(57)【要約】  本特許出願は、プロラクチン分子のアンタゴニスト二量体及び癌の処置におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一プロラクチンレセプター結合単量体、第二プロラクチンレセプター結合単量体、及びリンカーを含有するプロラクチンレセプターアンタゴニスト二量体であって、各単量体が第一及び第二プロラクチンレセプター結合部位を有し、第一単量体及び第二単量体が、得られる二量体が２つの機能的レセプター結合部位を有するように、各単量体の所定位置でリンカーにコンジュゲートしている二量体。
【請求項２】
２つの機能的結合部位が、双方とも第一プロラクチンレセプター結合部位である請求項１に記載の二量体。
【請求項３】
前記プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一が、プロラクチン又はプロラクチンアナログである請求項１又は２に記載の二量体。
【請求項４】
リンカーが、プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一において、配列番号１との配列アラインメントにより定めて、アミノ酸残基１４から４０又はアミノ酸残基１１０から１３６の間に位置している請求項１から３の何れか一項に記載の二量体。
【請求項５】
リンカーが、双方のプロラクチンレセプター結合単量体において、配列番号１との配列アラインメントにより定めて、アミノ酸残基１４から４０又は１１０から１３６の間に位置している請求項４に記載の二量体。
【請求項６】
リンカーが、プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一において、配列番号１との配列アラインメントにより定めて、アミノ酸残基１７、２０、２１、２４、２５、１２１、１２５、１２８、１２９及び１３２の何れかに位置している請求項１から５の何れか一項に記載の二量体。
【請求項７】
リンカーが、双方のプロラクチンレセプター結合単量体において、配列番号１との配列アラインメントにより定めて、残基１７、２０、２１、２４、２５、１２１、１２５、１２８、１２９及び１３２の何れかに位置している請求項６に記載の二量体。
【請求項８】
前記リンカーが、２４結合と同じか、それより短い請求項１から７の何れか一項に記載の二量体。
【請求項９】
前記リンカーが、２つのシステイン残基間に酸化的スルフィド架橋形成を含む請求項１から８の何れか一項に記載の二量体。
【請求項１０】
前記リンカーが、次の式(Ｉ)：
2010513405.tif 000012
[上式中：
Ｙ及びＺは独立して、-Ｓ-、-ＮＨ-、-ＣＲ=、-ＣＨ２-又は-ＣＯ-を表し、
ここで、Ｒは、水素、又はアリール、又は直鎖状、分枝状又は環状のＣ１−１０アルキルを表し；
Ｘは：
2010513405.tif 000013
から選択され、
ここで、Ｗは、-[ＣＨ２]ｍ-、-ＣＨ２-[ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２]ｍ-ＣＨ２-、-ＣＨ=ＣＨ-、-ＣＨ２-[ＣＨ=ＣＨ]ｍ-ＣＨ２-、-ＮＨ-ＣＨ２-[ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２]ｍ-ＣＨ２-ＮＨ-、-ＮＨ-ＣＨ２-[ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２]ｍ-ＣＨ２-、
2010513405.tif 000014
を表し、
ｍは１〜２２の整数である]
により表されるリンカーである請求項１から８の何れか一項に記載の二量体。
【請求項１１】
前記リンカーが二官能性リンカーである請求項１から１０の何れか一項に記載の二量体。
【請求項１２】
前記リンカーが、次の式(ＩＡ)
2010513405.tif 000015
[上式中、ｎは０〜３の整数を表す]
を有する請求項１１に記載の二量体。
【請求項１３】
治療に使用される請求項１から１２の何れか一項に記載の二量体。
【請求項１４】
乳癌の処置に使用される請求項１３に記載の二量体。
【請求項１５】
請求項１から１４の何れか一項に記載の二量体を含有する医薬組成物。
【請求項１６】
治療のための請求項１から１２の何れか一項に記載の二量体の使用。
【請求項１７】
エストロゲン依存性癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、膵臓癌、胃腸癌、白血病、皮膚癌、及びリンパ腫から選択される癌の処置における請求項１から１２の何れか一項に記載の二量体の使用。
【請求項１８】
エストロゲン依存性癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、膵臓癌、胃腸癌、白血病、皮膚癌、及びリンパ腫から選択される癌を処置する医薬組成物を調製するための請求項１から１２の何れか一項に記載の二量体の使用。
【請求項１９】
請求項１から１２の何れか一項に記載の二量体を投与することを含む、増殖性疾患の治療又は予防方法。
【請求項２０】
前記増殖性疾患が癌である請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なプロラクチンレセプターアンタゴニスト化合物、これら化合物を含有する医薬組成物、及び増殖性疾患に関連する病気の処置のための化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロラクチンが癌細胞の増殖促進因子としての役割を担っている可能性があることが最近の証拠により示唆された(Libyら Breast Cancer Research and Treatment 79, 241-252 (2003); Clevengerら Endocrine Rev. 24, 1-27 (2003))。インビトロでの実験で、プロラクチンレセプターアンタゴニストＧ１２９Ｒ-ｈＰＲＬが、タモキシフェンと併用された場合に、Ｔ４７Ｄ乳癌細胞の増殖阻害に対して相加的効果を示すことが証明された(Chenら Clin. Cancer Res. 5, 3583 (1999))。同じ化合物単独では、Ｔ４７Ｄ腫瘍異種移植片増殖のインビボ阻害を示した(Chenら Int. J. Oncology, 20, 813-818 (2002))。
しかしながら、高レベルのこれらプロラクチンレセプターアンタゴニストが、インビボでの効果を得るために必要である(Goffinら Endocrine Rev. 26, 400-422 (2005))。
【０００３】
レセプターアンタゴニスト多量体を生じせしめることで、更に長い血清半減期を有するより強力なホルモンアンタゴニストを生成するための近年の試みで、驚くべきことに、かかるレセプターアンタゴニスト多量体がレセプターアゴニストとして作用することが見出された(国際公開第０３／０８９５８２号)。
後の実験(Langeheimら Mol Endocrinol. 20(3), 661-674 (2006)では、リガンドが、レセプター媒介性シグナル伝達を引き起こすためには２つの機能的結合部位を有していなければならないことが示されたが、これは：
１．部位１＋部位２、又は
２．部位１＋部位１
でありうる。
１：２のリガンド-レセプター複合体モデルの３次元図の例を図１に示す。
従って、２つのレセプターアンタゴニストを連結させると、プロラクチンレセプター媒介性シグナル伝達を活性化可能な２つの機能的結合部位を有する二量体が生じる。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、第一プロラクチンレセプター結合単量体、第二プロラクチンレセプター結合単量体、及びリンカーを含有するプロラクチンレセプターアンタゴニスト二量体であって、各単量体が第一及び第二プロラクチンレセプター結合部位を有し、第一単量体及び第二単量体が、得られる二量体が２つの機能的レセプター結合部位を有するように、各単量体の所定位置でリンカーにコンジュゲートしている二量体を提供する。
【０００５】
また本発明は、増殖性疾患の治療又は予防方法で、本発明のプロラクチンレセプターアンタゴニスト二量体を投与することを含む方法を提供する。
更に本発明は、増殖性疾患を治療又は予防する医薬の製造における、プロラクチンレセプターアンタゴニスト二量体の使用を提供する。
また更に本発明は、増殖性疾患の治療又は予防に使用される、プロラクチンレセプターアンタゴニスト二量体を含有する医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】１：２のリガンド-レセプター複合体モデルの３次元図を示す。
【図２】図２は、アジレント２１００バイオアナライザー・プロテイン２３０キットを使用した様々なサンプルのタンパク質分析を示す。レーン１：ＰＲＬ Ｇ１２９Ｒアナログ(還元)、レーン２：ＰＲＬ二量体１(還元)、レーン３:ＰＲＬ Ｇ１２９Ｒアナログ、レーン４：ＰＲＬ二量体１
【図３】マトリックスとしてα-シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸を使用するＰＲＬ二量体１のＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量／荷電スペクトルを示す。
【図４】図４Ａ(上枠)は、トリプシン消化ＰＲＬ二量体１の質量／荷電スペクトルを示し、ＰＲＬの残基１２６−１４２のジスルフィド結合二量体を含むペプチド断片(ｍ／ｚ＝３７９０、ｚ＝１)に対応するピークを示す。図４Ｂ(下枠)は、ＤＴＴ処理されたトリプシン消化ＰＲＬ二量体の質量／荷電スペクトルを示す。００３３は、ＰＲＬ １２-１９９ Ｑ１２Ｓ Ｅ１２８Ｃである。
【図５】ＰＲＬ二量体の円二色性スペクトルを例示する。
【図６】実施例に記載されたホスホ-ＳＴＡＴ３ ＥＬＩＳＡの結果を示す。図のカラム１は未処理の細胞；カラム２：＋１０ｎＭのＰＲＬ、カラム３：＋１０ｎＭのＰＲＬ＋１０ｎＭのＰＲＬ二量体１；カラム４：＋１０ｎＭのＰＲＬ＋５０ｎＭのＰＲＬ二量体１；カラム５：＋１０ｎＭのＰＲＬ＋１００ｎＭのＰＲＬ二量体１である。
【図７】実施例に記載されたウエスタンブロットによるＳＴＡＴ５チロシンホスホリル化の結果を示す。ＰＲＬ及びＰＲＬＲアンタゴニスト二量体の量を示す。二量体はＰＲＬ１２-１９９ Ｑ１２Ｓ Ｅ１２８Ｃである。
【図８】実施例９に記載された細胞遊走アッセイの結果を示す。図のカラム１はＴ４７Ｄ細胞の基底遊走レベル(化学誘因物質存在せず)を表す：カラム２：５ｎＭのＰＲＬを、下部チャンバーにて化学誘因物質として使用；カラム３：５ｎＭのＰＲＬを、下部チャンバーにて化学誘因物質として使用；１０ｎＭの二量体が上部チャンバーに存在；カラム４：５ｎＭのＰＲＬを、下部チャンバーにて化学誘因物質として使用；１００ｎＭの二量体が上部チャンバーに存在；カラム５：下部チャンバーに化学誘因物質を添加せず；１０ｎＭの二量体が上部チャンバーに存在；カラム６：下部チャンバーに化学誘因物質を添加せず；１００ｎＭの二量体が上部チャンバーに存在；２０×顕微鏡視野の１／６の細胞数±ＳＤ(ｎ＝１０)を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
これまでの研究では、単量体自体はアンタゴニストであったが、Ｎ末端及びＣ末端でコンジュゲートした単量体から遺伝子操作された二量体はアゴニストとして作用することが示された(Langeheimら Mol Endocrinol. 20(3), 661-674 (2006))。よって、必要な結合部位を有するリガンドは、レセプター二量体化を活性化し、従ってシグナル伝達を可能にすると推定された(国際公開第０３／０８９５８２号)。
