(57)【要約】  新規クロストリジウム細菌種（クロストリジウム・ラグスダレイ、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２および／またはＰＴＡ−７８２６、「Ｐ１１」）を提供する。Ｐ１１は、廃ガスから、生物燃料として有用な産物を合成可能である。特に、Ｐ１１は、ＣＯをエタノールに変換可能である。したがって、この新規細菌は、廃ガス（例えば合成ガスおよび製油所廃棄物）を有用な産物に変換する。Ｐ１１はまた、アセテートの産生も触媒する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＣＣ第ＢＡＡ−６２２号または第ＰＴＡ−７８２６号の同定特徴のすべてを有する微生物、クロストリジウム・ラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ）の生物学的に純粋な培養物。
【請求項２】
ＣＯの供給源、および
クロストリジウム・ラグスダレイ
を含む、エタノールを産生するための組成物。
【請求項３】
ＣＯの前記供給源が合成ガスである、請求項２の組成物。
【請求項４】
ＣＯの供給源およびクロストリジウム・ラグスダレイを、前記クロストリジウム・ラグスダレイがＣＯをエタノールに変換することを可能にする条件下で合わせる
工程を含む、エタノールを産生する方法。
【請求項５】
ＣＯの供給源をクロストリジウム・ラグスダレイと合わせる容器；および
前記クロストリジウム・ラグスダレイが、前記ＣＯをエタノールに変換することを可能にする、前記容器中の条件を制御する制御装置
を含む、エタノールを産生するための系。
【請求項６】
合成ガスを産生するための第二の容器；および
前記容器に前記合成ガスを輸送するための輸送装置、ここで、前記合成ガスは前記ＣＯの供給源として働く
をさらに含む、請求項５の系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に、廃棄物から生物燃料を産生可能な細菌に関する。特に、本発明は、新規クロストリジウム種（ＡＴＣＣ寄託番号第ＢＡＡ−６２２号および／または第ＰＴＡ−７８２６号の同定特徴を有するクロストリジウム・ラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ））、ならびに該クロストリジウム種を用いて、ＣＯからエタノールおよび他の有用な産物を合成する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
米国政府が、石油輸入に対する国家の依存状態を軽減するために、再生可能な資源を開発する方法を発見する、より多くの構想に資金供給を始めたのは、１９７０年代の石油危機になってからのことだった（Ｋｌａｓｓ、１９９８）。また、米国政府が、ガソリンに混合するために、生物に基づく溶媒産生に新たに関心を持ったのも、このときだった。特に関心対象であり、そしてさらに近年、より関心対象となっているものの１つがバイオエタノール（バイオマス由来のエタノール）である。
【０００３】
現在、バイオエタノール産生の主な様式は、直接発酵を通じたものであり、これは米国において、エタノール産出の９０％を占める（Ｌｉｃｈｔ、２００１）。直接発酵は、酵母または細菌などの糖分解性微生物が糖をエタノールに変換するプロセスである。これらの糖は、単糖（すなわちグルコース）であってもまたは複合糖類（すなわちデンプン、セルロース、ヘミセルロース）であってもよい。コーンスターチは、今日、エタノール産生プラントにおいて用いられる主な基質である。コーンスターチ以外に、リグノセルロース系バイオマス（すなわち、草、小さい樹木、紙くず、おがくず）もまた、このプロセスのための基質として研究されてきている。リグノセルロースは、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、およびリグニンで構成される。リグノセルロース系バイオマスの直接発酵に伴う問題は、微生物利用の前に、バイオマスを個々の構成要素に分解するため、付随する前処理プロセスが必要であることである。これは、材料、プラント設計、廃棄物管理などの領域において、より多くのコストを付加する。
【０００４】
燃料エタノールを産生するのに利用可能な資源から最大限を得るために、別の方法が調べられてきている。これらの代替法の１つが間接発酵である。間接発酵は、リグノセルロース系バイオマスを熱分解して（燃やしてガスを産生して）、そして産生されたガスを細菌によってエタノールに変換するプロセスである。産生されたガスは、一般的に合成ガスと称される。熱分解されたバイオマスまたは石炭の産物である合成ガス（ＣＯ−Ｈ２−ＣＯ２）は、バイオマスから燃料アルコールへの間接発酵における潜在的な役割に関して、認識されてきたし、そして現在も認識されている（Ｚｅｉｋｕｓ、１９８０、Ｂｒｅｄｗｅｌｌら、１９８０）。
【０００５】
酢酸生成細菌などの嫌気性微生物は、合成ガスを有用な産物、特にエタノールなどの液体バイオ燃料に変換する多様な経路を提供する。こうした細菌は、化学的プロセスを用いて達成されうるよりも、より高い特異性、より高い収量およびより低いエネルギーコストで、合成ガスの変換を触媒する（Ｖｅｇａら、１９９０；  Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９９４）。廃ガスおよび他の基質から生物燃料を産生可能ないくつかの微生物が同定されてきている：
合成ガスから液体燃料を産生する際に使用するための３つの株の酢酸生成菌（Ｄｒａｋｅ、１９９４）が記載されてきている：ブチリバクテリウム・メチロトロフィクム（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｇｒｅｔｈｌｅｉｎら、１９９０；  Ｊａｉｎら、１９９４ｂ）；クロストリジウム・オートエタノゲヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）（Ａｂｒｉｎｉら、１９９４）；クロストリジウム・リュングダーリー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）（Ａｒｏｒａら、１９９５；  Ｂａｒｉｋら、１９８８；  Ｂａｒｉｋら、１９９０；およびＴａｎｎｅｒら、１９９３）。これらのうち、クロストリジウム・リュングダーリーおよびクロストリジウム・オートエタノゲヌムは、ＣＯをエタノールに変換することが知られる。
【０００６】
Ｇａｄｄｙらに対する米国特許５，１７３，４２９は、合成ガス中のＣＯおよびＨ２Ｏおよび／またはＣＯ２およびＨ２からエタノールおよびアセテートを産生する嫌気性微生物、クロストリジウム・リュングダーリー、ＡＴＣＣ第４９５８７号を開示する。
【０００７】
Ｊａｉｎらに対する米国特許５，１９２，６７３は、クロストリジウム・アセトビチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｙｔｙｌｉｃｕｍ）の突然変異体株、および該株を用いてブタノールを作製するためのプロセスを開示する。
【０００８】
Ｇａｄｄｙらに対する米国特許５，５９３，８８６は、クロストリジウム・リュングダーリー、ＡＴＣＣ第５５３８０号を開示する。この微生物は、基質として廃ガス（例えばカーボンブラック廃ガス）を用いて、アセテートおよびエタノールを嫌気的に産生可能である。
【０００９】
Ｇａｄｄｙらに対する米国特許５，８０７，７２２は、クロストリジウム・リュングダーリー、ＡＴＣＣ第５５３８０号などの嫌気性細菌を用いて、廃ガスを、有機酸およびアルコールなどの有用な産物に変換するための方法および装置を開示する
Ｇａｄｄｙらに対する米国特許６，１３６，５７７は、クロストリジウム・リュングダーリー、ＡＴＣＣ第５５９８８号および第５５９８９号などの嫌気性細菌を用いて、廃ガスを、有機酸およびアルコール（特にエタノール）などの有用な産物に変換するための方法および装置を開示する。
【００１０】
Ｇａｄｄｙらに対する米国特許６，１３６，５７７は、クロストリジウム・リュングダーリーの嫌気性株を用いて、廃ガスを、有機酸およびアルコール（特に酢酸）などの有用な産物に変換するための方法および装置を開示する。
