(57)【要約】対象における血管形成を抑制するために甲状腺ホルモン拮抗剤の重合体ナノ粒子形態の有効量を投与することを包含する血管形成に関連する状態を有する対象を治療する方法を開示する。甲状腺ホルモン、又は甲状腺ホルモン拮抗剤の重合体形態の組成物も開示する。一実施形態において、本発明は血管形成を促進することによる治療を必要とする対象に対し、血管形成を促進するために有効なテトラック、トリアック、テトラック及びトリアックのナノ粒子又はその類縁体のある量を投与することによる、そのような治療に適する状態を治療するための方法を特徴としている。血管形成を促進することによる治療に適するそのような状態の例は本明細書に記載する通りであり、そして閉塞性血管疾患、冠動脈疾患、勃起不全、心筋梗塞、虚血、卒中、末梢動脈血管障害、脳血管、四肢の虚血、及び創傷を包含することができる。
2010513526.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物療法に対して耐性である癌細胞の成長を抑制する方法であって、薬物療法を必要とする対象に対し、成長を抑制するために有効なテトラック、トリアック、テトラック及びトリアックのナノ粒子又はその類縁体の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記療法耐性癌細胞が原発性又は転移性の腫瘍、乳癌、甲状腺癌、神経芽腫、神経膠腫及び多形神経膠芽腫及び他の脳の癌、結腸癌、頭部頚部癌、黒色腫及び皮膚の基底細胞および扁平上皮細胞の癌、肉腫、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、ヘパトーム、肺癌及び胃癌よりなる群から選択される、請求項２７記載の方法。
【請求項３】
前記薬物療法が従来又は新規な化学療法薬の投与を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記化学療法薬品がドキソルビシン、エトポシド、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、シスプラチン、トリコスタチンＡ、パクリタキセル、ゲムシタビン、タキソテール、シスプラチナム、カルボプラチナム、イリノテカン、トポテカン、アドリアマイシン、ボルテゾミブ及びアトポシド又は上記薬剤の新規誘導体よりなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
化学療法薬を投与することを更に含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記化学療法薬がドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン、及びトリコスタチンＡよりなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項７】
前記テトラック又はテトラック類縁体が、１０〜１０００ｎｍの粒径を有するテトラック粒子複数にコンジュゲートしたナノ粒子を含むナノ粒子コンジュゲートであり、そして該テトラック粒子が、該テトラック粒子のアルコール部分とナノ粒子コンジュゲーションを架橋するエーテル（−Ｏ−）又はイオウ（−Ｓ−）連結によって該ナノ粒子に結合している、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記テトラック、テトラックナノ粒子又はその類縁体がポリビニルアルコール、アクリル酸エチレン共重合体、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリラクチド、アガロース、ＰＥＯ、ｍ−ＰＥＧ、ＰＶＡ、ＰＬＬＡ、ＰＧＡ、ポリＬ−リジン、ヒト血清アルブミン、セルロース誘導体、カルボメトキシ／エチル／ヒドロキシプロピル、ヒアルロン酸、葉酸塩連結シクロデキストリン／デキストラン、サルコシン／アミノ酸スペースド重合体、アルギネート／カラジーナン、ペクチン／キトサン、デキストラン、コラーゲン、ポリアミン、ポリアニリン、ポリアラニン、ポリトリプトファン、及びポリチロシンよりなる群から選択されるメンバーにコンジュゲートされている、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記テトラック又はテトラック類縁体がＮＨ２部分において保護基を有するナノ粒子である、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記保護基がＮ−メチル、Ｎ−エチル、Ｎ−トリフェニル、Ｎ−プロピル、Ｎ−イソプロピル、Ｎ−ｔ−ブチル、及び他の官能基よりなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ナノ粒子がナノ粒子当たり１〜１００個のテトラック又はテトラック類縁体分子を含有する、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記ナノ粒子がナノ粒子当たり１５〜３０個のテトラック又はテトラック類縁体分子を含有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ナノ粒子がナノ粒子当たり２０〜２５個のテトラック又はテトラック類縁体分子を含有する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記テトラック、テトラック類縁体又はそのナノ粒子が製薬上許容しうる担体を含む医薬品製剤中にある、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記医薬品製剤が更に製薬上許容しうる賦形剤１つ以上を含む請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
製剤が非経口、経口、直腸又は局所の投与様式又はその組み合わせを有する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
癌細胞の化学的感受性を増強するために十分な量においてテトラック、テトラック類縁体又はそのナノ粒子を該細胞に投与することによる、該化学的感受性を増大させる方法。
【請求項１８】
癌細胞の化学的感受性を増強するために有効な量においてテトラック、テトラック類縁体又は該ナノ粒子を腫瘍の存在に苦しむ患者に投与することを含む、該患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００６年１２月２２日に出願された米国仮出願第６０／８７６，７７０号、２００７年６月１８日に出願された米国仮出願第６０／９３６，２２３号、２００７年７月９日に出願された米国仮出願第６０／９５９，００６号、２００７年８月３０日に出願された米国仮出願第６０／９６７，０１６号、２００７年９月２１日に出願された米国仮出願第６０／９９４，８９５号、２００７年９月２５日に出願された米国仮出願第６０／９９５，４１６号、２００７年１０月２３日に出願された米国仮出願第６１／０００，２６２号、２００７年１１月２０日に出願された米国仮出願第６１／００３，９３５号（これらの全ては、それらの全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモン類縁体及びそれらの誘導体のナノ粒子及び重合体コンジュゲートの形態に関する。そのような化合物を使用する方法及びそれらを含有する医薬組成物も開示する。本発明は又そのような化合物を製造する方法、持続放出性及び長時間残留性の眼科用製剤及びその製造プロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
甲状腺ホルモン、例えばＬ−チロキシン（Ｔ４）及び３，５，３’−トリヨード−Ｌ−チロニン（Ｔ３）及びそれらの類縁体、例えばＧＣ−１、ＤＩＴＰＡ、テトラック（ｔｅｔｒａｃ）及びトリアック（ｔｒｉａｃ）は脊椎動物の種々の組織において多くの異なる生理学的過程を調節している。甲状腺ホルモンの作用の多くは甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）により媒介されていることが以前より知られている。甲状腺ホルモンに対する新規な細胞表面受容体（Ｌ−チロキシン、Ｔ４；Ｔ３）はインテグリンαＶβ３に関して記載されている。受容体はインテグリン上のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）認識部位又はその近傍に存在する。αＶβ３受容体は核甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）の相同体ではないが、細胞表面受容体の活性化は多くの核媒介事象、例えば最近報告されたホルモンの前血管形成及び創傷治癒におけるヒト皮膚線維芽細胞単層モデルにおけるインビトロの線維芽細胞遊走をもたらす。
【０００４】
テトラヨードチロ酢酸（テトラック）はインテグリンにおいてアゴニスト活性を有さないがインテグリンによるＴ４及びＴ３の結合及びαＶβ３におけるアゴニスト甲状腺ホルモン類縁体の前血管形成作用を抑制するＴ４の脱アミノ化類縁体である。甲状腺ホルモンの血管形成作用の抑制はニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）モデルにおいて、そしてヒト皮膚微細血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）の関与する血管新芽形成モデルにおいて観察されている。甲状腺ホルモンの非存在下においては、テトラックは塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及び他の前血管形成性ペプチドの血管形成活性をブロックする。テトラックはＣＡＭおよびＨＤＭＥＣモデルにおいて有効である。テトラックのこのような抑制作用は前血管形成性ペプチドの作用に関連するＲＧＤ認識部位に対するその影響を反映していると考えられる。
【０００５】
甲状腺ホルモンが細胞の核の外部で主に作用することができるという証拠は、Ｔ３又はＴ２に対するミトコンドリア応答の研究から、細胞膜におけるホルモンの急速に発生する作用から、そして細胞質蛋白に対する作用から生じたものである。インテグリンαＶβ３上の甲状腺ホルモンに対する原形質膜受容体の最近の説明は、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターのような膜イオンポンプ上のホルモンの作用に関する幾つかの識見を与えており、そして膜甲状腺ホルモン受容体と特定の腫瘍細胞の血管形成及び増殖のような重要な細胞又は組織の過程に伏在する核事象の間のインターフェイスの説明をもたらしている。
【０００６】
甲状腺ホルモンの循環系中レベルは相対的に安定しており；従って血管新生に対する、又は細胞増殖に対する、又は膜イオンチャンネル、そして当然ながら更には上記したＴＲにより媒介されるホルモンの遺伝子発現作用に対する甲状腺ホルモンの膜開始作用は「基底活性」又は未損傷生物におけるこれらの過程のセットポイントに寄与していると推定される。甲状腺ホルモンに対する膜受容体により媒介される細胞事象の可能な臨床的用途は血管新生又は腫瘍細胞成長の範囲におけるそのような作用の抑制にあると考えられる。実際、本発明者等は、受容体においてアゴニスト活性を有さないホルモン結合抑制類縁体であるテトラヨードチロ酢酸（テトラック）を用いてヨードチロニンに対する膜受容体をブロックすることは、神経膠腫細胞およびヒト乳癌細胞の成長をインビトロで停止することができることを示している。テトラックは甲状腺ホルモンの作用におけるインテグリン受容体の参与に関してスクリーニングするための有用なプローブである。
【０００７】
インテグリンαＶβ３は蛋白のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）認識部位近傍で甲状腺ホルモンと結合し；ＲＧＤ部位はビトロネクチン、フィブロネクチン及びラミニンのような細胞外マトリックス（ＥＣＭ）蛋白にインテグリンを連結させる蛋白−蛋白相互作用に関与している。細胞表面インテグリン受容体において同様に開始されるものは標準的なニワトリ血管試験において、又は新芽形成試験におけるヒト内皮細胞を用いてモニタリングされる血管形成の複雑な過程である。このホルモン依存性の過程はＭＡＰＫ活性化及び血管形成に対する甲状腺ホルモンの作用の下流メディエーターである塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ；ＦＧＦ２）の同化を必要とする。テトラックは、Ｔ４及びＴ３のこの作用を、ＲＧＤペプチド及びＲＧＤペプチドを模倣する小分子が行うと同様にブロックする。望ましい血管新生は例えば創傷治癒において甲状腺ホルモン類縁体の局所適用により促進することができること、又は、腫瘍成長を支援するような望ましくない血管形成はテトラックを用いて部分的に拮抗できること、の可能性がある。
【０００８】
甲状腺ホルモンは又、特定の腫瘍細胞系統のインビトロの増殖を刺激することができる。ネズミ神経膠腫細胞系統はインテグリン受容体において開始され、そしてＭＡＰＫ依存性である機序によりＴ４の生理学的濃度に応答して増殖することが分かっている。臨床的推論においては、軽度の甲状腺機能低下症がプロピルチオウラシルにより誘導された高度進行型の多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）を有する患者の予測的試験によれば、甲状腺機能正常対照患者より高値の重要な生存上の利益が観察された。本発明者等は２００４年にヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞がテトラックにより抑制された機序によりＴ４に応答して増殖したことを報告した。Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ等による最近の回顧的臨床分析によれば、乳癌を発症した甲状腺機能低下女性は、マッチした甲状腺機能正常対照よりも障害のより後期においてそのようになり、対照よりも診断時点においては低攻撃性のより小型の患部を有していることが示されている。即ち、脳腫瘍及び乳癌の両方のインビトロのモデルに対する甲状腺ホルモンの栄養性作用が臨床上の支援性を有すると考えられる。
【０００９】
インテグリンαＶβ３により開始されることがわかっており、そしてＭＡＰＫを介したホルモンシグナルのトランスダクションを必要とする甲状腺ホルモンの細胞又は組織での作用を以下に総括する。インテグリンは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）蛋白から細胞内部に（アウトサイド−イン）、又は細胞質及び細胞内小器官からＥＣＭに（インサイド−アウト）にシグナルを連結するシグナルトランスデューサー蛋白である。Ｌ−チロキシン（Ｔ４）又は３，５，３’−トリヨード−Ｌ−チロニン（Ｔ３）のヘテロ２量体αＶβ３への結合は有糸分裂促進物質活性化蛋白キナーゼ（ＭＡＰＫ；ＥＲＫ１／２）の活性化をもたらす。活性化されたＭＡＰＫ（ホスホＭＡＰＫ、ｐＭＡＰＫ）は細胞核に転座し、そこでトランスアクチベーター蛋白、例えば甲状腺ホルモン受容体−β１（ＴＲβ１）、エストロゲン受容体−α（ＥＲα）、又は転写のシグナルトランスデューサー及び活性化物質−１α（ＳＴＡＴ１α）をホスホリル化する。結果的に転写される遺伝子に含まれるものは、甲状腺ホルモン誘導血管形成を媒介する塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及び腫瘍細胞の細胞分裂にとって重要な他の増殖因子である。
【００１０】
以下に示すものはインテグリンにおけるＴ３及びＴ４の作用を抑制するテトラヨードチロ酢酸（テトラック）の能力を示すものであり；テトラックはインテグリン受容体へのヨードチロニンの結合をブロックする。同様に示すものはインテグリン及び表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の間のクロストークである。ここでは、細胞表面における甲状腺ホルモンの存在がＥＧＦＲの機能を改変する事により、後者がＥＧＦＲに結合する別の成長因子であるＴＧＦ−αからＥＧＦを識別できるようにしている。
【００１１】
【化１】
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即ち、細胞表面受容体には結合できるが細胞に侵入できない甲状腺ホルモン類縁体が当該分野で必要とされている。そのような再製剤されたホルモン類縁体はホルモンの細胞内作用を発現しないと考えられ、そのため、循環系に吸収されても合成の甲状腺ホルモン類縁体の作用を有さないと考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモン類縁体、それらの重合体及びナノ粒子形態が細胞膜のレベルで作用し、そして核甲状腺ホルモン作用とは独立した前血管形成作用を有することの発見に部分的に基づいている。従って、これらの甲状腺ホルモン類縁体、重合体形態、及びナノ粒子は種々の障害を治療するために使用できる。同様に、本発明は甲状腺ホルモン類縁体拮抗剤がそのような類縁体の前血管形成作用を抑制し、そしてやはり種々の障害を治療するために使用できるということの発見にも基づいている。
【００１３】
従って、１つの特徴において、本発明は血管形成を促進することによる治療を必要とする対象に対し、血管形成を促進するために有効なテトラック、トリアック、テトラック及びトリアックのナノ粒子又はその類縁体のある量を投与することによる、そのような治療に適する状態を治療するための方法を特徴としている。血管形成を促進することによる治療に適するそのような状態の例は本明細書に記載する通りであり、そして閉塞性血管疾患、冠動脈疾患、勃起不全、心筋梗塞、虚血、卒中、末梢動脈血管障害、脳血管、四肢の虚血、及び創傷を包含することができる。
【００１４】
甲状腺ホルモン類縁体の例もまた本明細書に記載する通りであり、そしてトリヨードチロニン（Ｔ３）、レボチロキシン（Ｔ４）、Ｔ４又はＴ３のＮ−メチル、Ｔ４又はＴ３のＮ−エチル、Ｔ４又はＴ３のＮ−トリフェニル、Ｔ４又はＴ３のＮ−プロピル、Ｔ４又はＴ３のＮ−イソプロピル、Ｔ４又はＴ３のＮ−ｔ−ブチル、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、又は３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）、テトラヨードチロ酢酸（ＴＥＴＲＡＣ）、及びトリヨードチロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）を包含できる。追加的な類縁体は図２０表Ａ〜Ｄに示す。これらの類縁体はポリビニルアルコール、アクリル酸エチレン共重合体、ポリ乳酸、又はアルギネートにコンジュゲートすることができる。コンジュゲーションは使用する重合体に応じて共有結合又は非共有結合を介する。
【００１５】
１つの実施形態において、甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモン類縁体、又はその重合体形態は非経口、経口、直腸又は局所的な手段、又はその組み合わせにより投与する。投与の非経口の様式は、例えば、皮下、腹腔内、筋肉内、又は静脈内の様式、例えばカテーテルによるものを包含する。投与の局所的な様式は例えばバンドエイドを包含する。
【００１６】
別の実施形態においては、甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモン類縁体、又はその重合体形態は微粒子、リポソーム、又は重合体内にカプセル化するか配合することができる。重合体は例えばポリグリコリド、ポリラクチド、又はそれらの共重合体を包含できる。リポソーム又は微粒子は約２５０ナノメートル未満の粒径を有し、そして１種以上の非経口の経路、又は他の投与様式を介して投与できる。別の実施形態においては、リポソーム又は微粒子は虚血組織を包囲する毛細血管床に定着させることができ、或いは、カテーテルを介して血管の内部に適用できる。
【００１７】
本発明の甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモン類縁体、又はその重合体形態は又、例えば成長因子、血管拡張剤、抗凝固剤、抗ウィルス剤、抗細菌剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、鎮痛剤、脈管形成剤、又は細胞接着分子、又はこれらの組み合わせを包含することができる生物学的に活性な物質１つ以上と共に同時投与することもできる。１つの実施形態において、甲状腺ホルモン類縁体又は重合体形態は生物学的に活性な物質１つ以上の投与前又は投与後に瞬時注射として投与される。
【００１８】
成長因子は例えば形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦα）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、塩基性線維芽細胞成長因子、血管内皮成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、血小板誘導成長因子、及び血管透過性因子を包含できる。血管拡張剤は、例えばアデノシン、アデノシン誘導体、又はその組み合わせを包含できる。抗凝固剤は、限定しないが例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、抗第Ｘａ因子、抗トロンビン、アスピリン、クロピドグレル、又はこれらの組み合わせを包含する。
【００１９】
本発明の別の特長においては、医療機器に沿って、或いはその周囲で血管形成を促進するための方法が提供され、これは、装置を患者に挿入する前に本発明の甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモン類縁体、又はその重合体形態で装置をコーティングすることにより行う。コーティング工程は更に１つ以上の生物学的に活性な物質、限定しないが例えば、成長因子、血管拡張剤、抗凝固剤、又はこれらの組み合わせで装置をコーティングすることを包含することができる。本発明の甲状腺ホルモン類縁体又は重合体形態でコーティングできる医療装置の例は、ステント、カテーテル、カニューレ、又は電極を包含する。
【００２０】
別の特長において、本発明は、血管形成を抑制することによる治療を要する対象に対して血管形成を抑制するために有効な抗血管形成剤のある量を投与することによる、そのような治療に適する状態を治療するための方法を提供する。血管形成を抑制することによる治療に適する状態の例は、限定しないが例えば、原発及び転移の腫瘍、糖尿病性網膜症、及び関連する状態を包含する。血管形成を抑制するために使用される抗血管形成剤の例もまた本明細書により提供され、そして限定しないが例えば、テトラヨードチロ酢酸（ＴＥＴＲＡＣ）、トリヨードチロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）、モノクローナル抗体ＬＭ６０９、ＸＴ１９９又はこれらの組み合わせを包含する。このような抗血管形成剤は細胞表面において作用することにより前血管形成剤を抑制することができる。
【００２１】
別の特長において、本発明は特定の癌の主要又は副次的な抗増殖治療を可能とする。この治療に適する癌性の状態の例は、限定しないが例えば、多形神経膠芽腫、肺癌、非甲状腺性の頭部頚部癌、甲状腺癌、乳癌及び卵巣癌を包含する。抗増殖作用のために使用される薬剤の例は本発明により提供され、そして限定しないが例えば、テトラヨードチロ酢酸（ＴＥＴＲＡＣ）、トリヨードチロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）、モノクローナル抗体ＬＭ６０９、ＸＴ１９９９又はこれらの組み合わせを包含する。これらの薬剤は甲状腺ホルモンに対する細胞表面インテグリン受容体において作用することにより癌細胞増殖を抑制する。
【００２２】
１つの実施形態において、抗血管形成剤は非経口、経口、直腸、又は局所の様式、又はそれらの組み合わせにより投与される。別の実施形態においては、抗血管形成剤は１つ以上の抗血管形成治療薬又は化学療法剤とともに同時投与することができる。
【００２３】
更に別の特徴において、本発明は重合体にコンジュゲートした甲状腺ホルモン及び類縁体を包含する組成物（即ち血管形成剤）を提供する。コンジュゲーションは重合体に応じて共有結合又は非共有結合を介することができる。共有結合は例えばエステル又は無水物の連結を介して起こることができる。甲状腺ホルモン類縁体の例もまた本明細書に記載する通りであり、そしてレボチロキシン（Ｔ４）、トリヨードチロニン（Ｔ３）、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、又は３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）を包含する。１つの実施形態において、重合体は限定しないが例えばポリビニルアルコール、アクリル酸エチレン共重合体、ポリ乳酸、又はアガロースを包含することができる。
【００２４】
別の特徴において、本発明は製薬上許容しうる担体中に本発明の血管形成剤を包含する医薬品製剤を提供する。１つの実施形態において、医薬品製剤は又１つ以上の製薬上許容しうる賦形剤を包含できる。
【００２５】
本発明の医薬品製剤はリポソーム、微粒子、又は重合体内にカプセル化するか配合することができる。リポソーム又は微粒子は約２５０ナノメートル未満の粒径を有する。本発明の医薬品製剤の何れも非経口、経口、直腸、又は局所的手段、又はこれらの組み合わせにより投与できる。別の実施形態においては、医薬品製剤はそれを必要とする対象に対し、１つ以上の生物学的に活性な物質、限定しないが例えば、成長因子、血管拡張剤、抗凝固剤、又はこれらの組み合わせと共に投与できる。
【００２６】
別の特徴において、本発明はニューロン機能の回復及び神経細胞の生存性の増強のための、重合体甲状腺ホルモン類縁体及びそのようなホルモンを含有する医薬品製剤の使用に関する。本発明の目的のためには、ニューロン機能は胚及び出生後の期間において神経系の発達を可能にし、そして、成体動物においては、損傷を受けたニューロンの再生機序及び中枢神経系のある部分が変性して再生不能となった場合のその順応能力の根幹となる集合的な生理学的、生化学的及び解剖学的な機序を意味するものとする。
【００２７】
従って、以下の過程、即ち：脱神経、再神経支配、シナプス発生、シナプス抑制、シナプス拡張、軸索の新芽形成、神経再生、損傷したものを置き換えるための神経経路及び回路の発達及び組織化はニューロンの機能を達成するために生じる。従って、本発明の重合体甲状腺ホルモン類縁体又はその組み合わせを用いて治療するべき適当な患者は、中枢神経系の変性障害（老年性痴呆様アルツハイマー病、パーキンソン症、ハンチントン舞踏病、小脳脊髄副腎脳白質ジストロフィー）、外傷及び脳虚血にり患した患者である。
【００２８】
好ましい実施形態においては、運動ニューロン欠陥、例えば筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、及び脊髄傷害を治療するための本発明の方法は、重合体甲状腺ホルモン類縁体、又はその組み合わせを成長因子、神経成長因子、又は他の前血管形成又は神経発生因子と組み合わせて投与することを含む。脊髄傷害は腫瘍、機械的外傷、及び化学的外傷に起因する傷害を包含する。筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、又は脊髄傷害を有する哺乳類における運動機能を回復するための同じか同様の方法も意図される。上記した重合体甲状腺ホルモン類縁体の１つを単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせて投与することも予防的機能をもたらす。そのような投与は筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、又は脊髄傷害を有するか、有する危険性のある哺乳類における運動機能を温存する作用を有する。同様に本発明によれば、重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子の投与との組み合わせは、黒質線状体経路の一貫性を温存する。
【００２９】
特記すれば、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、又は脊髄傷害を治療（前又は後症候性）するための本発明の方法は重合体甲状腺ホルモン類縁体を単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせて投与することを含む。特に好ましい実施形態においては、重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせたものは少なくとも１つの重合体甲状腺ホルモンを単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせて含む可溶性の複合体である。
【００３０】
１つの特徴において、本発明は、組成物、及び、損傷を受けた経路を修復すること、又はそれに対する追加的な損傷を抑制することを包含する、神経経路を維持するために十分な時間、そして濃度において、神経経路に対する傷害時に、又はそのような傷害が予測される場合に、本明細書に定義する形態発生性の蛋白（「重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせ」）の治療有効量を哺乳類に投与することを含む施療的治療方法を特徴とする。
【００３１】
別の特徴において、本発明は神経経路を維持するための組成物及び施療的治療方法を特徴とする。そのような治療方法は内因性の重合体甲状腺ホルモン類縁体の治療有効濃度を刺激する化合物を、神経経路に対する傷害時に、又はそのような傷害が予測される場合に、哺乳類に投与することを包含する。これらの化合物は本明細書においては、重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子刺激剤との組み合わせと称し、そして、哺乳類に投与された場合に、重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせを生産すること、及び／又は、重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせを分泌することを通常から担っているか、又はそれが可能である組織又は臓器に対して作用し、そして、重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせの内因性レベルを改変させる物質を包含するものと理解される。
【００３２】
特に、本発明は神経傷害に対する身体の免疫及び炎症性の応答に関連する組織破壊作用からニューロンを保護するための方法を提供する。本発明は又、未形質転換ニューロンの形態学的特徴へのニューロン起源の形質転換細胞の再分化を包含する、ニューロンの分化した表現型を維持するためにそれを刺激するための方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は細胞接着分子、特に神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）の生成を刺激するための手段を提供する。本発明は又、損傷を受けた樹状突起又は軸索を再生することを包含する、損傷を受けたニューロン及び神経経路の細胞修復を刺激するための方法、組成物及び装置を提供する。更に又、本発明は重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせのレベルの変動をモニタリングすることによる、神経組織の状態を評価するため、及び神経障害を検出及びモニタリングするための手段を提供する。
【００３３】
本発明の１つの特徴において、本明細書に記載した重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせは末梢神経系の損傷を受けた神経経路を修復する場合に有用である。特に、重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせは離断された、又は別様に損傷を受けた神経線維を包含する、損傷を受けた神経経路を修復するために有用である。特に、本明細書に記載した重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせは脈管形成及びミエリン鞘の再形成を包含する完全な軸索神経再生を刺激することができる。好ましくは、重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせを、傷害部位に対して、その部位に重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせを維持することができる生体適合性、成体再吸収性の担体中において、そして必要に応じて、切断されたニューロンの近位から遠位に向けて軸索成長を指向させるための手段を提供する。例えば、軸索の成長を指向させるための手段は神経の再生が１０ｍｍ超のような延長された距離に渡って誘導しなければならない場合に必要となる。これらの機能を与えることができる多くの担体が考案されている。例えば、有用な担体は、ラミニン、ヒアルロン酸又はコラーゲン、又は他の適当な合成の生体適合性の重合体物質、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はポリ酪酸及び／又はこれらの共重合体を含む、本明細書に開示したとおり製造された、実質的に不溶性の物質又は粘稠な溶液を包含する。好ましい担体は例えばマウス肉腫細胞から誘導された細胞外マトリックス組成物を含む。
【００３４】
