(57)【要約】本開示は、天然由来の野生型ケトレダクターゼ酵素と比較して改善された特性を有する操作されたケトレダクターゼ酵素を提供する。前記操作されたケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、前記操作されたケトレダクターゼ酵素を発現することができる宿主細胞、およびキラル化合物を合成するために前記操作されたケトレダクターゼ酵素を使用する方法も提供する。ある実施形態において、本発明のケトレダクターゼポリペプチドは、３−ケトチオランを（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに少なくとも約７０％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができる。
2010536385.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ケトチオランを（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに少なくとも約７０％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができるケトレダクターゼポリペプチド。
【請求項２】
Ｘ１４５に対応する残基にセリンを有する配列番号２または４または１４２に基づく参照配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含むが、但し、そのケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、Ｘ１４５に対応する残基に極性残基を有することを条件とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、Ｘ１４５に対応する残基にセリンを有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、次のもの：
Ｘ３に対応する残基が、極性、酸性、または芳香族残基である；
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ１１に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ１６に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２３に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；
Ｘ４１に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ４５に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ４９に対応する残基が、塩基性残基である；
Ｘ５７に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ６０に対応する残基が、芳香族、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ６４に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ７２に対応する残基が、塩基性残基である；
Ｘ８２に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ９７に対応する残基が、酸性、塩基性、または脂肪族残基である；
Ｘ１０６に対応する残基が、酸性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１１に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１２６に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１２７に対応する残基が、極性または塩基性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族残基、非極性、または極性残基である；
Ｘ１５２に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１６３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ１７７に対応する残基が、塩基性残基である；
Ｘ１９２に対応する残基が、塩基性または酸性残基である；
Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、非極性、酸性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ２００に対応する残基が、拘束、酸性、または塩基性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である；
Ｘ２０８に対応する残基が、極性、拘束、または塩基性残基である；
Ｘ２１０に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性または酸性残基である；
Ｘ２１４に対応する残基が、非極性、脂肪族、または極性残基である；
Ｘ２１７に対応する残基が、芳香族、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ２２３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ２２６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である、から選択される１つ以上の特徴を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、次のもの：
Ｘ３に対応する残基が、アスパラギン、アスパラギン酸、またはチロシンである；
Ｘ７に対応する残基が、グリシン、ヒスチジン、セリン、またはアスパラギンである；
Ｘ１１に対応する残基が、イソロイシンまたはトレオニンである；
Ｘ１６に対応する残基が、トレオニン、アラニン、バリン、またはグリシンである；
Ｘ１９に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ２３に対応する残基が、イソロイシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ４１に対応する残基が、セリン、アラニン、またはバリンである；
Ｘ４５に対応する残基が、グルタミン酸またはグリシンである；
Ｘ４９に対応する残基が、リジンまたはアルギニンである；
Ｘ５７に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ６０に対応する残基が、フェニルアラニン、バリン、またはトレオニンである；
Ｘ６４に対応する残基が、アラニン、セリン、またはトレオニンである；
Ｘ７２に対応する残基が、リジンまたはアルギニン、特にアルギニンである；
Ｘ８２に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリン、トレオニン、セリン、またはアルギニンである；
Ｘ９５に対応する残基が、バリンまたはアラニンである；
Ｘ９６に対応する残基が、アスパラギン、セリン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；
Ｘ９７に対応する残基が、リジン、アルギニン、またはロイシンである；
Ｘ１０６に対応する残基が、グルタミン酸またはアスパラギン酸である；
Ｘ１０８に対応する残基が、アルギニンまたはヒスチジンである；
Ｘ１１１に対応する残基が、ロイシンまたはメチオニンである；
Ｘ１１７に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ１２６に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ１２７に対応する残基が、グルタミンまたはアルギニンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシン、またはセリンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、トレオニン、セリン、またはメチオニンである；
Ｘ１５７に対応する残基が、アスパラギン、グルタミン、トレオニン、セリン、またはアスパラギン酸である；
Ｘ１６３に対応する残基が、バリンまたはイソロイシンである；
Ｘ１７３に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；
Ｘ１７７に対応する残基が、リジンまたはアルギニンである；
Ｘ１９２に対応する残基が、リジン、アルギニン、またはグルタミン酸である；
Ｘ１９４に対応する残基が、プロリン、グリシン、アスパラギン酸、アルギニン、またはロイシンである；
Ｘ１９８に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；
Ｘ２００に対応する残基が、プロリン、グルタミン酸、またはリジンである；
Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはグルタミンである；
Ｘ２０８に対応する残基が、グルタミン、ヒスチジン、またはアルギニンである；
Ｘ２１０に対応する残基が、トレオニンまたはアラニンである；
Ｘ２１１に対応する残基が、リジンまたはグルタミン酸である；
Ｘ２１４に対応する残基が、メチオニン、バリンまたはトレオニン、またはセリンである；
Ｘ２１７に対応する残基が、イソロイシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ２２３に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ２２６に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである、から選択される１つ以上の特徴を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、次のもの：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である；
Ｘ２２３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である、から選択される特徴の１つ以上または少なくともすべてを有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または拘束残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、少なくとも次の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である、を有し；そして
前記アミノ酸配列が、他のアミノ酸残基に、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
残基Ｘ１４５に対応する残基がセリンである配列番号２または４または１４２に基づく参照配列の残基９０から２１１と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を有するドメインを含むが、但し、該ポリペプチドの該ドメインのアミノ酸配列が、Ｘ１４５に対応する残基に極性残基を有することを条件とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
残基Ｘ１４５に対応する残基が、セリンである、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
残基９０から２１１に対応するアミノ酸配列が、
Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ９５に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；
Ｘ１０６に対応する残基が、酸性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；
Ｘ１１１に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１２６に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１２７に対応する残基が、極性または塩基性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族残基、非極性、または極性残基である；
Ｘ１５２に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ１６３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ１７７に対応する残基が、塩基性残基である；
Ｘ１９２に対応する残基が、塩基性または酸性残基である；
Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、非極性、酸性、または脂肪族残基である；
Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または非極性残基である；
Ｘ２００に対応する残基が、拘束、酸性、または塩基性残基である；
Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である；
Ｘ２０８に対応する残基が、極性、拘束、または塩基性残基である；
Ｘ２１０に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性または酸性残基である、から選択される特徴の１つ以上を有し；そして
前記アミノ酸配列が、残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基で、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
残基９０から２１１に対応するアミノ酸配列が、
Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリン、トレオニン、セリン、またはアルギニンである；
Ｘ９５に対応する残基が、バリンまたはアラニンである；
Ｘ９６に対応する残基が、アスパラギン、セリン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；
Ｘ９７に対応する残基が、リジン、アルギニン、またはロイシンである；
Ｘ１０６に対応する残基が、グルタミン酸またはアスパラギン酸である；
Ｘ１０８に対応する残基が、アルギニンまたはヒスチジンである；
Ｘ１１１に対応する残基が、ロイシンまたはメチオニンである；
Ｘ１１７に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；
Ｘ１２６に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ１２７に対応する残基が、グルタミンまたはアルギニンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシン、またはセリンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、トレオニン、セリン、またはメチオニンである；
Ｘ１５７に対応する残基が、アスパラギン、トレオニン、セリン、またはアスパラギン酸である；
Ｘ１６３に対応する残基が、バリンまたはイソロイシンである；
Ｘ１７３に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；
Ｘ１７７に対応する残基が、リジンまたはアルギニンである；
Ｘ１９２に対応する残基が、リジン、アルギニン、またはグルタミン酸である；
Ｘ１９４に対応する残基が、プロリン、グリシン、アスパラギン酸、アルギニン、またはロイシンである；
Ｘ１９８に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；
Ｘ２００に対応する残基が、プロリン、グルタミン酸、またはリジンである；
Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはグルタミンである；
Ｘ２０８に対応する残基が、グルタミン、ヒスチジン、またはアルギニンである；
Ｘ２１０に対応する残基が、トレオニンまたはアラニンである；
Ｘ２１１に対応する残基が、リジンまたはグルタミン酸である、から選択される特徴の１つ以上を有し；そして
前記アミノ酸配列が、残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基で、前記参照配列と比較して１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
残基Ｘ７に対応する残基にセリンを有する配列番号２または４または１４２に基づく参照配列の残基１から８９と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を有するドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ドメインが、次のもの：
Ｘ３に対応する残基が、極性、酸性、または芳香族残基である；
Ｘ７に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ１１に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ１６に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２３に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；
Ｘ４１に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ５７に対応する残基が、脂肪族または極性残基である；
Ｘ６０に対応する残基が、芳香族、脂肪族、非極性、または極性残基である；
Ｘ７２に対応する残基が、塩基性残基である；
Ｘ８２に対応する残基が、非極性または極性残基である、から選択される１つ以上の特徴をさらに有し得；そして
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基での１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
残基１から８９に対応するアミノ酸配列が、下記の、
Ｘ３に対応する残基が、アスパラギン、アスパラギン酸、またはチロシンである；
Ｘ７に対応する残基が、グリシン、セリン、またはアスパラギンである；
Ｘ１１に対応する残基が、イソロイシンまたはトレオニンである；
Ｘ１６に対応する残基が、トレオニン、アラニン、バリン、またはグリシンである；
Ｘ１９に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ２３に対応する残基が、イソロイシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ４１に対応する残基が、セリン、アラニン、またはバリンである；
Ｘ４９に対応する残基が、リジンまたはアルギニンである；
Ｘ５７に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ６０に対応する残基が、フェニルアラニン、バリン、またはトレオニンである；
Ｘ７２に対応する残基が、リジンまたはアルギニンである；および
Ｘ８２に対応する残基が、グリシンまたはセリンである、から選択される特徴の１つ以上を有し；そして
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基１〜８９に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基での１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
残基Ｘ２２３に対応する残基にバリンを有する配列番号２または４または１４２に基づく参照配列の残基２１２から２５２と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を有するドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
残基２１２から２５２に対応するアミノ酸配列が、下記の、
Ｘ２１４に対応する残基が、非極性、脂肪族または極性残基である；
Ｘ２１７に対応する残基が、芳香族、脂肪族、または非極性残基である；
Ｘ２２３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ２２６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である、から選択される特徴の１つ以上を有し；そして
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基２１２〜２５２に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基での１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
残基２１２から２５２に対応するアミノ酸配列が、下記の、
Ｘ２１４に対応する残基が、メチオニン、バリン、トレオニン、またはセリンである；
Ｘ２１７に対応する残基が、イソロイシンまたはフェニルアラニンである；
Ｘ２２３に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；
Ｘ２２６に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである、から選択される特徴の１つ以上を有し；そして
前記アミノ酸配列が、前記参照配列と比較して残基２１２〜２５２に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基での１つ以上の相違を必要に応じて有し得る、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記立体異性体過剰率が、少なくとも約９０％である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、９４、９６、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１２６、１２８、１３０、または１３４に対応するアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記立体異性体過剰率が、少なくとも約９８％である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
配列番号６、８、１０、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、３６、３８、４０、４２、５０、５２、５４、５８、６２、６６、７０、７２、７６、７８、８０、または１３４に対応するアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号４の野生型ポリペプチドよりも改善された率で３−ケトチオランを（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに変換することができ、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、１２４、１２６、１３０、または１３４に対応するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
３−ケトチオランを（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに少なくとも約９５％の立体異性体過剰率で立体選択的に還元することができ、配列番号４の野生型ポリペプチドと比較して改善された活性および熱安定性を有し、配列番号６、８、１２、１４、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４２、４４、４６、５０、５２、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、または１３４に対応するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
請求項１から３５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３７】
配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、および１３３から成る群より選択される、請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
宿主細胞における発現の指図に適する少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結された、請求項３６または３７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３９】
前記制御配列が、プロモーターを含む、請求項３８に記載の発現ベクター。
【請求項４０】
前記プロモーターが、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターを含む、請求項３９に記載の発現ベクター。
【請求項４１】
前記制御配列が、分泌シグナルを含む、請求項３８に記載の発現ベクター。
【請求項４２】
請求項３８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４３】
Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
前記発現ベクターを構成するコドンが、前記宿主細胞における発現のために最適化されている、請求項４２に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
３−ケトチオランを（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに還元または変換するために適する反応条件下で、３−ケトチオランと請求項１から３６のいずれか一項に記載のケトレダクターゼポリペプチドとを接触させることを含む、基質３−ケトチオランを生成物（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに立体選択的に還元するための方法。
【請求項４６】
３−ケトチオランが、少なくとも約７０％の立体異性体過剰率で（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに還元される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ケトレダクターゼポリペプチドを用いて、３−ケトチオランが、少なくとも約９０％の立体異性体過剰率で（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに還元される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記３−ケトチオラーゼが、少なくとも約９８％の立体異性体過剰率で（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに還元される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記基質が少なくとも１００ｇ／Ｌであり、該基質の少なくとも９０％が２４時間未満で生成物に変換され、前記ケトレダクターゼポリペプチドが、約０．８〜１．０ｇ／Ｌであり、且つ、配列番号６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、１２６、１３０、および１３４から成る群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記基質が少なくとも１００ｇ／Ｌであり、該基質の少なくとも９０％が２０時間未満で生成物に変換され、前記ケトレダクターゼポリペプチドが、約０．８〜１．０ｇ／Ｌであり、且つ、配列番号２６、４４、６８、および１０４から成る群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
約７．５以下のｐＨで行われる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
約５．０から約７．５のｐＨで行われる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記ケトレダクターゼ酵素を発現する全細胞、またはそのような細胞の抽出物もしくは溶解産物を用いて行われる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
前記ケトレダクターゼが、単離および／または精製され、ならびに前記還元反応が、該ケトレダクターゼのための補因子および必要に応じて該補因子のための再生系の存在下で行われる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記補因子再生系が、グルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース；ギ酸デヒドロゲナーゼおよびホルマート；またはイソプロパノールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第二級アルコールデヒドロゲナーゼが、ケトレダクターゼである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
構造式（Ｉ）の化合物と請求項１に記載のケトレダクターゼとを含む、組成物。
【請求項５８】
補因子再生系をさらに含む、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記補因子再生系が、グルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース；ギ酸デヒドロゲナーゼおよびホルマート；またはイソプロパノールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、請求項５８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の引用
本願は、米国特許法第１１９条第（ｅ）項のもとで、２００７年８月２４日に出願された出願番号６０／９５７，９７４の利益を主張する。この出願の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
２．技術分野
本開示は、操作されたポリペプチド、およびこれらのポリペプチドの使用に関する。
【０００３】
３．配列表、表またはコンピュータプログラムの援用
米国特許法施行規則第１．８２１条のもとでＥＦＳ−Ｗｅｂを介してコンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）で３７６２４７−０１６．ｔｘｔとのファイル名で、本願と同時に提出された配列表は、その全体が本明細書中に参考として援用される。この配列表の電子コピーは、２７２キロバイトのファイルサイズで、２００８年８月２４日に作成された。
【背景技術】
【０００４】
４．背景
ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）またはカルボニルレダクターゼクラス（ＥＣ１．１．１．１８４）に属する酵素は、対応するプロ立体異性体ケトン基質からの光学活性アルコールの合成に有用である。ＫＲＥＤは、代表的に、ケトンまたはアルデヒド基質を対応するアルコール生成物に変換するが、逆反応、すなわちアルコール基質の対応するケトン／アルデヒド生成物への酸化も触媒し得る。ＫＲＥＤなどの酵素によるケトンおよびアルデヒドの還元、ならびにアルコールの酸化は、補因子、最も一般的には還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、および酸化反応にはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を必要とする。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、電子供与体としての役割を果たし、その一方でＮＡＤおよびＮＡＤＰは、電子受容体としての役割を果たす。ケトレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼが、リン酸化された補因子またはリン酸化されていない補因子のいずれか（その酸化および還元状態のもの）を受容することが、多くの場合、観察される。
【０００５】
ＫＲＥＤ酵素は、広範にわたる細菌および酵母において見つけることができる（概説について：ＫｒａｕｓおよびＷａｌｄｍａｎ，Ｅｎｚｙｍｅ  ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｖｏｌｓ．１＆２．ＶＣＨ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  １９９５；Ｆａｂｅｒ，Ｋ．，Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．２０００；非特許文献１）。幾つかのＫＲＥＤ遺伝子および酵素配列が報告されている。例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ  （Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＣ７３３８；ＧＩ：１１３６０５３８）Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ２４５２８．１；ＧＩ：２８１５４０９）、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ１６０７９９；ＧＩ：６５３９７３４）。
【０００６】
重要な化合物の生産のための多くの化学合成手順を回避するために、異なるケト基質のキラルアルコール生成物への酵素的変換にケトレダクターゼが利用されることが増えている。これらの用途は、ケトレダクターゼを発現する全細胞を生体触媒的ケトンおよびアルデヒド還元に利用することがあり、または全細胞中の多数のケトレダクターゼの存在が所望の生成物の立体化学的純度および収量に悪影響を及ぼす場合には精製された酵素を利用することもある。インビトロ用途には、補因子（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）再生酵素、例えばグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ギ酸デヒドロゲナーゼなどがケトレダクターゼと併用される。有用な化合物を生成するためにケトレダクターゼを使用する例としては、４−クロロアセト酢酸エステルの不斉還元（非特許文献２；非特許文献３；特許文献１；特許文献２および特許文献３）、ジオキソカルボン酸の還元（例えば、特許文献４）、（Ｓ）クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔ−ブチルの還元（例えば、特許文献５および特許文献６）、ピロロトリアジン系化合物の還元（例えば、特許文献７）；置換アセトフェノンの還元（例えば、特許文献８）；およびケトチオランの還元（特許文献９）が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，５５９，０３０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７００，６７０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８９１，６８５号明細書
【特許文献４】米国特許第６，３９９，３３９号明細書
【特許文献５】米国特許第６，６４５，７４６号明細書
【特許文献６】国際公開第０１／４０４５０号パンフレット
【特許文献７】米国特許出願公開第２００６／０２８６６４６号明細書
【特許文献８】米国特許第６，８００，４７７号明細書
【特許文献９】国際公開第２００５／０５４４９１号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＨｕｍｍｅｌおよびＫｕｌａ，１９８９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８４：１〜１３
【非特許文献２】Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８３，１０５：５９２５−５９２６
【非特許文献３】Ｓａｎｔａｎｉｅｌｌｏ，Ｊ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（Ｓ）１９８４：１３２−１３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
様々なケトおよびアルデヒド基質のその対応するキラルアルコール生成物への変換を行うために使用することができる他のケトレダクターゼ酵素を同定することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
５．要旨
本開示は、３−ケトチオラン（本明細書では、以後、「基質」と呼ぶ）を（Ｒ）−３−ヒドロキシチオラン（本明細書では、以後、「生成物」と呼ぶ）に還元する能力を有するケトレダクターゼポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびそれらのペプチドの使用方法を提供する。一般に、本開示の操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、定義したケト基質の対応するキラルアルコール生成物への変換に関して、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ（「Ｌ．ｋｅｆｉｒ」；配列番号４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（「Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ」；配列番号２）、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒ（「Ｌ．ｍｉｎｏｒ」；配列番号１４２）から得られる天然由来の野生型ケトレダクターゼ酵素と比較して、改善された特性を有する。酵素活性の改善としては、立体選択性の増大、酵素活性の増大、熱安定性の増大、溶媒安定性の増大、還元産物阻害の増大、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００１１】
一部の実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１４２の参照配列の位置１４５に対応するアミノ酸残基が酸性残基、すなわちグルタミン酸またはアスパラギン酸ではないアミノ酸配列を含む。従って、位置１４５に対応する残基は、非酸性残基である。一部の実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、位置１４５に対応する残基が極性残基であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、Ｘ１４５に対応するこの残基はセリンである。
【００１２】
一部の実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１４５に対応する残基にセリンを有する配列番号２または配列番号４または配列番号１４２に基づく参照配列（またはその１領域もしくはドメイン、例えば、残基９０〜２１１）と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するが、但し、そのケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列が、Ｘ１４５に対応する残基に極性残基を有することを条件とする。一部の実施形態において、Ｘ１４５に対応する残基はセリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１４５に対応する残基が極性残基、特にセリンである、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式、またはそれらの１ドメイン、例えば残基９０〜２１１に基づく。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、参照配列、例えば配列番号４、２または１４２の参照配列と比較して、アミノ酸配列またはその規定されたドメインもしくは領域での１つ以上のアミノ酸残基の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ドメインにおけるアミノ酸配列相違は、非保存的アミノ酸置換、保存的アミノ酸置換、および非保存的アミノ酸置換と保存的アミノ酸置換との組み合わせを含み得る。そのような変更を行うことができる様々なアミノ酸残基位置を本明細書に記載する。
