(57)【要約】  本発明は代謝フラックス分析を用いて微生物の成長に必須の代謝産物をスクリーニングする方法に係り、さらに詳しくは、対象微生物を選定し、選定された微生物の代謝回路モデルを構築した後、前記構築された代謝回路モデルにおいて各代謝産物の消費反応式を不活性化させ、代謝フラックスを分析して、微生物の成長に必須の代謝産物を選定した後、フラックスサム（Φ）として定義した各代謝産物の活用度を用いて前記選定された代謝産物を確認して微生物の成長に必須の代謝産物をスクリーニングする方法に関する。本発明によれば、微生物の成長に必須の代謝産物代謝産物及び前記必須代謝産物に関与する遺伝子を簡単にスクリーニングすることができ、前記必須代謝産物の代謝活用度（フラックスサム：Φ）の減少による細胞成長を予測することができることから、前記方法によりスクリーニングされた代謝産物と関連する遺伝子を欠失させることにより病原性微生物の薬物標的遺伝子を予測するのに使用することができる。
2010512783.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のステップを含む、代謝フラックス分析を用いた微生物の成長に必須の代謝産物のスクリーニング方法：
（ａ）対象微生物を選定し、選定された微生物の代謝回路モデルを構築するステップと、（ｂ）前記構築された代謝回路モデルにおいて各代謝産物の消費反応式を不活性化させて代謝フラックスを分析し、下記式２を用いて、元の細胞成長速度に比べて細胞成長速度が５０％未満に減少する場合の代謝産物を、微生物の成長に必須の代謝産物として選定するステップ。
【数１】
2010512783.tif 000018
ここで、ｒｗｉｌｄは元の細胞成長速度を示し、ｒｌｏｓｓは当該代謝産物の消費反応式を不活性化させたときに減少する細胞成長速度を示す。
【請求項２】
前記代謝産物の消費反応式を不活性化させる方法を、当該消費反応式の代謝フラックス値を０に固定して計算することを特徴とする、請求項１に記載の代謝フラックス分析を用いた微生物の成長に必須の代謝産物のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記（ｂ）ステップ後に、次のステップをさらに含むことを特徴とする、代謝フラックス分析を用いた微生物の成長に必須の代謝産物のスクリーニング方法：
（ｃ）前記（ｂ）ステップにおいて選定された代謝産物の活用度を下記式３で表されるフラックスサム（Φ）として定義し、各代謝産物のΦ値を計算するステップと、
【数２】
2010512783.tif 000019
ここで、Φｉはｉ番目の代謝産物のフラックスサム（Φ）を示し、Ｓｉｊはｉ番目の代謝産物とｊ番目の代謝反応の化学量論係数を示し、νｊはｊ番目の代謝反応の代謝フラックスを示す。また、Ｐｉはｉ番目の代謝産物を産生する代謝反応の集合であり、Ｃｉはｉ番目の代謝産物を消費する代謝反応の集合である、
（ｄ）選定された各代謝産物のΦ値を減少させる場合、細胞成長が減少または停止する場合の代謝産物を微生物の成長に必須の代謝産物として確認するステップ。
【請求項４】
前記必須代謝産物が、Ｈ＋、Ｈ２Ｏ、ＡＴＰ、ホスファート、ＡＤＰ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＣＯ２、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ピルバート、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、Ｌ−グルタメート、コエンザイムＡ、アンモニウム、ＡＭＰ、アセチル−ＣｏＡ、２−オキソグルタラート、アシルキャリアタンパク質、ホスホエノールピルバート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−グルタミン、グリセルアルデヒド−３−ホスファート、ＣＭＰ、グリセロール−３−ホスファート、ＧＴＰ、５−ホスホ−α−Ｄ−リボース−１−ジホスファート、ジヒドロキシアセトンホスファート、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｄ−フルクトース−６−ホスファート、マロニル−［アシルキャリアタンパク質］、Ｄ−グルコース−１−ホスファート、ＧＤＰ、オキサロアセタート、還元チオレドキシン、ＦＡＤ、Ｄ−グルコース−６−ホスファート、酸化チオレドキシン、ＵＭＰ、ＣＴＰ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、α−Ｄ−リボース−５−ホスファート、ＵＤＰ−グルコース、５，６，７，８−テトラヒドロホラート、アセトアセチル−ＡＣＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰ、スクシニル−ＣｏＡ、Ｌ−トレオニン、プトレッシン、グリシン、ＧＭＰ、スペルミジン、ＩＭＰ、ホスファチジルグリセロール、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リシン、５，１０−メチレンテトラヒドロホラート、コリスメート、Ｄ−アラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アスパラギン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−グルコサミン−６−ホスファート、ニコチナート−Ｄ−リボヌクレオチド、ｄＧＴＰ、イミノアスパルタート、Ｄ−リブロース−５−ホスファート、ミリストイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１４：０ＡＣＰ）、３−メチル−２−オキソブタノアート、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、ｄＴＭＰ、ホスファチジン酸塩、Ｌ−バリン、バイカーボネート、ｄＣＴＰ、ｄＵＭＰ、Ｌ−グルタメート−５−セミアルデヒド、メソ−２，６−ジアミノヘプタンジオアート、ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソナート、ウンデカプレニルジホスファート、Ｌ−イソロイシン、ホスファチジルエタノールアミン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジン、ヘキサデセノイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１６：１ＡＣＰ）、１−ピロリン−５−カルボキシラート、スルフィット、カルバモイルホスファート、Ｄ−エリトロース−４−ホスファート、３−ホスホ−Ｄ−グリセラート、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、キサントシン−５’−ホスファート、ｄＴＴＰ、Ｌ−チロシン、Ｌ−ホモシステイン、ｄＡＴＰ、１０−ホルミルテトラヒドロホラート、Ｒ−３−ヒドロキシ−ミリストイル−ＡＣＰ、オクタデセノイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１８：１ＡＣＰ）、パルミトイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１６：０ＡＣＰ）、（Ｓ）−ジヒドロオロタート、テトラデセノイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１４：１ＡＣＰ）、２−オキソブタノアート、５−アミノ−１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）イミダゾール−４−カルボキサアミド、Ｌ−フェニルアラニン、ホスファチジルセリン、ＵＤＰ−２，３−ビス（３−ヒドロキシテトラデカノイル）グルコサミン、Ｌ−ホモセリン、ウンデカプレニ��ホスファート、（Ｒ）−パントテナート、オロタート、Ｌ−アスパルタート−４−セミアルデヒド、セドヘプツロース−７−ホスファート、Ｎ２−ホルミル−Ｎ１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）グリシンアミド、５−メチルテトラヒドロホラート、硫化水素、７，８−ジヒドロホラート、ｄＴＤＰ、グリコーゲン、ドデカノイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１２：０ＡＣＰ）、４−（１−Ｄ−リビチルアミノ）−５−アミノウラシル、プレフェナート、５−アミノ−１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）イミダゾール、ＫＤＯ（２）−脂質ＩＶ（Ａ）、Ｎ１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）グリシンアミド、５−［（５−ホスホ−１−デオキシリブロース−１−イルアミノ）メチリデンアミノ］−１−（５−ホスホリボシル）イミダゾール−４−カルボキサアミド、ホスファチジルグリセロホスファート、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニン、Ｎ−スクシニル−ＬＬ−２，６−ジアミノヘプタンジオアート、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプタナート−７−ホスファート、Ｏ−ホスホ−Ｌ−セリン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラマート、（Ｓ）−２−［５−アミノ−１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