特に好ましい実施形態においては、重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせは、損傷を受けた経路の距離に沿って伸びる神経ガイダンスチャンネルに配設される。チャンネルは保護用の被覆材、そしてニューライトの成長をガイドするための物理的手段の両方として機能する。有用なチャンネルは修復すべき神経における空隙に沿って伸びるために十分な寸法を有し、そして、切断された神経末端を受容するように適合された開口部を有する構造上は管状であってよい生体適合性の膜を含む。膜はいずれかの生体適合性の非刺激性の物質、例えばシリコーン、又は生体適合性重合体、例えばポリエチレン又はポリエチレン酢酸ビニルから作成してよい。ケーシングもまた生体適合性、生体再吸収性の重合体、例えばコラーゲン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、ポリ酪酸、及びポリグリコール酸を含んでよい。好ましい実施形態においては、チャンネルの外部表面は実質的に非透過性である。
【００３５】
重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせは生体適合性担体物質と会合してチャンネル内に配設してよく、或いは、それは米国特許５，０１１，４８６に記載されるようなケーシングの内部表面に吸着させるか別様に会合させてよいが、ただし、重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせが切断された神経末端に接触可能でなければならない。
【００３６】
本発明の別の特徴においては、本明細書に記載した重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせは神経組織への初期傷害に対する身体の免疫／炎症性応答に関連する損傷に対抗して保護する場合に有用である。そのような応答は例えば自己免疫機能不全、新生物性患部、感染、化学的又は機械的な外傷、疾患により、ニューロン又はグリア細胞への血流の遮断により、又は、神経又は包囲物質への他の外傷により生じた神経組織への外傷に後続する場合がある。例えば、塞栓発作の場合のような神経血液供給の閉鎖に後続する低酸素又は虚血再灌流に起因する一次損傷は免疫学的に関連性があると考えられている。更に又、原発脳腫瘍の多くに関連する損傷の少なくとも一部分も免疫学的に関係していると考えられる。直接、又は全身に重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせを適用することは、神経傷害への免疫学的に関係する応答を軽減及び／又は抑制する。或いは、好ましくは傷害部位において重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせの発現の発現及び／又は分泌を刺激することができる薬剤の投与もまた使用してよい。手術又は他の攻撃的な臨床治療中のような、傷害を誘導したい場合は、重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせ又は薬剤を傷害の誘導の前に提供することにより、危険な神経組織に対して神経保護作用を与えてよい。
【００３７】
一般的に、本発明の方法及び組成物において有用な重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせは１つ以上の真核生物の（例えば哺乳類の）細胞、組織又は臓器の形態発生を誘導する２量体蛋白である。組織形態発生は新規又は再生の組織形成、例えば発生中に脊椎動物の胚においておこるものを包含する。特に有利なものは少なくとも骨又は神経組織において組織特異的な形態発生を誘導する重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせである。上記定義した通り、重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせは、甲状腺受容体をディスプレイする細胞及び組織において、折り畳み時には形態発生応答を誘発する２量体蛋白を形成するポリペプチドの対を含む。即ち、重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせは一般的に、形態発生的に許容性の環境において以下、即ち：先祖細胞の増殖の刺激；先祖細胞の分化の刺激；分化した細胞の増殖の刺激；及び分化した細胞の成長及び維持の支援の全てを包含する事象のカスケードを誘導する。「先祖」細胞とは、そのゲノムレパートリー及び形態発生を誘導する許容性の環境の組織特異性に応じて、分化した細胞の特定の型１つ以上に分化する能力を有する無制約の細胞である。例示される先祖細胞は造血幹細胞、間葉幹細胞、基底上皮細胞、神経堤細胞等である。更に又、重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせは、老化又は静態関連性の、表現型及び／又は組織機能の喪失の発症を遅延又は緩和することができる。更に又、重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせは、分化した細胞型の表現型発現、例えば代謝及び／又は機能、例えばその分泌、特性の発現を刺激することができる。更に又、重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせは適切な条件下で制約された細胞（例えば骨芽細胞、神経芽細胞等）の再分化を誘導することができる。上記した通り、少なくとも骨又は神経組織の増殖及び／又は分化を誘導、及び／又は神経組織の成長、維持及び／又は機能特性を支援する重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせは本発明において特に有利である。
【００３８】
特に有利なものは、哺乳類の特定の組織に提供された場合に組織特異的な形態発生を誘導するか、その組織の分化及び成長の正常な状態を維持する重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせである。好ましい実施形態においては、本発明の重合体甲状腺ホルモン類縁体単独又は神経成長因子又は他の神経発生因子との組み合わせは、脊椎動物（例えばトリ、又は哺乳類）の身体組織、限定しないが例えば、神経、眼、骨、軟骨、骨髄、靭帯、歯牙象牙質、歯周組織、肝臓、腎臓、肺、心臓、又は胃腸内膜の形成を誘導する。好ましい方法は、胚組織を発生させる範囲において、又は、胚後の組織の無機的な非瘢痕性の創傷部位において、実施してよい。
【００３９】
本発明の他の特徴は、神経変性障害、例えばアルツハイマー病の画像化及び診断のための甲状腺ホルモン類縁体及びその重合体の組成物及びその使用方法を包含する。例えば、１つの特徴において、本発明はインビボで対象に対して投与した場合に標的部位に対して高い特異性を有するＴ４類縁体を特徴とする。好ましいＴ４類縁体は、少なくとも４：１の標的の非標的に対する比を示し、インビボで安定であり、そして投与後１時間以内に標的に実質的に局在化する。別の特徴において、本発明はＴ４類縁体に結合させたリンカー、例えばシングルフォトンエミッションを用いたガンマ線画像化（ＳＰＥＣＴ）の場合はテクネチウム、インジウムを含む、そしてＭＲＩ画像化の場合は造影剤を用いた医薬組成物を特徴とする。更に又、ＴＴＲに結合するハロゲン化類縁体はアミロイド原線維の形成を抑制することができ、そしてこのため、アルツハイマー病の防止及び治療のために利用できる。そのような化合物は又、陽電子射出断層撮影（ＰＥＴ）画像化方法とともに使用できる。
【００４０】
別の特徴においては、本発明は、成長因子及び自身の細胞表面受容体がインテグリンαＶβ３の周囲に集積している他のポリペプチド又はアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含有する他の細胞表面受容体の作用をモジュレートするための組成物及び方法を包含する。モジュレートできるポリペプチドは例えばインスリン、インスリン様成長因子、表皮成長因子、及びインターフェロン−γを包含する。
【００４１】
別の特徴においては、本発明は薬品療法に対して耐性である癌細胞の成長を抑制するために有効なテトラック、テトラックナノ粒子、又はそれらの類縁体のある量を、それを要する対象に投与することを含む、その成長抑制の方法を包含する。特定の実施形態においては、療法耐性癌細胞は限定しないが例えば、原発性又は転移性の腫瘍、乳癌、甲状腺癌、神経芽腫、神経膠腫及び多形神経膠芽腫及び他の脳の癌、結腸癌、頭部頚部癌、黒色腫及び皮膚の基底細胞および扁平上皮細胞の癌、肉腫、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、ヘパトーム、肺癌及び胃癌を包含する。１つの実施形態において、薬物療法は限定しないが例えばドキソルビシン、エトポシド、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、シスプラチン、トリコスタチンＡ、パクリタキセル、ゲムシタビン、タキソテール、シスプラチナム（ｃｉｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、カルボプラチナム（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｕｍ）、イリノテカン、トポテカン、アドリアマイシン、ボルテゾミブ及びアトポシド（ａｔｏｐｏｓｉｄｅ）又は上記薬剤の新規誘導体よりなる群から選択される従来及び新規の化学療法剤の投与を含む。
【００４２】
テトラック、テトラックナノ粒子、又はそれらの類縁体のある量を薬物療法に対して耐性である癌細胞の成長を抑制することが必要な対象に投与することを含むそのような抑制の方法のためには、テトラック又はテトラック類縁体は１０〜１０００ｎｍの粒径を有するテトラック粒子複数にコンジュゲートしたナノ粒子を含むナノ粒子コンジュゲートであってよく、その場合、テトラック粒子はテトラック粒子のアルコール部分とナノ粒子コンジュゲーションを架橋するエーテル（−Ｏ−）又はイオウ（−Ｓ−）連結によりナノ粒子に結合している。特定の実施形態においては、テトラック、テトラックナノ粒子、又はそれらの類縁体は、限定しないが例えば、ポリビニルアルコール、アクリル酸エチレン共重合体、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリラクチド、アガロース、ＰＥＯ、ｍ−ＰＥＧ、ＰＶＡ、ＰＬＬＡ、ＰＧＡ、ポリＬ−リジン、ヒト血清アルブミン、セルロース誘導体、カルボメトキシ／エチル／ヒドロキシプロピル、ヒアルロン酸、葉酸塩連結シクロデキストリン／デキストラン、サルコシン／アミノ酸スペースド重合体（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｐａｃｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ）、アルギネート／カラジーナン、ペクチン／キトサン、デキストラン、コラーゲン、ポリアミン、ポリアニリン、ポリアラニン、ポリトリプトファン、及びポリチロシンよりなる群から選択されるメンバーにコンジュゲートされる。
【００４３】
本発明の追加的方法は、癌細胞の化学的感受性を増強するために十分な量においてテトラック、テトラック類縁体又はそのナノ粒子を細胞に投与することによるその化学的感受性を増大させる方法、及び癌細胞の化学的感受性を増強するために有効な量においてテトラック、テトラック類縁体又はそのナノ粒子を腫瘍の存在に苦しむ患者に投与することを含むそのような患者の治療方法を包含する。
【００４４】
本発明の実施形態１つ以上の詳細は以下に記載する随伴の説明において明示されている。本明細書に記載したものと同様又は等価である如何なる方法及び物質も、本発明の実施又は試験において使用することができるが、ここでは好ましい方法及び物質を記載する。本発明の他の特徴、目的及び利点は説明及び請求項から明らかとなるはずである。明細書および添付の請求項においては、単数表記のものは、文脈から別様に解釈すべきであることが明らかでない限り、複数をも言及したものとする。別様に定義されない限り、本明細書において使用する全ての専門技術用語は本出願の属する分野の当業者が一般的に理解する意味と同様とする。本明細書において引用される全ての特許及び公開物は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ニワトリＣＡＭ試験において定量した血管形成に対するＬ−Ｔ４及びＬ−Ｔ３の作用。Ａ、対照試料をＰＢＳに、そして追加的な試料を１ｎＭのＴ３又は０．１μｍｏｌ／ＬのＴ４に３日間曝露した。両方のホルモンとも３実験に由来するこれらの代表的な画像において増大した血管分枝形成をもたらした。Ｂ、各々が９ＣＡＭ試験を包含する３実験から観察された実験期間の既存の血管から形成した新しい分枝の平均±ＳＥＭを作表したものである。示した濃度において、Ｔ３及びＴ４は同様の作用をもたらした（分枝形成においてそれぞれ１．９倍及び２．５倍）。＊＊Ｐ＜０．００１、ホルモン投与試料をＰＢＳ投与ＣＡＭ試料と比較した一元ＡＮＯＶＡによる。
【図２】テトラックはＴ４及びアガロース連結Ｔ４（Ｔ４−ａｇ）による血管形成の促進を抑制する。Ａ、血管分枝形成における２．５倍増大が３日間０．１μｍｏｌ／ＬのＴ４に曝露した代表的ＣＡＭプリパレーションにおいて観察されている。３つの同様の実験において、２．３倍の増大が観察された。ホルモンのこの作用はＴ４の原形質膜作用を抑制することがあらかじめ観察されているＴ４類縁体であるテトラック（０．１μｍｏｌ／Ｌ）により抑制されている。１３テトラック単独では血管形成を刺激していない（Ｃ）。Ｂ、Ｔ４−ａｇ（０．１μｍｏｌ／Ｌ）はテトラックによりやはりブロックされる作用である血管形成の２．３倍（３実験で２．９倍）刺激を示している。Ｃ、ＣＡＭ試験におけるテトラック、Ｔ４−ａｇおよびＴ４の作用を検討する３実験の結果の総括。データ（平均±ＳＥＭ）は３実験の各々における核実験条件に関する１０画像より得た。＊＊Ｐ＜０．００１、Ｔ４投与及びＴ４−アガロース投与試料をＰＢＳ投与ＣＡＭ試料と比較したＡＮＯＶＡによる。
【図３】ＦＧＦ２及びＴ４の前血管形成作用の比較。Ａ、最高未満濃度におけるＴ４（０．０５μｍｏｌ／Ｌ）及びＦＧＦ２（０．５μｍｏｌ／Ｌ）の直列的な作用はＣＡＭ試験においては相加的であり、そしてＦＧＦ２（Ｔ４非存在下１μｇ／ｍｌ）で観察された血管形成のレベルと等しくなっている。Ｂ、Ａと同様のＣＡＭ試験（平均±ＳＥＭ）におけるＦＧＦ２及びＴ４の作用を検討した３実験の総括。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、３実験において投与試料の結果をＰＢＳ投与対照試料のものと比較した場合。
【図４】Ｔ４又は外因性ＦＧＦ２によりもたらされた血管形成に対する抗ＦＧＦ２の作用。Ａ、ＦＧＦ２はＦＧＦ２（８μｇ）に対する抗体（ａｂ）により抑制される作用である、３実験のＣＡＭモデルにおける血管形成の２倍増大をもたらした。Ｔ４はまた血管形成を１．５倍刺激し、そしてこの作用もまたＦＧＦ２抗体によりブロックされており、ＣＡＭモデルにおける甲状腺ホルモンの作用は、Ｔ４及びＴ３がＣＡＭモデルにおいて細胞からのＦＧＦ２の放出を誘導することから、ＦＧＦ２のオートクリン／パラクリン作用により媒介されていることを示している（表１）。本発明者等は以前に非特異的ＩｇＧ抗体がＣＡＭ試験において血管形成に対する作用を有さないことを明らかにしている。Ｂ、ＦＧＦ２又はＴ４の存在下におけるＦＧＦ２−ａｂの作用を試験した３ＣＡＭ実験の結果の総括。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１、血管形成に対する甲状腺ホルモン及びＦＧＦ２の作用及びＦＧＦ２に対する抗体の存在下におけるこれらの作用の喪失を試験した３実験における有意な作用を示している。
【図５】Ｔ４、Ｔ３及びＦＧＦ２により誘導された血管形成に対するＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）シグナルトランスダクションカスケード抑制剤であるＰＤ９８０５９の作用。Ａ、Ｔ４（０．１μｍｏｌ／Ｌ）及びＴ３（１ｎｍｏｌ／Ｌ）により共に刺激された血管形成はＰＤ９８０５９（３μｍｏｌ／Ｌ）により完全に抑制されている。Ｂ、ＦＧＦ２（１μｍｏｌ／Ｌ）により誘導された血管形成も又ＰＤ９８０５９により抑制され、成長因子の作用はやはりＥＲＫ１／２経路の活性化に依存していることを示している。Ｔ４がその前血管形成作用を細胞膜において開始することを示すＴ４−アガロース（Ｔ４−ａｇ）及びテトラックの関与する実験（図２）の範囲においては、Ａ及びＢに示す結果は甲状腺ホルモンの前血管形成作用においてＭＡＰＫにより果たされた２つの役割：即ち、ＥＲＫ１／２はＦＧＦ２の合成をもたらすホルモンの早期のシグナルを伝達し、そして血管形成に対するＦＧＦ２のその後の作用を伝達することと整合性がある。Ｃ、Ａ及びＢにより示された３実験の結果の総括であり、ＣＡＭモデルにおけるＴ４及びＦＧＦ２の作用に対するＰＤ９８０５９の作用を示している。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１、３実験から得られたデータに対すＡＮＯＶＡの結果を示す。
【図６】Ｔ４及びＦＧＦ２はＥＣＶ３０４内皮細胞においてＭＡＰＫを活性化する。細胞を０．２５％ホルモン枯渇血清を含有するＭ１９９培地中で調製し、１５分〜６時間Ｔ４（０．１μｍｏｌ／Ｌ）を投与した。細胞を採取し、核画分を前述の通り調製した。ゲル電気泳動により分離した核蛋白をホスホリル化ＭＡＰＫ（ｐＥＲＫ１及びｐＥＲＫ２、それぞれ４４及び４２ｋＤａ）に対する抗体で、そしてその後、発光検出系に連結させた第２の抗体で免疫ブロットした。核画分のβ−アクチン免疫ブロットをこの図の各々におけるゲルローディングに関する対照として使用している。各免疫ブロットは３実験の代表である。Ａ、Ｔ４はＥＣＶ３０４細胞においてＥＲＫ１／２の増大したホスホリル化及び核転座をもたらしている。作用は３０分以内に最大となっているが、作用は６時間以上残存している。Ｂ、ＥＣＶ３０４細胞にＥＲＫ１／２活性化抑制剤ＰＤ９８０５９（ＰＤ；３０μｍｏｌ／Ｌ）又はＰＫＣ阻害剤ＣＧＰ４１２５１（ＣＧＰ；１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を３０分間投与し、その後、１０−７ＭＴ４を図示する通り細胞試料に１５分間添加した。核を採取したところ、この代表的な実験はＴ４によるＥＲＫ１／２の増大したホスホリル化（活性化）を示しており（レーン４）、これは両方の抑制剤によりブロックされ（レーン５及び６）、ＰＫＣ活性が内皮細胞におけるＴ４によるＭＡＰＫの活性化のために必要であることを示唆している。Ｃ、ＥＣＶ３０４細胞にＴ４（１０−７ｍｏｌ／Ｌ）、ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍＬ）又は両方の薬剤を１５分間投与した。図はホルモン又は成長因子の何れかの投与を行った場合の核におけるｐＥＲＫ１／２の蓄積、及び、両方の薬剤をともに使用した場合の増強された核ｐＥＲＫ１／２蓄積を示している。
【図７】Ｔ４はＥＣＶ３０４内皮細胞におけるＦＧＦ２ｃＤＮＡの蓄積を増大させる。細胞にＴ４（１０−７ｍｏｌ／Ｌ）及びＦＧＦ２を４８時間投与し、そして各細胞の小分量からＧＡＰＤＨｃＤＮＡを単離した。上ブロットに示すＦＧＦ２ｃＤＮＡのレベルを下ブロットに示すＧＡＰＤＨｃＤＮＡ含有量の変動に対して補正し、そしてＦＧＦ２の補正されたレベルをグラフとして以下に示す（平均±ＳＥＭ；ｎ＝２実験）。全ての時点においてＴ４を投与した細胞から得られたＲＮＡ抽出液中のＦＧＦ２の転写物の増大した豊富度が観察された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、対照値に対する各時点における値のＡＮＯＶＡによる比較を示す。
【図８】７日ニワトリ胚腫瘍成長モデル。腫瘍移植物のニワトリの絨毛尿膜（ＣＡＭ）モデルの説明。
【図９】Ｔ４は３Ｄ創傷治癒を刺激する。本明細書に記載する３Ｄ創傷治癒試験に従ったＴ４及び対照に曝露したヒト皮膚線維芽細胞の写真。
【図１０】Ｔ４は第３日の創傷治癒を用量依存的に増大させる。グラフで示す通り、Ｔ４は０．１μＭ〜１．０μＭの濃度において用量依存的に創傷治癒を増大させている（外部遊走細胞により測定）。これと同じ増大は０．１μＭ〜３．０μＭのＴ４の濃度では観察されていない。
【図１１】精製されたインテグリンへのＩ−１２５Ｔ４結合に対する未標識Ｔ４及びＴ３の作用。未標識のＴ４（１０−４Ｍ〜１０−１１Ｍ）又はＴ３（１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ）を精製されたαＶβ３インテグリン（２μｇ／試料）に添加し、室温で３０分間インキュベートした。２マイクロキューリーのＩ−１２５標識Ｔ４を各試料に添加した。試料を室温で２０分間インキュベートし、ローディング染料と混合し、そして４５ｍオングストロームにおいて４℃で２４時間５％のネイティブゲル上を泳動させた。電気泳動の後、ゲルをプラスチックラップで包み、フィルムに曝露した。精製されたαＶβ３へのＩ−１２５Ｔ４結合は１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍの範囲の未標識Ｔ４により影響されなかったが、１０−６Ｍの濃度の未標識Ｔ４により用量依存的に競合排除された。インテグリンへのホットＴ４結合は１０−４Ｍの未標識Ｔ４によりほぼ完全に置き換えられた。Ｔ３はαＶβ３へのＴ４結合を競合排除することにおいてはより低い作用を示し、１０−６Ｍ、１０−５Ｍおよび１０−４Ｍにおいてそれぞれ１１％、１６％及び２８％、シグナルを低減した。
【図１２】テトラック及びＲＧＤ含有ペプチドは精製されたαＶβ３に対するＴ４の結合を競合排除するがＲＧＥ含有ペプチドは排除しない。Ａ）精製されたαＶβ３へのテトラックの添加は用量依存的にインテグリンへのＩ−１２５標識Ｔ４結合を低減している。１０−８ＭのテトラックはインテグリンへのホットＴ４結合を競合排除することにおいては無効である。Ｔ４とαＶβ３の会合は１０−７Ｍテトラックの存在下で３８％、そして１０−５Ｍテトラックの存在下で９０％低減した。１０−５ＭにおけるＲＧＤペプチドの添加はαＶβ３へのＴ４の結合を競合排除している。ＲＧＤペプチドの対照としてＲＧＥペプチドを１０−５Ｍ及び１０−４Ｍで適用したところ、精製されたαＶβ３へのＴ４の結合を減衰させることはできなかった。Ｂ）パネルＡのテトラック及びＲＧＤデータのグラフ表示。データポイントは３つの独立した実験に関する平均±ＳＤとして示す。
【図１３】αＶβ３へのＴ４の結合に対するモノクローナル抗体ＬＭ６０９の作用。Ａ）ＬＭ６０９を指定された濃度においてαＶβ３に添加した。試料当たり１μｇのＬＭ６０９はインテグリンへのＩ−１２５標識Ｔ４の結合を５２％低減した。インテグリンへのＴ４の結合の最大抑制はＬＭ６０９の濃度が試料当たり２μｇである場合に到達され、そして８μｇもの高値の抗体濃度で維持された。抗体特異性の対照として、１０μｇ／試料のＣｏｘ−２ｍＡＢ及び１０μｇ／試料のマウスＩｇＧをαＶβ３に添加した後にＴ４とともにインキュベートした。Ｂ）パネルＡのデータのグラフ表示。データポイントは３つの独立した実験に関する平均±ＳＤとして示す。
【図１４】Ｔ４誘導ＭＡＰＫ活性化に対するＲＧＤ、ＲＧＥ、テトラック、及びｍＡＢＬＭ６０９の作用。Ａ）ＣＶ−１細胞（５０〜７０％コンフルエント）に１０−７ＭのＴ４を３０分間投与した（１０−７Ｍ総濃度、１０−１０Ｍ遊離濃度）。選択された試料にＲＧＤ含有ペプチド、ＲＧＥ含有ペプチド、テトラック、又はＬＭ６０９の何れかを指定濃度において１６時間投与した後にＴ４を添加した。核蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そして抗ホスホＭＡＰＫ（ｐＥＲＫ１／２）抗体を用いて免疫ブロッティングした。ｐＥＲＫ１／２の核蓄積は１０−６ＭＲＧＤペプチド以上を投与した試料では減衰しているが、１０−４ＭＲＧＥを投与した試料では有意に変化していない。ｐＥＲＫ１／２の蓄積は１０−６Ｍのテトラックを投与したＣＶ１細胞では７６％低下しているのに対し、１０−５Ｍ以上の濃度のテトラックは未投与対照試料と同様のレベルまでｐＥＲＫ１／２の核蓄積を低減している。αＶβ３ＬＭ６０９に対するモノクローナル抗体は１μｇ／ｍｌの濃度でＣＶ１培養物に適用した場合には核中の活性化されたＭＡＰＫの蓄積を低下させている。Ｂ）パネルＡに示したＲＧＤ、ＲＧＥ、及びテトラックに関するデータのグラフ表示。データポイントは３つの別個の実験に関する平均±ＳＤとして示す。
【図１５】Ｔ４誘導ＭＡＰＫ活性化に対するαＶ及びβ３へのｓｉＲＮＡの作用。ＣＶ１細胞をαＶ、β３、又はαＶとβ３両方へのｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ終濃度）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞に１０−７ＭのＴ４を投与した。Ａ）各ｓｉＲＮＡの特異性及び機能を確認するために各トランスフェクション群から単離したＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲを実施した。Ｂ）各トランスフェクションから得られた核蛋白を単離し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。
【図１６−１】ＣＡＭモデルにおけるＴ４刺激血管形成に対するαＶβ３ｍＡＢ（ＬＭ６０９）の抑制作用。Ａ）試料を３日間ＰＢＳ、Ｔ４（０．１μＭ）、又はＴ４＋１０ｍｇ／ｍＬＬＭ６０９に曝露した。Ｔ４により刺激された血管形成はαＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９の添加により実質的に抑制されている。Ｂ）実験期間に既存の血管から形成された新しい分枝の平均±ＳＥＭの表。データは、各々の投与群に９試料を各々含有する、３つの別個の実験から得た。Ｃ、Ｄ）Ｔ４又はＦＧＦ２により刺激された血管形成は又、αＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９又はＸＴ１９９の添加によっても抑制されている。
【図１６−２】ＣＡＭモデルにおけるＴ４刺激血管形成に対するαＶβ３ｍＡＢ（ＬＭ６０９）の抑制作用。Ａ）試料を３日間ＰＢＳ、Ｔ４（０．１μＭ）、又はＴ４＋１０ｍｇ／ｍＬＬＭ６０９に曝露した。Ｔ４により刺激された血管形成はαＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９の添加により実質的に抑制されている。Ｂ）実験期間に既存の血管から形成された新しい分枝の平均±ＳＥＭの表。データは、各々の投与群に９試料を各々含有する、３つの別個の実験から得た。Ｃ、Ｄ）Ｔ４又はＦＧＦ２により刺激された血管形成は又、αＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９又はＸＴ１９９の添加によっても抑制されている。
【図１６−３】ＣＡＭモデルにおけるＴ４刺激血管形成に対するαＶβ３ｍＡＢ（ＬＭ６０９）の抑制作用。Ａ）試料を３日間ＰＢＳ、Ｔ４（０．１μＭ）、又はＴ４＋１０ｍｇ／ｍＬＬＭ６０９に曝露した。Ｔ４により刺激された血管形成はαＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９の添加により実質的に抑制されている。Ｂ）実験期間に既存の血管から形成された新しい分枝の平均±ＳＥＭの表。データは、各々の投与群に９試料を各々含有する、３つの別個の実験から得た。Ｃ、Ｄ）Ｔ４又はＦＧＦ２により刺激された血管形成は又、αＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９又はＸＴ１９９の添加によっても抑制されている。
【図１７】甲状腺ホルモン類縁体の重合体組成物−ポリビニルアルコールを用いたエステル連結を介した重合体コンジュゲーション。本調製品においては、市販のポリビニルアルコール（又は関連の共重合体）を甲状腺ホルモン類縁体の酸クロリド、即ち酸クロリド型で処理することによりエステル化することができる。トリエチルアミンを添加して塩酸塩を中和することにより得られる塩酸トリエチルアミンは異なる類縁体に対する甲状腺ホルモンエステル重合体型の析出時に水で洗浄除去することができる。重合体へのエステル連結はインビボで加水分解を起こし、これにより活性な前血管形成甲状腺ホルモン類縁体を放出する。
【図１８】甲状腺ホルモン類縁体の重合体組成物−アクリル酸エチレン共重合体を用いた無水物連結を介した重合体コンジュゲーション。これは前の重合体共有結合コンジュゲーションと同様であるが、ただし、今回のそれはアクリル酸共重合体の反応から誘導される無水物連結を介している。この無水物連結もまたインビボの加水分解に感受性であり、甲状腺ホルモン類縁体を放出する。塩酸の中和はトリエチルアミンによる処理により達成され、そしてその後水を用いた析出ポリ無水物重合体の洗浄により、塩酸トリエチルアミン副生成物を除去する。この反応は甲状腺ホルモン類縁体アクリル酸共重合体＋トリエチルアミンの形成をもたらすことになる。インビボの加水分解時に、甲状腺ホルモン類縁体は、制御することができる時間に渡って放出されることなり、アクリル酸エチレン共重合体も伴う。
【図１９】甲状腺ホルモン類縁体の重合体組成物−ポリ乳酸重合体内への捕獲。ポリ乳酸ポリエステル重合体（ＰＬＡ）はインビボで加水分解を起こして乳酸単量体となり、そしてこれがヒトにおける薬物送達系のためのベヒクルとして利用されている。甲状腺ホルモン類縁体が重合体に化学結合により連結される以前の２つの共有結合方法とは異なり、これはＰＬＡ重合体ビーズ内に甲状腺ホルモン類縁体をカプセル化することになる非共有結合的な方法となる。この反応は水中で甲状腺ホルモン類縁体含有ＰＬＡビーズの形成をもたらすことになる。濾過及び洗浄により甲状腺ホルモン類縁体含有ＰＬＡビーズの形成が起こり、これはインビボの加水分解時に甲状腺ホルモン＋乳酸の制御可能なレベルの生成をもたらすことになる。
【図２０−１】種々の重合体とのコンジュゲーションが可能な甲状腺ホルモン類縁体。Ａ〜Ｄは本発明の甲状腺ホルモン類縁体の重合体形態を形成するためにコンジュゲートすることができる種々の甲状腺ホルモン類縁体を達成するために必要な置換を示す。
【図２０−２】種々の重合体とのコンジュゲーションが可能な甲状腺ホルモン類縁体。Ａ〜Ｄは本発明の甲状腺ホルモン類縁体の重合体形態を形成するためにコンジュゲートすることができる種々の甲状腺ホルモン類縁体を達成するために必要な置換を示す。
【図２１】インビトロの３Ｄ血管形成試験。図２１はフィブリンコーティングビーズ上のヒト微小血管内皮に関する３次元のインビトロの新芽形成試験のプロトコル及び説明である。
【図２２】３ＤフィブリンにおけるＨＯＭＥＣのインビトロ新芽形成血管形成。図２２は異なる倍率下の３次元のヒト微小血管内皮細胞新芽形成の説明である。
【図２３Ａ】低レベルコラーゲン存在下の血小板誘導創傷治癒因子の放出。
【図２３Ｂ】低レベルコラーゲン存在下の血小板誘導創傷治癒因子の放出。
【図２３Ｃ】低レベルコラーゲン存在下の血小板誘導創傷治癒因子の放出。
【図２３Ｄ】低レベルコラーゲン存在下の血小板誘導創傷治癒因子の放出。
【図２３Ｅ】低レベルコラーゲン存在下の血小板誘導創傷治癒因子の放出。
【図２４】未標識Ｔ４及びＴ３は精製されたインテグリンから［１２５Ｉ］−Ｔ４を置き換える。未標識Ｔ４（１０−１１Ｍ〜１０−４Ｍ）又はＴ３（１０−８Ｍ〜１０−４Ｍ）を精製されたαＶβ３インテグリン（２μｇ／試料）に添加した後に［１２５Ｉ］−Ｔ４を添加する。（ａ）精製されたαＶβ３への［１２５Ｉ］−Ｔ４の結合は１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍの範囲の未標識Ｔ４により影響されなかったが、１０−６Ｍ以上の濃度では未標識Ｔ４により濃度依存的に置き換えられた。αＶβ３へのＴ４の結合を置き換えることにおいてはＴ３の有効性は低値であった。（ｂ）Ｔ４及びＴ３のデータのグラフ表示により３つの独立した実験の平均±ＳＤを示す。
【図２５】テトラック及びＲＧＤ含有ペプチドは精製されたαＶβ３へのＴ４の結合を置き換えるが、ＲＧＥ含有ペプチドは置き換えない。（ａ）テトラック又はＲＧＤ含有ペプチドとともに精製されたαＶβ３を予備インキュベートしたところ、用量依存的な態様においてインテグリンと［１２５Ｉ］−Ｔ４との間の相互作用を低減した。ＲＧＤペプチドの対照としてＲＧＥペプチドを１０−５Ｍ及び１０−４Ｍで適用したところ、精製されたαＶβ３へのＴ４の結合を減衰させなかった。（ｂ）テトラック及びＲＧＤのデータのグラフ表示により３つの独立した実験の結果の平均±ＳＤを示す。
【図２６】インテグリン抗体はαＶβ３へのＴ４の結合を抑制する。抗体ＬＭ６０９及びＳＣ７３１２を指定濃度（μｇ／ｍｌ）においてαＶβ３に添加し、その３０分後に［１２５Ｉ］−Ｔ４を添加した。インテグリンへのＴ４の結合の最大抑制はＬＭ６０９濃度が２μｇ／ｍｌとなった時点に到達され、そして８μｇ／ｍｌもの高値の抗体濃度において維持された。ＳＣ７３１２は２μｇ／ｍｌの抗体／試料において４６％まで、そして８μｇ／ｍｌの抗体が存在していた場合には５８％まで、αＶβ３へのＴ４の結合を低減した。抗体特異性に関する対照として、１０μｇ／ｍｌの抗αＶβ３ｍＡｂ（ＰＩＦ６）及び１０μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧをαＶβ３に添加した後にＴ４と共にインキュベートした。グラフは３つの独立した実験のデータの平均±ＳＤを示す。
【図２７】Ｔ４誘導ＭＡＰＫ活性化に対するＲＧＤおよびＲＧＥペプチド、テトラック、及びｍＡｂＬＭ６０９の作用。（ａ）ｐＥＲＫ１／２の核蓄積は１０−６ＭＲＧＤペプチド以上を投与した試料で減衰したが、１０−４ＭＲＧＤまでを投与した試料では有意に改変されなかった。１０−５Ｍのテトラック及びＴ４を投与したＣＶ−１細胞におけるｐＥＲＫ１／２蓄積は未投与の対照試料において観察されたレベルと同様であった。αＶβ３へのモノクローナル抗体であるＬＭ６０９はそれを１μｇ／ｍｌの濃度でＣＶ−１培養物に適用した場合に核における活性化ＭＡＰＫの蓄積を低下させた。（ｂ）グラフは３つの別個の実験のデータの平均±ＳＤを示す。α−チューブリン抗体による免疫ブロットをゲルローディング対照として使用している。
