(57)【要約】本発明は１つ以上のアクセサリーポリペプチドに連結した生物学的に活性なポリペプチドに関する。本発明はまた、主題のタンパク性物質をコードするベクターを包含する組み換えポリペプチド、並びに該ベクターを含む宿主細胞を提供する。主題の組成物は医薬品用途の範囲を包含する種々の利用性を有する。一実施形態において、生物学的に活性なポリペプチドを生成する方法が提供され、この方法は、ａ）宿主細胞における修飾ポリペプチドの発現が、該生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較した場合に、より高い量の可溶性型の該生物学的に活性なポリペプチドをもたらすように、アクセサリーポリペプチドと連結された生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を提供する工程；ｂ）該修飾ポリペプチドを該宿主細胞内で発現させることにより、該生物学的に活性なポリペプチドを生成する工程；を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性なポリペプチドを生成する方法であって、
ａ）宿主細胞における修飾ポリペプチドの発現が、該生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較した場合に、より高い量の可溶性型の該生物学的に活性なポリペプチドをもたらすように、アクセサリーポリペプチドと連結された生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を提供する工程；
ｂ）該修飾ポリペプチドを該宿主細胞内で発現させることにより、該生物学的に活性なポリペプチドを生成する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
宿主細胞における前記修飾ポリペプチドの発現が、前記生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較した場合に、少なくとも約２倍多い可溶性型の生物学的に活性なポリペプチドをもたらす、請求項１記載の方法。
【請求項３】
宿主細胞における前記修飾ポリペプチドの発現が、前記生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較した場合に、少なくとも約５倍多い可溶性型の生物学的に活性なポリペプチドをもたらす、請求項１記載の方法。
【請求項４】
宿主細胞における前記修飾ポリペプチドの発現が、前記生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較した場合に、少なくとも約１０倍多い可溶性型の生物学的に活性なポリペプチドをもたらす、請求項１記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞における前記修飾ポリペプチドの発現が、前記生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較した場合に、約２倍〜約１０倍多い可溶性型の生物学的に活性なポリペプチドをもたらす、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記アクセサリーポリペプチドが約５０超のアミノ酸を含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記アクセサリーポリペプチドが約１００超のアミノ酸を含む請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的に活性なポリペプチドがヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インスリン、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＦＮ−アルファ）、ＩＬ−１ＲＡ、エキセナチド、ウリカーゼ及びプラムリチドからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも４０連続するアミノ酸を含み、更に、
（ａ）該アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の合計が、該アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約８０％超を構成し；並びに／又は、
（ｂ）少なくとも５０％の該アミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている；
請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも４０連続するアミノ酸を含み、該アクセサリーポリペプチドが対象において約４時間超のインビトロ血清中半減期を有し、そして更に、
（ａ）該アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の合計が、該アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約８０％超を構成し；並びに／又は、
（ｂ）少なくとも５０％の該アミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている；
請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも５０％がグリシン（Ｇ）残基である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも８０％がグルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の５０％未満がグリシン（Ｇ）残基である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも５０％がセリン（Ｓ）残基である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも５０％がセリン（Ｓ）及びグリシン（Ｇ）残基の何れかである、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記アクセサリーポリペプチドが、
（ａ）３つの型のアミノ酸よりなり、各型がアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）及びチロシン（Ｙ）からなる群より選択され；そして
（ｂ）１０以上のアミノ酸を含む；
ことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記アクセサリーポリペプチドが３つの型のアミノ酸よりなり、各型がアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）からなる群より選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記アクセサリーポリペプチドが３つの型のアミノ酸よりなり、各型がグルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、及びセリン（Ｓ）からなる群より選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記アクセサリーポリペプチドが、
（ａ）２つの型のアミノ酸よりなり、その１つはグリシン（Ｇ）であり、そしてもう１つの型はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、及びシステイン（Ｃ）からなる群より選択され；そして
（ｂ）１０以上のアミノ酸残基を含み、そのうち５０％以下がグリシンである；
ことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記アクセサリーポリペプチドが、
（ａ）５０以上のアミノ酸を含み；
（ｂ）２つの型のアミノ酸よりなり；そして
（ｃ）総アミノ酸の５０％以下がアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群より選択される；
ことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記アクセサリーポリペプチドが１０以上の反復モチーフを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
多数のアクセサリーポリペプチドを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
請求項１記載の修飾ポリペプチドを発現する、宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１記載のポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子ベヒクル。
【請求項２５】
前記アクセサリーポリペプチドが最大１０コピーの反復配列よりなり、各反復配列が約８〜約１２のアミノ酸を有する、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
前記修飾ポリペプチドが前記アクセサリータンパク質にプロテアーゼ切断部位を介して連結している、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
前記プロテアーゼ切断部位が前記生物学的に活性なポリペプチドをコードしている配列の一部ではない、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記プロテアーゼ切断部位がＴＥＶプロテアーゼ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トロンビン、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭプロテアーゼ、３Ｃプロテアーゼ、ソルターゼＡ、及びグランザイムＢからなる群より選択される、請求項２６記載の方法
【請求項２９】
前記アクセサリーポリペプチドがアフィニティータグを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３０】
前記アフィニティータグがＦＬＡＧ、Ｈｉｓタグ、ＣＢＤ、ＧＳＴ、ＭＢＰ及びＴＲＸからなる群より選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
前記宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
前記宿主細胞が哺乳類細胞及び酵母細胞からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３５】
アクセサリーポリペプチドに連結した可溶性形態の生物学的に活性なポリペプチドを含む組成物であって、該アクセサリーポリペプチドは、該生物学的に活性なポリペプチドと連結されている場合には、連結された該生物学的に活性なポリペプチドが発現される宿主細胞のサイトゾル画分中において該生物学的に活性なポリペプチドの溶解性を増大させる、組成物。
【請求項３６】
前記生物学的に活性なポリペプチドが前記アクセサリーポリペプチドにプロテアーゼ切断部位を介して連結している、請求項３５記載の組成物。
【請求項３７】
前記生物学的に活性なポリペプチドがヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インスリン、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＦＮ−アルファ）、ＩＬ−１ＲＡ、エキセナチド、ウリカーゼ及びプラムリチドからなる群より選択される、請求項３５記載の組成物。
【請求項３８】
前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも４０連続するアミノ酸を含み、更に、
（ａ）該アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の合計が、該アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約８０％超を構成し；並びに／又は、
（ｂ）少なくとも５０％の該アミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている；
請求項３５記載の組成物。
【請求項３９】
前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも４０連続するアミノ酸を含み、該アクセサリーポリペプチドが対象において約４時間超のインビトロ血清中半減期を有し、そして更に、
（ａ）該アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の合計が、該アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約８０％超を構成し；並びに／又は、
（ｂ）少なくとも５０％の該アミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている；
請求項３５記載の組成物。
【請求項４０】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも５０％がグリシン（Ｇ）残基である、請求項３５記載の組成物。
【請求項４１】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも８０％がグルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）からなる群より選択される、請求項３５記載の組成物。
【請求項４２】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の５０％未満がグリシン（Ｇ）残基である、請求項３５記載の組成物。
【請求項４３】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも５０％がセリン（Ｓ）残基である、請求項３５記載の組成物。
【請求項４４】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも５０％がセリン（Ｓ）及びグリシン（Ｇ）残基の何れかである、請求項３５記載の組成物。
【請求項４５】
前記アクセサリーポリペプチドが、
（ａ）３つの型のアミノ酸よりなり、各型がアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）及びチロシン（Ｙ）からなる群より選択され；そして
（ｂ）１０以上のアミノ酸を含む；
ことを特徴とする、請求項３５記載の組成物。
【請求項４６】
前記アクセサリーポリペプチドが３つの型のアミノ酸よりなり、各型がアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）からなる群より選択される、請求項４５記載の組成物。
【請求項４７】
前記アクセサリーポリペプチドが３つの型のアミノ酸よりなり、各型がグルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、及びセリン（Ｓ）からなる群より選択される、請求項４５記載の組成物。
【請求項４８】
前記アクセサリーポリペプチドが、
（ａ）２つの型のアミノ酸よりなり、その１つはグリシン（Ｇ）であり、そしてもう１つの型はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、及びシステイン（Ｃ）からなる群より選択され；
（ｂ）１０以上のアミノ酸残基を含み、そのうち５０％以下がグリシンである；
ことを特徴とする、請求項３５記載の組成物。
【請求項４９】
前記アクセサリーポリペプチドが、
（ａ）５０以上のアミノ酸を含み；
（ｂ）２つの型のアミノ酸よりなり；
（ｃ）総アミノ酸の５０％以下がアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群より選択される；
ことを特徴とする、請求項３５記載の組成物。
【請求項５０】
前記アクセサリーポリペプチドが１０以上の反復モチーフを含む、請求項３５記載の組成物。
【請求項５１】
前記アクセサリーポリペプチドが約＋０．１以上の正味の正荷電の前記連結した生物学的に活性なポリペプチドを提供する、請求項３５記載の組成物。
【請求項５２】
前記アクセサリーポリペプチドが約−０．１以下の正味の負荷電の前記連結した生物学的に活性なポリペプチドを提供する、請求項３５記載の組成物。
【請求項５３】
前記アクセサリーポリペプチドが約＋０．１以上の正味の正荷電の前記修飾ポリペプチドを提供する、請求項１記載の方法。
【請求項５４】
前記アクセサリーポリペプチドが約−０．１以下の正味の負荷電の前記修飾ポリペプチドを提供する、請求項１記載の方法。
【請求項５５】
ａ）緩徐放出剤、
ｂ）アクセサリーポリペプチドに連結した生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドであって、ここで、該アクセサリーポリペプチドは、該生物学的に活性なポリペプチドのプロテアーゼ耐性を増大させる、修飾ポリペプチド；
を含む、医薬組成物。
【請求項５６】
前記修飾ポリペプチドが３を超える見かけの分子量ファクターを与え、更に、該見かけの分子量ファクターが、該修飾ポリペプチドの予測された分子量に対する、サイズ排除クロマトグラフィーにより計測した該修飾ポリペプチドの見かけの分子量の比として求められる、請求項５５記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターが５を超えるものである、請求項５５記載の組成物。
【請求項５８】
前記修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターが７を超えるものである、請求項５５記載の組成物。
【請求項５９】
前記修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターが９を超えるものである、請求項５５記載の組成物。
【請求項６０】
前記アクセサリーポリペプチドが約５０超のアミノ酸を含む、請求項５５記載の組成物。
【請求項６１】
前記アクセサリーポリペプチドが約１００超のアミノ酸を含む、請求項５５記載の組成物。
【請求項６２】
前記生物学的に活性なポリペプチドがヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インスリン、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＦＮ−アルファ）、ＩＬ−１ＲＡ、エキセナチド、ウリカーゼ及びプラムリチドからなる群より選択される、請求項５５記載の組成物。
【請求項６３】
前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも４０連続するアミノ酸を含み、更に、
（ａ）該アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の合計が、該アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約８０％超を構成し；並びに／又は、
（ｂ）少なくとも５０％の該アミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている；
請求項５５記載の組成物。
【請求項６４】
前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも４０連続するアミノ酸を含み、該アクセサリーポリペプチドが対象において約２４時間超のインビトロ血清中半減期を有し、そして更に、
（ａ）該アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の合計が、該アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約８０％超を構成し；並びに／又は、
（ｂ）少なくとも５０％の該アミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている；
請求項５５記載の組成物。
【請求項６５】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも５０％がグリシン（Ｇ）残基である、請求項５５記載の組成物。
【請求項６６】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも８０％がグルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）からなる群より選択される、請求項５５記載の組成物。
【請求項６７】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の５０％未満がグリシン（Ｇ）残基である、請求項５５記載の組成物。
【請求項６８】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも５０％がセリン（Ｓ）残基である、請求項５５記載の組成物。
【請求項６９】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも５０％がセリン（Ｓ）及びグリシン（Ｇ）残基の何れかである、請求項５５記載の組成物。
【請求項７０】
前記アクセサリーポリペプチドが、
（ａ）３つの型のアミノ酸よりなり、各型がアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）及びチロシン（Ｙ）からなる群より選択され；そして
（ｂ）１０以上のアミノ酸を含む；
ことを特徴とする、請求項５５記載の組成物。
【請求項７１】
前記アクセサリーポリペプチドが３つの型のアミノ酸よりなり、各型がアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）からなる群より選択される、請求項７０記載の組成物。
【請求項７２】
前記アクセサリーポリペプチドが３つの型のアミノ酸よりなり、各型がグルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、及びセリン（Ｓ）からなる群より選択される、請求項７０記載の組成物。
【請求項７３】
前記アクセサリーポリペプチドが、
（ａ）２つの型のアミノ酸よりなり、その１つはグリシン（Ｇ）であり、そしてもう１つの型はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、及びシステイン（Ｃ）からなる群より選択され；そして
（ｂ）１０以上のアミノ酸残基を含み、そのうち５０％以下がグリシンである；
ことを特徴とする、請求項５５記載の組成物。
【請求項７４】
前記アクセサリーポリペプチドが、
（ａ）５０以上のアミノ酸を含み；
（ｂ）２つの型のアミノ酸よりなり；そして
（ｃ）総アミノ酸の５０％以下がアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群より選択される；
ことを特徴とする、請求項５５記載の組成物。
【請求項７５】
前記アクセサリーポリペプチドが１０以上の反復モチーフを含む、請求項５５記載の組成物。
【請求項７６】
多数のアクセサリーポリペプチドを含む、請求項５５記載の組成物。
【請求項７７】
前記緩徐放出剤が重合体マトリックスである、請求項５５記載の組成物。
【請求項７８】
前記重合体マトリックスがポリ−ｄ，ｌ−ラクチド（ＰＬＡ）、ポリ−（ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ共重合体、アルギネート、デキストラン及びキトサンからなる群より選択される、請求項７７記載の組成物。
【請求項７９】
前記緩徐放出剤が経皮パッチである、請求項５５記載の組成物。
【請求項８０】
前記アクセサリーポリペプチドが荷電したアミノ酸を含む、請求項５５記載の組成物。
【請求項８１】
前記アクセサリーポリペプチドが荷電したアミノ酸を含み、更に前記緩徐放出剤が荷電した重合体マトリックスを含む、請求項５５記載の組成物。
【請求項８２】
修飾ポリペプチドの生成方法であって、該方法は：
（ａ）請求項５５記載の修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程；
（ｂ）該修飾ポリペプチドを宿主細胞内で発現させることにより、該修飾ポリペプチドを生成する工程；
を含む、方法。
【請求項８３】
請求項５５記載の修飾ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、遺伝子ベヒクル。
【請求項８４】
請求項５５記載の修飾ポリペプチドを発現する、宿主細胞。
【請求項８５】
制御放出組成物の生成方法であって、該方法は：
（ａ）請求項５５記載の修飾ポリペプチドを提供する工程；
（ｂ）該修飾ポリペプチドを重合体マトリックスと混合する工程；
を含む、方法。
【請求項８６】
ａ）緩徐放出剤、
ｂ）アクセサリーポリペプチドに連結した生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドであって、該アクセサリーポリペプチドは、該生物学的に活性なポリペプチドの溶解性を増大させる、修飾ポリペプチド；
を含む、医薬組成物。
【請求項８７】
前記修飾ポリペプチドが３を超える見かけの分子量ファクターを与え、更に、該見かけの分子量ファクターが、該修飾ポリペプチドの予測された分子量に対する、サイズ排除クロマトグラフィーにより計測した該修飾ポリペプチドの見かけの分子量の比として求められる、請求項８６記載の医薬組成物。
【請求項８８】
前記修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターが５を超えるものである、請求項８６記載の組成物。
【請求項８９】
前記修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターが７を超えるものである、請求項８６記載の組成物。
【請求項９０】
前記修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターが９を超えるものである、請求項８６記載の組成物。
【請求項９１】
前記アクセサリーポリペプチドが約５０超のアミノ酸を含む、請求項８６記載の組成物。
【請求項９２】
前記アクセサリーポリペプチドが約１００超のアミノ酸を含む、請求項８６記載の組成物。
【請求項９３】
前記生物学的に活性なポリペプチドがヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インスリン、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＦＮ−アルファ）、ＩＬ−１ＲＡ、エキセナチド、ウリカーゼ及びプラムリチドからなる群より選択される、請求項８６記載の組成物。
【請求項９４】
前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも４０連続するアミノ酸を含み、更に、
（ａ）該アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の合計が、該アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約８０％超を構成し；並びに／又は、
（ｂ）少なくとも５０％の該アミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている；
請求項８６記載の組成物。
【請求項９５】
前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも４０連続するアミノ酸を含み、該アクセサリーポリペプチドが対象において約２４時間超のインビトロ血清中半減期を有し、そして更に、
（ａ）該アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の合計が、該アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約８０％超を構成し；並びに／又は、
（ｂ）少なくとも５０％の該アミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている；
請求項８６記載の組成物。
【請求項９６】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも５０％がグリシン（Ｇ）残基である、請求項８６記載の組成物。
【請求項９７】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも８０％がグルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）からなる群より選択される、請求項８６記載の組成物。
【請求項９８】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の５０％未満がグリシン（Ｇ）残基である、請求項８６記載の組成物。
【請求項９９】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも５０％がセリン（Ｓ）残基である、請求項８６記載の組成物。
【請求項１００】
前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも５０％がセリン（Ｓ）及びグリシン（Ｇ）残基の何れかである、請求項８６記載の組成物。
【請求項１０１】
前記アクセサリーポリペプチドが、
（ａ）３つの型のアミノ酸よりなり、各型がアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）及びチロシン（Ｙ）からなる群より選択され；そして
（ｂ）１０以上のアミノ酸を含む；
ことを特徴とする、請求項８６記載の組成物。
【請求項１０２】
前記アクセサリーポリペプチドが３つの型のアミノ酸よりなり、各型がアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）からなる群より選択される、請求項１０１記載の組成物。
【請求項１０３】
前記アクセサリーポリペプチドが３つの型のアミノ酸よりなり、各型がグルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、及びセリン（Ｓ）からなる群より選択される、請求項１０１記載の組成物。
【請求項１０４】
前記アクセサリーポリペプチドが、
（ａ）２つの型のアミノ酸よりなり、その１つはグリシン（Ｇ）であり、そしてもう１つの型はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、及びシステイン（Ｃ）からなる群より選択され；そして
（ｂ）１０以上のアミノ酸残基を含み、そのうち５０％以下がグリシンである；
ことを特徴とする、請求項８６記載の組成物。
【請求項１０５】
前記アクセサリーポリペプチドが、
（ａ）５０以上のアミノ酸を含み；
（ｂ）２つの型のアミノ酸よりなり；そして
（ｃ）総アミノ酸の５０％以下がアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、及びヒスチジン（Ｈ）からなる群より選択される；
ことを特徴とする、請求項８６記載の組成物。
【請求項１０６】
前記アクセサリーポリペプチドが１０以上の反復モチーフを含む、請求項８６記載の組成物。
【請求項１０７】
多数のアクセサリーポリペプチドを含む、請求項８６記載の組成物。
【請求項１０８】
前記緩徐放出剤が重合体マトリックスである、請求項８６記載の組成物。
【請求項１０９】
前記重合体マトリックスがポリ−ｄ，ｌ−ラクチド（ＰＬＡ）、ポリ−（ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ共重合体、アルギネート、デキストラン及びキトサンからなる群より選択される、請求項１０８記載の組成物。
【請求項１１０】
前記緩徐放出剤が経皮パッチである、請求項８６記載の組成物。
【請求項１１１】
前記アクセサリーポリペプチドが荷電したアミノ酸を含む、請求項８６記載の組成物。
【請求項１１２】
前記アクセサリーポリペプチドが荷電したアミノ酸を含み、更に前記緩徐放出剤が荷電した重合体マトリックスを含む、請求項８６記載の組成物。
【請求項１１３】
修飾ポリペプチドの生成方法であって、該方法は：
（ａ）請求項８６記載の修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程；
（ｂ）該修飾ポリペプチドを宿主細胞内で発現させることにより、該修飾ポリペプチドを生成する工程；
を含む、方法。
【請求項１１４】
請求項８６記載の修飾ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、遺伝子ベヒクル。
【請求項１１５】
請求項８６記載の修飾ポリペプチドを発現する、宿主細胞。
【請求項１１６】
制御放出組成物の生成方法であって、該方法が、
（ａ）請求項８６記載の修飾ポリペプチドを提供する工程；
（ｂ）該修飾ポリペプチドを重合体マトリックスと混合する工程；
を含む、方法。
【請求項１１７】
生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該アクセサリーポリペプチドは、
（ｉ）３つの型のアミノ酸よりなり、各型がアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）及びチロシン（Ｙ）からなる群より選択され；そして
（ｂ）１０以上のアミノ酸を含む；
ことを特徴とする、単離されたポリペプチド。
【請求項１１８】
前記アクセサリーポリペプチドが３つの型のアミノ酸よりなり、各型がＤ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、及びＴからなる群より選択される、請求項１１７記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１９】
前記アクセサリーポリペプチドが３つの型のアミノ酸よりなり、各型がＥ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、及びＡからなる群より選択される、請求項１１７記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２０】
前記生物学的に活性なポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項１１７記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２１】
前記アクセサリーポリペプチドが３つの型のアミノ酸よりなり、各型がＥ、Ｇ、及びＳからなる群より選択される、請求項１１７記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２２】
生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該アクセサリーポリペプチドは、
（ｉ）２つの型のアミノ酸よりなり、その１つはグリシン（Ｇ）であり、そしてもう１つの型はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、及びシステイン（Ｃ）からなる群より選択され；そして
（ｉｉ）１０以上のアミノ酸残基を含み、そのうち５０％以下がグリシンである；
ことを特徴とする、単離されたポリペプチド。
【請求項１２３】
生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該アクセサリーポリペプチドは、
（ｉ）１０以上のアミノ酸を含み；
（ｉｉ）２つの型のアミノ酸よりなり、総アミノ酸の５０％以下がＡ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、及びＨからなる群より選択される；
ことを特徴とする、単離されたポリペプチド。
【請求項１２４】
生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該アクセサリーポリペプチドは、
（ｉ）２つの型のアミノ酸よりなり、その１つはＰ、Ｒ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、及びＣからなる群より選択され；
（ｉｉ）１０以上のアミノ酸を含む；
ことを特徴とする、単離されたポリペプチド。
【請求項１２５】
生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該アクセサリーポリペプチドが少なくとも１０アミノ酸長を含み、等しい数で示される２つの異なる型のアミノ酸よりなる、単離されたポリペプチド。
【請求項１２６】
２つの異なる型のアミノ酸が１：２の比で示される、請求項１２１、１２２、及び１２３の何れか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２７】
２つの異なる型のアミノ酸が２：３の比で示される、請求項１２１、１２２、及び１２３の何れか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２８】
２つの異なる型のアミノ酸が３：４の比で示される、請求項１２１、１２２、及び１２３の何れか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２９】
前記アクセサリーポリペプチドが４以上の反復モチーフを含み、各々は２〜５００アミノ酸を含み、２つの異なる型のアミノ酸より構成される、請求項１２８記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３０】
前記反復モチーフが８を超えるアミノ酸を含む、請求項１２８記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３１】
前記４以上の反復モチーフが同一である、請求項１２８の何れか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３２】
前記４以上の反復モチーフが異なるアミノ酸配列を含む、請求項１２８の何れか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３３】
前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも１０の反復モチーフを含む、請求項１２８記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３４】
前記アクセサリーポリペプチドが二次構造を実質的に欠いている、請求項１２８記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３５】
前記単離されたポリペプチドの見かけの分子量が、前記アクセサリーポリペプチドを欠いた対応するポリペプチドの見かけの分子量よりも大きい、請求項１２８記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３６】
前記アクセサリーポリペプチドの見かけの分子量がその実際の分子量より少なくとも３倍大きい、請求項１２８記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３７】
前記アクセサリーポリペプチドを欠いた対応するポリペプチドと比較して２倍長い血清中半減期を示す、請求項１２８記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３８】
前記生物学的に活性なポリペプチド及び前記アクセサリーポリペプチドがペプチド結合を介して連結している、請求項１２８記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３９】
前記アクセサリーポリペプチドがアミノ酸配列（ＧＧＥＧＧＳ）ｎを含み、ここでｎは３以上の整数である、請求項１１７の何れか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４０】
前記アクセサリーポリペプチドがアミノ酸配列（ＧＥＳ）ｎを含み、ここでＧ、Ｅ、及びＳは何れかの順序であることができ、ｎは３以上の整数である、請求項１１７の何れか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４１】
前記アクセサリーポリペプチドがアミノ酸配列（ＧＧＳＧＧＥ）ｎを含み、ここでＧ、Ｅ、及びＳは何れかの順序であることができ、ｎは３以上の整数である、請求項１１７の何れか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４２】
前記アクセサリーポリペプチドがアミノ酸配列（ＧＧＥＧＧＥＧＧＥＳ）ｎを含み、ここでｎは１以上の整数である、請求項１１７の何れか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４３】
単離されたポリペプチドの生成方法であって、
ａ）請求項１１７、１２１、１２２、１２３、又は１２４の何れか１項に記載の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程；
ｂ）該ポリペプチドを宿主細胞内で発現させることにより、該ポリペプチドを生成する工程；
を含む、方法。
【請求項１４４】
請求項１１７、１２１、１２２、１２３、又は１２４の何れか１項に記載の単離されたポリペプチドをコードする核酸配列を含む、遺伝子ベヒクル。
【請求項１４５】
請求項１１７、１２１、１２２、１２３、又は１２４の何れか１項に記載の単離されたポリペプチドを発現する、宿主細胞。
【請求項１４６】
請求項１１７、１２１、１２２、１２３、又は１２４の何れか１項に記載の単離されたポリペプチドのライブラリ。
【請求項１４７】
ファージ粒子上にディスプレイされた、請求項１４５記載のライブラリ。
【請求項１４８】
ａ）緩徐放出剤、
ｂ）サイズ５ｋＤ超のＰＥＧ基に連結された生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドを含む修飾ポリペプチド；
を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、係属中の２００７年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／９５６，１０９号、２００７年１０月１８日に出願された同第６０／９８１，０７３号および２００７年１１月８日に出願された同第６０／９８６，５６９号（これらは、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えタンパク質は新しい治療薬の開発のための極めて魅力的な候補となっている。しかしながら、タンパク質医薬品の生成は特定の生物学的に活性なポリペプチドの十分な収量を得るためには多大なプロセスの最適化を必要とする。エシェリシア・コリの細胞質内の組み換えタンパク質の発現は、特に哺乳類組み換えタンパク質の場合、封入体として知られている不溶性凝集塊の形成をもたらす場合が多い。Ｅ．ｃｏｌｉの封入体からの組み換えタンパク質の高い細胞密度の発酵及び精製は、治療用タンパク質の経費効果的な生成に関わる２つの主な障害である（非特許文献１）。同様に、数百のタンパク質を種々の活性に関してスクリーニングする必要がある研究目的のためには、可溶性で活性なタンパク質の発現が望ましく、これにより封入体を先ず精製して次に各々別個にタンパク質を変性して再折畳する必要がある工程を回避できる。
【０００３】
Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質空間内で発現される場合に不溶性の封入体を形成する多くの薬学的に重要なタンパク質の例は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（非特許文献２；非特許文献３）、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（非特許文献４；非特許文献５）及びインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−アルファ；非特許文献６）を包含する。更に又、抗体の免疫グロブリンドメイン及びそのフラグメント、例えばドメイン抗体フラグメント（ｄＡｂ）、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメント及び多くの非抗体タンパク質（例えばＦｎＩＩＩドメイン）は一般的に細菌宿主の細胞質内での発現の際には封入体を形成する（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。
【０００４】
ヒトタンパク質は、典型的には多数の疎水性アミノ酸を含む疎水性コア部を用いて折り畳まれる。研究によればタンパク質は、特に、タンパク質のネイティブな結合相手が不在であるために折り畳みの支援が得られず、そして疎水性パッチが露出しているような、ある生物に由来する遺伝子が別の発現宿主内で発現される場合に、凝集して封入体を形成することができることが分かっている。これは特に大きい進化的距離を横断する場合に当てはまり、例えば真核生物から単離したｃＤＮＡは、原核生物内の組み換え遺伝子として発現される場合に、凝集して封入体を形成する危険性が高くなる。ｃＤＮＡは翻訳可能なｍＲＮＡを適切にコードし得るが、生じるタンパク質は外来の微小環境内に出現することになる。これは、濃度が十分高い場合には、一般的には凝集塊として蓄積する誤って折り畳まれた不活性のタンパク質をもたらす場合が多い。他のエフェクター、例えば原核生物細胞の内部の微小環境（ｐＨ、浸透圧）は遺伝子の本来の発生元のものとは異なり、そしてタンパク質の折り畳みに影響する場合がある。タンパク質を折り畳む機序は又、宿主依存性であり、そしてこのため非相同宿主内には非存在である場合があり、そして通常は疎水性コア部の一部として埋没したままとなる疎水性の残基がむしろ露出したままとなり、他のタンパク質上の疎水性の部位との相互作用のために使用可能となる。発現されたタンパク質の内部ポリペプチドの切断及び除去のためのプロセス系もまた細菌内には非存在である場合がある。更に又、タンパク質濃度を低く維持する場合がある精密な制御もまた原核生物細胞内では失われている場合があり、そして過剰発現は、適切に折り畳まれていてもその環境を飽和させることにより沈殿する場合があるタンパク質で細胞を充填してしまう場合がある。
【０００５】
封入体内に存在する凝集した状態からの生物学的に活性な生成物の回収は典型的にはカオトロピック剤又は酸を用いた展開と、その後の最適化された再折り畳み用緩衝液中への希釈又は透析により達成される。しかしながら、多くのポリペプチド（特に構造的に複雑なオリゴマータンパク質及び多数のジスルフィド結合を含有するもの）は化学変性後に活性なコンフォメーションを容易には採らない。
【０００６】
一次構造における小さい変化は、おそらくは折り畳みの経路を改変することにより溶解性に影響する場合がある（Ｍｉｔｒａｋｉ，Ａ．ら、（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，６９０；Ｂａｎｅｙｘ，Ｆ，ら、２００４  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２，１３９９；Ｖｅｎｔｕｒａ，Ｓ．２００５  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ，４，１１）。高密度の発酵の間における不溶性凝集塊の形成を低減するために、一部のグループは非相同の融合タンパク質を目的のタンパク質に連結させている。そのような融合配列の例はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｈｉｓ６タグ，キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）及びセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）である（Ｓａｈａｄｅｖ，Ｓ．ら、２００７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．；Ｄｙｓｏｍ，Ｍ．Ｒ．ら、２００４，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１４，３２）。総括すれば、これらの手順は、それらが全てのタンパク質に対して功を奏するわけではないため、タンパク質特異的であることが分かっている。
【０００７】
種々の融合タンパク質が折り畳みを向上させるために設計されているが、タンパク質の化学的ＰＥＧ化もまたタンパク質の溶解性を増強し、凝集を低減し、免疫原性を低減し、そしてタンパク質分解を低減することが報告されている。しかしなお過剰生成されたポリペプチドの適切な折り畳みは、凝集が濃度依存的な様式で起こる細胞質の高度に濃縮された粘稠な環境の内部においては問題であり続けている。細菌宿主内の哺乳類タンパク質の発現のための別の手順はリーダーペプチドを回避しており、そして宿主の細胞質内で直接活性なタンパク質を発現する。しかしながらこのプロセスは凝集及び封入体の形成をもたらす傾向がある。
【０００８】
細菌内での活性形態の哺乳類タンパク質の発現のための１つの広範に使用されている手順は、典型的には分泌を指向するシグナルペプチド又はリーダーペプチドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌宿主のペリプラズム空間の非還元環境内にタンパク質を指向させることである。ペリプラズム内への（稀には培地中への）分泌はタンパク質分泌、折り畳み及びジスルフィド形成のネイティブな真核生物のプロセスを模倣していると考えられ、そして頻繁には活性なタンパク質をもたらす。この手順は多くの深刻な難点を有している。ペリプラズムは低い収量を与える傾向があり；該プロセスは一般的にはより小型のタンパク質に限定され；該プロセスはタンパク質特異的である傾向があり；そしてまたペリプラズムタンパク質を抽出するための操作法は細胞質からの抽出ほどはロバストではなく、これが低収量に寄与している。このような理由のために、細菌のペリプラズム内のタンパク質の発現は大部分の医薬タンパク質には適用されず、これらは典型的には酵母又は哺乳類細胞系内で商業的に発現されている。
【０００９】
封入体を形成することなく細菌の細胞質内で哺乳類タンパク質を発現させるために試みられている別の手順は、広範囲の生物工学的な用途において役割を果たす分子シャペロンのような折り畳みヘルパータンパク質を過剰発現することである（Ｍｏｇｋら、２００２  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ３，８０７）。今日まで、数種の異なるファミリーのシャペロンが報告されている。全ては、展開された、又は部分的に展開されたタンパク質に結合し、そして細菌の細胞質内に折り畳まれたタンパク質を正確に放出するその能力を特徴としている。十分特性化された例は熱ショックタンパク質のファミリー（Ｈｓｐ）であり、これらはＢｕｃｈｎｅｒ，Ｊ．，Ｆａｓｅｂ  Ｊ．１９９６  １０，１０により、そしてＢｅｉｓｓｉｎｇｅｒ，Ｍ．及びＢｕｃｈｎｅｒ，１９９８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９，２４５により記載される通り、それらの相対分子量に従って設計されている。多くの細菌及び真核生物のシャペロンがタンパク質の過剰発現を目的に細菌において、そして程度は低いが哺乳類細胞においても試みられているが、この手順は一般的に効果が殆ど又は全くなく、そして、発現最適化のための実施頻度は更に低い。
【００１０】
従って、生物学的に活性なタンパク質の生成のため、そして原核生物のような宿主細胞を利用して大規模な生成を行うために、それらの溶解性を向上させるための方法及び組成物の必要性は多大である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｐａｎｄａ，Ａ．Ｋ、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３）８５，４３
【非特許文献２】Ｐａｔｒａ，Ａ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ（２０００）１８，１８２
【非特許文献３】Ｋｈａｎ，Ｒ．Ｈ，ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（１９９８）１４，７２２
【非特許文献４】Ｚａｖｅｃｋａｓ，Ｍ．ら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．（２００７）８５２，４０９
【非特許文献５】Ｌｅｅ，Ａ．Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．（２００３）２５，２０５
【非特許文献６】Ｖａｌｅｎｔｅ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．（２００６）４５，２２６
【非特許文献７】Ｋｏｕ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．（２００７）５２，１３１
【非特許文献８】Ｃａｏ，Ｐ．ら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００６）７３，１５１
【非特許文献９】Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．（２００６）４６，４９５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は生物学的に活性なポリペプチドを生成する方法を提供する。該方法では、典型的には、ａ）宿主細胞における修飾ポリペプチドの発現が、生物学的に活性なポリペプチド自体（例えばアクセサリーポリペプチドから遊離したもの）の発現と比較した場合に、より高い量の可溶性型の生物学的に活性なポリペプチドをもたらすように、前記アクセサリーポリペプチドと連結された生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を提供する工程；及びｂ）修飾ポリペプチドを前記宿主細胞内で発現させることにより、生物学的に活性なポリペプチドを生成する工程、を行う。１つの実施形態において、可溶性活性形態の生物学的に活性なポリペプチドの発現は、そのタンパク質の総量の約１％、５％、２５％、５０％、７５％、９５％又は９９％である。１つの実施形態において、宿主細胞内での修飾ポリペプチドの発現は生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較した場合に少なくとも約２倍高い可溶性形態の生物学的に活性なポリペプチドを与える。別の実施形態においては、生物学的に活性なポリペプチドは、プロテイナーゼ切断部位を介してアクセサリーポリペプチドに連結している。所望により、切断部位はＴＥＶプロテアーゼ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トロンビン、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭプロテアーゼ、３Ｃプロテアーゼ、ソルターゼ（ｓｏｒｔａｓｅ）Ａ、及びグランザイム（ｇｒａｎｚｙｍｅ)Ｂからなる群より選択できる。一部の実施形態においては、宿主細胞内の修飾ポリペプチドの発現は約２倍、５倍、１０倍、３０倍、又は１００倍以上の可溶性形態の生物学的に活性なポリペプチドをもたらす。
【００１３】
本発明は又、修飾ポリヌクレオチド配列を発現するための宿主細胞を提供する。宿主細胞は典型的には原核生物、限定しないが例えばＥ．ｃｏｌｉであり、それは又、真核生物、例えば酵母細胞、更には哺乳類細胞（例えばＣＨＯ細胞）であってもよい。
【００１４】
本発明は又アクセサリーポリペプチドに連結しているかしていない生物学的に活性なポリペプチドをコードする主題のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子ベヒクルを提供する。
【００１５】
更に本発明により提供されるものは、アクセサリーポリペプチドに連結した可溶性形態の生物学的に活性なポリペプチドを含む組成物であって、前記アクセサリーポリペプチドは、生物学的に活性なポリペプチドと連結されている場合には、連結された生物学的に活性なポリペプチドが発現される宿主細胞のサイトゾル画分中において生物学的に活性なポリペプチドの溶解性を増大させる、組成物である。所望により、生物学的に活性なポリペプチドは、アクセサリーポリペプチドにプロテアーゼ切断部位を介して連結している。切断部はＴＥＶプロテアーゼ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トロンビン、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭプロテアーゼ、３Ｃプロテアーゼ、ソルターゼＡ、及びグランザイムＢからなる群より選択されることができる。
【００１６】
主題の方法又は組成物において使用されるアクセサリーポリペプチドは全体として、又は部分的に、以下の通り特性化できる。１つの実施形態において、主題のアクセサリーポリペプチドはアミノ酸残基当たり約＋０．０２５、＋０．０５、＋０．０７５、＋０．１、＋０．２、＋０．３、＋０．４、＋０．５、＋０．６、＋０．７、＋０．８、＋０．９又は更には＋１．０の電荷の修飾された生物学的に活性なポリペプチドの平均実質正電荷密度を与える。別の実施形態においては、主題のアクセサリーポリペプチドはアミノ酸残基当たり約−０．２５、−０．５、−０．０７５、−０．１、−０．２、−０．３、−０．４、−０．５、−０．６、−０．７、−０．８、−０．９又は更には−１．０の平均実質電荷の修飾された生物学的に活性なポリペプチドの平均実質負電荷密度を与える。１つの実施形態において、主題のアクセサリーポリペプチドは約＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１２、＋１４、＋１６、＋１８、＋２０、＋２５、＋３０、＋３５、＋４０、＋５０以上の修飾された生物学的に活性なポリペプチドの実質正電荷を与える。１つの実施形態において、主題のアクセサリーポリペプチドは約−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１２、−１４、−１６、−１８、−２０、−２５、−３０、−３５、−４０、−５０以上の修飾された生物学的に活性なポリペプチドの実質負電荷を与える。
【００１７】
更に別の実施形態において、本発明のアクセサリーポリペプチドは約１０、３０、５０又は１００超のアミノ酸を含んでよい。１つの実施形態において、アクセサリーポリペプチドは少なくとも４０連続するアミノ酸を含み、血清タンパク質に非特異的に結合することは実質的にはできない。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）及びリジン（Ｋ）の残基の合計は、アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約８０％超を構成し；並びに／又は、アクセサリーポリペプチドの少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている。関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドは少なくとも４０連続するアミノ酸を含み、アクセサリーポリペプチドは約４時間、５時間、１０時間、１５時間又は２４時間超のインビトロ血清中半減期を有する。更に、（ａ）アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）及びリジン（Ｋ）の残基の合計がアクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約８０％超を構成し；並びに／又は、（ｂ）アクセサリーポリペプチドの少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている。一部の実施形態においては、総アミノ酸の８０％（又は５０、６０、７０又は９０％）が選択されるアミノ酸のセットは、Ｇ／Ｓ／Ｅ／Ｄ、Ｇ／Ｓ／Ｋ／Ｒ、Ｇ／Ｓ／Ｅ／Ｄ／Ｋ／Ｒ、又はＧ／Ａ／Ｓ／Ｔ／Ｑである。
【００１８】
一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは少なくとも５０％のグリシン残基を含む（即ち全残基の５０％がグリシンである）。或いは、アクセサリーポリペプチドは５０％未満のグリシン残基を含んでよい。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは少なくとも５０％のセリン残基を含む。他の実施形態は少なくとも５０％のセリン及びグリシン残基を含むアクセサリーポリペプチドを提供する。更なる実施形態は少なくとも５％のグルタミン酸、又は少なくとも１０、２０若しくは３０％のグルタミン酸を含むアクセサリーポリペプチドを提供する。
【００１９】
１つの実施形態において、アクセサリーポリペプチドは又、（ａ）３つの型のアミノ酸よりなり、各型がアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）及びチロシン（Ｙ）からなる群より選択され；（ｂ）１０、２５、５０、１００以上のアミノ酸を含むことを特徴とする。関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドは３つの型のアミノ酸よりなり、各型はＤ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、及びＴからなる群より選択される。アクセサリーポリペプチドは又３つの型のアミノ酸よりなり、各型がＥ、Ｇ、及びＳからなる群より選択されてよい。
【００２０】
本発明は又、（ｉ）３つの型のアミノ酸よりなり、その２つはセリン（Ｓ）及びグリシン（Ｇ）であり、そしてもう１つの型はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、及びシステイン（Ｃ）からなる群より選択され；（ｉｉ）１０以上のアミノ酸残基を含み、そのうち５０％以上がセリン又はグリシンであることを特徴とするアクセサリーポリペプチドを提供する。
【００２１】
別の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは、（ａ）２つの型のアミノ酸よりなり、その１つはグリシン（Ｇ）であり、そしてもう１つの型はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、及びシステイン（Ｃ）からなる群より選択され；（ｂ）１０以上のアミノ酸残基を含み、そのうち５０％未満がグリシンであることを特徴とする。
【００２２】
或いは、アクセサリーポリペプチドは２つの型のアミノ酸よりなり、総アミノ酸の５０％以下がＡ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｋ及びＨからなる群より選択される。
【００２３】
なお別の実施形態において、アクセサリーポリペプチドは、（ａ）５０以上のアミノ酸を含み；（ｂ）２つの型のアミノ酸よりなり、（ｃ）総アミノ酸の５０％以下がＡ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｋ及びＨからなる群より選択されることを特徴とする。
【００２４】
アクセサリーポリペプチドは１、２、５又は１０以上の反復モチーフを含んでよく、各々は２〜５００アミノ酸を含んでよい。一部の場合においては、反復モチーフは２つ又は３つ以上の異なる型のアミノ酸よりなる。多数のアクセサリーポリペプチドを使用してよい。アクセサリーポリペプチドは又荷電したアミノ酸を含んでよい。
一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＧＧＥＧＧＳ）ｎを含み、ここでｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＧＥＳ）ｎを含み、ここでＧ、Ｅ，及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の整数である。或いは、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＧＧＳＧＧＥ）ｎを含み、ここでＧ、Ｅ，及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の整数である。更に別の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＧＥＧＧＧＥＧＧＥ）ｎを含み、ここでｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の整数である。  更に別の実施形態において、アクセサリー配列はより小さい酸の配列（ＧＥ）ｎを含み、ここでＧ及びＥは何れかの順序であることができ、そしてｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の整数である。
一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（Ｓ）ｎを含み、ここでｎは１０、１５、２０、５０以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＳＳＳＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＳＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の整数である。更に他の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＥＳＳＳＥＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の整数である。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＳＥＳＳＳＳＥＳＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは３以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＳＳＥＳＳＳＳＳＥＳＳＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ，及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは３以上の整数である。なお他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＳＳＳＥＳＳＳＳＳＳＥＳＳＳＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは３以上の整数である。
【００２５】
一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは３、４、５、６又は７アミノ酸のペプチドモチーフの反復単位を含まないか、又は何れかの単一のポリペプチドモチーフの反復単位を含まない。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは固定された長さの２、５、１０、又は２０超の異なる反復モチーフを含む。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは何れかの長さの２、５、１０、又は２０超の異なる反復モチーフを含む。
【００２６】
更に又、本発明は（ａ）修飾ポリペプチドを提供する工程；（ｂ）前記修飾ポリペプチドを重合体マトリックスと混合する工程を含む、医薬組成物の生成方法を記載する。
【００２７】
主題の方法により生成されるか、又は主題の組成物中に存在する生物学的に活性なポリペプチドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、エキセナチド、プラムリチド（ｐｒａｍｌｉｔｉｄｅ）、ウリカーゼ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インスリン、インターロイキン１受容体拮抗剤（ＩＬ−１ＲＡ）、エリスロポエチン又は腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＦＮ−アルファ）であることができる。
【００２８】
本発明は、（ａ）緩徐放出剤、及び（ｂ）アクセサリーポリペプチドに連結した生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドを含む、医薬組成物に関する。修飾ポリペプチドが１より大きい見かけの分子量ファクター（molecular weight factor）を与えてよい。見かけの分子量ファクターは、修飾ポリペプチドの予測された分子量に対する、サイズ排除クロマトグラフィーにより計測した修飾ポリペプチドの見かけの分子量として求めてよい。１つの実施形態において、修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターは３より大きい。別の実施形態においては、修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターは５より大きい。更に別の実施形態において、修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターは７より大きい。なお別の実施形態において、修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターは９より大きい。
【００２９】
アクセサリーポリペプチドは生物学的に活性なポリペプチドの血清中半減期を増大させることができる。或いは、アクセサリーポリペプチドは生物学的に活性なポリペプチドのプロテアーゼ耐性を増大させることができる。他の場合において、アクセサリーポリペプチドは生物学的に活性なポリペプチドの溶解性を増大させることができる。他の場合において、アクセサリーポリペプチドは生物学的に活性なポリペプチドの免疫原性を低下させることができる。本発明のアクセサリーポリペプチドは約１０、３０、５０又は１００超のアミノ酸を含んでよい。一部の実施形態においては、生物学的に活性なポリペプチドはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、エキセナチド、プラムリチド、ウリカーゼ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インスリン、インターロイキン１受容体拮抗剤（ＩＬ−１ＲＡ）、エリスロポエチン又は腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）であることができる。
【００３０】
１つの実施形態において、アクセサリーポリペプチドは少なくとも４０連続するアミノ酸を含み、血清タンパク質に非特異的に結合することは実質的にはできない。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の合計は、アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約８０％超を構成し；並びに／又は、アクセサリーポリペプチド中の少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている。関連する実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは少なくとも４０連続するアミノ酸を含み、そしてアクセサリーポリペプチドは約４時間、５時間、１０時間、１５時間又は２４時間超のインビトロ血清中半減期を有する。更に、（ａ）アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の合計がアクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約８０％超を構成し；並びに／又は、（ｂ）アクセサリーポリペプチド中の少なくとも５０％のアミノ酸がＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている。
【００３１】
一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは少なくとも５０％のグリシン残基を含む（即ち全残基の５０％がグリシンである）。或いは、アクセサリーポリペプチドは５０％未満のグリシン残基を含んでよい。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは少なくとも５０％のセリン残基を含む。他の実施形態は少なくとも５０％のセリン及びグリシン残基を含むアクセサリーポリペプチドを提供する。更なる実施形態は少なくとも５％のグルタミン酸、又は少なくとも１０、２０若しくは３０％のグルタミン酸を含むアクセサリーポリペプチドを提供する。
【００３２】
１つの実施形態において、アクセサリーポリペプチドは又（ａ）３つの型のアミノ酸よりなり、各型がアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）及びチロシン（Ｙ）からなる群より選択され；（ｂ）１０、２５、５０、１００以上のアミノ酸を含むことを特徴としてよい。関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドは３つの型のアミノ酸よりなり、各型はＤ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、及びＴからなる群より選択される。アクセサリーポリペプチドは又３つの型のアミノ酸よりなり、各型はＥ、Ｇ、及びＳからなる群より選択される。
【００３３】
本発明は又（ｉ）３つの型のアミノ酸よりなり、その２つはセリン（Ｓ）及びグリシン（Ｇ）であり、そしてもう１つの型はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、及びシステイン（Ｃ）からなる群より選択され；（ｉｉ）１０以上のアミノ酸残基を含み、その５０％以上がセリン又はグリシンであることを特徴とするアクセサリーポリペプチドを提供する。
【００３４】
別の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは（ａ）２つの型のアミノ酸よりなり、その１つはグリシン（Ｇ）であり、そしてもう１つの型はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、及びシステイン（Ｃ）からなる群より選択され；（ｂ）１０以上のアミノ酸残基を含み、その５０％以下がグリシンであることを特徴とする。
【００３５】
或いは、アクセサリーポリペプチドは２つの型のアミノ酸よりなり、ここで総アミノ酸の５０％以下はＡ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、及びＨからなる群より選択される。
【００３６】
なお別の実施形態において、アクセサリーポリペプチドは、（ａ）５０以上のアミノ酸を含み；（ｂ）２つの型のアミノ酸よりなり、（ｃ）総アミノ酸の５０％以下がＡ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、及びＨからなる群より選択されることを特徴とする。
【００３７】
アクセサリーポリペプチドは１、２、５又は１０以上の反復モチーフを含んでよく、各々は２〜５００アミノ酸を含んでよい。一部の場合においては、反復モチーフは２つ又は３つ以上の異なる型のアミノ酸よりなる。多数のアクセサリーポリペプチドを使用してよい。アクセサリーポリペプチドは又荷電したアミノ酸を含んでよい。
【００３８】
一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＧＧＥＧＧＳ）ｎを含み、ここでｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＧＥＳ）ｎを含み、ここでＧ、Ｅ、及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の整数である。或いは、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＧＧＳＧＧＥ）ｎを含み、ここでＧ，Ｅ、及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の整数である。更に別の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＧＥＧＧＧＥＧＧＥ）ｎを含み、ここでｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の整数である。更に別の実施形態において、アクセサリー配列はより小さい酸の配列（ＧＥ）ｎを含み、ここでＧ及びＥは何れかの順序であることができ、そしてｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の整数である。
【００３９】
一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（Ｓ）ｎを含み、ここでｎは１０，１５、２０、５０以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＳＳＳＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＳＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の整数である。更に他の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＥＳＳＳＥＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の整数である。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＳＥＳＳＳＳＥＳＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは３以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＳＳＥＳＳＳＳＳＥＳＳＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ、及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは３以上の整数である。なお他の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＳＳＳＥＳＳＳＳＳＳＥＳＳＳＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは３以上の整数である。
【００４０】
一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは３、４、５、６又は７アミノ酸のペプチドモチーフの反復単位を含まないか、又は何れかの単一のポリペプチドモチーフの反復単位を含まない。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは固定された長さの２、５、１０、又は２０超の異なる反復モチーフを含む。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは何れかの長さの２、５、１０、又は２０超の異なる反復モチーフを含む。
【００４１】
緩徐放出剤は重合体マトリックスを包含してよい。一部の実施形態においては、重合体マトリックスは荷電している。特定の実施形態においては、重合体マトリックスはポリ−ｄ，ｌ−ラクチド（ＰＬＡ）、ポリ−（ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ共重合体、アルギネート、デキストラン及び／又はキトサンであってよい。緩徐放出剤は又経皮パッチを包含するパッケージ品であってよい。
【００４２】
本発明は又、修飾ポリペプチドの生成方法であって、ａ）修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程；ｂ）前記修飾ポリペプチドを宿主細胞内で発現させることにより前記修飾ポリペプチドを生成する工程を含む、方法を提供する。修飾ポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子ベヒクル、並びに本発明の修飾ポリペプチドを発現する宿主細胞も提供される。
【００４３】
更に又、本発明は医薬組成物の生成方法であって、（ａ）修飾ポリペプチドを提供する工程；（ｂ）前記修飾ポリペプチドを重合体マトリックスと混合する工程を含む、方法を記載する。
【００４４】
本発明の医薬組成物はａ）緩徐放出剤、ｂ）サイズが５ｋＤ超のＰＥＧ基に連結した生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドを含んでよい。
【００４５】
更に他の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは二次構造を実質的に欠いている。なお他の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアクセサリーポリペプチドを欠いた対応するポリペプチドと比較して２倍長い血清中半減期を示す。生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドはペプチド結合を介して連結してよい。
【００４６】
一部の実施形態においては、修飾ポリペプチドは更に少なくとも１つのデポモジュールを含む。デポモジュールは少なくとも１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１００アミノ酸長である。正荷電のデポモジュール（例えばリジンリッチ又はアルギニンリッチのポリペプチド）は負荷電の重合体と組み合わせる場合に有用である。負荷電のデポモジュールは正荷電の重合体と組み合わせる場合に有用である。ポリＨｉｓ配列を含むデポモジュールはキレート形成性のヒドロゲルと組み合わせて使用してよい。一部の場合においては、デポモジュールはプロテアーゼ感受性、例えば、そして限定しないが、血清中プロテアーゼ又は他のプロテアーゼに対して感受性であることができる。多数及び／又は異なるデポモジュールを使用してよい。デポモジュール、生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドの何れかの組み合わせは、除放性治療薬を生成するために使用可能である。特定の実施形態においては、緩徐放出剤は修飾ポリペプチドに連結したデポモジュールである。
【００４７】
更に又、本発明のＡＰＩをコードする核酸配列を含む遺伝子ベヒクルが提供される。別の実施形態においては、ポリペプチドを発現する宿主細胞を記載する。
【００４８】
本発明は生物学的に活性なポリペプチドの特性を改質するために使用してよいアクセサリーポリペプチドに関する。１つの実施形態において、本発明は生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを提供し、ここでアクセサリーポリペプチドは（ｉ）３つの型のアミノ酸よりなり、各型がアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、  アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）及びチロシン（Ｙ）からなる群より選択され；（ｉｉ）１０以上のアミノ酸を含むことを特徴とする。関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドは３つの型のアミノ酸よりなり、各型はＤ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、及びＴからなる群より選択される。別の関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドは３つの型のアミノ酸よりなり、各型はＥ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、及びＡからなる群より選択される。別の関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドは３つの型のアミノ酸よりなり、各型はＥ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、及びＡからなる群より選択される。更に別の実施形態において、アクセサリーポリペプチドは３つの型のアミノ酸よりなり、各型はＥ、Ｇ、及びＳからなる群より選択される。単離されたポリペプチドは治療用ポリペプチドであってよい。
【００４９】
本発明は又、生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを提供し、ここでアクセサリーポリペプチドは（ｉ）ポリセリンであり、（ｉｉ）１０以上のアミノ酸を含むことを特徴とする。関連する実施形態において、単離されたポリペプチドは（ｉ）２つの型のアミノ酸よりなり、その大多数はセリンであり、（ｉｉ）１０以上のアミノ酸を含む。
【００５０】
別の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは２つの型のアミノ酸よりなり、その１つはグリシン（Ｇ）であり、そしてもう１つの型はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、及びシステイン（Ｃ）からなる群より選択され；（ｉｉ）１０以上のアミノ酸残基を含み、その５０％以下がグリシンである。
【００５１】
本発明は又、生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを提供し、ここでアクセサリーポリペプチドは（ｉ）２つの型のアミノ酸よりなり、その１つはセリン（Ｓ）であり、そしてもう１つはアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、及びシステイン（Ｃ）からなる群より選択され；（ｉｉ）１０以上のアミノ酸残基を含み、その５０％以上がセリンであることを特徴とする。
【００５２】
或いは、本発明は生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを記載し、ここでアクセサリーポリペプチドは（ｉ）１０以上のアミノ酸を含み；（ｉｉ）２つの型のアミノ酸よりなり、ここで総アミノ酸の５０％以下がＡ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、及びＨからなる群より選択されることを特徴とする。
【００５３】
更に別の実施形態において、本発明は生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを記載し、ここでアクセサリーポリペプチドは（ｉ）１０以上のアミノ酸を含み；（ｉｉ）２つの型のアミノ酸よりなり、総アミノ酸の５０％以下がＡ、Ｇ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、及びＨからなる群より選択されることを特徴とする。
