(57)【要約】本発明は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的な結合化合物およびその使用に関する。より具体的には、本発明は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒを認識し、炎症性障害および自己免疫障害におけるその活性を調節する抗体に関し、ヒト被験者においてアゴニスト活性、高い結合親和性、良好な薬物動態および低い抗原性など、１つまたは複数の望ましい特性を持つ抗体を提供するものである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび少なくとも１つの抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインまたはこれらのドメインの結合フラグメントを含み、ＶＬドメインは、配列番号１〜１８から選択される配列を持つ少なくとも一定数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、かつＶＨドメインは、配列番号１９〜３６から選択される配列を持つ少なくとも少なくとも一定数のＣＤＲを含み、一定数は１、２または３である。
2010512791.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する結合化合物であって、
配列番号１〜１８および；およびＲＡＳＫＮＩＲＳＹＬＡ（配列番号５５）からなる群から選択される少なくとも一定数のＣＤＲ配列を持つ少なくとも１つの抗体軽鎖可変領域またはその結合フラグメント、
配列番号１９〜３６からなる群から選択される少なくとも一定数のＣＤＲ配列を持つ少なくとも１つの抗体重鎖可変領域またはその結合フラグメントを含み、
該一定数は１である、
結合化合物。
【請求項２】
前記一定数が２である、請求項１に記載の結合化合物。
【請求項３】
前記一定数が３である、請求項１に記載の結合化合物。
【請求項４】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１、２および３の前記ＣＤＲ配列を含み、かつ前記重鎖可変領域が、配列番号１９、２０および２１の前記ＣＤＲ配列を含むか、あるいは、前記軽鎖可変領域が、配列番号１６、１７および１８の前記ＣＤＲ配列を含み、かつ前記重鎖可変領域が、配列番号３４、３５および３６の前記ＣＤＲ配列を含む、請求項３に記載の結合化合物。
【請求項５】
前記軽鎖可変領域が、配列番号ＲＡＳＫＮＩＲＳＹＬＡ（配列番号１５５）、２および３の前記ＣＤＲ配列を含み、かつ前記重鎖可変領域が、配列番号１９、２０および２１の前記ＣＤＲ配列を含む、請求項３に記載の結合化合物。
【請求項６】
前記軽鎖可変領域が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号４２の前記配列を含み、かつ前記重鎖可変領域が、最大１０個の保存的アミノ酸置換を持つ配列番号４８の前記配列を含むか、あるいは．前記軽鎖可変領域が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５６の前記配列を含み、かつ前記重鎖可変領域が、最大１０個の保存的アミノ酸置換を持つ配列番号５７の前記配列を含む、請求項４に記載の結合化合物。
【請求項７】
前記結合化合物が、
配列番号４２を含む軽鎖可変領域；および
配列番号４８を含む重鎖可変領域あるいは．
配列番号５６を含む軽鎖可変領域；および
配列番号５７を含む重鎖可変領域
を含む抗体である、請求項６に記載の結合化合物
【請求項８】
前記軽鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５１の前記成熟型から本質的に成り、前記重鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５３の前記成熟型から本質的に成る、請求項４に記載の結合化合物。
【請求項９】
前記軽鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号４９から本質的に成り、かつ前記重鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５０から本質的に成るか、あるいは、前記軽鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５６から本質的に成り、かつ前記重鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５７から本質的に成る、請求項４に記載の結合化合物。
【請求項１０】
ヒトのヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する結合化合物であって、該結合化合物は、配列番号４２に対する相同性が少なくとも９０％である軽鎖可変領域および配列番号４８に対する相同性が少なくとも９０％である重鎖可変領域を含むか、あるいは、該結合化合物は、配列番号４１に対する相同性が少なくとも９０％である軽鎖可変領域および配列番号４７に対する相同性が少なくとも９０％である重鎖可変領域を含む、結合化合物。
【請求項１１】
請求項３に記載の結合化合物の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の少なくとも１つをコードする単離された核酸。
【請求項１２】
前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号４２であり、かつ前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号４８であるか、あるいは、前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号４２であり、かつ前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号４８である、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
制御配列に作動可能に連結された請求項１１に記載の核酸を含む発現ベクターであって、宿主細胞に該ベクターがトランスフェクトされるとき該制御配列が該宿主細胞により認識される、発現ベクター。
【請求項１４】
前記発現ベクターが、２００６年１２月６日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０６７（ｐＡＣＤ２００ＲＶ１プラスミド中にシグナル配列を含むｈｕＤＸ１８２）を持つ、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
ポリペプチドを産生する方法であって、
前記核酸配列を発現し、それにより前記軽鎖および重鎖可変領域を含むポリペプチドを産生する条件下、請求項１５に記載の宿主細胞を培地で培養する工程；および
該宿主細胞または培地から該ポリペプチドを回収する工程
を含む、方法。
【請求項１７】
成熟抗体配列が、請求項１４に記載の発現ベクターにコードされる、抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体。
【請求項１８】
交差ブロッキングアッセイにおいてヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに対する請求項１７に記載の結合化合物の結合を交差ブロックできる、抗体。
【請求項１９】
抗体ｈｕＤＸ１８２が結合するエピトープと同じ、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒにおけるエピトープに結合する、抗体。
【請求項２０】
前記結合化合物が、ヒト化モノクローナル抗体である、請求項１に記載の結合化合物。
【請求項２１】
前記結合化合物が、完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項１に記載の結合化合物。
【請求項２２】
前記結合化合物が、アゴニストヒト化モノクローナル抗体である、請求項２１に記載の結合化合物。
【請求項２３】
ヒト被験者の処置方法であって、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合し、該ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性を活性化する結合化合物を投与の必要がある被検体に治療有効量で投与する工程を含み、該結合化合物が、抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域を含有し、該軽鎖可変領域は配列番号４２を含み、かつ該重鎖可変領域は配列番号４８を含むか、あるいは、該結合化合物が、抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域を含有し、該軽鎖可変領域が配列番号４１を含み、かつ該重鎖可変領域が配列番号４７を含む、処置方法。
【請求項２４】
前記結合化合物が、モノクローナル抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヒト被験者が、炎症性障害または自己免疫障害を持つ、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヒト被験者が、関節リウマチを持つ、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヒト被験者が、喘息を持つ、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記ヒト被験者が、ぶどう膜炎を持つ、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヒト被験者が、アレルギーを持つ、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
別の免疫抑制剤または抗炎症剤を投与することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
組成物であって、以下：
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合し、該ヒト阻害性受容体を活性化する結合化合物であって、該結合化合物が抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域を含有し、該軽鎖可変領域は配列番号４２を含み、該重鎖可変領域は配列番号４８を含む、結合化合物；および
薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤あるいは
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合し、該ヒト阻害性受容体を活性化する結合化合物であって、該結合化合物は抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域を含有し、該軽鎖可変領域は配列番号４１を含み、該重鎖可変領域は配列番号４７を含む、結合化合物、
を含む、組成物
【請求項３２】
別の免疫抑制剤または抗炎症剤をさらに含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
重鎖定常領域をさらに含み、該重鎖定常領域は、γ１、γ２、γ３またはγ４ヒト重鎖定常領域またはこれらの改変体を含む、請求項４または５に記載の結合化合物。
【請求項３４】
γ１ヒト重鎖定常領域またはその改変体を含む、請求項３３に記載の結合化合物。
【請求項３５】
軽鎖定常領域をさらに含む、該軽鎖定常領域が、κヒト軽鎖定常領域を含む、請求項４または５に記載の結合化合物。
【請求項３６】
前記結合化合物が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、Ｆ（ａｂ’）２およびダイアボディからなる群から選択される抗体フラグメントである、請求項４または５に記載の結合化合物。
【請求項３７】
前記結合化合物は、前記ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒを活性化する、請求項１〜２８のいずれかに記載の結合化合物。
【請求項３８】
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する結合化合物であって、２００７年１２月 日にＨＣ８０９．１４２３．６．ＤＸ２４８．３株として寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−   であるハイブリドーマから産生される抗体と同じＣＤＲを含む、結合化合物。
【請求項３９】
２００７年１２月 日にＨＣ８０９．１４Ｆ１２．６．ＤＸ２４８．３株として寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ− である、ハイブリドーマ。
【請求項４０】
前記結合化合物は、アゴニストモノクローナル抗体である、請求項３１〜４４のいずれかに記載の結合化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互に関連する出願への参照
本願は、２００６年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／８７６，６１８号の利益を米国特許法のもとに主張する。米国仮特許出願第６０／８７６，６１８号の開示は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、全般的にはヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的な結合化合物およびその使用に関する。より具体的には、本発明は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ（ＣＤ２００受容体）を認識し、特に炎症性障害および自己免疫障害におけるその活性を調節する抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫系は、たとえば、バクテリア、多細胞生物およびウイルスなどの感染体からばかりでなく、癌からも人を保護する働きをする。この系として、単球、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、好酸球、Ｔ細胞、Ｂ細胞および好中球など、いくつかのタイプのリンパ系および骨髄系細胞が挙げられる。これらのリンパ系および骨髄系細胞は、多くの場合、サイトカインと呼ばれるシグナル伝達タンパク質を産生する。免疫応答には、炎症、すなわち、全身または体の特定の場所における免疫細胞の蓄積が含まれる。免疫細胞は、感染体または異物に反応してサイトカインを分泌し、次いでサイトカインは、免疫細胞の増殖、発生、分化または遊走を調節する。免疫応答は、たとえば、自己免疫障害のように過剰な炎症に関与するとき、病的変化を引き起こすことがある（たとえば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照）。
【０００４】
骨髄系細胞（すなわち、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、好中球、マスト細胞および好酸球）は、慢性炎症の維持に重要な役割を果たしている（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。骨髄系細胞は、阻害性受容体における活性化の対応するセットを誘発する細胞間相互作用により制御され得るほか、分泌因子に制御される場合もある（非特許文献１０）。直接的な細胞間接触による骨髄系細胞活性の制御では、コントロールがサイトカインにより媒介される場合に比べてより局所的になる。また、ＣＤ２００−ＣＤ２００Ｒ相互作用も、骨髄系細胞に細胞間接触による制御の相互作用を与える。広く発現する糖タンパク質ＣＤ２００は、Ｔ細胞共刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６と構造的に密接に関連し、ヒト３番染色体およびマウス１６番染色体上でＣＤ８０およびＣＤ８６と遺伝的に連鎖している（非特許文献１１；非特許文献１２）。ＣＤ２００は、構造的には、典型的なＶ／Ｃ２配列において、２つのＩｇスーパーファミリー（ＩｇＳＦ：Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）ドメインを含む（非特許文献１３）。
【０００５】
ＣＤ２００Ｒは、マクロファージ、ＤＣ、好中球およびマスト細胞など、ヒトおよびマウスの骨髄系細胞の表面に発現するほか、Ｔ細胞にも発現する（非特許文献１４；非特許文献１５）。ＣＤ２００Ｒは、構造的にＣＤ２００に関係しており、同じ染色体上に位置し、その遺伝子は、遺伝子重複により進化したと考えられる（非特許文献１５）。しかしながら、ＣＤ２００Ｒは、ＣＤ２００と異なり、細胞質尾部が長く、３つの保存されたチロシン残基を含み、その１つは、ＮＰＸＹモチーフとともに含まれる（非特許文献１４；非特許文献１５）。ＣＤ２００Ｒは、リガンドまたはアゴニスト抗体との結合時に、ＮＰＸＹモチーフのチロシン上でリン酸化され、その後、アダプタータンパク質ＤｏＫ１およびＤｏｋ２に結合する。これらのアダプタータンパク質がリン酸化されると、後にＲａｓ／ＭＡＰＫ活性化回路を阻害するＳＨＩＰおよびＲａｓＧＡＰがリクルートされる（非特許文献１６）。
【０００６】
ＣＤ２００受容体（ＣＤ２００Ｒ）は現在、ラット、マウス、ヒトおよびいくつかの非ヒト霊長類など、様々な種からクローニングされている。ＣＤ２００Ｒは、ヒト３番染色体ｑ１２−１３およびマウス１６番染色体に位置し、ヒトおよびマウスのＣＤ２００Ｒはともに、かなりの程度で配列および構造が類似している（非特許文献１５）。マウスでは、ＣＤ２００Ｒ以外にも、４個の関連遺伝子が同定されている（非特許文献１５）。これらの遺伝子は、ＣＤ２００ＲＬ（ＣＤ２００Ｒ様）と呼ばれ、アダプタータンパク質ＤＡＰ１２の活性化に関係していることが明らかにされている（非特許文献１７）。これらの受容体の細胞表面での発現およびシグナル伝達には、ＤＡＰ１２が必要である。ＤＡＰ１２は、古典的な免疫チロシン活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）を含む強力な活性化アダプタータンパク質であり、したがって、マウスＣＤ２００ＲＬ遺伝子は、骨髄活性化遺伝子である。マウスマスト細胞には、これらの活性化ＣＤ２００ＲＬ受容体が発現し、受容体特異的抗体を用いれば、ＦｃξＲＩ活性化で観察される反応と同等の規模の強力な脱顆粒反応を引き起こすことができる。これらの補足的なＣＤ２００Ｒファミリーメンバー遺伝子は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインに対する配列相同性から、ＣＤ２００Ｒ様と呼ばれているが、ＣＤ２００には結合しない。現時点では、これらの新しい受容体のリガンド（単数または複数）は依然として不明である（非特許文献１８）。さらに、異系交配系のマウスによっては、ＣＤ２００Ｒと相同性が見られるＣＤ２００ＲファミリーメンバーのＣＤ２００ＲＬｅを発現するものもある（非特許文献１８）。ヒトゲノムでは、マウスＣＤ２００Ｒファミリーとは異なり、明らかにされたＣＤ２００Ｒファミリーメンバーは、ＣＤ２００ＲおよびＣＤ２００ＲＬａの２つのみである（非特許文献１５）
炎症性障害または自己免疫障害などのヒト障害の処置に使用する、抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒモノクローナル抗体などのヒト阻害性ＣＤ２００Ｒのアゴニストが求められている。そうしたアゴニストは、ヒト被験者において免疫原性が低く、有害な免疫応答がなくて反復投与が可能であることが好ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（２０００）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ
【非特許文献２】Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ａｎｄ  Ｆｅｌｄｍａｎｎ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
【非特許文献３】ｖｏｎ  Ａｎｄｒｉａｎ  ａｎｄ  Ｍａｃｋａｙ（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１０２０−１０３４
【非特許文献４】Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉａｍｏｎｄ（２００１）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４５：３４０−３５０
【非特許文献５】Ｋｉｎｎｅ，Ｒ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ（２０００）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．２：１８９−２０２
【非特許文献６】Ｋｉｅｆｅｒ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｐｒｏｇｒ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６４：１０９−１２７
【非特許文献７】Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３７−４５
【非特許文献８】Ｈａｍｉｄ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：Ｓ５−Ｓ１２
【非特許文献９】Ｌｉｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．３０：１９−３９
【非特許文献１０】Ｂａｒｃｌａｙ，Ａ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２８５−２９０
【非特許文献１１】ＭｃＣａｕｇｈａｎ，Ｇ．Ｗ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：：１３３−１３５
【非特許文献１２】Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  ９：１１４−１１８
【非特許文献１３】Ｃｌａｒｋ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ  ４：１１３−１１８
【非特許文献１４】Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２３３−２４２
【非特許文献１５】Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：３０３４−３０４６
【非特許文献１６】Ｚｈａｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：６７８６−６７９３
【非特許文献１７】Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９：：７０３
【非特許文献１８】Ｈａｔｈｅｒｌｙ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５（４）：２４６９−７４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は全般的には、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的な結合化合物およびその使用を提供する。より具体的には、本発明は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒを特異的に認識し、かつヒト被験者においてアゴニスト活性、高い結合親和性、良好な薬物動態および低い抗原性など、１つまたは複数の望ましい特性を持つ抗体を提供する。本発明はまた、疾患を処置する際の本発明の抗体の使用方法も提供する。
【０００９】
したがって、一実施形態では、本発明は、たとえば、抗体分子またはその結合フラグメントなど、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ受容体に特異的に結合し、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒを活性化する結合化合物を提供する。いくつかの実施形態では、結合化合物は、少なくとも１つの抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび少なくとも１つの抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインまたはこれらのドメインの結合フラグメントを含み、ＶＬドメインは、配列番号１〜１８から選択される配列を持つ少なくとも一定数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、かつＶＨドメインは、配列番号１９〜３６から選択される配列を持つ少なくとも少なくとも一定数のＣＤＲを含み、一定数は１、２または３である。任意の結合化合物における軽鎖および重鎖可変ドメインのＣＤＲの一定数は、同一でも異なってもよい。別の実施形態では、ＶＬドメインＣＤＲは、配列番号１、２および３から選択される。なお別の実施形態では、ＶＨドメインＣＤＲは、配列番号１９、２０および２１から選択される。別の実施形態では、ＶＬドメインＣＤＲは、ＲＡＳＫＮＩＲＳＹＬＡ（配列番号５５）、配列番号２および配列番号３から選択され、ＶＨドメインＣＤＲは、配列番号１９、２０および２１から選択される。別の実施形態では、ＶＬドメインＣＤＲは、配列番号１６、１７および１８から選択され、ＶＨドメインＣＤＲは、配列番号３４、３５および３６から選択される。さらなる実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインの配列は、それぞれ配列番号４２および４８の配列である。なおさらに別の実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインの配列は、それぞれ配列番号５６および５７の配列である（図９を参照）。好ましい実施形態では、ＣＤ２００Ｒ結合化合物は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ受容体の阻害活性を活性化する。
【００１０】
他の実施形態では、結合化合物は、少なくとも１つのＶＬドメインおよび少なくとも１つのＶＨドメインまたはこれらのドメインの結合フラグメントを含み、ＶＬドメインは、配列番号１〜１８から選択される配列を持つ１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含み、ＶＨドメインは、配列番号１９〜３６から選択される配列を持つ１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインの配列は、それぞれ配列番号４２および４８の配列である。なおさらに別の実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインの配列は、それぞれ配列番号５６および５７の配列である。別の実施形態では、結合化合物は、２００６年１２月６日にアメリカンティシューカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ＵＳＡ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−８０６７である発現ベクターがコードする抗体と同じＣＤＲを持つ。別の実施形態では、結合化合物は、２００７年１２月__日にＨＣ８０９．１４Ｆ１２．６．ＤＸ２４８．３株として寄託され、ＡＴＣＣ受託番号が__であるハイブリドーマから産生される抗体と同じＣＤＲを持つ。
【００１１】
さらなる実施形態では、結合化合物は、少なくとも１つのＶＬドメインおよび少なくとも１つのＶＨドメインまたはこれらのドメインの結合フラグメントを含み、ＶＬドメインは、配列番号３７〜４２から選択される配列を持つ１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含み、ＶＨドメインは、配列番号４３〜４８から選択される配列を持つ１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含む。
【００１２】
他の様々な実施形態では、本発明は、配列番号４２および４８の配列との配列相同性がそれぞれ少なくとも９５％、９０％．８５％、８０％、７５％または５０％であるＶＬおよびＶＨドメインを持つヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する結合化合物を提供する。他の実施形態では、本発明は、配列番号５６および５７の配列との配列相同性がそれぞれ少なくとも９５％、９０％．８５％、８０％、７５％または５０％であるＶＬおよびＶＨドメインを持つヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する結合化合物を提供する。他の実施形態では、本発明の結合化合物は、配列番号４２および４８の配列に対する保存的アミノ酸置換が、それぞれ最大０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上であるＶＬおよびＶＨドメインを含む。別の実施形態では、本発明の結合化合物は、配列番号４９および５０の配列に対する保存的アミノ酸置換が、それぞれ最大０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である軽鎖および重鎖を持つ抗体である。別の実施形態では、本発明の結合化合物は、配列番号５６および５７の配列に対する保存的アミノ酸置換が、それぞれ最大０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である軽鎖および重鎖を持つ抗体である。
【００１３】
一実施形態では、結合化合物は、抗体またはその結合フラグメント、たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、Ｆ（ａｂ’）２およびダイアボディからなる群から選択される抗体フラグメントである。一実施形態では、本発明の結合化合物は、配列番号４９の配列を持つ軽鎖および配列番号５０の配列を持つ重鎖を含む、抗体ｈｕＤＸ１８２である。別の実施形態では、結合化合物は、２００６年１２月６日にＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ＵＳＡ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−８０６７の発現ベクターから産生される成熟抗体（ｐＡＣＤ２００ＲＶ１プラスミド中にシグナル配列を含むｈｕＤＸ１８２）である。別の実施形態では、結合化合物は、２００７年１２月__日にＨＣ８０９．１４Ｆ１２．６．ＤＸ２４８．３株として寄託され、ＡＴＣＣ受託番号が__のハイブリドーマから産生される抗体と同じＣＤＲを持つ。
【００１４】
一実施形態では、本発明の結合化合物は、たとえば、ヒトγ１、γ２、γ３またはγ４重鎖定常領域またはその改変体などのヒト定常領域のような重鎖定常領域を含む。別の実施形態では、結合化合物は、たとえば、ヒトλまたはκ軽鎖領域またはその改変体などのヒト軽鎖定常領域のような軽鎖定常領域を含む。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する抗体（またはその結合フラグメント）など、本発明の結合化合物をコードする、たとえば、ＤＮＡのような単離された核酸に関する。一実施形態では、単離された核酸は、少なくとも１つの抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび少なくとも１つの抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインまたはこれらのドメインの結合フラグメントを含む結合化合物をコードし、ＶＬドメインは、配列番号１〜１８から選択される配列を持つ少なくとも一定数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、かつＶＨドメインは、配列番号１９〜３６から選択される配列を持つ少なくとも少なくとも一定数のＣＤＲを含み、一定数は１、２または３である。
【００１６】
別の実施形態では、単離された核酸は、それぞれ配列番号４２および４８の軽鎖および重鎖の可変領域配列をコードする。なお別の実施形態では、単離された核酸は、配列番号４９の配列を持つ軽鎖および配列番号５０の配列を持つ重鎖を含む、抗体ｈｕＤＸ１８２をコードする。別の実施形態では、単離された核酸は、それぞれ配列番号４１および４７の軽鎖および重鎖の可変領域配列をコードする。なお別の実施形態では、単離された核酸は、配列番号５６の配列を持つ軽鎖および配列番号５７の配列を持つ重鎖を含む、抗体ｈｕＤＸ２４８をコードする。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、単一の核酸分子に軽鎖および重鎖の両方をコードし、他の実施形態では、軽鎖および重鎖は、２個以上の別の核酸分子にコードされる。別の実施形態では、核酸は、シグナル配列をさらにコードする。一実施形態では、核酸は、配列番号５２および５４である。
【００１７】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の単離された核酸を含む発現ベクターであって、核酸が制御配列に作動可能に連結され、宿主細胞にベクターをトランスフェクトすると、宿主細胞により制御配列が認識される、発現ベクターに関する。一実施形態では、発現ベクターは、２００６年１２月６日にＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ＵＳＡ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−８０６７（ｐＡＣＤ２００ＲＶ１プラスミド中にシグナル配列を含むプラスミド中のｈｕＤＸ１８２）である。別の実施形態では、結合化合物は、２００７年１２月__日にＨＣ８０９．１４Ｆ１２．６．ＤＸ２４８．３株として寄託され、ＡＴＣＣ受託番号が__のハイブリドーマから産生される抗体と同じＣＤＲを持つ。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明の結合化合物の作製方法に関するものであって、結合化合物をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を培地中で培養することと、結合化合物を宿主細胞または培地から単離することとを含む、作製方法に関する。
【００１９】
本発明はまた、抗体ｈｕＤＸ１８２、ＤＸ１８２、ＤＸ１８５、ＤＸ１７８、ＤＸ１８４またはＤＸ２４８が結合するのと同じ、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ受容体のエピトープに結合する抗体またはその結合フラグメント、たとえば、これらの本発明の抗体のいずれかの結合を交差ブロックできる抗体などの結合化合物に関する。
【００２０】
本発明は、抗体またはその結合フラグメントなどの結合化合物に関するものであって、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的であり、かつヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性を活性化することができ、平衡解離定数（Ｋｄ）が１０００、５００、１００、５０、２０、１０、５、２ｐＭまたはそれ以下（すなわち高親和性）である、結合化合物に関する。本発明はまた、抗体またはその結合フラグメントなどの結合化合物に関するものであって、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的であり、かつマスト細胞の脱顆粒を阻害し、マスト細胞の脱顆粒アッセイにおいてそのＩＣ５０が５０００、２０００、１０００、５００ｐＭである、結合化合物に関する。
【００２１】
本発明はまた、本発明のヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ結合化合物による処置が必要なヒト被験者など、被検体の処置方法に関する。そうした被検体は、関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症、関節リウマチ、骨粗鬆症、炎症性線維症（強皮症、肺線維症および肝硬変など）、炎症性腸障害（クローン病、潰瘍性大腸炎および炎症性腸疾患など）、喘息（アレルギー性喘息など）、アレルギー、ＣＯＰＤ、多発性硬化症、乾癬、ぶどう膜炎および癌などの炎症性障害または自己免疫障害を持っていてもよい。そうした処置方法は、免疫抑制剤または抗炎症剤など１つまたは複数の追加治療薬を投与することをさらに含んでもよい。限定としてではなく例として、本明細書に記載の方法により、ＲＡ、乾癬、喘息ならびにアレルギーおよびぶどう膜炎を処置する。特に好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法により喘息およびアレルギーを処置する。
【００２２】
さらなる実施形態では、本発明は、１つまたは複数の他の治療薬と併用して治療有効量の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体または結合フラグメントを投与することを含む、処置方法を提供する。限定としてではなく例として、１つまたは複数の治療薬には、ＩＬ−２３、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＧＦ−β（たとえば、Ｖｅｌｄｈｏｅｎ（２００６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４：１７９−１８９；Ｄｏｎｇ（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（４）：３２９−３３３を参照）または組み合わせが含まれる。種々の実施形態では、抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体またはフラグメントの前、同時または後に１つまたは複数の他の治療薬を投与する。
【００２３】
本発明はまた、結合化合物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、任意に、１つまたは複数の免疫抑制剤または抗炎症剤とを含む、本発明の結合化合物の組成物および調合物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ１８２（配列番号３７）、ＤＸ１８５（配列番号３８）、ＤＸ１７８（配列番号３９）、ＤＸ１８４（配列番号４０）およびヒト化ラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体（配列番号４２）の軽鎖可変ドメインのアライメントを示す。ＤＸ２４８は、マウス抗ｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２００Ｒ（配列番号４１）である。ＣＤＲをそれぞれ示す。番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂ．９１−３２４２，５ｔｈ  Ｅｄ．による。本明細書では、これを「Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）」という。
【図２】ラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ１８２（配列番号４３）、ＤＸ１８５（配列番号４４）、ＤＸ１７８（配列番号４５）、ＤＸ１８４（配列番号４６）およびヒト化ラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体（配列番号４８）の重鎖可変ドメインのアライメントを示す。ＤＸ２４８は、マウス抗ｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２００Ｒ（配列番号４７）である。ＣＤＲを示す。番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）による。
【図３】ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（ｈｕＤＸ１８２）の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４９）を示す。
【図４】ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（ｈｕＤＸ１８２）の重鎖のアミノ酸配列（配列番号５０）を示す。
【図５Ａ】ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（ｈｕＤＸ１８２）のシグナルペプチドおよび軽鎖をコードする核酸配列（配列番号５２）を示す。
【図５Ｂ】ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（ｈｕＤＸ１８２）のシグナルペプチドおよび軽鎖をコードする核酸配列（配列番号５２）を示す。
【図６Ａ】ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（ｈｕＤＸ１８２）のシグナルペプチドおよび軽鎖をコードする核酸配列（配列番号５４）を示す
【図６Ｂ】ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（ｈｕＤＸ１８２）のシグナルペプチドおよび軽鎖をコードする核酸配列（配列番号５４）を示す
【図６Ｃ】ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（ｈｕＤＸ１８２）のシグナルペプチドおよび軽鎖をコードする核酸配列（配列番号５４）を示す。
【図７】マスト細胞の脱顆粒アッセイにおける抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ１７６、ＤＸ１７７、ＤＸ１７８、ＤＸ１８２およびＤＸ１８４の作用を示す。
【図８】マスト細胞の脱顆粒アッセイにおけるヒト化抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体（ｈｕＤＸ１８２）の作用およびｈｕＤＸ１８２の結合を示す。
【図９】ヒト化ＤＸ２４８の重（配列番号５７）および軽（配列番号５６）可変ドメインの配列を示す
【図１０】図１０Ａは、マスト細胞の脱顆粒アッセイにおけるマウス抗ｃｙｎｏＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ２４８およびＤＸ１８２の作用を示す。図１０Ｂは、マウス抗ｃｙｎｏＣＤ２００Ｒ抗体およびＤＸ１８２の結合を示す。
【図１１】ＤＸ１８２（抗ｈｕＣＤ２００Ｒ）を用いたカニクイザルの培養マスト細胞に発現するＣＤ２００Ｒを示す。末梢血由来のカニクイザルの培養マスト細胞を対照の抗体ＤＸ４９（インビボ研究のアイソタイプコントロール）、ＣＤ１１７（幹細胞因子受容体）、ＤＸ１８２（抗ｈｕＣＤ２００Ｒ）およびＤＸ８０（ＦｃｅＲＩ）で染色した。
【図１２】カニクイザルの培養マスト細胞のＦｃεＲ１が引き起こす脱顆粒をＤＸ１８２が阻害することを示す。カニクイザルの培養マスト細胞をアイソタイプコントロール抗体ＤＸ４９または抗ｈｕＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ１８２とインキュベートし、次いで、抗ＦｃεＲＩ抗体で誘発し脱顆粒を起こした。ＤＸ１８２は、ＦｃεＲＩ受容体を誘発して起こしたマスト細胞の脱顆粒を用量依存的に阻害した。
【図１３】ヒトおよび非ヒト霊長類のＣＤ２００ＲおよびＣＤ２００ＲＬａ遺伝子のアミノ酸配列アライメントを示す。菱形は、これらの受容体の細胞表面発現に重要な、細胞外ドメインにおけるシステイン残基の位置を示す。
【図１４】カニクイザルＣＤ２００ＲＬａに結合するＤＸ１８２を示す。カニクイザルＣＤ２００ＲＬａをクローニングし、マウスマスト細胞またはヒトＤａｐ１２を含むマウスＢａｆ／３細胞にトランスフェクトした。次いで、これらのトランスフェクタントをアイソタイプコントロール抗体またはＤＸ１８２（抗ｈｕＣＤ２００Ｒ）で染色した。どちらのトランスフェクタントもＤＸ１８２抗体による強い染色が認められ、ＤＸ１８２がカニクイザルＣＤ２００ＲＬａを認識できることが示された。
【図１５】ｃｙｎｏＣＤ２００ＲＬａが、Ｄａｐ１２と対を形成する単一のポリペプチド鎖であることを示す。カニクイザルＣＤ２００ＲＬａをトランスフェクトしたマウスマスト細胞を対照抗体またはＤＸ１８２で免疫沈降した（ｉｍｍｕｎｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ）。ＤＸ１８２は、これらのトランスフェクタントからカニクイザルＣＤ２００ＲＬａを免疫沈降させた。Ｄａｐ１２のウエスタンブロッティングからは、カニクイザルＣＤ２００ＲＬａがこのシグナルアダプタータンパク質と会合することが示される。
【図１６】ＤＸ１８２が、カニクイザルＣＤ２００ＲＬａを発現するマウスマスト細胞の脱顆粒を誘導することを示す。カニクイザルＣＤ２００ＲＬａをトランスフェクトしたマウスマスト細胞をＤＸ１８２とインキュベートし、マスト細胞の脱顆粒についてアッセイを行った。ＤＸ１８２は、マスト細胞の強力な脱顆粒を誘導した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
Ｉ．定義。
【００２６】
本発明を理解しやすいように、いくつかの技術用語および科学用語を以下に具体的に定義する。本明細書に使用するこれ以外のすべての技術用語および科学用語は、本明細書の他の箇所に特に定義しない限り、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解している意味を有する。
【００２７】
添付の特許請求の範囲を含め、本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」など語の単数形は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、それに対応する複数の言及を含む。
【００２８】
細胞または受容体に使用する場合、「活性化」、「刺激」および「処置」とは、文脈上あるいは明確に異なる意味に解釈すべき場合を除き、たとえば、リガンドによる細胞または受容体の活性化、刺激または処置など、同じ意味を持つ場合がある。「リガンド」は、たとえば、サイトカイン、サイトカイン改変体、アナログ、ムテインおよび抗体から得られる結合化合物など、天然および合成リガンドを包含する。「リガンド」はまた、たとえば、サイトカインのペプチド模倣体および抗体のペプチド模倣体などの小分子も包含する。「活性化」は、内部機構だけでなく外部要因または環境要因により制御される細胞の活性化をいう場合もある。たとえば、細胞、組織、器官または生体の「反応」は、たとえば、生体コンパートメント内の濃度、密度、接着もしくは遊走、遺伝子発現率または分化状態など、生化学的または生理学的性質における変化を包含し、その変化は活性化、刺激もしくは処置と、または遺伝的プログラミングなどの内部機構と相関する。
【００２９】
分子の「活性」とは、リガンドまたは受容体に対する分子の結合、触媒活性；遺伝子発現または細胞のシグナル伝達、分化もしくは成熟を刺激する能力；抗原活性、他の分子の活性の調節などを記載しても指称してもよい。分子の「活性」はまた、接着などの細胞間の相互作用の調節または維持における活性、あるいは、細胞膜または細胞骨格などの細胞構造の維持における活性をいうこともある。さらに、「活性」は、たとえば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］もしくは［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］などの比活性、生体コンパートメント内の濃度などを意味することもある。さらに、「活性」は、自然免疫系または適応免疫系の成分の調節をいうこともある。「増殖活性」は、たとえば、正常な細胞分裂に加えて癌、腫瘍、異形性、細胞形質転換、転移および血管新生を促進したり、それに不可欠であったり、それと特異的に関係したりしている活性を包含する。
【００３０】
「投与」および「処置」とは、動物、ヒト、実験被検体、細胞、組織、器官または生物学的液体に適用する場合、外因性の薬剤、治療薬、診断薬または組成物と、動物、ヒト、被検体、細胞、組織、器官または生物学的液体との接触をいう。「投与」および「処置」は、たとえば、治療方法、薬物動態学的方法、診断方法、研究方法および実験方法をいうこともある。細胞の処置は、試薬と細胞との接触ばかりでなく、体液が細胞と接触している、試薬と体液との接触を包含する。「投与」および「処置」は、たとえば、試薬化合物、診断用化合物、結合化合物によるかまたは別の細胞によるインビトロおよびエキソビボでの細胞の処置も意味する。「処置」は、ヒト、家畜または研究被検体に適用する場合、研究および診断分野の治療処置、予防手段または防止手段をいう。「処置」は、ヒト、家畜もしくは研究被検体または細胞、組織もしくは器官に適用する場合、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒアゴニストヒトもしくは動物被検体、細胞、組織、生理的コンパートメントまたは生理的液体の接触を包含する。「細胞の処置」はまた、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒアゴニストが、たとえば、流体相またはコロイド相でヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ受容体と接触する状態ばかりでなく、このアゴニストが細胞または受容体と接触しない状態も包含する。
【００３１】
「処置する」または「処置している」は、本発明の結合化合物のいずれかを含む組成物などの治療薬を、その薬に治療活性があることが分かっている１つまたは複数の疾患症状を持つ患者に内用または外用投与することを意味する。一般に、その薬については、臨床的に測定可能な任意の程度で、疾患症状（単数または複数）の退行を引き起こすか、それともその進行を阻害することにより、処置する患者または集団の１つまたは複数のそうした症状を軽減するのに有効な量で投与する。任意の特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療薬の量（「治療有効量」ともいう）は、患者の病状、年齢および体重ならびにその患者に所望の反応を惹起する薬剤の能力などの因子によって異なる場合がある。疾患症状が軽減されているかどうかは、症状の重症度または進行状況を評価するために医師または他の熟練の医療提供者が一般に使用する任意の臨床的測定により評価することができる。本発明の実施形態（処置方法または製品など）は、対象の疾患症状（単数または複数）を軽減する上であらゆる患者において有効であるとは限らない場合があるが、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マンアンドホイットニーのＵ検定、クラスカル−ワリスの検定（Ｈ検定）、ヨンキー−テラプストラ検定およびウィルコクソン検定など、当該技術分野において公知の任意の統計的検定により判定すると、統計学的に有意な数の患者において対象の疾患症状（単数または複数）は軽減している。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「抗体」という語は、所望の生物活性を示す任意の形態の抗体をいう。したがって、この語については、最も広い意味で用いており、具体的には、以下に限定されるものではないが、モノクローナル抗体（全長のモノクローナル抗体など）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）をカバーする。本明細書で使用する場合、「抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ結合フラグメントまたは抗体（「親抗体」）の「結合フラグメント」という語は、通常、親抗体の結合特異性を少なくともある程度保持する、親抗体の抗原結合領域または可変領域（１つまたは複数のＣＤＲなど）の少なくとも一部を含む、抗体のフラグメントまたは誘導体を包含する。抗体結合フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；ｓｃ−Ｆｖなどの一本鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体があるが、これに限定されるものではない。一般に、結合フラグメントまたは誘導体は、その活性をモル基準で表した場合、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ結合活性の少なくとも１０％を保持する。好ましくは、結合フラグメントまたは誘導体は、親抗体のようなヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ結合親和性を少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％またはそれ以上保持する。また、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ結合フラグメントは、その生物学的活性を実質的に変えない保存的アミノ酸置換（抗体の「保存的改変体」という）を含むことも意図されている。「結合化合物」という語は、抗体およびその結合フラグメントの両方をいう。
【００３３】
「Ｆａｂフラグメント」は、１本の軽鎖と１本の重鎖のＣＨ１および可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
【００３４】
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する２つの重鎖フラグメントを含む。この２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によりともに保持されている。
【００３５】
「Ｆａｂ’フラグメント」は、１本の軽鎖と、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインのほか、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間の領域を含む１本の重鎖の一部とを含み、２つのＦａｂ’フラグメントの２本の重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子になることができる。
【００３６】
