(57)【要約】本発明は、本明細書で議論される１種以上の疾患に罹患した、もしくは現在罹患している患者ドナーから得られたドナー特異的抗体ライブラリーに関する。本発明はまた、ドナー特異的抗体を作製および使用するための方法に関する。本発明はさらに、上記ドナー特異的抗体ライブラリーから得られる中和抗体およびヒト疾患の予防／処置のためにこれら抗体を使用するための方法に関する。一実施形態において、本発明は、標的抗原に対する抗体生成を引き起こす疾患に罹患したか、もしくは該疾患に現在罹患しているヒト患者ドナーから得られる、抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子のレパートリーを含むベクター集団を提供し、ここで該集団は、独特のバーコードで同定される。
2010538618.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的抗原に対する抗体生成を引き起こす疾患に罹患したか、もしくは該疾患に現在罹患しているヒト患者ドナーから得られる、抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子のレパートリーを含むベクター集団であって、ここで該集団は、独特のバーコードで同定される、ベクター集団。
【請求項２】
抗体軽鎖もしくはそのフラグメントをコードする核酸分子のレパートリーを含む、請求項１に記載のベクター集団。
【請求項３】
前記抗体軽鎖は、λ鎖である、請求項２に記載のベクター集団。
【請求項４】
前記抗体軽鎖がκ鎖である、請求項２に記載のベクター集団。
【請求項５】
抗体重鎖もしくはそのフラグメントをコードする核酸分子のレパートリーを含む、請求項１に記載のベクター集団。
【請求項６】
前記バーコードは、前記集団中に存在するベクターに連結されるかもしくは組み込まれ、そして／または前記抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子に連結されるかもしくは組み込まれるヌクレオチド配列であり、その結果、該バーコードは、該核酸分子の発現を妨害しない、請求項１に記載のベクター集団。
【請求項７】
前記バーコードは、１〜約２４ヌクレオチドの連続する非コードヌクレオチド配列である、請求項６に記載のベクター集団。
【請求項８】
前記ヌクレオチド配列は、前記核酸分子の３’非コード領域もしくは５’非コード領域に連結される、請求項７に記載のベクター集団。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列は、前記抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子に組み込まれる１個以上のサイレント変異のコード配列である、請求項６に記載のベクター集団。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列は、非連続である、請求項６に記載のベクター集団。
【請求項１１】
前記非連続ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一部は、前記集団に存在するベクターに連結されるかもしくは組み込まれる、請求項１０に記載のベクター集団。
【請求項１２】
前記非連続配列の少なくとも一部は、前記抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子に組み込まれ、その結果、該非連続配列の少なくとも一部は、該核酸分子の発現を妨害しない、請求項１０に記載のベクター集団。
【請求項１３】
前記バーコードは、ペプチドもしくはポリペプチド配列である、請求項１に記載のベクター集団。
【請求項１４】
前記ベクターは、ファージミドベクターである、請求項１に記載のベクター集団。
【請求項１５】
前記ファージミドベクターは、バクテリオファージ遺伝子ＩＩＩ、および前記抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子と該バクテリオファージＩＩＩ遺伝子との間に終止コドンを含む、請求項１５に記載のベクター集団。
【請求項１６】
前記バーコードは、前記終止コドンの後ろの非翻訳領域に挿入される、連続する非コードヌクレオチド配列である、請求項１５に記載のベクター集団。
【請求項１７】
請求項１に記載のベクター集団を含む、宿主細胞。
【請求項１８】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
標的抗原に対する抗体もしくは抗体フラグメントの集団を発現するライブラリーメンバーを含む、ドナー特異的抗体ライブラリーであって、ここで該抗体もしくは抗体フラグメントは、該標的抗原に対する抗体生成を引き起こす疾患に罹患したか、もしくは該疾患に現在罹患しているヒトドナーから得られ、ここで該抗体ライブラリーは、少なくとも１個の特有のバーコードで同定される、ドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項２０】
前記抗体重鎖および軽鎖は、該抗体重鎖および軽鎖が得られる前記ヒトドナーに対して特有のバーコードで各々別個に同定される、請求項１９に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項２１】
１個の特有のバーコードで同定される、請求項１９に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項２２】
前記抗体もしくは抗体フラグメントは、ベクター中に存在する核酸分子によってコードされる抗体重鎖および軽鎖もしくはそのフラグメントから構成される、請求項１９に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項２３】
前記バーコードは、前記ライブラリーに存在するベクターに連結されるかもしくは組み込まれ、そして／または前記抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子に連結されるかもしくは組み込まれる、ヌクレオチド配列であり、その結果、該バーコードは、該核酸分子の発現を妨害しない、請求項２２に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項２４】
前記バーコードは、１〜約２４ヌクレオチドの連続する非コードヌクレオチド配列である、請求項２３に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項２５】
前記ヌクレオチド配列は、前記核酸分子の３’非コード領域もしくは５’非コード領域に連結される、請求項２４に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項２６】
前記ヌクレオチド配列は、前記抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子に組み込まれる１個以上のサイレント変異のコード配列である、請求項２３に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項２７】
前記ヌクレオチド配列は、非連続である、請求項２３に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項２８】
前記非連続配列のうちの少なくとも一部は、前記ライブラリーに存在するベクターに連結されているかもしくは組み込まれている、請求項２７に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項２９】
前記非連続配列のうちの少なくとも一部は、前記抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子に組み込まれており、その結果、該非連続配列のうちの少なくとも一部は、該核酸分子の発現を妨害しない、請求項２７に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項３０】
前記バーコードは、ペプチドもしくはポリペプチド配列である、請求項１９に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項３１】
前記ベクターは、ファージミドベクターである、請求項２２に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項３２】
前記ファージミドベクターは、バクテリオファージ遺伝子ＩＩＩ、および前記抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子と該バクテリオファージＩＩＩ遺伝子との間に終止コドンを含む、請求項３１に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項３３】
抗体重鎖もしくはそのフラグメントの集団を発現する、請求項１９に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項３４】
１個より多くの抗体重鎖ファミリーを含む、請求項３３に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項３５】
前記ヒトドナーの病歴は、前記患者が前記疾患に罹患したか、もしくは該疾患に現在罹患していることを示す、請求項１９に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項３６】
前記ヒトドナーが、前記疾患に罹患したか、もしくは該疾患に現在罹患していることが独立して確認される、請求項３５に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項３７】
前記標的抗原とは異なる抗原を特異的に結合する抗体および抗体フラグメントを実質的に欠いている、請求項１９に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項３８】
前記標的抗原は、インフルエンザＡウイルスである、請求項１９に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項３９】
前記標的抗原は、インフルエンザＡウイルスＨ１、Ｈ２もしくはＨ３サブタイプの単離株である、請求項３８に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項４０】
前記標的抗原は、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９インフルエンザＡウイルスサブタイプを含む群から選択される、請求項３８に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項４１】
１個より多くのインフルエンザＡウイルスサブタイプに特異的に結合する少なくとも１種の抗体もしくは抗体フラグメントを発現する、請求項３８に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項４２】
インフルエンザウイルスＡのＨ５Ｎ１サブタイプに結合しかつ中和する少なくとも１個の抗体もしくは抗体フラグメントを含む、請求項３９に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項４３】
前記ヒトドナーは、表１に列挙される疾患からなる群より選択される疾患に罹患したかもしくは現在罹患している、請求項１９に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項４４】
前記標的疾患と関連する抗原に結合する少なくとも１種の抗体もしくは抗体フラグメントを発現する、請求項４３に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項４５】
前記標的疾患と関連する抗原に結合しかつ中和する少なくとも１種の抗体もしくは抗体フラグメントを発現する、請求項４３に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項４６】
少なくとも１種の中和抗体を発現する、請求項１９に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項４７】
前記ドナー特異的抗体ライブラリーは、ファージライブラリーである、請求項１９に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項４８】
前記集団は、抗体もしくは抗体フラグメントの１０６個より多くの異なるメンバーをコードする配列を含む、請求項４７に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項４９】
前記集団は、抗体もしくは抗体フラグメントの１０９個より多くの異なるメンバーをコードする配列を含む、請求項４７に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項５０】
芽胞ディスプレイライブラリー（ｓｐｏｒｅ−ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）、リボソームディスプレイライブラリー、ｍＲＮＡディスプレイライブラリー、微生物細胞ディスプレイライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、および哺乳動物ディスプレイライブラリーからなる群より選択される、請求項１９に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項５１】
前記核酸は、前記ヒトドナーのリンパ球から抽出されたｍＲＮＡから逆転写される、請求項５０に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項５２】
前記リンパ球は、骨髄、血液、脾臓、もしくはリンパ節から得られる、請求項５１に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項５３】
前記ヒトドナーの血清学的プロフィールは、前記ｍＲＮＡを抽出する前に生成される、請求項５２に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項５４】
前記ヒトドナーの病歴は、前記ｍＲＮＡを抽出する前もしくはその後に検査される、請求項５３に記載のドナー特異的抗体ライブラリー。
【請求項５５】
標的抗原に対する抗体もしくは抗体フラグメントの集団を発現するドナー特異的ライブラリーを作製するための方法であって、該方法は、
ａ）該標的抗原に対する抗体生成を引き起こす疾患に罹患したかもしくは現在罹患しているヒト患者ドナーのリンパ球から、ｍＲＮＡを得る工程；
ｂ）該得られたｍＲＮＡの逆転写によって、該患者の免疫グロブリンレパートリーをコードする配列を含む核酸の集団を生成する工程；および
ｃ）該ドナー特異的ライブラリーを、該核酸を標識する特有のバーコードで同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５６】
工程ａ）の前もしくは後に、前記患者の血清学的プロフィールを生成する工程および／または該患者の病歴を検査する工程をさらに包含する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ｄ）前記核酸を発現ベクターに挿入する工程；
ｅ）前記免疫グロブリンレパートリーを発現する工程；および
ｆ）ディスプレイ系において、該免疫グロブリンレパートリーをディスプレイする工程、
をさらに包含する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ディスプレイ系は、ファージミドである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ライブラリーのメンバーを、前記標的抗原を中和もしくは活性化するそれらの能力に基づいて選択する工程をさらに包含する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも１種の中和抗体を生じる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
１種より多くの中和抗体を生じる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記標的抗原を中和もしくは活性化することが見いだされたライブラリーメンバーを含む１種以上の下位ライブラリーを作り出す工程をさらに包含する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
同定された少なくとも１種のライブラリーメンバーを配列決定する工程を包含する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
請求項５９に記載の方法によって選択される抗体によって中和もしくは活性化される標的抗原と関連する疾患を処置もしくは予防するための方法であって、該方法は、該選択される抗体の有効量を、必要とする該ヒト患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６５】
前記抗体は、中和抗体である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記疾患は、インフルエンザウイルスＡ感染である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記疾患は、表１に列挙される疾患からなる群より選択される、請求項６４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ドナー特異的抗体ライブラリー、ならびにこれを作製および使用するための方法に関する。本発明はまた、このようなドナー特異的抗体ライブラリーから得られる中和抗体、および種々のヒト疾患および状態の予防および／もしくは処置のために得られた抗体を使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ヒト疾患の診断、予防および処置に対して特異的な薬剤の生成および同定は、有用な化学的性質の巨大な集団の利用を要する。抗体ライブラリーの作出およびスクリーニングのための種々の技術の到来かつ迅速な開発に関して、疾患標的に対するモノクローナル抗体は、新たな薬物候補の主要なカテゴリーのうちの１つになった。ヒト使用のために、特異性および有効性に加えて、安全性は、主要な懸念であるので、ヒトモノクローナル抗体のライブラリーは、特に重要になった。
【０００３】
現在では、ヒト抗体ベースの薬物候補の開発は、代表的には、代表的には、それらの意図された適用に関連しないヒトレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）に由来する抗体配列の無作為集団を含むヒト抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって、同定される。特異的ヒトドナーから作出された各抗体ライブラリーは、上記ドナーがその個々の寿命の過程にわたって遭遇し、挑戦し、かつ乗り越えた全ての特有の挑戦（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に由来するかもしくは作り出す、全ての成分、生理学、および代謝的変化に対する抗体を潜在的に含む。現在のアプローチに伴って作製された代表的なヒト抗体ライブラリーは、ドナーの健康上の履歴の理解なしに構築されるので、得られた免疫グロブリンレパートリーにおいて予測されるものはほとんど未知である。
【０００４】
従って、特定の疾患との遭遇に首尾よく耐えたかもしくは現在耐えている個体から抗体ライブラリーを作り出すことは、特に重要である。なぜなら、彼らの得られたレパートリーは、関連する疾患を特異的に防御するためにドナーが使用した抗体を含むからである。ネガティブ要素もしくはポジティブ要素を除去もしくは単離し、望ましくない内容を排除し、そして改善された特性を有するヒト抗体を生成する能力を含む、このようなライブラリーの効率的なスクリーニングおよび取り扱いのための方法を提供することもまた、重要である。
【０００５】
本発明は、特定の標的疾患との遭遇に曝され、これに耐えたもしくは現在耐えている個体に由来するドナー特異的抗体ライブラリーの作出、スクリーニングおよび取り扱いのための方法および手段を提供することによって、これらの必要性に対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一局面において、本発明は、標的抗原に対する抗体生成を引き起こす疾患に罹患したもしくは現在罹患しているヒト患者ドナーから得られた、抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子のレパートリーを含むベクター集団（ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に関し、ここで上記集団は、特有のバーコードで同定される。
