(57)【要約】【課題】本発明は、ＦＶＩＩＩ蛋白質や修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドの発現を可能にする一方、ＦＶＩＩＩ蛋白質を含む組成物、特に基質を含む医薬品組成物あるいは凍結乾燥された組成物を含む組成物を提供することを目的としている。【解決手段】このため、ＦＶＩＩＩ蛋白質において、修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドがエンドサイトーシスを行う可能性のある細胞と相互作用したりその細胞内部に取り込まれたりする能力が修飾されていない対応するＦＶＩＩＩポリペプチドと比較して減少されたりなくなったりする。また、ＦＶＩＩＩ蛋白質において、修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドがエンドサイトーシスを行う可能性のある細胞からの表面レセプタと相互作用する能力が減少されたりなくなったりする。更に、ＦＶＩＩＩ蛋白質において、修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドの免疫源性がヒトにおいて実質的に低下されたりなくなったりする。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドを含むＦＶＩＩＩ蛋白質において、前記修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドがエンドサイトーシスを行う可能性のある細胞と相互作用したりその細胞内部に取り込まれたりする能力が修飾されていない対応するＦＶＩＩＩポリペプチドと比較して減少されたりなくなったりすることを特徴とするＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項２】
修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドを含むＦＶＩＩＩ蛋白質において、前記修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドがエンドサイトーシスを行う可能性のある細胞からの表面レセプタと相互作用する能力が減少されたりなくなったりすることを特徴とするＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項３】
修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドを含むＦＶＩＩＩ蛋白質において、前記修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドの免疫源性がヒトにおいて実質的に低下されたりなくなったりすることを特徴とするＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項４】
前記表面レセプタがマンノース感作性レセプタであることを特徴とする、請求項２記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項５】
前記表面レセプタがマンノース・レセプタ（ＭＲ、ＣＤ２０６）、樹状細胞固有ＩＣＡＭ３捕捉非インテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ，  ＣＤ２０９）、デクチン、及びＤＥＣ−２０５（ＣＤ２０５）で構成される群から選択されることを特徴とする、請求項４記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項６】
前記修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドの修飾が実質的に脱グリコシル化されたＦＶＩＩＩポリペプチドをもたらすことを特徴とする、請求項１−５のいずれか１項記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項７】
実質的に脱グリコシル化されたＦＶＩＩＩが末端マンノース脱グリコシル化ＦＶＩＩＩポリペプチドで終端された実質的なグリカン構造であることを特徴とする、請求項６記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項８】
前記末端マンノース残基で終端されたグリカン構造がオリゴマンノース−タイプのグリカン構造であることを特徴とする、請求項７記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項９】
前記エンドサイトーシス可能細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）であることを特徴とする、請求項２記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項１０】
前記抗原提示細胞（ＡＰＣ）が樹状細胞，マクロファージ、内皮細胞、あるいはＢリンパ球細胞であることを特徴とする、請求項９記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項１１】
前記ＦＶＩＩＩ蛋白質が凝固促進活性ＦＶＩＩＩ蛋白質であることを特徴とする、請求項１−１０のいずれか１項記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項１２】
前記修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドの修飾がコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ（Ｘｘｘはいずれかのアミノ酸）を有するグリコシル化コンセンサス・サイトの少なくとも１つのアミノ酸の置換あるいは欠失を内容とすることを特徴とする、請求項１−１１のいずれか１項記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項１３】
前記修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドの修飾が、アスパラギン２３９、  アスパラギン２１１８、セリン２４１、及びトレオニン２１２０で構成される群から選択される、配列番号  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の全長ヒトＦＶＩＩＩポリペプチドの置換あるいは欠失を内容とすることを特徴とする、請求項１−１２のいずれか１項記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項１４】
前記修飾がアラニン、グリシン、セリン、グルタミン、トレオニン、アスパル酸、あるいはグルタミン酸で構成される群から選択されるアミノ酸でアスパラギン２３９を置換することを内容とする、請求項１３記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項１５】
前記修飾が、少なくとも、アラニン、セリン、グルタミン、トレオニン、アスパル酸あるいはグルタミン酸で構成される群から選択されるアミノ酸によるアスパラギン２１１８の置換を内容としていることを特徴とする、請求項１３記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項１６】
前記修飾が、少なくとも、アラニンによるアスパラギン２３９の置換を内容としていることを特徴とする、請求項１４記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項１７】
前記修飾が、少なくとも、グルタミンによるアスパラギン２３９の置換を内容とすることを特徴とする、請求項１４記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項１８】
前記修飾が、少なくとも、アラニンによるアスパラギン２１１８の置換を内容とする、請求項１５記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項１９】
前記修飾が、少なくとも、グルタミンによるアスパラギン２１１８の置換を内容としていることをと特徴とする、請求項１５記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項２０】
前記修飾が、アラニンによるアスパラギン２３９とアスパラギン２１１８両方の置換を内容とすることを特徴とする、請求項１３記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項２１】
前記修飾がグルタミンによりアスパラギン２３９とアスパラギン２１１８の両方の置換を内容としていることを特徴とする、請求項１３記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項２２】
前記修飾がアラニンによるアスパラギン２３９の置換とグルタミンによるアスパラギン２１１８の置換の両方を含んでいることを特徴とする、請求項１３記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項２３】
前記修飾がグルタミンによるアスパラギン２３９の置換とアラニンによるアスパラギン２１１８の置換の両方を含んでいることを特徴とする、請求項１３記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項２４】
前記修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドの修飾がさらに配列番号  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０のＢドメインの全体あるいは一部の欠失を含んでいることを特徴とする、請求項１−２３のいずれか１項によるＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項２５】
前記修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドが、少なくとも
（ｉ）  配列番号  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６のアミノ酸配列、及び／又は
（ｉｉ）  配列番号  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８のアミノ酸配列
の１つを含んでいることを特徴とする、請求項１−２４のいずれか１項記載のＦＶＩＩＩ蛋白質。
【請求項２６】
請求項１−２５のいずれか１項記載の単離核酸分子あるいはＦＶＩＩＩ蛋白質をコードする修飾単離核酸配列において、前記修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする前記核酸配列あるいは前記修飾核酸配列が少なくとも
（ｉ）  配列番号  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５の核酸配列、及び／又は
（ｉｉ）  配列番号  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７の核酸配列
のいずれか１つを含んでいることを特徴とする、単離核酸分子あるいはＦＶＩＩＩ蛋白質をコードする修飾単離核酸配列。
【請求項２７】
請求項２６の前記単離された核酸配分子、あるいはその相補性核酸分子と、高刺激性条件の下でハイブリダイズすることができる単離された核酸分子。
【請求項２８】
請求項２６か２７のいずれか１項による単離された核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２８の発現ベクターでトランスフェクトされた、あるいは請求項１−１９のいずれか１項記載のＦＶＩＩＩ蛋白質を発現するホスト細胞。
【請求項３０】
請求項１−２５のいずれか１項記載のＦＶＩＩＩ蛋白質を発現するヒト以外の形質転換生物。
【請求項３１】
前記生物が微生物、動物、及び植物から選択されることを特徴とする、請求項３０記載のＦＶＩＩＩ蛋白質を発現するヒト以外の形質転換生物。
【請求項３２】
前記動物が哺乳動物であることを特徴とする、請求項３１記載のＦＶＩＩＩ蛋白質を発現するヒト以外の形質転換生物。
【請求項３３】
請求項１−２５のいずれか１項記載のＦＶＩＩＩ蛋白質を含む組成物。
【請求項３４】
医薬品組成物あるいは凍結乾燥されたことを特徴とする、請求項３３記載のＦＶＩＩＩ蛋白質を含む組成物。
【請求項３５】
さらに、薬学的に許容される基質を含んでいる、請求項３３−３４のいずれか１項記載のＦＶＩＩＩ蛋白質を含む組成物。
【請求項３６】
請求項１−２５のいずれか１項記載のＦＶＩＩＩ蛋白質を生成するための方法において、
a)    培地内で、請求項２６又は２７記載の核酸分子、あるいは請求項１−２５のいずれか１項記載のＦＶＩＩＩ蛋白質をコードする核酸分子で形質転換あるいはトランスフェクトされたホスト細胞を成長させるステップと、そして
b)    前記ホスト細胞及び／又は前記培地から、前記核酸分子の発現から得られたＦＶＩＩＩ蛋白質を単離するステップ
とで構成されていることを特徴とするＦＶＩＩＩ蛋白質を生成するための方法。
【請求項３７】
ＦＶＩＩＩ欠損によって特徴づけられる疾病を治療するための請求項１−２５のいずれか１項記載のＦＶＩＩＩ蛋白質の利用。
【請求項３８】
前記ＦＶＩＩＩ欠損によって特徴づけられる疾病がＡ型血友病、あるいは後天的血友病であることを特徴とする、請求項３７記載のＦＶＩＩＩ蛋白質の利用。
【請求項３９】
Ａ型血友病あるいは後天的血友病を治療するための医薬品を製造するための請求項１−２５のいずれか１項記載のＦＶＩＩＩ蛋白質の利用。
【請求項４０】
Ａ型血友病あるいは後天的血友病患者を治療する方法において、それを必要とする患者に対して請求項１−２５のいずれか１項記載のＦＶＩＩＩ蛋白質を凝固に有効な量だけ投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａ型血友病患者治療用の脱マンノシル化遺伝子組換えＦＶＩＩＩ（「因子ＶＩＩＩ」ともいう。）に係り、実質的に非免疫源性であるか、あるいは免疫源性が低い修飾因子ＶＩＩＩに関するものである。
本発明はさらに上記の修飾された因子ＶＩＩＩをコードするＤＮＡを含む核酸構成物、及びホスト細胞あるいは生物内で上記の修飾された因子ＶＩＩＩを発現し生成するための方法に関している。
本発明はさらに、上記修飾された因子ＶＩＩＩを個体に投与して出血不全を措置するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの因子ＶＩＩＩ：Ｃ（ＦＶＩＩＩ）は、出血性不全とそれに罹患した男性の死亡の主要な要因であるＸ染色体に関連した出血性不全であるＡ型血友病においては十分な役割を果たさない凝固因子である。
従来、出血性不全は全血の注入によって措置されていた。
より最近になって、ヒトの血漿から抽出されたＦＶＩＩＩ濃縮物製剤によって治療が行われるようになっている。
しかしながら、血漿から抽出された製品の使用は出血性患者を肝炎やＡＩＤＳなどのウィルス伝染性疾患の危険に曝す可能性がある。
このリスクを減らすためにコストがかかる精製方式を用いると治療コストの上昇を招く。
コストの増大と血漿抽出ＦＶＩＩＩの利用可能性が限定されていることから、予防的にではなく、むしろ要求ベースで成り行き任せに治療されている。
遺伝子組み換えで生産されたＦＶＩＩＩは、純度と安全性、そして入手しやすさという面で血漿から抽出されたＦＶＩＩＩよりかなり大きな利点を有しており、従って、遺伝子組み換えで生産されたＦＶＩＩＩの開発に関してはかなりの研究努力が払われている。
ＦＶＩＩＩは特に活性化された後に不安定であるので、血漿から抽出されたものであれ遺伝子組み換えによるものであれ、治療効果を挙げるためには、大量の蛋白質を繰り返し投与する必要がある。
しかしながら、患者が露出されるＦＶＩＩＩ蛋白質の量はその活性を抑制する抗体の形成発展と関係している。
こうした周知の免疫源性を考慮に入れると、治療剤として使用するための新しい遺伝子組み換え型のＦＶＩＩＩ開発のひとつの目的は、こうした免疫反応を減少させるかあるいは一掃するような製品の開発である。
ＦＶＩＩＩは血液凝固の内因的な経路において因子ＩＸａによる因子Ｘの活性化を促進する共因子として機能し、この反応はカルシウム・イオンの存在下でマイナスの電荷を有するリン脂質の表面で起きる反応である。
【０００３】
ＦＶＩＩＩ分子は６つの構造的な領域に分けられ、それは三つ組みの領域Ａ（Ａ１、Ａ２、Ａ３）、炭化水素を豊富に含みそれほど重要な役割は果たさない中央領域（領域Ｂ）、及び二重化された領域Ｃ（Ｃ１、Ｃ２）である（図５参照）。
ＦＶＩＩＩはＡ１−とＡ３−領域の間の非共有二荷金属イオン結合によって結合された重鎖（領域Ａ１−Ａ２−Ｂ）と軽鎖（領域Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）の異種二量体として血漿内に分泌される。
血漿においては、ＦＶＩＩＩはフォン・ヴィレブランド因子に結合することによって安定化される。
より具体的には、ＦＶＩＩＩ軽鎖は非共有的な相互作用によってフォン・ヴィレブランド因子内のアミノ末端の主要結合部位に結合される。
トロンビンによる蛋白質分解性の活性化が開始されると、ＦＶＩＩＩは活性化されて２つの重鎖フラグメント（５０ｋＤａフラグメントであるＡ１と４３ｋＤａフラグメントであるＡ２）及び軽鎖（７３ｋＤａ鎖であるＡ３−Ｃ１−Ｃ２）の異種二量体に変化する。
このＦＶＩＩＩの活性化形態（ＦＶＩＩＩａ）は従って上記の二荷金属イオン結合を通じてトロンビン切断Ａ３−Ｃ１−Ｃ２軽鎖と結合されたＡ１‐サブユニットとイオン結合によってＡ１領域に結合された自由なＡ２サブユニットで構成されている。
このＦＶＩＩＩａ異種二量体は不安定であり、生理学的な諸条件の下でＡ２  サブユニットの解離により急激に不活性化される。
