(57)【要約】  本発明は、P-糖タンパク質とカベオリン-1の相互作用を阻害することができる、これらの2種のタンパク質に由来するポリペプチド(例えば、断片)に関する。この相互作用の阻害は、P-gpにより輸送される化合物の排出の増加をもたらす。本発明はさらに、増加したP-gpを介する排出から利益を得る疾患を有する患者を治療する方法を含む。そのような疾患としては、癌などの新生物および神経変性疾患などの神経疾患が挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列DGIWKASFTTFTVTKYWFYRまたはVTKYWFYRに対して少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、170アミノ酸長未満である、前記ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが50アミノ酸長未満である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列DGIWKASFTTFTVTKYWFYRに対して少なくとも70％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが、該配列の13番目のアミノ酸に対応する位置にバリンもしくはロイシン、該配列の16番目のアミノ酸に対応する位置にチロシン、もしくは該配列の12番目のアミノ酸に対応する位置にリジンもしくはアルギニン、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列VTKYWFYRに対して少なくとも70％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが、該配列の1番目のアミノ酸に対応する位置にバリンもしくはロイシン、該配列の4番目のアミノ酸に対応する位置にチロシン、もしくは該配列の8番目のアミノ酸に対応する位置にリジンもしくはアルギニン、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列DGIWKASFTTFTVTKYWFYRまたはVTKYWFYRと比較して、少なくとも1個のアミノ酸置換または欠失を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸配列が、配列DGIWKASFTTFTVTKYWFYRまたはVTKYWFYRに対して少なくとも95％の同一性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
DGIWKASFTTFTVTKYWFYRまたはVTKYWFYRのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
DGIWKASFTTFTVTKYWFYRまたはVTKYWFYRのアミノ酸配列からなる請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、P-糖タンパク質と相互作用することができる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが可溶性である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが実質的に純粋である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドおよび製薬上許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項１３】
(a)配列DGIWKASFTTFTVTKYWFYRまたはVTKYWFYRに対して少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列および(b)異種配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１４】
(a)のアミノ酸配列が、配列DGIWKASFTTFTVTKYWFYRまたはVTKYWFYRと少なくとも95％同一である、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
(a)のアミノ酸配列が、DGIWKASFTTFTVTKYWFYRまたはVTKYWFYRである、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが実質的に純粋である、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドがP-糖タンパク質と相互作用することができる、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１３に記載のポリペプチドおよび製薬上許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項１９】
カベオリン-1の断片を含む可溶性ポリペプチドであって、該断片がP-糖タンパク質の一部に結合する、ポリペプチド。
【請求項２０】
前記一部がP-糖タンパク質のアミノ酸36-47を含む、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１９に記載のポリペプチドおよび製薬上許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項２２】
P-gpを介する排出を増加させるのに十分な量の請求項１、１３、または１９に記載のポリペプチドを投与することを含む、細胞中でのP-gpを介する排出を増加させる方法。
【請求項２３】
前記細胞が患者中にある、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記患者が、新生物、神経疾患、薬物中毒、封入体筋炎、脳アミロイド血管症、アミロイドーシス、または眼疾患に罹患している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドを、前記症状または疾患を治療するのに十分な量で投与する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記新生物が癌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記癌が、白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、グリア芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記神経疾患が神経変性疾患である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、プリオン病、ウシ海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、レヴィー小体疾患、またはピック病である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記眼疾患が黄斑変性または緑内障である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
配列VFSMFRYSNWLDKに対して少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、1000アミノ酸長未満であるポリペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが、前記配列の1番目のアミノ酸に対応する位置にバリンもしくはロイシン、該配列の7番目のアミノ酸に対応する位置にチロシン、もしくは該配列の13番目のアミノ酸に対応する位置にリジンもしくはアルギニン、またはそれらの組合せを有する、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが、配列VFSMFRYSNWLDKと比較して、少なくとも1個のアミノ酸置換または欠失を有する、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが50アミノ酸未満である、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記アミノ酸配列が、配列VFSMFRYSNWLDKに対して少なくとも95％の同一性を有する、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
アミノ酸配列VFSMFRYSNWLDKを含む請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
VFSMFRYSNWLDKのアミノ酸配列からなる請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記ポリペプチドがカベオリン-1と相互作用することができる、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが可溶性である、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが実質的に純粋である、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
請求項３１に記載のポリペプチドおよび製薬上許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項４２】
(a)配列VFSMFRYSNWLDKに対して少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列および(b)異種配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４３】
(a)のアミノ酸配列が、配列VFSMFRYSNWLDKと少なくとも95％同一である、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
(a)のアミノ酸配列がVFSMFRYSNWLDKである、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが実質的に純粋である、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
請求項４２に記載のポリペプチドおよび製薬上許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項４７】
前記ポリペプチドがカベオリン-1と相互作用することができる、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
P-糖タンパク質の断片を含む可溶性ポリペプチドであって、該断片がカベオリン-1の一部に結合する、ポリペプチド。
【請求項４９】
カベオリン-1の前記一部がアミノ酸82-101を含む、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記ポリペプチドが実質的に純粋である、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
P-gpを介する排出を増加させるのに十分な量の請求項３１、４２、および４８のいずれか１項に記載のポリペプチドを投与することを含む、細胞中のP-gpを介する排出を増加させる方法。
【請求項５２】