【０００７】
一実施形態において、上記ベクター集団は、抗体軽鎖もしくはそのフラグメントをコードする核酸分子（例えば、抗体λ軽鎖、もしくは抗体κ軽鎖、またはこれらのフラグメント）のレパートリーを含む。
【０００８】
別の実施形態において、上記ベクター集団は、抗体重鎖もしくはそのフラグメントをコードする核酸分子のレパートリーを含む。
【０００９】
さらに別の実施形態において、上記バーコードは、上記集団に存在するベクターに連結されるかもしくは組み込まれ、そして／または上記抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子に連結されるかもしくは組み込まれるヌクレオチド配列であり、その結果、上記バーコードは、上記核酸分子の発現を妨害しない。
【００１０】
従って、上記バーコードは、例えば、上記核酸分子の３’非コード領域もしくは５’非コード領域に連結され得る、１〜約２４ヌクレオチドの連続する非コードヌクレオチド配列であり得る。
【００１１】
さらなる実施形態において、上記バーコードは、上記抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子に組み込まれる１個以上のサイレント変異のコード配列であるヌクレオチド配列である。
【００１２】
なおさらなる実施形態において、上記バーコードは、非連続ヌクレオチド配列である。上記非連続ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一部は、上記集団に存在するベクターに連結され得るかもしくは組み込まれ得る。あるいは、上記非連続ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一部は、上記抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子に組み込まれ得、その結果、上記非連続ヌクレオチド配列のうちの少なくとも一部は、上記核酸分子の発現を妨害しない。
【００１３】
別の実施形態において、上記バーコードは、ペプチドもしくはポリペプチド配列である。
【００１４】
異なる実施形態において、上記ベクター集団に存在するベクターは、ファージミドベクターであり、このファージミドは、例えば、バクテリオファージ遺伝子ＩＩＩ、および上記抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子と上記バクテリオファージＩＩＩ遺伝子との間に終止コドンを含み、そしてバーコード（例えば、上記終止コドンの後ろの非翻訳領域に挿入される連続する非コードヌクレオチド配列）を有し得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、本発明のベクター集団を含む宿主細胞に関する。上記宿主細胞は、真核生物宿主細胞もしくは原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ脂肪）であり得る。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、標的抗原に対する抗体もしくは抗体フラグメントの集団を発現するライブラリーメンバーを含むドナー特異的抗体ライブラリーに関し、ここで上記抗体もしくは抗体フラグメントは、上記標的抗原に対する抗体生成を引き起こす疾患に罹患したかもしくは現在罹患しているヒトドナーから得られ、ここで上記抗体ライブラリーは、少なくとも１個の特有のバーコードで同定される。
【００１７】
一実施形態において、上記抗体重鎖および軽鎖は、これらが得られる上記ヒトドナーに特有のバーコードで各々別個に同定される。
【００１８】
別の実施形態において、上記ドナー特異的抗体ライブラリーは、１個の特有のバーコードで同定される。
【００１９】
さらに別の実施形態において、上記抗体もしくは抗体フラグメントは、ベクターに存在する核酸分子によってコードされる抗体重鎖および軽鎖もしくはそのフラグメントから構成される。
【００２０】
さらなる実施形態において、上記バーコードは、上記ライブラリーに存在するベクターに連結されるかもしくは組み込まれ、そして／または上記抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子に連結されるかもしくは組み込まれるヌクレオチド配列であり、その結果、上記バーコードは、上記核酸分子の発現を妨害しない。
【００２１】
なおさらなる実施形態において、上記バーコードは、１〜約２４ヌクレオチドの連続非コードヌクレオチド配列であり、これらは、例えば、上記核酸分子の３’非コード領域もしくは５’非コード領域であり得る。
【００２２】
異なる実施形態において、上記バーコードは、上記抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子に組み込まれる１個以上のサイレント変異のコード配列によってコードされる。
【００２３】
別の実施形態において、上記バーコードは、非連続ヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２４】
さらなる実施形態において、上記バーコードをコードする上記非連続配列のうちの少なくとも一部は、上記ライブラリーに存在するベクターに連結されるかもしくは組み込まれる。
【００２５】
なおさらなる実施形態において、上記バーコードをコードする上記非連続配列のうちの少なくとも一部は、上記抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子に組み込まれ、その結果、上記バーコードをコードする上記非連続配列のうちの少なくとも一部は、このような核酸分子の発現を妨害しない。
【００２６】
異なる実施形態において、上記バーコードは、ペプチドもしくはポリペプチド配列である。
【００２７】
別の実施形態において、ベクターは、ファージミドベクターであり、例えば、バクテリオファージ遺伝子ＩＩＩ、および上記抗体軽鎖もしくは重鎖またはそのフラグメントをコードする核酸分子と上記バクテリオファージＩＩＩ遺伝子との間に終止コドンを含み得る。
【００２８】
さらに別の実施形態において上記ヒト患者ドナーの病歴は、上記ドナーが上記疾患に罹患したかもしくは現在罹患していることを示す。いくつかの実施形態において、上記ヒトドナーが、上記疾患に罹患したかもしくは現在罹患していることは、独立して確認される。
【００２９】
さらなる実施形態において、上記ドナー特異的抗体ライブラリーは、上記標的抗原とは異なる抗原を特異的に結合する抗体および抗体フラグメントを実質的に欠いている。
【００３０】
一実施形態において、上記標的抗原は、インフルエンザＡウイルス（例えば、インフルエンザＡウイルス  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、もしくはＨ９サブタイプの単離株）である。
【００３１】
別の実施形態において、上記ライブラリーは、１つより多くのインフルエンザＡウイルスサブタイプに特異的に結合する少なくとも１種の抗体もしくは抗体フラグメントを発現する。
【００３２】
さらに別の実施形態において、上記ライブラリーは、上記インフルエンザウイルスＡのＨ５Ｎ１サブタイプに結合しかつ中和する少なくとも１種の抗体もしくは抗体フラグメントを発現する。
【００３３】
さらなる実施形態において、上記ヒトドナーは、以下の表１に列挙される疾患からなる群より選択される疾患に罹患したかもしくは現在罹患している。
【００３４】
なおさらなる実施形態において、上記抗体ライブラリーは、上記標的疾患と関連する抗原に結合する少なくとも１種の抗体もしくは抗体フラグメントを発現する。
【００３５】
さらなる実施形態において、上記抗体ライブラリーは、上記標的疾患と関連する抗原に結合しかつ中和する少なくとも１種の抗体もしくは抗体フラグメントを発現する。
【００３６】
上記ドナー特異的抗体ライブラリーは、例えば、ファージライブラリーであり得、一実施形態において、これは、抗体もしくは抗体フラグメントのうちの１０６個より多くの異なるメンバー、もしくは抗体もしくは抗体フラグメントのうちの１０９個より多くの異なるメンバーをコードする配列を含み得る。
【００３７】
他の実施形態において、上記ドナー特異的抗体ライブラリーは、限定されることなく、芽胞−ディスプレイライブラリー、リボソームディスプレイライブラリー、ｍＲＮＡディスプレイライブラリー、微生物細胞ディスプレイライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、もしくは哺乳動物ディスプレイライブラリーである。
【００３８】
一実施形態において、上記ベクターに存在する抗体もしくは抗体フラグメントをコードする核酸は、上記ヒト患者ドナーのリンパ球から抽出されるｍＲＮＡから逆転写され、ここで上記リンパ球は、例えば、骨髄、血液、脾臓、もしくはリンパ節から発生し得る。
【００３９】
望ましい場合、上記ヒトドナーの血清学的プロフィールは、上記ｍＲＮＡを抽出する前に生成され得る。
【００４０】
代わりに、もしくはさらに、上記ヒトドナー、および必要に応じて、上記ドナーの家族の病歴は、上記ｍＲＮＡを中するする前もしくはその後に検査される。
【００４１】
別の局面において、本発明は、標的抗原に対する抗体もしくは抗体フラグメントの集団を発現するドナー特異的ライブラリーを作製するための方法に関し、上記方法は、
ａ）上記標的抗原に対する抗体生成を引き起こす疾患に罹患したかもしくは現在罹患しているヒト患者ドナーのリンパ球からｍＲＮＡを得る工程；
ｂ）上記得られたｍＲＮＡの逆転写によって、上記患者の免疫グロブリンレパートリーをコードする配列を含む核酸の集団を生成する工程；および
ｃ）上記核酸を標識する特有のバーコードで、上記ドナー特異的ライブラリーを同定する工程、
を包含する。
【００４２】
上記方法は、上記患者の血清学的プロフィールを生成する工程、および／または工程ａ）の前もしくはその後に、上記患者の病歴を検査する工程をさらに包含し得る。
【００４３】
上記方法は、ｄ）上記核酸を発現ベクターに挿入する工程；ｅ）上記免疫グロブリンレパートリーを発現させる工程；およびｆ）上記免疫グロブリンレパートリーをディスプレイ系においてディスプレイする工程、をさらに包含し得る。
【００４４】
別の実施形態において、上記方法は、上記ライブラリーのメンバーを、上記標的抗原を中和もしくは活性化するそれらの能力に基づいて、選択する工程をさらに包含する。
【００４５】
なおさらなる実施形態において、上記方法は、少なくとも１種の中和抗体を生じる。
【００４６】
別の実施形態において、上記方法は、上記標的抗原を中和もしくは活性化させることが見いだされたライブラリーメンバーを含む１個以上の下位ライブラリー（ｓｕｂ−ｌｉｂｒａｒｙ）を作り出す工程をさらに包含する。
【００４７】
さらに別の実施形態において、本発明は、同定された少なくとも１個のライブラリーメンバーを配列決定する工程を包含する。
【００４８】
さらなる局面において、本発明は、上記方法によって選択された抗体によって中和もしくは活性化される標的抗原と関連する疾患を処置もしくは予防するための方法に関し、上記方法は、有効量の上記選択された抗体を、必要なヒト患者に投与する工程を包含する。
【００４９】
上記抗体は、例えば、中和抗体（例えば、少なくとも１つのインフルエンザＡウイルスサブタイプに対する中和抗体）であり得る。
【００５０】
別の実施形態において、上記疾患は、以下の表１に列挙される疾患からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、本発明のヒト抗体ライブラリーの作出のための代表的な方法を模式的に例示するフローチャートである。
【図２】図２は、２つの異なる標的（ＡおよびＢ）に対する反応強度を増大させるための代表的パニング富化スキームを例示する。富化の各ラウンドは、上記個々の標的に対するプールの反応性強度を増大させる。
【図３】図３は、標的ＡおよびＢと交叉反応性のクローンの選択のためのストラテジーを例示し、ここで各連続するラウンドは、反両方の標的に対して得られたプールの応性強度を強化する。
【図４】図４は、並行発見プール（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｐｏｏｌ）を組換えて、交叉反応性を生成／増大させることによって、２つの異なる標的（標的ＡおよびＢ）に対する反応性強度を増大させるためのストラテジーを例示する。上記組換え抗体ライブラリーの選択の各ラウンドは、両方の標的に対して得られたプールの反応性強度を増大させる。
【図５】図５は、標的Ａに対する反応性を維持しながら、標的Ｂに対する交叉反応性を増大させるためのストラテジーを例示する。第１に、標的Ａと反応性のクローンが選択され、次いで、上記標的Ａと反応性のクローンの変異誘発ライブラリーは調製され、選択は、示されるように行われ、標的Ａおよび標的Ｂの両方との強い反応性を示す１個以上の抗体クローンを生じる。
【図６】図６は、「指定変異誘発（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」方法による多様な多機能抗体集団を生成するための代表的変異誘発法を例示する。
【図７Ａ】図７は、１５個の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示す。
【図７Ｂ】図７は、１５個の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示す。
【図７Ｃ】図７は、１５個の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示す。
【図７Ｄ】図７は、１５個の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示す。
【図７Ｅ】図７は、１５個の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示す。
【図７Ｆ】図７は、１５個の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示す。
【図７Ｇ】図７は、１５個の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示す。
【図７Ｈ】図７は、１５個の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示す。
【図７Ｉ】図７は、１５個の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示す。
【図７Ｊ】図７は、１５個の既知のヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質サブタイプのアミノ酸配列を示す。
【図８】図８は、トルコＨ５Ｎ１トリインフルエンザの大発生の６名のヒト生存者から得られた血液サンプルについてのＨ５ヘマグルチニン（ＨＡ）血清学結果を示す。上記データは、上記ＨＡ抗原に対する抗体の存在を示す。
【図９】図９は、１２名のその土地のドナーの血清サンプルで得られ、Ｈ５抗原（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４）およびＨ１Ｎ１抗原（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９）およびＨ３Ｎ２抗原（Ａ／パナマ／２００７／９９）のウイルスに対して試験した血清学結果を示す。
【図１０】図１０は、抗体ファージライブラリーの構築において使用される特有のバーコード付与アプローチを例示する。
【図１１】図１１は、種々のインフルエンザＡサブタイプに由来するヘマグルチニンに結合する抗体の分析を示す。
【図１２】図１２は、必要とされるＨ５ヘマグルチニン結合グループ１の位置およびＦａｂ  ４７ｅにおける結晶構造に対するドミナント変異を示す。
【図１３】図１３および図１４は、トルコトリインフルエンザ生存者の血清および骨髄の分析によって同定された抗体重鎖および軽鎖配列を使用して、多様な抗体重鎖および軽鎖ライブラリーを作り出すための指定変異誘発の使用を例示する。
【図１４】図１３および図１４は、トルコトリインフルエンザ生存者の血清および骨髄の分析によって同定された抗体重鎖および軽鎖配列を使用して、多様な抗体重鎖および軽鎖ライブラリーを作り出すための指定変異誘発の使用を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
（詳細な説明）
（Ａ．定義）
別段定義されない限り、本明細書において使用される技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）は、当業者に、本願において使用される用語の多くに対する一般的ガイドを与える。
【００５３】
当業者は、本発明の実施において使用され得る、本明細書に記載されるものと類似もしくは等価な多くの方法および材料を認識する。実際に、本発明は、記載される方法および材料に決して限定されない。本発明の目的に関して、以下の用語は、以下で定義される。
【００５４】
語句「保存されたアミノ酸残基」とは、互いに整列させられた２種以上のアミノ酸配列の間で同一であるアミノ酸残基に言及するために使用される。
【００５５】
用語「疾患」、「障害」、および「状態」は、本明細書において交換可能に使用され、通常の身体機能の混乱、もしくは任意のタイプの病状の出現に言及する。正常の生理の混乱を引き起こす原因因子は、公知であってもよいし未知であってもよい。さらに、２名の患者が同じ障害と診断され得るが、それらの個体によって示される特定の症状は、同一でってもよいし、そうでなくてもよい。
【００５６】
「有効な量」とは、有益もしくは望ましい治療的（予防的を含む）結果をもたらすに十分な量である。有効な量は、１回以上の投与において投与され得る。
【００５７】
「組成物」は、本明細書において使用される場合、活性成分（例えば、本発明から生成される中和抗体）、および少なくとも１種の添加剤（例えば、薬学的に受容可能なキャリア）を含むと定義され、上記薬学的に受容可能なキャリアとしては、水、ミネラル、タンパク質、および／もしくは当業者に公知の他の賦形剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
本明細書において使用される場合、用語「処置する」もしくは「処置」とは、疾患を示す臨床的症状の改善を意味することが意図される。
【００５９】
本明細書において使用される場合、用語「予防する」もしくは「予防」とは、疾患を示す臨床的症状を妨げることを意味することが意図される。
【００６０】
用語「被験体」および「患者」とは、本明細書において使用される場合、交換可能に使用され、検査、処置、分析、試験もしくは診断の被験体である、動物、および好ましくは、哺乳動物のいずれかに言及し得る。従って、被験体もしくは患者は、ヒト、非ヒト霊長類、および他の哺乳動物を含み、彼らは、疾患もしくは他の病的状態を有してもよいし有さなくてもよい。
【００６１】
用語「アミノ酸」もしくは「アミノ酸残基」とは、代表的には、その分野で認識される定義を有するアミノ酸（例えば、アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）からなる群より選択されるアミノ酸）をいうが、改変アミノ酸、合成アミノ酸、もしくは稀なアミノ酸が、望ましい場合には使用され得る。従って、３７  ＣＦＲ  １．８２２（ｂ）（４）に列挙される改変アミノ酸および通常でないアミノ酸は、この定義内に含まれ、明示的に本明細書に参考として援用される。アミノ酸は、種々の亜群へと下位分類され得る。従って、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；負に荷電した側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；正に荷電した側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；もしくは非荷電極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒ）を有するとして分類され得る。アミノ酸はまた、低分子アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ）、求核性アミノ酸（Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ）、疎水性アミノ酸（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、アミド（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、および塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）として分類され得る。