）イミダゾール−４−カルボキサアミド］スクシナート、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−γ−グルタミル−メソ−２，６−ジアミノピメラート、３−カルボキシ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタノアート、２，３−ビス（３−ヒドロキシテトラデカノイル）−β−Ｄ−グルコサミニル−１−ホスファート、３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソナート−８−ホスファート、Ｎ−（（Ｒ）−４−ホスホパントテノイル）−Ｌ−システイン、大腸菌のペプチドグリカンサブユニット、アデノシン−５’−ホスホスルファート、ジヒドロプテロアート、３−デヒドロシキマート、１−（５−ホスホリボシル）−ＡＭＰ、４−メチル−２−オキソペンタノアート、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース−７−ホスファート、２，３，４，５−テトラヒドロジピコリナート、３−ホスホヒドロキシピルバート、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース−１−ホスファート、Ｄ−エリトロ−１−（イミダゾール−４−イル）グリセロール−３−ホスファート、スルファート、ＵＤＰ−３−Ｏ−（３−ヒドロキシテトラデカノイル）−Ｎ−アセチルグルコサミン、２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−（Ｄ−エリトロ−１，２，３−トリヒドロキシプロピル）−７，８−ジヒドロプテリジン、ＵＤＰ−３−Ｏ−（３−ヒドロキシテトラデカノイル）−Ｄ−グルコサミン、オロチジン−５’−ホスファート、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−３−Ｏ−（１−カルボキシビニル）−Ｄ−グルコサミン、６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリン、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミル−メソ−２，６−ジアミノピメロイル−Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタメート、カルジオリピン、（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−３−メチルブタノアート、（Ｓ）−２−アセトラクタート、３’−ホスホアデニリルスルファート、１−（５−ホスホリボシル）−ＡＴＰ、２，３，２’３’−テトラキス（β−ヒドロ��シミリストイル）−Ｄ−グルコサミニル−１，６−β−Ｄ−グルコサミン−１，４’−ビスホスファート、シキマート−５−ホスファート、（Ｒ）−パントアート、２−デヒドロパントアート、ＣＤＰエタノールアミン、５−アミノ−１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）イミダゾール−４−カルボキシラート、５−ホスホ−β−Ｄ−リボシルアミン、Ｎ−スクシニル−２−Ｌ−アミノ−６−オキソヘプタンジオアート、Ｄ−４’−ホスホパントテナート、３−デオキシ−Ｄ−マンノ−２−オクツロソナート、ＡＤＰ−Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、β−アラニン、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン、キノリナート、２−（ホルムアミド）−Ｎ１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）アセトアミジン、Ｄ−アラビノース−５−ホスファート、１−（５−ホスホリボシル）−５−［（５−ホスホリボシルアミノ）メチリデンアミノ］イミダゾール−４−カルボキサアミド、リポ多糖体、６−ヒドロキシメチル−ジヒドロプテリンピロフォスファート、シキマート、ウンデカプレニル−ジホスホ−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミル−メソ−２，６−ジアミノピメロイル−Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン、ウンデカプレニル−ジホスホ−Ｎ−アセチルムラモイル−（Ｎ−アセチルグルコサミン）−Ｌ−ａｌａ−Ｄ−ｇｌｕ−メソ−２，６−ジアミノピメロイル−Ｄ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａ、５−ホスホリボシル−５−カルボキシアミノイミダゾール、３−カルボキシ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタノアート、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−１−ホスファート、Ｌ−シスタチオニン、（Ｓ）−３−メチル−２−オキソペンタノアート、５−Ｏ−（１−カルボキシビニル）−３−ホスホシキマート、２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−（エリトロ−１，２，３−トリヒドロキシプロピル）ジヒドロプテリジントリフォスファート、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース−１，７−ビスホスファート、３−（イミダゾール−４−イル）−２−オキソプロピルフォスファート、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホスファート、ラウリン酸を有するＫＤＯ（２）−脂質ＩＶ（Ａ）、２−イソプロピルマレアート、ＫＤＯ−脂質ＩＶ（Ａ）、ＡＤＰ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、ＫＤＯ（２）−脂質（Ａ）、Ｎ６−（１，２−ジカルボキシエチル）−ＡＭＰ、５−ホルムアミド−１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）イミダゾール−４−カルボキサアミド、脂質Ａ二糖、２，３−ジヒドロジピコリナート、３−デヒドロキナート、４−ホスホ−Ｌ−アスパルタート、Ｓ−アデノシルメチオニンアミン、３−カルボキシ−４−メチル−２−オキソペンタノアート、フェニルピルバート、Ｄ−グルコサミン−１−ホスファート、デホスホ−ＣｏＡ、ＡＤＰ−グルコース、４−アミノベンゾアート、Ｌ−ヒスチジノールホスファート、ＬＬ−２，６−ジアミノヘプタンジオアート、ジヒドロネオプテリンモノホスファート、パンテテイン−４’−ホスファート、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−アスパルタート、（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−３−メチルペンタノアート、マロニル−ＣｏＡ、４−アミノ−４−デオキシコリスメート、Ｄ−グルタメート、３−（４−ヒドロキシ��ェニル）ピルバート、Ｌ−ヒスチジノール、デアミノ−ＮＡＤ＋および（Ｓ）−２−アセト−２−ヒドロキシブタノアートよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載の代謝フラックス分析を用いた微生物の成長に必須の代謝産物のスクリーニング方法。
【請求項５】
フラックスサム（Φ）の減少による細胞成長の減少類型は、線形的に減少する類型、臨界値未満に減少する類型、及び非線形的に減少してフラックスサム（Φ）が０に達する前に細胞成長が停止する類型よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項３に記載の代謝フラックス分析を用いた微生物の成長に必須の代謝産物のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記細胞成長の減少類型によってフラックスサム（Φ）の摂動量を変化させることを特徴とする、請求項５に記載の代謝フラックス分析を用いた微生物の成長に必須の代謝産物のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記対象微生物が大腸菌であることを特徴とする、請求項１に記載の代謝フラックス分析を用いた微生物の成長に必須の代謝産物のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記対象微生物が病原性微生物であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載の代謝フラックス分析を用いた微生物の成長に必須の代謝産物のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法によりスクリーニングされた微生物の成長に必須の代謝産物に関与する遺伝子を選別することを特徴とする、微生物の成長に必須の遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記対象微生物が大腸菌であることを特徴とする、請求項９に記載の微生物の成長に必須の遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記対象微生物が病原性微生物であることを特徴とする、請求項９に記載の微生物の成長に必須の遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法によりスクリーニングされた大腸菌の成長に必須の遺伝子でモデル微生物を形質転換することを特徴とする、形質転換された微生物の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法によりスクリーニングされた病原性微生物の成長に必須の遺伝子でモデル微生物を形質転換することを特徴とする、形質転換された微生物の製造方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法により製造され、大腸菌の成長に必須の遺伝子で形質転換された微生物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法により製造され、病原性微生物の成長に必須の遺伝子で形質転換された微生物。
