(57)【要約】天然型hCFTR cDNAと比較して、投与マウス肺および培養下のヒト細胞において顕著に高いレベルのhCFTR mRNAおよびタンパク質を生成する合成型hCFTR DNA配列を開発した。この合成DNAは、cDNA合成の間に導入される早期転写切断部位等の、ある天然型cDNAに固有の問題に対処する。mRNAがプロセシングされるまで、イントロンは最初にmRNAに存在する。プロセシングされたmRNAから生成されるcDNAは、イントロンを有さない。したがって、DNA配列（エクソン結合体）は、本来は細胞中に存在しないcDNA分子中に存在する。これらエクソン結合体は転写に影響を及ぼし得る。CFTRの発現を改善するための方法は、cDNA分子の配列の変化に基づく。本改善方法を、インビボ発現の試みでは効果がない他のcDNA分子に応用してもよい。この配列の変化を具体化した組成物は、cDNA分子由来のトランスジェニックmRNAおよびタンパク質の両方の産生を増加させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：1もしくは2（DNA）または配列番号：3もしくは4（RNA）に示される配列を含む核酸分子を含む組成物。
【請求項２】
配列が配列番号：1である、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
配列が配列番号：2である、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
配列が配列番号：3である、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
配列が配列番号：4である、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
核酸分子が非ウイルスベクターである、請求項1記載の組成物。
【請求項７】
核酸分子がウイルスベクターである、請求項1記載の組成物。
【請求項８】
前記核酸分子を発現する細胞を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項９】
前記核酸分子を発現する細胞を含む哺乳動物をさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１０】
配列番号：1もしくは2（DNA）または配列番号：3もしくは4（RNA）に示される配列を含む核酸分子を含む組成物を哺乳動物細胞に導入する工程であって、それによって該細胞がhCFTRをコードする、mRNAおよびhCFTRタンパク質を発現する工程
を含む、hCFTRをコードするmRNAおよびhCFTRタンパク質を生成する方法。
【請求項１１】
細胞がヒト細胞である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
細胞が肺細胞である、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
細胞がヒト肺にある、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
細胞が嚢胞性線維症の動物モデル中の肺細胞である、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
ヒト肺が嚢胞性線維症患者にある、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
組成物がエアロゾールを介して導入される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
核酸分子がポリカチオンを有する粒子中に詰められており、該粒子が核酸に対して単分子である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
ヒト細胞が嚢胞性線維症患者にある、請求項11記載の方法。
【請求項１９】
核酸分子がポリカチオンを有する粒子中に詰められており、該粒子が核酸に対して単分子である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
組成物がエアロゾールを介して導入される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
組成物が静脈内に導入される、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
組成物が内視鏡的逆行性胆道膵管造影法（ERCP）によって導入される、請求項19記載の方法。
【請求項２３】
組成物が膵臓に直接導入される、請求項19記載の方法。
【請求項２４】
組成物が子宮内で胎児に導入される、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
配列番号：1もしくは2（DNA）または配列番号：3もしくは4（RNA）に示される配列を含む核酸分子を含む組成物を、エアロゾールを介してヒト嚢胞性線維症患者内のヒト肺細胞に導入する工程であって、該核酸分子がポリカチオンを有する粒子中に詰められており、該粒子が核酸に対して単分子であり、それによって該細胞がhCFTRをコードするmRNAおよびhCFTRタンパク質を発現する、工程
を含む、hCFTRをコードするmRNAおよびhCFTRタンパク質を生成する方法。
【請求項２６】
早期転写終結シグナルの存在を確認するためにcDNA分子を調べる工程；
該cDNA分子の早期転写終結シグナルを、そのコードするアミノ酸配列を変えることなく除去する工程；
該cDNAを細胞内に導入し、それによってそれが発現される工程
を含む、cDNA分子由来のmRNAまたはタンパク質の発現を増加させる方法。
【請求項２７】