【００６２】
用語「改変体」とは、参照ポリペプチドに関して、ネイティブポリペプチドと比較して、少なくとも１個のアミノ酸変異もしくは改変（すなわち、変化）を有するポリペプチドをいう。「アミノ酸改変」によって生成される改変体は、上記ネイティブアミノ酸配列において、例えば、少なくとも１個のアミノ酸を置換、欠失、挿入および／もしくは化学的に改変することによって生成され得る。
【００６３】
「アミノ酸改変」とは、所定のアミノ酸配列のアミノ酸配列における変化をいう。例示的な改変としては、アミノ酸置換、挿入および／もしくは欠失を含む。
【００６４】
特定の位置における「アミノ酸改変」とは、上記特定の残基の置換もしくは欠失、または上記特定の位置に隣接する少なくとも１個のアミノ酸残基の挿入をいう。特定の残基に「隣接する」挿入とは、その１〜２個の残基内での挿入を意味する。上記挿入は、上記特定の残基に対してＮ末端側もしくはＣ末端側に存在し得る。
【００６５】
「アミノ酸置換」とは、所定のアミノ酸配列中の少なくとも１個の既存のアミノ酸残基を、別の異なる「置換」アミノ酸残基で置換することをいう。上記置換残基は、「天然に存在するアミノ酸残基」（すなわち、遺伝コードによってコードされる）であり得、以下からなる群より選択され得る：アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）。１個以上の天然に存在しないアミノ酸残基での置換はまた、本明細書におけるアミノ酸置換の定義によって包含される。
【００６６】
「天然に存在しないアミノ酸残基」とは、上記の天然に存在するアミノ酸残基以外の、ポリペプチド鎖において隣接するアミノ酸残基を共有結合することができる残基をいう。天然に存在しないアミノ酸残基の例としては、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリンおよび他のアミノ酸残基残ログ（例えば、Ｅｌｌｍａｎら  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１  ３３６（１９９１）に記載されるもの）が挙げられる。このような天然に存在しないアミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）およびＥｌｌｍａｎら（前出）の手順が、使用され得る。簡潔には、これら手順は、天然に存在しないアミノ酸残基でサプレッサｔＲＮＡを化学的に活性化すること、続いて、上記ＲＮＡのインビトロ転写および翻訳を伴う。
【００６７】
「アミノ酸挿入」とは、所定のアミノ酸配列への少なくとも１個のアミノ酸の組み込みをいう。上記挿入は、通常、１個もしくは２個のアミノ酸残基の挿入からなる一方で、本願は、より大きな「ペプチド挿入」（例えば、約３〜約５個もしくはさらに約１０個までのアミノ酸残基の挿入）を企図する。上記挿入された残基は、上記で議論されるように、天然に存在していてもよいし、天然に存在していなくてもよい。
【００６８】
「アミノ酸欠失」とは、少なくとも１個のアミノ酸残基を、所定のアミノ酸配列から除去することをいう。
【００６９】
用語「ポリヌクレオチド」とは、核酸（例えば、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子ならびにこれらのアナログ（例えば、ヌクレオチドアナログを使用して、もしくは核酸化学を使用して生成されるＤＮＡもしくはＲＮＡ）をいう。望ましい場合、上記ポリヌクレオチドは、合成的に、例えば、当該分野で認識される核酸化学を使用して、例えば、ポリメラーゼを使用して、作製され得、望ましい場合には、改変され得る。代表的な改変としては、メチル化、ビオチン化、および他の当該分野で公知の改変が挙げられる。さらに、上記核酸分子は、一本鎖もしくは二本鎖であり得、そして望ましい場合、検出可能な部分に連結され得る。
【００７０】
用語「変異誘発」とは、別段特定されない限り、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列を改変するために任意の当該分野で認識されている技術をいう。変異誘発の好ましいタイプとしては、エラープローンＰＣＲ変異誘発、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、もしくは他の部位指向性変異誘発が挙げられる。
【００７１】
「部位指向性変異誘発」とは、当該分野で標準的な技術であり、望ましい変異を表す制限されたミスマッチを除いて変異誘発されるように、一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して行われる。簡潔には、上記合成オリゴヌクレオチドは、上記一本鎖ファージＤＮＡに対して相補的な鎖の合成を指向するためにプライマーとして使用され、その得られた二本鎖ＤＮＡは、ファージ支援宿主細菌（ｐｈａｇｅ−ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｈｏｓｔ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に形質転換される。上記形質転換細菌の培養は、上部の寒天にプレートされ、上記ファージを内部にもつ単一の細胞からのプラーク形成を可能にし、上記新たなプラークのうちの５０％は、一本鎖として、変異した形態を有するファージを含み；５０％は、元の配列を有する。目的のプラークは、正確なマッチのハイブリダイゼーションを可能にする温度でキナーゼ処理（ｋｉｎａｓｅｄ）合成プライマーとハイブリダイズすることによって選択されるが、その温度で、上記元の鎖とのミスマッチは、ハイブリダイゼーションを妨げるのに十分である。次いで、上記プローブとハイブリダイズするプラークが選択され、配列決定され、培養され、そのＤＮＡが回収される。
【００７２】
用語「ベクター」とは、細胞における自律的複製が可能でかつＤＮＡセグメント（例えば、遺伝子もしくはポリヌクレオチド）が、上記結合されるセグメントの複製をもたらすように作動可能に連結されるｒＤＮＡ分子をいうために使用される。１種以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を指向し得るベクターは、本明細書において「発現ベクター」といわれる。用語「制御配列」とは、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必須のＤＮＡ配列をいう。原核生物に適した上記制御配列としては、例えば、プロモーター、必要に応じて、オペレーター配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが公知である。
【００７３】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合に「作動可能に連結されている」。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのＤＮＡは、上記ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合にポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されている；プロモーターもしくはエンハンサーは、上記配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている；またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置している場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結」とは、連結されている上記ＤＮＡ配列が連続しており、そして分泌リーダーの場合には、連続しておりかつリーディング相中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、都合のよい制限部位においてライブラリーゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、上記合成オリゴヌクレオチドアダプターもしくはリンカーが、従来の経験に従って使用される。
【００７４】
パーセント（％）アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を使用して決定され得る。上記ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードされるか、そうでなければ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから得られ得る。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は、いくつかの検索パラメーターを使用し、ここでそれらパラメーターの全ては、以下を含むデフォルト値に設定されている：例えば、ｕｎｍａｓｋ＝ｙｅｓ、ｓｔｒａｎｄ＝ａｌｌ、ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓ＝１０、ｍｉｎｉｍｕｍ  ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｌｅｎｇｔｈ＝１５／５、ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ  ｅ−ｖａｌｕｅ＝０．０１、ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ＝２５、ｄｒｏｐｏｆｆ  ｆｏｒ  ｆｉｎａｌ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝２５およびｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２。
【００７５】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」および「ＡＤＣＣ」とは、ＦｃＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、標的細胞上に結合抗体を認識し、その後、上記標的細胞の融解を引き起こす細胞媒介性反応をいうために、本明細書において使用される。種々の免疫細胞は、異なるＦｃレセプター（ＦｃＲ）を発現する。従って、ＡＤＣＣを媒介するための主な細胞（ＮＫ細胞）は、ＦｃgＲＩＩＩのみを発現するのに対して、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。
【００７６】
用語「インフルエンザＡサブタイプ」もしくは「インフルエンザＡウイルスサブタイプ」とは、交換可能に使用され、ヘマグルチニン（Ｈ）およびノイラミニダーゼ（Ｎ）ウイルス表面タンパク質の種々の組み合わせによって特徴付けられ、従って、Ｈ番号およびＮ番号の組み合わせ（例えば、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）によって表示されるインフルエンザＡウイルス改変体をいう。上記用語は、具体的には、通常は、変異から生じ、異なる病理的側面を示す、各サブタイプ内の全ての株（絶滅株を含む）を含む。このような株はまた、ウイルスサブタイプの種々の「単離株」として言及され、全ての過去の、現在の、および将来的な単離株を含む。従って、この状況において、用語「株」および「単離株」は、交換可能に使用される。
【００７７】
用語「インフルエンザ」とは、インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染性疾患をいうために使用される。
【００７８】
（Ｂ．一般的技術）
本発明の方法を行うための技術は、当該分野で周知であり、標準的な実験教科書に記載されており、これら教科書としては、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ｏ’Ｂｒｉａｎら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｈｉｃｋｌｅ  ａｎｄ  Ｆｉｔｃｈ，編，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９０；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ，Ｔ．Ｒ．Ｇｌａｒｅ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，２０００；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００１；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｇ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，編，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ，２００４が挙げられる。変異誘発は、例えば、部位指向性変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５））を使用して行われ得る。ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４，６８３，１９２号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、および同第４，９６５，１８８号に、およびいくつかの教科書（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  「ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，編，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。
【００７９】
本発明の方法は、抗体のディスプレイのために使用されるいかなる特定の技術によっても限定されない。本発明は、ファージディスプレイを参照しながら例示されるが、本発明の抗体は、他のディスプレイおよび富化技術（例えば、リボソームもしくはｍＲＮＡディスプレイ（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９０２２−９０２６（１９９４）；Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４９３７−４９４２（１９９７））、微生物細胞ディスプレイ（例えば、細菌ディスプレイ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２９−３４（１９９７））、もしくは酵母細胞ディスプレイ（Ｋｉｅｋｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：１３０３−１３１０（１９９７））、哺乳動物細胞上でのディスプレイ、芽胞ディスプレイ（Ｉｓｔｉｃａｔｏら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：６２９４−６３０１（２００１）；Ｃｈｅｎｇら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：３３３７−３３４１（２００５）および同時係属中の仮特許出願番号第６０／９５５，５９２号（２００７年８月１３日出願）、ウイルスディスプレイ（例えば、レトロ・ウイルスディスプレイ（Ｕｒｂａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ３５（２００５）、タンパク質−ＤＮＡ連結に基づくディスプレイ（Ｏｄｅｇｒｉｐら，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：２８０６−２８１０（２００４）；Ｒｅｉｅｒｓｅｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ１０（２００５））、および、マイクロビーズディスプレイ（Ｓｅｐｐら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５３２：４５５−４５８（２００２））によっても同定され得る。
【００８０】
リボソームディスプレイにおいて、上記抗体およびコードｍＲＮＡは、リボソームによって連結され、上記リボソームディスプレイは、翻訳の最後に、上記ｍＲＮＡが上記ポリペプチドを放出することなくとどまるようにする。選択は、全体として三成分複合体（ｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）に基づく。
【００８１】
ｍＲＮＡディスプレイライブラリーにおいて、抗体とそのコードｍＲＮＡとの間の共有結合は、アダプター分子として使用さらえるピューロマイシンを介して確立される（Ｗｉｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：３７５０−３７５５（２００１））。抗体をディスプレイするためのこの技術の使用に関しては、例えば、Ｌｉｐｏｖｓｅｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２９０：５１−６７（２００４）を参照のこと。
【００８２】
微生物細胞ディスプレイ技術は、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−５５７（１９９７）））上での表面ディスプレイを含む。従って、例えば、抗体は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面に、酵母細胞壁上に位置するα−アグルチニン酵母接着レセプターへの融合を介してディスプレイされ得る。この方法は、フローサイトメトリーによってレパートリーを選択する可能性を提供する。蛍光標識された抗原および抗エピトープタグ試薬によって上記細胞を染色することによって、上記酵母細胞は、抗原結合のレベルおよび細胞表面での抗体発現に従って、ソートされ得る。酵母ディスプレイプラットフォームはまた、ファージと組み合わされ得る（例えば、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｕｃｋｅｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５４６：２８８−２９４（２００３）を参照のこと）。
【００８３】
抗体ライブラリーを選択し、スクリーニングするための技術の総説については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（９）：１１０５−１１１６（２００５）を参照のこと。
【００８４】
（Ｃ．好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ｉ．ドナー特異的抗体ライブラリーの調製）
本発明は、特定の疾患との遭遇に首尾よく耐えたかもしくは現在耐えている個体に由来するドナー特異的抗体ライブラリーに関する。その得られた抗体レパートリーは、上記ドナーが関連する疾患を特異的に防御するために使用した抗体を含み、従って、例えば、標的疾患の予防および／もしくは処置のための中和抗体を開発するために、重要なツールである。
【００８５】
本発明は、ヒト被験体における抗体生成を引き起こす任意の標的疾患に適用可能であるが、このような疾患の代表的な（限定ではない）例は、表１に列挙される。
【００８６】
【表１】
2010538618.tif 000003
本発明のドナー特異的ライブラリーを作り出すための方法は、図１に模式的に例示される。第１の工程として、潜在的なドナーが同定される。上記患者ドナーは、標的疾患に現在罹患していてもよいし、上記標的疾患から回復していてもよいし、上記疾患に耐えていてもよい。従って、例えば、実施例に例示されるように、上記ドナー特異的ライブラリーは、本明細書において、以前のインフルエンザ感染（季節性インフルエンザ大発生、流行、および世界的流行が挙げられる）の回復期患者の骨髄から作り出され得る。
【００８７】
