(57)【要約】  本発明は、対象物に対して１μｍ未満の分解能での温度及び／又は温度分布の測定方法、及び当該方法を実行するためのデバイス、より具体的には上記方法を実行するための顕微鏡に関する。  上記方法は、対象物上の基質層に取り込まれた分子温度計を塗布するステップと、上記分子温度計を上記顕微鏡の光源で光励起するステップと、及び上記顕微鏡の２つの光検出器で上記分子温度計からの発光を測定するステップと、を含む。第１の波長での第１の強度は、上記第１の検出器によって測定され、第２の波長での第２の強度は、上記第２の検出器によって測定され、上記強度比率が計算され、調整された曲線で温度を決定するために利用される。上記顕微鏡は、共焦点顕微鏡又は誘導放出制御顕微鏡（ＳＴＥＤ）である【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１μｍ未満の分解能で、電子デバイス又は生体のような対象物の温度及び／又は温度分布の測定方法であって、
（ａ）対象物を準備するステップと、
（ｂ）温度に依存する放出特性を有する基質（ｍａｔｒｉｘ）及び分子温度計（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｅｒ）を含む温度計層について、
前記分子温度計は、前記基質に取り込まれており、
前記温度計層は、４０ｎｍ以下の、好ましくは１０ｎｍ〜４０ｎｍの範囲の厚みを有し、
前記対象物に又は前記対象物の表面の一部に、前記温度計層（ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｅｒ  ｌａｙｅｒ）を塗布して、温度及び／又は温度分布が測定されるステップであって、
ステップと、
（ｃ）光源、第１の検出器、第２の検出器、及び試験するサンプルを収容及び走査するための顕微鏡台を有する顕微鏡を準備するステップと、
（ｄ）前記対象物を前記顕微鏡台に設置して、前記光源を利用して前記分子温度計を光励起するステップと、
（ｅ）第１の波長及び第２の波長での発光強度比率について、
前記第１の検出器及び前記第２の検出器が、夫々、前記第１の波長及び前記第２の波長の発光強度を測定するために使われて、
前記第１の検出器及び前記第２の検出器を利用して前記発光強度比率を測定することによって、前記光励起された分子温度計からの輻射放出を測定するステップと、
（ｆ）前記測定された発光強度比率に基づいた温度及び／又は温度分布を決定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記顕微鏡が、共焦点顕微鏡又は誘導放出制御顕微鏡（ＳＴＥＤ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分子温度計が、
金属ポルフィリンと、
励起一重項の１％超過、好ましくは励起一重項の５０％超過、より好ましくは励起一重項の９０％超過で光励起により項間交差が起こる他の分子（例えば、Ｂｒを含有する分子）と、
例えば、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｒｕ、Ｐｄ、又はＺｎ、Ｆｅ、Ａｕ、Ａｇ等のような他の元素を有していて、励起一重項の１％超過、好ましくは５０％超過、更に好ましくは９０％超過に対して光励起で項間交差が起こる金属−有機分子と、
からなるグループから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記分子温度計は、金属ポルフィリンであり、好ましくは亜鉛オクタエチルポルフィリン（ＺｎＯＥＰ）、パラジウムオクタエチルポルフィリン（ＰｄＯＥＰ）、及び白金オクタエチルポルフィリン（ＰｔＯＥＰ）から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記分子温度計が、前記基質の全質量に対して、０．００１〜５質量％、好ましくは０．０１〜３質量％の範囲の濃度で前記温度計層に存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記基質が、光学的に透明である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記基質が、不活性である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記基質が、光学的に透明且つ不活性である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記光学的に透明且つ不活性である基質は、ポリマー基質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマー基質が、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）のようなポリシリコン、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンであるポリオレフィンから選択される物質で形成される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質が、無機酸化物又は無機窒化物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記基質が、無機酸化物又は無機窒化物である、請求項９〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