【００１３】
一部の実施形態において、本明細書に記載するケトレダクターゼポリペプチドは、Ｌ．ｋｅｆｉｒからの野生型酵素（すなわち、配列番号４）より高い立体異性体過剰率で、前記基質を前記生成物に立体選択的に還元することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載するケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約７０％の立体異性体過剰率で基質ケトチオランを生成物（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランに立体選択的に還元することができる。
【００１４】
一部の実施形態において、本開示は、約９０％より高い立体異性体過剰率（ｓ．ｅ．）で前記基質を前記生成物に還元することができる高立体選択的ケトレダクターゼポリペプチドを提供する。そのような高立体選択性を有する例示的ケトレダクターゼポリペプチドとしては、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、９４、９６、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１２６、１２８、１３０、および１３４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
一部の実施形態において、本開示は、約９８％より高いｓ．ｅ．で前記基質を前記生成物に還元することができる、立体選択的ケトレダクターゼポリペプチドを提供する。そのような立体選択性を有する例示的ポリペプチドとしては、配列番号６、８、１０、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、３６、３８、４０、４２、５０、５２、５４、５８、６２、６６、７０、７２、７６、７８、８０および１３４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
一部の実施形態において、前記操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、定義したケト基質の生成物への還元に関して、野生型ケトレダクターゼ酵素と比較して増大した酵素活性を有することができる。前記改善の量は、対応する野生型ケトレダクターゼ酵素の１．５倍の酵素活性から、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、またはそれ以上の酵素活性に及ぶことがある。特定の実施形態において、前記操作されたケトレダクターゼ酵素は、野生型ケトレダクターゼ酵素のものより１．５から５０倍、１．５から１００倍大きい範囲の改善された酵素活性を示す。野生型酵素よりも改善された率で前記基質を前記生成物に変換することができる例示的ポリペプチドとしては、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、１２４、１２６、１３０、および１３４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
一部の実施形態において、本開示は、野生型酵素より改善された活性および安定性を有し、且つ、約９５％より高いｓ．ｅ．で前記基質を前記生成物に還元することができる、ケトレダクターゼポリペプチドを提供する。そのような能力を有する例示的ポリペプチドとしては、配列番号６、８、１２、１４、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４２、４４、４６、５０、５２、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、および１３４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
一部の実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、高温下で野生型と比較した場合の酵素活性率の増加によって判定されるようなそれらの熱安定性に関して、野生型と比較して改善されている。改善された安定性を有する例示的ケトレダクターゼポリペプチドとしては、配列番号６、８、１２、１４、２２、２４、２６、３２、３４、３６、３８、４２、４４、４６、５０、５２、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、１２４、および１３４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載する操作されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチド、または高ストリンジェント条件下でそのようなポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、コードされた操作されたケトレダクターゼの発現に有用なプロモーターおよび他の調節エレメントを含むことができ、特定の所望される発現系について最適化されたコドンを利用することができる。例示的ポリヌクレオチドとしては、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、および１３３に対応するヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
別の態様において、本開示は、前記ケトレダクターゼポリペプチドの操作および発現のためのポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。前記宿主細胞は、Ｌ．Ｋｅｆｉｒ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、もしくはＬ．ｍｉｎｏｒであってよく、または他の生物であってもよい。本明細書に記載する操作されたケトレダクターゼ酵素の発現および単離に前記宿主細胞を用いることができ、あるいは３−ケトチオラン基質のキラル（Ｒ）−３−ヒドロキシチオラン生成物への変換にそれらを直接用いることができる。
【００２１】
前記方法を全細胞で行うにせよ、細胞抽出物で行うにせよ、または精製されたケトレダクターゼ酵素で行うにせよ、単一のケトレダクターゼ酵素を用いることができ、あるいは、２つ以上のケトレダクターゼ酵素の混合物を用いることができる。
【００２２】
先に述べたように、本明細書に記載するケトレダクターゼ酵素は、構造式（Ｉ）の化合物、すなわち３−ケトチオラン
【００２３】
【化１】
2010536385.tif 000003
のケト基の、構造式（ＩＩ）の対応するキラルアルコール生成物、すなわち（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランへの還元反応を触媒することができる。
【００２４】
【化２】
2010536385.tif 000004
従って、一部の実施形態において、本開示は、３−ケトチオラン（「基質」）を（Ｒ）−３−ヒドロキシチオラン（「生成物」）に還元するための方法を提供し、この方法は、基質の生成物への還元または変換に適する反応条件下で、基質と本開示のケトレダクターゼポリペプチドとを接触させるまたはインキュベートすることを含む。この方法の一部の実施形態において、前記基質は、少なくとも約６５％よりも高いまたは少なくとも野生型よりも高い立体異性体過剰率で、前記生成物に還元される。
【００２５】
この方法の一部の実施形態において、前記基質は、約９０％より高いｓ．ｅ．で前記生成物に還元され、この場合のケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、９４、９６、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１２６、１２８、１３０、および１３４に対応するアミノ酸配列を含む。
【００２６】
この方法の一部の実施形態において、前記基質は、約９８％より高いｓ．ｅ．で前記生成物に還元され、この場合のケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、３６、３８、４０、４２、５０、５２、５４、５８、６２、６６、７０、７２、７６、７８、８０、および１３４に対応するアミノ酸配列を含む。
【００２７】
前記基質を前記生成物に還元するためのこの方法の一部の実施形態において、前記基質は、野生型酵素（配列番号４）と比較して少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、または２０倍以上の改善された率で前記生成物に還元され、この場合のケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、１２４、１２６、１３０、および１３４に対応するアミノ酸配列を含む。
【００２８】
一部の実施形態において、前記方法は、薬物化合物などの他の化合物の合成における前記ケトレダクターゼポリペプチドの使用に関する。一部の実施形態において、前記方法は、下記構造式（ＩＩＩ）を有する抗生物質スロペネム（ＣＰ−７０，４２９）の合成における前記ケトレダクターゼポリペプチドの使用に関する：
【００２９】
【化３】
2010536385.tif 000005
従って、構造式（ＩＩＩ）の抗生物質（すなわち、ＣＰ−７０，４２９）の合成のための方法に関する一部の実施形態において、その方法における１つの工程は、構造式（Ｉ）の基質の構造式（ＩＩ）の生成物への変換または還元に適する反応条件下で、式（Ｉ）の基質と本明細書に記載するケトレダクターゼのいずれかとを接触させることを含み得る。少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の立体異性体過剰率の構造式（ＩＩ）の化合物を、式（ＩＩＩ）の化合物の調製の際に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】式（Ｉ）の基質化合物、すなわち３−ケトチオランの式（ＩＩ）の対応するキラルアルコール生成物、すなわち（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランへの変換の際のケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）の役割を図解する。この反応において、前記基質は、対応する（Ｒ）−アルコールに生体触媒により還元される。この還元は、本開示のＫＲＥＤと、ＮＡＤＰＨなどの補因子とを用いる。グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を使用してＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨに変換／再循環することができる。グルコースは、グルコン酸に変換され、そしてまたそれが、水酸化ナトリウムの添加によりそのナトリウム塩（グルコン酸ナトリウム）に変換される。実施例９は、この反応を行うための非限定的な方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
７．１  定義
本明細書において用いる場合、以下の用語は、以下の意味を有すると解釈する。
【００３２】
「ケトレダクターゼ」および「ＫＲＥＤ」は、カルボニル基をその対応するアルコールに還元する酵素能力を有するポリペプチドを指すために、本明細書では交換可能に用いている。より具体的には、本明細書に記載するケトレダクターゼポリペプチドは、上記の式（Ｉ）の化合物を上記の式（ＩＩ）の対応する生成物に立体選択的に還元することができる。前記ポリペプチドは、還元剤として補因子である還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を代表的に利用する。本明細書において用いる場合のケトレダクターゼは、天然由来（野生型）ケトレダクターゼ、ならびに人間の操作によって生成された非天然由来の操作されたポリペプチドを含む。
【００３３】
「コーディング配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸のその部分（例えば、遺伝子）を指す。
【００３４】
「天然由来の」または「野生型」は、自然界で見つけられる形態を指す。例えば、天然由来または野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然界の源から単離することができ、人間の操作によって故意に修飾されていない、生物体内に存在する配列である。
【００３５】
例えば細胞、核酸またはポリペプチドに関して用いるときの「組換え体」は、そうしなければ自然界に存在しないであろう方法で修飾された、またはそれと同一のものであるが合成材料からおよび／もしくは組換え技術を用いる操作によって生産もしくは誘導された、材料、またはその材料の自然なもしくは天然の形態に対応する材料を指す。非限定的な例としては、数ある中でも、天然（非組換え）形態のその細胞内では見つけられない遺伝子を発現する組換え細胞、またはそうでなければ異なるレベルで発現される天然遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。
【００３６】
「配列同一性百分率」および「相同性百分率」は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド間の比較を指すために本明細書では交換可能に用いており、これらは、ある比較ウインドウに関して２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定され、この場合、その比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、それら２配列の最適なアラインメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある。前記百分率は、同一核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列内に出現する位置の数を決定して一致した位置の数を得、その一致した位置の数を比較ウインドウ内の全位置数で割り、その結果に１００をかけて配列同一性百分率を得ることによって計算することができる。あるいは、前記百分率は、同一核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列内に出現する位置または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップとアラインされる位置の数を決定して一致した位置の数を得、その一致した位置の数を比較ウインドウ内の全位置数で割り、その結果に１００をかけて配列同一性百分率を得ることによって計算することができる。２つの配列をアラインするために利用できる多くの確立されたアルゴリズムがあることは当業者に理解される。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性探索法によって、これらのアルゴリズム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅの中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータでの実施によって、または目視検査（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との合同ベンチャー（１９９５年補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）参照）によって行うことができる。配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントの決定に適するアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，１９７７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３８９−３４０２に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ウェブサイトを通して公的に入手することができる。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードとアラインしたときある正の値の閾値スコアＴと一致するまたはある���の値の閾値スコアＴを満たす、クエリ配列中の長さＷの短いワードを特定することによって、高いスコアになる配列の対（ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｉｒ）（ＨＳＰ）を先ず特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記文献）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つける検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。その後、累積アラインメントスコアを増加することができる限り、そのワードヒットをそれぞれの配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（１対の一致残基に対する報酬スコア；常に、＞０）およびＮ（不一致残基に対するペナルティスコア；常に、＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列については、スコアリング行列を用いて累積スコアを計算する。それぞれの方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ落ちると；累積スコアが１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積に起因してゼロ以下になると；またはいずれかの配列の末端に達すると、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸによって、アラインメントの感度および速度が決まる。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を用いる（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。配列アラインメントおよび配列同一％の例示的判定には、用意されたデフォルトパラメータを用いて、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（ウィスコンシン州、マディソンのＡｃｃｅｌｒｙｓ）の中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを利用することができる。
【００３７】
「参照配列」は、配列比較のための基準として用いられる規定された配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、完全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントである場合もある。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の長さ、少なくとも２５残基の長さ、少なくとも５０残基の長さ、または核酸もしくはポリペプチドの完全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ、（１）２つの配列間に類似した配列（すなわち、その完全配列の一部分）を含むことがあり、ならびに（２）２つの配列間に互いに異なる配列をさらに含むことがあるので、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、「比較ウインドウ」に関して２つのポリヌクレオチドの配列を比較して局所的な配列類似性領域を特定し、比較することによって、代表的に行われる。
【００３８】
一部の実施形態において、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づく場合があり、この場合の参照配列は、その一次配列内に１つ以上の変更を有し得る配列である。例えば、「Ｘ１４５に対応する残基にセリンを有する配列番号４に基づく」参照配列は、配列番号４のＸ１４５における対応する残基がセリンに変更された参照配列を指す。
【００３９】
「比較ウインドウ」は、配列を少なくとも２０の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、且つ、その比較ウインドウ内の配列の一部分が、２つの配列の最適なアラインメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して２０パーセント以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある、少なくとも約２０の連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念上のセグメントを指す。比較ウインドウは、２０連続残基より長いことがあり、場合によっては、３０、４０、５０、１００、またはそれより長いウインドウを含む。
【００４０】
「実質的同一性」は、少なくとも２０の残基位置の比較ウインドウに関して、多くの場合、少なくとも３０〜５０残基のウインドウに関して参照配列を比較すると、少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性および８９から９５パーセントの配列同一性、より普通には少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、この場合の配列同一性百分率は、その比較ウインドウに関して参照配列とその参照配列の総計２０パーセント以下になる欠失または付加を含む配列とを比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される特定の実施形態において、用語「実質的な同一性」は、デフォルトギャップ重みづけを用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインしたとき、２つのポリペプチド配列が、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれ以上（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一でないアミノ酸残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。
【００４１】
所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けに関連して用いるときの「に対応する」、「への参照」または「基準として」は、その所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較するときのその指定参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えると、所与のポリマーの残基数または残基位置は、その所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値の位置によってではなく参照配列を基準にして指定される。例えば、所与のアミノ酸配列、例えば操作されたケトレダクターゼのもの、と参照配列とを、ギャップを導入してそれら２配列間の残基一致を最適化することによって、アラインすることができる。これらの場合では、ギャップは存在するが、アラインした参照配列を基準にしてその所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の番号付けを行う。
【００４２】
「立体選択性」は、化学反応または酵素的反応における１つの立体異性体の別のものに勝る優先的形成を指す。立体選択性は、部分的である場合があり、この場合は１つの立体異性体の形成が他のものより有利であり、または完全であることもあり、この場合は１つだけの立体異性体が形成される。立体異性体がエナンチオマーであるとき、その立体選択性はエナンチオ選択性と呼ばれ、これは、一方のエナンチオマーの両方の合計中の分率である（代表的に、百分率として報告される）。それは、当該技術分野では、一般に、代替的に、式［主エナンチオマー−副エナンチオマー］／［主エナンチオマー＋副エナンチオマー］に従ってそれから算出されるエナンチオマー過剰率（ｅ．ｅ．）として（代表的に、百分率として）報告される。これは、立体異性体過剰率（ｓ．ｅ．）と呼ばれる場合もある。立体異性体が、ジアステレオマーである場合、その立体選択性は、ジアステレオ選択性とも呼ばれ、これは、２つのジアステレオマーの混合物中の１つのジアステレオマーの分率である（代表的に、百分率で報告される）。
【００４３】
「高立体選択的」は、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で基質を対応する（Ｒ）−生成物に変換または還元することができるケトレダクターゼポリペプチドを指す。
【００４４】
「改善された酵素特性」は、参照ケトレダクターゼと比較して何らかの酵素特性の改善を示すケトレダクターゼポリペプチドを指す。本明細書に記載する操作されたケトレダクターゼポリペプチドについて、その比較は、一般に、野生型ケトレダクターゼ酵素に対して行われるが、一部の実施形態では、その参照ケトレダクターゼが、別の改善された操作されたケトレダクターゼである場合もある。改善が望ましい酵素特性としては、酵素活性（基質の変換パーセントによって表すことができる）、熱安定性、ｐＨ活性プロフィール、補因子要件、阻害因子（例えば、生成物阻害）に対する不応性、立体特異性、および立体選択性（エナンチオ選択性を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
「増大された酵素活性」は、操作されたケトレダクターゼポリペプチドの改善された特性を指し、参照ケトレダクターゼ酵素と比較して比活性（例えば生成される生成物／時間／タンパク質重量）の増加、または基質の生成物への変換パーセント（例えば、指定量のＫＲＥＤの使用による指定時間内の生成物への基質の出発量の変換パーセント）の増加がその代表であり得る。酵素活性を判定するための例示的方法は、実施例に提供する。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的酵素特性を含めて、その変化が増加された酵素活性につながり得る酵素活性に関するいずれの特性も対象となり得る。酵素活性の改善は、対応する野生型ケトレダクターゼ酵素の酵素活性の約１．５倍から、２倍ほどにもなる場合がある。天然由来のケトレダクターゼまたはそのケトレダクターゼポリペプチドが誘導された別の操作されたケトレダクターゼより５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、またはそれより大きい酵素活性。特定の実施形態において、前記操作されたケトレダクターゼ酵素は、親ケトレダクターゼ酵素のものより１．５から５０倍または１．５から１００倍大きい範囲の改善された酵素活性を示す。いずれの酵素の活性も、その触媒回転速度が基質（任意の必要補因子を含む）の拡散速度を超えることができないように、拡散制限されることは、当業者には理解される。その拡散限界、すなわちｋｃａｔ／Ｋｍ、の理論的最大値は、一般に、約１０８から１０９（Ｍ−１  ｓ−１）である。それ故、ケトレダクターゼの酵素活性のいずれの改善も、そのケトレダクターゼ酵素による作用を受ける基質の拡散速度に関連した上限を有する。ケトレダクターゼ活性は、ケトレダクターゼを測定するために用いられる標準的なアッセイのいずれか１つ、例えば、その酸化とケトンもしくはアルデヒドのアルコールへの付随的還元に起因する、ＮＡＤＰＨの吸光度もしくは蛍光の減少（実施例６参照）によって、または結合アッセイにおいて生成される生成物によって、測定することができる。酵素活性の比較は、本明細書中で詳細にさらに説明するような、酵素の規定された調製、設定条件下での規定されたアッセイ、および１つ以上の規定された基質を用いて行われる。一般に、溶解産物を比較するとき、宿主細胞によって生産されるおよび溶解産物中に存在する酵素の量の変化を最小にするために同一の発現系および同一の宿主細胞を使用するばかりでなく、アッセイする細胞の数およびタンパク質の量も決定する。
【００４６】
「変換」は、基質の対応する生成物への酵素的還元を指す。「変換パーセント」は、ある期間内に指定条件下で生成物に還元される基質のパーセントを指す。従って、ケトレダクターゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質の生成物への「変換パーセント」として表すことができる。
【００４７】
「熱安定性」は、ある期間（例えば、０．５〜２４時間）、高温（例えば、４０〜８０℃）への暴露後、未処理の酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％から８０％より多く）を維持するケトレダクターゼポリペプチドを指す。
【００４８】
「溶媒安定性」は、ある期間（例えば、０．５〜２４時間）、様々な濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（例えば、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）への暴露後、未処理の酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％から８０％より多く）を維持するケトレダクターゼポリペプチドを指す。
【００４９】
「ｐＨ安定性」は、ある期間（例えば、０．５〜２４時間）、高いまたは低いｐＨ（例えば、４．５〜６または８から１２）への暴露後、未処理の酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％から８０％より多く）を維持するケトレダクターゼポリペプチドを指す。
【００５０】
「熱および溶媒安定性」は、熱安定性でもあり、溶媒安定性でもある、ケトレダクターゼポリペプチドを指す。
【００５１】
操作されたケトレダクターゼ酵素に関連して本明細書において用いる場合の「から誘導される」は、その操作の基礎になった、元のケトレダクターゼ酵素、および／またはそのようなケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を特定する。例えば、配列番号１３４の操作されたケトレダクターゼ酵素は、配列番号４のＬ．ｋｅｆｉｒケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を何世代にもわたって人工的に進化させることによって得られた。従って、この操作されたケトレダクターゼ酵素は、配列番号４の野生型ケトレダクターゼ「から誘導される」。
【００５２】
「親水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の正規化コンセンサス疎水性尺度に従ってゼロ未満の疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された親水性アミノ酸としては、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ−Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬ−Ａｒｇ（Ｒ）が挙げられる。
【００５３】
「酸性アミノ酸または残基」は、そのアミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれているときに約６未満のｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。酸性アミノ酸は、ヒドロニウムイオン喪失のため、生理学的ｐＨで負の電荷を有する側鎖を代表的に有する。遺伝子コード化された酸性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００５４】
「塩基性アミノ酸または残基」は、そのアミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれているときに約６より大きいｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。塩基性アミノ酸は、水素イオンとの会合のため、生理学的ｐＨで正の電荷を有する側鎖を代表的に有する。遺伝子コード化された塩基性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ−Ｌｙｓ（Ｋ）が挙げられる。
【００５５】
「極性アミノ酸または残基」は、生理学的ｐＨで電荷を有さない側鎖を有するが、２個の原子によって共同で共有される電子対がそれらの原子のうちの１つによってより近くに保持される少なくとも１つの結合を有する、親水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された極性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）およびＬ−Ｔｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
【００５６】
「疎水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の正規化コンセンサス疎水性尺度に従ってゼロより大きい疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された疎水性アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００５７】
「芳香族アミノ酸または残基」は、少なくとも１つの芳香族またはヘテロ芳香族環を含む側鎖を有する、親水性または疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された芳香族アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｔｙｒ（Ｙ）およびＬ−Ｔｒｐ（Ｗ）が挙げられる。そのヘテロ芳香族窒素原子のｐＫａのせいでＬ−Ｈｉｓ（Ｈ）は、時として、塩基性残基として分類され、またはその側鎖がヘテロ芳香族環を含むので芳香族残基として分類されるが、本明細書では、ヒスチジンを親水性残基として、または「拘束残基」（下記参照）として分類する。
【００５８】
「拘束アミノ酸または残基」は、拘束された幾何学的配置を有する、アミノ酸または残基を指す。本明細書において、拘束残基としては、Ｌ−ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ−ｈｉｓ（Ｈ）が挙げられる。ヒスチジンは、比較的小さいイミダゾール環を有するため、拘束された幾何学的配置を有する。プロリンは、これも５員環を有するため、拘束された幾何学的配置を有する。
【００５９】
「非極性アミノ酸または残基」は、生理学的ｐＨで電荷を有さない側鎖を有し、且つ、２個の原子によって共同で共有される電子対がそれら２個の原子それぞれによってほぼ同等に保持される結合を有する（すなわち、側鎖が非極性である）、疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された非極性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）およびＬ−Ａｌａ（Ａ）が挙げられる。
【００６０】
「脂肪族アミノ酸または残基」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する、疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された脂肪族アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）およびＬ−Ｉｌｅ（Ｉ）が挙げられる。
【００６１】
「システイン」。アミノ酸Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、他のＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸または他のスルファニル含有もしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成することができる点で独特である。「システイン様残基」は、システイン、およびジスルフィド架橋の形成に利用できるスルフヒドリル部分を含有する他のアミノ酸を含む。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）（および−ＳＨ含有側鎖を有する他のアミノ酸）が、還元された遊離−ＳＨ形態または酸化されたジスルフィド架橋形態のいずれかでペプチド中に存在できることが、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）がペプチドに正味の疎水性をもたらすのか、親水性をもたらすのかに影響を及ぼす。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの正規化コンセンサス尺度（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９８４、上記文献）に従って０．２９の疎水性を示すが、本発明の開示のために、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）がそれ独自の独特な群に類別されることは理解されるべきである。
【００６２】
「小アミノ酸または残基」は、合計３個以下の炭素および／またはヘテロ原子（α−炭素および水素を除く）から構成される側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。小アミノ酸または残基は、上の定義に従って、脂肪族、非極性、極性または酸性小アミノ酸または残基としてさらに類別することができる。遺伝子コード化された小アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００６３】
「ヒドロキシル含有アミノ酸または残基」は、ヒドロキシル（−ＯＨ）部分を含有するアミノ酸を指す。遺伝子コード化されたヒドロキシル含有アミノ酸としては、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００６４】
「保存的」アミノ酸置換または突然変異は、類似した側鎖を有する残基の交換可能性を指し、従って、アミノ酸の同じまたは類似した規定されたクラスの中のアミノ酸でのポリペプチド内のアミノ酸の置換を代表的に含む。しかし、本明細書において用いる場合、一部の実施形態において、保存的突然変異は、その保存的突然変異が、代わりに、脂肪族残基から脂肪族残基、非極性残基から非極性残基、極性残基から極性残基、酸性残基から酸性残基、塩基性残基から塩基性残基、芳香族残基から芳香族残基、または拘束残基から拘束残基への置換であり得る場合、親水性残基から親水性残基、疎水性残基から疎水性残基、ヒドロキシル含有残基からヒドロキシル含有残基、または小残基から小残基への置換を含まない。さらに、本明細書において用いる場合、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＩは、別の脂肪族残基または別の非極性残基のいずれかに保存的に突然変異させることができる。下の表は、例示的保存的置換を示すものである。
【００６５】
【表１】
2010536385.tif 000006
「非保存的置換」は、有意に異なる側鎖特性を有するアミノ酸でのポリペプチド内のアミノ酸の置換または突然変異を指す。非保存的置換は、上に列挙した規定された群内ではなく、群間でのアミノ酸を用いるものであり得る。１つの実施形態において、非保存的突然変異は、（ａ）置換領域内のペプチド骨格の構造（例えば、グリシンの代わりにプロリン）（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩に影響を及ぼす。
【００６６】