【００１１】
Ｇａｄｄｙらに対する米国特許６，７５３，１７０は、酢酸の産生のための嫌気性微生物発酵プロセスを開示する。
【００１２】
合成ガスから液体燃料を産生する際に使用するための酢酸生成菌の他の株もまた、記載されてきている：例えば、ブチリバクテリウム・メチロトロフィクム（Ｇｒｅｔｈｌｅｉｎら，  １９９０，  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２４／２４：８７５−８８４）；およびクロストリジウム・オートエタノゲヌム（Ａｂｒｉｎｉら，  １９９４，  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １６１：３４５−３５１）。
【００１３】
発酵を介して生物燃料などの有用な産物を産生可能なさらなる微生物を発見し、そして開発する、継続中の必要性が依然としてある。特に、頑強で、培養および維持が比較的容易であり、そして生物燃料などの関心対象の産物を優れた収量で提供する微生物を提供することが好適であろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
参考文献、これらの各々は、本明細書に援用される。
【００１５】
【化１−１】
2010502191.tif 000002
【００１６】
【化１−２】
2010502191.tif 000003
【００１７】
【化１−３】
2010502191.tif 000004
【００１８】
【化１−４】
2010502191.tif 000005
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明の概要
本発明は、比較的一般的な基質から、価値がある有機流体を高収量で産生可能な、新規の生物学的に純粋な嫌気性細菌（称号ＢＡＡ−６２２のもとに、２００２年１０月、バージニア州マナサスのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、そして再び、称号ＰＴＡ−７８２６のもとに２００６年６月１４日に寄託された、「Ｐ１１」とも称される、クロストリジウム・ラグスダレイ）を提供する。特に、該微生物は、ＣＯを発酵させることによって、エタノールおよび酢酸を産生可能である。ＣＯの１つの一般的な供給源は、石炭ガス化のガス性副産物である、合成ガスである。したがって、該微生物は、そうでなければ廃棄物である物質を、価値ある産物に変換可能であり、そのうちいくつかが生物燃料である。合成ガス、およびしたがってＣＯはまた、容易に入手可能な低コスト農業原料から、熱分解によって産生可能であり、エネルギー産生の経済的および環境的懸念の両方に取り組む手段を提供する。したがって、本発明の細菌は、ガス化／発酵経路を介して、バイオマスの生物燃料への間接変換に関与する。
【００２０】
クロストリジウム・ラグスダレイの培養物は、非常に安定であり、そして活性を保持しながら、１年以上にわたって、室温または３８℃のインキュベーター中で保管可能である。
【００２１】
微生物、クロストリジウム・ラグスダレイの生物学的に純粋な培養物を提供することが本発明の目的である。該微生物は、ＡＴＣＣ第ＢＡＡ−６２２号および／または第ＰＴＡ−７８２６号の同定特徴のすべてを有する。さらに、本発明はエタノールを産生するための組成物を提供する。該組成物は、１）ＣＯの供給源、および２）クロストリジウム・ラグスダレイを含む。本発明の１つの態様において、ＣＯの供給源は合成ガスである。
【００２２】
さらに別の態様において、本発明は、エタノールを産生する方法を提供する。該方法は、ＣＯの供給源およびクロストリジウム・ラグスダレイを、前記クロストリジウム・ラグスダレイがＣＯをエタノールに変換するのを可能にする条件下で合わせる工程を含む。
【００２３】
本発明は、１）ＣＯの供給源をクロストリジウム・ラグスダレイと合わせる容器；および２）クロストリジウム・ラグスダレイが、ＣＯをエタノールに変換することを可能にする、前記容器中の条件を制御する制御装置を含む、エタノールを産生するための系をさらに提供する。本発明の１つの態様において、系にはまた、１）合成ガスを産生するための第二の容器；および２）容器に合成ガスを輸送するための輸送装置、ここで、該合成ガスはＣＯの供給源として働く、も含まれる。こうした系は図５に例示され、この図は、場合による第二の容器２００および輸送装置２０１とともに、容器１００および制御装置１０１を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】株Ｐ１１のネガティブ染色された細胞の透過型電子顕微鏡写真。バー、１μｍ。
【図２】フルクトースを基質とした場合の株Ｐ１１の最適ｐＨの決定。
【図３】フルクトースを基質とした場合の株Ｐ１１の最適温度の決定。
【図４】１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子配列類似性に基づき、そして近隣結合法を用いて構築した系統樹、Ｃ．ラグスダレイ、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２および／またはＰＴＡ−７８２６、ならびにクロストリジウム属の代表的な種の位置を示す。１６ｓ  ｒＲＮＡ配列のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を株番号の次に示す。
【図５】Ｐ１１を用いて、合成ガスからエタノールを産生するための系の概略図。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の好ましい態様の詳細な説明
本発明は、嫌気性条件下で、ＣＯおよび他の容易に入手可能な基質から、価値ある産物を高収量で産生可能な、新規酢酸生成細菌の発見に基づく。特に、該微生物は、ＣＯを発酵させることによって、エタノール、ブタノールおよびアセテートなどの価値ある液体産物を産生し、エタノールが主な産物である。「発酵」によって、我々は、基質が電子の供給源および電子シンク（基質の一部の酸化および基質の一部の還元）の両方として働き、これをアルコールおよび酸などの産物の産生に使用可能である、生理学的プロセスを意味する。その結果、この生物は、そうでなければ廃ガスになるであろうものを、生物燃料などの有用な産物に変換することが可能である。本発明の嫌気性微生物は、本明細書において、「Ｐ１１」と称される、ＡＴＣＣ寄託物ＢＡＡ−６２２および／またはＰＴＡ−７８２６に示される精製培養物の特徴を示す、新規クロストリジウム種である。
【００２６】
Ｐ１１の形態学的および生化学的特性が解析されてきており、そしてこれを本明細書において、以下の実施例セクションに記載する。Ｐ１１の特定の特性は、他のクロストリジウム属種に類似であるが、Ｐ１１は、この種がこの属の新規の種であることを示す、ユニークな特徴を所持する。Ｐ１１は、クロストリジウム・ラグスダレイと命名されており、そしてこの種の代表と考えられる。
【００２７】
本発明の生物学的に純粋な培養物中の該細菌は、嫌気性条件下で、以下の反応にしたがって、基質ＣＯ＋Ｈ２Ｏおよび／またはＨ２＋ＣＯ２からエタノールを産生する能力を有する：
エタノール合成
６ＣＯ＋３Ｈ２Ｏ→Ｃ２Ｈ５ＯＨ＋４ＣＯ２  （１）
６Ｈ２＋２ＣＯ２→Ｃ２Ｈ５ＯＨ＋３Ｈ２Ｏ  （２）
これらの基質の供給源に関して、当業者は、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の多くの供給源が存在することを認識するであろう。例えば、基質の好ましい供給源は、合成ガス、製油所廃ガス、酵母発酵およびいくつかのクロストリジウム発酵によって産生されるガス（ある程度のＨ２を含有する）、ガス化セルロース系物質、石炭ガス化などの「廃」ガスである。あるいは、こうしたガス性基質は、必ずしも、他のプロセスの副産物として産生されず、Ｐ１１を利用する本発明の発酵反応で使用するために、特に産生されてもよい。当業者は、微生物が発酵反応を実行するのに適した条件下で、基質ガスの十分な量を細菌に提供可能である限り、本発明の実施に、基質ガスの任意の供給源を用いてもよいことを認識するであろう。反応式（１）によって示される反応のＨ２Ｏの供給源は、典型的には、生物が培養されている水性培地である。