）が、スピン−コーティング、ディップ−コーティング、ドロップキャスティング、ドクターブレーディング、ＬＢ膜技術（Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、スプレー法、熱蒸着、分子ビーム沈殿法（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｍ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、ラミネーション、及び、例えば接着法のような付着法から選択される方法によって実行される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１４】
前記温度計層が、複層構造であって、少なくとも２つの副層を含み、
夫々の副層は、好ましくは異なる前記分子温度計の濃度を有する、請求項１〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象物に分子ヒーター層が塗布されずに、前記対象物の温度及び／又は温度分布を決定する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｄ）において、
前記光励起が、連続励起又はパルス励起によって実行される、請求項１〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記光励起が、４００ｎｍ〜６００ｎｍの範囲の波長で起こる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
−前記温度計層を光励起すること、
−少なくとも２つの異なる温度で前記温度計層からの発光強度比率を測定すること、
−前記温度を測定するための外部手段を利用して前記少なくとも２つの異なる温度を測定すること、及び
−測定された夫々の発光比率を、対応する温度と相関付けること
によって、
基板に塗布された際に前記温度計層のキャリブレーションを実行するキャリブレーションステップを更に備え、
前記キャリブレーションステップは、請求項１で説明した前記分子温度計を光励起するステップ（ステップｄ）より前に実行される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記キャリブレーションステップは、請求項１で説明したステップの何れからも独立して実行される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記発光強度比率は、前記第２の波長での燐光強度に対する、前記第１の波長での蛍光強度であって、好ましくは、例えば、三重項−三重項消滅過程に続いて起こる遅延した蛍光のような遅延蛍光強度を含む蛍光強度の比率である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記発光強度比率は、前記第２の波長での前記分子温度計の励起三重項状態からの燐光強度に対する、前記第１の波長での前記分子温度計の一重項の蛍光強度であって、選択的に三重項−三重項消滅過程に続いて起こる遅延蛍光強度を含む蛍光強度の比率（Ｉ一重項／Ｉ三重項）である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記分子温度計は、ＰｄＯＥＰであって、
前記発光強度比率は、Ｉ５４９ｎｍ／Ｉ６６２ｎｍである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
達成した分解能は、
前記顕微鏡の光線に垂直な平面で、５００ｎｍ未満であり、好ましくは３００ｎｍ未満であり、より好ましくは２００ｎｍ未満であり、より一層好ましくは１００ｎｍ未満であり、
前記顕微鏡の光線に沿った方向では、５００ｎｍ未満であり、好ましくは５０ｎｍ未満であり、より好ましくは２０ｎｍ未満であり、最も好ましくは約１０ｎｍ未満である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
−レーザのような光源、レーザダイオード、発光ダイオード（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）と、
−分子温度計層由来の発光の発光強度比率を測定するための第１の検出器及び第２の検出器と、
−試験するサンプルを収容及び走査するための顕微鏡台を有する顕微鏡と、
−前記顕微鏡台に設置されて、その後温度計層が塗布される対象物と、
を備え、
前記温度計層は、このように前記光源からの光線によって光励起された際に発光する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法を実行するための顕微鏡。
【請求項２５】
共焦点顕微鏡又は誘導放出制御顕微鏡（ＳＴＥＤ）である、請求項２４に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象物に対して１μｍ未満の分解能での温度及び／又は温度分布の測定方法、及び当該方法を実行するためのデバイス、より具体的には上記方法を実行するための顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
