(57)【要約】単一の容器中で安定に形質転換されたトウモロコシ植物を作製する方法を示す。この方法により、形質転換プロセスの自動化が許容され、典型的な植物組織培養システムに関連する労力、材料および人間工学的コストが減少する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック・トウモロコシ植物を作製する方法であって、
ａ）形質転換可能なトウモロコシ外植片を得；
ｂ）該形質転換可能なトウモロコシ外植片を形質転換し；
ｃ）選択培地上で、該形質転換可能なトウモロコシ外植片から形質転換したトウモロコシ細胞を選抜し；ついで
ｄ）該形質転換した細胞を、再生培地上で植物に再生する工程を含み、
ここに、工程ｂ）、ｃ）およびｄ）を同一の容器で行う該方法。
【請求項２】
容器が、バイオリアクター、ペトリ皿、マルチウェルプレート、フラスコ、ジャー、ボトル、ジャグ、PlantCon（商標）、一時出現システム、Sundaeカップおよびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
容器が、培地を供給および除去する手段と一緒に提供される請求項１記載の方法。
【請求項４】
外植片がカルス、胚および細胞懸濁液よりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項５】
培地が液体培地である請求項１記載の方法。
【請求項６】
選択培地が固体培地であって、再生培地が固体選択培地上にオーバーレイした液体培地である請求項１記載の方法。
【請求項７】
外植片を一時的に培地と接触させる請求項１記載の方法。
【請求項８】
外植片を選択培地および再生培地と約１２ないし約２４時間毎に約１ないし約５分間接触させる請求項７記載の方法。
【請求項９】
カルスをより小さなカルス片に分けることを含むトランスジェニック・トウモロコシ植物を作製するための外植片を得る方法。
【請求項１０】
カルスがＩ型カルスである請求項７記載の方法。
【請求項１１】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）の凍結グリセロールストックを誘導培地に直接的に培養することを含む外植片を接種するためのアグロバクテリウム細胞懸濁液を調製する方法。
【請求項１２】
形質転換可能で胚形成性の細胞を含むトウモロコシ細胞培養物。
【請求項１３】
トウモロコシの形質転換可能で胚形成性の細胞培養物を作製する方法であって、
ａ）トウモロコシ胚からカルスを得；ついで
ｂ）カルスを液体培地中で約５ないし３０日間培養して細胞培養物を作製する
ことを含む該方法。
【請求項１４】
カルスがＩ型カルスである請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
工程ｃ）およびｄ）をマトリクス上で行い、ここに該マトリクスがフェルト、Sorbarodプラグおよびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１６】
トランスジェニック植物を作製する方法であって、
ａ）再生可能な植物外植片を、選択剤に対する耐性を付与する選択マーカー遺伝子を含む組換えアグロバクテリウムおよび該選択マーカー遺伝子で形質転換された外植片の細胞に対して選択的である量の選択剤を含む培地と同時培養し；ついで
ｂ）該外植片から選択マーカーを含むトランスジェニック植物を再生する
ことを含む該方法。
【請求項１７】
外植片が未成熟な胚を含む請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
外植片がトウモロコシ植物である請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
培地がアグロバクテリア（Agrobacteria）の増殖を抑制する剤を含む請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
再生可能な植物外植片を組換えアグロバクテリアと同時培養することが、該外植片と該アグロバクテリアを含むスパチュラとを接触させた後に該外植片を培地に入れることを含む請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その開示全体を出典明示して本明細書の一部とみなす2006年8月31日に出願した米国仮特許出願番号60/841,519に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
植物の大量増殖は、大きなバッチで日常的に行われており、自動化されている。大量増殖においては、外植片は通常１の再生培地に取り上げてそこに設置し、該培地は再生プロセスの間は新鮮に維持して一連の植物を生成しなければならない。このことは、新たなトランスジェニック事象を生成するよう設計され、外来DNAを植物細胞に一体化させることを必要とする形質転換プロセスと対照的である。植物組織培養プロセス、特に形質転換プロセスを自動化することは困難とされている。植物組織は、異なる種類の増殖培地および条件を必要とする異なるステージを通ってゆく。形質転換プロセスは複数の工程および複数の培地を必要とする。例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）−媒介形質転換においては、再生可能および形質転換可能である外植片の単離でプロセスが開示する。ついで、外植片に接種培地中のアグロバクテリウムを接種する。接種後、過剰なアグロバクテリウムは典型的には除去され、外植片およびアグロバクテリウムを一緒に同時培養してDNAをトランスファーさせる。同時培養の後、アグロバクテリウムが存在することは植物組織培養に対して有害であり（例えば、その後の取扱いおよび組織培養工程の間に望ましくないコンタミネーションを引き起こす）、したがって、典型的には外植片を抗生物質を含有する新鮮な培地に移してアグロバクテリウムの増殖を阻害する。この培地は選択剤を含有していてもしていなくてもよい。そのようにしない場合、遅延培地（delay medium）または休止培地（resting medium）と呼ばれる。外植片は遅延培地に置いて、所望により選抜培地上に置かれる前に何度か増殖させることができる。他のプロトコールでも、外植片を、トランスジェニック事象の選択のための選択培地に直接置く場合もある。選択様式は、選択剤および外食片系統に依存して広く変化する。複数工程の選択を使用したり、変化した量の選択剤が異なる工程で必要になる場合もある。トランスジェニック事象の選択の後、ついで生存するトランスジェニック事象を土壌に移すことができる幼植物体に再生するための再生培地に移す。現在に至るまで、形質転換プロセスは時間や労力がかかり、大スケールで行うことができないでいる。形質転換プロセスを自動化すれば、少ない労力、材料および人間工学的負担で多数のトランスジェニック植物を生成することが許されるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、単一の容器において、幾つかまたはすべての形質転換工程を行い、所望により再生工程の幾つかも行う、方法および装置を提供することによって形質転換における以前の制限を克服した。したがって、本発明の方法は、植物組織を継代し、培地を変化させるのに必要な時間のかかる工程を排除することによって現在の形質転換プロトコールの欠点を克服する。該方法および装置は、形質転換自動化、再生自動化および/または形質転換した細胞、組織および植物の大スケール生産に特に好適である。
【０００４】
ゲノムの発明は、多数の遺伝子の同定および単離を可能とし、これらの遺伝子をトウモロコシのような経済的に重要な作物に形質転換することによってこれらの遺伝子の有用性を試験する信頼できる効率的なハイスループット形質転換産生系を必要としている。現在のトウモロコシ形質転換法は、形質転換した細胞を選択する工程からトランスジェニック植物を土壌に移す工程までの少なくとも４の工程を必要とし、それによって高い材料費、例えば培養皿および培地ならびに労働費を必要とする。組織の幾つかの手動の移動も、繰り返しの動作に起因する人間工学的な傷害の危険性を上昇させる。
【０００５】
したがって、材料および労働費用を低下させつつ遺伝子を試験し、有用な植物を創製するための多数のトランスジェニック植物を生産し得る植物形質転換、選択および再生用のハイスループット自動システムについてトウモロコシ形質転換の技術分野における要望が存在する。また、作業場をより安全にする人間工学的な傷害の危険性を低下させ得る方法に対する当該技術分野における要望も存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ここに、本発明者らは、ハイスループット自動システムに好適な形質転換したトウモロコシ植物を選択および再生するトウモロコシ形質転換法を提供する。当該方法では、液体選択および再生培地と組み合わせた好適な支持体マトリックスを用いる。この液体培養法を用いることによって、選択および再生工程に固形培地を用いる場合に通常必要である複数の移動の必要性が排除される。さらに、この方法は、今まで液体培養培地において課題であった進歩した再生が可能となる。いまださらに、形質転換した細胞を選択および再生する工程は、植物を土壌に移すまでSundaeカップのような単一の容器中で行い得る。
【０００７】
本発明は、容器中で植物を安定に形質転換し、ついで所望により選択し、ついで部分的に植物を再生させる方法を提供することよって植物形質転換プロセスを自動化する新規な方法を提供する。幾つかの形態において、単一の容器を用いて本発明の方法を行うことができる。他の形態において、複数の容器（例えば、相互連結した容器のシステム）は、使用の簡便性および本発明の最適化のために提供し得る。
【０００８】
本発明の１の態様において、トランスジェニック・トウモロコシ植物を作製する方法を提供する。当該方法は、形質転換可能なトウモロコシ外植片を得；形質転換可能なトウモロコシ外植片を形質転換し；選択培地上で形質転換可能なトウモロコシ外植片から形質転換したトウモロコシ細胞を選択し；ついで、再生培地上で形質転換した細胞を植物に再生させることを含み、ここに形質転換、選択および再生を同一の容器で行う。所望により、容器における選択は省略することができ、トランスジェニック幼植物体またはトランスジェニック植物は、土壌に設置した後に選択に付することができる（例えば、選択剤を噴霧して）。
【０００９】
容器はバイオリアクター、ペトリ皿、マルチウェル・プレート、フラスコ、ジャー、ボトル、ジャグ、PlantCon（商標）、一時出現システム、Sundaeカップおよびそれらの組合せとすることができ、培地を提供および除去する手段と一緒に提供される。幾つかの形態において、容器はペトリ皿、マルチウェル・プレート、PlantConまたは一時出現システムである。
【００１０】
外植片は、カルス、胚および細胞懸濁液よりなる群から選択することができる。
【００１１】
培地は、液体培地、固体培地またはそれらの組合せとすることができる。ある形態において、選択培地は固体培地であって、再生培地は固体選択培地上にオーバーレイした液体培地である。
【００１２】
外植片は培地と一時的に接触することができる。ある形態において、外植片は選択培地および再生培地と約12ないし24時間毎に約1ないし5分間接触する。
【００１３】
本発明のいまだもう１の態様において、トランスジェニック・トウモロコシ植物を作製するための外植片を得る方法を提供する。当該方法は、カルスをより小さなカルス片に分けることを含む。ある形態において、カルスはＩ型カルスである。
【００１４】
本発明のいまだもう１の態様において、外植片を接種するためのアグロバクテリウム細胞懸濁液を調製する方法を提供する。当該方法は、アグロバクテリウムの凍結グリセロールストックを誘導培地に直接的に培養することを含む。
【００１５】
本発明のいまだもう１の態様において、形質転換可能かつ胚形成性の細胞を含むトウモロコシ細胞培養物を提供する。
【００１６】
本発明のいまだもう１の態様において、トウモロコシの形質転換可能かつ胚形成性の細胞培養物を生成する方法を提供する。当該方法は、トウモロコシ胚からカルスを得、ついで該カルスを液体培地中で約5ないし30日間培養して細胞培養物を生成することを含む。ある形態において、カルスはII型カルスである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】pMON30113の例示的なプラスミド地図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下の定義は本発明の記載の理解を支援するであろう。
「カルス」とは、細胞または組織の脱分化した増殖する塊をいう。
