(57)【要約】本発明は、慢性的アルコール摂取によって生じる脳疾患または脳損傷を、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）アゴニストを投与することによって、治療するため、予防するため、または回復させるための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物におけるアルコール誘発性脳疾患を治療するため、予防するため、または回復させるための方法であって、該動物にペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）アゴニストの治療的有効量を投与する段階を含む方法。
【請求項２】
動物における慢性的アルコール摂取によって生じる脳損傷を治療するため、予防するため、または回復させるための方法であって、該動物にPPARアゴニストの治療的有効量を投与する段階を含む方法。
【請求項３】
脳損傷が酸化ストレスと関連している、請求項2記載の方法。
【請求項４】
脳損傷が脂質過酸化と関連している、請求項2記載の方法。
【請求項５】
脳損傷がDNA損傷と関連している、請求項2記載の方法。
【請求項６】
動物における慢性的アルコール摂取によって生じる認知障害を治療するため、予防するため、または回復させるための方法であって、該動物にPPARアゴニストの治療的有効量を投与する段階を含む方法。
【請求項７】
慢性的アルコール摂取によって生じる、動物の脳におけるインスリン抵抗性を治療するため、予防するため、または回復させるための方法であって、該動物にPPARアゴニストの治療的有効量を投与する段階を含む方法。
【請求項８】
親による慢性的アルコール摂取によって胎児動物の脳に生じる脳損傷を治療するため、予防するため、または回復させるための方法であって、該動物または該親にPPARアゴニストの治療的有効量を投与する段階を含む方法。
【請求項９】
PPARアゴニストがPPAR-α選択的アゴニストである、請求項1、2、6、7および8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
PPARアゴニストがPPAR-γ選択的アゴニストである、請求項1、2、6、7および8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
PPARアゴニストがPPAR-δ選択的アゴニストである、請求項1、2、6、7および8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
慢性的アルコール摂取量が平均で少なくとも約0.1gの純アルコール／kg／日である、請求項2、6、7および8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
慢性的アルコール摂取量が平均で少なくとも約0.5gの純アルコール／kg／日である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
慢性的アルコール摂取量が平均で少なくとも約1gの純アルコール／kg／日である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
Long-Evansラットにエタノールを慢性的に与えることによって作製したアルコール誘発性脳損傷または脳疾患の動物モデル。
【請求項１６】
エタノールが毎日の食餌のカロリー含有量の約37％を構成する、請求項15記載の動物モデル。
【請求項１７】
請求項15記載の動物モデルに作用物質（agent）を投与する段階、ならびに作用物質を投与されていない対照動物におけるレベルと比較して、脳損傷、認知障害および／またはインスリン抵抗性のレベルを決定する段階を含む、アルコール誘発性脳損傷または脳疾患の治療、予防または回復のために有用である可能性のある作用物質に関するスクリーニングのための方法であって、作用物質を投与されていない対照動物におけるレベルと比較した際の脳損傷、認知障害および／またはインスリン抵抗性のレベルにおける改善により、その作用物質がアルコール誘発性脳損傷または脳疾患の治療、予防または回復のために有用である可能性があることが示される方法。
【請求項１８】
請求項15記載の動物モデルに可能性のある治療を施す段階、ならびに可能性のある治療を施されていない対照動物におけるレベルと比較して脳損傷、認知障害および／またはインスリン抵抗性のレベルを決定する段階を含む、アルコール誘発性脳損傷または脳疾患のための可能性のある治療を試験するための方法であって、可能性のある治療を施されていない対照動物におけるレベルと比較した際の脳損傷、認知障害および／またはインスリン抵抗性のレベルにおける改善により、その治療がアルコール誘発性脳損傷または脳疾患の治療、予防または回復のために有効である可能性があることが示される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、薬物療法の分野にある。詳細には、本発明は、慢性的アルコール摂取またはアルコールに対する胎児期曝露によって生じる脳疾患または脳損傷を、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）アゴニストを投与することによって治療するため、予防するため、または回復させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
アルコール依存および乱用は世界中で最も費用のかかる医療上の問題の一つであり、それらの影響は、女性および若年者全般における過剰飲酒の発生率が増加しているため、増大し続けている。過度の飲酒は認知機能障害および脳に対する永続的な構造的損傷を引き起こす恐れがある。ウェルニッケ-コルサコフ症候群は、アルコールに伴う神経変性の最も廃疾性が高く臨床的に重大な形態の一つであるが、その病因の大部分は予防可能であるチアミン欠乏症に関係している。これとは対照的に、認知障害および運動障害をもたらす、白質縮小、脳室拡大、小脳変性、ならびに上前頭連合皮質、前帯状領域および視床下部の内部でのニューロン損失を含む、より有病率の高いアルコール関連脳病変の発生病理は明らかになっていない。
【０００３】
中枢神経系（CNS）において、認知機能および運動機能を維持するために決定的に重要なニューロンの生存、エネルギー代謝および可塑性は、インスリンならびにインスリン様成長因子（IGF）I型およびII型の作用を通じて調節される。インスリン、IGF-IおよびIGF-IIならびにそれらの対応する受容体は、ニューロンを含む、脳の全体にわたるさまざまな細胞種において大量に発現される（Goodyer et al., Endocrinology 114:1187 (1984)；Gammeltoft et al., Biochimie 67:1147 (1985)；Hill et al.,Neuroscience 17:1127 (1986)）。インビトロおよびインビボでの実験から、CNSニューロンにより利用されるインスリンおよびIGFシグナル伝達経路は、肝臓などの末梢臓器で特徴づけらているものと事実上同一であることが実証されている。脳内でのインスリンおよびIGFのポリペプチドおよび受容体の遺伝子発現の最も高いレベルは視床下部、側頭葉および小脳に分布しており、これらは特筆すべきことにエタノール神経毒性の主要標的である。
【０００４】
未成熟脳に関する研究により、PI3キナーゼ-Akt経路を経由する下流での（Zhang et al., J. Neurochem. 71:196 (1998)；de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 58:1950 (2001)；de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 59:882 (2002)；Ramachandran et al., Alcohol Clin. Exp. Res. 25:862 (2001)）、インスリンおよびIGFシグナル伝達のエタノール性阻害（Zhang et al., J. Neurochem. 71:196 (1998)；de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 58:1950 (2001)；de la Monte et al., Alcohol Clin. Exp. Res. 24:716 (2000)；Hallak et al., Alcohol Clin. Exp. Res. 25:1058 (2001)）は、アポトーシスの増加（Ikonomidou et al., Science 287:1056 (2000)；Zhang et al., J. Neurochem. 71:196 (1998)；de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 58:1950 (2001)）およびミトコンドリア機能障害（de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 58:1950 (2001)；de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 59:882 (2002)；Ramachandran et al., Alcohol Clin. Exp. Res. 25:862 (2001)）をもたらすことが示されている。脳内でのインスリンシグナル伝達のエタノール性阻害は、インスリン欠乏およびインスリン／IGF抵抗性によって媒介される（Soscia et al., Cell. Mol. Life Sci., 近刊 (2006)）。エタノール誘発性インスリン／IGF抵抗性は、対応する受容体に対するリガンド結合障害、受容体チロシンキナーゼの活性化の低下、および細胞生存経路を経由する下流でのシグナル伝達の低下により顕在化する。しかし、成人脳でのインスリンおよびIGFシグナル伝達機構に対する慢性的エタノール乱用の影響についてはほとんどわかっていない。
【０００５】
発達過程におけるエタノール曝露は、欧州および北米における精神遅滞の予防可能な原因のうち主要なものである。妊娠中のエタノールに対する高度または慢性的な曝露は、小頭症、大脳白質体積の減少、脳室拡大、小脳形成不全および神経細胞遊走障害といったCNS奇形を含む、多岐にわたる神経学的および全身性病変を範囲に含む胎児アルコール症候群（FAS）を引き起こす（Clarren et al., J. Pediatr. 92:64 (1978)；Mattson et al., Alcohol Res. Health 25:185 (2001)）。しかし、より低レベルのエタノール曝露によって生じるヒトCNS疾患の全体像については、正確な臨床病理学的な相関データがないため、非常にわずかしかわかっていない。FASの実験モデルは、妊娠中のエタノールに対する曝露がニューロンの生存、成長、遊走、シナプス形成、成熟、神経伝達物質機能および細胞内接着を障害させることを実証することにより、エタノール誘発性CNS異常の範囲に関する識見を与えている（Maier et al., Alcohol 23:49 (2001)；Minana et al., J. Neurochem. 75:954 (2000)；Olney et al., Apoptosis 5:515 (2000)；Swanson et al., Alcohol Clin. Exp. Res. 19:1252 (1995)；Yanni et al., Brain Res. Dev. Brain Res. 120:233 (2000)；Liesi et al., J. Neurosci. Res. 48:439 (1997)）。さらに、FASの実験モデルは、エタノールが、発達中のCNSに対して、比較的短い期間または低レベルの曝露の後であっても神経毒性作用を及ぼしうるという証拠も与えている（Maier et al., Alcohol 23:49 (2001)）。このため、ヒトに関して、低レベルまたは中等度レベルの子宮内エタノール曝露は、発達中の脳に対して著しい有害作用を及ぼす恐れがあり、注意欠陥／多動障害の発生率が増加している原因である可能性もあるという懸念がある（O'Malley et al., Can. J. Psychiatry 47:349 (2002)；Burd et al., Neurotoxicol. Teratol. 25:697 (2003)；Burd et al., Neurotoxicol. Teratol. 25:681 (2003)）。
【０００６】
ニューロンの発生、分化および遊走は、妊娠中のエタノールに対する曝露によって擾乱を受ける可能性の高い、決定的に重要な継続的プロセスである。発達中のCNSでは、インスリン受容体、IGF-I受容体およびIGF-II受容体が大量に発現され（Goodyer et al., Endocrinology 114:1187 (1984)；Gammeltoft et al., Biochimie 67:1147 (1985)；Hill et al., Neuroscience 17:1127 (1986)）、それらの対応する増殖因子はニューロンの成長、生存、エネルギー代謝およびシナプス形成を媒介する。加えて、インスリンおよびIGFシグナル伝達機構が、未成熟CNSにおけるエタノール媒介性神経毒性の鍵となる標的であるという証拠も増しつつある（Zhang et al., J. Neurochem. 71:196 (1998)；de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 58:1950 (2001)；de la Monte et al., Alcohol Clin. Exp. Res. 24:716 (2000)；Hallak et al., Alcohol Clin. Exp. Res. 25:1058 (2001)）。エタノール誘発性小頭症に伴うニューロン損失は、インスリン／IGF-Iにより刺激される生存シグナル伝達の阻害（Zhang et al., J. Neurochem. 71:196 (1998)；de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 58:1950 (2001)；de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 59:882 (2002)；Ramachandran et al., Alcohol Clin. Exp. Res. 25:862 (2001)）、ならびにそれに付随するアポトーシス増加（Zhang et al., J. Neurochem. 71:196 (1998)；de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 58:1950 (2001)；Ikonomidou et al., Science 287:1056 (2000)）およびミトコンドリア機能障害（de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 58:1950 (2001)；de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 59:882 (2002)；Ramachandran et al., Alcohol Clin. Exp. Res. 25:862 (2001)；de la Monte et al., Alcohol Clin. Exp. Res. 25:898 (2001)）によって媒介される。
【０００７】
発達中の脳におけるエタノール障害性インスリン／IGFシグナル伝達の機序を解明するためにデザインされた最近の研究により、比較的高レベルのエタノールに対する妊娠中の慢性的な曝露は、インスリン遺伝子の発現を阻害するが、インスリン受容体およびIGF-I受容体の発現の変化はわずかしか生じさせないことが示されている（de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 62:1131 (2005)）。そのような結果は、エタノールに曝露された発達中の脳における細胞損失が脳由来インスリンの局所的欠乏によって媒介される可能性を示唆するが、外因性成長因子による刺激後のインスリンおよびIGF-I受容体チロシンキナーゼ活性のレベル低下という所見は、そのほかの異常もCNS発達の障害の一因になることを示唆する。さらに、インビトロ実験により、エタノールによってIGF-IおよびIGF-IIの発現は阻害されるがインスリン受容体の発現は阻害されず、それでもなおインスリンおよびIGF-Iにより刺激されるグルコース取り込みおよびATP合成は同様に障害されることが実証されている（de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 62:1131(2005)）。このため、エタノールがインスリンおよびIGF-Iの応答性に有害な影響を及ぼす機序についてはさらに検討が必要である。
【発明の概要】
【０００８】
アルコール誘発性脳損傷とインスリン抵抗性との関係は、慢性的にアルコールを摂取した動物の脳内およびアルコールに曝露された胎児動物の脳内でのインスリン応答障害およびインスリン／IGF経路の変化という所見によって実証されている。これらの所見は、成体におけるアルコール誘発性脳損傷および胎児アルコール症候群（FAS）の両者と、治療目的に利用しうる可能性のあるインスリン／IGFシグナル伝達経路とのつながりを明確にするものである。
【０００９】
本発明は、アルコール誘発性脳損傷の動物モデルを用いた、ある種のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）アゴニストの投与が脳内の酸化ストレスおよびDNA損傷を著しく抑制するという驚くべき発見に関する。その正味の効果は、エタノールによって生じる継続的な脳損傷を減弱させること、または予防することである。本発明は、アルコールに関連した成体および胎児脳損傷の治療のために大きな意味を有する。
【００１０】
したがって、本発明の1つの局面は、動物におけるアルコール誘発性脳疾患を治療するため、予防するため、または回復させるための方法であって、前記動物にPPARアゴニストの治療的有効量を投与する段階を含む方法を対象とする。
【００１１】
本発明のもう1つの局面は、動物において慢性的アルコール摂取によって生じる脳損傷を治療するため、予防するため、または回復させるための方法であって、前記動物にPPARアゴニストの治療的有効量を投与する段階を含む方法を対象とする。
【００１２】
1つの態様において、本発明は、動物における慢性的アルコール摂取によって生じる認知障害を治療するため、予防するため、または回復させるための方法であって、前記動物にPPARアゴニストの治療的有効量を投与する段階を含む方法に関する。
【００１３】
1つの態様において、本発明は、慢性的アルコール摂取によって生じる、動物の脳におけるインスリン抵抗性を治療するため、予防するため、または回復させるための方法であって、前記動物にPPARアゴニストの治療的有効量を投与する段階を含む方法に関する。
【００１４】
1つのさらなる態様において、本発明は、親による慢性的アルコール摂取によって胎児動物の脳に生じる脳損傷を治療するため、予防するため、または回復させるための方法であって、前記動物または前記親にPPARアゴニストの治療的有効量を投与する段階を含む方法に関する。
【００１５】
驚いたことに、PPARアゴニストが、慢性エタノール摂取動物における脳損傷の治療および予防のために特に有効であることが発見された。このため、慢性的な飲酒者であるか、誘発性脳損傷もしくは脳疾患に罹患しているヒト対象にPPARアゴニストを投与することで、さらなる脳損傷が予防または緩徐化される、および脳損傷または脳疾患の症状が治療または寛解される可能性があると予想される。さらに、慢性的な飲酒者である妊娠女性にPPARアゴニストを投与することで、胎児に対するさらなる脳損傷が予防または緩徐化される、または胎児が示す脳損傷または脳疾患の症状が治療または寛解される可能性もあると予想される。
【００１６】
本発明はさらに、Long-Evansラットにエタノールを慢性的に与えることによって作製したアルコール誘発性脳損傷および脳疾患の動物モデルを提供する。驚いたことに、Long-Evansラットは他のラット系統と比較して、エタノールを与えることに対して強い応答を示すことが発見され、これにより、このラットは慢性的アルコール摂取の影響の試験のために理想的に適するものとされた。1つの態様において、エタノールはLong-Evansラットの毎日の食餌中に含められる。例えば、エタノールは、毎日の食餌の約0％、2％、4.5％、6.5％、9.25％（v／v）（カロリー含有量の0％、8％、18％、26％または37％に相当）またはそれ以上を構成する。
【００１７】
本発明はさらに、Long-Evansラットにエタノールを慢性的に与えることによって作製した動物モデルに作用物質（agent）を投与する段階、ならびに作用物質を投与されていない対照動物におけるレベルと比較して、脳損傷、認知障害および／またはインスリン抵抗性のレベルを決定する段階を含む、アルコール誘発性脳損傷または脳疾患の治療、予防または回復のために有用である可能性のある作用物質に関するスクリーニングのための方法であって、作用物質を投与されていない対照動物におけるレベルと比較した際の脳損傷、認知障害および／またはインスリン抵抗性のレベルにおける改善により、その作用物質がアルコール誘発性脳損傷または脳疾患の治療、予防または回復のために有用である可能性があることが示される方法に関する。
【００１８】
本発明はさらに、Long-Evansラットにエタノールを慢性的に与えることによって作製した動物モデルに可能性のある治療を施す段階、ならびに可能性のある治療を施されていない対照動物におけるレベルと比較して脳損傷、認知障害および／またはインスリン抵抗性のレベルを決定する段階を含む、アルコール誘発性脳損傷または脳疾患の治療、予防または回復のための、可能性のある治療を試験するための方法であって、可能性のある治療を施されていない対照動物におけるレベルと比較した際の脳損傷、認知障害および／またはインスリン抵抗性のレベルにおける改善により、その治療がアルコール誘発性脳損傷または脳疾患の治療、予防または回復のために有効である可能性があることが示される方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1A〜1Hは、慢性的にエタノールを与えることが、成体ラットにおける小脳変性を引き起こすことを示している（対照：A、C、E、G；37％エタノール食：B、D、F、H）。A〜D：ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した組織切片。E、F：脂質過酸化を検出するためにHNEに対するモノクローナル抗体で免疫染色した隣接切片。G、H：DNA損傷を検出するために8-OHdGに対するモノクローナル抗体で免疫染色した隣接切片。A、B：弱拡大（100×）の像は、小脳皮質の細胞構築に対するエタノールの影響を示している（矢印はプルキンエ細胞層を指し示している；ML＝分子層；GC＝顆粒細胞層；wm＝白質）。C、D：より強拡大（450×）の像は、顆粒細胞層の内部でのエタノールに伴う細胞密度の低下を示している。
