(57)【要約】  ＴＬＲ１４のアンタゴニストを用いて神経細胞機能を変調するための方法および組成物が開示される。特に、ＴＬＲ１４−関連神経変性疾患および／または障害を治療し、予防し、および／または診断する方法が開示される。ＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、アゴニストおよびアンタゴニストを評価するためのスクリーニング方法も開示される。
2010506930.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞または組織においてＴｏｌｌ様受容体１４（ＴＬＲ１４）の１または複数の生物学的活性を低下させる方法であって、
神経細胞または組織を、該細胞または組織においてＴＬＲ１４の１または複数の生物学的活性を低下させるのに十分な量を、ＴＬＲ１４活性または発現のアンタゴニストと接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記神経細胞または組織が、ニューロンまたは神経膠細胞または組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ニューロン細胞または組織が、ドーパミン作動性、コリン作動性、皮質、小脳、海馬、または脊髄ニューロン細胞から選択された１または複数の細胞を含み、および前記神経膠細胞または組織が、小神経膠細胞、神経膠星状細胞または稀突起神経膠細胞から選択された１または複数の細胞を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記接触工程が、細胞溶解物、復元された系または培養中の細胞で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記接触工程が、対象に存在する細胞で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対象が、神経変性障害または疾患を有する、または有する危険性があるヒト対象である、請求項４に記載の方法である。
【請求項７】
前記アンタゴニストが、
（ｉ）ＮｇＲ１結合または活性の変調、
（ｉｉ）ｐ７５ＮＴＲ結合または活性の変調、
（ｉｉｉ）脳中の１または複数のエンドトキシン−媒介炎症シグナルの変調、または
（ｉｖ）ニューロン細胞生存、分化、神経突起外殖および／または軸索再生の１または複数の変調、
の１または複数を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＬＲ１４が、ヒトまたはネズミＴＬＲ１４である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＬＲ１４アンタゴニストが、ヒトＴＬＲ１４に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＬＲ１４アンタゴニストが、ヒトＴＬＲ１４に結合する抗体分子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、ヒト、ヒト化、キメラ、ラクダ、またはヒトＴＬＲ１４に対するin vivoで生じた抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体分子が、２つの完全な重鎖、および２つの完全な軽鎖、またはその抗原−結合断片を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＬＲ１４アンタゴニストが、ヒトＴＬＲ１４の細胞外ドメインに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＬＲ１４アンタゴニストが、配列番号２の約アミノ酸８５〜１３、または５０９〜５２６を含むＴＬＲ１４上のエピトープに結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＬＲ１４アンタゴニストが、ＴＬＲ１４をコードする核酸の発現を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＴＬＲ１４アンタゴニストが、アンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡｉ、および三重ラセン分子からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記神経変性障害または疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、外傷脳負傷、脊髄負傷、多発性硬化症、虚血症または虚血症―誘導保障、発作、または細菌感染によって引き起こされる神経変性疾患または障害の１または複数から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記神経変性障害または疾患が、急性または慢性である、請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
対象において神経変性障害または疾患を治療または予防する方法であって、
対象に、神経細胞または組織において１または複数のＴＬＲ１４生物学的活性を阻害し、または低下させ、それにより、障害を治療するのに十分な量の、ＴＬＲ１４アンタゴニストを投与することを含む、方法。
【請求項２０】
前記神経変性障害または疾患が、急性または慢性である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＮＳ負傷が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、外傷脳負傷、脊髄負傷、多発性硬化症、虚血症または虚血症−誘導負傷、発作、または細菌感染によって引き起こされる神経変性疾患または障害の１または複数から選択される障害と関連付けられる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＴＬＲ１４アンタゴニストがヒトＴＬＲ１４の細胞外ドメインに結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞を、ＴＬＲ１４の細胞外ドメインと相互作用する抗体分子と接触させ、それにより、ニューロン細胞の神経突起外殖、生存、または分化の１または複数を刺激することを含む、ドーパミン作動性、コリン作動性、皮質、小脳、海馬または脊髄ニューロン細胞から選択されるニューロン細胞の神経外殖、生存、または分化の１または複数を刺激する、方法。
【請求項２４】
対象においてＴＬＲ１４の活性または発現の関連を低下させるのに十分な量のＴＬＲ１４アンタゴニストを投与することを含む、対象において神経組織を再生し、または修復する、方法。
【請求項２５】
対象に、ＣＮＳ中のＴＬＲ１４およびＬＰＳの関連、または活性を減少させ、それにより、免疫応答を低下させ、または阻害するのに十分な量のＴＬＲ１４アンタゴニストを投与することを含む、対象において神経変性病に関連する免疫応答を低下させ、または阻害する、方法。
【請求項２６】
参照試料に対する核酸またはポリペプチドのレベルの差が、神経変性障害の存在または進行を示すように、ＴＬＲ１４核酸またはポリペプチドの発現または活性を評価することを含む、テスト試料におけるＴＬＲ１４関連神経変性障害を評価し、診断し、またはその進行をモニターする、方法。
【請求項２７】
神経機能を変調する化合物を同定するための方法、またはアッセイであって、
（ｉ）ＴＬＲ１４またはＴＬＲ１４−関連ポリペプチドまたは核酸への結合に相互作用するテスト化合物を供し、または同定し、ここに、ＴＬＲ１４−関連ポリペプチドまたは核酸はＮｇＲ１またはｐ７５ＮＴＲポリペプチドまたは核酸であり、次いで、
（ｉｉ）参照試料に対する、テスト剤の存在下における神経細胞または組織の活性の変化を評価する、
ことを含む、方法、またはアッセイ。
【請求項２８】
前記テスト化合物が抗体分子、ＴＬＲ１４ペプチド、小分子、天然に生じるＴＬＲ１４アンタゴニスト、アンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡｉおよび三重ラセン分子からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法またはアッセイ。
【請求項２９】
前記評価工程が、
ＴＬＲ１４またはＴＬＲ１４受容体ポリペプチド、またはＴＬＲ１４またはＴＬＲ１４受容体をコードする核酸の１または複数をテスト化合物と接触させ、次いで、
テスト化合物を含まない対照試料に対する、テスト化合物の存在下における、ＴＬＲ１４またはＴＬＲ１４受容体ポリペプチドまたは核酸の１または複数の活性の変化を検出する、
ことを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
神経細胞または組織の活性も前記変化が、
（ｉ）ＮｇＲ１の結合または活性の変調、
（ｉｉ）ｐ７５ＮＴＲ結合または活性の変調、
（ｉｉｉ）脳における１または複数のエンドトキシン−媒介の炎症シグナルの変調、または
（ｉｖ）ニューロン細胞生存、分化、神経突起外殖、または軸索再生の１または複数の変調、
の１または複数における、参照試料に対する、テスト化合物の存在下において、変化を測定することによって検出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記評価工程が、テスト化合物の不存在または存在下におけるＴＬＲ１４およびＴＬＲ１４−関連ポリペプチドの間の結合の変化を検出することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
ヒトＴＬＲ１４の細胞外ドメインに結合する、抗体分子。
【請求項３３】
配列番号２の約アミノ酸８５〜１０３、または５０９〜５２６を含むＴＬＲ１４上のエピトープに結合する、請求項３１に記載の抗体分子。
【請求項３４】
請求項３１または３２に記載の抗体分子を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、ここに引用してその全体を援用する、２００６年１０月１８日に出願された「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅ」と題された英国出願第ＧＢ  ０６２０６９５．７からの優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＴＬＲ）は、微生物によって発現された構造モチーフを認識することによって病原体に対する先天性免疫応答を開始する高度に保存された分子の群である。ＴＬＲ受容体は一定範囲のリガンドを認識し、一連のシグナリング経路を活性化し、これは、免疫および炎症遺伝子の誘導に導く。
【０００３】
ＴＬＲファミリーのメンバーは、Ｔｏｌｌ  ＩＬ−ＩＲ（ＴＩＲ）ドメインと言われるサイトゾルドメイン、および一連のロイシンリッチな反復よりなる細胞外領域によって特徴付けられる。感染の間におけるＴｏｌｌ様受容体の活性化は、誘導性シクロオキシゲナーゼ、接着分子、ケモカイン、および免疫エフェクター細胞の活性化のような、非常に多数のプロ−炎症性蛋白質の発現に導く。この協調された応答は侵入する病原体を除去するように設計されるが、多くの場合において、細菌の産物は宿主由来メディエーターの制御されていないネットワークを活性化し、これは、敗血症、多器官不全、心血管崩壊および、結局は、死滅を含めた深刻な健康状態に導きかねない。
【０００４】
いくつかのヒトＴＬＲが今日同定されている。発見された最初のＴＬＲであるＴＬＲ−４は、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）に対する応答で必須である（Ｐｏｌｔｏｒａｋ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２０８５−２０８８（１９９８）；Ｑｕｒｅｓｈｉ，Ｓ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：６１５−６２５（１９９９））。ＴＬＲ２はＴＬＲ１および６とカップリングして各々、ジアシルーおよびトリアシルリポペプチドを認識する。ＴＬＲ５は細菌フラゲリン（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１０，１０９９−１１０３（２００１））を認識し、それに応答しＴＬＲ9は細菌ＤＮＡに存在するメチル化されていないＣｐＧモチーフの認識に必要である（Ｈｅｍｍｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，７４０−７４５（２００１））。ＴＬＲ１１、１２および１３はマウスにおいて記載されているが、ヒトオルソログは今日まで同定されていない（Ｚｈａｎｇ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，１５２２−１５２６（２００４）、Ｔａｂｅｔａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  １０１，３５１６−３５２１（２００４））。ヒトおよびマウスＴＬＲ１４についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は同定されている（ＷＯ  ０６／１１１９４６）。ほとんどのＴＬＲの対応するリガンドの刺激は、転写因子ＮＫκＢ、ならびにマイトジェン−活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ｐ３８，ＣＪＵＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）およびｐ４２／ｐ４４の活性化に導く。
【０００５】
ＮＦκＢの活性化は、細胞質ＴＩＲドメイン−含有アダプター蛋白質であるＭｙ  Ｄ８８に依存しているように見える（Ｈｅｍｍｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，１９６−２００（２００２）；Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９，１４３−１５０（１９９８）；Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，５５４−５５７（２０００））。Ｍｙ  Ｄ８８は、アダプター蛋白質ＴＲＩＦを動員する、ＴＬＲ３を除いて全ＴＬＲファミリーについてのアダプター蛋白質として作用するように見える（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，６６６８−７２（２００２））。ＮＦκＢの活性化に加えてＴＲＩＦもまた、ＴＬＲ３およびＴＬＲ４  Ｍｙ  Ｄ８８非依存性経路双方によって利用される転写因子インターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）に依存する遺伝子の誘導でやはり必要である（Ｋａｉｓｈｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，５６８８−５６９４）。この経路はＭｙ  Ｄ８８−非依存性経路と言われ、ウイルス起源の侵入性病原体に対して重要であることが示されている（Ｓｅｒｖａｎｔ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｏ．６４，９８５−９９２（２００２））。もう１つのＴＩＲアダプター蛋白質、Ｍｙ  Ｄ８８アダプター−様（Ｍａｌ；ＴＩＲＡＰとしての公知）はＭｙ  Ｄ８８依存性経路に関与し、（Ｆｉｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１３，７８−８３（２００１）；Ｈｏｒｎｇ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，８３５−８４１（２００１））、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４媒介シグナリングに対して特異的に必要とされる（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，３２４−３２９（２００２）；Ｈｏｒｎｇ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，３２９−３３（２００２））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０６／１１１９４６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｏｌｔｏｒａｋ，Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２０８５−２０８８（１９９８）
【非特許文献２】Ｑｕｒｅｓｈｉ，Ｓ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：６１５−６２５（１９９９）
【非特許文献３】Ｈａｙａｓｈｉ，Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１０，１０９９−１１０３（２００１）
【非特許文献４】Ｈｅｍｍｉ，Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，７４０−７４５（２００１）
【非特許文献５】Ｚｈａｎｇ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，１５２２−１５２６（２００４）
【非特許文献６】Ｔａｂｅｔａ，Ｋ．ら、ＰＮＡＳ  １０１，３５１６−３５２１（２００４）
【非特許文献７】Ｈｅｍｍｉ，Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，１９６−２００（２００２）
【非特許文献８】Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９，１４３−１５０（１９９８）
【非特許文献９】Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｏ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，５５４−５５７（２０００）
【非特許文献１０】Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，６６６８−７２（２００２）
【非特許文献１１】Ｋａｉｓｈｏ，Ｔ．ら、（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，５６８８−５６９４
【非特許文献１２】Ｓｅｒｖａｎｔ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｏ．６４，９８５−９９２（２００２）
【非特許文献１３】Ｆｉｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１３，７８−８３（２００１）
【非特許文献１４】Ｈｏｒｎｇ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，８３５−８４１（２００１）
【非特許文献１５】Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，３２４−３２９（２００２）
【非特許文献１６】Ｈｏｒｎｇ，Ｔ．ら．Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，３２９−３３（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＴＬＲ蛋白質の変調は、過剰活性免疫応答の有害な効果に逆作用するのに有用であることが示されている。しかしながら、ＴＬＲ１４のようなＴＬＲファミリーのメンバーと関連する新規な活性を同定する、およびこれらの蛋白質の活性を低下させ、ＴＬＲ−関連疾患の兆候を緩和するＴＬＲ蛋白質のモジュレーターを用いる要望が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、少なくとも部分的には、Ｔｏｌｌ−様受容体１４（ＴＬＲ１４）結合剤、例えば、ＴＬＲ１４蛋白質の細胞外ドメインに結合する抗体は、in vitroにて神経突起外殖のミエリン−誘導阻害を逆行させるという発見に基づく。また、出願人らは、ＴＬＲ１４  ｍＲＮＡおよび蛋白質が海馬、黒質、脳幹神経節、および大脳および小脳脂質のようなネズミの選択された領域で発現されることも示す。上昇したＴＬＲ１４  ｍＲＮＡの発現はアルツハイマー病およびパーキンソン病に罹った患者の脳で検出されている。共−免疫沈澱実験は、さらに、ＴＬＲ１４が、Ｎｏｇｏ６６受容体１（Ｎｇｒ）およびニュートロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）のような、ニューロン成長および／または活性のモジュレーターと相互作用することを明らかとした。これらの知見はニューロン活性および／または成長の調節におけるＴＬＲ１４を示唆する。ＴＬＲ１４のニューロン活性はＮｇＲ１および／またはｐ７５ＮＴＲを介する相互作用によって媒介され得る。従って、本発明は、部分的にはＴＬＲ１４結合剤、例えば、ＴＬＲ１４機能のアンタゴニストを用いてＴＬＲ１４機能（例えば、ＴＬＲ１４神経機能）を変調するための方法および組成物を提供する。特に、ＴＬＲ１４関連疾患および／または障害（例えば、ＴＬＲ１４関連神経変性疾患および障害）を治療し、予防し、および／または診断する方法が開示される。ＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、ＴＬＲ１４の機能または発現のアゴニストおよびアンタゴニストを評価するためのスクリーニング方法も開示される。
【００１０】
従って、１つの態様において、本発明は、ＴＬＲ１４−応答性細胞および／または組織（例えば、神経（例えば、ニューロンまたは神経膠）細胞または組織）における機能を変調する（例えば、ＴＬＲ１４の位置またはそれ以上の生物学的活性を変調する）方法をその特徴とする。該方法は、ＴＬＲ１４−応答性細胞または組織の機能（または該細胞または組織におけるＴＬＲ１４の生物学的活性）を変調するのに十分な量にて、ＴＬＲ１４−応答性細胞および／または組織ＴＬＲ１４モジュレーター例えば、ＴＬＲ１４結合剤（例えば、ヒトＴＬＲ１４活性または発現のアンタゴニスト）と接触させることを含む。１つの実施形態において、該接触工程は例えば、細胞溶解物中で、または復元された系において、in vitroで行うことができる。別法として主題の方法は、例えば、in vitroまたはex vivoにて培養中の細胞で行うことができる。例えば、細胞（例えば、精製されたまたは組換え細胞）をin vitroで培養することができ、該接触工程はＴＬＲ１４モジュレーターを培養基に加えることによって行うことができる。典型的には、ＴＬＲ１４−応答性細胞は哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。いくつかの実施形態においては、ＴＬＲ１４−応答性細胞が神経細胞（例えば、ニューロン細胞（例えば、ドーパミン作動性、コリン作動性、皮質、小脳、海馬、脊髄ニューロン細胞）および／または神経膠細胞（例えば、小神経膠細胞、神経膠星状細胞、および稀突起神経膠細胞））、またはその集団である。他の実施形態において、該方法は、例えば、in vivoプロトコルの一部として対象に、または（例えば、ヒト対象を含めた）動物対象に、またはＣＮＳ炎症モデルのようなin vivo動物モデルに存在する細胞で行うことができる。in vivoプロトコルは治療的または予防的なものとすることができ、炎症モデルは、例えば、ＥＡＥモデル、リンパ球髄膜脳炎モデル、または遺伝子的に修飾されたモデル（例えば、過剰発現されたＴＬＲ１４、またはＴＬＲ受容体に突然変異または欠失を有する動物モデル）であり得る。in vivo方法では、ＴＬＲ１４モジュレーターは単独で、あるいはもう１つの剤と組合せて対象において１または複数のＴＬＲ１４の活性または機能を変調するのに十分な量にて、ＴＬＲ１４−関連神経変性疾患および／または障害に罹った対象に投与することができる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、投与されるＴＬＲ１４モジュレーターの量または用量は、in vitroまたはex vivoにて、１または複数のＴＬＲ１４活性（例えば、本明細書中に記載された１または複数のＴＬＲ１４生物学的活性）を改変し、例えば、減少させまたは阻害するのに必要なＴＬＲ１４モジュレーターの量をテストすることによって、投与に先立って決定することができる。所望により、in vivo方法は、障害または疾患に関連する１または複数の兆候を有する、または有する危険性がある対象を同定する（例えば、評価する、診断する、スクリーニングするおよび／または選択する）工程を含むことができる。
【００１２】
１または複数のＴＬＲ１４生物学的活性の阻害、低下または減少が望まれるある実施形態においては、例えば、ＴＬＲ１４アンタゴニストを対象に投与することによってＴＬＲ１４−応答性細胞および／または組織をＴＬＲ１４アンタゴニストと接触させる。１つの実施形態において、ＴＬＲ１４アンタゴニストをＴＬＲ１４ポリペプチドまたはｍＲＮＡと相互作用させ、例えば、それに結合させ、１または複数のＴＬＲ１４活性を低下させまたは阻害する。典型的には、拮抗されるＴＬＲ１４は哺乳動物ＴＬＲ１４（またはその機能的変種）、例えば、ヒトＴＬＲ１４またはネズミＴＬＲ１４である。ある実施形態において、拮抗されるＴＬＲ１４は、図２または４に示されるアミノ酸配列を含むヒトまたはネズミＴＬＲ１４配列（各々、配列番号２または配列番号４）またはその部分、および／または、それに実質的に相同な、あるいは図１および３に示されたヌクレオチド配列によってコードされる配列（各々、配列番号１または配列番号３）、および／またはそれに実質的に相同な配列を含む。他の実施形態においては、アンタゴニストは、ＴＬＲ１４、および哺乳動物、例えば、ヒトおよびネズミＮｇＲ１および／またはｐ７５ＮＴＲ（例えば、各々、図２２Ｂおよび２３Ｂ、または図２４Ｂおよび２５Ｂに示されるアミノ酸配列を含むヒトおよびネズミＮｇＲ１および／またはｐ７５ＮＴＲ、またはその部分；またはそれに実質的に相同な配列；または各々、図２２Ａおよび２３Ａ、または図２４Ａおよび２５Ａに示されるヌクレオチド配列によってコードされる配列、または、それに実質的に相同な配列）等の他のニューロンモジュレーターの間の相互作用に干渉（例えば、低下または阻害）することができる。
【００１３】
１つの実施形態によると、ＴＬＲ１４結合剤（例えば、ＴＬＲ１４アンタゴニスト）を含めたＴＬＲ１４モジュレーターは、高い親和性でもって、例えば、少なくとも約１０７Ｍ−１、典型的には約１０８Ｍ−１、より典型的には約１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１またはそれ以上の親和性定数でもってＴＬＲ１４に結合し；およびＴＬＲ１４応答性細胞および／または組織（例えば、神経細胞または神経細胞の集団）において１または複数のＴＬＲ１４生物学的活性を変調し、例えば、低下させおよび／または阻害する。神経細胞またはその集団は、例えば、ドーパミン作動性、コリン作動性、皮質、小脳、海馬、脊髄ニューロン細胞を含めたニューロン細胞および／または小神経膠細胞、星状神経膠細胞、および稀突起神経膠細胞を含めた神経膠細胞であり得る。本発明の方法および組成物の変調する、例えば、阻害し、または低下させることができる例示的なＴＬＲ１４活性は、限定されるものではないが、以下の（ｉ）ＮｇＲ１結合または活性の変調、（ｉｉ）ｐ７５ＮＴＲ結合または発生、（ｉｉｉ）エンドトキシンシグナリングの変調、例えば、脳における１または複数のエンドトキシン−（例えば、ＬＰＳ）−媒介炎症シグナルの変調（例えば、ＴＣＲ１４へのエンドトキシンの結合、ＩκＢ分解、ｐ３８のリン酸化、プロ炎症サイトカインまたケモカイン分泌、例えば、星状神経膠細胞における酸化窒素生産の誘導、またはニューロン生存性および／またはグリオーシスの変調の１または複数の変調）、および／または（ｉｖ）ニューロン細胞の生存、分化および／または神経突起外殖の１または複数の変調の１または複数を含む。
【００１４】
添付の実施例に示すように、ＴＬＲ１４−発現小脳顆粒ニューロンとＴＬＲ１４結合抗体との接触は、in vitroにて神経突起外殖のミエリン誘導阻害を逆行させた。従って、理論に拘束されることなく、出願人は、ＴＣＲ１４が神経突起外殖脳府のレギュレーターとして作用し、従って、ＴＬＲ１４活性の阻害が、障害または疾患の治療または予防、および／または脳負傷および／または脳障害（神経変性障害）に関連する兆候を軽減することができると信じる。
【００１５】
１つの実施形態において、ＴＬＲ１４モジュレーターは、ＴＬＲ１４に対する抗体分子である。抗体分子はモノクローナルまたは単一特異性抗体、あるいはＴＬＲ１４、例えば、哺乳動物（例えば、ヒトＴＬＲ１４またはその機能的変種））に結合するその抗原−結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一鎖Ｆｖ断片、サメ抗体、またはラクダ変種）であり得る。典型的には、抗体分子は、ヒトＴＣＲ１４（またはその機能的断片）に対するヒト、ヒト化、キメラ、ラクダ、またはin vitroで生じた抗体である。典型的には、抗体分子はＴＣＲ１４の１または複数の活性（例えば、本明細書中に記載されたＴＣＲ１４の１または複数の生物学的活性）を阻害し、低下させ、または中和する。１つの実施形態において、抗体分子はＴＬＲ１４ポリペプチドまたはその部分、例えば、ＴＬＲ１４の細胞外ドメイン（例えば、図２（配列番号２）の約アミノ酸１〜６９５または６９６、またはその断片、例えば、約アミノ酸８５〜１０３、または５０９〜９２６に結合する。他の実施形態において、抗体分子はＴＬＲ１４のロイシン−リッチなドメイン、例えば、図２（配列番号２）の約アミノ酸２６〜５８、８２〜１０５、１０６〜１２９、１３０〜１５３、１５４〜１７７、１７８〜２０１、２０２〜２２７、２２８〜２５１、２５２〜２７５、２７６〜２９９、３００〜３２３、３２４〜３４７、または３５９〜３１５に位置するドメインに結合する。なお、もう１つの実施形態において、抗体分子は図２（配列番号２）の約アミノ酸５８９〜６７１に位置したフィブロネクチン−タイプＩＩＩドメイン（ＦＮ３）、および／または図２（配列番号２）の約アミノ酸６４０〜６６０、６４５〜６５５、または６５２〜６５４に位置したＲＧＤインテグリン結合部位に結合する。ヒトＴＬＲ１４蛋白質は、配列番号２の約アミノ酸１〜２０に対応する、リーダーアミノ酸約２０〜２１アミノ酸超を含むことができる。なお、他の実施形態において、抗体分子は、例えば、約アミノ酸７２０〜８１１におけるＴＬＲ１４の細胞内ドメインまたはその部分（例えば、図２（配列番号２）の約アミノ酸７９６〜８１１）に結合する。なお、他の実施形態において、抗体分子は本明細書中に記載された抗体０５４０（Ａ）、０５４１（Ｂ）、および０５４７（Ｃ）のいずれかと、ＴＬＲ１４への結合について競合する（例えば、抗体分子は、抗体０５４０（Ａ）、０５４１（Ｂ）、および０５４７（Ｃ）によって認識されるものと同一、または実質的に同様なＴＬＲ１４上のエピトープに結合する）。他の実施形態において、抗体分子は本明細書中に記載されたエピトープに結合し、ＴＬＲ１４の１または複数の活性を阻害し、低下させ、または中和する。
【００１６】
ある実施形態において、抗体分子はＴＬＲ１４−関連ポリペプチド、例えば、ＮｇＲ１（例えば、ヒトＮｇＲ１）；またはｐ７５ＮＴＲ（例えば、ヒトｐ７５ＮＴＲ）に結合する。例えば、抗体分子は、図２２Ｂ（配列番号８）または図２４Ｂ（配列番号１２）に各々示された、哺乳動物、例えば、ヒトＮｇＲ１またはｐ７５ＮＴＲと同一なアミノ酸配列を含むＮｇＲ１またはｐ７５ＮＴＲ、またはその実質的に相同な配列に結合し、ＴＬＲ１４の１または複数の活性を阻害し、低下させ、または中和する。
【００１７】
抗体分子は、全長であり得（例えば、少なくとも１つの、典型的には、２つの完全な重鎖、および少なくとも１つの典型的には、２つの完全な軽鎖を含むことができ）、あるいは抗原−結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２Ｆｖまたは単一鎖Ｆｖ断片）であり得る。なお、他の実施形態において、抗体分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥの重鎖定常領域から選択された；特に例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の（例えば、ヒト）重鎖定常領域から選択された重鎖定常領域を有する。もう１つの実施形態において、抗体分子は、例えば、カッパまたはラムダの（例えば、ヒト）軽鎖定常領域から選択された軽鎖定常領域を有する。定常領域は改変して、例えば、抗体の特性を修飾する（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、および／または補体機能の１または複数を増加させ、または減少させる）ことができる。
【００１８】
他の実施形態において、ＴＬＲ１４アンタゴニストは全長、またはＴＬＲ１４ポリペプチドの断片である。例えば、アンタゴニストはＴＣＲ１４−関連蛋白質の可溶性形態（例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）ＴＬＲ１４の可溶性形態；例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）ＴＣＲ１４の細胞外ドメインの可溶性形態）であり得る。例えば、ＴＬＲ１４アンタゴニストは図２（配列番号２）の約アミノ酸１〜６９５またはその断片を含むことができる。
【００１９】
ＴＬＲ１４の可溶性形態は、単独で用い、または（例えば、化学的カップリング、遺伝子またはポリペプチド融合、非−共有結合その他によって）第２の部位、例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン、血清アルブミン、ＰＥＧ化、ＧＳＴ，ＬｅｘＡまたはＭＢＰポリペプチド配列に機能的に連結させることができる。融合蛋白質は、加えて、第１の部位、例えば、可溶性ＴＬＲ１４を第２の部位へ連結するリンカー配列を含む。他の実施形態において、さらなるアミノ酸配列を融合蛋白質のＮ−またはＣ−末端に付加させて、発現、立体的柔軟性検出および／または単離または精製を容易とすることができる。例えば、ＴＬＲ１４の可溶性形態は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含めた種々のイソタイプの重鎖定常領域に融合させることができる。典型的には、融合蛋白質はヒトＴＬＲ１４の細胞外ドメイン（またはそれに相同な配列）を含むことができ、例えば、ヒト免疫グロブリンＦｃ鎖、例えば、ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２、またはその突然変異した形態）に融合させることができる。Ｆｃ配列は１または複数のアミノ酸において突然変異させて、エフェクター細胞の機能Ｆｃ受容体結合および／または補体活性を低下させることができる。
【００２０】
本明細書中に記載された抗体分子および／または可溶性または融合蛋白質は、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合その他によって）とりわけ、抗体（例えば、二特異的または多特異的抗体）、トキシン、放射性同位体、細胞傷害性または静細胞剤のような１または複数の他の分子存在に機能的に連結させることができる。
【００２１】
もう一つの実施形態において、ＴＬＲ１４モジュレーター例えば、ＴＬＲ１４結合剤はＴＬＲ１４をコードする核酸の発現を阻害する。そのようなＴＬＲ１４結合剤、例えば、ＴＬＲ１４アンタゴニストの例はアンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡi、および３重ラセン分子のような核酸分子を含む。これらの核酸は、ＴＬＲ１４をコードする核酸、またはその転写調節領域にハイブリダイズし、ＴＬＲ１４のｍＲＮＡ発現をブロックし、または低下させる。
【００２２】