【図２８】Ｔ４誘導ＭＡＰＫ活性化に対するαＶ及びβ３に対するｓｉＲＮＡの作用。ＣＶ−１細胞をαＶ、β３、又はαＶとβ３両方へのｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ最終濃度）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞に１０−７ＭのＴ４又はベヒクル対照を３０分間投与した。（ａ）各ｓｉＲＮＡの特異性及び機能を確認するために各トランスフェクション群から単離したＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲを実施した。（ｂ）トランスフェクトされた細胞の各セットから得られた核蛋白を単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、そしてＴ４の投与の存在下又は非存在下においてｐＥＲＫ１／２でプローブした。親細胞において、そしてスクランブルされたｓｉＲＮＡを投与したものにおいて、Ｔ４を用いた場合のｐＥＲＫ１／２の核蓄積が顕在化した。αＶ又はβ３に対するｓｉＲＮＡを投与した細胞はＴ４の非存在下のｐＥＲＫ１／２の増大およびＴ４投与による低下を示した。αＶ及びβ３ｓｉＲＮＡを含有する細胞はＴ４投与に応答しなかった。
【図２９】ＣＡＭモデルにおけるＴ４刺激血管形成に対するαＶβ３ｍＡｂ（ＬＭ６０９）の抑制作用。ＣＡＭを３日間ＰＢＳ、Ｔ４（１０−７Ｍ）又はＴ４＋１０μｇ／ｍｌＬＭ６０９で処理したフィルターディスクに曝露した。（ａ）Ｔ４により刺激された血管形成はαＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９の添加により実質的に抑制された。（ｂ）実験期間中の既存の血管から形成された新しい分枝の平均±ＳＥＭの表を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、投与群当たり９画像を各々が含有する３つの別個の実験において、Ｔ４／ＬＭ６０９投与試料の結果をＴ４投与試料と比較した。統計学的分析は一元ＡＮＯＶＡにより実施した。
【図３０Ａ】ＰＶＡをコーティングしたテトラックドーピングＰＬＧＡナノ粒子を合成し、そして特性化した。数セットのナノ粒子をテトラックの最適ローディングに関して検査した。更に又、ボイド及びテトラックドーピングのナノ粒子の粒径及びゼータ電位を検査した。テトラックドーピングとボイドのナノ粒子にＴｗｅｅｎ−８０をコーティングしたものとの間には粒径及びゼータ電位に有意差はなかった。ナノ粒子の平均の粒径はテトラックドーピングナノ粒子の場合には僅かに増大（ボイド〜１９３ｎｍ）した。ＨＰＬＣによりナノ粒子内部のテトラックの量を測定した。テトラックの濃度は５４０ｕｇ／ｍｌナノ粒子であることがわかった。（ａ）ゼータ電位。（ｂ）ＤＬＳによる粒径の測定。
【図３０Ｂ−１】ＰＶＡをコーティングしたテトラックドーピングＰＬＧＡナノ粒子を合成し、そして特性化した。数セットのナノ粒子をテトラックの最適ローディングに関して検査した。更に又、ボイド及びテトラックドーピングのナノ粒子の粒径及びゼータ電位を検査した。テトラックドーピングとボイドのナノ粒子にＴｗｅｅｎ−８０をコーティングしたものとの間には粒径及びゼータ電位に有意差はなかった。ナノ粒子の平均の粒径はテトラックドーピングナノ粒子の場合には僅かに増大（ボイド〜１９３ｎｍ）した。ＨＰＬＣによりナノ粒子内部のテトラックの量を測定した。テトラックの濃度は５４０ｕｇ／ｍｌナノ粒子であることがわかった。（ａ）ゼータ電位。（ｂ）ＤＬＳによる粒径の測定。
【図３０Ｂ−２】ＰＶＡをコーティングしたテトラックドーピングＰＬＧＡナノ粒子を合成し、そして特性化した。数セットのナノ粒子をテトラックの最適ローディングに関して検査した。更に又、ボイド及びテトラックドーピングのナノ粒子の粒径及びゼータ電位を検査した。テトラックドーピングとボイドのナノ粒子にＴｗｅｅｎ−８０をコーティングしたものとの間には粒径及びゼータ電位に有意差はなかった。ナノ粒子の平均の粒径はテトラックドーピングナノ粒子の場合には僅かに増大（ボイド〜１９３ｎｍ）した。ＨＰＬＣによりナノ粒子内部のテトラックの量を測定した。テトラックの濃度は５４０ｕｇ／ｍｌナノ粒子であることがわかった。（ａ）ゼータ電位。（ｂ）ＤＬＳによる粒径の測定。
【図３１】ＰＬＧＡ／ＰＶＡ−テトラックナノ粒子。Ｔｗｅｅｎ−８０をコーティングしたＰＬＧＡナノ粒子を安定化剤としてポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を用いながら単分散エマルジョン法により製造した。ナノ粒子の粒径は動的光散乱を用いて測定した。ナノ粒子内にカプセル化されたテトラックの量はＨＰＬＣを用いて測定した。（ａ）強度による粒径の統計値の報告。（ｂ）ゼータ電位の報告。
【図３２】本発明の範囲に包含されるテトラックナノ粒子の説明を以下に示す。
【図３３】（ａ）安定剤を使用しない場合のテトラックをカプセル化したＰＬＧＡナノ粒子の粒径分布スペクトル。（ｂ）１％ＰＶＡ溶液を安定剤として使用した場合のテトラックをカプセル化しているＰＬＧＡナノ粒子の粒径分布スペクトル。
【図３４】ＣＡＭモデルにおけるテトラック及びテトラックＰＬＧＡナノ粒子の抗血管形成を示す棒グラフである。
【図３５】テトラックとテモゾロミドを同時カプセル化しているＰＬＧＡナノ粒子の製造に関する模式的ダイアグラムである。
【図３６Ａ】（ａ）油中水エマルジョン法を用いることによりコラーゲンヒドロキシアパタイトナノ球を製造することができ、そして次にカルボジイミド化学を用いることによりナノ粒子をＴ４にコンジュゲートさせる方法を示す説明図である。（ｂ）ダブルエマルジョン法を用いることによるＰＬＧＡナノ粒子中へのＴ４及びその類縁体のカプセル化に関する多大な潜在性も存在する。予備的な放出動態の実験に関しても、生体分解性のナノ粒子はカプセル化物質を放出することができる。
【図３６Ｂ】（ａ）油中水エマルジョン法を用いることによりコラーゲンヒドロキシアパタイトナノ球を製造することができ、そして次にカルボジイミド化学を用いることによりナノ粒子をＴ４にコンジュゲートさせる方法を示す説明図である。（ｂ）ダブルエマルジョン法を用いることによるＰＬＧＡナノ粒子中へのＴ４及びその類縁体のカプセル化に関する多大な潜在性も存在する。予備的な放出動態の実験に関しても、生体分解性のナノ粒子はカプセル化物質を放出することができる。
【図３７Ａ】Ｃ１８カラム上で溶離させたＴ４コラーゲンナノ粒子試料のクロマトグラム及びスペクトルであり、ＤＷＬ：２２５ｎｍである。（ａ）水で希釈したＴ４標準液５０μＭ。（ｂ）水で希釈し、次に３００ＫＤの膜で濾過したＴ４コラーゲンナノ粒子。
【図３７Ｂ】Ｃ１８カラム上で溶離させたＴ４コラーゲンナノ粒子試料のクロマトグラム及びスペクトルであり、ＤＷＬ：２２５ｎｍである。（ａ）水で希釈したＴ４標準液５０μＭ。（ｂ）水で希釈し、次に３００ＫＤの膜で濾過したＴ４コラーゲンナノ粒子。
【図３８Ａ】Ｃ１８カラム上で溶離させたＴ４コラーゲンナノ粒子試料のクロマトグラム及びスペクトルであり、ＤＷＬ：２２５ｎｍである。（ａ）０．５ＭＮａＯＨで希釈したＴ４標準液５０μＭ。（ｂ）０．５ＭＮａＯＨとともに２時間インキュベートし、次に３００ＫＤの膜で濾過したＴ４コラーゲンナノ粒子。
【図３８Ｂ】Ｃ１８カラム上で溶離させたＴ４コラーゲンナノ粒子試料のクロマトグラム及びスペクトルであり、ＤＷＬ：２２５ｎｍである。（ａ）０．５ＭＮａＯＨで希釈したＴ４標準液５０μＭ。（ｂ）０．５ＭＮａＯＨとともに２時間インキュベートし、次に３００ＫＤの膜で濾過したＴ４コラーゲンナノ粒子。
【図３９】ＧＣ−１をカプセル化したＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子の模式図である。
【図４０】Ｔ３をカプセル化したＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子の模式図である。
【図４１】テトラックをコンジュゲートしたＰＬＧＡナノ粒子の大バッチの合成の結果を示す。（ａ）強度による粒径分布を示す。（ｂ）１計測により統計値のグラフを示す。
【図４２】ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ及びＴ３生理学的濃度の適用によりＣＡＭ試験において血管形成が刺激されたことを示す。ＣＡＭフィルターディスク上に置いたＦＧＦ２（１μｇ／ｍｌ）はＰＢＳ投与膜と比較して２．４倍まで血管分枝形成を誘導した（ｐ＜０．００１）。テトラックの添加（７５ｎｇ／フィルターディスク）はＦＧＦ２に対する前血管形成応答を抑制したのに対し、テトラック単独では血管形成に対する作用を有していなかった。
【図４３】ＦＧＦ２刺激血管形成の最大抑制を発見するために実施したテトラック用量応答曲線を示す線グラフである。
【図４４】テトラックはＶＥＧＦ及びＴ３の前血管形成作用をそれぞれ５２％及び６６％まで同様に抑制することを示す棒グラフである。
【図４５】２４時間マトリゲル上で培養し、そしてテトラック漸増量の存在下又は非存在下においてＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）で刺激したＨＭＶＥＣ−ｄ細胞の結果を示す線グラフである。テトラックは接合部の数および管の数における低減、及び、総管長における低下により明らかな通りＶＥＧＦにより誘導された管形成を抑制している。
【図４６】ＶＥＧＦにより誘導された管形成を抑制するテトラックの作用を示す写真である。
【図４７】インテグリンαＶ及びβ３、及びアンジオポエチン−２のｍＲＮＡ発現がテトラックにより低下したことを示すグラフである。ＨＭＶＥＣ−ｄ細胞をマトリゲル上に成長させ、２時間テトラックの存在下及び非存在下にＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）により刺激した。メッセンジャーＲＮＡを単離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲをインテグリンαＶ及びインテグリンβ３に関して実施した。
【図４８】アンジオポエチン−１及びアンジオポエチン−２に関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施し、そしてテトラックは用量応答的にアンジオポエチン−２のｍＲＮＡ発現を抑制し、そしてアンジオポエチン−１のｍＲＮＡレベルには影響しなかったことを示す棒グラフである。
【図４９】Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘより入手したＨｕｍａｎＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０アレイを用いながら実施したマイクロアレイ分析を示す棒グラフである。ＨＤＭＥＣ細胞をテトラック（３μＭ）の存在下及び非存在下に２４時間５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦとともにインキュベートした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘジーンチップ分析の結果によれば、３種の異なるアンジオポエチン様転写物はＨＭＶＥＣ−ｄ細胞中で示差的に発現され、血管形成の刺激に必要な標的遺伝子の発現をテトラックが抑制できることを示唆している。
【図５０】甲状腺ホルモンに対する原形質膜受容体に指向させた小分子テトラックが強力な抗血管形成活性を有することを示す棒グラフである。テトラックは甲状腺ホルモンの細胞表面開始作用の拮抗剤であるが、甲状腺ホルモンの非存在下のテトラックは今回、ニワトリ及びヒトの内皮細胞試験においてＶＥＧＦ及びＦＧＦ２の血管形成活性を抑制することが示されている。
【図５１】Ｔ４コンジュゲートＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子を製造する方法を示す模式図である。
【図５２】ＰＲＩＡＢ１、ＰＲＩＡＢ４及びＰＲＩＡＢ５の試験結果を示す写真であり、そして、保護されたＴ４類縁体及び最も嵩高な保護基による明確な前血管形成作用をもたらすコンジュゲーション前の及びニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）試験は最も小さい活性を示していた。
【図５３−１】薬品感受性ｖｓ薬品耐性の癌細胞の増殖に対するテトラックの作用。薬品感受性及び耐性のＳＫＮ−ＳＨ、ＳａＯＳ２、及びＭＣＦ７細胞を４日間の期間に渡り、テトラックの漸増濃度による投与に付した。次に細胞の生存性をＭＴＴ試験により計測した。データは４測定の平均±ＳＥを示す。
【図５３−２】薬品感受性ｖｓ薬品耐性の癌細胞の増殖に対するテトラックの作用。薬品感受性及び耐性のＳＫＮ−ＳＨ、ＳａＯＳ２、及びＭＣＦ７細胞を４日間の期間に渡り、テトラックの漸増濃度による投与に付した。次に細胞の生存性をＭＴＴ試験により計測した。データは４測定の平均±ＳＥを示す。
【図５４】テトラックによる薬剤耐性の逆行。ドキソルビシン耐性ＳＫＮ−ＳＨ／Ｒ、ＭＣＦ７／Ｒ及びＳａＯＳ２／Ｒ細胞をテトラックの単独又は指定濃度のドキソルビシン（Ｄｏｘ）、エトポシド（Ｅｔｏｐ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐ）、又はトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）組み合わせた投与に付した。４日後、細胞の生存性をＭＴＴ試験により測定し、データを３測定の平均±ＳＥとして示した。
【図５５】古典的な薬品耐性遺伝子の発現に対する、そして、薬品輸送に対するテトラックの作用。パネルＡ。野生型（Ｗ）の薬品感受性及び耐性（Ｒ）のＭＣＦ７細胞におけるＰ−ｇｐ、ＧＳＴ及びＳＯＤの発現を示すウエスタンブロット。パネルＢ。ＭＣＦ７／Ｒ細胞におけるこれらの遺伝子の発現に対するテトラック及びドキソルビシン（Ｄｏｘ）の作用。細胞に各薬品単独又は両方の組み合わせを２４時間投与し、その後、薬品耐性分子の発現を特異的抗体を用いたウエスタンブロットにより測定した。パネルＣ。薬品感受性ＭＣＦ７及び耐性ＭＣＦ７／Ｒ細胞における放射標識ドキソルビシン（［１４Ｃ］Ｄｏｘ）の細胞内蓄積に対するテトラックの作用。細胞はテトラックの非存在下又は存在下にドキソルビシンと共に２４時間インキュベートし、その後、洗浄し、次に可溶化した。細胞溶解物に会合している放射能を計数し、そしてテトラック投与又は未投与の何れかの２つの細胞系統の間で比較した。データは３測定の平均±ＳＥを示す。
【図５６】テトラックは薬品耐性癌細胞に強制的に老化及びアポトーシスを起こさせる。パネルＡ。ＳＫＮ−ＳＨ／Ｒ細胞を２４時間、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）単独、テトラック単独、又は両方の組み合わせによる投与に付した。ｐ２１／ＷＡＦ１、切断カスパーゼ−３（Ｃｌ−Ｃａｓｐ−３）及びベータアクチンの発現を特異的抗体を用いながらウエスタンブロットにより計測した。パネルＢ。細胞を２４穴プレートに播種し、上記した通り投与し、そして老化関連ベータガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）の発現を方法のセクションに記載した通り試験した。パネルＣ。細胞をカバーガラス上に播種し、そして２４時間上記した薬品を投与し、その後、固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔで染色し、そして陽性細胞のパーセントをグラフ化した。データは３測定の平均±ＳＥを示す。
【図５７】ヌードマウスにおけるドキソルビシン耐性腫瘍の成長に対するテトラックの作用。マウスにドキソルビシン耐性ＭＣＦ７／Ｒ細胞（１０６）を注射し、そして１０日後、それらを各７匹の群に割り付け、そしてドキソルビシン（２ｍｇ／ｋｇ）又はテトラック（３０ｍｇ／ｋｇ）の何れかの単独又は組み合わせを用いて誘発刺激した。腫瘍体積を３週間に至るまで３日毎に計測した。
【図５８】ＴＥＧを用いたヒト血液における凝固力学に対するＴ４又はＴ３（１００ｎＭ）の作用。
【図５９】ＣＡＭモデルにおけるＴ４媒介血管形成に対するテトラックｖｓテトラックナノ粒子の抗血管形成薬効。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本明細書に記載するものは「チロ−インテグリン分子」と称される細胞表面上で作用する甲状腺ホルモン分子の新しいクラスである。これらの分子は細胞表面上の受容体を選択的に活性化する。甲状腺ホルモンは前血管形成性であり、有糸分裂促進物質活性化蛋白キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ１／２）及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）依存性である機序を介して作用する。
【００４７】
腫瘍細胞に対するホルモンの作用はインテグリンαＶβ３上の新しい細胞表面受容体により媒介される。細胞の原形質膜に局在するこの受容体により甲状腺ホルモンが作用するという本発明者等の最近の発見は、重合体コンジュゲート甲状腺ホルモン類縁体及びナノ粒子甲状腺ホルモン類縁体が細胞に進入可能となることなく、細胞表面受容体に結合できるという発見をもたらした。
【００４８】
本発明の範囲内に属するものは、ナノ粒子甲状腺ホルモン類縁体及びその重合体コンジュゲートであり、それらは細胞の内部への接触性を獲得することはできず、そしてその活性は従ってインテグリン受容体に限定されるはずである。ナノ粒子ホルモン類縁体はポリリジルグリコール酸（ＰＬＧＡ）誘導体、エステル又はより安定なエーテル結合製剤である。アガロース−Ｔ４はインテグリン受容体において完全に活性であることを本発明者等が明らかにしているナノ粒子のモデルである。再製剤化されたホルモン類縁体はホルモンの細胞内作用を発現することはなく、そしてこのため、循環系中に吸収されても全身性の甲状腺ホルモンの作用を有することはない。
【００４９】
即ち本発明の分子は受容体を選択的に活性化できる。この受容体が活性化されれば、蛋白メディエーターの変化のカスケードが起こり、最終的には核トランスアクチベーター蛋白、例えばＳＴＡＴ蛋白、ｐ５３及び核ホルモン受容体のスーパーファミリーのメンバーの活性を変更することができるシグナルが生じる。
【００５０】
甲状腺ホルモンの非ゲノム的な作用は核Ｔ３受容体（ＴＲ）によるホルモンの核内結合とは独立したものである。これらの作用は細胞表面において大半が開始される。合成重合体に既知の甲状腺ホルモン類縁体をコンジュゲートすることにより、細胞表面受容体において排他的に作用するが、内因性のホルモンに対しては引き続き細胞内に進入してミトコンドリア上で、又は直接核ＴＲ上で作用することを可能とするホルモンの新しいファミリーが創生される。コンジュゲートされるホルモン類縁体に応じて、血管形成又は創傷治癒を支援することができるか、又は、腫瘍細胞の成長及び血管形成に対する作用に拮抗することができる。
【００５１】
以下に詳述するものは、本発明の範囲に属する甲状腺ホルモン重合体コンジュゲート及びナノ粒子の製剤及び使用である。
【００５２】
定義
簡便のために、明細書、実施例及び請求項において使用する特定の用語をここで収集する。別様に定義されない限り、本明細書において使用する全ての専門技術用語は本発明の関わる分野の当業者が一般的に理解する意味と同様とする。
【００５３】
本明細書においては、「血管形成剤」という用語は、単独又は他の物質と組み合わせられて血管形成を促進又は強化する何れかの化合物又は物質を包含する。例としては、限定しないが、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ３又はＴ４−アガロース、Ｔ３、Ｔ４の重合体類縁体、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、又はＤＩＴＰＡを包含する。これとは反対に、「抗血管形成剤」又は「抗血管形成性薬剤」という用語は、単独又は他の物質と組み合わせられて血管形成を抑制又は弱化させる何れかの化合物又は物質を包含する。例としては、限定しないが、ＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣ、ＸＴ１９９、及びｍＡｂＬＭ６０９を包含する。
【００５４】
本明細書においては、「心筋虚血」という用語は心臓の血管の低下した容量によりもたらされる心臓の筋肉への不十分な血液供給として定義される。本明細書においては、「冠動脈疾患」という用語は、正常な機能のために十分な血流を供給するための心筋の機能と冠動脈の容量との間の不均衡に起因する心臓機能の疾患／障害として定義される。本明細書に記載する組成物及び方法により治療することができる冠動脈疾患に関連する特定の冠動脈の疾患／障害は、心筋虚血、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈血栓、冠動脈血管痙攣、冠動脈疾患、冠動脈心臓疾患、冠動脈閉塞、及び冠動脈狭窄を包含する。
【００５５】
本明細書においては、「閉塞性末梢血管疾患」（末梢動脈閉塞性障害としても知られている）という用語は、腸骨動脈を包含する頸動脈又は大腿動脈における血管障害の関与する遮断である。大腿動脈における遮断は疼痛及び制限された運動をもたらす。閉塞性末梢血管疾患に関連する特定の障害は糖尿病性脚部であり、これは糖尿病患者に起こり、脚部切断をもたらす場合が多い。
【００５６】
本明細書においては、「血管の再生」、「血管形成」、「再脈管形成」、及び「増大した側副循環」（又はそのような作用に対する単語）という用語は、同義とみなされる。天然及び合成の物質に言及する場合の「製薬上許容しうる」という用語は、物質がそのはるかにより大きい有利な作用を鑑みれば許容できる毒性作用を有することを意味し、一方、関連する用語である「生理学的に許容される」とは物質が相対的に低い毒性を有することを意味する。「同時投与された」という用語は２種以上の薬品がある患者に対し、概ね同時に、或いは接近して逐次的に与えられることにより、それらの作用が概ね共存するか、又は実質的に重複して生じるようにすることを意味する。この用語は逐次的、並びに同時の薬品投与を包含する。
【００５７】
「製薬上許容しうる塩」とは、甲状腺ホルモン類縁体、重合体型、及び誘導体の製薬上許容しうる塩を指し、それらの塩は当該分野で良く知られている種々の有機及び無機の対イオンから誘導され、そして、単に例示すれば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム等を包含し；そして分子が塩基性の官能基を含有する場合は、有機又は無機の酸の塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシレート、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩等を製薬上許容しうる塩として使用できる。用語は又、酸及び塩基の付加塩も包含する。
【００５８】
「製薬上許容しうる酸付加塩」とは、生物学的又は別様に望ましくないものではなく、そして、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等のような無機の酸、及び酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等のような有機の酸から形成される、遊離の塩基の生物学的有効性及び特性を保持している塩を指す。本発明の化合物の特に好ましい塩は１塩化物の塩、及び２塩化物の塩である。
【００５９】
「製薬上許容しうる塩基付加塩」とは、生物学的又は別様に望ましくないものではない遊離の酸の生物学的有効性及び特性を保持している塩を指す。これらの塩は遊離の酸に無機の塩基又は優位の塩基を付加させることにより製造される。無機の塩基から誘導された塩は、限定しないが例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、アルミニウムの塩等を包含する。好ましい無機塩はアンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウムの塩である。有機の塩基から誘導された塩は、限定しないが例えば、第１、第２、及び第３アミン、置換されたアミン、例えば天然に存在する置換されたアミン、環状アミン及び塩基性のイオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン類、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂等の塩を包含する。特に好ましい有機の塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン及びカフェインである。
【００６０】
「ウレイド」とは、式−−Ｎ（Ｈ）−−Ｃ（Ｏ）−−ＮＨ２のラジカルを指す。
【００６１】
上記及び実施例から、置換されたアルキル基を含有するラジカルに関しては、その上の何れかの置換はアルキル基の何れかの炭素の上に存在し得ることが理解される。本発明の化合物、又は製薬上許容しうるその塩はそれらの構造中に不斉炭素原子を有してよい。本発明の化合物及びそれらの製薬上許容しうる塩は従って、単一のエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ混合物、及びエナンチオマーとジアステレオマーの混合物として存在してよい。そのような単一のエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ混合物及びそれらの混合物は全て、本発明の範囲に包含されることを意図している。化合物内部の特定の炭素原子の絶対配置が既知であれば、それは適切な絶対的な記述語であるＲ又はＳにより示す。
【００６２】
別個のエナンチオマーは光学活性の出発物質及び／又は中間体の使用により、又は、従来の分割手法、例えば酵素的分割又はキラルＨＰＬＣの使用により、製造することができる、
本明細書においては、「成長因子」又は「神経発生因子」という表現はＣＮＳ又はＰＮＳの細胞に対して成長、増殖、分化、又は栄養性の作用を有する蛋白、ペプチド又は他の分子を指す。そのような因子は増殖又は分化を誘導するために使用してよく、そして、例えば、ＣＮＳ又はＰＮＳの細胞を増殖させる何れかの栄養因子、例えば細胞表面上の受容体に結合して細胞に対して栄養性、又は増殖誘導性の作用を呈する何れかの分子を包含できる。好ましい因子は限定しないが例えば、神経成長因子（「ＮＧＦ」）、表皮成長因子（「ＥＧＦ」）、血小板誘導成長因子（「ＰＤＧＦ」）、インスリン様成長因子（「ＩＧＦ」）、酸性線維芽細胞成長因子（「ａＦＧＦ」）又は「ＦＧＦ−１」）、塩基性線維芽細胞成長因子（「ｂＦＧＦ」又は「ＦＧＦ−２」）、及び形質転換成長因子−アルファ及び−ベータ（「ＴＧＦ−α」及び「ＴＧＦ−β」）を包含する。
【００６３】
「対象」とは生存している生物、例えばヒト、サル、雌ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、雄ウシ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、それから得られる培養細胞、及びそのトランスジェニック種を包含する。好ましい実施形態においては、対象はヒトである。本発明の化合物の治療すべき対象への投与は対象の状態を治療するために有効な用量において、そして期間に渡り、既知操作法を用いながら実施できる。治療効果を達成するために必要な治療化合物の有効量は、対象の年齢、性別及び体重、及び対象における外来物質を処理する治療化合物の能力のような要因に応じて変動してよい。投薬計画は最適な治療応答が得られるように調節できる。例えば、数分割した用量を毎日投与してよく、或いは、治療状況の緊急性により示されるとおり用量を比例的に低減してよい。
【００６４】
「投与」とは本発明の組成物がその意図する機能、例えば血管形成を促進することを実施可能とする投与の経路を包含する。種々の投与経路が可能であり、例えば必ずしも限定しないが、治療すべき疾患又は状態に応じて、非経口（例えば静脈内、動脈内、筋肉内、皮下の注射）、経口（例えば食餌）、局所、経鼻、直腸、又は緩徐放出微小担体を介したものを包含する。経口、非経口及び静脈内投与が好ましい投与様式である。投与すべき化合物の製剤は選択された投与経路に応じて変動することになる（例えば溶液、乳液、ゲル、エアロゾル、カプセル）。投与すべき化合物を含む適切な組成物は生理学的に許容されるベヒクル又は担体及び任意の補助剤及び保存料中に製造できる。溶液又は乳液の場合は、適当な担体は例えば水性又はアルコール性／水性の溶液、乳液又は懸濁液、例えば食塩水及び緩衝媒体、滅菌水、クリーム、軟膏、ローション、オイル、ペースト及び固体担体を包含する。非経口用のベヒクルは塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、ラクテート添加リンゲル又は固定油を包含することができる。静脈内投与用のベヒクルは種々の添加物、保存料、又は流体、栄養又は電解質補給剤を包含することができる（一般的にはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１６版），Ｍａｃｋ，編（１９８０）を参照できる）。
【００６５】
「有効量」とは、前血管形成又は抗血管形成性の化合物がその意図する機能、例えば本明細書に記載する血管形成関連障害における血管形成を促進又は抑制することを実施可能とするその量を包含する。有効量は多くの要因、例えば生物学的活性、年齢、体重、性別、全身状態、治療すべき状態の重症度、並びに適切な薬物動態特性に応じたものとなる。例えば、活性物質の用量は約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５００ｍｇ／ｋｇ／日、好都合には約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日であってよい。活性物質の治療有効量は単用量又は多用量において適切な経路により投与できる。更に又、活性物質の用量は治療又は予防の状況の緊急性により示される通り比例的に増減できる。
【００６６】
「製薬上許容しうる担体」とは、化合物の活性に適合し、そして対象に対して生理学的に許容される、全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌及び抗カビ剤、等張性及び吸収遅延剤などを包含する。製薬上許容しうる担体の例は緩衝規定食塩水（０．１５ＭＮａＣｌ）である。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体及び薬剤の使用は当該分野で良く知られている。何れかの従来の媒体又は薬剤が治療用化合物と不適合でない限り、薬学的投与に適する組成物中のその使用は意図される。補助的な活性化合物も又、組成物内に配合できる。
【００６７】
「追加的成分」とは、限定しないが例えば、以下のもの、即ち：賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；顆粒化及び錠剤崩壊剤；結合剤；潤滑剤；甘味剤；フレーバー剤；着色剤；保存料；生理学的に分解される組成物、例えばゼラチン；水性ベヒクル及び溶媒；油性ベヒクル及び溶媒；懸濁剤；分散又は水和剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝剤；塩；濃厚化剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗カビ剤；安定化剤；及び製薬上許容しうる重合体又は疎水性の物質の１つ以上を包含する。本発明の医薬組成物に包含させてよい他の「追加的成分」は当該分野で知られており、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅに記載されている。
【００６８】
チロ−インテグリン分子
細胞表面受容体がインテグリンαＶβ３又は他のＲＧＤ含有化合物の周囲にクラスタリングしているポリペプチドの作用をモジュレートする場合の甲状腺ホルモン、類縁体、及び重合体コンジュゲーションの役割
本明細書に開示するものは「チロインテグリン分子」と称される細胞表面で機能する甲状腺ホルモン分子の新しいクラスである。これらの分子はインテグリンαＶβ３上にあると報告されている甲状腺ホルモン（Ｌ−チロキシン、Ｔ４；Ｔ３）に対する細胞表面受容体を選択的に活性化する。受容体はインテグリン上のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）認識部位又はその近傍に存在する。αＶβ３受容体は核甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）の相同体ではないが、細胞表面受容体の活性化は多くの核媒介事象、例えば最近報告されたホルモンの前血管形成及び創傷治癒のヒト皮膚線維芽細胞単層モデルにおけるインビトロの線維芽細胞遊走をもたらす。
【００６９】
インテグリンαＶβ３はＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）のアミノ酸配列を含有する数種の細胞外マトリックス蛋白リガンドを有するヘテロ２量体原形質膜蛋白である。精製されたインテグリンを用いながら、本発明者等はインテグリンαＶβ３がＴ４に結合すること、及び、この相互作用はαＶβ３拮抗剤により撹乱されることを発見した。放射性リガンド結合試験によれば、精製されたαＶβ３は高親和性（ＥＣ５０、３７１ｐＭ）でＴ４に結合し、そしてＴ３よりも優先的にＴ４に結合すると考えられることが明らかになった。これはＴ３と比較した場合のＴ４によるＭＡＰＫの活性化及び核転座、並びにホルモン誘導血管形成を示している以前の報告と合致している。インテグリンαＶβ３拮抗剤はインテグリンへのＴ４の結合を抑制し、そして、重要な点として、ＭＡＰＫシグナリングカスケードのＴ４による活性化を防止する。インテグリンへのホルモンの結合のこの機能的帰結、即ちＭＡＰＫ活性化は、インテグリンαＶβ３拮抗剤による甲状腺ホルモンのＭＡＰＫ依存性の前血管形成作用の抑制と組み合わせて考えた場合、本発明者等は、インテグリン上のヨードチロニン結合部位を受容体として解釈することができる。留意すべき点は甲状腺ホルモン誘導体である３−ヨードチロナミンは最近Ｓｃａｎｌａｎ等により、トレースアミン受容体（ＴＡＲ１）に結合することが明らかにされたが、この類縁体の作用は興味深いことにＴ４及びＴ３のものとは正反対である。
【００７０】