【図２】図2A〜2Hは、エタノール摂取成体ラットの海馬および側頭皮質における脂質過酸化およびDNA損傷の増加を示している（対照：A、C、E、G；37％エタノール食：B、D、F、H）。A〜F：脂質過酸化を検出するためにHNEに対するモノクローナル抗体で免疫染色した組織切片。G、H：DNA損傷を検出するために8-OHdGに対するモノクローナル抗体で免疫染色した組織切片。A、B：海馬の歯状領域（CA4）におけるHNE免疫反応性。C、D：海馬体のアンモン角のCA1領域におけるHNE免疫反応性。エタノール摂取ラットの脳内での錐体ニューロンの標識に注目されたい。E、F：海馬に隣接する側頭皮質におけるHNE免疫反応性。G、H：海馬に隣接する側頭皮質における8-OHdG免疫反応性。
【図３】図3A〜3Lは、慢性的エタノール曝露後の脳細胞集団における病的変移を示している。細胞特異的な遺伝子発現を、側頭皮質（A、D、G、J）、視床下部（B、E、H、K）および小脳（C、F、I、L）の試料において測定した。Huニューロン性RNA結合タンパク質（A〜C）、ミエリン結合糖タンパク質-1（D〜F）、アストロサイトグリア酸性線維素タンパク質（G〜I）およびエンドセリン-1（J〜L）に対応するmRNA転写物のレベルを、脳細胞種における病的変移を検出するために用いた。グラフは結果の平均±S.D.を表している。データはスチューデントのt検定を用いて統計学的に分析した。有意なP値は棒グラフの上に表示されている。
【図４】図4A〜4Iは、慢性的にエタノールを与えた成体雄性ラットの脳におけるインスリン、IGF-IおよびIGF-II遺伝子発現の変化を示している。インスリン（A〜C）、IGF-I（D〜F）およびIGF-II（G〜I）に対応するmRNA転写物のレベルを、側頭皮質（A、D、G）、視床下部（B、E、H）および小脳（C、F、I）で測定した。グラフは結果の平均±S.D.を表している。データはスチューデントのt検定を用いて統計学的に分析した。有意なP値は棒グラフの上に表示されている。
【図５】図5A〜5Iは、慢性的にエタノールを与えた成体雄性ラットの脳におけるインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体遺伝子発現の変化を示している。インスリン受容体（A〜C）、IGF-IR（D〜F）およびIGF-IIR（G〜I）に対応するmRNA転写物のレベルを、側頭皮質（A、D、G）、視床下部（B、E、H）および小脳（C、F、I）で測定した。グラフは結果の平均±S.D.を表している。データはスチューデントのt検定を用いて統計学的に分析した。有意なP値は棒グラフの上に表示されている。
【図６】図6A〜6Iは、慢性的にエタノールを与えることが脳におけるインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体結合を減じさせることを示している。平衡結合アッセイを、側頭皮質（A、C、E）、視床下部（B、D、F）または小脳膜（C、F、I）からのタンパク質抽出物に対して行った。グラフは、インスリン（A〜C）、IGF-I（D〜F）およびIGF-II（G〜I）に特異的な結合に関する結果の平均±S.D.を表している。データはスチューデントのT検定を用いて統計学的に分析した。有意なP値は棒グラフの上に表示されている。
【図７】図7A〜7Fは、アセチルコリン恒常性に対する、慢性的にエタノールを与えることの影響を示している。コリンアセチルトランスフェラーゼ（A〜C）およびアセチルコリンエステラーゼ（D〜F）のmRNA転写物を、対照ラットおよび慢性的エタノール摂取ラットの側頭皮質（A、D）、視床下部（B、E）および小脳（C、F）で測定した。グラフは結果の平均±S.D.を表している。データはスチューデントのt検定を用いて統計学的に分析した。有意なP値は棒グラフの上に表示されている。
【図８】図8A〜8Fは、慢性的アルコール依存患者の脳におけるインスリン、IGF-IおよびIGF-II遺伝子発現の変化を示している。インスリン（A、B）、IGF-I（C、D）およびIGF-II（E、F）のmRNA転写物の、帯状回（A、C、E）および小脳虫部（B、D、F）での発現レベルを測定した。グラフは、1群当たり6例の対象からの結果の平均±S.D.を表している。データはスチューデントのt検定を用いて統計学的に分析した。有意なP値は棒グラフの上に表示されている。
【図９】図9A〜9Fは、慢性的アルコール依存患者の脳におけるインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体遺伝子の発現の変化を示している。インスリン受容体（A、B）、IGF-I受容体（C、D）およびIGF-II受容体（E、F）のmRNA転写物の、帯状回（A、C、E）および小脳虫部（B、D、F）での発現レベルを測定した。グラフは、各群当たり6例の対象からの結果の平均±S.D.を表している。データはスチューデントのT検定を用いて統計学的に分析した。有意なP値は棒グラフの上に表示されている。
【図１０】図10A〜10Fは、インスリン受容体基質（IRS）遺伝子の発現に対する慢性的アルコール乱用の影響を示している。IRS-1（A、B）、IRS-2（C、D）およびIRS-4（E、F）のmRNA転写物の帯状回（A、C、E）および小脳虫部（B、D、F）での発現レベルを測定した。グラフは、各群当たり6例の対象からの結果の平均±S.D.を表している。データはスチューデントのT検定を用いて統計学的に分析した。有意なP値は棒グラフの上に表示されている。
【図１１】図11A〜11Fは、慢性的アルコール乱用が、ヒト脳におけるインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体結合を減じさせることを示している。平衡結合アッセイを、帯状回（A、C、E）または小脳（B、D、F）からの膜タンパク質抽出物に対して行った。グラフは、インスリン（A、B）、IGF-I（C、D）およびIGF-II（E、F）に特異的な結合に関する結果の平均±S.D.を表している。データはスチューデントのT検定を用いて統計学的に分析した。有意なP値は棒グラフの上に表示されている。
【図１２】図12A〜12Dは、アセチルコリン恒常性に対する慢性的アルコール乱用の影響を示している。コリンアセチルトランスフェラーゼ（A、B）およびアセチルコリンエステラーゼ（C、D）のmRNA転写物の帯状回（A、C）および小脳虫部（B、D）での発現レベルを測定した。グラフは、各群当たり6例の対象からの結果の平均±S.D.を表している。データはスチューデントのT検定を用いて統計学的に分析した。有意なP値は棒グラフの上に表示されている。
【図１３】図13A〜13Oは、小脳発達に対する、妊娠中の種々のレベルのエタノールに対する慢性的な曝露の影響を示している。妊娠した雌親に対して、カロリー含有量にして0％（対照；A〜C）、8％（D〜F）、18％（G〜I）、26％（J〜L）もしくは37％（M〜O）のエタノール、または0％、2％、4.5％、6.5％もしくは9.25％v／vのエタノールを含むLieber-DiCarli等カロリー液体飼料を与えた。脳の組織切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した（A、B、D、E、G、H、J、K、M、N）。弱拡大像は、皮質層構造の小葉（foliation）および境界線（delineation）を含む、小脳皮質の構造に対するエタノールの影響を示すために用いた（A、D、G、J、M；画像の上側または右側に沿った矢印は外顆粒細胞層を指し示しており、画像の左または下から伸びている矢印は内顆粒細胞層の内帯を示している；スケールバー＝60μm）。より強拡大の像（B、E、H、K、N；スケールバー＝40μm）は、内顆粒細胞層の内部の細胞の相対密度を示している。HおよびNにおける矢印は、凝縮した濃縮核を示している。DNA損傷を検出するために、隣接組織切片を一本鎖（ニック入りまたは断片化）DNAに対する抗体で免疫染色した（C、F、I、L、O）。一本鎖DNAに対する核の免疫反応性に注目されたい（スケールバー＝25μm）。
【図１４】図14A〜14Eは、妊娠中のエタノールに対する慢性的な曝露後の小脳細胞集団における病的変移を示している。（A）ニューロン（Hu）、（B）オリゴデンドログリア（ミエリン結合糖タンパク質-1）,（C）アストロサイト（グリア酸性線維素タンパク質）、（D）ミクログリア（アログラフト炎症因子-1）および（E）内皮細胞（エンドセリン-1）に対応するmRNAの発現を決定した。グラフは、各群当たり12匹のラット仔からの小脳組織における遺伝子発現の平均±S.E.M.レベルを表している。群間比較はpost-hoc Tukey-Krammer有意性検定を伴うANOVAを用いて行った。対照と比較して有意なP値は、バーの上に、または星印（*P＜0.05）で表示されている。
【図１５】図15A〜15Hは、成長因子遺伝子および成長因子受容体遺伝子の小脳発現に対する、妊娠中の種々のレベルのエタノールに対する慢性的な曝露の影響を示している。インスリン（A）、インスリン受容体（B）、IGF-I（C）、IGF-IR（D）、IGF-II（E）およびIGF-IIR（F）のmRNA転写物に対応する遺伝子発現、ならびに18S（G）および28S（H）リボソームRNAを、各群当たり9匹のラット仔からの小脳組織を用いて測定した。データは、Tukey-Kramer post-hoc有意性検定を伴うANOVAを用いて統計学的に分析した。対照と比較して有意なP値は、バーの上に、または星印（*P＜0.05）で表示されている。
【図１６】図16A〜16Bは、コリンアセチルトランスフェラーゼ（A）およびアセチルコリンエステラーゼ（B）の小脳発現に対するエタノールの用量効果を示している。遺伝子発現は、各群当たり10匹のラット仔からの小脳組織を用いて測定した。Tukey-Kramer post-hoc有意性検定を伴うANOVAを用いて統計学的に分析した。対照と比較して有意なP値は、バーの上に表示されている。
【図１７】図17A〜17Fは、インスリン（A）、IGF-I（B）およびIGF-II（C）受容体結合、ならびにインスリン、IGF-IおよびIGF-IIにより刺激されたATP（D）、ChAT（E）およびAChE（F）のレベルに対する、インビトロでの短期的なエタノール曝露の影響を示している。グラフは、特異的に結合したリガンドのfmol／mg値の平均±S.E.M.を表している。データはスチューデントのT検定を用いて統計学的に分析した。有意なP値は棒グラフの上に表示されている。16個のミクロ培養物から生成されたATP、ChATおよびAChEに関するデータ（秒当たりカウント；CPS）を平均し、代表的な結果をグラフ表示している（平均±S.E.M.）。結果は、Tukey-Kramer post-hoc有意性検定を伴うANOVAを用いて統計学的に分析した。対照群の対応する培養物と比較して有意なP値をバーの上に表示しており、同じ群の非刺激対照と比較した際の有意差は星印（*P＜0.05またはより勝る）によって表示されている。
【図１８】図18A〜18Fは、エタノール曝露後のインスリン受容体およびIGF受容体結合ならびにシグナル伝達の障害と関連した膜コレステロール含有量の減少について考えられる役割を示している。（A）対照およびエタノール曝露させたラット仔の小脳膜（各群当たりの仔の数N＝8）ならびに（B）小脳ニューロン培養物のタンパク質抽出物におけるコレステロール含有量を測定した。成長因子の結合に対するコレステロール枯渇または補充の影響を明らかにするために、対照およびエタノール曝露させた小脳ニューロン培養物を媒体、ロック緩衝液中にある10mMメチル-β-シクロデキストリン（MβCD）または10mMコレステロールとともに37℃で3時間インキュベートした。細胞を（C）膜コレステロール含有量、およびインスリン受容体（D）、IGF-I受容体（E）またはIGF-II受容体（F）に対する平衡結合（fmol／mgタンパク質）に関して分析した。グラフは結果の平均±S.E.M.を表している。データは、post-hoc Tukey-Kramer有意性検定を伴うANOVAを用いて分析した。媒体処置対照（群内）と比較した際の有意なP値は、星印（*P＜0.05またはより勝る）によって表示されている。有意な群間（対照と対応するエタノール処置との比較）差は、バーの上の横線によって表示されている。
【図１９】図19A〜19Lは、96ウェルプレートに播いた対照およびエタノール曝露（50mMで96時間）初代小脳ニューロン培養物における、基礎的な、およびインスリン、IGF-IまたはIGF-IIによる刺激下での、ニューロン生存度（A〜C）、ATP含有量（D〜F）、ChAT（G〜I）およびAChE（J〜L）の発現に対する、MβCDまたはコレステロール処置の影響を示している。対照細胞およびエタノール曝露細胞を媒体（A、D、G、J）、ロック緩衝液中にある10mM MβCD（B、E、H、K）または10mMコレステロール（C、F、I、L）により37℃で3時間処置し、続いて媒体（VEH）、無血清培地中にある10nMインスリン（IN）、10nM IGF-Iまたは25nM IGF-IIで12時間にわたり刺激した。各アッセイについて複数の培養物（N＝24）を繰り返し分析した。グラフは結果の平均±S.E.M.を表している。データは、post-hoc Tukey-Kramer有意性検定を伴うANOVAを用いて分析した。*各条件に関する対照細胞とエタノール曝露細胞との比較でP＜0.05またはより勝る。+対応する媒体処置細胞との群内比較でP＜0.05またはより勝る。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、アルコール誘発性脳損傷および脳疾患およびFASの発生においてインスリン抵抗性の増大が果たす重要な役割、ならびにPPARアゴニストが脳損傷を予防または治療する能力に関する。アルコールを慢性的に経口摂取した動物に対するPPARアゴニストの投与は、酸化ストレス（例えば、脂質過酸化）およびDNA損傷に起因する損傷を含むアルコール摂取に応じて起こる脳損傷を軽減または予防する。このため、本発明は、動物におけるアルコール誘発性脳疾患を治療するため、予防するため、または回復させるための方法であって、前記動物にPPARアゴニストの治療的有効量を投与する段階を含む方法に関する。
【００２１】
本発明のもう1つの局面は、動物における慢性的アルコール摂取によって生じる脳損傷を治療するため、予防するため、または回復させるための方法であって、前記動物にPPARアゴニストの治療的有効量を投与する段階を含む方法に関する。
【００２２】
1つの態様において、本発明は、慢性的アルコール摂取によって生じる、動物の脳におけるインスリン抵抗性を治療するため、予防するため、または回復させるための方法であって、前記動物にPPARアゴニストの治療的有効量を投与する段階を含む方法に関する。
【００２３】
1つのさらなる態様において、本発明は、親による慢性的アルコール摂取によって胎児動物の脳に生じる脳損傷を治療するため、予防するため、または回復させるための方法であって、前記動物にPPARアゴニストの治療的有効量を投与する段階を含む方法に関する。
【００２４】
「アルコール誘発性脳損傷または脳疾患」という用語は、本明細書で用いる場合、エタノール摂取によって引き起こされる脳内での多様な臨床的な病的変化のことを指す。そのような病態には、白質縮小、脳室拡大、小脳変性、ならびに上前頭連合皮質、前帯状領域および視床下部の内部でのニューロン損失が含まれ、これらは認知障害および運動障害、胎児アルコール症候群、小頭症、小脳形成不全およびニューロン遊走障害をもたらす。
【００２５】
「慢性的アルコール摂取」という用語は、本明細書で用いる場合、動物による、体重1kg当たり1日当たりで平均で少なくとも約0.1gの、例えば、平均で少なくとも約0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4または5g／kg／日の、純アルコール（エタノール）の消費のことを指す。ヒトの場合、慢性的アルコール摂取量は、体重1kg当たり1日当たりで平均で少なくとも約10gの、例えば、平均で少なくとも約20、30、40、50、60、70、80、90または100g／日の、純アルコールとみなされる。
【００２６】
「治療的有効量」という用語は、本明細書で用いる場合、障害の1つもしくは複数の症状の寛解をもたらす、または障害の進展を予防する、または障害の後退を引き起こす、治療薬（therapeutic agent）の量のことを指す。例えば、脳損傷の治療に関しては、1つの態様において、治療的有効量は、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも100％、損傷を受ける脳細胞の数を減少させるか、損傷を受ける脳細胞の数の増加の速度を緩徐化する、治療薬の量を指すと考えられる。
【００２７】
1つのさらなる態様において、治療的有効量は、脳の生物学的機能を少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも100％増大させる治療薬の量を指すと考えられる。脳機能は、脳波（例えば、脳波記録法による）または認知能力の測定を非限定的に含む、臨床医学において慣行的なアッセイを用いて測定することができる。認知的行動は、いくつかの検査のうち任意のものを用いて測定することができる（Gershon et al., Clinical Evaluation of Psychotropic Drugs: Principles and Guidelines, Prien and Robinson (eds.), Raven Press, Ltd., New York, 1994, p. 467を参照）。そのような検査の一つであるBCRSは、認知機能：すなわち集中、近時記憶、過去の記憶、見当識、生活機能（functioning）およびセルフケアのみを測定するようにデザインされている。認知障害の評価のために最も高い頻度で用いられている手段は、ミニメンタルステートテスト（MMSE）である（Cockrell, J.R., et al., Psychopharmacology 1988; 24:689-692, Crumb, R.M., et al., JAMA 1993; 269:2386-2391を参照）。MMSEは、記憶、場所および時間についての見当識、名前の呼称（naming）、読み、模写（視空間構成）、書き、および三段階の命令に従う能力に関する尺度を含む。MMSEでの24ポイント未満のスコアは認知障害を意味するものと一般に認められている。Blessedの情報・記憶・集中評価票（Blessed Information Memory Concentration instrument）（Blessed, G., et al., Br. J. Psychiatry 1968; 114:797-811）は、主として見当識、記憶および集中について評価する。Blessedの見当識・記憶・集中評価票（Blessed Orientation Memory Concentration instrument）（Katzman, R., et al., Am. J. Psychiatry 1983; 140:734-739）は、時間についての見当識、短い語句の想起、逆算する能力および月の名前を逆の順に暗唱する能力を判定する。精神状態簡易検査（Short Test of Mental Status）（Kokmen, E., et al., Mayo Clin. Proc., 1987; 62(4):281-289）は、見当識、注意、想起、集中、抽象化、時計描画および模写について評価する。機能的活動質問票（Functional Activities Questionnaire）（Pfeffer, R.I., et al., J. Gerontol. 1982; 37:323-329）は、被験者の家族または友人からの回答を利用して、障害を受けている可能性のある機能的活動について評価する。
【００２８】
1つのさらなる態様において、治療的有効量は、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも100％、脳の構造を改善するか脳の構造の変性を緩徐化する、治療薬の量を指すと考えられる。脳の構造は、磁気共鳴画像法、コンピュータ体軸断層撮影、単光子放出コンピュータ断層撮影、ポジトロン放出断層撮影、X線および超音波を非限定的に含む、臨床医学において慣行的な画像化手法を用いて決定することができる。
【００２９】
1つの追加的な態様において、治療的有効量は、脳におけるインスリン抵抗性を少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも100％低下させる治療薬の量を指すと考えられる。インスリン抵抗性は、当技術分野で慣行的なアッセイおよび本明細書で考察したものを用いて測定することができ、これにはインスリン受容体に対するインスリンの結合、耐糖能検査およびインスリン応答性遺伝子の発現の測定が非限定的に含まれる。
【００３０】
「予防する」、「予防すること」および「予防」という用語は、本明細書で用いる場合、動物における病的細胞（例えば、障害を受けた脳細胞）の出現を減少させることを指す。予防は、例えば対象における病的細胞の全消失というように完全であってもよい。また、対象における病的細胞の出現が、本発明を用いずに出現すると考えられるものよりも少ないというように、予防が部分的であってもよい。
【００３１】
本発明の1つの局面においては、動物におけるアルコール誘発性脳疾患を治療するため、予防するため、または回復させるための方法が提供される。ある態様において、本方法は、動物に対するPPARアゴニストの治療的有効量の投与を含む。PPARアゴニストは、脳疾患の身体的または組織学的症状の発現の前に投与しても後に投与してもよい。
【００３２】
本発明のもう1つの局面は、動物における慢性的アルコール摂取によって生じる脳損傷を治療するため、予防するため、または回復させるための方法を対象とする。ある態様において、本方法は、動物に対するPPARアゴニストの治療的有効量の投与を含む。PPARアゴニストは、脳損傷の身体的または組織学的症状の発現の前に投与しても後に投与してもよい。脳損傷は、アルコール摂取と関連している任意の種類の細胞障害または組織障害であってよい。例えば、障害は、酸化ストレス（例えば、脂質過酸化）またはDNA損傷と関連していてよい。「〜と関連している」という用語は、本明細書で用いる場合、アルコール誘発性脳損傷が、ある病状（例えば、酸化ストレスまたはDNA損傷）の身体的（例えば、組織学的、血清学的）徴候によって立証されることを意味する。
【００３３】
1つの態様において、本発明は、動物における慢性的アルコール摂取によって生じる認知障害を治療するため、予防するため、または回復させるための方法に関する。ある態様において、本方法は、動物に対するPPARアゴニストの治療的有効量の投与を含む。PPARアゴニストは、認知障害の身体的または組織学的症状の発現の前に投与しても後に投与してもよい。1つの態様において、認知障害は酩酊に起因しない。認知障害は以上に考察したようにして測定することができる。
【００３４】
1つの態様において、本発明は、慢性的アルコール摂取によって生じる、動物の脳におけるインスリン抵抗性を治療するため、予防するため、または回復させるための方法に関する。ある態様において、本方法は、動物に対するPPARアゴニストの治療的有効量の投与を含む。PPARアゴニストはインスリン抵抗性の発現の前に投与しても後に投与してもよい。インスリン抵抗性は、インスリン／IGFシグナル伝達経路に沿った任意の箇所でのアルコール誘発性変化に起因してよく、これには例えば、インスリンもしくはIGF-Iの発現の低下、IGF-IIの発現の増大、インスリン、IGF-IもしくはIGF-IIの受容体の発現の低下、インスリン、IGF-IもしくはIGF-IIの各々の受容体に対する結合の低下、またはAAHなどのインスリン応答性遺伝子の発現の低下がある。