in vivo実施形態においては、ＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、ＴＬＲ１４アンタゴニストは、ＴＬＲ１４関連障害および／または疾患を有する対象、またはそれを有する危険性がある対象に投与することができる。そのような実施形態において対象は、ＴＬＲ１４−関連神経変性疾患および／または障害に罹った哺乳動物、例えば、ヒトである。神経変性疾患および／または障害は、急性神経変性疾患、または慢性または進行性疾患であり得る。本発明の方法および組成物を用いて治療し予防することができる特別な選択された疾患または障害は、限定されるものではないが、ＣＮＳ負傷および／または軸索変性に関連する疾患または障害；パーキンソン病；限定されるものではないが、アルツハイマー病および年齢−関連認知症を含めた認知症；ハンチントン病；筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；外傷の負傷；脊髄負傷；多発性硬化症；化学療法のような医療的処置に関連する神経障害；虚血症または虚血症−誘導負傷；および発作を含む。神経変性疾患または障害は細菌感染（例えば、Ｓｔａｐｈｉｌｏｃｏｃｏｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｏｕｓおよびＰｎｅｕｍｏｃｏｃｏｕｓ）によって引き起こされたＣＬＳ疾患、および脳炎のような感染および神経炎症疾患も含むことができ。ある実施形態において、ＴＬＲ１４モジュレーターは神経変性疾患に関連する対象において１または複数の兆候を低下させ、または軽減する。ある実施形態において、ＴＬＲ１４モジュレーターは神経変性障害の進行を減少させ、または安定化する。
【００２３】
ＴＬＲ１４モジュレーターは、単独であるいはＴＬＲ１４関連神経変性障害および／または疾患を治療するのに有用な１または複数の剤（例えば、第２の治療剤または治療様式）と組合せて対象に投与することができる。１つの実施形態において、第２の剤または治療様式はＮｇＲ１アンタゴニスト、ｐ７５ＮＴＲアンタゴニスト、ベータブロッカー、ホルモンアンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、カルシウムチャネルブロッカー、サイトカイン阻害剤、スタチンおよび／または抗炎症剤である。他の実施形態において、この第２の剤はニューロン障害の兆候を治療するのにそうでなければ有用な剤であり得る（例えば、ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ（商標））およびリバスチグミン酒石酸（Ｅｘｅｌｏｎ（商標））。
【００２４】
なおもう１つの態様において、本発明は、対象において、ＴＬＲ１４−関連疾患および／または障害（例えば、ＴＬＲ１４−関連神経変性疾患および／または障害）を治療し、または予防する（例えば、１または複数の兆候を治癒し、抑制し、緩和し、軽減し、その開始または進行を遅延し、または予防し、またはその再発またはぶり返しを予防する）方法をその特徴とする。該方法は、対象に、ＴＬＲ１４−応答性細胞および／または組織、例えば、神経細胞および／または組織において１または複数のＴＬＲ１４生物学的活性（例えば、本明細書中に記載された生物学的活性）を変調し、例えば、阻害しまたは低下させるのに十分な量で、ＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、ＴＬＲ１４結合剤（例えば、本明細書中に記載されたＴＬＲ１４アンタゴニスト）を投与し、それにより障害または疾患を治療し、または予防することを含む。対象は、例えば、本明細書中に記載されたＴＬＲ１４−関連疾患および／または障害に罹った哺乳動物（例えば、ヒト）であり得る。いくつかの実施形態において、投与するＴＬＲ１４モジュレーターの量または用量、例えば、対象に投与するに先立って、in vitroまたはex vivoにて前記ＴＬＲ１４生物学的活性の１または複数を阻害し、または低下させるのに必要とされるＴＬＲ１４アンタゴニストの量をテストすることによって決定することができる。該方法は、所望により、ＴＬＲ１４−関連疾患および／または障害（例えば、本明細書中に記載された神経変性疾患および／または障害）に関連する１または複数の兆候を有する危険性がある、または有する対象を同定する（例えば、評価する、診断する、スクリーニングするおよび／または選択する）工程を含むことができる。
【００２５】
神経変性疾患および／または障害は、急性神経変性疾患、または慢性または進行性疾患であり得る。本発明の方法および組成物を用いて治療し、または予防することができる特別な選択された疾患または障害は、限定されるものではないが、ＣＮＳ負傷および／または軸索変性に関連する疾患または障害:パーキンソン病；アルツハイマー病；ハンチントン病；筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；外傷脳負傷；脊髄負傷；多発性硬化症；化学療法のような医療的処置に関連する神経障害；虚血症または虚血症―誘導負傷；および発作を含む。神経変性疾患または障害は、細菌感染（例えば、Ｓｔａｐｈｉｌｏｃｏｃｏｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｏｕｓおよびＰｎｅｕｍｏｃｏｃｏｕｓ）によって引き起こされたＣＮＳ疾患、および脳炎のような感染および神経炎症疾患も含むことができる。
【００２６】
ＴＬＲ１４モジュレーターは、単独で、あるいはＴＬＲ１４関連神経変性障害および／または疾患を治療するのに有用な１または複数の剤（例えば、第２の治療剤または治療様式）と組合せて対象に投与することができる。１つの実施形態において、第２の剤または治療様式はＮｇｒ1アンタゴニスト、ｐ７５ＮＴＲアンタゴニスト、ベータブロッカー、ホルモンアンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、カルシウムチャネルブロッカー、サイトカイン阻害剤、スタチン、および/または抗−炎症剤である。他の実施対応において、この第２の剤は、ニューロン障害の兆候を治療するのにそうでなければ有用な剤（例えば、ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ（商標））およびリバスチグミン酒石酸（Ｅｘｅｌｏｎ（商標））であり得る。
【００２７】
なおもう１つの態様において、本発明は、ニューロン細胞（例えば、ドーパミン作動性、コリン作動性、皮質、小脳、海馬および／または脊髄ニューロン細胞）の神経突起外殖、生存、および／または分化の１または複数を刺激する方法を提供する。該方法は、細胞を、ＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、本明細書中に記載されたＴＬＲ１４結合剤（例えば、ＴＬＲ１４アンタゴニスト）を接触させることを含む、アンタゴニストはＴＬＲ１４活性および/または発現の阻害剤であり得る。1つの実施形態において、阻害剤はＴＬＲ１４の細胞外アンタゴニスト、例えば、ＴＬＲ１４の細胞外ドメインと相互作用する抗体分子である。他の実施対応において、ＴＬＲ１４モジュレーターはＴＬＲ１４の細胞内アンタゴニストであり、例えば、ＴＬＲ１４アンタゴニストは、ＴＬＲ１４  ｍＲＮＡの転写の阻害剤、例えば、ＲＮＡｉである。典型的には、ＴＬＲ１４モジュレーターは、ＴＬＲ１４および／またはＴＬＲ１４−関連蛋白質、例えば、ＮｇＲ１および／またはｐ７５ＮＴＲと相互作用するのに十分な量で投与される。接触工程は、本明細書中に記載されたように、in vitroにて、例えば、培養中にて、またはin vivoにて、例えば対象への投与によって行うことができる。
【００２８】
なおもう１つの態様において、本発明は、対象において神経組織を再生し、および／または修復する方法を提供する。該方法は、神経組織をＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、ＴＬＲ１４結合剤（例えば、ＴＬＲ１４アンタゴニスト）と接触させることを含む。アンタゴニストは、ＴＬＲ１４の活性および／または発現の阻害剤であり得る。１つの実施形態において、阻害剤はＴＬＲ１４の細胞外アンタゴニスト、例えば、ＴＬＲ１４の細胞外ドメインと相互作用する抗体分子である。他の実施対応において、ＴＬＲ１４モジュレーターはＴＬＲ１４の細胞内アンタゴニストであり、例えば、ＴＬＲ１４アンタゴニストはＴＬＲ１４  ｍＲＮＡの転写の阻害剤、例えば、ＲＮＡｉである。ある実施形態において、ＴＬＲ１４モジュレーターは、ＴＬＲ１４および／またはＴＬＲ１４−関連蛋白質、例えば、ＮｇＲ１および／またはｐ７５ＮＴＲと相互作用するのに十分な量で投与される。接触工程はin vitroにて、例えば、培養中に、またはin vivoにて、例えば、本明細書中に記載されたように対象への投与によって行うことができる。
【００２９】
なおもう１つの態様において、本発明は、対象において、神経変性病に関連する免疫応答、または脳におけるエンドトキシン−媒介炎症応答を変調し、例えば、低下させ、または阻害する方法を提供する。該方法は、対象にＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、ＴＬＲ１４結合剤（例えば、ＴＬＲ１４アンタゴニスト）を投与することを含む。アンタゴニスト）は、ＴＬＲ１４の活性および／または発現の阻害剤であり得る。１つの実施形態において、阻害剤はＴＬＲ１４の細胞外アンタゴニスト、例えば、ＴＬＲ１４の細胞外ドメインと干渉する抗体分子である。他の実施対応において、ＴＬＲ４モジュレーターはＴＬＲ１４の細胞外アンタゴニストであり、例えば、ＴＬＲ１４アンタゴニストは、ＴＬＲ１４  ｍＲＮＡの転写の阻害剤、例えば、ＲＮＡiである。典型的には、ＴＬＲ１４モジュレーターは、ＴＬＲ１４および／またはＴＬＲ１４−関連蛋白質、例えば、ＮｇＲ１またはｐ７５ＮＴＲと相互作用する（例えば、それに結合し、および／またはその会合および／または活性を阻害する）のに十分な量で投与される。他の実施形態においては、ＴＬＲ１４モジュレーターは、ＴＬＲ１４およびエンドトキシン、例えば、ＬＰＳと相互作用する（例えば、それに結合し、および／またはその会合および／または活性を阻害する）のに十分な量で投与される。
【００３０】
もう１つの態様において、本発明は、ＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、ＴＬＲ１４結合剤（例えば、神経細胞および／または組織におけるＴＬＲ１４の発現および／または活性のアンタゴニスト）を提供する。例えば、ＴＬＲ１４結合剤（例えば、抗−ＴＬＲ１４抗体、可溶性ＴＬＲまたはその融合蛋白質）は、本明細書中に開示された方法を用いて同定し、および／または生じさせることができる。ＴＬＲ１４モジュレーター、を含む医薬組成物のような組成物も開示させる。組成物は、加えて、第２の治療剤、例えば、本明細書中に記載された第２の治療剤を含むことができることを注記する。
【００３１】
本明細書中鎖所望により中に記載された神経変性障害または疾患を治療するのに用いるＴＬＲ１４モジュレーターを含む包装された医薬組成物もまた本発明に含まれる、所望により、包装された医薬組成物は、標識され、および／または本明細書中に記載された神経変性障害または疾患を治療するのに用いられるいくつかの指示書を含有する。
【００３２】
もう１つの態様において、本発明は、ＴＬＲ１４結合剤、例えば、ＴＬＲ１４ポリペプチドまたはその断片、またはＴＬＲ１４をコードする核酸と相互作用する、より好ましくは、それに特異的に結合する、抗体分子、変種分子、小分子、アンチセンス核酸分子をその特徴とする。１つの実施対応において、抗体分子または変種分子は哺乳動物、例えば、ヒトＴＬＲ１４ポリペプチドまたはその断片に結合する。１つの実施形態において、抗体分子はＴＬＲ１４ポリペプチド、またはその部分、例えば、ＴＬＲ１４の細胞外ドメイン（例えば、図２（配列番号２）の約アミノ酸１〜６９５または６９６、またはその断片、例えば、約アミノ酸８５〜１０３、または５０９〜５２６）に結合する。他の実施形態において、抗体分子は、ＴＬＲ１４のロイシン−リッチなドメイン、例えば、図２（配列番号２）の約アミノ酸２６〜５８、８２〜１０５、１０６〜１２９、１３０〜１５３、１５４〜１７７、１７８〜２０１、２０２〜２２７、２２８〜２５１、２５２〜２７５、２７６〜２９９、３００〜３２３、３２４〜３４７、または３５９〜３１５に位置するドメインに結合する。なおもう１つの実施形態において、抗体分子は図２（配列番号２）の約アミノ酸５８９〜６７１に位置したフィブロネクチン−タイプＩＩＩドメイン（ＦＮ３），および／または図２（配列番号２）の約アミノ酸６４０〜６６０、６４５〜６５５、または６５２〜６５４に位置するＲＧＤインテグリン結合部位に結合する。ヒトＴＬＲ１４蛋白質は、（配列番号２）の約アミノ酸１〜２０に対応する約２０〜２１アミノ酸長のリーダー配列を含むことができる。なお他の実施形態において、抗体分子または変種分子はＴＬＲ１４の細胞内ドメインに、例えば、約アミノ酸７２０〜８１１、またはその部分（例えば、図２（配列番号２））の約アミノ酸７９６〜８１１）において結合する。なお他の実施形態において、抗体分子または変種分子は、本明細書中に記載された抗体０５４０（Ａ）、０５４１（Ｂ）、および０５４７（Ｃ）のいずれかと、ＴＬＲ１４への結合について競合する（例えば、抗体分子は、抗体０５４０（Ａ）、０５４１（Ｂ）、および０５４７（Ｃ）によって認識させるものと同一つまたは実質的に同様なＴＬＲ１４上のエピトープに結合する）。他の実施形態において、抗体分子または変種分子は、本明細書中に記載されたエピトープ結合し、およびＴＬＲ１４の１または複数の活性を阻害し、低下させ、または中和する。１つの実施形態において、抗体分子または変種分子は、１または複数のＴＬＲ１４−関連活性、例えば、本明細書中に記載された活性を変調し、例えば、拮抗する。
【００３３】
１つの態様において、本発明は、ヒトＴＬＲ１４蛋白質に、特異的に結合する抗体分子または変種分子を提供する方法をその特徴とする。該方法は：ヒトＴＬＲ１４蛋白質またはその断片（例えば、本明細書中に記載されたＴＬＲ１４蛋白質の少なくとも１部を含む抗原）を供し；ヒトＴＬＲ１４蛋白質またはその断片に特異的に結合する抗体分子または変種分子を得；次いで、抗体分子または変種分子がヒトＴＬＲ１４蛋白質に特異的に結合するかを評価し、またはヒトＴＬＲ１４蛋白質の活性を変調する。例えば、阻害するにおける抗体分子または変種分子の効率を評価することを含む。該方法は、さらに、抗体分子を対象、例えば、ヒトまたは非−ヒト動物に投与することを含む。
【００３４】
もう１つの態様において、本発明は、テスト試料において、ＴＬＲ１４関連障害、例えば、神経変性障害（例えば、本明細書中に記載された障害）を評価し、診断し、および／またはその進行をモニターする方法をその特徴とする。該方法は、参照試料、例えば、正常な対象から得られた、または治療に先立っての試料に対する核酸またはポリペプチドのレベルの差が、障害の存在または進行を示すように、ＴＬＲ１４またはＴＬＲ１４−関連遺伝子から選択された核酸またはポリペプチドの発現または活性を評価することを含む、ある実施形態において、ＴＬＲ１４関連核酸またはポリペプチドは、ＴＬＲ１４に応答しての改変された発現によって特徴付けられる。ある実施形態において、参照試料に対する、テスト試料中のＴＬＲ１４またはＴＬＲ１４−関連遺伝子のレベルの増加は、ＴＬＲ１４機能の拮抗が望ましいＴＬＲ１４障害（例えば、本明細書中に記載された神経変性障害）の診断に関連付けられる。他の実施対応において、参照試料に対する、テスト試料中のＴＬＲ１４またはＴＬＲ１４−関連遺伝子のレベルの減少は、ＴＬＲ１４機能が望ましいＴＬＲ１４障害の診断に関連付けられる。
【００３５】
１つの実施形態において、評価工程はin vitroまたはex vivoで行われる。例えば、試料、例えば、血清試料は対象から得られる。
【００３６】
１つの実施形態において、評価工程はin vivoで行われる。例えば、ＴＬＲ１６、またはＴＬＲ１４関連核酸またはポリペプチドに相互作用する検出可能に標識された剤を対象に投与することによって、該核酸またはポリペプチドの活性または発現のレベルに対してシグナルが生じる。
【００３７】
なおもう１つの態様において、本発明は、化合物、例えば、ＴＣＲ１４機能を変調するテスト化合物を同定するための方法、またはアッセイを提供する。該方法またはアッセイは：ＴＬＲ１４またはＴＬＲ１４−関連蛋白質と相互作用し、例えば、それに結合するテスト剤を供する、または同定することを含む。該方法は、さらに、参照、例えば、参照試料に対して、テスト剤の存在下で神経組織の活性の変化を評価する工程を含むことができる。
【００３８】
テスト化合物は、抗体分子；ペプチド；可溶性ＰＬＲ１４またはその融合；変種分子；小分子、例えば、コンビナトーリアルまたは天然産物ライブラリーのメンバー；核酸；アンチセンス分子；リボザイム；ＲＮＡｉ；３重ラセン分子；またはそのいずれかの組合せであり得る。１つの実施形態において、テスト化合物はＴＬＲ１４ポリペプチドまたは核酸の活性または発現を変調する（例えば、減少させ、または増加させる）。例えば、ＴＬＲ１４核酸の発現は、例えば、ｍＲＮA転写を改変編し、および／またはｍＲＮＡ活性を改変することによって変調することができる。
【００３９】
ある実施形態において、評価工程は、ＴＬＡ１４（例えば、本明細書中に記載されたＴＬＲ１４）、またはＴＬＲ１４をコードする核酸の１または複数をテスト化合物と接触させ、次いで、所定のレベル、例えば、テスト化合物を含まない対照試料に対して、テスト化合物の存在下で、ＴＬＲ１４ポリペプチドまたは核酸の１または複数の活性の変化を評価することを含む。接触工程（培養細胞、例えば、神経細胞、または復元された系において）in vitroにて、あるいは（例えば、テスト化合物を非−ヒト対象、例えば、ＣＮＳ炎症障害、例えば、ＴＬＲ１４、またはＴＬＲ１４関連蛋白質、例えば、ＮｇＲ１および／またはｐ７５ＮＴＲをコードする遺伝子におけるＥＡＥまたは突然変異を有する動物モデルにテスト化合物を投与することによって）in vivoにて行うことができる。接触工程および／または、テスト化合物の投与は反復することができる。他の実施形態において、ＴＬＲ１４−応答性細胞の活性の変化は、参照、例えば、参照試料（例えば、テスト化合物に曝露されていない対照試料）に対する、テスト化合物の存在下での、（ｉ）Ｎｇｒ１結合または活性の変調、（ｉｉ）ｐ７５ＮＴＲ結合または活性の変調、（ｉｉｉ）エンドトキシンシグナリングの変調、例えば、脳における、１または複数のエンドトキシン−（例えば、ＬＰＳ-）媒介炎症シグナルの変調（例えば、：ＴＬＲ１４へのエンドトキシン結合、ＩκＢ分解、ｐ３８のリン酸化、プロ−炎症サイトカインまたはケモカイン分泌、例えば、星状神経膠細胞における酸化窒素生産の誘導、またはニューロン生存性および／またはグリオーシスの変調の１または複数の変調）、（ｉｖ）ニューロン細胞生存、分化、神経突起外殖および／または軸作再生の１または複数の変調、（ｖ）ＲｈｏＡ、ＰＫＣ、ＣｄＣ４２、Ｒａｃ１、ＰＡＫ１、ＲＯＣＫ、ＬＩＭ−キナーゼ、コフィリン、アクチンの１または複数の活性化、ｃＡＮＰレベル、ＥＲＫ活性化、ＮＦ−ｋＢ、ＴＮＦａ、ＩＬ−１ｂ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１２のような免疫遺伝子の大きなファミリーの転写活性化、またはＮＯの生産、および／または（ｖｉ）（ｉ）〜（ｉｖ）の組合せの１または複数における変化を測定することによって評価される。ある実施形態において、（ｉ）〜（ｖｉ）の１または複数の減少はＴＬＲ１４機能のアンタゴニストを示し、これは、ＴＬＲ１４拮抗が望ましい神経変性障害の治療のための候補であり得る。
【００４０】
ある実施形態において、テスト化合物、ＴＬＲ１４またはＴＬＲ１４−関連ポリペプチド、例えば、ＮｇＲ１またはｐ７５ＮＴＲの間の相互作用を評価する。ある実施形態においては、そのような相互作用が、テスト化合物およびＴＬＲ１４および／またはＴＬＲ１４−関連ポリペプチドの間の複合体の形成および／または安定性の変化を検出することによって評価することができる。例えば、テスト化合物の存在下または不存在下におけるＴＬＲ１４およびＮｇＲ１またはｐ７５ＮＴＲの間の結合、例えば、複合体の形成を評価することができる。そのような相互作用は：例えば、生化学検出、親和性ベースの検出（例えば、ウエスタンブロット、アフィニティーカラム）、免疫沈澱、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）―ベースのアッセイ、分光分析手段（例えば、円二色性、吸光度および溶液特性の他の測定）による複合体それ自体の結合または物理的形成の変化；シグナル変換、例えば、ＴＬＲ１４、ＩκＢ分解へのＬＰＳ結合、ｐ３８のリン酸化、プロ−炎症サイトカインまたはケモカイン分泌、例えば、星状神経膠細胞における酸化窒素生産の誘導、またはニューロン生存性および／またはグリオーシスの変調；および／またはニューロン細胞生存、分化および／または神経突起外殖の１または複数の変調の変化、例えば、減少または増加の１または複数を検出することによって決定することができる。
【００４１】
１つの実施形態において、テスト化合物を同定し、同一または異なるアッセイにおいて評価する、例えば、テスト化合物をin vitroまたは無細胞系において同定し、動物モデルまたは細胞−ベースのアッセイで評価する。アッセイのいずれの順序または組合せも用いることができる。例えば、高スループットアッセイを動物モデルまたは組織培養と組合せて用いることができる。
【００４２】
他の実施形態において、該方法またはアッセイは、近接性−依存性シグナル生成ベースの工程、例えば、第１の融合蛋白質（例えば、ＴＬＲ１４部分を含む有効蛋白質）および第２の融合蛋白質（例えば、ＴＬＲ１４−関連ポリペプチドを含む融合蛋白質）を含む２−ハイブリッドアッセイを供し、該２−ハイブリッドアッセイを、該２ハイブリッドアッセイが複合体の形成および／または安定性の差を検出し、例えば、複合体の形成がレポーター遺伝子の転写活性化を開始させる条件下で該２−ハイブリッドアッセイをテスト化合物と接触させることを含む。
【００４３】
なおもう１つの態様において、本発明は、本明細書中に開示された複合体のＴＬＲ１４またはＴＬＲ１４―関連ポリペプチド構成要素の１または複数をコードする１または複数の核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００４４】
もう１つの態様において、本発明は、ＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、ＴＬＲ１４結合剤（例えば、ＴＬＲ１４アンタゴニスト）および医薬上許容される担体を含む組成物、例えば、治療用の医薬組成物を提供する。該組成物は、ＴＬＲ１４モジュレーターとの組合せ療法に適した１または複数のさらなる剤を含むことができる。組成物を用いて、対象、例えば、神経変性病を有する患者を治療することができる。
【００４５】
なおもう１つの態様において、本発明は、（ｉ）神経変性障害または疾患、例えば、本明細書中に記載された障害または疾患の治療、（ｉｉ）ニューロン細胞生存、分化、神経突起および／または軸作外殖、および／またはニューロン再生の１または複数の誘導、または（ｉｉｉ）脳におけるエンドトキシン−媒介シグナリングの低下または阻害の１または複数のための医薬の調製におけるＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、ＴＬＲ１４結合剤（例えば、ＴＬＲ１４アンタゴニスト）の使用を提供する。
【００４６】
本明細書中で用いるように、冠詞「ある」とは、冠詞の文法的目的の１、または１を超える（例えば、少なくとも１）をいう。
【００４７】
用語「または」は、本明細書中においては、文脈が明らかにそうでないことを示すのでなければ、用語「および／または」を意味し、それと相互交換可能に用いられる。
【００４８】
用語「蛋白質」および「ポリペプチド」は、相互交換可能に本明細書中で用いられる。
【００４９】
「約」および「ほぼ」は、一般に、測定の性質または精度を仮定すれば、測定された量についての誤差の許容される程度を意味する。誤差の例示的な程度は与えられた値または値の範囲の２０パーセント（％）内、典型的には１０％内、より典型的には５％内である。アミノ酸またはヌクレオチド配列についての範囲値の関係では、用語「約」は、１つのまたは双方の目的点において、１、２、３、４または５残基またはヌクレオチドだけ異なる範囲を含む。例えば、フレーズ、配列の「約アミノ酸９〜２２」は、特定のアミノ酸配列の７〜２３、１１〜２０のようなアミノ酸配列を含むことができる。
【００５０】
全ての刊行物、特許出願、特許および他の本明細書中に言及された文献は引用してその全体を援用する。
【００５１】
本発明の他の特徴、目的および利点は明細書および図面から、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、ヒトＴＬＲ１４のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２】図２は、ヒトＴＬＲ１４のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】図３はネズミＴＬＲ１４のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図４】図４は、ネズミＴＬＲ１４のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図５】図５は、ＴＬＲ１４、および他のロイシンリッチな反復含有蛋白質の系統発生分析を示す。
【図６】図６は、ＴＬＲ１４およびＮｏｇｏ−６６受容体１（ＮｇＲ）の配列整列を示す。陰影領域は同一性の領域を示す。
【図７】図７Ａは、ＮｇＲの結晶構造を示す。図７Ｂは、ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇから入手可能な自動Ｓｗｉｓｓモデル相同性−モデリングパイプラインを用いて生じさせたＴＬＦ１４の予測される構造を示す
【図８】図８は、ＴＬＲ１４、およびフィブロネクチンドメイン含有ファミリーの蛋白質のメンバーの間の相同性を示す。フィブロネクチンのロイシンリッチな膜貫通蛋白質（ＦＬＲＴ（例えば、ＦＬＲＴ  １−３））は、ＬＲＲ（ロイシン―リッチな反復ドメイン）、（ＦＮ３（フィブロレクチンタイプＩＩＩドメイン）、および膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含有する。太文字のフォントは、ＦＮ３ドメインを示す。太文字の下線を施したフォントは、ＲＺＤインテグリン結合部位を示す。二重線の塗りつぶしていないボックスは、膜貫通ドメインを示す。ＬＲＲドメインはアミノ酸２６〜５８（ＬＲＲＮＴ）；アミノ酸８２〜１０５（ＬＲＲ  ＴＹＰ）；アミノ酸１０６〜１２９（ＬＲＲ  ＴＹＰ）；アミノ酸１３０〜１５３（ＬＲＲ  ＴＹＰ）；アミノ酸１５４〜１７７（ＬＲＲ  ＴＹＰ）；アミノ酸１７８〜２０１（ＬＲＲ  ＴＹＰ）；アミノ酸２０２〜２２７（ＬＲＲ）；アミノ酸２２８〜２５１（ＬＲＲ  ＴＹＰ）；アミノ酸２５２〜２７５（ＬＲＲ  ＴＹＰ）；アミノ酸２７６〜２９９（ＬＲＲ  ＴＹＰ）；アミノ酸３００〜３２３（ＬＲＲ  ＴＹＰ）；アミノ酸３２４〜３４７（ＬＲＲ  ＴＹＰ）；およびアミノ酸３５９〜４１５（ＬＲＲＣＴ）である。示された配列はヒトＴＬＲ１４（配列番号２）である。ヒトＴＬＲ１４蛋白質は、配列番号２の約アミノ酸１〜２０に対応する約２０〜２１アミノ酸長のリーダー配列を含むことができる。該ドメインは、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：５８５７−５８６４およびＬｅｔｕｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ３４：Ｄ２５７−Ｄ２６０に記載されたＳＭＡＲＴソフトウエアに従って予測した。
【図９】図９は、ＬＲＲおよびＦＮ３ドメインを含有するさらなる蛋白質を示す表である。ロイシンリッチおよびフィブロネクチン含有（ＬＲＦＮ）；ニューロンロイシン―リッチな反復蛋白質（ＮＬＲＲ／ＬＲＲＮ）；光受容体−関連ＬＲＲスーパーファミリー（Ｐａl）;ＳＬＩＴ−様２（Ｈｏｍo   Ｓａｐｉｅｎｓ  Ｖａｓｏｒｉｎ）（ＳＬＩＴＬ）。他の略語：ＩｇＣ２（Ｃ２クラスの免疫グロブリンドメイン）、ＥＧＦ(表皮成長因子ドメイン)、Ｔｙｒｋ(チロシンキナーゼドメイン)。
【図１０】図１０は、ＳｙｍＡｔｌａｓ（Ｓｕ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＰＮＡＳ  ９９（７）：４４６５−７０）から得られたヒトＴＬＲ１４についてのｍＲＮＡ発現プロフィールを示す。
【図１１】図１１は、脳組織におけるＴＬＲ１４の発現プロファイリングを示す散乱プロットである。
【図１２】図１２は、アルツハイマーおよびパーキンソー病患者における上昇したＴＬＲ１４  ｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。図１２Ａは、家系学的発現データベースにおいてＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭによって測定された正常、アルツハイマー、およびパーキンソン脳試料についてのＴＬＲ１４平均±標準偏差発現レベルを示す。図１２Ｂは、（Ａ）で用いた個々の測定を示す。図１２Ｃは、図１２Ａおよび１２Ｂに存在するデータの表にしたまとめである。「頻度データベース」は、ＴＬＲ１４についての検出の全頻度を示す。「％パーセント」は、ＴＬＲ１４が検出された正常、アルツハイマー、およびパーキンソー試料の分率を示す。
【図１３】図１３は、抗―ＴＬＲ１４抗体０５４０（Ａ）、０５４１（Ｂ）、および０５４７（Ｃ）によって認識されたヒトＴＬＲ１４上のエピトープを示す。膜貫通ドメインを塗りつぶしていないボックスによって示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｄは、抗−ＴＬＲ１４  ０５４７抗体ペプチド競合アッセイを示すイムノブロットである。用いた細胞型はＣＨＯ−Ｋ１（１）、ＴＬＲ１４／ＣＨＯ−Ｋ１（２）、ＣＨＯ−Ｋ１（３）、星状神経膠細胞（４）、Ｅ１８  ＣＮ（皮質ニューロン）（５）、Ｐ４  ＣＧＮ（小脳顆粒ニューロン）（６および７）、Ｐ７  Ｃｂ（小脳溶解物）（８）、ＤＩＶ（in vitroでの日数）であった。図１４Ａおよび１４Ｂは、各々、競合ペプチドの不存在下において０５４７およびＮｇＲ１抗体を用いて行ったＴＬＲ１４およびＮｇＲ１イムノブロットを示す。図１４Ｃおよび１４Ｄ、各々、０５４７競合ペプチドの不存在下において、各々、０５４７および抗―ＮｇＲ１抗体を用いて行ったＴＬＲ１４およびＮｇＲ１イムノブロットを示す。矢印は、ＮｇＲに対応するバンドを示す。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、野生型（ｗｔ）マウスの脳におけるＴＬＲ１４発現を示す散乱プロットである。三匹のマウスを分析した（ｗｔ３−ｗｔ６）。図１５Ａは、０５４７抗―ＴＬＲ１４抗体を用いて表示させたデータを示す、図１５Ｂは、０５４１抗―ＴＬＲ１４抗体を用いて生じさせたデータを示す。図１５Ｃは、イソタイプ対照抗体を用いて生じさせたデータを示す。
【図１６】図１６は、ＴＬＲ１４（頂部）、ＮｇＲ１（２番目）、ｐ７５（３番目）、およびアクチン（底部）発現を示すイムノブロットである。星印は、ＮｇＲ１およびｐ７５に対応するバンドを示す。アクチンは負荷対照として用いた。ＮｇＲ、ｐ７５ＮＴＲ、またはＴＬＲ１４構築体は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において、単独でまたは組み合わせて発現させた。溶解物は、示したように、ＴＬＲ１４、ＮｇＲ、ｐ７５ＮＴＲ、またはアクチンに対する抗体にて、ウエスタンブロットによって分析した。
【図１７】図１７は、０５４７抗体を用いる免疫沈澱に続いてのＴＬＲ１４、ＮｇＲ、およびｐ７５を示すイムノブロットである。星印はＮｇＲに対応するバンドを示す。イプシロンは、ｐ７５に対応するバンドを示す。
【図１８】図１８は、抗―ＮｇＲ１抗体を用いる免疫沈澱に続いてのＮｇＲ、ＴＬＲ１４、ｐ７５を示すイムノブロットである。ＮｇＲ、ｐ７５ＮＴＲ、またはＴＬＲ１４構築体は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において、単独でまたは組み合わせて発現させた。
【図１９】図１９は、抗―ｐ７５抗体を用いる免疫沈澱に続いてのＮｇＲ、ＴＬＲ１４、ｐ７５を示すイムノブロットである。
【図２０】図２０はＰ４  ＣＧＮ（小脳顆粒ニューロン）細胞における神経細胞外殖を示す棒グラフである。ＮＴは対照細胞を示す。Ｙは神経細胞外殖を誘導することが知られている化合物である。（＊ｐ＝，０．０５；＊＊ｐ＝、０．０１）。
【図２１】図２１は、ラットおよびネズミＴＬＲ１４（頂部パネル）上の逆転写酵素ポリメラーゼ臭い反応（ＲＴ  ＰＣＲ）の結果を示すゲルの写真である。逆転写酵素がないプライマーでの対照パネルを中央パネルに示す。底部パネルは陽性対照としてのβアクチンＲＴ−ＰＣＲ対照プライマーを示す。レインは左側から右側にマーカー、Ｅ１９−ＣＮ初代細胞、Ｐ４−ＣＧＮ小脳顆粒ニューロン、および初代星状神経膠細胞に対応する。Ｃ５７Ｂ１／６脾臓は、陽性対照として働いた。
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂは，各々、ヒトＮｇＲ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号７および配列番号８）を示す。
【図２３】図２３Ａおよび２３Ｂは、各々、マウスＮｇＲ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号９および配列番号１０）を示す。
【図２４】図２４Ａおよび２４Ｂは、各々、ヒトｐ７５ＮＴＲのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１１および配列番号１２）を示す。
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、各々、マウスｐ７５ＮＴＲのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１３および配列番号１４）を示す。
【図２６】図２６Ａおよび２６Ｂは、各々、ラットＮｇＲのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号１５および配列番号１６）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明は、少なくとも部分的には、ＴＬＲ１４結合剤、例えば、ＴＬＲ１４蛋白質の細胞外ドメインに結合する抗体が、用量―依存的に小脳顆粒ニューロンの神経突起外殖のミエリン―誘導阻害を逆行させるという発見に基づく。出願人は、ＴＬＲ１４  ｍＲＮＡおよび蛋白質が、海馬、黒質、脳幹神経節、および大脳および小脳皮質のようなネズミ脳の選択された領域で発現されることも示した。上昇したＴＬＲ１４  ｍＲＮＡ発現はアルツハイマーおよびパーキンソー病に罹った患者の脳で検出された。
【００５４】
