(57)【要約】本発明は、少数の分子、例えば１０個以下の分子を凸面に、例えば頂点に含む、固体基質と、その生成および使用方法を提供する。本発明の方法は：第１の固体基質表面の凸面に受容体を結合させて、複数の受容体を含む受容体結合基質を生成するステップと；この受容体結合基質と、第２の固体基質の表面に結合されたリガンドとを、受容体−リガンド複合体結合固体基質を生成するのに十分な条件下で接触させるステップであって、複数の受容体の一部だけがリガンドと複合体を形成しているステップと；この受容体−リガンド複合体を修飾して、表面修飾固体基質を生成するステップとを含む。
2010539468.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の固体基質表面の凸面に受容体を結合させて、複数の受容体を含む受容体結合基質を生成するステップと；
該受容体結合基質と、第２の固体基質の表面に結合されたリガンドとを、受容体−リガンド複合体結合固体基質を生成するのに十分な条件下で接触させるステップであって、該複数の受容体の一部のみが該リガンドと複合体を形成しているステップと；
該受容体−リガンド複合体を修飾して、表面修飾固体基質を生成するステップと
を含む、固体基質表面を修飾するための方法。
【請求項２】
約３個以下の受容体が前記リガンドと複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一つの受容体のみが前記リガンドと複合体を形成する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記受容体−リガンド複合体が、二本鎖オリゴヌクレオチド、抗原−抗体複合体、オリゴペプチド−小分子複合体、またはオリゴペプチド−オリゴペプチド複合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記受容体−リガンド複合体が、二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記受容体−リガンド複合体を修飾する前記ステップが：
前記二本鎖オリゴヌクレオチドと金属イオンとを、二本鎖オリゴヌクレオチド−金属イオン複合体を形成するのに十分な条件下で接触させるステップと；
表面結合金属ナノロッドを含む前記表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、該金属イオンを還元するステップと
をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記受容体−リガンド複合体を修飾する前記ステップが、前記二本鎖オリゴヌクレオチドとインターカレーター−金属触媒複合体とを、インターカレーター−金属触媒が内部にインターカレートされている表面結合二本鎖オリゴヌクレオチドを含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で接触させるステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記受容体−リガンド複合体を修飾する前記ステップが：
前記二本鎖オリゴヌクレオチドを変性させて、一本鎖オリゴヌクレオチド結合基質を生成するステップと；
該一本鎖オリゴヌクレオチドに、
（ｉ）表面結合標識二本鎖オリゴヌクレオチドを含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、相補的標識オリゴヌクレオチド；または
（ｉｉ）表面結合二本鎖オリゴヌクレオチドに結合される酵素または触媒を含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、酵素または触媒を含む相補的オリゴヌクレオチド
をハイブリダイズするステップと
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドを変性させる前記ステップの前に、結合されていない一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を前記固体基質表面から切断するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記受容体結合基質と、第２の固体基質の表面に結合されたリガンドとを接触させる前記ステップが：
該第１の固体基質表面結合ｓｓＤＮＡと、該第２の固体基質表面に結合されたｓｓＤＮＡにハイブリダイズするリンカーｓｓＤＮＡとを、前記受容体−リガンド複合体結合固体基質を生成するのに十分な条件下で接触させるステップを含み、該リンカーｓｓＤＮＡは：
（ｉ）該第１の固体基質の表面に結合されたｓｓＤＮＡとハイブリダイズすることが可能な第１のＤＮＡ部分と；
（ｉｉ）該第２の固体基質表面に結合されたｓｓＤＮＡとハイブリダイズすることが可能な第２のＤＮＡ部分と；
（ｉｉｉ）任意選択でプローブと
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記リンカーｓｓＤＮＡがプローブを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記受容体−リガンド複合体が抗原−抗体複合体である、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記受容体−リガンド複合体を修飾する前記ステップが、前記抗原−抗体複合体と第２の抗体とを、抗原−抗体−第２抗体の表面結合複合体を含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で接触させるステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記受容体−リガンド複合体を修飾する前記ステップが、抗体−抗原−酵素連結２次抗体の表面結合複合体を含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、酵素連結２次抗体を添加するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記受容体−リガンド複合体を修飾する前記ステップが、抗体−抗原−金属連結２次抗体の表面結合複合体を含む表面修飾基質を生成するのに十分な条件下で、金属連結２次抗体を添加するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記受容体が、表面結合リンカーを介して前記第１の固体基質に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記表面結合リンカーが：
中心原子と；
リンカーを通して該中心原子に結合され、かつ受容体に結合されている官能基と；
該中心原子に結合され、かつ前記固体支持体の前記第１の表面に結合された複数の末端を有するベース部分と
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記表面結合リンカーが、式：
【化４】
2010539468.tif 000006
（式中、
ｍ、ａ、ｂ、およびｃのそれぞれは、独立して０または１であり；
ｘは、ｃが０の場合またはｃが１の場合に１であり、ｘは、１からＱ４−１の酸化状態までの整数であり；
ｙは、ｂが０の場合またはｂが１の場合に１であり、ｙは、１からＱ３−１の酸化状態までの整数であり；
ｚは、ａが０の場合またはａが１の場合に１であり、ｚは、１からＱ２−１の酸化状態までの整数であり；
ｎは、１からＱ１−１の酸化状態までの整数であり；
Ｑ１は、少なくとも３の酸化状態を有する中心原子であり；
Ｑ２、Ｑ３、およびＱ４のそれぞれは、独立して、少なくとも３の酸化状態を有する分岐原子であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、独立してリンカーであり；
Ｚは、受容体に結合された官能基であり；
Ｙのそれぞれは、独立して、前記ベース部分の末端にある官能基であり、
ここで、複数のＹは、ｎ、ｘ、ｙ、およびｚの積が少なくとも３であることを条件として、前記固体支持体の前記第１の表面に結合される）
を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｚが、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、およびこれらの組合せからなる群から選択されたヘテロ原子を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の固体基質が原子間力顕微鏡チップである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
凸面を含む、解析的分析を行うように適応させた固体基質であって、複数の受容体と、第２の固体基質の表面に結合したリガンドとを接触させたときに、複数の受容体の一部のみがリガンドと複合体を形成するように、該凸面が、該リガンドと複合体を形成するように適応させた受容体を含む複数の表面結合デンドロンを含む、固体基質。
【請求項２２】
前記固体基質が原子間力顕微鏡チップである、請求項２１に記載の固体基質。
【請求項２３】
前記デンドロンが、式：
【化５】
2010539468.tif 000007
（式中、
ｍ、ａ、ｂ、およびｃのそれぞれは、独立して０または１であり；
ｘは、ｃが０の場合またはｃが１の場合に１であり、ｘは、１からＱ４−１の酸化状態までの整数であり；
ｙは、ｂが０の場合またはｂが１の場合に１であり、ｙは、１からＱ３−１の酸化状態までの整数であり；
ｚは、ａが０の場合またはａが１の場合に１であり、ｚは、１からＱ２−１の酸化状態までの整数であり；
ｎは、１からＱ１−１の酸化状態までの整数であり；
Ｑ１は、少なくとも３の酸化状態を有する中心原子であり；
Ｑ２、Ｑ３、およびＱ４のそれぞれは、独立して、少なくとも３の酸化状態を有する分岐原子であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、独立してリンカーであり；
Ｚは、前記受容体に結合された官能基であり；
Ｙのそれぞれは、独立して、前記ベース部分の末端にある官能基であり、
ここで、複数のＹは、ｎ、ｘ、ｙ、およびｚの積が少なくとも３であることを条件として、前記固体支持体の前記第１の表面に結合される）
を有する、請求項２１に記載の固体基質。
【請求項２４】
前記受容体が、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、抗体、抗原、受容体、酵素、アプタマー、またはその他の生物学的にもしくは医薬品として活性な化合物である、請求項２１に記載の固体基質。
【請求項２５】
凸面と、該凸面の頂点に結合された３個以下のプローブ分子とを含む、原子間力顕微鏡で使用するのに適切な物品。
【請求項２６】
