(57)【要約】  本発明は、タンパク質加水分解組成物、タンパク質加水分解組成物の製造方法、およびタンパク質加水分解組成物を含む食品を提供する。タンパク質加水分解組成物は、通常、各カルボキシル末端に主としてアルギニン残基またはリジン残基のいずれかを有するポリペプチド断片を含む。
2010524471.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各カルボキシル末端に主としてアルギニン残基またはリジン残基のいずれかを有するポリペプチド断片の混合物を含むタンパク質加水分解組成物であって、約６．０よりも高いｐＨにおいて少なくとも約０．２％ＤＨの加水分解度および少なくとも約８０％の可溶性固形分指数を有する組成物。
【請求項２】
前記組成物が、大豆、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物、卵、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質に由来する請求項１に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項３】
前記組成物が、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物、乳製品、および卵からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質と組み合わせた大豆に由来する請求項１に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項４】
前記タンパク質が大豆である請求項２に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項５】
前記組成物の加水分解度が、約０．２％ＤＨ〜約１４％ＤＨである請求項４に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項６】
前記組成物の加水分解度が約１％ＤＨ〜約６％ＤＨである場合に、前記組成物が約ｐＨ７．０〜約ｐＨ８．０において実質的に安定である請求項５に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項７】
前記組成物が、加水分解度が約１％ＤＨである場合と比較して、加水分解度が約６％ＤＨである場合に実質的に光をより透過させる請求項５に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項８】
前記組成物が、加水分解度が約０．２％ＤＨである場合と比較して、加水分解度が約１％ＤＨ〜約６％ＤＨである場合に実質的に少ない穀類および大豆／豆類の官能特性を有する請求項５に記載のタンパク質組成物。
【請求項９】
前記組成物が、加水分解度が約２％ＤＨよりも高い場合と比較して、加水分解度が約２％ＤＨ未満である場合に実質的に少ない苦味の官能特性を有する請求項５に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも２つのポリペプチド断片を含む請求項４に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項１１】
前記組成物が大豆および乳製品タンパク質に由来し、配列番号５〜１９７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも２つのポリペプチド断片を含む請求項３に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項１２】
前記組成物がキャノーラタンパク質に由来し、配列番号１９８〜２３７からなる群から選択される少なくとも２つのポリペプチド断片を含む請求項２に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項１３】
前記組成物がトウモロコシタンパク質に由来し、配列番号２３８〜２６１からなる群から選択される少なくとも２つのポリペプチド断片を含む請求項２に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項１４】
前記組成物が小麦タンパク質に由来し、配列番号２６２〜２６９からなる群から選択される少なくとも２つのポリペプチド断片を含む請求項２に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、大豆、小麦、動物、乳製品、卵、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される非加水分解タンパク質をさらに含む請求項１に記載のタンパク質加水分解組成物。
【請求項１６】
タンパク質材料を、アルギニン残基またはリジン残基のカルボキシル末端側でタンパク質材料のペプチド結合を特異的に切断するエンドペプチダーゼと接触させて、約６．０よりも高いｐＨにおいて少なくとも約０．２％ＤＨの加水分解度および少なくとも約８０％の可溶性固形分指数を有するタンパク質加水分解組成物を生じさせることを含む、タンパク質加水分解組成物の調製方法。
【請求項１７】
前記エンドペプチダーゼが、食品グレードの微生物酵素である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記エンドペプチダーゼが、トリプシン様プロテアーゼである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記エンドペプチダーゼが、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのトリプシン様プロテアーゼ、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）からのトリプシン様プロテアーゼ、フザリウムｃｆ．ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｆ．  ｓｏｌａｎｉ）からのトリプシン様プロテアーゼ、およびアクロモバクター・リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ）からのリジルエンドペプチダーゼからなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記エンドペプチダーゼが、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのトリプシン様プロテアーゼである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記エンドペプチダーゼが、配列番号１、２、３、および４からなる群から選択される配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記エンドペプチダーゼが、配列番号１、２、３、および４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記エンドペプチダーゼが、配列番号１、２、３、および４からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記エンドペプチダーゼが、配列番号１、２、３、および４からなる群から選択される配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記エンドペプチダーゼが、約７．０〜約９．０のｐＨおよび約４５℃〜約６０℃の温度において最適なタンパク質分解活性を有する請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
タンパク質材料１キログラムあたり約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇのエンドペプチダーゼが接触させられる請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質材料が、大豆、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物、卵、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質材料が、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物、乳製品、および卵からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質と組み合わせた大豆である請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質材料が大豆である請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
前記大豆タンパク質材料が、大豆抽出物、豆乳、豆乳粉末、大豆カード、脱脂大豆粉、部分脱脂大豆粉、全脂大豆粉、単離大豆タンパク質、大豆タンパク質濃縮物、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物の加水分解度が、約０．２％ＤＨ〜約１４％ＤＨである請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記タンパク質加水分解組成物が、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも２つのポリペプチド断片を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記タンパク質材料が大豆および乳製品の組み合わせであり、前記タンパク質加水分解組成物が、配列番号５〜１９７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも２つのポリペプチド断片を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記タンパク質材料がキャノーラであり、前記タンパク質加水分解組成物が、配列番号１９８〜２３７からなる群から選択される少なくとも２つのポリペプチド断片を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記タンパク質材料がトウモロコシであり、前記タンパク質加水分解組成物が、配列番号２３８〜２６１からなる群から選択される少なくとも２つのポリペプチド断片を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記タンパク質材料が小麦であり、前記タンパク質加水分解組成物が、配列番号２６１〜２６９からなる群から選択される少なくとも２つのポリペプチド断片を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）食用材料と、
（ｂ）各カルボキシル末端に主としてアルギニン残基またはリジン残基のいずれかを有するポリペプチド断片の混合物を含むタンパク質加水分解組成物と
を含む食品であって、約６．０よりも高いｐＨにおいて少なくとも約０．２％ＤＨの加水分解度および少なくとも約８０％の可溶性固形分指数を有する食品。
【請求項３８】
前記タンパク質加水分解組成物が、大豆、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物、卵、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質に由来する請求項３７に記載の食品。
【請求項３９】
前記タンパク質加水分解組成物が、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物、乳製品、および卵からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質と組み合わせた大豆に由来する請求項３７に記載の食品。
【請求項４０】
前記タンパク質加水分解組成物が大豆に由来し、前記加水分解度が、約０．２％ＤＨ〜約１４％ＤＨである請求項３７に記載の食品。
【請求項４１】
前記食品が飲料である請求項３７に記載の食品。
【請求項４２】
前記飲料が、そのまま飲める飲料、ミルクまたはミルク類似飲料、体重管理飲料、プロテインシェーク、および食事代用飲料からなる群から選択される請求項４１に記載の食品。
【請求項４３】
前記飲料が、約６．５〜約７．５のｐＨを有する請求項４１に記載の食品。
【請求項４４】
前記食用材料が、スキムミルク、全乳、クリーム、乾燥粉乳、無脂肪乾燥粉乳、カゼイン塩、大豆タンパク質濃縮物、大豆タンパク質単離物、乳清タンパク質濃縮物、乳清タンパク質単離物、チョコレート、ココア粉末、コーヒー、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項４１に記載の食品。
【請求項４５】
前記食品が、甘味剤、乳化剤、増粘剤、安定剤、脂質材料、防腐剤、酸化防止剤、風味剤、着色剤、ビタミン、ミネラル、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される原料をさらに含む請求項３７に記載の食品。
【請求項４６】
前記食品が、食品バー、栄養補助食品、シリアルベースの製品、食肉または食肉類似製品、および乳製品または乳製品類似製品からなる群から選択される請求項３７に記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年４月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／９１１，９３５号、および２００８年４月１５日に出願された米国非仮特許出願第１２／１０３，５１４号（参照によってこれらの全体が本明細書に援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、改善された官能特性および物理特性を有するタンパク質加水分解組成物、タンパク質加水分解組成物の製造方法、およびタンパク質加水分解組成物を含む食品に関する。
【背景技術】
【０００３】
肥満および肥満に関連する疾患の割合は、米国および世界中で上昇している。根底にある原因は１つではないが、寄与する因子は、多くの人々の速いペースで追い立てられているライフスタイル、およびそれに伴うファーストフードの消費であり得る。ほとんどのファーストフードは脂肪および／または糖が多い傾向にある。従って、「持ち運んで（ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｏ）」食べたり飲んだりすることができ、栄養があって容易に入手可能な食品が必要とされている。この食品は美味しいだけでなく、栄養的に十分でなければならない。すなわち、この食品は脂肪が少なく、タンパク質が多く、そしてビタミンおよび酸化防止剤が多くなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
栄養的に十分であり、容易に消費され得る食品の１つのタイプは、液体タンパク質含有飲料である。タンパク質は、大豆または様々な他のタンパク質源に由来し得る。大豆は優れたタンパク質源であるが、人によっては不快または口に合わないと感じる「草のような」または「豆のような」風味を有する傾向がある。従って、必要とされるのは、「大豆」風味が低減された単離大豆タンパク質製品である。さらに、液体飲料に添加される単離大豆タンパク質製品は理想的には実質的に可溶性でなければならず、時には実質的に光を透過させなければならない。さらに、単離大豆タンパク質製品は、所望の液体飲料のｐＨにおいて安定でなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、本発明の多くの態様の１つは、タンパク質加水分解組成物の提供である。タンパク質加水分解組成物は、各カルボキシル末端に主としてアルギニン残基またはリジン残基のいずれかを有するポリペプチド断片の混合物を含む。さらに、タンパク質加水分解組成物は、約６．０よりも高いｐＨにおいて少なくとも約０．２％ＤＨの加水分解度および少なくとも約８０％の可溶性固形分指数（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｏｌｉｄｓ  ｉｎｄｅｘ）（ＳＳＩ）を有する。
【０００６】
本発明の別の態様は、タンパク質加水分解組成物の調製方法を提供する。この方法は、タンパク質材料を、アルギニン残基またはリジン残基のカルボキシル末端側でタンパク質材料のペプチド結合を特異的に切断するエンドペプチダーゼと接触させて、タンパク質加水分解組成物を生じさせることを含む。タンパク質加水分解組成物は、約６．０よりも高いｐＨにおいて少なくとも約０．２％ＤＨの加水分解度および少なくとも約８０％の可溶性固形分指数を有する。
【０００７】
本発明のさらに別の態様は、食用材料およびタンパク質加水分解組成物を含む食品を包含する。タンパク質加水分解組成物は、各カルボキシル末端に主としてアルギニン残基またはリジン残基のいずれかを有するポリペプチド断片の混合物を含む。さらに、組成物は、約６．０よりも高いｐＨにおいて少なくとも約０．２％ＤＨの加水分解度および少なくとも約８０％の可溶性固形分指数を有する。
【０００８】
本発明のその他の態様および特徴は、以下でさらに詳細に説明される。
【０００９】
カラー図面の参照
