(57)【要約】  本発明は、神経伝達物質の分泌を抑制するために、神経細胞内にＳＮＡＲＥ複合体を構成する３個の蛋白質の結合部位のポリペプチドと、蛋白質伝達体（ＰＴＤ, protein transduction domain）とを融合して細胞内伝達効率及び局所部位への伝達を向上させる方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
５〜３０個のアミノ酸からなり、アルギニンを３０％以上含む蛋白質伝達体（Protein Transduction Domain, ＰＴＤ）と、ＳＮＡＲＥ複合体を構成するＳＮＡＰ２５の結合ドメイン（SEQ ID. NO.: 4）又はＶＡＭＰ−２の結合ドメイン（SEQ ID. NO.: 5）とがコンジュゲイションされた、生体内で神経伝達物質の分泌を抑制するための融合ポリペプチド。
【請求項２】
蛋白質伝達体ＰＴＤが、SEQ ID NO.: 6乃至SEQ ID NO.: 12、及びSEQ ID NO.: 13からなる群から選択された何れか一つのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
蛋白質伝達体が、ＳＮＡＰ２５の結合ドメイン（SEQ ID. NO.: 4）又はＶＡＭＰ−２の結合ドメイン（SEQ ID. NO.: 5）とリンカー（linker）によりコンジュゲイションされることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
リンカーが３個のグリシンからなることを特徴とする請求項３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の融合ペプチドを活性成分として含有する神経伝達物質分泌抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経伝達物質の分泌を抑制するために、神経細胞内にＳＮＡＲＥ複合体を構成する３個の蛋白質の結合部位のポリペプチドと、蛋白質伝達体（ＰＴＤ, protein transduction domain）とを融合して細胞内伝達効率及び局所部位への伝達を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経伝達物質の分泌のためには、神経伝達物質を担持している小胞（vesicle）の表面に存在するシナプトブレビン（Synaptobrevin）（Vesicle-associate membrane protein, ＶＡＭＰ）、シナプス前血漿膜（pre-synaptic plasma membrane）に存在するＳＮＡＰ２５、及びシンタキシン（Syntaxin）の３個の蛋白質がＳＮＡＲＥ複合体を形成し、Ｃａ２＋の刺激により細胞外に分泌される（図１参照）。
【０００３】
神経伝達物質の分泌抑制剤として最もよく使われているボツリヌス神経毒素は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆなどのサブタイプ（sub-type）が存在し、これらは各々ＶＡＭＰ−２、ＳＮＡＰ２５、シンタキシンの特定位置を切断してＳＮＡＲＥ複合体の形成を妨害することにより神経伝達物質の分泌を抑制する（非特許文献１）。
【０００４】
このようなボツリヌス神経毒素は毒性が非常に高いため、上述の通り、ボツリヌス神経毒素によって切断されたペプチドの断片を利用した神経伝達物質の分泌抑制に関する研究結果が報告されているが、これは、全体の蛋白質の一部だけを利用するため、特異性が低く、ボツリヌス神経毒素に比べて低い活性を有するのが一般的であり、またペプチドのサイズが大きくなる場合、細胞内への伝達速度が遅いため、レセプターに結合して細胞内に誘導されるボツリヌス神経毒素に比べて細胞内伝達効率が低いのが現実である（非特許文献２）。
【０００５】