「欠失」は、参照ポリペプチドからの１つ以上のアミノ酸の除去によるポリペプチドへの修飾を指す。アミノ酸配列における欠失は、操作されたケトレダクターゼ酵素の酵素活性を維持しながらおよび／または改善された特性を維持しながらの、その参照酵素を構成する１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、６つ以上のアミノ酸、８つ以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、１５以上のアミノ酸、または２０以上のアミノ酸、総アミノ酸数の１０％以下、総アミノ酸数の１５％以下、または総アミノ酸数の２０％以下の除去を含むことができる。欠失は、ポリペプチドの内部に関する場合があり、および／または末端部分に関する場合がある。様々な実施形態において、欠失は、連続セグメントを含み得、または非連続的である場合がある。
【００６７】
「挿入」は、参照ポリペプチドと比較して１つ以上のアミノ酸の付加によるポリペプチドへの修飾を指す。一部の実施形態において、前記改善された操作されたケトレダクターゼ酵素は、天然由来のケトレダクターゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入、ならびに他の改善されたケトレダクターゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部でのものである場合があり、またはカルボキシもしくはアミノ末端へのものである場合がある。本明細書において用いる場合の挿入物は、当該技術分野において公知であるような融合タンパク質を含む。前記挿入物は、アミノ酸の連続セグメントである場合があり、または天然由来ポリペプチド内での１つ以上のアミノ酸によって隔てられている場合がある。
【００６８】
「フラグメント」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列はその配列の対応する位置と同じである、ポリペプチドを指す。フラグメントは、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長またはそれ以上で、その完全長ケトレダクターゼポリペプチドの７０％、８０％、９０％、９５％、９８％および９９％までであり得る。一部の実施形態において、前記完全長ケトレダクターゼは、完全長の操作されたまたは野生型のケトレダクターゼ（例えば、配列番号２および４）であり得る。
【００６９】
「単離されたポリペプチド」は、本来それに随伴する他の不純物、例えばタンパク質、脂質およびポリヌクレオチド、から実質的に分離されているポリペプチドを指す。この用語は、それらの自然発生環境または発現系（例えば、宿主細胞またはインビトロ合成）から除去または精製されたポリペプチドを包含する。前記改善されたケトレダクターゼ酵素は、細胞内に存在することもあり、細胞の培地に中に存在することもあり、または溶解産物もしくは単離された製剤などの様々な形態で調製することができる。従って、一部の実施形態において、前記改善されたケトレダクターゼ酵素は、単離されたポリペプチドであり得る。
【００７０】
「実質的に純粋なポリペプチド」は、そのポリペプチド種が、存在する優勢な種である（すなわち、ｍｏｌまたは重量ベースで、それがその組成物中のいずれの他の個々の高分子種よりも豊富である）組成物を指し、一般に、対象種がモルまたは重量％でその存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを構成する場合には実質的に精製されている組成物である。一般に、実質的に純粋なケトレダクターゼ組成物は、その組成物中に存在するすべての高分子種のモルまたは重量％で約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、および約９８％以上を構成する。一部の実施形態において、対象種は、その組成物が単一の高分子種から本質的に成る、本質的均質（すなわち、従来の検出方法によってその組成物中で汚染種を検出できない）へと精製される。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、高分子種とはみなされない。一部の実施形態において、単離された改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００７１】
「ストリンジェントハイブリダイゼーション」は、核酸ハイブリッドが安定している条件を指すために本明細書では用いる。当業者には公知であるように、ハイブリッドの安定性は、そのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含有率、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴｍ値は、融解温度の公知予測方法を用いて計算することができる（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏら，１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １６８：７６１−７７７；Ｂｏｌｔｏｎら，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：１３９０；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：８８９３−８８９７；Ｆｒｅｉｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；Ｋｉｅｒｚｅｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：７８４０−７８４６；Ｒｙｃｈｌｉｋら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：６４０９−６４１２（ｅｒｒａｔｕｍ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：６９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記文献；Ｓｕｇｇｓら，１９８１，Ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ（Ｂｒｏｗｎら編），ｐｐ．６８３−６９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＷｅｔｍｕｒ，１９９１，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６：２２７−２５９参照；すべての出版物は、参照により本明細書に援用されている）。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示するポリペプチドをコードし、ならびに規定された条件下、例えば中ストリンジェントまたは高ストリンジェント条件下で、本開示の操作されたケトレダクターゼ酵素をコードする配列の補体にハイブリダイズする。
【００７２】
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおけるハイブリダイゼーション条件、例えば洗浄条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、その後、様々だがより高いストリンジェンシーの洗浄が行われる。用語「中ストリンジェントハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡが、その標的ＤＮＡとの約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、約８５％の同一性と、標的ポリヌクレオチドとの約９０％より高い同一性とを有する相補的核酸に結合できる条件を指す。例示的中ストリンジェント条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、その後、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、４２℃での洗浄に相当する条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、規定されたポリヌクレオチド配列についての溶解条件のもとで決定されるような熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれより低い条件を一般に指す。一部の実施形態において、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す。（すなわち、ハイブリッドが０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中、６５℃で不安定な場合、それは、ここで考えられる場合には高ストリンジェンシー条件下で不安定であある）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアルデヒド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、その後、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄に相当する条件によって規定され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、および０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中、６５℃での洗浄に相当する条件でのハイブリダイゼーションである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、ならびに中ストリンジェント条件は、上で引用した参考文献に記載されている。
【００７３】
「異種」ポリヌクレオチドは、実験技術によって宿主細胞に導入される任意のポリヌクレオチドを指し、および宿主細胞から除去され、実験操作に付され、その後、宿主細胞に再び導入されるポリヌクレオチドを含む。
【００７４】
「コドン最適化される」は、そのコードされたタンパク質がその対象生物において効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを特定の生物において優先的に用いられるものに変更することを指す。遺伝子コードは、大部分のアミノ酸が、「シノニム」または「同義」コドンと呼ばれる幾つかのコドンによって表される点で縮重しているが、特定の生物によるコドン使用頻度が無作為でなく、特定のコドントリプレット偏ることは周知である。このコドン使用頻度の偏りは、所定の遺伝子、共通の機能または先祖起源の遺伝子、低コピー数タンパク質に対して高度に発現されるタンパク質、および生物のゲノムの総タンパク質コーディング領域に関して、より高いことがある。一部の実施形態において、ケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを、発現のために選択される宿主生物での最適な生産のためにコドン最適化することができる。
【００７５】
「好ましい、最適な、大いにコドン使用頻度に偏りのあるコドン」は、同義で、タンパク質コーディング領域内の同じアミノ酸をコードする他のコドンより高い頻度で使用されるコドン、を指す。単一の遺伝子のコドン使用頻度、共通の機能または起源の遺伝子のセット、高度に発現される遺伝子、生物全体の総タンパク質コーディング領域におけるコドン頻度、関連生物の総タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはそれらの組み合わせに関して、好ましいコドンを決定することができる。遺伝子発現レベルに伴って頻度が増加するコドンは、代表的に、発現に最適なコドンである。例えばクラスター分析または応答分析を用いる、多変量解析をはじめとする、特定の生物におけるコドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対同義コドン使用頻度）およびコドン選好性を判定するための様々な方法、ならびに遺伝子において使用されるコドンの有効数を決定するための様々な方法が公知である（ＧＣＧ  ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ，Ｊｏｈｎ  Ｐｅｄｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，Ｊ．Ｏ，１９９８，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４：３７２−７３；Ｓｔｅｎｉｃｏら，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２２４３７−４６；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｆ．，１９９０，Ｇｅｎｅ  ８７：２３−２９参照）。コドン使用頻度表は、増えつつある生物リストに利用できる（例えば、Ｗａｄａら，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８；Ｎａｋａｍｕｒａら，２０００、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２；Ｄｕｒｅｔら，上記文献；ＨｅｎａｕｔおよびＤａｎｃｈｉｎ，「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ」，１９９６，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら編，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ｐ．２０４７−２０６６参照）。コドン使用頻度を得るためのデータ源は、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依存し得る。これらのデータセットは、発現されるタンパク質をコードすることが実際に知られている核酸配列（例えば、完全タンパク質コーディング配列−ＣＤＳ）、発現される配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の予測コーディング領域を含む（例えば、Ｍｏｕｎｔ，Ｄ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，第８章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２５９−２８１；Ｔｉｗａｒｉら，１９９７，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：２６３−２７０参照）。
【００７６】
「制御配列」は、対象となるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現に必要または有利である、すべての成分を含むと本明細書では定義する。それぞれの制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって固有のものである場合もあり、または外来のものである場合もある。そのような制御配列としては、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写終結因子が挙げられるが、これらに限定されない。最低でも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコーディング領域とその制御配列のライゲーションを助長する特定の制限部位を導入するためのリンカーを備えている場合がある。
【００７７】
「作動可能に連結される」は、制御配列がポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指図または調節するように、制御配列が、ＤＮＡ配列内のコーディング配列などの対象となるポリヌクレオチドまたはポリペプチドと機能できる関係に（すなわち、相関的な位置に）適切に配置されている立体配置と、本明細書では定義する。
【００７８】
「プロモーター配列」は、対象となるポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列、例えば、コーディング領域である。一般に、プロモーター配列は、対象となるポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、突然変異プロモーター、短縮型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターをはじめとする、選択された宿主細胞において転写活性を示すいずれの核酸配列であってもよく、その宿主細胞にとって同種または異種いずれかの細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【００７９】
「補因子再生系」は、その補因子の酸化形に還元する反応（例えば、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨ）に関与する反応物のセットを指す。ケト基質のケトレダクターゼ触媒還元によって酸化された補因子は、補因子再生系によって還元形に再生される。補因子再生系は、水素当量の還元源であり、且つ、その補因子の酸化形を還元できる、化学量論的還元剤を含む。補因子再生系は、その還元体によるその補因子の酸化形の還元を触媒する触媒、例えば酵素触媒、をさらに含むことができる。ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋からそれぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生するための補因子再生系は、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載する方法においてそれらを用いることができる。
【００８０】
７．２  ケトレダクターゼ酵素
本開示は、構造式（Ｉ）の３−ケトチオラン（「基質」）：
【００８１】
【化４】
2010536385.tif 000007
を構造式（ＩＩ）の（Ｒ）−３−ヒドロキシチオラン（「生成物」）：
【００８２】
【化５】
2010536385.tif 000008
に立体選択的に還元または変換することができ、且つ、Ｌ．ｋｅｆｉｒ（配列番号４）、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ（配列番号２）もしくはＬ．ｍｉｎｏｒ（配列番号１４２）から得られる天然由来の野生型ＫＲＥＤ酵素と比較したとき、または他の操作されたケトレダクターゼ酵素と比較したとき、改善された特性を有することができる、操作されたケトレダクターゼ（「ＫＲＥＤ」）酵素を提供する。改善が望ましい酵素特性としては、酵素活性、熱安定性、ｐＨ活性プロフィール、補因子要件、阻害因子（例えば、生成物阻害）に対する不応性、立体特異性、立体選択性、および溶媒安定性が挙げられるが、これらに限定されない。前記改善は、単一の酵素特性、例えば酵素活性に関する場合もあり、または異なる酵素特性の組み合わせ、例えば酵素活性と立体選択性、に関する場合もある。
【００８３】
本開示は、規定されたケト基質をその対応するアルコール生成物に立体選択的に還元することができ、且つ、Ｌ．ｋｅｆｉｒ（配列番号２）もしくはＬ．ｂｒｅｖｉｓ（配列番号４）もしくはＬ．ｍｉｎｏｒ（配列番号１４２）から得られる天然由来の野生型ＫＲＥＤ酵素と比較したとき、または他の操作されたケトレダクターゼ酵素と比較したとき、改善された特性を有することができる、操作されたケトレダクターゼ（「ＫＲＥＤ」）酵素を提供する。本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２または４または１４２の位置１４５に対応する残基が酸性残基でないという要件を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２または４または１４２のＬ．ｋｅｆｉｒまたはＬ．ｂｒｅｖｉｓまたはＬ．ｍｉｎｏｒ  ＫＲＥＤ配列と比較して、位置１４５に対応する残基に極性残基を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２または４または１４２のＬ．ｋｅｆｉｒまたはＬ．ｂｒｅｖｉｓまたはＬ．ｍｉｎｏｒ  ＫＲＥＤ配列と比較して、位置１４５に対応する残基にセリンを有する。
【００８４】
一部の実施形態では、上で述べたように、改善された酵素活性を有する操作されたケトレダクターゼを、配列番号４のＬ．ｋｅｆｉｒケトレダクターゼ、配列番号２のＬ．ｂｒｅｉｖｉｓケトレダクターゼ、配列番号１４２のＬ．ｍｉｎｏｒ、または操作されたケトレダクターゼに関連して記載する。これらのケトレダクターゼ内のアミノ酸残基位置は、開始メチオニン（Ｍ）残基から始めて決定される（すなわち、Ｍは残基位置１を表す）が、この開始メチオニン残基を生物学的処理機械によって、例えば宿主細胞またはインビトロ翻訳系において、除去して、開始メチオニン残基のない成熟タンパク質を生じさせることができることは、当業者に理解される。特定のアミノ酸またはアミノ酸変更がアミノ酸配列内に存在するアミノ酸残基位置は、時として、用語「Ｘｎ」、または「位置ｎ」で本明細書に記述されおり、この場合のｎは、その残基位置を指す。同じ残基位置のアミノ酸残基が、ケトレダクターゼ間で異なる場合、それらの異なる残基を「／」によって表し、その配置は例えば、「ｋｅｆｉｒ残基／ｂｒｅｖｉｓ残基／ｍｉｎｏｒ」である。一部の実施形態では、参照配列、例えば配列番号２、配列番号４、または配列番号１４２の野生型ケトレダクターゼ、の対応する残基に関するアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基での置換である置換突然変異を、記号「→」によって表す。
【００８５】
本明細書において、突然変異は、時として、「１つの」アミノ酸タイプ「への」突然変異として記載される。例えば、残基Ｘ７は、「１つの」セリン残基「への」突然変異グリシンである場合がある。しかし、「１つの〜への」というフレーズの使用は、１つのクラスのあるアミノ酸から同じクラスの別のアミノ酸への突然変異を除外しない。例えば、残基Ｘ７を、グリシンからアルギニンに突然変異させることができる。
【００８６】
Ｌ．ｋｅｆｉｒ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、またはＬ．ｍｉｎｏｒの天然由来のケトレダクターゼ（「ＡＤＨ」または「アルコールデヒドロゲナーゼ」とも呼ばれる）をコードするポリヌクレオチド配列、および従ってその対応するアミノ酸配列は、Ｌ．ｋｅｆｉｒについてはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＰ９４０２９  ＧＩ：３３１１２０５６または配列番号３；Ｌ．ｂｒｅｖｉｓについてはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＤ６６６４８  ＧＩ：２８４００７８９または配列番号１；およびＬ．ｍｉｎｏｒについては配列番号１４１として入手できる。
【００８７】
一部の実施形態において、本明細書におけるケトレダクターゼポリペプチドは、改善されたケトレダクターゼ特性を結果として生じさせる、参照配列（例えば、天然由来のポリペプチドまたは操作されたポリペプチド）への多数の修飾を有することができる。そのような実施形態において、アミノ酸配列への修飾の数は、アミノ酸１つ以上、アミノ酸２つ以上、アミノ酸３つ以上、アミノ酸４つ以上、アミノ酸５つ以上、アミノ酸６つ以上、アミノ酸８つ以上、アミノ酸１０以上、アミノ酸１５以上、またはアミノ酸２０以上、参照ポリペプチド配列の総アミノ酸数の１０％以下、総アミノ酸数の１０％以下、総アミノ酸数の１５％以下、総アミノ酸数の２０％以下、または総アミノ酸数の３０％以下を含み得る。一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼ特性を生じさせる、天然由来のポリペプチドまたは操作されたポリペプチドへの修飾の数は、前記参照配列の約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基修飾を含み得る。一部の実施形態において、前記修飾の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個のアミノ酸残基であり得る。前記修飾は、挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００８８】
一部の実施形態において、前記修飾は、参照配列へのアミノ酸置換を含む。改善されたケトレダクターゼ特性を生じさせることができる置換は、前記参照酵素配列の１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、６つ以上のアミノ酸、８つ以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、１５以上のアミノ酸、または２０以上のアミノ酸、総アミノ酸数の１０％以下、総アミノ酸数の１０％以下、総アミノ酸数の２０％以下、または総アミノ酸数の３０％以下でのものであり得る。一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼ特性を生じさせる天然由来のポリペプチドまたは操作されたポリペプチドへの置換の数は、前記参照配列の約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個のアミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態において、前記置換の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個のアミノ酸残基であり得る。
【００８９】
一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドの（野生型または別の操作されたポリペプチドと比較して）改善された特性は、３−ケトチオラン基質の（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランへの還元または変換についてのその立体選択性の増大に関する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％の立体異性体過剰率で前記基質を前記生成物に立体選択的に還元することができる。
【００９０】
一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒまたはＬ．ｂｒｅｖｉｓまたはＬ．ｍｉｎｏｒ  ＫＲＥＤ（配列番号４または２または１４２）と比較して改善される立体異性体過剰率（ｓ．ｅ．）で、前記基質を前記生成物に立体選択的に還元することができる。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約７０％である立体異性体過剰率で前記基質を前記生成物に立体選択的に還元することができる。
【００９１】
一部の実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが約９０％より高い立体異性体過剰率（ｓ．ｅ．）で前記基質を前記生成物に還元することができる点で、高度に立体選択的である。そのような高い立体選択性を有する例示的ケトレダクターゼポリペプチドとしては、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、９４、９６、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１２６、１２８、１３０、および１３４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
一部の実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、それらの酵素活性率、すなわち前記基質を前記生成物に変換するそれらの率または能力、に関して、野生型（配列番号４）と比較して改善される。野生型よりも改善される率で前記基質を前記生成物に変換することができる例示的ポリペプチドとしては、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、１２４、１２６、１３０、および１３４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
一部の実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、高立体選択的であり、そして約９８％より高いｓ．ｅ．で前記基質を前記生成物に還元することができる。そのような立体選択性を有する例示的ポリペプチドとしては、配列番号６、８、１０、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、３６、３８、４０、４２、５０、５２、５４、５８、６２、６６、７０、７２、７６、７８、８０および１３４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
一部の実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、高温下で野生型と比較して酵素活性率の増加によって判定されるようなそれらの熱安定性に関して、野生型と比較して改善される。改善された安定性を有する例示的ケトレダクターゼポリペプチドとしては、配列番号６、８、１２、１４、２２、２４、２６、３２、３４、３６、３８、４２、４４、４６、５０、５２、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、１２４、および１３４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
一部の実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、野生型よりも改善された活性および安定性を有し、そして約９５％より高いｓ．ｅ．で前記基質を前記生成物に還元することができる。そのような能力を有する例示的ポリペプチドとしては、配列番号６、８、１２、１４、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４２、４４、４６、５０、５２、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、および１３４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
一部の実施形態において、本開示のケトレダクターゼは、約０．８〜１．０ｇ／Ｌのケトレダクターゼポリペプチドを用いて、室温で２４時間未満（例えば、約２０〜２４時間）で、少なくとも１００ｇ／Ｌのケトチオランをその対応する生成物に還元または変換することができる。そのような能力を有する例示的ポリペプチドとしては、配列番号６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、１２６、１３０、および１３４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
一部の実施形態において、本開示のケトレダクターゼは、約０．８〜１．０ｇ／Ｌのケトレダクターゼポリペプチドを用いて、室温で２０時間未満（例えば、約１２〜２０時間）で、少なくとも１００ｇ／Ｌのケトチオランを生成物に還元または変換することができる。そのような能力を有する例示的ポリペプチドとしては、配列番号２６、４４、６８、および１０４が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
下の表２は、例示的ケトレダクターゼを提供する。下のすべての配列は、特に別の指定がない限り、野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒケトレダクターゼ配列（配列番号３および４）に由来する。表２中のそれぞれのポリペプチド配列は、表中の番号より１小さい配列番号を有するヌクレオチド配列によってコードされる、すなわち、配列番号４のポリペプチドは、配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００９９】
【表２−１】
2010536385.tif 000009
【０１００】
【表２−２】
2010536385.tif 000010
【０１０１】
【表２−３】
2010536385.tif 000011
【０１０２】
【表２−４】
2010536385.tif 000012
上の表２において、立体選択性欄における「０」は、生成物（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランについての約６１．０〜７１．９％のｓ．ｅ．を示し、「＋」は、前記生成物の約８０．０〜８９．９％のｓ．ｅ．を示し、「＋＋」は、前記生成物についての約９０．０〜９４．９％のｓ．ｅ．を示し、「＋＋＋」は、前記生成物の約９５．０〜９７．９％のｓ．ｅ．を示し、「＋＋＋＋」は、前記生成物についての約９８．０〜９８．０％のｓ．ｅ．を示し、そして「＋＋＋＋＋」は、前記生成物についての約９９．０％より高いｓ．ｅ．を示す。活性欄において、「０」は、１．０〜４．０ｇ／ＬのＫＥＲＤが、室温で２４時間より長い時間での１００ｇ／Ｌのケトチオランの完全変換に必要であることを示し；「＋」は、０．８〜１．０ｇ／ＬのＫＲＥＤが、室温で２０〜２４時間以内の１００ｇ／Ｌのケトチオランの完全変換に必要であることを示し；そして「＋＋」は、０．８〜１．０ｇ／ＬのＫＲＥＤが、室温で１２〜２０時間以内の１００ｇ／Ｌのケトチオランの完全変換に必要であることを示す。安定性欄において、「−」は、そのポリペプチドが野生型よりも悪い熱安定特性を示すことを示し；「０」は、そのポリペプチドが野生型に類似した熱安定特性を示すことを示し；「＋」は、そのポリペプチドが野生型と比較して改善された熱安定性を示すことを示し；そして「＋＋」は、そのポリペプチドが野生型と比較してさらにいっそう改善された熱安定性を示すことを示す。
【０１０３】
一部の実施形態において、本明細書における改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼポリペプチドが位置１４５に対応する残基に極性残基、特にセリン、を有するという条件で、位置１４５に対応するアミノ酸残基が極性残基、特にセリン、である配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、他のアミノ酸残基で、前記参照配列と比較して１つ以上の残基の相違を有し得る。前記相違は、前記参照配列と比較した場合の置換、欠失および挿入を含み得る。前記相違は、非保存的置換、保存的置換、または非保存的置換と保存的置換の組み合わせである場合もある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違を場合によっては有することがある。一部の実施形態において、前記参照配列との相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、前記参照配列と比較して保存的突然変異を含む。
【０１０４】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３もしくは配列番号１４４もしくは配列番号１４５に並べられているような配列式に対応するアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む。配列番号１４５は、Ｌ．ｋｅｆｉｒケトレダクターゼの野生型アミノ酸配列（配列番号４）に基づき；配列番号１４４は、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓケトレダクターゼの野生型アミノ酸配列（配列番号２）に基づき；そして配列番号１４３は、Ｌ．ｍｉｎｏｒケトレダクターゼの野生型アミノ酸配列（配列番号１４２）に基づく。配列番号１４３、１４４および１４５の配列式に基づくケトレダクターゼには、Ｘ１４５に対応する残基が極性アミノ酸であるという指定がある。
【０１０５】
一部の実施形態において、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含み、且つ、Ｘ１４５に対応する残基に極性残基、特にセリン、を有する、ケトレダクターゼポリペプチドは、次のものから選択される１つ以上の特徴をさらに含む場合がある：Ｘ３に対応する残基が、極性、酸性、または芳香族残基である；Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；Ｘ１１に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；Ｘ１６に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１９に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ２３に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；Ｘ４１に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；Ｘ４５に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；Ｘ４９に対応する残基が、塩基性残基である；Ｘ５７に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ６０に対応する残基が、芳香族、脂肪族、非極性、または極性残基である；Ｘ６４に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ７２に対応する残基が、塩基性残基である；Ｘ８２に対応する残基が、非極性または極性残基である；Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；Ｘ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；Ｘ９７に対応する残基が、酸性、塩基性、または脂肪族残基である；Ｘ１０６に対応する残基が、酸性残基である；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；Ｘ１１１に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；Ｘ１２６に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１２７に対応する残基が、極性または塩基性残基である；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族残基、非極性、または極性残基である；Ｘ１５２に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；Ｘ１６３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；Ｘ１７７に対応する残基が、塩基性残基である；Ｘ１９２に対応する残基が、塩基性または酸性残基である；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、酸性、非極性、または脂肪族残基である；Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または非極性残基である；Ｘ２００に対応する残基が、拘束、酸性、または塩基性残基である；Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である；Ｘ２０８に対応する残基が、極性、拘束、または塩基性残基である；Ｘ２１０に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性または酸性残基である；Ｘ２１４に対応する残基が、非極性、脂肪族または極性残基である；Ｘ２１７に対応する残基が、芳香族、脂肪族、または非極性残基である；Ｘ２２３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；およびＸ２２６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である。一部の実施形態において、Ｘ９４に対応する残基は、芳香族残基、ヒスチジン、またはグリシンでない。一部の実施形態において、Ｘ９６に対応する残基は、芳香族残基、グリシン、イソロイシンまたはシステインでない。一部の実施形態において、配列番号１４３、１４４または１４５に並べられているような配列式に対応するアミノ酸配列（またはそのドメイン）を含むポリペプチドは、保存的突然変異を受ける、Ｘによって指定されない１つ以上の残基を有する場合がある。一部の実施形態において、前記保存的突然変異は、上でＸによって定義されていない他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の突然変異であり得る。一部の実施形態において、突然変異の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個のアミノ酸残基であり得る。