cDNAがCFTRをコードする、請求項26記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2006年10月12日に提出された仮出願第60/851,055号、2007年1月19日に提出された仮出願第60/885,827号、および2007年4月19日に提出された仮出願第60/907,852号の恩典を主張する。それぞれの開示内容は、本明細書中に明示的に組み入れられる。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は嚢胞性線維症の分野に関する。とくに、本発明は嚢胞性線維症および他の疾患のための遺伝子治療ベクターの分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
嚢胞性線維症は、膜結合型塩素チャネルである嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御（CFTR）遺伝子における種々の変異によって引き起こされる。CFの変異は、濃厚な高粘性の肺粘液をもたらし、再発性の肺感染症、その結果生じる構造的な肺損傷、および最終的には呼吸不全を引き起こす。CFを有する患者はまた、結果として栄養不良および糖尿病を生じる膵臓の消化酵素およびインシュリンの不十分な放出を含む、高粘性の分泌物による気道の閉塞が原因の他の兆候を呈する。大部分のCF患者は、膵酵素補給剤の摂取を必要とする。CF患者の平均生存率は30代半ばである。
【０００４】
CFの肺の兆候に対処するには、一般的に、肺上皮近位部、さらに場合によっては導管上皮近位部にもhCFTR（ヒトCFTR）の発現を得る必要があると考えられている。内在性CFTR mRNAレベルの10%での外因性CFTRの発現レベルが治療になり得る。Davis, P.B., Centennial Review, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 173: 475-482, 2006（非特許文献1）を参照されたい。この評価は、低レベルのCFTR mRNAしかないものの無症候であるCFキャリアの種々の亜集団におけるCFTR mRNAのレベルに基づく。この試算を支持する別のデータとして、組織培養モデルにおける測定、および正常CFTR mRNAが約6〜10%の場合にはCl-チャネル異常の電気補正（electrical correction）の証拠が含まれる。
【０００５】
大部分の患者では、肺の下層上皮細胞への有効な遺伝子導入を阻害する可能性のある濃厚な粘液でCFの気道が覆われている。したがって、このような生理的障害に対処する期待される遺伝子導入システムが、有効なCF遺伝子治療に重要であり得る。先行研究は、ナノ粒子ベクターをCF被験体の鼻孔内の呼吸上皮細胞に効率的にトランスフェクトすることを示している［Konstan MW, Davis PB, Wagener JS, Hilliard KA, Stern RC, Milgram LJ, Kowalczyk TH, Hyatt SL, Fink TL, Gedeon CR, Oette SM, Payne JM, Muhammad O, Ziady AG, Moen RC, Cooper MJ. 「Compacted DNA nanoparticles administered to the nasal mucosa of cystic fibrosis subjects are safe and demonstrate partial to complete cystic fibrosis transmembrane regulator reconstitution.」Hum Gene Ther. 2004 Dec; 15 (12): 1255-69（非特許文献2）］。
【０００６】
最初の鼻腔内投与第一相臨床試験が終了し、有望な結果が提供されており；該DNAナノ粒子に起因する有害事象はなく、8/12の被験体は鼻電位差測定による評価でCFTR塩素チャネル機能の改善を示した。さらに、4/12の被験体は正常範囲内の鼻電位差（NPD）値を示した［Konstan et al., 前記参照（非特許文献2）］。
【０００７】
当技術分野では、有意なレベルのCFTR発現を達成して臨床的に測定可能な改善を提供できるように、既存のベクターを改善する必要性が引き続き存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Davis, P.B., Centennial Review, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 173: 475-482, 2006
【非特許文献２】Konstan MW, Davis PB, Wagener JS, Hilliard KA, Stern RC, Milgram LJ, Kowalczyk TH, Hyatt SL, Fink TL, Gedeon CR, Oette SM, Payne JM, Muhammad O, Ziady AG, Moen RC, Cooper MJ. 「Compacted DNA nanoparticles administered to the nasal mucosa of cystic fibrosis subjects are safe and demonstrate partial to complete cystic fibrosis transmembrane regulator reconstitution.」Hum Gene Ther. 2004 Dec; 15 (12): 1255-69
【発明の概要】
【０００９】
本発明の一態様に従って、配列番号：1もしくは2（DNA）または配列番号：3もしくは4（RNA）に示される配列を含む核酸分子を含む組成物を提供する。
【００１０】
別の態様に従って、hCFTRをコードするmRNAおよびhCFTRタンパク質を生成するための方法を提供する。配列番号：1もしくは2（DNA）または配列番号：3もしくは4（RNA）に示される配列を含む核酸分子を含む組成物は、哺乳動物細胞内に導入される。該配列は、発現制御配列へ機能的に連結され得る。前記導入の結果として、該細胞はhCFTRをコードするmRNAおよびhCFTRタンパク質を発現する。