【請求項１６】
次のステップを含む病原性微生物の成長を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）病原性微生物の成長抑制候補物質の存在下で請求項１５に記載の形質転換微生物を培養するステップと、
（ｂ）前記成長抑制候補物質なしに培養する場合と比較して、前記形質転換微生物の成長が抑制される場合の候補物質を、病原性微生物の成長を抑制する物質として選定するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝フラックス分析を用いて微生物の成長に必須の代謝産物をスクリーニングする方法に関し、さらに詳しくは、対象微生物を選定し、選定された微生物の代謝回路モデルを構築した後、前記構築された代謝回路モデルにおいて各代謝産物の消費反応式を不活性化させ、代謝フラックスを分析して、微生物の成長に必須の代謝産物を選定した後、フラックスサム（Φ）として定義した各代謝産物の活用度を用いて前記選定された代謝産物を確認して、微生物の成長に必須の代謝産物をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系が弱化された者が病原性微生物に感染する場合には、治療が極めて困難であり、致命的な結果が招かれることがある。このため、病原性微生物のゲノム情報を活用してより効果的な抗病原性薬物を開発するための標的を見出す努力が盛んになされている。しかしながら、どのような遺伝子産物が理想的な薬物標的となって病原性微生物を死滅できるかを確認することは困難であり、病原性微生物の全ての単一遺伝子を欠失させていきながら当該遺伝子の致死性を確認することには技術的な困難がある。また、多くの場合、薬物標的は一つの遺伝子ではなく、複雑な細胞構成要素間の相互作用により決定され、それぞれの遺伝子が致死性を持たない場合にも複数の遺伝子欠失において致死性が現れるなどその組み合わせは極めて複雑である。
【０００３】
このため、病原性微生物を標的とする効果的な薬物を開発するために微生物細胞構成要素間の細胞機構および相互作用を理解することが極めて重要である。この理由から、ゲノム情報と機能遺伝学の発展を通じての代謝産物と代謝回路の構築は、細胞構成要素を構成するための遺伝子とタンパク質との相互作用を理解し、代謝回路を構成して効果的な薬物を開発する上でその重要性を増している。
【０００４】
実際に、ゲノム情報を通じての代謝回路情報を用いて、哺乳動物の細胞において発見されない新たな代謝経路が病原性微生物において同定される場合、このような代謝特性を標的とする治療法を開発して人体細胞には副作用を誘発せずに、病原性細胞だけを特異的に攻撃することが可能になる。一方、病原性微生物が生存するのに特定の代謝経路が必須であるということが判明した場合、当該代謝経路を抑制する薬物を開発することが可能である。一旦、病原性微生物に対する薬物が開発されれば、これと類似する化合物を活用して他の類似する病原性微生物を抑制する薬物が容易に得られると見込まれる。
【０００５】
代謝回路を通じての分析及び予測技術は、最近急増しつつあるゲノム情報と一緒にその可能性を示している。特に、各微生物の代謝回路モデルが、数学的モデル及び最適化技術などと組み合わせられて、特定の遺伝子の除去または追加後に起こる代謝回路の反応を予測することが可能になっている（Lee et al., Trends Biotechnol., 23:349, 2005）。また、周知の如く、代謝回路を用いた代謝フラックスの分析（ＭＦＡ）技法は動的情報を必要としないにも拘わらず、細胞の理想的な代謝フラックスを示し、実際的に細胞の行動を正確に模似し且つ予測することができる（Papin, J. et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology, 6:99, 2005）。代謝フラックス分析は、代謝反応式の係数と種々の代謝産物の産生及び消耗量を測定することにより、内部の代謝フラックスの変化を把握する技術であり、準定常状態の仮定に基づいている。
【０００６】
代謝フラックス分析は、生化学反応式の質量収支と細胞組成情報だけを用いて細胞が到達可能な理想的な代謝フラックス空間を求め、特定の目的関数を、最適化方法を通じて最大化させたり最小化させることを目的とする（細胞成長速度の最大化または特定の摂動（perturbation）による代謝調節の最小化など）。その他に、代謝フラックス分析は、一般に、菌株改良を通じて所望の代謝産物の特定の遺伝子の致死性を確認するために使用することができ、これを用いて菌株内部の代謝経路特性を把握することができる。なお、遺伝子の除去または追加により起こる代謝回路の流れ変化などを予測するために、代謝フラックスの分析方法を応用した種々の研究が報告されている。
【０００７】
本発明者らは、特定の代謝産物と有用物質産生との関係を予測することができ、特定の代謝産物と関連する酵素を発現する遺伝子を導入または増幅させて、有用物質の産生性が増大された生物を開発可能な代謝産物のフラックスサムを用いたインシリコ生物の改良方法を開示している（韓国登録特許第１０−６５５４９５号公報）。
【０００８】
特に、米国特許出願公開第ＵＳ２００２／０１６８６５４号明細書には、特定の制約を通じて流動平衡分析（flux balance analysis；ＦＢＡ）モデルを向上可能な細胞代謝のインシリコモデリング方法を開示している。前記特許は、細胞成長に影響を与える制約を通じて、細胞の成長速度を維持するための最小の代謝反応を確認しようとするものであり、前記確認された最小の代謝反応に関与する遺伝子のうち、細胞成長の低下に影響を与えながら、互いに密接な関係にある遺伝子は確認し難いという問題点がある。
【０００９】
そこで、当業界においては、代謝フラックスの分析技法を用いて、部分的な代謝情報を用いた菌株操作ではなく、全体的な観点から複雑な微生物の代謝を考察し、特定の遺伝子に対する操作が全体の代謝フラックスに及ぼす影響を把握して病原性微生物の標的遺伝子を正確に予測可能な方法の開発が切望されている。
【００１０】
そこで、本発明者らは効率的に病原性を含む微生物の標的遺伝子を予測可能な方法を見出すために鋭意努力した結果、代謝回路モデルにおいて各代謝産物の消費反応式を不活性化させて代謝フラックスを分析し、不活性化させなかった場合に比べて細胞成長速度が減少する場合の代謝産物を選定し、前記選定された各代謝産物の微生物の成長に必須の標的遺伝子を発見できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【００１１】
本発明の主たる目的は、代謝フラックス分析を用いた微生物の成長に必須の代謝産物をスクリーニングする方法を提供するところにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記スクリーニングされた代謝産物と関連する代謝回路から、微生物の成長に必須の代謝産物に関与する遺伝子を選別することを特徴とする、微生物の成長に必須の遺伝子のスクリーニング方法を提供するところにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記スクリーニングされた遺伝子を用いて病原性微生物の成長を抑制する物質のスクリーニング方法を提供するところにある。
【００１４】
前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）対象微生物を選定し、選定された微生物の代謝回路モデルを構築するステップと、（ｂ）前記構築された代謝回路モデルにおいて各代謝産物の消費反応式を不活性化させて代謝フラックスを分析し、下記式２を用いて、元の細胞成長速度に比べて細胞成長速度が５０％未満に減少する場合の代謝産物を、微生物の成長に必須の代謝産物として選定するステップと、を含む代謝フラックス分析を用いた微生物の成長に必須の代謝産物のスクリーニング方法を提供する。
【００１５】
【数１】
2010512783.tif 000003
ここで、ｒｗｉｌｄは元の細胞成長速度を示し、ｒｌｏｓｓは当該代謝産物の消費反応式を不活性化させたときに減少する細胞成長速度を示す。
【００１６】
本発明において、前記代謝産物の消費反応式を不活性化させる方法は、当該消費反応式の代謝フラックス値を０に固定して計算することを特徴とする。
【００１７】
本発明において、前記（ｂ）ステップ後に、（ｃ）前記（ｂ）ステップにおいて選定された代謝産物の活用度を下記式３で表されるフラックスサム（Φ）として定義し、各代謝産物のΦ値を計算するステップと、（ｄ）選定された各代謝産物のΦ値を減少させる場合、細胞成長が減少または停止する場合の代謝産物を微生物の成長に必須の代謝産物として確認するステップと、をさらに含むことを特徴とする、代謝フラックス分析を用いた微生物の成長に必須の代謝産物のスクリーニング方法を提供する。