生体内部及び外部のどちらでも細胞を損傷させず、生物学的活性を有する巨大分子を生物学的に効果的に伝達する一般的な方法が必要となった（非特許文献３）。このような方法の例として、脂質ペプチドの化学的な追加（非特許文献４）、又はポリリシンやポリアルギニンのような塩基性重合体を使用する方法（非特許文献５）があるが、これら方法はまだ検証されていない。輸送体として使われる葉酸（非特許文献６）は、葉酸−塩結合体として細胞内へ移動するという事実が報告されているが、細胞質の中にまで伝達されるかはまだ確認されていない。また、シュードモナス外毒素（Pseudomonas Exotoxin）も輸送体の一種類として使われている（非特許文献７）。しかし、これら方法においても、生物学的に活性化された‘伝達される’物質の細胞内への移動に関する効果及びその一般的な適用可能性については明確ではない。従って、生きている細胞の細胞質や核の中へ、生物学的に活性を有する物質を、より安全且つ効果的に伝達できる方法が継続的に求められているのが実情である。
【０００６】
このような要求に対する研究の結果として提示されたものにＰＴＤがあり、このうち最も多くの研究が進められたのは、ヒト免疫不全ウイルス−１（Human Immunodeficiency Virus-1, ＨＩＶ−1）の転写因子であるＴａｔ蛋白質である。この蛋白質が細胞膜を通過するにおいて、８６個のアミノ酸からなる完全な形態である時よりも、陽電荷を有するアミノ酸が集中的に分布している４７番目から５７番目のアミノ酸（YGRKKRRQRRR）の一部分からなる形態である時、より効果的であることが明らかになった（非特許文献８）。このようにＰＴＤとしての効果が確認された他の例としては、ＨＳＶ−１（Herpes Simplex Virus type 1）のＶＰ２２蛋白質の２６７番目から３００番目までのアミノ酸（非特許文献９）、及びショウジョウバエのＡＮＴＰ（Antennapedia）蛋白質の３３９番目から３５５番目までのアミノ酸（非特許文献１０）などがあり、電気的に陽性であるアミノ酸を羅列した人為的なペプチドの場合もその効果が確認された（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Schiavo et al. Nature 359，832-835，1992
【非特許文献２】Antonio V.Ferror-Monitiel et al. FEBS letters, 435, 84-88, 1998
【非特許文献３】L.A. Sternson, Ann. N.Y. Acad. Sci., 57, 19-21(1987)
【非特許文献４】P. Hoffmann et al. Immunobiol., 177, 158-170(1998)
【非特許文献５】W-C. Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1872-1876(1978)
【非特許文献６】C.P. Leamon and Low, Proc. Natl. Acd. Sci., USA, 88, 5572-5576(1991)
【非特許文献７】T. I. Prior et al., Cell, 64, 1017-1023(1991）
【非特許文献８】Fawell S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668(1994）
【非特許文献９】Elliott G. et al. Cell, 88, 223-233(1997）
【非特許文献１０】Schwarze S. R. et al. Trends Pharmacol Sci. 21, 45-48（2000）
【非特許文献１１】Laus R. et al. Nature Biotechnol. 18, 1269-1272（2000）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
よって、本発明は、ＳＮＡＲＥ複合体を形成する３種の蛋白質が相互結合されるドメインを利用して細胞内への伝達効率を高めて競争的に蛋白質の結合を妨害することにより、神経伝達物質の分泌を抑制することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、細胞内への伝達効率を増進させるために、蛋白質伝達体（ＰＴＤ, Protein Transduction Domain）と、ＳＮＡＲＥ複合体を形成する３種の蛋白質の結合ドメインとをコンジュゲイションして融合ポリペプチド（fusion polypeptide）を製造し、これを利用して神経伝達物質の分泌を抑制する。