【００１１】
本発明のさらに別の態様に従って、hCFTRをコードするmRNAおよびhCFTRタンパク質を生成するための方法を提供する。配列番号：1もしくは2（DNA）または配列番号：3もしくは4（RNA）に示される配列を含む核酸分子を含む組成物は、エアロゾールを介してヒト嚢胞性線維症患者におけるヒト肺細胞内に導入される。該配列は、発現制御配列へ機能的に連結され得る。該核酸分子はポリカチオンを有する粒子中に詰められ、該粒子は核酸に対して単分子である。前記導入の結果として、該細胞はhCFTRをコードするmRNAおよびhCFTRタンパク質を発現する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、cDNA分子由来のmRNAまたはタンパク質の発現を増加させる方法を提供する。早期転写終結シグナルの存在を確認するためにcDNAを調べる。該cDNA分子の早期転写終結シグナルは、そのコードするアミノ酸配列を変えることなく除去され、それにより改変配列を有するcDNA分子が形成される。改変配列を有するcDNA分子は、それが発現される細胞内に導入される。
【００１３】
本明細書を読んだ上で当業者に明らかになるであろうこれらの態様および他の態様は、遺伝子治療およびタンパク質発現に関する改良された方法および試薬を当技術分野に提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】圧縮pCMVCFTR、pUCF、およびpUCF2プラスミドを鼻腔内投与されたマウスの肺におけるhCFTR/mCFTR mRNAレベルのプロット。pCMVCFTRおよびpUCFの両方は同一の「天然型」CFTR cDNAを含むのに対し、pUCF2には、コドンが最適化され、CpGを欠失し（3'末端の1つのCpGを除いて）、かつ5’および3’UTRが切断されたインビトロ合成DNAが含まれる。投与の2日後および14日後に、hCFTR mRNA発現のqRT-PCR解析用に肺を採取し、hCFTR/mCFTR比として表にした。唯一の統計学的な有意差（マン・ホイットニー検定）は、14日目のpUCF2とpCMVCFTRとの間（p2＝0.032）、および14日目のpUCF2とpUCFとの間（p2＝0.040）であった。2日目のpCMVCFTRとpUCF2を含め、他のすべての一対比較は有意でなかった。N＝9/グループ。
【図２】pUCF、pUCF2、または対照pCMVCFTRプラスミドでトランスフェクションした2日後のHEK293細胞における、hCFTR発現のIP／ウエスタンブロット解析。細胞を、リポフェクタミンと低量（L, 0.75μg）もしくは多量（H, 3μg）のCFTRプラスミドのいずれかとでトランスフェクトした。Luc：ルシフェラーゼプラスミドでトランスフェクトされた細胞。NT：トランスフェクトされていない。IPおよび検出手順の両方で、コドン590〜830のRドメインに対する抗CFTRモノクローナル抗体1660（R&D Systems）を用いた。
【図３】hCFTRに対するELISAアッセイ。pUCF2でトランスフェクトされたHEK293細胞を用いた検量線。
【図４】圧縮pUCF22を投与されたマウスの肺における2日目および14日目のhCFTR/mCFTR mRNAのプロット。比較のために、pCMVCFTR、pUCF、およびpUCF2のデータを含む。pCMVCFTRおよびpUCFの両方は同一の「天然型」CFTR cDNAを含むのに対し、pUCF2には、コドンが最適化され、CpGを欠失し（3'末端の1つのCpGを除いて）、かつ5’および3’UTRが切断されたインビトロ合成DNAが含まれる。pUCF22はpUCF2のCO-CFTRを含むが、CpGを完全に欠失している。さらに、pUCF22はR6K複製起点、KmR、およびKmプロモーターを含む。鼻腔内に100μgの投与を受けた他のグループとは異なり、pUCF22マウスは気管内経路によって200μgのDNAを受けた。予想どおり、このグループには「失敗投与（missed dose）」はなく、グループごとの分散は鼻腔内投与のものに対するよりも小さい。N＝6/時点。
【図５】pCMVCFTR、pUCF、およびpUCF2由来のhCFTR転写産物を増幅するために用いたプライマーおよびプローブ。G、L、およびMセットはスプライスされた転写産物を適切に検出し、3’のC、J、およびKセットはこれらのプラスミドから生成された全長hCFTR mRNAを検出するためにすでに用いられている（図1、4）。
【図６】pCMVCFTR、pUCF、およびpUCF2によって生成されるhCFTR転写産物の提案されるクラス。
【図７】転写終結配列。（図7A）典型的な真核生物の転写終結配列は、ウリジンリッチエレメント（URE）の前に「AAUAAA」を含み、これら2つのモチーフの間に好ましい切断部位（A>U>C>>G）を有する［2］。エレメント間の間隔を示す。（図7B）hCFTR cDNA（配列番号：6）の「AATAAA」配列は、+12における潜在的な切断部位「A」（太字で示す）とともに、+14bpで始まるUREエレメントを有する。UREの区間間隔はかなり多様であるものの［2］、このUREは「AAUAAA」部位に対する典型的なものよりも近い。（図7C）hCFTRゲノム配列（配列番号：7）は、エクソン7に「AATAAA」モチーフを有し、すぐその後にイントロン7（太字）が続く。UREの候補配列は次の81bpには観察されない。
【図８】本実験で用いた組換えコンストラクト：pUL、pUCF、pUCF22、pCMVCFTR、およびpUCF2を図解する。棒付きアイスのような形をしたものは、CpGジヌクレオチドを表す。