【００５４】
一部の実施形態においては、生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドが提供され、ここでアクセサリーポリペプチドは（ｉ）２つの型のアミノ酸よりなり、その１つはＰ、Ｒ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、及びＣからなる群より選択され；（ｉｉ）１０以上のアミノ酸を含むことを特徴とする。
【００５５】
他の実施形態において、生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドが提供され、ここでアクセサリーポリペプチドは少なくとも１０アミノ酸長を含み、そして等しい数で示される２つの異なる型のアミノ酸よりなる。或いは、２つの異なる型のアミノ酸は１：２、２：３、又は３：４の比で示される。アクセサリーポリペプチドは更に４以上の反復モチーフを含んでよく、各々は２〜５００アミノ酸を含み、２つの異なる型のアミノ酸より構成される。反復モチーフは８アミノ酸長を含んでよく、そして一部の実施形態においては、４以上の反復モチーフが同一である。４以上の反復モチーフは異なるアミノ酸配列を含んでよい。関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドは少なくとも１０の反復モチーフを含む。
【００５６】
更に他の実施形態は二次構造を実質的に欠いているアクセサリーポリペプチドで修飾された生物学的に活性なポリペプチドを提供する。或いは、単離されたポリペプチドの見かけの分子量はアクセサリーポリペプチドを欠いた対応するポリペプチドの見かけの分子量より大きい。特定の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドの見かけの分子量はその実際の分子量より少なくとも３倍大きい。なお他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアクセサリーポリペプチドを欠いた対応するポリペプチドと比較して２倍長い血清中半減期を示す。生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドはペプチド結合を介して連結していてよい。
【００５７】
一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＧＧＥＧＧＳ）ｎを含み、ここでｎは３以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＧＥＳ）ｎを含み、ここでＧ、Ｅ、及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは３以上の整数である。或いは、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＧＧＳＧＧＥ）ｎを含み、ここでＧ、Ｅ、及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは３以上の整数である。更に別の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＧＧＥＧＧＥＧＧＥＳ）ｎを含み、ここでｎは１以上の整数である。更に別の実施形態において、アクセサリー配列はアミノ酸配列（ＧＥ）ｎを含み、ここでＧ及びＥは何れかの順序であることができる。
【００５８】
一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（Ｓ）ｎを含み、ここでｎは１０以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＳＳＳＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは２以上である。更に他の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＥＳＳＳＥＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは３以上の整数である。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＳＥＳＳＳＳＥＳＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは３以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＳＳＥＳＳＳＳＳＥＳＳＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ、及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは３以上の整数である。なお他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列（ＳＳＳＳＥＳＳＳＳＳＳＥＳＳＳＳＳＥ）ｎを含み、ここでＥ及びＳは何れかの順序であることができ、そしてｎは３以上の整数である。
【００５９】
本発明は又、単離されたポリペプチドの生成方法であって、ａ）請求項１、６、７、８、又は９の何れか１項の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程；ｂ）前記ポリペプチドを宿主細胞内で発現させることにより、前記ポリペプチドを生成する工程を含む、方法を提供する。
【００６０】
更に又、本発明の単離されたポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子ベヒクルが提供される。別の実施形態においては、主題のポリペプチドを発現する宿主細胞を記載する。主題のポリペプチドのライブラリも又、想定される。特定の実施形態においては、ペプチドのライブラリはファージ粒子上にディスプレイされる。
【００６１】
（参照による援用）
本明細書において言及する全ての公開物及び特許出願は、各々の個々の公開物又は特許出願が具体的及び個別に参照により本明細書に援用される場合と同じ程度まで、参照により本明細書に援用される。
【００６２】
本発明の新しい特徴は添付の特許請求の範囲において特に記載する。本発明の特徴及び利点の良好な理解は、本発明の原理を利用している説明上の実施形態を記載した以下の詳細な説明及び以下の添付図面を参照することにより可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は生物学的に活性なタンパク質を修飾しているアクセサリーポリペプチドの説明図である。
【図２】図２は本発明の修飾ポリペプチド内への封入のための可能なモジュール：アクセサリーポリペプチド、生物学的に活性なポリペプチド、任意のデポモジュール及び任意の重合体マトリックスを示す。
【図３】図３は本発明の修飾ポリペプチド内への封入のための可能なモジュール：アクセサリーポリペプチド、生物学的に活性なポリペプチド、任意のデポモジュール及び任意の重合体マトリックスを示す。
【図４】図４は種々の生成物の配置の例を示す。モジュールは例えばその標的に対する生物学的に活性なタンパク質の親和性を増大させるため、ｒＰＥＧモジュールを延長することにより半減期を延長するため、又は、デポ製剤の特性を改質するために、同じ生成物中で数回使用してよい。
【図５】図５は部位特異的ビオチニル化を可能にするデポモジュールを含む４量体の修飾ポリペプチドの特定の例を提示する。ストレプトアビジンの添加は高度に安定であるが、なお非共有結合性である修飾ポリペプチド４量体の形成を誘導する。多価のポリペプチドも又、多数のモジュールを単一のタンパク質鎖中に組み込まれることによるか、又は特定のモジュールを含有する多数のタンパク質鎖を化学的に連結することにより、形成することができる。
【図６】図６はアルギネートマイクロスフェアの重合体マトリックス内に取り込んでよいリジンリッチ又はアルギニンリッチのデポモジュール（長方形で示す）を示す。マトリックスモジュールはより大きい円で示す。リジンリッチ又はアルギニンリッチのデポは生理学的なｐＨにおいて実質正電荷を帯びており、この特性は負荷電のアルギネート重合体に修飾ポリペプチドを結合させるために利用できる。結合は多価の条件において起こってよい。
【図７】図７は重合体に結合した２価のカチオンＣｕ２＋により例示される２価カチオンキレート形成ヒドロゲル（マトリックスモジュール）を示す。ポリヒスチジンデポモジュール（長方形モジュール）は高い親和性でＣｕ２＋カチオンに結合する。
【図８】図８はプロテアーゼ感受性の多量体修飾ポリペプチドを示す。デポモジュール（長方形で示す）は延伸した重合体中で個々の修飾ポリペプチド単位を連結する。デポモジュールは血清プロテアーゼに対して特異的に感受性であるように設計する。デポモジュールのプロテアーゼ切断により個々の活性な修飾ポリペプチドが放出される。
【図９】図９は発現ベクターｐＣＷ０１５０の設計を示す。
【図１０】図１０はＧＦＰに融合したアクセサリーポリペプチドｒＰＥＧ（Ｌ２８８）の設計及び構築を示す。
【図１１】図１１はｒＰＥＧ＿Ｌ２８８ポリペプチドのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。
【図１２】図１２はｈＧＨ−ｒＰＥＧ（Ｌ２８８）及びＧＬＰ−１−ｒＰＥＧ（Ｌ２８８）構築物の設計を示す。
【図１３】図１３はアクセサリーポリペプチドにコンジュゲートした生物学的に活性なタンパク質の例を示す。
【図１４】図１４はアクセサリーポリペプチドの配列最適化に関する例示される指針を説明する。
【図１５】図１５はアクセサリーポリペプチドの配列最適化に関する例示される指針を説明する。
【図１６】図１６はＧＦＰに融合したｒＰＥＧ＿Ｊ２８８アクセサリーポリペプチド配列を含むベクターの構築を説明する。
【図１７】図１７はｒＰＥＧ＿Ｊ２８８ポリペプチドのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。
【図１８】図１８は本発明における使用に適したスタッファーベクターの設計を示す。
【図１９】図１９はｒＰＥＧ＿Ｊ２８８修飾ＧＦＰの精製を示す。
【図２０】図２０はｒＰＥＧ＿Ｊ２８８修飾ＧＦＰの血清中安定性の測定を示す。
【図２１】図２１は細胞標的とのアクセサリー修飾ポリペプチドの相互作用を示す。
【図２２】図２２は架橋アクセサリーポリペプチドの概念を説明する。
【図２３】図２３は架橋成分の例を説明する。
【図２４】図２４は架橋アクセサリーポリペプチドの数種の例を列挙する。
【図２５】図２５はリンカーとしてストレプトアビジンを使用する例を示す。
【図２６】図２６は架橋アクセサリーポリペプチドを構築する異なる様式を説明する。
【図２７】図２７は架橋アクセサリーポリペプチドの数種の可能なフォーマットを説明する。
【図２８】図２８は結合ドメイン又は他の基で追加的に修飾したアクセサリーポリペプチドを説明する。
【図２９】図２９は緩徐放出アクセサリーポリペプチドの概念を説明する。
【図３０】図３０はユニバーサルアクセサリーポリペプチドを示す。
【図３１】図３１はヒトＩｇＧ１由来の抗体Ｆｃフラグメントを示すが、これは又、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ由来であることもできる。このＦｃはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ由来のネイティブのヒンジを有することができる。ヒンジジスルフィドの数には天然の多様性があるが、これは又、ヒンジ、特にシステイン残基の突然変異、欠失、又はトランケーションによって作成することもできる。有用な変異体は３ジスルフィド（図示せず）、２ジスルフィド、１ジスルフィド（ＩｇＧ１の第１番目のもの、又は第２番目の天然のものの選択）又は無ジスルフィドの何れかを有する。
【図３２】図３２はアフィニティータグ、溶解性タグ及び／又はプロテアーゼ切断部位を含む修飾ポリペプチドの種々の配置を説明する。
【図３３】図３３は特定のアクセサリーポリペプチドを使用した修飾ポリペプチドの向上した発現レベルを説明する。
【図３４】図３４は未修飾ｈＧＨと比較したアクセサリー修飾ｈＧＨポリペプチドの活性を示す。
【図３５】図３５はアニオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーによるアクセサリー修飾ポリペプチドの精製を示す。
【図３６】図３６はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した場合のｒＰＥＧ修飾ＧＦＰの精製により得られた純粋な生成物を示す。
【図３７】図３７は分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより解明した場合のｒＰＥＧ連結ＧＬＰ１の純度を示す。
【図３８】図３８は分析用逆相ＨＰＬＣにより観察した場合のｒＰＥＧ＿Ｌ２８８−ＧＦＰ修飾ポリペプチドの純度を示す。
【図３９】図３９はｒＰＥＧ＿Ｊ２８８−ＧＦＰの質量スペクトルである。
【図４０】図４０は修飾ポリペプチドと血清タンパク質の間に殆ど非特異的結合が観察されないことを説明する。
【図４１】図４１はアクセサリーポリペプチドに生物学的に活性なポリペプチドを連結する際に観察される見かけの分子量の増大を説明する。
【図４２】図４２はラット及びヒトの血清中の修飾ポリペプチドの安定性を示す。
【図４３】図４３はラット血清中のｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ＧＦＰポリペプチドのＰＫプロファイルを説明する。
【図４４】図４４はｒＰＥＧ＿Ｊ２８８−ＧＦＰ、ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ＧＦＰ及びｒＰＥＧ＿Ｌ２８８−ＧＦＰに関する動物実験において測定した場合のｒＰＥＧポリペプチドの免疫原性の相対的欠如を説明する。
【図４５】図４５はアクセサリーポリペプチドに連結した生物学的に活性なポリペプチドを発現することの利点を説明する。
【図４６】図４６はアクセサリー修飾ポリペプチドの除放性を説明する。
【図４７】図４７はサイズ排除クロマトグラフィー（１操作当たり多数回注入）で測定した場合のｒＰＥＧ＿Ｊ２８８−ＧＬＰ１ポリペプチドの純度を示す。
【図４８】図４８はサイズ排除クロマトグラフィー（１操作当たり多数回注入）で測定した場合のｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ＧＬＰ１ポリペプチドの純度を示す。
【図４９】図４９はｒＰＥＧ＿Ｊ２８８、ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８、及びｒＰＥＧ＿Ｌ２８８アクセサリーポリペプチドに生物学的に活性なポリペプチド（ＧＬＰ１）を連結する際に観察される見かけの分子量の増大を説明する。
【図５０】図５０は生物学的に活性なポリペプチド（ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ｈＧＨ）としてのアフィニティータグ、アクセサリーポリペプチド及びｈＧＨを含むポリペプチドのプロテアーゼ切断を介して得られた生成物を示す。プロテアーゼはＴａｇを除去しつつ、ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８アクセサリーポリペプチドに連結したｈＧＨである最終生成物は残存させる。
【図５１】図５１はプロテアーゼ切断と更なる精製の後のｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ｈＧＨの純度を示す。
【図５２】図５２は完全なＩｇＧ１の構造を示すが、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＭも出発点として同様に使用できる。ｄＡｂ−ｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質も又、それが４価であるために使用できるが、これは図示しない。
【図５３】図５３は、Ｆｃ及び抗原結合ドメインを分離するｒＰＥＧ及びＣ末端のＦｃを有する構築物：（ｄＡｂ／ｓｃＦｖ）−ｒＰＥＧ−Ｆｃ及び（ｄＡｂ／ｓｃＦｖ）−（ｄＡｂ／ｓｃＦｖ）−ｒＰＥＧ−Ｆｃを示す。しかしながら同じ要素の異なる順序を有するフォーマットも有用であり、例えばｒＰＥＧ−Ｆｃ−（ｄＡｂ／ｓｃＦｖ）、ｒＰＥＧ−Ｆｃ−（ｄＡｂ／ｓｃＦｖ）−（ｄＡｂ／ｓｃＦｖ）、Ｆｃ−ｒＰＥＧ−（ｄＡｂ／ｓｃＦｖ）、Ｆｃ−ｒＰＥＧ−（ｄＡｂ／ｓｃＦｖ）−（ｄＡｂ／ｓｃＦｖ）、Ｆｃ−（ｄＡｂ／ｓｃＦｖ）−ｒＰＥＧ、Ｆｃ−（ｄＡｂ／ｓｃＦｖ）−（ｄＡｂ／ｓｃＦｖ）−ｒＰＥＧ、ｄＡｂ／ｓｃＦｖ）−Ｆｃ−ｒＰＥＧ，及び（ｄＡｂ／ｓｃＦｖ）−（ｄＡｂ／ｓｃＦｖ）−Ｆｃ−ｒＰＥＧを挙げることができる。更に又、ｓｃＦｖ及びｄＡｂｓを混合することもでき、例えばｄＡｂ−ｓｃＦｖ若しくはｓｃＦｖ−ｄＡｂとするか、又は異なる標的特異性の２つのｓｃＦｖｓ若しくは２つのｄＡｂｓを組み合わせてｓｃＦｖ１−ｓｃＦｖ２又はｄＡｂ１−ｄＡｂ２とすることもできる。図５３ａはｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質を示す。図５３ｂはｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を示す。  図５３ｃはｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質を示し、これは４価である。
【図５４】図５４はｓｃＦｖフラグメントの２量体を示す。ヘテロ２量体及びホモ２量体の両方を構築できる。
【図５５】図５５は単鎖ダイアボディーである。
【図５６】図５６は単鎖Ｆｃフラグメントの例を示す。場合により生物学的に活性なタンパク質をこの構築物の何れかの末端に融合することができる。
【図５７】図５７はタンパク質鎖の単一コピーよりなる生成物である。
【図５８】図５８：ＡＦＢＴの構造。５８ａ：１価ＡＦＢＴ；５８ｂ：二重特異性ＡＦＢＴの構造。
【図５９】図５９：標的抗原へのＡＦＢＴの多価結合。
【図６０】図６０ａ：２つの親抗体から誘導された抗体フラグメントを含有する多価ＡＦＢＴ。図６０ｂ：ダイアボディー及びペイロードを含むＡＦＢＴの構造。
【図６１】図６１：半合成ＡＦＢＴの生成。
【図６２】図６２：ｒＰＥＧ５０に融合した抗Ｈｅｒ−２ｓｃＦｖの精製、特性化及び結合活性。図６２ａ：結合活性。黒菱形：コーティングされたＨｅｒ−２への結合；白菱形：コーティングされたＩｇＧへの結合。図６２ｂ：サイズ排除クロマトグラフィー；図６２ｃ：遊離ＳＨ基の検出。
【図６３】図６３：抗Ｈｅｒ−２ダイアボディー、ａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧ５０の精製、特性化及び結合活性。６３ａ：結合活性。黒菱形：コーティングされたＨｅｒ−２への結合；白菱形：コーティングされたＩｇＧへの結合。６３ｂ：ダイアボディーａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧ５０及びｓｃＦｖ  ａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧ５０のサイズ排除クロマトグラフィー；６３ｃ：経時的なａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧ５０のＳＥＣはより高次の多量体の増大がないことを示す。
【図６４】図６４：ｓｃＦｖ−ｒＰＥＧ５０融合タンパク質の構築、配列及び発現。６４ａ：タンパク質構造の図；６４ｂ：Ｈｅｒ−２に対する特異性を有するＡＦＢＴの配列；６４ｃ：ｓｃＦｖ−ｒＰＥＧ５０融合タンパク質の発現を示すＳＤＳ／ＰＡＧＥ；７ｄ：ＥＧＦＲに対する特異性を有するＡＦＢＴの配列。
【図６５】図６５：ダイアボディーｒＰＥＧ５０融合タンパク質、ａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧの構築、配列及び発現。６５ａ：タンパク質構造の図；６５ｂ：タンパク質配列；６５ｃ：Ｅ．ｃｏｌｉのサイトゾル中の融合タンパク質の発現を示すＳＤＳ／ＰＡＧＥ。
【図６６】図６６：細菌発現のためのＦｃドメインのコドン最適化：６６ａ：プロセス及びオリゴヌクレオチド設計の説明。ヒトＦｃをコードする配列を半ランダムオリゴヌクレオチドから組み立て、そして報告された通り作用するｒＰＥＧ２５及びＧＦＰの前にクローニングした。６６ｂ：ライブラリから選択されたクローンのＳＤＳ／ＰＡＧＥ。矢印は所望の融合タンパク質のバンドを示す。６６ｃ：最適化されたヒトＦｃ遺伝子のアミノ酸及びヌクレオチド配列。
【図６７】図６７：Ｆａｂ−ｒＰＥＧ融合タンパク質に関する発現構築物を説明する図。
【図６８】図６８：抗血清由来のＡＦＢＴに関する発見プロセスのフローチャート。
【図６９】図６９：ＧＦＰ−ｒＰＥＧ５０のアミノ酸配列。ＧＦＰの配列は下線。
【図７０】図７０：カニクイザルにおけるＧＦＰ−ｒＰＥＧ５０及びＥｘ４−ｒＰＥＧ５０の薬物動態。
【図７１】図７１ａ：ＣＤＢ−Ｅｘ４−ｒＰＥＧ５０融合タンパク質のアミノ酸配列。図７１ｂ：図１４ａに示す融合配列由来のＥｘ４−ｒＰＥＧ５０を遊離させるために使用するプロセスの説明。
【図７２】図７２：マウスにおけるＥｘ４−ｒＰＥＧ５０の免疫原性。図７２ａは注入及び血液試料分析の時間経過を説明する。図７２ｂは１：５００希釈時の血液試料のＥＬＩＳＡ分析を示す。図７２ｃは１：１２，５００希釈時の血液試料のＥＬＩＳＡ分析を示す。
【図７３】図７３：ＧＦＰ−ｒＰＥＧ２５及びＧＦＰ−ｒＰＥＧ５０のサイズ排除クロマトグラフィー。グレーの線は球状タンパク質を用いた分子量標準を示す。
【図７４】図７４：Ｂ細胞との反復ＵＲＰ及び非反復ＵＲＰの相互作用の比較。図７４ａは多数の同一配列反復から構成される反復ＵＲＰを示す。このような反復ＵＲＰは、反復配列を認識するＢ細胞との多価の接触を形成することができ、これがＢ細胞の増殖の要因となり得る。図７４ｂは多数の異なるサブ配列から構成される非反復ＵＲＰを示す。各サブ配列は同族特異性を有するＢ細胞の特定のサブセットにより認識され得る。しかしながら、非反復ＵＲＰの個々の分子は何れかの特定のＢ細胞との１種又は数種の相互作用のみ生じさせることができ、これが増殖の要因となる可能性は低い。
【図７５】図７５：アミノ酸配列の反復性を評価するためのアルゴリズム。
【図７６】図７６：極めて低い反復性を有するｎｒＵＲＰを設計するためのコンピューターアルゴリズム。
【図７７】図７７：ＵＲＰセグメントのライブラリに由来するｎｒＵＲＰの構築。
【図７８】図７８：ｒＰＥＧ＿Ｙを構築するために使用されたアミノ酸配列。図は又、セグメントライブラリを構築するために使用されたオリゴヌクレオチドの相対的濃度を示す。
【図７９】図７９：合成オリゴヌクレオチド由来のＵＲＰセグメントの組み立て。図７９ａはライゲーション反応を示す。反復セグメントはホスホリル化した部分的重複オリゴヌクレオチドによりコードされる。アニーリングしたオリゴヌクレオチドの第２の対を添加することにより鎖伸長を終了する。これらのキャッピングオリゴヌクレオチドの１つはホスホリル化されず、これにより一端におけるライゲーションが防止される。図７９ｂはライゲーション反応のアガロースゲルを示す。
【図８０】図８０：ＵＲＰ＿Ｙ１４４配列の例。
【図８１】図８１：プラスミドｐＣＷ０２７９によりコードされるアミノ酸配列。オープンリーディングフレームはＦｌａｇ−ＵＲＰ＿Ｙ５７６−ＧＦＰの融合タンパク質をコードする。ＵＲＰ＿Ｙ５７６のアミノ酸配列に下線を引く。
【図８２】図８２は「ｒＰＥＧ連結結合対」を作成する一般的方法を示し、これは初期活性がないこと、そしてこれによりバースト放出作用が無いこと（毒性を生じさせることなく投与できる用量を増大させること）、及び低減した初期受容体媒介クリアランスの利点を有する。一般的な結合対は受容体−リガンド、抗体−リガンド、又は一般的には結合タンパク質１−結合タンパク質２であることができる。構築物は切断部位を有することができ、これは注入前、注入後（プロテアーゼにより血清中で）に切断することができ、そしてリガンド、受容体又は抗体の何れかであることができる治療生成物末端（活性タンパク質）と共にｒＰＥＧが存在できるように位置づけることができる。
【図８３】図８３ａはヒンジを包含する、抗体Ｆｃフラグメントに融合したｒＰＥＧが後続するＮ末端における薬物モジュールを有する構築物を示す。Ｆｃフラグメントは長い半減期をもたらし、そして、ｒＰＥＧによりＦｃフラグメントが可溶性及び活性な形態においてＥ．ｃｏｌｉの細胞質中で発現される。図８３ｂはヒンジを有さないが、抗体Ｆｃフラグメントに融合したｒＰＥＧが後続するＮ末端における薬物モジュールを有する構築物を示す。Ｆｃフラグメントは長い半減期をもたらし、そして、ｒＰＥＧによりＦｃフラグメントが可溶性及び活性な形態においてＥ．ｃｏｌｉの細胞質中で発現される。
【図８４】図８４ａでは、ＶＨ及びＶＬドメインの間の単鎖リンカーが約１０〜２０ＡＡより短い場合にダイアボディーを形成することにより、単鎖Ｆｖフラグメントの形成を防止する。ダイアボディーは２つのタンパク質鎖を有し、そして、Ｃ末端の一方若しくは両方及び／又はＮ末端の一方若しくは両方にｒＰＥＧを有することができる。ダイアボディーは２つの結合部位を有し、そのうち、０、１又は２つは医薬標的に、又は半減期標的（即ちＨＳＡ、ＩｇＧ、赤血球、コラーゲン等）に結合してよく、又は標的に結合しなくてよい。図８４ｂでは、ダイアボディーはタンパク質鎖０、１又は両方のＮ末端又はＣ末端に位置する０又は１つ以上の薬物モジュールを含有してよい。
【図８５】図８５ａは単鎖Ｆｖフラグメントを示し、これには薬物モジュール（例えばＩＦＮａ、ｈＧＨ等）がＮ及び／又はＣ末端の一方又は両方において融合することができる。ｓｃＦｖは１つの結合部位を有しており、これは医薬標的に、又は半減期標的（即ちＨＳＡ（図８５ｂ参照）、ＩｇＧ、赤血球等）に結合してもしなくてもよい。
【図８６】図８６は同じ複合体に属する２つのタンパク質を会合させるためのｒＰＥＧの使用を示す。そのようなタンパク質間の親和性はそれらを会合させるためには不十分である場合が多いが、ｒＰＥＧの添加によりそれらの相互作用を安定化させ、そしてそれらが重合体を形成する傾向を低減させることができる。
【図８７】図８７は細胞表面標的に結合したＦａｂフラグメントを示し；Ｈ鎖はＦｃに（全抗体の場合等）、又は広範な種類の他のタンパク質、ドメイン及びペプチドに融合してよい。ＶＨとＣＨドメインの間、及びＶＬとＣＬドメインの間の、通常は２〜６アミノ酸から４、５、６、７、８、９、１０、１１、１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、１００以上のアミノ酸の天然のリンカーの長さの伸長は、ドメイン交換により１つのＦａｂが別のＦａｂに架橋する能力を増大させ、これにより高次の価数を有する結合複合体が形成され、より高度な見かけの親和性（アビディティ）がもたらされる。リンカーはｒＰＥＧ又は異なる組成物であってよい。この「伸長したリンカー」のフォーマットにより腫瘍細胞上の（部分的）腫瘍特異的抗原のような標的のより高い密度を有する部位において特異的に増大した親和性を有する結合が可能になる。
【図８８】図８８は逆平行の方向で同じ配列の別のコピーに結合するＳＫＶＩＬＦ（Ｅ）又はＲＡＲＡＤＡＤＡのような会合ペプチドをプロドラッグの形成のために使用する方法を示す。この場合、薬物は最終生成工程においてプロテアーゼ切断されるが、２つの鎖がなお会合ペプチドにより会合するため、切断により薬物が不活性化されることはない。薬物が血中に注入され、そして濃度がかなり低減された後にのみ、小型の非ｒＰＥＧ含有タンパク質鎖が複合体を離れることになり（親和性に依存した速度、特にオフレートにおいて）、そして腎臓を介してクリアランスに付されると考えられ、これによりｒ−ＰＥＧ含有薬物モジュールが活性化される。
【図８９】図８９は生成された単鎖タンパク質を２つのタンパク質鎖の複合体に変換するタンパク質分解切断を示す。この切断は最終生成工程（注入前）として起こることができるか、又は注入後に患者の血液中のプロテアーゼにより起こることができる。
【図９０】図９０ａは（場合により）一端で薬物モジュール（例えばＩＦＮａ、ｈＧＨ等）に融合し、そして（場合により）もう一端でｒＰＥＧに融合している、ヒンジ領域を有する抗体Ｆｃフラグメントを示す。ＣＨ２とＣＨ３の間の配列は、その機能が突然変異により除去されない限り、ＦｃＲｎ、新生児Ｆｃ受容体への結合を媒介する。図９０ｂは同様の構築物であるがヒンジ領域を有さないものを示す。
【図９１】図９１ａはＣＨ３ドメインの対形成した対を含むタンパク質構築物を示し；これらの鎖の０、１又は両方がＮ末端及び／又はＣ末端においてｒＰＥＧに、そしてもう一端において薬物モジュール０又は１つ以上に融合してよい。ＦｃＲｎ結合配列は保持されるか、又は欠失するかの何れであってもよく、保持されればより長い血清中半減期がもたらされるはずである。図９１ｂは同様のタンパク質を示すが、ＦｃＲｎ受容体へのＦｃの結合がもはや機能性ではないようにＣＨ２が完全に除去されており、半減期が低減する。
【図９２】図９２ａはＣ末端に薬物／ファーマコフォアを有する、ｒＰＥＧにＣ末端で融合するヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを包含する完全なＦｃであるタンパク質を示す。図９２ｂは完全なＦｃであるが、ｒＰＥＧにＣ末端において融合するヒンジを有しておらず、Ｃ末端に位置する薬物／ファーマコフォアを有しており；これらの分子は鎖交換を起こすことができ、潜在的にヘテロ２量体を生じる。
【図９３】図９３ａは部分的Ｆｃを示しており、ヒンジを有しておらず、トランケーションされたがＦｃＲｎ結合を保持するＣＨ２を有しており、そしてＣ末端に位置する薬物／ファーマコフォアを有する。図９３ｂは部分的Ｆｃを示しており、ヒンジ及びＣＨ２を有していないが、ＣＨ３は保持しており、そしてＣ末端に位置する薬物／ファーマコフォアを有する。これはＦｃＲｎに結合しないが、ＣＨ３ドメインを介して２量体化できる。
【図９４】図９４ａは同一の受容体ドメイン（又は同じ結合機能を有するドメイン、又は同じ標的に同時に結合できるドメイン）によりフランキングされたｒＰＥＧを示す。両方の受容体が同時に標的に結合できる場合、一方の受容体の結合は第２の受容体の結合を安定化させ、そして有効／見かけの親和性／アビディティが、典型的には１０〜１００倍、ただし少なくとも３倍は増大する。ｒＰＥＧは血清中半減期をもたらす。１つの選択肢はリガンドで生成物を予備負荷することである。その場合、注入された生成物はそれがリガンドに結合した状態で残存する限り不活性である。この手順は最高用量毒性を低減し、そして又、受容体媒介クリアランスを低減し、このためそれが重要である用途においては有用となる場合がある。図９４ｂはリガンドに同時に結合できる２つの異なる受容体によりフランキングされたｒＰＥＧを有する生成物を示しており、これは複合体の相互安定化及び増大した見かけの親和性（アビディティ）をもたらし、この場合ｒＰＥＧは受容体の有効濃度を増大させる原子価架橋部として作用する。図９４ｃでは、１つの選択肢はリガンドで生成物を予備負荷することである。その場合，注入された生成物はそれがリガンドに結合した状態で残存する限り不活性である。リガンドが未結合となるとき、それは腎臓を介して急速にクリアランスに付され、生成物の活性化をもたらし、これはｒＰＥＧのテール部のために長い半減期を有する。この手順は最高用量毒性を低減し、そして又、受容体媒介クリアランスを低減し、このためそれが重要である用途においては有用となる場合がある。図９４に示す通り、一部のプロドラッグフォーマットは切断又は他の活性化部位を必要としない。単一のタンパク質鎖はｒＰＥＧにより分離された２つ（又はそれより多い）薬物モジュールを含有することができ；これらのモジュールは同じ（単一の型のもの）であるか、又は２つ以上の異なる型のものであることができる。全ての薬物モジュールは受容体であるか、全てはリガンドである。このｒＰＥＧ含有生成物が第２の相補タンパク質と複合体化することにより受容体−リガンド−受容体相互作用を生じさせる。このフォーマットにおいて、リガンドは２量体又は多量体であると考えられるが、特に２つの薬物モジュールが異なっている場合には単量体であることもできる。両方のモジュールが第３のタンパク質に結合する。Ｘ及びＹは同じか又は異なっていることができ、そしてＸ及びＹは薬物モジュールであるか、薬物モジュールに結合することができる。図９４における各々の場合において、Ｘ及びＹ（及びｒＰＥＧ）は１つのタンパク質鎖を含み、そしてそれらが結合する分子は別個の分子、典型的にはタンパク質又は小分子である。単一のタンパク質鎖中に組み込まれた２つより多い結合タンパク質を有することが可能である。考え方としては、大型のｒＰＥＧ含有タンパク質及び非ｒＰＥＧ含有タンパク質の複合体は注入時には不活性であるが、２〜２４時間に渡って、より小型の非ｒＰＥＧ含有タンパク質が複合体を離れ、そして腎臓を介して排出されることにより、薬物モジュールを活性化する。このフォーマットの利益は、薬物濃度の初期スパイクとそれに伴う安全性の問題点が低減又は除去されること、及び、複合体はそれが複合体化する場合には受容体媒介クリアランスを最小限とすることにより血清中分泌半減期を延長することである。
【図９５】図９５はＶＥＧＦ受容体により両側をフランキングされたｒＰＥＧを示す。ＶＥＧＦは２量体であるため、これはｒＰＥＧの両側の同じ受容体、又は異なる受容体であることができる（好ましくはＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２であるが、ＶＥＧＦＲ３も使用できる）。
【図９６】図９６は不活性のプロドラッグとして生成される（注入前に切断される）か、又は投与される（注入後血中で切断される）生成物を示す。薬物の不活性化は、３モジュール全てが単一のタンパク質鎖として生成されるように、ｒＰＥＧにより薬物に連結された結合タンパク質により媒介される。薬物が受容体である場合は、結合タンパク質はその受容体のリガンド（ペプチド又はタンパク質）であり；薬物が抗体フラグメントである場合は、結合部位はペプチド又はタンパク質リガンドである。これらの例において薬物はＸ及びＹと称される２つの結合ドメインの間の部位のプロテアーゼ切断により活性化される。タンパク質Ｙが活性な生成物である場合、ＹはｒＰＥＧを保持しなければならず、そしてプロテアーゼ切断部位は（ＸとＹの間であるが、ただし）Ｘに近接していなければならない。タンパク質Ｘが活性な生成物である場合は、ＸはｒＰＥＧを保持しなければならず、そして切断部位はＹに近接していなければならない。青色のクロスバーで示す通り１つ又は多数の切断部位が存在できる。薬物モジュールは受容体、リガンド、１つ以上のＩｇドメイン、抗体フラグメント、ペプチド、微小タンパク質、抗体に対するエピトープであることができる。薬物モジュールに結合するタンパク質は結合タンパク質、受容体、リガンド、１つ以上のＩｇドメイン、抗体フラグメント、ペプチド、微小タンパク質、抗体に対するエピトープであることができる。
【図９７】図９７は薬物モジュールへの結合タンパク質の添加により不活性のプロドラッグを作成することができる方法を示す。ペプチドは薬物の標的結合能力を中和しなければならず、そしてペプチドはｒＰＥＧ含有薬物よりも速い速度において、血中から徐々に浄化される。そのようなペプチドは天然物であることができるが、より典型的にはそれは薬物モジュールに対するランダムペプチドライブラリのファージパニングにより得られる。ペプチドは好ましくは合成により生成されるが、組み換えであることもできる。
【図９８】図９８はｒＰＥＧの同じ末端又はｒＰＥＧの反対側の末端にあることができる、多数の生物活性なペプチドを含有する単鎖タンパク質を示す。これらのペプチドは同じ活性又は異なる活性を有することができる。単鎖内に多数のペプチドを有することの目的は、生成を複雑化することなく、結合アビディティを介してそれらの効力を増大させることである。
【図９９】図９９は受容体媒介クリアランスを回避することによりプロドラッグ−ｒＰＥＧが血清中半減期を増大させることができる方法を示す。
【図１００】図１００はＩＶ注入後薬物濃度がどのように経時変化するかを示す。典型的な治療の目標は治療用量よりも高いが、毒性用量よりも低い濃度に薬物を維持することである。短い半減期を有する薬物の典型的なボーラス注射（ＩＶ、ＩＭ、ＳＣ、ＩＰ又は同等）は毒性用量より遙かに高い最高濃度、そしてその後は薬物濃度を治療用量未満まで急速に低下させる排除期をもたらす。このＰＫプロファイルは毒性及び長期間の無効治療をもたらす傾向があるが、薬物は短期間のみ治療濃度において存在する（青線）。ｒＰＥＧの薬物への添加は最高濃度を低下させ、そしてこれにより毒性を低下させ、そして薬物が治療性の非毒性用量において存在する期間を増大させる。ｒＰＥＧと薬物結合タンパク質の添加によるプロドラッグの形成は、薬物が数時間かけてのみ徐々に活性化され、そして毒性用量と治療用量の間の時間の長さが他のフォーマットと比較して増大するため、「バースト放出」、又は毒性最高用量（赤線）を回避することができる。
【図１０１】図１０１はＮ末端の薬物モジュールとその後のｒＰＥＧ及びＣ末端Ｆｃフラグメント（ヒンジあり）を示す。これはＥ．ｃｏｌｉの細胞質内でなお生成することができる薬物モジュールの半減期延長のための有用なフォーマットである。
【図１０２】図１０２ａはＦｃフラグメントを含有するプロドラッグに関する代替のフォーマットを示す。該フォーマットは図１０１に記載するものと同様であるが、薬物配列（赤）に結合して阻害する阻害配列（青）が（Ｎ末端において）追加されている。前回同様、薬物は切断部位により阻害配列から分離される。Ｎ末端阻害結合配列には切断部位が後続し、それに薬物配列（赤）が後続する。切断前に、薬物が阻害配列に結合し、そしてこれにより不活性となる（プロドラッグ）。切断後は阻害結合配列（青）が徐々に放出され、クリアランスに付され、薬物（赤）が活性である時間の量を徐々に増大させる。図１０２ｂはＦｃフラグメントを含有する代替のプロドラッグフォーマットである。フォーマットは図１０１に記載するフォーマットと同様であるが、ここでも切断部位により薬物（青で表示される）から分離される阻害結合配列（ペプチド又はドメイン、赤で表示、典型的にはｒＰＥＧ又はその近傍に位置する）が追加される。切断前に、薬物が阻害配列に結合し、そしてこれにより不活性となる（プロドラッグ）。切断後は阻害結合配列（青）が徐々に放出され、クリアランスに付され、薬物（青）が活性である時間の量を徐々に増大させる。
【図１０３】図１０３ａ〜ｄは未損傷の全抗体（例えばＩｇＧ１、２、３、４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ）に対するｒＰＥＧに関する好ましい融合部位を示す。示されたこれらの部位はそれらがドメイン、ヒンジ等のような構造付与された配列の境界において、これらの機能的ドメインの折り畳みを攪乱させることなく存在するので好ましい。即ちｒＰＥＧは抗体に対して１、２、３、４、５、６、７又は更には８つの（そしてＩｇＭ及びＩｇＧ３の場合は８つより多い）異なる位置において追加することができ、そして単一の抗体は多様な位置において、そして図示した８つの位置のいずれかの組み合わせにおいて１、２、３、４、５、６、７、８以上のｒＰＥＧを有することができる。図１０３ｅは抗体（ＩｇＧ１、２、３、４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ）のドメイン及びフラグメントに対するｒＰＥＧに関する好ましい融合部位を示す。ｒＰＥＧのＮ末端及び／又はＣ末端付加に関する融合部位は赤矢印又は赤線で示す。
【図１０４】図１０４はＦｃフラグメントの正しい折り畳みに関する試験を示す。
【図１０５】図１０５は血清中、又は注入前の何れかにおける、部位特異的プロテアーゼによる不活性タンパク質の活性タンパク質への転換を示す。この例においては赤色の配列は活性な治療薬である。
【図１０６】図１０６は部位特異的プロテアーゼによる不活性な薬物の活性な薬物への転換を示す。この例において、青色のドメイン（ｄＡｂ、ｓｃＦｖ、その他）が治療薬実体である。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
本発明はアクセサリーポリペプチドにより修飾された生物学的に活性なポリペプチドは、そのような修飾を有さない生物学的に活性なポリペプチドが凝集して封入体を形成する条件において、細胞質内で可溶性のまま残存し、その活性な形態に折り畳まれる性質を有する場合があるという意外な発見を使用する。本発明の方法は種々の用途のうちで特に、設計段階におけるタンパク質のハイスループットスクリーニング、現在のところペリプラズム発現を必要としているタンパク質の製造のため、そして封入体のような凝集塊から再折り畳みが困難であるタンパク質の製造のために有用である場合がある。本発明はアクセサリータンパク質配列を設計する方法、修飾ポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡ分子、そのようなポリペプチドのための発現ベクター、そのようなポリペプチドの発現のための宿主細胞及び精製プロセスを開示する。例えばペプチド、タンパク質、抗体、及びワクチンを包含してよく、そして真核生物又は哺乳類のタンパク質であってよいタンパク質への長鎖親水性ポリペプチド配列の融合は、活性型において細胞質内で向上した折り畳みを示す可溶性融合タンパク質をもたらす。
【００６５】
本発明のアクセサリーポリペプチドはＧＣＳＦ、成長ホルモン、インターフェロンアルファ及び抗体フラグメントを包含する医薬品タンパク質に連結してよい。これらの４種のタンパク質又はタンパク質のクラスは典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質内で発現した場合には封入体を形成する。しかしながら長鎖親水性アクセサリーポリペプチド配列に連結されれば、生物学的に活性なポリペプチドの折り畳み特性は大きく向上する場合があり、アクセサリータンパク質の非存在下において真核生物のタンパク質では典型的に生じる即座不可逆の凝集による封入体形成とは逆に、細胞内部で活性なタンパク質に正確に折り畳みできる大きく増大した画分をもたらす。アクセサリーポリペプチドは、単独で、又はキチン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、ＭＢＰ、ＧＳＴ又はＨｉｓタグのような他の知られた精製タグと組み合わせて、イオン交換によるタンパク質精製のためのアフィニティータグを追加的に含んでよい。
【００６６】
このこと、及び本発明の他の態様は以下において更に詳細に説明する。
【００６７】
一般的手法：
本発明の実施は、特段の記載が無い限り、当業者の知る免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム及び組み換えＤＮＡの従来の手法を使用する。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、（１９８７））；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）シリーズ：ＰＣＲ  ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，編、（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，及びＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，編、（１９８７））を参照。
【００６８】
定義：
本明細書及び請求項においては、文脈において別様に明示されない限り、単数は複数を包含する。例えば「細胞」という用語はそれらの混合物を包含する複数の細胞を包含する。
【００６９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」及び「タンパク質」という用語は何れかの長さのアミノ酸の重合体を指すために本明細書においては互換的に使用される。重合体は直鎖又は分枝鎖であってよく、それは修飾アミノ酸を含んでよく、そしてそれは非アミノ酸により中断されていてもよい。用語は又、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、ホスホリル化、又は何れかの他の操作法、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより修飾されているアミノ酸重合体を包含する。本明細書においては、「アミノ酸」という用語は、例えば限定しないが、グリシン及びＤ又はＬ型の光学異性体、及びアミノ酸の類縁体及びペプチドミメティックを包含する天然及び／又は非天然又は合成のアミノ酸の何れかを指す。アミノ酸を標記するために標準的な１文字又は３文字のコードを使用する。
【００７０】
「生物学的に活性なポリペプチド」という用語は、例えば細胞−、組織−又は臓器標的化のための治療薬標的及び／又はアクセサリー標的であることができる、所定の標的に対して結合特異性を示す何れかの長さのポリペプチドを指す。或いは、又は追加的に、それはインビトロ又はインビボで使用した場合に所望の生物学的特性を示すポリペプチドを指す。例示すれば、生物学的に活性なポリペプチドは、治療上又は診断上の標的に結合する機能的治療薬又はインビボの診断用タンパク質を包含する。「生物学的に活性なポリペプチド」及び「結合モジュール」又は「ＢＭ」という用語は本明細書においては互換的に使用される。生物学的に活性なポリペプチドは、例えば限定しないが、直鎖又は環状のペプチド、システイン拘束ペプチド、微小タンパク質、スカホールドタンパク質、例えばフィブロネクチン、アンキリン、クリスタリン、ストレプトアビジン、抗体フラグメント、ドメイン抗体、ペプチド性ホルモン、成長因子、サイトカイン、又は何れかの型のタンパク質ドメインであって、ヒト又は非ヒト、天然又は非天然のものであることができ、そしてそれらがは天然のスカホールドに基づくか、天然のスカホールドに基づかなくてよく（即ち操作又は選択されたもの）、或いは上記何れかの組み合わせ又はフラグメントに基づくものであってよい。或いは、生物学的に活性なポリペプチドは、その結合特性、その安定性、又は他の所望の特性を増強するために、１つ又は多数のアミノ酸を付加、除去又は置き換えることにより操作できる。結合モジュールは天然のタンパク質から、設計により、又はファージディスプレイ、細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイ又は他のディスプレイ方法を包含する遺伝子パッケージディスプレイにより、天然タンパク質から得ることができる。結合モジュールは同じ標的の同じコピーに結合してよく、これはアビディティをもたらし、或いは、それらは同じ標的の異なるコピーに結合してよく（これはこれらのコピーが例えば細胞膜など何らかにより接続又は連結されている場合はアビディティをもたらすことができる）、或いはそれらは２つの未関連の標的に結合していてよい（これはこれらの標的が例えば膜など何らかにより連結されている場合はアビディティをもたらす）。結合モジュールはペプチド又はタンパク質のランダムライブラリをスクリーニング又は別様に分析することにより識別できる。
【００７１】
「組み換えＰＥＧ」、「ｒＰＥＧ」又は「ｒＰＥＧポリペプチド」又は「組み換えＰＫ増強基」とは、生物学的に活性なポリペプチドを修飾するために使用できるポリペプチドのクラスを包含する一般的用語であり、この場合、修飾により生物学的特性、例えば血清中半減期又はインビボのクリアランスに所望の変化がもたらされる。一般的にｒＰＥＧポリペプチドは生物学的に活性なポリペプチドにより結合された同じ所定の標的に対する結合物特異性を欠いている。一部の態様においては、ｒＰＥＧはＰＥＧのよく知られた特性の必ずしも全てではないが一部を模倣していてよいＰＥＧの機能的類縁体である。後述においてより詳細に説明するそのような特性は、流体力学的半径を増大させる増強された能力、プロテアーゼに対する増大した耐性、低下した免疫原性及び低下した特異的活性を包含する。ｒＰＥＧ分子は線状性又は三次構造の欠如のような広範な構造的及び機能的特徴をＰＥＧと共有しているが、ＰＥＧとの厳密な化学的同様性はｒＰＥＧに必須な特徴ではない。
【００７２】
「アクセサリーポリペプチド」又は「アクセサリータンパク質」とは例えば生物学的に活性なポリペプチドへの連結による生物学的に活性なポリペプチドとのコンジュゲーションにおいて使用した場合に全体としての連結されたポリペプチドの生物学的特性に所望の変化を与えるポリペプチドを指す。アクセサリーポリペプチドの非限定的な例はｒＰＥＧ及び流体力学的半径を増大し、血清中半減期を延長し、及び／又はインビボのクリアランス速度を変更することができる何れかの他のポリペプチドを包含する。所望により、アクセサリーポリペプチドは予測された分子量の小さい増大であるが、見かけの分子量のはるかに大きい増大をもたらす。異なる名称は異なる特徴を強調するが、それらは同じモジュールを指しており、そして互換的に使用できる。
【００７３】
「修飾ポリペプチド」及び「アクセサリー修飾ポリペプチド」という用語は本発明のアクセサリーポリペプチドで修飾されている生物学的に活性なポリペプチドを指すために互換的に使用される。これらの用語は本発明のアクセサリーポリペプチドで修飾された生物学的に活性なポリペプチドを含む緩徐放出又は他の型又は製剤も指す場合がある。
【００７４】
「反復配列」又は「反復モチーフ」とは本明細書においては互換的に使用され、そして多数の配列のモチーフの正方向のリピート、又は反転したリピート、又は交互するリピートを形成する、反復ペプチド配列（「リピート」）のオリゴマーとして説明することができるアミノ酸配列を指す。これらの反復オリゴマー配列は相互に同一又は相同であることができるが、それらは多数の反復されたモチーフであることもできる。反復配列は極めて低い情報含有量を特徴とする。反復配列はアクセサリーポリペプチドの必要な特徴ではなく、そして一部の場合においては、非反復配列が実際は好ましいものとなる。
【００７５】
アミノ酸はそれらの疎水性に基づいて特徴付けることができる。多くの尺度が開発されている。一例としてはＬｅｖｉｔｔ，Ｍら（Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍ（１９７６）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １０４，５９，＃３２３３参照、これはＨｏｐｐ，ＴＰら（１９８１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８，３８２４，＃３２３２に列挙されている）により開発された尺度である。「親水性アミノ酸」の例はアルギニン、リジン、スレオニン、アラニン、アスパラギン、及びグルタミンである。特に興味深いものは親水性アミノ酸アスパルテート、グルタメート、及びセリン、及びグリシンである。「疎水性アミノ酸」の例はトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、及びバリンである。
【００７６】
本明細書においては、「細胞表面タンパク質」という用語は細胞の原形質膜成分を指す。それは内在性及び周辺性の膜タンパク質、糖タンパク質、多糖類及び脂質であって原形質膜を構成するものを包含する。内在性の膜タンパク質は細胞の原形質膜の脂質２層を通過して伸長する膜貫通タンパク質である。典型的な内在性膜タンパク質は疎水性アミノ酸残基を一般的に含む少なくとも１つの膜スパニングセグメントよりなる。周辺性の膜タンパク質は脂質２層の疎水性の内部へは伸長せず、そしてそれらは、直接又は他の膜成分により間接的に、共有結合又は非共有結合の相互作用を介して膜表面に結合している。
【００７７】
「膜」、「サイトゾル性」、「核の」又は「分泌された」という用語は、細胞タンパク質に適用される場合、細胞タンパク質が最も、優勢に、又は優先的に局在している細胞外及び／又は細胞下の位置を特定する。
【００７８】
「細胞表面受容体」とはその対応するリガンドに結合できる膜タンパク質のサブセットを示す。細胞表面受容体は細胞の原形質膜の上に係留されているか、又はその内部に挿入されている分子である。それらはタンパク質、糖タンパク質、多糖類及び脂質の大型のファミリーを構成し、これらは原形質膜の構造的構成要素としてのみならず、種々の生物学的機能を統括する調節エレメントとして作用している。
【００７９】
「天然に存在しない」とは、タンパク質に適用される場合は、タンパク質が、相当する野生型又はネイティブのタンパク質とは異なるアミノ酸を少なくとも１つ含有していることを意味する。非天然の配列は、例えば比較ウインドウを目的の（クエリされた）配列の長さとする最低最少合計確率を用いながらＢＬＡＳＴ検索を実施することにより、そしてＢＬＡＳＴ２．０を用いたＧｅｎｂａｎｋの非縮重（「ｎｒ」）データベースと比較した場合に、求めることができる。ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０においてそれぞれ説明されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公的に入手される。
【００８０】
「宿主細胞」は主題のベクターのためのレシピエントとなることができるか、又はレシピエントであった、個々の細胞又は細胞培養物を包含する。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を包含する。子孫は天然の、偶然による、或いは意図的な突然変異により元の親細胞と完全に同一ではなくともよい（形態学的に、又は総ＤＮＡ相補物のゲノムにおいて）。宿主細胞は本発明のベクターによりインビボでトランスフェクトされた細胞を包含する。
【００８１】
本明細書においては、「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はそのフラグメントが天然界においては通常会合している、細胞性又はその他の構成成分から分離されていることを意味する。当該分野で知られる通り、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はそのフラグメントは、その天然に存在する対応物からそれを区別するために「単離」を必要としない。更に又、「濃縮された」、「分離された」又は「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はそのフラグメントは、濃度又は体積当たりの分子数が、その天然に存在する対応物のものよりも、「濃縮されている」状態を超えて高値であるか、「分離されている」状態未満に低値である点において、その天然に存在する対応物から区別可能である。一般的に、組み換え手段により製造され、そして宿主細胞内で発現されたポリペプチドは「単離された」とみなされる。
【００８２】
「コンジュゲートした」、「連結した」及び「融合した」又は「融合」とは本明細書においては互換的に使用される。これらの用語は化学的コンジュゲーション又は組み換え手段を包含する何らかの手段による、２つより多い化学的エレメント又は成分の連合状態を指す。「インフレーム融合」とは元のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の正しい読み枠を維持する態様において連続したより長いＯＲＦを形成するような２つ以上のＯＲＦの連合状態を指す。即ち、結果として生じる組み換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによりコードされるポリペプチドに相当するセグメント２つ以上を含有する単一のタンパク質である（このセグメントは天然界では通常はそのように連合していない）。
【００８３】
ポリペプチドの文脈においては、「線状配列」又は「配列」とはアミノからカルボキシ末端の方向におけるポリペプチド内のアミノ酸の順序であり、配列内で相互に近隣である残基がポリペプチドの一次構造内で近接している。「部分配列」とは、一方又は両方の方向において追加的な残基を含むことが知られているポリペプチドの部分の線状の配列である。
【００８４】
「非相同」とは自身が比較されている実体の残余から遺伝子型的に区別可能である実体から誘導されることを意味する。例えば、自身のネイティブのコーディング配列から除去され、そしてネイティブ配列ではないコーディング配列に作動可能に連結されているグリシンリッチの配列は非相同のグリシンリッチ配列である。「非相同」という用語はポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される場合は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、自身が比較される実体の残余のものとは遺伝子型的に区別可能である実体から誘導されていることを意味する。
【００８５】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用される。それらは何れかの長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はそれらの類縁体の何れかの重合体形態を指す。ポリヌクレオチドは何れかの三次元構造を有してよく、そして既知又は未知の何れかの機能を果たしてよい。以下のものは非限定的なポリヌクレオチドの例である：遺伝子又は遺伝子フラグメントのコーディング又は非コーディング領域、連鎖分析から定義される遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、何れかの配列の単離されたＤＮＡ、何れかの配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは修飾ヌクレオチド、例えばメチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチドの類縁体を含んでよい。ヌクレオチド構造に対して修飾を行う場合は、それは重合体の組み立ての前又は後に付与してよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されていてよい。ポリヌクレオチドは重合の後に、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより更に修飾されてよい。
【００８６】
「組み換え体」とは、ポリヌクレオチドに適用する場合、ポリヌクレオチドがクローニング、制限及び／又はライゲーションの工程、及び宿主細胞で潜在的に発現することができる構築物をもたらす他の操作法の種々の組み合わせの産物であることを意味する。
【００８７】
「遺伝子」又は「遺伝子フラグメント」という用語は本明細書においては互換的に使用される。それらは転写及び翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることができるオープンリーディングフレーム少なくとも１つを含有するポリヌクレオチドを指す。遺伝子又は遺伝子フラグメントは、ポリヌクレオチドが、全コーディング領域又はそのセグメントを包含してよい少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有する限り、ゲノム性又はｃＤＮＡであってよい。「融合遺伝子」とは共に連結されている非相同のポリヌクレオチドを少なくとも２つ含む遺伝子である。
【００８８】
「ベクター」は、挿入された核酸分子を宿主細胞内及び／又は宿主細胞間に転移させる、好ましくは自己複製性の核酸分子である。この用語は、細胞へのＤＮＡ又はＲＮＡの挿入のために主に機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製のために主に機能する複製ベクター、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを包含する。同様に包含されるものは上記機能の１つより多くをもたらすベクターである。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞内に導入された場合にポリペプチドに転写及び翻訳されることができるポリヌクレオチドである。「発現系」とは通常は、所望の発現産物をもたらすために機能できる発現ベクターを含む適当な宿主細胞を意味する。
【００８９】
「標的」とは、アクセサリーポリペプチドの文脈において使用する場合、生物学的に活性なポリペプチドが結合することができ、そして結合事象が所望の生物学的活性をもたらすような生化学的な分子又は構造である。標的は、タンパク質により阻害、活性化又は別様に作用を受ける、タンパク質のリガンド又は受容体であることができる。標的の例は、ホルモン、サイトカイン、抗体又は抗体フラグメント、細胞表面受容体、キナーゼ、成長因子及び生物学的活性を有する他の生化学的構造である。
【００９０】
「血清中分解耐性」−タンパク質は血液中の分解により排除されることができ、これには典型的には血清又は血漿中のプロテアーゼが関与している。血清分解耐性は典型的には３７℃において数日程度の間（即ち０．２５、０．５、１、２、４、８、１６日間）、ヒト（又は適宜マウス、ラット、サルの）血清又は血漿にタンパク質を混合することにより計測される。次にこれらの時点に対する試料をウエスタン試験上で泳動させ、そしてタンパク質を抗体で検出する。抗体はタンパク質中でタグに対することができる。タンパク質がウエスタン上で単一のバンドを示せば、タンパク質の大きさが注入したタンパク質のものと同一であり、その場合は分解は起こっていない。ウエスタンブロット又は同等の手法により判断した場合にタンパク質の５０％が分解する時点が、タンパク質の血清中分解半減期又は「血清中半減期」である。
【００９１】
「見かけの分子量ファクター」又は「見かけの分子量」は特定のアミノ酸配列により示される見かけの分子量における相対的な増大又は減少の尺度を指す相対的な用語である。見かけの分子量は球状タンパク質を用いてカリブレーションすることができるサイズ排除カラムを用いながら測定され、そして「見かけのｋＤ」単位で計測される。見かけの分子量ファクターは球状タンパク質を用いてキャリブレーションされたサイズ排除カラム上で測定された見かけの分子量と実際の分子量（即ちアミノ酸組成物中のアミノ酸の各々の型の計算された分子量をアミノ酸組成に基づいて加算することにより予測される）との間の比として計測される。例えば２０ｋＤのポリグリシン配列はサイズ排除クロマトグラフィーによる２００ｋＤの見かけの分子量を有し、１０Ｘの見かけの分子量ファクターに相当する。「特異的流体力学的半径」とは単位分子量（ｋＤ）当たりの流体力学的半径であり、半減期延長物質の性能の尺度であり、これは単位質量あたりの血清中分泌半減期として計測される（ｋＤ当たりの時間）。これらの計測値の両方がより直観的な尺度である「見かけの分子量ファクター」と相関している。
【００９２】
タンパク質の「流体力学的半径」は水溶液中のその拡散速度並びに巨大分子のゲル中で遊走するその能力に影響する。タンパク質の流体力学的半径はその分子量、並びに形状及び緻密度を包含するその構造により決定される。大部分のタンパク質は、最小の流体力学的半径でタンパク質が有することができる最も緻密な三次元構造である球状構造を有する。一部のタンパク質はランダムで解放された、構造を有さない、又は「線状の」コンホーメーションを採用しており、そしてその結果、同様の分子量の典型的な球状タンパク質と比較して遙かに大きい流体力学的な半径を有している。
【００９３】
「生理学的条件」とは、温度、塩濃度、ｐＨを包含する、生体対象の条件のものを模倣した条件のセットを指す。インビトロ試験における使用のための生理学的に該当する条件の宿主が樹立されている。一般的に、生理学的緩衝液は生理学的濃度の塩を含有し、そして約６．５〜約７．８、好ましくは約７．０〜約７．５の範囲の中性のｐＨに調節されている。種々の生理学的緩衝液は上記したＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に列挙されており、従って本明細書においては詳述しない。生理学的に該当する温度は約２５℃〜約３８℃、好ましくは約３０℃〜約３７℃の範囲である。
【００９４】
「反応性の基」とは第２の反応性の基に結合することができる化学構造である。反応性の基の例はアミノ基、カルボキシル基、スルヒドリル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アジド基である。一部の反応性の基は第２の反応性の基とのカップリングを促進するために活性化することができる。活性化の例はカルボジイミドとのカルボキシル基の反応、カルボキシル基から活性化エステルへの変換、又はカルボキシル基からアジド官能基への変換である。
【００９５】
「架橋成分」とは１つ以上の反応性の基を含む化学構造を包含する。これらの反応性の基はそれらの化学構造において同一であることができ、これにより架橋したアクセサリーポリペプチドの直接の構築を可能とする。架橋成分は保護基によりブロックされている反応性の基を含有できる。これにより制御された連続反応において１つの架橋成分に数種の異なる非架橋成分をコンジュゲートできる。架橋成分は、その構造において異なり、そして異なる非架橋成分に選択的にコンジュゲートできる、多数の反応性の基を含有できる。多数の高親和性の結合部位を含有するタンパク質もまた架橋剤として機能できる。例としてはビオチニル化された非架橋成分の分子４つまでと結合できるストレプトアビジンが挙げられる。分枝鎖の多官能性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子は架橋成分として機能できる。２〜８個の官能基及び種々の長さのＰＥＧ並びに種々の反応性の基を有する種々の試薬が市販されている。入手元にはＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＳｕｎＢｉｏが包含される。
【００９６】
「非架橋成分」は架橋成分へのコンジュゲーションを可能にする反応性の基を含む化学構造を包含する。非架橋成分は種々のモジュール、例えば１つ以上の生物学的に活性なポリペプチド及び／又は１つ以上のアクセサリーポリペプチドを含有できる。更に又、非架橋成分は精製及び／又は検出を促進するアフィニティータグ、例えばＦｌａｇ−タグ、Ｅ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ、Ｈｉｓ６−タグ、緑色蛍光タンパク質等を含有できる。
【００９７】
「架橋したｒＰＥＧポリペプチド」、「架橋したアクセサリーポリペプチド」、「架橋したｒＰＥＧ」、「ＣＬ−ｒＰＥＧポリペプチド」、「ＣＬ−ｒＰＥＧ」とは、架橋成分との非架橋成分１つ以上のコンジュゲーションを指す用語である。
【００９８】
「制御放出剤」、「緩徐放出剤」、「デポ製剤」又は「除放剤」とは、その剤の非存在下に修飾ポリペプチドを投与した場合の放出の持続時間と比較した場合に本発明の修飾ポリペプチドの放出の持続時間を延長することができる剤を指すために互換的に使用される。本発明の異なる実施形態は異なる放出速度を有する場合があり、このため、異なる治療薬量をもたらす。
【００９９】
「ｖＬドメイン」とは抗体の軽鎖の可変ドメインを指す。
【０１００】
「ｖＨドメイン」とは抗体の重鎖の可変ドメインを指す。
【０１０１】
「可変フラグメント」（Ｆｖ）とは２つの非共有結合的に会合したＶＬ及びＶＨドメインを含む抗体の一部分を指す。
【０１０２】
「単鎖可変フラグメント」（ｓｃＦｖ）とは単鎖として１つのｖＬドメインに非天然ペプチドリンカーを介して連結している１つのｖＨを含む抗体の一部分を指す。ｓｃＦｖはｖＨ−リンカー−ｖＬ又はｖＬ−リンカー−ｖＨという構造を有することができ、ここでリンカーは種々の数量のアミノ酸を含む何れかのペプチド配列であることができる。ｓｃＦｖは好ましくは１２超のアミノ酸のペプチドリンカーを必要とする単量体構造として生理学的条件下では優勢に存在する。
【０１０３】
抗体のジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄＦｖ）とは相補性決定領域（ＣＤＲ）から隔たった構造的に保存されたフレームワーク位置の間に作成された鎖間ジスルフィド結合によりＶＨ−ＶＬヘテロ２量体が安定化されている分子を指す。この安定化方法は多くの抗体Ｆｖの安定化のために適用される。
【０１０４】
「可変ドメイン」とは抗体の抗原結合部位を形成するドメインを指す。可変ドメインはｖＨ又はｖＬであることができ；可変ドメインの間の相違点は超可変領域（ＨＶ−１、ＨＶ−２及びＨＶ−３）として知られている３つのループ上、即ちＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に位置する。ＣＤＲは保存されたフレームワーク領域により可変ドメイン内に支持されている。
【０１０５】
「ドメイン抗体」（ｄＡｂ）とは単量体としての標的に結合できる抗体の一部分を指す。ドメイン抗体は抗体の重鎖（ＶＨ）又は軽鎖（ＶＬ）の何れかの可変領域に相当する。ｄＡｂは一般的には標的結合のために第２の可変ドメイン（ｖＨ又はｖＬ）を必要としない。ｄＡｂはファージディスプレイ又は他のインビトロの方法により形成できる。或いは、ｄＡｂドメインは免疫化されたラクダ類又はサメ類又は軽鎖を欠失している抗体を形成する他の種から得ることができる。
【０１０６】
「ダイアボディー」とは２つのＦｖヘッド部を有する組み換え抗体を指し、各々はあるポリペプチドに由来するＶＨドメインを別のポリペプチドに由来するＶＩドメインと対にしたものよりなる。ダイアボディーは典型的には２つのｖＨ−ｖＬ（又はｖＬ−ｖＨ）鎖を含有する。ダイアボディーはペプチドリンカーにより抗体のｖＬ及びｖＨドメインを連結することにより構築できる。ペプチドリンカーの長さは種々の数量のアミノ酸、好ましくは２〜１２アミノ酸を含む。ダイアボディーは一重特異性又は二重特異性であることができる。
【０１０７】
「トリアボディー」とは３つのＦｖヘッド部を有する組み換え抗体を指し、各々はあるポリペプチドに由来するＶＨドメインを隣接するポリペプチドに由来するＶＬドメインと対にしたものよりなる。トリアボディーは３つのｖＨ−ｖＬ（又はｖＬ−ｖＨ）鎖を含有する。トリアボディーはペプチドリンカーにより抗体のｖＬ及びｖＨドメインを連結することにより構築できる。ペプチドリンカーの長さは種々の数量のアミノ酸、好ましくは０〜２アミノ酸を含む。トリアボディーは一重特異性、二重特異性、又は三重特異性であることができる。
【０１０８】
「テトラボディー」は４つのｖＨ−ｖＬ（又はｖＬ−ｖＨ）鎖を含有する。テトラボディーはペプチドリンカーにより抗体のｖＬ及びｖＨドメインを連結することにより構築できる。ペプチドリンカーの長さは種々の数量のアミノ酸、好ましくは０〜２アミノ酸を含む。テトラボディーはｖＬ及びｖＨドメインの連結された末端から、種々の数量のアミノ酸、好ましくは１〜１０アミノ酸をトランケーションすることにより得ることができる。
【０１０９】
「Ｆａｂフラグメント」とは抗原に結合する抗体上の領域を指す。Ｆａｂフラグメントは重鎖及び軽鎖の各々の定常ドメイン１つ及び可変ドメイン１つを含む。これらのドメインは単量体のアミノ末端にパラトープ、即ち抗原結合部位を形状化する。２つの可変ドメインはそれらの特異的抗原上のエピトープに結合する。ＦａｂフラグメントはＣ末端においてジスルフィド結合により連結できる。Ｆａｂフラグメントはインビトロで形成できる。酵素パパインを用いて免疫グロブリン単量体を切断して２つのＦａｂフラグメントと１つのＦｃフラグメントとすることができる。酵素ペプシンはヒンジ領域の下部で切断し、これによりＦ（ａｂ’）２フラグメント及びＦｃフラグメントが形成される。重鎖及び軽鎖の可変領域を共に融合することにより単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を形成することができ、これは親免疫グロブリンの元の特異性を保持している。
【０１１０】
「抗体フラグメント」という用語は本明細書においては、何れかの型のｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びＦｃのような後に詳述する通り定義される何れかの抗原結合単位を包含する本発明に記載するフラグメントのすべてを包含するように使用される。抗体フラグメントは抗体の追加的ドメインを含むことができる。抗体フラグメントは又、完全又は全体の抗体を包含する。
【０１１１】
「親抗体」という用語は本明細書においては、抗体フラグメントの構築の基本となる抗体を指す。
【０１１２】
「抗体フラグメント系治療薬」（ＡＦＢＴ）とは本明細書に記載した抗体フラグメントに基づく何れかの治療薬又は医薬組成物を指す。ＡＦＢＴは多数の異なる親抗体から誘導できる多数の抗体フラグメントを含むことができる。多重特異性ＡＦＢＴは多数の異なるエピトープに対する特異性を有する多数の抗体フラグメントを含んでよい。これらのエピトープは同じ標的抗原又は多数の異なる標的抗原の部分であることができる。二重特異性ＡＦＢＴは２つの異なる結合特異性を有する結合部位（一般的には２つ以上であるが１つであってもよい）を含んでよい。
【０１１３】
「抗原」、「標的抗原」又は「免疫原」という用語は抗体フラグメント又は抗体フラグメント系治療薬が結合するか、それに対する特異性を有する構造又は結合決定基を指すために本発明においては互換的に使用される。
【０１１４】
「ドメイン再アソートメント」及び「ドメイン交換」という用語は抗体フラグメント又は抗体フラグメント系の治療薬の価数を変化させるプロセスを指すために本明細書において互換的に使用される。例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は再アソートすることができ、これにより２量体、３量体等、並びにダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー等を形成する。Ｆａｂは他のＦａｂと全鎖を、或いは全抗体さえも交換することができ、潜在的にミスマッチのある鎖を生じ、これにより結合活性の一方又は両方の消失がもたらされる。Ｂｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓタンパク質と称される軽鎖２量体の形成も別の例となる。再アソートメントのもう１つの例は、二重特異性のＩｇＧ４抗体をもたらす場合がある、上記交換を防止するジスルフィド結合したヒンジを有さない、ＩｇＧ４抗体間の重鎖の再アソートメントである。ドメインの再アソートメントの比率は塩濃度、ｐＨ、温度、及び標的抗原の存在のような反応条件に応じたものとなる。
【０１１５】
「ペイロード」という用語は本明細書においては、小分子のファーマコフォアと等価である生物学的又は治療上の活性を有するタンパク質又はペプチド配列を指す。ペイロードの例は限定しないが、サイトカイン、酵素及び成長因子を包含する。ペイロードは遺伝子的に融合した、又は化学的にコンジュゲートされた部分を含むことができる。そのような化学的にコンジュゲートされた部分の例は限定しないが、化学療法剤、抗ウィルス化合物、又は造影剤を包含する。これらのコンジュゲートされた部分は切断可能又は非切断可能であってよいリンカーを介してＡＦＢＴの残余に連結できる。
【０１１６】
「コラーゲン結合ドメイン」（ＣＢＤ）とはコラーゲンに結合するか、それに対する特異性を有するタンパク質ドメインを指す。ＣＢＤはコラーゲンＩのようなコラーゲンの何れかの特定の型に対して特異的であることができる。或いは、ＣＢＤは種々のコラーゲン型に結合してよい。一例としては４つのタンパク質ドメインがコラーゲン結合のために十分であるフィブロネクチンである。
【０１１７】
「反復性」という用語は、ポリペプチド、例えばアクセサリーポリペプチドＰＥＧの文脈において使用する場合、ペプチド配列における内部の相同性の程度を指す。反復配列はアミノ酸配列の多数の同一又は相同なコピーを含有してよい。反復性は同一のサブ配列の頻度を分析することにより計測できる。例えば、目的のポリペプチド配列をｎ量体のサブ配列に分割してよく、そして同一のサブ配列の数を計算することができる。高度に反復性の配列は同一のサブ配列の大型の画分を含有する。
【０１１８】
「総電荷密度」とは、本明細書においては、正荷電したアミノ酸の数に負荷電したアミノ酸の数を加算し、そして、合計をポリペプチド中のアミノ酸の総数で割ることにより計算される。例えば：ｈＩｇＧ１Ｆｃ配列：（ＭＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＩＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬ）負荷電残基数：２４；正荷電残基数：２２；残基総数：２２４；Ｆｃ単独の総電荷密度：（２２＋２４）／２２４＝４６／２２４＝２０．５％
「実質電荷密度」とは、本明細書においては、正荷電したアミノ酸の数を負荷電したアミノ酸の数から差し引き、そして、その差をポリペプチド中のアミノ酸の総数で割ることにより計算される。例えば：ｈＩｇＧ１Ｆｃ配列：（ＭＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＩＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬ）負荷電残基数：２４；正荷電残基数：２２；残基総数：２２４；Ｆｃ単独の実質電荷密度：（２４−２２）／２２４＝２／２２４＝０．９％．
「予測された溶解性」とは、本明細書においては、折り畳まれたタンパク質の実質電荷を未構造化タンパク質（例えばｒＰＥＧ）の総電荷に加算し、そして合計をタンパク質中のアミノ酸の総数で割ることにより計算される。例えばＦｃ−ｒＰＥＧ５０の予測された溶解性は（−２＋１９２）／（２２４＋５７６）＝１９０／８００＝２３．７５％である。
【０１１９】
生物学的に活性なポリペプチドの発現の間の溶解性を向上させるためのアクセサリーポリペプチドの設計
可溶性の修飾された生物学的に活性なポリペプチドの発現は、修飾ポリペプチドの実質電荷密度を変更することにより最適化してよい。一部の場合においては、実質電荷密度は＋０．１超又は−０．１未満の電荷／残基である。他の例においては電荷密度は残基当たり＋０．２超又は−０．２未満の電荷である。電荷密度は生物学的に活性なポリペプチドに連結したアクセサリーポリペプチド内のアルギニン、リジン、グルタミン酸及びアスパラギン酸のような荷電したアミノ酸の含有量を変更することにより制御してよい。所望によりアクセサリーポリペプチドは荷電した残基の短いストレッチのみを含んでよい。或いは、アクセサリーポリペプチドはセリン又はグリシンのような他の残基により分離された荷電した残基を含んでよく、これは良好な発現又は精製の挙動をもたらす場合がある。より高度な発現を行ってよい。セリンの使用はより高度な発現レベルをもたらす場合がある。
【０１２０】
細胞質中で融合タンパク質を可溶性とし、折り畳み可能とするためにアクセサリータンパク質に必要とされる実質電荷は生物学的に活性なポリペプチド、特にその大きさ及び実質電荷に依存している。修飾ポリペプチドの実質電荷は正又は負であってよい。一部の用途においては、グルタミン酸又はアスパラギン酸のような負のアミノ酸がリッチであるアクセサリーポリペプチド配列が望ましい場合がある。他の用途においては、リジン又はアルギニンのような正のアミノ酸がリッチであるアクセサリーポリペプチド配列が好ましい場合がある。正及び負荷電のアミノ酸の両方の使用は電荷の中和をもたらす場合があり、これは潜在的には本発明の利点を中和する場合がある。例えば１６％、２５％又は３３％の負荷電残基を有する２８８アミノ酸のアクセサリータンパク質は、９６までの総電荷を与える場合があり、これはアミノ酸９６０個以下の中性融合タンパク質、又はアミノ酸６７２個の非融合タンパク質に関して０．１の電荷密度を達成するために十分である。１つの特定の例において、３３％のグルタミン酸残基を含むアクセサリーポリペプチドを使用することにより、極めて大型で発現しにくいタンパク質を可溶性とすることができる。
【０１２１】
結合タンパク質に溶解性を付与するためには、アクセサリーポリペプチドの実質正電荷又は負電荷は５、１０、１５又は２０超であるか、又更には３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００超であってよい。電荷は５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０アミノ酸の短い配列中に濃縮されることができ、或いは、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、又は５００以上のアミノ酸のより長い配列に渡って散在することもできる。負のアクセサリーポリペプチドの配列は５、１０、１５、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００パーセント超のグルタミン又はアスパラギン酸を含有してよく、そして正のアクセサリーポリペプチドは５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００パーセント超のアルギニン又はリジンを含有してよい。相対的に親水性の残基であるセリン及びグリシンのような非荷電残基を使用してよい。
【０１２２】
アクセサリーポリペプチドの設計における追加的な検討事項：
本発明の１つの態様は、生物学的に活性なポリペプチドの修飾のためのアクセサリーポリペプチド、例えばｒＰＥＧアクセサリーポリペプチド等の設計である（図１）。アクセサリーポリペプチドは治療上及び／又は診断上の価値を有する組み換えタンパク質を形成する場合に特に有用である。
【０１２３】
種々のアクセサリーポリペプチド配列を設計することができ、そしてこれらはグリシン及び／又はセリン、並びに他のアミノ酸、例えばグルタメート、アスパルテート、アラニン又はプロリンがリッチであってよい。アクセサリーポリペプチド配列は親水性アミノ酸がリッチであり、そして低いパーセンテージの疎水性又は芳香族のアミノ酸を含有してよい。アクセサリーポリペプチド配列は少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％のグリシン及び／又はセリン残基を有するように設計できる。一部の場合においては、アクセサリーポリペプチド配列は少なくとも５０、５５、６０、６５％のグリシン及び／又はセリンを含有する。他の場合においては、アクセサリーポリペプチド配列は少なくとも７０、７５、８０、８５、９０％のグリシン及び／又はセリン残基を含有してよい。
【０１２４】
本発明の組成物は典型的には少なくとも合計４０アミノ酸よりなるアクセサリーポリペプチド配列を含有することになる。しかしながら、生成物は多数のアクセサリーポリペプチド配列を含有することができ、そして、これらの個々のアクセサリーポリペプチド配列の一部又は全ては、生成物の全てのアクセサリーポリペプチド配列の合計長が少なくとも４０アミノ酸である限り、４０アミノ酸より短いものであってよい。一部の実施形態においては、タンパク質に結合しているアクセサリーポリペプチド配列の合計長は２０、２５、３５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００又は２０００超のアミノ酸であることができる。一部の修飾された生物学的に活性なポリペプチドにおいては、アクセサリーポリペプチド配列の合わせた長さは６０、７０、８０、９０以上のアミノ酸を超える。他の修飾ポリペプチドにおいてはアクセサリーポリペプチド配列の合わせた長さは１００、１２０、１４０、１６０又は１８０アミノ酸、そして更には２００、２５０、３００、３５０、４００、５０００、６００、７００、８００又は更には１０００超のアミノ酸を超える。
【０１２５】
１種又は数種のアクセサリーポリペプチド配列は、生物学的に活性なポリペプチドに、例えば生物学的に活性なポリペプチドのＮ又はＣ末端に融合することができ、或いは、目的のポリペプチドのループ内に挿入することにより、結果として生じる修飾ポリペプチドに、未修飾ポリペプチドと比較して、向上した特性を付与することができる。（治療用）タンパク質へのアクセサリー配列の融合は未修飾のタンパク質と比較して結果として生じる融合タンパク質の流体力学的半径を優位に増大させ、これは例えば超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、又は光散乱等により検出できる。
【０１２６】
アクセサリーポリペプチド配列は所望の特性が得られるようにアミノ酸の１種以上の型を回避するように設計することができる。例えば以下のアミノ酸、即ちシステイン（ジスルフィド形成及び酸化を回避するため）、メチオニン（酸化を回避するため）、アスパラギン及びグルタミン（デスアミド化を回避するため）及びアスパルテートを殆ど、又は全く含有しないようにアクセサリーポリペプチド配列を設計できる。アクセサリーポリペプチド配列はタンパク質分解に対する感受性を低減する傾向のあるプロリン残基を含有するように設計できる。
【０１２７】
アクセサリーポリペプチド配列はタンパク質の生産を最適化する等のために設計できる。これはコードしているＤＮＡの反復性を回避又は最小限化することにより達成できる。アクセサリーポリペプチド配列、例えばポリグリシン又はポリセリンは極めて望ましい医薬品特性を有する場合があるが、それらの製造は、ポリグリシンに関してコードしているＤＮＡ配列の高ＧＣ含有量のため、及び、組み換えをもたらす場合がある反復ＤＮＡ配列の存在のために困難である場合がある。
【０１２８】
Ｇ、Ｓ及びＥがリッチである配列がリッチである短い反復モチーフを含む単純な配列を包含するアクセサリーポリペプチドはこれらの配列にＴ細胞エピトープが非存在であるにもかかわらず、多数の種において＞１，０００の相対的に高い抗体価をもたらす場合がある。これは、タンパク質凝集塊、架橋した免疫原及び反復炭水化物を包含する反復エピトープを有する免疫原が高度に免疫原性であることが分かっていることから、アクセサリーポリペプチドの反復性により生じる場合がある。（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｊ．ら（２００７）Ｖａｃｃｉｎｅ，２５：１６７６−８２，Ｙａｎｋａｉ，Ｚ．ら（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，３４５：１３６５−７１，Ｈｓｕ，Ｃ．Ｔ．ら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６０：３７０１−５）。５価のＩｇＭ分子をディスプレイするＢ細胞は、ＩｇＭに対する免疫原の一価の結合親和性が例えばマイクロモル濃度のように極めて低値であっても反復免疫原により刺激される（図７４）。同じ分子上又は同じ細胞上に位置する多数の連結ＩｇＭドメインに連結リピートが同時に結合することは、Ｂ細胞を刺激する場合がある相互作用の見かけの（有効な）親和性の大きな（千、百万又はおそらくは一千万倍）増大をもたらす場合がある。この型の作用を回避するためには、アクセサリーポリペプチドは多数の種の動物（例えばラット、ウサギ、マウス、又はモルモット）において、免疫原性に関して（並びに半減期及び他の特性に対する作用に関して）スクリーニングしてよい（多数回の注入を実施し、免疫化の前及び後に同じ動物において薬物動態の特性を計測する）。更に又、アクセサリーポリペプチド配列は、非反復性（各配列モチーフの１つの同一コピーのみを含む）となるように、又は各配列モチーフの最小数のコピーを有するように設計してよい。低い反復性のアクセサリーポリペプチド配列は異なるＩｇＭに対する結合部位を含んでよいが、各Ｂ細胞は一般的に１つの型のみのＩｇＭを分泌し、そして各ＩｇＭは典型的には１つの型の結合部位のみを有するため、それらが同じＩｇＭ分子に、又は同じＢ細胞に多価性に結合する能力は低くなる場合がある。この機序は図７４ａ及びｂに説明する。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアクセサリーポリペプチド当たり１、２、３、４、５程度のコピーにおいて存在する配列のみを含有してよい。より少数のリピートを有するポリペプチドはより低い期待アビディティを有する場合があり、実質的な免疫応答を誘導する可能性は低いと考えられる。そのような配列は多数の型のアミノ酸、例えば２つの型（例えばＧ及びＥ又はＳ及びＥ）、３つの型のアミノ酸（例えばＧ、Ｅ及びＳ）又は４つ以上を含んでよい。そのようなアクセサリーポリペプチドは又、総アミノ酸組成の３０〜８０％のグリシン、１０〜４０％のセリン及び１５〜５０％のグルタメートを含んでよい。そのような配列は発現レベル、血清及びＥ．ｃｏｌｉのプロテアーゼ耐性、溶解性、凝集性、及び免疫原性のような所望の特性の最適なバランスをもたらす場合がある。