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、２本の軽鎖と、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間の定常領域の一部を含む２本の重鎖とを含み、２本の重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されている。したがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２本の重鎖間のジスルフィド結合によってともに保持される２つのＦａｂ’フラグメントから構成される。
【００３７】
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖両方の可変領域を含むが、定常領域を欠いている。
【００３８】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦＶ」抗体という語は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体フラグメントをいい、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによりｓｃＦＶは、抗原結合に対する所望の構造を形成することができる。ｓｃＦＶの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。さらに、国際公開第８８／０１６４９号および米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号も参照されたい。
【００３９】
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントである。場合によっては、２つ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーと共有結合で結合し、二価のドメイン抗体を形成する。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同一抗原を標的にしても、異なる抗原を標的にしてもよい。
【００４０】
「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。場合によっては、２つの結合部位は同一の抗原特異性を持つ。しかしながら、二価抗体は、二重特異性であってもよい（以下を参照）。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ」抗体とは、他に記載がない限り、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒもしくはその改変体またはその任意の抗原性フラグメントに対して形成される抗体をいう。好ましい実施形態では、「抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性を活性化するアゴニスト抗体である。ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性の例として、マスト細胞の脱顆粒およびサイトカイン分泌の阻害、マクロファージおよび樹状細胞の抗原提示およびサイトカイン分泌の阻害があるが、これに限定されるものではない。また、抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体とは、ｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２００Ｒ（図１３などを参照）に対して形成される抗体もしくはその改変体またはその抗原性フラグメントをいい、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒにも結合する。好ましい実施形態では、ｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２００Ｒに対して形成される抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性を活性化するアゴニスト抗体である。ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性の例として、マスト細胞の脱顆粒およびサイトカイン分泌の阻害、マクロファージおよび樹状細胞の抗原提示およびサイトカイン阻害があるが、これに限定されるものではない
「モノクローナル抗体」という語は、本明細書で使用する場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体をいい、言い換えれば、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る、可能な自然発生の突然変異を除けば同一である。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原エピトープを標的とする。これに対し、従来の（ポリクローナル）抗体調製物は一般に、様々なエピトープに対する（それに特異的な）数多くの抗体を含む。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られたものとしての抗体の特徴を示すもので、抗体を任意の特定の方法で作製する必要があるものと解釈してはならない。たとえば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体については、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５が最初に記載したハイブリドーマ法により作製してもよいし、組換えＤＮＡ法（たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）により作製してもよい。「モノクローナル抗体」はまた、たとえば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８  ａｎｄ  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記載の技法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離しても構わない。さらに、Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１も参照されたい。
【００４２】
本明細書のモノクローナル抗体は、所望の生物活性を示す限り、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を特に含む。キメラ抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体、あるいは、特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である一方、鎖の残り（単数または複数）については、別の種に由来する抗体、あるいは、別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、およびそうした抗体のフラグメント中の対応する配列と同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５）。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」は、第１の抗体の可変ドメインおよび第２の抗体の定常ドメインを持つ抗体であり、第１および第２の抗体は異なる種に由来する。一般に、可変ドメインはげっ歯類動物などの実験動物（「親抗体」）の抗体から得て、定常ドメイン配列はヒト抗体から得るため、得られるキメラ抗体は、親のげっ歯類動物抗体に比べて、ヒト被験者に有害な免疫応答を惹起する可能性が低くなる。
【００４４】
本明細書のモノクローナル抗体はまた、ラクダ型単一ドメイン抗体を含む。たとえば、参照によってその全体を本明細書に援用するＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５；国際公開第９４／０４６７８号；国際公開第９４／２５５９１号；米国特許第６，００５，０７９号を参照されたい）。一実施形態では、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるように改変された２つのＶＨドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「ダイアボディ」という語は、２つの抗原結合部位を含む小さな抗体フラグメントをいい、そのフラグメントでは、同じポリペプチド鎖に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とが連結されている（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）。この２つのドメインについては、同じ鎖上の２つのドメイン間で対を形成するには短すぎるリンカーを用いることで、別の鎖の相補ドメインと対を形成し、２つの抗原結合部位を形成させる。ダイアボディに関しては、たとえば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８にさらに詳細に記載されている。操作された抗体改変体の概説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１２６−１１３６を全般的に参照されたい。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という語は、ヒト抗体と非ヒト（マウス、ラットなどの）抗体との配列を含む抗体の形態をいう。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、超可変ループの全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに相当し、フレームワーク（ＦＲ）領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体は任意に、ヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでもよい。
【００４７】
また、本発明の抗体は、エフェクター機能を変化させるように改変された（またはブロックされた）Ｆｃ領域を持つ抗体も含む。たとえば、米国特許第５，６２４，８２１号；国際公開第２００３／０８６３１０号；国際公開第２００５／１２０５７１号；国際公開第２００６／００５７７０２号を参照されたい。そのような改変により、免疫系の様々な反応を促進または抑制することができ、診断および治療において有益な作用が可能になる。Ｆｃ領域の変更は、アミノ酸変化（置換、欠失および挿入）、グリコシル化または脱グリコシル化および複数のＦｃの付加を含む。さらに、Ｆｃを変化させて、治療用抗体の抗体半減期を変えてもよく、投薬頻度を少なくし、したがって、利便性の向上および材料の使用の減少が可能になる。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１の７３４−３５を参照されたい。
【００４８】
「完全ヒト抗体」という語は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体をいう。完全ヒト抗体は、マウス、マウス細胞またはマウス細胞から得られたハイブリドーマを用いて作製された場合、マウスの炭水化物鎖を含んでもよい。同様に、「マウス抗体」とは、マウス免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいう。あるいは、完全ヒト抗体は、ラット、ラット細胞またはラット細胞から得られたハイブリドーマを用いて作製された場合、ラット炭水化物鎖を含んでもよい。同様に、「ラット抗体」とは、ラット免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいう。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「超可変領域」という語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸の残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、５０〜５６（ＣＤＲＬ２）および８９〜９７（ＣＤＲＬ３）ならびに重鎖可変ドメインの残基３１〜３５（ＣＤＲＨ１）、５０〜６５（ＣＤＲＨ２）および９５〜１０２（ＣＤＲＨ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）および／または「超可変ループ」のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２（ＣＤＲＬ１）、５０〜５２（ＣＤＲＬ２）および９１〜９６（ＣＤＲＬ３）ならびに重鎖可変ドメインの２６〜３２（ＣＤＲＨ１）、５３〜５５（ＣＤＲＨ２）および９６〜１０１（ＣＤＲＨ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）を含む。本明細書で使用する場合、「フレームワーク」または「ＦＲ」残基という語は、本明細書でＣＤＲ残基として定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基をいう。
【００５０】
「結合物質」とは、標的に結合することができる分子、小分子、高分子、抗体、そのフラグメントもしくはアナログまたは可溶性受容体をいう。「結合物質」はまた、標的に結合することができる非共有結合複合体のような分子の複合体、イオン化分子、およびリン酸化、アシル化、架橋結合、環化または限定切断などによる改変など、共有結合的または非共有結合的に改変された分子をいうこともある。さらに、「結合物質」は、安定剤、賦形剤、塩、緩衝液、溶媒または添加剤と組み合わせて標的に結合することができる分子をいうこともある。「結合」とは、結合物質と標的との会合と定義することができ、結合物質を溶液中に溶解または懸濁できる場合、会合の結果、結合物質の通常のブラウン運動は減少する。
【００５１】
「保存的に修飾された改変体」または「保存的置換」とは、タンパク質内におけるアミノ酸と、類似の特徴（たとえば、電荷、側鎖のサイズ、疎水性／親水性、骨格構造および剛直性など）を持つ他のアミノ酸との置換をいい、したがって、その交換が行われても、そのタンパク質の生物活性は変わらない場合が多い。当業者であれば、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が一般に、生物活性を実質的に変化させないことを認識する（たとえば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ  Ｅｄ．）を参照）。さらに、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物活性を破壊する可能性も低い。本発明の結合化合物の種々の実施形態は、本明細書に開示される特定のアミノ酸配列（たとえば、配列番号２、４、５または６）と比較して、最大０（交換なし）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０またはそれ以上の保存的アミノ酸置換を含有する配列を持つポリペプチド鎖を含む。本明細書で使用する場合、「最大Ｘ」の保存的アミノ酸置換という語句は、０置換およびＸ置換を含めＸ置換まで任意の数の置換を含む。そうした例示的置換は、好ましくは以下の表２に示す置換に従って行われる：
【００５２】
【表１】
2010512791.tif 000003
「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という語または「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」もしくは「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの変形は、本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、記載された任意の要素または要素群を含むことと、その記載した要素よりもより類似または異なる性質を持ち、特定の投与レジメン、方法または組成の基本的特性もしくは新規の特性を実質的に変化させない他の要素を任意に含むこととを示す。非限定的な例として、記載のアミノ酸配列から本質的に成る結合化合物は、その結合化合物の特性に実質的に影響を与えない１つまたは複数のアミノ酸をさらに含んでもよい。
【００５３】
「有効量」とは、医学的状態の症状または徴候を軽減したり、予防したりするのに十分な量を包含する。有効量は、診断を可能にしたり、しやすくしたりするのに十分な量も意味する。個々の患者または家畜被検体の有効量は、処置対象の症候、患者の健康全般、投与の方法経路ならびに用量および副作用の重症度などの要因によって異なり得る（たとえば、Ｎｅｔｔｉらに付与された米国特許第５，８８８，５３０号を参照）。有効量は、重大な副作用または毒性作用を起こさない最高用量または投薬プロトコルであってもよい。その効果は、正常な被検体が示す診断パラメーターを１００％と定義した場合、診断尺度またはパラメーターは、少なくとも５％、一般には少なくとも１０％、より一般には少なくとも２０％、最も一般には少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、一層好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも６０％、理想的には少なくとも７０％、より理想的には少なくとも８０％、最も理想的には少なくとも９０％改善する（たとえば、Ｍａｙｎａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫを参照）。
【００５４】
「外因性」とは、文脈に応じて、生体外、細胞外または人体外で作られる物質をいう。「内因性」とは、文脈に応じて、細胞内、生体内または人体内で作られる物質をいう。
【００５５】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の配列類似性をいう。２つの比較配列中のある位置がともに同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットで占められる場合、たとえば、２個のＤＮＡ分子中のある位置がそれぞれアデニンで占められている場合、その分子は、その位置で相同的である。２つの配列間の相同性の割合は、２つの配列が共有するマッチング位置または相同的な位置の数を比較対象の位置の数で割り、その商を１００倍して決める。たとえば、２つの配列を最適に整列させたとき、その配列において１０個の位置のうち６個がマッチするか、相同的である場合、２つの配列は、６０％相同的である。相同性の割合が最大になるように２つの配列を整列させて比較を行うのが一般的である。
【００５６】
「免疫症候」または「免疫障害」は、たとえば、病的炎症、炎症性障害および自己免疫障害または疾患を包含する。さらに、「免疫症候」とは、免疫系による根絶に抵抗性のある感染、腫瘍および癌を含む、感染、持続感染および増殖症候（癌、腫瘍および血管新生など）もいう。「癌性症候」とは、たとえば、癌、癌細胞、腫瘍、血管新生および異形性などの前癌状態を含む。
【００５７】
「炎症性障害」とは、その病変の全部または一部が、たとえば、免疫系細胞の数の変化、遊走速度の変化または活性化の変化に起因する障害または病態を意味する。免疫系細胞は、たとえば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球またはマクロファージ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞、ミクログリア、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、好酸球、マスト細胞または、たとえば、サイトカイン産生内皮または上皮細胞など、免疫学に特に関係する任意の他の細胞を含む。
【００５８】
「単離された結合化合物」とは、結合化合物の精製状態をいい、そうした文脈では、その分子は、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、または細胞残屑および増殖培地のような他の物質など、他の生体分子を実質的に含まないことを意味する。通常、「単離された」という語は、本明細書に記載するような結合化合物の実験的使用または治療的使用を実質的に妨げない量で存在する限り、そうした他の物質がまったくないこと、あるいは、水、緩衝液または塩がないことを指すことを意図していない。
【００５９】
「単離された核酸分子」とは、ゲノムＤＮＡまたはゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくは合成起源のものまたはそのいくつかの組み合わせを意味しており、その単離されたポリヌクレオチドが、自然界にあるポリヌクレオチドの全部または一部と無関係であるか、自然界で連結しないポリヌクレオチドに連結している核酸分子を意味する。本開示において個々のヌクレオチド配列「を含む核酸分子」は、インタクトな染色体を包含しないことを理解すべきである。特定の核酸配列「を含む」単離された核酸分子は、その特定の配列に加えて、最大１０あるいは最大２０以上もの他のタンパク質のコード配列またはその一部を含んでもよいし、記載の核酸配列のコード領域の発現をコントロールする作動可能に連結された制御配列を含んでもよいし、および／または、ベクター配列を含んでもよい。
【００６０】
「制御配列」という語句は、個々の宿主生物において、作動可能に連結されたコード配列が発現するのに必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に好適な制御配列として、たとえば、プロモーター、任意にオペレーター配列およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞では、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを用いることが知られている。
【００６１】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に位置しているとき、「作動可能に連結されている」。たとえば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関わるプレタンパク質として発現する場合、そのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に作用する場合、コード配列に作動可能に連結されており；リボソーム結合部位は、翻訳を促進する位置にある場合、コード配列に作動可能に連結されている。通常、「作動可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合、隣接してリーディング相にあることを意味する。一方、エンハンサーについては隣接している必要はない。連結を行うには、好都合な制限部位でライゲートする。そうした部位が存在しない場合、従来のやり方に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という表現は、同義で使われ、そうした言い方はすべて子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、継代数に関係なく、対象の初代細胞およびそれから得られた培養物を含む。すべての子孫は、計画的または偶発的な突然変異のため、ＤＮＡの内容が正確に同一であるとは限らない場合があることも理解される。最初の形質転換細胞を用いてスクリーニングしたときと同じ機能または生物活性を変異子孫が持つ場合、その変異子孫を含む。異なる言い方が意味するところは、文脈から明らかになるであろう。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、たとえば、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されているように、微量の核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定の断片を増幅させる手順または技法をいう。通常、目的の領域の末端またはそれを越える配列情報を入手する必要がある。そうすれば、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。それらのプライマーは、増幅される鋳型の逆鎖に対して配列が同一または類似している。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅材料の末端と一致してもよい。ＰＣＲを用いて、全ゲノムＤＮＡと、全細胞性ＲＮＡ、バクテリオファージ配列またはプラスミド配列などから転写されたｃＤＮＡとから特定のＲＮＡ配列、特定のＤＮＡ配列を増幅することができる。Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３；Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，（１９８９）ＰＣＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）を全般的に参照されたい。本明細書で使用する場合、ＰＣＲは、プライマーとしての既知の核酸と核酸ポリメラーゼとを用いて核酸の特定の断片の増幅および生成を行うことを含む、核酸被検サンプルを増幅させる核酸ポリメラーゼ反応法の一例であるが、その唯一の例ではないと考える。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「生殖細胞系配列」という語は、再配列されていない免疫グロブリンＤＮＡ配列の配列をいう。再配列されていない免疫グロブリンの任意の好適な供給源を用いてもよい。
【００６５】
「阻害剤」および「アンタゴニスト」または「活性化剤」および「アゴニスト」とはそれぞれ、たとえば、リガンド、受容体、補助因子、遺伝子、細胞、組織または器官などの活性化に対する阻害分子または活性化分子をいう。たとえば、遺伝子、受容体、リガンドまたは細胞のモジュレーターは、遺伝子、受容体、リガンドまたは細胞の活性を変化させる分子であり、その制御特性により活性を、活性化したり、阻害したり、変化させたりすることができる。モジュレーターは、単独で作用してもよいし、たとえば、タンパク質、金属イオンまたは小分子のような補助因子を用いてもよい。阻害剤は、活性化を低下させたり、遮断したり、防止したり、遅延させたり、たとえば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体または細胞を不活化したり、低感受性にしたり、下方制御したりする化合物である。活性化剤は、活性化を高めたり、活性化したり、促進したり、増強したり、たとえば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体または細胞を高感受性にしたり、上方制御したりする化合物である。また、阻害剤は、恒常的な活性を低下させたり、遮断したり、不活化したりする化合物と定義してもよい。「アゴニスト」は、標的と相互作用して標的の活性化の増強を引き起こしたり、促進したりする化合物である。「アンタゴニスト」は、アゴニストの作用に対抗する化合物である。アンタゴニストは、アゴニストの活性を防止したり、低下させたり、阻害したり、中和したりする。さらに、アンタゴニストは、特定のアゴニストが存在しない場合でも、標的受容体などの標的の恒常的な活性を防止したり、阻害したり、低下させ得る。限定としてではなく例として、アゴニスト抗体は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性を活性化できる抗体である。
【００６６】
阻害の程度を調べるには、たとえば、所定のタンパク質、遺伝子、細胞または生体などを含むサンプルまたはアッセイを有望な活性化剤または阻害剤で処置し、その阻害剤を用いない対照サンプルと比較する。対照サンプル、すなわち、アンタゴニストで処置していないサンプルの相対活性値を１００％とする。阻害については、対照に対するその活性値が約９０％以下、典型的には８５％以下、より典型的には８０％以下、最も典型的には７５％以下、一般には７０％以下、より一般的には６５％以下、最も一般には６０％以下、典型的には５５％以下、通常には５０％以下、より通常には４５％以下、最も通常には４０％以下、好ましくは３５％以下、一層好ましくは３０％以下、なお一層好ましくは２５％以下、最も好ましくは２５％未満のとき、達成される。活性化については、対照に対する相対的活性値が約１１０％、一般には少なくとも１２０％、より一般的には少なくとも１４０％、より一般的には少なくとも１６０％、多くの場合、少なくとも１８０％、より多くの場合、少なくとも２倍、最も多くの場合、少なくとも２．５倍、通常には少なくとも５倍、より通常には少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、一層好ましくは少なくとも４０倍および最も好ましくは４０倍を超えるとき、達成される。
【００６７】
活性化または阻害のエンドポイントについては、以下のようにモニターしてもよい。たとえば、細胞、生理的液体、組織、器官および動物またはヒトの被検体の処置に対する活性化、阻害および反応をエンドポイントによりモニターすることができる。エンドポイントは、たとえば、所定の量または割合の炎症の徴候、発癌性または細胞の脱顆粒もしくは分泌（サイトカイン、毒性酸素またはプロテアーゼの放出など）を含んでもよい。エンドポイントは、たとえば、所定量のイオン流束または輸送；細胞遊走；細胞接着；細胞増殖；転移の可能性；細胞分化；および表現型の変化（たとえば、炎症、アポトーシス、形質転換、細胞周期または転移に関係する遺伝子発現の変化）を含んでも構わない（たとえば、Ｋｎｉｇｈｔ（２０００）Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．３０：１４５−１５８；Ｈｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：９１−１００；Ｔｉｍｍｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ４：２５１−２６１；Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｔｚｋｏｗｉｔｚ（２００２）Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．８６：１４６７−１４９５；Ｇｒａｄｙ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ（２００２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０１−１２８；Ｂａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｌｉａ  ３６：２３５−２４３；Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ  ａｎｄ  Ｓａｔｏｈ（２０００）Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１０：１１３−１２６を参照）。
【００６８】
阻害のエンドポイントは通常、対照の７５％以下、好ましくは対照の５０％以下、一層好ましくは対照の２５％以下、最も好ましくは対照の１０％以下である。通常、活性化のエンドポイントは、少なくとも対照の１５０％、好ましくは少なくとも対照の２倍、一層好ましくは少なくとも対照の４倍、最も好ましくは少なくとも対照の１０倍である。
【００６９】
「リガンド」とは、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る、たとえば、小分子、ペプチド、ポリペプチドおよび膜会合分子もしくは膜結合分子またはこれらの複合体をいう。「リガンド」はまた、アゴニストまたはアンタゴニストではないが、受容体に結合できる因子も包含する。さらに、「リガンド」は、たとえば、化学的方法または組換え法により可溶性形態の膜結合リガンドに変えられた膜結合リガンドも含む。原則として、リガンドが第１の細胞の膜に結合する場合、その受容体は通常、第２の細胞に発生する。第２の細胞の個性は、第１の細胞と同じ場合もあるし、異なる場合もある。リガンドまたは受容体は、完全に細胞内にあってもよい。すなわち、サイトゾル、核またはどこか他の細胞内コンパートメントにあっても構わない。そのリガンドまたは受容体は、たとえば、細胞内コンパートメントから形質膜の外表面へとその位置を変えることもある。リガンドと受容体との複合体は、「リガンド受容体複合体」と呼ばれる。リガンドおよび受容体がシグナル伝達経路に関与する場合、そのリガンドは、シグナル伝達経路の上流の位置に現れ、受容体は、その下流の位置に現れる。
【００７０】
「小分子」は、分子量が１０ｋＤａ未満、典型的には２ｋＤａ未満、好ましくは１ｋＤａ未満、最も好ましくは約５００Ｄａ未満の分子と定義する。小分子として、無機分子、有機分子、無機成分を含む有機分子、放射性原子を含む分子、合成分子、ペプチド模倣体および抗体模倣体を含むが、これに限定されるものではない。治療剤として、小分子は、大きな分子よりも細胞に対する透過性が高くて、分解を受けにくく、免疫応答を誘発しにくい傾向にあり得る。抗体やサイトカインのペプチド模倣体などの小分子および小分子のトキシンが記載されている（たとえば、Ｃａｓｓｅｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０７：１９８−２０５；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（２００Ｉ）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２；Ｌｉ（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２５１−１２５６；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９：４１１−４２０；Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．８：２１８５−２１９９；Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：６５２−６５６；Ｓａｔｏ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅ（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７１：６０３−６０８；Ｓｔｅｗａｒｔらに付与された米国特許第６，３２６，４８２号を参照）。
【００７１】
リガンド／受容体について言及する際に、「特異的に」または「選択的に」結合する抗体／抗原または他の結合対は、タンパク質および他の生物製剤の不均一な集団中における問題のタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、特定のリガンドは、指定の条件下で特定の受容体に結合するが、サンプル中に存在する他のタンパク質に相当量では結合しない。たとえば、意図した方法の抗体または抗体の抗原結合部位から得られる結合化合物は、任意の他の抗原の親和性に比べて、少なくとも２倍高い、好ましくは少なくとも１０倍高い、一層好ましくは少なくとも２０倍高い、最も好ましくは少なくとも１００倍高い親和性でその抗原またはその改変体またはムテインに結合する。好ましい実施形態では、抗体の親和性は、たとえば、スキャッチャード解析で判定する場合、約１０９Ｍ−１よりも高い（Ｍｕｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９）。限定としてではなく例として、指定の条件は、タンパク質および他の生物製剤の不均一な集団がすべて同じ種に由来するアッセイを包含してもよい。さらに、限定としてではなく例として、抗体または抗体の抗原結合部位から得られる結合化合物は、抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的または選択的に結合するが、ＣＹＳ改変ヒトＣＤ２００ＲＬａ（たとえば、図９および実施例１３を参照）またはヒトＣＤ２００ＲＬａ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したヒトＣＤ２００ＲＬａの細胞外ドメイン、たとえば、実施例１３を参照）には特異的または選択的に結合しない。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「免疫調節剤」という語は、免疫応答を抑制または調節する天然剤または合成剤をいう。免疫応答は、液性応答でも細胞応答でもよい。免疫調節剤は、免疫抑制剤または抗炎症剤を包含する。
【００７３】
「免疫抑制剤」、「免疫抑制薬物」または「免疫抑制薬」は、本明細書で使用する場合、免疫系の活性を阻害または防止するため、免疫抑制治療に使用する治療剤である。臨床的には、そうした治療剤を用いて、移植臓器および組織（骨髄、心臓、腎臓、肝臓など）の拒絶反応を防止し、および／または、自己免疫疾患または自己免疫が原因である可能性が非常に高い疾患（関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症など）を処置する。免疫抑制薬物は、糖質コルチコイド；細胞増殖抑制薬；抗体（生物学的応答調節剤）；イムノフィリンに作用する薬剤；増殖性障害の処置に使用される既知の化学療法剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）などのこれ以外の薬剤に分類できる。多発性硬化症の場合、特に、本発明の抗体を、コパクソンと呼ばれる新しいクラスのミエリン結合タンパク質様治療剤と併用して投与してもよい。
【００７４】
「抗炎症剤」または「抗炎症薬」とは、ステロイド治療剤および非ステロイド性治療剤の両方をいう。ステロイドは、コルチコステロイドとしても知られ、コルチゾール（副腎で自然に作られるホルモン）によく似た薬剤である。ステロイドは、全身性血管炎（血管の炎症）および筋炎（筋肉の炎症）など、ある種の炎症症候の主要な処置剤として用いられる。さらに、ステロイドは、関節リウマチ（体の両側の関節に起こる慢性炎症性関節炎）；全身性エリテマトーデス（異常な免疫系機能により引き起こされる全身疾患）；シェーグレン症候群（ドライアイおよび口内乾燥の原因となる慢性障害）などの炎症症候の処置に選択的に用いてもよい。
【００７５】
非ステロイド性抗炎症薬（通常ＮＳＡＩＤと略される）は、鎮痛作用、解熱作用および抗炎症作用のある薬剤であり、疼痛、発熱および炎症を緩和する。「非ステロイド性」という語は、これらの薬剤を、（他の多岐にわたる作用の中でも）同様のエイコサノイド抑制作用、抗炎性作用を持つステロイドと区別するために使用する。ＮＳＡＩＤは通常、関節リウマチ；変形性関節症；炎症性関節症（強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、ライター症候群など）；急性痛風；月経困難症（ｄｙｓｍｅｎｏｒｒｈｏｅａ）；転移性骨痛；頭痛および片頭痛；術後疼痛；炎症および組織傷害による軽度ないし中等度の疼痛；発熱；および腎仙痛などの症状を軽減させるために用いられる。ＮＳＡＩＤは、サリチラート、アリルアルカン酸（ａｒｌｙａｌｋｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、２−アリールプロピオン酸（プロフェン）、Ｎ−アリールアントラニル酸（フェナム酸）、オキシカム、コキシブおよびスルホンアニリドを含む。
【００７６】
疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）については、多くの場合、ＮＳＡＩＤと併用して投与することができる。一般に処方されているＤＭＡＲＤは、ヒドロキシクロロキン／クロロキン、メトトレキサート、金療法、スルファサラジンおよびアザチオプリンを含む。
【００７７】
ＩＩ．ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的な抗体
本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症、関節リウマチ、骨粗鬆症、炎症性線維症（強皮症、肺線維症および肝硬変など）、炎症性腸障害（クローン病、潰瘍性大腸炎および炎症性腸疾患など）、喘息（アレルギー性喘息など）、アレルギー、ＣＯＰＤ、多発性硬化症、乾癬、ぶどう膜炎および癌を含む、様々な炎症性障害、免疫障害および増殖性障害を処置する抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒｒ抗体およびその使用を提供する。
【００７８】
モノクローナル抗体を作製する任意の好適な方法を用いて、本発明の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体を作製することができる。たとえば、レシピエント動物を連結型または非連結型（天然など）のヒト阻害性ＣＤ２００Ｒまたはそのフラグメントで免疫してもよい。免疫化には任意の好適な方法を用いてよい。そうした方法は、アジュバント、他の免疫賦活薬、ブースター免疫の繰り返しおよび１つまたは複数の免疫経路の使用を含む。
【００７９】
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的な非ヒト抗体の作製には、任意の好適な形態のヒト阻害性ＣＤ２００Ｒを免疫原（抗原）として用いることができ、その抗体の生物活性をスクリーニングしてもよい。誘発免疫原は、全長ヒト阻害性ＣＤ２０００Ｒでも、単一エピトープまたは多重エピトープを包含するそのペプチドでもよい。免疫原は、単独でも、当該技術分野において公知の１つまたは複数の免疫原性増強剤と併用してもよい。免疫原については、天然の供給源から精製しても、遺伝子改変細胞を用いて作製してもよい。免疫原をコードするＤＮＡの起源は、ゲノムでも非ゲノム（ｃＤＮＡなど）でも構わない。免疫原をコードするＤＮＡについては、以下に限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、プラスミドおよび陽イオン性脂質のような非ウイルスベクターを含む、好適な遺伝子ベクターを用いて発現させてもよい。ヒトＣＤ２００Ｒの配列は、たとえば、米国特許出願公開第２００６／００８４１２１号，Ｗｒｉｇｈｔ  ＧＪ  ｅｔ  ａｌ（２００３）１７１（６）：３０３４−３０４６（参照によってその全体を本明細書に援用する）および図１３で確認することができる。限定としてではなく例として、ヒト阻害性受容体の長型あるいは短型を免疫原（抗原）として用いてもよい  ヒト阻害性受容体の短型およびヒト阻害性受容体の長型のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、それぞれＡＦ２８３７６０およびＡＦ２８３７６０である。ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの短型は、図１３にも示してある。
【００８０】
代替の実施形態では、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的な非ヒト抗体の作製に、ｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２００Ｒ（図１３を参照）など非ヒト霊長類の阻害性ＣＤ２００Ｒを免疫原（抗原）として用いてもよく、その抗体の生物活性をスクリーニングすればよい。誘発免疫原は、全長ｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２０００Ｒでも、単一エピトープまたは多重エピトープを包含するそのペプチドでもよい。免疫原は、単独でも、当該技術分野において公知の１つまたは複数の免疫原性増強剤と併用してもよい。免疫原については、天然の供給源から精製しても、遺伝子改変細胞を用いて作製してもよい。免疫原をコードするＤＮＡの起源は、ゲノムでも非ゲノム（ｃＤＮＡなど）でも構わない。免疫原をコードするＤＮＡについては、以下に限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、プラスミドおよび陽イオン性脂質のような非ウイルスベクターなど、好適な遺伝子ベクターを用いて発現させてもよい。
【００８１】
たとえば、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性を活性化するような所望の生物学的特性を持つ抗体反応を誘導するには、任意の好適な方法を用いることができる。いくつかの実施形態では、マウス、げっ歯類動物、霊長類、ヒトなどの哺乳動物宿主を用いて抗体を形成する。モノクローナル抗体を調製する技法は、たとえば、Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）ＢＡＳＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（４ｔｈ  ｅｄ．）Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡ，およびその中に引用された参考文献；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ（２ｄ  ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹで確認できる。したがって、モノクローナル抗体については、当該技術分野の熟練した研究者によく知られている様々な技法により得ることができる。通常、所望の抗原で免疫した動物の脾臓細胞を、一般には骨髄腫細胞と融合して不死化する。Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９を参照されたい。不死化に代わる方法として、エプスタインバーウイルス、オンコジーンまたはレトロウイルスによる形質転換または当該技術分野において公知の他の方法が挙げられる。たとえば、Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９４  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい。抗原に対して所望の特異性および親和性を持つ抗体を産生するかどうかについて、単一の不死化細胞から生じたコロニーをスクリーニングする。そうした細胞から産生されるモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿主の腹膜腔に注射するなど、様々な技法により高めてもよい。
【００８２】
他の好適な技法では、ファージまたは類似のベクターの抗体ライブラリーの選択を行う。たとえば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９）を参照されたい。本発明の抗体は、たとえば、親げっ歯類動物抗体として改変せずに用いても、キメラ抗体またはヒト化抗体など、ヒト被験者の治療薬としての使用を促進するように改変して用いてもよい。いくつかの実施形態では、抗体を、検出可能なシグナルを発する物質で共有結合的または非共有結合的に標識する。多岐にわたる標識およびコンジュゲーション技法が知られており、科学文献にも特許文献にも広く報告されている。好適な標識として、放射性核種、酵素、基質、補助因子、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、磁気粒子などが挙げられる。そうした標識の使用を教示する特許として、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。また、組換え免疫グロブリンを作製してもよく、Ｃａｂｉｌｌｙ  米国特許第４，８１６，５６７号；およびＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３を参照されたい。あるいは、組換え免疫グロブリンを、トランスジェニックマウスを用いて作製してもよく、Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６と、さらにＡｂｇｅｎｉｘおよびＭｅｄａｒｅｘの技法も参照されたい。
【００８３】
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの所定のフラグメントとキャリアタンパク質とのコンジュゲートで動物を免疫して、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの所定のフラグメントに対する抗体を形成してもよい。所望の抗体を分泌している細胞から、モノクローナル抗体を調製する。これらの抗体を、正常なヒト阻害性ＣＤ２００Ｒまたは不完全なヒト阻害性ＣＤ２００Ｒへの結合でスクリーニングできる  これらのモノクローナル抗体は、普通、少なくとも約１μＭ、より一般には少なくとも約３００、３０、１０または３ｎＭ、好ましくは少なくとも約３００、１００、３０、１０、３または１ｐＭのＫｄで結合する。Ｋｄ値と親和性とは逆の関係にあるため、あるＫｄ「以下」で結合するということは、少なくとも記載の数値と同じ高さの親和性、すなわち、少なくとも記載の値と同じ低さのＫｄで結合することをいう。結合親和性については、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴分光法（実施例４を参照）、ＫｉｎＥｘＡ（実施例３を参照）、ＥＣＬ法により測定することができる。また、好適な非ヒト抗体を、以下の実施例５に記載の生物学的アッセイを用いて同定してもよい。
【００８４】
本発明の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体を作製する例示的な方法については、実施例２に記載されている。
【００８５】
ＩＩＩ．ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ特異的抗体のヒト化
本発明の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の超可変領域の供給源として、任意の好適な非ヒト抗体を用いてよい。非ヒト抗体の供給源として、げっ歯類動物（マウス、ラットなど）、ウサギ類の動物（ウサギなど）、雌ウシおよび非ヒト霊長類があるが、これに限定されるものではない。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基を、所望の特異性および親和性を持つマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域残基で置き換えた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。さらに、ヒト化抗体は、所望の生物活性に対する抗体の性能をさらに向上させるための改変など、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含んでもよい。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照されたい。
【００８６】
抗体を組換え技術により操作および作製する方法は、たとえば、Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第４，８１６，３９７号）、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第４，８１６，５６７号）、Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．（欧州特許出願公開第４３８３１０号）およびＷｉｎｔｅｒ（欧州特許出願公開第２３９４００号）により記載されている。
【００８７】
適切なヌクレオチド変化をヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ  ＤＮＡに導入したり、ペプチド合成したりすることで、本発明のヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体のアミノ酸配列改変体を調製してもよい。最終コンストラクトが所望の特徴を持つという条件において、最終コンストラクトに到達するため、欠失、挿入および置換をどのように組み合わせてもよい。また、アミノ酸変化では、グリコシル化部位の数または位置の変化など、ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の翻訳後プロセシングを変化させても構わない。
【００８８】
変異誘発に好ましい位置にある、ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の残基または領域を特定する有用な方法の１つは、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれている。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５を参照されたい。一群の標的残基（たとえば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの荷電残基）を同定し、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置き換えてそのアミノ酸とヒト阻害性ＣＤ２００Ｒとの相互作用を変化させる。次いで、アラニン置換に対して機能的感受性を示す残基を、アミノ酸置換をさらに導入することで改良する。一実施形態では、所定の標的コドンにおける突然変異の作用を、アラニンスキャニングまたはランダム変異誘発で測定し、続いて得られたヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体改変体の活性および結合解析を行う。
【００８９】
アミノ酸配列の挿入は、長さ１残基から百以上の残基を含むポリペプチドに及ぶアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、および単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を持つヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体またはエピトープタグと融合した同抗体が挙げられる。他の改変体として、抗体の血清中半減期を延長させる酵素またはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端への融合が挙げられる。
【００９０】
改変体の別のタイプは、アミノ酸置換改変体である。これらの改変体は、ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている。置換改変誘発で最も注目される部位として、超可変ループを含むが、ＦＲの交換も意図される。抗原結合に関与する超可変領域残基またはＦＲ残基は通常、比較的保存的様式で置換される。
【００９１】
