(57)【要約】  本発明は次の式(I)の化合物に関する：2010517984.tif 000150（式中、kおよびjは、互いに独立して0または1を意味し、Yはマクロサイクルを意味し、その環は9〜36の原子を含み、3つのアミン官能性およびX結合を介してZスペーサーとの結合を可能にする炭素鎖により官能的に置換されており、RcはTNFスーパーファミリーに属する受容体への結合モチーフを意味し、XはY基がスペーサーと結合することを可能にする化学的官能性を意味し、Zはビ-、トリ-またはテトラ官能性スペーサーを意味する）。【選択図】なし
2010517984.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式(I)を有する化合物：
【化１】
2010517984.tif 000102
（式中、
−  kおよびjは、互いに独立して0または1を意味し、
−  Yはマクロサイクルを意味し、その環は9〜36の原子を含み、3つのアミン官能性およびX結合を介してZスペーサーとの結合を可能にする炭素鎖により官能的に置換されており、
−  RcはTNFスーパーファミリーに属する受容体への結合モチーフを意味し、好ましくは、その配列が受容体と相互作用し得る、リガンド受容体に適合する残基の中から選択されるリガンド由来配列を意味し、該リガンドはTNFスーパーファミリーに属する受容体リガンド、すなわち次のリガンド：EDA、CD40L、FasL、OX40L、AITRL、CD30L、VEGI、LIGHT、4-1BBL、CD27L、LTα、TNF、LTβ、TWEAK、APRIL、BLYS、RANKLおよびTRAILの中から選択され、
−  XはY基がスペーサーと結合することを可能にする化学的官能性を意味し、次の官能基の中から選択される：
【化２−１】
2010517984.tif 000103
【化２−２】
2010517984.tif 000104
（aはY基との結合を表し、bはZ基との結合を表す）
−  Zは次の式の1つを有するビ、トリまたはテトラ官能性スペーサーを意味し：
・j = k = 0 の場合、
* Xが式(1')、(8')、(9')、(5')、(6')、(7')、(13')および(15')の基を意味するとき、Zは次の式の1つを有する：
【化３】
2010517984.tif 000105
（mは1〜40の範囲の整数であり、
nは1〜10の範囲の整数である）
* Xが式(2')、(3')および(4')の基を意味するとき、Zは次の式の1つを有する：
【化４】
2010517984.tif 000106
* Xが式(12')および(14')の基を意味するとき、Zは次の式の1つを有する：
【化５】
2010517984.tif 000107
（mおよびnは前記で定義されたとおりであり、
pは1〜6の範囲の整数であり、
uは1〜4の範囲の整数であり、
Wは式：
【化６】
2010517984.tif 000108
の基、または式：
【化７】
2010517984.tif 000109
の基を表し、
W基は破線の結合手a'を介してNH基と結合している）
* Xが式(1')、(2')、(8')、(9')、(5')、(6')、(7')、(10')、(11')、(13')および(15')の基を意味するとき、Zは次の式の1つを有する：
【化８】
2010517984.tif 000110
（mおよびnは前記で定義されたとおりであり、
pは1〜6の範囲の整数であり、
uは1〜4の範囲の整数であり、
Wは式：
【化９】
2010517984.tif 000111
（rは1〜4の範囲の整数である）
の基を表し、
W基は破線の結合手a'を介してNH基と結合している）
・j = 1またはk = 1 の場合、
* Xが式(12')および(14')の基を意味するとき、Zは次の式の1つを有する：
【化１０】
2010517984.tif 000112
（uは1〜4の範囲の整数であり、
nは1〜10の範囲の整数であり、
Wは式：
【化１１】
2010517984.tif 000113
の基、または式
【化１２】
2010517984.tif 000114
の基を表し、
W基は破線の結合手a'を介してNH基と結合している）
* Xが式(1')、(2')、(8')、(9')、(5')、(6')、(7')、(10')、(11')、(13')および(15')の基を意味するとき、Zは次の式の1つを有する：
【化１３】
2010517984.tif 000115
（uは1〜4の範囲の整数であり、
nは1〜10の範囲の整数であり、
Wは式：
【化１４】
2010517984.tif 000116
（rは1〜4の範囲の整数である）
の基を表し、
W基は破線の結合手a'を介してNH基と結合している）
* Zは次の式の1つを意味することもできる：
【化１５】
2010517984.tif 000117
（式中、
−  Xが式(1')、(8')、(9')、(5')、(6')、(7')、(13')および(15')の基を意味するとき、Rは次の基の1つを意味し：
【化１６】
2010517984.tif 000118
R基は破線の結合手a'を介してNH基と結合している）
−  Xが式(2')、(3')および(4')の基を意味するとき、Rは次の基の1つを意味する：
【化１７】
2010517984.tif 000119
（nは1〜10の範囲の整数であり、
uは1〜4の範囲の整数である）
R基は破線の結合手a'を介してNH基と結合している、
−  Xが式(12')および(14')の基を意味するとき、
Rは次の基の1つを意味し：
【化１８】
2010517984.tif 000120
（nは1〜10の範囲の整数であり、
Wは式：
【化１９】
2010517984.tif 000121
の基、または式：
【化２０】
2010517984.tif 000122
の基を表し、
W基は破線の結合手a'を介してNH基と結合している）、
−  Xが式(1')、(2')、(8')、(9')、(5')、(6')、(7')、(10')、(11')、(13')および(15')の基を表すとき、
Rは次の基の1つを意味し：
【化２１】
2010517984.tif 000123
（uおよびnは前記で定義されたとおりであり、
Wは式：
【化２２】
2010517984.tif 000124
（rは1〜4の範囲の整数である）
の基を表し、
W基は破線の結合手a'を介してNH基と結合している）。
【請求項２】
RcがヒトまたはネズミのCD40受容体リガンド (CD40L)-由来のペプチドを意味し、該ペプチドが3〜10の間に含まれるアミノ酸数の、CD40のCD40Lリガンドの1次配列に属することを特徴とする、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
RcがヒトまたはネズミのCD40受容体リガンド (CD40L)-由来のペプチドを意味し、該ペプチドが次の配列：LQWAEKGYYTMSNN (配列番号1) ; LQWAKKGYYTMKSN (配列番号2) ; PGRFERILLRAANTH (配列番号3) ; SIGSERILLKAANTH (配列番号4)の中から選択される、3〜10の間に含まれるアミノ酸数のCD40Lリガンドの1次配列に属することを特徴とする、請求項1または2に記載の化合物。
【請求項４】
Rcが、式H-Xa-(Xb)l-Xc-Xd-Xe-(Xf)i-またはH-X'a-L-X'b-Xc-Xd-Xe-(Xf)i-の基；ここで、
・lは0または1を意味し、
・iは0または1を意味し、
・Xaは次のアミノ酸残基の中から選択される：
−  リシン；
−  アルギニン；
−  オルニチン；
−  αまたはβ位に置換基を有するリシン、アルギニンまたはオルニチンに相当するβ-アミノ酸；
−  トラネキサム酸；
−  N-メチル-トラネキサム酸；
−  8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸；
−  4-(ピペリジン-4-イル)ブタン酸；
−  3-(ピペリジン-4-イル)プロピオン酸；
−  N-(4-アミノブチル)-グリシン；
−  NH2-(CH2)n-COOH、nは1〜10の範囲；
−  NH2-(CH2-CH2-O)m-CH2CH2COOH、mは3〜6の範囲；
−  4-カルボキシメチル-ピペラジン；
−  4-(4-アミノフェニル)ブタン酸；
−  3-(4-アミノフェニル)プロパン酸；
−  4-アミノフェニル酢酸；
−  4-(2-アミノエチル)-1-カルボキシメチル-ピペラジン；
−  トランス-4-アミノシクロヘキサンカルボン酸；
−  シス-4-アミノシクロヘキサンカルボン酸；
−  シス-4-アミノシクロヘキサン酢酸；
−  トランス-4-アミノシクロヘキサン酢酸；
−  4-アミノ-1-カルボキシメチルピペリジン；
−  4-アミノ安息香酸；
−  4-(2-アミノエトキシ)安息香酸；
・Xbは次のアミノ酸残基の中から選択される：
−  グリシン；
−  イソロイシン；
−  ロイシン；
−  バリン；
−  アスパラギン；
−  D-アラニン；
−  D-バリン；
−  β、γまたはδ位で任意に置換されていてもよいL-プロリン；
−  β、γまたはδ位で任意に置換されていてもよいD-プロリン；
−  アルキル基がメチル、エチルまたはベンジル基である、N-アルキル-天然アミノ酸；
−  次の式のジアルキル-非環式アミノ酸：
【化２３】
2010517984.tif 000125
（RはH、Me、Et、PrまたはBuを表す）；
−  次の式のジアルキル-環式アミノ酸：
【化２４】
2010517984.tif 000126
（kは1、2、3または4を表す）；
・Xcは次のアミノ酸残基の中から選択される：
−  チロシン；
−  イソロイシン；
−  ロイシン；
−  バリン；
−  フェニルアラニン；
−  3-ニトロ-チロシン；
−  4-ヒドロキシメチル-フェニルアラニン；
−  3,5-ジヒドロキシ-フェニルアラニン；
−  2,6-ジメチル-チロシン；
−  3,4-ジヒドロキシ-フェニルアラニン (DOPA)；
・Xdは次のアミノ酸残基の中から選択される：
−  チロシン；
−  イソロイシン；
−  ロイシン；
−  バリン；
−  フェニルアラニン；
−  3-ニトロ-チロシン；
−  4-ヒドロキシメチル-フェニルアラニン；
−  3,5-ジヒドロキシ-フェニルアラニン；
−  2,6-ジメチル-チロシン；
−  3,4-ジヒドロキシ-フェニルアラニン；
・Xeは次のアミノ酸残基の中から選択される：
−  アルギニン；
−  -(Gly)n-、nは1〜10の範囲；
−  -(Pro)n-、nは1〜10の範囲；
−  NH2-(CH2)n-COOH、nは1〜10の範囲；
−  NH2-(CH2-CH2-O)m-CH2CH2COOH、mは3〜6の範囲；
−  8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸；
−  トラネキサム酸；
−  N-メチル-トラネキサム酸；
−  4-(ピペリジン-4-イル)ブタン酸；
−  3-(ピペリジン-4-イル)プロピオン酸；
−  N-(4-アミノブチル)-グリシン；
−  4-カルボキシメチル-ピペラジン；
−  4-(4-アミノフェニル)ブタン酸；
−  3-(4-アミノフェニル)プロパン酸；
−  4-アミノフェニル酢酸；
−  4-(2-アミノエチル)-1-カルボキシメチル-ピペラジン；
−  トランス-4-アミノシクロヘキサンカルボン酸；
−  シス-4-アミノシクロヘキサンカルボン酸；
−  シス-4-アミノシクロヘキサン酢酸；
−  トランス-4-アミノシクロヘキサン酢酸；
−  4-アミノ-1-カルボキシメチルピペリジン；
−  4-アミノ安息香酸；
−  4-(2-アミノエトキシ)安息香酸；
・Xfは次のアミノ酸残基の中から選択される：
−  -(Gly)n-、nは1〜10の範囲；
−  -(Pro)n-、nは1〜10の範囲；
−  NH2-(CH2)n-COOH、nは1〜10の範囲；
−  NH2-(CH2-CH2-O)m-CH2CH2COOH、mは3〜6の範囲；
−  8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸；
−  トラネキサム酸；
−  N-メチル-トラネキサム酸；
−  4-(ピペリジン-4-イル)ブタン酸；
−  3-(ピペリジン-4-イル)プロピオン酸；
−  N-(4-アミノブチル)-グリシン；
−  4-カルボキシメチル-ピペラジン；
−  4-(4-アミノフェニル)ブタン酸；
−  3-(4-アミノフェニル)プロパン酸；
−  4-アミノフェニル酢酸；
−  4-(2-アミノエチル)-1-カルボキシメチル-ピペラジン；
−  トランス-4-アミノシクロヘキサンカルボン酸；
−  シス-4-アミノシクロヘキサンカルボン酸；
−  シス-4-アミノシクロヘキサン酢酸；
−  トランス-4-アミノシクロヘキサン酢酸；
−  4-アミノ-1-カルボキシメチルピペリジン；
−  4-アミノ安息香酸；
−  4-(2-アミノエトキシ)安息香酸；
・-L-は、特に次に示すリストから選択される、残基X'aとX'bとの間のペプチド様タイプの結合を意味し：
-L- = -ψ(CH2CH2)-；-ψ(CH(Fk)=CH(Fk'))-；-ψ(CH2NH)-；-ψ(NHCO)-；-ψ(NHCONH)-；-ψ(CO-O)-；-ψ(CS-NH)-；-ψ(CH(OH)-CH(OH))-；-ψ(S-CH2)-；-ψ(CH2-S)-；-ψ(CH(CN)-CH2)-；-ψ(CH(OH))-；-ψ(COCH2)-；-ψ(CH(OH)CH2)-；-ψ(CH(OH)CH2NH)-；-ψ(CH2)-；-ψ(CH(Fk))-；-ψ(CH2O)-；-ψ(CH2-NHCONH)-;-ψ(CH(Fk)NHCONFk')-；-ψ(CH2-CONH)-；
-ψ(CH(Fk)CONH)-；-ψ(CH(Fk)CH(Fk')CONH)-；
または-ψ(CH2N)-；-ψ(NHCON)-；-ψ(CS-N)-；-ψ(CH(OH)CH2N)-；
-ψ(CH2-NHCON)-；-ψ(CH2-CON)-；-ψ(CH(Fk)CON)-；
-ψ(CH(Fk)CH(Fk')CON)-
X'bがプロリン側鎖を意味するとき、
FkおよびFk'は互いに独立して、水素、ハロゲン、1〜20の炭素原子のアルキル基、または5〜20の炭素原子を含む環構造のアリール基を意味する、
・X'aはリシン、アルギニンまたはオルニチンの側鎖を表す、
・X'bは次のアミノ酸残基の1つの側鎖を表す：
−  グリシン；
−  イソロイシン；
−  ロイシン；
−  バリン；
−  アスパラギン；
−  D-アラニン；
−  D-バリン；
−  β、γまたはδ位で任意に置換されていてもよいL-プロリン；
−  β、γまたはδ位で任意に置換されていてもよいD-プロリン；
−  アルキル基がメチル、エチルまたはベンジル基である、N-アルキル天然アミノ酸；
−  次の式のジアルキル-非環式アミノ酸：
【化２５】
2010517984.tif 000127
（RはH、Me、Et、PrまたはBuを表す）；
−  次の式のジアルキル-環式アミノ酸：
【化２６】
2010517984.tif 000128
（kは1、2、3または4を表す）
を意味することを特徴とする、請求項1に記載の化合物。
【請求項５】
Yが次の式(II)：
【化２７】
2010517984.tif 000129
［式中、
−  Aは、
【化２８】
2010517984.tif 000130
（nは0、1、2または3を表し；
pは0、１、2または3を表し；
EはNHまたはOを表す）
の中から無作為に選択されるアミノ酸残基またはアミノ酸誘導体を表し、
−  B1は、
【化２９】
2010517984.tif 000131
（nは0、1、2または3を表し；
pは0、1、2または3を表し；
EはNHまたはOを表し；
RaはC1-8 アルキル化された蛋白質原性アミノ酸の炭素鎖を意味する）
の中から独立して選択されるアミノ酸残基またはアミノ酸誘導体を表し、
−  B2は次の基の中から独立して選択され:
（c結合はX基との結合を表す）
【化３０】
2010517984.tif 000132
（nは0、1、2または3を表し；
pは0、1、2または3を表し；
EはNHまたはOを表し；
Rbは1〜6の炭素原子を含むアルキル鎖を意味し；
D'は次の基の1つを表し：
【化３１】
2010517984.tif 000133
（mは1〜40の範囲の整数であり；
vは1〜10の範囲の整数であり；
結合c'はX基との結合を表す）；
Dは次の基を表し：
−  式の基：
【化３２】
2010517984.tif 000134
（Xは式(13')および(15')の基を意味する）
−  または式の基：
【化３３】
2010517984.tif 000135
もしくは式の基：
【化３４】
2010517984.tif 000136
（式中、
Xは式(1')、(2')、(8')、(9')、(5')、（6')、(7')、(10')、(11')、(12')および(14')を意味し、c'結合はX基との結合を表し、
qは2〜6の範囲の整数を表し、
Xgは次の基の1つの残基に相当する：
−  -(Gly)n-、nは1〜10の範囲；
−  -(Pro)n-、nは1〜10の範囲；
−  NH2-(CH2)n-COOH、nは1〜10の範囲；
−  NH2-(CH2-CH2-O)m-CH2CH2COOH、mは3〜6の範囲；
−  8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸；
−  トラネキサム酸；
−  N-メチル-トラネキサム酸；
−  4-(ピペリジン-4-イル)ブタン酸；
−  3-(ピペリジン-4-イル)プロピオン酸；
−  N-(4-アミノブチル)-グリシン；
−  4-カルボキシメチル-ピペラジン；
−  4-(4-アミノフェニル)ブタン酸；
−  3-(4-アミノフェニル)プロパン酸；
−  4-アミノフェニル酢酸；
−  4-(2-アミノエチル)-1-カルボキシメチル-ピペラジン；
−  トランス-4-アミノシクロヘキサンカルボン酸；
−  シス-4-アミノシクロヘキサンカルボン酸；
−  シス-4-アミノシクロヘキサン酢酸；
−  トランス-4-アミノシクロヘキサン酢酸；
−  4-アミノ-1-カルボキシメチルピペリジン；
−  4-アミノ安息香酸；
−  4-(2-アミノエトキシ)安息香酸）］
を有することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1つに記載の化合物。
【請求項６】
Yが次の式：
【化３５−１】
2010517984.tif 000137