本出願はカラーで作成された少なくとも１枚の写真を含有する。カラー写真付きの本特許出願公報のコピーは、要求および必要な手数料の支払いに応じて特許庁により提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）トリプシン様エンドペプチダーゼ（ＴＬ１）による単離大豆タンパク質の加水分解を示す。図示されるのは、クーマシー染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの画像である。レーン３（Ｌ３）は、非加水分解単離大豆タンパク質（ＳＵＰＲＯ（登録商標）５００Ｅ）を含有する。レーン４（Ｌ４）、レーン５（Ｌ５）、レーン６（Ｌ６）、レーン７（Ｌ７）、およびレーン８（Ｌ８）はそれぞれ、０．３％ＤＨ、２．２％ＤＨ、３．１％ＤＨ、４．０％ＤＨ、および５．０％ＤＨの加水分解度（ＤＨ）を有するＴＬ１加水分解物を含有する。レーン９（Ｌ９）は、ゲルの右側に示されるキロダルトン（ｋＤａ）の大きさを有するタンパク質ＭＷ標準を含有する。
【図２】訓練された査定者により評価されたときの５．０％固形分におけるＴＬ１加水分解物およびＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）加水分解物の診断スコアを示す。各加水分解物の同一性および加水分解度（％ＤＨ）は各プロットの下に示される。正のスコアは加水分解物が対照サンプルよりも多くの官能特性を有したことを示し、負のスコアは加水分解物が対照サンプルよりも少ない官能特性を有したことを示す。対照サンプルは非加水分解単離大豆タンパク質であった。（Ａ）は、約２．５％ＤＨ未満の加水分解度を有するＴＬ１およびＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）加水分解物のスコアを示す。（Ｂ）は、３％ＤＨよりも大きい加水分解度を有するＴＬ１およびＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）加水分解物のスコアを示す。
【図３】ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）およびＴＬ１加水分解物の溶解度を比較する。それぞれの酵素および加水分解度（％ＤＨ）は、各管の下に示される。（Ａ）は、４℃で２週間ｐＨ７．０において貯蔵されたＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）およびＴＬ１加水分解物（２．５％固形分）の管を示す。（Ｂ）は、４℃で３週間ｐＨ８．２において貯蔵されたＴＬ１およびＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）加水分解物（２．５％固形分）を示す。
【図４】ＴＬ１およびＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）加水分解物の溶解度プロットを示す。各加水分解物（２．５％固形分）の可溶性固形分のパーセント（すなわち、可溶性固形分指数）は、ｐＨの関数としてプロットされる。各加水分解物の同一性および加水分解度（％ＤＨ）は、各プロットの下に示される。（Ａ）は、ＴＬ１加水分解物の溶解度曲線を示す。（Ｂ）は、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）加水分解物の溶解度曲線を示す。（Ｃ）は、選択されたＴＬ１およびＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）加水分解物の溶解度の直接比較を示す。
【図５】パイロットプラント規模におけるＴＬ１による大豆タンパク質材料の加水分解を示す。図示されるのはクーマシー染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの画像であり、ＴＬ１加水分解物および対照サンプルを分解した。レーン１（Ｌ１）およびレーン３（Ｌ３）は非加水分解大豆タンパク質を含有し、レーン２（Ｌ２）は２．７％ＤＨのＴＬ１加水分解物を含有し、レーン４（Ｌ４）は加水分解対照サンプル（酵素の混合物により２．８％ＤＨまで加水分解されたＳＵＰＲＯ（登録商標）ＸＴ２１９）を含有し、レーン５〜１１（Ｌ５〜Ｌ１１）はそれぞれ、１．３％ＤＨ、２．０％ＤＨ、３．８％ＤＨ、０．３％ＤＨ、０．９％ＤＨ、１．６％ＤＨ、および５．２％ＤＨを有するＴＬ１加水分解物を含有する。レーン１２（Ｌ１２）は、ゲルの右側に示されるキロダルトン（ｋＤａ）の大きさを有する分子量標準を含有する。
【図６】パイロットプラントＴＬ１加水分解物および対照サンプルの溶解度プロットを示す。各加水分解物の加水分解度（％ＤＨ）はプロットの下に示される。
【図７】パイロットプラントＴＬ１加水分解物および対照サンプルの粘度のプロットを示す。各加水分解物の加水分解度（％ＤＨ）は、プロットの下に示される。
【図８】パイロットプラントＴＬ１加水分解物の加水分解度の関数として、粘度および溶解度［すなわち、可溶性固形分指数（ＳＳＩ）および窒素可溶性指数（ＮＳＩ）］のプロットを示す。
【図９】対照サンプルと比較してＴＬ１加水分解物中の風味揮発性物質のレベルが低いことを示す。（Ａ）は、対照サンプルおよび種々の加水分解度（％ＤＨ）を有するＴＬ１加水分解物中の全活性揮発性物質およびヘキサナールのレベルを示す。（Ｂ）は、対照サンプルおよび種々の加水分解度（％ＤＨ）を有するＴＬ１加水分解物中の表示される風味揮発性物質のレベルを示す。
【図１０】パイロットプラントＴＬ１加水分解物および対照サンプルの診断スコアのプロットを示す。対照サンプルは非加水分解単離大豆タンパク質であった。正のスコアは加水分解物が対照サンプルよりも多くの官能特性を有したことを示し、負のスコアは加水分解物が対照サンプルよりも少ない官能特性を有したことを示す。（Ａ）は対照、０．３％ＤＨ、および１．６％ＤＨサンプルのスコアを示す。（Ｂ）は対照、１．３％ＤＨ、および５．２％ＤＨサンプルのスコアを示す。（Ｃ）は対照、２．７％ＤＨ、および０．９％ＤＨサンプルのスコアを示す。（Ｄ）は対照、２．０％ＤＨ、および３．８％ＤＨサンプルのスコアを示す。
【図１１】ＴＬ１加水分解物の官能スコアの要約したプロットを加水分解度（ＤＨ）の関数として示す。全体的な好みのスコアが上に示され、苦味のスコアが下に示される。ひし形は予測スコアを示し、正方形は実際のスコアを示す。
【図１２】いくつかの異なるトリプシン様プロテアーゼによる単離大豆タンパク質の加水分解を示す。提示されるのは、クーマシー染色されたＳＤＳポリアクリルアミドゲルの画像であり、非加水分解大豆タンパク質および酵素処理した大豆タンパク質サンプルを分解した。レーン１は、ゲルの左側に示される大きさを有する分子量マーカーを含有する。レーン３および９は未処理の単離大豆タンパク質を含有する。レーン２およびレーン４〜８はそれぞれ、ＴＬ１、ＳＰ３、ＴＬ５、ＴＬ６、ブタトリプシン、およびウシトリプシンで処理した大豆を含有する。
【図１３】大豆および乳製品タンパク質の組み合わせのＴＬ１加水分解物の溶解度をｐＨの関数として示す。
【図１４】他の植物タンパク質材料のＴＬ１による加水分解を示す。提示されるのは、クーマシー染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの画像であり、未処理および処理済タンパク質サンプルを分解した。レーン１（Ｌ１）は分子量マーカー（ゲルの左側にｋＤａで示される）を含有する。レーン２（Ｌ２）、レーン４（Ｌ４）、およびレーン６（Ｌ６）はそれぞれ、加水分解していないコーン胚芽、キャノーラおよび小麦胚芽のサンプルを含有する。レーン３（Ｌ３）、レーン５（Ｌ５）、およびレーン７（Ｌ７）はそれぞれ、コーン胚芽、キャノーラ、および小麦胚芽のＴＬ１加水分解物を含有する。
【図１５】豆乳モデル飲料の平均ヘドニックスコア（Ｈｅｄｏｎｉｃ  ｓｃｏｒｅ）を示す。スケールは、１＝非常に嫌い、５＝どちらでもない、９＝非常に好きであった。後に異なる文字が続く同じ列内の平均値は、９５％の信頼度で有意に異なる。
【図１６】組み合わせモデル飲料の平均ヘドニックスコアを示す。スケールは、１＝非常に嫌い、５＝どちらでもない、９＝非常に好きであった。後に異なる文字が続く同じ列内の平均値は、９５％の信頼度で有意に異なる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、タンパク質加水分解組成物、タンパク質加水分解組成物の製造方法、およびタンパク質加水分解組成物を含む食品を提供する。実施例において説明されるように、アルギニン残基またはリジン残基のカルボキシル末端側でタンパク質材料を特異的に切断するエンドペプチダーゼによるタンパク質材料の消化は、改善された物理特性、風味、および官能特性を有するポリペプチド断片を含む組成物をもたらすことが発見された。改善された物理特性、風味、および官能特性のために、本発明のタンパク質加水分解組成物は、様々な食品において有利に使用することができる。
【００１２】
（Ｉ）タンパク質加水分解物の調製方法
本発明の一態様は、各カルボキシル末端に主としてアルギニン残基またはリジン残基のいずれかを有するポリペプチド断片の混合物を含むタンパク質加水分解物の調製方法を提供する。本方法は、タンパク質材料を、アルギニン残基またはリジン残基のカルボキシル末端側でタンパク質材料のペプチド結合を特異的に切断するエンドペプチダーゼと接触させて、タンパク質加水分解物を生じさせることを含む。タンパク質加水分解物を調製するために使用されるタンパク質材料またはタンパク質材料の組み合わせは異なり得るであろう。適切なタンパク質材料の例は以下に詳述される。
【００１３】
（ａ）大豆タンパク質材料
いくつかの実施形態では、タンパク質材料は大豆タンパク質材料であり得る。様々な大豆タンパク質材料を本発明の方法で使用して、タンパク質加水分解物を生じさせることができる。一般に、大豆タンパク質材料は、当該技術分野において既知の方法に従って、全大豆から得ることができる。全大豆は、標準の大豆（すなわち、非遺伝子改変大豆）、遺伝子改変大豆（例えば、変性油を有する大豆、変性炭水化物を有する大豆、変性タンパク質サブユニットを有する大豆など）またはこれらの組み合わせでよい。大豆タンパク質材料の適切な例としては、大豆抽出物、豆乳、豆乳粉末、大豆カード、大豆粉、単離大豆タンパク質、大豆タンパク質濃縮物、およびこれらの混合物が挙げられる。
【００１４】
一実施形態では、本方法で使用される大豆タンパク質材料は、大豆タンパク質単離物（単離大豆タンパク質、またはＩＳＰとも呼ばれる）であり得る。一般に、大豆タンパク質単離物は、無水ベースで少なくとも約９０％の大豆タンパク質のタンパク質含量を有する。大豆タンパク質単離物は無処理の（ｉｎｔａｃｔ）大豆タンパク質を含んでもよいし、あるいは部分的に加水分解された大豆タンパク質を含んでもよい。大豆タンパク質単離物は、高含量の７Ｓ、１１Ｓ、２Ｓなどの貯蔵タンパク質サブユニットを有し得る。本発明において出発材料として使用することができる大豆タンパク質単離物の非限定的な例は、例えばＳｏｌａｅ，ＬＬＣ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から市販されており、その中には、ＳＵＰＲＯ（登録商標）５００Ｅ、ＳＵＰＲＯ（登録商標）ＥＸ  ４５、ＳＵＰＲＯ（登録商標）６２０、ＳＵＰＲＯ（登録商標）６７０、ＳＵＰＲＯ（登録商標）ＥＸ  ３３、ＳＵＰＲＯ（登録商標）ＰＬＵＳ  ２６００Ｆ、ＳＵＰＲＯ（登録商標）ＰＬＵＳ  ２６４０  ＤＳ、ＳＵＰＲＯ（登録商標）ＰＬＵＳ  ２８００、ＳＵＰＲＯ（登録商標）ＰＬＵＳ  ３０００、およびこれらの組み合わせが含まれる。
【００１５】
別の実施形態では、大豆タンパク質材料は、無水ベースで約６５％から約９０％未満のタンパク質含量を有する大豆タンパク質濃縮物であり得る。本発明において有用な適切な大豆タンパク質濃縮物の例としては、ＰＲＯＣＯＮTM製品ライン、ＡＬＰＨＡTM１２およびＡＬＰＨＡTM５８００が挙げられ、これらは全てＳｏｌａｅ，ＬＬＣから市販されている。あるいは、大豆タンパク質材料源として、大豆タンパク質単離物の一部の代わりになるために、大豆タンパク質濃縮物が大豆タンパク質単離物とブレンドされてもよい。通常、大豆タンパク質濃縮物が大豆タンパク質単離物の一部の代わりに使用される場合、大豆タンパク質濃縮物は、最大でも大豆タンパク質単離物の約４０重量％までの代わりに使用され、より好ましくは大豆タンパク質単離物の約３０重量％までの代わりに使用される。
【００１６】
さらに別の実施形態では、大豆タンパク質材料は、無水ベースで約４９％〜約６５％のタンパク質含量を有する大豆粉であり得る。大豆粉は、脱脂大豆粉、部分脱脂大豆粉、または全脂大豆粉であり得る。大豆粉は、大豆タンパク質単離物または大豆タンパク質濃縮物とブレンドされてもよい。
【００１７】
代替の実施形態では、大豆タンパク質材料は、遠心分離機における沈降に基づいて４つの主要な貯蔵タンパク質画分またはサブユニット（１５Ｓ、１１Ｓ、７Ｓ、および２Ｓ）に分離された材料であり得る。一般に、１１Ｓ画分はグリシニンが非常に豊富であり、７Ｓ画分はβ−コングリシニンが非常に豊富である。さらに別の実施形態では、大豆タンパク質材料は、高オレイン酸大豆からのタンパク質であり得る。
【００１８】
（ｂ）他のタンパク質材料
別の実施形態では、タンパク質材料は、大豆以外の植物に由来してもよい。非限定的な例として、適切な植物には、アマランス、クズウコン、大麦、ソバ、キャノーラ、キャッサバ、ヒヨコマメ（ガルバンゾ）、豆類、レンティル、ルピナス、トウモロコシ、キビ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、ライ麦、モロコシ属、ヒマワリ、タピオカ、ライ小麦、小麦、およびこれらの混合物が含まれる。特に好ましい植物タンパク質には、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、およびこれらの組み合わせが含まれる。一実施形態では、植物タンパク質材料は、キャノーラミール、キャノーラタンパク質単離物、キャノーラタンパク質濃縮物、およびこれらの組み合わせであり得る。別の実施形態では、植物タンパク質材料は、トウモロコシまたはコーンタンパク質粉末、トウモロコシまたはコーンタンパク質濃縮物、トウモロコシまたはコーンタンパク質単離物、トウモロコシまたはコーン胚芽、トウモロコシまたはコーングルテン、トウモロコシまたはコーングルテンミール、トウモロコシまたはコーン粉、ゼインタンパク質、およびこれらの組み合わせであり得る。さらに別の実施形態では、植物タンパク質材料は、大麦粉末、大麦タンパク質濃縮物、大麦タンパク質単離物、大麦ミール、大麦粉、およびこれらの組み合わせであり得る。代替の実施形態では、植物タンパク質材料は、ルピナス粉、ルピナスタンパク質単離物、ルピナスタンパク質濃縮物、およびこれらの組み合わせであり得る。別の代替の実施形態では、植物タンパク質材料は、オートミール、オート麦粉、オート麦タンパク質粉、オート麦タンパク質単離物、オート麦タンパク質濃縮物、およびこれらの組み合わせであり得る。さらに別の実施形態では、植物タンパク質材料は、エンドウ豆粉、エンドウ豆タンパク質単離物、エンドウ豆タンパク質濃縮物、およびこれらの組み合わせであり得る。さらに別の実施形態では、植物タンパク質材料は、ポテトタンパク質粉末、ポテトタンパク質単離物、ポテトタンパク質濃縮物、ポテト粉、およびこれらの組み合わせであり得る。さらなる実施形態では、植物タンパク質材料は、米粉、米ミール、米タンパク質粉末、米タンパク質単離物、米タンパク質濃縮物、およびこれらの組み合わせであり得る。別の代替の実施形態では、植物タンパク質材料は、小麦タンパク質粉末、小麦グルテン、小麦胚芽、小麦粉、小麦タンパク質単離物、小麦タンパク質濃縮物、可溶化小麦タンパク質、およびこれらの組み合わせであり得る。
【００１９】
他の実施形態では、タンパク質材料は動物源に由来してもよい。一実施形態では、動物タンパク質材料は卵に由来し得る。適切な卵タンパク質の非限定的な例としては、粉末卵、乾燥卵固形分、乾燥卵白タンパク質、液体卵白タンパク質、卵白タンパク質粉末、単離オボアルブミンタンパク質、およびこれらの組み合わせが挙げられる。卵タンパク質は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、または他の鳥の卵に由来し得る。代替の実施形態では、タンパク質材料は乳製品源に由来し得る。適切な乳製品タンパク質には、無脂肪乾燥粉乳、乳タンパク質単離物、乳タンパク質濃縮物、酸カゼイン、カゼイン塩（例えば、カゼインナトリウム塩、カゼインカルシウム塩など）、乳清タンパク質単離物、乳清タンパク質濃縮物、およびこれらの組み合わせが含まれる。乳タンパク質材料は、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ラクダ、ラクダ科動物、ヤク、水牛などに由来し得る。さらなる実施形態では、タンパク質は、陸生動物または水生動物の筋肉、臓器、結合組織、または骨格に由来し得る。一例として、動物タンパク質は、ウシまたは他の動物の骨、結合組織、臓器などから抽出されるコラーゲンの部分加水分解によって製造されるゼラチンであり得る。
【００２０】
本発明の方法において大豆タンパク質材料および少なくとも１つの他のタンパク質材料の組み合わせが使用され得ることも想定される。すなわち、タンパク質加水分解組成物は、大豆タンパク質材料および少なくとも１つの他のタンパク質材料の組み合わせから調製されてもよい。一実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、大豆タンパク質材料と、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物材料、乳製品、および卵からなる群から選択される１つの他のタンパク質材料との組み合わせから調製することができる。別の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、大豆タンパク質材料と、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物材料、乳製品、および卵からなる群から選択される２つの他のタンパク質材料との組み合わせから調製することができる。さらなる実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、大豆タンパク質材料と、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物材料、乳製品、および卵からなる群から選択される３つ以上の他のタンパク質材料との組み合わせから調製することができる。