抗体の他のアミノ酸改変体では、１つまたは複数の炭水化物部分を除去することで、および／または、１つまたは複数のグリコシル化部位を付加することで、抗体の当初のグリコシル化パターンを変化させる。抗体のグリコシル化は一般に、Ｎ結合型あるいはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基側鎖への炭水化物部分の結合をいう。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合の認識配列である。ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のどちらかが存在すれば、潜在的グリコシル化部位が形成される。Ｏ結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的なのはセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンもまた使われ得る）へのＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの結合を含む。
【００９２】
上記のトリペプチド配列の１つまたは複数を挿入することで（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）、あるいは、１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基を付加することで（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）、グリコシル化部位を本発明の抗体に付加してもよい。
【００９３】
ヒト化ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ特異的抗体のアミノ酸配列改変体をコードする核酸分子については、当該技術分野において公知の様々な方法により調製する。こうした方法として、天然の供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列改変体の場合）、あるいは、オリゴヌクレオチド媒介の（または部位特異的）改変誘発、ＰＣＲ改変誘発またはカセット改変導入によるものがあるが、これに限定されるものではない。
【００９４】
一般に、ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体のアミノ酸配列改変体は、重鎖あるいは軽鎖における最初のヒト化抗体のアミノ酸配列とのアミノ酸配列の同一性が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を持つ。本明細書では、この配列に対する同一性または相同性を、候補配列を最適に整列させたとき（すなわち、配列を整列させ必要に応じてギャップを入れ、配列のパーセント同一性が最大になるようにした後）、ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ残基と一致した候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義し、保存的置換については配列同一性の一部として一切考慮しない。抗体配列のＮ末端、Ｃ末端または内部の伸長、欠失または挿入については、配列同一性または相同性に影響を与えないものとみなす。
【００９５】
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む、免疫グロブリンの任意のクラスから選択してもよい。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む、ＩｇＧの任意のアイソタイプを用いてもよい。さらに、ＩｇＧアイソタイプの改変体も意図している。ヒト化抗体は、複数のクラスまたはアイソタイプからの配列を含んでよい。所望の生物学的活性を生じるのに必要な定常ドメイン配列の最適化は、以下の実施例に記載の生物学的アッセイにおいて、抗体をスクリーニングすることで容易に達成できる。
【００９６】
同様に、本明細書の化合物および方法には、軽鎖のいずれのクラスを用いてもよい。具体的には、κ、λまたはこれらの改変体は、本化合物および方法に有用である。
【００９７】
本発明のヒト化抗体を作製するには、非ヒト抗体からのＣＤＲ配列の任意の好適な一部を用いてもよい。置換、挿入または欠失によりＣＤＲ配列に改変を誘発してもよいが、そうした変異は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ結合親和性および特異性を維持する必要から、最低限にとどまる。一般に、ヒト化抗体ＣＤＲ残基は、少なくとも７５％、より多くの場合９０％、最も好ましくは９５％超、しばしば１００％が非ヒトＣＤＲ残基と一致する。
【００９８】
ヒト抗体からのＦＲ配列の任意の好適な一部を用いてもよい。使用するヒトおよび非ヒト抗体配列とＦＲ配列が異なるように、少なくとも１つの残基の置換、挿入、欠失によって、ＦＲ配列に変異を誘発してもよい。そうした変異は最低限にとどまるよう意図される。一般に、ヒト化抗体残基は、少なくとも７５％、より多くの場合９０％、最も好ましくは９５％超ヒトＦＲ残基と一致する。
【００９９】
さらに、所望の生物活性を示す限り、キメラ抗体またはこれらのフラグメントについても意図されている（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５）。上記のように、通常のキメラ抗体は、別の種から得られた抗原特異的抗体の可変ドメインに連結した、ある種由来の抗体からの定常ドメイン配列を含んでいる。
【０１００】
本発明の結合化合物は、二重特異性抗体を含んでもよい。本明細書で使用する場合、「二重特異性抗体」という語は、少なくとも２つの異なる抗原エピトープに対して結合特異性を持つ抗体、典型的にはモノクローナル抗体をいう。一実施形態では、そのエピトープは、同じ抗原由来である。別の実施形態では、そのエピトープは、２つの異なる抗原由来である。二重特異性抗体の作製方法は、当該技術分野において公知である。たとえば、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現を用いて、二重特異性抗体を組換え技術により作製することができる。たとえば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−３９を参照されたい。あるいは、化学結合により二重特異性抗体を調製しても構わない。たとえば、Ｂｒｅｎｎａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１を参照されたい。二重特異性抗体は、二重特異性抗体フラグメントを含む。たとえば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−４８，Ｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【０１０１】
本発明の抗ヒトヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体をヒト化する例示的な方法については、実施例２に記載してある。
【０１０２】
ＩＶ．ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ特異的抗体の特徴付け
実施例１および２により詳細に記載したように、本明細書に記載の方法を用いて、ヒトヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに免疫反応を示すモノクローナル抗体を作製した。図１および図２は、それぞれ様々な本発明の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の軽鎖および重鎖の可変領域の配列アライメントを示す。ＣＤＲ領域を示し、番号付けはＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）による。
【０１０３】
ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ軽鎖および重鎖をコードする核酸配列を含むプラスミドは、ブダペスト条約に従い２００６年１２月６日に受託番号ＰＴＡ−８０６７でＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）に寄託された。軽鎖および重鎖をコードする、および、さらにシグナルペプチドをコードする核酸配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに作動可能に連結された単一のプラスミドの中にある。このプラスミドはまた、プラスミド増幅のためマウス乳腺癌ウイルス末端長反復配列（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）に作動可能に連結されたＤＨＦＲ  ｃＤＮＡと、哺乳動物細胞での選択のためＴＫプロモーターに作動可能に連結されたハイグロマイシンＢ遺伝子とを含む。たとえば、そのプラスミドを用いて、組換えタンパク質を発現するｄｈｆｒ−哺乳動物細胞株にトランスフェクトしてもよい。ｄｈｆｒ−哺乳動物細胞株の例として、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１およびＤＧ４４．）があるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、結合化合物は、２００６年１２月６日にＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ＵＳＡ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−８０６７の発現ベクターから産生された成熟抗体（ｐＡＣＤ２００ＲＶ１プラスミド中にシグナル配列を含むｈｕＤＸ１８２）である。
【０１０４】
別の実施形態では、結合化合物は、２００７年１２月 日にＨＣ８０９．１４Ｆ１２．６．ＤＸ２４８．３株として寄託され、ＡＴＣＣ受託番号が であるハイブリドーマから産生される抗体と同じＣＤＲを持つ。
【０１０５】
本発明の抗体の軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲをそれぞれ表２および表３に示す。限定としてではなく例として、ＶＬドメインＣＤＲは、配列番号１、２および３から選択され、ＶＨドメインＣＤＲは、配列番号１９、２０および２１から選択される。さらに、限定としてではなく例として、ＶＬドメインＣＤＲは、ＲＡＳＫＮＩＲＳＹＬＡ（配列番号５５）、配列番号２および配列番号３から選択され、ＶＨドメインＣＤＲは、配列番号１９、２０および２１から選択される。限定としてではなく例として、ＶＬドメインＣＤＲは、配列番号１６、１７および１８から選択され、ＶＨドメインＣＤＲは、配列番号３４、３５および３５から選択される。
【０１０６】
【表２】
2010512791.tif 000004
【０１０７】
【表３】
2010512791.tif 000005
ヒト化ＶＬ領域およびＶＨ領域と、ヒト化抗体ｈｕＤＸ１８２との配列を示す（それぞれ配列番号４２および４８）。これらのヒト化可変ドメインを用いて、適切な定常ドメイン配列を加えることで全長キメラ抗体またはヒト化抗体を作製してもよい。
【０１０８】
本発明の一実施形態では、抗体ｈｕＤＸ１８２の軽鎖および重鎖を、ヒト定常ドメイン（それぞれヒトκ軽鎖およびヒトＩｇＧ１定常ドメイン）をヒト化ＶＬ領域（配列番号４２）およびＶＨ領域（配列番号４８）のＣ末端に付加して作製する。ｈｕＤＸ１８２軽鎖および重鎖の配列を配列番号４９および５０で示す。
【０１０９】
別の実施形態では、実施例２により詳細に記載されているように、キメラ型抗体のフレームワーク残基（すなわち、ＣＤＲの要素でない可変ドメインのアミノ酸残基）をヒト生殖細胞系フレームワーク配列で置換して、全長ヒト化抗体を作製する。得られた抗体は、ラット抗体からのＣＤＲ配列のみを保持し、定常ドメインおよびフレームワーク配列は、ヒト由来の配列に置き換えられている。シグナル配列を除くヒト化抗体ｈｕＤＸ１８２の全長成熟軽鎖および重鎖を、それぞれ配列番号４９および５０で示す（図３および図４）。
【０１１０】
さらなる実施形態では、抗体を作製するとき、本発明のヒト化抗体の全長軽鎖および重鎖を、Ｎ末端にシグナルペプチドを含むようにクローニングして、細胞から分泌されやすくする。一実施形態では、１９アミノ酸シグナル配列を、ヒト化ＤＸ１８２抗体の軽鎖および重鎖の両方に付加する。シグナル配列を加えた、ヒト化ＤＸ１８２の全長軽鎖および重鎖のＤＮＡ配列を配列番号５２および５４で示す（図５Ａおよび図５Ｂと、図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃ）。本発明のヒト化抗体を作製するには、そうしたＤＮＡ配列を、任意の好適な発現ベクターにクローニングし、発現させてもよい。他の実施形態では、抗体の作製を意図する方法に応じて、記載した特定のシグナル配列と異なるシグナル配列を付加する。そうしたシグナル配列については、科学文献、たとえば、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）「ＳＰｄｂ−ａ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅ，」ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ６：２４９から得てもよい。シグナル配列を加えた、ヒト化ＤＸ１８２の全長軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を配列番号５１および５３で示す（図５Ａおよび図５Ｂと、図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃ）。
【０１１１】
なお他の実施形態では、様々な定常ドメインを、本明細書に記載のヒト化ＶＬ領域およびＶＨ領域に付加してもよい。たとえば、本発明の抗体（またはフラグメント）の特定の使用目的によりエフェクター機能の変更が必要な場合、ＩｇＧ１以外の重鎖定常ドメインを用いてもよい。ＩｇＧ１抗体は、長い半減期ならびに補体活性化および抗体依存性細胞傷害などのエフェクター機能を与えるが、そうした作用が抗体のすべての使用に望ましいとは限らない場合がある。そうした場合には、たとえば、ＩｇＧ４定常ドメインを用いてもよい。
【０１１２】
Ｖ．ヒト化抗ＣＤ２００Ｒの親和性および生物活性
ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体において本明細書で望ましいと認めた特徴を持つ抗体について、インビトロで、インビボで、あるいは、結合親和性の測定により、阻害性の生物学的活性をスクリーニングしてもよい。目的の抗体が結合するヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ上の同じエピトープに結合する抗体（阻害性受容体に対する阻害機能を活性化する抗体など）をスクリーニングするには、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているような通常の交差ブロッキングアッセイを行えばよい。あるいは、たとえば、Ｃｈａｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４に記載されているように、エピトープマッピングを行い、抗体が目的のエピトープに結合するかどうかを判定してもよい。実施例３および４に記載の方法を含む標準的な方法を用いて、（たとえば、ヒトＣＤ２００Ｒに対する）抗体親和性を測定することもできる。好ましいヒト化抗体は、約１００ｎＭ（１×１０−７Ｍ）以下；好ましくは約１０ｎＭ以下；一層好ましくは約１ｎＭ以下のＫｄ値でヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する抗体である。抗体のＫｄ値が約２００ｐＭ（２×１０−１０Ｍ）、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、さらには２ｐＭ以下である実施形態は、なお一層好ましい。
【０１１３】
本化合物および方法に有用な抗体およびそのフラグメントには、生物学的に活性な抗体およびフラグメントが含まれるが、これに限定されるものではない。本明細書で使用する場合、「生物学的に活性な」という語は、抗体または抗体フラグメントが所望の抗原エピトープに結合し、直接的または間接的に生物学的作用（ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ受容体の阻害活性の活性化など）を発揮できることをいう。本明細書で使用する場合、「特異的」という語は、標的抗原エピトープへの抗体の選択的結合をいう。抗体の結合特異性については、一定の条件下でヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに対する結合と、無関係な抗原または抗原混合物に対する結合とを比較することで検査してもよい。一例を挙げると、無関係な抗原または抗原混合物に対する親和性よりも少なくとも１０倍、好ましくは５０倍高い親和性で、抗体がヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する場合、抗体は特異的であるとみなされる。たとえば、本明細書で使用する場合、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含む融合タンパク質「に特異的に結合する」抗体は、ＩｇＧ１のＦｃ部分単独には結合しないか、あるいは、そのＦｃ部分がヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ以外のタンパク質と融合されている場合、それに結合しない。さらに、限定としてではなく例として、本発明の方法に有用な抗体の抗原結合部位から得られた抗体または結合化合物は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的または選択的に結合するが、ＣＹＳ改変ヒトＣＤ２００ＲＬａ（たとえば、図９および実施例１３を参照）またはヒトＣＤ２００ＲＬａ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合されたヒトＣＤ２００ＲＬａの細胞外ドメイン、たとえば、実施例１３を参照）には特異的または選択的に結合しない。
【０１１４】
Ｖ．抗体の作製
本抗体を組換え技術により作製するには、さらにクローニング（ＤＮＡの増幅）を行ったり、発現させたりするため、本抗体をコードする核酸を単離し、複製可能なベクターに挿入する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡについては、従来の手順により（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）容易に単離し、配列決定できる。多くのベクターが入手可能である。そのベクター成分は通常、以下に限定されるものではないが、シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーターおよび転写終結配列のうち１つまたは複数を含む。一実施形態では、本発明のヒト化抗ヒト阻害性抗体の軽鎖および重鎖はともに、たとえば、プラスミドまたはアデノウイルスベクターのような同じベクターから発現する。
【０１１５】
本発明の抗体については、当該技術分野において公知の任意の方法により作製してもよい。一実施形態では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、マウス骨髄腫ＮＳＯ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣（Ｓｆ９）細胞のような培養中の哺乳動物細胞または昆虫細胞に抗体を発現させる。一実施形態では、ＣＨＯ細胞から分泌される抗体を、プロテインＡクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなど標準的なクロマトグラフ法により回収し、精製する。得られた抗体を濃縮し、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で保管する。
【０１１６】
別の実施形態では、国際公開第２００５／０４０３９５号に記載の方法に従って本発明の抗体を酵母で産生させる。簡単に説明すると、目的の抗体の個々の軽鎖または重鎖をコードするベクターを、異なる酵母半数体細胞、たとえば、交配型が異なる酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（この酵母半数体細胞は、任意に相補的な栄養要求株である）に導入する。次いで、形質転換された半数体酵母細胞を交配または融合させて、重鎖および軽鎖をともに産生できる２倍体酵母細胞を得る。その後、この２倍体株は、完全に構築され生物学的に活性な抗体を分泌できる。二本鎖の相対的な発現レベルについては、たとえば、コピー数が異なるベクターを使用したり、強さが異なる転写プロモーターを使用したり、あるいは、一本鎖または二本鎖をコードする遺伝子の転写を促す誘導性プロモーターから発現を誘導したりすることで、最適化できる。
【０１１７】
一実施形態では、複数種の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（「元の」抗体）の重鎖および軽鎖をそれぞれ酵母半数体細胞に導入して、複数の軽鎖を発現する１つの交配型の半数体酵母菌株ライブラリーと、複数の重鎖を発現する別の交配型の半数体酵母菌株ライブラリーとを作出する。これらの半数体株ライブラリーを接合（またはスフェロプラストとして融合）させて、種々の可能な軽鎖と重鎖の置換からなる抗体のコンビナトリアルライブラリーを発現する一連の２倍体酵母細胞を産生させてもよい。次いで、抗体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして、抗体のいずれかが、元の抗体の特性よりも優れた特性（抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに対するより高い親和性など）を持つかどうかを判定することができる。たとえば、国際公開第２００５／０４０３９５号を参照されたい。
【０１１８】
別の実施形態では、本発明の抗体は、分子量約１３ｋＤａのポリペプチド中で抗体可変ドメインの各部分が連結したヒトドメイン抗体である。たとえば、米国特許出願公開第２００４／０１１０９４１号を参照されたい。そうした単一ドメインの低分子量薬は、合成のしやすさ、安定性および投与経路の面から多くの利点がある。
【０１１９】
ＶＩ．医薬組成物および投与
本発明の抗ｈｕＣＤ２００Ｒ抗体の医薬組成物または無菌組成物を調製するには、この抗体を薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤と混合する。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照されたい。
【０１２０】
治療用および診断用の作用薬剤の調合物については、生理学的に許容されるキャリア、賦形剤または安定剤と混合することで、たとえば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形に調製してもよい（たとえば、Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照）。一実施形態では、本発明の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体を酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５〜６）で適切な濃度に希釈し、等張にするためＮａＣｌまたはスクロースを加える。安定性を高めるため、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などの追加の作用薬剤を加えてもよい。
【０１２１】
単独であるいは別の作用薬剤と組み合わせて投与する抗体組成物の毒性および治療の効力については、たとえば、細胞培養または実験動物を用いてＬＤ５０（集団の５０％致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％治療有効用量）を決定する標準的な薬学的手順で判定できる。毒性作用と治療効果との用量比が、治療指数（ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。好ましいのは、高い治療指数を示す抗体である。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトに使用する範囲の用量を処方する際に用い得る。そうした化合物の投薬量は、好ましくはほとんど毒性がないか、まったく毒性がないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用する剤形および投与経路によってこの範囲内で異なってもよい。
【０１２２】
投与モードは、特に重要ではない。好適な投与経路として、経口投与、直腸投与、経粘膜的または腸投与；筋肉内注射、皮下注射、髄内注射のほか、鞘内注射、室内直接注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注射などの非経口送達が挙げられる。投与に関しては、経口摂取、吸入、通気、局所応用または皮膚注射、経皮注射、皮下注射、腹腔内注射、非経口注射、動脈内注射または静脈内注射など様々な従来のやり方で行ってもよい。患者には静脈内投与が好ましい。
【０１２３】
あるいは、たとえば、関節炎の関節または免疫病理学的に特徴付けられる病原体による病巣に抗体を直接注射することで、全身的ではなく局所的に抗体を投与してもよい。その場合、デポ調合物または徐放性調合物が用いられることが多い。さらに、たとえば、関節炎の関節または免疫病理学的に特徴付けられる病原体による病巣などを標的とする組織特異的抗体でコーティングしたリポソームのような標的薬物送達システムで、抗体を投与しても構わない。リポソームは、患部組織を標的としてそこで選択的に取り込まれる。
【０１２４】
投与レジメンは、治療用抗体の血清または組織代謝回転速度、症状のレベル、治療用抗体の免疫原性および生体マトリックスにおける標的細胞の到達性などのいくつかの要因に依存する。好ましくは、投与レジメンは、標的の病状を改善するのに十分な治療用抗体を送達すると同時に、望ましくない副作用を最小限にとどめる。したがって、送達される生物製剤の量は、個々の治療用抗体および処置対象の症候の重症度にある程度依存する。治療用抗体の適切な用量を選択する際のガイダンスは、入手可能である（たとえば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．）（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｃｈ（ｅｄ．）（１９９３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３；Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９；Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２；Ｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２を参照）。
【０１２５】
適切な用量については、たとえば、当該技術分野において処置に作用することが知られているか、そう疑われているパラメーターまたは因子を用いて、臨床医が決定する。通常、その用量は、至適用量よりもやや少ない量から始め、その後、任意の負の副作用に対して望ましい効果または至適効果が得られるまで少しずつ増量する。重要な診断尺度として、たとえば、炎症、あるいは、産生された炎症性サイトカインのレベルのような症状の尺度が挙げられる。好ましくは、使用する生物製剤は、処置対象の動物と同じ種由来であり、それにより試薬に対する炎症反応、自己免疫反応または増殖反応を最小限にとどめる。ヒト被験者の場合、好ましいのは、たとえば、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体である。
【０１２６】
抗体、抗体フラグメントおよびサイトカインに関しては、持続注入を行ってもよいし、たとえば、毎日、１週間に１〜７回、週に１回、２週間に１回、月に１回、２ヶ月に１回などで投与を行ってもよい。投与量を静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、経直腸、筋肉内、脳内、髄腔内より与えてもよいし、吸入により与えてもよい。１週間の総投与量は通常、体重当たり少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ、より一般的には少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上である（たとえば、Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７−４３４；Ｈｅｒｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２−１６９８；Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１−４５６；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３−１４４を参照）。また、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌまたはそれ以上など、事前に設定した、被検体の血清中の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の標的濃度を達成するように、投与量を与えて構わない。他の実施形態では、本発明のヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体を、被検体当たり１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇを週１回、２週間に１回または「４週間ごとに」皮下または静脈内に投与する。
【０１２７】
本明細書で使用する場合、「阻害する」または「処置する」もしくは「処置」は、障害に関連する症状の発症の遅延および／またはそうした障害の症状の重症度の低下を含む。こうした用語は、制御不能または望ましくない既存の症状の軽減、さらなる症状の予防およびそうした症状の根底にある原因の軽減または予防をさらに含む。したがって、この用語は、障害、疾患または症状のある脊椎動物被検体またはそうした障害、疾患または症状を発症する恐れがある脊椎動物被検体に有益な結果を与えることを意味する。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」、「治療有効用量」および「有効量」という語は、細胞、組織または被検体に単独あるいは追加治療薬と組み合わせて投与したときに、疾患もしくは症候の１つまたは複数の症状、またはそうした疾患または症候の進行の防止または軽減に有効な本発明のヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ結合化合物の量をいう。治療有効用量とはさらに、たとえば、関連性のある医学的状態の処置、治癒、防止または軽減またはそうした状態の処置、治癒、防止または軽減の速度の増加のような症状の軽減を引き起こすのに十分な結合化合物の量もいう。治療有効用量とは、単独投与された個々の活性成分に使用する場合、その単独の成分をいう。治療有効用量とは、併用して使用される場合、併用投与か、連続投与か、同時投与かを問わず、治療効果が得られる活性成分を合わせた量をいう。治療剤が有効量であれば、診断尺度またはパラメーターは少なくとも１０％、普通は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、一層好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％改善する。
【０１２９】
たとえば、サイトカイン、別の治療用抗体、ステロイド、化学療法剤または抗生物質のような第２の治療薬と共投与する方法は、当該技術分野において周知であり、たとえば、Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ  ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｐｏｏｌｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ；Ｃｈａｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡを参照されたい。本発明の医薬組成物は、免疫抑制剤または免疫調節剤をさらに含んでもよい。任意の好適な免疫抑制剤を用いてもよく、抗炎症剤、コルチコステロイド、シクロスポリン、タクロリムス（すなわち、ＦＫ−５０６）、シロリムス、インターフェロン、可溶性サイトカイン受容体（ｓＴＮＲＦおよびｓＩＬ−１Ｒなど）、サイトカイン活性を中和する作用薬剤（インフリキシマブ、エタネルセプトなど）、ミコフェノール酸モフェチル、１５−デオキシスペルグアリン、サリドマイド、グラチラマー、アザチオプリン、レフルノミド、シクロホスファミド、メトトレキサートなどがあるが、これに限定されるものではない。さらに、本医薬組成物は、光線治療および放射線など、他の治療方式と一緒に用いてもよい。
【０１３０】
さらに、本発明のヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ結合化合物は、１つまたは複数の他の治療薬と併用してもよい。限定としてではなく例として、本発明の結合化合物を、サイトカインまたはケモカインと同時に、さらに以下に限定されるものではないが、ＩＬ−１０、ＩＬ−２３、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＧＦ−βなど、他のサイトカインのアンタゴニスト（抗体など）の前後に投与することができる。たとえば、Ｖｅｌｄｈｏｅｎ（２００６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４：１７９−１８９；Ｄｏｎｇ（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（４）：３２９−３３３を参照されたい
ＶＩＩ．用途。
【０１３１】
本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症、関節リウマチ  骨粗鬆症、炎症性線維症（強皮症、肺線維症および肝硬変など）、炎症性腸障害（クローン病、潰瘍性大腸炎および炎症性腸疾患など）、喘息（アレルギー性喘息など）、アレルギー、ＣＯＰＤ、多発性硬化症、乾癬、ぶどう膜炎および癌など、炎症性障害および症候のほか、自己免疫障害および増殖性障害を処置および診断する設計された抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の使用方法を提供する。
【０１３２】
当業者には明らかなように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変形および変更が可能である。本発明は、添付の特許請求の範囲の用語およびその特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲により規定される。以下の実施例を含む本明細書に記載の個々の実施形態は、例示のみを目的として提供するものであり、その細部により本発明の範囲を限定するものではない。
【０１３３】
実施例１
一般的な方法
分子生物学の標準的な方法は、記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。標準的な方法はまた、Ａｕｓｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹにも見られ、細菌細胞でのクローニングおよびＤＮＡ変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳動物細胞および酵母でのクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合糖質およびタンパク質の発現（Ｖｏｌ．３）およびバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）が記載されている。
【０１３４】
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および結晶化などのタンパク質精製法は、記述されている（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。化学的解析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の作製、タンパク質のグリコシル化も記載されている（たとえば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．１６．０．５−１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ｐｐ．４５−８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４−３９１を参照）。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製、精製および断片化に関する記載もある（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，上掲）。リガンド／受容体相互作用の特徴付けを行うための標準的な技法も入手可能である（たとえば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。
【０１３５】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびヒト化抗体は、調製することができる（たとえば、Ｓｈｅｐｅｒｄ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ（ｅｄｓ．）（２０００）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ（ｅｄｓ．）（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．１３９−２４３；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６２０５；Ｈｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７３７１−２７３７８；Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３；Ｆｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９；米国特許第６，３２９，５１１号を参照）。
【０１３６】
ヒト化の代替法は、ファージ上に提示されたヒト抗体ライブラリーまたはトランスジェニックマウスのヒト抗体ライブラリーを使用する（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０９−３１４；Ｂａｒｂａｓ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １：８３７−８３９；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−３７７；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ｄｅ  Ｂｒｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：３９７−３９９）。
【０１３７】
一本鎖抗体およびダイアボディは、記載されている（たとえば、Ｍａｌｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：２１３−２１８；Ｃｏｎｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：７３４６−７３５０；Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−２６２９０；Ｈｕｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｒｔｔ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１７７−１８９；および米国特許第４，９４６，７７８号を参照）。二機能性抗体は、記述されている（たとえば、Ｍａｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７０２１−７０２５；Ｃａｒｔｅｒ（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：７−１５；Ｖｏｌｋｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４：８１５−８２３；Ｓｅｇａｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：１−６；Ｂｒｅｎｎａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３；Ｒａｓｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７６２３；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９Ｉ）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９；および米国特許第５，９３２，４４８号、同第５，５３２，２１０号および同第６，１２９，９１４号を参照）。
【０１３８】
さらに、二重特異性抗体も記述されている（たとえば、Ａｚｚｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３４９３；Ｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６９０１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７４：９１１５；Ｐａｎｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８６３３；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６：１２９９９；Ｐｒｏｐｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：２２１４；Ｌｏｎｇ（１９９９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８７５を参照）。
【０１３９】
抗体の作製には、抗原を精製する必要はない。目的の抗原を持つ細胞で動物を免疫すればよい。その後、免疫動物から脾細胞を単離することができ、その脾細胞を骨髄腫細胞株と融合してハイブリドーマを作製すればよい（たとえば、Ｍｅｙａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：２８３−２９０；Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：２３３−２４２；Ｐｒｅｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，上掲；Ｋａｉｔｈａｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５１５７−５１６４を参照）。
【０１４０】
抗体は、普通、少なくとも約１０−６Ｍ、一般には少なくとも１０−７Ｍ、より一般的には少なくとも１０−８Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−９Ｍ、一層好ましくは少なくとも１０−１０Ｍ、最も好ましくは少なくとも１０−１１ＭのＫｄで結合する（たとえば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：３７９−３８９；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３８：１７−２３；Ｃａｒｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（Ｓｕｐｐｌ．）９：３９８２ｓ−３９９０ｓを参照）。
【０１４１】
抗体については、たとえば、小さな薬物分子、酵素、リポソーム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコンジュゲートしてもよい。こうした抗体は、治療、診断、キットまたは他の目的に有用であり、たとえば、色素、放射性同位元素、酵素または金属（たとえば、コロイド金）に結合した抗体が挙げられる（たとえば、Ｌｅ  Ｄｏｕｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１６９−１７５；Ｇｉｂｅｌｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３８９１−３８９８；Ｈｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｓｈｏｐ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２８０４−２８１１；Ｅｖｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：８８３−８８９を参照）。
【０１４２】
蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリーの方法も、入手可能である（たとえば、Ｏｗｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪを参照）。たとえば、診断試薬として使用する核酸プライマーおよびプローブなどの核酸、ポリペプチドおよび抗体の改変に好適な蛍光試薬は、入手可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【０１４３】
免疫系の組織学の標準的な方法は、記載されている（たとえば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（ｅｄ．）（１９８６）Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｈｉａｔｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｏｌｏｒ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ；Ｌｏｕｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂａｓｉｃ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ  ａｎｄ  Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照）。
【０１４４】
たとえば、抗原性フラグメント、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能ドメイン、グリコシル化部位および配列アライメントを判定するソフトウェアパッケージおよびデータベースは、入手可能である（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂａｙ，Ｎｅｖａｄａ）；  Ｍｅｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６：７４１−７４２；Ｍｅｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｎｏｔｅ  １６：７４１−７４２；Ｗｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７−１８１；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７−２１；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０を参照）。
【実施例】
【０１４５】
（実施例１）
ラット抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒモノクローナル抗体
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに対するモノクローナル抗体を以下のように得た。８週齡の雌Ｌｅｗｉｓラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）に、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したヒト阻害性受容体ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインを含む免疫原性融合タンパク質（参照によりその全体を本明細書に援用するＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：３０３４−３０４６を参照）を連続して注射した。この細胞外の残基については、改変ｐＣＤＭ８．Ｉｇ発現プラスミドのＸｈｏ１部位にサブクローニングした（Ｅ．Ｅ．Ｂａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：５１３）。Ｃｈｅｒｗｉｎｓｋｉ  ｅｔａｌ（２００５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：１３４８）に記載されているように、２９３Ｔまたは２９３ＦＴのトランスフェクションまたは感染後にタンパク質が産生された。注射は、０、１４、３２、４６および８３日目に行った。
【０１４６】
０日目の注射は、フロイント完全アジュバント中のＣＤ２００Ｒ−ヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質を５０μｇ皮下（ｓｃ）注射した。１４、３２および４６日目には、ラットに、フロイント不完全アジュバント中のＣＤ２００ＲヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質を２５μｇ腹腔内（ｉｐ）注射した。８３日目の注射は、不完全フロイントアジュバント中のＣＤ２００Ｒ−ヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質２０μｇのｉｐ注射と、生理食塩水中のＣＤ２００Ｒ−ヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質の静脈内（ｉｖ）注射（尾静脈）とを組み合わせた。
【０１４７】
５３日目に試験採血を行った。８７日目に、１．６×１０８脾細胞および１．８×１０８骨髄腫細胞を用いてラット脾細胞の融合を行い、３０枚の９６ウェルプレートに分け、全体で１ウェル当たりの細胞総数を１．１３×１０５とした。
【０１４８】
得られたモノクローナル抗体（数千）の一次スクリーニングを、ＣＤ２００Ｒ−ヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質の間接ＥＬＩＳＡで行った。得られた抗体の二次スクリーニングでは、ヒトＣＤ２００Ｒを発現しているトランスフェクタントおよびヒト培養ヒトマスト細胞の特異的染色を行った。。引き続き実験を行い、ヒトＣＤ２００Ｒを発現しているマスト細胞に候補抗体が結合できることと、その抗体が様々な治療目的、診断目的および／または研究目的に有用であることを確認した。そうしたスクリーニングを、本明細書にその例を記載する結合アッセイ（間接ＥＬＩＳＡまたはサンドイッチＥＬＩＳＡなど）、インビトロ活性アッセイまたはインビボ活性アッセイにより行ってもよい。
【０１４９】
ＨＣ６１２でＤＸ１７６、ＤＸ１７７およびＤＸ１７８を作製し、ＨＣ６１８でＤｘ１８２およびＤＸ１８４を作製した。
【０１５０】
阻害性ｃｙｎｏＣＤ２００Ｒ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメイン）をＢａｌｂ／ｃ雌マウスの免疫原として用いて、上述の方法によりマウス抗ｃｙｎｏＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ２４８を作製した。マウス抗ｃｙｎｏＣＤ２００Ｒ（ＤＸ２４８）については、ＨＣ８０９で作製した。ハイブリドーマを、２００７年１２月  日にＡＴＣＣ受託番号 のＨＣ８０９．１４Ｆ１２．６．ＤＸ２４８．３株として寄託した。作製した抗体のアイソタイプは、マウスＩｇＧ１−κである。
（実施例２）
ラット抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体のヒト化
開示内容の全体を参照によって本明細書に援用する国際公開第２００５／０４７３２４号および国際公開第２００５／０４７３２６号に本質的に記載されているように、ラット抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒモノクローナル抗体ｈｕＤＸ１８２のヒト化を行った。簡単に説明すると、ヒト定常ドメインを用いて親（ラット）定常ドメインを置き換え、ラット可変ドメイン配列に相同的なヒト生殖細胞系配列を選択し、以下により詳細に記載されているように、これを用いてラットＣＤＲのヒトフレームワークを得た。
【０１５１】
ヒト生殖細胞系フレームワーク配列の選択手順
本発明の抗ヒトヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体のヒト化において適切な生殖細胞系フレームワーク配列を選択するには、以下のステップを用いる。
【０１５２】
１）非ヒトＶＬドメインおよびＶＨドメインのクローニングおよび配列決定と、アミノ酸配列の決定。
【０１５３】
重鎖
２）非ヒトＶＨ配列と５つのヒトＶＨ生殖細胞系アミノ酸配列（サブグループＩＧＨＶ１およびＩＧＨＶ４から１つの代表配列とサブグループＩＧＨＶ３から３つの代表配列）の群とを比較する。ＶＨサブグループについては、Ｍ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ（２００１）「Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｈｅａｖｙ（ＩＧＨ）Ｇｅｎｅｓ」，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８：１００−１１６に記載されている。５つの生殖細胞系配列との比較を以下のように行う：