【００２８】
本発明の好ましい態様において、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の供給源は合成ガスである。基質として使用するための合成ガスは、例えば石炭ガス化のガス性副産物として得られうる。したがって、細菌は、そうでなければ廃棄物となる物質を、価値ある生物燃料に変換する。あるいは、特に細菌発酵の目的のために、容易に入手可能な低コスト農業原料のガス化によって、合成ガスを産生して、それによってバイオマスの燃料アルコールへの間接発酵のための経路を提供してもよい。大部分の種類の植物がこの目的のために使用可能であるため、合成ガスに変換可能な原料には多くの例がある。好ましい原料には、限定されるわけではないが、スイッチグラスなどの多年草、トウモロコシ茎葉などの作物残渣、おがくずなどの加工廃棄物などが含まれる。当業者は、こうした出発物質からの合成ガスの生成を熟知している。一般的に、合成ガスは、主に、熱分解、部分的酸化、および水蒸気改質によって、乾燥バイオマスから、ガス化装置中で生成され、主な産物は、ＣＯ、Ｈ２およびＣＯ２である。（用語「ガス化」および「熱分解」は、類似のプロセスを指す。どちらのプロセスもバイオマスが曝露される酸素の量を限定する。ガス化は、少量の酸素を許容し（これはまた、「部分的酸化」とも称されることも可能である）、そして熱分解はより多くの酸素を許容する。用語「ガス化」は、時に、ガス化および熱分解の両方を含むように用いられる。）典型的には、産物ガスの一部をリサイクルして、産物収量を最適にし、残渣タール形成を最小限にする。石灰および／またはドロマイトを用いて、合成ガス中の望ましくないタールおよびコークスのＣＯへのクラッキングを実行してもよい。これらのプロセスは、例えば、Ｒｅｅｄ，  １９８１（Ｒｅｅｄ，  Ｔ．Ｂ．，  １９８１，  Ｂｉｏｍａｓｓ  ｇａｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｎｏｖｅｓ  Ｄａｔａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  ニュージャージー州パークリッジ）に詳細に記載される。
【００２９】
さらに、基質ガス供給源の組み合わせを利用してもよい。例えば、ＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の主な供給源は合成ガスであってもよいが、これに、他の供給源から、例えば多様な商業的供給源から、ガスを補充してもよい。例えば、上記の反応式（１）にしたがった反応は、４分子のＣＯ２を生成し、そして反応式（２）にしたがった反応は、６分子のＨ２を利用するが、ＣＯ２を２分子しか利用しない。Ｈ２が十分でない限り、ＣＯ２増加が生じうる。しかし、培地にさらにＨ２を補充すると、ＣＯ２利用の増加が生じ、そしてその結果、さらにより多くのエタノールの産生が生じるであろう。
【００３０】
本発明の細菌によるＣＯの発酵によって生じる主な産物はエタノールである。しかし、アセテートもまた産生可能である。アセテート産生は、以下の反応を介して起こりうる：
アセテート合成
４ＣＯ＋２Ｈ２Ｏ→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２ＣＯ２  （３）
４Ｈ２＋２ＣＯ２→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２Ｈ２Ｏ  （４）
本発明の生物は、嫌気性条件下で培養されなければならない。「嫌気性条件」によって、我々は、培地に溶解した酸素が欠如していることを意味する。
【００３１】
一般的に、本発明の酢酸生成菌を培養するための培地は、ＡＴＣＣ培地１７５４（Ｒ．Ｓ．  Ｔａｎｎｅｒによって開発）などの液体培地である。しかし、当業者は、別の培地、例えば、初期ｐＨ  ６で、Ｈ２：ＣＯ２またはＣＯ：ＣＯ２雰囲気下のＡＴＣＣ培地１０４５を利用してもよいことを認識するであろう。さらに、任意のいくつかの目的のため、多様な培地補充物、例えば、緩衝剤、金属、ビタミン、塩などを添加してもよい。特に、当業者は、関心対象の産物の収量の増加または最適化を生じる、栄養素操作および適応などの技術を熟知している。例えば、「非増殖」条件下（すなわち細菌増殖および複製を支持しない条件下）で微生物を培養すると、発酵産物のより高い産生が生じうる。これはおそらく、非増殖条件下では、細菌の資源が、生殖に費やされず、そしてしたがって、他の合成活性に自由に使用可能であるためである。非増殖条件の例には、例えば、培養を最適でない温度またはｐＨに維持すること、栄養素および炭素供給源を限定することなどが含まれる。一般的に、非増殖条件は、培養中で、細菌が望ましい密度に到達した後に実行されるであろう。また、培地を最適化することによって、他のものよりも１つの産物を支持する、例えばアセテートよりもエタノールの産生を支持することが可能である。例えば、標準的な培地中のものに比較して鉄濃度を１０倍増加させると、酢酸の産生が減少する一方、産生されるエタノール濃度は倍になる。当業者は、所望の産物の産生を最適化するための方法を熟知しており、そしてＰ１１細菌を用いたこうした最適化法はすべて、本発明に含まれると意図される。例えば、こうした技術のための指針を提供する、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）を用いて実行された研究を参照されたい（例えば、Ｂａｈｌら，  １９８６，  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５２：１６９−１７２；ならびにＪａｉｎらに対する米国特許５，１９２，６７３およびＧａｄｄｙらに対する米国特許５，１７３，４２９を参照されたい、これら両方の完全な内容が、本明細書に援用される）。
【００３２】
特に：Ｔａｎｎｅｒ，  １９９７，  Ｍａｎｕａｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ｐ．５２−６０，  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｔａｎｎｅｒ，  ２００２，  Ｍａｎｕａｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  第２版，  ｐ．６２−７０；  Ｗｉｅｇｅｌら，  ２００５，  Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ，  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，  Ｒｅｌｅａｓｅ  ３．２０；  Ｔａｎｎｅｒ，  ２００６，  Ｍａｎｕａｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  第３版，  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓによる概説に記載されるような、Ｂａｌｃｈ技術（ＢａｌｃｈおよびＷｏｌｆｅ，  １９７６，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２：７８１−７９１；  Ｂａｌｃｈら，  １９７９，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ４３：２６０−２９６）を用いて、クロストリジウム・ラグスダレイを培養してもよい。これには、培養物質を調製するための嫌気性チャンバー、および密封された試験管または容器中で、どのようなものであれ望ましいガス相を確立するガス交換マニホールドの補助が伴う。酸性ｐＨの使用など、溶媒産生酢酸生成菌の培養に関する、より具体的な詳細は、Ｔａｎｎｅｒら，  １９９３，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ４３：２３２−２３６およびＬｉｏｕら，  ２００５，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｅｖｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５５：２０８５−２０９１に見られる。エタノール産生を増進する方法には、すべての培地構成要素（アンモニウム、ホスフェートおよび微量金属など）の最適化、培養ｐＨの調整、突然変異誘発およびクローンスクリーニング等が含まれる。