「外植片」とは、形質転換し、その後にトランスジェニック植物に再生することができる植物部分をいう。典型的な外植片には、未成熟胚、カルス、子葉、分裂組織、葉または茎が含まれる。
「組織培養培地」とは、非−土壌環境における植物の増殖および発達を支持するために用いる液体、半固体または固体の培地をいう。好適な植物組織培養培地は、続いて詳細に論じるように、当業者に知られている。培地成分は本明細書中に同定した者以外の供給業者から得ることができ、それらの要件に従って当業者によって使用するために最適化され得る。
【００１９】
「コーディング配列」、「コーディング領域」または「オープンリーディングフレーム」とは、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド配列をコードする連続する一連の核酸トリプレットの領域をいう。
「内因性」とは、生物または細胞内に起源を有する材料をいう。
「外因性」とは、生物または細胞の外側に起源を有する材料をいう。それは、形質転換されたまたはトランスジェニック宿主細胞および植物を作製するのに使用する核酸分子をいう。本明細書中で用いるように、外来性とは、同様の核酸がすでにかかる細胞に存在し得るか否かにかかわりなく、受容細胞に導入するいずれの核酸をもいうことを意図する。
【００２０】
「ゲノム」とは、生物の染色体DNAをいう。ゲノムは二倍体種の染色体の半数体セットと定義される。本願の目的については、ゲノムにはオルガネラゲノムも含まれる。
【００２１】
「単子葉」とは、単一の子葉を有する植物をいい、例えば、トウモロコシ、イネ、コムギ、エンバクおよびオオムギのような穀物が含まれる。
「核酸」とは、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）をいう。
「表現型」とは、遺伝子型および環境の相互作用から生じる生物によって示される特性をいう。
「ポリアデニル化シグナル」または「polyAシグナル」とは、コーディング領域から転写されたmRNAの3'末端へのアデニル酸ヌクレオチドの付加を促進する該コーディング領域の3'側に位置する核酸配列。
「プロモーター」または「プロモーター領域」とは、正確な部位で転写が開始されるのに必要なRNAポリメラーゼまたは他の因子に認識部位を与えることによってメッセンジャーRNA（mRNA）の生成を制御することによってコーディング配列の発現を制御する、通常コーディング配列の5'側に見出される核酸配列をいう。
【００２２】
「組換え核酸ベクター」または「ベクター」とは、１またはそれを超える核酸配列が機能的に作用する様式で連結している核酸分子を含む、ゲノム取込みまたは自律的な複製が可能であるいずれの供給源由来の、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製配列、ファージ、または直鎖もしくは環状の一本鎖もしくは二本鎖のDNAまたはRNAヌクレオチドセグメントのようないずれかの剤をいう。かかる組換え核酸ベクターまたは構築物は、5'調節配列またはプロモーター領域および選択した遺伝子産物のDNA配列を、該DNA配列が機能的なmRNAに転写され、その後にポリペプチドまたはタンパク質に転写されるように細胞に導入することができる。
【００２３】
「再生」とは、植物細胞から植物を生育させるプロセスをいう。
「再生培地」とは、選択剤を含有することを必要とする植物組織培養培地をいう。
「再生可能なカルス」とは、それから全植物を生成することができるが、その場合の再生の様式（胚形成または器官形成）が決定していないまたは議論にしっくりしていないカルスをいう。
【００２４】
「選択可能なマーカー」または「スクリーニング可能なマーカー」とは、その発現が核酸配列を含む細胞の同定を促進する表現型を付与する核酸配列をいう。
「選択」とは、形質転換した細胞、組織または植物を得るために接種した外植片と選択培地とを接触させることをいう。
「選択培地」とは、選択剤を含有する植物組織培養培地をいう。
【００２５】
「転写」とは日NA異型接合体からRNAコピーを生成するプロセスをいう。
「形質転換」とは、外因性核酸配列（ベクターまたは構築物）を細胞またはプロトプラストに導入するプロセスをいい、ここに外因性核酸は核DNA、プラスチドDNAに取り込まれ、自律複製することができる。
【００２６】
「トランスジェニック」とは、外因性核酸配列が組み込まれている生物をいう。
「形質転換可能な外植片」とは、形質転換に対して受容的である植物のいずれかの部分をいう。
【００２７】
本発明は、安定な形質転換を単一の用において行うことができるシステムを提供する。形質転換プロセスは、形質転換可能な外植片をアグロバクテリウムで接種することで開始し、土壌への移行に好適な根を有する安定して形質転換された幼植物体を生じる。
【００２８】
この目的のために使用することができる多くの容器が存在する。一時浸漬システムを含むバイオリアクターを用いることができる。限定されるものではないが、種々のサイズのペトリ皿、マルチウェル・プレート、フラスコ、ジャー、ボトル、ジャグおよびPlantConsを含む多くの異なる容器が植物の液体組織に使用されている。これらの容器には、通常、新鮮な培地を供給し、消費された培地を除去するための流入口および排水口のような手段が配されている。複数の容器を連結してハイスループットシステムを得ることができる。これらの容器は外植片用のなんらかの支持体を含むことができる。その支持体は、限定されるものではないが、濾紙、フェルト、ラフト（raft）、ガラスビーズ、ジルコニア/ケイ素ビーズ、フォームまたは固体培地とすることができる。液体培地は通常容器に入れ、ついで必要により交換する。この交換は手動または機械的に行うことができる。
【００２９】
容器には、一度に多くの外植片を含有させることができ、または単一の外植片を含有するのに十分に小さいものとすることができる。マルチウェルの場合、各々が外植片を含有する小さなウェルのアレイを用いて多数の外植片を培養する。外植片は手動的または機械的に調製し得る。
【００３０】
本発明の目的は、開始から終了まで簡便に自動化し得るシステムを有することであり、これらの液体培養系および容器のいずれも、当業者に知られている他の形質転換、選択および再生工程と組み合わせて使用することができる。
【００３１】
ハイスループット形質転換系を開発することができ、そこでは容器を、標準的な研究室器物に加えてインキュベーターおよび振盪機を含み得る自由に形成し得る作業テーブル上のロボットアームによって操作し得る。１またはそれを超えるピペットチップを供えた種々の液体取扱いツールを用いて、新鮮な培地を提供し、消費した培地を除去することができる。作業テーブル、ロボットアームおよび液体取扱いツールはコンピュータを介してソフトウェアによって制御することができる。あるいは、形質転換した細胞を選択および再生する液体培地を、培地保存容器に連結した１またはそれを超える管を介して容器に提供し、廃棄容器に連結した１またはそれを超える管を介して除去することができる。培地の提供および除去は手動的または機械的に制御することができる。
【００３２】
本発明にかかる形質転換法を開始するためには、植物の細胞または組織にインサートする遺伝子コンポーネントを選択することがまず必要である。遺伝子コンポーネントには、本発明にかかる方法を用いて植物の細胞または組織に導入されるいずれの核酸も含まれ得る。遺伝子コンポーネントには、非−植物DNA、植物DNAまたは合成DNAが含まれ得る。
【００３３】
好ましい形態において、遺伝子コンポーネントは、少なくとも１またはそれを超える以下の型のコンポーネント：（a）植物細胞中で機能してRNA配列の生成を引き起こすプロモーター、（b）作物学的に有用な産物をコードするRNAの生成を引き起こす構造DNA配列、および（c）植物細胞中で機能してRNA配列の3'末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を引き起こす3'非−翻訳DNA配列、を含む組換え、二本鎖プラスミドまたはベクター分子のようなDNA組成物に取り込まれる。
【００３４】
ベクターは、植物の細胞または組織の形質転換を促進し、望ましい遺伝子（または複数の遺伝子）の発現を調節する多数の遺伝子コンポーネントを含み得る。１の好ましい形態において、遺伝子コンポーネントはmRNAを発現するよう方向付けられ、それは１の形態において、タンパク質に翻訳され得る。二本鎖形態で存在する植物構造コード配列（遺伝子、cDNA、合成DNAまたは他のDNA）の発現には、RNAポリメラーゼ酵素によるDNAの1の鎖からのメッセンジャーRNA（mRNA）の転写につづく核の内側におけるmRNA一次転写物のプロセシングが含まれる。このプロセシングには、mRNAの3'末端にポリアデニル化ヌクレオチドを付加する3'非−翻訳領域が含まれる。
【００３５】
望ましい遺伝子コンポーネントを含むプラスミドまたはベクターを調製する手段は当該技術分野においてよく知られている。ベクターは典型的には多数の遺伝子コンポーネントからなり、それには限定されるものではないが、プロモーター、リーダー、イントロンおよびターミネーター配列のような調節要素が含まれる。調節要素は、それが制御する配列または遺伝子に対する該要素の近さに依存して、シス−またはトランス−調節要素ともいわれる。
【００３６】
mRNAへのDNAの転写は、通常「プロモーター」と呼ばれる領域によって調節される。プロモーター領域には日NAと会合してDNA鎖の1を鋳型として用いてmRNAへの転写を開始してRNAの対応する相補的な相補鎖を作成するようにRNAポリメラーゼに信号を送る塩基の配列が含まれる。
【００３７】
植物細胞において活動する多数のプロモーターが文献に記載されている。かかるプロモーターには、限定されるものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の癌腫誘導プラスミド上に運搬されているノパリンシンターゼ（NOS）およびオクトピンシンターゼ（OCS）プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）19Sおよび35Sプロモーターおよびゴマノハグサ科植物モザイク初する（FMV）35Sプロモーター、強化型CaMV35Sプロモーター（e35S）、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ（ssRUBISCO、非常に豊富な植物ポリペプチド）の小サブユニットからの光誘導性プロモーターが含まれるであろう。これらのプロモーターはすべて、植物中で発現されている種々の型のDNAを作製するために使用されている。
【００３８】
プロモーター・ハイブリッドを形成して転写活性を高める（米国特許第5,106,739号）、または、目的の転写活性、誘導性および組織特異性または発達特異性を結合することもできる。植物中で機能するプロモーターには、限定されるものではないが、前記した誘導性、ウイルス、合成構造的なもの、時期的に調節される、空間的に調節される、および空間−時期的に調節されるプロモーターが含まれる。組織−強化型、組織−特異的または発達的に調節される他のプロモーターも当該技術分野で知られており、これらも本発明の実施において有用性を有すると予想される。
【００３９】
プロモーターは、植物および植物DNAウイルスのような種々の起源から得ることができ、それには限定されるものではないが、CaMV35SおよびFMV35Sプロモーター、およびssRUBISCO遺伝子のような植物遺伝子から単離されたプロモーターが含まれる。以下に記載するように、選択する特定のプロモーターは、有効量の関心のある遺伝子産物の産生を生じる十分な発現を引き起こすことができなければならないことが好ましい。
【００４０】
本発明のDNA構築物（例えば、キメラ/組換え植物遺伝子）で用いるプロモーターは、望まれる場合は、修飾してそれらの制御特性に影響を及ぼすことができる。プロモーターは、オペレーター領域、ランダムまたは制御された突然変異導入ほかを用いた連結によって誘導することができる。さらに、プロモーターを改変して、複数の「エンハンサー配列」を含ませて遺伝子発現を上昇することを支援することができる。
【００４１】
本発明のDNA構築物によって生成されるmRNAも、5'非−翻訳リーダー配列を含むことができる。この配列は遺伝子を発現するために選択したプロモーター由来であって、mRNAの翻訳を増大するように特異的に修飾することができる。5'非−翻訳領域は、ウイルスRNAから、好適な真核生物の遺伝子から、または合成遺伝子配列から得ることもできる。かかる「エンハンサー」配列は、得られるmRNAの翻訳効率を増大または変化することが望まれる場合がある。本発明は、非−翻訳領域がプロモーター配列を伴う両方の5'非−翻訳配列に由来する構築物に限定されない。むしろ、非−翻訳リーダー配列は、無関係なプロモーターまたは遺伝子から誘導することができる（例えば、米国特許第5,362,865号）。遺伝子の転写を高める、または遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼすように作用する他の遺伝子コンポーネントも遺伝子コンポーネントそして予想される。