Ａ）Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）に従って、非ヒトＶＨ配列残基に番号を割り当てる。
【０１５４】
Ｂ）非ヒトＶＨ配列を５つのヒト生殖細胞系配列それぞれと整列させる。Ｖ遺伝子はＶＨ残基１〜９４しか含まないため、アライメントではこれらの残基のみを考慮する。
【０１５５】
Ｃ）その配列中の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク（ＦＲ）領域を区切る。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）（Ｉｄ．）およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６：９０１−９１７に記載の定義の組み合わせにとしてＣＤＲおよびＦＲを定義する。したがって、定義では、ＶＨＣＤＲ１＝２６〜３５、ＣＤＲ２＝５０〜６５、ＣＤＲ３＝９５〜１０２である。
【０１５６】
Ｄ）以下に記載する各残基位置（表４）の場合、非ヒト配列およびヒト配列が同一である各残基の位置に数値スコアを割り当てる：
【０１５７】
【表４−１】
2010512791.tif 000006
【０１５８】
【表４−２】
2010512791.tif 000007
Ｅ）すべての残基位置のスコアを合計する。合計スコアが最も高い配列がアクセプター生殖細胞系配列となる。２つ以上の生殖細胞系配列のスコアが同一である場合：
１）以下の残基位置において、非ヒトおよびヒト配列が同一である各位置の全体に１を加える：１、３、５〜２３、２５、３６、３８、４０〜４３、４６、６６、６８、７０、７２、７４、７５、７７、７９〜９０、９２（最大４９）。
【０１５９】
２）合計スコアが最も高い配列がアクセプター生殖細胞系配列となる。２つ以上の生殖細胞系配列のスコアがなお同一である場合、どちらの配列もアクセプターとして容認できる。
【０１６０】
軽鎖
ＩＩＩ）ＶＬ配列がＶＬのκサブクラスのメンバーである場合、非ヒトＶＬ配列と４つのヒトＶＬκ生殖細胞系アミノ酸配列とを比較する。この４配列の群は、Ｂａｒｂｉｅ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ（１９９８）「Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｋａｐｐａ  Ｖａｒｉａｂｌｅ（ＩＧＫＶ）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｉｎｇ（ＩＧＫＪ）Ｓｅｇｍｅｎｔｓ」，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１７１−１８３，ａｎｄ  Ｍ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ（２００１）「Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｋａｐｐａ（ＩＧＫ）Ｇｅｎｅｓ」，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８：１６１−１７４に記載された４つの確立したヒトＶＬサブグループ各々からの代表配列１つずつからなる。また、この４つのサブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）の１０３〜１３０頁に記載の４つのサブグループとも一致する。この４つの生殖細胞系配列との比較を以下のように行う：
Ａ）Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）に従って、非ヒトＶＬ配列残基に番号を割り当てる。
【０１６１】
Ｂ）非ヒトＶＬ配列を４つのヒト生殖細胞系配列それぞれと整列させる。Ｖ遺伝子はＶＬ残基１〜９５しか含まないため、アライメントではこれらの残基のみを考慮する。
【０１６２】
Ｃ）配列中の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク（ＦＲ）領域を区切る。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６：９０１−９１７に記載の定義の組み合わせとしてＣＤＲおよびＦＲを定義する。したがって、定義では、ＶＬＣＤＲ１＝２４〜３４、ＣＤＲ２＝５０〜５６、ＣＤＲ３＝８９〜９７である。
【０１６３】
Ｄ）以下に記載する各残基位置（表２）の場合、非ヒト配列およびヒト配列が同一である各残基の位置に数値スコアを割り当てる：
【０１６４】
【表５】
2010512791.tif 000008
Ｅ）すべての残基位置のスコアを合計する。合計スコアが最も高い配列がアクセプター生殖細胞系配列となる。２つ以上の生殖細胞系配列のスコアが同一である場合：
１）以下の残基位置において、非ヒトおよびヒト配列が同一である各位置の全体に１を加える：１、３、５〜２３、３５、３７、３９〜４２、５７、５９〜６１、６３、６５〜７０、７２〜８６、８８。
【０１６５】
２）合計スコアが最も高い配列がアクセプター生殖細胞系配列となる。２つ以上の生殖細胞系配列のスコアがなお同一である場合、どちらの配列もアクセプターとして容認できる。
【０１６６】
ＶＬ配列がＶＬのλサブクラスのメンバーである場合、上記の文献からのヒトＶＬλ生殖細胞系アミノ酸配列を用いて類似の手順を行う。
【０１６７】
抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体のヒト化
定常ドメインの改変に関しては、抗体ｈｕＤＸ１８２（ラット抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ）の可変軽ドメインおよび重ドメインをクローニングし、それぞれヒトκ軽鎖（ＣＬドメイン）およびヒトＩｇＧ１重鎖（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）と融合した。このラット可変ドメインおよびヒト定常ドメインの組み合わせは、キメラ型の抗体ｈｕＤＸ１８２を含む。
【０１６８】
可変ドメインのフレームワーク領域の改変に関しては、抗体ＤＸ１８２のＶＨドメインのアミノ酸配列を、５つのヒトＶＨ生殖細胞系アミノ酸配列（サブグループＩＧＨＶ１およびＩＧＨＶ４からの１つの代表配列とサブグループＩＧＨＶ３からの３つの代表配列）の群と比較した。ＶＨサブグループについては、Ｍ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ，「Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｈｅａｖｙ（ＩＧＨ）Ｇｅｎｅｓ」，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８：１００−１１６，２００１に記載されている。サブグループＩＶのヒト重鎖生殖細胞系ＤＰ−７１に対して、抗体１６Ｃ１０のスコアが最も高かった。
【０１６９】
ＤＸ１８２のＶＬ配列は、κサブクラスであった。この配列を４つのヒトＶＬκ生殖細胞系アミノ酸配列の群と比較した。この４配列の群は、Ｖ．Ｂａｒｂｉｅ  ＆  Ｍ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ，「Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｋａｐｐａ  Ｖａｒｉａｂｌｅ（ＩＧＫＶ）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｉｎｇ（ＩＧＫＪ）Ｓｅｇｍｅｎｔｓ」，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１７１−１８３，１９９８  ａｎｄ  Ｍ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ，「Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｋａｐｐａ（ＩＧＫ）Ｇｅｎｅｓ」，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８：１６１−１７４，２００１に記載された４つの確立したヒトＶＬサブグループの各々からの代表配列１つずつからなる。また、この４つのサブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）の１０３〜１３０頁に記載の４つのサブグループとも一致する。サブグループＩＩのヒト軽鎖生殖細胞系Ｚ−０１２に対して、抗体ＤＸ１８２のスコアが最も高かった。
【０１７０】
所望の生殖細胞系フレームワーク配列を判定したら、全長ヒト化可変重鎖および軽鎖をコードするプラスミドを作製した。ヒトフレームワーク残基への親ラット抗体ＤＸ１８２のフレームワーク残基の置換は、ヒトフレームワーク配列へのラットＤＸ１８２ＣＤＲの移植と同じと見なしてもよい。本明細書では、得られた抗体を「ｈｕＤＸ１８２ｗｔ」という。「ｗｔ」は、最適化ＣＤＲと区別できるように、親ラットＤＸ１８２と同じＣＤＲが存在することを示す
発現が最適になるように、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方についてコドン最適化を行い、合成し、定常ドメインに挿入した。コドン最適化に関しては、クローン化抗体の発現を促進する場合があるが、まったく任意である。
【０１７１】
ヒト化抗体ＤＸ１８２の軽鎖アミノ酸配列および重鎖アミノ酸配列をそれぞれ図３（配列番号４９）および図４（配列番号５０）に示す。命名法に関し明確にするためには、Ｋａｂａｔ番号付けシステムが、様々な抗体におけるＣＤＲ領域およびフレームワーク領域の長さの変化に対応する非数値のアミノ酸残基の表示（例えば、ＶＨ残基８３ａ、８３ｂ、８３ｃ）を含んでいることを理解することが重要である。この番号付けシステムは、長さが異なるＣＤＲを持つ様々な抗体において、対応するアミノ酸残基を参照しやすくするのには都合がよいが、厳密な連続数値の配列番号付け（配列表など）と比べるとき、特定のアミノ酸残基の表示が矛盾することがある。本明細書におけるアミノ酸残基の表示は、他に記載がない限り、たとえば、「Ｋａｂａｔ番号付け」を参考として関連する配列表を参照して行われる。
【０１７２】
配列番号５０および４９は、Ｎ末端にシグナルペプチドを含まない、成熟型のタンパク質を示す。成熟型のタンパク質とは、シグナル配列を含まないタンパク質である。配列番号５１および５３は、Ｎ末端にシグナルペプチドを含む。
【０１７３】
図９は、ＤＸ２４８抗体（ａｎｔｉｂｄｏｙ）のヒト化軽ドメインおよび重ドメインの例示的な説明図である。
（実施例３）
Ｋｉｎｅｘａ技術によるラットａｎｔヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の平衡解離定数（Ｋｄ）の測定
ＫｉｎＥｘＡ３０００機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ，ＵＳＡ）を用いて、抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の平衡解離定数（Ｋｄ）を測定した。ＫｉｎＥｘＡは、抗体、抗原および抗体抗原複合体の混合物における、複合体を形成していない抗体の濃度の測定を基に、結合平衡除外アッセイ法（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｍｅｔｈｏｄ）の原理を使用する。たとえば、Ｄａｒｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｒａｕｌｔ（２００４）Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２（６）：６４７−５７を参照されたい。この混合物を、固相に固定化した抗原に非常に短時間曝露して、遊離抗体の濃度を測定する。実際にこれを行うには、溶液相の抗原抗体混合物を、フローセルにトラップされた抗原被覆粒子を通過するように流す。この機器から得られたデータを特注のソフトウェアで解析する。平衡定数は、以下の仮定に基づき、数学的理論を用いて算出する：
１．結合は、平衡状態にある可逆的な以下の結合式に従う：
ｋｏｎ［Ａｂ］［Ａｇ］＝ｋｏｆｆ［ＡｂＡｇ］、式中、Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ
２．抗体（Ａｂ）および抗原（Ａｇ）は、１：１で結合し、全抗体は、抗原抗体複合体（ＡｂＡｇ）と遊離抗体の和に等しい。
【０１７４】
３．機器シグナルは、遊離抗体濃度と直線的な関係を示す。
【０１７５】
いくつかのラット抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体．、そのヒト化改変体、およびそれらのヒト化抗体の配列改変体についてＫｉｎＥｘＡ  解析を行った。ＫｉｎＥｘＡの測定ごとに、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したヒト阻害性受容体ＣＤ２００Ｒの細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｅｕｌａｒ）ドメインからなる融合タンパク質（参照によってその全体を本明細書に援用するＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：３０３４−３０４６を参照）を固定化相と溶液相の両方で用いた。Ｓａｐｉｄｙｎｅ「Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏａｔｉｎｇ  ＰＭＭＡ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｓｈｏｒｔ  ｏｒ  ｎｏｎｅｘｉｓｔｅｎｔ  ｌｉｎｋｅｒ  ａｒｍｓ」に従って、ポリ（メチル−メタクリレート）（ＰＭＭＡ）粒子（９８ミクロン）をビオチン化ヒトＣＤ２００Ｒ−Ｉｇでコーティングした。ＫｉｎＥｘＡ３０００マニュアルに従って、すべての実験手順を行った。すべての実験を二重反復で実施した。
【０１７６】
ＫｉｎＥｘＡの条件を表６に示す。
【０１７７】
【表６】
2010512791.tif 000009
抗原の２倍希釈系列を調製し、一定濃度で抗体と混合した。この混合物を２５℃で２時間インキュベートして平衡化した。
【０１７８】
【表７】
2010512791.tif 000010
（実施例４）
Ｂｉａｃｏｒｅ技術を用いたラットａｎｔヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の平衡解離定数（Ｋｄ）の測定
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したヒト阻害性受容体ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインからなる融合タンパク質（参照によってその全体を本明細書に援用するＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：３０３４−３０４６を参照）に対する抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の速度論的結合活性を、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００システム（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて表面プラズモン共鳴により測定した。アッセイフォーマットには、移動相中の抗ｈｕＣＤ２００Ｒ抗体の滴定により抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγで捕捉した融合タンパク質を使用した。約５０００ＲＵのＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，Ｆｃγ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ  Ｎｏ．１０９−００６−０９８）を、アミンカップリング化学によりセンサーチップＣＭ５（リサーチグレード、ＢＲ−１０００−１４）に固定化した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＢＲ−１００１−８８）を、５μＬ／分の流速でランニングバッファーとして用いた。各解析サイクルの前に、ｈｕＣＤ２００Ｒをチップに新たに飽和させた。様々な濃度（１３３および１３．３ｎＭ）の抗ｈｕＣＤ２００Ｒ抗体を、５μＬ／分の流速で、捕捉したｈｕＣＤ２００Ｒ表面に注入した。各注入サイクル後、ＣＭ５チップの表面を、５０μＬ／分の溶液流速で一連の溶液（１０ｍＭのＨＣｌおよび１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５）を用いて再生させた。
【０１７９】
結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）ならびに平衡解離定数ＫDの解析には、バックグラウンドを除去した結合センサーグラムを用いた。得られたデータセットを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．０．１）を用いてアナライトの二価モデルでフィッティングした。
【０１８０】
【表８】
2010512791.tif 000011
（実施例５）
ラット抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体に対するマスト細胞の脱顆粒アッセイ
マウスのマスト細胞の脱顆粒バイオアッセイで、ラット抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体がヒト阻害性ＣＤ２００Ｒを活性化する能力を測定した。。骨髄由来のマウスのマスト細胞株をトランスフェクトしてヒト阻害性ＣＤ２００Ｒを発現させ、抗体がマスト細胞の脱顆粒を阻害する能力を評価した。
【０１８１】
材料および方法
マスト細胞株：マウスのマスト細胞株はＣ５７ＢＬ６マウスの骨髄由来であった（Ｗｒｉｇｈｔ，ＧＪ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：３０３４）。全長ヒトＣＤ２００ＲをコードするｃＤＮＡをｐＭＸｎｅｏレトロウイルス発現ベクター（Ｔ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｙｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎから提供）にサブクローニングした。プラスミドＤＮＡをＰｈｏｅｎｉｘエコトロピックウイルスパッケージング細胞株（Ｇａｒｙ  Ｎｏｌａｎ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡから提供）．にトランスフェクトし、得られたウイルスを用いてマウスのマスト細胞に感染させ、続いて、これを、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地で選択した（Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：３２４の方法）。薬剤選択条件で１〜２週間後、フローサイトメトリーにより、受容体特異的抗体を用いて細胞表面上の受容体の発現について細胞を解析した。
【０１８２】
脱顆粒アッセイ：抗体：ＤＸ１７６、ＤＸ１７７、ＤＸ１７８、ＤＸ１８４、ＤＸ１８５、ＤＸ１８２およびラットＩｇＧ２ａ（アイソタイプコントロール抗体、Ｐｈａｒｍｉｎｏｇｅｎ＃５５３９２６）。刺激：ＤＸ８９、抗マウスＣＤ２００ＲＬａ（マウスの活性化ＣＤ２００Ｒ）
９６ウェル平底プレートの５０ｕｌのアッセイ培地（ＲＰＭＩ、１％ＢＳＡ、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ）中で、抗ＣＤ２００Ｒ抗体またはアイソタイプコントロールの滴定を行った。ｈｕＣＤ２００Ｒを発現しているマウスのマスト細胞（ＤＴ７６２）を遠沈させ、４×１０６／ｍｌで再懸濁し、５０ｕｌ／ウェルを抗体滴定物に加え、室温で２０分間インキュベートした。次いで、最終濃度が０．１ｕｇ／ｍｌになるように、刺激抗体ＤＸ８９（抗マウス活性化ＣＤ２００Ｒｌａ、Ｚｈａｎｇ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：６７８６）を５０ｕｌ／ウェル加えた。細胞を、３７°、５％ＣＯ２で１時間培養した。刺激時間の終了時に、各ウェルから２０ｕｌを取り出し、６０ｕｌの１．３ｍｇ／ｍｌβ−ヘキソサミニダーゼ基質（４−ニトロフェニＮ−アセチル−ｂ−Ｄ−グルコサミニド（４−ＮｉｔｒｏｐｈｅｎｙＮ−ａｃｅｔｙｌ−ｂ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ），Ｓｉｇｍａ  Ｎ９３７６）に移した。上清／基質反応を３７℃で３．５時間進行させた。０．２Ｍのグリシン（ｐＨ１０．７）を加えて反応を止め、ＯＤ４０５−６５０を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて測定し、脱顆粒の程度を評価した。結果を図７に示す。
【０１８３】
目的の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体のＩＣ５０は、マスト細胞の脱顆粒レベルを、添加抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の非存在下で観察されるレベルの約５０％まで阻害するのに必要な抗体の濃度である。
（実施例６）
ヒト化ラット抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体のマスト細胞脱顆粒アッセイ
ヒトＣＤ２００Ｒを発現しているマウスマスト細胞を用いて、脱顆粒を阻害するヒト化ＤＸ１８２の能力を評価した。また、フローサイトメトリーで測定して、ヒト化ＤＸ１８２の細胞に結合する能力も評価した。
【０１８４】
材料および方法：
細胞：ヒトＣＤ２００Ｒを発現させるためトランスフェクトされた骨髄由来のマウスのマスト細胞株（ＤＴ７６２）。
【０１８５】
抗体：ＰＡＢ１２１９、ラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ
ＰＡＢ１３３７、組換えヒトＤＸ１８２
ＰＡＢ１３３７、組換えヒトＤＸ１８２、バルク薬物
ＰＡＢ１３３６、（希釈ＰＡＢ１３３７）
ラットＩｇＧ２ａ、アイソタイプコントロール抗体、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃５５３９２６
刺激物：ＤＸ８９抗マウスＣＤ２００ＲＬａ（マウス活性化ＣＤ２００Ｒ）
脱顆粒アッセイ：実施例５に記載されているように、脱顆粒アッセイを行った。９６ウェル平底プレートの５０ｕｌのアッセイ培地（ＲＰＭＩ、１％ＢＳＡ、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ）中で、抗ＣＤ２００Ｒ抗体またはアイソタイプコントロールの滴定を行った。ｈｕＣＤ２００Ｒを発現しているマウスマスト細胞（ＤＴ７６２）を遠沈させ、４×１０６／ｍｌで再懸濁し、５０ｕｌ／ウェルを抗体滴定物に加え、室温で２０分間インキュベートした。次いで、最終濃度が０．１ｕｇ／ｍｌになるように、刺激抗体ＤＸ８９を５０ｕｌ／ウェル加えた。細胞を、３７°、５％ＣＯ２で１時間培養した。刺激時間の終了時に、各ウェルから２０ｕｌを取り出し、６０ｕｌの１．３ｍｇ／ｍｌβ−ヘキソサミニダーゼ基質（４−ニトロフェニＮ−アセチル−ｂ−Ｄ−グルコサミニド，Ｓｉｇｍａ  Ｎ９３７６）に移した。上清／基質反応を３７℃で３．５時間進行させた。０．２Ｍのグリシン（ｐＨ１０．７）を加えて反応を止め、ＯＤ４０５−６５０を測定し、脱顆粒の程度を評価した。結果を図８に示す。
【０１８６】
フローサイトメトリー：Ｃｄ２００Ｒを発現する細胞に対する抗ＣＤ２００Ｒ抗体の結合をフローサイトメトリーにより評価した。１００ｕｌのアッセイ培地（Ｄ−ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ３）で、ＤＴ７６２細胞を１０ｕｇ／ｍｌの抗体、５×１０５細胞と４℃で３０分インキュベートした。細胞を洗浄し、１０ｕｇ／ｍｌの、ラットＤＸ１８２にはヤギ抗ラットＰＥ（Ｃａｌｔａｇ  Ｒ４０００４−３）と、あるいは、ｒｈｕＤＸ１８２にはヤギ抗ヒトＰＥ（Ｃａｌｔａｇ  Ｈ１０１０４）（５０ｕｌ／サンプル）と４℃で２０分インキュベートした。染色後、細胞を２回洗浄し、２５０ｕｌで再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒおよび添付のソフトウェア（Ｂ−Ｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。脱顆粒の程度を評価するため測定した結果を図８．に示す。の結果については図７に示す。
（実施例７）
マウス抗ｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（ＤＸ２４８）のマスト細胞脱顆粒アッセイ
ヒトＣＤ２００Ｒを発現しているマウスのマスト細胞（ＤＴ７６２）を用いて、脱顆粒を阻害するヒト化ＤＸ１８２の能力を評価した。また、フローサイトメトリーで測定して、ヒト化ＤＸ１８２の細胞に結合する能力も評価した。
【０１８７】
実施例５に記載されているように、脱顆粒アッセイを行った。使用した抗体（およびロット番号）は、ラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ、ＤＸ１８２、ＰＡＢ１２１９；組換えヒトＤＸ１８２、バルク薬物、ＰＡＢ１３３７、ＳＣＨ１３７２３９１；調合化ＳＣＨ１３７２３９１（希釈ＰＡＢ１３３７）、ＰＡＢ１３３６；ラットＩｇＧ２ａ、アイソタイプコントロール抗体、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃５５３９２６であった。
【０１８８】
ＤＴ７６２細胞に対する抗ＣＤ２００Ｒ抗体の結合をフローサイトメトリーにより評価した。１００ｕｌのアッセイ培地（Ｄ−ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ３）で、ＤＴ７６２細胞を１０ｕｇ／ｍｌの抗体、５×１０５細胞と４℃で３０分インキュベートした。細胞を洗浄し、１０ｕｇ／ｍｌの、ラットＤＸ１８２にはヤギ抗ラットＰＥ（Ｃａｌｔａｇ  Ｒ４０００４−３）と、あるいは、ｒｈｕＤＸ１８２にはヤギ抗ヒトＰＥ（Ｃａｌｔａｇ  Ｈ１０１０４）（５０ｕｌ／サンプル）と、４℃で２０分インキュベートした。染色後、細胞を２回洗浄し、２５０ｕｌで再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒおよび添付のソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。結果を図８に示す。未染色細胞およびアイソタイプコントロール細胞はヒストグラムの左側のプロットで示され、ＤＸ１８２のヒストグラム（ｈｉｓｔｏｒｇｒａｍ）はプロットのはるか右側に示される。
【０１８９】
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ融合タンパク質をＢａｌｂ／ｃ雌マウスの免疫原として用いて、実施例１に記載されているのと同じ方法により、マウス抗ｃｙｎｏＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ２４８を作製した。脱顆粒およびフローサイトメトリー法は、実施例５に記載されているとおりであった。使用した抗体（およびロット番号）は、ラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ、ＤＸ１８２、ＰＡＢ１２１９；マウス抗カニクイザルＣＤ２００Ｒ、ＤＸ２４８、ＰＡＢ７６６、ラットＩｇＧ２ａ、アイソタイプコントロール抗体、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃５５３９２６；マウスＩｇＧ１、アイソタイプコントロール抗体であった。ＤＸ２４８は、細胞に結合し（図１０Ｂ）、脱顆粒を阻害した（図１０Ａ）。
（実施例８）
Ｂｉａｃｏｒｅ技術を用いたラットａｎｔヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の平衡解離定数（Ｋｄ）の測定
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したヒト阻害性受容体ＣＤ２００Ｒの細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｅｕｌａｒ）ドメインからなる融合タンパク質（参照によってその全体を本明細書に援用するＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：３０３４−３０４６を参照）に対する抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の速度論的結合活性を、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００システム（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、表面プラズモン共鳴により測定した。アッセイフォーマットには、移動相中の抗ｈｕＣＤ２００Ｒ抗体の滴定により抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγで捕捉した融合タンパク質を使用した。約５０００ＲＵのＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，Ｆｃγ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ  Ｎｏ．１０９−００６−０９８）を、アミンカップリング化学によりセンサーチップＣＭ５（リサーチグレード、ＢＲ−１０００−１４）に固定化した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＢＲ−１００１−８８）を、５μＬ／分の流速でランニングバッファーとして用いた。各解析サイクルの前に、ｈｕＣＤ２００Ｒをチップに新たに飽和させた。０．８２〜６００ｎＭ（７希釈点）の範囲にある様々な濃度の抗ｈｕＣＤ２００Ｒ抗体を、３０μＬ／分の流速で、捕捉したｈｕＣＤ２００Ｒ表面に注入した。各注入サイクル後、ＣＭ５チップの表面を、７５μＬ／分の溶液流速で一連の溶液（１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５および２５ｍＭのＮａＯＨ）を用いて再生させた。
【０１９０】
結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）ならびに平衡解離定数ＫＤの解析には、バックグラウンドを除去した結合センサーグラムを用いた。得られたデータセットを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．０．１）を用いてアナライトの二価モデルでフィッティングした。
【０１９１】
【表９】
2010512791.tif 000012
（実施例９）
ＤＸ１８２は、カニクイザルＣＤ２００Ｒを認識する
材料および方法：カニクイザルマスト細胞を、ヒト幹細胞因子およびヒトＩＬ−６の存在下で、末梢血単核球から培養した。インキュベーションから３ヶ月後、これらの培養物は、９５％がＣＤ１１７およびＦｃｅＲＩを発現するマスト細胞であった。このマスト細胞を、ヒトＩＬ−４およびヒトＩｇＥでさらに２週間培養し、これらの細胞の細胞表面に発現したＦｃｅＲＩを充填し、予備刺激した。
【０１９２】
フローサイトメトリー：１００ｕｌのアッセイ培地（Ｄ−ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ３）で、カニクイザルマスト細胞を、１０ｕｇ／ｍｌの抗体、５×１０５細胞と４℃で３０分インキュベートした。細胞を洗浄し、１０ｕｇ／ｍｌの、ラットＤＸ１８２、ラットＤＸ４９にはヤギ抗ラットＰＥ（Ｃａｌｔａｇ  Ｒ４０００４−３）と、あるいは、抗ＣＤ１１７にはヤギ抗マウスＰＥ（Ｃａｌｔａｇ  Ｍ３０００４）および、およびＦｃｅＲＩ（５０ｕｌ／サンプル）と、４℃で２０分インキュベートした。染色後、細胞を２回洗浄し、２５０ｕｌで再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒおよび添付のソフトウェア（Ｂ−Ｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。結果を図１１に示す
脱顆粒アッセイ：９６ウェル平底プレートの５０ｕｌのアッセイ培地（ＲＰＭＩ、１％ＢＳＡ、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ）中で、抗ＣＤ２００Ｒ（ＤＸ１８２）抗体の滴定を行った。ＣＤ２００Ｒを発現しているカニクイザルマスト細胞を遠沈させ、４×１０６／ｍｌで再懸濁し、５０ｕｌ／ウェルを抗体滴定物に加え、室温で２０分間インキュベートした。次いで、この細胞をプレートで２回洗浄し、ヤギ抗ラット（１０ｕｇ／ｍｌ）と架橋させた。次いで、最終濃度が８０ｎｇ／ｍｌになるように、刺激抗体、抗ＦｃｅＲＩを５０ｕｌ／ウェル加えた。アイソタイプコントロール抗体については、５０ｕｇ／ｍｌの最高濃度で使用した。細胞を、３７°、５％ＣＯ２で１時間培養した。刺激時間の終了時に、各ウェルから５０ｕｌを取り出し、以前に公表されているように（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００５，１７４：１３４８−１３５６）、上清に放出されるマスト細胞特異的トリプターゼを測定して脱顆粒を定量した。結果を図１２に示す。
（実施例１０）
回虫アレルギー性カニクイザルの実験
回虫をチャレンジしたカニクイザル２匹をラット抗ヒト阻害性ＤＸ１８２で処置した。以下は、その処置に関する実験を要約したものである。回虫のチャレンジ後に、このアレルギー性サル２匹をラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体で処置すると、気道抵抗が急速かつ顕著に増大し、血圧が低下し、心拍数が増加した。
【０１９３】
カニクイザルは、回虫抗原の吸入に対して自然のアレルギー性過敏症を示す。回虫抗原を吸入すると、直ちにマスト細胞依存性気管支収縮が起こるが、これは、エアロゾル抗原の曝露から１０〜２０分以内に測定することができる。
【０１９４】
インビトロ実験では、ＤＸ１８２およびｈｕＤＸ１８２はカニクイザルＣＤ２００Ｒに結合し、および、ＦｃξＲＩが介在するカニクイザルのマスト細胞の脱顆粒反応を阻害した。
【０１９５】
回虫抗原の吸入の前に、アレルギー性および非アレルギー性カニクイザル（アレルギー性２例、非アレルギー性２例）の小さなコホートを用いて、８ｍｇ／ｋｇ濃度のｉ．ｖ（静脈内）でＤＸ１８２抗体の薬物動態（ＰＫ）および毒性を評価した。ＤＸ１８２のＰＫでは、半減期は１．３日であった。抗原をチャレンジしていないサルでは、ＤＸ１８２（８ｍｇ／ｋｇ静脈内）は忍容性が高く、全身性毒性または心血管毒性の明らかに有害な徴候は見られなかった。
【０１９６】
アレルギー性カニクイザルを用いて、気管支収縮に対するＤＸ１８２抗体の作用を評価した。エアロゾル抗原曝露の曝露の４８時間前に、回虫アレルギー性サルに、Ｄｘ１８２（サル１０匹）あるいはアイソタイプコントロール抗体（サル１０匹）を８ｍｇ／ｋｇで静脈内投与し、引き続いてアレルギー性気管支収縮による気道抵抗の増加をモニターした。抗原の吸入曝露を行うと、ＤＸ１８２で処置した２匹のサルで気道抵抗が急速かつ顕著に増大し、血圧が低下し、心拍数が増加したため、抗原曝露段階の開始時点で本研究を終了した。アイソタイプコントロール抗体を投与したサルは、予期しない生理学的反応を示さなかった。
（実施例１１）
ヒトおよびＣＹＮＯにおけるＣＤ２００Ｒ遺伝子およびＣＤ２００ＲＬＡ遺伝子
カニクイザルにおけるＣＤ２００ＲＬａ遺伝子の発現：ヒトおよび非ヒト霊長類のＣＤ２００ＲＬａ遺伝子の配列アライメント解析により、カニクイザルおよびアカゲザルのＣＤ２００ＲＬａ遺伝子は、ヒトおよびチンパンジーＣＤ２００ＲＬａの遺伝子に存在しない２つの重要なシステインを維持していることが明らかになった。カニクイザルのＣＤ２００ＲＬａ配列中にこうしたシステインが含まれていることから、この遺伝子がＤａｐ１２と対を形成し、適切に誘導されれば、強力な活性化シグナルを伝えることができる機能的な細胞表面タンパク質を産生し得ることが示唆された。配列アライメントを図１３に示す。
【０１９７】
以下に、ヒトＣＤ２００Ｒ核酸コード配列およびタンパク質配列と、ヒトＣＤ２００ＲＬａ核酸およびタンパク質配列とを記載する。
【０１９８】
【化１】
2010512791.tif 000013
【０１９９】
【化２】
2010512791.tif 000014
以下に、ヒトＣＹＳ改変ＣＤ２００ＲＬａの核酸コード配列およびヒトＣＹＳ改変ＣＤ２００ＲＬａのタンパク質配列を記載する。ＣＹＳ改変ＣＤ２００ＲＬａについては、ヒトＣＤ２００ＲＬａの部位（ｃｉｔｅ）特異的変異誘発により得た。部位特異的変異誘発に使用したプライマーは、以下のとおりである：
【０２００】
【化３】
2010512791.tif 000015
【０２０１】
【化４】
2010512791.tif 000016
以下のプライマーを用いて、ｃｙｎｏマスト細胞ｃＤＮＡライブラリーからｃｙｎｏＣＤ２００ＲＬａを得た：ＣＡＡＡＴＧＣＡＣＡＣＴＴＴＡＧＧＡＡＡＧＡＴＧおよびＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＴＧ。以下のプライマーを用いて、ｃｙｎｏ肺ｃＤＮＡライブラリーからｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２００ＲｃＤＮＡを得た。：ＡＴＧＣＴＣＴＧＣＣＣＴＴＧＧＡＧＡＡＣおよびＡＧＡＧＴＣＣＡＡＣＡＡＣＴＴＡＴＡＡＡＧＴ。
【０２０２】
【化５】
2010512791.tif 000017
【０２０３】
【化６】
2010512791.tif 000018
カニクイザルＣＤ２００ＲＬａによるマウスマスト細胞のトランスフェクション：カニクイザル活性化ＣＤ２００ＲＬａに対するラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ１８２の結合能をフローサイトメトリーにより評価した。実施例５に記載の方法を用いて、マウスのマスト細胞株またはプレＢ細胞株Ｂａ／Ｆ３（Ｔ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｙｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎから提供）をトランスフェクトしてｃｙｎｏＣＤ２００ＲＬａを発現させた。ＢａＦ／３におけるＣＤ２００ＲＬａタンパク質の発現の場合、Ｎ末端にＦＬＡＧエピトープを含むシグナル伝達分子ＤＡＰ１２（Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：７０３）を共発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出できるようにする必要があった。ＦＬＡＧタグＤＡＰ１２は、対を形成するパートナーが存在しない場合、Ｂａ／Ｆ３の細胞質内にとどまる。一方、ＤＡＰ１２会合受容体が存在する場合、ＤＡＰ１２会合受容体は、膜貫通ドメインの反対の電荷を持つ残基との相互作用によりＤＡＰ１２と対を形成することができ、その結果、ＦＬＡＧエピトープが細胞表面に現れる。マウスマスト細胞には、異なる種に由来するＣＤ２００ＲＬａタンパク質と会合できる内因性ＤＡＰ１２が発現する。マウスマスト細胞およびＢａ／Ｆ３−ＤＡＰ１２細胞にｃｙｎｏＣＤ２００ＲＬａ遺伝子を導入したところ、細胞の細胞表面にこのタンパク質が発現し得、そしてそれを抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ１８２が認識することが確認された。結果を図１４に示す。
【０２０４】
ｃｙｎｏＣＤ２００ＲＬａ細胞表面発現受容体と、シグナル伝達アダプター分子ＤＡＰ１２との会合を生化学により確認した。ｃｙｎｏＣＤ２００ＲＬａを発現するマスト細胞の細胞表面を、ＥＺ−ｌｉｎｋスルホ−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてビオチンで標識した。細胞をＤ−ＰＢＳで洗浄してから、プロテアーゼ阻害剤（コンプリートプロテアーゼインヒビター混合物；Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む１％ジギトニン（Ｃａｂｉｏｃｈｅｍ）、０．１２％トリトンＸ−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリエタノールアミンに溶解した。溶解物を１２，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心した。前もって澄明化した（ｐｒｅｃｌｅａｒｅｄ）溶解物を１〜２μｇの抗ＣＤ２００ＲＤＸ１８２またはアイソタイプコントロール（ラットＩｇＧ２ａ，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，＃５５３９２６）およびプロテインＡおよびプロテインＧセファロースビーズとインキュベートして、免疫沈降を行った。ビーズを洗浄し、溶出したタンパク質を４〜２０％トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｎｏｖｅｘ）上で分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にトランスファーした。膜を、５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）にてブロックし、次いでストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でブロットし、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳで洗浄し、この膜をＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  ｄｕｒａ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）でインキュベートした後に可視化し，その後、薄膜に密着させた。ＤＡＰ１２については、細胞外ドメインが短いため、ビオチンで細胞表面標識を行わない。したがって、この膜をウサギ抗マウスＤＡＰ１２抗体、続いてプロテインＡ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でプローブし、上記のように可視化した。ＤＸ１８２の免疫沈降においてＤＡＰ１２が認められ、ｃｙｎｏ活性化ＣＤ２００ＲＬａとの会合が確認された。結果を図１５に示す。
【０２０５】
ＤＸ１８２は、マスト細胞の脱顆粒反応を誘導することにより、マウスのマスト細胞に発現するカニクイザルＣＤ２００ＲＬａの活性剤であることが明らかにされた。実施例１１に記載のマウスのマスト細胞に発現するｃｙｎｏＣＤ２００ＲＬａを用いて、実施例５に記載されているように、脱顆粒アッセイを行った。結果を図１６に示す。
【０２０６】
ＣＤ２００ＲＬａは、ヒトマクロファージおよび骨髄系細胞に発現しない。
【０２０７】
ヒトゲノムには、ＣＤ２００Ｒファミリーメンバーが、ＣＤ２００ＲおよびＣＤ２００ＲＬａの２つしかない（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：３０３４−３０４６）。ヒトＣＤ２００ＲＬａは、マウスＣＤ２００ＲＬａ遺伝子と同様に膜貫通配列に荷電残基を含むことから、ＤＡＰ１２と相互作用し、活性化シグナルを伝達する可能性が示唆される。マウスＣＤ２００ＲＬａ遺伝子は、大分部のマクロファージ／骨髄系細胞で容易に発現し、Ｄａｐ１２を含むマウス細胞株にトランスフェクトしやすいが、ヒトＣＤ２００ＲＬａは、ヒトマクロファージ／骨髄系細胞での転写レベルが極めて低く、Ｄａｐ１２を含むトランスフェクト可能な細胞株において細胞表面に発現できなかった。
【０２０８】
図１３に示すように、ヒトおよびｃｈｉｍｐＣＤ２００ＲＬａは、ＣＤ２００Ｒファミリーの他のすべてのメンバーで保存されている２つのシステイン残基が欠けている。理論に束縛されるものではないが、ヒトＣＤ２００Ｒｌａが機能的な受容体を形成できないのは、細胞外ドメインにおける２つのそのシステイン残基がグリシン残基またはイソロイシン残基に変異したためと考えられる。ゲノム配列に欠けているその２つのシステインをコードするようにｈｕＣＤ２００ＲＬａ遺伝子を改変させると、ヒトＣＤ２００ＲＬａ受容体を、Ｄａｐ１２と会合する細胞表面に発現させることを可能にした。
【０２０９】
ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーにより、抗ＣＤ２００Ｒ抗体がヒトＣＤ２００ＲＬａタンパク質、ｃｙｎｏＣＤ２００Ｒタンパク質およびｃｙｎｏＣＤ２００ＲＬａタンパク質に結合するかどうかについて測定した。ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と融合したヒトＣＤ２００ＲＬａ細胞外ドメインからなる融合タンパク質を作製した。この融合タンパク質は、２つの残基（グリシンおよびイソロイシン）をシステインに改変して、カニクイザルおよびアカゲザルのＣＤ２００ＲＬａタンパク質、ならびにヒトＣＤ２００Ｒタンパク質およびｃｙｎｏＣＤ２００Ｒタンパク質により類似したものになっている（図１３を参照）。実施例５に記載されているように、このタンパク質を発現させた。このタンパク質の野生型も作製したが、ＣＹＳ改変タンパク質に比べて発現がかなり減少した。
【０２１０】
同様に、野生型残基またはＣＹＳ改変残基を含む全長ヒトＣＤ２００ＲＬａ  ｃＤＮＡを作製した。実施例１１に記載されているように、このｃＤＮＡをｐＭＸｐｉｅレトロウイルスベクターにクローニングし、ヒトＤＡＰ１２を発現しているＢａ／Ｆ３細胞に導入した。このｐＭＸｐｉｅベクターは、ｐＭＸｎｅｏベクターに類似している（実施例５を参照）が、追加ＩＲＥＳ−ＧＦＰ配列をコード配列の３’に挿入してあり、ベクターにコードされたタンパク質を蛍光により検出できる。ネオマイシン耐性遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子で置換し、細胞を、１ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて薬剤選択する。
【０２１１】
ＣＹＳ改変型の受容体は、抗ＦＬＡＧエピトープ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いたＦＡＣＳ染色により検出され、細胞表面に発現していた。野生型の受容体は、細胞表面に検出されなかった。
【０２１２】
標準的な間接ＥＬＩＳＡプロトコルにより、ＤＸ１８２は、融合タンパク質として発現するとき、野生型またはＣＹＳ改変ヒトＣＤ２００ＲＬａに結合しなかった。さらに、ＤＸ１８２は、細胞表面でＣＹＳ改変ヒトＣＤ２００ＲＬａを発現するＢａ／Ｆ３細胞にも結合しなかった。
【０２１３】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の抗ヒト阻害性抗体は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ受容体には特異的に結合するが、ＣＹＳ改変ヒトＣＤ２００ＲＬａまたはヒトＣＤ２００ＲＬａ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したヒトＣＤ２００ＲＬａの細胞外ドメイン、実施例１３などを参照）には特異的に結合しない。
【０２１４】
ＣＤ２００ＲおよびＣＤ２００ＲＬａ（ＣＹＳ改変型）を発現させる方法は、本明細書に上記したとおりである。限定としてではなく例として、抗ＣＤ２００Ｒ抗体の結合特異性については、上記のアッセイで評価することができる。ＤＸ１８２、ＤＸ２４８、ＤＸ１８５、Ｄｘ１７８、ＤＸ１８４およびＤＸ１７６の結果を以下の表に示す。
【０２１５】
【表１０】
2010512791.tif 000019
上記の刊行物または文書の引用は、それらのいずれかが適当な従来技術であること認めることを意図するものでも、それらの刊行物または文書の内容または日付を承認するものでもない。本明細書に引用する参考文献についてはすべて、参照によって援用すべく、１つ１つの刊行物、特許出願または特許を具体的に個々に示していると同じ程度に参照によって援用する。
【図１】
2010512791.tif 000020
【図２】
2010512791.tif 000021
【図３】
2010512791.tif 000022
【図４】
2010512791.tif 000023
【図５Ａ】
2010512791.tif 000024
【図５Ｂ】
2010512791.tif 000025
【図６Ａ】
2010512791.tif 000026
【図６Ｂ】
2010512791.tif 000027
【図６Ｃ】
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【図７】
2010512791.tif 000029
【図８】
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【図９】
2010512791.tif 000031
【図１０】
2010512791.tif 000032
【図１１】
2010512791.tif 000033
【図１２】
2010512791.tif 000034
【図１３】
2010512791.tif 000035
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年8月18日(2009.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互に関連する出願への参照
本願は、２００６年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／８７６，６１８号の利益を米国特許法のもとに主張する。米国仮特許出願第６０／８７６，６１８号の開示は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、全般的にはヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的な結合化合物およびその使用に関する。より具体的には、本発明は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ（ＣＤ２００受容体）を認識し、特に炎症性障害および自己免疫障害におけるその活性を調節する抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫系は、たとえば、バクテリア、多細胞生物およびウイルスなどの感染体からばかりでなく、癌からも人を保護する働きをする。この系として、単球、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、好酸球、Ｔ細胞、Ｂ細胞および好中球など、いくつかのタイプのリンパ系および骨髄系細胞が挙げられる。これらのリンパ系および骨髄系細胞は、多くの場合、サイトカインと呼ばれるシグナル伝達タンパク質を産生する。免疫応答には、炎症、すなわち、全身または体の特定の場所における免疫細胞の蓄積が含まれる。免疫細胞は、感染体または異物に反応してサイトカインを分泌し、次いでサイトカインは、免疫細胞の増殖、発生、分化または遊走を調節する。免疫応答は、たとえば、自己免疫障害のように過剰な炎症に関与するとき、病的変化を引き起こすことがある（たとえば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照）。
【０００４】
骨髄系細胞（すなわち、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、好中球、マスト細胞および好酸球）は、慢性炎症の維持に重要な役割を果たしている（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。骨髄系細胞は、阻害性受容体における活性化の対応するセットを誘発する細胞間相互作用により制御され得るほか、分泌因子に制御される場合もある（非特許文献１０）。直接的な細胞間接触による骨髄系細胞活性の制御では、コントロールがサイトカインにより媒介される場合に比べてより局所的にな
る。また、ＣＤ２００−ＣＤ２００Ｒ相互作用も、骨髄系細胞に細胞間接触による制御の相互作用を与える。広く発現する糖タンパク質ＣＤ２００は、Ｔ細胞共刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６と構造的に密接に関連し、ヒト３番染色体およびマウス１６番染色体上でＣＤ８０およびＣＤ８６と遺伝的に連鎖している（非特許文献１１；非特許文献１２）。ＣＤ２００は、構造的には、典型的なＶ／Ｃ２配列において、２つのＩｇスーパーファミリー（ＩｇＳＦ：Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）ドメインを含む（非特許文献１３）。
【０００５】
ＣＤ２００Ｒは、マクロファージ、ＤＣ、好中球およびマスト細胞など、ヒトおよびマウスの骨髄系細胞の表面に発現するほか、Ｔ細胞にも発現する（非特許文献１４；非特許文献１５）。ＣＤ２００Ｒは、構造的にＣＤ２００に関係しており、同じ染色体上に位置し、その遺伝子は、遺伝子重複により進化したと考えられる（非特許文献１５）。しかしながら、ＣＤ２００Ｒは、ＣＤ２００と異なり、細胞質尾部が長く、３つの保存されたチロシン残基を含み、その１つは、ＮＰＸＹモチーフとともに含まれる（非特許文献１４；非特許文献１５）。ＣＤ２００Ｒは、リガンドまたはアゴニスト抗体との結合時に、ＮＰＸＹモチーフのチロシン上でリン酸化され、その後、アダプタータンパク質ＤｏＫ１およびＤｏｋ２に結合する。これらのアダプタータンパク質がリン酸化されると、後にＲａｓ／ＭＡＰＫ活性化回路を阻害するＳＨＩＰおよびＲａｓＧＡＰがリクルートされる（非特許文献１６）。
【０００６】