【００３３】
本発明の生物によるＣＯの発酵は、さらなる修飾を加えまたは加えず、当業者に知られる任意のいくつかの種類の装置において、あるいは現在開発中の他のスタイルの発酵装置において、実行可能である。例には、限定されるわけではないが、気泡塔反応装置、２段階バイオリアクター、トリクルベッド反応装置、膜反応装置、固定細胞を含有する充填層反応装置などが含まれる。こうした装置の主な必要条件には、無菌性、嫌気性条件、ならびに適切な条件または温度、圧力、およびｐＨが維持されること；ならびに十分量の基質が培養に供給されること；産物を容易に回収可能であること；などが含まれる。反応装置は、例えば、伝統的な攪拌タンク反応装置、固定されたまたは懸濁された細胞を含むカラム発酵装置、連続フロー型反応装置、高圧反応装置、細胞リサイクルを伴う懸濁細胞反応装置、および上に列挙するような他の例などであってもよい。さらに、反応装置を、上述の任意の反応装置を含有する、連続および／または平行反応装置系に配置してもよい。例えば、１つのセットの条件下で細胞を増殖させ、そして別のセットの条件下で、増殖を最小限にしてエタノール（または他の産物）を生成するのに、多数の反応装置が有用であることが可能である。
【００３４】
一般的に、発酵は、培地中で、所望のレベルの産物が産生されるまで、例えば、所望の量のエタノールが産生されるまで、進行されるであろう。典型的には、このレベルのエタノールは、少なくとも約１グラム／培地１リットル〜約５０グラム／リットルの範囲内であり、少なくとも約３０グラム／リットル（またはそれ以上）のレベルが好ましい。しかし、約１〜１０、または約１０〜２０、または約２０〜３０、または約３０〜４０、または約４０〜５０グラム／リットルを産生するように最適化される細胞または細胞培養系もまた、意図される。Ｐ１１は、少なくとも６０ｇ／Ｌのエタノール濃度中で生存可能のままであり、そして増殖するであろう。あるいは、ある一定の産生率を達成したとき、例えば、所望の産物の産生速度が、例えば細菌廃棄物の増加、基質入手可能性の減少、産物によるフィードバック阻害、生存細菌数の減少、または当業者に知られるいくつかの他の何らかの理由によって、減少した際に、産生を停止してもよい。さらに、任意の液体産物を含めて、使用した培地を同時に除去しつつ、新鮮な培地の連続補充を可能にする連続培養技術が存在する（すなわちケモスタット様式）。
【００３５】
本発明の細菌によって産生される産物を培養物から除去して、そして当業者に知られるいくつかの任意の方法によって精製してもよい。例えば、エタノールを除去して、そして例えば溶媒抽出；共沸混合物への蒸留、その後、共沸蒸留；分子ふるい脱水；パーベーパレーション；またはフロースルー・ゼオライト・チューブによって、さらにプロセシングしてもよい。当業者は、エタノール脱水後の蒸留のための、産業における２つの主な技術が、共沸蒸溜および分子ふるい脱水であることを認識するであろう（例えばＫｏｈｌ，  Ｓ．  ”Ｅｔｈａｎｏｌ  １０１−７：  Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ”  ｉｎ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ，  Ｍａｒｃｈ  ２００４：  ４０−４１を参照されたい）。さらに、産物の数に応じて、いくつかの純粋な産物を得るために、いくつかの分離技術を使用する必要がありうる。同様に、アセテートを除去して、そして類似のプロセスによって、さらにプロセシングしてもよい。
【００３６】
本発明のいくつかの態様において、エタノール（または関心対象の他の産物）を産生するため、Ｐ１１を純粋な培養物として培養する。しかし、他の態様において、Ｐ１１を他の生物と一緒に培養してもよい。
【実施例】
【００３７】
実施例
実施例１
合成ガスを効率的に代謝し、そしてエタノールを産生することが可能な新規微生物触媒を発見する取り組みの中で、新規の中温性で一酸化炭素を利用する酢酸生成菌であるクロストリジウム・ラグスダレイを単離し、そして本明細書において以下に記載する。既知のクロストリジウム・リュンダーリー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｄａｈｌｉｉ）株ＰＥＴＣに対する比較によって、該新規生物の性質決定を部分的に行った。
【００３８】
材料および方法
生物。クロストリジウム・リュンダーリー株ＰＥＴＣを、Ｒａｌｐｈ  Ｓ．  Ｔａｎｎｅｒ博士によって維持されたフルクトース・ストック培養物から得て、そして参照対象株として用いた。先に記載された方法（Ｂｒｙａｎｔ、１９７２）によって、ＣＯ：Ｎ２：ＣＯ２（７５：１５：１０）の雰囲気および６．０の初期ｐＨ下で、オクラホマ大学のＤｕｃｋ  Ｐｏｎｄの新鮮な水沈降物を接種した嫌気性濃縮物から、株Ｐ１１を得た。本明細書に記載する一酸化炭素酸化クロストリジウムは、クロストリジウム・ラグスダレイと命名された。この細菌は、株Ｐ１１と称され、そして元来、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに、株ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２として寄託され、そして後に、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７８２６として再び寄託された。
【００３９】
培地。この研究で用いた培地は、Ｂａｌｃｈ  ＆  Ｗｏｌｆｅ（１９７６）によって記載される厳密な嫌気的技術を用いて調製され、そしてＴａｎｎｅｒ（２００２）によって記載された無機塩、微量金属およびビタミン溶液を含有し、酵母抽出物（１ｇ／Ｌ、Ｄｉｆｃｏ）が補充された（表１〜４）。
【００４０】
【表１】
2010502191.tif 000006
【００４１】
【表２】
2010502191.tif 000007
【００４２】
【表３】
2010502191.tif 000008
【００４３】
【表４】
2010502191.tif 000009
【００４４】
ＮａＨＣＯ３が欠失しており、そして初期ｐＨが６．３であることを除いて、有機およびガス性基質上の増殖を、先に記載するように行った（Ｔａｎｎｅｒら、１９９３）。レザズリン（１ｍｇ／Ｌ）を酸化還元指示薬として用いた。コロニー形態描写のため、２％の濃度で、培地に精製アガーを添加した（表５）。熱不安定性基質をフィルター滅菌し（オートクレーブはしない）、そして接種前に、無菌ストック溶液から、最終濃度５ｇ／Ｌまで添加した。基質としてフルクトースを含有する培地中で、最適温度およびｐＨ（初期ｐＨ）を決定した。最適ｐＨを決定するため、培地を、（１．０ｇ／Ｌ）のＨＯＭＯＰＩＰＥＳ（ホモピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−２−［エタンスルホン酸］（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、オハイオ州クリーブランド）、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）、またはＴＥＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２−アミノエタンスルホン酸））で緩衝した。増殖を開始するのに、フルクトースで増殖させた細胞の０．１ｍｌ（〜２％）接種物を用いた。これらの実験に用いたすべての培地構成要素は、別に記載しない限り、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）から得られた。