前記細胞が患者中にある、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記患者が、新生物、神経疾患、薬物中毒、封入体筋炎、脳アミロイド血管症、アミロイドーシス、または眼疾患に罹患している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ポリペプチドを前記症状または疾患を治療するのに十分な量で投与する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記新生物が癌である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記癌が、白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、グリア芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫からなる群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記神経疾患が神経変性疾患である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、プリオン病、ウシ海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、レヴィー小体疾患、またはピック病である、請求項５８に記載の方法。
【請求項５９】
前記眼疾患が黄斑変性または緑内障である、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療用化合物、その使用、使用方法およびそれを含む組成物の分野に関する。本発明はまた、P-糖タンパク質基質の蓄積の結果生じる疾患の治療に関する。本発明はまた、細胞移動および／または血管新生に関連する疾患ならびに神経疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
ABC(ATP結合カセット)輸送因子スーパーファミリーのメンバーは、排出機能および／または障壁機能を有する多くの哺乳動物組織上で発現される。これらの輸送因子は、一方向基質転位に関与し、押出プロセスを活性化するエネルギー源としてATPを使用する。ABC輸送因子は、有害な物質から身体を防御する機構として発達したようである。
【０００３】
P-糖タンパク質(P-gp)は、ABC輸送因子であり、MDR1遺伝子の産物であり、肝臓、消化管、生殖腺、腎臓、胆管系、脳、および他の器官に認められる。P-糖タンパク質は、それが発現される器官および組織の構造的および機能的完全性を保護する排出ポンプである。P-糖タンパク質は細胞膜に、より具体的には、カベオラと呼ばれるコレステロールに富むマイクロドメイン中に局在する。カベオラは、シグナル伝達のプラットフォームとして作用し、カベオリン-1、-2、および-3などの特異的マーカーの存在により同定することができる。この特定の局在化は、P-gp ATPaseおよび輸送活性にとって重要であるようである。最近の研究は、2つのP-gp集団が、P-gpの近くの微小環境中の異なるコレステロール濃度により囲まれた細胞膜中に共存することを示している(Barakatら、Biochem. J. 388:563-571, 2005)。P-糖タンパク質は、多剤耐性に関連する。実際、P-gpは様々な抗癌剤と相互作用し、それがその細胞内濃度の低下をもたらし、最終的には化学療法の失敗をもたらす。また、P-糖タンパク質は神経疾患にも関連している。実際、限定されるものではないが、てんかん、アルツハイマー病およびハンチントン病などの神経障害は、ABC排出輸送因子またはその基質の過剰発現に関連する。その排出輸送活性とは別に、P-糖タンパク質は細胞移動および血管新生において役割を果たすことも知られている。
【０００４】
疾患におけるP-gp基質の関与を考えると、P-gp基質の蓄積を減少させ、細胞移動もしくは血管新生を阻害するか、または神経障害および他の疾患を治療することができる、P-gp機能を調節することを目的とする治療手法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００５】
第1の態様において、本発明は、配列DGIWKASFTTFTVTKYWFYRまたはVTKYWFYRまたは表1に記載のペプチドに対して少なくとも50％(例えば、少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、99％、もしくは100％)の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、170未満(例えば、150、125、100、75、50、40、30、25、20、15未満)のアミノ酸長である前記ポリペプチドを特徴とする。前記ポリペプチドは、P-糖タンパク質と相互作用する(例えば、特異的に結合する)ことができるであろう。特定の実施形態においては、DGIWKASFTTFTVTKYWFYRに対して配列同一性を有するポリペプチドは、その13番目のアミノ酸に対応する位置にバリンもしくはロイシンを有するか、16番目のアミノ酸に対応する位置にチロシンを有するか、もしくは20番目のアミノ酸に対応する位置にリジンもしくはアルギニンを有するか、またはそれらの任意の組合せを有する。前記ポリペプチドがVTKYWFYRに対して配列同一性を有する他の実施形態においては、該ポリペプチドはその1番目のアミノ酸に対応する位置にバリンもしくはロイシンを有するか、4番目のアミノ酸に対応する位置にチロシンを有するか、もしくは8番目のアミノ酸に対応する位置にリジンもしくはアルギニンを有するか、またはそれらの任意の組合せを有する。いくつかの実施形態においては、前記ポリペプチドは可溶性であるか、または該ポリペプチドは実質的に純粋である。本発明はまた、前記ポリペプチドおよび製薬上許容し得る担体を含む組成物を特徴とする。
【０００６】
本発明はまた、(a)配列DGIWKASFTTFTVTKYWFYRもしくはVTKYWFYRに対して少なくとも50％(例えば、少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、99％、もしくは100％)の同一性を有するアミノ酸配列および(b)異種配列(例えば、本明細書に記載の任意の配列)を含むポリペプチドを特徴とする。前記ポリペプチドは、P-糖タンパク質と相互作用する(例えば、特異的に結合する)ことができるであろう。いくつかの実施形態においては、前記ポリペプチドは可溶性であるか、または該ポリペプチドは実質的に純粋である。本発明はまた、前記ポリペプチドおよび製薬上許容し得る担体を含む組成物を特徴とする。
【０００７】
別の態様においては、本発明は、カベオリン-1の断片(例えば、本明細書に記載の任意の断片)を含む可溶性ポリペプチドであって、該断片がP-糖タンパク質の一部(例えば、P-糖タンパク質のアミノ酸36-47)に結合する(例えば、特異的に結合する)、ポリペプチドを特徴とする。本発明はまた、前記ポリペプチドおよび製薬上許容し得る担体を含む組成物を特徴とする。
【０００８】
別の態様においては、本発明は、配列VFSMFRYSNWLDKまたは表2に記載のペプチドに対して少なくとも50％(例えば、少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、99％、もしくは100％)の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、1000未満(例えば、750、500、250、200、150、100、90、75、60、50、40、35、30、25、または20未満)のアミノ酸長である前記ポリペプチドを特徴とする。前記ポリペプチドは、カベオリン-1と相互作用する(例えば、特異的に結合する)ことができる。特定の実施形態においては、前記ペプチドは、その1番目のアミノ酸に対応する位置にバリンもしくはロイシンを有するか、7番目のアミノ酸に対応する位置にチロシンを有するか、もしくは13番目のアミノ酸に対応する位置にリジンもしくはアルギニンを有するか、またはそれらの任意の組合せを有する。いくつかの実施形態においては、前記ポリペプチドは可溶性であるか、または該ポリペプチドは実質的に純粋である。本発明はまた、前記ポリペプチドおよび製薬上許容し得る担体を含む組成物を特徴とする。
【０００９】
別の態様においては、本発明は、(a)配列VFSMFRYSNWLDKに対して少なくとも50％(例えば、少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、99％、もしくは100％)の同一性を有するアミノ酸配列および(b)異種配列(例えば、本明細書に記載の任意の配列)を含むポリペプチドを特徴とする。前記ポリペプチドは、カベオリン-1と相互作用する(例えば、特異的に結合する)ことができるであろう。いくつかの実施形態においては、前記ポリペプチドは可溶性であるか、または該ポリペプチドは実質的に純粋である。本発明はまた、前記ポリペプチドおよび製薬上許容し得る担体を含む組成物を特徴とする。
【００１０】
別の態様においては、本発明は、P-糖タンパク質の断片を含む可溶性ポリペプチドであって、該断片がカベオリン-1の一部(例えば、アミノ酸82-101)に結合する、ポリペプチドを特徴とする。いくつかの実施形態においては、前記ポリペプチドは可溶性であるか、または該ポリペプチドは実質的に純粋である。本発明はまた、前記ポリペプチドおよび製薬上許容し得る担体を含む組成物を特徴とする。
【００１１】
上記態様のいずれかにおいては、前記ポリペプチドは、少なくとも1個のアミノ酸置換または欠失(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上のアミノ酸置換または欠失)により、野生型ヒトカベオリン-1またはヒトP-gpに対応する配列とは異なってもよい。上記態様のいずれかにおいて、前記ポリペプチドは、非天然アミノ酸置換(例えば、本明細書に記載のもの)を含んでもよく、本明細書に記載のものなどのペプチド模倣物質を含んでもよい。特定の実施形態においては、置換または欠失を有するポリペプチドは、増加(例えば、少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、100％、200％、500％、1000％、5000％、10,000％、50,000％)した活性(例えば、P-gp排出活性、カベオリン-1もしくはP-gpへのより強い結合)を有してもよい。特定の実施形態においては、置換または欠失を有するポリペプチドは、対応する野生型配列を有するポリペプチドと比較して、血管新生の減少、または細胞移動の減少(例えば、少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、80％、90％、95％、もしくは99％)を示す。
【００１２】
別の態様においては、本発明は、細胞における(例えば、患者における)P-gpを介する排出を増加させる方法であって、P-gpを介する排出を増加させるのに十分な量の、前記態様のいずれかのポリペプチドを投与することを含む前記方法を特徴とする。特定の実施形態においては、前記細胞は、患者中のものである。患者は、新生物(例えば、癌)または神経疾患に罹患していてもよく、前記ポリペプチドを、該新生物または神経疾患を治療するのに十分な量で投与することができる。新生物は、白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、グリア芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫からなる群より選択される癌であってよい。神経疾患は、神経変性疾患であってよく、同様に、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、プリオン病、ウシ海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、レヴィー小体疾患、またはピック病であってよい。他の実施形態においては、患者は、薬物中毒(例えば、過剰摂取)、封入体筋炎、脳アミロイド血管症、アミロイドーシス(例えば、AA-型)、および眼疾患(例えば、黄斑変性および緑内障)からなる群より選択される疾患または症状に罹患している。
【００１３】
「断片」とは、少なくとも4、5、6、7、8、10、15、20、25、40、50、60、75、90、100、125、150、200、250、300、500、750、または1000個のアミノ酸からなる、完全長ポリペプチド配列の一部を意味する。
【００１４】