【００３５】
インスリン抵抗性は、インスリン／IGFシグナル伝達経路内の少なくとも1つの因子のレベルまたは機能の変化を検出することによって測定することができる。1つの態様において、変化の検出はインビボで行われる。例えば、対象におけるインスリン／IGFシグナル伝達経路内の少なくとも1つの因子のレベルまたは機能を決定するために、画像化手法（例えば、磁気共鳴画像法、コンピュータ体軸断層撮影、単光子放出コンピュータ断層撮影、ポジトロン放出断層撮影、X線、超音波）を、検出可能なように標識された抗体、リガンド、酵素基質などと組み合わせて用いてもよい。検出可能な標識の例には、放射性、蛍光性、常磁性および超常磁性標識が非限定的に含まれる。当技術分野で公知の任意の適したインビボ画像化手法を本発明に用いることができる。画像化手法の例は、米国特許第6,737,247号、第6,676,926号、第6,083,486号、第5,989,520号、第5,958,371号、第5,780,010号、第5,690,907号、第5,620,675号、第5,525,338号、第5,482,698号および第5,223,242号に開示されている。
【００３６】
もう1つの態様において、変化の検出はインビトロで、例えば生物試料を用いて行われる。生物試料は、インスリン／IGFシグナル伝達経路内の少なくとも1つの因子のレベルまたは機能を検出するために適した、対象からの任意の組織または流体であってよい。有用な試料の例には、生検組織、血液、血漿、漿液、脳脊髄液、脳室内液、唾液、尿およびリンパ液が非限定的に含まれる。
【００３７】
検出および測定を行いうるインスリン／IGFシグナル伝達経路内の因子には、インスリン、インスリン様成長因子-I（IGF-I）、IGF-II、インスリン受容体、IGF-I受容体、IGF-II受容体、チロシンリン酸化インスリン受容体、チロシンリン酸化IGF-I受容体、チロシンリン酸化IGF-II受容体、インスリン受容体基質-1（IRS-1）、IRS-2、IRS-4、チロシンリン酸化IRS-1、チロシンリン酸化IRS-2、チロシンリン酸化IRS-4、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3キナーゼ）、PI3キナーゼのp85サブユニット、Akt、ホスホ-Akt、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3β（GSK-3β）およびホスホ-GSK-3βが非限定的に含まれる。測定を行いうる機能には、インスリン受容体、IGF-I受容体またはIGF-II受容体のリガンド結合能、インスリン受容体、IGF-I受容体またはIGF-II受容体のキナーゼ活性、PI3キナーゼのp85サブユニットとリン酸化IRS-1、IRS-2またはIRS-4との相互作用、成長因子受容体に結合したタンパク質2（Grb2）、SHPTP-2タンパク質チロシンホスファターゼまたはPI3キナーゼのp85サブユニットに対するリン酸化IRS-1、IRS-2またはIRS-4の結合、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（MAPKK）、Erk MAPK、Akt／プロテインキナーゼB、GSK-3βの酵素活性が非限定的に含まれる。
【００３８】
インスリン／IGFシグナル伝達経路内の因子のレベルは、タンパク質またはRNA（例えば、mRNA）のレベルで測定することができる。生物試料中の特定のタンパク質を定量するための当技術分野で公知の任意の方法を本方法に用いることができる。その例には、イムノアッセイ、ウエスタンブロット法、免疫沈降、免疫組織化学、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、カラムクロマトグラフィー、リガンド結合アッセイおよび酵素アッセイが非限定的に含まれる。例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 3rd Edition, (1995)を参照のこと。
【００３９】
特定のRNAのレベルを測定するためには、核酸の検出のための当技術分野で公知の任意のアッセイを用いることができる。その例には、逆転写および増幅アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、ノーザンブロット法、ドットブロット法、インサイチューハイブリダイゼーション、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動およびカラムクロマトグラフィーが非限定的に含まれる。例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 3rd ed., (1995)；Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3 (1989)を参照のこと。アッセイは、RNAそれ自体を、またはRNAの逆転写によって生成されるcDNAを検出することができる。アッセイは生物試料に対して直接行うこともでき、または試料から単離された核酸に対して行うこともできる。
【００４０】
1つのさらなる態様において、本発明は、親による慢性的アルコール摂取によって胎児動物の脳に生じる脳損傷を治療するため、予防するため、または回復させるための方法に関する。ある態様において、本方法は、その動物または親に対するPPARアゴニストの治療的有効量の投与を含む。PPARアゴニストは、脳損傷の発現の前に投与しても後に投与してもよい。脳損傷は、胎児脳のアルコールに対する曝露と関連している任意の種類の細胞障害または組織障害であってよい。
【００４１】
本発明の方法は、脳損傷または脳疾患に起因する病態を呈している動物、脳損傷または脳疾患に起因する病態を呈していると疑われる動物、および脳損傷または脳疾患に起因する病態を呈するリスクのある動物に対して行うことができる。例えば、アルコール依存症に対する遺伝的素因を有する者、中程度の飲酒者であるが他の理由で既に脳損傷を有する者、または妊娠していることが明らかになった者を、予防的に治療することができる。
【００４２】
本発明に用いうるPPARアゴニストには、米国特許第6,713,514号、第6,677,298号、第6,462,046号、第5,925,657号および第5,326,770号、ならびにCombs et al., J. Neurosci. 20:558 (2000)に開示されているようなPPAR-α、PPAR-γおよびPPAR-δの選択的アゴニスト、ならびに複数のPPARサブタイプのアゴニストである化合物が含まれる。選択的という用語は、1つのPPAR受容体サブタイプに対して、別のPPAR受容体サブタイプに対するよりも10倍を上回る、好ましくは100倍を上回る、最も好ましくは1,000倍を上回る活性を有する作用物質を記述するために用いられる。PPAR受容体サブタイプに対する作用物質の受容体親和性および機能的活性の特性決定は、WO 2005049572号に記載されたような方法を用いて行うことができる。脳疾患患者におけるPPAR-δアゴニストの使用にはI型筋繊維の数を増加させるというさらなる利点も考えられ、それは運動をしない場合でさえも、肥満に対する抵抗性を付与し、代謝プロフィールを改善する可能性がある（Wang et al., PLoS Biol. 2:3294 (2004)）。
【００４３】
有用なPPAR-α選択的アゴニストには、クロフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラート、2-ブロモヘキサデカン酸、エトモキシル水酸化ナトリウム、N-オレオイルエタノールアミン、GW-9578、GW-7647、WY-14643、ならびに米国特許第7,091,225号、第7,091,230号、第7,049,342号、第6,987,118号、第6,750,236号、第6,699,904号、第6,548,538号、第6,506,797号、第6,306,854号、第6,060,515号および第6,028,109号に開示された化合物が非限定的に含まれる。
【００４４】
有用なPPAR-γ選択的アゴニストには、シグリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、GW-1929、F-L-Leu、JTT-501、GI-262570、ならびに米国特許第7,090,874号、第7,060,530号、第6,908,908号、第6,897,235号、第6,852,738号、第6,787,651号、第6,787,556号、第6,713,514号、第6,673,823号、第6,646,008号、第6,605,627号、第6,599,899号、第6,579,893号、第6,555,536号、第6,541,492号、第6,525,083号、第6,462,046号、第6,413,994号、第6,376,512号、第6,294,580号、第6,294,559号、第6,242,196号、第6,214,850号、第6,207,690号、第6,200,995号、第6,022,897号、第5,994,554号、第5,939,442号および第5,902,726号に開示された化合物が非限定的に含まれる。
【００４５】
有用なPPAR-δ選択的アゴニストには、GW-501516、GW-0742、L-165041およびカルバプロスタサイクリンが非限定的に含まれ、それらは構造的には以下のように定義される。
2010502719.tif 000002
【００４６】
他の有用なPPAR-δアゴニストには、RWJ-800025、L-160043、ならびに米国特許第7,091,245号、第7,015,329号、第6,869,967号、第6,787,552号、第6,723,740号、第6,710,053号および第6,300,364号ならびにEP 1586573号、US 20050245589号およびWO 2005049572号に開示された化合物が非限定的に含まれる。
【００４７】
有用な混合型PPAR-α／γアゴニストには、GW-1556、AVE-8042、AVE-8134、AVE-0847、DRF-2519、ならびに米国特許第7,091,230号、第6,949,259号、第6,713,508号、第6,645,997号、第6,569,879号、第6,468,996号、第6,465,497号および第6,380,191号に開示された化合物が非限定的に含まれる。
【００４８】
すべてのPPAR受容体に対してアゴニストとして作用する有用な化合物には、LY-171883およびプソイドラリン酸B（pseudolaric acid B）が非限定的に含まれる。
【００４９】
本発明のいくつかの態様は、PPARアゴニストの治療的有効量を、アルコール誘発性脳疾患もしくは脳損傷の治療、予防もしくは回復のために有用なことが当技術分野で公知である（例えば、ビタミンB補給剤）か、またはアルコール離脱症状を治療もしくは予防する（例えば、鎮静薬、ジアゼパム）、追加的な作用物質と組み合わせて投与するための方法を提供する。
【００５０】
本発明のいくつかの態様において、PPARアゴニストおよび追加的な作用物質は、動物に対して、例えば2つの別個の組成物として別々に投与される。他の態様において、PPARアゴニストおよび追加的な作用物質は、単一の組成物の部分として投与される。
【００５１】
本発明のいくつかの態様において、PPARアゴニストおよび追加的な作用物質は、動物に対して、以下の条件のうち1つまたは複数の下で投与される：異なる周期で、異なる持続期間で、異なる濃度で、異なる投与経路により、など。いくつかの態様において、PPARアゴニストは、追加的な作用物質の前に、例えば、追加的な作用物質の投与の0.5、1、2、3、4、5、10、12もしくは18時間前、1、2、3、4、5もしくは6日前、または1、2、3もしくは4週前に投与される。いくつかの態様において、PPARアゴニストは、追加的な作用物質の後に、例えば、追加的な作用物質の投与の0.5、1、2、3、4、5、10、12もしくは18時間後、1、2、3、4、5もしくは6日後、または1、2、3または4週後に投与される。いくつかの態様において、PPARアゴニストおよび追加的な作用物質は同時並行的にではあるが異なるスケジュールで投与され、例えば、PPARアゴニストは毎日投与され、一方、追加的な作用物質は週1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回または4週間毎に1回投与される。他の態様において、PPARアゴニストは週1回投与され、一方、追加的な作用物質は毎日、週1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回または4週間毎に1回投与される。
【００５２】
PPARアゴニストの投与は、追加的な作用物質の投与とともに同時並行的に続けることができる。さらに、PPARアゴニストの投与を追加的な作用物質の投与を超過して続けること、またはその反対もできる。
【００５３】
本発明のある態様において、追加的な作用物質と組み合わせてPPARアゴニストを投与する方法は、少なくとも1回繰り返すことができる。本方法を、治療反応を達成または維持するために必要なだけ多くの回数、例えば1回〜約10回またはそれ以上、繰り返すこともできる。本方法のそれぞれの繰り返しに際して、PPARアゴニストおよび追加的な作用物質は、以前の繰り返しに用いたものと同じでも異なってもよい。さらに、PPARアゴニストおよび追加的な作用物質の投与の期間ならびにそれらを投与する様式は、繰り返し毎に異なりうる。
【００５４】
化合物の細胞取り込みを強化するために、本発明の作用物質を単体分子と連結することもできる。そのような担体分子の例には、Fulda et al., Nature Med. 8:808 (2002), Arnt et al., J. Biol. Chem. 277:44236 (2002)およびYang et al., Cancer Res. 63:831 (2003)に記載されたもの、融合誘導ペプチド (例えば、米国特許第5,965,404号を参照）ならびにウイルスおよびウイルスの部分、例えばエンプティキャプシドおよびウイルス血球凝集素（例えば、米国特許第5,547,932号を参照）が含まれる。他の担体分子には、アシアロ糖タンパク質のような細胞表面受容体に対するリガンド（アシアロ糖タンパク質受容体と結合する；米国特許第5,166,320号）およびT細胞に対して特異的な抗体のような細胞表面受容体に対する抗体、例えば抗CD4抗体（米国特許第5,693,509号）が含まれる。
【００５５】
PPARアゴニストは、例えば、脳室内（例えば、脳室内ステントを用いて）、頭蓋内、腹腔内、静脈内、動脈内、鼻腔内または経口的といった、任意の適した様式で投与することができる。1つの態様において、PPARアゴニストは血液脳関門を通過することができる。1つの態様において、作用物質は、血液脳関門に受容体が存在するトランスフェリンなどのターゲティング分子と結合させることができる。例えば、米国特許第4,902,505号を参照。1つのさらなる態様においては、疎水性の高い（極性の低い）作用物質は血液脳関門をより容易に通過するため、極性が低下するように、または疎水性が高くなるように作用物質を修飾してもよい。例えば、米国特許第5,260,308号を参照。1つのさらなる態様においては、疎水性（非極性）の作用物質を選択して用いることができる。さらにもう1つの態様において、作用物質はリポソーム中に、特に血液脳関門を標的とするリポソーム中にある状態で投与することができる。例えば、米国特許第6,372,250号を参照。リポソーム中にある薬学的作用物質の投与は公知である。
【００５６】
本発明の範囲内にある組成物には、本発明の作用物質がその意図する目的を達成するのに有効な量で含まれている、すべての組成物が含まれる。個々の必要性はさまざまであるが、各成分の有効量の至適範囲の決定は当技術分野の技能の範囲内にある。実際の投与量および治療レジメンは、通常の技能を有する医師により、投与の経路、対象の年齢、体重および健康状態、ならびに脳疾患の病期、さらには当然ながら作用物質の副作用、作用物質の有効性も考慮に入れて、従来通りの医学的な手順および慣行に従って容易に決定されうる。典型的には、作用物質は動物、例えばヒトに対して、1日当たりに、脳損傷または脳疾患に対する治療を受ける動物の体重1kg当たり0.0025〜50mg／kgの用量で、またはその薬学的に許容される塩の等価な量として経口的に投与することができる。好ましくは、約0.01〜約10mg／kgを、脳損傷または脳疾患の治療、予防または回復のために経口投与する。筋肉内注射の場合、用量は一般に経口用量の約半分である。例えば、適した筋肉内用量は約0.0025〜約25mg／kgであり、最も好ましくは約0.01〜約5mg／kgである。
【００５７】
単位経口用量は、各作用物質の約0.01〜約50mg、好ましくは約0.1〜約10mgを含みうる。単位用量は、作用物質の約0.1〜約10mg、好都合には約0.25〜50mgをそれぞれが含む1つまたは複数の錠剤またはカプセルとして、1日に1回または複数回投与することができる。
【００５８】
作用物質を未加工の化学物質として投与することに加えて、本発明の作用物質を、薬学的に用いうる製剤への化合物の加工処理を容易にする添加剤および補助剤を含む、適した薬学的に許容される担体を含む医薬製剤の一部として投与することもできる。好ましくは、製剤、特に、経口的または局所的に投与することが可能で、好ましい型の投与のために用いうる、錠剤、糖衣錠、徐放性ロゼンジ剤およびカプセル剤、口内すすぎ液および口内洗浄剤、ゲル剤、液体懸濁剤、ヘアリンス、毛髪用ゲル、シャンプーなどの製剤、ならびに直腸内に投与しうる座薬などの製剤、さらには注射、局所的または経口的な投与のために適した液剤は、活性化合物を約0.01〜99パーセント、好ましくは約0.25〜75パーセントとして、添加剤とともに含む。
【００５９】
本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物の有益な効果を経験する可能性のある任意の対象に投与することができる。そのような対象の中で第一に挙げられるのは哺乳動物、例えばヒトであるが、本発明はそのように限定されることは意図していない。他の動物には、獣医学的動物（ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなど）が含まれる。
【００６０】
化合物およびその薬学的組成物は、その意図した目的を達成する任意の手段によって投与することができる。例えば、投与は避腸的、皮下、静脈内、腹腔内、経皮的、口腔内、髄腔内、頭蓋内、鼻腔内または局所的経路によるものでよい。代替的または同時並行的に、投与は経口経路によるものであってもよい。投与される投与量はレシピエントの年齢、健康状態および体重、併用療法があればその種類、治療の頻度、ならびに所望の効果の性質に依存すると考えられる。
【００６１】
本発明の医薬製剤は、それ自体が公知である様式で、例えば、従来の混合、顆粒化、糖衣錠、溶解または凍結乾燥の工程によって、製造される。したがって、経口用途のための医薬製剤は、活性化合物を固体添加剤と配合し、錠剤または糖衣錠のコアを得るために適した補助剤を要望または必要性に応じて添加した後に、任意で、その結果得られた混合物を粉砕して顆粒混合物を加工処理することによって得ることができる。
【００６２】
適した添加剤には、特に、充填剤、例えばラクトースまたはスクロース、マンニトールまたはソルビトール、セルロース調製物などの糖類、および／またはリン酸カルシウム、例えばリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウムなど、ならびに結合剤、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプンを用いたデンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドンなどがある。所望であれば、上述したデンプン類などの崩壊剤、さらにはカルボキシメチル‐デンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどを添加することもできる。補助剤には特に、流動調節剤および潤滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸またはその塩、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウムなど、および／またはポリエチレングリコールがある。糖衣錠のコアには、所望であれば胃液に耐性があるような、適したコーティングが付与される。この目的には濃縮糖溶液を用いることができ、任意でアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適した有機溶媒または溶媒混合物を含めてもよい。胃液に耐性のあるコーティングを作製するためには、適したセルロース調製物、例えばフタル酸アセチルセルロースまたはフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの溶液が用いられる。これらの錠剤または糖衣錠コーティングには、例えば、識別用または活性化合物の用量の組み合せを特徴づけるために、色素材料または顔料が添加することができる。
【００６３】
経口的に用いうる他の薬学的調製物には、ゼラチンから製造されるプッシュフィット（push-fit）カプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤から製造される柔軟な密封カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、顆粒の形態にある活性化合物を含むことができ、それはラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウム潤滑剤などの潤滑剤、ならびに任意で安定化剤と混合されていてもよい。軟カプセルでは、これらの活性化合物は、好ましくは、適した液体、例えば脂肪油または流動パラフィンなどの中に溶解または懸濁されている。さらに、安定化剤を添加することもできる。
【００６４】
直腸的に用いうる可能性のある薬学的調製物には、例えば座薬が含まれ、これは1つまたは複数の活性化合物と座薬基剤との組み合せからなる。適した座薬ベースには、例えば、天然および合成のトリグリセリド、またはパラフィン性炭化水素がある。さらに、活性化合物と基剤との組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルを用いることも可能である。可能性のある基剤材料には、例えば、液状トリグリセリド、ポリエチレングリコールまたはパラフィン性炭化水素が含まれる。
【００６５】
避腸的投与のために適した製剤には、水溶性形態にある活性化合物の水溶液、例えば、水溶性塩およびアルカリ性溶液が含まれる。さらに、適した油性注射用懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投与することもできる。適した親油性溶媒または媒体には、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリドまたはポリエチレングリコール-400が含まれる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストリンを含みうる。任意で、この懸濁液は安定化剤も含んでよい。