【００４５】
【表５】
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【００４６】
生化学的反応。Ｓｍｉｂｅｒｔ  ＆  Ｋｒｉｅｇ（１９９４）によって記載される方法により、エスクリンおよびデンプン加水分解、ゼラチナーゼ産生、ならびにインドール産生に関する生化学的アッセイを実行した。ＣＨＥＭｅｔｒｉｃｓテストキットおよび５２０ｎｍに設定されたｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ２０Ｄを用いて、硝酸還元を測定した。フルクトースを補充した培地中で、中間期から後期指数増殖期に増殖した細胞をアッセイに用いた。
【００４７】
発酵バランス。フルクトース上での増殖に関して、発酵バランスを決定した。フェノール−硫酸・炭水化物アッセイを用いてフルクトースを測定した（Ｄｕｂｏｉｓら、１９５６）。８０／１２０  Ｃａｒｂｏｐａｋ  Ｂ−ＤＡ／４％カーボワックス樹脂２０Ｍ（Ｓｕｐｅｌｃｏ、ペンシルバニア州ベルフォンテ）を充填した２ｍスチールカラムを装備したＶａｒｉａｎ  ３４００上、炎イオン化検出装置（ＦＩＤ）を装備したガスクロマトグラフ（ＧＣ）によって、アセテートおよびエタノールを同時に測定した。カラム、インジェクター、および検出装置温度は、それぞれ、１５５、２００、および２００℃であった。ヘリウムがキャリアーガスであり、そして流速を３０ｍｌ  ｍｉｎ−１に設定した。熱伝導度検出装置（ＴＣＤ）（Ｖａｒｉａｎ、テキサス州シュガーランド）およびＰｏｒａｐａｋ  Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ２ｍスチールカラム（Ａｌｌｔｅｃｈ、ミシガン州ディアフィールド）を装備したガスクロマトグラフを用いて、ＣＯ２を測定した。カラム温度を６０℃に設定し、流速は１５ｍｌ  ｍｉｎ−１であり、そしてキャリアーガスとしてヘリウムを用いた。
【００４８】
電子および位相差顕微鏡法。基質として０．５％酵母抽出物上で増殖させた指数増殖期細胞を透過型電子顕微鏡法に用いた。カーボンでコーティングしたＦｏｒｍｖａｒグリッド上に細胞をスプレッドし、１％グルタルアルデヒドで固定し、そして０．５％リンタングステン酸塩（ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｓｇａｔｅ）（ｐＨ  ７．０）で染色した。ＪＥＯＬ  ＪＥＭ  ２０００  ＦＸ  ＴＥＭを用いて細胞を調べ、そして写真撮影した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＨ−２位相差顕微鏡を用いて細胞を観察した。
【００４９】
分析法。アルミニウム密封試験管中、６００ｎｍ（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ２０Ｄ；  Ｍｉｌｔｏｎ  Ｒｏｙ）で分光光度的に増殖を測定した（Ｂａｌｃｈ  ＆  Ｗｏｌｆｅ、１９７６）。株Ｐ１１が基質を利用可能であることを立証するため、複製試験管中で連続してトランスファーした後に、増殖が起こらなければならなかった。基質、マレートに関しては、２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ  ２．５および１０％（ｖ／ｖ）メタノールの移動相を用いて、Ａｌｌｔｅｃｈ、Ｐｒｅｖａｉｌ有機酸カラム（４．６ｘ１５０ｍｍ、５μｍ；  Ａｌｌｔｅｃｈ、ミシガン州ディアフィールド）を用い、２１４ｎｍに設定したＵＶ検出装置を装備したＨＰＬＣ（「高性能液体クロマトグラフィー」）によって、利用を分析した。
【００５０】
ｍｏｌ％Ｇ＋Ｃ（グアニンに加えてシトシン）分析のためのＤＮＡを、Ｍａｒｍｕｒ法の修飾法（Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９９４）にしたがって単離し、そしてリゾチーム、プロテイナーゼＫおよびＲＮａｓｅでの処理を含んだ。少なくとも６時間のリゾチーム処理が最も有効であることが見いだされた。ＨＰＬＣによってＧ＋Ｃ含量を測定した（Ｍｅｓｂａｈら、１９８９）。２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ  ２．５および４％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの移動相、ならびに２５４ｎｍに設定したＵＶ検出装置とともに、Ａｌｌｔｅｃｈ、Ｐｒｅｖａｉｌ  Ｃ１８逆相カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ、５μｍ粒子サイズ；  Ａｌｌｔｅｃｈ、イリノイ州ディアフィールド）を用いた。
【００５１】
ＢＯＸ−ＰＣＲゲノムフィンガープリンティング。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から得たＢＯＸＡ１Ｒプライマー、およびＶｅｒｓａｌｏｖｉｃら（１９９４）のプロトコルを用いて、反復ＤＮＡ  ＰＣＲフィンガープリンティングを実行した。ＰＣＲ混合物は、最終体積２５μｌ中に、２．５μｌの１０Ｘ緩衝剤Ｂ（５００ｍＭ  ＫＣｌおよび１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２μｌ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（２５ｍＭ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．２５μｌ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、各０．５μｌのデオキシヌクレオシド三リン酸（１０ｍＭ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）、１μｌプライマー、および試料ＤＮＡを含有した。初期変性工程（９４℃、４分間、１サイクル）、３０の反応サイクル（９４℃１分間、５０℃１分間、７２℃８分間）、および最終伸長工程（７２℃８分間）のプロトコルを用いて、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ４０  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、テキサス州シーダークリーク）上で、ＰＣＲ反応を実行した。１００塩基対ラダー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに、５％ポリアクリルアミド垂直ゲル上で、２６℃および１２０ｍＡｍｐで１７時間、ＰＣＲ産物（１０μｌ）を泳動した。ＮｕｃｌｅｏＣａｍ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｍａｇｅ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｕｃｌｅｏ  Ｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州サンマテオ）を用いて、エチジウムブロミド染色ゲル画像を分析した。１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列分析。Ｃｈａｎｄｌｅｒら（１９９７）に記載される方法にしたがって、配列分析を実行した。
【００５２】
ＤＮＡハイブリダイゼーション。先に記載された、Ｗａｙｎｅら（１９８７）の方法を用いて、ＤＳＭＺで、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを実行した。
【００５３】
ヌクレオチド配列分析。株Ｐ１１  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２の１６ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子配列のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号は、ＡＹ１７００３７８およびＤＱ２００２２である。