【００２１】
組み合わせて使用される大豆タンパク質材料および他のタンパク質材料の濃度は異なり得るであろう。大豆タンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約１％〜約９９％の範囲であり得る。一実施形態では、大豆タンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約１％〜約２０％の範囲であり得る。別の実施形態では、大豆タンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約２０％〜約４０％の範囲であり得る。さらに別の実施形態では、大豆タンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約４０％〜約８０％の範囲であり得る。さらなる実施形態では、大豆タンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約８０％〜約９９％の範囲であり得る。同様に、（少なくとも１つの）他のタンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約１％〜約９９％の範囲であり得る。一実施形態では、他のタンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約１％〜約２０％の範囲であり得る。別の実施形態では、他のタンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約２０％〜約４０％の範囲であり得る。さらに別の実施形態では、他のタンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約４０％〜約８０％の範囲であり得る。さらなる実施形態では、他のタンパク質材料の量は、組み合わせて使用される全タンパク質の約８０％〜約９９％の範囲であり得る。
【００２２】
（ｃ）タンパク質スラリー
本発明の方法では、通常、タンパク質材料は水中に混合または分散されて、約１重量％〜約２０重量％のタンパク質（「現状のまま（ａｓ  ｉｓ）」に基づいて）を含むスラリーを形成する。一実施形態では、スラリーは、約１重量％〜約５重量％のタンパク質（現状のまま）を含むことができる。別の実施形態では、スラリーは、約６重量％〜約１０重量％のタンパク質（現状のまま）を含むことができる。さらなる実施形態では、スラリーは、約１１重量％〜約１５重量％のタンパク質（現状のまま）を含むことができる。さらに別の実施形態では、スラリーは、約１６重量％〜約２０重量％のタンパク質（現状のまま）を含むことができる。
【００２３】
タンパク質材料が水中に分散された後、タンパク質材料のスラリーは、推定されている内在性プロテアーゼ阻害剤を不活性化するために、約７０℃〜約９０℃で約２分〜約２０分間加熱され得る。通常、タンパク質スラリーのｐＨおよび温度は、加水分解反応を最適化するように、そして特に、加水分解反応において使用されるエンドペプチダーゼがその最適な活性レベル付近で機能することを保証するように調整される。タンパク質スラリーのｐＨは、当該技術分野において一般に知られている方法に従って調整および監視することができる。タンパク質スラリーのｐＨは、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ１０．０に調整および保持され得る。一実施形態では、タンパク質スラリーのｐＨは、約ｐＨ７．０〜約ｐＨ８．０に調整および保持され得る。別の実施形態では、タンパク質スラリーのｐＨは、約ｐＨ８．０〜約ｐＨ９．０に調整および保持され得る。好ましい実施形態では、タンパク質スラリーのｐＨは、約ｐＨ８．０に調整および保持され得る。タンパク質スラリーの温度は、好ましくは、当該技術分野において既知の方法に従って加水分解反応の間約４０℃〜約７０℃に調整および保持される。好ましい実施形態では、タンパク質スラリーの温度は、加水分解反応の間約５０℃〜約６０℃に調整および保持され得る。一般に、この範囲よりも高い温度はエンドペプチダーゼを最終的に不活性化することができ、この範囲よりも低いまたは高い温度はエンドペプチダーゼの活性を遅くする傾向がある。
【００２４】
（ｄ）エンドペプチダーゼ
加水分解反応は一般に、エンドペプチダーゼをタンパク質材料のスラリーに添加することによって開始される。いくつかのエンドペプチダーゼは、本発明の方法での使用に適している。好ましくは、エンドペプチダーゼは食品グレードの酵素であろう。エンドペプチダーゼは、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ１１．０、より好ましくは約ｐＨ７．０〜約ｐＨ９．０、そして約４０℃〜約７０℃の温度、より好ましくは約４５℃〜約６０℃の温度の加水分解条件下で最適な活性を有することができる。
【００２５】
一般に、エンドペプチダーゼは、Ｓ１セリンプロテアーゼ類の一員であろう（ＭＥＲＯＰＳ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ｒｅｌｅａｓｅ  ８．００Ａ；／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）。好ましくは、エンドペプチダーゼは、アルギニン、リジン、または両残基のカルボキシル末端側でペプチド結合を切断するであろう。従って、エンドペプチダーゼは、アルギニン、リジン、または両方のカルボキシル末端側でペプチド結合を切断するトリプシン様エンドペプチダーゼであってもよい。本発明との関連におけるトリプシン様エンドペプチダーゼは、１００よりも大きいトリプシン比を有するエンドペプチダーゼであると定義することができる（実施例１６を参照）。トリプシン様エンドペプチダーゼは、リジン残基のカルボキシル末端側でペプチド結合を切断するリジルエンドペプチダーゼであってもよい。好ましい実施形態では、エンドペプチダーゼは微生物起源を有することができ、さらに好ましくは菌・カビ類起源を有する。トリプシンおよびトリプシン様エンドペプチダーゼは他の源（例えば、動物源）から入手することもできるが、動物源からのトリプシンは、実施例１４に示されるように、出発タンパク質材料を切断できないこともある。
【００２６】
一実施形態では、エンドペプチダーゼは、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのトリプシン様プロテアーゼでもよい（米国特許第５，２８８，６２７号明細書、米国特許第５，６９３，５２０号明細書、これらはそれぞれ参照によってその全体が本明細書に援用される）。このエンドペプチダーゼは「ＴＬ１」と呼ばれ、そのタンパク質配列（配列番号１）は表Ａに示される。ＴＬ１の受入番号はＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  Ｎｏ．Ｐ３５０４９であり、そのＭＥＲＯＰＳ  ＩＤはＳ０１．１０３である。別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）からのトリプシン様プロテアーゼでもよい（国際公開第２００５／０４０３７２−Ａ１号パンフレット、その全体が本明細書に援用される）。このエンドペプチダーゼは「ＴＬ５」と呼ばれ、そのタンパク質配列（配列番号２）は表Ａに示される。ＴＬ５の受入番号はＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＤＺ８０５７７である。さらに別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、フザリウムｃｆ．ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｆ．  ｓｏｌａｎｉ）からのトリプシン様プロテアーゼであってもよい。このエンドペプチダーゼは「ＴＬ６」と呼ばれ、そのタンパク質配列（配列番号３）は表Ａに示される。さらなる実施形態では、エンドペプチダーゼは、アクロモバクター・リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ）からのリジルエンドペプチダーゼであってもよい。このエンドペプチダーゼは「ＳＰ３」と呼ばれ、そのタンパク質配列（配列番号４）は表Ａに示される。ＳＰ３の受入番号はＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  Ｎｏ．１５６３６であり、ＳＰ３のＭＥＲＯＰＳ  ＩＤはＳ０１．２８０である。例示的な実施形態では、エンドペプチダーゼはＴＬ１であり得る。
【００２７】
2010524471.tif 000003
【００２８】
別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、４、またはこれらの断片と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、または８５％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。さらなる実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、４、またはこれらの断片と少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、または９２％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。さらに別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、４、またはこれらの断片と少なくとも９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。プロテアーゼ活性を有するこれらの配列のいずれかの断片は、例えば処理の後（シグナルペプチドおよび／またはプロペプチドが切断された後など）の活性酵素のアミノ酸配列であり得る。好ましい断片には、配列番号１のアミノ酸２５〜２４８、配列番号２のアミノ酸２６〜２５１、配列番号３のアミノ酸１８〜２５０、または配列番号４のアミノ酸２１〜６５３が含まれる。
【００２９】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列のアライメントは、ＥＭＢＯＳＳ  ｐａｃｋａｇｅからのＮｅｅｄｌｅプログラム（Ｒｉｃｅ，Ｐ．、Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．およびＢｌｅａｓｂｙ，Ａ．（２０００年）ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６、（６）、２７６−２７７頁、ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）バージョン２．８．０を用いて決定することができる。Ｎｅｅｄｌｅプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８、４４３−４５３頁に記載される包括的アライメントアルゴリズムを実行する。使用される置換マトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２であり、ギャップオープニングペナルティは１０であり、そしてギャップエクステンションペナルティは０．５である。一般に、配列同一性の割合は、比較ウィンドウ上で最適に整列された２つの配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウ内のアミノ酸配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。割合は、両方の配列内で同一のアミノ酸が生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を、比較ウィンドウ内の２つの配列の短い方の位置の総数で割り、そしてその結果に１００をかけて配列同一性の割合を得ることによって計算される。
【００３０】
当業者は、ポリペプチドの機能に影響を与えることなく類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基によってアミノ酸残基が置換され得ることを理解するであろう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸基はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸基はセリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸基はアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸基はフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸基はリジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸基はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンを含む。従って、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、または４に関して少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有し得る。一実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、または４に関して約５０の保存的アミノ酸置換を有し得る。別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、または４に関して約４０の保存的アミノ酸置換を有し得る。さらに別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、または４に関して約３０の保存的アミノ酸置換を有し得る。別の代替の実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、または４に関して約２０の保存的アミノ酸置換を有し得る。さらに別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、または４に関して約１０の保存的アミノ酸置換を有し得る。さらに別の実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、または４に関して約５の保存的アミノ酸置換を有し得る。さらなる実施形態では、エンドペプチダーゼは、配列番号１、２、３、または４に関して約１つの保存的アミノ酸置換を有し得る。
【００３１】
タンパク質材料およびエンドペプチダーゼの種々の組み合わせは表Ｂに示される。
【００３２】
2010524471.tif 000004
【００３３】
（表Ｂ続き）
2010524471.tif 000005
【００３４】
（表Ｂ続き）
2010524471.tif 000006
【００３５】
（表Ｂ続き）
2010524471.tif 000007
【００３６】
タンパク質材料に添加されるエンドペプチダーゼの量は、タンパク質材料の源、所望の加水分解度、および加水分解反応の持続時間に依存して異なり得るであろう。エンドペプチダーゼの量は、タンパク質材料１キログラムあたり酵素タンパク質約１ｍｇ〜酵素タンパク質約５０００ｍｇの範囲であり得る。別の実施形態では、量は、タンパク質材料１キログラムあたり酵素タンパク質１０ｍｇ〜酵素タンパク質約２０００ｍｇの範囲であり得る。さらに別の実施形態では、量は、タンパク質材料１キログラムあたり酵素タンパク質約５０ｍｇ〜酵素タンパク質約１０００ｍｇの範囲であり得る。
【００３７】
当業者により認識されるように、加水分解反応の持続時間は異なり得るであろう。一般的に言えば、加水分解反応の持続時間は、数分〜多時間（約３０分〜約４８時間など）の範囲であり得る。加水分解反応を終了させるために、組成物は、エンドペプチダーゼを不活性化するのに十分に高い温度まで加熱され得る。例えば、組成物を約９０℃の温度まで加熱すると、エンドペプチダーゼが実質的に熱不活性化されるであろう。
【００３８】
（ＩＩ）タンパク質加水分解組成物
タンパク質加水分解組成物は、タンパク質出発材料と比較して、種々の長さおよび分子量のポリペプチド断片の混合物を含むであろう。ペプチド断片のそれぞれは、通常、そのカルボキシル末端にアルギニンまたはリジン残基のいずれかを有するであろう（実施例３、４、１３、および１８で実証されるように）。ポリペプチド断片は、約７５ダルトン（Ｄａ）〜約５０，０００Ｄａ、より好ましくは約１５０Ｄａ〜約２０，０００Ｄａの範囲の大きさであり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチド断片の平均分子サイズは、約２０，０００Ｄａ未満であり得る。他の実施形態では、ポリペプチド断片の平均分子サイズは、約１５，０００Ｄａ未満であり得る。さらに他の実施形態では、ポリペプチド断片の平均分子サイズは、約１０，０００Ｄａ未満であり得る。付加的な実施形態では、ポリペプチド断片の平均分子サイズは約５０００Ｄａ未満であり得る。
【００３９】