ＣＤ２００受容体（ＣＤ２００Ｒ）は現在、ラット、マウス、ヒトおよびいくつかの非ヒト霊長類など、様々な種からクローニングされている。ＣＤ２００Ｒは、ヒト３番染色体ｑ１２−１３およびマウス１６番染色体に位置し、ヒトおよびマウスのＣＤ２００Ｒはともに、かなりの程度で配列および構造が類似している（非特許文献１５）。マウスでは、ＣＤ２００Ｒ以外にも、４個の関連遺伝子が同定されている（非特許文献１５）。これらの遺伝子は、ＣＤ２００ＲＬ（ＣＤ２００Ｒ様）と呼ばれ、アダプタータンパク質ＤＡＰ１２の活性化に関係していることが明らかにされている（非特許文献１７）。これらの受容体の細胞表面での発現およびシグナル伝達には、ＤＡＰ１２が必要である。ＤＡＰ１２は、古典的な免疫チロシン活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）を含む強力な活性化アダプタータンパク質であり、したがって、マウスＣＤ２００ＲＬ遺伝子は、骨髄活性化遺伝子である。マウスマスト細胞には、これらの活性化ＣＤ２００ＲＬ受容体が発現し、受容体特異的抗体を用いれば、ＦｃξＲＩ活性化で観察される反応と同等の規模の強力な脱顆粒反応を引き起こすことができる。これらの補足的なＣＤ２００Ｒファミリーメンバー遺伝子は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインに対する配列相同性から、ＣＤ２００Ｒ様と呼ばれているが、ＣＤ２００には結合しない。現時点では、これらの新しい受容体のリガンド（単数または複数）は依然として不明である（非特許文献１８）。さらに、異系交配系のマウスによっては、ＣＤ２００Ｒと相同性が見られるＣＤ２００ＲファミリーメンバーのＣＤ２００ＲＬｅを発現するものもある（非特許文献１８）。ヒトゲノムでは、マウスＣＤ２００Ｒファミリーとは異なり、明らかにされたＣＤ２００Ｒファミリーメンバーは、ＣＤ２００ＲおよびＣＤ２００ＲＬａの２つのみである（非特許文献１５）
炎症性障害または自己免疫障害などのヒト障害の処置に使用する、抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒモノクローナル抗体などのヒト阻害性ＣＤ２００Ｒのアゴニストが求められている。そうしたアゴニストは、ヒト被験者において免疫原性が低く、有害な免疫応答がなくて反復投与が可能であることが好ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（２０００）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ
【非特許文献２】Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ａｎｄ  Ｆｅｌｄｍａｎｎ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
【非特許文献３】ｖｏｎ  Ａｎｄｒｉａｎ  ａｎｄ  Ｍａｃｋａｙ（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１０２０−１０３４
【非特許文献４】Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉａｍｏｎｄ（２００１）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４５：３４０−３５０
【非特許文献５】Ｋｉｎｎｅ，Ｒ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ（２０００）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．２：１８９−２０２
【非特許文献６】Ｋｉｅｆｅｒ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｐｒｏｇｒ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６４：１０９−１２７
【非特許文献７】Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３７−４５
【非特許文献８】Ｈａｍｉｄ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：Ｓ５−Ｓ１２
【非特許文献９】Ｌｉｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．３０：１９−３９
【非特許文献１０】Ｂａｒｃｌａｙ，Ａ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２８５−２９０
【非特許文献１１】ＭｃＣａｕｇｈａｎ，Ｇ．Ｗ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：：１３３−１３５
【非特許文献１２】Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  ９：１１４−１１８
【非特許文献１３】Ｃｌａｒｋ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ  ４：１１３−１１８
【非特許文献１４】Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２３３−２４２
【非特許文献１５】Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：３０３４−３０４６
【非特許文献１６】Ｚｈａｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：６７８６−６７９３
【非特許文献１７】Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９：：７０３
【非特許文献１８】Ｈａｔｈｅｒｌｙ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５（４）：２４６９−７４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は全般的には、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的な結合化合物およびその使用を提供する。より具体的には、本発明は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒを特異的に認識し、かつヒト被験者においてアゴニスト活性、高い結合親和性、良好な薬物動態および低い抗原性など、１つまたは複数の望ましい特性を持つ抗体を提供する。本発明はまた、疾患を処置する際の本発明の抗体の使用方法も提供する。
【０００９】
したがって、一実施形態では、本発明は、たとえば、抗体分子またはその結合フラグメントなど、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ受容体に特異的に結合し、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒを活性化する結合化合物を提供する。いくつかの実施形態では、結合化合物は、少なくとも１つの抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび少なくとも１つの抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインまたはこれらのドメインの結合フラグメントを含み、ＶＬドメインは、配列番号１〜１８から選択される配列を持つ少なくとも一定数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、か
つＶＨドメインは、配列番号１９〜３６から選択される配列を持つ少なくとも少なくとも一定数のＣＤＲを含み、一定数は１、２または３である。任意の結合化合物における軽鎖および重鎖可変ドメインのＣＤＲの一定数は、同一でも異なってもよい。別の実施形態では、ＶＬドメインＣＤＲは、配列番号１、２および３から選択される。なお別の実施形態では、ＶＨドメインＣＤＲは、配列番号１９、２０および２１から選択される。別の実施形態では、ＶＬドメインＣＤＲは、ＲＡＳＫＮＩＲＳＹＬＡ（配列番号５５）、配列番号２および配列番号３から選択され、ＶＨドメインＣＤＲは、配列番号１９、２０および２１から選択される。別の実施形態では、ＶＬドメインＣＤＲは、配列番号１６、１７および１８から選択され、ＶＨドメインＣＤＲは、配列番号３４、３５および３６から選択される。さらなる実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインの配列は、それぞれ配列番号４２および４８の配列である。なおさらに別の実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインの配列は、それぞれ配列番号５６および５７の配列である（図９を参照）。好ましい実施形態では、ＣＤ２００Ｒ結合化合物は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ受容体の阻害活性を活性化する。
【００１０】
他の実施形態では、結合化合物は、少なくとも１つのＶＬドメインおよび少なくとも１つのＶＨドメインまたはこれらのドメインの結合フラグメントを含み、ＶＬドメインは、配列番号１〜１８から選択される配列を持つ１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含み、ＶＨドメインは、配列番号１９〜３６から選択される配列を持つ１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインの配列は、それぞれ配列番号４２および４８の配列である。なおさらに別の実施形態では、ＶＬおよびＶＨドメインの配列は、それぞれ配列番号５６および５７の配列である。別の実施形態では、結合化合物は、２００６年１２月６日にアメリカンティシューカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ＵＳＡ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−８０６７である発現ベクターがコードする抗体と同じＣＤＲを持つ。別の実施形態では、結合化合物は、２００７年１２月１３日にＨＣ８０９．１４Ｆ１２．６．ＤＸ２４８．３株として寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−８８３８であるハイブリドーマから産生される抗体と同じＣＤＲを持つ。
【００１１】
さらなる実施形態では、結合化合物は、少なくとも１つのＶＬドメインおよび少なくとも１つのＶＨドメインまたはこれらのドメインの結合フラグメントを含み、ＶＬドメインは、配列番号３７〜４２から選択される配列を持つ１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含み、ＶＨドメインは、配列番号４３〜４８から選択される配列を持つ１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含む。
【００１２】
他の様々な実施形態では、本発明は、配列番号４２および４８の配列との配列相同性がそれぞれ少なくとも９５％、９０％．８５％、８０％、７５％または５０％であるＶＬおよびＶＨドメインを持つヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する結合化合物を提供する。他の実施形態では、本発明は、配列番号５６および５７の配列との配列相同性がそれぞれ少なくとも９５％、９０％．８５％、８０％、７５％または５０％であるＶＬおよびＶＨドメインを持つヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する結合化合物を提供する。他の実施形態では、本発明の結合化合物は、配列番号４２および４８の配列に対する保存的アミノ酸置換が、それぞれ最大０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上であるＶＬおよびＶＨドメインを含む。別の実施形態では、本発明の結合化合物は、配列番号４９および５０の配列に対する保存的アミノ酸置換が、それぞれ最大０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である軽鎖および重鎖を持つ抗体である。別の実施形態では、本発明の結合化合物は、配列番号５６および５７の配列に対する保存的アミノ酸置換が、それぞれ最大０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である軽鎖および重鎖を持つ抗体である。
【００１３】
一実施形態では、結合化合物は、抗体またはその結合フラグメント、たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、Ｆ（ａｂ’）２およびダイアボディからなる群から選択される抗体フラグメントである。一実施形態では、本発明の結合化合物は、配列番号４９の配列を持つ軽鎖および配列番号５０の配列を持つ重鎖を含む、抗体ｈｕＤＸ１８２である。別の実施形態では、結合化合物は、２００６年１２月６日にＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ＵＳＡ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−８０６７の発現ベクターから産生される成熟抗体（ｐＡＣＤ２００ＲＶ１プラスミド中にシグナル配列を含むｈｕＤＸ１８２）である。別の実施形態では、結合化合物は、２００７年１２月１３日にＨＣ８０９．１４Ｆ１２．６．ＤＸ２４８．３株として寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−８８３８のハイブリドーマから産生される抗体と同じＣＤＲを持つ。
【００１４】
一実施形態では、本発明の結合化合物は、たとえば、ヒトγ１、γ２、γ３またはγ４重鎖定常領域またはその改変体などのヒト定常領域のような重鎖定常領域を含む。別の実施形態では、結合化合物は、たとえば、ヒトλまたはκ軽鎖領域またはその改変体などのヒト軽鎖定常領域のような軽鎖定常領域を含む。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する抗体（またはその結合フラグメント）など、本発明の結合化合物をコードする、たとえば、ＤＮＡのような単離された核酸に関する。一実施形態では、単離された核酸は、少なくとも１つの抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび少なくとも１つの抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインまたはこれらのドメインの結合フラグメントを含む結合化合物をコードし、ＶＬドメインは、配列番号１〜１８から選択される配列を持つ少なくとも一定数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、かつＶＨドメインは、配列番号１９〜３６から選択される配列を持つ少なくとも少なくとも一定数のＣＤＲを含み、一定数は１、２または３である。
【００１６】
別の実施形態では、単離された核酸は、それぞれ配列番号４２および４８の軽鎖および重鎖の可変領域配列をコードする。なお別の実施形態では、単離された核酸は、配列番号４９の配列を持つ軽鎖および配列番号５０の配列を持つ重鎖を含む、抗体ｈｕＤＸ１８２をコードする。別の実施形態では、単離された核酸は、それぞれ配列番号４１および４７の軽鎖および重鎖の可変領域配列をコードする。なお別の実施形態では、単離された核酸は、配列番号５６の配列を持つ軽鎖および配列番号５７の配列を持つ重鎖を含む、抗体ｈｕＤＸ２４８をコードする。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、単一の核酸分子に軽鎖および重鎖の両方をコードし、他の実施形態では、軽鎖および重鎖は、２個以上の別の核酸分子にコードされる。別の実施形態では、核酸は、シグナル配列をさらにコードする。一実施形態では、核酸は、配列番号５２および５４である。
【００１７】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の単離された核酸を含む発現ベクターであって、核酸が制御配列に作動可能に連結され、宿主細胞にベクターをトランスフェクトすると、宿主細胞により制御配列が認識される、発現ベクターに関する。一実施形態では、発現ベクターは、２００６年１２月６日にＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ＵＳＡ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−８０６７（ｐＡＣＤ２００ＲＶ１プラスミド中にシグナル配列を含むプラスミド中のｈｕＤＸ１８２）である。別の実施形態では、結合化合物は、２００７年１２月１３日にＨＣ８０９．１４Ｆ１２．６．ＤＸ２４８．３株として寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−８８３８のハイブリドーマから産生される抗体と同じＣＤＲを持つ。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明の結合化合物の作製方法に関するものであって、結合化合物をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を培地中で培養することと、結合化合物を宿主細胞または培地から単離することとを含む、作製方法に関する。
【００１９】
本発明はまた、抗体ｈｕＤＸ１８２、ＤＸ１８２、ＤＸ１８５、ＤＸ１７８、ＤＸ１８４またはＤＸ２４８が結合するのと同じ、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ受容体のエピトープに結合する抗体またはその結合フラグメント、たとえば、これらの本発明の抗体のいずれかの結合を交差ブロックできる抗体などの結合化合物に関する。
【００２０】
本発明は、抗体またはその結合フラグメントなどの結合化合物に関するものであって、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的であり、かつヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性を活性化することができ、平衡解離定数（Ｋｄ）が１０００、５００、１００、５０、２０、１０、５、２ｐＭまたはそれ以下（すなわち高親和性）である、結合化合物に関する。本発明はまた、抗体またはその結合フラグメントなどの結合化合物に関するものであって、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的であり、かつマスト細胞の脱顆粒を阻害し、マスト細胞の脱顆粒アッセイにおいてそのＩＣ５０が５０００、２０００、１０００、５００ｐＭである、結合化合物に関する。
【００２１】
本発明はまた、本発明のヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ結合化合物による処置が必要なヒト被験者など、被検体の処置方法に関する。そうした被検体は、関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症、関節リウマチ、骨粗鬆症、炎症性線維症（強皮症、肺線維症および肝硬変など）、炎症性腸障害（クローン病、潰瘍性大腸炎および炎症性腸疾患など）、喘息（アレルギー性喘息など）、アレルギー、ＣＯＰＤ、多発性硬化症、乾癬、ぶどう膜炎および癌などの炎症性障害または自己免疫障害を持っていてもよい。そうした処置方法は、免疫抑制剤または抗炎症剤など１つまたは複数の追加治療薬を投与することをさらに含んでもよい。限定としてではなく例として、本明細書に記載の方法により、ＲＡ、乾癬、喘息ならびにアレルギーおよびぶどう膜炎を処置する。特に好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法により喘息およびアレルギーを処置する。
【００２２】
さらなる実施形態では、本発明は、１つまたは複数の他の治療薬と併用して治療有効量の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体または結合フラグメントを投与することを含む、処置方法を提供する。限定としてではなく例として、１つまたは複数の治療薬には、ＩＬ−２３、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＧＦ−β（たとえば、Ｖｅｌｄｈｏｅｎ（２００６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４：１７９−１８９；Ｄｏｎｇ（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（４）：３２９−３３３を参照）または組み合わせが含まれる。種々の実施形態では、抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体またはフラグメントの前、同時または後に１つまたは複数の他の治療薬を投与する。
【００２３】
本発明はまた、結合化合物と、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤と、任意に、１つまたは複数の免疫抑制剤または抗炎症剤とを含む、本発明の結合化合物の組成物および調合物に関する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する結合化合物であって、
配列番号１〜１８および；およびＲＡＳＫＮＩＲＳＹＬＡ（配列番号５５）からなる群から選択される少なくとも一定数のＣＤＲ配列を持つ少なくとも１つの抗体軽鎖可変領域またはその結合フラグメント、
配列番号１９〜３６からなる群から選択される少なくとも一定数のＣＤＲ配列を持つ少なくとも１つの抗体重鎖可変領域またはその結合フラグメントを含み、
該一定数は１である、
結合化合物。
（項目２）
前記一定数が２である、項目１に記載の結合化合物。
（項目３）
前記一定数が３である、項目１に記載の結合化合物。
（項目４）
前記軽鎖可変領域が、配列番号１、２および３の前記ＣＤＲ配列を含み、かつ前記重鎖可変領域が、配列番号１９、２０および２１の前記ＣＤＲ配列を含むか、あるいは、前記軽鎖可変領域が、配列番号１６、１７および１８の前記ＣＤＲ配列を含み、かつ前記重鎖可変領域が、配列番号３４、３５および３６の前記ＣＤＲ配列を含む、項目３に記載の結合化合物。
（項目５）
前記軽鎖可変領域が、配列番号ＲＡＳＫＮＩＲＳＹＬＡ（配列番号１５５）、２および３の前記ＣＤＲ配列を含み、かつ前記重鎖可変領域が、配列番号１９、２０および２１の前記ＣＤＲ配列を含む、項目３に記載の結合化合物。
（項目６）
前記軽鎖可変領域が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号４２の前記配列を含み、かつ前記重鎖可変領域が、最大１０個の保存的アミノ酸置換を持つ配列番号４８の前記配列を含むか、あるいは．前記軽鎖可変領域が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５６の前記配列を含み、かつ前記重鎖可変領域が、最大１０個の保存的アミノ酸置換を持つ配列番号５７の前記配列を含む、項目４に記載の結合化合物。
（項目７）
前記結合化合物が、
配列番号４２を含む軽鎖可変領域；および
配列番号４８を含む重鎖可変領域あるいは．
配列番号５６を含む軽鎖可変領域；および
配列番号５７を含む重鎖可変領域
を含む抗体である、項目６に記載の結合化合物
（項目８）
前記軽鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５１の前記成熟型から本質的に成り、前記重鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５３の前記成熟型から本質的に成る、項目４に記載の結合化合物。
（項目９）
前記軽鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号４９から本質的に成り、かつ前記重鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５０から本質的に成るか、あるいは、前記軽鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５６から本質的に成り、かつ前記重鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５７から本質的に成る、項目４に記載の結合化合物。
（項目１０）
ヒトのヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する結合化合物であって、該結合化合物は、配列番号４２に対する相同性が少なくとも９０％である軽鎖可変領域および配列番号４８に対する相同性が少なくとも９０％である重鎖可変領域を含むか、あるいは、該結合化合物は、配列番号４１に対する相同性が少なくとも９０％である軽鎖可変領域および配列番号４７に対する相同性が少なくとも９０％である重鎖可変領域を含む、結合化合物。
（項目１１）
項目３に記載の結合化合物の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の少なくとも１つをコードする単離された核酸。
（項目１２）
前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号４２であり、かつ前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号４８であるか、あるいは、前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号４２であり、かつ前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号４８である、項目１１に記載の核酸。
（項目１３）
制御配列に作動可能に連結された項目１１に記載の核酸を含む発現ベクターであって、宿主細胞に該ベクターがトランスフェクトされるとき該制御配列が該宿主細胞により認識される、発現ベクター。
（項目１４）
前記発現ベクターが、２００６年１２月６日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０６７（ｐＡＣＤ２００ＲＶ１プラスミド中にシグナル配列を含むｈｕＤＸ１８２）を持つ、項目１３に記載の発現ベクター。
（項目１５）
項目１４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目１６）
ポリペプチドを産生する方法であって、
前記核酸配列を発現し、それにより前記軽鎖および重鎖可変領域を含むポリペプチドを産生する条件下、項目１５に記載の宿主細胞を培地で培養する工程；および
該宿主細胞または培地から該ポリペプチドを回収する工程
を含む、方法。
（項目１７）
成熟抗体配列が、項目１４に記載の発現ベクターにコードされる、抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体。
（項目１８）
交差ブロッキングアッセイにおいてヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに対する項目１７に記載の結合化合物の結合を交差ブロックできる、抗体。
（項目１９）
抗体ｈｕＤＸ１８２が結合するエピトープと同じ、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒにおけるエピトープに結合する、抗体。
（項目２０）
前記結合化合物が、ヒト化モノクローナル抗体である、項目１に記載の結合化合物。
（項目２１）
前記結合化合物が、完全ヒトモノクローナル抗体である、項目１に記載の結合化合物。（項目２２）
前記結合化合物が、アゴニストヒト化モノクローナル抗体である、項目２１に記載の結合化合物。
（項目２３）
ヒト被験者の処置方法であって、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合し、該ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性を活性化する結合化合物を投与の必要がある被検体に治療有効量で投与する工程を含み、該結合化合物が、抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域を含有し、該軽鎖可変領域は配列番号４２を含み、かつ該重鎖可変領域は配列番号４８を含むか、あるいは、該結合化合物が、抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域を含有し、該軽鎖可変領域が配列番号４１を含み、かつ該重鎖可変領域が配列番号４７を含む、処置方法。（項目２４）
前記結合化合物が、モノクローナル抗体である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記ヒト被験者が、炎症性障害または自己免疫障害を持つ、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記ヒト被験者が、関節リウマチを持つ、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記ヒト被験者が、喘息を持つ、項目２３に記載の方法。
（項目２８）
前記ヒト被験者が、ぶどう膜炎を持つ、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
前記ヒト被験者が、アレルギーを持つ、項目２３に記載の方法。
（項目３０）
別の免疫抑制剤または抗炎症剤を投与することをさらに含む、項目２３に記載の方法。（項目３１）
組成物であって、以下：
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合し、該ヒト阻害性受容体を活性化する結合化合物であって、該結合化合物が抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域を含有し、該軽鎖可変領域は配列番号４２を含み、該重鎖可変領域は配列番号４８を含む、結合化合物；および
薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤あるいは
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合し、該ヒト阻害性受容体を活性化する結合化合物であって、該結合化合物は抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域を含有し、該軽鎖可変領域は配列番号４１を含み、該重鎖可変領域は配列番号４７を含む、結合化合物、
を含む、組成物
（項目３２）
別の免疫抑制剤または抗炎症剤をさらに含む、項目３１に記載の組成物。
（項目３３）
重鎖定常領域をさらに含み、該重鎖定常領域は、γ１、γ２、γ３またはγ４ヒト重鎖定常領域またはこれらの改変体を含む、項目４または５に記載の結合化合物。
（項目３４）
γ１ヒト重鎖定常領域またはその改変体を含む、項目３３に記載の結合化合物。
（項目３５）
軽鎖定常領域をさらに含む、該軽鎖定常領域が、κヒト軽鎖定常領域を含む、項目４または５に記載の結合化合物。
（項目３６）
前記結合化合物が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、Ｆ（ａｂ’）２およびダイアボディからなる群から選択される抗体フラグメントである、項目４または５に記載の結合化合物。
（項目３７）
前記結合化合物は、前記ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒを活性化する、項目１〜２８のいずれかに記載の結合化合物。
（項目３８）
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する結合化合物であって、２００７年１２月  日にＨＣ８０９．１４２３．６．ＤＸ２４８．３株として寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−
であるハイブリドーマから産生される抗体と同じＣＤＲを含む、結合化合物。
（項目３９）
２００７年１２月  日にＨＣ８０９．１４Ｆ１２．６．ＤＸ２４８．３株として寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−  である、ハイブリドーマ。
（項目４０）
前記結合化合物は、アゴニストモノクローナル抗体である、項目３１〜４４のいずれかに記載の結合化合物。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ１８２（配列番号３７）、ＤＸ１８５（配列番号３８）、ＤＸ１７８（配列番号３９）、ＤＸ１８４（配列番号４０）およびヒト化ラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体（配列番号４２）の軽鎖可変ドメインのアライメントを示す。ＤＸ２４８は、マウス抗ｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２００Ｒ（配列番号４１）である。ＣＤＲをそれぞれ示す。番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂ．９１−３２４２，５ｔｈ  Ｅｄ．による。本明細書では、これを「Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）」という。
【図２】ラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ１８２（配列番号４３）、ＤＸ１８５（配列番号４４）、ＤＸ１７８（配列番号４５）、ＤＸ１８４（配列番号４６）およびヒト化ラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体（配列番号４８）の重鎖可変ドメインのアライメントを示す。ＤＸ２４８は、マウス抗ｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２００Ｒ（配列番号４７）である。ＣＤＲを示す。番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）による。
【図３】ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（ｈｕＤＸ１８２）の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４９）を示す。
【図４】ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（ｈｕＤＸ１８２）の重鎖のアミノ酸配列（配列番号５０）を示す。
【図５Ａ】ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（ｈｕＤＸ１８２）のシグナルペプチドおよび軽鎖をコードする核酸配列（配列番号５２）を示す。
【図５Ｂ】ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（ｈｕＤＸ１８２）のシグナルペプチドおよび軽鎖をコードする核酸配列（配列番号５２）を示す。
【図６Ａ】ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（ｈｕＤＸ１８２）のシグナルペプチドおよび軽鎖をコードする核酸配列（配列番号５４）を示す
【図６Ｂ】ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（ｈｕＤＸ１８２）のシグナルペプチドおよび軽鎖をコードする核酸配列（配列番号５４）を示す
【図６Ｃ】ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（ｈｕＤＸ１８２）のシグナルペプチドおよび軽鎖をコードする核酸配列（配列番号５４）を示す。
【図７】マスト細胞の脱顆粒アッセイにおける抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ１７６、ＤＸ１７７、ＤＸ１７８、ＤＸ１８２およびＤＸ１８４の作用を示す。
【図８】マスト細胞の脱顆粒アッセイにおけるヒト化抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体（ｈｕＤＸ１８２）の作用およびｈｕＤＸ１８２の結合を示す。
【図９】ヒト化ＤＸ２４８の重（配列番号５７）および軽（配列番号５６）可変ドメインの配列を示す
【図１０】図１０Ａは、マスト細胞の脱顆粒アッセイにおけるマウス抗ｃｙｎｏＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ２４８およびＤＸ１８２の作用を示す。図１０Ｂは、マウス抗ｃｙｎｏＣＤ２００Ｒ抗体およびＤＸ１８２の結合を示す。
【図１１】ＤＸ１８２（抗ｈｕＣＤ２００Ｒ）を用いたカニクイザルの培養マスト細胞に発現するＣＤ２００Ｒを示す。末梢血由来のカニクイザルの培養マスト細胞を対照の抗体ＤＸ４９（インビボ研究のアイソタイプコントロール）、ＣＤ１１７（幹細胞因子受容体）、ＤＸ１８２（抗ｈｕＣＤ２００Ｒ）およびＤＸ８０（ＦｃｅＲＩ）で染色した。
【図１２】カニクイザルの培養マスト細胞のＦｃεＲ１が引き起こす脱顆粒をＤＸ１８２が阻害することを示す。カニクイザルの培養マスト細胞をアイソタイプコントロール抗体ＤＸ４９または抗ｈｕＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ１８２とインキュベートし、次いで、抗ＦｃεＲＩ抗体で誘発し脱顆粒を起こした。ＤＸ１８２は、ＦｃεＲＩ受容体を誘発して起こしたマスト細胞の脱顆粒を用量依存的に阻害した。
【図１３】ヒトおよび非ヒト霊長類のＣＤ２００ＲおよびＣＤ２００ＲＬａ遺伝子のアミノ酸配列アライメントを示す。菱形は、これらの受容体の細胞表面発現に重要な、細胞外ドメインにおけるシステイン残基の位置を示す。
【図１４】カニクイザルＣＤ２００ＲＬａに結合するＤＸ１８２を示す。カニクイザルＣＤ２００ＲＬａをクローニングし、マウスマスト細胞またはヒトＤａｐ１２を含むマウスＢａｆ／３細胞にトランスフェクトした。次いで、これらのトランスフェクタントをアイソタイプコントロール抗体またはＤＸ１８２（抗ｈｕＣＤ２００Ｒ）で染色した。どちらのトランスフェクタントもＤＸ１８２抗体による強い染色が認められ、ＤＸ１８２がカニクイザルＣＤ２００ＲＬａを認識できることが示された。
【図１５】ｃｙｎｏＣＤ２００ＲＬａが、Ｄａｐ１２と対を形成する単一のポリペプチド鎖であることを示す。カニクイザルＣＤ２００ＲＬａをトランスフェクトしたマウスマスト細胞を対照抗体またはＤＸ１８２で免疫沈降した（ｉｍｍｕｎｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ）。ＤＸ１８２は、これらのトランスフェクタントからカニクイザルＣＤ２００ＲＬａを免疫沈降させた。Ｄａｐ１２のウエスタンブロッティングからは、カニクイザルＣＤ２００ＲＬａがこのシグナルアダプタータンパク質と会合することが示される。
【図１６】ＤＸ１８２が、カニクイザルＣＤ２００ＲＬａを発現するマウスマスト細胞の脱顆粒を誘導することを示す。カニクイザルＣＤ２００ＲＬａをトランスフェクトしたマウスマスト細胞をＤＸ１８２とインキュベートし、マスト細胞の脱顆粒についてアッセイを行った。ＤＸ１８２は、マスト細胞の強力な脱顆粒を誘導した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
Ｉ．定義。
【００２６】
本発明を理解しやすいように、いくつかの技術用語および科学用語を以下に具体的に定義する。本明細書に使用するこれ以外のすべての技術用語および科学用語は、本明細書の他の箇所に特に定義しない限り、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解している意味を有する。
【００２７】
添付の特許請求の範囲を含め、本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」など語の単数形は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、それに対応する複数の言及を含む。
【００２８】
細胞または受容体に使用する場合、「活性化」、「刺激」および「処置」とは、文脈上あるいは明確に異なる意味に解釈すべき場合を除き、たとえば、リガンドによる細胞または受容体の活性化、刺激または処置など、同じ意味を持つ場合がある。「リガンド」は、たとえば、サイトカイン、サイトカイン改変体、アナログ、ムテインおよび抗体から得られる結合化合物など、天然および合成リガンドを包含する。「リガンド」はまた、たとえば、サイトカインのペプチド模倣体および抗体のペプチド模倣体などの小分子も包含する。「活性化」は、内部機構だけでなく外部要因または環境要因により制御される細胞の活性化をいう場合もある。たとえば、細胞、組織、器官または生体の「反応」は、たとえば、生体コンパートメント内の濃度、密度、接着もしくは遊走、遺伝子発現率または分化状態など、生化学的または生理学的性質における変化を包含し、その変化は活性化、刺激もしくは処置と、または遺伝的プログラミングなどの内部機構と相関する。
【００２９】
分子の「活性」とは、リガンドまたは受容体に対する分子の結合、触媒活性；遺伝子発現または細胞のシグナル伝達、分化もしくは成熟を刺激する能力；抗原活性、他の分子の活性の調節などを記載しても指称してもよい。分子の「活性」はまた、接着などの細胞間の相互作用の調節または維持における活性、あるいは、細胞膜または細胞骨格などの細胞構造の維持における活性をいうこともある。さらに、「活性」は、たとえば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］もしくは［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］などの比活性、生体コンパートメント内の濃度などを意味することもある。さらに、「活性」は、自然免疫系または適応免疫系の成分の調節をいうこともある。「増殖活性」は、たとえば、正常な細胞分裂に加えて癌、腫瘍、異形性、細胞形質転換、転移および血管新生を促進したり、それに不可欠であったり、それと特異的に関係したりしている活性を包含する。
【００３０】
「投与」および「処置」とは、動物、ヒト、実験被検体、細胞、組織、器官または生物学的液体に適用する場合、外因性の薬剤、治療薬、診断薬または組成物と、動物、ヒト、被検体、細胞、組織、器官または生物学的液体との接触をいう。「投与」および「処置」は、たとえば、治療方法、薬物動態学的方法、診断方法、研究方法および実験方法をいうこともある。細胞の処置は、試薬と細胞との接触ばかりでなく、体液が細胞と接触している、試薬と体液との接触を包含する。「投与」および「処置」は、たとえば、試薬化合物、診断用化合物、結合化合物によるかまたは別の細胞によるインビトロおよびエキソビボでの細胞の処置も意味する。「処置」は、ヒト、家畜または研究被検体に適用する場合、
研究および診断分野の治療処置、予防手段または防止手段をいう。「処置」は、ヒト、家畜もしくは研究被検体または細胞、組織もしくは器官に適用する場合、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒアゴニストヒトもしくは動物被検体、細胞、組織、生理的コンパートメントまたは生理的液体の接触を包含する。「細胞の処置」はまた、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒアゴニストが、たとえば、流体相またはコロイド相でヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ受容体と接触する状態ばかりでなく、このアゴニストが細胞または受容体と接触しない状態も包含する。
【００３１】
「処置する」または「処置している」は、本発明の結合化合物のいずれかを含む組成物などの治療薬を、その薬に治療活性があることが分かっている１つまたは複数の疾患症状を持つ患者に内用または外用投与することを意味する。一般に、その薬については、臨床的に測定可能な任意の程度で、疾患症状（単数または複数）の退行を引き起こすか、それともその進行を阻害することにより、処置する患者または集団の１つまたは複数のそうした症状を軽減するのに有効な量で投与する。任意の特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療薬の量（「治療有効量」ともいう）は、患者の病状、年齢および体重ならびにその患者に所望の反応を惹起する薬剤の能力などの因子によって異なる場合がある。疾患症状が軽減されているかどうかは、症状の重症度または進行状況を評価するために医師または他の熟練の医療提供者が一般に使用する任意の臨床的測定により評価することができる。本発明の実施形態（処置方法または製品など）は、対象の疾患症状（単数または複数）を軽減する上であらゆる患者において有効であるとは限らない場合があるが、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マンアンドホイットニーのＵ検定、クラスカル−ワリスの検定（Ｈ検定）、ヨンキー−テラプストラ検定およびウィルコクソン検定など、当該技術分野において公知の任意の統計的検定により判定すると、統計学的に有意な数の患者において対象の疾患症状（単数または複数）は軽減している。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「抗体」という語は、所望の生物活性を示す任意の形態の抗体をいう。したがって、この語については、最も広い意味で用いており、具体的には、以下に限定されるものではないが、モノクローナル抗体（全長のモノクローナル抗体など）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）をカバーする。本明細書で使用する場合、「抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ結合フラグメントまたは抗体（「親抗体」）の「結合フラグメント」という語は、通常、親抗体の結合特異性を少なくともある程度保持する、親抗体の抗原結合領域または可変領域（１つまたは複数のＣＤＲなど）の少なくとも一部を含む、抗体のフラグメントまたは誘導体を包含する。抗体結合フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；ｓｃ−Ｆｖなどの一本鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体があるが、これに限定されるものではない。一般に、結合フラグメントまたは誘導体は、その活性をモル基準で表した場合、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ結合活性の少なくとも１０％を保持する。好ましくは、結合フラグメントまたは誘導体は、親抗体のようなヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ結合親和性を少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％またはそれ以上保持する。また、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ結合フラグメントは、その生物学的活性を実質的に変えない保存的アミノ酸置換（抗体の「保存的改変体」という）を含むことも意図されている。「結合化合物」という語は、抗体およびその結合フラグメントの両方をいう。
【００３３】
「Ｆａｂフラグメント」は、１本の軽鎖と１本の重鎖のＣＨ１および可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
【００３４】
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する２つの重鎖フラグメントを含む。この２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によりともに保持されている。
【００３５】
「Ｆａｂ’フラグメント」は、１本の軽鎖と、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインのほか、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間の領域を含む１本の重鎖の一部とを含み、２つのＦａｂ’フラグメントの２本の重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子になることができる。
【００３６】
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、２本の軽鎖と、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間の定常領域の一部を含む２本の重鎖とを含み、２本の重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されている。したがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２本の重鎖間のジスルフィド結合によってともに保持される２つのＦａｂ’フラグメントから構成される。
【００３７】
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖両方の可変領域を含むが、定常領域を欠いている。
【００３８】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦＶ」抗体という語は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体フラグメントをいい、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによりｓｃＦＶは、抗原結合に対する所望の構造を形成することができる。ｓｃＦＶの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。さらに、国際公開第８８／０１６４９号および米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号も参照されたい。
【００３９】
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントである。場合によっては、２つ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーと共有結合で結合し、二価のドメイン抗体を形成する。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同一抗原を標的にしても、異なる抗原を標的にしてもよい。
【００４０】
「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。場合によっては、２つの結合部位は同一の抗原特異性を持つ。しかしながら、二価抗体は、二重特異性であってもよい（以下を参照）。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ」抗体とは、他に記載がない限り、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒもしくはその改変体またはその任意の抗原性フラグメントに対して形成される抗体をいう。好ましい実施形態では、「抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性を活性化するアゴニスト抗体である。ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性の例として、マスト細胞の脱顆粒およびサイトカイン分泌の阻害、マクロファージおよび樹状細胞の抗原提示およびサイトカイン分泌の阻害があるが、これに限定されるものではない。また、抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体とは、ｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２００Ｒ（図１３などを参照）に対して形成される抗体もしくはその改変体またはその抗原性フラグメントをいい、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒにも結合する。好ましい実施形態では、ｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２００Ｒに対して形成される抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性を活性化するアゴニスト抗体である。ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性の例として、マスト細胞の脱顆粒およびサイトカイン分泌の阻害、マクロファージおよび樹状細胞の抗原提示およびサイトカイン阻害があるが、これに限定されるものではない
「モノクローナル抗体」という語は、本明細書で使用する場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体をいい、言い換えれば、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る、可能な自然発生の突然変異を除けば同一である。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原エピトープを標的とする。これに対し、従来の（ポリクローナル）抗
体調製物は一般に、様々なエピトープに対する（それに特異的な）数多くの抗体を含む。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られたものとしての抗体の特徴を示すもので、抗体を任意の特定の方法で作製する必要があるものと解釈してはならない。たとえば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体については、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５が最初に記載したハイブリドーマ法により作製してもよいし、組換えＤＮＡ法（たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）により作製してもよい。「モノクローナル抗体」はまた、たとえば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８  ａｎｄ  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に記載の技法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離しても構わない。さらに、Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１も参照されたい。
【００４２】