【図９】天然型cDNAと1つのCpGを有するCFTRの合成型DNAとの比較（それぞれ、配列番号：5および2）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明者らは、「天然型」hCFTR cDNA（すなわち、ナイーブmRNAから作製したcDNA；配列番号：5）と比較して、マウスの肺（mRNA）および細胞（タンパク質）においてmRNAおよびタンパク質レベルの改善をもたらす合成型CFTR DNA断片（「CO-CFTR」；配列番号：1および2）を開発した。この合成型CFTRセグメントは、コドンが最適化され（ゆえに、「CO」ラベル）、CpGを欠失し、内在性の5’および3’UTRが取り除かれており、かつ最適化Kozak配列を有している。ある種は1つのC末端CpGアイランドを有し（配列番号：2）、別の種はCpGアイランドを有していない（配列番号：1）。定量的RT-PCRのデータは、マウス肺において、「天然型」cDNAと比較してCFTR mRNAの35倍の増加を示している。免疫沈降ウエスタンブロットは、「天然型」cDNAと比較してCFTRタンパク質の9倍の改善を示している。トランスフェクトされたHEK293（ヒト腎臓）細胞におけるヒトCFTR ELISA（酵素結合免疫吸着法）は、「天然型」hCFTR cDNAをコードする類似プラスミドと比較してhCFTRタンパク質の〜19倍の増加を示している。
【００１６】
天然型と合成型hCFTR cDNAの間の該多数の相違点が理由で、該変化の1つまたは複数が発現の改善に寄与しているかまたはその原因となっているのか否かは明らかでない。本出願人はいかなる理論またはメカニズムに縛られることを意図しないが、該改善は、一部分には「天然型」cDNAにおける早期転写ターミネータの除去に起因している可能性がある。このターミネータはゲノムDNAには存在せず、それゆえ、トランスジェニックでない全動物に無関係である。本発明者らは、「天然型」cDNAにおいて、コドン最適化hCFTR DNAに存在しないそのような転写ターミネータを同定した。
【００１７】
本発明による核酸組成物は、固体（例えば、凍結乾燥したもしくは沈殿した）または液体であってもよく、またはエアロゾル化されていてもよい。それらは、RNA（例えば、配列番号：3および4）またはDNA（配列番号：1および2）であってよい。該組成物は、線状核酸断片であってよく、または線状であれ環状であれ、プラスミドもしくはウイルスベクター内に含まれていてもよい。多くのウイルスベクターが当技術分野において公知であり、それらはその公知の特性により当業者によって選択され得る。例示的なベクターを以下の実施例で使用しているが、他のものも同様に使用することができる。嚢胞性線維症治療のための非ウイルスベクターが、Alton, E.W.F.W., Proceedings of the American Thoracic Society, 1, 296-301, 2004で議論されている。
【００１８】
発現制御配列は当技術分野において公知であり、本発明において典型的に使用される。これらを使用して、転写を開始させ、促進し、もしくは終結させてもよく、または例えば翻訳を増進してもよい。これらはコード配列へ機能的に連結され、すなわち、それらは核酸分子上の必要な近傍内にあって、その機能に影響を及ぼす。これらエレメントの適切な配置は、当技術分野において周知である。
【００１９】
哺乳動物細胞は、本発明のヒト核酸分子の典型的な標的である。これらは、培養物、組織、かん流臓器、動物モデル全体、または患者もしくは対照個体にあり得る。嚢胞性線維症の場合、典型的な標的細胞は肺細胞または膵臓細胞である。肺および膵臓の上皮細胞および導管細胞がとくに標的になり得る。標的化は、該核酸の局所送達または導入によってもたらされ得る。他の送達手段は、静脈および内視鏡送達を含む。他の標的細胞には、消化管、内分泌系、および他の任意の患部器官もしくは器官系の細胞が含まれてよい。送達はまた、子宮内で胎児に実施することもできる。
【００２０】
該核酸ベクターを、当技術分野で公知の任意の手段によって送達してもよい。核酸を包装しかつ送達するための一つの方法は、圧縮ナノ粒子を介するものである。これらは、典型的にポリリジン等のポリカチオンで形成されている。ナノ粒子は、核酸一分子を有するように形成することができる。
【００２１】
以下の実験結果は、cDNAを作製することによって形成されたターミネータによる予想外の転写の早期終結が発現を阻害し得ることを示している。そのような偶発的ターミネータに着目し、それらを除去することで、発現を増加させることができる。これは、そのような偶発的ターミネータを含むcDNA分子のクラスにおいて発現を増加させる一般に有用な方法であり得る。ターミネータが存在するか否かを確認するために、問題のcDNA分子の配列を調べる。これは、目/手/ヒトの脳による、または機械/コンピュータによるものであってよい。転写終結シグナルの特徴は、当技術分野において周知である。「AAUAAA」の後に、典型的にウリジンリッチエレメント（URE）が存在する。切断部位は典型的に「AAUAAA」の11〜24塩基下流に存在し、URE配列は該切断部位の10〜30bp後に存在する。該シグナルの除去はその配列を十分に変化させることを伴い、それにより、それは転写終結シグナルとしてもはや機能しなくなる。該「除去された」cDNAは、その後細胞内に導入され、mRNAおよび/またはタンパク質の発現を促進し得る。
【００２２】
上記の開示内容は、概して本発明を説明している。本明細書に開示するすべての参考文献は、参照によって明示的に組み込まれているものとする。本明細書中に説明のみを目的として提供されており、本発明の範囲を制限することを意図していない以下の特定の実施例を参照することにより、より完全な理解が得られる。
【００２３】
実施例1：コドン最適化hCFTR cDNAの評価
hCFTR配列のコドン最適化は、トランスフェクトされた肺細胞において翻訳効率を改善し得るため、以下のhCFTR DNAを合成した。天然型hCFTR cDNAとコドン最適化hCFTR配列の解析を、以下に提示する。後者はまた、3’領域における1つのCpGアイランドを除いてCpGアイランドを欠失していた。他の種では、この1つのCpGアイランドを除去した（CpGアイランドなし）。
【００２４】
（表１）天然型hCFTR cDNA：CpGアイランド＝58
コドン使用表1
2010506838.tif 000002
【００２５】