微視的な対象物の高速な熱過渡の精密な測定及び記録は、例えば、生体の試験又は半導体や他の電子デバイスの製造において重要である。電子デバイスの操作において、温度及び／又は温度分布の測定は、集積回路（ＩＣ）の温度管理において重要である。更に重要なこととして、上記測定は、デバイス物理学の理解に関する情報を与える。過去に、操作している装置の時空間温度分布のモデル化及び実験的な記録に関する研究がなされてきており、ラマン顕微鏡と組み合わせた赤外熱顕微鏡及び光放出顕微鏡の２つの光学的な記録のアプローチが報告されている。（Ｇ．Ａｌｂｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｓｔｕｍｐ，  Ｃ．  Ｌｉ，  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｆｏｃｕｓ  Ｉｎｓ．  Ｃｏｒｐ．  ａｎｄ  Ｈ．  Ｋａｐｌａｎ，  Ｈｏｎｅｙｈｉｌｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ，  ２００６；  Ｔ．  Ｆｕｙｕｋｉ，  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ４４，  ２８９５−２９０１，  ２００５；  Ｓ．Ｉｎｏｕｅ，  Ｍ．Ｋｉｍｕｒａ，  Ｔ．  Ｓｈｉｍｏｄａ，  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ４２  １１６８−１１７２，  ２００３；  Ａ．  Ｓａｒｕａ，  Ｈ．Ｌｉ，  Ｍ．  Ｋｕｂａｌ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｕｒｅｎ，  Ｔ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｋ．  Ｐ．  Ｈｉｌｔｏｎ，  Ｒ．  Ｓ．  Ｂａｌｍｅｒ，  ＣＳ  Ｍａｎｔｅｃｈ，  Ａｐｒ．  ２４−２７，  ２００６，  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，  Ｃａｎａｄａ；  Ｊ．  Ｗ．  Ｐｏｍｅｒｏｙ，  Ｍ．  Ｋｕｂａｌ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｕｒｅｎ，  Ｋ．  Ｐ．  Ｈｉｌｔｏｎ，  Ｒ．  Ｓ．  Ｂａｌｍｅｒ，  Ｔ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８８，  ０２３５０７，２００６）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これらの報告された方法において、高速検出及び高温分解能と組み合わせて、３次元全て、すなわちｘ、ｙ、ｚ方向で高物理空間分解能（ｈｉｇｈ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｐａｔｉａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を実現できる方法はなかった。一般的に、従来技術で実現した、焦点が合った状態でのＸＹ平面での分解能は、１〜１０μｍの範囲であり、Ｚ方向、すなわち光軸に沿った方向での対象物に対する分解能は、ＸＹ方向の分解能の２倍であった。
【０００４】
そこで、本発明の目的とするところは、高時空間分解能で温度及び／又は温度分布を測定するための方法及びデバイスを提供することにある。更に、本発明の目的とするところは、ＸＹ方向で３００ｎｍ以下の分解能を有し、Ｚ方向で１０〜４０ｎｍの範囲の分解能を有する、温度及び／又は温度分布を測定するための方法及び装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
これら全ての目的は、１μｍ未満の分解能で、電子デバイス又は生体のような対象物の温度及び／又は温度分布の測定方法であって、
（ａ）対象物を準備するステップと、
（ｂ）温度に依存する放出特性を有する基質（ｍａｔｒｉｘ）及び分子温度計（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｅｒ）を含む温度計層について、
前記分子温度計は、前記基質に取り込まれており、
前記温度計層は、４０ｎｍ以下の、好ましくは１０ｎｍ〜４０ｎｍの範囲の厚みを有し、
前記対象物に又は前記対象物の表面の一部に、前記温度計層（ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｅｒ  ｌａｙｅｒ）を塗布して、温度及び／又は温度分布が測定されるステップであって、
ステップと
（ｃ）光源、第１の検出器、第２の検出器、及び試験するサンプルを収容及び走査するための顕微鏡台を有する顕微鏡を準備するステップと、
（ｄ）前記対象物を前記顕微鏡台に設置して、前記光源を利用して前記分子温度計を光励起するステップと、
（ｅ）第１の波長及び第２の波長での発光強度比率について、
前記第１の検出器及び前記第２の検出器が、夫々、前記第１の波長及び前記第２の波長の発光強度を測定するために使われて、
前記第１の検出器及び前記第２の検出器を利用して前記発光強度比率を測定することによって、前記光励起された分子温度計からの輻射放出を測定するステップと、
