代表的なサーチュインタンパク質の生物学的活性には、サーチュイン基質の脱アセチル化（例えばヒストンまたはｐ５３のような、例えばアセチル化ポリペプチドの脱アセチル化）、寿命の延長、ゲノム安定性の増大、転写のサイレンシング、母細胞と娘細胞の間の酸化型タンパク質の分離の制御、または少なくとも１つのサーチュインバイオマーカー（例えばＭＣＰ−１のような、例えば表１に示される遺伝子）の発現レベルの変調が含まれる。サーチュイン活性化化合物の代表例には、フラボン系、スチルベン系、フラバノン系、イソフラバノン系、カテキン系、カルコン系、タンニン系およびアントシアニジン系が含まれる。スチルベン系の代表例には、トリヒドロキシスチルベン系のようなヒドロキシスチルベン系、例えば３，５，４’−トリヒドロキシスチルベン（「レスベラトロール」）が含まれる。レスベラトロールは３，４’，５−スチルベントリオールとしても公知である。テトラヒドロキシスチルベン系、例えばピセアタンノールもまた包含される。イソリキリチゲニンのようなトリヒドロキシカロンおよびブテインのようなテトラヒドロキシカロンを含むヒドロキシカロンを使用することもできる。フィセチンのようなテトラヒドロキシフラボン系およびクエルセチンのようなペンタヒドロキシフラボン系を含むヒドロキシフラボン系を使用することもできる。その他のサーチュイン活性化化合物は、米国特許出願公開第２００５／００９６２５６号およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／００２０９２号、同第ＰＣＴ／ＵＳ０６／００７７４６号、同第ＰＣＴ／ＵＳ０６／００７７４４号、同第ＰＣＴ／ＵＳ０６／００７７４５号、同第ＰＣＴ／ＵＳ０６／００７７７８号、同第ＰＣＴ／ＵＳ０６／００７６５６号、同第ＰＣＴ／ＵＳ０６／００７６５５号および同第ＰＣＴ／ＵＳ０６／００７７７３号に記載される。
【００５７】
「サーチュイン阻害化合物」は、サーチュインタンパク質のレベルを低下させる、および／またはサーチュインタンパク質の少なくとも１つの活性を低下させる化合物を指す。１つの代表的な実施態様では、サーチュイン阻害化合物は少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％以上のサーチュインタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を低下させることができる。代表的なサーチュインタンパク質の生物学的活性には、サーチュイン基質の脱アセチル化（例えばヒストンまたはｐ５３のような、例えばアセチル化ポリペプチドの脱アセチル化）、寿命の延長、ゲノム安定性の増大、転写サイレンシング、母細胞と娘細胞の間の酸化型タンパク質の分離の制御、または少なくとも１つのサーチュインバイオマーカー（例えばＭＣＰ−１のような、例えば表１に示される遺伝子）の発現レベルの変調が含まれる。サーチュイン阻害剤の代表例には、例えばシルチノールおよびその類似体（例えばＮａｐｐｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４８：８０４５−５４（２００５））、ニコチンアミド（ＮＡＤ＋）ならびにスラミンおよびその類似体が含まれる。その他のサーチュイン阻害化合物は米国特許出願公開第２００５／００９６２５６号、ＰＣＴ公開ＷＯ第２００５／００２５２７号およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳＳ０６／００７７４６号、同第ＰＣＴ／ＵＳ０６／００７７４４号、同第ＰＣＴ／ＵＳ０６／００７７４５号、同第ＰＣＴ／ＵＳ０６／００７７７８号、同第ＰＣＴ／ＵＳ０６／００７６５６号、同第ＰＣＴ／ＵＳ０６／００７６５５号、同第ＰＣＴ／ＵＳ０６／００７７７３号および同第ＰＣＴ／ＵＳ０６／００７７４２号に記載される。
【００５８】
「サーチュイン変調化合物」は、サーチュインタンパク質の機能的特性または生物学的活性を上方調節する（例えば活性化または刺激する）、下方調節する（例えば阻害または抑制する）か、あるいは、変化させるかのいずれかをできる化合物を指す。サーチュイン変調化合物は直接的または間接的のいずれかでサーチュインタンパク質を変調するように作用できる。特定の実施態様では、サーチュイン変調化合物はサーチュイン活性化化合物またはサーチュイン阻害化合物でよい。
【００５９】
２．診断および治療方法
本明細書では、サーチュインバイオマーカーならびに例えば診断適用、治療的モニタリング適用および薬物スクリーニングアッセイを含む多岐にわたる適用に関するサーチュインバイオマーカーを使用する方法が提供される。本明細書に記載される方法は、生物学的試料中の１つ以上のサーチュインバイオマーカーのレベルを決定することを伴う。かかるバイオマーカーは、生物学的試料または生物学的試料が得られた対象におけるサーチュイン活性の指標である。特定の実施態様では、その方法は生物学的試料中の１つのサーチュインバイオマーカーのレベルを決定することを伴うことができる。その他の実施態様では、その方法は例えば試料中の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０もしくは１００以上のサーチュインバイオマーカーのレベルのような、試料中の２つまたはそれより多いサーチュインバイオマーカーのレベルを決定することを伴うことができる。
【００６０】
サーチュインバイオマーカーは、サーチュイン活性のレベルに依存する発現レベルを有するため、、サーチュイン活性の指標として提供できる遺伝子である。サーチュインバイオマーカーの発現レベルは、ｍＲＮＡ発現レベルおよび／またはタンパク質発現レベルでよい。代表的なサーチュインバイオマーカーを本明細書にて表１（図１）で提供する。
【００６１】
特定の実施態様では、本明細書に記載される方法は、生物学的試料中の表１（図１）で示される１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルの検出を伴う。代表的な実施態様では、本明細書に記載される方法は、１つ以上の以下のサーチュインバイオマーカーの発現レベルの検出を伴う：ＭＣＰ−１、ＢＭＰ受容体１Ａ、Ｓｍｐｄｌ３ａ、ＣＤ１４、ＡｐｏＥ、ＦＡＳ、トランスサイレチン、ＦＡＢＰ１（肝臓）、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ２、アクアポリン４、Ｒｒａｄ、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ８、Ｐｐｐ１ｒ３ｇ、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＢまたはＦＧＦ２１。特定の実施態様では、本明細書に記載される方法は、ＭＣＰ−１の発現レベルの検出を伴う。特定の実施態様では、本明細書に記載される方法は、ＦＧＦ２１の発現レベルの検出を伴う。
【００６２】
特定の実施態様では、サーチュインモジュレーターでの処置から利益を享受する個体を同定するための方法が提供される。その方法は、例えば対照と比較して該対象から生物学的試料中の少なくとも１つのサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定し、それによりサーチュイン変調化合物での処置から利益を享受する対象を同定することを伴うことができる。代表的なサーチュインバイオマーカーをサーチュイン活性化化合物での処置時に観察される発現における変化の型と共に表１（図１）にて示す。例えば、ＭＣＰ−１発現は、サーチュイン活性において増大を示すサーチュイン活性化化合物での処置時に低下する。したがって、対照と比較してＭＣＰ−１発現レベルが増大した対象は、サーチュイン活性化化合物での処置から利益を享受する、サーチュイン活性が正常レベルよりも低い対象であり得る。同様に、対照と比較してＭＣＰ−１発現レベルが低下した対象は、サーチュイン阻害化合物での処置から利益を享受する、サーチュイン活性が正常レベルよりも高い対象であり得る。加えて、正常レベルのＭＣＰ−１発現レベルもまたサーチュイン変調化合物での処置から利益を享受する対象の指標でもあり得る。特に、サーチュイン変調は、さらに本明細書にて記載されるような種々の疾患および障害を処置するために有利であることが示されている。したがって、例えば、正常レベルのサーチュイン活性を有する対象がそれでもなおサーチュイン活性の増大または低下から利益を享受し得る。
【００６３】
サーチュイン変調化合物での処置から利益を享受する対象を同定するために、１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルの決定に基づくサーチュイン活性のレベルを場合によっては、サーチュイン媒介疾患または障害に関する１つ以上のその他の指標と組み合わせることができる。例えば、正常から高レベルのＭＣＰ−１発現（例えば正常から低レベルのサーチュイン活性）を有し、体重過多であるかまたは糖耐性不全である対象は、サーチュイン活性化化合物での処置から利益を享受する対象の指標であり得る。同様に、正常から低レベルのＭＣＰ−１発現（例えば正常から高レベルのサーチュイン活性）を有し、体重過少または食欲不振である対象は、サーチュイン阻害化合物での処置から利益を享受する対象の指標である。
【００６４】
ＭＣＰ−１は、単なる一例として用いられているに過ぎず、本明細書に記載される方法は、ＭＣＰ−１に限定されないことを理解すべきである。むしろ表１にて提供されるいずれかのサーチュインバイオマーカーを類似の様式で使用できる。例えば、Ａｌｋ３はサーチュイン活性化因子での処置時にヒト白血球において上方調節される。したがって、正常から低レベルのＡｌｋ３を有するヒト対象は、サーチュイン活性化化合物での処置から利益を享受し得る対象を表すが、正常から高レベルのＡｌｋ３を有するヒト対象は、サーチュイン阻害化合物での処置から利益を享受し得る対象を表す。
【００６５】
特定の実施態様では、サーチュイン媒介疾患または障害を患っているか、またそれを発症する危険性のある個体を同定するための方法が提供される。例えば、その方法は対照と比較して、表１（図１）に示される１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定し、それによりサーチュイン媒介疾患または障害を患っているか、またそれを発症する危険性のある対象を同定することを伴う。前記された方法に類似して、サーチュインバイオマーカーの発現レベルが増大または低下した対象は、改変されたレベルのサーチュイン活性を有するため、サーチュイン媒介疾患または障害を患っているか、またそれを発症する危険性のある対象の指標である。例えば、ＭＣＰ−１発現のレベルが増大した対象は、例えば種々の神経変性疾患または糖尿病のような正常レベルよりも低いサーチュイン活性に関連するサーチュイン媒介疾患または障害を患っているか、またそれを発症する危険性のある対象の指標であり得る。これに代えて、ＭＣＰ−１発現のレベルが低下した対象は、例えば、癌または食欲低下のような正常レベルよりも高いサーチュイン活性に関連する疾患または障害を患っている対象の指標である。かかる方法は場合によっては、体重、糖耐性、認知能力等のようなサーチュイン媒介疾患または障害のその他の指標の考慮を伴うことができる。サーチュインバイオマーカーを用いるサーチュイン媒介疾患の同定および予後診断により早期の診断および適切な予防医療を導くことができる。
【００６６】
特定の実施態様では、本明細書に記載される診断および予後診断方法はさらに治療的処置を対象に投与することを含むことができる。例えば１つ以上のサーチュインバイオマーカーのレベルを用いて、サーチュイン媒介疾患または障害を患っているかまたそれを発症する危険性のある対象を同定することができる。（複数の）サーチュインバイオマーカーから得られた情報を用いて、対象がサーチュイン変調化合物、例えばサーチュイン活性化化合物またはサーチュイン阻害化合物での処置から利益を享受するでかどうかを決定することができる。次いで適切なサーチュインモジュレーターでの治療計画を選択し、適切な投与スケジュールを用いて対象に投与することができる。かかるサーチュイン変調治療を場合によっては、対象がかかりやすいか、または患っている疾患または障害の少なくとも１つの病徴を処置するかまたは軽減する別の治療薬と組み合わせて投与することができる。サーチュインバイオマーカープロフィールを用いて治療計画、例えばサーチュインモジュレーターの選択および／または投与計画の設計を補助することができる。例えば対照と比較して改変された発現レベルを有する（複数の）サーチュインバイオマーカーの数および／または同一性、（複数の）発現レベルの変化の規模等を適切なサーチュイン変調化合物の選択容易にするために、および／または治療薬の用量および投与の頻度の決定において使用することができる。例えばＭＣＰ−１発現レベルが正常よりも有意に高い対象は、ＭＣＰ−１発現レベルが正常よりもわずかしか高くない個体よりもより高用量またはより頻繁な投与スケジュールを必要とし得る。
【００６７】
特定の実施態様では、本明細書に記載される方法は、対象におけるサーチュイン変調を検出またはモニタリングするために、１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルを測定することを伴うことができる。対照と比較して、サーチュインバイオマーカー（例えば表１（図１）に示される１つ以上のサーチュインバイオマーカー）の発現レベルの変化は、その対象におけるサーチュイン変調を示す。特定の実施態様では、対照と比較して、ＭＣＰ−１の発現レベルにおける低下は、サーチュイン活性化を示す。
【００６８】
別の実施態様では、サーチュインバイオマーカーの発現レベルを測定することは、サーチュイン変調化合物での治療的処置をモニタリングするのに有用であり得る。例えば、サーチュイン治療薬での処置の経過中に、個体の生物学的試料からの１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルを１つ以上の時点で決定することができる。サーチュインモジュレーターでの処置時の、サーチュインバイオマーカーの発現レベルの変化は、個体がその処置に応答することを示す。代表的な実施態様では、サーチュイン活性化因子の投与は、結果的にＭＣＰ−１の発現レベルにおける低下に至り得る。
【００６９】
サーチュインバイオマーカーでの処置の経過中のサーチュイン活性のモニタリングは、治療用化合物の用量または投与スケジュールの調整にも有用であり得る。特定の実施態様では、対象にサーチュイン治療薬を経時的に、例えば少なくとも１日１回、週１回、月１回等、少なくとも１週間、２週間、１か月、２か月、６か月、１年または長期間投与する。処置の経過中に１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルを定期的にまたは散発的にモニタリングすることができ、例えばサーチュインバイオマーカー発現レベルを毎日、毎週、隔週、毎月、もしくは隔月に、または６か月毎に１回、または１年に１回測定することができる。サーチュインバイオマーカー発現レベルモニタリングの頻度は時間によって異なってよく、例えば最適な処置計画（投薬量および／または投与の頻度を含む）が決定された後、モニタリングの頻度を減らすことができる。代表的な実施態様では、本明細書に記載される方法は、最適な投薬計画が決定されるまで少なくとも１日１回または少なくとも週１回１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルをモニタリングすることを伴うことができる。その後、１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルのモニタリングを週１回だけ、または毎月１回だけまで低減させる。
【００７０】
特定の実施態様では、サーチュイン変調化合物で処置されている対象は、１つ以上の種々のサーチュイン媒介疾患または障害を患っていてよい。例えば、サーチュイン活性化化合物で処置されている対象は、例えば、加齢もしくはストレス、糖尿病、肥満、神経変性疾患、化学療法誘発性ニューロパチー、虚血イベントに関連するニューロパチー、眼疾患もしくは障害、心血管疾患、血液凝固障害、炎症、または潮紅に関係する疾患または障害のようなサーチュイン活性のレベルにおける増大から利益を享受する疾患または障害を患っていてよい。サーチュイン阻害化合物で処置されている対象は、例えば癌または食欲刺激もしくは体重増加の必要のある個体のようなサーチュイン活性における低下から利益を享受する疾患または障害を患っている可能性がある。
【００７１】
対象からの生物学的試料中のサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定することができる。代表的な生物学的試料には、血液、尿、血清、唾液、細胞、組織および／または毛髪を含む試料が含まれる。標準的な技術を用いて対象から試料を入手することができる。好ましくは、組織試料等を入手するために針生検のような最小限の侵襲的、非外科的手順を用いて生物学的試料を入手する。種々の実施態様では、生物学的試料を健常な個体、サーチュイン変調から利益を享受する疾患もしくは障害を患っている個体、またはサーチュイン変調化合物で処置されている対象等から採取することができる。特定の実施態様では、対象は、例えばヒトを含む哺乳動物でよい。その他の実施態様では、対象は例えば加齢もしくはストレス、糖尿病、肥満、神経変性疾患、化学療法誘発性ニューロパチー、虚血イベントに関連するニューロパチー、眼疾患もしくは障害、心血管疾患、血液凝固障害、炎症、潮紅または癌の動物モデル、または体重増加もしくは食欲刺激を研究するための動物モデルを含む動物モデルでよい。適当な動物モデルは本明細書に記載されるかまたは当該分野において公知である。
【００７２】
特定の実施態様では、対象からの生物学的試料中の１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルを対照と比較することが有用であり得る。対照は定量的形態（例えば数、比率、パーセンテージ、グラフ等）または定性的形態（例えばゲルまたはブロット上のバンド強度等）の１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルの測定値でよい。種々の対照を用いることができる。例えば、サーチュインモジュレーターで処置されていない個体からの１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルを用いることができる。健常な個体、例えば、サーチュイン変調化合物で処置されている個体に存在する疾患または障害を患っていない個体からの１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルを対照として用いることもできる。これに代えて、対照は、サーチュインモジュレーターでの処置の前の時点の、またはサーチュインモジュレーターでの処置の経過中の初期の期間の処置されている個体からの１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルでよい。なお、その他の対照には、データベース（例えば表、電子データベース、スプレッドシート等）に存在する発現レベルが含まれ得る。
【００７３】
３．サーチュインバイオマーカー発現レベルの決定
サーチュインバイオマーカーの発現レベルをバイオマーカーのｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、活性レベルまたはバイオマーカーの遺伝子もしくはタンパク質発現データに反映されるか、もしくは導き出せるその他の量により測定することができる。各々のサーチュインバイオマーカーの発現生成物にはＲＮＡおよびタンパク質の双方が含まれる。サーチュインバイオマーカーのＲＮＡ生成物はサーチュインバイオマーカーの転写生成物であり、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの１つ以上のスプライシング変異体の集団を含む。サーチュインバイオマーカーのタンパク質生成物を本明細書に記載される方法にしたがって測定することもできる。サーチュインバイオマーカーのタンパク質生成物には、例えばタンパク質、スプライシングされたｍＲＮＡ変異体から生じるタンパク質変異体、および翻訳後修飾されたタンパク質が含まれる。
【００７４】