【００４２】
キメラ構築物の3'非−翻訳領域は転写ターミネーターまたは同様の機能を有するエレメントまたは同等の機能を有するエレメントを含むべきであり、ならびに、RNAの3'末端にポリアデニル化ヌクレオチドの付加を引き起こす植物中で機能するポリアデニル化シグナルとすることができる。好適な3'領域の例には、(1)ノパリンシンターゼ（NOS）遺伝子のようなアグロバクテリウム腫瘍−誘導（Ti）プラスミド遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む3'転写された、非−翻訳領域、および（2）ダイズ貯蔵タンパク質遺伝子およびリブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ（ssRUBISCO）遺伝子の小サブユニットのような植物遺伝子が含まれる。好ましい3'領域の例には、エンドウからのssRUBISCO E9遺伝子からのものである（欧州特許出願 0385 962）。
【００４３】
典型的に日NA配列は、ポリアデニル化部位の数百塩基対下流に位置して転写を終結するように作用する。本明細書中で、該DNA配列は、転写終結領域という。該領域は、転写されたメッセンジャーRNA(mRNA）の効率的なポリアデニル化に必要であり、3'非−翻訳領域として知られている。RNAポリメラーゼは、ポリアデニル化が生じたその場所を介して、コードDNA配列を転写する。
【００４４】
１の好ましい形態において、ベクターは、選択可能、スクリーニング可能または評点付け可能なマーカー遺伝子を含んでいる。本明細書中において、これらの遺伝子コンポーネントをそれらが形質転換植物または農業的有用性の産物の識別に機能する産物を生成する限り、機能的遺伝子コンポーネントという。該DNAは、再生可能な植物組織において機能する選択デバイスとして作用して他の毒性化合物に対する抵抗性を植物組織に付与するであろう化合物を生成する。選択可能、スクリーニング可能、または評点付け可能なマーカーとして使用する関心のある遺伝子には、限定されるものではないが、GUS、緑色蛍光タンパク質（GFP）、アントシアニン生合成関連遺伝子（C1、Bperu）、ルシフェラーゼ（LUX）、カナマイシン（Dekeyserら,1989）のような抗生物質、およびグリフォセート（Della-Cioppaら，1987）のような除草剤が含まれる。他の選択デバイスも実施することができ、それには限定されるものではないが、ホスフィノトリシン、ビアラフォス、ジカンバおよび陽性選択機構に対する耐性が含まれ、いまだ本発明の範囲に入るであろう。
【００４５】
本発明は、特定の特性を付与するのに十分なように発現される１またはそれを超える核酸と一緒に、記載したような選択可能またはスクリーニング可能なマーカーおよび関連する調節要素を含むいずれか好適な植物形質転換プラスミドまたはベクターと一緒に使用できる。本発明によって想定される作物学的関心のある好適な構造遺伝子の例には、限定されるものではないが、昆虫または有害生物耐性、除草剤耐性の遺伝子、収量、栄養向上、環境またはストレス耐性のような品質改良の遺伝子、または植物生理、成長、発達、形態または植物生成物（または複数の生成物）におけるいずれか望ましい変化が含まれるであろう。
【００４６】
あるいは日NAコーディング配列は、例えば、アンチセンス−または相互抑制効果−媒介機構（例えば、Birdら,1991を参照されたい）を介して、内因性遺伝子の発現の標的化した阻害を引き起こす非−翻訳可能なRNA分子をコードすることによってこれらの表現型に影響し得る。RNAは、望ましい内因性mRNA生成物を切断するよう設計された触媒RNA分子（例えば、リボザイム）とすることもできよう（例えば、GibsonおよびShillitoe,1997を参照されたい）。より詳細には、植物細胞における遺伝子発現のアンチセンス調節の記載については、米国特許第5,107,065号を参照され、また日sRNAの転写による植物における遺伝子抑制の記載については、米国特許第6,506,559号、米国特許出願公開2002/0168707 A1および米国特許出願09/423,143（WO 98/53083ご参照）、09/127,735（WO 99/53050ご参照）および09/084,942（WO 99/61631ご参照）（すべて出典明示して本明細書の一部とみなす）を参照されたい。したがって、関心の表現型または形態の変化を発現するタンパク質またはmRNAを生成するいずれの遺伝子も、本発明の実施に有用である。
【００４７】
本発明によって包含される方法によって導入し得る例示的な核酸には、例えば、他の種からのDNA配列または遺伝子、または同一の種に起源を発するまたは存在するが古典的な生殖または育種技術よりも遺伝子工学的方法によって受容細胞に取り込ませる遺伝子または配列でさえもが含まれる。しかしながら、外因性なる語は、形質転換する細胞に通常は存在しない、または形質転換するDNAセグメントまたは遺伝子に見出されるような形態、構造ほかで単純に存在しない遺伝子、または例えば過剰発現されると望まれるいまだ正常に存在する遺伝子をいうことも意図する。したがって、「外因性」遺伝子またはDNAなる語は、かかる細胞にすでに存在し得る同様の遺伝子であるかにかかわりなく、受容細胞に導入されるいずれの遺伝子またはDNAセグメントをいうことを意図する。外因性DNAに含まれるDNAの型には、植物細胞にすでに存在するDNA、他の植物からのDNA、異なる生物からのDNA、または遺伝子のアンチセンスメッセンジャーを含むDNA配列のような外的に作製したDNA、または合成または修飾版の遺伝子をコードするDNA配列が含まれ得る。
【００４８】
本開示に鑑み、膨大な他の可能な選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子、調節要素および関心のある他の配列が当業者に明らかであろう。したがって、前記の議論は排他的というよりも例示的であることを意図する。
【００４９】
細胞にDNAを導入する技術は当業者によく知られており、限定されるものではないが：（1）化学的方法；（2）マイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよびマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントのような物理的方法；（3）ウイルスベクター；（4）受容体−媒介機構；および（5）アグロバクテリウム−媒介植物形質転換法を含むカテゴリーに分けることができる。
【００５０】
アグロバクテリウム−媒介形質転換については、植物形質転換ベクターまたは構築物を構築した後、イン・ビトロ(in vitro)でDNA組成物として調製した該核酸分子をイー・コリ（E．coli）のような好適な宿主に導入し、アグロバクテリウムのようなもう１の好適な宿主に接合させ、またはコンピーテントなアグロバクテリウムに直接的に形質転換する。これらの技術は当業者によく知られており、ダイズ、ワタおよびコムギを含む多数の植物系について記載されている（例えば、出典明示して本明細書の一部とみなす、米国特許第5,569,834号および5,159,135号およびWO 97/48814を参照されたい）。
【００５１】
本発明は、１またはそれを超える遺伝子コンポーネントを植物に導入するための細菌菌株の使用を包含する。当業者は、アグロバクテリウム−媒介形質転換法の有用性を認識するであろう。TiまたはRiプラスミドを収容するアグロバクテリウム・ツメファシエンスおよびアグロバクテリウム・リゾゲネスの多数の野生型および非病原化菌株を、植物への遺伝子トランスファーに使用し得る。好ましくは、アグロバクテリウム宿主は、癌腫または発根を引き起こす腫瘍遺伝子を各々含まない非病原化したTiおよびRiプラスミドを含み、それらはベクターとして使用され、つづいて植物に導入する関心のある遺伝子を含む。好ましい菌株には、限定されるものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンスC58株、植物細胞へのDNAのトランスファーを媒介するために用いるノパリン−型菌株、LBA4404のようなオクトピン型菌株またはスクシナモパイン型菌株、例えばEHA101またはEHA105が含まれるであろう。自然界において植物と相互作用するシノリゾビウム、リゾビウムおよびメソリゾビウムのような他の細菌を修飾して、多数の多様な植物への遺伝子トランスファーを媒介し得る。これらの植物関連の共生細菌は、非病原化Tiプラスミドおよび好適なバイナリーベクターの両方の獲得によって遺伝子トランスファーについてコンピーテントとすることができる（Broothaertsら,2005）。
【００５２】
植物形質転換についてのこれらの菌株の使用は、報告されており、それらの方法は当業者によく知られている。
【００５３】
外植片は単一の遺伝子型または遺伝子型の組合せからのものとすることができる。発芽し得るいずれかのトウモロコシ種子は、実行可能な出発材料である。好ましい形態において、植物雑種からの優れた外植片は外植片として使用することができる。例えば、高い培養応答（高い頻度の胚形成カルス形成、増殖速度、植物再生頻度ほか）を有する高速増殖セルラインは、幾つかの遺伝子型を含む雑種胚を用いて創製することができる。好ましい形態において、交配育種のF1雑種または第一世代子孫は、供与植物として使用でき、他の遺伝子型と交配することができる。当業者であれば、２の同系繁殖体を交配した場合に、本明細書中では「雑種強勢」ともいうヘテロシスが起こることを知っている。したがって、本発明は、三方向交配から生じる外植片の使用を包含し、そこでは少なくとも１またはそれを超える同系繁殖体が硬度に再生可能および形質転換可能であり、三方向交配外植片の形質転換および再生頻度は同系繁殖体の個々の頻度を超える。他の組織も、本発明の実施に有用性を有することが想定される。外植片には、成熟胚、未成熟胚、分裂組織、カルス組織または形質転換可能および再生可能であるいずれか他の組織が含まれ得る。
【００５４】
形質転換プロセスの間に、いずれの好適な植物培養培地も使用することができる。好適な培地の例には、限定されるものではないが、さらなる植物成長調節剤を補充したMS基本培地（MurashigeおよびSkoog，1962）またはN6基本培地（Chuら，1975）が含まれ、その調節剤には限定されるものではないが、ピクロラム（4−アミノ−3,5,6−トリクロロピコリン酸）、2,4-D（2,4-ジクロロフェノキシ酢酸）およびジカンバ（3,6-ジクロロアニス酸）のようなオーキシン；BAP（6-ベンジルアミノプリン）およびカイネチンのようなサイトカイン；ABA；およびジベレリンが含まれる。他の培地添加物には、限定されるものではないが、必要であれば、低融点アガロースまたはGelrite（登録商標）寒天の形態のような適当なゲル化剤を含むかまたは含まない、アミノ酸、多量要素、鉄、微量要素、イノシトール、ビタミンおよび有機物、炭水化物、カゼイン加水分解物のような決まっていない培地成分、硝酸銀を含むエチレンアンタゴニストが含まれ得る。当業者であれば、種々の組織培養培地をよく知っており、それは適当に補充した場合、植物組織の増殖および発達を支持し、植物の形質転換および再生に好適である。これらの組織培養培地は、市販の調製物またはカスタム調製および修飾したもののいずれかとして購入し得る。かかる培地の例には、限定されるものではないが、MurashigeおよびSkoog（1962）、N6（Chuら，1975）、LinsmaierおよびSkoog（1965）、UchiyamaおよびMurashige（1962）、Gamborgの培地（Gamborgら，1968）日培地（Duncanら，1985）、McCownのWoody植物培地（McCownおよびLloyd，1981）、NitschおよびNitsch（1985）、およびSchenkおよびHildebrandt（1972）または準じて補充したこれらの培地の誘導体が含まれるであろう。当業者であれば、形質転換および再生に用いる栄養および成長調節剤のような培地および培地補充物を知っており、ならびにインキュベーションの間の光度、pHおよびインキュベーション温度のような他の培養条件を関心のある特定の品種について最適化し得る。
【００５５】