本発明は、第一プロラクチンレセプター結合単量体、第二プロラクチンレセプター結合単量体、及びリンカーを含有するプロラクチンレセプターアンタゴニスト二量体であって、各単量体が第一及び第二プロラクチンレセプター結合部位を有し、第一単量体及び第二単量体が、得られる二量体が２つの機能的レセプター結合部位を有するように、各単量体の所定位置でリンカーにコンジュゲートしている二量体を提供する。
【０００８】
プロラクチンは、約２４０００ダルトンの分子量を有する１９９アミノ酸残基の単鎖ポリペプチドである。これは、下垂体前葉(脳下垂体前葉)、乳房、及び脱落膜で合成され、成長ホルモン(ＧＨ)及び胎盤性ラクトゲン(ＰＬ)に類似した構造を有している。３つのジスルフィド結合の活性によって、分子は折り畳まれている。ヒトプロラクチンの配列を配列番号１に与え、ヒト成長ホルモンの配列を配列番号２に与え、ヒト胎盤性ラクトゲンの配列を配列番号３に与える。
プロラクチンの断片及びアナログを記載するために簡単な系を使用する。例えばＧ１２９Ｒ-ＰＲＬは、１２９位にある天然に生じたアミノ酸残基グリシン(Ｇ)をアルギニン(Ｒ)で置換することにより、プロラクチンから形式的に誘導されるプロラクチンのアナログを命名したものである。ＰＲＬ(９-１９９)及びＰＲＬ(１２-１９９)は、鎖の最初の８又は１１個のアミノ酸を除去することにより、ＰＲＬから形式的に誘導された断片を命名したものである。
【０００９】
ヒトプロラクチン(ｈＰＲＬ)は、互いにプロラクチンレセプターと相互作用して、１：２のリガンド-レセプター複合体を形成する２つの別個で異なった結合部位(部位１及び部位２)を有している。適切なリガンド誘導性レセプター二量体化は、それぞれシグナル伝達性転写因子ＳＴＡＴ５又はＳＴＡＴ３を刺激する、チロシンキナーゼＪＡＫ２又はＪＡＫ１のレセプター関連ヤヌスファミリーの活性化を引き起こす立体構造変化を誘導する。また、レセプターの活性化は、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫキナーゼ／Ｅｒｋ１／２及びホスファチジルイノシトール-３キナーゼ／Ａｋｔシグナル伝達経路の活性化を生じる。これらのリガンドのレセプターが細胞の分化、増殖、及び／又は生存を誘導するのは主としてこれらの経路を介してである。
【００１０】
結合プロセスは、２つのレセプター結合部位間での親和性の差のために、順次的であることが報告されている。よって、高親和性部位(部位１)は第一レセプターと相互作用し、これが、低親和性部位(部位２)が第二レセプターと相互作用できるように、リガンド中の立体構造変化を引き起こす。レセプターのリガンド誘導性二量体化は、ｈＰＲＬシグナル伝達に必須である。
【００１１】
「部位２」の構造的完全性に影響を及ぼす変異を有する単量体リガンドは、機能性レセプター結合部位を一つしか有しておらず、よって一方のレセプターにしか結合せず、適切なレセプターの二量体化が防止されるため、シグナル伝達を活性化しない。かかる分子はレセプターを活性化せず、機能的レセプターアンタゴニストとして作用する。
【００１２】
現在、６種のプロラクチンレセプターアンタゴニストが文献では知られている(Goffinら Endocrine Rev. 26, 400-422 (2005))：
(ａ)Ｇ１２０Ｒ／Ｋ-ｈＧＨ、ヒト成長ホルモン変異体；
(ｂ)Ｇ１２０Ｒ-ｈＰＬ、ヒト胎盤性ラクトゲン変異体；
(ｃ)Ｇ１２９Ｒ-ｈＰＲＬ、ヒトプロラクチンの完全長変異体；
(ｄ)Ｓ１７９Ｄ-ｈＰＲＬ、ヒトプロラクチンの完全長変異体；
(ｅ)Ｇ１２９Ｒ-ｈＰＲＬ(１０-１９９)、ヒトプロラクチンの切断型変異体；及び
(ｆ)Ｇ１２９Ｒ-ｈＰＲＬ(１５-１９９)、ヒトプロラクチンの切断型変異体
【００１３】
ここで使用される「プロラクチンレセプター結合単量体」なる用語は、プロラクチンレセプターに対する結合可能性を有するリガンドを意味する。リガンドはポリペプチド、例えばプロラクチン、プロラクチンアナログ、又はプロラクチンレセプターへの同じ結合可能性を有する他のホルモン又はアナログ、例えば成長ホルモン(ＧＨ)又は成長ホルモンアナログ、及び胎盤性ラクトゲン(ＰＬ)又は胎盤性ラクトゲンアナログでありうる。一実施態様では、プロラクチンレセプター結合単量体はプロラクチンレセプターアンタゴニスト単量体である。
【００１４】
ここで使用される「ポリペプチド」及び「ペプチド」なる用語は、ペプチド結合により連結した少なくとも５の構成アミノ酸からなる化合物を意味する。構成アミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるアミノ酸の群からのものであってよく、またそれらは遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸、並びに合成アミノ酸であってもよい。遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸は、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ-アラニン及びＤ-グルタミンである。合成アミノ酸は、化学合成により製造されたアミノ酸、すなわち遺伝暗号によりコードされるアミノ酸のＤ-異性体、例えばＤ-アラニン及びＤ-ロイシン、Ａｉｂ(ａ-アミノイソ酪酸)、Ａｂｕ(ａ-アミノ酪酸)、Ｔｌｅ(tert-ブチルグリシン)、β-アラニン、３-アミノメチル安息香酸、及びアントラニル酸を含む。
【００１５】
ポリペプチドに言及してここで使用される「アナログ」なる用語は、ペプチドの一又は複数のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基で置換され、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基がペプチドから欠失され、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基がペプチドに付加されている修飾ペプチドを意味する。アミノ酸残基のこのような付加又は欠失は、ペプチドのＮ末端及び／又はペプチドのＣ末端で起こりうる。光学異性体と記載されていない全てのアミノ酸はＬ-異性体を意味するものと理解されなければならない。
【００１６】
ここで使用される「プロラクチンアナログ」なる用語は、プロラクチンレセプターに対する結合可能性を有しているプロラクチンアナログを意味する。一実施態様では、プロラクチンアナログは、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。一実施態様では、プロラクチンアナログは、配列番号１と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１７】
ここで使用される「成長ホルモンアナログ」なる用語は、プロラクチンレセプターに対する結合可能性を有する成長ホルモンアナログを意味する。一実施態様では、成長ホルモンアナログは、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。一実施態様では、成長ホルモンアナログは、配列番号２と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１８】
ここで使用される「胎盤性ラクトゲンアナログ」なる用語は、プロラクチンレセプターに対する結合可能性を有している胎盤性ラクトゲンアナログを意味する。一実施態様では、胎盤性ラクトゲンアナログは、配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。一実施態様では、胎盤性ラクトゲンアナログは、配列番号３と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１９】
当該分野で知られている「同一性」なる用語は、配列を比較することにより決定される、２又はそれ以上のペプチド配列間の関係を意味する。当該分野において、「同一性」とは、２又はそれ以上のアミノ酸残基のストリング間の適合数により決定される、ペプチド間の配列関連性の度合いを意味する。「同一性」は、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム(すなわち「アルゴリズム」)により処理されるギャップアラインメント(もしあれば)を用いて、２又はそれ以上の配列の同一適合性のパーセントを測定する。関連ペプチドの同一性は、知られている方法により容易に算出することができる。このような方法は、限定されるものではないが、 Computational Molecular Biology, Lesk, A. M編, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W編, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M.,及びGriffin, H. G編, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 及びDevereux, J編, M. Stockton Press, New York, 1991;及びCarilloら, SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)に記載されているものを含む。
【００２０】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最も大きな適合性を付与するように設計される。同一性を決定するための方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法は、ＧＡＰ(Devereuxら, Nucl. Acid. Res., 12：387(1984)を含むＧＣＧプログラムパッケージ；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ(Altschulら, J. Mol. Biol., 215：403-410(1990))を含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)及び他の供給源(BLAST Manual, Altschulら, NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894；Altschulら, 上掲)から公に入手可能である。よく知られているスミス・ウォーターマン・アルゴリズム(Smith Waterman algorithm)も、同一性を決定するために使用されうる。