（表２）コドン最適化およびCpGアイランド欠失hCFTR DNA：CpGアイランド＝1
コドン使用表2
2010506838.tif 000003
【００２６】
好ましいコドン使用が33.3％〜83.9％増加することに留意されたい。ヒトおよびマウスにおける好ましいコドン使用のパターンが非常に似ていることに留意されたい（18アミノ酸が同一で、プロリンとアルギニンに対してごくわずかな第二コドン選択性を有する）。
【００２７】
実施例2：天然型hCFTR cDNAをコードする発現ベクターの評価
本発明者らはまず、本発明者らの先のCMVCFTR臨床試験プラスミドを投与したマウスにおける2日目と14日目の肺採取物についてhCFTR mRNAレベルを評価した（図1）。9匹の投与マウスのうち2匹は、2日目と14日目の両方でhCFTRシグナルを示さず、これらの鼻腔内（IN）投与マウスにおける「失敗投与」または真の陰性と一致している。2日目に関するすべてのデータの平均hCFTR/mCFTR比は8.7％（+/- 6.7％, SD）であり、14日目までにこの比は0.06％（+/- 0.06％）に下がっていた。この実験を、CMVCFTRプラスミドに用いた同じCFTR cDNAで置換した、ルシフェラーゼを有するpULプラスミド（pUCF）の誘導体について繰り返した。pULにおけるルシフェラーゼ活性は、本発明者らの類似のCMVlucプラスミドに相当するが、hCFTR発現レベルは、2日目にpCMVCFTRよりも低く、hCFTR/mCFTR比は0.28％であり、14日目までに0.09％に下がっていた。pUCFに関するこの結果は期待はずれのものであり、以下に議論するいくつかの要因による可能性がある。
【００２８】
CFTR cDNA内のCpGモチーフおよび発現消滅へのそれらの潜在的影響；プロモーター転写効率；適切な転写後CFTR mRNAスプライシングおよび細胞質輸送とのその関連、二次構造に関連する転写後CFTR mRNAの安定性（コドン最適化の過程で変わる可能性がある）；ならびに、3’UTRにおける相互作用ドメインによって制御される転写後CFTR mRNAの安定性（Baudouin-Legros et al. (1) によって最近記載されている）を含め、hCFTR mRNA発現レベルには複数の要因が関与している可能性があることが理解される。タンパク質の発現レベルに関して、コドンの最適化と完全なKozakコンセンサス配列の存在の両方が重要である可能性が高い。これら要因のいくつかの影響を調節し、望ましくは改善するために、本発明者らは、3’末端に1つのCpGを有しかつ天然型5’および3’UTRを完全に欠失しているコドン最適化CFTR（CO-CFTR）DNAを設計した。表3は、pCMVCFTR、pUCF、およびpUCF2（CO-CFTRを含むpUCFの誘導体）の重要な特性を要約している。CO-CFTRは天然型CFTRとは異なるmRNA配列を有し、このことがその二次構造に関連したmRNAの安定性に影響し得る。留意すべきは、pCMVCFTRとpUCFの両方は、コード配列の最初の300bpに2つの潜在的な選択的スプライス受容部位を含んだ同一のCFTR配列を含むのに対し、CO-CFTRにはこの領域内に選択的スプライス受容部位は存在しないことであり、これは適切なスプライシングを最適化するのに重要であり得る知見である。また、これらのコンストラクトにおける5’および3’UTRの大きさにはごくわずかな違いしかなく、かつ本発明者らのベクターにおける天然型CFTR 3’UTRは、Baudouin-Legros et al.によって記載されているポリUまたはG調節領域を含んでおらず、そのため3’UTRが介在する転写後の安定性における相違は、議論の余地があると考えられることに留意されたい。最後に、天然型CFTR cDNAは部分的Kozak配列（agACCatg）を有するのに対し、CO-CFTRの設計には完全なKozak配列（CCACCatg）が含まれていた。
【００２９】
（表３）CFTR発現プラスミドの特徴
2010506838.tif 000004
†最初の300コード配列におけるスプライス受容コンセンサス配列の評価。
††5’および3’UTRに見られる天然型CFTR cDNAのbp数を参照している。
【００３０】
実施例3：合成型hCFTR DNAをコードする発現ベクターの評価
pUCF2をBalb/Cマウスに鼻腔内（IN）投与し、CFTR mRNAの評価のために2日目と14日目に肺を採取した。図1に示すように、pUCF2は2日目に9.8％（+/- 15％, SD）のhCFTR/mCFTR比をもたらし、これは14日目に0.72％（+/- 0.67％）に下がった。pUCF2についての2日目の平均シグナルはpCMVCFTRに相当し、hCFTR/mCFTR比＞5〜6％を有するCFTR発現の生物学的に有意なレベルに到達しつつある可能性がある。CFTR mRNA発現は維持されなかったものの、pUCF2についての14日目のhCFTR/mCFTR比は、pCMVCFTRおよびpUCFについてよりも有意に高く、これはCFTR発現を引き延ばす第一歩である。興味深いことに、pUCF2についての2日目の発現はpUCFについてよりも大幅に高く（35倍）、両プラスミドは他の点ではほとんど同一であるため、これはCO-CFTRに関係していると考えられる。この知見は、このベクターという背景において、CO-CFTR cDNAが天然型CFTR cDNAよりも効率的に転写および/またはプロセシングされることを示唆している。
【００３１】
実施例4：IP/ウエスタンブロット解析によりhCFTRタンパク質の増加をもたらす合成型hCFTR配列をコードするベクター