「特異的に結合する」または「特異的結合」とは、所望のポリペプチドを認識し、これに結合するが、サンプル、例えば、生物学的サンプル中の他の分子を実質的に認識せず、これに結合しない化合物(例えば、ポリペプチド)または抗体を意味する。結合は、少なくとも1000μmol、100μmol、10μmol、1μmol、100 nm、10 nm、1 nm、100 pmol、10 pmol、または1 pmolの解離定数で起こり得る。
【００１５】
「実質的に純粋」とは、それに天然に不随する成分から分離された核酸、ポリペプチド、または他の分子を意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが天然に結合するタンパク質および天然の有機分子を、少なくとも30重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、80重量％、90重量％、95重量％、またはさらに99重量％含まない場合、実質的に純粋である。例えば、実質的に純粋なポリペプチドを、天然の起源からの抽出により、通常はそのタンパク質を発現しない細胞中での組換え核酸の発現により、または化学的合成により取得することができる。
【００１６】
遺伝子またはタンパク質の発現または活性のレベルにおける「減少」とは、細胞、細胞抽出物、または細胞上清におけるタンパク質または核酸のレベルまたは活性における低下を意味する。例えば、そのような減少は、外来性化合物RNA安定性、転写、もしくは翻訳による阻害、タンパク質分解の増加、またはRNA干渉に起因するものであってよい。好ましくは、この減少は、対照条件下で発現または活性のレベルの少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、80％、またはさらに90％である。この減少を、表現型応答における変化を測定することによりアッセイすることができる。いくつかの実施形態においては、この減少を、例えば、本明細書に記載のアッセイを用いて、血管新生または細胞移動における変化を測定することにより同定することができる。
【００１７】
遺伝子またはタンパク質の発現または活性における「増加」とは、細胞、細胞抽出物、または細胞上清におけるタンパク質または核酸のレベルまたは活性における正の変化を意味する。例えば、そのような増加は、阻害剤の競合的阻害、RNA安定性、転写、もしくは翻訳の増加、またはタンパク質分解の減少に起因するものであってよい。好ましくは、この増加は、対照条件下での発現または活性のレベルを、少なくとも5％、10％、25％、50％、75％、80％、100％、200％、またはさらに500％以上超えるものである。この増加を、表現型応答の変化を測定することによりアッセイすることができる。いくつかの実施形態においては、この増加を、例えば、本明細書に記載のアッセイを用いて、血管新生または細胞移動における変化を測定することにより同定することができる。
【００１８】
「患者」とは、ヒトまたは非ヒト動物(例えば、哺乳動物)を意味する。
【００１９】
被験体における疾患もしくは症状を「治療すること」または疾患もしくは症状を有する患者を「治療すること」とは、疾患もしくは症状の少なくとも1種の徴候が減少し、安定化するか、または防止されるように、個体を、薬学的処理、例えば、薬剤の投与にかけることを指す。
【００２０】
「可溶性」とは、生理学的条件下で水性溶液中で可溶性であることを意味する。
【００２１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図1Aおよび1Bは、時間に対する(図1A)または漸増するpepPgpもしくはpepCav濃度を用いた(図1B)、例示的pepPgpペプチド(VFSMFRYSNWLDK)もしくは例示的pepCavペプチド(DGIWKASFTTFTVTKYWFYR)を用いる処理の際の細胞におけるビンブラスチン蓄積の減少を示すグラフである。
【図２】図2はpepCavまたはpepPgpを用いる処理の際に脳に進入するTAXOLの減少を示すグラフである。
【図３】図3Aは細胞へのpepCavまたはpepPgpの投与の際の細胞移動の減少を示す顕微鏡写真のセットである。図3Bは、pepPgpまたはpepCavの投与の際のMDR1を過剰発現するMDCK細胞の移動の減少を示す一対のグラフである。
【図４Ａ】図4AはHUVEC細胞へのpepCavまたはpepPgpの投与の際の管(毛細血管)形成の減少を示す顕微鏡写真およびグラフである。この投与は、キャピラリー様構造の形成を、それぞれ75％および40％低下させた。
【図４Ｂ】図4BはMatrigelプラグアッセイを用いる管の減少を示す顕微鏡写真およびグラフである。このグラフは、毛細血管形成の尺度である、プラグ中の測定されたヘモグロビン含量を示す。PepCavおよびPepPgpは、対照(bFGFのみ)と比較して、ヘモグロビン含量を、それぞれ25％および40％低下させた。
【図５】図5はヒトカベオリン-1およびヒトP-糖タンパク質のアミノ酸配列を示し、結合領域を太字で示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
P-糖タンパク質は、細胞から多くの異なる分子を輸送することができる膜タンパク質である。別の膜タンパク質であるカベオリン-1は、P-gpと相互作用することができ、P-gp排出活性を阻害する。本発明者らは初めて、カベオリン-1/P-gp相互作用を遮断し(例えば、競合的阻害を介して)、P-gpの排出活性を増加させることができるカベオリン-1およびP-gpのそれぞれから得られるペプチド(例えば、pepCavおよびpepPgp)を同定した。従って、本発明のポリペプチドは、P-gp排出の増加が望ましい疾患(例えば、本明細書に記載のものなどの神経疾患および新生物)の治療において有用でありうる。さらに、本発明者らは、これらのペプチドの投与が細胞移動および血管新生を低下させ、かくして、癌などの新生物の治療におけるこれらのペプチドの使用を示唆することを示した。
【００２４】
カベオリン-1
カベオリン-1は、カベオリン-1、-2、および-3を含む、カベオリンファミリーのタンパク質のうちの178アミノ酸のメンバーである。典型的には、これらのタンパク質は、多くの細胞型に認められる膜陥入である、カベオラに認められる。カベオラは、エンドサイトーシスに関与する。カベオリン-1は、P-gp(Jodoinら、J. Neurochem. 87:1010-1023, 2003)などの多くのタンパク質と相互作用する(例えば、参照により本明細書に組み入れられるものとするRazaniら、Pharmacol. Rev. 54:431-467, 2002の表2を参照)。また、カベオリン-1は、膜輸送、脂質トラフィッキング、およびシグナル伝達にも関与する。カベオリン-1は、細胞中でホモオリゴマーも形成する。カベオリン-1は、P-gpに結合することができる(Demeuleら、Vascul. Pharmacol. 38:339-348, 2002)足場ドメイン(アミノ酸残基82-101)を含む。カベオリン-1の足場ドメインは、多数のタンパク質との相互作用に関与し、eNOS、タンパク質キナーゼC、および上皮増殖因子受容体などの、カベオラに局在化するいくつかのシグナリング分子を負に調節することが示された(Okamotoら、J. Biol. Chem. 273:5419-5422, 1998)。これと対照的に、カベオリン-1とインスリン受容体との相互作用は、下流の標的のインスリンにより刺激されるリン酸化を増加させる(Yamamotoら、J. Biol. Chem. 273:26962-26968, 1998)。
【００２５】
P-糖タンパク質
P-糖タンパク質(P-gp)は、ATP結合カセット(ABC)輸送因子の1280アミノ酸のメンバーであり、細胞から化合物を輸送することができる。P-gpは、MDR1遺伝子によりコードされる。そしてこの遺伝子の発現は、多剤耐性癌と関連している。実際、P-gpは、化学療法剤などの様々な薬剤を細胞の外へ輸送することができる。
【００２６】
P-糖タンパク質基質は、内因性および／または外来性物質であってよい。これらの基質は、抗癌剤、免疫抑制剤、HIVプロテアーゼ阻害剤、生物活性ポリペプチド、心臓病薬、毒性ペプチド、およびサイトカインを包含する。P-gp基質の具体例としては、β-アミロイド、タキソール、タキソール誘導体、シクロスポリンA、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、シクロホスファミド、タキソテール、メルファラン、クロラムブシル、製薬上許容し得る塩およびその組合せならびに、特に、Turcotteら、「The Blood-Brain Barrier: Roles of the Multidrug Resistance Transporter P-glycoprotein. Chapter 19 in Blood-Brain Interfaces: From Ontogeny to Artificial Interfaces.」、R. Dermietzel、D. C. SprayおよびM. Nedergaard(編)、Wiley-VCH, Weinheim, pp. 431-461, 2006により記載された別のもののうちのP-糖タンパク質基質でありうる、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、アントラサイクリン、およびタキサンなどの抗癌剤が挙げられる。
【００２７】
P-gp活性は、新生物および神経障害などの多くの疾患状態と関連付けられている。ここで、本発明者らは、P-gp活性の阻害が、血管新生および細胞移動の減少をもたらすことを示す(例えば、本明細書の実施例を参照)。さらに、P-gpにおける多型性は、パーキンソン病(PD)と関連している(Furunoら、Pharmacogenetics 2:529-534, 2002)。P-gp発現は癌細胞における薬剤耐性と相関するが、P-gp発現は、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)などの神経疾患において下方調節される(Vogelgesangら、Acta. Neuropathol. (Berl.) 111:436-443, 2006)。神経疾患におけるP-gpの関与のさらなる証拠は、脳から外へアミロイド-βペプチドを輸送するその能力により示される(Lamら、J. Neurochem. 76:1121-1128, 2001)。従って、血液脳関門でのP-gpの発現または活性の低下を、神経疾患の発生と相関させることができ、P-gp活性の増加は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン病、プリオン病、ウシ海綿状脳症(BSE)、CJD、レヴィー小体疾患、およびピック病などの神経変性疾患を治療するのに有用でありうる。
【００２８】
P-gpは、カベオリンの足場ドメインに結合する共通カベオリン結合モチーフを含む。3個の関連するカベオリン結合モチーフとしては、ΦXΦXXXXΦ、ΦXXXXΦXXΦおよびΦXΦXXXXΦXXΦ(式中、Φはフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンであり、Xは任意のアミノ酸である)が挙げられる。
【００２９】
共通結合ドメイン
例示的な配列は、カベオリン-1上に局在化するコレステロール結合配列：
2010506860.tif 000002
に由来する。P-gpタンパク質に由来する例示的配列は、
2010506860.tif 000003
であるP-gpコレステロール結合配列である。これらの例示的配列は両方とも、コレステロール結合共通モチーフ：
L/V-A2-Y-A3-K/R
(式中、A2およびA3はそれぞれ独立に、1〜5個のアミノ酸である)
に合致する。このアミノ酸は、任意の天然アミノ酸(例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン)または任意の修飾された、もしくは非天然のアミノ酸(例えば、本明細書に記載のもの)であってよい。
【００３０】
従って、本発明のペプチドは式：