【００２１】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)を使用して、パーセント配列同一性が測定される２つのペプチドを、その各アミノ酸が最適に適合するように整列させる(アルゴリズムにより決定される「適合スパン」)。ギャップ開裂ペナルティ(平均ダイアゴナルの３倍と算出される；「平均ダイアゴナル」は使用される比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；「ダイアゴナル」とは、特定の比較マトリックスにより各完全アミノ酸マッチに割り当てられるスコア又は数である)及びギャップ伸長ペナルティ(通常、ギャップ開裂ペナルティの{分率(１／１０)倍}である)、並びに比較マトリックス、例えばＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２が、アルゴリズムと共に使用される。標準的な比較マトリックス(ＰＡＭ２５０比較マトリックス用には、Dayhoffら, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol.5, supp.3(1978)；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックス用には、Henikoffら, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89：10915-10919(1992)を参照)もまたアルゴリズムにより使用される。
【００２２】
ペプチド配列比較のために好ましいパラメータは、次のものを含む：
アルゴリズム：Needlemanら, J. Mol. Biol, 48：443-453(1970)；比較マトリックス：Henikoffら, PNAS. USA, 89：10915-10919(1992)のＢＬＯＳＵＭ６２；ＧＡＰペナルティ：１２、ＧＡＰ長ペナルティ：４、類似性閾値：０。
ＧＡＰプログラムは上述のパラメータの場合が有用である。上述のパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを使用するペプチド比較(末端ギャップに対するペナルティを伴わない)のための初期設定パラメータである。
【００２３】
一実施態様では、プロラクチンアナログは、配列番号１と少なくとも８０％類似しているアミノ酸配列を有する。一実施態様では、プロラクチンアナログは、配列番号１と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％類似しているアミノ酸配列を有する。
一実施態様では、成長ホルモンアナログは、配列番号２と少なくとも８０％類似しているアミノ酸配列を有する。一実施態様では、成長ホルモンアナログは、配列番号２と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％類似しているアミノ酸配列を有する。
一実施態様では、胎盤性ラクトゲンアナログは、配列番号３と少なくとも８０％類似しているアミノ酸配列を有する。一実施態様では、胎盤性ラクトゲンアナログは、配列番号３と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％類似しているアミノ酸配列を有する。
【００２４】
「類似性」なる用語は、同一性に関連した概念であるが、「同一性」とは異なり、同一適合性と保存的置換適合性の双方を含む配列関係を意味する。２つのポリペプチド配列が、例えば(分率(１０／２０))同一のアミノ酸を有し、残りが全て非保存的置換であるならば、パーセント同一性及び類似性は、双方とも５０％である。同じサンプルにおいて、保存的置換が５を越える位置で存在するならば、パーセント同一性は５０％のままであるが、パーセント類似性は７５％((分率(１５／２０))になる。よって、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチドの間の類似性の度合いは、それら２つのポリペプチドの間のパーセント同一性よりも高い。
【００２５】
所定のアミノ酸配列を含むペプチドの保存的修飾(及びコード化核酸に対する対応の修飾)により、その所定のアミノ酸配列を含むペプチドのものと類似した機能的及び化学的特徴を有するペプチドが生成される。これに対して、元のペプチドと比較して、かかるペプチドの機能的及び／又は化学的特徴における実質的な修飾は、(ａ)置換領域における分子骨格の構造、例えばシート又はヘリックス構造、(ｂ)標的部位における分子の電荷又は疎水性度、又は(ｃ)側鎖の嵩の維持に対するそれらの影響で顕著に異なるアミノ酸配列での置換を選択することにより、達成され得る。
【００２６】
例えば「保存的アミノ酸置換」は、その位置での、アミノ酸残基の極性又は電荷にほとんど又は全く影響を与えないような、非天然残基による天然のアミノ酸残基の置換を含み得る。更に、ポリペプチドにおける任意の天然残基は、「アラニンスキャンニング突然変異誘発」について先に記載されているように、アラニンで置換されうる(例えば、アラニンスキャンニング突然変異誘発を検討しているMacLennanら, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643, 55-67(1998); Sasakiら, Adv. Biophys. 35, 1-24(1998)を参照)。
【００２７】
(保存的か非保存的かにかかわらず)所望のアミノ酸置換は、このような置換が所望された時点で、当業者により決定されうる。例えば、アミノ酸置換は、本発明のペプチドの重要な残基を同定し、又は既に記載された変異に加えて、レセプターに対するここで記載されたペプチドの親和性を増加又は減少させるために使用することができる。
【００２８】
天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいたクラスに分けることができる：
１)疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ｌｉｅ；
２)中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３)酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４)塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５)鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
６)芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００２９】
このような変化をさせる際、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮されうる。各アミノ酸には、それらの疎水性及び電荷特性に基づき、疎水性親水性指標があてがわれており、これらは、イソロイシン(＋４．５)；バリン(＋４．２)；ロイシン(＋３．８)；フェニルアラニン(＋２．８)；システイン／シスチン(＋２．５)；メチオニン(＋１．９)；アラニン(＋１．８)；グリシン(−０．４)；スレオニン(−０．７)；セリン(−０．８)；トリプトファン(−０．９)；チロシン(−１．３)；プロリン(−１．６)；ヒスチジン(−３．２)；グルタマート(−３．５)；グルタミン(−３．５)；アスパラタート(−３．５)；アスパラギン(−３．５)；リジン(−３．９)；及びアルギニン(−４．５)である。
【００３０】
タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際における疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は当該分野で理解されている。Kyteら, J. Mol. Biol., 157, 105-131(1982)。ある種のアミノ酸は、類似した疎水性親水性指標又はスコアを有する他のアミノ酸に置換されてもよく、類似した生物活性を保持していることも知られている。疎水性親水性指標に基づく変化をさせる際、その疎水性親水性指標が±２の範囲内にあるアミノ酸の置換が好ましく、また±１の範囲内にあるものが特に好ましく、更には±０．５の範囲内にあるものが更により好ましい。
【００３１】
類似のアミノ酸の置換は、特にそれにより生じた生物学的、機能的に等価なタンパク質又はペプチドが、本願の場合におけるように、免疫学的実施態様に使用されることを意図されている場合、親水性度に基づき効果的になされることがまた当該分野では理解されている。その隣接するアミノ酸の親水性度により支配されるタンパク質の最も高い局所的平均親水性度は、その免疫原性及び抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と相関する。
【００３２】
次の親水性値が、アミノ酸残基に対して割り当てられている：アルギニン(＋３．０)；リジン(＋３．０)；アスパラタート(＋３．０±１)；グルタマート(＋３．０±１)；セリン(＋０．３)；アスパラギン(＋０．２)；グルタミン(＋０．２)；グリシン(０)；スレオニン(−０．４)；プロリン(−０．５±１)；アラニン(−０．５)；ヒスチジン(−０．５)；システイン(−１．０)；メチオニン(−１．３)；バリン(−１．５)；ロイシン(−１．８)；イソロイシン(−１．８)；チロシン(−２．３)；フェニルアラニン(−２．５)；トリプトファン(−３．４)。類似した親水性値に基づき変化させる際、その親水性値が±２の範囲内にあるアミノ酸の置換が好ましく、±１の範囲内にあるものが特に好ましく、±０．５の範囲内にあるものが更に好ましい。また、親水性度に基づく一次アミノ酸配列からエピトープを同定してもよい。これらの領域は「エピトープコア領域」とも称される。
【００３３】
ここで使用される「プロラクチンレセプターアンタゴニスト単量体」なる用語は、プロラクチンレセプターにアンタゴニスト活性を有し、よって一又は複数の細胞プロセスのインヒビターとして作用するプロラクチンレセプター結合単量体を意味する。このようなプロラクチンアンタゴニスト活性は、Langenheim, J.F.ら, Mol Endocrinol. 20(39), 661-674 (2006)に詳しく記載されているように、ＳＴＡＴ５のリン酸化状態のウエスタンブロット分析により測定され得る。
ここで使用される「プロラクチンレセプターアンタゴニスト二量体」なる用語は、一又は複数の細胞プロセスのインヒビターとして作用するプロラクチンレセプター結合二量体を意味する。このようなプロラクチン拮抗活性は、Langenheim, J.F.ら, Mol Endocrinol. 20(39), 661-674 (2006)に詳しく記載されているように、ＳＴＡＴ５のリン酸化状態のウエスタンブロット分析により測定され得る。ここで使用される「プロラクチンレセプター結合二量体」なる用語は、２つのプロラクチンレセプター結合単量体を含有する二量体を意味する。
【００３４】
ここで使用される「第一プロラクチンレセプター結合部位」なる用語は、第一プロラクチンレセプターと相互作用する高親和性部位を持つプロラクチンの領域を意味する。プロラクチンのこの領域は当業者によく知られており、「部位１」として交換可能に知られている(Langenheim, J.F.ら, Mol Endocrinol. 20(39), 661-674 (2006))。
ここで使用される「第二プロラクチンレセプター結合部位」なる用語は、第二プロラクチンレセプターと相互作用する低親和性部位を持つプロラクチンの領域を意味する。近年、部位１と第一レセプターとの相互作用が、リガンド内に立体構造的変化を誘発し、機能的部位２を生じせしめることが分かった。プロラクチンのこの領域は当業者によく知られており、「部位２」として交換可能に知られている(Langenheim, J.F.ら, Mol Endocrinol. 20(39), 661-674 (2006))。
【００３５】