pUCFおよびpUCF2が介在するCFTRタンパク質の産生は、転写および翻訳効率の両方の相違と関係する可能性があることが理解される。これらのコンストラクトを直接比較するために、CFTR陰性のHEK293細胞をリポフェクタミンとpUCFもしくはpUCF2のいずれかとでトランスフェクトした。プレート間のトランスフェクション効率の差を最小限に抑えるために、各リポソーム/DNAトランスフェクション混合物には、等しい総量のプラスミドDNAであるが異なる量の試験プラスミド、等量のルシフェラーゼプラスミド（10ng, トランスフェクション効率を評価するため）、および適当な量の「充填」プラスミド（Bluescript）を含めた。トランスフェクションの2日後に、ライセートを調製し、ルシフェラーゼ活性を評価し、かつCFTRについてIP/ウエスタンを行なった（図2）。バンド密度を定量し、ルシフェラーゼ活性のわずかな差について標準化した。該ウエスタンブロットは、pUCFと比較して、pUCF2でトランスフェクトされた細胞におけるCFTRタンパク質の9倍の増加を示している。さらに、これらのトランスフェクト細胞におけるCFTRタンパク質の相対存在量は、トランスフェクトされたマウス肺における2日目のCFTR mRNAの順位（図1）とよく合致しており、これら細胞株の実験がインビボにおける肺の遺伝子導入環境に対してある関連性を有し得ることを示唆している。
【００３２】
実施例5：ELISA解析によりhCFTRタンパク質の増加をもたらす合成型hCFTR配列をコードするベクター
本発明者らは、捕捉物としての抗hCFTR Mab 1660（R&D Systems）と、検出用のウサギ抗hCFTR抗体（Santa Cruz, #10747）とを組み込んだhCFTR用のELISAアッセイを確立した。Mab 1660はコドン590〜830の間のhCFTRエピトープを検出し、ウサギポリクローナル#10747はヒト、ラット、およびマウスCFTRのN末アミノ酸1〜182を検出する。該アッセイはpUCF2でトランスフェクトされたHEK293細胞由来のライセートを用いることによって最適化されており、典型的な検量線を図3に示す。IP−ウエスタンにより、pUCF2でトランスフェクトされたHEK293細胞由来のライセートでは、pUCFと比較してhCFTRタンパク質の9倍の増加が検出された。このELISAにより、これらのライセートはhCFTRタンパク質の19倍の増加を示し、かつqRT-PCR解析（3μgの形質転換体に対する）では、mRNA存在量の39倍の増加があった。
【００３３】
実施例6：hCFTR発現のqRT-PCR評価
hCFTRについてのqRT-PCRデータによれば、CO-CFTR（コドンが最適化され、1つの3’部位を除いてはCpGを欠失し、天然型UTRを欠失し、Kozak配列が最適化されている）は、同一のプラスミド（pUCF2対pUCF、図1を参照）において、天然型CFTR cDNAと比較して2日目のマウス肺で35倍高いレベルのhCFTR/mCFTR mRNAを産生したことが示された。この改善された2日目の結果は、IP−ウエスタン解析によるトランスフェクトされたHEK293細胞における2日目のCFTRタンパク質発現の亢進（9倍高い）の証拠とよく相関した。しかし、マウス肺におけるhCFTR/mCFTR mRNA発現の2日目のレベルは維持されず、14日目の比は0.72％に下がった。完全にCpGを欠失した誘導体（CO*-CFTR）とCO-CFTRを比較するために、3’末端のCpGを除去し、臨床的に適当なKmR（カナマイシン耐性）遺伝子も最初に導入しているpUL8ベクター（pUCF22）にCO*-CFTRをサブクローニングした。発現レベルを改善することを試みるために、先の100μgの鼻腔内投与ではなく、pUCF22を気管内に200μg投与した。図4に示すように、2日目のhCFTR/mCFTRレベルは50.6％（+/- 27％, SD）に増加したものの、14日目までにpUCF2の結果と同程度の0.77％（+/- 0.36）に下がった。
【００３４】
CO-CFTRにおける3’CpGの除去は、持続性を改善しなかった。pUCF2と比較したpUCF22についての2日目におけるhCFTR発現の5倍の改善は、投与経路の違いによって説明することができる。本発明者らが以前発表しているように、肺発現の3倍の改善は、気管内と鼻腔内の投与を比較することによって予期されている（Mol Therapy 8: 936-947, 2003）。気管内投与の反応試験において、100および300μgのDNA投与量の間にほとんど差はなかった（Mol Therapy 8: 936-947, 2003）。
【００３５】
表4に要約するように、ルシフェラーゼをコードする同じプラスミド設計（例えば、pUL, pUL8）は高いレベルをもたらし、14日目において活性を維持したのに対し、CFTR mRNA発現は消滅しており、これは：
a）CFTR mRNA安定性の時間依存的な低下；
b）CFTR mRNA転写効率の時間依存的な低下および/または異常スプライシング；
c）原核生物骨格によるクロマチン侵害、またはヌクレオソームのデノボ形成および/もしくは他のクロマチン構造を介した真核生物カセットにおける直接的なヘテロクロマチン形成が原因であり得る、CFTR転写を消滅させるプラスミド内のヘテロクロマチン形成；
d）CFTR発現プラスミドの選択的喪失（一方で、ルシフェラーゼプラスミドは活性データを考慮すると明らかに維持されている）
が原因である可能性がある。
【００３６】
（表４）CMVおよびUbCベクターにおけるルシフェラーゼおよびCFTR発現の相対的レベル†
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†〜200μg DNAの気管内投与であるpUCF22以外はすべて〜100μg DNAの鼻腔内投与。
‡pCMVlucおよびpULのルシフェラーゼ活性（RLU/mgタンパク質/μg DNA）は、2日目において実質的に同じである。
【００３７】
これらの結果を説明するメカニズムは、現在明らかでない。CFTR mRNA発現を制御する自己調節経路が存在する可能性がある。各CFTRプラスミドは14日目までにmRNA発現を有意に低下させたが、コドンを最適化しCpGを欠失したCFTRをコードする両プラスミドは、天然型CFTR cDNAより約35倍高いhCFTR/mCFTRレベルを示しており、CpGの除去ならびに/またはDNAおよび/もしくはmRNA配列の改変が、消滅プロセスに影響を及ぼしたことを示唆した。