（ｆ）前記測定された発光強度比率に基づいた温度及び／又は温度分布を決定するステップと、を含む、方法によって解決される。
【０００６】
一実施形態によれば、前記顕微鏡は、共焦点顕微鏡又は誘導放出制御顕微鏡（ＳＴＥＤ）である。
【０００７】
一実施形態によれば、前記分子温度計が、金属ポルフィリンと、励起一重項の１％超過、好ましくは励起一重項の５０％超過、より好ましくは励起一重項の９０％超過で光励起により項間交差が起こる他の分子（例えば、Ｂｒを含有する分子）と、例えば、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｒｕ、Ｐｄ、又はＺｎ、Ｆｅ、Ａｕ、Ａｇ等のような他の元素を有していて、励起一重項の１％超過、好ましくは５０％超過、更に好ましくは９０％超過に対して光励起で項間交差が起こる金属−有機分子と、から成るグループから選択される。
【０００８】
好ましくは、前記分子温度計は、金属ポルフィリンであり、好ましくは亜鉛オクタエチルポルフィリン（ＺｎＯＥＰ）、パラジウムオクタエチルポルフィリン（ＰｄＯＥＰ）、及び白金オクタエチルポルフィリン（ＰｔＯＥＰ）から選択される。
【０００９】
一実施形態によれば、前記分子温度計が、前記基質の全質量を参照して、０．００１〜５質量％、好ましくは０．０１〜３質量％の範囲の濃度で前記温度計層に存在する。
【００１０】
一実施形態によれば、前記基質は、光学的に透明である。
【００１１】
一実施形態によれば、前記基質は、不活性である。
【００１２】
好ましい実施形態によれば、前記基質は、選択的に透明且つ不活性であり、前記選択的に透明且つ不活性である基質は、ポリマー基質であり、好ましくは、前記ポリマー基質は、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）のようなポリシリコン、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンであるポリオレフィンから選択される物質で形成される。
【００１３】
一実施形態によれば、重合性基質又は非重合性基質であってもよい前記気質が、無機酸化物又は無機窒化物であってもよい。
【００１４】
好ましい実施形態によれば、前記重合性気質は、無機酸化物又は無機窒化物を含む。
【００１５】
好ましい実施形態によれば、ステップ（ｂ）が、スピン−コーティング、ディップ−コーティング、ドロップキャスティング、ドクターブレーディング、ＬＢ膜技術（Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、スプレー法、熱蒸着、分子ビーム沈殿法（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｍ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、ラミネーション、及び例えば、接着法である付着法から選択される方法によって実行される。
【００１６】
好ましい実施形態によれば、前記温度計層は、複層構造であって、少なくとも２つの副層を含み、夫々の副層は、好ましくは異なる前記分子温度計の濃度を有する。
【００１７】
好ましくは、前記対象物に分子ヒーター層が塗布されずに、前記対象物の温度及び／又は温度分布を決定する。
【００１８】
本明細書において、“分子ヒーター”は、単体物質、化合物、もしくは化合物及び／又は電磁放射の放出又は吸収で過度のエネルギーを生成する単体物質の混合物を包含しているものと意図される。
【００１９】
好ましい実施形態によれば、ステップ（ｄ）において、前記光励起が、連続励起又はパルス励起によって実行され、前記光励起が、４００ｎｍ〜６００ｎｍの範囲の波長で起こる。
【００２０】
好ましい実施形態によれば、本発明に係る方法は、更に、
−前記温度計層を光励起すること、
−少なくとも２つの異なる温度で前記温度計層からの発光強度比率を測定すること、
−前記温度を測定するための外部手段を利用して前記少なくとも２つの異なる温度を測定すること、及び
−測定された夫々の発光比率を、対応する温度と相関付けることによって、基板に塗布された際に前記温度計層のキャリブレーションを実行するキャリブレーションステップを更に備え、前記キャリブレーションステップは、請求項１で説明した前記分子温度計を光励起するステップ（ステップｄ）より前に実行される。
【００２１】
好ましくは、前記キャリブレーションステップは、上述したステップの何れからも独立して実行される。
【００２２】
好ましい実施形態によれば、前記発光強度比率は、前記第２の波長での燐光強度に対する、前記第１の波長での蛍光強度であって、好ましくは例えば、三重項−三重項消滅過程に続いて起こる遅延した蛍光のような遅延蛍光強度を含んでいるものの比率である。
【００２３】
好ましい実施形態によれば、前記発光強度比率は、前記第２の波長での前記分子温度計の励起三重項状態からの燐光強度に対する、前記第１の波長での前記分子温度計の一重項の蛍光強度であって、選択的に三重項−三重項消滅過程に続いて起こる遅延蛍光強度を含んでいるものの比率（Ｉ一重項／Ｉ三重項）である。
【００２４】
好ましい実施形態によれば、前記分子温度計は、ＰｄＯＥＰであって、前記発光強度比率は、Ｉ５４９ｎｍ／Ｉ６６２ｎｍである。
【００２５】