【００６６】
本発明はさらに、Long-Evansラットにエタノールを慢性的に与えることによって作製したアルコール誘発性脳損傷および脳疾患の動物モデルも提供する。驚いたことに、Long-Evansラットは他のラット系統と比較して、エタノールを与えることに対して強い応答を示すことが発見され、これにより、このラットは慢性的アルコール摂取の影響の試験のために理想的に適するものとされた。1つの態様において、エタノールはLong-Evansラットの毎日の食餌中に含められる。例えば、エタノールは、毎日の食餌の約0％、2％、4.5％、6.5％、9.25％（v／v）（カロリー含有量の0％、8％、18％、26％または37％に相当）またはそれ以上を構成する。1つの態様において、エタノールは、毎日の食餌のカロリー含有量の約37％を構成する。エタノールを与えることは所望の長さにわたって、例えば、2日間という短さから6カ月またはそれ以上という長さまでにわたって継続することができる。1つの態様において、エタノールを与えることは脳損傷が誘発されるまで、例えば1、2、3、4、5または6週またはそれ以上にわたって継続され、その後に作用物質または他の治療が脳損傷に対する効果を判定するために投与または施される。もう1つの態様において、作用物質または治療は、脳損傷を予防または緩徐化しうるか否かを判定するためにエタノールを与える前または同時並行的に投与または施される。
【００６７】
本発明はさらに、Long-Evansラットにエタノールを慢性的に与えることによって作製した動物モデルに作用物質を投与する段階、ならびに作用物質を投与されていない対照動物と比較して脳損傷、認知障害および／またはインスリン抵抗性のレベルを決定する段階を含む、アルコール誘発性脳損傷または脳疾患の治療、予防または回復のために有用である可能性のある作用物質に関するスクリーニングのための方法であって、作用物質を投与されていない対照動物と比較した際の脳損傷、認知障害および／またはインスリン抵抗性のレベルにおける改善により、その作用物質がアルコール誘発性脳損傷または脳疾患の治療、予防または回復のために有用である可能性があることが示される方法にも関する。
【００６８】
スクリーニングすることのできる作用物質には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、核酸、有機分子、天然物、化学物質ライブラリーなどが含まれる。
【００６９】
本発明はさらに、Long-Evansラットにエタノールを慢性的に与えることによって作製した動物モデルに可能性のある治療を施す段階、ならびに可能性のある治療を施されていない対照動物におけるレベルと比較して脳損傷および／またはインスリン抵抗性のレベルを決定する段階を含む、アルコール誘発性脳損傷または脳疾患の治療、予防または回復のための、可能性のある治療を試験するための方法であって、可能性のある治療を施されていない対照動物におけるレベルと比較した際の脳損傷および／またはインスリン抵抗性のレベルにおける改善により、その治療がアルコール誘発性脳損傷または脳疾患の治療、予防または回復のために有用である可能性があることが示される方法も提供する。
【００７０】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物を例示したものであって限定的ではない。臨床的治療法において通常遭遇し、当業者に明らかである種々の条件およびパラメーターのその他の適切な修正および改変は、本発明の精神および範囲に含まれる。
【００７１】
実施例1
慢性的エタノール曝露の成体ラットモデルに関する一般的方法
雄性（約200g）のLong Evansラット（Charles River Laboratories, Cambridge, MA）に対して、エタノールがカロリー含有量の0％または37％（9.25％v／v）を構成する等カロリー液体飼料（BioServ, Frenchtown, N.J.）を6週間与えた（Yeon et al., Hepatology 38:703 (2003)）。固形飼料を与えた対照群も試験対象とした。同等な食物消費および体重の維持を確かなものとするためにラットを毎日モニターした。屠殺後に脳を摘出し、パラフィン包埋のためにHistochoice固定液（Amresco Corp., Solon, OH）中に浸漬固定するか、または側頭皮質、視床下部および小脳のマイクロダイセクションのために未加工のまま切片化した。未加工の組織ブロックをドライアイス-メタノール浴中で急速凍結（snap-frozen）させ、mRNAおよびタンパク質の試験のために-80℃で保存した。
【００７２】
組織学的試験
固定した脳を、統一された目標物に沿って冠状面で切片化し、パラフィン中に包埋した。パラフィン包埋切片（8μm厚）をヘマトキシリンおよびエオシンで染色するか、またはDNA損傷および脂質過酸化を検出するためにそれぞれ8-ヒドロキシデオキシグアノシン（8-OHdG）（Oxis Research）もしくは4-ヒドロキシノネナール（4-hydroxynonenol）（HNE）（Chemicon International, Temecula, CA）に対するモノクローナル抗体で免疫染色した。免疫染色の前に、脱パラフィン処理して再水和させた切片を、リン酸緩衝食塩水（10mMリン酸ナトリウム、0.9％NaCl、pH 7.4；PBS）中の0.1mg／mlサポニンにより室温で20分間処理し、その後に内因性ペルオキシダーゼ活性を消失させるためにメタノール中の3％過酸化水素により10分間処理し、続いて非特異的な結合部位をブロックするためにSuperBlock-TBS（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）中にて室温で30分間処理した。切片を0.5〜1μg／mlの一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。免疫反応性は、ビオチン化二次抗体、アビジン-ビオチン-西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（ABC）試薬、および色素原としてのジアミノベンジジンを用いて検出した（Vector Laboratories, Burlingame, CA）（Lam et al., J. Biol. Chem. 269:20648 (1994)）。組織切片をヘマトキシリンで対比染色し、光学顕微鏡法によって検査した。陰性対照（非関連抗体）および陽性対照（グリア酸性線維素タンパク質）の反応を並行して行った。切片には符号を付した上で検査した。
【００７３】
リアルタイム定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）アッセイ
全RNAを、TRIzol試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA）を製造元のプロトコールに従って用いて脳組織から単離した。RNAの濃度および純度を、260nmおよび280nmで測定した吸光度から決定した。RNA（2μg）を、AMV First Strand cDNA合成キット（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN）およびランダムオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いて逆転写させた。リアルタイム定量的RT-PCRを用いて、インスリン、IGF-IおよびIGF-II成長因子、それらの対応する受容体、ニューロン（Hu）、アストロサイト（グリア酸性線維素タンパク質；GFAP）、オリゴデンドログリア（ミエリン結合糖タンパク質-1；MAG-1）、ミクログリア（AIF1）および内皮細胞（エンドセリン-1；ET-1）の遺伝子、アセチルコリンエステラーゼ（AChE）およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）のmRNAレベルを測定した。並行した反応で測定したリボソーム18S RNAのレベルを用いて、mRNA転写物の相対的存在量を算出した（Myers et al., Trends Biochem. Sci. 19:289 (1994)；Baltensperger et al., Science 260:1950 (1993)）。PCR増幅は、2.5ngの元のRNAテンプレートから生成されたcDNA、各300μMの遺伝子特異的な順方向および逆方向プライマー（表1）ならびに12.5μlの2×QuantiTect SYBR Green PCR Mix（Qiagen Inc, Valencia, CA）を含む25μlの反応物中で行った。増幅されたシグナルを、BlO-RAD iCycler iQ Multi-Color RealTime PCR検出システム（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いて連続的に検出した。用いた増幅プロトコールは以下の通りである：最初に95℃で15分間の変性および酵素活性化、95℃×15秒間、55〜60℃×30秒間および72℃×30秒間を45サイクル。アニーリング温度は、iCyclerソフトウエアに備わっている温度勾配プログラムを用いて最適化した。
【００７４】
（表１）リアルタイム定量的RT-PCRのためのプライマー対
2010502719.tif 000003
2010502719.tif 000004
2010502719.tif 000005
【００７５】
予備的試験では、SYBR Greenで標識されたPCR産物をアガロースゲル電気泳動で評価し、各アンプリコンの真正性を核酸シークエンシングによって確認した。相補的（c）DNAをPCRIIベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）中にクローニングした。特定の標的配列を含む既知量の組換えプラスミドDNAの系列希釈物をPCR反応における標準物質として用い、標準物質のCt値から作成された回帰直線をmRNA存在量の算出に用いた。相対的mRNA存在量は、同一の試料で測定した特定のmRNAと18Sとのng比から求めた。結果を18Sに対して標準化したのは、18Sは存在量が多く、そのレベルが試料間で本質的に不変であるが、ハウスキーピング遺伝子は疾病状態によって変わったためである。群間の統計学的比較は、算出したmRNA／18S比を用いて行った。対照試験には、以下のもののリアルタイム定量的PCR分析を含めた：1）無テンプレート反応物；2）逆転写されていないRNA；3）DNアーゼIで前処理したRNA試料；4）逆転写酵素反応の前にRNアーゼAで処理した試料；および5）ゲノムDNA。
【００７６】
受容体結合アッセイ
未加工の凍結組織（約100mg）を、プロテアーゼ阻害薬（1mM PMSF、0.1mM TPCK、1μg／mlのアプロチニン、1μg／mlのペプスタチンA、0.5μg／mlのロイペプチン、1mM NaF、1mM Na4P2O7）を含む5倍容積のNP-40溶解緩衝液（50mM Tris-HCl、pH 7.5、1％ NP-40、150mM NaCl、1mM EDTA、2mM EGTA）中でホモジナイズした。タンパク質濃度をビシンコニン酸（BCA）アッセイ（Pierce, Rockford, IL）を用いて決定した。診査的試験により、20％の特異的結合を達成するために必要なタンパク質の量および放射性標識リガンドの濃度を決定した。インスリン受容体結合アッセイは、100μgのタンパク質を用いて行った。IGF-I結合アッセイは試料当たり25μgのタンパク質を必要とし、IGF-II受容体結合アッセイは10μgタンパク質を用いて最適化した。エタノール曝露との関連で成長因子の結合を評価するためには競合的平衡結合アッセイを用いた。全結合量に関しては、2つずつの個々のタンパク質試料を、結合緩衝液（100mM HEPES、pH 8.0、118mM NaCl、1.2mM MgSO4、8.8mMデキストロース、5mM KCl、1％ウシ血清アルブミン）および100nCi／mlの［125I］（2000Ci／mmol；50pM）インスリン、IGF-IまたはIGF-IIを含む100μlの反応物中でインキュベートした。非特異的結合の測定のためには、反復試験試料を0.1μMの非標識（非放射性）リガンドの添加の点を除いて全く同じく調製した。
【００７７】
すべての反応は1.5ml Eppendorffチューブ内で行い、インキュベーションは穏やかな架台撹拌下にて4℃で16時間行った。続いて、各チューブに500μlの0.15％ウシガンマグロブリン（100mM Tris-HCl、pH 8.0中に調製）を添加し、その後に400μlの37.5％ポリエチレングリコール8000（PEG-8000；100mM Tris-HCl、pH 8.0中に調製）を添加することにより、結合した放射性標識トレーサーを沈殿させた。試料をボルテックス処理によって十分に混合し、続いて氷上で少なくとも2時間インキュベートした。試料を15,000×gで5分間、室温で遠心することにより、沈殿物を収集した。非結合（遊離）リガンドを含む上清画分の全体をガンマ計数管（Sarstedt, Newton, NC）に移した。ペレットを含むEppendorffチューブチップを切り、別のガンマ計数管の中にそのまま遊離させた。試料をLKB CompuGamma CS Gammaカウンターの中で1分間計数した。特異的結合は、非特異的な結合のfmol値、すなわち非放射性リガンドの存在下で結合した量を、（非標識競合リガンドの非存在下で）結合した全fmol値から差し引くことによって算出した。結果は、GraphPad Prism 4ソフトウエア（GraphPad Software, Inc., San Diego, CA）を用いて分析してプロットした。
【００７８】
試薬の供給元
ヒト組換え[125I]インスリン、IGF-IおよびIGF-IIはAmersham Biosciences（Piscataway, NJ）から購入した。非標識ヒトインスリンはSigma-Aldrich（St. Louis, MO）から購入した。組換えIGF-IおよびIGF-IIはBachem（King of Prussia, PA）から入手した。8-OHdGおよびHNEに対するモノクローナル抗体はOxis Scientific（Foster City, CA）から購入した。他のすべての精製化学薬品および試薬は、CalBiochem（Carlsbad, CA）またはSigma-Aldrich（St. Louis, MO）から購入した。
【００７９】
統計学的分析
実験は各群当たり9匹のラットを用いて実施した。データはグラフ中に平均±S.E.M.として表した。群間比較はスチューデントのT検定を用いて行った。統計学的分析はNumber Cruncher Statistical System（Kaysville, UT）を用いて行った。有意差および傾向に対応するP値はグラフの上に表示されている。
【００８０】
実施例2
慢性的エタノール消費により引き起こされる成体ラット脳における神経変性
組織病理学的検討は、小脳、および海馬を含む側頭葉に的を絞ったが、これはこれらの構造がエタノール媒介性神経毒性の公知の標的であり、それらを分子的および生化学的アプローチを用いて評価した。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した脳切片は、エタノール摂取ラットの小脳皮質における構造異常を示し、これにはプルキンエ細胞の損失および内顆粒層の内部の細胞の密度低下が含まれた（図1A〜D）。これに対して、側頭葉および海馬では、細胞損失の明らかな証拠を含め、明確な組織病理学的異常がみられなかった。
【００８１】
隣接切片の免疫組織化学染色により、エタノール摂取ラットの脳内でのHNEに対する細胞標識の著しい増加、およびより程度は落ちるが8-OHdGに対する細胞標識の増加が判明した。エタノール曝露ラットの小脳において、脂質過酸化を反映するHNE免疫反応性の増加は主としてプルキンエ細胞層および顆粒細胞層に局在していたが（図1E〜1F）、皮質下白質グリアでも検出された。これに対して、8-OHdG免疫反応性はエタノール摂取ラットの小脳のプルキンエ層および顆粒層の内部の散在性細胞で検出された（図1G〜1H）。エタノール摂取ラットでは、HNE免疫反応性の顕著な増加が海馬および側頭皮質で検出された（図2A〜2F）。HNE免疫反応性の増加は、海馬の歯状回（図2A〜2B）およびアンモン角（図2C〜2D）の全体にわたって、ならびに側頭皮質の全層（図2E〜2F）にわたって分布したニューロンの核および細胞質で検出された。HNE免疫反応性の増加は主としてニューロンに分布していたが（位置、サイズ（直径10〜16ミクロン）およびその錐状形に基づく）、灰白質および白質構造の両方に分布したグリアおよび内皮細胞を含む他の細胞種もHNE陽性であった。HNEとは対照的に、DNA損傷を反映する8-OHdG免疫反応性の増加は、小脳顆粒層（図1G〜1H）および側頭皮質（図2G〜2H）の内部の散在性細胞のみで検出された。8-OHdG免疫反応性の増加の分布は隣接切片におけるHNEのそれと部分的に重複しており、このことはエタノール媒介性DNA損傷がニューロンのほかに脳内の他の細胞種でも起こったことを示している。
【００８２】
成人の慢性的アルコール依存患者において、CNS変性は、小脳萎縮、大脳白質萎縮、ならびに視床下部、視床、海馬および前頭皮質の内部のニューロンの損失または機能障害によって特徴づけられる。これらの異常にはさまざまな度合いの認知障害および運動障害が伴い、重症例では痴呆が伴ってみられる。慢性的にエタノールを与えることの本実験モデルでは、CNS神経変性は小脳皮質における明白な細胞損失により顕在化し、視床下部または海馬／側頭葉ではそうではなかった。しかし、この3つの構造すべてにおけるHNEおよび8-OHdGに対する免疫反応性の増加という所見は、慢性的にエタノールを与えることが脂質過酸化およびDNA損傷を引き起こし、それには明白な細胞損失が随伴しない場合もあることを示している。このことは、成体における慢性的エタノール曝露が、誘導される酸化ストレスの増大が原因でニューロン機能を障害させうることを示唆する。加えて、エタノール媒介性の慢性的酸化ストレスは、CNSニューロンを、正常な脳であれば必ずしも永続的な損傷または神経変性を引き起こさないと考えられる、低酸素または虚血といった「第2の打撃（second hits）」に対してより脆弱にする可能性もある。
【００８３】
実施例3
細胞種におけるエタノール誘発性病的変移
慢性的にエタノールを与えることが側頭皮質、視床下部および小脳の内部の細胞集団における病的変移を引き起こしたか否かを明らかにするために、リアルタイム定量的RT-PCR試験を用いて、Huニューロン性リボソームRNA結合タンパク質（Datta et al., Cell 91:231(1997)；Hetman et al., J. Neurosci. 20:2567(2000)；Dudek et al., Science 275:661(1997)）、オリゴデンドログリアに関するミエリン結合糖タンパク質-1（MAG-1）、アストロサイトに関するグリア酸性線維素タンパク質（GFAP）、および内皮細胞に関するエンドセリン-1（ET-1）をコードするmRNA転写物を測定した。検出された各々の特異的mRNA転写物のng量を、同一の試料中で測定された18S RNAレベルに対して標準化し、各群当たり9匹の動物からの結果を統計学的に分析した。この試験により、側頭葉（図3A）および小脳（図3C）ではHu遺伝子発現のエタノールに関連した低下がみられるが、視床下部（図3B）ではみられないことが示された。MAG-1発現はエタノール摂取ラットの視床下部で有意に低下したが、側頭葉および小脳ではそうではなかった（図3D〜3F）。GFAP発現の有意な増大がエタノール摂取ラットの小脳で検出されたが、側頭葉および視床下部ではそうではなかった（図3G〜3I）。ET-1発現はエタノール摂取ラットの側頭葉で有意に増大したが、視床下部または小脳ではそうではなかった（図3J〜3L）。
【００８４】
エタノール摂取ラットにおいて、神経変性の組織病理学的および／または免疫組織学的な指標は、調べた領域のそれぞれの内部での脳細胞集団の病的変移と関連していた。本試験では、ニューロン、オリゴデンドログリア、アストロサイトおよび内皮細胞の割合を推算するために、同一の組織試料におけるHu、MAG-1、GFAPおよびET-1のそれぞれの相対的mRNA発現レベルを比較することによる新規なアプローチを利用した。
【００８５】
調べた脳領域はそれぞれエタノール神経毒性の公知の標的であるが、エタノールの有害作用は細胞損失に関して不均一であった。側頭皮質では、慢性的エタノール曝露はニューロンの損失（Hu遺伝子発現の低下）をもたらし、内皮細胞集団を相対的に増加させた。視床下部では、オリゴデンドログリア細胞が相対的に減少した。小脳では、組織切片において明白であったニューロン損失は、アストロサイト集団の増加を伴った。このように、成体において、慢性的エタノール曝露は、異なる脳領域では神経毒性および細胞損失の点で異なる影響を及ぼした。重要なこととして、この所見は、同じ構造物でHNEおよび8-OHdG免疫反応性の増加が観察されていることと併せて考えると、小脳および側頭葉がエタノール媒介性ニューロン毒性に対して非常に脆弱な標的であることを示唆する。エタノールのこれらの有害作用は、慢性的アルコール依存患者で起こる進行性の認知障害および運動障害の原因になりうると考えられる。
【００８６】
実施例4
インスリン、IGF-IおよびIGF-IIポリペプチド、ならびにインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体のmRNA発現に対するエタノールの影響
リアルタイム定量的RT-PCR試験により、対照およびエタノール曝露させた脳の両方において、インスリン、IGF-IおよびIGF-IIポリペプチドならびにインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体に対応するmRNA転写物が検出された（図4および5）。インスリン遺伝子は視床下部で最も大量に発現され、そのレベルは側頭葉および小脳よりも20〜40倍の高さであった（図4A〜4C）。IGF-I遺伝子も視床下部で最も大量に発現されたが、その平均レベルは側頭葉および小脳よりも3〜4倍の高さであった（図4D〜4F）。全体的には、IGF-IIはインスリンおよびIGF-Iよりも大量に発現され、この場合も最も高度な発現は視床下部においてであった（図4G〜4I）。慢性的にエタノールを与えることは、側頭葉におけるIGF-I発現（図4D）および小脳におけるIGF-II発現（図4I）の平均レベルを有意に低下させた。それ以外の点では、慢性的にエタノールを与えることは脳におけるインスリン、IGF-IおよびIGF-II発現に対して有意な影響を及ぼさなかった。
【００８７】
インスリン受容体遺伝子の平均発現レベルは側頭葉および視床下部において同程度であり、いずれも小脳よりも2.5〜3倍の高さであった（図5A〜5C）。IGF-1受容体発現は視床下部で最も高度であり、続いて小脳、さらに側頭葉の順であった（図5D〜5F）。これに対して、IGF-II受容体mRNAの平均レベルは側頭葉、視床下部および小脳において同程度であった（図5G〜5I）。慢性的にエタノールを与えることは、側頭葉におけるインスリン受容体遺伝子の発現（図5A）ならびに側頭葉、視床下部および小脳におけるIGF-II受容体の発現（図5G〜5I）を有意に低下させた。それ以外の点では、慢性的エタノール曝露は脳におけるインスリン受容体およびIGF-I受容体の発現を変化させなかった。