【化３５−２】
2010517984.tif 000138
（Ra、Rc、D、D'、Xg、q、iおよびpは請求項1〜5のいずれか1つで定義されたとおりである）
の1つを有することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1つに記載の化合物。
【請求項７】
次の式(III-a)または(III-b)：
【化３６】
2010517984.tif 000139
（Rcおよびmは請求項1〜5のいずれか1つで定義されたとおりである）
の1つを有する、請求項1〜6のいずれか1つに記載の化合物。
【請求項８】
Rcが、
−  H-Lys-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-、または
−  H-Lys-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-、または
−  Ahx-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-、または
−  H-Lys-ψ(CH2N)-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-、-ψ(CH2N)-はメチレン-アミノタイプのペプチド様結合に相当、または
−  H-Lys-ψ(CH2)-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-、-ψ(CH2)-はメチレンタイプのペプチド様結合に相当、または
−  H-Lys-ψ(CH2-CH2)-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-、-ψ(CH2CH2)-はエチレンタイプのペプチド様結合に相当、または
−  H-Lys-Gly-DOPA-Tyr-NH-(CH2)5-CO-、または
−  H-Arg-Ile-Ile-Leu-Arg- NH-(CH2)5-CO-
である、請求項1〜7のいずれか1つに記載の化合物。
【請求項９】
次の式(III-a)：
【化３７】
2010517984.tif 000140
（式中、
−  nは1、2または6に等しく；
−  RcはH-Lys-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-基を意味する）
を有する、請求項1〜8のいずれか1つに記載の化合物。
【請求項１０】
活性成分として請求項1〜9のいずれか1つに記載の化合物を、医薬的に許容される担体と共に含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
活性成分として請求項1〜9のいずれか1つに記載の化合物を、医薬的に許容される抗原増強剤と共に含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項１２】
免疫応答の阻害または活性化を伴って、病状の治療を意図した医薬を製造するための、請求項1〜9のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１３】
免疫応答の阻害を伴って、移植拒絶、アレルギー疾患または自己免疫疾患のような病状を治療することを意図した医薬を製造するための、請求項12に記載の使用。
【請求項１４】
免疫応答の増強を伴って、癌または寄生虫感染症、細菌感染症、ウイルス感染症もしくはプリオンのような非従来型の感染因子を含む感染症のような病状を治療することを意図した医薬を製造するための、請求項13に記載の使用。
【請求項１５】
次の工程：
−  その前駆体が生長するペプチド鎖を形成するアミノ酸配列から構成され、それらの3つがアミンタイプの基を有するN-保護されたアミノ酸残基と生長するペプチド鎖のアミン官能性との逐次カップリングのサイクルおよび脱保護により合成される、請求項1で定義されたYの鎖状前駆体を形成すること、ここで、最初のアミノ酸残基は固体担持体に結合され、前記のYの鎖状前駆体は少なくとも1つのD-アラニン残基を含み、該D-アラニン残基はD-リシン残基によって置換されており、そのε-NHアミンは、請求項1で定義されたX基に相当する所望の官能性を有するカルボン酸でアシル化されており、
−  保護され官能的に置換された環を得るために、前記の保護された状態の鎖状前駆体のYを環化すること、
−  2量化された、保護され官能的に置換された環を得るために、上記の保護され官能的に置換された環を請求項1で定義されたZ-由来のスペーサーと反応させること、
−  前記の保護基を開裂し、前記の保護されたアミン官能性をフリーにし、2量化された、脱保護され官能的に置換された環を得ること、
−  前記のフリーのアミン官能性をそこで形成されるかまたは前もって形成されたペプチドと請求項1で定義されたRc基に相当するアミノ酸残基の逐次構築によりカップリングすること、および
−  請求項1〜9のいずれか1つに記載の化合物を得るために、Rc基の官能的に置換された側鎖上に存在する全ての保護基を除去した後、分子を固体担持体から開裂すること
を含むことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1つに記載の化合物を固体担持体上で製造する方法。
【請求項１６】
請求項7に記載の式(III-a)または(III-b)の化合物を製造するための請求項15に記載の製造方法であって、次の工程：
−  次の式：
【化３８】
2010517984.tif 000141
（GPは特にBoc、ZまたはAllocの中から選択される保護基を表し、
X'は-SH基または
【化３９】
2010517984.tif 000142
を表す）
の保護され官能的に置換された環を、式
【化４０】
2010517984.tif 000143
（nは1〜10の範囲の整数を表し、
ZはN3基または基
【化４１】
2010517984.tif 000144
を表す）
（ここで、X'が基
【化４２】
2010517984.tif 000145
を表すとき、Z'はN3基を表し、
X'が-SH基を表すとき、Z'は基
【化４３】
2010517984.tif 000146
を表すものと理解される）
のスペーサー基と反応させて、次の式(VIII)：
【化４４】
2010517984.tif 000147
（GPは前記で定義されたとおりであり、
Y'は次の式：
【化４５】
2010517984.tif 000148
の1つを有する）
（ここで、Z'がN3基を表すとき、Y'は式(A)を有し、
Z'が基
【化４６】
2010517984.tif 000149
を表すとき、Y'は式(B)を有すると理解される）
の化合物を得る工程、
−  前記の保護基GPを開裂させ、保護されたアミン官能性をフリーとし、該前記のフリーのアミン官能性をそこで形成されるかまたは前もって形成されたペプチドと請求項1で定義されたRc基に相当するアミノ酸残基の逐次構築によりカップリングさせる工程、および
−  Rc基の官能的に置換された側鎖上に存在する全ての保護基を除去した後、分子をその固体担持体から開裂させて、請求項7に記載の式(III-a)または(III-b)の化合物を得る工程
を含むことを特徴とする製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な多量体(multimeric)分子、それらの製造方法および医薬の製造のためのそれらの使用を指向している。
本発明は、免疫応答を刺激するかまたは阻害することができる分子をさらに指向している。
【０００２】
免疫応答におけるCD40/CD40L対の重要な役割は、免疫系を阻害または刺激するよう、そのような両分子に対する高められた抗体を治療の終末用として使用することに非常に多くの研究チームを導いたことである。抗CD40L抗体の投与は、実験ネズミのアレルギー性脳脊髄炎（ヒトの多発性硬化症のモデル）（Howardら；1999）のような自己免疫疾患の治療またはサルの腎臓同種移植の拒絶反応（Kirkら、1999）の治療に有望な結果を与えている。
【０００３】
対照的に、アゴニスト性の抗CD40抗体の使用は、一方ではマウスの抗腫瘍ペプチドワクチンへの応答の強い改善（Diehlら、1999）をもたらし、他方ではネズミの腫瘍制御においてCD4+T細胞効率の増強（Sotomayorら、1999; Lodeら、2000）をもたらしている。CD40Lに対してコード化するアデノウイルスにより転換された樹状細胞（CDs）の注入後にネズミのモデルでの腫瘍退縮が示された（Kikuchiら、2000）。最後に、CD40分子のCD40Lとの相互作用による樹状細胞の活性化は、寄生虫感染、Trypanosoma Cruziからネズミを保護することができる（Chaussabelら、1999）。
【０００４】
これまでに成し遂げられた調査研究により、CD40と6価の複合体を形成するために3量体の形態に自己結合するCD40L分子の特異な原子価は、機能レベルでCD40/CD40L対を妨害することができる機能抗体の製造を困難にする。CD40Lに対してコード化するアデノウイルスの開発は、ある程度この欠点を克服している。しかしながら、それらの使用はヒトに危険がないわけではない。最終的に、この系の特異な原子価が、CD40/CD40Lが相互作用する様式を妨害することができる合成分子の発見に対する障害物として存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、蛋白質−蛋白質相互作用を妨害することを意図された多量体リガンドを提供することを目的としている。
本発明は、多価の蛋白質−蛋白質相互作用を妨害することができる分子を製造することも目的としている。
【０００６】
本発明は、TNFおよびTNF-Rファミリーに属するメンバーの活性を微調整または調節することができる分子を製造することをさらに目的としている。
本発明は、CD40/CD40L系に作用する合成分子を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、次の式(I)を有する化合物に関する：
【化１】
2010517984.tif 000003
【０００８】
（式中、
−  kおよびjは、互いに独立して0または1を意味し、
−  Yはマクロサイクル（macrocycle）を意味し、その環は9〜36の原子を含み、そのC-末端カルボキシ官能基によりRcとの結合を可能にする3つのアミン官能性およびX結合を介してZスペーサーとの結合を可能にする炭素鎖により官能的に置換されており、
−  RcはTNFスーパーファミリーに属する受容体への結合モチーフ（motif）を意味し、好ましくは、その配列が受容体と相互作用し得る、リガンド受容体に適合する残基の中から選択されるリガンド由来配列を意味し、該リガンドはTNFスーパーファミリーに属する受容体リガンド、すなわち次のリガンド：EDA、CD40L、FasL、OX40L、AITRL、CD30L、VEGI、LIGHT、4-1BBL、CD27L、LTα、TNF、LTβ、TWEAK、APRIL、BLYS、RANKLおよびTRAILの中から選択され、
【０００９】
−  XはY基がスペーサーと結合することを可能にする化学的官能性を意味し、次の官能基の中から選択される：
【化２】
2010517984.tif 000004
（aはY基との結合を表し、bはZ基との結合を表す）
【００１０】
−  Zは、Xタイプの結合の形成により、式
【化３】
2010517984.tif 000005
の2量化、3量化または4量化を可能にするビ、トリまたはテトラ官能性スペーサーを意味し、Zスペーサーは次の式の1つを有する：
【００１１】
・j = k = 0 の場合、
* Xが式(1')、(8')、(9')、(5')、(6')、(7')、(13')および(15')の基を意味するとき、Zは次の式の1つを有する：
【化４】
2010517984.tif 000006
（mは1〜40の範囲の整数であり、
nは1〜10の範囲の整数である）
【００１２】
* Xが式(2')、(3')および(4')の基を意味するとき、Zは次の式の1つを有する：
【化５】
2010517984.tif 000007
【００１３】
* Xが式(12')および(14')の基を意味するとき、Zは次の式の1つを有する：
【化６】
2010517984.tif 000008
【００１４】
（mおよびnは前記で定義されたとおりであり、
pは1〜6の範囲の整数であり、
uは1〜4の範囲の整数であり、
Wは式：
【化７】
2010517984.tif 000009
の基、または式：
【化８】
2010517984.tif 000010
の基を表し、
W基は破線の結合手a'を介してNH基と結合している）
【００１５】
* Xが式(1')、(2')、(8')、(9')、(5')、(6')、(7')、(10')、(11')、(13')および(15')の基を意味するとき、Zは次の式の1つを有する：
【化９】
2010517984.tif 000011
【００１６】
（mおよびnは前記で定義されたとおりであり、
pは1〜6の範囲の整数であり、
uは1〜4の範囲の整数であり、
Wは式：
【化１０】
2010517984.tif 000012
（rは1〜4の範囲の整数である）
の基を表し、
W基は破線の結合手a'を介してNH基と結合している）
【００１７】
・j = 1またはk = 1 の場合、
* Xが式(12')および(14')の基を意味するとき、Zは次の式の1つを有する：
【化１１】
2010517984.tif 000013
【００１８】
（uは1〜4の範囲の整数であり、
nは1〜10の範囲の整数であり、
Wは式：
【化１２】
2010517984.tif 000014
の基、または式
【化１３】
2010517984.tif 000015
の基を表し、
W基は破線の結合手a'を介してNH基と結合している）
【００１９】
* Xが式(1')、(2')、(8')、(9')、(5')、(6')、(7')、(10')、(11')、(13')および(15')の基を意味するとき、Zは次の式の1つを有する：
【化１４】
2010517984.tif 000016
【００２０】
（uは1〜4の範囲の整数であり、
nは1〜10の範囲の整数であり、
Wは式：
【化１５】
2010517984.tif 000017
（rは1〜4の範囲の整数である）
の基を表し、
W基は破線の結合手a'を介してNH基と結合している）
【００２１】
* Zは次の式の1つを意味することもできる：
【化１６】
2010517984.tif 000018
【００２２】
（式中、
−  Xが式(1')、(8')、(9')、(5')、(6')、(7')、(13')および(15')の基を意味するとき、Rは次の基の1つを意味し：
【化１７】
2010517984.tif 000019
R基は破線の結合手a'を介してNH基と結合している）
【００２３】
−  Xが式(2')、(3')および(4')の基を意味するとき、Rは次の基の1つを意味する：
【化１８】
2010517984.tif 000020
【００２４】
（nは1〜10の範囲の整数であり、
uは1〜4の範囲の整数である）
R基は破線の結合手a'を介してNH基と結合している、
−  Xが式(12')および(14')の基を意味するとき、
Rは次の基の1つを意味し：
【化１９】
2010517984.tif 000021
（nは1〜10の範囲の整数であり、
【００２５】
Wは式：
【化２０】
2010517984.tif 000022
の基、または式：
【化２１】
2010517984.tif 000023
の基を表し、
W基は破線の結合手a'を介してNH基と結合している）、
【００２６】
−  Xが式(1')、(2')、(8')、(9')、(5')、(6')、(7')、(10')、(11')、(13')および(15')の基を表すとき、
Rは次の基の1つを意味し：
【化２２】
2010517984.tif 000024
【００２７】
（uおよびnは前記で定義されたとおりであり、
Wは式：
【化２３】
2010517984.tif 000025
（rは1〜4の範囲の整数である）
の基を表し、
W基は破線の結合手a'を介してNH基と結合している）。
【００２８】
それゆえ、本発明は、
【化２４】
2010517984.tif 000026
モチーフの2量体（j=K=0のとき）、3量体（j=1またはk=1のとき）および4量体（j=k=1のとき）に関する。
【００２９】
実施の有利な態様によれば、本発明の化合物は、RcがヒトまたはネズミのCD40受容体リガンド（CD40L）由来のペプチドを意味し、該ペプチドが3〜10の間に含まれるアミノ酸数の、CD40のCD40Lリガンドの1次配列に属することを特徴とする。
【００３０】
実施の有利な態様によれば、本発明の化合物は、RcがヒトまたはネズミのCD40受容体リガンド (CD40L)-由来のペプチドを意味し、該ペプチドが次の配列：LQWAEKGYYTMSNN (ヒト配列 配列番号1) ; LQWAKKGYYTMKSN (ネズミ配列 配列番号2) ; PGRFERILLRAANTH (ヒト配列 配列番号3) ; SIGSERILLKAANTH (ネズミ配列 配列番号4)の中から選択される、3〜10の間に含まれるアミノ酸数のCD40Lリガンドの1次配列に属することを特徴とする。
【００３１】
本発明は、Rcが、式H-Xa-(Xb)l-Xc-Xd-Xe-(Xf)i-またはH-X'a-L-X'b-Xc-Xd-Xe-(Xf)i-の基；ここで、
・lは0または1を意味し、
・iは0または1を意味し、
・Xaは次のアミノ酸残基の中から選択される：
−  リシン；
−  アルギニン；
−  オルニチン；
−  αまたはβ位に置換基を有するリシン、アルギニンまたはオルニチンに相当するβ-アミノ酸；
【００３２】
−  トラネキサム酸；
−  N-メチル-トラネキサム酸；
−  8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸；
−  4-(ピペリジン-4-イル)ブタン酸；
−  3-(ピペリジン-4-イル)プロピオン酸；
−  N-(4-アミノブチル)-グリシン；
−  NH2-(CH2)n-COOH、nは1〜10の範囲；
−  NH2-(CH2-CH2-O)m-CH2CH2COOH、mは3〜6の範囲；
−  4-カルボキシメチル-ピペラジン；
−  4-(4-アミノフェニル)ブタン酸；
【００３３】
−  3-(4-アミノフェニル)プロパン酸；
−  4-アミノフェニル酢酸；
−  4-(2-アミノエチル)-1-カルボキシメチル-ピペラジン；
−  トランス-4-アミノシクロヘキサンカルボン酸；