好ましい実施形態によれば、達成した分解能は、前記顕微鏡の光線に垂直な平面で、５００ｎｍ未満であり、好ましくは３００ｎｍ未満であり、より好ましくは２００ｎｍ未満であり、更により好ましくは１００ｎｍ未満であり、前記顕微鏡の光線に沿った方向では、５００ｎｍ未満であり、好ましくは５０ｎｍ未満であり、より好ましくは２０ｎｍ未満であり、最も好ましくは約１０ｎｍ未満である。
【００２６】
本発明の目的は、
−レーザのような光源、レーザダイオード、発光ダイオード（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）、
−分子温度計層由来の発光の発光強度比率を測定するための第１の検出器及び第２の検出器、
−試験するサンプルを収容及び走査するための顕微鏡台を有する顕微鏡、及び
−前記顕微鏡台に設置されて、その後温度計層が塗布される対象物、
を備え、前記温度計層は、このように前記光源からの光線によって光励起された際に発光する、本発明に係る方法を実行するための顕微鏡によっても解決される。
【００２７】
好ましくは、本発明に係る顕微鏡は、共焦点顕微鏡又は誘導放出制御顕微鏡（ＳＴＥＤ）である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
以下では、次の図面が参照される。
【図１】図１は、エネルギー計画及び活性な温度計分子の一例としてのパラジウムオクタエチルポルフィリン（ＰｄＯＥＰ）の分子構造を示す。
【図２】図２は、膜の厚みを４０ｎｍとして、励起光パワーを０．８〜１０ｍＷとした場合のポリスチレン基質での１ｗｔ．％のＰｄＯＥＰを含む温度計層のキャリブレーション曲線を示す。挿入図は、異なる温度での発光スペクトルを示す。
【図３】図３は、本発明に係る発光強度比率を測定するための２つの検出器を有する共焦点顕微鏡デバイスの概略的な構成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書において、“温度計層”とは、重合性基質を含む層及び重合性基質を取り込まれた層を指していると意図される。本明細書において、“分子温度計”とは、共に温度依存する放出特性を有する分子種又はいくつかの分子種の組み合わせを指していると意図される。“分子温度計”という用語は、単体物質、化合物、もしくは化合物及び／又は蛍光及び／又は燐光の放出強度特性が温度に依存する単体物質の混合物を包含しているものと意図される。好ましくは、“分子温度計”は、ピコ秒（ｐｓ）からマイクロ秒（μｓ）までの範囲にわたる励起状態の寿命を有する。分子温度計の好ましい実施形態は、色素又は本明細書においてメタレーティッドポルフィリン（ｍｅｔａｌｌａｔｅｄ  ｐｏｕｐｈｙｒｉｎｓ）とも時々呼ばれる金属ポルフィリン、励起一重項の１％超過、好ましくは５０％超過、より好ましくは９０％超過で光励起により一重項から三重項への項間交差が起こる分子、及び構造にＩｒ、Ｐｔ、Ｒｕ、Ｐｄ、又は他のＺｎ、Ｆｅ、Ａｕ、Ａｇ等を有していて、励起一重項の１％超過、好ましくは５０％超過、より好ましくは９０％超過で光励起により一重項から三重項への項間交差が起こる金属−有機分子を含むグループから選択される色素の組み合わせである。一般に、分子温度計として、熱的に活性化されたバンドを有する放射性色素又は少なくとも２つの放射性色素の組み合わせを使うことができ、それらの発光強度は、温度で変わる。
【００３０】
特に好ましくは、分子温度計は、金属ポルフィリン（ＭＯＥＰ）であり、金属は、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｚｎ、Ｉｒ、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｃｏ、Ｎｉ等から選択される。これらの分子にとって、温度に依存する発光強度比率は、上記第２の波長でのポルフィリン分子の励起三重項からの燐光強度に対する、ポルフィリン分子の一重項からの蛍光強度比率であり、上記第１の波長での三重項−三重項消滅過程に続いて起こる遅延した蛍光強度を選択的に含むものの比率である（Ｉ一重項／Ｉ三重項）。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態によれば、分子温度計が取り込まれる基質は、選択的に透明及び／又は不活性であり、好ましくは、選択的に透明且つ不活性である。基質と関連して本実施形態で用いられる、“選択的に透明”という用語は、このような基質は、このような基質に取り込まれる分子温度計が発光する波長領域で透明であるということを示していると意図される。好ましくは、本明細書において、“選択的に透明”という用語は、５００ｎｍ〜１５００ｎｍの範囲で透明であることを指していると意図される。基質と関連して本実施形態で用いられる、“不活性な”という用語は、このような基質が化学的に不活性、すなわち、化学反応を経ないということを示していると意図される。好ましくは、このような用語は、基質が、このような基質に取り込まれた分子温度計とは化学反応を経ないという事実を指していると意図される。従って、好ましくは、“不活性な”という用語は、本明細書において、“分子温度計に関して化学的に不活性な”と同義に利用される。
【００３２】