一実施態様では、プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一は、親ポリペプチドと比較して切断されていてもよい。ここでは、親ポリペプチドは、そこからプロラクチンレセプター結合単量体が誘導されたポリペプチド、特にヒトプロラクチン、ヒト成長ホルモン又はヒト胎盤性ラクトゲンとして理解されるべきである。一実施態様では、前記プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一はＰＲＬ(１０-１９９)である。一実施態様では、前記プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一はＰＲＬ(１２-１９９)である。一実施態様では、前記プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一はＰＲＬ(１５-１９９)である。このような切断型単量体は、この領域におけるシステイン残基間の更なる又は代替のリンカー形成を防止しうる。
【００３６】
一実施態様では、プロラクチンレセプターアンタゴニスト二量体は、２つの同一のプロラクチンレセプター結合単量体を含みうる。一実施態様では、リンカーは、各単量体の同じ残基位置に位置しており、二量体がホモ二量体である実施態様では、二量体は対称性である。ここで使用される「プロラクチンレセプターアンタゴニストホモ二量体」なる用語は、２つの同一のプロラクチンレセプター結合単量体を含むプロラクチンレセプターアンタゴニスト二量体を意味する。
【００３７】
一実施態様では、二量体の一部である場合、各単量体は、機能的な第一プロラクチンレセプター結合部位のみを有する。例えば、リンカーは、コンジュゲートの後に、第二結合部位が破壊されるように、第二プロラクチンレセプター結合部位の内部又はこれに隣接した残基間に位置されうる。
一実施態様では、プロラクチンレセプター結合単量体は、プロラクチンレセプターアンタゴニスト単量体でありうる。例えば、これは、「部位２」の構造的完全性に影響を及ぼす変異の結果として破壊された第二結合部位によるものでありうる。
【００３８】
一実施態様では、リンカーは、プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一において、配列番号１との配列アラインメントにより定めて、アミノ酸残基１４から４０又はアミノ酸残基１１０から１３６の間に位置している。一実施態様では、リンカーは、双方のプロラクチンレセプター結合単量体において、配列番号１との配列アラインメントにより定めて、アミノ酸残基１４から４０又はアミノ酸残基１１０から１３６の間に位置している。
一実施態様では、リンカーは、プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一において、配列番号１との配列アラインメントにより定めて、アミノ酸残基１７、２０、２１、２４、２５、１２１、１２５、１２８、１２９及び１３２の何れかに位置している。一実施態様では、リンカーは、双方のプロラクチンレセプター結合単量体において、配列番号１との配列アラインメントにより定めて、残基１７、２０、２１、２４、２５、１２１、１２５、１２８、１２９及び１３２の何れかに位置している。
一実施態様では、リンカーは、プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一において、配列番号１との配列アラインメントにより定めて、残基１２５又は１２８の何れかに位置している。一実施態様では、リンカーは、双方のプロラクチンレセプター結合単量体において、配列番号１との配列アラインメントにより定めて、残基１２５又は１２８の何れかに位置している。
【００３９】
一実施態様では、リンカーは２４結合と同じか、それより短い。「結合」とは、原子を組み合わせる化学結合を意味し、直鎖における結合のみを意味し、側鎖結合又は芳香族結合を含まない。
【００４０】
一実施態様では、本発明は、次の式(Ｉ)：
2010513405.tif 000002
[上式中、
Ｙ及びＺは独立して、-Ｓ-、-ＮＨ-、-ＣＲ=、-ＣＨ２-又は-ＣＯ-を表し、
ここで、Ｒは、水素、アリール又はＣ１−１０-アルキルを表し；
Ｘは：
2010513405.tif 000003
から選択されるリンカーを表し、
ここで、Ｗは、-[ＣＨ２]ｍ-、-ＣＨ２-[ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２]ｍ-ＣＨ２-、-ＣＨ=ＣＨ-、-ＣＨ２-[ＣＨ=ＣＨ]ｍ-ＣＨ２-、-ＮＨ-ＣＨ２-[ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２]ｍ-ＣＨ２-ＮＨ-、-ＮＨ-ＣＨ２-[ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２]ｍ-ＣＨ２-、
2010513405.tif 000004
を表し、
ｍは１〜２２の整数である]
により表されるリンカーを提供する。
【００４１】
本明細書において、「アルキル」なる用語は、直鎖状(線形)、分枝状又は環状の飽和した一価の炭化水素基を示すことを意図している。「Ｃ１−１０アルキル」は１〜１０の炭素原子を有するアルキルである。
本明細書において、「アリール」なる用語は、例えば６〜８の員原子を有する単環又は多環の炭素環式芳香環基、又は例えば１２〜１８の員原子を有する芳香環系基を示すことを意図している。またアリールは、炭素環系の部分的に水素化された誘導体を含むことを意図しており、ここで、少なくとも一の環は芳香族である。このような部分的に水素化された誘導体の具体例には、１,２,３,４-テトラヒドロナフチル、フルオレニル及び１,４-ジヒドロナフチルが含まれる。
【００４２】
一実施態様では、Ｒは水素を表す。
一実施態様では、Ｒはアリールを表す。
一実施態様では、ＲはＣ１−１０アルキルを表す。一実施態様では、ＲはＣ１-６アルキルを表す。Ｃ１-６アルキル基には、例えばメチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、ｎ-ペンチル、２-メチルブチル、３-メチルブチル、４-メチルフェニル、ｎ-ヘキシル、１,１-ジメチルプロピル、１,２-ジメチルプロピル、２,２-ジメチルプロピル(ネオペンチル)及び１,２,２-トリメチルプロピルが含まれる。
【００４３】
一実施態様では、リンカーは、２つのシステイン残基間に酸化的スルフィド架橋形成を含む。
一実施態様では、リンカーは、二官能性リンカーを含む。例えば、二量体化に使用される反応性二官能性リンカー前駆体は、次の式(ＩＡ)：
2010513405.tif 000005
[上式中、ｎは０〜３の整数を表す]
を有していてもよい。
式(ＩＡ)のリンカーは、単量体のアミノ酸配列中の遊離のシステイン残基と反応すると考えられる。
必要とされるリンカー形成を促進させるために、上に定めた領域で、システイン残基で既存の残基を置換してもよいことが理解されるであろう。
【００４４】
更なる態様では、本発明は、次の式(ＩＩ)：
2010513405.tif 000006
[上式中、
ＰＲＬ-Ａ及びＰＲＬ-Ｂはそれぞれポリペプチドの基を表し、ここでポリペプチドはプロラクチンレセプターに結合可能であり；
-Ｙ-Ｘ-Ｚ-は、式(Ｉ)の化合物に対して上で定義されたリンカーである]
の化合物を提供する。
【００４５】
一実施態様では、ＰＲＬ-Ａ及びＰＲＬ-Ｂは互いに独立して、プロラクチン、プロラクチンアナログ、又はプロラクチンレセプターに対して同じ結合可能性を有する他のホルモン又はアナログ、例えば上述したような成長ホルモン(ＧＨ)又は成長ホルモンアナログ、及び胎盤性ラクトゲン(ＰＬ)又は胎盤性ラクトゲンアナログである。
一実施態様では、ＰＲＬ-Ａ及びＰＲＬ-Ｂは互いに独立して、親ポリペプチドと比較して切断されていてもよい。ここでは親ポリペプチドは、そこからＰＲＬ-Ａ及び／又はＰＲＬ-Ｂが誘導されるポリペプチド、特にヒトプロラクチン、ヒト成長ホルモン又はヒト胎盤性ラクトゲンとして理解されるべきである。一実施態様では、ＰＲＬ-Ａ及び／又はＰＲＬ-ＢはＰＲＬ(１０-１９９)である。一実施態様では、ＰＲＬ-Ａ及び／又はＰＲＬ-ＢはＰＲＬ(１２-１９９)である。一実施態様では、ＰＲＬ-Ａ及び／又はＰＲＬ-ＢはＰＲＬ(１５-１９９)である。
一実施態様では、ＰＲＬ-Ａ及びＰＲＬ-Ｂは同一であり、本発明のプロラクチンレセプターアンタゴニスト二量体に関して、式(ＩＩ)の化合物を上述したようなホモ二量体にする。
【００４６】
本発明のプロラクチンレセプターアンタゴニスト二量体は、商業的に入手可能な出発物質及び／又は従来からの方法により調製される出発物質を使用し、種々の異なる経路を介して、プロラクチンレセプター結合単量体から合成されうる。ポリペプチドの生産は当該分野でよく知られている。例えば、ポリペプチドは古典的なペプチド合成法、例えばｔ-Ｂｏｃ又はＦｍｏｃケミストリー又は他の十分に確立された技術を使用する固相ペプチド合成法により製造されうる。Green及びWuts, 「Protective Groups in Organic Synthesis」, John Wiley & Sons, 1999を参照。またポリペプチドは、ポリペプチドをコードし、ポリペプチドを発現可能なＤＮＡ配列を含む宿主細胞を、ペプチドの発現を可能にする条件下で、適切な栄養培地中で培養することを含む方法により生産されうる。非天然アミノ酸を含有するポリペプチドでは、組換え細胞は、例えばｔＲＮＡ変異体の使用によって非天然アミノ酸がポリペプチド内に導入されるように修飾されるべきである。細胞を培養するために使用される培地は、宿主細胞の増殖に適切な任意の一般的な培地、例えば適切な栄養補助剤を含有する最小又は複合培地でありうる。ついで、細胞により生産されたポリペプチドは、一般的な手順により培養培地から回収され得る。
【００４７】