【００１８】
【数２】
2010512783.tif 000004
ここで、Φｉはｉ番目の代謝産物のフラックスサム（Φ）を示し、Ｓｉｊはｉ番目の代謝産物とｊ番目の代謝反応の化学量論係数を示し、νｊはｊ番目の代謝反応の代謝フラックスを示す。また、Ｐｉはｉ番目の代謝産物を産生する代謝反応の集合であり、Ｃｉはｉ番目の代謝産物を消費する代謝反応の集合である。
【００１９】
本発明において、前記必須代謝産物は、Ｈ＋、Ｈ２Ｏ、ＡＴＰ、ホスファート、ＡＤＰ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＣＯ２、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ピルバート、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、Ｌ−グルタメート、コエンザイムＡ、アンモニウム、ＡＭＰ、アセチル−ＣｏＡ、２−オキソグルタラート、アシルキャリアタンパク質、ホスホエノールピルバート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−グルタミン、グリセルアルデヒド−３−ホスファート、ＣＭＰ、グリセロール−３−ホスファート、ＧＴＰ、５−ホスホ−α−Ｄ−リボース−１−ジホスファート、ジヒドロキシアセトンホスファート、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｄ−フルクトース−６−ホスファート、マロニル−［アシルキャリアタンパク質］、Ｄ−グルコース−１−ホスファート、ＧＤＰ、オキサロアセタート、還元チオレドキシン、ＦＡＤ、Ｄ−グルコース−６−ホスファート、酸化チオレドキシン、ＵＭＰ、ＣＴＰ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、α−Ｄ−リボース−５−ホスファート、ＵＤＰ−グルコース、５，６，７，８−テトラヒドロホラート、アセトアセチル−ＡＣＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰ、スクシニル−ＣｏＡ、Ｌ−トレオニン、プトレッシン、グリシン、ＧＭＰ、スペルミジン、ＩＭＰ、ホスファチジルグリセロール、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リシン、５，１０−メチレンテトラヒドロホラート、コリスメート、Ｄ−アラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アスパラギン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−グルコサミン−６−ホスファート、ニコチナート−Ｄ−リボヌクレオチド、ｄＧＴＰ、イミノアスパルタート、Ｄ−リブロース−５−ホスファート、ミリストイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１４：０ＡＣＰ）、３−メチル−２−オキソブタノアート、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、ｄＴＭＰ、ホスファチジン酸塩、Ｌ−バリン、バイカーボネート、ｄＣＴＰ、ｄＵＭＰ、Ｌ−グルタメート−５−セミアルデヒド、メソ−２，６−ジアミノヘプタンジオアート、ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソナート、ウンデカプレニルジホスファート、Ｌ−イソロイシン、ホスファチジルエタノールアミン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジン、ヘキサデセノイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１６：１ＡＣＰ）、１−ピロリン−５−カルボキシラート、スルフィット、カルバモイルホスファート、Ｄ−エリトロース−４−ホスファート、３−ホスホ−Ｄ−グリセラート、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、キサントシン−５’−ホスファート、ｄＴＴＰ、Ｌ−チロシン、Ｌ−ホモシステイン、ｄＡＴＰ、１０−ホルミルテトラヒドロホラート、Ｒ−３−ヒドロキシ−ミリストイル−ＡＣＰ、オクタデセノイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１８：１ＡＣＰ）、パルミトイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１６：０ＡＣＰ）、（Ｓ）−ジヒドロオロタート、テトラデセノイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１４：１ＡＣＰ）、２−オキソブタノアート、５−アミノ−１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）イミダゾール−４−カルボキサアミド、Ｌ−フェニルアラニン、ホスファチジルセリン、ＵＤＰ−２，３−ビス（３−ヒドロキシテトラデカノイル）グルコサミン、Ｌ−ホモセリン��ウンデカプレニルホスファート、（Ｒ）−パントテナート、オロタート、Ｌ−アスパルタート−４−セミアルデヒド、セドヘプツロース−７−ホスファート、Ｎ２−ホルミル−Ｎ１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）グリシンアミド、５−メチルテトラヒドロホラート、硫化水素、７，８−ジヒドロホラート、ｄＴＤＰ、グリコーゲン、ドデカノイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１２：０ＡＣＰ）、４−（１−Ｄ−リビチルアミノ）−５−アミノウラシル、プレフェナート、５−アミノ−１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）イミダゾール、ＫＤＯ（２）−脂質ＩＶ（Ａ）、Ｎ１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）グリシンアミド、５−［（５−ホスホ−１−デオキシリブロース−１−イルアミノ）メチリデンアミノ］−１−（５−ホスホリボシル）イミダゾール−４−カルボキサアミド、ホスファチジルグリセロホスファート、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニン、Ｎ−スクシニル−ＬＬ−２，６−ジアミノヘプタンジオアート、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプタナート−７−ホスファート、Ｏ−ホスホ−Ｌ−セリン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラマート、（Ｓ）−２−［５−アミノ−１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）イミダゾール−４−カルボキサアミド］スクシナート、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−γ−グルタミル−メソ−２，６−ジアミノピメラート、３−カルボキシ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタノアート、２，３−ビス（３−ヒドロキシテトラデカノイル）−β−Ｄ−グルコサミニル−１−ホスファート、３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソナート−８−ホスファート、Ｎ−（（Ｒ）−４−ホスホパントテノイル）−Ｌ−システイン、大腸菌のペプチドグリカンサブユニット、アデノシン−５’−ホスホスルファート、ジヒドロプテロアート、３−デヒドロシキマート、１−（５−ホスホリボシル）−ＡＭＰ、４−メチル−２−オキソペンタノアート、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース−７−ホスファート、２，３，４，５−テトラヒドロジピコリナート、３−ホスホヒドロキシピルバート、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース−１−ホスファート、Ｄ−エリトロ−１−（イミダゾール−４−イル）グリセロール−３−ホスファート、スルファート、ＵＤＰ−３−Ｏ−（３−ヒドロキシテトラデカノイル）−Ｎ−アセチルグルコサミン、２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−（Ｄ−エリトロ−１，２，３−トリヒドロキシプロピル）−７，８−ジヒドロプテリジン、ＵＤＰ−３−Ｏ−（３−ヒドロキシテトラデカノイル）−Ｄ−グルコサミン、オロチジン−５’−ホスファート、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−３−Ｏ−（１−カルボキシビニル）−Ｄ−グルコサミン、６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリン、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミル−メソ−２，６−ジアミノピメロイル−Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタメート、カルジオリピン、（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