【０１０６】
一部の実施形態において、配列番号１４３、１４４、または１４５に与える配列式に基づくアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号４、２、または１４２の参照配列と比較して１つ以上の保存的突然変異を有する場合がある。例示的保存的置換としては、アミノ酸置換、例えば、限定されないが、Ｘ１９に対応する残基（Ｉ）の別の脂肪族残基、例えばバリンでの置き換え；Ｘ２３に対応する残基（Ｉ）の別の非極性残基、例えばフェニルアラニンでの置き換え；Ｘ４９に対応する残基（Ｋ）の別の塩基性残基、例えばアルギニンでの置き換え；Ｘ５７に対応する残基（Ｉ）の別の脂肪族残基、例えばバリンでの置き換え；Ｘ７２に対応する残基（Ｋ）の別の塩基性アミノ酸、例えばアルギニンでの置き換え；Ｘ９４に対応する残基（Ａ）の別の脂肪族アミノ酸、例えばバリンでの置き換え；Ｘ９５に対応する残基（Ａ）の別の脂肪族残基、例えばバリンでの置き換え；Ｘ９７に対応する残基（Ｋ）の別の塩基性アミノ酸、例えばアルギンでの置き換え：Ｘ１０６に対応する残基（Ｅ）の別の酸性アミノ酸、例えばアスパラギン酸での置き換え；Ｘ１１１に対応する残基（Ｌ）の別の非極性または脂肪族アミノ酸、例えばメチオニンでの置き換え；残基Ｘ１４７（Ｆ）の別の非極性アミノ酸、例えばロイシンでの置き換え；Ｘ１７７に対応する残基（Ｋ）の別の塩基性アミノ酸、例えばアルギニンでの置き換え；Ｘ１９２に対応する残基（Ｋ）の別の塩基性アミノ酸、例えばアルギニンでの置き換え；Ｘ２１４に対応する残基（Ｍ）の別の非極性アミノ酸、例えばバリンでの置き換え；Ｘ２１７に対応する残基（Ｉ）の別の非極性アミノ酸、例えばフェニルアラニンでの置き換え；Ｘ２２３に対応する残基（Ｉ）の別の非極性または脂肪族アミノ酸、例えばバリンでの置き換え；およびＸ２２６に対応する残基（Ｉ）の別の非極性または脂肪族アミノ酸、例えばロイシンでの置き換えが挙げられる。
【０１０７】
一部の実施形態において、配列番号１４３、１４４、もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含み、且つ、Ｘ１４５に対応する残基に極性残基、特にセリン、を有するケトレダクターゼポリペプチドは、以下のものから選択される１つ以上の特徴をさらに含む場合がある：Ｘ３に対応する残基がアスパラギン、アスパラギン酸、またはチロシンである；Ｘ７に対応する残基が、グリシン、ヒスチジン、セリンまたはアスパラギンである；Ｘ１１に対応する残基が、イソロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１６に対応する残基が、トレオニン、アラニン、バリン、またはグリシンである；Ｘ１９に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；Ｘ２３に対応する残基が、イソロイシンまたはフェニルアラニンである；Ｘ４１に対応する残基が、セリン、アラニン、またはバリンである：Ｘ４５に対応する残基が、グルタミン酸またはグリシンである；Ｘ４９に対応する残基が、リジンまたはアルギン、特にアルギニンである；Ｘ５７に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；Ｘ６０に対応する残基が、フェニルアラニン、バリン、またはトレオニンである；Ｘ６４に対応する残基が、アラニン、セリン、またはトレオニンである；Ｘ７２に対応する残基が、リジンまたはアルギニン、特にアルギニンである；Ｘ８２に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリン、トレオニン、セリン、またはアルギニンである；Ｘ９５に対応する残基が、バリンまたはアラニンである；Ｘ９６に対応する残基が、アスパラギン、セリン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ９７に対応する残基が、リジン、アルギニンまたはロイシンである；Ｘ１０６に対応する残基が、グルタミン酸またはアスパラギン酸である；Ｘ１０８に対応する残基が、アルギニンまたはヒスチジンである；Ｘ１１１に対応する残基が、ロイシンまたはメチオニンである；Ｘ１１７に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；Ｘ１２６に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；Ｘ１２７に対応する残基が、グルタミンまたはアルギニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシンまたはセリンである；Ｘ１５２に対応する残基が、トレオニン、セリン、またはメチオニンである；Ｘ１５７に対応する残基が、アスパラギン、グルタミン、トレオニン、セリン、またはアスパラギン酸である；Ｘ１６３に対応する残基が、バリンまたはイソロイシンである；Ｘ１７３に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；Ｘ１７７に対応する残基が、リジンまたはアルギニンである；Ｘ１９２に対応する残基が、リジン、アルギニンまたはグルタミン酸である；Ｘ１９４に対応する残基が、プロリン、グリシン、アスパラギン酸、アルギニン、またはロイシンである；Ｘ１９８に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；Ｘ２００に対応する残基が、プロリン、グルタミン酸、またはリジンである；Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはグルタミンである；Ｘ２０８に対応する残基が、グルタミン、ヒスチジンまたはアルギニンである；Ｘ２１０に対応する残基が、トレオニンまたはアラニンである；Ｘ２１１に対応する残基が、リジンまたはグルタミン酸である；Ｘ２１４に対応する残基が、メチオニン、バリンまたはトレオニンまたはセリン、特にバリンまたはトレオニンである；Ｘ２１７に対応する残基が、イソロイシンまたはフェニルアラニンである；Ｘ２２３に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；およびＸ２２６に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである。一部の実施形態において、配列番号１４３、１４４または１４５に並べられているような配列式に対応するアミノ酸配列（またはそのドメイン）を含むポリペプチドは、保存的突然変異を受ける、Ｘによって指定されない１つ以上の残基を有する場合がある。一部の実施形態において、前記保存的突然変異は、上でＸによって定義されていない他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の突然変異であり得る。一部の実施形態において、突然変異の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個のアミノ酸残基であり得る。
【０１０８】
一部の実施形態において、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含み、且つ、Ｘ１４５に対応する残基に極性残基、特にセリン、を有する、ケトレダクターゼポリペプチドは、次の特徴の１つ以上または少なくともすべてをさらに含む場合がある：Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基である；Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である。一部の実施形態において、Ｘ１４５に対応するアミノ酸残基は、セリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴に加えて、次のものから選択される特徴の１つ以上をさらに含む場合がある：Ｘ３に対応する残基が、極性、酸性、または芳香族残基である；Ｘ１１に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；Ｘ１６に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１９に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ２３に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；Ｘ４１に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；Ｘ４５に対応する残基が、グリシン、脂肪族、非極性、または極性残基である；Ｘ４９に対応する残基が、塩基性残基である；Ｘ５７に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ６０に対応する残基が、芳香族、脂肪族、非極性、または極性残基である；Ｘ６４に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ７２に対応する残基が、塩基性残基である；Ｘ８２に対応する残基が、非極性または極性残基である；Ｘ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ９７に対応する残基が、酸性、塩基性、または脂肪族残基である；Ｘ１０６に対応する残基が、酸性残基である；Ｘ１１１に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１２６に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１２７に対応する残基が、極性または塩基性残基である；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族残基、非極性または極性残基である；Ｘ１５２に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１６３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１７７に対応する残基が、塩基性残基である；Ｘ１９２に対応する残基が、塩基性または酸性残基である；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、非極性、酸性、または脂肪族残基である；Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または非極性残基である；Ｘ２００に対応する残基が、拘束、酸性、または塩基性残基である；Ｘ２０８に対応する残基が、極性、拘束、または塩基性残基である；Ｘ２１０に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性または酸性残基である；Ｘ２１４に対応する残基が、非極性、脂肪族または極性残基である；Ｘ２１７に対応する残基が、芳香族、脂肪族、または非極性残基である；およびＸ２２６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である。一部の実施形態において、配列番号１４３、１４４または１４５に並べられているような配列式に対応するアミノ酸配列（またはそのドメイン）を含むポリペプチドは、保存的突然変異を受ける、Ｘによって指定されない１つ以上の残基を有する場合がある。一部の実施形態において、前記保存的突然変異は、上でＸによって定義されていない他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の突然変異であり得る。一部の実施形態において、前記突然変異の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個のアミノ酸残基であり得る。
【０１０９】
一部の実施形態において、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含み、且つ、Ｘ１４５に対応する残基に極性残基、特にセリン、を有する、ケトレダクターゼポリペプチドは、次のものから選択される特徴の１つ以上または少なくともすべてをさらに含む場合がある：Ｘ７に対応する残基が、グリシン、ヒスチジン、セリンまたはアスパラギンである；Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリン、トレオニン、セリン、またはアルギニンである；Ｘ９６に対応する残基が、アスパラギン、セリン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ１０８に対応する残基が、アルギニンまたはヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、アスパラギン、グルタミン、トレオニン、セリン、またはアスパラギン酸である；Ｘ１７３に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはグルタミンである；およびＸ２２３に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴に加えて、次のものから選択される特徴の１つ以上をさらに含む場合がある：Ｘ３に対応する残基が、アスパラギン、アスパラギン酸、またはチロシンである；Ｘ１１に対応する残基が、イソロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１６に対応する残基が、トレオニン、アラニン、バリン、またはグリシンである；Ｘ１９に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；Ｘ２３に対応する残基が、イソロイシンまたはフェニルアラニンである；Ｘ４１に対応する残基が、セリン、アラニンまたはバリンである；Ｘ４５に対応する残基が、グルタミン酸またはグリシンである；Ｘ４９に対応する残基が、リジンまたはアルギニン、特にアルギニンである；Ｘ５７に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；Ｘ６０に対応する残基が、フェニルアラニン、バリン、またはトレオニンである；Ｘ６４に対応する残基が、アラニン、セリンまたはトレオニンである；Ｘ７２に対応する残基が、リジンまたはアルギニン、特にアルギニンである；Ｘ８２に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；Ｘ９５に対応する残基が、バリンまたはアラニンである；Ｘ９７に対応する残基が、リジン、アルギニンまたはロイシンである；Ｘ１０６に対応する残基が、グルタミン酸またはアスパラギン酸である；Ｘ１１１に対応する残基が、ロイシンまたはメチオニンである；Ｘ１２６に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；Ｘ１２７に対応する残基が、グルタミンまたはアルギニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシンまたはセリンである；Ｘ１５２に対応する残基が、トレオニン、セリン、またはメチオニンである；Ｘ１６３に対応する残基が、バリンまたはイソロイシンである；Ｘ１７７に対応する残基が、リジンまたはアルギニンである；Ｘ１９２に対応する残基が、リジン、アルギニンまたはグルタミン酸である；Ｘ１９４に対応する残基が、プロリン、グリシン、アスパラギン酸、アルギニン、またはロイシンである；Ｘ１９８に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；Ｘ２００に対応する残基が、プロリン、グルタミン酸、またはリジンである；Ｘ２０８に対応する残基が、グルタミン、ヒスチジンまたはアルギニンである；Ｘ２１０に対応する残基が、トレオニンまたはアラニンである；Ｘ２１１に対応する残基が、リジンまたはグルタミン酸である；Ｘ２１４に対応する残基が、メチオニン、バリン、またはトレオニンまたはセリン、特にバリンまたはトレオニンである：Ｘ２１７に対応する残基が、イソロイシンまたはフェニルアラニンである；およびＸ２２６に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである。一部の実施形態において、配列番号１４３、１４４または１４５に並べられているような配列式に対応するアミノ酸配列（またはそのドメイン）を含むポリペプチドは、保存的突然変異を受ける、Ｘによって指定されない１つ以上の残基を有する場合がある。一部の実施形態において、前記保存的突然変異は、上でＸによって定義されていない他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の突然変異であり得る。一部の実施形態において、前記突然変異の数は、他の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個のアミノ酸残基であり得る。
【０１１０】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ３に対応する残基が、極性、酸性、または芳香族残基、特にチロシンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１１１】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基、特にセリン、ヒスチジン、またはアルギニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１１２】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１１に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１１３】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１６に対応する残基が、脂肪族または非極性残基、特にアラニンまたはグリシンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１１４】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１９に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特にアラニンまたはグリシンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１１５】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ２３に対応する残基が、非極性または芳香族残基、特にフェニルアラニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１１６】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ４１に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基、特にセリン、アラニンまたはバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１１７】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ４５に対応する残基が、グリシン、脂肪族、非極性または極性残基、特にグルタミン酸またはグリシンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１１８】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ４９に対応する残基が、塩基性残基、特にアルギニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１１９】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ５７に対応する残基が、脂肪族または非極性残基、特にイソロイシンまたはバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１２０】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ６０に対応する残基が、芳香族、脂肪族、非極性または極性残基、特にフェニルアラニン、バリン、またはトレオニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１２１】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ６４に対応する残基が、脂肪族または極性残基、特にアラニン、セリン、またはトレオニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１２２】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ７２に対応する残基が、塩基性残基、特にアラニン、セリン、またはトレオニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１２３】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ８２に対応する残基が、非極性または極性残基、特にグリシンまたはセリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１２４】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基、特にバリン、トレオニン、またはアルギニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１２５】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ９５に対応する残基が、非極性残基または脂肪族残基、特にアラニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１２６】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特にアスパラギン、セリン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１２７】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ９７に対応する残基が、酸性、塩基性、または脂肪族残基、特にリジン、アルギニンまたはロイシンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１２８】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１０６に対応する残基が、酸性残基、特にアスパラギン酸である。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１２９】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にアルギニンまたはヒスチジンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１３０】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１１１に対応する残基が、脂肪族または非極性残基、特にメチオニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１３１】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１３２】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１２６に対応する残基が、脂肪族または非極性残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１３３】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１２７に対応する残基が、極性または塩基性残基、特にグルタミンまたはアルギニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１３４】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族残基、非極性または極性残基、特にフェニルアラニン、ロイシンまたはセリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１３５】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１５２に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、非極性、または極性残基、特にトレオニン、セリン、またはメチオニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１３６】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１５７に対応する残基が、極性または塩基性残基、特にアスパラギン、トレオニン、セリン、またはアスパラギン酸である。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１３７】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１６３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基、特にバリンまたはイソロイシンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１３８】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基、特にアスパラギン酸またはグリシンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１３９】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１７７に対応する残基が、塩基性残基、特にアルギニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１４０】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１９２に対応する残基が、塩基性または酸性残基、特にリジン、アルギニンまたはグルタミン酸である。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１４１】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ１９４に対応する残基が、拘束、極性、非極性、酸性、または脂肪族残基、特にプロリン、グリシン、アスパラギン酸、アルギニン、またはロイシンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１４２】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または非極性残基、特にアスパラギン酸またはグリシンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１４３】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ２００に対応する残基が、拘束、酸性、または塩基性残基、特にプロリン、グルタミン酸、またはリジンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１４４】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ２００に対応する残基が、拘束、酸性、または塩基性残基、特にプロリン、グルタミン酸、またはリジンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１４５】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にメチオニンまたはグルタミンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１４６】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ２０８に対応する残基が、極性、拘束、または塩基性残基、特にグルタミン、ヒスチジンまたはアルギニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１４７】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ２１０に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基、特にトレオニンまたはアラニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１４８】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ２１１に対応する残基が、塩基性または酸性残基、特にリジンまたはグルタミン酸である。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１４９】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ２１４に対応する残基が、非極性、脂肪族または極性残基、特にバリンまたはトレオニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１５０】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ２１７に対応する残基が、芳香族、脂肪族、または非極性残基、特にイソロイシンまたはフェニルアラニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１５１】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ２２３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基、特にイソロイシンまたはバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１５２】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ２２６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特にイソロイシンまたはバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１５３】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンであり、そしてＸ２２８に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特にバリンまたはアラニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１５４】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１５５】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基、特にセリン、ヒスチジンまたはアスパラギンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１５６】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基、特にバリン、トレオニンまたはアルギニンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１５７】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基、特にアスパラギン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１５８】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１５９】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基、特にグリシンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１６０】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１６１】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基、特にセリン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１６２】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基、特にセリン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基、特にバリン、トレオニン、またはアルギニンである；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１６３】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基、特にセリン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基、特にアスパラギン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１６４】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基、特にセリン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基、特にバリン、トレオニン、またはアルギニンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基、特にアスパラギン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１６５】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１６６】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基、特にセリン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１６７】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基、特にセリン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基、特にバリン、トレオニン、またはアルギニンである；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１６８】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基、特にセリン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基、特にアスパラギン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１６９】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基、特にセリン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基、特にバリン、トレオニン、またはアルギニンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基、特にアスパラギン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１７０】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基、特にグリシンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１７１】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基、特にセリン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基、特にグリシンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１７２】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基、特にセリン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基、特にバリン、トレオニン、またはアルギニンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基、特にグリシンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１７３】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基、特にセリン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基、特にアスパラギン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基、特にグリシンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１７４】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１を含み、前記アミノ酸配列は、次の特徴を少なくとも有する：Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基、特にセリン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基、特にバリン、トレオニン、またはアルギニンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基、特にアスパラギン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にトレオニンである；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基、特にグリシンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼは、Ｘ２２３に対応する残基に脂肪族残基、特にバリンをさらに有する場合がある。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１７５】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、表２に列挙するとおりの配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、９４、９６、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１２６、１２８、１３０、および１３４から選択される参照配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、この場合、前記改善されたケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列は、表２に提示する指定のアミノ酸置換の組み合わせのいずれか１セットを含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前記参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０１７６】