インテグリンの伝統的なリガンドは蛋白である。小分子である甲状腺ホルモンも同様にインテグリンのリガンドであることは、新しい発見である。本発明は又、ある程度のエストロゲン活性を有するポリフェノールであるレスベラトロールがインテグリンαＶβ３に結合し、それとともに甲状腺ホルモンの結合から生じるものとは異なる機能的な細胞上の帰結であるアポトーシスをもたらすことを開示している。Ｔ４が結合するインテグリン上の部位はヘテロ２量体インテグリンのＲＧＤ結合溝部又はその近傍である。しかしながら、αＶβ３はＴ４に蛋白上の別の場所で結合すること、及び、テトラックによる、又はＲＧＤ含有ペプチドによるＲＧＤ認識部位の占有がＴ４結合部位をアロステリックにブロックするか、又はＴ４部位を使用不可能とするインテグリン内のコンホーメーション変化をもたらすことも、可能性としてあり得る。従って、星状細胞のラミニン−インテグリン相互作用のＴ４によるモジュレーションはインテグリンへのホルモンの結合の結果である場合がある。即ち、細胞外部の甲状腺ホルモンがラミニンの外に細胞外マトリックス蛋白のインテグリンαＶβ３によるリガンドンド形成に影響する可能性がある。
【００７１】
機序において非ゲノム性であるＴ４の作用は近年多く報告されている。これらの活性の多くはＭＡＰＫ媒介性である。本発明者等は、甲状腺ホルモンによるＭＡＰＫカスケードの活性化における初期の工程、例えば蛋白キナーゼＣの活性化は、ＧＴＰγＳ及び百日咳毒素に対して感受性であることを明らかにしており、甲状腺ホルモンに関する原形質膜受容体がＧ蛋白感受性であることを示している。留意すべきは、インテグリンαＶβ３により媒介される特定の細胞機能はＧ蛋白モジュレートされることを明らかにしているものもある。例えば、ＲＧＤ結合ドメインの部位指向性の突然変異誘発はＧ０を活性化させるヌクレオチド受容体Ｐ２Ｙ２の能力を根絶するが、Ｇｑの活性化は影響されない。Ｗａｎｇ等はインテグリン関連蛋白であるＩＡＰ／ＣＤ４７はＭＡＰＫ活性化のＧｉ媒介抑制を介して平滑筋遊走を誘導することを明らかにしている。
【００７２】
特定の細胞内シグナルトランスダクション経路の活性化にインテグリンαＶβ３によるＴ４及び他の類縁体の結合を関連付けることのほかに、本発明は又ＭＡＰＫ依存性血管形成のＴ４による誘導のためにはインテグリンによるホルモンのリガンドンド形成が必須であることも開示する。ＣＡＭモデルにおいて、Ｔ４投与４８〜７２時間後に有意な血管成長が起こっており、Ｔ４の原形質膜作用は複雑な転写の変化をもたらすことができることを示している。即ち、ホルモンの非ゲノム性の作用として開始されるもの、即ち細胞表面Ｔ４シグナルのトランスダクションは、血管新生に終結するホルモンのゲノム性の作用と境界を接している。甲状腺ホルモンの非ゲノム性及びゲノム性の作用の境界面は以前にも報告されており、例えばＴ４により細胞表面において開始され、そしてコリプレッサー蛋白のＴＲによる廃棄及びコアクチベーターのリクルートメントをもたらすＴＲβ１のＳｅｒ−１４２におけるＭＡＰＫ依存性ホスホリル化が挙げられる。本発明は又、ＲＧＤペプチドにより抑制されるＭＡＰＫ依存性の機序によるＣ−６グリア細胞の成長をＴ４が刺激すること、及び、ＲＧＤペプチドにより抑制可能であることが今回わかった過程によるＭＣＦ−７細胞における核エストロゲン受容体（ＥＲα）のＭＡＰＫ媒介セリン−ホスホリル化を甲状腺ホルモンがもたらすことを開示している。数細胞系統におけるこのような所見は全て、甲状腺ホルモンへの細胞の機能的応答におけるインテグリンの関与を裏付けている。
【００７３】
甲状腺ホルモンに関する膜受容体としてのαＶβ３の発見は、インテグリンとホルモンの相互作用及び血管形成の下流における帰結の臨床的重要性を示している。例えば、αＶβ３は多くの腫瘍において過剰発現され、そしてこの過剰発現は腫瘍の侵襲及び成長において役割を果たしていると考えられる。甲状腺ホルモンの比較的一定した循環系中レベルは腫瘍関連血管形成を促進することができる。ここで、そして他の場合でもＣＡＭモデルにおけるＴ４の前血管形成作用を示すことに加えて、本発明はまた、ヒト皮膚微小血管内皮細胞もまた甲状腺ホルモンに曝露されれば新しい血管を形成することを開示する。腫瘍細胞周囲にαＶβ３拮抗剤又はテトラックを局所送達すると、甲状腺ホルモン刺激血管形成が抑制されると考えられる。テトラックは甲状腺ホルモンの生物学的活性の多くを欠いているが、なお、特定の細胞の内部への出入りは可能である。非免疫原性の基板（アガロース又は重合体）へのテトラック又は特定のＲＧＤ拮抗剤のアンカリングは、化合物が原形質膜に交差する可能性を排除するが、なお、本明細書に示す通りＴ４誘導血管形成を防止する能力を保持している。即ち本試験において使用するアガロース−Ｔ４は特定の細胞作用を有するが、細胞内部への出入りは不可能である甲状腺ホルモン類縁体の新しいファミリーのためのプロトタイプである。
【００７４】
従って、本明細書に記載した実施例では、甲状腺ホルモン（Ｌ−チロキシン、Ｔ４）に対する細胞表面受容体として、そして、細胞内シグナリングカスケードのＴ４誘導活性化のための開始部位として、インテグリンαＶβ３を発見している。αＶβ３は高い親和性で放射標識Ｔ４に解離可能に結合し；放射性リガンドの結合はテトラヨードチロ酢酸（テトラック）、αＶβ３抗体及びインテグリンＲＧＤ認識部位ペプチドにより置き換えられている。ＣＶ−１細胞は核甲状腺ホルモン受容体を欠いているが、原形質膜αＶβ３を担持しており；Ｔ４の生理学的濃度をこれらの細胞に投与すれば、テトラック、ＲＧＤペプチド及びαＶβ３抗体により抑制される作用であるＭＡＰＫ経路の活性化が起こる。インテグリンへのＴ４の結合の抑制剤は又Ｔ４のＭＡＰＫ媒介前血管形成作用もブロックする。ＭＡＰＫのＴ４誘導ホスホリル化はαＶ及びβ３のｓｉＲＮＡノックダウンによりブロックされる。これらの所見は、Ｔ４がＲＧＤ認識部位の近傍でαＶβ３に結合することを示しており、そして、αＶβ３へのホルモンの結合が生理学的帰結であることを示している。
【００７５】
本発明の組成物は、部分的には、甲状腺ホルモン、甲状腺ホルモン類縁体、及びそれらの重合体形態が細胞膜レベルで作用し、そして核甲状腺ホルモンの作用とは独立している前血管形成特性を有するという発見に基づいている。従って、これらの甲状腺ホルモン類縁体及び重合体形態（即ち血管形成性薬剤）は種々の障害を治療するために使用できる。同様に、本発明は又、甲状腺ホルモン類縁体拮抗剤がそのような類縁体の前血管形成作用を抑制し、そしてやはり種々の障害を治療するために使用できるという発見に基づいている。従ってこれらの組成物及び使用方法を以下に詳細に説明する。
【００７６】
組成物
本明細書に開示するものは、甲状腺ホルモン、その類縁体、重合体コンジュゲーション、及びホルモン及びその類縁体のナノ粒子を含む血管形成性、及び抗血管形成性の薬剤である。開示した組成物は血管形成が有益である障害を治療するために血管形成を促進するために使用できる。更に又、これらの甲状腺ホルモン、類縁体及び重合体コンジュゲーションの抑制は血管形成を抑制するために使用することができ、これによりそのような望ましくない血管形成に関連する障害を治療できる。本明細書においては、「血管形成性の薬剤」という用語は、単独又は他の物質と組み合わせた場合の何れにおいても血管形成を促進又は強化する何れかの化合物又は物質を包含する。
【００７７】
本発明の前血管形成性の薬剤は甲状腺ホルモンアゴニストであり、そして甲状腺ホルモン、類縁体及び誘導体の単独のもの、又は重合体との共有結合又は非共有結合のコンジュゲーションによるものを包含する。例としては、限定しないが、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ３又はＴ４−アガロース、Ｔ３、Ｔ４の重合体類縁体、３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ酢酸（ＧＣ−１）、又はＤＩＴＰＡを包含する。本発明の抗血管形成性の薬剤は甲状腺ホルモン拮抗剤、類縁体及び誘導体の単独のもの、又は重合体との共有結合又は非共有結合のコンジュゲーションによるものを包含する。そのような抗血管形成性の甲状腺ホルモン拮抗剤の例は、限定しないが、ＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣ、ＸＴ１９９、及びｍＡｂＬＭ６０９を包含する。
【００７８】
代表的な甲状腺ホルモンアゴニスト、拮抗剤、類縁体及び誘導体の例を以下に示し、そして更に図２０、表Ａ〜Ｄにも示す。表ＡはＴ２、Ｔ３、Ｔ４、及びブロモ誘導体を示す。表Ｂはアラニル側鎖修飾を示す。表Ｃはヒドロキシ基、ジフェニルエステル連結、及びＤ−配置を示す。表Ｄはチロシン類縁体を示す。代表的な化合物の一部の式を以下に示す。
【００７９】
【化２】
2010513526.tif 000004
重合体コンジュゲーション
重合体コンジュゲーションは薬品の実効性を向上させるために使用する。多くの新旧の治療薬が十分耐容性を示しているが、多くの化合物は毒性を低下させ、循環時間を増大させ、或いは生体分布を変更するために、進歩した薬品発見技術を必要とする。薬品の実効性を向上させるための１つの戦略は水溶性重合体の利用である。種々の水溶性重合体が生体分布を変更し、細胞取り込みの様式を向上させ、生理学的障壁を通過する透過性を変化させ、そして身体を通過するクリアランスの速度を変更することが分かっている。ターゲティングされた、又は持続放出性の作用を達成するために、末端基として、骨格の一部として、又は重合体鎖上の懸垂基として薬品部分を含有する水溶性重合体が合成されている。
【００８０】
本発明の代表的な組成物は重合体にコンジュゲートした甲状腺ホルモン又はその類縁体を包含する。重合体とのコンジュゲーションは共有結合又は非共有結合の連結を介するものであることができる。好ましい実施形態においては、重合体コンジュゲーションはエステル連結又は無水物連結を介して起こることができる。ポリビニルアルコールを用いたエステル連結を介した重合体コンジュゲーションの例を図１７に示す。この調製品においては、市販のポリビニルアルコール（又は関連の共重合体）を甲状腺ホルモン類縁体の酸クロリド、例えば酸クロリド型を用いた処理によりエステル化できる。トリエチルアミンを添加して塩酸塩を中和することにより得られる塩酸トリエチルアミンは異なる類縁体に対する甲状腺ホルモンエステル重合体型の析出時に水で洗浄除去することができる。重合体へのエステル連結はインビボで加水分解を起こし、これにより活性な前血管形成甲状腺ホルモン類縁体を放出する。
【００８１】
アクリル酸エチレン共重合体を用いた無水物連結を介した重合体コンジュゲーションの例を図１８に示す。これは前の重合体共有結合コンジュゲーションと同様であるが、ただし、今回のそれはアクリル酸共重合体の反応から誘導される無水物連結を介している。この無水物連結もまたインビボの加水分解に感受性であり、甲状腺ホルモン類縁体を放出する。塩酸の中和はトリエチルアミンによる処理により達成され、そしてその後水を用いた析出ポリ無水物重合体の洗浄により、塩酸トリエチルアミン副生成物を除去する。この反応は甲状腺ホルモン類縁体アクリル酸共重合体＋トリエチルアミンの形成をもたらすことになる。インビボの加水分解時に、甲状腺ホルモン類縁体は、制御することができる時間に渡って放出されることなり、アクリル酸エチレン共重合体も伴う。
【００８２】
別の代表的な重合体コンジュゲーションはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートした甲状腺ホルモン又はその類縁体を包含する。種々の薬品、蛋白及びリポソームへのＰＥＧの結合は滞留時間を向上させ、そして毒性を低下させることが分かっている。ＰＥＧは鎖の末端においてヒドロキシル基により、そして他の化学的方法を介して活性剤にカップリングすることができる。しかしながらＰＥＧ自身は分子当たり２つの活性剤に限定される。異なる道筋においては、ＰＥＧ及びアミノ酸の共重合体は、ＰＥＧの生体適合性の特性は保持しているが、分子当たり多くの結合点を有するという追加的利点を有しており、そして種々の用途に適するように合成上設計できる新規な生体物質として開発されている。
【００８３】
効率的な生体分解性の骨格重合体を有する種々の合成、天然及び生体重合体起源の側鎖基を甲状腺ホルモン類縁体にコンジュゲートすることができる。ポリアルキルグリコール、ポリエステル、ポリ無水物、多糖類、及びポリアミノ酸がコンジュゲーションに使用できる。以下に示すものはコンジュゲートされた甲状腺ホルモン類縁体の代表例である。
【００８４】
天然、合成及びポリペプチド重合体鎖の重合体コンジュゲート構造。
【００８５】
【化３】
2010513526.tif 000005
【００８６】
【化４】
2010513526.tif 000006
【００８７】
【化５】
2010513526.tif 000007
【００８８】
【化６】
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生体分解性及び生体適合性の重合体は非加水分解性の重合体コンジュゲートを包含する長期及び短時間の送達ベヒクルのための確かな担体として指定されている。ＰＥＧ及びＰＥＯは溶解性（容易な担体様式）、分解時間およびコンジュゲーションの容易さの目的のために選択すべき分子量の範囲が広範である最も一般的なヒドロキシル末端重合体である。一端が保護されたメトキシ−ＰＥＧも又、膨潤することができ、そしてこのため細胞下の輸送の間に蛋白が結合又は付着する可能性を低減することができる直鎖担体として使用されることになる。エチレン及び酢酸ビニルの特定の共重合体、即ち例外的に良好な生体適合性、低結晶性及び疎水性を有するＥＶＡはカプセル化媒介薬物送達担体のための理想的な候補である。
【００８９】
長い半減期及び系内滞留特性を有することが分かっている重合体がコンジュゲーション目的のために検討されている。乳酸及びグリコール酸に由来する最も一般的で推奨される生体分解性の重合体を使用することになる。Ｌ−ラクチド及びＬ−リジンの共重合体はアミド結合の形成のためのアミン官能基をそれが使用できることから有用であり、そしてこのことにより、全ての甲状腺構成成分のカルボキシル部分を介してともに連結した担体及び輸送可能な甲状腺化合物のより長時間持続する共有結合部位として機能する。
【００９０】
セルロース、キチン、デキストラン、フィコール、ペクチン、カラギーナン（全てのサブタイプ）、及びアルギネートに由来する天然に存在する多糖類及びそれらの半合成の誘導体の一部は、その高い生体適合性、生物系に馴染む分解産物（グルコース及びフラクトースに由来する単糖類）、親水性、溶解性、重合体マトリックスのより長期の安定性をもたらす蛋白固定化／相互作用のために、理想的な担体である。これは経時的な分解からの重合体マトリックスの追加的保護のため、そして、コンジュゲートの有効な半減期に寄与するシェルをもたらす。
【００９１】
血清アルブミン、コラーゲン、ゼラチン及びポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アラニン、ポリ−Ｌ−セリンに由来する蛋白及びポリペプチドは担体分子の生体分解性、生体適合性、及び中間的な放出時間の利点を有する天然アミノ酸系の薬品担体である。ポリ−Ｌ−セリンはその異なる鎖誘導体、例えば特異的な共有結合コンジュゲーションのための使用可能な部位を有するポリセリンエステル、ポリセリンイミン及び従来のポリセリン重合体骨格のために更に興味深いものとなっている。
【００９２】
メタクリレート誘導重合体に由来する合成ヒドロゲルはその生体組織への類似性のために、生物医学用途において頻繁に使用されている。もっとも広範に使用されている合成ヒドロゲルはアクリル酸、アクリルアミド及び２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）の重合体である。ポリＨＥＭＡは安価であり、生体適合性であり、コンジュゲーションのための使用可能な第１アルコール側鎖伸長官能基を有し、そして眼、眼内、及び他の眼科用の用途に適しており、そのためそれらは完璧な薬物送達物質とみなされている。ｐＨＥＭＡは細胞接着に対して免疫性であり、そして細胞運動性を呈さないため、内科用の送達系のための理想的候補となっている。
【００９３】
合成の甲状腺類縁体ＤＩＴＰＡコンジュゲーションライブラリ設計プログラムが粗製のＤＩＴＰＡコンジュゲート産物の開発とともに達成されている。ＰＶＡとＰＥＧ親水性重合体のカップリングも又ジシクロヘキシルカルボジイミドを介して、そして親水性及び疎水性の他のカップリング試薬により、媒介することができる。以下に示すものは本発明の範囲に包含される重合体コンジュゲートのリストである。（表９）
【００９４】
【表９−１】
2010513526.tif 000009
【００９５】
【表９−２】
2010513526.tif 000010
他の代表的な重合体コンジュゲーションは重合体との非共有結合コンジュゲーションにおける甲状腺ホルモン又はその類縁体を包含する。これは図１９において詳細に示す。好ましい非共有結合コンジュゲーションはポリ乳酸重合体中の甲状腺ホルモン又はその類縁体の捕獲である。ポリ乳酸ポリエステル重合体（ＰＬＡ）はインビボで加水分解を起こして乳酸単量体となり、そしてこれがヒトにおける薬物送達系のためのベヒクルとして利用されている。甲状腺ホルモン類縁体が重合体に化学結合により連結される以前の２つの共有結合方法とは異なり、これはＰＬＡ重合体ビーズ内に甲状腺ホルモン類縁体をカプセル化することになる非共有結合的な方法となる。この反応は水中で甲状腺ホルモン類縁体含有ＰＬＡビーズの形成をもたらすことになる。濾過及び洗浄により甲状腺ホルモン類縁体含有ＰＬＡビーズの形成が起こり、これはインビボの加水分解時に甲状腺ホルモン＋乳酸の制御可能なレベルの生成をもたらすことになる。
【００９６】
Ａ．ＴＲのアゴニスト又は拮抗剤及びナノ粒子の重合体コンジュゲート合成
ＴＲのアゴニスト及び拮抗剤分子には２つの官能基、即ち：カルボン酸及びヒドロキシ基が存在する。ＴＲのアゴニスト又は拮抗剤／重合体コンジュゲートを合成するためには、反応部位は２つのうちの何れかであることができる。本発明の範囲に包含される可能なアゴニスト及び拮抗剤を以下の表に示す。２つの可能な合成経路を以下に説明する。
【００９７】
１）内部のフェニル環に対してα、β又はγ位上に位置するカルボン酸基の場合。酸基を活性化し、そして次にヒドロキシル及びアミノ基を反応させることによりエステル及びアミドを形成することができる。候補となる重合体はＰＶＡ、ＰＥＧ−ＮＨ２、ポリ（リジン）及び関連の重合体を包含する。模式的な合成経路をスケッチ１Ａに示す。
【００９８】
２）外部のフェニル上に位置するヒドロキシル基をスケッチ２Ａに示す。
【００９９】
スケッチ１Ａ：カルボン酸基を介したＴＲアゴニスト又は拮抗剤／重合体コンジュゲートの合成の模式的経路
【０１００】
【化７】
2010513526.tif 000011
スケッチ２Ａ：ヒドロキシル基を介したＴＲアゴニスト又は拮抗剤／重合体コンジュゲートの合成の模式的経路
【０１０１】
【化８】
2010513526.tif 000012
本発明の範囲に包含される代表的な甲状腺アゴニスト（前血管形成性）はＴ３、Ｔ４、ＤＩＴＰＡ、ＧＣ−１及びこれらの類縁体及び誘導体を包含する。例示される実施形態を以下に示す。
【０１０２】
【化９】
2010513526.tif 000013
【０１０３】
【化１０】
2010513526.tif 000014
本発明の範囲に包含される代表的な甲状腺拮抗剤（抗血管形成性）を以下に示す。
【０１０４】
【化１１】
2010513526.tif 000015
【０１０５】
【化１２】
2010513526.tif 000016
【０１０６】
【化１３】
2010513526.tif 000017
Ｂ．Ｔ４及びそのナノ粒子の重合体コンジュゲート合成
Ｔ４分子には３つの官能基、即ち：１つのカルボン酸、１つのアミン基、及び１つのヒドロキシ基が存在する。
【０１０７】
Ｔ４／重合体コンジュゲートを合成するためには、反応部位は３つの何れかの１つであることができる。
【０１０８】
１）カルボン酸基の場合。酸基を活性化し、そしてヒドロキシル及びアミン基との反応によりエステル及びアミドを形成することができる。Ｔ４におけるアミン基の高い反応性のため、アミン基はコンジュゲート反応の前に保護しなければならず、その後、脱保護反応を行う。別様には、自己重合によりＴ４オリゴマーを形成することになる。候補となる重合体はＰＶＡ、ＰＥＧ−ＮＨ２、ポリ（リジン）及び関連の重合体を包含する。模式的な合成経路をスケッチ１Ｂに示す。
【０１０９】
２）アミン基の場合。アミン基を活性化されたカルボン酸を有するか、ハロゲン基を有する重合体と反応させる。重合体が大過剰量の活性化酸基を有する場合は、反応は直接進行できる。ポリ（メタクリル酸）及びポチ（アクリル酸）をこの方法で使用できる。スキームをスケッチ２Ｂに示す。
【０１１０】
３）ヒドロキシル基の場合。より高度な反応性のアミン基の存在のために、カルボン酸を有する重合体とのＴ４の直接の反応は困難である。このアミン基は反応の前に保護し、そしてコンジュゲート反応の後に脱保護しなければならない。共通する保護基はアセテート（Ａｃ）又はＢＯＣ基であることができる。スキームをスケッチ３Ｂに示す。
【０１１１】
スケッチ１Ｂ：カルボン酸基を介したＴ４／重合体コンジュゲート合成の模式的経路
【０１１２】
【化１４】
2010513526.tif 000018
スケッチ２Ｂ：アミン基を介したＴ４／重合体コンジュゲート合成の模式的経路
【０１１３】
【化１５】
2010513526.tif 000019
スケッチ３Ｂ：ヒドロキシル基を介したＴ４／重合体コンジュゲート合成の模式的経路
【０１１４】
【化１６】
2010513526.tif 000020
本明細書に記載したＴ４重合体コンジュゲート、ナノ重合体及びナノ粒子は種々の適応症、限定しないが例えば、動脈瘤、手術（歯科、血管、又は全身を包含する）、心臓発作（例えば急性心筋梗塞）において、除細動機のような装置又は他の手段を用いて送達されるか、局所適用、例えば軟膏、クリーム、スプレー、又はシート（皮膚適用等）、又はステント又は他の医療装置に固定化され、そして心筋梗塞、卒中、又は末梢動脈疾患における持続的局所送達のために組織部位において移植することにより数週間〜数か月の範囲の延長された期間に渡り側腹動脈の形成を達成するために使用できる。
【０１１５】
Ｃ．ＧＣ−１及びそのナノ粒子の重合体コンジュゲート合成
ＧＣ−１分子には２つの官能基、即ち：１つのカルボン酸基及び１つのヒドロキシル基が存在する。ＧＣ−１／重合体コンジュゲートを合成するためには、反応部位は２つの何れかであることができる。
【０１１６】
１）カルボン酸基の場合。酸基を活性化させ、そしてヒドロキシル及びアミン基と反応させることによりエステル及びアミドを形成することができる。候補となる重合体はＰＶＡ、ＰＥＧ−ＮＨ２、ポリ（リジン）、ポリ（アルギニン）及び関連の重合体を包含する。模式的な合成経路をスケッチ１Ｃに示す。
【０１１７】
２）ヒドロキシル基の場合。スキームをスケッチ２Ｃに示す。
【０１１８】
スケッチ１Ｃ：カルボン酸基を介したＧＣ−１／重合体コンジュゲート合成の模式的経路
【０１１９】
【化１７】
2010513526.tif 000021
スケッチ２Ｃ：ヒドロキシル基を介したＧＣ−１／重合体コンジュゲート合成の模式的経路
【０１２０】
【化１８】
2010513526.tif 000022
Ｄ．テトラック及びそのナノ粒子の重合体コンジュゲート合成
テトラック分子には２つの官能基、即ち：１つのカルボン酸基及び１つのヒドロキシル基が存在する。テトラック／重合体コンジュゲートを合成するためには、反応部位は３つの何れかであることができる。
【０１２１】
１）カルボン酸基の場合。酸基を活性化させ、そしてヒドロキシル及びアミン基と反応させることによりエステル及びアミドを形成することができる。候補となる重合体はＰＶＡ、ＰＥＧ−ＮＨ２、ポリ（リジン）及び関連の重合体を包含する。模式的な合成経路をスケッチ１Ｄに示す。
【０１２２】
２）ヒドロキシル基の場合のスキームをスケッチ２Ｄに示す。
【０１２３】
スケッチ１Ｄ：カルボン酸基を介したテトラック／重合体コンジュゲート合成の模式的経路
【０１２４】
【化１９】
2010513526.tif 000023
スケッチ２Ｄ：ヒドロキシル基を介したテトラック／重合体コンジュゲート合成の模式的経路
【０１２５】
【化２０】
2010513526.tif 000024
更に又、本発明の組成物は甲状腺ホルモン結合蛋白トランスチレチン（「ＴＴＲ」）及びレチン酸結合蛋白（「ＲＢＰ」）に結合する、レチノール類（例えばレチン酸（即ちビタミンＡ））にコンジュゲートされた甲状腺ホルモン類縁体を包含する。甲状腺ホルモン類縁体は又、単独またはレチン酸と組み合わせて、アミロイドプラークを検出及び抑制する場合において使用するために、ハロゲン化スチルベステロール類にコンジュゲートすることもできる。これらの類縁体はＴ４−ＴＴＲの好都合な特性、即ち、脳及びアミロイド中へのそれらの急速な取り込み及び延長された貯留を、ハロゲン置換基、例えばＰＥＴ画像化用の特定の有用なハロゲン同位体、例えばフッ素−１８、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２４、ヨウ素−１３１、臭素−７５、臭素−７６、臭素−７７及び臭素−８２の特性と組み合わせている。以下に示すものはレチノール及びハロゲン化スチルベストロールにコンジュゲートした甲状腺ホルモン類縁体の代表例である。
【０１２６】
【化２１】
2010513526.tif 000025
【０１２７】
【化２２】
2010513526.tif 000026
【０１２８】
【化２３】
2010513526.tif 000027
ナノ粒子
更に又、ナノメートル規模における大きさを有する有用な物質及び構造の創生のためにナノテクノロジーを使用することができる。生物学的に活性な物質の１つの難点は脆弱さである。ナノスケール物質をそのような生物学的に活性な物質と組み合わせることにより物質の耐容性を劇的に向上させ、物質の局在高濃度をもたらし、そして損失を最小限にすることにより経費を低減することができる。従って、追加的な重合体コンジュゲーションは甲状腺ホルモン及びその類縁体のナノ粒子形成を包含する。そのような実施形態においては、ナノ重合体及びナノ粒子は甲状腺ホルモン及びその類縁体の局所送達のためのマトリックスとして使用できる。これは細胞および組織の標的内への時間制御送達において有益となる。
【０１２９】
本発明は疎水性の抗酸化、抗炎症、及び抗血管形成化合物を含有する甲状腺ホルモン類縁体のナノ粒子の形成を可能にする。本発明は又、捕獲された薬品の放出を制御することができる除放性及び長時間滞留性の眼科用製剤及びその製造プロセスを提供する。
【０１３０】
本発明の範囲に包含されるものは、細胞内部への出入りが不可能であり、そしてそのため自身の活性がインテグリン受容体に限定されるはずであるナノ粒子型の甲状腺ホルモン類縁体（Ｔ４、Ｔ３、ＧＣ−１、ＤＩＴＰＡ、及びテトラック）である。ナノ粒子型のホルモン類縁体はポリリジルグリコール酸（ＰＬＧＡ）誘導体であり、エステル又はより安定なエーテル結合の製剤である。アガロース−Ｔ４はインテグリン受容体において完全に活性であることを本発明者等が明らかにしているナノ粒子のモデルである。製剤されたホルモン類縁体はホルモンの細胞内作用を発現することはなく、従って、循環系中に吸収された場合でも、全身性の甲状腺ホルモン類似の作用を有さないことになる。
【０１３１】
本明細書においては、「ナノ粒子」という用語は直径が約１ｎｍと１０００ｎｍ未満の間の粒子を指す。適当な実施形態においては、本発明のナノ粒子の直径は直径５００ｎｍ未満、より適当には直径約２５０ｎｍ未満である。特定のこのような実施形態においては、本発明のナノ粒子は直径約１０ｎｍと約２００ｎｍの間、約３０ｎｍと約１００ｎｍの間、又は約４０ｎｍと約８０ｎｍの間である。本明細書においては、いずれかの数値に言及している場合、「約」とは記載された値の±１０％の値を意味する（例えば「約１００ｎｍ」は９０ｎｍ〜１１０ｎｍの両端を含む直径の範囲を包含する）。
【０１３２】
本発明によれば、複数の甲状腺ホルモン類縁体にコンジュゲートしたナノ粒子を含むナノ粒子コンジュゲート又は重合体コンジュゲートが提供される。ナノ粒子の基本となることができる甲状腺ホルモン類縁体は、限定しないが例えば、Ｔ３、Ｔ４、ＤＩＴＰＡ、ＧＣ−１、及びテトラックを包含する。本発明の追加的な実施形態はエーテル又はスルフィドリル連結を介して治療用化合物にＰＬＧＡを連結することによりナノ粒子とされた何れかの治療薬を包含する。適当な治療用化合物の例はレスベラトロール、エストロゲン、アンドロゲン及びプロゲステロンを包含する。
【０１３３】
ナノ粒子ホルモン類縁体はポリリジルグリコール酸（ＰＬＧＡ）誘導体であり、エステル又はより安定なエーテル結合の製剤である。ナノ粒子製剤の重要な要素は甲状腺ホルモン又は他の治療用分子とナノ粒子の間の連結架橋部である。甲状腺ホルモン類縁体又は他の治療用化合物は、甲状腺ホルモン類縁体又は他の治療用分子のアルコール部分を介してエーテル（−Ｏ−）又はスルフィドリル連結（イオウ（−Ｓ−）により、ナノ粒子にコンジュゲートされる。アルコール部分を介したコンジュゲーションは甲状腺ホルモン類縁体又は他の治療用分子のＣＯＯＨ部分を介したコンジュゲーションよりも高い活性を有する。甲状腺ホルモン類縁体、例えばＴ３及びＴ４のＮＨ２基は又保護基（Ｒ基）を用いてブロックすることもできる。本発明の範囲に包含される適当なＲ基はＢＯＣ、アセチル、メチル、エチル又はイソプロピルを包含する。未修飾Ｔ４の場合はＲ＝Ｈである。更に又、甲状腺ホルモンがＮＨ２において保護基を有するＴ４又はＴ３である場合、Ｔ４又はＴ３のＮＨ２における適当な保護基はＮ−メチル、Ｎ−エチル、Ｎ−トリフェニル、Ｎ−プロピル、Ｎ−イソプロピル、Ｎ−ｔ−ブチル及び他の官能基を包含することができる。
【０１３４】
ナノ粒子は約１〜＜１０００ｎｍの範囲の直径を有してよい。本発明の範囲に包含されるナノ粒子はナノ粒子当たり甲状腺ホルモン類縁体約１００分子までを有してよい。ナノ粒子当たりの甲状腺ホルモン又は他の治療用分子の比は１ナノ粒子当たり１甲状腺ホルモン分子（１：１とも示される）〜ナノ粒子当たり甲状腺ホルモン又は他の治療用分子１００個（１００：１とも示される）までの比の範囲である。より好ましくは、範囲はナノ粒子当たり甲状腺ホルモン類縁体又は他の治療用分子１５：１〜３０：１、そしてより好ましくは、ナノ粒子当たり甲状腺ホルモン類縁体又は他の治療用分子２０：１〜２５：１である。
【０１３５】
本発明の範囲に包含される適当なナノ粒子はＴ４、Ｔ３、ＤＩＴＰＡ、ＧＣ−１、テトラックと、又は他の治療用化合物、限定しないが例えばレスベラトロール、エストロゲン等（リストに追加）をはじめとしたものとコンジュゲートしたＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子を包含する。更に又、テモゾロミドをＰＬＧＡナノ粒子中にカプセル化することができる。ナノ粒子の主要な利点の１つは多数のカプセル化物質を全て一緒に自身の内部に同時カプセル化できるその能力である。従って、これらのＰＬＧＡナノ粒子は又、Ｔ４、Ｔ３、ＤＩＴＰＡ、ＧＣ−１、テトラック又は他の治療用化合物及びテモゾロミドを全て一緒に同時カプセル化する多大な潜在性を有している。更に又、ナノ粒子表面上の遊離の−ＣＯＯＨ基の存在のために、これらのナノ粒子は異なるターゲティング分子にコンジュゲートすることができ、そして所望の部位に送達することができる。予備的な試験において、本発明者等は、腫瘍特異的部位指向性送達のために、ナノ粒子に結合した特異的な抗体を用いることにより数少ない細胞系統をターゲティングすることができた。本発明の範囲に包含されるナノ粒子の追加的な実施形態はリン酸カルシウムを含有するＴ４、Ｔ３、ＤＩＴＰＡ、ＧＣ−１、又はテトラックコラーゲンコンジュゲートナノ粒子；適当なエーテル連結部を介してモノ−又はジ−ＰＥＧＯＨにコンジュゲートしたＴ４、Ｔ３、ＤＩＴＰＡ、ＧＣ−１、又はテトラックを包含する。
【０１３６】
更に又、ナノ粒子は、ナノ粒子の内部に、又はナノ粒子の細胞表面上に化学的連結を介して固定化されて、甲状腺ホルモンアゴニスト、部分アゴニスト、又は拮抗剤をカプセル化する。本発明の範囲に包含されるナノ粒子の代表的な実施形態を以下に説明する。
【０１３７】
Ａ．ＴＲアゴニスト及び拮抗剤のナノ粒子
エステル連結によりＴＲのアゴニスト又は拮抗剤をコンジュゲートしたナノ重合体
【０１３８】
【化２４】
2010513526.tif 000028
安定なエーテル連結を介してモノ−又はジ−ＰＥＧＯＨとコンジュゲートされたＴＲアゴニスト又は拮抗剤
【０１３９】
【化２５】
2010513526.tif 000029
他の適当なナノ粒子の実施形態はＴＲアゴニストコンジュゲートＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子の調製品である。空隙ナノ粒子を最初に製造することになる。アミノ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ重合体を選択してナノ粒子を製造することになる。ＴＨ類縁体はエピクロロヒドリンを用いて活性化することになる。このエポキシ活性化ＴＨアゴニストはアミノ末端ＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子と容易に反応することになる。
【０１４０】
【化２６】
2010513526.tif 000030
Ｂ．Ｔ４ナノ粒子
本発明に包含されるナノ粒子の別の適当な実施形態は以下に示すような安定なエーテル連結を介してモノ又はジ−ＰＥＧ−ＯＨに固定化されたＴ４を包含する。
【０１４１】
【化２７】
2010513526.tif 000031
Ｃ．ＧＣ−１ナノ粒子
本発明に包含されるナノ粒子の代表的な実施形態は又、以下に示すようなエステル連結を介してコンジュゲートされたＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子中のＧＣ−１のカプセル化を包含する。
【０１４２】
【化２８】
2010513526.tif 000032
本発明に包含されるナノ粒子の別の適当な実施形態は以下に示すような安定なエーテル連結を介してモノ又はジ−ＰＥＧＯＨに固定化されたＧＣ−１を包含する。
【０１４３】
【化２９】
2010513526.tif 000033