前記凸面が単一プローブ分子を含む、請求項２５に記載の物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００７年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／９７３，０７９号の優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、少数の分子、例えば１０個以下の分子を凸面に、例えば頂点に含む固体基質と、その生成方法および使用方法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
当初、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）は、固体表面トポグラフィーを観察するために開発された。現在、ＡＦＭは、薬物スクリーニングなど、生体分子間の相互作用の測定を含むがこれらに限定することのない広範な用途に使用されている。生体分子間の相互作用を測定する能力は、生体分子間の様々な会合および解離現象の特定を可能にする、強力な分析ツールである。例えばＡＦＭは、細胞表面の特定のリガンドの位置および分布を見出すのに時々使用される。蛍光顕微鏡および放射性同位体は細胞表面のリガンドの分布を特定するのに使用されてきたが、これらの方法は、数十から数百の集塊リガンドの分布をミクロンサイズの規模でしか示すことができない。これとは対照的に、ＡＦＭによる生体分子間の相互作用力の測定は、より正確かつ詳細な分析をもたらし、ナノサイズのリガンド個々の位置を追跡可能にしかつ個々の生命現象の観察を可能にする。
【０００４】
残念ながら、ＡＦＭチップ上に生体分子を固定化する従来の方法は、典型的には生体分子をチップの頂点にまたは頂点付近に結合するだけではなく様々なＡＦＭチップ部位に結合させるので、比較的低いＡＦＭ解像度をもたらす。そのような制約を克服するために、一部では、ＡＦＭチップ上に生体分子を導入するときに、高希釈方法または混合単層方法が使用されていた。これらの方法は、ＡＦＭチップに固定化された生体分子の相対的個体群密度を低下させるが、生体分子をＡＦＭチップの頂点に特異的に、効果的に固定化するのに成功しておらず、多くの場合、生体分子はＡＦＭチップの頂点に固定化することができなかった。
【０００５】
ＡＦＭを用いた生体分子間の相互作用の測定に関する前述の研究に加え、ＡＦＭのその他の用途が最近試みられた。例えば、現在、一部では、ＡＦＭチップの頂点にカーボンナノチューブまたはナノ粒子のような化合物を導入することが試みられている。しかし現在利用可能な方法は、ＡＦＭチップの頂点を選択的に修飾するよう適合されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ＡＦＭの頂点または任意のその他の凸面の頂点を、選択的に修飾することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明のいくつかの態様は、固体基質表面を修飾するための方法と、それを使用するための方法を提供する。具体的には、本発明の方法では、凸面を含む固体基質上に、プローブ、受容体、リガンド、または任意のその他の材料もしくは分子を修飾または結合させる。本明細書で使用される「凸面」という用語は、外側にまたは一般には表面の水平面上方に突出しまたは膨れた任意の表面を指す。凸面は、漸進的な曲率、鋭い突出、またはこれらの任意の組合せにすることができる。典型的には、本発明の方法により修飾された固体基質は、限定するものではないが走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、電気力顕微鏡（ＥＦＭ）、磁力顕微鏡（ＭＦＭ）、および数個の分子、即ち１０個以下の分子、典型的には５個以下の分子、しばしば３個以下の分子、より頻繁には単一分子を分析することが可能なその他の分析デバイスなどの、分析デバイスで使用されるものである。
【０００８】
本発明の方法は、少なくとも約５０％、典型的には少なくとも約６０％、しばしば少なくとも約７０％、より頻繁には、少なくとも約７５％という、凸面に数個の分子を結合させるのに成功する確率（即ち、成功率）を有する。本発明の方法は：
第１の固体基質表面の凸面に受容体を結合させて、複数の受容体を含む受容体結合基質を生成するステップと；
この受容体結合基質と、第２の固体基質の表面に結合されたリガンドとを、受容体−リガンド複合体結合固体基質を生成するのに十分な条件下で接触させるステップであって、複数の受容体の一部だけがリガンドと複合体を形成しているステップと；
この受容体−リガンド複合体を修飾して、表面修飾固体基質を生成するステップと
を含む。
【０００９】
上述のように、本発明のそのような方法は、数個の分子のみが凸面に結合されるように、固体基質表面（例えば、第１の固体基質表面）を提供する。しばしば、受容体−リガンド複合体の修飾は、単一の所望の分子のみをうまく結合させる。
【００１０】
文脈が他に必要としない限り、「リガンド」という用語は、受容体と選択的に結合することが可能な任意の物質を指す。リガンドは、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド（タンパク質、ホルモンなどを含む）、酵素、基質、薬物、薬物受容体、細胞表面、受容体作動薬、部分作動薬、混合作動薬、拮抗薬、応答誘発または刺激分子、薬物、ホルモン、フェロモン、伝達物質、オータコイド、成長因子、サイトカイン、補欠分子団、補酵素、補因子、基質、前駆体、ビタミン、毒素、調節因子、抗原、ハプテン、炭水化物、分子模倣体、構造分子、エフェクター分子、選択可能な分子、ビオチン、ジゴキシゲニン、交差反応物、類似体、これら分子の競合体または誘導体、並びに選択された標的に特異的に結合することが可能な、ライブラリー選択された非オリゴヌクレオチド分子、およびこれらの分子のいずれかを第２の分子に結合することによって形成された接合体、および対応する受容体と選択的に結合する任意のその他の分子にすることができる。
【００１１】
文脈が他に必要としない限り、「受容体」という用語は、対応するリガンドと選択的に結合することが可能な任意の物質を指す。文脈が他に必要としない限り、「リガンド」および「受容体」という用語は、いかなる特定の物質、またはサイズもしくは結合関係も指さないことを理解すべきである。これらの用語は、リガンドとそれに対応する受容体との間の選択的結合を示す、単なる運用上の用語であり、第１の固体基質表面に結合された化合物が受容体と呼ばれ、この受容体に選択的に結合された任意の物質がリガンドと呼ばれる。したがって、抗体が第１の固体基質表面に結合される場合、この抗体が受容体であり、それに対応する抗原がリガンドである。しかし、抗原が第１の固体基質表面に結合される場合、この抗原が受容体であり、それに対応する抗体がリガンドである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、約３個以下の受容体がリガンドと複合体を形成する。しばしば、単一の受容体のみがリガンドと複合体を形成し、次いでそれが単一の所望の分子のみの結合をもたらし、その後、受容体−リガンド複合体の修飾が行われる。
【００１３】
受容体−リガンド複合体は、例えば静電相互作用、ファンデルワールス力、イオン結合、共有結合、水素結合、および少なくとも一部にはある形の選択性に基づいて複合体を形成することが可能な任意のその他の物理的現象または特徴を通して、比較的緊密な相互作用が形成されるように、互いに結合することができる２つ以上の異なる化合物の、任意の組合せにすることができる。いくつかの実施形態では、受容体−リガンド複合体は、二本鎖オリゴヌクレオチド、抗原−抗体複合体、オリゴペプチド−小分子複合体、またはオリゴペプチド−オリゴペプチド複合体である。
【００１４】
受容体−リガンド複合体を形成するための成功の確率（または成功率）は、受容体−リガンドの性質または本性に依存する可能性がある。しかし、一般に本発明の方法の成功率は、少なくとも５０％であり、典型的には少なくとも６０％、しばしば少なくとも７０％、より頻繁には、少なくとも７５％である。相対的に、従来から利用可能な方法は、約３５％以下という、単一分子のみを固体基質表面に結合する成功率を有する。したがって本発明の方法は、現在利用可能なものよりも著しく高い成功率を提供する。
【００１５】
受容体−リガンド複合体が二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）である場合、即ち相補的ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡである場合、受容体−リガンド複合体を修飾するための様々な方法がある。多くの場合、修飾ステップでは、いずれにせよ、ｄｓＤＮＡ（即ち、受容体−リガンド複合体）そのものを直接修飾し、即ちｄｓＤＮＡを「変性」することなく修飾する。その他の場合には、修飾ステップでは、受容体−リガンド複合体の「複合体形成を行わず」、即ちｄｓＤＮＡを変性させて、ｓｓＤＮＡを改質し、変性によって除去された相補性とは異なる別の相補的ｓｓＤＮＡ、例えばプローブ、標識、酵素、触媒などのその他の部分に結び付けられた別の相補的ｓｓＤＮＡとハイブリダイズする。ある特定の実施形態では、受容体−リガンド複合体を修飾するステップはさらに、表面結合二本鎖オリゴヌクレオチドおよびその内部にインターカレートされたインターカレーター−金属触媒を含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、二本鎖オリゴヌクレオチドとインターカレーター−金属触媒複合体とを接触させるステップを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、受容体−リガンド複合体を修飾するステップは：
二本鎖オリゴヌクレオチドを変性させて、一本鎖オリゴヌクレオチド結合基質を生成するステップと；
一本鎖オリゴヌクレオチドに、
（ｉ）表面結合された標識二本鎖オリゴヌクレオチドを含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、相補的標識オリゴヌクレオチドを；または
（ｉｉ）表面結合二本鎖オリゴヌクレオチドに結合される酵素または触媒を含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、酵素または触媒を含む相補的オリゴヌクレオチドを
ハイブリダイズするステップとを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法はさらに、二本鎖オリゴヌクレオチドを変性させるステップの前に、非結合一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を固体基質表面から切断するステップを含む。このように、未反応のまたは複合体を形成していない受容体（即ち、ｓｓＤＮＡ）は、受容体−リガンド複合体を修飾する前に固体基質表面から除去される。そのような除去は、望ましくない受容体から、可能性ある反応競合を排除する。しばしば、全てのまたは実質的に全ての未反応受容体は、固体基質表面から切断されまたは比較的未反応にされる。ｓｓＤＮＡの場合、これは、当業者に周知にｓｓＤＮＡ開裂酵素によって実現することができる。