ＦＶＩＩＩ分子はＮ結合グリコシル化を可能にする２５個のコンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）を含んでおり、そのうちの２０個はグリコシル化されていることが示されている（１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第４，９６５，１９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＦＶＩＩＩ蛋白質は機能的にはＡ型血友病に冒された患者から抽出された血漿での凝固不全を補うことができる因子と定義することができる。
Ａ型血友病の治療を可能にするためには、ヒトやブタの血漿から精製され、そしてより最近では組み換えＤＮＡ技術によってつくりだされている。
米国特許第４，９６５，１９９は、例えば、哺乳動物のホスト細胞で治療的に役に立つ量のＦＶＩＩＩを遺伝子組み換えによって生産するために開発された方法を開示している。
ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞及びＢＨＫＣ（生まれたてのハムスターの腎臓細胞）でのヒトＦＶＩＩＩの発現も報告されており、より最近では、領域Ｂ欠失ＦＶＩＩＩの有効性も臨床実験で報告されている（米国特許第４，８６８，１１２、引用文献２）。
【０００６】
市場で入手できる治療用ＦＶＩＩＩ製品には全長ｒＦＶＩＩＩ（Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）  Ｂａｙｅｒ，  Ａｄｖａｔｅ（登録商標）  Ｂａｘｔｅｒ，  Ｈｅｌｉｘａｔｅ（登録商標）  ＣＳＬ−Ｂｅｈｒｉｎｇ）及び領域Ｂ欠失ｒＦＶＩＩＩ（ＲｅｆａｃｔｏＲ  Ｗｙｅｔｈ）などの血漿抽出ＦＶＩＩＩ（ｐｄＦＶＩＩＩ）と遺伝子組み換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）製品がある。
【０００７】
しかしながら、治療用のＦＶＩＩＩが入手できるにも係らず、性質を強化したＦＶＩＩＩ類似物に対するニーズが依然として高い。実際、治療用ＦＶＩＩＩ（ｐｄＦＶＩＩＩあるいはｒＦＶＩＩＩ）によるＡ型血友病患者の治療は、治療用に投与されるＦＶＩＩＩ（３，４）の凝固促進活性を中和する抗ＦＶＩＩＩ抗体（抑制因子）の出現以後、全臨床例の１５−３０％の範囲にとどまっている。
抑制因子の出現は外来性ＦＶＩＩＩ蛋白質の投与を繰り返した場合の類似の免疫反応を反映していると考えられる。
一部の血友病は外来性遺伝子組み換え因子ＶＩＩＩに対しては極端に鋭敏な反応を示し、その治療の有効性を制限する抗因子ＶＩＩＩ抗体を形成する。
従って、ＦＶＩＩＩ抑制因子の形成は、ＦＶＩＩＩ抑制因子をつくりだす患者が通常の代替治療に対して抵抗性を示すようになるので、医療上の重大な障害になると同時に重大な社会的関心の対象ともなっている。
ＦＶＩＩＩ抑制因子の出現は治療コストを三倍増大させるとともに（５）、患者の生活の質に劇的な影響を及ぼし、患者の不全状態や死亡を増大させる。
加えて、治療対象のヒトの体内での循環時間が増大したＦＶＩＩＩを提供するのが高度に望ましく、これはＡ型血友病の場合のように慢性的及び度々繰り返される疾病では特に有効であろう。
【０００８】
ＦＶＩＩＩに対すると有免疫反応の第一段階は抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスにあることが示された。
樹状細胞（ＤＣ）は外部の影響を受けいないＴ細胞の活性化とそれに対応する抗原固有免疫反応を開始させる上で最も強力なＡＰＣであることが示唆されている（６，７）。
ＤＣによる抗原エンドサイトーシスは一般的にはマクロピノサイトーシスあるいはレセプタ媒介エンドサイトーシスによって行われる。
実際、ＤＣの表面は無数の細胞内レセプタを示しており、その大部分は二荷イオン、多くの場合カルシウム・イオンの存在に依存している。
多くの細胞内レセプタは、それらが露出された炭水化物認識領域（ＣＲＤ）を有しているので、抗原上に存在する糖残基に固有性を示し（８）、Ｃタイプ・レクチン・レセプタ（ＣＬＲ）と呼ばれている。
１つの抗原上のマンノース残基はＤＣ表面上の一連のマンノース感作性ＣＬＲによって認識されることが可能である。
これらのマンノース感作性ＣＬＲには、マンノース・レセプタ（ＭＲ、ＣＤ２０６）、樹状細胞固有ＩＣＡＭ３グラビング・ノンインテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ，  ＣＤ２０９）、デクチン、ＤＥＣ−２０５（ＣＤ２０５）などが含まれる。
ポリカーボハイドレート・マンナンは、特にＭＲ及びＤＣ−ＳＩＧＮに関してこれらのマンノース感作性ＣＬＲのためのリガンドであることが示されている（９−１１）。
ＤＣ上のＤＣ−ＳＩＧＮ分子はＩＣＡＭ−３をＴ細胞上に固定する。この特殊な相互作用がＤＣとＴ細胞間の免疫学的シナプスの開始において重要な役割を果たしているようだ。
従って、リンパ球の活性化はブロッキング抗体抗ＤＣ−ＳＩＧＮによって抑止される可能性がある。
【０００９】
ＦＶＩＩＩ免疫反応の影響を減らすためのいくつかの措置が示された。
例えば、デスモプレシン（ＦＶＩＩＩの生成を促す合成ホルモン）、凝固促進因子（例えばプロトロンビン複合体濃縮物あるいは活性化されたプロトロンビン複合体濃縮物）、遺伝子組み換え因子ＶＩＩＩａあるいはＦＶＩＩＩの潅流を用いた耐性を誘発させるための措置などである。
【００１０】
その他の抗体の可変領域と相互作用する抗イディオタイプ抗体の使用を内容とする新しい方法が開発され、この方法は上記の抑制因子抗体を中和することを目的としている（１２）。
この方法によって、抗ＦＶＩＩＩ  Ｃ１領域に向けられたＩｇＧ４カッパー・モノクローナル・ヒト抗体が単離され、この抗体はＦＶＩＩＩの共因子活性及びそのフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）への結合を阻止する働きをする（１３）。
同様に、ヒト・モノクローナル抗体抗ＦＶＩＩＩ  Ｃ２領域であるＢＯ２Ｃ１１（ＩｇＧ４カッパー）も単離され（１４）、これはＦＶＩＩＩのｖＷＦ及びリン脂質への結合を抑制するものである。
従って、この抗体は天然及び活性化されたＦＶＩＩＩの凝固促進作用を完全に抑止する。
モノクローナル抗体の他の例はＢＯＩＩＢ２で、これはＦＶＩＩＩ  Ａ２領域に向けられたものであり、ＦＶＩＩＩの活性を９９％は阻止する。
しかしながら、ＦＶＩＩＩ誘発免疫反応はポリクローナルな反応であり、抗ＦＶＩＩＩ抗体に向けられた抗イディオタイプ抗体の使用を内容とする措置ではＦＶＩＩＩ免疫反応を部分的に中和出来ただけである。
【００１１】
本出願人は、最近、ＦＶＩＩＩのマンノース終端グリコシル化が未成熟なヒト樹状細胞（ＤＣ）によるＦＶＩＩＩの内部化を媒介することを実証した。
これらの結果は、ＦＶＩＩＩ上に存在するマンノシル化された糖とＤＣマンノース・レセプタの間の相互作用の抑止がＦＶＩＩＩの内部化とＦＶＩＩＩ固有Ｔ細胞の一層の生成を減少させることを実証した。
従って、ＦＶＩＩＩ免疫源性の減少は、それがマンノース感作性レセプタと相互作用する能力を低下させることで達成できる。
【００１２】
本出願人は、さらに驚くべきことに、ＤＣによって示された場合に、アスパラギン２３９（Ａｓｎ２３９）及びアスパラギン２１１８（Ａｓｎ２１１８）から選択される１つ以上のアミノ酸が置換あるいは決失されてＴ細胞を活性化させる修飾ＦＶＩＩＩの能力がかなり減少あるいはなくされて、患者に対して非免疫源的な、あるいは免疫源性がより低い治療用ＦＶＩＩＩを提供できる可能性があることを発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この発明は、修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドを含むＦＶＩＩＩ蛋白質において、前記修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドがエンドサイトーシスを行う可能性のある細胞と相互作用したりその細胞内部に取り込まれたりする能力が修飾されていない対応するＦＶＩＩＩポリペプチドと比較して減少されたりなくなったりすることを特徴とする。
また、修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドを含むＦＶＩＩＩ蛋白質において、前記修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドがエンドサイトーシスを行う可能性のある細胞からの表面レセプタと相互作用する能力が減少されたりなくなったりすることを特徴とする。
更に、修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドを含むＦＶＩＩＩ蛋白質において、前記修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドの免疫源性がヒトにおいて実質的に低下されたりなくなったりすることを特徴とする。
【００１４】
本発明は修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドを含むＦＶＩＩＩ蛋白質を提供し、この修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドがエンドサイトーシス可能な細胞と相互作用したりその細胞に取り込まれる能力が、修飾されていない対応するＦＶＩＩＩポリペプチドと比較して低下したり、あるいはその能力がなくなることを特徴としている。
【００１５】
１つの具体的な実施の形態では、本発明はエンドサイトーシス可能な細胞からの表面レセプタと相互作用する能力がその表面レセプタがマンノース感作性レセプタである場合に低下したりなくなったりする修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドを提供するものであり、特に、表面レセプタがマンノース感作性レセプタであり、さらに具体的にはその表面レセプタがマンノース・レセプタ（ＭＲ，ＣＤ２０６）、非インテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＤ２０９）を取り込む樹状細胞固有ＩＣＡＭ３、デクチン、及びＤＥＣ−２０５（ＣＤ２０５）で構成される群から選択される場合に、その能力が低下したりなくなったりする修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドを提供するものである。
１つの特殊な実施の形態では、エンドサイトーシス可能な細胞は抗原発生細胞（ＡＰＣ）、そして特に樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞、あるいはＢリンパ球細胞である。
【００１６】
他の１つの具体的な実施の形態では、本発明はその免疫源性がヒトにおいて著しく低下されたりなくなったりする修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドを提供する。
【００１７】
他の態様では、本発明の修飾ＦＶＩＩＩは実質的に脱グリコシル化され、より具体的には本発明の修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドは実質的にはマンノース残基脱グリコシル化ＦＶＩＩＩポリペプチドによって終端されたグリカン構造である。
【００１８】
より具体的には、本発明の修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドはコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒを有するグリコシル化コンセンサス・サイトの少なくとも１つのアミノ酸が置換されているか欠失している。
上の式でＸｘｘはいずれかのアミノ酸を示す。
より具体的には、本発明の修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドは配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２で示されている全長ヒトＦＶＩＩＩポリペプチド配列と比較して、アスパラギン２３９、アスパラギン２１１８、セリン２４１及びトレオニン２１２０で構成される群から選択される少なくとも１つのアミノ酸の置換あるいは欠失を含んでいる。
１つの具体的な実施の形態で、アスパラギン２３９は、アラニン、グリシン、セリン、グルタミン、トレオニン、アスパル酸あるいはグルタミン酸で構成される群から選択されるアミノ酸で置換されている。
さらに別の具体的な実施の形態では、アスパラギン２３９がアラニンで置換されており、そして／又はアスパラギン２１１８がアラニンで置換されている。
さらに別の実施の形態で、アスパラギン２３９はグルタミンで置換されており、そして／又はアスパラギン２１１８がグルタミンで置換されている。
別の実施の形態では、アスパラギン２３９がグルタミンで置換されており、そして／又はアスパラギン２１１８がアラニンで置換されている。
別の実施の形態では、アスパラギン２３９がグルタミンで置換されており、アスパラギン２１１８がアラニンで置換されている。さらに別の実施の形態では、アスパラギン２３９がグルタミンで置換されており、そしてアスパラギンがアラニンで置換されている。
別の具体的な実施の形態では、本発明による修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドは、（ｉ）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６及び／又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８の少なくとも１つを含んでいる。
別の具体的な実施の形態では、本発明の修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドは（ｉ）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２及び／又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４の少なくとも１つを含んでいる。
さらに別の具体的な実施の形態では、本発明の修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドは（ｉ）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６及び／又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４を含んでいる。さらに別の実施の形態では、本発明の修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドは（ｉ）アミノ酸配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２及び／又は（ｉｉ）アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８を含んでいる。
【００１９】
別の態様では、本発明の修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドは凝固促進因子活性ＦＶＩＩＩ蛋白質である。
【００２０】
他の実施態様では、本発明の修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドは配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０で示されるＢ領域の全体あるいはその一部が欠失されている。
他の好ましい実施の形態では、本発明による修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドはＢ領域が部分的に欠失しており、より好ましくは、本発明の修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドは少なくともＢ領域の最初の２２６アミノ酸を含んでいる（配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０と比較して）。
【００２１】
本発明のさらに別の目的は、本発明による修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドで構成されるＦＶＩＩＩ蛋白質をコードする単離された核酸分子あるいは修飾され単離された核酸配列を提供することである。
１つの具体的な実施の形態で、ＦＶＩＩＩ蛋白質をコードする核酸配列は、（１）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５で示される核酸配列及び／又は（ｉｉ）配列番号Ｎｏ．７で示される核酸配列の少なくとも１つを含んでいる。
さらに別の実施の形態では、ＦＶＩＩＩ蛋白質をコードする上記の核酸配列は、高刺激性条件の下で、（ｉ））配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５の核酸配列及び／又は（ｉｉ）  ）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７の核酸配列の少なくとも１つとハイブリダイズすることができる単離された核酸分子を含んでいる。
【００２２】
他の１つの具体的な実施の形態で、ＦＶＩＩＩ蛋白質をコードする核酸配列は（ｉ）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１及び／又は（ｉｉ）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３の少なくとも１つを含んでいる。
さらに別の具体的な実施の形態では、ＦＶＩＩＩ蛋白質をコードする核酸配列は高刺激性条件の下で（ｉ）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１及び／又は（ｉｉ）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３の少なくとも１つとハイブリダイズすることができる単離された核酸分子を含んでいる。