また、出願人らは、ＴＬＲ１４のロイシンリッチな反復（ＬＲＲ）領域が、蛋白質のＮｏgo受容体ファミリー、特に、ＮｇＲに対して有意な相同性（約３７％同一性、４７％相同性）を有することも突き止めた。蛋白質のＮｏｇｏファミリーはニューロン成長を調節することが示されている。ＮｇＲ1はミエリン、すなわち、軸作を覆う絶縁物質に見出される３つの蛋白質に対する受容体である（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３４１−３４６，２００１）。ＮｇＲ1およびミエリンは神経成長を阻害し、負傷の後に神経再生を妨げる。共−免疫実験は、さらに、ＴＬＲ１４が、ＮｇＲ１およびニュートロフィン受容体ｐ７５ＮＴＲのような、ニューロン成長および／または活性のモジュレーターと相互作用することを明らかとした。ＮｇＲ１およびｐ７５ＮＴＲは、最終的に神経突起外殖および阻害を制御するニューロン―ミエリン相互作用およびシグナル変換経路を変調するのに関連する（ここに引用して援用するＷａｌｍｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ｍｉｒ（２００７）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  １５：２４７０−２４８４にレビューされている）。例えば、ｐ７５ＮＴＲ発現は、例えば、病巣虚血症、アルツハイマー病、発作およびＬＰＳから由来するＣＮＳ負傷に応答して増大する（Ｈｅｎｎｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１３０：１５８−１６６）。ｐ７５ＮＴＲはより多くの一般的なＣＮＳ負傷に続いて増大する。加えて、ＮｇＲエクトドメイン−Ｆｃは皮質の負傷に続いて回復ラットを増大させることが示されている（Ｊ  Ｎｅｕｒｏ  ２００４，２４：６２０９−６２１７）もう１つの例においてＮｏｇｏＡ（ＮｇＲ１リガンド）に対する抗体は、ＭＳにおいて保護的であることが示されている（Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）７：７３６−７４４）。もう１つの例において、ＮｇＲ１に対する抗体を生じさせるように設計されたＤＮＡワクチンは動物モデルにおいて脊髄負傷から保護する（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）１１４７：６６−７６）。
【００５５】
ＬＰＳのようなエンドトキシンは、恐らくは、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７およびＴＮＦαのようなプロ−炎症サイトカインの活性化を介してシナプス機能に対して負の役割を有することが示されている。ＬＰＳはネズミ脳においてＴＬＲ１４  ｍＲＮＡおよび蛋白質発現を誘導する（「Ｔｈｅ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ：Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ」と題されたＫｅｙｓｔｏｎｅシンポジウムポスター提示された（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｒｉｌ  ２００７）「Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｒｉｃｈ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＴＬＲ４  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ，」）。ＴＬＲ１４は星状神経膠細胞におけるＬＰＳシグナリングを変調する。Ｉｄ。例えば、ＴＬＲ１４低下ＬＰＳ−誘導シグナリング事象のｓｉＲＮＡ阻害が神経膠星状細胞腫細胞系におけるＬＰＳ−誘導シグナリング事象を低下させたことを示す実験により、神経膠星状細胞におけるＬＰＳ応答を媒介するにおけるＴＬＲ１４の機能的役割が確認された。Ｉｄ。事実、ＴＬＲ１４はＬＰＳに結合し、およびＬＰＳ−シグナリングの公知のメディエーターであるＴＬＲ４と相互作用することが示された。Ｉｄ。
【００５６】
いくつかの刊行物は、ニューロンの傷および損なわれたニューロン機能に対する応答を媒介するにおけるＴＬＲ４およびＬＰＳシグナリングのようなＴＬＲ受容体を示唆する。例えば、ＴＬＲ４発現は虚血症に続いて小神経膠細胞および神経膠星状細胞において増大する。加えて、ＴＬＲ４欠乏マウスは、ＭＣＡＯ発作モデルにおいて低下した大脳虚血症−再灌流負傷を呈し（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ（２００７）  ＢＢＲＣ３５３：５０９−５１４；Ｃａｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１５（１２）：１５９９−１６０８）、発作におけるＬＰＳの役割を示唆する。損なわれたニューロン分化におけるＬＰＳの役割を裏付けるさらなる証拠は、ＴＬＲ４欠乏マウスにおける高められた増殖およびニューロン分化によって示唆される（Ｒｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９（９）：１０８１−８）。ＬＰＳは、ラット初代神経膠星状細胞において酸化窒素およびＭＭＰ−９を誘導することが示唆されている。加えて、線条体（脳幹神経節）へのＬＰＳ注入は、小神経膠細胞におけるＰ２Ｘ７Ｒの発現を増加させることによってニューロン生存性を低下させた（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）２７（１８）４９５７−６８）。これらの知見は、ＴＬＲ１４機能（および／または拮抗するＴＬＲ機能）が、膨張したおよび病気の脳の神経保護を供することができるという出願人らの発明を確認する。
【００５７】
最後に、ＣＤ１４およびＴＬＲ４は、脈絡叢および脳中の脳室周辺器官において構成的に発現される。エンドトキシン血症は、脳室周辺器官を囲う領域において遅延した応答を伴って、迅速なＣＤ１４遺伝子発現を引き起こす（Ｇｌｅｚｅｒ  ａｌ  ａｔ  ２００７  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １４７：８６７−８８３）。ＬＰＳは、脳中のＴＬＲ２をアップレギュレートすることも示されている。ＴＬＲ２は神経膠星状細胞上のＣＤ１４によって変調されて、ＣＸＣＬ８、ＩＬ−６、およびＩＬ−１２ｐ４０（Ｂｓｉｂｓｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００７  Ｇｌｉａ  ５５：４７３−４８２）のようなプロ炎症サイトカインを生じさせることができる。ＬＰＳ下流効果を変調することによるこれらのプロセスを１または複数での干渉は、神経炎症を阻害するにおいて有益であろう。
【００５８】
本明細書中に開示された知見は、脳中のエンドトキシン−誘導炎症および変性事象の少なくともいくつかのメディエーターとしての、ニューロンおよび神経膠細胞の活性および／または成長の調節におけるＴＬＲ１４およびＴＬＲ４を示唆する。ＴＬＲ１４の機能は、ＮｇＲ１および／またはｐ７５ＮＴＲのようなニューロンモジュレーターとの相互作用を介して、あるいはＴＬＲ４およびＬＰＳシグナリングとのその相互作用によって媒介することができる。従って、ＴＬＲ１４は、ＣＮＳの再生能力を改良するように設計された療法での魅力的な標的を表わす。かくして、本発明は、部分的には、ＴＬＲ１４結合剤、例えば、ＴＬＲ１４機能のアンタゴニストを用いてＴＬＲ１４機能（例えば、神経機能）を変調するための方法および組成物を提供する。特に、ＴＬＲ１４−関連疾患および／または障害（例えば、ＴＬＲ１４−関連神経変性疾患および障害）を治療し、予防し、および／または診断するための方法が開示される。ＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、ＴＬＲ１４の機能または発現のアゴニストおよびアンタゴニストも開示される。
【００５９】
本発明がより容易に理解できるように、ある種の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な記載を通じて記載される。
【００６０】
用語「Ｔｏｌｌ様受容体−１４」または「ＴＬＲ１４」とは、一定範囲のリガンドを認識し、免疫および炎症遺伝子の誘導に導く一連のシグナリング経路を活性化する受容体のＴＬＲファミリーのメンバーをいう。ＴＬＲファミリーのメンバーは、Ｔｏｌｌ−ＩＬ−ＩＲ（ＴＩＲ）ドメインといわれるサイトゾルドメイン、および一連のロイシンリッチな反復よりなる細胞外ロイシンによって特徴付けられる。感染の間におけるｔｏｌｌ−様受容体の占有は、誘導性シクロオキシゲナーゼ、接着分子、サイトカイン、ケモカイン、および免疫エフェクター細胞の活性化のような非常に多数のプロ−炎症蛋白質の発現に導く。
【００６１】
本明細書中で用いるように、「ＴＬＲ１４」とは、いずれかの種（例えば、マウス、ラット、ニワトリ、イヌ、ウシ、ヒトおよび非−ヒト霊長類、しかしながら、典型的には哺乳動物、例えば、ネズミ、またはひとまたは非−ヒト霊長類起源）からのＴＬＲファミリーのメンバー、ならびにＴＬＲ１４活性（例えば、本明細書中に記載されたＴＬＲ１４活性）を保持する。いずれかのその変種（突然変異体、断片、キメラ、およびペプチドミメティック形態を含む）をいう。典型的には、ＴＬＲ１４は、本明細書中に記載された生物学的活性、および以下の特徴：（ｉ）天然に生じる哺乳動物ＴＬＲ１４ポリペプチドのアミノ酸配列、またはその断片、例えば、図２に示されたアミノ酸配列（配列番号２）（ヒト）またはその断片（例えば、ＴＬＲ１４の細胞外ドメイン、例えば、図２（配列番号２）の約アミノ酸１〜６９５）、（ｉｉ）図２（配列番号２）（ヒト）として示されたアミノ酸配列に対して実質的に相同な、例えば、それに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％相同性のアミノ酸、またはその断片（例えば、ＴＬＲ１４の細胞外ドメイン、図２（配列番号２）の約アミノ酸１〜６９５）、（ｉｉｉ）天然に生じる哺乳動物ＴＬＲ１４ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、またはその断片（例えば、図１（配列番号１）（ヒト）またはその断片）、（ｉｖ）図１に示されたヌクレオチド配列（配列番号１）（ヒト）に対して実質的に相同な、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％相同なヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、またはその断片、（ｖ）天然に生じるＴＬＲ１４ヌクレオチド配列に対して縮重ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、またはその断片（例えば、図１（配列番号１）（ヒト）、またはその断片、または（ｖｉ）ストリンジェントな条件、例えば、高度にストリンジェントな条件下でこれまでのヌクレオチド配列の１つにハイブリダイズするヌクレオチド配列；の１つを有する。
【００６２】
フレーズ、ＴＬＲ１４「の生物学的活性」とは、限定されるものではないが、（ｉ）ＮｇＲ1結合または活性の変調；（ｉｉ）ｐ７５ＮＴＲ結合または活性の変調、（ｉｉｉ）ＬＰＳシグナリングの変調、例えば、脳中での１または複数のエンドトキシン−（例えば、ＬＰＳ−）媒介炎症シグナルの変調（例えば、：ＴＬＲ１４へのＬＰＳ結合、ＩκＢ分解、ｐ３８のリン酸化、プロ−炎症サイトカインまたはケモカイン分泌、例えば、神経膠星状細胞における酸化窒素生産の誘導、またはニューロンの生存性および／またはグリオーシスの変調の１または複数の変調）、および／または（ｉｖ）ニューロン細胞生存、分化および／または神経突起外植の１または複数の変調を含めた、ＴＬＲ１４の生物学的活性の１または複数をいう。
【００６３】
本明細書中で用いるように、用語「ＴＬＲ１−関連」蛋白質またはポリペプチドとは、ＴＬＲ１４に物理的におよび／または機能的に関連するいずれかの種からの蛋白質またはポリペプチドをいう。例えば、この用語は、ＴＬＲ１４と相互作用することはここに示されているＮｇＲ1またはｐ７５ＮＴＲを含む。ヒトおよびマウスＮｇＲ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ここでは、図２２Ａ〜２２Ｂ（配列番号７および配列番号８）（ヒト）として、および図２３Ａ〜２３Ｂ（配列番号９および配列番号１０）（マウス）；および図２４Ａ〜２４Ｂ（配列番号１１および配列番号１２）（ヒト）として、および図２５Ａ〜２５Ｂ（配列番号１３および配列番号１４）として示される（また、ＮｇＲ１およびｐ７５ＮＴＲの記載および特徴付けについては、Ｂａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ．，２２：３２９１−３３０２，２００３；Ｌａｕｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２４：５８１−５９４，２００３；Ａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３４３：３３２７−３３３８，２００７；およびＭｃＧｒｅｇｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ｂ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１４４：６９６−７００，２００７も参照）。
【００６４】
本発明の方法および組成物はＴＬＲ１４およびＴＬＲ１４−関連ポリペプチド、例えば、ＮｇＲ１またはｐ７５ＮＴＲ、および特定の配列、またはそれと実質的に同一または同様な配列を有するアミノ酸配列、例えば、特定の配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％同一またはそれ以上の配列を含む。アミノ酸配列との関係では、用語「実質的に同一」は、本明細書中においては、第一および第二のアミノ酸配列が共通の構造的ドメインおよび共通の機能的活性を有することができるように、第二のアミノ酸配列における整列させたアミノ酸残基とｉ）同一、またはｉｉ）その保存的置換である十分なまたは最小数のアミノ酸残基を含有する第一のアミノ酸をいうのに用いる。例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号８、または配列番号１２に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する共通の構造的ドメインを含有するアミノ酸配列を実質的に同一という。
【００６５】
ヌクレオチド配列との関係では用語「実質的に同一」とは、本明細書中においては、第一および第二のヌクレオチド配列は、共通の機能的活性を有するポリペプチドをコードし、または共通の構造的ポリペプチドドメイン、または共通の機能的ポリペプチド活性をコードするように、第二の核酸配列における整列したヌクレオチドと同一の十分なまたは最小数のヌクレオチドを含有する第一の核酸配列をいうのに用いる。例えば、配列番号１および３に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するヌクレオチド配列を実質的に同一という。
【００６６】
用語「機能的変種」とは、天然に生じる配列に対して実質的に同一のアミノ酸配列を有し、または実質的に同一のヌクレオチド配列によってコードされ、および天然に生じる配列の１または複数の活性を有することができるポリペプチドをいう。
【００６７】
配列の間の相同性または配列同一性（該用語は本明細書中においては相互交換可能に用いられる）の計算は以下のように行う。
【００６８】
２つのアミノ酸配列の、または２つの核酸配列パーセント同一性を決定するには、該配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、ギャップを、最適整列のために第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一方または双方に導入することができ、および非−相同配列を比較目的のために無視することができる）。いくつかの実施形態においては、比較目的のために整列させた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、なおより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列における位置は、第二の配列における対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、分子はその位置において同一である（本明細書中で用いるように、アミノ酸または核酸「同一性」はアミノ酸または核酸「相同性」と同等である）。
【００６９】
２つの配列の間のパーセント同一性は、２つの配列の最適な整列のために導入することが必要なギャップの数、および各ギャップの長さをコードして、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００７０】
配列の比較、および２つの配列の間のパーセント同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。いくつかの実施形態において、２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み、および１、２、３、４、５、または６の長さの重みを用いて、（ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて入手可能な）ＧＣＧソフトウエアパッケージにおいてＧＡＰプログラムに導入されているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）アルゴリズムを用いて決定される。）いくつかの実施形態においては、２つのヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＧＭＰマトリックス、および４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み、および１、２、３、４、５、または６の長さの重みを用いる、（ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて入手可能な）ＧＣＧソフトウエアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いて決定される。パラメータ−の特に好ましい組（およびそうでないことが特定されているのでなければ用いるべきもの）は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ拡大ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティを伴うＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスである。
【００７１】
２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、１２のギャップ長さペナルティおよび４のギャップペナルティを用いて、ＡＬＩＧＬプログラム（バージョン２．０）に導入されたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７）のアルゴリズムを用いて決定することができる。
【００７２】
本明細書中に記載された核酸および蛋白質の配列を「クエリ配列」として用いて、公のデータベースにおけるサーチを行い、例えば、ファミリーメンバーまたは関連する配列を同定することができる。そのようなサーチは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチを、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２で行って、本発明のＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質の核酸（配列番号１）分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴ蛋白質サーチをＸＢＬＡＳＴプログラムスコア＝５０、語長＝３で行って、本発明のＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質（配列番号１）蛋白質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップを入れた整列を得るためには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されているように利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォールトパラメーターを用いることができる。ｎｃｂｉ．ｎａｌ．ｎｙｈ．ｇｏｖ．参照。
【００７３】
本明細書中で用いるように、用語「低ストリンジェンシー、中程度ストリンジェンシー、高ストリンッジェンシー、または非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を記載する。ハイブリダイゼーション反応を行うためのガイダンスは、ここに引用して援用するＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出すことができる。水性および非水性方法はその文献に記載されており、いずれを用いることもできる。本明細書中で言及する特異的ハイブリダイゼーション条件は以下の通りである：１）約４５℃における６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）における低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、続いての少なくとも５０℃における０．２×  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の洗浄（洗浄の温度は低ストリンジェンシー条件では５５℃まで上昇させることができる）、２）約４５℃における６×  ＳＳＣにおける中程度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、続いての６０℃における０．２×  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄、３）約４５℃における６×  ＳＳＣにおける高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、続いての６５℃における０．２×  ＳＳＣ０．１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄、および好ましくは、４）非常に高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は６５℃における０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、続いての６５℃における０．２×  ＳＳＣ、１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄。
【００７４】
ＴＬＲ１４およびＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、本発明のＴＬＲ１４結合剤（例えば、ＴＲＬ１４アンタゴニスト）は、それらの機能に対して実質的に効果を有しない、さらなる保存的または非保存的必須アミノ酸置換を有することができると理解される。
【００７５】
「保存的アミノ酸置換」は、同様な側鎖を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基が置換されたものである。同様な側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で定義されている。これらのファミリーは塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸を含む。
【００７６】
本発明の種々の態様を以下にさらに詳細に記載する。
治療の方法
【００７７】
本発明は、（例えば、神経細胞および／または組織におけるＴＬＲ１４の１または複数の生物学的活性の大きさおよび強度を低下させ、減衰させ、またはそうでなければ減少させることによって）ＴＬＲ１４機能を変調し、例えば、拮抗する方法を提供する。該方法は、細胞および／組織を、ＴＬＲ１４−応答性細胞および／または組織の機能（または細胞または組織におけるＴＬＲ１４の生物学的活性）を変調する（例えば、減少する）のに十分な量の、ＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、ヒトＴＬＲ１４に拮抗するＴＬＲ１４結合剤と接触させることを含む。用語「ＴＬＲ１４−応答性細胞および／または組織」とは、ＴＬＲ１４に応答しての、シグナル、例えば、ＩκＢ分解またはｐ３８リン酸化を変換することができるいずれの細胞および／または組織もいう。
【００７８】
本明細書中で用いるように、本発明の方法で有用な「ＴＬＲ１４アンタゴニスト」とは、ＴＬＲ１４の、またはＴＬＲ１４−関連ポリペプチドの生物学的活性を低下させ、阻害し、またはそうでなければ減少させる剤をいう。アンタゴニストはＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連ポリペプチドと相互作用でき、例えば、それに結合することができる。ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４―関連ポリペプチドアンタゴニストを用いる拮抗は、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連ポリペプチド生物学的活性の全排除を必ずしも示さない。例えば、ＴＬＲ１４アンタゴニストは、ＴＬＲ１４の活性化および／または下流シグナリングが低下され、または阻害されるように、ＴＬＲ１４のリガンド結合に干渉し、例えば、それに結合する。ある実施形態において、ＴＬＲ１４アンタゴニストはＴＬＲ１４へのＬＰＳ結合、および／またはＬＰＳ−誘導シグナリング（例えば、ＬＰＳ−誘導ＩκＢ分解およびｐ３８のリン酸化）の活性化に干渉する。
【００７９】
ある実施形態において、ＴＬＲ１４応答性細胞または組織は、例えば、ニューロン細胞（例えば、ドーパミン作動性、コリン作動性、皮質、小脳、海馬、脊髄ニューロン細胞）および／または神経膠細胞（例えば、小神経膠細胞、神経膠星状細胞および稀突起神経膠細胞）である。本明細書中において定義されるように、中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞は、限定されるものではないが、ニューロン細胞およびヒト神経膠細胞を含む。特定のヒト神経膠細胞は、小神経膠細胞、神経膠星状細胞および稀突起神経膠細胞の１または複数から選択することができる。
【００８０】
本発明の方法および組成物を用いて変調する（例えば、減衰させる）ことができる例示的なＴＬＲ１４活性は、（ｉ）ＮｇＲ１結合または活性の変調、（ｉｉ）ｐ７５ＮＴＲ結合または活性の変調、（ｉｉｉ）脳における、ＬＰＳシグナリングの変調、例えば、１または複数のエンドトキシン−（例えば、ＬＰＳ−）媒介炎症シグナルの変調（例えば、ＴＬＲ１４へのエンドトキシン結合ＩκＢ分解、ｐ３８のリン酸化、プロ−炎症サイトカインまたはケモカイン分泌、酸化窒素生産の誘導、および、例えば、神経膠星状細胞におけるＭＭＰ−９発現の１または複数の変調）、またはニューロン生存性および／またはグリオーシスの変調、および／または（ｉｖ）ニューロン細胞製造、分化および／または神経突起外殖の１または複数の変調、の１または複数を含む。
【００８１】
本発明の方法は、例えば、in vivo（例えば、治療または予防）プロトコルの一部として対象に、または動物対象（例えば、中央脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）または発作モデル、ＣＮＳ炎症モデル（例えば、ＥＡＥ、リンパ球髄膜脳炎モデル）、ベネズエラウマ脳炎感染、髄膜脳炎、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｏｕｓ  ＣＮＳ炎症、または遺伝子的に修飾されたモデル、例えば、ＴＬＲ受容体において過剰発現されたＴＬＲ１４または突然変異を有する動物モデル（例えば、ＴＬＲ１４欠乏動物）のようなin vivo動物モデル）に存在する細胞（例えば、神経細胞および／または組織）で行うことができる。in vivo方法では、ＴＬＲ１４アンタゴニストは、単独で、あるいはもう１つの剤と組合せて、対象、例えば、神経変性疾患および／または障害に罹った、あるいは神経変性疾患および／または障害の兆候に罹った固有動物に、対象においてＴＬＲ１４機能、または１または複数のＴＬＲ１４活性に拮抗し、および／または神経変性疾患または障害の１または複数の兆候を減少させ、または緩和するのに十分な量で投与することができる。治療すべき神経変性疾患は急性神経変性疾患であってよく、あるいはそれは慢性または進行性疾患であってよい。
【００８２】
ＴＬＲ１４変調は、神経学的病気および障害について再生療法として用いることもできる。これは、神経組織の再生または修復のための医薬組成物および方法まで拡大される。損傷した末梢神経における軸策再生は起こらないが、ＣＮＳにおける軸策再生は、例えば、最少であり、それ自体、脳または脊髄に対する病気または負傷に由来する神経損傷または外傷は重症であり、延長されたものであり得る。軸策再成長を阻害する分子は本発明者らによって同定されており、ＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、ＴＬＲ１４結合剤は、驚くべきことに、軸策再生を誘導する用途を有するＴＬＲ１４モジュレーター（例えば、ＴＬＲ１４結合剤）はここに同定されたことを突き止めた。
【００８３】
従って、さらなる実施形態において、本発明はニューロンを再生する方法を提供する。該方法は、それを必要とする対象に、ニューロン再生を誘導するのに有効な量のＴＬＲ１４モジュレーター（例えば、本明細書中に記載されたＴＬＲ１４結合剤）を投与することを含む。
【００８４】
本明細書中で定義するように、用語「ニューロン再生」とは、神経突起伸長に関する。特に、この用語はニューロン成長円錐の崩壊の阻害、および／またはニューロンにおける軸策突起伸長および発芽の阻害の減少を含む。伸長および発芽は軸策成長であり得、ニューロンはＣＮＳニューロンであり得る。
【００８５】
本発明の治療または使用の方法を実施するにおいて、治療上有効量のＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、ＴＬＲ１４結合剤（例えば、ＴＬＲ１４アンタゴニスト）を単独で、または治療のような他の療法と組合せて投与してもよい。
【００８６】
ＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、ＴＬＲ１４結合剤、例えば、アンタゴニストが投与される対象は、例えば、異常なＴＬＲ１４活性によって特徴付けられる神経変性疾患および／または障害に罹った哺乳動物、例えば、ヒトであり得る。ある実施形態において、神経変性障害または疾患は急性神経変性疾患、または慢性または進行性神経変性疾患である。本明細書中で定義するように、用語「神経変性障害」（または疾患）は、中枢または末梢神経系の急性および慢性疾患、障害または病気を含む包括的な用語である。神経変性疾患は年齢−関連であってよく、あるいはそれは負傷または外傷に由来するものでよく、あるいはそれは特定の病気または障害に関連するものであってよい。
【００８７】
急性神経変性疾患は、限定されるものではないが、例えば、物理的化学的火傷、深い切り傷または四肢切断に由来する、脳血管不全、限局性または広範性の外傷、広範性脳損傷、脊髄の負傷または末梢神経外傷を含めたニューロン細胞死滅または危ういことに関連する疾患を含む。急性神経変性障害の例は：塞栓性閉塞および血栓性閉塞、急性虚血症後の再灌流、周産期低酸素症−虚血症負傷、心臓阻止、（打撲傷、貫入、剪断、圧縮および裂傷のような）頭蓋内および脊椎内病巣を含めた脳虚血症または梗塞である。慢性神経変性疾患は、限定されるものではないが、アルツハイマー病、ピック病、広範性レヴィー小体病、進行性核上痙攣（スチール−リチャードソン症候群）、多系変性（シャイ−ドラガー症候群）、神経変性に関連する慢性癲癇性疾患、筋委縮性側索硬化症を含めた運動神経病、変性運動失調、皮質基底変性、グアムのＡＬＳ−パーキンソン−痴ほう症合併症、亜急性硬化性汎脳炎、ハンチントン病、パーキンソン病、（多発性系委縮を含めた）シヌクレイン障害、原発性進行性失語症、線条体黒質変性症、マカド−ヨセフ病／脊髄小脳運動失調タイプ３およびオリーブ橋小脳変性、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット病、延髄および偽延髄痙攣、脊髄および脊髄延髄筋委縮（ケネディ病）、原発性側索硬化症、家族性痙性対麻痺、ウェルドニッヒ・ホフマン病、クーゲルバーグ・ウェランダー病、テイ・ザックス病、サンドホッフ病、家族性痙性病、ウールファルト−クーゲルバーグ・ウェランダー病、痙攣性の不全対麻痺、進行性多病巣白質脳症、家族性自律神経障害（ライリー・デイ症候群）、（限定されるものではないが、クロイッツェルフェルト−ヤコブ病（ＣＪＢ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ケルおよび致命的家族性不眠症を含めた）プリオン病、脱髄病、および多発性硬化症を含めた障害、および大脳白質萎縮症のような遺伝病を含む。
【００８８】
他の神経変性疾患は、とりわけ、多病巣神経障害、感覚神経障害、運動神経障害、感覚−運動神経障害、感染−関連神経障害、自律神経障害、感覚―自律神経障害、脱随神経障害、（限定されるものではないが、ギャラン−バーレー症候群および慢性炎症脱随多発性小根神経障害を含む）、他の炎症および免疫神経障害、薬物によって誘導される神経障害、薬理学的処置によって誘導される神経障害、トキシンによって誘導される神経障害、外傷神経障害（限定されるものではないが、圧縮、挫傷、裂傷および断切神経障害を含む）、代謝神経障害、内分泌および腫瘍随伴症を含む。
【００８９】
さらなる神経変性疾患は、元となる病因にかかわらず、年齢−関連痴ほう症および他の痴ほう症を含めた痴ほう症、およびアルツハイマー病に関連する痴ほう症、血管痴ほう症、広範性白色物質病（ビンスバンガー病）、内分泌または代謝起源の痴ほう症、頭部外傷および広範性脳損傷の痴ほう症、ボクサー認知症および前葉痴ほう症を含めた記憶喪失を伴う疾患を含む。
【００９０】
例示的な特別な障害は、限定されるものではないが、ＣＮＳ負傷および／または軸策変性によって特徴付けられるＣＮＳ障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、オリーブ橋小脳委縮、多発性硬化症（ＭＳ）、ピック病、温和な認識損傷（ＭＣＩ）、重症筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、ＣＪＤのようなプリオン病、ＡＩＤＳ関連痴ほう症、脳炎、発作、外傷性脳負傷；脊髄負傷、多発性硬化症、化学療法のような医学的処置に伴う神経障害、および虚血症または虚血症−誘導負傷を含む。神経変性疾患または障害は、細菌感染（例えば、Ｓｔａｐｈｉｌｏｃｏｃｏｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｏｕｓおよびｐｎｅｕｍｏｃｏｃｏｕｓ）によって引き起こされるＣＮＳ疾患および脳炎のような感染および神経炎症疾患を含むこともできる。
【００９１】
本明細書中で用いるように、用語「治療上有効量」は、意味のある患者の利点で、例えば、そのような疾患の兆候の緩和、そのような疾患の治癒、またはそのような疾患の治癒の速度の増大を示すのに十分な医薬組成物または方法の核活性成分の合計量を意味する。単独で投与された個々の有効成分に適応する場合、該用語はその成分単独をいう。用語はその成分単独をいう。組合せに適用された場合、用語は、組み合わせて、順次に、または同時に投与されたかを問わず、治療効果をもたらす有効成分の組み合わせの量をいう。
【００９２】
１または複数の剤と共−投与された場合、ＴＬＲ１４アンタゴニストおよび／またはＴＬＲ１４−関連ポリペプチド−アンタゴニストは第二の剤と同時に、あるいは順次に適用することができる。順次に投与されれば、主治医は、他の剤と組合せたＴＬＲ１４アンタゴニスト／ＴＬＲ１４関連ポリペプチド−アンタゴニストを投与する適当な順番を決定するであろう。この文脈での「組み合わせて」なる用語は、該剤が実質的に同時期（同時または順次いずれか）に与えられることを意味する。もし順次に与えられれば、第二の化合物の投与の開始において、２つの化合物の最初のものは、好ましくは、処置の部位における有効濃度で依然として検出できる。
【００９３】