−  シス-4-アミノシクロヘキサンカルボン酸；
−  シス-4-アミノシクロヘキサン酢酸；
−  トランス-4-アミノシクロヘキサン酢酸；
−  4-アミノ-1-カルボキシメチルピペリジン；
−  4-アミノ安息香酸；
−  4-(2-アミノエトキシ)安息香酸；
【００３４】
・Xbは次のアミノ酸残基の中から選択される：
−  グリシン；
−  イソロイシン；
−  ロイシン；
−  バリン；
−  アスパラギン；
−  D-アラニン；
−  D-バリン；
−  β、γまたはδ位で任意に置換されていてもよいL-プロリン；
−  β、γまたはδ位で任意に置換されていてもよいD-プロリン；
−  アルキル基がメチル、エチルまたはベンジル基である、N-アルキル-天然アミノ酸；
【００３５】
−  次の式のジアルキル-非環式アミノ酸：
【化２５】
2010517984.tif 000027
（RはH、Me、Et、PrまたはBuを表す）；
【００３６】
−  次の式のジアルキル-環式アミノ酸：
【化２６】
2010517984.tif 000028
（kは1、2、3または4を表す）；
【００３７】
・Xcは次のアミノ酸残基の中から選択される：
−  チロシン；
−  イソロイシン；
−  ロイシン；
−  バリン；
−  フェニルアラニン；
−  3-ニトロ-チロシン；
−  4-ヒドロキシメチル-フェニルアラニン；
−  3,5-ジヒドロキシ-フェニルアラニン；
−  2,6-ジメチル-チロシン；
−  3,4-ジヒドロキシ-フェニルアラニン (DOPA)；
【００３８】
・Xdは次のアミノ酸残基の中から選択される：
−  チロシン；
−  イソロイシン；
−  ロイシン；
−  バリン；
−  フェニルアラニン；
−  3-ニトロ-チロシン；
−  4-ヒドロキシメチル-フェニルアラニン；
−  3,5-ジヒドロキシ-フェニルアラニン；
−  2,6-ジメチル-チロシン；
−  3,4-ジヒドロキシ-フェニルアラニン；
【００３９】
・Xeは次のアミノ酸残基の中から選択される：
−  アルギニン；
−  -(Gly)n-、nは1〜10の範囲；
−  -(Pro)n-、nは1〜10の範囲；
−  NH2-(CH2)n-COOH、nは1〜10の範囲；
−  NH2-(CH2-CH2-O)m-CH2CH2COOH、mは3〜6の範囲；
−  8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸；
−  トラネキサム酸；
【００４０】
−  N-メチル-トラネキサム酸；
−  4-(ピペリジン-4-イル)ブタン酸；
−  3-(ピペリジン-4-イル)プロピオン酸；
−  N-(4-アミノブチル)-グリシン；
−  4-カルボキシメチル-ピペラジン；
−  4-(4-アミノフェニル)ブタン酸；
−  3-(4-アミノフェニル)プロパン酸；
−  4-アミノフェニル酢酸；
【００４１】
−  4-(2-アミノエチル)-1-カルボキシメチル-ピペラジン；
−  トランス-4-アミノシクロヘキサンカルボン酸；
−  シス-4-アミノシクロヘキサンカルボン酸；
−  シス-4-アミノシクロヘキサン酢酸；
−  トランス-4-アミノシクロヘキサン酢酸；
−  4-アミノ-1-カルボキシメチルピペリジン；
−  4-アミノ安息香酸；
−  4-(2-アミノエトキシ)安息香酸；
【００４２】
・Xfは次のアミノ酸残基の中から選択される：
−  -(Gly)n-、nは1〜10の範囲；
−  -(Pro)n-、nは1〜10の範囲；
−  NH2-(CH2)n-COOH、nは1〜10の範囲；
−  NH2-(CH2-CH2-O)m-CH2CH2COOH、mは3〜6の範囲；
−  8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸；
−  トラネキサム酸；
−  N-メチル-トラネキサム酸；
【００４３】
−  4-(ピペリジン-4-イル)ブタン酸；
−  3-(ピペリジン-4-イル)プロピオン酸；
−  N-(4-アミノブチル)-グリシン；
−  4-カルボキシメチル-ピペラジン；
−  4-(4-アミノフェニル)ブタン酸；
−  3-(4-アミノフェニル)プロパン酸；
−  4-アミノフェニル酢酸；
−  4-(2-アミノエチル)-1-カルボキシメチル-ピペラジン；
【００４４】
−  トランス-4-アミノシクロヘキサンカルボン酸；
−  シス-4-アミノシクロヘキサンカルボン酸；
−  シス-4-アミノシクロヘキサン酢酸；
−  トランス-4-アミノシクロヘキサン酢酸；
−  4-アミノ-1-カルボキシメチルピペリジン；
−  4-アミノ安息香酸；
−  4-(2-アミノエトキシ)安息香酸；
【００４５】
・-L-は、特に次に示すリストから選択される、残基X'aとX'bとの間のペプチド様タイプの結合を意味し：
-L- = -ψ(CH2CH2)-；-ψ(CH(Fk)=CH(Fk'))-；-ψ(CH2NH)-；-ψ(NHCO)-；-ψ(NHCONH)-；-ψ(CO-O)-；-ψ(CS-NH)-；-ψ(CH(OH)-CH(OH))-；-ψ(S-CH2)-；-ψ(CH2-S)-；-ψ(CH(CN)-CH2)-；-ψ(CH(OH))-；-ψ(COCH2)-；-ψ(CH(OH)CH2)-；-ψ(CH(OH)CH2NH)-；-ψ(CH2)-；-ψ(CH(Fk))-；-ψ(CH2O)-；-ψ(CH2-NHCONH)-;-ψ(CH(Fk)NHCONFk')-；-ψ(CH2-CONH)-；
-ψ(CH(Fk)CONH)-；-ψ(CH(Fk)CH(Fk')CONH)-；
【００４６】
または-ψ(CH2N)-；-ψ(NHCON)-；-ψ(CS-N)-；-ψ(CH(OH)CH2N)-；
-ψ(CH2-NHCON)-；-ψ(CH2-CON)-；-ψ(CH(Fk)CON)-；
-ψ(CH(Fk)CH(Fk')CON)-
X'bがプロリン側鎖を意味するとき、
FkおよびFk'は互いに独立して、水素、ハロゲン、1〜20の炭素原子のアルキル基、または5〜20の炭素原子を含む環構造のアリール基を意味する、
【００４７】
・X'aはリシン、アルギニンまたはオルニチンの側鎖を表す、
・X'bは次のアミノ酸残基の1つの側鎖を表す：
−  グリシン；
−  イソロイシン；
−  ロイシン；
−  バリン；
−  アスパラギン；
−  D-アラニン；
−  D-バリン；
−  β、γまたはδ位で任意に置換されていてもよいL-プロリン；
−  β、γまたはδ位で任意に置換されていてもよいD-プロリン；
−  アルキル基がメチル、エチルまたはベンジル基である、N-アルキル天然アミノ酸；
【００４８】
−  次の式のジアルキル-非環式アミノ酸：
【化２７】
2010517984.tif 000029
（RはH、Me、Et、PrまたはBuを表す）；
【００４９】
−  次の式のジアルキル-環式アミノ酸：
【化２８】
2010517984.tif 000030
（kは1、2、3または4を表す）
を意味することを特徴とする、前記で定義された化合物に関する。
【００５０】
それゆえ、Xaは特に次の基の中から選択される：
【表１−１】
2010517984.tif 000031
【００５１】
【表１−２】
2010517984.tif 000032
【００５２】
【表１−３】
2010517984.tif 000033
【００５３】
Xbは特に次の基の中から選択される：
【表２】
2010517984.tif 000034
【００５４】
XcおよびXdは特に次の基の中から選択される：
【表３】
2010517984.tif 000035
【００５５】
XeおよびXfは特に次の基の中から選択される：
【表４−１】
2010517984.tif 000036
【００５６】
【表４−２】
2010517984.tif 000037
【００５７】
本発明は、Yが次の式(II)を有することを特徴とする、前記で定義された式(I)の化合物にも関する：
【化２９】
2010517984.tif 000038
【００５８】
式中、
−  Aは次の中から無作為に選択されるアミノ酸残基またはアミノ酸誘導体を表し：
【化３０】
2010517984.tif 000039
【００５９】
・nは0、1、2または3を表し；
・pは0、1、2または3を表し；
・EはNHまたはOを表し；
【００６０】
−  B1は次の中から独立して選択されるアミノ酸残基またはアミノ酸誘導体を表し：
【化３１】
2010517984.tif 000040
【００６１】
・nは0、1、2または3を表し；
・pは0、1、2または3を表し；
・EはNHまたはOを表し；
・RaはC1〜C8のアルキル化された蛋白質原性アミノ酸の炭素鎖を意味し、
【００６２】
−  B2は次の基の中から独立して選択され：
c結合はX基との結合を表し、
【化３２】
2010517984.tif 000041
【００６３】
・nは0、1、2または3と等しく；
・pは0、1、2または3と等しく；
・EはNHまたはOを表し；
・Rbは1〜6の炭素原子を含むアルキル鎖を意味し；
・D'は次の基の1つを表し；
【００６４】
【化３３】
2010517984.tif 000042
【００６５】
mは1〜40の範囲の整数であり；
vは1〜10の範囲の整数であり；
結合c'はX基との結合を表し、
【００６６】
・Dは次の基を表し：
−  式の基
【化３４】
2010517984.tif 000043
（ここで、Xは式(13')および(15')の基を意味する）
【００６７】
−  または式の基
【化３５】
2010517984.tif 000044
【００６８】
もしくは式の基
【化３６】
2010517984.tif 000045
（ここで、Xは式(1')、(2')、(8')、(9')、(5')、(6')、(7')、(10')、(11')、(12')および(14')の基を意味する）、
【００６９】
c'結合はX基との結合を表し、
qは2〜6の範囲の整数を表し；
Xgは次の基の1つの残基に相当する：
−  -(Gly)n-、nは1〜10の範囲；
−  -(Pro)n-、nは1〜10の範囲；
−  NH2-(CH2)n-COOH、nは1〜10の範囲；
−  NH2-(CH2-CH2-O)m-CH2CH2COOH、mは3〜6の範囲；
−  8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸；
【００７０】
−  トラネキサム酸；
−  N-メチル-トラネキサム酸；
−  4-(ピペリジン-4-イル)ブタン酸；
−  3-(ピペリジン-4-イル)プロピオン酸；
−  N-(4-アミノブチル)-グリシン；
−  4-カルボキシメチル-ピペラジン；
−  4-(4-アミノフェニル)ブタン酸；
−  3-(4-アミノフェニル)プロパン酸；
【００７１】
−  アミノフェニル酢酸；
−  4-(2-アミノエチル)-1-カルボキシメチル-ピペラジン；
−  トランス-4-アミノシクロへキサンカルボン酸；
−  シス-4-アミノシクロへキサンカルボン酸；
−  シス-4-アミノシクロヘキサン酢酸；
−  トランス-4-アミノシクロヘキサン酢酸；
−  4-アミノ-1-カルボキシメチルピペリジン；
−  4-アミノ安息香酸；
−  4-(2-アミノエトキシ)安息香酸。
【００７２】
有利な実施態様によれば、本発明の化合物は、Yが次の式の1つを有する、前記で定義された式(I)の化合物である：
【化３７−１】
2010517984.tif 000046
【００７３】
【化３７−２】
2010517984.tif 000047
Ra、Rc、D、D'、Xg、q、iおよびpは前記で定義されたとおりである。
【００７４】
本発明による好ましい化合物は、次の式(III-a)または(III-b)の1つを有する化合物である：
【化３８】
2010517984.tif 000048
Rcおよびmは前記で定義されたとおりである。
【００７５】
有利な実施態様によれば、本発明の化合物は、Rcが次の基の1つの中から選択されることを特徴とする：
−  H-Lys-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-
−  H-Lys-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-
−  Ahx-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-
−  H-Lys-ψ(CH2N)-(D)Pro-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-、-ψ(CH2N)-はメチレン-アミノタイプのペプチド様結合に相当、
−  H-Lys-ψ(CH2)-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-、-ψ(CH2)-はメチレンタイプのペプチド様結合に相当、
−  H-Lys-ψ(CH2-CH2)-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-、-ψ(CH2CH2)-はエチレンタイプのペプチド様結合に相当、
−  H-Lys-Gly-DOPA-Tyr-NH-(CH2)5-CO-、または
−  H-Arg-Ile-Ile-Leu-Arg-NH-(CH2)5-CO-。
【００７６】
本発明は、次の式(III-a)の前記で定義された化合物をさらに指向する：
【化３９】
2010517984.tif 000049
（式中、
−nは1、2または6に等しく；
−RcはH-Lys-Gly-Tyr-Tyr-NH-(CH2)5-CO-基を意味する）
【００７７】
本発明は、活性成分として前記で定義された式(I)の化合物を、医薬的に許容される担体と共に含むことを特徴とする医薬組成物にも関する。
本発明は、活性成分として前記で定義された式(I)の化合物を、医薬的に許容される抗原増強剤と共に含むことを特徴とするワクチン組成物にも関する。
【００７８】
本発明は、免疫応答の阻害または活性化を伴って、病状の治療を意図した医薬を製造するための、前記で定義された化合物の使用も指向している。
炎症疾患（炎症性のリウマチ疾患）、自己免疫疾患、一般的な過敏反応および特別なアレルギー障害、移植拒絶、移植片対宿主反応の過程で、免疫応答は阻害されるべきである。
【００７９】
一般的にワクチン接種処置、癌免疫療法、免疫抑制を誘導する細菌またはウイルス感染症（麻疹、エイズ、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス・・・）、1次もしくは2次の免疫不全に罹患している対象物の、細菌もしくはウイルス感染症または非従来型の感染因子（プリオン）に関連する疾患の治療においては、免疫応答は活性化されるべきである。
【００８０】
本発明は、移植拒絶、アレルギー性疾患および自己免疫疾患のような病状の免疫応答の阻害を伴う治療を意図した医薬を製造するための、前記で定義された化合物の使用をさらに指向している。
本発明は、癌または寄生虫感染症、細菌感染症、ウイルス感染症もしくはプリオンのような非従来型の感染因子を含むその他の感染症のような病状の免疫応答の増強を伴う治療を意図した医薬を製造するための、前記で定義された使用もさらに指向している。
【００８１】
免疫応答の阻害を伴う疾患は、糖尿病、多発性硬化症、播種性紅斑性狼蒼(disseminated lupus erythromatosis)またはリウマチ様関節炎、特に同種移植、異種移植もしくは移植片対宿主反応に関する移植拒絶のような自己免疫疾患、ならびにアレルギー状態、特に枯草熱およびアレルギー性皮膚炎のような過敏反応または肉芽腫を含む。
【００８２】
免疫応答を阻害するときに用いられる本発明の化合物は、静脈内、粘膜内（経口、鼻腔内、膣内手段により、吸入により）、皮下、皮内または表皮ルートにより投与され得る。
【００８３】
本発明は、免疫応答の阻害を伴って病状を治療するための、本発明による化合物を含むことを特徴とする医薬組成物にも適用され、そして、その化合物は、対象物に1日約100 ng〜5 mgの割合で投与されるような量で医薬組成物中に存在する。
【００８４】
本発明は、免疫応答の増強を伴って癌または寄生虫感染症、細菌感染症、ウイルス感染症もしくはプリオンのような非従来型の感染因子を含むその他の感染症のような病状の治療を意図した医薬を製造するための、前記のような使用にも関する。
【００８５】
免疫応答の活性化を含む場合は、一般的なワクチン接種処置、特にインフルエンザまたは小児科の疾患に対するワクチン接種処置、癌免疫療法、特に黒色腫または転移性癌の管理(management)における癌免疫療法、または免疫抑制を誘導する細菌もしくはウイルス疾患、特に麻疹、エイズ、ヘルペスウイルスもしくはサイトメガロウイルスの管理における疾患、または1次もしくは2次の免疫不全に罹患している対象物に対して意図されたワクチンを含む。
【００８６】
免疫応答を活性化するときに用いられる本発明の化合物は、静脈内、粘膜内（経口、鼻腔内、膣内手段により、吸入により）、皮下、皮内または表皮ルートにより投与され得る。
【００８７】
本発明は、免疫応答の活性化を伴って病状を治療するための、本発明による化合物を含むことを特徴とする医薬組成物にも関する、そして、その化合物は、対象物に1日約100 ng〜5 mgの割合で投与されるような量で医薬組成物中に存在する。
【００８８】
本発明は、前記で定義された式(I)の化合物を固体の担持体上で製造する方法にも関し、該製造方法は次の工程を含むことを特徴とする：
−  その前駆体が生長するペプチド鎖を形成するアミノ酸配列から構成され、それらの3つがアミンタイプの基を有するN-保護されたアミノ酸残基と生長するペプチド鎖のアミン官能性との逐次カップリングのサイクルおよび脱保護により合成される、前記で定義されたYの鎖状前駆体を形成すること、ここで、最初のアミノ酸残基は固体担持体に結合され、前記のYの鎖状前駆体は少なくとも1つのD-アラニン残基を含み、該D-アラニン残基はD-リシン残基によって置換されており、そのε-NHアミンは、前記で定義されたX基に相当する所望の官能性を有するカルボン酸でアシル化されている、
【００８９】
−  保護され官能的に置換された環を得るために、前記の保護された状態の鎖状前駆体のYを環化すること、
−  2量化された、保護され官能的に置換された環を得るために、上記の保護され官能的に置換された環を前記で定義されたZ-由来のスペーサーと反応させること、
−  前記の保護基を開裂し、前記の保護されたアミン官能性をフリーにし、2量化された、脱保護され官能的に置換された環を得ること、
【００９０】