本明細書のモノクローナル抗体は、所望の生物活性を示す限り、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を特に含む。キメラ抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体、あるいは、特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である一方、鎖の残り（単数または複数）については、別の種に由来する抗体、あるいは、別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、およびそうした抗体のフラグメント中の対応する配列と同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５）。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」は、第１の抗体の可変ドメインおよび第２の抗体の定常ドメインを持つ抗体であり、第１および第２の抗体は異なる種に由来する。一般に、可変ドメインはげっ歯類動物などの実験動物（「親抗体」）の抗体から得て、定常ドメイン配列はヒト抗体から得るため、得られるキメラ抗体は、親のげっ歯類動物抗体に比べて、ヒト被験者に有害な免疫応答を惹起する可能性が低くなる。
【００４４】
本明細書のモノクローナル抗体はまた、ラクダ型単一ドメイン抗体を含む。たとえば、参照によってその全体を本明細書に援用するＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５；国際公開第９４／０４６７８号；国際公開第９４／２５５９１号；米国特許第６，００５，０７９号を参照されたい）。一実施形態では、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるように改変された２つのＶＨドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「ダイアボディ」という語は、２つの抗原結合部位を含む小さな抗体フラグメントをいい、そのフラグメントでは、同じポリペプチド鎖に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とが連結されている（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）。この２つのドメインについては、同じ鎖上の２つのドメイン間で対を形成するには短すぎるリンカーを用いることで、別の鎖の相補ドメインと対を形成し、２つの抗原結合部位を形成させる。ダイアボディに関しては、たとえば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８にさらに詳細に記載されている。操作された抗体改変体の概説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１２６−１１３６を全般的に参照されたい。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という語は、ヒト抗体と非ヒト（マウス、ラットなどの）抗体との配列を含む抗体の形態をいう。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも
１つ、通常２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、超可変ループの全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに相当し、フレームワーク（ＦＲ）領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体は任意に、ヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでもよい。
【００４７】
また、本発明の抗体は、エフェクター機能を変化させるように改変された（またはブロックされた）Ｆｃ領域を持つ抗体も含む。たとえば、米国特許第５，６２４，８２１号；国際公開第２００３／０８６３１０号；国際公開第２００５／１２０５７１号；国際公開第２００６／００５７７０２号を参照されたい。そのような改変により、免疫系の様々な反応を促進または抑制することができ、診断および治療において有益な作用が可能になる。Ｆｃ領域の変更は、アミノ酸変化（置換、欠失および挿入）、グリコシル化または脱グリコシル化および複数のＦｃの付加を含む。さらに、Ｆｃを変化させて、治療用抗体の抗体半減期を変えてもよく、投薬頻度を少なくし、したがって、利便性の向上および材料の使用の減少が可能になる。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１の７３４−３５を参照されたい。
【００４８】
「完全ヒト抗体」という語は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体をいう。完全ヒト抗体は、マウス、マウス細胞またはマウス細胞から得られたハイブリドーマを用いて作製された場合、マウスの炭水化物鎖を含んでもよい。同様に、「マウス抗体」とは、マウス免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいう。あるいは、完全ヒト抗体は、ラット、ラット細胞またはラット細胞から得られたハイブリドーマを用いて作製された場合、ラット炭水化物鎖を含んでもよい。同様に、「ラット抗体」とは、ラット免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいう。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「超可変領域」という語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸の残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、５０〜５６（ＣＤＲＬ２）および８９〜９７（ＣＤＲＬ３）ならびに重鎖可変ドメインの残基３１〜３５（ＣＤＲＨ１）、５０〜６５（ＣＤＲＨ２）および９５〜１０２（ＣＤＲＨ３）；Ｋａｂａｔ
ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）および／または「超可変ループ」のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２（ＣＤＲＬ１）、５０〜５２（ＣＤＲＬ２）および９１〜９６（ＣＤＲＬ３）ならびに重鎖可変ドメインの２６〜３２（ＣＤＲＨ１）、５３〜５５（ＣＤＲＨ２）および９６〜１０１（ＣＤＲＨ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）を含む。本明細書で使用する場合、「フレームワーク」または「ＦＲ」残基という語は、本明細書でＣＤＲ残基として定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基をいう。
【００５０】
「結合物質」とは、標的に結合することができる分子、小分子、高分子、抗体、そのフラグメントもしくはアナログまたは可溶性受容体をいう。「結合物質」はまた、標的に結合することができる非共有結合複合体のような分子の複合体、イオン化分子、およびリン酸化、アシル化、架橋結合、環化または限定切断などによる改変など、共有結合的または非共有結合的に改変された分子をいうこともある。さらに、「結合物質」は、安定剤、賦形剤、塩、緩衝液、溶媒または添加剤と組み合わせて標的に結合することができる分子をいうこともある。「結合」とは、結合物質と標的との会合と定義することができ、結合物質を溶液中に溶解または懸濁できる場合、会合の結果、結合物質の通常のブラウン運動は減少する。
【００５１】
「保存的に修飾された改変体」または「保存的置換」とは、タンパク質内におけるアミノ酸と、類似の特徴（たとえば、電荷、側鎖のサイズ、疎水性／親水性、骨格構造および剛直性など）を持つ他のアミノ酸との置換をいい、したがって、その交換が行われても、そのタンパク質の生物活性は変わらない場合が多い。当業者であれば、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が一般に、生物活性を実質的に変化させないことを認識する（たとえば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ
Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ  Ｅｄ．）を参照）。さらに、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物活性を破壊する可能性も低い。本発明の結合化合物の種々の実施形態は、本明細書に開示される特定のアミノ酸配列（たとえば、配列番号２、４、５または６）と比較して、最大０（交換なし）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０またはそれ以上の保存的アミノ酸置換を含有する配列を持つポリペプチド鎖を含む。本明細書で使用する場合、「最大Ｘ」の保存的アミノ酸置換という語句は、０置換およびＸ置換を含めＸ置換まで任意の数の置換を含む。そうした例示的置換は、好ましくは以下の表２に示す置換に従って行われる：
【００５２】
【表１】
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「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という語または「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」もしくは「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの変形は、本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、記載された任意の要素または要素群を含むことと、その記載した要素よりもより類似または異なる性質を持ち、特定の投与レジメン、方法または組成の基本的特性もしくは新規の特性を実質的に変化させない
他の要素を任意に含むこととを示す。非限定的な例として、記載のアミノ酸配列から本質的に成る結合化合物は、その結合化合物の特性に実質的に影響を与えない１つまたは複数のアミノ酸をさらに含んでもよい。
【００５３】
「有効量」とは、医学的状態の症状または徴候を軽減したり、予防したりするのに十分な量を包含する。有効量は、診断を可能にしたり、しやすくしたりするのに十分な量も意味する。個々の患者または家畜被検体の有効量は、処置対象の症候、患者の健康全般、投与の方法経路ならびに用量および副作用の重症度などの要因によって異なり得る（たとえば、Ｎｅｔｔｉらに付与された米国特許第５，８８８，５３０号を参照）。有効量は、重大な副作用または毒性作用を起こさない最高用量または投薬プロトコルであってもよい。その効果は、正常な被検体が示す診断パラメーターを１００％と定義した場合、診断尺度またはパラメーターは、少なくとも５％、一般には少なくとも１０％、より一般には少なくとも２０％、最も一般には少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、一層好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも６０％、理想的には少なくとも７０％、より理想的には少なくとも８０％、最も理想的には少なくとも９０％改善する（たとえば、Ｍａｙｎａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫを参照）。
【００５４】
「外因性」とは、文脈に応じて、生体外、細胞外または人体外で作られる物質をいう。「内因性」とは、文脈に応じて、細胞内、生体内または人体内で作られる物質をいう。
【００５５】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の配列類似性をいう。２つの比較配列中のある位置がともに同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットで占められる場合、たとえば、２個のＤＮＡ分子中のある位置がそれぞれアデニンで占められている場合、その分子は、その位置で相同的である。２つの配列間の相同性の割合は、２つの配列が共有するマッチング位置または相同的な位置の数を比較対象の位置の数で割り、その商を１００倍して決める。たとえば、２つの配列を最適に整列させたとき、その配列において１０個の位置のうち６個がマッチするか、相同的である場合、２つの配列は、６０％相同的である。相同性の割合が最大になるように２つの配列を整列させて比較を行うのが一般的である。
【００５６】
「免疫症候」または「免疫障害」は、たとえば、病的炎症、炎症性障害および自己免疫障害または疾患を包含する。さらに、「免疫症候」とは、免疫系による根絶に抵抗性のある感染、腫瘍および癌を含む、感染、持続感染および増殖症候（癌、腫瘍および血管新生など）もいう。「癌性症候」とは、たとえば、癌、癌細胞、腫瘍、血管新生および異形性などの前癌状態を含む。
【００５７】
「炎症性障害」とは、その病変の全部または一部が、たとえば、免疫系細胞の数の変化、遊走速度の変化または活性化の変化に起因する障害または病態を意味する。免疫系細胞は、たとえば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球またはマクロファージ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞、ミクログリア、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、好酸球、マスト細胞または、たとえば、サイトカイン産生内皮または上皮細胞など、免疫学に特に関係する任意の他の細胞を含む。
【００５８】
「単離された結合化合物」とは、結合化合物の精製状態をいい、そうした文脈では、その分子は、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、または細胞残屑および増殖培地のような他の物質など、他の生体分子を実質的に含まないことを意味する。通常、「単離された」
という語は、本明細書に記載するような結合化合物の実験的使用または治療的使用を実質的に妨げない量で存在する限り、そうした他の物質がまったくないこと、あるいは、水、緩衝液または塩がないことを指すことを意図していない。
【００５９】
「単離された核酸分子」とは、ゲノムＤＮＡまたはゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくは合成起源のものまたはそのいくつかの組み合わせを意味しており、その単離されたポリヌクレオチドが、自然界にあるポリヌクレオチドの全部または一部と無関係であるか、自然界で連結しないポリヌクレオチドに連結している核酸分子を意味する。本開示において個々のヌクレオチド配列「を含む核酸分子」は、インタクトな染色体を包含しないことを理解すべきである。特定の核酸配列「を含む」単離された核酸分子は、その特定の配列に加えて、最大１０あるいは最大２０以上もの他のタンパク質のコード配列またはその一部を含んでもよいし、記載の核酸配列のコード領域の発現をコントロールする作動可能に連結された制御配列を含んでもよいし、および／または、ベクター配列を含んでもよい。
【００６０】
「制御配列」という語句は、個々の宿主生物において、作動可能に連結されたコード配列が発現するのに必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に好適な制御配列として、たとえば、プロモーター、任意にオペレーター配列およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞では、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを用いることが知られている。
【００６１】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に位置しているとき、「作動可能に連結されている」。たとえば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関わるプレタンパク質として発現する場合、そのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に作用する場合、コード配列に作動可能に連結されており；リボソーム結合部位は、翻訳を促進する位置にある場合、コード配列に作動可能に連結されている。通常、「作動可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合、隣接してリーディング相にあることを意味する。一方、エンハンサーについては隣接している必要はない。連結を行うには、好都合な制限部位でライゲートする。そうした部位が存在しない場合、従来のやり方に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という表現は、同義で使われ、そうした言い方はすべて子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、継代数に関係なく、対象の初代細胞およびそれから得られた培養物を含む。すべての子孫は、計画的または偶発的な突然変異のため、ＤＮＡの内容が正確に同一であるとは限らない場合があることも理解される。最初の形質転換細胞を用いてスクリーニングしたときと同じ機能または生物活性を変異子孫が持つ場合、その変異子孫を含む。異なる言い方が意味するところは、文脈から明らかになるであろう。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、たとえば、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されているように、微量の核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定の断片を増幅させる手順または技法をいう。通常、目的の領域の末端またはそれを越える配列情報を入手する必要がある。そうすれば、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。それらのプライマーは、増幅される鋳型の逆鎖に対して配列が同一または類似している。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅材料の末端と一致してもよい。ＰＣＲを用いて、全ゲノムＤＮＡと、全細胞性ＲＮＡ、バクテリオファージ配列またはプラスミド配列などから転写されたｃＤＮＡとから特定のＲＮＡ配列、特定のＤＮＡ配列を増幅することができる。Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５
１：２６３；Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，（１９８９）ＰＣＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）を全般的に参照されたい。本明細書で使用する場合、ＰＣＲは、プライマーとしての既知の核酸と核酸ポリメラーゼとを用いて核酸の特定の断片の増幅および生成を行うことを含む、核酸被検サンプルを増幅させる核酸ポリメラーゼ反応法の一例であるが、その唯一の例ではないと考える。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「生殖細胞系配列」という語は、再配列されていない免疫グロブリンＤＮＡ配列の配列をいう。再配列されていない免疫グロブリンの任意の好適な供給源を用いてもよい。
【００６５】
「阻害剤」および「アンタゴニスト」または「活性化剤」および「アゴニスト」とはそれぞれ、たとえば、リガンド、受容体、補助因子、遺伝子、細胞、組織または器官などの活性化に対する阻害分子または活性化分子をいう。たとえば、遺伝子、受容体、リガンドまたは細胞のモジュレーターは、遺伝子、受容体、リガンドまたは細胞の活性を変化させる分子であり、その制御特性により活性を、活性化したり、阻害したり、変化させたりすることができる。モジュレーターは、単独で作用してもよいし、たとえば、タンパク質、金属イオンまたは小分子のような補助因子を用いてもよい。阻害剤は、活性化を低下させたり、遮断したり、防止したり、遅延させたり、たとえば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体または細胞を不活化したり、低感受性にしたり、下方制御したりする化合物である。活性化剤は、活性化を高めたり、活性化したり、促進したり、増強したり、たとえば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体または細胞を高感受性にしたり、上方制御したりする化合物である。また、阻害剤は、恒常的な活性を低下させたり、遮断したり、不活化したりする化合物と定義してもよい。「アゴニスト」は、標的と相互作用して標的の活性化の増強を引き起こしたり、促進したりする化合物である。「アンタゴニスト」は、アゴニストの作用に対抗する化合物である。アンタゴニストは、アゴニストの活性を防止したり、低下させたり、阻害したり、中和したりする。さらに、アンタゴニストは、特定のアゴニストが存在しない場合でも、標的受容体などの標的の恒常的な活性を防止したり、阻害したり、低下させ得る。限定としてではなく例として、アゴニスト抗体は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性を活性化できる抗体である。
【００６６】
阻害の程度を調べるには、たとえば、所定のタンパク質、遺伝子、細胞または生体などを含むサンプルまたはアッセイを有望な活性化剤または阻害剤で処置し、その阻害剤を用いない対照サンプルと比較する。対照サンプル、すなわち、アンタゴニストで処置していないサンプルの相対活性値を１００％とする。阻害については、対照に対するその活性値が約９０％以下、典型的には８５％以下、より典型的には８０％以下、最も典型的には７５％以下、一般には７０％以下、より一般的には６５％以下、最も一般には６０％以下、典型的には５５％以下、通常には５０％以下、より通常には４５％以下、最も通常には４０％以下、好ましくは３５％以下、一層好ましくは３０％以下、なお一層好ましくは２５％以下、最も好ましくは２５％未満のとき、達成される。活性化については、対照に対する相対的活性値が約１１０％、一般には少なくとも１２０％、より一般的には少なくとも１４０％、より一般的には少なくとも１６０％、多くの場合、少なくとも１８０％、より多くの場合、少なくとも２倍、最も多くの場合、少なくとも２．５倍、通常には少なくとも５倍、より通常には少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、一層好ましくは少なくとも４０倍および最も好ましくは４０倍を超えるとき、達成される。
【００６７】
活性化または阻害のエンドポイントについては、以下のようにモニターしてもよい。たとえば、細胞、生理的液体、組織、器官および動物またはヒトの被検体の処置に対する活性化、阻害および反応をエンドポイントによりモニターすることができる。エンドポイントは、たとえば、所定の量または割合の炎症の徴候、発癌性または細胞の脱顆粒もしくは分泌（サイトカイン、毒性酸素またはプロテアーゼの放出など）を含んでもよい。エンド
ポイントは、たとえば、所定量のイオン流束または輸送；細胞遊走；細胞接着；細胞増殖；転移の可能性；細胞分化；および表現型の変化（たとえば、炎症、アポトーシス、形質転換、細胞周期または転移に関係する遺伝子発現の変化）を含んでも構わない（たとえば、Ｋｎｉｇｈｔ（２０００）Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．３０：１４５−１５８；Ｈｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ
２：９１−１００；Ｔｉｍｍｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ４：２５１−２６１；Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｔｚｋｏｗｉｔｚ（２００２）Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．８６：１４６７−１４９５；Ｇｒａｄｙ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ（２００２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０１−１２８；Ｂａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｌｉａ  ３６：２３５−２４３；Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ  ａｎｄ  Ｓａｔｏｈ（２０００）Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１０：１１３−１２６を参照）。
【００６８】
阻害のエンドポイントは通常、対照の７５％以下、好ましくは対照の５０％以下、一層好ましくは対照の２５％以下、最も好ましくは対照の１０％以下である。通常、活性化のエンドポイントは、少なくとも対照の１５０％、好ましくは少なくとも対照の２倍、一層好ましくは少なくとも対照の４倍、最も好ましくは少なくとも対照の１０倍である。
【００６９】
「リガンド」とは、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る、たとえば、小分子、ペプチド、ポリペプチドおよび膜会合分子もしくは膜結合分子またはこれらの複合体をいう。「リガンド」はまた、アゴニストまたはアンタゴニストではないが、受容体に結合できる因子も包含する。さらに、「リガンド」は、たとえば、化学的方法または組換え法により可溶性形態の膜結合リガンドに変えられた膜結合リガンドも含む。原則として、リガンドが第１の細胞の膜に結合する場合、その受容体は通常、第２の細胞に発生する。第２の細胞の個性は、第１の細胞と同じ場合もあるし、異なる場合もある。リガンドまたは受容体は、完全に細胞内にあってもよい。すなわち、サイトゾル、核またはどこか他の細胞内コンパートメントにあっても構わない。そのリガンドまたは受容体は、たとえば、細胞内コンパートメントから形質膜の外表面へとその位置を変えることもある。リガンドと受容体との複合体は、「リガンド受容体複合体」と呼ばれる。リガンドおよび受容体がシグナル伝達経路に関与する場合、そのリガンドは、シグナル伝達経路の上流の位置に現れ、受容体は、その下流の位置に現れる。
【００７０】
「小分子」は、分子量が１０ｋＤａ未満、典型的には２ｋＤａ未満、好ましくは１ｋＤａ未満、最も好ましくは約５００Ｄａ未満の分子と定義する。小分子として、無機分子、有機分子、無機成分を含む有機分子、放射性原子を含む分子、合成分子、ペプチド模倣体および抗体模倣体を含むが、これに限定されるものではない。治療剤として、小分子は、大きな分子よりも細胞に対する透過性が高くて、分解を受けにくく、免疫応答を誘発しにくい傾向にあり得る。抗体やサイトカインのペプチド模倣体などの小分子および小分子のトキシンが記載されている（たとえば、Ｃａｓｓｅｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０７：１９８−２０５；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（２００Ｉ）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２；Ｌｉ（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２５１−１２５６；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９：４１１−４２０；Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．８：２１８５−２１９９；Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：６５２−６５６；Ｓａｔｏ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅ（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７１：６０３−６０８；Ｓｔｅｗａｒｔらに付与された米国特許第６，３２６，４８２号を参照）。
【００７１】
リガンド／受容体について言及する際に、「特異的に」または「選択的に」結合する抗
体／抗原または他の結合対は、タンパク質および他の生物製剤の不均一な集団中における問題のタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、特定のリガンドは、指定の条件下で特定の受容体に結合するが、サンプル中に存在する他のタンパク質に相当量では結合しない。たとえば、意図した方法の抗体または抗体の抗原結合部位から得られる結合化合物は、任意の他の抗原の親和性に比べて、少なくとも２倍高い、好ましくは少なくとも１０倍高い、一層好ましくは少なくとも２０倍高い、最も好ましくは少なくとも１００倍高い親和性でその抗原またはその改変体またはムテインに結合する。好ましい実施形態では、抗体の親和性は、たとえば、スキャッチャード解析で判定する場合、約１０９Ｍ−１よりも高い（Ｍｕｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９）。限定としてではなく例として、指定の条件は、タンパク質および他の生物製剤の不均一な集団がすべて同じ種に由来するアッセイを包含してもよい。さらに、限定としてではなく例として、抗体または抗体の抗原結合部位から得られる結合化合物は、抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的または選択的に結合するが、ＣＹＳ改変ヒトＣＤ２００ＲＬａ（たとえば、図９および実施例１３を参照）またはヒトＣＤ２００ＲＬａ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したヒトＣＤ２００ＲＬａの細胞外ドメイン、たとえば、実施例１３を参照）には特異的または選択的に結合しない。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「免疫調節剤」という語は、免疫応答を抑制または調節する天然剤または合成剤をいう。免疫応答は、液性応答でも細胞応答でもよい。免疫調節剤は、免疫抑制剤または抗炎症剤を包含する。
【００７３】
「免疫抑制剤」、「免疫抑制薬物」または「免疫抑制薬」は、本明細書で使用する場合、免疫系の活性を阻害または防止するため、免疫抑制治療に使用する治療剤である。臨床的には、そうした治療剤を用いて、移植臓器および組織（骨髄、心臓、腎臓、肝臓など）の拒絶反応を防止し、および／または、自己免疫疾患または自己免疫が原因である可能性が非常に高い疾患（関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症など）を処置する。免疫抑制薬物は、糖質コルチコイド；細胞増殖抑制薬；抗体（生物学的応答調節剤）；イムノフィリンに作用する薬剤；増殖性障害の処置に使用される既知の化学療法剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）などのこれ以外の薬剤に分類できる。多発性硬化症の場合、特に、本発明の抗体を、コパクソンと呼ばれる新しいクラスのミエリン結合タンパク質様治療剤と併用して投与してもよい。
【００７４】
「抗炎症剤」または「抗炎症薬」とは、ステロイド治療剤および非ステロイド性治療剤の両方をいう。ステロイドは、コルチコステロイドとしても知られ、コルチゾール（副腎で自然に作られるホルモン）によく似た薬剤である。ステロイドは、全身性血管炎（血管の炎症）および筋炎（筋肉の炎症）など、ある種の炎症症候の主要な処置剤として用いられる。さらに、ステロイドは、関節リウマチ（体の両側の関節に起こる慢性炎症性関節炎）；全身性エリテマトーデス（異常な免疫系機能により引き起こされる全身疾患）；シェーグレン症候群（ドライアイおよび口内乾燥の原因となる慢性障害）などの炎症症候の処置に選択的に用いてもよい。
【００７５】
非ステロイド性抗炎症薬（通常ＮＳＡＩＤと略される）は、鎮痛作用、解熱作用および抗炎症作用のある薬剤であり、疼痛、発熱および炎症を緩和する。「非ステロイド性」という語は、これらの薬剤を、（他の多岐にわたる作用の中でも）同様のエイコサノイド抑制作用、抗炎性作用を持つステロイドと区別するために使用する。ＮＳＡＩＤは通常、関節リウマチ；変形性関節症；炎症性関節症（強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、ライター症候群など）；急性痛風；月経困難症（ｄｙｓｍｅｎｏｒｒｈｏｅａ）；転移性骨痛；頭痛および片頭痛；術後疼痛；炎症および組織傷害による軽度ないし中等度の疼痛；発熱；および腎仙痛などの症状を軽減させるために用いられる。ＮＳＡＩＤは、サリチラート、アリルアルカン酸（ａｒｌｙａｌｋｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、２−アリールプロピオン酸（プロ
フェン）、Ｎ−アリールアントラニル酸（フェナム酸）、オキシカム、コキシブおよびスルホンアニリドを含む。
【００７６】
疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）については、多くの場合、ＮＳＡＩＤと併用して投与することができる。一般に処方されているＤＭＡＲＤは、ヒドロキシクロロキン／クロロキン、メトトレキサート、金療法、スルファサラジンおよびアザチオプリンを含む。
【００７７】
ＩＩ．ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的な抗体
本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症、関節リウマチ、骨粗鬆症、炎症性線維症（強皮症、肺線維症および肝硬変など）、炎症性腸障害（クローン病、潰瘍性大腸炎および炎症性腸疾患など）、喘息（アレルギー性喘息など）、アレルギー、ＣＯＰＤ、多発性硬化症、乾癬、ぶどう膜炎および癌を含む、様々な炎症性障害、免疫障害および増殖性障害を処置する抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒｒ抗体およびその使用を提供する。
【００７８】
モノクローナル抗体を作製する任意の好適な方法を用いて、本発明の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体を作製することができる。たとえば、レシピエント動物を連結型または非連結型（天然など）のヒト阻害性ＣＤ２００Ｒまたはそのフラグメントで免疫してもよい。免疫化には任意の好適な方法を用いてよい。そうした方法は、アジュバント、他の免疫賦活薬、ブースター免疫の繰り返しおよび１つまたは複数の免疫経路の使用を含む。
【００７９】
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的な非ヒト抗体の作製には、任意の好適な形態のヒト阻害性ＣＤ２００Ｒを免疫原（抗原）として用いることができ、その抗体の生物活性をスクリーニングしてもよい。誘発免疫原は、全長ヒト阻害性ＣＤ２０００Ｒでも、単一エピトープまたは多重エピトープを包含するそのペプチドでもよい。免疫原は、単独でも、当該技術分野において公知の１つまたは複数の免疫原性増強剤と併用してもよい。免疫原については、天然の供給源から精製しても、遺伝子改変細胞を用いて作製してもよい。免疫原をコードするＤＮＡの起源は、ゲノムでも非ゲノム（ｃＤＮＡなど）でも構わない。免疫原をコードするＤＮＡについては、以下に限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、プラスミドおよび陽イオン性脂質のような非ウイルスベクターを含む、好適な遺伝子ベクターを用いて発現させてもよい。ヒトＣＤ２００Ｒの配列は、たとえば、米国特許出願公開第２００６／００８４１２１号，Ｗｒｉｇｈｔ  ＧＪ  ｅｔ  ａｌ（２００３）１７１（６）：３０３４−３０４６（参照によってその全体を本明細書に援用する）および図１３で確認することができる。限定としてではなく例として、ヒト阻害性受容体の長型あるいは短型を免疫原（抗原）として用いてもよい  ヒト阻害性受容体の短型およびヒト阻害性受容体の長型のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、それぞれＡＦ２８３７６０およびＡＦ２８３７６０である。ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの短型は、図１３にも示してある。
【００８０】
代替の実施形態では、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的な非ヒト抗体の作製に、ｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２００Ｒ（図１３を参照）など非ヒト霊長類の阻害性ＣＤ２００Ｒを免疫原（抗原）として用いてもよく、その抗体の生物活性をスクリーニングすればよい。誘発免疫原は、全長ｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２０００Ｒでも、単一エピトープまたは多重エピトープを包含するそのペプチドでもよい。免疫原は、単独でも、当該技術分野において公知の１つまたは複数の免疫原性増強剤と併用してもよい。免疫原については、天然の供給源から精製しても、遺伝子改変細胞を用いて作製してもよい。免疫原をコードするＤＮＡの起源は、ゲノムでも非ゲノム（ｃＤＮＡなど）でも構わない。免疫原をコードするＤＮＡについては、以下に限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、プラスミドおよび陽イオン性脂質のような非ウイルスベクターなど、好適な遺伝子ベクターを用いて発現させてもよい。
【００８１】
たとえば、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性を活性化するような所望の生物学的特性を持つ抗体反応を誘導するには、任意の好適な方法を用いることができる。いくつかの実施形態では、マウス、げっ歯類動物、霊長類、ヒトなどの哺乳動物宿主を用いて抗体を形成する。モノクローナル抗体を調製する技法は、たとえば、Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）ＢＡＳＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（４ｔｈ  ｅｄ．）Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡ，およびその中に引用された参考文献；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ（２ｄ  ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹで確認できる。したがって、モノクローナル抗体については、当該技術分野の熟練した研究者によく知られている様々な技法により得ることができる。通常、所望の抗原で免疫した動物の脾臓細胞を、一般には骨髄腫細胞と融合して不死化する。Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９を参照されたい。不死化に代わる方法として、エプスタインバーウイルス、オンコジーンまたはレトロウイルスによる形質転換または当該技術分野において公知の他の方法が挙げられる。たとえば、Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９４  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ，Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい。抗原に対して所望の特異性および親和性を持つ抗体を産生するかどうかについて、単一の不死化細胞から生じたコロニーをスクリーニングする。そうした細胞から産生されるモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿主の腹膜腔に注射するなど、様々な技法により高めてもよい。
【００８２】
他の好適な技法では、ファージまたは類似のベクターの抗体ライブラリーの選択を行う。たとえば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９）を参照されたい。本発明の抗体は、たとえば、親げっ歯類動物抗体として改変せずに用いても、キメラ抗体またはヒト化抗体など、ヒト被験者の治療薬としての使用を促進するように改変して用いてもよい。いくつかの実施形態では、抗体を、検出可能なシグナルを発する物質で共有結合的または非共有結合的に標識する。多岐にわたる標識およびコンジュゲーション技法が知られており、科学文献にも特許文献にも広く報告されている。好適な標識として、放射性核種、酵素、基質、補助因子、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、磁気粒子などが挙げられる。そうした標識の使用を教示する特許として、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。また、組換え免疫グロブリンを作製してもよく、Ｃａｂｉｌｌｙ  米国特許第４，８１６，５６７号；およびＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３を参照されたい。あるいは、組換え免疫グロブリンを、トランスジェニックマウスを用いて作製してもよく、Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６と、さらにＡｂｇｅｎｉｘおよびＭｅｄａｒｅｘの技法も参照されたい。
【００８３】
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの所定のフラグメントとキャリアタンパク質とのコンジュゲートで動物を免疫して、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの所定のフラグメントに対する抗体を形成してもよい。所望の抗体を分泌している細胞から、モノクローナル抗体を調製する。これらの抗体を、正常なヒト阻害性ＣＤ２００Ｒまたは不完全なヒト阻害性ＣＤ２００Ｒへの結合でスクリーニングできる  これらのモノクローナル抗体は、普通、少なくとも約１μＭ、より一般には少なくとも約３００、３０、１０または３ｎＭ、好ましくは少なくとも
約３００、１００、３０、１０、３または１ｐＭのＫｄで結合する。Ｋｄ値と親和性とは逆の関係にあるため、あるＫｄ「以下」で結合するということは、少なくとも記載の数値と同じ高さの親和性、すなわち、少なくとも記載の値と同じ低さのＫｄで結合することをいう。結合親和性については、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴分光法（実施例４を参照）、ＫｉｎＥｘＡ（実施例３を参照）、ＥＣＬ法により測定することができる。また、好適な非ヒト抗体を、以下の実施例５に記載の生物学的アッセイを用いて同定してもよい。
【００８４】
本発明の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体を作製する例示的な方法については、実施例２に記載されている。
【００８５】
ＩＩＩ．ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ特異的抗体のヒト化
本発明の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の超可変領域の供給源として、任意の好適な非ヒト抗体を用いてよい。非ヒト抗体の供給源として、げっ歯類動物（マウス、ラットなど）、ウサギ類の動物（ウサギなど）、雌ウシおよび非ヒト霊長類があるが、これに限定されるものではない。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基を、所望の特異性および親和性を持つマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域残基で置き換えた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。さらに、ヒト化抗体は、所望の生物活性に対する抗体の性能をさらに向上させるための改変など、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含んでもよい。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ
３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照されたい。
【００８６】
抗体を組換え技術により操作および作製する方法は、たとえば、Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第４，８１６，３９７号）、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第４，８１６，５６７号）、Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．（欧州特許出願公開第４３８３１０号）およびＷｉｎｔｅｒ（欧州特許出願公開第２３９４００号）により記載されている。
【００８７】
適切なヌクレオチド変化をヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ  ＤＮＡに導入したり、ペプチド合成したりすることで、本発明のヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体のアミノ酸配列改変体を調製してもよい。最終コンストラクトが所望の特徴を持つという条件において、最終コンストラクトに到達するため、欠失、挿入および置換をどのように組み合わせてもよい。また、アミノ酸変化では、グリコシル化部位の数または位置の変化など、ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の翻訳後プロセシングを変化させても構わない。
【００８８】
変異誘発に好ましい位置にある、ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の残基または領域を特定する有用な方法の１つは、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれている。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５を参照されたい。一群の標的残基（たとえば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの荷電残基）を同定し、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置き換えてそのアミノ酸とヒト阻害性ＣＤ２００Ｒとの相互作用を変化させる。次いで、アラニン置換に対して機能的感受性を示す残基を、アミノ酸置換をさらに導入することで改良する。一実施形態では、所定の標的コドンにおける突然変異の作用を、アラニンスキャニングまたはランダム変異誘発で測定し、続いて得られたヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体改変体の活性および結合解析を行う。
【００８９】
アミノ酸配列の挿入は、長さ１残基から百以上の残基を含むポリペプチドに及ぶアミノ
および／またはカルボキシル末端融合、および単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を持つヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体またはエピトープタグと融合した同抗体が挙げられる。他の改変体として、抗体の血清中半減期を延長させる酵素またはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端への融合が挙げられる。
【００９０】
改変体の別のタイプは、アミノ酸置換改変体である。これらの改変体は、ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている。置換改変誘発で最も注目される部位として、超可変ループを含むが、ＦＲの交換も意図される。抗原結合に関与する超可変領域残基またはＦＲ残基は通常、比較的保存的様式で置換される。
【００９１】
抗体の他のアミノ酸改変体では、１つまたは複数の炭水化物部分を除去することで、および／または、１つまたは複数のグリコシル化部位を付加することで、抗体の当初のグリコシル化パターンを変化させる。抗体のグリコシル化は一般に、Ｎ結合型あるいはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基側鎖への炭水化物部分の結合をいう。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合の認識配列である。ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のどちらかが存在すれば、潜在的グリコシル化部位が形成される。Ｏ結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的なのはセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンもまた使われ得る）へのＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの結合を含む。
【００９２】
上記のトリペプチド配列の１つまたは複数を挿入することで（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）、あるいは、１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基を付加することで（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）、グリコシル化部位を本発明の抗体に付加してもよい。
【００９３】
ヒト化ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ特異的抗体のアミノ酸配列改変体をコードする核酸分子については、当該技術分野において公知の様々な方法により調製する。こうした方法として、天然の供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列改変体の場合）、あるいは、オリゴヌクレオチド媒介の（または部位特異的）改変誘発、ＰＣＲ改変誘発またはカセット改変導入によるものがあるが、これに限定されるものではない。
【００９４】
一般に、ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体のアミノ酸配列改変体は、重鎖あるいは軽鎖における最初のヒト化抗体のアミノ酸配列とのアミノ酸配列の同一性が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を持つ。本明細書では、この配列に対する同一性または相同性を、候補配列を最適に整列させたとき（すなわち、配列を整列させ必要に応じてギャップを入れ、配列のパーセント同一性が最大になるようにした後）、ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ残基と一致した候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義し、保存的置換については配列同一性の一部として一切考慮しない。抗体配列のＮ末端、Ｃ末端または内部の伸長、欠失または挿入については、配列同一性または相同性に影響を与えないものとみなす。
【００９５】
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む、免疫グロブリンの任意のクラスから選択してもよい。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む、ＩｇＧの任意のアイソタイプを用いてもよい。さらに、ＩｇＧアイソタイプの改変体も意図している。ヒト化抗体は、複数のク
ラスまたはアイソタイプからの配列を含んでよい。所望の生物学的活性を生じるのに必要な定常ドメイン配列の最適化は、以下の実施例に記載の生物学的アッセイにおいて、抗体をスクリーニングすることで容易に達成できる。
【００９６】
同様に、本明細書の化合物および方法には、軽鎖のいずれのクラスを用いてもよい。具体的には、κ、λまたはこれらの改変体は、本化合物および方法に有用である。
【００９７】
本発明のヒト化抗体を作製するには、非ヒト抗体からのＣＤＲ配列の任意の好適な一部を用いてもよい。置換、挿入または欠失によりＣＤＲ配列に改変を誘発してもよいが、そうした変異は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ結合親和性および特異性を維持する必要から、最低限にとどまる。一般に、ヒト化抗体ＣＤＲ残基は、少なくとも７５％、より多くの場合９０％、最も好ましくは９５％超、しばしば１００％が非ヒトＣＤＲ残基と一致する。
【００９８】
ヒト抗体からのＦＲ配列の任意の好適な一部を用いてもよい。使用するヒトおよび非ヒト抗体配列とＦＲ配列が異なるように、少なくとも１つの残基の置換、挿入、欠失によって、ＦＲ配列に変異を誘発してもよい。そうした変異は最低限にとどまるよう意図される。一般に、ヒト化抗体残基は、少なくとも７５％、より多くの場合９０％、最も好ましくは９５％超ヒトＦＲ残基と一致する。
【００９９】
さらに、所望の生物活性を示す限り、キメラ抗体またはこれらのフラグメントについても意図されている（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５）。上記のように、通常のキメラ抗体は、別の種から得られた抗原特異的抗体の可変ドメインに連結した、ある種由来の抗体からの定常ドメイン配列を含んでいる。
【０１００】
本発明の結合化合物は、二重特異性抗体を含んでもよい。本明細書で使用する場合、「二重特異性抗体」という語は、少なくとも２つの異なる抗原エピトープに対して結合特異性を持つ抗体、典型的にはモノクローナル抗体をいう。一実施形態では、そのエピトープは、同じ抗原由来である。別の実施形態では、そのエピトープは、２つの異なる抗原由来である。二重特異性抗体の作製方法は、当該技術分野において公知である。たとえば、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現を用いて、二重特異性抗体を組換え技術により作製することができる。たとえば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−３９を参照されたい。あるいは、化学結合により二重特異性抗体を調製しても構わない。たとえば、Ｂｒｅｎｎａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１を参照されたい。二重特異性抗体は、二重特異性抗体フラグメントを含む。たとえば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−４８，Ｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【０１０１】