【００１８】
さらにその他の実施形態では、受容体−リガンド複合体を修飾するステップは、二本鎖オリゴヌクレオチドと金属イオンとを、二本鎖オリゴヌクレオチド−金属イオン複合体を形成するのに十分な条件下で接触させるステップと；表面結合金属ナノロッドを含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、金属イオンを還元するステップとをさらに含む。
【００１９】
さらにその他の実施形態では、受容体−リガンド複合体は、抗原−抗体複合体である。これらの実施形態において、ある場合には、受容体−リガンド複合体を修飾するステップは、抗原−抗体−第２の抗体の表面結合複合体を含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、抗原−抗体複合体と第２の抗体とを接触させるステップを含む。これらの実施形態におけるその他の場合には、受容体−リガンド複合体を修飾するステップは、抗体−抗原−酵素結合２次抗体の表面結合複合体を含む表面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、酵素結合２次抗体を添加するステップをさらに含む。さらにこれら実施形態におけるその他の場合には、受容体−リガンド複合体を修飾するステップは、抗体−抗原−金属結合２次抗体の表面結合複合体を含む表面修飾基質を生成するのに十分な条件下で、金属結合２次抗体を添加するステップをさらに含む。これらの場合に適した条件は、当業者に周知である。
【００２０】
さらにその他の実施形態では、受容体は、表面結合リンカーを介して第１の固体基質に結合される。これら実施形態におけるある場合には、表面結合リンカーは：
中心原子と；
リンカーを通して中心原子に結合されかつ受容体に結合された官能基と；
中心原子に結合され、かつ第１の固体支持体の表面に結合された複数の末端を有するベース部分と
を含む。
【００２１】
多くの場合、表面結合リンカーは、式：
【００２２】
【化１】
2010539468.tif 000003
を有する
（式中、
ｍ、ａ、ｂ、およびｃのそれぞれは、独立して０または１であり；
ｘは、ｃが０の場合またはｃが１の場合に１であり、ｘは、１からＱ４−１の酸化状態までの整数であり；
ｙは、ｂが０の場合またはｂが１の場合に１であり、ｙは、１からＱ３−１の酸化状態までの整数であり；
ｚは、ａが０の場合またはａが１の場合に１であり、ｚは、１からＱ２−１の酸化状態までの整数であり；
ｎは、１からＱ１−１の酸化状態までの整数であり；
Ｑ１は、少なくとも３の酸化状態を有する中心原子であり；
Ｑ２、Ｑ３、およびＱ４のそれぞれは、独立して、少なくとも３の酸化状態を有する分岐原子であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、独立してリンカーであり；
Ｚは、受容体に結合された官能基であり；
Ｙのそれぞれは、独立して、前記ベース部分の末端にある官能基であり、
但し、複数のＹは、ｎ、ｘ、ｙ、およびｚの積が少なくとも３であることを条件として、前記固体支持体の前記第１の表面に結合される）。
【００２３】
ａ、ｂ、またはｃが１であり、対応するｚ、ｙ、またはｘがそれぞれＱ２−１、Ｑ３−１、またはＱ４−１の酸化状態未満である場合、Ｑ２、Ｑ３、またはＱ４に結合された残りの原子はそれぞれ水素であることを、理解すべきである。本明細書で使用される「Ｑ」は、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４のいずれか１つまたは全てを指す。典型的には、Ｑは、周期表のＩＶＡまたはＶＡ族中の任意の原子である。Ｑに関する例示的な原子には、限定するものではないがＮ、Ｐ、Ｃ、Ｓｉ、Ｇｅなどが含まれる。しばしば、ＱはＮ、Ｐ、Ｃ、またはＳｉである。
【００２４】
式Ｉからわかるように、Ｚは、任意選択でリンカーＲ１を通して、中心原子に結合される。しばしばａは、ＺがリンカーＲ１を通して中心原子に結合されるように、１である。
【００２５】
さらにその他の実施形態では、Ｚは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、およびこれらの組合せからなる群から選択されたヘテロ原子を含む。
【００２６】
各Ｙは、独立して、官能基にすることができる。即ち、各Ｙは、その他のＹ基と無関係にすることができる。しかししばしば、Ｙ’の全ては同じ官能基である。しかし、一般にＺおよびＹは、異なる官能基である。ある場合には、ＺおよびＹを同じ官能基にすることができるが、そのどちらか一方は保護形態である。そのような官能基の違いおよび／または保護基の存在によって、ＺおよびＹの反応性を区別することが可能になり、それによって、複数のＹ’を介してデンドロンを固体支持体に結合することが可能になり、Ｚにプローブを結合することが可能になる。
【００２７】
第１および／または第２の固体基質は、表面結合リンカーを含むことができることに留意すべきである。さらに、第１および／または第２の固体基質の表面結合リンカーを、デンドロンにすることができる。そのようなデンドロンは、第１および第２の固体基質の間で同じである必要はない。いくつかの実施形態では、第１の固体基質は、表面結合リンカーとしてデンドロンを含む。その他の実施形態では、第２の固体基質は、表面結合リンカーとしてデンドロンを含む。さらにその他の実施形態では、第１および第２の固体基質は共に、表面結合リンカーとしてデンドロンを含む。後者の場合、第１および第２の固体基質に関するデンドロンは、同じである必要はない。いくつかの特定の実施形態では、デンドロンは、本明細書に開示された式Ｉを有する。
【００２８】
ある特定の実施形態では、第１の固体基質は原子間力顕微鏡チップである。
【００２９】
本発明のその他の態様は、凸面を含む、分析的解析を行うように適合された固体基質を提供する。凸面は、複数の受容体と第２の固体基質の表面に結合されるリガンドとを接触させた場合に複数の受容体の一部のみがリガンドと複合体を形成するように、リガンドと複合体を形成するよう適合された受容体を含む複数の表面結合デンドロンを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、固体基質が原子間力顕微鏡チップである。
【００３１】
さらにその他の実施形態では、デンドロンが、本明細書に開示された式Ｉを有する。
【００３２】
さらにその他の実施形態では、受容体が、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、抗体、抗原、受容体、酵素、アプタマー、または生物学的にもしくは医薬品として活性な化合物である。
【００３３】
本発明のさらにその他の態様は、凸面とこの凸面の頂点に結合された３個以下のプローブ分子とを含む、原子間力顕微鏡での使用に適した物品を提供する。いくつかの実施形態では、凸面は、単一プローブ分子のみ含む。
【００３４】
本発明のさらにその他の態様は、凸面結合ｓｓＤＮＡを含む固体基質の凸面を修飾するための方法を提供する。この方法は一般に、固体基質の凸面に結合されたｓｓＤＮＡと複合体を形成するリンカーｓｓＤＮＡを含む凸面修飾固体基質を生成するのに十分な条件下で、凸面結合ｓｓＤＮＡと、その他の固体基質の表面に結合されたｓｓＤＮＡにハイブリダイズするリンカーｓｓＤＮＡとを接触させるステップを含み、このリンカーｓｓＤＮＡは：
（ｉ）固体基質の凸面に結合されたｓｓＤＮＡとハイブリダイズすることが可能な第１のＤＮＡ部分と；
（ｉｉ）その他の固体基質表面に結合されたｓｓＤＮＡとハイブリダイズすることが可能な第２のＤＮＡ部分と；
（ｉｉｉ）任意選択でプローブまたは標識と
を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、そのような方法は、本明細書に開示されるようなデンドロン（即ち、式Ｉのデンドロン）並びに当業者に公知のその他のデンドロンを利用する。
【００３６】
その他の実施形態では、方法は、１０個以下の分子、典型的には５個以下の分子、しばしば３個以下の分子、より頻繁には単一分子のみを、固体基質の凸面に結合させる。
【００３７】
方法は、リンカーｓｓＤＮＡと接触させる前に、ｓｓＤＮＡと固体基質の凸面とを結合させるステップを含むこともできる。
【００３８】
加えて、リンカーｓｓＤＮＡまたはリンカーｓｓＤＮＡにハイブリダイズするｓｓＤＮＡは、本明細書に開示されるようにさらに修飾することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、典型的なＡＦＭチップと、ＡＦＭチップの頂点の拡大概略図を示す図である。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、自己組織化単層技法（例えば、オリゴヌクレオチドの固定化）を使用して、ＡＦＭチップおよびマトリックス表面をそれぞれ修飾するための方法を示す概略図である。
【図３】図３は、ＡＦＭチップの頂点に生体分子を選択的に固定化することを示す概略図である。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、自己組織化単層技法およびメソ空間技法（例えば、デンドロン分子およびオリゴヌクレオチドの固定化）を使用して、ＡＦＭチップおよびマトリックス表面をそれぞれ修飾することを示す概略図である。
【図５】図５は、酵素反応を使用して、ＡＦＭチップ上に、無傷の一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドの一本鎖を残すための方法を示す概略図である。
【図６】図６Ａは、開裂酵素を添加する前にＡＦＭチップ上に導入された一本鎖オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析グラフである。図６Ｂは、開裂酵素を添加してから１５分後にＡＦＭチップ上に導入された一本鎖オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析グラフである。図６Ｃは、開裂酵素を添加してから３０分後にＡＦＭチップ上に導入された一本鎖オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析グラフである。図６Ｄは、開裂酵素を添加してから４５分後にＡＦＭチップ上に導入された一本鎖オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析グラフである。図６Ｅは、開裂酵素を添加してから６０分後にＡＦＭチップ上に導入された一本鎖オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析グラフである。