−  前記のフリーのアミン官能性をそこで形成されるかまたは前もって形成されたペプチドと前記で定義されたRc基に相当するアミノ酸残基の逐次構築によりカップリングすること、および
−  前記で定義された化合物を得るために、Rc基の官能的に置換された側鎖上に存在する全ての保護基を除去した後、分子を固体担持体から開裂すること。
【００９１】
本発明は、式(III-a)または(III-b)の化合物を製造するための前記で定義された方法にも関し、該方法は次の工程を含むことを特徴とする：
−  次の式：
【化４０】
2010517984.tif 000050
（GPは特にBoc、ZまたはAllocの中から選択される保護基を表し、
【００９２】
X'は-SH基または
【化４１】
2010517984.tif 000051
を表す）
の保護され官能的に置換された環を、式
【００９３】
【化４２】
2010517984.tif 000052
（nは1〜10の範囲の整数を表し、
【００９４】
ZはN3基または基
【化４３】
2010517984.tif 000053
を表す）
【００９５】
（ここで、X'が基
【化４４】
2010517984.tif 000054
を表すとき、Z'はN3基を表し、
【００９６】
X'が-SH基を表すとき、Z'は基
【化４５】
2010517984.tif 000055
を表すものと理解される）
のスペーサー基と反応させて、次の式(VIII)：
【００９７】
【化４６】
2010517984.tif 000056
（GPは前記で定義されたとおりであり、
Y'は次の式：
【００９８】
【化４７】
2010517984.tif 000057
の1つを有する）
【００９９】
（ここで、Z'がN3基を表すとき、Y'は式(A)を有し、
Z'が基
【化４８】
2010517984.tif 000058
を表すとき、Y'は式(B)を有すると理解される）
の化合物を得る工程、
【０１００】
−  前記の保護基GPを開裂させ、保護されたアミン官能性をフリーとし、該前記のフリーのアミン官能性をそこで形成されるかまたは前もって形成されたペプチドと前記で定義されたRc基に相当するアミノ酸残基の逐次構築によりカップリングさせる工程、および
−  Rc基の官能的に置換された側鎖上に存在する全ての保護基を除去した後、分子をその固体担持体から開裂させて、前記で定義された式(III-a)または(III-b)の化合物を得る工程。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】L1と抗CD40抗体アゴニスト試薬3/23との相乗効果を示す図である。
【図２】エントリー6で定義された条件下でのマクロサイクルIV.23とIV.15ジアジドとの間の1,3-双極子反応および続くTFAでの処理のHPLC溶出プロファイルを示す図である。
【図３】エントリー5で定義された条件下でのマクロサイクルIV.23とIV.14ジアジドとの間の1,3-双極子反応および続くTFAでの処理のHPLC溶出プロファイルを示す図である。
【図４】図4Aは、TFAでの処理後の2量化したマクロサイクルIV.25と保護されたペンタペプチドP1との粗カップリング反応媒体のHPLC溶出プロファイルを示す。図4Bは、分取HPLCで精製した後のL41リガンドのHPLC溶出プロファイルを示す（HPLC：直線勾配、5〜65% B、20分）。図4Cは、L41リガンド（予想マス：5529）のMALDI-TOFスペクトルプロファイルを示す。
【図５】図5Aおよび5Bは、L1およびL41によるバーキットリンパ腫RAJI細胞でのアポトーシス誘導およびB細胞増殖誘導を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０２】
図の説明
図１は、L1（後記の式を参照）と抗CD40抗体アゴニスト試薬3/23との相乗効果を示す。cpmで3H-チミジンの取り込みを縦座標軸に示す。
図2は、エントリー6で定義された条件下でのマクロサイクルIV.23とIV.15ジアジドとの間の1,3-双極子反応および続くTFAでの処理のHPLC溶出プロファイルを示す（HPLC：直線勾配、5〜65% B、20分）。
図3は、エントリー5で定義された条件下でのマクロサイクルIV.23とIV.14ジアジドとの間の1,3-双極子反応および続くTFAでの処理のHPLC溶出プロファイルを示す（HPLC：直線勾配、5〜65% B、20分）。
図4Aは、TFAでの処理後の2量化したマクロサイクルIV.25と保護されたペンタペプチドP1との粗カップリング反応媒体のHPLC溶出プロファイルを示す。図4Bは、分取HPLCで精製した後のL41リガンドのHPLC溶出プロファイルを示す（HPLC：直線勾配、5〜65% B、20分）。図4Cは、L41リガンド（予想マス：5529）のMALDI-TOFスペクトルプロファイルを示す。
【０１０３】
図5Aおよび5Bは、L1およびL41によるバーキットリンパ腫RAJI細胞でのアポトーシス誘導およびB細胞増殖誘導を示す。白い棒はL41リガンドを意味し、黒い棒はL1リカンドを意味する。
図5Aにおいて、比アポトーシス(specific apoptosis)のパーセントが縦座標軸にプロットされ、一方μMでのリガンド濃度が横座標軸にプロットされる。結果は、3つの独立した実験の算術平均+/-SDを意味する。
図5Bにおいて、縦座標軸は、CD40L類似物と一緒の培養で得られたcpm値をCD40L類似物なしでの培養で得られたcpm値で割った値に相当する刺激指数(stimulation index)を示すのに対し、横座標軸は各CD40L類似物（L1およびL41）の濃度を示す。白色の四角はL41リガンを意味し、一方黒い四角はL1リガンドを意味する。
【０１０４】
それらそれぞれのリガンドとの相互作用により、TNFスーパーファミリーの受容体は、細胞を生存、増殖および分化ならびに／または（細胞死をプログラムする）アポトーシスを可能にするシグナルを伝達する。TNFスーパーファミリーの特定の受容体が考慮されることに基づいて、および／または細胞のタイプが考慮されることに基づいて、シグナル伝達に対して要求されるオリゴマー化の程度は異なる：あるものは可溶性の形態の(in soluble form)ホモ3量体(homotrimeric)リガンドにより活性化されるのに対し、他のものは膜結合のホモ3量体リガンドによってのみで活性化される。このように、TWEAK、TNFおよびBAFFリガンドは可溶性の形態で活性である。
【０１０５】
対照的に、FasL、TRAIL、CD40LまたはCD30Lによる活性化は、採用されるためには、1以上の空間的に近いホモ3量体を必要とする(Holler, N. ; Tardivel, A. ; Kovacsovics-Bankowski, M. ; Hertig, S. ; Gaide, O. ; Martinon, F. ; Tinel, A. ; Deperthes, D. ; Calderara, S. ; Schulthess, T. ; Engel, J. ; Schneider, P. ; Tschopp, J. Molec. Cell. Biol. 2003, 23, 1428 - 1440 ; Schneider, P. ; Holler N. ; Bodmer, J.L. ; Hahne, M. ; Frei, M. ; Fontana, A. ; Tschopp, J. J. Exp. Med. 1998, 187, 1205 - 1213)。
【０１０６】
CD40信号伝達(signalling)の場合、ある細胞のタイプおよび特にB細胞に対して、6量複合体3:3の形成のみでは、信号伝達を誘導するには不十分である。この場合、最小の信号伝達ユニットまたはモチーフ(motif)が、互いに近接する1つではなくいくつかの6量複合体になる。
【０１０７】
この観察された事実は、可溶性リガンドによって誘導される受容体のオリゴマー化を増加させる手段を開発することに生化学者を駆り立てている。このアプローチは、一方で、受容体関与により誘発される生物学的作用を増大させることを可能にし、他方で、それによる多量体化がそのような増大を引き起こす作用機序の研究を可能にする。
【０１０８】
今のところ、CD40のオリゴマー化を増幅するための生物学的アプローチだけが記載されている。基本的に、2つの方法が報告されている。1番目の方法は2つのパートナー：リガンドとオリゴマー化増幅剤を用いることに基づく。2番目の方法は、多量体融合蛋白質を構築することに基づく。両アプローチは、CD40LおよびFasLの生物学的作用を増幅するために用いられている。
【０１０９】
1番目の方法を検討するとき、増幅剤は、可溶性リガンドと相乗的に作用する抗-受容体モノクローナル抗体（例えば抗-CD40 mAb） (Pound, J.D. ; Challa, A. ; Holder,M.J. ; Armitage, R.J. ; Dower, S.K. ; Fanslow, W.C. ; Kikutani, H. ; Paulie, S. ; Gregory, C.D. ; Gordon, J. Int. Immunol. 1999, 11, 11 - 20 ; Schneider, P. ; Holler, N. ; Bodmer, J.L. ; Hahne, M. ; Frei, K. ; Fontana, A. ; Tschopp, J. J. Exp. Med. 1998, 187, 1205 - 1213)あるいはFlag蛋白質と融合した遺伝子組み換えリガンドのオリゴマー化をもたらす抗-Flagモノクローナル抗体であり得る (Haswell, L.E. ; Glennie, M.J. ; Al-Shamkhani, A. Eur. J. Immunol. 2001, 31, 3094 - 3100)。
【０１１０】
2番目の方法は、リガンドのいくつかの複製からなる融合蛋白質を組み入れることにある。ローザンヌ大学のJorg Tschoppのチームは、FasLまたはCD40LがACRP30蛋白質のコラーゲンドメインに融合した分子を作成した。この蛋白質、C1qスーパーファミリーのメンバーは、特有の3D立体配置とたった1つの分子上での融合により2つのホモ3量体のドメインを結合する2つのホモ3量体のヘッド(head)を有する。同じような方法において、Hasxellらは、4つのCD40Lホモ3量体を与えることができる分子を記載している。これは、「肺表面活性蛋白質-D」（SP-D：レクチンスーパーファミリーのメンバー）のレクチンドメインをCD40LのC-末端の細胞外ドメインで置き換えることにより達成された(Haswell, L.E. ; Glennie, M.J. ; Al-Shamkhani, A. Eur. J. Immunol. 2001, 31, 3094 - 3100)。
【０１１１】
ホモ3量体のCD40Lに融合したこれらの多量体蛋白質ACRP30およびSP-Dの使用は、マウスの脾臓Bリンパ球の強い増殖を誘導することができる最も小さい活性単位は、ホモ3量体のCD40Lの2量体であることを示している。両方法を組み合わせること、すなわちFlag部分を含有する融合蛋白質CD40L：ACRP30を抗-Flag抗体と「結合すること(crosslinking)」は、B細胞上でのCD40L：ACRP30の効果を著しく増大する、それ故に、効果的なシグナリングのために受容体のオリゴマー化の度合を増幅することの必要性を示している。
【０１１２】
実験の部
Ａ）化学
可溶性のCD40Lのように、合成擬態体（例えば、国際出願WO03/102207で特定されているL1）は、ネズミ脾臓B細胞の増殖を誘導しない。本明細書で既に議論された文献に報告された結果は、我々のリガンドのオリゴマー化能力をさらに増大させることを目的とした戦略が非常に適切であることを提案している。このことは、モノクローナル抗体3/23を用いた実験結果により確認されている。事実、我々は、脾臓B細胞でのL1の効果は、可溶性ホモ3量体CD40Lの効果と同様に、抗-C40抗体アゴニスト剤により高められることを幸運にも明らかにした。これら2つの分子を組み合わせることはB細胞増殖を誘導する（図1）。
【０１１３】
【化４９】
2010517984.tif 000059
【０１１４】
並行して、本発明者らは、ホモ3量体CD40Lを擬態する合成リガンドの少なくとも2つのコピーを提供することができる分子を設計するために、広範な研究開発を行った。基本的概念は、リガンドのオリゴマー化をもたらす増幅効果を示すことおよびB細胞増殖を誘導することができる最小の単位を確認することであった。これを達成するため、1つの選択は、リガンド2量体を合成することであった。
【０１１５】
合成リガンドの2量化
１）一般的逆合成法アプローチ
2量化された分子は、n-アルキルまたはポリエチレングリコールタイプのスペーサーにより互いに結合したシクロ-D、L-α-ペプチドの2つの3量体構造から出発して合成される。この結合を築くために、2つのアプローチが検討された：1つはチオール化学（マレイミドへのチオールのマイケル付加反応）を用い、一方、他方は「クリック化学」、アルキンとアジドとの双極子付加環化[3+2]反応（またはHuisgen反応）に基づく。1番目のアプローチでは、導入される結合はチオエーテル結合であるのに対し、「クリック化学」アプローチは、1,4-ジ置換された1,2,3-トリアゾールタイプの結合が生成する。
【０１１６】
用いられる一般的な方法は、次のスキームによる、官能的に置換された基：「クリック化学」の場合は正規の(formal)アルキン、2番目のアプローチの場合はチオール基のどちらかが付いたマクロサイクル-D、L-α-ペプチド共役の合成に関する：
【０１１７】
【化５０】
2010517984.tif 000060
【０１１８】
この官能的に置換されたサイクル（cycle）は、次の方法：ペプチド前駆体製造の間に、3つのD-アラニン残基の1つを、そのεNHアミンが前もって所望の官能性を有するカルボン酸でアシル化されているD-リシン残基で置換することにより製造される。
【０１１９】
２）チオールとマレイミドを含むマイケル付加反応により2量化
最初に、CD40Lの官能的擬態体を、チオール基によって官能的に環外置換されたリガンドと6炭素原子を有するビスマレイミドスペーサー(IV.1)の間のマイケル付加反応により2量化することを構想した。
【０１２０】
このスペーサーは、対応するジアミンから出発して、THFと炭酸水素ナトリウムの飽和溶液の混液中、同じジアミンをN-(メチルカルボニル)マレイミドと反応することにより製造される((a) Bodanszky, M.; Bodanszky, A. in the Practice of Peptide Synthesis ; Springer-Verlag: New York, 1984, 29 - 31. (b) Cheronis, J.C. ; Whalley, E.T. ; Nguyen, K.T. ; Eubanks, S.R. ; Allen, L.G. ; Duggan, M.J. ; Loy, S.D. ; Bonham, K.A. ; Blodgett, K. J. Med. Chem. 1992, 35, 1563 - 1572)。所期の生成物が、さらに精製することなく、洗浄だけで得られる。
【０１２１】
【化５１】
2010517984.tif 000061
【０１２２】
ａ．官能的に置換されたマクロサイクルの合成
この合成経路の重要な工程の1つは、チオール基により官能的に置換されたマクロサイクル分子の製造である。第1段階で、Boc基に直交(orthogonal)するが、通常のペプチド合成条件で安定な、この官能性のための簡便な保護基を見つける必要性があった。この目的のためにアセトアミド基(Acm)が用いられた。実際、この保護基は、Fmoc基の脱保護条件（DMF中の20％ピペリジン）で安定であり、トリフルオロ酢酸の存在下でも安定である。
【０１２３】
マクロサイクル部分を官能的に置換するために要求される、この中間体生成物3-(アセチルアミノ-メチルスルファニル)プロピオン酸(IV.2)の合成は次のスキームに概略される：
【化５２】
2010517984.tif 000062
【０１２４】
3-メルカプトプロパン酸、チオール誘導体のアセトアミド保護基による保護は、N-(ヒドロキシメチル)アセトアミドの存在下、トルフルオロ酢酸中で行われる(Phelan, J.C. ; Skelton, N.J. ; Braisted, A.C. ; McDowell, R.S. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 455 - 460)。
【０１２５】
次いで、酸IV.2を適当に保護されたIV.4 D-リシン誘導体のεNHアミンとカップリングする。続いて、このようにして得られるIV.5化合物を、当該Fmocおよびベンジルエステル基を除去することにより脱保護する。次に、このようにして形成される両性イオンのN-末端部分を、順次マクロサイクル化（macrocyclization）のために意図された直鎖ペプチドを組み立てるために要求されるIV.7前駆体を得るために、Fmoc基で再度保護する。
【０１２６】
【化５３】
2010517984.tif 000063
【０１２７】
次いで、保護されたチオール基を含むこのモノマーを、固体の担持体上での合成の過程で直鎖ヘキサペプチドIV.8に組み込む。
合成は、次に示されるFmoc法に従い、2-クロロトリチルクロライド樹脂から出発して行われる。
【０１２８】
【化５４】
2010517984.tif 000064
【０１２９】
直鎖前駆体IV.8の環化は、問題があることが判った。標準的な条件下で行われたII.2マクロサイクル合成の初期の試みは、大量の重合生成物を伴った脱保護後の粗マクロサイクル生成物のHPLC溶出プロファイルを示した。それゆえ、マクロサイクル化条件のより綿密な研究が必要とされた。これを達成するため、我々はカップリング剤のタイプ、反応媒体の濃度ならびに反応時間を変えた。この研究の結果は表1に要約される。この表において、純度のパーセントは、IV.9のTFAでの処理後に得られた粗化合物IV.10のHPLC溶出プロファイルから計算した純度を意味する。実際、完全に保護されたサイクルIV.9のHPLC分析を行うことは、この化合物がHPLCに通常用いられる溶媒中にやや溶けにくいので、適さない。
【０１３０】
表1：マクロサイクル化反応に用いられた種々の条件
【表５】
2010517984.tif 000065
【０１３１】
この反応は、用いられる実験条件に非常に敏感であることが分かる。第1の段階で、反応が行われる濃度が非常に重要な因子であることが分かった。実際、反応媒体の希釈に基づいて、マクロサイクルIV.10化合物の純度は、大きい程度で変化する（表1のエントリー＃1、2および3）。マクロサイクルIV.10の形成が許容される純度で生じるために、4.10-3Mの濃度が適合するようである。