【００８８】
リアルタイム定量的RT-PCR試験により、小脳、側頭葉および視床下部においてインスリン、IGF-I、IGF-IIおよびそれらの対応する受容体に対応するmRNA転写物が示され、このことはインスリンおよびIGFシグナル伝達に必要なこれらの遺伝子が成体脳で発現されることを示している。重要なこととして、インスリンおよびIGFポリペプチドの遺伝子はすべて、小脳または側頭葉よりも視床下部ではるかに高いレベルで発現されており、このことは視床下部がCNS内部のこれらの成長因子の主な供給源であることを示唆する。しかし、慢性的にエタノールを与えることは、側頭葉におけるIGF-I mRNA発現および小脳におけるIGF-II発現を有意に低下させた。これらの構造物ではHuの発現低下を伴うニューロン損失が明白であったが視床下部ではそうではなかったため、これらの結果は、これらの成長因子の相対的離脱が、エタノール曝露脳で観察された領域特異的なニューロン損失の一因である可能性を示唆する。
【００８９】
IGF-IIシグナル伝達機構に関してCNSでの十分な検討は行われていないが、他の組織および細胞種における最近の研究から、IGF-IIが自らの受容体と相互作用し、G共役型タンパク質シグナル伝達を介してPI3キナーゼ-Aktを活性化することによって、細胞生存を媒介しうることが実証されている。または、IGF-IIはインスリン受容体およびIGF-I受容体と結合し、インスリン受容体基質依存的な機構を通じて成長および生存のシグナル伝達経路を活性化することもできる。このため、小脳におけるエタノールを介したIGF-II発現の低下は、歩行および姿勢の安定性ならびに協調運動活性といった重要な運動機能を媒介するニューロンの生存および機能に対して広範な有害作用を及ぼす可能性がある。
【００９０】
インスリン受容体およびIGF-I受容体は、側頭葉および小脳よりも視床下部でより大量に発現され、一方、IGF-II受容体はこれらの3つの構造物において同程度に発現された。慢性的エタノール曝露の主な影響は、3つの脳領域すべてにおけるIGF-II受容体発現、および側頭葉におけるインスリン受容体発現のレベルを低下させることであった。インスリン受容体およびIGF-II受容体の発現レベルの低下は、これらの受容体を保有する細胞の損失を反映している可能性がある。脳におけるインスリン受容体発現細胞の損失はインスリン抵抗性に寄与し、インスリン応答性遺伝子の発現の低下をもたらしうると考えられる。IGF-II受容体発現細胞の損失は、IGF-II受容体を通じてのシグナル伝達がG共役型タンパク質シグナル伝達を介してPI3キナーゼ-Aktを活性化しうることから、ニューロンの生存および可塑性に有害な影響を及ぼしうると考えられる。PI3キナーゼ-Akt経路は、ニューロンの生存、および可塑性のために必要な神経突起伸長を刺激する上で決定的な役割を果たす。
【００９１】
実施例5
エタノールによるインスリン受容体およびIGF受容体の結合の障害
成長因子および成長因子受容体の発現に対する、慢性的にエタノールを与えることの影響にばらつきがあったことから、エタノールが別の機構を通じてインスリン／IGFシグナル伝達を障害させうるか否かを明らかにすることが関心の対象となった。有効なリガンド結合はインスリンおよびIGFのシグナル伝達カスケードにとって決定的に重要であり、ニューロン生存性の低下を含む、エタノール曝露脳で報告されているインスリンシグナル伝達障害の下流での影響の多くは、CNSにおけるインスリンまたはIGF-Iの結合の低下によって媒介されうると考えられる。側頭皮質、視床下部および小脳の膜タンパク質抽出物をトレーサーとして［125I］で標識したインスリン、IGF-IまたはIGF-IIとともに、過剰な非放射性リガンドの存在下または非存在下でインキュベートすることによって、平衡結合アッセイを行った。それらの試験により、側頭皮質および小脳よりも視床下部においてインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体結合（fmol／mg）がより高レベルであることが示された（図6）。慢性的にエタノールを与えることは、側頭葉、視床下部および小脳においてインスリンおよびIGF-I受容体結合を有意に低下させた（図6A〜6F）。加えて、IGF-II受容体結合は対照ラットと比較してエタノール曝露の小脳において有意に低く（図6I）、一方、側頭葉および視床下部ではIGF-II受容体結合がエタノール曝露群において相対的に保持されていた（図6G〜6H）。
【００９２】
有効なリガンド結合はシグナル伝達カスケードにとって決定的に重要であり、ニューロン生存性の低下を含む、インスリンシグナル伝達に対するエタノールの下流での有害な影響に関して以前に報告されているものの多くは、CNSにおけるインスリンまたはIGF-Iの結合の障害によって媒介されうると考えられる。平衡結合アッセイにより、最も高レベルのインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体結合は視床下部でみられることが示されたが、このことはこれらの受容体の高度の発現レベルに一致する。慢性的エタノール曝露は、側頭葉、視床下部および小脳におけるインスリンおよびIGF-I受容体結合、ならびに小脳におけるIGF-II受容体結合のレベルを顕著に低下させた。このことは、慢性的エタノール曝露が成体脳のさまざまな領域でインスリンおよびIGF-1シグナル伝達機構を阻害することを示唆する。重要なこととして、小脳におけるインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体結合の阻害はニューロン損失の組織病理学的証拠を伴っていたが、一方、他の2つの領域では、慢性的酸化損傷の証拠はあるにもかかわらず組織構築は相対的に保持されていた。
【００９３】
側頭葉および視床下部におけるIGF-II受容体結合の相対的保持と、それと相対してのIGF-II受容体の発現低下は、機能的なIGF-IIシグナル伝達を保持するために代償機構が生じていることを示している。これらの結果は、妊娠中のエタノールに対する慢性的曝露がインスリンおよびIGF-I受容体結合をIGF-II受容体結合を上回る程度で障害させ、これに相対して受容体mRNA発現はわずかな低下（以下を参照）であったという点で、実験的FASモデルで得られたものと類似している。重要なこととして、本明細書および以前の研究による知見は、細胞生存およびエネルギー代謝のために必要なインスリンおよびIGFのシグナル伝達のエタノール性阻害が、受容体結合のレベル、すなわちシグナル伝達カスケードの中で最も基部の箇所で媒介されることを示唆する。さらに、これらの総合的な結果は、特に持続的な酸化ストレスおよびインスリン／IGF-I抵抗性という状況下での、発達中の脳および成熟脳の両方におけるニューロン生存および機能のメディエーターとしてIGF-IIシグナル伝達経路が重要である可能性を強く示すものである。
【００９４】
実施例6
アセチルコリン恒常性におけるエタノール媒介性障害
アセチルコリンはCNSの認知系および運動系において主要な機能的役割を果たしている。アセチルコリン産生はコリンおよびアセチル-Co-Aの十分な供給を必要とする。アセチル-Co-Aはエネルギー代謝によって産生されるが、それはインスリンおよびIGF-I刺激によって主導される。最近の研究では、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）の発現はインスリンおよびIGF-I刺激によって調節されることが実証されている（Minana et al., J. Neurochem. 75:954 (2000)）。このため、インスリンおよびIGF-Iシグナル伝達機構のエタノール性阻害がChATの欠乏を伴うか否かを明らかにすることが関心の対象となった。アセチルコリンの定常レベルはアセチルコリンエステラーゼ（AChE）による負の調節を受けるため、AChE mRNAレベルを測定することも関心の対象となった。リアルタイム定量的RT-PCR試験により、ChAT mRNA発現の平均レベルは視床下部（図7B）および小脳（図7C）では有意に低下するが、側頭葉（図7A）ではそうでないことが実証された。これに対して、慢性的にエタノールを与えることは、調べた3つの脳領域のいずれにおいてもAChEの発現は有意に変化させなかった（図7D〜7F）。
【００９５】
ChAT発現がインスリンおよびIGF-I刺激によって調節されること、ならびにアセチルコリンがCNSの認知機能および運動機能を媒介する主要な神経伝達物質であることから、インスリンおよびIGFシグナル伝達に対するエタノールの阻害的影響が成体脳におけるアセチルコリン恒常性を障害させるか否かを明らかにすることが関心の対象となった。リアルタイム定量的RT-PCR試験により、エタノール曝露下では対照の視床下部および小脳と比較してChAT発現が低下することが実証された。ChAT発現はエタノール曝露させた側頭葉でも低下したが、対照との差は統計学的有意性に達しなかった。これらの結果は、エタノール摂取ラットの脳におけるインスリンおよびIGF-I受容体結合の広範な障害という所見に一致する。ChAT発現の低下はアセチルコリン生合成の不足をもたらしうると考えられ、AChE発現の代償性低下がなければアセチルコリン恒常性が有害な擾乱を受けると考えられる。
【００９６】
これらの総合的な結果は、慢性的エタノール消費が、成体脳における、ニューロン損失、ニューロン機能障害および酸化ストレス／脂質過酸化の増大によって特徴づけられる神経変性を引き起こすことを実証している。ニューロンの酸化ストレスは細胞損失よりも顕著であり、このことは脳内の残りのニューロンの多くが、組織学的には無傷であるものの、ChAT遺伝子発現の有意なレベル低下によって示されるような重大な機能不全を有していたことを示唆する。慢性的エタノール曝露によって生じるアセチルコリン恒常性の不全は認知機能および運動機能を障害させ、それにより、慢性的アルコール依存患者で高頻度に観察されるCNS障害に寄与しうると考えられる。これらの試験の結果は、エタノール誘発性ニューロン損失および神経変性が、2つの異なるものの部分的に重複する機序によって媒介されることを示唆する：1）インスリン／IGF-1抵抗性、これは主として受容体結合の障害によってもたらされる；ならびに2）脂質過酸化およびDNA損傷によって媒介される酸化ストレスの増大。最近、エタノールにより障害されるインスリン受容体およびIGF-I受容体に対する結合が、細胞膜からのコレステロール枯渇およびそれに付随する対応する受容体チロシンキナーゼ活性化の低下と関連づけられている（Soscia et al., Cell. Mol. Life Sci., in press (2006)）。ニューロン損失およびニューロン機能障害のほぼ同一なメディエーターが、FAS（以下を参照）およびアルツハイマー型神経変性の実験モデルにおける小脳形成不全との関連で、ならびにアルツハイマー病のヒト脳において同定されていることは注目に値する。
【００９７】
実施例7
ヒトにおける慢性的エタノール曝露に関する一般的方法
対照例および慢性的アルコール依存患者からのヒトの死後貯蔵脳組織を、オーストラリアのシドニー大学組織資源センター（Tissue Resource Center at the University of Sydney）から入手した。症例はすべて慢性的エタノール乱用の証拠が文書記録されており、他の薬物乱用の証拠はない。対照被験者は年齢および性別に関して合致し、エタノール消費が低レベルであることが文書記録されているものとした。2つの脳領域を調べた：小脳皮質（前上虫部領域）および前頭葉内の前帯状回。これらの領域を試験のために選択した理由は、それらがエタノール神経毒性の主な標的であるためである。これらの領域のホルマリン固定してパラフィン包埋した切片をヘマトキシリンおよびエオシン色素で染色し、光学顕微鏡法により検査した。隣接組織切片は免疫組織学的染色に供した。同じ領域からの組織の未加工の急速凍結ブロックをmRNA発現および受容体結合の測定のために用いた。
【００９８】
組織学的試験、RT-PCRアッセイおよび受容体結合アッセイは実施例1に記載した通りに行った。ヒト遺伝子を検出するためのPCRプライマーは表2に列記されている。
【００９９】
（表２）
2010502719.tif 000006
2010502719.tif 000007
【０１００】
実施例8
慢性的エタノール消費による、成体脳における神経変性の発生
ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した切片により、慢性的アルコール依存患者の小脳皮質における構造異常が実証された。これらの異常には、プルキンエ細胞の斑状損失、内顆粒層の内部の細胞密度の低下およびバーグマングリアの増殖が含まれた。これに対して、帯状回では、アルコール依存患者における細胞損失の明らかな証拠を含め、明確な組織病理学的異常がみられなかった。隣接切片の免疫組織化学染色により、アルコール依存患者におけるGFAPおよびHNEに対する細胞標識の著しい増加、ならびに8-OHdGに対する限局的な免疫反応性の増加が判明した。アルコール依存患者の小脳では、顆粒層、および皮質の下層をなす白質中核においてGFAP免疫反応性の増加が検出され、脂質過酸化を反映するHNE免疫反応性の増加は、皮質のプルキンエ細胞層および顆粒細胞層ならびに皮質下白質に局在していた。これに対して、8-OHdG免疫反応性は、アルコール依存患者において、小脳皮質のプルキンエ層および顆粒層の内部の散在性細胞ならびに皮質下白質で検出された。
【０１０１】
前帯状回では、明白な細胞損失はみられないにもかかわらず、GFAPおよびHNE免疫反応性の顕著な増加が、皮質および皮質下白質の両方で観察された。HNE免疫反応性はニューロンの核および細胞質で検出されたが（位置、サイズ（直径10〜16ミクロン）およびその錐状形に基づく）、灰白質および白質構造の両方に分布したグリアおよび内皮細胞を含む他の細胞種もHNE陽性であった。HNEとは対照的に、DNA損傷を反映する8-OHdG免疫反応性の増加は、皮質および白質の内部の散在性細胞のみで検出された。8-OHdG免疫反応性の増加の分布は隣接切片におけるHNEのそれと部分的に重複しており、このことはエタノール媒介性DNA損傷がニューロンのほかに脳内の他の細胞種でも起こったことを示している。
【０１０２】
成人の慢性的アルコール依存患者において、CNS変性は、小脳萎縮、大脳白質萎縮、ならびに視床下部、視床、海馬および前頭皮質の内部のニューロンの損失または機能障害によって特徴づけられる。これらの異常にはさまざまな度合いの認知障害および運動障害が伴い、重症例では痴呆が伴ってみられる。慢性的にエタノールを与えることの実験モデルでは、CNS神経変性は明白な細胞損失を伴い、これは小脳皮質におけるHNEおよび8-OHdGに対する免疫反応性の増加を伴う（Soscia et al., Cell. Mol. Life Sci., in press (2006)）。本試験では、慢性的アルコール依存患者の小脳皮質におけるニューロン損失およびグリオーシスの組織病理学的証拠が検出され、これらの変化はHNEおよび8-OHdGに対する免疫反応性の増加を伴ったが、このことは脂質過酸化およびDNA損傷の増大を反映している。アルコール依存患者の脳の帯状回におけるGFAP（グリオーシス）、HNEおよび8-OHdG免疫反応性の増加は、その領域が慣行的な組織病理学的検査によっては明らかな神経変性の証拠を呈しなかったことから、関心の対象となった。このことは、慢性的アルコール乱用が脂質過酸化およびDNA損傷によって媒介される慢性的酸化ストレスを引き起こし、そのために神経変性の発現の前にニューロン機能が障害されることを示唆する。加えて、エタノール媒介性の慢性的酸化ストレスは、CNSニューロンを、正常な脳であれば必ずしも永続的な損傷または神経変性を引き起こさないと考えられる、低酸素または虚血といった「第2の打撃（second hits）」に対してより脆弱にする可能性もある。
【０１０３】
実施例9
細胞種におけるエタノール誘発性病的変移
慢性的アルコール乱用が帯状回および小脳虫部の内部の細胞集団における病的変移を引き起こしたか否かを明らかにするために、リアルタイム定量的RT-PCRを用いて、Huニューロン性リボソームRNA結合タンパク質（Datta et al., Cell 91:231(1997)；Hetman et al., J. Neurosci. 20:2567(2000)；Dudek et al., Science 275:661(1997)）、オリゴデンドログリアに関するミエリン結合糖タンパク質-1（MAG-1）、アストロサイトに関するグリア酸性線維素タンパク質（GFAP）、内皮細胞に関するエンドセリン-1（ET-1）、およびミクログリアに関するアログラフト抑制因子-1（AIF-1）をコードするmRNA転写物を測定した。検出された各々の特異的mRNA転写物のng量を、同一の試料中で測定された18S RNAレベルに対して標準化し、各群当たり9匹の動物からの結果を統計学的に分析した。この試験により、小脳ではHu遺伝子発現のエタノールに関連した低下がみられるが帯状回ではみられないこと、ならびに帯状回および虫部の両方でのGFAP発現の有意な増大が示された。ET-1発現は帯状回では有意に低下し、小脳では増大した。これに対して、MAG-1、AIF-1および18S rRNAの平均レベルに関して、慢性的アルコール乱用に伴う有意な変化は認められなかった。
【０１０４】
アルコール依存患者の脳において、神経変性の組織病理学的および／または免疫組織学的な指標は、帯状回および小脳虫部の内部の脳細胞集団における病的変移と関連していた。本試験では、ニューロン、オリゴデンドログリア、アストロサイト、内皮細胞およびミクログリアの割合を推算するために、同一の組織試料におけるHu、MAG-1、GFAP、ET-1およびAIF-1のそれぞれの相対的mRNA発現レベルを比較することによる新規なアプローチを利用した。
【０１０５】
調べた脳領域はどちらもエタノール神経毒性の公知の標的であるが、慢性的アルコール乱用の有害作用は細胞損失および代償性反応に関して不均一であった。帯状回では、慢性的アルコール乱用は血管内皮細胞の損失（ET-1遺伝子発現の低下）をもたらし、アストロサイト（GFAP発現）集団を相対的に増加させた。小脳虫部では、Huの発現低下はニューロン損失に対応し、GFAPおよびET-1の発現増加はアストロサイトおよび血管内皮細胞の存在量または活性化の増大に対応する。このように、慢性的アルコール乱用は、異なる脳領域の内部では神経毒性および細胞損失の点で異なる影響を及ぼした。重要なこととして、これらの所見は、同じ構造物でHNEおよび8-OHdG免疫反応性の増加が観察されていることと併せて考えると、小脳および帯状回がエタノール媒介性神経毒性に対して非常に脆弱な標的であることを示唆する。エタノールのこれらの有害作用は、慢性的アルコール依存患者で起こる進行性の認知障害および運動障害の原因になりうると考えられる。
【０１０６】
分子的な細胞プロファイリング試験からも、慢性的アルコール依存患者の脳ではMAG-1遺伝子発現が有意に低下していないことが実証された。慢性的アルコール依存患者において白質萎縮の発生頻度が高いこと、およびアルコール依存患者の脳におけるミエリン関連遺伝子の発現の低下が以前に実証されていることを考慮すれば、アルコール依存患者ではMAG-1 mRNAレベルの有意な低下が認められると予想されたことであろう。しかし、この観察所見の不一致に関して考えられる可能性の高い一つの説明は、分析した帯状回および小脳虫部組織が灰白質構造物から得られ、このため白質に関してはわずかしか含まれなかったというものである。この点は、小脳においてHuがMAG-1と比較してより高レベルであったこと、ならびに帯状回組織試料におけるHuおよびMAG-1のレベルが同程度であったことによってある程度裏づけられる。
【０１０７】
実施例10
インスリン、IGF-IおよびIGF-IIポリペプチド、ならびにインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体のmRNA発現に対するエタノールの影響
リアルタイム定量的RT-PCR試験により、対照例およびアルコール依存患者の脳の両方において、インスリン、IGF-IおよびIGF-IIポリペプチドならびにインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体に対応するmRNA転写物が検出された（図8および9）。対照脳では、インスリン遺伝子およびIGF-II遺伝子の発現は小脳虫部よりも帯状回において高度であり、一方、IGF-1 mRNAレベルはこの2つの構造物において同程度であった（図8）。全体的には、IGF-IIはインスリンおよびIGF-Iよりも大量に発現された。慢性的アルコール乱用は、帯状回および小脳虫部におけるインスリン遺伝子発現（図8A〜8B）ならびに小脳におけるIGF-I発現の平均レベルを有意に低下させたが、帯状回ではそうではなかった（図8C〜8D）。興味深いことに、IGF-II mRNAレベルはアルコール依存患者の小脳では有意に増大したが、帯状回ではそうではなかった（図8E〜8F）。
【０１０８】
対照脳では、インスリン受容体遺伝子およびIGF-I受容体遺伝子の平均発現レベルは、帯状回よりも小脳において高かった（図9A〜9D）。これに対して、IGF-II受容体発現は小脳虫部と比較して帯状回の方が幾分高度であった（図9E〜9F）。帯状回では、IGF-II受容体発現が最も高度であり、続いてIGF-I、さらにインスリンの順であった。小脳虫部では、IGF-I受容体発現が最も高度であり、続いてIGF-II受容体、さらにインスリン受容体の順であった（図9）。慢性的アルコール乱用は、帯状回および小脳虫部におけるインスリン受容体遺伝子発現（図9A〜9B）、 小脳におけるIGF-I受容体発現（図9C〜9D）ならびに帯状回におけるIGF-II受容体発現（図9E〜9F）を有意に低下させた。これに対して、慢性的アルコール乱用は、帯状回におけるIGF-I受容体および小脳におけるIGF-II受容体の発現を有意に変化させなかった。
【０１０９】
実施例11
慢性的アルコール依存患者の脳において元のまま保たれるインスリン受容体基質（IRS）遺伝子発現
成長因子により刺激される、IRS分子を通じてのシグナル伝達に対する主な応答には、細胞の成長および生存性の増加、ならびにアポトーシスの阻害が含まれる（Eves et al., Mol. Cell. Biol. 18:2143 (1998)；Condorelli et al., Mol. Cell. Biol. 21:3025 (2001)；Halestrap et al., Biochem. Soc. Trans. 28:170 (2000)；Hirsch et al., Cell. Biol. Toxicol. 14:141 (1998)；Xu et al., J. Biol. Chem. 278:26929 (2003)；Yeon et al., Hepatology 38:703 (2003)；Dahia et al., Hum. Mol. Genet. 8:185 (1999)；Urso et al., Life Sci. 28:1053 (1981)）。インスリン／IGF-Iによって活性化されるシグナル伝達経路の完全性を検討するために、IRS-1、IRS-2およびIRS-4 mRNA転写物のレベルを測定した。IRS-3については調べなかったが、これはこのアイソフォームが齧歯動物の脂肪組織でのみ発現されるためである。リアルタイム定量的RT-PCRにより、対照例および慢性的アルコール依存患者の脳の両方においてIRS-1、IRS-2およびIRS-4 mRNA転写物が検出された（図10）。対照の帯状回組織では、IRS-1発現が最も高度であり、続いてIRS-2、さらにIRS-4の順であった（図10A、10C、10E）が、小脳虫部では、IRS-2およびIRS-1が同程度に多く、IRS-4は最も少なく発現された（図10B、10D、10F）。慢性的アルコール乱用は、帯状回および小脳虫部のいずれにおいても、IRS-1、IRS-2およびIRS-4の平均レベルに対して有意な影響を及ぼさなかった。