【００２３】
別の具体的な実施の形態で、ＦＶＩＩＩ蛋白質をコードする核酸配列は、（ｉ）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５及び／又は（ｉｉ）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３の少なくとも１つを含んでいる。
さらに別の実施の形態で、ＦＶＩＩＩ蛋白質をコードする上記の核酸配列は、高刺激性条件の下で（ｉ）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５及び／又は（ｉｉ）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３の少なくとも１つとハイブリダイズすることができる単離された核酸分子を含んでいる。
【００２４】
別の実施の形態で、ＦＶＩＩＩ蛋白質をコードする上記の核酸配列は、（ｉ）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１及び／又は（ｉｉ）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７の少なくとも１つを含んでいる。
さらに別の具体的な実施の形態で、ＦＶＩＩＩ蛋白質をコードする上記の核酸配列は、高刺激性条件下で、（ｉ）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１及び／又は（ｉｉ）配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７の少なくとも１つとハイブリダイズすることができる単離された核酸分子を含んでいる。
【００２５】
本発明はさらに、本発明の単離された核酸分子か、あるいは本発明の修飾されたＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【００２６】
本発明の１つの目的は、本発明のＦＶＩＩＩ蛋白質や修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドの発現を可能にする本発明の単離された核酸分子を含む発現ベクターでトランスフェクトされたホスト細胞を提供することである。
【００２７】
本発明はさらに、本発明のＦＶＩＩＩ蛋白質を発現する非ヒト形質導入生物、特に、微生物、ヒト以外の動物あるいは植物、そして哺乳動物から選択される生物を提供する。
【００２８】
本発明のもう１つの目的は、本発明で開示されているようなＦＶＩＩＩ蛋白質を含む組成物、特にさらに医薬品として受け入れられる基質を含む医薬品組成物あるいは凍結乾燥された組成物を含む組成物を提供することである。
【００２９】
本発明の他の目的は、本発明によるＦＶＩＩＩ蛋白質を生産するための方法を提供することであり、この方法は、培地で本発明の核酸分子かあるいは本発明のＦＶＩＩＩ蛋白質をコードする酢酸分子て形質転換あるいはトランスフェクトされたホスト細胞を培養するステップと、そして、上記核酸分子の発現によってもたらされたＦＶＩＩＩ蛋白質を上記のホスト細胞及び／又は細胞培地から単離するステップで構成されている。
【００３０】
本発明はまた、出血性疾患、特にＦＶＩＩＩ不全を特徴とする疾患、より具体的にはＡ型血友病及び後天的Ａ型血友病の治療のために本発明によるＦＶＩＩＩ蛋白質の使用を可能にするものである。
【００３１】
１つの具体的な実施の形態で、本発明はＡ型血友病あるいは後天的Ａ型血友病を治療するための治療薬の製造のために本発明のＦＶＩＩＩ蛋白質の使用を可能ならしめるものであり、凝固に有効な量の本発明のＦＶＩＩＩ蛋白質をそれを必要とする患者に投与するステップを含むＡ型血友病患者を措置するための方法を提供する。
【発明の効果】
【００３２】
以上詳細に説明した如くこの発明によれば、ＦＶＩＩＩ蛋白質や修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドの発現を可能にする、単離された核酸分子を含む発現ベクターでトランスフェクトされたホスト細胞を提供することができる。
また、この発明は、ＦＶＩＩＩ蛋白質を含む組成物、特にさらに医薬品として受け入れられる基質を含む医薬品組成物あるいは凍結乾燥された組成物を含む組成物を提供することができる。
更に、この発明は、ＦＶＩＩＩ蛋白質を生産するための方法を提供することができる。
更にまた、この発明は、出血性疾患、特にＦＶＩＩＩ不全を特徴とする疾患、より具体的にはＡ型血友病及び後天的Ａ型血友病の治療のために、ＦＶＩＩＩ蛋白質の使用を可能にすることができる。
また、この発明は、Ａ型血友病あるいは後天的Ａ型血友病を治療するための治療薬の製造のために、ＦＶＩＩＩ蛋白質の使用を可能ならしめる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１：ＦＶＩＩＩの樹状細胞（ＤＣ）へのマンノース感作性進入（Ａ）ＦＶＩＩＩ（４０μｇ／ｍｌ）を加える２時間前に、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌマンナン、あるいは１ｍｇ／ｍｌ  Ｄガラクトースで３７℃の温度下で３０分間予備培養した。      報告された数値は［（３７℃ＭＦＩｉｎｈ  −  ４℃ＭＦＩｍｅｄｉｕｍ）／（３７℃ＭＦＩｍｅｄｉｕｍ  −  ４℃ＭＦＩｍｅｄｉｕｍ）］ｘ１００で定義される相対抗原取り込み量を示し、この式において、ＭＦＩｉｎｈとは抑制因子の存在下で検出されるＭＦＩを意味する。      結果は１２名のドナーから得られたもので、統計的な有意差は対になっていない学生テストを用いて生データで計算された。（Ｂ）マンナンによるＤＣでのエンドサイトーシスの抑止。      マンナン（１ｍｇ／ｍｌ）によるＤＣの予備培養に続いて、デキストラン―ＦＩＴＣ（５０μｇ／ｍｌ）あるいはルシフェール・イェロウ（２００μｇ／ｍｌ）が２時間かけて加えられた。
【図２】図２：ＤＣによるＦＶＩＩＩのマンノース感作性取り込みはＦＶＩＩＩ誘導ペプチドのＦＶＩＩＩ固有ＣＤ４＋Ｔ細胞への変化を示す。（Ａ）ＤＲＢ１＊１５０１／ＤＲＢ＊０１の健康なドナーからのＤＣを培地だけ、及びマンナン（１ｍｇ／ｍｌ）あるいは抗ＣＤ２０６ＩｇＧ（１０  μｇ／ｍｌ）の存在下で培養し（１００００細胞／ウェル）、その後、ＦＶＩＩＩの量を変えて（５．５６、２．７８、あるいは１．３９μｇ／ｍｌ）、２０Ｕ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２の条件で２時間３７℃の温度下でＦＶＩＩＩ固有Ｔ細胞クローンＤ９Ｅ９（５０００細胞／ウェル）を用いて培養を行った。      Ｔ細胞の活性化を培養上澄液内でのＩＦＮ−ガンマの放出によって評価した。結果は、３−８の独立した実験の中の１つの典型的な実験で得られたものである。      ＩＦＮ−ガンマのイールドはＤ９Ｅ９の種々のバッチとそれぞれの実験で用いられたドナーのＤＣ供給源によって変化した。（Ｂ）ＭＨＣ  ＩＩ適合ドナーからのＤＣをマンナン（１ｍｇ／ｍｌ）あるいは抗ＣＤ２０６ＩｇＧ（１０  μｇ／ｍｌ）の存在下で予備培養してから、ＦＶＩＩＩ（５．５６μｇ／ｍｌ）あるいはペプチドＩ２１４４−Ｔ２１６１（配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  ９）（２μｇ／ｍｌ）及びＤ９Ｅ９を加えた。       各実験で、ＩＦＮガンマ生成をそれぞれの実験で得られた最大値で示した（＊：Ｐ＜０．０００１、マン−ホイットニー・テストで評価したもの）。      結果は３つのそれぞれ独立した実験で得られたもの。（Ｃ）ヒトＦＶＩＩＩ固有ＨＬＡ適合Ｂ細胞株ＬＥ２Ｅ９及びＢＯ２Ｃ１１、あるいはＤＣをＦＶＩＩＩ（１０μｇ／ｍｌ）及びＤ９Ｅ９の存在下で培養した。
【図３】図３：Ｂ領域外に存在する予想されたマンノース残基はＤＣによるＦＶＩＩＩエンドサイトーシスにおいて重要な役割を果たし、Ｔ細胞の活性化をもたらす。（Ａ）ＤＣをマンナン（１，５，１０，１００及び１０００μｇ／ｍｌ）で予備培養してから、ＦＶＩＩＩ（４０μｇ／ｍｌ４３ｎＭ、黒丸）及びＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（２４．３１μｇ／ｍｌ、１４３ｎＭ、白丸）、あるいはデキストランＦＩＴＣ（５０μｇ／ｍｌ）を加えた。      抗原の取り込みをフロー・サイトメトリで分析した。抑止率はそれぞれの条件でマンナンなしの場合と比較して計算した。      ２つの独立した実験の代表的な結果。（Ｂ）天然あるいはエンドＦＩで処理したＢＤＤ―ＦＶＩＩＩ（３．７μｇ／ｍｌ）を７．５％ＳＤＳ―ＰＡＧＥで分離して、ニトロセルロース膜上に移した。      移された蛋白質はＰｒｏｔｏｇｏｌｄ（登録商標）で定性するか、あるいはアルカリ性ホスファターゼ接合抗ヒトＩｇＧを用いて１０μｇ／ｍｌＣＴＬＤ４−７−Ｆｃを用いて培養した。      その軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）をＬＣ及びＨＣ固有モノクローナル抗ＦＶＩＩＩＩｇＧを用いて識別した（図示せず）。（Ｃ）ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのＥｎｄｏＦＩ措置によるＴ細胞の活性低下。      結果は３つの独立した実験のうちの１つの代表例を示す。ＩＦＮガンマのイールドはＤ９Ｅ９のバッチとそれぞれの実験で用いられたヒトＤＣの供給源に応じて変化した。      ３つの実験の結果を統計的に比較するために、ＩＦＮガンマの産出を３つの実験それぞれの最大値を基準として標準化した。      Ｔ細胞活性化の標準化されたレベルでの差は、ＡＮＯＶＡ及びフィッシャーのＰＳＬＤテスト（Ｐ＜０．０００１、データ示さず）の間に評価した限りでは、”ｍｅｄｉｕｍ”と“ＥｎｄｏＦ１−措置”のと間ではかなり有意の差であった。
【図４】図４：野生タイプあるいは突然変異体ＦＶＩＩＩ軽鎖によるＦＶＩＩＩ固有Ｔ細胞クローン（Ｄ９Ｅ９）の活性化（Ａ）Ｔ細胞活性化につながるＦＶＩＩＩの野生タイプ軽鎖のマンノース感作性ＤＣ進入の確認。      ＦＶＩＩＩの精製された血漿誘導軽鎖（野生種ＬＣｈ）をＥｎｄｏ−Ｆ１で処理した。      マンナン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在下での天然野生タイプＬｃｈ、野生タイプ軽鎖とＥｎｄｏＦ１で措置した野生タイプの軽鎖をＤＣ（パネルＡ）あるいはＦＶＩＩＩ固有Ｂ細胞クローン（ＢＯ２Ｃ１１、パネルＢ）に加えて、Ｄ９Ｅ９細胞と２０時間共培養した。      Ｄ９Ｅ９の活性化は、ＥＬＩＳＡで培養上澄み液内のＩＦＮ−ガンマを測定することによって評価した。（Ｃ）及び（Ｄ）ＦＶＩＩＩ軽鎖のサイトに向けた突然変異発生によるＤ９Ｅ９の活性化の喪失。      ＢＯ２Ｃ１１  Ｂ細胞クローンとモノサイト誘導ＤＣを野生タイプＬＣｈ（パネルＣ）あるいは突然変異Ａｓｎ２１１８Ａｌａ  ＬＣｈ（パネルＤ）の存在下でＤ９Ｅ９を用いて培養された。      Ｄ９Ｅ９の活性化を培養上澄み液内のＩＦＮガンマを２０時間後に測定することで評価した。
【図５】図５：全長ＦＶＩＩＩ構造の図式表示  全長ヘテロ二量体ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  ２）は２３３２個のアミノ酸で構成されており、残基１−１６４８に対応し領域Ａｌ−ａｌ−Ａ２−ａ２−Ｂを含む『重鎖』をその範囲内に収める共に、さらに、残基１６４９−２３３２に対応すると同時に領域ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２（アミノ酸残基の番号付けは配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  ２に示されるアミノ酸配列に対応する）を含む『軽鎖』をその範囲内に含んでいる。  ＦＶＩＩＩ分子はＮ結合グリコシル化を可能にする２５のコンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）を含んでおり、そしてこの配列のうちの２０個はグリコシル化されていることが示された（１）。
【図６】図６：天然全長ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  １）のアミノ酸配列  下線を付したアミノ酸配列は天然全長ヒトＦＶＩＩＩの最初の１９のアミノ酸を含む信号ペプチドに対応する。  全長ヘテロ二量体ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  ２）の古典的なアミノ酸番号付けは、位置２０に位置するアラニン残基で始まっている。太字で示すアミノ酸残基はコンセンサス・グリコシル化サイトに対応しており、これらのサイトは本発明の実施の形態では優先的に改変される。  Ｂ領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１で示されているアミノ酸配列の位置７６０から位置１６６７にわたるアミノ酸配列（図６に図示）に対応している。  実施例６で比較対照として用いられており、「ＦＶＩＩＩの精製血漿誘導軽鎖」と称されている天然軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のアミノ酸配列の位置１６６８から位置２３５１（図６に図示）に対応している。  天然のヒトＦＶＩＩＩの重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のアミノ酸配列の位置１９から位置７５９（図６に図示）に対応している。
【図７】図７：ＢＤＤ（Ｂ領域決失）−ヒトＦＶＩＩＩ  ＦＶＩＩＩのＢ領域は凝固促進作用には不可欠ではないことが示された。  図７は、Ｂ領域が配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の全長ヒトＦＶＩＩＩから取り除かれた場合に得られるＢ領域決失ヒトＦＶＩＩＩに対応するアミノ酸配列と核酸配列の両方を示している。  これらのアミノ酸配列と核酸配列を、アミノ酸（上側）が対応する核酸コドン（下側）と向き合うように合わせた。  ＢＤＤ−ヒトＦＶＩＩＩに対応するこれらのアミノ酸配列と核酸配列は相互に無関係に番号付けがなされている（番号は配列の右側に示されている）。  図７に示されているＢＤＤヒトＦＶＩＩＩのアミノ酸配列は配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４に対応している。  図７に示されているＢＤＤヒトＦＶＩＩＩの核酸配列は配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３に対応している。  太字で示してあるアミノ酸残基（あるいは対応する核酸残基）は本発明の１つの実施の形態において優先的に修飾されるコンセンサス・グリコシル化サイトに対応する。  停止コドンの上に＊を示してある。
【図８】図８：Ａｓｎを位置２３９のＡｌａと置換することにより修飾されたヒトＦＶＩＩＩ重鎖（配列番号  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  ２で示す全長ヒトＦＶＩＩＩ配列に関連して）  図８は本発明の１つの具体的な実施の形態で実現されたヒトＦＶＩＩＩの修飾重鎖に対応するアミノ酸配列と核酸配列の両方を示している。これらのアミノ酸配列と核酸配列を、各アミノ酸（上側）が対応する核酸コドン（下側）と向き合うようにして示してある。ヒトＦＶＩＩＩの修飾重鎖に対応するアミノ酸配列と核酸配列には相互にはまったく無関係に番号付けがなされている（番号は配列の右側に示す）。  図８に示すヒトＦＶＩＩＩの修飾重鎖のアミノ酸配列は配列番号  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６の配列に対応する。図８に示すヒトＦＶＩＩＩの修飾重鎖の核酸配列は配列番号  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  ５の配列に対応する。太字で示すアミノ酸残基（アラニン）（あるいはそれに対応する核酸コドン）は本発明の１つの実施の形態で修飾されたグリコシル化サイト（Ａｓｎ２３９）に対応している。
【図９】図９：  Ａｓｎを位置２１１８のＡｌａと置換することにより修飾されたヒトＦＶＩＩＩ軽鎖  （配列番号  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２で示す全長ヒトＦＶＩＩＩ配列に関連して）  図９は本発明の１つの具体的な実施の形態で実現されたヒトＦＶＩＩＩの修飾軽鎖に対応するアミノ酸配列と核酸配列の両方を示している。  これらのアミノ酸配列と核酸配列を、各アミノ酸（上側）が対応する核酸コドン（下側）と向き合うようにして示してある。  ヒトＦＶＩＩＩの修飾軽鎖に対応するアミノ酸配列と核酸配列には相互にはまったく無関係に番号付けがなされている（番号は配列の右側に示す）。  図８に示すヒトＦＶＩＩＩの修飾軽鎖のアミノ酸配列は配列番号  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８の配列に対応する。  図８に示すヒトＦＶＩＩＩの修飾軽鎖の核酸配列は配列番号  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７の配列に対応する。  太字で示すアミノ酸残基（アラニン）（あるいはそれに対応する核酸コドン）は本発明の１つの実施の形態で修飾されたグリコシル化サイト（Ａｓｎ２２１８）に対応している。