ＴＬＲ１４モジュレーターと組合せて用いて、パーキンソン病を治療することができる療法は、限定されるものではないが、以下の抗酸化剤（例えば、α−トコフェロール）；抗コリン作動性剤；ドーパミン前駆体（例えば、レボドパ／カルビドパ）；直接的作用ドーパミンアンタゴニスト（例えば、エルゴト誘導体、例えば、ブロモクリプチンおよびペルゴリド；および非−エルゴリン、例えば、プラミペキソールおよびロピニロール）；間接的−作用ドーパミンアゴニスト（例えば、セレグリンおよびアマンダジン）；またはカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤（例えば、トルカポンおよびエンタカポン）の１または複数を含む。
【００９４】
ＴＬＲ１４モジュレーターと組合せて用いて、アルツハイマー病を治療することができる療法は、限定されるものではないが、以下の抗酸化剤（例えば、α−トコフェロール）；コリンエステラーゼ阻害剤（例えば、タクリン、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、およびメトリフォネート）；Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト（例えば、メマンチン、アマンタジン、リマンタジン、およびケタミン）；抗−炎症剤（例えば、プロペンチフィリンおよび選択的ＣＯＸ２阻害剤、例えば、セレコキシブおよびロフェコキシブ）；キレート化剤（例えば、クリキノール）；エストロゲン（例えば、選択的エストロゲン受容体モジュレーター）；またはセクレターゼ阻害剤の１または複数を含む。
【００９５】
ＴＬＲ１４モジュレーターと組合せて用いて、脊髄負傷を治療することができる療法は、限定されるものではないが、以下のメチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム；抗酸化剤；膜安定化剤；グルタメートアンタゴニスト；抗−炎症；カスパーゼ阻害剤；またはカルパリン阻害剤を含む。
【００９６】
本発明のＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、アンタゴニスト、およびＴＬＲ１４−関連ポリペプチド−アンタゴニスト（本明細書中においては「活性化合物」ともいう）は医薬組成物に配合することができる。そのような組成物は、典型的には、核酸分子、蛋白質、または抗体および医薬上許容される担体を含む。本明細書中で用いるように、用語「医薬上許容される担体」は、医薬投与に適合した、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。補充的な活性化合物を組成物に配合することもできる。
【００９７】
医薬組成物は、その意図した投与経路に適合するように処方される投与経路の例は非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、蛍光（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与を含む。非経口、皮内、または皮下適用で用いる溶液または懸濁液は以下の成分：注射用水のような滅菌希釈剤、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸、または重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような等張性の調整のための剤を含む。ｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整することができる。非経口製剤をガラスまたはプラスティックで作成されたアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは多用量バイアルに入れることができる。
【００９８】
治療上有効量のＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、アンタゴニスト、ＴＬＲ１４−関連ポリペプチドアンタゴニストを経口投与する場合、結合剤は錠剤、カプセル剤、粉末、溶液またはエリキシルの形態となろう。錠剤形態で投与する場合、本発明の医薬組成物は、加えて、ゼラチンまたはアジュバントのような固体単体を含有する。錠剤、カプセル、および粉末は約５〜９５％結合剤、好ましくは約２５〜９０％結合剤を含有する。液体形態で投与する場合、水のような液体担体、鉱油、落花生油、ミネラル油、大豆油、またはゴマ油のような動物または植物起源の油、または合成油を加えることができる。医薬組成物の液体形態は、さらに、生理食塩水、デキストロース、または他の糖溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコオールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールを含有することができる。液体形態で投与する場合、医薬組成物は約０．５〜９０重量％の結合剤、好ましくは約１〜５０％結合剤を含有する。
【００９９】
治療上有効量のＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、アンタゴニスト、またはＴＬＲ１４−関連ポリペプチド−アンタゴニストを静脈内、皮膚または皮下注射によって投与する場合、結合剤はパイロジェン−フリーの非経口的に許容される水性溶液の形態となろう。ｐＨ、等張性、安定性等に関して要件を有するそのような非経口的に許容される蛋白質溶液の調製は当該分野における技量内のものである。静脈内、皮膚または皮下注射のための好ましい医薬組成物は、結合剤に加えて、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、デキストロース注射、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射、乳加リンゲル注射、または当該分野で公知の他のビークルを含有すべきである。本発明の医薬組成物は安定化剤、保存剤、緩衝液、抗酸化剤、または当業者に公知の他の添加剤を含有してもよい。
【０１００】
吸入による投与では、化合物は、適当なプロペラント、例えば、二酸化炭素のようなガス、またはネビュライザーを含有する加圧容器またはディスペンサからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１０１】
全身投与は、経粘膜または経皮手段によることもできる。経粘膜または経皮投与では、浸透させるべきバリアーに適した浸透剤を処方で用いる。そのような浸透剤は、一般に、当該分野で公知であり、例えば、経粘膜投与では、洗剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は鼻スプレーまたは坐薬の使用を通じて達成することができる。経皮投与では、活性な化合物は一般に当該分野で公知の軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに処方される。
【０１０２】
ＴＬＲ１４モジュレーターは脳室内注射（ｉｃｖ／ＩＣＶ）によって、またはミニポンプによる送達を介して、あるいは脳または神経組織に標的化されたウイルスベクターを用いることによって、あるいはモジュレーターをコードする裸のプラスミドＤＮＡを直接投与することによって脳またはＣＮＳに送達することができる。別法として、脳またはＣＮＳに送達されるモジュレーターをもたらすいずれかの他の適当な送達メカニズムを用いてもよい。さらなる適した送達経路の例は以下に掲げる。
【０１０３】
特別な実施形態において、ＴＬＲ１４モジュレーターは神経膠細胞、特に、小神経膠細胞、または神経膠星状細胞および／または稀突起神経膠細胞に送達される。ある実施形態において、モジュレーターは神経膠星状細胞、稀突起神経膠細胞、ニューロン、神経先祖、神経幹細胞または他の多能性または多潜能力幹細胞のような少なくとも１つの他の細胞型と共に投与される。これらの実施形態において、他の細胞型はモジュレーターと共に、その前にまたはその後に投与することができる。同様に、これらまたは他の実施形態において、ＴＬＲ１４モジュレーターは神経療法のための薬物のような少なくとも１つの他の剤、あるいは抗−炎症剤、抗−アポトーシス剤、抗酸化剤または成長因子のようなもう１つの有益な補助剤と共に投与される。これらの実施形態において、他の剤はモジュレーターと同時に、その前にまたはその後に投与することができる。
【０１０４】
さらなる実施形態において、細胞は対象、例えば、患者の中枢または末梢神経系における所定の部位に投与される。それらは注射または注入によって投与することができ、あるいは移植可能なデバイス内に、あるいは細胞を含有するマトリックスまたは足場の移植によって、あるいはいずれかの他の手段によってカプセル化することができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、活性な化合物は脳、または中枢神経系（ＣＮＳ）のもう１つの適当な部位に直接的に投与されるであろう。これらの方法を用い、ＴＬＲ１４アンタゴニストは、海馬、例えば、小神経膠細胞およびニューロン細胞に直接的に送達されるであろう。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ１４アンタゴニストは脳室内注射（ＩＣＶ）、（例えば、鞘内薬物送達ポンプを用いる）鞘内投与によって投与することができる。いくつかの実施形態において、活性な化合物は、十分に移植可能なポンプシステムまたは、外部ポンプシステムのようなカテーテルおよびポンプシステムによって投与することができる。適当なポンプおよびカテーテルシステム、例えば、（共にＭｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｓｏｆａｍｏｒ  Ｄａｎｅｋ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮからの）ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ（登録商標）ポンプおよびＩｎＤｕｒａ（登録商標）鞘内カテーテルは商業的に入手可能である。
【０１０６】
別法として、ウイルスベクターを用いて、ＴＬＲ１４モジュレーターの脳への送達を標的化することができる。そのようなベクターは、モジュレーターが抗体、特にモノクローナル抗体または他の同様な結合断片のような蛋白質である場合に、モジュレーターをコードする遺伝子を含有する構築体を含むであろう。構築体は、さらに、遺伝子に隣接して設けられ、かつ遺伝子の発現を制御するプロモーターを含有することができる。そのような送達および標的化に適したウイルスベクターは、非複製単純疱疹１型ウイルス（例えば、Ｐｏｌｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１  ２０；１２（８）：９０５−２０．参照）；セミリティフォレストウイルス（Ｊｅｒｕｓａｌｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３  ８（６）：８８６−９４参照）、およびアベノウイルス（例えば、Ｂｒａｃｉａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｊａｎ  １５；１７０（２）：７６５−７４参照）であってよい。
【０１０７】
神経変性病のような種々の神経学的疾患は異なる方法で脳に影響し、また、脳組織の異なる領域に影響する。従って、あるさらなる態様においては、本発明の組成物は脳の区別される領域に直接的に投与して、治療効果を最適化することができる。
【０１０８】
ある実施形態においては、Ｔｏｌｌ様受容体１４の発現または生物学的機能を阻害する化合物は海馬、特に小神経膠細胞に投与される。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ＴＬＲ１４モジュレーターは、移植およびマイクロカプセル化された送達系を含めた制御放出処方のような、身体からの迅速な排出に対して化合物を保護する担体で調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生分解性の生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような処方の調製方法は当業者に明らかであろう。また、材料はＡｌｚａ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈｅｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することもできる。（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体と共に感染した細胞に標的化されたリポソームを含めた）リポソーム懸濁液を医薬上許容される担体として用いることができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されたように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０１１０】
モジュレーターがバイオロジック、例えば、抗体分子である実施形態においては、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇのアンタゴニストは、例えば、１または複数の別々の投与によるか、または連続的な注入によるかを問わず、病気のタイプおよび重症度に応じて患者への投与用の最初の候補用量である。典型的な日用量は、前記した因子に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲となろう。数日以上にわたっての反復された投与では、疾患に依存して、病気兆候の所望の抑制が起きるまで処置を反復する。しかしながら、他の投与方法も有用であろう。この療法の進行は、例えば、ラジオグラフィー腫瘍イメージングを含めた慣用的な技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０１１１】
本発明の医薬組成物を用いる療法の持続は、治療すべき病気の重症度、および各個々の患者の疾患および潜在的なイディオシンクラチック応答に依存して変化するであろう。
【０１１２】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトで用いられる一定範囲の用量を処方するのに用いることができる。そのような化合物の用量は、好ましくは、ほとんどまたは全く特性を伴わないＥＤ５０を含む一定範囲の循環濃度内にある。用量は、使用する投与形態および利用する投与経路に依存してこの範囲内で変化する。本発明の方法で用いるいずれの化合物についても、治療上有効な用量は細胞培養アッセイから最初に評価することができる。用量を動物モデルにおいて処方して、細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、兆候の半−最大阻害を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成することができる。そのような処方を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０１１３】
本明細書中において定義するように、蛋白質またはポリペプチドの治療上有効量（すなわち、有効用量）は約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇまたは５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。蛋白質またはポリペプチドは約１〜１０週間の間、好ましくは２〜８週間の間、より好ましくは約３〜７週間の間、なおより好ましくは約４、５または６週間の間、１週間当たり１回投与することができる。当業者であれば、限定されるものではないが、病気または障害の重症度、術前の処置、対象の一般的健康および／または年齢、および存在する他の病気を含めた、ある種の因子が対象を効果的に治療するのに必要な用量およびタイミングに影響するであろう。さらに、治療上有効量の蛋白質ポリペプチド、または抗体での対象の治療は、単一処置、または一連の処置を含むことができる。
【０１１４】
抗体では、好ましい用量は０．１ｍｇ／ｋｇの体重（一般に、１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）である。もし抗体が脳において作用すべきであれば、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量が通常は適切である。一般に、部分的にヒトの抗体および十分にヒトの抗体は他の抗体よりもヒト身体内でより長い半減期を有する。従って、より低い用量およびより低頻度の投与がしばしば可能である。脂質化のような修飾を用いて、抗体を安定化させ、および（例えば、脳への）取込および組織浸透を高めることができる。抗体の脂質化のための方法は、Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９７）Ｊ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４：１９３）によって記載されている。
【０１１５】
小分子では、例示的な用量は対象または試料重量のキログラム当たり小分子のミリグラムまたはマイクログラム量、例えば、キログラム当たり約１マイクログラム〜キログラム当たり約５００マイクログラム、キログラム当たり約１００マイクログラム〜キログラム当たり約５マイクログラムまたは、キログラム当たり約１マイクログラム〜キログラム当たり約５０マイクログラムを含む。さらに、小分子の適当な用量は、変調すべき発現または活性に関する小分子の能力に依存することは理解される。これらの小分子の１または複数を動物（例えば、ヒト）に投与して、本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を変調する場合、医師、獣医、または研究者は、例えば、最初に比較的低い用量を処方し、引き続いて、適切な応答が得られるまで用量を増大させる。加えて、いずれの特別な動物対象についての具体的用量レベルは、使用する特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、一般的な健康、性別、およびダイエット、投与の時間、投与の経路、排出の速度、半減期、いずれかの薬物の組合せ、および変調すべき発現または活性の程度を含めた種々の因子に依存することは理解される。
【０１１６】
本発明の核酸分子をベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与によって（米国特許第５，３２８，４７０号参照）または定位注射によって（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７参照）で対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は許容される希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含むことができ、あるいは遺伝子送達ビークルが包埋される遅延放出マトリックスを含むことができる。別法として、完全な遺伝子送達ベクターを組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから無傷で生産できる場合、医薬製剤は、遺伝子送達系を生じさせる１または複数の細胞を含むことができる。
【０１１７】
医薬組成物は、投与のための指示書と共に容器、パック、またはディスペンサ−中に含めることができる。
ＴＬＲ１４モジュレーター
抗体分子
【０１１８】
いくつかの実施形態において、ＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、結合剤はＴＬＲ１４に対する抗体分子である。いくつかの実施形態において、抗体分子は、モノクローナルまたは単一特異性抗体、またはＴＬＲ１４、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ＴＬＲ１４（またはその機能的変種））に結合するその抗原−結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一鎖Ｆｖ断片サメ変種またはラクダ変種）である。
【０１１９】
典型的には、抗体分子はヒトＴＬＲ１４（またはその機能的断片）に対するヒト、ヒト化、キメラ、ラクダ、またはin vitroで生じた抗体である。典型的には、抗体はＴＬＲ１４の１または複数の活性（例えば、本明細書中に記載されたＴＬＲ１４の１または複数の生物学的活性）を阻害し、低下させ、または中和する。いくつかの実施形態において、抗体分子はＴＬＲ１４（例えば、図２（配列番号２）の約アミノ酸１〜８１１、またはその断片を含むエピトープ、またはそれに対して実質的に相同な配列）に結合する。例えば、抗体分子はＴＬＲ１４の細胞外ドメイン（例えば、図２（配列番号２）の約アミノ酸１〜６９５または６９６、またはその断片、例えば、約アミノ酸８５〜１０３、または５０９〜５２６）に結合することができる。他の実施形態において、抗体分子はＴＬＲ１４のロイシン−リッチなドメイン、例えば、図２（配列番号２）の約アミノ酸２６〜５８、８２〜１０５、１０６〜１２９、１３０〜１５３、１５４〜１７７、１７８〜２０１、２０２〜２２７、２２８〜２５１、２５２〜２７５、２７６〜２９９、３００〜３２３、３２４〜３４７、または３５９〜３１５に位置するドメインに結合する。なおもう１つの実施形態において、抗体分子は図２（配列番号２）の約アミノ酸５８９〜６７１に位置したフィブロネクチン−タイプＩＩＩドメイン（ＦＮ３）、および／または図２（配列番号２）の約アミノ酸６４０〜６６０、６４５〜６５５、または６５２〜６５４に位置したＲＧＤインテグリン結合部位に結合する。ヒトＴＬＲ１４蛋白質は、配列番号２の約アミノ酸１〜２０に対応する約２０〜２１アミノ酸長のリーダー配列を含むことができる。なお他の実施形態において、抗体分子はＴＬＲ１４の細胞内ドメイン、例えば、約アミノ酸７２０〜８１１、またはその部分（例えば、図２（配列番号２）の約アミノ酸７９６〜８１１）に結合する。なお他の実施形態において、抗体分子は、本明細書中に記載された抗体０５４０（Ａ）、０５４１（Ｂ）、および０５４７（Ｃ）のいずれかとＴＬＲ１４への結合について競合する（例えば、抗体分子は、抗体０５４０（Ａ）、０５４１（Ｂ）、および０５４７（Ｃ）によって認識されるものと同一、または実質的に同様なＴＬＲ１４上のエピトープに結合する。他の実施形態において、抗体分子は、本明細書中に記載されたエピトープに結合し、ＴＬＲ１４の１または複数の活性を阻害し、低下させ、または中和する。
【０１２０】
ある実施形態において、抗体分子はＴＬＲ１４−相互作用ポリペプチド、例えば、ＮｇＲ、例えば、ヒトＮｇＲ；またはｐ７５ＮＴＲ、例えば、ヒトｐ７５ＮＴＲ（例えば、おのおの、図２２Ｂ（配列番号８）または図２４Ｂ（配列番号１２）に示されたような哺乳動物、例えば、ヒトＮｇＲ、またはｐ７５ＮＴＲ  と同一のアミノ酸を含むＮｇＲ、またはｐ７５ＮＴＲ）、またはそれに対して実質的に相同な配列に結合し、ＴＬＲ１４の１または複数の活性を阻害し、低下させ、または中和する。
【０１２１】
本明細書中で用いるように、用語「抗体分子」とは、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む蛋白質をいう。用語抗体分子は、例えば、全長の成熟抗体、および抗体の抗原−結合断片を含む。例えば、抗体分子は重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（本明細書中においては、ＶＨと略される）、および軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（本明細書中においては、ＶＬと略する）を含むことができる。もう１つの例において、抗体分子は２つの重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列、および、２つの軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列を含み、それにより、２つの抗原結合部位を形成する。抗原−結合断片の例は（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣｌおよびＣＨｌドメインよりなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域におけるジスルフィドブリッジによって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインよりなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインよりなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインのドメインよりなるｄＡｂ断片；（ｖｉ）ラクダまたはラクダ化可変ドメイン、および（ｖｉｉ）単一鎖Ｆｖ（ｓｖＦv）を含む。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６．およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照。これらの抗体断片は、当業者に知られた慣用的な技術を用いて得られ、断片は、無傷抗体と同一方法で有用性につきスクリーニングされる。
【０１２２】
ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と言われるより保存された領域が介在する、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という超可変領域に細分することができる。フレームワーク領域およびＣＤＲの程度は多数の方法（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ３ｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．  Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２．  Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７参照）；およびＯｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられたＡｂＭ定義によって正確に定義されてきた。一般に、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄy Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ．  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｅｄ．：  Ｄｕｅｂｅｌ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，  Ｒ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌＡｇ、  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ)参照。一般に、特に示されるのでなければ、以下の定義を用いる：重鎖可変ドメインのＣＤＲ１のＡｂＭ定義、および他のＣＤＲについてのＫａｂａｔ定義。加えて、ＫａｂａｔまたはＡｂＭ  ＣＤＲに関して記載された本発明の実施形態は、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変ループを用いて実行することができる。各ＶＨおよび、ＶＬは典型的には、アミノ−末端からカルボキシ−末端まで以下の順序：ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。
【０１２３】
本明細書中で用いるように、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」とは、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成することができるアミノ酸配列をいう。例えば、配列は天然に生じる可変ドメインのアミノ酸配列の全て、または一部を含むことができる。例えば、配列は１、２以上のＮ−またはＣ−末端アミノ酸を含んでも含まなくてもよく、あるいは蛋白質構造の形成に適合する他の改変を含むことができる。
【０１２４】
用語「抗原−結合部位」とは、ＴＬＲ１４に結合する界面を形成する決定基を含む抗体分子の部分、またはそのエピトープをいう。蛋白質（または蛋白質ミメティックス）に関しては、抗原−結合部位は、典型的には、ＴＬＲ１４に結合する界面を形成する（少なくとも４つのアミノ酸またはアミノ酸ミメティックの）１または複数のループを含む。典型的には、抗体分子の抗原−結合部位は、少なくとも１または２のＣＤＲ、または典型的には少なくとも３、４、５または６のＣＤＲを含む。
【０１２５】
用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書中で用いるように、単一分子組成物の抗体分子の調製をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一結合特異性および親和性を呈する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマー−技術によって、またはハイブリドーマー技術を用いない方法（例えば、組換え方法）によって作成することができる。
【０１２６】
「効果的にヒトの」蛋白質は、中和抗体応答、例えば、ヒト抗−ネズミ抗体（ＨＡＭＡ）応答を惹起しない蛋白質である。ＨＡＭＡは、例えば、もし抗体分子が、例えば、慢性または再発病疾患の治療において反復して投与されるならば、多数の環境において問題であり得る。ＨＡＭＡ応答は、血清からの増大した抗体のクリアランスのため（例えば、Ｓａｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，  ３２：１８０−１９０  （１９９０）参照)および、また、潜在的アレルギー反応のため、（例えば、ＬｏＢｕｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，  ５：５１１７−５１２３  （１９８６）参照）、反復した抗体投与を潜在的に有効でなくすることができる。
【０１２７】
抗−ＴＬＲ１４抗体は、ポリクロールまたはモノクローナル抗体であり得る。他の実施形態において、抗体は組換えにより生産することができ、例えば、ファージディスプレイによって生産し、またはコンビナトーリアル方法によって生産することができる。
【０１２８】
抗−ＴＬＲ１４抗体を生じさせるためのファージディスプレイおよびコンビナトーリアル方法は（例えば、その全部の内容をここに引用して援用する、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．国際公開番号ＷＯ  ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開番号ＷＯ  ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開ＷＯ  ９２／２０７９１；Ｍａｒｌｋａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．国際公開番号ＷＯ  ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．国際公開ＷＯ  ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．国際公開番号ＷＯ  ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．国際公開番号ＷＯ  ９２／０９６９０；Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．０国際公開番号ＷＯ  ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ． （１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：  １３７０−１３７２； Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５; Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１．Ｇｒｉｆｆｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４;  Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６．  Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８．  Ｇｒａｍ  ｅｔ  ｅl. （１９９２）  ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０;  Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７; Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７; およびＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２に記載されたように）当該分野で公知である。
【０１２９】
１つの実施形態において、ＴＬＲ１４抗体は十分にヒト抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン配列からの抗体を生じるように遺伝子的に作成されたマウスにおいて作られた抗体）、または非−ヒト抗体、例えば、げっ歯類（マウスまたはラット）、ヤギ、霊長類（例えば、サル）、またはラクダ抗体である、好ましくは、非−ヒト抗体はげっ歯類（マウスまたはラット抗体）である。げっ歯類抗体を生産する方法は当該分野で公知である。
【０１３０】
ヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりはむしろヒト免疫グロブリン遺伝子を運ぶトランスジェニックマウスを用いて生じさせることができる。注目する抗原で免疫化したこれらのトランスジェニックマウスからの脾臓細胞を用いて、ヒト蛋白質からのエピトープに対して特異的親和性を持つヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマーを生産する（例えば、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．国際出願ＷＯ  ９１／００９０６、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開  ＷＯ９１／１０７４１；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．国際出願ＷＯ  ９２／０３９１８；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．国際出願ＷＯ  ９２／０３９１７；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｎａｔｕｒｅ ３６８:８５６−８５９．  Ｇｒｅｅｎ，  Ｌ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ７：１３−２１；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓci. ＵＳＡ８１：６８５１−６８５５．  Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３  Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏl ７：３３−４０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３  ＰＮＡＳ  ９０：３７２０−３７２４．  Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：１３２３−１３２６参照）。
【０１３１】