【００１０】
ＳＮＡＲＥ複合体を構成するシナプトブレビン（Synaptobrevin）（ＶＡＭＰ−２）、ＳＮＡＰ２５、シンタキシン（Syntaxin）のアミノ酸配列は、各々次の通りである。
【００１１】
【表１】
2010502592.tif 000003
【００１２】
ＳＮＡＰ２５（SEQ ID NO.: 1）のうち１７０番目のアミノ酸から２０６番目のアミノ酸（太文字及び下線で示した部分）は、ＶＡＭＰ−２と結合される部分であり（SEQ ID NO.: 4, ＳＢＤ）、ＶＡＭＰ−２（SEQ ID NO.: 2）のうち２９番目のアミノ酸から８６番目のアミノ酸（太文字及び下線で示した部分）は、ＳＮＡＰ２５／シンタキシンと結合されるドメイン（SEQ ID NO.: 5, ＶＢＤ）である。本発明では、ＰＴＤをＳＢＤ（SEQ ID NO.: 4）又はＶＢＤ（SEQ ID NO.: 5）の各々にコンジュゲイションして神経伝達物質の分泌抑制剤として利用する。
【００１３】
上記の目的を達成するために、本発明は、ヒトＳＮＡＰ２５がＶＡＭＰ−２と結合するドメイン、及びＶＡＭＰ−２がシンタキシン、ＳＮＡＰ２５と結合するドメイン、即ち神経細胞で神経伝達物質の分泌のために形成されるＳＮＡＲＥ複合体の構成を抑制するペプチドと、細胞透過性及び皮膚、目等への伝達効率の高い蛋白質伝達体（ＰＴＤ, Protein Transduction Domain）との融合ポリペプチドを提供する。本発明による融合ペプチドは、カテコールアミン、アセチルコリンなどの神経伝達物質の分泌を抑制し、ＰＴＤの結合によって神経伝達物質の分泌抑制効能を大きく増加させ、細胞毒性は変化しないことを特徴とする。
【００１４】
本発明による融合ペプチドは、ヒトＳＮＡＰ−２５から由来したペプチド（‘ＳＢＤ’と言う）と、ヒトＶＡＭＰ−２から由来したペプチド（‘ＶＢＤ’と言う）とにＰＴＤペプチドが結合された融合ポリペプチド（本明細書で度々‘ＰＴＤ−ＳＢＤ又はＶＢＤ’とも言う）に関し、そのペプチド配列の化学式は下記化１の通りである。
【００１５】
【化１】
2010502592.tif 000004
【００１６】
上記式で、[]ＰＴＤは自己細胞侵透性ＰＴＤペプチドであり、Ｒ１はタイロシン、アラニン、アルギニン、バリン、グリシン及びプロリンの側鎖（side chain）からなる群から一種以上選択され、ｎは５〜３０の整数であり、全体のアミノ酸のうち３０％以上がアルギニンである。ＰＴＤの例としては、Ｈｐｈ−１（SEQ ID. NO.: 6 - YARVRRRGPRR）、Ｓｉｍ−２（SEQ ID. NO.: 7 - AKAARQAAR）、Ｔａｔ（SEQ ID. NO.: 8 - YGRKKRRQRRR）、Ａｎｔｐ（SEQ ID. NO.: 9 - RQIKIWFQNRRMKWKK）、ＶＰ２２（SEQ ID. NO.: 10 - DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSAS RPRRPVE）、Ｒ７（SEQ ID. NO.: 11 - RRRRRRR）、ＭＴＳ（SEQ ID. NO.: 12 - AAVALLPAVLLALLAPAAADQNQLMP）、ｐｅｐ−１（SEQ ID. NO. 13 - KETWWETWWTEWSQPKKKRKV）などがある。[]Ｇｌｙは、自己細胞侵透性ＰＴＤペプチドとＳＢＤ又はＶＢＤペプチドとを連結し、融合ペプチドの流動性を増進させて、浸透したＰＴＤ−ＳＢＤ又はＶＢＤとＳＮＡＰＥ複合体との間の結合効率性を増進させる。ｍは０〜５の整数である。上記化学式１では、Ｇｌｙがリンカーとして使用されたことが提示されているが、多様なリンカーが本発明の目的によって利用可能である。
【００１７】
ＳＢＤ（SEQ ID. NO.: 4）とＶＢＤ（SEQ ID. NO.: 5）は、各々ヒトＳＮＡＰ−２５及びＶＡＭＰ−２から由来したペプチドであり、本発明ではこれらドメインの切片を含む。上記配列番号４と５の配列に任意の変形、即ち置換、挿入及び欠失などを行ったものも、本発明による融合ペプチドのＳＢＤ及びＶＢＤ部分として使用可能であることは、当業者によって理解されるであろう。
【００１８】