サーチュインバイオマーカーのＲＮＡ生成物の発現を測定する任意の適当な手段を本明細書に記載される方法にしたがって用いることができる。例えばその方法は例えばオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ生成物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡまたは、サーチュインバイオマーカーの１つ以上のＲＮＡ生成物に特異的にハイブリダイズする天然発生の修飾されたヌクレオチドのその他の組み合わせを含む、サーチュインバイオマーカーの１つ以上のＲＮＡ生成物に特異的にハイブリダイズする種々のポリヌクレオチドを利用することができる。かかるポリヌクレオチドを、例えばアレイハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ヌクレアーゼ保護およびノーザンブロットを含む本明細書でさらに記載されるＲＮＡ発現を測定するための方法と組み合わせて用いることができる。
【００７５】
アレイハイブリダイゼーション
１つの実施態様では、ＲＮＡ発現のレベルを評価するためにアレイハイブリダイゼーションを用いてサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定することができる。アレイハイブリダイゼーションは、サーチュインバイオマーカー発現生成物とハイブリダイズできる、支持体に安定して随伴される核酸メンバーを利用する。アレイに結合した核酸メンバーの長さは、８〜１０００ヌクレオチド長にわたってよく、サーチュインバイオマーカーのＲＮＡ生成物に特異的になるように選択される。アレイは、例えば、表１（図１）に示される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、５０、１００もしくは全てのサーチュインバイオマーカーのＲＮＡ生成物、またはその変異体（例えばスプライシング変異体）に特異的である１つ以上の核酸メンバーを含むことができる。核酸メンバーは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖でよいか、および／またはｃＤＮＡから増幅されるオリゴヌクレオチドもしくはＰＣＲフラグメントでよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、およそ１０−１００、１０−５０、２０−５０または２０−３０ヌクレオチド長である。サーチュインバイオマーカーの発現された領域の部分をアレイ上でプローブとして利用することができる。さらに、特にサーチュインバイオマーカー遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドおよび／またはサーチュインバイオマーカー遺伝子から誘導されるｃＤＮＡが有用である。オリゴヌクレオチド基盤のアレイに関してプローブとして有用である目的の遺伝子に相当するオリゴヌクレオチドの選択は、当該分野において十分に理解されている。さらに特に標的核酸へのハイブリダイゼーションを許容するであろう領域を選択することは重要である。オリゴヌクレオチドのＴｍ、ＧＣ含量パーセント、二次構造の程度および核酸の長さのような因子は重要な因子である。例えば米国特許第６５５１７８４号を参照のこと。
【００７６】
アレイを構築、特別注文または商業用製造供給元から購入することができる。アレイを構築するための種々の方法が当該分野において周知である。例えば、固体支持体上での、例えば、アレイ様式でのオリゴヌクレオチド合成に適用可能な方法および技術は、例えば、ＷＯ第００／５８５１６号、
【００７７】
【数１】
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ならびにＺｈｏｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：５４０９−５４１７（２００４）に記載されている。
【００７８】
代表的な実施態様では、マスクレスアレイ合成装置（ＭＡＳ）を用いて固体支持体上で構築および／または選択オリゴヌクレオチドを合成することができる。マスクレスアレイ合成装置例えばＰＣＴ出願ＷＯ第９９／４２８１３号において、および対応する米国特許第６３７５９０３号に記載される。アレイを構築するためのその他の方法には、例えばマスクを利用する光指向法（例えばＶＬＳＩＰＳ（商標）法、例えば米国特許第５１４３８５４号、第５５１０２７０号および第５５２７６８１号に記載される）、フローチャネル法（例えば米国特許第５３８４２６１号参照）、スポッティング法（例えば米国特許第５８０７５２２号参照）、ピン基盤の方法（例えば米国特許第５２８８５１４号参照）、および複数の支持体を利用する方法（例えば米国特許第５７７０３５８号、同第５６３９６０３号および同第５５４１０６１号参照）が含まれる。
【００７９】
特定の実施態様では、アレイ上の独特な位置で１つ以上の相補的核酸メンバーが標的核酸に特異的にハイブリダイズする相補的核酸メンバー／標的複合体のハイブリダイゼーションパターンを生成するのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、支持体の表面に安定して随伴される核酸メンバーのアレイを、標的核酸を含む試料と接触させる。アレイ上の核酸メンバーの位置を参照してハイブリダイズする標的核酸の同一性を決定することができる。
【００８０】
対照核酸メンバーはゲノムＤＮＡ、ハウスキーピング遺伝子、ベクター配列、陰性および陽性対照遺伝子等に相当するオリゴヌクレオチドまたは核酸を含む核酸メンバーを含むアレイ上に存在し得る。対照核酸メンバーは、その機能が目的の特定の遺伝子が発現されるかどうかを見分けるためではなく、むしろ発現のバックグラウンドまたは基礎レベルのようなその他の有用な情報を提供するためである較正または対照遺伝子である。
【００８１】
アレイ上のその他の対照核酸を標的発現対照核酸およびミスマッチ対照ヌクレオチドとして使用して、プローブが指向する標的以外の試料中の核酸に対する非特異的結合または交差ハイブリダイゼーションをモニタリングする。故に、ミスマッチプローブは、ハイブリダイゼーションが特異的であるかどうかを示す。例えば、標的が存在する場合、完全に対応するプローブは、ミスマッチプローブよりも一貫してより明るいはずである。加えて、全ての対照ミスマッチが存在する場合、ミスマッチプローブを用いて変異を検出する。
【００８２】
本明細書にて提供されるアレイは、アレイを用いるアッセイ条件下、特にハイスループット取り扱い条件下で物理的な支持体を提供し、そこに存在する関連する核酸を構造化するのに十分な基質を含むことができる。
【００８３】
基質は粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、管、球、ビーズ、容器、毛細管、パッド、切片、フィルム、プレート、スライド、チップ等として存在する生物学的、非生物学的、有機、無機またはこれらのうちのいずれかの組み合わせでよい。基質は、円盤状、正方形、球形、円形等のような任意の都合のよい形状を有し得る。基質は、好ましくは平坦または平面であるが、種々の代替の表面立体配置をとり得る。基質は、重合ラングミュアーブロジェット膜、機能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳＩＮ４、修飾シリコンまたはガラス、または（ポリ）テトラフルオロエチレン、二フッ化（ポリ）ビニリデン、ポリスチレン、ポリカーボネートまたはその組み合わせのような多岐にわたるゲルもしくは重合体のいずれか１つでよい。その他の、基質材料は本開示を鑑みて当業者に容易に明白になろう。
【００８４】
特定の実施態様では、標的核酸試料は、生物学的試料から単離された全ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに相当する核酸試料（例えばｃＤＮＡ）を含むことができる。例えば酸グアニジン−フェノール−クロロホルム抽出法を用いて全ｍＲＮＡを所定の試料から単離でき、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィーを用いて、または（ｄＴ）ｎ磁性ビーズを用いてポリＡ＋ｍＲＮＡを単離することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９８７）参照）。特定の実施態様では、ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５５９６）を用いて全ＲＮＡを抽出することができる。２６０／２８０ｎｍでの吸光度およびアガロースゲル電気泳動、続く紫外線下での検査によりＲＮＡの純度および完全性を評価することができる。
【００８５】
特定の実施態様では、ハイブリダイゼーションの前に標的核酸試料を増幅することが望ましい場合もある。定量的な結果が望ましい場合、どのような増幅方法を用いても、増幅された核酸の相対頻度を維持するかまたは制御する方法を使用するために注意を払わなければならないことは当業者には理解されよう。定量的増幅の方法は、当業者に周知である。例えば、定量ＰＣＲは同一プライマーを用いる公知の量の制御配列を同時に同時増幅することを伴う。これはＰＣＲ反応を較正するために用いることができる内部標準を提供する。次いで高密度アレイは増幅された核酸の定量に関する内部標準に特異的なプローブを含むことができる。定量ＰＣＲに関する詳細なプロトコールは、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓら、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州（１９９０）にて提供される。
【００８６】
特定の実施態様では、逆転写酵素ならびにオリゴｄＴおよびファージＴ７プロモーターをコードする配列からなるプライマーを用いて標的核酸試料ｍＲＮＡを逆転写して一本鎖ＤＮＡ鋳型を提供する。ＤＮＡポリメラーゼを用いて第２のＤＮＡ鎖を重合化する。二本鎖ｃＤＮＡの合成の後、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを添加し、ＲＮＡをｃＤＮＡ鋳型から転写する。各一本鎖ｃＤＮＡ鋳型からの転写の連続ラウンドの結果、ＲＮＡ増幅に至る。インビトロ転写の方法は、当業者に周知であり（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、前出参照）、この特定の方法はＶａｎ  Ｇｅｌｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１６６３−１６６７（１９９０）にて詳細に記載され、この方法によるインビトロ増幅は種々のＲＮＡ転写物の相対頻度を維持することが実証される。さらにＥｂｅｒｗｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３０１０−３０１４により、生物学的試料が限定される場合でさえ、発現モニタリングを許容する、元来の出発材料の１０６倍大きい増幅を達成するためにインビトロ転写を介する２ラウンドの増幅を用いるプロトコールが提供される。
【００８７】
本明細書に記載される方法による使用に適当な検出可能な標識には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物が含まれる。有用な標識には、標識ストレプトアビジン抱合体で染色するためのビオチン、磁性ビーズ（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えばフルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、放射標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいて一般的に用いられるその他のもの）、および金コロイドまたは着色ガラスもしくはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズのような比色標識が含まれる。かかる標識の使用を教示する特許には、米国特許第３８１７８３７号；同第３８５０７５２号；同第３９３９３５０号；同第３９９６３４５号；同第４２７７４３７号；同第４２７５１４９号；および同第４３６６２４１号が含まれる。
【００８８】
かかる標識を検出する手段は、当業者に周知である。故に、例えば写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて放射標識を検出することができ、放射光を検出する光検出器を用いて蛍光マーカーを検出することができる。酵素標識は、典型的には酵素を基質と共に提供し、基質上の酵素の作用により生成される反応生成物を検出することにより検出され、比色標識は着色された標識を単に可視化することにより検出される。
【００８９】
当業者に周知である多くの手段のいずれかにより標識を組み込むことができる。例えば、標識を試料核酸の調製における増幅工程の間に標識を同時に組み込むことができる。故に、例えば、標識プライマーまたは標識ヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により標識増幅生成物が提供されるであろう。加えて、前記されたような標識ヌクレオチド（例えばフルオレセイン標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を用いる転写増幅は、転写された核酸に標識を組み込む。
【００９０】
これに代えて、元来の核酸試料（例えばｍＲＮＡ、ポリＡ  ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）に、または増幅が完了した後、増幅生成物に直接標識を加えることができる。標識を核酸に結合させる手段は、当業者に周知であり、例えば、ニックトランスレーションまたは、核酸のキナーゼ処理、および続いて試料核酸を標識（例えばフルオロフォア）に連結する核酸リンカーの結合（ライゲーション）による末端標識（例えば標識ＲＮＡを用いる）が含まれる。
【００９１】
特定の実施態様では、蛍光修飾は、シアニン色素、例えばＣｙ−３／Ｃｙ−５  ｄＵＴＰ、Ｃｙ−３／Ｃｙ−５  ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）またはアレクサ色素（Ｋｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：５００９−５０１３（１９９８））による。
【００９２】
特定の実施態様では、例えば、対象（例えばサーチュイン変調化合物で処置されている対象、またはサーチュイン媒介疾患または障害の危険性があると疑われるか、もしくはそれを患っている対象等）からの標的核酸試料および対照核酸試料（例えばサーチュイン変調化合物で処置されていない対象または健常個体からの核酸試料等）を含む２つの標的核酸試料をアレイに同時にハイブリダイズすることが望ましい場合もある。比較に用いられる２つの標的試料を、区別可能な検出シグナルを生成する異なる蛍光色素で標識し、例えば、対照試料からの標的をＣｙ５で標識し、モニタリングまたは診断されるべき対象からの標的をＣｙ３で標識する。異なって標識された標的試料を同一のマイクロアレイに同時にハイブリダイズする。当該分野において公知の方法を用いて、例えば、エタノール精製またはカラム精製により、標識された標的を精製することができる。
【００９３】
特定の実施態様では、標的核酸試料は、マイクロアレイ上で対照プローブにハイブリダイズしてマイクロアレイから作成されるシグナルを正規化する１つ以上の対照分子を含むであろう。標識された正規化標的は、例えば、前記されたようなマイクロアレイにスポットされる対照オリゴヌクレオチドに完全に相補的である核酸配列でよい。ハイブリダイゼーションの後に正規化対照から得られたシグナルにより、ハイブリダイゼーション条件、標識強度、読み取り効率、および完全なハイブリダイゼーションのシグナルをアレイ間で変動させ得るその他の因子における変動に関する対照が提供される。アレイにおける全てのその他のプローブから読み取られるシグナル（例えば蛍光強度）を対照プローブからのシグナル（例えば蛍光強度）で除してそれにより測定値を正規化することができる。
【００９４】
試料中に存在するその他の標的の平均の長さを反映するように、正規化標的を選択できるか、または様々な長さに及ぶようにそれらを選択できる。また、アレイのその他のプローブの（平均の）塩基組成を反映するように（複数の）正規化対照を選択することができる。特定の実施態様では、１つのみ、またはいくつかの正規化プローブを使用し、それらが十分にハイブリダイズし（すなわち二次構造を有さず、自己ハイブリダイズしない）、いずれの標的分子にも対応しないようにそれらを選択する。正規化プローブをアレイの任意の位置で、またはアレイ全体の複数の位置で局在させて、ハイブリダイゼーション効率における空間的変動に関して制御することができる。例えば、正規化対照をアレイの隅、縁および中央に配置することができる。
【００９５】
アレイに対する核酸ハイブリダイゼーションは、プローブまたは標的核酸メンバーおよびその相補的標的が相補的塩基対形成を介して安定したハイブリッド二重鎖を形成することができる条件下で、アレイ上の変性プローブまたは標的核酸メンバーおよび標的核酸試料をインキュベートすることを伴う。次いで、ハイブリッド二重鎖を形成しない核酸を洗い流して、典型的には結合した検出可能な標識の検出により検出されるべきハイブリダイズされた核酸を残す。温度を上げるか、または核酸を含有するバッファーの塩濃度を低下させることにより核酸を変性させることは一般的に認識される。低ストリンジェント条件下（例えば低温および／または高塩）では、アニーリングされた配列が完全に相補的ではない場合でさえもハイブリッド二重鎖（例えばＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡまたはＲＮＡ：ＤＮＡ）を形成するであろう。故に、ハイブリダイゼーションの特異性は低ストリンジェンシーで低減される。反対に高ストリンジェンシー（例えば高温および／または低塩）では、成功したハイブリダイゼーションはミスマッチをほとんど必要としない。ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は当業者に周知である（例えばＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４巻：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク州（１９９３）参照）。
【００９６】
ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズされない標識または未標識核酸は、洗浄により支持体表面から除去され、それにより基質表面上でハイブリダイズされた標的核酸のパターンを作成する。種々の洗浄溶液が当業者に公知であり、使用され得る。標的核酸試料の特定の標識に基づいて選択されている特定の検出の様式で、標識され、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドおよび／または核酸の得られたハイブリダイゼーションパターンを種々の方式で可視化または検出することができ、ここで代表的な検出手段にはシンチレーションカウンティング、オートラジオグラフィー、蛍光測定、熱量測定、発光測定等が含まれる。
【００９７】
ハイブリダイゼーション、洗浄工程および／またはその後の処理に続いて、得られたハイブリダイゼーションパターンを検出する。ハイブリダイゼーションパターンの検出または可視化において、標識の強度またはシグナル値は検出されるのみならず、定量され、例えばハイブリダイズされたアレイ上の各スポットからのシグナルを測定し、公知の数の末端標識された標的核酸により放出されるシグナルに相当する単位値と比較して、ハイブリダイゼーションパターンにおけるアレイ上の特定のスポットにハイブリダイズする各末端標識された標的のコピー数の計数値または絶対値を得る。
【００９８】
アレイハイブリダイゼーションから収集されたデータを分析するための方法は、当該分野において周知である。例えば、ハイブリダイゼーションの検出が蛍光標識を伴う場合、データ分析には収集されたデータからの基質位置の関数として蛍光強度を決定し、異常値、すなわち予め決定された統計分布から逸脱するデータを除去し、残りのデータからの被験核酸の相対結合親和性を計算する工程が含まれ得る。得られたデータを、関連するオリゴヌクレオチドおよび／または核酸と被験核酸との間の結合親和性にしたがって変動する各領域における強度を伴う画像として表示する。