抗−ＴＬＲ１４抗体は、可変領域、またはその部分、例えば、ＣＤＲは非−ヒト生物、例えば、ラットまたはマウスにおいて生じさせるものであり得る。キメラＣＤＲ−グラフト、およびヒト化抗体は本発明内にある。非−ヒト生物、例えば、ラットまたはマウスにおいて生じ、次いで、例えば、ヒトにおける免疫原性を減少させるために可変フレームワークまたは定常領域において修飾された抗体は本発明内のものである。
【０１３２】
キメラ抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術において生産することができる。例えば、ネズミ（または他の種）モノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子を、制限酵素で消化して、ネズミＦｃをコードする領域を除去し、ヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の同等部分を置き換える（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際特許公開  ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａ，ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際出願  ＷＯ  ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９参照）。
【０１３３】
ヒト化またはＣＤＲ−グラフト抗体は、ドナーＣＤＲで置き換えられた（免疫グロブリン重鎖または軽鎖の）少なくとも１つまたは２つであるが、一般には、全ての３つの受容者ＣＤＲを有するであろう。抗体は非−ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えることができるか、あるいはＣＤＲのいくつかのみを非−ヒトＣＤＲで置き換えることができる。ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質またはその断片へのヒト化抗体の結合で必要なＣＤＲの数を置き換える必要があるにすぎない。好ましくは、ドナーはげっ歯類抗体、例えば、ラットまたはマウス抗体であり、受容者はヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークであろう。典型的には、ＣＤＲを供する免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを供する免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。１つの実施形態において、ドナー免疫グロブリンは非−ヒト（例えば、げっ歯類）である。アクセプターフレームワークは天然に生じる（例えば、ヒト）フレームワークまたはコンセンサスフレームワーク、あるいはそれに対して約８５％以上、好ましくは９０％、９５％、９９％以上同一である配列である。
【０１３４】
本明細書中で用いるように、用語「コンセンサス配列」とは、関連配列のファミリーにおいて最も頻繁に起こるアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成された配列をいう（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ  １９８７）参照）。蛋白質のファミリーにおいて、コンセンサス配列各位置はファミリーにおけるその位置において最も頻繁に起こるアミノ酸によって占められる。もし２つのアミノ酸が同等な頻度で起こるならば、いずれかはコンセンサス配列に含むことができる。「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列においてフレームワーク領域をいう。
【０１３５】
抗体は当該分野で公知の方法によってヒト化することができる。ヒト化抗体は、抗原結合に直接的に関与しないＦｖ可変領域の配列を、ヒトＦｖ可変領域からの同等配列で置き換えることによって生じさせることができる。ヒト化抗体を生じさせるための一般的方法は、その全ての内容をここに引用して援用する、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７によって、Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４によって、およびＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号および同第５，６９３，７６２号によって供される。これらの分子は、重鎖または軽鎖の少なくとも１つから免疫グロブリンＦｖ可変領域の全てまたは一部をコードする核酸配列を単離し、操作し、および発現させることを含む。そのような核酸の源は当業者に公知であり、例えば、ＴＬＲ１４ポリペプチドまたはその断片に対する抗体を生じさせるハイブリドーマーから得ることができる。ヒト化抗体、またはその断片をコードする組換えＤＮＡを、次いで、適当な発現ベクターにクローン化することができる。
【０１３６】
ヒト化またはＣＤＲ−グラフト抗体はＣＤＲ−グラフティングまたはＣＤＲ置換によって生じさせることができ、ここに、免疫グロブリン鎖の１つ、２つ、または全てのＣＤＲを置き換えることができる。例えば、その全ての内容をここに引用して明示的に援用する米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；Ｂｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８８  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０；Ｗｉｎｔｅｒ米国特許第５，２２５，５３９号参照。Ｗｉｎｔｅｒは、本発明のヒト化抗体を調製するのに用いることができるＣＤＲ−グラフティング方法を記載する（その内容をここに引用して明示的に援用する、１９８７年３月２６日に出願されたＵＫ特許出願ＧＢ２１８８６３８Ａ；Ｗｉｎｔｅｒ米国特許第５，２２５，５３９号）。
【０１３７】
また、特異的アミノ酸が置換され、欠失されまたは付加されたヒト化抗体は本発明の範囲内のものである。好ましいヒト化抗体は、抗原への結合を改良するため等に、フレームワーク領域においてアミノ酸置換を有する。例えば、ヒト化抗体は、受容者フレームワーク残基以外の、ドナーフレームワーク残基に、またはもう１つのアミノ酸に同一なフレームワーク残基を有するであろう。そのような抗体を生じさせるためには、ヒト化免疫グロブリン鎖の選択された少数のアクセプターフレームワーク残基を、対応するドナーアミノ酸によって置き換えることができる。置換の好ましい位置は、ＣＤＲに隣接する、あるいはＣＤＲと相互作用することができるアミノ酸残基を含む（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号参照）。ドナーからのアミノ酸を選択するための基準は、その内容をここに引用して援用する、米国特許第５，５８５，０８９号、例えば、米国特許第５，５８５，０８９号の１２〜１６欄、例えば、米国特許第５，５８５，０８９号の１２〜１６欄に記載されている。抗体をヒト化するための他の技術は１９９２年１２月２３日に公開されたＰａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．のＥＰ５１９５９６  Ａ１に記載されている。
【０１３８】
１つの実施形態において、抗体は、精製されたＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４関連−抗原、またはその断片、例えば、本明細書中に記載された断片、膜関連抗原、組織、例えば、粗製組織調製物、全細胞、好ましくは、生きた細胞、溶解した細胞、または細胞画分、例えば、膜画分で免疫化することによって作成することができる。
【０１３９】
抗−ＴＬＲ１４抗体は単一鎖抗体、または、その断片であり得る。単一鎖抗体（ｓｃＦＶ）は作成することができる（例えば、Ｃｏｌｃｈｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８８０：２６３−８０；およびＲｅｉｔｅｒ，Ｙ．（１９９６）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２：２４５−５２参照）。単一鎖抗体を二量体化または多量体化して、同一の標的ＴＬＲ１４蛋白質の異なるエピトープに対する特異性を有する多価抗体を生じさせることができる。
【０１４０】
なお他の実施形態において、抗体分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥの重鎖定常領域から選択された；特に、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の（例えば、ヒト）重鎖定常領域から選択された重鎖定常領域を有する。もう１の実施形態において、抗体分子は、例えば、カッパまたはラムダの（例えば、ヒト）軽鎖定常領域から選択された軽鎖定常領域を有する。定常領域を改変して、例えば、突然変異させて、抗体の特性を修飾し（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、および／または補体機能の１または複数を増加させ、または減少させる）ことができる。１つの実施形態において、抗体はエフェクター機能を有し、補体を固定することができる。他の実施形態において、抗体はエフェクター細胞を動員せず、または補体を固定しない。もう１つの実施形態において、抗体はＦｃ受容体に結合する低下した能力を有し、または能力を有しない。例えば、それはＦｃ受容体への結合を支持しないイソタイプまたはサブタイプ、断片または他の突然変異体であり、例えば、それは突然変異誘発された、または欠失されたＦｃ受容体結合領域を有する。
【０１４１】
抗−ＴＬＲ１４抗体（例えば、モノクローナル抗体）を用いて、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈澱のような標準的な技術によってＴＬＲ１４を単離することができる。さらに、ＴＬＲ１４抗体を用いて、（例えば、細胞溶解物または細胞上清中の）ＴＬＲ１４蛋白質を検出して、蛋白質の豊富さ、および発現のパターンを評価することができる。抗−ＴＬＲ１４抗体を診断で用いて、臨床試験手法の一部として組織中の蛋白質レベルをモニターして、例えば、与えられた治療養生法の効率を決定することができる。検出は、抗体を検出可能な物質（例えば、抗体標識）にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結させる）ことによって容易とすることができる。検出可能な物質としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、ルミネセント材料、バイオルミネセント材料、および放射活性材料が挙げられる。適当な酵素としては、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリネステラーゼが挙げられ；適当な補欠分子族複合体としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、適当な蛍光材料としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンが挙げられ、ルミネセント材料としては、ルミノールが挙げられ、バイオルミネセント材料としては、ルシフェラーゼ、リシフェリンおよびアクオリンが挙げられ、適当な放射活性材料としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０１４２】
また、本発明は、ＴＬＲ１４抗体、例えば、本明細書中に記載された抗−ＴＬＲ１４抗体をコードする核酸を含む。また、核酸を含むベクター、核酸で形質転換された細胞、特に、抗体を生産するのに有用な細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯまたはリンパ細胞も含まれる。
【０１４３】
また、本発明は、抗−ＴＬＲ１４抗体、例えば、本明細書中に記載された抗体を作成する細胞系、例えば、ハイブリドーマー、および該細胞を用いてＴＬＲ１４抗体を作成する方法を含む。
【０１４４】
また、ＴＬＲ１４配列およびその変種をコードする核酸も特徴とされる。ポリペプチドを用いて、ＴＬＲ１４および、所望により、もう１つの種からのＴＬＲ１４に結合するＴＬＲ１４結合剤を供することができる。
【０１４５】
１つの態様において、本発明は、ＴＬＲ１４に特異的に結合する標的結合分子を供する方法をその特徴とする、例えば、標的結合分子は抗体分子である。該方法は：非−ヒト蛋白質の少なくとも一部を含む標的蛋白質を供し、該部分はヒト標的蛋白質の対応する部分に相同（に少なくとも７０、７５、８０、８５、８７、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８％同一）であるが、少なくとも１つのアミノ酸（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つのアミノ酸）だけ異なり；抗原に特異的に結合する結合剤を得；および標的蛋白質の活性を変調するにおける結合剤の効果を評価することを含む。該方法は、さらに、結合剤（例えば、抗体分子）または誘導体（例えば、ヒト化抗体分子）をヒト対象に投与することを含むことができる。いくつかの実施形態において、標的蛋白質はＴＬＲ１４である。
【０１４６】
１つの実施形態において、得る工程は、上述のとおり、蛋白質発現ライブラリーを用いることを含む。例えば、ライブラリーはｓｃＦｖのＦａｂのような抗体分子をディスプレイする。１つの実施形態において、得る工程は、免疫原として抗原を用いて動物を免疫化することを含む。例えば、動物はげっ歯類、例えば、マウスまたはラットであり得る。動物はトランスジェニック動物であり得る。
ＴＬＲ１４ペプチド
【０１４７】
いくつかの実施形態において、ＴＬＲ１４アンタゴニストはＴＬＲ１４アンタゴニストプロ―ペプチド（例えば、ＴＬＲ１４とで阻害性複合体を形成することができる、ＴＬＲ１４の切形されたまたは変種形態（例えば、図２（配列番号２）の約アミノ酸１〜６１４を含むＴＬＲ１４の設計されたまたは変種形態））である。ＴＬＲ１４プロペプチドおよびその変種を生じさせるための方法は当該分野で公知であり、その内容をここに引用して援用する米国特許第２００６／００２４７８３号に開示されている。
可溶性ＴＬＲ１４
【０１４８】
ＴＬＲ１４アンタゴニストの可溶性形態は単独で用いることができる。あるいは（例えば、化学的カップリング、遺伝子またはポリペプチド融合、非−共有結合その他によって）第二の部位、例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン、血清アルブミン、ＰＥＧ化、ＧＳＴ、Ｌｅｘ−ＡまたはＭＢＰポリペプチド配列に機能的に連結させることができる。本明細書中で用いるように、「融合蛋白質」とは、２以上の操作可能に会合した、例えば、連結された部位、例えば、蛋白質部位を含有する蛋白質をいう。典型的には、該部位は共有結合される。該部位は直接的に会合させるか、またはスペーサー、または、リンカーを介して連結させることができる。
【０１４９】
融合蛋白質は、加えて、第一の部位、例えば、可溶性ＴＬＲ１４を第二の部位に連結するリンカー配列を含むことができる。例えば、融合蛋白質はペプチドリンカー、例えば、長さが約４〜２０、より好ましくは５〜１０アミノ酸のペプチドリンカーを含むことができる；ペプチドリンカーは長さが８アミノ酸である。ペプチドリンカーにおけるアミノ酸の各々はＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、ＴｈｒおよびＡｌａよりなる群から選択され；ペプチドリンカーはＧｌｙ−Ｓｅｒエレメントを含む。いくつかの実施形態において、融合蛋白質はペプチドリンカーを含み、ペプチドリンカーは式（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｙを有する配列を含み、ここに、ｙは１、２、３、４、５、６、７、または８である。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、さらなるアミノ酸配列を融合蛋白質のＬ−またはＣ−末端に付加して、発現、検出および／または単離または精製を容易とすることができる。例えば、ＴＬＲ１４融合蛋白質を１または複数のさらなる部位、例えば、ＧＳＴ、Ｈｉｓ6タグ、ＦＬＡＧタグに連結することができる。例えば、融合蛋白質は、加えて、融合蛋白質配列をＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ−末端に融合させたＧＳＴ融合蛋白質に連結することができる。そのような融合蛋白質はＴＬＲ１４融合蛋白質の精製を容易とすることができる。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、融合蛋白質は、そのＮ−末端として異種シグナル配列（すなわち、ＴＬＲ１４核酸によってコードされるポリペプチドに存在し、なおポリペプチド配列）を含む。例えば、いくつかの実施形態において、天然ＴＬＲ１４シグナル配列を除去し、もう１つの蛋白質からのシグナル配列で置き換えることができる。ある宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＴＬＲ１４の配列および／または分泌を、異種シグナル配列の使用を介して増加させることができる。
【０１５２】
本発明のキメラまたは融合蛋白質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生産することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、例えば、連結のための平滑−末端またはスタガー末端、適当な末端を提供するための制限酵素消化、適切には粘着末端のフィリング−イン、望ましくない接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素連結を使用することによって、慣用的な技術に従ってイン−フレームで一緒に連結される。いくつかの実施形態において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡシンセサイザーを含めた慣用的な技術によって合成することができる。別法として、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、引き続いて、アニールシー、再度増幅して、キメラ遺伝子配列を生じさせることができる。２つの連続した遺伝子断片の間に相補的突出を生起させるアンカープライマーを用いて行うことができる。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２参照）。さらに、融合部位（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが商業的に入手可能である。ＴＬＲ１４コーディング核酸が、融合部位が免疫グロブリン蛋白質にイン−フレームで連結されるようにそのような発現ベクターにクローン化することができ得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、ＴＬＲ１４融合ポリペプチドは、ダイマーまたはトリマーのようなオリゴマーとして存在する。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、ＴＬＲ１４ポリペプチドは、ＴＬＲ１４ポリペプチドの、ＴＬＲ１４会合蛋白質、リガンドまたは共受容体への（突然変異していない配列に対して）より高い親和性の結合をもたらす天然に生じるＴＬＲ１４配列（野生型）において、突然変異を有する変種ＴＬＲ１４ポリペプチドとして提供される。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、ＴＬＲ１４ポリペプチド部位は、（突然変異していない配列に対して）蛋白質分解に対してより抵抗性であるＴＬＲ１４配列をもたらす天然に生じるＴＬＲ１４ポリペプチド配列（野生型）において突然変異を有する変種ＴＬＲ１４ポリペプチドとして提供される。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは全長ＴＬＲ１４ポリペプチドを含む。別法として、第一のポリペプチドは全長未満のＴＬＲ１４ポリペプチドを含む。例えば、アンタゴニストはＴＬＲ１４の可溶性形態（例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）ＴＬＲ１４の細胞外ドメインの可溶性形態）であり得る。例えば、ＴＬＲ１４アンタゴニストはヒトＴＬＲ１４の約アミノ酸１〜６９７（図：２；配列番号２）；ネズミＴＬＲ１４の約アミノ酸１〜６９７（図：４；配列番号４）を含むことができる。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、さらなるアミノ酸配列を融合蛋白質のＮ−またはＣ−末端に付加して、発現、立体的柔軟性、検出および／または単離または精製を容易とすることができる。第二のポリペプチドは好ましくは可溶性である。いくつかの実施形態において、第二のポリペプチドは連結されたポリペプチドの半減期（例えば、血清中半減期）を高める。いくつかの実施形態において、第二のポリペプチドは、融合ポリペプチドの第二のＴＬＲ１４ポリペプチドとの会合を容易とする配列を含む。いくつかの実施形態において、第二のポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリンポリペプチドの領域を含む。免疫グロブリン融合ポリペプチドは当該分野で公知であり、例えば、米国特許第５，５１６，９６４号；同第５，２２５，５３８号；同第５，４２８，１３０号；同第５，５１４，５８２号；同第５，７１４，１４７号；および同第５，４５５，１６５号に記載されている。例えば、ＴＬＲ１４またはＴＬＲ１４アンタゴニストプロペプチドの可溶性形態を、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含めた種々のイソタイプの重鎖定常領域に融合することができる。典型的には、融合蛋白質はヒトＴＬＲ１４の細胞外ドメインを含むことができ、例えば、ヒト免疫グロブリンＦｃ鎖、例えば、ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１、またはヒトＩｇＧ２、またはその突然変異した形態）を含むことができる。
【０１５８】
Ｆｃ配列は１または複数のアミノ酸において突然変異させて、エフェクター細胞機能、Ｆｃ受容体結合および／または補体結合を低下させることができる。抗体定常領域を改変する方法は当該分野で公知である。改変された機能、例えば、細胞上のＦｃＲ、または補体のＣ１成分のようなエフェクターリガンドに対する改変された親和性を持つ抗体は、抗体の定常部分における少なくとも１つのアミノ酸残基を異なる残基で置き換えることによって生産することができる（例えば、ＥＰ  ３８８，１５１  Ａ１、米国特許第５，６２４，８２１号および米国特許第５，６４８，２６０号参照）。同様なタイプの改変が記載されており、これは、もしネズミに適用されれば他の種の免疫グロブリンはこれらの機能を低下させ、または排除するであろうというものである。例えば、特定の残基をその側鎖上の適当な官能性を有する残基で置き換えることによって、あるいはグルタメートまたはアスパルテートのような荷電された官能基、または恐らくは、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンまたはアランインのような芳香族非極性残基を導入することによって、ＦｃＲ（例えば、ＦｃガンマＲ１）に対する、またはＣ１ｑに対する抗体のＦｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧのようなＩｇＧ）の親和性を改変することが可能である（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号参照）。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、第二のポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能よりも少ないエフェクター機能を有する。Ｆｃエフェクター機能は、例えば、Ｆｃ受容体結合、補体結合およびＴ細胞枯渇活性を含む（例えば、米国特許第６，１３６，３１０号参照）。Ｔ細胞枯渇活性、Ｆｃエフェクター機能、および抗体安定性をアッセイする方法は当該分野で公知である。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドはＦｃ受容体に対して低い検出可能な親和性を有し、または全く検出可能な親和性を有しない。別の実施形態において、第二のポリペプチドは補体蛋白質Ｃ１ｑに対して低い検出可能な親和性を有し、あるいは検出可能な親和性は有しない。
【０１６０】
抗体分子、および本明細書中に記載された可溶性受容体および／または融合蛋白質は、とりわけ、抗体（例えば、二特異的または多特異的抗体）、トキシン放射性同位体、細胞傷害性または静細胞剤のような１または複数の他の分子存在に（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合その他によって）機能的に連結させることができる。
ＴＬＲ１４変種分子および小分子
【０１６１】
なおもう１つの実施形態において、ＴＬＲ１４モジュレーター、例えば、結合剤、アンタゴニストは変種分子または小分子である。変種分子の例は、典型的には、ヒンジ、またはヒンジ−作用領域ポリペプチドに融合し、またはそうでなければ連結される結合ドメインポリペプチドを含み、外部ペプチドは、今度は、１または複数の天然、あるいはＣＨ１以外の重鎖からの作成された定常領域、例えば、ＩｇＧおよびＩｇＡのＣＨ２およびＣＨ３領域、あるいはＩｇＥのＣＨ３およびＣＨ４領域を含む領域に融合し、またはそうでなければ連結されている（より完全な記載については、例えば、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．による米国特許第０５／０１３６０４９号参照）。結合ドメイン−融合蛋白質は、さらに、ヒンジ領域ポリペプチドに融合した、またはそうでなければ連結した天然、または作成された重鎖ＣＨ２定常領域ポリペプチド（または全部または一部がＩｇＥに由来する構築体の場合にはＣＨ３）、およびＣＨ２定常領域ポリペプチドに融合した、またはそうでなければ連結した（または、全部または一部がＩｇＥに由来する構築体の場合にはＣＨ３）天然または作成された重鎖ＣＨ３定常領域ポリペプチド（または全部または一部がＩｇＥに由来する構築体の場合にはＣＨ４）を含む領域を含むことができる。典型的には、そのような結合ドメイン−融合蛋白質は、融合蛋白質−非依存性細胞−媒介細胞傷害性、補体固定、および／または標的、例えば、ＴＬＲ１４への結合よりなる群から選択される少なくとも１つの活性が可能である。
【０１６２】
典型的には、変種または小分子は、少なくとも約１０７Ｍ−１、典型的には約１０８Ｍ−１、より典型的には、約１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１またはそれ以上の親和性をもって哺乳動物、例えば、ヒトＴＬＲ１４に結合し；および本明細書中に記載された１または複数のＴＬＲ１４は生物学的活性を低下させ、および／または阻害する。いくつかの実施形態において、変種または小分子はＴＬＲ１４配列（例えば、ＴＬＲ１４の細胞外ドメインを含むＴＬＲ１４配列）に結合する（例えば、１つの実施形態においては、抗体分子はＴＬＲ１４ポリペプチド、またはその部分、例えば、ＴＬＲ１４の細胞外ドメイン（例えば、図２（配列番号２）の約アミノ酸１〜６９５または６９６、またはその断片、例えば、約アミノ酸８５〜１０３、または５０９〜５２６）に結合する）。他の実施形態において、抗体分子はＴＬＲ１４のロイシン−リッチなドメイン、例えば、図２（配列番号２）の約アミノ酸２６〜５８、８２〜１０５、１０６〜１２９、１３０〜１５３、１５４〜１７７、１７８〜２０１、２０２〜２２７、２２８〜２５１、２５２〜２７５、２７６〜２９９、３００〜３２３、３２４〜３４７、または３５９〜３１５に位置するドメインに結合する。なおもう１つの実施形態において、抗体分子は図２（配列番号２）の約アミノ酸５８９〜６７１に位置するフィブロネクチン−タイプＩＩＩドメイン（Ｆｎ３）、および／または図２（配列番号２）の約アミノ酸６４０〜６６０、６４５〜６５５、または６５２〜６５４に位置するＲＧＤインテグリン結合部位に結合する。ヒトＴＬＲ１４蛋白質は配列番号２の約アミノ酸１〜２０に対応する約２０〜２１アミノ酸長のリーダー配列を含むことができる。なお他の実施形態において、変種または小分子は、例えば、約アミノ酸７２０〜８１１、またはその部分（例えば、図２（配列番号２）の約アミノ酸７９６〜８１１）におけるＴＬＲ１４の細胞内ドメインに結合する。なお他の実施形態において、変種または小分子は、本明細書中に記載された、抗体０５４０（Ａ）、０５４１（Ｂ）、および０５４７（Ｃ）のいずれかと、ＴＬＲ１４に対する結合について競合する（例えば抗体分子は、抗体０５４０（Ａ）、０５４１（Ｂ）、および０５４７（Ｃ）によって認識されるのと同一または実質的に同様なＴＬＲ１４上のエピトープに結合する）。他の実施形態において、変種または小分子は本明細書中に記載されたエピトープに結合し、ＴＬＲ１４の１または複数の活性を阻害し、低下させ、または中和する。
【０１６３】
ある実施形態において、変種または小分子はＴＬＲ１４−相互作用ポリペプチド、例えば、ＮｇＲ、例えば、ヒトＮｇＲ；またはｐ７５ＮＴＲ、例えば、ヒトｐ７５ＮＴＲ（例えば、おのおの、図２２Ｂ（配列番号８）または図２４Ｂ（配列番号１２）に示された哺乳動物、例えば、ヒトＮｇＲ，またはｐ７５ＮＴＲ）、あるいはそれに実質的に相同な配列に結合し、ＴＬＲ１４の１または複数の活性を阻害し、低下させ、または中和する。
他のＴＬＲ１４アンタゴニスト
【０１６４】
もう１つの実施形態において、ＴＬＲ１４アンタゴニストは天然に生じるアンタゴニスト、またはその機能的断片または変種である。実施形態において、アンタゴニストはＲＧＤポリペプチド／ペプチドミメティックである。ＲＧＤペプチド／ペプチドミメティックの例は、Ｄｕｎｅｈｏｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９５（９）；１８５６−１８６７に記載されている。
【０１６５】
なおもう１つの実施形態において、ＴＬＲ１４アンタゴニストは、ＴＬＲ１４またはＴＬＲ１４−関連ポリペプチド、例えば、ＮｇＲ１またはｐ７５ＮＴＲをコードする核酸の発現を阻害する。そのようなＴＬＲ１４アンタゴニストの例は核酸分子、例えば、アンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡｉ、小干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＴＬＲ１４をコードする核酸にハイブリダイズする三重ラセン分子、または転写調節領域を含み、ＴＬＲ１４のｍＲＮＡ発現をブロックし、または低下させる。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、核酸アンタゴニストを用いて、ＴＬＲ１４をコードする内因性遺伝子の発現を減少させる。いくつかの実施形態において、核酸アンタゴニストは、ＴＬＲ１４をコードするｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡである。アンタゴニスト核酸の他のタイプ、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡリボザイム、三重−ラセンフォーマー、またはアンチセンス核酸を用いることもできる。従って、核酸阻害剤である単離された核酸分子、例えば、ＴＬＲ１４をコードする核酸分子に対するアンチセンスＲＮＡｉが提供される。
【０１６７】
「アンチセンス」核酸は、例えば、二本鎖ｃＤＮA分子のコーディングストランドに対して相補的な、またはｍＲＮＡ配列に対して相補的な、蛋白質をコードする「センス」核酸に対して相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。アンチセンス核酸は全ＴＬＲ１４コーディングストランド、あるいはその一部に対してのみ相補的であり得る。いくつかの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ＴＬＲ１４をコードするヌクレオチド配列のコーディングストランドの「非コーディング領域」（例えば、５’および３’非翻訳領域）に対してアンチセンスである。アンチセンス剤は、例えば、約８〜約８０ヌクレオベース（すなわち、約８〜約８０ヌクレオチド）、例えば、約８〜約５０ヌクレオベース、約１２〜約３０ヌクレオベースを含むことができる。アンチセンス化合物はリボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴ酵素）、および標的核酸にハイブリダイズし、およびその発現を変調する他の短い触媒ＲＮＡまたは触媒オリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス化合物は、標的遺伝子中の配列に相補的な少なくとも８つの連続ヌクレオベースのストレッチを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸配列対して１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドは、標的へのオリゴヌクレオチドの結合が標的分子の正常な機能に干渉して、有用性の喪失を引き起こし、および特異的結合が望まれる条件下で、すなわち、in vivoアッセイまたは治療的措置の場合における、あるいはin vitroアッセイの場合における生理学的条件下で、アッセイが行われる条件下で非−標的配列へのオリゴヌクレオチドの非−特異的結合を回避するための十分な程度の相補性があれば、特異的にハイブリダイズ可能である。
【０１６８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションはｍＲＮＡの１または複数の正常な機能に干渉することができる。干渉すべきｍＲＮＡの機能は、例えば、蛋白質転写の部位へのＲＮＡのトランスロケーションＲＮＡからの蛋白質の翻訳、１または複数のｍＲＮＡ種を生じさせるためのＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに従事することができる触媒活性のような全ての鍵となる機能を含むであろう。ＲＮＡへの特異的蛋白質の結合は、ＲＮＡへのアンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって干渉することができる。
【０１６９】