【０１２９】
図７４は反復（７４ａ）及び非反復（７４ｂ）のアクセサリーポリペプチド配列の該配列中のエピトープを認識するＢ細胞との相互作用を比較している。反復配列は、それが相対的に少数の異なるエピトープを含有するため、ある生物において、僅かなＢ細胞によって認識されることになる。しかしながら、反復配列はこれらの僅かなＢ細胞と多価の接点を形成することができ、そしてその結果、それは図７４ａにおいて説明する通りそれらの増殖を刺激することができる。非反復配列は、それが多くの異なるエピトープを含有するため、多くの異なるＢ細胞との接点を形成できる。しかしながら、各々個々のＢ細胞は、図７４ｂにおいて説明する通り反復性の欠如により、個々の非反復アクセサリーポリペプチド（「ｎｒＵＲＰ」）とは１つ又は少数の接点を形成できるのみである。その結果、非反復アクセサリーポリペプチドがＢ細胞の増殖、そしてそれによる免疫応答を刺激する傾向は、遙かに低値となる場合がある。
【０１３０】
反復アクセサリーポリペプチドと比較した場合の非反復アクセサリーポリペプチドの追加的利点は、非反復アクセサリーポリペプチドが反復アクセサリーポリペプチドと比較して抗体とより弱い接点を形成することである。抗体は多価分子である。例えば、ＩｇＧは２つの同一の結合部位を有しており、そしてＩｇＭは１０の同一の結合部位を含有する。即ち、反復配列に対する抗体は高いアビディティでそのような反復配列との多価の接点を形成することができ、これはそのような反復配列の力価及び／又は排出に影響する場合がある。これとは対照的に、非反復アクセサリーポリペプチドに対する抗体は、該非反復アクセサリーポリペプチドが各エピトープの僅かなリピートを含有していることから、抗体とは殆どが１価の相互作用を生じる傾向がある。
【０１３１】
反復性はペプチド配列における内部相同性の程度を説明するものである。極端な例においては、反復配列はアミノ酸配列の多数の同一のコピーを含有できる。反復性は同一のサブ配列の頻度を分析することにより計測される。例えば目的の配列をｎ量体に分割し、そして同一又は相同な配列の数を計数できる。高度の反復性の配列は同一又は相同なサブ配列の大型の画分を含有することになる。
【０１３２】
遺伝子の反復性はコンピュータアルゴリズムにより計測できる。例は図７５において説明する。クエリ配列に基づいて、特定の長さのサブ配列全てのペアワイズな比較を実施できる。これらのサブ配列は同一性又は相同性に関して比較できる。図７５に示す例は、同一性に関して４アミノ酸のサブ配列を比較している。例においては、大部分の４量体サブ配列はクエリ配列中に１回のみ生じており、そして３４量体サブ配列は２回生じている。遺伝子内の反復性を平均することができる。サブ配列の長さは調節できる。所望により、サブ配列の長さは免疫系により認識されることができる配列エピトープの長さを反映する場合がある。即ち、４〜１５アミノ酸のサブ配列の分析を実施できる。非反復アクセサリーポリペプチドをコードする遺伝子を遺伝子合成の標準的手法を用いながらオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。遺伝子設計はコドンの使用及びアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを使用しながら実施できる。更に又、プロテアーゼ感受性であるか、又はヒトの免疫系により容易に認識されることができるエピトープであることが知られているアミノ酸配列を回避することができる。コンピュータアルゴリズムは結果として生じるアミノ酸配列反復を最小限にするように配列設計中に適用することができる。アミノ酸組成、コドンの使用、プロテアーゼ感受性サブ配列の回避、エピトープの回避のようなプリセットされた基準にマッチする遺伝子設計の多数の反復性を評価することができ、合成及びその後の評価のために最低反復性の配列を選択する。
【０１３３】
非反復アクセサリーポリペプチド遺伝子の設計のための代替の手順は、高レベルの発現、低凝集傾向、高い溶解性、及び良好なプロテアーゼ耐性を示す非反復アクセサリーポリペプチドの既存のコレクションの配列を分析することである。コンピュータアルゴリズムは配列フラグメントの再組立によりそのような既存の非反復アクセサリーポリペプチド配列に基づいて非反復アクセサリーポリペプチド配列を設計できる。アルゴリズムはこれらの非反復アクセサリーポリペプチド配列からサブ配列のコレクションを形成し、そしてそのようなサブ配列から非反復アクセサリーポリペプチド配列を組み立てる多数の方法を評価する。これらの組み立てられた配列は、あらかじめ識別された非反復アクセサリーポリペプチドのサブ配列のみを含む非反復アクセサリーポリペプチド配列を識別するために反復性を評価することができる。
【０１３４】
非反復アクセサリーポリペプチドをコードする遺伝子は図７７において説明する通り短いアクセサリーポリペプチドセグメントのライブラリから組み立てることができる。先ずアクセサリーポリペプチドセグメントの大型のライブラリを形成することができる。そのようなライブラリは部分ランダム化オリゴヌクレオチドから組み立てることができる。ランダム化のスキームは各位置に関するアミノ酸の選択並びにコドン使用を制御するために最適化できる。アクセサリーポリペプチドセグメントのライブラリを発現ベクター内にクローニングしてよい。或いは、ＧＦＰのようなインジケーター遺伝子に融合した発現ベクター内にアクセサリーポリペプチドセグメントのライブラリをクローニングしてよい。その後、発現のレベル、プロテアーゼ安定性、抗血清への結合のような多くの特性に関してライブラリのメンバーをスクリーニングできる。特に望ましいアミノ酸組成、セグメント長を有するセグメントを識別するため、又は内部リピートが低頻度であるセグメントを識別するために、ライブラリのメンバーのアミノ酸配列を決定することができる。その後、ランダム２量体化又は多量体化によりアクセサリーポリペプチドセグメントのコレクションから非反復アクセサリーポリペプチド配列を組み立てることができる。２量体化又は多量体化はライゲーション又はＰＣＲ組み立てにより達成できる。このプロセスは、最良の特性を有する非反復アクセサリーポリペプチド配列を識別するために多くの特性に関して評価できるライブラリ非反復アクセサリーポリペプチド配列をもたらす。２量体化又は多量体化のプロセスを反復することにより非反復アクセサリーポリペプチド配列の長さを更に増大することができる。
【０１３５】
特定の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは以下の８アミノ酸モチーフ：ＧＥＧＳＧＥＧＳＥ、ＧＥＧＧＳＥＧＳＥ、ＧＥＧＳＥＧＳＧＥ、ＧＥＧＳＥＧＧＳＥ、ＧＥＧＳＧＥＧＧＥ、ＧＥＧＧＳＥＧＧＥ、ＧＥＧＧＧＥＧＳＥ、ＧＥＧＧＥＧＳＧＥ、ＧＥＧＧＥＧＧＳＥ、又はＧＥＧＳＥＧＧＧＥの混合物を含む。この設計は相互に相対的なモチーフ数の比に応じて平均で３３％Ｅ及び１１〜２２％セリン含有量を有する。別の特定の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは以下の１２アミノ酸モチーフ：ＧＸＥＧＳＧＥＧＸＧＸＥ、ＧＸＥＧＧＳＥＧＸＧＸＥ、ＧＸＥＧＳＧＥＧＧＳＧＥ、ＧＸＥＧＧＳＥＧＧＳＧＥ、ＧＳＧＥＧＸＥＧＸＧＸＥ、ＧＧＳＥＧＸＥＧＸＧＸＥ、ＧＳＧＥＧＸＥＧＧＳＧＥ又はＧＧＳＥＧＸＥＧＧＳＧＥの混合物を含み、ここでＸは等しい尤度においてＳ又はＥの何れかを示す。この設計は選択された特定の比に応じて平均で２５％Ｅ及び約１％Ｓを有する。適当な特定の比は１：１：１：１：１：１：１：１比又は他の何れかの比であってよく、そして組成を微調整するものであってよい。
【０１３６】
アクセサリーポリペプチド配列はアミノ酸レベルにおいて高度に反復性、低い反復性又は非反復性であるように設計することができる。例えば、高度に反復性のアクセサリーポリペプチド配列は重複する９量体のペプチド配列少数のみを含有してよく、これにより免疫反応を誘発する危険性は低減される。
【０１３７】
単一アミノ酸型のアクセサリーポリペプチド配列の例は：ポリグリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリセリン、ポリスレオニンであり、ここで長さは少なくとも２０残基である。２つの型のアミノ酸を有するアクセサリーポリペプチドの例は
（ＧＸ）ｎ、（ＳＸ）ｎであり、ここでＧはグリシンであり、そしてＳはセリンであり、そしてＸはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、又はプロリンであり、そしてｎは少なくとも１０である。別の例は（ＧＧＸ）ｎ又は（ＳＳＸ）ｎであり、ここでＸはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、又はプロリンであり、そしてｎは少なくとも７である。別の例は（ＧＧＧＸ）ｎ又は（ＳＳＳＸ）ｎであり、ここでＸはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、又はプロリンであり、そしてｎは少なくとも５である。別の例は（ＧＧＧＧＸ）ｎ又は（ＳＳＳＳＸ）ｎであり、ここでＸはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、又はプロリンであり、そしてｎは少なくとも４である。他の例は（ＧｚＸ）ｎ、及び（ＳｚＸ）ｎであり、そしてここでＸはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、又はプロリンであり、ｎは少なくとも１０であり、そしてｚは１〜２０である。
【０１３８】
これらのリピートの数は５〜３００以上の何れかの数であることができる。本発明の生成物は半ランダム配列であるアクセサリーポリペプチド配列を含有してよい。例としては少なくとも３０、４０、５０、６０又は７０％グリシンを含有する半ランダム配列であり、この場合、グリシンは十分分散しており、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの総濃度は合わせて７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０％未満である。好ましい半ランダムアクセサリーポリペプチド配列は少なくとも４０％グリシンを含有し、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの総濃度は１０％未満である。より好ましいランダムアクセサリーポリペプチド配列は少なくとも５０％グリシンを含有し、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの総濃度は５％未満である。アクセサリーポリペプチド配列は２つ以上のより短いアクセサリーポリペプチド配列又はアクセサリーポリペプチド配列のフラグメントの配列を組み合わせることにより設計できる。そのような組み合わせは、アクセサリーポリペプチド配列を含有する生成物の医薬品特性を良好に調整できるようにし、そしてそれはアクセサリーポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列の反復性を低減できるようにし、これはアクセサリーポリペプチド配列をコードする配列の発現を向上させ、組み換えを低減することができる。
【０１３９】
高レベルの溶解性が望まれる場合は、高画分の荷電した残基、好ましくは＞２５％グルタメート（Ｅ）とし、そして残余はほとんどグリシン又はセリンとしたものを使用してよい。高レベルの発現は１０〜５０％セリン（Ｅ）を好ましく使用するが、その理由はセリンが６コドンを有しており、これは一般的にグリシン（４コドン）よりも遙かに高値の発現レベルをもたらすためである。これは一般的に、配列における高いグルタメート含有量を利用した場合の溶解性及び急速なクリアランスを引き換えにしている。所望により５０％未満、３０％未満のグルタメート含有量を使用することにより、所望の溶解性をもたらし、そして動物における急速なクリアランスを回避する。
【０１４０】
非グリシン残基は特性を最適化するために選択できる
特に興味深いものは、グリシン及び／又はセリンリッチであるアクセサリーポリペプチド配列である。これらのｇｌｙリッチ又はｓｅｒリッチの配列における非ｇｌｙ、非ｓｅｒ残基の配列はタンパク質の特性を最適化するために選択できる。例えば、特定の組織に対する生物学的に活性なポリペプチドの選択性を増強するためにアクセサリーポリペプチドの配列を最適化できる。そのような組織選択的なアクセサリーポリペプチド配列はランダム又は半ランダムなアクセサリーポリペプチド配列のライブラリを作成し、それらを動物又は患者に注入し、そして、組織試料中の所望の組織選択性を有する配列を決定することにより得ることができる。配列の決定は質量スペクトル分析により実施できる。同様の方法を用いながら、経口、口内、腸内、鼻内、髄腔内、腹腔内、肺内、直腸内、又は皮膚による取り込みを促進するアクセサリーポリペプチド配列を選択できる。特に興味深いものは膜を経由した細胞取り込み又は輸送に好都合な正荷電アミノ酸であるアルギニン又はリジンが相対的にリッチである領域を含有するアクセサリーポリペプチド配列であり；そのようなアクセサリーポリペプチドはタンパク質の細胞内送達のために有用である場合がある。
【０１４１】
後述においてより詳細に説明する通り、アクセサリーポリペプチド配列はプロテアーゼ感受性配列１つ又は数個を含有するように設計できる。そのようなアクセサリーポリペプチド配列は、本発明の生成物がその標的の位置に到達すれば切断されることができる。この切断は薬学的に活性なドメインの力価の増大をトリガーする（プロドラッグ活性化）か、又はそれは受容体への切断産物の結合を増強する場合がある。これは現在では抗体に対しては可能ではない。しかしながら、ＰＥＧ化された又はアクセサリータンパク質で修飾された生物学的に活性なポリペプチドの場合は、トマトエッチウィルスプロテアーゼ又は同様の部位特異的非ヒトプロテアーゼのような外来性プロテアーゼに対する切断部位を与えることができる。プロテアーゼ部位がアクセサリータンパク質と治療用タンパク質の間、又は治療用タンパク質に近接してある場合は、プロテアーゼの注入は薬物からアクセサリータンパク質テール部を除去することになり、これにより、より短い半減期及び患者の系からの除去がもたらされる。血清中の薬物の濃度は１０〜１００倍低下することになり、治療を効果的に終了する。これは例えばＴＮＦ阻害ミクロタンパク質（例えばＴＮＦａ受容体ｒＰＥＧ）を用いた治療の間の感染により治療を急に中止する必要が生じた場合等に望ましいものとなる。一例としては、アクセサリータンパク質を切断除去するプロテアーゼを治療計画に追加することにより、タンパク質の活性なＴＮＦ阻害部分の半減期を急激に減少させることができ、これが次に急速なクリアランスに付される。この手順によれば感染症が抑制できることになる。
【０１４２】
アクセサリーポリペプチド配列は又、アスパラギン酸、又はグルタミン酸の残基を導入することにより過剰な負電荷を担持するように設計できる。特に興味深いものは、８、１０、１５、２０、２５、３０、４０又更には５０％のグルタミン酸及び２％未満のリジン又はアルギニンを含有するアクセサリーポリペプチドである。そのようなアクセサリーポリペプチドは高い実質負電荷を担持し、そしてその結果として、それらはペプチドの個々の負電荷の間の静電気的反発力のために開放型のコンホーメーションを採用する傾向を有する。そのような実質負電荷はそれらの流体力学的半径の効果的な増大をもたらし、そしてその結果として、それはそのような分子の低減された腎クリアランスをもたらす場合がある。即ち、アクセサリーポリペプチド配列中の負荷電のアミノ酸の頻度及び分布を制御することによりアクセサリーポリペプチド配列の有効実質電荷及び流体力学的半径を調整することができる。ヒト又は動物の大部分の組織及び表面は実質負電荷を有している。実質負電荷を有するようにアクセサリーポリペプチド配列を設計することにより、アクセサリーポリペプチド−治療用タンパク質と種々の表面、例えば血管、健常な組織、又は種々の受容体との間の非特異的相互作用を最小限にすることができる。
【０１４３】
本発明で有用な他のアクセサリーポリペプチドは以下の特徴の１つ以上を呈する。
【０１４４】
アクセサリーポリペプチドは増強された流体力学的半径を特徴とすることができるが、アクセサリーポリペプチドはそれが連結している生物学的に活性なポリペプチドの見かけの分子量ファクターを増大させる。見かけの分子量ファクターは血清中の分泌半減期の予測材料（予測された分子量が一定であると仮定）であるため、より高値の見かけの分子量ファクターを有するアクセサリーポリペプチドはより長い血清中半減期を示すことが期待される。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドに関する見かけの分子量ファクターは３、５、７又更には９超であることができる。見かけの分子量ファクターは種々の方法、限定しないが例えばコントロールされた孔径を有するメンブレンを通した限外濾過によるか、又はサイズ排除ゲル濾過（ＳＥＣ）により計測できる。見かけの分子量ファクターは塩及び他の溶質の濃度により影響される場合がある。それは一般的には血液又は生理食塩水のような生理学的条件と同様の条件下で計測しなければならない。
【０１４５】
アクセサリーポリペプチドは又、生物学的に活性なポリペプチド内へのその配合時に生物学的に活性なポリペプチドがアクセサリーポリペプチドを欠いている相当するタンパク質と比較してより長い半減期を呈する作用を特徴とする場合がある。血清中半減期を確認する方法は当該分野で知られている（例えばＡｌｖａｒｅｚ、Ｐ．ら（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７９：３３７５−８１参照）。結果として生じるタンパク質が未修飾のタンパク質と比較してより長い血清中半減期を有するかどうかは、当業者の知る、又は本明細書において例示する何れかの方法を実施することにより容易に調べることができる。
【０１４６】
アクセサリーポリペプチドポリペプチドは又、それが結合しているタンパク質の溶解性を増大させることができる。例えばヒトインターフェロン−アルファ、ヒト成長ホルモン及びヒトＧ−ＣＳＦは典型的にはＥ．ｃｏｌｉの細胞質中で発現されれば封入体を形成するが、アクセサリーポリペプチド（例えば（ＳＳＧＳＳＥ）４８又は（ＳＳＥＳＳＳＳＥＳＳＳＥ）２４、（ＧＥＧＧＧＥＧＧＥ）３６又はその他）の結合により発現されたポリペプチドの溶解性が増大し、これによりそれはもはや封入体を形成しないが、なお原形質中で可溶であり、そこから活性型及び高い発現レベル及び効率において容易に精製することができ、封入体からの再折り畳みの必要性が回避できるのである。
【０１４７】
アクセサリーポリペプチドは生理学的条件下で高度なコンホーメーションの柔軟性を有する場合があり、そしてそれらは同様の分子量の球状タンパク質と比較してより大きい流体力学的半径（ストークス半径）を有する傾向があり、これにより大きい「比体積」（単位質量当たり体積）をもたらす。即ち、アクセサリーポリペプチドは生理学的条件下において明確に定義された二次及び三次構造を欠いている変性したペプチド配列と同様な挙動を示す場合がある。変性したコンホーメーションは、ペプチド骨格の大きいコンホーメーション的自由度を特徴とする溶液中のペプチドの状態を説明している。大部分のペプチド及びタンパク質は高濃度の変性剤存在下において、又は上昇した温度において、変性したコンホーメーションを採用している。変性したコンホーメーションにあるペプチドは特徴的なＣＤスペクトルを有し、そしてそれらはＮＭＲで測定した場合の長いレンジの相互作用を欠いていることを特徴とする。「変性したコンホーメーション」及び「未折り畳みのコンホーメーション」は、本明細書においては同義的に使用する。所定のポリペプチドの二次及び三次構造の存在又は非存在を確認するための種々の方法が当該分野で確立されている。例えば、ポリペプチドの二次構造は「遠ＵＶ」スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）におけるＣＤスペクトル分析により測定できる。二次構造の要素、例えばアルファへリックス、ベータシート及びランダムコイル構造の各々は、ＣＤスペクトルの特徴的な形状及び大きさを生じさせる。二次構造は又、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Ｃｈｏｕ、Ｐ．Ｙ．ら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：２２２−４５）のような特定のコンピュータプログラム又はアルゴリズムを用いて確認することもできる。特定のアクセサリー配列に関しては、アルゴリズムは二次構造が一部存在するのか、又は全く存在しないのかを予測できる。多くの場合において、アクセサリー配列はそれらの二次及び三次構造の程度が低いために、変性された配列に似たスペクトルを有することになる。他の場合においては、アクセサリー配列は二次構造、特にアルファへリックスのようなへリックス、又はベータシートのようなシートを採用できる。未構造のアミノ酸重合体が一般的には本発明にはこのましいが、一部は二次構造、特にアルファへリックス、そしてより少量であればベータシートを採用したアミノ酸配列を使用することも可能である。三次構造は一般的にはその低い比流体力学的半径のために望ましくない。二次構造を有する配列はより少ない二次構造を有する配列よりも小さい流体力学的半径を有すると考えられるが、しかしそれらはなお有用である場合がある。アクセサリー配列が三次構造を（例えばタンパク質ドメインにおいて）採用する場合は、流体力学的半径は更に小さくなると予測される。ポリグリシンは流体力学的半径の質量に対する比が最も高いが（グリシンは僅か７０Ｄである）、球状タンパク質の流体力学的半径の質量に対する比は最も小さい。例外としては、血清曝露標的に結合し、そして異なる機序により血清中分泌半減期を延長する、０、１、２、３又は４ジスルフィド及び種々の程度の二次及び三次構造を有するペプチドのアクセサリーポリペプチド中の包含である。
【０１４８】
アクセサリーポリペプチドは低い免疫原性を有する配列であることができる。低い免疫原性はアクセサリー配列のコンホーメーションの柔軟性の直接の結果である場合がある。多くの抗体がタンパク質抗原中のいわゆるコンホーメーションエピトープを認識する。コンホーメーションエピトープはタンパク質抗原の多数の不連続のアミノ酸配列を含むタンパク質表面の領域により形成される。タンパク質の厳密な折り畳みにより、これらの配列は、抗体により認識可能な明確に定義された特定の配置となる。好ましいアクセサリーポリペプチドはコンホーメーションエピトープの形成を回避するように設計される。例えば特に興味深いものは水溶液中で緻密に折り畳まれたコンホーメーションを採用する傾向が低いアクセサリー配列である。特に、低い免疫原性は抗原提示細胞において抗原のプロセシングに抵抗する配列を選択すること、ＭＨＣに良好に結合しない配列を選択すること、及び／又は、ヒト配列から誘導された配列を選択することにより達成できる。アクセサリーポリペプチド配列は生物学的に活性なポリペプチドの免疫原性を低減することもできる。
【０１４９】
アクセサリーポリペプチドは高度なプロテアーゼ耐性を有する配列であることができる。プロテアーゼ耐性は例えばアクセサリー配列のコンホーメーションの柔軟性の結果、例えばそれらの高エントロピーに起因する場合がある。プロテアーゼ耐性はエンド及びエキソプロテアーゼの両方に対する既知プロテアーゼ認識部位を回避することにより、そして高グリシン含有量を包含することにより設計できる。或いはプロテアーゼ耐性配列はランダム又は半ランダムの配列ライブラリからファージディスプレイ又は関連の手法により選択できる。デポ剤タンパク質からの緩徐放出のような特殊な用途のために望まれる場合は、血清プロテアーゼ切断部位をアクセサリーポリペプチド内部に構築できる。そのような場合、本発明の組成物は使用中に溶解又は分解してよい（又は溶解又は分解することを意図してよい）。一般的に生体分解性に起因する分解では重合体のその構成成分（限定しないが例えば修飾ポリペプチド及び結果として生じる分解産物）への分解が起こる。重合体の分解は、種々の要因、例えば重合体を形成する何れかの構成成分の実体（例えばプロテアーゼ感受性部位）、何れかの置換基の比、及びどのようにして組成物が形成又は処理されるか（例えば置換基が保護されるかどうか）に部分的には依存している。しかしながら興味深いものは又、適用法に関連する血液中又は身体組織中の高度な安定性（例えば長い血清中半減期、体液中に存在するプロテアーゼによる分解を被り難いこと）を有するアクセサリー配列である。アクセサリーポリペプチドは又、それらがタンパク質をプロテアーゼ攻撃から遮蔽するため、そのプロテアーゼ特性を向上させることができる。３アミノ酸を含む天然の未構造化反復配列の例は、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩタンパク質中のリンカーであり、これはリピート（ＧＧＧＳＥ）ｎを有し、そして広範なアレイのプロテアーゼに対して例外的に安定であることが知られている。モチーフ（ＧＧＧＳＥ）ｎを有するアクセサリータンパク質は極めて有用であると予測されている。長い配列に関しては、延長された長さにおいて必要とされるより高値の溶解性を達成するためには（ＧＧＳＥ）ｎが好ましい場合がある。
【０１５０】
生理学的条件下において、水、血液及び他の体液中での良好な溶解性を有するアクセサリーポリペプチドもまた生体利用性を促進するために望ましい。そのような配列はグリシン、セリン、アスパルテート、グルタメート、リジン、アルギニン、スレオニンのような親水性アミノ酸がリッチである、そして、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニンのような疎水性アミノ酸を殆ど含有しない配列を設計することにより得ることができる。それらのアミノ酸組成の結果として、アクセサリーポリペプチドは水性製剤中で凝集塊を形成する傾向が低く、そして他のタンパク質又はペプチドへのアクセサリーポリペプチドの融合は、それらの溶解性を増強し、そしてそれらが凝集塊を形成する傾向を低減する傾向を示し、これは免疫原性を低減するための別個の機序である。
【０１５１】
アクセサリーポリペプチドは一部の場合においては、組織又は血清のタンパク質への増強された非特異的結合を呈し（図２８）、これはそれらの血清中半減期を延長する作用を示す場合がある。血清中のタンパク質の結合は種々の方法を用いて計測できる。結合試験の例はＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｋｉｎｅｘａ、又はＦｏｒｔｅ  Ｂｉｏである。大部分の動物の組織の表面は（実質）弱負電荷を有するため、実質負電荷を有するタンパク質は実質正電荷を有するタンパク質よりも低値の非特異的組織結合を示す。負電荷の付加によるか、又は正電荷の欠失により実質弱負電荷を形成することは、タンパク質結合をより特異性とするか、又は少なくとも非特異的結合を低減することができる。
【０１５２】
しかしながら実質負電荷（又は実質電荷密度）が高すぎる場合、細胞外マトリックスに、又はＤＮＡ又はＲＮＡに結合する部分又はタンパク質（例えばＶＥＧＦ、ヒストン）のような正電荷の局所パッチによる表面への非特異的結合をもたらす。これとは対照的に、正電荷の付加（例えばＫ、Ｒ）により、或いは、負電荷の除去により実質正電荷を有するタンパク質を形成することは、タンパク質を組織に非特異的に結合させる場合があり、これは半減期の延長をもたらす。
【０１５３】
アクセサリーポリペプチドそのものの電荷の型及び密度は変更することができる。負荷電のアミノ酸はＥ、Ｄ、（Ｃ）であり、そして正荷電のアミノ酸はＲ、Ｋ、（Ｈ）である。変化では一般的に、１つの負荷電の残基を別のものに、例えばＥをＤに、又はその逆となるように交換する。一部の場合においては、Ｄは異性化することにより製造のためには望ましくない化学的不安定性をもたらす場合があるため、Ｅが好ましい。正電荷から負電荷又はその逆のような電荷の型の変化では、Ｋ又はＲをＥ又はＤで置き換える（正電荷が負電荷で置き換えられる）。電荷における変化は又、非荷電又は弱荷電のアミノ酸（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ）を荷電したアミノ酸（Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ）で置き換えるか、その逆を包含する。「電荷密度」とは総残基のパーセントとしての荷電したアミノ酸の数である。電荷密度の変更においては、総アミノ酸のパーセントとしての負荷電のアミノ酸（特にＥ、Ｄ）又は正荷電のアミノ酸（Ｋ、Ｒ）の数を増大又は低減する。これとは対照的に「実質電荷密度」とは残基の総数のパーセントとしての、全ての負荷電したアミノ酸の合計を全ての正荷電したアミノ酸の合計から差し引いたもの（実質電荷）である。
【０１５４】
「実質電荷」及び「実質電荷密度（ＡＡ当たりの実質電荷）」はアクセサリーポリペプチド及びアクセサリー修飾ポリペプチドの溶解性、並びに他の分子に結合するその能力に影響する場合がある。アクセサリーポリペプチドは融合タンパク質の電荷の型及び密度を変更することができ、これは血清中半減期を延長する場合があり、そして所望の相互作用を増強するため、又は他のタンパク質又は物質との融合タンパク質の望ましくない相互作用を低減するために、利用することができる。
【０１５５】
アクセサリーポリペプチドは一部の場合においては、組織又は血清のタンパク質への増強された非特異的結合を示し、これはそれらの血清中半減期を延長する作用を有する場合がある。これは非特異的結合を示さないアクセサリー配列と比較した場合の血清中半減期の延長として計測できるか、或いは、それは逆の電荷の高密度のタンパク質に対する弱い結合親和性としてＥＬＩＳＡにより示される場合がある。
【０１５６】
アクセサリーポリペプチドは単一のアミノ酸、例えば（Ｅ）ｎ、（Ｇ）ｎ又は（Ｓ）ｎ（別名ポリＥ、ＥＥＥＥＥ、ポリＧ、ＧＧＧＧＧ、又はポリＳ、ＳＳＳＳＳ）、又更には、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ；即ちＡＡＡＡＡ）の１つの単独重合体より部分的又は完全になる場合がある。最良の単一のアミノ酸のモチーフ（Ｅ、Ｇ、Ｓ）は免疫学的には最も小さい複合体（僅か１つの型のみの９アミノ酸ペプチドを形成できる）であるが、各々が何らかの欠点を有している。グリシンは弱疎水性であり、そしてポリＧは限定的な溶解性を有している。グリシンの利点はその高いエントロピーである。一部の場合においては、セリンのほうが、相当するＤＮＡ配列がより均衡のとれたＧＣ比を有する可能性があり、そして一般的には恐らくはその６コドンのためにより高値の発現レベルをもたらすことから、グリシンよりも好ましいと考えられる。グルタミン酸（Ｅ）を包含する４つの荷電したアミノ酸は２０天然アミノ酸で最も高い溶解性を有し、それに後続してグリシン及びセリンとなる。しかしながら、高い実質負電荷密度においては、タンパク質は、正荷電したタンパク質及び表面、例えばＶＥＧＦ（ＥＣＭに結合する塩基性エクソン）、ヒストン、ＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質に、そして更には骨に、非特異的に結合を開始する。その他、ポリＥの長いストリングが所望の延長された半減期ではなく低減した半減期をもたらすという報告もある。
【０１５７】
セリン及びポリセリンは凝集塊形成の危険性を伴うことなく、そして最良のコドン使用及び発現レベルを伴いながら、高い溶解性を与える。セリンの６コドンは均衡のとれたＧＣ含有量をもたらすが、より重要な点として、それらは、ポリＥ又はポリＧのような他のアミノ酸よりも大きい程度のコドン使用最適化及び発現レベル最適化をもたらす例外的に多様なＤＮＡ配列によりポリＳ又はＳリッチ配列がコードされ得るようにする（図１４及び１５）。
【０１５８】
アクセサリーポリペプチドは上記した機能的変化を起こすために必要な何れかの長さのものであることができる。アミノ酸の１、２、３以上の型を含有するのみであるアクセサリー配列の長さは、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００アミノ酸の下限、及び、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００又更には１０００アミノ酸の上限を有する場合がある。
【０１５９】
アクセサリーポリペプチドのアミノ酸組成は得られるポリペプチドの所望の特性が最大限となるように選択できる。例えば血清中半減期の延長のためには、見かけの分子量の予測された分子量に対する高い比が好ましい。同じ質量に関してより大きい流体力学的半径を与える未構造化アクセサリーポリペプチドは、アルファヘリックス又はベータシートのような構造を支持しないアミノ酸で構築する。Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのアルゴリズムによるアミノ酸残基の格付けに従えば、残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｖはアルファヘリックス構造を支持し、そして残基Ｃ、Ｑ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖはベータシート構造を支持する。ターン形成性であるためにＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムが最も未構造化状態であると見なしているアミノ酸は、構造化が最高から最低のものの順に、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｄ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｋとなる。均衡すれば、構造の支持が最低の残基はＧ、Ｎ、Ｐ、Ｓである。
【０１６０】
重合体の特性のより良好な微調整、特に溶解性及び電荷密度を達成するためには、２つ又は３つのアミノ酸を含むアクセサリーポリペプチドが単一のアミノ酸を含むものよりも一般的にこのましい。２つ又は３つのアミノ酸を含むアクセサリーポリペプチドが好ましい理由は、それらが免疫的単純性（僅か少数の異なる９量体ペプチドをもたらすことはＭＨＣ複合体又は抗体結合のためのエピトープを形成する８量体ペプチドに結合できる）の溶解性、プロテアーゼ耐性、電荷の型及び密度、構造の不在、エントロピー、及び組織への非特異的結合の最適化（これは望ましくないが、半減期機序として使用できる）との最も良好なバランスを与えるためである。一般的に、アクセサリータンパク質配列から形成できる非ヒト８量体又は９量体ペプチドの数が大きいほど、免疫原性の危険性は高くなる。従って、一部の特徴においては、アクセサリーポリペプチドは少数の異なる８量体又は９量体を含み、そしてその場合、これらのペプチド配列の全て又は大部分は好ましくは多くのコピーを有するヒトプロテオーム内に存在する。
【０１６１】
所望により、２つ又は３つのアミノ酸の型のブレンド物を、特性の所望のバランスを得るために、最適化することができる。２０の天然のアミノ酸（ＡＡ）を、関連する特性を有する群に分離できる。残基Ｅ、Ｄは（そして若干Ｃも）生理学的（中性）ｐＨにおいて負荷電しており、そして残基Ｋ、Ｒ、そして若干Ｈは中性ｐＨにおいて正荷電している。荷電した残基Ｅ、Ｄ、Ｋ及びＲの存在は長鎖ポリペプチドの水溶性を最大限にするために望ましい場合がある。一部の生物学的用途のためには、高い電荷密度を有するが低い実質電荷を有する未荷電、又はほぼ未荷電のポリペプチドをもたらす負及び正の残基の高度であるが等しいか同様の頻度を有することが望ましく、そのようなポリペプチドはヘパリンのような荷電した重合体に結合する受容体との非特異的相互作用の傾向は低値である。一部の生物学的用途に対しては、（Ｄとは異なり）化学的に安定である単一の電荷の型（負）であり；従ってＥ（グルタメート）に好都合である。問題点はアミノ酸のどの程度のパーセンテージがＥであるべきか、そして非荷電アミノ酸の大部分はＧ又はＳであるべきかどうか、そして配列は高度に反復性であるべきか、低反復性であるべきかどうかである。
【０１６２】
負荷電残基Ｅ、Ｄの高頻度はＤＮＡ結合タンパク質、ヒストン及び他のＲ、Ｋリッチ配列のような正電荷多数を有する分子に重合体を結合させると考えられる。正荷電残基Ｋ、Ｒの高頻度は大部分の細胞表面を包含する負電荷を多数有する表面に重合体を結合させると考えられる。細胞表面への結合は一般的には望ましくないがそのような非特異的結合が低い程度で存在すれば、半減期の増大のために有用である場合がある。極性の、親水性アミノ酸であるＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅ及び追加的にアミノ酸Ｃ及びＹは相対的に水溶性であるアクセサリーポリペプチドを作成する場合に有用であることができる。Ｑ及びＮはグリコシル化部位であることができ、流体力学的半径を増大させ、これにより半減期を延長する別個の機序を与える。非極性の疎水性残基、例えばＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｍ、Ｃは高度に水溶性の配列を作成する場合の有用性は低いが、これらの残基の１つ以上を、それらが全体の１０〜２０％を構成するような低い頻度で配合することは、望ましい場合がある。例えば、疎水性残基の置換基の現定数は血清曝露部位への非特異的結合を増大させることにより半減期を延長することができる。同様に、システイン残基に由来する遊離のチオールは、ヒト血清アルブミン中の遊離のチオールのような、他の遊離のチオールに結合することによる半減期延長のための機序として機能する場合がある。更に又、これらの低好適性のアミノ酸は血清曝露タンパク質に結合するペプチドを形成するために使用でき、これによりアクセサリータンパク質に対して、流体力学的半径以外の、第２の半減期延長機序を付与することができる。
【０１６３】
グリシンは、流体力学的半径の質量に対する、又は見かけの分子量の予測された分子量に対する比が高いことから、アクセサリーポリペプチドにおいて使用できる。グリシンは側鎖を有しておらず、従って７０Ｄａの最も小型の残基である。その小さい大きさのために、それは最大の回転自由度及び最大のエントロピーを与える。このため、タンパク質は、グリシンの高頻度において配列に結合することは困難であり、そしてグリシンリッチの配列は高度にプロテアーゼ耐性である。
【０１６４】
残基Ｃ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅは他の残基と水素結合を形成でき、そしてこのため、構造（分子間水素結合）及び他のタンパク質への結合（分子間水素結合）を支援することができる。これらは構造が望まれない場所では排除され、或いはある程度の結合（特異的又は非特異的）が半減期延長のために必要である場合は包含されることができる。イオウ含有残基Ｃ及びＭは典型的には、アクセサリーポリペプチドにおいては回避されるが、システインはその遊離のチオールを介して半減期をもたらすために包含される場合があり、そして更に、血清曝露タンパク質に結合することにより半減期を延長するため、又は組織特異的部位に結合することにより組織標的化又は調整された生体分布を得るために低免疫原性の結合エレメントとして環状ペプチド中で使用することができる。
【０１６５】
１つの実施形態において、アクセサリーポリペプチドは反復配列を全く含有しないか、又は最小限のみ含有する。ＩｇＭは５価であり、そして反復配列を認識する傾向を示す。ＩｇＭとの低親和性の接点であってもＩｇＭの５価性により顕著な見かけの親和性（アビディティ）がもたらされる場合がある。反復の程度が低減され、そしてＩｇＭ結合の尤度が低減されている配列を形成するための１つの方法は、長い（即ち反復長が７、８、９、１０、１２、１４、１６、２０、３０、４０、５０、７０、１００、１５０、２００アミノ酸である）反復配列を使用することである。低減した反復を有する配列の例は（ＳＥＳＳＳＥＳＳＥ）ｎ、（ＳＳＥＳＳＳＳＥＳＳＳＥ）ｎ、（ＳＳＳＥＳＳＳＳＳＥＳＳＳＳＥ）ｎ、又は（ＳＳＳＳＥＳＳＳＳＳＳＥ）ｎであり、ここで同様の全体的組成を有する反復配列は（ＳＳＥ）ｎ、（ＳＳＳＥ）ｎ、（ＳＳＳＳＥ）ｎ、（ＳＳＳＳＳＥ）ｎ又は（ＳＳＳＳＳＳＥ）ｎとなる。別の手順では同じアクセサリーポリペプチドにおいて相互に混合された多数のモチーフ及び／又はモチーフ１つ以上の変異（例えばモチーフの配列変異、スペーシングの変異、及びモチーフを分離する配列中の変異）の使用を行う。本発明の他の特徴は、大部分が非反復性であり、そして所望のアミノ酸組成を有する長鎖の、完全ヒト型又はヒト化された配列の使用を可能にする。関連の実施形態においては、アミノ酸の他の型又はアミノ酸の他の型に基づいたモチーフを点在させることができる。例としてはＧＥＧＥＳＥＧＥＧＥＧＥＳＥＧＥＧＥＳＧＥが挙げられる。
【０１６６】
アミノ酸の３つの異なる型を含有するアクセサリーポリペプチド配列：
１つの実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸の３つの異なる型を含有する配列を含む。１つ又は２つと比較した場合の３つのアミノ酸の利点は、意図する商業的用途のために最終品重合体の特性を微調整する能力が増大していることである。
【０１６７】
本発明の１つの特定の実施形態は、アミノ酸の３つの異なる型を含有する非反復配列を提供する。本発明の別の実施形態は、アミノ酸がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ及びＹからなる群より選択される、アミノ酸の３つの異なる型を含有する非反復配列を提供する。本実施形態の例示される配列を表１に示す。好ましい実施形態においては、アミノ酸はＤ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、Ｓ及びＴからなる群より選択される。より好ましい実施形態においては、アミノ酸はＥ、Ｓ、Ｇ、Ｒ及びＡからなる群より選択される。最も好ましい実施形態においては、アミノ酸はＥ、Ｇ及びＳである。そのようなタンパク質において、好ましい組成物は３０〜７０％（最良：５０〜６０％）の範囲のＧ、２０〜４０％（最良：２５〜３０％）の範囲のＥ及び１０〜２５％の範囲のＳを有することが必要であり、そして好ましくは９〜１５ＡＡ超を有する各配列の１、２、３、４又は５コピー（リピート）のみを有する。
【０１６８】
別個の実施形態において、アクセサリーポリペプチドは反復配列モチーフを含有する配列を含み、ここで各反復配列モチーフはアミノ酸の３つの異なる型を含有し、そしてここでアミノ酸はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ及びＹからなる群より選択される。本実施形態に関する例示される配列を表１に示す。１つの実施形態において、アミノ酸はＤ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、Ｓ及びＴからなる群より選択される。別の実施形態においては、アミノ酸はＥ、Ｓ、Ｇ、Ｒ及びＡからなる群より選択される。更に別の実施形態において、アミノ酸はＥ、Ｇ及びＳ（何れかの順序）である。
【０１６９】
関連の実施形態において、本発明のアクセサリーポリペプチドは反復配列モチーフ内で組織化されたアミノ酸の３つの異なる型を含有し、ここで各反復配列モチーフは３連続アミノ酸より長鎖である。本実施形態に関する例示される配列を表１に示す。反復配列モチーフは正方向又は逆方向であることができ、そして１、２、３、４以上の異なる型のモチーフが同じタンパク質内に別個に、又は相互に混合されて存在することができる。リピートは完全又は不完全であることができ、１、２、３、４、５以上のミスマッチ残基を有し、そしてリピートは近接しているか、分散していることができ、このことは、それらが同じモチーフを含まない他の未関連の配列により分離されていることを意味する。一部の実施形態においては、反復配列がアクセサリーポリペプチドの大部分を構成するが、他の実施形態においては非反復配列が優勢となる。１つの特定の実施形態においては、反復配列は配列の厳密に反復性の性質を破壊する点在する単一のアミノ酸を含有する。本実施形態に関する例示される配列を表１に示す。別の関連する実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは、異なる型のアミノ酸のより少ない数と共に、反復又は非反復の配列中で組織化されたアミノ酸の主に３つの型を含有し、ここでアミノ酸の該３つの型が全配列の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は＞９９％超を構成する。
【０１７０】
反復モチーフの多数の型を含む配列の別の例はＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥである。他の好ましい例は２、３、４、５以上のモチーフの種々の組み合わせを有する配列であり、ここでモチーフはＥ、Ｓ、Ｇ、ＧＥ、ＧＳ、ＳＥ、ＧＥＳ、ＧＳＥ、ＥＳＧ、ＥＧＳ、ＳＧＥ、及びＳＥＧから選択され、これにより組成物（Ｅ）ｎ、（Ｓ）ｎ、（Ｇ）ｎ、（ＧＥ）ｎ、（ＧＳ）ｎ、（ＳＥ）ｎ、（ＧＥＳ）ｎ、（ＧＳＥ）ｎ、（ＥＳＧ）ｎ、（ＥＧＳ）ｎ、（ＳＧＥ）ｎ、及び（ＳＥＧ）並びに多くの追加的配列がもたらされる。
【０１７１】
モチーフ中、又は重合体配列中のアミノ酸の組成はバランスをとる（例えば５０％Ｇと５０％Ｅ；又は３３％Ｇ、３３％Ｅと３３％Ｓ、及び他の同様の例）ことができ、或いはバランスを取らない（即ち７５％Ｓと２５％Ｅ）こともできる。
【０１７２】
アクセサリー配列リピートはタンパク質のＮ末端に、タンパク質のＣ末端に、或いは、Ｎ末端又はＣ末端から１、２、３、４、５、６、１０、２０、３０アミノ酸残基以上離れて、位置することができる。ポリアミノ酸もまた２つのタンパク質ドメインの間に存在できる。
【０１７３】
ポリアミノ酸中のモチーフのリピートの数は４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００の下限、及び１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、又は更には６００の上限を有することができる。
【０１７４】
反復モチーフは多数派のアミノ酸の型及び少数派のアミノ酸の型を有することができる。ある所定の反復モチーフに関して、多数派のアミノ酸の型の残基が少数派の型のものより多くなる。例えば、アクセサリーポリペプチド（ＧＧＧＥＥ）ｎの場合、Ｇが多数派であり、そしてＥが少数派のアミノ酸の型である。これらの配列は明らかにバランスを取られていない。そのようなモチーフにおいて、２、３、４以上の多数派のアミノ酸の型を有することが可能である。好ましい実施形態においては、多数派のアミノ酸はＧ、Ｅ、Ｓであり、そして少数派のアミノ酸はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙであり、ここで追加的な制約事項として、同じアミノ酸の型がモチーフ中に存在する多数派及び少数派のグループの両方に入っていることはない。そのようなモチーフにおいて、少数派アミノ酸の２つ以上の型を有することが可能であり；一例は（ＧＧＥＧＧＳ）ｎであり、ここでＧが多数派の型であり、そしてＥ及びＳが少数派の型のアミノ酸である。他の例は（ＥＧＧＳＧＧ）ｎ、（ＧＥＧＧＳＧ）ｎ、（ＧＧＳＧＧＥ）ｎ、（ＳＧＧＥＧＧ）ｎ、（ＧＳＧＧＥＧ）ｎ、（ＧＥＥＧＳＳ）ｎ、（ＧＳＳＧＥＥ）ｎ、（ＳＧＳＥＧＥ）ｎ、（ＳＳＧＥＥＧ）ｎである。
【０１７５】
特定の配列にかかわりなく、アクセサリー配列内のアミノ酸残基の総数は、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、又は３００アミノ酸の下限、及び３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又更には６００、７００、８００、９００又は１０００アミノ酸超の上限を有する。これらの数は単一の近接配列の長さを、又は、非近接で存在する多数のモチーフを含む多数の配列に関して合計した累積的な長さを指すことができ、これらのリピートが分散しており、そして異なるモチーフのリピートを包含する他の配列により分離されていることを意味している。
【０１７６】
【表１】
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アミノ酸の２つの異なる型を含有するアクセサリーポリペプチド：
１つの実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸の２つの異なる型を含有する配列を含む。
【０１７７】
特定の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸の２つの異なる型を含有する配列を含み、ここでアミノ酸の一方はグリシンであり、そしてもう一方はＤ、Ｅ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｈ、Ｎ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、Ｍ、Ｆ、Ｉ又はＣである。より特定の実施形態はアミノ酸の２つの異なる型を含有する配列を含むアクセサリーポリペプチドを提供し、ここでアミノ酸の一方はグリシンであり、そしてここでグリシンは全配列の０％、半分又は半分未満を構成する。関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドは１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は更には１００％のグリシン残基を含む。
【０１７８】
異なる実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸の２つの異なる型を含有する配列を含み、ここでアミノ酸の一方はセリンであり、そしてもう一方はＤ、Ｅ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、Ｇ、Ｔ、Ａ、Ｈ、Ｎ、Ｙ、Ｌ、Ｖ、Ｗ、Ｍ、Ｆ、Ｉ又はＣである。より特定の実施形態はアミノ酸の２つの異なる型を含有する配列を含むアクセサリーポリペプチドを提供し、ここでアミノ酸の一方はセリンであり、そしてここでセリンは全配列の０％、半分又は半分未満を構成する。関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドは１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は更には１００％のセリン残基を含む。
【０１７９】
関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸の２つの異なる型を含み、ここでアミノ酸は等しい、又は概ね等しい量（１：１比）において表される。関連する実施形態において、アミノ酸の２つの型は１：２、１：３、２：３、３：４の比で表される。例示される配列を表２に示す。
【０１８０】
本発明の代替となる実施形態はアミノ酸の２つの異なる型を含有する配列を含むアクセサリーポリペプチドを提供し、ここで総アミノ酸の半分又は半分未満はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｅ又はＨである。
【０１８１】
本発明の代替となる実施形態はアミノ酸の２つの異なる型を含有する配列を含むアクセサリーポリペプチドを提供し、ここでアミノ酸の半分以上はＧであり、そして総アミノ酸の半分又は半分未満はＡ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ又はＨである。
【０１８２】
本発明の別の実施形態はアミノ酸の２つの異なる型を含有する配列を含むアクセサリーポリペプチドを提供し、ここでアミノ酸の半分以上はＳであり、そして総アミノ酸の半分又は半分未満はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｅ又はＨである。
【０１８３】
本発明の別の実施形態はアミノ酸の２つの異なる型を含有する配列を含むアクセサリーポリペプチドを提供し、ここで総アミノ酸の半分又は半分未満はＰ、Ｒ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、Ｆ、Ｉ、Ｋ又はＣである。
【０１８４】
反復配列モチーフを含むアクセサリーポリペプチドもまた包含され、ここで配列モチーフは２、３、４、５、６、７、８、９以上のアミノ酸よりなることができる。
【０１８５】
モチーフ中、又は重合体配列中のアミノ酸の組成はバランスをとる（例えば５０％Ｓと５０％Ｅ）、或いはバランスをとらない（即ち７５％Ｓ及び２５％Ｅ）ことができる。
【０１８６】
アクセサリーポリペプチドリピートはタンパク質のＮ末端に、タンパク質のＣ末端に、或いは、Ｎ末端又はＣ末端から１、２、３、４、５、６、１０、２０、３０アミノ酸残基以上離れて、位置することができる。ポリアミノ酸もまた２つのタンパク質ドメインの間に存在できる。
【０１８７】
ポリアミノ酸中のモチーフのリピートの数は４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００の下限、及び１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、又は更には６００の上限を有することができる。
【０１８８】
アクセサリーポリペプチドにおけるアミノ酸残基の総数は２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、又は３００アミノ酸の下限、及び、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、又は更には６００、７００、８００、９００又は１０００超のアミノ酸の上限を有することができる。この数は単一の近接配列の長さを、又は、非近接で存在する多数の配列に関して合計した累積的な長さを指すことができ、これらのリピートが分散しており、そして異なるモチーフのリピートを包含する他の配列により分離されていることを意味している。
【０１８９】
２つのアミノ酸を含む可能なモチーフはＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＨ、ＡＩ、ＡＫ、ＡＬ、ＡＭ、ＡＮ、ＡＰ、ＡＱ、ＡＲ、ＡＳ、ＡＴ、ＡＶ、ＡＷ、ＡＹ、ＤＡ、ＤＥ、ＤＦ、ＤＧ、ＤＨ、ＤＩ、ＤＫ、ＤＬ、ＤＭ、ＤＮ、ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ、ＤＳ、ＤＴ、ＤＶ、ＤＷ、ＤＹ、ＥＡ、ＥＤ、ＥＦ、ＥＧ、ＥＨ、ＥＩ、ＥＫ、ＥＬ、ＥＭ、ＥＮ、ＥＰ、ＥＱ、ＥＲ、ＥＳ、ＥＴ、ＥＶ、ＥＷ、ＥＹ、ＦＡ、ＦＤ、ＦＥ、ＦＧ、ＦＨ、ＦＩ、ＦＫ、ＦＬ、ＦＭ、ＦＮ、ＦＰ、ＦＱ、ＦＲ、ＦＳ、ＦＴ、ＦＶ、ＦＷ、ＦＹ、ＧＡ、ＧＤ、ＧＥ、ＧＦ、ＧＨ、ＧＩ、ＧＫ、ＧＬ、ＧＭ、ＧＮ、ＧＰ、ＧＱ、ＧＲ、ＧＳ、ＧＴ、ＧＶ、ＧＷ、ＧＹ、ＨＡ、ＨＤ、ＨＥ、ＨＦ、ＨＧ、ＨＩ、ＨＫ、ＨＬ、ＨＭ、ＨＮ、ＨＰ、ＨＱ、ＨＲ、ＨＳ、ＨＴ、ＨＶ、ＨＷ、ＨＹ、ＩＡ、ＩＤ、ＩＥ、ＩＦ、ＩＧ、ＩＨ、ＩＫ、ＩＬ、ＩＭ、ＩＮ、ＩＰ、ＩＱ、ＩＲ、ＩＳ、ＩＴ、ＩＶ、ＩＷ、ＩＹ、ＫＡ、ＫＤ、ＫＥ、ＫＦ、ＫＧ、ＫＨ、ＫＩ、ＫＬ、ＫＭ、ＫＮ、ＫＰ、ＫＱ、ＫＲ、ＫＳ、ＫＴ、ＫＶ、ＫＷ、ＫＹ、ＬＡ、ＬＤ、ＬＥ、ＬＦ、ＬＧ、ＬＨ、ＬＩ、ＬＫ、ＬＭ、ＬＮ、ＬＰ、ＬＱ、ＬＲ、ＬＳ、ＬＴ、ＬＶ、ＬＷ、ＬＹ、ＭＡ、ＭＤ、ＭＥ、ＭＦ、ＭＧ、ＭＨ、ＭＩ、ＭＫ、ＭＬ、ＭＮ、ＭＰ、ＭＱ、ＭＲ、ＭＳ、ＭＴ、ＭＶ、ＭＷ、ＭＹ、ＮＡ、ＮＤ、ＮＥ、ＮＦ、ＮＧ、ＮＨ、ＮＩ、ＮＫ、ＮＬ、ＮＭ、ＮＮ、ＮＰ、ＮＱ、ＮＲ、ＮＳ、ＮＴ、ＮＶ、ＮＷ、ＮＹ、ＰＡ、ＰＤ、ＰＥ、ＰＦ、ＰＧ、ＰＨ、ＰＩ、ＰＫ、ＰＬ、ＰＭ、ＰＮ、ＰＱ、ＰＲ、ＰＳ、ＰＴ、ＰＶ、ＰＷ、ＰＹ、ＱＡ、ＱＤ、ＱＥ、ＱＦ、ＱＧ、ＱＨ、ＱＩ、ＱＫ、ＱＬ、ＱＭ、ＱＮ、ＱＰ、ＱＲ、ＱＳ、ＱＴ、ＱＶ、ＱＷ、ＱＹ、ＲＡ、ＲＤ、ＲＥ、ＲＦ、ＲＧ、ＲＨ、ＲＩ、ＲＫ、ＲＬ、ＲＭ、ＲＮ、ＲＰ、ＲＱ、ＲＲ、ＲＳ、ＲＴ、ＲＶ、ＲＷ、ＲＹ、ＳＡ、ＳＤ、ＳＥ、ＳＦ、ＳＧ、ＳＨ、ＳＩ、ＳＫ、ＳＬ、ＳＭ、ＳＮ、ＳＰ、ＳＱ、ＳＲ、ＳＳ、ＳＴ、ＳＶ、ＳＷ、ＳＹ、ＴＡ、ＴＤ、ＴＥ、ＴＦ、ＴＧ、ＴＨ、ＴＩ、ＴＫ、ＴＬ、ＴＭ、ＴＮ、ＴＰ、ＴＱ、ＴＲ、ＴＳ、ＴＶ、ＴＷ、ＴＹ、ＶＡ、ＶＤ、ＶＥ、ＶＦ、ＶＧ、ＶＨ、ＶＩ、ＶＫ、ＶＬ、ＶＭ、ＶＮ、ＶＰ、ＶＱ、ＶＲ、ＶＳ、ＶＴ、ＶＷ、ＶＹ、ＷＡ、ＷＤ、ＷＥ、ＷＦ、ＷＧ、ＷＨ、ＷＩ、ＷＫ、ＷＬ、ＷＭ、ＷＮ、ＷＰ、ＷＱ、ＷＲ、ＷＳ、ＷＴ、ＷＶ、ＷＹ、ＹＡ、ＹＤ、ＹＥ、ＹＦ、ＹＧ、ＹＨ、ＹＩ、ＹＫ、ＹＬ、ＹＭ、ＹＮ、ＹＰ、ＹＱ、ＹＲ、ＹＳ、ＹＴ、ＹＶ、ＹＷである。これらのうち、好ましい２アミノ酸モチーフはＥＧとＧＥ（重合体ＥＧＥＧＥＧＥＧＥＧＥ及び他の変異体を形成）、ＧＳとＳＧ（重合体ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ及び他の変異体を形成）、ＥＳとＳＥ（重合体ＳＥＳＥＳＥＳＥＳＥＳＥＳＥＳＥＳ及び他の変異体を形成）である。リピートは又３、４、５、６又は７アミノ酸残基を含むことができる。リピートは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は更には＞２０残基を含むことも可能である。このようなリピートの各々はリピート内に存在する残基の数まで、２、３、４、５以上の型のアミノ酸を含有してよい。
【０１９０】
アクセサリーの１つの好ましい型は僅か２つのアミノ酸の型のみを含有するが、残基の５０％以上が好ましい残基（Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｈ）の１つである。一部の場合においては、アクセサリーポリペプチドは僅か２つの主要な型のアミノ酸を含有するが、アクセサリーポリペプチドの特性の最適な微調整のためにより低い比のＰ、Ｒ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｗ、Ｍ、Ｆ、Ｉ、Ｋ又はＣを添加することができる（表２参照）。
【０１９１】
【表２−１】
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【０１９２】
【表２−２】
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【０１９３】
【表２−３】
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ヒト配列に関連するアクセサリーポリペプチド配列
ヒトタンパク質の配列に緊密に関連するアクセサリーポリペプチド配列は、それらが患者における免疫反応を誘導する危険性が減衰していることから一部の用途においては望ましい。そのような配列は本発明の一部の実施形態においてアクセサリーポリペプチドとして使用してよい。ヒト配列へのアクセサリー配列の関連性はヒトゲノムにおける該アクセサリーポリペプチド配列の部分配列の豊富度を測定することにより評価できる。表３は８量体の部分配列の発生に関する例を示す。アクセサリーポリペプチドは切断することにより表３に示す通り少数の８量体配列とすることができ、ここでは８量体に下線を付してある。各８量体配列に関し、ヒトタンパク質配列のデータベースにおけるマッチ数を識別するためにデータベース検索を実施できる。同様の分析を７量体、９量体、１０量体、１１量体、又はより長いオリゴマーに関して実施できる。これらの部分配列の完全なマッチを求めて検索を行いながらデータベース分析を行うことができ、或いは緊密な相同体を求めて検索することができる。即ち、検索のストリンジェンシーは、アクセサリーポリペプチドをヒトタンパク質に対するそれらの関連性に関して順位づけできるように調節することができる。表３のデータはアクセサリーポリペプチドをヒトタンパク質に対する緊密関連度に基づいて選択し、その数例を示している。特に興味深いものは配列（ＳＳＳＳＥ）ｎ、（ＳＳＳＳＳＳＥ）ｎ、及び（ＳＳＳＳＥＳＳＳＳＳＳＥ）ｎのアクセサリータンパク質であり、式中全ての８量体サブ配列は数種のヒトタンパク質中に存在する場合がある。
【０１９４】
【表３−１】
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【０１９５】
【表３−２】
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未構造化組み換え重合体（ＵＲＰ）：
本発明の１つの特徴はアクセサリーポリペプチドとしての未構造化組み換え重合体（ＵＲＰ）の使用である。主題のＵＲＰは治療上及び／又は診断上の価値を有する組み換えタンパク質を形成する場合に特に有用である。主題ＵＲＰは以下に示す特徴の１つ以上を呈する。
【０１９６】
主題ＵＲＰは生理学的条件下で変性されたペプチド配列と共通部分を典型的には共有しているアミノ酸配列を含む。ＵＲＰ配列は典型的には生理学的条件下で変性されたペプチド配列と同様の挙動を示す。ＵＲＰ配列は生理学的条件下では明確に定義された二次及び三次構造を欠いている。所定のポリペプチドの二次及び三次構造を確認するための種々の方法が当該分野で確立されている。例えば、ポリペプチドの二次構造は「遠ＵＶ」スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）においてＣＤスペクトル分析により測定できる。アルファヘリックス、ベータシート、及びランダムコイルの構造は各々、ＣＤスペクトルの特徴的な形状及び大きさを生じさせる。二次構造は又Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムのような特定のコンピュータプログラム又はアルゴリズムを介して確認できる（Ｃｈｏｕ，Ｐ．Ｙ．ら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２−４５）。所定のＵＲＰ配列に関して、アルゴリズムは二次構造が一部あるのか、又は全くないのかを予測できる。一般的に、ＵＲＰ配列は二次及び三次構造の程度が低いため変性された配列に似たスペクトルを有することになる。所望により、ＵＲＰ配列は生理学的条件下では主に変性されたコンホーメーションを有するように設計できる。ＵＲＰ配列は典型的には生理学的条件下では高度なコンホーメーション柔軟性を有し、そしてそれらは同様の分子量の球状タンパク質と比較して大きい流体力学的な半径（ストークス半径）を有する傾向がある。本明細書においては、生理学的条件とは生体対象のものを模倣した温度、塩濃度、ｐＨを包含する一連の条件を指す。インビトロの試験において使用するための生理学的に該当する条件の宿主が樹立されている。一般的に、生理学的緩衝液は生理学的濃度の塩を含有し、そして約６．５〜約７．８、好ましくは約７．０〜約７．５の範囲の中性のｐＨに調節されている。種々の生理学的緩衝液は上記したＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に列挙されており、従って本明細書においては詳述しない。生理学的に該当する温度は約２５℃〜約３８℃、好ましくは約３０℃〜約３７℃の範囲である。
【０１９７】
主題ＵＲＰは低免疫原性を有する配列であることができる。低免疫原性はＵＲＰ配列のコンホーメーション柔軟性の直接の結果である場合がある。多くの抗体がタンパク質抗原中のいわゆるコンホーメーションエピトープを認識する。コンホーメーションエピトープはタンパク質抗原の多数の不連続のアミノ酸配列を含むタンパク質表面の領域により形成される。タンパク質の厳密な折り畳みはこれらの配列を抗体により認識され得る明確に定義された特殊な配置とする。好ましいＵＲＰはコンホーメーションエピトープの形成を回避するように設計される。例えば特に興味深いものは水溶液中で緻密に折り畳まれたコンホーメーションを採用する傾向が低いＵＲＰ配列である。特に、低い免疫原性は抗原提示細胞において抗原のプロセシングに抵抗する配列を選択すること、ＭＨＣに良好に結合しない配列を選択すること、及び／又は、ヒト配列から誘導された配列を選択することにより達成できる。
【０１９８】
主題ＵＲＰは高度なプロテアーゼ耐性を有する配列である場合がある。プロテアーゼ耐性はまたＵＲＰ配列のコンホーメーション柔軟性の結果である場合がある。プロテアーゼ耐性は既知のプロテアーゼ認識部位を回避することにより設計できる。或いは、プロテアーゼ耐性配列はランダム又は半ランダム配列ライブラリからファージディスプレイ又は関連の手法により選択できる。デポ剤タンパク質からの緩徐放出のような特殊な用途のために望まれる場合は、血清プロテアーゼ切断部位をＵＲＰ内部に構築できる。特に興味深いものは血中において高い安定性を有するＵＲＰ配列である（例えば長い血清中半減期、生体の体液中に存在するプロテアーゼによる切断を被り難い）。
【０１９９】
主題ＵＲＰは又、生物学的に活性なポリペプチド内へのその取り込み時に、修飾ポリペプチドが未修飾の生物学的に活性なポリペプチドと比較してより長い血清中半減期及び／又はより高値の溶解性を呈するという作用を特徴とする場合がある。主題ＵＲＰは（ａ）ＵＲＰを含むタンパク質の血清中半減期の延長；（ｂ）結果として生じるタンパク質の溶解性の上昇；（ｃ）プロテアーゼへの増大した耐性；及び／又は（ｄ）結果として生じるＵＲＰを含むタンパク質の低減された免疫原性を呈するために必要な何れかの長さのものであることができる。典型的には主題ＵＲＰは約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００以上連続するアミノ酸を有する。タンパク質内に取り込まれれば、ＵＲＰは、結果として生じるタンパク質が多数のＵＲＰ、又は多数のＵＲＰフラグメントを含有するようにフラグメント化することができる。これらの個々のＵＲＰ配列の一部又は全ては、結果として生じるタンパク質内の全てのＵＲＰ配列の合計長が少なくとも４０アミノ酸である限り、４０アミノ酸より短くてもよい。好ましくは、結果として生じるタンパク質は４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上のアミノ酸を超えるＵＲＰ配列の合計長を有する。
【０２００】
ＵＲＰは１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５又更には１３．０の等電点（ｐＩ）を有してよい。
【０２０１】
一般的にＵＲＰ配列は親水性アミノ酸がリッチであり、そして疎水性又は芳香族アミノ酸の低いパーセンテージを含有する。適当な親水性残基は例えば限定しないがグリシン、セリン、アスパルテート、グルタメート、リジン、アルギニン、及びスレオニンを包含する。ＵＲＰの構築において好適度が低い疎水性残基はトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、及びメチオニンを包含する。ＵＲＰ配列はグリシンリッチである場合があるが、ＵＲＰ配列は又アミノ酸グルタメート、アスパルテート、セリン、スレオニン、アラニン又はプロリンがリッチである場合もある。即ち、優勢なアミノ酸はＧ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｔ、Ａ又はＰであってよい。プロリン残基を含むことはタンパク質分解に対する感受性を低減する傾向がある。
【０２０２】
親水性残基を包含することは典型的には生理学的条件下での水及び水性媒体中のＵＲＰの溶解性を上昇させる。これらのアミノ酸組成の結果として、ＵＲＰ配列は水性製剤中で凝集塊を形成する傾向が低く、そして他の生物学的に活性なポリペプチド又はペプチドへのＵＲＰ配列の融合はそれらの溶解性を増大させ、そして凝集塊を形成するそれらの傾向を低減する傾向を有し、これは免疫原性を低減する別個の機序である。
【０２０３】
ＵＲＰ配列は生物学的に活性なポリペプチドに望ましくない特性を付与する特定のアミノ酸を回避するように設計できる。例えば以下のアミノ酸、即ちシステイン（ジスルフィド形成及び酸化を回避するため）、メチオニン（酸化を回避するため）、アスパラギン及びグルタミン（デスアミド化を回避するため）を僅かしか含有しないか、又は全く含有しないようにＵＲＰ配列を設計できる。
【０２０４】
グリシンリッチＵＲＰ：
１つの実施例において、主題ＵＲＰはグリシンリッチ配列（ＧＲＳ）を含む。例えばグリシンはそれが目的の配列中に存在する最も優勢な残基であるように優先的に存在することができる。別の実施例においては、ＵＲＰ配列は、グリシン残基が総アミノ酸の少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％を構成するように設計できる。ＵＲＰは又１００％グリシンを含有できる。更に別の実施例において、ＵＲＰは少なくとも３０％のグリシンを含有し、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン及びイソロイシンの総濃度は２０％未満である。又別の実施例において、ＵＲＰは少なくとも４０％のグリシンを含有し、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン及びイソロイシンの総濃度は１０％未満である。又別の実施例において、ＵＲＰは少なくとも５０％のグリシンを含有し、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン及びイソロイシンの総濃度は５％未満である。
【０２０５】
ＧＲＳの長さは約５アミノ酸〜２００アミノ酸以上に変動できる。例えば単一の近接ＧＲＳの長さは５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２４０、２８０、３２０又は４００以上のアミノ酸を含有できる。ＧＲＳは又両方の末端にグリシン残基を含んでよい。
【０２０６】
ＧＲＳは又、他のアミノ酸、例えばＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、又はＰｒｏのかなりの含有量を有することができる。ＧＲＳは例えば限定しないがＡｓｐ及びＧｌｕを包含する負荷電のアミノ酸のかなりの画分を含有できる。ＧＲＳは例えば限定しないがＡｒｇ又はＬｙｓを包含する正荷電のアミノ酸のかなりの画分を含有できる。所望によりＵＲＰは、２０種の型のアミノ酸の大部分を一般的に含んでいる典型的なタンパク質及び典型的なリンカーとは対照的に、単一の型のアミノ酸（例えばＧｌｙ又はＧｌｕ）、場合により僅か数種の型のアミノ酸、例えば２〜５つの型のアミノ酸（例えばＧ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｔ、Ａ及びＰから選択）を含有するように設計できる。ＵＲＰはアミノ酸位置の３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１パーセントにおいて負荷電の残基（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）を含有してよい。
【０２０７】
典型的には、主題のＧＲＳ含有ＵＲＰは約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上連続するアミノ酸を有する。生物学的に活性なポリペプチドに取り込まれる場合、ＵＲＰは、結果として生じる修飾ポリペプチドが多数のＵＲＰ、又は多数のＵＲＰフラグメントを含有するように、フラグメント化することができる。これらの個々のＵＲＰ配列の一部又は全ては、結果として生じるポリペプチド中の全てのＵＲＰ配列の合計長が少なくとも３０アミノ酸である限り、４０アミノ酸より短くてもよい。好ましくは、結果として生じるポリペプチドはアミノ酸４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上を超えたＵＲＰ配列の合計長を有する。
【０２０８】
ＧＲＳ含有ＵＲＰは部分的にはグリシン含有ペプチドの増大したコンホーメーションの自由度のために特に興味深い。溶液中の変性ペプチドは高度なコンホーメーション自由度を有する。そのコンホーメーション自由度の大部分は受容体、抗体、又はプロテアーゼのような標的への該ペプチドの結合により失われる。このエントロピー損失はペプチドとその標的の間の相互作用のエネルギーにより相殺される必要がある。変性ペプチドのコンホーメーション自由度の程度はそのアミノ酸配列に依存している。小型の側鎖を有するアミノ酸多くを含有するペプチドは、より大型の側鎖を含むペプチドよりも、高度なコンホーメーション自由度を有する傾向がある。アミノ酸グリシンを含有するペプチドは特に大きい自由度を有する。グリシン含有ペプチド結合は相当するアラニン含有配列と比較して溶液中で約３．４倍大きいエントロピーを有することが推定されている（Ｄ’Ａｑｕｉｎｏ，Ｊ．Ａ．ら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２５：１４３−５６）。この因子は配列中のグリシン残基の数に伴って増大する。その結果、そのようなペプチドは、他のタンパク質と相互作用するそれらの全体的能力並びに明確な三次元構造を採用するそれらの能力を低減する、標的結合時のより多くのエントロピーの損失の傾向を有する。グリシンペプチド結合の大きいコンホーメーション柔軟性は又、グリシンペプチド結合が他のペプチド結合ではめったに占有されない領域を占有するタンパク質構造のＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットを分析する場合にも顕在化する（Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍ，Ｃ．Ｍ．ら（１９６９）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，３８：４５−８２）。Ｓｔｉｔｅｓらは２０アミノ酸の各々のｐｈｉ、ｐｓｉコンホーメーション好適性を測定するために６１の非相同性の高解像度の結晶構造に由来する１２，３２０残基のデータベースを検討している。タンパク質のネイティブの状態において観察された分布は、変性した状態において存在する分布を反映していると推定される。分布は各残基のエネルギー表面を概算するために使用されており、これによりグリシンと比較した場合の各残基の相対的なコンホーメーションエントロピーの計算が可能となる。最も極端な例においては、プロリンによるグリシンの置き換え、コンホーメーションエントロピーの変化は、変性状態と比較した場合にネイティブの状態を２０℃で−０．８２＋／−０．０８ｋｃａｌ／ｍｏｌ安定化させることになる（Ｓｔｉｔｅｓ，Ｗ．Ｅ．ら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２２：１３２）。これらの観察結果は２０の天然のアミノ酸のうちのグリシンの特殊な役割を確認するものである。
【０２０９】
主題のＵＲＰを設計する場合、天然又は非天然の配列を使用できる。例えば高いグリシン含有量を有する天然の配列の宿主は表４、表５、表６、及び表７に示す通りである。当業者であれば、ＵＲＰとしていずれか１つの配列を採用するか、又は意図する特性を達成するために配列を修飾してよい。宿主対象に対する免疫原性が問題となる場合は、宿主から誘導されたグリシンリッチの配列に基づいてＧＲＳ含有ＵＲＰを設計することが好ましい。好ましいＧＲＳ含有ＵＲＰは、ヒトタンパク質由来の配列、又はレファレンスヒトタンパク質中の相当するグリシンリッチ配列とかなりの相同性を共有している配列である。
【０２１０】
【表４】
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【０２１１】
【表５】
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【０２１２】
【表６】
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【０２１３】
【表７−１】
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【０２１４】
【表７−２】
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【０２１５】
【表７−３】
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【０２１６】
【表７−４】
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【０２１７】
【表７−５】
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【０２１８】
【表７−６】
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【０２１９】
【表７−７】
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非グリシン残基含有（ＮＧＲ）ＵＲＰ：
これらのＧＲＳにおける非グリシン残基の配列はＵＲＰ、そしてその結果として所望のＵＲＰを含有する生物学的に活性なポリペプチドの特性を最適化するために選択できる。例えば、結果として生じる修飾ポリペプチドの、特定の組織、特定の細胞片又は細胞系統に対する選択性を増強するためにＵＲＰの配列を最適化できる。例えばユビキタスには発現されないが、むしろ心臓、肝臓、前立腺、肺、腎臓、骨髄、血液、皮膚、膀胱、脳、筋肉、神経、及び感染性疾患、自己免疫疾患、腎臓、神経、心臓の疾患及び癌のような疾患に罹患している選択された組織を包含する身体組織の１つ以上のにおいて示差的に発現されるタンパク質配列を取り込むことができる。多細胞生物における外胚葉、内胚葉又は中胚葉の形成の間、胚又は生体において発現されるもののような特定の発生起源の代表例である配列を使用できる。更に又、特定の生物学的プロセス、例えば限定しないが細胞周期の調節、細胞の分化、アポトーシス、化学遊走、細胞の運動性及び細胞骨格再配列に関与する配列を利用できる。更に又、結果として生じるタンパク質を、特定の細胞下の位置、即ち：細胞外マトリックス、核、細胞質、細胞骨格、原形質及び／又は細胞内膜構造、例えば限定しないが被覆少窩、ゴルジ体、小胞体、エンドソーム、リソソーム、及びミトコンドリアに指向させるために他の非ユビキタスに発現されるタンパク質配列を利用できる。
【０２２０】
これらの種々の組織特異的、細胞片特異的、細胞下位置特異的な配列は知られており、そして多くのタンパク質データベースから入手できる。そのような選択的ＵＲＰ配列はランダム又は半ランダムなＵＲＰ配列のライブラリを作成すること、それを動物又は患者に注入すること、そして、組織試料中における所望の組織選択性を有する配列を決定することにより得ることができる。配列の決定は質量スペクトルにより実施できる。同様の方法を用いながら経口、口内、経腸、経鼻、髄腔内、腹腔内、肺内、直腸内、又は経皮の取り込みを促進するＵＲＰ配列を選択できる。
【０２２１】
特に興味深いものは細胞の取り込み又は膜を通過する輸送に好都合な正荷電アミノ酸アルギニン又はリジンが相対的にリッチである領域を含有するＵＲＰ配列である。ＵＲＰ配列は１個又は数個のプロテアーゼ感受性配列を含有するように設計できる。そのようなＵＲＰ配列は本発明の生成物がその標的位置に到達すれば、切断されることができる。この切断は薬学的に活性なドメインの力価の増大をトリガーする（プロドラッグ活性化）か、又はそれは受容体への切断産物の結合を増強する場合がある。ＵＲＰ配列はアスパラギン酸又はグルタミン酸の残基を導入することにより過剰な負電荷を担持するように設計できる。特に興味深いものは５％超、６％超、７％、８％、９％、１０％、１５％、３０％以上のグルタミン酸及び２％未満のリジン又はアルギニンを含有するＵＲＰである。そのようなＵＲＰは過剰な負電荷を担持し、そしてその結果として、それらはペプチドの個々の負電荷の間の静電気的反発力のために解放されたコンホーメーションを採用する傾向を有する。そのような過剰な負電荷はそれらの流体力学的半径の効果的な増大をもたらし、そしてその結果として、それはそのような分子の低減した腎クリアランスをもたらすことができる。即ち、ＵＲＰ配列中の負荷電のアミノ酸の頻度及び分布を制御することによりＵＲＰ配列の有効実質電荷及び流体力学的半径を調整することができる。ヒト又は動物の大部分の組織及び表面字は過剰な負電荷を担持している。過剰な負電荷を担持するようにＵＲＰ配列を設計することにより、結果として生じるＵＲＰを含む修飾ポリペプチドと血管、健常組織、又は種々の受容体のような種々の表面との間の非特異的相互作用を最小限にできる。
【０２２２】
ＵＲＰはフォーマット（モチーフ）ｘの反復アミノ酸配列を有し、式中、配列モチーフは正方向のリピート（即ちＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ）又は逆方向のリピート（ＡＢＣＣＢＡＡＢＣＣＢＡ）を形成し、そしてこれらのリピートの数は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、５０以上であることができる。ＵＲＰ又はＵＲＰ内部のリピートは頻繁には僅か１、２、３、４、５又は６つの異なる型のアミノ酸を含有する。ＵＲＰは典型的には４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６アミノ酸長以上のヒトアミノ酸配列のリピートよりなるが、ＵＲＰは又２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０アミノ酸長である非ヒトアミノ酸配列よりなってもよい。
【０２２３】
ヒト配列から誘導されたＵＲＰ：
ＵＲＰはヒト配列から誘導できる。ヒトゲノムは１つの特定のアミノ酸がリッチである多くのサブ配列を含有する。特に興味深いものはセリン、スレオニン、グルタメート、アスパルテート、又はグリシンのような親水性アミノ酸がリッチであるアミノ酸配列である。特に興味深いものは疎水性アミノ酸を殆ど含有しないサブ配列である。そのようなサブ配列は未構造化状態であり、そして水溶液中で高度に溶解性であることが予測される。そのようなヒトサブ配列はそれらの利用性をさらに向上させるために修飾することができる。例えばデンチンシアロホスホタンパク質は６７０アミノ酸のサブ配列を含有し、それにおいては、残基の６４％がセリンであり、そして大部分の他の位置は親水性アミノ酸、例えばアスパルテート、アスパラギン、及びグルタメートである。配列は極端に反復性であり、そしてその結果として、低情報含有量を有する。そのようなヒトタンパク質のサブ配列を直接使用できる。所望により配列をその全体的特徴は温存されるがそれを医薬品用途としてより適したものとする方法において修飾できる。デンチンシアロホスホタンパク質に関連する配列の例は（ＳＳＤ）ｎ、（ＳＳＤＳＳＮ）ｎ、（ＳＳＥ）ｎであり、ここでｎは約４〜２００である。
【０２２４】
ヒトタンパク質由来の配列の使用はヒト対象における低減された免疫原性を有するＵＲＰの設計において特に望ましい。外来性タンパク質への免疫応答を誘発するための重要な工程はＭＨＣクラスＩＩ受容体による該タンパク質のペプチドフラグメントの提示である。これらのＭＨＣＩＩ結合フラグメントを次にＴ細胞受容体により検出することができ、これがＴヘルパー細胞の増殖をトリガーし、そして免疫応答を開始させる。医薬品タンパク質に由来するＴ細胞エピトープの排除は免疫応答を誘発する危険性を低減するための手段として認識されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ，Ｍ．ら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８１：９５−１０８）。ＭＨＣＩＩ受容体は典型的にはディスプレイされたペプチドの例えば９アミノ酸超の領域を有するエピトープと相互作用する。即ち、タンパク質の可能な９量体サブ配列の全て又は大部分をヒトタンパク質中に発見することができれば患者においてタンパク質への免疫応答を誘発する危険性を低減することができ、そしてそうであれば、これらの配列及びこれらの配列のリピートは外来性配列として患者により認識されなくなるはずである。適当なアミノ酸組成を有するヒト配列をオリゴマー化又は連結させることによりＵＲＰ配列の設計にヒト配列を取り込むことができる。これらは正方向のリピート又は逆方向のリピート又は異なるリピートの混合物であることができる。例えば、表５に示す配列をオリゴマー化することができる。そのようなオリゴマーは免疫原性となる危険性が低減されている。しかしながら、単量体単位の間の接合部配列はなお、免疫反応をトリガーすることができるＴ細胞エピトープを含有している場合がある。多数の重複するヒト配列に基づいてＵＲＰ配列を設計することにより免疫応答を誘発する危険性を更に低減することができる。ＵＲＰ配列は、オリゴマーの各９量体サブ配列がヒトタンパク質中に存在できるように、多数のヒト配列に基づいてオリゴマーとして設計してよい。これらの設計において、各９量体サブ配列はヒト配列である。例えばＵＲＰ配列は３つのヒト配列に基づいてよい。更に又、オリゴマーのＵＲＰ配列中の全ての可能な９量体サブ配列が同じヒトタンパク質内に生じるように、単一のヒト配列に基づいてＵＲＰ配列を設計することも可能である。非オリゴマーのＵＲＰ配列もヒトタンパク質に基づいて設計できる。主要な条件は９量体サブ配列全てがヒト配列中に存在できるというものである。配列のアミノ酸組成は好ましくは疎水性残基を殆ど含有しない。特に興味深いものはヒト配列に基づいて設計され、そしてグリシン残基の大画分を含有するＵＲＰ配列である。
【０２２５】
このスキーム又は同様のものを利用しながら、目的の宿主に対して低い免疫原性を有するリピート配列を含むＵＲＰのクラスを設計することができる。目的の宿主は脊椎動物及び無脊椎動物を包含する何れかの動物であることができる。好ましい宿主は哺乳類、例えば霊長類（例えばチンパンジー及びヒト）、クジラ類（例えばクジラ及びイルカ）、翼手動物類（例えばコウモリ）、奇蹄類（例えばウマ及びサイ）、げっ歯類（例えばラット）、及び特定の種類の食虫動物類、例えばトガリネズミ、モグラ及びハリネズミである。ヒトを宿主として選択する場合、ＵＲＰは典型的にはリピート配列又は単位の多数のコピーを含有し、その場合約６〜約１５連続するアミノ酸を含むセグメントの大多数が１つ以上のネイティブのヒトタンパク質中に存在する。更に又、約９〜約１５連続するアミノ酸を含むセグメントの大多数が１つ以上のネイティブのヒトタンパク質中に存在するＵＲＰも設計できる。本明細書においては、セグメントの大多数とは約５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％、好ましくは９０％、好ましくは１００％より多いことを指す。所望により、反復単位内の約６〜１５アミノ酸、好ましくは約９〜１５アミノ酸の可能なセグメントの各々は１つ以上のネイティブヒトタンパク質中に存在する。ＵＲＰは２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の反復単位を有する多数の反復単位又は配列を含むことができる。
【０２２６】
ヒトＴ細胞エピトープを実質的に含有しないＵＲＰの設計：