【図１０】図１０：野生タイプあるいは突然変異体ＦＶＩＩＩ軽鎖によるマウス内での抗ＦＶＩＩＩ  ＩｇＧの生成  ヒトＦＶＩＩＩの精製された血漿誘導軽鎖（ｗｔＬＣｈ）とＦＶＩＩＩの突然変異されたＬＣｈ（Ａｓｎ２１１８Ａｌａ  ＬＣｈ）を、一週間ごとに４回、ＦＶＩＩＩ欠失マウスに、静脈経由で注射した（２００μＬ  ＰＢＳ内に０．２μｇ蛋白質）。  四回目の注射から１週間後に、マウスを出血させて、ＦＶＩＩＩ固有ＥＬＩＳＡを用いて抗ＦＶＩＩＩＩｇＧのレベルを調べた。  ９０倍に希釈したマウス血清をヒトＦＶＩＩＩで被覆したＥＬＩＳＡプレートで培養した。（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ、Ｂａｘｔｅｒ）  Ｂｏｕｎｄ  ＩｇＧをペロキシダーゼとその基質であるＯＰＤに結合された抗マウスＩｇＧを用いて明らかにした。  分光計（Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｙｏｓ）を用いて４９２ｎｍで光学密度を測定した。
【図１１】図１１：三種類のマンノース残基終端グリカン構造の図式表示。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
ここで用いられる場合、『ＦＶＩＩＩ蛋白質』とは少なくともＦＶＩＩＩポリペプチドを含むアミノ酸分子を意味しているが、必ずしもこのポリペプチドには限定されない。
従って、本発明のＦＶＩＩＩポリペプチドは本発明のＦＶＩＩＩ蛋白質のアミノ酸含有量の少なくとも約５０％、好ましくは、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％を占めている。
ＦＶＩＩＩ蛋白質内のＦＶＩＩＩポリペプチドの割合が１００％から違っていると、ＦＶＩＩＩ蛋白質はいずれか他のアミノ酸配列を含んでいる可能性があり、その場合そのＦＶＩＩＩ蛋白質はキメラ性蛋白質と考えるべきである。
ＦＶＩＩＩ蛋白質内に含まれているその追加的なアミノ酸配列はそのＦＶＩＩＩポリペプチドに共有結合あるいは非共有結合で結合している可能性があり、いずれか天然あるいは合成ポリペプチドに対応するか、発生したものである可能性もある。
これらの追加的なアミノ酸配列は酵素あるいは活性蛋白質、細胞トラフィック、転座、輸出、分泌などのための信号配列として機能したり、あるいは他の酵素及び／又は処理蛋白質のための認識サイトとしての役割を果たす場合がある。
【００３５】
ここで用いられている『ＦＶＩＩＩポリペプチド』という用語は、凝固促進活性と配列番号  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の全長ヒトＦＶＩＩＩと類似したトロンビン活性化の特徴を有しており、配列番号  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２で示されるポリペプチド配列の１−７４０と１６８９−２３３２領域に対して少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の同一性を有しているポリペプチドを意味している。
特に、種々の突然変異や保存性のアミノ酸変化も許容可能で、変種ＦＶＩＩＩが凝固促進作用を持っていれば非保存性のアミノ酸変化も許容できる。
フラグメント及びある種のグルコシル化も許容され、あるいは好ましいものであり、そのポリペプチドがその特殊な活性を保持する限り、ＦＶＩＩＩポリペプチドに対するどんな変化でも許容され得る。
【００３６】
ここで用いられている『ＦＶＩＩＩポリペプチド』という用語は、また、凝固促進活性と配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の全長ヒトＦＶＩＩＩと類似したトロンビン活性化の特徴を有しており、配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２で示されるヒト全長ＦＶＩＩＩに対して少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の同一性を有しているポリペプチドを意味している。
特に、種々の突然変異や保存性のアミノ酸変化も許容可能で、変種ＦＶＩＩＩが凝固促進作用を持っていれば非保存性のアミノ酸変化も許容できる。
フラグメント及びある種のグルコシル化も許容され、あるいは好ましいものであり、そのポリペプチドがその特殊な活性を保持する限り、ＦＶＩＩＩポリペプチドに対するどんな変化でも許容され得る。
【００３７】
ここで用いられている『修飾ＦＶＩＩＩポリペプチド』は、いずれの数のアミノ酸、あるいは天然形態、全長、又はＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ非重要領域におけるアミノ酸の何らかの変化を含んでいてもよく、その変化にはそのポリペプチド分子のいずれか他の領域での置換及び／又は欠失を含んでいるが、ただし、そのポリペプチド変異体が配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の少なくとも約１−７４０及び／又は１６８９−２３３２ポリペプチド配列に対して少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の同一性を有しており、そして、その変化がその変異体ＦＶＩＩＩの活性に影響を及ぼさないことを条件とする。
【００３８】
ここで用いられている『修飾ＦＶＩＩＩポリペプチド』は、示されている基準配列、つまり、配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のヒト全長ＦＶＩＩＩに対して６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性を有しているアミノ酸配列をその範囲内に含んでいる。
【００３９】
ここで用いられている『修飾』という用語は、基準となる（例えば全長ＦＶＩＩＩ配列などの）ポリペプチドと比較してそのアミノ酸配列に何らかの相違がある分子を意味する。
このアミノ酸の変化としては、天然あるいは全長アミノ酸配列における置換、挿入、欠失、あるいはそうした変化の何らかの組み合わせなどがある。
その置換は単一のものであってもよく、その場合はその分子内のだた１つだけのアミノ酸が置換されている。
また、複数の置換であってもよく、その場合は、同じ分子内で２つ以上のアミノ酸が置換されている。
【００４０】
本発明によるＦＶＩＩＩポリペプチドの特性を改善するために、アミノ酸加工技術を用いてもよい。
単一あるいは複数のアミノ酸置換、欠失、付加を含む新しい突然変異体ポリペプチド、あるいは溶融蛋白質を創出するために、当業者に公知の遺伝子組み換えＤＮＡ技術を用いることもできる。
こうした修飾ポリペプチドは、例えば、活性の増減あるいは安定性の増減を示すことができる。
加えて、それらは高いイールドで精製することができ、少なくとも一定の精製及び保存条件下では、対応する自然のポリペプチドより優れた安定性を示す。
【００４１】
ここで用いられている『ポリペプチド』という用語は、全長蛋白質分子だけでなく、それ自体で、あるいは他のフラグメントと共に凝固アッセイでＦＶＩＩＩの凝固促進作用を発生させるフラグメントも含んでいる。
本発明による新しい蛋白質生成物の合成ポリペプチドも本発明の範囲に含まれ、標準的な合成方法で製造することができる。
さらに、ここで用いられているアミノ酸番号付け方式で、アミノ酸残基１は天然の成熟したＦＶＩＩＩ蛋白質の最初の残基を意味している。
さらに、『領域』という用語は当業者に公知のＦＶＩＩＩの近似領域を意味していることは分かるであろう。
【００４２】
本発明において用いられているアミノ酸記号は以下のものを含んでいる。
本願では、個々のアミノ酸の最初の一文字か三文字の省略形を用いており、いずれかが適宜用いられており、以下の意味を有する。
ＡあるいはＡｌａ＝アラニン、ＲあるいはＡｒｇ＝アルギニン、ＮあるいはＡｓｎ＝アスパラギン、ＤあるいはＡｐｓ＝アスパル酸、Ｃ又はＣｙｓ＝システイン、Ｑ  Ｇｌｎ＝グルタミン、ＥまたはＧｌｕ＝グルタミン酸、ＧまたはＧｌｙ＝グリシン、ＨまたはＨｉｓ＝ヒスチジン、ＩまたはＩｌｅ＝イソロイシン、ＬまたはＬｅｕ＝ロイシン、ＫまたはＬｙｓ＝リシン、ＭまたはＭｅｔ＝  メチオニン、ＦまたはＰｈｅ＝フェニルアラニン、ＰまたはＰｒｏ＝プロリン、ＳまたはＳｅｒ＝セリン、ＴまたはＴｈｒ＝トレオニン、ＷまたはＴｒｐ＝トリプロファン、ＹまたはＴｙｒ＝チロシン、そしてＶまたはＶａｌ＝バリン。
【００４３】
さらに、ここで用いられている『修飾ＦＶＩＩＩポリペプチド』の修飾とは、機能や達成される結果が同じである限り、示されている番号や位置に限定されるものではない。
トロンビン切断あるいは凝固促進機能が維持されるなど機能的活性が同じである限り、ヒト全長ＦＶＩＩＩのＮまたはＣ末端やその他の部分に少数のアミノ酸位置が挿入、付加されたり、欠失されてもよい。
また、蛋白質やそれと同様の生物学的活性を示すそのフラグメントや誘導物及び、例えばグリコシル化、蛋白質切断、抗体分子やその他の細胞リガンドに対する結合などによる翻訳中及び翻訳後にそれぞれ異なって修飾される誘導物なども本発明の範囲内にある。
【００４４】
ここで用いられている『フラグメント』とは、利用可能性と機能的特徴を保持しているポリペプチドの一部分を意味している。
例えば、本発明の文脈で用いられる場合、ＦＶＩＩＩポリペプチド・フラグメントは血液を凝固させる機能を有している。
【００４５】
ここで用いられる場合、ＦＶＩＩＩ凝固促進活性を有する蛋白質とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏモデル・システムで因子Ｘの活性化を惹起する蛋白質のことである。
非限定的な例として述べれば、この定義には全長遺伝子組み換えヒトＦＶＩＩＩ及びＢ領域欠失ＦＶＩＩＩが含まれる。
ここで用いられている『凝固促進活性』及び『活性』ＦＶＩＩＩという用語は同じことを意味しており、凝固アッセイで凝固促進作用を示す１つ以上のポリペプチドあるいは蛋白質を意味している。
ＦＶＩＩＩという用語は、ここではＦＶＩＩＩａを含んで用いられることもあり、当業者であれば使われている文脈でそれらの用語がトロンビン活性化前のＦＶＩＩＩとトロンビン活性化ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）のいずれの意味で使われているかは分かるであろう。
ここで用いられている『マンノース残基脱グリコシル化ＦＶＩＩＩポリペプチドで終端しているグリカン構造』とは、１つあるいは複数のマンノース残基で終端されたグリカンを欠失しているＦＶＩＩＩポリペプチドあるいは修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドを意味している。
【００４６】
ここで用いられている『マンノース残基で終端されたグリカン構造』とは、ポリペプチドの基本構造からは離れたグリコシル化の箇所で１つあるいは複数のマンノース残基で終端されたグリカン構造を意味しており、こうしたマンノース残基は末端マンノース残基と呼ばれる。
『マンノース残基で終端されたグリカン構造』には、１つあるいは複数のマンノース残基がポリペプチドの主要部分から分岐している単及び複数分岐グリカン構造が含まれ、特に『マンノース残基で終端されたグリカン構造』という用語はオリゴマンノース・タイプ・グリカン構造を含んでいる。（図１１）。
【００４７】
ここで用いられている『終端マンノース残基』という用語は、グリコシル化の箇所でグリカン構造のアンテナ（突起部）を終端しているポリペプチドの主要部からは離れたマンノース残基を意味している（図１１）。
【００４８】
ここで用いられている『高刺激性条件の下でハイブリダイズすることができる』という用語は高刺激性条件で発現対象のＤＮＡと相補的なＤＮＡのストランドをアニーリングすることを意味している。
同様に『低刺激性条件の下でハイブリダイズすることができる』という条件は、低刺激性条件で発現対象のＤＮＡと相補的なＤＮＡのストランドをアニーリングすることを意味している。
アニーリング・プロセスのための『高刺激性条件』とは、例えば、ミスマッチした塩基対間の水素結合接触をできなくさせるような高温度及び／又は低塩分含有度などを含んでいる。
こうした条件では、２つのストランドの間に完全ではないとしても実質的な相補性が存在している場合に２つのＤＮＡストランドがアニールでき、これは同じではあるが遺伝子コードの縮退によって多少違っている蛋白質をコードするＤＮＡストランド間で起きることと同様である。
ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切な刺激性条件としては、例えば、約４５℃で６＊ＳＳＣ、その後で５０℃で２＊ＳＳＣの洗浄などが当業者に知られており、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．  Ｙ  （１９８９），  ６．３１−６．３．６にも見出すことができる。例えば、洗浄ステップでの塩分濃度は５０℃での約２＊  ＳＳＣから５０℃での約０．２＊ＳＳＣまでの低刺激性の範囲から選択されてもよい。
加えて、洗浄ステップでの温度を室温、約２２℃程度の低刺激性から約７５℃の高刺激性条件に上昇させてもよい。
その他の刺激性パラメータは、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｎ，  Ｙ．，  （１９８２）  ，  ｐｐ．  ３８７−３８９に述べられている。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．  ｅｔ．  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２，  Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｎ，  Ｙ．，  ｐｐ．  ８．４６−８．４７  （１９８９）も参照。
【００４９】
ここで用いられている『基質』とは、用いられる用量と濃度で細胞や哺乳動物に対して毒性のない薬学的に許容される基質、賦形剤、あるいは安定剤を意味する。
多くの場合、上記の薬学的に許容される基質は水性ｐＨ緩衝液である。薬学的に許容される基質の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及びその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ジェラチン、あるいは免疫グロブリンなどの蛋白質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；ポリシン、グルタミン、アスパラギン、あるいはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、あるいはデキストリンなどを含むその他の炭化水素；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールやソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの対イオン；そしてＴＷＥＥＮ（Ｒ）、ポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）、そしてＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（Ｒ）などの非イオン性界面活性剤などがある。
【００５０】
ここで用いられている『有効量』とは、有効なあるいは望ましい臨床的あるいは生化学的結果を及ぼすのに十分な量のことである。
有効量は一回あるいは複数回の処方で投与することができる。
本発明の目的においては、抑制剤化合物の有効量とは病状の進行を和らげたり、改善したり、安定化させたり、逆転させたり、遅くさせたり、あるいは遅らせるのに十分な量である。
本発明の好ましい実施の形態においては、『有効量』は血液の凝固を起こすことができる化合物の量を意味している。
【００５１】
ここで用いられている『ホスト細胞』とは、本発明のベクターの受容体として用いることが出来る、あるいは用いられている個別の細胞あるいは細胞培養体を含んでいる。
ホスト細胞は１つのホスト細胞の子孫を含み、そしてその子孫は（全体的ＤＮＡ補体の形態において）最初の親細胞と完全に同一でなくてもよく、偶然的なあるいは微小の突然変異及び／又は変化が含まれていてもよい。
ホスト細胞は血管由来の因子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにｉｎ  ｖｉｖｏあるいはｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクトあるいは感染された細胞も含む。
【００５２】
ここで用いられている『精製された』あるいは『単離された』という表現は、その自然の環境から取り出され、自然に結びついている他の構成要素からは単離、分離あるいは開放されている生化学分子を意味している。
【００５３】
ここで用いられている『措置』とは、有効なあるいは望ましい臨床結果を得るための行動を意味している。
本発明の目的に即して言えば、有効なあるいは望ましい臨床結果とは、検出可能か否かとは関係なく症状の緩和、病気の範囲の縮小、病状の安定化（悪化しないこと）、病気進行の遅延あるいは遅くさせること、病状の改善あるいは緩和、及び（部分的であれ全体的にであれ）鎮静化などを意味している。
『措置』とは措置を受けない場合に予想される生存期間と比較しての引き延ばされた延長期間も意味している。
『措置』とは治療目的の措置と予防的あるいは防止的措置の両方を意味している。
措置を必要とする人はすでに不全状態を有している人だけでなく、不全を予防しなければならない人も含まれる。
病状の『緩和』とは、措置を受けない場合と比較して、疾病状態の範囲及び／又は望ましくない臨床的兆候を軽減したり、進行の時間的経過が遅くなったり引き延ばされたりすることを意味する。
【００５４】
ここで用いられている『ベクター』、『ポリヌクレオチド・ベクター』、『構成物』及び『ポリヌクレオチド構成物』は相互に適宜取り替えて使われている。
本発明のポリヌクレオチド・ベクターとは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、レトルウイルスに包まれたＲＮＡ、アデノウイルスに包まれたＤＮＡ、その他のウイルスやウイルス上の形態（例えば、ヘルペス−シンプレックス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））などに取り込まれたＤＮＡ、リポソーム、ポリリシンで複合化されたＤＮＡ、合成多価陽イオン性分子と複合化したＤＮＡ、免疫学的にその分子を『マスク』するために及び／又はその半減期を延ばすためにポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）などの化合物と複合化されたり、非ウイルス性蛋白質に接合されたＤＮＡなどを意味する。