形質転換可能な植物組織を単離したら、方法の次の工程は、遺伝子コンポーネントを植物組織に導入することである。この工程は本願明細書中において「形質転換」ともいう。植物細胞を形質転換し、各々の独立して形質転換した植物細胞を選択する。独立した形質転換体は、トランスジェニック事象という。多数の方法が報告されており、それらの方法を用いて遺伝子コンポーネントを形質転換可能な植物組織に挿入し得る。マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントおよびアグロバクテリウム媒介遺伝子デリバリーが２の最も一般的に使用されている植物の形質転換法であるが、他の方法も知られている。
【００５６】
当業者であれば、植物形質転換法における典型的な工程を知っている。当業者であれば、アグロバクテリウムの増殖方法および好適な培養条件ならびにその後の接種法を熟知している。接種に使用するアグロバクテリウム培養物の密度および外植片に対するアグロバクテリウム細胞の比は系によって変化し得、したがって、いずれかの形質転換法についてのこれらのパラメータの最適化は予想される。アグロバクテリウムは冷凍ストックから直接的に誘導することもでき、あるいは当業者に知られている複数の方法で培養することができる。
【００５７】
形質転換法の次のステージは接種である。このステージにおいては、外植片およびアグロバクテリウム細胞懸濁液を一緒に混合する。これは、アグロバクテリウム細胞懸濁液中で外植片をインキュベートすることによって行い得る。本明細書に記載する他の形態において、外植片はそれが供与体組織にいまだ結合している間に、供与体組織から外食片を除去する間に、外植片を選択培地に平板した後に、またはそれらの組合せによって接種する。接種の器官および条件ならびにアグロバクテリウム細胞密度は、植物形質転換系に依存して変化する。
【００５８】
接種後、過剰なアグロバクテリウム懸濁液を除去し、アグロバクテリウムおよび標的植物材料を同時培養し得る。同時培養とは、接種前であって、遅延培地または選択培地に移す前の時間をいう。かなりの数の植物組織培養培地を同時培養工程に使用することができる。アグロバクテリウムを接種した後の植物組織は、液体または半固体培地中で培養することができる。同時培養は典型的には約１８℃−３０℃の温度にて約１〜３日間行う。同時培養は照明下または照明を制限した条件下で行い得る。当業者に知られているように、照明条件は各植物系について最適化し得る。
【００５９】
アグロバクテリウムとの同時培養の後、外植片は典型的には選択培地に直接的に置くことができる。別法として、アグロバクテリウムとの同時培養の後、外植片は選択剤を含まない培地に置き、つづいて選択培地に置くことができる。当業者であれば、植物系に依存して変化し得る選択様式の膨大な修飾、培地および増殖条件、および選択剤を知っている。典型的な選択剤には、限定されるものではないが、ゲネチシン（Ｇ４１８）、カナマイシン、パロモマイシンのような抗生物質、またはグリホセート、ホスフィノスリシン、ビアラフォスおよびジカンバのような他の化学剤が含まれる。さらなる適当な培地成分を選択または遅延培地に添加して、アグロバクテリウム増殖を阻止することができる。かかる培地成分には、限定されるものではないが、カルベニシリンまたはセフォタキシムが含まれ得る。
【００６０】
１の形態において、接種、同時培養および選択工程は、形質転換生産システム効率を改善するためにアグロバクテリウムの増殖を抑制し、非−形質転換外植片細胞を殺すための選択剤を含む培地に直接的に接種した外植片を置くこおｔによって、単一の工程に結合する。
【００６１】
培養物は、その後、形質転換幼植物体の回収に好適な培地に移す。当業者であれば、形質転換植物を回収する多々数の方法を知っている。種々の培地および移行要件を、植物形質転換用の各植物系およびトランスジェニック植物の回収について実施および最適化することができる。その結果、本発明で開示するかかる培地および培養条件は、栄養学的に等価な成分、またはトランスジェニック事象の選択および回収用の同様の方法で修飾または置換することができ、それらはいまだ本発明の範囲内に入る。
【００６２】
本発明は以前に記載した工程のすべてを包含する；しかしながら、修飾を適当に行って単一の容器におけるプロセスを促進する。種々の型の支持体上の液体培地を用いて、工程から工程での培地の交換を促進する。同様の結果を付与する一時的な浸漬系のバイオリアクターまたは他の装置を培地交換に使用することができる。
【００６３】
外植片としてのカルスの場合、該カルスは限定されるものではないが、ガーリックプレス、ハサミ、メスまたは他の機器を含む種々のデバイスを用いて切り刻むことができる。カルスは非常に細かく切り刻んで小さいマルチウェル・プレート・システムに適合することができ、その場合、各ウェルに単一の事象を得ることが期待される。これらの修飾はエルゴノミクス的な救済を提供し、修飾を用いて単一のカルス片から多くのトランスジェニック事象を回復することができる。
【００６４】
生成した形質転換体は、つづいて分析して形質転換ベクターに含まれる関心のある特定の核酸の存在または不存在を決定する。分子分析には、限定されるものではないが、サザンブロット（Southern，1975）またはPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）分析、免疫診断アプローチおよびフィールド評価が含まれ得る。これらおよび他のよく知られた方法を行って、開示した方法によって作製した形質転換植物の安定性を確認することができる。これらの方法は当業者によく知られており、報告されている（例えば、Sambrookら，1989を参照されたい）。
【００６５】
当業者であれば、本発明によって提供される方法および組成物の多くの利点を理解するであろう。以下の実施例は本発明の好ましい形態を実証するために含めるものである。本発明者らによって見出された代表的な技術の後につづく実施例に開示された技術が本発明の実施においてよく機能することは当業者によって理解されるべきである。したがって、その実施について好ましい様式を構成していると考え得る。しかしながら、本明細書の開示に鑑みれば、当業者であれば、本発明の意図および範囲から逸脱することなく似たまたは同様の結果がいまだ得られる開示された特定の形態に多くの変化をなし得ることは理解される。本明細書に引用するすべての刊行物は、それらが、本明細書中で用いる背景または技術方法論、技術または組成物を補足し、説明し、提供する、出典明示して本明細書の一部とみなす。
【００６６】
実施例
以下の実施例は本発明の種々の形態を説明する目的で提供するものであって、いかなる場合においても本発明を限定することを意味するものではない。当業者であれば、本発明が前述した目的を行い、目標および利点、ならびにそれらに固有のこれらの目的、目標および利点を得るのによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載した方法とともに本実施例は、好ましい形態の現在の代表であって例示的であり、本発明の範囲に対する制限を意図するものではない。本明細書中の変化および特許請求の範囲によって規定される発明の意図の中に包含される他の使用は、当業者に思い出されるであろう。
【００６７】
実施例１
外植片源および培養条件
トウモロコシの未成熟胚から得た８日齢カルス（継代培養後８日）をゲル化211V培地（N6基本塩混合物、1mg/Lの2,4-D、1mg/Lの塩酸チアミン、1mg/Lのニコチン酸、0.91g/LのL-アスパラギン一水和物、0.1g/Lのミオ-イノシトール、0.5g/LのMES、1.6g/LのMgCl2・6H2O、0.1g/Lのカゼイン加水分解物、0.69g/Lのプロリン、20g/Lのスクロース、0.1mMの硝酸銀、6g/LのPhyta agar）上で培養した。
【００６８】
ゲル化培地の使用を言及する場合は、プレート当たり12の外植片を含む50mLの培地を含む25×100mmのペトリ皿を用い、すべての移動は手動で行った。
液体培地は212V（2mg/Lの2,4-D、1mg/LのチアミンHCl、1mg/Lのニコチン酸、0.91g/LのL-アスパラギン一水和物、0.1g/Lのミオ-イノシトール、0.5g/LのMES、1.6g/LのMgCl2・6H2O、0.1g/Lのカゼイン加水分解物、0.69g/Lのプロリン、20g/Lのスクロース、0.01mMの硝酸銀からなり、pH5.8に調整し、121℃、105kPaにて20分間オートクレーブ処理した。オートクレーブ後、250mg/Lまたは500mg/Lおよび100mg/Lまたは200mg/Lの濃度の濾過滅菌したカルベニシリンおよびパロモマイシンを選択剤として培地に添加した。
【００６９】
液体培養については、Temporary Immersion System（TIS)容器、240×240mmの大きなペトリプレート、または25×100mmのペトリプレート、またはマルチウェルプレートを用いた。
すべての培養は増殖キャビネット（Percival scientific Series 101US）中、暗所下、27-28℃にてインキュベートした。
【００７０】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス感染および同時培養
活発に増殖した均一なサイズの8日齢カルスを選択し、アグロバクテリウム懸濁液（0.25×109cfu/mL）で30分間感染させた。そのカルスを0.1mMのAgNO3を含有する212V液体培地で線上し、TIS容器または濾紙を含む25×100mmのペトリプレートまたは２層のポリエステル製フェルト（220×220mm）を含む大きな浅底ペトリプレート（240×240mm）に移した。同時培養処理は、暗所下、23℃にて行った。
【００７１】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株およびプラスミド
ABIアグロバクテリウムC58株を用いて植物細胞へのDNAのトランスファーを媒介した。プラスミドpMON30113（図１）には、選択マーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子（NPTII）および35Sプロモーターによって駆動するスクリーニング可能なマーカーとして緑色蛍光タンパク質（GFP）を含ませた。
【００７２】
実施例２
臨時浸漬系（TIS）
修飾TISは以下のようにして構築した。オートクレーブ可能な250mLフィルターユニット（Nalge Nunc Intl., Rochester, NY）の２のチャンバーを、通常はメンブレンフィルターを保持するために使用する支持プレートの基部にガラス管を挿入することによって連結した。空気の流れは、ポアサイズ0.2μm、50mm直径の疎水性PTFEメンブレンフィルター（Millipore, Billerica, MA）を通過させることによって滅菌した。液体培地を下側のチャンバーに入れ、外植片材料を上側のチャンバー中の支持ディスクに入れた。空気を下側チャンバーにポンプ送給してガラス管を通して液体培地を上側のチャンバーに転置して、カルスを浸漬した。上側チャンバーにポンプ送給された空気は培地に圧力をかけて下側チャンバーに戻した（液体培地の薄いフィルムのみが組織上に残っている）。電子タイマーを用いて、上側または下側のいずれかのチャンバーへの空気の流れを制御するソレノイドを制御した。タイマーは、下側チャンバーへの空気の流れ、上側チャンバーへの空気の流れまたは「空転空気の流れ」のいずれかにプログラムした。空気の流れのタイマーは各々１ないし５分に設計したが、空転時間を変化することはできる。ついで、プログラムを設定して、異なるステージの形質転換プロセスを通した連続サイクルで進めた。このようにして、組織を、設定した間隔でほぼ1-5分間完全に浸漬した。これを浸漬サイクル頻度という。
【００７３】
浸漬サイクル頻度の最適化
組織を１分間の水没および４の異なる浸漬サイクル頻度（6時間、8時間、12時間および24時間毎に1回）の各々で組織を培養し、8週間試験した。対照として、同一の穂由来のカルスの半分を選択剤を含む211Vゲル化培地で培養した。
【００７４】
浸漬時間の間隔がTISにおけるカルスの増殖速度に顕著な影響を与えることを見出した。カルス増殖およびバイオマス増加の最高速度が、12時間または24時間のいずれかの浸漬頻度を用いて生じた。これらの2の浸漬サイクル頻度を用いて、70-80％のカルスがGFP陽性セクターを生成した。浸漬頻度を6時間または8時間毎に1回に増加することにより、カルス増殖の兆候が観察されなくなり、10ないし14日以内にカルスは茶色に変化して最終的に死滅した。
【００７５】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス増殖に対するカルベニシリンの効果