患者ドナーを選択もしくは同定する際に、上記患者は、実際に上記標的疾患を有したかまたは現在有していることを確認することが重要である。上記確認の一部は、上記患者ドナーの病歴の検査である。上記病歴に加えて、種々の他の要因（例えば、上記患者の家族の病歴、上記患者の性別、体重、健康状態など）が、考慮に入れられ得る。上記患者の病歴が入手可能でないもしくはあてにならない、または任意の他の理由（例えば、さらなる他の確認手段）がある場合には、上記患者の血清学的側面が、決定され得る。血清学的アッセイは、当該分野で周知であり、種々の形式において（例えば、種々のＥＬＩＳＡアッセイフォーマットの形態において）行われ得る。従って、例えば、インフルエンザウイルスに対する抗体の存在は、周知のヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）アッセイ（Ｋｅｎｄａｌ，Ａ．Ｐ．，Ｍ．Ｓ．Ｐｅｒｅｉｒａ，ａｎｄ  Ｊ．Ｊ．Ｓｋｅｈｅｌ．１９８２．Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ａｔｌａｎｔａ，  Ｇｅｏｒｇｉａ）、もしくはミクロ中和アッセイ（Ｈａｒｍｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６：３３３−３３７（１９８８））によって検出され得る。この工程は、上記血清サンプルがインフルエンザ  中和抗体を含むことが既に確認された場合には必要ではないかもしれない。
【００８８】
ドナー特異的ヒト抗体ライブラリーを調製するために、リンパ球を含むサンプルを、標的疾患（例えば、表１に列挙されるものからの少なくとも１つの疾患）を発症させたことが既知の個体（患者ドナー）から集められる。上記サンプルは、例えば、骨髄、血液、脾臓、リンパ節、扁桃、胸腺などから得られ得る。骨髄は、本明細書において上記抗体ライブラリーの好ましい供給源である。なぜなら、個々のドナーの成熟抗体レパートリーの完全な「過去のアーカイブ（ｆｏｓｓｉｌ  ａｒｃｈｉｖｅ）」を表すからである。
【００８９】
リンパ球を含むサンプルは、種々の時点において上記患者ドナーから集められ得る。一実施形態において、リンパ球は、上記標的とした疾患から回復した患者から、少なくとも１日間、５日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、または少なくとも１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、１０年間にわたって、集められる。別の実施形態において、リンパ球は、回収の時点で上記標的とした疾患を有している、および上記疾患を有していると診断された患者から、少なくとも回収前の１日間、５日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、もしくは少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、もしくは１年間、２年間、３年間、４年間、もしくは５年間にわたって集められる。
【００９０】
末梢血サンプル（特に、地理的に異なる供給源に由来する）は、輸送および使用の前に安定化される必要があり得る。この目的のためのキットは周知であり、市販の（例えば、ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）  ＣＰＴＴＭ  細胞調製チューブ）は、リンパ球の遠心分離精製のために使用され得、およびグアニジウム、Ｔｒｉｚｏｌ、もしくはＲＮＡｌａｔｅｒが、上記サンプルを安定化するために使用され得る。リンパ球を他の供給源（例えば、リンパ系器官）から単離するための方法およびキットはまた、周知であり、市販されている。
【００９１】
上記安定化したリンパ球もしくは全骨髄を受け取ったら、ＲＮＡが抽出され、ＲＴ−ＰＣＲは、当該分野で公知の免疫グロブリンオリゴプライマーを使用して、抗体重鎖および軽鎖レパートリーをレスキューするために行われる。
【００９２】
骨髄リンパ球、もしくは任意の他の供給源のリンパ球に由来するＲＮＡの調製のための方法は、当該分野で周知である。ｍＲＮＡ抽出の一般的方法は、分子生物学の標準的教科書で開示されており、上記標準的教科書としては、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）が挙げられる。ＲＮＡ精製キットは、商業的製造業者（例えば、Ｑｉａｇｅｎ）から市販されており、上記製造業者の説明書に従って使用され得る。
【００９３】
ＲＮＡは、ＰＣＲのためのテンプレートとして働き得ないので、ＲＮＡは、ｃＤＮＡへと逆転写され、これは、ＰＣＲ増幅に供される。２つの最も一般的に使用される逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉｌｏ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写工程は、代表的には、環境および発現プロフィールの目的に依存して、特異的プライマー、ランダムヘキサマー、もしくはオリゴ−ｄＴプライマーを用いて始められる。例えば、抽出されたＲＮＡは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、製造業者の説明書に従って逆転写され得る。次いで、得られたｃＤＮＡは、その語のＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用され得る。
【００９４】
ファージディスプレイライブラリーを作り出すために、上記ＰＣＲレパートリー生成物は、ｓｃＦｖライブラリーを精製するためにリンカーオリゴと合わされて、当該分野で公知の手順に従って、ｍ１３  ｐＩＩＩタンパク質とインフレームで直接クリーニングされ得る。他のディスプレイ技術（例えば、上記で議論されるもの）を使用するライブラリーは、当該分野で周知の方法によって調製され得る。
【００９５】
代表的プロトコルにおいて、総ＲＮＡは、Ｔｒｉ  ＢＤ試薬（Ｓｉｇｍａ）によって、新鮮なもしくはＲＮＡｌａｔｅｒ安定化組織から抽出される。続いて、上記単離されたドナー総ＲＮＡは、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ精製（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ｍＲＮＡへとさらに精製される。次に、第１鎖ｃＤＮＡ合成は、ＡｃｃｕＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のプロトコルに従って、ランダムナノマーオリゴヌクレオチドおよび／もしくはオリゴ（ｄＴ）１８プライマーを使用することによって、生成される。簡潔には、１００ｎｇ  ｍＲＮＡ、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰおよび３００ｎｇ  ランダムナノマーならびに／または５００ｎｇオリゴ（ｄＴ）１８プライマーを、Ａｃｃｕｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で、６５℃で５分間にわたってインキュベートし、続いて、４℃へと迅速に冷却した。次いで、１００ｍＭ  ＤＴＴ、Ａｃｃｕｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ、およびＲＮＡｓｅ  Ｂｌｏｃｋを各反応系に添加し、４２℃において１時間にわたってインキュベートし、上記逆転写酵素は、７０℃において１５分間にわたって加熱することによって不活性化される。上記得られたｃＤＮＡは、上記抗体重鎖および軽鎖Ｖ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用され得、これは、次いで、ベクターへと、もしくはファージディスプレイライブラリーが意図される場合には、ファージミドベクターへとクローニングされ得る。この手順は、抗体重鎖および軽鎖可変領域クローン（ＶＨおよびＶＬライブラリー）のレパートリーを生成し、それは、スクリーニング目的で、別個にもしくは合わせて保持され得る。上記ベクター（例えば、ファージミドベクター）は、次いで、宿主細胞（例えば、Ｅ  ｃｏｌｉ宿主）へと導入されて、抗体軽鎖もしくは重鎖またはそれらのフラグメントをコードする核酸分子のレパートリーを含むベクター集団を生成し得る。各場合において、上記ベクター集団は、１個以上の抗体軽鎖もしくは抗体重鎖サブタイプを含み得る。従って、上記ベクター集団は、抗体κ軽鎖および／もしくはλ軽鎖をコードする配列を含み得る。
【００９６】
本発明の方法において、代表的には、抗体軽鎖および抗体重鎖は、上記で議論されるように最初に、別個にクローニングされ、また、上記κおよびλ軽鎖ライブラリーを分離する。上記ライブラリーはアーカイブに入れられ（ａｒｃｈｉｖｅｄ）得、そして必要とされる場合、重鎖ライブラリーを、分離されたκ鎖ライブラリーおよびλ鎖ライブラリーと合わされ得、重鎖および軽鎖対形成が、例えば、ファージディスプレイの場合においては、パニングによって同定され得る。達成されるべき目的に依存して、これら工程は、複数回、種々のライブラリーもしくは下位ライブラリーと反復することが可能である。本発明の方法は、成功を最大化するために、パニングの間に必要とされる場合、ライブラリー、下位ライブラリーもしくはクローンを含めるもしくは排除することにおいて、優れた可撓性を提供する。
【００９７】
特に、上記ベクター集団に存在する配列は、上記抗体重鎖および軽鎖（もしくはフラグメント）のコード配列をそれぞれ保有するので、上記配列は切り出され得、そして上記抗体重鎖および軽鎖、もしくはこれらのフラグメントの発現のために、１個以上の発現ベクターに挿入され得る。好ましくは、上記抗体重鎖および軽鎖もしくはそれらのフラグメントのコード配列は、上記抗体もしくは抗体フラグメントのライブラリーを生成するために重鎖および軽鎖の同時発現のために、同じ発現ベクターへと導入される。
【００９８】
本発明の発現ベクターは、上記ベクターを１個以上の選択された宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスに対して周知である。上記プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適しており、上記２μプラスミド起点は、酵母に適しており、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶもしくはＢＰＶ）は、哺乳動物再紡においてベクターをクローニングするために有用である。
【００９９】
発現ベクターは、代表的には、選択遺伝子（選択マーカーともいわれる）を含む。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくた他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するか、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するか、もしくは（ｃ）複雑な培地から利用可能でない重要な栄養要素を補う（例えば、ＢａｃｉｌｌｉのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）、タンパク質をコードする。
【０１００】
哺乳動物再紡に対する適切な選択マーカーの例は、上記再紡成分の同定が、上記抗体コード核酸を取り込みことを可能にするものである（例えば、ＤＨＦＲもしくはチミジンキナーゼ）。野生型ＤＨＦＲが使用される場合に適切な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）によって記載されるように調製および増殖される、ＤＨＦＲ活性が欠損しているＣＨＯ細胞株である。酵母において使用するための適切な選択遺伝子は、上記酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら，Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら，Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０）］。上記ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠いている酵母の変異株（例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６もしくはＰＥＰ４−１）についての選択マーカーを提供する［Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）］。
【０１０１】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、ｍＲＮＡ合成を指向するために、上記抗体コード核酸配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む。種々の潜在的な宿主細胞によって認識されるプロモーターは、周知である。原核生物宿主とともに使用するために適したプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）；ＥＰ  ３６，７７６］、およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター）［ｄｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３）］が挙げられる。細菌系において使用するためのプロモーターはまた、上記抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結されるシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【０１０２】
酵母宿主とともに使用するのに適したプロモーター配列（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼに対するプロモーター［Ｈｉｔｚｅｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３（１９８０）］もしくは他の糖分解性酵素［Ｈｅｓｓら，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．，７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：４９００（１９７８）］（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）に対するプロモーターが挙げられる。
【０１０３】
増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素に対するプロモーター領域である。酵母発現において使用するための適切なベクターおよびプロモーターは、ＥＰ  ７３，６５７においてさらに記載されている。
【０１０４】
哺乳動物宿主細胞における上記発現ベクター中の重鎖もしくは軽鎖遺伝子の転写は、例えば、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（ＵＫ  ２，２１１，５０４（１９８９年７月５日公開））、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られるプロモーターによって、異種哺乳動物プロモーター（例えば、上記アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーター）から得られるプロモーターによって、および熱ショックプロモーターから、このようなプロモーターが上記宿主細胞系と適合性であれば、制御される。
【０１０５】
高等真核生物による、上記抗体遺伝子をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列を上記ベクターに挿入することによって、増大させられ得る。エンハンサーは、その転写を増大させるようにプロモーターに対して作用する、通常、約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性要素である。多くのエンハンサー配列は、いまや哺乳動物遺伝子から公知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）。しかし、代表的には、真核生物細胞ウイルスに由来するエンハンサーを使用する。例としては、複製起点（ｂｐ１００〜２７０）の後ろ側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。上記エンハンサーは、上記抗体コード配列に対して５’側もしくは３’側にある位置において、上記ベクターにスプライスされ得るが、好ましくは、上記プロモーターから５’側の位置に位置する。
【０１０６】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、もしくは他の多細胞生物に由来する核化細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結に、および上記ｍＲＮＡを安定化させるために必須の配列を含む。このような配列は、真核生物のもしくはウイルスのＤＮＡもしくはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、およびときおり３’  非翻訳領域から一般に入手可能である。これら領域は、上記抗体重鎖および軽鎖をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【０１０７】
組換え脊椎動物細胞培養に従ってポリペプチドの合成に適合させるために適したさらに他の方法、ベクター、および宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０−４６（１９７９）；ＥＰ  １１７，０６０；およびＥＰ  １１７，０５８に記載されている。
【０１０８】
特定の実施形態において、上記抗体ライブラリーは、ファージライブラリーの形態において生成され、ここで上記抗体重鎖および軽鎖もしくはそれらのフラグメントのコード配列は、ファージミドベクター（例えば、上記バクテリオファージ遺伝子ＩＩＩを含むベクター）にクローニングされる。ファージミドベクターは、周知であり、市販されている。これらのベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターＳＫＩＩ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｘ５２３２８）、および他のｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔベクターが挙げられる。ファージディスプレイ技術は、ヒト抗体の大きなレパートリーの生成を可能にし、生体パニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）手順は、任意の望ましい特異性もしくは他の特性を有する個々の抗体の選択を可能にする。
【０１０９】
例えば、初期の流行および大流行（例えば、１９１８年のスペイン風邪）からの生存者の末梢リンパ球に由来する免疫学的レパートリーは、上記記載されるものに類似の様式において復活させられ得、安定化され得、レスキューされ得、そして発現させられ得る。さらなるＨ１およびＨ３ライブラリーについて、レパートリーは、適切にタイミングを計ってワクチン接種したその土地の出身のドナーから回収され得る。さらなる選択肢として、市販の骨髄総ＲＮＡもしくはｍＲＮＡは、Ｈ１およびＨ３に適した、また、ドナーの背景に依存して、Ｈ２抗体スクリーニングに適したライブラリーを生成するための市販の供給源から購入され得る。一般に、ワクチン接種が利用可能な処置選択しである標的疾患に関しては、抗体は、免疫したヒトドナーから得られる生物学的サンプルからも単離され得る。上記特定の抗原を認識する抗体の力価を発揮した、免疫した患者から、骨髄、血液、もしくは別のリンパ球供給源が集められ、生成された抗体が単離され、上記のように増幅され発現される。
【０１１０】
上記で議論されるように、各ドナーについて、抗体軽鎖および重鎖ライブラリーは、別個にクローニングされ得る。従って、各ドナーについて、種々のκ軽鎖およびλ軽鎖ファミリーは、別個にプールされ得、かつ等モル量でクローニングされ得る。同様に、各ドナーについて、種々の重鎖ファミリーは、プールされ得、等モル量でクローニングされ得る。抗体の遺伝子ファミリー特異的レスキューを可能にすることによって、本発明の方法は、量が少ない抗体を含む、プールされた抗体ライブラリーの場合には、任意のおよび全ての個体からの免疫グロブリン寄与を保証する上記ドナーの抗体レパートリーをより完全に表すライブラリーを得る。例えば、実施例の実施例１に例示されるように、本明細書における
上記インフルエンザ重鎖および軽鎖ライブラリーを調製することにおいて、６個のκ軽鎖ファミリー、１１個のλ軽鎖ファミリーおよび４個の重鎖ファミリーをレスキューした。
【０１１１】