好ましくは、そのポリヌクレオチドはＤＮＡである。
【００５５】
本発明のベクターによるトランスフェクションのためのＦＶＩＩＩ誘導物と例えばジヒドロフォレート・リダクターゼ（ＤＨＦＲ）蛋白質をコードするＤＮＡ配列で構成される好ましいホスト細胞の選択においては、用いられたＤＨＦＲ蛋白質のタイプに従ってホストを選択するのが適切である。
野生タイプのＤＨＦＲ蛋白質を選択した場合は、ＤＨＦＲを欠失したホスト細胞を選んで、ハイポキサンチン、グリシン、そしてチミジンを欠失した選択的培養体の中でトランスフェクションをうまくいかせるためのマーカーとしてのＤＨＲＦコーディング配列を利用できるようにするのが好ましい。
他方、調節塩基配列としてメトトレキセート（ＭＴＸ）に対する結合親和性が低いＤＨＦＲ蛋白質を用いる場合は、ＤＨＦＲ抵抗性細胞を用いることは不必要である。
突然変異体ＤＨＦＲはＭＴＸに対して抵抗性を有しており、ホスト細胞自体がＭＴＸに対する感作性を有しているのであれば、ＭＴＸを含む培養液を用いることができる。
あるいまた、ヒグロマイシン抵抗性など、第２の薬品選択可能マーカーが用いられるのであれば、ＤＨＦＲを欠失しているホスト細胞で、野生タイプのＤＨＦＲ遺伝子を用いることが可能である。
以下に述べる実施例は、ＭＴＸに抵抗性を示すＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＤＢＸ１１細胞）をホスト細胞として、そしてＣＭＶとＳＶ４０プロモータをＦＶＩＩＩ誘導体及びＤＨＦＲを発生させるための調節塩基配列として用いるベクター上でそれぞれ用いた場合について述べている。その他の選択可能なマーカーとしてはネオマイシン、ヒゴロマイシン、そしてメトトレキセートなどの薬品に対して抵抗性を示す遺伝子などがある。
【００５６】
ここで用いられている『ＤＮＡ』とは塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧだけでなく、メチル化核酸、無電荷結合及びチオエートなどのような核酸間修飾、糖類似物、及びポリアミドのような修飾及び／又は代替バックボーン構造など、これらの塩基の類似物や修飾形態も含んでいる。
【００５７】
別の態様で、本発明は厳しいハイブリダイゼーション条件下で、上に述べた核酸分子の一部分にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。
ハイブリダイズするポリヌクレオチドは上に述べたようにプローブ及びプライマーとして有益である。
ＦＶＩＩＩポリペプチド・コーディング配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドの部分は、正確には、上に述べたように５’及び３’塩基部分によって特定でき、ヌクレオチド塩基のサイズに特徴がある。
同様にＦＶＩＩＩポリペプチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの部分もプローブやプライマーとして用いることができる。
本発明において好ましいハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ラベルされてこの技術分野で知られているハイブリダイゼーション・アッセイ（例えばサザーン及びノーザン・ブロット分析）で用いられると、他の異種配列が等モル量で存在していても最大の信号強度を示すものである。
【００５８】
本明細書では、修飾核酸配列はヌクレオチドの置換、決失、あるいは付加によってつくりだされたものを含んでいる。
これら置換、決失、あるいは付加は１つ以上のヌクレオチドを含んでいてもよい。
アミノ酸配列における変性は保存性と非保存性の両方のタイプのアミノ酸置換、決失、あるいは付加をつくりだす可能性がある。
これらの中で特に好ましいのは、本発明のポリペプチドやその部分の性質を変化させないサイレントな置換、決失、及び付加である。
この点では保存性の置換が好ましい。
【００５９】
本発明は発現ベクターにおける配列の利用と、原核細胞であれ真核細胞であれホスト細胞及び細胞株へのトランスフェクトを可能にしてくれる。
本発明はまた、発現ベクターから発現されたポリペプチドの精製も可能にする。
この発現ベクターは精製を容易にするために種々の分子タグを含んでいてもよい。
その後で、得られた発現構成物を随意のホスト細胞に変質させることができる。
ホスト細胞からの細胞溶解物はこの分野で公知の既存の方法で単離される。
【００６０】
１つの具体的な実施の形態で、本発明のポリペプチドの異常な発現及び／又は作用に関連した疾患や不全を治療、抑止、あるいは防止するために遺伝子治療の方法を用いて、ＦＶＩＩＩ蛋白質あるいは修飾されたＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする配列を含んだ核酸が投与される。
遺伝子治療とは、本発明の実施の形態においては、治療対象の個体に発現された、あるいは発現可能な核酸を投与することによって行われる治療を意味する。
【００６１】
本発明においては、この技術分野で知られているいずれの遺伝子治療方法でも用いることができる。
１つの好ましい態様において、核酸配列は、その内部でそれらの核酸配列が適切なホスト細胞内でポリペプチドを発現する発現ベクターの一部になっているＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする場合がある。
特に、そうした核酸配列はそのポリペプチド・コーディング領域に操作可能に結合されたプロモータを有しており、そのプロモータは誘導可能あるいは構成的であり、そして組織固有であってもよい。
別の特殊な実施の形態では、その内部でポリペプチド・コーディング配列とその他の望ましい配列がそのゲノムの望ましい箇所で相同性遺伝子組み換えを促進する領域で側鎖されていて、従って抗体コード核酸の染色体内発現をもたらすような核酸分子が用いられる。
患者の体内への核酸の送り込みは直接的に行われてもよく、その場合は、患者はその核酸や核酸を担持しているベクターに直接露出されることになる。
間接的に行われる場合は、先ず細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸を用いて変質させておき、そして患者に移植される。
これらの２つの方式は、それぞれｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療として知られている。
【００６２】
１つの具体的な実施の形態において、核酸配列はｉｎ  ｖｉｖｏで直接的に投与され、発現されてコードされた生成物をつくりだす。
このことはこの技術分野で公知のいろいろな方法で達成することができ、例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、それらが細胞内に取り込まれるように投与したり、不具合のある又は弱力化されたレトロウイルス性あるいはその他のウイルス性ベクターを用いて感染させるか、むき出しになったＤＮＡを直接注射するか脂質あるいは細胞表面レセプタや感染剤で被覆するか、リポソーム、微粒子、あるいは微小カプセルに入れるか、あるいはそれらを核に入り込むことが知られているペプチドに結合させてそれらを投与するか、（そのレセプタを特異的に発現する細胞タイプに向けさせるために用いることができる）レセプタ媒介エンドサイトーシスを受けるリガンドに結合させて投与したりするなどの方法がある。
【００６３】
あるいは、核酸は静脈注射で導入したり、相同性遺伝子組み換えによって発現用のホスト細胞ＤＮＡに組み込むこともできる。
１つの具体的な実施の形態ではポリペプチドをコードする核酸を含んでいるウイルス性ベクターを用いることもできる。
遺伝子治療で用いることが出来るポリペプチドをコードする核酸配列は１つあるいは複数のベクターにクローンされ、これによって、遺伝子を患者の体内に入れることが容易になる。
レトロウイルス性ベクター、アデノウイルス性ベクター、及びアデノ関連ウィルスは用いることができるウイルス性ベクターの例である。
レトロウイルス性ベクターはウイルス性ゲノムのパッケージングやホスト細胞ＤＮＡへの取り込みを正しく行うのに必要な成分を含んでいる。
【００６４】
遺伝子治療の別の方式では、電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、あるいはウイルスによる感染などの方法で組織培養中の細胞に遺伝子を移送する。
通常、移送方法は選択可能なマーカーを細胞に移送するステップを含む。
そしてその細胞を選択下に置いてその移送された遺伝をを取り込むか発現している細胞を単離させる。
これらの細胞を次に患者の体内に移す。
この実施の形態では、核酸は得られる組み換え遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏで投入する前に細胞に導入する。
こうした導入は先行技術で公知のいずれかの方法を用いて実行することができ、その方法としては、トランスフェクション、電気穿孔法、微量注射、その核酸配列を含んでいるウイルス性あるいはバクテリオファージ・ベクターを用いた感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子移送、マイクロセル媒介遺伝子移送、スフェロプラスト融合などである。
外来遺伝子を細胞内に導入するためには多数の方法が知られており、受容体側の細胞の成長及び生理学的機能が損なわれない限り、それらの方法を本発明の手順において用いることができる。
【００６５】
これらの技術は細胞への核酸の安定した移入を可能にしてくれるものであり、核酸が細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝可能で、その後代細胞によても発現される。
【００６６】
遺伝子療法の目的で核酸を導入でき細胞は入手できるどのような望ましい細胞タイプであってもよく、上皮細胞；内皮細胞；ケラチン生成細胞；筋肉細胞；肝細胞；Ｔリンパ球やＢリンパ球、単核白血球、マクロファージ、好中球、好酸球、顆粒球などの血液細胞；種々の幹あるいは前駆細胞、特に骨髄から得られるような造血性幹あるいは前駆細胞、へその緒血液、抹消血液、胎児幹細胞などである。
【００６７】
１つの実施の形態で、本発明は血液凝固に関する疾病の治療と関係している。
その方法においては、本発明による新規の治療用化合物がそうした疾病に罹病した、あるいはそうした疾病を罹病しやすい人間の患者に対して血液の凝固を刺激する化合物を提供することで投与することができる。
具体的には、それらの疾病は血友病、特にＡ型血友病である。治療用化合物の製剤は先行技術で知られており、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １７ｔｈ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  ＵＳＡが参考資料として好適である。
【００６８】
用量は最大の治療効果を得られるように調節することができる。
例えば、１日に何回か分けて投与することもできるし、あるいは治療状況に応じて減らすことも可能である。
活性成分は経口、静脈注射（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻孔内、皮内あるいは座薬さらには移植（例えば、徐放分子を使って腹腔内経路や、感作性を増幅させた単球や樹状細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いて養子免疫療法の手法で患者に移入したりするなどの方法によって）などの方法で投与することができる。
投与経路に応じて、ＦＶＩＩＩ蛋白質あるいは修飾ＦＶＩＩＩポリペプチドをその活性成分を不活性化させる可能性がある酵素、酸、及びその他の条件から保護するために、それらをコーティングする必要性が生じる場合もある。
【００６９】
注射での使用に適した薬剤形態としては（水溶性の場合）滅菌水溶液、分散剤、あるいは滅菌注射可能溶液あるいは分散剤の即席調合剤用の滅菌粉末などである。
【００７０】
すべての場合に、薬剤形態は滅菌性で、注入が容易な程度に流動性を持っていなければならない。
さらに、製造及び保管中の条件下で安定していなければならず、バクテリアや黴などの汚染作用から保護されていなければならない。
基剤としては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレン・グリコール及び液体ポリエチレン・グリコールなど）、それらの適切な混合物、そしてベジタブル・オイルなどが含まれる。
適正な流動性は、例えば、レチシンなどの皮膜剤の利用、分散剤の場合は必要な粒子サイズを維持することによって、そして界面活性剤などを用いることで維持することができる。
微生物による作用の防止は、例えば、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、テオメサルなどの種々の抗菌剤や抗黴剤を使用することによって行うことができる。
多くの場合、例えば、砂糖や塩化ナトリウムなどの等張剤を含んでいることが好ましい。
注射可能な組成物を長時間かけて吸収させるためには、例えば、アルミニウム・モノステアレート及びゼラチンなどの吸収を遅らせる組成物を用いることができる。
【００７１】
無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合は、製剤の好ましい方法は真空乾燥及び凍結乾燥技術で、これらの技術は事前に滅菌ろ過されたそれらの溶液から活性成分とその他の付加的な成分を含んだ粉末をつくりだすことができる。
【００７２】
ペプチドを上に述べたように適切に保護すると、活性化合物はその不活性希釈剤あるいは吸収可能な基剤と共に経口投与することができ、あるいは、硬い又は柔らかいシェル・ゼラチンに封入するか、錠剤に圧入するか、あるいはダイエット用食品に組み合わせることもできる。
経口で治療用投与を行うためには、活性化合物を賦形剤に組み込んで、摂取可能な錠剤、口腔用錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェファーなどに組み入れることができる。
【００７３】
錠剤、丸薬、カプセルなどはさらに以下のものを含んでいてもよい。
ゴム・トラガカント、アカシア、コーン・スターチあるいはゼラチンなどの結合剤；リン酸ジカルシウムなどの賦形剤；コーン・スターチ、ポテト・スターチ、アルギニン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、さらに、サクロース、ラクトース、あるいはサッカリンなどの甘味料や、ペッパーミント、ウィンター・グリーン・オイル、あるいはチェリー芳香剤などの芳香剤を加味することもできる。
用量単位形態がカプセルの場合、上に列挙した物質に加えて、液体基剤を含んでいてもよい。
用量単位の物理的形状を被覆その他の方法で修正するために、他のいろいろな物質が含まれていても差し支えない。
例えば、錠剤、丸薬、あるいはカプセルをシェラック、糖、あるいはその両方でコーティングしてもよい。
シロップやエリキシル剤は活性化合物、甘味剤としてのサクロース、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、染料、そしてチェリーあるいはオレンジなどの芳香剤を含んでいてもよい。
もちろん、用量単位を調製するために用いられるどの物質も薬学的に純粋であり、用いられる用量において基本的に非毒性でなければならない。
さらに、活性化合物は持続放出製剤あるいは薬品に組み込むことができる。
【００７４】
ここで用いられている『薬学的に許容される基剤及び／又は希釈剤』とは溶剤、分散媒、抗菌性被覆及び抗黴剤、等張剤、及び吸収遅延剤などのいずれか、あるいはそれらのすべてを含む。
薬学的に活性のある物質のためにそうした媒体や薬剤を使用することはこの技術分野でよく知られている。
従来の媒体や薬剤が活性成分と共存できない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用は考えられる。
補助的な活性成分をその組成物に組み入れてもよい。
【００７５】
投与のし易さと用量の均一性を考えると、非経口組成物を用量単位に製剤するのが特に好適である。
ここで用いられている用量単位形状とは、措置されるべき哺乳動物の個体に対して一回分の用量として用いるのに適している物理的にそれぞれ個別の単位を指しており、各単位が必要な薬学的基質と組み合わされて望ましい治療効果をつくりだすように予め計算され決められた量の活性物質を含んでいる。
本発明による用量単位形状に関する仕様は（ａ）その活性物質固有の特性と達成されるべき治療効果、及び（ｂ）身体的健康が損なわれているような疾病状態を有している生きた個体における疾病の治療のための活性物質などの配合技術に伴う要件を絶対条件として、それらに従って決められる。
【００７６】
主要活性成分は、簡便で効果的な投与ができるように、適切な量で薬学的に供される基剤と共に用量単位形状内に配合される。
【００７７】
組成物は、その投与がそれを受容する動物によって耐えられ、あるいはその動物に対して何らかの意味で適している場合に、『薬学的あるいは生理学的に許容される』と言われる。
投与される量が生理学的に有意であれば、そうした薬剤は『治療的に有効な量』で投与されたと表現される。
その存在の結果が受容者である患者の生理に検出可能な変化を生じた時に、その薬剤が生理学的に有意であると認定される。
【００７８】
１つの特別な実施の形態では、哺乳動物の細胞培養が本発明で開示されている機能的なヒトＦＶＩＩＩ誘導物をつくりだすための外来ＤＮＡの発現方法である。