【０１１０】
リアルタイム定量的RT-PCR試験により、帯状回および小脳虫部においてインスリン、IGF-I、IGF-II、それらの対応する受容体、ならびにIRS-1、IRS-2およびIRS-4に対応するmRNA転写物が示され、このことはインスリンおよびIGFシグナル伝達に必要なこれらの遺伝子が成人脳で発現されることを示している。対照脳では、IGF-IおよびIGF-IIポリペプチドの遺伝子はインスリンよりもはるかに高いレベルで発現され、帯状回ではIGF-IIが支配的な（最も量の多い）成長因子であったが、小脳ではIGF-Iが最も大量に発現された。慢性的アルコール依存患者ではこの両方の領域でインスリン遺伝子発現レベルが低下しており、小脳でIGF-I発現が低下していた。小脳ではHuの発現低下を伴うニューロン損失が明白であったが帯状回ではそうでなかったため、ニューロン生存はインスリンおよびIGF-Iシグナル伝達の両方を通じての無傷のシグナル伝達によって媒介される可能性が高い。この点は、インスリンシグナル伝達のエタノール性阻害によって引き起こされるニューロン生存障害をIGF-I投与によって部分的に解消しうることを実証した以前の実験データによって裏づけられる。インスリン遺伝子およびIGF遺伝子の発現に対するエタノールの阻害的影響の違いは、ヒトにおいて慢性的アルコール乱用に伴って生じるニューロン損失の領域特異的な違いの一因である可能性がある。
【０１１１】
IGF-IIシグナル伝達機構に関してCNSでの十分な検討は行われていないが、他の組織および細胞種における最近の研究から、IGF-IIが自らの受容体と相互作用し、G共役型タンパク質シグナル伝達を介してPI3キナーゼ-Aktを活性化することによって、細胞生存を媒介しうることが実証されている。または、IGF-IIはインスリン受容体およびIGF-I受容体と結合し、インスリン受容体基質依存的な機構を通じて成長および生存のシグナル伝達経路を活性化することもできる。このため、小脳におけるエタノールを介したIGF-II発現の増大は、インスリンおよびIGF-Iの離脱という状況下でニューロン生存を促進する一助になると考えられる、良い方向の代償性反応になりうると考えられる。
【０１１２】
インスリン受容体およびIGF-I受容体は、帯状回よりも小脳においてより大量に発現され、一方、IGF-II受容体は小脳よりも帯状回の方が多かった。慢性的アルコール乱用の主な影響は、帯状回および小脳虫部におけるインスリン受容体発現、小脳におけるIGF-I受容体発現、ならびに帯状回におけるIGF-II受容体発現のレベルを低下させることであった。インスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体発現のレベルの低下は、これらの受容体を保有する細胞の損失を反映している可能性がある。脳におけるインスリン受容体発現細胞の損失はインスリン抵抗性に寄与し、インスリン応答性遺伝子の発現の低下をもたらす。IGF-I受容体およびIGF-II受容体を発現する細胞の損失はニューロンの生存および可塑性に有害な影響を及ぼしうると考えられる。例えば、IGF-IおよびIGF-II受容体を通じてのシグナル伝達は、IRS経路またはG共役型タンパク質シグナル伝達機構を介してPI3キナーゼ-Aktを活性化することができる。PI3キナーゼ-Akt経路は、ニューロンの生存、および可塑性のために必要な神経突起伸長を刺激する上で決定的な役割を果たす。
【０１１３】
インスリン受容体およびIGF-I受容体の下流での成長、生存および代謝のシグナルの伝達に決定的な役割を果たすインスリン受容体基質遺伝子の分析により、慢性的アルコール乱用はIRS-1、IRS-2またはIRS-4の発現レベルに対して有意な影響を及ぼさないことが実証されている。この結果は、発達中の小脳においてIRS-1、IRS-2および／またはIRS-4の顕著な減少が検出されている、FASの実験モデルにおける所見とは対照的である（以下を参照）。このため、インスリンおよびIGFのシグナル伝達の障害がカスケード中の複数のレベルで起こるFASとは対照的に、成人アルコール依存患者の脳における主要な異常は、成長因子および成長因子受容体の発現および機能に関連した、すなわち、シグナル伝達カスケード内部の基部の箇所での問題に端を発するように思われる。
【０１１４】
実施例12
エタノールによるインスリン受容体およびIGF受容体の結合の障害
成長因子および成長因子受容体の発現に対する慢性的エタノール乱用の影響にばらつきがあったことから、アルコール依存患者の脳が別の機構を通じてのインスリン／IGFシグナル伝達の障害を有しうるか否かを明らかにすることが関心の対象となった。有効なリガンド結合はインスリンおよびIGFのシグナル伝達カスケードにとって決定的に重要であり、ニューロン生存性の低下を含む、エタノール曝露ラット脳で報告されているインスリンシグナル伝達障害の下流での影響の多くは、CNSにおけるインスリンまたはIGF-Iの結合の低下によって媒介されうると考えられる。帯状回および小脳虫部の膜タンパク質抽出物を、トレーサーとして［125I］で標識したインスリンIGF-IまたはIGF-IIとともに、過剰な非放射性リガンドの存在下または非存在下でインキュベートすることによって、平衡結合アッセイを行った。それらの試験により、IGF-II受容体の結合（fmol／mg）がIGF-I受容体およびインスリン受容体の結合と比較してより高レベルであること、ならびにインスリン受容体に対する結合が最も低いレベルであることが示され、これは帯状回および虫部のいずれにおいてもインスリン受容体発現のレベルが相対的に低いことに一致した（図11）。慢性的アルコール乱用は、帯状回および小脳虫部におけるインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体結合を有意に低下させた（図11A〜11F）。
【０１１５】
有効なリガンド結合はシグナル伝達カスケードにとって決定的に重要であり、ニューロン生存性の低下を含む、インスリンシグナル伝達に対するエタノールの下流での有害な影響に関して以前に報告されているものの多くは、CNSにおけるインスリンまたはIGF-Iの結合の障害によって媒介されうると考えられる。平衡結合アッセイにより、慢性的アルコール依存患者の脳では帯状回および小脳虫部の両方においてインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体結合レベルが有意に低下していることが示された。このことは、慢性的エタノール乱用が脳のさまざまな領域でインスリン、IGF-1およびIGF-IIシグナル伝達機構を障害させることを示唆する。重要なこととして、小脳におけるインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体結合の阻害はニューロン損失の組織病理学的証拠を伴っていたが、一方、帯状回では、慢性的酸化損傷の証拠はあるにもかかわらず組織構築は相対的に保持されていた。これらの違いは、帯状回におけるIGF-IおよびIGF-II受容体結合の低下が小脳虫部と比較して小さいことに起因する可能性がある。重要なこととして、本明細書および以前の研究による知見は、細胞生存およびエネルギー代謝のために必要なインスリンおよびIGFのシグナル伝達のエタノール性阻害が、受容体結合のレベル、すなわちシグナル伝達カスケード内部で最も基部の箇所で媒介されることを示唆する。さらに、これらの総合的な結果は、慢性アルコール性脳疾患におけるニューロン生存障害および永続的酸化ストレスのメディエーターとしてのインスリンならびにIGF抵抗性の重要性を強く示すものである。
【０１１６】
実施例13
アセチルコリン恒常性におけるエタノール媒介性障害
アセチルコリンはCNSの認知系および運動系において主要な機能的役割を果たしている。アセチルコリン産生はコリンおよびアセチル-Co-Aの十分な供給を必要とする。アセチル-Co-Aはエネルギー代謝によって産生されるが、それはインスリンおよびIGF-I刺激によって主導される。最近の研究では、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）の発現はインスリンおよびIGF-I刺激によって調節されることが実証されている（Minana et al., J. Neurochem. 75:954 (2000)）。このため、インスリンおよびIGFのシグナル伝達機構のエタノール性阻害がChATの欠乏を伴うか否かを明らかにすることが関心の対象となった。アセチルコリンの定常レベルはアセチルコリンエステラーゼ（AChE）による負の調節を受けるため、AChE mRNAレベルを測定することも関心の対象となった。リアルタイム定量的RT-PCR試験により、ChAT mRNA発現の平均レベルは帯状回（図12A）および小脳虫部（図12B）で有意に低下していることが実証された。加えて、アルコール依存患者では、AChE発現も帯状回では有意に低下していたが（図12C）、小脳虫部では統計学的に有意ではないものの増大していた（図12D）。
【０１１７】
ChAT発現がインスリンおよびIGF-I刺激によって調節されること、ならびにアセチルコリンがCNSの認知機能および運動機能を媒介する主要な神経伝達物質であることから、インスリンおよびIGFシグナル伝達に対するエタノールの阻害的影響が脳内でのアセチルコリン恒常性を障害させるか否かを明らかにすることが関心の対象となった。リアルタイム定量的RT-PCR試験により、アルコール依存患者の帯状回および小脳虫部におけるChAT発現の低下が実証された。これらの結果は、アルコール依存患者の脳におけるインスリンおよびIGF-I受容体結合の障害という所見に一致する。ChAT発現の低下はアセチルコリン生合成の不足をもたらしうると考えられ、AChE発現の代償性低下がなければアセチルコリン恒常性が有害な擾乱を受けると考えられる。この点に関して、アルコール依存患者では帯状回におけるAChE発現が有意に低く、一方、小脳ではアルコール依存患者におけるAChE発現がより高度であったこと（その差は統計学的な有意性には達しなかったが）は注目に値する。これらの所見は、ある程度の代償が帯状回で生じており、それがその領域におけるアセチルコリン恒常性を回復させる一助となり、それによって認知機能を保持させる一助になりうるという可能性を示唆する。しかし、小脳虫部に関しては、AChEのレベルの上昇がアセチルコリン恒常性をさらに障害させ、運動障害の悪化をもたらしうると考えられる。
【０１１８】
これらの総合的な結果は、慢性的アルコール乱用が、成人脳における、ニューロン損失、ニューロン機能障害および酸化ストレス／脂質過酸化の増大によって特徴づけられる神経変性を引き起こすことを実証している。ニューロンの酸化ストレスは細胞損失よりも顕著であり、このことは脳内の残りのニューロンの多くが、組織学的には無傷であるものの、ChAT遺伝子発現の有意なレベル低下によって示されるような重大な機能不全を有していたことを示唆する。慢性的エタノール乱用によって生じるアセチルコリン恒常性の不全は認知機能および運動機能を障害させ、それにより、慢性的アルコール依存患者で高頻度に観察されるCNS障害に寄与しうると考えられる。これらの試験は、エタノール誘発性ニューロン損失および神経変性が、2つの異なるものの部分的に重複する機序によって媒介されることを示唆する：1）インスリン／IGF-1抵抗性、これは主として受容体結合の障害によってもたらされる；ならびに2）脂質過酸化およびDNA損傷によって媒介される酸化ストレスの増大。最近、エタノールにより障害されるインスリン受容体およびIGF-I受容体に対する結合が、細胞膜からのコレステロール枯渇およびそれに付随する対応する受容体チロシンキナーゼ活性化の低下と関連づけられている（Soscia et al., Cell. Mol. Life Sci., in press (2006)）。ニューロン損失およびニューロン機能障害のほぼ同一なメディエーターが、FAS（以下を参照）およびアルツハイマー型神経変性の実験モデルにおける小脳形成不全との関連で、ならびにアルツハイマー病（AD）のヒト脳において同定されていることは注目に値する。アルコール性脳疾患をADと区別するものは、アルツハイマー病においては、根本的問題がCNSのインスリンおよびIGF離脱、ならびにこれらの栄養因子に応答する細胞のその後の変性および損失に集約されるということである。アルコール性脳疾患では、対応する受容体に対する結合の障害によって媒介されるインスリン／IGF抵抗性が、成長、生存および代謝のカスケードを通じてのシグナル伝達を低下させる。いずれの疾患過程も持続的な酸化ストレスをもたらす。ADでは、酸化ストレスはアミロイド前駆体タンパク質の発現増大、アポトーシス促進性遺伝子の活性化およびミトコンドリア機能障害と関連しており、一方、慢性的エタノール曝露では、酸化ストレスはエタノールの毒性作用またはその主な中間代謝産物であるアセトアルデヒドによって媒介される可能性が高い。
【０１１９】
実施例14
妊娠期間中の慢性的エタノール曝露のラットモデルに関する一般的方法
妊娠したLong-Evansラットに対して、エタノールがカロリー含有量の0％、8％、18％、26％または37％と等価である0％、2％、4.5％、6.5％、9.25％（v／v）を構成する等カロリー液体飼料（BioServ, Frenchtown, N.J.）を与えた。慢性的エタノール曝露のインビボモデルを作製するためには、これらの濃度のエタノールが一般的に用いられる（Vander Top et al., Alcohol Clin. Exp. Res. 29:882 (2005)）。これらの液体飼料を妊娠第6日に開始し、全妊娠期間にわたって継続した。同等な食物消費および体重の維持を確かなものとするためにラットを毎日モニターした。小脳はエタノール神経毒性の主な標的であるため（Maier et al., Alcohol 23:49 (2001)；Maier et al., Alcohol Clin. Exp. Res. 23:726 (1999)；Mohamed et al., I. Cytol. Exp. Neurol. 97:35 (1987)）、小脳を用いて、発達中のCNSにおけるインスリンおよびIGFシグナル伝達に対する、妊娠中のエタノールに対する慢性的曝露の影響を検討した。出生直後に採取した未加工の組織をドライアイス-メタノール浴中で急速凍結させ、mRNAおよびタンパク質の試験のために-80℃で保存した。加えて、小脳をHistochoice固定液（Amresco Corp., Solon, OH）中で浸漬固定してパラフィン中に包埋した。組織切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、光学顕微鏡法によって検査した。
【０１２０】
受容体チロシンキナーゼアッセイ：
インスリン受容体またはIGF-I受容体の分子を、ウサギポリクローナル抗体（1μg／ml）およびプロテインAセファロース（Amersham-Pharmacia, Arlington Heights, IL）を用いて個々の100μgタンパク質試料から免疫沈降させた（Ausubel et al., (2002) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons New York）。非放射性アッセイ（Chemicon International, Temecula, CA）を製造元のプロトコールに少し変更を加えたものに従って用いて、免疫沈降物における受容体チロシンキナーゼ活性を測定した。手短に述べると、ストレプトアビジンをコーティングしたウェル上に捕捉させたビオチン化合成ペプチド基質のチロシンリン酸化を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ホスホ-チロシンおよびSuperSignal West Pico化学発光性基質（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）を用いて検出した。発光はTopCount装置（Packard Instrument Co., Meriden, CT）にて測定した。プロテインA上に捕捉された免疫沈降物を、チロシンキナーゼ活性のレベルを反応物中の受容体タンパク質の含有量に対して標準化する目的で、デンシトメトリーを用いるウエスタンブロット法に供した。
【０１２１】
ニューロン培養物を用いるインビトロ試験：
インビトロ実験を用いて、小脳ニューロンにおける受容体結合ならびにコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）およびアセチルコリンエステラーゼ（AChE）の発現に対するエタノールの影響を検討した。初代ニューロン培養物を生後第8日のラット仔小脳組織（Nikolic et al., Genes Dev. 10:816 (1996)）から作製した。培養物は、5％ウシ胎仔血清、4mMグルタミン、100μM非必須アミノ酸混合物（Gibco-BRL, Grand Island, NY）、25mM KClおよび9g／Lグルコースを補充したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中に維持した。エタノール処置は、培養物（6ウェル培養皿または96ウェルプレートに播いた）を、50mMエタノールをリザーバートレイから気化させた密封チャンバー内に入れることによって達成した（de la Monte et al., Alcohol Clin. Exp. Res. 24:716 (2000)；Banerjee et al., Alcohol Clin. Exp. Res. 22:2093 (1998)）。対照培養物は、リザーバートレイに水を加えた点を除いて全く同じく処置した。チャンバーには75％窒素、20％酸素および5％二酸化炭素を含む気体を流した。37℃での96時間のインキュベーション後に、細胞を収集してインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体結合に関して測定した。または、細胞を12時間血清欠乏状態においた後に10nmインスリン、10nM IGF-I、25nM IGF-IIまたは媒体により16時間刺激して、RNAを収集してChATおよびAChEの発現を測定した。成長因子により10分間刺激した同時並行的な96ウェル培養物をATPの測定のために用いるか、または16時間刺激したものを生存度およびChATまたはAChEの免疫反応性を測定するために用いた。受容体結合に関連した膜コレステロール含有量の役割を調べるためには、対照細胞およびエタノール曝露細胞を媒体、ロック緩衝液（154mM NaCl、5.6mM KCl、2.3mM CaCl2、1.0mM MgCl2、3.6mM NaHCO3、5mM グルコース、5mM Hepes、pH 7.4）中にある10mMメチル-β-シクロデキストリン（MβCD）または10mMの水性可溶性コレステロールによって3時間処置し、その後に収集して結合アッセイを行った。成長因子による刺激下でのニューロン生存度および機能に対する膜コレステロール含有量の影響を検討するためには、全く同じく処置した96ウェル培養物を媒体、10nMインスリン、10nM IGF-Iまたは25nM IGF-IIにより10分間刺激し、その後にATP含有量に関して分析するか、または16時間刺激したものを生存度およびChATまたはAChEの免疫反応性に関してMICEアッセイを用いて測定した（de la Monte et al., Biotechniques 26:1073 (1999)）。ATP含有量はATPLiteアッセイ（Packard, Meriden, CT）を用いて測定した。生存度はCyQuantアッセイ（Molecular Probes, Eugene, OR）。免疫反応性は、マイクロタイター免疫細胞化学ELISA（MICE）アッセイ（de la Monte et al., Biotechniques 26:1073 (1999)）を用いて培養ウェル中にて直接測定した。
【０１２２】
コレステロールアッセイ：
コレステロール含有量は、Amplex Redアッセイキット（Molecular Probes, Eugene, Oregon）を製造元のプロトコールに従って用いて測定した。予備的試験により、脂質（クロロホルム：メタノール）抽出物におけるコレステロールレベルおよび群間差は、製造元が示しているRIPA緩衝液抽出物中で測定したものと同程度であった。このため、組織試料の脂質抽出物による分析を行う必要はなかった。手短に述べると、組織ホモジネートを上記の通りにRIPA緩衝液中に調製した。1×反応緩衝液（キットに付属）中に系列希釈した試料を、100μlの最終反応容積中にて、150μM Amplex Red試薬、1U／ml西洋ワサビペルオキシダーゼ、1U／mlコレステロールオキシダーゼおよび0.1U／mlコレステロールエステラーゼとともにインキュベートした。反応物を37℃で30分間インキュベートし、蛍光をFluorocountマイクロプレートリーダー（Packard Instrument Co., Meriden, CT）にて測定した（Ex 560nm／Em 590nm）。キットに付属のコレステロール標準物質を用いて標準曲線を同時に作成した。コレステロールのレベルを試料中のタンパク質濃度に対して標準化した。
【０１２３】
免疫組織化学染色、RT-PCRアッセイ（表1に列記したPCRプライマーを使用）および受容体結合アッセイは、実施例1に記載した通りに行った。
【０１２４】
実施例15
出生時体重および小脳発達に対する、妊娠中のエタノールに対する慢性的曝露の用量効果
8％、18％および26％エタノール群における仔の出生時体重は、対照と比較して有意に低くなかった。しかし、37％エタノールを含む食餌を与えた雌親からの仔は、平均体重が対照と比較して有意に低かった（P＜0.05；表4）。8％エタノール食餌群の仔は平均体重が対照と比較して高かったが（P＜0.01）、それにもかかわらず、CNS遺伝子発現および機能に関して他のエタノール曝露群と類似した複数の異常があり、このことは発達中のCNSにおけるエタノール誘発性神経毒性は出生時体重が正常でも高くても起こりうることを示唆している。低エタノール曝露群における出生時体重の増加に関して考えられる一つの解釈は、2型糖尿病患者の子孫に起こるものと同様に、仔が主としてインスリン抵抗性の影響を呈したというものである。用いた最高濃度のエタノールで達成された血中アルコールレベル（表3）は、ヒトにおいて中毒性であると法的にみなされ、救急処置のために救急治療室に搬送されたアルコール依存患者で以前に観察されている範囲内にあった（Fulop et al., Am. J. Med. 80:191 (1986)；Jagger et al., Neurosurgery 15:303 (1984)）。