本発明のタンパク質加水分解組成物の加水分解度は、タンパク質材料源、使用されるエンドペプチダーゼ、および加水分解反応の完成度に依存して異なり得るであろう。加水分解度（ＤＨ）は、出発ペプチド結合数に対する切断されたペプチド結合の割合を指す。例えば、５００のペプチド結合を含有する出発タンパク質が、５０のペプチド結合が切断されるまで加水分解されると、得られる加水分解物のＤＨは１０％ＤＨである。加水分解度は、実施例で詳述されるように、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）比色分析法またはオルト−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）法を用いて決定することができる。加水分解度が高い程、タンパク質の加水分解の程度は大きい。通常、タンパク質がさらに加水分解されるにつれて（すなわち、ＤＨが高い程）、ペプチド断片の分子量は減少し、それに応じてペプチドプロファイルは変化し、そして混合物の粘度は低下する。ＤＨは加水分解物全体（すなわち、全画分）において測定されてもよいし、あるいはＤＨは、加水分解物の可溶性画分（すなわち、約５００〜１０００×ｇで約５〜１０分間加水分解物を遠心分離した後の上澄み画分）において測定されてもよい。
【００４０】
一般に、タンパク質加水分解物の加水分解度は少なくとも約０．２％ＤＨであろう。一実施形態では、タンパク質加水分解物の加水分解度は、約０．２％ＤＨ〜約２％ＤＨの範囲でよい。別の実施形態では、タンパク質加水分解物の加水分解度は、約２％ＤＨ〜約８％ＤＨの範囲でよい。さらに別の実施形態では、タンパク質加水分解物の加水分解度は、約８％ＤＨ〜約１４％ＤＨの範囲でよい。代替の実施形態では、タンパク質加水分解物の加水分解度は、約１４％ＤＨ〜約２０％ＤＨの範囲でよい。付加的な実施形態では、タンパク質加水分解物の加水分解度は、約２０％ＤＨよりも大きくてよい。
【００４１】
タンパク質加水分解組成物の溶解度は、出発タンパク質材料源、使用されるエンドペプチダーゼ、および組成物のｐＨに依存して異なり得るであろう。可溶性固形分指数（ＳＳＩ）は、タンパク質加水分解組成物を構成する固形分（すなわち、ポリペプチド断片）の溶解度の尺度である。可溶性固形分の量は、遠心分離（例えば、約５００〜１０００×ｇで約５〜１０分間）の前後の溶液中の固形分の量を測定することによって推定することができる。あるいは、可溶性固形分の量は、当該技術分野においてよく知られている技法（例えば、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質決定比色分析アッセイなど）を用いて遠心分離の前後の組成物中のタンパク質の量を推定することによって決定することができる。
【００４２】
一般に、本発明のタンパク質加水分解組成物は、その加水分解度にかかわらず、約ｐＨ６．０よりも高いｐＨで少なくとも約８０％の可溶性固形分指数を有する。一実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、約ｐＨ６．０よりも高いｐＨで約８０％〜約８５％の範囲の可溶性固形分指数を有し得る。別の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、約ｐＨ６．０よりも高いｐＨで約８５％〜約９０％の範囲の可溶性固形分指数を有し得る。さらなる実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、約６．０よりも高いｐＨで約９０％〜約９５％の範囲の可溶性固形分指数を有し得る。別の代替の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、約６．０よりも高いｐＨで約９５％〜約９９％の範囲の可溶性固形分指数を有し得る。
【００４３】
さらに、本発明のタンパク質加水分解組成物の溶解度は、加水分解度に応じて約ｐＨ４．０〜約ｐＨ５．０で異なり得る。例えば、約３％ＤＨよりも大きい加水分解度を有する大豆タンパク質加水分解組成物は、約３％ＤＨ未満の加水分解度を有するものよりも、約ｐＨ４．０〜約ｐＨ５．０においてより可溶性である傾向がある。
【００４４】
一般的に言えば、約１％ＤＨ〜約６％ＤＨの加水分解度を有する大豆タンパク質加水分解組成物は、約ｐＨ７．０〜約ｐＨ８．０のｐＨで安定である。安定性は、時間が経っても沈降物の形成がないことを言う。タンパク質加水分解組成物は、室温（すなわち、約２３℃）または冷蔵温度（すなわち、約４℃）で貯蔵され得る。一実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、約１週間〜約４週間安定であり得る。別の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、約１ヶ月〜約６ヶ月間安定であり得る。さらなる実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、約６ヶ月よりも長く安定であり得る。
【００４５】
タンパク質加水分解組成物は乾燥されてもよい。例えば、タンパク質加水分解組成物はスプレー乾燥され得る。スプレードライヤーの入口の温度は、約２６０℃（５００°Ｆ）〜約３１５℃（６００°Ｆ）の範囲でよく、排気温度は、約８２℃（１８０°Ｆ）〜約３８℃（１００°Ｆ）の範囲でよい。あるいは、タンパク質加水分解組成物は、真空乾燥、凍結乾燥、または当該技術分野において既知の他の手順を用いて乾燥されてもよい。
【００４６】
タンパク質加水分解物が大豆タンパク質に由来する実施形態では、加水分解度は約０．２％ＤＨ〜約１４％ＤＨ、より好ましくは約１％ＤＨ〜約６％ＤＨの範囲でよい。形成されるポリペプチド断片の数に加えて、実施例において説明されるように、加水分解度は、通常、得られる大豆タンパク質加水分解組成物の他の物理特性および官能特性に影響を与える。通常、加水分解度が約１％ＤＨから約６％ＤＨまで増大するにつれて、大豆タンパク質加水分解組成物は、透明性または透光性が増大し、穀類および大豆／豆類の官能特性が低下する。さらに、加水分解度が約２％ＤＨよりも大きい場合と比較して加水分解度が約２％ＤＨ未満である場合には、大豆タンパク質加水分解組成物は苦味の官能特性が実質的に少ない。別の言い方をすると、より高い加水分解度は穀類および大豆／豆類の官能特性を低下させ、より低い加水分解度は苦味の官能特性を低下させる。官能特性およびその決定方法は、実施例において詳述される。
【００４７】
さらに、タンパク質加水分解物が大豆に由来する実施形態では、大豆タンパク質加水分解組成物は、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群から選択されるポリペプチドを含み得る。一実施形態では、大豆タンパク質加水分解物は、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群に相当するかまたは由来するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。代替の実施形態では、大豆タンパク質加水分解物は、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約１０のポリペプチドまたはその断片を含み得る。別の実施形態では、大豆タンパク質加水分解物は、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約２０のポリペプチドまたはその断片を含み得る。さらなる実施形態では、大豆タンパク質加水分解物は、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約４０のポリペプチドまたはその断片を含み得る。さらに別の実施形態では、大豆タンパク質加水分解物は、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約８０のポリペプチドまたはその断片を含み得る。さらに別の実施形態では、大豆タンパク質加水分解物は、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約１２０のポリペプチドまたはその断片を含み得る。さらなる実施形態では、大豆タンパク質加水分解物は、配列番号５〜１７７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約１７８のポリペプチドまたはその断片を含み得る。
【００４８】
タンパク質加水分解物が大豆タンパク質および乳製品の組み合わせに由来するその他の実施形態では、大豆／乳製品の組み合わせタンパク質加水分解組成物は、配列番号５〜１９７および２７０〜２７４からなる群から選択されるポリペプチドを含み得る。一実施形態では、大豆／乳製品の組み合わせ加水分解物は、配列番号５〜１９７および２７０〜２７４からなる群に相当するかまたは由来するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。代替の実施形態では、大豆／乳製品の組み合わせ加水分解物は、配列番号５〜１９７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約１０のポリペプチドまたはその断片を含み得る。別の実施形態では、大豆／乳製品の組み合わせ加水分解物は、配列番号５〜１９７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約５０のポリペプチドまたはその断片を含み得る。別の代替の実施形態では、大豆／乳製品の組み合わせ加水分解物は、配列番号５〜１９７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約１００のポリペプチドまたはその断片を含み得る。別の実施形態では、大豆／乳製品加水分解物は、配列番号５〜１９７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約１５０のポリペプチドまたはその断片を含み得る。さらに別の代替実施形態では、大豆／乳製品の組み合わせ加水分解物は、配列番号５〜１９７および２７０〜２７４からなる群から選択される少なくとも約１９８のポリペプチドまたはその断片を含み得る。
【００４９】
タンパク質加水分解物がキャノーラに由来する付加的な実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、配列番号１９８〜２３７からなる群から選択されるポリペプチドを含み得る。一実施形態では、キャノーラ加水分解物は、配列番号１９８〜２３７からなる群に相当するかまたは由来するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。代替の実施形態では、キャノーラ加水分解物は、配列番号１９８〜２３７からなる群から選択される少なくとも約１０のポリペプチドまたはその断片を含み得る。別の実施形態では、キャノーラ加水分解物は、配列番号１９８〜２３７からなる群から選択される少なくとも約２０のポリペプチドまたはその断片を含み得る。さらに別の代替実施形態では、キャノーラ加水分解物は、配列番号１９８〜２３７からなる群に相当するかまたは由来するアミノ酸配列を有する少なくとも３９のポリペプチドを含み得る。
【００５０】
タンパク質加水分解物がトウモロコシに由来するその他の付加的な実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、配列番号２３８〜２６１からなる群から選択されるポリペプチドを含み得る。一実施形態では、トウモロコシ加水分解物は、配列番号２３８〜２６１からなる群に相当するかまたは由来するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。別の実施形態では、トウモロコシ加水分解物は、配列番号２３８〜２６１からなる群に相当するかまたは由来するアミノ酸配列を有する少なくとも１０のポリペプチドを含み得る。さらなる実施形態では、トウモロコシ加水分解物は、配列番号２３８〜２６１からなる群に相当するかまたは由来するアミノ酸配列を有する少なくとも２４のポリペプチドを含み得る。
【００５１】
さらに、タンパク質加水分解物が小麦に由来する実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、配列番号２６２〜２６９からなる群から選択されるポリペプチドを含み得る。一実施形態では、小麦加水分解物は、配列番号２６２〜２６９からなる群に相当するかまたは由来するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。さらなる実施形態では、小麦加水分解物は、配列番号２６２〜２６９からなる群に相当するかまたは由来するアミノ酸配列を有する少なくとも８つのポリペプチドを含み得る。
【００５２】
本発明は、本発明の大豆タンパク質加水分解組成物、大豆／乳製品タンパク質加水分解組成物、キャノーラタンパク質加水分解組成物、トウモロコシタンパク質加水分解組成物または小麦タンパク質加水分解組成物から精製され得るポリペプチドまたはその断片のいずれを包含してもよい。通常、純粋なポリペプチド断片は、所与の精製サンプル中の全ポリペプチドの少なくとも約８０重量％、好ましくは９０重量％、そしてさらにより好ましくは少なくとも約９５重量％を構成する。ポリペプチド断片は、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィなどのクロマトグラフィ法によって精製することができる。例えば、ポリペプチド断片は、配列番号５〜２７４からなる群から選択することができる。さらに、本発明は、配列番号５〜２７４からなる群から選択されるものと実質的に同様の配列であるポリペプチド断片も包含する。一実施形態では、ポリペプチド断片は、配列番号５〜２７４からなる群から選択されるポリペプチド断片に対して少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、または８９％の配列同一性を有し得る。別の実施形態では、ポリペプチド断片は、配列番号５〜２７４からなる群から選択されるポリペプチド断片に対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有し得る。ポリペプチド断片が本発明の配列と特定の割合の配列同一性を共有するかどうかを決定するための方法は、上記に示される。
【００５３】
本発明のタンパク質加水分解組成物はさらに、非加水分解（すなわち、無処理の）タンパク質を含み得ることも想定される。非加水分解タンパク質は、本質的に無処理の調製物（例えば、大豆カード、コーンミール、ミルクなど）中に存在することができる。さらに、非加水分解タンパク質は、植物由来のタンパク質源（例えば、アマランス、クズウコン、大麦、ソバ、キャノーラ、キャッサバ、ヒヨコマメ（ガルバンゾ）、豆類、レンティル、ルピナス、トウモロコシ、キビ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、ライ麦、モロコシ属、ヒマワリ、タピオカ、ライ小麦、小麦などの源）から単離されてもよいし、あるいは動物タンパク質材料（適切な単離動物タンパク質の例としては、酸カゼイン、カゼイン塩、乳清、アルブミン、ゼラチンなどが挙げられる）から単離されてもよい。好ましい実施形態では、タンパク質加水分解組成物はさらに、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、大豆、小麦、動物、乳製品、卵、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される非加水分解タンパク質を含む。タンパク質加水分解物および非加水分解タンパク質の相対的な比率は、関連するタンパク質、および組成物の所望の使用に依存して異なり得るであろう。
【００５４】
（ＩＩＩ）タンパク質加水分解物を含む食品
本発明のさらなる態様は、食用材料および本明細書に記載されるタンパク質加水分解組成物のいずれかを含む食品の提供である。あるいは、食品は、食用材料および本明細書に記載される単離ポリペプチド断片のいずれかを含んでもよい。
【００５５】
食用材料と混ぜ合わせるための特定のタンパク質加水分解組成物の選択は、所望の食品に依存して異なり得るであろう。いくつかの実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、大豆タンパク質に由来し得る。他の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物、卵、およびこれらの組み合わせに由来し得る。さらに他の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、大豆と、大麦、キャノーラ、ルピナス、トウモロコシ、オート麦、エンドウ豆、ポテト、米、小麦、動物、乳製品、および卵からなる群から選択される少なくとも１つの他のタンパク質源との組み合わせに由来し得る。代替の実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、異なるタンパク質加水分解物の組み合わせを含むことができる。付加的な実施形態では、タンパク質加水分解組成物は、配列番号５〜２７４からなるアミノ酸配列の群から選択される単離または合成ポリペプチドを含むことができる。
【００５６】
適切な食用材料の選択も所望の食品によって異なるであろう。食用材料は、植物由来材料、動物由来材料、または植物由来材料や動物由来材料から単離されるバイオマテリアル（すなわち、タンパク質、炭水化物、脂質など）などであり得る。
【００５７】