本発明によれば、ＳＢＤ又はＶＢＤとＰＴＤのペプチドとの間に約３個のグリシン残基を挿入させることによって、細胞内への伝達及び吸収効率を上昇させることができる。
【００１９】
一方、本発明による融合ペプチドを製造する方法は、当業界で明らかに公知された方法、例えば固相合成法又は組換え発現システムを利用した合成方法が用いられることができる。しかし、本発明による融合ペプチドの製造方法が、これら方法にのみ限定されるわけではない。
【００２０】
第一に、ペプチド合成用有機合成機器を利用して純粋な融合ペプチドの合成を行うことができる。この方法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相（solid phase）ペプチド合成法であり（J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-21, 54(1963））、ペプチド半自動合成機（Peti-Syzer Model PSS-510）を利用してアミノ酸のＣ−末端及びＮ−末端の反応性を有するモノマーを縮合反応させて融合ペプチドを合成する。
【００２１】
固相合成は、適当な樹脂に、α−アミノ基が保護されたアミノ酸をカルボキシル末端のアミノ酸からカップリングさせることによって始まる。この時、α−アミノ基が保護されたアミノ酸をヒドロキシメチル樹脂又はクロロメチル化樹脂にエステル結合で付ける。α−アミノ基を保護するグループとしては、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を使用する（Ｆｍｏｃに保護されたアミノ酸は、（株）BIDTECH社を通して購入可能である）。例えば、Ａｒｇのアミノ基は反応性を有する。Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎの反応性残基としては、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、Ｐｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル）のような適当なグループに保護されたＦｍｏｃ−アミノ酸を利用する。ペプチド合成は、固体担体（solid support）樹脂に付いているペプチド鎖のアミノ末端の保護基をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、フェノールのような試薬で順次に除去することによって進行される。ペプチドは、ＴＦＡ溶液からジエチルエーテルを利用して抽出されて分離され高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製できる。
【００２２】
第二に、生物学的方法を利用した融合ペプチドの製造方法は、（ａ）特定のペプチドを発現できる発現ベクターｐＰＥＴに融合ペプチドの遺伝子をクローニング（cloning）して融合ペプチドの形態で発現させることができる組換えベクターを製造する段階、及び（ｂ）上記ｐＰＥＴ−ＰＴＤ−ＳＢＤ（ＶＢＤ）発現ベクターを利用して大腸菌内での組換え輸送体−ＰＴＤ−ＳＢＤ（ＶＢＤ）ペプチドの形態で大量発現させた後、純粋分離精製する段階を含む。この時、組換えベクターを製造するために融合ペプチドをコードする塩基配列は、当業者であれば本願に開示されたアミノ酸の配列から容易に類推でき、このような塩基配列を挿入するためのクローニングベクター、クローニング技術を利用して製造した組換え発現ベクター、この組換えベクターによって形質転換させて目的融合ペプチドを発現させるための宿主細胞、組換えベクターによって宿主を形質転換させる方法、形質転換された宿主細胞から目的融合ペプチドを発現させる方法、及び最終生成物から目的融合ペプチドを収得する方法などに対する選択及び全般的な技術的事項は、当業者であれば容易に認識できる。
【００２３】
一方、本発明は、ヒト由来のＳＢＤ、ＶＢＤのペプチドに上記蛋白質伝達体ＰＴＤペプチドが結合された融合ペプチドを含んだ神経伝達物質の抑制剤を提供する。
【００２４】
このような神経伝達物質の抑制剤は、痛み緩和、皺改善、四角顎改善など、多様な分野に応用可能で、特にＰＴＤにより皮膚などの局所部位への伝達が可能である。