ＵＲＰ配列はヒトＴ細胞により認識されるエピトープを実質的に含有しないように設計できる。例えば変性した未構造化状態のコンホーメーションに好都合であるアミノ酸組成を有する半ランダム配列のシリーズを合成し、そしてこれらの配列を、ヒトＴ細胞エピトープの存在に関して、そしてそれらがヒト型の配列であるかどうかについて、評価することができる。ヒトＴ細胞エピトープに関する試験は報告されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ，Ｍ．ら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８１：９５−１０８）。特に興味深いものはＴ細胞エピトープ又は非ヒト配列を形成することなくオリゴマー化できるペプチド配列である。これは、Ｔ細胞エピトープの存在に関して、そしてヒト型ではない６〜１５量体、特に９量体のサブ配列の発生に関して、これらの配列の正方向リピートを試験することにより達成できる。代替法は、ヒト配列の組み立てに関して前のセクションで記載した通り、反復単位内に組み込むことができる多数のペプチド配列を評価することである。別の代替法はＴＥＰＩＴＯＰＥ（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，Ｔ．ら（１９９９）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７：５５５−６１）のようなエピトープ予測アルゴリズムを用いながら低スコアをもたらすＵＲＰ配列を設計することである。Ｔ細胞エピトープを回避するための別の手順はＭ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＦのようなＭＨＣ上のペプチドディスプレイの間にアンカー残基として作用できるアミノ酸を回避することである。疎水性アミノ酸及び正荷電アミノ酸は、そのようなアンカー残基として作用できる場合が頻繁であり、そしてＵＲＰ配列におけるそれらの頻度を最小限とすることはＴ細胞エピトープを形成する、そしてその結果として免疫反応を誘発する機会を低減する。選択されたＵＲＰは一般的に少なくとも１つのヒトタンパク質中に存在するサブ配列を含有し、そしてより低い含有量の疎水性アミノ酸を有する。
【０２２７】
ＵＲＰ配列はタンパク質生産を最適化するように設計できる。これはコードするＤＮＡの反復性を回避又は最小限化することにより達成できる。ポリグリシンのようなＵＲＰ配列は極めて望ましい薬学的特性を有する場合があるが、それらの製造は、ＧＲＳに関してコードしているＤＮＡ配列のＧＣ含有量が高いため、そして組み換えをもたらす場合がある反復ＤＮＡ配列が存在するために、困難になる場合がある。
【０２２８】
上記した通り、ＵＲＰ配列はアミノ酸レベルにおいて高度に反復性であるように設計できる。その結果ＵＲＰ配列は極めて低い情報含有量を有し、そして免疫反応を誘発する危険性を低減できる。
【０２２９】
反復アミノ酸を含有するＵＲＰの非限定的な例は、ポリグリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリセリン、ポリスレオニン、（ＧＸ）ｎただしＧはグリシンであり、そしてＸはセリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、又はプロリンであり、そしてｎは少なくとも２０であるもの、（ＧＧＸ）ｎただしＸはセリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、又はプロリンであり、そしてｎは少なくとも１３であるもの、（ＧＧＧＸ）ｎただしＸはセリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、又はプロリンであり、そしてｎは少なくとも１０であるもの、（ＧＧＧＧＸ）ｎただしＸはセリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、又はプロリンであり、そしてｎは少なくとも８であるもの、（ＧｚＸ）ｎただしＸはセリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、又はプロリンであり、そしてｎは少なくとも１５であり、そしてｚは１〜２０であるもの、
である。
【０２３０】
これらのリピートの数は１０〜１００の何れかの数であることができる。本発明の生成物は半ランダム配列であるＵＲＰ配列を含有してよい。例としては少なくとも３０、４０、５０、６０又は７０％グリシンを含有する半ランダム配列であり、その場合、グリシンは十分分散しており、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの総濃度は合わせて７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０％未満である。好ましい半ランダムＵＲＰ配列は少なくとも４０％グリシンを含有し、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの総濃度は１０％未満である。より好ましいランダムＵＲＰ配列は少なくとも５０％グリシンを含有し、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの総濃度は５％未満である。ＵＲＰ配列はより短いＵＲＰ配列又はＵＲＰ配列のフラグメント２つ以上の配列を組み合わせることにより設計できる。そのような組み合わせにより、ＵＲＰ配列を含有する生成物の薬学的特性を良好に調整できるようになり、そしてＵＲＰ配列をコードするＤＮＡ配列の反復性を低減することができ、これによりＵＲＰをコードする配列の発現を向上させ、そして組み換えを低減することができる。
【０２３１】
ＵＲＰ配列は以下の所望の特性、即ち：ａ）産生宿主中でのコーディング配列の高度な遺伝子的安定性、ｂ）高レベルの発現、ｃ）低い（予測／計算された）免疫原性、ｄ）血清プロテアーゼ及び／又は他の組織プロテアーゼの存在下での高い安定性、ｅ）生理学的条件下での大きい流体力学的半径のいくつかを保有するように設計し、選択することができる。多数の基準に合致するＵＲＰ配列を得るための１つの例示される手順は候補配列のライブラリを構築すること、及び、適当なサブ配列をライブラリから識別することである。ライブラリはランダム及び／又は半ランダム配列を含むことができる。特に有用なものはコドンライブラリであり、これは同一のアミノ酸残基に対して多数のコドンを含有するＤＮＡ分子のライブラリである。コドンのランダム化は特定の型の選択されたアミノ酸位置に、或いは大部分又は全ての位置に適用できる。真のコドンライブラリは単一のアミノ酸配列のみをコードするが、それらはアミノ酸ライブラリと容易に組み合わせることができ、これは、同じ残基位置における（関連又は未関連の）アミノ酸の混合物をコードするＤＮＡ分子の集団である。コドンライブラリはＤＮＡレベルでは比較的低い反復性を有するが高度に反復性のアミノ酸配列をコードする遺伝子の識別を可能にする。これが有用である理由は、反復ＤＮＡ配列は組み換えを起こす傾向があり、不安定性をもたらすためである。更に又、限定されたアミノ酸多様性をコードするコドンライブラリも構築できる。そのようなライブラリは配列の一部の位置においてアミノ酸の限定された数量の導入を可能にしつつ、他の位置はコドン変動を可能にするが、全てのコドンが同じアミノ酸をコードしている。オリゴヌクレオチド合成の間、同じ位置にヌクレオチドの混合物を取り込むことにより部分ランダムオリゴヌクレオチドを合成できる。そのような部分ランダムオリゴヌクレオチドは重複ＰＣＲ又はライゲーション系の手順により融合できる。特に、グリシンリッチ配列をコードする半ランダムオリゴヌクレオチドを多量体化できる。これらのオリゴヌクレオチドは長さ及び配列及びコドンの使用において異なる場合がある。その結果、候補ＵＲＰ配列のライブラリを得ることができる。ライブラリを形成する別の方法は出発配列を合成し、その後、該配列を部分ランダム化に付すことである。これは突然変異菌株におけるＵＲＰ配列をコードする遺伝子の培養によるか、又はコードしている遺伝子を突然変異誘発条件下に増幅することにより行える（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．ら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５）。所望の特性を有するＵＲＰ配列は種々の方法を用いてライブラリから識別できる。高度な遺伝子安定性を有する配列は生成宿主におけるライブラリの培養によりリッチ化できる。不安定な配列は突然変異を蓄積し、これはＤＮＡ配列決定により識別できる。高レベルで発現できるＵＲＰ配列の変異体は当業者の知る多数のプロトコルを用いたスクリーニング又は選択により識別できる。例えばライブラリから多数の単離株を培養し、発現レベルを比較することができる。発現レベルはゲル分析、分析用クロマトグラフィー、又は種々のＥＬＩＳＡ系の方法により計測できる。個々の配列変異体の発現レベルの計測はｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグのような配列タグに候補ＵＲＰ配列のライブラリを融合することにより促進できる。別の手順は控訴又は他のレポータータンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質にライブラリを融合させることである。特に興味深いものは、選択マーカー、例えばベータラクタマーゼ又はカナマイシンアシルトランスフェラーゼへのライブラリの融合である。高レベルの発現及び良好な遺伝子安定性を有する変異体をリッチ化するために抗生物質選択を使用できる。良好なプロテアーゼ耐性を有する変異体はプロテアーゼと共にインキュベートした後に未損傷の配列があるかどうかスクリーニングすることにより識別できる。プロテアーゼ耐性ＵＲＰ配列を識別するための有効な方法は細菌ファージディスプレイ又は関連のディスプレイ法である。急速なタンパク質分解を起こす配列をファージディスプレイによりリッチ化することができる多数の系が報告されている。これらの方法はプロテアーゼ耐性配列をリッチ化するために容易に適合させることができる。例えば、アフィニティータグとＭ１３ファージのＰＩＩＩタンパク質の間に候補ＵＲＰ配列のライブラリをクローニングすることができる。次にライブラリをプロテアーゼ又はプロテアーゼ含有生物学的試料、例えば血液又はリソソーム調製品に曝露することができる。プロテアーゼ耐性配列を含有するファージはプロテアーゼ処理後にアフィニティータグに結合させることによりキャプチャーできる。リソソーム調製品による分解に耐性である配列は、リソソーム分解が樹状細胞及び他の抗原提示細胞における抗原の提示の間の重要な工程であることから、特に興味深い。ファージディスプレイは低い免疫グロブリン性を有するＵＲＰ配列番号を識別するために特定の免疫血清に結合しない候補ＵＲＰ配列を識別するために利用できる。候補ＵＲＰ配列で、又はＵＲＰ配列のライブラリで動物を免疫化することによりライブラリにおけるＵＲＰ配列に対する抗体を作成できる。次に得られた血清をファージパニングのために使用することにより、結果として生じる免疫系において抗体により認識される配列を除去又は識別できる。細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイのような他の方法を利用することにより所望の特性を有するＵＲＰ配列の変異体を識別できる。他の手順は質量スペクトルによる目的のＵＲＰ配列の識別である。例えば、候補ＵＲＰ配列のライブラリをプロテアーゼ又は目的の生物学的試料と共にインキュベートし、そして分解に耐性である配列を質量スペクトルで識別することができる。同様の手順において、経口取り込みを促進するＵＲＰ配列を識別できる。候補ＵＲＰ配列の混合物を動物又はヒトに給餌し、そして一部の組織バリヤ（即ち皮膚など）を通過する最高の転移又は取り込みの効率を有する変異体を質量スペクトルにより識別できる。同様の方法において、肺、鼻内、直腸、経皮送達のような他の取り込み機序に好都合なＵＲＰ配列を識別することができる。また更に、細胞取り込みに好都合であるＵＲＰ配列、又は細胞取り込みに耐性であるＵＲＰ配列を識別することができる。
【０２３２】
ＵＲＰ配列は上記した方法のいずれかにより設計されたＵＲＰ配列又はＵＲＰ配列のフラグメントを組み合わせることにより設計できる。更に又、上記した規則に基づいて設計された配列を最適化するために半ランダムの手順を適用できる。特に興味深いものは、増強されたポリペプチドの発現を向上させるという目的のコドン最適化、及び生成宿主中のコードしている遺伝子の遺伝子安定性を向上させることである。コドンの最適化は、グリシンリッチであるか、極めて反復性のアミノ酸配列を有するＵＲＰ配列のためには特に重要である。コドンの最適化はコンピュータプログラム（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｃ．ら（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３４６−５３）を用いて実施でき、その一部はリボソーム休止を最小限にする（Ｃｏｄａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．）。ＵＲＰ配列を設計する場合、多くの特性を考慮できる。コードしているＤＮＡ配列における反復性を最小限にできる。更に又、産生宿主によりめったに使用されないコドンの使用を回避又は最小限にすることができる（即ちＥ．ｃｏｌｉにおけるＡＧＧ及びＡＧＡアルギニンコドン及び１つのロイシンコドン）。高レベルのグリシンを有するＤＮＡ配列は不安定性又は低い発現レベルをもたらす場合がある高いＧＣ含有量を有する傾向がある。即ち、可能であれば、ＵＲＰを製造するために使用することになる産生生物にとってＵＲＰをコードする配列のＧＣ含有量が適当であるように、コドンを選択することが好ましい。
【０２３３】
ＵＲＰをコードする遺伝子は１つ以上の工程において、完全に合成によるか、又は酵素的プロセスと組み合わせた合成、例えば制限酵素媒介クローニング、ＰＣＲ及び重複伸長により作成できる。ＵＲＰアクセサリーポリペプチドはＵＲＰアクセサリーポリペプチドをコードする遺伝子が低い反復性を有している一方、コードされたアミノ酸配列は高度な反復性を有するように構築できる。第１工程として、比較的短いＵＲＰ配列のライブラリを構築する。これは、各ライブラリメンバーが同じアミノ酸配列を有するが、多くの異なるコーディング配列が可能である純粋なコドンライブラリであることができる。良好に発現するライブラリメンバーの識別を促進するためには、レポータータンパク質への融合物としてライブラリを構築できる。適当なレポーター遺伝子の例は緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼである。スクリーニングにより、選択された宿主生物において高濃度で発現することができる短いＵＲＰ配列を識別できる。その後、ランダムＵＲＰの２量体のライブラリを形成し、そして高レベルの発現のためにスクリーニングを反復する。２量体化はライゲーション、重複伸長又は同様のクローニング手法により実施できる。２量化のこのプロセス及びその後のスクリーニングは得られるＵＲＰ配列が所望の長さに到達するまで多数回反復できる。場合により、望ましくない配列を含有する単離株を排除するためにライブラリ中のクローンを配列決定することができる。短いＵＲＰ配列の初期ライブラリはアミノ酸配列の一部の変異を可能にする場合がある。例えば、多くの親水性アミノ酸が該位置に生じることができるように一部のコドンをランダム化できる。繰り返し多量体化のプロセスの間、高レベル発現に関するスクリーニングのほかに、溶解性又はプロテアーゼ耐性のような別の特性に関してライブラリメンバーをスクリーニングできる。ＵＲＰ配列を２量化する代わりに、より長い多量体を作成できる。これによりＵＲＰアクセサリーポリペプチドの長さを早く増大することができる。
【０２３４】
多くのＵＲＰ配列が高画分で特定のアミノ酸を含有する。そのような配列は、それらのコーディング遺伝子が組み換えに付される反復配列を含有する場合があるため、組み換え手法により生成することが困難である場合がある。更に又、極めて高い頻度で特定のコドンを含有する遺伝子は、産生宿主における該当するロードされたｔＲＮＡが限定要因となるため、発現を制限する場合がある。一例としてはＧＲＳの組み換え生産である。グリシン残基は４つのトリプレット、ＧＧＧ、ＧＧＣ、ＧＧＡ及びＧＧＴによりコードされる。その結果、ＧＲＳをコードする遺伝子は高いＧＣ含有量を有する傾向があり、そして特に反復性である傾向がある。追加的な克服対象は産生宿主のコドンの偏りに起因する場合がある。Ｅ．ｃｏｌｉの場合、２つのグリシンコドンＧＧＡ及びＧＧＧは高発現タンパク質においてはめったに使用されない。即ちＵＲＰ配列をコードする遺伝子のコドン最適化は極めて望ましい場合がある。コドン使用の最適化は産生宿主のコドンの偏りを考慮したコンピュータプログラムを使用することにより行える（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｃ．ら（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３４６−５３）。代替法として、ライブラリの全メンバーが同じアミノ酸配列をコードしているがコドン使用が変動するコドンライブラリを構築できる。そのようなライブラリはＵＲＰ含有産物の大規模生産に特に適している高発現性の遺伝子的に安定なメンバーを得るためにスクリーニングできる。
【０２３５】
多価未構造化組み換えタンパク質（ＭＵＲＰ）：
上記した通り、主題のＵＲＰは生物学的に活性なポリペプチドの修飾のためのアクセサリーポリペプチドとして特に有用である。従って本発明は主題ＵＲＰ１つ以上を含むタンパク質を提供する。そのようなタンパク質は本明細書においては多価未構造化組み換えタンパク質（Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＭＵＲＰ））と称する。
【０２３６】
ＭＵＲＰを構築するためには、１つ以上のＵＲＰ配列を、タンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合するか、又は、タンパク質の中央において、例えばタンパク質のループ内部に、又は目的の生物学的に活性なポリペプチドのモジュールの間に、挿入することができ、これにより結果として得られる修飾ポリペプチドに未修飾のタンパク質と比較した場合に進歩した特性を付与できる。タンパク質に結合するＵＲＰ配列の合計の長さは４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上のアミノ酸であることができる。
【０２３７】
主題のＭＵＲＰは以下に詳述する通り進歩した特性１つ以上を呈する。
【０２３８】
進歩した半減期：
生物学的に活性なポリペプチドにＵＲＰ配列を付加することはそのタンパク質の多くの特性を向上できる。特に、長いＵＲＰ配列を付加することはタンパク質の血清中半減期を有意に増大できる。そのようなＵＲＰは典型的には少なくとも約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上のアミノ酸のアミノ酸配列を含有する。
【０２３９】
ＵＲＰは結果として生じるタンパク質が多数のＵＲＰ又はＵＲＰの多数のフラグメントを含有するようにフラグメント化できる。これらの個々のＵＲＰ配列の一部又は全ては、結果として生じるタンパク質中の全てのＵＲＰ配列の合計長が少なくとも３０アミノ酸である限り４０アミノ酸より短くてよい。好ましくは、結果として生じるタンパク質は４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上のアミノ酸を超えるＵＲＰ配列の合計長を有する。１つの特徴において、融合したＵＲＰはタンパク質の流体力学的半径を増大し、そしてその結果、腎臓による血液からのそのクリアランスを低減することができる。結果として生じる融合タンパク質の流体力学的半径の未修飾タンパク質と比較した場合の増大は超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、又は光散乱により検出できる。
【０２４０】
進歩した組織選択性：
流体力学的半径の増大は又組織内への浸透をもたらす場合があり、これを利用することにより生物学的に活性なポリペプチドの副作用を最小限にできる。親水性重合体は腫瘍組織中に選択的に蓄積する傾向を有することは十分明らかにされており、これは増強した浸透性及び貯留（ＥＰＲ）の作用により誘発される。ＥＰＲ作用の伏在的原因は腫瘍脈管の漏出性（ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｄ．Ｍ．ら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６２：５３８１−５）及び腫瘍組織中のリンパドレナージの欠如である。従って、腫瘍組織に対する生物学的に活性なポリペプチドの選択制は親水性重合体を付加することにより増強できる。それにより所定の生物学的に活性なポリペプチドの治療指数は主題ＵＲＰの取り込みを介して上昇できる。
【０２４１】
分解からの保護及び低減した免疫原性：
ＵＲＰ配列を付加させることはタンパク質のプロテアーゼ耐性を有意に向上できる。ＵＲＰ配列自体をプロテアーゼ耐性となるように設計でき、そしてそれらをタンパク質に付加させることにより分解酵素の接触からそのタンパク質を遮蔽できる。ＵＲＰ配列は他の受容体又は表面とのタンパク質の望ましくない相互作用を低減するという目標で生物学的に活性なポリペプチドに付加できる。これを達成するためには、そのような望ましくない接触を起こすタンパク質の部位の近接部において生物学的に活性なポリペプチドにＵＲＰ配列を付加させることが有益である場合がある。特に、ＵＲＰ配列は、本発明の生成物に対する免疫応答を防止するために免疫系の何れかの成分とのそれらの相互作用を低減するという目標で、生物学的に活性なポリペプチドに付加することができる。生物学的に活性なポリペプチドにＵＲＰ配列を付加させることは、既存の抗体又はＢ細胞受容体との相互作用を低減できる。更に又、ＵＲＰ配列の付加は抗原提示細胞による本発明の生成物の取り込み及びプロセシングを低減できる。１つ以上のＵＲＰ配列をタンパク質に付加させることは、それが多くの種において免疫応答を抑制することになり、これにより動物のデータに基づいて患者における生成物の期待される免疫原性を予測できるようになるため、その免疫原性を低減する好ましい方法である。そのような免疫原性の種非依存性試験は、ヒトＴ細胞エピトープの識別及び除去、又はヒト配列との配列比較に基づいた手順に対しては可能ではない。
【０２４２】
Ｔ細胞エピトープの中断：
ＵＲＰ配列はＴ細胞エピトープを中断するためにタンパク質に導入できる。これは多数の別個の機能的モジュールを組み合わせたタンパク質の場合に特に有用である。Ｔ細胞エピトープの形成はタンパク質抗原のペプチドフラグメントがＭＨＣに結合することを必要とする。ＭＨＣ分子は提示されたペプチドの典型的には９近接残基であるアミノ酸の短いセグメントと相互作用する。タンパク質分子の異なる結合モジュールの直接の融合は２つの隣接するドメインに渡るＴ細胞エピトープをもたらす場合がある。ＵＲＰアクセサリーポリペプチドにより機能的モジュールを分離することにより、そのようなモジュールに渡っているＴ細胞エピトープの形成を防止できる。機能的モジュール間のＵＲＰ配列の挿入は又、抗原提示細胞におけるタンパク質分解性のプロセシングを妨害することができ、これにより免疫原性の追加的低減が起こることになる。
【０２４３】
進歩した溶解性：
タンパク質の機能的モジュールは限定された溶解性を有する場合がある。特に、結合モジュールはその表面に疎水性の残基を担持する傾向があり、これがその溶解性を制限する場合狩り、そして凝集塊形成をもたらす場合がある。ＵＲＰアクセサリーポリペプチドでそのような機能的モジュールをスペーシング又はフランキングすることにより、結果として生じる生成物の全体的溶解性を向上できる。これは多大なパーセンテージの親水性又は荷電した残基を担持するＵＲＰアクセサリーポリペプチドの場合に特に当てはまる。可溶性ＵＲＰモジュールで機能的モジュールを分離することにより、これらの機能的モジュールの間の分子内相互作用を低減できる。
【０２４４】
進歩したｐＨプロファイル及び生成物電荷の均一性：
ＵＲＰ配列は負又は正電荷の過剰量を担持するように設計できる。その結果、それらは何れかの融合相手に対して静電気的な場を与え、これは、酵素又は結合相互作用のｐＨプロファイルをシフトするために使用できる。更に又、荷電したＵＲＰ配列の静電気的な場はタンパク質生成物の表面電荷のｐＫａ値の均一性を増大させることができ、これはリガンド相互作用のｐＨプロファイルのシャープさ、及び等電点電気泳動又はクロマト電気泳動による分離のシャープさをもたらす。
【０２４５】
よりシャープな生成物ｐＫａによる向上した精製特性：
溶液中の各アミノ酸自体は単一の固定されたｐＫａを有し、これはその官能基が半プロトン化されるｐＨである。典型的なタンパク質においては残基には多くの型があり、そして接近性及びタンパク質換気作用により、それらは様々な態様において相互の有効ｐＫａを変化させる。このため広範なｐＨ条件において、典型的なタンパク質は数百もの異なるイオン化物質種を採用し、その各々は荷電及び中性アミノ酸残基の多数の組み合わせのために、異なる分子量及び実質電荷を有している。これは広範なイオン化スペクトルと称し、そしてそのようなタンパク質の分析（例えば質量スペクトル分析による）及び精製をより困難にする。
【０２４６】
ＰＥＧは非荷電であり、そしてそれが結合しているタンパク質のイオン化スペクトルに影響せず、広範なイオン化スペクトルを温存する。しかしながら、Ｇｌｙ及びＧｌｕの高含有量を有するＵＲＰは原則として僅か２つの状態のみ、即ちｐＨがグルタメートのｐＫａ未満である場合には中性（−ＣＯＯＨ）、そしてｐＨがグルタメートのｐＫａを超えている場合には負荷電（−ＣＯＯ−）において存在する。ＵＲＰアクセサリーポリペプチドは単一の均質なイオン化された方の分子を形成することができ、そして質量スペクトル分析においては単一の質量を示すことができる。
【０２４７】
所望により、ＭＵＲＰはＵＲＰアクセサリーポリペプチドを通して一定の間隔で分布した電荷の単一な型（Ｇｌｕ）を有するＵＲＰとの融合物として発現できる。ＵＲＰ２０ｋＤ当たり２５〜５０Ｇｌｕ残基を取り込むことを選択してよく、そしてこれらの２５〜５０残基の全てが極めて近いｐＫａを有する場合がある。
【０２４８】
更に又、２５〜５０の負電荷を小型のタンパク質、例えばＩＦＮ、ｈＧＨ又はＧＣＳＦ（２０荷電残基のみを有する）に付加することは、生成物の電荷の均一性を増大させ、そしてその等電点をシャープにし、それは遊離のグルタメートのｐＫａに極めて近くなる。
【０２４９】
タンパク質集団の電荷の均一性の増大は、伝統的なＰＥＧ化と比較して、例えばイオン交換、等電点電気泳動、質量スペクトル分析等において好都合なプロセシング特性を有する。
【０２５０】
生物学的に活性なポリペプチド
アクセサリーポリペプチドに連結できる適当なポリペプチドは、インビトロ又はインビボで使用した場合に所定の標的に対する結合特異性又は別の所望の生物学的活性を示す全ての生物学的に活性なポリペプチドを包含する。特に、治療又は診断上の目的である何れかのタンパク質をアクセサリーポリペプチドにより修飾できる。特に興味深いものは、血清中半減期又はインビボクリアランスのような特定の特性の修飾が望まれるポリペプチドである。そのような修飾は、例えば投与されたタンパク質治療薬の半減期を延長することが望まれる場合、治療用途の範囲に包含される場合がある。アクセサリーポリペプチドによる修飾は例えば診断用タンパク質又は造影剤の他の分子への非特異的結合を低減するために、診断用途においても利用性を示す場合がある。
【０２５１】
生物学的に活性なポリペプチドは例えば限定しないがサイトカイン、ケモカイン、リンホカイン、リガンド、受容体、ホルモン、酵素、抗体及び抗体フラグメント、及び成長因子を包含することができる。受容体の例はＴＮＦＩ型受容体、ＩＬ−１受容体ＩＩ型、ＩＬ−１受容体拮抗剤、ＩＬ−４受容体及び何れかの化学的又は遺伝子的に修飾された可溶性受容体を包含する。酵素の例は、活性化タンパク質Ｃ、第ＶＩＩ因子、コラゲナーゼ（例えば販売元Ａｄｖａｎｃｅ  Ｂｉｏｆａｃｔｕｒｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、販売名Ｓａｎｔｙｌ）；アガルシダーゼ−ベータ（例えば販売元Ｇｅｎｚｙｍｅ、販売名Ｆａｂｒａｚｙｍｅ）；ドルナーゼ−アルファ（例えば販売元Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、販売名Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）；アルテプラーゼ（例えば販売元Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、販売名Ａｃｔｉｖａｓｅ）；ＰＥＧ化アスパラギナーゼ（例えば販売元Ｅｎｚｏｎ、販売名Ｏｎｃａｓｐａｒ）；アスパラギナーゼ（例えば販売元Ｍｅｒｃｋ、販売名Ｅｌｓｐａｒ）；及びイミグルセラーゼ（例えば販売元Ｇｅｎｚｙｍｅ、販売名Ｃｅｒｅｄａｓｅ）を包含する。特定のポリペプチド又はタンパク質の例は例えば限定しないが顆粒級マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒級コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターフェロンガンマ誘導因子Ｉ（ＩＧＩＦ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、ＲＡＮＴＥＳ（活性化時調節、正常Ｔ細胞発現性及び恐らくは分泌性）、マクロファージ炎症タンパク質（例えばＭＩＰ−１−α及びＭＩＰ−１−β）、リーシュマニア伸長開始因子（ＬＥＩＦ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、成長因子、例えば表皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子、（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニュートロフィン−２（ＮＴ−２）、ニュートロフィン−３（ＮＴ−３）、ニュートロフィン−４（ＮＴ−４）、ニュートロフィン−５（ＮＴ−５）、グリア細胞系統誘導神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＴＮＦαＩＩ型受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン及び可溶性糖タンパク質、例えばｇｐｌ２０及びｇｐｌ６０糖タンパク質を包含する。ｇｐ１２０糖タンパク質はヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）エンベロープタンパク質であり、そしてｇｐ１６０糖タンパク質は既知のｇｐ１２０糖タンパク質前駆体である。
【０２５２】
例示すれば、以下に示すものは本発明による修飾に適する場合がある生物学的に活性なポリペプチドの数例である。
【０２５３】
１つの実施形態において、生物学的に活性なポリペプチドはＧＬＰ−１である。ＧＬＰ−１は糖尿病の治療の可能性について現在研究中の約３０アミノ酸のポリペプチドである。ＧＬＰ−１はグルカゴン放出を抑制し、そしてインスリン放出を増大させる。ＧＬＰ−１に対する両方の応答はグルコースの血清中濃度の低下をもたらす。ＧＬＰ−１は身体内のジペプチジルペプチダーゼ−４により急速に分解され、そしてその結果、極めて短い血清中半減期２分を有する。治療用タンパク質としてのＧＬＰ−１の良好な開発にはタンパク質の血清中半減期及び送達を増大させるための製剤が必要である。この例はｒＰＥＧに基づいたｒＰＥＧ−ＧＬＰ−１融合タンパク質（Ｌ２８８）の製造及び治療用途のためのＧＬＰ−１の半減期を向上させるための重合体マトリックス中のそのカプセル化を説明している。
【０２５４】
別の実施形態においては、生物学的に活性なポリペプチドはネシリチド、即ちヒトＢ型ナトリウム排泄増加性ペプチド（ｈＢＮＰ）である。ネシリチドは組み換えＤＮＡ技術を用いながらＥ．ｃｏｌｉ中で製造できる。特定の実施形態においては、ネシリチドは３２アミノ酸配列より成り、分子量は３４６４ｇ／ｍｏｌである。
【０２５５】
更に別の実施形態において、生物学的に活性なポリペプチドは２７アミノ酸よりなる天然に存在するブタセクレチンに同一であるアミノ酸配列を含むペプチドホルモンであるセクレチンである。未修飾のポリペプチド０．４ｍｃｇ／ｋｇの静脈内単回投与の後、合成ヒトセクレチン濃度は９０〜１２０分以内にベースラインのセクレチンレベルまで急速に低下する。合成ヒトセクレチン（アクセサリーポリペプチドで修飾しない）の消失半減期は約４５分である。
【０２５６】
別の実施形態においては、生物学的に活性なポリペプチドはＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞の融合の阻害剤である直鎖３６アミノ酸合成ポリペプチドであるエンフビルチドである。
【０２５７】
別の実施形態においては、生物学的に活性なポリペプチドは特異的で可逆的な直接のトロンビン阻害剤であるビバリルジンである。より特定の実施形態は、分子量１２８０ダルトンの合成の２０アミノ酸ペプチドである生物学的に活性なポリペプチドを提供する。
【０２５８】
或いは、抗血友病因子（ＡＨＦ）は生物学的に活性なポリペプチドとして選択してよい。ＡＨＦは遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系統における合成に使用できる糖タンパク質である。それはＨＥＭＯＦＩＬＭ（商標）ＡＨＦ（Ｂａｘｔｅｒ）又は抗血友病因子（ヒト）［ＡＨＦ（ヒト）］としても知られている。ＨＥＭＯＦＩＬＭ（商標）ＡＨＦの平均インビボ半減期は１４．７±５．１時間（ｎ＝６１）であることが分かっている。
【０２５９】
別の実施形態においては、エリスロポエチンが生物学的活性ポリペプチドである。エリスロポエチンは組み換えＤＮＡ技術により製造される１６５アミノ酸の糖タンパク質であり、内因性エリスロポエチンと同じ生物学的作用を有する。特定の実施形態においては、エリスロポエチンは３０，４００ダルトンの分子量を有し、そしてヒトエリスロポエチン遺伝子が導入されている哺乳類細胞により生産される。生成物は単離された天然のエリスロポエチンの同一アミノ酸配列を含有する場合がある。慢性腎不全を有する成人及び小児の患者において、静脈内投与の後の未修飾の血漿中エリスロポエチンの消失半減期は４〜１３時間の範囲であることが知られている。
【０２６０】
又別の実施形態において、生物学的に活性なポリペプチドはレテプラーゼである。レテプラーゼはクリングル２及びヒトｔＰＡのプロテアーゼドメインを含む組織プラスミノーゲン活性化物質（ｔＰＡ）の非グリコシル化欠失ムテインである。レテプラーゼはネイティブｔＰＡの５２７アミノ酸の３５５個（アミノ酸１〜３及び１７６〜５２７）を含有する。ポリペプチドはＥ．ｃｏｌｉ中で組み換えＤＮＡ技術により生産してよく、そしてＥ．ｃｏｌｉから不活性の封入体として単離し、インビトロ折り畳みプロセスによりその活性型に変換し、そしてクロマトグラフィー分離により精製してよい。未修飾レテプラーゼの分子量は３９，５７１ダルトンである。血栓溶解活性の計測に基づけば未修飾レテプラーゼの有効半減期は約１５分であることが分かっている。
【０２６１】
更に別の実施形態はヒトインターロイキン−１受容体拮抗剤（ＩＬ−ＩＲａ）の組み換え非グリコシル化型であるアナキルナである生物学的に活性なポリペプチドを提供する。１つの例においては、アナキンラは１５３アミノ酸より成り、１７．３キロダルトンの分子量を有する。それはＥ．ｃｏｌｉ細菌発現系を用いながら組み換えＤＮＡ技術により製造してよい。未修飾のアナキルナのインビボ半減期は４〜６時間の範囲であることがわかっている。
【０２６２】
ベカプレルミンも又、生物学的に活性なポリペプチドとして選択してよい。ベカプルミンは局所投与用の組み換えヒト血小板誘導成長因子（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）である。ベカプルミンはコウボ菌株サッカロマイセス・セレビシアエ内への血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）のＢ鎖に関する遺伝子の挿入により組み換えＤＮＡ技術により生産してよい。ベカプレルミンの１つの形態は約２５ｋＤの分子量を有し、そしてジスルフィド結合によりともに結合している２つの同一のポリペプチド鎖を含むホモ２量体である。
【０２６３】
生物学的に活性なポリペプチドは組み換えＤＮＡ技術によりエシェリシア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で生産されるインターロイキン１１（ＩＬ−１１）の組み換え型であるオプレルベキンであってよい。１つの実施形態において、選択された生物学的活性ポリペプチドは約１９，０００ダルトンの分子質量を融資、そして非グリコシル化されている。ポリペプチドは１７７アミノ酸長であり、そしてアミノ末端プロリン残基を欠いていることにおいてのみネイティブのＩＬ−１１の１７８アミノ酸長とは異なっており、これはインビトロ又はインビボの何れかの生物活性において計測可能な差をもたらさないことがわかっている。未修飾のオプレルベキンの終末半減期は約７時間であることがわかっている。
【０２６４】
更に別の実施形態は、グルカゴン、即ち血中グルコースを上昇させ、そして胃腸管の平滑筋を弛緩させるヒトグルカゴンと同一のポリペプチドホルモンである生物学的活性ポリペプチドを提供する。グルカゴンはグルカゴンに関する遺伝子の付加により遺伝子的に改変されているＥ．ｃｏｌｉ細菌の特定の非病原性の実験室菌株中で合成してよい。特定の実施形態においては、グルカゴンは２９アミノ酸残基を含有し、そして３，４８３の分子量を有する単鎖ポリペプチドである。インビボの半減期は８〜１８分の範囲と短いことが分かっている。
【０２６５】
Ｇ−ＣＳＦも又、生物学的活性ポリペプチドとして選択してよい。組み換え顆粒球コロニー刺激因子即ちＧ−ＣＳＦは白血球の回復を刺激するために種々の化学療法の後に使用される。組み換えＧ−ＣＳＦの報告されている半減期は僅か３．５時間である。
【０２６６】
或いは、生物学的活性ポリペプチドはインターフェロンアルファ（ＩＦＮアルファ）であることができる。化学的にＰＥＧ修飾されたインターフェロン−アルファ２ａはＣ型肝炎の治療に関して臨床的に有効化されている。このＰＥＧ化タンパク質は毎週注射を必要とし、そしてより長い半減期を有する緩徐放出製剤が望ましい。
【０２６７】
アクセサリーポリペプチドで修飾してよい、又は生物学的活性ポリペプチドを標的化してよい追加的な細胞タンパク質はＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＶＥＧＦ−Ｒ３、Ｈｅｒ−１、Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−３、ＥＧＦ−１、ＥＧＦ−２、ＥＧＦ−３、Ａｌｐｈａ３、ｃＭｅｔ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＦＡ−１、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＩＬ−６、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＯＸ４０、ＩＬ−１ｂ、ＴＡＣＩ、ＩｇＥ、ＢＡＦＦ又はＢＬｙｓ、ＴＰＯ−Ｒ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＩＬ−１−Ｒ１、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、補体受容体１、ＦＧＦａ、オステオポンチン、ビトロネクチン、エフリンＡ１−Ａ５、エフリンＢ１−Ｂ３、アルファ−２−マクログロブリン、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＰＤＧＦ、ＴＧＦｂ、ＧＭＣＳＦ、ＳＣＦ、ｐ４０（ＩＬ１２／ＩＬ２３）、ＩＬ１ｂ、ＩＬ１ａ、ＩＬ１ｒａ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２３、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、Ｆｌｔ３リガンド、４１ＢＢ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、ＫＧＦ、ＦＧＦ−７、ＳＣＦ、ネトリン１，２、ＩＦＮａ，ｂ，ｇ、カスパーゼ２、３、７、８、１０、ＡＤＡＭＳ１、Ｓ５、８、９、１５、ＴＳ１、ＴＳ５；アジポネクチン、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ−１、ＡＰＲＩＬ、アネキシンＶ、アンジオゲニン、アンフィレグリン、アンジオポエチン１，２，４、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂｃｌ−２、ＢＡＣＥ−１、ＢＡＫ、ＢＣＡＭ、ＢＤＮＦ、ｂＮＧＦ、ｂＥＣＧＦ、ＢＭＰ２、３、４、５、６、７、８；ＣＲＰ、カドヘリン６、８、１１；カテプシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｓ、Ｖ、Ｘ；ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＧＰ２ｂ３ａ、ＧＨ受容体、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＩＬ−２３（ｐ４０、ｐ１９）、ＩＬ−１２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、α４β１、α４β７、ＴＮＦ／リンホトキシン、ＩｇＥ、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＢＬＹＳ／ＢＡＦＦ、ＩＬ−２Ｒ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ジゴキシン、Ｒｈｏ（Ｄ）、水痘、肝炎、ＣＭＶ、破傷風、ワクシニア、抗ヘビ毒、ボツリヌス、Ｔｒａｉｌ−Ｒ１、Ｔｒａｉｌ−Ｒ２、ｃＭｅｔ、ＴＮＦ−Ｒファミリー、例えばＬＡＮＧＦ−Ｒ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ９５、リンホトキシンａ／ｂ受容体、Ｗｓｌ−１、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６  ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ／ＴＮＦＳＦ１１、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＮＧＦＲ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＷＥＡＫ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１２、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦ−アルファ／ＴＮＦＳＦ１Ａ、Ｐｒｏ−ＴＮＦ−アルファ／ＴＮＦＳＦ１Ａ、リンホトキシンベータＲ／ＴＮＦＲＳＦ３、リンホトキシンベータＲ（ＬＴｂＲ）／ＦｃＣｈｉｍｅｒａ、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦ−ベータ／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、ＰＧＲＰ−Ｓ、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＥＤＡ−Ａ２、ＴＮＦ−アルファ／ＴＮＦＳＦ１Ａ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦ  ＲＳＦ１Ａを包含する。
【０２６８】
特に興味深いものは精製された形態において市販されているヒト標的タンパク質並びにこれらの標的タンパク質に結合するタンパク質である。例は、４ＥＢＰ１、１４−３−３ゼータ、５３ＢＰ１、２Ｂ４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＣＬ２１／６Ｃカイン、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、８Ｄ６Ａ、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、８−オキソ−ｄＧ、４−アミノ−１，８−ナフタリミド、Ａ２Ｂ５、アミノペプチダーゼＬＲＡＰ／ＥＲＡＰ２、Ａ３３、アミノペプチダーゼＮ／ＡＮＰＥＰ、Ａａｇ，アミノペプチダーゼＰ２／ＸＰＮＰＥＰ２、ＡＢＣＧ２、アミノペプチダーゼＰ１／ＸＰＮＰＥＰ１、ＡＣＥ、アミノペプチダーゼＰＩＬＳ／ＡＲＴＳ１、ＡＣＥ−２、アムニオンレス、アクチン、アンフィレグリン、ベータ−アクチン、ＡＭＰＫアルファ１／２、アクチビンＡ、ＡＭＰＫアルファ１、アクチビンＡＢ、ＡＭＰＫアルファ２、アクチビンＢ、ＡＭＰＫベータ１、アクチビンＣ、ＡＭＰＫベータ２、アクチビンＲＩＡ／ＡＬＫ−２、アンドロゲンＲ／ＮＲ３Ｃ４、アクチビンＲＩＢ／ＡＬＫ−４、アンジオゲニン、アクチビンＲＩＩＡ、アンジオポエチン−１、アクチビンＲＩＩＢ、アンジオポエチン−２、ＡＤＡＭ８、アンジオポエチン−３、ＡＤＡＭ９、アンジオポエチン−４、ＡＤＡＭ１０、アンジオポエチン様１、ＡＤＡＭ１２、アンジオポエチン様２、ＡＤＡＭ１５、アンジオポエチン様３、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７、アンジオポエチン様４、ＡＤＡＭ１９、アンジオポエチン様７／ＣＤＴ６、ＡＤＡＭ３３、アンジオスタチン、ＡＤＡＭＴＳ４、アネキシンＡ１／アネキシンＩ、ＡＤＡＭＴＳ５、アネキシンＡ７、ＡＤＡＭＴＳ１、アネキシンＡ１０、ＡＤＡＭＴＳＬ−１／パンクチン、アネキシンＶ、アジポネクチン／Ａｃｒｐ３０、ＡＮＰ、ＡＥＢＳＦ、ＡＰ部位、アグリカン、ＡＰＡＦ−１、アグリン、ＡＰＣ、ＡｇＲＰ、ＡＰＥ、ＡＧＴＲ−２、ＡＰＪ、ＡＩＦ、ＡＰＬＰ−１、Ａｋｔ、ＡＰＬＰ−２、Ａｋｔ１、アポリポタンパク質ＡＩ、Ａｋｔ２、アポリポタンパク質Ｂ、Ａｋｔ３、ＡＰＰ、血清アルブミン、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＡＬＣＡＭ、ＡＲＣ、ＡＬＫ−１、アルテミン、ＡＬＫ−７、アリールスルファターゼＡ／ＡＲＳＡ、アルカリホスファターゼ、ＡＳＡＨ２／Ｎ−アシルスフィンゴシン  アミドヒドロラーゼ−２、アルファ２ｕ−グロブリン、ＡＳＣ、アルファ−１−酸糖タンパク質、ＡＳＧＲ１、アルファ−フェトプロテイン、ＡＳＫ１、ＡＬＳ、ＡＴＭ、アメロブラスチン、ＡＴＲＩＰ、ＡＭＩＣＡ／ＪＡＭＬ、ＡｕｒｏｒａＡ、ＡＭＩＧＯ、ＡｕｒｏｒａＢ、ＡＭＩＧＯ２、Ａｘｉｎ−１、ＡＭＩＧＯ３、Ａｘｌ、アミノアシラーゼ／ＡＣＹ１、アズロシジン／ＣＡＰ３７／ＨＢＰ、アミノペプチダーゼＡ／ＥＮＰＥＰ、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＢＩＭ、Ｂ７−１／ＣＤ８０、６−ビオチン−１７−ＮＡＤ、Ｂ７−２／ＣＤ８６、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＸＣＬ１３／ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、Ｂ７−Ｈ２、ＢＬＩＭＰ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂｌｋ、Ｂ７−Ｈ４、ＢＭＩ−１、ＢＡＣＥ−１、ＢＭＰ−１／ＰＣＰ、ＢＡＣＥ−２、ＢＭＰ−２、Ｂａｄ、ＢＭＰ−３、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＭＰ−３ｂ／ＧＤＦ−１０、ＢＡＦＦ  Ｒ／Ｔ��ＦＲＳＦ１３Ｃ、ＢＭＰ−４、Ｂａｇ−１、ＢＭＰ−５、ＢＡＫ、ＢＭＰ−６、ＢＡＭＢＩ／ＮＭＡ、ＢＭＰ−７、ＢＡＲＤ１、ＢＭＰ−８、Ｂａｘ、ＢＭＰ−９、ＢＣＡＭ、ＢＭＰ−１０、Ｂｃｌ−１０、ＢＭＰ−１５／ＧＤＦ−９Ｂ、Ｂｃｌ−２、ＢＭＰＲ−ＩＡ／ＡＬＫ−３、Ｂｃｌ−２関連タンパク質Ａ１、ＢＭＰＲ−ＩＢ／ＡＬＫ−６、Ｂｃｌ−ｗ、ＢＭＰＲ−ＩＩ、Ｂｃｌ−ｘ、ＢＮＩＰ３Ｌ、Ｂｃｌ−ｘＬ、ＢＯＣ、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＢＯＫ、ＢＤＮＦ、ＢＰＤＥ、ベンズアミド、ブラキウリー、共通ベータ鎖、Ｂ−Ｒａｆ、ベータＩＧ−Ｈ３、ＣＸＣＬ１４／ＢＲＡＫ、ベータセルリン、ＢＲＣＡ１、ベータ−デフェンシン２、ＢＲＣＡ２、ＢＩＤ、ＢＴＬＡ、ビグリカン、Ｂｕｂ−１、Ｂｉｋ様キラータンパク質、ｃ−ｊｕｎ、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ｃ−Ｒｅｌ、ＣＤ９４、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＤ９７、Ｃ１ｑＲ１／ＣＤ９３、ＣＤ１５１、Ｃ１ｑＴＮＦ１、ＣＤ１６０、Ｃ１ｑＴＮＦ４、ＣＤ１６３、Ｃ１ｑＴＮＦ５、ＣＤ１６４、補体成分Ｃ１ｒ、ＣＤ２００、補体成分Ｃ１ｓ、ＣＤ２００Ｒ１、補体成分Ｃ２、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、補体成分Ｃ３ａ、ＣＤ２３／ＦｃイプシロンＲＩＩ、補体成分Ｃ３ｄ、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、補体成分Ｃ５ａ、ＣＤ５Ｌ、カドヘリン−４／Ｒ−カドヘリン、ＣＤ６９、カドヘリン−６、ＣＤＣ２、カドヘリン−８、ＣＤＣ２５Ａ、カドヘリン−１１、ＣＤＣ２５Ｂ、カドヘリン−１２、ＣＤＣＰ１、カドヘリン−１３、ＣＤＯ、カドヘリン−１７、ＣＤＸ４、Ｅ−カドヘリン、ＣＥＡＣＡＭ−１／ＣＤ６６ａ、Ｎ−カドヘリン、ＣＥＡＣＡＭ−６、Ｐ−カドヘリン、セルベルス１、ＶＥ−カドヘリン、ＣＦＴＲ、カルビンジンＤ、ｃＧＭＰ、カルシニューリンＡ、ＣｈｅｍＲ２３、カルシニューリンＢ、ケメリン、カルレチキュリン−２、ケモカインサンプラーパック、ＣａＭキナーゼＩＩ、キチナーゼ３様１、ｃＡＭＰ、キトトリオシダーゼ／ＣＨＩＴ１、カンナビノイドＲ１、Ｃｈｋ１、カンナビノイドＲ２／ＣＢ２／ＣＮＲ２、Ｃｈｋ２、ＣＡＲ／ＮＲ１Ｉ３、ＣＨＬ−１／Ｌ１ＣＡＭ−２、カルボニックアンヒドラーゼＩ、コリンアセチルトランスフェラーゼ／ＣｈＡＴ、カルボニックアンヒドラーゼＩＩ、コンドロレクチン、カルボニックアンヒドラーゼＩＩＩ、コルジン、カルボニックアンヒドラーゼＩＶ、コルジン様１、カルボニックアンヒドラーゼＶＡ、コルジン様２、カルボニックアンヒドラーゼＶＢ、ＣＩＮＣ−１、カルボニックアンヒドラーゼＶＩ、ＣＩＮＣ−２、カルボニックアンヒドラーゼＶＩＩ、ＣＩＮＣ−３、カルボニックアンヒドラーゼＶＩＩＩ、クラスピン、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、クラウジン−６、カルボニックアンヒドラーゼＸ、ＣＬＣ、カルボニックアンヒドラーゼＸＩＩ、ＣＬＥＣ−１、カルボニックアンヒドラーゼＸＩＩＩ、ＣＬＥＣ−２、カルボニックアンヒドラーゼＸＩＶ、ＣＬＥＣＳＦ１３／ＣＬＥＣ４Ｆ、カアルボキシメチルリジン、ＣＬＥＣＳＦ８、カルボキシペプチダーゼＡ１／ＣＰＡ１、ＣＬＦ−１、カルボキシペプチダーゼＡ２、ＣＬ−Ｐ１／ＣＯＬＥＣ１２、カルボキシペプチダーゼＡ４、クラステリン、カルボキシペプチダーゼＢ１、クラステリン様１、カ��ボキシペプチダーゼＥ／ＣＰＥ、ＣＭＧ−２、カルボキシペプチダーゼＸ１、ＣＭＶ  ＵＬ１４６、カルジオトロフィン−１、ＣＭＶ  ＵＬ１４７、カルノシンジペプチダーゼ１、ＣＮＰ、カロンテ、ＣＮＴＦ、ＣＡＲＴ、ＣＮＴＦ  Ｒアルファ、カスパーゼ、凝固因子ＩＩ／トロンビン、カスパーゼ−１、凝固因子ＩＩＩ／組織因子、カスパーゼ−２、凝固因子ＶＩＩ、カスパーゼ−３、凝固因子Ｘ、カスパーゼ−４、凝固因子ＸＩ、カスパーゼ−６、凝固因子ＸＩＶ／プロテインＣ、カスパーゼ−７、ＣＯＣＯ、カスパーゼ−８、コヘシン、カスパーゼ−９、コラーゲンＩ、カスパーゼ−１０、コラーゲンＩＩ、カスパーゼ−１２、コラーゲンＩＶ、カスパーゼ−１３、共通ガンマ鎖／ＩＬ−２  Ｒガンマ、カスパーゼペプチド阻害剤、ＣＯＭＰ／トロンボスポンジン−５、カタラーゼ、補体成分Ｃ１ｒＬＰ、ベータ−カテニン、補体成分Ｃ１ｑＡ、カテプシン１、補体成分Ｃ１ｑＣ、カテプシン３、補体Ｄ因子、カテプシン６、補体第Ｉ因子、カテプシンＡ、補体ＭＡＳＰ３、カテプシンＢ、コネキシン４３、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、コンタクチン−１、カテプシンＤ、コンタクチン−２／ＴＡＧ１、カテプシンＥ、コンタクチン−４、カテプシンＦ、コンタクチン−５、カテプシンＨ、コリン、カテプシンＬ、コーヌリン、カテプシンＯ、ＣＯＲＳ２６／Ｃ１ｑＴＮＦ，３、カテプシンＳ、ラット皮質幹細胞、カテプシンＶ、コルチゾール、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、ＣＯＵＰ−ＴＦ  Ｉ／ＮＲ２Ｆ１、ＣＢＰ、ＣＯＵＰ−ＴＦ  ＩＩ／ＮＲ２Ｆ２、ＣＣＩ、ＣＯＸ−１、ＣＣＫ−Ａ  Ｒ、ＣＯＸ−２、ＣＣＬ２８、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＣＣＲ１、Ｃ反応性タンパク質、ＣＣＲ２、クレアチンキナーゼ、筋肉／ＣＫＭＭ（Ｍｕｓｃｌｅ／ＣＫＭＭ）、ＣＣＲ３、クレアチニン、ＣＣＲ４、ＣＲＥＢ、ＣＣＲ５、ＣＲＥＧ、ＣＣＲ６、ＣＲＥＬＤ１、ＣＣＲ７、ＣＲＥＬＤ２、ＣＣＲ８、ＣＲＨＢＰ、ＣＣＲ９、ＣＲＨＲ−１、ＣＣＲ１０、ＣＲＩＭ１、ＣＤ１５５／ＰＶＲ、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、ＣＤ２、ＣＲＩＳＰ−２、ＣＤ３、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＤ４、クロスベインレス−２、ＣＤ４＋／４５ＲＡ−、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ４＋／４５ＲＯ−、ＣＲＴＨ−２、ＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ−／ＣＤ４４、ＣＲＹ１、ＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４４、クリプト（Ｃｒｙｐｔｉｃ）、ＣＤ５、ＣＳＢ／ＥＲＣＣ６、ＣＤ６、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫ、ＣＤ８、ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、ＣＤ８＋／４５ＲＡ−、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８＋／４５ＲＯ−、キュビリン、ＣＤ９、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１４、ＣＸＡＤＲ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＸＣＬ１６、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＸＣＲ３、ＣＤ２８、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＸＣＲ５、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＸＣＲ６、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１、シクロフィリンＡ、ＣＤ３４、Ｃｙｒ６１／ＣＣＮ１、ＣＤ３６／ＳＲ−Ｂ３、シスタチンＡ、ＣＤ３８、シスタチンＢ、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、シスタチンＣ、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、シスタチンＤ、ＣＤ４３、シスタチンＥ／Ｍ、ＣＤ４４、シスタチンＦ、ＣＤ４５、シスタチンＨ、ＣＤ４６、シスタチンＨ２、ＣＤ４７、シスタチンＳ、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、シスタチンＳＡ、ＣＤ５５／ＤＡＦ、シスタチンＳＮ、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、チトクロームｃ、ＣＤ５９、アポチトクロームｃ、ＣＤ６８、ホロチトクロームｃ、ＣＤ７２、サイトケラチン８、ＣＤ７４、サイトケラチン１４、ＣＤ８３、サイトケラチン１９、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、サイトニン、Ｄ６、ＤＩＳＰ１、ＤＡＮ、Ｄｋｋ−１、ＤＡＮＣＥ、Ｄｋｋ−２、ＤＡＲＰＰ−３２、Ｄｋｋ−３、ＤＡＸ１／ＮＲ０Ｂ１、Ｄｋｋ−４、ＤＣＣ、ＤＬＥＣ、ＤＣＩＲ／ＣＬＥＣ４Ａ、ＤＬＬ１、ＤＣＡＲ、ＤＬＬ４、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ｄ−ルシフェリン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ／ＣＤ２９９、ＤＮＡポリメラーゼベータ、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ２３、ＤＮＡＭ−１、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ２２、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＤＤＲ１、ＤＮＥＲ、ＤＤＲ２、ドーパデカルボキシラーゼ／ＤＤＣ、ＤＥＣ−２０５、ＤＰＣＲ−１、デカペンタプレジック、ＤＰＰ６、デコリン、ＤＰＰＡ４、デクチン−１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＡ５／ＥＳＧ１、デクチン−２／ＣＬＥＣ６Ａ、ＤＰＰＩＩ／ＱＰＰ／ＤＰＰ７、ＤＥＰ−１／ＣＤ１４８、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、デザートヘッジホッグ、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、デスミン、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、デスモグレイン−１、ＤＳＣＡＭ、デスモグレイン−２、ＤＳＣＡＭ−Ｌ１、デスモグレイン−３、ＤＳＰＧ３、ジスヘベルド−１、Ｄｔｋ、ジスヘベルド−３、ダイナミン、ＥＡＲ２／ＮＲ２Ｆ６、ＥｐｈＡ５、ＥＣＥ−１、ＥｐｈＡ６、ＥＣＥ−２、ＥｐｈＡ７、ＥＣＦ−Ｌ／ＣＨＩ３Ｌ３、ＥｐｈＡ８、ＥＣＭ−１、ＥｐｈＢ１、エコチン、ＥｐｈＢ２、ＥＤＡ、ＥｐｈＢ３、ＥＤＡ−Ａ２、ＥｐｈＢ４、ＥＤＡＲ、ＥｐｈＢ６、ＥＤＧ−１、エフリン、ＥＤＧ−５、エフリン−Ａ１、ＥＤＧ−８、エフリン−Ａ２、ｅＥＦ−２、エフリン−Ａ３、ＥＧＦ、エフリン−Ａ４、ＥＧＦＲ、エフリン−Ａ５、ＥＧＲ１、エフリン−Ｂ、ＥＧ−ＶＥＧＦ／ＰＫ１、エフリン−Ｂ１、ｅＩＦ２アルファ、エフリン−Ｂ２、ｅＩＦ４Ｅ、エフリン−Ｂ３、Ｅｌｋ−１、エピゲン、ＥＭＡＰ−ＩＩ、エピモルヒン／シンタキシン２、ＥＭＭＰＲＩＮ／ＣＤ１４７、エピレグリン、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ、ＥＰＲ−１／Ｘａ受容体、エンドカン、ＥｒｂＢ２、エンドグリン／ＣＤ１０５、ＥｒｂＢ３、エンドグリカン、ＥｒｂＢ４、エンドヌク
レアーゼＩＩＩ、ＥＲＣＣ１、エンドヌクレアーゼＩＶ、ＥＲＣＣ３、エンドヌクレアーゼＶ、ＥＲＫ１／ＥＲＫ２、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＥＲＫ１、エンドレペリン／パーレカン、ＥＲＫ２、エンドスタチン、ＥＲＫ３、エンドセリン−１、ＥＲＫ５／ＢＭＫ１、エングレイルド−２、ＥＲＲアルファ／ＮＲ３Ｂ１、ＥＮ−ＲＡＧＥ、ＥＲＲベータ／ＮＲ３Ｂ２、エンテロペプチダーゼ／エンテロキナーゼ、ＥＲＲガンマ／ＮＲ３Ｂ３、ＣＣＬ１１／エオタキシン、エリスロポエチン、ＣＣＬ２４／エオタキシン−２、エリスロポエチンＲ、ＣＣＬ２６／エオタキシン−３、ＥＳＡＭ、ＥｐＣＡＭ／ＴＲＯＰ−１、ＥＲアルファ／ＮＲ３Ａ１、ＥＰＣＲ、ＥＲベータ／ＮＲ３Ａ２、Ｅｐｈ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＥｐｈＡ１、エキストシン様２／ＥＸＴＬ２、ＥｐｈＡ２、エキストシン様３／ＥＸＴＬ３、ＥｐｈＡ３、ＦＡＢＰ１、ＦＧＦ−ＢＰ、ＦＡＢＰ２、ＦＧＦＲ１−４、ＦＡＢＰ３、ＦＧＦＲ１、ＦＡＢＰ４、ＦＧＦＲ２、ＦＡＢＰ５、ＦＧＦＲ３、ＦＡＢＰ７、ＦＧＦＲ４、ＦＡＢＰ９、ＦＧＦＲ５、補体Ｂ因子、Ｆｇｒ、ＦＡＤＤ、ＦＨＲ５、ＦＡＭ３Ａ、フィブロネクチン、ＦＡＭ３Ｂ、フィコリン−２、ＦＡＭ３Ｃ、フィコリン−３、ＦＡＭ３Ｄ、ＦＩＴＣ、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ／ＦＡＰ、ＦＫＢＰ３８、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、Ｆｌａｐ、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＦＬＩＰ、ＦＡＴＰ１、ＦＬＲＧ、ＦＡＴＰ４、ＦＬＲＴ１、ＦＡＴＰ５、ＦＬＲＴ２、ＦｃガンマＲＩ／ＣＤ６４、ＦＬＲＴ３、ＦｃガンマＲＩＩＢ／ＣＤ３２ｂ、Ｆｌｔ−３、ＦｃガンマＲＩＩＣ／ＣＤ３２ｃ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＦｃガンマＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ、フォリスタチン、ＦｃガンマＲＩＩＩ／ＣＤ１６、フォリスタチン様１、ＦｃＲＨ１／ＩＲＴＡ５、ＦｏｓＢ／Ｇ０Ｓ３、ＦｃＲＨ２／ＩＲＴＡ４、ＦｏｘＤ３、ＦｃＲＨ４／ＩＲＴＡ１、ＦｏｘＪ１、ＦｃＲＨ５／ＩＲＴＡ２、ＦｏｘＰ３、Ｆｃ受容体様３／ＣＤ１６−２、Ｆｐｇ、ＦＥＮ−１、ＦＰＲ１、フェチュインＡ、ＦＰＲＬ１、フェチュインＢ、ＦＰＲＬ２、ＦＧＦ酸性、ＣＸ３ＣＬ１／フラクタルカイン、ＦＧＦ塩基性、フリズルド−１、ＦＧＦ−３、フリズルド−２、ＦＧＦ−４、フリズルド−３、ＦＧＦ−５、フリズルド−４、ＦＧＦ−６、フリズルド−５、ＦＧＦ−８、フリズルド−６、ＦＧＦ−９、フリズルド−７、ＦＧＦ−１０、フリズルド−８、ＦＧＦ−１１、フリズルド−９、ＦＧＦ−１２、Ｆｒｋ、ＦＧＦ−１３、ｓＦＲＰ−１、ＦＧＦ−１６、ｓＦＲＰ−２、ＦＧＦ−１７、ｓＦＲＰ−３、ＦＧＦ−１９、ｓＦＲＰ−４、ＦＧＦ−２０、フリン、ＦＧＦ−２１、ＦＸＲ／ＮＲ１Ｈ４、ＦＧＦ−２２、Ｆｙｎ、ＦＧＦ−２３、Ｇ９ａ／ＥＨＭＴ２、ＧＦＲアルファ−３／ＧＤＮＦＲアルファ−３、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒアルファ１、ＧＦＲアルファ−４／ＧＤＮＦＲアルファ−４、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒアルファ２、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒアルファ４、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒアルファ５、ＧＬＩ−１、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒアルファ６、ＧＬＩ−２、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒベータ１、ＧＬＰ／ＥＨＭＴ１、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒベータ２、ＧＬＰ−１Ｒ、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒベータ３、グルカゴン，ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒガンマ２、グルコサミン（Ｎ−アセチル）−６−スルファターゼ／ＧＮＳ、ＧＡＢＡ−Ｂ−Ｒ２、ＧｌｕＲ１、ＧＡＤ１／ＧＡＤ６７、ＧｌｕＲ２／３、ＧＡＤ２／ＧＡＤ６５、ＧｌｕＲ２、ＧＡＤＤ４５アルファ、ＧｌｕＲ３、ＧＡＤＤ４５ベータ、Ｇｌｕｔ１、ＧＡＤＤ４５ガンマ、Ｇｌｕｔ２、ガレクチン−１、Ｇｌｕｔ３、ガレクチン−２、Ｇｌｕｔ４、ガレクチン−３、Ｇｌｕｔ５、ガレクチン−３ＢＰ、グルタレドキシン１、ガレクチン−４、グリシンＲ、ガレクチン−７、グリコホリンＡ、ガレクチン−８、グリピカン２、ガレクチン−９、グリピカン３、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ、グリピカン５、ＧＡＰ−４３、グリピカン６、ＧＡＰＤＨ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇａｓ１、ＧＭ−ＣＳＦＲアルファ、Ｇａｓ６、ＧＭＦ−ベータ、ＧＡＳＰ−１／ＷＦＩＫＫＮＲＰ、ｇｐ１３０、ＧＡＳＰ−２／ＷＦＩＫＫＮ、グリコーゲンホスホリラーゼＢＢ／ＧＰＢＢ、ＧＡＴＡ−１、ＧＰＲ１５、ＧＡＴＡ−２、ＧＰＲ３９、ＧＡＴＡ−３、ＧＰＶＩ、ＧＡＴＡ−４、ＧＲ／ＮＲ３Ｃ１、ＧＡＴＡ−５、Ｇｒ−１／Ｌｙ−６Ｇ、ＧＡＴＡ−６、グラヌリシン、ＧＢＬ、グランザイムＡ、ＧＣＮＦ／ＮＲ６Ａ１、グランザイムＢ、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、グランザイムＤ、Ｇ−ＣＳＦ、グランザイムＧ、Ｇ−ＣＳＦＲ、グランザイムＨ、ＧＤＦ−１、ＧＲＡＳＰ、ＧＤＦ−３  ＧＲＢ２、ＧＤＦ−５、グレムリン、ＧＤＦ−６、ＧＲＯ、ＧＤＦ−７、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯアルファ、ＧＤＦ−８、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯベータ、ＧＤＦ−９、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯガンマ、ＧＤＦ−１１、成長ホルモン、ＧＤＦ−１５、成長ホルモンＲ、ＧＤＮＦ、ＧＲＰ７５／ＨＳＰＡ９Ｂ、ＧＦＡＰ、ＧＳＫ−３アルファ／ベータ、ＧＦＩ−１、ＧＳＫ−３アルファ、ＧＦＲアルファ−１／ＧＤＮＦＲアルファ−１、ＧＳＫ−３ベータ、ＧＦＲアルファ−２／ＧＤＮＦＲアルファ−２、ＥＺＦＩＴ、Ｈ２ＡＸ、ヒスチジン、Ｈ６０、ＨＭ７４Ａ、ＨＡＩ−１、ＨＭＧＡ２、ＨＡＩ−２、ＨＭＧＢ１、ＨＡＩ−２Ａ、ＴＣＦ−２／ＨＮＦ−１ベータ、ＨＡＩ−２Ｂ、ＨＮＦ−３ベータ／ＦｏｘＡ２、ＨＡＮＤ１、ＨＮＦ−４アルファ／ＮＲ２Ａ１、ＨＡＰＬＮ１、ＨＮＦ−４ガンマ／ＮＲ２Ａ２、気道トリプシン様プロテアーゼ／ＨＡＴ、ＨＯ−１／ＨＭＯＸ１／ＨＳＰ３２、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＯ−２／ＨＭＯＸ２、ＣＣＬ１４ａ／ＨＣＣ−１、ＨＰＲＧ、ＣＣＬ１４ｂ／ＨＣＣ−３、Ｈｒｋ、ＣＣＬ１６／ＨＣＣ−４、ＨＲＰ−１、アルファＨＣＧ、ＨＳ６ＳＴ２、Ｈｃｋ、ＨＳＤ−１、ＨＣＲ／ＣＲＡＭ−Ａ／Ｂ、ＨＳＤ−２、ＨＤＧＦ、ＨＳＰ１０／ＥＰＦ、ヘモグロビン、ＨＳＰ２７、ヘパソシン、ＨＳＰ６０、ＨＥＳ−１、ＨＳＰ７０、ＨＥＳ−４、ＨＳＰ９０、ＨＧＦ、ＨＴＲＡ／プロテアーゼＤｏ、ＨＧＦ活性化物質、ＨＴＲＡ１／ＰＲＳＳ１１、ＨＧＦ  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ニン−１、Ｌｉｖｉｎ、ラミニン−５、ＬＩＸ、ＬＡＭＰ、ＬＭＩＲ１／ＣＤ３００Ａ、ランゲリン、ＬＭＩＲ２／ＣＤ３００ｃ、ＬＡＲ、ＬＭＩＲ３／ＣＤ３００ＬＦ、ラテキシン、ＬＭＩＲ５／ＣＤ３００ＬＢ、ライリン、ＬＭＩＲ６／ＣＤ３００ＬＥ、ＬＢＰ、ＬＭＯ２、ＬＤＬＲ、ＬＯＸ−１／ＳＲ−Ｅ１、ＬＥＣＴ２、ＬＲＨ−１／ＮＲ５Ａ２、ＬＥＤＧＦ、ＬＲＩＧ１、レフティー、ＬＲＩＧ３、レフティー−１、ＬＲＰ−１、レフティー−Ａ、ＬＲＰ−６、レグマイン、ＬＳＥＣｔｉｎ／ＣＬＥＣ４Ｇ、レプチン、ルミカン、レプチンＲ、ＣＸＣＬ１５／ラングカイン、ロイコトリエンＢ４、ＸＣＬ１／リンホタクチン、ロイコトリエンＢ４Ｒ１、リンホトキシン、ＬＩＦ、リンホトキシンベータ／ＴＮＦＳＦ３、ＬＩＦＲアルファ、リンホトキシンベータＲ／ＴＮＦＲＳＦ３、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、Ｌｙｎ、リミジン、Ｌｙｐ、ＬＩＭＰＩＩ／ＳＲ−Ｂ２、リジルオキシダーゼ相同体２、ＬＩＮ−２８、ＬＹＶＥ−１、ＬＩＮＧＯ−１、アルファ２−マクログロブリン、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＭＡＤ２Ｌ１、ミメカン、ＭＡｄＣＡＭ−１、ミンジン、ＭａｆＢ、鉱質コルチコイドＲ／ＮＲ３Ｃ２、ＭａｆＦ、ＣＣＬ３Ｌ１／ＭＩＰ−１アルファアイソフォームＬＤ７８ベータ、ＭａｆＧ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１アルファ、ＭａｆＫ、ＣＣＬ４Ｌ１／ＬＡＧ−１、ＭＡＧ／シグレック−４ａ、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１ベータ、ＭＡＮＦ、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ−１デルタ、ＭＡＰ２、ＣＣＬ９／１０／ＭＩＰ−１ガンマ、ＭＡＰＫ、ＭＩＰ−２、マラプシン／パンクレアシン、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３ベータ、ＭＡＲＣＫＳ、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３アルファ、ＭＡＲＣＯ、ＭＩＰ−Ｉ、Ｍａｓｈ１、ＭＩＰ−ＩＩ、マトリリン−２、ＭＩＰ−ＩＩＩ、マトリリン−３、ＭＩＳ／ＡＭＨ、マトリリン−４、ＭＩＳＲＩＩ、マトリプターゼ／ＳＴ１４、ＭＩＸＬ１、ＭＢＬ、ＭＫＫ３／ＭＫＫ６、ＭＢＬ−２、ＭＫＫ３、メラノコルチン３Ｒ／ＭＣ３Ｒ、ＭＫＫ４、ＭＣＡＭ／ＣＤ１４６、ＭＫＫ６、ＭＣＫ−２、ＭＫＫ７、Ｍｃｌ−１、ＭＫＰ−３、ＭＣＰ−６、ＭＬＨ−１、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＭＬＫ４アルファ、ＭＣＰ−１１、ＭＭＰ、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＭＭＰ−１、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３／ＭＡＲＣ、ＭＭＰ−２、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４、ＭＭＰ−３、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＭＭＰ−７、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−８、Ｍ−ＣＳＦＲ、ＭＭＰ−９、ＭＣＶ−ＩＩ型、ＭＭＰ−１０、ＭＤ−１、ＭＭＰ−１１、ＭＤ−２、ＭＭＰ−１２、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＭＭＰ−１３、ＭＤＬ−１／ＣＬＥＣ５Ａ、ＭＭＰ−１４、ＭＤＭ２、ＭＭＰ−１５、ＭＥＡ−１、ＭＭＰ−１６／ＭＴ３−ＭＭＰ、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２、ＭＭＰ−２４／ＭＴ５−ＭＭＰ、ＭＥＫ１、ＭＭＰ−２５／ＭＴ６−ＭＭＰ、ＭＥＫ２、ＭＭＰ−２６、メルシン、ＭＭＲ、ＭＥＰＥ、ＭＯＧ、メプリンアルファ、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１、メプリンベータ、Ｍ−Ｒａｓ／Ｒ−Ｒａｓ３、Ｍｅｒ、Ｍｒｅ１１、メソセリン、ＭＲＰ１メテオリン、ＭＳＫ１／ＭＳＫ２、メチオニンアミノペプチダーゼ１、ＭＳＫ１、メチオニンアミノペプチダーゼ、ＭＳＫ２、メチオニンアミノペプチダーゼ２、ＭＳＰ、ＭＦＧ−Ｅ８、ＭＳＰＲ／Ｒｏｎ、ＭＦＲＰ、Ｍｕｇ、ＭｇｃＲａｃＧＡＰ、ＭＵＬＴ−１、ＭＧＬ２、ムサシ−１、ＭＧＭＴ、ムサシ−２、ＭＩＡ、ＭｕＳＫ、ＭＩＣＡ、ＭｕｔＹＤＮＡグリコシラーゼ、ＭＩＣＢ、ＭｙＤ８８、ＭＩＣＬ／ＣＬＥＣ１２Ａ、ミエロパーオキシダーゼ、ベータ２ミクログロブリン、ミオカルジン、ミドカイン、ミオシリン、ＭＩＦ、ミオグロビン、ＮＡＩＰＮＧＦＩ−Ｂガンマ／ＮＲ４Ａ３、ナノｇ、ＮｇＲ２／ＮｇＲＨ１、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＮｇＲ３／ＮｇＲＨ２、Ｎｂｓ１、ニドゲン−１／エンタクチン、ＮＣＡＭ−１／ＣＤ５６、Ｎｉｄｏｇｅｎ−２、ＮＣＡＭ−Ｌ１、酸化窒素、ネクチン−１、ニトロチロシン、ネクチン−２／ＣＤ１１２、ＮＫＧ２Ａ、ネクチン−３、ＮＫＧ２Ｃ、ネクチン−４、ＮＫＧ２Ｄ、ネオゲニン、ＮＫｐ３０、ネプリリシン／ＣＤ１０、ＮＫｐ４４、ネプリリシン−２／ＭＭＥＬ１／ＭＭＥＬ２、ＮＫｐ４６／ＮＣＲ１、ネスチン、ＮＫｐ８０／ＫＬＲＦ１、ＮＥＴＯ２、ＮＫＸ２．５、ネトリン−１、ＮＭＤＡＲ、ＮＲ１サブユニット、ネトリン−２、ＮＭＤＡＲ、ＮＲ２Ａサブユニット、ネトリン−４、ＮＭＤＡＲ、ＮＲ２Ｂサブユニット、ネトリン−Ｇ１ａ、ＮＭＤＡＲ、ＮＲ２Ｃサブユニット、ネトリン−Ｇ２ａ、Ｎ−Ｍｅ−６，７−ｄｉＯＨ−ＴＩＱ、ニューレグリン−１／ＮＲＧ１、Ｎｏｄａｌ、ニューレグリン−３／ＮＲＧ３、ノギン、ニューリチン、Ｎｏｇｏ受容体、ニューロＤ１、Ｎｏｇｏ−Ａ、ニューロファスシン、ＮＯＭＯ、ニューロゲニン−１、Ｎｏｐｅ、ニューロゲニン−２、ノルリン、ニューロゲニン−３、ｅＮＯＳ、ニューロリシン、ｉＮＯＳ、ニューロフィシンＩＩ、ｎＮＯＳ、ニューロピリン−１、ノッチ−１、ニューロピリン−２、ノッチ−２、ニューロポエチン、ノッチ−３、ニューロトリミン、ノッチ−４、ニュールツリン、ＮＯＶ／ＣＣＮ３、ＮＦＡＭ１、ＮＲＡＧＥ、ＮＦ−Ｈ、ＮｒＣＡＭ、ＮＦｋＢ１、ＮＲＬ、ＮＦｋＢ２、ＮＴ−３、ＮＦ−Ｌ、ＮＴ−４、ＮＦ−Ｍ、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＮＧ２／ＭＣＳＰ、ＮＴＨ１、ＮＧＦＲ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ヌクレオステミン、ベータ−ＮＧＦ、Ｎｕｒｒ−１／ＮＲ４Ａ２、ＮＧＦＩ−Ｂアルファ／ＮＲ４Ａ１、ＯＡＳ２、オレキシンＢ、ＯＢＣＡＭ、ＯＳＣＡＲ、ＯＣＡＭ、ＯＳＦ−２／ペリオスチン、ＯＣＩＬ／ＣＬＥＣ２ｄ、オンコスタチンＭ／ＯＳＭ、ＯＣＩＬＲＰ２／ＣＬＥＣ２ｉ、ＯＳＭＲベータ、Ｏｃｔ−３／４、オステオアクチビン／ＧＰＮＭＢ、ＯＧＧ１、オステオアドヘリン、Ｏｌｉｇ１、２、３、オステオカルシン、Ｏｌｉｇ１、オステオクリン、Ｏｌｉｇ２、オステオポンチン、Ｏｌｉｇ３、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、稀突起神経膠細胞マーカーＯ１、Ｏｔｘ２、稀突起神経膠細胞マーカーＯ４、ＯＶ−６、ＯＭｇｐ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、オプチシン、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、オレキシンＡ、ＯＡＳ２、オレキシンＢ、ＯＢＣＡＭ、ＯＳＣＡＲ、ＯＣＡＭ、ＯＳＦ−２／ペリオスチン、ＯＣＩＬ／ＣＬＥＣ２ｄ、オンコスタチンＭ／ＯＳＭ、ＯＣＩＬＲＰ２／ＣＬＥＣ２ｉ、ＯＳＭＲベータ、Ｏｃｔ−３／４、オステオアクチビン／ＧＰＮＭＢ、ＯＧＧ１、オステオアドヘリン、Ｏｌｉｇ１、２、３、オステオカルシン、Ｏｌｉｇ１、オステオクリン、Ｏｌｉｇ２、オステオポンチン、Ｏｌｉｇ３、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、稀突起神経膠細胞マーカーＯ１、Ｏｔｘ２、稀突起神経膠細胞マーカーＯ４、ＯＶ−６、ＯＭｇｐ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、オプチシン、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、オレキシンＡ、ＲＡＣＫ１、Ｒｅｔ、Ｒａｄ１、ＲＥＶ−ＥＲＢアルファ／ＮＲ１Ｄ１、Ｒａｄ１７、ＲＥＶ−ＥＲＢベータ／ＮＲ１Ｄ２、Ｒａｄ５１、Ｒｅｘ−１、Ｒａｅ−１、ＲＧＭ−Ａ、Ｒａｅ−１アルファ、ＲＧＭ−Ｂ、Ｒａｅ−１ベータ、ＲＧＭ−Ｃ、Ｒａｅ−１デルタ、Ｒｈｅｂ、Ｒａｅ−１イプシロン、リボソームプロテインＳ６、Ｒａｅ−１ガンマ、ＲＩＰ１、Ｒａｆ−１、ＲＯＢＯ１、ＲＡＧＥ、ＲＯＢＯ２、ＲａｌＡ／ＲａｌＢ、ＲＯＢＯ３、ＲａｌＡ、ＲＯＢＯ４、ＲａｌＢ、ＲＯＲ／ＮＲ１Ｆ１−３（ｐａｎ）、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＲＯＲアルファ／ＮＲ１Ｆ１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＲＯＲガンマ／ＮＲ１Ｆ３、Ｒａｐ１Ａ／Ｂ、ＲＴＫ様オーファン受容体１／ＲＯＲ１、ＲＡＲアルファ／ＮＲ１Ｂ１、ＲＴＫ様オーファン受容体２／ＲＯＲ２、ＲＡＲベータ／ＮＲ１Ｂ２、ＲＰ１０５、ＲＡＲガンマ／ＮＲ１Ｂ３、ＲＰＡ２、Ｒａｓ、ＲＳＫ（ｐａｎ）、ＲＢＰ４、ＲＳＫ１／ＲＳＫ２、ＲＥＣＫ、ＲＳＫ１、Ｒｅｇ２／ＰＡＰ、ＲＳＫ２、ＲｅｇＩ、ＲＳＫ３、ＲｅｇＩＩ、ＲＳＫ４、ＲｅｇＩＩＩ、Ｒ−スポンジン１、ＲｅｇＩＩＩａ、Ｒ−スポンジン２、ＲｅｇＩＶ、Ｒ−スポンジン３、リラキシン−１、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、リラキシン−２、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１、リラキシン−３、ＲＵＮＸ３／ＣＢＦＡ３、ＲＥＬＭアルファ、ＲＸＲアルファ／ＮＲ２Ｂ１、ＲＥＬＭベータ、ＲＸＲベータ／ＮＲ２Ｂ２、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＲＸＲガンマ／ＮＲ２Ｂ３、レジスチン、Ｓ１００Ａ１０、ＳＬＩＴＲＫ５、Ｓ１００Ａ８、ＳＬＰＩ、Ｓ１００Ａ９、ＳＭＡＣ／ジアブロ、Ｓ１００Ｂ、Ｓｍａｄ１、Ｓ１００Ｐ、Ｓｍａｄ２、ＳＡＬＬ１、Ｓｍａｄ３、デルタ−サルコグリカン、Ｓｍａｄ４、Ｓｃａ−１／Ｌｙ６、Ｓｍａｄ５、ＳＣＤ−１、Ｓｍａｄ７、ＳＣＦ、Ｓｍａｄ８、ＳＣＦＲ／ｃ−キット、ＳＭＣ１、ＳＣＧＦ、アルファ−平滑筋アクチン、ＳＣＬ／Ｔａｌ１、ＳＭＵＧ１、ＳＣＰ３／ＳＹＣＰ３、スネイル、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ナトリウムカルシウム交換物質１、ＳＤＮＳＦ／ＭＣＦＤ２、Ｓｏｇｇｙ−１、アルファ−セクレターゼ、ソニクヘッジホッグ，ガンマ−セクレターゼ、ＳｏｒＣＳ１、ベータ−セクレターゼ、ＳｏｒＣＳ３、Ｅ−セレクチン、ソルチリン、Ｌ−セレクチン、ＳＯＳＴ、Ｐ−セレクチン、ＳＯＸ１、セマホリン３Ａ、ＳＯＸ２、セマホリン３Ｃ、ＳＯＸ３、セマホリン３Ｅ、ＳＯＸ７、セマホリン３Ｆ、ＳＯＸ９、セマホリン６Ａ、ＳＯＸ１０、セマホリン６Ｂ、ＳＯＸ１７、セマホリン６Ｃ、ＳＯＸ２１セマホリン６Ｄ，ＳＰＡＲＣ、セマホリン７Ａ、ＳＰＡＲＣ様１、セパラーゼ、ＳＰ−Ｄ、セリン／スレオニンホスファターゼ基質Ｉ、スピネシン、セルピンＡ１、Ｆ−スポンジン、セルピンＡ３、ＳＲ−ＡＩ／ＭＳＲ、セルピンＡ４／カリスタチン、Ｓｒｃ、セルピンＡ５／プロテインＣ阻害剤、ＳＲＥＣ−Ｉ／ＳＲ−Ｆ１、セルピンＡ８／アンジオテンシノーゲン、ＳＲＥＣ−ＩＩ、セルピンＢ５、ＳＳＥＡ−１、セルピンＣ１／アンチトロンビン−ＩＩＩ、ＳＳＥＡ−３、セルピンＤ１／ヘパリンコファクターＩＩ、ＳＳＥＡ−４、セルピンＥ１／ＰＡＩ−１、ＳＴ７／ＬＲＰ１２、セルピンＥ２，スタビリン−１、セルピンＦ１、スタビリン−２、セルピンＦ２、スタニオカルシン１、セルピンＧ１／Ｃ１阻害剤、スタニオカルシン２、セルピンＩ２、ＳＴＡＴ１、血清アミロイドＡ１、ＳＴＡＴ２、ＳＦ−１／ＮＲ５Ａ１、ＳＴＡＴ３、ＳＧＫ、ＳＴＡＴ４、ＳＨＢＧ、ＳＴＡＴ５ａ／ｂ、ＳＨＩＰ、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＨＰ／ＮＲ０Ｂ２、ＳＴＡＴ５ｂ、ＳＨＰ−１、ＳＴＡＴ６、ＳＨＰ−２、ＶＥ−スタチン、ＳＩＧＩＲＲ、ステラ／Ｄｐｐａ３、シグレック−２／ＣＤ２２、ＳＴＲＯ−１、シグレック−３／ＣＤ３３、サブスタンスＰ、シグレック−５、スルファミダーゼ／ＳＧＳＨ、シグレック−６、スルファターゼ変性因子１／ＳＵＭＦ１、シグレック−７、スルファターゼ変性因子２／ＳＵＭＦ２、シグレック−９、ＳＵＭＯ１、シグレック−１０、ＳＵＭＯ２／３／４、シグレック−１１、ＳＵＭＯ３、シグレック−Ｆ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＳＩＧＮＲ１／ＣＤ２０９、スーパーオキシドジスムターゼ−１／Ｃｕ−ＺｎＳＯＤ、ＳＩＧＮＲ４、スーパーオキシドジスムターゼ−２／Ｍｎ−ＳＯＤ、ＳＩＲＰベータ１、スーパーオキシドジスムターゼ−３／ＥＣ−ＳＯＤ、ＳＫＩ、サービビン、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０、シナプシンＩ、スリーピングビューティートランスポザーゼ、シンデカン−１／ＣＤ１３８、Ｓｌｉｔ３、シンデカン−２、ＳＬＩＴＲＫ１、シンデカン−３、ＳＬＩＴＲＫ２、シンデカン−４、ＳＬＩＴＲＫ４、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＭＥＦＦ１／トモレグリン−１、ＴＡＯ２、ＴＭＥＦＦ２、ＴＡＰＰ１、ＴＮＦ−アルファ／ＴＮＦＳＦ１Ａ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＴＮＦ−ベータ／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、Ｔａｕ、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＣ２１／Ｒ−Ｒａｓ２、ＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＣＡＭ−１、ＴＯＲ、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ−１、ＴＰ−１、ＴＣ−ＰＴＰ、ＴＰ６３／ＴＰ７３Ｌ、ＴＤＧ、ＴＲ、ＣＣＬ２５／ＴＥＣＫ、ＴＲアルファ／ＮＲ１Ａ１、テナシンＣ、ＴＲベータ１／ＮＲ１Ａ２、テナシンＲ、ＴＲ２／ＮＲ２Ｃ１、ＴＥＲ−１１９、ＴＲ４／ＮＲ２Ｃ２
、ＴＥＲＴ、ＴＲＡ−１−８５、テスチカン１／ＳＰＯＣＫ１、ＴＲＡＤＤ、テスチカン２／ＳＰＯＣＫ２，ＴＲＡＦ−１、テスチカン３／ＳＰＯＣＫ３、ＴＲＡＦ−２、ＴＦＰＩ、ＴＲＡＦ−３、ＴＦＰＩ−２、ＴＲＡＦ−４、ＴＧＦ−アルファ、ＴＲＡＦ−６、ＴＧＦ−ベータ、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＬＡＰ（ＴＧＦ−ベータ１）、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、潜在ＴＧＦ−ベータ１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＧＦ−ベータ１．２、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１、ＴＧＦ−ベータ３、ＴｆＲ（トランスフェリンＲ）、ＴＧＦ−ベータ５、Ａｐｏ−トランスフェリン、潜在ＴＧＦ−ベータｂｐ１、Ｈｏｌｏ−トランスフェリン、潜在ＴＧＦ−ベータｂｐ２、トラッピン−２／エラフィン、潜在ＴＧＦ−ベータｂｐ４、ＴＲＥＭ−１、ＴＧＦ−ベータＲＩ／ＡＬＫ−５、ＴＲＥＭ−２、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、ＴＲＥＭ−３、ＴＧＦ−ベータＲＩＩｂ、ＴＲＥＭＬ１／ＴＬＴ−１、ＴＧＦ−ベータＲＩＩＩ、ＴＲＦ−１、テルモリシン、ＴＲＦ−２、チオレドキシン−１、ＴＲＨ−分解細胞外酵素／ＴＲＨＤＥ、チオレドキシン−２、ＴＲＩＭ５、チオレドキシン−８０、トリペプチジル−ペプチダーゼＩ、チオレドキシン様５／ＴＲＰ１４、ＴｒｋＡ、ＴＨＯＰ１、ＴｒｋＢ、トロンボモジュリン／ＣＤ１４１、ＴｒｋＣ、トロンボポエチン、ＴＲＯＰ−２、トロンボポエチンＲ、トロポニンＩペプチド３，トロンボスポンジン−１，トロポニンＴ、トロンボスポンジン−２、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、トロンボスポンジン−４、トリプシン１、チモポエチン、トリプシン２／ＰＲＳＳ２、胸腺ケモカイン−１、トリプシン３／ＰＲＳＳ３、Ｔｉｅ−１、トリプターゼ−５／Ｐｒｓｓ３２、Ｔｉｅ−２、トリプターゼアルファ／ＴＰＳ１、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、トリプターゼベータ−１／ＭＣＰＴ−７、ＴＩＭ−２、トリプターゼベータ−２／ＴＰＳＢ２、ＴＩＭ−３、トリプターゼイプシロン／ＢＳＳＰ−４、ＴＩＭ−４、トリプターゼガンマ−１／ＴＰＳＧ１、ＴＩＭ−５、トリプトファンヒドロキシラーゼ、ＴＩＭ−６、ＴＳＣ２２、ＴＩＭＰ−１、ＴＳＧ、ＴＩＭＰ−２、ＴＳＧ−６、ＴＩＭＰ−３、ＴＳＫ、ＴＩＭＰ−４、ＴＳＬＰ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＳＬＰＲ、ＴＬＲ１、ＴＳＰ５０、ＴＬＲ２、ベータ−ＩＩＩチューブリン、ＴＬＲ３、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、ＴＬＲ４、ＴＷＥＡＫＲ／ＴＮＦＲＳＦ１２、ＴＬＲ５、Ｔｙｋ２、ＴＬＲ６、ホスホチロシン、ＴＬＲ９、チロシンヒドロキシラーゼ、ＴＬＸ／ＮＲ２Ｅ１、チロシンホスファターゼ基質Ｉ、ユビキチン、ＵＮＣ５Ｈ３、Ｕｇｉ、ＵＮＣ５Ｈ４、ＵＧＲＰ１、ＵＮＧ、ＵＬＢＰ−１、ｕＰＡ、ＵＬＢＰ−２、ｕＰＡＲ、ＵＬＢＰ−３、ＵＲＢ、ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＶＤＥ、ＵＮＣ５Ｈ２、バニロイドＲ１、ＶＥＧＦＲ、ＶＡＳＡ、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１、バソヒビン、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、バソリン、ＶＥＧＦＲ３／Ｆｌｔ−４、バソスタチン、ベルシカン、Ｖａｖ−１、ＶＧ５Ｑ、ＶＣＡＭ−１、ＶＨＲ、ＶＤＲ／ＮＲ１Ｉ１���ビメンチン、ＶＥＧＦ、ビトロネクチン、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＬＤＬＲ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ｖＷＦ−Ａ２、ＶＥＧＦ−Ｄ、シヌクレイン−アルファ、Ｋｕ７０、ＷＡＳＰ、Ｗｎｔ−７ｂ、ＷＩＦ−１、Ｗｎｔ−８ａＷＩＳＰ−１／ＣＣＮ４、Ｗｎｔ−８ｂ、ＷＮＫ１、Ｗｎｔ−９ａ、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−９ｂ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−１０ｂ、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−５ｂ，ｗｎｖＮＳ３、Ｗｎｔ７ａ、ＸＣＲ１、ＸＰＥ／ＤＤＢ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＰＥ／ＤＤＢ２、Ｘｇ、ＸＰＦ、ＸＩＡＰ、ＸＰＧ、ＸＰＡ、ＸＰＶ、ＸＰＤ、ＸＲＣＣ１、Ｙｅｓ、ＹＹ１、ＥｐｈＡ４である。