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、好適にはゲノム又はｃＤＮＡ由来のものであり、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準的な技術(例えば、Sambrook, J, Fritsch, EF及びManiatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989)に従い、特異的ＤＮＡ又はＲＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーションにより、ペプチドの全体又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることにより得られる。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、確立された標準的な方法、例えばBeaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters 22, 1859-1869(1981)に記載されたホスホラミダイト法、又はMatthesら, EMBO Journal 3, 801-805(1984)により記載された方法により合成的に調製されてもよい。ＤＮＡ配列は、例えば米国特許第４６８３２０２号、又はSaikiら, Science 239, 487-491(1988)に記載されたようにして、特定のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により調製されてもよい。ＤＮＡ配列は、簡便には組換えＤＮＡ手順を施されうる任意のベクターに挿入されてもよく、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞にしばしば依存する。ベクターは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、プロモーター、ターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列、及び翻訳エンハンサー配列等の、ＤＮＡの転写に必要な付加的なセグメントに作用可能に結合している発現ベクターでありうる。またベクターは、選択マーカー、例えばその産物が宿主細胞における欠陥を補完する遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、又はメトトレキセート等の薬剤に対する耐性を付与するものをまた含んでいてもよい。大規模製造では、選択マーカーは、抗生物質耐性がなくてもよく、例えばベクター中の抗生物質耐性遺伝子は、ベクターが大規模製造に使用される場合に切除されうる。ベクターから抗生物質耐性遺伝子を除去する方法は、当該分野で知られており、例えば出典明示によってここに援用される米国特許第６３５８７０５号を参照されたい。宿主細胞の分泌経路に、本発明の親ペプチドを方向付けるために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列、又はプレ配列としても知られている)が、組換えベクターに提供されてもよい。ＤＮＡ配列又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、本ペプチドを生産可能な任意の細胞であってよく、細菌、酵母、真菌、及び高等真核細胞が含まれる。これを達成するための手順工程は、全て当業者によく知られている。
【００４８】
様々な細胞増殖性疾患を、ここに記載されている化合物を用いて治療又は予防することができる。「増殖性疾患」は、異常な細胞増殖により特徴付けられ、例えば、細胞が、それらの対応の正常細胞よりも、より多く分裂してしまう病気又は疾患を意味する。異常な増殖は、任意の作用機序又は作用機序の組合せにより、引き起こされうる。例えば、一又は複数の細胞の細胞周期が、細胞がそれらの対応の正常細胞よりも頻繁に分裂するように冒され、また他の例では、一又は複数の細胞が、それらの分裂数を通常制限する阻害シグナルを迂回してしまう場合がある。増殖性疾患には、限定されるものではないが、細胞癌、肉腫、白血病、神経細胞腫瘍、及び非侵襲性腫瘍が含まれる。細胞増殖の阻害に使用される場合、化合物は、細胞を殺すために細胞障害的に、又は細胞を殺すことなく増殖を阻害するために細胞分裂阻害的に作用し得る。
【００４９】
一実施態様では、本発明は、治療的有効量の本発明の二量体を投与することを含む増殖性疾患の治療又は予防方法を提供する。一実施態様では、増殖性疾患を治療又は予防する医薬の製造における本発明の二量体の使用を提供する。一実施態様では、増殖性疾患の処置に使用される本発明の二量体を含有する医薬組成物を提供する。
【００５０】
ここで使用される場合「処置（治療）」及び「処置（治療）する」なる用語は、病気又は疾患等の病状に抗することを目的として、患者を管理及び世話することを意味する。本用語には、兆候又は合併症を軽減、病気、疾患又は病状の進行を遅延化、兆候及び合併症を軽減又は緩和、及び／又は病気、疾患又は病状を治癒又は除去、並びに病状を予防するための活性化合物の投与等、患者が患っている病状に対する全範囲の処置を含むことを意図しており、ここで予防とは、病気、病状又は疾患に抗することを目的として、患者を管理及び世話することと理解され、兆候又は合併症の発症を防止する活性ペプチドを投与することが含まれる。処置される患者は、哺乳動物、特にヒトであるが、更にイヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ及びブタ等の動物を含んでもよい。それでもなお、治療及び予防(防止)療法は、本発明の別の側面を表すことが理解されるべきである。
【００５１】
ここで使用されるペプチドの「治療的有効量」とは、与えられた病気及びその合併症の臨床症状を治癒、軽減又は部分的に停止させるのに十分な量であることを意味する。これを達成するのに十分な量が「治療的有効量」であると定義される。各目的のための有効量は、病気又は傷害の種類及び重症度、及び体重、及び患者の一般的状態に依存するであろう。適切な用量の決定は、値のマトリックスを作成し、マトリックスの種々の点で試験することにより、常套的な実験を使用して達成することができることが理解され、これは、訓練を受けた医師又は獣医の通常の技量の範囲内である。
【００５２】
一実施態様では、かかる増殖性疾患は癌である。
癌は、伝統的には、癌細胞が由来する組織及び細胞型に基づいて分類される。癌腫は上皮細胞から生じる癌であると考えられる一方、肉腫は結合組織又は筋肉から生じる癌であると考えられる。他の癌の種類には、造血細胞から生じる白血病、及び神経組織から生じる神経系細胞の癌が含まれる。非侵襲的腫瘍の場合、腺腫は腺性組織を伴う良性の表皮腫瘍であると考えられる一方、軟骨腫は軟骨から生じる良性腫瘍であると考えられる。本発明によれば、二量体は、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、神経細胞腫瘍、及び非侵襲的腫瘍によって包含される増殖性疾患の処置に使用され得る。
【００５３】
一実施態様では、二量体は、限定されるものではないが、骨、乳房、呼吸器(例えば肺)、脳、生殖器(例えば子宮頸部)、消化管(例えば胃腸管及び結腸直腸管)、尿路、膀胱、眼、肝臓、皮膚、頭部、頸部、甲状腺、副甲状腺、腎臓、膵臓、血液、卵巣、胚／前立腺、神経細胞腫瘍、及びその転移形態の癌を含む、種々な組織型から生じる腫瘍を処置するのに使用される。
一実施態様では、二量体はエストロゲン依存性癌の処置に使用される。
【００５４】
一実施態様では、前記増殖性疾患には、限定されるものではないが、浸潤性腺管癌、浸潤性小葉癌、腺管癌、非浸潤性小葉癌、髄様癌及び転移性乳癌を含む、胸部の増殖性疾患を含んでもよい。
増殖性疾患の記述は、上述の病状に限定されるものではないが、調節できない増殖及び悪性腫瘍に特徴付けられる他の疾患が含まれることも理解される。更に、増殖性疾患には、ここに記載の腫瘍及び癌のタイプの種々の転移形態が含まれると理解される。本発明の化合物は、ここに記載の疾患に対する効能について試験され、治療的に有効な療法が確立されうる。効能には、腫瘍の低減又は緩解、細胞増殖速度の低下、アポトーシスの誘導、細胞老化の誘導、又は細胞増殖における細胞増殖抑制又は細胞傷害性が含まれる。
【００５５】
ここに記載の二量体は、単独で、他のものと組み合わせて、又は補助剤として、又は他の確立された抗増殖性治療と併用して使用されてもよい。よって、本化合物は、伝統的な癌治療、例えばγ線又はｘ線の形態でのイオン化放射線と共に使用され得、放射性化合物の移入により外部又は内部に送達させられ、腫瘍の外科的除去に対するフォローアップとして使用されうる。他の態様では、本化合物は他の化学療法剤と共に使用されうる。
ここに記載の二量体は、抗エストロゲン治療、増殖因子レセプターのシグナル伝達のインヒビター、免疫調節剤、抗血管新生及び抗リンパ向性治療と併用して使用されうる。
また二量体は、他の疾患又は病弊の処置に有用な薬剤、例えばステロイド類、膜安定剤、及び細胞内シグナル伝達の他の調節剤、プロテインキナーゼインヒビター、プロテインホスホターゼインヒビター、細胞周期調節剤、及びアポトーシス誘導／調節剤と併用して投与されうる。
【００５６】
有用な抗癌化合物の具体例は、Merck Index, 第13版. (O'Neil M.J.ら編) Merck Publish Group (2001)、及びGoodman及びGilmans The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第10版, Hardman, J.G.及びLimbird, L.E.編, pg. 1381-1287, McGraw Hill (1996)に記載されている。
【００５７】
このような併用療法の具体例には、
一般的な化学療法剤、例えば代謝拮抗剤(例えば、アザチオプリン、シタラビン、リン酸フルダラビン、フルダラビン、ゲムシタビン、シタラビン、クラドリビン、カペシタビン-６-メルカプトプリン、６-チオグアニン、メトトレキサート、５-フルオロウラシル、及びヒドロキシ尿素)、アルキル化剤(例えば、メルファラン、ブスルファン、シス-プラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカルバジン、プロカルバジン、クロラムブシル、チオテパ、ロムスチン、テモゾロミド(temozolamide))、有糸分裂阻害剤(例えば、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドセタキセル、パクリタキセル)、トポイソメラーゼインヒビター(例えば、ドキソルビシン、アムサクリン、イリノテカン、ダウノルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、イダルビシン、テニポシド、エトポシド、トポテカン)、抗生物質(例えば、アクチノマイシン及びブレオマイシン)、アスパラギナーゼ、又はアントラサイクリン類又はタキサン類；
ある種のモノクローナル抗体(ｍＡｂｓ)、例えばリツキシマブ、アレムツズマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、ゲムツズマブ-オゾガマイシン(Myelotarg(登録商標), Wyeth)、セツキシマブ(ErbituxＴＭ)、ベバシズマブ、ＨｕＭａｘ-ＣＤ２０、ＨｕＭａｘ-ＥＧＦｒ、ザミル(Zamyl)及びペルツズマブ、及び／又は例えば組織因子に対する抗体、キラーＩｇ様レセプター(ＫＩＲ)、ラミニン-５、ＥＧＦ-Ｒ、ＶＥＧＦ-Ｒ、ＰＤＧＲ-Ｒ、ＨＥＲ-２／ｎｅｕ、又は腫瘍抗原に対する抗体、例えばＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＫＳＡ等；
細胞周期制御／アポトーシス調節剤、例えば(ｉ)ｃｄｃ-２５、(ｉｉ)細胞周期を過剰刺激するサイクリン依存性キナーゼ(例えば、フラボピリドール(Ｌ８６８２７５、ＨＭＲ１２７５；Aventis)、７-ヒドロキシスタウロスポリン(ＵＣＮ-０１、ＫＷ-２４０１；協和発酵工業)及びロスコビチン(Ｒ-ロスコビチン、ＣＹＣ２０２；Cyclacel))、及び(ｉｉｉ)テロメラーゼ(例えば、ＢＩＢＲ１５３２及びＳＯＴ-０９５、並びにアポトーシス経路に干渉する薬剤、例えばＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド(ＴＲＡＩＬ)／アポトーシス-２リガンド(Ａｐｏ-２Ｌ)、ＴＲＡＩＬレセプターを活性化させる抗体、ＩＦＮａ及びアンチセンスＢｃｌ-２等の調節剤を標的とする化合物；
増殖因子阻害剤、例えば上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)ファミリーのレセプターの細胞外リガンド結合ドメインに向けられる抗体、及びこれらのレセプターのチロシンキナーゼドメインを阻害する低分子量分子、例えばハーセプチン、セツキシマブ、タルセバ及びイレッサ；