一実施形態では、食品は飲料であり得る。好ましい飲料としては、そのまま飲める（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｄｒｉｎｋ）（ＲＴＤ）飲料または乾燥ブレンド飲料（ＤＢＢ）が挙げられる。飲料は、実質的に濁った飲料でも実質的に透明な飲料でもよい。適切な飲料の非限定的な例としては、ミルクベースの飲料、ミルク類似飲料（例えば、豆乳、米ミルクなど）、体重管理飲料、プロテインシェーク（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｈａｋｅ）、食事代用飲料（ｍｅａｌ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｄｒｉｎｋ）、コーヒーベースの飲料、栄養ドリンク、エネルギードリンク、調製粉乳、果実ジュースベースの飲料、果実飲料、果実風味飲料、野菜ベースの飲料、スポーツドリンクなどが挙げられる。飲料のｐＨは一般に約ｐＨ２．８〜約ｐＨ７．５、好ましくは約ｐＨ６．５〜約ｐＨ７．５の範囲であり、より好ましくは約ｐＨ７．０であろう。
【００５８】
別の実施形態では、食品は、グラノーラバー、シリアルバー、栄養バー、またはエネルギーバーなどの食品バーであり得る。さらに別の実施形態では、食品は、シリアルベースの製品であり得る。シリアルベースの食品の非限定的な例としては、朝食用シリアル、パスタ、パン、焼成製品（すなわち、ケーキ、パイ、ロール、クッキー、クラッカー）、およびスナック製品（例えば、チップス、プレッツェルなど）が挙げられる。シリアルベースの食品の食用材料は、小麦（例えば、漂白小麦粉、全粒小麦粉、小麦胚芽、小麦フスマなど）、コーン（例えば、コーン粉、コーンミール、コーンスターチなど）、オート麦（例えば、膨化オート麦、オートミール、オート麦粉など）、米（例えば、膨化米、米粉、米デンプン）などに由来し得る。さらに別の実施形態では、食品は、「固形の」乳製品ベースの製品であり得る。適切な「固形の」乳製品ベースの食品の非限定的な例としては、ハードチーズ製品、ソフトチーズ製品、アイスクリーム製品、ヨーグルト製品、フローズンヨーグルト製品、ホイップした乳製品様の製品、シャーベットなどが挙げられる。代替の実施形態では、食品は栄養補助食品であり得る。栄養補助食品は液体でも固体でもよい。別の代替の実施形態では、食品は、食肉製品または食肉類似製品であり得る。食肉食品の例としては、加工肉、ひき肉、および全筋肉の食肉製品が挙げられるがこれらに限定されない。食肉材料は、動物肉でもシーフード肉でもよい。食肉類似品は、動物またはシーフード肉の感触を模倣するテクスチャ化植物または乳製品タンパク質であり得る。食肉類似品は、食肉食品中の食肉材料の一部でも全てでもよい。
【００５９】
タンパク質加水分解組成物の加水分解度も、加水分解物および所望の食品を製造するために使用される出発材料に依存して異なるであろう。例えば、大豆含有タンパク質加水分解組成物を含む飲料では、実質的により可溶性であり、時には実質的に光をより透過させる大豆タンパク質加水分解組成物（１％ＤＨよりも６％ＤＨに近い加水分解度を有する組成物など）を用いることが望ましいかもしれない。同様に、苦味の官能特性を最小限にすることが望ましい食品では、６％ＤＨよりも１％ＤＨに近い加水分解度を有する大豆タンパク質加水分解組成物を選択することができる。さらに、穀類および大豆／豆類の官能特性を最小限にすることが望ましい食品では、１％ＤＨよりも６％ＤＨに近い加水分解度を有する大豆タンパク質加水分解組成物を選択することができる。
【００６０】
好ましい実施形態では、食品は上記で詳述したような飲料であり得る。そしてタンパク質加水分解組成物の適切な例は上記で詳述した。適切な食用材料の非限定的な例としては、スキムミルク、低脂肪乳、２％乳、全乳、クリーム、エバミルク（ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ  ｍｉｌｋ）、ヨーグルト、バターミルク、乾燥粉乳、無脂肪乾燥粉乳、乳タンパク質、酸カゼイン、カゼイン塩（例えば、カゼインナトリウム塩、カゼインカルシウム塩など）、乳清タンパク質濃縮物、乳清タンパク質単離物、大豆タンパク質単離物、大豆タンパク質加水分解物、乳清加水分解物、チョコレート、ココア粉末、コーヒー、茶、果実ジュース、野菜ジュースなどが挙げられる。飲料食品はさらに、甘味剤（グルコース、スクロース、フルクトース、マルトデキストリン、スクラロース、コーンシロップ、蜂蜜、メープルシロップなど）、風味剤（例えば、チョコレート、ココア、チョコレート風味、バニラ抽出物、バニラ風味、果実風味など）、乳化または増粘剤（例えば、レシチン、カラギナン、セルロースガム、セルロースゲル、デンプン、アラビアガム、キサンタンガムなど）、安定剤、脂質材料（例えば、キャノーラ油、ヒマワリ油、高オレイン酸ヒマワリ油、脂肪粉末など）、防腐剤（例えば、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸など）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウムなど）、着色剤、ビタミン、ミネラル、およびこれらの組み合わせを含んでもよい。
【００６１】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００６２】
「加水分解度」という用語は、タンパク質１００キログラム（ｋｇ）あたりに存在するＮＨ2のモル数を決定することによって測定される、切断された全ペプチド結合の割合を指す。
【００６３】
「エンドペプチダーゼ」という用語は、オリゴペプチドまたはポリペプチド鎖中の内部ペプチド結合を加水分解する酵素を指す。エンドペプチダーゼの群は、酵素サブクラスＥＣ  ３．４．２１〜２５を含む（国際生化学・分子生物学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）酵素分類システム）。
【００６４】
「食品グレード酵素」は、一般に安全と認められる（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  ｓａｆｅ（ＧＲＡＳ））と認可されており、ヒトなどの生物体により消費される場合に安全な酵素である。通常、酵素および酵素が由来し得る製品は、適用可能な法的規制ガイドラインに従って製造される。
【００６５】
「加水分解物」は、化合物が水の影響によって切断されたときに得られる反応生成物である。タンパク質加水分解物は、熱的、化学的、または酵素的な分解に引き続いて生じる。反応の間、大きい分子は、より小さいタンパク質、可溶性タンパク質、ペプチド断片、および遊離アミノ酸に破壊される。
【００６６】
「穀類」「大豆／豆類」または「苦味」のような用語を説明するために使用されるような「官能特性」という用語は、実施例６において特に明確に記述されるようなＳＱＳ採点システムに従って決定される。
【００６７】
「可溶性固形分指数」という用語は、可溶性タンパク質または可溶性固形分の割合を指す。
【００６８】
本明細書で使用される「単離大豆タンパク質」または「大豆タンパク質単離物」という用語は、無水ベースで少なくとも約９０％の大豆タンパク質のタンパク質含量を有する大豆材料を指す。単離大豆タンパク質は、子葉から大豆の皮および胚を除去し、子葉をフレークまたは粉砕してフレークまたは粉砕子葉から油を除去し、子葉の大豆タンパク質および炭水化物を子葉繊維から分離し、次いで大豆タンパク質を炭水化物から分離することによって、大豆から形成される。
【００６９】
本明細書で使用される「大豆タンパク質濃縮物」という用語は、無水ベースで約６５％から約９０％未満までの大豆タンパク質のタンパク質含量を有する大豆材料である。大豆タンパク質濃縮物は、無水ベースで通常約３．５重量％から約２０重量％までの大豆子葉繊維も含有する。大豆タンパク質濃縮物は、大豆の皮および胚を除去し、子葉をフレークまたは粉砕してフレークまたは粉砕子葉から油を除去し、大豆タンパク質および大豆子葉繊維を子葉の可溶性炭水化物から分離することによって大豆から形成される。
【００７０】
本明細書で使用される「大豆粉」という用語は、粒子がＮｏ．１００メッシュ（米国基準）スクリーンを通過できるようなサイズを有する脱脂、一部脱脂、または全脂大豆材料の粉砕形態を指す。大豆ケーク、チップ、フレーク、ミール、または材料の混合物は、従来の大豆粉砕方法を用いて大豆粉に粉砕される。大豆粉は、無水ベースで約４９％〜約６５％の大豆タンパク質含量を有する。好ましくは、粉は非常に細かく粉砕され、最も好ましくは、３００メッシュ（米国基準）スクリーン上に約１％未満の粉が保持されるように粉砕される。
【００７１】
本明細書で使用される「大豆子葉繊維」という用語は、少なくとも約７０％の食物繊維を含有する大豆子葉の多糖類部分を指す。大豆子葉繊維は通常いくらか少量の大豆タンパク質を含有するが、１００％繊維であってもよい。本明細書で使用される大豆子葉繊維は、大豆皮の繊維を指さないかまたは含まない。一般的に、大豆子葉繊維は、大豆の皮および胚芽を除去し、子葉をフレークまたは粉砕してフレークまたは粉砕子葉から油を除去し、大豆子葉繊維を子葉の大豆材料および炭水化物から分離することによって、大豆から形成される。
【００７２】
「トリプシン様セリンプロテアーゼ」は、アルギニン残基またはリジン残基のカルボキシル末端側でペプチド結合を優先的に切断する酵素である。
【００７３】
本発明またはその好ましい実施形態の要素を導入する場合に、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」は、その要素が１つまたは複数存在することを意味するものとする。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」および「ｈａｖｉｎｇ」という用語は包括的であり、記載される要素以外にさらなる要素が存在し得ることを意味するものとする。
【００７４】
本発明の範囲から逸脱することなく上記の化合物、製品および方法には種々の変化がなされ得るので、上記説明および以下に示される実施例に含まれる全ての事項は例示として解釈されるべきであり、限定の意味で解釈されるべきではないことが意図される。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例は、本発明の実施形態を説明する。
【００７６】
実施例１．トリプシン様エンドペプチダーゼＴＬ１による単離大豆タンパク質の加水分解
その溶解度を高め、そしてその官能特性を改善するために、単離大豆タンパク質をより小さいペプチド断片に加水分解した。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からの菌・カビ類トリプシン様ペプチダーゼＴＬ１（その配列は本出願の配列番号１で示される）はアルギニンまたはリジン残基のＣ末端側でペプチド結合を切断するが、他のペプチダーゼは大豆タンパク質内のランダムなペプチド結合を切断することが示されているので、ＴＬ１を選択した。
【００７７】
発泡を低減するために穏やかな混合を用いて、３２０ｇのＳＵＰＲＯ（登録商標）５００Ｅ、Ｓｏｌａｅ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））を３６８０ｇの水中に分散させることによって、単離大豆タンパク質（ＩＳＰ）の８％スラリーを製造した。必要であれば、２滴の消泡剤を添加した。溶液を８０℃に５分間加熱して、存在している可能性のあるセリンプロテアーゼ阻害剤を不活性化した。混合物を５０℃まで冷却し、食品グレードのＫＯＨ（５０％ｗ／ｗ溶液）を用いてｐＨを８．０に調整した。０、７５ｍｇ、３５０ｍｇ、６５０ｍｇ、または９５０ｍｇのＴＬ１／大豆タンパク質１ｋｇの存在下、一定分量（８００ｍＬ）の８％大豆タンパク質スラリーを５０℃で６０分間インキュベートした。サンプルを８５℃に５分間加熱し、酵素を不活性化した。サンプルを氷上で冷し、４℃で貯蔵した。
【００７８】
加水分解度（％ＤＨ）は、加水分解された特定のペプチド結合のパーセント（すなわち、出発タンパク質中に存在するペプチド結合の総数のうち切断された数）を指す。％ＤＨは、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）法を用いて推定した。この手順は正確で再現可能であり、食品タンパク質加水分解物の加水分解度を決定するために一般に適用可能な手順である。このために、０．１ｇの大豆タンパク質加水分解物を１００ｍＬの０．０２５ＮのＮａＯＨ中に溶解した。一定分量（２．０ｍＬ）の加水分解物溶液を８ｍＬの０．０５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）と混合した。２ｍＬの緩衝加水分解物溶液を０．２０ｍＬの１０％トリニトロベンゼンスルホン酸で処理した後、室温において暗所で１５分間インキュベーションした。４ｍＬの０．１Ｍ亜硫酸ナトリウム−０．１Ｍリン酸ナトリウム溶液（１：９９比）を添加することにより反応を失活させ、４２０ｎｍで吸光度を読み取った。０．１ｍＭのグリシン溶液を標準として用いた。以下の計算を用いてグリシン標準溶液の回収パーセントを決定した：［（４２０ｎｍにおけるグリシンの吸光度−４２０ｎｍにおけるブランクの吸光度）×（１００／０．７１０）］。９４％以上の値は許容可能であると考えた。
【００７９】
表１は、各サンプルの平均ＴＮＢＳ値および％ＤＨを示す。加水分解は６％ＤＨの付近でプラトーになり始め、これは、切断のために容易に利用できるアルギニンおよびリジン部位の数を反映し得ると思われる。この実験は、３５０ｍｇ／ｋｇのＴＬ１による１時間の消化が、十分な加水分解生成物を生じたことを示唆する。
【００８０】
2010524471.tif 000008
【００８１】
実施例２．ＴＬ１加水分解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
０．３％ＤＨ、２．２％ＤＨ、３．１％ＤＨ、４．０％ＤＨ、および５．０％ＤＨを有するＴＬ１加水分解物を、本質的に実施例１に記載したとおりに調製した。一定分量の各加水分解物および非加水分解単離大豆タンパク質を、標準的な手順を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解した。この分析によって、大豆加水分解物中のポリペプチドの分子サイズの、出発大豆タンパク質との比較が可能になった。図１は、クーマシー染色ゲルの画像を示す。非加水分解単離大豆タンパク質は、約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲の大きさのポリペプチドを含む。０．３％ＤＨ加水分解物中のポリペプチドのサイズ範囲は出発材料と同様であったが、この加水分解物は付加的な小さいポリペプチド断片を含有した。より高い％ＤＨを有する加水分解物は、本質的に約２０〜３０ｋＤａよりも大きいポリペプチドが欠けており、全てが付加的な小さい（＜５ｋＤａ）ポリペプチドを有していた。２．２％ＤＨ、３．１％ＤＨ、および４．０％ＤＨ加水分解物のポリペプチドパターンはかなり類似していた。しかしなら、５．０％ＤＨ加水分解物は、他の加水分解物よりも狭い範囲のポリペプチドサイズ（約０．１〜２０ｋＤａ）を有した。特に、５．０％ＤＨ加水分解物には７Ｓおよび１１Ｓサブユニットバンドは存在しなかった。（図１、レーン８を参照）。
【００８２】
実施例３．ＬＣ−ＭＳによるＴＬ１加水分解物中のペプチド断片の分析
実施例１で調製したＴＬ１加水分解物中のペプチド断片を、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって同定した。２ｍｇの各ＴＬ１加水分解物を含有する一定分量を、０．１％ギ酸（１ｍＬ）とガラスバイアル中で混合して１〜２分間ボルテックスすることによってＬＣ−ＭＳ分析のためのサンプルを調製した。混合物を１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＨＰ（登録商標）−１１００（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ））ＨＰＬＣ機器において、Ｃ１８分析ＨＰＬＣカラム（１５ｃｍ×２．１ｍｍ内径５μｍ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｂｉｏ  Ｗｉｄｅ  Ｐｏｒｅ、Ｓｕｐｅｌｃｏ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））に、一定分量（２５μＬ）の上澄みを注入した。溶出プロファイルは表２に示され、溶媒Ａは０．１％ギ酸であり、溶媒Ｂはアセトニトリル中０．１％のギ酸であった。流速は０．１９ｍＬ／分であり、カラムのサーモスタット温度は２５℃であった。
【００８３】
2010524471.tif 000009
【００８４】
ＭＳ分析のためのスプリッターシステムを用いて一定分量（１０μＬ）のＬＣ溶離液をＥＳＩ−ＭＳ源に供給した。Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｎｎｉｇａｎTMＬＣＱTM（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ））デカイオントラップ質量分析計を用いて、データ依存性ＭＳ／ＭＳおよび動的排除走査事象（ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｓｃａｎ  ｅｖｅｎｔ）のあるデータ依存性ＭＳ／ＭＳによりペプチドを分析した。ＥＳＩ−ＭＳはキャピラリー温度２２５℃の正イオンモードで実行し、エレクトロスプレーニードルは電圧５．０ｋＶに設定し、走査範囲はｍ／ｚ４００〜２０００であった。酵素検索パラメータのないＳｅｑｕｅｓｔ検索エンジン（ＢＩＯＷＯＲＫＳTMソフトウェア、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ））によってＭＳ／ＭＳ生データをデコンボリューション処理した。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈにおけるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、またはＳｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓからのＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの標準データベースを検索することによってペプチドを同定した。