【図７】図７Ａは、開裂酵素を添加する前にマトリックス表面上に導入された一本鎖オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析グラフである。図７Ｂは、開裂酵素を添加してから１５分後にマトリックス表面上に導入された一本鎖オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析グラフである。図７Ｃは、開裂酵素を添加してから３０分後にマトリックス表面上に導入された一本鎖オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析グラフである。図７Ｄは、開裂酵素を添加してから４５分後にマトリックス表面上に導入された一本鎖オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析グラフである。図７Ｅは、開裂酵素を添加してから６０分後にマトリックス表面上に導入された一本鎖オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析グラフである。
【図８】図８Ａは、開裂酵素を添加する前の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物のＨＰＬＣ分析グラフである。図８Ｂは、開裂酵素を添加してから１５分後の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物のＨＰＬＣ分析グラフである。図８Ｃは、開裂酵素を添加してから３０分後の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物のＨＰＬＣ分析グラフである。図８Ｄは、開裂酵素を添加してから４５分後の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物のＨＰＬＣ分析グラフである。図８Ｅは、開裂酵素を添加してから６０分後の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物のＨＰＬＣ分析グラフである。
【図９】図９は、大豆ヌクレアーゼの反応に関する緩衝溶液中のＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用力を示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、抗原−抗体反応を使用したＡＦＭチップの頂点の修飾を示す概略図である。
【図１１】図１１は、二本鎖オリゴヌクレオチドの周りに金属ナノロッドを形成することを示す概略図である。
【図１２】図１２は、インターカレーター−金属触媒接合体でＡＦＭチップの頂点を修飾することを示す概略図である。
【図１３】図１３は、標識（例えば、磁気ナノ粒子）二本鎖オリゴヌクレオチドでＡＦＭチップの頂点を修飾することを示す概略図である。
【図１４】図１４は、固体マトリックス表面に固定化された基質と、ＡＦＭチップの頂点に結合された触媒（または酵素）との間の位置選択的触媒反応を示す概略図である。
【図１５】図１５は、ナノ粒子結合オリゴヌクレオチドをリンカーオリゴヌクレオチドの相補的（ハイブリダイゼーション）部分に結合することによる、ナノ粒子を含むオリゴヌクレオチドで、ＡＦＭチップの頂点を修飾するための方法を示す図である。
【図１６】図１６Ａ〜Ｃは、それぞれ、（ｉ）２７酸デンドロン修飾基質およびＡＦＭチップをどのように生成し、ＤＮＡプローブ分子をデンドロンの頂点にどのように結合するかを示す概略図；（ｉｉ）２７酸分子の構造；および（ｉｉｉ）ＡＰＤＥＳ修飾基質およびＡＦＭチップが密接に位置したＤＮＡプローブ分子を有することを示す概略図に対応する図である。
【図１７】図１７Ａ〜Ｃは、単一ＤＮＡ固定化ＡｕＮＰを単離した結果を示す図であり；特に、図１７Ａは、リンカーＤＮＡ固定化ＡｕＮＰの３％アガロースゲル電気泳動を示し（レーン１は、参照として、ホスフィンキャップＡｕＮＰを含有する）、図１７Ｂは、ＡＦＭチップ上の捕獲リンカーＤＮＡとのハイブリダイゼーションに関する相補的ＤＮＡ固定化ＡｕＮＰの３％アガロースゲル電気泳動を示し；図１７Ａおよび１７Ｂが示すように、各バンド間の分離は、単一ＤＮＡ固定化ＡｕＮＰのみを含有するゲルを切断し収集するのに十分であり；図１７Ｃは、チオール化ＤＮＡ分子の配列を示す。
【図１８】図１８Ａは、単一リンカーＤＮＡ分子の捕獲を示す概略図である。図１８Ｂは、ＡＦＭ実験に使用されるＤＮＡ配列を示す図である。図１８Ｃは、ＡＦＭチップの最上部にある金標識単一リンカーＤＮＡのＴＥＭ画像である。図１８Ｄは、金標識ＤＮＡ分子と捕獲された金標識リンカーＤＮＡとのハイブリダイゼーションを示す概略図である。図１８Ｅは、別の金標識ＤＮＡ分子とハイブリダイズした、捕獲された金標識リンカーＤＮＡを示すＴＥＭ画像である。
【図１９】図１９は、単一リンカーＤＮＡ分子の首尾良い捕獲を示す、ＡＦＭチップのＴＥＭ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本明細書で使用される「アプタマー」は、ワトソン−クリック塩基対または３重鎖形成以外のメカニズムによって、選択された非オリゴヌクレオチド分子または分子群を特異的に認識することが可能な、一本鎖、部分的一本鎖、部分的二本鎖、または二本鎖ヌクレオチド配列、有利には複製可能なヌクレオチド配列を意味する。
【００４１】
本明細書で使用される「２官能性」、「３官能性」、および「多官能性」は、合成ポリマーまたは多価ホモもしくはヘテロポリマー混成構造に関して使用されるとき、場合によっては、２価、３価、または多価であることを意味し、または、２個、３個、もしくは多数の特異的認識要素、定義された配列セグメント、または結合部位を含むことを意味する。
【００４２】
本明細書で使用される「樹枝状分子」は、コアへのまたはコアからの分岐層の連続的または世代的付加によって形成された、通常の樹枝状分岐を示す分子である。
【００４３】
「デンドロン」という用語は、コアへのまたはコアからの分岐層の連続的または世代的付加によって形成された、通常の樹枝状分岐を示すポリマーを指す。樹枝状ポリマーという用語は、コアと、少なくとも１つの内部分岐層と、表面分岐層とによって特徴付けられる「デンドリマー」を包含する（例えば、Ｐｅｔａｒら、６４１〜６４５頁、Ｉｎ  Ｃｈｅｍ．  ｉｎ  Ｂｒｉｔａｉｎ、（１９９４年８月）参照）。「デンドロン」は、デンドリマーが形成されるように、直接または連結部分を通してコアに接合されまたは接合することができる、中心点または中心原子から生じる分岐を有するデンドリマーの１種である。多くのデンドリマーは、共通のコアに接合された２つ以上のデンドロンを含む。
【００４４】
デンドロンには、限定するものではないが対称および非対称分岐デンドリマー、カスケード分子、およびアルボロールなどが含まれる。いくつかの実施形態では、分岐アームは等しい長さを有する。しかし、非対称デンドリマーを使用してもよいことも考えられる。
【００４５】
本明細書で使用される「固定化」および「結合（固体基質表面への）」という用語は、本明細書では同義に使用され、不溶化されたことを意味し、または、不溶性、部分不溶性、コロイド状、粒状、分散され、懸濁され、かつ／または脱水された物質を含み、これらの物質に結合されまたは操作可能に関連付けられたことを意味し、または、固体支持体を含みまたは固体支持体に結合された分子または固相を意味する。
【００４６】
本明細書で使用される「ヌクレオチド」は、核酸合成および処理、例えば酵素的並びに化学的な合成および処理で天然に生ずる塩基の代わりに使用することができる、天然および合成の両方のヌクレオチド分子を指す。このように、ヌクレオチドには、塩基対合が可能な修飾ヌクレオチド、および任意選択で、アデニン、グアニン、サイトカイン、チミジン、ウラシル、または微量塩基を含まない合成塩基が含まれる。例えば、「ヌクレオチド」には、限定するものではないが修飾プリンおよびピリミジン、微量塩基、変換性ヌクレオシド、プリンおよびピリミジンの構造的類似体、標識され、誘導体化され、修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチド、複合ヌクレオシドおよびヌクレオチド、配列修飾剤、末端修飾剤、スペーサ修飾剤、および主鎖修飾剤を有するヌクレオチドであって、限定するものではないがリボース修飾ヌクレオチド、ホスホラミデート、ホスホロチオエート、ホスホンアミダイト、ホスホン酸メチル、メチルホスホラミダイト、メチルホスホンアミダイト、５’−β−シアノエチルホスホラミダイト、メチレンホスホネート、ホスホロジチオエート、ペプチド核酸、アキラルおよび中性ヌクレオチド間結合、および非ヌクレオチド橋、例えばポリエチレングリコール、芳香族ポリアミド、および脂質などを含めたものが含まれる。
【００４７】
本明細書で使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基または類似体のポリマーを指すために、本明細書では同義に使用される。これらの用語は、１個または複数のアミノ酸残基がこれに対応する天然に生ずるアミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸ポリマーに、並びに天然に生ずるアミノ酸ポリマーに適用される。この用語は、ポリペプチドを構成するアミノ酸に接合する伝統的なペプチド結合の、変形例を含んでもよい。
【００４８】
本明細書で使用する「保護基」は、分子上の反応性基（例えば、ヒドロキシルまたはアミン）に接合される基を指す。保護基は、化学反応の１つまたは複数のステップ中に特定の基が反応しないように選択される。一般に、特定の保護基は、分子中に存在するその他の反応性基を変化させることなく反応性基を修復させるため、後になって除去されるように選択される。保護基に何を選択するかは、保護される特定の基と、それが曝される化合物とに関係がある。保護基の選択は当業者に周知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，  Ｎ．Ｊ．（１９９１年）を参照されたい。
【００４９】
本明細書で使用される「固体支持体」は、限定するものではないが不溶化物質、固相、表面、基質、層、コーティング、織または不織繊維、マトリックス、結晶、膜、不溶性ポリマー、プラスチック、ガラス、生物学的または生体適合性または生体内分解性または生物分解性ポリマーまたはマトリックス、微粒子、またはナノ粒子などの、固定化マトリックスを含む組成物を指す。固体支持体には、例えば、限定するものではないが、単層、２重層、商用の膜、樹脂、マトリックス、繊維、分離媒体、クロマトグラフィー支持体、ポリマー、プラスチック、ガラス、マイカ、金、ビーズ、ミクロスフィア、ナノスフィア、シリコン、ガリウムヒ素、有機および無機金属、半導体、絶縁体、ミクロ構造、およびナノ構造が含まれる。ミクロ構造およびナノ構造には、限定するものではないが、超小型化された、ナノメートル規模の、超分子プローブ、チップ、バー、ペッグ、プラグ、ロッド、スリーブ、ワイヤ、フィラメント、およびチューブを含めてもよい。