具体的には、遺伝子組み換え蛋白質を生成するために用いられる一般的な哺乳動物細胞としては、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ベビー・ハムスター（ＢＨＫ）細胞株、ＣＯＳ細胞株、ＨＫＢ１１（腎臓とＢ細胞のハイブリッド；ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１２５６８）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）及びマディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞株などが発現の対象となる。
そうした細胞の発現ベクターは通常（必要であれば）複製源、発現されるべき遺伝子の前に位置するプロモータといずれかの必要なリボソーム結合サイト、ＲＮＡスプライシング・サイト、ポリアデニル化サイト、そして転写停止配列を含んでいる。
【００７９】
哺乳動物細胞で使用するためには、その発現ベクター上での調節機能はウイルス性物質によって与えることができる。
例えば、通常用いられているプロモータは伸長因子−１（ＥＦ−１）、シミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）（１５）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（１６）、及びアデノウイルス２からの大型後期プロモータ（１７）から誘導される。
さらに望ましい遺伝子配列と正常に結合しているプロモータあるいは調節配列を用いることも可能であり、多くの場合、それが望ましい。
ただし、そうした調節配列がホスト細胞系と共存できることが条件である。
【００８０】
細胞プロモータはマウス・カッパー遺伝子プロモータ（１８）、マウスＶＨプロモータ（１９）、マウス金属結合性−Ｉプロモータ（２０）などである。
発現ベクターはプロモータの下流及びＦＶＩＩＩ配列自体の挿入サイトから上流に位置する一連のＲＮＡスプライシング・サイトも含んでいる場合もある。
好ましいＲＮＡスプライシング・サイトはアデノウイルス及び／又は免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。
発現ベクターはｃＤＮＡ  ＦＶＩＩＩ配列内に位置している一連のＲＮＡスプライシング・サイトを含んでいる場合もある。
発現ベクターは、上記挿入サイトから下流に位置するポリアデニル化信号も含まれている。
特に好ましいポリアデニル化信号はＳＶ４０からの初期あるいは後期ポリアデニル化信号（Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ）、アデノウイルス５Ｅｌｂ領域からのポリアデニル化信号、あるいはヒト成長ホルモン遺伝子ターミネータ（２１）などである。
発現ベクターはプロモータとＲＮＡスプライシング・サイトと間に位置するアデノウイルス２三部構成リーダーなどの非コーディング・ウイルス性配列とＳＶ４０エンハンサなどのエンハンサ配列も含んでいる。
【００８１】
本発明で生成される修飾ＦＶＩＩＩは抗ＦＶＩＩＩ抗体カラムでの親和性クロマトグラフィで精製することができる。
さらなる精製は、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）などの通常の科学的精製手段によって達成することができる。
クエン酸バリウム沈積なども含むその他の精製方法もこの技術分野でも知られており、新規の修飾ＦＶＩＩＩの精製に適用することができる。
基本的に純粋な修飾ＦＶＩＩＩは薬学的使用に用いることができる。
部分的にでもあるいは望ましい均一性まで一度精製されれば、修飾ＦＶＩＩＩを治療的に用いることができる。
【００８２】
ここで用いられているＩ２１４４−Ｔ２１６１ペプチドは配列番号  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９の合成ペプチドである。
このペプチドはマンノシル化されておらず、従って、マンナンは樹状細胞（ＤＣ）などのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）による受容体媒介エンドサイトーシスに対しては影響を示さない。
【００８３】
ここで用いられているＤ９Ｅ９細胞はＭａｒｃ  Ｊａｃｑｕｅｍｉｎによって開発されたヒトＦＶＩＩＩ固有ＣＤ４＋Ｔ細胞クローン（Ｒｅｆ  Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  Ｂｌｏｏｄ  ２００３）である。
これらの細胞は、事前にＦＶＩＩＩあるいはＦＶＩＩＩ誘導ペプチドＩ２１４４−Ｔ２１６１をエンドサイトーシスした抗原提示細胞で培養された場合にＩＦＮガンマを生成する。
【００８４】
ここで用いられているＬＥ２Ｅ９細胞はＭａｒｃ  Ｊａｃｑｕｅｍｉｎによって開発されたヒトＦＶＩＩＩ固有Ｂ細胞クローン（Ｒｅｆ  Ｐｅｅｒｌｉｎｃｋ  Ｂｌｏｏｄ  １９９９）である。
これらの細胞はＦＶＩＩＩのＣＩドメインを認識するヒト固有ＩｇＧ４をつくりだす。
【００８５】
ここで用いられているＢＯ２Ｃ１１細胞はＭａｒｃ  Ｊａｃｑｕｅｍｉｎによって開発されたヒトＦＶＩＩＩ固有Ｂ細胞クローン（Ｒｅｆ  Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  Ｂｌｏｏｄ  １９９８）である。
これらの細胞はＦＶＩＩＩのＣ２ドメインを認識するヒトＦＶＩＩＩ固有ＩｇＧ４をつくりだす。
【００８６】
ここで用いられているＣＴＬＤ４−７Ｆｃ分子はマウス・マクロファージ・マンノース・レセプタ（ＣＤ２０６）のドメイン４−７を含むキメラ性構成物である。
ＣＴＬＤ４−７Ｆｃ分子はＬｕｉｓａ  Ｍａｒｔｉｎｅｓｓ−Ｐｏｍａｒｅｚ  （Ｌｉｎｅｈａｎ  ２００１  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）によってつくりだされたものである。
【００８７】
ここで用いられている樹状細胞（ＤＣ）は専門的な抗原提示細胞で、種々の特殊な表面マーカー（ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ４０・・・）及び種々の機能（抗原のエンドサイトーシス、Ｔリンパ球に対する抗原の提示）で特徴付けられる。
【００８８】
ここで用いられている抗ＣＤ２０６  ＰＡＭ−１抗体はヒト・マクロファージ・マンノース・レセプタ（ＣＤ２０６）に対して特に向けられた抗体である。
これはＰ．Ａｌｌａｖｅｎａ  （Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍａｒｉｏ  Ｎｅｇｒｉ，  Ｍｉｌａｎ，  Ｉｔａｌｙ）によってつくられたものである。
【００８９】
以下の配列は配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のアミノ酸配列、つまり、１９個のアミノ酸による信号ペプチドを含む天然全長ヒト因子ＶＩＩＩに対応している。
【００９０】
【表１】
2010524453.tif 000002
【００９１】
以下の配列は配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のアミノ酸、つまり１９個のアミノ酸による信号ペプチドを含んでいない全長ヒトＦＶＩＩＩに対応している。
【００９２】
【表２】
2010524453.tif 000003
【００９３】
以下の配列は配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３の核酸配列、つまり、ヒトＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードする核酸配列に対応している。
【００９４】
【表３−１】
2010524453.tif 000004
【表３−２】
2010524453.tif 000005
【００９５】
以下の配列は配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４のアミノ酸配列、つまり、ヒトＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列に対応している。
【００９６】
【表４】
2010524453.tif 000006
【００９７】
以下の配列は配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５核酸配列、つまり、ヒトＦＶＩＩＩの突然変異体Ａｓｎ２３９Ａｌａを含む重鎖をコードする核酸配列に対応している。
【００９８】
【表５】
2010524453.tif 000007
【００９９】
以下の配列は配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６のアミノ酸配列、つまり、ヒトＦＶＩＩＩの突然変異体Ａｓｎ２３９Ａｌａを含む重鎖のアミノ酸配列に対応している。
【０１００】
【表６】
2010524453.tif 000008
【０１０１】
以下の配列は配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７の核酸酸配列、つまり、ヒトＦＶＩＩＩの突然変異体Ａｓｎ２１１８Ａｌａを含む軽鎖の核酸配列に対応している。
【０１０２】
【表７】
2010524453.tif 000009
【０１０３】
以下の配列は配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８のアミノ酸配列、つまり、ヒトＦＶＩＩＩの突然変異体Ａｓｎ２１１８Ａｌａを含む軽鎖のアミノ酸配列に対応している。
【０１０４】
【表８】
2010524453.tif 000010
【０１０５】
以下の配列は配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９のアミノ酸配列、つまりＩ２１４４−Ｔ２１６１ポリペプチドのアミノ酸配列に対応している。
【０１０６】
【表９】
2010524453.tif 000011
【０１０７】
以下の配列は配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０のアミノ酸配列、つまり、全長ヒトＦＶＩＩＩのＢドメインのアミノ酸配列に対応している。
【０１０８】
【表１０】
2010524453.tif 000012
【０１０９】
以下の配列は配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１の核酸配列、つまり、ヒトＦＶＩＩＩの突然変異体Ａｓｎ２３９ＧＩｎを含む重鎖をコードする核酸配列に対応している。
【０１１０】
【表１１】
2010524453.tif 000013
【０１１１】
以下の配列は配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２のアミノ酸配列、つまり、ヒトＦＶＩＩＩの突然変異体Ａｓｎ２３９ＧＩを含む重鎖のアミノ酸配列に対応している。
【０１１２】
【表１２】
2010524453.tif 000014
【０１１３】
以下の配列は配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３の核酸配列、ヒトＦＶＩＩＩの突然変異体Ａｓｎ２１１８Ｇｌｎを含む軽鎖をコードする核酸配列に対応している。
【０１１４】
【表１３】
2010524453.tif 000015
【０１１５】
以下の配列は配列番号ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４のアミノ酸配列、つまり、ヒトＦＶＩＩＩの突然変異体Ａｓｎ２１１８Ｇｌｎを含む軽鎖のアミノ酸配列に対応している。
【０１１６】
【表１４】
2010524453.tif 000016
【０１１７】
本発明はここで述べられている具体的な実施の形態に範囲を限定されることは意図していない。
実際、上に述べられたものに対して種々の修正が本発明の範囲内にあることは、上の記述や添付する図面から当業者には明らかであろう。
以下の実施例は本発明の説明のためのものであって、限定を意図するものではない。
【実施例１】
【０１１８】
実施例１：単球から誘導されたヒト樹状細胞
抹消血単球細胞を１０％ヒトＡＢ血清、グルタミン、及び抗生物質で補強したＲＰＭＩ１６４０倍溶液内でプラスチック製培養皿に６０分間くっつけることによって、健康な成人のヘパリン添加軟膜から単離した。
付着性のない細胞は培養液で３回穏やかに洗浄することで取り除いた。
付着性のある単球は１％ヒトＡＢ血清、抗生物質で補強したＸ−ＶＩＶＯ１５（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐａｒｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）内で、そして、５００  ＩＵ／ｍＬの遺伝子組み換えヒト・インターロイキン４（ｒｈＩＬ−４）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｌｉｌｌｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）、そして１０００ＩＵ／ｍＬ遺伝子組み換えヒト顆粒球マクロファージ・コロニー刺激性因子（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）  ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ  （Ｆｒｉｅｓｏｙｔｈｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下で培養した。
すべての補強物を含んだ培養液の半分を２日に１回取り替えた。５日間培養した後、付着しない、及び樹状細胞を増やしたフラクションに対応するゆるく付着した細胞を取り出して、洗浄し、以後の実験で用いた。
【実施例２】
【０１１９】
実施例２：ヒト遺伝子組み換え全長ＦＶＩＩＩ、Ｂドメイン欠失ヒト遺伝子組み換えＦＶＩＩＩをフルオレセインと接合
遺伝子組み換えヒト全長ＦＶＩＩＩ（１００００  ＩＵ、Ｋｏｇｅｎａｔｅ，  Ｂａｙｅｒ）、遺伝子組み換えヒトＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ  （ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ，  １０００  ＩＵ，  Ｒｅｆａｃｔｏ（登録商標），  Ｗｙｅｔｈ）を水中で安定化させて、５ｍＭのＣａＣｌ２を含む重炭酸緩衝液（ｐＨ  ９．２）で透析にかけ、その後、４℃の温度で７−８時間フルオレセイン５−イソチオシアネート（アイソマーＩ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓａｉｎｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，  Ｆｒａｎｃｅ）と結合させた。
ラベルされたＦＶＩＩＩをさらにＲＰＭ１  １６４０培養液で透析にかけて、結合していないＦＩＴＣを取り除いた。
ＦＶＩＩＩ−ＦＩＴＣをウシ血清アルブミンを基準に用いてブラッドフォード・アッセイで定量した。
【実施例３】
【０１２０】
実施例３：ＦＶＩＩＩエンドサイトーシスに関与したレセプタの性質
手順
ＤＣを５ｍＭ  ＥＤＴＡ、マンナン（１ｍｇ／ｍｌ）あるいはガラクトース（１ｍｇ／ｍｌ）のいずれかを用いて３７℃で３０分間培養してから、ＦＶＩＩＩ−ＦＩＴＣ  （４０μｇ／ｍｌ）を２時間かけて添加した。
比較対象として４℃でのエンドサイトーシスを用いた（図示せず）。
結果
図１Ａ：
ＥＤＴＡの場合は、ＦＶＩＩＩ−ＦＩＴＣのエンドサイトーシスは９２＋１６．５  ％（Ｐ＜０．０１）まで抑制された。
このデータは樹状細胞によるＦＶＩＩＩエンドサイトーシスにおける二価イオンに依存したレセプタの役割を示唆している。
マンナン感作性摂取のためのモデル競合性リガンドであるポリカーボネート・マンナンはＦＶＩＩＩ−ＦＩＴＣの摂取を６０＋１９  ％低下させ（ｐ＜０．０１）、ガラクトース競合性リガンドであるガラクトースにおいては有意な効果は認められなかった。
図１Ｂ：
その内部化がレセプタ依存マクロピノサイトーシスによってだけ進行するマンナン感作性ＣＬＲに対する典型的なリガンドであるマンナンの特異性をＦＩＴＣでラベルしたデキストラン、特にＣＤ２０６、及びルシフェール・イエロウ（ＬＹ）を用いて実験的な設定で確認した。
デキストランの内部化はマンナンの存在下では８９＋９．３％阻止されたが、ＬＹの存在では影響は認められなかった。
結論
これらの結果は、マンノース感作性レセプタが樹状細胞によるＦＶＩＩＩのエンドサイトーシスのかなりの部分を媒介していることを示唆している。
【実施例４】
【０１２１】
実施例４：樹状細胞によるＦＶＩＩＩのマンノース感作性摂取はＦＶＩＩＩ固有ＣＤ４＋
Ｔ細胞に対するＦＶＩＩＩ誘導ペプチドの提示をもたらす
手順
図２Ａ：
ＭＨＣ  ＩＩ適合ドナーから発生された樹状細胞を培養液だけ、あるいはマンナン（１ｍｇ／ｍｌ）あるいは抗ＣＤ２０６  ＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で培養して、その後、いろいろな量の全長ＦＶＩＩＩ（Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標））（５．５６，  ２，７８あるいは１．３９μｇ／ｍｌ）あるいは２０Ｕ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−２の存在下で２０時間３７℃の温度下でＦＶＩＩＩ固有Ｔ細胞クローンＤ９Ｅ９（５０００細胞／ウェル）で培養した。
Ｔ細胞の活性化を培養上澄み液内でのＩＦＮガンマの放出によって評価した。
図２Ｂ：
ＭＨＣ−ＩＩ適合ドナーから発生された樹上細胞をマンナン（１ｍｇ／ｍｌ）あるいは抗ＣＤ２０６  ＩｇＧ  （１０μｇ／ｍｌ）で予備培養してから、ＦＶＩＩＩ（５．５６μｇ／ｍｌ）あるいはペプチドＩ２１４４−Ｔ２１６１  （２μｇ／ｍｌ）及びＤ９Ｅ９を加えた。各処理ごとのＩＦＮ−ガンマ生成をそれぞれの実験で得られた最大値を基準として示した（＊：Ｐ＜０．０００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙテストで評価）。