前記したpMON30113をカルスに接種した。接種後、感染したカルスは、0、100、250、500または1000mg/Lのカルベニシリンのいずれかを補充したカルス増殖培地（212V）に移した。アグロバクテリウムの増殖は、TIS装置の下側チャンバー中の液体培地の濁度を観察することによって視覚で判定した。非接種対照処理の別のTISユニットを含めた。非−接種カルスのさらなる対照も、カルベニシリンを補充したゲル化培地（211V）上で培養して、カルス培養物に対するカルベニシリンの効果を実験した。
【００７６】
カルベニシリンを補充したまたは補充しなかった211V（ゲル化）および212V（液体）培地で培養した非−接種マウスカルスの品質における顕著な違いは全く気付かなかった。このことは、非接種カルスの増殖および発達に対してカルベニシリンが全く負の影響を有していないことを示している。しかしながら、アグロバクテリウム・ツメファシエンスおよびGFP-陽性セクターの増殖における相違が、カルベニシリンの濃度を０.０から1000mg/Lに増大した際に観察された。100mg/Lの濃度のカルベニシリンは、液体またはゲル化した培地のいずれかでアグロバクテリウムの増殖を抑制できなかった。カルベニシリンの最適濃度はゲル化および液体培地について500mg/mLであることが判明した。
【００７７】
カルスおよびシュート増殖に対するパロモマイシンの効果
非−トランスジェニックカルス増殖を阻害するために、ゲル化（対照）および液体培養培地の両方に、選択剤パロモマイシン（25、50、75、100または200mg/L）を補充した。対照処理は、（1）選択培地上の非−接種カルス、（2）選択を含まない培地上の非−接種カルス、および（3）選択を含まない培地上の接種カルスとした。基本培養培地は、211Vまたは212Vのいずれかからなる。この実験については25×100mmの底深ペトリプレートを用いた。液体培養では、2層の60×60mmのフェルトを用いて外植片を保持した。アグロバクテリウム接種培養の選択剤には、カルベニシリンおよびパロモマイシンを含ませた。
【００７８】
低濃度のパロモマイシンは、ゲル化培地よりも液体培地において胚形成カルスの増殖および植物再生をより有効に阻害した。50mg/Lの低濃度のパロモマイシンを含有する液体培地からの非−接種カルスからは植物が全く得られなかったが、50%のカルスが同濃度のパロモマイシンのゲル化培地上で幼植物体を生成した。100mg/Lの濃度のパロモマイシンは、液体およびゲル化培地の両方でカルス増殖を阻害した。
【００７９】
TISで用いる液体培地量の最適化
発達しているカルスを4の異なる量の液体培地（20mL、30mL、50mLおよび100mL/容器）のうちの1で培養した。
【００８０】
TISにおける選択および再生
TIS中での同時培養の3日後に、20mLの選択培地212VRT（2mg/Lの2,4-D、1mg/LのチアミンHCL、1mg/Lのニコチン酸、0.91g/LのL-アスパラギン一水和物、0.1g/Lのミオ-イノシトール、0.5g/LのMES、1.6g/LのMgCl2.6H2O、0.1g/Lのカゼイン加水分解物、0.69g/Lのプロリン、20g/Lのスクロース、0.01mMの硝酸銀、500mg/Lのカルベニシリンおよび100mg/Lのパロモマイシンを含むN6基本塩）をTISの下側チャンバーに注入した。カルスは12時間毎に1回1分間浸漬した。2週間のインキュベーション後に、真空ポンプを用いて下側チャンバーから212VRT培地を吸引し、20mLの212RT（硝酸銀を含まない）培地で置換した。カルスはさらに2週間、24時間毎に1回1分間浸漬した。4週間の選択フェーズを完了した後に、選択培地をBAP-プラス217A培地（1mg/LのチアミンHCL、1mg/Lのニコチン酸、3.52mg/LのBAP、0.91g/LのL-アスパラギン一水和物、0.1g/Lのミオ-イノシトール、0.5g/LのMES、1.6g/LのMgCl2.6H2O、0.1g/Lのカゼイン加水分解物、0.69g/Lのプロリン、20g/Lのスクロース、250mg/Lのカルベニシリンを含むN6基本塩）で置換した。カルスは7日間、12時間毎に1回1分間浸漬して217A培地で処理した。
【００８１】
植物再生については、217A培地を632AG培地（MS塩混合物、MSビタミン、50mg/Lのミオ-イノシトール、60g/Lのスクロース、50mg/Lのパロモマイシンおよび250mg/Lのカルベニシリン）で置換した。培地はTISの上側チャンバーに注入し、1分間の浸漬を2回迅速に行って残存217A培地を希薄化した。Percivalにおける照明は16時間点灯/8時間消灯サイクルで行った。TISは72時間空転させ（浸漬を含まない）、その後に、シュートが5-20mmのサイズに発達するまで、24時間毎に1回カルスを浸漬した。
【００８２】
1の容器における10-12週間の選択および再生の後に、トランスジェニック植物を得た。TISにおいて、5.9%の形質転換頻度が達成された。これは対照における17.7%になぞられる。
【００８３】
実施例３  ペトリプレートの使用
実施例１のようにして得たカルスを0.1mMのAgNO3を含有する212V液体培地で洗浄し、濾紙を含む25×100mmのペトリプレートまたは2層の（220×220mm）アクリル酸製フェルトを含有する25×100mmの大きな浅底ペトリプレート（240×240mm）のいずれかに移した。
【００８４】
ついで、液体培地の交換を手動で行う以外は実施例2のTISで記載したのと同様にして外植片を培養した。液体培地をゲル化培地と比較した。より小さいペトリプレートにおいては、液体培地は、ゲル化培地での6.6%と比較して4.2%の形質転換頻度を与えた。より大きなペトリプレートにおいては、液体培地は、ゲル化培地での11.5%と比較して7.8%の形質転換頻度を与えた。このことは、液体培地が標準的な凍体培地プロトコールに対する価値ある代替であることを示している。液体培地はより大きなアートメーションを許容するであろう。
【００８５】
実施例４  容器としてのマルチウェル・プレートの使用
マルチウェル・プレートも単一の容器システムとして使用することができる。ペトリプレートの代わりにマルチウェル・プレートを用いる以外は前記と同様にして実験を行った。Costar（Corning Life Sciences, Acton, MA）からのマルチウェル・プレートをTranswell（商標）インサートを含めてまたは含めないで使用した。使用したメンブレンの孔径（0.1μ）により、組織が溢れ出すことなく、培地がメンブレンを横切ってトウモロコシ組織に滴下することが許容される。ピペット先端アクセスポートにより、培地変化のために培地を迅速に除去してウェルに添加することが許容される。培地移動の間に、真空ホースで古い培地を吸引し、新しい培地をピペット操作することによってウェル内の培地を交換した。
【００８６】
本発明に使用するマルチウェル・プレートは、プレート当たり24の別々のウェルのサイズになる。あるいは、別々のものとは反対に、共通の培地貯溜部を有するマルチウェル・プレートを用いることもできる。プレートは、典型的にはNescofilm（登録商標）またはParafilm（商標）で拭き取るか、拭き取らないまま固体培地選択で行ったのと同様にしてインキュベーター（27℃）で保存した。ウェルが互いに別々になっているという事実は特に有利である。共通の培地貯留部、フェルト液体選択または固体培地選択の場合に起こり得るように、細菌の汚染が他の外植片に広がらないためである。
【００８７】
ベクターpMON68410を形質転換に用い、それは選択可能なマーカーとしてnptII遺伝子を含み、評点付け可能なマーカーとしてgfpを含む。LH244のカルスを外植片として用いた。形質転換工程は、実施例8に開示したのと同様とした。実験は、液体培地中の外植片に支持を提供する異なるマトリクスを含むおよび含まないCostarマルチウェル・プレートでも行った。さらなる液体培地と一緒にガラスビーズ、シリコンビーズ、フェルト、フォームおよび固体培地を用いた。対照処理は：Petriプレート中の固体培地上（処理番号1；表1）およびマルチウェル・プレート中の液体培養のみ（処理番号2；表1）であった。4の異なるヒトによって、異なるマトリクスを4の実験で用いた。すべての処理がトランスジェニック植物を与えた。しかしながら、シリコンビーズマトリクスの使用および小フェルトは、ペトリプレート中の固体培地上の培養の対照処理と同等であった。
【００８８】
【表１】
2010502193.tif 000002
【００８９】
表2は、マトリクスを含む（処理番号3ないし5）および含まない（処理番号6）複数ウェルシステムが外植片として未成熟胚および選択剤としてグリホセートを用いるトランスジェニック・トウモロコシ植物の作製にも使用し得ることを示している。この実験のベクターpMON92690はcp4およびgus遺伝子を含んでいた。マルチウェル中の培地の移動は、週ベースで行った。
【００９０】
【表２】
2010502193.tif 000003
【００９１】
実施例５  固体培地につづいて液体培地を含む単一のペトリ皿の使用
単一容器システムのもう１の例は、固体培地を含み、つづいて液体培地を添加して、古い培地を置換することなく単一のプレートで選択および再生を促進する単一のペトリ皿の使用である。トウモロコシカルスは、実施例７に記載するように得て、接種した。
【００９２】
ついで、カルスを、1のWhatman濾紙および23℃の100μLの1/2 MSPL培地を含有する25×100の底深いペトリ皿で同時培養した。3日後、カルスを固体培地850QRT（4.33g/LのMS塩、0.5mg/LのチアミンHCl、0.5mg/LのピリドキシンHCl、0.5mg/Lのニコチン酸、100mg/Lのミオ−イノシトール、0.5g/Lのカゼイン加水分解物、1.38g/Lのプロリン、30g/Lのスクロース、0.5mg/Lの2,4-D、10μg/LのBAP、20μMのAgNO3、500mg/Lのカルベニシリン、100mg/Lのパロモマイシン、pH 5.8、6g/Lのagar）に移した。
【００９３】
14日後に、7-10mLの新鮮な850QRTT培地（寒天を含まず、200mg/Lのパロモマイシンを含む850QRT）を添加し、プレートを低照明下でインキュベートした。さらに14日後に、7-10mLの新鮮な850RT培地（4.33g/LのMS塩、0.5mg/LのチアミンHCl、0.5mg/LのピリドキシンHCl、0.5mg/Lのニコチン酸、100mg/Lのミオ-イノシトール、0.5g/Lのカゼイン加水分解物、1.38g/Lのプロリン、30g/Lのスクロース、0.5mg/L、10μg/LのBAP、500mg/Lのカルベニシリン、100mg/Lのパロモマイシン、pH 5.8）を添加し、プレートを低照明下でさらにインキュベートした。
【００９４】
さらに14日後に、再生したシュートを632AT培地（4.33g/LのMS塩、0.5 mg/LのチアミンHCl、0.5mg/LのピリドキシンHCl、0.5mg/Lのニコチン酸、50mg/Lのミオ−イノシトール、60g/Lのスクロース、250mg/Lのカルベニシリン、100mg/Lのパロモマイシン、pH 5.8、6g/Lの寒天）に移した。ついで、再生した植物を14日後に同一の培地を含有するphytatrayに移し、ついで2週間土壌に移した。
【００９５】
固体培地で選択および再生した植物は、フェルト支持体上の液体培地を用いた対照方法からの47%の使用可能な形質転換植物と比較して、約46%の使用可能な形質転換植物を生成した。
【００９６】
実施例６
新規な懸濁液培養法を用いたトウモロコシのアグロバクテリウム媒介形質転換
形質転換可能な細胞懸濁液培養物の創製が時間がかかり、非−胚形成細胞の創製をしばしば生じる。この実施例は、非常に胚形成であってアグロバクテリウム−媒介遺伝子形質転換について非常にコンピーテントである迅速な懸濁液培養を作るための非常に再現性の高い方法（本明細書中において「短期懸濁液培養」または「SSC」）を記載する。外植片としてのSSCは、カルス（胚形成および使用の簡便性）および懸濁培養（均一、非常に再生可能およびハイスループット生産への修正余地の望ましい特徴を結合する。この非−限定的な例において、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（nptII）を選択可能なマーカーとして用い、標準的なバイナリーベクターシステムをトウモロコシにおけるアグロバクテリウム−媒介安定トランスジェニック事象の効率的な選択および再生に用いた。
【００９７】
アグロバクテリウム菌株、プラスミドおよび培養物