本発明の抗ヒトヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体をヒト化する例示的な方法については、実施例２に記載してある。
【０１０２】
ＩＶ．ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ特異的抗体の特徴付け
実施例１および２により詳細に記載したように、本明細書に記載の方法を用いて、ヒトヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに免疫反応を示すモノクローナル抗体を作製した。図１および図２は、それぞれ様々な本発明の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の軽鎖および重鎖の可変領域の配列アライメントを示す。ＣＤＲ領域を示し、番号付けはＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）による。
【０１０３】
ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ軽鎖および重鎖をコードする核酸配列を含むプラスミ
ドは、ブダペスト条約に従い２００６年１２月６日に受託番号ＰＴＡ−８０６７でＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）に寄託された。軽鎖および重鎖をコードする、および、さらにシグナルペプチドをコードする核酸配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに作動可能に連結された単一のプラスミドの中にある。このプラスミドはまた、プラスミド増幅のためマウス乳腺癌ウイルス末端長反復配列（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）に作動可能に連結されたＤＨＦＲ  ｃＤＮＡと、哺乳動物細胞での選択のためＴＫプロモーターに作動可能に連結されたハイグロマイシンＢ遺伝子とを含む。たとえば、そのプラスミドを用いて、組換えタンパク質を発現するｄｈｆｒ−哺乳動物細胞株にトランスフェクトしてもよい。ｄｈｆｒ−哺乳動物細胞株の例として、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１およびＤＧ４４．）があるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、結合化合物は、２００６年１２月６日にＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ＵＳＡ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−８０６７の発現ベクターから産生された成熟抗体（ｐＡＣＤ２００ＲＶ１プラスミド中にシグナル配列を含むｈｕＤＸ１８２）である。
【０１０４】
別の実施形態では、結合化合物は、２００７年１２月１３日にＨＣ８０９．１４Ｆ１２．６．ＤＸ２４８．３株として寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−８８３８であるハイブリドーマから産生される抗体と同じＣＤＲを持つ。
【０１０５】
本発明の抗体の軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲをそれぞれ表２および表３に示す。限定としてではなく例として、ＶＬドメインＣＤＲは、配列番号１、２および３から選択され、ＶＨドメインＣＤＲは、配列番号１９、２０および２１から選択される。さらに、限定としてではなく例として、ＶＬドメインＣＤＲは、ＲＡＳＫＮＩＲＳＹＬＡ（配列番号５５）、配列番号２および配列番号３から選択され、ＶＨドメインＣＤＲは、配列番号１９、２０および２１から選択される。限定としてではなく例として、ＶＬドメインＣＤＲは、配列番号１６、１７および１８から選択され、ＶＨドメインＣＤＲは、配列番号３４、３５および３５から選択される。
【０１０６】
【表２】
2010512791.tif 000040
【０１０７】
【表３】
2010512791.tif 000041
ヒト化ＶＬ領域およびＶＨ領域と、ヒト化抗体ｈｕＤＸ１８２との配列を示す（それぞれ配列番号４２および４８）。これらのヒト化可変ドメインを用いて、適切な定常ドメイン配列を加えることで全長キメラ抗体またはヒト化抗体を作製してもよい。
【０１０８】
本発明の一実施形態では、抗体ｈｕＤＸ１８２の軽鎖および重鎖を、ヒト定常ドメイン（それぞれヒトκ軽鎖およびヒトＩｇＧ１定常ドメイン）をヒト化ＶＬ領域（配列番号４２）およびＶＨ領域（配列番号４８）のＣ末端に付加して作製する。ｈｕＤＸ１８２軽鎖および重鎖の配列を配列番号４９および５０で示す。
【０１０９】
別の実施形態では、実施例２により詳細に記載されているように、キメラ型抗体のフレームワーク残基（すなわち、ＣＤＲの要素でない可変ドメインのアミノ酸残基）をヒト生殖細胞系フレームワーク配列で置換して、全長ヒト化抗体を作製する。得られた抗体は、ラット抗体からのＣＤＲ配列のみを保持し、定常ドメインおよびフレームワーク配列は、ヒト由来の配列に置き換えられている。シグナル配列を除くヒト化抗体ｈｕＤＸ１８２の全長成熟軽鎖および重鎖を、それぞれ配列番号４９および５０で示す（図３および図４）。
【０１１０】
さらなる実施形態では、抗体を作製するとき、本発明のヒト化抗体の全長軽鎖および重鎖を、Ｎ末端にシグナルペプチドを含むようにクローニングして、細胞から分泌されやすくする。一実施形態では、１９アミノ酸シグナル配列を、ヒト化ＤＸ１８２抗体の軽鎖および重鎖の両方に付加する。シグナル配列を加えた、ヒト化ＤＸ１８２の全長軽鎖および重鎖のＤＮＡ配列を配列番号５２および５４で示す（図５Ａおよび図５Ｂと、図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃ）。本発明のヒト化抗体を作製するには、そうしたＤＮＡ配列を、任意の好適な発現ベクターにクローニングし、発現させてもよい。他の実施形態では、抗体の作製を意図する方法に応じて、記載した特定のシグナル配列と異なるシグナル配列を付加する。そうしたシグナル配列については、科学文献、たとえば、Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）「ＳＰｄｂ−ａ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅ，」ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ６：２４９から得てもよい。シグナル配列を加えた、ヒト化ＤＸ１８２の全長軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を配列番号５１および５３で示す（図５Ａおよび図５Ｂと、図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃ）。
【０１１１】
なお他の実施形態では、様々な定常ドメインを、本明細書に記載のヒト化ＶＬ領域およびＶＨ領域に付加してもよい。たとえば、本発明の抗体（またはフラグメント）の特定の使用目的によりエフェクター機能の変更が必要な場合、ＩｇＧ１以外の重鎖定常ドメインを用いてもよい。ＩｇＧ１抗体は、長い半減期ならびに補体活性化および抗体依存性細胞傷害などのエフェクター機能を与えるが、そうした作用が抗体のすべての使用に望ましいとは限らない場合がある。そうした場合には、たとえば、ＩｇＧ４定常ドメインを用いてもよい。
【０１１２】
Ｖ．ヒト化抗ＣＤ２００Ｒの親和性および生物活性
ヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体において本明細書で望ましいと認めた特徴を持つ抗体について、インビトロで、インビボで、あるいは、結合親和性の測定により、阻害性の生物学的活性をスクリーニングしてもよい。目的の抗体が結合するヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ上の同じエピトープに結合する抗体（阻害性受容体に対する阻害機能を活性化する抗体など）をスクリーニングするには、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ
Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているような通常の交差ブロッキングアッセイを行えばよい。あるいは、たとえば、Ｃｈａｍｐｅ  ｅｔ
ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４に記載されているように、エピトープマッピングを行い、抗体が目的のエピトープに結合するかどうかを判定してもよい。実施例３および４に記載の方法を含む標準的な方法を用いて、（たとえば、ヒトＣＤ２００Ｒに対する）抗体親和性を測定することもできる。好ましいヒト化抗体は、約１００ｎＭ（１×１０−７Ｍ）以下；好ましくは約１０ｎＭ以下；一層好ましくは約１ｎＭ以下のＫｄ値でヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する抗体である。抗体のＫｄ値が約２００ｐＭ（２×１０−１０Ｍ）、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、さらには２ｐＭ以下である実施形態は、なお一層好ましい。
【０１１３】
本化合物および方法に有用な抗体およびそのフラグメントには、生物学的に活性な抗体およびフラグメントが含まれるが、これに限定されるものではない。本明細書で使用する場合、「生物学的に活性な」という語は、抗体または抗体フラグメントが所望の抗原エピトープに結合し、直接的または間接的に生物学的作用（ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ受容体の阻害活性の活性化など）を発揮できることをいう。本明細書で使用する場合、「特異的」という語は、標的抗原エピトープへの抗体の選択的結合をいう。抗体の結合特異性については、一定の条件下でヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに対する結合と、無関係な抗原または抗原混合物に対する結合とを比較することで検査してもよい。一例を挙げると、無関係な抗原または抗原混合物に対する親和性よりも少なくとも１０倍、好ましくは５０倍高い親和性で、抗体がヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する場合、抗体は特異的であるとみなされる。たとえば、本明細書で使用する場合、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含む融合タンパク質「に特異的に結合する」抗体は、ＩｇＧ１のＦｃ部分単独には結合しないか、あるいは、そのＦｃ部分がヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ以外のタンパク質と融合されている場合、それに結合しない。さらに、限定としてではなく例として、本発明の方法に有用な抗体の抗原結合部位から得られた抗体または結合化合物は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに特異的または選択的に結合するが、ＣＹＳ改変ヒトＣＤ２００ＲＬａ（たとえば、図９および実施例１３を参照）またはヒトＣＤ２００ＲＬａ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合されたヒトＣＤ２００ＲＬａの細胞外ドメイン、たとえば、実施例１３を参照）には特異的または選択的に結合しない。
【０１１４】
Ｖ．抗体の作製
本抗体を組換え技術により作製するには、さらにクローニング（ＤＮＡの増幅）を行ったり、発現させたりするため、本抗体をコードする核酸を単離し、複製可能なベクターに挿入する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡについては、従来の手順により（例え
ば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）容易に単離し、配列決定できる。多くのベクターが入手可能である。そのベクター成分は通常、以下に限定されるものではないが、シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーターおよび転写終結配列のうち１つまたは複数を含む。一実施形態では、本発明のヒト化抗ヒト阻害性抗体の軽鎖および重鎖はともに、たとえば、プラスミドまたはアデノウイルスベクターのような同じベクターから発現する。
【０１１５】
本発明の抗体については、当該技術分野において公知の任意の方法により作製してもよい。一実施形態では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、マウス骨髄腫ＮＳＯ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣（Ｓｆ９）細胞のような培養中の哺乳動物細胞または昆虫細胞に抗体を発現させる。一実施形態では、ＣＨＯ細胞から分泌される抗体を、プロテインＡクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなど標準的なクロマトグラフ法により回収し、精製する。得られた抗体を濃縮し、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で保管する。
【０１１６】
別の実施形態では、国際公開第２００５／０４０３９５号に記載の方法に従って本発明の抗体を酵母で産生させる。簡単に説明すると、目的の抗体の個々の軽鎖または重鎖をコードするベクターを、異なる酵母半数体細胞、たとえば、交配型が異なる酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（この酵母半数体細胞は、任意に相補的な栄養要求株である）に導入する。次いで、形質転換された半数体酵母細胞を交配または融合させて、重鎖および軽鎖をともに産生できる２倍体酵母細胞を得る。その後、この２倍体株は、完全に構築され生物学的に活性な抗体を分泌できる。二本鎖の相対的な発現レベルについては、たとえば、コピー数が異なるベクターを使用したり、強さが異なる転写プロモーターを使用したり、あるいは、一本鎖または二本鎖をコードする遺伝子の転写を促す誘導性プロモーターから発現を誘導したりすることで、最適化できる。
【０１１７】
一実施形態では、複数種の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（「元の」抗体）の重鎖および軽鎖をそれぞれ酵母半数体細胞に導入して、複数の軽鎖を発現する１つの交配型の半数体酵母菌株ライブラリーと、複数の重鎖を発現する別の交配型の半数体酵母菌株ライブラリーとを作出する。これらの半数体株ライブラリーを接合（またはスフェロプラストとして融合）させて、種々の可能な軽鎖と重鎖の置換からなる抗体のコンビナトリアルライブラリーを発現する一連の２倍体酵母細胞を産生させてもよい。次いで、抗体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして、抗体のいずれかが、元の抗体の特性よりも優れた特性（抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに対するより高い親和性など）を持つかどうかを判定することができる。たとえば、国際公開第２００５／０４０３９５号を参照されたい。
【０１１８】
別の実施形態では、本発明の抗体は、分子量約１３ｋＤａのポリペプチド中で抗体可変ドメインの各部分が連結したヒトドメイン抗体である。たとえば、米国特許出願公開第２００４／０１１０９４１号を参照されたい。そうした単一ドメインの低分子量薬は、合成のしやすさ、安定性および投与経路の面から多くの利点がある。
【０１１９】
ＶＩ．医薬組成物および投与
本発明の抗ｈｕＣＤ２００Ｒ抗体の医薬組成物または無菌組成物を調製するには、この抗体を薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤と混合する。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照されたい。
【０１２０】
治療用および診断用の作用薬剤の調合物については、生理学的に許容されるキャリア、賦形剤または安定剤と混合することで、たとえば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形に調製してもよい（たとえば、Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照）。一実施形態では、本発明の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体を酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５〜６）で適切な濃度に希釈し、等張にするためＮａＣｌまたはスクロースを加える。安定性を高めるため、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などの追加の作用薬剤を加えてもよい。
【０１２１】
単独であるいは別の作用薬剤と組み合わせて投与する抗体組成物の毒性および治療の効力については、たとえば、細胞培養または実験動物を用いてＬＤ５０（集団の５０％致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％治療有効用量）を決定する標準的な薬学的手順で判定できる。毒性作用と治療効果との用量比が、治療指数（ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。好ましいのは、高い治療指数を示す抗体である。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトに使用する範囲の用量を処方する際に用い得る。そうした化合物の投薬量は、好ましくはほとんど毒性がないか、まったく毒性がないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用する剤形および投与経路によってこの範囲内で異なってもよい。
【０１２２】
投与モードは、特に重要ではない。好適な投与経路として、経口投与、直腸投与、経粘膜的または腸投与；筋肉内注射、皮下注射、髄内注射のほか、鞘内注射、室内直接注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注射などの非経口送達が挙げられる。投与に関しては、経口摂取、吸入、通気、局所応用または皮膚注射、経皮注射、皮下注射、腹腔内注射、非経口注射、動脈内注射または静脈内注射など様々な従来のやり方で行ってもよい。患者には静脈内投与が好ましい。
【０１２３】
あるいは、たとえば、関節炎の関節または免疫病理学的に特徴付けられる病原体による病巣に抗体を直接注射することで、全身的ではなく局所的に抗体を投与してもよい。その場合、デポ調合物または徐放性調合物が用いられることが多い。さらに、たとえば、関節炎の関節または免疫病理学的に特徴付けられる病原体による病巣などを標的とする組織特異的抗体でコーティングしたリポソームのような標的薬物送達システムで、抗体を投与しても構わない。リポソームは、患部組織を標的としてそこで選択的に取り込まれる。
【０１２４】
投与レジメンは、治療用抗体の血清または組織代謝回転速度、症状のレベル、治療用抗体の免疫原性および生体マトリックスにおける標的細胞の到達性などのいくつかの要因に依存する。好ましくは、投与レジメンは、標的の病状を改善するのに十分な治療用抗体を送達すると同時に、望ましくない副作用を最小限にとどめる。したがって、送達される生
物製剤の量は、個々の治療用抗体および処置対象の症候の重症度にある程度依存する。治療用抗体の適切な用量を選択する際のガイダンスは、入手可能である（たとえば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．）（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｃｈ（ｅｄ．）（１９９３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ
Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３；Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９；Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２；Ｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２を参照）。
【０１２５】
適切な用量については、たとえば、当該技術分野において処置に作用することが知られているか、そう疑われているパラメーターまたは因子を用いて、臨床医が決定する。通常、その用量は、至適用量よりもやや少ない量から始め、その後、任意の負の副作用に対して望ましい効果または至適効果が得られるまで少しずつ増量する。重要な診断尺度として、たとえば、炎症、あるいは、産生された炎症性サイトカインのレベルのような症状の尺度が挙げられる。好ましくは、使用する生物製剤は、処置対象の動物と同じ種由来であり、それにより試薬に対する炎症反応、自己免疫反応または増殖反応を最小限にとどめる。ヒト被験者の場合、好ましいのは、たとえば、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体である。
【０１２６】
抗体、抗体フラグメントおよびサイトカインに関しては、持続注入を行ってもよいし、たとえば、毎日、１週間に１〜７回、週に１回、２週間に１回、月に１回、２ヶ月に１回などで投与を行ってもよい。投与量を静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、経直腸、筋肉内、脳内、髄腔内より与えてもよいし、吸入により与えてもよい。１週間の総投与量は通常、体重当たり少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ、より一般的には少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上である（たとえば、Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７−４３４；Ｈｅｒｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２−１６９８；Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１−４５６；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３−１４４を参照）。また、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌまたはそれ以上など、事前に設定した、被検体の血清中の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の標的濃度を達成するように、投与量を与えて構わない。他の実施形態では、本発明のヒト化抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体を、被検体当たり１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇを週１回、２週間に１回または「４週間ごとに」皮下または静脈内に投与する。
【０１２７】
本明細書で使用する場合、「阻害する」または「処置する」もしくは「処置」は、障害に関連する症状の発症の遅延および／またはそうした障害の症状の重症度の低下を含む。こうした用語は、制御不能または望ましくない既存の症状の軽減、さらなる症状の予防お
よびそうした症状の根底にある原因の軽減または予防をさらに含む。したがって、この用語は、障害、疾患または症状のある脊椎動物被検体またはそうした障害、疾患または症状を発症する恐れがある脊椎動物被検体に有益な結果を与えることを意味する。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」、「治療有効用量」および「有効量」という語は、細胞、組織または被検体に単独あるいは追加治療薬と組み合わせて投与したときに、疾患もしくは症候の１つまたは複数の症状、またはそうした疾患または症候の進行の防止または軽減に有効な本発明のヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ結合化合物の量をいう。治療有効用量とはさらに、たとえば、関連性のある医学的状態の処置、治癒、防止または軽減またはそうした状態の処置、治癒、防止または軽減の速度の増加のような症状の軽減を引き起こすのに十分な結合化合物の量もいう。治療有効用量とは、単独投与された個々の活性成分に使用する場合、その単独の成分をいう。治療有効用量とは、併用して使用される場合、併用投与か、連続投与か、同時投与かを問わず、治療効果が得られる活性成分を合わせた量をいう。治療剤が有効量であれば、診断尺度またはパラメーターは少なくとも１０％、普通は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、一層好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％改善する。
【０１２９】
たとえば、サイトカイン、別の治療用抗体、ステロイド、化学療法剤または抗生物質のような第２の治療薬と共投与する方法は、当該技術分野において周知であり、たとえば、Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ  ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｐｏｏｌｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ；Ｃｈａｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡを参照されたい。本発明の医薬組成物は、免疫抑制剤または免疫調節剤をさらに含んでもよい。任意の好適な免疫抑制剤を用いてもよく、抗炎症剤、コルチコステロイド、シクロスポリン、タクロリムス（すなわち、ＦＫ−５０６）、シロリムス、インターフェロン、可溶性サイトカイン受容体（ｓＴＮＲＦおよびｓＩＬ−１Ｒなど）、サイトカイン活性を中和する作用薬剤（インフリキシマブ、エタネルセプトなど）、ミコフェノール酸モフェチル、１５−デオキシスペルグアリン、サリドマイド、グラチラマー、アザチオプリン、レフルノミド、シクロホスファミド、メトトレキサートなどがあるが、これに限定されるものではない。さらに、本医薬組成物は、光線治療および放射線など、他の治療方式と一緒に用いてもよい。
【０１３０】
さらに、本発明のヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ結合化合物は、１つまたは複数の他の治療薬と併用してもよい。限定としてではなく例として、本発明の結合化合物を、サイトカインまたはケモカインと同時に、さらに以下に限定されるものではないが、ＩＬ−１０、ＩＬ−２３、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＧＦ−βなど、他のサイトカインのアンタゴニスト（抗体など）の前後に投与することができる。たとえば、Ｖｅｌｄｈｏｅｎ（２００６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４：１７９−１８９；Ｄｏｎｇ（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（４）：３２９−３３３を参照されたい
ＶＩＩ．用途。
【０１３１】
本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症、関節リウマチ  骨粗鬆症、炎症性線維症（強皮症、肺線維症および肝硬変など）、炎症性腸障害（クローン病、潰瘍性大腸炎および炎症性腸疾患など）、喘息（アレルギー性喘息など）、アレルギー、ＣＯＰＤ、多
発性硬化症、乾癬、ぶどう膜炎および癌など、炎症性障害および症候のほか、自己免疫障害および増殖性障害を処置および診断する設計された抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の使用方法を提供する。
【０１３２】
当業者には明らかなように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変形および変更が可能である。本発明は、添付の特許請求の範囲の用語およびその特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲により規定される。以下の実施例を含む本明細書に記載の個々の実施形態は、例示のみを目的として提供するものであり、その細部により本発明の範囲を限定するものではない。
【０１３３】
実施例１
一般的な方法
分子生物学の標準的な方法は、記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。標準的な方法はまた、Ａｕｓｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹにも見られ、細菌細胞でのクローニングおよびＤＮＡ変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳動物細胞および酵母でのクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合糖質およびタンパク質の発現（Ｖｏｌ．３）およびバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）が記載されている。
【０１３４】
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および結晶化などのタンパク質精製法は、記述されている（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。化学的解析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の作製、タンパク質のグリコシル化も記載されている（たとえば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．１６．０．５−１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ｐｐ．４５−８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４−３９１を参照）。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製、精製および断片化に関する記載もある（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，上掲）。リガンド／受容体相互作用の特徴付けを行うための標準的な技法も入手可能である（たとえば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４
，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。
【０１３５】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびヒト化抗体は、調製することができる（たとえば、Ｓｈｅｐｅｒｄ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ（ｅｄｓ．）（２０００）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ（ｅｄｓ．）（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．１３９−２４３；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６２０５；Ｈｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７３７１−２７３７８；Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３；Ｆｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９；米国特許第６，３２９，５１１号を参照）。
【０１３６】
ヒト化の代替法は、ファージ上に提示されたヒト抗体ライブラリーまたはトランスジェニックマウスのヒト抗体ライブラリーを使用する（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０９−３１４；Ｂａｒｂａｓ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １：８３７−８３９；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−３７７；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ｄｅ  Ｂｒｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：３９７−３９９）。
【０１３７】
一本鎖抗体およびダイアボディは、記載されている（たとえば、Ｍａｌｅｃｋｉ  ｅｔ
ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：２１３−２１８；Ｃｏｎｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：７３４６−７３５０；Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−２６２９０；Ｈｕｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｒｔｔ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１７７−１８９；および米国特許第４，９４６，７７８号を参照）。二機能性抗体は、記述されている（たとえば、Ｍａｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７０２１−７０２５；Ｃａｒｔｅｒ（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：７−１５；Ｖｏｌｋｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４：８１５−８２３；Ｓｅｇａｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：１−６；Ｂｒｅｎｎａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３；Ｒａｓｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７６２３；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９Ｉ）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９；および米国特許第５，９３２，４４８号、同第５，５３２，２１０号および同第６，１２９，９１４号を参照）。
【０１３８】
さらに、二重特異性抗体も記述されている（たとえば、Ａｚｚｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３４９３；Ｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６９０１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７４：９１１５；Ｐａｎｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８６３３；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６：１２９９９；Ｐｒｏｐｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：２２１４；Ｌｏｎｇ（１９９９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８７５を参照）。
【０１３９】
抗体の作製には、抗原を精製する必要はない。目的の抗原を持つ細胞で動物を免疫すればよい。その後、免疫動物から脾細胞を単離することができ、その脾細胞を骨髄腫細胞株と融合してハイブリドーマを作製すればよい（たとえば、Ｍｅｙａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：２８３−２９０；Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：２３３−２４２；Ｐｒｅｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，上掲；Ｋａｉｔｈａｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５１５７−５１６４を参照）。
【０１４０】
抗体は、普通、少なくとも約１０−６Ｍ、一般には少なくとも１０−７Ｍ、より一般的には少なくとも１０−８Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−９Ｍ、一層好ましくは少なくとも１０−１０Ｍ、最も好ましくは少なくとも１０−１１ＭのＫｄで結合する（たとえば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：３７９−３８９；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３８：１７−２３；Ｃａｒｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（Ｓｕｐｐｌ．）９：３９８２ｓ−３９９０ｓを参照）。
【０１４１】
抗体については、たとえば、小さな薬物分子、酵素、リポソーム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコンジュゲートしてもよい。こうした抗体は、治療、診断、キットまたは他の目的に有用であり、たとえば、色素、放射性同位元素、酵素または金属（たとえば、コロイド金）に結合した抗体が挙げられる（たとえば、Ｌｅ  Ｄｏｕｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１６９−１７５；Ｇｉｂｅｌｌｉｎｉ
ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３８９１−３８９８；Ｈｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｓｈｏｐ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２８０４−２８１１；Ｅｖｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：８８３−８８９を参照）。
【０１４２】
蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリーの方法も、入手可能である（たとえば、Ｏｗｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ
Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪを参照）。たとえば、診断試薬として使用する核酸プライマーおよびプローブなどの核酸、ポリペプチドおよび抗体の改変に好適な蛍光試薬は、入手可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【０１４３】
免疫系の組織学の標準的な方法は、記載されている（たとえば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（ｅｄ．）（１９８６）Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏ
ｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｈｉａｔｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｏｌｏｒ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ；Ｌｏｕｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂａｓｉｃ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ  ａｎｄ  Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照）。
【０１４４】
たとえば、抗原性フラグメント、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能ドメイン、グリコシル化部位および配列アライメントを判定するソフトウェアパッケージおよびデータベースは、入手可能である（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂａｙ，Ｎｅｖａｄａ）；  Ｍｅｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６：７４１−７４２；Ｍｅｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｎｏｔｅ  １６：７４１−７４２；Ｗｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７−１８１；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７−２１；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０を参照）。
【実施例】
【０１４５】
（実施例１）
ラット抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒモノクローナル抗体
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに対するモノクローナル抗体を以下のように得た。８週齡の雌Ｌｅｗｉｓラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）に、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したヒト阻害性受容体ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインを含む免疫原性融合タンパク質（参照によりその全体を本明細書に援用するＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：３０３４−３０４６を参照）を連続して注射した。この細胞外の残基については、改変ｐＣＤＭ８．Ｉｇ発現プラスミドのＸｈｏ１部位にサブクローニングした（Ｅ．Ｅ．Ｂａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：５１３）。Ｃｈｅｒｗｉｎｓｋｉ  ｅｔａｌ（２００５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：１３４８）に記載されているように、２９３Ｔまたは２９３ＦＴのトランスフェクションまたは感染後にタンパク質が産生された。注射は、０、１４、３２、４６および８３日目に行った。
【０１４６】
０日目の注射は、フロイント完全アジュバント中のＣＤ２００Ｒ−ヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質を５０μｇ皮下（ｓｃ）注射した。１４、３２および４６日目には、ラットに、フロイント不完全アジュバント中のＣＤ２００ＲヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質を２５μｇ腹腔内（ｉｐ）注射した。８３日目の注射は、不完全フロイントアジュバント中のＣＤ２００Ｒ−ヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質２０μｇのｉｐ注射と、生理食塩水中のＣＤ２００Ｒ−ヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質の静脈内（ｉｖ）注射（尾静脈）とを組み合わせた。
【０１４７】
５３日目に試験採血を行った。８７日目に、１．６×１０８脾細胞および１．８×１０８骨髄腫細胞を用いてラット脾細胞の融合を行い、３０枚の９６ウェルプレートに分け、全体で１ウェル当たりの細胞総数を１．１３×１０５とした。
【０１４８】
得られたモノクローナル抗体（数千）の一次スクリーニングを、ＣＤ２００Ｒ−ヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質の間接ＥＬＩＳＡで行った。得られた抗体の二次スクリーニン
グでは、ヒトＣＤ２００Ｒを発現しているトランスフェクタントおよびヒト培養ヒトマスト細胞の特異的染色を行った。。引き続き実験を行い、ヒトＣＤ２００Ｒを発現しているマスト細胞に候補抗体が結合できることと、その抗体が様々な治療目的、診断目的および／または研究目的に有用であることを確認した。そうしたスクリーニングを、本明細書にその例を記載する結合アッセイ（間接ＥＬＩＳＡまたはサンドイッチＥＬＩＳＡなど）、インビトロ活性アッセイまたはインビボ活性アッセイにより行ってもよい。
【０１４９】
ＨＣ６１２でＤＸ１７６、ＤＸ１７７およびＤＸ１７８を作製し、ＨＣ６１８でＤｘ１８２およびＤＸ１８４を作製した。
【０１５０】
阻害性ｃｙｎｏＣＤ２００Ｒ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメイン）をＢａｌｂ／ｃ雌マウスの免疫原として用いて、上述の方法によりマウス抗ｃｙｎｏＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ２４８を作製した。マウス抗ｃｙｎｏＣＤ２００Ｒ（ＤＸ２４８）については、ＨＣ８０９で作製した。ハイブリドーマを、２００７年１２月１３日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８８３８のＨＣ８０９．１４Ｆ１２．６．ＤＸ２４８．３株として寄託した。作製した抗体のアイソタイプは、マウスＩｇＧ１−κである。
（実施例２）
ラット抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体のヒト化
開示内容の全体を参照によって本明細書に援用する国際公開第２００５／０４７３２４号および国際公開第２００５／０４７３２６号に本質的に記載されているように、ラット抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒモノクローナル抗体ｈｕＤＸ１８２のヒト化を行った。簡単に説明すると、ヒト定常ドメインを用いて親（ラット）定常ドメインを置き換え、ラット可変ドメイン配列に相同的なヒト生殖細胞系配列を選択し、以下により詳細に記載されているように、これを用いてラットＣＤＲのヒトフレームワークを得た。
【０１５１】
ヒト生殖細胞系フレームワーク配列の選択手順
本発明の抗ヒトヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体のヒト化において適切な生殖細胞系フレームワーク配列を選択するには、以下のステップを用いる。
【０１５２】
１）非ヒトＶＬドメインおよびＶＨドメインのクローニングおよび配列決定と、アミノ酸配列の決定。
【０１５３】
重鎖
２）非ヒトＶＨ配列と５つのヒトＶＨ生殖細胞系アミノ酸配列（サブグループＩＧＨＶ１およびＩＧＨＶ４から１つの代表配列とサブグループＩＧＨＶ３から３つの代表配列）の群とを比較する。ＶＨサブグループについては、Ｍ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ（２００１）「Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｈｅａｖｙ（ＩＧＨ）Ｇｅｎｅｓ」，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８：１００−１１６に記載されている。５つの生殖細胞系配列との比較を以下のように行う：
Ａ）Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）に従って、非ヒトＶＨ配列残基に番号を割り当てる。
【０１５４】
Ｂ）非ヒトＶＨ配列を５つのヒト生殖細胞系配列それぞれと整列させる。Ｖ遺伝子はＶＨ残基１〜９４しか含まないため、アライメントではこれらの残基のみを考慮する。
【０１５５】
Ｃ）その配列中の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク（ＦＲ）領域を区切る。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）（Ｉｄ．）およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  
Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６：９０１−９１７に記載の定義の組み合わせにとしてＣＤＲおよびＦＲを定義する。したがって、定義では、ＶＨＣＤＲ１＝２６〜３５、ＣＤＲ２＝５０〜６５、ＣＤＲ３＝９５〜１０２である。
【０１５６】
Ｄ）以下に記載する各残基位置（表４）の場合、非ヒト配列およびヒト配列が同一である各残基の位置に数値スコアを割り当てる：
【０１５７】
【表４−１】
2010512791.tif 000042
【０１５８】
【表４−２】
2010512791.tif 000043
Ｅ）すべての残基位置のスコアを合計する。合計スコアが最も高い配列がアクセプター生殖細胞系配列となる。２つ以上の生殖細胞系配列のスコアが同一である場合：
１）以下の残基位置において、非ヒトおよびヒト配列が同一である各位置の全体に１を加える：１、３、５〜２３、２５、３６、３８、４０〜４３、４６、６６、６８、７０、７２、７４、７５、７７、７９〜９０、９２（最大４９）。
【０１５９】
２）合計スコアが最も高い配列がアクセプター生殖細胞系配列となる。２つ以上の生殖細胞系配列のスコアがなお同一である場合、どちらの配列もアクセプターとして容認できる。
【０１６０】
軽鎖
ＩＩＩ）ＶＬ配列がＶＬのκサブクラスのメンバーである場合、非ヒトＶＬ配列と４つのヒトＶＬκ生殖細胞系アミノ酸配列とを比較する。この４配列の群は、Ｂａｒｂｉｅ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ（１９９８）「Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｋａｐｐａ  Ｖａｒｉａｂｌｅ（ＩＧＫＶ）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｉｎｇ（ＩＧＫＪ）Ｓｅｇｍｅｎｔｓ」，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１７１−１８３，ａｎｄ  Ｍ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ（２００１）「Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｋａｐｐａ（ＩＧＫ）Ｇｅｎｅｓ」，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８：１６１−１７４に記載された４つの確立したヒトＶＬサブグループ各々からの代表配列１つずつからなる。また、この４つのサブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）の１０３〜１３０頁に記載の４つのサブグループとも一致する。この４つの生殖細胞系配列との比較を以下のように行う：
Ａ）Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）に従って、非ヒトＶＬ配列残基に番号を割り当てる。
【０１６１】
Ｂ）非ヒトＶＬ配列を４つのヒト生殖細胞系配列それぞれと整列させる。Ｖ遺伝子はＶＬ残基１〜９５しか含まないため、アライメントではこれらの残基のみを考慮する。
【０１６２】
Ｃ）配列中の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク（ＦＲ）領域を区切る。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６：９０１−９１７に記載の定義の組み合わせとしてＣＤＲおよびＦＲを定義する。したがって、定義では、ＶＬＣＤＲ１＝２４〜３４、ＣＤＲ２＝５０〜５６、ＣＤＲ３＝８９〜９７である。
【０１６３】
Ｄ）以下に記載する各残基位置（表２）の場合、非ヒト配列およびヒト配列が同一である各残基の位置に数値スコアを割り当てる：
【０１６４】
【表５】
2010512791.tif 000044
Ｅ）すべての残基位置のスコアを合計する。合計スコアが最も高い配列がアクセプター生殖細胞系配列となる。２つ以上の生殖細胞系配列のスコアが同一である場合：
１）以下の残基位置において、非ヒトおよびヒト配列が同一である各位置の全体に１を加える：１、３、５〜２３、３５、３７、３９〜４２、５７、５９〜６１、６３、６５〜７０、７２〜８６、８８。
【０１６５】
２）合計スコアが最も高い配列がアクセプター生殖細胞系配列となる。２つ以上の生殖細胞系配列のスコアがなお同一である場合、どちらの配列もアクセプターとして容認できる。
【０１６６】
ＶＬ配列がＶＬのλサブクラスのメンバーである場合、上記の文献からのヒトＶＬλ生
殖細胞系アミノ酸配列を用いて類似の手順を行う。
【０１６７】
抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体のヒト化