代表的なスクリーンは、ゼロ、１個、もしくは１個より多い標的特異的ポジティブクローンを生じ得る。特定のコンビナトリアル抗体ライブラリーが、もっぱらスクリーニングされ、さらなる解決策がさらには獲得されそうにない場合、これは、上記重鎖および軽鎖レパートリーが標的に結合する能力がないことではないかもしれないが、逆に、上記集団は、標的を結合するために必要とされる上記必要な重鎖および軽鎖対を一緒にすることができなかった可能性がある。任意の個体からの代表的なレスキューされた軽鎖のレパートリーは、約１０５〜１０６個の特有の軽鎖、および約１０６〜１０８個の特有の重鎖を含み得る。このような対形成の考えられるコンビナトリアル生成物は、１０１１〜１０１４の範囲に及ぶ。このような集団は、数桁の規模で、大部分のディスプレイ系（例えば、ファージディスプレイ）の実際の限界を超える。結論として、現在のディスプレイ技術（例えば、ファージディスプレイ）を使用すると、ごく一部の上記コンビナトリアルの可能性が、任意の単一のファージ抗体ライブラリーにおいて捕獲および評価される。従って、重鎖の本来のセットと、軽鎖の本来の集団との再クローニングは、特定の標的に対するおそらく新規な抗体を有する、シャッフルされた重鎖および軽鎖の組み合わせの完全に新たなセットを生成する。このような新たな再シャッフルされた集団は、以前に存在した機能が乏しい（ｐｏｏｒｌｙ  ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ）ドナー特異的ライブラリーを再現性が高い集団へと形質転換することが見いだされた。具体的には、単一ドナーに由来する集団に関して、以前に、３ラウンドの選択後のバックグラウンドと比較すると、０．３倍の富化が達成されたに過ぎなかった。しかし、この集団が再クローニングされ、再シャッフルされた場合、３ラウンドのパニングの後に、１５倍の富化が可能になり、９２個の選択されたクローンから５５個の新規な配列が生じる。
【０１１２】
以前に言及されたように、代表的なスクリーニングは、標的特異的ポジティブクローンの任意の数を生じ得る。本発明は、それらの埋め込まれたバーコードによって任意のクローンの起源の同定を可能にする。代表的な抗体のスクリーンは、多くのドナー特異的ライブラリーに由来するファージ抗体を併せ得るので、上記ライブラリーのうちのいくらかおよびそれらのコンビナトリアルクローンが、抗体保有ファージ粒子として完全には表されないことが考えられる。この場合において、ポジティブクローンは、スクリーニングされる下位ライブラリーファージ集団において存在する可能なクローニングされた解決策全ての制限された物理的セットのみから生じた可能性がある。このような場合において、ドナー特異的ファージの集団をより完全に質問することはかなり重要である。この場合、ポジティブクローンからの上記バーコードは、上記クローンを担う上記特異的ライブラリーに導き、もっぱらおよびより深く上記目的の集団を深くスクリーニングすることを可能にする。
【０１１３】
望ましい抗体が、最初のライブラリー構築物のための基礎として最初に使用されるものを超えた機能的能力（例えば、中和もしくは活性化）を有しなければならない場合において、本発明者らは、将来を見越して、このような活性の証拠のために個々のドナー血清の輪郭を描き得る。上記望ましい活性が、任意の特定のドナー血清において合理的な力価で存在する場合、上記目的の標的に対してスクリーニングするために選択されるライブラリーに対応するものを選択し得る。他の場合において、上記関連する選択基準は、血清学に関連しない可能性があるが、ドナー特徴（例えば、年齢、性別もしくは病歴）に関連する可能性がある。いずれにしても、ドナープロフィールは、ライブラリー選択についての論理的なガイドでありかつドナー特異的かつ分離された抗体ライブラリーにおいてのみ可能ある。
【０１１４】
ファージパニングスクリーンを完了し、免疫優性クローンの存在を発見することは、異常ではない。さらに、反復パニングスクリーニングレジメンの際に、このようなクローンを再発見することも、異常ではない。優性クローンの場合において、より多くのもしくは異なるクローンのいずれかが望ましい場合、このクローンの存在を担うライブラリー物質を回避することが重要である。代表的なファージ抗体ライブラリーにおいて、上記特異的ライブラリーもしくは上記クローン起源の原因である物質は、上記集団から分離可能ではないが、ドナー特異的ライブラリーにおいて、上記ライブラリーを再スクリーニングし、望ましくないドナー下位ライブラリーを単純に省くことは可能であり、それによって、以前に同定された優性クローンからポジティブな選択に焦点を当てる。
【０１１５】
単純さのために、上記ライブラリーは、重鎖もしくは軽鎖ライブラリーとして記載されるが、同じ記載が抗体フラグメントのライブラリー、抗体重鎖および／もしくは軽鎖の抗体フラグメント、および抗体様分子のライブラリーに適用されることは、当業者にとって明らかである。
【０１１６】
特定の実施形態において、二重特異性（例えば、２つの異なるインフルエンザＡサブタイプと、および／もしくは同じサブタイプの２つの株（単離株）と、および／もしくはヒトおよび非ヒト分離物との反応性を示す）を有する抗体は、制御される交叉反応性選択および／もしくは指向性のコンビナトリアル操作および／もしくは変異誘発操作を介して発見および最適化され得る。
【０１１７】
図２に例示される代表的な富化スキームにおいて、２個の標的（標的ＡおよびＢと示される）に対する交叉反応性を示す抗体を含むライブラリーは、複数ラウンドの富化に供される。富化が標的Ａとの反応性に基づいている場合、各ラウンドの富化は、標的Ａに対する、上記プールの反応性強度を増大させる。同様に、富化が、標的Ｂとの反応性に基づく場合、各ラウンドの富化は、標的Ｂに対する、上記プールの反応性強度を増大させる。図２は、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングする場合に使用される選択方法である（以下を参照のこと）パニングに言及するが、上記アプローチは、上記で議論されるライブラリーのうちのいずれかのタイプおよびディスプレイ技術のいずれかのタイプに等しく適用可能であるか、そうでなければ当該分野で公知である。標的ＡおよびＢは、抗体が結合する任意の標的を包含し、上記標的としては、インフルエンザウイルスの種々の分離物、タイプおよびサブタイプが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
上記目的が、複数の特異性を有する中和抗体を同定することである場合、交叉反応性発見選択スキームが、使用され得る。単純性という重要性において、このスキームは、二重特異性を有する抗体の選択性を示す図３において例示される。この場合、２個の標的（標的ＡおよびＢ）との反応性を示す抗体を含む抗体ライブラリーは、最初に、上記標的のうちの一方（例えば、標的Ａ）との反応性について、続いて、他方の標的（例えば、標的Ｂ）との反応性について選択される。各連続選択ラウンドは、両方の標的に対して生じたプールの反応性強度を強化する。従って、この方法は、二重特異性を有する抗体を同定するために特に有用である。当然のことながら、上記方法は、さらなる標的に対する反応性を示す抗体を、上記さらなる標的に対する富化のさらなるラウンドを含めることによって、同定するために拡張され得る。繰り返すと、上記スクリーニングされるライブラリーが、ファージディスプレイライブラリーである場合、選択は、交叉反応性パニングによって行われるが、他のライブラリーおよび他の選択法もまた、使用され得る。
【０１１９】
上記で議論した２つの方法の組み合わせは、標的Ａおよび標的Ｂ、それぞれに対する反応性に対する２回の別個の富化ラウンド、得られた２個のプールを組換え、その後、上記のように、交叉反応性選択ラウンドを含む。このアプローチは、図４に例示される。ちょうど純粋な交叉反応性選択におけるように、上記組換えライブラリーの各ラウンドの選択は、両方の標的に対して得られたプールの反応性強度を増大させる。
【０１２０】
図５に例示されるさらなる実施形態において、標的Ａとの強力な反応性を示しかつ検出可能な標的Ｂとの検出可能な交叉反応性を有する第１のクローンが、同定される。このクローンに基づいて、変異誘発性ライブラリーが調製され、これは、次いで交互のラウンドにおいて、それぞれ、標的Ｂおよび標的Ａとの反応性について選択される。このスキームは、標的Ａとの強力な反応性を維持し、標的Ｂとの増大した反応性を有する抗体を生じる。直前に、選択は、上記スクリーニングされたライブラリーが、ファージディスプレイライブラリーである場合に、パニングによって行われるが、他のライブラリー、他のディスプレイ技術、よび他の選択法もまた、同じストラテジーに従って使用され得る。
【０１２１】
上記で議論されるように、標的ＡおよびＢは、例えば、上記インフルエンザＡウイルスの２個の異なるサブタイプ、同じインフルエンザＡウイルスの２個の異なる株（単離株）、２つの異なる種からのサブタイプもしくは単離株であり得、ここで１種は、好ましくは、ヒトである。従って、例えば、標的Ａは、上記Ｈ５Ｎ１ウイルスの２００４年のベトナム単離株であり得、そして標的Ｂは、上記Ｈ５Ｎ１ウイルスの１９９７年の香港単離株であり得る。これら例は、単なる例示であり、任意の２個もしくは複数の標的に対して二重および複数の特異性を有する抗体は、同定され得、選択され得、類似の様式において最適化され得ることが強調される。
【０１２２】
一旦所望の特性を有する中和抗体が同定されると、このような抗体の大部分によって認識される優勢なエピトープを同定することが所望である得る。エピトープマッピングのための方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．，Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６；およびＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｈａｙ，編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１において開示されている。
【０１２３】
（ＩＩ．特融のバーコード付与でのドナー特異的抗体ライブラリーの同定）
本発明によれば、上記抗体重鎖および軽鎖レパートリーを、上記のように調製されたｃＤＮＡ（例えば、骨髄ｃＤＮＡ）から増幅した後、好ましくは、抗体重鎖および軽鎖ライブラリーは、各患者ドナーに関して別個にクローニングされ、ここで上記個々のライブラリーは、特融のバーコードを使用して区別され得る。
【０１２４】
上記バーコードは、好ましくは、所望の抗体鎖もしくはそのフラグメントの発現を妨害することなく、標識されたクローンとともに、増殖することができるように、選択される。本発明の例示的実施形態において、上記バーコードは、上記発現ベクターの配列（好ましくは、ファージミドベクターが使用される場合には、末端ｐＩＩＩ終止コドンの後に、３’非翻訳領域）に挿入され得る。クローン選択の際に、ベクターの特融の配列が決定され、単一の規定されたライブラリーの専用のものになる。この規定されたライブラリーは、単一のドナーのみならず、ドナーの別個のプール、または合成レパートリーもしくは半合成集団にも由来し得る。別の実施形態において、上記バーコードは、上記抗体重鎖および／もしくは軽鎖またはそれらのフラグメントのコード配列に、上記それぞれの鎖の発現を妨害しない位置もしくは形態において、挿入される。
【０１２５】
従って、上記バーコードは、配列決定もしくは特異的ＰＣＲプライマーによってデコンボルーションされ得る、長さが約１〜２４個の連続する非コードヌクレオチドの配列であり得る。この方法、核酸の集団（例えば、抗体レパートリー）は、上記クローニング工程において連結され得る。本発明の例示的実施形態において、上記バーコードは、無作為に作製された配列の３塩基もしくは５塩基である。
【０１２６】
別の例において、上記バーコードは、サイレント変異のコード配列である。上記ライブラリーが、中断パリンドローム（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ  ｐａｌｉｄｒｏｍｅ）（例えば、Ｓｆｉ  ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣＣ）を認識する制限酵素を利用する場合、別個のヌクレオチドが、クローンの種々の集団（例えば、抗体ライブラリー）を区別するために上記「Ｎ」の代わりに組み込まれ得る。このバーコード付与アプローチは、上記増幅工程において上記レパートリーが連結されるという利点を有する。
【０１２７】
さらなる実施形態において、上記バーコードは、非連続ヌクレオチド配列であり、この配列は、上記ベクター配列および／もしくは上記望ましい抗体鎖のコード配列中に存在し得る。従って、非連続配列を有するバーコードは、上記種々の個々の配列の起源を同定し、それらのその後の取り扱いをモニターすることにおいて、非常に大きな融通性を提供する。
【０１２８】
この例において、上記バーコードは、ファージ粒子に融合された、免疫学的に別個のペプチドもしくはタンパク質配列をコードするコード配列である。例としては、例えば、ｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＶＩＩ、もしくはｐＩＸファージへのエピトープ（例えば、Ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧ）融合物が挙げられる。上記エピトープは、単純に、もしくは種々の組み合わせにおいて提供され得、そしてシス（ライブラリーコードプラスミドにおいて）もしくはトランス（特異的に改変されたヘルパーファージ）構成において提供され得る。
【０１２９】
考えられるバーコードの他の例としては、ハプテンもしくは蛍光性発色団を用いた、化学的および酵素的ファージ改変（ファージライブラリーに関して）が挙げられるが、これらに限定されない。このようなタグは、単一のラウンドの選択のために好ましい。
【０１３０】
個体ドナーから得られた上記個々の重鎖および軽鎖ライブラリー、もしくは他のバーコード付与クローンもしくは集団が、個々の配列の供給源を区別する能力を失うことなく、プールされ得る。
【０１３１】
（ＩＩＩ．ドナー特異的抗体ライブラリー由来の中和抗体の最適化）
望ましい場合、二重特異性もしくは複数の特異性を有する上記中和抗体の交叉反応性は、米国特許出願公開第２００５０１３６４２８号（２００５年６月２３日公開）（この開示は、本明細書に参考として明示的に援用される）に記載されるように、当該分野で公知の方法（例えば、ルックスルー（Ｌｏｏｋ  Ｔｈｒｏｕｇｈ）変異誘発（ＬＴＭ））によってさらに改善され得る。
【０１３２】
ルックスルー変異誘発（ＬＴＭ）は、選択されたアミノ酸のコンビナトリアル変位を同時に評価しかつ最適化する多次元変異誘発方法である。上記プロセスは、１個以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメイン内の正確な分布に焦点を当て、アミノ酸側鎖化学の相乗効果的寄与を調査する。ＬＴＭは、ＣＤＲ内の位置的な一連の単一の変異を生成し、ここで各野生型残基は、多くの選択されたアミノ酸のうちの１個によって、体系的に置換される。変異したＣＤＲは、全ての改変体の定量的ディスプレイを妨げることなく、増大している複雑性およびサイズのコンビナトリアル一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ライブラリーを生成するために合わされる。ポジティブ選択の後、改善された特性を有するクローンは配列決定され、それらの有益な変異がマッピングされる。改善された結合特異性のための相乗効果的変異を同定するために、全ての有益な交換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を発現するコンビナトリアルライブラリー（コンビナトリアル有益変異（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）、ＣＢＭ）は、混合されたＤＮＡプローブによって生成され、ポジティブ選択され、分析されて、最適化されたｓｃＦｖ候補のパネルを同定し得る。上記手順は、Ｆｖおよび他の抗体ライブラリーで、類似の様式において行われ得る。
【０１３３】
変異誘発はまた、上記のように、ウォークスルー（ｗａｌｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ）変異誘発（ＷＴＭ）によって行われ得る。
【０１３４】
１個より多くのインフルエンザＡサブタイプおよび／もしくは同じサブタイプの１個より多くの分離株で、本明細書に記載される抗体の交叉反応性を意図的に設計するための別の有用な変異誘発方法は、「指定」変異誘発として本明細書において言及される。指定変異誘発は、好ましくは、異なる反応性の１個以上の抗体クローンに基づいて、抗体の集団を合理的に操作するために使用され得る。本発明の状況において、指定変異誘発は、抗体の個々のＣＤＲにおけるもののような類似の配列上の類似の位置によって規定される単一もしくは複数の残基をコードするために使用され得る。この場合において、これら集団は、匹敵する位置において見いだされる残基の範囲を捕捉するために、オリゴ縮重を使用して生成される。この集団内で、特異性の連続体（ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）は、親クローンの中にもしくは親クローンを超えたところに存在することが予測される。指定変異誘発の目的は、多様な多機能性抗体集団、ライブラリーを、２個以上の別個の実体もしくは集団の間に生成することである。指定変異誘発ライブラリーを作り出すために、両方の抗体についての上記ＣＤＲ配列が最初に得られ、整列される。次に、保存された同一性の全ての位置が、最初に、単一のコドンで、マッチングされた残基に固定される。保存されていない位置において、縮重コドンが組み込まれて、両方の残基をコードする。いくつかの場合において、上記縮重コドンは、この位置において２個の親残基のみをコードする。しかし、いくつかの場合において、さらなる副産物が生成される。副産物生成のレベルは測定されて、サイズ制限もしくは目的に依存して、副産物生成を強化するかもしくはこの生成を排除し得る。
【０１３５】
従って、例えば、２個の抗体それぞれの最初の位置がスレオニンおよびアラニンである場合、上記縮重コドン（上記最初の２個の位置においてＡ／Ｇ−Ｃ−）は、第３の位置における塩基に関わらず、スレオニンもしくはアラニンのみをコードする。例えば、次の位置の残基がリジンおよびアルギニンである場合、その縮重コドンＡ−Ａ／Ｇ−Ａ／Ｇは、リジンもしくはアルギニンをコードするのみである。しかし、その縮重コドンＡ／Ｃ−Ａ／Ｇ−Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔが使用されれば、アスパラギン、ヒスチジン、およびセリン副産物も生成される。
【０１３６】
便宜上、マッチングされたＣＤＲ長を有する抗体のみを使用することは、より単純である。これを推し進めるための１つの方法は、上記ＣＤＲ長およびはじめに発見された抗体によって付与される潜在的に均一なフレームワーク制限に基づいて、上記第２の抗原に対するサイズ制限されたライブラリーをスクリーニングすることである。しかし、等しい長さのＣＤＲを使用することは、便宜のためにすぎず、必要条件ではないことに注意する。この方法は、インフルエンザＡウイルス中和抗体の大きな機能的に多様なライブラリーを作り出すために有用であると同時に、その適用性は、遙かに広いことを理解することは容易である。この変異誘発技術は、任意の抗体の機能的に多様なライブラリーもしくは集団を作製するために使用され得る。従って、図６は、ＴＮＦ−α抗体およびＣＤ１１ａ抗体のＣＤＲを、変異誘発された親配列として使用して、指定変異誘発方法の使用を例示するために本明細書に含められる。
【０１３７】
他の例示的変異誘発方法は、飽和変異誘発およびエラープローンＰＣＲを含む。
【０１３８】
飽和変異誘発（Ｈａｙａｓｈｉら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：３１０−３１５（１９９４））は、全ての２０アミノ酸が、タンパク質中の特定の位置、および特定の表現系についてアッセイされる各改変体に対応するクローンにおいて置換される技術である（米国特許第６，１７１，８２０号；同第６，３５８，７０９号および同第６，３６１，９７４号もまた参照のこと）。
【０１３９】
エラープローンＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１−１５（１９８９）；Ｃａｄｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−３３（１９９２））は、ランダム点変異をクローニングされた遺伝子に導入する改変ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術である。得られたＰＣＲ生成物は、無作為変異ライブラリーを生成するためにクローニングされ得るか、またはＴ７プロモーターが適切なＰＣＲプライマー内に組み込まれる場合に、直接転写され得る。