【０１２５】
（表３）出生時体重に対する、妊娠中のエタノールに対する慢性的曝露の影響
2010502719.tif 000008
妊娠した雌親に対して、カロリー含有量に対するパーセンテージまたは（v／v）として種々の濃度のエタノールを含むLieber-DiCarli等カロリー液体飼料を妊娠第6日から与え、全妊娠期間にわたって継続した。仔の体重を出生後直ちに秤量した。母体血液を出産後に採取して血中アルコール濃度を測定した。データは結果の平均±S.D.を示している。データは、Tukey-Kramer post-hoc有意性検定を伴うANOVAを用いて統計学的に分析した。有意なP値は対照と比較した際のものである（*P＜0.05；**P＜0.005）。
【０１２６】
実施例16
細胞密度、細胞構築および細胞遊走に関係するエタノール用量依存的な構造異常
対照小脳は、外顆粒細胞および内顆粒細胞、プルキンエ細胞ならびに分子層および稠密な顆粒細胞層に対応する明瞭な境界を伴う、皮質の境界明瞭な小葉（ひだ形成）および層構造を有し、散在性のアポトーシス性（凝縮性または断片化）核はわずかであった。エタノール用量が増えるに伴って、小脳皮質小葉は進行性に単純化し、皮質層構造はより不明瞭になり、顆粒層内部の細胞密度は低下した（図13A、13D、13G、13J、13M）。皮質小葉の減少は皮質表面の平坦化および広幅化ならびに溝形成の限定（浅い溝）を伴っていた。皮質層の境界線の減少は、内顆粒細胞層およびプルキンエ細胞層の幅広化および不規則層構造、ならびに外顆粒細胞層および分子層の狭小化を伴っていた。外顆粒細胞層のより強拡大の像により、エタノール用量依存的な進行性の細胞密度低下が示された。37％エタノール群では、細胞損失およびアポトーシスが目立ち、残りの細胞種は、細胞の多くが神経芽の要素（高密度のクロマチンを伴う、密に並んだ小さな円形または長円形の核）ではなくグリアの形態学的特徴（薄い小嚢状の核）を有しているという点で、対照とは異なった（図13B、13E、13H、13Kおよび13N）。アポトーシスの前のDNA切断に対応する一本鎖DNAを検出するための免疫組織化学染色により、標識核の密度のエタノール用量依存的な増加が判明した（図13C、13F、13I、13L、13O）。しかし、37％エタノール群における顕著な細胞損失およびアポトーシスは核標識の相対的な低下を伴っており、これはおそらく多くの細胞が既にアポトーシスを起こしているためと考えられる。
【０１２７】
ヒトにおいて、高レベルのエタノールに対する慢性的な子宮内曝露は身体および脳の成長を障害させ、妊娠期間の割りに小さな乳児、小頭症、白質体積縮小、脳室拡大および注意欠陥多動性障害の発生率の増加をもたらす（Goodlett et al., Exp. Biol. Med. (Maywood) 230:394 (2005)）。加えて、大脳基底核および小脳における重大な構造的および機能的な異常が、FASおよび胎児アルコールスペクトル障害のヒト症例に伴ってみられる顕著な運動系障害の原因となっている。FAS誘発性小脳異常は、ニューロン形成、ニューロン生存、ニューロン付着およびニューロン遊走の障害を伴う（Goodlett et al., Exp. Biol. Med. (Maywood) 230:394 (2005)；Guerri, Alcohol Clin. Exp. Res. 22:304 (1998)；Lewis et al., Alcohol 20:195 (1985)）。FASの本実験モデルにおいて、51.1±11.9mMという母体血中エタノール濃度をもたらした比較的高レベルのエタノール（37％カロリー含有量または8.2％v／v）に対する妊娠中の慢性的曝露は、以前に報告されているように、平均出生時体重を有意に低下させ、子孫のCNS発達に対して著しい催奇形作用を及ぼした（Xu et al., J. Biol. Chem. 278:26929 (2003)）。種々のレベルの子宮内エタノール曝露を受けた仔の分析により、異なるエタノール用量でどの程度のエタノール誘発性CNS異常が生じるかに関する新たな情報が得られた。検討は小脳を的に絞ったが、これはそれがヒトおよび実験動物の両方においてエタノール神経毒性の主なCNS標的であるためである。
【０１２８】
インビボ試験からの結果により、段階的に用量を増やしたエタノール曝露に対する混合型応答が示された。エタノールの用量依存的な有害作用は、小脳発達、ニューロン遺伝子発現（ニューロン生存）、アストロサイトおよびミクログリア細胞の増殖、ATP含有量（エネルギー代謝）ならびにChATおよびAChEの発現に関して観察された。これに対して、ミエリン結合糖タンパク質遺伝子の発現、インスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体結合、ならびにインスリン受容体およびIGF-I受容体のチロシンキナーゼ活性は、低濃度または高濃度の食餌中エタノールに対する曝露後に同程度に低下し、すなわち、エタノールのこれらの有害作用は段階的ではなかった。このため、妊娠中のエタノールに対する慢性的曝露の転帰のうち用量依存的であるのは一部のみと考えられ、それらはニューロン生存障害およびそれに付随するアストロサイトの増殖、ならびに損傷に応答したミクログリア細胞の活性化と関連づけられるように思われる。一方、受容体結合の障害といったエタノール用量非依存的な異常は、エタノールおよび／またはその代謝産物の二次的毒性作用といった他の要因によって媒介される可能性があるが、これらの応答の機序を詳細に特徴づけるためにはさらなる研究が必要と考えられる。
【０１２９】
エタノール曝露を受けた仔の小脳は形成不全、細胞生存性の低下ならびにニューロン遊走の障害を呈し、これらの病変の重症度はエタノール用量と関連して段階的に変化した。組織病理学的試験により、エタノールに対する慢性的な子宮内曝露は、DNA損傷の増加、ならびにニューロン遊走の障害に起因する小脳皮質の構造（小葉）および細胞構築（層構造）の顕著な変化を伴う、用量依存的な細胞損失を生じさせることが示された。
【０１３０】
実施例17
小脳内の細胞種におけるエタノール誘発性病的変移
小脳形成不全およびアポトーシスのエタノール用量依存的な増大が、残りの細胞集団における病的変移を生じさせたか否かを明らかにするために、リアルタイム定量的RT-PCR試験を用いて、Huニューロン性リボソームRNA結合タンパク質（Hu et al., J. Neurosci. Res. 78:637 (2004)；Kumagai et al., J. Neuroimmunol. 93:37 (1999)；Szabo et al., Cell 67:325 (1991)）、オリゴデンドログリアに関するミエリン結合糖タンパク質-1（MAG-1）、アストロサイトに関するグリア酸性線維素タンパク質（GFAP）、ミクログリアに関するアログラフト炎症因子-1（AIF-1）（Imai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 224:855 (1996)；Ito et al., Stroke 32:1208(2001)）、および内皮細胞に関するエンドセリン-1（ET-1）をコードするmRNA転写物を測定した。検出された各々の特異的mRNA転写物のng量を、同一の試料中で測定された18S RNAレベルに対して標準化し、各群当たり8〜12匹の動物からの結果を統計学的に分析した。これらの試験により、エタノールによって媒介されるHuおよびMAG-1発現の低下ならびにGFAPおよびAIF-1発現の増大が示されたが、ET-1には有意な変化はみられなかった（図14）。Huに対する阻害作用ならびにGFAPおよびAIF-1に対する刺激作用はエタノール用量依存的であったが、MAG-1発現に対する阻害作用は用いたすべてのエタノール投与量で同程度であった。
【０１３１】
種々の脳細胞集団の相対的存在量を評価するための分子的検討により、それぞれニューロンおよびオリゴデンドログリアに対応するHuおよびMAG-1発現の有意な低下、ならびにアストロサイトおよびミクログリアに対応するGFAPおよびAIF-1の増加が示された。これらの結果は、ニューロンおよびオリゴデンドログリアの両方がCNSにおけるエタノール神経毒性の標的であることを示唆し、これはFASのヒト症例におけるニューロン損失および白質体積縮小という以前の知見を裏づける（Ozer et al., Clin. Neuropathol. 19:21 (2000)；Bandstra et al., Neurotoxicol. Teratol. 23:545 (2001)）。妊娠中のエタノールに対する慢性的曝露という状況下でのニューロンおよびオリゴデンドログリア細胞の損失の機序は完全には解明されていないが、可能性のあるメディエーターには以下が含まれる：1）インスリン受容体の抵抗性（以下を参照）およびPI3キナーゼを通じた下流でのシグナル伝達の障害に起因する、インスリンにより刺激される細胞生存の障害（Xu et al., Biochem. J. 310:125 (1995)）；2）細胞生存のために必要なインスリンのCNSでの局所的産生の低下、すなわち栄養因子離脱；および3）ミトコンドリア機能障害に起因する酸化ストレスの増大。分子的細胞プロファイリング試験からもGFAPの発現増大が示され、これはニューロンおよびオリゴデンドログリア細胞の損失後のアストロサイトの数の増加および／または活性化を反映している可能性がある。加えて、ミクログリアはインビボおよびインビトロの両方でエタノール誘発性細胞損失の公知のメディエーターである酸化ストレスの増大およびミトコンドリア機能障害を導くサイトカインおよび一酸化窒素を放出するため、AIF-1のレベル増大も組織損傷の機序からは重要である可能性がある。
【０１３２】
実施例18
インスリン、IGF-IおよびIGF-II、ならびにインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体の小脳発現に対するエタノールの影響
リアルタイム定量的RT-PCR試験により、対照およびエタノール曝露させた小脳の両方において、インスリン、IGF-IおよびIGF-IIポリペプチド遺伝子、ならびにインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体に対応するmRNA転写物が検出された（図15）。インスリンおよびIGF-IIはIGF-Iよりも大量に発現された。妊娠中のエタノールに対する曝露はインスリン遺伝子発現の有意な低下を生じさせたが、それは用量依存的ではなく、すなわち、低レベルのエタノール曝露もインスリン遺伝子発現を阻害した（図15A）。妊娠中のエタノールに対する曝露はまた、IGF-I（図15C）およびIGF-II（図15E）のレベルのわずかな低下も引き起こしたが、これらの傾向は用量依存的ではなかった。インスリン受容体およびIGF-I受容体のmRNAレベルは同程度であり、いずれもIGF-II受容体発現よりも1.5〜2.0倍の高さであった（図15B、15D、15F）。妊娠中のエタノールに対する慢性的曝露は、インスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体発現をいずれも有意には阻害しなかったが、用いた最高濃度ではIGF-II受容体発現が対照と比較して低下した。同一試料中で測定したリボソーム18S（図15G）および28S（図15H）のレベルはすべての群で同程度の高さであった。RT-PCRによって得られた結果に一致して、ウエスタンブロット分析では、対照およびエタノール曝露小脳におけるインスリン受容体およびIGF-I受容体発現のレベルが同程度であることが示された。
【０１３３】
妊娠中のエタノールに対する慢性的曝露に伴う細胞損失では、ニューロンおよびオリゴデンドログリアの相対的割合が選択的に減少した。以前の研究により、これらの細胞種はインスリンおよび／またはIGF-1刺激に対して応答性であること、ならびに無傷のインスリンまたはIGF-1シグナル伝達機構がニューロンおよびオリゴデンドログリア細胞の生存を媒介することが実証されている（Dudek et al., Science 275:661 (1997)；Kummer et al., J. Biol. Chem. 272:20490 (1997)；Yamaguchi et al., J. Biol. Chem. 276:5256 (2001)；Barres et al., Development 118:283 (1993)；Barres et al., Cell 70:31 (1992)；Ness et al., Mol. Cell. Neurosci. 20:476 (2002)）。成長因子シグナル伝達は、成長因子の利用能、成長因子受容体の発現または成長因子刺激に対する受容体の応答性を変化させることによって調節しうる。このため、エタノール曝露小脳におけるニューロンおよびオリゴデンドログリアの選好的損失がインスリン、IGF-I、IGF-IIまたはそれらの対応する受容体の発現低下と関連しているか否かを明らかにすることが関心の対象となった。
【０１３４】
リアルタイム定量的RT-PCR試験により、インスリン、IGF-IおよびIGF-II遺伝子発現レベルのエタノールに伴う有意な低下が示されたが、それが急峻であり、より高レベルのエタノール曝露に対して一貫して低下したのはインスリン遺伝子発現レベルのみであった。これに対して、インスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体発現はエタノールに対する子宮内曝露による一貫した影響を受けなかった。インスリンおよびIGF受容体発現に対するエタノールの影響のばらつきは、本試験および以前に発表された結果の両方で認められている。この現象についての説明は明らかではないが、インビボでは、インスリンおよびIGF受容体の発現を調節する遺伝子の方が、対応するタンパク質のシグナル伝達機能よりもエタノールの有害作用に対して脆弱性が低いことが示唆される。この概念は、培養小脳ニューロンの慢性的インビトロエタノール曝露後に検出されるインスリンおよびIGF受容体遺伝子発現に対するインスリンの強い阻害作用によって裏づけられる。これらの結果は、エタノールが、インスリンおよびIGFシグナル伝達を必要とするCNS機能を障害させる1つの機序が、CNSでの局所的な成長因子産生を阻害することであることを示唆する。この作用は選択的な細胞死滅または成長因子遺伝子のダウンレギュレーションのいずれかによって媒介されうる。しかし、整合しない1つの所見として、用量にかかわらず、妊娠中のエタノールに対する曝露によってインスリン受容体およびIGF-I受容体のチロシンキナーゼ活性が有意に低下することがある。さらに、以前のインビトロ試験により、成長因子の外因性供給にもかかわらず、エタノールがインスリン受容体およびIGF-I受容体のチロシンリン酸化およびキナーゼ活性化を障害させることが示されている（Seiler et al., Alcohol Clin. Exp. Res. 24:1869 (2000)；Seiler et al., J. Neurochem. 76:573 (2001)）。これらの観察所見は、成長因子遺伝子発現以外の要因が、CNSにおけるインスリンおよびIGFシグナル伝達のエタノール媒介性障害に寄与することを示唆する。
【０１３５】
実施例19
エタノールによるインスリン受容体およびIGF受容体の結合の障害
有効なリガンド結合はシグナル伝達カスケードにとって決定的に重要であり、ニューロン生存性の低下を含む、エタノール曝露脳で報告されているインスリンシグナル伝達障害の下流での影響の多くは、CNSにおけるインスリンまたはIGF-Iの結合の低下によって媒介されうると考えられる。小脳膜タンパク質抽出物を、トレーサーとして［125I］で標識したインスリン、IGF-IまたはIGF-IIとともに、過剰な非放射性リガンドの存在下または非存在下でインキュベートすることによって、平衡結合アッセイを行った。平衡結合試験により、IGF-I受容体およびIGF-II受容体に対する特異的結合（fmol／mg）はインスリン受容体に対するよりも高レベルであることが示された。エタノール曝露群はすべて、インスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体に対する結合が対照と比較して有意に低下していた。加えて、エタノール曝露は、インスリン受容体およびIGF-I受容体の結合を、IGF-II受容体結合（約50％）よりも大きな度合い（約80％）で障害させた。しかし、受容体結合が障害される度合いはエタノール用量依存的ではなかった。
【０１３６】
有効なリガンド結合はシグナル伝達カスケードにとって決定的に重要であり、ニューロン生存性の低下を含む、インスリンシグナル伝達に対するエタノールの下流での有害な影響に関して以前に報告されているものの多くは、CNSにおけるインスリンまたはIGF-Iの結合の障害によって媒介されうると考えられる。平衡結合アッセイにより、対照脳ではIGF-I受容体およびIGF-II受容体に対する特異的結合がインスリン受容体に対するよりも高レベルであり、エタノール曝露脳では対照脳と比較してインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体に対する結合が低下していることが示された。加えて、妊娠中のエタノールに対する慢性的曝露は、インスリン受容体よびIGF-I受容体に対する結合を、IGF-II受容体に対して（約50％）よりも大きい度合い（約80％）で障害させた。しかし、インスリン、IGF-IおよびIGF-II結合に対するエタノールの阻害的影響は用量依存的ではなく、実際には結合が低下した度合いは種々のエタノール投与量群の間で同程度であった。このため、インスリン受容体およびIGF受容体の発現レベルが相対的に保持されていたにもかかわらず、受容体に対するリガンド結合はエタノールに対する慢性的な子宮内曝露後に顕著に低下した。さらなるインビトロ試験により、リガンド結合は比較的短期間（96時間）のエタノール曝露後にも障害されることが示された（以下を参照）。これらの結果は、脳における細胞生存およびエネルギー代謝のために必要なインスリンおよびIGFシグナル伝達に対するエタノールの阻害的影響が、受容体結合のレベル、すなわちシグナル伝達カスケードの中で最も基部の箇所で媒介されることを示唆する。
【０１３７】
インスリン受容体およびIGF-I受容体を通じてのシグナル伝達の可能性のある障害の転帰として考えられるものには、IRS分子を通じての下流でのシグナル伝達の低下、ならびに細胞の成長および生存のために必要な経路の活性化の低下が含まれる。しかし、IGF-II遺伝子および受容体発現の障害という影響については十分には解明されていない。IGF-IIは胎児脳のさまざまな領域で、しかし主として間葉および神経冠に由来する細胞において発現される（D'Ercole et al., Norm. Res. 45:5 (1996)；D'Ercole et al., Ann. NY Acad. Sci. 692:149 (1993)）。IGF-II受容体も胎児脳に広く分布している（D'Ercole et al., Norm. Res. 45:5 (1996)；D'Ercole et al., Ann. NY Acad. Sci. 692:149 (1993)）。標的指向的な遺伝子突然変異試験により、IGF-IIは出生前の脳成長を刺激し、インスリン受容体を介してインスリンにより刺激されるシグナル伝達経路を活性化することが示されている（Nakae et al., Endocr. Rev. 22:818 (2001)）。IGF-II受容体はタンパク質の輸送および分解を促進することによってIGF-IIのためのスカベンジャーとしても機能するが（Ghosh et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4:202 (2003)）、IGF-IIは自らの受容体の活性化を通じて成長および運動性を刺激しうるという証拠が蓄積しつつある（Herr et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 88:4811(2003)；Zygmunt et al., Mol. Hum. Reprod. 11:261 (2005)）。この点に関して、IGF-IIによって刺激される成長および運動性シグナルは、IRS-非依存的な経路を介してG共役型タンパク質を通じて伝達されうる（Patel, Pharmacol. Rev. 56:371 (2004)）。加えて、IGF-II刺激に反応しての細胞増殖もインスリン受容体およびIGF-I受容体を通じてのシグナル伝達によって媒介可能であり、結果としてこれはIRS経路に収束する。
【０１３８】
実施例20
インスリン受容体およびIGF-I受容体のチロシンキナーゼ活性に対する、妊娠中のエタノールに対する曝露の影響
エタノールに伴う受容体結合の障害がインスリン受容体およびIGF-I受容体のチロシンキナーゼ活性、ならびにインスリン受容体およびIGF-I受容体タンパク質の発現の低下と関連づけられる度合いを特徴づけるための試験を行った。受容体タンパク質レベルはデジタル画像デンシトメトリーを用いるウエスタンブロット法によって測定した。免疫沈降物における受容体チロシンキナーゼ活性を、非放射性発光を利用するアッセイを用いて測定した。これらの試験により、インスリン受容体およびIGF-I受容体チロシンキナーゼ活性のレベルはいずれも有意に低下しているが、エタノール曝露仔からの小脳組織におけるインスリン受容体およびIGF-I受容体タンパク質発現のレベルは対照と比較して同程度であることが示された。結合アッセイの結果に一致して、エタノールに伴う受容体チロシンキナーゼ活性の低下は用量依存的ではなく、種々の子宮内レベルの食餌性エタノールに曝露された仔からの小脳において同程度に低下した。結果は免疫沈降物中のインスリン受容体およびIGF-I受容体のタンパク質レベル（デンシトメトリーを用いるウエスタンブロット分析により検出した）に対して標準化されているため、エタノールに伴うインスリン受容体およびIGF-I受容体のチロシンキナーゼ活性の低下は、成長因子受容体発現の変化に起因するのではなかった。CNSニューロンにおけるエタノールで障害されたインスリンおよびIGF-Iシグナル伝達の主な転帰は、グルコース利用およびATP産生の不足に起因するエネルギー代謝の低下である（de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 62:1131(2005)）。種々のレベルのエタノールに対する慢性的な子宮内曝露の影響をエネルギー代謝に関連して明らかにするために、小脳組織ホモジネート中のATP含有量を、発光を利用するアッセイを用いて測定した。それらの試験により、小脳ATP含有量のエタノール用量依存的な進行性の低下が示され、18％、26％または37％のエタノールを含む食餌に曝露された仔から得た試料では対照との有意差が検出された。
【０１３９】