図１Ｃ：
ヒトＦＶＩＩＩ固有ＨＬＡ適合Ｂ細胞株ＬＥ２Ｅ９，  ＢＯＣ２Ｃ１１，あるいは樹状細胞を単独あるいはマンナン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在下で培養してから、全長ＦＶＩＩＩ（Ｋｏｇｎａｔｅ（登録商標））（１０μｇ／ｍｌ）とＤ９Ｅ９を用いて培養した。
結果
全体として、データは樹状細胞によるマンナン感作性エンドサイトーシスの阻止によって得られた結果であるＤ９Ｅ９活性化に対するマンナンの効果を裏付けている。
【実施例５】
【０１２２】
実施例５：Ｄドメイン外に存在している露出マンノース残基がＴ細胞活性化につながる樹状細胞によるＦＶＩＩＩエンドサイトーシスにおいて重要な役割を演じている。
手順
図３Ａ：
樹状細胞をマンナン（１、５、１００及び１０００μｇ／ｍｌ）で予備培養してから、全長ＦＶＩＩＩ―ＦＩＴＣ（Ｋｏｇｎａｔｅ（登録商標））（４０μｇ／ｍｌ、１４３  ｎＭ、黒丸）あるいはＢＤＤ―ＦＩＴＩ（２４．３１μｇ／ｍｌ、１４３  ｎＭ、白丸）、あるいはデキストラン−ＦＩＴＣ（５０μｇ／ｍｌ）を追加した。
抗原の取り込みはフロー・サイトメトリーで分析した。抑止率（パーセント）はマンナンなしの場合を基準としてそれぞれの条件について計算した。
図３Ｂ：
天然あるいはＥｎｄｏＦ１で処理したＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（３．７μｇ／ｍｌ）を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ニトロセルロース膜上に移した。
移された蛋白質をＰｒｏｔｏｇｏｌｄ（登録商標）を用い明らかにするか、あるいは続いて、アルカリ性フォスファターゼ接合抗ヒトＩｇＧを用いて１０μｇ／ｍｌＣＴＬＤ４−７で培養した。
軽鎖（ＬＣｈ）と重鎖（ＨＣｈ）はＬＣｈ及びＨｃｈ固有モノクローナル抗ＦＶＩＩＩ  ＩｇＧ（図示せず）でブロッティングすることで確認した。
図３Ｃ：
ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのＥｎｄｏＦ１処理によるＴ細胞の活性化の低下。結果は３つの独立した実験のうちの最も代表的なものを示す。
結果
データは、Ｂドメイン外に位置しているマンノース終端グリカン類がＦＶＩＩＩの取り組みに関与していることを裏付けている。
図３Ｂ：
ＥｎｄｏＦ１処理によるオリゴマンノース構造の除去はＢＤＤ−ＦＶＩＩＩのミグレーション・プロファイルの変化とＣＴＬＤ４−７−Ｆｃによる認識の喪失によって示された。
図３Ｃ：
ＥｎｄｏＦ１で処理したＢＤＤ−ＦＶＩＩＩはＤ９Ｅ９を活性化したが、その程度は天然のＢＤＤ−ＦＶＩＩＩで培養したものと比較すると低かった（樹状細胞の場合Ｐ＜０．０００１）。
ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの脱マンノシル化はＴ細胞の活性化の低下において、マンナンを用いての樹状細胞上でのマンノース・レセプタの飽和ほど効果的ではなかった。
Ｄ９Ｅ９の活性化に関するＥｎｄｏＦ１で処理したＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの残留能力は、マンノース感作性レセプタに対する親和性を示すＦＶＩＩＩ上に残っているＮアセチル−グルコサミン残基の存在にその理由を求めることが可能であろう。
【実施例６】
【０１２３】
実施例６：修飾ＦＶＩＩＩ軽鎖Ａｓｎ２１１８ＡｌａのＴ細胞活性化
手順
Ｅ．  Ｓａｅｎｋｏ博士（メリーランド大学、Ｍａｒｙｌａｎｄ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ．  ＵＳＡ）から提供を受けたＦＶＩＩＩ（ｗｔＬＣｈ）の精製血漿誘導軽鎖をＥｎｄｏ−Ｆ１を用い、あるいは用いないで処理した。
ｗｔＬＣｈ、マンナン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在下でのｗｌＬＣｈ及びＥｎｄｏＦ１で処理したｗｔＬＣｈを樹状細胞（図４）あるいはＢＯ２Ｃ１１（図４Ｂ）に加えて、Ｄ９Ｅ９細胞と共に２０時間共培養した。
Ｄ９Ｅ９の活性化はＥＬＩＳＡで培養上澄液内でＩＦＮガンマを測定することで評価した。
図ＣとＤはＬＣｈ−ＦＶＩＩＩ（Ａｓｎ２１１８Ａｌａ−ＬＣｈ−ＦＶＩＩＩ）のサイト指向突然変異形成によるＤ９Ｅ９の活性化の喪失を示している。
ＢＯ２Ｃ１１Ｂ細胞クローンと単球誘導樹状細胞を野生タイプＬＣｈの存在下（図４Ｃ）あるいは突然変異Ａｓｎ２１１８Ａｌａ―ＬＣｈ―ＦＶＩＩＩの存在下（図４Ｃ）でＤ９Ｅ９を用いて培養した。
Ａｌａ残基でＡｓｎ２１１８を置換するとＮマンノシル化のためのサイトが取り除かれる。
Ｄ９Ｅ９の活性化は培養上澄液内でのＩｇＮ
ガンマを２０時間測定することで評価した。
結論
図４Ａと４Ｂ：
最初に、我々はｗｔＬＣｈが単球誘導樹状細胞にマンノース感作性状態で入り込み、ＦＶＩＩＩ固有Ｄ９Ｅ９Ｔ細胞クローンを活性化することを検証した。
樹状細胞によるＤ９Ｅ９の活性化レベルは、ｗｔＬＣｈをマンナンで培養した場合及びＥｎｄｏ−Ｆ１で処理したｗｔＬＣｈの場合は未処理のｗｔＬＣｈの場合（図４Ａ）の場合と比較してかなり低かった。
対照的に、ＦＶＩＩＩ固有Ｂ細胞レセプタを通じてＦＶＩＩＩを細胞内に取り込むＢＯ２Ｃ１１  Ｂ細胞株によるＤ９Ｅ９の活性化は、マンナンの存在下でのｗｔＬＣｈの培養あるいはＥｎｄｏ−Ｆ１処理によっても変化が認められなかった（図４Ｂ）。
これらのデータは完全なＦＶＩＩＩによる培養（図３）を連想させ、単球誘導樹状細胞内へのＦＶＩＩＩ軽鎖の進入がマンノシル化されたグリカンに依存していることを示している。
図４Ｃと４Ｄ：
ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインにおける立体配座に対して固有を示すモノクローナル・ヒトＩｇＧ（つまり、ＢＯ２Ｃ１１細胞クローンによってつくりだされたＩｆＧ）を用いたＥＬＩＳＡで、Ａｓｎ２１１８Ａｌａ−ＬＣｈの適切な畳み込みが確認された。
ＢＯ２Ｃ１１及び樹状細胞の両方を提示すると、ｗｔＬＣｈはＤ９Ｅ９を活性化させた。
対照的に、ＢＯ２Ｃ１１の提示によってＡｓｎ２１１８Ａｌａ−ＬＣｈ−ＦＶＩＩＩによるＤ９Ｅ９の活性化は認められたが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として樹状細胞が用いられた場合は、それは認められなかった。
【実施例７】
【０１２４】
実施例７：遺伝子組み換えＦＶＩＩＩ変種のクローニング及び生成
ステップ１：種々のＦＶＩＩＩ変種のクローニング
この実施例では、（ＡＴＣＣ、クローンｐＳＰ６４−ＦＶＩＩＩから）ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードするｃＤＮＡ、遺伝子組み換え全長ＦＶＩＩＩ（Ｋｏｇｎｅｒａｔｅ，  Ｂａｙｅｒ）あるいは修正ＦＶＩＩＩが『ＦＶＩＩＩ』として用いられている。
ＦＶＩＩＩはＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）  ＴＯＰＯ（登録商標）を用いてサブクローニング・ベクター（ベクターｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標））でサブクローニングされた。
適切なプライマーを用いてサイト指向突然変異形成が行われ、４つの異なったＦＶＩＩＩ変種ｃＤＮＡを発生させた。
−  野生タイプの配列
−  単一重鎖変種：コドンＡＣＣ（Ａｓｎ２３９）−＞コドンＧＣＣ（Ａｌａ２３９）
−  単一重鎖変種：コドンＡＴＴ（Ａｓｎ２１１８）−＞コドンＧＣＴ（Ａｌａ２１１８）
−  二重重鎖：Ａｓｎ２３９Ａｓｎ２１１８−＞Ａｌａ２３９Ａｌａ２１１８
この挿入物を真核細胞株内で蛋白質を発現させるために，精製してｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｂａｄ，  ＣＡ，，  ＵＳＡ）で強制的末端結紮させるか、あるいはｐＬＩＶＥベクター（Ｍｉｒｕｓ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ  ＵＳＡ）を用いてｉｎ  ｖｉｖｏでの流体力学的注入を行った。
ステップ２：  哺乳動物細胞株の一過性トランスフェクション
種々のｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ＦＶＩＩＩ変種を種々の真核細胞株：つまり、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベイビー・ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、及びＨＫＢ１１（腎臓およびＢ細胞のハイブリッド；ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１２５６８）にＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）技術（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてトランスフェトさせた。
通常、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）技術は細胞の７０−１００％への安定したトランスフェクションを可能にしてくれる。
ＨＫＢ１１細胞は特に遺伝子組み換えＦＶＩＩＩを生成するために開発されたものである。
サンドイッチＥＬＩＳＡ、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））とウェスターン・ブロッティングを用いてＦＶＩＩＩが上澄液内で検出された。
そのＦＶＩＩＩレベルを市販の遺伝子組み換えＦＶＩＩＩ標準サンプル（ｒＦＶＩＩＩ、Ｋｏｇｅｒａｔｅ（登録商標）、ＢａｙｅｒあるいはＢＤＤ  ＢｒＦＶＩＩＩ  Ｒｅｆａｃｔｏ（登録商標）  Ｗｙｅｔｈ）と比較した。
一過性のトランスフェクションは、ＦＶＩＩＩの変種がそれらの細胞でうつくり出されたかどうかを示すものである。
ステップ３：  種々のＦＶＩＩＩ構成物のｉｎ  ｖｉｖｏでのトランスフェクション
ｐＬＩＶＥベクターにクローンした種々のＦＶＩＩＩ構成物をＦＶＩＩＩ欠損マウスに注入した。
各プラスミド１００μｇを２ｍｌづつ数秒間かけて静脈注射した。
『流体力学的注入』といわれるこの方法は、過去において、ウィルブランド因子（ＶＷＦ）をＶＷＦ欠損マウスで高レベルで発現させる実績を有している（２５）。
これらの実験で、ＶＷＦの発現を野生タイプの血漿で見られるものより高いレベルで最大３週間維持した。
これらの実験で、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、及びウェスターン・ブロッティングを用いてＦＶＩＩＩ発現の反応速度についての検証が３週間にわたって行われた。
ステップ４：  哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションと及び小規模生産
安定的なトランスフェクションはステップ２で述べたように行われる。
ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＲを用いての候補細胞のトランスフェクションに続いて、細胞を限定希釈でクローンする。
ＦＶＩＩＩを生成する細胞を増幅して、その細胞株を−８０℃で凍結保存する。
小規模生産は一般的な方法を用いてＤＭＥＭ  １：１−Ｆ１２で行う。
つまり、細胞を３−４日培養して準密集状態にしてから、上澄液を回収する。
上澄液は、マウス及びヒト・モノクローナル抗ＦＶＩＩＩＩｇＧを用いて、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（ＢｉｃｏｒｅＲ）、及びウェスターン・ブロッティングによってＦＶＩＩＩ変種の存在についてテストする。ＦＶＩＩＩの量は、市販のｒＦＶＩＩＩ（Ｋｏｇｅｎｒａｔｅ，  ＢａｙｅｒあるいはＲｅｆａｃｔｏ  Ｗｙｅｔｈ）を基準として用いて、細胞１個あたり１日毎のＦＶＩＩＩの産出量を計算する。
ステップ５：  ｒＦＶＩＩＩ変種の分泌／創出量を増大させるための方法（案）
哺乳動物細胞によるｒＦＶＩＩＩ産出のレベルは以下のような種々の要因によって制限されている。
例えば
１）ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインと免疫結合蛋白質（ＢＰ）などの小胞体（ＥＲ）との相互作用。
この相互作用はＦＶＩＩＩの分泌を抑止する。
２）ＦＶＩＩＩ分子上でのマンノシル化された糖のＬＭＡＮＩ（ＥＲＧＩＣ５３）への結合がＧｏｌｇｉ装置からＥＲへの適切な輸送に必要であり、これがＬＭＡＮＩ及びＦＶＩＩＩの輸送を妨げないように、すべてのＮ結合グリコシル化を必要としていること
、などである。
逆に、ＦＶＩＩＩの分泌／産出量は以下のような分子生物工学によって増大することが可能である。
１）Ｎグリコシル化のための６つのサイトを発現するＢドメインの先端を切り取った部分を付加すると、野生タイプ・ドメインを欠失したｒＦＶＩＩＩと比較してｒＦＶＩＩＩの産出を数倍増大させる。
２）Ｐｈｅ３０９をＳｅｒ残基に導入すると、ＢｉＰへの結合を減少させ、ＦＶＩＩＩの分泌を増大させる。
この点で、サイト指向突然変異形成によるＮ結合グリコシル化のためのサイトの消滅はＦＶＩＩＩ生成の減少をもたらす可能性がある。
実際、野生タイプＢドメイン欠失ｃＤＮＡはグリコシル化のための３つのサイトを有している。
サイト指向突然変異形成の後は、１つのサイト、つまりＡ３上のＡｓｎ１８１０だけが残ると予想され、これでは前記分子の適切な分泌に十分ではないと考えられる。
突然変異されたｅＦＶＩＩＩ変種によるＦＶＩＩＩの産出量が低いのであれば、その構成物にＦＶＩＩＩのＢドメインの最初の２２６個のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ配列を導入することが可能であろう。
この配列はＮ結合グリコシル化のための６つのサイトを有している。
この目的のためにヒト肝臓抽出物からすでにｍＲＮＡが抽出されており、さらにヒトｃＤＮＡがつくられている（Ｉｎｓｔｕｔｉｔ  Ｃｏｃｈｉｎ，  ＰａｒｉｓのＣａｖａｒｄ博士からの寄贈）。
ＢドメインをコードするＤＮＡは適当なプライマを用いて増幅することができ、上記４つのＦＶＩＩＩ構成物の重鎖と軽鎖の間に挿入される。
そしてそのＢドメイン含有構成物をｐＣＤＮＡ３及びｐＬＩＶＥベクターにクローンする。
細胞がトランスフェクトされて、その発現を上に述べたように調べる。
【実施例８】
【０１２５】
実施例８：修飾ＦＶＩＩＩの中規模生成
血清で補強した基礎培地でローラー・ボトルを用いて、実施例７のＦＶＩＩＩ（野生タイプ／２３９ｍｕｔ／２１１８ｍｕｔ／２３９ｍｕｔ２１１８ｍｕｔ）を産出した。
ローラー・ボトル内で十分な量の素中のＦＶＩＩＩが産出されたので、親和性クロマトグラフィを用いて精製した。
上に述べた研究のすべてを行うのに必要な量はそれぞれのＦＶＩＩＩ変種毎にほぼ２ｍｇ（１０，０００ＵＩ）であると積算された。
精製プロセスでの生産量は２５％程度であるので、各ＦＶＩＩＩ変種に対して８ｍｇ（４０，０００ＵＩ）を産出することが必要であろう。
各クローンによるＦＶＩＩＩの産出をそれぞれのクローンの生産性に応じて適合化させた。
高いレベルで産出するクローンの場合（１日細胞１０６個あたり５ＵＩ以上）、産出はローラー・ボトルを用いてバッチ方式で行われる。
低いレベルで産出するクローンの場合（１日細胞１０６個あたり５ＵＩ以下）、産出はローラー・ボトルを用いて反復バッチで行われる。
【実施例９】
【０１２６】
実施例９：修飾ＦＶＩＩＩの構造的／機能的一体性
ステップ１．  遺伝子組み換えＦＶＩＩＩ変種のｉｎ  ｖｉｖｏでのトランスフェクション
実施例７あるいは８での種々のＦＶＩＩＩ変種をｐＬＩＶＥベクター内にクローンして、流体力学的注入後にＦＶＩＩＩ欠失マウス内で発現させた。
マウス血漿内のＦＶＩＩＩのレベルをＥＬＩＳＡ及び機能的凝固アッセイで測定した。尾の切り取り、出血時間の測定、血液ロスの測定に続いて、凝固の是正について調べた。
ステップ２．  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの凝固促進活性
４つの遺伝子組み換えＦＶＩＩＩ変種（実施例７）の凝固促進活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏで調べた。
ＦＶＩＩＩを希釈したものをヒトＦＶＩＩＩ欠失血漿で培養して、機能的凝固アッセイ（Ｆｉｂｒｉｎ  Ｔｉｍｅｒ  ＣＡ５４０，  Ｄａｔｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ）で測定した。
それとは別に、ＦＶＩＩＩ活性をクロマトグラフィ手法で評価した。
この場合、ＦＶＩＩＩは活性化された因子ＩＸ及び因子Ｘとリン脂質と混合した。
そして、活性化された因子Ｘの発生を活性化因子Ｘのクロマトグラフィ合成基質を用いて測定した。
種々のＦＶＩＩＩ変種の比活性を算出した。
Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（Ｒｅｆａｃｔｏ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）が好ましく、上記のアッセイで用いられた。
ＦＸａ発生の結果は基準から得られる値をテスト・サンプルｔ１／２  （半最大応答）値で割った値で示した。
ステップ３．  ＦＶＩＩＩとモノクローナル抗体、ウィルブランド因子、及びリン脂質との相互作用
ＦＶＩＩＩとモノクローナル抗体、ウィルブランド因子、及びリン脂質との相互作用について調べた。
ステップ４．  翻訳後の修正を分析するための方法
a)  ＦＶＩＩＩの脱塩、濃縮、及び活性化
ＦＶＩＩＩサンプルの濃縮及び脱塩は一連のさらなる分析の妨げになる可能性のある塩類、単糖類、及び小さな分子などを一掃するために必要である。