【００５０】
本明細書で使用される「基質」は、物質、構造、表面、または材料に関して使用する場合、特異的結合、ハイブリダイゼーション、もしくは触媒認識部位、または複数の異なる認識部位、または、表面、構造、もしくは材料を含む異なる分子種の数を超えたいくつかの異なる認識部位を含むことがこれまで公知ではなかった、非生物学的、合成的、非生物的、平面的、球状、または平らな表面を含む組成物を意味する。基質には、例えば、限定するものではないが、半導体、合成（有機）金属、合成半導体、絶縁体、およびドーパント；金属、合金、元素、化合物、および無機物；合成され、切断され、エッチングされ、リソグラフィーにかけられ、プリントされ、機械加工され、および微細加工されたスライド、デバイス、構造、および表面；工業的ポリマー、プラスチック、膜；シリコン、シリケート、ガラス、金属、セラミック；木材、紙、ボール紙、木綿、羊毛、布、織および不織繊維、材料、および織物；分岐状／線状ポリマーを通して固定化プローブ分子により修飾されていないナノ構造およびミクロ構造を含めてもよい。
【００５１】
文脈が他に必要としない限り、「リガンド」という用語は、プローブで選択的に結合することが可能な任意の物質を指す。リガンドは、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド（タンパク質、ホルモンなどを含む）、酵素、基質、薬物、薬物受容体、細胞表面、受容体作動薬、部分作動薬、混合作動薬、拮抗薬、応答誘発または刺激分子、薬物、ホルモン、フェロモン、伝達物質、オータコイド、成長因子、サイトカイン、補欠分子団、補酵素、補因子、基質、前駆体、ビタミン、毒素、調節因子、抗原、ハプテン、炭水化物、分子模倣体、構造分子、エフェクター分子、選択可能な分子、ビオチン、ジゴキシゲニン、交差反応物、類似体、これら分子の競合体または誘導体、並びに選択された標的に特異的に結合することが可能な、ライブラリー選択された非オリゴヌクレオチド分子、およびこれら分子のいずれかを第２の分子に結合することによって形成された接合体、および対応する受容体と選択的に結合する任意のその他の分子にすることができる。
【００５２】
「リガンド」および「受容体」という用語は、任意の特定の物質またはサイズの関係を指さないことを理解すべきである。これらの用語は、リガンドとこれに対応するプローブとの間の選択的結合を示す単なる運用上の用語であり、基質表面に結合される部分をプローブと呼び、プローブに選択的に結合する任意の物質をリガンドと呼ぶ。したがって、抗体が基質表面に結合される場合、抗体はプローブであり、これに対応する抗原がリガンドである。しかし、抗原が基質表面に結合される場合、抗原がプローブであり、それに対応する抗体はリガンドである。
【００５３】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書では同義に使用され、一本または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、他に限定しない限り、天然に生ずるヌクレオチドと同様の手法で核酸とハイブリダイズする、公知の天然ヌクレオチドの類似体を包含する。そのような類似体の例には、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、ホスホン酸メチル、キラル−ホスホン酸メチル、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、およびペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれる。「サブ配列」または「セグメント」は、より長い配列のヌクレオチドの一部を含む、ヌクレオチドの配列を指す。
【００５４】
「相補的」という用語は、別の核酸分子と同一のまたは別の核酸分子と選択的にハイブリダイズする、ある核酸を意味する。ハイブリダイゼーションの選択性は、特異性が完全に欠如している場合よりも選択的なハイブリダイゼーションが生じるときに、存在する。典型的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも１４〜２５ヌクレオチドのひと続きの配列を通して少なくとも約５５％の同一性、典型的には少なくとも６５％、しばしば少なくとも７５％、より頻繁には少なくとも９０％の同一性があるときに、生ずることになる。
【００５５】
「同一な」または「同一性」％という用語は、２つ以上の核酸またはポリペチドに関する文脈では、例えば以下に記述されるような配列比較アルゴリズムを使用してまたは目視検査によって測定したときに、最大限の対応に関して比較し位置合わせした場合、２つ以上の同じ配列またはサブ配列を指し、または、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の指定されたパーセンテージが同じであることを指す。
【００５６】
「実質的に同一」という文言は、２つの核酸に関する文脈では、例えば以下に記述されるような配列比較アルゴリズムを使用してまたは目視検査によって測定したときに、最大限の対応について比較し位置合わせした場合、少なくとも７５％、典型的には少なくとも８０％または８５％、しばしば少なくとも９０％、９５％、またはより高いヌクレオチド同一性を有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。一般に、実質的な同一性は、長さが少なくとも約４０〜６０ヌクレオチドである配列の領域全体にわたって存在し、その他の場合には、長さが少なくとも６０〜８０ヌクレオチドである領域全体にわたって、さらにその他の場合には長さが少なくとも９０〜１００ヌクレオチドにわたって存在し、さらにその他の場合には、配列は、例えばヌクレオチドのコード領域など、比較される配列の完全長にわたって実質的に同一である。
【００５７】
原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）は、その高い感度によってピコニュートン規模の力を感知することができるので、分子間相互作用を研究するためのツールとして使用されてきた。原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）チップに生体分子を固定化する従来の方法は、チップの頂点またはその頂点付近だけではなく、様々なＡＦＭチップ部位に、生体分子を結合させる。ＡＦＭチップに対する生体分子の、そのような比較的非選択的な結合は、ＡＦＭの比較的低い解像度をもたらす。単一の分子間相互作用のみ調査するために、多くの研究者は、化合物およびナノワイヤでＡＦＭチップおよび基質を修飾してきた。最近、一部では、チップの頂点の官能基の密度を制御するために自己組織化単層および長リンカーで製作されたＡＦＭチップを使用した、ＤＮＡパターンのボトムアップアセンブリの方法が報告されている。そのような方法は、単一ＤＮＡの捕獲と標的領域への捕獲されたＤＮＡの移送において、３５％の成功確率しか有していなかった。
【００５８】
本発明のいくつかの態様は、ＡＦＭチップの頂点にまたは凸面を含む任意の固体の頂点に、いくつかの化合物（例えば、１０以下、典型的には５以下、しばしば３以下、より頻繁には単一の分子）を結合するための方法を提供する。いくつかの実施形態は、ＡＦＭチップの頂点に１個の分子のみ選択的に結合するための方法を提供する。ＡＦＭチップの頂点に結合することができる例示的な化合物には、限定するものではないが生体分子（例えば、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、酵素、触媒、受容体、タンパク質、ＤＮＡなど）、小分子（例えば、薬物、薬物候補、標識、プローブなど）、ナノ粒子、ナノワイヤ、カーボンナノチューブ、およびこれらの２つ以上の組合せなど、当業者に周知のものが含まれる。
【００５９】
ＡＦＭチップの頂点は、図１に概略的に示されるように、典型的にはその直径が数ナノメートルであり、図２に示される自己組織化反応を通して様々な官能基で修飾することができる。これらの官能基は、生体分子、化合物、ナノ粒子、およびナノワイヤなど、様々な化合物に結合することができる。そのような化合物を、この自己組織化反応を使用してＡＦＭチップの表面に固定化することが可能であり、理論的には図３に示されるような所望の化合物でチップの頂点のみ修飾することが可能である。例えば、ＤＮＡおよび相補的ＤＮＡをそれぞれＡＦＭチップおよびマトリックス表面に固定化した後、ＡＦＭチップの頂点にのみ少数の二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ対を形成するのに十分な条件下で、ＡＦＭチップをマトリックス表面近くに持っていく。次いで一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を溶解する酵素の添加によって、チップの頂点に形成された無傷のｄｓＤＮＡ対を残しておく。次いでｄｓＤＮＡを様々な部分に修飾することができ、例えばプローブ、標識、インターカレート剤を導入することができ、様々なナノ構造をｄｓＤＮＡから形成することができる。そのような修飾技法は、ＤＮＡ−ＤＮＡ複合体にだけではなく、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−タンパク質、ＲＮＡ−タンパク質、抗原−抗体、または生体分子−化学分子複合体にも適用することができる。
【００６０】
さらに、図４に示されるような、メソ空間技法に関して本明細書に開示されまたは当業者に公知の技法のいずれかの組合せによって、ＡＦＭチップの頂点にのみ化合物または分子を固定化することが可能になる。生体分子間の多数の相互作用の除去は、ＡＦＭを使用して生体分子間相互作用を正確に測定するのに重要な因子の１つである。いかなる理論にも拘泥するものではないが、ある場合には、メソ空間技法によって、ハイブリダイズしたＤＮＡ−ＤＮＡ対をチップの頂点にのみ形成し、ｉｎ−ｖｉｖｏナノマシンを使用して酵素反応の導入を可能にし、化合物をチップの頂点にのみ固定化することが可能になると考えられる（図５）。その結果、本発明の方法は、ＡＦＭに関する新たな研究および適用例を可能にする。
【００６１】