A1-L/V-A2-Y-A3-K/R-A4
を有し、P-糖タンパク質排出、輸送活性を刺激することができるか、または細胞移動および／もしくは血管新生を阻害することができる。A1は存在しないか、もしくは1〜約19個のアミノ酸のアミノ酸配列であってよく；A2は1〜5個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり；A3は1〜5個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、A4は存在しないか、もしくは1〜約19個のアミノ酸のアミノ酸配列であってよい。各アミノ酸は、任意のアミノ酸(例えば、本明細書に記載のもののいずれか)であってよい。
【００３１】
カベオリン-1断片
本発明者らは、P-gp排出活性を増強させることができるものとして、カベオリン-1配列に由来する例示的な断片DGIWKASFTTFTVTKYWFYRおよびVTKYWFYRを同定した。これに基づいて、本発明は、これらの断片を含むポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、カベオリン-1配列の断片に対して少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。好ましいポリペプチドは、生理的条件下で可溶性であるか、またはP-糖タンパク質に結合し、その排出活性を増加させることができる。例示的な断片を表1に示す。特定の実施形態においては、前記ポリペプチドは、断片DGIWKASFTTFTVTKYWFYRもしくはVTKYWFYR、またはそれらの一部(例えば、表1を参照)を含む。本発明のポリペプチドはまた、カベオリン-1配列のさらなる部分(例えば、断片のN末端、断片のC末端、またはその両方の、少なくとも1、2、3、4、6、7、10、15、20、25、30、40、50、60、75、90、100個の追加アミノ酸)を含んでもよい。本発明のポリペプチドはまた、異種配列(例えば、本明細書に記載のもの)を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、本発明のポリペプチドは、P-gp断片のタンデムリピート(例えば、少なくとも2、3、5、8、10、または15個のリピート)を含んでもよい。
【表１】
2010506860.tif 000004
【００３２】
欠失分析を用いて、P-gpとの相互作用に必要とされるか、またはP-gpを介する排出を増加させるのに必要とされる最小のペプチド配列を決定することができる。DGIWKASFTTFTVTKYWFYR断片の欠失断片(例えば、N末端、C末端、またはその組合せから欠失された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16個のアミノ酸を有するもの)を、当業界で公知の分子生物学的方法を用いて作製し、P-gpへの結合またはP-gp活性の増加についてアッセイすることができる(例えば、以下に記載の方法を参照)。
【００３３】
P-糖タンパク質断片
本発明者らは、カベオリン-1に結合し、P-gp排出活性を増強させることができるものとして、P-gp配列(アミノ酸36-48)に由来する例示的断片VFSMFRYSNWLDKを同定した。これに基づいて、本発明は、これらの断片を含むポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、P-gp配列の断片(例えば、本明細書に記載の断片)に対して少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。好ましいポリペプチドは、生理的条件下で可溶性であり、カベオリン-1に結合することができるか、またはP-gp排出活性を増加させることができる。例示的断片を表2に示す。特定の実施形態においては、前記ポリペプチドは、断片VFSMFRYSNWLDK、またはその一部(例えば、表2を参照)を含む。本発明のポリペプチドはまた、P-gp配列の追加部分(例えば、該断片のN末端、該断片のC末端、またはその両方の少なくとも1、2、3、4、6、7、10、15、20、25、30、40、50、60、75、90、100、200、300、400、500、または600個の追加のアミノ酸)を含んでもよい。本発明のポリペプチドはまた、異種配列(例えば、本明細書に記載のもの)を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、本発明のポリペプチドは、P-gp断片のタンデムリピート(例えば、少なくとも2、3、5、8、10、または15個のリピート)を含んでもよい。
【表２】
2010506860.tif 000005
【００３４】
カベオリン-1断片に関して、欠失分析を用いて、P-gp断片とカベオリン-1との相互作用に必要とされる最小のペプチド配列またはP-gpを介する排出を増加させるのに必要とされる最小のペプチド配列を決定することもできる(例えば、本明細書に記載のアッセイを用いて)。VFSMFRYSNWLDK断片の欠失断片(例えば、N末端、C末端、またはその組合せから誘導された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、または16個のアミノ酸を有する)を、当業界で公知の分子生物学的方法を用いて作製し、カベオリン-1への結合についてアッセイするか、またはP-gp活性の増加についてアッセイすることができる(例えば、以下に記載の方法を参照)。
【００３５】
融合タンパク質
本発明のポリペプチドは、融合タンパク質(例えば、カベオリン-1またはP-gpの断片と異種配列)を含む。融合タンパク質のカベオリン-1またはP-gp部分は可溶性である(例えば、膜貫通ドメインを欠く)か、またはカベオリン-1もしくはP-gpの任意の機能的断片(例えば、P-gpの排出活性を調節することができる断片)であってよい。融合タンパク質のカベオリン-1またはP-gp部分は、完全長カベオリン-1またはP-gpタンパク質(例えば、ヒトタンパク質)の少なくとも一部(例えば、本明細書に記載の任意の部分)と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、または100％同一であってよい。
【００３６】
カベオリン-1またはP-gp断片を、そのN末端またはC末端で1個以上の融合パートナーに融合することができる。特定の実施形態においては、融合パートナーの1つは、Fcタンパク質(例えば、マウスFcまたはヒトFc)である。他の実施形態においては、異種配列は、精製または検出タグ、例えば、緑色蛍光タンパク質、ヘマグルチニン、もしくはアルカリホスファターゼなどの直接的もしくは間接的に検出することができるタンパク質、DNA結合ドメイン(例えば、GAL4もしくはLexA)、遺伝子活性化ドメイン(例えば、GAL4もしくはVP16)、精製タグ、または分泌シグナルペプチド(例えば、プレプロトリプシンシグナル配列)であってよい。他の実施形態においては、融合パートナーは、c-myc、ポリヒスチジン、またはFLAGなどのタグであってよい。それぞれの融合パートナーは、1個以上のドメイン、例えば、プレプロトリプシンシグナル配列およびFLAGタグを含んでもよい。
【００３７】
融合タンパク質は、NまたはC末端のいずれか(例えば、1〜10、1〜11、1〜12、1〜13、1〜14、1〜15、1〜16、1〜17、1〜18、および1〜19アミノ酸)に、さらなるアミノ酸残基(例えば、少なくとも1、2、3、4、5、8、10、12、15、20、25、40、50、75、100個)を含んでもよい。
【００３８】
ペプチド修飾
修飾を有するペプチドを、本発明において用いることができる。そのような修飾としては、元のポリペプチドの生物学的活性を維持するか、もしくは増加するか、または本発明の化合物の1種以上の特定性(例えば、安定性、生物学的利用能など)を最大化するものが挙げられる。本発明のポリペプチドは、例えば、翻訳後プロセッシングなどの天然プロセス、または当業界で公知である化学的修飾技術により修飾されたアミノ酸を含んでもよい。修飾は、ポリペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端などのポリペプチド中の任意の場所で行うことができる。同じ型の修飾が、所与のポリペプチド中のいくつかの部位で同じか、または変化する程度で存在してもよいことが理解されるであろう。また、所与のポリペプチドは、多くの型の修飾を含んでもよい。ポリペプチドを、ユビキチン化の結果として分枝化することができ、それらは、分枝鎖を含むか、または含まない環式のものであってもよい。環式、分枝状、および分枝状環式ポリペプチドは翻訳後の天然プロセスの結果生じるものであるか、または合成方法により作製することができる。他の修飾としては、例えば、PEG化、アセチル化、アシル化、アセトミドメチル(Acm)基の付加、ADP-リボシル化、アルキル化、アミド化、ビオチニル化、カルバモイル化、カルボキシエチル化、エステル化、フラビンの共有結合、ヘム部分への共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、薬剤の共有結合、マーカー(例えば、蛍光もしくは放射活性)の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質溶解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化およびユビキチン化などのタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介性付加が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドは、2個以上の修飾を含んでもよい。
【００３９】
本発明のポリペプチドはまた、非天然アミノ酸の置換を含んでもよい。非天然アミノ酸は、本明細書では、哺乳動物においては天然に産生されないか、または認められないアミノ酸と理解されるべきである。非天然アミノ酸としては、D-アミノ酸、システインの硫黄原子に結合したアセチルアミノメチル基を有するアミノ酸、PEG化アミノ酸が挙げられる。また、非天然アミノ酸としては、nが2〜6である、式NH2(CH2)nCOOHのωアミノ酸、サルコシン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン、ノルロイシン、およびフェニルグリシン(例えば、Trp、TyrまたはPheに対する置換)も挙げられる。他のアミノ酸としては、シトルリン、メチオニンスルホキシド、システイン酸、オルニチン、ヒドロキシプロリン(例えば、プロリンの代わり)が挙げられる。
【００４０】
ペプチド誘導体およびペプチド模倣体の調製
天然アミノ酸のみからなるペプチドに加えて、ペプチド模倣体またはペプチド類似体も本発明により包含される。一般的には、ペプチド類似体は、鋳型ペプチドのものと類似する特性を有する非ペプチド薬剤として製薬業界で用いられている。非ペプチド化合物を、「ペプチド模倣物質」またはペプチド模倣体(peptidemimetics)と呼ぶ(Fauchereら、Infect. Immun. 54: 283-287, 1986; Evansら、J. Med. Chem. 30:1229-1239, 1987)。治療上有用なペプチドに構造的に関連するペプチド模倣物質を用いて、等価な、または増強された治療もしくは予防効果を製造することができる。一般的には、ペプチド模倣体は、天然の受容体-結合ポリペプチドなどの規範(paradigm)ポリペプチド(すなわち、生物学的または薬学的活性を有するポリペプチド)と構造的に類似するが、必要に応じて、当業界でよく知られる方法(Spatola, Peptide Backbone Modifications, Vega Data, 1(3):267, 1983); Spatolaら(Life Sci. 38:1243-1249, 1986); Hudsonら(Int. J. Pept. Res. 14:177-185, 1979);およびWeinstein. B., 1983, Chemistry and Biochemistry, of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weinstein(編) Marcel Dekker, New-York)により、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2、-CH=CH-(シスおよびトランス)、-CH2SO、-CH(OH)CH2、-COCH2-などの連結によって置換された1個以上のペプチドを有する。そのようなペプチド模倣物質は、より経済的な産生、より大きい化学的安定性、増強された薬学的特性(例えば、半減期、吸光度、有効性、効率)、低下した抗原性などの、天然ポリペプチドを超える有意な利点を有しうる。