バイナリーベクターpMON25457を保有する非病原化アグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA101をこの実験に用いた。pMON25457は、各々強化35Sプロモーター（「e35S」)およびつづく非−翻訳hsp70イントロンによって駆動される、選択可能な遺伝子（nptII）およびレポーター遺伝子（uidA）を含んでいる。uidA遺伝子は、そのコード配列内にさらなるイントロンを有して細菌発現を最小限化する。プラスミドは、2.5kVおよび400オームで操作するBio-Rad Gene Pulserを用いたエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム菌株に導入した。形質転換したコロニーは、各々100mg/Lのカナマイシンおよびゲンタマイシンを含有する固体Luria-Bertani（LB）培地（SambrookおよびRussell，2001）上で選択した。
【００９８】
アグロバクテリウムの誘導および増殖
形質転換に用いたアグロバクテリウム細胞は、ABベースの誘導培地（0.1 M MES、0.5mMのNaH2PO4、2%のグルコース、1g/LのNH4Cl、300mg/LのMgSO4・7H2O、150mg/LのKCl、10mg/Lの無水CaCl2、2.5mg/LのFeSO4・7H2O、NaOHでpHを5.4に調整）中のアセトシリンゴン（200μM）およびグルコース（2%）で予め誘導した。
【００９９】
アグロバクテリウムを誘導する一般的な手順は以下のとおりである。新鮮なプレートから１ループフルの細菌コロニーを取り上げ、適当な抗生物質を含有する50mLのLB培地中、28℃にて増殖した。培養後約15ないし24時間の細菌培養物の660nmにおける光学密度は約1.4であった。培養物の10mLアリコートを適当な抗生物質を含有する50mLの新鮮なLB培地に移し、約1.2の660nmの光学密度まで、さらに6ないし8時間増殖させた。アグロバクテリウム細胞は、3250×g、4℃にて10分間遠心した。得られたペレットを誘導培地に再懸濁して660nmにおける最終光学密度を約0.2とし、28℃にて約12ないし15時間インキュベートした。形質転換に使用する前に、アグロバクテリウム細胞は、3250×g、4℃にて10分間遠心した。上清をデカンテーションした後、そのペレットを1/2 MSVI培地（2.2g/LのMS塩(Gibco)、1mL/Lの1000xストックMSビタミン、115mg/Lのプロリン、10g/Lのグルコース、20g/Lのスクロース、pH 5.4、濾過滅菌済み）に再懸濁し、200μMのアセトシリンゴンを補充した。200μMのアセトシリンゴンを補充した少なくとも100mLの1/2 MS VI培地を、1L毎のアグロバクテリウム懸濁液に使用した。再懸濁した細胞を小さな体積に小分けし、3250×g、4℃にて10分間遠心し、上清を破棄し、ペレットを使用するまで氷中に保存する（4時間まで）。ペレットは、200μMのアセトシリンゴンを補充した1/2 MS VI培地を用いて望ましい光学密度に再懸濁するが、約109細胞/MLの懸濁液が約0.2の660nmの光学密度を与える。
【０１００】
ストック植物の成長およびカルス形成
トウモロコシHi-IIおよびFBLL遺伝子型は温室中、16時間の日照にて成長させた。これらの2の遺伝子型を含む交配を行い、未成熟な胚を、1.0mg/Lの2,4-D、1mg/LのチアミンHCl、0.5mg/Lのニコチン酸、0.91g/LのL-アスパラギン一水和物、100mg/Lのミオ−イノシトール、0.5g/LのMES、1.6g/LのMgCl2.6H20、100mg/Lのカゼイン加水分解物、0.69g/Lのプロリンおよび20g/Lのスクロースを補充した修飾N6培地（Chuら，1976）上に切り取り;該修飾N6培地を2g/LのGelgro(カタログ番号150180，ICN Biomedicals)で固化し、培地のpHをKOH（予めオートクレーブ処理した）で5.8に調整した。同一の成長条件を選ばれた遺伝子型RBDQ2に用いた。FBLL×Hi-II雑種およびRBDQ2カルス系統は2週間間隔で継代培養し、同一の培地上、暗所下で4ヶ月間28℃に維持した。この継代培養プロトコールを、Hi-IIおよびFBLL-MAB系統でも行った。
【０１０１】
短期間懸濁培養（SSC）形成
カルスからSSCを創製する一般的なプロトコールは以下の通りである。SSC形成を開始するために、約2gのカルス、継代培養後2週間を、2.0mg/Lの2,4-D、20g/Lのスクロース、150mg/LのL-アスパラギン、100mg/Lのミオ−イノシトール、650mg/Lのニコチン酸、125mg/LのピリドキシンHCl、125mg/LのチアミンHClおよび125mg/Lのパントテン酸カルシウム（中性pHをKOHで5.8に調整）を含有する1mLのMS Fromm 1000xビタミンストックを補充したMS Fromm培地を含有する250mL容積のバッフルフラスコに移した。SSCは、178rpmおよび28℃に設定した旋回シェーカー上で創製した。つづく各移行の間に、懸濁液を広口Falcon（商標）滅菌ディスポーザ物ピペットで移す前に、組織をフラスコの底部に簡単に沈ませて望ましくない細胞型を除去した（例えば、細長い、薄い壁、低細胞質含量または無分裂）。開始後1日目に、フラスコからの組織を80mLの修飾MS培地を含有する新鮮なフラスコに移し、さらに2日間増殖させた；この移行工程は開始後3日目に繰り返した。開始後5日目に、組織を2のフラスコの間に均等に分け、フラスコ当たり約2.5mLのパック細胞体積（PCV）を得た。その後に、3日毎に培地を置換した。開始後14日までに、各フラスコに得られたパック細胞体積は約6mLであった（フラスコ当たりほぼ4g、または2週間にわたる合計PCVにおける約4倍の増加）。これらの細胞（SSC)を開始後14日に新鮮な培地に移し、開始15日後に形質転換を開始した。このSSC工程全体を通しての培地の比較的頻繁な変化は、迅速な組織増殖を許容する。SSC工程のさらに有利な工程とは、各移行工程において組織の目視選択が不要であることであり、このシステムを実践的かつ再現可能にしている。
【０１０２】
接種および同時培養
合した合計約18mLのPCVを含有するこれらのフラスコを、FBLL×Hi-IIハイブリッドSSC外植片の形質転換実験に用いた。先行実験を行い、種々の形質転換工程に含まれるパラメータを高めた。出典明示して本明細書の一部とみなすChengら（2003）によって記載された、修飾した同時培養技術を用いた。アグロバクテリウム感染後、乾燥工程を用い、これはT日NAトランスファーを大幅に増大させ、ならびにトランスジェニック事象の回復を増大させることが判明した。
【０１０３】
幾つかの液体培地を伴う各フラスコからのFBLL×Hi-IIハイブリッドSSC組織を等しく分け、6−ウェル組織培養皿（Corning CoStar（商標）、非処理、部分番号9088）の2のウェル、または別法として、20×60mmのペトリディッシュに移した。液体培地を各ウェルまたは皿から除去した。200μMのアセトシリンゴンを補充した1/2 MS VI培地中の5mLのアグロバクテリウム懸濁液（OD660nm〜0.5)を各ウェルまたは皿に添加し、つづいて1時間接種した。接種時間の終わりに、大部分のアグロバクテリウム懸濁液を温和に除去し、接種したSSC細胞を200μMのアセトシリンゴンを補充した5mLの1/2 MS VI培地で洗浄した。各ウェルまたは皿からの細胞を、3層の滅菌濾紙を含むペトリ皿に移して細胞から過剰な液体を吸収し、ついで、等しく別け、各々5.5cm直径の滅菌濾紙片（Baxter）を含む2の60×20mmペトリ皿に移した。そのようにして、合計12の濾紙を含む同時培養皿を得た（各元のフラスコから4）。移した細胞は濾紙上に6ないし8の塊で並べた。乾燥下の1日同時培養を、出典明示して本明細書の一部とみなすChengら（2003）の修飾プロトコールを用いて行った。200μMのアセトシリンゴンを補充した1000μLの1/2 MS VI培地を各濾紙に添加し、プレートをParafilm（商標）でラップし、暗所下、23℃にてインキュベートした。mL PCV当たりに再生した独立した事象の数として形質転換頻度を計算した。
【０１０４】
3の反復パック細胞体積（各4.5mL）を用いて、RBDQ2 SSC外植片で形質転換実験を同様に行った。形質転換手順は、フラスコ当たり2のウェルのうち1について、200μMのアセトシリンゴンを補充し、20μMのAgNO3を含有する1/2 MS VI培地を接種および洗浄工程の間に用いた以外、一般的にFBLL×Hi-IIハイブリッドSSC外植片で用いたものと同じとした。
【０１０５】
トランスジェニック植物の選択および再生
パロモマイシン選択を用いるnptIIでのSSCの形質転換のプロトコールには選択の間の外植片を移すためのシンプルな濾紙支持体が含まれ、これは労力を最小限化し、アグロバクテリウムの迅速な取り出しを確保し、組織の成長速度を増大し、迅速な選択を生じる。
【０１０６】
この手続をFBLL×Hi-IIハイブリッドSSCに以下のようにして行った。形質転換0日目（すなわち、同時工程の最後）に、1000mg/Lの1000mg/Lのカルベニシリン、100mg/Lのチカルシリン、100mg/Lのバンコマイシンおよび40mMのAgNO3（これのみ各同時培養プレートに直接的に添加した）を補充した5mLのMS Fromm培地で洗浄工程を行い、滅菌スパチュラを用いて細胞塊を温和にたたいて確実に沈めた。洗浄培地をプレートから除去し、細胞を運搬している濾紙を、遅延培地として1000mg/Lのカルベニシリン、100mg/Lのチカルシリンおよび40マイクロモルのAgNO3を補充した3.0mg/Lの2,4-Dを含有する新鮮な固形Duncan"D"培地を含むペトリ皿に移したDuncan"D"培地は、出典明示して本明細書の一部とみなすDuncanら（1985）によって記載された基本塩および"D"培地のビタミンを含む；一般的に、この培地の2×ストック500mLを調製し、6gのPhytagarを含むオートクレーブ処理した滅菌蒸留水500mLに添加した。細胞は遅延培地に6日間維持した。形質転換6日目に、細胞を運んでいる濾紙を第1の選択培地として750mg/Lのカルベニシリン、100mg/Lのチカルシリン、40マイクロモルのAgNO3および50mg/Lのパロモマイシンを補充した1.5mg/Lの2,4-Dを含むDuncan"D"を含有するペトリ皿に移して第1の選択工程を行った。同時培養工程の終了2週間後に、第２の選択培地として、750mg/Lのカルベニシリン、100mg/Lのチカルシリン、40マイクロモルのAgNO3および100mg/Lのパロモマイシンを補充した1.5mg/Lの2,4-Dを含むDuncan"D"培地を含むペトリ皿に移した細胞を運搬している濾紙を用いて第２の選択工程を行った。同時培養工程の終了３週間後に、各濾紙から取り出した小な大きさにした組織を用いて第３の選択工程を行い、第３の選択培地として750mg/Lのカルベニシリン、100mg/Lのチカルシリンおよび100mg/Lのパロモマイシンを補充した1.5mg/Lの2,4-Dを含む固形Duncan"D"培地に置いた。各濾紙からプレートした約4ないし6の得られた細胞の塊が存在し、今後、各細胞の塊を実験において個々に処理した。濾紙当たり１のプレートした塊をトランスジェニックセクターのサイズについて組織化学的にアッセイし、直径約1ないし2mmであることが判明した。同時培養工程の終了4週間後に、750mg/Lのカルベニシリン、100mg/Lのチカルシリンおよび100mg/Lのパロモマイシンを補充した1.5mg/Lの2,4-Dを補充したDuncan“D”培地を含むペトリ皿に各塊を移して第４の選択工程を行った。この第４の選択サイクルの終わりに、合計232のパロモマイシン耐性FBLL×Hi-II雑種系統を得た。同時培養工程の7週間後に、3.52mg/Lの6-BAP、500mg/Lのカルベニシリンおよび100mg/Lのパロモマイシンを含む底深いペトリ皿（20×100mm）に移した耐性カルスを用いて選択および前−再生工程を行った。最後に、再生する組織をペトリ皿中で2週間MS再生培地に移し、その後にさらに3週間Phytatrayに移した。MS再生培地は10g/Lのグルコース、20g/Lのスクロース、100mg/Lのミオ−イノシトール、150mg/LのL-アスパラギンおよび1mL/LのMS Fromm 1000xビタミンストック、650mg/Lのニコチン酸、125mg/LのピリドキシンHCl、125mg/LのチアミンHClおよび125mg/Lのパントテン酸カルシウムおよび6g/LのPhytagarを補充した修飾MS培地からなり;培地はpHをKOHおよび前−オートクレーブで5.8に調整し、オートクレーブ後に250mg/Lのカルベニシリンおよび100mg/Lのパロモマイシンを添加した。同時培養工程の終了13週間後に、得られた幼植物体を土壌に移した。
【０１０７】
トランスジェニック植物の子孫分析