−３−メチルブタノアート、（Ｓ）−２−アセトラクタート、３’−ホスホアデニリルスルファート、１−（５−ホスホリボシル）−ＡＴＰ、２，３，２’３’−テトラ���ス（β−ヒドロキシミリストイル）−Ｄ−グルコサミニル−１，６−β−Ｄ−グルコサミン−１，４’−ビスホスファート、シキマート−５−ホスファート、（Ｒ）−パントアート、２−デヒドロパントアート、ＣＤＰエタノールアミン、５−アミノ−１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）イミダゾール−４−カルボキシラート、５−ホスホ−β−Ｄ−リボシルアミン、Ｎ−スクシニル−２−Ｌ−アミノ−６−オキソヘプタンジオアート、Ｄ−４’−ホスホパントテナート、３−デオキシ−Ｄ−マンノ−２−オクツロソナート、ＡＤＰ−Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、β−アラニン、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン、キノリナート、２−（ホルムアミド）−Ｎ１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）アセトアミジン、Ｄ−アラビノース−５−ホスファート、１−（５−ホスホリボシル）−５−［（５−ホスホリボシルアミノ）メチリデンアミノ］イミダゾール−４−カルボキサアミド、リポ多糖体、６−ヒドロキシメチル−ジヒドロプテリンピロフォスファート、シキマート、ウンデカプレニル−ジホスホ−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミル−メソ−２，６−ジアミノピメロイル−Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン、ウンデカプレニル−ジホスホ−Ｎ−アセチルムラモイル−（Ｎ−アセチルグルコサミン）−Ｌ−ａｌａ−Ｄ−ｇｌｕ−メソ−２，６−ジアミノピメロイル−Ｄ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａ、５−ホスホリボシル−５−カルボキシアミノイミダゾール、３−カルボキシ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタノアート、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−１−ホスファート、Ｌ−シスタチオニン、（Ｓ）−３−メチル−２−オキソペンタノアート、５−Ｏ−（１−カルボキシビニル）−３−ホスホシキマート、２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−（エリトロ−１，２，３−トリヒドロキシプロピル）ジヒドロプテリジントリフォスファート、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース−１，７−ビスホスファート、３−（イミダゾール−４−イル）−２−オキソプロピルフォスファート、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホスファート、ラウリン酸を有するＫＤＯ（２）−脂質ＩＶ（Ａ）、２−イソプロピルマレアート、ＫＤＯ−脂質ＩＶ（Ａ）、ＡＤＰ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、ＫＤＯ（２）−脂質（Ａ）、Ｎ６−（１，２−ジカルボキシエチル）−ＡＭＰ、５−ホルムアミド−１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）イミダゾール−４−カルボキサアミド、脂質Ａ二糖、２，３−ジヒドロジピコリナート、３−デヒドロキナート、４−ホスホ−Ｌ−アスパルタート、Ｓ−アデノシルメチオニンアミン、３−カルボキシ−４−メチル−２−オキソペンタノアート、フェニルピルバート、Ｄ−グルコサミン−１−ホスファート、デホスホ−ＣｏＡ、ＡＤＰ−グルコース、４−アミノベンゾアート、Ｌ−ヒスチジノールホスファート、ＬＬ−２，６−ジアミノヘプタンジオアート、ジヒドロネオプテリンモノホスファート、パンテテイン−４’−ホスファート、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−アスパルタート、（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−３−メチルペンタノアート、マロニル−ＣｏＡ、４−アミノ−４−デオキシコリスメート、Ｄ−グルタメート、３−��４−ヒドロキシフェニル）ピルバート、Ｌ−ヒスチジノール、デアミノ−ＮＡＤ＋および（Ｓ）−２−アセト−２−ヒドロキシブタノアートよりなる群から選ばれることを特徴とする。
【００２０】
本発明において、フラックスサム（Φ）の減少による細胞成長の減少類型は、線形的に減少する類型、臨界値未満に減少する類型、及び非線形的に減少してフラックスサム（Φ）が０に達する前に細胞成長が停止する類型よりなる群から選ばれることを特徴とし、前記細胞成長の減少類型によってフラックスサム（Φ）の摂動量を変化させることを特徴とする。
【００２１】
本発明はまた、前記方法によりスクリーニングされた微生物の成長に必須の代謝産物に関与する遺伝子を選別することを特徴とする、微生物の成長に必須の遺伝子のスクリーニング方法を提供する。本発明において、前記対象微生物は大腸菌または病原性微生物であることを特徴とする。
【００２２】
さらに、本発明は、前記方法によりスクリーニングされた大腸菌または病原性微生物の成長に必須の遺伝子でモデル微生物を形質転換することを特徴とする、形質転換された微生物の製造方法を提供する。
【００２３】
さらに、本発明は、前記方法により製造され、大腸菌または病原性微生物の成長に必須の遺伝子で形質転換された微生物を提供する。
【００２４】
さらに、本発明は、（ａ）病原性微生物の成長抑制候補物質の存在下で前記形質転換微生物を培養するステップと、（ｂ）前記成長抑制候補物質なしに培養する場合と比較して、前記形質転換微生物の成長が抑制される場合の候補物質を病原性微生物の成長を抑制する物質として選定するステップと、を含む病原性微生物の成長を抑制する物質のスクリーニング方法を提供する。
【００２５】
本発明の他の特徴及び具現例は下記の詳細な説明及び特許請求の範囲から一層明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】必須代謝産物の確認のための概念図であり、当該代謝産物を消費する代謝反応を不活性化させたときの細胞成長速度の減少比率（ｆ）を確認して０．５未満である場合に、必須代謝産物と分類し、０．５以上の場合に非必須代謝産物と分類した。
【図２】フラックスサム（Φ）の摂動による細胞成長速度の変化を予測したものである（Ａ：フラックスサム（Φ）が減少するにつれて線形的に減少する場合、Ｂ：フラックスサム（Φ）が減少するにつれて臨界値を有していて臨界値未満に減少する場合、Ｃ：フラックスサム（Φ）が減少するにつれて非線形的に減少してフラックスサム（Φ）が０の値を有する前に細胞成長速度が０に達する場合）。
【図３】必須代謝産物及び非必須代謝産物が除去された細胞の成長速度を示すものである（縦軸：遺伝子除去後に細胞の成長速度を正常細胞の成長速度に対する比率で表示したもの、横軸：除去された遺伝子（Ｐ：ｐｕｒＮ、Ｌ：ｌｐｄＡ、Ｇ：ｇｌｙＡ、ＰＬ：ｐｕｒＮ／ｌｐｄＡ、ＰＬＧ：ｐｕｒＮ／ｌｐｄＡ／ｇｌｙＡ、及びＤＸ：ｄｘｓ／ｘｙｌＢ）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明において、摂動とは、あらゆる代謝産物の集団に特定の外部要因を加えて乱すことにより所望の特性の代謝産物を見出す措置を意味する。
【００２８】
本発明において、遺伝子「欠失」とは、遺伝子の塩基配列のうち全体または一部を生物内において、除去したり変更するなど生物内において特定の遺伝子が発現されないようにする操作をいずれも包括する。
【００２９】
本発明において、「培養」とは、バクテリア、酵母、カビ、動植物細胞など微生物の培養だけではなく、植物の栽培及び動物の飼育も包括するものと定義する。
【００３０】
本発明において、「対象微生物」とは、成長に必須の代謝産物をスクリーニングするための微生物を意味する。
【００３１】
本発明において、「代謝回路モデル」とは、対象微生物において起こるあらゆる生化学反応を含む物質代謝の経路を意味する。
【００３２】
本発明において、「代謝産物の消費反応式」とは、代謝回路に存在する代謝産物が消費される方向に進行する反応を示す式である。
【００３３】
１．代謝回路の構築
本発明においては、細胞成長を抑制するための対象菌株として大腸菌変異菌株を用いて新たな代謝フラックス分析システムを構築した。このシステムは、大腸菌の代謝回路をほとんど含んでいる。
【００３４】
２．必須代謝産物の定義及び必須代謝産物の選定
２−１：必須代謝産物の定義
構築された代謝回路を数学的に表現するために、あらゆる代謝産物、前記代謝産物の代謝経路及び前記代謝経路における化学量論マトリックス（Ｓｉｊ：ｊ番目の反応におけるｉ番目の代謝産物の時間による化学量論係数）を用いて、代謝フラックスベクトル（νｊ：ｊ番目の代謝反応の代謝フラックス）を計算することができるが、代謝産物濃度Ｘの経時変化はあらゆる代謝反応の流れの総和で表すことができる。
【００３５】
また、Ｘの経時変化量が一定であるとしたとき、すなわち、準定常状態の仮定下において、代謝産物濃度Ｘの経時変化量は下記式１のように定義することができる。
【００３６】
【数３】
2010512783.tif 000005