【００２５】
本発明による融合ペプチドは、細胞内伝達効率及び局所部位への伝達効率に優れ、従って上記融合ペプチドにより神経伝達物質の分泌を効果的に抑制する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】神経伝達物質の分泌メカニズムを示した図である。
【図２】合成ペプチドのＨＰＬＣ結果を示したものである。
【図３】ＰＴＤコンジュゲイトのＤＮＡの開裂地図である。
【図４】ＰＴＤ−ＳＢＤ、ＰＴＤ−ＶＢＤのアガロースゲル写真である。
【図５】ＰＴＤのコンジュゲイションによる細胞透過効率を示したものである。
【図６】座骨神経を２Ｈｚで５０回刺激して記録された複合筋活動電位の平均、筋肉収縮の量を示す活動電位の振幅（ｄＹ）、及び刺激後、筋肉の活動電位が発生する時までの遅延時間（ｔＣ）を示したものである。
【図７】複合筋活動電位の振幅（Amplitude of compound muscle action potential）を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下発明の実施例について述べる。
【実施例１】
【００２８】
実施例１：ＰＴＤ−ＳＢＤ（ＶＢＤ）コンジュゲイトの製造
（１）ＰＴＤ−ＳＢＤ（ＶＢＤ）コンジュゲイトの製造
YARVRRRGPRRGGGEIDTQNRQIDRIMEKAQANKTRIDEANQRATKMLGSG（PTD-GGG-SBD polypeptide）
YARVRRRGPRRGGGNRRLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKR（PTD-GGG-VBD polypeptide）のアミノ酸配列を有する融合ポリペプチドをペプチド半自動合成機（Peti-Syzer Model PSS-510）を利用して固相（solid phase）ペプチド合成法により合成した。０．１ｍｍｏｌのＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂を標準反応容器に入れ、合成しようとするペプチドのＣ−末端の１番目のアミノ酸である活性化された０．５ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−ＧとＦｍｏｃ−Ｒを各々入れて合成を始めた。Ｃ−末端アミノ酸からＮ−末端アミノ酸まで配列順序通りに該当するアミノ酸残基を０.５ｍｍｏｌずつ３回反応させた。Ｆｍｏｃの脱保護は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で希釈した２０％のピペリジンを使用して１０分間３回行い、ＤＭＦで１０分間洗浄し、カップリングを１００分間実施した。カップリングには、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）と１,３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を使用し、ＤＭＦで１０分間洗浄するシステムを利用した。
【００２９】
（２）融合ペプチドの分離及び精製
合成が完了した後、５０ｍＬのペプチドをコーニングチューブ（corning tube）に入れ、０℃に冷却させた後、フェノール０．７５ｇ、１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）０.２５ｍＬ、チアニソル（thianisol）０.２５ｍＬ、蒸溜水０.５ｍＬ及びＴＦＡ８.２５ｍＬの混合比を有した切断溶媒（cleavage solution）を入れた後、室温で４時間反応させた。反応が終わった後、ペプチド及び分離された樹脂をろ過して残った溶液に５０℃以下のジエチルエーテルを３０ｍＬ添加してペプチドを沈殿させ、ジエチルエーテルを２度更に添加して洗浄した。得られた沈殿物を乾燥させた後、ＭｅＯＨに溶かしてＨＰＬＣで精製した。精製に使われたカラムは、Ｃ１８分析用カラム２１８ＴＰ５４（VyDac）とＣ１８分取用カラム２１８ＴＰ１０２２（VyDac）である。精製条件は各々１ｍＬ／ｍｉｎ、２５ｍＬ／ｍｉｎであり、溶媒としてＡ：１００％Ｈ２Ｏ＋０.０１％ＴＦＡとＢ：１００％アセトニトリル＋０.０１％ＴＦＡを使用してペプチドを溶出した。溶出されたペプチドのアセトニトリルを除去し、凍結乾燥して純度の高いペプチドが得られた（図２参照）。