【００８５】
ペプチドは表３に示される。ほぼ全てのペプチド断片は、カルボキシル末端にアルギニンまたはリジンを有した（３つの断片はカルボキシル末端にグルタミンを有した）。リジン残基よりもアルギニン残基を有する末端の断片のほうが約２倍多かった。
【００８６】
ペプチド断片の同定によって、βコングリシニンのαサブユニット、βコングリシニンのβサブユニット、グリシニンサブユニットＧ１、グリシニンサブユニットＧ３、およびグリシニンＧｙ４の加水分解生成物が各ＴＬ１加水分解物中に存在することが明らかになった。同じペプチド断片の多くが各加水分解物で検出された。５．８％および６．１％ＤＨの加水分解物は、Ｐ２４オレオシンアイソフォームＡからの断片も含有した。６．１％ＤＨの加水分解物は、付加的なタンパク質であるトリプシン阻害剤Ｋｔｉ３からの断片の存在を明らかにした。
【００８７】
2010524471.tif 000010
【００８８】
（表３続き）
2010524471.tif 000011
【００８９】
実施例４．高加水分解度を有するＴＬ１加水分解物中のペプチド断片のＭＡＬＤＩ−ＭＳによる分析
実施例１で調製した６．１％ＤＨ大豆加水分解物中のペプチド断片は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ−ＭＳ）によっても分析した。最終溶出工程を約５０分に延長し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））フラクションコレクタにおいて１分間隔で画分を集めたことを除いて実施例３に記載されるように、サンプルをＨＰＬＣのために調製して分析した。Ｇｅｎｅｖａｃ（登録商標）（Ｇｅｎｅｖａｃ，Ｌｔｄ（ＵＫ））エバポレータにおいて画分＃４〜４８を３０℃よりも低い温度で完全に蒸発させた。
【００９０】
このために、乾燥サンプルを５０％アセトニトリル中の１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液２００μＬ中に溶解した。一定分量（１．５μＬ）の各サンプルを１．５μＬのＭＡＬＤＩマトリックス溶液（６．２ｍｇのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸／３６％のメタノール（ｖ／ｖ）、５６％のアセトニトリル（ｖ／ｖ）、および８％の水１ｍｌ）と混合した。サンプルをボルテックスし、遠心分離し、そして１μＬをＭＡＬＤＩステンレス鋼標的板にスポットした。さらなる精製およびＭＳ／ＭＳ分析のために高品質ＭＳスペクトルを有する１３個のサンプルを選択した。それぞれの画分を乾燥させ、ＰＣＲ管内で１％のアセトニトリル中の０．１％のギ酸溶液１０μＬ中に再懸濁させ、３０秒間ボルテックスし、２０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離した。ボルテックスおよびスピニングを５回繰り返した。ＮｕＴｉｐ（１０μＬの多孔質黒鉛炭素ＳＰＥチップ）を用いてペプチド混合物を精製した。予め湿潤させた（６０％のアセトニトリル中の０．１％のギ酸、続いて０．１％ギ酸で平衡にした）チップを用いてサンプルを含有するＰＣＲ管からペプチドを抽出した。合計５０回、サンプル溶液全体をチップ内に吸い込んで管内に排出した。次に、サンプル負荷チップを０．１％のギ酸（１０μＬ）で５回洗浄した（吸込みおよび排出）。最後に、６０％のアセトニトリル中の０．１％ギ酸１０μＬでペプチドをチップから溶出させた。溶出方法は、同じ溶媒混合物（１０μＬ）を用いて１０回繰り返した。貯蔵された溶出サンプル溶液を速度真空下で乾燥させ、５０％のアセトニトリル中の１％のＴＦＡの溶液１．５μＬおよびＭＡＬＤＩマトリックス溶液１．５μＬ中に再懸濁させた。混合物を３０秒間ボルテックスし、２０００ｒｐｍで５秒間遠心分離し、１μＬをＭＡＬＤＩ標的板にスポットした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ機器（ＡＢＩ−４７００）においてＭＳ分析を実施した。機器はＮＤ：ＹＡＧ（３３５ｎｍ）を備え、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳモードの両方において２００Ｈｚの反復率で動作した。第１のＴＯＦにおいて２０ＫｅＶの加速エネルギーでデータを記録し、電圧ｍアインツェル（Ｅｉｎｚｅｌ）レンズは６ＫｅＶに設定した。酵素検索パラメータのないＭＡＳＣＯＴ検索エンジン（ＭＡＴＲＩＸ  ＳＣＩＥＮＣＥ）によって、ＭＳ／ＭＳデータをデコンボリューション処理した。ＮＣＢＩまたはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの標準データベースを検索することによってペプチドを同定した。
【００９１】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより同定されたペプチドは表４に示される。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）で同定されたものと同じペプチド断片のいくつかをこの分析で同定した。例えば、βコングリシニンのαサブユニット、βコングリシニンのβサブユニット、グリシニンサブユニットＧ１、およびグリシニンＧｙ４の断片が両方の分析で発見された。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析は、βコングリシニンαプライムサブユニット、グリシニンサブユニットＧ２、および６２Ｋスクロース結合タンパク質前駆体および種子成熟タンパク質ＬＥＡ４などの付加的なポリペプチドの断片を検出した。
【００９２】
2010524471.tif 000012
【００９３】
実施例５．ＴＬ１またはＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）による単離大豆タンパク質の加水分解
ＴＬ１またはＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）２．４Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手可能な微生物サブチリシンプロテアーゼのいずれかにより、種々の加水分解物の官能特性および機能性を比較し得るように、単離大豆タンパク質を加水分解した。５分間の穏やかな混合を用いて７２ｇのＳＵＰＲＯ（登録商標）５００Ｅを８２８ｇの水道水中にブレンドすることによって、８％単離大豆タンパク質のスラリーを調製した。２滴の消泡剤を添加した。２ＮのＫＯＨを用いてスラリーのｐＨを８．０に調整した。一定分量（８００ｇ）のスラリーを混合しながら５０℃に加熱した。様々な量のＴＬ１ペプチダーゼまたはＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）プロテアーゼを添加して、０、１％ＤＨ、２％ＤＨ、４％ＤＨ、および６％ＤＨの目標の加水分解度を達成した。自動滴定装置を用いて、反応のｐＨをｐＨ８．０で一定に保持した。５０℃で所望の加水分解度を生じる時間インキュベートした後、サンプルを８５℃に５分間加熱し、酵素を不活性化し、溶液をｐＨ７．０に調整した。サンプルを氷上で冷やし、４℃で貯蔵した。ＴＮＢＳ法を用いて加水分解度（％ＤＨ）を決定した（実施例１に記載されるように）。表５は、添加した酵素の量、反応時間、反応中にｐＨを滴定するために添加したＫＯＨの体積、平均ＴＮＢＳ値、および％ＤＨを示す。
【００９４】
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【００９５】
実施例６．ＴＬ１およびＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）加水分解物の官能分析
独占的な官能スクリーニング法であるＳｏｌａｅ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ＳＱＳ）法を用いて、実施例５で調製されるＴＬ１およびＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）加水分解物の風味特性を査定した。この方法は試験サンプルおよび対照サンプル間の直接比較に基づいており、定性的差異および方向性の（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）定量的差異の両方を提供する。７人の訓練された査定者集団に、一定分量の各サンプル（５％スラリーに希釈）と、非加水分解単離大豆タンパク質の５％スラリーである対照サンプルとを提供した。食品グレードのリン酸を用いて各溶液のｐＨを７．０に調整した。
【００９６】
評価プロトコルは、カップの底をテーブル上に置いたままでカップを３回かき混ぜることを含んだ。サンプルを２秒間そのままにした後、各査定者は約１０ｍＬ（小さじ２）を少しずつ飲み、彼女／彼の口の中で１０秒間音を立て、そして吐き出した。次に、査定者は表６に示されるスケールに従って試験サンプルと対照サンプルとの差異を評定した。
【００９７】
2010524471.tif 000014
【００９８】
表７は、各サンプルの平均ＳＱＳスコアを示す。ＴＬ１加水分解物は、一般に、対照サンプル（未処理の単離大豆タンパク質）とは中程度の差異であると評定された。ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）加水分解物は対照とはわずか〜極度の差異を有すると評定された。
【００９９】
2010524471.tif 000015
【０１００】
試験サンプルが対照サンプルとは異なる（すなわち、２、３、または４のＳＱＳスコア有する）と評定された場合、試験サンプルが対照サンプルとどのように異なるかについての診断情報を提供するために試験サンプルをさらに評価した。従って、試験サンプルが対照サンプルよりもわずかに多い、中程度に多い、または極度に多い特性（表８を参照）を有する場合には、それぞれ＋１、＋２、＋３のスコアを割り当てた。同様に、試験サンプルが対照サンプルよりもわずかに少ない、中程度に少ない、または極度に少ない特性を有する場合に、それぞれ−１、−２、−３のスコアを割り当てた。この分析は、試験サンプルと対照サンプルとの間の方向性の定量的差異の査定を提供する。
【０１０１】
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【０１０２】
９つの風味特性の方向性の差異は、同様の％ＤＨレベルを有する加水分解物について図２Ａおよび２Ｂに示される。全ての％ＤＨレベルにおいて、ＴＬ１加水分解物はＡＬＣ加水分解物よりも大きい穀類および大豆／豆類特性の低下と、小さい渋味および苦味の増大とを有した。最も高い％ＤＨのＡＬＣ加水分解物は、対照と比べて特に大きい苦味の増大を有した。
【０１０３】
実施例７．ＴＬ１およびＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）加水分解物の溶解度
加水分解物を２．５％固形分に希釈し、４℃、ｐＨ７．０で１週間貯蔵することによって、実施例５で調製したＴＬ１およびＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）加水分解物のそれぞれの溶解度を評価した。サンプルを視覚的に評価した。写真画像は図３Ａに示される。ＴＬ１加水分解物は全てほとんど沈降物がなかったが、５．１％ＤＨのＴＬ１加水分解物は、より低い％ＤＨのものと比べて透明性も増大していた。対照的に、最高の％ＤＨを有するＡＬＣ加水分解物は、著しい量の沈降物があった。図３Ｂは、ｐＨ８．２、４℃で３週間貯蔵した、２．５％固形分に希釈した６．１％ＤＨのＴＬ１加水分解物および１３．８％ＤＨのＡＬＣ加水分解物の管の画像を示す。ＴＬ１加水分解物は沈降物がなく、ｐＨ８．２、４℃で長期間安定であることが示されたが、ＡＬＣ加水分解物は沈降物を有した。
【０１０４】
実施例５で調製したＴＬ１およびＡＬＣ加水分解物のそれぞれにおいて、溶解度に対するｐＨの効果を試験した。それぞれの一定分量をｐＨ２、ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、またはｐＨ９に調整し、サンプルを５００×ｇで１０分間遠心分離した。遠心分離の前の溶液中の固体物質の量を遠心分離の後の溶液中の固体物質の量と比較して、可溶性固形分指数（ＳＳＩ）を得た。ＴＬ１およびＡＬＣ加水分解物の％可溶性固形分はｐＨの関数として図４Ａおよび４Ｂにそれぞれ示される。溶液は全て、約ｐＨ４〜ｐＨ５のｐＨレベル（すなわち、大豆タンパク質の等電点）で低下した溶解度と、それよりも低いｐＨ値でいくらか増大した溶解度とを有した。しかしながら、より高いｐＨ値では、ＴＬ１加水分解物は全てｐＨ６．０よりも高いレベルで優れた溶解度を有した（図４Ａ）が、ＡＬＣ加水分解物のいくつかはより高いｐＨレベルで低下した溶解度を有した（図４Ｂ）。図４Ｃは、低いおよび高い％ＤＨにおけるＴＬ１およびＡＬＣ加水分解物の溶解度の直接比較をｐＨの関数として示す。
【０１０５】
実施例８．ＴＬ１加水分解物の透過度
実施例５で調製したＴＬ１加水分解物のいくつかの透過度を測定した。このために、異なる割合の固形分（すなわち、０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、および２．５％）を有する１％ＤＨおよび５．１％ＤＨのＴＬ１加水分解物を調製した。一定分量の各タンパク質スラリーをＴＵＲＢＩＳＣＡＮ（登録商標）Ｌａｂ  Ｅｘｐｅｒｔ装置（Ｆｏｒｍｕｌａｃｔｉｏｎ（Ｉ’Ｕｎｉｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ））に入れ、合計６０秒間、毎秒透過度を記録した。表９は、各サンプルの平均パーセント透過度を示す。０．５％固形分での１．０％ＤＨ加水分解物の１．３％の透過度と比較して、５．１％ＤＨのＴＬ１加水分解物は０．５％固形分で３７．４％の透過度を有した。これらのデータは視覚的に観察されたこと（図３Ａを参照）を確認する。
【０１０６】
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【０１０７】
実施例９．ＴＬ１または他のエンドペプチダーゼを用いて調製した大豆加水分解物の苦味分析
ＴＬ１、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）、またはアクロモバクター・リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ）からのリジルエンドペプチダーゼ（ＳＰ３、配列番号４）を用いて、本質的に実施例１および５に記載したように、単離大豆タンパク質を加水分解した。酵素濃度および反応条件は、実施例１に記載されるＴＮＢＳ法によって決定される場合に約５〜６％ＤＨの％ＤＨ値を与えるように選択した。実施例６に記載されるＳＱＳ法を用いた苦味に焦点を合わせた評価のために加水分解物を５人の査定者集団に与えた。
【０１０８】
平均ＳＱＳスコアおよび診断的な苦味スコアは表１０に示される。ＴＬ１およびＳＰ３加水分解物は、対照サンプル（非加水分解単離大豆タンパク質）とはわずかな差異を有すると評定された。同様に、ＴＬ１およびＳＰ３加水分解物は、対照サンプルよりもほんのわずかだけ苦くないと評定された。対照的に、ＡＬＣ加水分解物は対照サンプルとは極めて異なり、対照サンプルよりも極めて苦いと評定された。
【０１０９】
2010524471.tif 000018
【０１１０】
実施例１０．パイロットプラントＴＬ１加水分解物の物理特性
単離大豆タンパク質のＴＬ１加水分解物の製造をベンチ規模からより大きいパイロットプラント規模に拡大し、加水分解物の官能および機能特性を分析した。このために、出発材料は大豆タンパク質カードであった。大豆タンパク質カード材料を製造するために、大豆フレーク、大豆粉、または大豆グリットを約ｐＨ６．５〜約ｐＨ１０の水溶液で連続的に抽出して、フレーク／粉／グリット状のタンパク質を繊維などの不溶性材料から分離した。フレーク重量を基準として０．０５〜０．１５％の低レベルの亜硫酸塩を抽出媒体に添加した。フレーク、粉、またはグリットは、第１の抽出のために約ｐＨ６．５〜７．０の水酸化ナトリウム水溶液で抽出し、次に第２の抽出のために約ｐＨ８．５〜１０の溶液で抽出した。大豆フレーク／粉／グリット材料に対する水の重量比は、約８：１〜約１６：１であった。
【０１１１】
抽出の後、ろ過または遠心分離によって抽出物を不溶性材料から分離した。次に、分離した抽出物のｐＨを適切な酸で大豆タンパク質の等電点付近（約ｐＨ４〜５、または好ましくはｐＨ４．４〜４．６）に調整して、大豆タンパク質が大豆可溶分（ガス誘発性のオリゴ糖および他の水溶性炭水化物を含む）から分離されるように大豆タンパク質カードを沈殿させた。適切な食用酸は塩酸、硫酸、硝酸、または酢酸を含む。沈殿したタンパク質材料（カード）を遠心分離により抽出物（乳清）から分離して、大豆タンパク質カード材料を製造した。約５：１〜約１２：１の水対タンパク質材料の重量比で、分離した大豆タンパク質カード材料を水で洗浄して残留可溶分を除去した。
【０１１２】