本発明に包含されるナノ粒子の別の適当な実施形態はＧＣ−１コンジュゲートＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子を包含する。この場合、空隙ナノ粒子を最初に製造することになる。アミノ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ重合体を選択してナノ粒子を製造することになる。ＧＣ−１はエピクロロヒドリンを用いて活性化することになる。この活性化されたＧＣ−１は以下に示す通りアミノ末端ＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子と容易に反応することになる。
【０１４４】
【化３０】
2010513526.tif 000034
別のカプセル化又は固定化されたＧＣ−１類縁体ナノ粒子を以下に示す。
【０１４５】
【化３１】
2010513526.tif 000035
Ｄ．テトラックナノ粒子
本発明に包含される代表的なテトラックナノ粒子を図３０Ａ〜Ｂ、図３１Ａ−ｂ、及び図３２に示す。以下に示すものはエステル連結を介したテトラックコンジュゲートナノ重合体の追加的表示である。
【０１４６】
【化３２】
2010513526.tif 000036
以下に示すものは安定なエーテル連結を介してモノ又はジ−ＰＥＧＯＨにコンジュゲートされたテトラックの適当な実施形態である。
【０１４７】
【化３３】
2010513526.tif 000037
Ｅ．Ｔ３ナノ粒子
別の適当な実施形態はＴ３コンジュゲートＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子の製造である。Ｔ３のコンジュゲーションはＧＣ−１のコンジュゲーションと同様である。ただしこの場合、Ｔ３中に存在する高度に反応性のアミン基をアセテート（Ａｃ）又はＢＯＣ基の何れかを用いることによりまずブロックすることになる。次に、それをエピクロロヒドリンで活性化することになる。最後に、Ｔ３へのコンジュゲーションの後、それを以下に示す通り脱保護する。
【０１４８】
アセテート（Ａｃ）又はＢＯＣによるアミン基の保護
【０１４９】
【化３４】
2010513526.tif 000038
Ｆ．ＤＩＴＰＡ
別の適当なナノ粒子実施形態は以下に示す通りＤＩＴＰＡ類縁体を包含する。
【０１５０】
【化３５】
2010513526.tif 000039
ＤＩＴＰＡ−３，５ヨウ素をメチル又はハロゲン基で置き換えることができる。
【０１５１】
甲状腺ホルモン類縁体の使用
本発明の甲状腺ホルモン類縁体はＴ３、Ｔ４、ＧＣ−１、ＤＩＴＰＡ、テトラック、トリアック及びそれらの重合体コンジュゲート及びナノ粒子である。Ｔ３、Ｔ４、ＧＣ−１及びＤＩＴＰＡ及びそのコンジュゲート及びナノ粒子は前血管形成性であり、そしてまた本明細書においては甲状腺ホルモンアゴニストとも称する。テトラック及びトリアック及びそのコンジュゲート及びナノ粒子は抗血管形成性及び抗増殖性であり、そして本明細書においては甲状腺ホルモン拮抗剤とも称する。
【０１５２】
本発明の甲状腺ホルモン類縁体は皮膚の障害を治療するために使用できる。これらの障害は創傷治癒、非癌皮膚状態及び癌性の皮膚状態を包含する。創傷治癒は外科的切開部及び外傷による傷害を包含する。Ｔ４、Ｔ３、ＧＣ−１及びＤＩＴＰＡは、未修飾及びナノ粒子の両方として、創傷治癒のために使用できる。これらの甲状腺ホルモン類縁体は血管形成により、そして線維芽細胞及び白血球の創傷領域への遊走を増強することにより、功を奏する。Ｔ４は、修飾及びナノ粒子として、追加的に、早期の創傷治癒に関連する血小板凝集活性を有する。Ｔ４、Ｔ３、ＧＣ−１及びＤＩＴＰＡナノ粒子の作用は細胞表面に限定される。それらは細胞に進入しないため、それらが局所適用部位から退避した場合も全身性の副作用を回避する。これらの細胞内の全身性の副作用の例は、軽度の甲状腺機能亢進状態、及び特に下垂体甲状腺刺激細胞におけるチロトロピン（ＴＳＨ）の放出の抑制を包含する。未修飾及びナノ粒子又は重合体コンジュゲートの両方としての、本発明の組成物、特にテトラック、トリアック及び他の抗血管形成性及び抗増殖性の甲状腺ホルモン類縁体で治療できる非癌の皮膚障害は、限定しないが例えばしゅさ、血管腫、末梢神経拡張症、シヴァット多形皮膚委縮症及び乾癬を包含する。本発明の組成物で治療できる癌性の皮膚障害の例は、基底細胞癌、皮膚の扁平上皮癌及び黒色腫である。そのような目的のために使用するべき組成物は、未修飾及びナノ粒子又は重合体コンジュゲートの両方としての、テトラック、トリアック及び他の抗血管形成性及び抗増殖性の甲状腺ホルモン類縁体である。皮膚障害に対しては、本発明の組成物は局所用の皮膚適用、例えば溶液、スプレーとして投与するか、ガーゼパッド又は合成シートに配合することができる。
【０１５３】
ナノ粒子内にカプセル化又は固定化されたテトラック、トリアック及び類縁体を包含する本発明の組成物により治療できる非癌皮膚障害は、限定しないが例えば、しゅさ、血管腫、末梢神経拡張症、多形皮膚委縮症及び乾癬を包含する。皮膚障害に対しては、本発明の組成物は局所用の皮膚薬（例えば溶液、スプレー、ガーゼパッド又は他の合成シートに配合）として投与できる。
【０１５４】
未修飾及びナノ粒子又は重合体コンジュゲートの両方としての、テトラック、トリアック及び他の抗増殖性及び抗血管形成性の甲状腺ホルモン類縁体を包含する本発明の甲状腺ホルモン類縁体は又、皮膚の外に、臓器の癌を治療するために使用できる。これらの癌は、限定しないが例えば、神経膠腫及び神経膠芽腫、非甲状腺性の頭部頚部腫瘍、甲状腺癌、肺、乳腺及び卵巣を包含する。テトラック及びトリアックのナノ粒子又は重合体コンジュゲートは、全身又は局所投与された場合、細胞内部への出入りが不可能であり、そして甲状腺ホルモンに対する細胞表面インテグリン受容体においてのみ排他的に作用する。製剤のこの属性は甲状腺機能亢進及び下垂体の甲状腺刺激細胞による甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の放出の抑制を包含する未修飾のテトラック及びトリアックの望ましくない甲状腺模倣性の副作用を排除する。テトラックは約２００〜２０００ｕｇ／日又は約７００ｕｇ／ｍ２までの用量において投与できる。
【０１５５】
テトラック、トリアック、類縁体、他の甲状腺類縁体、及びその重合体コンジュゲート及びナノ粒子を包含する本発明の甲状腺ホルモン類縁体はまた、癌、限定しないが例えば神経膠腫、頭部頚部、皮膚、肺、乳腺、及び甲状腺を治療するために使用できる。この実施形態においては、テトラックをナノ粒子を伴って、又は伴うことなく投与できる。テトラックナノ粒子は、ナノ粒子が細胞内に進入できないため、甲状腺機能亢進症の危険性を低減する。甲状腺癌の場合は、テトラック及びテトラックナノ粒子の両方を同時投与するか、又は、安定な化学結合を介してナノ粒子表面上にカプセル化及び／又は固定化されたテトラックを投与する。テトラック又はテトラックナノ粒子は約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与できる。
【０１５６】
テトラック、トリアック、類縁体、甲状腺拮抗剤、及びその重合体コンジュゲート及びナノ粒子を包含する本発明の甲状腺ホルモン類縁体は又、癌化学療法感作剤及び抗癌剤としても使用できる。テトラック、トリアック、類縁体、甲状腺拮抗剤、及びその重合体コンジュゲート及びナノ粒子は疾患の回帰の原因である薬品耐性の発生を抑制する。テトラックは神経芽腫、骨肉腫及び乳癌に由来する耐性の腫瘍細胞において、細胞応答を増強し、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びトリコスタチンＡへの耐性を逆行させる。
【０１５７】
テトラック、トリアック、類縁体、甲状腺拮抗剤、及びその重合体コンジュゲート及びナノ粒子を包含する本発明の甲状腺ホルモン類縁体は又、糖尿病性網膜症及び黄斑変性を包含する眼の障害を治療するために使用できる。テトラック及び類縁体は、未修飾で、重合体コンジュゲートとして、又はナノ粒子として全身に、又は点眼薬として与えることができる。
【０１５８】
Ｔ３、Ｔ４、ＧＣ−１、ＤＩＴＰＡ、及びその重合体コンジュゲート及びナノ粒子を包含する本発明の甲状腺ホルモン類縁体は又、アテローム性動脈硬化症、例えば冠動脈又は頸動脈の疾患、虚血性四肢障害、虚血性腸障害を治療するために使用できる。好ましい実施形態はポリＬ−アルギニン、又はポリＬ−リジンとのＴ３、ＧＣ−１、ＤＩＴＰＡの重合体型、又はそのナノ粒子である。更に又、本発明の組成物は生体分解性及び非分解性でのステント又は他のマトリックスと組み合わせて使用できる。
【０１５９】
本発明の甲状腺ホルモン類縁体はまた神経膠ニューロン及びＮＧＦの関与するもののような細胞の遊走の関与する障害を治療するために投与できる。治療すべきそのような障害は神経学的疾患を包含する。更に又、本発明の甲状腺ホルモン類縁体は造血系及び幹細胞に関連する障害に対して使用できる。それらは細胞がより急速に再形成できるように骨髄移植時に投与できる。本発明の組成物は１２５ヨウ素標識テトラックナノ粒子を使用することによりアルツハイマーに関する画像化を包含する診断画像化のためにも使用できる。アルツハイマープラークはテトラックに結合するトランスサイレチンを有しているため、これを早期検出のために使用できる。本発明の組成物はまた除細動機と共に使用できる。それらは又西ナイル、ＨＩＶ、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、アデノウィルス、及び他のウィルス体のようなウィルス体の治療にも使用できる。
【０１６０】
血管形成の誘発及び抑制の両方における本発明の組成物に関する使用の詳細は以下に詳述する通りである。
【０１６１】
血管形成の促進
甲状腺ホルモン類縁体、その重合体形態又はナノ粒子の前血管形成作用は、ＭＡＰＫシグナルトランスダクション経路の薬理学的抑制剤による低減に対するホルモン作用の感受性により試験した場合、非ゲノム性の開始に依存している。そのような結果は甲状腺ホルモンによるＭＡＰＫの活性化の別の帰結が新しい血管の成長であることを示している。後者は非ゲノム的に開始されるが、当然ながら、必然的に複雑な遺伝子転写のプログラムを必要とする。甲状腺ホルモンの周囲濃度は比較的安定である。ＣＡＭモデルは、本発明者等が試験した時点では、甲状腺欠損性であり、そしてこのため未損傷の臓器を再形成しない系であるとみなしてよい。
【０１６２】
血管形成に関するニワトリの絨毛尿膜（ＣＡＭ）試験の使用可能性は血管形成を定量するため、及び新しい血管の成長の甲状腺ホルモンによる誘導に関与している考えられる機序を試験するためのモデルを与えている。本出願はＦＧＦ２のＣＡＭモデルにおけるものを近似し、そしてＦＧＦ２の最適未満の用量の作用を増強することができるＴ４の前血管形成作用を開示している。ホルモンの前血管形成作用が原形質膜において開始され、そしてＭＡＰＫシグナルトランスダクション経路のＴ４による活性化に依存していることも更に開示する。上記した通り、閉塞性末梢血管疾患及び冠動脈疾患、特に冠動脈の閉塞、及び末梢血管及び／又は冠動脈血管の閉塞に関連する障害の治療のための方法を開示する。同様に開示されるものは、血管形成を促進すること及び／又は側腹血管のリクルートメントを、それを要する患者において行うための組成物及び方法である。組成物は甲状腺ホルモン類縁体、重合体形態、及び誘導体の有効量を包含する。方法では有効量の甲状腺ホルモン類縁体、重合体形態、及び誘導体を、低い一日当たり用量において、１週間以上、他の標準的な前血管形成性の成長因子、血管拡張剤、抗凝固剤、血栓溶解剤又は他の血管関連の治療と共に同時投与する。
【０１６３】
ＣＡＭ試験は種々の成長因子及び血管形成を促進すると考えられている化合物の血管形成活性を確認するために使用されている。例えば、生理学的濃度におけるＴ４はインビトロのモデルにおいて前血管形成性であること、そして、モルベースにおいてＦＧＦ２の活性を有することが明らかにされている。ＰＴＵの存在はＴ４の作用を低減しておらず、Ｔ４の脱ヨウ素化によるＴ３の発生はこのモデルにおいては前提条件ではないことが示唆されている。種々の甲状腺ホルモン類縁体の前血管形成作用の総括を以下の表に列挙する。
【表Ａ−１】
2010513526.tif 000040
【０１６４】
【表Ａ−２】
2010513526.tif 000041
【０１６５】
このモデルにおける新しい血管の成長の出現は数日間を要し、甲状腺ホルモンの作用が甲状腺ホルモンに対する核受容体（ＴＲ）のホルモンとの相互作用に完全に依存していることを示している。ＴＲのその天然のリガンドＴ３との核内複合体形成を必要とするヨードチロニンの作用は、当然ながら、ゲノム性であり、そして最終的には遺伝子発現に至る。一方、ＴＲの天然のリガンドであるＴ３ではなくＴ４に対して優先的なこのモデル系の応答は、血管形成がＴ４により原形質膜において非ゲノム的に開始され、そして最終的には遺伝子転写を要する作用に至る可能性を生じさせている。Ｔ４の非ゲノム性の作用は広く報告されており、そして通常は原形質膜において開始され、そしてシグナリングトランスダクション経路により媒介される場合がある。それらはヨードチロニンの核内リガンド及びＴＲを必要としないが、遺伝子転写と相互作用するか、又はそれをモジュレートする場合がある。ステロイドの非ゲノム性の作用は又多く報告されており、そしてステロイド又は他の化合物のゲノム性の作用と境界を接していることが分かっている。Ｔ４及びテトラックを用いて、又はアガロース−Ｔ４を用いて実施した実験によれば、Ｔ４の前血管形成作用は実際には原形質膜において開始される可能性が最も高いことを示している。テトラックはＴ４の膜開始作用をブロックするが、それ自体はシグナルトランスダクションを活性化しない。即ち、これは甲状腺ホルモンの非ゲノム性の作用に関するプローブである。アガロース−Ｔ４は細胞内部への進入が可能であるとは考えられておらず、そしてホルモンの可能な細胞表面開始作用のためのモデルを検討するために使用されていない。ニワトリの絨毛尿膜（ＣＡＭ）モデルにおける甲状腺ホルモンの前血管形成作用の検査によれば、既存の血管からの新しい血管の発生は１０−７〜１０−９ＭのＬ−チロキシン（Ｔ４）又は３，５，３’−トリヨード−Ｌ−チロニン（Ｔ３）のいずれかにより２〜３倍促進されたことが示された。より興味深い点はＴ４−アガロース、即ち細胞膜を通過しない甲状腺ホルモン類縁体は、Ｔ３又はＴ４を用いた場合に得られるものに匹敵する強力な前血管形成作用をもたらしていた。
【０１６６】
部分的には、本発明は血管形成を促進することが必要な対象におけるそのための組成物及び方法を提供する。血管形成を促進することによる治療に適する状態は、例えば閉塞性末梢血管疾患及び冠動脈疾患、特に冠動脈の閉塞、及び末梢血管及び／又は冠動脈の血管の閉塞に関連する障害、勃起不全、卒中、及び創傷を包含する。同様に開示されるものは、血管形成を促進すること及び／又は側腹血管のリクルートメントを、それを要する患者において行うための組成物及び方法である。組成物は甲状腺ホルモン類縁体及び誘導体の重合体形態の有効量及びアデノシン及び／又は酸化窒素ドナーの有効量を包含する。組成物は血管形成有効量の甲状腺ホルモン様物質及びアデノシン誘導体を生理学的及び薬学的に許容される担体中に、場合により１個以上の賦形剤と共に包含する、滅菌された、注射可能な、医薬品製剤の形態であることができる。
【０１６７】
心筋梗塞
急性の心筋梗塞の後の心不全の主要な原因は新しい血管の形成、即ち血管形成の不適切な応答である。甲状腺ホルモン及びその類縁体は心不全において有益であり、そして冠動脈の血管形成を促進する。本発明の方法では、部分的に、甲状腺ホルモン類縁体の単回投与の送達を、心筋梗塞発生時に、心筋内への直接の注射によるか、又は冠動脈注射のシミュレーションのために間欠的な大動脈結紮により一過性の等容性の収縮をもたらすことにより血管形成及び／又は心室リモデリングを達成することによるかの何れかにより行う。
【０１６８】
従って、１つの特徴において、本発明は血管形成を誘発するために有効な、甲状腺ホルモン又はその類縁体の重合体形態のある量を、閉塞性血管疾患、冠動脈疾患、心筋梗塞、虚血、卒中、及び／又は末梢動脈血管障害を治療することが必要な対象に投与することにより血管形成を促進することにより上記疾患を治療するための方法を特徴とする。
【０１６９】
甲状腺ホルモン類縁体の重合体形態の例もまた本明細書に記載する通りであり、そしてポリビニルアルコール、アクリル酸エチレン共重合体、ポリ乳酸、ポリＬ−アルギニン、ポリＬ−リジンにコンジュゲートしたトリヨードチロニン（Ｔ３）、レボチロキシン（Ｔ４）、（ＧＣ−１）、又は３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）を包含することができる。
【０１７０】
方法では又、有効量の甲状腺ホルモン様物質及び有効量のアデノシン及び／又はＮＯドナーを低い１日当たり用量において、１週間以上同時投与する。一方又は両方の成分をカテーテルを介して局所送達できる。インビボの甲状腺ホルモン類縁体及び誘導体は、適切な大きさのナノ粒子中に化合物を配合することにより虚血組織を包囲する毛管床に対して送達できる。甲状腺ホルモン類縁体、重合体形態及び誘導体は適当な抗体との共有結合により虚血組織にターゲティングすることができる。
【０１７１】
方法は心筋梗塞の後に心臓機能を復元するための治療として使用してよい。方法は又、心筋梗塞又は心臓以外の領域への不適切な血流、例えば閉塞性末梢血管疾患（末梢動脈閉塞疾患としても知られている）、又は勃起不全に罹患した冠動脈疾患を有する患者において血流を改善するために使用してよい
創傷治癒
インテグリン受容体において開始され、そしてインビボの創傷治癒に関連する甲状腺ホルモンの作用は、血小板凝集、血管形成及び線維芽細胞の内部遊走である。
【０１７２】
創傷血管形成は治癒の増殖期の重要な部分である。最表面以外の何れの皮膚の創傷の治癒も血管形成なくしては生じ得ない。如何なる損傷を受けた血管も修復する必要があるのみならず、治癒のために必要な増大した局所的な細胞の活動性は血流からの栄養の増大した供給を必要とする。更に又、血管の管壁を形成する内皮細胞は治癒のオーガナイザー及びレギュレーターとしてそれ自身重要である。
【０１７３】
即ち、血管形成は治癒中の創傷を支援する新しい微小循環系を提供する。新しい血管は傷害の４日後までに創傷空間内部で臨床上目視可能となる。血管内皮細胞、線維芽細胞、及び平滑筋細胞は全て、創傷の肉芽形成を支援するために協調して増殖する。同時に再上皮化が起こり、上皮被覆を再樹立する。創傷辺縁部似由来する、又は深部の毛包に由来する上皮細胞は創傷を通過して遊走し、そして肉芽形成組織上の自身、及び暫定的マトリックスを樹立する。ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）のような成長因子がこの過程を媒介する。上皮化の数種のモデルが存在する（スライディングｖｓローリング細胞）。
【０１７４】
甲状腺ホルモンは代謝速度を調節するため、甲状腺機能低下により代謝が緩徐化した場合、創傷治癒も又緩徐化する。従って創傷治癒における局所適用した甲状腺ホルモン類縁体又は重合体形態の役割は、損なわれた創傷治癒能力を有する糖尿病及び非糖尿病の患者における創傷治癒を加速させるための新しい戦略となる。局所適用はバンドエイドに対するアタッチメントの形態であることができる。更に又、ナノ重合体及びナノ粒子を甲状腺ホルモン及びその類縁体の局所送達のためのマトリックスとして使用できる。これは細胞および組織の標的の内部への時間制御送達に寄与することになる。
【０１７５】
従って、本発明の別の実施形態は、血管形成を促進するために有効な、甲状腺ホルモン又はその類縁体の重合体又はナノ粒子の形態のある量を、血管形成を促進することにより創傷を治療することが必要な対象に投与することによる、そのための方法を特徴とする。詳細に関しては、実施例９Ａ及び９Ｂを参照できる。
【０１７６】
ナノ粒子に関しては、ＰＬＧＡ製剤としてのＴ４は、ガーゼパッド又は合成フィルムへの吸着により手術又は外傷による創傷に局所適用した場合、上記した機序により創傷治癒を増強することになる。小型の皮膚創傷又は擦過症の場合、誘導体化されたＴ４はＯＴＣガーゼパッド又はフィルムにおける臨床使用のために使用可能としてよい。
【０１７７】
ＰＬＧＡ製剤としてのＴ４は、ガーゼパッド又は合成フィルムへの吸着により皮膚潰瘍に適用した場合、上記した機序により創傷治癒を増強することになる。血小板凝集を誘発しないため、ナノ粒子Ｔ３はこれらの用途のためには好適度は低下する。
【０１７８】
追加的な創傷治癒の使用は粘膜関連の障害、例えば生検後放射線誘導炎症、ＧＩ管潰瘍、内出血抑制、抗凝固療法中の歯科患者に対する抜歯後のための使用を包含する。これらの使用のためには、ナノ粒子又は重合体コンジュゲートを使用してよい。
【０１７９】
眼科用
本発明は又、熱感受性、粘膜接着性、及び小さい粒径（１０＜１０００ｎｍ）を有する甲状腺ホルモン類縁体の除放性及び長時間滞留性の眼科用製剤に関する。当該製剤は疎水性又は親水性の甲状腺ホルモン拮抗剤を有するランダムブロック共重合体のミセル溶液を含む。本発明は又、点眼液又は軟膏中の、異なる粒径及び異なる表面電荷（正電荷、負電荷又は中性）を有する当該製剤を製造するプロセスを提供する。
【０１８０】
大部分の眼科疾患は点眼液又は軟膏として投与される溶液の局所適用により治療される。眼科用薬品の局所送達の場合に遭遇する主要な問題点の１つは廃液及び高度な涙液の交換により生じる急速で広範な角膜前の損失である。点眼薬の点眼後、典型的には適用薬剤の２〜３％未満が角膜を貫通し、眼内組織に到達するが、点眼された用量の大部分は結膜及び鼻涙管を介して全身吸収される場合が多い。別の限定要因は眼吸収を制限する相対的に非透過性の角膜障壁である。
【０１８１】
従来の点眼薬に伴っていた固有の問題点のために、ヒドロゲル、マイクロ−及びナノ粒子、リポソーム及びコラーゲンシールドのような眼科用投与のための新しい薬物送達系を指向した多大な研究がおこなわれている。眼科用薬物送達は、眼におけるその標的組織への薬品の送達を制御すること、そして究極的には最適化することへの道程である。製剤の研究の大部分は、角膜及び結膜嚢中の薬品滞留時間の延長を介して眼科用薬品の吸収を最大化すること並びに送達系からの薬品の放出を緩徐化すること、及び視野を霞ませる作用を有するゲルを使用することなく角膜前薬品損失を最小限とすることに着目している。
【０１８２】
眼科用製剤中に大量のゲルを使用することによる視野の霞み及び薬剤の乏しい生態利用性の問題を克服するために、コロイド状の担体がより良好な作用を有することが示唆されている。眼科用の送達のための薬品担体としてのナノ粒子はリポソームよりも効率的であることが明らかにされており、そしてリポソームの全ての好都合な点に加えて、これらのナノ粒子は例外的に安定な実体であり、そして薬品の除放性はモジュレートすることができる。
【０１８３】
眼科用薬品のための共重合体性の物質の使用に関して研究がなされており、そしてとくに注目すべきは共重合体ミセルの疎水性のコア部内に疎水性薬品を取り込ませる試みである。これらの製剤の薬学的な効力は使用される共重合体物質及び化合物の特定の性質及び特徴に依存している。更に又、角膜表眼における薬剤の長い滞留時間及び除放性は他の生体適合性の製剤により達成されていない。
【０１８４】
ニューロン性
神経誘導の伝統的な理解とは逆に、本発明は部分的には、血管形成を開始させて維持する機序は神経発生の効果的な促進剤及び持続剤であるという意外な発見に基づいている。これらの方法及び組成物は、例えば運動ニューロン傷害及び外傷、傷害及びニューロン障害における神経障害の治療のために有用である。本発明は種々の前血管形成戦略を単独、又は神経成長因子及び他の神経発生因子と組み合わせて使用することを開示する。前血管形成因子は本明細書に記載する重合体甲状腺ホルモン類縁体を包含する。重合体甲状腺ホルモン類縁体及びその重合体コンジュゲートは、単独で、又は当該分野で知られた他の前血管形成成長因子と、そして神経成長因子又は他の神経発生因子組み合わせた状態で、最適な神経発生のために組み合わせることができる。
【０１８５】
哺乳類における神経経路を維持するための治療方法、組成物、及び装置を開示し、その例には、死滅の危険性のあるニューロンの生存性を増強すること、損傷を受けたニューロン及び神経経路の細胞修復を誘導すること、及びニューロンを刺激してその分化表現型を維持することが包含される。更に又、抗酸化剤及び／又は抗炎症剤の存在下に重合体甲状腺ホルモン類縁体およびその組み合わせを含有する組成物はニューロンの再生及び保護を示す。
【０１８６】
本発明は又、ニューロンの生存性を増強し、そして神経経路を維持するための単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた甲状腺ホルモン、類縁体、及び重合体コンジュゲートを提供する。本明細書においては、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体は、ニューロンの生存性を増強すること、ニューロンＣＡＭ発現を刺激すること、分化したニューロンの表現型発現を維持すること、神経起源の形質転換細胞の再分化を誘導すること、及び神経突起における切断部、特に軸索における大型の間隙に渡る軸索の成長を刺激することが可能である。形態発生物質も又、免疫学的に関連する神経組織の損傷に関連する組織の破壊に対抗して保護を行う。最後に、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体は哺乳類における神経組織の実効性をモニタリングするための方法の部分として使用してよい。
【０１８７】
本発明は又、インビトロの機能的シナプス形成を推定するためのシステムを用いながら、培養されたラット頸動脈ニューロンの間のシナプス形成に対する重合体甲状腺ホルモンの作用を与える。１０−９Ｍの重合体甲状腺ホルモン、３，５，３’−トリヨードチロニン又はチロキシンへの曝露により、細胞内カルシウム濃度における自発的な同期した振動の変化の頻度の増大がもたらされ、それは形成されたシナプスの数と相関していた。免疫細胞化学的及び免疫ブロット分析によるシナプスの小胞関連蛋白であるシナプシンＩの検出もまたチロキシンへの曝露がシナプス形成を促進したことを確認するものであった。５’−デイオジナーゼの阻害剤であるアミノダロン、又は除草剤であるアミトロールの存在は、チロキシンの存在下のシナプスの形成を抑制していた。即ち、本発明の方法は又重合体甲状腺システムを途絶させることにより発達中のＣＮＳにおけるシナプスの形成を妨害する可能性のある雑多な化学物質のスクリーニングのための有用なインビトロの試験系を提供する。
【０１８８】
一般的なこととして、本発明の方法は神経組織の攻撃又は神経障害の危険性のある、或いはそれに罹患した何れかの哺乳類対象の治療に適用してよい。本発明は何れかの霊長類、好ましくはより高等な霊長類、例えばヒトの治療のために適している。しかしながら、本発明は更に又、人間のペットとして維持されている（例えばイヌ、ネコ、ウマ）、多大な商業的価値のある（例えばヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、競技用又は荷車用の動物）、多大な学術的価値のある（例えば絶滅危惧種の捕獲された、又は放牧された動物種、又は同系交配された、又は操作された動物の系統）、又は別様に価値のある、家畜哺乳類の治療において使用してよい。
【０１８９】
本明細書に記載した単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体は、特に死滅の危険性のあるニューロン細胞の細胞生存性を増強する。例えば、完全に分化したニューロンは非有糸分裂性であり、そして化学的に定義された、又は当該分野で知られた低血清培地を用いながら標準的な哺乳類細胞培養条件下に培養されればインビトロで死滅する。例えばＣｈａｒｎｅｓｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６：３１６４−３１６９（１９８６）及びＦｒｅｅｓｅ，ら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５２１：２５４−２６４（１９９０）を参照できる。しかしながら、非有糸分裂性ニューロン細胞の一次培養物を単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺類縁体で処理すれば、これらの細胞の生存性は有意に増強される。例えば成熟ラット脳の黒質から単離した線条体脳幹神経節の一次培養物を標準的な操作法を用いながら、例えば標準的な組織培養プロトコルを用いて黒質組織のパスツールピペットを用いた磨砕により解離させることにより調製し、そして例えば５０％ＤＭＥＭ（ダルベッコ変性イーグル培地）、５０％Ｆ−１２培地、熱不活性化ウマ血清にペニシリン／ストレプトマイシン及び４ｇ／ｌグルコースを添加したものを含有する低血清培地中で成長させる。標準的な培養条件下では、これらの細胞は血清非含有培地中で培養されれば３週間までに多大な細胞死を起こす。細胞死は接着を維持する能力を細胞が有さないことにより、そして、その超構造特性の変化により、例えばクロマチンのクランピング及び細胞内小器官の崩壊により、形態学的に顕在化する。特に、細胞は接着性のまま残存し、実効性の分化したニューロンの形態を維持する。単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子投与と組み合わせた甲状腺類縁体の非存在下においては、培養された細胞の大部分は解離し、そして細胞の壊死を起こす。
【０１９０】
黒質の脳幹神経節における機能不全はハンチントン舞踏病及びパーキンソン病とインビボで関連している。ニューロンの生存性を増強させる本明細書に定義する単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体の能力は、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせたこれらの重合体甲状腺ホルモン類縁体が、例えば神経障害又は化学的又は機械的外傷によるインビボで死滅する危険性のあるニューロン細胞の生存性を増強するための治療の部分として有用となる。本発明は更に、これらの重合体甲状腺ホルモン類縁体が、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた場合に、ハンチントン舞踏病及びパーキンソン病を包含する線条体脳幹神経節に影響する神経障害を治療するための有用な治療薬を与えることを示す。臨床適用のためには、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体を投与してよく、或いは単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子刺激剤と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体を投与してよい。
【０１９１】
本明細書に記載した甲状腺ホルモン化合物は又、化学的外傷からの神経組織の保護のためにも使用できる。ニューロン細胞の生存性を増強し、そして、再分化した細胞における細胞の凝集及び細胞−細胞の接着を誘導する本明細書に記載した単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体の能力は、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体が化学的外傷により引き起こされた損傷からの神経経路を定義する細胞を保護することによりその経路を維持するための治療薬として有用となることを示している。特に、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体は、ニューロンの増殖及び郵送を抑制すること、及び細胞−細胞の接着を妨害することが分かっている毒素の作用から、発達中のニューロンを含むニューロンを保護することができる。そのような毒素の例はエタノール、煙草の煙中に存在する毒素の１つ以上、及び種々のアヘン様物質を包含する。発達中のニューロンに対するエタノールの毒性作用は、胎児アルコール症候群において顕在化する神経学的損傷を誘導する。単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体は又グルタメートのような興奮性アミノ酸に関連する細胞毒性作用からニューロンを保護する場合もある。
【０１９２】
例えば、エタノールは単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺類縁体を投与したＮＧ１０８−１５細胞において誘導された細胞−細胞接着作用を、これらの細胞に対して２５〜５０ｍＭの濃度で与えられた場合に、抑制する。半最大抑制は５〜１０ｍＭエタノールにおいて達成することができ、これは単回アルコール飲料の摂取後の成人における血中アルコール濃度である。エタノールは同様に、細胞間のＣＡＭの同種親和性の結合に関しては、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺類縁体により誘導されたＮ−ＣＡＭのレベルがエタノールにより影響されないことから、誘導するよりはむしろ妨害する。更に又、抑制作用は、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺類縁体の濃度に逆比例している。従って、エタノールのような毒素への曝露に由来する損傷の危険性のあるニューロン、特に発達中のニューロンへの、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺類縁体、又は単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子刺激剤と組み合わせた重合体甲状腺類縁体の投与は、毒素の抑制作用を克服することにより神経組織の損傷からこれらの細胞を保護する場合がある。本明細書に記載した単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺類縁体は又、これらの毒素への曝露により誘導された神経障害に起因する損傷した神経経路を治療するための療法において有用である。
【０１９３】