“項間交差が光励起により起こる分子”は、本件においては特に、Ｓ−−＞Ｔｎであるが、インターシステムクロッシング（ＩＳＣ）と命名されている異なる多重項間での分子内無放射遷移が起こる分子を指していると意図される。特に、光励起により一重項から三重項への励起した電子の遷移が起こる。本明細書で、このような項間交差が起こる割合について述べられる際（“励起一重項のｘ％”）、このことは、このような項間交差遷移を経る一重項状態の電子の割合を指していると意図される。従って、項間交差（ＩＳＣ）が励起一重項状態の１％超過で起こるならば、これは、一重項の電子の全てのうちの１％超過が、三重項に交差することを意味する。
【００３３】
“三重項−三重項消滅過程”は、双方が三重項である２つの温度計分子が励起一重項の分子及び基底状態の分子を生成するように相互作用することを指していると意図される。
【００３４】
従って、本発明の好ましい実施形態によれば、発光強度比率は、上記第２の波長での上記分子温度計の励起三重項からの燐光強度に対する、上記第１の波長での上記分子温度計の一重項の蛍光強度比率であり、当該蛍光は遅延した蛍光及び速い蛍光の混合であってもよい。蛍光強度は、遅延した蛍光及び速い蛍光の混合であってもよい。好ましくは、遅延した蛍光は、三重項−三重項消滅過程に続いて起こる遅延した蛍光である。本明細書において、“速い蛍光”は、遅延していない蛍光である。
【００３５】
三重項Ｔｎへの項間交差が、励起一重項Ｓｎの５０％超過で起こるのであれば、このことにより、発光が燐光として検出される三重項レベルＴｎの存在割合は、確実に高いものとなる。上述したように、三重項−三重項消滅過程の後に、遅延した蛍光をもたらしているのかもしれないインターナルアップコンバージョン（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｕｐ−ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）が続いて起こる。本明細書の表記として、遅延した蛍光は第１の波長で起こり、燐光は第２の波長で起こり、それらの夫々の強度は、第１及び第２の検出器で検出される。
【００３６】
原則として、夫々の過程は、図１を参照しながら説明され、図１は、本発明に係る分子温度計の例として、パラジウム−オクタエチルポルフィリンのエネルギー計画及び分子構造を示す。原理は以下のようになる：分子の一重項帯での光子の吸収後、分子の金属中心へのスピン軌道結合により強化された効率的な項間交差（ＩＳＣ）により（この分子では、９０％超過）、寿命の長い分子の三重項状態Ｔ１の存在割合は大きくなる。この三重項状態について、続いて起こるエネルギー移動のための励起状態の容器とみなすことができる。励起した温度計分子間の三重項−三重項消滅（ＴＴＡ）過程の結果として、基底状態に戻る温度計分子もいれば、より高い一重項状態に励起される温度計分子もいる。三重項状態から基底状態への放出緩和は、燐光であり、より高い一重項状態からの放出緩和は、遅延した蛍光として検出される。本発明者は、驚くことに、温度計層を対象物に塗布して、高分解能顕微鏡技術を利用してこのような対象物を研究することが可能であり、それ故にこれまでにない高精度及び高時空間分解能で、この対象物の内部及び表面の温度及び／又は温度分布を測定することが可能であることを発見した。従来の方法とは対照的に、別の分子ヒーター層は必要とされず、方法がラマン顕微鏡又は赤外線熱顕微鏡を必要としない。本発明に関連して利用される顕微鏡の好ましい方法は、共焦点顕微鏡及び誘導放出制御顕微鏡（ＳＴＥＤ）である。
【００３７】
典型的なＳＴＥＤ顕微鏡によれば、励起ビームは、誘導放出により蛍光分子を脱励起（ｄｅ−ｅｘｃｉｔｉｎｇ）することができるドーナッツ型ビームと重ね合わされる。ビームの共同の調整により、ゼロに近づく励起スポット（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｓｐｏｔ）の中央領域でのみ、確実に蛍光発光が可能となる。サンプルに対しての狭いスポットでの走査が、容易に副回折像を生成する。非常に大きいドーナッツ型ビームでは、ＳＴＥＤ顕微鏡の蛍光スポットの鮮明さは、原理的に、分子のスケールにまで落ちる（例えば、Ｗｉｌｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．  ４４０，  ｐ．９３５−９３９参照）。
【００３８】
共焦点顕微鏡の原理については、標準的な落射蛍光顕微鏡と比較することによって説明することができる。標準的な落射蛍光顕微鏡では、より短い波長での励起光は、対象物を通して色反射体（ｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ）によって反射され、ほとんど一定の照射をサンプルの全体に浴びさせる。色反射体は、短波長光を反射して、長波長光を透過する特性を有する。放射される（例えば、励起光よりも長波長である）蛍光は、サンプルから色反射体を通って、まっすぐに接眼レンズに伝わる。
【００３９】
共焦点の結像系では、励起光の単一ポイント（又は時々、ポイントの集まりもしくはスリット）がサンプルに対して走査される。上記ポイントは、サンプルの回折限界スポットであり、サンプルの共役焦点面に置かれた照射されるアパーチャーを撮像することによって、又は通常は平行なレーザービームの焦点を合わせることによって、生成される。単一のポイントのみが照射されて、ビームが集光及び分岐するに従い、照射強度は焦点面上下ですぐに低下して、それにより試験される焦点面から離れて置かれている対象物に干渉する発光の励起は減少する。発光のライト（すなわち、信号）は、二色反射体（ミラー）に戻って、次いで、サンプルの共焦点面に置かれたピンホール口径を通る。像のピンホールを通る光は、光検出器によって検出される。大抵、コンピュータは、サンプルの連続的スキャニングを制御して、像を集めてビデオモニター上に表示するために利用される。大抵の共焦点顕微鏡は、標準的な顕微鏡に結合する結像系として実施される。