【０１３２】
逆に、反応の成果は、用いられる特定のカップリング剤ならびに反応が起こるpH（EDC.HClカップリングに対してpH〜7、BOPカップリングに対してpH〜8-9）により非常に影響される。実際、BOPカップリング剤は、EDC.HClに比較して明らかにより劣った結果となる（エントリー＃4および5）。最後に、反応時間が評価された。EDC.HClカップリングの場合、完全なマクロサイクル化が起こるためには、72時間が必要である。
【０１３３】
反応性の差は、反応が起きる温度に依存することも観察された。40℃の温度で、重合生成物が非常に顕著である。
このようにして得られるIV.10マクロサイクル化合物をBOPの存在下に、保護されたペンタペプチド、Boc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(OtBu)-Tyr(OtBu)-Ahx-OH P1とカップリングし、さらに精製することなく、完全に保護された3量体リガンドをもたらす。BocおよびtBuならびにAcm保護基は、たった1回の工程で除かれ、チオール官能基を有するL38リガンドはC18分取HPLCで精製される。
【０１３４】
【化５５】
2010517984.tif 000066
【０１３５】
基本的に、アセトアミド基は、Boc/tBu保護基の除去条件に直交するいくつかの種々の条件で除去される。特に、酸環境下での水銀塩（pH4の緩衝液中のHg[OAc]2）でのペプチドの処理(Veber, D. ; Milkowski, J.D. ; Varga, Varga, S.L. ; Denkewalter, R.G. ; Hirschmann, R. J. Am. Chem. Soc. 1972, 94, 5456-5461)、銀塩の使用（例えば、トリフルオロ酢酸中、アニソールの存在下でのCF3SO3Ag）(Fujii, N. ; Otaka, A. ; Watanabe, T. ; Okamachi, A. ; Tamamura, H. ; Yajima, H. ; Inagaki, Y. ; Nomizu, M. ; Asano, K. J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1989, 283-284)、タリウム塩（Tl(CF3CO2)2）での処理(Fujii, N.ら、Chem. Pharm. Bull. 1987, 36, 2339)、またはヨウ素(Kamber, B.ら、Helv. Chim. Acta 1980, 63, 899)で行われることが挙げられる（最後の2つの場合、ジスルフィド結合が形成される）。
【０１３６】
アニソールの存在下、トリフルオロ酢酸中のトリフルオロ酢酸銀CF3CO2Agを用いることが決定された。そのような脱保護条件は、ペプチドに存在するアセトアミド保護基ならびにtert-ブチルオキシカルボニル（Boc）およびtert-ブチルエーテル（tBu）基の両方の除去を可能にする((a) Albericio, F. et al. in Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach, W.C. Chan and P.D. White (Eds.), Oxford University Press, Oxford, 2000, pp. 104; (b) Novabiochem catalog 2004/5 pp 3.21)。続いて、リカンドは、存在するかもしれない、前に形成されたジスルフィド結合を還元するために、酢酸中の1,4-ジチオスレイトール（DTT）の溶液で処理される。
C18カラムでの分取HPLCによる精製に続いて、L38リガンドを素早く2量化反応に付す。
【０１３７】
b．チオールを有するリガンドとビスマレイミドスペーサーとの間のマイケル付加反応
マイケル付加反応は、水／アセニトリル混液中で行われる。アセトニトリル中のビスマレイミドIV.1（1 eq.）の溶液を水中のL38リガンド（3 eq.）の溶液に加える。たとえマイケル付加反応が速くても、2つのL38リガンド間の起こるかもしれないジスルフィド結合の形成を防ぐために、逆に比較的希薄な媒体（2,5.10-3 M）中で反応を行うことを決めた。
【０１３８】
L38のIV.1へのマイケル付加反応によって促進される2量化
【化５６】
2010517984.tif 000067
【０１３９】
反応は分析HPLCでモニターされ、反応から15分後に、正味の割合のモノ付加物L39'リガンドが既に形成されていることが認められた。しかしながら、いくらかのビスマレイミドIV.1が残っており、いくらかのチオールを有するリガンドL38が過剰に加えられた。24時間後に、L39 2量化生成物が検知された。しかしながら、反応はやっと10日後に完了する。モノ付加化合物の部分の全ては、過剰に加えられたL38リガンドと反応し、それにより初期のL39 2量体を
生じる。
【０１４０】
ｃ．結論
この合成方法の重要な工程は、官能的に置換されたマクロサイクルを製造することである。このマクロサイクル化反応の成果は、実験条件の選択に非常に敏感なことを示している。そのような条件の最適化は、幾分、さらに精製することなしに続く合成工程に用いられるほどの相当に許容される純度でマクロサイクルに導いた。
【０１４１】
マイケル付加反応は、チオール基により官能的に置換されたリガンドとビスマレイミドスペーサーを水／アセトニトリル混液中に溶解することだけが必要なので、行うのが簡単である。pHを調整（pH〜7）することは、反応を加速することができ、2量体形成の時間を短くすることができる。分取HPLCで粗反応媒体を精製することにより2量化したリガンドを得る。しかしながら、他のビスマレイミド化合物が用いられたとき、2量化生成物を精製するときにいくつかの困難を経験した。実際、この反応は、ポリエチレングリコールIV.11タイプのビスマレイミドスペーサーから出発して同様に行われた。
【０１４２】
【化５７】
2010517984.tif 000068
【０１４３】
３）「クリック化学」経路によりリガンドの2量化
マイケル反応を用いる方法と並行して、「クリック化学」法による我々のリガンドの2量化を行った。
【０１４４】
ａ．「クリック化学」反応
アルキンとアジドとの間の1,3-双極子環化付加反応は、Huisgenらにより60年代に発見された(Huisgen, R. ; Szeimies, G. ; Moebius, L. Chem. Ber. 1967, 100, 2494-2507 ; Huisgen, R. Pure Appl. Chem. 1989, 61, 613 - 628)。この反応は、次に概略したスキームにより、トリアゾールモチーフの形成を可能にする：
【０１４５】
【化５８】
2010517984.tif 000069
【０１４６】
最近、Sharplessらのチームは、触媒量の銅Iの使用は、より穏和な反応条件（室温で反応を行うこと）を提供し、反応収率ならびに選択性（1,4-位置異性体の選択的形成）を改善することを発見した(Kolb, H.C. ; Finn, M.G. ; Sharpless, K.B. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004 - 2021 ; Rostovtsev, V.V. ; Green, L.G. ; Fokin, V.V. ; Sharpless, K.B. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596 - 2599)。この銅-触媒反応は、反応条件（溶媒、pHであろうと銅源のレベルであろうと）を選択するときに大きな自由度を可能にする。
【０１４７】
通常、反応は、アスコルビン酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような還元剤によりその場で還元されるCu(SO4)・5H2Oを用いて行われる。しかしながら、所望の結果を得ることができないような条件の場合、銅I源（CuI、CuBr、CuOTf.C6H6・・・）が直接用いられ得る。後者の場合、反応は酸化に対してより敏感で、第2の生成物の形成が時々観察される。この望まない副反応を避けるため、反応は空気を避けて行われるべきであり、2,6-ルチジンのような塩基の添加がなされるべきである。
【０１４８】
Sharplessによる報告と並行して、Meldalのチームは、有機アジド化合物とペプチド-樹脂の末端部分に結合したアルキンから出発する、1,4-トリアゾールペプチドの固相製造のために銅I塩（CuI）の使用を記載している(Tornoe, C.W. ; Christensen, C. ; Meldal, M. J. Org. Chem. 2002, 67, 3057 - 3064)。溶液中の反応において同様の方法で、この反応は全ての種類の溶媒（アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド、トルエン、ジクロロメタン）に対応し、優れた純度を有する所望のトリアゾールペプチドへの容易な手段を与える。
【０１４９】
この発見以来、今や、Huisgenの1,3-双極子反応は多くの応用分野：コンビナトリー化学 (Lober, S. ; Rodriguez-Loaiza, P. ; Gmeiner, P. Org. Lett. 2003, 5, 1753 - 1755 ; Kolb, H.C. et al. Preparation of 1,2,3-triazole carboxylic acids from azides and β-ketoesters in the presence of base. US2003135050) であろうと、有機化学 ((a) Fazio, F. ; Bryan, M.C. ; Blixt, O. ; Paulson, J.C. ; Wong, C.-H. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 14397 - 14402 ; (b) Bodine, K.D. ; Gin, D.Y. ; Gin, M.S. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 1638 - 1639 ; (c) Seo, T.S. ; Li, Z. ; Ruparel, H. ; Ju, J. J. Org. Chem. 2003, 68, 609 - 612 ; (d) Zhou, Z. ; Fahrni, C.J. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 8862 - 8863 ; (e) Jin, T. ; Kamijo, S. ; Yamamoto, Y. Eur. J. Org. Chem. 2004, 3789 - 3791) であろうと、さらにバイオコンジュゲート合成 (bioconjugate synthesis) ((a) Wang, Q. ; Chan, T.R. ; Hilgraf, R. ; Fokin, V.V. ; Sharpless, K.B. ; Finn , M.G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3192 - 3193. (b) Link, A.J. ; Tirell, D.A. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 11164 - 11165. (c) Speers, A.E. ; Adam, G.C. ; Cravatt, B.F. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 4686 - 4687. (d) Seo, T.S. ; Li, Z. ; Ruparel, H. ; Ju, J. J. Org. Chem. 2003, 68, 609 - 612. (e) Speers, A.E. ; Cravatt, B.F. Chem. Biol. 2004, 11, 535 - 546. (f) Lee, L.V. ; Mitchell, M.L. ; Huang, S.-J. ; Fokin, V.V. ; Sharpless, K.B. ; Wong, C.-H. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 9588 - 8589) の分野に用いられる。
【０１５０】
ｂ．「クリック化学」反応のために必要とされる2つの試薬：ジアジドおよび正規のアルキンにより官能的に置換されたマクロサイクルの製造
ジアゾスペーサーは、対応するポリエチレングリコール鎖から出発し、次のように2工程で製造される：
【化５９】
2010517984.tif 000070
【０１５１】
ジオールは最初ジメシレートに変換され、次にアジ化ナトリウム添加によって置換される。このようにして、スペーサーの鎖長の重要性を評価するために、3つの種々のサイズの化合物 (IV.15 - IV.17) (n= 1, 2, 6)を製造した。
【０１５２】
固体の担持体ペプチド合成での使用のための、正規のアルキン官能性を含み、適当に保護されたD-リシンIV.21誘導体の合成のためのD,L-α-ペプチドマクロサイクルの製造
【０１５３】
IV.21を構築し、マクロサイクル官能性を生み出すために用いられる正規のアルキン誘導体(IV.18)は、次の無水コハク酸とモノ-プロパルギルアミンとの間の反応から生じる。
【化６０】
2010517984.tif 000071
【０１５４】
次いで、このようにして得られるN-プロピ-2-インイル-スクシンアミド酸(IV.18)を、IV.19誘導体を形成するために、N-Fmoc-保護されたD-リシンアミノ酸とカップリングする。一連の保護および脱保護工程が、全収率23％の5工程でIV.21前駆体を与える。
【０１５５】
正規のアルキンとカップリングした中間体生成物の合成
【化６１】
2010517984.tif 000072
【０１５６】
次いで、このようにして得られる官能的に置換された前駆体を、固相合成中に直鎖IV.22ヘキサペプチドに組み込む。続いて、該ペプチドをIV.23マクロサイクルを形成するために環化する。
【０１５７】
【化６２】
2010517984.tif 000073
【０１５８】
再度、マクロサイクル化反応が最適化されなければならない。事実、EDC・HClタイプのカップリング剤により行われる環化反応のHPLC溶出プロファイルは、脱保護されたマクロサイクルIV.24に対応する細いピークを示すが、これは重合生成物に対応する幅広いピークと関連する。反応媒体の希釈はマクロサイクル化合物の純度を増加するけれども、このカップリング剤を用いた反応収率はなお非常に低い。
【０１５９】
代わりに、BOP試薬を用いることを検討した。これは、実質的な収率の増加（83％）およびBoc基の脱保護後のマクロサイクルの純度の増加（67％）という結果を招いた。
環化反応条件の最適化により、前もって分取HPLCでIV.24マクロサイクル化合物を精製することなく対応するL40リガンドを形成するためのペプチドカップリング反応を試みることが可能であった。
【０１６０】
【化６３】
2010517984.tif 000074
【０１６１】
ｃ．「クリック化学」反応
i. 「クリック化学」反応の純化
これらの保護基からの脱保護(L40)リガンドまたは非脱保護(L40')リガンドのどちらかから出発する「クリック化学」反応が、最初に検討された。反応性試験は、IV.15ジアゾ体を用いて行った。
【０１６２】
表2に、用いた実験条件を要約する。反応の進行は、脱保護リガンド(L40)を用いて行われた実験の場合は粗反応媒体の直接注入か、または保護リガンド(L40')を用いて行われた反応の場合はトリフルオロ酢酸での事前処理後のいずれかによる分析HPLCでモニターされる。実際、L40'リカンドの低溶解性は、逆相HPLCによるその分析およびを「クリック化学」によって促進される2量化反応の直接的なモニタリングを非常に困難にする。
【０１６３】
最初は、Sharplessによって記載された標準条件、すなわち触媒量で導入され、還元剤、アスコルビン酸ナトリウムでその場で還元される銅II源、Cu(SO4).5H2Oの使用で行った。非常に親和性であるL40リガンドは、Sharplessにより一般的に用いられるtBuOH/H2O（1:1、v/v）混液に溶かした。保護されたL40'リガンドを用いて行われる反応は、その反応中、それが可溶性である唯一の溶媒のN,N-ジメチルホルムアミド中で行われた。
【０１６４】
4日間の反応後、余分の銅IIおよび還元剤を加えたにもかかわらず、どんなに特定の出発リガンド（L40またはL40'）を用いてもHPLCにより変化がないことを認めた。反応はマイクロ-ウエーブ下、80℃でも行われた。しかしながら、成果は見られなった。代わりに、出発物の崩壊が観察された。
【０１６５】
表2：L40またはL40'リガンドから出発する1,3-双極子反応に用いられた実験条件
【表６】
2010517984.tif 000075
【０１６６】
それゆえ、銅I源の直接的使用が、ヨウ化銅(CuI)を用いて、溶液または固相のどちらかで、ペプチドから出発する1,3-双極子反応を行った、Kirschenbaumらのチームの研究 (Jang, H. ; Fafarman, A. ; Holub, J.M. ; Kirschenbaum, K. Org. Lett. 2005, 7, 1951 - 1954)およびGhadiriのチームの研究(Van Maarseveen, J.H. ; Horne, W.S., Ghadiri M.R. Org. Lett. 2005, 7, 4503 - 4506) に基づいて試みられた。銅I源の使用は、不活性雰囲気下で行われる実験室の作業および化合物の溶解後に溶媒をアルゴンでフラッシュすることを必要とした。こららの予防措置にもかかわらず、リガンドL40およびL40'から出発した反応を行ったとき、変化は観察されなかった。
【０１６７】