【００５４】
結果および考察
細胞形態。株Ｐ１１の細胞はまれにしか運動性でなく、棒状であり、グラム陽性染色され、そして単独でまたは鎖状で存在した。細胞は、０．７〜０．８μｍ  ｘ  ４〜５μｍであり、そして周毛性に鞭毛が生えていた（図１を参照されたい）。胞子はまれにしか存在しないが、存在する場合、非膨張性であり、そして末端近傍（ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌ）から末端に位置した。コロニーは、栄養アガー上、円状に見え、透明で、そして平らであった。
【００５５】
生理学。クロストリジウム・ラグスダレイは、厳密に嫌気性であった。酵母抽出物は増殖を刺激したが、これが存在しない場合、長期の遅滞期後に、最低限の増殖が観察された。Ｈ２／ＣＯ２またはＣＯ／ＣＯ２があると独立栄養増殖が起こり、そして以下の基質があると、化学有機栄養増殖が観察された：ピルベート、Ｄ−トレオース、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース、スクロース、エタノール、１−プロパノール、カザミノ酸、グルタメート、セリン、コリン、およびアラニン（表６）。マレートまたはフォルメートは、５．０〜６．５のｐＨ範囲で調べた場合であっても、初期には増殖を支持しなかった。しかし、試験したｐＨ範囲内で、約３０日間インキュベーションした後、Ｃ．リュングダーリーは、マレートを単独の炭素供給源として増殖可能であった。これは、この生物が、試験した条件下で、マレートへの適応を必要としうることを示す。グルコース上で増殖させた場合のＣ．リュングダーリーで、同様の必要条件が示されている。表６は、株Ｐ１１およびクロストリジウム・リュングダーリー株ＰＥＴＣの間の比較、ならびに単独の炭素およびエネルギー供給源としての基質上での増殖を示す。
【００５６】
【表６−１】
2010502191.tif 000011
【００５７】
【表６−２】
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【００５８】
株Ｐ１１は、初期ｐＨ６．３で最適に増殖し；初期ｐＨ値が４．０〜８．５の間の値で増殖が起きた（図２）。初期ｐＨ  ６．３で、緩衝されていない培地中で培養すると、最終ｐＨは４．１と測定された。増殖に最適の温度は３７℃であり（図３）；Ｐ１１が増殖する温度範囲は１８〜３７℃であった。
【００５９】
最適条件下で、フルクトースおよびＣＯとともに増殖させた際の株Ｐ１１の倍加時間は、それぞれ、０．１４３ｈ−１および０．１７５ｈ−１であった。しかし、キシロースとともに増殖させた場合、倍加時間は有意に減少し（０．２２０ｈ−１）、キシロースが株Ｐ１１の好ましい炭素およびエネルギー供給源でありうることが示された。
【００６０】
株Ｐ１１は、１ｍｍｏｌのフルクトースから２．３５ｍｍｏｌの酢酸を産生し；それに加えて、最終産物として、０．６３ｍｍｏｌのＣＯ２および０．５ｍｍｏｌのエタノールが産生された（表７）。他の酢酸生成生物、アセトバクテリウム・ウッディー（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ）、アセトバクテリウム・ウィエリンゲ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｉｅｒｉｎｇａｅ）およびアセトバクテリウム・カルビノリクム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｍ）もまた、ヘキソースの発酵中にエタノールを産生することが観察されている（Ｂｕｓｃｈｈｏｒｎら、１９８９）。アセテートは、Ｈ２／ＣＯ２上で増殖させた際、有意な量で形成される唯一の産物であり、これは、Ｃ．ラグスダレイが、おそらく、アセチル補酵素Ａ（アセチル−Ｃｏ−Ａ）Ｗｏｏｄ／Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路（Ｄｒａｋｅ  １９９４）を利用することを示す。
【００６１】
【表７】
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【００６２】
ＢＯＸ−ＰＣＲゲノムフィンガープリンティング。Ｃ．リュングダーリーおよび株Ｐ１１由来のＰＣＲ産物のゲル電気泳動の結果を比較した（未提示）。どちらも、共通して、サイズがおよそ１，３１０塩基対のバンド、サイズがおよそ１，２１０塩基対のバンド、サイズがおよそ９８０塩基対のバンド、サイズがおよそ８２０塩基対のバンド、サイズがおよそ４００塩基対のバンドを有した。Ｃ．リュングダーリーはまた、サイズが２，０００塩基対、１，７７０塩基対、１，４１０塩基対、１，３７０塩基対、１，２６０塩基対、１，０４０塩基対、６８０塩基対、および３６０塩基対のＰＣＲ産物バンドを有した。株Ｐ１１は、１，５００塩基対のユニークなバンドを有した。
【００６３】
したがって、これらの２つのクロストリジウムは、この技術を用いると、異なっていることが容易に示された。ゲノムフィンガープリンティングは、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションの代替法ではないが、この技術の使用は、近縁細菌株を区別しようと望む多くの研究室には価値あるツールとなりうる。
【００６４】
遺伝子分析。Ｐ１１の１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子配列の系統分析によって、この生物が、クロストリジウム属のクラスターＩ（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９９４）、本質的にはＪｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ（１９７５）のＩ群に属することが示された。このクラスターにおいて、株Ｐ１１は、５つの他のクロストリジウム：Ｃ．リュングダーリー、Ｃ．チロブチリクム（Ｃ．  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、Ｃ．マグヌム（Ｃ．  ｍａｇｎｕｍ）、Ｃ．パステウリアヌム（Ｃ．  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、およびＣ．スカトロゲネス（Ｃ．  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ）のユニット内に位置した。株Ｐ１１の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列は、やはりＣＯ上で増殖可能な酢酸生成菌である、クロストリジウム・リュングダーリーのもの、ＡＴＣＣ  Ｍ５９０９７（Ｔａｎｎｅｒら、１９９３）と最も類似であった（９９．９％）（図４）。
【００６５】
株Ｐ１１およびＣ．リュングダーリー間の１６Ｓ  ｒＤＮＡ類似性が高いため、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション研究を実行した。決定された値は５７パーセントであり、株Ｐ１１が新規の種であることが明らかに示された。ＤＮＡのｍｏｌ％Ｇ＋Ｃは２９〜３０％（ｎ＝５）であり、近縁クロストリジウム属種のものとやはり類似であった。
【００６６】
本実施例は、Ｃ．リュングダーリーおよび関連種に対する表現型上の相違、ならびに７０％未満のＤＮＡ−ＤＮＡ関連性を有する（Ｗａｙｎｅら、１９８７）という明らかな基準の両方に基づいて、クロストリジウム・ラグスダレイ株Ｐ１１が、別個の新規の種であることを示す。
【００６７】
実施例２．
最も望ましい結果を得るために、固有の特性を変化させることなく、効果、および生物内に含有されることがすでに見出されている特定の特徴を改善するか、最大にするかまたは最小にする研究は、最適化と定義されうる。最適化研究は、増殖、ならびに所望の発酵産物の産生を改善する戦略を開発する際の非常に重要な要素である。本発明者らの場合、エタノールが所望の最終産物である。