【００９９】
ＲＴ−ＰＣＲ
特定の実施態様では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせた逆転写（ＲＴ）を用いて、試料からのバイオマーカーのＲＮＡ生成物を増幅することにより、サーチュインバイオマーカーのＲＮＡ生成物の発現のレベルを測定することができる。特定の実施態様では、当業者に理解されるようにＲＴは定量的でよい。
【０１００】
試料からの全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型として使用し、サーチュインバイオマーカーの転写された部分に特異的なプライマーを使用して逆転写を開始する。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、前出）に記載される。市販により入手可能であるソフトウェア（例えばＰｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  １．０、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ等）または標準的であり、当該分野において周知である方法を利用してプライマー設計を達成することができる。プライマーソフトウェアプログラムを用いてプライマーの設計および選択に役立てることができ、例えば、以下のウェブサイトリンク：ｂｉｏｔｏｏｌｓ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｐｒｉｍｅｒｑｕｅｓｔ／を介して利用可能である、Ｔｈｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアが含まれる。加えて、以下のウェブサイトリンク：１）ＮＣＢＩ  ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ  Ｈｏｍｅｐａｇｅ：ワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ／；および２）Ｅｎｓｅｍｂｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ：ワールドワイドウェブｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓは、バイオマーカープライマー設計において使用するためのヒトゲノムデータベースからの配列情報を検索およびアップデートする場合に有用であり、好ましくは、遺伝子または配列情報、受け入れもしくは配列番号、遺伝子記号、ＲｅｆＳｅｑ番号および／またはユニジーン番号のような関連バイオマーカー情報を用いる。
【０１０１】
本明細書に記載される方法にしたがって使用できるプライマーを設計するための一般的なガイドラインには、以下のものが含まれる：生成物またはアンプリコンの長さは〜１００−１５０塩基でよく、最適Ｔｍは〜６０℃または約５８−６２℃でよく、ＧＣ含量は〜５０％または約４５−５５％でよい。加えて、１つ以上の以下のような特定の配列を避けるのが望ましいことがある：（ｉ）プライマー−二量体形成を低減させるために、同一のプライマーの別の部分もしくは別のプライマーに相補的である各プライマーの３’末端の３つ以上の塩基のストリング；（ｉｉ）別のプライマー配列に相補的であるプライマー内の配列；（ｉｉｉ）３’末端で３つ以上のＧ’  もしくはＣ’の繋がり；（ｉｖ）単一の塩基が３塩基より多く繰り返される；（ｖ）Ｇ／ＣおよびＡ／Ｔリッチドメインの不均衡な分布；ならびに／または（ｖｉ）３’末端でのＴ。
【０１０２】
続いて、逆転写の生成物をＰＣＲの鋳型として使用する。目的の標的配列を増幅するために、熱安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ複製の複数のサイクルを用いることにより、特定の核酸配列を迅速に増幅するための方法がＰＣＲにより提供される。ＰＣＲは、増幅されるべき核酸、増幅されるべき配列をフランキングする２つの一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、バッファーおよび塩の存在を必要とする。ＰＣＲの方法は、当該分野において周知である。ＭｕｌｌｉｓおよびＦａｌｏｏｎａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５（１９８７）に記載されるようにＰＣＲを実施する。
【０１０３】
本質的に定量的であるＱＲＴ−ＰＣＲを実施して、サーチュインバイオマーカー遺伝子発現レベルの定量的測定値を提供することもできる。ＱＲＴ−ＰＣＲでは逆転写およびＰＣＲを２工程で実施できるか、またはＰＣＲと組み合わされた逆転写を同時に実施することができる。Ｔａｑｍａｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、フォスターシティー、カリフォルニア州）のような市販により入手可能であるキットがあるこれらの技術の１つを、転写物特異的アンチセンスプローブを用いて実施する。このプローブは、ＰＣＲ生成物（例えば遺伝子から誘導される核酸フラグメント）に特異的であり、オリゴヌクレオチドの５’末端に複合化されるクエンチャーおよび蛍光レポータープローブを用いて調製される。異なる蛍光マーカーを異なるレポーターに結合させて、１つの反応において２つの生成物を測定することを可能にする。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが活性化される場合、それはその５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により鋳型に結合したプローブの蛍光レポーターを切断する。クエンチャーの不在下では、今度はレポーターが蛍光を発する。レポーターにおける色の変化は各特異的生成物の量に比例し、蛍光光度計により測定される；それ故に各色の量を測定し、ＰＣＲ生成物を定量化する。多くの個体に由来する試料を処理し、同時に測定するようにＰＣＲ反応を９６ウェルプレートで実施する。ゲル電気泳動を必要としないＴａｑｍａｎ系はさらに有利であり、標準曲線と共に用いて定量を可能にする。
【０１０４】
ＰＣＲ生成物を定量的に検出するために有用な第２の技術は、市販により入手可能であるＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カリフォルニア州）のような挿入色素を使用することである。ＰＣＲ段階の間にＰＣＲ生成物に組み込まれる蛍光標識としてＳＹＢＲグリーンを用いてＲＴ−ＰＣＲが実施され、ＰＣＲ生成物の量に比例した蛍光を生成する。加えて、ｍＲＮＡ発現生成物を定量的に測定するために、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ（商標）を含むその他の系が公知である。
【０１０５】
ＲＮＡ発現を定量的に測定するさらなる技術には、限定するものではないがポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、Ｑｂｅｔａレプリカーゼ（例えば国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０号を参照）、等温増幅法（例えばＷａｌｋｅｒら、ＰＮＡＳ  ８９：３８２−３９６（１９９２）参照）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、修復連鎖反応、非対称定量ＰＣＲ（例えば米国特許公開第ＵＳ２００３３０１３４３０７（Ａ１）号）およびＦｕｊａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０８：１９３−２０５（２００４）に記載されるマルチプレックスミクロスフェアビーズアッセイが含まれる。
【０１０６】
核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲを含む転写基盤の増幅系（ＴＡＳ）を用いて試料からＲＮＡを増幅することにより遺伝子発現のレベルを測定することができる。例えば、Ｋｗｏｈら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：１１７３（１９８９）；国際公開ＷＯ第８８／１０３１５号；および米国特許第６３２９１７９号を参照のこと。ＮＡＳＢＡでは、従来のフェノール／クロロホルム抽出、熱変性、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離のための溶解バッファーおよびミニスピンカラムでの処理、またはＲＮＡの塩化グアニジン抽出を用いて増幅するために核酸を調製することができる。これらの増幅技術は、標的特異的配列を有するプライマーをアニーリングすることを伴う。重合化の後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅ  Ｈで消化するが、二本鎖ＤＮＡ分子は再度熱変性する。いずれにしても、重合化に続いて第２の標的特異的プライマーの添加により一本鎖ＤＮＡを完全に二本鎖にする。次いで二本鎖ＤＮＡ分子は、Ｔ７またはＳＰ６のようなポリメラーゼにより複合的に転写される。等温サイクル反応では、ＲＮＡのものを二本鎖ＤＮＡに逆転写し、Ｔ７またはＳＰ６のようなポリメラーゼで１回転写する。得られた生成物は、トランケートされていても完全であっても、標的特異的配列を示す。
【０１０７】
いくつかの技術を用いて、増幅生成物を分離することができる。例えば、従来の方法を用いてアガロース、アガロース−アクリルアミドまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動により増幅生成物を分離することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと。電気泳動せずに、ＰＣＲ生成物を定量的に検出するためのいくつか技術を用いることもできる（例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓら、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州（１９９０）参照）。例えば、クロマトグラフィー技術を用いて分離を行うことができる。用いることができる多くの種類のクロマトグラフィーがある：吸着、分配、イオン交換および分子ふるい、ＨＰＬＣ、ならびにカラム、ペーパー、薄層およびガスクロマトグラフィーを含むそれらを用いるための多くの特殊な技術（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ、Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｗｍ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ニューヨーク、ニューヨーク州、１９８２）。
【０１０８】
目的の核酸配列の増幅を確認するために、増幅生成物を可視化しなければならない。１つの典型的な可視化方法は、臭化エチジウムでのゲルの染色およびＵＶ光下での可視化を伴う。これに代えて、増幅生成物が放射または蛍光分析用に標識されたヌクレオチドで一体的に標識されている場合、次いで増幅生成物をＸ線フィルムに暴露するか、または適切なスペクトル刺激下で可視化し、続いて分離することができる。
【０１０９】
これに代えて、可視化を間接的に達成することができる。増幅生成物の分離に続いて、標識された核酸プローブを目的の増幅された核酸配列と接触させる。プローブは発色団に抱合されるか、放射標識されるか、または抗体もしくはビオチンのような結合パートナーに抱合されてよく、ここで結合対のその他のメンバーは検出可能な部分を担持する。
【０１１０】
加えて、サザンブロッティングおよび標識プローブとのハイブリダイゼーションを用いて検出を実施することができる。サザンブロッティングに関与する技術は、当業者に周知であり、分子プロトコールに関する多くの標準的な書籍において見出され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出を参照のこと。簡単には、増幅生成物をゲル電気泳動により分離する。次いで、ゲルをニトロセルロースのような膜と接触させ、核酸および非共有結合の移動を許容する。その後、膜を標的増幅生成物とハイブリダイズすることが可能である発色団抱合プローブと共にインキュベートする。検出は、膜をＸ腺フィルムまたはイオン放出検出装置に暴露することによる。
【０１１１】
ヌクレアーゼ保護アッセイ
特定の実施態様では、ヌクレアーゼ保護アッセイ（リボヌクレアーゼ保護アッセイおよびＳ１ヌクレアーゼアッセイの双方を含む）を用いてサーチュインバイオマーカーのＲＮＡ生成物を検出および定量することができる。ヌクレアーゼ保護アッセイでは、アンチセンスプローブ（例えば放射標識された、または非同位体標識された）は溶液中でＲＮＡ試料にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションに続いて、一本鎖のハイブリダイズされていないプローブおよびＲＮＡをヌクレアーゼにより分解する。アクリルアミドゲルを用いて、残りの保護されたフラグメントを分離する。典型的には溶液ハイブリダイゼーションは試料ＲＮＡを１００μｇまで収容できるが、ブロットハイブリダイゼーションはＲＮＡ試料を〜２０−３０μｇまでしか収容できない。
【０１１２】
最も一般的な型のヌクレアーゼ保護アッセイであるリボヌクレアーゼ保護アッセイは、ＲＮＡプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドおよびその他の一本鎖ＤＮＡプローブは、Ｓ１ヌクレアーゼを含有するアッセイにおいてのみ使用することができる。一本鎖のアンチセンスプローブは、典型的にはヌクレアーゼによるプローブ：標的ハイブリッドの切断を防御するために標的ＲＮＡに完全に相同でなければならない。
【０１１３】
ノーザンブロット
当業者に公知である従来のノーザンハイブリダイゼーション技術にしたがって標準的なノーザンブロットアッセイを用いてＲＮＡ転写物の大きさを確認し、選択的スプライシングされたＲＮＡ転写物、およびサーチュインバイオマーカーのＲＮＡ生成物の相対量を同定することもできる。ノーザンブロットでは、最初に変性条件下でのアガロースゲルにおける電気泳動を介してＲＮＡ試料を大きさにより分離する。次いで、ＲＮＡを膜に移し、標識プローブで架橋およびハイブリダイズする。ランダムプライミング、ニックトランスレーションまたはＰＣＲ生成されたＤＮＡプローブ、インビトロ転写されたＤＮＡプローブおよびオリゴヌクレオチドを含む非同位体性または高特異活性放射標識されたプローブを使用することができる。加えて、部分的にのみ相同である配列（例えば、異なる種からのｃＤＮＡまたはエクソンを含有し得るゲノムＤＮＡフラグメント）をプローブとして使用することができる。全長、一本鎖ＤＮＡまたはそのＤＮＡ配列のフラグメントのいずれか含有する標識プローブ、例えば放射標識ｃＤＮＡは少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０または少なくとも１００の連続ヌクレオチド長までの任意の長さでよい。当該分野において公知の多くの異なる方法のいずれかによりプローブを標識することができる。これらの研究に最も一般的に用いられる標識は、放射活性エレメント、酵素、紫外光に暴露した場合に蛍光を発する化学物質等である。多くの蛍光材料が公知であり、標識として利用され得る。これらには、限定するものではないがフルオレセイン、ローダミン、オーラミン，テキサスレッド、ＡＭＣＡブルーおよびルシファーイエローが含まれる。特定の検出材料は、ヤギで調製され、イソチオシアナートを介してフルオレセインで抱合された抗ウサギ抗体である。同位体の非限定例には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉおよび１８６Ｒｅが含まれる。酵素標識は、同様に有用であり、現在利用される比色分析、分光光度、蛍光分光光度、電流測定または気体定量技術のいずれかにより検出され得る。カルボジイミド、ジイソシアナート、グルタルアルデヒド等のような架橋分子との反応により酵素を選択されたプローブに抱合させることができる。例えば、ペルオキシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼを含む当業者に公知の任意の酵素を利用することができる。代替の標識材料および方法のその開示に関して、例として米国特許第３６５４０９０号、同第３８５０７５２号および同第４０１６０４３号が参照される。
【０１１４】
タンパク質生成物
任意の当該分野において公知の方法を用いて、バイオマーカーのタンパク質レベルによりサーチュインバイオマーカーの発現レベルを測定することもできる。タンパク質定量に関する伝統的な方法論には、２−Ｄゲル電気泳動、質量分析および抗体結合が含まれる。生物学的試料中のバイオマーカータンパク質レベルを検定するための好ましい方法には、イムノブロッティング（ウェスタンブロッティング）、免疫組織化学的アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはタンパク質チップのような抗体基盤の技術が含まれる。例えば、バイオマーカー特異的モノクローナル抗体を免疫吸着剤として、および酵素標識プローブとしての双方で使用して、バイオマーカーを検出し、定量することができる。直線回帰コンピューターアルゴリズムを用いて標準調製物に存在する量を参照して、試料中に存在するバイオマーカーの量を計算することができる。別の実施態様では、サーチュインバイオマーカーを生物学的試料から（例えば尿もしくは血清から、または細胞のライゼート等から直接的に）バイオマーカーに特異的な抗体を用いて免疫沈殿することができる。次いで、単離されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流し、標準的な手順を用いてブロッティング（例えばニトロセルロースまたはその他の適当な材料に）することができる。次いで、ブロットを抗バイオマーカー特異的抗体でプロービングしてサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定することができる。
【０１１５】
例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｇ．Ｓｕｉｚｄａｋ、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６）ならびにそこで引用されるその他の参考文献に記載されるもののような標準的な技術を用いて、ゲル電気泳動、免疫沈殿および質量分析を実施することができる。
【０１１６】
本明細書で使用される際には、「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）なる用語は、サーチュインバイオマーカーに特異的に結合することが可能であるインタクトな分子および抗体部分（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖ＦｖまたはＦｄのような）を含むことを意味する。
【０１１７】
サーチュインバイオマーカー、例えば、表１に示されるバイオマーカーの単離および検出に適当な抗体を種々の供給源から商業的に購入することができる。例えば、ヒトＭＣＰ−１に特異的な抗体をＡｂｃａｍ  Ｉｎｃ．（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）またはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２１）から購入することができる。標準的な技術を用いて、サーチュインバイオマーカーに特異的な抗体を生成することもできる。一般的に、抗体を生成するのに適用可能な方法は当該分野において周知であり、本明細書に引用される参考文献、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌに広く記載されている。全長ポリペプチド、部分的ポリペプチド、融合タンパク質またはペプチド（免疫原性を強化するために別の部分と抱合させることができる）のいずれかで動物（またはヒト）を免疫することにより抗体を作成できることが留意される。抗体の特異性は、動物を免疫するために用いられる特定の調製物および抗体がポリクローナルであるか、モノクローナルであるかに依存して変動するであろう。一般的には、好ましい抗体は特異的サーチュインバイオマーカーに関して高い親和性、例えば＜２００ｎＭ、および好ましくは＜１００ｎＭのＫｄを有するであろう。