ここで、Ｓ・ν：Ｘの経時変化量、Ｘ：代謝産物濃度、ｔ：時間。
【００３７】
また、代謝フラックス分析を通じて、各代謝産物に対して、細胞がその代謝産物を代謝反応を通じて消費しないときに細胞の成長に及ぼす影響を調べることにより、代謝産物の必須性を決定することができる。代謝産物の不可欠性は代謝フラックス分析過程中に各代謝産物を消費するあらゆる代謝反応を不活性化させた状態で細胞の成長速度を計算して、これが正常的な細胞成長速度においていかに異なっているかを計算する。
【００３８】
【数４】
2010512783.tif 000006
ここで、ｒｗｉｌｄは元の細胞成長速度を示し、ｒｌｏｓｓは当該代謝産物の消費反応式を不活性化させたときに減少する細胞成長速度を示す。
【００３９】
２−２：必須代謝産物の選定
前記不可欠性を選定するための分析過程中に、与えられた代謝産物を消費せずに産生する代謝反応を不活性化させない理由は、もし代謝産物が必須ではないとしても、その代謝産物を産生する代謝反応は他の必須代謝産物も産生する可能性があるため、前記代謝反応の不活性化に起因して細胞成長が抑制されるならば、それはそもそもは非必須の代謝産物が必須の代謝産物として誤解される可能性があるためである。上記の点に留意して、結果的に、代謝産物を、計算した細胞の成長速度が正常細胞の成長速度の半分に達しなければ必須代謝産物と分類し、そうでなければ非必須代謝産物と分類することができる（図１）。図１は、必須代謝産物確認のための概念図であり、当該代謝産物を消費する代謝反応を不活性化させたときの細胞成長速度の減少の比率（ｆ）を確認して、０．５未満である場合には必須代謝産物と分類し、０．５以上である場合には非必須代謝産物と分類した。
【００４０】
３．フラックスサムの定義と摂動
各代謝産物が１時間当たりに産生されたり消費される総量、すなわち、フラックスサム（Φ）を下記式３のように定義して、この量が正常レベルから外れたときに細胞の成長に及ぼす影響を体系的に分析した。
【００４１】
【数５】
2010512783.tif 000007
式中、Φｉはｉ番目の代謝産物のフラックスサム（Φ）を示し、Ｓｉｊはｉ番目の代謝産物とｊ番目の代謝反応の化学量論係数を示し、νｊはｊ番目の代謝反応の代謝フラックスを示す。また、Ｐｉはｉ番目の代謝産物を産生する代謝反応の集合であり、Ｃｉはｉ番目の代謝産物を消費する代謝反応の集合である。
【００４２】
フラックスサム（Φ）は、既存の代謝フラックスの分析方法においては表示できなかった代謝産物の活用度を示すために新たに定義された量であり、当該代謝産物の利用量が増加するにつれてΦ値は大きくなり、当該代謝産物の利用量が減少するにつれてΦの値は小さくなる。
【００４３】
もし、代謝回路に摂動が加えられるとき、細胞の成長速度が正常レベルからあまり変化しないならば、必須代謝産物のフラックスサム（Φ）も非必須代謝産物よりは正常レベルからあまり外れていないということを確認することができる。すなわち、細胞に必須の代謝産物は、その産生比率または消費比率をできる限り一定に維持することにより、細胞の成長速度を安定化させる傾向があると言える。このため、必須代謝産物のフラックスサム（Φ）が正常数値から減少する場合、これは細胞の成長に大きな打撃を負わせる恐れがある。すなわち、必須代謝産物のフラックスサム（Φ）が半分に減少する場合、ほとんどの場合（約８５％）に全体細胞の成長速度は半分やそれ以下に減少し、そして、必須代謝産物のフラックスサム（Φ）を０近くに低減することにより、細胞の成長そのものを止める効果を予測することができる。
【００４４】
通常の代謝フラックス分析においては、特定の遺伝子欠失による細胞成長速度を確認するために、各当該反応式を不活性化させる方法を利用する。しかしながら、このような方法を利用する場合、２以上の遺伝子欠失による細胞成長低下現象を確認するためには、実際に２以上の組み合わせによる場合をいずれも計算しなければならないという欠点がある。これに対し、各代謝産物の不可欠性を定義し、その活用度を定義して各代謝産物の特性を調べてみる場合、２以上の遺伝子欠失による細胞成長低下現象を容易に確認することができるというメリットがある。
【００４５】
実施例
以下、本発明を、実施例を参照しながら詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界において通常の知識を持った者にとって自明である。
【００４６】
特に、下記の実施例には、大腸菌をモデルシステムとして用いた微生物の成長に必須の代謝産物のスクリーニング方法についてのみ例示されているが、当業者であれば、大腸菌以外の他のバクテリア、酵母、カビ及び動植物をモデルとして用いる場合にも適用されるということは本明細書に開示された内容から理解できるであろう。
【００４７】
実施例１：モデルシステムの構築
微生物の成長に必須の代謝産物のスクリーニングのための対象菌株として大腸菌の変異菌株を用いて、新たな代謝フラックス分析システムを構築した。このシステムは、大腸菌の代謝回路をほとんど含んでいる。大腸菌の場合、新たな代謝回路は９７９個の生化学反応から構成されており、８１４個の代謝産物が代謝回路において考慮される（Lee et al., Biotechnol. Bioproc. Eng., 10: 425-431, 2005）。
【００４８】
実施例２：必須代謝産物の選定方法
実施例１において構築した代謝フラックスシステムにおいて、大腸菌の８１４個の代謝産物を対象として代謝フラックス分析を行った。代謝産物の不可欠性は、代謝フラックス分析過程中に各代謝産物を消費するあらゆる代謝反応を不活性化させた状態で、すなわち、当該消費反応式の代謝フラックス値を０に固定した状態で、細胞の成長速度を計算してこれが正常的な細胞成長速度においていかに異なっているかを、下記式２を用いて計算した。
【００４９】
【数６】
2010512783.tif 000008
（式中、ｒｗｉｌｄは元の細胞成長速度を示し、ｒｌｏｓｓは当該代謝産物の消費反応式を不活性化させたときに減少する細胞成長速度を示す。）
【００５０】
代謝産物を消費する代謝反応を不活性化させたときの細胞成長速度の減少比率（ｆ）を確認して、０．５未満である場合に必須代謝産物と分類した。また、細胞の様々な成長条件、すなわち、表１に示すように、細胞の１９種類の成長条件に対して大腸菌において考慮される下記の８１４個の代謝産物を対象として不可欠性を調査した。
【００５１】
Ｈ＋、Ｈ２Ｏ、ＡＴＰ、ホスファート、ＡＤＰ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＣＯ２、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ピルバート、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、Ｌ−グルタメート、コエンザイムＡ、アンモニウム、ＡＭＰ、アセチル−ＣｏＡ、２−オキソグルタラート、アシルキャリアタンパク質、ホスホエノールピルバート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−グルタミン、グリセルアルデヒド−３−ホスファート、ＣＭＰ、グリセロール−３−ホスファート、ＧＴＰ、５−ホスホ−α−Ｄ−リボース−１−ジホスファート、ジヒドロキシアセトンホスファート、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｄ−フルクトース−６−ホスファート、マロニル−［アシルキャリアタンパク質］、Ｄ−グルコース−１−ホスファート、ＧＤＰ、オキサロアセタート、還元チオレドキシン、ＦＡＤ、Ｄ−グルコース−６−ホスファート、酸化チオレドキシン、ＵＭＰ、ＣＴＰ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、Ｌ−システイン、α−Ｄ−リボース−５−ホスファート、ＵＤＰ−グルコース、５，６，７，８−テトラヒドロホラート、アセトアセチル−ＡＣＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰ、スクシニル−ＣｏＡ、Ｌ−トレオニン、プトレッシン、グリシン、ＧＭＰ、スペルミジン、ＩＭＰ、ホスファチジルグリセロール、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リシン、５，１０−メチレンテトラヒドロホラート、コリスメート、Ｄ−アラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アスパラギン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−グルコサミン−６−ホスファート、ニコチナート−Ｄ−リボヌクレオチド、ｄＧＴＰ、イミノアスパルタート、Ｄ−リブロース−５−ホスファート、ミリストイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１４：０ＡＣＰ）、３−メチル−２−オキソブタノアート、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、ｄＴＭＰ、ホスファチジン酸塩、Ｌ−バリン、バイカーボネート、ｄＣＴＰ、ｄＵＭＰ、Ｌ−グルタメート−５−セミアルデヒド、メソ−２，６−ジアミノヘプタンジオアート、ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソナート、ウンデカプレニルジホスファート、Ｌ−イソロイシン、ホスファチジルエタノールアミン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