【００４１】
ペプチドはin vitroでのP-gpを介する排出において有効であるが、in vivoでのその有効性は、プロテアーゼの存在により低下し得る。血清プロテアーゼは特定の基質要件を有する。この基質は、L-アミノ酸と切断のためのペプチド結合の両方を有する必要がある。さらに、血清中のプロテアーゼ活性の最も著名な成分であるエキソペプチダーゼは通常、ペプチドの第1のペプチド結合に対して作用し、遊離のN末端を必要とする(Powellら、Pharm. Res. 10: 1268-1273, 1993)。これに照らせば、修飾された型のペプチドを使用することが有利であることが多い。修飾されたペプチドは、元のL-アミノ酸ペプチドの構造的特徴を保持し、IGF-1に関して生物学的活性を付与するが、有利には、プロテアーゼおよび／またはエキソペプチダーゼによる切断を容易に受けやすい。
【００４２】
同じ型のD-アミノ酸を有する共通配列の1個以上のアミノ酸の体系的な置換(例えば、L-リジンの代わりにD-リジン)を用いて、より安定なペプチドを作製することができる。かくして、本発明のペプチド誘導体またはペプチド模倣体は、全てL、全てDまたは混合されたD、Lペプチドであってよい。N末端またはC末端D-アミノ酸の存在は、ペプチダーゼは基質としてD-アミノ酸を用いることができないため、ペプチドのin vivoでの安定性を増加させる(Powellら、Pharm. Res. 10:1268-1273, 1993)。逆Dペプチドは、L-アミノ酸を含むペプチドと比較して逆配列に配置された、D-アミノ酸を含むペプチドである。かくして、L-アミノ酸ペプチドのC末端残基は、D-アミノ酸のN末端になるなどである。逆D-ペプチドは、L-アミノ酸ペプチドと同じ三次コンフォメーション、従って同じ活性を保持するが、in vitroおよびin vivoでの酵素的分解に対してより安定であり、かくして、元のペプチドよりも大きい治療効力を有する(BradyおよびDodson, Nature 368:692-693, 1994; Jamesonら、Nature 368:744-746, 1994)。逆D-ペプチドに加えて、共通配列または実質的に同一の共通配列変化を含む拘束されたペプチドを、当業界でよく知られる方法により作製することができる(RizoおよびGierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387-418, 1992)。例えば、拘束されたペプチドを、ジスルフィド架橋を形成し、それによって、環式ペプチドをもたらすことができるシステイン残基を付加することにより作製することができる。環式ペプチドは、遊離のNまたはC末端を有さない。従って、それらはエキソペプチダーゼによるタンパク質溶解を受けにくいが、それらは勿論、ペプチド末端で切断しないエンドペプチダーゼを受けやすい。N末端もしくはC末端のD-アミノ酸を有するペプチドおよび環式ペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ、N末端もしくはC末端のD-アミノ酸残基の存在、またはその環式構造について以外は一致するペプチドの配列と通常は同一である。
【００４３】
分子内ジスルフィド結合を含む環式誘導体を、アミノおよびカルボキシ末端などの環化のために選択された位置に好適なS-保護されたシステインまたはホモシステイン残基を組込みながら、従来の固相合成により調製することができる(Sahら、J. Pharm. Pharmacol. 48:197, 1996)。鎖集合の完了後、(1)対応する2個の遊離SH官能基の結果として生じる支持体上での酸化を用いてS保護基を選択的除去し、S-S結合を形成させた後、支持体から生成物を従来通り除去し、好適な精製手段を用いることにより、または(2)完全な側鎖脱保護と共に支持体からペプチドを除去した後、高度に希釈した水性溶液中で遊離のSH官能基を酸化することにより、環化を行うことができる。
【００４４】
分子内アミド結合を含む環式誘導体を、環化のために選択された位置に、好適なアミノおよびカルボキシル側鎖保護アミノ酸誘導体を組込みながら、従来の固相合成により調製することができる。分子内-S-アルキル結合を含む環式誘導体を、環化のために選択された位置に、好適なアミノ保護側鎖を有するアミノ酸残基、および好適なS-保護システインまたはホモシステイン残基を組込みながら、従来の固相化学により調製することができる。
【００４５】
ペプチドのN末端またはC末端残基に対して作用するペプチダーゼに対する耐性を付与するための別の有効な手段は、修飾されたペプチドが最早ペプチダーゼのための基質ではなくなるように、ペプチド末端に化学基を付加することである。1つのそのような化学的修飾は、いずれか、または両方の末端でのペプチドのグリコシル化である。特定の化学的修飾、特に、N末端グリコシル化は、ヒト血清中でのペプチドの安定性を増加させることが示された(Powellら、Pharm. Res. 10: 1268-1273, 1993)。血清安定性を増加させる他の化学的修飾としては、限定されるものではないが、アセチル基などの、1〜12個の炭素の低級アルキルからなるN末端アルキル基の付加、および／またはC末端アミドもしくは置換アミド基の付加が挙げられる。特に、本発明は、N末端アセチル基および／またはC末端アミド基を担持するペプチドからなる修飾されたペプチドを含む。
【００４６】
また、誘導体がペプチドの所望の機能的活性を保持するという条件で、通常は該ペプチドの一部ではないさらなる化学的部分を含む他の型のペプチド誘導体も、本発明に含まれる。そのような誘導体の例としては、(1)アミノ末端またはアシル基がアルカノイル基(例えば、アセチル、ヘキサノイル、オクタノイル)、アロイル基(例えば、ベンゾイル)もしくはF-moc(フルオレニルメチル-O-CO-)などのブロッキング基であってよい、別の遊離アミノ基のN-アシル誘導体；(2)カルボキシ末端または別の遊離カルボキシもしくはヒドロキシル基のエステル；(3)カルボキシ末端またはアンモニアもしくは好適なアミンとの反応により生成される別の遊離カルボキシル基のアミド；(4)リン酸化誘導体；(5)抗体または他の生物学的リガンドにコンジュゲートされた誘導体および他の型の誘導体が挙げられる。
【００４７】
本発明のペプチドへのさらなるアミノ酸残基の付加の結果生じるより長いペプチド配列も、本発明に包含される。そのようなより長いペプチド配列は、上記ペプチドと同じ生物学的活性(例えば、P-gpへの結合およびP-gpを介する排出の刺激)を有すると期待される。実質的な数のさらなるアミノ酸を有するペプチドは排除されないが、いくつかの大きいポリペプチドが有効な配列をマスクする配置を取り、それによって、標的(例えば、カベオリン-1またはP-gp)への結合を防止することができると認識される。これらの誘導体は、競合的アンタゴニストとして作用し得る。かくして、本発明は、伸長を有する本明細書に記載のペプチドまたはペプチドの誘導体を包含するが、望ましくは、この伸長は該ペプチドまたは誘導体のP-gp排出刺激活性を破壊しない。
【００４８】
本発明に含まれる他の誘導体は、アラニン残基の短いストレッチ、もしくはタンパク質溶解のための推定部位(例えば、カテプシンによる、例えば、米国特許第5,126,249号および欧州特許第495049号を参照)などにより、直接的に、またはスペーサーを介して互いに共有結合された、2個の同じか、または2個の異なる本発明のペプチドからなる二重ペプチドである。本発明のペプチドのマルチマーは、同じか、もしくは異なるペプチドまたはその誘導体から形成される分子のポリマーからなる。
【００４９】
本発明はまた、本明細書に記載のペプチドを含むキメラもしくは融合タンパク質であるペプチド誘導体、またはそのアミノもしくはカルボキシ末端、またはその両方で、異なるタンパク質のアミノ酸配列に連結された、その断片も包含する。そのようなキメラまたは融合タンパク質を、該タンパク質をコードする核酸の組換え発現により製造することができる。例えば、キメラまたは融合タンパク質は、本発明のペプチドの少なくとも6個のアミノ酸を含んでもよく、望ましくは、本発明のペプチドと等価な、またはそれより高い機能的活性を有する。
【００５０】
本発明のペプチド誘導体を、アミノ酸残基の置換、付加、もしくは欠失によりアミノ酸配列を変化させて、必要に応じて、機能的に等価な分子、または機能的に増強されるか、もしくは減少した分子を提供することにより作製することができる。本発明の誘導体としては、限定されるものではないが、一次アミノ酸配列として、機能的に等価なアミノ酸残基の置換を含む変化した配列などの本明細書に記載のペプチド(例えば、VEGFRペプチド2.1、2.2、もしくは2.3、またはAPG-201、APG-202、APG-203、APG-204、APG-205、もしくはAPG-206ペプチド、またはAPI-101、API-103、もしくはAPI-106ペプチド、またはAPI-401、API-402、API-403、API-404、もしくはAPI-405ペプチド)のアミノ酸配列の全部または一部を含むものが挙げられる。例えば、前記配列内の1個以上のアミノ酸残基を、サイレントな変化をもたらす、機能的等価物として働く類似する極性の別のアミノ酸により置換することができる。該配列内のアミノ酸の置換を、該アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、正に荷電した(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。非極性(疎水性)アミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。非荷電極性アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。負に荷電した(酸性)アミノ酸としては、グルタミン酸およびアスパラギン酸が挙げられる。アミノ酸グリシンは、非極性アミノ酸ファミリーまたは非荷電(中性)極性アミノ酸ファミリーに含まれる。アミノ酸のファミリー内で作製される置換は、一般的には、保存的置換であると理解される。
【００５１】
ペプチド模倣体を同定するためのアッセイ
上記のように、本発明の方法により同定されたペプチドの主鎖幾何学および薬理作用基展示(ペプチド模倣体)を置換するために作製された非ペプチジル化合物は、より高い代謝活性、より高い効力、より長い作用時間およびより良好な生物学的利用能の属性を有することが多い。
【００５２】