【実施例２】
【００３０】
実施例２．微生物発現システムを利用した融合ペプチド発現ベクターの製造及び精製
（１）発現ベクターの製造
融合ペプチドをコードする塩基配列の製作のために、ｐＵＣ１９（入手先：invitrogen）のＮ−末端にＨｉｎｄ ＩＩＩを、Ｃ−末端にＢａｍＨ Ｉを入れて鋳型を製作した。融合ペプチドの高発現と容易な精製のためのｐｏｌｙ Ｈｉｓ ｔａｇ領域を、高発現蛋白質をコードする塩基配列と結合させるために、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 、ＢａｍＨ Ｉ反応を経て鋳型を分離し、Ａｕｉａｑｕｉｃｋ精製キットを使用して精製した。発現ベクター、ｐＰＥＴベクターは、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 、ＢａｍＨ Iを使用して処理し、Ａｕｉａｑｕｉｃｋ精製キットを使用して精製した。精製された発現ベクターを、上記準備された融合ペプチドをコードする塩基配列鋳型を利用してクローニングして組換え発現ベクターを製造した。概略的な発現ベクターの遺伝子地図は、図３に示した通りである。
【００３１】
（２）大腸菌形質転換体の製造並びに融合ペプチドの発現及び精製
上記で製造された発現ベクターを使用して大腸菌ＢＬ２１（入手先：invitrogen）を熱衝撃形質転換方法（Heat shock transformation）で形質転換させてから、形質転換された大腸菌１ｍＬを１００ｍＬのＬＢ培地に１％で接種し、３７℃で１２時間攪拌しながら前培養した。続いて、これを再び各々１,０００ｍＬのＬＢ培地に接種し３７℃で４時間培養した後、１ｍＭ濃度のＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド, GibcoBRL cat. #15529-019）を添加してｌａｃオペロンの発現を誘導し、８時間培養して融合ペプチドの発現を誘導した。上記培養液を４℃、５,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してペレットだけ残し、上澄液を除去した後、１ｍｇ／ｍＬのライソザイム（Sigma, cat, #L-7651）が含まれた１０ｍＬの緩衝溶液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ ８.０）でペレットを溶かしてから、氷の上で３０分間放置した後、超音波粉砕機（Heat systems, ultrasonic processor XL）を使用して３００Ｗの強度で１０秒間超音波を注入し１０秒間冷却する過程を反復して累積超音波注入時間が３分になるようにした。溶出液を４℃、１２,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して大腸菌の破砕物を除去し、純粋な溶出液だけを分離した。分離された溶出液に２.５ｍＬの５０％Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガローススラリー（Qiagen, cat #30230）を入れ、４℃、２００ｒｐｍで１時間攪拌して融合蛋白質とＮｉ２＋−ＮＴＡアガロースとを結合させ、この混合液をクロマトグラフィー用０.８×４ｃｍカラム（BioRad, cat #731-1550）に流し入れた。４ｍＬの緩衝溶液２（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ ８.０）を使用して２度洗浄した後、０.５ｍＬの緩衝溶液３（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ ８.０）で４回に分けて融合蛋白質を分取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、クーマシーブルー染色法で確認し、その結果を図４に示した。図４で、レーン１は標準分子量の蛋白質であり、レーン２はＰＴＤ−ＳＢＤ、レーン３はＰＴＤ−ＶＢＤである。