【０２６９】
多くのヒトイオンチャンネルが特に注目すべき標的である。非限定的な例は５−ヒドロキシトリプタミン３受容体Ｂサブユニット、５−ヒドロキシトリプタミン３受容体前駆体、５−ヒドロキシトリプタミン受容体３サブユニットＣ、ＡＡＤ１４タンパク質、アセチルコリン受容体タンパク質、アルファサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、ベータサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、デルタサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、イプシロンサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、ガンマサブユニット前駆体、酸感知イオンチャンネル３スプライス変異体ｂ、酸感知イオンチャンネル３スプライス変異体ｃ、酸感知イオンチャンネル４、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ、ミトコンドリア前駆体、アルファ１Ａ−電圧依存性カルシウムチャンネル、アミロリド感受性カチオンチャンネル１、ニューロン性、アミロリド感受性カチオンチャンネル２、ニューロン性アミロリド感受性カチオンチャンネル４、アイソフォーム２、アミロリド感受性ナトリウムチャンネル、アミロリド感受性ナトリウムチャンネルアルファ−サブユニット、アミロリド感受性ナトリウムチャンネルベータ−サブユニット、アミロリド感受性ナトリウムチャンネルデルタ−サブユニット、アミロリド感受性ナトリウムチャンネルガンマ−サブユニット、アネキシンＡ７、尖様タンパク質、ＡＴＰ感受性内向整流性カリウムチャンネル１、ＡＴＰ感受性内向整流性カリウムチャンネル１０、ＡＴＰ感受性内向整流性カリウムチャンネル１１、ＡＴＰ感受性内向整流性カリウムチャンネル１４、ＡＴＰ感受性内向整流性カリウムチャンネル１５、ＡＴＰ感受性内向整流性カリウムチャンネル８、カルシウムチャンネルアルファ１２．２サブユニット、カルシウムチャンネルアルファ１２．２サブユニット、カルシウムチャンネルアルファ１Ｅサブユニット、デルタ１９デルタ４０デルタ４６スプライス変異体、カルシウム活性化カリウムチャンネルアルファサブユニット１、カルシウム活性化カリウムチャンネルベータサブユニット１、カルシウム活性化カリウムチャンネルベータサブユニット２、カルシウム活性化カリウムチャンネルベータサブユニット３、カルシウム依存性塩化物チャンネル−１、カチオンチャンネルＴＲＰＭ４Ｂ、ＣＤＮＡＦＬＪ９０４５３ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＰ３００１５４２、カリウムチャンネル４量体化ドメイン含有６に高度な同様性、ＣＤＮＡＦＬＪ９０６６３ｆｉｓ、クローンＰＬＡＣＥ１００５０３１、塩化物細胞内チャンネルタンパク質５に高度な同様性、ＣＧＭＰゲートカチオンチャンネルベータサブユニット、塩化物チャンネルタンパク質、塩化物チャンネルタンパク質２、塩化物チャンネルタンパク質３、塩化物チャンネルタンパク質４、塩化物チャンネルタンパク質５、塩化物チャンネルタンパク質６、塩化物チャンネルタンパク質ＣｌＣ−Ｋａ、塩化物チャンネルタンパク質ＣｌＣ−Ｋｂ、塩化物チャンネルタンパク質、骨格筋、塩化物細胞内チャンネル６、塩化物細胞内チャンネルタンパク質３、塩化物細胞内チャンネルタンパク質４、塩化物細胞内チャンネルタンパク質５、ＣＨＲＮＡ３タンパク質、Ｃｌｃｎ３ｅタンパク質、ＣＬＣＮＫＢタンパク質、ＣＮＧＡ４タンパク質、カリン−５、環状ＧＭＰゲートカリウムチャンネル、環状ヌクレオチドゲートカチオンチャンネル４、環状ヌクレオチドゲートカチオンチャンネルアルファ３、環状ヌクレオチドゲートカチオンチャンネルベータ３、環状ヌクレオチドゲート嗅覚チャンネル、嚢胞性線維症膜貫通伝導性調節物質、チトクロームＢ−２４５重鎖、ジヒドロピリジン感受性Ｌ型、カルシウムチャンネルアルファ−２／デルタサブユニット前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節物質３前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節物質５前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節物質６前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節物質７、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節物質８前駆体、Ｇタンパク質活性化内向整流性カリウムチャンネル１、Ｇタンパク質活性化内向整流性カリウムチャンネル２、Ｇタンパク質活性化内向整流性カリウムチャンネル３、Ｇタンパク質活性化内向整流性カリウムチャンネル４、ガンマアミノ酪酸受容体アルファ−１サブユニット前駆体、ガンマアミノ酪酸受容体アルファ−２サブユニット前駆体、ガンマアミノ酪酸受容体アルファ−３サブユニット前駆体、ガンマアミノ酪酸受容体アルファ−４サブユニット前駆体、ガンマアミノ酪酸受容体アルファ−５サブユニット前駆体、ガンマアミノ酪酸受容体アルファ−６サブユニット前駆体、ガンマアミノ酪酸受容体ベータ−１サブユニット前駆体、ガンマアミノ酪酸受容体ベータ−２サブユニット前駆体、ガンマアミノ酪酸受容体ベータ−３サブユニット前駆体、ガンマアミノ酪酸受容体デルタサブユニット前駆体、ガンマアミノ酪酸受容体イプシロンサブユニット前駆体、ガンマアミノ酪酸受容体ガンマ−１サブユニット前駆体、ガンマアミノ酪酸受容体ガンマ−３サブユニット前駆体、ガンマアミノ酪酸受容体ｐｉサブユニット前駆体、ガンマアミノ酪酸受容体ｒｈｏ−１サブユニット前駆体、ガンマアミノ酪酸受容体ｒｈｏ−２サブユニット前駆体、ガンマアミノ酪酸受容体シータサブユニット前駆体、ＧｌｕＲ６カイネート受容体、グルタメート受容体１前駆体、グルタメート受容体２前駆体、グルタメート受容体３前駆体、グルタメート受容体４前駆体、グルタメート受容体７、グルタメート受容体Ｂ、グルタメート受容体デルタ−１サブユニット前駆体、グルタメート受容体、イオノトロピックカイネート１前駆体、グルタメート受容体、イオノトロピックカイネート２前駆体、グルタメート受容体、イオノトロピックカイネート３前駆体、グルタメート受容体、イオノトロピックカイネート４前駆体、グルタメート受容体、イオノトロピックカイネート５前駆体、グルタメート［ＮＭＤＡ］受容体サブユニット３Ａ前駆体、グルタメート［ＮＭＤＡ］受容体サブユニット３Ｂ前駆体、グルタメート［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットイプシロン１前駆体、グルタメート［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットイプシロン２前駆体、グルタメート［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットイプシロン４前駆体、グルタメート［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットゼータ１前駆体、グリシン受容体アルファ−１鎖前駆体、グリシン受容体アルファ−２鎖前駆体、グリシン受容体アルファ−３鎖前駆体、グリシン受容体ベータ鎖前駆体、Ｈ／ＡＣＡリボヌクレオタンパク質複合体サブユニット１、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体ベータサブユニット、仮説的タンパク質ＤＫＦＺｐ３１３Ｉ０３３４、仮説的タンパク質ＤＫＦＺｐ７６１Ｍ１７２４、仮説的タンパク質ＦＬＪ１２２４２、仮説的タンパク質ＦＬＪ１４３８９、仮説的タンパク質ＦＬＪ１４７９８、仮説的タンパク質ＦＬＪ１４９９５、仮説的タンパク質ＦＬＪ１６１８０、仮説的タンパク質ＦＬＪ１６８０２、仮説的タンパク質ＦＬＪ３２０６９、仮説的タンパク質ＦＬＪ３７４０１、仮説的タンパク質ＦＬＪ３８７５０、仮説的タンパク質ＦＬＪ４０１６２、仮説的タンパク質ＦＬＪ４１４１５、仮説的タンパク質ＦＬＪ９０５７６、仮説的タンパク質ＦＬＪ９０５９０、仮説的タンパク質ＦＬＪ９０６２２、仮説的タンパク質ＫＣＴＤ１５、仮説的タンパク質ＭＧＣ１５６１９、イノシトール１，４，５−トリホスフェート受容体１型、イノシトール１，４，５−トリホスフェート受容体２型、イノシトール１，４，５−トリホスフェート受容体３型、中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャンネルタンパク質４、内向整流性カリウムチャンネル１３、内向整流性カリウムチャンネル１６、内向整流性カリウムチャンネル４、内向整流性Ｋ（＋）チャンネルの負の調節物質Ｋｉｒ２．２ｖ、カイネート受容体サブユニットＫＡ２ａ、ＫＣＮＨ５タンパク質、ＫＣＴＤ１７タンパク質、ＫＣＴＤ２タンパク質、ケラチノサイト関連膜貫通タンパク質１、Ｋｖチャンネル−相互作用タンパク質４、メラスタチン１、膜タンパク質ＭＬＣ１、ＭＧＣ１５６１９タンパク質、ムコリピン−１、ムコリピン−２、ムコリピン−３、多剤耐性関連タンパク質４、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート受容体２Ｃサブユニット前駆体、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ相同体１、Ｎａｖ１．５、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、アルファ−１０サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、アルファ−２サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、アルファ−３サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、アルファ−４サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、アルファ−５サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、アルファ−６サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、アルファ−７サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、アルファ−９サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、ベータ−２サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、ベータ−３サブユニット前駆体、ニューロンアセチルコリン受容体タンパク質、ベータ−４サブユニット前駆体、ニューロン電圧依存性カルシウムチャンネルアルファ２Ｄサブユニット、Ｐ２Ｘプリノセプター１、Ｐ２Ｘプリノセプター２、Ｐ２Ｘプリノセプター３、Ｐ２Ｘプリノセプター４、Ｐ２Ｘプリノセプター５、Ｐ２Ｘプリノセプター６、Ｐ２Ｘプリノセプター７、膵臓カリウムチャンネルＴＡＬＫ−１ｂ、膵臓カリウムチャンネルＴＡＬＫ−１ｃ、膵臓カリウムチャンネルＴＡＬＫ−１ｄ、ホスホレマン前駆体、プラズモリピン、多嚢胞性腎疾患２関連タンパク質、多嚢胞性腎疾患２様１タンパク質、多嚢胞性腎疾患２様２タンパク質、多嚢胞性腎疾患及び卵凝膠体関連タンパク質前駆体に対する受容体、ポリシスチン−２、カリウムチャンネル調節物質、カリウムチャンネルサブファミリーＫメンバー１、カリウムチャンネルサブファミリーＫメンバー１０、カリウムチャンネルサブファミリーＫメンバー１２、カリウムチャンネルサブファミリーＫメンバー１３、カリウムチャンネルサブファミリーＫメンバー１５、カリウムチャンネルサブファミリーＫメンバー１６、カリウムチャンネルサブファミリーＫメンバー１７、カリウムチャンネルサブファミリーＫメンバー２、カリウムチャンネルサブファミリーＫメンバー３、カリウムチャンネルサブファミリーＫメンバー４、カリウムチャンネルサブファミリーＫメンバー５、カリウムチャンネルサブファミリーＫメンバー６、カリウムチャンネルサブファミリーＫメンバー７、カリウムチャンネルサブファミリーＫメンバー９、カリウムチャンネル４量体化ドメイン含有３、カリウムチャンネル４量体化ドメイン含有タンパク質１２、カリウムチャンネル４量体化ドメイン含有タンパク質１４、カリウムチャンネル４量体化ドメイン含有タンパク質２、カリウムチャンネル４量体化ドメイン含有タンパク質４、カリウムチャンネル４量体化ドメイン含有タンパク質５、カリウムチャンネル４量体化ドメイン含有１０、カリウムチャンネル４量体化ドメイン含有タンパク質１３、カリウムチャンネル４量体化ドメイン含有１、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＡメンバー１、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＡメンバー２、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＡメンバー４、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＡメンバー５、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＡメンバー６、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＢメンバー１、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＢメンバー２、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＣメンバー１、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＣメンバー３、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＣメンバー４、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＤメンバー１、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＤメンバー２、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミ
リーＤメンバー３、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＥメンバー１、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＥメンバー２、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＥメンバー３、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＥメンバー４、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＦメンバー１、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＧメンバー１、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＧメンバー２、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＧメンバー３、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＧメンバー４、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＨメンバー１、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＨメンバー２、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＨメンバー３、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＨメンバー４、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＨメンバー５、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＨメンバー６、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＨメンバー７、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＨメンバー８、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＫＱＴメンバー１、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＫＱＴメンバー２、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＫＱＴメンバー３、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＫＱＴメンバー４、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＫＱＴメンバー５、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＳメンバー１、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＳメンバー２、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＳメンバー３、カリウム電圧ゲートチャンネルサブファミリーＶメンバー２、カリウム電圧ゲートチャンネル，サブファミリーＨ，メンバー７、アイソフォーム２、カリウム／ナトリウム超分極活性化環状ヌクレオチドゲートチャンネル１、カリウム／ナトリウム超分極活性化環状ヌクレオチドゲートチャンネル２、カリウム／ナトリウム超分極活性化環状ヌクレオチドゲートチャンネル３、カリウム／ナトリウム超分極活性化環状ヌクレオチドゲートチャンネル４、予測ミトコンドリアインポート受容体サブユニットＴＯＭ４０相同体、プリン作用性受容体Ｐ２Ｘ５、アイソフォームＡ、推定４リピート電圧ゲートイオンチャンネル、推定塩化物チャンネルタンパク質７、推定ＧｌｕＲ６カイネート受容体、推定イオンチャンネルタンパク質ＣＡＴＳＰＥＲ２変異体１、推定イオンチャンネルタンパク質ＣＡＴＳＰＥＲ２変異体２、推定イオンチャンネルタンパク質ＣＡＴＳＰＥＲ２変異体３、カリウムチャンネルタンパク質変異体１の推定調節物質、推定チロシン−タンパク質ホスファターゼＴＰＴＥ、リアノジン受容体１、リアノジン受容体２、リアノジン受容体３、ＳＨ３ＫＢＰ１結合タンパク質１、短一過性受容体電位チャンネル１、短一過性受容体電位チャンネル４、短一過性受容体電位チャンネル５、短一過性受容体電位チャンネル６、短一過性受容体電位チャンネル７、小型コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャンネルタンパク質１、小型コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャンネルタンパク質２、アイソフォームｂ、小型コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャンネルタンパク質３、アイソフォームｂ、小型コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャンネルＳＫ２、小型コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャンネルＳＫ３、ナトリウムチャンネル、ナトリウムチャンネルベータ−１サブユニット前駆体、ナトリウムチャンネルタンパク質ＩＩ型アルファサブユニット、ナトリウムチャンネルタンパク質ＩＩＩ型アルファサブユニット、ナトリウムチャンネルタンパク質ＩＶ型アルファサブユニット、ナトリウムチャンネルタンパク質ＩＸ型アルファサブユニット、ナトリウムチャンネルタンパク質Ｖ型アルファサブユニット、ナトリウムチャンネルタンパク質ＶＩＩ型アルファサブユニット、ナトリウムチャンネルタンパク質ＶＩＩＩ型アルファサブユニット、ナトリウムチャンネルタンパク質Ｘ型アルファサブユニット、ナトリウムチャンネルタンパク質ＸＩ型アルファサブユニット、ナトリウム及び塩化物活性化ＡＴＰ感受性カリウムチャンネル、ナトリウム／カリウム−輸送ＡＴＰアーゼガンマ鎖、精子関連カチオンチャンネル１、精子関連カチオンチャンネル２、アイソフォーム４、シンタキシン−１Ｂ１、一過性受容体電位カチオンチャンネルサブファミリーＡメンバー１、一過性受容体電位カチオンチャンネルサブファミリーＭメンバー２、一過性受容体電位カチオンチャンネルサブファミリーＭメンバー３、一過性受容体電位カチオンチャンネルサブファミリーＭメンバー６、一過性受容体電位カチオンチャンネルサブファミリーＭメンバー７、一過性受容体電位カチオンチャンネルサブファミリーＶメンバー１、一過性受容体電位カチオンチャンネルサブファミリーＶメンバー２、一過性受容体電位カチオンチャンネルサブファミリーＶメンバー３、一過性受容体電位カチオンチャンネルサブファミリーＶメンバー４、一過性受容体電位カチオンチャンネルサブファミリーＶメンバー５、一過性受容体電位カチオンチャンネルサブファミリーＶメンバー６、一過性受容体電位チャンネル４イプシロンスプライス変異体、一過性受容体電位チャンネル４ゼータスプライス変異体、一過性受容体電位チャンネル７ガンマスプライス変異体、腫瘍壊死因子、アルファ誘導タンパク質１、内皮、２孔性カルシウムチャンネルタンパク質２、ＶＤＡＣ４タンパク質、電圧ゲートカリウムチャンネルＫｖ３．２ｂ、電圧ゲートナトリウムチャンネルベータ１Ｂサブユニット、電圧依存性アニオンチャンネル、電圧依存性アニオンチャンネル２、電圧依存性アニオン選択的チャンネルタンパク質１、電圧依存性アニオン選択的チャンネルタンパク質２、電圧依存性アニオン選択的チャンネルタンパク質３、電圧依存性カルシウムチャンネルガンマ−１サブユニット、電圧依存性カルシウムチャンネルガンマ−２サブユニット、電圧依存性カルシウムチャンネルガンマ−３サブユニット、電圧依存性カルシウムチャンネルガンマ−４サブユニット、電圧依存性カルシウムチャンネルガンマ−５サブユニット、電圧依存性カルシウムチャンネルガンマ−６サブユニット、電圧依存性カルシウムチャンネルガンマ−７サブユニット、電圧依存性カルシウムチャンネルガンマ−８サブユニット、電圧依存性Ｌ型カルシウムチャンネルアルファ−１Ｃサブユニット、電圧依存性Ｌ型カルシウムチャンネルアルファ−１Ｄサブユニット、電圧依存性Ｌ型カルシウムチャンネルアルファ−１Ｓサブユニット、電圧依存性Ｌ型カルシウムチャンネルベータ−１サブユニット、電圧依存性Ｌ型カルシウムチャンネルベータ−２サブユニット、電圧依存性Ｌ型カルシウムチャンネルベータ−３サブユニット、電圧依存性Ｌ型カルシウムチャンネルベータ−４サブユニット、電圧依存性Ｎ型カルシウムチャンネルアルファ−１Ｂサブユニット、電圧依存性Ｐ／Ｑ型カルシウムチャンネルアルファ−１Ａサブユニット、電圧依存性Ｒ型カルシウムチャンネルアルファ−１Ｅサブユニット、電圧依存性Ｔ型カルシウムチャンネルアルファ−１Ｇサブユニット、電圧依存性Ｔ型カルシウムチャンネルアルファ−１Ｈサブユニット、電圧依存性Ｔ型カルシウムチャンネルアルファ−１Ｉサブユニット、電圧ゲートＬ型カルシウムチャンネルアルファ−１サブユニット、電圧ゲートカリウムチャンネルベータ−１サブユニット、電圧ゲートカリウムチャンネルベータ−２サブユニット、電圧ゲートカリウムチャンネルベータ−３サブユニット、電圧ゲートカリウムチャンネルＫＣＮＡ７を包含する。ヒト電圧ゲートナトリウムチャンネルのＮａｖ１．ｘファミリーも又特に有望な標的である。このファミリーは例えばチャンネルＮａｖ１．６及びＮａｖ１．８を包含する。
【０２７０】
本用途においてスカホールドとして使用するマイクロタンパク質の多くはＧタンパク質カップリング受容体（ＧＰＣＲ）に対してネイティブの活性を有しており、そして新しいＧＰＣＲモジュレーター（ＧＰＣＲの何れかの特製のアゴニスト、拮抗剤及びモジュレーターを包含する）を作成するための理想的な出発点を提供する。例示されるＧＰＣＲは限定しないがクラスＡロドプシン様受容体、例えばムスカチン性（Ｍｕｓｃ．）アセチルコリン脊椎動物１型、Ｍｕｓｃ．アセチルコリン脊椎動物２型、Ｍｕｓｃ．アセチルコリン脊椎動物３型、Ｍｕｓｃ．アセチルコリン脊椎動物４型；アドレナリン受容体（アルファアドレナリン受容体１型、アルファアドレナリン受容体２型、ベータアドレナリン受容体１型、ベータアドレナリン受容体２型、ベータアドレナリン受容体３型、ドーパミン脊椎動物１型、ドーパミン脊椎動物２型、ドーパミン脊椎動物３型、ドーパミン脊椎動物４型、ヒスタミン１型、ヒスタミン２型、ヒスタミン３型、ヒスタミン４型、セロトニン１型、セロトニン２型、セロトニン３型、セロトニン４型、セロトニン５型、セロトニン６型、セロトニン７型、セロトニン８型、他のセロトニン型、痕跡量アミン、アンジオテンシン１型、アンジオテンシン２型、ボンベシン、ブラジキニン、Ｃ５ａアナフィラトキシン、Ｆｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ、ＡＰＪ様、インターロイキン−８Ａ型、インターロイキン−８Ｂ型、インターロイキン−８の他の型、Ｃ−Ｃケモカイン１型〜１１型及び他の型、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（２型〜６型及びその他）、Ｃ−Ｘ３−Ｃケモカイン、コレシストキニンＣＣＫ、ＣＣＫ  Ａ型、ＣＣＫ  Ｂ型、ＣＣＫその他、エンドセリン、メラノコルチン（メラノサイト刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、メラノコルチンホルモン）、Ｄｕｆｆｙ抗原、プロラクチン放出ペプチド（ＧＰＲ１０）、ニューロペプチドＹ（１型〜７型）、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＹその他、ニューロテンシン、オピオイド（Ｄ、Ｋ、Ｍ、Ｘ型）、ソマトスタチン（１〜５型）、タキキニン（サブスタンスＰ（ＮＫ１）、サブスタンスＫ（ＮＫ２）、ニューロメジンＫ（ＮＫ３）、タキキニン様１、タキキニン様２、バソプレシン／バソトシン（１〜２型）、バソトシン、オキシトシン／メソトシン、コノプレシン、ガラニン様、プロテイナーゼ活性化様、オレキシン＆ニューロペプチドＦＦ，ＱＲＦＰ、ケモカイン受容体様、ニューロメジンＵ様（ニューロメジンＵ、ＰＲＸアミド）、ホルモンタンパク質（濾胞刺激ホルモン、ルトロピン絨毛製ゴナドトロピンホルモン、チロトロピン、ゴナドトロピンＩ型、ゴナドトロピンＩＩ型）、（ロド）オプシン，ロドプシン脊椎動物（１〜５型），ロドプシン脊椎動物５型，ロドプシン節足動物、ロドプシン節足動物１型，ロドプシン節足動物２，ロドプシン節足動物３型，ロドプシン軟体動物、ロドプシン、嗅覚（嗅覚ＩＩｆａｍ１〜１３）、プロスタグランジン（プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ１、プロスタグランジンＥ２／Ｄ２サブタイプＥＰ２、プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ３、プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ４、プロスタグランジンＦ２−アルファ、プロスタサイクリン、トロンボキサン、アデノシン��〜３型、プリノセプター、プリノセプターＰ２ＲＹ１−４，６，１１ＧＰＲ９１、プリノセプターＰ２ＲＹ５，８，９，１０ＧＰＲ３５，９２，１７４、プリノセプターＰ２ＲＹ１２−１４ＧＰＲ８７（ＵＤＰ−グルコース）、カンナビノイド、血小板活性化因子、ゴナドトロピン放出ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ型、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ型、アジポキニンホルモン様、コラゾニン、チロトロピン放出ホルモン及び分泌促進物質、チロトロピン放出ホルモン、成長ホルモン分泌促進物質、成長ホルモン分泌促進物質様、エクジシストリガーホルモン（ＥＴＨＲ）、メラトニン、リソスフィンゴリピド＆ＬＰＡ（ＥＤＧ）、スフィンゴシン１−ホスフェートＥｄｇ−１、リソホスファチジン酸Ｅｄｇ−２、スフィンゴシン１−ホスフェートＥｄｇ−３、リソホスファチジン酸Ｅｄｇ−４、スフィンゴシン１−ホスフェートＥｄｇ−５、スフィンゴシン１−ホスフェートＥｄｇ−６、リソホスファチジン酸Ｅｄｇ−７、スフィンゴシン１−ホスフェートＥｄｇ−８、Ｅｄｇ他のロイコトリエンＢ４受容体、ロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴ１、ロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴ２、クラスＡオーファン／その他、推定神経伝達物質、ＳＲＥＢ、Ｍａｓプロトオンコジーン及びＭａｓ関連（ＭＲＧｓ）、ＧＰＲ４５様、システイニルロイコトリエン、Ｇ−タンパク質カップリング胆汁酸受容体、遊離脂肪酸受容体（ＧＰ４０，ＧＰ４１，ＧＰ４３）、クラスＢセクレチン様、カルシトニン、コルチコトロピン放出因子、胃抑制性ペプチド、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、ＰＡＣＡＰ、セクレチン、血管作用性腸ポリペプチド、ラトロフィリン、ラトロフィリン１型、ラトロフィリン２型、ラトロフィリン３型、ＥＴＬ受容体、脳特異的血管形成阻害剤（ＢＡＩ）、メツセラー様タンパク質（ＭＴＨ）、カドヘリンＥＧＦ  ＬＡＧ（ＣＥＬＳＲ）、超大型Ｇ−タンパク質カップリング受容体、クラスＣ代謝生成物産生グルタメート／フェロモン、代謝生成物産生グルタメートグループＩ〜ＩＩＩ、カルシウム感知様、細胞外カルシウム感知、フェロモン、カルシウム感知様その他、推定フェロモン受容体、ＧＡＢＡ−Ｂ、ＧＡＢＡ−Ｂサブタイプ１、ＧＡＢＡ−Ｂサブタイプ２、ＧＡＢＡ−Ｂ様、オーファンＧＰＲＣ５、オーファンＧＰＣＲ６、ブライドオブセブンレスタンパク質（ＢＯＳＳ）、味受容体（Ｔ１Ｒ）、クラスＤカビフェロモン，カビフェロモンＡ−因子様（ＳＴＥ２，ＳＴＥ３），カビフェロモンＢ様（ＢＡＲ，ＢＢＲ，ＲＣＢ，ＰＲＡ）、クラスＥｃＡＭＰ受容体、眼アルビノタンパク質、フリズルド／スムースンドファミリー、フリズルドグループＡ（Ｆｚ１＆２＆４＆５＆７〜９）、フリズルドグループＢ（Ｆｚ３＆６）、フリズルドグループＣ（他）、鋤鼻受容体、線虫ケモ受容体、昆虫臭気受容体、及びクラスＺ古細菌／細菌／カビオプシンを包含する。
【０２７１】
特に利用性が高いものは以下の活性なポリペプチド、即ち：ＢＯＴＯＸ、ミオブロック、ニューロブロック、ジスポート（又は他のボツリヌス神経毒の血清型）、アルグルコシダーゼアルファ、ダプトマイシン、ＹＨ−１６、絨毛ゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリックス、インターロイキン−２、アルデスロイキン、テセロイキン、デニロイキンジフチトックス、インターフェロンアルファ−ｎ３（注射）、インターフェロンアルファ−ｎ１、ＤＬ−８２３４、インターフェロン、サントリー（ガンマ−１ａ）、インターフェロンガンマ、チモシンアルファ１、タソネルミン、ジギファブ、ビペラタブ、エチタブ、クロファブ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、レビフ、エプトテルミンアルファ、テリパラチド（骨粗鬆症）、カルシトニン注射用（骨疾患）、カルシトニン（鼻内、骨粗鬆症）、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー２５０（ウシ）、ドロトレゴジンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組み換えヒト表皮成長因子（局所用ゲル、創傷治癒）、ＤＷＰ−４０１、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグアルファ、モノニン、エプタコグアルファ（活性化）、組み換え型第ＶＩＩＩ因子＋ＶＷＦ、リコンビネート、組み換え型第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（組み換え型）、アルファネート、オクトコグアルファ、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、インジキナーゼ、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカフンジン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エキセナチド、プラムリンチド、イミグルセラーゼ、ガルスルファーゼ、ロイコトロピン、モルグラモスチム、トリプトレリンアセテート、ヒストレリン（皮下インプラント、Ｈｙｄｒｏｎ）、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、ロイプロリド除放性デポ剤（ＡＴＲＩＧＥＬ）、ロイプロリドインプラント（ＤＵＲＯＳ）、ゴセレリン、ソマトトロピン、ユートロピン、ＫＰ−１０２プログラム、ソマトロピン、ソマトロピン、メカセルミン（成長障害）、エンフビルチド、Ｏｒｇ−３３４０８、インスリングラルジン、インスリングルリシン、インスリン（吸入）、インスリンリスプロ、インスリンデテミル、インスリン（舌下錠、ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファベート、アナキンラ、セルモロイキン、９９ｍＴｃ−アプシチド注射剤、ミエロピド、ベータセロン、グラチラマーアセテート、ゲポン、サルグラモスチン、オプレルベキン、ヒト白血球誘導アルファインターフェロン、ビリベ、インスリン（組み換え型）、組み換え型ヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセルミン、ロフェロン−Ａ、インターフェロン−アルファ２、アルファフェロン、インターフェロンアルファｃｏｎ−１、インターフェロンアルファ、Ａｖｏｎｅｘ’組み換え型ヒト黄体形成ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、ゼマイラ、ＣＴＣ−１１１、シャンバック−Ｂ、ＨＰＶワクチン（４価）、ＮＯＶ−００２、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、プレザチド銅アセテート（局所用ゲル）、ラスブリカーゼ、ラニビツマブ、アクチミューン、ＰＥＧ−イントロン、トリコミン、組み換え型チリダニアレルギー脱感作剤注射、組み換え型ヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１−８４（ｓｃ、骨粗鬆症）、エポエチンデルタ、トランスジェニックアンチトロンビンＩＩＩ、グランジトロピン、ビトラーゼ、組み換え型インスリン、インターフェロン−アルファ（経口ロゼンジ剤）、ＧＥＭ−２１Ｓ、バプレオチド、イヅルスルファーゼ、オマパトリラット、組み換え型血清アルブミン、セルトリズマブペゴール、グルカルピダーゼ、ヒト組み換え型Ｃ１エステラーゼ阻害剤（血管浮腫）、ラノテプラーゼ、組み換え型ヒト成長ホルモン、エンフビルチド（無針注射、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ２０００）、ＶＧＶ−１、インターフェロン（アルファ）、ルシナクタント、アビプタジル（吸入用、肺疾患）、イカチバント、エカランチド、オミガナン、オーログラブ、ペキシガナンアセテート、ＡＤＩ−ＰＥＧ−２０、ＬＤＩ−２００、デガレリックス、シントレデキンベスドトックス、ＦａｖＩｄ、ＭＤＸ−１３７９、ＩＳＡｔｘ−２４７、リラグルチド、テリパラチド（骨粗鬆症）、チファコジン、ＡＡ−４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション、カツマキソマブ、ＤＷＰ−４１３、ＡＲＴ−１２３、クリサリン、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンアルファ、ＴＨ−９５０７、テヅグルチド、ジアミド、ＤＷＰ−４１２、成長ホルモン（除放性注射剤）、組み換え型Ｇ−ＣＳＦ、インスリン（吸入用、ＡＩＲ）、インスリン（吸入用、Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ）、インスリン（吸入用、ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ−３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンベータ（Ｃ型肝炎ウィルス感染症（ＨＣＶ））、インターフェロンアルファ−ｎ３（経口用）、ベラタセプト、経皮用インスリンパッチ、ＡＭＧ−５３１、ＭＢＰ−８２９８、キセレセプト、オペバカン、ＡＩＤＳＶＡＸ、ＧＶ−１００１、リンホスキャン、ランピルナーゼ、リポキシサン、ルスプルチド、ＭＰ５２（ベータトリカルシウムホスフェート担体、骨再生）、メラノーマワクチン、シプレウセル−Ｔ、ＣＴＰ−３７、インセギア、ビテスペン、ヒトトロンビン（凍結、手術出血）、トロンビン、トランスＭＩＤ、アリフィメプラーゼ、プリカーゼ、テルリプレシン（静脈内、肝腎臓症候群）、ＥＵＲ−１００８Ｍ、組み換え型ＦＧＦ−１（注射用、血管疾患）、ＢＤＭ−Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ−２１６、Ｐ−１１３、ＭＢＩ−５９４ＡＮ、ヅラマイシン（吸入用、嚢胞性線維症）、ＳＣＶ−０７、ＯＰＩ−４５、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＡＢＴ−５１０、ボーマンバーク阻害剤濃縮物、ＸＭＰ−６２９、９９ｍＴｃ−Ｈｙｎｉｃ−アネキシンＶ、カハラリドＦ、ＣＴＣＥ−９９０８、テベレリクス（延長放出）、オザレリックス、ロミデプシン、ＢＡＹ−５０−４７９８、インターロイキン−４、ＰＲＸ−３２１、ペプスキャン、イボクタデキン、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ−０１５、ＩＬ−２１、ＡＴＮ−１６１、シレンジチド、アルブフェロン、ビファジックス、ＩＲＸ−２、オメガインターフェロン、ＰＣＫ−３１４５、ＣＡＰ−２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１−ＤＭ１、卵巣癌免疫療法用ワクチン、ＳＢ−２４９５５３、オンコバックス−ＣＬ、オンコバックス−Ｐ、ＢＬＰ−２５、セルバックス−１６、多エピトープペプチドメラノーマワクチン（ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ）、ネミフィチド、ｒＡＡＴ（吸入用）、ｒＡＡＴ（皮膚科用）、ＣＧＲＰ（吸入用、喘息）、ペグスネルセプト、チモシンベータ−４、プリチデプシン、ＧＴＰ−２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ−１、ＡＣ−１００、サケカルシトニン（経口用、エリゲン）、カルシトニン（経口用、骨粗鬆症）、エキサモレリン、カプロモレリン、カルデバ、ベラフェルミン、１３１Ｉ−ＴＭ−６０１、ＫＫ−２２０、ＴＰ−１０、ウラリチド、デペレスタット、ヘマチド、クリサリン（局所用）、ｒＮＡＰｃ２、組み換え型第ＶＩＩＩ因子（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組み換え型スタフィロキナーゼ変異体、Ｖ−１０１５３、ソノリシスプロリーゼ、ニューロバックス、ＣＺＥＮ−００２、島細胞新生療法、ｒＧＬＰ−１、ＢＩＭ−５１０７７、ＬＹ−５４８８０６、エキセナチド（制御放出、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ）、ＡＶＥ−００１０、ＧＡ−ＧＣＢ、アボレリン、ＡＯＤ−９６０４、リナクロチドアセテート、ＣＥＴｉ−１、ヘモスパン、ＶＡＬ（注射用）、急速作用性インスリン（注射用、Ｖｉａｄｅｌ）、鼻内インスリン、インスリン（吸入用）、インスリン（経口用、ｅｌｉｇｅｎ）、組み換え型メチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ皮下注射、湿疹）、ピトラキンラ（吸入用乾燥粉末、喘息）、マルチカイン、ＲＧ−１０６８、ＭＭ−０９３、ＮＢＩ−６０２４、ＡＴ−００１、ＰＩ−０８２４、Ｏｒｇ−３９１４１、Ｃｐｎ１０（自己免疫疾患／炎症）、タラクトフェリン（局所用）、ｒＥＶ−１３１（眼用）、ｒＥＶ−１３１（呼吸疾患）、経口用組み換え型ヒトインスリン（糖尿病）、ＲＰＩ−７８Ｍ、オプレルベキン（経口用）、ＣＹＴ−９９００７  ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＤＴＹ−００１、バラテグラスト、インターフェロンアルファ−ｎ３（局所用）、ＩＲＸ−３、ＲＤＰ−５８、タウフェロン、胆汁酸塩刺激リパーゼ、メリスパーゼ、アルカリホスファターゼ、ＥＰ−２１０４Ｒ、メラノタン−ＩＩ、ブレメラノチド、ＡＴＬ−１０４、組み換え型ヒトミクロプラスミン、ＡＸ−２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ−１、Ｘｅｎ−２１７４、ＣＪＣ−１００８、ジノルフィンＡ、ＳＩ−６６０３、ＬＡＢ  ＧＨＲＨ、ＡＥＲ−００２、ＢＧＣ−７２８、マラリアワクチン（ビロソーム、ＰｅｖｉＰＲＯ）、ＡＬＴＵ−１３５、パルボウイルスＢ１９ワクチン、インフルエンザワクチン（組み換え型ノイラミニダーゼ）、マラリア／ＨＢＶワクチン、炭疽病ワクチン、Ｖａｃｃ−５ｑ、Ｖａｃｃ−４ｘ、ＨＩＶワクチン（経口用）、ＨＰＶワクチン、Ｔａｔトキソイド、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ−１３３４０、ＰＴＨ（１−３４）リポソームクリーム（ノバソーム）、オスタボリン−Ｃ、ＰＴＨ類縁体（局所用、乾癬）、ＭＢＲＩ−９３．０２、��ＴＢ７２Ｆワクチン（結核）、ＭＶＡ−Ａｇ８５Ａワクチン（結核）、ＦＡＲ−４０４、ＢＡ−２１０、組み換え型ペストＦ１Ｖワクチン、ＡＧ−７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶ１、Ｄｅｒ−ｐ１／Ｄｅｒ−ｐ２／Ｄｅｒ−ｐ７アレルゲン標的化ワクチン（チリダニアレルギー）、ＰＲ１ペプチド抗原（白血病）、突然変異体ｒａｓワクチン、ＨＰＶ−１６Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリンシンワクチン（腺癌）、ＣＭＬワクチン、ＷＴ１−ペプチドワクチン（癌）、ＩＤＤ−５、ＣＤＸ−１１０、ペントリス、ノレリン、サイトファブ、Ｐ−９８０８、ＶＴ−１１１、イクロカプチド、テルベルミン（皮膚科、糖尿病性脚部潰瘍）、ルピントリビル、レチキュロース、ｒＧＲＦ、Ｐ１Ａ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ−０１１、ＡＬＴＵ−１４０、ＣＧＸ−１１６０、アンジオテンシン治療用ワクチン、Ｄ−４Ｆ、ＥＴＣ−６４２、ＡＰＰ−０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ−０７（経口用、結核）、ＤＲＦ−７２９５、ＡＢＴ−８２８、ＥｒｂＢ２特異的イムノトキシン（抗癌）、ＤＴ３８８ＩＬ−３、ＴＳＴ−１００８８、ＰＲＯ−１７６２、コムボトックス、コレシストキニン−Ｂ／ガストリン−受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ−ｈＥＧＦ、ＡＥ−３７、トラスツヅマブ−ＤＭ１、拮抗剤Ｇ、ＩＬ−１２（組み換え型）、ＰＭ−０２７３４、ＩＭＰ−３２１、ｒｈＩＧＦ−ＢＰ３、ＢＬＸ−８８３、ＣＵＶ−１６４７（局所用）、Ｌ−１９系放射線免疫療法剤（癌）、Ｒｅ−１８８−Ｐ−２０４５、ＡＭＧ−３８６、ＤＣ／Ｉ５４０／ＫＬＨワクチン（癌）、ＶＸ−００１、ＡＶＥ−９６３３、ＡＣ−９３０１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ワクチン（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、メラノーマワクチン（パルスド抗原治療薬）、前立腺癌ワクチン、ＣＢＰ−５０１、組み換え型ヒトラクトフェリン（ドライアイ）、ＦＸ−０６、ＡＰ−２１４、ＷＡＰ−８２９４Ａ２（注射用）、ＡＣＰ−ＨＩＰ、ＳＵＮ−１１０３１、ペプチドＹＹ［３−３６］（肥満、鼻内）、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３−Ｆｃ、ＢＮ−００３、ＢＡ−０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１−３４（鼻内、骨粗鬆症）、Ｆ−１８−ＣＣＲ１、ＡＴ−１００１（セリアック秒／糖尿病）、ＪＰＤ−００３、ＰＴＨ（７−３４）リポソームクリーム（ノバソーム）、ヅラマイシン（眼用、ドライアイ）、ＣＡＢ−２、ＣＴＣＥ−０２１４、グリコＰＥＧ化エリスロポエチン、ＥＰ
Ｏ−Ｆｃ、ＣＮＴＯ−５２８、ＡＭＧ−１１４、ＪＲ−０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノカンジン、ＰＮ−９５１、７１６１５５、ＳＵＮ−Ｅ７００１、ＴＨ−０３１８、ＢＡＹ−７３−７９７７、テベレリックス（即時放出）、ＥＰ−５１２１６、ｈＧＨ（制御放出、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ）、ＯＧＰ−Ｉ、シフビルチド、ＴＶ−４７１０、ＡＬＧ−８８９、Ｏｒｇ−４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ−９９１、チモペンチン（肺疾患）、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝選択的インスリン、スバリン、Ｌ１９−ＩＬ−２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ−１５０、ＡＬＴＵ−１３９、ＥＮ−１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト（血小板減少症）、ＡＬ−１０８、ＡＬ−２０８、神経成長因子拮抗剤（疼痛）、ＳＬＶ−３１７、ＣＧＸ−１００７、ＩＮＮＯ−１０５、経口用テリパラチド（エリゲン）、ＧＥＭ−ＯＳ１、ＡＣ−１６２３５２、ＰＲＸ−３０２、ＬＦｎ−ｐ２４融合ワクチン（テラポア）、ＥＰ−１０４３、Ｓ小児肺炎ワクチン、マラリアワクチン、髄膜炎細菌グループＢワクチン、新生児グループＢ連鎖球菌ワクチン、炭疽菌ワクチン、ＨＣＶワクチン（ｇｐＥ１＋ｇｐＥ２＋ＭＦ−５９）、中耳炎治療、ＨＣＶワクチン（コア抗原＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、ｈＰＴＨ（１−３４）（経皮用、ＶｉａＤｅｒｍ）、７６８９７４、ＳＹＮ−１０１、ＰＧＮ−００５２、アビスクミン、ＢＩＭ−２３１９０、結核ワクチン、多エピトープチロシナーゼペプチド、癌ワクチン、エンカスチム、ＡＰＣ−８０２４、ＧＩ−５００５、ＡＣＣ−００１、ＴＴＳ−ＣＤ３、血管標的化ＴＮＦ（固形腫瘍）、デスモプレシン（舌下制御放出）、オネルセプト、ＴＰ−９２０１の何れかへのアクセサリー配列の融合である。
【０２７２】
非反復ＵＲＰ（ｎｒＵＲＰ）
本発明はまた、非反復ＵＲＰ（ｎｒＵＲＰ）を包含する。ｎｒＵＲＰは小型の親水性アミノ酸を主に含み、そしてインビボで二次構造を形成する傾向が低いアミノ酸配列である。ｎｒＵＲＰは生理学的条件下で明確な二次及び三次構造を欠いていることによりそれらの配座配座柔軟性に寄与していること；高度なプロテアーゼ耐性；生物学的活性ポリペプチド内へのＵＲＰ配列の取り込みにより生物学的活性ポリペプチドの半減期及び／又は溶解性を増大する能力を包含するＵＲＰの特性を保有している。ｎｒＵＲＰの特定の特性はそれらの内部反復性の程度が低いことである。ｎｒＵＲＰは多数の異なるペプチドサブ配列を含む。これらのサブ配列はＵＲＰ様アミノ酸組成を有するが、それらのアミノ酸の配列及び長さにおいて相互に異なっている。
【０２７３】
ｎｒＵＲＰは同様のアミノ酸組成を有する反復性のＵＲＰ（ｒＵＲＰ）と比較して向上した溶解性を有する傾向がある。一般的に反復性のアミノ酸配列はコラーゲン及びロイシンジッパーのような天然の反復配列により例示されるように凝集する傾向を有する。反復配列は、同一のサブ配列が同様の接点を形成して結晶性又は疑似結晶性の構造を生じるように高次構造を形成できる。ｎｒＵＲＰはそれらが如何なる反復性の高次構造の形成も防止する多数の異なるサブ配列を含有しているため、上記のような疑似結晶性構造を形成する傾向は遙かに低い。非反復配列が凝集する傾向が低いことは反復性ＵＲＰにおいて凝集する可能性が高い荷電アミノ酸の相対的な頻度が低いＵＲＰの設計を可能にする。ｎｒＵＲＰの低凝集傾向はｎｒＵＲＰ含有医薬品の形成を促進し、特に１００ｍｇ／ｍＬを超える極めて高い薬剤濃度を有する製剤を可能にする。
【０２７４】
（ａ）ｎｒＵＲＰは低免疫原性を有する。
【０２７５】
反復性及び非反復性のＵＲＰ配列の該配列中のエピトープを認識するＢ細胞との相互作用を比較し、図７４に示した。ｒＵＲＰは、比較的少数の異なるエピトープを含有するため、生物中で極少数のＢ細胞にのみ認識される。しかし、ｒＵＲＰはこれらの極少数のＢ細胞と多価の接点を形成することができ、その結果、図７４ａに示す通りＢ細胞増殖を刺激できる。対照的にｎｒＵＲＰは多くの異なるエピトープを含有するため多くの異なるＢ細胞との接点を形成できる。しかしながら、各々個々のＢ細胞は図７４ｂに示す通り反復性の欠如のため個々のｎｒＵＲＰとは１つ又は少数の接点のみ形成できる。その結果、ｎｒＵＲＰはＢ細胞の増殖、そしてその結果としての免疫応答を刺激する傾向は遙かに低い。
【０２７６】
ｒＵＲＰに対してｎｒＵＲＰの追加的利点は、ｎｒＵＲＰはｒＵＲＰに対してに対して抗体とより弱い接点を形成することである。抗体は多価の分子である。例えばＩｇＧは２つの同一の結合部位を有しており、そしてＩｇＭは同一の結合部位１０個を含有する。即ち、反復配列に対する抗体は高いアビディティでそのような反復配列と多価の接点を形成でき、これはそのような反復配列の力価及び／又は排除に影響する場合がある。対照的にｎｒＵＲＰに対する抗体は、該ｎｒＵＲＰが各エピトープのリピートを僅かのみ含有するため、抗体とは主に１価の相互作用を生じさせる。
【０２７７】
（ｂ）反復性の方向
遺伝子の反復性はコンピューターアルゴリズムにより計測できる。一例を図７５に示す。クエリ配列に基づいて、特定の長さの全てのサブ配列のペアワイズな比較を実施できる。これらのサブ配列を同一性又は相同性に関して比較できる。図７５の例は同一性に関して４アミノ酸のサブ配列を比較している。例においては、大部分の４量体サブ配列がクエリ配列において１回生じており、そして３４量体のサブ配列は２回生じている。遺伝子内の反復性は平均することができる。サブ配列の長さは調節することができる。サブ配列の長さは免疫系により認識されることができる配列エピトープの長さを反映している。即ち、４〜１５アミノ酸のサブ配列の分析が最も有用である場合がある。
【０２７８】
（ｃ）ｎｒＵＲＰ配列の設計
ｎｒＵＲＰをコードする遺伝子は遺伝子合成の標準的手法を用いてオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。遺伝子設計はコドンの使用及びアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを用いて実施できる。更にまた、プロテアーゼ感受性であるか、又は、ヒト免疫系により容易に認識され得るエピトープを含有することが分かっているアミノ酸配列を回避できる。コンピューターアルゴリズムは結果として生じるアミノ酸配列の反復性を最小限にするように配列設計中に適用できる。アミノ酸組成、コドン使用、プロテアーゼ感受性配列の回避、エピトープの回避のようなプリセット基準に合致する多数の遺伝子設計の反復性を評価することができ、そして合成とその後の評価のための最小反復配列を選択する。
【０２７９】
ｎｒＵＲＰ遺伝子を設計する代替の手順は、高レベル発現、低凝集傾向、高溶解性、及び良好なプロテアーゼ耐性を示すｎｒＵＲＰの既存の収集物の配列を分析することである。コンピューターアルゴリズムは図７６に示す通り配列フラグメントの再組み立てによりそのような既存のｎｒＵＲＰ配列に基づいてｎｒＵＲＰ配列を設計できる。アルゴリズムはこれらのｎｒＵＲＰ配列からサブ配列の収集物を形成し、そして次にそのようなサブ配列からｎｒＵＲＰ配列を組み立てる多数の方法を評価する。これらの組み立てられた配列は、以前に識別されたｎｒＵＲＰのサブ配列のみを含むが全ての親ｎｒＵＲＰと比較して反復性が低減したｎｒＵＲＰ配列を識別するために反復性を評価できる。
【０２８０】
（ｄ）ライブラリからのｎｒＵＲＰ配列の構築
ｎｒＵＲＰコード遺伝子は図７７に示す通り短いＵＲＰセグメントのライブラリから組み立てられる。まずＵＲＰセグメントの大型ライブラリを形成する。そのようなライブラリは部分的にランダム化されたオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。ランダム化のスキームは各位置に関するアミノ酸の選択並びにコドンの使用及び配列の長さを制御できるように最適化できる。１つの実施形態において、ＵＲＰセグメントのライブラリを発現ベクター内にクローニングする。別の実施形態においては、ＵＲＰセグメントのライブラリをＧＦＰのような指標遺伝子に融合した発現ベクター内にクローニングする。その後、発現レベル、プロテアーゼ安定性、血清タンパク質への結合のような多くの特性に関してライブラリメンバーをスクリーニングできる。該血清に対する高い親和性を有するセグメントを排除するために抗血清への結合に関してＵＲＰセグメントをスクリーニングできる。特にＵＲＰ配列への反応性を有する抗血清を識別してそれへの結合を回避するために、ライブラリメンバーをスクリーニングできる。ライブラリメンバーのアミノ酸配列は、特定の望ましいアミノ酸組成、セグメント長さを有するセグメントを識別するため、又は内部リピートの低頻度を有するセグメントを識別するために、測定できる。その後、ｎｒＵＲＰ配列をランダム２量体化又は多量体化によりＵＲＰセグメントの収集物から組み立ててよい。２量体化又は多量体化はライゲーション又はＰＣＲ組み立てにより達成できる。このプロセスは最も望ましい特性を有するｎｒＵＲＰ配列を識別するために多くの特性に関して評価することができるｎｒＵＲＰ配列のライブラリをもたらす。２量体化又は多量体化のプロセスを反復することによりさらにｎｒＵＲＰ配列の長さを増大できる。
【０２８１】
架橋アクセサリーポリペプチドの設計
本発明はまた、架橋アクセサリーポリペプチドを含み、特性（例えば流体力学的半径の増大又は血清中半減期延長）が高まったポリペプチドに関する。架橋アクセサリーポリペプチドは非架橋成分１つ以上及び架橋成分１つ以上をコンジュゲートすることにより形成できる。
【０２８２】
この手順の利点は、高度に発現される中程度の長さを有するアクセサリーポリペプチドを使用することにより、所望の特性を有するより大きい分子を効率的に形成できるという点である。例えば、化学的カップリングを用いることにより、単一のタンパク質として発現される単一の１０００アミノ酸長のポリペプチドよりも遙かに効率的に２００アミノ酸長の単位５つを含む分子を形成できる。
【０２８３】
何れかの数量の非架橋成分、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の成分をともに連結できる。これらの成分は同一であるか、又は２、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上の異なる種類のものであることができる。好ましい実施形態においては、各成分は所定の結合特異性を有しており、それは各成分につき同じであるか、又は２、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上の異なる型のものであることができる。非架橋成分の配列はまた同じであることができ、或いは、１〜１０の異なる配列を含んでよい。
【０２８４】
本発明の好ましい実施形態は、単反応性の非架橋成分の１、２、３、４、５、６、７、８コピー以上を、場合によりポリエチレングリコール、アクセサリーポリペプチド又は他の水溶性重合体を含有する多反応性の架橋成分１コピーに反応させることにより、非架橋成分の厳密に（例えば）４コピーを、各コピーが架橋剤に連結された状態で含有する予め定義された重合体をもたらすことを可能にする。非架橋成分は場合により結合特異性を有するドメインを含んでよい。
【０２８５】
種々の連結の化学的特徴をコンジュゲーションのために使用できる。好ましい実施形態においては、標準的なアミノ−カルボキシルカップリング、そして特にリジン基の、又はＮ末端のアミノ基を介した連結、又は、グルタメートの、又はＣ末端のカルボキシル基を介した連結が、架橋アクセサリーポリペプチドの架橋のために特に有用である。
【０２８６】
一部の実施形態においては、架橋成分は合成ポリペプチドであることができる。例えば、そのようなポリペプチドは場合によりカルボキシル基の間に挿入された配列（「連結ペプチド」）により隔てられた５カルボキシ残基（即ち４グルタメート＋Ｃ末端カルボキシ）を含んでよい。この連結ペプチドのアミノ末端はさらなる変異体の形成を防止するために例えばアミド化によりブロックすることができる（図２７）。第２の反応性基はアクセサリーポリペプチドを含有するタンパク質のアミノ末端である。場合により、連結ペプチドのカルボキシルにカップリングするためのリジン１つ以上を保存できる。完全な化学連結の後、５アクセサリーポリペプチド（場合により結合ドメインを含有する）並びに連結ペプチドを含有する分子である均質な単一の生成物を得ることができる。一つの変形例は、連結ペプチドにアミノ基を含有させ、典型的には結合ドメインを担持している他のタンパク質上のカルボキシルを使用することである。
【０２８７】
そのような分枝鎖構造に加えて、あるタンパク質のアミノ末端を別のタンパク質のカルボキシ末端に連結することにより２、３、４、５、６、７、８つ以上の別個に発現されたポリペプチドの線状重合体を形成することも可能である。この場合も、これらのポリペプチドは上記した通り同じか又は異なっていてよい。
【０２８８】
好ましい連結はアミノからカルボキシに行う。カップリングに使用するアミノ基は、使用するカルボキシル基が化学的架橋剤上に位置する場合には、組み換えタンパク質上に位置する。或いは、カップリングに使用するアミノ基は、使用するカルボキシル基が組み換えタンパク質上に位置する場合には、化学的架橋剤上に位置する。
【０２８９】
架橋剤上で使用されるカップリング部位の数は、１、２、３、４、５以上の結合ドメインを各々が典型的には含有する１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上の組み換えタンパク質を生成物が含有することになるかどうかを決定する。架橋成分は典型的には小型のＦＤＡ認可された化学物質であるが、組み換えポリペプチドであることもでき、そして場合により少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００単位の反復モチーフ、及び最大で１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００単位の反復モチーフを含有する。
【０２９０】
異なる条件により示差的に除去できる保護基を用いて、各々が異なるタンパク質をコンジュゲートに付加する幾つかのコンジュゲーション工程を有することが可能である。これにより、予め設計された化学量論的特徴において多数の異なるタンパク質鎖とのコンジュゲートの形成が可能になる。１つの連結可能な位置（例えばＮ末端）を有する２つのタンパク質鎖との２価の架橋剤のコンジュゲーションは、２量体を形成する。２つの連結部位を有するタンパク質の架橋は線状重合体を形成する。両方の末端に連結部位を含有するタンパク質との３価の架橋剤の架橋は樹状高分子を形成する（図２６）。
【０２９１】
一部の実施形態においては、非架橋成分は標的受容体への親和性を有する生物学的活性ポリペプチド１つ以上を含んでよい。これらの生物学的活性ポリペプチドは異なる標的受容体に結合することができ、これにより、数種の異なる標的受容体の数種のコピーに結合する架橋アクセサリーポリペプチドの形成が可能になる。或いは、非架橋成分は同じ標的受容体の数種の異なるエピトープに結合する多数の生物学的活性ポリペプチドを含むことができる。結果として生じる架橋アクセサリーポリペプチドは標的受容体の多数のコピーに結合することができる一方、各標的受容体との多数の結合接点を形成し、極めて高いアビディティをもたらす。他の選択肢は、極めて多数の同一の結合部位を有する架橋アクセサリーポリペプチドを構築するために多数の同一の結合エレメントを含有する非架橋成分を使用することである。
【０２９２】
他の実施形態において、非架橋成分は１つ又は多数のアクセサリーポリペプチドモジュールを含んでよい。これらのｒＰＥＧモジュールは、結果として生じる架橋アクセサリーポリペプチドに大きい流体力学的半径、そしてその結果として低い腎排出速度をもたらす。更にまた、アクセサリーポリペプチドモジュールは、結果として生じる架橋アクセサリーポリペプチド内部の種々のドメインの運動性を増大させる。これは多数の用途を有することができる。例えば配座の運動性は、細胞、組織、又は感染体のような標的上の多数の標的受容体に、該標的受容体が相互に近接して位置していない場合であっても、架橋アクセサリーポリペプチドが結合できるようにする。アクセサリーポリペプチドモジュールはまた架橋アクセサリーポリペプチドの組織分布を調整する作用も有する場合がある。例えば、架橋アクセサリーポリペプチド内にアクセサリーポリペプチドモジュールを包含させることにより、大型のタンパク質に対して低い浸透性を有する未損傷の脈管を特徴とする健常な組織内部への該架橋アクセサリーポリペプチドの浸透を制限することができる。
【０２９３】
更に他の実施形態において、非架橋成分は、結果として生じる架橋アクセサリーポリペプチドの血清中半減期を延長する結合エレメントを含有できる。そのような結合エレメントは１つ又は多数の血清成分、例えばＨＳＡ、ＩｇＧ、赤血球、又は大量に存在するその他の血清成分に結合できる。
【０２９４】
また他の実施形態において、非架橋成分は１つ以上の小分子薬剤分子にコンジュゲートできる。有用な薬剤分子の例はドキソルビシン、メルファラン、パクリタキセル、マイタンシン、ズオカルマイシン、カリケアマイシン、オーリスタチン及び他の細胞毒性、細胞増殖抑制性、抗感染症性の薬剤である。
【０２９５】
一部の実施形態においては、非架橋成分はアフィニティータグを含むことができる。有用なアフィニティータグの例はＦｌａｇ、ＨＡタグ、ヘキサヒスチジンである。これらのアフィニティータグは非架橋成分並びに結果として生じる架橋アクセサリーポリペプチドの精製を容易にする。更にまた、アフィニティータグは生物学的試料中の架橋アクセサリーポリペプチドの検出を容易にする。特に、アフィニティータグは患者又は動物における架橋アクセサリーポリペプチドの血清中半減期及び／又は組織分布をモニタリングする場合に有用である。
【０２９６】
他の実施形態において、非架橋成分は結合ドメイン、活性薬剤、又は生物学的活性を有する他のサブ配列の持続放出を可能にするプロテアーゼ部位を含むことができる。
【０２９７】
特に有用なものは、リジン残基を含有しない非架橋成分である。そのような配列はそのＮ末端に単一のアミノ基を含有し、これを架橋成分とのコンジュゲーションのために利用できる。単一の遊離のシステイン残基を含有する非架橋成分もまた、遊離のシステイン残基の側鎖への制御されたコンジュゲーションを可能にする多くの化学的操作法が使用可能であるため、同様に有用である。別の手順は反応基として非架橋成分のＣ末端カルボキシル基を利用することである。
【０２９８】
多数の反応性基を含む多くの分子が有用な架橋成分として作用できる。多くの有用な架橋剤はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、又はＰｉｅｒｃｅのような会社から販売されている。特に有用なものは活性化された形態で入手でき、そして直接コンジュゲーションに使用できる架橋成分である。例を図２２に示す。架橋成分は同様又は同一の化学構造を有する多数の反応性基を含むことができる（図２３）。そのような反応性基を同時に活性化して多数の同一の非架橋成分にカップリングすることによりホモ多量体生成物の直接の形成が可能になる。多数の同様の反応性基を有する架橋成分の例はクエン酸、ＥＤＴＡ、ＴＳＡＴである。特に有利なものは多数の同一の反応性基を含有する分枝鎖ＰＥＧ分子である。
【０２９９】
以下に示す少数の基本的反応スキームに基づいて作用する特定の多数の化学生成物が存在し、その全てはｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ．で詳細に説明されている。有用な架橋剤の例はイミドエステル、活性ハロゲン、マレイミド、ピリジルジスルフィド、及びＮＨＳ−エステルである。ホモ２官能性架橋剤は２つの同一の反応性基を有しており、そして１工程の化学架橋操作法において頻繁に使用される。例はＢＳ３（非切断性水溶性ＤＳＳ類縁体），ＢＳＯＣＯＥＳ（塩基可逆性），ＤＭＡ（ジメチルアジピミデート−２ＨＣｌ），ＤＭＰ（ジメチルピメリミデート−２ＨＣｌ），ＤＭＳ（ジメチルスベリミデート−２ＨＣｌ），ＤＳＧ（ＤＳＳの５炭素類縁体），ＤＳＰ（Ｌｏｍａｎｔ試薬），ＤＳＳ（非切断性），ＤＳＴ（酸化剤により切断可能），ＤＴＢＰ（ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート−２ＨＣｌ），ＤＴＳＳＰ，ＥＧＳ，スルホ−ＥＧＳ，ＴＨＰＰ，ＴＳＡＴ，ＤＦＤＮＢ（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）であり、これら空間的隔たりが小さい場合の架橋のために特に有用である（Ｋｏｒｎｂｌａｔｔ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｋｅ，Ｄ．Ｆ．（１９８０）．Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｌｕｏｒｏｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ．Ｃａｎ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８，２１９−２２４）。
【０３００】
スルヒドリル反応性ホモ２官能性架橋剤はスルヒドリルと反応するホモ２官能性タンパク質架橋剤であり、そしてマレイミド系である場合が多く、これはｐＨ６．５〜７．５で−ＳＨ基と反応して安定なチオエーテル連結を形成する。ＢＭ［ＰＥＯ］３はスルヒドリルからスルヒドリルへの架橋の用途においてコンジュゲート沈澱の可能性を低減する８原子ポリエーテルスペーサーである。ＢＭ［ＰＥＯ］４は同様であるが１１原子のスペーサーである。ＢＭＢは４炭素スペーサーを有する非切断性の架橋剤である。ＢＭＤＢは過ヨウ素酸塩により切断できる連結を形成する。ＢＭＨは広範に使用されているホモ２官能性のスルヒドリル反応性架橋剤である。ＢＭＯＥは特に短いリンカーである。ＤＰＤＰＢ及びＤＴＭＥは切断可能な架橋剤である。ＨＶＢＳはメレイミドの加水分解の可能性を有さない。ＴＭＥＡは別の選択肢である。ヘテロ２官能性の架橋剤は２つの異なる反応性基反応性基を有する。例としてはＮＨＳエステル及びＥＤＣ活性化を介したアミン／ヒドラジン、ＡＥＤＰ、ＡＳＢＡ（光反応性、ヨード化可能），ＥＤＣ（水溶性カルボジイミド）である。アミン−スルヒドリル反応性の２官能性架橋剤はＡＭＡＳ、ＡＰＤＰ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＡ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＫＭＵＡ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＭＢＳ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ（極端に短い）、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＳＭＰＴ、ＳＰＤＰ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＰＢである。アミノ基反応性のヘテロ２官能性架橋剤はＡＮＢ−ＮＯＳ、ＭＳＡ、ＮＨＳ−ＡＳＡ、ＳＡＤＰ、ＳＡＥＤ、ＳＡＮＤ、ＳＡＮＰＡＨ、ＳＡＳＤ、ＳＦＡＤ、スルホ−ＨＳＡＢ、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＡＳＡ、スルホ−ＳＡＤＰ、スルホ−ＳＡＮＰＡＨ、ＴＦＣＳである。アルギニン反応性の架橋剤は例えば、ＡＰＧであり、これはｐＨ７〜８においてアルギニンと特異的に反応する。
【０３０１】
ポリペプチドは架橋成分として作用するように設計できる。そのようなポリペプチドは化学合成又は組み換え手法により形成できる。例は多数のアスパルテート又はグルタメート残基を含有するポリペプチドである。これらの残基の側鎖並びにＣ末端カルボキシル基は非架橋成分へのカップリングのために使用できる。アスパルテート又はグルタメート残基の間に１つ又は数個のアミノ酸を付加することにより反応性基反応性基の間の距離を制御することができ、これによりコンジュゲーションの効率並びに結果として生じる架橋したアクセサリーポリペプチドの全体的特性に影響を与えることができる。特に有用なものは、多数のアスパルテート又はグルタメート残基を含有し、そしてそのＮ末端アミノ基において保護基を担持しているポリペプチドである。適当な保護スキームの例はアセチル化、スクシニル化、及びペプチドのＮ末端アミノ基の反応性を低減する他の修飾である。
【０３０２】
架橋成分として特に有用なものは樹状高分子構築物である。多くの樹状高分子構造が当該分野で知られており、そしてそれらは多数の反応性基を含有するように設計できる。架橋アクセサリーポリペプチドの例は図２４に説明する。
【０３０３】
アクセサリーポリペプチドの追加的な修飾
追加的機序を、血清曝露された分子への結合親和性を有するペプチドにより媒介されるアクセサリーポリペプチド並びに架橋アクセサリーポリペプチドの設計に組み込んでよい。そのような標的に結合することにより本発明のポリペプチドの半減期は更に増大する。例えば架橋したアクセサリーポリペプチドは血清曝露された標的への結合親和性を有するポリペプチドを含む非架橋単位を含んでよい。或いは、アクセサリーポリペプチドはそのような結合親和性を有するポリペプチドをコーディングしている配列を含んでよい。半減期延長のためにペプチド又はタンパク質ドメインを結合させることができる好ましい血清曝露された標的は（ヒト、マウス、ラット、サルの）血清アルブミン、免疫グロブリン、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１，２，３，４），ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＥ並びに赤血球（ＲＢＣ）、又は内皮細胞である。アクセサリーポリペプチドはまた、例えば細胞外マトリックスを標的化する配列、膜内へのインサート、又は他の標的化ペプチド又はドメインを含んでよい（図２８）。
【０３０４】
別の実施形態においては、アクセサリーポリペプチド又は架橋したアクセサリーポリペプチドは、分離した数個の生物学的活性ポリペプチド並びに血清プロテアーゼに対する特異的切断部位を含む配列を含んでよい（図２９）。投与又は血清への曝露の後、血清プロテアーゼは切断部位に作用し、段階的なタンパク質分解及び生物学的活性ポリペプチド又はアクセサリーポリペプチドの血中への放出をもたらす。
【０３０５】
アクセサリーポリペプチド又は架橋したアクセサリーポリペプチドはまた、合成後に修飾されてよい。１つの実施形態において、リジン残基１つ以上を含むアクセサリーポリペプチドが発現される（図３０）。発現の後、ポリペプチドは、例えば生物学的活性ポリペプチドであってよい少なくとも１つの第２の機能性単位に結合しているＬｙｓ反応性部分と反応する。関連の実施形態において、機能性単位は血清曝露された標的に対する結合親和性を有するポリペプチド。例えば血清アルブミン、免疫グロブリン、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１，２，３，４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、並びに赤血球（ＲＢＣ）又は内皮細胞である。
【０３０６】
抗原結合単位に連結したアクセサリーポリペプチド
本発明は抗原結合単位に連結したアクセサリーポリペプチドを実施態様とする。「抗原結合単位」という用語は、総称して、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の何れかの形態、即ち、抗原に特異的に結合するか、又は免疫反応する抗原結合部位を含有する分子を指す。構造的には、もっとも簡素な天然に存在する抗体（例えばＩｇＧ）は４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合で相互に連結された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む。免疫グロブリンはＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥのような幾つかの型の分子を包含する分子の大型のファミリーを呈する。「免疫グロブリン分子」という用語は例えばハイブリッド抗体、又は改変された抗体、及びそれらのフラグメントを包含する。抗体結合単位は「単鎖」（Ｓｃ）及び「非単鎖」（Ｎｓｃ）の型に大まかに分割することができ、これは限定しないが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＦｖ、ｄＡｂ、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ドメインＡｂ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、二重特異性Ａｂ及び多重特異性Ａｂを包含する。
【０３０７】
「抗原結合単位」という用語に同様に包含されるものは無脊椎動物及び脊椎動物を包含する種々の種起源の免疫グロブリン分子である。抗原結合単位に適用する場合の「ヒト」という用語は、ヒト遺伝子により発現される免疫グロブリン分子又はそのフラグメントを指す。非ヒト（例えばげっ歯類又は霊長類）の抗体に適用する場合の「ヒト化」という用語は非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小限の配列を含有するハイブリッド免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメントである。大部分においては、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は相当する非ヒト残基で置き換えられる。更にまた、ヒト化抗体は、レシピエントの抗体内にもインポートされたＣＤＲ又はフレームワーク配列内にも存在しない残基を含んでよい。これらの修飾は抗体性能を更に精鋭化及び最適化し、そしてヒト身体内に導入された場合に免疫原性を最小限にするために行う。一般的にヒト化抗体は少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインのほぼ全てを含むことになり、その場合ＣＤＲ領域の全て又はほぼ全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、そしてＦＲ領域の全て又はほぼ全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を含んでよい。
【０３０８】
「非単鎖抗原結合単位」とは軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドを含むヘテロ多量体である。非単鎖抗原結合単位の例は限定しないが、（ｉ）ＶＬ及びＶＨ領域にインフレームに融合した第１及び第２のヘテロ２量体化配列のペアワイズな親和性を介して２量化するＶＬ及びＶＨ領域を含む２量体タンパク質であるｃｃＦｖフラグメント；（ｉｉ）少なくとも１つのｃｃＦｖフラグメントを含む何れかの他の１価及び多価の分子；（ｉｉｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインよりなるＦａｂフラグメント；（ｉｖ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインよりなるＦｄフラグメント；（ｖ）抗体の単一のアーム部のＶＬ及びＶＨドメインよりなるＦｖフラグメント；（ｖｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結されている２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｖｉｉ）ダイアボディー；及び、（ｖｉｉｉ）報告されているか当該分野で知られた何れかの他の非単鎖抗原結合単位を包含する。
【０３０９】
上記した通り、非単鎖抗原結合単位は「１価」又は「多価」の何れかであることができる。前者は抗原結合単位当たり１つの結合部位を有するが、後者は同じか又は異なる種類の１つより多い抗原に結合できる多数の結合部位を含有する。結合部位数に応じて、非単鎖抗原結合単位は２価（２つの抗原結合部位を有する）、３価（３つの抗原結合部位を有する）、４価（４つの抗原結合部位を有する）等々であってよい。多価の非単鎖抗原結合単位はさらにそれらの結合特異性に基づいて分類できる。「単一特異的な」非単鎖抗原結合単位は同じ種類の１つ以上の抗原に結合できる分子である。「多重特異性」の非単鎖抗原結合単位は少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する分子である。そのような分子は通常は２つの区別可能な抗原に結合するのみであるが、３重特異性抗体のような追加的な特異性を有する抗体は本発明に包含される。
【０３１０】
「単鎖抗原結合単位」は単量体の抗原結合単位を指す。Ｆｖフラグメントの２つのドメインは別個の遺伝子によりコードされるが、組み換え法によりそれらを単一のタンパク質鎖（即ちＢｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６及びＨｕｓｔｏｎら（１９８８）ＰＮＡＳ  ８５：５８７９−５８８３に記載されている単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））として作成可能とする合成のリンカーを作成できる。他の単鎖抗原結合単位は主題のヘテロ２量体化配列により安定化される抗原結合分子、ＶＨドメイン及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）よりなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）を包含する。好ましい単鎖抗原結合単位は一対の主題のヘテロ２量体化配列により共に連結されて安定化されているＶＬ及びＶＨ領域を含有する。ｓｃＦｖは如何なる順序にも組み立てることができ、例えばＶＨ−（第１のヘテロ２量体化配列）−（第２のヘテロ２量体化配列）−ＶＬ又はＶＬ−（第１のヘテロ２量体化配列）−（第２のヘテロ２量体化配列）−ＶＨとすることができる。
【０３１１】
抗原結合単位は、ポリペプチド又は他の物質を包含する他のレファレンス抗原に結合するよりも大きい親和性又はアビディティで結合する場合に、ある抗原に特異的に結合するか、又はそれに対して免疫反応性である。抗原結合単位は宿主細胞の外表面に直接結合してよく、或いはファージ粒子のような遺伝子パッケージに結合した宿主細胞を介して宿主細胞に間接的に結合させてよい。
【０３１２】
抗原結合単位に連結されたアクセサリーポリペプチドは例えば限定しないが、ｒＰＥＧ、ｎｒＰＥＧ及び流体力学的半径を増大、血清中半減期を延長、及び／又はインビボのクリアランス速度を変更することができる何れかの他のポリペプチドを包含する。所望により、アクセサリーポリペプチドは予測分子量を僅かに増大させるが、見かけの分子量を遙かに大きく増大させる。
【０３１３】
本発明の他の実施形態は結合対に両端で連結しているｒＰＥＧのようなアクセサリーポリペプチドを包含する。そのような結合対は一般的にｒＰＥＧを介して連結した結合タンパク質１及び結合タンパク質２よりなる。そのような結合対の例は限定しないが、受容体−リガンド対、抗体−抗原対、又は相互に相互作用できる何れかの２つのポリペプチドである。図８２はそのようなｒＰＥＧ連結結合対を作成する一般的方法を示しており、これは、初期活性を有さない、そしてそのためバースト放出作用を有さないという利点（毒性を生じることなく投与できる用量を増大する）及び低減された初期の受容体媒介クリアランスを有している。一般的な結合対は受容体−リガンド、抗体−リガンド、又は一般的に結合タンパク質１−結合タンパク質２であることができる。構築物は注入前、注入後（プロテアーゼにより血清中で）に切断されることができる切断部位を有することができ、そして、リガンド、受容体又は抗体であることができる治療用生成物の末端（活性なタンパク質）とともにｒＰＥＧが存続できるように位置することができる。
【０３１４】
抗体フラグメント系治療薬（ＡＦＢＴ）
本発明の別の実施形態は抗体フラグメント系の治療薬（ＡＦＢＴ）を包含する。ＡＦＢＴは少なくとも１つの抗原結合単位又は抗体フラグメント及び１つのアクセサリーポリペプチド、例えばｒＰＥＧドメインを含む。ＡＦＢＴはまた１つ以上のペイロードを含んでよく、これは生物学的活性を有する部分、例えばサイトカイン、酵素又は成長因子、並びに治療能力を有する場合がある物質、例えば細胞毒性剤、化学療法剤、抗ウィルス化合物、又は造影剤を包含する。ＡＦＢＴはまた追加的なドメイン、例えば多量体化ドメイン、例えばＦｃ領域又はロイシンジッパーを包含してよい。図５８ａはＡＦＢＴの主要成分を説明するＡＦＢＴの例である。抗体フラグメントはＡＦＢＴに標的抗原特異性を与える（同じく一般的に図２１に説明）。ｒＰＥＧは抗体フラグメントに対し、そしてペイロードに対しても、種々の利点を与える。これらの利点には、例えば限定しないが、延長されたインビボ半減期、増大した溶解性、増大した熱安定性、増大したプロテアーゼ安定性、向上したタンパク質折り畳み、低減した鎖再集合、ペイロードの低減した免疫原性、及び化学物質ＰＥＧに対する既存の免疫応答の回避が包含される。ｒＰＥＧドメインはまた製造及び精製を容易にする。ｒＰＥＧドメインの高い溶解性は、凝集塊を形成する傾向を低くしながら高濃度で製剤できるようにＡＦＢＴに高い溶解性を付与する。当然ながら、ＡＦＢＴはこの図において特に示されていない追加的な成分を含有してよい。
【０３１５】
ｖＨ／ｖＬドメイン系構造
本発明の１つの実施形態において、ＡＦＢＴはまた、１つ以上の抗体誘導免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン又はフラグメント、例えば単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖはｖＨ及びｖＬドメインの間のペプチドリンカーを介してｖＬに連結されたｖＨドメインよりなる。ｓｃＦｖ中のリンカーは、それが単一の分子種を形成するように選択され、それは、完全長、即ち全抗体（図５２）とは対照的にｓｃＦｖ、ダイアボディー、トリアボディー、又はテトラボディー（図５３、５４、５５）を包含する。典型的には、結果として生じるＡＦＢＴの価数は、より高い価数も排除されないが、１〜４である。単一の均質な種を主に形成する設計が好ましい。Ｆｖフラグメントはドメイン再集合の危険性を低減するために接触しているｖＨ及びｖＬのドメインの間にジスルフィド結合を包含してよい。達成してよい所望の種の割合は抗体フラグメント混合物の１％未満〜１００％の範囲である。主要な制御はフォーマットを指向するリンカー長、及び抗体フラグメント鎖再集合を低減するｒＰＥＧである。好ましい実施形態は少なくとも１２アミノ酸のリンカーを使用している単一のｖＨ−ｖＬ鎖からの単量体ｓｃＦｖの形成を包含する。より好ましい実施形態は少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００，又は、少なくとも２８８アミノ酸のリンカー長を包含する。とくに有用なものは１０〜２０未満のアミノ酸、好ましくは１，２，３，４，５，６，７，８，９又は１０アミノ酸のリンカーを必要とする抗体を優先的に形成するｖＨ−ｖＬ鎖である（図８４）。ダイアボディーは２つのタンパク質鎖を有し、そして、一方又は両方のＣ末端、及び／又は一方又は両方のＮ末端にｒＰＥＧを有することができる。ダイアボディーは２つの結合部位を有し、そのうち０、１又は２つが医薬品標的に、又は半減期標的に（例えばＨＳＡ、ＩｇＧ、赤血球、コラーゲン等）に結合してよく、或いは標的に結合しなくてもよい。ダイアボディーは０、片方又は両方のタンパク質鎖のＮ末端又はＣ末端に位置する薬剤モジュール０、１又はそれより多くを含有してよい。ダイアボディーを含有するＡＦＢＴは、それらの２量体構造のために増大した分子量を有しており、これは腎排出を緩徐化する。１つの実施形態において、ある種から別の種への抗体フラグメント鎖再集合の程度は固定された温度（例えば４℃、２５℃又は３７℃）において１日当たり又は１週当たりタンパク質の質量の５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％未満、好ましくは５％、２％、１％又は０．１％未満である。
【０３１６】
別の実施形態においては、ＡＦＢＴはトリアボディーを包含し、これは３つのポリペプチド鎖を含有し、その各々が１０アミノ酸未満、好ましくは５アミノ酸未満のリンカーを介して連結されたｖＨ及びｖＬドメインを含有する。トリアボディーの頻度はトリアボディーが良好に形成されるように連結配列を短縮する、ｖＨ及びｖＬドメインの片方又は両方の連結末端から１つ又は数個のアミノ酸を除去することにより増大できる。抗体の融合末端の片方又は両方から除去された残基の数は１〜１０アミノ酸の範囲で変動できる。
【０３１７】
更に別の実施形態において、ＡＦＢＴはテトラボディーを包含し、これは４つのポリペプチド鎖を含有し、その各々が５アミノ酸未満の短いリンカーを介して、又は、抗体の融合末端の片方又は両方からの１〜１０残基の除去の結果として、連結された１つのｖＨドメイン及びｖＬドメインを有する。ｖＨ及びｖＬドメインの片方又は両方の連結末端から除去すべきアミノ酸の数はもっとも望ましい結果を確保するために調節できる。
【０３１８】
ポリペプチド鎖の単コピーよりなる単鎖（ｓｃＦｖ）の組み合わせの種々の型の例は、限定しないが、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ−ｓｃＦｃ、ｄＡｂ−ｓｃＦｃ、ｓｃＦｃ−ｓｃＦｃ、ｓｃＦｃ−ｓｃＦａｂ、及びｓｃＦｃ−ｄＡｂを包含する（図５７）。ｓｃＦｖフラグメントはＩＦＮα、ｈＧＨ等のような薬剤モジュールにＮ及び／又はＣ末端の一方又は両方において融合できる（図８５）。ｓｃＦｖは１つの結合部位を有しており、これは医薬品標的に、又は半減期標的、例えばＨＳＡ（図８５ｂ）、ＩｇＧ、赤血球等に結合してもしなくてもよい。