【００６８】
材料および方法
細菌株および培地。研究を通じて、クロストリジウム株Ｐ１１を用いた。一酸化炭素培地（ＣＯＭ）を用いて、培養物を培養し、そして維持した。増殖温度は３７℃であった。ＣＯＭは、最初にＮ２／ＣＯ２で１０ｐｓｉ（７０ｋＰａ）に加圧され、そして次いで１２１℃で１５分間オートクレーブされた、定義されていない緩衝培地である。該培地は、再蒸留水１リットルあたり：２５ｍｌのミネラル溶液（表１）、１０ｍｌの微量金属溶液（表２）、１０ｍｌのビタミン溶液（表３）、１．０ｇの酵母抽出物、１０ｇのＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）、０．００１ｇのレザズリン、４．０ｇのシステイン・ＨＣｌ、および４．０のＮａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを含有し；この培地の初期ｐＨは６．１〜６．３であった。厳密な嫌気的技術（Ｂａｌｃｈ  ＆  Ｗｏｌｆｅ、１９７６）を用いて、培地を調製した。一酸化炭素は、２１０ｋＰａ（３０ｐｓｉ）で提供される単独の基質であった。別に記載しない限り、３０ｐｓｉの圧下で、単独のまたは主な基質としてＣＯを用いてすべての増殖実験を行い、そして培地内へのガス拡散を最大にするため、水平にしてインキュベーションした。別に記載しない限り、標準接種物サイズは、中間期から後期指数増殖期に増殖しているストック培養物からトランスファーした約２％（ｖ／ｖ）であった。
【００６９】
分析法。アルミニウム密封試験管中、６００ｎｍ（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ２０Ｄ；  Ｍｉｌｔｏｎ  Ｒｏｙ）で分光光度的に増殖を測定した（Ｂａｌｃｈ  ＆  Ｗｏｌｆｅ、１９７６）。８０／１２０  Ｃａｒｂｏｐａｋ  Ｂ−ＤＡ／４％カーボワックス樹脂２０Ｍ（Ｓｕｐｅｌｃｏ、ペンシルバニア州ベルフォンテ）を充填した２ｍスチールカラムを装備したＶａｒｉａｎ  ３４００上、炎イオン化検出装置（ＦＩＤ）を装備したガスクロマトグラフ（ＧＣ）によって、アセテートおよびエタノールを同時に測定した。カラム、インジェクター、および検出装置温度は、それぞれ、１５５、２００、および２００℃であった。ヘリウムがキャリアーガスであり、そして流速を３０ｍｌ  ｍｉｎ−１に設定した。水素イオン濃度を電極によって測定した。
【００７０】
代謝阻害剤研究。フルオロ酢酸（ＦＡ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）のフィルター滅菌した嫌気性ストック溶液を最終濃度４．５Ｍに調製した。調製前に、ＦＡおよびＴＦＡ粉末を、嫌気性チャンバー中の小さいビーカー中に一晩放置して、捕捉されたいかなる酸素も粉末から拡散されるのを可能にした。増殖収量に比較して、最大エタノール産生になるような、酢酸生成を阻害する最小阻害濃度（ＭＩＣ）および最大有効濃度を決定するため、５ｍＭ〜２１０ｍＭの範囲の最終濃度をアッセイした。通常、Ｐ１１を接種する１日前に阻害剤を培地に添加して、嫌気性が維持されることを確実にした。すべての添加は、シリンジによって嫌気性に行った。この研究中、分光計によって増殖を定期的に測定した。休止細胞期終了の少し前に、液体試料（１ｍｌ）を採取し、そしてＧＣおよびＨＰＬＣによって分析するまで、凍結保存（−２０℃）した。
【００７１】
半連続バッチ培養。１００〜２００ｍＬの間の非修正ＣＯＭを含有する５００ｍＬ血清ボトルを用いて、長期半連続バッチ培養実験を行った。振盪条件（５０ｒｐｍ）中で増殖させた１つの培養と一緒に観察するために、ｐＨ  ５．５に修正したＣＯＭもまた添加した。７〜１０日ごとに、新鮮な非修正および修正ＣＯＭを使用済みの液体培地と交換し、そして気体雰囲気へのＨ２／ＣＯ２をの添加／交換およびＣＯによって、培養を維持した。ＣＯを少なくとも３０ｐｓｉまで添加した。培地交換中、増殖およびｐＨ測定値を記録し、そして液体試料（１．０ｍＬ）をここから採取し、そしてＧＣおよびＨＰＬＣによってエタノールおよびアセテートを分析するまで、凍結保存（−２０℃）した。
【００７２】
エタノール耐性。ＣＯ代謝および溶媒産生に対するエタノールの影響を株Ｐ１１で調べた。これらの研究経過中、株Ｐ１１が生存可能な初期最大濃度を決定した。１リットルあたり、１５〜３５グラムの範囲のエタノール濃度を含有するＣＯＭを含むＢａｌｃｈ試験管にＰ１１を接種し、そしておよそ１０日間、増殖を測定した。細胞が定常期のままになったら液体試料（１．０ｍＬ）を抽出し、そしてＧＣおよびＨＰＬＣによって分析するまで凍結保存（−２０℃）した。細胞が生存するための最大エタノール濃度を決定した後、株Ｐ１１を高溶媒条件に適応させるため、異なる濃度のエタノール（２０、３０、４０、および５０ｇ／Ｌ）を含有する１００〜２００ｍＬの間のＣＯＭを含有する５００ｍＬ血清ボトルを用いて、半連続バッチ培養実験を行った。フィルター滅菌したエタノールを、あらかじめ滅菌したＢａｌｃｈ試験管に添加し、そして次いで、Ｎ／ＣＯ２でパージして酸素を除去することによって、エタノールで修正したＣＯＭを調製した。培地を滅菌した後、エタノールを適切な濃度まで添加した。上記ですでに樹立した半連続バッチ培養から、Ｐ１１細胞をこれらのボトルに接種した。増殖およびｐＨを定期的に測定した。これらの測定のために抽出した培地の一部を、エタノールおよび酢酸濃度の分析用に取り置いた。
【００７３】
微量金属。鉄（Ｆｅ）、モリブデン（Ｍｏ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、およびニッケル（Ｎｉ）を多様な濃度で調べて、増殖収量およびエタノール産生に対する影響を決定した。非修正（１Ｘ）および修正（０Ｘおよび１０Ｘ）培地の３つ組試験管に株Ｐ１１を接種し、これらの個々の微量金属を各々、元来の金属濃度の１０Ｘおよび０Ｘで、ＣＯＭに添加するかまたはＣＯＭから除去した。培養物に４８時間ごとにＣＯを供給した。
【００７４】
また、小規模バッチ条件をシミュレートするため、１６０ｍＬ血清ボトル中、２つ組で、この実験を完了した。上記金属各々に関してストック溶液を調製し、そして煮沸および脱気前、培地調製物中に添加した。０μＭ金属試験濃度のための細胞において、金属イオン・キャリーオーバーを最小限にし、そして存在する金属の量を枯渇させるため、増殖実験を開始する前に、少なくとも６回のトランスファーを行った。細胞をより高い濃度の金属に適応させるため、各設定に関して、少なくとも２回のトランスファーを行った。この実験を３つ組で行い、そして７日間にわたって増殖を測定し、その後、ｐＨおよびエタノール濃度分析を完了した。
【００７５】
酵母抽出物。０〜２．０％の範囲の多様な濃度の酵母抽出物を調べて、増殖およびエタノール産生に対する影響を決定した。７日間にわたって増殖を測定し、そして実験終了時に、ｐＨおよびエタノール濃度を決定した。以下の濃度パーセントの酵母抽出物を調べた：０、０．０２５、０．０５、０．１、０．２。ＣＯが主な基質および炭素供給源であった。先のように、少なくとも６回の連続トランスファーを用いることによって、株Ｐ１１を、より低い濃度に適応させ、そしてより高い濃度に関しては少なくとも２回の連続トランスファーを用いた。
【００７６】
ｐＨ。ＣＯ代謝からのエタノール産生を増進するのに最適な条件を決定するため、最適ｐＨ研究を完了した。最適ｐＨを決定するため、培地を、（１．０ｇ  Ｌ−１）のＨＯＭＯＰＩＰＥＳ（ホモピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−２−［エタンスルホン酸］（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、オハイオ州クリーブランド）、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）、またはＴＥＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２−アミノエタンスルホン酸））で緩衝した。増殖を開始するのに、ＣＯで増殖させた定常期細胞の０．１ｍｌ（〜２％）接種物を用いた。これらの実験に用いたすべての培地構成要素は、別に記載しない限り、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）から得られた。これらの実験の完了時、ｐＨを決定し、そしてエタノールおよびアセテート濃度を分析した。