融合蛋白質に２ｍＬの氷冷された４Ｍ ＮＨ２ＯＨ、０.４Ｍ Ｋ２ＣＯ３、６Ｍ ＧｕＨＣｌ、ｐＨ ９.０を入れて最終的な緩衝溶液濃度が２Ｍ ＮＨ２ＯＨ、０.２Ｍ Ｋ２ＣＯ３、３Ｍ ＧｕＨＣｌ、ｐＨ ９.０になるようにした後、４５℃、２２５ｒｐｍで５時間攪拌して融合蛋白質を融合ペプチドと輸送体蛋白質とに分離し、１２Ｎ ＨＣｌを入れてｐＨを２〜３に調整し、１０分間更に攪拌して反応を完了した。１２.５Ｎ ＮａＯＨを入れてｐＨ６.５になるように中性化反応させた後、充填されたＮｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラムに入れて輸送体蛋白質を分離してから、ゲルろ過して緩衝溶液内の塩成分を除去した後、凍結乾燥して純粋な融合ペプチドを得た。
【実施例３】
【００３２】
実施例３．実験管内における融合ペプチドによる神経伝達物質の分泌抑制効果
上記実施例１及び２で製造された融合ペプチドの神経伝達物質の分泌抑制効果を分析した。ＳＢＤ及びＶＢＤの切片を各々２個ずつ製造して活性を比較した。
【００３３】
試料１：ＳＢＤ（SEQ ID. NO.:4）
試料２：ＶＢＤ（SEQ ID. NO.:5）
試料３：Ｈｐｈ−１−ＧＧＧ−ＳＢＤ（SEQ ID. NO.:14）
試料４：Ｈｐｈ−１−ＧＧＧ−ＶＢＤ（SEQ ID. NO.:15）
試料５：Ｔａｔ−ＧＧＧ−ＳＢＤ（SEQ ID. NO.:16）
試料６：Ｈｐｈ−１−ＧＧＧ−ＳＢＤＦ１（SEQ ID. NO.:17）
試料７：Ｈｐｈ−１−ＧＧＧ−ＳＢＤＦ２（SEQ ID. NO.:18）
試料８：Ｈｐｈ−１−ＧＧＧ−ＶＢＤＦ１（SEQ ID. NO.:19）
試料９：Ｈｐｈ−１−ＧＧＧ−ＶＢＤＦ２（SEQ ID. NO.:20）
Ｈｐｈ−１−ＧＧＧ−ＳＢＤ（SEQ ID. NO.: 14） 
YARVRRRGPRRGGGEIDTQNRQIDRIMEKAQANKTRIDEANQRATKMLGSG
Ｈｐｈ−１−ＧＧＧ−ＶＢＤ（SEQ ID. NO.: 15）
YARVRRRGPRRGGGNRRLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKR
Ｔａｔ−ＧＧＧ−ＳＢＤ（SEQ ID. NO.: 16） 
YGRKKRRQRRRGGGEIDTQNRQIDRIMEKAQANKTRIDEANQRATKMLGSG
Ｈｐｈ−１−ＧＧＧ−ＳＢＤＦ１（SEQ ID. NO.: 17）
YARVRRRGPRRGGGIMEKAQANKTRIDEANQRATKMLGSG
Ｈｐｈ−１−ＧＧＧ−ＳＢＤＦ２（SEQ ID. NO.: 18） 
YARVRRRGPRRGGGKTRIDEANQRATKM
Ｈｐｈ−１−ＧＧＧ−ＶＢＤＦ1（SEQ ID. NO.: 19）
YARVRRRGPRRGGGNRRLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQK
Ｈｐｈ−１−ＧＧＧ−ＶＢＤＦ２（SEQ ID. NO.: 20） 
YARVRRRGPRRGGGLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKR 
ＰＣ１２細胞（Pheochromocytoma, ATCC CRL-1721）を、Ｔ７５（Nunc）で２ｍＭのＬ−グルタミン、１.５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、１５％のウマ血清、及び２.５％のＦＢＳを入れた１５ｍＬのＦ−１２Ｋ培地（Gibco）で解氷し、二日間培養して、細胞密度が６２５,０００細胞／ｃｍ２になるようにした後、遠心分離して上澄液を除去し、同一ボリュームのＦ−１２Ｋ培地と薬物を各々入れて一日間培養し、１０ｕＭのＣａ２＋で刺激し、分泌されるカテコールアミンの量を蛍光ＨＰＬＣを通して分析した。薬物の濃度は１０-６〜１０-５の濃度（Ｍ）で入れた。その結果を表２に示した。表２から、本発明に使われた［化１］に示される化合物は神経伝達物質の分泌抑制効果に優れていることが分かった。
【００３４】
【表２】
2010502592.tif 000005
【実施例４】
【００３５】
実施例４：ＰＴＤコンジュゲイションによる細胞内伝達効果