【０１４０】
他の変異誘発技術はまた、周知であり、例えば、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊ．Ｂｒａｍａｎ，Ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に記載される。
【０１４１】
最適化は、単独で、もしくは任意の組み合わせにおいて、上記で議論されるライブラリーのうちのいずれか、もしくは当該分野で公知のライブラリーの任意の他のタイプに基づき得る。
【０１４２】
（ＩＶ．中和抗体の生成）
一旦所望の中和特性を有する抗体が同定されると、このような抗体（抗体フラグメントを含む）は、当該分野で周知の方法（例えば、ハイブリドーマ技術もしくは組換えＤＮＡ技術を含む）によって、生成され得る。
【０１４３】
上記ハイブリドーマ方法において、マウスもしくは他の適切な宿主動物（例えば。ハムスター）が免疫されて、免疫に使用されるタンに特異的に結合する抗体を生成するもしくは生成し得るリンパ球を顕在化させる。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。次いで、リンパ球は、適切な融解剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して骨髄腫細胞と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０１４４】
このように調製されたハイブリドーマ細胞は播種され、適切な培養培地（好ましくは、融合していない、親骨髄細胞の増殖もしくは生存を阻害する１種以上の物質を含む）中で増殖させられる。例えば、上記親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴもしくはＨＰＲＴ）を欠いている場合、上記ハイブリドーマ用の培養培地は、代表的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（ＨＡＴ配置）、これら物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる。
【０１４５】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、上記選択された抗体生成細胞による抗体の安定な高レベルの生成を支援し、そして培地（例えば、ＨＡＴ培地）に対して感受性であるものである。これらの中でも、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株（例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから市販されるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍から得られるもの、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡ．から入手可能なＳＰ−２もしくはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞から得られるもの）である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の生成に関して記載されてきた（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；およびＢｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１４６】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地は、上記抗原に対して指向されるモノクローナル抗体の生成についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって、決定される。
【０１４７】
組換えモノクローナル抗体は、例えば、上記必要とされる抗体鎖をコードする上記ＤＮＡを単離し、周知の組換え発現ベクターを使用して、同時発現のためのコード配列で組換え宿主細胞を同時トランスフェクトすることによって、生成され得る。組換え宿主細胞は、原核生物細胞および真核生物細胞（例えば、上記のもの）であり得る。
【０１４８】
上記ヒト化抗体の作製において使用されるべきヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性を軽減するために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」方法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト改変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。上記齧歯類のものに最も近い上記ヒト配列は、次いで、上記ヒト化抗体についてのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受け入れられている（Ｓｉｍｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７））。抗体は、上記抗原および他の都合のよい生物学的特性に対して高い親和性の保持とともにヒト化されることは、重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、上記親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、上記親配列および種々の概念的ヒト化抗体生成物の分析プロセスによって調製される。
【０１４９】
さらに、ヒト抗体は、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。例えば、トランスジェニック動物（例えば、マウス）が作製され得、上記動物は、免疫の際に、内因性免疫グロブリン生成の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを生成し得る。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３（１９９３）；および米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号および同第５，５４５，８０７号を参照のこと。
【０１５０】
（Ｖ．中和抗体の使用）
本発明の中和抗体は、標的とした疾患の予防および／もしくは処置のために使用され得る。治療的適用に関しては、上記抗体もしくは他の分子（その送達は、上記抗体もしくは抗体ベースの輸送配列を使用することによって促進される）は、通常、薬学的組成物の形態において使用される。技術および処方は、一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１９９０）において見いだされ得る。Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ  「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．１０，Ｓｕｐｐ．４２−２Ｓ（１９８８）もまた参照のこと。
【０１５１】
抗体は、代表的には、凍結乾燥処方物もしくは水溶液の形態で処方される。受容可能なキャリア、賦形剤、もしくは安定化剤は、使用される投与量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、緩衝化剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸およびメチオニンが挙げられる）；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド）；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられる。
【０１５２】
上記抗体はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、もしくは界面重合化によって調製されるマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）中に、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に、捕捉され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）で開示されている。
【０１５３】
本明細書で開示される中和抗体はまた、イムノリポソームとして処方され得る。上記抗体を含むリポソームは、当該分野で公知の方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８；Ｈｗａｎｇら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０；米国特許第４，４８５，０４５号；同第４，５４４，５４５号；およびＷＯ  ９７／３８７３１（１９９７年１０月２３日公開）に記載される）によって調製される。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１５４】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物との逆相エバポレーション法によって生成され得る。リポソームは、規定の孔サイズのフィルタを通して押し出されて、所望の直径を有するリポソームを生じ得る。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎら（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８に記載されるように、リポソームに結合体化され得る。化学療法剤は、必要に応じて、上記リポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎら（１９８９）Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４を参照のこと。
【０１５５】
疾患の予防もしくは処置については、抗体の適切な投与量は、処置されるべき感染のタイプ、上記疾患の重篤度および経過、上記抗体が予防目的で投与されるのか、治療目的で投与されるのか、に依存する。上記抗体は、上記患者に一度に、もしくは一連の処置にわたって、適切に投与される。上記疾患のタイプおよび重篤度に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの抗体が、例えば、１回以上の別個の投与によろうが、または連続注入によろうが、上記患者への投与のための最初の候補投与量である。
【０１５６】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的実施例によって例示される。
【実施例】
【０１５７】
（実施例１：以前のトリインフルエンザ大発生の生存者からの抗体ライブラリーおよび中和抗体の調製）
（材料および骨髄プロトコルおよび血清調製）
血液を、標準的な静脈穿刺（ｖｅｎｏｐｕｎｃｔｕｒｅ）によって得、凝固させ、処理して血清を回収した。上記血清を、ドライアイス上で輸送されるまで、−２０℃で３〜４日間保存した。ドナーを局所麻酔の注射で麻酔し、５ｍｌの骨髄を、各Ｈ５Ｎ１生存者の骨盤から回収した。次に、上記５ｍｌの骨髄を、４５ｍｌ  ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）を含む滅菌５０ｍｌチューブに入れた。上記混合物を、眼に見える凝集がなくなり、かつ上記骨髄およびＲＮＡｌａｔｅｒが十分に混合されるまで、約８〜２０回穏やかに転倒混和した。次に、上記標本を、２〜１０℃の間で一晩冷蔵した。一晩冷蔵した後、上記標本を、ドライアイス上で輸送されるまで、−２０℃において３〜４日間保存した。上記ＲＮＡｌａｔｅｒ／ｍａｒｒｏｗを受け取ったら、上記血清含有チューブを、処理するまで−８０℃で保存した。
【０１５８】
（血清学：ＨＡ  ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ，Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４ＨＢＸ  ９６Ｗ）を、１×ＥＬＩＳＡプレートコーティング溶液（ＢｉｏＦＸ）中の１００μｌの１００ｎｇ／ｍＬ  Ｈ５ヘマグルチニン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ／ベトナム／１２０３／２００４）で、室温において一晩インキュベーションすることによって、コーティングした。翌日、プレートを３００μｌ  ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。洗浄後、３００μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０中の４％  無脂肪乾燥乳）を添加し、室温において１時間インキュベートした。ブロッキング工程の後、上記プレートを、３００μｌ  ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。次に、ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎにおいて１：２０，０００希釈した１００μｌ  血清サンプルを、室温において１＝２時間インキュベートし、次いで、３００μｌ  ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎにおいて１：５，０００希釈した１００μｌの抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ結合体を、室温において１〜２時間インキュベートし、次いで、３００μｌ  ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。この最後の洗浄の後、１００μｌの色素生成基質溶液を添加し（ＴＭＢ１基質，ＢｉｏＦｘ）、十分な時間の後、１００μｌの停止溶液（ＢｉｏＦｘ）の添加によって終了させた。４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを備えたＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｔｈｅｒｍｏｍａｘマイクロプレートリーダー）で読み取り、データを記録し、その後、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用してプロットした。
【０１５９】
（骨髄：ＲＮＡ抽出およびｍＲＮＡ精製）
予め−８０℃で保存しておいた骨髄（２０ｍｌ  ＲＮＡｌａｔｅｒ中約２．５ｍｌ）を遠心分離によって回収して、ＲＮＡｌａｔｅｒを除去し、次いで、３００μｌ  酢酸を含む１１．２５ｍｌ  ＴＲＩ  ＢＤ試薬（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁した。次いで、上記ペレットを、激しくボルテックスした。次に、１．５ｍｌ  ＢＣＰ（１−ブロモ−３−クロロプロパン，Ｓｉｇｍａ）を添加し、ボルテックスによって混合し、室温において５分間インキュベートし、次いで、１２０００×ｇにおいて１５分間４℃で遠心分離した。その界面を廃棄しないように、上記水相を注意深く取り出した。水相からの総ＲＮＡを、次に、２５ｍｌ  イソプロパノールを添加することによって沈澱させ、室温において１０分間インキュベートし、１２０００×ｇにおいて１０分間４℃で遠心分離した。イソプロパノールを添加した後、残りのＲＮＡｌａｔｅｒに起因して、２相を形成し、界面に位置した沈澱したＲＮＡを生じた。上記残りのＲＮＡｌａｔｅｒを排除し、ＲＮＡの最大の回収を可能にするために、Ｈ２Ｏ中の５０％  イソプロパノールの５ｍｌのアリコートを添加し、相分離が認められなくなるまで混合し、その時点で、上記ＲＮＡを、１２０００×ｇにおいて１０分間にわたって４℃で遠心分離によってペレット化した。上記ＲＮＡペレットを、７５％  ＥｔＯＨで洗浄し、ＲＮＡｓｅなしの１．６ｍｌ  微小遠心チューブに移し、遠心分離によって再び回収した。最後に、上記ＲＮＡペレットを、１００μｌの１ｍＭ  リン酸Ｎａ，ｐＨ８．２中に再懸濁し、Ａ２６０およびＡ２８０を読み取って、ＲＮＡ純度を評価した。
【０１６０】
逆転写の前に、ｍＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ精製キットに従って、総ＲＮＡから精製した。簡潔には、５０〜２００μｇ  骨髄ＲＮＡを、ＲＮａｓｅ非含有水と一緒にして２５０μｌにし、２５０μｌのＯＢＢ緩衝液およびＯｌｉｇｏｔｅｘ懸濁物と混合、続いて、３分間にわたって７０℃においてインキュベートした。上記Ｏｌｉｇｏｔｅｘ粒子の上記オリゴｄＴ３０と上記ｍＲＮＡ  ポリＡ−テールとの間のハイブリダイゼーションを室温において１０分間行った。次いで、上記ハイブリダイズした懸濁物を、スピンカラムに移し、１分間遠心分離した。上記スピンカラムを４００μｌ  緩衝液ＯＷ２で２回洗浄した。次いで、精製したｍＲＮＡを、２０μｌの熱い（７０℃）緩衝液ＯＥＢと遠心分離することによって、２回溶出した。代表的な収量は、１．５μｇ  総ＲＮＡに対して５００ｎｇであった。
【０１６１】
（骨髄ｍＲＮＡに対してＮ９およびオリゴｄＴを使用する逆転写）
逆転写（ＲＴ）反応を、７５〜１００ｎｇ  ｍＲＮＡと、２μｌ  １０×Ａｃｃｕｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、０．８μｌ  １００ｍＭ  ｄＮＴＰ、およびｅｉｔｈｅｒ  Ｎ９（３００ｎｇ）もしくはオリゴｄＴプライマー（１００ｎｇ）を一緒に混合することによって達成し、次いで、水で最終容積１７μｌにした。上記混合物を、６５℃において５分間加熱し、次いで、室温へと冷却した。次に、２μｌ  ＤＴＴ、０．５μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、０．５μｌ  ＡｃｃｕＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、各反応に添加した。次に、上記Ｎ９刺激した反応系を、１０分間にわたって室温でインキュベートし、上記オリゴ−ｄＴ刺激した反応系を、氷上で１０分間にわたってインキュベートした。最後に、両方の反応系を、４２℃において６０分間、続いて、７０℃において１５分間インキュベートして、上記酵素を失活させた。
【０１６２】
（骨髄由来ｃＤＮＡからのＰＣＲ）
抗体重鎖および軽鎖レパートリーを、ヒト生殖系列ＶおよびＪ呂言う基に基づいて、以前に記載された方法および縮重プライマーを本質的に使用して（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｐ．Ｍ．，Ａｉｔｋｅｎ  Ｒ．  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃＦｖ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ-Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌ．１７８，５９−７１，２００１，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、骨髄ｃＤＮＡから増幅した。
【０１６３】