一部の実施形態において、前記改善されたケトレダクターゼは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、９４、９６、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１２６、１２８、１３０、および１３４に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１７７】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７２に対応する残基が、塩基性残基、特にアルギニンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１０４の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号１０４との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１７８】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４４の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号４４との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１７９】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ４９に対応する残基が、塩基性残基、特にアルギニンである；Ｘ１１１に対応する残基が、非極性残基、特にメチオニンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；Ｘ１７３に対応する残基が、非極性残基、特にグリシンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６８の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号６８との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１８０】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンである；Ｘ９７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特にロイシンである；Ｘ１０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；Ｘ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである；およびＸ２２６に対応する残基が、脂肪族残基、特にロイシンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４２の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号４２との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１８１】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束または酸性残基、特にプロリンである；Ｘ１０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２４の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号２４との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１８２】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンである；Ｘ１０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；Ｘ２０６に対応する残基が、極性残基、特にグルタミンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号３８の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号３８との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１８３】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束または酸性残基、特にグルタミン酸である；Ｘ１０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号３２の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号３２との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１８４】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にアルギニンである；Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンである；Ｘ１０６に対応する残基が、酸性残基、特にアスパラギン酸である；Ｘ１０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号８の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号８との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１８５】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ３に対応する残基が、芳香族残基、特にチロシンである；Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にアルギニンである；Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンである；Ｘ１０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１３４の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号１３４との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１８６】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にアルギニンである；Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンである；Ｘ１０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；Ｘ２０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号６との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１８７】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にアルギニンである；Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束残基、特にプロリンである；Ｘ１０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；Ｘ２０６に対応する残基が、極性残基、特にグルタミンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２６の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号２６のと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１８８】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にアルギニンである；Ｘ１０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；Ｘ２０６に対応する残基が、極性残基、特にグルタミンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号５２の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号５２との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１８９】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にアルギニンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束残基、特にプロリンである；Ｘ１０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；Ｘ２０６に対応する残基が、極性残基、特にグルタミンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号５０の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号５０との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１９０】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にアルギニンである；Ｘ１６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特にグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束残基、特にプロリンである；Ｘ１０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；Ｘ２０６に対応する残基が、極性残基、特にグルタミンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号７６の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号７６との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１９１】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にアルギニンである；Ｘ１６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特にバリンである；Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束残基、特にプロリンである；Ｘ１０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；Ｘ２０６に対応する残基が、極性残基、特にグルタミンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号８０の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号８０との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１９２】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にアルギニンである；Ｘ１６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特にグリシンである；Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束残基、特にプロリンである；Ｘ１０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；Ｘ２０６に対応する残基が、極性残基、特にグルタミンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号７８の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号７８との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１９３】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にアルギニンである；Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束残基、特にプロリンである；Ｘ１０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；Ｘ１９４に対応する残基が、非極性残基、特にグリシンである；Ｘ２０６に対応する残基が、極性残基、特にグルタミンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号３０の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号３０との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１９４】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にアルギニンである；Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束残基、特にプロリンである；Ｘ１０８に対応する残基が、拘束残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；Ｘ１９４に対応する残基が、塩基性残基、特にアルギニンである；Ｘ２０６に対応する残基が、極性残基、特にグルタミンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２２の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号２２との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１９５】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にアルギニンである；Ｘ４９に対応する残基が、塩基性残基、特にアルギニンである；Ｘ１１１に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特にメチオニンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；Ｘ１７３に対応する残基が、非極性残基、特にグリシンである；Ｘ２０６に対応する残基が、極性残基、特にグルタミンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号７０の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号７０との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１９６】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にアルギニンである；Ｘ４９に対応する残基が、塩基性残基、特にアルギニンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束残基、特にプロリンである；Ｘ１１１に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特にメチオニンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；Ｘ１７３に対応する残基が、非極性残基、特にグリシンである；Ｘ２０６に対応する残基が、極性残基、特にグルタミンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６６の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号６６との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１９７】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４もしくは１４５の配列式に基づくアミノ酸配列、またはそのドメイン、例えば残基９０〜２１１、を含む：Ｘ７に対応する残基が、極性残基、特にアルギニンである；Ｘ４９に対応する残基が、塩基性残基、特にアルギニンである；Ｘ９４に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束残基、特にプロリンである；Ｘ１１１に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特にメチオニンである；Ｘ１１７に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、極性残基、特にトレオニンである；Ｘ１７３に対応する残基が、非極性残基、特にグリシンである；Ｘ２０６に対応する残基が、極性残基、特にグルタミンである；およびＸ２２３に対応する残基が、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号５８の参照配列と比較して、他の残基位置での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ならびにこの場合のアミノ酸配列は、配列番号５８との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１９８】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４または１４５の配列の残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有し、そのドメイン内のＸ１４５に対応する残基が極性残基である、アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式の残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、Ｘ１４５に対応する残基にセリンを有する。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１９９】
一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応するドメインを有し、且つ、Ｘ１４５に対応する残基に極性残基、特にセリン、を有するケトレダクターゼポリペプチドは、次のものから選択される１つ以上の特徴をさらに含む場合がある：Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；Ｘ９５に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；Ｘ９７に対応する残基が、酸性、塩基性、または脂肪族残基である；Ｘ１０６に対応する残基が、酸性残基である；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；Ｘ１１１に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；Ｘ１２６に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１２７に対応する残基が、極性または塩基性残基である；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族残基、非極性、または極性残基である；Ｘ１５２に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；Ｘ１６３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；Ｘ１７７に対応する残基が、塩基性残基である；Ｘ１９２に対応する残基が、塩基性または酸性残基である；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、非極性、酸性、または脂肪族残基である；Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または非極性残基である；Ｘ２００に対応する残基が、拘束、酸性、または塩基性残基である；Ｘ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である；Ｘ２０８に対応する残基が、極性、拘束、または塩基性残基である；Ｘ２１０に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性または酸性残基である。一部の実施形態において、Ｘ９４に対応する残基は、芳香族残基、ヒスチジン、およびグリシンでない。一部の実施形態において、Ｘ９６に対応する残基は、芳香族残基、グリシン、イソロイシンおよびシステインでない。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０２００】
一部の実施形態において、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式に基づく残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域を有するケトレダクターゼポリペプチドは、アミノ酸配列：４、２または１４２のアミノ酸配列と比較して、１つ以上の保存的突然変異を有する場合がある。例示的保存的置換としては、Ｘ９４に対応する残基（Ａ）の別の脂肪族アミノ酸、例えばバリンでの置き換え；Ｘ９５に対応する残基（Ｖ）の別の非極性または脂肪族残基、例えばアラニンでの置き換え；Ｘ９７に対応する残基（Ｋ）の別の塩基性アミノ酸、例えばアルギンンでの置き換え；Ｘ１０６に対応する残基（Ｅ）の別の酸性アミノ酸、例えばアスパラギン酸での置き換え；Ｘ１１１に対応する残基（Ｌ）の別の非極性または脂肪族アミノ酸、例えばメチオニンでの置き換え；Ｘ１４７に対応する残基（Ｆ）の別の非極性アミノ酸、例えばロイシンでの置き換え；Ｘ１７７に対応する残基（Ｋ）の別の塩基性アミノ酸、例えばアルギニンでの置き換え；およびＸ１９２に対応する残基（Ｋ）の別の塩基性アミノ酸、例えばアルギニンでの置き換えなど（しかし、これらに限定されない）のアミノ酸置換が挙げられる。
【０２０１】
一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応するドメインを有し、且つ、Ｘ１４５に対応する残基に極性残基、特にセリン、を有するケトレダクターゼポリペプチドは、次のものから選択される１つ以上の特徴をさらに含む場合がある：Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリン、トレオニン、セリン、またはアルギニンである；Ｘ９５に対応する残基が、バリンまたはアラニンである；Ｘ９６に対応する残基が、アスパラギン、セリン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ９７に対応する残基が、リジン、アルギニンまたはロイシンである；Ｘ１０６に対応する残基が、グルタミン酸またはアスパラギン酸である；Ｘ１０８に対応する残基が、アルギニンまたはヒスチジンである；Ｘ１１１に対応する残基が、ロイシンまたはメチオニンである；Ｘ１１７に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；Ｘ１２６に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；Ｘ１２７に対応する残基が、グルタミンまたはアルギニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシンまたはセリンである；Ｘ１５２に対応する残基が、トレオニン、セリン、またはメチオニンである；Ｘ１５７に対応する残基が、アスパラギン、グルタミン、トレオニン、セリン、またはアスパラギン酸である；Ｘ１６３に対応する残基が、バリンまたはイソロイシンである；Ｘ１７３に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；Ｘ１７７に対応する残基が、リジンまたはアルギニンである；Ｘ１９２に対応する残基が、リジン、アルギニンまたはグルタミン酸である；Ｘ１９４に対応する残基が、プロリン、グリシン、アスパラギン酸、アルギニン、またはロイシンである；Ｘ１９８に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；Ｘ２００に対応する残基が、プロリン、グルタミン酸、またはリジンである；Ｘ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはグルタミンである；Ｘ２０８に対応する残基が、グルタミン、ヒスチジンまたはアルギニンである；Ｘ２１０に対応する残基が、トレオニンまたはアラニンである；およびＸ２１１に対応する残基が、リジンまたはグルタミン酸である。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０２０２】
一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応するドメインを有し、且つ、Ｘ１４５に対応する残基に極性残基、特にセリン、を有するケトレダクターゼポリペプチドは、以下から選択される特徴の１つ以上または少なくともすべてをさらに含む場合がある：Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基である；Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基である；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基である；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基である；Ｘ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基である；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基である；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基である。一部の実施形態において、前記ドメインまたは領域は、前述の特徴に加えて、次のものから選択される特徴の１つ以上をさらに含む場合がある：Ｘ９７に対応する残基が、酸性、塩基性、または脂肪族残基である；Ｘ１０６に対応する残基が、酸性残基である；Ｘ１１１に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１２６に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１２７に対応する残基が、極性または塩基性残基である；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族残基、非極性、または極性残基である；Ｘ１５２に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１６３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１７７に対応する残基が、塩基性残基である；Ｘ１９２に対応する残基が、塩基性または酸性残基である；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、非極性、酸性、または脂肪族残基である；Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または非極性残基である；Ｘ２００に対応する残基が、拘束、酸性、または塩基性残基である；Ｘ２０８に対応する残基が、極性、拘束、または塩基性残基である；Ｘ２１０に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基である；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性または酸性残基である。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０２０３】
一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応するドメインを有し、且つ、Ｘ１４５に対応する残基に極性残基、特にセリン、を有するケトレダクターゼポリペプチドは、以下から選択される特徴の１つ以上または少なくともすべてをさらに含む場合がある：Ｘ９４に対応する残基が、アラニン、バリン、トレオニン、セリン、またはアルギニンである；Ｘ９６に対応する残基が、アスパラギン、セリン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ１０８に対応する残基が、アルギニンまたはヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、グリシンまたはセリンである；Ｘ１５７に対応する残基が、アスパラギン、グルタミン、トレオニン、セリン、またはアスパラギン酸である；Ｘ１７３に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；およびＸ２０６に対応する残基が、メチオニンまたはグルタミンである。一部の実施形態において、前記ドメインまたは領域は、前述の特徴に加えて、次のものから選択される特徴の１つ以上をさらに含む場合がある：Ｘ９５に対応する残基が、バリンまたはアラニンである；Ｘ９７に対応する残基が、リジン、アルギニンまたはロイシンである；Ｘ１０６に対応する残基が、グルタミン酸またはアスパラギン酸である；Ｘ１１１に対応する残基が、ロイシンまたはメチオニンである；Ｘ１２６に対応する残基が、イソロイシンまたはバリンである；Ｘ１２７に対応する残基が、グルタミンまたはアルギニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、フェニルアラニン、ロイシンまたはセリンである；Ｘ１５２に対応する残基が、トレオニン、セリン、またはメチオニンである；Ｘ１６３に対応する残基が、バリンまたはイソロイシンである；Ｘ１７３に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；Ｘ１７７に対応する残基が、リジンまたはアルギニンである；Ｘ１９２に対応する残基が、リジン、アルギニンまたはグルタミン酸である；Ｘ１９４に対応する残基が、プロリン、グリシン、アスパラギン酸、アルギニン、またはロイシンである；Ｘ１９８に対応する残基が、アスパラギン酸またはグリシンである；Ｘ２００に対応する残基が、プロリン、グルタミン酸、またはリジンである；Ｘ２０８に対応する残基が、グルタミン、ヒスチジンまたはアルギニンである；Ｘ２１０に対応する残基が、トレオニンまたはアラニンである；およびＸ２１１に対応する残基が、リジンまたはグルタミン酸である。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。
【０２０４】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式に基づく残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む：Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にセリンまたはトレオニンである。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の対応するドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２０５】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式に基づく残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む：Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にセリンまたはトレオニンである。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２０６】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式に基づく残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む：Ｘ９４に対応する残基が、極性、塩基性、脂肪族、または非極性残基、特にトレオニンまたはバリンである；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にセリンまたはトレオニンである。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２０７】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式に基づく残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む：Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基、特にアスパラギン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にセリンまたはトレオニンである。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、そのドメイン内の他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０の突然変異をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のドメインと比較して、他のアミノ酸残基での約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２０８】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式に基づく残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む：Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンまたはバリンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基、特にアスパラギン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にセリンまたはトレオニンである。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２０９】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式に基づく残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む：Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にセリンまたはトレオニンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２１０】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式に基づく残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む：Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンまたはバリンである；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にセリンまたはトレオニンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２１１】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式に基づく残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む：Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基、特にアスパラギン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にセリンまたはトレオニンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２１２】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式に基づく残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む：Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンまたはバリンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基、特にアスパラギン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性、拘束、または芳香族残基、特にヒスチジンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にセリンまたはトレオニンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２１３】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式に基づく残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む：Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にセリンまたはトレオニンである；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基、特にグリシンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２１４】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式に基づく残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む：Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンまたはバリンである；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にセリンまたはトレオニンである；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基、特にグリシンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２１５】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式に基づく残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む：Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基、特にアスパラギン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にセリンまたはトレオニンである；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基、特にグリシンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２１６】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、少なくとも次の特徴を有する、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式に基づく残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む：Ｘ９４に対応する残基が、非極性または極性残基、特にトレオニンまたはバリンである；Ｘ９６に対応する残基が、拘束、脂肪族、非極性、酸性、または極性残基、特にアスパラギン、プロリン、アラニン、またはグルタミン酸である；Ｘ１１７に対応する残基が、非極性または極性残基、特にセリンである；Ｘ１４５に対応する残基が、極性残基、特にセリンである；およびＸ１５７に対応する残基が、極性または酸性残基、特にセリンまたはトレオニンである；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性または非極性残基、特にグリシンである；およびＸ２０６に対応する残基が、極性または非極性残基、特にグルタミンである。一部の実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２に基づく参照配列のそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他のアミノ酸残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、そしてこの場合のアミノ酸配列は、前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２１７】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式の残基１〜８９に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ドメイン内のＸ７に対応する残基は、極性または拘束残基、特にセリン、ヒスチジン、またはアスパラギンである。一部の実施形態において、残基１〜８９に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２の参照配列と比較して、そのドメイン内の他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内での残基相違１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８または約２０であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、前記参照配列と比較して保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、残基Ｘ７における前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２１８】