例示的なアンチセンス化合物は、標的核酸に特異的にハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。相補的領域は約８〜約８０ヌクレオベースの間に拡大することができる。化合物は１または複数の修飾されたヌクレオベースを含むことができる。修飾されたヌクレオベースは、例えば、５−ヨードウラシル、５−ヨードシトシンのような５−置換ピリミジン、およびＣ５−プロピニルシトシンおよびＣ５−プロピニルウラシルのようなＣ５−プロピニルピニピジンを含むことができる。他の適当な修飾されたヌクレオベースはＮ４−（Ｃ１−Ｃ１２）アルキルアミノシトシンおよびＮ４，Ｎ４−（Ｃ１−Ｃ１２）ジアルキルアミノシトシンを含む。修飾されたヌクレオベースは７−置換−８−アザ−７−デアザプリン、および例えば、７−ヨード−７−デアザプリン、７−シアノ−７−デアザプリン、７−アミノカルボニル−７−デアザプリンのような７−置換−７−デアザプリンを含むこともできる。これらの例は、６−アミノ−７−ヨード−７−デアザプリン、６−アミノ−７−シアノ−７−デアザプリン、６−アミノ−７−アミノカルボニル−７−デアザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−ヨード−７−デアザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−シアノ−７−デアザプリン、および２−アミノ−６−ヒドロキシ−７−アミノカルボニル−７−デアザプリンを含む。さらに、Ｎ６−メチルアミノアデニンおよびＮ６，Ｎ６−ジメチルアミノアデニンを含めた、Ｎ６−（Ｃ１−Ｃ１２）アルキルアミノプリンおよびＮ６，Ｎ６−（Ｃ１−Ｃ１２）ジアルキルアミノプリンもまた、適当な修飾されたヌクレオベースである。同様に、例えば、６−シオグアニンを含めた、他の６−置換プリンは適当な修飾されたヌクレオベースを構成することができる。他の適当なヌクレオベースは２−シオウラシル、８−ブロモアデニン、８−ブロモグアニン、２−フルオロアデニン、および２−フルオログアニンを含む。前記した修飾されたヌクレオベースのいずれかの誘導体もまた適当である。これまでの化合物のいずれかの置換基はＣ１−Ｃ３０アルキル、Ｃ２−Ｃ３０アルケニル、Ｃ２−Ｃ３０アルケニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ハロ、アミノ、アミド、ニトロ、チオ、スルホニル、カルボキシル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル等を含むことができる。他のタイプの核酸剤の記載も入手可能である。例えば、米国特許第４，９８７，０７１号；第５，１１６，７４２  号；および第５，０９３，２４６号；Ｗｏｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ，Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）；８９：７３０５−９；Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４：８０７−１５参照。
【０１７０】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、（例えば、組織部位における直接的注射によって）対象に投与されるか、あるいはそれらが、ＴＬＲ１４蛋白質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズし、またはそれに結合して、それにより、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって蛋白質の発現を阻害するように、イン・サイチュで生じさせる。別法として、アンチセンス核酸分子を修飾して、選択された細胞を標的化し、次いで、全身投与することができる。全身投与では、アンチセンス分子は、それらが、例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結させることによって、選択された細胞表面に発現された受容体または抗原に特異的に結合するように修飾することができる。アンチセンス核酸分子は、本明細書中に記載されたベクターを用いて細胞に送達することができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ｉｉまたはｐｏｌ  ｉｉｉプロモーターの制御化におかれたベクター構築体が好ましい。
【０１７１】
なおもう１つの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子である。アルファ−アノマー核酸分子は相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、ここに、通常のβ−ユニットとは対照的にストランドは相互に平行に動く（Ｇａｕｌｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子は２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）を含むこともできる。
【０１７２】
ｓｉＲＮＡは、所望により、突出を含む小さな二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡある。例えば、ｓｉＲＮＡのリュプレックス領域は長さが約１８〜２５ヌクレオチド、例えば、長さが約１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドである。典型的には、ｓｉＲＮＡ配列は、標的ｍＲＮＡに対して正確に相補的である。ｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、特に、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）において、遺伝子発現をサイレントとするのに用いることができる。ｓｉＲＮＡは２９−塩基−対ステムおよび２−ヌクレオチド３’突出を持つ短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も含む。例えば、Ｃｌｅｍｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：６４９９−６５０３；Ｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１４４２８−１４４３３；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ．４１１：４９４−８；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７；Ｓｉｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（２）：２２７−３１；２００４００８６８８４；米国特許第２００３０１６６２８２号；第２００３０１４３２０４号；第２００４００３８２７８号；および第２００３０２２４４３２号参照。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである。ＴＬＲ１４をコードする核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示するＴＬＲ１４  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な１または複数の配列（すなわち、配列番号１または配列番号３）、およびｍＲＮＡ切断を担う公知の触媒配列を有する配列を含むことができる（例えば、米国特許第５，０９３，２４６号またはＨａｓｅｌｈｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１参照）。例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築することができ、ここに、活性部位のヌクレオチド配列は、ＴＬＲ１４−コーディングｍＲＮＡにおいて切断されるべきヌクレオチド配列に対して相補的である。例えば、Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，１１６，７４２号参照。別法として、ＴＬＲ  ｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールからの特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択することができる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８参照。
【０１７４】
ＴＬＲ１４遺伝子発現は、ＴＬＲ１４受容体の調節領域（例えば、ＴＬＲ１４プロモーターおよび／またはエンハンサー領域）に対して相補的なヌクレオチド配列を標的化して、標的遺伝子中のＴＬＲ１４遺伝子の転写を妨げる三重ラセン構造を形成することによって阻害することができる。一般に、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．ｉ（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４：８０７−１５参照。三重ラセン形成のために標的化することができる潜在的配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作り出すことによって増加させることができる。スイッチバック分子は、それらがデュプレックスの最初の1つのストランドと塩基対合し、次いで、他方のストランドと対合し、デュプレックスの1つのストランドに存在すべきプリンまたはピリミジンいずれかのサイズ変更可能ストレッチに対する必要性を排除するように、交互５’−３’、３’−５’様式で合成される。
【０１７５】
また、本発明は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ分子も提供する。典型的には、そのような標識は、ケミルミネセント、蛍光、放射性、または比色的である。
【０１７６】
ＴＬＲ１４核酸分子は、塩基部位、糖部位またはリン酸骨格において修飾して、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解性を改良することができる。修飾を施した合成オリゴヌクレオチドの非−限定的例については、Ｔｏｕｌｍｅ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：１７およびＦａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：４０−４４を参照されたし。そのようなホスホルアミダイトオリゴヌクレオチドは効果的なアンチセンス剤であり得る。
【０１７７】
例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を作り出すことができる（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４：５−２３参照）。本明細書中で用いるように、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」とは、核酸ミミック、例えば、ＤＮＡミミックをいい、ここに、デオキシリボースリン酸骨格は、プソイドペプチド骨格によって置き換えられており、４つの天然のヌクレオベースのみが保持されている。ＰＮＡの中性骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能とすることができる。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ｓｕｐｒａおよびＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１４６７０−６７５に記載されている標準的な固相ペプチド合成プロトコルを用いて行うことができる。
【０１７８】
ＴＬＲ１４核酸分子のＰＮＡは治療および診断適応で用いることができる。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写または翻訳の阻止を誘導し、あるいは複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列−特異的変調のためのアンチセンスまたは抗遺伝子剤として用いることができる。ＴＬＲ１４核酸分子のＰＮＡは、（例えば、ＰＮＡ−指向性ＰＣＲクランピングによって）遺伝子中の単一塩基対突然変異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ｓｕｐｒａ））と組合せて用いた場合に「人工の制限酵素」として；あるいはＤＮＡ配列決定またはハイブリダイゼーションのためのプロープまたはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ｓｕｐｒａ；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ｓｕｐｒａ）、用いることもできる。
【０１７９】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは（例えば、in vivoにて宿主細胞受容体を標的化するための）ペプチド、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８−６５２；Ｗ０８８／０９８１０参照）または血液―脳関門（例えば、Ｗ０  ８９／１０１３４参照）を横切っての輸送を容易とする剤のような他の付属の基を含むことができる。加えて、オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション−トリガード切断剤（例えば、Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６参照）またはインタカレーティング剤（例えば、Ｚｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９参照）で修飾することができる。この目的では、オリゴヌクレオチドはもう１つの分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショントリガード架橋剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーション−トリガード切断剤）にコンジュゲートすることができる。
組換え発現ベクター、宿主細胞および遺伝子工学により作成された細胞
【０１８０】
もう１つの態様において、本発明は、本明細書中に記載されたポリペプチドをコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターを含む。本明細書中で用いるように、用語「ベクター」とは、それが連結されたもう１つの核酸を輸送することができる核酸分子をいい、プラスミド、コスミドまたはウイルスベクターを含むことができる。ベクターは自律複製が可能であり、あるいはそれは宿主ＤＮＡに組み込むことができる。ウイルスベクターは、例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ−関連ウイルスを含む。
【０１８１】
ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態のＴＬＲ１４核酸を含むことができる。好ましくは、組換え発現ベクターは、発現すべき核酸配列に操作可能に連結された１または複数の調節配列を含む。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（たとえば、ポリアデニル化シグナル）を含む。調節配列は、ヌクレオチド配列、ならびに組織―特異的調節および／または誘導性配列の構成的発現を指令するものを含む。発現ベクターの切形は、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望の蛋白質の発現のレベル等のような因子に依存し得る。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより、本明細書中に記載された核酸によってコードされる融合蛋白質またはポリペプチドを含めた蛋白質またはポリペプチド（例えば、ＴＬＲ１４蛋白質、ＴＬＲ１４蛋白質の突然変異体形態、融合蛋白質等）を生産することができる。
【０１８２】
用語「組換え宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）は、本明細書中で用いるように、組換え発現ベクターが導入されている細胞をいうことを意図する。そのような用語は特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫をいうことを意図する。ある修飾は突然変異または環境の影響のいずれかにより継続する世代で起こり得るので、そのような子孫は、事実、親細胞と同一でないかも知れないが、依然として、本明細書中で用いる用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【０１８３】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物細胞におけるＴＬＲ１４蛋白質の発現のために設計することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ、（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いる）昆虫細胞酵母細胞または哺乳動物細胞において発現させることができる。適当な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡにさらに議論されている。別法として、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてin vitroで転写させ、翻訳することができる。
【０１８４】
原核生物における蛋白質の発現は、最もしばしば、融合または非−融合蛋白質いずれかの発現を指令する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを持つＥ．ｃｏｌｉ中で行われる。融合ベクターは多数のアミノ酸を、その中にコードされた蛋白質に、通常は、組換え蛋白質のアミノ末端に付加し、そのような融合ベクターは典型的には、３つの目的：１）組換え蛋白質の発現を増加させること：２）組換え蛋白質の溶解性を増大させること；および３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換え蛋白質の精製を助けること；を発揮する。しばしば、蛋白質分解切断部位および組換え蛋白質の接合において導入されて、融合蛋白質の精製に引き続いて融合部位からの組換え蛋白質の分離を可能とする。そのような酵素、およびそれらの同族認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、各々、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合蛋白質、またはプロテインＡを標的組換え蛋白質に融合させるｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含む。
【０１８５】
精製された融合蛋白質はＴＬＲ１４活性アッセイ（例えば、後に詳細に記載される直接的アッセイまたは競合アッセイ）において、あるいはＴＬＲ１４蛋白質について（すなわち、に対して）特異的な抗体を生じさせるために用いることができる。好ましい実施形態において、本発明のレトロウイルス発現ベクターにおいて発現された融合蛋白質を用いて、骨髄細胞を感染させ、それを、引き続いて、照射された受容者に移植することができる。次いで、十分な時間が経過した後（例えば、６週間）、対象受容者の病理学を調べる。
【０１８６】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換え蛋白質発現を最大にすることは、組換え蛋白質を蛋白質分解により切断する損なわれた能力を持つ宿主細菌において蛋白質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  １１９−１２８）。もう１つの戦略は、各アミノ酸についての個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるものであるように、発現ベクターに挿入されるべく核酸の核酸配列を改変することである（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のそのような改変は、標準的なＤＮＡ合成技術によって行うことができる。
【０１８７】
ＴＬＲ１４発現ベクターは、酵母発現ベクター、昆虫細胞における発現のためのベクター、例えば、バキュロウイルス発現ベクター、または哺乳動物細胞における発現に適したベクターであり得る。
【０１８８】
哺乳動物細胞で用いる場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントによって、供することができる。例えば、通常使用されるプロモーターはポリオーマアデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。
【０１８９】
もう１つの実施形態において、プロモーターは誘導性プロモーター、例えば、ステロイドホルモンによって、ポリペプチドホルモンによって（例えば、シグナル変換経路によって）、または異種ポリペプチドによって調節されるプロモーターである（例えば、テトラサイクリン−誘導性システム「Ｔｅｔ−Ｏｎ」および「Ｔｅｔ−Ｏｆｆ」；例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，ＣＡ，Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７，およびＰａｉｌｌａｒｄ（１９８９）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：９８３参照）。
【０１９０】
もう１つの実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指令することができる（例えば、組織−特異的調節エレメントを用いて、核酸を発現させる）。適当な組織−特異的プロモーターの非限定的例はアルブミンプロモーター（肝臓−特異的プロモーター；Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系−特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ａｎｄ  Ｅａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン−特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓−特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、および乳腺−特異的プロモーター（例えば、乳ホエイプロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）を含む。発生的に調節されたプロモーター、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ  ａｎｄ  Ｔｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も含まれる。
【０１９１】
本発明は、さらに、アンチセンス向きに発現ベクターにクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。種々の細胞型におけるアンチセンスＲＮＡの構成的組織特異的または細胞型特異的発現を指令する、アンチセンス向きにクローン化された核酸に操作可能に連結された調節配列（例えば、ウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー）を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファゲミドまたは減弱ウイルスの形態とすることができる。
【０１９２】
本発明のもう１つの態様は、本明細書中に記載された核酸分子、例えば、組換え発現ベクター内のＴＬＲ１４核酸分子、または相同的に宿主細胞のゲノムの特異的部位に組み込まれるのを可能とする配列を含有するＴＬＲ１４核酸分子を含む宿主細胞を提供する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は本明細書中において相互交換可能に用いられる。そのような用語は特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫または潜在的子孫もいう。ある修飾が突然変異または環境の影響いずれかのため継続する世代で起こり得るので、そのような子孫は事実親細胞と同一でないかも知れないが、依然として、本明細書中で用いる用語の範囲内に含まれる。
【０１９３】
宿主細胞は原核生物または真核生物細胞である得る。例えば、ＴＬＲ１４蛋白質は（Ｅ．ｃｏｌｉのような）細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞または（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＶ−１起源ＳＶ４０細胞のような；Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５−１８２）哺乳動物細胞で発現させることができる。他の適当な宿主細胞は当業者に知られている。
【０１９４】
ベクターＤＮＡは、慣用的な形切転換またはトランスフェクション技術を介して宿主細胞に導入することができる。本明細書中で用いるように、用語「形切転換」および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共−沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含めた、外来性核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための種々の当該分野で認識される技術をいうことを意図する。
【０１９５】
本発明の宿主細胞を用いて、ＴＬＲ１４蛋白質を生産（すなわち、発現）させることができる。従って、本発明は、さらに、本発明の宿主細胞を用いてＴＬＲ１４蛋白質を生産する方法を提供する。いくつかの実施形態において、該方法は本発明の宿主細胞を用いて全長ＴＬＲ１４を生産する（すなわち、発現させる）ことを含む。いくつかの実施形態において、該方法は可溶性ＴＬＲ１４ドメインのみを生産する（すなわち、発現させる）ことを含む。いくつかの実施形態において、該方法はＴＬＲ１４エクトドメインおよび／またはＴＬＲ１４膜貫通ドメインを生産する（すなわち、発現させる）ことを含む。いくつかの実施形態において、該方法はＴＬＲ１４抗原断片、例えば、抗体と相互作用することができるＴＬＲ１４断片を生産する（すなわち、発現させる）ことを含む。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、該方法は、ＴＬＲ１４蛋白質が生産されるように、適当な培地中で（ＴＬＲ１４蛋白質をコードする組換え発現ベクターが導入された）本発明の宿主細胞を培養することを含む。もう１つの実施形態において、該方法は、さらに、ＴＬＲ１４蛋白質を培地または宿主細胞から単離することを含む。
【０１９７】
もう１つの態様において、本発明はＴＬＲ１４導入遺伝子を含む。あるいはそうでなければ、ＴＬＲ１４を誤って発現する細胞、または複数細胞の精製された調製物をその特徴とする。該細胞調製物はヒトまたは非ヒト細胞、例えば、げっ歯類細胞、例えば、マウスまたはラット細胞、ウサギ細胞、またはブタ細胞よりなる群から選択されることができる。好ましい実施形態において、該細胞または複素細胞はＴＬＲ１４導入遺伝子、例えば、ＴＬＲ１４の異種形態、例えば、（非−ヒト細胞の場合には）ヒトに由来する遺伝子を含む。ＴＬＲ１４導入遺伝子は誤って発現させ、例えば、過剰発現させ、または過少発現させることができる。他の好ましい実施形態において、細胞または複素細胞は内因性ＴＬＲ１４、例えば、その発現が破壊され、例えば、ノックアウトされた遺伝子を誤って発現する遺伝子を含む。そのような細胞は、突然変異した、または誤って発現されたＴＬＲ１４対立遺伝子に関連する障害を研究するための、または薬物スクリーミングで用いるためのモデルとして働くことができる。
【０１９８】
また、内因性ＴＬＲ１４が、内因性ＴＬＲ１４遺伝子の発現を正常に制御しない調節配列の制御下にある細胞、好ましくはヒト細胞、例えば、線維芽細胞である。細胞、例えば、細胞系または微生物内の内因性遺伝子の発現特徴は、異種ＤＮＡ調節エレメントを、挿入された調節エレメントが内因性ＴＬＲ１４遺伝子に操作可能に連結されるように、細胞のゲノムに挿入することによって修飾されることができる。例えば、「転写的にサイレント」である。例えば、正常に発現されない、あるいは非常に低いレベルでのみ発現される内因性ＴＬＲ１４遺伝子は、正常に発現された遺伝子産物の発現を促進することができる調節エレメントをその細胞に挿入することによって活性化することができる。標的化相同組換えのような技術を用いて、例えば、１９９１年５月１６日に公開されたＣｈａｐｐｅｌ，米国特許第５，２７２，０７１号；ＷＯ  ９１／０６６６７に記載されているように、異種ＤＮＡを挿入することができる。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、移植された組換え細胞は、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質ポリペプチドに特異的な抗体を発現させ、分泌させる。該抗体はいずれかの抗体、または本明細書中に記載されたいずれかの抗体誘導体であり得る。
スクリーニングアッセイ
【０２００】
本発明は、ＴＬＲ１４蛋白質に結合し、例えば、ＴＬＲ１４発現、またはＴＬＲ１４活性に対して、阻害効果を有するか、あるいは、例えば、ＴＬＲ１４−関連蛋白質、例えば、本明細書中に記載されたリガンド、共−受容体またはニューロン蛋白質、例えば、ｐ７５ＮＴＲまたはＮｇＲ１の発現または活性に対して阻害効果を有するモジュレーター、すなわち、候補またはテスト化合物または剤（例えば、蛋白質、ペプチド、ペプチドミメティック、ペプトイド、小分子または他の薬物）を同定するための（本明細書中においては、「スクリーミングアッセイ」ともいわれる）方法を提供する。そのようにして同定された化合物を用いて、治療プロトコルにおいて標的遺伝子産物（例えば、ＴＬＲ１４遺伝子）の活性を変調し、標的遺伝子産物の生物学的機能を改善し、あるいは正常な標的遺伝子相互作用を破壊する化合物を同定することができる。いくつかの実施形態において、本発明は、ＴＬＲ１４蛋白質またはポリペプチド、またはその生物学的に活性な部分に結合し、またはその活性を変調する候補またはテスト化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【０２０１】
従って、本発明は、ＴＬＲ１４を変調する化合物、例えば、テスト化合物を同定するための方法またはアッセイを提供する。該方法または該アッセイは（ｉ）（所望により）ＴＬＲ１４と相互作用し、例えば、それに結合するテスト剤を供し、または同定し；および／または（ｉｉ）ＴＬＲ１４−発現細胞（例えば、本明細書中に記載された抗体を用いてＴＬＲ１４発現に対して陽性をテストする細胞、および限定されるものではないが、例えば、ニューロン、神経先祖、神経幹細胞、多脳性または多能力性細胞、神経膠細胞、小神経膠細胞、神経膠星状細胞、および稀突起神経膠細胞を含めた他のニューロン細胞）を発現するＴＬＲ１４の活性の変化を、参照、例えば、参照試料に対するテスト剤の存在下で評価することを含む。
【０２０２】
テスト化合物または剤は抗体分子；ペプチド；可溶性ＴＬＲ１４またはその融合；変種分子；小分子、例えば、コンビナトーリアルまたは天然産物ライブラリーのメンバー；核酸；アンチセンス分子；リボザイム；ＲＮＡｉ；三重ラセン分子；またはそのいずれかの組合せであり得る。いくつかの実施形態において、テスト化合物はＴＬＲ１４ポリペプチドまたは核酸の活性または発現に拮抗する（例えば、それを減少させる）。例えば、ＴＬＲ１４核酸分子の発現は、例えば、ｍＲＮＡ転写、ｍＲＮA安定性を改変するによって、拮抗させることができる。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、評価工程は、ＴＬＲ１４ポリペプチド（例えば、本明細書中に記載されたＴＬＲ１４）、またはＴＬＲ１４をコードする核酸の１または複数をテスト化合物と接触させ；次いで、所定のレベル、例えば、テスト化合物を含まない対照試料に対するテスト化合物の存在下におけるＴＬＲ１４ポリペプチドまたは核酸の１または複数の活性の変化を評価することを含む。接触工程は（培養細胞、例えば、ニューロンまたは神経膠細胞、または復元した系中で）in vitroにて（例えば、テスト化合物を非ヒト対象、例えば、ＴＬＲ１４遺伝子中に突然変異を有する動物モデルに投与することによって）in vivoにて行うことができる。接触工程および／またはテスト化合物の投与を反復することができる。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、テスト化合物およびＴＬＲ１４の間の相互作用を評価する。いくつかの実施形態において、そのような相互作用は、テスト化合物との間での複合体の形成および／または安定性の変化を検出することによって評価することができ、およびＴＬＲ１４は：例えば、生化学的検出、アフィニティーベースの検出（例えば、ウエスタンブロットアフィニティーからの）免疫沈澱、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースのアッセイ、分光光学的手段（例えば、円二色性、吸光度、および溶液特性の他の測定）によって、複合体それ自体の結合または物理的形成の変化；シグナル変換、例えば、ｐ３８リン酸化、ＫκＢ分解、および／またはＴＬＲ１４−関連遺伝子の転写活性の変化、例えば、増加または減少；および／または（ＶＩＩ）神経突起外植の変化、例えば、増加または減少の１または複数を検出することによって決定することができる。
【０２０５】
１つの実施形態において、同一または異なるアッセイにおいて、テスト化合物が同定され再度テストされる。例えば、テスト化合物がin vitroまたは無細胞系において同定され、動物モデルまたは細胞−ベースのアッセイにおいて再度テストされる。アッセイのいずれかの順序または組合せを用いることができる。例えば、高スループットアッセイを動物モデルまたは組織培養と組み合せて用いることができる。
【０２０６】
本発明テスト化合物は生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有するが、酵素分解に対して抵抗性であるが、それにもかかわらず生物活性なままであり新規な非ペプチド骨格を持つ分子のライブラリー；例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５参照）；空間的にアドレス可能な平衡固相または液相ライブラリー；デコンボルーションを必要とする合成ライブラリー方法；「１−ビーズ、１−化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー方法を含めた、当該分野で公知のコンビナトーリアルライブラリー方法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができる。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに制限されており、他方、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ１９９７）  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ.１２：１４５）。
【０２０７】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、例えば、ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３において当該分野で見出すことができる。