簡潔には、オリゴｄＴ刺激ｃＤＮＡ（λ軽鎖に対して７５ｎｇ  ｍＲＮＡから）およびＮ９刺激ｃＤＮＡ（κ軽鎖に対して７５ｎｇ  ｍＲＮＡから、重鎖に関して１００ｎｇ  ｍＲＮＡから）を使用して、ＰＣＲ反応を、５μｌ  １０×増幅緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．５μｌ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１μｌ  ＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）、２．５μｌ  Ｖ領域プライマー（１０μＭ）および２．５μｌ  Ｊ領域プライマー（１０μＭ）  ＶＨに関して−１０μＭ、０．５μｌ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および滅菌ｄＨ２Ｏと一緒に混合して、最終容積５０μｌにした。ＰＣＲパラメーターは、以下のとおりであった：工程１−９５℃、５分間、工程２−９５℃、３０秒、工程３−５８℃、３０秒、工程４−６８℃、１分間、工程５−工程２〜４を４０回サイクルさせる、工程６−６８℃、５分間。軽鎖ＰＣＲ生成物を、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎｕｐキットを使用してきれいにした。重鎖ＰＣＲ生成物を、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、１．５％  アガロースゲルから精製し、次いで、再増幅した。重鎖再増幅を以下のようにおこなった：１０μｌ  １０×増幅緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、３μｌ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、２μｌ  ＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）、５μｌ  各ＶＨプライマー（１０μＭ）およびＪＨプライマー（１０μＭ）、５μｌ  重鎖プライマーＰＣＲ生成物、１μｌ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘを混合し、水で容積を１００μｌに調節した。サイクリングパラメーターは、以下のとおりであった：工程１−９５℃、５分間、工程２−９５℃、３０秒、工程３−５８℃、３０秒、工程４−６８℃、１分間、工程５−工程２〜４を２０回サイクルさせる、工程６−６８℃、５分間。再増幅した重鎖ＰＣＲ生成物を、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、１．５％  アガロース−ＴＡＥゲルからきれいにした。
【０１６４】
（抗体ファージライブラリー構築）
各個々のトリインフルエンザ生存者についての別個の抗体ライブラリーを、繊維状ファージのｐＩＩＩ遺伝子の終止コドンの後ろの非翻訳領域において挿入した特融識別３−ヌクレオチドバーコードを使用して構築した。
【０１６５】
軽鎖クローニング：
ドナー１名につきプールしたκ軽鎖およびプールしたλ軽鎖の各１μｇを、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて１．５％  アガロース−ＴＡＥゲルからゲル精製した。５μｇの各ベクター（ｐＡＭＰＦａｂ）を、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、１％  アガロース−ＴＡＥゲルからゲル精製した。ライブラリーライゲーションを、室温において６０μｌ中で１時間にわたって、もしくは１４℃において一晩にわたって、２００ｎｇのゲル精製したκ挿入物もしくはλ挿入物および１μｇのゲル精製したベクターで行った。ライゲーションを、Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ  Ｐｅｒｆｒｏｍａスピンカラムを使用して脱塩した。上記ライブラリーを、８０μｌ  ＴＧ−１もしくはＸＬ−１  Ｂｌｕｅアリコート中の５個のエレクトロポレーションに移し、各々、１ｍｌ  ＳＯＣ中に回収し、プールし、１時間にわたって３７℃において増殖させた。形質転換体の総数を、上記形質転換体の各々からのアリコートをプレートすることによって、この増殖の後に決定した。その残りのエレクトロポレーションを、２００ｍｌ  ２ＹＴ＋５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン＋２％  グルコース中で、３７℃において一晩増殖させることによって増幅させた。その後の軽鎖ライブラリーを、これらの一晩培養物から、Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉｇｈ  Ｓｐｅｅｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用して、プラスミド精製によって回収した。
【０１６６】
（重鎖クローニング）：
上記ドナー特異的重鎖（ＶＨ１、ＶＨ２、５、６プール、ＶＨ３、およびＶＨ４）の１．５〜２μｇの各々を、４０ユニット過剰／μｇ  ＤＮＡと、ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩで消化し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、１．５％  アガロース−ＴＡＥゲルからゲル精製した。１５μｇの各軽鎖ライブラリーベクターを、４０ユニット／μｇ  ＤＮＡと、ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩで消化し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、１％  アガロース−ＴＡＥゲルからゲル精製した。ライブラリーライゲーションを、消化した１．２μｇ  ＳｆｉＩ／ＸｈｏＩ、ゲル精製重鎖ドナー集団および５μｇの各軽鎖ライブラリー（κおよびλ）を一晩４℃において合わせることによって設定した。次いで、上記ライブラリーライゲーションを、Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ  Ｐｅｆｒｏｍａスピンカラムで脱塩し、次いで、８０μｌ  ＴＧ−１アリコート中、２０エレクトロポレーション／ライブラリーを介して形質転換し、各々、１ｍｌ  ＳＯＣ中に回収し、プールし、３７℃において１時間増殖させた。再び、この増殖の後、各々のアリコートを、１Ｌ  ２ＹＴ＋５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン＋２％  グルコースに移した残りと一緒に、形質転換体の総数を決定するために使用し、約０．３のＯＤ６００になるように、激しく曝気して３７℃において増殖させた。次に、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを、感染多重度（ＭＯＩ）５：１で添加し、攪拌せずに、３７℃において１時間インキュベートした。次に、上記細胞を、遠心分離によって採取し、１Ｌ  ２ＹＴ＋５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン、７０μｇ／ｍｌ  カナマイシン中で再懸濁し、激しく曝気しながら３７℃において一晩増殖させて、ｓｃＦｖファージミド生成を可能にした。翌朝、上記細胞を遠心分離によって集め、ファージミドを含む上清を集めた。上記ファージミドを、０．２容積の２０％  ＰＥＧ／５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を添加し、１時間氷上でインキュベート刷ることによって、上記上清から沈澱させた。次いで、上記ファージミドライブラリーストックを、遠心分離によって回収し、２０ｍｌ  滅菌ＰＢＳ中に再懸濁した。残りの細菌を、さらなる遠心分離によって回収し。最終ファージミドライブラリーを、−２０℃において、ＰＢＳ＋５０％  グリセロール中で保存した。
【０１６７】
（ファージミドパニングおよび増幅）
ＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４ＨＢＸ平底，Ｎｕｎｃ）を、室温において一晩のインキュベーションによって、ＥＬＩＳＡコーティング溶液（ＢｉｏＦＸ）中、１００μｌの１００ｎｇ／ｍＬ  Ｈ５  ヘマグルチニンタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ／ベトナム／１２０３／２００４）でコーティングした。翌日、プレートを、３００μｌ  ＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄後、３００μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０中４％  無脂肪乾燥乳）を添加し、３０分間、氷上でインキュベートした。上記ブロッキング工程の後、上記プレートを、３００μｌ  ＰＢＳＴで３回洗浄した。ファージパニングの直前に、凍結したファージミドストックから、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａカラムを使用して、上記グリセロールを除去し、次いで、４％  無脂肪乾燥乳中、１５分間にわたってブロッキングした。次に、ファージミドの１００μｌ  アリコートを、８ウェル（総ファージ約１×１０１２ＣＦＵ）へと分配し、４℃において２時間にわたってインキュベートし、続いて、３００μｌ  ＰＢＳＴで６〜８回洗浄した。ファージミドを、１００μｌ／ウェル中、室温において１０分間後にＥｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  （０．２Ｍ  グリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．２、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中に回収した。次いで、上記溶出物を、溶出物１ｍｌあたり５６．２５μｌ  ２Ｍ  トリス塩基を添加することによって中和した。中和後、５ｍｌ  ＴＧ１細胞（ＯＤ６００  約０．３）に、０．５ｍｌ  中和ファージを、３７℃において３０分間にわたって、２−ＹＴ中、振盪することなく感染させた。この工程の後、いくつかの細胞を、ＬＢ  ＡＭＰグルコースプレート上にプレートして、全てのファージミド回収を決定した。残りの接種物を、１０ｍｌ  ２−ＹＴＡＧ（最終濃度２％  グルコースおよび５０ｕｇ／ｍｌ  アンピシリン）へ入れ、ＯＤ６００が約０．３になるまで３７℃において激しく曝気しながら増殖させた。次に、上記培養物に、５：１のＭＯＩでＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染させ、３７℃において３０〜６０分間にわたって、振盪することなくインキュベートした。上記細胞を遠心分離によって集め、２５ｍｌ  ２−ＹＴＡＫ（アンピシリン  ５０μｇ／ｍｌ、カナマイシン  ７０μｇ／ｍｌ）中に再懸濁し、新しい培養フラスコに移し、振盪しながら３７℃において増殖させ続けた。その後のラウンドは、同様に回収し、増幅させた。
【０１６８】
（ｓｃＦｖ  ＥＬＩＳＡ）
生体パニングしたファージからのＥ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ２１５１形質転換細胞の個々のコロニーを、１ｍｌの２ＹＴ＋１００μｇ／ｍｌ  ＡＭＰ中、３７℃において一晩増殖させた。翌朝、上記細胞を遠心分離によって回収し、１．５ｍｌ  ペリムラズム溶解緩衝液（１ｍｌ  ＢＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ）＋０．５ｍｌ  １０ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム＋１０ｍＭ  終濃度になるまでＥＤＴＡ）中に再懸濁した。上記細胞を、遠心分離によって再びペレット化し、上記ｓｃＦｖを含むペリムラズム溶解物を回収した。上記ｓｃＦｖ溶解物を、希釈緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％  ＢＳＡ）と１：１で合わせ、１００μｌを、予め抗原コーティングし、希釈緩衝液でブロッキングしたウェルに添加した。上記サンプルを、２時間にわたって室温においてインキュベートし、次いで、ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。次に、１００μｌの希釈緩衝液中で１：５０００希釈したビオチン抗ヒスチジンマウス（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を各ウェルに添加し、室温において１時間インキュベートした。このインキュベーションの後、上記ウェルを、ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、各ウェルに、１００μｌの１：２５００  ストレプトアビジン：ＨＲＰ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を添加し、室温において１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。この最後の洗浄の後、１００μｌの色素生成性基質溶液を添加し（ＴＭＢ１基質，ＢｉｏＦｘ）、十分な時間の後、１００μｌの停止緩衝液（ＢｉｏＦｘ）を添加することによって集結させた。４５０ｎｍの吸光度を、プレートリーダー（Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを装備したＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｔｈｅｒｍｏｍａｘマイクロプレートリーダー）で読み取って、データを記録し、その後、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用してプロットした。
【０１６９】
（配列決定）
上記重鎖および軽鎖配列を推測するために、個々のクローンを増殖させ、プラスミドＤＮＡ抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。上記プラスミドＤＮＡを標準的ＤＮＡ配列決定に供した。
【０１７０】
（ヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）アッセイ）
ヘマグルチニン阻害を、丸底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、４  ＨＡＵ（赤血球凝集単位）のウイルスもしくはタンパク質／ウェルを使用して、Ｒｏｇｅｒｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３１：３９４−４０８（１９８３）の方法に本質的に従って行った。ＨＡＩ決定のために、精製した一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の２５μｌ  サンプルを、各マイクロタイターウェルにおいて、上記試験ウイルスの４  ＨＡＵを含む２５μｌのＰＢＳと混合した。室温において１５分間のプレインキュベーションの後、２５μｌの０．７５％  ヒト赤血球を添加し、混合した。ＨＡＩ抗体活性を、室温での６０分間のインキュベーション後の視覚的検査によって決定した。
【０１７１】
特に、以下のプロトコルを使用した：
抗体、タンパク質およびウイルス
ＩｇＧ１タンパク質を、ｐＣＩベースの（Ｐｒｏｍｅｇａ）全長哺乳動物タンパク質発現ベクターへとそれらのコード領域をサブクローニングすることによってｓｃＦｖもしくはＦａｂのいずれかから生成し、次いで、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと、製造業者のガイドラインに従ってトランスフェクトした。簡潔には、２０μｇの軽鎖および１０μｇの重鎖をコードするプラスミドを、１．０ｍｌ  ２９３ｆｅｃｔｉｎと合わせ、６０分間インキュベートした。このプレインキュベーションの後、上記ＤＮＡ混合物を、３０ｍｌ  培地中で、３×１０７細胞と合わせ、その得られた細胞懸濁物を、７日間にわたって、製造業者の示唆に従って増殖させた。７日後に、上記分泌免疫グロブリンを、プロテインＡクロマトグラフィー（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して、培養上清から精製した。その得られた精製抗体を、遠心分離サイズ分画（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−２０）を使用して滅菌ＰＢＳへと緩衝液交換し、それらのタンパク質濃度を、比色ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定した。
【０１７２】
（交叉反応ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ）
マイクロタイタープレートを、コーティング緩衝液中で希釈した０．１ｍｌの以下の抗原でコーティングし、室温において一晩インキュベートした：１００ｎｇ／ｍｌ  Ｈ５Ｎ１  ベトナム  １２０３／０４、２５０ｎｇ／ｍｌ  Ｈ５Ｎ１  トルコ／６５５９６／０６、１μｇ／ｍｌ  Ｈ５Ｎ１  インドネシア／５／０５、７００ｎｇ／ｍｌ  Ｈ１Ｎ１  ニューカレドニア／２０／９９、１μｇ／ｍｌ  Ｈ１Ｎ１  ノースキャロライナ／１／１８、１００ｎｇ／ｍｌ  ａｎｄ  Ｈ３Ｎ２  ウィスコンシン／６７／０５。ブロッキングを、０．３ｍｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０中４％  無脂肪乾燥乳）で行った。ブロッキングの後、２％  無脂肪乾燥乳ブロッキング緩衝液中、０．５μｇ／ｍｌに希釈した抗体を、４℃において２時間にわたってインキュベートし、洗浄し、後に、２％  無脂肪乾燥乳ブロッキング緩衝液中１：３０００希釈のペルオキシダーゼ結合体化抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）および標準的ＴＭＢ基質検出（ＢｉｏＦＸ）を使用して検出した。４５０ｎｍの吸光度を読み取り、データを記録し、本明細書において報告した。
【０１７３】
（ウイルス微小中和（ｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）
インドネシアおよびトルコのヘマグルチニン遺伝子はを、ヒトコドン最適化配列（ＤＮＡ  ２．０）を使用して合成的に組み立て、次いで、これを使用して、組換え操作ウイルスを生成した。組換えインフルエンザウイルスを、以前に記載されるように（Ｆｏｄｏｒ，Ｅ．ら  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９９；７３（１１）：９６７９−８２）、逆遺伝子学を使用して生成した。簡潔には、１０個のプラスミドの１μｇ  各々を、単層において２９３  Ｔ細胞へとトランスフェクトした。各トランスフェクションは、ｖＲＮＡ（ｐＰＯＬ１タイプ）およびＡ／ベトナム／１２０３／０４  ＨＡおよびＮＡ（ｐＣＡＧＧＳ発現プラスミドは、Ｊ．Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｏｓａｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．ら  Ｇｅｎｅ  １９８９；７９（２）：２６９−７７）によって供与）に関しては、タンパク質発現プラスミド（ｐＣＡＧＧＳ  ｔｙｐｅ）に加えて、Ａ／プエルトリコ／８／３４／ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳセグメントに関して、両センス（ａｍｂｉｓｅｎｓｅ）プラスミド（ｖＲＮＡおよびｍＲＮＡ両方の発現に関して）を含んでいた。トランスフェクションの２０時間後、２９３Ｔ細胞を、細胞培養上清中に再懸濁し、これを使用して、１０日齢受精卵に接種した。
【０１７４】
抗体を、以下のように、ウイルスに対する中和活性についてスクリーニングした。各Ｍａｂの２倍連続希釈物を、ＰＢＳ中のウイルスの１００  ＴＣＩＤ５０とともに、３７℃において１時間インキュベートした。２４ウェルプレート中のＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞単層をＰＢＳで１回洗浄し、ウイルス−抗体混合物とともにインキュベートした。５％  ＣＯ２中で３７℃において１時間インキュベートした後、上記接種物を除去し、単層を、ＰＢＳでもう１回洗浄した。０．３％  ＢＳＡ、０．０１％  ＦＢＳおよび１μｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫ処理トリプシンを補充したＯｐｔｉ−ＭＥＭを添加し、細胞を、３７℃において７２時間にわたってインキュベートした。細胞培養上清中のウイルスの存在は、０．５％  ニワトリ赤血球を使用して、ＨＡアッセイによって評価した。
【０１７５】
（結果）
骨髄および血液サンプルを、２００６年１月にトルコで起こったＨ５Ｎ１トリインフルエンザ大流行（大流行後約４ヶ月）の６名の生存者から集めた。６名全ての生存者について、トリインフルエンザの初期診断は、物理的検査、臨床実験室的試験、および分子診断測定によってなされ、Ｔｕｒｋｉｓｈ  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって確認された。これら生存者のうちの４名は、世界保健機関（ＷＨＯ）によってさらに確認された。血清サンプルを分析して、上記の血清学プロトコルを使用して、Ｈ５  ヘマグルチニン（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４）に対する抗体の存在を確認した。図８に示されるように、６名の患者全ての上記血液サンプル（それぞれ、ＳＬＢ  Ｈ１〜Ｈ６と称した）は、上記Ｈ５抗原に対する抗体の存在を示した。この確認後に、ＲＮＡを、これら個体の骨髄サンプルから抽出し、骨髄ｍＲＮＡを精製し、上記のプロトコルを使用して逆転写した。次いで、上記抗体重鎖および軽鎖レパートリーを、上記のように、上記骨髄ｃＤＮＡから増幅して、個々の抗体重鎖および軽鎖ファージライブラリーを、上記の３ヌクレオチドバーコード付与を使用して、各生存者について別個にクローニングして、個々のライブラリーを区別した。