一部の実施形態において、残基１〜８９に対応する領域またはドメインは、次のものから選択される特徴の１つ以上を有する場合がある：Ｘ３に対応する残基が、極性、酸性、または芳香族残基、特にチロシンまたはアスパラギン酸である；Ｘ７に対応する残基が、非極性、極性、または拘束残基、特にセリン、ヒスチジン、またはアスパラギンである；Ｘ１１に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基、特にイソロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１６に対応する残基が、脂肪族または極性残基、特にトレオニン、アラニン、バリン、またはグリシンである；Ｘ１９に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特にイソロイシンまたはバリンである；Ｘ２３に対応する残基が、非極性または芳香族残基、特にフェニルアラニンである；Ｘ４１に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基、特にセリン、アラニン、またはバリンである；Ｘ４５に対応する残基が、脂肪族、非極性、または極性残基、特にグルタミン酸またはグリシンである；Ｘ４９に対応する残基が、塩基性残基、特にリジンまたはアルギニンである；Ｘ５７に対応する残基が、脂肪族または非極性残基、特にイソロイシンまたはバリンである；Ｘ６０に対応する残基が、芳香族、脂肪族、非極性、または極性残基、特にフェニルアラニン、バリン、またはトレオニンである；Ｘ６４に対応する残基が、脂肪族または非極性残基、特にアラニン、セリン、またはトレオニンである；Ｘ７２に対応する残基が、塩基性残基、特にリジンまたはアルギニンである；およびＸ８２に対応する残基が、非極性または極性残基、特にグリシンまたはセリンである。一部の実施形態において、残基１〜８９に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２の参照配列と比較して、そのドメイン内の他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内での残基相違１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８または約２０であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、前記参照配列と比較して保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、残基Ｘ７における前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２１９】
一部の実施形態において、改善されたケトレダクターゼは、配列番号１４３、１４４または１４５の配列式の残基２１２〜２５２に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ドメイン内のＸ２２３に対応する残基は、脂肪族残基、特にバリンである。一部の実施形態において、残基２１２〜２５２に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２の参照配列と比較して、そのドメイン内の他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内での残基相違１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８または約２０であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、前記参照配列と比較して保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、残基Ｘ２２３における前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基２１２〜２５２に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２２０】
一部の実施形態において、残基２１２〜２５２に対応する領域またはドメインは、次のものから選択される特徴の１つ以上または少なくともすべて有する場合がある：Ｘ２１４に対応する残基が、非極性、脂肪族または極性残基、特にメチオニン、バリン、トレオニン、またはセリンである；Ｘ２１７に対応する残基が、芳香族、脂肪族、または非極性残基、特にイソロイシンまたはフェニルアラニンである：Ｘ２２３に対応する残基が、脂肪族または非極性残基、特にイソロイシンまたはバリンである；およびＸ２２６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特にイソロイシンまたはバリンである。一部の実施形態において、残基２１２〜２５２に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１４２の参照配列に基づくそのドメインと比較して、他のアミノ酸残基での１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個の残基相違をさらに有する場合がある。一部の実施形態において、相違の数は、前記ドメイン内の他の残基での１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、または約２０個の残基相違であり得る。一部の実施形態において、前記相違は、保存的突然変異を含む。一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、残基Ｘ２２３における前述の特徴を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列の残基２１２〜２５２に対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０２２１】
一部の実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号１４２に基づく参照配列またはその１領域もしくはドメイン、例えば、残基９０〜２１１、と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む場合があるが、但し、残基１４５に対応する残基が極性残基であることを条件とする。一部の実施形態において、残基１４５に対応する残基は、極性残基である場合があり、前記ポリペプチドは、前記基質を前記生成物に少なくとも約７０％のｓ．ｅ．で還元することができる。一部の実施形態において、残基１４５に対応する残基は、セリンであり、さらに以下の置換のうちの１つ以上を有するので前記ポリペプチドは野生型ｋｅｆｉｒケトレダクターゼまたは別の操作されたケトレダクターゼより（立体選択性、酵素活性、および／または熱安定性に関して）さらに改善される：３→Ｙ（すなわち、配列番号２、４または１４２の残基３に対応する残基が、チロシンに置換される）；７→Ｓ、Ｎ；１１→Ｔ；１６→Ａ、Ｖ、Ｇ；１９→Ｖ；２３→Ｆ；４１→Ｖ；４５→Ｇ；４９→Ｒ；５７→Ｖ；６０→Ｔ；６４→Ｔ；７２→Ｒ；８２→Ｓ；９４→Ｔ、Ｒ；９５→Ａ；９６→Ｐ、Ａ、Ｅ；９７→Ｒ；１０６→Ｄ；１０８→Ｈ；１１１→Ｍ；１１７→Ｓ；１２６→Ｖ；１２７→Ｒ；１４７→Ｌ、Ｓ；１５２→Ｍ；１５７→、Ｔ、Ｓ、Ｄ；１６３→Ｉ；１７３→Ｇ；１７７→Ｒ；１９２→Ｒ、Ｅ；１９４→Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ｌ；１９８→Ｇ：２００→Ｋ；２０６→Ｑ；２０８→Ｈ、Ｒ；２１０→Ａ；２１１→Ｅ；２１４→Ｖ、Ｔ；２１７→Ｆ；２２３→Ｖ；２２６→Ｌ；および２２８→Ａ。
【０２２２】
一部の実施形態において、残基１４５に対応する残基は、セリンであり、さらに以下の置換のうちの１つ以上を有するので前記ポリペプチドは野生型ｋｅｆｉｒケトレダクターゼまたは別の操作されたケトレダクターゼよりさらに改善される：７→Ｓ、Ｎ；９４→Ｔ、Ｖ；９６→Ｐ；１０８→Ｈ；１１７→Ｓ；１５７→Ｔ；１９４→Ｎ；２０６→Ｑ；および２２３→Ｖ。
【０２２３】
一部の実施形態において、残基１４５に対応する残基は、セリンであり、さらに以下の置換のうちの１つ以上を有するので前記ポリペプチドは野生型ｋｅｆｉｒケトレダクターゼまたは別の操作されたケトレダクターゼよりさらに改善される：７→Ｓ、Ｎ；９４→Ｔ、Ｖ；９６→Ｐ；１０８→Ｈ；１１７→Ｓ；１５７→Ｔ；１７３→Ｇ；１９４→Ｎ；２０６→Ｑ；および２２３→Ｖ。
【０２２４】
一部の実施形態において、本明細書に記載する改善された操作されたケトレダクターゼ酵素は、本明細書に記載するポリペプチドの欠失を含み得る。従って、本開示のケトレダクターゼポリペプチドのそれぞれおよびすべての実施形態について、欠失は、そのケトレダクターゼ活性の機能的活性が維持される限り、そのケトレダクターゼポリペプチドの１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、６つ以上のアミノ酸、８つ以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、１５以上のアミノ酸、または２０以上のアミノ酸、総アミノ酸数の１０％以下、総アミノ酸数の１０％以下、総アミノ酸数の２０％以下、または総アミノ酸数の３０％以下であり得る。一部の実施形態において、前記欠失は、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０のアミノ酸を含み得る。一部の実施形態において、前記欠失は、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、または１〜２０のアミノ酸残基の欠失を含み得る。一部の実施形態において、欠失の数は、アミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０であり得る。一部の実施形態において、前記欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、または２０アミノ酸残基の欠失を含み得る。
【０２２５】
当業者に理解されるように、アミノ酸残基についての上で定義したカテゴリーの一部は、特に別の指定が無い限り、互いに排他的ではない。従って、２つ以上の物理化学的性質を示す側鎖を有するアミノ酸は、多数のカテゴリーに含まれることがある。任意のアミノ酸または残基についての適切な分類は、特に、本明細書に提供する詳細な開示に鑑みて、当業者に明らかである。
【０２２６】
本明細書に記載する場合、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、ケトレダクターゼポリペプチドが他のポリペプチド、例えば抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）または精製用配列（例えば、Ｈｉｓタグ）、と融合している、融合ポリペプチドの形態である場合がある。従って、他のポリペプチドへの融合を伴うまたは伴わないケトレダクターゼポリペプチドを使用することができる。
【０２２７】
一部の実施形態において、本明細書に記載するポリペプチドは、遺伝子コード化されたアミノ酸に限定されない。遺伝子コード化されたアミノ酸に加えて、本明細書に記載するポリペプチドは、全部または一部、天然由来のおよび／または合成の非コード化アミノ酸から成り得る。本明細書に記載するポリペプチドを構成し得る一定の一般に見かける非コード化アミノ酸としては、次のものが挙げられるが、それらに限定されない：遺伝子コード化されたアミノ酸のＤ−立体異性体；２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２−クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３−フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２−ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３−ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２−メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４−メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２−ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３−ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２−シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４−アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４−アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド−２−イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド−３−イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド−４−イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト−１−イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト−２−イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルカラニン（ｓＡｌａ）；オーソリルアラニン（ａＡｌａ）；３，３−ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３−アミノ−５−フェニルペンタン酸（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）−ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリジン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈＧｌｕ）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）；アゼチジン−３−カルボン酸（ＡＣＡ）；１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸；アリルグリシン（ａＯｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）；ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）。本明細書に記載するポリペプチドを構成し得る追加の非コード化アミノ酸は、当業者に認識される（例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，ＣＲＣ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬの３−７０頁およびそこに引用されている参考文献に提供されている様々なアミノ酸を参照のこと。それらのすべてが参照として援用されている）。これらのアミノ酸は、Ｌ立体配置である場合もあり、またはＤ立体配置である場合もある。
【０２２８】
側鎖保護基を有するアミノ酸または残基も本明細書に記載するポリペプチドを構成する場合があることは、当業者に理解される。そのような保護アミノ酸（この場合、これらは芳香族カテゴリーに属する）の非限定的な例としては、次のもの（括弧内に保護基を列挙する）が挙げられるが、それらに限定されない：Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ−ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ−δ−キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ−ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ−ベンジル）およびＴｙｒ（Ｏ−ベンジル）。
【０２２９】
本明細書に記載するポリペプチドを構成し得る、配座的に拘束されている非コード化アミノ酸としては、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｌ立体配置）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン−３−カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３０】
７．３  操作されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチド
別の態様において、本開示は、操作されたケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを生じさせるために遺伝子発現を制御する１つ以上の異種調節配列に作動可能に連結させることができる。前記操作されたケトレダクターゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するケトレダクターゼポリペプチドを発現させることができる。
【０２３１】
様々なアミノ酸に対応するコドンが知られているため、タンパク質配列を利用できることで、本主題をコードできるすべてのポリヌクレオチドの説明が得られる。同じアミノ酸が代替または同義コドンによってコードされる遺伝子コードの縮重は、極めて多数の核酸（これらのすべてが、本明細書に開示する改善されたケトレダクターゼ酵素をコードする）の作製を可能にする。従って、特定のアミノ酸配列が同定されていれば、当業者は、そのタンパク質のアミノ酸配列を変えないような方法で１つ以上のコドンの配列を単に改変することによって、任意の数の異なる核酸を作ることができる。これに関して、本開示は、可能なコドン選択肢に基づいて組み合わせを選択することによって作ることができるポリヌクレオチドのそれぞれおよびすべての可能な異形を具体的に熟慮しており、すべてのそうした異形は、表２に提示するアミノ酸配列を含めて本明細書に開示するいずれのポリペプチドについても具体的に開示されていると考えられるべきである。
【０２３２】
様々な実施形態において、好ましくは、前記コドンは、そのタンパク質が生産されている宿主細胞に合うように選択される。例えば、細菌において用いられている好ましいコドンを用いて、細菌において遺伝子を発現させ；酵母において用いられている好ましいコドンを酵母での発現に用い；そして哺乳動物において用いられている好ましいコドンを哺乳動物細胞での発現に用いる。例として、配列番号３のポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のためにコドン最適化されているが、他の点ではＬ．ｋｅｆｉｒの天然由来のケトレダクターゼをコードする。
【０２３３】
一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する参照の操作されたケトレダクターゼポリペプチドのいずれかとの少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するケトレダクターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、この場合、そのコードされたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１４２の残基位置１４５に対応する残基に極性残基、特にセリン、を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、１２４、１２６、１３０または１３４から選択されるアミノ酸配列を含む操作されたケトレダクターゼポリペプチドをコードする。
【０２３４】
一部の実施形態において、前記操作されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、および１３３から選択される。
【０２３５】
一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、および１３３に対応する配列を含むポリヌクレオチドの１つに、高ストリンジェント条件下で、ハイブリダイズすることができ、この場合、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする前記ポリヌクレオチドは、構造式（Ｉ）の基質を構造式（ＩＩ）の生成物に変換することができる機能的ケトレダクターゼをコードする。
【０２３６】
一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、本明細書に記載するポリペプチドをコードする核酸配列を含むが、ヌクレオチドレベルで、操作されたケトレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドとの約８０％以上の配列同一性、約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有し、この場合、前記ポリヌクレオチドは、構造式（Ｉ）の基質を構造式（ＩＩ）の生成物に変換することができる機能的ケトレダクターゼをコードする。一部の実施形態において、前記参照ポリヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、および１３３に対応する配列から選択される。
【０２３７】
改善されたケトレダクターゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを、そのポリペプチドの発現に備えるために、様々な方法で操作することができる。発現ベクターによっては、ベクターに挿入する前にその単離されたポリヌクレオチドを操作することが、望ましいまたは必要である場合がある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾する技術は、当該技術分野において周知である。ガイダンスは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９８，２００６年までの最新版に提供されている。
【０２３８】
細菌宿主細胞のための、本開示の核酸構築物の転写の指図に適するプロモーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成性アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核性β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７〜３７３１）から得られるプロモーター、ならびにｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）が挙げられる。さらなるプロモーターは、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９８０，２４２：７４〜９４における「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」；およびＳａｍｂｒｏｏｋら，上記文献に記載されている。
【０２３９】
糸状菌宿主細胞のための、本開示の核酸構築物の転写の指図に適するプロモーターとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ  ９６／００７８７）についての遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼについての遺伝子からのプロモーターとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、ならびにそれらの突然変異プロモーター、短縮型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターが挙げられる。
【０２４０】
酵母宿主において、有用なプロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセレートキナーゼについての遺伝子からのものであり得る。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら，１９９２，Ｙｅａｓｔ８：４２３〜４８８によって説明されている。
【０２４１】
制御配列は、適する転写終結因子配列（宿主細胞によって認識されて転写を終結させる配列）である場合もある。前記ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端にその終結因子配列を作動可能に連結させる。本発明では、選ばれた宿主細胞において機能できる任意の終結因子を用いることができる。
【０２４２】
例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的転写終結因子は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  α−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼについての遺伝子から得ることができる。
【０２４３】
酵母宿主細胞のための例示的終結因子は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼについての遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用な終結因子は、Ｒｏｍａｎｏｓら，１９９２，上記文献によって説明されている。
【０２４４】
制御配列は、適するリーダー配列（宿主細胞による翻訳のために重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域）である場合もある。前記ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端にそのリーダー配列を作動可能に連結させる。選ばれた宿主細胞において機能できる任意のリーダー配列を用いることができる。糸状菌宿主細胞のための例示的リーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適するリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセレートキナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）についての遺伝子から得られる。
【０２４５】
制御配列は、ポリアデニル化配列（核酸配列の３’末端に作動可能に連結された配列であって、転写されると宿主細胞にシグナルとして認識されて、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加させる配列）である場合もある。本発明では、選ばれた宿主細胞において機能できる任意のポリアデニル化配列を用いることができる。糸状菌宿主細胞のための例示的ポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  α−グルコシダーゼについての遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、ＧｕｏおよびＳｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．１５：５９８３〜５９９０によって説明されている。
【０２４６】
制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、そのコードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に向ける、シグナルペプチドコーディング領域である場合もある。前記核酸配列のコーディング配列の５’末端は、翻訳リーディングフレーム内に元々連結されているシグナルペプチドコーディング領域を固有に含有することがあり、そのコーディング領域のセグメントが分泌されるポリペプチドをコードする。あるいは、前記コーディング配列の５’末端は、そのコーディング配列にとって異種であるシグナルペプチドコーディング領域を含有する場合がある。この異種シグナルペプチドコーディング領域は、そのコーディング配列がシグナルペプチドコーディング領域を元々含有しない場合に必要とされ得る。
【０２４７】
あるいは、前記異種シグナルペプチドコーディング領域で天然シグナルペプチドコーディング領域を単に置き換えて、そのポリペプチドの分泌を増進させることができる。しかし、本発明では、発現されたポリペプチドを選ばれた宿主細胞の分泌経路に向ける任意のシグナルペプチドコーディング領域を用いることができる。
【０２４８】
細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコーディング領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣｌＢ  １１８３７マルトース生成性アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  α−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  β−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡについての遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング領域である。さらなるシグナルペプチドは、ＳｉｍｏｎｅｎおよびＰａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ５７：１０９〜１３７によって説明されている。
【０２４９】
糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコーディング領域は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼについての遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング領域であり得る。
【０２５０】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ転化酵素についての遺伝子からのものであり得る。他の有用なシグナルペプチドコーディング領域は、Ｒｏｍａｎｏｓら，１９９２，上記文献によって説明されている。
【０２５１】
制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコーディング領域である場合もある。結果として得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（または一部の場合では酵素原）として知られている。プロポリペプチドは一般に不活性であり、そのプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的開裂によって成熟活性ポリペプチドへと変換され得る。前記プロペプチドコーディング領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼ（ＷＯ  ９５／３３８３６）についての遺伝子から得ることができる。
【０２５２】
シグナルペプチド領域とプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端のすぐ隣に位置し、シグナルペプチド領域は、そのプロペプチド領域のアミノ末端のすぐ隣に位置する。
【０２５３】
宿主細胞の増殖に関連してポリペプチドの発現を調節することを可能にする調節配列を付加させることが望ましい場合もある。調節系の例は、調節化合物の存在を含めて、化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにさせる。原核宿主細胞において、適する調節配列としては、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞において、適する調節系には、例として、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌において、適する調節配列としては、ＴＡＫＡ  α−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
【０２５４】
調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にする。真核系の場合、これらとしては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合では、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードする核酸配列をその調節配列に作動可能に連結させることとなる。
【０２５５】
従って、一部の実施形態において、本開示は、組換え発現ベクターが導入されることとなる宿主のタイプに依存して、操作されたケトレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその変異体、ならびに１つ以上の発現調節領域、例えばプロモーターおよび終結因子、複製起点などを含む、組換え発現ベクターにも関する。上に記載した様々な核酸および制御配列を互いに連結させて、組換え発現ベクター（これは、１つ以上の適便な制限部位を含んで、ポリペプチドをコードする核酸配列のそのような部位での挿入または置換を可能にすることができる）を生じさせることができる。あるいは、本開示の核酸配列を、発現のための適切なベクターにその核酸配列または該配列を含む核酸構築物を挿入することによって、発現させることができる。前記発現ベクターを作る場合には、コーディング配列をそのベクター内に配置して、そのコーディング配列を発現のための適切な制御配列と作動可能に連結させる。
【０２５６】
組換え発現ベクターは、適便に組換えＤＮＡ手順に付すことができ、且つ、ポリヌクレオチド配列の発現を生じさせることができる、任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。前記ベクターの選択は、そのベクターを導入することとなる宿主細胞とそのベクターの適合性に代表的に依存する。前記ベクターは、線状プラスミドである場合もあり、または閉環状プラスミドである場合もある。
【０２５７】
一部の実施形態において、前記発現ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、染色体外エンティティーとして存在するベクター（その複製は染色体の複製に依存しない）、例えばプラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であり得る。前記ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有する場合がある。あるいは、前記ベクターは、宿主細胞に導入されたときにそのゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（単数または複数）と一緒に複製されるものである場合もある。さらに、単一のベクターもしくはプラスミドまたは２つ以上のベクターもしくはプラスミド（これらは、一緒に、宿主細胞のゲノムに導入されるべき全ＤＮＡを含有する）、あるいはトランスポゾンを使用する場合がある。
【０２５８】
本開示の発現ベクターは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする１つ以上の選択マーカーを含有することができる。選択マーカーは、その産物が殺生物剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養、などを規定する遺伝子である。細菌選択マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのｄａｌ遺伝子、または抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール（実施例１）もしくはテトラサイクリン耐性、を付与するマーカーである。酵母宿主細胞のための適するマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３である。
【０２５９】
糸状菌宿主細胞において使用するための選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの等価物が挙げられるが、それらに限定されない。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞において使用するための実施形態としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子が挙げられる。
【０２６０】
好ましくは、本発明の発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへのそのベクターの組み込みを可能にするまたはそのゲノムとは無関係にその細胞におけるそのベクターの自律複製を可能にするエレメント（単数または複数）を含有する。宿主細胞ゲノムへの組込みのために、前記ベクターは、前記ポリペプチドをコードする核酸配列に依存する場合もあり、または相同もしくは非相同組換えによるそのベクターのそのゲノムへの組み込みのためにそのベクターの任意の他のエレメントに依存する場合もある。
【０２６１】
あるいは、前記発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組込みを指図するための追加の核酸配列を含有する場合がある。それらの追加の核酸配列は、宿主細胞ゲノムのその（それらの）染色体（単数または複数）内の正確な位置（単数または複数）に前記ベクターを組み込むことができる。正確な位置での組込みの尤度を増すために、前記組込みエレメントは、対応する標的配列と高相同性である核酸の、相同組換えの確率を増すために十分な数、例えば、１００から１０，０００塩基対、好ましくは４００から１０，０００塩基対、および最も好ましくは８００から１０，０００塩基対を好ましくは含有すべきである。前記組込みエレメントは、宿主細胞のゲノム内の標的配列と相同性である任意の配列であり得る。さらに、前記組込みエレメントは、非コード化核酸配列である場合もあり、またはコード化核酸配列である場合もある。一方、前記ベクターを非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。