この反応性の欠如の有望な1つの可能性は、L40リガンに存在する高い割合のフリーのアミノ基である。事実、1つの可能性は、銅が、これらの官能基の回りでキレート化を起こし、それゆえ、それが、銅がマクロサイクルに存在するアルキン官能性とキレート化することが妨げているのかもしれないことである。この説明は、アルギニン残基を含むペプチドを用いて行われた反応の場合に、既にNolteらによって提言されている (Dirks, A.J. ; Van Berkel, S.S. ; Hatzakis, N.S. ; Opsteen, J.A. ; Van Delft, F.L. ; Cornelissen, J.J.L.M. ; Rowan, A.E. ; Van Hest, J.C.M. ; Rutjes, F.P.J.T. ; Nolte, R.J.M. ; Chem. Commun. 2005, 4172 - 4174)。あるいは、マクロサイクルのスペーサー上のペンタペプチドの存在に関連する強い立体障害が、銅のキレート化を妨害するかまたは邪魔しているのかもしれない。
【０１６８】
こららの問題の結果として、保護されたマクロサイクル(IV.23)または非保護マクロサイクル(IV.24)から出発する「クリック化学」反応を実行することを決めた。マクロサイクルとジアゾ化合物IV.15とを反応する過程で用いられた実験条件を表3に示す。前述のように、反応の進行は、脱保護されたマクロサイクルで行われる実験の場合は反応混合物の直接注入で、あるいは保護されたマクロサイクル(IV.23)から出発して行われた反応の場合はトリフルオロ酢酸での前処理後のいずれかで、分析HPLCでモニターされる。
【０１６９】
Kirschenbaumの条件(エントリー♯1)にしたがって行うとき、分析HPLCにより変化は観察されなかった。対照的に、Ghadiriの条件(エントリー♯2、3および4）にしたがって行うとき、新しい生成物の形成と相まって出発物の実質的な減少が観察された。しかしながら、この生成物はこの段階では特徴づけることができなかった。これらの反応は、アセトニトリル(エントリー♯2および4)を用いるか、または水／アセトニトリル混液(エントリー♯3)中で行われた。この溶媒は、銅I源を用いるときにSharplessにより推奨されている(Rostovtsev, V.V. ; Green, L.G. ; Fokin, V.V. ; Sharpless, K.B. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596 - 2599)ので、選択された。
【０１７０】
表3：保護または非保護のマクロサイクルから出発する1,3-双極子反応のために用いられた実験条件
【表７】
2010517984.tif 000076
【０１７１】
これらの結果に基づいて、保護されたマクロサイクルIV.24から出発する反応を、よりよい可溶化を達成するためにN,N-ジメチルホルムアミド中で行うことを決めた。ペプチド-様化合物合成において、Meldalは、2等量のCuIと50等量のDIEAを用いている(Tornoe, C.W. ; Christensen, C. ; Meldal, M. J. Org. Chem. 2002, 67, 3057 - 3064)。この場合、塩基の割合は、25等量のDIEAおよび25等量の2,6-ルチジンに増加した。3日間撹拌およびTFAでの処理後、HPLC分析は、出発の環化合物のほとんど全部の消失（TFA処理後にIV.24に変換され、約2％がまだ存在した）および主生成物の形成を示す。分取HPLCで粗反応媒体を精製し、「クリック化学」反応から誘導される主生成物が所望の2量化分子IV.25であることを確認した。HPLC分析により、IV.24/IV.25比は3/97である(図2)。
【０１７２】
CuBrの使用（エントリー♯5）も調べられた。80℃で3日間撹拌後、反応を停止した。前記のように、HPLC分析は、出発物のほとんど全部の変換（12％のIV.24がまだ存在)を示すが、この時点で、2つの生成物が41/59（IV.25:IV.45)の比により主成分として形成される。これは所望の2量化IV.25化合物およびたった1つのトリアゾールモチーフの形成から生じるIV.25'誘導体である(図3)。
【０１７３】
これらの条件が2量化物への通路を与えるけれども、3日後に反応は最終的には3つの混合物になるので、それはヨウ化銅含むものより効率が悪い。その結果、表2のエントリー♯6に記載された条件が、他のスペーサーIV.16およびIV.17への1,3-双極子反応を一般化するのに明確に採用された。
【０１７４】
異なるスペーサーから出発する、官能的に置換されたマクロサイクルの2量化反応
【化６４】
2010517984.tif 000077
【０１７５】
化合物IV.25〜IV.27が、分取HPLC精製後、12〜20％に範囲の収率で単離された。
次いで、対応するリガンドL41〜L43が、2量化されたマクロサイクルを保護されたペンタペプチドBoc-Lys(Boc)-Gly-Tyr(OtBu)-Tyr(OtBu)-Ahx-OH（P1)とカップリングし、保護基の除去により脱保護し、分取HPLCで精製することにより製造された。
通常、カップリング反応は、2日以内で行われる。この場合、反応が完了するまでに室温で1週間の撹拌が必要とされる。単なる3日間で反応を停止すると、利用可能なεNHアミンにペンタペプチドが部分的にカプリングすることから生じるいくつかの中間体生成物の存在が見られる。
【０１７６】
【化６５】
2010517984.tif 000078
【０１７７】
こららのリガンドのそれぞれは、HPLC、質量分析(MOLD-TOF)により特徴付けられた(図4A、4Bおよび4C)。
表4：NMRによるリガンドL41の分析、500MHzスペクトロメータを用いた、300Kで、H2O/tert-ブタノール-d6中で行われたNMR実験
【表８】
2010517984.tif 000079
【０１７８】
ii. 「クリック化学」反応での注意
試薬が加えられる順序が、前で技術的に純化された反応で重要のように思える。事実、両方の塩基は、ヨウ化銅の添加の前に加えるべきである。もし、金属を最初に加えると、2量化したマクロサイクルの純度の減少が反応の最後に観察される。
【０１７９】
さらに、2量体の形成に対して、ジアジド体に対して2等量の官能的に置換された環の使用が必ずしも必要でないことを認めていることは興味深いことである。事実、等分子混合物を調製することにより、2量化反応も完了する。それゆえに、Sharplessにより既に認められているように、ジアジドの使用がジトリアゾール体の形成に好ましく、最初のトリアゾール体の形成が、第2のトリアゾール体の形成を促進する(Rodionov, V.O. ; Fokin, V.V. ; Finn, M.G. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 2210-2215)。
【０１８０】
最後に、トリス-(ベンジルトリアゾリルメチル)アミン(TBTA)のような添加物の使用は、L40またはL40'リガンドからの直接的な「クリック化学」反応を行うために適切な選択肢となり得る((a) Wang, Q. ; Chan, T.R. ; Hilgraf, R. ; Fokin, V.V.; Sharpless, K.B. ; Finn , M.G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3192 - 3193. (b) Chan, T.R. ; Hilgraf R. ; Sharpless K.B. ; Fokin, V.V. Org. Lett. 2004, 6, 2853 - 2855)。Sharplessにより指摘されているように、TBTAは銅Iを囲み、アミンのようなフリーの結合部位に由来する相互作用を不安定化することを防ぐ。さらに、それは1,3-双極子反応を加速する。
【０１８１】
Ｂ）生物学
１）脾臓B細胞の精製および培養
脾臓は、5〜12週齢のBALB/cマウスから外科的に摘出した。脾臓B細胞は、モノクローナル抗CD-19抗体でコーティングされた磁気ビーズ(MACS, Milteny biotech, Germany)を用いるポジティブ選択により調製した。この画分は95％以上のB220+細胞を含む。次に、B細胞(3×106/ml)を、CD40L類縁物質の存在下、10% 補体欠乏FBS、ゲンタマイシン (10 μg/ml)、25 mM HEPESおよび10 mM β-メルカプトエタノールが補完されたRPMI 1640培地中で培養した。細胞を1μCi/ウエルのトリチウム化したチミジン (ICN, Irvine, CA)で培養の最後の20時間、パルス(pulse)し、72時間後、cpmで表した[3H]-チミジンの取込みを、Matrix 9600モデルダイレクトβカウンター (Packard, Meriden, CT)を用いて測定した。結果（図5）を、CD40L類縁物質と一緒に培養して得られるcpmをCD40L類縁物質なしの培養で得られるcpmで割った値に対応する刺激インデックス(stimulation index)として表す。この研究に用いられたマウスは、フランス獣医当局によりNo.D-67-482-2で認可されている我々の動物飼育施設で飼育された。
【０１８２】
２）細胞培養およびアポトーシスの誘導
Burkittリンパ腫（RAJI）を、10％補体欠乏ウシ胎仔血清(FBS)およびゲンタマイシン(10 μg/ml)が補完されたRPMI 1640培地(Cambrex Bioscience, Verviers, Belgium)で培養した。アポトーシスの評価に対して、細胞(1×106/ml)を、最終容積200 μl中、CD40L類縁物質の特定の濃度で、96-ウエルプレート中37℃でインキュベートした。16時間のインキュベーション後、細胞アポトーシスを次に示すようにして測定した。
【０１８３】
３）細胞アポトーシス測定
アポトーシスを、フローサイトメトリーにより示されるように、陽イオン着色剤3,3'-ジヘキシオキサカルボシアニンヨーダイド（DiOC6(3)）捕捉のレベルでの減少に関するミトコンドリアの膜間電圧（Δψm）における低下を測定することにより評価した(Zamzami et al., J. Exp. Med. 1995,191:1661)。
【０１８４】
この目的のために、細胞を、培養の最後の45分間、最終濃度40 nMでDiOC6(3) (Interchim, Montlucon, France)を用いてパルスした。
続いて、細胞を洗浄し、300 μlのPBSに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。結果(図5A)を、次の式により比アポトーシスのパーセントで表した：
比アポトーシス％＝[(死亡処理細胞の％−死亡コントロール細胞の％)×100]／(100−死亡コントロール細胞の％)。
【０１８５】
細胞をFACSCalibur(登録商標)機器によって分析した。CellQuest 3.3ソフトウエア (Becton Dickinson, Pont de Claix, France)を用いて各実験に対して、少なくとも25000パルスイベント(event)を得、データをWinMDI 2.8ソフトウエア software (Joseph Trotter, Scripps Research Institute,  HYPERLINK "http://facs.scripps.edu/software.html" http://facs.scripps.edu/software.html)。
【０１８６】
４）結果
L41リガンド、「クリック化学」合成によって得られた2量化リガンドは、L1では活性が見られない用量レベルで、Burkittリンパ腫(RAJI)の比アポトーシスパーセントを誘導することが観察された(図5A)。
さらに、このリガンドは、抗-CD40 3/23抗体増強効果不在下での単量体リガンドL1ではそのような効果が認められないネズミの脾臓B細胞増殖を単独で誘導する。
【実施例】
【０１８７】
詳細な実験の部
【化６６】
2010517984.tif 000080
【０１８８】
ビスマレイミドへキサン(IV.1)
N-(メトキシ-カルボニル)マレイミド (320 mg; 2.06 mmol)を、飽和NaHCO3/THF (テトラヒドロフラン)混合物) (Vt = 8 ml, 1:1 v/v)中のN,N'-ジアミノへキサン (100 mg; 0.86 mmol)の撹拌溶液に0℃で加える。反応混合物を0℃で10分間撹拌し、その後、室温で4時間撹拌する。次いで、生成物を酢酸エチルでの抽出により回収する。溜めた有機層を水および食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濾過し、真空下に濃縮し、それにより化合物VI.1 (230 mg; 収率 = 100%)を得た。
【０１８９】
HPLC tR 15.78分 (直線勾配, 30-100% B, 20分); 1H NMR (300 MHz, CDCl3, 298 K) δ 6,67 (s; CHマレイミド; 4H); 3.48 (t; NCH2; J = 7.2 Hz; 4H); 1.62 -1.54 (m, NCH2CH2, 4H); 1.31 - 1.26 (m, NCH2CH2CH2, 4H); 13C NMR(300 MHz, CDCl3, 298 K) 170.84 (4 CO); 134.03 (4 CH); 37.67 (2 CH2); 28.32 (2 CH2); 26.15 (2 CH2); HRMS (ESI): m/z: C14H16N2O4Naの計算値: 277.11; 実測値: 277.1183; C14H16N2O4Naの計算値: 299.11; 実測値: 299.1002
【０１９０】
【化６７】
2010517984.tif 000081
【０１９１】
3-((アセトアミドメチル)スルファニル)プロパン酸(Acm)(IV.2)
3-メルカプトプロパン酸(1.64 ml; 19 mmol)をトリフルオロ酢酸(30 ml)に溶解する。次いで、N-(ヒドロキシメチル)アセトアミド(1.6 g; 19 mmol)を加える。室温で30分間撹拌後、TFAを留去し、IV.2を得る。
【０１９２】
HPLC tR 7.1分 (直線勾配, 5 - 65% B, 20分); 1H NMR (300 MHz, CDCl3, 298 K) δ 12.4 (s, COOH, 1H); 7.74 (d, NH, J = 5.8 Hz, 1H); 4.34 (d, SCH2NH, J = 6 Hz, 2H); 2.81 (t, CH2SCH2NH, J = 6.4 Hz, 2H); 2.67 (t, CH2COOH, J = 6.4 Hz, 2H); 2.1 (s, NHCOCH3, 3H); 13C NMR (300 MHz, CDCl3, 298 K) 177.45 (CO); 174.63 (CO); 41.60 (CH2); 34.37 (CH2); 25.67 (CH2); 21.46 (CH3)
【０１９３】
【化６８】
2010517984.tif 000082
【０１９４】
Fmoc-D-Lys(Boc)-OBn(IV.3)
Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(5 g; 10 mmol)をDMSO(ジメチルスルホキシド)(22 ml)に溶解する。KHCO3(1.6 g; 16 mmol)およびBu4NI(390 mg; 1 mmol)を連続して加える。30分間撹拌後、ベンジルブロマイド(3.8 ml; 30 mmol)を加える。次いで、混合物を一晩撹拌する。該溶液に水を加え、水層を酢酸エチルで抽出する。溜めた有機層をNaHCO3の飽和溶液、Na2S2O3の飽和溶液および食塩水で洗浄した。溶媒の蒸発および78℃でシクロヘキサン中での沈殿で化合物IV.3(5.80 g; 収率 = 98%)を得る。
【０１９５】
HPLC tR 16.94分 (直線勾配, 30 - 100% B, 20分); 1H NMR (300 MHz, CDCl3, 298 K) δ 7.76 (d, CH Arom Fmoc, J = 7.4 Hz, 2H); 7.60 (d, CH Arom Fmoc, J = 7.4 Hz, 2H); 7.42 - 7.25 (m, CH Arom FmocおよびPh, 9H); 5.18 (s, CH2Ph, 2H); 4.47 - 4.23 (m, CH2 FmocおよびCH Fmoc, 3H); 4.21 (t, FmocNHCH, J = 6.9 Hz, 1H); 3.09 - 3.01 (m, CH2 Lysine, 2H); 1.95 - 1.64 (m, CH2 リシン, 2H); 1.51 - 1.22 (m, CH2 リシンおよびC(CH3)3, 13H); 13C NMR (300 MHz, CDCl3, 298 K) 172.33 (CO); 156.08 (CO); 156.00 (CO); 143.93 (2 C); 141.3 (C); 135.27 (2 C); 128.65 (2 CH); 128.54 (2 CH); 128.37 (CH); 127.71 (2 CH); 127.08 (2 CH); 125.12 (2 CH); 119.98 (2 CH); 79.20 (C); 67.19 (CH2); 67.03 (CH2); 53.80 (CH); 47.16 (CH); 40.04 (CH2); 32.11 (CH2); 29.58 (CH2); 28.43 (CH3); 22.30 (CH2)
【０１９６】
【化６９】
2010517984.tif 000083
【０１９７】
Fmoc-D-Lys-Obn塩、TFA(IV.4)
化合物IV.3(5,80 g; 10,34 mmol)をTFA(16 ml)に溶解する。室温で30分間撹拌後、エーテルおよびシクロヘキサンを用いてTFAを留去する。それにより、化合物IV.4を得る。
【０１９８】
HPLC tR 10.91分 (直線勾配, 30 - 100% B, 20分); 1H NMR (300 MHz, CDCl3, 298 K) δ 7.71 (d, CH Arom Fmoc, J = 7.5 Hz, 2H); 7.53 (d, CH Arom Fmoc, J = 7.5 Hz, 2H); 7.37 - 7.21 (m, CH Arom FmocおよびPh, 9H); 5.6 (d, NH, J = 8.06 Hz, 1H); 5.12 (s, CH2Ph, 2H); 4.33 (m, CH FmocおよびCH2 Fmoc, 3H); 4.14 (t, FmocNHCH, J = 6.94 Hz, 1H); 2.91 - 2.83 (m, CH2 リシン, 2H); 1.65 - 1.52 (m, CH2 リシン, 4H); 1.39 - 1.26 (m, CH2 リシン, 2H); NMR 13C (300 MHz, CDCl3, 298 K) 172.12 (CO); 156.30 (CO); 143.66 2 (C); 141.26 (C); 135.08 (2 C); 128.63 (2 CH); 128.57 (2 CH); 128.33 (CH); 127.77 (CH); 127.10 (CH); 125.10 (CH); 120.01 (CH); 67.38 (CH2); 67.21 (CH2); 53.61 (CH); 47.01 (CH); 39.55 (CH2); 31.76 (CH2); 26.69 (CH2); 21.98 (CH2)