【０２０８】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ，米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ，米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）上またはファージ（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ  ｓｕｐｒａ）上に提示することができる。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、アッセイは細胞−ベースのアッセイであり、ＴＬＲ１４蛋白質またはその生物学的に活性な部分に発現する細胞をテスト化合物と接触させ、ＴＬＲ１４活性に拮抗するテスト化合物の能力を決定する。ＴＬＲ１４活性に拮抗するテスト化合物の能力の決定は例えば、神経突起外殖、ＲｈｏＡ、ＰＫＣ、ＣｄＣ４２、Ｒａｃ１、ＰＡＫ１、ＲＯＣＫの活性化、ＬＩＭ−キナーゼ、コフィリン、アクチン、Ｃａｍｐ、ＥＲＫ活性化、ＮＦ−κＢ、ＴＮＦａ、ＩＬ−１ｂ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１２のような免疫遺伝子の大きなファミリーの転写活性ＬＯの生産をモニターすることによって達成することができる。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、無細胞アッセイが提供され、そこではＴＬＲ１４蛋白質またはその生物学的に活性な部分をテスト化合物と接触させ、ＴＬＲ１４蛋白質またはその生物学的に活性な部分に結合するテスト化合物の能力を評価する。本発明のアッセイで用いるべきＴＬＲ１４蛋白質の好ましい生物学的に活性な部分は、非−ＴＬＲ１４分子との相互作用に参画する断片、例えば、高い表面確率スコアを持つ断片を含む。
【０２１１】
単離された蛋白質（例えば、ＴＬＲ１４蛋白質またはその生物学的に活性な部分）の可溶性および／または膜−結合形態を用いる場合、可溶化剤を利用するのが望ましいであろう。そのような可溶化剤の例はｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−ｎ−メチルグルカミド、デカノイドｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−「（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ」１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−「（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ」−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）Ａ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ１−プロパンスルホネートのような非−イオン性洗剤を含む。
【０２１２】
無細胞アッセイは、二つの成分が相互作用し、結合するのを可能とする条件下にて、かつ、それに十分な時間の間、標的遺伝子蛋白質およびテスト化合物の反応混合物を調製し、かくして、除去し、および／または検出することができる複合体を形成することを含む。
【０２１３】
２つの分子の間の相互作用は、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いて検出することもできる。第一の「ドナー」分子上のフルオロフォアー標識を、その発せられた蛍光エネルギーが、吸収されたエネルギーにより蛍光を発することができる第二の「アクセプター」分子上の蛍光標識によって吸収されるように選択される。別法として「ドナー」蛋白質分子はトリプトファン残基の天然蛍光エネルギーを単に利用することができる。「アクセプター」分子標識が「ドナー」のそれと区別できるように、異なる波長の光を発することができる標識を選択する。標識の間のエネルギー移動の効率は分子を分離する距離に関連するので、分子の間の空間的関係を評価することができる。結合は分子の間で起こる状況において、アッセイにおける「アクセプター」分子の蛍光発光は最大とすべきである。ＦＲＥＴ結合事象は、便宜には、（例えば、フリオリメーターを用いる）当該分野で公知の標準フルオロメトリー検出手段を通じて測定することができる。
【０２１４】
もう１つの実施形態において、標的分子に結合するＴＬＲ１４蛋白質の能力の決定は、リアル−タイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５およびＳｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５参照）を用いて達成することができる。「表面プラズモン共鳴」または「ＢＩＡ」は、相互作用体（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）のいずれかを標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用を検出する。（結合事象を示す）結合表面における質量の変化の結果、表面近くの光の屈折率の改変（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）をもたらし、その結果、生物学的分子の間のリアルタイム反応の指標として用いることができる検出可能なシグナルが得られる。
【０２１５】
１つの実施形態において、標的遺伝子産物またはテスト物質を固相係留する。固相に係留された標的遺伝子産物／複合体は反応の最後に検出されることができる。好ましくは、標的遺伝子産物を固体表面に係留することができ、（係留されていない）テスト化合物を本明細書中で議論した検出可能な標識で直接的または間接的に標識することができる。
【０２１６】
ＴＬＲ１４または抗−ＴＬＲ１４抗体いずれかを固定化して、蛋白質の一方また双方の複合体化していない形態から複合体化した形態の分離を容易とし、ならびにアッセイの自動化を受け入れるのが望ましいであろう。ＴＬＲ１４蛋白質へのテスト化合物の結合、または候補化合物の存在下または不存在下におけるＴＬＲ１４蛋白質と標的分子との相互作用は、反応体を含有するのに適したいずれの容器中で達成することもできる。そのような容器の例はマイクロタイタープレート試験管、およびミクロ−遠心管を含む。１つの実施形態において、蛋白質の一方または双方をマトリックスに結合させるのを可能とするドメインを付加する融合蛋白質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＴＬＲ１４融合蛋白質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合蛋白質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、次いで、これをテスト化合物または、テスト化合物および非吸着標的蛋白質またはＴＬＲ１４蛋白質いずれかと合わせ、混合物を（例えば、塩およびｐＨについての生理学的条件にて）複合体形成に導く条件下でインキュベートする。インキュベーションに続き、ビーズまたはマイクロタイタープレートウエルを洗浄して、いずれかの未結合成分、ビーズの場合には固定化されたマトリックス、例えば、前記したように直接的または間接的に決定された複合体を除去する。別法として複合体をマトリックスから解離させることができ、ＴＬＲ１４結合または活性のレベルを、標準的技術を用いて決定することができる。
【０２１７】
ＴＬＲ１４蛋白質または標的分子いずれかをマトリックス上に固定化するための他の技術は、ビオチンおよびストレプオトアビジンのコンジュゲーションの使用を含む。ビオチニル化ＴＬＲ１４蛋白質または標的分子は、当該分野で公知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、ビオチン―ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン−被覆９６ウエルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウエル中に固定化することができる。
【０２１８】
アッセイを行うために、非固定化成分を、係留された成分を含有する被覆表面に加える。反応が完了した後、形成されたいずれの複合体も固体表面に固定化されたままである条件下で、未反応成分を（例えば、洗浄によって）除去する。固体表面に係留された複合体の検出は、多数の方法で達成することができる。従前に固定化されていない成分を予め標識する場合、表面に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。従前に固定化されていない成分が、予め標識されていない場合、間接的な標識を用いて、例えば、固定化された成分に特異的な標識抗体（該抗体は、今度は、例えば、標識された抗−ＩＧ抗体で直接的に標識することができるか、または間接的に標識することができる）を用いて、表面に係留された複合体を検出することができる。
【０２１９】
１つの実施形態において、このアッセイは、ＴＬＲ１４蛋白質または標的分子に反応性であるが、ＴＬＲ１４蛋白質のその標的分子への結合に干渉しない抗体を利用して行われる。そのような抗体はプレートのウエルに誘導体化し、抗体コンジュゲーションによって未結合標的またはＴＬＲ１４蛋白質をウエルに捕獲することができる。ＧＳＤ固定化複合体について記載したものに加えて、そのような複合体を検出するための方法は、ＴＬＲ１４蛋白質または標的分子と反応性である抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質または標的分子に関連する酵素活性の検出に依拠する酵素−結合アッセイを含む。
【０２２０】
別法として、無細胞アッセイを液相中で実行することができる。そのようなアッセイにおいて、反応生成物は、限定されるものではないが、分別遠心（例えば、Ｒｉｖａｓ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．，（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １８：２８４−７参照）；クロマトグラフィーゲル濾過クロマトグラフィーイオン―交換、クロマトグラフィー電気泳動（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）；および免疫沈澱（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）を含めた、多数の標準的な技術のいずれかによって未反応生成分から分離する。そのような樹脂およびクロマトグラフィー技術は当業者に知られている（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ，Ｎ．Ｈ．，（１９９８）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １１：１４１−８；Ｈａｇｅ，Ｄ．Ｓ．，およびＴｗｅｅｄ，Ｓ．Ａ．（１９９７）Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ．６９９：４９９−５２５参照）。さらに、蛍光エネルギー移動は、便宜には、本明細書中で記載するように、複合体の溶液からのさらなる精製なくして結合を検出するのに利用することもできる。
【０２２１】
本発明の標的遺伝子産物は、in vivoにて、蛋白質のような１または複数の細胞または細胞外マクロ分子と相互作用することができる。この議論の目的では、そのような細胞および細胞外マクロ分子を、本明細書中においては、「結合パートナー」という。そのような相互作用を破壊する化合物は、標的遺伝子産物の活性を調節するのに有利であり得る。そのような成分は限定されるものではないが、抗体ペプチドおよび小分子のような分子を含むことができる。この実施形態で用いる好ましい標的遺伝子／産物は本明細書中において、同定されたＴＬＲ１４遺伝子である。別の実施形態において、本発明は、ＴＬＲ１４標的分子の下流エフェエクターの活性の変調を通じてＴＬＲ１４蛋白質の活性を変調するテスト化合物の能力を決定する方法を提供する。例えば、適当な標的に対するエフェクター分子の活性を決定することができ、あるいは適当な標的へのエフェクターの結合を既に記載したように決定することができる。
【０２２２】
標的遺伝子産物およびその細胞または細胞外結合パートナーの間の相互作用に干渉する化合物を同定するために、標的遺伝子産物および結合パートナーを含有する反応混合物を２つの産物が複合体を形成するのを可能とする条件下で、かつそれに十分な時間の間で調製する。阻害性剤をテストするために、テスト化合物の存在下および不存在下で反応混合物を供する。テスト化合物を反応混合物に最初に含めることができるか、あるいは標的遺伝子およびその細胞または細胞外結合パートナーの付加に続いての時間に添加することができる。対照反応混合物を、テスト化合物なくして、あるいはプラセボと共にインキュベートする。標的遺伝子産物および細胞または細胞外結合パートナーの間のいずれかの複合体の形成を次いで検出する。テスト化合物を含有する反応混合物においてはそうでないが、対照反応における複合体の形成は、化合物が標的遺伝子産物および相互活性結合パートナーの相互作用に干渉することを示す。加えて、テスト化合物および正常標的遺伝子産物を含有する反応混合物を内での複合体形成をテスト化合物および突然変異体標的遺伝子産物を含有する反応混合物内での複合体形成と比較することもできる。この比較は、正常な標的遺伝子産物はそうでないが、突然変異体の相互作用を破壊する化合物を同定するのが望ましい場合に重要であり得る。
【０２２３】
これらのアッセイは不均一または均一様式で行うことができる。不均一アッセイは、標的遺伝子産物または結合パートナーのいずれかを固相係留させ、次いで、反応の最後に固相に係留させた複合体を検出することを含む。均一アッセイにおいて、全反応は液相で行う。いずれのアプローチにおいても、反応体の添加の順序を変更して、テストすべき化合物についての異なる情報を得ることができる。例えば、競合によって、標的遺伝子産物および結合パートナーの間の相互作用に干渉するテスト化合物はテスト物質の存在下で反応を行うことによって同定することができる。別法として、予め形成された複合体を破壊するテスト化合物、例えば、複合体からの成分の１つを置き換えるより高い結合定数を持つ化合物は、複合体が形成された後に、テスト化合物を反応混合物に加えることによってテストすることができる。種々の様式を簡単に以下に記載する。
【０２２４】
不均一アッセイ系においては、標的遺伝子産物または相互作用性細胞または細胞外結合パートナーいずれかを固体表面（例えば、マイクロタイタープレート）に係留させ、他方、非係留種を直接的にまたは間接的に標識する。係留された種を非共有結合または共有結合によって固定化することができる。別法として、係留すべき種に特異的な固定化抗体を用いて、種を固相に係留することができる。
【０２２５】
アッセイを行うためには、固定化された種のパートナーをテスト化合物と共に、またはそれなくして、被覆表面に曝露する。反応が完了した後、未反応成分を（例えば、洗浄によって）除去し、形成されたいずれの複合体も固体表面に固定化されたままであろう。固定化されていない種を予め標識する場合、表面に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。固定化されていない種が予め標識されない場合、間接的な標識を用いて、例えば、最初に固定化されていない種に特異的な標識抗体を用い、表面に係留された複合体を検出することができる（該抗体は、今度は、例えば、標識抗−ＩＧ抗体で直接的に標識することができるか、または間接的に標識することができる。反応成分の添加の順序に応じて、複合体形成を阻害し、または予め形成された複合体を破壊するテスト化合物を検出することができる。
【０２２６】
別法として、例えば、溶液中で形成されたいずれかの複合体を係留するための結合成分の１つに特異的な固定化抗体、および係留された複合体を検出するための他のパートナーに特異的な標識抗体を用い、未反応複合体、および検出された複合体から分離される。再度、液相への反応体の付加の順序に依存して、複合体を阻害する、または予め形成された複合体を破壊するテスト化合物を同定することができる。
【０２２７】
本発明の別の実施形態において、均一なアッセイを用いることができる。例えば、標的遺伝子産物、および相互作用性細胞または細胞外結合パートナー産物の予め形成された複合体を、標的遺伝子産物またはそれらの結合パートナーに標識されるが、標識によって生じるシグナルは複合体形成のためクエンチされるように調製される（例えば、イミュノアッセイのためのこのアプローチを利用する米国特許第４，１０９，４９６号参照）。予め形成された複合体からの種の１つと競合しそれに置き換えるテスト物質の添加の結果、バックグラウンドを超えるシグナルを発生する。このようにして、標的遺伝子産物−結合パートナー相互作用を破壊するテスト物質を同定することができる。
【０２２８】
なおもう１つの態様において、ＴＬＲ１４蛋白質を２−ハイブリッドアッセイまたは、３−ハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；ｏｙｏｂｉＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００参照）において「エサ蛋白質」として用いて、ＴＬＲ１４に結合し、またはそれと相互作用し、（「ＴＬＲ１４−結合蛋白質」または「ＴＬＲ１４−ｂｐ」）、およびＴＬＲ１４活性に関与する他の蛋白質を同定することができる。そのようなＴＬＲ１４−ｂｐは、例えば、ＴＬＲ１４−媒介シグナリング経路の下流エレメントとしての、ＴＬＲ１４蛋白質またはＴＬＲ１４標的によるシグナルの阻害剤であり得る。
【０２２９】
２−ハイブリッド系は分離可能なＤＮＡ−結合および活性化ドメインよりなるほとんどの転写因子のモジュール性質に基づく。簡単に述べれば、アッセイは２つの異なるＤＮＡ構築体を利用する。１つの構築体において、ＴＬＲ１４蛋白質をコードする遺伝子を、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４ｆ）ＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合させる。他の構築体において、同定されていない蛋白質（「プレイ」または「試料」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリーからのＤＮＡ配列を、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。別法として、ＴＬＲ１４蛋白質をアクチベータードメインに融合させることができる。もし、「エサ」および「プレイ」蛋白質がin vivoにて相互作用でき、ＴＬＲ１４依存性複合体を形成するならば、ＤＮＡ結合、および転写因子の活性化ドメインを近接させる。この近接は、転写因子に応答性である転写調節部位に操作可能に転結されたレポーター遺伝子（例えば、ＮＮＣＺ）の転写を可能とする。レポーター遺伝子の発現は検出することができ、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離でき、それを用いてＴＬＲ１４蛋白質と相互作用する蛋白質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
【０２３０】
もう１つの実施形態において、ＴＬＲ１４発現のモジュレーターが同定される。例えば、細胞または無細胞混合物を候補化合物と接触させ、ＴＬＲ１４  ｍＲＮＡまたは蛋白質の発現を、候補化合物の不存在下においてＴＬＲ１４  ｍＲＮＡまたは蛋白質の発現のレベルに対して評価する。ＴＬＲ１４  ｍＲＮＡまたは蛋白質の発現がその不存在下におけるよりも候補化合物の存在下においてより小さい（統計学的に有意により小さい）場合、候補化合物はＴＬＲ１４  ｍＲＮＡまたは蛋白質発現の阻害剤として同定される。ＴＬＲ１４  ｍＲＮＡまたは蛋白質発現のレベルは、ＴＬＲ１４  ｍＲＮＡまたは蛋白質を検出するための本明細書中に記載された方法によって決定することができる。
【０２３１】
もう１つの態様において、本発明は本明細書中に記載されたアッセイの２以上の組合せに関する。例えば、細胞−ベースのまたは無細胞アッセイを用い、変調剤を同定することができ、およびＴＬＲ１４蛋白質の活性を変調する剤の能力は、例えば、動物モデルにおいてin vivoで確認することができる。
【０２３２】
一般に、神経系における与えられたテスト化合物の活性は、神経突起外殖を促進する、化学的処理による損傷からニューロンを保護する、ニューロンまたはニューロン細胞の成長を促進する、神経系の神経組織または器官に関連する、失われたまたは損傷された運動、機能または認識能力を回復し、またはニューロンを再生する；の１または複数に影響する化合物の影響力を検出することによってアッセイすることができる。例えば、単離されたニューロン細胞を培養（例えば、ドーパミン作動性、皮質、ＤＲＧ細胞培養）は、当該分野で公知の方法によって単離し、培養することができる。（例えば、Ｐｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：９８６−９９４；Ｐｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．１７１（１）：８４−９７参照）。ニューロン活性、分化生存の変化は、例えば、（３Ｈ−ドーパミン取り込みの変化、および、各々、培養されたドーパミン作動性ニューロンおよび皮質ニューロンにおけるニューロフィラメント含有量の測定を示す実施例を記載する）米国特許第２００５／０１９７３５６号に記載された当該分野で認識された技術を用いて、検出し、定量することができる。別法として、ニューロン活性は培養された神経細胞系、例えば、神経芽細胞腫、細胞系、褐色細胞種細胞（ＰＣ１２細胞）、Ｆ１１において特徴付けることができる。in vitroでの活性は、限定されるものではないが、とりわけ、パーキンソン病；アルツハイマー病；筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）;外傷の負傷；多発性硬化症；糖尿病性神経障害；化学療法のような医学的処置に関連する神経障害；虚血症または虚血症−誘導負傷；発作を含めた、多数のヒト神経変性疾患を治療し、および／または緩和することができる剤を同定するのに有用であり得る。
【０２３３】
ニューロン活性を検出するための方法は、例えば、化合物をグルタメート神経障害性に対して保護するその能力についてテストする神経保護アッセイを含む。感覚ニューロン培養（ＤＲＧ）もまた神経突起外殖についてアッセイすることもでき、および神経栄養活性についてアッセイすることができる。培養された細胞をイムノフィリンリガンドで処理し、その後、新しい神経突起繊維についてアッセイする。免疫組織化学は、対照と比較して神経突起の可視化および定量を助けることができる。
【０２３４】
テスト化合物の効果を評価するのに用いることができる動物モデルの例は、中央の動脈閉そく（ＮＣＡＯ）または発作モデル；ＣＮＳ炎症モデル、例えば、ＥＡＥ、リンパ球、髄膜脳炎モデル；ベネズエラウマ脳炎感染髄膜脳炎、ニューモコッカスＣＮＳ炎症；または遺伝子的に修飾されたモデル、例えば、過剰発現されたＴＬＲ１４、またはＴＬＲ受容体において突然変異体を有する動物モデル（例えば、ＴＬＲ１４欠乏動物）を含む。
【０２３５】
多数のさらなる動物モデルおよび細胞培養アッセイが開発されており、前記したヒト病気を含めた、病気処置に対するそれらの臨床的関連に依拠することができる。以下の文献の各々はこれらのアッセイのための源として用いることができ、それらの全てはその目的で個々に引用してその全体を援用する：Ｓｔｅｉｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：２０１９−２０２４（１９９７）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：１７８５−１７９０（１９９７）；ＭｃＭａｈｏｎｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．５：６１６−６２４（１９９５）；Ｇａｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２５２−２５５（１９９６）；Ｇｅｒｌａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．――Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０８：２７３−２８６（１９９１）；Ａｐｆｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６３４：７−１２（１９９４）；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．２８２：１０８４−１０９３（１９９７）；Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４７：２６９−２７８（１９９７）；Ｈｏｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ．［Ｓｕｐｐｌ．］４９：１−１０（１９９７）およびＬｙｏｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９１：３１９１−３１９５（１９９４）。
【０２３６】
本発明は、さらに、前記したスクリーニングアッセイによって同定された新規な剤に関する。従って、さらに、適当な動物モデルにおいて本明細書中に記載されたように同定された剤（例えば、ＴＬＲ１４拮抗剤、アンチセンスＴＬＲ１４核酸分子、ＴＬＲ１４−特異的抗体またはＴＬＲ１４−結合パートナー）を用いて、そのような剤での治療の効率、毒性、副作用または作用メカニズムを決定するのは本発明の範囲内である。さらに、前記したスクリーニングアッセイによって同定される新規な剤は、本明細書中に記載された処置に用いることができる。
【０２３７】
本発明のスクリーニング方法は、（例えば、細胞−ベースのアッセイにおいて、または酵素活性アッセイにおいてＴＬＲ１４活性をモニターすることによって）in vitroにて、あるいは（例えば、テスト剤を哺乳動物に投与した後に、組織試料においてＴＬＲ１４活性または発現をモニターすることによって）in vivoにて行うことができる。例示的な哺乳動物は、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、およびイヌを含む。
診断および予後アッセイ
【０２３８】
もう１つの態様において、本発明は、テスト試料におけるＴＬＲ１４−関連神経変性障害（例えば、本明細書中に記載された障害）の進行を評価し、診断し、および／またはモニターする方法を提供する。該方法は、参照試料、例えば、正常な対象から得られた、または処置に先立っての試料に対する核酸またはポリペプチドのレベルの差が、障害の存在または進行を示すように、ＴＬＲ１４−関連遺伝子から選択された核酸またはポリペプチドの発現または活性を評価することを含み、ここに、ＴＬＲ１４蛋白質または遺伝子の異なる発現は、病気の開始および／または進行を示すようにマーカーとして用いることができる。例示的なＴＬＲ１４−関連遺伝子は、限定されるものではないが、ｐ７５ＮＴＲ、ＴＮＦ、ＮＯ、およびＭＭＰ−９を含む。ある実施形態において、参照試料に対する、テスト試料におけるＴＬＲ１４またはＴＬＲ１４−関連遺伝子のレベルの増加は、ＴＬＲ１４機能の拮抗が望ましいＴＬＲ１４神経変性障害の診断に関連付けられる。ある実施形態において、参照試料に対する、テスト試料におけるＴＬＲ１４またはＴＬＲ１４−関連遺伝子のレベルの減少は、ＴＬＲ１４機能の活性化が望ましいＴＬＲ１４障害の診断に関連付けられる。
【０２３９】
１つの実施形態において、評価工程はin vitroまたはex vivoで行われる。例えば、試料、例えば、血清試料は対象から得られる。ある実施形態において、第１の時点からより遅い時点まで、神経変性病の進行をモニターする方法が提供される。該方法は：第１の時点で得られた第１の試料中のＴＬＲ１４蛋白質または核酸の濃度を測定し；第１の生物学的試料よりも遅い時点で得られた第２の試料中のＴＬＲ１４蛋白質または核酸の濃度を測定し；該第１および第２の試料の間のＴＬＲ１４の濃度の差を決定することを含み、ここに、第２の時点におけるより高い濃度は神経変性病の開始または進行を示す。
【０２４０】
もう１つの実施形態において、評価工程はin vivoで行われる。例えば、対象に、ＴＬＲ１４、またはＴＬＲ１４関連核酸またはポリペプチドと相互作用する検出可能に標識された剤を投与することによって、該核酸またはポリペプチドの活性または発現のレベルに対してシグナルが生じる。
【０２４１】
本発明のさらなる態様は、神経変性病のための予測マーカーとしてのＴＬＲ１４蛋白質の使用を提供する。
【０２４２】
なおさらなる態様において、本発明は、個体において、神経変性病、または神経変性病の開始を診断する方法を含む。該方法は、
個体から得られた試料中のＴＬＲ１４蛋白質または核酸の量を測定し、次いで、
ＴＬＲ１４蛋白質または核酸の量を所定の値と比較する、
ことを含み、
ここに、所定の値よりも大きな量でのＴＬＲ１４蛋白質の存在は、神経変性病の開始または発生を示す。
【０２４３】
１つの実施形態において、所定の値は、より早い時点における同一個体からの試料中で測定されたＴＬＲ１４蛋白質または核酸の量である。
【０２４４】
１つの実施形態において、試料中のＴＬＲ１４蛋白質または核酸は、本明細書中に記載された手段、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素−結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、および本明細書中に記載された蛋白質または核酸検出の他の技術によって測定される。
【０２４５】
なおさらなる態様において、本発明は、対象において、神経変性障害、または神経変性障害に対する罹患性を建設する方法を提供する。該方法は、
（ａ）対象からの核酸および／またはポリペプチドの試料を供し、次いで、
（ｂ）ＴＬＲ１４遺伝子、またはその断片の異なる発現の存在を検出する、
ことを含む。
【０２４６】
１つの実施形態において、検出工程は試料中のＴＬＲ１４蛋白質の量を評価することを含む。
発現モニタリングおよびプロファイリング
【０２４７】
試料、例えば、生物学的試料中のＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質（例えば、ＮｇＲ１またはｐ７５ＮＴＲ）または核酸の存在、レベル、または不存在は、テスト対象から試料を得、生物学的試料を、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質、またはＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出できる化合物または剤と、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質または核酸の存在が生物学的試料中で検出されるように接触させることによって評価することができる。用語「生物学的試料」は、対象から単離された組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含む。好ましい生物学的試料は血清である。ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質遺伝子の発現のレベルは、限定されるものではないが、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの測定；ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質遺伝子によってコードされる蛋白質の量の測定；またはＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質遺伝子によってコードされる蛋白質の活性の測定を含めた多数の方法で測定することができる。
【０２４８】
細胞におけるＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質遺伝子に対応するｍＲＮＡのレベルは、イン・サイチュ様式によって、およびin vitro様式によって決定することができる。
【０２４９】
単離されたｍＲＮＡは、限定されるものではないが、サザーンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ鎖反応分析およびプローブアッセイを含むハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで用いることができる。ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの好ましい診断方法は、単離されたｍＲＮＡを、検出すべき遺伝子によってコードされたｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。核酸プローブは、例えば、ストリンジェントな条件下でＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４関連蛋白質ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの少なくとも７．１５．３０．５０．１００．２５０または５００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドのような、配列番号１の核酸、またはその部分のような全長ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質核酸であり得る。プローブは、アレイ、例えば、以下に記載されるアレイのアドレスに設けることができる。診断アッセイで用いる他の適当なプローブは本明細書中に記載される。
【０２５０】
１つの様式において、ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）を表面に固定化し、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上に流し、ｍＲＮAをゲルからニトロセルロースのような膜に移すことによってプローブと接触させる。別の様式にて、プローブは表面に固定化され、ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）を、例えば、後に記載する二次元遺伝子チップアレイ中のプローブと接触させる。当業者であれば、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのレベルの検出で用いるために公知のｍＲＮＡ検出方法を適合させることができる。
【０２５１】
ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連の１つによってコードされる試料中のｍＲＮAのレベルは、例えば、ｒｔＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号）、リガーゼ鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３）、自己保持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｄ  ａｌ．（１９８８）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，８５３，０３３号）、またはいずれかの他の核酸増幅方法、続いての当該分野で公知の技術を用いる増幅された分子の検出によって、核酸増幅で評価することができる。本明細書中で用いるより、増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域（各々、プラスおよびマイナスストランド、またはその逆）にアニールすることができ、間に短い領域を含有することができる核酸分子の対と定義される。一般に、増幅プライマーは長さが約１０〜３０ヌクレオチドである。長さが約５０〜２００ヌクレオチドの領域に隣接する。適当な条件下で、かつ適当な試薬にて、そのようなプライマーは、プライマーが近接するヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能とする。
【０２５２】
イン・サイチュ方法では、細胞または組織試料を調製／処理でき、支持体、典型的には、ガラススライド上に固定化でき、次いで、分析すべきＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質遺伝子をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるプローブと接触させることができる。
【０２５３】