【０１１８】
任意の当該分野において公知の方法を用いて、バイオマーカーの活性レベルによりサーチュインバイオマーカーの発現レベルを測定することができる。例えば、サーチュインバイオマーカーの一例であるＭＣＰ−１はインビトロおよびインビボで単球に関する強力な化学誘引物質である。ＴＵＮＥＬ（Ｎａｋａｚａｗａ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：２４２５−２４３０（２００７））により定量されるように、網膜剥離（ＲＤ）誘起の光受容体アポトーシス率に基づいてＭＣＰ−１活性を決定した。サーチュインバイオマーカーの特定の代表的な活性についてのさらなる情報を以下に提供する。
【０１１９】
単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）
ＭＣＰ−１は、ＣＣケモカインファミリーのメンバーであり、インビトロおよびインビボで単球に関する強力な化学誘引物質である。アテローム性動脈硬化症の病因におけるＭＣＰ−１に関する重要な役割を支持する多くの証拠が存在する。心筋虚血およびうっ血性心不全のようなその他の心血管疾患において、ＭＣＰ−１が重要な病因的役割を果たし得るという証拠も増えつつある。最近では、網膜剥離およびいくつかのその他の視覚障害を有する患者の硝子体液試料中のＭＣＰ−１発現の増大が報告された。ＭＣＰ−１の活性化はまた網膜剥離誘起の光受容体アポトーシスにも関係する。
【０１２０】
骨形態形成タンパク質受容体、ＩＡ型（ＢＭＰ受容体１Ａ）
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）に対する細胞応答は、Ｉ型およびＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体のヘテロオリゴマー複合体の形成により媒介されることが示されている。アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）−３としても公知のＢＭＰ受容体１Ａ（ＢＭＰＲ−１Ａ）は、ＴＧＦ−βファミリーサイトカインのシグナル伝達に必要とされる７つの公知のＩ型セリン／スレオニンキナーゼのうちの１つである。Ｉ型受容体がＩＩ型受容体の不在下ではＴＧＦ−βに結合しないＴＧＦ−β受容体系とは対照的に、ＢＭＰシグナリングに関与するＩ型受容体（ＢＭＰＲ−ＩＡ、ＢＭＰＲ−ＩＢ／ＡＬＫ−６およびＡｃｔＲ−Ｉ／ＡＬＫ−２を含む）はＩＩ型受容体の不在下で種々のＢＭＰファミリータンパク質に独立して結合することができる。組換え可溶性ＢＭＰＲ−ＩＡは、溶液中で高い親和性でＢＭＰ−２および−４に結合し、インビトロで強力なＢＭＰ−２／４アンタゴニストである。ＢＭＰＲ−ＩＡは、胚形成の間に遍在滴に発現される。成体組織では、骨格筋において見出される最高の発現レベルで、ＢＭＰＲ−ＩＡ  ｍＲＮＡもまた広く分布する。ＢＭＰＲ−ＩＡの細胞外ドメインは、その他の哺乳動物ＡＬＫ  Ｉ型受容体キナーゼとアミノ酸配列同一性をほとんど共有しないが、システイン残基は保存される。ヒトおよびマウスＢＭＰＲ−ＩＡは高度に保存され、９８％配列同一性を共有する。
【０１２１】
スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ、酸様３Ａ（Ｓｍｐｄｌ３ａ）
Ｓｍｐｄｌ３ａは、スフィンゴミエリン上で作用するホスホジエステラーゼ酵素である。この酵素の欠損は、ニーマン・ピック病に関連する。Ｓｍｐｄｌ３ａタンパク質は対応する正常な尿路上皮組織に相対して、１２の膀胱腫瘍のうちの８つにおいて差次的に発現されることが見出されている。膀胱腫瘍細胞系の一過性のトランスフェクションにより、ヒト膀胱腫瘍細胞における膀胱癌欠損１（ＤＢＣＣＲ１）過剰発現が結果的にＳｍｐｄｌ３ａ  ＲＮＡおよびタンパク質発現の上方調節に至ることが示された。
【０１２２】
ＣＤ１４抗原
ＣＤ１４は、細胞特にマクロファージの表面で発現される膜結合型グリコシルホスファチジルイノシトール連結タンパク質である。ＣＤ１４は、細胞表面マーカータンパク質の分化群のクラスタにおけるその封入から命名された。ＣＤ１４は、細菌性リポ多糖類の検出のための共受容体（Ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ４およびＭＤ−２と共に）として作用する。ＣＤ１４は、最初に記載されたパターン認識受容体であった。可溶性形態ｓＣＤ１４は、肝臓および単球により分泌され、低濃度で、あるいは、ＣＤ１４を発現しない細胞にＬＰＳ応答性を付与するのに十分である。
【０１２３】
アポリポタンパク質  Ｅ（ＡｐｏＥ）
カイロミクロンの主要なアポタンパク質であるＡｐｏＥは、肝臓細胞および末梢細胞上の特異的受容体に結合する。ＡｐｏＥは、トリグリセリドリッチリポタンパク質構成要素の正常な異化に必須である。ＡｐｏＥは、リポタンパク質代謝および心血管疾患においてその重要性が最初に認識された。さらに最近では、アルツハイマー病、免疫調節および認知を含む、リポタンパク質輸送に直接関係しないいくつかの生物学的過程におけるその役割に関して研究されている。ＡｐｏＥの欠損の結果、家族性異常βリポタンパク質血症またはＩＩＩ型高リポタンパク質血症（ＨＬＰ  ＩＩＩ）に至り、ここで血漿コレステロールおよびトリグリセリドの増大は、カイロミクロン、ＶＬＤＬおよびＬＤＬレムナントのクリアランス不全の結果である。ＡｐｏＥタンパク質は２９９アミノ酸長であり、リポタンパク質、脂溶性ビタミンおよびコレステロールをリンパ系、次に血液に輸送する。それは、主として肝臓において合成されるが、脳、腎臓および脾臓のようなその他の組織においても見出されている。神経系では、非ニューロン細胞型、最も顕著にはアストログリアおよびミクログリアがＡｐｏＥの主要な生成体であるが、ニューロンはＡｐｏＥに関する受容体を選択的に発現する。
【０１２４】
脂肪酸シンテターゼ（ＦＡＳ）
ＦＡＳは、アセチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、すなわちＮＡＤＰＨから長鎖脂肪酸の還元的デノボ合成を可能にする唯一の酵素である。ＦＡＳは、長鎖脂肪酸の合成を触媒するが、ベータ酸化による脂肪酸の分解は、酸化のための脂肪酸のミトコンドリアへの移行に関する律速酵素であるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１により調節される。２つの転写因子、上流刺激因子（ＵＳＦ）およびステロール調節エレメント結合タンパク質−ｌｃ（ＳＲＥＢＰ−ｌｃ）はＦＡＳ転写の調節において優勢な、およびあるいは協同的な役割を果たすようである。セルレニンまたはＣ７５のような合成ＦＡＳ阻害剤を用いるＦＡＳの阻害は食物摂取を低減させ、重大な可逆的な体重減少を誘起する。その後の研究により、Ｃ７５はまたＣＰＴ−１を刺激し、ベータ酸化を増大させることも表される。Ｃ７５およびセルレニンがその効果を媒介するメカニズムに関する仮説が提示されている。中枢的には、これらの化合物は摂食関連神経ペプチドの発現プロフィールを改変し、しばしば食欲促進ペプチドの発現を阻害する。中枢媒介によっても、末梢メカニズムによっても、Ｃ７５はまたエネルギー消費を増大させ、それは体重減少に寄与する。インビトロおよびインビボ研究により、Ｃ７５の効果の少なくとも一部は公知の末梢エネルギーセンシングキナーゼであるＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）の変調により媒介されることが実証される。まとめると、これらのデータは、エネルギー収支の知覚および調節における脂肪酸代謝に関する役割を示唆する。加えて、ＦＡＳはほとんど全ての非悪性成体組織において極めて低いが、多くの型の癌ではそれは有意に上方調節されるかまたは活性化され、癌治療のための興味深い標的となっている。
【０１２５】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）
トランスサイレチンは、甲状腺ホルモンチロキシン（Ｔ４）の血清および脳脊髄液キャリアである。それは、２つのその他の甲状腺ホルモン結合タンパク質、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）およびアルブミンと呼応して機能する。トランスサイレチンは肝臓、脈絡叢および網膜色素上皮で合成される二量体立体配置の二量体を伴う５５ｋＤａのホモ四量体である。各単量体は、βシート構造に富む１２７残基ポリペプチドである。２つの単量体の会合は、広げられたβサンドイッチを形成する。別の同一の単量体のセットのさらなる会合により、ホモ四量体構造が生成される。四量体あたりの２つのチロキシン結合部位は、後者の二量体のセットの間の接触面にある。トランスサイレチンはアミロイド疾患老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、家族性アミロイド多発ニューロパチー（ＦＡＰ）および家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）に関連することが分かっている。多くの天然生成物（例えばレスベラトロール）、薬物（ジフルニサル、フルフェナム酸）および毒素ＰＣＢを含む非常に多くのその他の小型分子が、チロキシン結合部位で結合することが分かっている。
【０１２６】
脂肪酸結合タンパク質１、肝臓（ＦＡＢＰ１）
肝臓脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ１）は、肝細胞細胞質に非常に豊富に見出されるが、特異的なリガンド依存的様式で肝細胞核にも随伴される。それは、脂肪酸の細胞取り込み、輸送および代謝を促進し、遺伝子発現および細胞分化の調節に関与する。ＦＡＢＰ１は、２つの短い逆平行らせんによりゲート開閉される脂質結合腔を付与する１０本鎖のβクラム構造を有する細胞内脂質結合タンパク質のファミリーに属する；しかしながらＦＡＢＰ１は、リガンドポケットが異常に大きいため、２つの均等モル濃度の長鎖脂肪酸およびまたヘムのような大きなリガンドの結合を可能にする点でこのファミリーでは独特である。ＦＡＢＰ１結合およびペルオキシソーム増殖剤、特にロイコトリエンＤ４アンタゴニストの輸送は抗炎症性喘息治療の副作用に関わる。
【０１２７】
アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１（Ａｃｏｔ１）およびアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ２（Ａｃｏｔ２）
脂質代謝における不均衡は、ヒトの健康において重篤な結果を有するので、遊離脂肪酸および、遊離脂肪酸の活性化形態であるアシル−ＣｏＡの細胞レベルの維持は極めて重要である。アシル−コエンザイムＡ（ＣｏＡ）チオエステラーゼ（Ａｃｏｔ）はアシル−ＣｏＡを遊離脂肪酸およびＣｏＡＳＨに加水分解し、それによりこれらの化合物の細胞内レベルを調節する潜在能力を有する。マウスおよびヒトの双方のＡｃｏｔ遺伝子クラスタが特徴付けされており、その各々が、ＡＣＯＴ１（細胞質内）、ＡＣＯＴ２（ミトコンドリア内）およびＡＣＯＴ３−６（ペルオキシソーム内）をコードする遺伝子複製を含む。
【０１２８】
アクアポリン４
アクアポリンは、膜内在性タンパク質のクラスであるか、またはさらに一般的には生物学的細胞の膜においてポアを形成する主要な内因性タンパク質（ＭＩＰ）のクラスとして称される。アクアポリンは、水分子を選択的に内外に導くが、イオンおよびその他の溶質の通過を防御する。アクアポリンは、哺乳動物では一般的に４つ（典型的には）の同一のサブユニットタンパク質から構成され、その各々の単量体は水チャネルとして作用する。アクアポリン遺伝子を伴う遺伝的欠損は、いくつかのヒト疾患に関連している。アクアポリン１は、広く発現される水チャネルである。アクアポリン２は、腎臓の集合管主細胞の頂端細胞膜において、および細胞全体に位置する細胞内小胞において見出される。アクアポリン３および４は、集合管主細胞の基底細胞膜において見出され、これらの細胞を出る水のための経路を提供する。腎臓では、アクアポリン４が構成的に発現される。アクアポリン４は、星状細胞において発現され、中枢神経系に直接的に侵襲することにより上方調節される。アクアポリン７は、脂肪細胞において発現されるグリセロールチャネルであり、脂肪分解において役割を果たすと報告された。
【０１２９】
糖尿病に関連するＲａｓ関連（Ｒｒａｄ）
Ｒｒａｄは、２９−ｋＤタンパク質およびＲａｓグアノシン三リン酸スーパーファミリーのメンバーである。ＲｒａｄのメッセンジャーＲＮＡは、主に骨格および心筋において発現され、正常個体と比較してＩＩ型糖尿病の筋肉において平均８．６倍増大する。骨格筋におけるＲｒａｄ  ｍＲＮＡのレベル上昇は、ヒト糖尿病患者におけるインスリン抵抗性に関連すると報告しているものもある。
【０１３０】
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９（ＣＸＣＬ９）
ＣＸＣＬ９は、ガンマインターフェロンにより誘導されるモノカイン（ＭＩＧ）としても公知であるＣＸＣケモカインファミリーに属する小型サイトカインである。ＣＸＣＬ９は、ＩＦＮ−γにより誘導されるＴ細胞化学誘引物質である。それは、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１と称される２つのその他のＣＸＣケモカインに密接に関係し、その遺伝子は、ヒト第４染色体上のＣＸＣＬ９に関する遺伝子の近くに位置する。ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１は、全てケモカイン受容体ＣＸＣＲ３と相互作用することによりその走化性機能を誘発する。
【０１３１】
ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド８（ＣＣＬ８）
ＣＣＬ８は、かつて単球走化性タンパク質−２（ＭＣＰ−２）と称されたＣＣケモカインファミリーに属する小型サイトカインである。ＣＣＬ８タンパク質は、１０９個のアミノ酸を含有する前駆体として生成され、それは切断されて７５個のアミノ酸を含有する成熟ＣＣＬ８を生成する。ＣＣＬ８に関する遺伝子は３個のエクソンによりコードされ、ヒトの第１７ｑ１１．２染色体上のＣＣケモカインの大きなクラスタ内に位置する。ＭＣＰ−２は、肥満細胞、好酸球および好塩基球（アレルギー応答に関係する）ならびに炎症応答に関与する単球、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む多くの様々な免疫細胞に関して走化性であり、それらを活性化する。ＣＣＬ８は、ケモカイン受容体と称されるいくつかの異なる細胞表面受容体に結合することによりその効果を誘発する。これらの受容体には、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２ＢおよびＣＣＲ５が含まれる。
【０１３２】
タンパク質ホスファターゼ１、調節（阻害剤）サブユニット３Ｇ（Ｐｐｐ１ｒ３ｇ）
タンパク質ホスファターゼ１（ＰＰ１）は、その触媒性サブユニット（ＰＰ１ｃ）と５０を超える、異なる、確立されたまたは推定される調節サブユニットとの相互作用を介して非常に多様な細胞機能を調節する主要な真核生物タンパク質セリン／スレオニンホスファターゼである。Ｐｐｐｌｒ３ｇは、ＰＰ１のグリコーゲン結合領域をターゲティングする新たに同定された調節サブユニットである。それはＰＰ１との相互作用を媒介する正準−ＲＶｘＦ−モチーフ、およびグリコーゲンをターゲティングし、ＰＰ１基質との相互作用を促進するための推定モジュールを含有する。
【０１３３】
アポリポタンパク質（ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩおよびＡｐｏＢ）
アポリポタンパク質は、血漿リポタンパク質の構成要素である脂質結合タンパク質であり、食事性脂質を、血流を介して腸から肝臓へ、および内因的に合成された脂質を、肝臓からそれらを貯蔵する（脂肪細胞）、それらを代謝する（筋肉、心臓、肺）、またはそれらを分泌する（乳房）ことができる組織に輸送する超顕微鏡的球形粒子ある。アポリポタンパク質の両親媒性特性は、リポタンパク質の疎水性脂質構成要素を可溶化するが、アポリポタンパク質はまた酵素補助因子、受容体リガンドならびにリポタンパク質の血管内代謝およびその最終的な組織取り込みを調節する脂質移動キャリアとしても提供される。
【０１３４】
アポリポタンパク質の５つの主要なクラスおよびいくつかのサブクラスが存在する：Ａ（ａｐｏＡ−Ｉ、ａｐｏＡ−ＩＩ、ａｐｏＡ−ＩＶおよびａｐｏＡ−Ｖ）；Ｂ（ａｐｏＢ４８およびａｐｏＢ１００）、Ｃ（ａｐｏＣ−Ｉ、ａｐｏＣ−ＩＩ、ａｐｏＣ−ＩＩＩおよびａｐｏＣ−ＩＶ）；Ｄ、Ｅ、ＨおよびＪ。アポリポタンパク質の数百の遺伝子多型が記載されており、その多くはその構造および機能を改変する。
【０１３５】
腸におけるアポリポタンパク質合成は、主に食事の脂肪含量により調節される。肝臓におけるアポリポタンパク質合成は、食事組成、ホルモン（インスリン、グルカゴン、チロキシン、エストロゲン、アンドロゲン）、アルコール摂取および種々の薬物（スタチン系、ニコチン酸およびフィブリン酸）を含む多数の因子により制御される。
【０１３６】
線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１またはＦＧＦ２１）
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）タンパク質は、種々の細胞型の成長および分化を調節するシグナリング分子のファミリーに属する。ＦＧＦ−２１は肝臓において選択的に発現されることが報告されている（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４９２：２０３−２０６（２０００）；ＷＯ第０１／３６６４０号；および同ＷＯ第０１／１８１７２号）。ヒトＦＧＦ−２１遺伝子および対応する遺伝子発現生成物は、米国特許出願第２００７０２３８６５７号に記載される。ＦＧＦ２１は虚血性血管疾患、創傷治癒および肺、気管支または肺胞細胞機能の喪失に関連する疾患、ならびに非常に多くのその他の障害のための処置として記載されている。さらに最近では、ＦＧＦ−２１はインスリンの存在下および不在下での処置後のマウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるグルコースの取り込みを刺激し、ｏｂ／ｏｂおよびｄｂ／ｄｂマウスならびに８週齢ＺＤＦラットにおいて用量依存的な様式で食後および空腹時血中グルコース、トリグリセリドおよびグルカゴンレベルを低下させることが示されており、故に、糖尿病および肥満を処置するための治療としてのＦＧＦ−２１の使用に関する基礎が提供される（ＷＯ第０３／０１１２１３号）。ＦＧＦ２１を上方調節することの潜在的なその他の利点には、例えば、いくつかの栄養における相対的欠損を招き得る基質代謝における変化から生じる不安定な代謝亢進状態を経験するもののような重病患者における死亡率および罹患率を低減させることが含まれる。一般的には、不安定な代謝亢進状態では脂肪および筋肉の双方の酸化が増大する。加えてＦＧＦ−２１は例えば全身性炎症反応症候群または呼吸促迫を経験する患者における死亡および罹患の危険性を低減させるので、重病患者はＦＧＦ−２１の増大から利益を享受し得る。
【０１３７】
４．スクリーニングアッセイ
その他の態様では、本発明はサーチュイン活性を変調する化合物を同定するための方法を提供する。アッセイは、サーチュインタンパク質を発現する細胞を被験化合物と接触させること、および１つ以上のサーチュインバイオマーカー（例えば表１に示される１つ以上のバイオマーカー）の発現レベルを決定することを含むことができる。特定の実施態様では、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイは、表１にて示される１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５またはそれより多いサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定することを伴うことができる。