【０１９９】
【化７０】
2010517984.tif 000084
【０２００】
(9H-フルオレン-9-イル)メチル 1-((ベンジルオキシ)カルボニル)-5-(3-((アセトアミドメチル)スルファニル)プロパンアミド)ペンチルカーバメート(IV.5)
化合物IV.2(2,2 g; 12.41 mmol)をDMF(ジメチルホルムアミド)(40 ml)に溶解する。TFAの中和溶液にDIEA(N,N-ジイソプロピルエチレンアミン)(2 ml; 12.41 mmol)を添加する。次に、DIEA(2 ml; 12.41 mmol)と共にDMF(20 ml)に溶解した化合物IV.4(10.34 mmol)およびBOP (ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ-トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート)(2.2 g; 12.41 mmol)を連続して加える。反応混合物をDIEAでpH = 8/9に調整する。6時間撹拌後、減圧下にDMFを蒸発し、CH2Cl2中に採取し、前もって飽和NaHCO3で数回、水および1N KHSO4で洗浄する。Na2SO4で乾燥し、蒸発し、油状物を得、それをCH2Cl2/IPE(ジイソプロピルエーテル)中で沈殿させ、純粋な化合物IV.5(5.74 g; 収率= 90 %)を得る。
【０２０１】
HPLC tR 13.29分 (直線勾配, 30 - 100% B, 20分); HPLC tR 13.29分 (直線勾配, 30 - 100% B, 20分); 1H NMR  (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) δ 8,46 (t, NH, J = 6.11 Hz, 1H); 7.9 (d, CH Arom Fmoc, J = 7.4 Hz, 2H); 7.87 - 7.81 (m, NH, 2H); 7.71 (d, CH Arom Fmoc, J = 7.2 Hz, 2H); 7.45 - 7.26 (m, CH Arom FmocおよびPh, 9H); 5.12 (s, CH2Ph, 2H); 4.31 (d, CH Fmoc, J = 6,3 Hz, 1H); 4.20 (d, CH2 Fmoc, J = 6.3 Hz, 2H); 4,06 - 4.01 (m, FmocNHCH, 1H); 3.0 (m, CH2 リシン, 2H); 2.72 (t, CH2CONH, J = 7.2 Hz, 2H); 2.53 (s, NHCOCH3, 3H); 2.35 (t, CH2SCH2NHCOCH3, J = 7.2 Hz, 2H); 1.83 (s, SCH2NH, 2H); 1.71 - 1.60 (m, CH2 リシン, 2H); 1.30 - 1.39 (m, CH2 リシン, 4H); 13C NMR (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) 172.78 (CO); 170.70 (CO); 169.68 (CO); 156.63 (CO); 144.25 (2 C); 141.17 (C); 136.40 (2 C); 128.66 (2 CH); 128.54 (2 CH); 128.33 (CH); 127.76 (2 CH); 127.11 (2 CH); 125.12 (2 CH); 120.11 (2 CH); 66.31 (CH2); 66.12 (CH2); 54.41 (CH); 47.07 (CH); 40.18 (CH2); 38.66 (CH2); 36.07 (CH2); 30.72 (CH2); 29.06 (CH2); 26.62 (CH2); 23.35 (CH2); 23.01 (CH3)
【０２０２】
【化７１】
2010517984.tif 000085
【０２０３】
6-(3-((アセトアミドメチル)スルファニル)プロパンアミド)-2-アミノヘキサン酸(IV.6)
化合物IV.5(4.6 g; 7.4 mmol)をDMF(50 ml)に溶解する。LiOHの1N溶液(22 ml)を0℃で徐々に加える。5時間撹拌後、減圧下にDMFを蒸発し、アセトニトリルで沈殿させ、化合物IV.6(1.91 g; 収率 = 91%)を得る。
【０２０４】
【化７２】
2010517984.tif 000086
【０２０５】
化合物Fmoc-D-Lys(Acm)-OH(IV.7)
化合物IV.6 (2.21 g; 7.2 mmol)を、H2O(50 ml)およびK2CO3(2 g; 14.4 mmol)の混合溶液に溶解する。次に、アセトン(50 ml)中のFmoc-OSu(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-N-ヒドロキシスクシンイミド)(2.4 g; 7.2 mmol)を徐々に加える。7時間撹拌後、、水を加える。水層を素早くエーテルで洗浄し、1N HClでpH = 3に調整し、次いでCH2Cl2で抽出する。Na2SO4で乾燥し、濾液を蒸発し、油状物を得、それをCH2Cl2/IPE(ジイソプロピルエーテル)で沈殿させ、純粋な化合物IV.7(2.24 g; 収率 = 60%)得る。
【０２０６】
HPLC tR 8,9分 (直線勾配, 30 - 100% B, 20分) 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) δ 8.47 (t, NH, J = 6.07 Hz, 1H); 7.9 (d, CH Arom Fmoc, J = 7.46 Hz, 2H); 7.85 (t, NH, J = 5.92 Hz, 1H); 7.73 (d, CH Arom Fmoc, J = 7.4 Hz, 2H); 7.58 (d, NH, J = 8 Hz, 1H); 7.44 - 7.30 (m, CH Arom Fmoc, 4H); 4.26 (t, CH Fmoc, J = 7.5 Hz, 1H); 4.20 (d, CH2 Fmoc, J = 6.3 Hz, 2H); 3.90 (m, FmocNHCH, 1H); 3.05 - 2.99 (m, CH2 リシン, 2H); 2.72 (t, CH2CONH, J = 7.3 Hz, 2H); 2.5 (s, NHCOCH3, 3H); 2.36 (t, CH2SCH2NHCOCH3, J = 7.23 Hz, 2H); 1.67 - 1.57 (m, CH2 リシン, 2H); 1.42 - 1.33 (m, CH2 リシン, 4H); 13C NMR (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) 174.48 (CO); 170.70 (CO); 169.68 (CO); 156.58 (CO); 144.25 (2 C); 141.15 (2 C); 128.85 (CH); 128.08 (2 CH); 127.51 (2 CH); 125.73 (2 CH); 66.03 (CH2); 54.26 (CH); 47.10 (CH); 40.21 (CH2); 38.73 (CH2); 36.09(CH2); 30.91 (CH2); 29.12 (CH2); 26.64 (CH2); 23.50 (CH2); 23.24 (CH3); MS (MALDI-TOF) C27H33N3O6Sの計算値: 527.21. 実測値 [M+Na+] = 550.11 ; [M+K+] = 566.20
【０２０７】
【化７３】
2010517984.tif 000087
【０２０８】
H-(D)Ala-Lys(Boc)-(D)Lys(Acm)-Lys(Boc)-(D)Ala-Lys(Boc)-OH(IV.8)
800 mgの2-クロロトリチルクロライド樹脂(装填 = 1.6 mmol/g)を蒸留したCH2Cl2で2回洗浄する。この樹脂に、CH2Cl2中のFmoc-Lys(Boc)-OH(2 eq.)およびDIEA(6 eq.)の混合物を加える。3時間撹拌後、樹脂を濾過し、CH2Cl2で洗浄する。樹脂をメタノール中で1時間撹拌下、膨潤させ、次いで、DMF、イソプロパノール、CH2Cl2、ジエチルエーテルで洗浄し、真空下に乾燥する。樹脂の装填は、DMF中の20%ピペリジンで処理後のFmoc誘導体のUV読み取りにより決定する(装填 = 0,3 mmol/g)。
FmocXaaOH(5 eq.)を、BOP(5 eq.)、HOBt(1-ヒドロキシベンゾトリアゾール)(5 eq.)およびDIEA(15 eq.)の存在下、脱保護されたFmoc樹脂と室温で30分間、2回カップリングする。化合物IV.7(2.5 eq.)を、BOP(2.5 eq.)、HOBt(2.5 eq.)およびDIEA(10 eq.)の存在下、室温で2時間、1回カップリングする。そのような脱保護-カップリング工程の繰り返し後、HFIP(ヘキサフルオロイソプロパノール)およびCH2Cl2(60/40)の混合物で樹脂からペプチドを開裂する。2時間撹拌後、樹脂を濾過し、CH2Cl2で数回洗浄する。溶媒を蒸発し、化合物IV.8(収率 = 100%)を得る。
【０２０９】
HPLC tR 7.62分 (直線勾配, 30-100% B, 20分); HPLC(直線勾配, 30 - 100 % B, 20分)で測定した粗生成物の純度: 73%; MS (MALDI-TOF) C51H93N11O15Sの計算値: 1131,66. 実測値: [M+Na+] =1154.27, [M+K+] = 1170.21; HRMS(ESI): m/z: C51H94N11O15Sの計算値: 1132.66, 実測値: 1132.6646; C51H93N11O15SNaの計算値: 1154.66, 実測値: 1154.6466
【０２１０】
【化７４】
2010517984.tif 000088
【０２１１】
シクロ [(D)Ala-Lys(Boc)-(D)Lys(Acm)-Lys(Boc)-(D)Ala-Lys(Boc)](IV.9)
ペプチドIV.8(500 mg 0.44 mmol)を室温でDMFに溶解する。EDC, HCl(101.16 mg; 0.53 mmol)、HOBt(71.56 mg; 0.53 mmol)およびDIEA(110 μL ; 0.66 mmol)を連続して加える。室温で3日間撹拌後、反応混合物を大容積の飽和NaHCO3中で沈殿させる。沈殿を濾過し、飽和NaHCO3、次いで水、1N KHSO4、食塩水、酢酸エチル、アセトニトリルおよびシクロヘキサンで洗浄する。白色の固体を真空下に乾燥する(222 mg, 収率: 77%)。
HPLC (直線勾配, 30 - 100 % B, 20分)で測定した粗生成物の純度: 87 %; MS (MALDI-TOF) C51H91N11O14Sの計算値: 1113.65. 実測値: [M+Na+] = 1136.44; [M+K+] = 1152.42
【０２１２】
【化７５】
2010517984.tif 000089
【０２１３】
シクロ [D)Ala-Lys-(D)Lys(Acm)-Lys-(D)Ala-Lys](IV.10)
化合物IV.9(100 mg; 0.089 mmol)を、水5%を有するトリフルオロ酢酸(5 ml)に溶解する。室温で20分間撹拌後、反応混合物をエーテルを用いて沈殿させる。所期のTFA塩を濾過し、エーテルで洗浄する。白色の固体IV.10を真空下で乾燥する(84 mg, 収率: 85%)。
HPLC tR 6.56分 (直線勾配, 5-65% B, 20分); HPLC(直線勾配, 5 - 65 % B, 20分)で測定した粗生成物の純度: 86%; MS (MALDI-TOF) C36H67N11O8Sの計算値: 813.05. 実測値: [M+Na+] = 836.44; [M+K+] = 852.41; HRMS(ESI): m/z: C36H68N11O8Sの計算値: 814.05; 実測値: 814,497
【０２１４】
【化７６】
2010517984.tif 000090
【０２１５】
ビスマレイミドジエチレングリコール(IV.11)
飽和NaHCO3/THF(Vt = 6 ml, 1:1 v/v)中のN,N'-ジアミノジエチレングリコール(100 mg; 0.67 mmol)の0℃での撹拌溶液に、N-(メトキシ-カルボニル)マレイミド(251 mg; 1.62 mmol)を加える。反応混合物を0℃で10分間撹拌し、その後、室温で4時間撹拌を維持する。次に、酢酸エチルでの抽出により生成物を単離する。溜めた有機層を水および食塩水で洗浄しNa2SO4で乾燥し、濾過し、真空下に濃縮し、それにより化合物IV.11(150 mg, 収率 = 72%)を得る。
【０２１６】
HPLC tR 10.40分 (直線勾配, 30 - 100% B, 20分); 1H NMR (300 MHz, CDCl3, 298 K) δ 6.67 (s, CH マレイミド, 4H); 3.68 - 3.63 (m, NCH2CH2O, 4H); 3.58 - 3.54 (m, NCH2CH2O, 4H); 3.51 (s, OCH2CH2O, 4H); 13C NMR (300 MHz, CDCl3, 298 K) 170.66 (4 CO); 134.13 (4 CH); 69.97 (2 CH2); 67.77 (2 CH2); 37.09 (2 CH2); HRMS (ESI): m/z: C14H17N2O6の計算値: 309.10; 実測値: 309.1081; C14H16N2O6Naの計算値: 331.10; 実測値: 331.0901
【０２１７】
【化７７】
2010517984.tif 000091
【０２１８】
ジメシレート(IV.12)
トリエチレングリコール(2 g; 13.31 mmol)をCH2Cl2(20 ml)に溶解する。DIEA (5.6 ml; 33.3 mmol)およびメタンスルホニルクロライド(2.6 ml; 33.3 mmol)を連続して加える。混合物を3時間撹拌し、その後CH2Cl2を蒸発する。残渣を酢酸エチル中に採取する。有機層を飽和NaHCO3、水、1N KHSO4および食塩水で洗浄する。Na2SO4で乾燥し、溶媒を蒸発して、化合物IV.12(3.93 g; 収率 = 96%)を得る。
1H NMR (300 MHz, CDCl3, 298 K) δ 4.25 - 4.22 (m, CH2OMs, 4H); 3.64 (m, CH2CH2OMs, 4H); 3.55 (s, OCH2CH2O, 4H); 2.96 (s, SO2CH3, 6H); 13C NMR (300 MHz, CDCl3, 298 K) 70.33 (CH2); 69.43 (CH2); 68.82 (CH2); 37.42 (CH3)
【０２１９】
【化７８】
2010517984.tif 000092
【０２２０】
ジメシレート(IV.14)
オクタエチレングリコール(540 mg; 1.46 mmol)をCH2Cl2(2 ml)中に溶解する。混合物に、トリエチルアミン(606 μL; 4,37 mmol)およびメタンスルホニルクロライド(288 μL; 3,6 mmol)を0℃で連続して加える。4時間撹拌後、溶媒を蒸発する。残渣を酢酸エチル中に採取し、有機層を飽和NaHCO3および1N KHSO4で洗浄する。Na2SO4で乾燥し、溶媒を蒸発して、化合物IV.14(560 mg; 収率 = 73%)を得る。
1H NMR (300 MHz, CDCl3, 298 K) 4.26 - 4.22 (m, CH2OMs, 4H); 3.65 - 3.62 (m, CH2CH2OMs, 4H); 3.53 - 3.50 (m, OCH2CH2O, 24H); 2.96 (s, OSO2CH3, 6H); 13C NMR (300 MHz, CDCl3, 298 K) 70.43 (CH2); 69.47 (CH2); 68.88 (CH2); 37.57 (CH)
【０２２１】
【化７９】
2010517984.tif 000093
【０２２２】
1,2-ビス(2-アジドエトキシ)エタン(IV.15)
アジ化ナトリウム(1.33 g; 20.57 mmol)を、DMF(10 ml)中の化合物IV.12(1.05 g; 3.4 mmol)の溶液に加える。反応混合物を60℃で一晩加熱する。冷却後、水を加え、水層をエーテルで抽出する。次いで有機層を水で洗浄し、Na2SO4で乾燥する。溶媒を蒸発し、化合物IV.15(670 mg, 収率 = 96%)を得る。
HPLC tR 8.29分 (直線勾配, 30-100% B, 20分); 1H NMR (300 MHz, CDCl3, 298 K) δ 2.98-2.94 (m, CH2CH2N3, 4H); 2.94 (s, OCH2CH2O, 4H); 2.67-2.63 (m, CH2N3, 4H); 13C NMR (300 MHz, CDCl3, 298 K) 70.44 (CH2); 69.88 (CH2); 50.45 (CH2)
【０２２３】
【化８０】
2010517984.tif 000094
【０２２４】
ジアジド(IV.17)
アジ化ナトリウム(170 mg; 2.6 mmol)を、DMF(8 ml)中の化合物IV.14(550 mg, 1.044 mmol)の撹拌溶液に加える。反応混合物を60℃で一晩加熱する。冷却後、水を加え、水層をエーテルで抽出する。次いで有機層を水で洗浄し、Na2SO4で乾燥する。溶媒を蒸発し、化合物IV.17(300 mg, 収率 = 70%)を得る。
HPLC tR 6,59分 (直線勾配, 30 - 100% B, 20分); 1H NMR (300 MHz, CDCl3, 298 K) δ 3.66 - 3.60 (m, OCH2CH2OおよびCH2CH2N3, 28H); 3.38 - 3.33 (m, CH2N3, 4H); 13C NMR (300 MHz, CDCl3, 298 K) 70.68 (CH2); 70.66(CH2); 70.62 (CH2); 70.57 (CH2); 50.67 (CH2)
【０２２５】
【化８１】
2010517984.tif 000095