選択および形質転換の種々の工程でUidA活性をアッセイし、その後に出典明示して本明細書の一部とみなすJefferson（1987）によって記載された組織化学的手法を種々の形質転換および植物の成長の種々の工程で行った。nptIIの検出およびコピー数の分析は、INVADER（登録商標）アッセイ（Third Wave Technologies, Madison, WI）を用いて行った。少なくとも、上記した実験条件下では、選択圧における遅延工程につづく逐次の増大が、SSC外植片からトランスジェニックセクターを回復するために必要であることが判明した。一般的に、トウモロコシ細胞のアグロバクテリウム−媒介形質転換能力は、形質転換を開始する前にカルスを少なくとも短い液体相に付することによって改善されることが見出されている。例えば、FBLLxHI-IIハイブリッドSSC外植片は、形質転換3日後にgusを発現している80%の組織を用いて、SSCの開始後約5ないし14日の間のT日NAトランスファーに対して非常にコンピーテントであることが判明した。より高齢（2月）のSSC培養物も、形質転換3日後にuidA活性についての組織化学的染色を示す約20%の外植片を用いて、形質転換に対してコンピーテントであることが判明した。それに対して、211修飾N6培地に維持したFBLLxHi-IIハイブリッドカルスは、形質転換3日後にUidA活性についての組織化学的染色を示す20%未満の外食片を用いて、ほとんどコンピーテントでないことが判明した。
【０１０８】
FBLLxHi-IIハイブリッド遺伝子型の場合、元の3のフラスコから合計232のパロモマイシン−耐性系統を得た。試験した76の耐性カルス系統のうち、56（約74%）がuidAを発現することが判明した。35のパロモマイシン耐性系統の亜集団が再生し；これらのうち、植物に再生した25事象のうちの24事象はuidAを含むことが判明した。幾つかのSSC実験から生じた植物のサザンブロットおよび組織化学アッセイは、R1世代におけるトランスジーンの組み込み、およびR0およびR1世代によるトランスジーンの遺伝を確認した。RBDQ2遺伝子型の場合、3の複製フラスコ（各々約4mLのPCVを含有する）から合計37のパロモマイシン−耐性のuidA陽性推定事象が得られた。形質転換頻度は実際より小さく見積った。幾つかの組織をUidA組織化学アッセイに犠牲にしたからである。この遺伝子型においえは、接種または洗浄の間のAgNO3の使用は形質転換頻度を高めず、これは乾燥によるアグロバクテリウム増殖の抑制がアグロバクテリウム毒性を最小限化するのに十分であったことを示唆している。合計29の推定パロモマイシン−耐性カルスを作製し、そのうちの18の推定事象を土壌に移した。18事象のうちの18は、葉組織の組織化学アッセイによってuidA−陽性であることが判明した。したがって、（推定事象に基づく）RBDQ2 SSCの形質転換頻度は、ほぼ1.4事象/1ml PCV（17事象/12mL PCV）であると概算される。
【０１０９】
したがって、このSSC手順は、FBLLxHi-IIハイブリッドおよび所有権の選良なRBDQ2遺伝子型の両方からの、アグロバクテリウム−媒介安定形質転換に適した、再生可能なII型懸濁液培養を迅速に確立することができた。SSC外植片は、ハイスループット遺伝子評価系の開発に特に有用となり得る。
【０１１０】
実施例７
アグロバクテリウムの凍結グリセロールストックの誘導培地への直接接種による形質転換用のアグロバクテリウムの調製
これは、形質転換用のアグロバクテリウムを調製する１つの方法の非限定的な例である。より詳細には、本実施例は、vir誘導ブロスへのアグロバクテリウムの凍結グリセロールストックの直接接種を記載する。
【０１１１】
Tiプラスミドを用いた植物細胞へのT日NAの移行には、タンパク質VirAおよびVirGをコードするvir遺伝子の活性化が必要である。VirA活性化のシグナルには、例えば、酸性のpH、フェノール性化合物（例えば、アセトシリンゴン）、およびフェノール性化合物と相乗的に作用するある種の糖が含まれる。従来、vir遺伝子の前−誘導には、アグロバクテリウム細胞を種々の時間増殖培地中で増殖させ（通常は冷凍ストックから）、アグロバクテリウム密度を測定し、望ましい密度に調整し、AB最少誘導培地または誘導に好適な他の培地中で増殖させ、細胞を遠心および洗浄し、最後に接種前に所望の密度にアグロバクテリウム培養物を調整することが含まれる。含まれる多くの工程はかなりの時間および労力を要し、実験における望ましくない変動の機会を与える。
【０１１２】
本明細書に開示するのは、時間、労力および形質転換実験における変動を減少する迅速な、単一工程のアグロバクテリウム直接誘導法である。誘導に必要な工程数の減少は、エルゴノミー的な負荷の減少および質的制御目的についても有利である。
【０１１３】
本明細書に記載する非限定的な形態において、グリホセート耐性の遺伝子（cp4）を運搬するベクターpMON70801（出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第5,633,435号を参照されたい）を用い；しかしながら、当該技術分野で知られているように、多くの他のアグロバクテリウムベクターが用い得る。光学密度（OD）は660ナノメートルで測定した。グリホセート選択を用いる植物形質転換用の培地および試薬の説明を含むさらなる好適な方法は、例えば出典明示して本明細書の一部とみなす、Caiらに対する米国特許出願公開2004/0244075に開示されている。
【０１１４】
修飾MS誘導培地を用いた直接誘導
非限定的形態において、方法は、必要なvir誘導コンポーネントを含むMS誘導培地中の凍結アグロバクテリウムグリセロール・ストックの前誘導を含み得る。前誘導の後に、アグロバクテリウム細胞を形質転換実験に直接的に使用する。
【０１１５】
MS培地（25%（v/v）のグリセロールを含む1/2MS塩、100μMのMES、2%のグルコース）を用いて作成した凍結ストックからアグロバクテリウムを増殖させた。MS塩を用いて作成した凍結ストックを、アセトシリンゴンを含有する修飾MS誘導ブロス（適当な抗生物質（スペクチノマイシン/ストレプトマイシン  50μg/mL、カナマイシン  50μg/mLおよびクロラムフェニコール25マイクログラム/mLおよび200μMのアセトシリンゴン）を補充した1/2MS塩、100μMのMES、2%グルコース）に再懸濁した。0.4の初期ODの後に合計5時間の誘導を続けた。誘導のために、50ミリリットルの誘導培地を入れた1のフラスコ（250mLバッフルフラスコ）を用いた。誘導の最後にアグロバクテリウム懸濁液を接種に直接用い、接種の直前に20μMのAgNO3を補充した。
【０１１６】
上記した修飾MS直接誘導プロトコールを以下の工程を含む従来のプロトコールと比較した：適当な抗生物質（スペクチノマイシン/ストレプトマイシン  100マイクログラム/ミリリットル、カナマイシン  100マイクログラム/ミリリットル、およびクロラムフェニコール  25マイクログラム/ミリリットル）を含むLB液体中で凍結ストックからアグロバクテリウムを8時間増殖し、アグロバクテリウムを遠心で集め、適当な抗生物質（スペクチノマイシン/ストレプトマイシン  50マイクログラム/マイクロリットル、カナマイシン  50マイクログラム/ミリリットル、およびクロラムフェニコール  25マイクログラム/ミリリットル）および200マイクロモルのアセトシリンゴンを含むAB最小誘導ブロスに再懸濁した。0.2の初期ODに続いて合計13時間の誘導を行った。誘導のため、300ミリリットルの誘導培地を含む1のフラスコ（1リットルのバッフル付きフラスコ）を用いた。誘導の終了時にアグロバクテリウムを遠心で集め、0.4のODまで200マイクロモルのアセトシリンゴンを補充した1/2MSVIで再懸濁した。接種の直前に、AgNO3を最終濃度20マイクロモルまで加えた。
【０１１７】
この実験用の外植片は、N6ベースの201培地上で形質転換を開始する8日前に、新鮮な培地で継代培養した近−選良トウモロコシ系統に由来するカルスである。接種は、25×100mm深さの皿で行った。約6gのカルスを、50mLの1/2MS VIを含有する深い皿に移した（処理当たり1皿）。外植片を洗浄し、全ての液体を除去した。アセトシリンゴン（最終濃度200マイクロモル）およびAgNO3（最終濃度20マイクロモル）を補充した24ミリリットルのアグロバクテリウム懸濁液（OD 0.4）を調製し、1時間の接種を行った。接種後、アグロバクテリウム懸濁液を除去し、外植片を20マイクロモルのAgNO3および200マイクロモルのアセトシリンゴンを補充した15ミリリットルの1/2 MSVIで洗浄した。各接種皿からのカルスを10の濾紙を含む深い皿（7.5ミリメートル；Baxterカタログ番号28313-046）に移して過剰な液体を除去した。約0.5グラム（湿重量）または約2.5グラム（排水重量）のカルスを、単一の濾紙（5.5ミリメートル；Baxterカタログ番号28297−868）を含む単一の同時培養プレート（25×60ミリリットル）に移した。外植片は、同時培養プレートの端に向かって4の群で配置した。同時培養は、23℃にて18時間の乾燥を含むまたは含まないで行った（1ミリリットルの1/2 MSVIを添加した）。従来の誘導または修飾したMS誘導である各処理について、7の反復（4は乾燥を含まず、3は乾燥を含む）を用いた。2の誘導プロトコールの間に統計学的有意差は認められなかった。修飾MS直接誘導プロトコールは、より長い従来のプロトコールとほぼ同数の推定事象を生成することが示された。
【０１１８】
AB誘導培地を用いた直接誘導
もう１の非限定的な形態において、方法は、必要なvir誘導コンポーネントを含むAB誘導培地中の凍結アグロバクテリウムのグリセロールストックの前−誘導を含む。前−誘導の後、アグロバクテリウム細胞は望ましい密度に調整し、形質転換実験に直接使用した。アグロバクテリウムは、660nmで測定して3.0のアグロバクテリウム光学密度（OD）（最終濃度）で通常のLB凍結ストックから増殖させた。
【０１１９】
アグロバクテリウム培養物を調製し、2の部分に分けた。1の部分は36ミリリットルの2XYT培地でOD  〜0.6までさらに4.5時間増殖させ、遠心し、20%グリセロールを含有するAB最小培地中でOD  〜3.0に再懸濁し、直接誘導プロトコールで使用するために凍結した。誘導のために、5ミリリットルの凍結ストックを解凍し、アセトシリンゴンを含有する70ミリリットルのAB最小培地に添加し、一晩誘導した。
【０１２０】
2番目のアグロバクテリウム培養物部分は、プレートにストリークして3日間インキュベートし；これらのプレートから調製した第１の種培養物を一晩増殖させた。これにつづいて、第１の種培養物から調製した第２の種調製物を、1日増殖させ、アセトシリンゴンを含有するAB最小培地中でOD  〜2.0にて一晩誘導した。
【０１２１】
2の誘導したアグロバクテリウム調製物を用いて、平行実験でトウモロコシ胚に接種した。各穂の半分からのトウモロコシ胚を各々のアグロバクテリウム調製物（OD  〜1.0）に15分間切り出し、ついで15分間置いた。胚を取り出し、同時培養プレートに置いた。従来のプロトコールを用いて、合計883の胚を接種し、得られた合計174（20%）の植物を土壌に移し、17%（標準偏差＝11.4）の平均形質転換頻度であった。直接誘導プロトコールを用いて、合計814の胚を接種し、得られた合計153（19%）を土壌に移し、19%（標準偏差＝11.6）の平均形質転換頻度であった。cp4トランスジーンのコピー数は処理の間で同様であることが判明した。
【０１２２】
実施例８
機械的手段による継代培養用のトウモロコシカルスの調製方法
トウモロコシ形質転換生産システムの最大の人間工学的な負荷であって時間のかかるプロセスは、継代培養の間にカルスを手動によりバラバラにする必要があるアグロバクテリウム媒介形質転換用の胚形成カルスの確立および維持である。さらに、形質転換プロセスの間に、多くの細胞を単一の未熟胚または単一の片のカルスで形質転換する。しかしながら、現在の選択および再生で行っていることは、通常は組織片当たり1の植物を再生する、単一の事象として単一の未熟胚または一片のカルスで形質転換した細胞の各集団を処理している。
【０１２３】
カルス、特にI型カルス、をピンセットによって手動でバラバラにすることにより生まれる人間工学的な負荷を軽減するために、コーヒーグラインダー、ベビーフードミル、コショウの実のグラインダー、ハーブグラインダー、ニンニクカッターおよびガーニッシュナイフのような幾つかの機械的手段を、継代培養用のカルスをバラバラにするかまたは切断するための手段として試験した。これらの手段の中で、ハーブグラインダーおよびガーニッシュナイフが、カルスをバラバラまたは切断するために、および、継代培養および形質転換に適したカルス片を生成するのに最も適することが判明した。
【０１２４】