【０１３８】
特定の実施態様では、本明細書に記載される方法は、表１（図１）に示される１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルの検出を伴う。代表的な実施態様では、本明細書に記載される方法は１つ以上の以下のサーチュインバイオマーカーの発現レベルの検出を伴うことができる：ＭＣＰ−１、ＢＭＰ受容体１Ａ、Ｓｍｐｄｌ３ａ、ＣＤ１４、ＡｐｏＥ、ＦＡＳ、トランスサイレチン、ＦＡＢＰ１（肝臓）、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ１、アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ２、アクアポリン４、Ｒｒａｄ、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ８、Ｐｐｐ１ｒ３ｇ、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＢまたはＦＧＦ２１。特定の実施態様では、本明細書に記載される方法は、ＭＣＰ−１の発現レベルの検出を伴う。特定の実施態様では、本明細書に記載される方法はＦＧＦ２１の発現レベルの検出を伴う。
【０１３９】
単に一例として、対照と比較して、被験化合物との接触時の細胞におけるＭＣＰ−１発現の増大は、サーチュイン活性を活性化する被験化合物の指標である。これに代えて、対照と比較して被験化合物との接触時の細胞におけるＭＣＰ−１発現の低下は、サーチュイン活性を阻害する被験化合物の指標である。表１（図１）に示されるその他のバイオマーカーまたはその組み合わせを用いて類似の方法を行うことができる。表１は、サーチュイン活性化化合物の存在下でバイオマーカー発現に及ぼす影響を示すため、被験化合物がサーチュイン活性化効果を有する本明細書に記載されるアッセイにおいて類似の効果が予期されるであろう。同様に、被験化合物がサーチュイン阻害効果を呈する場合、表１に示されるものに発現に及ぼす反対の効果が予期されるであろう。
【０１４０】
バイオマーカーのｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、活性レベルまたはバイオマーカーの遺伝子もしくはタンパク質発現データに反映されるかもしくはそこから誘導されるその他の量により、サーチュインバイオマーカーの発現レベルを測定することができる。サーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定するための代表的な方法を本明細書の実施例の項にて提供する。サーチュインバイオマーカーのＲＮＡまたはタンパク質生成物の量を決定するための標準的な方法および組成物を利用することができる。かかる方法および組成物を前記で詳細に記載した。
【０１４１】
特定の実施態様では、本明細書に記載される細胞基盤のアッセイは、サーチュインタンパク質を内因的に発現する細胞を利用することができる。これに代えて、細胞がサーチュインを発現するように操作することができる（例えば宿主細胞のゲノムへのサーチュイン遺伝子の組み込み、サーチュイン配列を含有するプラスミドからの発現等）。特定の実施態様では、本明細書に記載されるアッセイにおいて有用な細胞は表１に列挙される少なくとも１つのサーチュインバイオマーカー（またはその相同体）を内因的に発現する。その他の実施態様では、表１に列挙される１つ以上のサーチュインバイオマーカーを発現するように細胞を操作することができる。当該分野において周知の技術を用いて細胞を操作して、サーチュイン、サーチュインバイオマーカーまたはその他の配列を発現させることができる。かかる技術の実例には、限定するものではないが、リン酸カルシウム沈殿（例えばＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌ．５２：５４６（１９７８））、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中の核酸の封入、および核酸の核への直接マイクロインジェクションが含まれる。
【０１４２】
サーチュインタンパク質は、サーチュインデアセチラーゼタンパク質ファミリー、または好ましくは酵母Ｓｉｒ２（ジェンバンク受け入れ番号Ｐ５３６８５）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）Ｓｉｒ−２．１（ジェンバンク受け入れ番号ＮＰ  ５０１９１２）、ならびにヒトＳＩＲＴ１（ジェンバンク受け入れ番号ＮＭ  ０１２２３８およびＮＰ  ０３６３７０（またはＡＦ０８３１０６））およびＳＩＲＴ２（ジェンバンク受け入れ番号ＮＭ  ０１２２３７、ＮＭ  ０３０５９３、ＮＰ  ０３６３６９、ＮＰ  ０８５０９６およびＡＦ０８３１０７）タンパク質を含むｓｉｒ２ファミリーのメンバーを指す。その他のファミリーメンバーには、「ＨＳＴ遺伝子」（Ｓｉｒ  ２の相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ  ｏｆ  Ｓｉｒ  ｔｗｏ））、ＨＳＴ１、ＨＳＴ２、ＨＳＴ３およびＨＳＴ４と称される４つのさらなる酵母Ｓｉｒ２様遺伝子、ならびに５つのその他のヒト相同体ｈＳＩＲＴ３、ｈＳＩＲＴ４、ｈＳＩＲＴ５、ｈＳＩＲＴ６およびｈＳＩＲＴ７（Ｂｒａｃｈｍａｎｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：２８８８（１９９５）およびＦｒｙｅら、ＢＢＲＣ  ２６０：２７３（１９９９））が含まれる。相同体、例えば、前記のもののオルソログおよびパラログ、ドメイン、フラグメント、変異体ならびに誘導体を本明細書に記載される方法にしたがって使用することもできる。
【０１４３】
代表的な実施態様では、本明細書に記載される方法を用いてＳＩＲＴ１タンパク質の活性を決定することができる。ＳＩＲＴ１タンパク質はサーチュインデアセチラーゼのｓｉｒ２ファミリーのメンバーを指す。１つの実施態様では、ＳＩＲＴ１タンパク質には酵母Ｓｉｒ２（ジェンバンク受け入れ番号Ｐ５３６８５）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）Ｓｉｒ−２．１（ジェンバンク受け入れ番号ＮＰ  ５０１９１２）、ヒトＳＩＲＴ１（ジェンバンク受け入れ番号ＮＭ  ０１２２３８またはＮＰ  ０３６３７０（またはＡＦ０８３１０６））、およびヒトＳＩＲＴ２（ジェンバンク受け入れ番号ＮＭ  ０１２２３７、ＮＭ  ０３０５９３、ＮＰ  ０３６３６９、ＮＰ  ０８５０９６またはＡＦ０８３１０７）タンパク質、ならびにその等価物およびフラグメントが含まれる。別の実施態様では、ＳＩＲＴ１タンパク質にはジェンバンク受け入れ番号ＮＰ  ０３６３７０、ＮＰ  ５０１９１２、ＮＰ  ０８５０９６、ＮＰ  ０３６３６９またはＰ５３６８５に示されるアミノ酸配列からなるか、または本質的にそれらからなる配列を含むポリペプチドが含まれる。ＳＩＲＴ１タンパク質にはジェンバンク受け入れ番号ＮＰ  ０３６３７０、ＮＰ  ５０１９１２、ＮＰ  ０８５０９６、ＮＰ  ０３６３６９またはＰ５３６８５に示されるアミノ酸配列；１〜約２、３、５、７、１０、１５、２０、３０、５０、７５以上の保存アミノ酸置換を有するジェンバンク受け入れ番号ＮＰ  ０３６３７０、ＮＰ  ５０１９１２、ＮＰ  ０８５０９６、ＮＰ  ０３６３６９またはＰ５３６８５に示されるアミノ酸配列；ジェンバンク受け入れ番号ＮＰ  ０３６３７０、ＮＰ  ５０１９１２、ＮＰ  ０８５０９６、ＮＰ  ０３６３６９またはＰ５３６８５に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列およびその機能的フラグメントの全てまたは一部を含むポリペプチドが含まれる。ＳＩＲＴ１タンパク質にはジェンバンク受け入れ番号ＮＰ  ０３６３７０、ＮＰ  ５０１９１２、ＮＰ  ０８５０９６、ＮＰ  ０３６３６９またはＰ５３６８５の相同体（例えばオルソログおよびパラログ）、変異体またはフラグメントもまた含まれる。
【０１４４】
１つの実施態様では、本明細書に記載される方法を用いて、ＳＩＲＴ３タンパク質の活性を決定することができる。ＳＩＲＴ３タンパク質は、サーチュインデアセチラーゼタンパク質ファミリーのメンバーおよび／またはＳＩＲＴ１タンパク質の相同体を指す。１つの実施態様では、ＳＩＲＴ３タンパク質にはヒトＳＩＲＴ３（ジェンバンク受け入れ番号ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ  ０３６３７１またはＮＰ  ００１０１７５２４）およびマウスＳＩＲＴ３（ジェンバンク受け入れ番号ＮＰ  ０７１８７８）タンパク質、ならびにその等価物およびフラグメントが含まれる。別の実施態様では、ＳＩＲＴ３タンパク質には、ジェンバンク受け入れ番号ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ  ０３６３７１、ＮＰ  ００１０１７５２４またはＮＰ  ０７１８７８に示されるアミノ酸配列からなるか、または本質的にそれらからなる配列を含むポリペプチドが含まれる。ＳＩＲＴ３タンパク質には、ジェンバンク受け入れＡＡＨ０１０４２、ＮＰ  ０３６３７１、ＮＰ  ００１０１７５２４またはＮＰ  ０７１８７８に示されるアミノ酸配列；１〜約２、３、５、７、１０、１５、２０、３０、５０、７５以上の保存アミノ酸置換を有するジェンバンク受け入れ番号ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ  ０３６３７１、ＮＰ  ００１０１７５２４またはＮＰ  ０７１８７８に示されるアミノ酸配列；ジェンバンク受け入れ番号ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ  ０３６３７１、ＮＰ  ００１０１７５２４またはＮＰ  ０７１８７８に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列およびその機能的フラグメントの全てまたは一部を含むポリペプチドが含まれる。ＳＩＲＴ３タンパク質には、ジェンバンク受け入れ番号ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ  ０３６３７１、ＮＰ  ００１０１７５２４、またはＮＰ  ０７１８７８の相同体（例えばオルソログおよびパラログ）、変異体またはフラグメントも含まれる。
【０１４５】
別の実施態様では、サーチュインの生物学的に活性な部分を本明細書に記載される方法にしたがって使用することができる。サーチュインの生物学的に活性な部分は、脱アセチル化する能力のような生物学的活性を有するサーチュインタンパク質の一部を指す。サーチュインの生物学的に活性な部分は、サーチュインのコアドメインを含むことができる。ＮＡＤ＋結合ドメインおよび基質結合ドメインを包含するジェンバンク受け入れ番号ＮＰ  ０３６３７０を有するＳＩＲＴ１の生物学的に活性な部分は、例えば、限定するものではないが、ジェンバンク受け入れ番号ＮＰ  ０３６３７０のアミノ酸６２−２９３を含むことができ、それはジェンバンク受け入れ番号ＮＭ  ０１２２３８のヌクレオチド２３７〜９３２によりコードされる。したがって、この領域は、コアドメインと称されることもある。ＳＩＲＴ１のその他の生物学的に活性な部分もまた時にコアドメインと称され、ジェンバンク受け入れ番号ＮＰ  ０３６３７０の約アミノ酸２６１〜４４７（それはジェンバンク受け入れ番号ＮＭ  ０１２２３８のヌクレオチド８３４〜１３９４によりコードされる）；ジェンバンク受け入れ番号ＮＰ  ０３６３７０の約アミノ酸２４２〜４９３（それはジェンバンク受け入れ番号ＮＭ  ０１２２３８のヌクレオチド７７７〜１５３２によりコードされる）；またはジェンバンク受け入れ番号ＮＰ  ０３６３７０の約アミノ酸２５４〜４９５（それはジェンバンク受け入れ番号ＮＭ  ０１２２３８のヌクレオチド８１３〜１５３８によりコードされる）を含む。別の実施態様では、サーチュインの生物学的に活性な部分は、ミトコンドリアマトリックスプロセシングペプチダーゼ（ＭＰＰ）および／またはミトコンドリアインターメディエートペプチダーゼ（ＭＩＰ）での切断により生成されるＳＩＲＴ３タンパク質のフラグメントでよい。
【０１４６】
本明細書で提供されるアッセイにしたがって有用な細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれかでよい。代表的な実施態様では、宿主細胞は、サーチュインタンパク質および表１に列挙される１つ以上のサーチュインバイオマーカーを内因的に発現する培養された哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である。特定の実施態様では、細胞は、培養物中に懸濁され得るか、または非ヒト動物内に含有され得る。例えば、推定サーチュイン変調化合物を非ヒト動物に投与すること、該動物から生物学的試料を入手すること、および生物学的試料中の１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定することによりアッセイを実施することができる。非ヒト動物は、例えば、サーチュイン媒介疾患もしくは障害の動物モデルまたは正常な動物でよい。加えて、ヒト対象を含む哺乳動物のような対象からの生物学的試料中に含有される細胞を用いてアッセイを実施することができる。例えば、生物学的試料をサーチュイン変調化合物で処置された対象から取り出すことができ、次に試料中の１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定することができる。対象は、例えば、サーチュイン媒介疾患もしくは障害を患っているヒト対象、またはサーチュイン媒介疾患もしくは障害の動物モデルでよい。
【０１４７】
その他の実施態様では、核酸の翻訳および場合によっては転写を許容する任意の細胞不含抽出物を本明細書に記載される方法にしたがって使用することができる。細胞不含抽出物を任意の起源の細胞から単離することができる。細胞不含翻訳抽出物をヒト細胞、培養マウス細胞、培養ラット細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、アフリカツメガエル卵母細胞、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽またはライムギ胚（例えば、ＫｒｉｅｇおよびＭｅｌｔｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３０８：２０３（１９８４）およびＤｉｇｎａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：１９４−２０３（１９９０）参照）から単離することができる。これに代えて、細胞不含翻訳抽出物、例えばウサギ網状赤血球ライゼートおよびコムギ胚芽抽出物を例えばＰｒｏｍｅｇａ（マジソン、ウィスコンシン州）から商業的に購入することができる。代表的な実施態様では、細胞不含抽出物は例えばＨｅＬａ細胞またはリンパ球のようなヒト細胞から単離された抽出物である。
【０１４８】
特定の実施態様では、サーチュイン変調化合物を同定するために本明細書に記載される方法はサーチュイン活性化可能な細胞系を利用することができる。サーチュイン活性化可能な細胞系は、相対的に低い内因性レベルの１つ以上のサーチュインタンパク質（例えば細胞におけるサーチュイン活性の量が飽和しておらず、活性の増大を観察できる）ならびに相対的に低いレベルのミトコンドリアおよび／または酸化的リン酸化能力（例えば細胞におけるミトコンドリアおよび／または酸化的リン酸化の量が飽和しておらず、ＡＴＰレベルの増大を観察できる）を含む。サーチュイン活性化可能な細胞系の実例には例えばＮＣＩ−Ｈ３５８およびＭＣＳ７が含まれる。
【０１４９】
特定の実施態様では、本明細書に記載されるスクリーニング方法は被験化合物の存在下での１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルを対照と比較することを伴う。種々の実施態様では、対照は、被験化合物の不在下で行われる重複アッセイ、または公知のサーチュイン変調活性を有する被験化合物（例えば活性化因子、阻害剤またはサーチュイン変調活性を有さない化合物）の存在下で行われる重複アッセイでよい。なおその他の実施態様では、対照はデータベースにおける参照番号でよい。
【０１５０】
特定の実施態様では、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイは、レポーター遺伝子基盤のアッセイを用いてサーチュイン変調化合物を同定することができる。例えばサーチュインバイオマーカーの上流調節配列の制御下でレポーター遺伝子を用いてサーチュインバイオマーカーの発現に及ぼす被験化合物の効果を決定し、それよりサーチュイン活性に及ぼす被験化合物の影響を反映することができる。特に、方法は、例えば（ａ）サーチュインバイオマーカーの調節エレメント（例えばプロモーター／エンハンサーエレメント）に作動可能なように連結されたレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物を発現する細胞を被験化合物と接触させる工程；（ｂ）該レポーター遺伝子の発現を測定する工程；および（ｃ）（ａ）における量を被験化合物と接触させていない対応する対照細胞において存在する量と比較して、発現されたレポーター遺伝子の量が対照細胞における量と相対して改変される場合、サーチュイン活性を変調する化合物を同定する工程；を含むことができる。別の実施態様では、サーチュイン変調を同定するための方法は：（ａ）細胞不含抽出物およびサーチュインバイオマーカーの調節エレメント（例えばプロモーター／エンハンサーエレメント）に作動可能なように連結されたレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物を被験化合物と接触させる工程；（ｂ）該レポーター遺伝子の発現を測定する工程；および（ｃ）（ａ）における量を被験化合物と接触させていない対応する対照において存在する量と比較して、発現されたレポーター遺伝子の量が対照における量と相対して改変される場合、サーチュイン変調化合物を同定する工程；を含むことができる。
【０１５１】
当業者に周知の任意のレポーター遺伝子を本明細書に記載される方法にしたがって使用することができる。レポーター遺伝子は、その存在（例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等）または活性のいずれかにより容易に検出可能であるＲＮＡ転写物またはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。レポーター遺伝子の非限定例には、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ；放射活性アセチル基をクロラムフェニコールに移行させる、または薄層クロマトグラフィーおよびオートラジオグラフィーによる検出）、ベータガラクトシダーゼ（ＧＡＬ；無色ガラクトシドを加水分解して着色生成物を生じる）、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ；無色グルクロニドを加水分解して着色生成物を生じる）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ；ルシフェリンを酸化してフォトンを放出する）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；基質を伴わない蛍光タンパク質）、分泌型アルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ；適当な基質との、または発色団を作成する基質との発光反応）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；酸化水素の存在下、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを酸化して着色複合体を形成する）およびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ；適当な基質との、または発色団を作成する基質との発光反応）が含まれる。適当なレポーター遺伝子に関するヌクレオチド配列を、例えば、文献またはジェンバンクのようなデータベースから入手することができる。本明細書に記載される方法にしたがって使用するのに適当なレポーター遺伝子を作成するために、ヌクレオチド配列の操作に関して当該分野において周知の方法、例えば組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ等（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（１９９０）およびＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州（１９９８）に記載される技術を参照のこと）を用いてレポーター遺伝子のヌクレオチド配列をサーチュインバイオマーカーに関する調節配列に連結させることができる。