まず大豆タンパク質カード材料を水酸化ナトリウム溶液または水酸化カリウム溶液などのアルカリ水溶液またはアルカリ土類水溶液で約ｐＨ８．０〜約ｐＨ９．０、好ましくは約ｐＨ８．０〜８．５に中和した。好ましくはジェット調理およびフラッシュ冷却によって、中和した大豆タンパク質カードを加熱および冷却した。次に、大豆タンパク質加水分解物が約３５〜５５のＴＮＢＳ値を有するように大豆タンパク質材料を加水分解するために有効な温度及び時間で大豆タンパク質材料をＴＬ１酵素で処理した。タンパク質カード重量を基準として０．００５％〜０．０２％の酵素タンパク質の濃度で、酵素を大豆タンパク質材料に添加した。４０℃〜６０℃、好ましくは約５０℃の温度で３０分〜１２０分間、好ましくは５０分〜７０分間、酵素を大豆タンパク質カード材料と接触させてタンパク質を加水分解した。加水分解大豆タンパク質材料を、酵素を不活性化するために有効な温度に加熱することによって加水分解を終了させた。最も好ましくは、加水分解大豆タンパク質カード材料をジェット調理して酵素を不活性化し、フラッシュ冷却し、次に上記のようにスプレー乾燥した。
【０１１３】
表１１は、加水分解物の典型的なセットのための反応パラメータを示す。加水分解度は、本質的に実施例１に記載されるように、ＴＮＢＳ法を用いて決定した。各サンプルのＴＮＢＳ値および％ＤＨも表１１に示される。対照サンプルは、非加水分解単離大豆タンパク質（すなわち、ＳＵＰＲＯ（登録商標）５００Ｅ）および本質的に市販の単離大豆タンパク質加水分解物（すなわち、酵素の混合物で２．８％ＤＨに加水分解したＳＵＰＲＯ（登録商標）ＸＴ２１９）を含んだ。
【０１１４】
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【０１１５】
標準手順を用いて、ＴＬ１加水分解物および対照サンプルをＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。図５は、ゲルの画像を示す。この分析により、主要な大豆貯蔵タンパク質サブユニットの全てがＴＬ１により切断されることが明らかになった。
【０１１６】
実施例１１．パイロットプラントＴＬ１加水分解物の溶解度および粘度
実施例１０で調製したパイロットプラントＴＬ１加水分解物および対照サンプルの溶解度も調べた。一定分量の各サンプルをｐＨ２、ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、およびｐＨ９に調整し、本質的に実施例７に記載されるように可溶性固形分指数（ＳＳＩ）を決定した。図６に示されるように、ＴＬ１加水分解物サンプルの全てがｐＨ６以上のｐＨレベルでほぼ１００％可溶性であったが、加水分解対照サンプルはｐＨ６でわずか約４０％の可溶性であった。さらに、加水分解度が増大すると、等電点（すなわち、ｐＨ４〜５付近）における溶解度も増大する。
【０１１７】
ＴＬ１加水分解物のいくつかおよび対照サンプルの粘度を種々の割合の固形分（すなわち、１２〜２０％の固形分）において決定した。小型のＷａｒｉｎｇ（登録商標）（Ｗａｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｔｏｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＣＴ））ブレンダーを用いて、７０グラムの全スラリー含量でサンプルを分散させた。発泡を低減するために最少のせん断を用いてサンプルを合計４分間ブレンドした。次に、小型サンプルアダプターおよびスピンドル１８を有するＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度計を用いて室温でサンプルを分析した。各サンプルを２通り調製及び分析した。図７は、種々のパラメータに対して粘度測定値をセンチポアズ（ｃｐｓ）でプロットする。単離品は１０，０００ｃｐｓよりも大きく、これは、１２％固形分ではＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄのためには粘性過ぎた。この分析によって、加水分解度が増大すると粘度が低下し、固形分パーセントが増大すると粘度が増大することが明らかになった。図８は、粘度および溶解度データを要約する。溶解度は、可溶性固形分指数（ＳＳＩ）および窒素可溶性指数（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｉｎｄｅｘ）（ＮＳＩ、全窒素の関数としての水溶性窒素のパーセントである）で表される。図８に示されるように、加水分解度が増大すると粘度は低下し、溶解度は増大する。
【０１１８】
ＴＬ１加水分解物のいくつかにおいて存在する風味揮発性物質の量を、非加水分解単離大豆タンパク質中に存在する量と比較した。風味揮発性物質は、標準的なＧＣ技法を用いて決定した。非加水分解単離大豆タンパク質と比較してＴＬ１加水分解物中では、ヘキサナール、ヘプタナール、ペンタナール、３−オクテン−２−オン、および１−オクテン−３−オールのレベルは低下した（図９Ａおよび９Ｂ）。
【０１１９】
実施例１２．パイロットプラントＴＬ１加水分解物の官能分析
本質的に実施例６に記載されるＳＱＳ法を用いて、実施例１０で調製したパイロットプラントＴＬ１加水分解物の風味プロファイルを分析した。１１または１２人の訓練された査定者集団が、対照サンプル（すなわち、非加水分解単離大豆タンパク質）と比較して加水分解物を評定した。表１２は平均ＳＱＳスコアを示し、図１０Ａ〜Ｄは診断スコアのプロットを示す。一般に、ＴＬ１加水分解物は対照サンプルと比べてわずかに少ない穀類および大豆／豆類特性と、低下した粘度とを有したが、特により高い加水分解度（％ＤＨ）では、増大した苦味特性を有した。加水分解対照サンプル（すなわち、サンプル５−３）はわずかに低下した穀類特性を有したが、中程度に増大した苦味および渋味特性を有した。従って、ＴＬ１加水分解物は一般に、加水分解対照サンプルよりも苦くないと評定された。
【０１２０】
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【０１２１】
図１１はＴＬ１加水分解物の官能分析の要約を示し、重要な官能特性が加水分解度の関数としてプロットされている。加水分解度が増大すると加水分解物の全体の官能スコアは低下し、加水分解度が増大すると苦味スコアが増大する。約２％ＤＨ未満を有する加水分解物は最良の風味を有し、苦味感が最も少なかったと思われる。
【０１２２】
実施例１３．大豆のＴＬ１加水分解物中のペプチド断片の分析
Ｑ−ＳＴＡＲ（登録商標）ＸＬ  ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（ＡＢＩ）（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ））およびＬＣＱ−Ｄｅｃａ  ＭＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ（Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ））を用いて、ＬＣ−ＭＳ分析によって種々の加水分解度を有する単離大豆タンパク質のＴＬ１加水分解物中のペプチドを同定した。
【０１２３】
およそ（０．５〜２．０ｍｇ）の各サンプルを０．５ｍＬの５０ｍＭの重炭酸アンモニウム中に溶解した。データ依存性の収集を用いるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために内径７５ｕｍのカラムに５μＬを注入した（ＬＣ流速は１８０ｎＬ／分であった）。Ｃ１８  ＰｅｐＭａｐ１００カラム（Ｄｉｏｎｅｘ（ＵＫ））を用いるＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇｓ  ＵｌｔｉｍａｔｅナノＬＣ／Ｃ１８  ＰｅｐＭａｐ１００カラム（Ｄｉｏｎｅｘ）を用いるＥｋｓｉｇｅｎｔ  ２ＤナノＬＣによって、ナノＬＣを実施した。溶出プロファイルは表１３に示される。溶媒ＡはＭｉｌｌｉＱ水中の５％のアセトニトリル、０．１％のギ酸であり、溶媒ＢはＭｉｌｌｉＱ水中の９５％のアセトニトリル、０．０７５％のギ酸であった）。
【０１２４】
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【０１２５】
ナノエレクトロスプレー源（Ｐｒｏｔａｎａ  ＸＹＺマニピュレータ）を備えたＡＢＩ  ＱＳＴＡＲ（登録商標）ＸＬ  ｈｙｂｒｉｄ  ＱＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ））を用いてサンプル分析を進めた。２．５ｋＶでホウケイ酸塩（ｂｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅ）ナノエレクトロスプレーニードルからポジティブモードのナノエレクトロスプレーを発生した。製造業者からの標準物を用いて機器のｍ／ｚ応答を毎日較正した。以下のパラメータを有するＡｎａｌｙｓｔ  ＱＳソフトウェア中の情報依存性データ収集（ＩＤＡ）特徴を用いて、ＴＯＦ質量スペクトルおよび生成イオンスペクトルを取得した。ＴＯＦ  ＭＳおよびＭＳ／ＭＳの質量範囲はそれぞれ、ｍ／ｚ３００〜２０００および７０〜２０００であった。毎秒、ＴＯＦ  ＭＳ前駆体イオンスペクトルを累積した後、３つの生成イオンスペクトルをそれぞれ３秒間累積した。ＴＯＦ  ＭＳからＭＳ／ＭＳへの切換えは、ペプチドの質量範囲（ｍ／ｚ  ３００〜２０００）、前駆体の荷電状態（２〜４）およびイオン強度（＞５０カウント）によって始動させた。ＤＰ、ＤＰ２、およびＦＰの設定はそれぞれ６０、１０、および２３０であり、回転衝突エネルギーを使用した。
【０１２６】
Ａｎａｌｙｓｔ  ＱＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてペプチドエレクトロスプレータンデム質量スペクトルを処理した。以下の制約を有するＭＡＳＣＯＴバージョン１．９を用いてＮＣＢＩまたはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの標準データベースを検索することによってペプチドを同定した：どの酵素も１つまでの失敗した切断部位を持たず、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ断片イオンの質量許容差はそれぞれ０．８／２．０および０．８Ｄａである。選択される前駆体イオンの電荷状態は１〜３であった。
【０１２７】
ＬＣＱ−Ｄｅｃａ  ＭＳを用いるＬＣ−ＭＳ分析のために、１）ガラスバイアル中で２ｍｇの各ＴＬ１加水分解物を含有する一定分量を０．１％のギ酸（１ｍＬ）と混合し、１〜２分間分間ボルテックスし、そしてマイクロ遠心分離機において混合物を１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、あるいは２）マイクロ遠心管内で３ｍｇの各ＴＬ１加水分解物を含有する一定分量および０．１％のギ酸（３００ｕＬ）を混合し、混合物を１〜２分間ボルテックスすることによって、サンプルを調製した。次に、ペプチドの単離のために予め清浄にしたＣ１８チップ（Ｇｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ））に全混合物を移した。６０％アセトニトリル中の０．１％のギ酸（３００μＬ）で溶出し、０．１％のギ酸（６００μＬ）で平衡にすることによってＣ１８チップを清浄にした。０．１％のギ酸で溶出した材料画分を廃棄し、ペプチドを６０％アセトニトリル中０．１％のギ酸（６００μＬ）で溶出させた。Ｇｅｎｅｖａｃエバポレータにおいて３００℃で１０分間溶媒混合物を蒸発させることによって、ペプチド溶液の全体積を２００μＬに減らした。本質的に実施例３に記載されるようにＬＣ−ＭＳ分析を実施した。
【０１２８】
表１４は、大豆タンパク質のＴＬ１加水分解物中で同定されたペプチドの全てを示す。
【０１２９】
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【０１３０】
（表１４続き）
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【０１３１】
（表１４続き）
2010524471.tif 000024
【０１３２】
（表１４続き）
2010524471.tif 000025
【０１３３】
実施例１４．他のエンドペプチダーゼによる大豆タンパク質の加水分解
種々のエンドペプチダーゼ（例えば、ＳＰ３、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）からのトリプシン様プロテアーゼ（ＴＬ５、配列番号２）、フザリウムｃｆ．ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｆ．  ｓｏｌａｎｉ）からのトリプシン様プロテアーゼ（ＴＬ６、配列番号３）、ブタトリプシン、またはウシトリプシン）によって単離大豆タンパク質を処理し、別の源からのトリプシンまたはトリプシン様プロテアーゼが大豆タンパク質を加水分解するために使用できるかどうかを決定した。
【０１３４】
単離大豆タンパク質（すなわち、ＳＵＰＲＯ（登録商標）５００Ｅ）の８％スラリーを調製し、ｐＨ８に調整し、１００ｍｇプロテアーゼ／ｋｇ大豆タンパク質の最終濃度のためにエンドペプチダーゼの１つと混合した。プロテアーゼを含有しない対照サンプルも含まれた。スラリーを混合しながら水浴中５０℃で２時間インキュベートし、次にプロテアーゼを熱不活性化した（８０℃で３０分間）。５％大豆タンパク質の最終濃度のために各サンプルに脱イオン水を添加した。
【０１３５】
加水分解度を評価するために、４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ  Ｉｎｃ．（Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ、ＯＨ））において、一定分量の各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解した。図１２に示されるように、ＴＬ１、ＳＰ３、ＴＬ５、およびＴＬ６は、大豆タンパク質をより小さいポリペプチド断片に加水分解したが、ブタトリプシンまたはウシトリプシンのいずれかで処理した後の大豆タンパク質加水分解は少ししかないかまたは全くなかった（レーン７および８を参照）。ブタおよびウシトリプシンが大豆タンパク質を切断できないことは、３７℃および５０℃（ｐＨ８）の両方で観察された。
【０１３６】
実施例１５．Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤によるトリプシン様プロテアーゼの阻害
大豆は、大豆材料の製造中に加熱処理に持ちこたえる活性プロテアーゼ阻害剤を含有するので、ブタおよびウシトリプシンが大豆タンパク質材料を加水分解できなかったことはあり得る。この仮説を試験するために、プロテアーゼを種々の濃度のＢｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤の市販の調製物と共にインキュベートし、残留酵素活性を測定した。
【０１３７】
アッセイ緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ、０．０２％のＢｒｉｊ  ３５、ｐＨ８．０）によりプロテアーゼを０．００１ｍｇ／ｍｌに希釈し、マイクロタイタープレートのウェル内で種々の濃度のＢｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤（Ｃａｔ＃  Ｔ−９７７７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した。攪拌しながらプレートを室温で１時間インキュベートした。０．６ｍｇ／ｍｌの基質、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｌ−１２０５、Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ））を添加することによって、残留活性を測定した。室温で１０秒ごとに３分間、４０５ｎｍにおいて吸光度を測定した。４０５ｎｍで測定された吸光度の初期傾斜から活性を計算した。残留活性は、阻害剤のないウェル内の活性に対する、阻害剤を有するウェル内の活性として計算した。
【０１３８】
表１５に示されるように、微生物プロテアーゼよりも低い濃度のＢｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤によってブタおよびウシトリプシンは阻害された。従って、大豆材料は、動物由来のトリプシンの活性を阻害する化合物を含有すると思われる。
【０１３９】
2010524471.tif 000026
【０１４０】
実施例１６．トリプシン様プロテアーゼのトリプシン比および同定
トリプシン様活性を有する酵素を同定するためにアッセイを開発した。このために、一般式Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−ｐＮＡ（式中、Ｘｘｘは２０種の天然アミノ酸残基のうちの１つの３文字の略語であり、ｐＮＡはパラ−ニトロアニリドである）（Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ））を有する色素生産性の基質を用いてトリプシン様活性を測定した。エンドペプチダーゼがＸｘｘのカルボキシル末端側でペプチド結合を切断したら、パラ−ニトロアニリドが放出され、黄色が生じ、本質的に実施例１５に記載されるように測定した。ＸｘｘがＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、ＰｈｅまたはＶａｌである１０種のｐＮＡ基質を使用した。
【０１４１】