定常ドメインの改変に関しては、抗体ｈｕＤＸ１８２（ラット抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ）の可変軽ドメインおよび重ドメインをクローニングし、それぞれヒトκ軽鎖（ＣＬドメイン）およびヒトＩｇＧ１重鎖（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）と融合した。このラット可変ドメインおよびヒト定常ドメインの組み合わせは、キメラ型の抗体ｈｕＤＸ１８２を含む。
【０１６８】
可変ドメインのフレームワーク領域の改変に関しては、抗体ＤＸ１８２のＶＨドメインのアミノ酸配列を、５つのヒトＶＨ生殖細胞系アミノ酸配列（サブグループＩＧＨＶ１およびＩＧＨＶ４からの１つの代表配列とサブグループＩＧＨＶ３からの３つの代表配列）の群と比較した。ＶＨサブグループについては、Ｍ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ，「Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｈｅａｖｙ（ＩＧＨ）Ｇｅｎｅｓ」，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８：１００−１１６，２００１に記載されている。サブグループＩＶのヒト重鎖生殖細胞系ＤＰ−７１に対して、抗体１６Ｃ１０のスコアが最も高かった。
【０１６９】
ＤＸ１８２のＶＬ配列は、κサブクラスであった。この配列を４つのヒトＶＬκ生殖細胞系アミノ酸配列の群と比較した。この４配列の群は、Ｖ．Ｂａｒｂｉｅ  ＆  Ｍ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ，「Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｋａｐｐａ
Ｖａｒｉａｂｌｅ（ＩＧＫＶ）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｉｎｇ（ＩＧＫＪ）Ｓｅｇｍｅｎｔｓ」，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１７１−１８３，１９９８  ａｎｄ  Ｍ．−Ｐ．Ｌｅｆｒａｎｃ，「Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｋａｐｐａ（ＩＧＫ）Ｇｅｎｅｓ」，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８：１６１−１７４，２００１に記載された４つの確立したヒトＶＬサブグループの各々からの代表配列１つずつからなる。また、この４つのサブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）の１０３〜１３０頁に記載の４つのサブグループとも一致する。サブグループＩＩのヒト軽鎖生殖細胞系Ｚ−０１２に対して、抗体ＤＸ１８２のスコアが最も高かった。
【０１７０】
所望の生殖細胞系フレームワーク配列を判定したら、全長ヒト化可変重鎖および軽鎖をコードするプラスミドを作製した。ヒトフレームワーク残基への親ラット抗体ＤＸ１８２のフレームワーク残基の置換は、ヒトフレームワーク配列へのラットＤＸ１８２ＣＤＲの移植と同じと見なしてもよい。本明細書では、得られた抗体を「ｈｕＤＸ１８２ｗｔ」という。「ｗｔ」は、最適化ＣＤＲと区別できるように、親ラットＤＸ１８２と同じＣＤＲが存在することを示す
発現が最適になるように、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方についてコドン最適化を行い、合成し、定常ドメインに挿入した。コドン最適化に関しては、クローン化抗体の発現を促進する場合があるが、まったく任意である。
【０１７１】
ヒト化抗体ＤＸ１８２の軽鎖アミノ酸配列および重鎖アミノ酸配列をそれぞれ図３（配列番号４９）および図４（配列番号５０）に示す。命名法に関し明確にするためには、Ｋａｂａｔ番号付けシステムが、様々な抗体におけるＣＤＲ領域およびフレームワーク領域の長さの変化に対応する非数値のアミノ酸残基の表示（例えば、ＶＨ残基８３ａ、８３ｂ、８３ｃ）を含んでいることを理解することが重要である。この番号付けシステムは、長さが異なるＣＤＲを持つ様々な抗体において、対応するアミノ酸残基を参照しやすくするのには都合がよいが、厳密な連続数値の配列番号付け（配列表など）と比べるとき、特定
のアミノ酸残基の表示が矛盾することがある。本明細書におけるアミノ酸残基の表示は、他に記載がない限り、たとえば、「Ｋａｂａｔ番号付け」を参考として関連する配列表を参照して行われる。
【０１７２】
配列番号５０および４９は、Ｎ末端にシグナルペプチドを含まない、成熟型のタンパク質を示す。成熟型のタンパク質とは、シグナル配列を含まないタンパク質である。配列番号５１および５３は、Ｎ末端にシグナルペプチドを含む。
【０１７３】
図９は、ＤＸ２４８抗体（ａｎｔｉｂｄｏｙ）のヒト化軽ドメインおよび重ドメインの例示的な説明図である。
（実施例３）
Ｋｉｎｅｘａ技術によるラットａｎｔヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の平衡解離定数（Ｋｄ）の測定
ＫｉｎＥｘＡ３０００機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ，ＵＳＡ）を用いて、抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の平衡解離定数（Ｋｄ）を測定した。ＫｉｎＥｘＡは、抗体、抗原および抗体抗原複合体の混合物における、複合体を形成していない抗体の濃度の測定を基に、結合平衡除外アッセイ法（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｍｅｔｈｏｄ）の原理を使用する。たとえば、Ｄａｒｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｒａｕｌｔ（２００４）Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２（６）：６４７−５７を参照されたい。この混合物を、固相に固定化した抗原に非常に短時間曝露して、遊離抗体の濃度を測定する。実際にこれを行うには、溶液相の抗原抗体混合物を、フローセルにトラップされた抗原被覆粒子を通過するように流す。この機器から得られたデータを特注のソフトウェアで解析する。平衡定数は、以下の仮定に基づき、数学的理論を用いて算出する：
１．結合は、平衡状態にある可逆的な以下の結合式に従う：
ｋｏｎ［Ａｂ］［Ａｇ］＝ｋｏｆｆ［ＡｂＡｇ］、式中、Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ
２．抗体（Ａｂ）および抗原（Ａｇ）は、１：１で結合し、全抗体は、抗原抗体複合体（ＡｂＡｇ）と遊離抗体の和に等しい。
【０１７４】
３．機器シグナルは、遊離抗体濃度と直線的な関係を示す。
【０１７５】
いくつかのラット抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体．、そのヒト化改変体、およびそれらのヒト化抗体の配列改変体についてＫｉｎＥｘＡ  解析を行った。ＫｉｎＥｘＡの測定ごとに、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したヒト阻害性受容体ＣＤ２００Ｒの細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｅｕｌａｒ）ドメインからなる融合タンパク質（参照によってその全体を本明細書に援用するＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：３０３４−３０４６を参照）を固定化相と溶液相の両方で用いた。Ｓａｐｉｄｙｎｅ「Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏａｔｉｎｇ  ＰＭＭＡ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ
ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｓｈｏｒｔ  ｏｒ  ｎｏｎｅｘｉｓｔｅｎｔ  ｌｉｎｋｅｒ  ａｒｍｓ」に従って、ポリ（メチル−メタクリレート）（ＰＭＭＡ）粒子（９８ミクロン）をビオチン化ヒトＣＤ２００Ｒ−Ｉｇでコーティングした。ＫｉｎＥｘＡ３０００マニュアルに従って、すべての実験手順を行った。すべての実験を二重反復で実施した。
【０１７６】
ＫｉｎＥｘＡの条件を表６に示す。
【０１７７】
【表６】
2010512791.tif 000045
抗原の２倍希釈系列を調製し、一定濃度で抗体と混合した。この混合物を２５℃で２時間インキュベートして平衡化した。
【０１７８】
【表７】
2010512791.tif 000046
（実施例４）
Ｂｉａｃｏｒｅ技術を用いたラットａｎｔヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の平衡解離定数（Ｋｄ）の測定
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したヒト阻害性受容体ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインからなる融合タンパク質（参照によってその全体を本明細書に援用するＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ
ａｌ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：３０３４−３０４６を参照）に対する抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の速度論的結合活性を、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００システム（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて表面プラズモン共鳴により測定した。アッセイフォーマットには、移動相中の抗ｈｕＣＤ２００Ｒ抗体の滴定により抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγで捕捉した融合タンパク質を使用した。約５０００ＲＵのＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，Ｆｃγ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ  Ｎｏ．１０９−００６−０９８）を、アミンカップリング化学によりセンサーチップＣＭ５（リサーチグレード、ＢＲ−１０００−１４）に固定化した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＢＲ−１００１−８８）を、５μＬ／分の流速でランニングバッファーとして用いた。各解析サイクルの前に、ｈｕＣＤ２００Ｒをチップに新た
に飽和させた。様々な濃度（１３３および１３．３ｎＭ）の抗ｈｕＣＤ２００Ｒ抗体を、５μＬ／分の流速で、捕捉したｈｕＣＤ２００Ｒ表面に注入した。各注入サイクル後、ＣＭ５チップの表面を、５０μＬ／分の溶液流速で一連の溶液（１０ｍＭのＨＣｌおよび１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５）を用いて再生させた。
【０１７９】
結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）ならびに平衡解離定数ＫDの解析には、バックグラウンドを除去した結合センサーグラムを用いた。得られたデータセットを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．０．１）を用いてアナライトの二価モデルでフィッティングした。
【０１８０】
【表８】
2010512791.tif 000047
（実施例５）
ラット抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体に対するマスト細胞の脱顆粒アッセイ
マウスのマスト細胞の脱顆粒バイオアッセイで、ラット抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体がヒト阻害性ＣＤ２００Ｒを活性化する能力を測定した。。骨髄由来のマウスのマスト細胞株をトランスフェクトしてヒト阻害性ＣＤ２００Ｒを発現させ、抗体がマスト細胞の脱顆粒を阻害する能力を評価した。
【０１８１】
材料および方法
マスト細胞株：マウスのマスト細胞株はＣ５７ＢＬ６マウスの骨髄由来であった（Ｗｒｉｇｈｔ，ＧＪ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：３０３４）。全長ヒトＣＤ２００ＲをコードするｃＤＮＡをｐＭＸｎｅｏレトロウイルス発現ベクター（Ｔ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｙｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎから提供）にサブクローニングした。プラスミドＤＮＡをＰｈｏｅｎｉｘエコトロピックウイルスパッケージング細胞株（Ｇａｒｙ  Ｎｏｌａｎ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡから提供）．にトランスフェクトし、得られたウイルスを用いてマウスのマスト細胞に感染させ、続いて、これを、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地で選択した（Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：３２４の方法）。薬剤選択条件で１〜２週間後、フローサイトメトリーにより、受容体特異的抗体を用いて細胞表面上の受容体の発現について細胞を解析した。
【０１８２】
脱顆粒アッセイ：抗体：ＤＸ１７６、ＤＸ１７７、ＤＸ１７８、ＤＸ１８４、ＤＸ１８５、ＤＸ１８２およびラットＩｇＧ２ａ（アイソタイプコントロール抗体、Ｐｈａｒｍｉｎｏｇｅｎ＃５５３９２６）。刺激：ＤＸ８９、抗マウスＣＤ２００ＲＬａ（マウスの活性化ＣＤ２００Ｒ）
９６ウェル平底プレートの５０ｕｌのアッセイ培地（ＲＰＭＩ、１％ＢＳＡ、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ）中で、抗ＣＤ２００Ｒ抗体またはアイソタイプコントロールの滴定を行っ
た。ｈｕＣＤ２００Ｒを発現しているマウスのマスト細胞（ＤＴ７６２）を遠沈させ、４×１０６／ｍｌで再懸濁し、５０ｕｌ／ウェルを抗体滴定物に加え、室温で２０分間インキュベートした。次いで、最終濃度が０．１ｕｇ／ｍｌになるように、刺激抗体ＤＸ８９（抗マウス活性化ＣＤ２００Ｒｌａ、Ｚｈａｎｇ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：６７８６）を５０ｕｌ／ウェル加えた。細胞を、３７°、５％ＣＯ２で１時間培養した。刺激時間の終了時に、各ウェルから２０ｕｌを取り出し、６０ｕｌの１．３ｍｇ／ｍｌβ−ヘキソサミニダーゼ基質（４−ニトロフェニＮ−アセチル−ｂ−Ｄ−グルコサミニド（４−ＮｉｔｒｏｐｈｅｎｙＮ−ａｃｅｔｙｌ−ｂ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ），Ｓｉｇｍａ  Ｎ９３７６）に移した。上清／基質反応を３７℃で３．５時間進行させた。０．２Ｍのグリシン（ｐＨ１０．７）を加えて反応を止め、ＯＤ４０５−６５０を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて測定し、脱顆粒の程度を評価した。結果を図７に示す。
【０１８３】
目的の抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体のＩＣ５０は、マスト細胞の脱顆粒レベルを、添加抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の非存在下で観察されるレベルの約５０％まで阻害するのに必要な抗体の濃度である。
（実施例６）
ヒト化ラット抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体のマスト細胞脱顆粒アッセイ
ヒトＣＤ２００Ｒを発現しているマウスマスト細胞を用いて、脱顆粒を阻害するヒト化ＤＸ１８２の能力を評価した。また、フローサイトメトリーで測定して、ヒト化ＤＸ１８２の細胞に結合する能力も評価した。
【０１８４】
材料および方法：
細胞：ヒトＣＤ２００Ｒを発現させるためトランスフェクトされた骨髄由来のマウスのマスト細胞株（ＤＴ７６２）。
【０１８５】
抗体：ＰＡＢ１２１９、ラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ
ＰＡＢ１３３７、組換えヒトＤＸ１８２
ＰＡＢ１３３７、組換えヒトＤＸ１８２、バルク薬物
ＰＡＢ１３３６、（希釈ＰＡＢ１３３７）
ラットＩｇＧ２ａ、アイソタイプコントロール抗体、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃５５３９２６
刺激物：ＤＸ８９抗マウスＣＤ２００ＲＬａ（マウス活性化ＣＤ２００Ｒ）
脱顆粒アッセイ：実施例５に記載されているように、脱顆粒アッセイを行った。９６ウェル平底プレートの５０ｕｌのアッセイ培地（ＲＰＭＩ、１％ＢＳＡ、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ）中で、抗ＣＤ２００Ｒ抗体またはアイソタイプコントロールの滴定を行った。ｈｕＣＤ２００Ｒを発現しているマウスマスト細胞（ＤＴ７６２）を遠沈させ、４×１０６／ｍｌで再懸濁し、５０ｕｌ／ウェルを抗体滴定物に加え、室温で２０分間インキュベートした。次いで、最終濃度が０．１ｕｇ／ｍｌになるように、刺激抗体ＤＸ８９を５０ｕｌ／ウェル加えた。細胞を、３７°、５％ＣＯ２で１時間培養した。刺激時間の終了時に、各ウェルから２０ｕｌを取り出し、６０ｕｌの１．３ｍｇ／ｍｌβ−ヘキソサミニダーゼ基質（４−ニトロフェニＮ−アセチル−ｂ−Ｄ−グルコサミニド，Ｓｉｇｍａ  Ｎ９３７６）に移した。上清／基質反応を３７℃で３．５時間進行させた。０．２Ｍのグリシン（ｐＨ１０．７）を加えて反応を止め、ＯＤ４０５−６５０を測定し、脱顆粒の程度を評価した。結果を図８に示す。
【０１８６】
フローサイトメトリー：Ｃｄ２００Ｒを発現する細胞に対する抗ＣＤ２００Ｒ抗体の結合をフローサイトメトリーにより評価した。１００ｕｌのアッセイ培地（Ｄ−ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ３）で、ＤＴ７６２細胞を１０ｕｇ／ｍｌの抗体、５×１０
５細胞と４℃で３０分インキュベートした。細胞を洗浄し、１０ｕｇ／ｍｌの、ラットＤＸ１８２にはヤギ抗ラットＰＥ（Ｃａｌｔａｇ  Ｒ４０００４−３）と、あるいは、ｒｈｕＤＸ１８２にはヤギ抗ヒトＰＥ（Ｃａｌｔａｇ  Ｈ１０１０４）（５０ｕｌ／サンプル）と４℃で２０分インキュベートした。染色後、細胞を２回洗浄し、２５０ｕｌで再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒおよび添付のソフトウェア（Ｂ−Ｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。脱顆粒の程度を評価するため測定した結果を図８．に示す。の結果については図７に示す。
（実施例７）
マウス抗ｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体（ＤＸ２４８）のマスト細胞脱顆粒アッセイ
ヒトＣＤ２００Ｒを発現しているマウスのマスト細胞（ＤＴ７６２）を用いて、脱顆粒を阻害するヒト化ＤＸ１８２の能力を評価した。また、フローサイトメトリーで測定して、ヒト化ＤＸ１８２の細胞に結合する能力も評価した。
【０１８７】
実施例５に記載されているように、脱顆粒アッセイを行った。使用した抗体（およびロット番号）は、ラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ、ＤＸ１８２、ＰＡＢ１２１９；組換えヒトＤＸ１８２、バルク薬物、ＰＡＢ１３３７、ＳＣＨ１３７２３９１；調合化ＳＣＨ１３７２３９１（希釈ＰＡＢ１３３７）、ＰＡＢ１３３６；ラットＩｇＧ２ａ、アイソタイプコントロール抗体、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃５５３９２６であった。
【０１８８】
ＤＴ７６２細胞に対する抗ＣＤ２００Ｒ抗体の結合をフローサイトメトリーにより評価した。１００ｕｌのアッセイ培地（Ｄ−ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ３）で、ＤＴ７６２細胞を１０ｕｇ／ｍｌの抗体、５×１０５細胞と４℃で３０分インキュベートした。細胞を洗浄し、１０ｕｇ／ｍｌの、ラットＤＸ１８２にはヤギ抗ラットＰＥ（Ｃａｌｔａｇ  Ｒ４０００４−３）と、あるいは、ｒｈｕＤＸ１８２にはヤギ抗ヒトＰＥ（Ｃａｌｔａｇ  Ｈ１０１０４）（５０ｕｌ／サンプル）と、４℃で２０分インキュベートした。染色後、細胞を２回洗浄し、２５０ｕｌで再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒおよび添付のソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。結果を図８に示す。未染色細胞およびアイソタイプコントロール細胞はヒストグラムの左側のプロットで示され、ＤＸ１８２のヒストグラム（ｈｉｓｔｏｒｇｒａｍ）はプロットのはるか右側に示される。
【０１８９】
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ融合タンパク質をＢａｌｂ／ｃ雌マウスの免疫原として用いて、実施例１に記載されているのと同じ方法により、マウス抗ｃｙｎｏＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ２４８を作製した。脱顆粒およびフローサイトメトリー法は、実施例５に記載されているとおりであった。使用した抗体（およびロット番号）は、ラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ、ＤＸ１８２、ＰＡＢ１２１９；マウス抗カニクイザルＣＤ２００Ｒ、ＤＸ２４８、ＰＡＢ７６６、ラットＩｇＧ２ａ、アイソタイプコントロール抗体、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃５５３９２６；マウスＩｇＧ１、アイソタイプコントロール抗体であった。ＤＸ２４８は、細胞に結合し（図１０Ｂ）、脱顆粒を阻害した（図１０Ａ）。
（実施例８）
Ｂｉａｃｏｒｅ技術を用いたラットａｎｔヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の平衡解離定数（Ｋｄ）の測定
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したヒト阻害性受容体ＣＤ２００Ｒの細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｅｕｌａｒ）ドメインからなる融合タンパク質（参照によってその全体を本明細書に援用するＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：３０３４−３０４６を参照）に対する抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体の速度論的結合活性を、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００システム（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、表面プラズモン共鳴により測定した。アッセイフォーマットには、移動相中の抗ｈｕＣＤ２００Ｒ抗体の滴定により抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγで捕捉した融合タンパク質を使用した。約５０００ＲＵのＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍ
ｅｎｔ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，Ｆｃγ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ  Ｎｏ．１０９−００６−０９８）を、アミンカップリング化学によりセンサーチップＣＭ５（リサーチグレード、ＢＲ−１０００−１４）に固定化した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＢＲ−１００１−８８）を、５μＬ／分の流速でランニングバッファーとして用いた。各解析サイクルの前に、ｈｕＣＤ２００Ｒをチップに新たに飽和させた。０．８２〜６００ｎＭ（７希釈点）の範囲にある様々な濃度の抗ｈｕＣＤ２００Ｒ抗体を、３０μＬ／分の流速で、捕捉したｈｕＣＤ２００Ｒ表面に注入した。各注入サイクル後、ＣＭ５チップの表面を、７５μＬ／分の溶液流速で一連の溶液（１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５および２５ｍＭのＮａＯＨ）を用いて再生させた。
【０１９０】
結合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）ならびに平衡解離定数ＫＤの解析には、バックグラウンドを除去した結合センサーグラムを用いた。得られたデータセットを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．０．１）を用いてアナライトの二価モデルでフィッティングした。
【０１９１】
【表９】
2010512791.tif 000048
（実施例９）
ＤＸ１８２は、カニクイザルＣＤ２００Ｒを認識する
材料および方法：カニクイザルマスト細胞を、ヒト幹細胞因子およびヒトＩＬ−６の存在下で、末梢血単核球から培養した。インキュベーションから３ヶ月後、これらの培養物は、９５％がＣＤ１１７およびＦｃｅＲＩを発現するマスト細胞であった。このマスト細胞を、ヒトＩＬ−４およびヒトＩｇＥでさらに２週間培養し、これらの細胞の細胞表面に発現したＦｃｅＲＩを充填し、予備刺激した。
【０１９２】
フローサイトメトリー：１００ｕｌのアッセイ培地（Ｄ−ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ３）で、カニクイザルマスト細胞を、１０ｕｇ／ｍｌの抗体、５×１０５細胞と４℃で３０分インキュベートした。細胞を洗浄し、１０ｕｇ／ｍｌの、ラットＤＸ１８２、ラットＤＸ４９にはヤギ抗ラットＰＥ（Ｃａｌｔａｇ  Ｒ４０００４−３）と、あるいは、抗ＣＤ１１７にはヤギ抗マウスＰＥ（Ｃａｌｔａｇ  Ｍ３０００４）および、およびＦｃｅＲＩ（５０ｕｌ／サンプル）と、４℃で２０分インキュベートした。染色後、細胞を２回洗浄し、２５０ｕｌで再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒおよび添付のソフトウェア（Ｂ−Ｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。結果を図１１に示す
脱顆粒アッセイ：９６ウェル平底プレートの５０ｕｌのアッセイ培地（ＲＰＭＩ、１％ＢＳＡ、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ）中で、抗ＣＤ２００Ｒ（ＤＸ１８２）抗体の滴定を行った。ＣＤ２００Ｒを発現しているカニクイザルマスト細胞を遠沈させ、４×１０６／ｍｌで再懸濁し、５０ｕｌ／ウェルを抗体滴定物に加え、室温で２０分間インキュベートした。次いで、この細胞をプレートで２回洗浄し、ヤギ抗ラット（１０ｕｇ／ｍｌ）と架橋させた。次いで、最終濃度が８０ｎｇ／ｍｌになるように、刺激抗体、抗ＦｃｅＲＩを５０ｕｌ／ウェル加えた。アイソタイプコントロール抗体については、５０ｕｇ／ｍｌの最高濃度で使用した。細胞を、３７°、５％ＣＯ２で１時間培養した。刺激時間の終了時に、各ウェルから５０ｕｌを取り出し、以前に公表されているように（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００５，１７４：１３４８−１３５６）、上清に放出されるマスト細胞特異的トリプターゼを測定して脱顆粒を定量した。結果を図１２に示す。
（実施例１０）
回虫アレルギー性カニクイザルの実験
回虫をチャレンジしたカニクイザル２匹をラット抗ヒト阻害性ＤＸ１８２で処置した。以下は、その処置に関する実験を要約したものである。回虫のチャレンジ後に、このアレルギー性サル２匹をラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体で処置すると、気道抵抗が急速かつ顕著に増大し、血圧が低下し、心拍数が増加した。
【０１９３】
カニクイザルは、回虫抗原の吸入に対して自然のアレルギー性過敏症を示す。回虫抗原を吸入すると、直ちにマスト細胞依存性気管支収縮が起こるが、これは、エアロゾル抗原の曝露から１０〜２０分以内に測定することができる。
【０１９４】
インビトロ実験では、ＤＸ１８２およびｈｕＤＸ１８２はカニクイザルＣＤ２００Ｒに結合し、および、ＦｃξＲＩが介在するカニクイザルのマスト細胞の脱顆粒反応を阻害した。
【０１９５】
回虫抗原の吸入の前に、アレルギー性および非アレルギー性カニクイザル（アレルギー性２例、非アレルギー性２例）の小さなコホートを用いて、８ｍｇ／ｋｇ濃度のｉ．ｖ（静脈内）でＤＸ１８２抗体の薬物動態（ＰＫ）および毒性を評価した。ＤＸ１８２のＰＫでは、半減期は１．３日であった。抗原をチャレンジしていないサルでは、ＤＸ１８２（８ｍｇ／ｋｇ静脈内）は忍容性が高く、全身性毒性または心血管毒性の明らかに有害な徴候は見られなかった。
【０１９６】
アレルギー性カニクイザルを用いて、気管支収縮に対するＤＸ１８２抗体の作用を評価した。エアロゾル抗原曝露の曝露の４８時間前に、回虫アレルギー性サルに、Ｄｘ１８２（サル１０匹）あるいはアイソタイプコントロール抗体（サル１０匹）を８ｍｇ／ｋｇで静脈内投与し、引き続いてアレルギー性気管支収縮による気道抵抗の増加をモニターした。抗原の吸入曝露を行うと、ＤＸ１８２で処置した２匹のサルで気道抵抗が急速かつ顕著に増大し、血圧が低下し、心拍数が増加したため、抗原曝露段階の開始時点で本研究を終了した。アイソタイプコントロール抗体を投与したサルは、予期しない生理学的反応を示さなかった。
（実施例１１）
ヒトおよびＣＹＮＯにおけるＣＤ２００Ｒ遺伝子およびＣＤ２００ＲＬＡ遺伝子
カニクイザルにおけるＣＤ２００ＲＬａ遺伝子の発現：ヒトおよび非ヒト霊長類のＣＤ２００ＲＬａ遺伝子の配列アライメント解析により、カニクイザルおよびアカゲザルのＣＤ２００ＲＬａ遺伝子は、ヒトおよびチンパンジーＣＤ２００ＲＬａの遺伝子に存在しない２つの重要なシステインを維持していることが明らかになった。カニクイザルのＣＤ２００ＲＬａ配列中にこうしたシステインが含まれていることから、この遺伝子がＤａｐ１２と対を形成し、適切に誘導されれば、強力な活性化シグナルを伝えることができる機能的な細胞表面タンパク質を産生し得ることが示唆された。配列アライメントを図１３に示す。
【０１９７】
以下に、ヒトＣＤ２００Ｒ核酸コード配列およびタンパク質配列と、ヒトＣＤ２００ＲＬａ核酸およびタンパク質配列とを記載する。
【０１９８】
【化１】
2010512791.tif 000049
【０１９９】
【化２】
2010512791.tif 000050
以下に、ヒトＣＹＳ改変ＣＤ２００ＲＬａの核酸コード配列およびヒトＣＹＳ改変ＣＤ２００ＲＬａのタンパク質配列を記載する。ＣＹＳ改変ＣＤ２００ＲＬａについては、ヒ
トＣＤ２００ＲＬａの部位（ｃｉｔｅ）特異的変異誘発により得た。部位特異的変異誘発に使用したプライマーは、以下のとおりである：
【０２００】
【化３】
2010512791.tif 000051
【０２０１】
【化４】
2010512791.tif 000052
以下のプライマーを用いて、ｃｙｎｏマスト細胞ｃＤＮＡライブラリーからｃｙｎｏＣＤ２００ＲＬａを得た：ＣＡＡＡＴＧＣＡＣＡＣＴＴＴＡＧＧＡＡＡＧＡＴＧおよびＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＴＧ。以下のプライマーを用いて、ｃｙｎｏ肺ｃＤＮＡライブラリーからｃｙｎｏ阻害性ＣＤ２００ＲｃＤＮＡを得た。：ＡＴＧＣＴＣＴＧＣＣＣＴＴＧＧＡＧＡＡＣおよびＡＧＡＧＴＣＣＡＡＣＡＡＣＴＴＡＴＡＡＡＧＴ。
【０２０２】
【化５】
2010512791.tif 000053
【０２０３】
【化６】
2010512791.tif 000054
カニクイザルＣＤ２００ＲＬａによるマウスマスト細胞のトランスフェクション：カニクイザル活性化ＣＤ２００ＲＬａに対するラット抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ１８２の結合能をフローサイトメトリーにより評価した。実施例５に記載の方法を用いて、マウスの
マスト細胞株またはプレＢ細胞株Ｂａ／Ｆ３（Ｔ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｙｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎから提供）をトランスフェクトしてｃｙｎｏＣＤ２００ＲＬａを発現させた。ＢａＦ／３におけるＣＤ２００ＲＬａタンパク質の発現の場合、Ｎ末端にＦＬＡＧエピトープを含むシグナル伝達分子ＤＡＰ１２（Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：７０３）を共発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出できるようにする必要があった。ＦＬＡＧタグＤＡＰ１２は、対を形成するパートナーが存在しない場合、Ｂａ／Ｆ３の細胞質内にとどまる。一方、ＤＡＰ１２会合受容体が存在する場合、ＤＡＰ１２会合受容体は、膜貫通ドメインの反対の電荷を持つ残基との相互作用によりＤＡＰ１２と対を形成することができ、その結果、ＦＬＡＧエピトープが細胞表面に現れる。マウスマスト細胞には、異なる種に由来するＣＤ２００ＲＬａタンパク質と会合できる内因性ＤＡＰ１２が発現する。マウスマスト細胞およびＢａ／Ｆ３−ＤＡＰ１２細胞にｃｙｎｏＣＤ２００ＲＬａ遺伝子を導入したところ、細胞の細胞表面にこのタンパク質が発現し得、そしてそれを抗ヒトＣＤ２００Ｒ抗体ＤＸ１８２が認識することが確認された。結果を図１４に示す。
【０２０４】
ｃｙｎｏＣＤ２００ＲＬａ細胞表面発現受容体と、シグナル伝達アダプター分子ＤＡＰ１２との会合を生化学により確認した。ｃｙｎｏＣＤ２００ＲＬａを発現するマスト細胞の細胞表面を、ＥＺ−ｌｉｎｋスルホ−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてビオチンで標識した。細胞をＤ−ＰＢＳで洗浄してから、プロテアーゼ阻害剤（コンプリートプロテアーゼインヒビター混合物；Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む１％ジギトニン（Ｃａｂｉｏｃｈｅｍ）、０．１２％トリトンＸ−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリエタノールアミンに溶解した。溶解物を１２，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心した。前もって澄明化した（ｐｒｅｃｌｅａｒｅｄ）溶解物を１〜２μｇの抗ＣＤ２００ＲＤＸ１８２またはアイソタイプコントロール（ラットＩｇＧ２ａ，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，＃５５３９２６）およびプロテインＡおよびプロテインＧセファロースビーズとインキュベートして、免疫沈降を行った。ビーズを洗浄し、溶出したタンパク質を４〜２０％トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｎｏｖｅｘ）上で分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にトランスファーした。膜を、５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）にてブロックし、次いでストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でブロットし、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳで洗浄し、この膜をＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  ｄｕｒａ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）でインキュベートした後に可視化し，その後、薄膜に密着させた。ＤＡＰ１２については、細胞外ドメインが短いため、ビオチンで細胞表面標識を行わない。したがって、この膜をウサギ抗マウスＤＡＰ１２抗体、続いてプロテインＡ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でプローブし、上記のように可視化した。ＤＸ１８２の免疫沈降においてＤＡＰ１２が認められ、ｃｙｎｏ活性化ＣＤ２００ＲＬａとの会合が確認された。結果を図１５に示す。
【０２０５】
ＤＸ１８２は、マスト細胞の脱顆粒反応を誘導することにより、マウスのマスト細胞に発現するカニクイザルＣＤ２００ＲＬａの活性剤であることが明らかにされた。実施例１１に記載のマウスのマスト細胞に発現するｃｙｎｏＣＤ２００ＲＬａを用いて、実施例５に記載されているように、脱顆粒アッセイを行った。結果を図１６に示す。
【０２０６】
ＣＤ２００ＲＬａは、ヒトマクロファージおよび骨髄系細胞に発現しない。
【０２０７】
ヒトゲノムには、ＣＤ２００Ｒファミリーメンバーが、ＣＤ２００ＲおよびＣＤ２００ＲＬａの２つしかない（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：３０３４−３０４６）。ヒトＣＤ２００ＲＬａは、マウスＣＤ２００ＲＬ
ａ遺伝子と同様に膜貫通配列に荷電残基を含むことから、ＤＡＰ１２と相互作用し、活性化シグナルを伝達する可能性が示唆される。マウスＣＤ２００ＲＬａ遺伝子は、大分部のマクロファージ／骨髄系細胞で容易に発現し、Ｄａｐ１２を含むマウス細胞株にトランスフェクトしやすいが、ヒトＣＤ２００ＲＬａは、ヒトマクロファージ／骨髄系細胞での転写レベルが極めて低く、Ｄａｐ１２を含むトランスフェクト可能な細胞株において細胞表面に発現できなかった。
【０２０８】
図１３に示すように、ヒトおよびｃｈｉｍｐＣＤ２００ＲＬａは、ＣＤ２００Ｒファミリーの他のすべてのメンバーで保存されている２つのシステイン残基が欠けている。理論に束縛されるものではないが、ヒトＣＤ２００Ｒｌａが機能的な受容体を形成できないのは、細胞外ドメインにおける２つのそのシステイン残基がグリシン残基またはイソロイシン残基に変異したためと考えられる。ゲノム配列に欠けているその２つのシステインをコードするようにｈｕＣＤ２００ＲＬａ遺伝子を改変させると、ヒトＣＤ２００ＲＬａ受容体を、Ｄａｐ１２と会合する細胞表面に発現させることを可能にした。
【０２０９】
ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーにより、抗ＣＤ２００Ｒ抗体がヒトＣＤ２００ＲＬａタンパク質、ｃｙｎｏＣＤ２００Ｒタンパク質およびｃｙｎｏＣＤ２００ＲＬａタンパク質に結合するかどうかについて測定した。ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と融合したヒトＣＤ２００ＲＬａ細胞外ドメインからなる融合タンパク質を作製した。この融合タンパク質は、２つの残基（グリシンおよびイソロイシン）をシステインに改変して、カニクイザルおよびアカゲザルのＣＤ２００ＲＬａタンパク質、ならびにヒトＣＤ２００Ｒタンパク質およびｃｙｎｏＣＤ２００Ｒタンパク質により類似したものになっている（図１３を参照）。実施例５に記載されているように、このタンパク質を発現させた。このタンパク質の野生型も作製したが、ＣＹＳ改変タンパク質に比べて発現がかなり減少した。
【０２１０】
同様に、野生型残基またはＣＹＳ改変残基を含む全長ヒトＣＤ２００ＲＬａ  ｃＤＮＡを作製した。実施例１１に記載されているように、このｃＤＮＡをｐＭＸｐｉｅレトロウイルスベクターにクローニングし、ヒトＤＡＰ１２を発現しているＢａ／Ｆ３細胞に導入した。このｐＭＸｐｉｅベクターは、ｐＭＸｎｅｏベクターに類似している（実施例５を参照）が、追加ＩＲＥＳ−ＧＦＰ配列をコード配列の３’に挿入してあり、ベクターにコードされたタンパク質を蛍光により検出できる。ネオマイシン耐性遺伝子をピューロマイシン耐性遺伝子で置換し、細胞を、１ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて薬剤選択する。
【０２１１】
ＣＹＳ改変型の受容体は、抗ＦＬＡＧエピトープ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いたＦＡＣＳ染色により検出され、細胞表面に発現していた。野生型の受容体は、細胞表面に検出されなかった。
【０２１２】
標準的な間接ＥＬＩＳＡプロトコルにより、ＤＸ１８２は、融合タンパク質として発現するとき、野生型またはＣＹＳ改変ヒトＣＤ２００ＲＬａに結合しなかった。さらに、ＤＸ１８２は、細胞表面でＣＹＳ改変ヒトＣＤ２００ＲＬａを発現するＢａ／Ｆ３細胞にも結合しなかった。
【０２１３】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の抗ヒト阻害性抗体は、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ受容体には特異的に結合するが、ＣＹＳ改変ヒトＣＤ２００ＲＬａまたはヒトＣＤ２００ＲＬａ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と融合したヒトＣＤ２００ＲＬａの細胞外ドメイン、実施例１３などを参照）には特異的に結合しない。
【０２１４】
ＣＤ２００ＲおよびＣＤ２００ＲＬａ（ＣＹＳ改変型）を発現させる方法は、本明細書に上記したとおりである。限定としてではなく例として、抗ＣＤ２００Ｒ抗体の結合特異
性については、上記のアッセイで評価することができる。ＤＸ１８２、ＤＸ２４８、ＤＸ１８５、Ｄｘ１７８、ＤＸ１８４およびＤＸ１７６の結果を以下の表に示す。
【０２１５】
【表１０】
2010512791.tif 000055
上記の刊行物または文書の引用は、それらのいずれかが適当な従来技術であること認めることを意図するものでも、それらの刊行物または文書の内容または日付を承認するものでもない。本明細書に引用する参考文献についてはすべて、参照によって援用すべく、１つ１つの刊行物、特許出願または特許を具体的に個々に示していると同じ程度に参照によって援用する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する結合化合物であって、
配列番号１〜１８および；およびＲＡＳＫＮＩＲＳＹＬＡ（配列番号５５）からなる群から選択される少なくとも一定数のＣＤＲ配列を持つ少なくとも１つの抗体軽鎖可変領域またはその結合フラグメント、
配列番号１９〜３６からなる群から選択される少なくとも一定数のＣＤＲ配列を持つ少なくとも１つの抗体重鎖可変領域またはその結合フラグメントを含み、
該一定数は１である、
結合化合物。
【請求項２】
前記一定数が２である、請求項１に記載の結合化合物。
【請求項３】
前記一定数が３である、請求項１に記載の結合化合物。
【請求項４】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１、２および３の前記ＣＤＲ配列を含み、かつ前記重鎖可変領域が、配列番号１９、２０および２１の前記ＣＤＲ配列を含むか、あるいは、前記軽鎖可変領域が、配列番号１６、１７および１８の前記ＣＤＲ配列を含み、かつ前記重鎖可変領域が、配列番号３４、３５および３６の前記ＣＤＲ配列を含む、請求項３に記載の結合化合物。
【請求項５】
前記軽鎖可変領域が、配列番号ＲＡＳＫＮＩＲＳＹＬＡ（配列番号５５）、２および３の前記ＣＤＲ配列を含み、かつ前記重鎖可変領域が、配列番号１９、２０および２１の前記ＣＤＲ配列を含む、請求項３に記載の結合化合物。
【請求項６】
前記軽鎖可変領域が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号４２の前記配列を含み、かつ前記重鎖可変領域が、最大１０個の保存的アミノ酸置換を持つ配列番号４８の前記配列を含むか、あるいは．前記軽鎖可変領域が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５６の前記配列を含み、かつ前記重鎖可変領域が、最大１０個の保存的アミノ酸置換を持つ配列番号５７の前記配列を含む、請求項４に記載の結合化合物。
【請求項７】
前記結合化合物が、
配列番号４２を含む軽鎖可変領域；および
配列番号４８を含む重鎖可変領域あるいは．
配列番号５６を含む軽鎖可変領域；および
配列番号５７を含む重鎖可変領域
を含む抗体である、請求項６に記載の結合化合物
【請求項８】
前記軽鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５１の前記成熟型から本質的に成り、前記重鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５３の前記成熟型から本質的に成る、請求項４に記載の結合化合物。
【請求項９】
前記軽鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号４９から本質的に成り、かつ前記重鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５０から本質的に成るか、あるいは、前記軽鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５６から本質的に成り、かつ前記重鎖が、最大１０個の保存的置換を持つ配列番号５７から本質的に成る、請求項４に記載の結合化合物。
【請求項１０】
ヒトのヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する結合化合物であって、該結合化合物は、配列番号４２に対する相同性が少なくとも９０％である軽鎖可変領域および配列番号４８に対する相同性が少なくとも９０％である重鎖可変領域を含むか、あるいは、該結合化合物は、配列番号４１に対する相同性が少なくとも９０％である軽鎖可変領域および配列番号４７に対する相同性が少なくとも９０％である重鎖可変領域を含む、結合化合物。
【請求項１１】
請求項３に記載の結合化合物の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の少なくとも１つをコードする単離された核酸。
【請求項１２】
前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号４２であり、かつ前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号４８であるか、あるいは、前記軽鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号４２であり、かつ前記重鎖可変領域の前記アミノ酸配列が配列番号４８である、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
制御配列に作動可能に連結された請求項１１に記載の核酸を含む発現ベクターであって、宿主細胞に該ベクターがトランスフェクトされるとき該制御配列が該宿主細胞により認識される、発現ベクター。
【請求項１４】
前記発現ベクターが、２００６年１２月６日に寄託されたＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０６７（ｐＡＣＤ２００ＲＶ１プラスミド中にシグナル配列を含むｈｕＤＸ１８２）を持つ、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
ポリペプチドを産生する方法であって、
前記核酸配列を発現し、それにより前記軽鎖および重鎖可変領域を含むポリペプチドを産生する条件下、請求項１５に記載の宿主細胞を培地で培養する工程；および
該宿主細胞または培地から該ポリペプチドを回収する工程
を含む、方法。
【請求項１７】
成熟抗体配列が、請求項１４に記載の発現ベクターにコードされる、抗ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒ抗体。
【請求項１８】
交差ブロッキングアッセイにおいてヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに対する請求項１７に記載の結合化合物の結合を交差ブロックできる、抗体。
【請求項１９】
抗体ｈｕＤＸ１８２が結合するエピトープと同じ、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒにおけるエピトープに結合する、抗体。
【請求項２０】
前記結合化合物が、ヒト化モノクローナル抗体である、請求項１に記載の結合化合物。
【請求項２１】
前記結合化合物が、完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項１に記載の結合化合物。
【請求項２２】
前記結合化合物が、アゴニストヒト化モノクローナル抗体である、請求項２１に記載の結合化合物。
【請求項２３】
ヒト被験者の処置のための組成物であって、ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合し、該ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒの阻害活性を活性化する結合化合物を治療有効量で含み、該結合化合物が、抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域を含有し、該軽鎖可変領域は配列番号４２を含み、かつ該重鎖可変領域は配列番号４８を含むか、あるいは、該結合化合物が、抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域を含有し、該軽鎖可変領域が配列番号４１を含み、かつ該重鎖可変領域が配列番号４７を含む、組成物。
【請求項２４】
前記結合化合物が、モノクローナル抗体である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ヒト被験者が、炎症性障害または自己免疫障害を持つ、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ヒト被験者が、関節リウマチを持つ、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ヒト被験者が、喘息を持つ、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ヒト被験者が、ぶどう膜炎を持つ、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ヒト被験者が、アレルギーを持つ、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組成物が、別の免疫抑制剤または抗炎症剤とともに投与されることで特徴付けられる、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３１】
組成物であって、以下：
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合し、該ヒト阻害性受容体を活性化する結合化合物であって、該結合化合物が抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域を含有し、該軽鎖可変領域は配列番号４２を含み、該重鎖可変領域は配列番号４８を含む、結合化合物；および
薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤あるいは
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合し、該ヒト阻害性受容体を活性化する結合化合物であって、該結合化合物は抗体軽鎖可変領域および抗体重鎖可変領域を含有し、該軽鎖可変領域は配列番号４１を含み、該重鎖可変領域は配列番号４７を含む、結合化合物、
を含む、組成物
【請求項３２】
別の免疫抑制剤または抗炎症剤をさらに含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
重鎖定常領域をさらに含み、該重鎖定常領域は、γ１、γ２、γ３またはγ４ヒト重鎖定常領域またはこれらの改変体を含む、請求項４または５に記載の結合化合物。
【請求項３４】
γ１ヒト重鎖定常領域またはその改変体を含む、請求項３３に記載の結合化合物。
【請求項３５】
軽鎖定常領域をさらに含む、該軽鎖定常領域が、κヒト軽鎖定常領域を含む、請求項４または５に記載の結合化合物。
【請求項３６】
前記結合化合物が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、Ｆ（ａｂ’）２およびダイアボディからなる群から選択される抗体フラグメントである、請求項４または５に記載の結合化合物。
【請求項３７】
前記結合化合物は、前記ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒを活性化する、請求項１〜１０のいずれかに記載の結合化合物。
【請求項３８】
ヒト阻害性ＣＤ２００Ｒに結合する結合化合物であって、２００７年１２月１３日にＨＣ８０９．１４Ｆ１２．６．ＤＸ２４８．３株として寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−８８３８であるハイブリドーマから産生される抗体と同じＣＤＲを含む、結合化合物。
【請求項３９】
２００７年１２月１３日にＨＣ８０９．１４Ｆ１２．６．ＤＸ２４８．３株として寄託され、ＡＴＣＣ受託番号がＰＴＡ−８８３８である、ハイブリドーマ。
【請求項４０】
前記結合化合物は、アゴニストモノクローナル抗体である、請求項３１〜３９のいずれかに記載の結合化合物。
【国際調査報告】
2010512791.tif 000056
2010512791.tif 000057
2010512791.tif 000058
2010512791.tif 000059
2010512791.tif 000060
2010512791.tif 000061
2010512791.tif 000062
2010512791.tif 000063