【０１５２】
特定の実施態様では、本発明は１つ以上のサーチュインバイオマーカーの発現レベルを変調する化合物をスクリーニングするための方法を提供する。特定の実施態様では、本明細書に記載される方法を用いて、被験化合物の不在下でのバイオマーカー発現レベルに相対して少なくとも約２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍またはそれより多くまでサーチュインバイオマーカー発現を低下または増大させる被験化合物を同定することができる。
【０１５３】
本明細書に記載されるアッセイにおいて活性に関して試験されるべき被験化合物は、タンパク質（翻訳後に修飾されたタンパク質を含む）、ペプチド（化学的または酵素的に修飾されたペプチドを含む）、または化合物のライブラリーを含む小型分子（炭水化物、ステロイド、脂質、陰イオンまたは陽イオン、薬物、小型有機分子、オリゴヌクレオチド、抗体、および薬剤またはアンチセンス分子の遺伝子コード化タンパク質を含む）を含むことができる。被験化合物は、天然発生（例えば天然に見出されるかまたは天然から単離される）でよいか、または非天然発生（例えば合成、化学合成または人工）でよい。
【０１５４】
所望により、限定するものではないが、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な並列固相または液相ライブラリー、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を含む、当該分野において公知の非常に多くのコンビナトリアル法のいずれかを用いて被験化合物を入手することができる。生物学的ライブラリー研究法は、ポリペプチドライブラリーに限定されるが、その他の４つの研究法はポリペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小型分子ライブラリーに適用可能である。Ｌａｍ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５（１９９７）を参照のこと。
【０１５５】
分子ライブラリーを合成するための方法は、当該分野において周知である（例えば、ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９（１９９３）；Ｅｒｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２（１９９４）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．３７：２６７８（１９９４）；Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３（１９９３）；Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．３３：２０５９（１９９４）；Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．３７：１２３３（１９９４）を参照のこと）。化合物のライブラリーを溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１（１９９２））、またはビーズ（Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４（１９９１））、チップ（Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６（１９９３））、細菌もしくは胞子（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５２２３４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１８６５−１８６９（１９９２））、またはファージ（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６（１９９０））；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：６３７８−６３８２（１９９０）；Ｆｅｌｉｃｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０（１９９１）；およびＬａｄｎｅｒ、米国特許第５２２３４０９号）上に提示することができる。
【０１５６】
ハイスループットスクリーニングを用いて、サーチュインバイオマーカー発現またはサーチュインデアセチラーゼ活性を変調する能力に関して被験化合物をスクリーニングすることができる。多数の被験化合物を迅速にスクリーニングできるように、ハイスループットスクリーニングを用いて多くの別個の化合物を並行して試験することができる。最も広く確立された技術は、９６ウェルマイクロタイタープレートを利用する。プレートに加えて、９６ウェル様式に適合させるための多くの装置、材料、分注器、ロボット工学、プレート洗浄機、およびプレートリーダーが市販により入手可能である。
【０１５７】
これに代えて、フリーフォーマットアッセイまたは試料間に物理的障壁を有さないアッセイを用いることができる。フリーフォーマットを伴うアッセイは、例えば、Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  １９：１６１４−１８（１９９４）；生体分子スクリーニング（Ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）学会第１回年次大会（フィラデルフィア、ペンシルバニア州、１９９５年１１月７−１０日）で報告されたＣｈｅｌｓｋｙ、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ｎｏｖｅｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」；およびＳａｌｍｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ２：５７−６３（１９９６）に記載される。別のハイスループットスクリーニング法は、Ｂｅｕｔｅｌら、米国特許第５９７６８１３号に記載される。
【０１５８】
特定の実施態様では、本明細書に記載されるバイオマーカーアッセイを一次アッセイとして用いて推定サーチュイン変調化合物を同定することができる。かかるアッセイは、さらに推定サーチュイン変調化合物の存在下で、サーチュインデアセチラーゼ活性に及ぼす効果を直接的に測定するさらなるインビトロアッセイをさらに含むことができる。サーチュインデアセチラーゼ活性を決定するための任意の適当なアッセイを本明細書に記載される方法にしたがって使用することができる。デアセチラーゼアッセイを用いて、サーチュインデアセチラーゼ活性を活性化する化合物、またはサーチュインデアセチラーゼ活性を阻害する化合物のいずれかを同定することができる。デアセチラーゼアッセイを細胞基盤または細胞不含様式で行うことができる。サーチュイン変異体による基質の脱アセチル化を許容する条件下でアッセイを行うことができる。特定の実施態様では、アッセイをＮＡＤ＋の存在下で行う。
【０１５９】
脱アセチル化アッセイ法は、例えば推定サーチュイン変調化合物の存在下で少なくとも１つのアセチル化サーチュイン基質をサーチュインポリペプチドと接触させること、およびサーチュイン基質のアセチル化のレベルを決定することを伴うことができる。対照（例えば被験薬剤を伴わないアッセイ、公知のサーチュイン変調活性を有する薬剤の存在下のアッセイ、サーチュイン変調活性を有さない薬剤の存在下のアッセイまたはデータベースにおける値）と比較して、推定サーチュインモジュレーターの存在下でのサーチュインによる基質の脱アセチル化のレベルの変化は、サーチュインデアセチラーゼ活性を変調する化合物の指標である。
【０１６０】
本明細書に記載されるバイオマーカー基盤のアッセイを用いて同定された推定サーチュイン変調化合物を任意の型の脱アセチル化と組み合わせて用いることができ、そのアッセイは、サーチュイン活性の試験を許容する。例えば推定サーチュインモジュレーターをＢｉｏｍｏｌから市販により入手可能であるアッセイ、例えばＳＩＲＴ１  Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（ＡＫ−５５５）、ＳＩＲＴ２  Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（ＡＫ−５５６）またはＳＩＲＴ３  Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（ＡＫ−５５７）（Ｂｉｏｍｏｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、プリマスミーティング、ペンシルバニア州）のような蛍光基盤のアッセイと関連して用いることができる。本明細書に記載される方法に関連して用いることができるその他のアッセイ様式には、ニコチンアミド放出アッセイ（Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（１７）：１７０３８（２００５））、ＦＲＥＴアッセイ（Ｍａｒｃｏｔｔｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３２：９０（２００４））およびＣ１４  ＮＡＤホウ素樹脂結合アッセイ（ＭｃＤｏｎａｇｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：３４６（２００５））が含まれる。本明細書に記載されるサーチュイン変異体と併用して用いることができるなおその他のアッセイ様式には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、シンチレーション近接アッセイ、ＨＰＬＣ基盤のアッセイおよびレポーター遺伝子アッセイ（例えば転写因子標的に関する）が含まれる。その他の実施態様では、推定サーチュイン変調化合物を蛍光偏光アッセイに関連して使用することができる。蛍光偏光アッセイの実例は、本明細書に記載され、またＰＣＴ公開ＷＯ第２００６／０９４２３９号においても記載される。その他の実施態様では、推定サーチュイン変調化合物を質量分析基盤のアッセイに関連して使用することができる。質量分析基盤のアッセイの例は、本明細書に記載され、またＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／０４６０２１号においても記載される。
【０１６１】
種々の実施態様では、本明細書に記載される脱アセチル化アッセイは１つ以上のサーチュイン基質ポリペプチドの複数のコピーを含むサーチュイン基質プールを利用する。代表的な実施態様では、サーチュイン基質プールは同一のポリペプチド基質の複数のコピーを含む。かかるサーチュイン基質プールは溶液中で浮遊するか、またはプレート、ビーズ、フィルター等に結合したサーチュイン基質を含むことができる。浮遊するかまたは繋留されたサーチュイン基質分子の組み合わせを本明細書に記載される方法にしたがって使用することもできる。本明細書に記載される方法にしたがって使用するのに適当な基質は、例えばｐ５３またはヒストンのようなサーチュインタンパク質により脱アセチル化することができる任意のポリペプチドに基づいてよい。代表的な基質には、例えばＢＩＯＭＯＬ（プリマスミーティング、ペンシルバニア州）のＦｌｕｏｒ  ｄｅ  Ｌｙｓ−ＳＩＲＴ１基質が含まれる。ＦＰおよび質量分析基盤のアッセイに含まれるその他の適当な基質には、例えばＡｃ−ＥＥ−Ｋ（ビオチン）−ＧＱＳＴＳＳＨＳＫ（Ａｃ）ＮｌｅＳＴＥＧ−Ｋ（ＭＲ１２１）−ＥＥ−ＮＨ２（配列番号：７）およびＡｃ−ＥＥ−Ｋ（ビオチン）−ＧＱＳＴＳＳＨＳＫ（Ａｃ）ＮｌｅＳＴＥＧ−Ｋ（５ＴＭＲ）−ＥＥ−ＮＨ２（配列番号：８）が含まれ、ここでＫ（ビオチン）はビオチン化リジン残基であり、Ｋ（Ａｃ）はアセチル化リジン残基であり、Ｎｌｅはノルロイシンであり、Ｋ（ＭＲ１２１）はＭＲ１２１フルオロフォアにより修飾されたリジン残基であり（励起６３５ｎｍ／発光６８０ｎｍ）、Ｋ（５ＴＭＲ）は５ＴＭＲフルオロフォアにより修飾されたリジン残基である（励起５４０ｎｍ／発光５８０ｎｍ）。ペプチド基質の配列は、いくつかの修飾を有するｐ５３に基づく。特に、アセチル化リジン残基以外の全てのアルギニンおよびロイシン残基をセリンで置き換えて、脱アセチル化の不在下でペプチドをトリプシン切断され難くする。加えて、メチオニンは合成および精製の間に酸化されやすい可能性があるので、配列に天然に存在するメチオニン残基をノルロイシンで置き換える。
【０１６２】
特定の実施態様では、本明細書に記載されるサーチュインバイオマーカー基盤のスクリーニングアッセイを二次的スクリーニングとして用いて、例えば、サーチュイン脱アセチル化アッセイを用いて同定された推定サーチュイン変調化合物をさらに特徴付けすることができる。例えば、バイオマーカーアッセイを用いて、インビトロで同定されたサーチュイン変調化合物が細胞環境でサーチュイン変調活性を有することを確認し、細胞膜透過性および／または細胞毒性についての情報を提供することができる。インビトロアッセイと比較して、バイオマーカーアッセイにおいて低レベルのサーチュイン変調活性を示す化合物は、細胞膜透過性が低い化合物または細胞膜不透過性である化合物の指標であり得る。加えて、インビトロアッセイにおいて低いサーチュイン活性化活性を示すが、細胞基盤アッセイでは、サーチュイン阻害活性を示す化合物は、細胞毒性である化合物の指標であり得る。したがって、かかる細胞基盤アッセイは治療薬の開発に有用な情報を提供するであろう。
【０１６３】
本明細書に記載される方法にしたがって選択され得るサーチュインバイオマーカー発現を変調する化合物は、抗菌物質、抗癌剤、および種々のその他の使用のための候補化合物として有用である。例えば、サーチュイン活性化化合物の様式でサーチュインバイオマーカー発現を変調する化合物は、細胞の寿命の増大、ならびに例えば加齢もしくはストレス、糖尿病、肥満、神経変性疾患、化学療法誘発性ニューロパチー、虚血イベントに関連するニューロパチー、眼疾患および／または障害、心血管疾患、血液凝固障害、炎症および／または潮紅等に関係する疾患または障害を含む多様な疾患および障害の処置および／または防御に有用であり得る。その他の実施態様では、サーチュイン阻害化合物に類似する様式でサーチュインバイオマーカーを変調する化合物は、例えばストレスに対する細胞感受性の増大、アポトーシスの増大、癌の処置、食欲の刺激および／または体重増加の刺激等を含む種々の治療適用に有用であり得る。
【０１６４】
５．キット
別の態様では、本発明はサーチュインバイオマーカーの発現レベルを測定し、前記されたようなサーチュイン活性を阻害または強化する化合物に関してスクリーニングするためのキットを提供する。かかるキットは、調査目的、創薬、診断目的、治療の進展のモニタリング、投薬量の最適化等に有用であり得る。
【０１６５】
特定の実施態様では、キットは、サーチュインバイオマーカー（前記されたような）の発現レベルを決定するための少なくとも１つの構成成分および少なくとも１つのサーチュイン変調化合物（前記されたような）を含むことができる。バイオマーカー検出構成成分は、サーチュインバイオマーカーに結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、サーチュインバイオマーカーｍＲＮＡを特異的に増幅するＰＣＲプライマーのセット、または結合したサーチュインバイオマーカーをコードするポリヌクレオチド配列の少なくともフラグメントを含む固体支持体（例えばマイクロアレイチップ）でよい。キットはさらに以下のうちの１つ以上を含有できる：検出標識、陽性対照、陰性対照、サーチュインタンパク質、使用説明書、反応容器、バッファー等。
【０１６６】
特定の実施態様では、キットは、少なくとも１つのサーチュインタンパク質および少なくとも１つのサーチュインバイオマーカー（前記されたような）を発現する細胞ならびに以下のうちの１つ以上のくを含むことができる：検出標識、陽性対照、陰性対照、使用説明書、反応容器、バッファー等。
【０１６７】
キットの各々の構成成分を組み合わせて反応に適当である最終濃度を知ることができる。さらにこれらの構成成分に加えて、キットは、反応に適当な条件を与えるバッファーを含むことができる。サーチュインバイオマーカーおよびサーチュインタンパク質を、タンパク質を安定させるその他の構成成分と組み合わせることができる。例えば、凍結乾燥後のタンパク質変性を防御するために、キット構成成分を約１％ＢＳＡおよび約１％ポリオール（例えばスクロースまたはフルクトース）の存在下で貯蔵および／または輸送することができる。
【０１６８】
サーチュインバイオマーカーの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０の、全てのまたは任意の組み合わせのタンパク質およびＲＮＡ生成物の発現を測定するためのキットもまた本明細書で提供される。かかるキットは、かかるタンパク質およびＲＮＡ生成物の発現を測定するために必要とされる材料および試薬を含む。具体的な実施態様では、キットはさらに：（１）生物学的試料からＲＮＡを精製するための試薬；（２）被験核酸を作成するためのプライマー；（３）ｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ（予め混合されているか、または分離されているかのいずれか）、場合によっては１つ以上の独特に標識されたｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ（例えばビオチン化またはＣｙ３もしくはＣｙ５ターゲティングされたｄＮＴＰ）を伴う；（４）蛍光色素の化学的に活性な誘導体のような合成後標識試薬；（５）逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ等のような酵素；（６）種々のバッファー培地、例えばハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファー；（７）スピンカラムのような標識プローブ精製試薬および構成成分等；（８）タンパク質精製試薬；ならびに（９）シグナル作成および検出試薬、例えばストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ抱合体、化学蛍光または化学発光基質等；のような種々の方法において用いられる１つ以上のさらなる試薬を含むことができる。特別な実施態様では、キットは対照として使用するための、生物学的試料から単離された予め標識された品質管理されたタンパク質および／またはＲＮＡを含む。
【０１６９】
いくつかの実施態様では、キットは、ＲＴ−ＰＣＲキットである。その他の実施態様では、キットは核酸アレイおよびタンパク質アレイである。かかるキットは、少なくともサーチュインバイオマーカーの発現レベルを決定するために使用できる関連タンパク質または核酸メンバーを有するアレイおよびそのための包装手段を含むであろう。これに代えて、サーチュインバイオマーカーの発現レベルを検出するために用いられるタンパク質または核酸生成物をアレイに予め包装することができる。
【０１７０】
キットの各構成成分を液体形態または乾燥形態で提供することができる。サーチュインデアセチラーゼ活性の測定を阻害しない限り、当該分野において一般的に用いられるデタージェント、保存剤、バッファー等を構成成分に添加することができる。