以前の研究により、無傷なインスリン受容体タンパク質発現に相対しての、インスリン受容体チロシンリン酸化およびキナーゼ活性のエタノール性阻害が実証されている。本試験は、インスリン受容体およびIGF-I受容体のチロシンキナーゼ活性に対するエタノールの用量効果を特徴づけることにより、この研究方針を拡張した。これらの結果から、妊娠中の慢性的曝露には、インスリン受容体およびIGF-I受容体のチロシンキナーゼ活性のレベルの有意な低下が伴ってみられることが示された；しかし、リガンド結合に対するエタノールの影響に段階性がみられなかったことに一致して、エタノールに伴うインスリン受容体およびIGF-I受容体のチロシンキナーゼ活性の低下も段階的ではなく、そのレベルはすべてのエタノール曝露群で対照と比較して同程度の低下であった。このことは、脳におけるインスリンおよびIGF-Iシグナル伝達の少なくとも一部の局面は、妊娠中の比較的低レベルのエタノールに対する慢性的曝露によって実質的に障害されることを示唆する。エタノールのこれらの有害作用が長期的曝露を必要とするか否かを明らかにするために、50mMエタノールで4日間処置した小脳ニューロン培養物を用いるインビトロ実験を行った（以下を参照）。エタノール処置したニューロン培養物におけるインスリンおよびIGFの結合低下、ならびに以前に観察されているインスリンおよびIGF-Iにより刺激されるチロシンキナーゼ活性化の低下という所見は、飲み過ぎの時のような短期的エタノール曝露も、インスリン受容体およびIGF-I受容体の機能に対して大きな阻害作用を及ぼしうることを示している。この分子的障害が基部性であることは、エタノールが、細胞生存およびエネルギー代謝を含む、インスリンまたはIGF-Iシグナル伝達によって媒介される多様な下流機能の妨げとなりうることを意味する。
【０１４０】
実施例21
アセチルコリン恒常性におけるエタノールに伴う障害
アセチルコリンはCNSの認知系および運動系において主要な機能的役割を果たしている。アセチルコリン産生はコリンおよびアセチル-Co-Aの十分な供給を必要とする。アセチル-Co-Aはエネルギー代謝によって産生されるが、それはインスリンおよびIGF-I刺激によって主導される。最近の研究では、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）の発現はインスリンおよびIGF-I刺激によって調節されることが実証されている（Rivera et al., J. Alzheimers Dis. 8:247 (2005)）。このため、インスリンおよびIGF-Iシグナル伝達機構のエタノール性阻害がChATの欠乏を伴うか否かを明らかにすることが関心の対象となった。アセチルコリンの定常レベルはアセチルコリンエステラーゼ（AChE）による負の調節を受けるため、AChE mRNAレベルを測定することも関心の対象となった。リアルタイム定量的RT-PCR試験により、エタノール曝露小脳組織におけるChAT発現の平均レベルの有意な低下（図16A）およびAChE発現の増大（図16B）が示された。ChAT mRNAのレベルは、用いた最も低いエタノール濃度で急峻に低下し、ChAT発現のさらなる低下はエタノール曝露の用量を増やしてもわずかに過ぎなかった（図16A）。これに対して、AChE mRNAレベルはエタノール用量とともに漸増的に増大した（図16B）。
【０１４１】
実施例22
インビトロでの短期的エタノール曝露による、インスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体の結合、受容体チロシンキナーゼ活性、ならびに対応する成長因子により刺激されるChAT発現の障害
インビボ観察所見を検証し、エタノールがインスリン／IGF抵抗性を引き起こす考えられる機序を特徴づけるために、初代小脳ニューロン培養物を用いるインビトロ実験を行った。以前の研究により、エタノールに曝露させた小脳ニューロン培養物では、インスリンおよびIGF-Iにより刺激される受容体チロシンキナーゼ活性のレベルの低下が示されている（de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 62:1131(2005)）。エタノールのこの影響がリガンド-受容体結合の障害によって媒介されるか否かを明らかにするために、初代ラット小脳対照またはエタノール曝露させた（50mMに96時間）ニューロン培養物から採取した膜タンパク質を用いて平衡結合アッセイを行った。用いるエタノールの濃度は、ヒトアルコール依存患者で検出されている範囲内とした（Fulop et al., Am. J Med. 80:191 (1986)；Jagger et al., Neurosurgery 15:303 (1984)）。ChATおよびAChEの免疫反応性はMICEアッセイ（細胞ELISA）を用いて培養細胞において直接測定し、その値を細胞密度に対して標準化した。これらの結果から、インスリン受容体（図17A）、IGF-I受容体（図17B）およびIGF-II受容体（図17C）の結合のレベルの有意な低下が実証された。加えて、エタノール処置したニューロン細胞では、ATPの基礎レベル、およびインスリン、IGF-IまたはIGF-IIによる刺激下でのレベル（図17D）、ならびに基礎的な、インスリンおよびIGF-Iによる刺激下でのChAT免疫反応性（図17E）も、対照と比較して有意に低下していた。AChE免疫反応性は成長因子刺激によって顕著には変化しなかったが、AChE発現はIGF-IIで刺激したものの方が対応する非刺激対照細胞と比べて高く、非刺激エタノール曝露細胞の方が非刺激対照細胞と比較して高かった（図17F）。
【０１４２】
実施例23
インスリン受容体およびIGF受容体の結合ならびにChATの刺激の障害の考えられる機序
膜コレステロール含有量は、細胞表面受容体に対するリガンド結合に影響を及ぼしうる。例えば、膜におけるコレステロール含有量の減少または増加は、成長因子の結合およびシグナル伝達の変化または障害と関連している（Cho et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286:H1881 (2004)；Huo et al., J. Biol. Chem. 278:11561 (2003)；Meuillet et al., Biochim. Biophys. Acta 1454:38 (1999)；Peiro et al., J. Biol. Chem. 275:37846 (2000)）。受容体結合に関して観察された違いが膜コレステロール含有量と相関するか否かを明らかにするために、小脳膜抽出物におけるコレステロールレベルを測定した。仔の脳の分析（各群当たりN＝8）により、エタノール曝露させた小脳膜では対照と比較してコレステロール含有量の有意な低下が示された（図18A）。小脳膜コレステロール含有量は8％エタノール食餌群では対照と比較して約50％減少したが、より高用量のエタノールでは膜コレステロールのそれ以上の減少はわずかしか観察されなかった（図18A）。同様に、50mMエタノールに対する96時間のインビトロ曝露も、小脳ニューロン膜コレステロール含有量を有意に減少させた（図18B）。
【０１４３】
結合障害のメディエーターとしてのコレステロールまたは脂質の枯渇の役割をさらに調べるために、対照およびエタノール曝露させた（50mMに96時間）小脳ニューロン培養物を媒体、ロック緩衝液中の10mM MβCDまたは10mMコレステロールによって3時間処置した。続いて細胞をインスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体の平衡結合に関して分析した。初期試験において、MβCDによる処置は膜コレステロール含有量を有意に低下させたが、一方、コレステロールによる処置は対照およびエタノール曝露させた小脳培養物のいずれにおいても膜コレステロール含有量を有意に増加させた（図18C）。対照およびエタノール曝露させた培養物において、MβCD処置はインスリン受容体（図18D）、IGF-I受容体（図18E）およびIGF-II受容体（図18F）の結合を対応する媒体処置細胞と比較して有意に阻害し、一方、コレステロール処置はエタノール処置細胞ではインスリン-受容体結合を増強したが、対照細胞ではインスリン受容体結合に対して有意な影響を及ぼさなかった（図18D）。しかし、コレステロール処置は、対照小脳ニューロンにおけるIGF-I受容体およびIGF-II受容体結合を有意に障害させた（図18Eおよび18F）。媒体処置エタノール曝露細胞において、インスリン、IGF-IおよびIGF-II受容体結合は、図17に示されているように媒体処置対照細胞と比較して有意に低かった（図18D〜18F）。加えて、エタノール曝露細胞のMβCD処置は、インスリン受容体結合を、MβCD処置対照細胞と比較して同じく有意に低いレベルに有意に低下させた（図18D）。これに対して、MβCDまたはコレステロール処置は、対照およびエタノール曝露させたニューロン細胞においてIGF-IおよびIGF-II受容体結合の障害を同程度の度合いで引き起こした（図18Eおよび18F）。
【０１４４】
ニューロン生存度（図19A〜19C）、ATP産生（エネルギー代謝；図19D〜19F）、ChAT免疫反応性（図19G〜23I）およびAChE免疫反応性（図19J〜19L）に対するコレステロールまたはMβCD処置の影響を、上記の通りに処置した上で媒体（対照）、無血清培地中の10nMインスリン、10nM IGF-Iまたは25nM IGF-IIで12時間刺激した細胞において検討した。アッセイはすべて96ウェル培養物を用いて行った。生存度はCyQuantアッセイを用いて測定し、ATP含有量はATPLiteアッセイを用いて測定した。ChATおよびAChEの免疫反応性は、発光検出試薬を用いるように改変したMICEアッセイ（de la Monte et al., Biotechniques 26:1073(1999)）を用いて測定した（de la Monte et al., Cell. Mol. Life Sci. 59:882 (2002)；Xu et al., J. Biol. Chem. 278:26929 (2003)）。媒体処置細胞において、ニューロン生存度はインスリンで刺激したエタノール曝露培養物では有意に低下したが、IGF-IまたはIGF-IIで刺激したエタノール曝露培養物ではそうではなかった（図19A）。しかし、ATP含有量は、成長因子刺激にかかわらず、すべてのエタノール処置培養物で有意に低下した（図19D）。MβCDまたはコレステロール処置は、対照およびエタノール曝露させた培養物の両方においてニューロン生存度およびミトコンドリア機能を広範に低下させたが、成長因子による刺激下での生存度およびエネルギー代謝は、MβCD処置エタノール曝露培養物において、対応する対照培養物と比較してさらに低下した（図19B、19C、19E、19F）。媒体処置対照細胞におけるChAT発現はインスリン刺激によって有意に増加したが、エタノール曝露細胞ではChATはインスリン刺激によって変化せず、ChATの基礎レベルおよび成長因子による刺激下でのレベルは対照よりも有意に低かった（図19G）。対照細胞のMβCD処置はインスリン刺激下でのChATの増加を消失させたが、IGF-IおよびIGF-IIによる刺激下でのChATは有意に増加させた（図19H）。エタノール曝露細胞において、MβCD処置は、成長因子刺激にかかわらず、対照と比較してChAT発現の広範なレベル低下を伴った（図19）。対照細胞において、対照細胞のコレステロール処置は基礎的なChAT発現および成長因子による刺激下でのChAT発現を消失させたが、エタノール曝露細胞におけるコレステロール処置は、インスリン、IGF-IおよびIGF-IIによる刺激下でのChATのレベルを対応する媒体処置細胞と比較して有意に増加させ、対照と同程度またはそれよりも高いChAT発現レベルをもたらした（図19）。実質上、コレステロール処置は、成長因子刺激の存在下でのChAT発現を対照レベルに回復させることにより、エタノール曝露細胞を復旧させた。しかし、コレステロール処置したエタノール曝露細胞におけるインスリン刺激下でのChAT発現はインスリン刺激下での媒体処置対照細胞よりも依然として有意に低く（P＜0.005）、このことはコレステロールによる復旧が部分的に過ぎないことを示している。AChE発現は、媒体処置対照およびエタノール曝露させたニューロン細胞において、成長因子刺激にかかわらず同程度であった（図19）。MβCDまたはコレステロールによる処置は、対照およびエタノール曝露させた細胞の両方においてAChEの平均レベルを有意に増大させたが、一般にMβCDの方がコレステロールよりも大きな効果が認められた（図19）。認められた唯一の群間差は、AChEレベルが、エタノール曝露培養物において、対照のMβCD処置または���レステロール処置＋非刺激、MβCD処置＋インスリン刺激、およびコレステロール処置＋IGF-II刺激下の培養物と比較して有意に低いことであった（図19Kおよび19L）。
【０１４５】
ChAT発現はインスリンおよびIGF-I刺激によって調節され、アセチルコリンはCNS認知機能および運動機能を媒介する主要な神経伝達物質であることから、脳におけるインスリンおよびIGF-Iシグナル伝達に対するエタノールの阻害的影響がアセチルコリン恒常性を障害させるか否かを明らかにすることが関心の対象となった。リアルタイム定量的RTPCR試験により、エタノール曝露小脳におけるChATのレベル低下およびAChE遺伝子発現レベルの増大が示された。加えて、インビトロ試験により、培養物が分裂終了後となって有意な細胞損失が検出されなくなった時点である4日間のエタノール曝露後の小脳ニューロン培養物において、ChAT免疫反応性の基礎的レベル、インスリン刺激下およびIGF-I刺激下でのレベルが有意に低下していることも示された。エタノール曝露がChAT発現の低下を導く考えられる機序には、インスリン／IGF-Iシグナル伝達の阻害と、慢性的インビボ曝露の場合には、ChAT発現ニューロンの生存性の障害が含まれる。エタノールに対する慢性的な子宮内曝露後のAChE発現の増大は、アストロサイトおよびミクログリア細胞の増殖ならびに／またはニューロンおよびオリゴデンドログリアの活性化に基づいて説明しうると考えられる。
【０１４６】
子宮内でエタノールに対して慢性的に曝露されたラット仔からの小脳では、対照小脳と比較して膜コレステロールのレベルの有意な低下が見いだされた。加えて、短期的エタノール曝露を受けた小脳ニューロン培養物でも膜コレステロール含有量は有意に低下しており、このことは短期的なエタノール曝露であっても脳細胞膜の脂質組成を変化させうることを示している。インビトロ実験により、膜コレステロールののMβCD枯渇は、対照細胞におけるIGF-IおよびIGF-II結合、ならびにエタノール曝露細胞におけるインスリン、IGF-IおよびIGF-II結合を有意に阻害することが示された。小脳ニューロン膜におけるコレステロール含有量の増加をもたらしたコレステロール処置も、対照細胞およびエタノール曝露細胞におけるIGF-IおよびIGF-II受容体結合を阻害した。これらの所見は、コレステロールが膜の流動性または分子間相互作用を変化させることによってリガンド-受容体相互作用に影響を及ぼすという考え方に一致する（Gimpl et al., Biochemistry 36:10959 (1997)）。しかし、コレステロール処置は対照細胞におけるインスリン受容体結合は障害させず、これはエタノール曝露細胞におけるインスリン受容体結合を有意に増大させた。復旧が不完全であったという事実は、エタノール曝露によって枯渇した他の脂質もインスリン受容体結合を媒介するために重要であることを示唆する。これらの結果は、膜におけるコレステロールおよび脂質の含有量ならびに組成が、細胞表面受容体に対するリガンド結合およびそれに付随する下流での細胞内シグナル伝達に有意に影響を及ぼしうるという以前の報告に一致する（Meuillet et al., Biochim. Biophys. Acta 1454:38 (1999)）。MβCDで処置した対照細胞におけるインスリン受容体結合の相対的な保持、およびエタノール曝露細胞においてコレステロール処置によって生じたインスリン受容体結合の不完全な復旧は、MβCDによっては枯渇しないがエタノール処置によって減少する、カベオラ内に存在する他の脂質が、インスリン受容体結合の決定的なメディエーターである可能性を示唆する。
【０１４７】
以前の研究により、膜コレステロールを枯渇させるMβCD処置はインスリン抵抗性を引き起こすこと（Le Lay et al., J. Biol. Chem. 276:16904(2001)；Parpal et al., J. Biol. Chem. 276:9670(2001)）、および他の点では正常である細胞の膜脂質組成を有効に変化させるコレステロール添加もインスリン応答性を低下させることが示されている（Meuillet et al., Biochim. Biophys. Acta 1454:38(1999)）。ニューロン細胞において、チロシンキナーゼ受容体は、カベオラに対応する低密度膜画分に分布しており（Wu et al., J. Biol. Chem. 272:3554(1997)）、一般にインスリン受容体はカベオラマイクロドメイン内部でシグナルを伝える。実験的には、MβCDによるコレステロールのキレート化およびそれに付随するカベオラの破壊は、インスリン受容体チロシンキナーゼの自己活性化およびインスリン刺激下でのグルコース取り込みを阻害する（Gustavsson et al., FASEB J. 13:1961(1999)；Cohen et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285:E1151(2003)）。さらなる検討により、IRS-I分子の一部分はカベオラに位置することが特定されており、インスリン受容体の自己リン酸化もIRS-Iチロシンリン酸化も阻害しない比較的低濃度のMβCD（2mM）による処置が、カベオラ／脂質ラフトならびに下流でのインスリンおよびIRS-Iシグナル伝達機構を乱すこと（Balbis et al., J. Biol. Chem. 279:39348(2004)；Karlsson et al., Eur. J. Biochem. 271:2471(2004)）、およびこれに伴ってIRS-1-PI3キナーゼ-Akt経路の活性化（McGuire et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:399(1994)）、および場合によってはMAPKシグナル伝達の保持（Parpal et al., J. Biol. Chem. 276:9670(2001)）がみられることが示されている。このため、受容体結合に対するその阻害作用のほかにも、コレステロール枯渇は、その受容体の下流でのPI3キナーゼを通じてのインスリンシグナル伝達を、カベオラマイクロドメインの破壊によって障害させる可能性がある。
【０１４８】
以前の研究において、本発明者らは、エタノール曝露が、未成熟ニューロンおよび発達中の脳において、インスリンおよびIGF-Iによる刺激下でのPI3キナーゼ-Aktも選択的に障害させることを示しており、このことは生存シグナル伝達およびミトコンドリア機能に対するエタノールの有害作用が、カベオラおよび脂質ラフトにおけるコレステロールおよび脂質の組成の病的変化によって媒介されることを示唆する。しかし、カベオラの完全性に対するその依存性に関してのインスリンシグナル伝達の特性は、組織および細胞種によってさまざまである。例えば、肝臓では、リガンドが結合した受容体が脂質ラフトに動員されてシグナル伝達を媒介しうるため、カベオラ遺伝子の枯渇はインスリン受容体活性化およびシグナル伝達を阻害しない（Vainio et al., EMBO Rep. 3:95 (2002)。IRS-I-Aktを通じたIGF-Iシグナル伝達もコレステロール枯渇によって障害されるが（Podar et al., J. Biol. Chem. 278:5794 (2003)）、IGF-Iシグナル伝達は脂質ラフトに位置することが特定されており、カベオラ非依存的であることが判明している（Hong et al., Cell Death Differ. 11:714 (2004)）。カベオラおよび脂質ラフトにおけるインスリンおよびIGF-Iシグナル伝達の細胞内局在の違いは、下流経路は高度に重複しているとはいえ、インスリンおよびIGF-I刺激の影響の違いの部分的な理由である可能性がある。
【０１４９】
ChAT発現が、対応する媒体処置細胞と比較して有意に低下した結合性にもかかわらず、MβCD処置したIGF-IまたはIGF-IIによる刺激下の対照細胞において顕著に増大したという所見は、インスリンおよびIGFで刺激される機能は結合と厳密には関係していないというさらなる証拠を提供する。同様に、エタノール曝露細胞において、コレステロール処置はインスリン受容体結合のみを有意に増強したが、インスリン、IGF-IおよびIGF-IIで刺激されるChATは対応する媒体処置細胞と比較していずれも有意に増加した。したがって、インスリンおよびIGFで刺激されるChAT発現は膜コレステロール含有量および脂質組成によって顕著に調節される。対照細胞において、コレステロール含有量を減少させるとIGF-IおよびIGF-II刺激下でのChATは劇的に増加したが、コレステロールの増加はインスリン刺激下でのChATの増加を弱めた。このことは、対照細胞においては、他の膜脂質と比較した際のコレステロールの減少が、カベオラ依存的（インスリン）シグナル伝達機構ではなく、脂質ラフトを通じてのアセチルコリン生合成を増強させることを示唆する。これに対して、コレステロール処置は、インスリン、IGF-IおよびIGF-IIによる刺激下でのChAT発現を増強することによってエタノール曝露ニューロン細胞を復旧させた。したがって、膜脂質およびコレステロール含有量は、インスリンおよびIGFによる刺激下でのChAT発現およびアセチルコリン生合成に対するニューロン応答の調節において決定的な役割を有する。MβCDまたはコレステロールで処置した対照細胞およびエタノール曝露細胞におけるAChE発現レベルの広範な増加は予想外であった。しかし、この結果に関して考えられる1つの説明は、膜脂質組成における実質的な増加または減少が、成長因子で刺激されるエネルギー代謝を障害させるというものである。この解釈は、MβCDまたはコレステロール処置がニューロン細胞におけるエネルギー代謝および生存度を成長因子刺激にかかわらず低下させたという本発明者らの所見に一致する（図19）。エネルギー代謝の障害は酸化ストレスを引き起こす恐れがあり、最近の研究では酸化ストレスがアセチルコリンエステラーゼ機能を高めることが示されている（Kaizer et al., J. Inorg. Biochem. 99:1865 (2005)；Melo et al., J. Neurosci. Res.45:117 (2003)）。エタノールにより障害されるインスリンおよびIGF-Iシグナル伝達を、ChATのレベル低下およびAChEのレベル増大、すなわちアセチルコリン恒常性の擾乱と、さらには脳における神経炎症および酸化ストレス（エネルギー代謝の障害、ミクログリアおよびアストロサイトの増加）のメディエーターと関連づけるこれらの結果は、妊娠中のエタノールに対する慢性的曝露がCNSの認知機能および運動機能における発達障害を導く、重要かつ新規な機序を示唆する。
【０１５０】
本発明をここまで詳細に説明してきたが、本発明の範囲またはそのいずれの態様にも影響を及ぼさずに、幅広い等価な条件、配合および他のパラメーターの範囲内で本発明を修正または変更することによってそれを遂行しうることは、当業者には理解されるであろう。本明細書に引用されたすべての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細書にすべて組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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