【００７７】
ｐＨに関する２セットの実験を行った。Ｂａｌｃｈ試験管中で第一のｐＨ実験を行い、そしてｐＨを維持することなく、５日間にわたって増殖を調べた。小さい血清ボトル（１２０ｍＬ）中で第二の実験を行って、エタノール産生に最適なｐＨを決定した。第二の設定では、滅菌１Ｎ  ＨＣｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨを添加することによって、ｐＨを調節した。
【００７８】
結果
代謝阻害剤−ＦＡ／ＴＦＡ。フルオロ酢酸（ＦＡ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に関して確立されたＭＩＣは、それぞれ１００ｍＭおよび１５０ｍＭであった。アッセイした多様な濃度のＦＡおよびＴＦＡの存在下で、エタノールおよびアセテート産生に関して、Ｐ１１では、明らかな傾向は確立されなかった（表８を参照されたい）。２０ｍＭ  ＦＡを含有するＣＯＭ中で増殖させた場合、Ｐ１１対照に比較して、増殖収量（ＯＤ）または最終産物に有意な相違は観察されなかった。しかし、３０ｍＭ以上のＦＡの存在下で、アセテート産生はほぼ９０パーセント減少し、そしてエタノール産生および増殖収量は、それぞれ５０および４０パーセント減少した。エタノール対アセテート比は、８０パーセント増加した。
【００７９】
３０ｍＭ  ＴＦＡを含有するＣＯＭ中で増殖させた場合、産生されるエタノールおよびアセテートは、それぞれ１２６および５２パーセント増加したが、溶媒対酸比はわずかにしか増加しなかった（５０％）。増殖収量は不変のままであった。これは、用いたどちらの阻害剤に関しても、カーボンフローが、酸から溶媒産生にシフトし、ＦＡの場合のみに増殖に影響があったことを示唆する。
【００８０】
【表８】
2010502191.tif 000014
【００８１】
半連続バッチ培養
Ｐ１１増殖収量は、４ヶ月間にわたって監視した間、安定なままであるかまたは増加し続けた。希釈に関して修正した後、１つのＰ１１培養の増殖収量は、２．４ＯＤ単位に達した。すべての培養物のｐＨは、一貫して、ほぼ４．３と測定された。最高の非修正エタノール収量が９５ｍＭ（４．４ｇ／Ｌ）であったのに対して、修正ＣＯＭ（ｐＨ５．５）は、２５２ｍＭ（１１．６ｇ／Ｌ）の最高エタノール収量およびエタノール対アセテート比を達成した。アセテート濃度の増加およびエタノール産生の減少は、ある期間にわたって培養された場合に一般的に示される傾向であった（おそらく株変性の指標）。例外は、ｐＨ  ５．５で開始したＰ１１培養であった（データ未提示）。
【００８２】
エタノール耐性
１５、２０、２５、３０、および３５ｇ／Ｌで修正したＣＯＭ中で株Ｐ１１を増殖させ、そして株Ｐ１１が３０ｇ／Ｌまでのエタノール濃度に初期耐性であり、最低阻害濃度は３５ｇ／Ｌであることを見いだした。エタノールを含まない非修正対照に比較して、すべてのエタノール濃度の存在下で、増殖は遅延された。２５ｇ／Ｌ修正培養では９８時間で増殖したことを例外として、修正培養に関しては、測定可能な培養は、４８時間まで達成されなかった（データ未提示）。最高エタノール濃度での最適増殖は、２０ｇ／Ｌで生じた。
【００８３】
２０ｇ／Ｌ濃度の存在下で増殖する培養を用いて、そして半連続バッチ培養を開始し、そして維持した。２０ｇ／Ｌで培養が樹立された場合、３０ｇ／Ｌに適応させる試みは成功した。この適応プロセスは、５０ｇ／Ｌの濃度に到達するまで続いた。この値を超えると、数回試みたものの、５０ｇ／Ｌより高い濃度では培養は樹立不能であった。５０ｇ／Ｌの濃度での増殖は、０．５５ＯＤ単位を超えて維持されることは不能であったが、監視の間中、このレベルに近い値を維持した。アセテートおよびエタノール産生は、監視の間中、入り混じった結果を示し、そしてしたがって、これらの培養では明確な傾向は確立されなかった。
【００８４】
微量金属
Ｐ１１におけるＣＯ代謝に対する、金属除去および添加の影響を試験した。Ｆｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、およびＮｉの除去は、ＣＯ代謝を制限した。しかし、Ｍｏの非存在下では、ＣＯ代謝はわずかに増加した。増加したレベルのＭｏ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｃｕ、およびＮｉ（それぞれ２００μＭ、８０μＭ、１２μＭ、および８μＭ）は、ＣＯ代謝を刺激し、そして４８時間供給した後に特に顕著であった（データ未提示）。
【００８５】
溶媒対酸比は、Ｍｏ以外のすべての金属を除去すると改善された。ＦｅおよびＮｉを除去した場合、溶媒対酸比に３００および４００パーセント近い増加があった。ＣｏおよびＣｕの除去はアセテート産生を減少させ、溶媒対酸比を増加させ、一方、Ｍｏ除去はアセテート産生を増加させた。
【００８６】
酵母抽出物
株Ｐ１１は、最初に、０％酵母抽出物濃度では増殖せず、そして上述の他の濃度でのみ増殖実験を行った。しかし、ほぼ４週間後、増殖の証拠が観察された。この時点以降、１〜２週間ごとにトランスファーを行い、そして最初の試験管にＣＯを再供給した。少なくとも１５回トランスファーを行った。したがって、Ｐ１１は、複雑な培地構成要素である酵母抽出物の非存在下でも、増殖に適応可能である。
【００８７】
エタノール産生に関する最適ｐＨ効果
増殖およびアルコール：酸比を測定した。Ｃ．ラグスダレイにおけるＣＯ代謝およびエタノール産生に関する最適ｐＨは、５．５〜６．０の間であると決定された。５．５および６．０の初期ｐＨでの培養のエタノール：アセテート比は、それぞれ、０．７：１および０．６：１であった。
【００８８】
考察
ＦＡ／ＴＦＡ
以前、５０ｍＭ濃度のフルオロ酢酸は、好熱性クロストリジウムの増殖を阻害することが示されている（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、１９８６）。本明細書に提示するデータの重要性は、同一条件中で維持された対照株に比較した際、フルオロ酢酸およびトリフルオロ酢酸の存在下で、Ｐ１１によるエタノール産生の増加が示されたことである。
【００８９】
株Ｐ１１は、初期単離に際して、１リットルあたり３０グラムの濃度のエタノールによって阻害された。Ｙａｍａｎｏら、１９９８の適応技術と同様に、適応によって、より高い濃度のエタノールに耐性を示すよう培養物を適応させた。現在までに、培養物は、１リットルあたり５０グラムのエタノール濃度で、完全に機能するよう適応している。この例は、産業微生物学で用いられる適応法を用いて、エタノールおよび／または酢酸産生の微生物触媒としての株Ｐ１１の性能を増進可能であることを示す。
【００９０】
本発明は好ましい態様に関して記載されてきているが、当業者は、付随する請求項の精神および範囲内で修飾を加えて、本発明を実施可能であることを認識するであろう。したがって、本発明は、上述のような態様に限定されるべきではなく、本明細書に提供する説明の精神および範囲内のすべての修飾および同等物をさらに含むはずである。
【符号の説明】
【００９１】
１００  容器
１０１  制御装置
２００  第二の容器
２０１  輸送装置
【受託番号】
【００９２】
クロストリジウム・ラグスダレイ：称号ＢＡＡ−６２２のもとに、２００２年１０月、バージニア州マナサスのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、そして再び、称号ＰＴＡ−７８２６のもとに２００６年６月１４日に寄託された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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