もう１つの実施形態において、該方法は、さらに、対照試料を、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡを検出することができる化合物または剤と接触させ、次いで、対照試料中のＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、テスト試料中のＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較することを含む。さらにもう１つの実施形態において、米国特許第５，６９５，９３７号に記載されている遺伝子発現の一連の分析を用いて、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質転写体レベルを検出する。
【０２５４】
種々の方法を用いて、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質によってコードされる蛋白質のレベルを決定することができる。一般に、これらの方法は、抗体のような蛋白質に選択的に結合する剤を試料と接触させて、試料中の蛋白質のレベルを評価することを含む。好ましい実施形態において、抗体は検出可能な標識を担う。抗体はポリクロナル、またはより好ましくはモノクローナルであり得る。無傷抗体、またはその断片（例えば、ＦａｄまたはＦ（ａｂ’）２）を用いることができる。用語「標識された」は、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結させることによるプローブまたは抗体の直接的標識ならびにプローブまたは抗体の検出可能な物質との反応性による間接的標識を含む。検出可能な物質の例は本明細書中に提供される。
【０２５５】
検出方法を用いて、生物学的試料中のＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質をin vitroならびにin vivoで検出することができる。ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質の検出のためのin vitro技術は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈澱、免疫蛍光、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびウエスタンブロット分析を含む。ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質の検出のためのin vivo技術は、対象に標識された抗−ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質抗体を導入することを含む。例えば、抗体は、対象におけるその存在および１を標準的なイメージング技術によって検出することができる放射性マーカーで標識することができる。もう１つの実施形態において、試料は標識し、例えば、ビオチニル化し、次いで、抗体、例えば、（後に記載する）抗体アレイ上に位置する抗−ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質抗体に接触させる。試料は、例えば、蛍光標識にカップリングされたアビジンで検出することができる。
【０２５６】
もう１つの実施形態において、該方法は、さらに、対照試料を、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質を検出することができる化合物または剤を接触させ、次いで、対象試料中のＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質の存在を、テスト試料中のＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質の存在と比較することを含む。
【０２５７】
本発明は、生物学的試料中ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質の存在を検出されるためのキットを含む。さらに、該キットは、生物学的試料中のＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質またはｍＲＮＡを検出することができる化合物または剤；および標準を含むことができる。該化合物または剤は適当な容器にパッキングすることができる。該キットは、さらに、該キットをＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質または核酸を検出するのに用いるための指示書を含むことができる。
【０２５８】
抗体−ベースのキットでは、キットは（１）本発明のマーカーに対応するポリペプチドに結合する（例えば、固体支持体に結合した）第１の抗体；および所望により、（２）該ポリペプチドまたは該第１の抗体いずれかに結合し、検出可能な剤にコンジュゲートされた第２の異なる抗体を含むことができる。
【０２５９】
オリゴヌクレオチド−ベースのキットでは、該キットは（１）オリゴヌクレオチド、例えば、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、または（２）本発明のマーカーに対応する核酸分子を増幅するのに有用なプライマーの対を含むことができる。該キットは緩衝剤、保存剤、または蛋白質安定化剤を含むこともできる。該キットは、検出可能な剤、例えば、酵素または基質）を検出するのに必要な成分を含むことができる。キットは、アッセイし、含まれるテスト試料と比較することができる対照試料または一連の対照試料を含有することができる。キットの各成分は、個々の容器内に封入することができ、種々の容器の全ては、キットを用いて行ったアッセイの結果を解釈するための指示書と共に、単一のパッケージ内に入れることができる。
【０２６０】
本明細書中に記載された診断方法は、誤って発現された、または異常なまたは望まないＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質発現または活性を関連する病気または障害を有する、またはそれを発症する危険性がある対象を同定することができる。本明細書中で用いるように、用語「望まない」は、気道炎症のような生物学的応答に関与する望まない現象を含む。
【０２６１】
１つの実施形態において、異常なまたは望まないＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質発現または活性に関連する病気または障害が同定される。テスト試料は対象から得られ、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質または核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）が評価され、ここに、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質または核酸のレベル、例えば、存在または不存在が、異常なまたは望まないＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質の発現または活性に関連する病気または障害を有する、またはそれが発症する危険性がある対象について診断的である。本明細書中で用いるように、「テスト試料」とは生物学的流体（例えば、血清）、細胞試料、または組織を含めた注目する対象から得られた生物学的試料をいう。
【０２６２】
本明細書中に記載された予後アッセイを用いて、対象に剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、蛋白質、ペプチド、核酸、小分子、または他の薬物候補）を投与して、異常なまたは望まないＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質発現または活性に関連する病気または障害を治療できるか否かを決定することができる。例えば、そのような方法を用いて、対象が、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質発現または活性に拮抗し、またはそうでなければそれを阻害する剤で効果的に治療できるか否かを決定することができる。
【０２６３】
もう１つの態様において、本発明は、複数のデジタル的に暗号化されたデータ記録を有するコンピューター媒体をその特徴とする。各データ記録は、試料中のＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質の発現のレベルを表す値、および試料の記述子を含む。試料の記述子は、試料の識別子、試料が由来する対象（例えば、患者）診断、または治療（例えば、好ましい治療）であり得る。好ましい実施形態において、データ記録は、さらに、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質以外の遺伝子（例えば、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質−障害に関連する他の遺伝子、またはアレイ上の他の遺伝子）の発現のレベルを表わす値を含む。データ記録は表、例えば、関連データベース（例えば、ＯｒａｃｌｅまたはＳｙｂａｓｅデータベース環境のＳＱＬデータベース）のようなデータベースの一部である表として構成することができる。
【０２６４】
また、試料を評価する方法の特徴である。該方法は、例えば、対象からの試料を供し、試料の遺伝子発現プロフィールを決定することを含む、ここに、プロフィールはＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質発現のレベルを表わす値を含む。該方法は、さらに、値またはプロフィール（すなわち、多数の値）を参照値または参照プロフィールと比較することを含むことができる。試料の遺伝子発現プロフィールは、（例えば、試料からの核酸を供し、該核酸をアレイに接触させることによって）本明細書中に記載された方法のいずれかによって得ることができる。該方法を用いて、対象において気道炎症障害を診断することができ、ここに、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質発現または活性の増加は、該対象が、例えば、喘息を含めた慢性気道炎症障害を有する、または有する傾向があることを示す。該方法を用いて、対象において喘息についての処置をモニターすることができる。例えば、遺伝子発現プロフィールを、治療を受けつつある対象からの試料について決定することができる。プロフィールを参照プロフィールと、または処置に先立って、または障害の開始に先立って対象から得られたプロフィールと比較することができる（例えば、Ｇｏｌｕｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：５３１参照）。
【０２６５】
なおもう１つの態様において、本発明は、テスト化合物を評価する方法を特徴とする（前記スクリーニングアッセイ）。該方法は、細胞（例えば、神経細胞）およびテスト化合物を供し；該テスト化合物を該細胞に接触させ、接触した細胞についてのプロフィールを発現する対象を得、該対象の発現プロフィールを１または複数の参照プロフィールと比較することを含む。該プロフィールは、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質発現のレベルを表わす値を含む。好ましい実施形態において、対象の発現プロフィールと標的プロフィールを、例えば、正常な細胞についての、または細胞の所望の状態のプロフィールと比較する。もし対象発現プロフィールが、テスト化合物と接触されていない細胞から得られた発現プロフィールよりも標的プロフィールにより似ていれば、テスト化合物は好都合に評価される。
【０２６６】
もう１つの態様において、本発明は対象を評価する方法を特徴とする。該方法は、ａ）対象から、例えば、介護者、例えば、対象からの試料を得る介護者から試料を得、ｂ）試料について対象発現プロフィールを決定することを含む。所望により、該方法は、さらに、工程ｃ）対象発現プロフィールを１または複数の参照発現プロフィールと比較し、ｄ）対照参照プロフィールに最も似た参照プロフィールを選択する；のいずれかまたは双方を含む。対象発現プロフィールおよび参照プロフィールは、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質発現のレベルを表わす値を含む。種々のルーチン的な統計学的尺度を用いて、２つの参照プロフィールを比較することができる。１つの可能な方法は、２つのプロフィールの間の差である距離ベクトルの長さである。対象および参照プロフィールのおのおのは多次元ベクトルとして表され、ここに、各次元はプロフィールのおける値である。
【０２６７】
該方法は、さらに、結果を介護者に伝達することを含むことができる。結果は対象発現プロフィール、対象発現プロフィールともう１つのプロフィールとの比較の結果、最も似た参照プロフィール、または前記のいずれかの記述子であり得る。結果はコンピューターネットワークを通じて伝達することができ、例えば、結果はコンピューター伝達の形態、例えば、キャリアウェブに包埋されたコンピューターデータシグナルであり得る。
【０２６８】
また、以下の工程で、対象発現プロフィールの受療、参照発現プロフィールのデータベースへのアクセス、およびｉ）対象発現プロフィールに最も似たマッチング参照プロフィールの選択、またはｉｉ）少なくとも１つの参照プロフィールに対する対象発現プロフィールの同様性についての少なくとも１つの比較スコアの決定のいずれかを行うための実行可能な暗号を有するコンピューター媒体をその特徴とする。対象発現プロフィール、および参照発現プロフィールは、各々、ＴＬＲ１４／ＴＬＲ１４−関連蛋白質発現のレベルを表わす値を含む。
【実施例】
【０２６９】
以下の実施例は本発明の理解を助けるために記載されるが、断じて本発明の範囲を限定することを意図せず、かつそのように解釈されるべきではない。
実施例１
ヒトＴＬＲ１４の構造分析
【０２７０】
非−冗長（ＮＲ）蛋白質データベースおよび三次元構造データベース（ＰＤＢ）を、ＮＣＢＩにおけるＢＬＡＳＴＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｌｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を用い、ヒトＴＬＲ１４ヌクレオチド配列（図１；配列番号１）または蛋白質配列（図２；配列番号２）および他の蛋白質の間の相同性についてサーチした。
【０２７１】
ＴＬＲ１４およびＮｇＲ１の間の相同性は、原理的には、配列の最初の４００アミノ酸に制限された。系統発生分析は、ｈｔｔｐ：／／ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｙｌｉｐ．ｈｔｍｌから入手可能な系統発生推定パッケージ（ＰＨＹＬＩＰ）を用いて行った。ＰＨＹＬＩＰは、系統発生を推定するためのプログラムのフリーパッケージである。それは源暗号、書類ファイルおよび多数の異なるタイプの実行として分布している。ワシントン大学のゲノムサイエンス部門および生物学の部門のＪｏｅ  Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎによるこれらのウェブページは、ＰＨＹＬＩＰについての情報、および実行、源暗号およびドキュメンテイションを貴殿のコンピューターに移動させる方法を含有する。ＰＨＹＬＩＰ  ３．６７は２００４年７月２４日に解放された。
【０２７２】
ＴＬＲ１４は「＊」として示される。この分析には、Ｎｏｇｏ−受容体ファミリー、および他のロイシン−リッチ反復を含有する蛋白質のメンバーが含まれた。系統発生分析からの結果を図５に示す。この分析は、ＴＬＲ１４がニューロン蛋白質のＮｇＲ１ファミリーに密接に関連することを明らかにした。
【０２７３】
有意な相同性（３７％同一性、４７％相同性）が、ＴＬＲ１４、およびロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）領域におけるＮｇＲ１の間で見出された。次いで、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌ  ｗ／）のデフォルトパラメータを用いて、図６に示すように、ＴＬＲ１４およびＮｇＲ１の間の整列を生じさせた（Ｂａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｅｍｂｏ  Ｊ．２２，３２９１）。
【０２７４】
ＮｇＲ１の結晶構造（Ｂａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  ｓｕｐｒａ）を自動化し、図７Ａに示すように、（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なＮＣＢＩにおけるＣＮ３Ｄバージョン４．１を用いて見た。
【０２７５】
ＴＬＲ１４の三次元モデルは、ＥｘｐａｓｙにおけるＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）を介して参照された自動Ｓｗｉｓｓ−モデル相同性−モデリングピペリンを用いて作成した（図７Ｂ）。該自動モデルは、鋳型として、ＮｇＲ１（Ａｃｃ．ｎｏ．１０ＺＮＡ，１８ＰＴ）およびＤｅｃｏｒｉｎ（Ａｃｃ．Ｎｏ．１×ＣＤＡ，１×ＥＣＢ）構造を用いた。該モデルは、ＤｅｅｐＶｉｅｗ  Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢビューアー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｐｄｂｖ）を用いて自動化した。
【０２７６】
ＴＬＲ１４蛋白質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列、およびそのネズミカウンターパート（図３〜４（配列番号３〜４）、各々、ネズミヌクレオチドおよびアミノ酸配列のものである）は、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）領域、フィブロネクチンＩＩＩ様ドメイン（ＦＮ３）および膜貫通ドメインを含有することが示された（図８）。これらのドメインを用いて、この蛋白質を、ＬＲＦＮ（ロイシンリッチ、およびフィブロネクチン含有）、ＮＬＲＲ／ＬＲＲN（ニューロンロイシン−リッチな反復（蛋白質）、Ｐａｌ（光受容体−関連ＬＲＲスーパーファミリー）およびＳＬＩＴＬ（ＳＬＩＴ−様２（Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ  Ｖａｓｏｒｉｎ））（図９）のようなＬＲＲおよびＦＮ３ドメインを含有する脳で発現される他の蛋白質と同様なものであると分類することができる。また、脳で発現される多数の他のＬＲＲ−含有蛋白質もある。
実施例２
正常および病気脳におけるＴＬＲ１４  ｍＲＮＡの発現
【０２７７】
脳におけるＴＬＲ１４発現の分析は、ＳｙｍＡｔｌａｓ（Ｓｕ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）  ＰＮＡＳ  ９９（７）：４４６５−７０）を用いてＴＬＲ１４で行った。この分析は図１０で示されるように高いニューロン発現を明らかとした。正常なヒト脳試料からのさらなる発現プロファイリングは、さらに、このデータを裏付けた（図１１）。
【０２７８】
ＴＬＲ１４  ｍＲＮＡレベルは、アルツハイマーおよびパーキンソン病の患者において上昇することが示された（図１２）。ＴＬＲ１４発現は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）  Ｈｇ  Ｕ１３３  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用い、種々の組織において分析した。図１２Ａは、ゲノロジック発現データベースにおける、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）  によって測定された正常、アルツハイマー、およびパーキンソン脳試料についてのＴＬＲ１４平均±標準偏差発現レベルを示す。図１２Ｂは、（Ａ）で用いる個々の測定を示す。図１２Ｃは、図１２Ａおよび１２Ｂに示されたデータの表にしたまとめである。「頻度データベース」は、ＴＬＲ１４についての検出の総じての頻度を示す。「％パーセント」は、ＴＬＲ１４が検出された、正常、アルツハイマー、およびパーキンソン試料の分率を示す。
実施例３
ＴＬＲ１４に対する抗体の作製および特徴付け
【０２７９】
３つのペプチド精製ポリクローナルウサギ抗体は、ＴＬＲ１４に対して生じさせた。抗体のうち２つはエクトドメインにおけるペプチド（０５４１および０５４０）を認識し、１つは蛋白質の細胞内領域（０５４７）を認識する（図１３）。０５４７抗体は、ヒト、マウスおよびラットを含めたいくつかの種の間で１００％保存されている。０５４７抗体を用いて、初代神経膠星状細胞培養、胚１４日ラット皮質ニューロン、誕生後４日ラット小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）、および誕生後７日ラット小脳溶解物におけるＴＬＲ１４の発現を同定した。ＴＬＲ１４蛋白質の予測されたサイズは８８Ｋｄである。ＴＬＲ１４特異的バンドを、抗体を生じさせるのに用いた０５４７ペプチドと競合させ；１つのバンドはサイズが〜８８Ｋｄであり、いくつかの他のバンドはより小さく、蛋白質のより低いＭＷ種の存在を示唆する。
【０２８０】
図１４Ａ〜１４Ｄは、抗−ＴＬＲ１４  ０５４７抗体ペプチド競合アッセイを示すイムノブロットを示す。図１４Ａおよび１４Ｂは、各々、競合ペプチドの不存在下において、１．８  μｇ／ｍＬ  ０５４７およびＮｇＲ１抗体（Ｒ＆Ｄシステム、ヤギ抗−マウスＮｇＲ１抗体）を用いて行ったＴＬＲ１４およびＮｇＲ１イムノブロットを示す。図１４Ｃおよび１４Ｄは、０５４７競合ペプチドの存在下において、各々、１．８  ｕｇ／ｍＬ  ０５４７およびＮｇＲ１抗体（Ｒ＆Ｄシステム、ヤギ抗−、マウスＮｇＲ１抗体）を用いて行ったＴＬＲ１４およびＮｇＲ１イムノブロットを示す。矢印は、ＮｇＲ１に対応するバンドを示す。
【０２８１】
１）および３）ＣＨＯ−Ｋ１細胞、２）ＴＬＲ１４を過剰発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞、４）初代ラット神経膠星状培養、５）胚１４日ラット皮質ニューロン２日in vitro培養、６）誕生後４日ラット小脳顆粒ニューロン２日in vitro培養、７）誕生後４日ラット小脳顆粒ニューロン１日in vitro培養、および８）誕生後７日ラット小脳溶解物からの試料の匹敵する量をウエスタンブロットに付し、そのブロッキングペプチドとのプレ−インキュベーションの有りまたは無し（図１４Ｃ）にて、ＴＬＲ１４抗体（０５４７／２４３４）（図１４Ａ）によって検出した。ＴＬＲ１４抗体は、ＴＬＲ１４／ＣＨＯ−Ｋ１細胞における約１００ＫｄＡにおける２つのバンドを検出した。上方バンドはこのＴＬＲ１４抗体に対して特異的である。というのは、抗体がそのブロッキングペプチドで予め処理された場合、それは競合されるからである。ＴＬＲ１４／ＣＨＯ−Ｋ１中の約１００ｋＤａにおける下方バンド、および他の試料中の同様な位置におけるバンドは、ＴＬＲ１４ブロッキングペプチドによって影響される、これは、それらがこのＴＬＲ１４抗体に対して特異的ではないであろうことを示唆する。ブロットをＮｇＲ１抗体と共にインキュベートし（図１４Ｂおよび１４Ｄ）、ＮｇＲ１は皮質ニューロン培養において、および小脳において強く検出され、および小脳顆粒ニューロン培養において少なく検出された。＊はペプチド処理後に異なるパターンを呈するバンドを示す。
【０２８２】
ネズミおよびラットＴＬＲ１４  ｍＲＮＡ双方を増幅することができるプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲデータにより、ＰＣＲ１４は皮質ニューロン小脳顆粒ニューロンおよび神経膠星状細胞で発現される（図２１）。簡単に述べれば、ラットおよびネズミＴＬＲ１４についてのＲＴ  ＰＣＲを、製造業者の指示に従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  キット（Ｑｉａｇｅｎ）で行った。０．２〜０．４μｇ程度のＲＮＡを用い、逆転写酵素がない反応を陰性対照として用いた。ラットおよびネズミＴＣＲ１４プライマーは５’−ＡＧＣＡＧＧＣＡＧＴＡＧＧＣＡＧ−３’（配列番号５）および５’−ＧＧＡＡＣＴＴＧＧＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号６）であった。（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｒｎから得られた）アクチンＲＴ−ＰＣＲ対照プライマーは陽性対照であった。レーンは、以下のＥ１９-ＣＮラット初代細胞、Ｐ４−ＣＧＮラット小脳顆粒ニューロン、およびラット初代ラット神経膠星状細胞に対応する。Ｃ５７Ｂ１／６脾臓は陽性対照として働いた。
実施例４
ネズミ脳におけるＴＬＲ１４蛋白質の発現
【０２８３】
２つの抗体（０５４７および０５４１）を用い、ＴＬＲ１４発現は野生型マウスにおいて脳の特異的領域で観察された。
【０２８４】
図１５Ａ〜１５Ｃは、野生型（ｗｔ）マウスの脳におけるＴＬＲ１４発現を示す散乱プロットである。三匹のマウスを分析した（ｗｔ３−ｗｔ６）図１５Ａは、０５４７抗−ＴＬＲ１４抗体を用いて作成されたデータを示す。図１５Ｂは、０５４１抗−ＴＬＲ１４抗体を用いて作成したデータを示す。図１５Ｃは、イソタイプ対照抗体を用いて作成されたデータを示す。
【０２８５】
４％パラホルムアルデヒドネズミ脳セクションの免疫組織化学による染色は、海馬、黒質、脳幹神経節、大脳皮質、小脳皮質におけるＴＬＲ１４発現を明らかとしたら、脳のいずれかの他の領域においては明らかとしなかった。双方の抗−ＴＬＲ１４抗体は同一染色パターンを生じ、イソタイプ対照抗体はこれらの領域を染色しなかった。合致して、Ａｌｌｅｎ  Ｂｒａｉｌ  Ａｔｌａｓの分析データはＴＬＲ１４の発現が皮質、海馬、および小脳プルキニエ細胞層において最も顕著である（データは示さず）。観察された局所化発現パターンは、ＴＬＲ１４が脳のこれらの領域において役割を演じることを示唆する。
実施例６
ＴＬＲ１４共−免疫沈澱実験
【０２８６】
ＴＬＲ１４はＮｇＲ１との高い配列相同性を有するので、ＴＬＲ１４が共−発現された蛋白質の免疫沈澱実験においてＮｇ１またはｐ７５ＮＴＲと相互作用することができるかをテストした。ＴＬＲ１４が単独で、あるいはＮｇＲ１およびｐ７５と組合せて発現された（図１６）。
【０２８７】
図１６はＴＬＲ１４（頂部）、ＮｇＲ１（二番目）、ｐ７５（三番目）、およびアクチン（底部）発現を示すイムノブロットである。星印はＮｇＲ１およびｐ７５に対応するバンドを示す。Ｎｇ１、ｐ７５ＮＴＲ、またはＴＬＲ１４構築体は単独で、またはＣＨＯ−Ｋ１細胞と組合せて発現させた。溶解物は抗体で、示されたようにＴＬＲ１４、ＮｇＲ１（Ｒ＆Ｄシステム、ヤギ抗−マウスＮｇＲ１抗体）、ｐ７５ＮＴＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウサギ抗−ヒトｐ７５抗体）、またはアクチン（Ｓｉｇｍａ）へ、ウエスタンブロットした。それ自身の抗体による各蛋白質の検出により、細胞中での発現を確認した。負荷は、各試料中のアクチンの同様な発現によって示されるように同等であった。
【０２８８】
ＴＬＲ１４と０５４７抗体との免疫沈澱に続き、ＮｇＲ１およびｐ７５ＮＴＲの双方はＴＬＲ１４と相互作用することが観察された（図１７）。図１７は、２ｕｇのＴＬＲ１４  ０５４７抗体を用いる免疫沈澱に続いて、ＴＬＲ１４、ＮｇＲ１、およびｐ７５ＮＴＲを示す免疫ブロットを示す。免疫沈澱は、０．５ｍｇ細胞溶解物を用いて行った。星印は、ＮｇＲ１に対応するバンドを示す。イプシロンは、ｐ７５ＮＴＲに対応するバンドを示す。矢印は、抗体の免疫グロブリン軽鎖を示す。分子量マーカーは、イムノブロットの右側に示される。ＮｇＲ１、ｐ７５ＮＴＲ、またはＴＬＲ１４構築体は単独で、またはＣＨＯ−Ｋ１細胞と組合せて発現された。ＴＬＲ１４抗体（０５４７／２４３４）による免疫沈澱は、示されたように、同一ＴＬＲ１４抗体での、またはＮｇＲ１またはｐ７５ＮＴＲに対する抗体でのウエスタンブロットによって分析した。細胞で発現された場合、ＴＬＲ１４はその抗体によって免疫沈澱させた。ＮｇＲ１またはｐ７５ＮＴＲの下方バンドもまたＴＬＲ１４と共−沈澱された。
【０２８９】
同様に、抗−ＮｇＲ１抗体（図１８）または抗−ｐ７５抗体（図１９）との免疫沈澱により、蛋白質が共−発現された場合の、ＴＬＲ１４およびＮｇＲ１またはＴＬＲ１４およびｐ７５の間の相互作用が明らかとされた。
【０２９０】
より具体的には、図１８は、抗−ＮｇＲ１抗体（Ｒ＆Ｄシステム、ヤギ抗−ヒトＮｇＲ１抗体）（この抗体は前記ウエスタンイムノブロットで用いたものとは異なることに注意されたし）を用いる免疫沈澱後の、ＮｇＲ１、ｐ７５ＮＴＲ、またはＴＬＲ１４を示すイムノブロットである。星印は、ｐ７５ＮＴＲに対応するバンドを示す。矢印は、抗体の免疫グロブリン軽鎖を示す。ＮｇＲ１、ｐ７５ＮＴＲ、またはＴＬＲ１４構築体は単独で、またはＣＨＯ−Ｋ１細胞と組み合わせて発現されたＮｇＲ１または対照ヤギＩｇＧ抗体による免疫沈澱は、示されたように、ＮｇＲ１抗体での、またはＴＬＲ１４またはｐ７５ＮＴＲに対する抗体でのウエスタンブロットによって分析した。細胞で発現される場合、ＮｇＲ１はその抗体によって免疫沈澱された。ＴＬＲ１４またはｐ７５ＮＴＲのより下方バンドもまたＮｇＲ１と共−沈澱された。対照ヤギＩｇＧはＮｇＲ１を沈殿させることができなかった。
【０２９１】
図１９は、抗−ｐ７５ＮＴＲ抗体を用いる免疫沈澱に続いての、ＮｇＲ１、ＴＣＲ１４、ｐ７５ＮＴＲを示すイムノブロットを示す。星印は、ＮｇＲ１に対応するバンドを示す。矢印は、抗体の免疫グロブリン軽鎖を示す。ＮｇＲ１、ｐ７５ＮＴＲ、またはＴＬＲ１４構築体は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞中で、単独で、または種々の組合せで発現された。ｐ７５ＮＴＲまたは対照ウサギＩｇＧ抗体による免疫沈澱は、示されたように、ｐ７５ＮＴＲ抗体での、またはＴＬＲ１４またはＮｇＲ１に対する抗体でのウエスタンブロットによって分析された。ｐ７５ＮＴＲは、細胞で発現させた場合、その抗体によって免疫沈澱された。ＴＬＲ１４またはＮｇＲ１の下方バンドもまたｐ７５ＮＴＲで共−沈澱された。対照ウサギＩｇＧはｐ７５ＮＴＲを沈殿させることができなかった。
実施例７
神経突起外殖のＴＬＲ１４逆ミエリン阻害の細胞外ドメインに対する抗体
【０２９２】
ＴＬＲ１４の機能をテストするために、誕生後日ラット小の顆粒ニューロンを、Ｙ（１０ｕＭ）、または３つの異なる精製されたＴＬＲ１４抗体：０５４０、０５４１、０５４７の存在下または不存在下で、ラットミエリン基質上で培養した。
【０２９３】
図２０は、Ｐ４  ＣＧＮ(小脳顆粒ニューロン)細胞の神経突起外殖における精製されたＴＬＲ１４抗体：０５４０，０５４１，０５４７の効果を示す棒グラフである。ＮＴは、処置無しの対照細胞を示す。Ｙ−２７６３２は、ミエリンの存在下において神経突起外殖を誘導することが知られた所有された化合物である（＊ｐ＝０．０５；＊＊ｐ＝０．０１）。誕生後４日ラット小脳顆粒ニューロンを、示されたように、Ｙ−２７６３２（１０ｕＭ）、または１、１０または１００ｕｇ／ｍｌの３つの異なる精製されたＴＬＲ１４抗体：０５４０、０５４１、０５４７の存在下または不存在下で、ラットミエリン基質上で培養した。ＴＬＲ１４抗体０５４０および０５４１は、用量−依存的にミエリン阻害を逆行させる。加えて、１００ｕｇ／ｍｌの０５４０は基底神経突起外殖を有意に促進する。ニューロンクラスＩＩＩ  β−チューブリンについて固定され、染色される前に、培養を２２時間維持した（ウサギポリクローナルＴｕｊ１，Ｃｏｖａｎｃｅ）。ニューロンイメージはＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏによって捕獲し、Ｍ−ｅｔａＸｐｒｅｓｓの神経突起外殖モジュールによって定量した。平均全神経突起長さは各培養条件下で三連にて、２００を超えるニューロンから決定された。結果は３つの独立した実験からプールし、棒線はＳＥＭを示す。
【０２９４】
細胞外ＴＬＲ１４抗体０５４０および０５４１は、用量−依存的に神経突起外殖のミエリン阻害を逆行させる。加えて、１００ｕｇ／ｍｌにおける０５４０は基底神経突起外殖を有意に促進する。内部０５４７抗体は、神経突起外殖のミエリン阻害を逆行させない。これらのデータは、表面ＴＬＲ１４に結合することによって、抗体はミエリンリガンドの相互作用をブロックすることができ、およびミエリン媒介神経突起外殖阻害をブロックすることを示唆する。この効果は、ＮｇＲ／ｐ７５ＮＴＲ複合体の変調を通じることができる。
【０２９５】
全てを一緒にすると、これらの結果は、脳負傷に関連する障害において役割を演じているＴＬＲ１４を示し、ＴＬＲ１４はニューロン成長を促進するための有用な治療標的であり得る。
他の実施形態
【０２９６】
本発明をその詳細な記載と組合せて記載してきたが、これまでの記載は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を説明し、限定するものではないことを意図する。他の態様、利点、および修飾は以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１】
2010506930.tif 000003
【図２】
2010506930.tif 000004
【図３】
2010506930.tif 000005
【図４】
2010506930.tif 000006
【図５】
2010506930.tif 000007
【図６】
2010506930.tif 000008
【図７Ａ】
2010506930.tif 000009
【図７Ｂ】
2010506930.tif 000010
【図８】
2010506930.tif 000011
【図９】
2010506930.tif 000012
【図１０】
2010506930.tif 000013
【図１１】
2010506930.tif 000014
【図１２−１】
2010506930.tif 000015
【図１２−２】
2010506930.tif 000016
【図１３】
2010506930.tif 000017
【図１４Ａ】
2010506930.tif 000018
【図１４Ｂ】
2010506930.tif 000019
【図１４Ｃ】
2010506930.tif 000020
【図１４Ｄ】
2010506930.tif 000021
【図１５】
2010506930.tif 000022
【図１６】
2010506930.tif 000023
【図１７】
2010506930.tif 000024
【図１８】
2010506930.tif 000025
【図１９】
2010506930.tif 000026
【図２０】
2010506930.tif 000027
【図２１】
2010506930.tif 000028
【図２２Ａ】
2010506930.tif 000029
【図２２Ｂ】
2010506930.tif 000030
【図２３Ａ】
2010506930.tif 000031
【図２３Ｂ】
2010506930.tif 000032
【図２４Ａ】
2010506930.tif 000033
【図２４Ｂ】
2010506930.tif 000034
【図２５Ａ】
2010506930.tif 000035
【図２５Ｂ】
2010506930.tif 000036
【図２６Ａ】
2010506930.tif 000037
【図２６Ｂ】
2010506930.tif 000038
【配列表】
2010506930000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月17日(2009.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010506930000001.app
【国際調査報告】
2010506930.tif 000055
2010506930.tif 000056
2010506930.tif 000057
2010506930.tif 000058
2010506930.tif 000059