【００４０】
要約すれば、共焦点結像系は、２つの方策によって焦点外の除去を実現する：（ａ）
照射強度が焦点面上下ですぐに落ちるように、集束ビームで、どの時点においてもサンプルの単一のポイントに照射すること、（ｂ）照射されるサンプルのポイントから離れて放出された光が検出器に届くことを阻むように、共役焦点面でサンプルのピンホール口径を遮断すること（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）の利用。共焦点像は望ましい状況（小さいピンホールサイズ、照射されているサンプル）で、他の利点を提供することができる：得られる分解能は、標準的に操作される顕微鏡で得られる分解能の１．４倍に向上する。共焦点顕微鏡は、反射モードで利用されても、焦点外の除去を実行する。
【００４１】
本発明に係る方法及び顕微鏡の好ましい実施形態によれば、レーザは、照明光源として利用される。更に好ましくは、サンプルの光学的断面は、サンプルの走査ステージを走査することによって得られてもよい。更に好ましくは、このようなサンプルの走査ステージは、圧電駆動ステージである。ステージはｘ−ｙ方向（ｘ−ｙ走査）の走査パターンにより、マイクロメーターの距離で移動される。更に、顕微鏡台のｚ方向の動力化の付加によりｚ方向の走査の実行を可能として、それにより、サンプルの一連の光学的断面を取得することが可能となる。更に、好ましくは、アバランシェフォトダイオードが検出器として利用される。夫々の検出器が特定の波長に対して特有のものであることを確実なものとするために、夫々の検出器は、この特定の検出器によって検出されるこの特定の波長のために界面フィルター（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｆｉｌｔｅｒ）を有する。代わりに、光電子増倍管をアバランシェフォトダイオードの代わりに同様に利用することができる。
【００４２】
本発明に係る方法及び顕微鏡の好ましい実施形態によれば、上記方法は、温度を測定するための外部手段が利用される、付加的なキャリブレーションステップを含む。温度を測定するためのこのような外部手段は、例えば、温度計層で覆われる対象物のトップで固定される熱電対のＰＴ−１００（ＮＴＢ  Ｓｅｎｓｏｒｄａｔｅｎｂａｎｋ／Ｌａｂｏｒ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｓｃｈｅ  Ｍｅｓｓｓｙｓｔｅｍｅ；  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｎｏ．  ０３，  Ｓｅｉｔｅｎ  １  −  ３に記載されている；市販されているものとして、例えば、Ｅｎｄｒｅｓｓ  ＋  Ｈａｕｓｅｒ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ  からのＢａｕｍｇａｒｔｎｅｒを利用することができる。）である。次いで、対象物は、肉眼的に熱せされる。一実施形態によれば、キャリブレーションステップの間、夫々の照射強度比率は、対応する測定温度と相関する。このような相関は、測定温度に対する測定される光励起された分子温度計による照射強度比率のプロットとして示されてもよい。“キャリブレーション曲線”と呼ばれてもよいプロットがこの操作に由来することは、当業者にとって明らかである。同様に、同じ情報が、適当な数学式によって、例えば、ある場合には式ｙ＝ｍｘ＋ｂの一次方程式によって表されてもよい。いずれの場合においても、このような相関から得られる情報により、実験を補間又は推定して、光励起分子温度計からの測定される発光強度比率から温度を決定することが可能となることは当業者にとって明らかである。同様に、得られるデータが必ずしも直線関係を有していなくてもよく、単純化のためにこの例が与えられ、このような相関ステップの目的を示していることは当業者にとって明らかである。
【００４３】
このような高分解能顕微鏡技術と組み合わせて、特定のヒーター層を利用せずに温度計層を利用することによって、開口数及び励起光源の波長に依存して、回折限界であって２００ｎｍ未満であってもよいｘｙ平面での空間分解能を得ることが可能である。更に、ｚ方向に得られる分解能は、単純に温度計層の厚みに依存しており、１０ｎｍから４０ｎｍの範囲にある。更に、本発明によって達成される感度は０．２５Ｋ又はそれ以上のものであり、達成される応答時間は短く、１００ｎｓ程度である。温度計層は副層構造に取り込まれていてもよく、測定される対象物内に多様な深さで設置される１つ以上の温度計層があってもよいので、温度／温度分布の３次元像及び測定を得ることができる。本発明に係る温度測定方法をきわめてロバストなものとする発光強度比率が測定されるので、方法は光源強度とは独立したものである。
【実施例１】
【００４４】
温度計層