本明細書に記載した単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体のインビボの活性もまた本明細書に記載した動物モデルにおいて容易に評価できる。例えば遺伝子的又は環境的に誘導された神経組織の損傷を好ましくは呈している適当な動物に、リン酸塩緩衝食塩水ｐＨ７のような適当な治療用製剤中の単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体の有効量を大脳内注射する。単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体は好ましくは、罹患したニューロンの領域内に注射する。罹患した組織をその後のある時点で摘出し、そして組織を、形態学的に、及び／又は適切な生化学的マーカーの評価により評価する（例えば単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体又はＮ−ＣＡＭの局在化によるか；又は、例えばマーカーとして神経膠原線維酸性蛋白を用いながらＣＮＳ神経栄養性活性に関するか、又はＣＮＳ組織損傷に関する生化学的マーカーに対する用量依存性の作用を計測することによる）。用量及びインキュベーション時間は試験すべき動物に応じて変動することになる。種々の異なる動物種に対する適当な用量の範囲は確立された動物モデルとの比較により求めてよい。以下に示すものはラット脳穿刺モデルに関する例示プロトコルである。
【０１９４】
慨すれば、標準的な販売元から入手した雄性ロングエバンズラットを麻酔し、頭部領域を手術用に調整する。頭蓋冠を標準的な外科的操作法により露出させ、頭蓋冠を丁度穿刺するように０．０３５Ｋのワイアを用いながら各葉の中心に向かって孔部を掘削する。次に単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子（例えばＯＰ−１、２５ｍｇ）と組み合わせた重合体甲状腺類縁体又はＰＢＳの何れかを含有する２５ｍｌの溶液をハミルトンシリンジにより孔部の各々に添加する。溶液は表面下部約３ｍｍの深度まで、伏在する皮質、脳梁及び海馬の内部にまで送達する。次に皮膚を縫合し、動物を回復させる。
【０１９５】
手術後３日に、ラットを断首屠殺し、その脳を切片作成用に処理する。瘢痕組織の形成は神経膠の瘢痕形成に関するマーカー蛋白である神経膠原線維酸性蛋白に対して免疫蛍光染色することにより評価し、これにより瘢痕形成の程度を定性的に測定する。神経膠原線維酸性蛋白抗体は例えばＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．より入手可能である。切片は抗ＯＰ−１抗体によりプローブし、これによりＯＰ−１の存在を測定する。神経膠原線維酸性蛋白の低減されたレベルは単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺類縁体を投与した動物の組織切片において予測され、神経膠瘢痕形成を抑制し、そして神経再生を刺激する単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺類縁体の能力が顕在化する。
【０１９６】
脳の画像化、診断、及び神経変性疾患の治療
本発明は例えばアルツハイマー病のような神経変性疾患の早期診断、防止及び治療のために有用な医薬品及び放射性医薬品を提供する。本発明は又、生物学的な系において特異的結合を融資、そして、陽電子射出断層撮影（ＰＥＴ）、シングルフォトンエミッション（ＳＰＥＣＴ）画像化法、及び磁気共鳴（ＭＲＩ）画像化法のために使用されることができる新規な化学物質も包含する。身体内部の局在化したリガンドに結合するＴ４及び他の甲状腺ホルモン類縁体の能力は、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩ、及び同様の画像化方法によるリガンドのインサイチュの画像化のためにそのような化合物を利用することを可能にする。原則として、結合が生じ、そしてその結合が目的の細胞、臓器、組織又は受容体のクラスに対して特異的である限り、リガンドの性質に関して何も知る必要はない。
【０１９７】
ＰＥＴ画像化は陽電子射出同位体で標識したトレーサー化合物を使用しながら行う（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｍ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｏｓｂｙ  Ｙｅａｒｂｏｏｋ，１９９２，Ｋ．Ｆ．Ｈｕｂｎｅｒ等、Ｃｈａｐｔｅｒ  １４）。大部分の生物学的物質に関して、適当な同位体は数少ない。炭素同位体１１ＣはＰＥＴのために使用されているが、２０．５分というその短い半減期のためにその有用性は迅速に合成及び精製が可能な化合物に、そして、前駆体１１Ｃ出発物質が発生するサイクロトロンに近い施設に限定されている。他の同位体はなお短い半減期を有する。Ｎ１３は１０分の半減期を有し、Ｏ１５は２分という更に短い半減期を有する。両方の放出はＣ１１のものよりも高エネルギー性である。しかしなお、ＰＥＴの試験はこれらの同位体で行われている（Ｈｕｂｎｅｒ，Ｋ．Ｆ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｏｓｂｙ  Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，１９９２，Ｋ．Ｆ．Ｈｕｂｎｅｒ等、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２）。より有用な同位体である１８Ｆは１１０分の半減期を有する。これは精製のため、及びヒト又は動物の対象内への投与のための、放射標識されたトレーサー内への取り込みのために十分な時間を与える。更に又、半径２００マイルまでのサイクロトロンからより遠隔の施設もＦ１８標識化合物が使用できる。１８Ｆの不都合な点は天然に存在する生物学的物質との機能的等価性を有するフッ素化類縁体が相対的に欠乏していること、及び、サイクロトロン中で発生する出発物質を効率的に利用する合成方法を設計することが困難なことである。そのような出発物質はフロリドイオン又はフッ素ガスであることができる。後者の場合においては、２分子気体の一方のみのフッ素原子が実際には放射性核種であり、このためガスはＦ−Ｆ１８と表記される。従って出発物質としてＦ−Ｆ１８を用いる反応は出発物質としてＫＦ１８を利用する反応の放射性核種の量の半分のみを有する生成物をもたらす。一方、Ｆ１８は担体非含有の親核置換反応を用いて高比放射能、理論的には１．７Ｃｉ／ｎｍｏｌにおける放射性医薬品化合物内への取り込みのためのフロリドイオンとしてのキューリー量において製造することができる。Ｆ１８のエネルギー放出は０．６３５ＭｅＶであり、比較的短い、２．４ｍｍの平均陽電子範囲を組織にもたらし、高分解能のＰＥＴ画像を与える。
【０１９８】
ＳＰＥＣＴ画像化は高エネルギーの光量子を放出する同位体トレーサーを使用する（ガンマ線放出物質）。有用な同位体の範囲はＰＥＴより大きいが、ＳＰＥＣＴはより低値の３次元分解能を示す。しかしなおＳＰＥＣＴは類縁体の結合、局在化及びクリアランス速度に関する臨床上有意義な情報を得るために広範に使用されている。ＳＰＥＣＴ画像化のための有用な同位体は１３．３時間の半減期を有するＩ１２３α−ガンマ線放出物質である。Ｉ１２３で標識した化合物は製造場所から約１０００マイルまで出荷することができ、或いは同位体そのものをオンサイトの合成のために輸送できる。同位体の放出の８５パーセントは１５９ＫｅＶの光量子であり、これは現在使用されているＳＰＥＣＴ機器により容易に測定される。本発明の化合物はテクネチウムで標識できる。テクネチウム−９９ｍはＳＰＥＣＴ画像化のための有用な放射性核種であることが分かっている。飽和しているか、又は二重又は三重結合を有することができる４〜６炭素鎖を介してＴｃ−９９ｍ金属クラスターに本発明のＴ４類縁体を連結する。
【０１９９】
ＰＥＴにおけるＦ１８標識化合物の使用は数種の類縁体化合物に限定される。最も注目すべきは、Ｆ１８−フルオロデオキシグルコースは、脳の活動に関連するグルコース代謝及びグルコースの取り込みの局在化の研究において広範に使用されている。Ｆ１８−Ｌ−フルオロドーパ及び他のドーパミン受容体類縁体も又ドーパミン受容体の分布をマッピングする場合に使用されている。
【０２００】
他のハロゲン同位体をＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ画像化のために、又は従来のトレーサー標識のために使用することができる。これらには有用な半減期及び放出特製を有するものとして７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ及び８２Ｂｒが包含される。一般的に、記載した同位体に対して何れかのハロゲン部分を置換するための化学的手段が存在する。従って、記載した化合物の何れかのハロゲン化相同体の生化学的又は生理学的な活性が現在当業者による使用のために入手可能であり、例えば安定な同位体ハロゲン相同体が包含される。アスタチンは他のハロゲン同位体の代替となることができる。例えば２１０Ａｔは８．３時間の半減期でアルファ粒子を放出する。他の同位体も又、合理的に有用な半減期でアルファ粒子を放出する。従ってＡｔ置換された化合物は、結合が十分に脳特異的である場合の脳の治療のために有用である。
【０２０１】
多くの試験が炭水化物及びアミノ酸の悪性脳細胞への増大した取り込みを示している。この蓄積はそのような細胞の加速した増殖及び蛋白合成に関連している。グルコース類縁体である１８Ｆ−２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＦＤＧ）は正常な脳の組織又は良性の成長から高度に悪性の脳を識別するために使用されている（ＤｉＣｈｉｒｏ，Ｇ．等（１９８２）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（ＮＹ）３２：１３２３−１３２９）。しかしながら、フッ素−１８標識２−ＦＤＧは、正常組織内への高度な取り込みが脳の存在をマスキングする場合があるため、低等級の脳を検出するための選択肢となる物質ではない。更に又、フッ素−１８標識２−ＦＤＧは、感染組織中、及び膀胱中における２−ＦＤＧ放射能の高度な取り込みのために、それぞれ、感染組織から肺、脳を識別するか、又は卵巣癌を検出するためには理想的な放射性医薬品ではない。炭素−１１で標識された天然に存在するアミノ酸メチオニンは正常組織から悪性組織を識別するために使用されている。しかしながら、それは同様に正常組織中の比較的高い取り込みを示す。更に又、炭素−１１の半減期は僅か２０分であり、従ってＣ１１メチオニンは長期間保存できない。
【０２０２】
脳脊髄液（「ＣＳＦ」）トランスサイレチン（「ＴＴＲ」）、即ちラット及びヒトにおける主要なＣＳＦチロキシン（Ｔ４）担体蛋白は脈絡叢（「ＣＰ」）において合成される。ラットにおける１２５Ｉ−Ｔ４の注射の後、放射性Ｔ４はまずＣＰに、次にＣＳＦに、そしてその後、脳に蓄積する（Ｃｈａｎｏｉｎｅ  ＪＰ，Ｂｒａｖｅｒｍａｎ  ＬＥ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｔｏ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  ｂｒａｉｎ．Ａｃｔａ  Ｍｅｄ  Ａｕｓｔｒｉａｃａ．１９９２；１９補遺１：２５−８）。
【０２０３】
本発明の化合物は特に脳のアミロイド蛋白を有する身体領域に関して実質的に向上したＰＥＴ画像化を可能にする。生物学的に活性な化合物内に取り込ませることができる全ての使用可能な陽電子射出同位体は短い半減期を有している。従ってそのような標識された化合物の実際の利用は標識された化合物をどの程度迅速に合成できるか、合成の収率、そして最終生成物の放射化学的純度に依存している。同位体の製造元であるサイクロトロン施設からＰＥＴ画像化が行われる病院又は研究室まで出荷時間も制限される。有用な距離を大まかに計算すると半減期分当たり約２マイルとなる。即ち、２０．５ｍの半減期を有するＣ１１は製造元から半径約４０マイルに制限されるが、Ｆ１８で標識された化合物は半径約２００マイル以内で使用することができる。１８Ｆ−標識化合物の別の条件は、それが結合することを意図している受容体又は標的分子に対する結合特異性を有すること、他の標的への非特異的結合が標的と非標的の結合の間の識別を可能にするほど十分に低値であること、及び試験環境中の別の物質との交換を回避するために標識が試験条件下で安定であることである。より特定すれば、本発明の化合物は所望の標的への十分な結合を呈するが、他の組織又は細胞とは比較可能な如何なる程度においても結合することはできないはずである。
【０２０４】
ＰＥＴ画像化に関する厳密な基準に対する部分的解決策はＳＰＥＣＴ画像化においてガンマ線放出同位体を使用することである。１２３Ｉは合成場所から１０００マイルを超える有用な範囲に関する１３時間の半減期を有するＳＰＥＣＴ用の一般的に使用されている同位体マーカーである。本発明の化合物はＰＥＴ画像化の代替としてのＳＰＥＣＴ分析における使用のためにＩ１２３で迅速及び効率的に標識できる。更に又、同じ化合物を何れかの同位体で標識できるという事実のため、同じトレーサーを用いながらＰＥＴ及びＳＰＥＣＴにより得られる結果を比較することが初めて可能となった。
【０２０５】
脳結合の特異性は又、本発明のＩ−置換化合物の利用性を与える。そのような化合物はＳＰＥＣＴ画像化のための短命１２３Ｉで、又は治療の経過をモニタリングする場合のようなより長い期間の試験のための長命１２５Ｉで標識することができる。他のヨウ素及び臭素の同位体を例示したものの代替とすることができる。
【０２０６】
一般的に本発明の放射性画像化剤は放射性４−ハロベンジル誘導体をピペリジン誘導体と反応させることにより製造する。好ましいものはＰＥＴ画像化用のＦ−１８標識４−フルオロベンジル誘導体である。４−フルオロ１８Ｆ−ベンジルハライドの製造のための一般的な方法はＩｗａｔａ等、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ（２０００），Ｖｏｌ．５２，ｐｐ．８７−９２に記載されている。
【０２０７】
シングルフォトンエミッションコンピューター断層撮影（「ＳＰＥＣＴ」）のためには、９９ｍＴｃ標識化合物が好ましい。これらの化合物に関する一般的な合成経路は９９ｍＴｃ結合キレート形成剤、例えばＮ２Ｓ２−キレーターと反応する本発明に包含される非放射性ＴＨ類縁体で開始される。キレート形成剤の合成は標準的な操作法、例えばＭａｈｍｏｏｄ等、Ａ  Ｎ２Ｓ２−Ｔｅｔｒａｄｅｎｔａｔｅ  Ｃｈｅｌａｔｅ  ｆｏｒ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ，Ｒｈｅｎｉｕｍ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９９），Ｖｏｌ．５，ｐ．７１，又はＺ．Ｐ．Ｚｈｕａｎｇ等、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９），Ｖｏｌ．１０，ｐ．１５９に記載されている操作法に従う。
【０２０８】
キレート形成剤の１つは本発明のＴＨ類縁体の非放射性化合物の−−Ｎ（Ｒ４）Ｒ５基における窒素に直接、或いは、１〜１０炭素原子を有するアルキルラジカルを含むリンカー部分を介して結合し、この場合、アルキルラジカルは場合により１〜１０個の−−Ｃ（Ｏ）−−基、１〜１０個の−−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−−基、１〜１０個の−−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−−基、１〜１０個の−−Ｎ（Ｒ）−−基、１〜１０個の−−Ｎ（Ｒ）２基、１〜１０個のヒドロキシ基、１〜１０個の−−Ｃ（Ｏ）ＯＲ−−基、１〜１０個の酸素原子、１〜１０個のイオウ原子、１〜１０個の窒素原子、１〜１０個のハロゲン原子、１〜１０個のアリール基、及び１〜１０個の飽和又は不飽和の複素環を含有し、ここでＲは水素又はアルキルである。好ましいリンカー部分は−−Ｃ（Ｏ）−−ＣＨ２−−Ｎ（Ｈ）−−である。
【０２０９】
従って本発明の化合物はＰＥＴ及びＳＰＥＣＴを用いた脳の画像化のための進歩した方法を提供する。方法は対象（実験及び／又は診断目的のヒト又は動物であることができる）に対し適切な同位体で標識された本発明の化合物の画像発生量を投与すること、そして次にＦ１８又は他の陽電子射出物質を使用する場合はＰＥＴ、又はＩ１２３又は他のガンマ線放出物質を使用する場合はＳＰＥＣＴにより化合物の分布を計測することを包含する。画像発生量とは、スキャナーの検出感度及びノイズレベル、同位体の年代、対象の体格及び投与経路を考慮しながらＰＥＴ又はＳＰＥＣＴスキャナー中で少なくとも画像を与えることができる量であり、これらの変数は全て、知られたものの例示であり、そして予定外の実験に依存することなく当業者が知る計算及び計測により対応可能である。
【０２１０】
本発明の化合物は構造中の何れかの原子又は原子の組み合わせの同位体で標識できる。Ｆ１８、Ｉ１２３及びＩ１２５は本明細書においてはＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ及びトレーサー分析のために特に有用であるものとして強調したが、他の使用、例えば安定な同位体相同体の生理学的又は薬理学的特性から生じるものも意図され、そしてそれは当業者の知る通りである。
【０２１１】
本発明は又、Ｔｃ付加物を介したテクネチウム（Ｔｃ）標識を可能とする。Ｔｃの同位体、特にＴｃ９９ｍは脳の画像化のために使用されている。本発明は脳の画像化に有用な本発明の化合物のＴｃ複合体化付加物を提供する。付加物は飽和であるか、二重又は三重結合を有することができる４〜６炭素鎖により環状アミノ酸に連結されたＴｃ配位複合体である。二重結合が存在する場合は、Ｅ（トランス）又はＺ（シス）の異性体の何れかを合成することができ、そして何れかの異性体を使用することができる。合成は同位体の有用な寿命を最大限にするように最終段階において９９ｍＴｃ同位体を取り込むことに関して説明する。
【０２１２】
以下の方法は本明細書において報告した操作法において使用した。１８Ｆ−フロリドは９５％リッチ化１８Ｏ水上において１１ＭｅＶのプロトンとの１８Ｏ（ｐ，ｎ）１８Ｆの反応を用いてＳｅｉｍｅｎｓのサイクロトロンから製造した。全ての溶媒及び化学物質は分析用の等級であり、更に精製することなく使用した。化合物の融点はＢｕｃｈｉ  ＳＰ装置を用いることにより毛管中で測定した。薄層クロマトグラフィー分析（ＴＬＣ）はアルミニウム上にコーティングしたシリカゲルＧＰＦ−２９４（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）の２５０ｍｍの厚みの層を用いながら実施した。カラムクロマトグラフィーは６０〜２００メッシュのシリカゲル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を用いることにより実施した。赤外スペクトル（ＩＲ）はＮａＣｌプレートを用いながらＢｅｃｋｍａｎ１８Ａスペクトル分析機上で記録した。プロトン核磁気共鳴スペクトル（１ＨＮＭＲ）はＮｉｃｏｌｅｔ高分解能機器を用いながら３００ＭＨｚにおいて求めた。
【０２１３】
別の特徴において、本発明はヒトにおけるアルツハイマー病の診断のための放射性医薬品の製造のために本発明の化合物を使用する方法に関する。別の特徴において、本発明は本発明の化合物を製造する方法に関する。
【０２１４】
本明細書に記載した本発明の化合物は、ＴＴＲに結合し、そして血液脳関門を通過する能力を有する甲状腺ホルモン類縁体又は他のＴＴＲ結合リガンドである。従って化合物はアルツハイマー病の画像化のためのインビボの診断剤として適している。放射能の検出は、ガンマ線カメラを用いるか、又は陽電子射出断層撮影（ＰＥＴ）により、当該分野で良く知られている操作法に従って実施する。
【０２１５】
好ましくは、本発明の化合物の遊離の塩基又は製薬上許容しうる塩の形態、例えば１塩化物又は２塩化物を診断剤として生薬製剤中で使用する。本発明の化合物を含有する生薬製剤は場合により当該分野で知られた補助剤、例えば緩衝液、塩化ナトリウム、乳酸、界面活性剤等を含有する。使用の前に滅菌条件下で生薬製剤を濾過することにより滅菌することが可能である。
【０２１６】
放射能線量は適用当たり１〜１００ｍＣｉ、好ましくは５〜３０ｍＣｉ、そして最も好ましくは５〜２０ｍＣｉとなる。本発明の範囲に包含されるＴＨ組成物は陽電子射出断層撮影（ＰＥＴ）における診断剤として使用できる。
【０２１７】
本発明の化合物はいずれかの適当な経路により、好ましくはそのような経路に適した医薬組成物の形態において、そして脳内のＴＴＲに結合することによりガンマ線カメラ又はＰＥＴにより検出される効果のある用量において、投与してよい。典型的には、投与は非経口、例えば静脈内、腹腔内、皮下、皮内、又は筋肉内とする。静脈内投与が好ましい。即ち、例えば、本発明は許容可能な担体、例えば血清又は生理食塩水中に溶解又は懸濁した造影剤の溶液を含む非経口投与のための組成物を提供する。
【０２１８】
水性の担体は水、アルコール性／水性の溶液、食塩水、非経口ベヒクル、例えば塩化ナトリウム、リンゲルデキストロース等を包含する。非水性の溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油及び注射可能な有機性エステル類、例えばオレイン酸エチルである。他の製薬上許容しうる担体、非毒性の賦形剤、例えば塩、保存料、緩衝剤等は例えばＲＥＭＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１５版  Ｅａｓｔｏｎ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，ｐｐ．１４０５−１４１２及び１４６１−１４８７（１９７５）及びＴＨＥ  ＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＦＯＲＭＵＬＡＲＹ  ＸＩＶ．，第１４版  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９７５）に記載されている。水性担体が好ましい。
【０２１９】
本発明の医薬組成物は水性媒体中に、場合により生薬中の慣用的な添加剤と組み合わせて、本発明の化合物を懸濁又は溶解すること、そして次に場合により懸濁液又は溶液を滅菌することにより、自体公知の態様において製造する。適当な添加剤は例えば生理学的に許容される緩衝剤（例えばトロメタミン）、複合体形成剤（例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸）の添加、又は所望により電解質、例えば塩化ナトリウム、又は所望により抗酸化剤、例えばアスコルビン酸等である。
【０２２０】
水又は生理食塩水中の本発明の化合物の懸濁液又は溶液が経腸投与又は他の目的のために望まれる場合は、それらを生薬分野で慣用的な１つ又は数種の副次的物質（例えばメチルセルロース、乳糖、マンニトール）及び／又はテンサイド（例えばレシチン、「Ｔｗｅｅｎ」、「Ｍｙｒｊ」）及び／又は風味を向上させるフレーバー剤（例えばエーテル系オイル）と混合する。
【０２２１】
組成物は従来のよく知られた滅菌手法により滅菌してよく、或いは濾過滅菌してよい。得られた水溶液はそのまま使用するためにパッケージングするか、又は凍結乾燥し、凍結乾燥調製品は投与前に滅菌溶液と混合する。組成物は生理学的状態に近似させるために必要な製薬上許容しうる副次的物質、例えばｐＨ調節剤及び緩衝剤、張力調節剤、水和剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート等を含有してよい。
【０２２２】
放射性ハロゲンを有する本発明による化合物に関しては、これらの化合物は「ホット」化合物、即ち化合物中に放射性ハロゲンを伴っているものとして出荷することができ、そして例えば生理学的に許容される食塩水中で投与する。金属複合体の場合は、これらの化合物は「コールド」化合物、即ち放射性イオンを伴わないものとして出荷することができ、そして次にＴｃ発生物質溶出剤又はＲｅ発生物質溶出剤と混合する。
【０２２３】
血管形成の抑制
本発明は又、別の部分において、血管形成を抑制することが必要な対象におけるそのための組成物及び方法を提供する。血管形成を抑制することによる治療に適する状態は、例えば原発性又は転移性の腫瘍及び糖尿病性網膜症を包含する。組成物は有効量のテトラヨードチロ酢酸（ＴＥＴＲＡＣ）、トリヨードチロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）、モノクローナル抗体ＬＭ６０９、又はこれらの組み合わせを包含できる。このような抗血管形成剤は前血管形成剤を抑制するために細胞表面において作用することができる。組成物は場合により賦形剤１つ以上と共に生理学的及び薬学的に許容される担体中に抗血管形成性の物質の抗血管形成有効量を包含する滅菌された、注射可能な医薬品製剤の形態であることができる。
【０２２４】
別の特徴において、本発明は血管形成を抑制することによる治療が必要な患者に対し、血管形成を抑制するために有効な抗血管形成剤のある量を投与することによる、そのような治療に適する状態を治療するための方法を提供する。本発明の組成物は頭部頚部、神経膠腫、皮膚、肺、乳房、及び甲状腺を包含する癌に関連する血管形成を抑制するために使用できる。テトラックのような甲状腺ホルモン拮抗剤は、重合体コンジュゲートとして、又はナノ粒子として投与できる。
【０２２５】
原形質膜において開始されるテトラックの細胞作用の性質：
甲状腺ホルモンに対する原形質膜受容体において作用することにより、テトラックは血管新生の標準的試験（ニワトリの絨毛尿膜、皮膚微細血管内皮細胞）においてＴ４及びＴ３の前血管形成性作用を抑制している。テトラックはヒト及び動物の癌細胞のインビトロの成長に対する、並びに、特定のインビボのモデルにおける、アゴニスト甲状腺ホルモン類縁体（Ｔ４、Ｔ３）の作用をブロックする。テトラックにより増殖が抑制されるヒト癌細胞モデルに包含されるものは乳癌及び肺癌である。動物の腫瘍細胞に包含されるものは、神経膠腫／神経膠芽腫のようなヒトの脳の癌に関するモデルである神経膠腫細胞である。
【０２２６】
アゴニスト甲状腺ホルモン類縁体の非存在下の原形質膜において開始されるテトラックの作用：
インテグリン上のＲＧＤ部位へのホルモン受容体部位の接近性はポリペプチド内皮細胞成長因子、限定しないが例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の前血管形成性の活性をブロックするＴ４及びＴ３のようなホルモンアゴニストの非存在下におけるテトラックの能力の根拠をなしている。
【０２２７】
神経膠腫及び甲状腺癌細胞におけるアポトーシスを誘導するためのテトラック
以下に示す図は、Ｃ６神経膠腫細胞における、そして甲状腺癌細胞（ＢＨＰ２−７）におけるアポトーシスをテトラックが誘導することができることを示している。即ち、癌細胞がテトラックに曝露された場合にその増殖の低下の少なくとも部分はプログラムされた細胞死（アポトーシス）である。増殖が何れかの癌細胞の研究において緩徐化した場合、問題は、細胞周期の停止モードにおいて細胞が生存するか、又はそれらが死滅するかである。細胞死は細胞周期の停止よりも望ましいものである。
【０２２８】
ウィルス体に対するテトラック
テトラックはウィルス体、例えば西ナイルウィルス、ＨＩＶ、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、アデノウィルス、及び他のウィルス体の治療のために使用してよい。特定のウィルス体、例えば自身の細胞への進入がＲＧＤ結合部位を介したアルファｖベータ３インテグリンに依存している西ナイルウィルスは、テトラックで治療できる。提案される作用機序はアルファＶ単量体が細胞の核内に遊走すること、そして、これは多くのウィルスが細胞内部に進入する経路となることである。テトラックは、それがアルファｖベータ３インテグリン結合部位への結合によりこの細胞内へのウィルスの進入をブロックできることから、ウィルス体の治療のために使用できる。
【０２２９】
ヒト肺癌に対するテトラック
甲状腺ホルモン／テトラックの作用には、小細胞及び非小細胞のヒト肺癌細胞の両方において、エストロゲン受容体（ＥＲ）が関与している。Ｌ−チロキシン（Ｔ４）及び３，５，３’−トリヨード−Ｌ−チロニン（Ｔ３）は小細胞及び非小細胞のヒト肺癌系統の増殖をもたらし、そしてそれはエストロゲン受容体−アルファ（ＥＲアルファ）の腫瘍細胞における存在を必要とする機序を介している。テトラヨードチロ酢酸（テトラック）はＴ４及びＴ３の細胞内行動におけるインテグリンアルファｖベータ３上の甲状腺ホルモンに対する細胞表面受容体を包含するためのプローブとなる。テトラックは遊離の状態、又はナノ粒子としてのいずれかにおいて、肺癌細胞に対するＴ４及びＴ３のこの増殖作用をブロックする。このことはインテグリンアルファｖベータ３上の甲状腺ホルモンに対する細胞表面受容体がＴ４及びＴ３の作用を媒介していることを示している。本発明者等は又、抗アルファＶ及び抗ベータ３を用いて、そしてＲＧＤペプチドを用いて、肺癌細胞に対するＴ４及びＴ３の増殖作用をブロックした。これらの所見は更に、肺癌細胞の増殖のＴ４及びＴ３による促進における甲状腺ホルモンに対するインテグリン受容体の役割を裏付けるものである。
【０２３０】
テトラックは遊離の状態、又はナノ粒子として、ヒト肺癌の対処のための魅力的で新規な戦略である。その抗増殖作用に加えて、テトラックは遊離の状態、又はナノ粒子として、抗血管形成性であり、肺癌の成長を支援する新しい血管の成長を抑制する。即ち、テトラックは肺腫瘍成長の抑制関連する少なくとも２つの個別の作用を有する。
【０２３１】
テトラックのナノ粒子形成に包含されるものはポリリジルグリコール酸（ＰＬＧＡ）に、又はコラーゲン又はテトラックによる細胞侵入を防止する十分な大きさの他の分子に、エステル又はエーテル結合により連結されたテトラックである。これらの製剤はインテグリンアルファＶベータ３上の甲状腺ホルモンに対する細胞表面受容体にテトラックの作用を限定する。
【０２３２】
癌に関連する新しい血管の成長：
血管形成を抑制することによる治療に適する状態の例は、限定しないが例えば、原発性又は転移性の腫瘍、例えば限定しないが神経膠腫及び乳癌を包含する。そのような方法において、甲状腺ホルモン誘導血管形成作用を抑制する化合物は血管形成を抑制するために使用される。そのような方法の詳細は実施例１２において説明する。甲状腺ホルモン拮抗剤、例えばテトラック、その類縁体、重合体コンジュゲート、及びナノ粒子はまたアンジオポエチン−２を抑制するための抗血管形成性の薬剤として使用できる。この抑制は、アンジオポエチン−２が腫瘍周囲の血管を脱安定化させ、これらの血管をＶＥＧＦによる新芽形成の誘導に対してより感受性とすることから、癌に関連する新しい血管の成長の防止を支援するものである。
【０２３３】
糖尿病性網膜症：
血管形成を抑制することによる治療に適する状態の例は、限定しないが例えば、糖尿病性網膜症、及び関連する状態である。そのような方法において、甲状腺ホルモン誘導血管形成作用を抑制する化合物は血管形成を抑制するために使用される。そのような方法の詳細は実施例８Ａ及びＢにおいて説明する。
【０２３４】
低酸素（糖尿病ではなく）により誘導される増殖性網膜症はアルファＶ（αＶ）インテグリンの発現に依存していることが知られている（Ｅ  Ｃｈａｖａｋｉｓ等、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ４５：２６２−２６７，２００２）。ここでは特定のインテグリンアルファＶベータ３（αＶβ３）に対する甲状腺ホルモンの作用は糖尿病性網膜症の発症において寛容であることを提案する。インテグリンαＶβ３はここでは甲状腺ホルモンに対する細胞表面受容体として認識される。甲状腺ホルモン、その類縁体、及び重合体コンジュゲートはこの受容体を介して作用することにより血管形成を誘導する。
【０２３５】
皮膚科分野−皮膚の末梢血管拡張症及び血管腫の大きさを減衰させるナノ粒子のテトラヨードチロ酢酸（テトラック）
甲状腺ホルモン拮抗剤、例えばテトラック、その類縁体、重合体コンジュゲート、及びナノ粒子はまた非癌の皮膚障害を治療するために使用できる。誘導体化されたテトラックのこの治療及び／又は美容上の作用はその抗血管形成性の活性に基づいている。皮膚の末梢血管拡張症又はクモ状血管腫に軟膏又はクリームとして局所適用された場合、誘導体化されたテトラックは内因性（循環系中）甲状腺ホルモンの、そして、ポリペプチド血管成長因子の内皮細胞に対する前血管形成性の作用に対抗することになる。ＰＬＧＡ誘導体として局所適用されたホルモン類縁体の全身作用は無視できる程度である。低等級の末梢血管拡張症又は血管腫に対しては、誘導体化されたテトラックはＯＴＣ調製品中の臨床使用のために使用可能としてよい。
【０２３６】
テトラックは甲状腺ホルモンの血小板凝集作用に対抗するため、テトラック適用部位における外傷は局所出血をもたらす場合がある。これは既存の未治療の末梢血管拡張症及び血管腫に伴う危険である。しかしながら、そのような欠陥の幹部の大きさのテトラックの適用による良好な減衰は、局所的な斑状出血の危険性を低下させる。
【０２３７】
ナノ粒子コンジュゲート甲状腺拮抗剤に関する追加的な皮膚科分野の局所適用は、シヴァット多形皮膚委縮症（日光への長期曝露による顔面の血管新生及び拡張した血管）、ざ瘡又は顔面のしゅさ、乾癬の単独又はビタミンＤ類縁体との組み合わせ、及び皮膚癌を包含する。
【０２３８】
使用可能な抗血管形成性の薬剤は本明細書においてターゲティングする皮膚疾患にたいする使用には、高価すぎる。これらの薬剤はそれらが局所吸収されないため、皮膚適用のためには不適当である場合がある。
【０２３９】
癌の化学療法剤感作及び抗癌剤としてのテトラック
本発明の甲状腺ホルモン類縁体、例えばテトラック、トリアック、テトラック及びトリアックの類縁体、その重合体及びナノ粒子コンジュゲート、及びインテグリンαＶβ３上の甲状腺ホルモン受容体の他の拮抗剤は、癌の化学療法剤感作及び抗癌剤としても使用できる。テトラック、トリアック、類縁体、甲状腺拮抗剤、及びその重合体コンジュゲート及びナノ粒子は疾患の回帰の原因である薬剤耐性の発生を抑制する。テトラックは神経芽腫、骨肉腫及び乳癌から誘導した耐性腫瘍細胞系統において、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びトリコスタチンＡに対する細胞応答を増強し、耐性を逆行させる。
【０２４０】