本発明のペプチド模倣化合物を、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相もしくは液相ライブラリー；解析を要する合成ライブラリー方法；「1ビーズ1化合物」ライブラリー方法；および親和性クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー方法などの、当業界で公知の組合せライブラリー方法におけるいくつかの手法のいずれかを用いて取得することができる。生物学的ライブラリー手法はペプチドライブラリーに限定されるが、他の4つの手法はペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である(Lam, Anticancer Drug Des. 12:145, 1997)。分子ライブラリーの合成のための方法の例を、当業界で、例えば、DeWittら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909, 1993); Erbら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422, 1994); Zuckermannら、J. Med. Chem. 37:2678, 1994); Choら(Science 261:1303, 1993); Carellら(Angew. Chem, Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994および同書の2061);ならびにGallopら(Med. Chem. 37:1233, 1994)に見出すことができる。化合物のライブラリーを、溶液中で(例えば、Houghten, Biotechniques 13:412-421, 1992)またはビーズ(Lam, Nature 354:82-84, 1991)、チップ (Fodor, Nature 364:555-556, 1993)、細菌もしくはスポア(米国特許第5,223,409号)、プラスミド(Cullら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869, 1992)上で、またはファージ上で(ScottおよびSmith, Science 249:386-390, 1990)、またはルシフェラーゼ、および好適な基質の生成物への変換の決定により検出される酵素標識中に提供することができる。
【００５３】
一度、本発明のペプチドが同定されたら、それを、限定されるものではないが、示差的溶解性(例えば、沈降)、遠心分離、クロマトグラフィー(例えば、親和性、イオン交換、サイズ排除など)などの任意の数の標準的な方法により、またはペプチド、ペプチド模倣体もしくはタンパク質の精製に用いられる任意の他の標準的な技術により単離および精製することができる。目的の同定されたペプチドの機能的特性を、当業界で公知の任意の機能的アッセイを用いて評価することができる。望ましくは、細胞内シグナリングにおいて下流の受容体機能を評価するためのアッセイを用いる(例えば、細胞増殖)。
【００５４】
例えば、本発明のペプチド模倣化合物を、以下の3相のプロセス：(1)本発明のペプチドを走査して、カベオリン-1もしくはP-gpに対する認識および活性にとって必要な二次構造の領域を同定すること；(2)立体構造が拘束されたジペプチド代替物を用いて、主鎖幾何学を精緻化し、これらの代替物に対応する有機基本骨格を提供すること；ならびに(3)最良の有機基本骨格を用いて、天然ペプチドの所望の活性を模倣するように設計された候補のライブラリー中に有機薬理活性基を提示することを用いて取得することができる。より詳細には、3相は以下の通りである。第1相においては、リード候補ペプチドを走査し、その構造を簡略化して、その活性に関する必要条件を同定する。元のものの一連のペプチド類似体を合成する。第2相においては、最良のペプチド類似体を、立体構造が拘束されたジペプチド代替物を用いて調べる。インドリジジン-2-オン、インドリジジン-9-オンおよびキノリジジノンアミノ酸(それぞれ、I2aa、I9aaおよびQaa)を、最良のペプチド候補の主鎖幾何学を研究するための基本骨格として用いる。これらの、および関連する基本骨格(Halabら、Biopolymers 55:101-122, 2000; およびHanessianら、Tetrahedron 53:12789-12854, 1997)を、薬理活性基を異なる方向に向けるためにペプチドの特定領域に導入することができる。これらの類似体の生物学的評価は、活性のための幾何学的必要条件を模倣する改善されたリードペプチドを同定する。第3相においては、最も活性なリードペプチドに由来する基本骨格を用いて、天然ペプチドの活性を担う薬理活性基の有機代替物を提示する。薬理活性基と足場を、並行合成形式において組み合わせる。ペプチドの誘導体化および上記相は、当業界で公知の方法を用いて他の手段により達成することができる。
【００５５】
本発明のペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド模倣体または他の小分子から決定された構造機能関係を用いて、類似するか、またはより良好な特性を有する類似分子構造を精製および調製することができる。従って、本発明の化合物はまた、本明細書に記載のペプチドの構造、極性、電荷特性および側鎖特性を共有する分子も含む。
【００５６】
まとめると、本明細書の開示に基づいて、当業者であれば、P-gpと相互作用し、P-gpを介する排出を刺激するための化合物を同定するのに有用であるペプチドおよびペプチド模倣体スクリーニングアッセイを開発することができる。本発明のアッセイを、低スループット、高スループット、または超高スループットスクリーニング形式のために開発することができる。本発明のアッセイは、自動化に適したアッセイを含む。
【００５７】
さらなるP-gp阻害ペプチドの同定
P-gp排出を阻害するさらなるペプチド(例えば、カベオリン-1またはP-gpに由来する)を、本明細書に記載の方法または当業界で公知のP-gp活性を測定するのに用いることができる任意の他のアッセイを用いて同定することができる。特定の実施形態においては、試験ペプチドを、本明細書に記載(例えば、実施例4〜6を参照)の細胞移動または血管新生(例えば、in vivoもしくはin vitro)アッセイにおいて用いる。これらの実施形態においては、試験ペプチドを、P-gpを発現する細胞または生物と接触させる。移動または血管形成を、これらのペプチドの存在または非存在下で測定する。ペプチドの非存在下と比較した、試験ペプチドの存在下での細胞移動または血管新生の減少により、該試験ペプチドがP-gp阻害ペプチドとして同定される。
【００５８】
他の実施形態においては、P-gpを発現する細胞中での化合物(例えば、ビンブラスチンまたはTAXOL)の排出を測定することができる(例えば、実施例1〜3を参照)。P-gpにより輸送されることが知られる任意の化合物を、これらのアッセイにおいて用いることができる。この化合物を、当業界で公知の任意の標識(例えば、本明細書に記載のもの)を用いて検出可能なように標識することができる。これらの例示的な方法においては、化合物の排出を、試験ペプチドの存在下および非存在下で比較し、ここで、該試験ペプチドの存在における該化合物の排出の増加が、P-gp刺激活性を有するペプチドを示す。
【００５９】
in vitroでの結合アッセイなどの他の手法を用いて、候補ペプチドを同定することができる。1つの特定の実施形態においては、P-gpもしくはカベオリン-1またはその一部に結合する試験ペプチドを、クロマトグラフィーに基づく技術を用いて同定することができる。例えば、P-gpまたはカベオリン-1の組換えまたは合成断片を、標準的な技術により製造および精製し、カラム上に固定することができる。次いで、試験ペプチドまたは試験ペプチドの基を、カラムに通過させ、結合したP-gpまたはカベオリン-1断片に特異的なペプチドを、該ポリペプチドに結合し、カラム上に固定されるその能力に基づいて同定する。試験ペプチドを単離するために、カラムを洗浄して、非特異的に結合した分子を除去した後、目的のペプチドをカラムから放出させ、回収する。この方法(または任意の他の好適な方法)により単離されたペプチドを、必要に応じて、さらに精製することができる(例えば、高速液体クロマトグラフィーにより)。また、この手法により単離されたペプチドを、例えば、P-gp排出が減少する障害(例えば、本明細書に記載の任意のもの)を治療するための治療剤として用いることもできる。10 mM以下の親和定数で結合すると同定された化合物は、本発明において特に有用であると考えられる。
【００６０】
核酸
本発明はまた、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかをコードする核酸も含む。いくつかの実施形態においては、前記ポリペプチドを、細胞または生物(例えば、以下に記載の遺伝子治療またはタンパク質発現にとって有用な)中での該ポリペプチドの発現にとって好適なベクター中に含有させることができる。
【００６１】
ポリペプチド発現
一般的には、本発明のポリペプチドを、好適な発現ビヒクル中、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子またはその断片の全部または一部を用いて、好適な宿主細胞を形質転換することにより製造することができる。
【００６２】
分子生物学の分野の当業者であれば、任意の様々な発現系を用いて、組換えポリペプチドを提供することができることを理解するであろう。用いられる正確な宿主細胞は、本発明にとって重要ではない。本発明のポリペプチドを、原核宿主(例えば、大腸菌)または真核宿主(例えば、Saccharomyces cerevisiae、昆虫細胞、例えば、Sf21細胞、または哺乳動物細胞、例えば、NIH 3T3、HeLa、または好ましくは、COSもしくはCHO細胞)において産生させることができる。そのような細胞は、様々な起源(例えば、American Type Culture Collection, Rockland, Md.; また、Ausubelら、上掲を参照)から入手可能である。形質転換またはトランスフェクションの方法および発現ビヒクルの選択は、選択される宿主系に依存するであろう。形質転換およびトランスフェクション方法は、例えば、Ausubelら(上掲)に記載されている；発現ビヒクルを、例えば、Cloning Vectors: A Laboratory Manual (Pouwels, P. H.ら、1985, Supp. 1987)に提供されるものから選択することができる。
【００６３】
ポリペプチド産生のための1つの特定の細菌発現系は、大腸菌のpET発現系(Novagen, Inc., Madison, Wis)である。この発現系に従って、ポリペプチドをコードするDNAを、発現を可能にするように設計された向きにpETベクター中に挿入する。そのようなポリペプチドをコードする遺伝子をT7調節シグナルの制御下にある場合、該ポリペプチドの発現は、宿主細胞中でT7 RNAポリメラーゼの発現を誘導することにより達成される。典型的には、これを、IPTG誘導に応答するT7 RNAポリメラーゼを発現する宿主株を用いて達成する。次いで、一度産生されたら、当業界で公知の標準的な方法、例えば、本明細書に記載のものに従って単離する。
【００６４】
ポリペプチド産生のための別の細菌発現系は、pGEX発現系(Pharmacia)である。この系は、機能的遺伝子産物の迅速な精製および回収と共に、融合タンパク質としての遺伝子または遺伝子断片の高レベル発現のために設計されたGST遺伝子融合系を用いる。目的のポリペプチドを、シストソーマ・ジャポニカム(Schistosoma japonicum)に由来するグルタチオンS-トランスフェラーゼタンパク質のカルボキシル末端に融合させ、グルタチオンセファロース4Bを用いる親和性クロマトグラフィーにより細菌溶解物から容易に精製する。融合タンパク質を、グルタチオンを用いる溶出により穏和な条件下で回収することができる。融合タンパク質からのグルタチオンS-トランスフェラーゼドメインの切断を、このドメインの上流の部位特異的プロテアーゼの認識部位の存在により容易にする。例えば、pGEX-2Tプラスミド中で発現されたポリペプチドを、トロンビンを用いて切断することができる；pGEX-3X中で発現されたものを、第Xa因子を用いて切断することができる。
【００６５】
一度単離されたら、必要に応じて、組換えポリペプチドを、例えば、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製することができる(例えば、Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology(編)、WorkおよびBurdon, Elsevier, 1980)。
【００６６】