【０３１９】
Ｉｇドメインを含有するＡＦＢＴは種々のアーキテクチャーを有することができる。とくに有用な構築物は限定しないが例えば、以下のもの、即ち：ｖＬ−リンカー−ｖＨ−ｒＰＥＧ、ｖＨ−リンカー−ｖＬ−ｒＰＥＧ、ｖＬ−リンカー−ｖＨ−ｒＰＥＧ−ペイロード、ｖＨ−リンカー−ｖＬ−ｒＰＥＧ−ペイロード、ｖＬ−リンカー−ｖＨ−ペイロード−ｒＰＥＧ、ｖＨ−リンカー−ｖＬ−ペイロード−ｒＰＥＧ、ｒＰＥＧ−ｖＬ−リンカー−ｖＨ、ｒＰＥＧ−ｖＨ−リンカー−ｖＬ、ペイロード−ｒＰＥＧ−ｖＬ−リンカー−ｖＨ、ペイロード−ｒＰＥＧ−ｖＨ−リンカー−ｖＬ、ｒＰＥＧ−ペイロード−−ｖＬ−リンカー−ｖＨ、ｒＰＥＧ−ペイロード−ｖＨ−リンカー−ｖＬを包含する。これらのＡＦＢＴはドメイン間、又は何らかの箇所においてｒＰＥＧに挿入することができる追加的ドメインを含有することができる。それらはまたいくつかのペイロードモジュールであることもできる。
【０３２０】
ｖＨ及びｖＬを連結しているリンカー配列は最適なタンパク質の折り畳み及び安定性並びに所望の種の高レベルの発現及び大画分を達成するために最適化できる。好ましい実施形態はグリシン及び他の小型の親水性アミノ酸、例えばセリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパルギン酸、リジン、アルギニン、及びアラニンが高濃度（例えば５０％超）であるリンカー配列を包含する。ｒＰＥＧはｖＨ及びｖＬドメインの間のリンカーとして特に適している。進歩した特性を有するリンカーは選択又はライブラリのスクリーニングにより得ることができる。
【０３２１】
ｒＰＥＧリンカーを有するｓｃＦｖ
更に別の実施形態において、ｓｃＦｖはｖＨ及びｖＬドメインの間のリンカーとしてｒＰＥＧ配列を含有する。好ましい実施形態は有意な負の正味荷電を含有するｒＰＥＧを包含し、これは向上した溶解性及びｓｃＦｖの折り畳みをもたらす。好ましい実施形態は少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、又は少なくとも２８８残基を有するリンカーを含有する。
【０３２２】
ＡＦＢＴの安定な抗体フラグメントを生成するための方法
本発明はまた、ＡＦＢＴの抗原結合単位を形成及び操作する方法に関する。標的抗原に対する特異性を有する抗体を形成する多くの方法が知られている。例としては、特にヒト抗体を産生するトランスジェニック動物におけるモノクローナル抗体；Ｆａｂ又はｓｃＦｖライブラリのファージディスプレイ；リボソームディスプレイ；及びモノクローナル抗体のヒト化が包含される。ｓｃＦｖの安定性を操作する多数の方法もまた報告されている［Ｗｏｒｎ，Ａ．ら（２００１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３０５：９８９］。ｓｃＦｖのｖＨ及びｖＬドメインの間にジスルフィド結合を付加すると多大な安定化がもたらされる場合があることが分かっている［Ｄｏｏｌｅｙ，Ｈら（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２８（Ｐｔ  １），７７，＃２８０２］。代替法はコンセンサス突然変異の導入である。抗体フレームワーク残基中の種々の位置におけるアミノ酸の頻度が分析されている。ボルツマン方程式が一部のコンセンサス突然変異の安定化作用を予測できることがわかっている［Ｓｔｅｉｐｅ，Ｂら（１９９４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４０，１８８，＃２０２６］。単鎖抗体フラグメント内への多数のコンセンサス突然変異の同時導入を可能にする組み合わせ方法が報告されている［Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｍ．ら（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ，１９：１４１］。より安定な抗体フラグメントを産生することは、インビボの標的化の向上をもたらしている［Ｗｏｒｎ，Ａ．ら（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７５：２７９５］。
【０３２３】
一部のｓｃＦｖがＥ．ｃｏｌｉのサイトゾル中で可溶性形態で発現されている。一般的に、ジスルフィド結合はサイトゾル中では形成されないが、それらは細胞溶解後に自発的に形成することができる［Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ，Ｐ．ら（１９９９）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２６２：６１７］。一般的に抗体のサイトゾル発現は抗体の安定性と大きく相関している［Ｗｏｒｎ，Ａ．ら（２００１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３０５：９８９］。抗体フラグメントの突然変異体ライブラリを進歩したサイトゾル発現に関する選択に付すことができる［Ｍａｒｔｉｎｅａｕ，Ｐ．ら（１９９８）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２８０：１１７］。Ｅ．ｃｏｌｉの酸化還元操作菌株を用いてＦａｂフラグメントのサイトゾル発現を向上させることができる［Ｌｅｖｙ，Ｒ．ら（２００７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３２１：１６４］。培養条件をＥ．ｃｏｌｉのサイトゾル中の可溶性ｓｃＦｖの発現の向上のために最適化することにより、培養物中３５ｍｇ／Ｌまでの発現レベルとされている［Ｐａｄｉｏｌｌｅａｕ−Ｌｅｆｅｖｒｅ，Ｓ．ら（２００７）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，４４：１８８８］。ｓｃＦｖのサイトゾル発現を向上させるための別の手順はシャペロン又は発現を促進する他の因子を識別することを目標としたゲノムライブラリのスクリーニング又は選択である。この手順はラムダファージを用いて評価されている。ｓｃＦｖ中のジスルフィド結合を良好に除去することによりイントラボディーが形成されている。そのようなイントラボディーの進歩したサイトゾル発現をもたらす変異体を識別できる［ｄｅｒ  Ｍａｕｒ，Ａ．Ａ．ら（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７７：４５０７５］。しかしながら、ジスルフィド結合は大部分の抗体フラグメントの全体的安定性のために重要であり、そして大部分の場合において、イントラボディーは限定された利用性を有している。
【０３２４】
相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフティング
抗体又は抗体フラグメントとその標的との間の結合相互作用は主に相補性決定領域（ＣＤＲ）により決定される。ＣＤＲは異なる抗体の可変ドメインの間にグラフトできることがわかっている［Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ．ら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２］。多くの場合において抗原結合を保持するためにはＣＤＲ残基に加えて抗体フレームワーク内の他の残基をグラフトする必要がある。ＣＤＲグラフティングはＣＤＲを安定性の低い可変ドメインからより安定な可変ドメインにグラフトすることにより抗体の安定性を向上させる場合に有用であることができる。例としては「足場」として使用される良好に発現されたｓｃＦｖ内へのフルオレセイン結合ｓｃＦｖからのＣＤＲのグラフティングであり、これにより向上した発現及び増大した折り畳み安定性が得られる［Ｊｕｎｇ，Ｓ．ら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，１０：９５９］。抗体フラグメント内へのＣＤＲグラフティングの別の例は［Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．ら（２００１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１６：１０６］及び［Ｗｅｒｔｈｅｒ，Ｗ．Ａ．ら（１９９６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５７：４９８６］に記載されている。ＣＤＲグラフティングはヒトフレームワーク残基にネズミ抗体からＣＤＲをグラフトすることにより患者内の抗体の免疫原性を低減するために使用できる［Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ，１４：１３９］。
【０３２５】
ＡＦＢＴの抗原結合単位の親和性
本発明はまた、ＡＦＢＴの抗原結合単位の親和性を向上させる方法を実施形態とする。向上した親和性を有する抗体及び抗体フラグメントの識別を可能にする多数の手順が報告されている。例えばＰａｓｔａｎは天然には超突然変異を起こしやすいホットスポット上に着目した１０００〜１００００クローンのミニライブラリを作成している。ファージパニングにより１５〜５５倍向上した変異体が得られている［Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，ＰＳら（１９９９）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７，５６８，＃２８００］。ファージディスプレイ及び他のディスプレイ方法を利用することにより向上した親和性を有する抗体フラグメントの変異体を識別できる。異なるベクターがファージディスプレイに対して使用される［Ｃｏｒｉｓｄｅｏ，Ｓ．ら（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，３４：２７０］。抗原結合に関与する残基はアラニンスキャニング突然変異誘発を用いて識別できる。その後、これらの位置を突然変異誘発のために標的化することにより向上した親和性を有する変異体を識別できる［Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．ら（２００１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１６：１０６］。別の方策は高い標的結合親和性を有する抗体フラグメントの識別をもたらすことができるＣＤＲウォーキング突然変異誘発である［Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｐ．ら（１９９５）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２５４：３９２］。向上した親和性は抗体フラグメントの向上した腫瘍選択性をもたらすことができる［Ａｄａｍｓ，Ｇ．Ｐ．ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５８：４８５］。高い親和性はｓｃＦｖの腫瘍浸透を制約することができる［Ａｄａｍｓ，Ｇ．Ｐ．ら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６１：４７５０］［Ｇｒａｆｆ，Ｃ．Ｐ．ら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６３：１２８８］。向上した親和性を有する抗体フラグメントはＦＡＣＳソーティングと組み合わせてコウボディスプレイを使用して識別できる［Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．ら（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７：１０７０１］。
【０３２６】
種々のＩｇＧドメイン
ＡＦＢＴは種々の免疫グロブリンドメインを含有してよい。これらのドメインはタンパク質発現、多量体化に影響する場合があり、そしてエフェクターとして作用できる。種々のＩｇドメインを説明する例を与える以下の限定的な列挙物はヒトを包含する何れかの種に由来するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＤを包含する何れかの抗体アイソタイプへの融合のために適用できる。免疫グロブリンファミリー配列へのｒＰＥＧの融合のための部位は限定しないが以下を包含する。
○ＣＬ１ドメインに対してＮ末端、鎖内システインの前
○ＣＬ１ドメインに対してＮ末端、鎖内システインの後
○ＣＬ１ドメインに対してＣ末端、鎖内システインの前
○ＣＬ１ドメインに対してＣ末端、鎖内システインの後
○ＣＨ１ドメインに対してＮ末端、鎖内システインの前
○ＣＨ１ドメインに対してＮ末端、鎖内システインの後
○ＣＨ１ドメインに対してＣ末端、鎖内システインの前
○ＣＨ１ドメインに対してＣ末端、ヒンジシステインの前
○ＣＨ１ドメインに対してＣ末端、ヒンジシステインの後
○ヒンジシステインに対してＮ末端
○ヒンジシステインに対してＣ末端、ＣＨ２の前
○ＣＨ２ドメインに対してＮ末端
○ＣＨ２ドメインに対してＣ末端
○ＣＨ３ドメインに対してＮ末端
○ＣＨ３ドメインに対してＣ末端
○ＣＨ４ドメインに対してＮ末端
○ＣＨ４ドメインに対してＣ末端
○ＣＤＲＨ１−３及び／又はＣＤＲＬ１−３から誘導されたペプチドに対してＮ末端（ラムダ及びカッパ）
○ＣＤＲＨ１−３及び／又はＣＤＲＬ１−３から誘導されたペプチドに対してＮ末端（ラムダ及びカッパ）
Ｆａｂドメイン系のＡＦＢＴ
本発明の更に別の実施形態はＦａｂドメイン系ＡＦＢＴを包含する（図５６）。Ｆａｂドメインは２つのペプチド鎖を含み、その各々が抗体の重鎖及び軽鎖から誘導される。ｒＰＥＧ及びペイロード及び他のドメインはＦａｂフラグメントの何れかの鎖に融合することができる。或いは、ｒＰＥＧ及びペイロードはＦａｂの両方の鎖に融合できる。Ｆａｂドメインは、最終タンパク質が４つのペプチド鎖を含有するように、結果として生じるタンパク質の２量化を促進するように設計できる。以下に示すものは少なくとも１つのＦａｂドメインを含むＡＦＢＴを列挙したものである。
【０３２７】
【表８】
2010536341.tif 000018
完全長抗体
ｒＰＥＧ及びペイロード及び他のドメインは抗体の軽鎖又は重鎖、又は抗体の両方の鎖に融合できる。以下の表は完全長抗体に基づいたＡＦＢＴの数例を示す。
【０３２８】
【表９】
2010536341.tif 000019
本明細書に定義した完全長抗体又は抗体フラグメントの上の特定の部位は完全長抗体（ＩｇＧ１、２、３、４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ，及びＩｇＭを包含）又は抗体フラグメントに対するｒＰＥＧのための好ましい融合部位である。これらの好ましい部位は構造化された配列の境界、例えばドメイン、ヒンジ等に、これらの機能的ドメインの折り畳みを攪乱させることなく存在している。ｒＰＥＧは１、２、３、４、５、６、７又は更には８つの（そしてＩｇＭ及びＩｇＧ３の場合は８つより多い）異なる位置において抗体に付加することができ、そして単一の抗体は１、２、３、４、５、６、７、８以上のｒＰＥＧを、多様な位置において、そして図１０３に示す８つの位置の何れかの組み合わせにおいて、有することができる。図１０３ｅはドメイン及び抗体のフラグメントへのｒＰＥＧの好ましい融合部位を示す。
【０３２９】
ドメイン抗体系ＡＦＢＴ
更に別の実施形態において、ｒＰＥＧ及びペイロード及び他のドメインをドメイン抗体（ｄＡｂ）に融合させることができる。適当な結合特性を有するドメイン抗体を形成するためには、軽鎖を天然に欠いているラクダ及びサメの免疫レパートリー中に存在する天然に単量体のｖＨドメイン（ｖＨＨと称する）を使用できる［Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６３：４４６］。或いは、溶解性を向上させ、そして２量化及び凝集を低減するためにヒトｖＨ又はｖＬドメインのｖＨ−ｖＬ界面を操作できる。そのような突然変異は結果として生じるドメイン抗体の免疫原性を増大させる危険性を有する。本発明はｒＰＥＧにヒトｖＨ又はｖＬＩｇドメインを融合させることを説明するものであり、これは溶解性及び折り畳みを向上させ、凝集を低減し、そしてなおヒトフレームワーク残基の突然変異誘発によりトリガーされる免疫応答を誘導しない。ｄＡｂドメインに基づくＡＦＢＴの例は限定しないが、ｄＡｂ−ｒＰＥＧ、ｄＡｂ−ｒＰＥＧ−ペイロード、ｄＡｂ−ペイロード−ｒＰＥＧ、ｒＰＥＧ−ｄＡｂ、ペイロード−ｒＰＥＧ−ｄＡｂ、ｒＰＥＧ−ペイロード−ｄＡｂを包含する。ｄＡｂドメインは抗体分子のｖＨ又はｖＬドメインから誘導できる。
【０３３０】
多重特異性ＡＦＢＴ
本発明はまた異なる結合特異性を有する多数の異なる抗体から誘導したフラグメントを含むＡＦＢＴを実施形態とする。例を図５８ｂに示す。そのようなＡＦＢＴは２つ以上の親抗体の結合特異性を組み合わせている。親抗体は結果として生じるＡＦＢＴが多数の異なる標的抗原に結合するように選択できる。或いは親抗体は同じ標的抗原の異なるエピトープに結合できる。ＡＦＢＴは、図５９に示す通り同じ標的抗原上の多数の部位に結合することにより多価の相互作用をそれらが生じさせることができれば、極めて堅固に標的に結合する。多重特異性ＡＦＢＴは同じタンパク質鎖の多量体を形成できる。例えば図５８ｂはｖＨ−ｖＬ鎖Ａに基づいた２つの結合部位及びｖＨ−ｖＬ鎖Ｂに基づいた２つの追加的な結合部位を含有する２つのポリペプチド鎖の２量体である多重特異性ＡＦＢＴを示している。当業者の知る通り結合ドメイン又は結合モジュールの多くの異なる組み合わせを含有する多重特異性ＡＦＢＴを形成する可能性がある。異なる可変ドメインに加えて、多価ＡＦＢＴは１つ以上のペイロードドメイン、ｒＰＥＧモジュール及び治療上の利用性又は産生及び精製を増強するように選択できる他のタンパク質ドメインを包含してよい。１つの実施形態は同じ疾患症状、同じ病原体又は発症原因、又は同じ生理学的経路又はプロセスに関連する多数の標的抗原と相互作用する多重特異性ＡＦＢＴを包含する。そのような多重特異性ＡＦＢＴの例は限定しないが、関連する生物学的プロセスに関与する多数のサイトカインをブロックする多重特異性ＡＦＢＴを包含する。好ましい実施形態はＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、及びＰＩＧＦのような血管形成に関与している多数の成長因子をブロックする多重特異性ＡＦＢＴを包含する。図９５はＶＥＧＦ受容体により両側をフランキングされたｒＰＥＧを示す。ＶＥＧＦは２量体であるため、ｒＰＥＧの両側の同じ受容体、或いは異なる受容体、好ましくはＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２であることができるが、ＶＥＧＦＲ３も使用してよい。別の好ましい実施形態はＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ１２、ＩＬ−１３、ＩＬ１７、及びＩＬ−２３のような炎症性疾患に関与している多数のサイトカインをブロックする多重特異性ＡＦＢＴを包含する。さらに別の好ましい実施形態はＨｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＥＧＦＲ、ＴＦ抗原、ＣＥＡ、Ａ３３、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１、αｖ／β３インテグリン、及びαｖ／β５インテグリン、及びα５／β１インテグリンのような多数の腫瘍抗原に結合する多重特異性ＡＦＢＴを包含する。更に別の好ましい実施形態は感染性疾患に関連する多数の抗原に結合する多重特異性ＡＦＢＴを包含する。該多重特異性ＡＦＢＴは感染体と多価の相互作用を生じることができ、向上した治療効果をもたらす。多重特異性ＡＦＢＴは腫瘍抗原に対する結合部位及び免疫細胞上の抗原に対する第２の結合部位を含むように操作できる。例としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をリクルートして活性化することができる腫瘍抗原及びＣＤ３又はＣＤ１６に結合するＡＦＢＴが包含される。更に力価を増大するためには、腫瘍細胞近傍の免疫細胞を活性化するためにＩＬ−２のようなサイトカインドメインを包含させることができる。
【０３３１】
同じ抗体の多数のフラグメントを含有するＡＦＢＴ
ＡＦＢＴは各ポリペプチド鎖が同じ親抗体の多数の可変フラグメントを含有するように操作できる。これらのフラグメントはそれらの配列において同一であることができ、或いは、それらは適切なドメインの組み立てを促進するように操作できる。例は図６０ａに示す通りである。このＡＦＢＴは同じ親抗体に基づいたダイアボディードメイン及び１価のｓｃＦｖドメインを含有する。その結果ＡＦＢＴは合計で４つの等価な標的結合部位を含有する２量体構造に組み立てられる。そのような多価のＡＦＢＴはアビディティに起因する向上した力価を有することができる。
【０３３２】
ダイアボディーに基づいた二重特異性ＡＦＢＴ
ＡＦＢＴは１つのダイアボディー及び可変ドメイン及び少なくとも１つのｒＰＥＧドメインを組み合わせるように構築できる。構築物は２量体を形成し、そして合計で４つの抗原結合部位を含有する。図５８ｂは二重特異性ＡＦＢＴの例を示す。そのような構築物中の可変ドメインＡはｓｃＦｖドメイン又はｄＡｂドメインであることができる。可変ドメインＡはダイアボディードメインＢのＣ末端側鎖にあることができる。或いは、可変ドメインＡはダイアボディードメインＢのＮ末端側鎖にあることができる。二重特異性ＡＦＢＴは追加的なｒＰＥＧドメイン又は他のドメイン、例えばホルモン、サイトカイン又は酵素を含有できる。二重特異性ＡＦＢＴ中の可変ドメインがｓｃＦｖドメインである場合、ｓｃＦｖドメインは配置ｖＨ−リンカー−ｖＬ又は配置ｖＬ−リンカー−ｖＨを有することができる。
【０３３３】
好ましい実施形態においては、二重特異性ＡＦＢＴはダイアボディーＢ及びｓｃＦｖＡを含み、ここでダイアボディー及びｓｃＦｖドメインはこれらの構築物中の４つのＩｇドメインの誤った対形成を低減するために最適化される。ドメインはｖＬ−Ａ及びｖＨ−Ａ並びにｖＬ−Ｂ及びｖＨ−Ｂが誤った対形成ｖＬ−Ａ及びｖＨ−Ｂ及びｖＬ−Ｂ及びｖＨ−Ａよりも堅固な相互作用を生じさせるように最適化できる。これは、ｓｃＦｖドメインＡのｖＨ／ｖＬ接触面がダイアボディードメインＢのｖＨ／ｖＬ接触面とは有意な構造的相違を有するように、ｖＨ及びｖＬドメインの両方のフレームワークを選択することにより達成できる。これらの相違はｓｃＦｖドメインＡ及びダイアボディードメインＢのｖＨ／ｖＬ接触領域を操作して望ましくない接触の機会を最小限とすることにより更に増大することができる。例えば、イオン対は正しいｖＨ／ｖＬ対形成のために形成されるが、同じイオン対が二重特異性ＡＦＢＴのｖＨ及びｖＬドメインの誤った対形成の間には形成されえないように、電荷の相違を操作することができる。別の手順はｖＨ及びｖＬドメインの誤った対形成においては形成されえない所望のｖＨ／ｖＬ接触面内に水素結合相手を導入することである。更に別の手順は誤ったｖＬ／ｖＨ対形成が脱安定化されるようにｖＬ／ｖＨの接触面の形状を改変する事である。
【０３３４】
ダイアボディーに基づいた二重特異性ＡＦＢＴは、それらが２価複合体当たり２つのｒＰＥＧドメインを含有しており、それが低減された腎濾過及び向上したインビボ半減期をもたらすことから、とくに有用である。ＡＦＢＴはポリペプチド鎖当たりダイアボディードメイン及び２つの追加的可変ドメインを含有するように操作できる。そのようなタンパク質は合計で６抗原結合部位を含む２量体複合体を形成できる。別の可変フラグメント又はペイロードドメインを付加することにより力価を増大させることができる。
【０３３５】
ペイロードを含有する２量体ＡＦＢＴ
図６０ｂはダイアボディードメイン及びペイロードドメインを含有する２量体ＡＦＢＴを説明している。そのようなタンパク質は、各複合体が２つの標的結合部位、２つのｒＰＥＧ、及び２つのペイロードドメインを含有するように２量体複合体を形成する。追加的タンパク質ドメインは利用性を増大させるために付加することができる。タンパク質複合体当たり２つのｒＰＥＧを有することは、腎濾過を低減し、そしてインビボ半減期を延長する。２つのペイロードドメインを有することは力価を増大させる。ダイアボディードメインの標的結合部位は、赤血球、ヒト血清アルブミン、ＩｇＧ、コラーゲン又は血中の他のタンパク質又は細胞のような血液の成分への結合によりインビボ半減期が更に延長されるように操作できる。
【０３３６】
抗体フラグメント及びペイロードの組み合わせ
本発明はまた１つ以上のペイロードを含むＡＦＢＴを実施形態とする。１つの好ましい実施形態はタンパク質ドメインであり、ＡＦＢＴを含む他のドメインに直接融合できるペイロードを包含する。そのようなペイロードドメインの例は限定しないがサイトカイン、ホルモン、成長因子、及び酵素を包含する。そのようなＡＦＢＴは抗体の特異性をペイロードの薬効と組み合わせており、一方ｒＰＥＧドメインは半減期をもたらし、製造及び製剤を容易にしている。他の好ましい実施形態は特定の組織に対する特異性を有する抗体フラグメント及び同じ組織において自身の活性を示すペイロードを組み合わせたＡＦＢＴを包含する。一例としては細胞増殖抑制性又は細胞毒性のペイロードと組み合わせた腫瘍に対する特異性を有する抗体フラグメントを包含する。別の例は抗感染ペイロードと組み合わせた感染細胞又は感染体に対する特異性を有する抗体フラグメントを含む。更に別の有用な組み合わせは、抗炎症活性を有するペイロードと組み合わせた炎症組織に対する特異性を有する抗フラグメントを含む。アクセサリーポリペプチドに連結できる抗体は限定しないが、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシツマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、イブリツモマブ，チウキセタン、インフリキシマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリツマブ、オマリツマブ、パリビツマブ、パニツムマブ、ラニビツマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、リツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、及び補体Ｃ５、ＣＢＬ、ＣＤ１４７、ＩＬ８、ｇｐ１２０、ＶＬＡ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＶＥＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、抗Ｉｄ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ２、ＥＧＦＲ、ＴＧＦ−β２、ＴＮＦα、Ｅセレクチン、ＦａｃｔＩＩ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｆ  ｇｐ、ＣＤ１１／１８、ＣＤ１４、ＣＤ８０、ＩＣＡＭ３、ＣＤ４、ＣＤ２３、β２−インテグリン、α４β７、ＣＤ５２、ＣＤ２２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ６４（ＦｃＲ）、ＴＣＲαβ、ＣＤ３、ＨｅｐＢ、ＣＤ１２５、ＥｐＣＡＭ、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ２０、ＩＬ５、ＩＬ４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＨＬＡ、Ｆ  ｇｐ、及びＶＮＲインテグリンを包含する抗原に特異的な何れかの抗体フラグメントを包含する。
【０３３７】
酵素は腫瘍特異的ＡＦＢＴに対するペイロードとして使用できる。酵素はアスパラギナーゼ、アルギナーゼ、ヒスチジナーゼ、又はメチオニナーゼのような腫瘍環境から必要な栄養又は代謝産物を排除するために選択できる。或いは、細胞毒性活性を示す酵素を利用できる。例としては腫瘍特異的抗体フラグメント及び細胞内に内在化すればアポトーシスを誘導するＲＮＡｓｅを含むＡＦＢＴが包含される。
【０３３８】
抗癌、抗微生物、及び／又は抗炎症治療薬において有用であるペイロードは毒素、例えばシュードモナス外毒素、リシン、ボツリヌス毒、及び他の植物又は細菌の毒素を包含する。その他の生物学的毒素は、限定しないが、アブリン、エアロリシン、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ｂ−ブンガロトキシン、ケルレオトキシン、セレオリシン、コレラ毒素、クロストリジウム・ディフィシルエンテロトキシンＡ及びＢ、クロストリジウム・パーフリンゲンスレシチナーゼ、クロストリジウム・パーフリンゲンスカッパ毒素、クロストリジウム・パーフリンゲンスパーフリンゴリシンＯ、クロストリジウム・パーフリンゲンスエンテロトキシン、クロストリジウム・パーフリンゲンスベータ毒素、クロストリジウム・パーフリンゲンスデルタ毒素、クロストリジウム・パーフリンゲンスイプシロン毒素、コノトキシン、クロトキシン、ジフテリア毒素、リステリオリシン、ロイコシジン、モデシン、刺糸胞毒素、ノテキシン、百日咳毒素、ニューモリシン、緑膿菌毒素Ａ、サキシトキシン、志賀毒素、志賀赤痢菌神経毒、ストレプトリシンＯ、スタフィロコッカスエンテロトキシンＢ及びＦ、ストレプトリシンＳ、タイポキシン、テタニー毒素、テトロドトキシン，ビスクミナム、フォルケンシン、及びネズミペスト菌毒素を包含する。
【０３３９】
ペイロードは毒性の代謝産物を排除するように選択できる。例としては痛風の治療用の尿酸オキシダーゼ及びフェニルケトン尿症の治療用のフェニルアラニンアンモニアリアーゼが挙げられる。ペイロードはまた化学的にコンジュゲートされた小分子を含むことができる。そのようなペイロードをＡＦＢＴにコンジュゲートすることにより半合成のＡＦＢＴを得ることができる。半合成ＡＦＢＴのタンパク質部分は図６１に示す通り消耗的カップリングを介して制御された化学コンジュゲーションを促進するように操作できる。タンパク質部分は所定数のカップリング部位を有するように操作できる。このことは、カップリング効率を完全に近いものとし得ることにより所定のカップリング生成物が得られるように、カップリング部位の濃度に対して過剰量のカップリングの使用を可能にする。有用なカップリング部位はアミノ基であることができる。そのような半合成ＡＦＢＴのタンパク質部分は、抗体フラグメントの全て又は大部分のリジン残基が折り畳み及び標的結合に適合した他の残基で置き換えられるように、操作することができる。多くのタンパク質において、アルギニン、グルタメート、アスパルテート、セリン、スレオニン又は他のアミノ酸でリジン残基を置き換えることができる。所定のカップリング部位をｒＰＥＧドメイン内に、又はタンパク質の何れかの他のタンパク質部分内に組み込むことができる。更にまた、各タンパク質鎖のＮ末端はコンジュゲーション部位として作用できる。システイン残基もまたコンジュゲーション部位として作用できる。ＡＦＢＴにコンジュゲートできる例示されるペイロードは腫瘍特異的抗体フラグメントを有するＡＦＢＴに融合できるドキソルボシン、オーリスタチン、マイタンシン及び関連の分子のような細胞毒性薬剤を包含する。コンジュゲーションに有利な他のペイロードは抗ウィルス化合物、画像化試薬、及び放射線療法のための画像化剤又はＡＦＢＴを形成するために放射性核種で標識できるキレート形成剤を包含する。
【０３４０】
ｒＰＥＧテール部におけるチオール
本発明の他の実施形態は１つ又は多数のシステイン残基を含有するｒＰＥＧ配列を含むＡＦＢＴを包含する。これらのシステイン側鎖は患者への注入の後に他のタンパク質とジスルフィド架橋を形成できる。これらのジスルフィド架橋はインビボ半減期の延長をもたらすことができる。他の実施形態において、ジスルフィド結合の形成は注入部位におけるＡＦＢＴの延長された貯留をもたらすことができ、これにより持続放出のＰＫプロファイルが得られる。遊離のシステインを含有するＡＦＢＴもまた、経口、鼻内、及び皮内投与されたＡＦＢＴの進歩した生体利用性が得られるように操作できる。このことは、上皮細胞の表面でタンパク質とのジスルフィド架橋を形成してＡＦＢＴの増強された取り込みをもたらすことにより達成できる。
【０３４１】
ｒＰＥＧ中のＲＧＤペプチド
ＡＦＢＴは１つ又は多数のＲＧＤ配列又はインテグリン及び細胞外マトリックスの成分と相互作用することがわかっている関連の配列を含有してよい。これらのＲＧＤ関連配列はシステイン残基によりフランキングされることによりジスルフィド媒介環化をもたらすことができる。或いは、ＲＧＤ関連配列は特定のインテグリンとの親和性及び／又は相互作用の特異性を増強するために選択できる追加的アミノ酸によりフランキングされることができる。１つの好ましい実施形態はＲＧＤ配列を含有し、そして種々の腫瘍細胞上で過剰発現されるインテグリンαｖβ３、αｖβ５、α５β１と相互作用するＡＦＢＴを包含する。
【０３４２】
半減期を延長する抗体フラグメント
本発明はまた、ＡＦＢＴのインビボ半減期を延長する抗体フラグメントを含有するＡＦＢＴを実施形態としている。これは長いインビボ半減期を有する標的に結合する抗体フラグメントを取り込むことにより達成できる。インビボ半減期を延長するそのような標的の例は限定しないが、血清タンパク質、特に血清アルブミン、免疫グロブリン、及び他の高濃度のタンパク質を包含する。ＡＦＢＴはまた、血球又は血管に対する特異性を有する抗体フラグメントを取り込むことができる。特に興味深いものは赤血球（ＲＢＣ）であり、これは極めて高濃度であり、約４か月の平均寿命を有し、最小限の代謝活性を特徴としている。ＡＦＢＴはＲＢＣの表面上の何れかのタンパク質に結合するように操作できる。好ましい実施形態はＲＢＣの表面上に高濃度で発現されるグリコホリンＡに結合するＡＦＢＴを包含する。ＡＦＢＴはインビボでＡＦＢＴと接触できる何れかの細胞表面標的に結合するように操作することができ、これによりＡＦＢＴの延長された滞留が得られる。別の実施形態は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分に結合するＡＦＢＴを包含する。ＥＣＭは多くのタンパク質、例えば限定しないが、アグリン、アルファエラスチン、アミシン、ベストロフィン、コラーゲン、コンタクチン１、ＣＲＩＰＴ、ドレブリン、エンタクチン、フェツインＡ、ＨＡＳ３、ＨＣＡＰ−Ｇ、シンデカン、ＫＡＬ１、１アファジン、ラミニン、ミント３、ＭＭＰ２４、ＮＣＡＭ、ニューロカン、ニドゲン２、オプチメジン、プロコラーゲンＩＩＡ型、ＰＳＣＤＢＰ、レエリン、ＳＩＲＰ、シナプトタグミン、ｓｙｎＣＡＭ、シンデカン、シントロフィン、ＴＡＧ１、テナシンＣ、及びザイキシンを含有する。更に別の実施形態はＦｃＲｎ受容体に結合する抗体フラグメントを含むＡＦＢＴを包含し、これはエンドサイトーシスに付されたＡＦＢＴのリサイクルをもたらす。例としては、抗体フラグメントは中性付近のｐＨでは低い親和性でＦｃＲｎに結合するが、リソソームコンパートメント内で優勢に生じているｐＨ範囲内である例えばｐＨ５のようなより低いｐＨでは高い親和性で結合するように、ＦｃＲｎへのｐＨ依存性の結合を示す抗体フラグメントが包含される。延長された半減期をもたらすＡＦＢＴは図５８ａ及び６０ｂに示す。当然ながら、ペイロードドメイン及び半減期延長をもたらす抗体フラグメントを含む多くのその他の配置を設計できる。
【０３４３】
本発明はまた、ｒＰＥＧに融合したＦｃフラグメントを含む融合タンパク質を実施形態とする。図８３はヒンジを有するか有さない抗体Ｆｃフラグメントに融合されたｒＰＥＧが後続するＮ末端に薬剤モジュールを有する構築物を示す。Ｆｃフラグメントは長い半減期を与え、そしてｒＰＥＧは可溶性で活性な型においてＥ．ｃｏｌｉの細胞質中でＦｃフラグメントが発現できるようにする。別の実施形態においては、抗体Ｆｃフラグメントは、ヒンジ領域の有無に関わらず、場合により一端上で薬剤モジュール（例えばＩＦＮａ、ｈＧＨ等）に融合され、そして場合によりもう一端上でｒＰＥＧに融合される。ＣＨ２とＣＨ３の間の配列はＦｃＲｎ、即ち新生仔Ｆｃ受容体への結合を媒介する（図９０）。更に別の実施形態はＣＨ３ドメインの対を含むタンパク質構築物を包含する（図９１）。２つのポリペプチド鎖のゼロ、１又は両方がＮ末端及び／又はＣ末端上でｒＰＥＧに融合してよく、そして、もう一端においてゼロ、１以上の薬剤モジュールに融合してよい。ＦｃＲｎ結合配列は保持されるか欠失されることができる。ＦｃＲｎ結合配列の保持はより長い血清中半減期をもたらす。更に別の実施形態は、Ｃ末端に位置する薬剤／ファーマコアを有するｒＰＥＧにＣ末端において融合しているＣＨ２及びＣＨ３ドメインを包含する完全Ｆｃ（ヒンジを伴うか伴わない）であるタンパク質を記載する（図９２）。分子はポリペプチド鎖交換が可能であり、ヘテロ２量体をもたらす。更に別の実施形態はヒンジを有さず、そしてトランケーションされているがＦｃＲｎ結合を保持しているＣＨ２ドメインを有し、そしてＣ末端に位置する薬剤／ファーマコアを有する部分的Ｆｃを説明している（図９３ａ）。図９３ｂはヒンジ及びＣＨ２ドメインを有さないがＣＨ３ドメインを保持しており、そしてＣ末端に位置する薬剤／ファーマコアを有する部分的Ｆｃを示す。そのようなＦｃフラグメントはＦｃＲｎに結合しないがＣＨ３ドメインを介して２量体化できる。
【０３４４】
更に別の実施形態はｒＰＥＧの後続するＮ末端薬剤モジュール及びヒンジを有するＣ末端Ｆｃフラグメントを使用する（図１０１）。これはＥ．ｃｏｌｉ細胞質中で製造できる薬剤モチーフの半減期延長のための有用なフォーマットである。Ｆｃフラグメントを含有するプロドラッグのための代替フォーマットを本明細書に記載する（図１０２）。フォーマットは薬剤配列に結合してこれを阻害する阻害性配列を付加しているが、図１０１に記載のものと同様である。薬剤は切断部位により阻害性配列から分離される。Ｎ末端阻害性結合配列には切断部位が後続しており、これに薬剤配列が後続している。切断前に、プロドラッグを阻害性配列に結合し、そしてこれによりそれが不活性化される。切断により、阻害性結合配列は徐々に放出されて消去され、薬剤が活性である時間の量が徐々に増大する。ヒンジジスルフィド形成に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＨ３の２量体化に関するサイズ排除クロマトグラフィーを包含するｒＰＥＧに融合したＦｃフラグメントの正しい折り畳みを評価するための試験を図１０４に記載する。
【０３４５】
持続放出をもたらす抗体フラグメント
ＡＦＢＴは注入部位から緩徐に放出されるように操作することに長期の薬剤曝露をもたらすことができる。本発明の１つの実施形態は注入部位において高濃度で発現される分子に結合する抗体フラグメントの取り込みを包含する。例えば、そのような抗体フラグメントは標的抗原、例えば限定しないが、コラーゲン、ヒアルロン酸，硫酸ヘパラン、ラミニン、エラスチン、硫酸コンドロイチン、硫酸ケラタン、フィブロネクチン、及びインテグリンに結合する場合がある。抗体フラグメントのその標的抗原に対する親和性及び／又はアビディティを操作することにより注入部位からのＡＦＢＴ放出の速度を制御できる。別の実施形態は注入部位におけるＡＦＢＴの放出速度を制御するために注入部位におけるプロテアーゼで切断できる１つ又は幾つかのプロテアーゼ部位の導入を包含する。
【０３４６】
組織分布に影響する抗体フラグメント
本発明はまた、特定の細胞又は組織又は特定の組織セットに存在する標的抗原に結合する抗体フラグメントを取り込んだＡＦＢＴを包含する。これらの構築物はＡＦＢＴの局所的な組織特異的蓄積を達成することにより活性な薬剤の治療濃度域を増大することができる。例としては腫瘍脈管形成を包含する腫瘍組織又は腫瘍のミクロ環境において過剰発現される腫瘍抗原に対する特異性を有する抗体フラグメントを含有するＡＦＢＴが包含される。細胞内活性を有するペイロードを包含するＡＦＢＴの標的として細胞により効率的に内在化される腫瘍抗原を選択できる。例えば、ＡＦＢＴは結合時に内在化されることができる腫瘍抗原に対する特異性を有する抗体フラグメント及び細胞毒性ペイロードを含む。他の例はウィルス標的に対する特異性を有するＡＦＢＴを包含する。
【０３４７】
コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）
本発明の別の実施形態はＡＦＢＴ中のドメインとしてのＣＢＤ及び他のタンパク質薬剤の使用を包含する。コラーゲンは多くの組織、特に細胞外空間において高濃度である。ＣＢＤを含むタンパク質医薬品は注入部位又は注入部位の近接部においてコラーゲンに結合し、蓄積部を形成し、その後、そこからＡＦＢＴを持続的に放出することができる。放出速度はプロテアーゼ部位を導入することにより、又はコラーゲンに対する適当な親和性を有するＣＢＤを選択することにより制御できる。コラーゲンに対して低い親和性を有するＣＢＤを選択することにより、ＡＦＢＴの放出速度を増大させる。或いは、ＡＦＢＴ放出速度は極めて高い親和性でコラーゲンに結合するＣＢＤを包含することにより、又は、アビディティを達成するためにＡＦＢＴ内に多数のＣＢＤを包含することにより、緩徐化することができる。ＣＢＤ配列は天然に存在するＣＢＤから得ることができる。コラーゲンに結合し、そしてＣＢＤを含むタンパク質の例は限定しないが、インテグリン、特にα１β１インテグリン、α２β１インテグリン、αｖβ３インテグリン、血管形成阻害剤、コラーゲンＶ、Ｃ−プロテイナーゼ、デコリン、フィブロネクチン、インターロイキン−２、マトリックスメタロプロテイナーゼ１、２、９、及び１３、ホスホフォリン、トロンボスポンジン、ビグリカン、ビリルビン、ＢＭ４０／ＳＰＡＲＣ、ＭＲＰ８、ＭＲＰ−１４、ヒル由来カリン、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、フィブロモヅリン、Ｇｌａタンパク質、糖タンパク質４６、熱ショックタンパク質４７、ルミカン、ミエリン関連糖タンパク質、血小板受容体、スタフィロコッカス・アウレウス表面分子及び及び他の微生物接着分子、シンデカン−１、テナシン−Ｃ、ビトロネクチン、フォンウィルブランド因子、及び第ＸＩＩ因子を包含する。コラーゲンに結合し、ＣＢＤを含有するタンパク質の追加的な例はＤｉ  Ｌｕｌｌｏ，Ｇ．Ａ．ら（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７７：４２２３に記載されている。天然のタンパク質に由来するＣＢＤは、その治療利用性を増大させ、そしてその安定性を向上させるために更に操作できる。ＣＢＤ含有タンパク質の免疫原性はＢ及び／又はＴ細胞により認識されるエピトープを除去することにより低減できる。ＣＢＤ配列はまた、タンパク質産生を最大限にするため、及び／又は、タンパク質溶解性を向上させるために最適化できる。
【０３４８】
テール部におけるＨＳＡ結合ペプチド
インビボ半減期を延長するペプチド配列を含むＡＦＢＴはまた、血清タンパク質に、又は血球表面に結合するペプチド配列を利用することにより達成できる。例としてはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合するペプチド配列が包含される。そのような配列はランダムペプチド配列のファージディスプレイ又はスクリーニング方法の同様の選択により得ることができる。ＡＦＢＴはそのようなペプチド配列の１つ以上の同一又は異なっているコピーを含有できる。
【０３４９】
標的抗原
本発明の更に別の実施形態は治療上又は診断上の関連性を有する標的抗原に結合する抗体フラグメントを包含する。図８７は細胞表面標的へのＦａｂフラグメントの結合を示す。ＶＨ及びＣＨドメインの間、及びＶＬ及びＣＬドメインの間の通常の２〜６アミノ酸から４〜１００個以上のアミノ酸への天然リンカーの長さの伸長は、１つのＦａｂがドメイン交換により別のＦａｂに架橋する能力を増大させ、これによりより高い価数の結合複合体を形成し、より高値の見かけの親和性（アビディティ）をもたらす。リンカーはｒＰＥＧ又は異なる組成物であることができる。伸長されたリンカーフォーマットはより高い密度の標的を有する部位において特異的に増大した親和性の結合を可能にする。ＡＦＢＴの抗体フラグメントは血液成分に結合することにより循環系中のＡＦＰＴの半減期を延長することができる。ＡＦＢＴの抗体フラグメントはまたリソソームリサイクルを促進する受容体に結合できる。例としてはリソソーム取り込みの後にタンパク質を再度エキスポートできるＦｃＲｎ受容体が挙げられる。特に興味深いものは、抗体フラグメントがリソソーム中の条件下では高い親和性で結合するが細胞表面の条件下では同じ受容体により低い親和性で結合するように、リソソームのリサイクルを促進できる受容体に空間的又は時間的な依存性のある親和性で結合する抗体フラグメントである。ＡＦＢＴの抗体フラグメントは疾患関連組織に優勢に存在する標的抗原に結合できる。その結果、そのようなＡＦＢＴは特定の疾患関連組織中に蓄積できる。例としては腫瘍組織又はウィルス感染組織に結合するＡＦＢＴが挙げられる。ＡＦＢＴの抗体フラグメントは疾患関連組織における細胞内在化を促進する標的抗原に結合できる。ＡＦＢＴの抗体フラグメントは身体の特定のコンパートメント内へのＡＦＢＴの取り込みを促進する標的抗原、例えばＡＦＢＴの経口、鼻内、粘膜、又は肺取り込みを促進する標的抗原、及び血液脳関門を通過するＡＦＢＴの輸送を促進する標的抗原に結合することもできる。特に興味深い標的抗原の例は、限定しないが、ＩＬ１、ＩＬ４、ＩＬ６、Ｉｌ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１７、ＩＬ２３、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ、及び及びＴＮＦαを包含する。
【０３５０】
ＡＦＢＴにおけるｒＰＥＧの利点
ＡＦＢＴはｒＰＥＧ及び抗体フラグメントの価値ある特性を組み合わせている。ＡＦＢＴのｒＰＥＧ部分はＡＦＢＴの低い全体的免疫原性をもたらす。これはｒＰＥＧによるＡＦＢＴの抗体及び他の潜在的に免疫原性の部分の立体的遮蔽により達成される。ｒＰＥＧは高度に柔軟性であり、そしてその結果それらは配座エピトープを欠いている。それらの高い親水性及び高いエントロピーのために、ｒＰＥＧは極めて低い固有の免疫原性を有している。
【０３５１】
ＡＦＢＴのｒＰＥＧ部分はまた、他のＡＦＢＴドメインの安定化をもたらす。その親水性の性質のために、ｒＰＥＧドメインはＡＦＢＴの凝集を低減する。これはＡＦＢＴの製剤開発を大きく簡素化する。更にまた、ｒＰＥＧによる立体的遮蔽はＡＦＢＴの他の部分をタンパク質分解から保護する。これはタンパク質分解を受けやすいペイロード及び抗体フラグメントのために特に重要である。
【０３５２】
完全長抗体よりもＡＦＢＴを使用することの別の利点は完全長抗体に関連する望ましくないエフェクター機能の最小限化又は排除である。完全長抗体分子は多くのエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）、並びに補体活性化（ＣＤＣ）を有しており、これはエフェクター機能が望ましくない場合の適応症に対するその治療用途を大きく制限している。例えば、多くの適応症がサイトカイン又はホルモンのような分子を結合及び封鎖する薬剤を必要とする。一般的に、抗体はそのような適応症に対しては、そのエフェクター機能が望ましくない毒性をもたらすため、利用することは望ましくない。抗体依存性エフェクター機能の大部分はＦｃ部分を介して媒介される。本明細書に記載した多くの実施形態において、ＡＦＢＴは、エフェクター機能を担っているＦｃ部分を置き換えつつ、標的結合を担っている抗体の可変ドメインを利用している。ＡＦＢＴは細胞死受容体ＤＲ４及びＤＲ５のような細胞表面受容体に結合してこれらを活性化するように操作できる。活性化は受容体の多量体化により達成できる。完全長抗体はこのような受容体を活性化できるが、それらはまた同じ標的受容体を発現する正常細胞への抗体結合により誘発される細胞毒性を誘導する。ＡＦＢＴは毒性を誘発するエフェクター機能を呈することなく、細胞表面受容体を活性化できる。
【０３５３】
ｒＰＥＧの更に別の利点は図８６に示すように、同じ複合体に属する２つのタンパク質を会合させる場合に寄与する点である。そのようなタンパク質の間の親和性はそれらを会合させた状態で維持するために不十分である場合が多いが、ｒＰＥＧの添加は、それらの相互作用を安定化し、そして重合体を形成するそれらの傾向を低減する。
【０３５４】
ＡＦＢＴの製造／産生
本発明はまた、ＡＦＢＴの産生に関連する。ＡＦＢＴのｒＰＥＧドメインはタンパク質の折り畳みを促進し、そしてタンパク質の凝集を低減する。この特性はＡＦＢＴの微生物産生を容易にする。文献記載の抗体フラグメントの大部分は封入体からの再折り畳み又は細胞周辺腔内への分泌を必要とし、これは低い産生収率をもたらす。それとは対照的に、大部分のＡＦＢＴは微生物発現宿主のサイトゾル中、高濃度で可溶性形態において産生できる。ＡＦＢＴの好ましい発現宿主はＥ．ｃｏｌｉである（図４５）。しかしながら、ＡＦＢＴの特性により、それは大部分の微生物並びに真核生物の発現系における発現に適したものとなっている。ＡＦＢＴのＮ末端配列は翻訳後のプロセシングを制御するために最適化できる。特に開始コドンに後続するアミノ酸はＮ末端メチオニンの後のプロセシングを決定できる［Ｈｉｒｅｌ，Ｐ．Ｈ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８６：８２４７］。１つの実施形態は均一な生成物をもたらすＮ末端配列を包含する。Ｎ末端ｍｅｔに後続するアミノ酸としてｇｌｙ、ａｌａ、ｐｒｏ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、又はｖａｌを選択することにより、Ｎ末端ｍｅｔの効率的なプロセシング及び除去が達成できる。別の実施形態はＮ末端ｍｅｔに後続するアミノ酸としてｈｉｓ、ｇｌｎ、ｇｌｕ、ｐｈｅ、ｍｅｔ、ｌｙｓ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、又はａｒｇを包含し、これはＮ末端ｍｅｔの除去を防止し、そして均質な生成物をもたらす。ＡＦＢＴはまた、大部分の未修飾のタンパク質が凝集するような高いタンパク質濃度の条件下で再折り畳みを促進する。ＡＦＢＴの製造中のｒＰＥＧの利点は、凝集塊を形成する傾向を有する多数のタンパク質ドメインをＡＦＢＴが含有しているため、決定的である。そのようなタンパク質ドメインは折り畳み中の個々のタンパク質ドメイン間の凝集を最小限にするためにＡＦＢＴ中のｒＰＥＧ配列により分離できる。
【０３５５】
疾患関連及び／又は患者特異的ＡＦＢＴの形成及び産生
本発明はまた、疾患関連ＡＦＢＴ、即ちｒＰＥＧのようなアクセサリーポリペプチドに融合した抗体フラグメントの形成及び産生を実施形態としている。抗体遺伝子は感染した、又は別様に曝露された患者から直接単離できる［Ｗｒａｍｍｅｒｔ，Ｊ．ら（２００８）Ｎａｔｕｒｅ］。ｒＰＥＧに融合されている抗体フラグメントの種々のフォーマットをそのような抗体遺伝子から迅速に形成できる。得られた融合タンパク質は標準化されたプロトコルを用いて産生及び精製することができ、これにより疾患関連ＡＦＢＴの迅速な形成が可能となる。プロセスの例を図６８に示す。迅速な識別プロセスにより、細菌又はウィルス感染症のような急性の疾患の蔓延に応答した特定の治療法の発見及び準備が可能となる。抗体フラグメントとｒＰＥＧの間の融合タンパク質の迅速な形成は患者特異的な治療法の作成も可能とし、それには限定しないが、患者からの免疫細胞の単離；免疫細胞からの疾患特異的抗体遺伝子のクローニング；抗体フラグメント−ｒＰＥＧ融合物（即ち疾患関連ＡＦＢＴの構築及びその後の製造）；及び疾患を有する患者の治療が包含される。
【０３５６】
ポリクローナル及びモノクローナルのＡＦＢＴ
本発明はまた、１つより多いＡＦＢＴを含む医薬組成物に関連する。ＡＦＢＴ混合物のそのような組成物は個々のＡＦＢＴに対して向上した性能を有する場合がある。ＡＦＢＴ系生成物は２つ、３つ、又はそれより多い所定のＡＦＢＴを含有するように、マルチクローンであることができる。或いは、ＡＦＢＴは多数のＡＦＢＴを含有するポリクローナルであることができる。そのようなポリクローナルＡＦＢＴは、有用な特異性を有する抗体又は抗体フラグメントに関して濃縮された原料から抗体フラグメントをクローニングすることにより形成できる。一例としては、感染した患者に由来する抗体フラグメントレパートリーのクローニングが挙げられる。他の例は、目的の標的に対してパニングすることにより濃縮されているディスプレイライブラリを包含する。
【０３５７】
ｒＰＥＧ融合生成物
１つの実施形態において、生物系（例えばエシェリシア・コリ、ピチア・パストリス、ＣＨＯ−Ｓ等）における高レベルタンパク質発現のための適切な転写及び及び翻訳配列の制御下にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）又はヒト成長ホルモン受容体（ｈＧＨ−Ｒ）遺伝子のＮ又はＣ末端に、ｒＰＥＧ配列を遺伝子的に融合する。タンパク質発現は使用した発現系に関して当該分野で良く知られている標準的な手法を用いて誘導し、そして標準的な操作法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、示差析出、相抽出等）を用いて精製する。次に精製されたタンパク質を、適応症、例えば限定しないが、成人成長ホルモン不全，小児成長ホルモン不全，ターナー症候群、慢性腎不全、特発性低身長、移植後の成長障害、低リン酸塩血症性くる病、炎症性腸疾患、ヌーナン症候群、小児セリアック病、エイズ消耗、肥満、加齢、又は未修飾タンパク質が治療上の利益を与えることが分かっている他の適応症の治療のためにヒト患者に投与できる。ｒＰＥＧ配列の付加は延長された血清中半減期、向上した患者の曝露／薬効、及び／又は向上した製造効率の特性を付与する。
【０３５８】
１つの実施形態において、生物系（例えばエシェリシア・コリ、ピチア・パストリス、ＣＨＯ−Ｓ等）における高レベルタンパク質発現のための適切な転写及び翻訳配列の制御下にヒト成長ホルモンフラグメント１７６〜１９１又は１７７〜１９１遺伝子のＮ又はＣ末端に、ｒＰＥＧ配列を遺伝子的に融合する。タンパク質発現は使用した発現系に関する標準的な手法を用いて誘導し、そして当該分野で良く知られている標準的な操作法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、示差析出、相抽出等）を用いて精製する。次に精製されたタンパク質を、適応症、例えば限定しないが、成人成長ホルモン不全，小児成長ホルモン不全，ターナー症候群、慢性腎不全、特発性低身長、移植後の成長障害、低リン酸塩血症性くる病、炎症性腸疾患、ヌーナン症候群、小児セリアック病、エイズ消耗、肥満、加齢、又は未修飾タンパク質が治療上の利益を与えることが分かっている他の適応症の治療のためにヒト患者に投与できる。ｒＰＥＧ配列の付加は延長された血清中半減期、向上した患者の曝露／薬効、及び／又は向上した製造効率の特性を付与する。
【０３５９】
１つの実施形態において、生物系（例えばエシェリシア・コリ、ピチア・パストリス、ＣＨＯ−Ｓ等）における高レベルタンパク質発現のための適切な転写及び翻訳配列の制御下にエキセナチド遺伝子のＮ又はＣ末端に、ｒＰＥＧ配列を遺伝子的に融合する。タンパク質発現は使用した発現系に関する標準的な手法を用いて誘導し、そして当該分野で良く知られている標準的な操作法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、示差析出、相抽出等）を用いて精製する。次に精製されたタンパク質を、以下の適応症、即ち：ＩＩ型糖尿病、又は未修飾タンパク質が治療上の利益を与えることが分かっている他の適応症の治療のためにヒト患者に投与できる。ｒＰＥＧ配列の付加は延長された血清中半減期、向上した患者の曝露／薬効、及び／又は向上した製造効率の特性を付与する。インビボ薬効の維持することに対するエキセナチドのＮ末端の感受性のために、組み換え体の発現及び精製の際に天然のＮ末端構造を維持するためには特殊な配慮が必要である場合があり、そして、好ましい実施形態はエキセナチド配列のＣ末端へのｒＰＥＧの融合を含むことになる。インビトロ又はインビボの何れかにおいてプロテアーゼにより切断できるＮ末端リーダー配列を使用することにより製造収率を向上及び／又はインビボの活性分子の送達を向上することができる。代替の方策は、エキセナチドの内部メチオニンを適合するアミノ酸（例えばロイシン、これはＧＬＰ−１配列の相同な位置に存在する）に突然変異させることを含み、そして臭化シアン又は同様の化学的方法を用いてＮ末端リーダー配列を除去することにより天然のエキセナチドのＮ末端を形成する。
【０３６０】
１つの実施形態において、生物系（例えばエシェリシア・コリ、ピチア・パストリス、ＣＨＯ−Ｓ等）における高レベルタンパク質発現のための適切な転写及び翻訳配列の制御下にＧＬＰ−１遺伝子のＮ又はＣ末端に、ｒＰＥＧ配列を遺伝子的に融合する。タンパク質発現は使用した発現系に関する標準的な手法を用いて誘導し、そして当該分野で良く知られている標準的な操作法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、示差析出、相抽出等）を用いて精製する。次に精製されたタンパク質を、以下の適応症、即ち：ＩＩ型糖尿病、又は未修飾タンパク質が治療上の利益を与えることが分かっている他の適応症の治療のためにヒト患者に投与できる。ｒＰＥＧ配列の付加は延長された血清中半減期、向上した患者の曝露／薬効、及び／又は向上した製造効率の特性を付与する。インビボ薬効の維持することに対するＧＬＰ−１のＮ末端の感受性のために、組み換え体の発現及び精製の際に天然のＮ末端構造を維持するためには特殊な配慮が必要である場合があり、そして、好ましい実施形態はＧＬＰ−１配列のＣ末端へのｒＰＥＧの融合を含むことになる。インビトロ又はインビボの何れかにおいてプロテアーゼにより切断できるＮ末端リーダー配列を使用することにより製造収率を向上及び／又はインビボの活性分子の送達を向上することができる。
【０３６１】
１つの実施形態において、生物系（例えばエシェリシア・コリ、ピチア・パストリス、ＣＨＯ−Ｓ等）における高レベルタンパク質発現のための適切な転写及び及び翻訳配列の制御下にＩＬ１−ＲＡ遺伝子のＮ又はＣ末端に、ｒＰＥＧ配列を遺伝子的に融合する。タンパク質発現は使用した発現系に関する標準的な手法を用いて誘導し、そして当該分野で良く知られている標準的な操作法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、示差析出、相抽出等）を用いて精製する。次に精製されたタンパク質を、適応症、例えば限定しないが、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患、クローン病、又は未修飾タンパク質が治療上の利益を与えることが分かっている他の適応症の治療のためにヒト患者に投与できる。ｒＰＥＧ配列の付加は延長された血清中半減期、向上した患者の曝露／薬効、及び／又は向上した製造効率の特性を付与する。
【０３６２】
１つの実施形態において、生物系（例えばエシェリシア・コリ、ピチア・パストリス、ＣＨＯ−Ｓ等）における高レベルタンパク質発現のための適切な転写及び翻訳配列の制御下にインターフェロンアルファ、ベータ、又はガンマ遺伝子のＮ又はＣ末端に、ｒＰＥＧ配列を遺伝子的に融合する。タンパク質発現は使用した発現系に関する標準的な手法を用いて誘導し、そして当該分野で良く知られている標準的な操作法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、示差析出、相抽出等）を用いて精製する。次に精製されたタンパク質を、適応症、例えば限定しないが、ヘアリー細胞白血病、エイズ関連カポジ症候群、ｐＨ染色体陽性ＣＭＬ、慢性Ｃ型肝炎、尖形コンジローム、慢性Ｂ型肝炎、悪性黒色腫、濾胞性リンパ腫、多発性硬化症、非ホジキンリンパ腫、骨粗鬆症、慢性肉芽腫症関連感染症、肺の多剤耐性結核、又は未修飾タンパク質が治療上の利益を与えることが分かっている他の適応症の治療のためにヒト患者に投与できる。ｒＰＥＧ配列の付加は延長された血清中半減期、向上した患者の曝露／薬効、及び／又は向上した製造効率の特性を付与する。
【０３６３】
１つの実施形態において、生物系（例えばエシェリシア・コリ、ピチア・パストリス、ＣＨＯ−Ｓ等）における高レベルタンパク質発現のための適切な転写及び翻訳配列の制御下にＧ−ＣＳＦ遺伝子のＮ又はＣ末端に、ｒＰＥＧ配列を遺伝子的に融合する。タンパク質発現は使用した発現系に関する標準的な手法を用いて誘導し、そして当該分野で良く知られている標準的な操作法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、示差析出、相抽出等）を用いて精製する。次に精製されたタンパク質を、適応症、例えば限定しないが、化学療法誘導発熱性好中球減少症、骨髄移植、先天性好中球減少症、周期性好中球減少症、特発性好中球減少症、エイズ関連好中球減少症、骨髄異形成症候群、又は未修飾タンパク質が治療上の利益を与えることが分かっている他の適応症の治療のためにヒト患者に投与できる。ｒＰＥＧ配列の付加は延長された血清中半減期、向上した患者の曝露／薬効、及び／又は向上した製造効率の特性を付与する。
【０３６４】
１つの実施形態において、生物系（例えばエシェリシア・コリ、ピチア・パストリス、ＣＨＯ−Ｓ等）における高レベルタンパク質発現のための適切な転写及び翻訳配列の制御下にＦＧＦ２１遺伝子のＮ又はＣ末端に、ｒＰＥＧ配列を遺伝子的に融合する。タンパク質発現は使用した発現系に関する標準的な手法を用いて誘導し、そして当該分野で良く知られている標準的な操作法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、示差析出、相抽出等）を用いて精製する。次に精製されたタンパク質を、適応症、例えば限定しないが、糖尿病、肥満、又は未修飾タンパク質が治療上の利益を与えることが分かっている他の適応症の治療のためにヒト患者に投与できる。ｒＰＥＧ配列の付加は延長された血清中半減期、向上した患者の曝露／薬効、及び／又は向上した製造効率の特性を付与する。
【０３６５】
１つの実施形態において、生物系（例えばエシェリシア・コリ、ピチア・パストリス、ＣＨＯ−Ｓ等）における高レベルタンパク質発現のための適切な転写及び翻訳配列の制御下にカルシトニン遺伝子のＮ又はＣ末端に、ｒＰＥＧ配列を遺伝子的に融合する。タンパク質発現は使用した発現系に関する標準的な手法を用いて誘導し、そして当該分野で良く知られている標準的な操作法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、示差析出、相抽出等）を用いて精製する。次に精製されたタンパク質を、適応症、例えば限定しないが、閉経後の骨粗鬆症、パジェット病、高カルシウム血症、又は未修飾タンパク質が治療上の利益を与えることが分かっている他の適応症の治療のためにヒト患者に投与できる。ｒＰＥＧ配列の付加は延長された血清中半減期、向上した患者の曝露／薬効、及び／又は向上した製造効率の特性を付与する。
【０３６６】
１つの実施形態において、生物系（例えばエシェリシア・コリ、ピチア・パストリス、ＣＨＯ−Ｓ等）における高レベルタンパク質発現のための適切な転写及び翻訳配列の制御下に副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）遺伝子のＮ又はＣ末端に、ｒＰＥＧ配列を遺伝子的に融合する。タンパク質発現は使用した発現系に関する標準的な手法を用いて誘導し、そして当該分野で良く知られている標準的な操作法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、示差析出、相抽出等）を用いて精製する。次に精製されたタンパク質を、以下の適応症、即ち：骨粗鬆症、又は未修飾タンパク質が治療上の利益を与えることが分かっている他の適応症の治療のためにヒト患者に投与できる。ｒＰＥＧ配列の付加は延長された血清中半減期、向上した患者の曝露／薬効、及び／又は向上した製造効率の特性を付与する。
【０３６７】
１つの実施形態において、生物系（例えばエシェリシア・コリ、ピチア・パストリス、ＣＨＯ−Ｓ等）における高レベルタンパク質発現のための適切な転写及び翻訳配列の制御下にヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）遺伝子のＮ又はＣ末端に、ｒＰＥＧ配列を遺伝子的に融合する。タンパク質発現は使用した発現系に関する標準的な手法を用いて誘導し、そして当該分野で良く知られている標準的な操作法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、示差析出、相抽出等）を用いて精製する。次に精製されたタンパク質を、適応症、例えば限定しないが、不妊、カポジ肉腫、喘息、動脈症、サラセミア、オステオペニア、緑内障、肥満、又は未修飾タンパク質が治療上の利益を与えることが分かっている他の適応症の治療のためにヒト患者に投与できる。ｒＰＥＧ配列の付加は延長された血清中半減期、向上した患者の曝露／薬効、及び／又は向上した製造効率の特性を付与する。
【０３６８】
１つの実施形態において、生物系（例えばエシェリシア・コリ、ピチア・パストリス、ＣＨＯ−Ｓ等）における高レベルタンパク質発現のための適切な転写及び翻訳配列の制御下にＦｕｚｅｏｎ（エンフルビチド）遺伝子のＮ又はＣ末端に、ｒＰＥＧ配列を遺伝子的に融合する。タンパク質発現は使用した発現系に関する標準的な手法を用いて誘導し、そして当該分野で良く知られている標準的な操作法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、示差析出、相抽出等）を用いて精製する。次に精製されたタンパク質を、以下の適応症、即ち：ＨＩＶ−１感染症、又は未修飾タンパク質が治療上の利益を与えることが分かっている他の適応症の治療のためにヒト患者に投与できる。ｒＰＥＧ配列の付加は延長された血清中半減期、向上した患者の曝露／薬効、及び／又は向上した製造効率の特性を付与する。
【０３６９】
１つの実施形態において、生物系（例えばエシェリシア・コリ、ピチア・パストリス、ＣＨＯ−Ｓ等）における高レベルタンパク質発現のための適切な転写及び翻訳配列の制御下にレプチン又はレプチン受容体遺伝子のＮ又はＣ末端に、ｒＰＥＧ配列を遺伝子的に融合する。タンパク質発現は使用した発現系に関する標準的な手法を用いて誘導し、そして当該分野で良く知られている標準的な操作法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、示差析出、相抽出等）を用いて精製する。次に精製されたタンパク質を、適応症、例えば限定しないが、乳癌、変形性関節症、骨粗鬆症、敗血症性関節炎、肥満、又は未修飾タンパク質が治療上の利益を与えることが分かっている他の適応症の治療のためにヒト患者に投与できる。ｒＰＥＧ配列の付加は延長された血清中半減期、向上した患者の曝露／薬効、及び／又は向上した製造効率の特性を付与する。
【０３７０】
１つの実施形態において、生物系（例えばエシェリシア・コリ、ピチア・パストリス、ＣＨＯ−Ｓ等）における高レベルタンパク質発現のための適切な転写及び翻訳配列の制御下にＴＮＦ結合タンパク質１（ＴＮＦ−ＢＰ１；ｐ５５）遺伝子のＮ又はＣ末端に、ｒＰＥＧ配列を遺伝子的に融合する。タンパク質発現は使用した発現系に関する標準的な手法を用いて誘導し、そして当該分野で良く知られている標準的な操作法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、示差析出、相抽出等）を用いて精製する。次に精製されたタンパク質を、適応症、例えば限定しないが、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患、クローン病、又は未修飾タンパク質が治療上の利益を与えることが分かっている他の適応症の治療のためにヒト患者に投与できる。ｒＰＥＧ配列の付加は延長された血清中半減期、向上した患者の曝露／薬効、及び／又は向上した製造効率の特性を付与する。
【０３７１】
１つの実施形態において、生物系（例えばエシェリシア・コリ、ピチア・パストリス、ＣＨＯ−Ｓ等）における高レベルタンパク質発現のための適切な転写及び翻訳配列の制御下にグルカゴン遺伝子のＮ又はＣ末端に、ｒＰＥＧ配列を遺伝子的に融合する。タンパク質発現は使用した発現系に関する標準的な手法を用いて誘導し、そして当該分野で良く知られている標準的な操作法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、示差析出、相抽出等）を用いて精製する。次に精製されたタンパク質を、適応症、例えば限定しないが、ＩＩ型糖尿病、若年性糖尿病、又は未修飾タンパク質が治療上の利益を与えることが分かっている他の適応症の治療のためにヒト患者に投与できる。ｒＰＥＧ配列の付加は延長された血清中半減期、向上した患者の曝露／薬効、及び／又は向上した製造効率の特性を付与する。インビボ薬効の維持することに対するグルカゴンのＮ末端の感受性のために、組み換え体の発現及び精製の際に天然のＮ末端構造を維持するためには特殊な配慮が必要である場合があり、そして、好ましい実施形態はＧＬＰ−１配列のＣ末端へのｒＰＥＧの融合を含むことになる。インビトロ又はインビボの何れかにおいてプロテアーゼにより切断できるＮ末端リーダー配列を使用することにより製造収率を向上及び／又はインビボの活性分子の送達を向上することができる。
【０３７２】
１つの実施形態において、生物系（例えばエシェリシア・コリ、ピチア・パストリス、ＣＨＯ−Ｓ等）における高レベルタンパク質発現のための適切な転写及び翻訳配列の制御下にＩＧＦ−１遺伝子のＮ又はＣ末端に、ｒＰＥＧ配列を遺伝子的に融合する。タンパク質発現は使用した発現系に関する標準的な手法を用いて誘導し、そして当該分野で良く知られている標準的な操作法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、示差析出、相抽出等）を用いて精製する。次に精製されたタンパク質を、適応症、例えば限定しないが、ＩＧＦ−１不全、遺伝子欠失又は抗ＧＨ抗体形成により誘発されたｈＧＨ不全、又は未修飾タンパク質が治療上の利益を与えることが分かっている他の適応症の治療のためにヒト患者に投与できる。ｒＰＥＧ配列の付加は延長された血清中半減期、向上した患者の曝露／薬効、及び／又は向上した製造効率の特性を付与する。
【０３７３】
デポモジュール
本発明の組成物は場合によりデポモジュールを包含してよい。デポモジュールは天然に存在するポリペプチド、人工のポリペプチド又はファージディスプレイにより選択されたものであってよい。１つの実施形態において、デポモジュールは以下において言及する重合体マトリックスに直接結合することになる。デポモジュールは修飾ポリペプチド内部の何れかの位置に取り込まれることができ、そして、１回のみ、又は多数のコピーとして、図２及び３に示す通り存在できる。
【０３７４】
デポモジュールは種々の態様において修飾ポリペプチドに結合できる。例えば、１つの実施形態において（図４）、修飾ポリペプチドは以下の反復単位、即ち：アクセサリーポリペプチド−生物学的に活性なポリペプチド−デポモジュール、生物学的に活性なポリペプチド−アクセサリーポリペプチド−デポモジュール、デポモジュール−アクセサリーポリペプチド−生物学的に活性なポリペプチド、又はデポモジュール−生物学的に活性なポリペプチド−アクセサリーポリペプチドを含む。
【０３７５】
本発明の別の特徴において、デポモジュールは血清中のプロテアーゼに対して特異的に感受性であるポリペプチドを含む（図８）。デポモジュールのプロテアーゼ切断により生物学的に活性なポリペプチドが放出される。プロテアーゼ部位は特定のプロテアーゼに対し、例えば血清中プロテアーゼに対して感受性となるように、又はプロテアーゼ切断の異なる速度を呈するように操作できる。即ち放出の速度又は部位はデポモジュールのプロテアーゼ切断部位の操作を介して制御できる。そのように操作された修飾ポリペプチドは本明細書に記載する重合体マトリックスを用いて製剤できる。
【０３７６】
本発明の更に別の特徴において、デポモジュールはまた、高アビディティの結合モジュールを生成するために修飾できる。これはプロテアーゼ耐性モジュールで一部のプロテアーゼ感受性モジュールを置き換えることにより達成できる。例えば４つ毎の生物学的に活性なポリペプチドの間にプロテアーゼ感受性デポモジュールを有するアクセサリーポリペプチド−生物学的に活性なポリペプチドの融合タンパク質を生成すれば、融合タンパク質のタンパク質分解により４価の結合モジュールが放出されることになる。４価の物質種は単量体の結合モジュールに対して有意に増大した標的アビディティを有し、そして細胞表面受容体を標的化する場合に特に望ましい（図５３ａ〜５３ｃ）。
【０３７７】
本発明のまた更に別の特徴において、デポモジュールは例えば標的アビディティを増大させるため、及び／又は持続放出用途のために、４価のアクセサリーポリペプチド−生物学的に活性なポリペプチドの融合タンパク質を与えるように設計される。デポモジュールは小分子ビオチンの部位特異的コンジュゲーションのためのアミノ酸を含有するように設計される。ビオチンは店頭販売されている栄養補給剤中に存在する一般的なビタミンである。それは脂肪酸の生合成に関与するものを包含する数種の酵素に関する「補因子」として作用する。ビオチンはまた、それがタンパク質であるアビジン、ニュートラアビジン、及びストレプトアビジンと極めて高い親和性の複合体を形成することから、生物工学の用途において広範に使用されている。本実施形態においては、各々がビオチンの４分子に結合するアビジン、ストレプトアビジン、又はニュートラアビジンは、高度に安定なアクセサリーポリペプチド−生物学的に活性なポリペプチドの融合タンパク質４量体を形成するために使用できる（図５）。
【０３７８】
リジン（Ｋ）及びシステイン（Ｃ）残基は高い収率及び特異性で穏やかな条件下にそれぞれスクシンイミジルエステル又はマレイミドとの化学反応により修飾することができる。アクセサリーポリペプチドがリジン（Ｋ）又はシステイン（Ｃ）残基を含有しない場合は、これらはデポモジュール内に容易に取り込むことができる。デポモジュールは１、２、又はそれより多いリジン又はシステイン残基を含むことができる。
【０３７９】
デポモジュールはまた、部位特異的修飾を確保するために「ホットシステイン」の使用を包含できる。「ホットシステイン」はリジン残基によりフランキングされており、例えばＫがリジン、Ｃがシステインとした場合にＫＣＫＫと表す。近位のリジン残基はシステインのｐＫａをシフトさせ、その親核性を増大させ、この残基をより反応性とする。「ホットシステイン」が同じタンパク質上に存在する２３の他のシステイン残基のバックグラウンドがある場合でも優先的に修飾される（９０％超）ことができることが幾つかのグループにより報告されている［Ｏｋｔｅｎ，Ｚ．ら（２００４）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１１：８８４−７］。即ち、デポモジュールはインビトロでアクセサリーポリペプチド又はアクセサリーポリペプチド−生物学的に活性なポリペプチドの融合物の部位特異的で効率的な修飾をもたらすことができる。これらの反応性基のいずれかにコンジュゲートしたビオチンは市販されている。
【０３８０】
アビジン、ストレプトアビジン、又はニュートラアビジンのようなビオチン結合タンパク質の付加は極めて安定なアクセサリーポリペプチド−結合タンパク質ポリペプチド４量体の形成を誘導できる。次にアクセサリーポリペプチド−結合タンパク質ポリペプチド４量体を後述する通り重合体マトリックスと共に製剤（例えばマイクロスフェア内にカプセル化）することができる。アクセサリーポリペプチド−結合タンパク質ポリペプチド４量体は極めて大きい流体力学的半径を呈し、これにより重合体マトリックス、例えばマイクロスフェアからの緩徐な放出を確保する。アクセサリーポリペプチド−結合タンパク質ポリペプチド４量体はまた、その生物学的標的に対して増大したアビディティを有することになる。アクセサリーポリペプチド−結合タンパク質ポリペプチド４量体は例えば細胞の原形質膜上の４つの標的分子と相互作用できるため、アクセサリーポリペプチド−結合タンパク質ポリペプチドのオフレートは劇的に低減されることになる。増大したアビディティは生物学的活性を増強するか、又はアクセサリーポリペプチド−結合タンパク質ポリペプチドの必要用量を低減する場合がある。
【０３８１】
本発明の更に別の特徴においては、同じ活性残基を有するデポモジュールは反応性のビオチンの代わりにポリエチレングリコールで修飾することもできる。とくに有用なものは４及び８アームを有するＰＥＧ分子である。これらのＰＥＧ分子は本明細書に記載するデポモジュールに共有結合することができ、これにより均質な４量体及び八量体の物質種を形成できる。この態様においてコンジュゲートされたタンパク質治療薬は、それらの生物学的標的に対して、特に細胞表面タンパク質に対して、有意に増強されたアビディティを有することになる。
【０３８２】
タンパク質沈殿物を形成するための対イオン
本発明はまた、目的のタンパク質の溶解性を調節するため、即ちデポ製剤のためのタンパク質沈殿物を形成するための、対イオンの使用に関する。対イオンはその存在が全体的に中性に荷電した物質種の形成を可能にするイオンである。例えば（中性の）物質種ＮａＣｌにおいて、ナトリウムカチオンはクロリドアニオンに対向され、或いはその逆となる。カチオン交換剤を用いた水難溶性の塩の形成の機序は以下の式：ｒＰＥＧｎ＋＋ｎＣ−  →ｒＰＥＧ・Ｃｎ（不溶性）により表され、式中、ＰＥＧｎ＋は正荷電したペプチドイオンであり、Ｃ−は負荷電した対イオンである。この反応において関与するアミノ酸残基はＡｒｇ、Ｌｙｓ及びＮ末端を包含する。アニオン交換剤を用いた水難溶性の塩の形成の機序は以下の式：ｒＰＥＧｎ−＋ｎＣ＋→ｒＰＥＧ・Ｃｎ（不溶性）により表され、式中、ｒＰＥＧｎ−は負荷電したペプチドイオンであり、Ｃ＋は正荷電した対イオンである。この反応において関与するアミノ酸残基はＡｓｐ、Ｇｌｕ及びＣ末端を包含する。
【０３８３】
好ましい実施形態においては、対イオンは混合型の疎水性及びイオン性の特徴を示す。即ち、対イオンの電荷が目的のタンパク質との複合体形成により中和されると、対イオンの疎水性の性質が結果として生じる複合体を支配することになり、その水溶性を大きく低下させる。更にまた、対イオンは急性及び慢性の毒性、発癌性、生殖に対する作用等の観点において、目的のタンパク質に関して意図される臨床適応症の範囲内でインビボの投与に適合しなければならない。この用途のために適する混合型の対イオンの非限定的な例を以下に示す。
・アニオン：
・ベヘネート
・コレステリルスルフェート
・デオキシコレート
・ドデカンスルホネート
・エピガロカテキンガレート
・ヘキサデカンスルホネート
・パモエート
・ペンタガロイルグルコース
・ステアレート
・タンネート
・カチオン：
・コリン誘導体
・ペプチド対イオン：例えばＨ−Ｌｙｓ−（Ｌｅｕ）ｎ−ＮＨ２；Ｈ−（Ｌｅｕ）ｎ−ＮＨ２
・脂質：
・ホスファチジルコリン
・重合体物質：
・キトサン
・コラーゲン
・ヒアルロン酸
・ポリβ−アミノエステル
・ＰＬＡ／ＰＬＧＡ
・ポリ（エチレングリコール）ビス（２−アミノエチル）
１つの実施形態において、目的のタンパク質を上記した通り疎水性及び荷電性の特徴の両方を含む対イオンと所定比において混合する。相互作用によりタンパク質と対イオンは溶液から沈殿する不溶性複合体を形成する。好ましい実施形態においては総タンパク質の２０％、４０％、６０％、又は８０％以上がこれらの条件下に沈殿し、これは溶液中に残存するタンパク質の定量試験により評価できる。タンパク質：対イオンの比、有機溶媒の使用、ｐＨ調節、イオン強度、及び／又は温度調節の最適化は沈殿反応の効率を調整するために使用してよい。沈殿は標準的な方法（即ち濾過、遠心分離）を用いて液相から分離することができ、そして、乾燥形態において、又は不活性緩衝液中の懸濁液として保存できる。医薬組成物とするためには、保存時のタンパク質の安定性が、所定の製剤の実現性を判断する場合の決定的なパラメーターとなる。１つの実施形態において、タンパク質は１、２、３、６、１２、１８、又は２４か月より長期に渡り所定の保存条件及び製剤において安定である。
【０３８４】
本発明はまたインビボで対象内に上記タンパク質を投与する方法を実施形態とする。本発明の化合物は医薬品製剤、例えば経口（口内及び舌下を包含する）、直腸、経鼻、局所、経皮パッチ、肺内、膣内、座薬、又は非経腸（筋肉内、動脈内、髄腔内、皮内、腹腔内、皮下及び静脈内を包含する）投与に適するものを包含する医薬品製剤として、或いはエアロゾル、吸入又は通気による投与に適する形態において、投与してよい。好ましい実施形態においては、タンパク質複合体は非経腸注射を介して対象に投与する。本明細書においては、「非経腸」という用語は腸を経由するのではなく、むしろ静脈内（ｉ．ｖ．）、動脈内（ｉ．ａ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、脳室内、気管支内、及び皮下（ｓ．ｃ．）の経路を経由した注入による、身体内への複合体の導入を指す。非経腸の注射（例えば瞬時注射又は連続注入）により投与するためには、沈殿物は投与経路に適合する緩衝液中に再懸濁する。好ましい実施形態においては、沈殿物は最小限の閉塞を伴いて１８、２２、２５、２６、２７、又は２８ゲージの針を通過することができる均質な懸濁液として再懸濁させる。ミリング又は同様の加工処理を実施することにより再懸濁特性を向上させることができ、同時に、より高ゲージの針を効率的に通過できるように粒子の大きさを低減することができる。洗剤又は溶液の表面張力、粘度、又は水和特性を変えることができる他の賦形剤もまた注射のための沈殿物懸濁液の均質性を向上させる場合に有用である場合がある。
【０３８５】
本発明はまた、例えば非経腸注射を介したインビボの環境内への沈殿物の導入の際のデポ製剤中のタンパク質の放出速度に関する。タンパク質放出速度はタンパク質：対イオン沈殿物を等張性緩衝液（例えばリン酸塩緩衝食塩水）に懸濁させ、そして経時的に可溶性タンパク質の濃度を計測することによりインビトロで近似させることができる。好ましい実施形態はインビボの状態を良好に模倣するために生理学的な温度を使用するが、実験設定に応じて再可溶化速度を変更するためにより高温又は低温を使用してもよい。所定のタンパク質に対する最適な放出速度はそのインビボのクリアランスの速度及び機序、並びにインビボ薬効のために必要な曝露に応じたものとなる。タンパク質の有意な蓄積を達成するためには、再可溶化速度は天然のクリアランス速度よりも速くなければならない。タンパク質の血清中濃度はクリアランス速度に対する再可溶化速度の比に比例することが予測される。タンパク質複合体のその可溶性及び沈澱状態の間の動態は以下の方程式で示される。
【０３８６】
【数１】
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複合体への再沈殿速度が無視できると仮定すれば：［タンパク質ｎ−］はｋ可溶化／ｋクリアランス（即ちクリアランス速度に対する再可溶化速度の比）に概ね等しい。
【０３８７】
インビボで達成される実際の血清中濃度はまた、多くのその他の要因、例えば注射する複合体の総量、沈殿物粒子の表面積、タンパク質吸収速度、タンパク質のその同族体受容体への結合、及びリサイクル機序に応じたものとなる。
【０３８８】
沈殿物の再可溶化特性は沈殿物の種々の処理により変更してよい。例えば熱処理又は対イオンのＵＶ架橋を使用することにより沈殿物の化学的な（及び再可溶化の）特性を変更もすることができる。沈殿物はまた、溶媒の直接の除去（例えば噴霧乾燥、凍結乾燥）、その後の対イオン又はコーティング物質による処理により所望のデポ特性を達成することによっても形成してよい。
【０３８９】
賦形剤は複合体形成の速度及び効率を制御するため、並びにインビボ環境への移行時のタンパク質：対イオン複合体の再可溶化速度を調整するために、複合体形成反応に包含させてよい。賦形剤は典型的には未荷電の、不活性の分子であり、これは複合体形成反応緩衝液中に包含され、そして種々の程度の最終沈澱物質量を含む。賦形剤はまた、溶媒への沈殿物粒子の表面積を調節し、そしてこれによりタンパク質の再可溶化速度及び／又は安定性を調節する作用を有する、沈殿物粒子の表面に適用されるコーティングを含んでよい。賦形剤の例は限定しないが以下のものを包含する。
・重合体
・ポリエチレングリコール５００
・ポリエチレングリコール２０００
・ポリエチレングリコール５０００
・ポリエチレングリコール８０００
・ポリエチレングリコール２００００
・ポリリジン
・ＰＬＡ／ＰＬＧＡ
・洗剤
・ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）
・ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）
・トリトンＸ−１００
・糖類／多価アルコール
・グルコース
・グリセリン
・グリセロール
・マンニトール
・マンノース
・ソルビトール
・スクロース
・トレハロース
本発明の別の実施形態は注射時にインサイチュでデポ形成が生じるような製剤を包含する。例えば、タンパク質及び対イオンは沈殿物が生理学的ｐＨ（即ちｐＨ７．４）付近で形成されるように選択する。タンパク質及び対イオンは複合体形成が起こらないように、相互に相対的に最適である濃度比において、ただし生理学的ｐＨからは十分異なるｐＨ（例えばｐＨ４又はｐＨ１０）において製剤される。非経腸注射、好ましくは皮下又は筋肉内注射の際に、組織の固有の緩衝能により、溶液はｐＨ７．４に調節され、その結果、注射部位においてタンパク質：対イオンの沈殿、そしてその結果としてのその持続放出が起こる。注射時の温度変化及びインビボで観察される天然の対イオンとの注射されたタンパク質の複合体形成はまた、持続放出タンパク質デポがインサイチュで形成されてよい方法でもある。
【０３９０】
アクセサリー連結ポリペプチドの製造
本発明は以下の工程、即ち：ａ）宿主細胞における修飾ポリペプチドの発現が、生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較した場合に生物学的に活性なポリペプチドの可溶性型のより高値の量をもたらすように、アクセサリーポリペプチドに連結された生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を準備すること；及び、ｂ）修飾ポリペプチドを該宿主細胞内で発現させることにより、生物学的に活性なポリペプチドを産生することを含む生物学的に活性なポリペプチドを産生する方法を提供する。修飾された生物学的に活性なポリペプチドの発現は生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較して少なくとも約１００％、２００％、５００％又は１０００％多い生物学的に活性なポリペプチドの可溶性型をもたらす場合がある。一部の実施形態においては、修飾された生物学的に活性なポリペプチドの発現は生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較して少なくとも１００％〜１０００％多い生物学的に活性なポリペプチドの可溶性型をもたらす場合がある。
【０３９１】
本発明の方法はＤＮＡが発現される条件下にアクセサリーポリペプチドをコードするキメラＤＮＡ分子で形質転換された細胞を培養することによりアクセサリー連結ポリペプチドを産生すること；及び細胞又は培地からキメラＤＮＡ分子の発現産物を抽出することを包含する場合がある。
【０３９２】
分子生物学における標準的な組み換え手法を用いて本発明のアクセサリー連結ポリペプチドを作成できる。１つの実施形態において、アクセサリーポリペプチドに相当するＤＮＡ配列を含有する構築物を先ず調製する。例えば、生物学的に活性なタンパク質をコードする遺伝子又はポリヌクレオチドを先ず、プラスミド又は他のベクターであることができる構築物内にクローニングする。後者の工程において、アクセサリーポリペプチドをコードしている第２の遺伝子又はポリヌクレオチドを、生物学的に活性なポリペプチドをコードしている遺伝子に隣接かつインフレームに構築物内にクローニングする。第２の工程はライゲーション又は多量体化の工程を介して行うことができる。