継代培養用のトウモロコシカルスを調製する機械的手段の使用は、形質転換植物を再生することができ、したがって同一の組織の単位からより多くのトランスジェニック植物を得ることができる小さい単位の個別に形質転換した細胞に、組織を切断またはバラバラにすることによって一定の単位の組織内で多くの形質転換細胞を分離するために使用することもできる。
【０１２５】
本実施例のためのカルスは、授粉約10日後の発達中の穀粒から単離した、カルス培地1074（表3）上で未熟トウモロコシ胚を培養することによって誘導した。5ないし9週齢のカルスをハーブグラインダーで処理し、選択用のnptII遺伝子を運搬するベクターを含むアグロバクテリウムと60分間にのぼり接触させた。接種したカルスはブロット乾燥し、暗所下、23℃にて2−3日間同時培養/乾燥した。ついで、カルス組織を、約50mg/Lのパロモマイシンを含有する液体選択培地1086（表3）中のフェルト片に移し、暗所下27−28℃にて30日にのぼり培養して、nptII選択マーカー遺伝子を含む形質転換組織について選択した。ついで、形質転換組織は、BAPを含有する発芽培地1087（表3）中で選択を生存する組織を16時間の明期下、27-27℃にて培養することによって5-7日間シュートを誘導した。増殖する組織は、さらに2−3週間、培地1067（表3）中でインキュベートして根を誘導した。根を有するかまたは有さない健全なシュートを、培地1067を含有するPhytatrayに移し、その後に成長させるために土壌に移した。
【０１２６】
【表３】
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【０１２７】
結果は、ハーブグラインダーを首尾よく用いて、継代培養および形質転換に好適な片にカルスをバラバラにし得ることを示している（表4）。
【０１２８】
【表４】
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【０１２９】
ガーニッシュナイフ（Pickle Slicer, International Culinary, Mystic, CTからの番号4428）も、手動による継代培養法の人間工学的負荷を軽減するカルスを切断する手段として用いた。ガーニッシュナイフは、プラスチック製ハンドルの末端に結合した8の平行ブレードからなる。ナイフは温和なブリーチにつづいてエタノールに浸漬して滅菌し、ついでほぼ30分間風乾した。ナイフを乾燥している間に、4−週齢のカルス（2週に手動で継代培養）を150×15mmのペトリ皿に入れ、ディッシュ内で3ないし4のより小さな平坦な片に分け、各ディッシュはほぼ40−60のカルス片を含有していた。ある時点にて1の平坦な片を用いて作業し、ナイフを用いてカルスを通して切断した。滅菌した器具を用いて、カルスをブレード間に収集されたカルスをナイフからプレートに押出し、そこでそれを2回切断した。他のカルスの平坦な片を同様にして処理した。切断したカルスを、継代培養および形質転換に用いた。
【０１３０】
幾つかのガーニッシュナイフ実験からのデータは、13.16%の形質転換頻度を示した。さらなる試験において、21.5%の手動で継代培養したカルスの形質転換頻度は、ガーニッシュナイフによって調製したカルス（18.9%）に匹敵した。5の異なる使用者によりカルスを切断する手段としてガーニッシュナイフを用いたいまだ他の74の実験においては、全使用者にわたる平均形質転換頻度は19.4%であり、この方法の有用性を示している。
【０１３１】
実施例９
形質転換用のアグロバクテリウムで外植片を接種する方法
アグロバクテリウム−媒介形質転換の現在の方法、例えば、トウモロコシ未成熟胚の方法では、穀粒からの時点に1の胚を切断し、それをアグロバクテリウム細胞懸濁液中でインキュベートし、アグロバクテリウム懸濁液を除去し、胚を感染を起こす同時培養プレートに移し、胚を方向付け、ついでそれを胚盤の側方に（side up）置き、最後に、選択および再生のようなさらなる操作のための選択または遅延培地に胚を移した。これらの工程の多くは、人間工学的に馴染まず、切断した胚を損傷する可能性があり、アグロバクテリウムに関連する細胞死の発生を増大させ、それによって形質転換頻度が低下する。したがって、人間工学的に馴染み、かつ、より高い形質転換頻度を生じるような、接種工程を単純化する要望がトウモロコシ形質転換の分野において存在する。
【０１３２】
そこで、本発明者らは、１）胚をスパチュラで切断する前にスパチュラをアグロバクテリウム懸濁液に浸し；２）トウモロコシ穂を胚を切断する前にアグロバクテリウム懸濁液に浸漬することによって；または３）例えば、トウモロコシ穂をアグロバクテリウム懸濁液に浸し、つづいてその穂をアグロバクテリウム懸濁液に浸したスパチュラによって切断する2の工程を結合することによって、のいずれかによって、形質転換可能な外植片、例えば、未成熟胚を接種することによって工程の合計数を減少することによって接種工程を単純化した。
【０１３３】
一般的に、以下の形質転換法を用いた。受容トウモロコシ系統からのトウモロコシ胚を授粉10日後の発達中の穀粒から切除し、インキュベーション、浸したスパチュラ（18.0%）または構築物を含むアグロバクテリウムに穂を浸すかのいずれかによって接種した。接種した胚は、同時培養培地1514（表5）上、暗所下、23℃にて約24時間同時培養した。ついで、胚を0.1mMのグリホセートを含有する選択培地1278（表5）上の選択に移して、cp4選択マーカー遺伝子を含む形質転換組織について選択し、500mg/Lのカルベニシリンに移し、暗所下、27℃にて2−3週間インキュベートすることによってアグロバクテリウム増殖を阻害した。ついで、形質転換したトウモロコシ組織を、形質転換したカルス片を第１の再生培地1073（表5）に移し、16時間明期/8時間暗期の照明周期下、27℃にて5−7日間増殖させた。ついで、組織を第2の再生培地1071（表5）にほぼ2週間移した。再生したシュートをPhytatray中の発根培地1084（表5）に移した。発達する幼植物体をついで土壌に移し、27℃、80％湿度、ほぼ1週間低光度の生育チャンバー中で寒気に曝して強くし、ついで温室に移し、標準的な温室条件下で生育した。
【０１３４】
グリホセート選択用の改変CP4 aroA遺伝子（米国特許第5,627,061号）を含むプラスミドpMON92689を運搬するアグロバクテリウムを、実施例7に記載したMS接種培地で作製した凍結ストックから接種用に増殖させた。穂軸上の穀粒を80%エタノールで滅菌し、根頭で切断し、ついで100mlの1/2 MSVIで洗浄し、20mlのアグロバクテリウム懸濁液を適用した。スパチュラをアグロバクテリウム懸濁液に浸し、未成熟胚を切除し、暗所下、23℃にて24時間、同時培養培地1514にプレートした。これらの処理を、胚をある時点で1回切断し、アグロバクテリウム懸濁液と5分間インキュベートする標準的な処理と比較した。胚の大きさは1.5-1.8mmであった。しかしながら、この方法は他の胚の大きさにおいても同様に良好に作用することが判明し、その場合の胚の大きさは1.4ないし2.2mmの範囲であった。トランスジェニック事象は、外植片を母組織にいまだ結合させながら、外植片をアグロバクテリウムで直接的に接種することによっておよびそれを源から離しつつ外植片を接種することによって得られた。以下の形質転換頻度が各処理について得られた：インキュベーションによる接種（20%）；浸したスパチュラによる接種（18.0%）および穂を浸漬することによる接種（17.0%）。
【０１３５】
アグロバクテリウムと外植片を接触させる他の手段および接触の期間は、当業者によって予想され得る。例えば、アグロバクテリウム懸濁液に浸したナイフは葉またはカルス組織をより小さな片に切断することによる接種に用いることができ、浸したニードルは植物組織にニードルを挿入することによる植物組織に用いることができる。
【０１３６】
この方法は、組織の取扱いを減少し、アグロバクテリウムに関連した細胞死を減少することによって形質転換頻度を改善することが判明した。6の異なる構築物を用いて、浸したスパチュラの方法は9.2%のTFを生成する標準的なインキュベーションを超える14.3%の平均TFを生成した。
【０１３７】
【表５】
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【０１３８】
実施例１０
単一の工程による投与接種、同時培養および選択によるトウモロコシのアグロバクテリウム−媒介形質転換
通常、アグロバクテリウム−媒介形質転換法には3の異なる工程が含まれる：アグロバクテリウムによる外植片の接種、抗生物質を含まない培地上での接種した外植片を同時培養させて、アグロバクテリウムを生存させ、外植片の感染を高めること、および、カナマイシンおよびグリホセートのような選択剤を含有する培地上での形質転換した細胞の選択。形質転換法に必要な工程の数を減少させて生産効率を改善する要望が常に存在する。そこで、本発明者らは、トウモロコシのアグロバクテリウム−媒介形質転換の方法を提供し、そこでは、接種した外植片をアグロバクテリウムの増殖を抑制し、非−形質転換外植片細胞を殺すための選択剤を含む培地にプレートすることによって接種、同時培養および選択工程を単一の工程に結合し得、したがって形質転換生産系の効率を改善することができる。
【０１３９】
一般的に、実施例９に開示する形質転換方法を使用した。接種するための、グリホセート選択用の改変CP4 aro4遺伝子（米国特許第5,627,061号）を含むpMON65375を含むアグロバクテリウムは、実施例７に開示したAB最小誘導培地に作製した凍結ストックから調製した。
【０１４０】
各胚を切除する前にアグロバクテリウム懸濁液にスパチュラを浸し、切除した胚を同時培養培地1233、ついで選択培地1278に置き、または、選択培地1278に直接プレートした。結果は、種々のアグロバクテリウム濃度および胚の大きさで、接種、同時培養および選択を単一の工程に結合することによって形質転換を行い得ることを示した。
【０１４１】
もう１の形態において、形質転換は、最初にアグロバクテリウムを適用し、ついで胚を選択培地上で培養するのではなく、最初に胚を選択培地上で培養し、ついで胚に直ちにアグロバクテリウム懸濁液を適用することによっても達成し得る。トランスジェニック植物は、同時培養および選択の間にさらなるアグロバクテリウムを適用することによっても得ることができる。
【０１４２】
実施例１１
SORBAROD上での形質転換細胞の選択およびハイスループットシステムの開発
カルスおよび未成熟胚のような好適な外植片は、当該技術分野で公知の機械的および手動による切断手段を介して得ることができ、当該技術分野において関心のあるいずれかの遺伝子を含むプラスミドを含むアグロバクテリウムで接種することができる。１の形態において、形質転換細胞の選択は液体培地に置いたフェルト片で行い、再生は液体培地に置いたSorbarod（商標）プラグ（Baumgartner Papiers SA, Crissier-Lausanne, Switzerland）上で行う。フェルトとSorbarodとを組み合わせたもう１の培養においては、幾つかの移行工程が削除される。
【０１４３】
トウモロコシ用のハイスループット形質転換システムを開発し、そこでは、標準的な研究室器具に加えて便利なインキュベーターおよび振盪器を含む自由に構成し得る作業台上のロボットアームによって容器を操作する。１またはそれを超えるピペット操作チップを備えた種々の液体操作ツールを用いて、新鮮な培地を供給し、消費した培地を除去する。作業台、ロボットアームおよび液体操作ツールは、コンピュータを介したソフトウェアによって制御される。あるいは、形質転換した細胞を選択および再生するための液体培地を、培地貯蔵容器に連結した１またはそれを超えるチューブを介して容器に供給し、廃棄容器に連結した１またはそれを超えるチューブを介して除去することができる。液体培地の供給および除去は、手動または機械的に制御する。
【０１４４】
【表６】
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【０１４５】
参考文献
例示的な手順または明細書に記載した参考文献を補足する他の詳細を提供する葉にで以下の参考文献は出典明示して本明細書の一部とみなす。
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米国特許第 5,362,865号
米国特許第 5,569,834号
米国特許第 5,106,739号
米国特許第 5,107,065号
米国特許第 5,627,061号
米国特許第 5,633,435号
米国特許第6,506,559号
米国特許出願公開2002/0168707
米国特許出願公開2004/0244075
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