以下のエンドペプチダーゼを試験した：ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＰ３、ＴＬ１、およびブタトリプシン。クロマトグラフィにより全ての酵素を高純度に精製した。すなわち、クーマシー染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて各ペプチダーゼに対してただ１つのバンドが見られた。活性がＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−ｐＮＡ基質に関してｐＨ最適値における活性の少なくとも半分であるｐＨ値において、各酵素の活性を測定した。これらの基質に関して、ＡＬＣのｐＨ最適値はｐＨ９であり、他の３つのペプチダーゼのｐＨ最適値はｐＨ１０であった。アッセイ緩衝液は、１００ｍＭのコハク酸、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＣＨＥＳ、１００ｍＭのＣＡＢＳ、１ｍＭのＣａＣｌ2、１５０ｍＭのＫＣｌ、および０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ９．０であった。２０μＬの各ペプチダーゼ希釈液（０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に希釈）をマイクロタイタープレートの１０個のウェルに入れた。各ウェルに１０種のｐＮＡ基質の１つを２００μＬ添加する（５０ｍｇを１．０ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解し、さらにアッセイ緩衝液で９０倍に希釈した）ことによってアッセイを開始した。ペプチダーゼ活性の尺度としてＯＤ405の初期増加を監視した。４分の測定時間内に直線的なプロットが達成されなければ、ペプチダーゼをさらに希釈してアッセイを繰り返した。
【０１４２】
トリプシン比は、ＡｒｇまたはＬｙｓのいずれかを含有する基質による最大活性を８つの他の基質のいずれかによる最大活性で割って計算した。トリプシン様エンドペプチダーゼは、１００よりも大きいトリプシン比を有するエンドペプチダーゼと定義した。
【０１４３】
活性レベルは、最高活性およびトリプシン比を有するＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘｘｘ−ｐＮＡ基質の活性に対する活性として表１６に示される。アッセイはｐＨ９で実施され、試験ペプチダーゼのうちの３つはｐＨ９よりも高いｐＨ最適値を有するが、ｐＨ９におけるこれらの３つのペプチダーゼの活性は、ｐＨ最適値における活性の半分よりも大きかった。従って、この分析によって、アクロモバクター・リティカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ）プロテアーゼ（ＳＰ３）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（ＴＬ１）およびブタトリプシンはトリプシン様エンドペプチダーゼであるが、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）（ＡＬＣ）はトリプシン様エンドペプチダーゼでないことが明らかになった。
【０１４４】
2010524471.tif 000027
【０１４５】
実施例１７．大豆および乳製品タンパク質の組み合わせから得られるＴＬ１加水分解物
単離大豆タンパク質および単離乳製品タンパク質の組み合わせを、組み合わせの機能特性および官能特性を評価できるように、ＴＬ１によって種々の加水分解度に加水分解した。
【０１４６】
単離大豆タンパク質（ＳＵＰＲＯ（登録商標）５００Ｅ）およびカゼインナトリウム塩（Ａｌａｎａｔｅ（登録商標１８０、ＮＺＭＰ  Ｉｎｃ．（Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ））の５０／５０混合物を穏やかに混合しながら水中に分散させることによって、大豆および乳製品タンパク質の５％スラリーを製造した。混合物を８０℃に加熱して、５分間保持し、５０℃に冷却し、そして１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを８．０に調整した。一定分量のスラリーを中位に混合しながら５０℃に加熱し、様々な量のＴＬ１（無処理のタンパク質１ｋｇあたり約１７〜６００ｍｇの酵素タンパク質）を添加して、０、２％ＤＨ、４％ＤＨ、および６％ＤＨの目標の％ＤＨ値を達成した。５０℃で所望の加水分解度を生じるための時間（約６０分間）インキュベートした後、サンプルを９０℃に３分間加熱して、酵素を不活性化した。サンプルを氷上で冷やし、４℃で貯蔵した。ＴＮＢＳを用いて加水分解度（％ＤＨ）を決定した（実施例１に記載されるように）。
【０１４７】
２つの大豆／乳製品ＴＬ１加水分解物（すなわち、４．３％ＤＨおよび６．７％ＤＨ）において溶解度に対するｐＨの効果を試験した。それぞれの一定分量をｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、またはｐＨ８に調整し、サンプルを５００×ｇで１０分間遠心分離した。遠心分離の前の溶液中の固体物質の量を、遠心分離の後の溶液中の固体物質の量と比較して、可溶性固形分指数（ＳＳＩ）を得た。ｐＨの関数としての％可溶性固形分は図１３に示される。溶液は両方共、約ｐＨ５のｐＨレベル（すなわち、大豆タンパク質の等電点付近）において低下された溶解度を有した。しかしながら、大豆／乳製品ＴＬ１加水分解物は両方共、約ｐＨ６．０以上のレベルにおいて優れた溶解度を有した。
【０１４８】
実施例１８．大豆／乳製品のＴＬ１加水分解物中のペプチド断片の分析
実施例１７で調製した大豆／乳製品ＴＬ１加水分解物中のペプチド断片は、上記で詳述した方法（実施例３、４、および１３を参照）を用いて、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって同定した。この研究で同定したペプチド断片の配列は表１７に記載される。４つの新しい大豆由来のペプチドを同定した（すなわち、配列番号１７４、１７５、１７６、および１７７）。乳製品由来の配列は配列番号１７８〜１９７である。
【０１４９】
2010524471.tif 000028
【０１５０】
（表１７続き）
2010524471.tif 000029
【０１５１】
実施例１９．他のタンパク質材料から得られるＴＬ１加水分解物
様々な他の植物由来のタンパク質材料をＴＬ１で処理して、さらなる加水分解物を生成した。これらの加水分解物は、小さい規模（すなわち、ベンチトップ）で製造した。このために、キャノーラタンパク質単離物、小麦グルテン、またはコーン胚芽タンパク質のいずれかの５％スラリーを、８０℃よりも高い温度で５分間変性させた。タンパク質スラリーを、水酸化ナトリウム溶液または水酸化カリウム溶液などのアルカリ水溶液またはアルカリ土類水溶液で約ｐＨ８．０〜８．５に中和した。次に、タンパク質材料を加水分解するために十分な温度および時間で、タンパク質スラリーのそれぞれをＴＬ１酵素で処理した。タンパク質カード重量を基準として０．０１％〜０．０８％の酵素タンパク質の濃度でＴＬ１酵素をタンパク質スラリーに添加した。約５０℃の温度で５０分〜７０分の間、酵素をタンパク質カード材料と接触させて、タンパク質を加水分解した。加水分解大豆タンパク質材料を、酵素を有効に不活性化する温度に加熱することによって加水分解反応を終了させた。
【０１５２】
表１８は、加水分解物の典型的なセットのための反応パラメータを示す。ＴＬ１酵素の活性は、タンパク質１００ｋｇあたりに存在するＮＨ2のモル数を決定することによって測定される％ＤＨに基づいて測定した。増大したＴＮＢＳ値は、酵素活性を実証する。活性は各タンパク質のために最適化されないが、酵素活性はタンパク質材料の懸濁または溶解度によって影響を受けるように見えた。
【０１５３】
2010524471.tif 000030
【０１５４】
標準的な手順を用いてＳＤＳ  ＰＡＧＥによってＴＬ１キャノーラ、コーン、または小麦加水分解物および非加水分解対照サンプルを分析した。図１４はゲルの画像を示す。この分析によって、各タンパク質材料の主要なタンパク質サブユニットの全てがＴＬ１によって切断されることが明らかになった。
【０１５５】
上記で詳述した手順を用いてキャノーラ、コーン、または小麦ＴＬ１加水分解物中の代表的なペプチドを同定した。表１９、２０、および２１はそれぞれ、キャノーラ、コーン、および小麦のＴＬ１加水分解物中で同定された代表的なペプチドを示す。
【０１５６】
2010524471.tif 000031
【０１５７】
（表１９続き）
2010524471.tif 000032
【０１５８】
2010524471.tif 000033
【０１５９】
2010524471.tif 000034
【０１６０】
実施例２０．大豆加水分解物および無処理の乳製品タンパク質の組み合わせの官能分析
大豆のＴＬ１加水分解物を無処理の乳製品タンパク質（すなわち、カゼイン塩または乳清）と混ぜ合わせた。上記の実施例６で詳述されたＳＱＳ法を用いて、大豆加水分解物および無処理の乳製品タンパク質のこれらの組み合わせの官能プロファイルを、非加水分解（無処理の）大豆および無処理の乳製品タンパク質の組み合わせと比較した。約２．１％ＤＨの加水分解度を有するＴＬ１大豆加水分解物を５％スラリーに希釈した。非加水分解大豆タンパク質も５％スラリーに希釈した。１回の試行のためにＴＬ１加水分解物をカゼインナトリウム塩（１：１）と混合し、カゼインナトリウム塩と混合した非加水分解大豆タンパク質（１：１）である対照サンプルに対して査定した。第２の試行では、ＴＬ１加水分解物を乳製品の甘味乳清（４：１）と混合し、乳製品の甘味乳清と混合した非加水分解大豆タンパク質（４：１）である対照サンプルに対して査定した。
【０１６１】
表２２は、各サンプルの平均ＳＱＳスコアおよび診断評定を示す。ＴＬ１加水分解物を含む組み合わせは、一般に、対照サンプルとはわずかに異なると評定された。診断スコアは、ＴＬ１加水分解物および無処理の乳製品タンパク質の組み合わせが、対照サンプル（すなわち、非加水分解大豆および無処理の乳製品タンパク質の組み合わせ）と比べて改善された官能特性を有することを示した。
【０１６２】
2010524471.tif 000035
【０１６３】
実施例２１．タンパク質加水分解物を含む飲料の分析
種々の加水分解度を有するＴＬ１単離大豆タンパク質加水分解物を用いて、いくつかのプロトタイプのそのまま飲める（ＲＴＤ）中性飲料および乾燥ブレンド飲料ミックスを調製した。飲料には、豆乳モデル飲料（すなわち、８オンスの１回分あたり８．５ｇのタンパク質を有する、４％の大豆タンパク質単離物を含有する風味付けされていない低脂肪豆乳飲料）、組み合わせモデル飲料（すなわち、８オンスの１回分あたり８ｇのタンパク質を有する風味付けされていない飲料、ここで、全タンパク質の半分は大豆からのものであり、タンパク質のもう半分はスキムミルクからのものである）、および乾燥ブレンドモデル飲料が含まれた。ＲＴＤ飲料の物理特性および官能特性を、種々の源の非加水分解大豆タンパク質および／または乳製品タンパク質で調製した飲料の特性と比較した。
【０１６４】
表２３は、豆乳モデル飲料の配合を示す。豆乳モデル飲料を調製するために、クエン酸塩を水中に溶解し、大豆タンパク質を添加し、混合速度を上昇させて、タンパク質を水中に分散させた。タンパク質が十分に分散されたら、スラリー温度を７７℃（１７０°Ｆ）に上昇させて混合速度を低下させ、スラリーを１０分間混合した。マルトデキストリン、糖および安定剤を予め一緒にブレンドし、タンパク質スラリーに添加した。スラリーを低速で５分間混合した。ヒマワリ油をスラリーに添加し、混合物が均質になるまで低速で混合を継続した（約３分間）。４５％の水酸化カリウムを用いてスラリーのｐＨを約７．０〜７．２に調整した。スラリーを５００ｐｓｉ（第２段階）および２５００ｐｓｉ（第１段階）で均質にした。超高温（ＵＨＴ）処理によってスラリーを１４１℃（２８６°Ｆ）で６秒間低温殺菌した。混合物を３１℃（８８°Ｆ）に冷却し、滅菌ボトル内に詰めた。製品を冷蔵温度で貯蔵した。
【０１６５】
2010524471.tif 000036
【０１６６】
表２４は組み合わせモデル飲料の配合を示す。組み合わせモデル飲料を調製するために、穏やかに混合しながらクエン酸塩を水中に溶解した。大豆タンパク質を添加し、混合速度を上昇させて、タンパク質を水中に分散させた。タンパク質が十分に分散されたら、スラリー温度を７７℃（１７０°Ｆ）に上昇させて混合速度を低下させ、スラリーを１０分間混合した。マルトデキストリン、糖、ビタミン／ミネラルプレミックス、リン酸マグネシウム、セルロース、および安定剤を予め一緒にブレンドし、タンパク質スラリーに添加した。スラリーを低速で５分間混合した。ヒマワリ油をスラリーに添加し、混合物が均質になるまで低速で混合を継続した（約３分間）。４５％の水酸化カリウムまたは５０％のクエン酸を用いてスラリーのｐＨを約６．９〜７．１に調整した。スキムミルクを７２℃（１６２°Ｆ）にゆっくり加熱し、加熱したスキムミルクに大豆タンパク質スラリーを添加し、混合物を３分間ゆっくり混合した。混合物を５００ｐｓｉ（第２段階）および２５００ｐｓｉ（第１段階）で均質にした。超高温（ＵＨＴ）処理によって混合物を１４１℃（２８６°Ｆ）で６秒間低温殺菌した。混合物を３１℃（８８°Ｆ）に冷却し、滅菌ボトル内に詰めた。製品を冷蔵温度で貯蔵した。
【０１６７】
2010524471.tif 000037
【０１６８】
乾燥ブレンドモデル飲料の配合は表２５に示される。飲料ミックスを製造するために、大豆タンパク質およびココア粉末をふるい、中間速度で１５分間、他の原料全てと混合した。乾燥粉末は、消毒した容器内に貯蔵した。
【０１６９】
2010524471.tif 000038
【０１７０】
飲料の粘度を測定するために、豆乳モデルおよび組み合わせモデル飲料を均一の分散液が達成されるまで振とうさせ、ブレンダーを用いて１回分のサイズの乾燥ブレンドモデル飲料の乾燥粉末を、低速で３０〜４０秒間または完全に分散するまで、特定の量の水中に完全に分散させた。各サンプルをすぐに１８０ｍｌのビーカー（ｎｏ．１４０７０、Ｋｉｍａｘ（登録商標）、ＵＳＡ）内に注ぎ、ビーカーの湾曲部分の底に達するまで充満させた。目に見える発泡は測定前に除去した。固定時間が経過したら、スピンドル＃１を有するＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度計（モデルＤＶ−ＩＩ＋）（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ、ＭＡ））およびＲＰＭ６０を用いて１分間、粘度をセンチポアズ（ｃＰ）で測定した（２５〜３０℃）。
【０１７１】
豆乳モデル飲料の安定性を査定するために、ＵＨＴ処理の後、２５０ｍｌの無菌の四角のメディアボトル内にサンプルを収集した。ボトルを室温（２５℃）で４週間貯蔵（平静に）した。次に、ボトルを平坦な表面に置き、定規（１ｍｍ増分で最低１００ｍｍ）を用いて沈降レベルを測定した。以下の式：（沈降（ｍｍ）／全液体体積（ｍｍ））×１００を用いて、沈降パーセントを得た。ボトルの底に、そしてサンプルボトルの側面に接して置いたときに定規の端部の下側に沈降層があれば、これを微量の沈降として記録した。
【０１７２】
表２６および２７はそれぞれ、豆乳モデルおよび組み合わせモデル飲料の粘度および安定性を示す。豆乳モデル飲料の粘度測定は、非加水分解大豆対照サンプルと同等であった。組み合わせモデル飲料の粘度測定は大豆を含有する対照サンプルの範囲内であり、ミルク対照サンプルよりもわずかに低かった。豆乳モデルおよび組み合わせモデル飲料は全て良好な安定性を有した。これらのデータは、種々の加水分解度を有するＴＬ１単離大豆タンパク質加水分解物を用いることによってモデル飲料の機能特性が悪影響を受けないことを明らかにした。
【０１７３】
2010524471.tif 000039
【０１７４】
2010524471.tif 000040
【０１７５】
９点ヘドニック（Ｈｅｄｏｎｉｃ）スケールを用いて様々なモデル飲料の官能および風味特性の消費者テストを査定した。非常に嫌いに対する１から非常に好きに対する９までのスケールで飲料をランク付けした。５は好きでも嫌いでもないことを示す。図１５は、豆乳モデル飲料、すなわち２つの対照サンプルおよびＴＬ１の２．２％ＤＨサンプルの強制ランキングを示す。ＴＬ１加水分解物サンプルは、「全体的な好み」、「風味の好み」および「あと味の好み」に関して２つの対照サンプルよりも著しく高いと評定された。さらに、強いてランク付けを要求すると、消費者はセットの中で好ましいサンプルとしてＴＬ１の２．２％ＤＨサンプルをランク付けした。図１６は、組み合わせモデル飲料、すなわち１００％スキムミルク対照、５０％非加水分解大豆／５０％スキムミルク、および５０％ＴＬ１の２．２％ＤＨ大豆加水分解物／５０％スキムミルクの強制ランキングを示す。ＴＬ１加水分解物含有サンプルは、ほぼ全ての好みの特性において非加水分解大豆含有サンプルよりも著しく高いとランク付けされ、全ての好みの特性（すなわち、全体的な好み、色の好み、風味の好み、口あたりの好み、濃さの好み、およびあと味の好み）に関して１００％スキムミルク対照サンプルと同等であると採点された。
【０１７６】
また、豆乳モデルおよび組み合わせモデル飲料ならびにその対応するタンパク質スラリーもＳＱＳ法を用いて分析した（実施例６に詳述されるように）。表２８は、ＳＱＳスコアおよび診断評定を示す。表に示されるように、各試験サンプルを対照サンプルと比較した。一般に、ＴＬ１加水分解物を含有するサンプルは、対照サンプルと比べて低下した大豆／豆類、穀類、およびボール紙／木質の官能特性を有した。
【０１７７】
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【図１】
2010524471.tif 000042
【図２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010524471.tif 000053
【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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