【０１７６】
このベクターとそのコード付与系とを使用して、本発明者らは、一本鎖（ｓｃＦｖ）およびＦａｂファージミド両方の形式において６名の生存者のうちの５名の骨髄に由来するレパートリーを首尾よくクローニングした。個々の生存者に由来する各集団は、１．０×１０８メンバーより大きい多様性を有する。さらに、本発明者らは、混合した生存者軽鎖および重鎖から構成される、採取的な多様性が１．１×１０９のさらなるバーコード付与ライブラリーを作り出した。まとめると、上記５個のドナー特異的集団および全てのドナーからの上記プールしたライブラリーは、ｓｃＦｖ集団として１．０×１０９およびＦａｂディスプレイ集団として４．２×１０９の全体多様性を有する（表４）。
【０１７７】
表２は、ｓｃＦｖおよびＦａｂ両方の形式における軽鎖および全ライブラリー総形質転換体を示す。全ライブラリーによって表される全体多様性は、５．６×１０９である。
【０１７８】
【表２】
2010538618.tif 000004
骨髄および血液サンプルをまた、２００６年のインフルエンザ症状に対して処置した１２名のその土地のドナーから集めた。上記のように血清学を行って、Ｈ１、Ｈ３およびＨ５  ヘマグルチニン、それぞれに対する抗体の存在を確認した。図８に示されるように、全ての血清サンプルを試験したところ、Ｈ１および／もしくはＨ３ヘマグルチニンに対する抗体について陽性であった。ここで特定のサブタイプの優性は、インフルエンザＡウイルスサブタイプに依存し、このサブタイプに対して、上記特定のドナーは、彼もしくは彼女のほぼ人生全体を通して曝された。興味深いことに、血清がＨ５ヘマグルチニンの抗体の顕著なレベルも含んでいたドナー（図９においてドナーＳＬＢ１およびＳＬＢ５）が存在した。この確認後、ＲＮＡを、上記ドナーの骨髄サンプルから抽出し、骨髄ｍＲＮＡを精製し、上記のプロトコルを使用して逆転写した。上記抗体重鎖および軽鎖レパートリーを、次いで、上記骨髄ｃＤＮＡから上記のように増幅し、個々の抗体重鎖および軽鎖ファージライブラリーを、上記の３ヌクレオチドバーコード付与を使用して各ドナーについて別個にクローニングして、個々のライブラリーを区別した。
【０１７９】
（結合抗体の選択）
上記Ｈ５Ｎ１生存者ライブラリーを、表２にまとめ、ベトナム／１２０３／０４ウイルスＨＡおよびＮＡタンパク質もしくは組換え精製ヘマグルチニン（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．ら（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））を含む不活性化ウイルスに対してパニングした。３〜４ラウンドのファージパニングの後、富化ファージプールからの個々のコロニーを、Ｈ５Ｎ１ウイルスもしくは精製ヘマグルチニンに対するＥＬＩＳＡによって分析し、上記ポジティブクローンを配列決定して、それらの重鎖および軽鎖軽鎖配列を決定し、それらの生存者バーコードを読み取った（Ｄ．Ｗ．Ｃｏｏｍｂｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７８，１３３（２００２））。このことから、本発明者らは、上記個々の生存者ライブラリーのうちの５個全てから、特定のＨ５ヘマグルチニン結合クローンを単離した。合計して、３００，０００個より多い種々の抗ウイルス抗体が回収され、そのうちの１４６個が、上記Ｈ５ヘマグルチニンタンパク質を特異的に結合する。
【０１８０】
（選択したクローンの一般的特徴）
全体として、上記個々のドナーは、重鎖および軽鎖両方に関して異なる生殖系列を利用し、このことは、個々の患者が、同じ潜在的に致死的な免疫学的攻撃に対して異なる解決策を見いだしたことを示している。得られたレパートリーの質に関する信頼を与えかつ抗体結合および／もしくは中和の化学に関する情報を与えるために使用され得るコンビナトリアル抗体ライブラリーの主要な特徴は、これらクローンにおいて認められる。これらクローンは、親和性成熟の天然の発達において、同様に選択された合成抗体ライブラリーにおいても見いだされる抗原結合に対する以前に記載された反復クローン（「ジャックポットソリューション（ｊａｃｋｐｏｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）」）の顕著な特徴を全て含む（Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ４５，８１０６（Ｄｅｃ  １１，２００６）；Ａ．Ｒａｊｐａｌら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２，８４６６（Ｊｕｎ  １４，２００５））。これら大きな集団における「ジャックポット」の存在は、上記スクリーニング手順を確認する。なぜなら、上記ファージが活性に基づいて選択されなければ、同じくローンを複数回得るという機会は、起こり得る可能性が非常に少ないからである。さらに、群内の上記重鎖の差異を分析する場合、上記アミノ酸置換の多くが、化学的にかつ構造的に保存的であることが観察された（表４）。反復クローンのように、化学的に妥当な複数のアミノ酸置換の出現は、無作為事象である可能性は低い。
【０１８１】
（回収された抗体の結合特異性）
６個のクローンを、全ＩｇＧ１タンパク質への変換に対して異なる２個のエピトープを認識した３名の生存者から選択した。これら抗体のうちの４つの結合を、上記ヘマグルチニンタンパク質のＨＡ１サブユニットにマッピングしたが、その残りの２つは、マッピングしなかった。上記ＨＡ１サブユニットは、感染において非常に関連しているので、本発明者らは、それら４個の抗体の活性を、以下に記載されるようにさらに分析した。
【０１８２】
これら研究の１つの目的は、基準から外れた（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）ウイルス株を広く中和する稀な抗体を回収することであった。本発明者らの抗体のうちのいくつかは、広く反応性であり得ることが示唆された。なぜなら、上記ドナー由来の血清は、彼らが感染したウイルスを超えて拡がって、基準から外れたサブファミリーのＨ５Ｎ１ウイルスに対して高い力価の抗体を有したからである。個々の抗体のレベルにおける交叉反応性の程度を決定するために、本発明者らは、異なるインフルエンザヘマグルチニン抗原に対する本発明者らのクローンの結合を最初に分析した（図１１）。驚くべきことではく、これら抗体は、トルコ／６５５９６／０６株に感染する対応するものに由来するヘマグルチニンを認識し、そしてさらに、選択のために使用されたベトナム／１２０３／０４株に由来する異種ヘマグルチニンを認識する。さらに、それらは、抗原的に基準から外れたインドネシア／５／０５  Ｈ５ヘマグルチニンを認識する。さらに、本発明者らは、４個のプロトタイプ抗体が、密接に関連したサブタイプＨ１Ｎ１最新の基準株ニューカレドニア／２０／９９に由来するヘマグルチニンを結合しることを見いだした。顕著なことには、生存者５に属する上記３個の中和抗体はまた、１９１８年のスペイン風邪世界的流行の間に現れたＨ１Ｎ１  サウスキャロライナ／１／１８単離株に由来するヘマグルチニンを結合した。逆に言えば、これら４個の抗体のうちのいずれも、最新のＨ３Ｎ２  ウィスコンシン／６７／０５基準株に由来するヘマグルチニンを結合せず、このことは、上記抗体ディスプレイが、インフルエンザサブタイプの間で広いスペクトルで結合するとしても、上記反応性は、全てのインフルエンザサブタイプに拡がらなかったことを示す。図１１は、２名の生存者に由来するＨ５Ｎ１抗体とＨ１Ｎ１ウイルス由来のヘマグルチニンとの交叉反応性を示す。（Ａ）棒は、Ｈ５Ｎ１  ベトナム  １２０３／０４（暗い灰色）、Ｈ５Ｎ１  トルコ／６５５９６／０６（白）、Ｈ５Ｎ１  インドネシア／５／０５（斜線）、Ｈ１Ｎ１  ニューカレドニア／２０／９９（縦縞）、Ｈ１Ｎ１  サウスキャロライナ／１／１８（クロスハッチストライプ）、およびＨ３Ｎ２  ウィスコンシン／６７／０５（明るい灰色）である。
【０１８３】
（中和研究）
最初に、上記抗体を、Ｈ５  ＨＡ（ベトナム／１２０３／０４）含有インフルエンザウイルスを中和するそれらの能力について評価した。共通するエピトープ（エピトープ「Ａ」）を認識した生存者２および３、生存者５に由来する１つの抗体は、全て中和したのに対して、第２のエピトープ（エピトープ［Ｂ］）を認識した生存者１に由来する２つの抗体は、中和しなかった。
【０１８４】
Ｈ５Ｎ１もしくはＨ１Ｎ１  ヘマグルチニンいずれかに対する生存者５から別個に単離されたクローンの顕著な配列類似性に基づいて、本発明者らは、それらの交叉反応性は、単純な結合を超えて拡がり、それらがまた、Ｈ５Ｎ１ウイルスおよびＨ１Ｎ１ウイルスの両方を中和するという非常にまれな特性を有すると推測した。上記ＩｇＧの交叉中和活性を試験するために、本発明者らは、中和アッセイにおけるＨ５Ｎ１スクリーニングからの代表的な抗体を試験して、抗体がまた、Ｈ１Ｎ１ウイルスもしくはＨ３Ｎ２ウイルスを中和するか否かを調べた（表３）。本発明者らは、Ｈ１保有ウイルスＡ／ニューカレドニア／２０／９９およびＨ３保有ウイルスＡ／香港／６８を研究した。Ｈ５サブタイプヘマグルチニンを保有するウイルスの集団はまた、以下を試験した：（Ａ／ベトナム／１２０３／０４；Ａ／インドネシア／５／０５；Ａ／トルコ／６５５９６／０６；Ａ／エジプト／０６）。上記抗体は、Ｈ３サブタイプインフルエンザに対して何ら活性を示さなかった。しかし、Ｈ５含有ウイルスを中和した上記モノクローナル抗体（１〜３）のうちの３つはまた、サブタイプＨ１からＨＡを保有するウイルス全てを強く中和した（表５）。
【０１８５】
【表３】
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（中和の免疫化学的基準）
抗体ライブラリーの１つの利点は、多数の抗体を得る場合に、これらがそれらの関連性に関してグループ分けされ得ることである。従って、上記集団における所定の抗体についての機能が観察される場合、所定の抗体が属する上記群の他のメンバーが類似の活性を有することを推定し得る。
【０１８６】
表４は、Ｈ５Ｎ１  ベトナムパニングの後の、生存者５ライブラリーから発見された中和の免疫化学的基礎を示す例示的配列を示す。上記６１個の特融の重鎖配列を、１１４個の特融の重鎖および軽鎖組み合わせに由来するそれらの生殖系列可変領域と整列させた。必須の変異は、太字、下線を付したテキスト（列５-ＰＩからＧＭおよびＡからＴ；列６-ＫＳからＥＬもしくはＥＭもしくはＸＬ）で示され、優勢な変異は、斜体、下線を付したテキスト（列２-ＡからＴ；列３-ＩＳからＶＴ；列５-ＧからＡ；列８-ＫからＱもしくはＲ）で示される。Ｈ１Ｎ１  ニューカレドニアパニングにおいて発見された重鎖配列はまた、灰色で強調される。抗体領域およびＫａｂａｔ番号付け範囲は、各配列の列の上に列挙される。
【０１８７】
【化１】
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【０１８８】
【表４−１】
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【０１８９】
【表４−２】
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生存者５に由来するエピトープ「Ａ」に対する上記中和抗体集団を含んだ上記群のメンバーは、表４に示される。上記群は、上記ＶＨ１ｅ生殖系列重鎖に最も近く似ている６１個の特有のメンバーから構成される。いくつかの重鎖は、１個より多くの軽鎖と対形成される。合計で、これら重鎖は、κおよびλ両方の軽鎖に対する１１４個の特有の対形成を有する。これら重鎖と、上記非常に関連するＶＨ１ｅ生殖系列とを比較すると、本発明者らは、点置換の３つのタイプを観察する。いくつかの変化は、必要とされるようであり、他は優性であり、そしていくつかの残基は、散発的にのみ変化した。必要とされる変化は、位置５２Ａ（Ｐｒｏ＞Ｇｌｙ）、５３（Ｉｌｅ＞Ｍｅｔ）、および５７（Ａｌａ＞Ｔｈｒ）においてＣＤＲ２内の群において、ならびに位置７３（Ｌｙｓ＞Ｇｌｕ）および７４（Ｓｅｒ＞ＬｅｕもしくはＭｅｔ）においてフレームワーク３領域において、あらゆるクローンで生じ、このうちの全てが、生殖系列側鎖化学から変化し、このことは、上記変異が抗原結合および中和に必須であることを示唆する。変異の上記第２のセットは優性であり、大部分のクローンにおいて見いだされる。最初は、位置２４（Ａｌａ＞Ｔｈｒ）においてフレームワーク１において、顕著な化学的変化を表す。次の３個は、位置３４（Ｉｌｅ＞Ｖａｌ）および位置３５（Ｓｅｒ＞Ｔｈｒ）においてＣＤＲ中に、ならびに位置５０（Ｇｌｙ＞Ａｌａ）においてＣＤＲ２中にも保存的変化がある。しかし、これら優性な置換のうちの４個全ては、なくてもよい。このことは、上記置換が、有益である一方で、必須ではないことを示唆する。フレームワーク領域１、３、および４、ならびにＣＤＲ３の全体を通じて見いだされる上記散発性の変化は、全て保存的であり、おそらく小さな最適化事象を表す。
【０１９０】
図１２は、４７ｅといわれる非常に関連する抗ＨＩＶ  Ｆａｂ（１ｒｚｉ．ｐｄｂ）（Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｃ．ら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１，２７０６−２７１１）の結晶構造に対して重ね合わせられた抗体の構造における必要とされる変異の位置を示す。図１２は、必要とされるＨ５  ヘマグルチニン結合群１の位置およびＦａｂ  ４７ｅの結晶構造上の優性な変異を示す。上記必要とされる変異は、Ｇ５２（５２Ａ（Ｐｒｏ＞Ｇｌｙ））、Ｍ５３（Ｉｌｅ＞Ｍｅｔ）、Ｔ５７（Ａｌａ＞Ｔｈｒ）、Ｅ７３（Ｌｙｓ＞Ｇｌｕ）およびＬＭ７４（Ｓｅｒ＞ＬｅｕもしくはＭｅｔ）として示される。上記優性な変異は、Ｔ２４（Ａｌａ＞Ｔｈｒ）、Ｖ３４（Ｉｌｅ＞Ｖａｌ）、Ｔ３５（Ｓｅｒ＞Ｔｈｒ）、およびＡ５０（Ｇｌｙ＞Ａｌａ）として示される。Ｈ５  ベトナム／１２０３／２００４  ＨＡ生体パニングにおいて同定された、上記必要とされかつ優性な群１の重鎖配列を、上記非常に関連する抗ＨＩＶ  Ｆａｂ  ４７ｅの結晶構造に重ね合わせる。変異を、骨格モデル（上）および空間充填モデル（下）の両方において示す。密なクラスターが、ＣＤＲ２中およびＣＤＲ２のみ隣接する必要とされる変異のうちの４個によって形成される。上記必要とされる変異５２Ａ（Ｐｒｏ＞Ｇｌｙ）、５３（Ｉｌｅ＞Ｍｅｔ）、７３（Ｌｙｓ＞Ｇｌｕ）および７４（Ｓｅｒ＞ＬｅｕもしくはＭｅｔ）は、上記重鎖可変ドメインの露出された表面に顕著に密なクラスターを形成し、ここでこれらは、上記タンパク質表面から顕著に突出する隆起を形成する（図１２）。その残りの必要とされる変異５７（Ａｌａ＞Ｔｈｒ）は、部分的には、上記ＣＤＲ２ループの基部に埋め込まれる。ＣＤＲ２およびフレームワーク３における表面露出変化は、おそらく抗原結合において直接的な役割を有することである一方で、上記あまり露出されていない必要土佐折れる変異および本質的でない優性変異は、上記ＣＤＲ２ループを安定化し、そして／もしくは位置づけることを介して間接的な効果を有し得る。
【０１９１】
生存者２に由来する抗体は、上記ＶＨ４−４ｂ生殖系列重鎖に最もよく似た２個の特有の重鎖からなる（表５）。上記第１の重鎖は、５個の特有のλ軽鎖と対形成していることが見いだされ、そのうちの４個は、滅多に使用されないλの６個の軽鎖ファミリーに由来し、他方は、単一のκ軽鎖と対形成される。中和プロフィールがより制限された抗体４は、この群に由来する。
【０１９２】
【表５】
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所定の変異が、抗体の活性に重要であるという可能性は、独立して選択される時間数の関数として増大する。上記必要とされる変異が、独立したクローンから体細胞変異の間に選択されるか、またはその後の複製の間にさらに変異される単一のクローンの子孫に由来するか否かを決定するために、上記優性変異のコドン使用法を分析した（表６Ａ〜６Ｂ）。上記データは、異なるコドンが使用されたが、上記コドンは、同じアミノ酸変化を生じたことを明らかにし、このことは、これら変異が、このなるクローンにおいて独立して発生したこと、従って、複数回選択されたことを実証する。独立して選択された事象のこの収束性の結果は、これら優性変異が、上記ウイルスへの結合および／もしくはまたはその中和における重要な役割を果たすという強力な証拠である。
【０１９３】
表６Ａ〜６Ｂに例示されるように、個々のクローンのコドン使用法は、選択されたＨ５  ＨＡ結合クローンの独立した起源を示す。ＤＮＡアラインメントおよびコードされるアミノ酸は、ＶＨ１−ｅ  生殖系列に対する６個の代表的群１の抗体である。同じアミノ酸についての異なるコドンの使用は、各特有の配列が、別個の起源のものであることを示す。表６ＡはＣＤＲ２に対応し、表６Ｂは、フレームワーク３に対応する。生殖系列コドンは、太字を付したコドンとして示される。生殖系列コドンから同じアミノ酸への変化は、通常のテキストのコドンとして示される。生殖系列アミノ酸からの第１の変化は、太字の下線を付したコドンとして示される。生殖系列アミノ酸からの第２の変化は、斜体の下線を付したコドンとして示される。生殖系列アミノ酸からの第３の変化は、下線の灰色で強調したコドンとして示される。
【０１９４】
【表６Ａ】
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【０１９５】
【表６Ｂ】
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（実施例２：ＨＩＶ感染患者についてのドナー特異的抗体ライブラリーの構築）
（骨髄プロトコルおよび血清調製）
血液を、標準的静脈穿刺によって得、凝固させ、処理して、血清を回収する。上記血清を、氷上で輸送されるまで、−２０℃において３〜４日間保存する。ドナーを局所麻酔剤の注射で麻酔し、５ｍｌの骨髄を、各患者ドナーの骨盤から回収する。次に、上記５ｍｌの骨髄を、４５ｍｌ  ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）を含む滅菌５０ｍｌチューブに移す。上記混合物を、眼に見える塊が存在せずかつ上記骨髄およびＲＮＡｌａｔｅｒが十分に混合されるまで、約８〜２０回穏やかに転倒混和する。次に、上記標本を、２〜１０℃の間で一晩冷蔵する。一晩冷蔵した後、上記標本を、氷上で輸送されるまで、−２０℃において３〜４日間貯蔵する。受け取ったら、上記ＲＮＡｌａｔｅｒ／骨髄および血清を含むチューブを、処理するまで、−８０℃において貯蔵する。候補患者は、ドナーとして選択される前に、ＨＩＶポジティブについて試験されるべきである。
【０１９６】
骨髄抽出およびｍＲＮＡ精製、逆転写、ＰＣＲ、抗体軽鎖および重鎖構築、ファージミドパニングなｒばいに増幅、ＥＬＩＳＡおよび配列決定を、実施例１に本質的に記載されるように行う。
【０１９７】
前述の説明において、本発明は、特定の実施形態を参照して例示されるが、そのように限定されない。実際に、本発明の種々の改変は、本明細書において示され、記載されるものに加えて、前述の説明から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲内に入る。
【０１９８】
本明細書全体を通じて引用される全ての参考文献は、本明細書に参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2010538618.tif 000019
【図７Ｃ】
2010538618.tif 000020
【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
2010538618.tif 000024
【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年6月23日(2010.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2010538618.tif 000037
2010538618.tif 000038
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