【０１７１】
６．医薬組成物
特定の実施態様では、本明細書に記載される方法は、１つ以上のサーチュイン変調化合物の対象への投与を伴うことができる。かかるサーチュイン変調化合物は、公知のサーチュイン変調化合物または本明細書に記載される方法を用いて同定されるサーチュイン変調化合物でよい。１つ以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて従来の様式でサーチュイン変調化合物を処方することができる。例えば、サーチュイン変調化合物ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物を例えば注射（例えば皮下、筋肉内、腹腔内）、吸入もしくは吹送（口または鼻のいずれかを介する）または経口、口腔内、舌下、経皮、鼻内、非経口もしくは直腸投与による投与のために処方することができる。１つの実施態様では、サーチュイン変調化合物を限局的に、標的細胞が存在する部位に、すなわち具体的な組織、器官または液体（例えば血液、脳脊髄液等）に投与することができる。
【０１７２】
サーチュイン変調化合物を全身および局所または限局された投与を含む種々の様式の投与ために処方することができる。技術および処方を一般的にはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、イーストン、ペンシルバニア州に見出すことができる。非経口投与用には、筋肉内、静脈内、腹腔内および皮下を含む注射が好ましい。注射用には化合物を液体溶液中、好ましくはハンクス液またはリンガー液のような生理学的に許容されるバッファー中で処方することができる。加えて、化合物を固体形態に処方し、使用の直前に再溶解または懸濁することができる。凍結乾燥形態も含まれる。
【０１７３】
経口投与用には、医薬組成物は、例えば結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えばラルリル硫酸ナトリウム）のような薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手段により調製される錠剤、ロゼンジまたはカプセルの形態を取ることができる。錠剤を当該分野において周知の方法によりコーティングすることができる。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップもしくは懸濁液の形態を取ることができるか、またはそれらを使用の前に水もしくはその他の適当なベヒクルで構築するための乾燥生成物として提示することができる。かかる液体調製物を懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂）；乳化剤（例えばレシチンまたはアラビアゴム）；非水性ベヒクル（例えばアチオンド油（ａｔｉｏｎｄ  ｏｉｌ）、油状エステル、エチルアルコールまたは分別植物油（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｏｉｌｓ））；および保存剤（例えばメチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）のような薬学的に許容される添加剤を用いて従来の手段により調製することができる。調製物はまた、必要に応じてバッファー塩、着香剤、着色剤、および甘味剤を含有することもできる。経口投与のための調製物を適当に処方して活性化合物の放出制御を付与することができる。
【０１７４】
吸入による投与のために（例えば肺送達）、適当な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適当なガスを使用して、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレイ提示の形態でサーチュイン変調化合物を都合良く送達することができる。加圧エアロゾルの場合、定量を送達するためのバルブを提供することにより投薬単位を決定することができる。吸入器または注入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）で使用するために、化合物およびラクトースまたはデンプンのような適当な粉末の粉末混合物を含有する、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方することができる。
【０１７５】
注射による、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のためにサーチュイン変調化合物を処方することができる。注射用処方を単位投薬形態で、例えば、アンプルまたは多回投与用容器中で保存剤を添加して提示することができる。組成物は、油性または水性ベヒクル中、懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態を取ることができ、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤のような処方用薬剤を含有することができる。これに代えて、使用の前に適当なベヒクル、例えば滅菌パイロジェン不含水で構築するために活性成分を粉末形態にできる。
【０１７６】
加えて、サーチュイン変調化合物をデポー調製物として処方することもできる。かかる長時間作用性処方を植込み（例えば皮下または筋肉内に）または筋肉内注射により投与することができる。故に例えばサーチュイン変調化合物を適当な重合性もしくは疎水性材料（例えば許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として処方することができる。放出制御処方にはパッチも含まれる。
【０１７７】
特定の実施態様では、本明細書に記載される化合物を中枢神経系（ＣＮＳ）への送達用に処方することができる（Ｂｅｇｌｅｙ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １０４：２９−４５（２００４）にて概説される）。ＣＮＳへの薬物送達のための従来の研究法には：脳神経外科的計画（例えば脳内注射または脳室内注入）；血液脳関門の内因性輸送経路の１つを開発する試みの薬剤の分子操作（例えば内皮細胞表面分子に関して親和性を有する輸送ペプチドを、それ自体血液脳関門を通過することができない薬剤と組み合わせて含むキメラ融合タンパク質の生成）；薬剤の脂質溶解性を増大させるために設計された薬理学的計画（例えば水溶性薬剤の脂質またはコレステロールキャリアへの抱合）；および高浸透圧性崩壊による血液脳関門の完全性の一過性の崩壊（マンニトール溶液の頸動脈への注入またはアンギオテンシンペプチドのような生物学的に活性な薬剤の使用の結果として）；が含まれる。
【０１７８】
１つの実施態様では、本明細書に記載されるサーチュイン変調化合物を、一般的に局所薬物投与に適している局所用担体を含有し、当該分野において公知の任意のかかる材料を含む局所用処方に組み込む。局所用担体は望ましい形態で、例えば軟膏、ローション、クリーム、マイクロエマルジョン、ゲル、油、溶液等として組成物を提供するために選択され、天然発生または合成起源のいずれかの材料からなってよい。選択された担体は活性薬剤または局所用処方のその他の構成成分に有害な影響を及ぼさないことが好ましい。本明細書での使用に適当な局所用担体の実例には、水、アルコールおよびその他の無毒性有機溶媒、グリセリン、鉱物油、シリコン、黄色ワセリン、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン、ワックス等が含まれる。
【０１７９】
医薬組成物（化粧用調製物を含む）は重量で約０．００００１〜１００％、例えば、０．００１〜１０％または０．１％〜５％の本明細書に記載される１つ以上のサーチュイン変調化合物を含むことができる。特定の局所用処方では、活性薬剤は、処方のおよそ０．２５重量％〜７５重量％の範囲の、好ましくは、処方のおよそ０．２５重量％〜３０重量％の範囲の、さらに好ましくは、処方のおよそ０．５重量％〜１５重量％の範囲の、最も好ましくは、処方のおよそ１．０重量％〜１０重量％の範囲の量で存在する。
【０１８０】
眼の症状を、例えば、サーチュイン変調化合物の全身、局所、眼内注射により、またはサーチュイン変調化合物を放出する徐放装置の挿入により処置または防御することができる。化合物が十分な時間、眼球表面との接触を維持して、化合物が眼の角膜および内部領域、例えば前眼房、後眼房、硝子体、眼房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、水晶体、脈絡膜／網膜および強膜に浸透することを可能にするように、サーチュイン変調化合物を薬学的に許容される眼科用ベヒクル中で分配することができる。薬学的に許容される眼科用ベヒクルは、例えば、軟膏、植物油またはカプセル化材料でよい。これに代えて、化合物を硝子体液および眼房水に直接注射することができる。さらなる代替では、眼の処置のために静脈内注入または注射によるように、化合物を全身的に投与することができる。
【０１８１】
本明細書に記載されるサーチュイン変調化合物を当該分野における公知の方法にしたがって酸素不含の環境で貯蔵することができる。例えばレスベラトロールまたはその類似体を経口投与用にＰｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．のＣａｐｓｕｇｅｌ形態のような気密カプセルで調製することができる。
【０１８２】
サーチュイン変調化合物の毒性および治療効果を、細胞培養および実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。ＬＤ５０は集団の５０％致死用量である。ＥＤ５０は集団の５０％で治療的に有効な用量である。毒性および治療効果の間の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）は、治療指数である。大きな治療指数を呈するサーチュイン変調化合物が好ましい。毒性副作用を呈するサーチュイン変調化合物を使用することはできるが、非感染細胞に対する損傷の可能性を最小にし、それにより副作用を低減させるために、影響を受ける組織の部位にかかる化合物をターゲティングする送達系を設計するのに注意を払わなければならない。
【０１８３】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトにおける使用のための範囲の投薬量を処方するのに使用することができる。かかる化合物の投薬量は毒性をわずかしか、または全く有さないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあってよい。用いられる投薬形態および利用され投与経路に依存して、この範囲内で投薬量を変えることができる。任意の化合物に関して、最初に細胞培養アッセイから治療上有効な用量を推定することができる。用量を動物モデルにおいて処方して、細胞培養において決定されるようなＩＣ５０（すなわち病徴の最大半量の阻害を達成する被験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成することができる。かかる情報を用いてさらに正確にヒトにおける有用な用量を決定することができる。例えば高速液体クロマトグラフィーにより血漿中のレベルを測定することができる。
【０１８４】
ここで本発明を一般的に記載しているが、本発明の特定の態様および実施態様の説明の目的のためだけに含まれ、いかなるようにも本発明を限定すると意図されるものではない以下の実施例を参照することにより、それはさらに容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０１８５】
実施例１
サーチュインモジュレーターの調製
１．ａ  ６−（２−ニトロ−フェニル）−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−３−カルボン酸エチルエステルの調製
【０１８６】
【化１】
2010524432.tif 000004
典型的な調製では、２−アミノチアゾール−４−カルボン酸エチル（２．１ｇ、０．０１２３モル）を２−ブロモ−２’−ニトロアセトフェノン（３．０ｇ、０．０１２３モル）と共にメチルエチルケトン（２５ｍｌ）中に取った。反応混合物を還流下１８時間攪拌した。次いでそれを室温まで冷却し、ろ過していくらかの固体を除去した。ろ液を濃縮して６−（２−ニトロ−フェニル）−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−３−カルボン酸エチルエステル３．１０ｇを得た（Ｃ１４Ｈ１２Ｎ３Ｏ４Ｓに関する計算値：３１８．３、［Ｍ＋Ｈ］＋実測値：３１９）。
【０１８７】
１．ｂ  ［６−（２−ニトロ−フェニル）−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−３−イル］−メタノールの調製
【０１８８】
【化２】
2010524432.tif 000005
６−（２−ニトロ−フェニル）−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−３−カルボン酸エチルエステル（１４．５０ｇ、０．０４５８モル）を、ＮａＯＨ（７．３ｇ、４当量）を含有するＴＨＦ（１００ｍｌ）および水（１００ｍｌ）中に取った。反応混合物を室温で１８時間攪拌した。次に、それを濃縮した。水層をＣＨ２Ｃｌ２で１回洗浄し、次に６Ｎ  ＨＣｌで酸性にした。ろ過により固体を収集し、乾燥させて酸中間体７．４ｇを提供した。この材料（７．４ｇ、０．０２５６モル）をＮ−メチルモルホリン（２．８ｍｌ、０．０２５６モル）と共に無水ＴＨＦ（２００ｍｌ）中に取り、０℃まで冷却した。クロロギ酸イソブチル（３．３５ｍｌ、０．０２５６モル）を添加し、反応混合物を氷浴中で３時間攪拌した。ＮａＢＨ４（０．９７ｇ、０．０２５６モル）を水（３０ｍｌ）中の溶液として添加した。反応混合物を０℃で４５分間攪拌した。それを次いで室温まで加温し、濃縮した。水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮して粗製生成物を得た。クロマトグラフィーによる精製（Ｉｓｃｏ、ペンタン／酢酸エチルの混合物を使用）により［６−（２−ニトロ−フェニル）−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−３−イル］−メタノール５．２０ｇを得た（収率７４％）（Ｃ１２Ｈ１１Ｎ３ＯＳに関する計算値：２４５．３、［Ｍ＋Ｈ］＋実測値：２４６）。
【０１８９】
１．ｃ  ４−［６−（２−アミノ−フェニル）−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−３−イルメチル］−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの調製
【０１９０】
【化３】
2010524432.tif 000006
［６−（２−ニトロ−フェニル）−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−３−イル］−メタノール（１．０ｇ、３．６４ミリモル）をトリエチルアミン（０．５１ｍｌ、３．６４ミリモル）と共にＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍｌ）に溶解した。塩化メタンスルホニル（１当量、０．２８ｍｌ）を添加し、反応混合物を室温まで加温し、１５分間攪拌した。それを次いでブラインでクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮してメシル酸中間体を得た。この材料をトリエチルアミン（０．５１ｍｌ、３．６４ミリモル）およびＢｏｃ−ピペラジン（６８０ｍｇ、３．６４ミリモル）と共にＣＨ３ＣＮ（４ｍｌ）中に取り、室温で１日間攪拌した。反応混合物を濃縮し、得られた残留物をＣＨ２Ｃｌ２と水との間で分配した。有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮して生成物の実質的な定量的収率が得られた。この材料を水硫化ナトリウム水和物（２００ｍｇ）と共にメタノール（６ｍｌ）および水（１ｍｌ）中に取った。得られた反応混合物を還流下２４時間攪拌した。それを次いで室温まで冷却し、濃縮した。得られた残留物を水（２ｍｌ）で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮して４−［６−（２−アミノ−フェニル）−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−３−イルメチル］−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル０．９０ｇを得た（Ｃ２１Ｈ２７Ｎ５Ｏ２Ｓに関する計算値：４１３．５、［Ｍ＋Ｈ］＋実測値：４１４）。
【０１９１】
１．ｄ  化合物１の調製
【０１９２】
【化４】
2010524432.tif 000007
４−［６−（２−アミノ−フェニル）−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−３−イルメチル］−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．２５ミリモル）を塩化２−キノキサロイル１当量（５０ｍｇ）と共にピリジン１ｍｌ中に取った。反応混合物をＢｉｏｔａｇｅマイクロ波リアクター中で加熱した（１６０℃で１０分間）。それを次いで室温まで冷却し、濃縮した。得られた粗製生成物をクロマトグラフィー（Ｉｓｃｏ、グラジエント溶出、ＣＨ２Ｃｌ２から９５％ＣＨ２Ｃｌ２、４％メタノールおよび１％トリエチルアミンまで）。次いで精製された生成物をＣＨ２Ｃｌ２（２ｍｌ）中２５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する溶液と２時間処理した。それを次いで濃縮し、得られた残留物をエチルエーテルで粉砕して望ましい生成物をＴＦＡ塩として得た（Ｃ２５Ｈ２３Ｎ７ＯＳに関する計算値：４６９．５、［Ｍ＋Ｈ］＋実測値：４７０）。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１３．９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），９．８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），９．６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）８．９−７．２（ｍ，１１Ｈ），４．８（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）。分析用ＨＰＬＣを３．５ｕｍ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８（４．６ｍｍ×１００ｍｍ）カラムを装着したＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣにおいて以下の条件で実施した：アセトニトリル／Ｈ２Ｏ、０．１％ギ酸移動相で修飾。グラジエント溶出は５％維持（２分）、５％から９５％グラジエント（１１分）、９５％から５％グラジエント（０．３分）、および５％維持（２．７分）、全実行時間は１５分間、流速０．８  ｍｌ／分であった。保持時間は３．０４分であった。
【０１９３】
１．ｅ  化合物２の調製
【０１９４】
【化５】
2010524432.tif 000008
３ｍｌのアセトニトリル中、３−クロロメチル−６−（２−ニトロ−フェニル）−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール（０．２００ミリモル）をトリエチルアミン（１４０μｌ、１ミリモル）で中和し、ｔｅｒｔ−ブチルピペリジン−４−イル−カルバマート（４４ｍｇ、１．１当量）を添加した。反応物を１１０℃で３０分間マイクロ波加熱し、濃縮乾固した。残留物を酢酸エチル中に取り、飽和ＮａＨＣＯ３、水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮乾固して｛１−［６−（２−ニトロ−フェニル）−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−３−イルメチル］−ピペリジン−４−イル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを得た。