本発明のいくつかの態様は、ｓｓＤＮＡ選択的溶菌酵素を使用して、ハイブリダイズしたＤＮＡ−ＤＮＡ対を残しながら、表面に結合したｓｓＤＮＡを切断するステップを含む。そのような酵素を使用することによって、ｄｓＤＮＡがＡＦＭチップの先端に残り、同時にハイブリダイズしていないｓｓＤＮＡが除去される。ｄｓＤＮＡをさらに修飾するのに利用可能な様々な方法がある。例えば、生体分子、化学分子、ナノ粒子、ナノワイヤ、カーボンナノチューブなどの様々な化合物で修飾されたＤＮＡとの再ハイブリダイゼーションを通して、ＡＦＭチップの頂点をこれら化合物で修飾することができる。いくつかの実施形態では、金属粒子を含むｄｓＤＮＡのメタライゼーション反応が、対応する金属ナノワイヤを生成する。その他の実施形態では、触媒または酵素の特徴は、触媒または酵素でそれぞれ修飾されたＡＦＭチップを使用することによって分析することができる。さらにその他の実施形態では、抗原−抗体相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、タンパク質−ＲＮＡ相互作用、化合物−化合物相互作用、および化合物−生体分子相互作用を研究するために、ＡＦＭチップの頂点を修飾することができる。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態は、本発明者らによって発見された自己組織化円錐形デンドロンを使用する。これらのデンドロンは、デンドロンの頂点に結合された反応性部分（例えば、ＤＮＡ分子）の有効なスペーシングをもたらす。そのような、制御されたスペーシングは、横方向立体障害を除去し、ハイブリダイゼーション効率および再現性を高め、力−距離曲線を大幅に単純化する。これらの特徴および結果は、単一分子力が首尾よく測定される確率が大幅に高まるように、デンドロン官能化チップをもたらすことが予測される。デンドロンの適用可能性を示すために、ＤＮＡハイブリダイゼーションを基にした単一ＤＮＡ捕獲系を、図１８に示すように設計した。
【００６３】
図１８を参照すると、各基質およびＡＦＭチップを、最初にＮ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＴＰＵ）単層でコーティングした。次いでデンドロン層を、エステル化反応によってシリル化表面に導入した（図１６Ａ）。デンドロン層の導入後、プローブおよび標的ＤＮＡ分子をデンドロンの頂点に共有結合した。プローブＤＮＡの最上部にある２０ｂｐ部は、リンカーＤＮＡとのハイブリダイゼーション用に設計され、底部で連続サイトカイン配列からなる別の１５ｂｐ部は、リンカーＤＮＡに繋ぎ止められた５ｎｍ金ナノ粒子にフリースペースが与えられるよう挿入した（図１８Ｂ）。リンカーＤＮＡは、基質上のプローブＤＮＡおよびＡＦＭチップ上の標的ＤＮＡにハイブリダイズするように設計された。透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）でリンカーＤＮＡ分子を視覚化するために、５ｎｍの金ナノ粒子を使用した。
【００６４】
ＡＦＭ実験の前に、金で標識されたリンカーＤＮＡ分子を最初にシリコン基質上でプローブＤＮＡ分子とハイブリダイズし、次いで標的ＤＮＡ修飾ＡＦＭチップおよびリンカーＤＮＡハイブリダイズ基質を、ＡＦＭ上に位置付けた。各ＡＦＭチップを、１点で５回、繰り返し近付けかつ遠ざけ、全体として５点をスキャンした。リンカーＤＮＡの遊離４０ｂｐストレッチと標的ＤＮＡとの間の破壊力は、リンカーＤＮＡの別の２０ｂｐ部とプローブＤＮＡとの間よりも強力であるので、ＡＦＭチップはリンカーＤＮＡを基質から除去することができると予測された。スキャン後、ＡＦＭチップを、さらなる処理を全く行うことなくＴＥＭによって視覚化した。
【００６５】
各リンカーＤＮＡを１個の金ナノ粒子でしか標識しなかったので、ＡＦＭチップ上の金ナノ粒子の数は、ＡＦＭチップ上の標的ＤＮＡ分子と相互に作用するリンカーＤＮＡ分子の数に相当する可能性がある。図１８Ｃに示されるように、ＡＦＭチップの最上部には１個の金ナノ粒子しか観察されなかった。合計で１６個ＡＦＭチップを試験し、１２のチップは１個の金ナノ粒子のみ示し、その他は金ナノ粒子を全く示さなかった（図１９）。
【００６６】
別の金−ＤＮＡ接合体のハイブリダイゼーションが、捕獲されたリンカーＤＮＡの遊離ｓｓＤＮＡ部分に対して試みられ、その結果、チップ上の金標識リンカーＤＮＡは特異的相互作用によって導入されることがはっきりと確認された（図１８Ｄ）。図１８Ｅに示されるように、ＡＦＭチップ上に２個の金ナノ粒子が観察された。これらの結果は、デンドロン修飾ＡＦＭチップおよび基質が特異的な単一分子間相互作用をもたらすことを示す。
【００６７】
本発明の方法は、現在利用可能な方法よりも著しく高い成功確率（例えば、少なくとも約７５％）で単一分子間相互作用のみを認識する、ＡＦＭチップを作製するのに使用することができる。ＡＦＭチップのＴＥＭ画像は、単一の特異的な相互作用の直接的証拠を示した。本発明のいくつかの態様は、生体分子間の単一分子力の測定、単一分子の製作、および単一分子のみ制御するためのその他の適用例に適切な、ＡＦＭチップを製作する成功確率を著しく高めるデンドロンコーティング付きチップを使用する。本発明の組成物および装置は、例えば金ナノ粒子と酵素、有機金属触媒、または半導体ナノ粒子との交換によって、単一触媒反応および単一電子移動メカニズムを研究するための有用なツールも提供する。
【００６８】
本発明の追加の目的、利点、および新規な特徴は、限定しようとするものではないそれらの以下の実施例を検討することによって、当業者に明らかにされよう。実施例において、実施されるよう構造的に単純化した手順を現在時制で記述し、実験室で実施された手順を過去時制で記述する。
【実施例】
【００６９】
（実施例１）
シランカップリング剤Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシド
シランカップリング剤Ｎ−（３−（トリエトキシシリル）プロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＴＰＵ）を、Ｇｅｌｅｓｔから購入した。その他の化学薬品全ては、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製の試薬級のものであった。ＵＶ級溶融シリカプレートを、ＣＶＩ  Ｌａｓｅｒから購入した。研磨したＳｉ（１００）ウェーハ（ドーパント：リン；抵抗率：１．５〜２．１Ω・ｃｍ）をＭＥＭＣ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓから購入した。脱イオン水（１８ＭΩ・ｃｍ）は、蒸留水をＢａｒｎｓｔｅａｄ  Ｅ−ｐｕｒｅ  ３−Ｍｏｄｕｌｅシステムに通すことによって得られた。全ての短オリゴヌクレオチドはＢｉｏｎｉｃｓ（韓国）から購入した。
【００７０】
基質の清浄化
シリコンウェーハおよび溶融シリカプレート（デンドロン表面被覆率分析用；データは図示せず）を、ピラニア溶液［濃Ｈ２ＳＯ４：３０％Ｈ２Ｏ２＝７：３（ｖ／ｖ）］中で４時間超音波処理した。次いで基質を脱イオン水で完全に洗浄し、その後、脱イオン水、濃アンモニア溶液、および３０％過酸化水素の混合物［５：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）］に、Ｔｅｆｌｏｎビーカ内で浸漬した。ビーカを水浴中に置き、８０℃に１０分間加熱した。基質を溶液から取り出し、脱イオン水で完全に濯いだ。基質を、脱イオン水、濃ＨＣｌ、および３０％Ｈ２Ｏ２の混合物［６：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）］が入っているＴｅｆｌｏｎビーカ内に再び置いた。ビーカを８０℃に１０分間加熱した。基質を溶液から取り出し、脱イオン水で完全に洗浄した。清浄な基質を真空チャンバ（３０〜４０ｍＴｏｒｒ）内で約３０分間乾燥し、直ぐに次のステップで使用した。
【００７１】
ＡＦＭプローブの前処理
ピラミッド型チップを有する標準的な長方形のシリコンカンチレバー（ＳＩＣＯＮ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＮａｎｏＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓ；ｋ＝０．２Ｎ／ｍ）を、まず８０％硝酸溶液に浸漬することによって酸化し、次いで８０℃に２０分間加熱した。カンチレバーを溶液から取り出し、脱イオン水で完全に洗浄した。清浄なカンチレバーを真空チャンバ（３０〜４０ｍＴｏｒｒ）内で約３０分間乾燥し、直ぐに次のステップで使用した。
【００７２】
シリル化
シリコン／シリカ基質およびカンチレバーを、シランカップリング剤（０．２０ｍＬ）を含有する無水トルエン（２０ｍＬ）中に、窒素雰囲気中で４時間浸漬し、トルエンで洗浄し、次いで３０分間１１０℃で加熱した。基質を、トルエン、トルエン−メタノール［１：１（ｖ／ｖ）］、およびメタノールに順次浸漬し、各洗浄溶液中で３分間超音波処理した。カンチレバーを、トルエンおよびメタノールで順次、完全に濯いだ。得られた基質およびカンチレバーを真空中（３０〜４０ｍＴｏｒｒ）で乾燥した。
【００７３】
デンドロン修飾表面の調製
上述のヒドロキシル化基質およびカンチレバーを、２７−酸デンドロン（１．０ｍＭ）、カップリング剤、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２９．７ｍＭ）、および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２．９ｍＭ）を含む塩化メチレン溶液中に、１２〜２４時間浸漬した。この作業で使用される２７−酸デンドロン、９−アントリルメチル−３−（｛［トリス（｛［（１−｛トリス［（２−｛［（トリス｛［２−カルボキシエトキシ］メチル｝−メチル）アミノ］カルボニル｝エトキシ）メチル］メチル｝アミノ）カルボニル］−２−エトキシ｝メチル）メチル］−アミノ｝カルボニル）プロピルカルバメート（または２７−酸、図１６Ｂ）を、公知の手順に従い調製した。これらの化合物を最小量のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、その後、塩化メチレンに添加した。反応後、基質を、塩化メチレン、メタノール、および水に順次浸漬し、各洗浄ステップで３分間超音波処理した。カンチレバーを、塩化メチレン、メタノール、および水で順次、完全に濯いだ。基質およびカンチレバーをメタノールで洗浄し、真空乾燥（３０〜４０ｍＴｏｒｒ）した。
【００７４】
９−アントリルメトキシカルボニル基の脱保護
デンドロン修飾カンチレバーおよび基質を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１．０Ｍ）を含有する塩化メチレン溶液中で２時間撹拌した。反応後、２０％（ｖ／ｖ）ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を含む塩化メチレン溶液中に１０分間浸漬した。基質を、塩化メチレンおよびメタノール中でそれぞれ３分間、超音波処理し、カンチレバーを、塩化メチレンおよびメタノールで順次、完全に濯いだ。基質およびカンチレバーを真空乾燥（３０〜４０ｍＴｏｒｒ）した。