ＰＴＤの結合による細胞内伝達効果を分析するために、ＰＴＤとコンジュゲイションしたＳＢＤＦ１ペプチドと、コンジュゲイションしていないＳＢＤＦ１ペプチドとの各々に、蛍光物質であるＦＩＴＣ（入手先：Sigma, Fluorescein 5-isothiocyanate, 27072-45-3）をラベルしてＦａｃｓ（FACSCalibur, Becton Dickinson）で分析した（図５参照）。その結果、ＰＴＤのコンジュゲイションによって約５０倍に伝達効果を向上させることと分析された。
【実施例５】
【００３６】
実施例５：ＰＴＤコンジュゲイトによる筋麻痺効力試験
ボツリヌス神経毒素及び本発明によるペプチドは神経伝達物質を遮断して筋肉の麻痺を発生させるため、ボツリヌス神経毒素及びペプチドをラットの前脛骨筋に注射して１週、２週、及び３週後に座骨神経の電気刺激による前脛骨筋の複合筋活動電位（compound muscle action potential, ＣＭＡＰ）の振幅（ｄＹ）を測定した。測定方法は、まず８週齢のＳＤラット（供給先：HYOCHANG）にボツリヌス神経毒素Ａ（製造元：allergan, 購入先：Sigma）と試料１、試料３、試料６を後足の右側前脛骨筋に５μｌずつ注射した。ボツリヌス神経毒素の注射方法は、４００Ｕのボツリヌス神経毒素を１ｍＬの生理食塩水に溶かして４００Ｕ／ｍＬの溶液を作り、ラットに５μｌを１回注射した。また、試料１、試料３、試料６は各々ラット当たり１０ｎｇ、１００ｎｇ、５００ｎｇずつ投与した。
【００３７】
複合筋活動電位の測定は、ラットにketamine/xylazineカクテルを腹腔内注射して麻酔した後、３０℃に維持される検査台の上にラットをうつ伏せに置き四肢を固定して行った。検査しようとする下肢の股関節、膝関節、足首関節を各々９０度に屈曲させて固定し、記録電極、基準電極、接地電極を前脛骨筋、踵骨腱、足の裏側に各々付着した。刺激電極（＋）針を膝窩部に刺し、刺激電極（−）針を後恥骨部と大腿近位部（proximal femur）の恥骨筋（pectineal muscle）に刺した。刺激電極を通して１〜５ｍｉｃｒｏＡ範囲で電流を流して座骨神経を刺激することで前脛骨筋の複合筋活動電位を誘発させた。最大振幅を示す刺激の約１５０％強度で２Ｈｚで５０回反復刺激して複合筋活動電位を繰り返し誘発した。５分の休息後、２０Ｈｚで５０回反復刺激して複合筋活動電位を繰り返し誘発した。これら信号を生物電気増幅器及び信号処理器（CyberAmp380, Axon Instruments, Inc.）で５００倍に増幅させ３００〜３０００Ｈｚの範囲でフィルタリングした後、信号獲得装置（Digidata1320, Axon Instruments, Inc.）を使用してコンピュータに入力して波形を示した。
【００３８】
コンピュータに保存された信号を分析し２Ｈｚで５０回反復してＣＭＡＰの平均電位のネガティブピークとポジティブピークの振幅の差（ｄＹ）と、電気刺激と、ネガティブピークの時点間遅延時間（ｔＣ）とを計算した（図６参照）。
【００３９】
ボツリヌス神経毒素及び試料１、試料３、試料６の時間による複合筋活動電位の結果は、図７のように、ボツリヌス神経毒素の場合、５ｕｎｉｔの注射によって完壁に筋肉を麻痺させ、試料１の場合、２０％程度の弱い筋麻痺を表し、試料３及び試料６の場合、物質の投与量が増加するにつれてボツリヌス神経毒素と同じ効果を表した。
【００４０】
以上、本発明の望ましい実施例を参照して説明したが、本技術分野の熟練した当業者であれば下記の特許請求範囲に記載の本発明の思想及び領域から逸脱しない範囲内で本発明を多様に修正及び変更することができることを理解できるであろう。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
以上で説明した通り、本発明による融合ペプチドは、細胞内伝達効率及び局所部位への伝達効率に優れ、従って上記融合ペプチドにより神経伝達物質の分泌を効果的に抑制する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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