【０１９５】
上記の生成物をエタノール：テトラヒドロフラン２：１に溶解し、水素（１気圧）下炭素（１５ｍｇ、触媒）上１０％パラジウムと共に４８時間攪拌した。溶液をＣｅｌｉｔｅ（商標）に通してろ過し、濃縮乾固し、ＣＨ２Ｃｌ２およびペンタンで追跡して｛１−［６−（２−アミノ−フェニル）−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−３−イルメチル］−ピペリジン−４−イル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを赤色油状物として得た。
【０１９６】
前記のアニリンをピリジン（４ｍｌ）に溶解し、塩化２−キノキサロイル（４６ｍｇ、１．２当量）と共に室温で１８時間攪拌した。メタノール（１ｍｌ）を入れ、反応混合物を濃縮乾固した。Ｂｏｃ保護された生成物をシリカゲル（ＣＨ２Ｃｌ２中０から５％メタノールグラジエント）で精製し、ＣＨ２Ｃｌ２中２５％ＴＦＡで１時間処理し、濃縮乾固し、ＣＨ２Ｃｌ２／ペンタンで追跡し（３回）、調製用ＨＰＬＣで精製した。純粋な分画を４Ｎ  ＨＣｌ（５滴）の存在下で凍結乾燥してキノキサリン−２−カルボン酸｛２−［３−（４−アミノ−ピペリジン−１−イルメチル）−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−６−イル］−フェニル｝−アミドを黄色固体として得た（３６．２ｍｇ）。（ＭＳ、［Ｍ＋＋Ｈ］＝４８４．２）。
【０１９７】
実施例２
食餌誘発肥満モデルを用いたサーチュインバイオマーカーの同定
２．ａ  食餌誘発肥満モデル
食餌誘発肥満のマウスモデルを用いて、２つの化学的に関連性のないサーチュイン活性化因子での投与後のマウスにおけるサーチュインバイオマーカーを同定した。肥満およびＩＩ型糖尿病は動物モデル、特にマウスにおいて集中的に研究されている。かかるモデルの１つは一般的に食餌誘発肥満（ＤＩＯ）モデルと称される。典型的には、Ｃ５７ＢＬ／６の雄に高脂肪食を８〜１２週間与えることで、結果的に肥満の軽度から中度の高血糖および糖不耐性になる。次いで、これらのマウスを用いて肥満およびＩＩ型糖尿病の遺伝的および生理学的メカニズムを研究する。
【０１９８】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス５１匹を６０％ｋｃａｌ高脂肪食で開始する。ＤＩＯマウスの平均体重が４０ｇになるまで、高脂肪食でおよそ７週間、週１回マウスの体重を測定する。研究を平均体重／ケージを有する群あたり１８匹のマウスの３群に分ける。動物を以下のように１日１回経口投与する：レスベラトロールを２％ＨＰＭＣ／０．２％ＤＯＳＳ中１０００ｍｇ／ｋｇ、化合物１を２％ＨＰＭＣ／０．２％ＤＯＳＳ中１００ｍｇ／ｋｇおよびベヒクル対照動物に２％ＨＰＭＣ／０．２％ＤＯＳＳ。各群に関して毎週平均体重にしたがって化合物の濃度を適切な用量に調整する。典型的には、マウスに午前に投与し、１６時間絶食の後の日には午後のみに投与する。各群を３、１６および４２日収集時点に関して３つの亜群に分ける。
【０１９９】
一旦投与を開始すると、データ収集は以下のとおりである。第３日：投与後１時間に各群からの６匹のマウスからの組織、血液およびグルコースを収集する。また残りの群から食後グルコースを取る。第１３日：腹腔内糖耐性試験（ＩＰＧＴＴ）。第１６日：投与後１時間に各群からの６匹のマウスからの組織、血液およびグルコースを収集する。また残りの群から食後グルコースを取る。第２８日：空腹時グルコース。第４２日：投与後１時間に各群からの６匹のマウスからの組織、血液およびグルコースを収集する。
【０２００】
２．ｂ  エンドポイント収集
白血球（ＷＢＣ）収集のための最終採血ならびに肝臓、腓腹筋および精巣上体白色脂肪組織の切開。ＷＢＣ試料および組織試料からの全ＲＮＡを標準的な技術で抽出する（例えばＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏ−ｔｏ−Ｍｉｄｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１２１８３−０１８）。
【０２０１】
２．ｃ  マウスＷＢＣの単離
血液をクエン酸ナトリウムが入ったＢＤ（登録商標）Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴ（商標）細胞調製チューブ（ＢＤ  ＲＥＦ３６２７６０）内に置く。試料を１７００ｇで２０分間遠心して赤血球（ＲＢＣ）をペレット化する。ＷＢＣ、血小板および血漿を含有する上澄を取り出し、氷上で保存する。次いで試料をＰＢＳで希釈し、３００ｇ、４℃で１５分間遠心してＷＢＣをペレット化する。ペレットをＰＢＳで１回洗浄し、次にＷＢＣペレットを凍結培地（Ｌ−グルタミン含有およびフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０＋１０％（最終）ＤＭＳＯ）５００μｌに再懸濁し、用時まで凍結保存する。
【０２０２】
実施例３
Ｓｉｒｔ１エキソビボ活性化後の遺伝子発現レベルの分析
新たに単離されたヒト白血球を２つの化学的に関連性のないＳｉｒｔ１活性化因子と共にエキソビボでインキュベートし、遺伝子発現における変化を決定した。
【０２０３】
３．ａ  ヒトＷＢＣの単離
全血およそ６ｍｌを入手し（ヘパリンナトリウム含有ＢＤ（登録商標）Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴ（商標）細胞調製チューブ（ＢＤ  ＲＥＦ３６２７５３））、反転させて混合し、１７００ＲＣＦ（３１００ＲＰＭ）、室温で（１８−２５℃）で２０分間遠心する。
【０２０４】
血漿を除去し、ＷＢＣ、血小板およびいくらかの血漿を含有する細胞相を新たな管に移し、ＰＢＳで希釈し、３００ＲＣＦ（１２００ＲＰＭ）で室温で（１８−２５℃）１５分間遠心する。細胞ペレットをＰＢＳで少なくとも２回洗浄し、次に凍結培地（ＦＢＳ不含）１ｍｌに再懸濁し、用時まで−８０℃で保存する。血液６ｍｌは、ＷＢＣ約１００万〜１０００万個を生じ、全ＲＮＡ約０．４から４μｇ、全細胞タンパク質４から４０μｇおよびＳＩＲＴ１タンパク質０．０１５から０．１５ｎｇを含有する。
【０２０５】
３．ｂ  ＷＢＣのエキソビボインキュベーション
新たに単離されたＷＢＣをＨＢＳＳバッファー（カルシウムおよびマグネシウムを含有するがフェノールレッド不含のハンクス平衡塩溶液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１４０２５０７６）に再懸濁する。血液６〜８ｍｌから単離されたＷＢＣ、すなわちＷＢＣ約１００万から１０００万個にＨＢＳＳ３ｍｌを用いる。ＷＢＣ懸濁液１ｍｌを１４０００ｇで５分間遠心して細胞をペレット化する。上澄を捨て、ＷＢＣペレットを凍結し、さらなる分析まで−８０℃を維持する。
【０２０６】
ＳＩＲＴ１活性化因子（Ｓｉｒｔｒｉｓ化合物、例えば５０μＭレスベラトロールまたは２μＭ化合物２）またはベヒクル（例えばＤＭＳＯ最終濃度０．２５％）の入った２４ウェル細胞培養プレートの１つのウェルにＷＢＣ懸濁液１ｍｌを添加する。細胞培養プレートを穏やかにかき混ぜながら３７℃および５％ＣＯ２で２時間から２０時間インキュベートする。次いで細胞懸濁液をウェルから取り出し（各ウェル／試料別個に）、１４０００ｇで５分間の遠心によりペレット化する。ペレットを凍結し、さらなる分析まで−８０℃を維持する。
【０２０７】
ＷＢＣ試料から全ＲＮＡを標準的な技術（例えばＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏ−ｔｏ−Ｍｉｄｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１２１８３−０１８）を用いて抽出する。精製されたＲＮＡを用いてＳＩＲＴ１活性化因子（またはベヒクル）に暴露されたＷＢＣ中のＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質−１）ｍＲＮＡレベルを逆転写、リアルタイムＰＣＲで決定する。
【０２０８】
実施例４
アレイを用いる遺伝子発現分析
前記の実施例２（化合物１またはレスベラトロールのいずれかでのインビボ処理後のマウス組織）または前記の実施例３（化合物２またはレスベラトロールのいずれかでのエキソビボ処理後のヒトＷＢＣ）のいずれかから単離された全ＲＮＡを、マウスまたはヒトゲノムのいずれかに特異的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐを用いて分析した。具体的にはマウスゲノム分析をＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｉｎｃ．（ダラム、ノースカロライナ州）でその全転写物基盤ＲＮＡ発現プロファイリングサービスを用いて行った。ヒトゲノム分析はＢｅｔｈ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ（カタログ番号９００４７０、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ）を用いて行った。
【０２０９】
ヒトおよびマウス遺伝子チップ分析の結果は、表１（図１）に示され、それは新たに単離されたヒトＷＢＣを用いるインビトロ研究およびマウスモデルを用いるインビボ研究からの結果をまとめる。ヒトＷＢＣをレスベラトロールまたは化合物２で処理した；マウスモデルをレスベラトロールまたは化合物１で処理した。表１は、化合物１または化合物２およびレスベラトロールでの処理時に２倍以上大きく上方または下方に変化した発現レベルを示す４３のバイオマーカーを列挙する。具体的には、その発現が双方の化合物（すなわちマウス組織で化合物１およびレスベラトロールまたはヒトＷＢＣに関して化合物２およびレスベラトロール）での処置時に２倍を超えて上方または下方に変化したのみならず、最も堅調なまたは再現性のある応答を実証した好ましいバイオマーカー（「＊＊＊」で標識）を示す。好ましいバイオマーカーはヒトＷＢＣ実験の実験全体にわたって変動性が低く最も高く倍変化したか、またはマウスインビボ実験で目的の組織における最も高い倍変化を実証したかのいずれかであった。ＭＣＰ−１発現は一貫してヒトおよびマウス試料の双方において全被験化合物で少なくとも２から１４倍の下方調節を示した。
【０２１０】
レスベラトロールで処置された３日肝臓における遺伝子発現の変化の全体的なパターンの分析により、１）インスリン抵抗性の低下を示唆し得る炎症性シグナリングの低下；２）グルコース恒常性およびストレス応答経路に関与する肝性転写因子の活性増大；ならびに３）脂質代謝およびミトコンドリアバイオジェネシスを制御するＰＧＣ１ａおよびＰＰＡＲファミリーメンバーの活性増大；が実証された。３日間で肝臓に及ぼすレスベラトロールの効果は、大部分はレスベラトロールおよびカロリー制限の効果についての文献において公知のものと合致する。レスベラトロールまたは化合物１の後に３日肝臓における遺伝子発現における変化の全体的なパターンの直接比較により１）レスベラトロールおよび化合物１は３日間の処置の後、肝臓において類似の結果を有する傾向がある；ならびに２）これらの結果はレスベラトロールおよびカロリー制限の効果に合致することが示唆される。
【０２１１】
実施例５
ＰＣＲを用いる遺伝子発現分析
前記の実施例３（化合物２またはレスベラトロールのいずれかでのエキソビボ処置後のヒトＷＢＣ）から単離された全ＲＮＡを、ＭＣＰ−１遺伝子および１８Ｓ  ｒＲＮＡに特異的なオリゴプライマー対およびＴａｑＭａｎプローブで逆転写、リアルタイムＰＣＲを用いて分析した。ＭＣＰ−１  ｍＲＮＡのレベルは１８Ｓ  ｒＲＮＡのレベルに相対して表された。ベヒクルと共にインキュベートされたＷＢＣ（２０時間）と比較してレスベラトロール（５０μＭ）に暴露されたＷＢＣはＭＣＰ−１  ｍＲＮＡレベルを５から６５７２倍まで低下させた。
【０２１２】
５．ａ  ヒトＭＣＰ１オリゴ対：
【０２１３】
【数２】
2010524432.tif 000009
以下のオリゴを用いてヒトＭＣＰ１メッセージに相当するＰＣＲシグナルの定量化を行った：
【０２１４】
【数３】
2010524432.tif 000010
５．ｂ  マウスＭＣＰ１オリゴ
【０２１５】
【数４】
2010524432.tif 000011
以下のオリゴを用いてマウスＭＣＰ１メッセージに相当するＰＣＲシグナルの定量化を行った：
【０２１６】
【数５】
2010524432.tif 000012
実施例６
ＰＣＲを用いるＦＧＦ２１発現分析
６．ａ  食餌誘発肥満モデル
実施例２で用いたような食餌誘発肥満（ＤＩＯ）モデルを使用した。
【０２１７】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス５１匹を６０％ｋｃａｌ高脂肪食で開始する。ＤＩＯマウスの平均体重が４０ｇになるまで、高脂肪食でおよそ７週間、週１回マウスの体重を測定する。研究を平均体重／ケージを有する群あたり１８匹のマウスの３群に分ける。動物を以下のように１日１回経口投与する：レスベラトロールを２％ＨＰＭＣ／０．２％ＤＯＳＳ中１０００ｍｇ／ｋｇ、化合物１を２％ＨＰＭＣ／０．２％ＤＯＳＳ中１００ｍｇ／ｋｇおよびベヒクル対照動物に２％ＨＰＭＣ／０．２％ＤＯＳＳ。各群に関して毎週平均体重にしたがって化合物の濃度を適切な用量に調整する。典型的にはマウスに午前に投与し、１６時間絶食の後の日には午後のみに投与する。投与の第３日に、投与後１時間にマウスから肝臓組織を収集する。
【０２１８】
６．ｂ  エンドポイント収集
肝臓を実施例２におけるように単離する。肝臓試料からの全ＲＮＡを標準的な技術で抽出する（例えばＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏ−ｔｏ−Ｍｉｄｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１２１８３−０１８）。
【０２１９】
６．ｃ  ＦＧＦ２１発現の分析
複数の遺伝子の発現を実施例におけるようなマイクロアレイにより決定した。この実験で決定されたＦＧＦ２１遺伝子発現を図２に示す。図２で説明されるように、ＦＧＦ２１  ｍＲＮＡレベルはレスベラトロール処置および化合物１処置マウスにおいて対照マウスよりも著明に高い。これによりＦＧＦ２１がＳＩＲＴ１活性のバイオマーカーであり、ＦＧＦ２１  ｍＲＮＡレベルの上昇がＳＩＲＴ１活性の上昇を示すことが示される。
【０２２０】
実施例７
ＳＩＲＴ１過剰発現はＦＧＦ２１上方調節に至る
７．ａ  細胞培養
Ｒａｔ  Ｈ４ＩＩＥ肝臓の肝細胞腫細胞をＡＴＣＣ（＃ＣＲＬ−１５４８）から購入した。１０％ウシ胎仔血清（低エンドトキシン；ベンチマーク；Ｇｅｍｉｎｉ  ＃１００−１０６）を伴うＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１９９５）で補充されたＤＭＥＭ中で細胞を維持した。
【０２２１】
７．ｂ  Ｈ４ＩＩＥ細胞におけるＳＩＲＴ１の過剰発現
キットＶを伴うＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、製造者のプロトコールを用いてラットＨ４ＩＩＥ細胞をトランスフェクトした。プラスミドトランスフェクションには１μｇ／ウェルｐＣＭＶ−ＧＦＰ、１μｇ／ウェルｐＣＭＶ−ＳＩＲＴ１または５μｇ／ウェルＳＩＲＴ１が含まれた。細胞をウェルあたり２×１０６の密度で６ウェル皿に蒔いた。トランスフェクション後２４時間に細胞を収集し、タンパク質発現をイムノブロッティングにより分析した。ＦＧＦ２１遺伝子発現レベルをリアルタイムＰＣＲにより測定した。
【０２２２】
７．ｃ  リアルタイムＰＣＲ分析
Ｐｕｒｅ  Ｌｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏ  ｔｏ  Ｍｉｄｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２１８３−０１８）を用いて細胞ペレットからＲＮＡを単離した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３６８８１３）を用いて精製されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムＰＣＲ反応を実施し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて分析した。
【０２２３】
ＦＧＦ２１発現を各試料からの対応する１８Ｓ  ＲＮＡ発現値に正規化した。各々の独特な処置に関して２検体ずつの試料を作成し、各試料を２検体ずつでＲＴ−ＰＣＲ用に処理した。
【０２２４】
ＲＴ−ＰＣＲプライマーおよびプローブをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより合成した。ラットＦＧＦ２１プローブを５’末端で６−ＦＡＭ（商標）色素（６−カルボキシフルオレセイン）を用いて、３’末端でＢＨＱ−１（Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｒｅｒ−１（商標））を用いて標識した。ラット１８Ｓ  ＲＮＡプローブを５’末端でＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）を用いて、３’末端でＢＨＱ−１を用いて標識した。
【０２２５】
図３で示されるように、ＦＧＦ２１遺伝子発現は対照細胞においてよりもＳＩＲＴ１を過剰発現する細胞においてより高い。このデータにより、ＦＧＦ２１はＳＩＲＴ１活性のバイオマーカーであり、ＦＧＦ２１レベルの上昇はＳＩＲＴ１活性の上昇を示すことが確認される。
【０２２６】
７．ｄ  プライマーおよびプローブ配列：
ラットＦＧＦ２１に関して：
【０２２７】
【数６】
2010524432.tif 000013
ラット１８Ｓ  ＲＮＡに関して：
【０２２８】
【数７】
2010524432.tif 000014
参照による援用
各個々の出版物または特許は参照により援用されることが具体的に、および別個に示されるかのように、以下に列挙される項目を含む本明細書にて言及される全ての出版物および特許はその全てにおいて参照により援用される。矛盾する場合、本明細書における任意の定義を含む本出願が制御するであろう。
【０２２９】
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）（ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）および／またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）により維持されるもののような、公開データベースにおけるエントリーに対応する受け入れ番号を参照する任意のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列もまたその全てにおいて参照により援用される。
【図１−１】
2010524432.tif 000015
【図１−２】
2010524432.tif 000016
【図１−３】
2010524432.tif 000017
【図１−４】
2010524432.tif 000018
【図１−５】
2010524432.tif 000019
【図１−６】
2010524432.tif 000020
【図１−７】
2010524432.tif 000021
【図１−８】
2010524432.tif 000022
【図１−９】
2010524432.tif 000023
【図１−１０】
2010524432.tif 000024
【図２】
2010524432.tif 000025
【図３】
2010524432.tif 000026
【配列表】
2010524432000001.app
【国際調査報告】
2010524432.tif 000027
2010524432.tif 000028
2010524432.tif 000029
2010524432.tif 000030
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