一実施形態によれば、活性な温度計層は、不活性な基質膜（ポリスチレン、ＰＳ、又はポリメチルメタクリレート、ＰＭＭＡ、又は適当な他の物質）に非常に低い濃度で分散された金属ポルフィリン分子（ＭＯＥＰ）から成る。この分子は、インターナルアップコンバージョンをもたらす非常に強力に温度に依存する三重項−三重項消滅に基づく、遅延した蛍光の強力な温度依存性を有し、室温で高い発光効率及び高温で高い発光効率を有する。それらは２つの主な特徴であり、それにより、それらを以下の特性を有する薄い副層構造の現場のリアルタイムの温度センシングに適当な発光システムにする：
・  供給電圧に比例した応答−光源の強度の多様性に対する独立を確実なものとする。
・  ｘｙ方向の回折限界空間分解能（現時点でＮＡ１で２００ｎｍ及び４０５ｎｍの励起光源を有する）及びｚ方向（温度計層の厚み）で１０ｎｍまで低下する空間分解能
・  ０．２５Ｋ又はそれ以上の感度
・  短い応答時間−１００ｎｓ
・  複層構造での同様の動作
【００４５】
本発明者は、複層構造に含まれる温度計層としてＰＳ又はＰＭＭＡ中に０．１〜３ｗｔ％の濃度のＺｎＯＥＰ、ＰｄＯＥＰ、又はＰｔＯＥＰを有し、１０〜４０ｎｍの厚みのものを利用した。励起光源として４０５ｎｍのｃｗ（連続波）又はパルスレーザダイオードが利用された。ｃｗ又は高い周波数のパルスを利用する際、ポリマーブレンドされたＭＯＥＰの発光スペクトルは、励起三重項の寿命よりも長い時間領域に対して積分された。
【００４６】
ＭＯＥＰ分子の励起後、造られた一重項は、中央の金属原子の影響により非常に増加する項間交差を介して三重項励起に遷移される。分子のエネルギー計画は、三重項−三重項消滅過程および例としてのＰｄＯＥＰの分子構造と共に、図１に示されている。含まれるＩＳＣ及びＴＴＡ過程の結果として、ＲＴでの発光スペクトルは、Ｐｄ及びＰｔＯＥＰにとっては、かなりレッドシフトした有効な燐光及び非常に弱い緑色蛍光かなら成る。
【００４７】
図１は、エネルギー計画及び活性な温度計分子の一例としてのＰｄＯＥＰの分子構造を示す。
【００４８】
温度の増加により、蛍光発光でのかなりの増加が観測された（図２、挿入図）。上述したような非動的励起型では、直線的に温度に対して一重項（ＤＦ）−三重項（燐光）の強度比率が寄与していると考えることは可能である。
【００４９】
図２では、１ポイント当たり２０ｍｓの積分時間及び１０μｍの照射スポットでの異なる励起パワーに対するキャリブレーション曲線が示される。温度計の大員環は、４０ｎｍの厚みでＰＳ層中にブレンドされたＰｄＯＥＰである。このキャリブレーションのために、サンプルは巨視的に熱せられ、表面（ＰＳ膜）温度が調整された熱電対によって測定された。蛍光Ｉ一重項（Ｉ５４９）（図２、挿入図参照）に対して測定された強度と測定された燐光ピーク強度Ｉ三重項（Ｉ６６２）との間の比率は、２９３Ｋと４００Ｋの間の温度に対して示される。
【００５０】
図２は、ポリスチレン中に１ｗｔ％の濃度でブレンドされたＰｄＯＥＰについてのキャリブレーション曲線を示す。膜厚４０ｎｍ。０．８〜１０ｍＷのパワー。更に詳細は、本明細書参照。挿入図：異なる温度での発光スペクトル。
【００５１】
厳密なレーザの強度、サンプルの構造（厚み、大員環、及びその濃度）、及び積分時間
に対して、Ｉ一重項／Ｉ三重項の比率の指数関数的な依存性は非常に再現性の良いものである。温度計分子の１ｗｔ％の濃度及び２０ｍｓの積分時間に対して、比率は調べられた温度の間隔に対する厳密なレーザのパワーには依存しない。精度は、大員環に依存して０．１〜０．２５Ｋである。
【実施例２】
【００５２】
図３は、本発明に係る共焦点顕微鏡の構成の実施形態の概略図を示し、サンプルは、温度又は温度分布が測定され、温度計層が塗布された対象物である。共焦点デバイスが、発光強度比率を検出するための２つの検出器を有していることは、注意しておく必要がある。
【００５３】
夫々の検出器は、選択的に特定の波長を検出するための界面フィルター（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｆｉｌｔｅｒ）を有する。更に、デバイスは、サンプル走査ステージを有し、好ましくは（Ｌｅｉｋａ、Ｚｅｉｓｓ、Ｏｌｙｍｐｕｓのように）標準的に利用される蛍光共焦点顕微鏡に対して高周波数を有する圧電駆動ステージであり、高数値の非液浸又は液浸対物レンズは、ノッチ又はエッジカットオフフィルター（ｅｄｇｅ  ｃｕｔ−ｏｆｆ  ｆｉｌｔｅｒ）に対して検出部の入り口で励起波長をカットオフして、当該検出部は、（２つの検出器によって検出される波長に対応して）２色性のビームスプリッター（２色性ミラー）及び２つの検出器（好ましくは、アバランシェフォトダイオード）を有し、夫々の検出器は、所望の波長又は波長範囲のみを通り抜けられる（例えば、夫々が５４９ｎｍ及び６６２ｎｍのように、一方は緑、一方は赤）ようにする界面フィルターと、走査ステージ（選択的に複数の走査ステージ）、光源、及び検出器からのデータを制御及び収集するソフトウェアを有する検出部を制御するためのコンピュータとを有する。
光源は、例えば、レーザ、レーザダイオード、又は発光ダイオードであってもよいが、それらに限定されない。
【００５４】
明細書、特許請求の範囲、及び／又は対応する図面に開示された本発明の特徴は、独立させてもそれらをどのように組み合わせても、双方の場合において、発明を様々な形態で理解するための資料となってよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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