また、本発明のポリペプチド、特に、短いペプチド断片を、化学的合成により製造することもできる(例えば、Solid Phase Peptide Synthesis、第2版、1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Illに記載の方法により)。
【００６７】
ポリペプチドの発現および精製のこれらの一般的技術を用いて、有用なペプチド断片または類似体(本明細書に記載)を製造および単離することもできる。特定の実施形態においては、技術の組合せを用いて、融合タンパク質を作製することができる。例えば、前記タンパク質およびその融合パートナーを組換え的に産生および精製するか、または天然起源から精製した後、一緒に化学的に結合させて、融合タンパク質を形成させることができる。
【００６８】
本発明の治療方法
本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、任意のP-gp関連障害に罹患している哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することができる。これらの障害としては、癌などの任意の新生物、神経変性障害などの任意の神経障害(例えば、本明細書に記載のもの)、または本明細書に記載の任意の他の疾患が挙げられる。
【００６９】
前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、当業界で公知の、または本明細書に記載の任意の経路、例えば、経口、非経口(例えば、静脈内もしくは筋肉内)、腹腔内、直腸、皮下、鼻、膣、吸入、皮膚(パッチ)、または眼内経路により投与することができる。前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、任意の用量または投薬計画(例えば、本明細書に記載のもの)で投与することができる。
【００７０】
用量
本発明の治療方法に関して、そのようなタンパク質をコードするポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与が、特定の様式の投与、用量、または投与頻度に限定されることを意図されない；本発明は、筋肉内、静脈内、腹腔内、膀胱内、関節内、病巣内、皮下、またはP-gp関連障害を治療するのに十分な用量を提供するのに十分な任意の他の経路などの全ての様式の投与を意図する。治療剤を、単回用量または複数回用量で患者に投与することができる。複数回用量を投与する場合、用量を、例えば、1時間、3時間、6時間、8時間、1日、2日、1週間、2週間、または1ヶ月、互いに分離させることができる。例えば、治療剤を、例えば、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20週間以上投与することができる。任意の特定の被験体について、特定の投薬計画を、個体の必要および組成物を投与するか、または組成物の投与を管理する人の専門的な判断に従って、時間に対して調整すべきであることが理解されるべきである。例えば、より低い用量が十分な治療活性を提供しない場合、治療剤の用量を増加させることができる。
【００７１】
究極的には、主治医が好適な量および投薬計画を決定するであろうが、本発明のタンパク質のポリペプチドの治療上有効量を、0.0001、0.01、0.1、1、5、10、25、50、100、500、または1,000 mg/kgの用量で提供することができる。
【００７２】
疾患
本発明のポリペプチドを用いて、カベオリン-1とP-gpとの相互作用の阻害が望ましいか、またはP-gp排出の増加が望ましい任意の疾患を治療することができる。本発明者らが、例示的なペプチドpepCavおよびpepPgpが血管新生および細胞移動を減少させることができることを示したため、本発明のポリペプチドを用いて、癌などの任意の新生物を治療することができる。癌の例としては、白血病(例えば、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病)、真性赤血球増加症、リンパ腫(ホジキン病、非ホジキン病)、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに肉腫および癌腫(例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫)などの固形腫瘍が挙げられる。
【００７３】
さらに、神経変性疾患などの神経疾患も、P-gp活性の減少と関連し得る。従って、神経疾患(例えば、本明細書に記載の神経変性疾患)に罹患するか、またはそれを生じる危険性が高い患者は、P-gp活性の増加から利益を得ることができる。従って、本発明のポリペプチドを用いて、AD、PD、ハンチントン病、プリオン病、ウシ海綿状脳症、CJD、ALS、レヴィー小体疾患、またはピック病などの疾患に罹患する患者を治療することができる。
【００７４】
本発明のポリペプチドを用いて治療することができる他の疾患としては、薬物中毒(例えば、過剰摂取)、封入体筋炎、脳アミロイド血管症、アミロイドーシス(例えば、AA型)、および眼疾患(例えば、黄斑変性および緑内障)が挙げられる。
【００７５】
医薬組成物の製剤化
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与は、障害を治療するタンパク質濃度をもたらす任意の好適な手段によるものであってよい。前記化合物を、任意の好適な担体物質中、任意の好適な量で含有させることができ、それは一般的には、該組成物の総重量の1〜95重量％の量で存在する。前記組成物を、経口、非経口(例えば、静脈内もしくは筋肉内)、腹腔内、直腸、皮下、鼻、膣、吸入、皮膚(パッチ)、または眼内投与経路にとって好適である投与剤形で提供することができる。かくして、前記組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、ピル、粉末、顆粒、懸濁液、乳濁液、溶液、ヒドロゲルなどのゲル、ペースト、軟膏、クリーム、硬膏、ドレンチ、浸透送達デバイス、座剤、浣腸、注射剤、埋込み物、スプレー剤、またはエアロゾル剤の形態にあってもよい。医薬組成物を、従来の製薬業務に従って製剤化することができる(例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第20版、2000、A.R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins(編)、Philadelphia、ならびにEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, J. SwarbrickおよびJ. C. Boylan(編)、1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照)。
【００７６】
本発明に従う医薬組成物を、投与の際にすぐに、または投与後の任意の所定の時間もしくは期間に活性化合物を放出するように製剤化することができる。後者の型の組成物は、一般的には制御放出製剤として知られており、(i)長時間に渡って体内で実質的に一定濃度の本発明の薬剤を生成する製剤；(ii)所定の遅延時間後に、長時間に渡って体内で実質的に一定濃度の本発明の薬剤を生成する薬剤；(iii)薬剤の血漿レベルの変動と関連する望ましくない副作用を同時に最小化しながら、体内の薬剤の比較的一定の有効レベルを維持することにより、所定の期間に薬剤作用を持続する製剤(鋸歯状動態パターン)；(iv)薬剤の作用を局在化させる製剤、例えば、所望の組織もしくは器官に近くか、またはその中での制御放出組成物の空間的配置；(v)投与の利便性を達成する製剤、例えば、週に1回または2週間毎に1回の該組成物の投与；ならびに(vi)特定の標的細胞型に治療剤を送達するための担体または化学的誘導体を用いることにより薬剤の作用を標的化する製剤が挙げられる。制御放出製剤の形態でのタンパク質の投与が、胃腸管中で狭い吸収ウィンドウまたは比較的短い生物学的半減期を有する化合物にとって特に好ましい。
【００７７】
いくつかの戦略のいずれかを続行して、放出速度が問題の化合物の代謝速度を上回る制御放出を得ることができる。一例においては、制御放出を、様々な製剤パラメーターおよび成分、例えば、様々な型の制御放出組成物およびコーティングの好適な選択により得る。かくして、前記タンパク質を、好適な賦形剤と共に、投与に際して、制御された様式で該タンパク質を放出する医薬組成物中に製剤化する。例としては、単回もしくは複数回単位の錠剤もしくはカプセル組成物、油溶液、懸濁液、乳濁液、マイクロカプセル、分子複合体、ミクロスフェア、ナノ粒子、パッチ、およびリポソームが挙げられる。
【００７８】
非経口組成物
前記医薬組成物を、投与剤形、製剤中、または従来の非毒性の製薬上許容し得る担体およびアジュバントを含む好適な送達デバイスもしくは埋込み物を介して、注射、注入、または埋込み(皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内など)により非経口的に投与することができる。そのような組成物の製剤および調製物は医薬製剤の業界における当業者にはよく知られている。
【００７９】
非経口的使用のための組成物を、単一投与剤形(例えば、単回投与アンプル)中に、または数回用量を含み、好適な保存剤を添加することができるバイアル中に提供することができる(以下を参照)。前記組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、輸液デバイス、もしくは埋込みのための送達デバイスの形態にあるか、またはそれを使用前に水もしくは別の好適なビヒクルを用いて再構成される乾燥粉末として提供することができる。活性薬剤とは別に、前記組成物は好適な非経口的に許容し得る担体および／または賦形剤を含んでもよい。活性薬剤を、制御された放出のためのミクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに組み入れることができる。さらに、前記組成物は、懸濁剤、可溶化剤、安定化剤、pH調整剤、等張性調整剤、および／または分散剤を含んでもよい。
【００８０】
上記に示されるように、本発明に従う医薬組成物は、滅菌注入にとって好適な形態であってもよい。そのような組成物を調製するために、好適な活性剤を、非経口的に許容し得る液体ビヒクル中に溶解するか、または懸濁する。用いることができる許容し得るビヒクルおよび溶媒は、水、好適な量の塩酸、水酸化ナトリウムもしくは好適なバッファーの添加により好適なpHに調整される水、1,3-ブタンジオール、リンゲル液、デキストロース溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液である。水性製剤はまた、1種以上の保存剤(例えば、メチル、エチルもしくはn-プロピルp-ヒドロキシ安息香酸)を含んでもよい。化合物の1つのみが水に難溶性であるか、もしくはわずかに溶解性である場合、溶解増強剤もしくは可溶化剤を添加するか、または溶媒は10〜60％ w/wのプロピレングリコールなどを含んでもよい。
【００８１】
制御放出非経口組成物
制御放出非経口組成物は、水性懸濁液、ミクロスフェア、マイクロカプセル、磁気ミクロスフェア、油溶液、油懸濁液、または乳濁液の形態にあってもよい。また、前記組成物を、生体適合性担体、リポソーム、ナノ粒子、埋込み物、または輸液デバイス中に組み入れることもできる。
【００８２】
ミクロスフェアおよび／またはマイクロカプセルの調製における使用のための材料は、例えば、ポリガラクチン、ポリ-(イソブチルシアノアクリレート)、ポリ(2-ヒドロキシエチル-L-グルタミン)、ポリ(乳酸)、ポリグリコール酸、およびその混合物などの生分解性／生体内分解性ポリマーである。制御放出非経口製剤を製剤化する場合に用いることができる生体適合性担体は、炭水化物(例えば、デキストラン)、タンパク質(例えば、アルブミン)、リポタンパク質、または抗体である。埋込み物における使用のための材料は、非生分解性(例えば、ポリジメチルシロキサン)または生分解性(例えば、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)もしくはポリ(オルトエステル))またはその組合せであってよい。