腫瘍血管新生のインヒビター(抗血管新生剤及び代謝拮抗剤)、例えばエンドスタチン、アンジオスタチン、血管新生を開始させる因子をブロックする抗体(例えば、抗ＶＥＧＦ-アバスチン)、関連シグナル伝達経路における重要な要素を阻害することにより、血管新生を阻害する低分子化合物；
抗血管新生剤、例えばアバスチン、ネオバスタット(neovastat)、サリドマイド、ＰＴＫ７８７、ＺＫ２２２５８４、ＺＤ-６４７４、ＳＵ６６６８、ＰＤ５４７，６３２、ＶＥＧＦ-トラップ(Trap)、ＣＥＰ-７０５５、ＮＭ-３、ＳＵ１１２４８；
ホルモン剤、例えばリン酸エストラムスチン、リン酸ポリエストラジオール、エストラジオール、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、タモキシフェン、酢酸メゲストロール、酢酸メドロキシプロゲステロン、オクトレオチド、酢酸シプロテロン、ビカルタミド(bi-caltumide)、フルタミド、トリトレリン(tritorelin)、リュープロレリン、ブセレリン、又はゴセレリン；
腫瘍細胞又はウイルス感染細胞に対する免疫応答を高める薬剤、例えばワクチンアジュバント等のアジュバント類、特にＱＳ２１、ＧＭ-ＣＳＦ及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド類、リポ多糖類、ポリイノシ：ポリシチジン酸、α-ガラクトシルセラミド又はそのアナログ、ヒスタミン二塩酸塩、又は水酸化アルミニウム；
サイトカイン類、例えばＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γ、ＩＬ-２、ＰＥＧ-ＩＬ-２、ＩＬ-４、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-１２、ＩＬ-１３、ＩＬ-１５、ＩＬ-１８、ＩＬ-２３、ＩＬ-２７、ＩＬ-２８ａ、ＩＬ-２８ｂ、ＩＬ-２９、ＧＭ-ＣＳＦ、Ｆｌｔ３リガンド又は幹細胞因子又はこれらの任意のもののアナログもしくは誘導体；
シスプラチン、タモキシフェン、ＤＴＩＣ、カルムスチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、ビンデシン、チモシンα、自己ＬＡＫ細胞、ゲムシタビン；
免疫系における抑制シグナル伝達をブロックする薬剤、例えばＣＴＬＡ-４に特異的なｍＡｂｓ(抗-ＣＴＬＡ-４)、ＫＩＲに特異的なｍＡｂｓ(抗-ＫＩＲ)、ＬＩＲに特異的なｍＡｂｓ(抗-ＬＩＲ)、ＣＤ９４に特異的なｍＡｂｓ(抗-ＣＤ９４)、又はＮＫＧ２Ａに特異的なｍＡｂｓ(抗-ＮＫＧ２Ａ)；
抗アネルギー剤、例えばＭＤＸ-０１０(Phanら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 8372 (2003))；
ＮＫ細胞、Ｔ細胞、又はＮＫＴ細胞において発現した抑制レセプターに対する抗体；
治療用ワクチン；
腫瘍成長、ウイルス感染細胞の転移又は拡散に干渉する薬剤、及び
免疫抑制剤／免疫調節剤、例えばＴリンパ球ホーミングに影響を及ぼす薬剤、例えばＦＴＹ-７２０、カルシニューリンインヒビター、例えばバルスポーダー(valspodar)、ＰＳＣ８３３、ＴＯＲ-インヒビター、シロリムス、エベロリムス、及びラプマイシン(rapmycin)；
等の、癌を処置するのに有用な医薬と併用して、本発明の二量体を投与することが含まれる。
【００５８】
また、このような併用療法には、放射線治療、例えば外照射療法(ＥＢＲＴ)、又は内照射療法(密封小線源療法(ＢＴ))と共に、本発明の二量体を投与することが含まれ、使用される典型的な放射性原子には、ラジウム、セシウム-１３７、イリジウム-１９２、アメリシウム-２４１、金-１９８、コバルト-５７、銅-６７、テクネチウム-９９、ヨウ素-１２３、及びインジウム-１１１が含まれる。
更にこのような併用療法には、抗癌反応を刺激し又はこれを作用させうる細胞を患者から単離し、これらをより大きな数に増殖させ、それらを同じ患者又は別の患者に再導入することを含みうる細胞免疫治療法と共に、本発明の二量体を投与することを含みうる。
【００５９】
また更にこのような併用療法には、(ｉ)全体としての腫瘍細胞、又は(ｉｉ)(ａ)分泌タンパク質、糖タンパク質又は他の生成物、(ｂ)膜結合タンパク質又は糖タンパク質、又は膜に結合し又はその内部に挿入された他の成分、及び(ｃ)細胞内タンパク質又は他の細胞内成分に対する免疫応答の誘発に至らしめる腫瘍細胞の薬剤誘導又は放射線誘導細胞死を意味する内部ワクチン接種と共に、本発明の二量体を投与することをも含み得る。
またこのような併用療法には、細胞に遺伝子物質を移し、細胞表現型を一時的又は永久的に変えることを含む遺伝子治療と共に、本発明の二量体を投与することを含み得る。
併用療法は、当業者にとってまたこの明細書の目的のために必要であるか又は簡便であると思われる任意の方法で実施され得、順序、量、頻度、又は併用に使用される化合物の相対量に関して制限はない。
【００６０】
本発明の二量体は、遊離の物質として、又はその薬学的に許容可能な塩として、一般的には利用されうる。
「薬学的に許容可能な塩」なる用語は、遊離塩基と、適切な有機又は無機の酸とを反応させるか、又は酸と、適切な有機又は無機の塩基とを反応させることによって一般的に調製されるプロラクチンレセプターアンタゴニストの無毒の塩を意味する。
本発明の二量体が遊離の塩基を含んでいる場合は、このような塩は、薬学的に許容可能な酸の化学的等価物を用いて、二量体の溶液又は懸濁液を処理することによる一般的な形で調製される。
本発明の二量体が遊離の酸を含んでいる場合は、このような塩は、薬学的に許容可能な塩基の化学的等価物を用いて、二量体の溶液又は懸濁液を処理することによる一般的な形で調製される。
【００６１】
ヒドロキシ基を有する化合物の薬学的に許容可能な塩には、ナトリウム又はアンモニウムイオン等の適切なカチオンと前記化合物のアニオンとの組合せが含まれる。製薬的に許容可能ではない他の塩も本発明の二量体の調製に有用であり得、これらの塩も本発明の範疇に含まれる。
薬学的に許容可能な塩であるか否かにかかわらず、本発明の二量体の任意の塩は、「本発明の二量体」といった記載に含まれることを意図している。よって、請求の範囲に提供されるように、本発明は、二量体それ自体、並びにそれらの任意の塩、例えば製薬用の塩を含む。
本発明の二量体、又は上述したその任意の組合せ物は、単一又は複数投薬用量の何れかで、同じ投与経路又は異なる経路により、逐次又は同時に、単独で又は薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と組合せて簡便に投与されうる。
【００６２】
本発明の医薬組成物は薬学的に許容可能な担体又は希釈剤、並びに任意の他の既知のアジュバント及び賦形剤と、例えばRemington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, Gennaro編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995に開示されているものに従って、また当該分野でよく知られているようにして、製剤化することができる。
よって、本発明の二量体、又は薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、又はそのプロドラッグと、一又は複数の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤を含有する医薬組成物が提供される。医薬組成物の組成は、幾つかの事項、例えば投与経路、処置を受ける患者の一般的状態及び年齢、処置される病状の性質、及び選択される活性成分に依存するであろう。与えられたペプチドに対する適切な医薬組成物の決定は、当業者の技量の範囲内にある。
【００６３】
本二量体又はその組成物は、一般的に、意図する結果を達成するのに効果的な量、例えば処置される特定の病気を処置又は予防するのに効果的な量で使用されるであろう。化合物は、治療的効果が達成されるように治療的に投与され得る。治療的効果とは、処置される基礎疾患の根絶又は改善、及び／又は基礎疾患に関連した一又は複数の系の根絶又は改善を意味する。また治療的効果には、改善が実感されるかどうかにかかわらず、病気の進行の中断又は遅延化が含まれる。
正確な用量は、投与の頻度及び方式、処置を受ける患者の性別、年齢、体重、及び一般的状態、処置される病状の性質及び重篤度、及び処置される任意の合併症、及び当業者に明白な他の要因に依存する。有効量の決定は、当業者の能力の範囲内で十分になされる。
【００６４】
本発明の二量体(その薬学的に許容可能な塩、溶媒和物又はプロドラッグ)が、同じ病状に対して活性な第二治療剤と組合せて使用される場合、各化合物の用量は、化合物が単独で使用される場合とは異なっていてもよい。適切な用量は、当業者には容易に理解される。
以下は、本発明の実施態様の非限定的列挙である。
【００６５】
実施態様１：第一プロラクチンレセプター結合単量体、第二プロラクチンレセプター結合単量体、及びリンカーを含有するプロラクチンレセプターアンタゴニスト二量体であって、各単量体が第一及び第二プロラクチンレセプター結合部位を有し、第一単量体及び第二単量体が、得られる二量体が２つの機能的レセプター結合部位を有するように、各単量体の所定位置でリンカーにコンジュゲートしている二量体。
実施態様２：２つの機能的結合部位が、双方とも第一プロラクチンレセプター結合部位である、実施態様１の二量体。
【００６６】
実施態様３：前記プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一が、プロラクチン又はプロラクチンアナログである、実施態様１又は実施態様２の二量体。
実施態様４：前記プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一が、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するプロラクチンアナログである、実施態様３の二量体。
実施態様５：前記プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一が、アミノ酸配列を有するプロラクチンアナログであり、該配列が配列番号１と少なくとも８０％類似している、実施態様３の二量体。
【００６７】
実施態様６：前記プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一が、成長ホルモン又は成長ホルモンアナログである、実施態様１又は実施態様２の二量体。
実施態様７：前記プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一が、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する成長ホルモンアナログである、実施態様６の二量体。
実施態様８：前記プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一が、アミノ酸配列を有する成長ホルモンアナログであり、該配列が配列番号２と少なくとも８０％類似している、実施態様６の二量体。
【００６８】
実施態様９：前記プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一が、胎盤性ラクトゲン又は胎盤性ラクトゲンアナログである、実施態様１又は実施態様２の二量体。