【００７５】
ＮＨＳ修飾基質の作製
上述のアミン末端基質およびカンチレバーを、ジ（Ｎ，Ｎ’−スクシニミジル）カーボネートまたはＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート（ＤＳＣ）（２５ｍＭ）およびＤＩＰＥＡ（１．０ｍＭ）を含有するアセトニトリル溶液中に、窒素雰囲気中で４時間浸漬した（図１６Ａ）。反応後、基質およびカンチレバーを、ジメチルホルムアミド中に３０分間置き、メタノールで洗浄した。基質およびカンチレバーを真空乾燥（３０〜４０ｍＴｏｒｒ）した。
【００７６】
ＤＮＡの固定化
上述のＮＨＳ−係留基質およびカンチレバーを、ＤＮＡ溶液（５．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．５）中、４０μＭ）中に１２時間浸漬した。ＤＮＡ分子は、基質に固定された活性化ＮＨＳ−エステルと反応する末端アミノ基を有する（図１６Ａ）。反応後、基質およびカンチレバーを、３７℃で１時間、ハイブリダイゼーション緩衝溶液（２×ＳＳＰＥ緩衝液（ｐＨ７．４）、７．０ｍＭドデシル硫酸ナトリウムを含有する）中で撹拌し、水で完全に濯いで非特異的に結合したオリゴヌクレオチドを除去した。基質およびカンチレバーを真空乾燥（３０〜４０ｍＴｏｒｒ）した。
【００７７】
対照実験
シリコン基質およびカンチレバーを、トルエンに溶かした０．１％（ｖ／ｖ）ＡＰＤＥＳ溶液と３時間反応させた（図１６Ｃ）。シリル化後、基質およびカンチレバーを、デンドロンなしで行ったこと以外は上述のように処理した。
【００７８】
金標識ＤＮＡ
先に報告された、金標識ＤＮＡの合成方法を採用した。例えば、Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６年、３８２巻、６０９〜６１１頁；  Ｌｏｗｅｔｈら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、１９９９年、１１１巻、１９２５〜１９２９頁；およびＦｕら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、２００４年、１２６巻、１０８３２〜１０８３３頁を参照されたい。このように、ビス（パラ−スルホナトフェニル）フェニルホスフィン脱水二カリウム塩（１ｍｇ）を金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液（１０ｍＬ）に添加し、この溶液を２２℃で一晩インキュベートした。次いでＡｕＮＰを、溶液の色が青く変わるまで、ＮａＣｌを添加することによって沈殿させた。遠心分離後、上澄みを完全に除去し、ＡｕＮＰを０．５×ＴＢＥ緩衝液中に再分散させた。ＡｕＮＰの濃度は２μＭであった。次いでＡｕＮＰ溶液を、トレート化ＤＮＡ溶液と１：１のモル比で混合し、２２℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、単一ＤＮＡ固定化ＡｕＮＰだけを、ランニング緩衝液として０．５×ＴＢＥ緩衝液を用いた３％アガロースゲル電気泳動によって分離した。図１７。単一リンカーＤＮＡ固定化ＡｕＮＰに対応するバンドを、ゲルからスライスし、０．５×ＴＢＥ緩衝液で満たされた透析膜中に置いた。別の操作後、膜中の溶液を慎重に回収し、ＤＮＡ固定化ＡｕＮＰを遠心分離によって濃縮した。これらの濃縮されたＡｕＮＰ標識ＤＮＡ分子を、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する０．５×ＴＢＥ緩衝液中に再分散させた。ＡｕＮＰ標識ＤＮＡ溶液の最終濃度は、約１００ｎＭであった。各溶液の濃度を、ＵＶ−可視分光法によって推定した。
【００７９】
単一リンカーＤＮＡの捕獲
全ての単一リンカーＤＮＡ捕獲実験は、ＮａｎｏＷｉｚａｒｄ  ＡＦＭ（ＪＰＫ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて行った。全てのＡＦＭ実験は、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する新しい０．５×ＴＢＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で、室温で実施した。各ＡＦＭチップを、１点で５回にわたり、繰り返し近付けかつ遠ざけ、全体で５点についてスキャンした。チップ速度は、０．２μｍ／秒に固定した。
【００８０】
（実施例２）
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を選択的に溶解することができる大豆ヌクレアーゼを、実験で使用される酵素として選択した。Ｓ１ヌクレアーゼはこの酵素に取って代わることができるが、ｓｓＤＮＡを選択的に溶解することができる任意の酵素を使用することができる。ＡＦＭチップには、
【００８１】
【化２】
2010539468.tif 000004
を結合させた。また基質表面には
【００８２】
【化３】
2010539468.tif 000005
を結合させた。
【００８３】
５’−末端のアミノ基は、表面にオリゴヌクレオチドを固定化するのに使用した。５０ヌクレオチドの長さは、酵素によって切断された短ＤＮＡとの区別を可能にするのに使用した。合成されたＤＮＡおよび大豆ヌクレアーゼとの反応生成物を、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して分析し、それによって、ＤＮＡが大豆ヌクレアーゼにより溶解されたのか否か、またｄｓＤＮＡとｓｓＤＮＡとの間に選択性が存在したかの否かを決定した。ＡＦＭチップの合成ｓｓＤＮＡを大豆ヌクレアーゼと反応させ、Ｃ−１８逆相カラムを使用したＨＰＬＣによって分析した。結果を図６Ａ〜６Ｅに示すが、図６Ａは、大豆ヌクレアーゼをｓｓＤＮＡ溶液に添加する前の、無傷のｓｓＤＮＡの検出（即ち、保持）時間を示す。検出時間を決定した後、大豆ヌクレアーゼをＤＮＡ溶液に添加し、溶解の程度を１５分間観察した。酵素的切断から得たより短いｓｓＤＮＡは、ＤＮＡ主鎖の負電荷の減少に起因して、より大きな無傷のｓｓＤＮＡよりも後になって検出される。図６Ｂに示されるように、５０ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡのほとんどは既に１５分以内で溶解し、３０分後には（図６Ｃ）、５０ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡのほぼ全てが溶解した。実験で使用される緩衝液およびＨＰＬＣ条件は、下記の通りである：大豆ヌクレアーゼ反応緩衝液（ｐＨ４．６）；３０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ酢酸亜鉛、１ｍＭシステイン、０．００１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５％グリセロール、ＨＰＬＣランニング緩衝液（ｐＨ５．０）；３０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ酢酸亜鉛、５％グリセロール；ＨＰＬＣ溶離剤：ランニング緩衝液：ＭｅＯＨ（Ｖ／Ｖ）＝７：３；流量＝２ｍＬ／分；温度＝２５℃；ＤＮＡ濃度＝３ｍＭ；大豆ヌクレアーゼ＝９０単位。
【００８４】
同様に、マトリックス表面用ｓｓＤＮＡを酵素と反応させ、上述の同じ条件下でＨＰＬＣにより分析したが、その結果を図７Ａ〜７Ｅに示す。図７Ａは、大豆ヌクレアーゼを添加する前のｓｓＤＮＡ溶液のＨＰＬＣプロットを示し、それに対して図Ｂ〜Ｅは、それぞれ、酵素添加後の同じ溶液の１５分後、３０分後、４５分後、および６０分後のＨＰＬＣプロットを示す。結果は、ＡＦＭチップＤＮＡおよびマトリックス表面ＤＮＡの両方が６０分以内で完全に溶解したことを示す。
【００８５】
ｓｓＤＮＡ対ｄｄＤＮＡ
ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡの混合物を、同様の条件下で大豆ヌクレアーゼに曝して、ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡとの間の選択性を決定した。二本鎖ＤＮＡは、相補的ｓｓＤＮＡを上記ｓｓＤＮＡの１つとハイブリダイズすることによって形成した。ｄｓＤＮＡは、その主鎖がｓｓＤＮＡの場合よりも大きく負に帯電しているので、検出（即ち、保持）時間はｓｓＤＮＡの場合よりも短かった。ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡの保持時間を、図８Ａに示す。図８Ｂ〜８Ｅは、それぞれ、酵素を添加した後の１５分、３０分、４５分および６０分でのＨＰＬＤ分析結果である。図８Ａ〜８Ｅからわかるように、ｄｓＤＮＡは溶解しないままであり、ｓｓＤＮＡだけが選択的に溶解した。
【００８６】
メソ空間技法を使用して、ＡＦＭチップおよびマトリックス表面であって上記にて開示された５０ｍｅｒ  ｓｓＤＮＡを含むものを修飾した（即ち、結合した）。ＤＮＡ−ＤＮＡのハイブリダイゼーション力を、大豆ヌクレアーゼ反応用の緩衝溶液中で測定した。その結果は、ハイブリダイゼーション力が４９．２±５．４ｐＮであることを示した（図９）。
【００８７】
実験は、大豆ヌクレアーゼがＡＦＭ上のＤＮＡを溶解するのに必要とされる時間を決定するために実施した。簡単に言うと、大豆ヌクレアーゼを添加し、ハイブリダイゼーション力を非常にゆっくり測定した（例えば、１回の力測定当たり９秒）。結果は、実験に使用された８個のサンプル全てが、１時間以内でハイブリダイゼーション力を失うことを示した。実際のＡＦＭ上のｓｓＤＮＡの加水分解は、デンドロン修飾ＡＦＭチップおよびデンドロン修飾マトリックス表面に結合されたｓｓＤＮＡを使用して、繰り返した。ｓｓＤＮＡを、デンドロンのアミン基との架橋を介して結合させた。チップおよびマトリックスをＡＦＭに導入した後、緩衝溶液を添加し、その後、大豆ヌクレアーゼを添加した。チップは、ＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用力が測定される位置を特定するためにマトリックス表面に近付くように誘導され、次いでマトリックス表面を、大豆ヌクレアーゼ添加部位から、チップが軽く抑え付けられた状態に１時間保った。その後、チップを表面から素早く持ち上げ、大豆ヌクレアーゼの反応緩衝液に溶解した硫酸ドデシルの０．０１％溶液（ＳＤＳ）に１０分間浸漬し、滅菌水で洗浄し、真空中で保存した。
【００８８】
（実施例３）
抗原−抗体相互作用を使用した単一分子によるＡＦＭチップの修飾