【００３８】
実施例7：早期転写ターミネータの存在を明らかにするスプライシング効率の評価
CFTR mRNA発現に影響を及ぼし得る1つの可能性のあるメカニズムは、イントロン介在性5’スプライシングである。天然型およびCO-CFTRにおける選択的スプライス受容部位の詳細な解析によれば、いくつかの5’部位が天然型には存在するがCO-CFTRには存在せず、フレームをはずれた（out-of-frame）転写をもたらすことが示されている。イントロンスプライシングを調べるために、本発明者らのhCFTR mRNA解析に以前用いた3’プライマーセットに加えて所望のドナー受容配列をブリッジしたプライマーセットを用いて、hCFTR cDNAをqRT-PCR解析によって評価した（図4）。HEK293細胞を0.75または3μgのpCMVCFTR（本発明者らの先の臨床試験プラスミド）、pUCF、またはpUCF2のいずれかでトランスフェクトし、mRNA解析ならびにIP−ウエスタンによるCFTRタンパク質発現用に2日目に細胞を回収した。ランダムプライマーを用いてcDNAを生成し、TaqManプローブを用いたqRT-PCRによって異なるCFTR転写産物の形態を検出した。図5は、適切にスプライスされた（G、L、M）および全体の（C、J、K）hCFTR転写産物を検出するためのプローブ設計を図解している。
【００３９】
この転写スプライシング解析は、いくつかの興味深くかつ予想外の知見を示している。表5は、このqRT-PCR解析による重要な結果を要約しており、この要約した表における知見を詳細に再検討するために、完全なデータセットは表7に含まれている。
【００４０】
（表５）トランスフェクション2日後のHEK293細胞における、hCFTR転写産物についてのqRT-PCRスプライス解析
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【００４１】
CO-CFTR（pUCF2）についてのデータは、〜23％の転写産物が適切にスプライスされたことを示しているのに対し、pUCFまたはpCMVCFTR形質転換体のいずれかによって発現した天然型CFTRについての知見は、5’シグナル（スプライスされた）が3’シグナル（全体）よりも多く存在するという非論理的結果（表中の太字）を出している。これは、3’プライマーおよびプローブが転写産物の全集団を検出しなかった場合にのみ生じ得る。この現象は、選択的な「潜在する（stealth）」pA部位が天然型hCFTR cDNA内に存在する場合に生じ得る。興味深いことに、 「AATAAA」転写終結コンセンサス配列についての天然型hCFTR cDNAの配列解析によれば、オープン・リーディング・フレームの1100位で一致が1つ現れた。pUCF2におけるhCFTRのコドン最適化により、CO-CFTRには「AATAAA」配列が存在しない。
【００４２】
該データは、以下の作業仮説と合致している（図6）。pUCF2は〜23％のスプライシング効率という理解可能なRT-PCR結果を出していると考えられるのに対し、pUCFおよびpCMVCFTRは4つのクラスの転写産物とより複雑な像を生じているようである。
【００４３】
図6で言及するように、提案された転写産物の全セットを測定することが可能であろう新しいプローブセット「Z」を用いてこの解析を続けた。この提案されたシナリオが正しい場合には、pCMVCFTRおよびpUCFに対して、プライマーセットZはCまたはJのいずれかよりも豊富に存在するはずである。この解析により、これらのプローブセットからもたらされる相対的効率（表5中のR.E.）から、以下を決定することが可能であろう。
【００４４】
（表６）
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【００４５】
本発明者らのデータに基づけば、「Z」プローブ解析の結果が出るまでの定量化で、pUCFおよびpCMVCFTRにより生成されたhCFTR転写産物のかなりの割合が切断されていると考えられる。この知見は、一部分において、以下を含む複数の知見を説明し得る：i）pUCFと比較した、pUCF2に対する3’に基づくqRT-PCR hCFTRシグナルの有意な増加（マウス肺における2日目の35倍増加、HEK293細胞における16〜39倍増加）；および最も重要なことには、ii）3’プライマーセットをしばしば利用している種々のCF臨床試験におけるhCFTR mRNAを測定することの困難さ。
【００４６】
DNA配列解析により、この推定上の転写ターミネータは天然型hCFTR cDNAでは活性であるがゲノムDNAでは活性ではなく（図7）、それにより内在性hCFTRは早期切断（premature truncation）を受けないことが示唆されることに留意することが重要である。Chen et al.によって報告されているように（2）、以下の配列モチーフが転写終結部位に通常存在する。「AAUAAA」の後に、典型的にウリジンリッチエレメント（URE）が存在する。切断部位は典型的に「AAUAAA」の11〜24塩基下流に存在し、URE配列は該切断部位の10〜30bp後に存在する。天然型hCFTR cDNAにおいて、UREモチーフは「AATAAA」 後の＋14に存在し、潜在的な切断部位は＋12である。対照的に、ゲノムhCFTR DNAにおいて「AATAAA」の下流にURE部位は見出されず（イントロン7が近接して続く）、この潜在的な終結モチーフが機能的でないことを示唆している。要するに、DNA配列の検討により、この推定上の転写終結部位は「天然型」hCFTR cDNAでは活性であるが、ゲノムhCFTRまたはCO-hCFTR DNAのいずれかでは活性ではない可能性があることが示唆される。
【００４７】
本発明者らの懸案中の「Z」および「Q」プローブ実験が予想どおりのデータを生じる場合には、このスプライス解析のいくつかの重要な意味が存在する。
1．天然型CFTR cDNAには、pCMVCFTRおよびpUCFによって生成される転写産物の大部分を終結させると考えられる潜在的な転写ターミネータが存在する；