実施態様１０：前記プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一が、配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有する胎盤性ラクトゲンアナログである、実施態様９の二量体。
実施態様１１：前記プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一が、アミノ酸配列を有する胎盤性ラクトゲンアナログであり、該配列が配列番号３と少なくとも８０％類似している、実施態様９の二量体。
【００６９】
実施態様１２：前記プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一が、親ポリペプチドと比較して切断されている、実施態様３から１１のいずれかの二量体。
実施態様１３：前記プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一が、プロラクチンレセプターアンタゴニスト単量体である、実施態様１から１２のいずれかの二量体。
実施態様１４：双方のプロラクチンレセプター結合単量体が、プロラクチンレセプターアンタゴニスト単量体である、実施態様１３の二量体。
【００７０】
実施態様１５：リンカーが、プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一において、配列番号１との配列アラインメントにより定めて、アミノ酸残基１４から４０又はアミノ酸残基１１０から１３６の間に位置している、実施態様１から１４のいずれか一つの二量体。
実施態様１６：リンカーが、双方のプロラクチンレセプター結合単量体において、配列番号１との配列アラインメントにより定めて、アミノ酸残基１４から４０又は１１０から１３６の間に位置している、実施態様１５の二量体。
実施態様１７：リンカーが、プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一において、配列番号１との配列アラインメントにより定めて、アミノ酸残基１７、２０、２１、２４、２５、１２１、１２５、１２８、１２９及び１３２の何れかに位置している、実施態様１から１６のいずれかの二量体。
実施態様１８：リンカーが、双方のプロラクチンレセプター結合単量体において、配列番号１との配列アラインメントにより定めて、残基１７、２０、２１、２４、２５、１２１、１２５、１２８、１２９及び１３２の何れかに位置している、実施態様１７の二量体。
実施態様１９：リンカーが、プロラクチンレセプター結合単量体の少なくとも一において、配列番号１との配列アラインメントにより定めて、残基１２５又は１２８の何れかに位置している、実施態様１から１８のいずれかの二量体。
実施態様２０：リンカーが、双方のプロラクチンレセプター結合単量体において、配列番号１との配列アラインメントにより定めて、残基１２５又は１２８の何れかに位置している、実施態様１９の二量体。
【００７１】
実施態様２１：二量体がホモ二量体である、実施態様１から２０のいずれかの二量体。
実施態様２２：リンカーが、各単量体において同じ残基位置に位置している、実施態様２１の二量体。
実施態様２３：リンカーが、２４結合と同じか、それより短い、実施態様１から２２のいずれかの二量体。
実施態様２４：リンカーが、２つのシステイン残基間に、酸化的スルフィド架橋形成を含む、実施態様１から２３のいずれかの二量体。
【００７２】
実施態様２５：リンカーが、次の式(Ｉ)：
2010513405.tif 000007
[上式中：
Ｙ及びＺは独立して、-Ｓ-、-ＮＨ-、-ＣＲ=、-ＣＨ２-又は-ＣＯ-を表し、
ここで、Ｒは、水素、又はアリール、又は直鎖状、分枝状又は環状のＣ１−１０-アルキルを表し；
Ｘは：
2010513405.tif 000008
から選択され、
ここで、Ｗは、-[ＣＨ２]ｍ-、-ＣＨ２-[ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２]ｍ-ＣＨ２-、-ＣＨ=ＣＨ-、-ＣＨ２-[ＣＨ=ＣＨ]ｍ-ＣＨ２-、-ＮＨ-ＣＨ２-[ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２]ｍ-ＣＨ２-ＮＨ-、-ＮＨ-ＣＨ２-[ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２]ｍ-ＣＨ２-、
2010513405.tif 000009
を表し、
ｍは１〜２２の整数である]
により表されるリンカーである、実施態様１から２３のいずれかの二量体。
【００７３】
実施態様２６：前記リンカーが二官能性リンカーである、実施態様１から２５のいずれかの二量体。
実施態様２７：前記リンカーが、次の式(ＩＡ)：
2010513405.tif 000010
[上式中、ｎは０〜３の整数を表す]
を有する、実施態様２６の二量体。
【００７４】
実施態様２８：治療に使用される、実施態様１から２７のいずれかの二量体。
実施態様２９：増殖性疾患の処置に使用される、実施態様２８の二量体。
実施態様３０：前記増殖性疾患が癌である、実施態様２９の二量体。
実施態様３１：前記癌が、エストロゲン依存性癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、膵臓癌、胃腸癌、白血病、皮膚癌、及びリンパ腫から選択される、実施態様３０の二量体。
実施態様３２：前記癌が乳癌である、実施態様３１の二量体。
【００７５】
実施態様３３：実施態様１から３２のいずれかの二量体を含有する医薬組成物。
実施態様３４：増殖性疾患の治療又は予防に使用される、実施態様３３の医薬組成物。
実施態様３５：前記増殖性疾患が癌である、実施態様３４の医薬組成物。
実施態様３６：前記癌が、エストロゲン依存性癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、膵臓癌、胃腸癌、白血病、皮膚癌、及びリンパ腫から選択される、実施態様３５の医薬組成物。
【００７６】
実施態様３７：治療のための、実施態様１から２７のいずれかの二量体の使用。
実施態様３８：増殖性疾患の治療又は予防における、実施態様１から２７のいずれかの二量体の使用。
実施態様３９：増殖性疾患を治療又は予防する医薬組成物の調製のための、実施態様１から２７のいずれかの二量体の使用。
実施態様４０：前記増殖性疾患が癌である、実施態様４７又は実施態様３９の使用。
実施態様４１：前記癌が、エストロゲン依存性癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、膵臓癌、胃腸癌、白血病、皮膚癌、及びリンパ腫から選択される、実施態様４０の使用。
【００７７】
実施態様４２：実施態様１から２７のいずれかの二量体を投与することを含む、増殖性疾患の治療又は予防方法。
実施態様４３：前記増殖性疾患が癌である、実施態様４２の方法。
実施態様４４：前記癌が、エストロゲン依存性癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、膵臓癌、胃腸癌、白血病、皮膚癌、及びリンパ腫から選択される、実施態様４３の方法。
【００７８】
実施態様４５：単独で、又は抗エストロゲン治療と併用して使用される、実施態様１から２７のいずれかの二量体。
実施態様４６：単独で、又は成長因子レセプターのシグナル伝達のインヒビターと併用して使用される、実施態様１から２７のいずれかの二量体。
実施態様４７：単独で、又は抗血管新生治療と併用して使用される、実施態様１から２７のいずれかの二量体。
実施態様４８：単独で、又は抗リンパ向性治療と併用して使用される、実施態様１から２７のいずれかの二量体。
実施態様４９：単独で、又は免疫調節治療と併用して使用される、実施態様１から２７のいずれかの二量体。
実施態様５０：単独で、又は化学療法剤と併用して使用される、実施態様１から２７のいずれかの二量体。
【００７９】
実施態様５１：エストロゲン依存性癌の処置のための、実施態様４５から５０のいずれかのまた使用される二量体。
実施態様５２：乳癌の処置のための、実施態様４５から５０の何れかに記載され使用される二量体。
実施態様５３：前立腺癌の処置のための、実施態様４６から５０の何れかに記載され使用される二量体。
実施態様５４：胚癌の処置のための、実施態様４６から５０の何れかに記載され使用される二量体。
実施態様５５：結腸直腸癌の処置のための、実施態様４６から５０の何れかに記載され使用される二量体。
実施態様５６：頭頸部癌の処置のための、実施態様４６から５０の何れかに記載され使用される二量体。
実施態様５７：卵巣癌の処置のための、実施態様４５から５０の何れかに記載され使用される二量体。
実施態様５８：子宮頸癌の処置のための、実施態様４５から５０の何れかに記載され使用される二量体。
実施態様５９：膀胱癌の処置のための、実施態様４６から５０の何れかに記載され使用される二量体。
実施態様６０：膵臓癌の処置のための、実施態様４６から５０の何れかに記載され使用される二量体。
実施態様６１：胃腸癌の処置のための、実施態様４６から５０の何れかに記載され使用される二量体。
実施態様６２：白血病の処置のための、実施態様４６から５０の何れかに記載され使用される二量体。
実施態様６３：皮膚癌の処置のための、実施態様４６から５０の何れかに記載され使用される二量体。
実施態様６４：リンパ腫の処置のための、実施態様４６から５０の何れかに記載され使用される二量体。
【００８０】
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、その全体が出典明示によりここに援用される(法律により許容される最大範囲)。全ての表題及び副題は、ここでは便宜的に使用され、何らの方法においても本発明を限定するものと解すべきではない。ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語（例えば「等」）の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に請求項に記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も請求項に記載していない要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解すべきではない。ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。この発明は、適用可能な法律により容認される、ここに添付の特許請求の範囲に記載の主題事項の全ての修正物及び均等物を含む。
【実施例】
【００８１】
本発明は、ここに記載の様々な化合物の調製、及びそれらの生物活性をアッセイするための方法を記載した次の実施例を参照することにより、更に明確になるであろう。当業者であれば、材料及び方法の双方における多くの修正が、本発明の範囲から逸脱することなく実施されうることが分かるであろう。
【００８２】
実施例１
タンパク質の発現及び精製