【０２６２】
自律複製のために、前記ベクターは、問題の宿主細胞におけるそのベクターの自律複製を可能にする複製起点をさらに含み得る。細菌の複製起点の例は、Ｐ１５Ａ  ｏｒｉ、またはＥ．ｃｏｌｉにおける複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７（このプラスミドはＰ１５Ａ  ｏｒｉを有する）もしくはｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、またはＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするプラスミドｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０もしくはｐＡＭβ１の複製起点である。酵母宿主細胞において使用するための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組み合わせ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組み合わせである。前記複製起点は、宿主細胞におけるその機能化を温度感受性にする突然変異を有するものである場合もある（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ，１９７８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１４３３参照）。
【０２６３】
本発明の核酸配列の１つより多くのコピーを宿主細胞に挿入して、遺伝子産物の生産を増加させることができる。前記核酸配列のコピー数の増加は、その配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞のゲノムに組み込むことによって達成することができ、または増幅可能な選択マーカー遺伝子をその核酸配列と共に含めることによって達成することがでる（この場合、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含有し、その結果、追加の核酸配列コピーを含有する細胞は、それらの細胞を適切な選択作用因子の存在下で培養することによって、選択することができる）。
【０２６４】
本発明において使用するための発現ベクターの多くは、市販されている。適する市販の発現ベクターとしては、ＣＭＶプロモーターと、哺乳動物宿主細胞における発現のためのｈＧＨポリアデニル化部位と、ｐＢＲ３２２複製起点と、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのアンピシリン耐性マーカーとを含む、ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓからのｐ３ｘＦＬＡＧＴＭＴＭ発現ベクターが挙げられる。他の適する発現ベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）およびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらは、カリフォルニア州、ラ・ホーヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅから市販されている）、ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙ（Ｌａｔｈｅら，１９８７、Ｇｅｎｅ  ５７：１９３〜２０１）から誘導されるプラスミドである。
【０２６５】
７．４  ケトレダクターゼポリペプチドの発現のための宿主細胞
別の態様において、本開示は、本開示の改善されたケトレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、このポリヌクレオチドは、その宿主細胞におけるケトレダクターゼ酵素の発現のために１つ以上の制御配列に作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされるＫＲＥＤポリペプチドを発現させる際に使用される宿主細胞は、当該技術分野において周知であり、それらとしては、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエＳ２およびヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞；ならびに動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記宿主細胞のための適切な培養培地および増殖条件は、当該技術分野において周知である。
【０２６６】
前記ケトレダクターゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当該技術分野において公知の様々な方法によって細胞に導入することができる。技術としては、数ある中でも、エレクトロポレーション、バイオリスティック・パーティクル・ボンバードメント、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。細胞にポリヌクレオチドを導入するための様々な方法は、当業者に明らかである。
【０２６７】
例示的宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０である。ｌａｃＩリプレッサーの制御下で、ｌａｃプロモーターに作動可能に連結されたプラスミドｐＣＫ１１０９００に、改善されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結させることによって、発現ベクターを作成した。この発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有する。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０の中の対象ポリヌクレオチドを含有する細胞を、それらの細胞をクロラムフェニコール選択に付すことによって、単離した。
【０２６８】
７．５  操作されたケトレダクターゼポリペプチドの生成方法
一部の実施形態では、本開示の改善されたＫＲＥＤポリヌクレオチドおよびポリペプチドを作るために、還元反応を触媒する天然由来のケトレダクターゼ酵素を、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓから得る（または誘導する）。一部の実施形態では、その親ポリヌクレオチド配列をコドン最適化して、指定宿主細胞におけるケトレダクターゼの発現を増進させる。実例として、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおいて入手できるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ  ＫＲＥＤ配列の公知ポリペプチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＰ９４０２９  ＧＩ：３３１１２０５６）に基づいて調製したオリゴヌクレオチドから、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒの野生型ＫＲＥＤポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列を構築した。その親ポリヌクレオチド配列をＥ．ｃｏｌｉでの発現のためにコドン最適化し、そのコドン最適化されたポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングし、ｌａｃプロモーターおよびｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下でそのケトレダクターゼ遺伝子を発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて活性ケトレダクターゼを発現するクローンを同定し、遺伝子の塩基配列を決定してそれらの素性を確認した。（配列番号１）と呼ぶその配列が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒケトレダクターゼから進化させる操作されたケトレダクターゼの大部分の実験およびライブラリ構築のための出発点として利用した親配列であった。
【０２６９】
前記操作されたケトレダクターゼは、上で論じたように、天然由来のケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｃｄｅ）を突然変異誘発および／または定方向進化法に付すことによって得ることができる。例示的定方向進化技術は、Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：１０７４７〜１０７５１；ＷＯ  ９５／２２６２５；ＷＯ  ９７／００７８；ＷＯ  ９７／３５９６６；ＷＯ  ９８／２７２３０；ＷＯ  ００／４２６５１；ＷＯ  ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号に記載されているような突然変異誘発および／またはＤＮＡシャッフリングである。用いることができる他の定方向進化手順としては、数ある中でも、スタッガード伸長プロセス（ＳｔＥＰ）、インビトロ組換え（Ｚｈａｏら，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２５８〜２６１）、突然変異誘発ＰＣＲ（Ｃａｌｄｗｅｌｌら，１９９４，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３：Ｓ１３６〜Ｓ１４０）、およびカセット突然変異誘発（Ｂｌａｃｋら，１９９６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：３５２５〜３５２９）が挙げられる。
【０２７０】
突然変異誘発処理後に得られたクローンを、所望の改善された酵素特性を有する操作されたケトレダクターゼについてスクリーニングする。発現ライブラリからの酵素活性の測定は、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋に変換されるにつれてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ濃度が減少する率を（吸光度または蛍光の減少によって）モニターする標準的な生化学技術を用いて行うことができる。（例えば、実施例７参照）。この反応では、ケトレダクターゼがケトン基質をその対応するヒドロキシル基に還元するにつれて、そのケトレダクターゼによってＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが消費（酸化）される。単位時間あたりの、吸光度または蛍光の減少によって測定されるような、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ濃度の減少率は、固定量の溶解産物（またはそれから作られた凍結乾燥粉末）中のＫＲＥＤポリペプチドの相対（酵素）活性を示す。所望される改善された酵素特性が、熱安定性である場合、酵素活性は、その酵素調製品を規定された温度に付し、熱処理後に残存する酵素活性の量を測定した後、測定することができる。その後、ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを単離し、塩基配列を決定して（もしあれば）そのヌクレオチド配列の変化を特定し、そしてそれらを用いて宿主細胞においてその酵素を発現させる。
【０２７１】
その操作されたポリペプチドの配列がわかっている場合、公知の合成方法に従って、標準的な固相法により、その酵素をコードするポリヌクレオチドを調製することができる。一部の実施形態では、約１００塩基までのフラグメントを個々に合成し、その後、（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション法、またはポリメラーゼ媒介法によって）連結させて、任意の所望される連続配列を形成することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら，１９８１，Ｔｅｔ  Ｌｅｔｔ  ２２：１８５９〜６９により説明された古典的ホスホルアミダイト法、または例えば、それを主として自動合成法で実施する場合には、Ｍａｔｔｈｅｓら，１９８４，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８０１〜０５により説明された方法を用いて、化学合成により調製することができる。前記ホスホルアミダイト法によると、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成装置で合成され、精製され、アニールされ、ライゲートされ、適切なベクターにクローニングされる。加えて、本質的に、様々な市場の供給業者、例えばテキサス州、ミッドランドのＴｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、カリフォルニア州、ラモーナのＴｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州、シカゴのＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、アラミダのＯｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．および多くの他の業者、のいずれからいずれの核酸を入手してもよい。
【０２７２】
宿主細胞において発現された操作されたケトレダクターゼ酵素は、数ある中でもリゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離法およびクロマトグラフィーをはじめとする周知のタンパク質精製技術のいずれか１つ以上を用いて、それらの細胞およびまたは培養培地から回収することができる。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌からのタンパク質の溶解および高効率抽出に適する溶液は、ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃ  ＢＴＭで市販されている。
【０２７３】
ケトレダクターゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフ技術としては、数ある中でも、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、実効電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの因子に一部依存し、当業者に明らかである。
【０２７４】
一部の実施形態では、アフィニティー技術を用いて、前記改善されたケトレダクターゼ酵素を単離することができる。アフィニティークロマトグラフィー精製には、前記ケトレダクターゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用することができる。抗体の生産のために、ポリペプチドを注射することによって、ウサギ、マウス、ラットなどが挙げられる（しかし、これらに限定されない）様々な宿主動物を免疫することができる。前記ポリペプチドは、側鎖官能基、または側鎖官能基に結合されたリンカーによって、ＢＳＡなどの適するキャリアに結合させることができる。宿主種に依存して、フロイント（完全または不完全）アジュバント、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（杆菌Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍが挙げられる（しかし、これらに限定されない）様々なアジュバントを使用してその免疫応答を増加させることができる。
【０２７５】
７．６  操作されたケトレダクターゼ酵素の使用法およびそれらを用いて調製される化合物
本明細書に記載するケトレダクターゼ酵素は、構造式（Ｉ）の化合物である３−ケトチオラン：
【０２７６】
【化６】
2010536385.tif 000013
におけるケト基の、構造式（ＩＩ）の対応するキラルアルコール生成物である（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランへの還元反応を触媒することができる：
【０２７７】
【化７】
2010536385.tif 000014
一部の実施形態において、本発明は、式（Ｉ）の構造式の基質を構造式（ＩＩ）の生成物に還元するための方法を提供し、この方法は、その基質をそのアルコール生成物に還元するために適する反応条件下で、その基質を、本明細書に開示するケトレダクターゼポリペプチドと接触させることまたは本明細書に開示するケトレダクターゼポリペプチドと共にインキュベートすることを含む。
【０２７８】
例えば、前記方法の一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、それぞれ配列番号４、２および１４２の野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒまたはＬ．ｂｒｅｖｉｓまたはＬ．ｍｉｎｏｒ  ＫＲＥＤ配列と比較して、Ｘ１４５に対応する残基に極性残基、特にセリン、を有するアミノ酸配列を含む。本明細書中で述べているように、加えて、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１０６の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基での１つ以上の突然変異を有する場合がある。そのような相違は、配列番号１４３、１４４および１４５の配列式ならびに本明細書における説明において説明する。
【０２７９】
この方法の一部の実施形態において、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、例として、限定としてでなく、Ｘ１４５に対応する残基に極性残基、特にセリン、を有する配列番号２、４または１４２に基づく参照配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含み、この場合のケトレダクターゼポリペプチドも、Ｘ１４５に対応する残基に極性残基、特にセリンを有する。
【０２８０】
前記方法の一部の実施形態において、前記生成物は、約６５％より高い立体異性体過剰率で還元され、この場合のケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、１２４、１２６、１３０、または１３４に対応する配列を含む。
【０２８１】
この方法の一部の実施形態において、前記基質は、約９０％より高い立体異性体過剰率で前記生成物に還元され、この場合のケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、９４、９６、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１２６、１２８、１３０、または１３４に対応するアミノ酸配列を含む。
【０２８２】
前記方法の一部の実施形態において、前記基質は、約９８％より高いｓ．ｅ．で前記生成物に還元され、この場合のケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、３６、３８、４０、４２、５０、５２、５４、５８、６２、６６、７０、７２、７６、７８、８０、および１３４に対応するアミノ酸配列を含む。
【０２８３】
前記基質を前記生成物に還元するための一部の実施形態において、前記基質は、野生型酵素（配列番号４）と比較して改善した率で生成物に還元され、この場合のケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、１２４、１２６、１３０、または１３４に対応するアミノ酸配列を含む。
【０２８４】
一部の実施形態において、前記反応条件は、ｐＨ７．５以下である。一部の実施形態において、前記反応条件は、約５．０から約７．５のｐＨでのものである。一部の実施形態において、前記反応条件は、約ｐＨ６．０から７．５のｐＨでのものである。一部の実施形態において、前記反応条件温度は、約２５℃以下である。一部の実施形態において、前記反応条件は、５℃から約２５℃または５℃から１５℃の温度でのものである。一部の実施形態において、前記反応条件は、下でさらに説明するような、補因子再生系も含む。
【０２８５】
一部の実施形態において、前記基質を前記生成物に還元するための方法は、前記基質と本開示のケトレダクターゼとを、少なくとも１００ｇ／Ｌの基質および少なくとも０．８〜１．０ｇ／Ｌのケトレダクターゼポリペプチドを含む反応条件で、接触させることを含み得、この場合、その基質の少なくとも９０％が、２４時間未満（例えば２０〜２４時間）で生成物に変換される。部の実施形態において、前記基質の９５％より多く、９６％、９７％、９８％、または９９％以上が、前記反応条件下で前記生成物に変換される。前記方法において使用するための例示的ポリペプチドとしては、配列番号６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３２、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６４、６６、６８、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８６、８８、９０、９２、１０４、１０６、１１０、１１２、１２６、１３０、および１３４に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８６】
一部の実施形態において、前記基質を前記生成物に還元するための方法は、前記基質と本開示のケトレダクターゼとを、少なくとも１００ｇ／Ｌの基質および少なくとも０．８〜１．０ｇ／Ｌのケトレダクターゼポリペプチドを含む反応条件で、接触させることを含み得、この場合、その基質の少なくとも９０％が、１２〜２０時間で生成物に変換される。一部の実施形態において、前記基質の９５％より多く、９６％、９７％、９８％、または９９％以上が、前記反応条件下で前記生成物に変換される。前記方法において使用するための例示的ポリペプチドは、配列番号２６、４４、６８、および１０４を含むが、これらに限定されない。
【０２８７】
一部の実施形態では、抗生物質およびプロテアーゼ阻害剤などの様々な薬物を生成するための中間体である（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランの生成に、本明細書に提供するケトレダクターゼポリペプチドのいずれか１つを使用することができる。一部の実施形態では、下記構造式（ＩＩＩ）を有する抗生物質スロペネム（ＣＰ−７０，４２９）、およびその塩、ならびにそれらの溶媒和物および水和物の生成に前記ケトレダクターゼポリペプチドを使用することができる：
【０２８８】
【化８】
2010536385.tif 000015
従って、一部の実施形態において、構造式（ＩＩＩ）の抗生物質（すなわち、ＣＰ−７０，４２９）の合成のための方法において、その方法における１つの工程は、式（Ｉ）の基質と本明細書に記載するケトレダクターゼのいずれかとを接触させ、それによってその基質を構造式（ＩＩ）の生成物に変換または還元することを含み得る。
【０２８９】
構造式（ＩＩ）の生成物は、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，５７：４３５２（本明細書に参照として援用されている）に記載されている合成経路によって、構造式（ＩＩＩ）を有するスロペネム、およびその中間体に変換することができる。そこに記載されている経路を下に図示する（この式中のＴｓは、ｐ−トシルであり、Ａｃは、アセチルであり、そしてＴＢＳは、ｔ−ブチルジメチルシリルである）。
【０２９０】
【化９】
2010536385.tif 000016
一部の実施形態における方法は、構造式（ＩＶ），（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、および（ＸＩ）の中間体のそれぞれ１つの合成に備えるものであり、この場合、それらの中間体の合成方法における１つの工程は、式（Ｉ）の基質と本明細書に記載するケトレダクターゼのいずれかとを、その基質を構造式（ＩＩ）の生成物に変換または還元するために適する条件下で、接触させることを含むことがある。
【０２９１】
そのような方法の追加の工程（単数または複数）は、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，５７：４３５２（参照により援用されている）に記載されている工程（単数もしくは複数）についての手順、またはその変形に従うものであり得る。構造式（ＩＩ）の生成物の構造式（ＩＶ）の中間体への変換のために、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，５７：４３５２に記載されている手順で使用されるジメチルアミノピリジン試薬の代わりにピリジンまたは１−メチルイミダゾールを用いることができる。構造式（ＩＶ）の中間体の構造式（Ｖ）の中間体への変換のために、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，５７：４３５２に記載されている手順では０℃で行われる反応をより低い温度で、例えば−２５℃で行って、対応するスルホン副生成物の形成をさらに最小にすることができる。
【０２９２】
一部の実施形態において、前記（Ｒ）−３−ヒドロキシチオラン中間体は、ＨＩＶ−プロテアーゼ阻害剤（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，３７：１１７７）またはその合成が中間体（Ｒ）−３−ヒドロキシチオラン（式（ＩＩ））に依存する他の化合物もしくは薬物の合成において使用することができ、この場合、前記薬剤化合物の合成方法における１つの工程は、本明細書に提供するケトレダクターゼポリペプチドのいずれか１つを使用して式（Ｉ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物に還元または変換することを含む。
【０２９３】
当業者には公知であるように、ケトレダクターゼ触媒還元反応は、代表的に補因子を必要とする。本明細書に記載する操作されたケトレダクターゼ酵素によって触媒される還元反応も代表的に補因子を必要とするが、本操作されたケトレダクターゼの多くの実施形態は、野生型ケトレダクターゼ酵素で触媒される反応よりはるかに少ない補因子しか必要としない。本明細書において用いる場合、用語「補因子」は、ケトレダクターゼ酵素との組み合わせで動作する非タンパク質化合物を指す。本明細書に記載する操作されたケトレダクターゼ酵素と共に使用するために適する補因子としては、ＮＡＤＰ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰ＋の還元形）、ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）およびＮＡＤＨ（ＮＡＤ＋の還元形）が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、前記補因子の還元形を反応混合物に添加する。前記還元ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ形は、場合によっては、補因子再生系を使用してその酸化ＮＡＤ（Ｐ）＋形から再生させることができる。
【０２９４】
用語「補因子再生系」は、補因子の酸化形を還元する反応（例えば、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨ）に関与する１セットの反応物を指す。ケト基質のケトレダクターゼ触媒還元によって酸化された補因子は、補因子再生系によって還元形に再生される。補因子再生系は、還元性水素等価物の源であり、且つ、その補因子の酸化形を還元できる、化学量論的量の還元剤を含む。補因子再生系は、その還元剤によるその補因子の酸化形の還元を触媒する触媒、例えば酵素触媒、をさらに含み得る。ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋からそれぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生するための補因子再生系は、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載する方法においてそれらを使用することができる。
【０２９５】
利用することができる、適する例示的補因子再生系としては、グルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼ、ホルマートおよびギ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸塩およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、第二級（例えば、イソプロパノール）アルコールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼ、亜リン酸塩および亜リン酸デヒドロゲナーゼ、分子水素およびヒドロゲナーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの系を、補因子としてＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ＋／ＮＡＤＨいずれかと併用することができる。ヒドロゲナーゼを使用する電気化学的再生も、補因子再生系として用いることができる。例えば、米国特許第５，５３８，８６７号および同第６，４９５，０２３号参照（これらの両方が参照により本明細書に援用されている）。金属触媒および還元剤（例えば、分子水素またはホルマート）を含む化学的補因子再生系も適する。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２０００／０５３７３１参照（これは参照により本明細書に援用されている）。
【０２９６】
用語「グルコースデヒドロゲナーゼ」および「ＧＤＨ」は、グルコン酸およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへのＤ−グルコースおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の変換をそれぞれ触媒する、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性酵素を指すために本明細書では交換可能に用いている。下の反応式（１）は、グルコースによるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のグルコースデヒドロゲナーゼ触媒還元を説明する。
【０２９７】
【化１０】
2010536385.tif 000017
本明細書に記載する方法の実施の際の使用に適するグルコースデヒドロゲナーゼは、天然由来グルコースデヒドロゲナーゼと非天然由来グルコースデヒドロゲナーゼの両方を含む。天然由来グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、文献に報告されている。例えば、Ｂａｃｃｉｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ６１２９７  ＧＤＨ遺伝子が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてその天然宿主において生産された酵素と同じ物理化学的性質を示すと報告されている（Ｖａｓａｎｔｈａら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７８５）。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１２２７６に対応するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＧＤＨ遺伝子の遺伝子配列は、Ｌａｍｐｅｌら，１９８６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６：２３８〜２４３により報告されており、そして補正された形のものは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ５０４５３としてＹａｍａｎｅら，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２：３０４７〜３０５６により報告されている。天然由来のＧＤＨ遺伝子は、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９からのＧＤＨをコードするもの（Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２３：８７〜９１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ０１７０１３）およびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍからのＧＤＨをコードするもの（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８８，１７４：４８５〜４９０，ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１２３７０；Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９９０，７０：３６３〜３６９，ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ２１６２７０）も含む。Ｂａｃｉｌｌｕｓ種からのグルコースデヒドロゲナーゼは、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９に、（そのＰＣＴ公報の配列番号９および１１にそれぞれ対応するポリヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１０および１２として提供されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
【０２９８】
非天然由来グルコースデヒドロゲナーゼは、例えば突然変異誘発、定方向進化などのような公知の方法を用いて生じさせることができる。天然由来であろうと、非天然由来であろうと、適する活性を有するＧＤＨ酵素は、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９の実施例４に記載されているアッセイを用いて容易に同定することができ、その開示は参照により本明細書に援用される。例示的非天然由来グルコースデヒドロゲナーゼは、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９に配列番号６２、６４、６６、６８、１２２、１２４、および１２６として提供されている。それらをコードするポリヌクレオチド配列は、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９に、それぞれ、配列番号６１、６３、６５、６７、１２１、１２３、および１２５として提供されている。これらの配列のすべてが参照により本明細書に援用される。本明細書に開示するケトレダクターゼ触媒還元反応において使用するために適する追加の非天然由来グルコースデヒドロゲナーゼは、米国特許出願公開第２００５／００９５６１９号および同第２００５／０１５３４１７号に提供されており、これらの開示は、参照により本明細書に援用される。
【０２９９】
本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応に利用されるグルコースデヒドロゲナーゼは、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９の実施例４に記載されているアッセイにおいて、少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇの、および時として少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇまたは約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇ、約１０４μｍｏｌ／分／ｍｇまで、またはそれより高い活性を示すことができる。
【０３００】
本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応は、一般に、溶媒中で行われる。適する溶媒としては、水、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエンなど）、イオン性液体（例えば、テトラフルオロホウ酸１−エチル−４−メチルイミダゾリウム、テトラフルオロホウ酸１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、ヘキサフルオロリン酸１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムなど）が挙げられる。一部の実施形態では、水および水性共溶媒系をはじめとする水性溶媒が、使用される。
【０３０１】
例示的水性共溶媒系は、水および１つ以上の有機溶媒を有する。一般に、水性共溶媒系の有機溶媒成分は、それがケトレダクターゼ酵素を完全には不活性化しないように選択される。適切な共溶媒系は、本明細書に記載するものなどの酵素活性アッセイを利用して、候補溶媒系中での対象となる規定された基質を用いて特定の操作されたケトレダクターゼ酵素の酵素活性を測定することによって、容易に特定することができる。
【０３０２】
水性共溶媒系の有機溶媒成分は、その水性成分と混和性であって、単一の液相を生じさせる場合もあり、またはその水性成分と部分混和性もしくは不混和性であって、２つの液相を生じさせる場合もある。一般に、水性共溶媒系を利用するときには、有機溶媒に分散された水、またはその逆で、二相性になるように選択する。一般に、水性共溶媒系を利用するときには、水相から容易に分離することができる有機溶媒を選択することが望ましい。一般に、前記共溶媒系中の水の有機溶媒に対する比率は、代表的に、有機溶媒対水  約９０：１０から約１０：９０（ｖ／ｖ）の範囲、および有機溶媒対水  ８０：２０と２０：８０（ｖ／ｖ）の間である。前記共溶媒系は、反応混合物に添加する前に前もって形成される場合もあり、または反応容器内でインサイチュで形成される場合もある。
【０３０３】
水性溶媒（水または水性共溶媒系）は、ｐＨ緩衝されていても、緩衝されていなくてもよい。一般に、前記還元は、約１０以下、通常は約５から約１０の範囲のｐＨで行うことができる。一部の実施形態において、前記還元は、約９以下、通常は約５から約９の範囲のｐＨで行われる。一部の実施形態において、前記還元は、約８以下、多くの場合、約５から約８の範囲、および通常は約６から約８の範囲のｐＨで行われる。前記還元は、約７．８以下、または約７．５以下のｐＨで行われる場合もある。あるいは、前記還元は、中性ｐＨ、すなわち約７、で行われる場合がある。
【０３０４】
前記還元反応の過程で、反応混合物のｐＨが変わることがある。反応の過程で酸または塩基を添加することにより、その反応混合物のｐＨを所望のｐＨでまたは所望のｐＨ範囲内で維持することができる。あるいは、緩衝剤を含む水性溶媒を使用することによって、ｐＨを制御することができる。所望のｐＨ範囲を維持するために適する緩衝剤は、当該技術分野において公知であり、それらとしては、例えば、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液などが挙げられる。緩衝と酸または塩基添加とを併用してもよい。
【０３０５】
グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ補因子再生系を用いる場合、反応式（１）で表されるようなグルコン酸の共生成（ｐＫａ＝３．６）は、結果として生ずる水性グルコン酸を別の方法で中和しなければ、その反応混合物のｐＨを低下させる。反応混合物のｐＨは、備わっている緩衝能まで緩衝剤がグルコン酸を中和する標準的な緩衝技術によって、またはその変換の過程で並行して塩基を添加することによって、所望のレベルで維持することができる。緩衝と塩基添加とを併用してもよい。所望のｐＨ範囲を維持するために適する緩衝剤は、上に記載されている。グルコン酸の中和に適する塩基は、有機塩基、例えばアミン、アルコキシドなど、および無機塩基、例えば水酸化物塩（例えば、ＮａＯＨ）、炭酸塩（例えば、ＮａＨＣＯ３）、重炭酸塩（例えば、Ｋ２ＣＯ３）、塩基性リン酸塩（例えば、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４）などである。前記変換の過程と並行した塩基の添加は、その反応混合物のｐＨをモニターしながら手作業で、またはより適便には、ｐＨスタットのような自動滴定装置を使用することによって、行うことができる。プロセス制御のために、部分緩衝能と塩基添加とを併用することもできる。