【０３９３】
この態様において、修飾ポリペプチドをコードしているキメラＤＮＡ分子を構築物内部で形成する。場合により、このキメラＤＮＡ分子をより適切な発現ベクターである別の構築物内に転移又はクローニングしてもよい。この時点において、キメラＤＮＡ分子を発現できる宿主細胞をキメラＤＮＡ分子で形質転換する。形質転換は発現ベクターのような担体を利用して、又は利用することなく行ってよい。次に形質転換された宿主細胞をキメラＤＮＡ分子の発現に適する条件下に培養することにより、アクセサリーポリペプチドをコードする。本発明において有用なライゲーション又は多量体化の方法は良く知られている。Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、１．５３（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）を参照できる。
【０３９４】
数種のクローニングの方策が本発明の実施に適するものとして想定され、その大部分は本発明のアクセサリーポリペプチドをコードしている遺伝子を含む構築物を形成するために使用できる。
【０３９５】
目的のＤＮＡセグメントを含有するベクターを細胞宿主の型に応じて良く知られている方法により宿主細胞内に転移させることができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核生物の細胞に対して一般的に利用されており、リン酸カルシウム処理、リポフェクション、又はエレクトロポレーションはその他の細胞宿主に対して使用してよい。哺乳類細胞を形質転換するために使用される他の方法はポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、及びマイクロインジェクションの使用を包含する（一般的に上出のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照）。原核生物又は真核生物の細胞が宿主として想定される。アクセサリーポリペプチドは原核生物及び真核生物の系を包含する種々の発現系において製造できる。適当な発現宿主は例えばコウボ、真菌、哺乳類細胞培養物、及び昆虫細胞である。
【０３９６】
使用できる有用な発現ベクターは例えば染色体、非染色体及び合成のＤＮＡ配列のセグメントを包含する。適当なベクターは限定しないが、ＳＶ４０及びｐｃＤＮＡの誘導体、及び既知の細菌プラスミド、例えばｃｏｌ  ＥＩ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ，５７：３１−４０（１９８８）記載のｐＧＥＸ、ｐＭＢ９及びその誘導体、プラスミド、例えばＲＰ４、ファージＤＮＡ、例えばＮＭ９８  ９のようなファージＩの多くの誘導体、並びに他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３及びフィラメント性の１本鎖ファージＤＮＡ；コウボプラスミド、例えば２ミクロンプラスミド又は２ｍプラスミドの誘導体、並びに動原体及び一体型のコウボシャトルベクター；真核生物の細胞において有用なベクター、例えば昆虫又は哺乳類細胞において有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせから誘導されたベクター、例えばファージＤＮＡ又は発現制御配列を使用するように改質されているプラスミド；等を包含する。要件はベクターが選択された宿主細胞において複製可能で生存できることである。低又は高コピー数のベクターを所望により使用してよい。
【０３９７】
例えばバキュロウィルス発現系においては、非融合転移ベクター、例えば限定しないが、ｐＶＬ９４１（ＢａｍＨＩクローニング部位、入手元Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４：３９０−４０２（１９７８））、ｐＶＬ１３９３（ＢａｍＨＩ、Ｓｍａｌ、Ｘｂａｌ、ＥｃｏＲＩ、ＩＶｏｔｌ、Ｘｍａｌｌｌ、ＢｇＩＩＩ及びＰｓｔｌクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２（ＢｇＩＩＩ、Ｐｓｔｌ、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｘｂａｌｌ、Ｓｍａｌ及びＢａｍＨＩクローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８４：３９０−４０２（１９７８）及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ＢａｍＨＩ、ＢｇＩＩＩ、Ｐｓｔｌ、Ｎｃｏｌ及びＨｉｎｄｉ  ＩＩクローニング部位＋ブルー／ホワイト組み換えスクリーニング、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び融合転移ベクター、例えば限定しないが、ｐＡｃ７００（ＢａｍＨＩ及びＫｐｎｌクローニング部位、ＢａｍＨＩ認識部位が開始コドンで始まる；Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４：３９０−４０２（１９７８））、ｐＡｃ７０１及びｐＡｃ７０−２（ｐＡｃ７００と同様、異なる読み枠を有する）、ｐＡｃ３６０［ＢａｍＨＩクローニング部位、ポリヘドリン開始コドンの３６塩基対下流；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（１９９５））及びｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＢａｍＨＩ、Ｂｇ  ＩＩＩ、Ｐｓｔｌ、Ｎｃｏ  ｌ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩクローニング部位を有する３つの異なる読み枠、ＰｒｏＢｏｎｄ精製用のＮ末端ペプチド及びプラークのブルー／ホワイト組み換えスクリーニング；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（２２０）の両方を使用できる。
【０３９８】
哺乳類発現ベクターは複製起点、適当なプロモーター及びエンハンサー、及び、更には何れかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終止配列、及び５’フランキング非転写配列を含むことができる。ＳＶ４０スプライス及びポリアデニル化部位から誘導されたＤＮＡ配列を用いることにより必要な非転写遺伝子エレメントを得てよい。本発明における使用を意図する哺乳類発現ベクターは、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーターのような誘導プロモーターを有するベクター、ＤＨＦＲ発現カセットを有する何れかの発現ベクター、又はＤＨＦＲ／メトトレキセート同時増幅ベクター、例えばｐＥＤ（Ｐｓｔｌ、Ｓａｉｌ、Ｓｂａｌ、Ｓｍａｌ及びＥｃｏＲＩクローニング部位、クローニングされた遺伝子とＤＨＦＲの両方を発現するベクター；Ｒａｎｄａｌ  Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ，１９９１，Ｒａｎｄａｌ  Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６，１２（１９９１））を包含する。或いは、グルタメート合成酵素／メチオニンスルホキシイミン同時増幅ベクター、例えばｐＥＥ１４（Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｘｂａｌｌ、Ｓｍａｌ、Ｓｂａｌ、ＥｃｏＲＩ及びＳｅｌｌクローニング部位、この場合ベクターはグルタミン合成酵素及びクローニングされた遺伝子を発現；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。エプスタインバーウィルス（ＥＢＶ）又は核抗原（ＥＢＮＡ）の制御下にエピソーム発現を指向するベクター、例えばｐＲＥＰ４（ＢａｍＨＩ  ｒ  ＳｆＨ、Ｘｈｏｌ、ＮｏｔＩ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄｉ  ＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩ及びＫｐｎｌクローニング部位、構成ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨＩ、ＳｆＨ、Ｘｈｏｌ、ＮｏｔＩ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｎｈｅｌ、ＰｖｕＩＩ及びＫｐｎｌクローニング部位、構成ｈＣＭＶ最初期遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＥＰ４（．Ｋｐｎｌ、Ｐｖｕｌ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＮｏｔＩ、Ｘｈｏｌ、Ｓｆｉｌ、ＢａｍＨＩクローニング部位、誘導メタロチオネインＨ  ａ遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨＩ、Ｘｈｏｌ、ＮｏｔＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｎｈｅｌ及びＫｐｎｌクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ヒスチジノール選択マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ９（Ｋｐｎｌ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄ  ｌｌｌ、ＮｏｔＩ、Ｘｈｏ  ｌ、Ｓｆｉ  ｌ、ＢａｍＨ  Ｉクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、Ｇ４１８選択マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びｐＥＢＶＨｉｓ（ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂で精製可能であり、エンテロキナーゼで切断できるＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用できる。
【０３９９】
本発明における使用のための選択可能な哺乳類発現ベクターは限定しないが例えばｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｈｉｎｄ  ｌｌｌ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、Ｓｂａｌ及びＡｐａｌクローニング部位、Ｇ４１８選択、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｈｉｎｄ  ＩＩ、Ｓｐｅｌ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、Ｘｂａｌクローニング部位、Ｇ４１８選択、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等を包含する。本発明において使用できるワクシニアウィルス哺乳類発現ベクター（例えばＲａｎｄａｌｌ  Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６．１２（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、、Ｗｉｌｅｙ編、１９９１）参照）は例えば限定しないがｐＳＣ１１（Ｓｍａｌクローニング部位、ＴＫ−及びベータ−ｇａｌ選択）、ｐＭＪ６０１（Ｓａｌｌ、Ｓｍａ  ｌ、Ａ  ｆｌＩ、Ｎａｒｌ、ＢｓｐＭｌＩ、ＢａｍＨＩ、Ａｐａｌ、Ｎｈｅｌ、ＳａｃＩＩ、Ｋｐｎｌ及びＨｉｎｄｌｌｌクローニング部位；ＴＫ−及びｇａｌ選択）、ｐＴＫｇｐｔＦｌＳ（ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ、ＳａＩＩＩ、Ａｃｃｌ、ＨｉｎｄＩＩ、Ｓｂａｌ、ＢａｍＨＩ及びＨｐａクローニング部位、ＴＫ又はＸＰＲＴ選択）等を包含する。
【０４００】
本発明においてやはり使用できるコウボ発現系は例えば限定しないが、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸＪｂａｌ、Ｓｐｈｌ、Ｓｈｏｌ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓａｄ、Ｋｐｎｌ及びＨｉｎｄｌｌｌクローニング部位、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（Ｘｂａｌｌ、Ｓｐｈｌ、Ｓｈｏｌ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓａｄ、Ｋｐｎｌ及びＨｉｎｄｉ  ＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂で精製可能であり、エンテロキナーゼで切断できるＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳベクター等を包含する。
【０４０１】
更にまた、キメラＤＮＡ分子を含有する発現ベクターは薬剤選択マーカーを包含してよい。そのようなマーカーはクローニングにおいて、そしてキメラＤＮＡ分子を含有するベクターの選択又は識別において役割を果たす。例えばネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、ゼオシン、及びヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は有用な選択マーカーである。或いは、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のような酵素を使用してよい。免疫学的マーカーもまた使用できる。何れの知られた選択マーカーも、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現され得る限り、使用してよい。選択マーカーのその他の例は当該分野で良く知られており、そしてレポーター、例えば増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ベータガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する。
【０４０２】
結果として、哺乳類及び典型的にはヒトの細胞、並びに細菌、コウボ、真菌、昆虫、線虫及び植物細胞を宿主細胞として本発明において使用することができ、そして本明細書に定義する通り発現ベクターにより形質転換してよい。
【０４０３】
適当な細胞の例は、限定しないが、ＶＥＲＯ細胞、ＨＥＬＡ細胞例えばＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ２、ＣＨＯ細胞系統、ＣＯＳ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞、ＰＣ１２細胞、Ｋ５６２細胞、２９３細胞、Ｓｆ９細胞及びＣｖＩ細胞を包含する。
【０４０４】
本発明において使用できる他の適当な細胞は例えば限定しないが、原核生物宿主細胞系統、例えばエシェリシア・コリ、（例えば菌株ＤＨ５−α）、バチルス・サブチルス、サルモネラ・チフィムリウム、又はシュードモナス、ストレプトマイセス及びスタフィロコッカスの属の菌株を包含する。適当な原核生物の非限定的な例は以下の属：アクチノプラネス；アルケオグロブス；ブデロビブリオ；ボレリア；クロロフレクサス；エンテロコッカス；エシェリシア；ラクトバチルス；リステリア；オセアノバチルス；パラコッカス；シュードモナス；スタフィロコッカス；ストレプトコッカス；ストレプトマイセス；サーモプラズマ；及びビブリオに由来するものを包含する。特定の菌株の非限定的な例はアルケオグロブス・フルギダス；ブデロビブリオ・バクテリオボルス；ボレリア・ブルグドルフェリ；クロロフレクサス・オーランチアカス；エンテロコッカス・フェカーリス；エンテロコッカス・フェシウム；ラクトバチルス・ジョンソニー；ラクトバチルス・プランタラム；ラクトコッカス・ラクチス；リステリア・イノキュア；リステリア・モノサイトゲネス；オセアノバチルス・イヘイエンシス；パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス；シュードモナス・メバロニー；スタフィロコッカス・アウレウス；スタフィロコッカス・エピデルミディス；スタフィロコッカス・ヘモリチカス；ストレプトコッカス・アガラクチエ；ストレプトマイセス・グリセオロスポレウス；ストレプトコッカス・ミュータンス；ストレプトコッカス・ニューモニア；ストレプトコッカス・ピオゲネス；サーモプラズマ・アシドフィラム；サーモプラズマ・ボルカニウム；ビブリオ・コレラ；ビブリオ・パラヘモリチカス；及びビブリオ・ブルニフィカスを包含する。
【０４０５】
本発明において使用できるその他の適当な細胞はコウボ細胞、例えばサッカロマイセス、例えばサッカロマイセス・セレビシアエのものを包含する。
【０４０６】
本発明を実施するために細菌発現を使用することの重要な利点は、グリコシル化が無い点である。アクセサリーポリペプチドのグリコシル化はその分子量を増大させ、そして一般的にはその血清中半減期を延長するが、グリコシル化産物の品質を管理することは極めて困難である。多くのグリコシル化部位が存在し、そしてタンパク質の発現レベルが高い場合、グリコシル化の機序がついていけず、そしてグリコシル化は不完全なプロセシングのために不完全となる可能性が高く、その結果、不均質な炭水化物構造となり、これが精製、特性化、品質管理及び再現性を大きく複雑化する。
【０４０７】
どのようにタンパク質を細菌中で発現させるか（培地中に分泌、細胞周辺腔中に、細胞質中で可溶性状態、又は細胞質中の不溶性封入体として）に応じて、生成物又は中間体はホルミル化されたＮ末端を含有してよい。
【０４０８】
本発明のアクセサリーポリペプチド又はアクセサリー修飾ポリペプチドが付されてよい追加的な翻訳後の修飾は、例えば限定しないが、アシル化、アセチル化、アルキル化、脱メチル化、アミド化、ビオチニル化、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グルタミル化、グリコシル化、グリシル化、ヘム部分の結合、ヒドロキシル化、ヨウ素化、イソプレニル化、リポイル化、プレニル化、ミリストイル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化、ＡＤＰ−リボシル化、フラビン付加、酸化、ＰＥＧ化、ホスファチジルイノシトールの結合、ホスホパンテテイニル化、ホスホリル化、ピログルタメート形成、プロリルイソメラーゼによるプロリンのラセミ化、ｔＲＮＡ媒介のアミノ酸付加、例えばアルギニル化、硫酸化及びセレノイル化を包含する。
【０４０９】
目的のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞はプロモーターを活性化、形質転換体を選択、又は遺伝子を増幅するために適切に改質された従来の栄養培地（例えばＨａｍの栄養混合物）中で培養できる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は発現のために選択された宿主細胞とともに以前より使用されていたものであり、そして当業者の知る通りである。細胞は典型的には遠心分離により採取し、物理的又は化学的な手段で崩壊させ、そして得られた粗製の抽出物は更に精製するために保持する。タンパク質の発現において使用する微生物細胞は何れかの好都合な方法、例えば凍結解凍サイクリング、超音波処理、器械的崩壊、又は細胞溶解剤の使用により、崩壊することができ、これらは全て当該分野で良く知られている。細胞溶解を行う実施形態ではキメラＤＮＡ分子の発現後の分解を制限するプロテアーゼ阻害剤を含有する緩衝液を使用してよい。適当なプロテアーゼ阻害剤はロイペプチン、ペプスタチン又はアプロチニンを包含する。次に上澄みを漸増濃度の飽和硫酸アンモニウム中で沈殿させてよい。
【０４１０】
アクセサリーポリペプチド産物は当該分野で知られた方法を介して精製してよい。ゲル濾過、アフィニティー精製、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー及びゲル電気泳動のような操作法を使用してよい。一部のアクセサリーポリペプチドは再折り畳みを必要とする場合がある。精製の方法はＲｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒ．Ｃａｓｔｏｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９４）及びＪｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）に記載されている。多工程精製分離もまたＢａｒｏｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１７９−９０（１９９０）及びＢｅｌｏｗら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．６７９：６７−８３（１９９４）に記載されている。
【０４１１】
架橋アクセサリーポリペプチドの生成
架橋アクセサリーポリペプチドは種々の方法により生成できる。非架橋及び架橋の成分の両方を化学合成により、又は組み換え手法を用いて形成できる。特に有用なものは、非架橋成分の組み換え製造であり、これは種々の微生物並びに真核生物の発現系において、例えば上記した通り、達成できる。非架橋成分は架橋の前に干渉性又は夾雑性の副生成物を除去するために精製できる。特に有用なものはカップリングのために活性化できる化学架橋剤である。例を図２２に示す。結果として生じるカップリング産物は種々の方法、特にサイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーにより更に精製できる。
【０４１２】
多数の異なる非架橋成分を生成物の構造を制御できる方法を用いて架橋成分にコンジュゲートできる。例えば、異なるコンジュゲーションの化学的特徴を可能にする数種の異なる反応性基を担持した架橋成分を使用できる。或いは、自身の反応性基の一部に対して保護基を担持している架橋成分を使用できる。そのような部分的に保護された架橋成分を１つ以上の非架橋成分にカップリングできる。その後、架橋成分から保護基を除去し、そして追加的な非架橋成分を架橋成分にコンジュゲートすることができる。このプロセスは選択的除去を可能にする多数の異なる保護基を用いることにより反復できる。
【０４１３】
本発明の別の実施形態においては、組み換え架橋成分を使用してよい。架橋成分は種々の発現系を用いて組み換え技術により製造できるアミノ酸配列であることができる。非架橋成分の配列中に取り込まれた例えばｆＭｅｔアミノ酸を組み換え架橋成分中のアミノ基にコンジュゲートしてよい。
【０４１４】
１つの好ましい実施形態は１つ以上のグルタメート及び／又はアスパルテート残基を含む架橋成分を提供し、これは反応性基として作用でき、そして反応性基としての遊離のアミノ基を有する非架橋し得分に効果的にコンジュゲートできる側鎖を含有する。種々のカルボジイミドを用いて遊離のカルボキシル基を活性化できるが、ほかにも多くの化学的特徴が適している。組み換え架橋成分中の遊離のアミノ基はアセチル化又はスクシニル化によりブロッキングしてよい。
【０４１５】
或いは、架橋成分は多数の高親和性の結合部位を有するタンパク質であることができる。例はアビジン、ストレプトアビジン、ＩｇＧ又はＩｇＭである。例えば４価の複合体の形成をもたらすことになるストレプトアビジンにビオチニル化非架橋成分を接触させることにより架橋したアクセサリーポリペプチドを形成できる。プロセスは図２５に示す通りである。同様の態様において、例えばペプチドエピトープに対する特異性を有するＩｇＭ又はＩｇＧを該ペプチドエピトープを含む非架橋成分と組み合わせて使用する。
【０４１６】
本発明のアクセサリーポリペプチドは、生物学的に活性なポリペプチドの作用について調べるために試験してよい。生物学的に活性なポリペプチドを試験する方法は当業者の知る通りである。例えば血清中半減期は、タンパク質をヒト（又は適宜、マウス、ラット、サル）の血清又は血漿と、典型的には数日間程度（即ち０．２５、０．５、１、２、４、８、１６日）、３７℃で混合することにより計測できる。次にこれらの時点に関する試料をウエスタン試験に付し、そしてタンパク質を抗体で検出する。抗体はタンパク質中のタグであることができる。タンパク質がウエスタン上で単一のバンドを示せばタンパク質のサイズは注入したタンパク質のものと同一であり、その場合には、分解は起こっていない。ウエスタンブロット又は同等の手法により判断した場合にタンパク質の５０％が分解する時点は、タンパク質の血清中分解半減期又は「血清中半減期」と判定される。
【０４１７】
本発明のアクセサリーポリペプチドは種々の細胞標的、例えば限定しないが「生物学的に活性なポリペプチド」のセクションで記載したものの発現又は活性をモジュレートするために使用してよい。一部の実施形態においては、標的の発現はアクセサリーポリペプチドの投与により低減されることになり、他の実施形態ではそれは増大されることになる。アクセサリーポリペプチドは標的上の機能的部位との相互作用により細胞標的の活性を妨害してよい。
【０４１８】
持続放出剤
本発明の修飾ポリペプチドは所望の用途においてポリペプチドの制御された放出を可能にする組成物中に取り込ませるか、カプセル化するか、製剤化するか、又は別様に包含させてよい。一般的に、本発明の修飾ポリペプチドは種々の態様、例えば限定しないが共有結合、イオン相互作用、又は重合体又は製剤内へのカプセル化において、本発明の持続放出剤と相互作用してよい。
【０４１９】
本発明における使用に適する種々の型の持続放出剤を以下に記載する。
【０４２０】
重合体マトリックス
一般的に、マイクロスフェアは約１〜約１０００ミクロンの範囲の大きさを有するほぼ球状のコロイド構造である。マイクロカプセルは一般的に重合体製剤のような物質が何らかの型のコーティングにより被覆されている構造として一般的に説明される。「微粒子」という用語は上記２つの範疇の何れかに容易に入れられない、又は両方に関する包括的用語としての構造を記載するために使用してよい。直径が約１ミクロン未満である構造に関しては、相当する用語「ナノ球」、「ナノカプセル」及び「ナノ粒子」を利用してよいが、これらはそれぞれ「マイクロスフェア」、「マイクロカプセル」及び「微粒子」という用語に包含される。特定の実施形態においては、ナノ球、ナノカプセル又はナノ粒子は約５００、２００、１００、５０又は１０ｎｍの大きさを有する。
【０４２１】
本発明の持続放出製剤はまた、微粒子の形態をとってよく、これはマイクロカプセル又はマイクロスフェアを包含する場合がある。
【０４２２】
微粒子において、修飾ポリペプチドは重合体分子により形成された膜内部に中心的に位置してよく、又は微粒子全体に渡って分散することができる。内部構造は修飾ポリペプチド及び重合体賦形剤のマトリックスを含んでよい。典型的にはマイクロスフェアの該表面は水に対して透過性であり、これにより水性の流体がマイクロスフェア内に進入でき、並びに、可溶化された修飾ポリペプチド及び重合体がマイクロスフェアを退出できるようになる。１つの実施形態において、重合体膜は架橋重合体を含む。修飾ポリペプチドは重合体膜の拡散及び／又は分解により放出してよい。
【０４２３】
微粒子の外層のための可能な物質は以下の範疇の重合体：（１）炭水化物系重合体、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース系重合体、デキストラン、ポリデキストロース、キチン、キトサン、及びデンプン（例えばヘタスターチ）、及びその誘導体；（２）多価脂肪族アルコール、例えばポリエチレンオキシド及びその誘導体、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ−アクリレート、ポリエチレンイミン、ポリビニルアセテート、及びその誘導体；（３）ポリ（ビニル）重合体、例えばポリ（ビニル）アルコール、ポリ（ビニル）ピロリドン、ポリ（ビニル）ホスフェート、ポリ（ビニル）ホスホン酸、及びその誘導体；（４）ポリアクリル酸及びその誘導体；（５）ポリ有機酸、例えば重合体レイン酸、及びその誘導体；（６）ポリアミノ酸、例えばポリリジン、及びポリイミノ酸、例えばポリイミノチロシン、及びその誘導体；（７）共重合体及びブロック共重合体、例えばポロキサマー４０７又はプルロニックＬ−１０１（商標）重合体、及びその誘導体；（８）第３重合体及びその誘導体；（９）ポリエーテル、例えばポリ（テトラメチレンエーテルグリコール）、及びその誘導体；（１０）天然に存在する重合体、例えばゼイン、キトサン及びプルラン、及びその誘導体；（１１）ポリイミド、例えばポリｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルメタクリレート、及びその誘導体；（１２）界面活性剤、例えばポリオキシエチレンソルビタン、及びその誘導体；（１３）ポリエステル、例えばポリ（エチレングリコール）（ｎ）モノメチルエーテルモノ（スクシンイミジルスクシネート）エステル、及びその誘導体；（１４）分枝鎖及び環状の重合体、例えば分枝鎖ＰＥＧ及びシクロデキストリン、及びその誘導体；及び（１５）ポリアルデヒド、例えばポリ（パーフルオロプロピレンオキシド−ｂ−パーフルオロホルムアルデヒド）、及び参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６、２６８、０５３号に開示されているその誘導体を包含する。当該分野で知られた他の典型的な重合体はポリ（ラクチド−コ−グリコリド，ポリラクチド単独重合体；ポリグリコリド単独重合体；ポリカプロラクトン；ポリヒドロキシブチレート−ポリヒドロキシバレレート共重合体；ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）；ポリエステルアミド；ポリオルトエステル；ポリ１３−ヒドロキシ酪酸；及び参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５１７，８５９号に開示されているポリ無水物を包含する。一部の実施形態においては、重合体はアルギネート重合体を含んでよく、（ヒドロキシエチル）メタクリル化デキストラン重合体、又はキトサン重合体を使用してよい。
【０４２４】
本発明の修飾ポリペプチドは凍結乾燥されたケーキ状物又は水溶液の形態において、生理学的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版、Ｏｓｌｏ，Ａ．編、１９８０）と混合してよい。微粒子の調製のための許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は使用される用量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そして緩衝液、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；単糖類、２糖類、及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、又はデキストリン；キレート形成剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。
【０４２５】
本発明のマイクロスフェアは標準的な手法により製造される。例えば、１つの実施形態においては、米国特許第６，２６８，０５３号に開示されているような粒子を形成するために十分な時間、エネルギー源の存在下、溶液中の重合体又は重合体の混合物と溶液中の活性剤を混合することにより、体積排除を行う。溶液のｐＨは所望のｐＨに調節する。次に、溶液をエネルギー源、例えば熱、放射線又はイオン化の単独に、又は超音波処理、旋回、混合又は攪拌と組み合わせたものに曝露することにより、微粒子を形成する。結果として生じる微粒子を次に、当該分野で良く知られている物理的分離方法により溶液中に存在する場合がある未取り込み成分から分離し、そして次に洗浄してよい。
【０４２６】
一部の実施形態においては、微粒子の懸濁液は修飾ポリペプチドを含有する水溶液及び重合体が溶解している有機溶液（典型的にはジクロロメタン）を激しく混合することにより調製する。次にこの油中水懸濁液をエマルゲント（典型的にはポリビニルアルコール）を含有する水性緩衝液中に希釈する。最後に、マイクロスフェアをこの水注油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）乳化物から分離し、凍結乾燥する。このよく知られ、試験されているＷ／Ｏ／Ｗプロセスは一般的に直径０．１〜１００μｍのマイクロスフェアをもたらす。これらの寸法のマイクロスフェアは皮下注射用の懸濁液として容易に調製される。或いは、マイクロスフェアは単エマルジョン溶媒抽出／蒸発（Ｏ／Ｗ）、固体／油／油法（Ｓ／Ｏ／Ｏ）、及び文献に記載されているこれらの方法の全ての変形例により調製できる。
【０４２７】
既知の製造操作法はまた、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，６６９，９６１号；第６，５１７，８５９号；第６，４５８，３８７号；第６，３９５，３０２号；第６，３０３，１４８号；第６，２６８，０５３号；第６，０９０，９２５号；第６，０２４，９８３号；第５，９４２，２５２号；第５，９８１，７１９号；第５，５７８，７０９号；第５，５５４，７３０号；第５，４０７，６０９号；第４，８９７，２６８号；及び第４，５４２，０２５号に記載されている。微粒子の調製及び製剤はまた、以下の刊行物：（Ｂｉｔｔｎｅｒ，Ｂ．ら（１９９８）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ，４５：２９５−３０５；Ｒｏｓａ，Ｇ．Ｄ．ら（２０００）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，６９：２８３−９５；Ｋｉｓｓｅｌ，Ｔ．ら（２００２）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，５４：９９−１３４；Ｋｗｏｎ，Ｙ．Ｍ．ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｓ．Ｗ．（２００４）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，２１：３３９−４３；Ｌａｎｅ，Ｍ．Ｅ．ら（２００６）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，３０７：１６−２２；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．ら（２００７）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ）に記載されている。
【０４２８】
微粒子はまた、よく知られており、そして延長された放出の薬物送達のための技術を提供する専門の企業から当業者が容易に入手できるものである。例えば、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．の子会社であるＥｐｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは完全に水系のプロセスにおいて生体腐食性のタンパク質マイクロスフェアを製造するタンパク質マトリックス薬物送達系であるＰＲＯＭＡＸＸ（商標）を開発しており；ＯｃｔｏＰｌｕｓは表面腐食に基づくのではなくマトリックスの塊状分解に基づいて活性成分を放出する架橋デキストランマイクロスフェアであるＯｃｔｏＤＥＸ（商標）を開発しており；そしてＢｒｏｏｋｗｏｏｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは薬物送達のためのその微粒子技術の使用可能性を広告している。
【０４２９】
特許、公開特許出願及び関連刊行物の検索もまた、本開示の読者である当業者に多大な可能性のある微粒子技術をもたらすことになる。例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，６６９，９６１号；第６，５１７，８５９号；第６，４５８，３８７号；第６，３９５，３０２号；第６，３０３，１４８号；第６，２６８，０５３号；第６，０９０，９２５号；第６，０２４，９８３号；第５，９４２，２５２号；第５，９８１，７１９号；第５，５７８，７０９号；第５，５５４，７３０号；第５，４０７，６０９号；第４，８９７，２６８号；及び第４，５４２，０２５号はマイクロスフェア及びその製造方法を記載している。当業者であれば、本発明の開示内容及びこれらの他の特許の開示内容の両方を鑑みれば、本発明の修飾ポリペプチドの延長された放出のための微粒子を作成及び使用できることができる。
【０４３０】
更に別の変更が本発明により提供される。ＰＬＧＡビーズのような微粒子は投与直後にかなりのレベルの薬剤をなお放出するため、本発明は上記した通り修飾ポリペプチドの部分としてアクセサリーポリペプチド及び任意のデポモジュールを包含することによりこの瞬時作用を緩解する方法を提供する。
【０４３１】
所望により、治療用タンパク質の放出は、２つ以上の層を有する微粒子を使用する場合にさらに制御できる。１つの実施形態において、マイクロスフェアは内層並びに外層を有する。外層の組成又は厚みを変更することにより、修飾ポリペプチドを含有しているビーズ中心を曝露するまでの時間に差を設けてよい。１つの実施形態において、マイクロスフェアは高濃度で修飾ポリペプチドを含有する内層を有し、そして外層はより低濃度の修飾ポリペプチドを含有するか、修飾ポリペプチドを含有しなくてもよい。或いは、外層は異なるマイクロスフェア間で厚みが変動する。薄層の外層を有するマイクロスフェアはより早期（例えば第１〜５日）に修飾ポリペプチドを放出することになり、外層の中程度の厚みを有するビーズはより後期（例えば第４〜８日）に修飾ポリペプチドを放出し、そしてより厚い外層を有するビーズは更に後期（例えば第７〜１１日）に修飾ポリペプチドを放出する。即ち、本実施形態においてはより一定の放出速度が得られる。
【０４３２】
重合体マトリックス製剤からの薬剤放出速度は生物学的に活性なペプチドに結合したアクセサリーポリペプチドに依存する場合がある。アクセサリーポリペプチドは修飾ポリペプチドの流体力学的半径を有意に増大させる。即ち、アクセサリーポリペプチドモジュールは微粒子からの薬剤放出の速度を制御する手段を与える。本明細書に記載したアクセサリーポリペプチドの何れも重合体マトリックスとともに製剤することにより、制御放出、血清中半減期安定性、及び本明細書に記載した他の所望の特性において有利な作用を達成することができる。
【０４３３】
本発明の別の特徴において本明細書に記載したデポモジュールはアクセサリーポリペプチド−生物学的に活性なポリペプチドと重合体マトリックスの間の非共有結合相互作用を増強するため、及びマトリックスビーズからの修飾ポリペプチドの放出の速度を緩徐化するために設計できる。例えば、アルギネートはマンヌロン及びグルクロン酸よりなる重合体であり、そしてアルギネートマイクロスフェアはＰＬＧＡマイクロスフェアの調製と同様に水／油エマルジョン法により調製できる［Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｒ．ら（２００５）Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ，２２：３９７−４１１］。ＰＬＧＡマイクロスフェアとは異なり、アルギネートは、タンパク質放出が通常は数日間で終了する高度に多孔性のマイクロスフェアを形成する。本発明はアルギネートマイクロスフェア内部の融合タンパク質の保持を増大するために体積増強モジュール及び生物学的に活性なポリペプチドと組み合わせたデポモジュールの使用を提供する。
【０４３４】
アルギネート重合体マトリックスの各単位は生理学的ｐＨにおいて−１の電荷を有するカルボキシル基を含有する。即ち、アルギネート重合体は生理学的条件下に大きな実質負電荷を有する。デポモジュールは塩基性の等電点を有する（即ち生理学的ｐＨで正荷電している）ように設計され、そしてそのため、アルギネートマイクロスフェア内部ではるかに長時間保持されることになる（図６）。このデポモジュールは例えば多数のリジン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）残基を含有するヒトポリペプチドを含む。生理学的ｐＨにおいて、リジンアミノ酸は実質正電荷を担持することになり、これによりアルギネート重合体へのその非共有結合を増大させる。デポモジュールは天然に存在するポリペプチド又は設計／操作された、又は選択されたポリペプチドを包含してよい。潜在的なデポモジュールはアルギネートと相互作用するそれらの能力に関して迅速に評価できる。更にまた、アルギネートに弱く結合するのみであるポリペプチドは、重合体との相互作用を強化するために、反復デポモジュール単位を形成するために組み合わせることができる。
【０４３５】
本発明の更に別の実施形態において、２価のカチオンキレート形成重合体マトリックス（例えばヒドロゲル；Ｌｉｎ，Ｃ．Ｃ．ａｎｄ  Ｍｅｔｔｅｒｓ，Ａ．Ｔ．（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ）を２価カチオンに結合するデポモジュールと組み合わせて使用する。例えば、デポモジュール及びキレート形成重合体マトリックスの両方はＣｕ２＋、Ｃｏ２＋及びＮｉ２＋カチオンに結合し、そしてデポモジュールと２価カチオンとの間の強力な非共有結合相互作用はヒドロゲルからの治療用タンパク質の持続放出を達成するための効率的な機序として作用する（図７）。図４６はアクセサリー修飾ポリペプチドの持続放出を示している。例えばデポモジュールはポリヒスチジンタグ付けタンパク質を取り込むことができる。ポリヒスチジン配列は、そのような配列が固体支持体上のＮｉ２＋カチオンに堅固に結合するため、精製タグとして日常的に使用されている。代替のデポモジュールは上記教示内容を鑑みて同様に設計できる。デポモジュールは、ポリヒスチジン配列が別様に治療用ポリペプチドの生物学的活性を妨害する可能性があれば、生物学的に活性なポリペプチドの代わりにアクセサリーポリペプチドに直接結合できる。
【０４３６】
すなわち、アクセサリーポリペプチド、デポモジュール及び／又は生物学的に活性なポリペプチドの何れかの数の変形例及び選択を組み合わせることにより患者における所望の作用を達成できる。
【０４３７】
本発明は修飾ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。それらは経口、鼻内、非経腸、又は吸入治療により投与でき、そして錠剤、ロゼンジ剤、顆粒、カプセル、丸薬、アンプル、座薬又はエアロゾルの形態をとってよい。それらはまた、水性又は非水性の希釈剤中の活性成分の懸濁物、溶液又は乳化物、シロップ、顆粒又は粉末の形態を取ってよい。更にまた、医薬組成物は他の薬学的に活性な化合物又は本発明の複数の化合物も含有できる。
【０４３８】
本発明の組成物はまた、種々の液相の担体、例えば滅菌又は水性の溶液、製薬上許容しうる担体、懸濁液又は乳液と組み合わせることができる。非水性溶媒の例はプロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール及び植物油を包含する。
【０４３９】
より具体的には、本発明の医薬組成物は経口、直腸、経鼻、局所（経皮、エアロゾル、口内及び舌下を包含）、膣内、非経腸（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を包含）及び肺内を包含する何れかの適当な経路により治療のために投与してよい。当然ながら、好ましい経路はレシピエントの状態及び年齢、及び治療すべき疾患により変動することになる。
【０４４０】
本発明において有用な延長放出製剤は、マトリックス及びコーティング組成物を含む経口用製剤であってよい。適当なマトリックス物質はワックス（例えばカルナウバ、蜜蝋、パラフィンワックス、セレシン、シェラックワックス、脂肪酸、及び脂肪アルコール）、油脂類、硬化油又は脂肪（例えば硬化ナタネ油、ヒマシ油、牛脂、ヤシ油、及びダイズ油）、及び重合体（例えばヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリエチレングリコール）を包含してよい。その他の適当なマトリックス錠剤成型用物質は微結晶セルロース、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、並びに他の担体、及び充填剤である。錠剤はまた、顆粒、コーティングされた粉末、又はペレットを含有してよい。錠剤はまた、多層であってよい。多層錠剤は活性成分が顕著に異なる薬物動態特性を有する場合に特に好ましい。場合により、最終錠剤をコーティングするか、未コーティングとしてよい。
【０４４１】
コーティング組成物は不溶性マトリックス重合体及び／又は水溶性物質を含んでよい。水溶性物質は重合体、例えばポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、又は単量体物質、例えば糖類（例えばラクトース、スクロース、フラクトース、マンニトール等）、塩類（例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等）、有機酸（例えばフマル酸、コハク酸、乳酸及び酒石酸）、及びこれらの混合物であることができる。場合により、腸溶性重合体をコーティング組成物中に配合してよい。適当な腸溶性重合体はヒドロキシプロピルメチルセルロース、アセテートスクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタレート、ポリビニルアセテートフタレート、セルロースアセテートフタレート、セルロースアセテートトリメリテート、シェラック、ゼイン、及びカルボキシル基を含有するポリメタクリレートを包含する。コーティング組成物は適当な可塑剤、例えばジエチルフタレート、シトレートエステル、ポリエチレングリコール、グリセロール、アセチル化グリセリド、アセチル化シトレートエステル、ジブチルセバセート、及びヒマシ油を添加することにより可塑化してよい。コーティング組成物はまた、充填剤を包含してよく、これは不溶性物質、例えば二酸化ケイ素、二酸化チタン、タルク、カオリン、アルミナ、でんぷん、粉末セルロース、ＭＣＣ、又はポラクリリンカリウムであることができる。コーティング組成物は有機溶媒又は水性溶媒又はそれらの混合物中の溶液又はラテックスとして適用してよい。水、低級アルコール、低級塩素化炭化水素、ケトン又はこれらの混合物のような溶媒を使用してよい。
【０４４２】
本発明の修飾ポリペプチドは種々の賦形剤を用いて製剤してよい。適当な賦形剤は微結晶セルロース（例えばＡｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０１）、ポリメタクリレート、ポリ（エチルアクリレート、メチルメタクリレート、トリメチルアンモニオエチルメタクリレートクロリド）（例えばＥｕｄｒａｇｉｔＲＳ−３０Ｄ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｋ１００Ｍ、Ｐｒｅｍｉｕｍ  ＣＲ  Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｋ１００Ｍ、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｅ５、Ｏｐａｄｒｙ(登録商標)）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トリエチルシトレート、水性エチルセルロース分散体（Ｓｕｒｅｌｅａｓｅ(登録商標)）を包含する。持続放出剤はまた、担体を含んでよく、これは、例えば溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張性付与剤及び吸収遅延剤を含むことができる。製薬上許容しうる塩、例えば無機塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、又は硫酸塩、並びに有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、又は安息香酸塩もまたこれらの持続放出剤中で使用できる。組成物はまた、液体、例えば水、食塩水、グリセロール、及びエタノール、並びに浸潤剤、乳化剤、又はｐＨ緩衝剤のような物質も含有してよい。リポソームもまた担体として使用してよい。
【０４４３】
経皮用製剤を介した投与は当該分野で知られた方法、例えば一般的には参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，１８６，９３８号及び第６，１８３，７７０号、第４，８６１，８００号、第６，７４３，２１１号、第６，９４５，９５２号、第４，２８４，４４４号及びＷＯ  ８９／０９０５１号に記載されているものを用いて実施できる。経皮パッチは吸収に問題のあるポリペプチドの場合の特に有用な実施形態である。パッチは１２時間、２４時間、３日間、及び７日間に渡って皮膚浸透性の活性成分の放出を制御するために作成できる。１つの実施形態においては、本発明のポリペプチドの２倍の一日当たり過剰量を非揮発性流体中に入れる。本発明の組成物は粘稠な非揮発性の液体の形態で提供される。特定の製剤の皮膚を経由する浸透は当該分野の標準的な方法により計測してよい（例えばＦｒａｎｚら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．６４：１９４−１９５（１９７５））。適当なパッチの例は受動転移皮膚パッチ、イオントフォレシス皮膚パッチ、又はＮｉｃｏｄｅｒｍのようなマイクロニードルを有するパッチである。
【０４４４】
他の実施形態において、組成物は鼻内、口内、又は舌下の経路により脳に送達することにより、ＣＮＳ内への嗅覚系通過を介した活性剤の通過、及び全身投与の低減を可能にしてよい。この経路の投与のために一般的に使用される装置は米国特許第６，７１５，４８５号に包含されている。この経路を経由して送達される組成物は増大したＣＮＳ用量又は低減した全身負荷を可能とし、これにより、特定の薬剤に伴う全身毒性の危険性が低減される。皮下移植可能な装置の送達のための医薬組成物の調製は当該分野で知られた方法、例えば米国特許第３，９９２，５１８号；第５，６６０，８４８号及び第５，７５６，１１５号に記載されたものを用いて実施できる。
【０４４５】
浸透圧ポンプは錠剤、丸薬、カプセル又は移植可能な装置の形態の持続放出剤として使用してよい。浸透圧ポンプは当該分野で良く知られており、そして延長放出薬物送達のための浸透圧ポンプの提供を専門としている企業から当業者が容易に入手できる。例としてはＡＬＺＡのＤＵＲＯＳ（商標）；ＡＬＺＡのＯＲＯＳ（商標）；Ｏｓｍｏｔｉｃａ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌのＯｓｍｏｄｅｘ（商標）システム；Ｓｈｉｒｅ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＥｎＳｏＴｒｏｌ（商標）システム；及びＡｌｚｅｔ（商標）が挙げられる。浸透圧ポンプの技術を記載している特許は参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８９０，９１８号；第６，８３８，０９３号；第６，８１４，９７９号；第６，７１３，０８６号；第６，５３４，０９０号；第６，５１４，５３２号；第６，３６１，７９６号；第６，３５２，７２１号；第６，２９４，２０１号；第６，２８４，２７６号；第６，１１０，４９８号；第５，５７３，７７６号；第４，２００，０９８４号；及び第４，０８８，８６４号である。当業者であれば、本発明の開示内容及びこれらの他の特許の開示内容を鑑みれば、本発明のポリペプチドの延長放出のための浸透圧ポンプを作成できることができる。
【０４４６】
シリンジポンプもまた持続放出剤として使用してよい。シリンジポンプは当該分野で知られており、容易に入手できる。そのような装置は参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，９７６，６９６号；第４，９３３，１８５号；第５，０１７，３７８号；第６，３０９，３７０号；第６，２５４，５７３号；第４，４３５，１７３号；第４，３９８，９０８号；第６，５７２，５８５号；第５，２９８，０２２号；第５，１７６，５０２号；第５，４９２，５３４号；第５，３１８，５４０号；及び第４，９８８，３３７号に記載されている。当業者であれば、本発明の開示内容及びこれらの他の特許の開示内容を鑑みれば、本発明のポリペプチドの延長放出のためのシリンジポンプを作成できることができる。
【０４４７】
別の実施形態においては、本発明の修飾ポリペプチドはリポソーム中にカプセル化され、これは延長された期間に渡り、制御された態様において有利な活性剤を送達する場合に有用であることが分かっている。リポソームは捕獲された水性の堆積を含有する閉鎖された二層の膜である。リポソームはまた、単一の膜の二層を保有するユニラメラ小胞又は水性の層により各々が次のものと分離されている多数の膜の二層を有するマルチラメラ小胞であってよい。結果として生じる膜二層の構造は、脂質の疎水性（非極性）のテール部が二層の中心に向けて方向付けられているのに対し、親水性（極性）のヘッド部は水相に向けて方向付けられているものとなる。１つの実施形態において、リポソームは単核貪食細胞系の臓器、主に肝臓及び脾臓による取り込みを回避する可撓性の水溶性重合体でコーティングしてよい。リポソームを包囲するための適当な親水性重合体は、限定しないが、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース  ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミド及び参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，３１６，０２４号；第６，１２６，９６６号；第６，０５６，９７３号；第６，０４３，０９４号に記載されている親水性ペプチド配列を包含する。
【０４４８】
リポソームは当該分野で知られた何れかの脂質又は脂質の組み合わせを含んでよい。例えば、小胞形成脂質は天然に存在する、又は合成の脂質、例えばリン脂質、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、及び米国特許第６，０５６，９７３号及び第５，８７４，１０４号に開示されているスフィンゴミエリンであってよい。小胞形成脂質はまた、糖脂質、セレブロシド、又はカチオン性脂質、例えば１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ−［１−（２，３，−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；Ｎ−［１［（２，３，−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；３［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；又は米国特許第６，０５６，９７３号に開示されているジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）であってよい。コレステロールはまた米国特許第５，９１６，５８８号及び第５，８７４，１０４号に開示されている小胞に安定性を付与する適切な範囲で存在してよい。
【０４４９】
リポソームはまた当該分野で良く知られており、そして延長放出薬物送達のためのリポソームを提供する専門の企業から容易に入手できる。例えば静脈内薬物送達のためのＡＬＺＡ（前の社名Ｓｅｑｕｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ’）のＳＴＥＡＬＴＨ（商標）リポソーム技術は免疫系による認識を免れるためのリポソーム上のポリエチレングリコールコーティングを使用しており；Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（前の社名Ｎｅｘｓｔａｒ’ｓ）のリポソーム技術はＡｍＢｉｓｏｍｅ（商標）に組み込まれ、そしてＦＤＡが真菌感染症の治療を認可しており；そしてＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．は商品名ＣＯＡＴＳＯＭＥ（商標）及びＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（商標）の下にＧＭＰ等級のリン脂質、リン脂質誘導体及びＰＥＧ−リン脂質の広範な種類を提供している。
【０４５０】
その他の可能なリポソーム技術は参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７５９，０５７；第６，４０６，７１３号；第６，３５２，７１６号；第６，３１６，０２４号；第６，２９４，１９１号；第６，１２６，９６６号；第６，０５６，９７３号；第６，０４３，０９４号；第５，９６５，１５６号；第５，９１６，５８８号；第５，８７４，１０４号；第５，２１５，６８０号及び第４，６８４，４７９号に記載されている。これらはリポソーム及び脂質コーティング微小気泡及びそれらの製造方法を記載している。即ち、当業者であれば、本発明の開示内容及びこれらの他の特許の開示内容を鑑みれば、本発明のポリペプチドの延長放出のためのリポソームを作成できることができる。
【０４５１】
本発明の組成物の投与による治療に適する疾患は例えば限定しないが、癌、炎症性疾患、関節炎、骨粗鬆症、感染症、特に肝炎、細菌感染症、ウィルス感染症、遺伝子疾患、肺疾患、糖尿病、ホルモン関連疾患、アルツハイマー病、心臓疾患、心筋梗塞、深静脈血栓症、循環系の疾患、高血圧、低血圧、アレルギー、疼痛緩和、小人症及び他の成長障害、中毒、ブロット凝固疾患、先天免疫系の疾患、塞栓症、創傷治癒、熱傷の治癒、クローン病、喘息、潰瘍、敗血症、緑内障、脳血管虚血、呼吸窮迫症候群、角膜潰瘍、腎疾患、糖尿病性足部潰瘍、貧血、第ＩＸ因子不全、第ＶＩＩＩ因子不全、第ＶＩＩ因子不全、粘液症、嚥下障害、血小板障害、肺塞栓、不妊、性機能低下症、白血球減少症、好中球減少症、子宮内膜症、ゴーシェ病、肥満、リソソーム貯留疾患、エイズ、月経前症候群、ターナー症候群、悪液質、筋ジストロフィー、ハンチントン病、腸炎、ＳＡＲＳ、カポジ肉腫、肝腫瘍、乳癌、神経膠腫、非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病；ヘアリー細胞白血病；腎細胞癌；肝腫瘍；リンパ腫；黒色腫、多発性硬化症、カポジ肉腫、乳頭腫ウィルス、気腫、気管支炎、歯周病、痴呆症、分娩、非小細胞肺癌、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、先端巨大症、乾癬、卵巣腫瘍、ファブリー病、リソソーム貯留疾患を包含する。
【０４５２】
何れかの薬剤（タンパク質又はレポーター剤又はその他）の分泌半減期を微調整する能力及び組織分布をモジュレートする能力はＰＥＴ画像化、超音波、ＮＭＲ、コンピューター断層撮影、又は放射線核種画像化のようなインビボの診断用途のために特に有利である。即ち、本発明の組成物は画像化剤を形成するためにも使用できる。例は胃腸画像化用の剤、心筋灌流画像化剤、ＭＲＩ画像化剤、ガドリニウムキレート、心臓壁運動異常用及び他の超音波用途の超音波用剤、又はコントラスト増強コンピューター断層撮影用の試薬である。
【０４５３】
修飾ポリペプチドの製造の最適化
更にまた、本発明のアクセサリーポリペプチドは発現の間の向上した折り畳み又は精製を可能にする追加的配列を含んでよい。この考え方は一般的に図３２に示す。例えば、アクセサリーポリペプチドは精製を容易にするためにアフィニティー又は可溶性タグに連結してよい。非限定的な例はＨｉｓタグ、ＦＬＡＧ、Ｓｔｒｅｐｔａｇ  ＩＩ、ＨＡタグ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、ｃ−ｍｙｃ、Ｔ７タグ、Ｓタグ、エラスチン様ペプチド、キチン結合ドメイン、チオレドキシン、キシラナーゼ１０Ａ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＮｕｓＡ、及びセルロース結合タンパク質を包含する。
【０４５４】
アクセサリーポリペプチドポリペプチドはまた、プロテアーゼ切断部位又は修飾ポリペプチドを発現後に切断可能とする他の配列を含んでよい。そのような部位は修飾ポリペプチド内部の何処かに位置してよい。例えばプロテアーゼ切断部位は、アフィニティータグがプロテアーゼ処理により除去されるように、溶解性を向上させる配列とアフィニティータグを含む別の配列との間に導入してよい。或いは、切断部位は、特定のプロテアーゼが全アクセサリーポリペプチド配列を切断除去するように、生物学的に活性なタンパク質とアクセサリーポリペプチドの間に位置させてよい。タンパク質を切断するための種々の酵素的方法が知られている。そのような方法はエンテロキナーゼ（ＤＤＤＫ）、第Ｘａ因子（ＩＤＧＲ）、トロンビン（ＬＶＰＲ／ＧＳ）、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）ＬＥＶＬＦＱ／ＧＰ）、ＴＥＶプロテアーゼ（ＥＱＬＹＦＱ／Ｇ）、３Ｃプロテアーゼ（ＥＴＬＦＱ／ＧＰ）、ソルターゼＡ（ＬＰＥＴ／Ｇ）、グランザイムＢ（Ｄ／Ｘ、Ｎ／Ｘ、Ｍ／Ｎ又はＳ／Ｘ）、インテイン、ＳＵＭＯ、ＤＡＰａｓｅ（ＴＡＧＺｙｍｅ（商標））、エアロモナスアミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼＭ、及びカルボキシペプチダーゼＡ及びＢを包含する。追加的な方法はＡｒｎａｕらＰｒｏｔ  Ｅｘｐｒ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆ（２００６）４８，１−１３に開示されている。
【０４５５】
タンパク質発現の分析
発現されたタンパク質の活性は正しい折り畳みの程度を確認するために計測してよい。そのような試験は発現された特定の修飾ポリペプチドに応じて当該分野で良く知られている。そのような試験は細胞系の試験、例えば増殖、細胞死、アポトーシス及び細胞遊走に関する試験を包含してよい。他の可能な試験は発現されたポリペプチドの受容体結合を測定してよく、その場合、試験は可溶性の受容体分子を含んでよく、或いは細胞発現受容体への結合を測定してよい。更にまた、フローサイトメトリー又は表面プラズモン共鳴のような手法を使用して結合事象を検出できる。特定のインビボの生物学的試験を用いることにより本発明の各生物学的に活性なポリペプチドの活性を試験してよい。例えばｈＧＨの特性は、ＥＳＴＡバイオアッセイを用いるか、又は代替としてｒｈＧＨ誘導用量関連体重増加及び骨成長、又は受容体結合を計測することにより測定してよい。追加的な方法はＤａｔｔａｎｉ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９６）Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ，４６：６４−７３；Ａｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら（１９９８）Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，６５：１８３−９０；Ｃｌａｒｋ，Ｒ．ら（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７１：２１９６９−７７；Ｃｌａｒｇ  ＲＧ  ら（１９９６）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１３７：４３０８−１５に開示されている。．
発現されたタンパク質の物理的特性を計測するための特定の試験を以下に記載する。タンパク質凝集、折り畳み状態、融解特性、夾雑物含有及び水分量のような特性を測定するための種々の方法が当該分野で知られており、そして本発明に適用してよい。そのような方法は、分析用遠心分離、ＥＰＲ、ＨＰＬＣイオン交換、ＨＰＬＣサイズ排除、ＨＰＬＣ逆相、光散乱、毛細血管電気泳動、円偏光二色性、示差走査熱量分析、蛍光、ＨＰＬＣイオン交換、ＨＰＬＣサイズ排除、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマンスペクトル分析、屈折率測定法、及びＵＶ／可視スペクトル分析を包含する。追加的な方法はＡｒｎａｕらＰｒｏｔ  Ｅｘｐｒ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆ（２００６）４８，１−１３に開示されている。これらの方法の本発明への適用は当業者の知る通りである。
【０４５６】
より特記すれば、本発明の発現されたポリペプチドの細胞局在化は上記した方法の何れかにより測定できる。例えば、目的のポリペプチドを発現している細胞から得られた粗製の溶解物を遠心分離することにより、封入体内の不溶性タンパク質からサイトゾル画分中の可溶性の発現されたタンパク質を分離してよい。所望により、可溶性（サイトゾル性）及び不溶性（封入体）の画分を、次に、ウエスタンブロット又は同様の手法により分析することにより、可溶性ｖｓ不溶性タンパク質の発現の比を測定できる。
【０４５７】
溶解物中の可溶性タンパク質はアニオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィーのような手法、分取用又は分析用に適用できる手法により更に精製してよい（図３５〜３９、４７、４８、５０及び５１）。最終生成物の純度の確認はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ例えば逆相又はサイズ排除）又は質量スペクトル分析のような当該分野で知られた手法により得てよい。精製工程はアフィニティー／可溶性タグ及び／又はアクセサリーポリペプチド、又は両方を除去するプロテアーゼ切断工程の前又は後であってよい。上記した方法の何れかによるそれ以上の精製工程が、例えば消化混合物から使用したプロテアーゼを除去するために必要である場合がある。そのような工程は当該分野で良く知られている。いくつかのそのような方法はまた、実施例のセクションにおいてより詳細に説明する。
【０４５８】
ｒＰＥＧ融合タンパク質の製剤、薬物動態、及び投与
本発明はまた対象への投与のための組成物及びｒＰＥＧ融合タンパク質を操作する方法に関する。逆平行の方向において同じ配列の別のコピーに結合する会合ペプチド、例えばＳＫＶＩＬＦ（Ｅ）又はＲＡＲＡＤＡＤＡを図８８ａ〜８８ｃに示すようにプロドラッグを作成するために使用できる。１つの実施形態において、薬剤は製造の最終段階でプロテアーゼ切断されるが、会合ペプチドにより２つの鎖がなお会合しているため、切断が薬剤を活性化することはない。薬剤が対象中に注入され、そして濃度が大きく低下した場合のみ、小型の非ｒＰＥＧ含有タンパク質鎖が親和性に依存した速度で複合体を離れ、そして恐らくは腎臓を介して浄化され、これによりｒＰＥＧ含有薬剤モジュールが活性化される。
【０４５９】
別の実施形態においては、ｒＰＥＧ５０はタンパク質分解部位を含有し、そしてタンパク質分解切断が製造された単鎖タンパク質を２つのタンパク質鎖の複合体に変換する（図８９ａ〜８９ｃ）。この切断は対象への注入の前の最終製造工程において行うことができ、或いは、それは対象内に存在するプロテアーゼにより対象中に注入した後に起こることができる。
【０４６０】
別の実施形態は同一の受容体ドメイン又は同じ結合機能を有するドメイン、又は同じ標的に同時に結合できるドメインによりフランキングされたｒＰＥＧを包含する（図９４ａ〜９４ｃ）。両方の受容体が同時に標的に結合できる場合、１つの受容体の結合が第２の受容体の結合を安定化させ、複合体の相互安定化をもたらし、これにより見かけの親和性（アビディティ）は典型的には１０〜１００倍、ただし少なくとも３倍増大し、その際、ｒＰＥＧは受容体の有効濃度を増大させる結合価架橋として作用する（図９４ｂ）。１つの実施形態において、ｒＰＥＧ産物はリガンドに予備ロードされる（図９４ｃ）。対象に投与されると、注入された産物はそれがリガンドに結合した状態で残存する限り不活性である。リガンドが解離すれば、それは腎により急速に浄化され、生成物の活性化がもたらされ、これはｒＰＥＧテール部に起因する長い半減期を有する。この手順は最高用量毒性及び受容体媒介クリアランスを低減し、これにより図９９に示す通り血清中分泌半減期を延長する。
【０４６１】
図９４に示す通り、一部のプロドラッグフォーマットは切断又は他の活性化部位を必要としない。単一のタンパク質鎖はｒＰＥＧにより分離される薬剤モジュール２つ以上を含有できる。これらのモジュールは単一の型、又は２つ以上の異なる型のものであることができる。このｒＰＥＧ含有産物は第２の相補タンパク質と複合体形成することにより、受容体−リガンド−受容体相互作用を生じる。このフォーマットにおいて、リガンドは２量体又は多量体であってよいが、特に２つのモジュールが異なっている場合には単量体であってもよい。両方のモジュールが第３のタンパク質に結合する。Ｘ及びＹは同じか又は異なっていることができ、そしてＸ及びＹは薬剤モジュールであるか、又は薬剤モジュールに結合することができる。図９４ａ〜９４ｃにおける各々の場合において、Ｘ及びＹ（及びｒＰＥＧ）は１つのタンパク質鎖を含み、そしてそれらが結合する分子は別個の分子、典型的にはタンパク質又は小分子である。単一のタンパク質鎖中に組み合わせられた２つより多い結合タンパク質を有することが可能である。
【０４６２】
薬剤は治療用量より高値であるが、毒性用量より低値である濃度において維持されることが治療においては一般的に望ましい。半減期の短い薬剤の典型的な瞬時注射（ＩＶ、ＩＭ、ＳＣ、ＩＰ又は類似）は毒性用量よりも遙かに高値の最高濃度をもたらし、その後は、薬剤濃度を治療用量未満まで急速に低下させる排出相となる。図１００はｒＰＥＧに連結した薬剤と比較した場合の薬剤単独の静脈内注射後の経時的な薬剤濃度変化を示す。薬剤単独では僅か短時間のみ治療濃度で存在している（青線）。薬剤にｒＰＥＧを添加したところ、ピーク濃度が低下し、そしてこれにより毒性が低下し、そして薬剤が治療的な非毒性の用量で存在する期間が延長される。ｒＰＥＧ＋薬剤結合タンパク質の添加によるプロドラッグの形成は、薬剤が数時間に渡って徐々に活性化されるのみであり、そして毒性用量と治療用量の間の時間の長さが他のフォーマットと比較して延長されているため、「バースト放出」又は毒性最高用量（赤線）が防止できる。
【０４６３】
別の実施形態において、ｒＰＥＧ融合産物は対象への投与の前に切断されるか、又は不活性なプロドラッグとして投与される（即ち対象への投与の後に切断され、そしてインビボで活性化される）。プロセスは図９６ａ〜９６ｈに示す通りである。薬剤の不活性化は、全３モジュールが単一のタンパク質鎖として製造されるように、ｒＰＥＧにより薬剤に連結されている結合タンパク質により媒介される。薬剤が受容体の場合、結合タンパク質はその受容体のリガンドであってよく；薬剤が抗体フラグメントである場合は、結合部位は抗原であってよい。これらの例においては、薬剤は本明細書においてはＸ及びＹと称する２つの結合ドメインの間の部位のプロテアーゼ切断により活性化される。タンパク質Ｙが活性な産物である場合は、ＹはｒＰＥＧを保持しており、そしてプロテアーゼ切断部位はＸに近接している必要がある。タンパク質Ｙが活性な産物である場合は、ＸはｒＰＥＧを保持しており、そして切断部位はＹに近接している。青色の横断線で示す通り１つ又は多数の切断部位が存在できる（図９６ａ〜９６ｇ）。薬剤モジュールは例えば限定しないが、受容体、リガンド、１つ以上のＩｇドメイン、抗体フラグメント、ペプチド、マイクロタンパク質、又は抗体に対するエピトープを包含する。薬剤モジュールに結合するタンパク質は、例えば限定しないが、結合タンパク質、受容体、リガンド、１つ以上のＩｇドメイン、抗体フラグメント、ペプチド、マイクロタンパク質、又は抗体に対するエピトープを包含する。図１０５及び１０６は対象の血清中に存在するか、対象内に投与前に与えられている、部位特異的プロテアーゼによる不活性タンパク質（即ちプロドラッグ）から活性タンパク質（即ち活性なペプチド又はｄＡｂ又はｓｃＦｖ）への変換を示している。
【０４６４】
別の実施形態は薬剤モジュールへの結合ペプチドの添加により形成された不活性のプロドラッグを説明している（図９７）。ペプチドは薬剤の標的結合能力を中和し、そしてペプチドは、ｒＰＥＧ含有薬剤よりも速い速度で、プロドラッグを投与された対象の系から、徐々に浄化される。そのようなペプチドは天然物であるか、又は薬剤モジュールに対するランダムペプチドライブラリのファージパニングにより得られる。ペプチドは好ましくは合成により作成されるが、組み換えペプチドであることもできる。
【０４６５】
単鎖タンパク質薬剤はまた、多数の生物活性ペプチドを含有してよく、これはｒＰＥＧの同じ末端に、又はｒＰＥＧの反対側の末端にあることができる（図９８）。ペプチドは同じ活性又は異なる活性を有することができる。単鎖内に多数のペプチドを有することは、製造を複雑化させることなく結合アビディティを介してそれらの有効力価を上昇させる。
【実施例】
【０４６６】
実施例１：アクセサリーポリペプチドに融合させたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の設計
本実施例は増大した活性な細胞質収率を伴い、そして向上した血清中半減期を有するｒＰＥＧ−ｈＧＨ融合タンパク質の調製を記載する。ヒト成長ホルモン産物は、ｈＧＨの血清中の半減期が僅か約３０分であることから、典型的には毎日、又は一日２回の注入を必要とする。ＰＥＧ化を介した半減期の延長は、ｈＧＨが治療活性のために必要なリジン多数を含有しており、そしてこれらがコンジュゲーションに使用できないことから、現実的ではない。ｈＧＨは典型的にはそれが凝集して不活性タンパク質を含有する封入体を形成できるＥ．ｃｏｌｉの細胞質中の発現により製造さる。典型的にはこれらの封入体は可溶化され、そしてタンパク質が折り畳まれることにより活性なタンパク質が得られる。本実施例においては、ｒＰＥＧ−ｈＧＨを可溶性及び活性な形態において細胞質中で発現させることにより、封入体からの再折り畳みの工程を回避する。
【０４６７】
本実験において使用するｈＧＨのアミノ酸配列は以下の通りである。
【０４６８】
【化１】
2010536341.tif 000021
ｈＧＨは１９１アミノ酸を含有し、ｐＩは５．２７であり、分子量は２２．１３０ｋＤである。ｈＧＨは１３グルタメート残基、１１アスパルテート残基（２４の総負荷電残基）、８リジン残基及び１１アルギニン残基（１９の総正荷電残基）を含有し、正味荷電は−５であり、そして正味荷電密度は−０．０２６（−５／１９１アミノ酸として計算）である。正味荷電密度は５．２７の実験ｐＩ値と相関している。
【０４６９】
種々のｈＧＨ−ｒＰＥＧ融合タンパク質を以下の通り設計する。
【０４７０】
設計１．正味荷電密度−０．１のｒＰＥＧ修飾ｈＧＨの構築
本設計は短い長さのアクセサリーポリペプチド及び正味荷電密度−０．１で修飾ポリペプチドを記載する。
【０４７１】
本設計の目標は数個のアミノ酸を付加して正味荷電密度−０．１を有するタンパク質を生成することである。−０．１の電荷密度を有するｈＧＨタンパク質を作成するために必要な電荷の数は、付加した荷電アミノ酸から生じる合計の長さの増大を考慮しなければ１４．１（１９．１−５＝１４．１）である。１６の負荷電アミノ酸の付加は修飾されたｈＧＨポリペプチドの正味荷電密度を−０．１とする（（１６＋５）／（１９１＋１６）アミノ酸として計算）。
【０４７２】
設計２．正味荷電密度−０．２のｒＰＥＧ修飾されたｈＧＨの構築。
【０４７３】
本設計は短い長さのアクセサリーポリペプチド及び正味荷電密度−０．２で修飾ポリペプチドを記載する。
【０４７４】
本設計は全ポリペプチド中合計４６の組み合わせられた負荷電のアミノ酸残基について、４１負電荷を有するアクセサリータンパク質を組み込んでいる。修飾ポリペプチドの総長は２３２アミノ酸（１９１＋４１アミノ酸として計算）。結果として−０．２の電荷密度は４６の負荷電アミノ酸残基（０．２ｘ２３２  アミノ酸として計算）を必要とし、このことはアクセサリータンパク質が４１の負荷電残基を含有することを意味する（４６−５として計算）。
【０４７５】
設計３．正味荷電密度＋０．１を有するｒＰＥＧ修飾ｈＧＨの構築。
【０４７６】
本設計は短い長さのアクセサリーポリペプチド及び＋０．１の正味荷電密度で修飾ポリペプチドを記載する。
【０４７７】
正荷電アミノ酸を有するアクセサリータンパク質は正味荷電密度＋０．１を達成するように設計できる。この融合タンパク質は実質正電荷＋２２を包含し、これは２７の正荷電（２７−５＝２２アミノ酸として計算）を含有するアクセサリータンパク質を付加することにより達成でき、これにより合わせたポリペプチド長は２８７アミノ酸となる（１９１＋２７アミノ酸として計算）。
【０４７８】
設計４．ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８−ＧＦＰ、ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８−ｈＧＨ及びｒＰＥＧ＿Ｊ２８８−ＧＬＰ１修飾ポリペプチドの構築
本設計は１６．６％のグルタメート残基を含む２８８アミノ酸の長い親水性のアクセサリーポリペプチドで修飾したポリペプチドを記載する。
【０４７９】
ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８は配列（ＧＧＳＧＧＥ）４８を有し、そして４８のＥ残基を含有する（図１７）。ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８をｈＧＨに付加すれば、修飾ポリペプチドの長さは４７９アミノ酸（１９１＋２８８として計算）となり、そして正味荷電は５３（４８＋５として計算）となり、これにより正味荷電密度（５３／４７９＝０．１１として計算）となる。この設計においてはアクセサリーポリペプチド自身は多くのグリシン及びセリン残基の存在のために正味荷電密度１６％を有するのに対し、設計１においてはアクセサリーポリペプチドは完全に荷電残基よりなる。実験の結果が示している通り、この設計は高度に可溶性で活性なポリペプチドをもたらす。正味荷電密度−０．１１は、セリン及び／又はグリシンの付加により電荷が拡散していればタンパク質を溶液中に維持するために十分であると考えられる。
【０４８０】
本実施例は１４４アミノ酸のアクセサリーポリペプチド及び配列（ＧＧＳＧＧＥ）４８をコードする融合遺伝子の構築を記載する。スタッファーベクターｐＣＷ００５１は図１６に示す通り構築する。ｐＣＷ００５１における発現カセットの配列は図１８に示す。インサートは本質的にはｒＰＥＧ＿Ｌ２８８に関して後述するとおり得られるが、ここではアダプターをコードするオリゴヌクレオチドの対を有するｒＰＥＧ配列ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８（図１１）をコードする合成オリゴヌクレオチドをＫｐｎＩ部位にアニーリングする。以下のオリゴヌクレオチドをフォワード及びリバースプライマーとして使用する。
【０４８１】
【化２】
2010536341.tif 000022
以下のオリゴヌクレオチドをストッパープライマーとして使用する。
【０４８２】
【化３】
2010536341.tif 000023
フォワード／リバースプライマーのストッパープライマーに対する比を変動させることにより、結果として生じるＰＣＲ産物の大きさを制御できる。ｒＰＥＧ＿Ｌ２８８修飾ＧＦＰと同様の態様において、インサートを使用することによりｒＰＥＧ＿Ｊ２８８修飾ＧＦＰをコードするプラスミド及びこのプラスミドを発現する細胞を形成した（図１０）。同様のインサートを用いることによりｒＰＥＧ＿Ｌ２８８修飾ＧＦＰと同様の態様においてｒＰＥＧ＿Ｊ２８８修飾ｈＧＨ及びｒＰＥＧ＿Ｊ２８８修飾ＧＬＰ１をコードするプラスミド及びこのプラスミドを発現する細胞を形成した（図１２）。
【０４８３】
ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８修飾ＧＦＰの純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３６）、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（図３７参照）、質量スペクトル分析（図３９）により確認した。ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８修飾ＧＦＰの見かけの分子量はまた、前述の通り計測した（図４１）。図４９はｒＰＥＧ＿Ｊ２８８アクセサリーポリペプチドに生物学的活性ポリペプチド（ＧＬＰ１）を連結させた場合に観察された見かけの分子量の増大を示す。インビボ実験においてほとんど免疫原性がないことがこのポリペプチドで観察された（図４４）。
【０４８４】
設計５．ｒＰＥＧ＿Ｌ２８８−ＧＦＰ、ｒＰＥＧ＿Ｌ２８８−ｈＧＨ及びｒＰＥＧ＿Ｌ２８８−ＧＬＰ１修飾ポリペプチドの構築
本設計は２８８アミノ酸の長い親水性のアクセサリーポリペプチドで修飾され、そして２５％のグルタメート残基を含むポリペプチドを記載する。ｒＰＥＧ＿Ｌ２８８は配列（ＳＳＥＳＳＳＳＥＳＳＳＥ）２４を有し、そして７２のＥ残基を含有する。ｒＰＥＧ＿Ｌ２８８をｈＧＨに付加すれば融合物の総長は４７９アミノ酸（１９１＋２８８アミノ酸として計算）となり、そして正味荷電は７７（７２＋５として計算）となり、正味荷電密度０．１６（７７／４７９アミノ酸として計算）となる。後述する実験の結果が示す通り、正味荷電密度−０．１６のこの設計は優れた溶解性を示し、タンパク質は活性であった。低温で一部ゲル形成が観察されたが、これは問題とは考えられなかった。
【０４８５】
本セクションはアクセサリーポリペプチド、２８８アミノ酸を有するｒＰＥＧ＿Ｌ２８８及び配列（ＳＳＳＥＳＳＥＳＳＳＳＥ）２４をコードするコドン最適化遺伝子の構築を記載する。ｐＥＴベクター系でありＴ７プロモーターを包含するスタッファーベクターｐＣＷ０１５０は図９に示す通り構築する。ベクターはＦｌａｇ配列とそれに後続するＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、及びＫｐｎＩ部位でフランキングされたスタッファー配列をコードする。スタッファー配列にはＨｉｓ６タグ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子を後続させた。ＧＦＰは生物学的に活性なタンパク質として選択したが、画像化用途において、或いは選択マーカーとして使用してよい。スタッファー配列は停止コドンを含有し、そしてこれによりスタッファープラスミドｐＣＷ０１５０を担持するＥ．ｃｏｌｉ細胞は非蛍光コロニーを形成する。スタッファーベクターｐＣＷ０１５０はＢｓａＩ及びＫｐｎＩで消化した。３６アミノ酸長のアクセサリーポリペプチドをコードするコドンライブラリを構築した。アクセサリーポリペプチドはｒＰＥＧ＿Ｌ３６と命名し、そしてアミノ酸配列（ＳＳＳＥＳＳＥＳＳＳＳＥ）３を有していた。アミノ酸配列ＳＳＥＳＳＥＳＳＳＳＥＳをコードする合成オリゴヌクレオチド対並びにＫｐｎＩ部位に対するアダプターをコードするオリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによりインサートを得た。以下のオリゴヌクレオチドをフォワード及びリバースプライマーとして使用した。
【０４８６】
【化４】
2010536341.tif 000024
以下のオリゴヌクレオチドをストッパープライマーとして使用する。
【０４８７】
【化５】
2010536341.tif 000025
フォワード／リバースプライマーのストッパープライマーに対する比を変動させることにより、結果として生じるＰＣＲ産物の大きさを制御できる。アニーリングされたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、これにより多様な数の（ＳＳＳＥＳＳＥＳＳＳＳＥ）リピートを示す多様な長さの産物の混合物が得られた。ｒＰＥＧ＿Ｌ３６の長さに相当する産物をアガロースゲル電気泳動により混合物から単離し、そしてＢｓａＩ／ＫｐｎＩ消化スタッファーベクターｐＣＷ０１５０内にライゲーションした。ベクターにより形質転換された細胞は導入後に緑色蛍光を呈し、これはｒＰＥＧ＿Ｌ３６の配列がＧＦＰ遺伝子とインフレームにライゲーションされていることを示す。得られたライブラリはＬＣＷ０１４８と命名した。ライブラリＬＣＷ０１４８に由来する単離株（例えば３１２単離株）を高レベルの蛍光に関してスクリーニングした。強い蛍光を有していた単離株（例えば７０単離株）をＰＣＲで分析することによりｒＰＥＧ＿Ｌセグメントの長さを確認したところ、ｒＰＥＧ＿Ｌ３６の予測長を有していた３４クローンが識別された。このプロセスにより高発現を示し、そして自身のコドンの使用において異なっているｒＰＥＧ＿Ｌ３６の３４単離株の収集物が得られた。プラスミド混合物をＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化し、そしてｒＰＥＧ＿Ｌ３６配列及び一部のＧＦＰを含むフラグメントを単離した。同じプラスミド混合物を同様にＢｂｓＩ／ＮｃｏＩで消化し、そしてｒＰＥＧ＿Ｌ３６、プラスミドベクターの大部分、及びＧＦＰ遺伝子の残余を含むベクターフラグメントを単離した。両方のフラグメントを混合し、ライゲーションし、そしてＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）内に形質転換し、そして単離株を蛍光に関してスクリーニングした。２量体化のこのプロセスをあと２回反復した。各回中、ｒＰＥＧ＿Ｌ遺伝子の長さは二倍になり、そして最終的にはｒＰＥＧ＿Ｌ２８８をコードする遺伝子の収集物が得られた。ｒＰＥＧ＿Ｌ２８８モジュールは同じアミノ酸配列を有しているにもかかわらずそのヌクレオチド配列において異なるｒＰＥＧ＿Ｌ３６のセグメントを含有している。即ち、遺伝子の内部相同性は最小限となり、そしてその結果自発的組み換えの危険が低減される。ｒＰＥＧ＿Ｌ２８８をコードするプラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）を少なくとも２０の二倍化となるまで培養したところ、自発的組み換えは観察されなかった。
【０４８８】
ｒＰＥＧ＿Ｌ２８８をコードするプラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞をＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）中で位置や生育させ、そして翌日新しいＴＢ中に２００倍希釈した。培養物がＡ６００ｎｍ＝０．６に達した時点で、０．２ｍＭ終濃度となるようにＩＰＴＧを添加することによりｒＰＥＧ＿Ｌ２８８−ＧＦＰの発現を誘導した。２６℃で１８時間後、細胞を採取し、そして更にプロセシングするまで−８０℃で保存することができる。細胞を細菌培養物リットル当たり９０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、１０％グリセロール，ｐＨ  ８．０中に再懸濁した。プロテアーゼ阻害剤、リソザイム（終濃度２０μｇ／ｍｌ）、及びベンゾナーゼヌクレアーゼを細菌懸濁液に添加した後に、細胞溶解した。細胞は４分間氷上の超音波処理とそれに後続する２０分８０℃の熱処理により溶解した。溶解物はその後氷上で冷却し、そしてＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ−３４ローター中１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。可溶性の組み換え体タンパク質は、上澄みの固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）及びゲル濾過クロマトグラフィーによりタンパク質を更に精製した。場合により、標準的な手法を用いて固定化抗ＦＬＡＧ抗体を有するカラムによりタンパク質を更に精製できる。タンパク質の純度及び均質性はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ネイティブ−ＰＡＧＥ、分析用ゲル濾過クロマトグラフィー、光散乱、及び質量スペクトル分析を包含する標準的な生化学的方法を用いて評価した。少なくとも９０％の純度が得られた。更にまた、修飾ポリペプチドｒＰＥＧ＿Ｌ２８８−ｈＧＨ及びｒＰＥＧ＿Ｌ２８８−ＧＬＰ１を同様の態様において得た。