上記した通り、甲状腺ホルモンは癌の進行において重要な役割を果たしている。更に又、テトラックは細胞増殖及び血管形成を抑制するその能力を介して抗癌剤機能を有することが本明細書において示されている。実施例３１において詳述する通り、テトラックは又、疾患の回帰の原因である薬剤耐性の発生を抑制する。実施例３１に示す通り、テトラックは神経芽腫、骨肉腫及び乳癌から誘導した耐性腫瘍細胞系統において、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びトリコスタチンＡに対するインビトロの細胞応答を増強している。テトラックの作用機序には古典的な薬品耐性遺伝子の発現は関与していない。しかしながら、細胞における放射標識ドキソルビシンの取り込みはテトラックにより増強され、化学療法剤に関するエキスポートの機序の１つ以上が抑制されることを示唆している。テトラックは又老化及びアポトーシスに対する細胞の感受性を増強することが分かっており、この物質が多剤耐性の機序をターゲティングする場合があることを示唆している。テトラックは以前にインビトロの腫瘍細胞増殖を抑制することが分かっている。本明細書において報告するインビボの試験によれば、パルスされた用量計画におけるテトラックはヌードマウスにおいてドキソルビシン耐性ヒト乳腺腫瘍の成長を抑制する場合に有効であることが分かった。この状態において、ドキソルビシン感受性は回復されておらず、１）テトラックによる薬剤感受性のインビトロの回復はインビボの耐性減少とは相関していない場合があること、及び２）テトラックはドキソルビシン耐性細胞における有効な化学療法剤であること、を示している。
【０２４１】
癌細胞の顕著な特徴の１つは実質的に如何なる型のストレスに対しても順応して耐性となるそれらの能力である。臨床的見地からは、これが治療の失敗及び疾患の回帰の第１の原因とみなされる。従って、薬品耐性の発生を防止及び／又は逆行させる方策を開発することには大きな利益が存在する。近年、多くの薬品候補（その大部分がイオンチャンネルの抑制剤である）が発見され、そして、大部分はインビトロの薬品耐性を逆行させる場合にきわめて有効であることがわかったものの、それらは、頻繁にはそれらの高毒性のために、インビボでは功を奏しない。新規でより低毒性の薬品耐性調節剤の検索において、本発明者等は、他の以前に発見されている薬品耐性逆行剤とは異なり、検出可能な毒性を有さない期待できる薬剤として甲状腺ホルモン拮抗剤テトラックを発見しており、そしてこれは薬品の輸送に対して、そして、薬品誘導の増殖の停止及びアポトーシス性の死滅に対する細胞の感受性を制御するシグナリング経路に対して、二重の作用を発揮する。これは、腫瘍血管形成に対する上記した作用に加えて、テトラックを期待できる抗癌薬の候補とするものである。
【０２４２】
テトラックが薬品感受性及び薬品耐性の細胞に対してインビトロで等しい抗増殖活性を発揮したという初期の所見（図５３）は、この拮抗剤が薬品耐性を克服できることを示唆していた。ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びＴＳＡに対する細胞の応答はこれらの薬剤をテトラックと組み合わせた場合に有意に増強された（図５４）。しかしながら、これらの薬剤に対する耐性に関与する機序は必ずしも同様でないため、テトラックは１つより多い薬品耐性経路を調節することにより作用していると考えられる。この可能性に着目して、実施例３１において、本発明者等はＰ−糖蛋白、ＳＯＤ及びＧＳＴ−πの発現に対するテトラックの作用を検討し、そしてこれらの遺伝子の何れの発現も有意に改変されなかったことを観察した（図５５）。他にはアゴニスト甲状腺ホルモンがＰ−ｇｐの発現を増大させることができることが分かっている。使用した濃度におけるテトラックはインテグリン受容体において主にその甲状腺ホルモン拮抗活性を呈しており、即ち本発明者等の結果はＰ−ｇｐ遺伝子発現が細胞表面インテグリン受容体からはモジュレートされないことを示している。
【０２４３】
しかしながら、薬品輸送の分析によれば、放射標識ドキソルビシンの細胞内蓄積は非投与細胞と比較してテトラックの存在下で有意に増大しており（図５５Ｃ）、そしてテトラックがＰ−ｇｐ活性の抑制剤として作用する可能性が示唆された。甲状腺ホルモンがαＶβ３インテグリンに、そしてＰ−ｇｐに結合することができるという以前の観察結果を鑑みれば、インテグリンへのそれらの結合をテトラックが抑制するという所見は、Ｐ−ｇｐへのそれらの結合もまたテトラックが妨害するという可能性が生じる。同じ理論を用いれば、テトラックは又Ｐ−ｇｐへの結合に関して薬品と競合し、そしてこのためこのトランスポーターの薬効を途絶するとも考えられる。如何なる機序であれ、薬品のエキスポートがテトラックにより抑制されたという本発明者等の所見は、それが化学療法に対する癌の応答の調節におけるホルモンホメオスタシスの重要な役割に光明を投じていることから、基本的重要性を有している。
【０２４４】
この所見はテトラックが薬品耐性を逆行させる機序を理解することにおいて意味のある進歩をもたらすが、この拮抗剤が非ｐ−ｇｐ物質であるシスプラチンに対する細胞の応答を増強する理由を説明しているわけではない（図５４）。蓄積されつつある証拠は老化又はアポトーシス性の死滅を起こす細胞の能力が化学療法の結果において重要な役割を果たしていることを示していることから、本発明者等は実施例３１において相当する経路に対するテトラックの作用を試験した。図５６に示す通り、ドキソルビシン誘導増殖停止（ｐ２１／ＷＡＦ１の増強された発現）及びＳＡ−β−Ｇａｌ及び細胞死（カスパーゼ−３活性化及び染色質の縮合）を起こす細胞の能力は、テトラックへの曝露により劇的に増強され、癌細胞に対して強制的に老化又はアポトーシスを起こさせることはテトラックが薬品耐性を逆行させる追加的な機序となっていると考えられる。
【０２４５】
これに関し、予備的な試験はｂａｄ及びｂａｘのような前アポトーシス性の遺伝子の増大した発現が造血系起源の癌における化学療法剤への増大した応答に関連していることを示している。しかしながら大部分の固形腫瘍の場合、アポトーシスと化学療法への細胞の応答との間の明確な関係は確立されていない。これとは対照的に、老化を起こす細胞の能力はこれらの腫瘍の治療結果に関連することが最近分かった。本発明者等はテトラックが薬品の輸送を調節するプロセスと機序の両方を調節することを発見しており；したがってこの拮抗剤は造血系及び固形腫瘍起源の両方の攻撃的な癌の治療のために広範な用途を有していると考えられる。これに関する例は、毒性作用を全く伴うことなくヌードマウスにおいて薬品耐性腫瘍の成長を抑制することにおいてテトラックが効果的であることを示すインビボのデータ（図５７）により与えられる。これらの所見は、テトラックが血管形成を抑制することができるという事実に加えて、このホルモン拮抗剤を攻撃的な癌の治療のための強力な手段としている。
【０２４６】
ドキソルビシン耐性はテトラックによりインビトロで逆行させられたが、異種移植片における薬品感受性を回復させなかったという観察結果には幾つかの説明が必要である。第１に、異種移植片試験において使用したテトラックの濃度は最大腫瘍応答を得るために十分高値（３０ｍｇ／ｋｇｘ３）である。第２に、異種移植片試験における細胞外マトリックス中への細胞の包埋は細胞培養の場合とは極めて異なる微小環境をもたらし、そしてその差異はＭＤＲポンプ又は化学療法剤の細胞内滞留時間に影響する他の要因に影響すると考えられる。より低濃度のテトラックが以前に耐性であった細胞においてドキソルビシンの作用の検出を可能にするかどうかを調べるためにはテトラック及びドキソルビシンの濃度試験を実施することが重要となる。
【０２４７】
治療及び製剤の方法：
甲状腺ホルモン類縁体、重合体形態、及び誘導体は血管形成を促進することが必要な患者において、そのための方法において使用できる。方法は、１週間以上、低値の一日当たり用量において甲状腺ホルモン類縁体、重合体形態、及び誘導体の有効量を同時投与することを包含する。方法は心筋梗塞後の心臓機能を回復させるための治療として使用してよい。方法は又、心筋虚血に罹患した冠動脈疾患、又は心臓以外の区域への不十分な血流、例えば末梢血管疾患、例えば低下した血流が問題となる末梢動脈閉塞性疾患を有する患者において血流を改善するために使用してよい。
【０２４８】
化合物は経口、直腸、局所又は非経口（例えば皮下、筋肉内及び静脈内）投与を含む、投与される化合物に適する何れかの医学的に許容される手段を介して投与できる。例えばアデノシンは極めて短い半減期を有する。この理由のため、それは好ましくは静脈内投与される。しかしながらはるかに長い半減期を有し、そして他の手段を介して投与できるアデノシンＡ２アゴニストが開発されている。甲状腺ホルモン類縁体、重合体形態、及び誘導体は例えば静脈内、経口、局所、鼻内投与により投与できる。
【０２４９】
一部の実施形態においては、甲状腺ホルモン類縁体、重合体形態、及び誘導体は異なる手段を介して投与される。
【０２５０】
血管形成の刺激において有効となるために必要とされる甲状腺ホルモン、その類縁体、重合体形態、及び誘導体の量は、当然ながら、治療される個体により変動し、そして最終的には医師の判断による。考慮すべき要因は治療される患者の状態、使用される特定のアデノシンＡ２受容体アゴニストの薬効、製剤の性質、及び患者の体重を包含する。甲状腺ホルモン類縁体又はその重合体形態、及び誘導体の閉塞治療用量は所望の作用を与える何れかの用量である。
【０２５１】
上記した化合物は好ましくは投与様式に対する許容可能な担体と共に甲状腺ホルモン類縁体又はその重合体形態、及び誘導体を含む製剤において投与される。一般的に当該分野で知られる通り、意図する用途に適する活性成分を含有する製剤又は薬物送達系を使用できる。経口、直腸、局所又は非経口（例えば皮下、腹腔内、筋肉内及び静脈内）投与のための適当な製薬上許容しうる担体は当該分野で知られている。担体は製剤の他の成分との適合性があり、そしてそのレシピエントに対して有害ではないという意味において製薬上許容しうるものでなければならない。
【０２５２】
非経口投与に適する製剤は好都合には活性化合物の滅菌水性製剤を包含し、これは好ましくはレシピエントの血液と等張である。即ち、そのような製剤は好都合には蒸留水、蒸留水中５％デキストロース、又は食塩水を含有してよい。有用な製剤は又、適切な溶媒で希釈することにより上記した非経口投与のために適当な溶液を与える、式（Ｉ）の化合物を含有する濃縮された溶液又は固体を包含する。
【０２５３】
経腸投与のためには、化合物は、活性化合物の所定の量を各々が含有するカプセル、カシェ剤、錠剤又はロゼンジ剤のような個別の単位中で不活性の担体内に配合されるか；粉末又は顆粒とするか；又は水性の液体又は非水性の液体中の懸濁液又は溶液、例えばシロップ、エリキシル、乳液、又はドラフトであることができる。適当な担体はデンプン又は糖類であってよく、そして潤滑剤、フレーバー剤、結合剤、及び同様の性質の他の物質を包含する。
【０２５４】
錠剤は圧縮又は鋳造により、場合により１つ以上の副次成分を包含して製造してもよい。圧縮された錠剤は自由流動性の形態、例えば粉末又は顆粒の活性化合物を、場合により副次的成分、例えば結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、界面活性剤又は分散剤と混合して、適当な機械中で圧縮することにより製造してよい。鋳造された錠剤は、何れかの適当な担体との粉末化された活性化合物の混合物を適当な機械中で鋳造することにより製造してよい。
【０２５５】
シロップ又は懸濁液は、何れかの副次的成分も添加してよい例えばスクロースのような糖類の濃縮された水溶液中に活性化合物を添加することにより製造してよい。そのような副次的成分はフレーバー、糖類の結晶化を遅延させる物質、又は多価アルコール、例えばグリセロール又はソルビトールのような何れかの他の成分の溶解性を増大させるための物質を包含してよい。
【０２５６】
直腸投与用の製剤は、座薬基剤のための従来の担体、例えばカカオ脂、又はＷｉｔｅｐｓｏｌＳ５５（Ｄｙｎａｍｉｔｅ  Ｎｏｂｅｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙの商標）を用いながら座薬として提供してよい。
【０２５７】
或いは、化合物はリポソーム又は微小球（又はマイクロ粒子）として投与してよい。患者に対する投与のためのリポソーム及び微小球を製造するための方法は当該分野で良く知られている。参照により本明細書に組み込まれる米国特許４，７８９，７３４はリポソーム中に生物学的物質をカプセル化するための方法を記載している。本質的には、物質を水溶液中に溶解し、適切なリン脂質及び脂質を添加し、所望により界面活性剤も使用し、そして材料を必要に応じて透析又は超音波処理する。知られた方法の考察はＧ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，”Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｐ．２８７−３４１（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９７９）に記載されている。
【０２５８】
重合体又は蛋白から形成された微小球は当該分野で良く知られており、そして胃腸管を通過して直接血流中に至るように調節することができる。或いは、化合物を配合し、そして微小球、又は微小球の複合物を移植することにより、数日〜数か月の範囲の期間に渡り緩徐放出を行うことができる。例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許４，９０６，４７４、４，９２５，６７３及び３，６２５，２１４、及びＪｅｉｎ，ＴＩＰＳ１９：１５５−１５７（１９９８）を参照できる。
【０２５９】
１つの実施形態において、甲状腺ホルモン類縁体又はその重合体形態、及びアデノシン誘導体を静脈内投与後に毛細血管床中に定着するように適当な大きさとされたリポソーム又は微粒子中に製剤することができる。リポソーム又は微粒子が虚血組織を包囲する毛細血管床中に定着すれば、薬剤はそれらが最も有効であることができる部位に局所的に投与することができる。虚血組織をターゲティングするために適するリポソームは一般的に約２００ナノメートル未満であり、そして典型的には例えば参照により本明細書に組み込まれる「Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ」と題されているＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒへの米国特許５，５９３，６８８に開示されている通り単層の小胞である。
【０２６０】
好ましい微粒子は生体分解性の重合体、例えばポリグリコリド、ポリラクチド及びこれらの共重合体から製造したものである。当業者であれば種々の要因、例えば所望の薬剤放出速度及び所望の用量を包含する種々の要因に応じて適切な担体系を容易に決定できる。
【０２６１】
１つの実施形態において、製剤は血管内部に直接カテーテルを介して投与される。投与は例えばカテーテル中の孔部を介して行うことができる。活性化合物が比較的長い半減期（１日〜１週間以上のオーダー）を有するこれらの実施形態においては、製剤はＨｕｂｂｅｌｌ等への米国特許５，４１０，０１６に開示されているもののような生体分解性重合体ヒドロゲル中に包含させることができる。これらの重合体ヒドロゲルは組織管腔内部に送達することができ、そして活性化合物は重合体が分解するに従って経時的に放出される。所望により、重合体ヒドロゲルは活性化合物を自身内部に分散させて含んでいる微粒子又はリポソームを有することができ、これにより活性化合物の制御放出の別の機序が与えられる。
【０２６２】
製剤は単位剤型において好都合に提供してよく、そして薬学分野でよく知られた何れかの方法により製造してよい。全ての方法は、１つ以上の副次的成分を構成する担体に活性化合物を会合させるための工程を包含する。一般的に、製剤は活性化合物を液体担体又は微細分割固体担体と均質及び緊密に会合させること、そして次に、必要に応じて生成物を所望の単位剤型に形状付与することにより製造される。
【０２６３】
製剤は場合により追加的な成分、例えば種々の生物学的に活性な物質、例えば成長因子（例えばＴＧＦ−ベータ、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子アルファ及びベータ（ＴＧＦアルファ、及びベータ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、及び血管内皮成長因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ））、抗ウィルス剤、抗細菌剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、鎮痛剤、脈管形成剤、及び細胞接着分子を包含することができる。
【０２６４】
上記した成分に加えて、製剤は更に医薬品製剤の分野で利用されている１つ以上の任意の副次的成分、例えば希釈剤、緩衝剤、フレーバー剤、結合剤、界面活性剤、濃厚化剤、潤滑剤、懸濁剤、保存料（例えば抗酸化剤）等を包含してよい。
【０２６５】
製剤及び治療方法
本発明の単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子インデューサーと組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体、又は単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子受容体と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体のアゴニストは、使用される単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子、インデューサー又はアゴニストと組み合わせた特定の重合体甲状腺ホルモン類縁体に適合する何れかの経路により投与してよい。即ち、適宜、投与は経口又は非経口、例えば静脈内及び腹腔内の投与経路であってよい。更に又、投与は単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子、インデューサー又はアゴニストと組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体の周期的瞬時注射によるものであってよく、或いは、外部（例えばｉｖバッグ）又は内部（例えば生体分解性インプラント、又は移植された単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺類縁体を生産する細胞のコロニー）にあるリザーバからの静脈内又は腹腔内投与により、より継続的に行ってよい。
【０２６６】
本発明の治療薬（即ち単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子、インデューサーと組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体、又は単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子受容体と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体のアゴニスト）は個体に対して、何れかの適当な手段により、直接（例えば局所的に、例えば注射、移植又は組織局部に対する局所投与による）又は全身（例えば非経口又は経口）に提供してよい。薬剤を非経口的に、例えば静脈内、皮下、筋肉内、眼内、腹腔内、筋肉内、舌下、直腸、膣内、眼窩内、脳内、頭蓋内、脊髄内、脳質内、髄腔内、クモ膜下内、包内、鼻内により、或いはエアロゾル投与により提供する場合、薬剤は好ましくは水性又は生理学的に適合性のある流体の懸濁液又は溶液の部分を含む。即ち、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子、担体又はベヒクルと組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体は、患者への所望の薬剤の送達に加えてそれが患者の電解質及び／又は容量バランスに別様に悪影響を与えないように、生理学的に許容されるものである。即ち薬剤のための流体の媒体は規定度の生理食塩水（例えば９．８５％水性ＮａＣｌ、０．１５Ｍ、ｐＨ７〜７．４）を含むことができる。
【０２６７】
重合体甲状腺ホルモン類縁体の前ドメインとの２量体の会合は、典型的には相当する成熟形態よりも生理学的溶液中でより可溶性である重合体甲状腺ホルモン類縁体の前形態をもたらす。
【０２６８】
非経口投与のための有用な溶液は例えばＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．編）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．，１９９０に記載の製薬分野でよく知られた方法の何れかにより製造してよい。本発明の治療薬の製剤は、例えばポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、植物起源の油脂、水素化ナフタレン類等を包含してよい。特に直接投与のための製剤はグリセロール及び他の高粘度組成物を包含することにより、所望の局部に薬剤が維持され易くしてよい。生体適合性、好ましくは生体再吸収性の重合体、例えばヒアルロン酸、コラーゲン、リン酸３カルシウム、ポリブチレート、ラクチド、及びグリコリド重合体及びラクチド／グリコリド共重合体がインビボの薬剤の放出を制御するための有用な賦形剤であってよい。これらの薬剤のための他の潜在的に有用な非経口の送達系はエチレン酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、インプラント可能な注入システム、及びリポソームを包含する。吸入による投与のための製剤は賦形剤として、例えば乳糖を含有するか、又は例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレート及びデオキシコレートを含有する水溶液、又は点鼻薬の形態における、又は鼻内適用されるゲルとしての投与のための油性の溶液であってよい。非経口投与のための製剤はまた舌下投与のためのグリココレート、直腸投与のためのメトキシサリシレート、又は膣内投与のためのクエン酸を包含してよい。直腸投与用の座薬も又、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子、インデューサー又はアゴニストと組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体を、非刺激性の賦形剤、例えばカカオ脂又は室温で固体、体温で液体である他の組成物と混合することにより製造してよい。
【０２６９】
皮膚表面に対する局所適用のための製剤は、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子、インデューサー又はアゴニストと組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体を、皮膚科的に許容される担体、例えばローション、クリーム、軟膏又は石鹸と共に分散させることにより製造してよい。特に有用なものは、適用を局所化し、除去を抑制するために皮膚上でフィルム又は層を形成することができる担体である。内部組織表面への局所適用のためには、薬剤は組織接着性の液体又は組織表面への吸着を増強することが分かっている他の物質中に分散させてよい。例えば、ヒドロキシプロピルセルロース又はフィブリノーゲン／トロンビン溶液が好都合に使用される。或いは、組織コーティング溶液、例えばペクチン含有製剤を使用してよい。
【０２７０】
或いは、本明細書に記載した薬剤は経口投与してよい。治療薬としての蛋白の経口投与は、大部分の蛋白はそれらが血流中に吸収され得るよりも前に哺乳類の消化器系における消化酵素及び酸により容易に分解されることから、一般的には実施されない。しかしながら、本明細書に記載した単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体は典型的には酸安定性であり、そしてプロテアーゼ耐性である（例えば米国特許４，９６８，５９０参照）。更に又、ＯＰ−１は乳腺抽出物、初乳及び５７日乳汁と同一である。更に、乳腺抽出物から精製したＯＰ−１は形態発生的に活性であり、そして又、血流中に検出される。摂取乳汁を介した母体からの投与はＴＧＦ−βスーパーファミリー蛋白の天然の送達経路である場合がある。Ｌｅｔｔｅｒｉｏ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４：１９３６−１９３８（１９９４）はＴＧＦ−βがネズミ乳汁中に存在すること、及び放射標識ＴＧＦ−βは授乳中の幼若体の胃腸粘膜から吸収されることを報告している。標識された摂取後のＴＧＦ−βは肺、心臓及び肝臓を含む幼若体の身体組織中で未損傷の形態で急速に現れる。最後に、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体の可溶性形態は、抗酸化剤又は抗炎症剤を伴うか伴わない、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた成熟重合体甲状腺ホルモン類縁体である。これらの所見、並びに後述する実施例に開示するものは、経口及び非経口の投与が個体への単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺類縁体を包含するＴＧＦ−βスーパーファミリー蛋白を投与するための実効性のある手段であることを示している。更に又、本明細書に記載した単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた特定の重合体甲状腺類縁体の成熟形態は典型的にはほぼ不溶性であるが、乳汁（及び乳腺抽出液及び初乳）中に検出される単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺類縁体の形態は、恐らくは、発現された完全長のポリペプチド配列の前ドメインの部分又は全てとの成熟した形態発生的に活性な形態の会合により、及び／又は、乳汁成分１つ以上との会合により、容易に溶解する。従って本明細書に記載した化合物はまたインビトロ及びインビボのそれらの溶解性を増強させることができる分子と会合させてよい。
【０２７１】
単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体をＣＮＳの障害に対する治療薬として使用することを意図する場合、追加的な問題点、即ち、血液中に存在する物質の選択された種類以外の全てを効果的に分別除去することによりそれらが脳内を通過することを妨げる脳の毛細血管壁の構造である血液脳関門を克服することに着目しなければならない。血液脳関門は脳内への重合体甲状腺ホルモン類縁体の直接の注入により、又は、嗅覚ニューロンによる取り込み及び逆方向輸送に適する製剤の鼻内投与又は吸入により、効果的にバイパスすることができる。或いは、重合体甲状腺ホルモン類縁体は血液脳関門を通過するその輸送を増強するために修飾することができる。例えば、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体のトランケーションされた形態、又は、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体を刺激する薬剤が最も功を奏する場合がある。或いは、本発明により提供される単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子、インデューサー又はアゴニストと組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体は、当該分野で知られた標準的な手段を用いながら、誘導体化するか、又は親油性部分に、又は血液脳関門を通過して活動的に輸送される物質にコンジュゲートすることができる。例えば
Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ７：３１４−３３０（１９８６）及び米国特許４，８０１，５７５を参照できる。
【０２７２】
本発明により提供される化合物はまた所望の組織に対して単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子、インデューサー又はアゴニストと組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体をターゲティングすることができる分子と会合させてよい。例えば、所望の組織の細胞上の表面分子と特異的に相互作用する抗体、抗体フラグメント、又は他の結合蛋白を使用してよい。有用なターゲティング分子は、例えば米国特許５，０９１，５１３に記載の単鎖結合部位技術を用いながら設計してよい。ターゲティング分子は単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子、インデューサー又はアゴニストと組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体と共有結合的に、又は非共有結合的に会合させることができる。
【０２７３】
当該分野で知られる通り、製剤された組成物は単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子、インデューサー又はアゴニストと組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体の治療有効量を含有する。即ち、それらは、損傷を受けた中枢又は末梢の神経系の機能を、それらの完全な回復に至るまでの検出可能な回復を刺激するために十分な時間、罹患した神経系の組織に対して薬剤の適切な濃度を与える量を含有する。当該分野で知られる通り、これらの濃度は多くの要因、例えば選択された薬剤の生物学的な薬効、特定の薬剤の化学的特性（例えば疎水性）、その製剤、例えば賦形剤１つ以上との混合物、投与経路、及び推定される治療、例えば活性成分を組織部位に直接投与することになるか、又は、それを全身投与することになるかに応じて変動することになる。投与すべき好ましい用量は又、変動要因、例えば疾患を有する、又は損傷を受けた組織の状態、及び特定の哺乳類の全般的な健康状態にも依存すると考えられる。一般的に、単回、一日当たり、週２回、又は週１回の用量で０．００００１〜１０００ｍｇの単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺類縁体が抗酸化剤及び／又は抗炎症剤の存在下で十分であり、０．０００１〜１００ｍｇが好ましく、そして０．００１〜１０ｍｇが更に好ましい。或いは、単回、一日当たり、週２回、又は週１回の用量で０．０１〜１０００μｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重が好都合に使用される。ナノ粒子は化学結合を介してナノ粒子表面上にカプセル化又は固定化されたナノ粒子当たり１〜１００甲状腺ホルモン分子を含有する。ナノ粒子は化学療法剤、又は他の知られた前血管形成又は抗血管形成剤と共に甲状腺ホルモン類縁体を同時カプセル化することができる。更に又、ナノ粒子は化学療法剤、前−又は抗血管形成剤を内部に含有し、そして甲状腺ホルモン類縁体は安定な化学結合を介してナノ粒子の表面上に固定化される。ナノ粒子の表面は安定な化学結合を介して表面に結合したαＶβ３リガンドのような部分を指向する部位を含有する。本発明の有効用量は、特定の状況下で望ましい、又は適切と考えられる単回用量において、又は複数回（２回以上）の分割用量において投与できる。瞬時注射又は拡散可能な注入用の製剤が使用できる。反復又は頻繁な注入が望ましい場合は、半永久的なステントの移植（例えば静脈内、腹腔内、クモ膜下内、包内）が推奨される。
【０２７４】
本発明の単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子、インデューサー又はアゴニストと組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体は当然ながら、単独、又は本明細書に記載した状態の治療において有益であることが分かっている他の分子と組み合わせて投与してよい。例えば、種々のよく知られた成長因子、ホルモン、酵素、治療用組成物、抗生物質、又は他の生物学的に活性な薬剤も又、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体と共に投与できる。即ち、種々の知られた成長因子、例えばＮＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、及びＴＧＦ−β、並びに酵素、酵素阻害剤、抗酸化剤、抗炎症剤、フリーラジカルスカベンジャー、抗生物質及び／又は化学誘引物質／化学走性因子を単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた本発明の重合体甲状腺ホルモン類縁体の製剤内に包含させることができる。
【０２７５】
以下の実施例は本発明の特定の実施形態を更に説明することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【０２７６】
実施例１〜７