【０３０６】
ケトレダクターゼ触媒還元反応中に放出されるグルコン酸を中和するために塩基添加を用いる場合、ｐＨを維持するために添加する塩基の量によってその変換の進行をモニターすることができる。代表的に、還元の過程で緩衝されていない反応混合物または部分緩衝反応混合物に添加される塩基は、水溶液で添加される。
【０３０７】
一部の実施形態において、前記補因子再生系は、ギ酸デヒドロゲナーゼを含み得る。用語「ギ酸デヒドロゲナーゼ」および「ＦＤＨ」は、二酸化炭素およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへのホルマートおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の変換をそれぞれ触媒する、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性酵素を指すために、本明細書では交換可能に用いている。本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応における補因子再生系としての使用に適するギ酸デヒドロゲナーゼは、天然由来のギ酸デヒドロゲナーゼと、非天然由来ギ酸デヒドロゲナーゼの両方を含む。ギ酸デヒドロゲナーゼとしては、ＰＣＴ公報２００５／０１８５７９の配列番号６９および７１にそれぞれ対応するポリヌクレオチド配列によってコードされる、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９の配列番号７０（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種）および７２（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）に対応するものが挙げられ、これらの開示は参照により本明細書に援用される。本明細書に記載する方法において用いられるギ酸デヒドロゲナーゼは、天然由来であろうと、または非天然由来であろうと、少なくとも約１μｍｏｌ／分／ｍｇ、時として少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇ、または少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇ、約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇまで、またはそれより高い活性を示すことができ、およびＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９の実施例４に記載されているアッセイで活性について容易にスクリーニングすることができる。
【０３０８】
本明細書において用いる場合、用語「ホルマート」は、ギ酸アニオン（ＨＣＯ２−）、ギ酸（ＨＣＯ２Ｈ）、およびこれらの混合物を指す。ホルマートは、塩の形態、代表的にアルカリまたはアンモニウム塩（例えば、ＨＣＯ２Ｎａ、ＫＨＣＯ２ＮＨ４など）の形態で、ギ酸、代表的にギ酸水溶液、の形態で、またはそれらの混合物で供給することができる。ギ酸は、穏やかな酸である。そのｐＫａ（水中で、ｐＫａ＝３．７）の数ｐＨ単位以内の水溶液中では、ホルマートは、平衡濃度でＨＣＯ２−とＨＣＯ２Ｈの両方として存在する。約ｐＨ４より高いｐＨ値では、ホルマートは、主としてＨＣＯ２−として存在する。ホルマートをギ酸として供給する場合、代表的に、塩基の添加によってその反応混合物を緩衝してまたはより低酸性にして、代表的に約ｐＨ５以上の、所望のｐＨを生じさせる。ギ酸の中和に適する塩基としては、有機塩基、例えばアミン、アルコキシドなど、および無機塩基、例えば水酸化物塩（例えば、ＮａＯＨ）、炭酸塩（例えば、ＮａＨＣＯ３）、重炭酸塩（例えば、Ｋ２ＣＯ３）、塩基性リン酸塩（例えば、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０９】
ホルマートが主としてＨＣＯ２−として存在する約ｐＨ５より高いｐＨ値については、下の反応式（２）によって、ホルマートによるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のギ酸デヒドロゲナーゼ触媒還元が説明される。
【０３１０】
【化１１】
2010536385.tif 000018
ホルマートおよびギ酸デヒドロゲナーゼを補因子再生系として用いる場合、備わっている緩衝能まで緩衝剤がプロトンを放出する標準的な緩衝技術によって、またはその変換の過程と並行して酸を添加することによって、その反応混合物のｐＨを所望のレベルで維持することができる。ｐＨを維持するためにその反応の過程で添加される適する酸としては、有機酸、例えばカルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸など、および鉱酸、例えば、ハロゲン化水素酸（例えば、塩化水素酸）、硫酸、リン酸など、酸性塩、例えば二水素リン酸塩（例えば、ＫＨ２ＰＯ４）、重硫酸塩（例えば、ＮａＨＳＯ４）などが挙げられる。一部の実施形態は、ギ酸を利用し、それによって、その溶液のホルマート濃度とｐＨの両方を維持する。
【０３１１】
ホルマート／ギ酸デヒドロゲナーゼ補因子再生系を使用する還元反応中にｐＨを維持するために酸添加を用いる場合、そのｐＨを維持するために添加する酸の量によって、その変換の進行をモニターすることができる。代表的に、変換の過程で緩衝されていない反応混合物または部分緩衝反応混合物に添加される酸は、水溶液で添加される。
【０３１２】
用語「第二級アルコールデヒドロゲナーゼ」および「ｓＡＤＨ」は、ケトンおよびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへの第二級アルコールおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の変換をそれぞれ触媒する、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性酵素を指すために、本明細書では交換可能に用いている。下の反応式（３）は、イソプロパノールによって例証される第二級アルコールによるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の還元を説明する。
【０３１３】
【化１２】
2010536385.tif 000019
本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応において補因子再生系としての使用に適する第二級アルコールデヒドロゲナーゼは、天然由来第二級アルコールデヒドロゲナーゼと、非天然由来第二級アルコールデヒドロゲナーゼの両方を含む。天然由来第二級アルコールデヒドロゲナーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏａｎｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｔｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓからの公知アルコールデヒドロゲナーゼが挙げられ、そして非天然由来第二級アルコールデヒドロゲナーゼとしては、それらから誘導された操作されたアルコールデヒドロゲナーゼが挙げられる。本明細書に記載する方法において用いられる第二級アルコールデヒドロゲナーゼは、天然由来であろうと、または非天然由来であろうと、少なくとも約１μｍｏｌ／分／ｍｇ、時として少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇ、または少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇ、約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇまで、またはそれより高い活性を示すことができる。
【０３１４】
適する第二級アルコールとしては、低級第二級アルコールおよびアリール−アルキルカルビノールが挙げられる。低級第二級アルコールの例としては、イソプロパノール、２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、３，３−ジメチル−２−ブタノールなどが挙げられる。１つの実施形態において、前記第二級アルコールは、イソプロパノールである。適するアリール−アルキルカルビノールとしては、非置換および置換１−アリールエタノールが挙げられる。
【０３１５】
第二級アルコールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを補因子再生系として用いる場合、結果として生ずるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋は、その第二級アルコールデヒドロゲナーゼによるその第二級アルコールのケトンへの共役酸化によって還元される。一部の操作されたケトレダクターゼは、第二級アルコール還元体を脱水素する活性も有する。還元体として第二級アルコールを使用する一部の実施形態では、その操作されたケトレダクターゼとその第二アルコールケトレダクターゼが同じ酵素である。
【０３１６】
補因子再生系を用いる本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応の実施形態を行う場合、最初にその補因子の酸化形を供給してもよいし、還元形を供給してもよい。上で説明したように、補因子再生系は、酸化された補因子をその還元形に変換し、その後、それがケトレダクターゼ基質の還元に利用される。
【０３１７】
一部の実施形態では、補因子再生系を使用しない。補因子再生系を使用せずに行われる還元反応については、補因子を還元形で反応混合物に添加する。
【０３１８】
一部の実施形態において、宿主生物の全細胞を使用して前記プロセスを行う場合、その全細胞は、生得的に補因子を提供することができる。あるいは、または併せて、前記細胞は、生得的にまたは組換えにより、グルコースデヒドロゲナーゼを提供することができる。
【０３１９】
本明細書に記載する立体選択的還元反応を行う場合、前記操作されたケトレダクターゼ酵素、および任意の補因子再生系を構成する任意の酵素は、精製された酵素の形態、それらの酵素をコードする遺伝子（単数もしくは複数）で形質転換された全細胞の形態、ならびに／またはそのような細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解産物の形態で、その反応混合物に添加することができる。操作されたケトレダクターゼ酵素および任意の補因子再生酵素をコードする遺伝子（単数または複数）は、宿主細胞に別々に形質転換することができ、または一緒に同じ宿主細胞に形質転換することができる。例えば、一部の実施形態では、前記操作されたケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子（単数または複数）で１セットの宿主細胞を形質転換し、前記補因子再生酵素をコードする遺伝子（単数または複数）で別のセットを形質転換することができる。形質転換された細胞の両方のセットを、一緒に、全細胞の形態で、またはそれから誘導した溶解産物もしくは抽出物の形態で、反応混合物に用いることができる。他の実施形態では、前記操作されたケトレダクターゼ酵素と前記補因子再生酵素の両方をコードする遺伝子（単数または複数）で宿主細胞を形質転換することができる。
【０３２０】
前記操作されたケトレダクターゼ酵素および／もしくは任意の補因子再生酵素をコードする遺伝子（単数もしくは複数）で形質転換された全細胞、またはそれらの細胞抽出物および／もしくは溶解産物は、固体（例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど）または半固体（例えば、粗製ペースト）をはじめとする様々な異なる形態で用いることができる。
【０３２１】
前記細胞抽出物または細胞溶解産物は、沈殿（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミンまたは熱処理など）、続いて脱塩手順、その後凍結乾燥（例えば、限外濾過、および透析など）によって部分的に精製することができる。いずれの細胞調製物も、例えばグルタルアルデヒドなどの公知架橋剤を使用する架橋または固相への固定化（例えば、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃなど）によって安定させることができる。
【０３２２】
固体反応物（例えば、酵素、塩など）は、粉末（例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど）、溶液、乳濁液、懸濁液などをはじめとする様々な異なる形態で反応に供給することができる。前記反応物は、当業者に公知である方法および装置を用いて容易に凍結乾燥または噴霧乾燥させることができる。例えば、前記タンパク質溶液を−８０℃で少量ずつ凍結させ、その後、予冷した凍結乾燥チャンバにそれを添加し、その後、真空を適用することができる。それらのサンプルから水を除去した後、代表的にその温度を２時間、４℃に上昇させ、その後、真空を解放し、凍結乾燥サンプルを回収する。
【０３２３】
一般に、還元反応に使用される反応物の量は、所望される生成物の量によって、および付随して、利用されるケトレダクターゼ基質の量によって変わる。以下のガイドラインを用いて、使用するケトレダクターゼ、補因子および任意の補因子再生系の量を決定することができる。一般に、ケト基質は、約５０ｍｇから約５ｇのケトレダクターゼおよび約１０ｍｇから約１５０ｍｇの補因子を使用して、約２０から３００グラム／リットルの濃度で利用することができる。所望の生産性レベルおよび生産規模に合わせるためにこれらの量を変える方法は、当業者には容易にわかるであろう。任意の補因子再生系の適切な量は、用いる補因子および／またはケトレダクターゼの量に基づき慣用的実験によって容易に決定することができる。一般に、還元体（例えば、グルコース、ホルマート、イソプロパノール）をケトレダクターゼ基質の等モルレベルより高いレベルで用いて、そのケトレダクターゼ基質の本質的に完全なまたはほぼ完全な変換を達成する。
【０３２４】
反応物の添加順序は、重要でない。反応物を一緒に溶媒（例えば、単相溶媒、二相水性共溶媒系など）に添加してもよいし、あるいは反応物の一部を別々に、および一部を異なる時点で一緒に添加してもよい。例えば、補因子再生系、補因子、ケトレダクターゼ、およびケトレダクターゼ基質を最初に溶媒に添加してもよい。
【０３２５】
水性共溶媒系を使用する際の混合効率改善のために、補因子再生系、ケトレダクターゼ、および補因子を最初に水相に添加して混合する。その後、有機相を添加して混合し、その後、ケトレダクターゼ基質を添加することができる。あるいは、水相に添加する前に、ケトレダクターゼ基質を有機相に予め混合することができる。
【０３２６】
本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応を行うために適する条件は、操作されたケトレダクターゼ酵素と基質とを実験ｐＨおよび温度で接触させ、例えば本明細書に提供する実施例において説明する方法を用いて、生成物を検出することを含む（しかし、これらに限定されない）慣用的な実験によって、容易に最適化することができる、多種多様な条件を含む。
【０３２７】
前記ケトレダクターゼ触媒還元は、代表的に、約１５℃から約７５℃の範囲の温度で行われる。一部の実施形態について、前記反応は、約２０℃から約５５℃の範囲の温度で行われる。さらに他の実施形態では、約２０℃から約４５℃の範囲の温度で行われる。前記反応は、周囲条件下で行われる場合もある。
【０３２８】
一般に、前記還元反応を本質的に完了またはほぼ完了するまで進行させ、基質の還元を達成する。基質および／または生成物を検出することによる公知の方法を用いて、基質の生成物への還元をモニターすることができる。適する方法としては、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどが挙げられる。前記反応混合物において生成されるアルコール還元生成物の変換収率は、一般に約５０％より高く、約６０％より高い場合もあり、約７０％より高い場合もあり、約８０％より高い場合もあり、約９０％より高い場合もあり、および多くの場合、約９７％より高い。
【実施例】
【０３２９】
８．  実施例
本開示の様々な特徴および実施形態を以下の代表的実施例において例証する。これらの実施例は、例証のためのものであり、限定のためのものではない。
【０３３０】
８．１  実施例１：野生型ケトレダクターゼ遺伝子獲得および発現ベクターの構築
ケトレダクターゼの報告されているアミノ酸配列と、参照により本明細書に援用されている米国特許仮出願第６０／８４８，９５０号およびＷＯ２００８０４２８７６の実施例１に記載されているようなコドン最適化アルゴリズムとに基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために、ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）をコードする遺伝子を設計した。４２ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドを使用して遺伝子を合成し、ｌａｃプロモーターの制御下で発現ベクターｐＣＫ１１０９００（米国特許出願公開第２００６０１９５９４７号に図３として図示されている）にクローニングした。この発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有した。得られたプラスミドを、標準的な方法を用いてＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０に形質転換させた。コドン最適化遺伝子およびコードされたポリペプチドの配列も表３に列挙する。野生型ケトレダクターゼの活性を、米国特許仮出願第６０／８４８，９５０号に記載されているように確認した。
【０３３１】
【表３】
2010536385.tif 000020
本発明の操作されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドもまた、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０での発現のためにベクターｐＣＫ１１０９００にクローニングした。
【０３３２】
８．２  実施例２：ケトレダクターゼ粉末の製造；振盪フラスコ手順
対象となるケトレダクターゼ遺伝子を有するプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉの単一微生物コロニーを、３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールと１％グルコースとを含有する５０ｍＬのＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉブロスに接種した。３０℃のインキュベーターの中で一晩（少なくとも１６時間）、２５０ｒｐｍで振盪しながら細胞を増殖させた。その培養物を１Ｌのフラスコの中の２５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（１２ｇ／Ｌのバクトトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌのグリセロール、６５ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１ｍＭのＭｇＳＯ４、３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）中で０．２の６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）に希釈し、３０℃で放置して増殖させた。その培養物のＯＤ６００が０．６から０．８になったらケトレダクターゼ遺伝子の発現を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、一晩（少なくとも１６時間）インキュベートした。細胞を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）によって回収し、上清を廃棄した。その細胞ペレットを同じ容量の冷（４℃）１００ｍＭのトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液（ｐＨ７．０）（ＡＤＨ−ＬＫおよびＡＤＨ−ＬＢならびにそれらから誘導される操作されたケトレダクターゼの場合は２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む）で再び懸濁させ、上のと同様に遠心分離によって回収した。洗浄した細胞を２容量の冷トリエタノールアミン（塩化物）緩衝液に再び懸濁させ、４℃で維持しながら１２０００ｐｓｉで２回、フレンチ・プレスに通した。細胞破壊片を遠心分離（９０００ｒｐｍ、４５分、４℃）によって除去した。透明な溶解産物上清を回収し、−２０℃で保管した。透明な冷凍溶解産物の凍結乾燥によって、粗製ケトレダクターゼ酵素の乾燥粉末を得た。
【０３３３】
それらの野生型ケトレダクターゼの活性を米国特許仮出願第６０／８４８，９５０に記載されているように確認した。１ｍＬの１００ｍＭリン酸（ナトリウム）緩衝液（ｐＨ７．５）の溶液に、１０ｍｇのケトレダクターゼ粉末、５０ｍｇのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、１００μＬのイソプロパノールおよび１０ｍｇの４’−クロロアセトフェノンまたは非置換アセトフェノンを添加した。その反応混合物を室温で１６時間攪拌し、その後、１ｍＬのＴＭＢＥで抽出した。ＭＴＢＥ相のサンプルを、４’−クロロ−アセトフェノンの変換およびその生成物のエナンチオマー組成について、キラルＨＰＬＣによって分析した。
【０３３４】
８．３  実施例３：ケトレダクターゼの生成−発酵手順
曝気し攪拌した１５ｍＬ発酵槽において、０．８８ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムと、０．９８ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウムと、１２．５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム・三水和物と、６．２５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウムと、６．２ｇ／ＬのＴａｓｔｏｎｅ−１５４酵母抽出物と、０．０８３ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムと、（２ｇ／Ｌの塩化カルシウム・二水和物、２．２ｇ／Ｌの硫酸亜鉛・七水和物、０．５ｇ／Ｌの硫酸マンガン・一水和物、１ｇ／Ｌの硫酸第一銅・七水和物、０．１ｇ／Ｌのモリブデン酸アンモニウム・四水和物、および０．０２ｇ／Ｌの四ホウ酸ナトリウム・十水和物を含有する）８．３ｍＬ／Ｌの微量元素溶液とを含有する６．０Ｌの増殖培地を、３０℃の温度にした。実施例２において説明したような振盪フラスコで０．５から２．０の出発ＯＤ６００に増殖させた、対象となるケトレダクターゼ遺伝子を有するプラスミドを含有する、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０の後期指数増殖培養物を、その発酵槽に接種した。その発酵槽を５００〜１５００ｒｐｍで攪拌し、その発酵容器に空気を１．０〜１５．０Ｌ／分で供給して、３０％以上の飽和溶解酸素レベルを維持した。２０％  ｖ／ｖの水酸化アンモニウムの添加によって、培養物のｐＨを７．０に調節した。５００ｇ／Ｌのセルロースと、１２ｇ／Ｌの塩化アンモニウムと、１０．４ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム・七水和物とを含有する供給溶液の添加によって、培養物の増殖を維持した。その培養物が、５０のＯＤ６００に達した後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度まで添加することによって、ケトレダクターゼの発現を誘導した。その培養物をさらに１４時間、増殖させた。その後、その培養物を４℃に冷却し、回収するまで４℃で維持した。４℃でのＳｏｒｖａｌ  ＲＣ１２ＢＰ遠心分離機における４０分間、５０００Ｇでの遠心分離によって細胞を回収した。回収した細胞は、後続の下流回収プロセスで直接使用するか、そのような使用まで４℃で保管した。
【０３３５】
その細胞ペレットを、それぞれの湿潤細胞ペースト容量に対して２容量の１００ｍＭのトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液（ｐＨ６．８）に、４℃で再び懸濁させた。１２０００ｐｓｉｇの圧力を用いて、二段均質化バルブ組立体を装着したホモジナイザーにその懸濁液を通すことによって、細胞内ケトレダクターゼを細胞から放出させた。破壊直後に、その細胞ホモジネートを４℃に冷却した。１０％  ｗ／ｖのポリエチレンイミンの溶液（ｐＨ７．２）を０．５％  ｗ／ｖの最終濃度までその溶解産物に添加し、３０分間攪拌した。得られた懸濁液を、３０分間の標準的な実験室用遠心分離機における５０００Ｇでの遠心分離によって透明にした。透明な上清をデカントし、３０Ｋｄの分子量カットオフでセルロース限界濾過膜を使用して１０倍濃縮した。その最終濃縮物を浅い容器に分配し、−２０℃で冷凍し、凍結乾燥させて粉末にした。そのケトレダクターゼ粉末を−８０℃で保管した。
【０３３６】
８．４  実施例４：３−ケトチオランの変換およびＲ−３−ヒドロキシチオランのエナンチオマー過剰率を決定するための分析方法
変換を判定するためのアキラルＧＣ：１．０ｍＬ／分のヘリウム流量で、５％フェニルメチルシロキサンカラム（Ｍｏｄｅｌ  １９０９１Ｓ−４３３：３０ｍ×２５０μｍ、公称厚さ０．２５μｍ）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ−５ＭＳガスクロマトグラフを使用して、３−ケトチオランの３−ヒドロキシチオランへの還元を判定した。入口温度は、２２０℃であり、次の温度プログラムを用いた：１分間、１２０℃、その後、２０℃／分で１６０℃に、その後、０．５分間、１６０℃。化合物を分光光度分析により２１０ｎｍで検出した。そのケトンおよびアルコールの保持時間は、それぞれ、２．８分および３．０分であった。
【０３３７】
３−ヒドロキシチオランの立体異性体純度を決定するためのキラルＨＰＬＣ：室温で２．５ｍＬ／分の流量でＩＰＡ／ヘキサン（２／９８）を溶離剤として用いて、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤカラム（４．６×２５０ｍｍ、およびガードカラムなし）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ  １１００または１０５０  ＨＰＬＣを使用して、３−ヒドロキシチオランのＲおよびＳエナンチオマーの存在度を決定した。そのケトン、Ｓ−アルコールおよびＲ−アルコールの保持時間は、それぞれ、８．６分、１２．０分および１３．１分であった。
【０３３８】
あるいは、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈカラム（４．６×１５０ｍｍ、および１０ｍｍガードカラム）を装着したＨＰＬＣを、４０℃で２．０ｍＬ／分の流量のＩＰＡ／ヘキサン（２／９８）で使用した。化合物を分光光度分析により２１０ｎｍで検出した。そのケトン、Ｓ−アルコールおよびＲ−アルコールの保持時間は、それぞれ、６．３分、８．７分および９．４分であった。
【０３３９】
８．５  実施例５：３−ケトチオランの還元についての野生型ケトレダクターゼの評価
表３に記載するケトレダクターゼ（実施例１）を、補因子制限条件下で３−ケトチオランのエナンチオ選択的還元についてスクリーニングした：空気のもとでバイアルに１〜２０ｍｇの酵素と、２０ｍＬの１００ｍＭ（ｐＨ８．０）トリエタノールアミン（塩化物）緩衝液に溶解した７６６ｍｇのＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含有する１ｍＬの補因子保存溶液と、２０μＬの３−ケトチオランとを添加した。室温で一晩攪拌した後、その反応混合物を酢酸エチルで抽出し、実施例４において説明したようにエナンチオ選択性をアッセイした。結果を表４に記載する。（ＮＲ＝反応なし）
【０３４０】
【表４】
2010536385.tif 000021
この実施例は、ＡＤＨ−ＬＫが、試験した野生型酵素の中で最もＲ−エナンチオ選択的なケトレダクターゼであり、６７％のｅ．ｅ．でＲ−３−ヒドロキシチオランを与えることを示している。従って、所望の特性への酵素操作のための出発点として、ＡＤＨ−ＬＫを選択した。
【０３４１】
８．６  実施例６：３−ケトチオランの還元用の改善された酵素を同定するためのハイスループットＮＡＤＰＨ蛍光プレスクリーニング。
【０３４２】
進化させたケトレダクターゼ遺伝子を含有するプラスミドライブラリをＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０に形質転換し、１％グルコースと３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）とを含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天プレートにプレーティングした。３０℃で少なくとも１６時間、インキュベートした後、Ｑ−ｂｏｔ（登録商標）コロニーピッカーロボット（オレゴン州、ビーヴァートンのＧｅｎｅｔｉｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）を使用して、１８０μＬのＬＢと１％のグルコースと３０μｇ／ｍＬのＣＡＭが入っている浅い９６ウエルのウエルマイクロタイタープレートにコロニーを採取した。２５０ｒｐｍで振盪しながら、一晩、３７℃で細胞を増殖させた。その後、この培養物の１０μＬを、３９０μＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）と３０μｇ／ｍＬのＣＡＭとが入っている９６ウエルマイクロタイタープレート（深ウエル）に移した。３０℃、２５０ｒｐｍで２．５から３時間振盪しながら深ウエルプレートでインキュベートした（ＯＤ６００  ０．６〜０．８）後、１ｍＭの最終濃度までのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって、それらの細胞培養物による組換え遺伝子発現を誘導した。その後、それらのプレートを、一晩、２５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃でインキュベートした。
【０３４３】
細胞を遠心分離によってペレット化し、３００μＬの溶解緩衝液に懸濁させ、室温での少なくとも２時間の振盪によって溶解した。この溶解緩衝液は、１００ｍＭのトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液（ｐＨ７．０〜７．２）、１ｍｇ／ｍＬのリゾチームおよび７５０μｇ／ｍＬの硫酸ポリミキシンＢを含有した。それらのプレートを４０００ＲＰＭで１０分間、遠心分離し、その透明な上清（溶解産物）を蛍光アッセイにおいて使用した。
【０３４４】
９６ウエル黒色マイクロタイタープレートにおいて、（必要な場合には、１０ｍＭのトリエタノールアミン／塩化物緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭのＭｇＳＯ４中で希釈した）２０μＬの透明な上清を、１００ｍＭのトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液（ｐＨ７．０）と、１ｍＭのＭｇＳＯ４と、０．２５ｍＭのＮＡＤＰＨと、６００ｍＭのグルコースと、１２００ｍＭのグルコン酸ナトリウムと、１ｍＭの３−ケトチオランとから成る１８０μＬのアッセイ混合物に添加し、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ（米国、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において３３０ｎｍで励起後、４４５ｎｍでＮＡＤＰＨの蛍光の減少を追跡することによって反応の進行を測定した。ＫＲＥＤ変異体の熱安定性を評価するために、透明な上清を、少なくとも１６時間、４０から５０℃にわたる温度で場合によってはプレインキュベートし、その後、アッセイ混合物に添加した。
【０３４５】
この実施例は、３−ケトチオラン還元率について改善された、および／または熱安定性について改善されたＫＲＥＤ変異体を特定するために用いた方法を説明する。
【０３４６】
８．７  実施例７：補因子再循環のためにグルコース／グルコースデヒドロゲナーゼを使用する３−ケトチオランの還元についてのケトレダクターゼ活性およびエナンチオ選択性に関するハイスループットＨＰＬＣアッセイ
実施例６において説明したように溶解産物を調製した。測定した量の細胞溶解産物を深ウエルマイクロタイタープレートのウエルに移すことによって、ケトレダクターゼ活性を測定した。それらのウエルの中のアッセイ混合物（各ウエル  最終容量５００μｌ）は、１ｍｇ／ｍＬのＧＤＨ、０．４ｍｇ／ｍｌのＮａ−ＮＡＤＰ、０．２から１．２５Ｍのグルコース、０から４００ｍＭのグルコン酸ナトリウム、１００ｍＭのトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液（ｐＨ７）、２０ｍＭのＭｇＳＯ４および５０ｍｇまでの炭酸カルシウムを含有した。１００μｌまでの細胞溶解産物および５０μｌの３−ケトチオラン（最終濃度１Ｍ）の添加によって、反応を開始させた。アルミニウム／ポリプロピレンラミネート・ヒートシールテープ（Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  １１（カリフォルニア州、メンロー・パーク）、Ｃａｔ＃  ０６６４３−００１）で封止した後、それらのプレートを４から２５℃で１６時間まで、インキュベートした。１ｍｌの酢酸エチルをそれらのプレートのそれぞれのウエルに注入し、それらのプレートを１０分間、振盪し、その後、２０秒間、遠心分離し；１００μｌの酢酸エチル相を浅ウエル・マイクロタータープレートに移した。これらのサンプルプレートをヒートシールテープで封止して、蒸発を防止した。実施例４の方法によって、サンプルをＨＰＬＣにより分析した。
【０３４７】
この実施例は、３−ケトチオランの還元についての改善された活性および／またはＲ−３−ヒドロキシチオランの形成についての改善されたエナンチオ選択性を有するケトレダクターゼ変異体がケトレダクターゼ遺伝子ライブラリの中でどのように特定されたかを示す。
【０３４８】
８．８  実施例８：ＡＤＨ−ＬＫから誘導した操作されたケトレダクターゼによる３−ケトチオランの還元
ＡＤＨ−ＬＫ変異体から誘導した改善されたケトレダクターゼを次のように調製規模で評価した。ＰＴＦＥ被覆磁気攪拌棒と容器への供給チューブによるオンデマンドの塩基のｐＨ制御添加のために自動滴定装置に接続したｐＨ電極とを装着した２５ｍＬ三つ口容器に、６．６３ｇのグルコースを含有する１８ｍｌの水性（水または緩衝液）相を投入した。その後、３．０ｇの３−ケトチオラン（再蒸留したもの）と、１ｍＬの水相中の３０から１２０ｍｇのＫＲＥＤ変異体と、１ｍＬの水相中の３０ｍｇのＧＤＨと、１２ｍｇのＮＡＤＰ−Ｎａ２とを添加した。この自動滴定装置は、４Ｎ  ＮａＯＨの添加によってｐＨを７で維持し、それを継続的に記録した。塩基の速度および累積加算ならびに酢酸エチルでの抽出および実施例４の方法による分析のための反応混合物の周期的サンプリングによって、反応の進行をモニターした。反応完了時のＲ−３−ヒドロキシチオランの濃度は、１００±５ｇ／Ｌであった。
【０３４９】
表５は、ケトレダクターゼ変異体に対応する配列番号、野生型ＡＤＨ−ＬＫからのアミノ酸突然変異の数、３−ケトチオランの還元についてのそれらの活性（２４時間反応において３−ケトチオランを３−ヒドロキシチオランに完全に変換するために必要な酵素粉末の量として）、および３−ヒドロキシチオラン生成物についてのそれらのＲ−エナンチオ選択性（ｅ．ｅ．範囲として）を与える。
【０３５０】
この実施例は、ケトレダクターゼＡＤＨ−ＬＫから誘導した操作されたケトレダクターゼが、野生型ケトレダクターゼＡＤＨ−ＬＫと比較して改善されたエナンチオ選択性および活性をもたらすことを例証する。
【０３５１】
【表５−１】
2010536385.tif 000022
【０３５２】
【表５−２】
2010536385.tif 000023
ａ．  エナンチオ選択性欄：
０  （Ｒ）エナンチオマーについて６１．０〜７９．９９％  ｅｅ
＋  （Ｒ）エナンチオマーについて８０．０〜８９．９９％  ｅｅ
＋＋  （Ｒ）エナンチオマーについて９０．０〜９４．９９％  ｅｅ
＋＋＋  （Ｒ）エナンチオマーについて９５．０〜９７．９９％  ｅｅ
＋＋＋＋  （Ｒ）エナンチオマーについて９８．０〜９８．９９％  ｅｅ
＋＋＋＋＋  （Ｒ）エナンチオマーについて、＞９９．０％  ｅｅ
ｂ．  活性欄：
０  ２４時間以内に１００ｇ／Ｌ  ３−ケトチオランの完全変換をもたらすために、この酵素の１．０〜４．０ｇ／Ｌの濃度が必要とされる
＋  この酵素の０．８〜１．０ｇ／Ｌの濃度が、２０から２４時間で１００ｇ／Ｌ  ３−ケトチオランの完全変換をもたらす
＋＋  この酵素の０．８〜１．０ｇ／Ｌの濃度が、１２から２０時間で１００ｇ／Ｌ  ３−ケトチオランの完全変換をもたらす
ｃ．  安定性欄：
−  ＡＤＨ−ＬＫより安定でない
０  ＡＤＨ−ＬＫと同様に安定
＋  ＡＤＨ−ＬＫより安定。
【０３５３】
８．９  実施例９：Ｒ−（３）−ヒドロキシチオランの調製規模製造。
【０３５４】
空気のもと、室温の、および約３００ｒｐｍでのメカニカルスターラーと温度計と容器への供給チューブによるオンデマンドでの塩基のｐＨ制御添加のために自動滴定装置に接続したｐＨ電極とを装着した、２Ｌ三つ口・ジャケット付フラスコに、６００ｍＬの１００ｍＭ（ｐＨ７．０）トリエタノールアミン（塩化物）緩衝液、２ｍＬの１Ｍ  ＭｇＳＯ４および２２５ｇのＤ−グルコースを添加した。グルコースの溶解（約１／２時間）後、１００ｇの３−ケトチオランをその反応物に添加して、二相混合物を得た。反応温度を１５℃に低下させ、３０ｍＬの１００ｍＭ（ｐＨ７．０）トリエタノールアミン（塩化物）緩衝液中の１．０ｇのケトレダクターゼ粉末（配列番号２２）と、２０ｍＬの１００ｍＭ（ｐＨ７．０）トリエタノールアミン（塩化物）緩衝液中の０．２５ｇのＧＤＨと、１０ｍＬの１００ｍＭ（ｐＨ７．０）トリエタノールアミン（塩化物）緩衝液中の０．４ｇのＮＡＤＰ−Ｎａ２を添加した。外部循環冷却器によって反応温度を１５℃で維持し、自動滴定装置が８Ｎ  ＮａＯＨの添加によりｐＨを７．０＋０．１で維持した。１５℃で１５時間攪拌した後、その循環装置の温度を２５℃に上昇させ、さらに１時間後、０．２５ｇのＧＤＨ粉末を添加した（最終ＧＤＨ濃度＝０．５ｇ／Ｌ）。合計２３時間後、１０ｇのＮａ２Ｓ２Ｏ５を添加した。さらに１時間、２５℃で攪拌した後、その生成物を７５０ｍＬの酢酸エチルで抽出した。分離した有機相を約２０ｇのＣｅｌｉｔｅ  ５４５によって濾過した。その湿潤Ｃｅｌｉｔｅパッドを７５０ｍＬのＥｔＯＡｃですすいだ。併せた有機相を１００ｍＬの水で洗浄した。分離した有機相を減圧下、６０℃で回転蒸発させて、８３．６ｇ（収率８２％）の３−ヒドロキシチオランを淡黄色の油として得た。キラルＨＰＬＣ分析は、９９．３％エナンチオマー過剰率で（Ｒ）−３−ヒドロキシチオランを示した。
【０３５５】
本出願に引用したすべての公報、特許、特許出願および他の文献は、それぞれの個々の公報、特許、特許出願または他の文献がすべての目的で参照により援用されていると個々に示されているのと同じ程度に、すべての目的でそれら全体が参照により本出願に援用される。
【０３５６】
様々な特定の実施形態を例証し、説明したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく様々な変更を行うことができることが理解される。
【図１】
2010536385.tif 000024
【配列表】
2010536385000001.app
【国際調査報告】
2010536385.tif 000025
2010536385.tif 000026
2010536385.tif 000027
2010536385.tif 000028
2010536385.tif 000029
2010536385.tif 000030