2．ゲノムhCFTR DNAには、エクソン7に推定上の「AATAAA」pA部位が存在し、そしてUREモチーフを有しないイントロン7配列が近接して続いており、それが機能的でないことを示唆している；
3．この潜在するpA部位の存在が、先のヒトCF臨床試験におけるhCFTR mRNA検出能を低下させた可能性がある；
4．コドン最適化hCFTR cDNAはこの潜在する転写ターミネータ配列を有さず、治療されたCF患者におけるmRNAレベルはこの制限を受けない可能性がある。
【００４８】
（表７）pCMVCFTR、pUCF、およびpUCF2でトランスフェクトされたHEK293細胞の5’スプライス部位解析
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【００４９】
HEK293細胞を0.75または3μgの各プラスミドのいずれかでトランスフェクトし（すべてのDNA/リポフェクタミン比が同じになるように「空の」無関係なプラスミドとともに）、2日後に回収した。TaqMan chemistryおよびFAM-TAMRA標識プローブを用いてqRT-PCRを行なった。4回の再現で各反応を行なった。いくつかの場合には、範囲外のものを排除し、三点平均値に関して解析を行なった。5’hCFTRおよび3’hCFTRに対するCtsを、閾値0.4を用いて評価した。hGAPDHに対するCtsを、閾値0.2を用いて評価した。ベクター混入はわずかであった。R.E.：相対的発現。
【００５０】
HEK293細胞を0.75または3μgのいずれかのpCMVCFTRまたはpUCFのいずれかでトランスフェクトした。RNA調製用ならびに有効なプライマーセットJおよびZ6を用いたqRT-PCR用に、2日後に細胞を回収した。これらの知見の概要を表8に示す。これらベクター由来の天然型hCFTR転写産物のおよそ27〜38％は早期切断を示しているように思われる。プライマー−プローブの検証実験は、qPCRΔCt 精度が+/- 7％の範囲にあることを示している。そのため、Z6およびJの増幅において観察される差を増幅効率の違いによって説明することはできない。その他の点では、HEK293細胞は検出可能な内在性hCFTR mRNAを転写せず（生理食塩水対照は陰性であった）、そのためすべてのシグナルはベクターに由来することに留意すべきである。これらの結果は、天然型hCFTR cDNAによる機能的hCFTRタンパク質の公知の生成能と合致するが、このcDNAの潜在的な非効率性を強調している。注目すべきは、CO-CFTRおよびCO*-CFTRコンストラクトはこの転写終結配列を有しないことである。
【００５１】
（表８）天然型hCFTRベクターでトランスフェクトされたHEK293細胞の転写切断解析
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†相対的効率の比が算出されている：2^(J-Adj. Z)
‡このトランスフェクションからのデータは、mGAPDHプライマーからのRNA分解の証拠に基づいて考察されないであろう。
§切断パーセンテージ＝1-2^(Adj. Z-J)
【００５２】
次の段階は、トランスフェクトされたマウス肺において天然型hCFTR cDNAが早期に切断されるか否かを決定することであった（表9）。この解析を行なうために、最も高いhCFTR mRNA発現レベル（3’Jプライマーに基づく）を有する4つの肺サンプルを選択した；これらサンプルのすべては、pCMVCFTR 2日目のグループ由来のものであり、pUCF形質転換体よりも〜30倍高いレベルのhCFTR/mCFTR発現を有した。mGAPDHプライマーに基づくと、M5サンプルは他のサンプルよりも〜2-4倍少ないcDNAを有し、その他の点は同程度であった。すべてのサンプルが、14％〜62％に及ぶ早期切断の証拠を示した。M5サンプルの低いmGAPDHシグナルはサンプル品質についての疑問（より少ないサンプルに対して）を生じさせるものの、M5サンプルに対する低い値の理由は明らかではない。要するに、HEK293細胞およびpCMVCFTRを投与されたマウス肺の実験の両方が、天然型hCFTR cDNAに対する早期転写切断の証拠を明示している。細胞および動物の両方において同様のデータがこの結論を強く支持している。
【００５３】
（表９）天然型hCFTRベクターpCMVCFTRを投与されたBalb/cマウス肺の転写切断解析
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†相対的効率の比が算出されている：2^(J-Adj. Z)
‡切断パーセンテージ＝1-2^(Adj. Z-J)
【００５４】
結論
HEK293細胞およびマウス肺の両方において、pCMVCFTRベクター（天然型hCFTR cDNA）から転写されるhCFTR mRNAについての切断解析は、早期切断の証拠を明示している。切断された転写産物のパーセンテージは、HEK293細胞では27〜38％、マウス肺では14〜62％に及んでいる。
【００５５】
早期転写終結は、pUCF2（CO*-hCFTR）をpUCF（天然型hCFTR cDNA）と比較した場合に、2日目のマウス肺におけるhCFTR/mCFTR mRNA発現の35倍の差を部分的にのみ説明し得る。プラスミド内のヌクレオソーム形成の潜在的な差、導入遺伝子のCpG除去、および最初のリボヌクレオチド配列の変化に起因するmRNA半減期の潜在的改善を含めた他の要因が重要であり得る。pUCFと比較した、pUCF2でトランスフェクトされたHEK293細胞におけるhCFTRタンパク質の9〜19倍の改善は、コドン最適化も重要であり得るが、hCFTR mRNA存在量の改善によって説明され得る。
【００５６】
参考文献
引用した各参考文献の開示内容は、本明細書中に明示的に組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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