【０４８９】
ｒＰＥＧ＿Ｌ２８８修飾ＧＦＰの純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３６）、分析用逆相ＨＰＬＣ（図３８）で確認した。ｒＰＥＧ＿Ｌ２８８修飾ＧＦＰの見かけの分子量もまた前述の通り計測した（図４１）。図４９はｒＰＥＧ＿Ｌ２８８アクセサリーポリペプチドに生物学的に活性なポリペプチド（ＧＬＰ１）を連結した場合に観察された見かけの分子量の増大を示す。ラット及びヒトの血清中でのインビボの安定性は図４２に示す通り測定した。ｒＰＥＧはラット及びヒトの血清中で安定であり、そしてｒＰＥＧ２８８はラットにおいて約１０〜２０時間の半減期を有していた（図４３）。インビボ実験においてほとんど免疫原性がないことがこのポリペプチドで観察された（図４４）。
【０４９０】
設計６．ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ＧＦＰ、ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ｈＧＨ及びｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ＧＬＰ１アクセサリーポリペプチドの構築
本設計は３３％グルタメート残基を含む２８８アミノ酸の長い親水性アクセサリーポリペプチドで修飾ポリペプチドを記載する。ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８は配列（ＧＥＧＧＧＥＧＧＥ）３２を有し、そして９６Ｅ残基を含有する。ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８をｈＧＨに付加すると、融合物の総長は４７９アミノ酸（１９１＋２８８として計算）となり、そして正味荷電は１０１（９６＋５として計算）となり、正味荷電密度０．２１（１０１／４７９として計算）となる。後述する実験結果から予測及び確認された通り、正味荷電密度−０．２１を有するこの設計は最高度の溶解性を示し、タンパク質は活性であった。ゲル形成は試験した温度又は塩濃度では観察されなかった。
【０４９１】
本セクションは配列（ＧＥＧＧＧＥＧＧＥ）３２のアクセサリーポリペプチドをコードする融合遺伝子の構築を記載する。ＫｐｎＩ部位にアダプターをコードするオリゴヌクレオチドの対を有するｒＰＥＧ配列ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８をコードする合成オリゴヌクレオチドをアニーリングした以外は、本質的にはｒＰＥＧ＿Ｌ２８８に関して記載した通り、インサートを得た。以下のオリゴヌクレオチドをフォワード及びリバースプライマーとして使用した。
【０４９２】
【化６】
2010536341.tif 000026
以下のオリゴヌクレオチドをストッパープライマーとして使用した。
【０４９３】
【化７】
2010536341.tif 000027
フォワード／リバースプライマーのストッパープライマーに対する比を変動させることにより、結果として生じるＰＣＲ産物の大きさを制御できる。ｒＰＥＧ＿Ｌ２８８修飾ＧＦＰと同様の態様において、インサートを使用することによりｒＰＥＧ＿Ｋ２８８修飾ＧＦＰをコードするプラスミド及びこのプラスミドを発現する細胞を形成した。更にまた、修飾ポリペプチドｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ｈＧＨ及びｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ＧＬＰ１を同様の態様において得た。
【０４９４】
ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８修飾ＧＦＰの純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３６）、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（図３７参照）により確認した。ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８修飾ＧＦＰの見かけの分子量はまた、前述の通り計測した（図４１）。図４９はｒＰＥＧ＿Ｋ２８８アクセサリーポリペプチドに生物学的活性ポリペプチド（ＧＬＰ１）を連結させた場合に観察された見かけの分子量の増大を示す。ラット及びヒトの血清中のインビボの安定性は図４２に示す通り測定し、そしてインビボの薬物動態特性を図４３に示す。ｒＰＥＧはラット及びヒトの血清中で安定であり、そしてｒＰＥＧ２８８はラットにおいて約１０〜２０時間の半減期を有している（図４３）。インビボ実験においてほとんど免疫原性がないことがこのポリペプチドで観察された（図４４）。
【０４９５】
タンパク質発現
以下に記載する通り設計４、５及び６を構築し、そしてタンパク質を発現させ、特性化した。慨すれば、Ｔ７プロモーター及び上記したｒＰＥＧ−Ｊ、−Ｋ又はＬ（それぞれ設計４、５及び６）のコーディング配列を保有するプラスミドのｒＰＥＧ配列にｈＧＨ遺伝子を融合させ、これによりＧＦＰ遺伝子を置き換えた。本実施例においてはｒＰＥＧにはｈＧＨに関する遺伝子が後続しているが、修飾ポリペプチドのＣ末端にｒＰＥＧを有するもののような他のフォーマットも想定できる。プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）−ｓｔａｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、そして適切な抗生物質を含有するＬＢ寒天平板上にプレーティングし、そして３７℃で一夜生育させた。単コロニーを５ｍｌのＴＢ１２５培地に植菌し、３７℃で一夜生育させた。翌日、植菌物を５００ｍＬのＴＢ１２５の入った２Ｌの容器に移し、ＯＤ＝０．６に達するまで生育させ、その後１００ｍＭ  ＩＰＴＧ存在下に１６時間２６℃で継続的に生育させた。
【０４９６】
細胞を遠心分離により収集し、そして細胞ペレットを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＤＮＡｓｅを含有する５０ｍｌの緩衝液中に再懸濁した。細胞は超音波細胞粉砕機を用いて粉砕し、細胞破砕物を４℃において１５０００ＲＰＭで遠心分離することにより除去した。細胞上澄みをアニオン交換剤（Ｑ−セファロース、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用し、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８．０）で洗浄し、そして１Ｍ  ＮａＣｌを含有する同じ緩衝液の直線勾配を用いてカラムから溶離させた。タンパク質は約５００ｍＭ  ＮａＣｌで溶離した。溶離した融合タンパク質を合わせ、透析し、そしてアニオン交換剤（Ｑ−セファロース、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードし、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８．０）で洗浄し、そして１Ｍ  ＮａＣｌを含有する同じ緩衝液の弱い直線勾配を用いてカラムから溶離させた。溶離した融合タンパク質を合わせ、緩衝液Ａに対して透析し、濃縮し、そして最終精製としてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。タンパク質の純度は９８％超であると推定され、これは、イオン交換及びＳＥＣのみを用いて全細胞からｒＰＥＧ特異的態様においてタンパク質を精製したことを考えれば、予期されないことであった。溶離した融合タンパク質の量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、そして、全タンパク質濃度計測により測定した。溶離融合タンパク質量が高値であったことは、ｈＧＨ単独時に対して融合タンパク質の溶解性が高値であることを反映している。
【０４９７】
ｈＧＨ受容体結合試験におけるアクセサリーポリペプチド修飾ｈＧＨの試験
精製されたｈＧＨ−ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８がその活性で天然の配座にあるかどうかを調べるために本発明者らはヒト成長ホルモン受容体に結合するその能力を試験した。慨すれば、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解した組み換え体ｈＧＨ受容体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入）５００ｎｇを４℃で一夜マイクロプレートのウェルに吸収させた。未結合の受容体はその後、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄することにより除去した。その他の非特異的結合はＰＢＳ中１％牛血清アルブミン（結合緩衝液）を添加することによりブロックした。ＰＢＳＴで更に洗浄した後、結合緩衝液中に希釈した２００ｎＭのｈＧＨ−ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８又は組み換え体ｈＧＨ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより購入）をｈＧＨ受容体コーティングウェルに添加した。結合したｈＧＨ−ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８及びｈＧＨはポリクローナルウサギ抗ｈＧＨ抗体及びセイヨウワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ウサギ二次抗体で検出した。ＨＲＰの基質である２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）を添加し、そして４０５ｎｍにおける吸光度を３０分後に計測した。図３４に示す通り、ｈＧＨ−ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８はｈＧＨ受容体並びに組み換え体ｈＧＨに結合した。結果はｈＧＨは細胞質中でｒＰＥＧ融合タンパク質として発現されれば可溶性であり、正しく折り畳まれ、そしてその活性な配座にあることを示している。この結果は、典型的にはＥ．ｃｏｌｉの細胞質内で不活性なタンパク質よりなる封入体を形成し、そして活性になるためには開いて再度折り畳みを行う必要がある天然のヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）とは対照的である。このことは、ｈＧＨがｒＰＥＧポリペプチドに融合されればＥ．ｃｏｌｉの細胞質中において可溶性で活性な形態で発現され得ることを示している。データによれば、０．１電荷／ＡＡの正味荷電密度（ｈＧＨ−ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８を用いた場合）は融合タンパク質を可溶性とするために十分であり、ｈＧＨ−ｒＰＥＧ＿Ｌ２８８を用いて得られた０．１６の正味荷電密度はより可溶性のタンパク質をもたらし、そしてｈＧＨ−ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８を用いて得られた０．２１の正味荷電密度は同様に溶解性を向上させている。
【０４９８】
ｒＰＥＧ−Ｊ、−Ｋ及びＬ配列の代わりにそれぞれ１６負荷電アミノ酸（全３例においてグルタメート）、４１負荷電アミノ酸又は２７正荷電アミノ酸を包含した以外は同様にして設計１、２及び３を調製すれば、そして向上した溶解性特性を有することができる。
【０４９９】
アクセサリーポリペプチド配列を設計する場合、治療用タンパク質の全体的な所望の特性を考慮してよく、例えば血清中の安定性、発現レベル及び免疫原性が挙げられるが、これらは上記した通りアクセサリーポリペプチド内に取り込まれるアミノ酸の選択により影響される場合がある。
【０５００】
実施例２：ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）−切断可能なｒＰＥＧ修飾ポリペプチドの発現
本実施例は、図１３に示す通り、治療用タンパク質とアクセサリーポリペプチドの間にプロテアーゼ切断配列を有するｒＰＥＧ＿Ｋ２８８連結ヒト成長ホルモンポリペプチドの調製を記載する。アクセサリーポリペプチド部分は、活性なタンパク質は大量に容易に単離できるような程度まで組み換え体発現の間の溶解性を向上させるが、プロテアーゼ切断部位はプロテアーゼ消化によるｒＰＥＧの最適な除去を可能にする。最終タンパク質産物は純粋で活性なｈＧＨである。
【０５０１】
ｈＧＨを保有し、ｒＰＥＧ−Ｋ２８８の２８８アミノ酸にＮ末端融合され、そして反復配列（ＧＥＧＧＧＥＧＧＥ）３２及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱ／Ｘ）をＴ７プロモーターの後に有するプラスミド（即ちＴ７プロモーター−ｈＧＨ−ＴＥＶ−ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８）をＢＬ２１（ＤＥ３）−ｓｔａｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ菌株内に形質転換し、そして上記した通り生育させる。細胞を遠心分離により収集し、そして細胞ペレットを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ＝８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＤＮＡｓｅを含有する５０ｍＬの緩衝液に再懸濁する。細胞は超音波細胞粉砕機を用いて粉砕し、細胞破砕物を４℃において１５０００ＲＰＭで遠心分離することにより除去する。細胞上澄みをアニオン交換剤（Ｑ−セファロース、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用し、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８．０）で洗浄し、そして１Ｍ  ＮａＣｌを含有する同じ緩衝液の直線勾配を用いてカラムから溶離させる。タンパク質は約５００ｍＭ  ＮａＣｌで溶離する。溶離した融合タンパク質を合わせ、透析し、そしてＴＥＶ消化する。消化混合物をアニオン交換剤（Ｑ−セファロース、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に再ロードし、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８．０）で洗浄し、そして１Ｍ  ＮａＣｌを含有する同じ緩衝液の弱い直線勾配を用いてカラムから溶離させる。溶離したｈＧＨタンパク質を合わせ、緩衝液Ａに対して透析し、濃縮し、そして最終精製としてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製する。タンパク質の純度は９８％超であると推定される。
【０５０２】
実施例３：ＣＢＤ及びｒＰＥＧ＿Ｋ２８８に融合されたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の発現
本実施例はＣＢＤ−ＴＥＶ−ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ｈＧＨ融合タンパク質の調製を記載する。ＴＥＶプロテアーゼによる消化及び精製の後、最終タンパク質産物は−ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ｈＧＨとなる。
【０５０３】
Ｎ末端のセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、それに後続してトマトエッチウィルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、それに後続してｈＧＨコーディング配列及びｒＰＥＧ＿Ｋ２８８コーディング配列：ＣＢＤ−ＴＥＶ−ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ｈＧＨを含有するタンパク質を発現するｐＥＴシリーズのベクターを、Ｔ７プロモーターを用いて構築した。ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８は反復配列（ＧＥＧＧＧＥＧＧＥ）３２を有する。使用したＣＢＤ配列はスイスプロットファイルＱ０６８５１に示されており、そしてＣＢＤ融合タンパク質の精製はＯｆｉｒ，Ｋ．ら（２００５）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ５：１８０６に記載されている。ＴＥＶ切断部位の配列はＥＮＬＹＦＱ／Ｘであり；ＧをＸの位置において使用した。この構築物をＢＬ２１（ＤＥ３）−ｓｔａｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ菌株内に形質転換し、そしてＣＢＤ配列をｒＰＥＧ配列にＮ末端で導入した以外は本質的に上記した通り生育させた。細胞を収集し、本質的に上記した通り粉砕した。細胞上澄みをビーズ化セルロース樹脂（Ｐｅｒｌｏｚａ  １００）に適用し、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８．０）で洗浄し、そして２０ｍＭ  ＮａＯＨでカラムから溶離した。ｐＨは１ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ＝８．０と共に試料を再利用することにより調節した。タンパク質の純度は９０％超であると推定された。
【０５０４】
実施例２に記載した通りＴＥＶ消化を適用した後、消化した試料をビーズ化セルロース樹脂（Ｐｅｒｌｏｚａ  １００）に適用し、ここでＣＢＤをカラム上に保持させ、そしてｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ｈＧＨはカラム流出物中に観察された。合わせた流出物をアニオン交換剤（Ｑ−セファロース、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードし、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８．０）で洗浄し、そして１Ｍ  ＮａＣｌを含有する同じ緩衝液の弱い直線勾配を用いてカラムから溶離させた。溶離した融合タンパク質を合わせ、緩衝液Ａに対して透析し、濃縮し、そして最終精製としてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。タンパク質の純度は９８％超であると推定された（図５０及び５１）。最終タンパク質はｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ｈＧＨである。
【０５０５】
実施例４：ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８に融合したＣＢＤ−ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の発現
本実施例はＣＢＤ−ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ＴＥＶ−ｈＧＨ融合タンパク質の調製を記載する。ＴＥＶプロテアーゼ消化及び精製の後、最終タンパク質産物は純粋なｈＧＨである。
【０５０６】
ｈＧＨを保有し、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位に、そしてＣＢＤにＴ７プロモーターの後でＮ末端融合され、そして更に反復配列（ＧＥＧＧＧＥＧＧＥ）３２を有するｒＰＥＧ−Ｋ２８８にＣ末端融合され、その結果ＣＢＤ−ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ＴＥＶ−ｈＧＨを含有するベクターとなったプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）−ｓｔａｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ）内に形質転換し、そして本質的に実施例３に記載する通り生育させる。細胞を収集し、本質的に実施例３に記載の通り粉砕し、そして細胞上澄みをビーズ化セルロース樹脂（Ｐｅｒｌｏｚａ１００；Ｉｏｎｔｏｓｏｒｂ  Ｉｎｃ．）に適用し、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８．０）で洗浄する。本質的に実施例３に記載の通り実施したＴＥＶ消化の適用の後、ｈＧＨはカラム流出物中に観察されるのに対し、ＣＢＤ−ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８はカラム上に残存する。合わせた流出物をアニオン交換剤（Ｑ−セファロース、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードし、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８．０）で洗浄し、そして１Ｍ  ＮａＣｌを含有する同じ緩衝液の弱い直線勾配を用いてカラムから溶離させる。溶離したｈＧＨタンパク質を合わせ、緩衝液Ａに対して透析し、濃縮し、そして最終精製としてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製する。タンパク質の純度は９８％超であると推定される。最終タンパク質産物は純粋で活性なｈＧＨである。
【０５０７】
実施例５：リソザイムに結合するドメイン抗体であるｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ＶＨＨの発現
本実施例はＶＨＨドメイン抗体（ｄＡｂ）に融合したｒＰＥＧ＿Ｋ２８８の調製を記載する。
【０５０８】
ｈＧＨを保有し、ｒＰＥＧ−Ｋの２８８アミノ酸にＮ末端融合され、Ｔ７プロモーターの後に反復配列（ＧＥＧＧＧＥＧＧＥ）３２を有するプラスミドは、ｈＧＨコーディング配列をドメイン抗体コーディング配列で置き換える以外は本質的に実施例１に記載の通り調製する。ドメイン抗体コーディング配列はＤｕｍｏｕｌｉｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１：５００−５０５（２００２）に記載されている。クローンｄＡｂ−Ｌｙｓ３のアミノ酸残基１〜１１３をｒＰＥＧ構築物内に取り込む。この配列は１１ｎＭのＫｄを有するニワトリ卵リソザイムに結合するドメイン抗体である。このドメイン抗体配列は追加的な溶解性増強配列の非存在下でＥ．ｃｏｌｉの細胞質中で発現されれば不活性なタンパク質よりなる封入体のみをもたらし；或いは、それはリーダー配列によりガイドされれば細胞周辺腔中で活性型で発現させることもできる。ＶＨＨｄＡｂ配列をｒＰＥＧ＿Ｋ２８８の上流に挿入し、そして得られたプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）−ｓｔａｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に形質転換する。本質的に上記した通り、細胞を生育させ、収集し、そして粉砕する。細胞上澄みをアニオン交換剤（Ｑ−セファロース、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用し、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８．０）で洗浄し、そして１Ｍ  ＮａＣｌを含有する同じ緩衝液の直線勾配を用いてカラムから溶離させる。タンパク質は約５００ｍＭ  ＮａＣｌで溶離する。溶離した融合タンパク質を合わせ、透析し、そしてアニオン交換剤（Ｑ−セファロース、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードし、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８．０）で洗浄し、そして１Ｍ  ＮａＣｌを含有する同じ緩衝液の弱い直線勾配を用いてカラムから溶離させる。溶離した融合タンパク質を合わせ、緩衝液Ａに対して透析し、濃縮し、そして最終精製としてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製する。タンパク質の純度は９８％超であると推定される。
【０５０９】
得られたＶＨＨ−ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８タンパク質はその標的であるニワトリ卵リソザイム（Ｓｉｇｍａ）に結合する能力に関してＥＬＩＳＡにより試験する。タンパク質はリソザイムに特異的に結合するが、３つの対照タンパク質には結合せず、ＶＨＨへのｒＰＥＧ＿Ｋ２８８の付加によりＥ．ｃｏｌｉ細胞質内において可溶性かつ活性な形態でそれが発現できるようになったことを示している。
【０５１０】
実施例６：ＩＦＮａ２ａ−ｒＰＥＧの発現
本実施例はＩＦＮａ２ａ−ｒＰＥＧ融合タンパク質の調製を記載する。
【０５１１】
インターフェロンアルファ２ａは１６５アミノ酸、５．９９のｐＩ、及び以下の配列に相当する１９２４１．６２の分子量を有する。
【０５１２】
【化８】
2010536341.tif 000028
ポリペプチドは１４グルタメート残基及び８アスパルテート残基を有し、加算すれば合計２２の負荷電残基となる。同様に、１１リジン及び８アルギニン残基は合計１９の正荷電をタンパク質に付加し、その結果正味荷電は−３となる。即ち、電荷密度は−０．０１８となる（−３／１６５アミノ酸として計算）。この正味荷電密度は５．９９の実験的ｐＩ値と良好に相関する。向上した溶解性のための所望の電荷密度として０．１負電荷／アミノ酸を選択した。この電荷密度を達成するため、追加の１３．５の負電荷が必要であった（１６．５−３として計算）。
【０５１３】
１５の負荷電アミノ酸をインターフェロンアルファに付加すると融合タンパク質の正味荷電密度は−０．１となり（（１５＋３）／（１６５＋１５）として計算）、これは増大した溶解性のためには望ましい。−０．２電荷／アミノ酸のより高値の電荷密度は合計４１の負荷電アミノ酸残基となるようにタンパク質中に約２６の追加的な負荷電アミノ酸残基を包含することにより得てよい。合わせた長さが２０６アミノ酸（１６５＋４１として計算）となるため、−０．２の電荷密度は４１の総負荷電アミノ酸残基（０．２ｘ２０５アミノ酸として計算）を必要とし、これはアクセサリータンパク質が３８の負荷電残基を包含してよいことを意味する（４１−３として計算）。
【０５１４】
同様の理由により、＋０．１の正味荷電密度に到達するためにはアクセサリーポリペプチドは１５＋６＝２１の正荷電アミノ酸を包含してよい。
【０５１５】
ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８は配列ＧＧＳＧＧＥを有し、そして４８Ｅ残基を含有し、そしてそのためＩＦＮａ２ａの電荷密度を増大させるために使用できる。ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８をＩＦＮａ２ａに付加した場合、融合タンパク質の総長は４５３アミノ酸（１６５＋２８８アミノ酸として計算）となり、そして正味荷電は５１（４８＋３）となり、正味荷電密度は０．１１（５１／４５３として計算）となり、これは細胞の細胞質中で可溶性で活性な形態でのＩＦＮａ２ａの発現を可能にする。構築物、発現及び精製の方法は本質的に実施例１に記載の通り調製及び実施される。融合タンパク質は可溶性及び活性であることが分かっているが、一部凝集傾向が一部の条件下ではなお観察される場合がある。これはタンパク質を溶液中に維持するために正味荷電密度を増大させることにより克服できる。同じ大きさであるがより大きい電荷を有するｒＰＥＧ、例えばｒＰＥＧ＿Ｌ（２８８ＡＡ、２５％Ｅ）及びｒＰＥＧ＿Ｋ（２８８ＡＡ、３３％Ｅ）はＩＦＮａ２ａ−ｒＰＥＧ融合タンパク質を完全に可溶性であり活性状態で折り畳まれた状態にできる場合がある。ＩＦＮａ２ａ−ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８に関してはアクセサリーポリペプチド中の負荷電アミノ酸残基の数は９６であり、これにより融合タンパク質の総正味荷電は９９（９６＋３として計算）となり、これは正味荷電密度が０．２１８（９９／（２８８＋１６５）として計算）であることを意味する。
【０５１６】
実施例７：Ｇ−ＣＳＦ−ｒＰＥＧＪ−２８８の発現
本実施例はＧ−ＣＳＦ−ｒＰＥＧ融合タンパク質の調製を記載する。
【０５１７】
Ｇ−ＣＳＦは１７４アミノ酸の長さ、５．６５のｐＩ及び以下の配列に相当する分子量１８６７２．２９を有する。
【０５１８】
【化９】
2010536341.tif 000029
ポリペプチドは９グルタメート残基及び４アスパルテート残基を有し、加算すれば合計１３の負荷電残基となる。同様に、４リジン及び５アルギニン残基は合計９の正荷電をタンパク質に付加し、その結果正味荷電は−４となる。即ち、電荷密度は−０．０２３となる（−４／１７４アミノ酸として計算）。この正味荷電密度は５．６５の実験的ｐＩ値と良好に相関する。
【０５１９】
向上した溶解性のための所望の電荷密度として０．１負電荷／アミノ酸を選択した。この電荷密度を達成するため、追加の１３．４の負電荷アミノ酸残基が必要であった（１７．４−４として計算）。
【０５２０】
ＧＣＳＦに関しては、１４の負荷電アミノ酸の付加により融合タンパク質の正味荷電密度は約−０．１となり（（１４＋４）／（１７４＋１４）として計算）、これは典型的には溶解性のためには望ましい。−０．２の好ましい電荷密度は約２６の追加的な負荷電アミノ酸残基を必要とし、合計で４１の負荷電アミノ酸残基となるが、その理由は合わせた長さが２１７アミノ酸であるためである（１７４＋４３として計算）。−０．２の代替として選択された電荷密度は合計４３の負荷電アミノ酸残基を必要とし（０．２ｘ２１７アミノ酸として計算）、これはアクセサリータンパク質が３９の負荷電残基を含有しなければならないことを意味する（４３−４として計算）。
【０５２１】
別の代替設計においては、正味荷電密度＋０．１に到達するための正荷電アミノ酸を有するアクセサリータンパク質が望ましく、これは実質正電荷＋２１を必要とする。これは２５の正電荷（２５−４＝２１として計算）を含有するアクセサリータンパク質の付加により達成され、これにより合わせた融合タンパク質長は２０９アミノ酸となる。
【０５２２】
実験結果：
ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８は配列ＧＧＳＧＧＥを有し、そして４８Ｅ残基を含有する。ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８をＧＣＳＦに付加させると、融合タンパク質の総長は１７４＋２８８＝４６２アミノ酸となり、そして正味荷電は４８＋３＝５１となり、正味荷電密度は０．１１となる（５１／４６２として計算）。この電荷は＞８０％凝集から＞８０％可溶性タンパク質にＧＣＳＦを切り替えるために十分であると期待される。０．１５又は０．２のより高値の電荷密度も使用できる。
【０５２３】
標準的な分子生物学の手法を用いて上記実施例の何れかを修飾することにより治療用タンパク質に融合した異なるｒＰＥＧモジュールを使用してよい。本発明者らは０．１の正味荷電密度は細胞質におけるタンパク質の向上した溶解性をもたらす（例えばＧＦＰ、ｈＧＨ及びＩＦＮａ２ａの場合）が、約０．２の正味荷電密度は凝集の傾向を伴うことなく高度に溶解性のタンパク質を与えることを明らかにしている。
【０５２４】
実施例８：Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質中で組み換え発現した場合のＧＦＰに融合された種々のｒＰＥＧ配列の溶解性
本実験においては以下のタンパク質配列を調製して試験した。
【０５２５】
ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８−ＧＦＰ−はＧＦＰタンパク質配列に融合した反復配列（ＧＳＧＧＥＧ）４８よりなるタンパク質配列を示す。
【０５２６】
ｒＰＥＧ＿Ｋ２８８−ＧＦＰ−はＧＦＰ配列に融合した反復配列（ＧＥＧＥＧＧＧＥＧ）３２よりなるタンパク質配列を示す。
【０５２７】
ｒＰＥＧ＿Ｌ２８８−ＧＦＰ−はＧＦＰ配列に融合した反復配列（ＳＳＥＳＳＥＳＳＳＳＥＳ）２４よりなるタンパク質配列を示す。
【０５２８】
ｒＰＥＧ＿Ｏ３３６−ＧＦＰ−はＧＦＰ配列に融合した反復配列（ＳＳＳＳＳＥＳＳＳＳＳＳＥＳ）２４よりなるタンパク質配列を示す。
【０５２９】
ｒＰＥＧ＿Ｐ３２０−ＧＦＰ−はＧＦＰ配列に融合した反復配列（ＳＳＳＥＳＳＳＳＥＳ）３２よりなるタンパク質配列を示す。
【０５３０】
各ＧＦＰのＮ末端に融合したｒＰＥＧＪ２８８、Ｋ２８８、Ｌ２８８、Ｏ３３６及びＰ３２０をＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１−Ｓｔａｒ内に導入し、ＬＢ−Ｋａｎ寒天平板上で生育させ、そして３７℃で１６時間インキュベートした。翌日、各構築物の単コロニーをＴＢ１２５生育培地２ｍＬ中に植菌し、そして５時間生育させた。各細菌ブロス１００ｕＬをＴＢ１２５培地＋Ｋａｎの入った１０ｍＬフラスコに移し、そしてＯＤ６００が約０．６に到達するまで生育させた。生育フラスコを２６℃に移し、振とうしながら１６時間１００ｕＭ  ＩＰＴＧで誘導した。細菌細胞を遠心分離し、１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、そして後に超音波処理により粉砕した。各試料１００μｌずつを遠心分離し、それらの上澄みを収集した。最後に１００μｌの細胞溶解物及び可溶性画分を読み取り、ＧＦＰ蛍光と比較した。
【０５３１】
結果を図３３に示す。ｒＰＥＧアクセサリーポリペプチドＪ、Ｋ及びＬで修飾されたＧＦＰはＧＦＰシグナルの大部分を可溶性形態で有していたのに対し、ｒＰＥＧ  Ｏ及びｒＰＥＧ  Ｐ融合配列ではＧＦＰ蛍光のかなりの画分が不溶性の形態で保持されていた。更にまた、ＳｅｒリッチのｒＰＥＧ配列に融合したＧＦＰはＧｌｙリッチ配列よりも良好な発現を示したのに対し、ＧｌｙリッチｒＰＥＧ配列はＧＦＰ蛍光の大半を可溶性形態で保持していた。
【０５３２】
実施例９：アクセサリー連結ポリペプチドの特性の測定
アクセサリー連結ポリペプチドの血清中安定性の測定
Ｎ末端Ｆｌａｇタグ及び緑色蛍光タンパク質のＮ末端に融合したアクセサリー配列ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８を含有する図１９に示す通り精製した融合タンパク質Ｆｌａｇ−ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８−Ｈ６−ＧＦＰを３日間３７℃で５０％マウス血清中でインキュベートする。試料を種々の時点で採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した後、ウエスタン分析により検出する。Ｎ末端ｆｌａｇタグに対する抗体をウエスタン検出のために使用する。図２０はアクセサリータンパク質が少なくとも３日間血清中で安定であることを示している。
【０５３３】
アクセサリー連結ポリペプチドの血漿中半減期の測定
アクセサリー連結ポリペプチドの血漿中半減期は本質的にはＰｅｐｉｎｓｋｙ，Ｒ．Ｂ．ら（２００１）  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，２９７：１０５９−６６に記載された挿管ラットへのアクセサリーポリペプチドの静脈内又は腹腔内注入の後に計測できる。血液試料を種々の時点（５分、１５分、３０分、１時間、３時間、５時間、１日、２日、３日）において採取でき、そしてアクセサリーポリペプチドの血漿中濃度をＥＬＩＳＡで計測できる。薬物動態パラメーターはＷｉｎＮｏｎｌｉｎのバージョン２．０（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ａｐｅｘ，ＮＣ）を用いて計算できる。ｒＰＥＧ連結ポリペプチドの作用を分析するためには、ｒＰＥＧポリペプチドを欠いている同じタンパク質の血漿中半減期にｒＰＥＧポリペプチドを含有するタンパク質の血漿中半減期を比較することができる。
【０５３４】
ＬＣＷ００５７及びＬＣＷ００６６のインビボ半減期をラットにおいて試験した。両方のタンパク質をラットに静脈内注射した。血清試料は注射後５分〜３日間の間にＧＦＰの存在に関して分析した。ＬＣＷ００５７を注射したラットに関してはタンパク質注射後２４時間にはＧＦＰは検出されなかった。このことはタンパク質の半減期が１〜３時間であることを示唆している。一方、ＬＣＷ００６６は注射後４８時間にも検出され、１匹のラットは注射後３日においてさえも検出可能なＧＦＰを示していた。このことはＬＣＷ００６６が計算分子量５２ｋＤａを有するタンパク質に関して期待されるよりもはるかに長い約１０時間のラット血清中半減期を有していることを示している。
【０５３５】
アクセサリー連結ポリペプチドの溶解性の試験
アクセサリー連結ポリペプチドの溶解性は０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲の種々の濃度にまでリン酸塩緩衝食塩水のような生理学的緩衝液中のアクセサリー連結ポリペプチドの精製された試料を濃縮することにより測定できる。試料は数週間までインキュベートできる。濃度がアクセサリー連結ポリペプチドの溶解性を超えた試料は、濁度により示される通り沈殿を呈するが、これは吸光度測定器により計測できる。遠心分離又は濾過により沈殿物を除去でき、そしてブラッドフォード試験のようなタンパク質試験を用いて、又は、２８０ｎｍにおける吸光度を計測することにより、上澄み中の残存タンパク質の濃度を計測できる。溶解性試験は−２０℃に試料を凍結し、その後解凍することにより加速できる。このプロセスは難溶性のタンパク質の沈殿をもたらす場合が多い。
【０５３６】
アクセサリーポリペプチドで修飾されたＧＦＰのサイズ排除クロマトグラフィー
配列（ＧＧＳＧＧＥ）４８を有するｒＰＥＧを緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合させ、クローンＬＣＷ００６６を得た。融合タンパク質はまたＮ末端Ｆｌａｇタグ及びｒＰＥＧとＧＦＰの間のＨｉｓ６タグを担持していた。融合タンパク質は標準的なＴ７発現ベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。細胞をＬＢ培地中で培養し、ＩＰＴＧで発現を誘導した。発現の後、１５分間７０℃までペレットを加熱することにより細胞を溶解した。大部分のＥ．ｃｏｌｉタンパク質はこの加熱工程中に変性し、そして遠心分離により除去できた。融合タンパク質はＩＭＡＣクロマトグラフィー、次いで固定化抗Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ）による精製により、上澄みから精製した。融合タンパク質は１０／３０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００（ＧＥ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析した。カラムは球状タンパク質（ｄｉａｍｏｎｄｓ）でカリブレーションした。ｒＰＥＧ＿Ｊ２８８及びＧＦＰを含む融合タンパク質はその計算された分子量に基づいて予測されるよりも有意に早くカラムから溶出した。球状タンパク質を用いたカリブレーションに基づけば、ＳＥＣは融合タンパク質の見かけの分子量を２４３ｋＤａと計測しており、これは計算された分子量５２ｋＤａよりも約５倍高値である。関連する融合タンパク質（ＬＣＷ００５７）はｒＰＥＧ３６を含有しており、そして見かけの分子量は５５ｋＤａであるのに対し、計算された分子量は３２ｋＤａであった。ＬＣＷ００６６及びＬＣＷ００５７の比較によれば、計算された分子量が２０ｋＤａのｒＰＥＧ鎖の付加により生じた１８９ｋＤａの見かけの分子量における相違が示されている。即ち、計算された分子量が２０ｋＤａであるｒＰＥＧテール部の付加は１８９ｋＤａの分子量の増大をもたらすと計算できる。
【０５３７】
実施例１０：修飾ポリペプチドの制御放出製剤
ｒＰＥＧ−ＧＦＰ融合タンパク質のマイクロカプセル化
リソマー−ＰＥＧ共重合体は市販されている（例えばＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）。ｒＰＥＧ（Ｌ２８８）−ＧＦＰ又はＧＦＰ単独を含有するマイクロスフェアをダブルエマルジョン溶媒抽出／蒸発（Ｗ／Ｏ／Ｗ、水中油中水）法により調製する。タンパク質（１％ｗ／ｖ）及びリソマー−ＰＥＧ共重合体（９％ｗ／ｖ）をジクロロメタンに溶解する。即ち、理論上のマイクロスフェアローディング効率は１０％ｗ／ｗタンパク質となる。タンパク質重合体混合物を次に５分間激しく旋回させる。混合物を１％ポリビニルアルコール含有水溶液中に５０倍希釈し、そして室温で数時間激しく攪拌した。硬化したマイクロスフェアを超純水で数回洗浄し、乾燥し、そしてデシケーター中４℃で保存する。
【０５３８】
このプロトコルに対する種々の変更を行ってよく、例えばタンパク質：共重合体比を変えること、凍結乾燥タンパク質試料の代わりに水溶液中のタンパク質試料を使用すること、及び硬化したマイクロスフェアを凍結乾燥することなどが挙げられる。異なる重合体マトリックスもまた、例えばジブロック（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）又はトリブロック（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）共重合体でリソマー−ＰＥＧ共重合体を置きかえる等により、利用することができる。同様にマイクロスフェアは種々の条件下、例えば−２０℃又は８０℃で保存できる。より小さい表面積を有する内層であってもより高い薬剤濃度のために単位時間当たりに同じ薬剤放出をもたらすように、粒子の多コーティングを利用して薬剤濃度勾配を生じさせることができる。
【０５３９】
カプセル化効率の計測
マイクロスフェアへのｒＰＥＧ（Ｌ２８８）−ＧＦＰのカプセル化効率を評価するために、マイクロスフェア２００ｍｇをジクロロメタンに溶解する。次にｒＰＥＧ（Ｌ２８８）−ＧＦＰを３容量のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で抽出する。マイクロスフェアから抽出されたｒＰＥＧ（Ｌ２８８）−ＧＦＰの量を、標準物質として精製された組み換えｒＰＥＧ（Ｌ２８８）−ＧＦＰを用いてサンドイッチＥＬＩＳＡにより計測する。慨すれば、放出されたｒＰＥＧ（Ｌ２８８）−ＧＦＰをα−ＦＬＡＧ抗体でコーティングされているマイクロプレートのウェル中にキャプチャーする。キャプチャーされたタンパク質をポリクローナルα−ＧＦＰ抗体及びセイヨウワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートした二次抗体を用いて検出する。ウェル中のタンパク質の量は精製されたｒＰＥＧ（Ｌ２８８）−ＧＦＰを用いて作成した標準曲線との比較により定量した。
【０５４０】
マイクロスフェアからのｒＰＥＧ−ＧＦＰのインビトロ放出の計測
ｒＰＥＧ−ＧＦＰ融合物及びＧＦＰのインビトロの放出を以下の操作法により計測する。第１にマイクロスフェア（２００ｍｇ）をＰＢＳ１ｍｌ中に懸濁する。マイクロスフェアの懸濁液を穏やかに振とうしながら３７℃でインキュベートする。次に少量づつ（１０〜１００μＬ）を少なくとも２週間２４時間ごとに取り出す。放出されたｒＰＥＧ−ＧＦＰ及びＧＦＰの量を上記した通りサンドイッチＥＬＩＳＡで定量する。この操作に対する可能な変更は、血清又は血清／ＰＢＳ混合物中に懸濁したビーズからのｒＰＥＧ−ＧＦＰの放出を計測することを包含する。
【０５４１】
カプセル化タンパク質の皮下注射後のｒＰＥＧ−ＧＦＰの血清中濃度の測定
ｒＰＥＧ−ＧＦＰ及びＧＦＰの血清中濃度はモデル実験生物において、それぞれ、ｒＰＥＧ−ＧＦＰマイクロスフェア又はＧＦＰマイクロスフェアの単回皮下注射を追跡することにより試験できる。カプセル化ｒＰＥＧ−ＧＦＰ又はカプセル化ＧＦＰをマウス、ラット、ウサギ又は他のモデル生物に注射（１ｍＬ／ｋｇ体重）することによりインビボの放出速度を評価する。血清試料を１ヵ月間毎日収集する。ｒＰＥＧ−ＧＦＰの血清中濃度は上記した通りサンドイッチＥＬＩＳＡ試験を用いて計測する。ｒＰＥＧ−ＧＦＰ融合ポリペプチドは、マイクロスフェアからのより緩徐な放出及びより長いその後の半減期のためにＧＦＰよりも遙かに長く高濃度で存在する。
【０５４２】
実施例１１：アクセサリーポリペプチドに連結した重合体カプセル化インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−アルファ）
本実施例は本ポリペプチドの投薬間隔を延長できるｒＰＥＧ−ＩＦＮ−アルファのデポ製剤を記載する。ｒＰＥＧ−融合ＩＦＮ−アルファは、ＩＦＮ−アルファのコーディング配列でＧＬＰ−１コード配列を置き換える以外は、本質的に実施例３のｈＧＨ−ｒＰＥＧ融合構築物に関して記載した通り構築する。全ての他の方法及び手法は、カプセル化方法も含めて、本質的に実施例１０に記載した通りである。
【０５４３】
標準的な分子生物学の手法を用いて、本明細書に記載した実施例の何れかを変更することにより生物学的に活性なポリペプチドに融合した異なるアクセサリーポリペプチドを使用してよい。アクセサリーポリペプチドは前述の配列の何れかを包含してよく、そして数百アミノ酸長までであってよい。同様に、実施例は例えば限定しないがｒＰＥＧ−インスリン、ｒＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ、ｒＰＥＧ−エリスロポエチン及びｒＰＥＧ−腫瘍壊死因子−アルファのような本明細書に記載した治療用タンパク質の何れかに適用するために変更することができる。これらの実施例に記載した組み換えタンパク質は標準的な生化学の手法に従ってＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、それから精製してよい。当該分野で知られる通り、例えばｒＰＥＧ−エリスロポエチン及びｒＰＥＧ−腫瘍壊死因子−アルファは翻訳後のグリコシル化を必要とし、そしてそのため、ヒト組織培養細胞中で産生しなければならない。そのような場合、アクセサリーポリペプチドはヒト細胞中で発現してよく、そしてヒト細胞中の良好な発現のためにコドン最適化してよい。コドン最適化は標準的な分子生物学の方法を用いて実施してよい。
【０５４４】
実施例１２：非反復アクセサリーポリペプチドの構築
本実施例は合成オリゴヌクレオチドからのアクセサリーポリペプチドセグメントのライブラリの構築を記載する。図７８は合成オリゴヌクレオチドによりコードされたもののアミノ酸配列を列挙している。各アミノ酸配列につき、本発明者らは２つの相補オリゴヌクレオチドを使用した。配列はコドンライブラリとして設計し、即ち、多数の異なるコドンを可能としたが、全ての配列は１つのアミノ酸配列のみをコードするものとした。相補オリゴヌクレオチドは加熱によりアニーリングし、その後冷却した。オリゴヌクレオチドは図７９に示す通りアニーリングの間に４塩基対の重複を形成するように設計した。ライゲーション反応による多量体化の間にターミネーターとして作用させた２つの追加的なアニーリングしたオリゴヌクレオチドもまた付加させた。図７９は種々の長さのアクセサリーポリペプチドセグメントをコードする遺伝子フラグメントをもたらしたアニーリングしたオリゴヌクレオチドのライゲーションを示す。得られたライゲーション混合物を図７９に示す通り電気泳動で分離し、そしてＵＲＰ３６をコードするライゲーション産物を単離した。このライゲーション産物を発現ベクター内にライゲーションし、そしてＵＲＰ３６セグメントのライブラリをＧＦＰへの融合タンパク質として発現させた。
【０５４５】
この態様において調製したアクセサリーポリペプチド配列を図８０に示す。追加的な配列を以下に開示する。
【０５４６】
【化１０】
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実施例１３：ｒＰＥＧ＿Ｙ５７６の構築
本実施例は合成オリゴヌクレオチドからのＵＲＰセグメントのライブラリの構築を記載する。図７８は合成オリゴヌクレオチドによりコードされたアミノ酸配列を列挙している。各アミノ酸配列につき、本発明者らは２つの相補オリゴヌクレオチドを使用した。配列はコドンライブラリとして設計し、即ち、多数の異なるコドンを可能としたが、全ての配列は１つのアミノ酸配列のみをコードするものとした。相補オリゴヌクレオチドは加熱によりアニーリングし、その後冷却した。オリゴヌクレオチドは図７９ａに示す通りアニーリングの間に４塩基対の重複を形成するように設計した。本発明者らはライゲーション反応による多量体化の間にターミネーターとして作用させた２つの追加的なアニーリングしたオリゴヌクレオチドもまた付加させた。図７９ｂは種々の長さのＵＲＰセグメントをコードする遺伝子フラグメントをもたらしたアニーリングしたオリゴヌクレオチドのライゲーションを示す。得られたライゲーション混合物を図７９ｂに示す通り電気泳動で分離し、そしてＵＲＰ３６をコードするライゲーション産物を単離した。このライゲーション産物を発現ベクター内にライゲーションし、そしてＵＲＰ３６セグメントのライブラリをＧＦＰへの融合タンパク質として発現させた（図８１）。良好な発現を示すライブラリメンバーはそれらの強力な蛍光強度に基づいて識別した。
【０５４７】
ＵＲＰ３６のライブラリメンバーを２量化し、そして得られたＵＲＰ７２ライブラリを高レベル発現に関してスクリーニングした。２量化及びスクリーニングのこのプロセスをもう一回反復することによりＵＲＰ１４４を生成した。図８０は配列の収集物を示す。配列はライブラリの設計を確認するものであるが、大部分のライブラリメンバーはその実際の配列において異なっている。ＵＲＰ＿Ｙ１４４のこの収集物をあと２回２量化することによりＵＲＰ＿Ｙ２８８及びＵＲＰ＿Ｙ５７６の収集物を生成した。ＵＲＰ＿Ｙ５７６の１つの単離株のアミノ酸配列を図８０に示す。得られた単離株を発現、凝集、及び免疫原性に関して評価することにより薬剤タンパク質への融合に最も適するＵＲＰを識別した。
【０５４８】
実施例１４：ｓｃＦｖ−ｒＰＥＧ５０融合物の構築
抗−Ｈｅｒ２及び抗−ＥＧＦＲの構築
本実施例はｓｃＦｖ−ｒＰＥＧ５０融合物の構築を記載する。１つはＨｅｒ２に結合し、もう１つは表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する、２つのｓｃＦｖを作成した。各ｓｃＦｖをそれぞれｒＰＥＧ５０のＮ末端に遺伝子的に融合した。ｓｃＦｖ構築物はＴ７プロモーターを有しｒＰＥＧ５０−ＦＬＡＧ−タグ−ヘキサヒスチジンをコードする発現ベクター内にクローニングし、ｓｃＦｖ−ｒＰＥＧ５０−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ６を発現する構築物を得た。スタッファーフラグメントはＮｄｅＩ及びＢｓａＩエンドヌクレアーゼを用いた制限消化により除去した。合成ｓｃＦｖフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、これによりスタッファー構築物と適合するＮｄｅＩ及びＢｂｓＩ制限部位を導入した。制限消化ｓｃＦｖフラグメント及びスタッファー構築物をＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションし、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ内に電気形質転換した。得られたＤＮＡ構築物は図６４ａに示す通りであり、ここで軽鎖（ｖＬ）及び重鎖（ｖＨ）可変フラグメントはｒＰＥＧＹ３０、即ち３０アミノ酸配列（ＳＧＥＧＳＥＧＥＧＧＧＥＧＳＥＧＥＧＳＧＥＧＧＥＧＥＧＳ）により分離されている。Ｙ３０アミノ酸コード配列はｖＬとｖＨの間のリンカー配列の好都合な除去又は置き換えのためにＡｇｅＩ及びＫｐｎＩ制限部位によりフランキングされるようにした。構築物はＤＮＡ配列決定により確認した。ａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．＝８０，０４４Ｄａ）及びａＥＧＦＲ３０−ｒＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．＝８０，１０２Ｄａ）構築物に関するタンパク質配列をそれぞれ図６４ｂ及びｄに示す。
【０５４９】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄにおける抗−Ｈｅｒ２３０−ｒＰＥＧ及びａＥＧＦＲ３０−ｒＰＥＧ融合物は、２０℃において０．２ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導することにより発現させた。細胞を遠心分離により収集し、リン酸塩緩衝食塩水中、バグバスター＋ベンゾナーゼ中で溶解した。溶解物を遠心分離により浄化し、上澄み（可溶性画分）を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードした。ｓｃＦｖ−ｒＰＥＧ融合物は約８０ｋＤａにおいてＥ．ｃｏｌｉ溶解物中で過剰発現され、黙示可能である（図６４ｃ）。
【０５５０】
実施例１５：ｓｃＦｖ−ｒＰＥＧ５０融合物ａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧの特性化
精製
ａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧを生じさせるためにＨｅｒ２受容体を標的化標的化し、そしてｒＰＥＧに融合された単鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）抗体フラグメントをＥ．ｃｏｌｉのサイトゾルから発現させ、精製した。ａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）−Ｇｏｌｄ内に形質転換し、そして組み換え抗体フラグメントの発現を２０℃で０．２ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。細胞を遠心分離により採取し、そして３０ｍＭリン酸ナトリウム。０．３Ｍ塩化ナトリウム、１０％グリセロール、及び２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５中に再懸濁した。細胞溶解は超音波処理により達成し、そして可溶性タンパク質は標準的なクロマトグラフィー方法、例えば固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、及びイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）により精製した。
【０５５１】
結合
標的（Ｈｅｒ２）結合を評価するために、ａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧを上記した通りＢＬ２１（ＤＥ３）−Ｇｏｌｄ中で発現させた。細胞をバグバスター試薬及び５Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含有するリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁することにより溶解した。懸濁液を室温で２０分間インキュベートした後、１０分間１００００ｒｐｍで遠心分離した。次に可溶性画分を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中に５倍連続希釈した。連続希釈したａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧを、Ｈｅｒ２−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングし、そして１％ＢＳＡでブロックしておいた９６穴プレートのウェルに添加した。結合反応は穏やかに振とうしながら２時間室温でインキュベートした。ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで十分洗浄し、そして結合したａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧをＨＲＰ−コンジュゲート抗−ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）で検出した。図６２ａはａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧはＨｅｒ２−Ｆｃ融合タンパク質には結合し、そしてヒトＩｇＧに非特異的に結合しないことを示している。結合データは試料希釈度の関数として示す。半最大結合（ＥＣ５０）は約１０ｎＭのａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧにおいて達成されると推定される。
【０５５２】
精製されたａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧをサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）で分析することによりそのオリゴマー化状態を測定した。ａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧのＳＥ−ＨＰＬＣ分析はＴＳＫ−ゲルＧ４０００ＳＷＸＬカラム上で実施した。図６２ｂに示す通りａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧは単量体のみ形成する。抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖへのｒＰＥＧアクセサリーポリペプチドの付加は非ｒＰＥＧ融合ｓｃＦｖでは一般的に観察されていない２量体の形成を効果的に排除している。
【０５５３】
ＳＳ−結合酸化
Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質中のジスルフィド含有タンパク質の発現は、ジスルフィド形成を抑制する細胞質の高度に還元性の性質のため良好に行われない場合が多い。しかしながらジスルフィド結合は、タンパク質がより酸化性の条件に曝露されれば、細胞溶解の後に形成される場合がある。上記において示した通りＥ．ｃｏｌｉ中で発現されたａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧはその標的であるＨｅｒ２に結合し、タンパク質が適切に折り畳まれていることを示唆している。ｖＨ及びｖＬドメインの各々に１つ存在するａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧの２つのジスルフィド結合が精製されたタンパク質中で適切に形成されているかどうかを試験するために、変性、精製されたタンパク質中の遊離のスルヒドリルの数をｓｃＦｖの完全に還元された形態と比較した。精製されたａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧを６Ｍ尿素中、又は１０ｍＭトリス［２−カルボキシメチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）を添加した６Ｍ尿素中、１時間室温で変性させた。次に試料をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５樹脂上で脱塩することにより尿素及びＴＣＥＰを除去した。その直後、Ｅｌｌｍａｎ試薬（５，５’−ジチオ−ビス−［２−ニトロ安息香酸］）を終濃度２０ｍＭとなるまで添加し、反応を１５分間進行させた。最後に各溶液の吸光度を４１２ｎｍで計測した。変性したａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧは極めて小さい吸光度を示し、このことは精製された試料が完全に酸化されていることを示唆している（図６２ｃ）。変性され還元された反応物（図６２ｃ）はａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧ中の全てのシステインが還元状態にあれば予測されたシグナルを示す。即ち、抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ内のジスルフィドの全てが適切に形成されていた。
【０５５４】
実施例１６：ダイアボディーａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧの構築
ダイアボディーは１０アミノ酸未満のリンカーを用いてｖＨ及びｖＬドメインを連結することにより形成できる。短いリンカーはｓｃＦｖ形成を可能とせず、そしてその結果ｖＨ及びｖＬドメインは相補な第２のｖＨ−ｖＬ鎖に結合し、４ドメイン、２鎖の５０ｋＤ複合体を形成する。ダイアボディーはＨｅｒ２に結合する単鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）抗体フラグメントから構築し、これはｒＰＥＧ５０のＮ末端に遺伝子的に融合させた。構築物は３つのアミノ酸（ＳＧＥ）で実施例１のＹ３０ｓｃＦｖリンカー配列を置き換えてダイアボディーフォーマットを可能とすることにより形成した（図６５ａ）。ＳＧＥ配列はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で導入し、更にまたｒＰＥＧスタッファー構築物と適合するＮｄｅＩ及びＢｂｓＩ制限部位を導入した。次にダイアボディーコードフラグメントを実施例１に記載の通りクローニングした。構築物はＤＮＡ配列決定により確認した。ａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧダイアボディー（ダイアボディーとしてＭ．Ｗ．＝１５６，５９８Ｄａ、又は７８，２９９  Ｄａ単量体配列、ｒＰＥＧを包含）に関するタンパク質配列を図６５ｂに示す。
【０５５５】
ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ中のａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧを２０℃において０．２ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導することにより発現させた。細胞を遠心分離により採取し、そしてリン酸塩緩衝食塩水中のバグバスター／ベンゾナーゼ中で溶解した。溶解物を遠心分離により浄化し、そして上澄み（可溶性画分）を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードした。ａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧダイアボディーは約９０ｋＤａにおいてＥ．ｃｏｌｉ溶解液中で検出した（図６５ｃ）。
【０５５６】
実施例１７：ダイアボディー−ｒＰＥＧ５０融合物ａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧの特性化
精製
ダイアボディーは１０アミノ酸未満を含むリンカーでｖＨ及びｖＬドメインを連結することにより形成できる。短いリンカーはｓｃＦｖ形成を可能とせず、そしてその結果、ｖＨ及びｖＬドメインは相補ｖＨ−ｖＬ鎖と結合する。ダイアボディーは２価の、そして恐らくは二重特異性の、エフェクターＦｃ機能を欠いた治療薬を形成するための有用なフォーマットである。
【０５５７】
Ｈｅｒ２に結合するダイアボディーは上記した通り設計した。標的（Ｈｅｒ２）結合を評価するために、組み換えａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧダイアボディーを発現させ、そしてａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧに関して上記した通り精製した。ａＨｅｒ２０３−ｒＥＰＧ５０をＢＬ２１（ＤＥ３）−Ｇｏｌｄ内に形質転換し、そして組み換え抗体フラグメントの発現を２０℃において０．２ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。細胞を遠心分離により採取し、そして３０ｍＭリン酸ナトリウム、０．３Ｍ塩化ナトリウム、１０％グリセロール、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５中に再懸濁した。溶解は超音波処理により達成し、そして可溶性タンパク質は標準的なクロマトグラフィー方法、例えば固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、及びイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）により精製した。
【０５５８】
結合
ａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧダイアボディーのその標的への結合はａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧに関して記載したとおり実施した。細胞をバグバスター試薬及び５Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含有するリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁することにより溶解した。懸濁液を室温で２０分間インキュベートした後、１０分間１００００ｒｐｍで遠心分離した。次に可溶性画分を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（以後ＥＬＩＳＡ結合緩衝液と称する）中に５倍連続希釈した。連続希釈したａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧを、Ｈｅｒ２−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングし、そして１％  ＢＳＡでブロックしておいた９６穴プレートのウェルに添加した。結合反応は穏やかに振とうしながら２時間室温でインキュベートした。ウェルを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで十分洗浄し、そして結合したａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧをＨＲＰ−コンジュゲート抗−ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ）で検出した。図６３ａはａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧはＨｅｒ２−Ｆｃ融合タンパク質には結合し、そしてヒトＩｇＧに非特異的に結合しないことを示している。結合データは試料希釈度の関数として示す。半最大結合（ＥＣ５０）は約１０ｎＭのａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧにおいて達成されると推定される。即ちｒＰＥＧアクセサリーポリペプチドを有する機能的ａＨｅｒ２０３ダイアボディーはＥ．ｃｏｌｉのサイトゾル中で発現できる。
【０５５９】
ＳＥ−ＨＰＬＣ
ダイアボディーは潜在的に２価の治療薬として開発されているが、より高次のオリゴマー、即ち３量体、４量体等に再集合するそれらの傾向のためにその利用性が制限されている。再集合は、単量体ｓｃＦｖの精製の後、液体形態における保存時に、それが緩徐ではあるが予測可能に再集合して２量体及びより高次の多量体を生じるため、製造のためには特に問題となる。これは最終的に得ることができる正しいフォーマットのタンパク質の量の多大な損失をもたらすのみならず、保存時の生成物の不均質性及び薬物動態及び薬効における不均質性ももたらす。ｓｃＦｖの単量体と多量体の間の平衡はｖＨ及びｖＬドメインの間のリンカーの長さにより影響される場合がある。一般的に１２〜１４アミノ酸長のリンカーを有する構築物は主に単量体形態で生じるのに対し１２アミノ酸より短いリンカーを有するｓｃＦｖは大部分が多量体形態で生じる［Ｄｅｓｐｌａｎｃｑ，Ｄ．ら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，７：１０２７］［Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ．ら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，７：１０１７］［Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３１：１７７］。３０アミノ酸までｖＨとｖＬの間のリンカーの長さを増大させることにより平衡が単量体の方向にシフトする［Ｄｅｓｐｌａｎｃｑ，Ｄ．ら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，７：１０２７］。３〜７アミノ酸のリンカー長がダイアボディーの形成に好都合である［Ｄｏｌｅｚａｌ，Ｏ．ら（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，１３：５６５］［Ｋｏｒｔｔ，Ａ．Ａ．ら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，１０：４２３］。５〜１０アミノ酸のリンカーは大部分が２量体をもたらす。抗原の存在及びイオン強度が単量体２量体遷移に影響する場合がある［Ａｒｎｄｔ，Ｋ．Ｍ．ら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：１２９１８］。３アミノ酸より短いリンカーはトリアボディー及びテトラボディーの形成に好都合である［Ｌｅ  Ｇａｌｌ，Ｆ．ら（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４５３：１６４］［Ｄｏｌｅｚａｌ，Ｏ．ら（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，１３：５６５］［Ｋｏｒｔｔ，Ａ．Ａ．ら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，１０：４２３］。
【０５６０】
ＳＥ−ＨＰＬＣによるａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧダイアボディーのオリゴマー化状態が評価されており、そしてそれが再集合しないことが明らかにされている。図６３ｂはａＨｅｒ２３０−ｒＰＥＧ単鎖及びａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧダイアボディーのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。これによればダイアボディーは大部分が２量体であり、そして重要な点として、それが３％未満の３量体又は４量体を含有することが明らかである。ａＨｅｒ２０３−ｒＰＥＧダイアボディーのオリゴマー化状態はまた４℃における保存の間にもモニタリングされており。そして再集合は観察されていない（図６３ｃ）。ｒＰＥＧアクセサリーポリペプチドポリペプチドはダイアボディーの再集合を防止することに寄与し、これにより均質な生成物の精製及び形成を可能にする。
【０５６１】
実施例１８：細菌発現のためのＦｃドメインのコドン最適化
図６６ａに示す通り、ヒトＩｇＧ１定常フラグメント（Ｆｃ）を合成し、ｒＰＥＧ２５−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合することによりＦｃ−ｒＰＥＧ２５−ＧＦＰを得た。Ｆｃ配列をコードするＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ最適化コドンを用いてインビトロで構築した。Ｆｃコドンライブラリは２０ヌクレオチド重複（アニーリング）領域を有する６０量体オリゴヌクレオチドを用いて組み立てた。多数のコドンを合成オリゴヌクレオチドの非重複領域内に導入した。得られたコドンライブラリは全てのヌクレオチド配列が所望のＦｃ配列をコードするように約１０，０００の理論的サイズを有していた。合計１８オリゴヌクレオチドをｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼの存在下に組み立てることにより最終サイズ６８４ｂｐとした。ＦｃコドンライブラリはＮｄｅＩ及びＢｂｓＩ適合末端を形成するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡフラグメントを制限消化し、そしてＮｄｅＩ及びＢｓａＩ制限消化部位においてｒＰＥＧ２５−ＧＦＰベクター内にライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡをＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄ内に形質転換した。合計１０００クローンを単離し、９６穴フォーマット中に生育させ、そして発現を誘導するために０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを含有するプレートに複製した。十分に発現された構築物はＵＶ光下に高レベルの蛍光を呈した。合計で１７クローンが高度に蛍光性であると特性化された。これらのクローンを０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて１ｍｌ培養物中で発現させ、細胞を遠心分離により採取し、そしてリン酸塩緩衝食塩水中バグバスター＋ベンゾナーゼで溶解した。可溶性画分を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードした（図６６ｂ）。組み換えＦｃ−ｒＰＥＧ融合物は約８０〜９０ｋＤａのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の観察分子量を有していた（予測ＭＷは約８０であるがｒＰＥＧがタンパク質を高値に泳動させた）。コドン最適化ＦｃのＤＮＡ配列を図６６ｃに示す。
【０５６２】
実施例１９：Ｆｃ−ｒＰＥＧ融合タンパク質の発現及び特性化
ＩｇＧ１のＦｃフラグメントを実施例５に詳述した通り（そして変異体は図３１に示す）ｒＰＥＧに融合し、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質中で発現させた。融合タンパク質を発現している細胞を緩衝液、この例では２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．０に再懸濁し、そして細胞を超音波により溶解させた。不溶性物質を遠心分離により除去し、そしてＦｃ−ｒＰＥＧ−ＧＦＰを可溶性画分から精製した。未損傷の折り畳まれたフラグメントはプロテインＡに結合し、そしてそのため、固定化組み換えプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより好都合に精製できる。Ｆｃ融合物を含有する可溶性溶解物をプロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、そして微生物タンパク質をリン酸塩緩衝役で十分洗浄することにより除去した。Ｆｃ−ｒＰＥＧ−ＧＦＰ融合タンパク質はグリシン緩衝液又はクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．０の何れかを用いてプロテインＡカラムから溶出させた。溶出画分はＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５の等量を用いて即座に調節した。精製されたタンパク質は還元及び酸化条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。約８０ｋＤａの単一のバンドが還元条件下に検出されたのに対し、１６０ｋＤａ（酸化ヒンジ）及び８０ｋＤａ（還元ヒンジ）におけるバンドが酸化条件下に検出された。ＣｕＳＯ４、デヒドロアスコルビン酸、又は他の酸化性の試薬の何れかの添加を用いることによりヒンジシステインの完全な酸化を触媒した。
【０５６３】
実施例２０：Ｆａｂ−ｒＰＥＧ融合タンパク質の構築及び細菌発現
本実施例はＦａｂ−ｒＰＥＧ融合タンパク質の構築及び細菌発現を記載する。ＩｇＧのフラグメントである抗原結合（Ｆａｂ）部は可溶性Ｆａｂ発現の向上並びに半減期延長の手段としてｒＰＥＧに融合できる。発現構築物を誘導アラビノースプロモーターの制御下にあるビシストロン性のＲＮＡメッセージに設計した（図６７）。ビシストロン性メッセージはＴ７ターミネーター配列のようなヘアピンターミネーターにおいて終始する。各シストロン又は遺伝子は翻訳を開始するためのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）及び翻訳を終止するための終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）を有する。軽鎖（ｖＬ／ｃＬ）又は重鎖（ｖＨ／ｃＨ）配列はｒＰＥＧ、次いでアフィニティータグ、例えばＨＡ（ヘマグルチニン）、Ｈ（ヘキサヒスチジン）、及び／又はＦＬＡＧタグに遺伝子的に融合できる。ＤＮＡ構築物は図６７に示す通り重鎖の第１又は軽鎖の最後（ＨＬ）又は軽鎖の第１及び重鎖の最後（ＬＨ）をコードできる。この型の構築物からのタンパク質発現は合計５０ｋＤａのｒＰＥＧ配列を包含する約１００ｋＤａのサイズの完全Ｆａｂフラグメントを形成する２つの約５０ｋＤａの鎖をもたらす。
【０５６４】
実施例２１：ＧＦＰ−ｒＰＥＧ５０のＰＫ分析
ＧＦＰ−ｒＰＥＧ５０のアミノ酸配列を図６９に示す。タンパク質は実施例１と同様のＴ７プロモーターを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させた。タンパク質はイオン交換クロマトグラフィー、次いで疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製した。ＧＦＰ−ｒＰＥＧ５０の薬物動態は皮下及び静脈内注射ののちにカニクイザルにおいて試験した。カニクイザル３匹を２群に分割し、２匹に静脈内、１匹に皮下投与において、０．１５ｍｇ／ｋｇのＧＦＰ−ｒＰＥＧ５０を投与した。連続採血を各サルで行い、血漿を分離し、そして被験物質の血漿中濃度をＥＬＩＳＡ試験により計測した。静脈内投与動物に関する半減期は１７．４時間であり、そして皮下投与動物では１３．８時間であった。被験物質の生体利用性は図７０に示す通り約５４．６％であった。
【０５６５】
実施例２２：Ｅｘ４−ｒＰＥＧ５０のＰＫ分析
Ｅｘ４−ｒＰＥＧ５０はエキセンジン−４とｒＰＥＧ５０の間の融合蛋白である。これは図７１ｂに示す通り、ＴＥＶプロテアーゼによる切断により除去されるように設計されているセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を有する融合蛋白として生成した。融合蛋白のアミノ酸配列を図７１に示す。発現プラスミド及び精製蛋白はＴＥＶ蛋白分解のための工程を付加した以外は実施例１と同様とした。切断されたＣＢＤをビーズ化セルロースとともにインキュベートすることにより除去した。Ｅｘ４−ｒＰＥＧ５０の薬物動態をカニクイザルで試験した。カニクイザル４匹を群当たり２匹の２群に分割し、そして皮下及び静脈内投与において、０．１５ｍｇ／ｋｇのＥｘ４−ｒＰＥＧ５０を投与した。連続採血を各サルで行い、そして被験物質の血漿中濃度をＥＬＩＳＡ試験により計測した。半減期は図７０に示す通り皮下及び静脈内投与についてそれぞれ９．５時間及び９．１時間であった。
【０５６６】
実施例２３：げっ歯類におけるＧＦＰ−ｒＰＥＧ５０のＰＫ分析
本実施例はＧＦＰ−ｒＰＥＧ２５及びＧＦＰ−ｒＰＥＧ５０の皮下及び静脈内投与時の薬物動態を比較している。ラット１５匹を各群３匹の５群に分割し、そしてＧＦＰ−ｒＰＥＧＹ２５及びＧＦＰ−ｒＰＥＧ＿Ｙ２８８の何れかで１．６７ｍｇ／ｋｇにおいて皮下及び静脈内の両方で投与した。ＧＦＰ−ｒＰＥＧ２５は皮下注射時に約８〜９のｔ０．５を有したのに対し、ＧＦＰ−ｒＰＥＧ５０の場合は１１〜１５時間のｔ０．５であった。ＧＦＰ−ｒＰＥＧ２５は約２５％の皮下投与時の生体利用性を有していたのに対し、ＧＦＰ−ｒＰＥＧ５０では１１％の皮下投与時生体利用性であった。マウスにおいては１２５Ｉ−ＧＦＰ−ｒＰＥＧ５０をヌードマウスに投与した。半減期は１３．４時間であった。
【０５６７】
実施例２４：ｒＰＥＧ５０に融合したヒト成長ホルモンのＰＫ分析
ｒＰＥＧ５０をヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のＣ又はＮ末端の何れかに融合した。蛋白は実施例８に記載する通り精製した。薬物動態をカニクイザルで試験した。２匹のカニクイザルを１群１匹の２群に分割した。各サルにｈＧＨ−ｒＰＥＧ５０又はｒＰＥＧ５０−ｈＧＨの何れか一方の成長ホルモン構築物を０．１５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。２種の成長ホルモン構築物はそれぞれ７及び１０．５時間の半減期を有していた。
【０５６８】
実施例２５：Ｅｘ４−ｒＰＥＧ５０のマウス免疫原性及び毒性学的試験
本実施例はマウスへのＥｘ４−ｒＰＥＧ５０（１／週）の１０回の皮下投与５０μｇ用量に関連する免疫原性及び潜在的毒性を記載している。図７２ａに示す通り、２群を用いながら、群当たり雄５匹及び雌５匹の群当たり１０匹とし、各々３０〜４０ｇの合計２０匹のマウス（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）にＥｘ４−ｒＰＥＧ５０及び対照として使用したＥＬＳＰＡＲの何れかを毎週投与した。各投与の前に採血し、図７２ｂ及び７２ｃに示す通りＩｇＧをＥＬＩＳＡ試験により計測した。ＥＬＳＰＡＲは経時的に増大した有意な免疫応答をもたらした。これとは対照的にＥｘ４−ｒＰＥＧ５０は６回の抗原注射後に最大を示し、そして１０回の抗原の注射の後に得られた試料においては低下していた極めて弱い応答を示した。全マウスが試験中体重増加を示し、そして毒性挙動兆候は示さず、そして死後剖検によれば臓器形態に関して異常所見がないことが判明した。生存中の採決が終了した後、血液スミア及び血漿及び組織の試料をＲＡＤＩＬ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＯ）に送付して毒性学的分析を行った。組織学的分析によればＰＥＧとの化学的コンジュゲートに関する主要な懸案事項である近位又は遠位の細管における顕著な細胞質の空胞化は観察されなかった。肝臓の組織学的評価によれば分析した試料４点全てにおいて軽度の炎症が示された。これは見かけ上健常な動物の肝臓における一般的な所見である。脾臓の分析によれば、４匹のマウス全てが中等度から顕著な巨核球症及び中等度の造血を有していた。臨床化学試験によれば、１匹において中等度に高値であったＡＬＴ及びＡＬＰレベルが観察され、これは肝細胞の損傷／壊死を示していた。観察によれば重度又は慢性ではなかった。血液学的分析によればマウス４匹全てが少なくとも１つの僅かに上昇した血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリットパーセント又は血中総蛋白濃度を有していた。全体として、ｒＰＥＧ融合蛋白の多数回注射は極めて弱い免疫原性及び毒性をもたらした。
【０５６９】
実施例２６：ＧＦＰ−ｒＰＥＧ融合蛋白のサイズ排除クロマトグラフィー
ｒＰＥＧ＿Ｙ２５及びｒＰＥＧ＿Ｙ５０に融合したＧＦＰを実施例８に記載の通り発現させた。蛋白は図７３に示す通りＴＳＫ  Ｇ４０００  ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ，Ｇｒｏｖｅ  Ｃｉｔｙ，ＯＨ）を用いて分析用ＳＥＣにより分析した。カラムは球状蛋白の市販の標準物質を用いてカリブレーションし、そして対照の分子量は図７３に示す通りである。ＧＦＰ−ｒＰＥＧ２５は見かけの分子量５００ｋＤａで溶離したのに対し、ＧＦＰ−ｒＰＥＧ５０は見かけの分子量１５００ｋＤａで溶離した。
【０５７０】
実施例２７：ＧＦＰ−ｒＰＥＧＹ融合蛋白の製剤及びインビボ投与
ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌのＧＦＰ−ｒＰＥＧＹの溶液をＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌのキトサンの等量と混合し、そして３０分間室温でインキュベートする。沈殿を１０分間５０００ｇで遠心分離することにより収集し、そして０．１容量の滅菌ＰＢＳで１回迅速に洗浄する。次に沈殿を凍結乾燥することにより過剰な流体を除去し、そして粉砕して微細粉末とする。次に粉末１５ｍｇを１ｍＬの滅菌ＰＢＳに再懸濁し、そしてピペッティングにより均質化させる。ホモジネートは２週間３７℃で回転させながら保存し、一定間隔で１０μＬの試料を採取する。試料は遠心分離後は即座に調製して不溶性物質を除去し、そして再可溶化した蛋白はＧＦＰ蛍光、光学密度、及びｒＰＥＧＹ  ＥＬＩＳＡにより上澄み中で定量する。上澄み濃度を時間の関数としてプロットし、そして片指数過程にフィットさせることにより再可溶化速度を測定する。インビボの放出速度を測定するために、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｙラットに１ｍＬ／ｋｇ（５ｍｇ／ｋｇ有効用量）の用量において１ｍＬ  ＰＢＳ中２０ｍｇ粉末の新しく調製した懸濁液を皮下注射する。未複合体化ＧＦＰ−ｒＰＥＧＹの静脈内及び皮下注射は平行して動物の独立したコホートに対し、５ｍｇ／ｋｇで注射する。一定間隔で採血し、蛋白の血清中濃度をＧＦＰ及びｒＰＥＧＹ  ＥＬＩＳＡで測定する。クリアランス速度、Ｃｍａｘ、Ｃｓｓ、ＶＤ、ＡＵＣ及び血清中半減期を包含する薬物動態パラメーターを標準的な方法で求める（即ちＷｉｎＮｏｎＬｉｎ分析）。皮下及びデポ製剤に関する生体利用性及び有効用量は静脈内投与との比較により求める。
【０５７１】
即ち、本発明の好ましい実施形態を示し、説明してきたが、当業者の知る通りそのような実施形態は例示に過ぎない。多くの変形、変更、及び置き換えは、本発明から外れることなく当業者には自明となる。本明細書に記載した本発明の実施形態の種々の代替例を本発明の実施において使用してよい。以下の請求項は本発明の範囲を定義し、そしてこれらの請求項の範囲に包含される方法及び構造及びそれらの等価物がそれに包含されることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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