【００８３】
経口使用のための固体投与剤形
経口使用のための製剤としては、非毒性の製薬上許容し得る賦形剤との混合物中に活性成分を含む錠剤が挙げられ、そのような製剤は当業者には公知である(例えば、参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許第5,817,307号、第5,824,300号、第5,830,456号、第5,846,526号、第5,882,640号、第5,910,304号、第6,036,949号、第6,036,949号、第6,372,218号)。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤もしくは充填剤(例えば、スクロース、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶セルロース、ジャガイモデンプンなどのデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、もしくはリン酸ナトリウム)；顆粒化剤および崩壊剤(例えば、微結晶セルロースなどのセルロース誘導体、ジャガイモデンプンなどのデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギナート、もしくはアルギン酸)；結合剤(例えば、スクロース、グルコース、ソルビトール、アカシア、アルギナート、もしくはアルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、プレゼラチン化デンプン、微結晶セルロース、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、もしくはポリエチレングリコール)；ならびに潤滑剤、流動促進剤、および抗粘着剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化野菜油、もしくはタルク)であってよい。他の製薬上許容し得る賦形剤は、着色剤、香料、可塑剤、保湿剤、緩衝剤などであってよい。
【００８４】
錠剤はコーティングされていないものであってもよく、またはそれらを、必要に応じて、胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ、それによって、長時間に渡る持続作用を提供するための公知の技術によりコーティングすることができる。コーティングを、所定のパターンでタンパク質を放出するように適合させる(例えば、制御放出製剤を達成するため)か、またはそれを胃の通過後まで薬剤を放出させないように適合させることができる(腸溶性コーティング)。コーティングは、糖コーティング、フィルムコーティング(例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレートコポリマー、ポリエチレングリコールおよび／もしくはポリビニルピロリドンに基づく)、または腸溶性コーティング(例えば、メタクリル酸コポリマー、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、ポリビニルアセテートフタレート、シェラック、および／もしくはエチルセルロースに基づく)であってよい。さらに、例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を用いることができる。
【００８５】
固体錠剤組成物は、望ましくない化学的変化(例えば、活性物質の放出の前の化学的分解)から該組成物を保護するように適合されたコーティングを含んでもよい。コーティングを、Encyclopedia of Pharmaceutical Technology、上掲に記載のものと同様の様式で固体投与剤形に適用することができる。
【００８６】
本発明の組成物を錠剤と一緒に混合するか、または分割することができる。一例においては、第2の薬剤の実質的な部分を放出した後、第1の薬剤を放出するように、第1の薬剤を錠剤の内側に含有させ、第2の薬剤を外側に含有させる。
【００８７】
経口使用のための製剤を、チュアブル錠剤として、または活性成分を不活性固体希釈剤(例えば、ジャガイモデンプン、ラクトース、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、もしくはカオリン)と混合した硬ゼラチンカプセルとして、または活性成分を水もしくは油媒質、例えば、ピーナッツ油、液体パラフィン、もしくはオリーブ油と混合した軟ゼラチンカプセルとして提供することもできる。粉末および顆粒を、例えば、ミキサー、流動床デバイス、もしくはスプレー乾燥装備を用いて、従来の様式で錠剤およびカプセルの下で上記成分を用いて調製することができる。
【００８８】
遺伝子治療
本発明のポリペプチドを、遺伝子治療技術を用いて細胞または患者に効率的に投与することができる。一般的には、例えば、米国特許第5,399,346号を参照されたい。一般的な原理は、ポリヌクレオチドを患者中の標的細胞に導入し、内因性P-gpタンパク質の活性を増強するポリペプチドを発現させることである。
【００８９】
細胞への進入を、好適なベクターの形態での前記ポリヌクレオチドの提供、またはリポソーム中への該ポリヌクレオチドの封入などの当業界で公知の好適な技術により容易にする。
【００９０】
遺伝子治療の望ましい様式は、ポリヌクレオチドが細胞の内側で複製し、所望の効果を増強し、延長する様式で該ポリヌクレオチドを提供することである。かくして、該ポリヌクレオチドを、対応する遺伝子の天然のプロモーター、肝臓細胞、神経細胞、骨細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、関節細胞、もしくは軟骨細胞中で本質的に活性である異種プロモーター、または好適な薬剤により誘導することができる異種プロモーターなどの好適なプロモーターに機能し得る形で連結する。
【００９１】
(実施例)
以下の実施例は、本発明の可能性のある用途を例示するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、改変および変更を行うことができる。
【実施例１】
【００９２】
in vitroでのビンブラスチンのP-gp排出輸送活性の刺激
P-gp排出輸送活性に対する化合物PepPgpおよびPepCavの効果を、MDR1で安定にトランスフェクトされたMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞中で試験した。細胞をpepPgpまたはpepCav化合物(20μg/ml)の存在下でインキュベートした。処理後の様々な時点で、P-gpの特異的基質であるビンブラスチンの蓄積を測定した。図1Aは、[3H]-ビンブラスチンの蓄積が、両化合物の存在下で時間の関数として減少したことを示す。この結果は、P-gp輸送活性がMDCK-MDR1細胞中で刺激されることを示している。さらに、漸増濃度の化合物の添加は、MDCK-MDR1細胞中で[3H]-ビンブラスチン蓄積を低下させた(図1B)。これらの結果は、両方の例示的化合物は、用量依存的様式でP-gp輸送を刺激（促進）することを示している。これらは、P-gp輸送活性に対する刺激化合物の作用を説明する初めての結果である。
【実施例２】
【００９３】
in vitroでのβ-アミロイドのP-gp排出輸送活性の刺激
β-アミロイドのP-gp取込みに対する化合物の効果を、MDCK細胞中で試験する。細胞をP-gpの特異的基質であるβ-アミロイド(ProSpec-Tany TechnoGene LTD社製カタログ番号PRO-447)と共にインキュベートする。次いで、PepPgpまたはPepCav化合物(20μg/ml)を添加する。処理の様々な時点で、β-アミロイドの蓄積を測定する。そのいずれか一方の化合物の存在下で観察されるβ-アミロイド取込みの減少は、P-gp排出輸送活性に対するそれらの刺激効果を示す。
【実施例３】
【００９４】
in vivoでのP-gp排出輸送活性の刺激
P-gp排出輸送活性に対する化合物の効果を、in vivoで調査した。この目的のために、P-gpの特異的基質である[3H]-タキソールの脳の取込みを測定した。[3H]-タキソールを、20μg/mlの濃度のpepCavまたはpepPgpの存在下または非存在下で、右頸静脈を通じて脳へと5分間かん流させた。[3H]-タキソールの放射活性を、全脳、毛細血管および実質組織中で分析した。図2に示されるように、タキソールの通過は、対照マウスと比較して、pepCavおよびpepPgpに関して、全脳においてそれぞれ50％および30％減少した。この減少は、毛細血管および実質組織においても同様であったが、これはP-gpの増加した活性が、内皮細胞における[3H]-タキソールの蓄積およびその脳取込みを減少させたことを示している。これらの結果は、前記化合物が血液脳関門でのin vivoのP-gp輸送活性を刺激することができることを示唆している。
【実施例４】
【００９５】
細胞移動の阻害
細胞移動に対する両化合物の効果を、0.15％ゼラチンで予めコーティングされたTranswellフィルター(Costar;8μm孔径)を用いるMDCK-MDR1細胞の移動により判定した。簡単に述べると、1 x 105個の細胞を、化合物(20μg/ml)を含むか、または含まない100μlの無血清培地中に再懸濁した。Transwellの下の方のチェンバーは、化学誘引物質として用いた10％血清を含んでいた。細胞移動を、Nikon TMS-F顕微鏡およびNorthern Eclipse Softwareを用いて測定した。図3Aおよび3Bで観察されるように、pepPgpおよびpepCavは、対照と比較して、MDCK-MDR1の細胞移動を、それぞれ30％および80％阻害した。
【実施例５】
【００９６】
in vitroでの血管新生の阻害
血管新生に対するこれらの化合物の効果を、Matrigel上でのヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)管形成を用いてin vitroで評価した。トランスフェクション後、細胞をトリプシン処理し、2.5 x 104個の細胞をMatrigel上に播種した。細胞接着後、培地を除去し、100μlの新鮮な培地を、40μg/mlのpepCavまたはpepPgpのいずれかを加えて、またはそれを加えずに添加した。管形成を、18時間後に評価した。インキュベーション後、管構造を、Nikon TMS-F顕微鏡およびNorthern Eclipse Softwareを用いて、60倍の倍率で可視化した。図4Aに示されるように、pepCavおよびpepPgpを用いるHUVEC細胞の処理は、毛細血管様構造形成を、それぞれ75％および40％減少させた。
【実施例６】
【００９７】
in vivoでの血管新生の阻害
血管新生に対するこれらの化合物の効果を、Matrigelプラグアッセイを用いて、in vivoで評価した。簡単に述べると、ヘパリンおよびbFGFを含むMatrigelを、100μg/mlのpepCavおよびpepPgpの存在下または非存在下で、マウスの皮膚の下に注入した。Matrigelプラグを1週間後に除去した。形成された血管に対応する、Matrigelプラグ中のヘモグロビン含量を測定した。図4Bに示されるように、40μg/mlのpepCavおよびpepPgpを用いた処理は、ヘモグロビン含量をそれぞれ25％および40％減少させたが、これは両化合物がin vivoで血管新生を阻害することを示している。
【００９８】
他の実施形態
2006年10月19日に提出された米国特許仮出願第60/852,678号などの全ての特許、特許出願、および本明細書に記載の刊行物は、それぞれの独立した特許、特許出願、または刊行物が具体的かつ個々に参照により本明細書に組み入れられることが示唆されるのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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