ヒスチジン、ヘキサデセノイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１６：１ＡＣＰ）、１−ピロリン−５−カルボキシラート、スルフィット、カルバモイルホスファート、Ｄ−エリトロース−４−ホスファート、３−ホスホ−Ｄ−グリセラート、ＣＤＰ−ジアシルグリセロール、キサントシン−５’−ホスファート、ｄＴＴＰ、Ｌ−チロシン、Ｌ−ホモシステイン、ｄＡＴＰ、１０−ホルミルテトラヒドロホラート、Ｒ−３−ヒドロキシ−ミリストイル−ＡＣＰ、オクタデセノイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１８：１ＡＣＰ）、パルミトイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１６：０ＡＣＰ）、（Ｓ）−ジヒドロオロタート、テトラデセノイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１４：１ＡＣＰ）、２−オキソブタノアート、５−アミノ−１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）イミダゾール−４−カルボキサアミド、Ｌ−フェニルアラニン、ホスファチジルセリン、ＵＤＰ−２，３−ビス（３−ヒドロキシテトラデカノイル）グルコサミン、Ｌ−ホモセリン、ウンデカプレニルホスファート、（Ｒ��−パントテナート、オロタート、Ｌ−アスパルタート−４−セミアルデヒド、セドヘプツロース−７−ホスファート、Ｎ２−ホルミル−Ｎ１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）グリシンアミド、５−メチルテトラヒドロホラート、硫化水素、７，８−ジヒドロホラート、ｄＴＤＰ、グリコーゲン、ドデカノイル−ＡＣＰ（ｎ−Ｃ１２：０ＡＣＰ）、４−（１−Ｄ−リビチルアミノ）−５−アミノウラシル、プレフェナート、５−アミノ−１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）イミダゾール、ＫＤＯ（２）−脂質ＩＶ（Ａ）、Ｎ１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）グリシンアミド、５−［（５−ホスホ−１−デオキシリブロース−１−イルアミノ）メチリデンアミノ］−１−（５−ホスホリボシル）イミダゾール−４−カルボキサアミド、ホスファチジルグリセロホスファート、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニン、Ｎ−スクシニル−ＬＬ−２，６−ジアミノヘプタンジオアート、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプタナート−７−ホスファート、Ｏ−ホスホ−Ｌ−セリン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラマート、（Ｓ）−２−［５−アミノ−１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）イミダゾール−４−カルボキサアミド］スクシナート、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−γ−グルタミル−メソ−２，６−ジアミノピメラート、３−カルボキシ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタノアート、２，３−ビス（３−ヒドロキシテトラデカノイル）−β−Ｄ−グルコサミニル−１−ホスファート、３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソナート−８−ホスファート、Ｎ−（（Ｒ）−４−ホスホパントテノイル）−Ｌ−システイン、大腸菌のペプチドグリカンサブユニット、アデノシン−５’−ホスホスルファート、ジヒドロプテロアート、３−デヒドロシキマート、１−（５−ホスホリボシル）−ＡＭＰ、４−メチル−２−オキソペンタノアート、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース−７−ホスファート、２，３，４，５−テトラヒドロジピコリナート、３−ホスホヒドロキシピルバート、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース−１−ホスファート、Ｄ−エリトロ−１−（イミダゾール−４−イル）グリセロール−３−ホスファート、スルファート、ＵＤＰ−３−Ｏ−（３−ヒドロキシテトラデカノイル）−Ｎ−アセチルグルコサミン、２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−（Ｄ−エリトロ−１，２，３−トリヒドロキシプロピル）−７，８−ジヒドロプテリジン、ＵＤＰ−３−Ｏ−（３−ヒドロキシテトラデカノイル）−Ｄ−グルコサミン、オロチジン−５’−ホスファート、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−３−Ｏ−（１−カルボキシビニル）−Ｄ−グルコサミン、６−ヒドロキシメチルジヒドロプテリン、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミル−メソ−２，６−ジアミノピメロイル−Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタメート、カルジオリピン、（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−３−メチルブタノアート、（Ｓ）−２−アセトラクタート、３’−ホスホアデニリルスルファート、１−（５−ホスホリボシル）−ＡＴＰ、２，３，２’３’−テトラキス（β−ヒドロキシミリストイル）−��−グルコサミニル−１，６−β−Ｄ−グルコサミン−１，４’−ビスホスファート、シキマート−５−ホスファート、（Ｒ）−パントアート、２−デヒドロパントアート、ＣＤＰエタノールアミン、５−アミノ−１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）イミダゾール−４−カルボキシラート、５−ホスホ−β−Ｄ−リボシルアミン、Ｎ−スクシニル−２−Ｌ−アミノ−６−オキソヘプタンジオアート、Ｄ−４’−ホスホパントテナート、３−デオキシ−Ｄ−マンノ−２−オクツロソナート、ＡＤＰ−Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、β−アラニン、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン、キノリナート、２−（ホルムアミド）−Ｎ１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）アセトアミジン、Ｄ−アラビノース−５−ホスファート、１−（５−ホスホリボシル）−５−［（５−ホスホリボシルアミノ）メチリデンアミノ］イミダゾール−４−カルボキサアミド、リポ多糖体、６−ヒドロキシメチル−ジヒドロプテリンピロフォスファート、シキマート、ウンデカプレニル−ジホスホ−Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミル−メソ−２，６−ジアミノピメロイル−Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン、ウンデカプレニル−ジホスホ−Ｎ−アセチルムラモイル−（Ｎ−アセチルグルコサミン）−Ｌ−ａｌａ−Ｄ−ｇｌｕ−メソ−２，６−ジアミノピメロイル−Ｄ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａ、５−ホスホリボシル−５−カルボキシアミノイミダゾール、３−カルボキシ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタノアート、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−１−ホスファート、Ｌ−シスタチオニン、（Ｓ）−３−メチル−２−オキソペンタノアート、５−Ｏ−（１−カルボキシビニル）−３−ホスホシキマート、２−アミノ−４−ヒドロキシ−６−（エリトロ−１，２，３−トリヒドロキシプロピル）ジヒドロプテリジントリフォスファート、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース−１，７−ビスホスファート、３−（イミダゾール−４−イル）−２−オキソプロピルフォスファート、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン−４−ホスファート、ラウリン酸を有するＫＤＯ（２）−脂質ＩＶ（Ａ）、２−イソプロピルマレアート、ＫＤＯ−脂質ＩＶ（Ａ）、ＡＤＰ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、ＫＤＯ（２）−脂質（Ａ）、Ｎ６−（１，２−ジカルボキシエチル）−ＡＭＰ、５−ホルムアミド−１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）イミダゾール−４−カルボキサアミド、脂質Ａ二糖、２，３−ジヒドロジピコリナート、３−デヒドロキナート、４−ホスホ−Ｌ−アスパルタート、Ｓ−アデノシルメチオニンアミン、３−カルボキシ−４−メチル−２−オキソペンタノアート、フェニルピルバート、Ｄ−グルコサミン−１−ホスファート、デホスホ−ＣｏＡ、ＡＤＰ−グルコース、４−アミノベンゾアート、Ｌ−ヒスチジノールホスファート、ＬＬ−２，６−ジアミノヘプタンジオアート、ジヒドロネオプテリンモノホスファート、パンテテイン−４’−ホスファート、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−アスパルタート、（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−３−メチルペンタノアート、マロニル−ＣｏＡ、４−アミノ−４−デオキシコリスメート、Ｄ−グルタメート、３−（４−ヒドロキシフェニル）ピルバート��Ｌ−ヒスチジノール、デアミノ−ＮＡＤ＋、（Ｓ）−２−アセト−２−ヒドロキシブタノアート。