【０２２６】
N-プロピル-2-インイル-スクシンアミド(Nps)(IV.18)
ジヒドロフラン-2,5-ジオン(3.9 g; 40 mmol)をアセトニトリル(40 ml)中に溶解する。プロピ-2-イン-1-アミン(1.5 ml; 51 mmol)を加える。2時間撹拌後、沈殿が生じる。沈殿を濾過し、アセトニトリルで洗浄する。化合物IV.18を得る(4.12 g; 収率 = 71%)。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) δ 3.83 (dd, NHCH2CCH, J = 5.4および2.5 Hz, 2H); 3.33 (d, CCH, J = 2,5 Hz, 1H); 2.42 - 2.36 (m, CH2CO2H, 2H); 2.33 - 2.27 (m, CH2CONH, 2H); 13C NMR (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) 174.33 (CO); 172.29 (CO); 81.69 (CH); 73.45 (C); 30.35 (CH2); 29.66 (CH2); 28.24 (CH2)
【０２２７】
【化８２】
2010517984.tif 000096
【０２２８】
(9H-フルオレン-9-イル)メチル 1-((ベンジルオキシ)カルボニル)-5-(スクシンアミド)ペンチルカーバメート(Fmoc-Lys(Nps)-OBn)(IV.19)
化合物IV.4(9.7 mmol)を、DIEA(1.9 ml; 11.6 mmol)と共にアセトニトリル (30 ml)に溶解する。3-(プロピ-2-インイルカルバモイル)プロパン酸(1.8 g; 11.6 mmol)、BOP(5.13 g; 11.6 mmol)およびDIEA(1.9 ml; 11.6 mmol)を連続して加える。3時間撹拌後、沈殿が生じる。沈殿を濾過し、飽和NaHCO3、水および1N KHSO4で洗浄し、続いてアセトニトリルおよびジイソプロピルエーテルで洗浄する。化合物IV.9(3.7 g; 収率 = 64%)を得る。
【０２２９】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) δ 8.32 (t, NH, J = 5,27 Hz, 1H); 7.90 - 7.85 (m, 2 NHおよびCH Arom Fmoc, 4H); 7.71 (d, CH Arom Fmoc, J = 7,33 Hz); 7.42 (t, CH Arom Fmoc, J = 7.32 Hz, 2H); 7.34 - 7.28 (m, CH Arom FmocおよびCH Arom Bn, 7H); 5.13 (s, CH2Ph, 2H); 4.32 - 4.10 (m, CH2 FmocおよびCH Fmoc, 3H); 4.09 - 4.02 (dd, NHCHCH2,1H); 3.84 (dd, NHCH2CCH, J = 5.25および2.32 Hz, 2H); 3.085 (t, CCH, J = 2,35 Hz, 1H); 2.35 - 2.30 (m, COCH2CH2CO, 4H); 1.78 - 1.59 (m, CH2 リシン, 2H); 1.41 - 1.22 (m, CH2 リシン, 4H); 13C NMR (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) 172.8 (CO); 171.62 (CO); 171.46 (CO); 155.66 (CO); 144.27 (2 C); 141.18 (C); 136.42 (2 C); 128.86 (2 CH); 128.47 (2 CH); 128.21 (2 CH); 128.11 (CH); 127.53 (2 CH); 125.7 (2 CH); 120.57 (2 CH); 81.73 (CH); 73.32 (C); 66.34 (CH2); 66.16 (CH2); 54.44 (CH); 47.10 (CH); 38.67 (CH2); 31.03 (CH2); 30.76 (CH2); 30.98 (CH2); 29.10 (CH2); 28.26 (CH2); 23.38 (CH2); MS (MALDI-TOF) C35H37N3O6の計算値: 595.27. 実測値 [M+H+] = 595.78; [M+Na+] = 618.26; [M+K+] = 634.35
【０２３０】
【化８３】
2010517984.tif 000097
【０２３１】
2-アミノ-6-(スクシンアミド)ヘキサン酸(H-Lys(Nps)-OH)(IV.20)
化合物IV.9(3.6 g; 6.0 mmol)をDMF(25 ml)中に溶解する。LiOHの1N溶液(12 ml)を0℃で徐々に加える。4時間撹拌後、減圧下にDMFを蒸発し、アセトニトリル中で残渣を沈殿させ、化合物IV.20(912 mg; 収率 = 54%)を得る。
【０２３２】
【化８４】
2010517984.tif 000098
【０２３３】
Fmoc-D-Lys(Nps)-OH(IV.21)
化合物IV.20(972 mg; 3.43 mmol)を水およびアセトンの混液(50 ml, v/v : 1/1)に溶解する。水(25 ml)中のK2CO3(948 mg; 6.86 mmol)溶液を加える。次に、アセトン(25 ml)中のFmoc-OSu(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-N-ヒドロキシスクシンイミド)(1.16 g; 3.43 mmol)を徐々に加える。一晩撹拌後、水を加える。水相を素早くエーテルで洗浄し、1 N HClによりpH = 3に調整し、続いてCH2Cl2で抽出する。Na2SO4で乾燥し、濾液を蒸発し油状物を得、それをCH2Cl2/IPEで沈殿させ、それにより化合物IV.21(1.7 g; 収率 = 62%)を得る。
【０２３４】
HPLC tR 8.61分 (直線勾配, 30 - 100% B, 20分); 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) δ 8.26 (t, NH, J = 5.36 Hz, 1H); 7.89 (d, CH Arom Fmoc, J = 7.42 Hz, 2H); 7.81 (t, NH, J = 5.25 Hz, 1H); 7.73 (d, CH Arom Fmoc, J = 7,38 Hz, 2H); 7.62 (d, FmocNH, J = 7.98 Hz, 1H); 7.42 (t, CH Arom Fmoc, J = 7.41および1.06 Hz, 2H); 7.33 (dt, CH Arom Fmoc, J = 7.47および0.88 Hz, 2H); 4.29 - 4.19 (m, CH2 FmocおよびCH Fmoc, 3H); 3.94 - 3.87 (m, FmocNHCH, 1H); 3.83 (dd, NHCH2CCH, J = 5.45および2.51 Hz, 2H); 3.07 (t, CCH, J = 2.51 Hz, 1H); 3.04 - 2.96 (m, CH2 リシン, 2H); 2.33 - 2.26 (m, CH2CONHおよびCH2CONH, 4H); 1.72 - 1.54 (m, CH2 リシン, 4H); 1.41 - 1.24 (m, CH2 リシン, 4H); 13C NMR (300 MHz, DMSO-d6, 298 K) 173.89 (CO); 171.04 (CO); 170.88 (CO); 156.08 (CO); 143.72 (2 C); 140.62 (2 C); 127.56 (CH); 126.98 (CH); 125.19 (CH); 120.03 (CH); 81.54 (CH); 72.80 (CH); 65.52 (CH2); 53.68 (CH); 46.57 (CH); 38.73 (CH2); 30.46 (CH2); 30.41 (CH2); 30.34 (CH2); 28.60 (CH2); 27.71 (CH2); 22.99 (CH2); MS (MALDI-TOF) C28H31N3O6の計算値: 505.22. 実測値 [M+Na+] = 528.79; [M+K+] = 545.57
【０２３５】
【化８５】
2010517984.tif 000099
【０２３６】
H-(D)Ala-Lys(Boc)-(D)Lys(Nps)-Lys(Boc)-(D)Ala-Lys(Boc)-OH(IV.22)
2-クロロトリチルクロライド樹脂(装填 = 1.8 mmol/g)を蒸留したCH2Cl2で2度洗浄する。樹脂に、CH2Cl2中のFmoc-Lys(Boc)-OH(2 eq.)およびDIEA(6 eq.)の混合物を加える。3時間撹拌後、樹脂を濾過し、CH2Cl2で洗浄する。樹脂をメタノール中で1時間撹拌下にもう一度膨潤させ、次にDMF、イソプロパノール、CH2Cl2、ジエチルエーテルで洗浄し、真空下に乾燥する。樹脂の装填は、DMF中の20%ピペリジンで処理後のFmoc誘導体のUV読み取りにより決定する(装填 = 0.5 mmol/g)。
【０２３７】
FmocXaaOH(5 eq.)を、BOP(5 eq.)、HOBt(5 eq.)およびDIEA（15 eq.)の存在下、脱保護されたFmoc樹脂と室温で30分間、2回カップリングする。化合物IV.21(2.5 eq.)を、BOP(2.5 eq.)、HOBt(2.5 eq.)およびDIEA(10 eq.)の存在下、室温で2時間、1回カップリングする。そのような脱保護-カップリング工程の繰り返し後、HFIPおよびCH2Cl2(60/40)の混合物で樹脂からペプチドを開裂する。2時間撹拌後、樹脂を濾過し、CH2Cl2で数回洗浄する。溶媒を蒸発し、化合物IV.22(収率 = 100%)を得る。
【０２３８】
HPLC tR 8.54分 (直線勾配, 30 - 100% B, 20分); Purity of the crude product as determined by HPLC (直線勾配, 30 - 100 % B, 20分)で測定した粗生成物の純度: 60%; MS (MALDI-TOF) C52H91N11O15の計算値: 1109.67. 実測値: [M+Na+] 1132.45; [M+K+] = 1148.43; HRMS(ESI): m/z: C52H92N11O15の計算値: 1110.67; 実測値: 1110.6769; C52H91N11O15Naの計算値: 1132.67; 実測値: 1132.6588
【０２３９】
【化８６】
2010517984.tif 000100
【０２４０】
シクロ [(D)Ala-Lys(Boc)-(D)Lys(Nps)-Lys(Boc)-(D)Ala-Lys(Boc)](IV.23)
ペプチドIV.22(60 mg; 0.054 mmol)を室温で、DMF(12 ml)中に溶解する。BOP(28.6 mg; 0.064 mmol)およびDIEA (14 μL; 0.081 mmol)を連続して加える。室温で3時間撹拌後、反応混合物を大容積の飽和NaHCO3中で沈殿させる。沈殿を濾過し、飽和NaHCO3で洗浄し、続いて水、1N KHSO4、食塩水、酢酸エチル、アセトニトリルおよびシクロヘキサンで洗浄する。白色の固体IV.23 を真空下に乾燥する(49 mg, 収率: 83%)。HPLC tR 12.92分 (直線勾配, 30 - 100% B, 20分); HPLC (直線勾配, 30 - 100% B, 20分)で測定した粗生成物の純度: 60 %; MS (MALDI-TOF) C52H89N11O14の計算値: 1091.66. 実測値: [M+Na+] = 1114.58; [M+K+] = 1130.56
【０２４１】
【化８７】
2010517984.tif 000101
【０２４２】
シクロ [(D)Ala-Lys-(D)Lys(Nps)-Lys-(D)Ala-Lys](IV.24)
化合物IV.23(38 mg; 0.035 mmol)を、水5%を含むトリフルオロ酢酸(3.5 ml)中に溶解する。室温で15分間撹拌後、反応混合物をエーテル中で沈殿させる。所期のTFA塩を濾過し、エーテルで洗浄する。白色の固体IV.23を真空下に乾燥する(34 mg, 収率: 87%)。
HPLC tR 6.28分 (直線勾配, 5 - 65% B, 20分); HPLC (直線勾配, 5 - 65 % B, 20分)で測定した粗生成物の純度: 66 %; MS (MALDI-TOF) C37H65N11O8の計算値: 791.5. 実測値: [M+H+] = 792.57; [M+Na+] = 814.54; [M+K+] = 830.52
【０２４３】
「クリック化学」一般的方法(IV.25 - IV.27)
化合物IV.23(1 eq.)をDMFに溶解する(c = 6.10-3 M)。DMF中の1N ジアジド溶液(1 eq.)を加える。この混合物を、酸素を飛ばすためにアルゴンで30分間パージする。DIEA(25 eq.)、2,6-ルチジン(25 eq.)およびCuI(2 eq.)を連続して加える。室温で3日間撹拌後、反応混合物を大容積の飽和 NaHCO3中で沈殿させる。沈殿を濾過し、飽和NaHCO3で洗浄し、続いて水、1N KHSO4および食塩水で洗浄する。白色の固体を真空下に乾燥する。この化合物を水5%を含むトリフルオロ酢酸中に溶解する。室温で30分間撹拌後、反応混合物をエーテル中で沈殿させる。所期のTFA塩を濾過し、エーテルで洗浄し、真空下に乾燥する。半（semi）-分取C18 RP-HPLC (5-65% B, 20分)で精製し、続いて凍結乾燥し、所期の化合物を得る。
【０２４４】
IV.25: この一般的方法を用いて、化合物IV.25を得る。粗生成物の純度は47%である(C18 RP-HPLCで測定)。半-分取C18 RP-HPLCでの精製により純粋な化合物IV.25を得る(収率40%および純度>99%): HPLC tR 6.63分 (直線勾配, 5 - 65% B, 20分); MS (MALDI-TOF) C80H142N28O18の計算値: 1783.11. 実測値: [M+Na+] = 1806.48; [M+K+] = 1823.39; HRMS(ESI): m/z: C80H142N28O18Naの計算値: 1806.11; 実測値: 1806.095
【０２４５】
IV.26: この一般的方法を用いて、化合物IV.26を得る。粗生成物の純度は30%である(C18 RP-HPLCで測定)。半-分取C18 RP-HPLCでの精製により純粋な化合物IV.26を得る(収率13%および純度>99%): HPLC tR 6.95分 (直線勾配, 5 - 65% B, 20分); MS (MALDI-TOF) C82H146N28O19の計算値: 1827.13. 実測値: [M+H+] = 1828.14; [M+Na+] = 1850.14; [M+K+] = 1866.14
【０２４６】
IV.27: この一般的方法を用いて、化合物IV.27を得る。粗生成物の純度は54%である(C18 RP-HPLCで測定)。半-分取C18 RP-HPLCでの精製により純粋な化合物IV.27を得る(収率20%および純度>99%): HPLC tR 7,8分 (直線勾配, 5 - 65% B, 20分); MS (MALDI-TOF) C90H162N28O23の計算値: 2003.24. 実測値: [M+H+] = 2004.34; [M+Na+] = 2026,34; [M+K+] = 2042.31
【０２４７】
一般的カップリング方法
コアペプチドIV.24、IV.25またはIV.26(1 eq.)をDMF中に溶解する。ペプチド(6.6 eq.)、BOP(6.6 eq.)およびDIEA(20 eq.)を室温で加える。反応混合物を1週間撹拌し、大容積の飽和NaHCO3中で沈殿させる。沈殿を濾過し、飽和NaHCO3で洗浄し、続いて水、1N KHSO4、食塩水およびシクロヘキサンで洗浄する。固体を真空下で乾燥する。
【０２４８】
粗生成物を水5%を含むトリフルオロ酢酸中に溶解する。室温で30分間撹拌後、反応混合物をエーテル中で沈殿させる。所期のTFA塩を濾過し、エーテルで洗浄し、真空下で乾燥する。半-分取C18 RP-HPLC (5-65% B, 20分)で精製し、続いて凍結乾燥し、所期のリカンドを得る。
【０２４９】
L41: 上記に概略した一般的方法を用いて、リガンドL41を得る。粗リカンドの純度は51%である(C18 RP-HPLCで測定)。半-分取C18 RP-HPLCでの精製により純粋なL41リガンドを得る(収率12%および純度>99%): HPLC tR 10.65分 (直線勾配, 5 - 65% B, 20分); MS (MALDI-TOF) C272H406N64O60の計算値: 5529.07. 実測値: [M+H+] = 5529.78
【０２５０】
L42: 上記に概略した一般的方法を用いて、リガンドL42を得る。粗リカンドの純度は58%である(C18 RP-HPLCで測定)。半-分取C18 RP-HPLCでの精製により純粋なL42リガンドを得る(収率15%および純度>99%): HPLC tR 10.89分 (直線勾配, 5 - 65% B, 20分); MS (MALDI-TOF) C275H411N65O61の計算値: 5600.11. 実測値: [M+H+] = 5580
【０２５１】
L43: 上記に概略した一般的方法を用いて、リガンドL43を得る。粗リカンドの純度は54%である(C18 RP-HPLCで測定)。半-分取C18 RP-HPLCでの精製により純粋なL43リガンドを得る(収率15%および純度>99%): HPLC tR 11.04分 (直線勾配, 5 - 65% B, 20分); MS (MALDI-TOF) C282H426N64O65の計算値: 5749.2. 実測値: [M+H+] = 5751
【図１】
2010517984.tif 000151
【図２】
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【図３】
2010517984.tif 000153
【図４Ａ】
2010517984.tif 000154
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
2010517984.tif 000157
【配列表】
2010517984000001.app
【国際調査報告】
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