ｐＥＴ３２-ａ(＋)発現ベクター(Novagen, Madison WI)を、タンパク質の発現に使用した。組換えＳｅｒ-ｈＰＲＬＲ(１-２１０)、ＰＲＬ、及び変異ＰＲＬの単量体を、大腸菌ＭｅｔＡＰタンパク質を発現するｐＡＣＹＣＤｕｅｔ-ＭｅｔＡＰプラスミドを同時形質移入した大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞中に封入体として産生させた。８Ｍの尿素、０．１Ｍのトリス、２−２０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．５のバッファーに溶解させ、ついで、２０ｍＭのトリス、０．０５％のトゥイーン２０、ｐＨ８．０に希釈することにより再折り畳みさせた。Ｓｏｕｒｃｅ３０Ｑイオン交換カラム(Amersham Biosciences)、続いてｍａｃｒｏ-ｐｒｅｐ Ｃａｒａｍｉｃヒドロキシアパタイトカラム(BioRad)、最後に、セファデックスＧ２５カラムでの分子ふるいクロマトグラフィーを使用し、タンパク質精製を実施した。最初に０．４Ｍのアルギニン、ｐＨ８．５、ついでさらなる２０ｍＭのトリス、０．０５％のトゥイーン２０、ｐＨ８．０に希釈させる２回の希釈工程で、ＰＲＬレセプターを再折り畳みさせた。
【００８３】
実施例２
ジスルフィド架橋ＰＲＬ １２-１９９ Ｑ１２Ｓ Ｅ１２８Ｃ二量体
実施例１に記載したようにして調製した４ｍｇの精製され凍結乾燥されたＰＲＬ１２-１９９ Ｑ１２Ｓ Ｅ１２８Ｃ単量体を、３ｍｌの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファー、ｐＨ７．８に溶解させた。Ｏ２の存在下、２５℃で１８時間、ゆっくりと攪拌しつつ、緩衝溶液を放置し、所望の二量体化生成物を得た。タンパク質溶液を、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムバッファーを使用するＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ Ｇｒａｄｅカラム(GE Healthcare)に充填し、１．０８ｍｇの所望の化合物を得た。ＮａｎｎｏＤｒｏｐ ＮＤ-１０００分光光度計、吸光係数(２８０ｎｍ)Ｅ１％ ９．０４Ｌ／ｇｍ-ｃｍで、定量を実施した。得られた生成物をＳＤＳ-電気泳動、アジレント２１００バイオアナライザー(図２)、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ；ＭＷ(ｍ／ｚ、Ｚ＝１)４３５７３．８(図３)、トリプシン消化(図４)、及び円二色性(図５)により特徴付けた。
【００８４】
実施例３
ジスルフィド架橋ＰＲＬ １２-１９９ Ｑ１２Ｓ Ｒ１２５Ｃ二量体
実施例１に記載したようにして調製した５ｍｇの精製され凍結乾燥されたＰＲＬ１２-１９９ Ｑ１２Ｓ Ｅ１２５Ｃ単量体を、４ｍｌの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファー、ｐＨ７．８に溶解させた。Ｏ２の存在下、２５℃で１８時間、ゆっくりと攪拌しつつ、緩衝溶液を放置し、所望の二量体化生成物を得た。タンパク質溶液を、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムバッファーを使用するＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ Ｇｒａｄｅカラム(GE Healthcare)に充填し、０．４ｍｇの所望の化合物を得た。ＮａｎｎｏＤｒｏｐ ＮＤ-１０００分光光度計、吸光係数(２８０ｎｍ)Ｅ１％ ９．０４Ｌ／ｇｍ-ｃｍで、定量を実施した。得られた生成物をＳＤＳ-電気泳動及びＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ；ＭＷ(ｍ／ｚ、Ｚ＝１)４３５０７．４により特徴付けた。
【００８５】
実施例４
ジスルフィド架橋ＰＲＬ １２-１９９ Ｑ１２Ｓ Ｓ６１Ａ Ｅ１２８Ｃ二量体
実施例１に記載したようにして調製した５ｍｇの精製され凍結乾燥されたＰＲＬ１２-１９９ Ｑ１２Ｓ Ｅ１２５Ｃ単量体を、２０ｍｌの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファー、ｐＨ７．８に溶解させた。Ｏ２の存在下、２５℃で７２時間、ゆっくりと攪拌しつつ、緩衝溶液を放置し、所望の二量体化生成物を得た。タンパク質溶液を、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムバッファーを使用する、ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ Ｇｒａｄｅカラム(GE Healthcare)に充填し、１．８８ｍｇの所望の化合物を得た。ＮａｎｎｏＤｒｏｐ ＮＤ-１０００分光光度計、吸光係数(２８０ｎｍ)Ｅ１％ ９．０４Ｌ／ｇｍ-ｃｍで、定量を実施した。得られた生成物をＳＤＳ-電気泳動及びＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ；ＭＷ(ｍ／ｚ、Ｚ＝１)４３５４４．１により特徴付けた。
【００８６】
実施例５
ビス-マレイミドｄＰＥＧ３結合ＰＲＬ １２-１９９ Ｑ１２Ｓ Ｅ１２５Ｃ二量体
実施例１に記載したようにして調製した２．２ｍｇの精製され凍結乾燥ＰＲＬ１２-１９９ Ｑ１２Ｓ Ｅ１２５Ｃ単量体を、１．２ｍｌの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムッファー、ｐＨ７．８に溶解させた。ＤＭＳＯ／１００ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ：６．９中のＢｉＳ-ＭＡＬ-ｄＰＥＧ４(Quanta Biodesign, ＱＢＤ製品番号１０２１５)の６．３７ｍｇ／ｍｌ溶液を１３２μｌ、最終濃度が０．１ｍｇ／ｍｌのリンカーに添加した。１時間；１．５時間；２．５時間；５時間に、更に１３２μｌのリンカー保存溶液を添加した。Ｏ２の存在下、１０℃で１８時間、ゆっくりと攪拌しつつ、緩衝溶液を放置し、所望の二量体化生成物を得た。タンパク質溶液を、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムバッファーを使用する、ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ Ｇｒａｄｅカラム(GE Healthcare)を使用し、２回精製した。最終的に６０μｇの所望の化合物を得た。ＮａｎｎｏＤｒｏｐ ＮＤ-１０００分光光度計、吸光係数(２８０ｎｍ)Ｅ１％ ９．０４Ｌ／ｇｍ-ｃｍで、定量を実施した。得られた二量体化生成物をＳＤＳ-電気泳動及びＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳにより特徴付けし、確認した。
【００８７】
実施例６
ホスホ-ＳＴＡＴ３ ＥＬＩＳＡアッセイ
約８０％の培養密度になるまで増殖させたＴ４７Ｄ細胞を、トリプシンで剥離させ；完全成長培地(ＲＰＭＩ、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ-グルタミン、０．２Ｕ／ｍｌのウシインスリン)に５ｘ１０５／ｍｌになるまで、細胞密度を調節した。２００μｌのこの懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに配した。次の日、増殖培地を１５０μｌの飢餓培地(１０％のＦＣＳを除いた増殖培地)に置き換えた。ＰＲＬＲ結合化合物で処理する前に、２４時間、細胞を飢えさせた。飢餓培地において、ＰＲＬとインヒビターとを事前混合し、５０μｌを各ウェルに添加し、１０ｎＭのＰＲＬ、及び図６に示すような種々の濃度のＰＲＬ １２-１９９ Ｑ１２Ｓ Ｓ６１Ａ Ｅ１２８Ｃ二量体にした。加湿されたＣＯ２インキュベータにおいて、３７℃で１５分、細胞をインキュベートした。培地を取り除き、氷冷されたＰＢＳで細胞を洗浄した。細胞の溶解とＥＬＩＳＡを、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ ＳＴＡＴ-３[ｐＹ７０５]ホスホＥＬＩＳＡマニュアルに従い実施した。
【００８８】
実施例７
ＳＴＡＴ５活性化アッセイ
ＡＵ５６５細胞を、６ウェル皿で２日間培養した。ＰＲＬＲ結合化合物で処理する前に、＜１％のＦＣＳを含有する増殖培地で、細胞を１８時間飢えさせた。図７に示すような、様々な濃度のＰＲＬ １２-１９９ Ｑ１２Ｓ Ｅ１２８Ｃ二量体を添加した後、加湿されたＣＯ２インキュベータにおいて、３７℃で１５分、細胞をインキュベートした。細胞溶菌液を調製し、ウエスタンブロットにより、抗ＳＴＡＴ５[ｐＹ６９４]特異性抗体(CellSignalling Technologies)を使用し、ＳＴＡＴ５チロシンホスホリル化について分析した。
【００８９】
実施例８
表面プラズモン共鳴測定により評価したプロラクチンレセプター結合性
可溶化形態のレセプター(１０ｍＭの酢酸ナトリウムに１０μｇ／ｍｌ、ｐＨ４．０)を、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００機器に注入し、アミンカップリング化学により、ＣＭ５センサーチップにカップリングさせた。固定化レベルは、カップリングしたレセプターの約５００ＲＵであった。実施例２から５に記載のプロラクチン二量体及び野生型プロラクチン(バッファー中に１０、５、２．５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１μｇ；２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、０．１ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２及び０．００５％のＰ２０を含有)を、３０μｌ／分の流量で５分、固定化レセプター上に注入し、バッファーが注入されている間の１０分の解離期間が続き、レセプター結合親和性を評価した。実行の間に、３０μｌ／分の流量で９０秒、４．５ＭのＭｇＣｌ２を用いて、再生を達成させた。データ評価をＢｉａｃｏｒｅＴ１００評価ソフトウェアにおいて実施し、表１に記載した。
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【００９０】
実施例９
細胞遊走アッセイ
約８０％の培養密度になるまで増殖させたＴ４７Ｄ細胞を、ヴェルセン溶液で剥離させた。細胞を、０．１％のＢＳＡを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁させた。１２μｍの孔サイズを有する膜(BD Biosciences)を通して、トランスウェル(transwell)アッセイ(改変ボイデン(Boyden)チャンバーアッセイ)において、細胞遊走を研究した。刺激遊走については、５ｎＭのＰＲＬを下部チャンバー内の化学誘因物質として使用し、基本(自発性)遊走については、０．１％のＢＳＡを含有するＲＰＭＩ１６４０培地を下部チャンバーに配した。ＰＲＬ１２-１９９ Ｑ１２Ｓ Ｓ６１Ａ Ｅ１２８Ｃ二量体を、１０ｎＭ又は１００ｎＭの濃度で上部チャンバーに添加した。細胞遊走を１８時間分析した。下部チャンバーに到達した(膜に結合した)細胞を、ヘマトキシリン-エオジン(hematoxilin-eozin)で染色し、計測した。データは２０×顕微鏡視野の１／６の細胞数±ＳＤ(ｎ＝１０)を示す。データを図８に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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