【００５２】
【表１】
2010512783.tif 000009
【００５３】
その結果、全体の必須代謝産物の約８７．８％が全ての１９種類の成長条件に対して共通的に必須であるということが判明した。逆に、１２．２％は１９種類の成長条件によって一部は必須であり、一部は必須ではないことが判明した。さらに、他の代謝産物に比べて比較的にあまり研究されていなかった代謝産物であるヘキサデセノイル−ＡＣＰ、ホスファチジルグリセロール及び２−イソプロピルマレアートはいずれも細胞成長に必須のものと判明した。
【００５４】
実施例３：フラックスサム減少法を通じての必須代謝産物のスクリーニング
実施例２において選定された必須代謝産物を対象としてフラックスサムを計算して、微生物の成長に必須の代謝産物であることを確証した。すなわち、前記実施例２において選定された２３１個の代謝産物が１時間あたりに産生または消費される総量、すなわち、フラックスサム（Φ）を下記式３のように定義して、この量が正常レベルから外れたときに細胞の成長に及ぼす影響を体系的に分析した。
【００５５】
【数７】
2010512783.tif 000010
式中、Φｉはｉ番目の代謝産物のフラックスサム（Φ）を示し、Ｓｉｊはｉ番目の代謝産物とｊ番目の代謝反応の化学量論係数を示し、νｊはｊ番目の代謝反応の代謝フラックスを示す。また、Ｐｉはｉ番目の代謝産物を産生する代謝反応の集合であり、Ｃｉはｉ番目の代謝産物を消費する代謝反応の集合である。
【００５６】
フラックスサム（Φ）は、既存の代謝フラックスの分析方法では表示できなかった代謝産物の活用度を示すために新たに定義された量である。すなわち、当該代謝産物の利用量が増大するにつれてΦ値は大きくなり、当該代謝産物の利用量が減少するにつれてΦの値は小さくなる。
【００５７】
代謝回路に摂動が加えられるとき、細胞の成長速度が正常レベルからあまり変化しないならば、必須代謝産物のフラックスサム（Φ）も非必須代謝産物よりは正常レベルから容易に外れないということを確認することができる。すなわち、細胞に必須の代謝産物は、その産生比率または消費比率をできる限り一定に維持することにより細胞の成長速度を安定化させる傾向があると言える。
【００５８】
もし、必須代謝産物のフラックスサム（Φ）が正常数値から減少する場合、これは細胞の成長に大きな打撃を負わせる恐れがある。例えば、必須代謝産物のフラックスサム（Φ）を半分に減らせば、ほとんどの場合（約８５％）に全体細胞の成長速度は半分やそれ以下に減少する。これは、非必須代謝産物の少数（約２８．９％）だけがそのような効果を示すことと極めて対比される。すなわち、必須代謝産物のフラックスサム（Φ）を０近くに減らすことにより、細胞の成長そのものと止める効果を予測することができる。このような変化は、図２に示す類型別に分類されることが分かる。
【００５９】
図２において、Ａ群はフラックスサム（Φ）が減少するにつれて線形的に減少する場合、Ｂ群はフラックスサム（Φ）が減少するにつれて臨界値を有していて臨界値未満に減少する場合、Ｃ群はフラックスサム（Φ）が減少するにつれて非線形的に減少してフラックスサム（Φ）が０に達する前に細胞成長が止まる場合である。
【００６０】
これらのＡ群からＣ群は、同じ代謝産物に対しても各成長条件によって異なってくる傾向を示し、その結果は表２に示す通りである。すなわち、表２は、表１に示す条件のうち、フラックスサム（Φ）値を減少させる場合、大腸菌の成長が抑制される条件を記載したものである。表２に示すように、細胞の成長を実際に抑制するためには各成長条件における群の特性に応じてフラックスサム（Φ）の摂動量を変化させる必要があるということが分かる。
【００６１】
【表２】
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2010512783.tif 000012
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【００６２】
一般的に、既存の代謝フラックスの分析に際して特定の遺伝子欠失による細胞成長速度を確認する方法としては、各当該反応式を不活性化させる方法を利用する。しかしながら、上記の場合、２以上の遺伝子欠失による細胞成長の低下現象を確認するためには、実際に２以上の組み合わせによる場合をいずれも計算しなければならないという欠点がある。これに対し、各代謝産物の不可欠性を定義し、その活用度を定義して各代謝産物の特性を調べてみる場合、２以上の遺伝子欠失による細胞成長の低下現象を容易に確認することができるというメリットがある。
【００６３】
したがって、本発明においては、代謝産物の活用度としてフラックスサム（Φ）を定義することにより、この量が減少するにつれて細胞成長に及ぼす影響を定量的に評価してどれ位の摂動量が各代謝産物に加えられるべきであるかを体系的に決定可能な根拠を提供する。
【００６４】
実施例４：細胞成長抑制のための実験的分析−当該代謝産物と関連する遺伝子の欠失
必須代謝産物のフラックスサム（Φ）を０に減らしたとき、すなわち、その代謝産物が最初から産生や消費されないようにしたとき、細胞の成長に及ぼす影響を実験により検証した。すなわち、必須代謝産物の産生や消費に関与する遺伝子多数を細胞から除去したとき、細胞の成長速度にいかなる変化がもたらされるかを調べてみた。
【００６５】
それぞれの遺伝子除去については、細胞が成長を続けられるとしても、遺伝子を一括して除去すれば、相当する代謝産物を産生または消費する経路そのものを遮断してしまい、細胞の成長を止めることができる。必須であり、且つ、フラックスサム（Φ）を０に減らしたときに、細胞成長に影響を与えるものと分類されたテトラヒドロホラート代謝産物を実験対象とし、前記代謝産物と関連する８個の代謝反応のうち３個の代謝反応に関与する遺伝子（ｐｕｒＮ、ｌｐｄＡ、ｇｌｙＡ）を同時に欠失させる場合、必須のテトラヒドロホラート代謝産物の消費が遮断されて結果的に細胞の成長が止まることが予測された。
【００６６】
前記結果を基に大腸菌変異菌株を製作するために、ＤＮＡ操作標準プロトコールを使用し（Sambrooket al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edition, 2001）、大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０に表３のプライマー配列を用いてワンステップ不活性化方法（Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640-6645, 2000）を用いて相同組み換え方法により標的遺伝子により抗生剤耐性遺伝子を置き換えて最終的に抗生剤耐性を除去した。表３において、Ｃｍｒはクロラムフェニコール抵抗性を意味し、Ｋｍｒはカナマイシン抵抗性を意味する。
【００６７】
【表３】
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【００６８】
上記の結果から、遺伝子をそれぞれ別々に除去した場合、あるいは、２つの遺伝子（ｐｕｒＮ、ｌｐｄＡ）を一括して除去した場合には細胞が成長を続けていたが、遺伝子３個をいずれも同時に除去した場合には細胞成長が止まることが分かった（表４及び図３）。
【００６９】
【表４】
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【００７０】
これとは対照的に、理論的に必須ではないと分類した代謝産物である１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−ホスファートに対しては、それを産生する遺伝子（ｄｘｓ、ｘｙｌＢ）をいずれも除去しても細胞は正常状態と大差ないことを確認した（図３）。図３において、ＰはｐｕｒＮを、ＬはｌｐｄＡを、ＧはｇｌｙＡを、ＰＬはｐｕｒＮ／ｌｐｄＡを、ＰＬＧはｐｕｒＮ／ｌｐｄＡ／ｇｌｙＡを、そしてＤＸはｄｘｓ／ｘｙｌＢ遺伝子を意味する。このような実験結果は、必須代謝産物のフラックスサム（Φ）の欠損があるとき、細胞は大きな打撃を負うことがあるが、非必須代謝産物のフラックスサム（Φ）の欠損はあまり影響を及ぼさないことを実証している。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
以上、詳述したように、本発明によれば、微生物の成長に必須の代謝産物代謝産物及び前記必須代謝産物に関与する遺伝子を簡単にスクリーニングすることができ、前記必須代謝産物の代謝活用度（フラックスサム：Φ）の減少による細胞成長を予測することができることから、前記方法によりスクリーニングされた代謝産物と関連する遺伝子を欠失させることにより病原性微生物の薬物標的遺伝子を予測するのに使用することができる。
【００７２】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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