上記実施例１および２に例示されたＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用を使用する方法に加え、ＡＦＭチップの頂点は、抗原−抗体相互作用を使用して単一分子により修飾される（図１０）。シリコン（Ｓｉ）ウェーハを、メソ空間技法を使用してデンドロンで修飾した後、デンドロンを、架橋反応を通してウサギ抗ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に結合する。残されたウサギ抗ＢＳＡ溶液を洗い落としたら、Ｓｉウェーハに結合されたウサギ抗ＢＳＡおよび溶液中のＢＳＡが、ＢＳＡを含有する溶液にマトリックスを浸漬することによって抗原−抗体反応を通して互いに特異的に結合するようにする。Ｓｉウェーハの場合と同様に、ＡＦＭチップはまずデンドロンによって修飾され、架橋を通してウサギ抗ＢＳＡによって再び修飾される。ＳｉウェーハおよびＡＦＭチップがＡＦＭ装置に導入され、次いでＡＦＭチップをＳｉ表面に近付くようにする。接近させる反復試行を通して、Ｓｉウェーハ表面に固定化されたＢＳＡは、抗原−抗体反応を通してＡＦＭチップに移される。次いで得られたＡＦＭチップを、ウサギ抗ＢＳＡを含有する溶液に曝し、その結果、頂点に唯一の抗原−抗体−抗原複合体を有するＡＦＭチップが得られる。
【００８９】
（実施例４）
ＡＦＭチップ上の金属ナノロッド
多くの金属イオンは、静電相互作用および配位共有結合を通してｄｓＤＮＡに結合することができる。結合された金属イオンは、還元プロセスを通して金属粒子に還元することができる。例えば、Ｊ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｃｈｅｍ．、２００４年、１４巻、６１１〜６１６頁を参照されたい。還元することができる適切な金属イオンには、限定するものではないが銅、白金、および銀が含まれる。金属還元法などの利点の１つは、ナノワイヤの厚さを、還元時間を調節することによって制御できることである。
【００９０】
ＡＦＭチップの頂点に銀（多くの種類の金属の中でも）ナノワイヤを形成するための方法を、本明細書に例示する。図１１を参照されたい。４種の溶液が、銀のメタライゼーションには必要である。各溶液の組成物は、下記の通りである：溶液１：１０ｍＭ  ＣｓＮＯ３を水に溶かした溶液；溶液２：１０％  ＮＨ４ＯＨ、１０ｍＭ  ＣｓＮＯ３、０．１ｍＭ  ＡｇＮＯ３を水に溶かした溶液；溶液３：１０％  ＮＨ４ＯＨ、１０％ホルムアルデヒド、１０ｍＭ  ＣｓＮＯ３を水に溶かした溶液；および溶液４：１０％  ＮＨ４ＯＨ、１０％ホルムアルデヒド、１０ｍＭ  ＣｓＮＯ３、０．１ｍＭ  ＡｇＮＯ３を水に溶かした溶液。とりわけ溶液１は、Ｃｓ＋イオンで酸化シリコン表面を覆うという望ましくないメタライゼーションを防止する役割を演ずると考えられる。溶液２は、ｄｓＤＮＡの間に銀イオンの結合をもたらす。溶液３は、ｄｓＤＮＡに結合された溶液２中のＡｇ＋を還元するメタライゼーション用のシードの形成を可能にする。最後に、溶液４は、溶液３によって形成されたシードから出発する結晶成長をもたらす。
【００９１】
ＡＦＭチップの頂点に銀のナノワイヤを形成するために、上記実施例１および２で得られたＡＦＭチップでのＤＮＡのハイブリダイゼーションを使用する。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション緩衝溶液を９０℃から室温にゆっくりと冷却することによって実施される。得られたＡＦＭチップを溶液１に３０分間浸漬して、表面をＣｓ＋イオンで遮断する。次いでチップを溶液２に約３０分間浸漬し、溶液１で５秒間洗浄することにより、過剰なＡｇ＋イオンを除去し、溶液３に５分間浸漬することにより、ＤＮＡ２重鎖に結合されたＡｇ＋イオンを還元する。最後に、ＡＦＭチップを溶液４に浸漬してナノワイヤを形成する。得られた銀のナノワイヤを、ＴＥＭで特定する。銀のナノワイヤの直径は、溶液４での反応時間を調節することによって制御することができる。
【００９２】
銀のナノワイヤで修飾されたこのＡＦＭチップは、電気力顕微鏡法（ＥＦＭ）に利用することもできる。簡単に言えば、導電性ポリマーをＳｉウェーハ上にコーティングし、この導電性ポリマーのトポロジーをＥＦＭモードの導電性画像と比較する。２つの画像は、互いに一致している。このように、銀のナノワイヤで修飾されたＡＦＭチップを使用して、表面の電気的特性を研究することができる。
【００９３】
（実施例５）
ＡＦＭチップ上のインターカレーター−金属触媒
様々な有機化合物および金属は、ｄｓＤＮＡ間で結合する。これらの材をインターカレーターと呼ぶ。これらには、シクロホスファミド、メルファラン、ブスルファン、クロラムブシル、マイトマイシン、シスプラチン、ブレオムチン、イリノテカン、ミトキサントロン、ダクチノマイシンなどの様々な化合物が含まれる。これら材料の利点は、様々な誘導体および豊かな適用可能性を有することである。
【００９４】
この実施例は、その第１級アミン基で金属触媒に架橋するマイトマイシン誘導体を使用した、ＡＦＭチップの頂点への金属触媒の固定化を例示する。図１２を参照されたい。
【００９５】
ＡＦＭチップは、上記実施例１および２に記述される手順を使用して作製され、上記実施例１および２に記述される手順を使用してｄｓＤＮＡにハイブリダイズされて、ｄｓＤＮＡを形成する。少量のマイトマイシンを、ハイブリダイゼーション溶液の場合と同じ組成の緩衝液に溶解する。ＡＦＭチップを、室温で１２時間、マイトマイシン溶液中に置き、取り出し、脱イオン水で洗浄し、真空乾燥する。乾燥後、マイトマイシンを、第１級アミン基を有する事前に調製した酸化チタンナノ粒子に架橋する。第１級アミン基を有する酸化チタンナノ粒子は、４水酸化チタンを空気中で噴霧することによって形成され、ＡＰＴＥＳ（アミノ−プロピルトリエトキシシラン）との自己組織化反応によって得られる。ＴＥＭ分析は、得られたＡＦＭチップがナノ粒子で修飾されることを示す。
【００９６】
光触媒特性を検証するために、得られたＡＦＭチップを、Ｈ２Ｏ２を含有する溶液に浸漬し、紫外線を照射する。得られた溶液の分析は、Ｈ２Ｏ２が還元されることを示し、これは、酸化チタンナノ粒子で修飾されたＡＦＭが光触媒特性を有することを示している。
【００９７】
（実施例６）
ＡＦＭチップに固定化された磁性粒子
この実施例は、ＡＦＭチップの頂点に磁性粒子を固定化するための方法を例示する。図１３を参照されたい。
【００９８】
アミン基をＦｅ３Ｏ４ナノ粒子上に導入するために、ＡＰＴＥＳを自己組織化し、ＤＮＡを、ＵＶ架橋法を使用してＦｅ３Ｏ４表面に固定化する。得られたＦｅ３Ｏ４を遠心分離して、過剰なＤＮＡを除去する。上記実施例１の手順を使用して、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子上に導入されたｓｓＤＮＡに相補的なｓｓＤＮＡを、ＡＦＭチップの頂点に固定化する。Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子およびＡＦＭチップを、実施例１および２の手順を使用して互いにハイブリダイズさせる。
【００９９】
磁性粒子で修飾されたＡＦＭチップは、磁気力顕微鏡法（ＭＦＭ）に適用可能である。Ｆｅ３Ｏ４の磁化は、ＡＦＭチップ上に強力な磁石を置くことによって誘発され、次いで散乱した磁性材料を含有するＳｉウェーハのトポロジー画像および磁気力画像を比較する。このようにＡＦＭチップは、高解像度磁気力顕微鏡法で使用することができる。
【０１００】
（実施例７）
表面での部位特異的酵素または触媒反応
図１４に示されるように、タンパク質キナーゼは、ＡＦＭチップに結合されたｓｓＤＮＡ（上記実施例１および２の手順に従って調製された）とタンパク質キナーゼに結び付けられたＤＮＡとをハイブリダイズすることによって、ＡＦＭチップの頂点に結合することができる。
【０１０１】
メソ空間技法および架橋法を使用して、セリン残基末端を有するオリゴヌクレオチドを、表面結合デンドロンを有するシリコンウェーハに結合する。得られたＡＦＭチップおよびＳｉウェーハを、ＡＦＭに設置する。ＡＦＭチップを、ＡＴＰを含有する緩衝溶液中でＳｉウェーハ表面に接触させる。チップを表面でゆっくりと移動させることによって、チップの軌道上のヒドロキシル基をリン酸基と置き換える。このようにして、高解像度パターンが形成され、パターン増幅およびその他の化合物の選択的導入は、チップの軌道とその他の部分との間の官能基の相違を使用して得ることができる。
【０１０２】
（実施例８）
単一分子結合
この実施例は、ＤＮＡに結び付けられているナノ粒子をＡＦＭチップの頂点に導入するための方法を例示する。図１５を参照されたい。
【０１０３】
比較的長いＤＮＡを、表面結合デンドロンを有するＡＦＭチップに結合させる。比較的より短いＤＮＡは、シリコンウェーハに結合させる。ＡＦＭチップおよびシリコンウェーハの両方のＤＮＡにハイブリダイズすることができるリンカーＤＮＡを、シリコンウェーハのＤＮＡとハイブリダイズさせる。ＡＦＭチップをシリコン表面付近に配置することによって、シリコンウェーハ表面に結合されるリンカーＤＮＡの残りの部分をＡＦＭチップＤＮＡとハイブリダイズさせる。ＡＦＭチップをシリコンウェーハから分離したら、相対的な結合力の差によってリンカーＤＮＡをＡＦＭチップに引き付ける。この方法の首尾の良さを検証するために、捕獲されたリンカーＤＮＡの非ハイブリダイズ部分にハイブリダイズすることが可能な配列を有するＤＮＡを、金ナノ粒子上に導入する。金ナノ粒子連結ＤＮＡのハイブリダイゼーションは、わずか１個のナノ粒子がＡＦＭチップの頂点に結合したことを示した。
【０１０４】
結果は、ナノ粒子、ナノワイヤ、触媒、金属、化学分子、および生体分子をＡＦＭチップの頂点に固定化できることを示す。
【０１０５】
本発明の前述の考察は、例示および説明を目的に提示した。前述の内容は、本発明を、本明細書に開示された１つまたは複数の形態に限定しようとするものではない。本発明の記述には、１つまたは複数の実施形態と、ある特定の変形例および修正例との記述を含めたが、本発明の開示を理解した後は、例えば当業者の技量および知識の範囲内にあるように、その他の変形例および修正例が本発明の範囲内にある。本発明の記述は、特許請求の範囲に記載されている範囲まで、代替の交換可能なおよび／または均等な構造、機能、範囲もしくはステップも含めて許容される程度に、そのような代替の交換可能なおよび／または均等な構造、機能、範囲、もしくはステップが本明細書に開示されているか否かに関わらず、代替の実施形態を含む権利を得ようとするものであり、任意の特許性ある対象を公に供しようとするものではない。
【図２（Ａ）】
2010539468.tif 000008
【図２（Ｂ）】
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【図１９】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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