脱塩は逆相（ＲＰ）Ｕｐｔｉｓｈｐｅｒｅ  １０ＷＣ−２５ＱＳカラム（Ｉｎｔｅｒｃｃｈｉｍ）を備えたＡＫＴＡ純化システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を５％ＭｅＣＨ＋ＴＦＡ  ０．１％で均衡化させて行う。
溶出は、５−９０％勾配の５％ＭｅＣＨ＋ＴＦＡ  ０．１％を用いて５ＣＶ内で行う。
脱塩された生成物は回収され、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ真空蒸発装置内で乾燥させる。
精製されたＦＶＩＩＩサンプルはトロンビン処理で活性化もされる。
得られたＦＶＩＩＩ鎖は、次に、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｕｐｔｉｓｐｈｅｒｅ  ＵＰＷＯＤＤ＄２５ＱＫ）を用い、正常なＭｅＣＨ＋ＴＦＡ勾配で分離が可能であろう。
b)  ＦＶＩＩＩの酵素による脱グリコシル化
ｉ）  ＰＮＧａｓｅ  Ｆ脱グリコシル化
ＰＮＧａｓｅ  ＦはＮグリカン構造に特異性を示す酵素である。
脱塩及び乾燥後に、ＦＶＩＩＩを酵素緩衝液内に還元剤を用いて、あるいはそれを用いないで懸濁させ、室温で１５分間培養させる。
そして。酵素を加えて（Ｅ／Ｓ  ５ｍＩＵ／２００  μｇ）、３７℃で１８時間培養することによって、脱グリコシル化を行う。
ｉｉ）  Ｅｎｄｏ−Ｈ脱グリコシル化
Ｅｎｄｏ  Ｈはオリゴマンノース及びハイブリッド・タイプのＮグリカン構造に特異性を示す酵素である。
脱塩及び乾燥後に、ＦＶＩＩＩを酵素緩衝液内に還元剤を用いて、あるいはそれを用いないで懸濁させ、９５℃で５分間加熱する。
氷上で冷却してから、酵素を加える（Ｅ／Ｓ：  ０．２ｍＩＵ／μｇプロット）。脱グリコシル化反応は３７℃の音頭で２時間行われる。
ｉｉｉ）  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ＦＶＩＩＩのグリコシル化は、一部においては、ＰＮＧａｓｅ  ＦあるいはＥｎｄｏ  Ｈを用いた酵素による脱グリコシル化の前後に得られた生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行うことを特徴としている。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＮＯＶＥＸシステム（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で行われる。サンプルを非還元性条件下と還元性条件下で４−１２  ％  ゲル（Ｎｏｖｅｘ）に付加する。
２００Ｖで５０分間ミグレーションを行った後、蛋白質を銀染色する。
ゲル（Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｂｉｏｒａｄ）のデジタル走査とインテグレーションの後にいろいろな蛋白質帯域の見かけ分子量を基準蛋白質と比較することによって測定する。
ｉｖ）  レクチン・ブロット分析
ＦＶＩＩＩを含むグリコシル化（複合タイプ、高マンノース・タイプなど）ペプチド及びポリペプチドの検出は、レクチン・ブロット分析を用いて行われる（Ｆｕｋｕｄａ  ＆  Ｋｏｂａｔａ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａ  Ｐｒａｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）。
上に述べたようにＳＤＳ―ＰＡＧＥによって１０μｇのＦＶＩＩＩが分離され、メーカー（Ｎｏｖｅｘ）の指示に基づいてニトロセルロースあるいはナイロン膜上に移された。
そして、ブロットした後、その膜をＢＳＡでブロックして、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ，  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０５％）で洗浄して、それからペロキシダーゼ（Ｅｙ  ｌａｂｓ）でラベルした適切なレクチン（つまり、ＧＮＡｍＤＧＡ、ＬｃＨ、ＭＮＡ―Ｍ、ＶＦＡ、ＰＥＡ、ＰＭＡ、ＡＭＡ．．．）を用いて、４℃で２時間培養した。
ＰＢＳＴで何回か洗浄した後、比色法あるいは化学蛍光法でぺロキシダーゼを露出させ、得られたブロット画像をスキャナーあるいはＣＣＤカメラで撮影した。
画像分析と定量は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  （Ｂｉｏｒａｄ）を用いて分析した。
ステップ５．  ＦＶＩＩＩ一次構造解析の方法
a)  ＦＶＩＩＩマッピングで一次構造解析ができる。
この蛋白質配列は独特のものであるので、特殊な酵素（トリプシンあるいはエンドプロテアーゼＡｓｎ−Ｎ）で消化して発生されたペプチドはその発現対象の蛋白質に独特の特徴を示す。
脱塩乾燥後、ＦＶＩＩＩを変性させ（ＳＭ  Ｕｒｅａ）、還元し（ＤＴＴ  ２０モル／ＳＨ１モルあたり、そしてアルキル化させた（ヨードアセトアミド４０モル／ＳＨ１モルあたり）。
次にＦＶＩＩＩをトリプシン（Ｅ／Ｓ：１／２５  ｍ／ｎ）で消化させたところ、Ａｒｇ（Ｒ）及びＬｙｓ  （Ｋ）残基の後の蛋白質が切断された。
Ａｓｐ  （Ｄ）残基の前でその蛋白質を切断するＡｓｐ−Ｎ（Ｅ／Ｓ：１／１００  ｍ／ｎ）も用いた。
蛋白質消化後に、発生されたペプチドは分析のためにＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに直接注入するか、あるいはＣ１８  ３００Ａカラム上で増大アセトニトリル勾配を用いて逆相クロマトグラフィによって分離した。
そして画分を回収して、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃを用いて乾燥させてから、Ｅｄｍａｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いてさらに分析した。
b)  Ｅｄｍａｎ  配列決定
ＦＶＩＩＩのＮ末端Ｅｄｍａｎ配列決定をマイクロシーケンサー（Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９１  ＨＴ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて結合、切断、及び変換の３段階手順で行った。
そして、逆相クロマトグラフィでアミノ酸を分離した。
Ｎ末端残基の分析と同定をＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｐｒｏ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入手した標準アミノ酸を用いて行い、ＦＶＩＩＩの理論配列との比較を行い、例えばアミノ酸置換の確認を行った。
ｃ）  質量分光分析
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  （ＴＯＦ）
飛行質量分析のマトリックス支援レーザー脱離／イオン化時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）は分子量の非常に正確な測定を可能にしてくれる技術である。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳはペプチド、蛋白質、及びグリカンの分析を可能にするイオン化法である。
発現対象のペプチド、蛋白質及びグリカン（ＦＶＩＩＩ、そのフラグメント、あるいはグリカン）をレーザーの波長で吸収するマトリックスに混合する。
最も一般的に用いられるマトリックスはペプチドの分析に対してはａ−シアノ−４−水酸化桂皮酸（ＨＣＣＡ）、蛋白質に対してはシナピン酸（ＳＡ）、そして、（ＤＨＢ）オリゴサッカライドに対しては２−５−ジヒドロベンゾイック酸である。
各ペプチドの同定は質量分光分析でその質量を測定し、それを理論的な蛋白質配列から推定した理論質領値と比較することで行うことができる。
ペプチドの配列決定は任意のペプチドに対するこれらの条件下で得られたフラグメント・イオンに基づいてＭＳ／ＭＳ実験（タンデム質量分光分析、ＴＯＦ／ＴＯＦ）によって行うことができる。
オリゴサッカライドの同定と特徴づけについても、同様に戦略を用いることができる。
Ｂｒｕｃｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ装置を用いることができる。
電気スプレイ・イオン化質量分光分析と組み合わせた液体クロマトグラフィ（ＬＣ−ＥＳＩＭＳ）
ＭＡＬＤＩとは対照的に、電気スプレイ・イオン化（ＥＳＩ）はマトリックスの使用を必要としない。
ＥＳＩでは、サンプル溶液が高電圧下に置かれた毛管内に導入される。
管の出口に強力な電磁場をかけると、帯電した液滴のスプレイが形成され、質量分光分析装置の経路である電磁場と圧力勾配を横断する。
ＥＳＩＭＳによる分析は調査対象のペプチドのクロマトグラフィによる分離後に実行することができ、ペプチド・マップも得られる。
ＦＶＩＩＩの場合、ペプチドの分離はアセトニトリル勾配を用いてＵｐｔｉｓｐｈｅｒｅ  ＵＰ４ＷＯＤ２５ＱＫ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）上で行うことができる。
質量分光分析による検出はＭＳ及びＭＳ／ＭＳデータの回収を可能にしてくれるＱｑ−ＴＯＦハイブリッド質量分光分析計（４極−飛行時間、Ｑｓａｔｒ−ｘｌ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行う。
従って、アミノ酸配列が得られる。
ｄ）  ＨＰＣＥ−ＬＩＦオリゴサカッカライド・マッピング
アスパラギンと結合した種々のオリゴサッカライド構造あるいは『Ｎ結合構造』の特徴づけと定量はＨＰＣＥ−ＬＩＦで行われる。
ＰＮＧａｓｅＦ処理によってＦＶＩＩＩから糖が放出され、そして、氷冷エタノールでの蛋白質沈析によって単離される。
これらのサンプルをエグゾグリコシダーゼ（シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、ヘックスナカーゼ）で処理して、単離された各構造の定量と特徴づけが出来るようにする。
用いられたすべてのグリコシダーゼはＰｒｏｚｙｍｅ社から入手されたものである。
この段階で、二回目のエタノール沈析を行う。
得られたグリカンをフルオロフォル（ＡＰＴＳ）でラベルして、両方の質量及び電荷に基づいて分析する。
２つの基準（グルコース・ホモポリマー、オリゴサッカライド）を用いると、これらの構造の同定が可能になる。
Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｎ−ＣＨＯ被覆毛管（寸法：５０ｃｍ  ｘ  ５０μｍ  ＩＤ）を用いて毛管電気泳動（ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ  ＰＡ８００，  Ｂｅｃｈｍａｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）を行う。
実験条件は以下の通り。
分離緩衝体：ゲル・バッファＮ−Ｂｅｃｋｍａｎカウンター；ミグレーション：２０℃で２５ＫＶ、２０分、及びレーザー検出：λｅｘ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ．
ｇ）  ＮＰ−ＨＰＬＣオリゴサッカライド・マッピング
Ｎ結合構造として知られているアスパラギンに結合したいろいろなオリゴサッカライド構造の同定と定量も正常相高性能液体クロマトグラフィ（ＮＰ−ＨＰＬＣ）によって行うことができる。
これらのＮグリカンは特殊な酵素（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）を用いて放出され、エタノール沈析で単離する。
得られたグリカンを２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）フルオロフォルでラベルする。
このラベルされたグリカンはＧｏｌｄシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ）に接続されたＡｍｉｄｅ−８０カラム（Ｔｏｓｏｈａａｓ）を用いてＮＰ−ＨＰＬＣで分離する。
サンプル注入の前に、カラムを８０％アセトニトリル緩衝液で均衡させる。
オリゴサッカライドを５０ｍギ塩酸アンモニウム（ｐＨ：  ４．４５）の増大勾配で溶出させる。
検出はλｅｘ：３３０ｎｍ及びλｅｍ：４２０ｎｍで蛍光発光を用いて行う。
【実施例１０】
【０１２７】
実施例１０：  ＦＶＩＩＩ欠損マウスでのＡｎｓ２１１８ＬＣｈの免疫源性
手順
ヒトＦＶＩＩＩの精製血漿誘導軽鎖（ｗｔＬＣｈ）はＥ  Ｓａｅｎｃｏ博士  （Ｕｎｉｖｅｖｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ，，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）から提供されたものである。
ＦＶＩＩＩの突然変異させた軽鎖（Ａｓｎ２１１８Ａｌａ  ＬＣｈ）が発生生成された。ｗｔＬＣｈと突然変異させた軽鎖（０．２μｇ蛋白質を２００μＬ  ＰＢＳに希釈したもの）を静脈経由でＦＶＩＩＩ欠失マウス（米国、ペンシルバニア大学のＫａｒａｚｉａｎ博士から提供）を一週間毎に４回注射した。
第４週目から１週間経った時点で、マウスを出血させ、ＦＶＩＩＩ特異性ＥＬＩＳＡを用いて抗ＦＶＩＩＩ  ＩｇＧのレベルを調べた。
ＥＬＩＳＡ：  マウスの血清を９０倍に希釈して、ヒトＦＶＩＩＩで被覆したＥＬＩＳＡプレート（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ，  Ｂａｘｔｅｒ）内で培養した。
結合したＩｇＧをペロキシダーゼに結合したポリクローナル抗マウスＩｇＧとペロキシダーゼ基質（ＯＰＤ）を用いて露出させた。
分光計（Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｙｏｓ）を用いて４９２ｎｍでの光学密度を測定して、抗ＦＶＩＩＩ  ＩｇＧのレベルを求めた。
結果
ヒトＦＶＩＩＩの精製血漿誘導軽鎖（ｗｔＬＣｈ）を静脈経由でＦＶＩＩＩ欠失マウスに投与したところ、検出可能なレベルの抗ＦＶＩＩＩ  ＩｇＧが誘発された。
興味深いのは、ｗｔＬＣｈに対するマウスの免疫応答がこの実験で用いられた６匹のマウスで不均一な結果を示したことである。
対照的に、突然変異されたＡｓｎ２１１８Ａｌａ  ＬＣｈでマウスを措置した場合、高レベルの抗ＦＶＩＩＩ  ＩｇＧは検出できなかった。
結論
これらのデータは、特殊な免疫応答を誘発するＡｓｎ２１１８Ａｌａの能力はｗｔＬＣｈと比較してかなり低下されることを示している。
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１５．Ｓｕｂｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．．  １９８１  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １：８５４−８６４
１６．Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９８５  Ｃｅｌｌ  ４１：  ５２１−５３０
１７．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｔｐ，  １９８２  ＭＮｏ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ  ２：  １３０４−１３１９
１８．Ｂｅｒｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  Ｓ１：７０４１−７０４５
１９．Ｌｏｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９８３  Ｃｅｌｌ  ３３：８５−９３
２０．Ｐａｌｍｉｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９８３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２２：  ８０９−８１４
２１．ＤｅＮｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９８１  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ９：３７１９−３７３０
２２．Ｐｉｔｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４．  Ｂｌｏｏｄ  ８４（１２）：  ４２１４−４２２５
２３．Ｋａｕｆｍａｎ  ＲＪ  １９８９．  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２（６２４６）：  ２０７−２０８
２４．Ｔｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９８４．  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２  （５９９２）：  ３４２−３４７
２５．Ｌｅｎｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７．  Ｂｌｏｏｄ．  １０９（５）：  ２２６７−２２６８
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2010524453.tif 000026
【図１１】
2010524453.tif 000027
【配列表】
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【国際調査報告】
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2010524453.tif 000073
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