以下の材料及び方法を実施例１〜７において使用した。全ての試薬は化学薬品等級であり、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から、又はＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ，ＮＪ）を介して購入した。酢酸コルチゾン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びゼラチン溶液（ウシ皮膚由来２％Ｂ型）はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から購入した。ニワトリ有精卵はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＳＰＡＦＡＳ  Ａｖｉａｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ＆Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｎｏｒｔｈ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＣＴ）から購入した。Ｔ４、３，５，３’−トリヨード−Ｌ−チロニン（Ｔ３）、テトラヨードチロ酢酸（テトラック）、Ｔ４−アガロース、６−Ｎ−プロピル−２−チオウラシル（ＰＴＵ）、ＲＧＤ−含有ペプチド、及びＲＧＥ−含有ペプチドはＳｉｇｍａより入手し；ＰＤ  ９８０５９はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍより；そしてＣＧＰ４１２５１はＮｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から提供を受けた。ポリクローナル抗−ＦＧＦ２及びモノクローナル抗−β−アクチンはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより入手し、そしてヒト組み換えＦＧＦ２及びＶＥＧＦはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。
【０２７７】
ホスホリル化ＥＲＫ１／２に対するポリクローナル抗体はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓより入手し、そしてヤギ抗ウサギＩｇＧはＤＡＫＯから入手した。αＶβ３（ＳＣ７３  １２）及びα−チューブリン（Ｅ９）に対するモノクローナル抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から購入した。正常マウスＩｇＧ及びＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇはＤａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）から購入した。αＶβ３（ＬＭ６０９）及びαＶβ５（ＰｌＦ６）に対するモノクローナル抗体並びに精製されたαＶβ３はＣｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）から購入した。Ｌ−［１２５Ｉ］−Ｔ４（比放射能、１２５０μＣｉ／μｇ）はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から入手した。
【０２７８】
血管形成の絨毛尿膜（ＣＡＭ）モデル：インビボの血管新生は前に記載した方法により検査した。９〜１２匹の１０日齢のニワトリの胚をＳＰＡＦＡＳ（Ｐｒｅｓｔｏｎ，ＣＴ）より購入し、３７℃相対湿度５５％でインキュベートした。皮下注射針を使用しながら気嚢を隠蔽している殻に小孔を開け、そして第２の孔部を卵の広範な側面上で、キャンドリングにより認識できる胚膜の無血管の部分の上に直接形成した。第１の孔部において陰圧を適用することにより第２の孔部の下部に疑似的な気嚢を形成し、ＣＡＭが殻から分離するようにした。小型工作研磨旋盤（Ｄｒｅｍｅｌ、Ｅｍｅｒｓｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏ．の部門）を用いて陥没したＣＡＭの上の殻に約１．０ｃｍ２のウインドウを切り出し、伏在するＣＡＭに直接出入りできるようにした。ＦＧＦ２（１μｇ／ｍｌ）を標準的な前血管形成性の薬剤として使用することにより１０日齢の胚のＣＡＭ上に心血管分枝を誘導した。１番のフィルターペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の滅菌ディスクに３ｍｇ／ｍＬの酢酸コルチゾン及び１ミリモル／ＬのＰＴＵを予備適用し、そして滅菌条件下で風乾した。次に甲状腺ホルモン、ホルモン類縁体、ＦＧＦ２又は対照溶媒、及び抑制剤をディスクに適用し、ディスクを乾燥させた。次にディスクをＰＢＳ中に懸垂し、成長中のＣＡＭ上に置いた。Ｔ４又はＦＧＦ２で処理したフィルターを３日間インキュベーションの第１日におき、ＦＧＦ２に対する抗体を３０分後に指示通りの選択された試料に添加した。２４時間の時点で、ＭＡＰＫカスケード抑制剤ＰＤ９８０５９を更にフィルターディスクを用いることにより局所的にＣＡＭに添加した。
【０２７９】
ＣＡＭ切片の顕微鏡分析
３日間相対湿度５５％３７℃においてインキュベーションした後、各フィルターディスクの直下のＣＡＭ組織を対照及び投与ＣＡＭ試料から切り出した。組織をＰＢＳで３回洗浄し、３５ｍｍのペトリ皿（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）上に置き、そしてＳＶ６立体顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）下に５０倍の倍率で検査した。フィルターに曝露したＣＡＭ切片のデジタル画像を３電荷結合装置カラービデオカメラシステム（Ｔｏｓｈｉｂａ）を用いて採取し、そしてＩｍａｇｅ−Ｐｒｏソフトウエア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いて分析した。各フィルターディスクの面積に等しい環状の領域中に含有される血管分枝点の数を計数した。１つの画像を各ＣＡＭプリパレーションにおいて計数し、そして８〜１０ＣＡＭプリパレーションに由来する結果を各投与条件（甲状腺ホルモン又は類縁体、ＦＧＦ２、ＦＧＦ２抗体、ＰＤ９８０５９）に関して分析した。更に又、各実験は３回実施した。得られた血管形成指数は試料の各セットにおける新しい分枝点の平均±ＳＥＭである。
【０２８０】
ＦＧＦ２試験：
ＥＣＶ３０４内皮細胞を１０％ウシ胎児血清を添加したＭ１９９培地中で培養した。ＥＣＶ３０４細胞（１０６個）を一夜完全培地中０．２％ゲルコーティング２４穴プレート中でプレーティングし、そして次に細胞を血清非含有培地で洗浄し、Ｔ４又はＴ３を指示通り投与した。７２時間後、上澄みを採取し、市販のＥＬＩＳＡシステム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いながら未希釈でＦＧＦに関する試験を実施した。
【０２８１】
ＭＡＰＫ活性化：
ＥＣＶ３０４内皮細胞を２日間０．２５％ホルモン枯渇血清１３と共にＭ１９９培地中で培養した。次に細胞に１５分間〜６時間、Ｔ４（１０−７モル／Ｌ）を投与した。別の実験において、細胞にＴ４又はＦＧＦ２又はＰＤ９８０５９又はＣＧＰ４１２５１の存在下のＴ４を投与した。以前に報告した本発明者等の方法により全ての試料から核画分を調製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により蛋白を分離し、そしてホスホリル化ＥＲＫ１／２に対する抗体によるイムノブロッティングのために膜に転移させた。核ホスホリル化ＥＲＫ１／２の出現はＴ４によるこれらのＭＡＰＫのアイソフォームの活性化を示すものである。
【０２８２】
逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応：
１０ｃｍプレート中のコンフルエントのＥＣＶ３０４細胞に６〜４８時間、Ｔ４（１０−７モル／Ｌ）を投与し、グアニジニウムイソチオシアネート（Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いながら全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ（１μｇ）をＡｃｃｅｓｓ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）に付した。全ＲＮＡを４５分間４８℃でｃＤＮＡ内に逆転写し、次に２分間９４℃で変性させた。第２の鎖の合成及びＰＣＲ増幅は、変性を９４℃で３０秒、アニーリングを６０℃で６０秒、そして伸長を６８℃で１２０秒を４０サイクル行い、そして全サイクル終了後に最終伸長を７分間６８℃とした。ＦＧＦ２用のＰＣＲプライマーは以下の通り、即ち、ＦＧＦ２センス鎖５’−ＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＣＡＣＴＧＡＡＡＣＧ−３’（配列番号１）、アンチセンス鎖５’ＣＴＣＡＡＴＧＡＣＣＴＧＧＣＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号２）とし；ＰＣＲ産物の長さは７３４ｂｐであった。ＧＡＰＤＨ用のプライマーはセンス鎖５’−ＡＡＧＧＴＣＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＡＣＧ−３’（配列番号３）、及びアンチセンス鎖５’−ＧＧＧＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧＡ−３’（配列番号４）を包含し；ＰＣＲ産物の長さは２１８ｂｐであった。ＲＴ−ＰＣＲの産物は１．５％アガロースゲル上の電気泳動により分離し、そして臭化エチジウムを用いて可視化した。ゲルの標的バンドはＬａｂＩｍａｇｅソフトウエア（Ｋａｐｅｌａｎ）を用いて定量し、そして［ＦＧＦ２／ＧＡＰＤＨ］Ｘ１０に関する値を各時点において計算した。
【０２８３】
統計学的分析：
統計学的分析はそれぞれの対照群を用いた実験と比較する一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）により行い、そして統計学的有意性はＰ＜０．０５に基づいて計算した。
【０２８４】
マウスにおけるマトリゲルＦＧＦ２又は癌細胞系統の移植物におけるインビボの血管形成：インビボネズミ血管形成モデル：
ネズミマトリゲルモデルは以前に記載されている方法（Ｇｒａｎｔ等、１９９１；Ｏｋａｄａ等、１９９５）に従って、そして本発明者等の実験室で実施されている通り（Ｐｏｗｅｌ等、２０００）実施することになる。慨すれば、成長因子非含有マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）を４℃で一夜解凍し、そして氷上に置く。マトリックスの小分量ずつを冷ポリプロピレン管に入れ、そしてＦＧＦ２、甲状腺ホルモン類縁体又は癌細胞（１ｘ１０６個）をマトリゲルに添加する。マトリゲルと食塩水、ＦＧＦ２、甲状腺ホルモン類縁体又は癌細胞をマウスの腹側正中線内に皮下注射する。第１４日において、マウスを屠殺し、固化したゲルを切開し、新血管の存在に関して分析する。化合物Ａ〜Ｄを種々の異なる用量において皮下注射する。対照及び実験ゲルの移植物を細胞溶解溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）０．５ｍｌを含有するマイクロ遠沈管内に入れ、乳鉢で粉砕する。その後、管を４℃で一夜インキュベートし、そして翌日１５分間１，５００ｘｇで遠心分離する。細胞溶解物の２００μｌの小分量を各試料につきＤｒａｂｋｉｎ試薬溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１．３ｍｌに添加する。５４０ｎｍにおいて分光光度計で溶液を分析する。光の吸収は試料中に含有されるヘモグロビンの量に比例する。
【０２８５】
腫瘍の成長及び転移−腫瘍移植物のニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）モデル：
プロトコルは以前に記載されたものとする（Ｋｉｍ等、２００１）。慨すれば、１ｘ１０７の腫瘍細胞を各ＣＡＭ（７日齢胚）の表面におき、そして１週間インキュベートする。得られた腫瘍を摘出して５０ｍｇのフラグメントに切り出す。これらのフラグメントを群当たり追加１０個のＣＡＭの上に置き、翌日ＰＢＳ中に溶解した化合物（Ａ〜Ｄ）２５μＬを局所投与する。７日後、今度は腫瘍を卵から摘出し、そして中の重量を各ＣＡＭについて測定する。図８はＣＡＭにおけるインビボ腫瘍成長モデルに関与する工程を示すダイアグラムである。
【０２８６】
癌細胞系統の腫瘍成長速度、腫瘍血管形成、及び腫瘍転移に対するＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣ、及び甲状腺ホルモン拮抗剤の作用を測定することができる。
腫瘍の成長及び転移−マウスにおける腫瘍異種移植片モデル：
モデルは本発明者等の公開物においてＫｅｒｒ等、２０００；Ｖａｎ  Ｗａｅｓ等、２０００；Ａｌｉ等、２００１；及びＡｌｉ等、２００１により記載される通りであり、そしてこれらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる。異なる用量における、そして異なる腫瘍型に対する、ＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣ、及び他の甲状腺ホルモン拮抗剤に関する抗癌薬効を測定し、比較することができる。
腫瘍の成長及び転移−転移の実験的モデル：
モデルは本発明者等の公開物において記載された通りである（Ｍｏｕｓａ，２００２；Ａｍｉｒｋｈｏｓｒａｖｉ等、２００３ａ及び２００３ｂ、これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる）。慨すれば、Ｂ１６ネズミ悪性黒色腫細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）及び他の癌細胞系統を１０％ウシ胎児血清、ペニシリン及びストレプトマイシ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で培養する。細胞は、７０％コンフルエントとなるまで培養し、そしてトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いて採取し、そしてリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で二回洗浄する。細胞を実験的転移のために２．０ｘ１０５個／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に再懸濁する。動物：体重１８〜２１グラムのＣ５７／ＢＬ６マウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）を本試験では使用する。全操作はＩＡＣＵＣ及び研究所のガイドラインに従って行う。ＴＥＴＲＡＣ、ＴＲＩＡＣ及び他の甲状腺ホルモン拮抗剤の種々の用量における、そして種々の腫瘍型に対する抗癌薬効を測定して比較することができる。
【０２８７】
血管形成に対する甲状腺ホルモン類縁体の作用
Ｔ４はＣＡＭモデルにおいて血管形成指数（基礎的状態を超えた倍加数）の有意な増大を誘導した。０．００１〜１．０μＭのＴ３又は０．１〜１．０μＭのＴ４はＦＧＦ２の１μｇによる血管形成指数の２〜３倍増大と比較して、血管形成指数の２〜２．５倍増大をもたらすことにおいて最大の作用を達成した（表１及び図１ａ及び１ｂ）。血管形成を促進することにおけるＴ４の作用（血管形成指数の２〜２．５倍増大）はＴ４からＴ３への返還を抑制するＰＴＵの存在下又は非存在下において達成された。Ｔ３自身は９１〜１００ｎＭにおいて、強力な前血管形成性の作用をＣＡＭモデルにおいて誘導した。Ｔ４アガロースはＴ４により達成された前血管形成作用と同様の作用をもたらした。Ｔ４又はＴ４アガロースの前血管形成性の作用はＴＥＴＲＡＣ又はＴＲＩＡＣにより１００％ブロックされた。
【０２８８】
最大未満の濃度のＴ４によるＦＧＦ２の前血管形成性の活性の増強：
最大未満の濃度におけるＴ４とＦＧＦ２の組み合わせはＦＧＦ２又はＴ４の何れかの最大前血管形成作用と同様のレベルまで血管形成指数の相加的増大をもたらした（図２）。
【０２８９】
ＣＡＭモデルにおけるＴ４及びＦＧＦ２の前血管形成性の作用に対するＭＡＰＫカスケード抑制剤の作用：
Ｔ４又はＦＧＦ２の前血管形成作用は０．８〜８μｇのＰＤ９８０５９により完全にブロックされた（図３）。
【０２９０】
ＣＡＭモデルにおけるＴ４及びＦＧＦ２の前血管形成性の作用に対する特異的インテグリンαＶβ３拮抗剤の作用：
Ｔ４又はＦＧＦ２の前血管形成作用は１０μｇの特異的モノクローナル抗体ＬＭ６０９により完全にブロックされた（図４ａ及び４ｂ）。
【０２９１】
ＣＡＭ試験は種々の成長因子及び他の血管形成の促進剤又は抑制剤の血管形成活性を確認するために使用されている。本試験においては、生理学的濃度のＴ４が前血管形成性であることがわかり、ＦＧＦ２の活性に匹敵するものであった。ＰＴＵの存在はＴ４の作用を低減せず、Ｔ４の脱ヨウ素化によるＴ３の形成はこのモデルにおける前提要件とはならないことを示している。このモデルにおける新血管成長の発生には数日間を要したため、本発明者等は甲状腺ホルモンの作用は甲状腺ホルモンに対する核受容体（ＴＲ）の相互作用に完全に依存していると推定した。ＴＲのその天然のリガンドＴ３との核内複合体化を要するヨードチロニンの作用は当然ながらゲノム性であり、そして最終的には遺伝子発現に至る。一方、ＴＲの天然のリガンドであるＴ３ではなくＴ４に対するこのモデル系の優先的な応答は、血管形成がＴ４により原形質膜において非ゲノム的に開始され、最終的には遺伝子転写を要する作用に至る可能性を生じさせている。Ｔ４の非ゲノム性の作用は広範に記載されており、通常は原形質膜で開始され、そしてシグナルトランスダクション経路により媒介されると考えられる。それらはヨードチロニンとＴＲの核内リガンド結合を必要としないが、遺伝子転写と境界を接するか、これをモジュレートする場合がある。ステロイドの非ゲノム的な作用は十分報告されており、そしてステロイド又は他の化合物のゲノム的な作用と境界を接していることが分かっている。Ｔ４及びテトラックを用いて、又はアガロース−Ｔ４を用いて実施した実験によれば、Ｔ４の前血管形成性の作用は実際は原形質膜で開始される可能性が最も高かった。本発明者等は別途、テトラックがＴ４の膜開始作用をブロックするが、それ自体はシグナルトランスダクションを活性化しないことを明らかにしている。即ち、それは甲状腺ホルモンの非ゲノム性の作用のためのプローブとなる。アガロース−Ｔ４は細胞内部への進入が不可能であると考えられており、そして、ホルモンの考えられる細胞表面開始作用のためのモデルを検査するために本発明者等及び他の者により使用されている。これらの結果は甲状腺ホルモンによるＭＡＰＫの活性化の別の結果は新しい血管の成長であることを示唆している。後者は非ゲノム的に開始されるが、当然ながら結果として複雑な遺伝子転写プログラムを要する。
【０２９２】
甲状腺ホルモンの周囲濃度は比較的安定である。ＣＡＭモデルは本発明者等が試験した時点においては、甲状腺欠損性であり、そしてこのため、未損傷の生物を再生しない系とみなしてよい。本発明者等はＴ４の循環系中レベルが、種々の他の調節物質と共に、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２のような内因性の血管形成因子に対する血管の感受性をモジュレートする作用があることを提案している。
【０２９３】
三次元血管形成試験
フィブリンコーティングされたマイクロ担体ビーズ上に培養されたヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）のインビトロの三次元新芽血管形成：コンフルエントのＨＤＭＥＣ（５〜１０継代）をゼラチンコーティングＣｙｔｏｄｅｘ−３ビーズとビーズ当たり細胞４０個の比率で混合した。細胞及びビーズ（２４穴プレートのウェル当たり１５０〜２００ビーズ）を５ｍｌのＥＢＭ＋１５％正常ヒト血清で懸濁させ、最初の４時間は毎時穏やかに混合し、次に放置して一夜ＣＯ２インキュベーター中で培養した。翌日、新しいＥＢＭ＋５％ＨＳ１０ｍｌを添加し、混合物を更に３時間培養した。実験の前に、ＥＣ−ビーズの培養物を確認し；次にＰＢＳ５００ｕｌを２４穴プレートのウェルに添加し、そしてＥＣ−ビーズの培養物の溶液１００ｕｌをＰＢＳに添加した。ビーズの数を計数し、そしてＥＣ／ビーズの濃度を計算した。
【０２９４】
血管形成因子又は被験因子を含有する、又は含有しない、ＥＢＭ培地中のフィブリノーゲン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を製造した。陽性対照として、５０ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦ＋２５ｎｇ／ｍＬＦＧＦ２を使用した。ＥＣ−ビーズはＥＢＭ培地で二回洗浄し、そしてＥＣ−ビーズをフィブリノーゲン溶液に添加した。実験は各条件につき３連で実施した。ＥＣ−ビーズをフィブリノーゲン溶液と穏やかに混合し、そして２．５ｕｌのヒトトロンビン（０．０５Ｕ／ｕｌ）を１ｍｌのフィブリノーゲン溶液中で添加し；３００ｕＬを即時、２４穴プレートの各ウェルに移した。フィブリノーゲン溶液は５〜１０分以内に重合し；２０分後、本発明者等はＥＢＭ＋２０％正常ヒト血清＋１０ｕｇ／ｍＬアプロチニンを添加した。プレートをＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。ＨＤＭＥＣがフィブリンゲルを侵襲して管を形成するために約２４〜４８時間を要する。
【０２９５】
ウシフィブリンゲル中のウシ肺動脈内皮細胞血管形成挙動を調べるために以前に設計されたマイクロ担体インビトロ血管形成試験［Ｎｅｈｌｓ  ａｎｄ  Ｄｒｅｎｃｋｈａｈｎ，１９９５ａ，ｂ］を３次元ＥＣＭ環境におけるヒトの微小血管内皮細胞血管形成の試験のために変更した（図１及び２）。慨すれば、以前に記載されている通り［Ｆｅｎｇ等、１９９９］単離したヒトフィブリノーゲンを１ｍｇ／ｍＬの濃度でＭ１９９培地に溶解し（ｐＨ７．４）、そして０．２２ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。滅菌されたＶｉｔｒｏｇｅｎ１００を５ｘＭ１９９培地及び蒸留水中に混合することにより等張性の１．５ｍｇ／ｍＬのコラーゲン溶液を製造した。ｐＨは１ＮのＮａＯＨで７．４に調節した。特定の実験においては、成長因子及びＥＣＭ蛋白（例えばＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、血清、ゼラチン、及びフィブロネクチン）をフィブリノーゲン又はコラーゲンの溶液に添加した。次に約５００個のＥＣ−ビーズを１ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン又は１．５ｍｇ／ｍＬのコラーゲン溶液に添加した。その後、ＥＣ−ビーズ−コラーゲン又はＥＣ−ビーズ−フィブリノーゲンの懸濁液（５００ＥＣ−ビーズ／ｍｌ）を３００ｕｌ／ウェルで２４穴プレート上にプレーティングした。ＥＣ−ビーズ−コラーゲン培養物は３７℃でインキュベートすることによりゲルを形成した。ＥＣ−ビーズ−フィブリンの培養物のゲル化は、終濃度０．５Ｕ／ｍｌでトロンビンを添加した後、室温で５分未満で起こった。ゲル化の後、１ｍｌの新しい試験培地（ＨＤＭＥＣ用には２０％正常ヒト血清を添加したＥＢＭ、又は１０％ウシ胎児血清を添加したＥＢＭ）を各ウェルに添加した。血管形成応答目視によりモニタリングし、そしてビデオイメージキャプチャーにより記録した。特記すれば、毛細血管新芽形成が観察され、そしてＮｉｋｏｎ  ＮＰ−２サーモスタット及びＳｈｅｌｄｏｎ＃２００４二酸化炭素フローミキサーを有するインキュベーターハウジングの装着されたＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ−ＴＭＤ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｃ．；Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて記録した。顕微鏡はＭａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｇ３コンピューターに連結したＤａｇｅ−ＭＴＩＣＣＤ−７２Ｓビデオカメラ及びＳｏｎｙ  １２”ＰＶＭ−１２２ビデオモニターよりなるビデオシステムと直接インターフェイス連絡した。画像はＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いながら種々の倍率でキャプチャーした。新芽血管形成に対する血管形成性の因子の作用は毛細血管の新芽を有するＥＣ−ビーズの数及びパーセントを測定することにより目視により定量した。３連のウェルの各々中１００個のビーズ（５〜６のランダムな低倍率の視野）が各実験条件について計数された。全ての実験は少なくとも３回反復した。
【０２９６】
細胞培養：
甲状腺ホルモンに対する核受容体を欠失しているアフリカミドリザル線維芽細胞系統ＣＶ−１（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を５０００個／ｃｍ２の細胞密度でプレーティングし、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＤＭＥＭ中に維持した。全培養試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より購入した。培養物は５％ＣＯ２下に３７℃の湿潤チャンバー中で維持した。培地は３日毎に交換し、そして細胞系統は８０％コンフルエントで継代した。実験投与のために、細胞を１０ｃｍの細胞培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中にプレーティングし、１０％ＦＢＳ含有培地中２４時間成長させた。次に細胞をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で二回洗浄し、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びＨＥＰＥＳを添加した血清非含有ＤＭＥＭを与えた。血清非含有培地中４８時間のインキュベーションの後、細胞にベヒクル対照（０．４％ポリエチレングリコール［ｖ／ｖ］含有の終濃度０．００４ＮのＫＯＨ）又はＴ４（終濃度１０−７Ｍ）を３０分間投与し；次に培地を収集し、遊離のＴ４レベルを酵素免疫学的検定試験により測定した。１０−７Ｍの全Ｔ４と共にインキュベートした培養物は１０−９〜１０−１０Ｍの遊離Ｔ４を有している。投与ののち、細胞を採取し、核蛋白を前述の通り調製した。
【０２９７】
ｓｉＲＮＡによる一過性トランスフェクション：
ＣＶ−１細胞を１０ｃｍ培養皿にプレーティング（１５０，０００個／皿）し、そして１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で２４時間インキュベートした。細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）中で洗浄し、製造元の説明書に従ってｓｉＰＯＲＴ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用しながらαＶ、β３、又はαＶとβ３療法に対するｓｉＲＮＡ（終濃度１００ｎＭ）でトランスフェクトした。追加のセットのＣＶ−１細胞をスクランブルドｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、陰性対照として使用した。トランスフェクション後４時間に、１０％ＦＢＳ含有培地７ｍｌを培養皿に添加し、そして培養物を一夜インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｔ４を投与する前４８時間血清非含有ＤＭＥＭ中に入れた。
【０２９８】
ＲＮＡ単離及びＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）より入手したＲＮｅａｓｙキットを用いながら製造元の説明書に従ってトランスフェクション後７２時間に細胞培養物から抽出した。２００ナノグラムの全ＲＮＡをＡｃｃｅｓｓＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いながら製造元の説明書に従って逆転写した。プライマーは公開されている種特異的な配列：αＶ（アクセッション番号ＮＭ−００２２１０）Ｆ−５’−ＴＧＧＧＡＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＧ（配列番号５）及びＲ−５’−ＡＡＡＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴ（配列番号６）（３１９ｂｐ産物）、β３（ＮＭ０００２１２）Ｆ−５’−ＧＴＧＴＧＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧ（配列番号７）及びＲ−５’−ＣＴＧＡＣＴＣＡＡＴＣＴＣＧＴＣＡＣＧＧ（配列番号８）（５１５ｂｐ産物）、及びＧＡＰＤＨ（ＡＦ２６１０８５）Ｆ−５’−ＧＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴ（配列番号９）及びＲ−５’−ＴＧＡＧＣＴＴＧＡＣＭＧＴＧＧＴＣＧ（配列番号１０）（２１２ｂｐ産物）に基づくものとした。ＲＴ−ＰＣＲはＦｌｅｘｉｇｅｎｅサーマルサイクラーｅｏｍＴＥＣＨＮＥ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＪ）中で実施した。９５℃で２分間インキュベーションした後、２５サイクルの以下の工程、即ち：変性９４℃１分、アニーリング５７℃１分、及び伸長１分６８℃、２５サイクルを実施した。ＰＣＲ産物は臭化エチジウム染色１．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で可視化した。
【０２９９】
ウエスタンブロット：
核蛋白の小分量ずつ（１０μｇ／レーン）をＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液と混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％分割ゲル）で分離し、次にニトロセルロース膜に転移させた。３０分間１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス緩衝液（ＴＢＳＴ）中の５％ノンファットミルクでブロッキングした後、膜を４℃で一夜、５％ミルク添加ＴＢＳＴ中でホスホリル化ｐ４４／４２ＭＡＰキナーゼ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｎｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に対するモノクローナル抗体の１：１０００希釈物と共にインキュベートした。ＴＢＳＴで３ｘ１０分間洗浄した後、膜を室温で１時間、５％ミルク添加ＴＢＳＴ中、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）より入手したＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇ（１：１０００希釈）と共にインキュベートした。膜をＴＢＳＴ中で３ｘ５分洗浄し、免疫反応性の蛋白をケミルミネセンス（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）により検出した。バンドの強度をＶｅｒｓａＤｏｃ５０００イメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて測定した。
【０３００】
放射性リガンド結合試験：
精製したαＶβ３の２μｇを指定された濃度の化合物と混合し、室温で３０分間インキュベートした。次に［１２５Ｉ］−Ｔ４（２μＣｉ）を添加し、そして混合物を２０℃で更に３０分間インキュベートした。試料を試料緩衝液（５０％グリセロール、０．１Ｍトリス塩酸、ｐＨ６．８及びブロモフェノールブルー）と混合し、そして５％塩基性ネイティブゲル上で２４時間４５ｍＡにおいて冷時泳動した。装置を解体し、ゲルをフィルターペーパー上に置き、プラスチックラップでラッピングし、フィルムに曝露した。バンドの強度はＶｅｒｓａＤｏｃ５０００イメージングシステムを用いて測定した。
【０３０１】
ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）試験（αＶβ３試験）：
１０日齢のニワトリの胚をＳＰＡＦＡＳ（Ｐｒｅｓｔｏｎ，ＣＴ）より購入し、３７℃相対湿度５５％でインキュベートした。皮下注射針を使用しながら卵の平滑な端部に小孔を開け、そして第２の孔部を卵の広範な側面上で、胚膜の無血管の部分の上に直接形成した。第１の孔部において穏やかな陰圧を適用することにより気嚢を排除し、そしてＣＡＭを殻から脱落させた。Ｄｒｅｍａｌモデルの工作研磨機（Ｄｒｅｍｅｌ、Ｒａｃｉｎｅ，ＷＩ）を用いながら、約１．０ｃｍ２のウインドウを疑似気嚢上の殻に切り込み、ＣＡＭに出入りできるようにした。１番のフィルターペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ）の滅菌ディスクに３ｍｇ／ｍＬの酢酸コルチゾン及び１ｍＭのプロピルチオウラシルを予備適用し、そして滅菌条件下で風乾した。甲状腺ホルモン、対照溶媒、及びｍＡｂＬＭ６０９をディスクに適用し、その後乾燥させた。次にディスクをＰＢＳ中に懸垂し、成長中のＣＡＭ上に置いた。３日間インキュベーションした後、フィルターディスク下部のＣＡＭを摘出し、ＰＢＳで洗浄した。各膜を３５ｍｍのペトリ皿に入れ、ＳＶ６立体顕微鏡下に５０倍の倍率で検査した。デジタル画像をキャプチャーし、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏソフトウエア（Ｍｅｄｉａｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いて分析した。フィルターディスクに等しい環状の領域中に含有される血管分枝点の数を計数した。各投与条件に対して８〜１０ＣＡＭプリパレーションの各々に由来する１つの画像を計数し、そして更に、各実験は３回実施した。
【０３０２】
実施例１：血管形成に対する甲状腺ホルモンの作用
図１Ａから分かる通り、そして図１Ｂに総括する通り、Ｌ−Ｔ４及びＬ−Ｔ３の両方はＣＡＭ試験において血管形成を増強した。Ｔ４は０．１μｍｏｌ／Ｌの培地中の生理学的な総濃度において、２．５倍まで血管分枝形成を増大させた（ｐ＜０．００１）。Ｔ３（１ｎｍｏｌ／Ｌ）もまた２倍血管形成を刺激した。細胞５’−モノデヨージナーゼによるＴ４からＴ３への変換によってＴ４は有効となるのみであるという可能性は、デイオジナーゼの阻害剤であるＰＴＵがＴ４によりもたらされる血管形成に対する抑制作用を有さなかったという所見により排除された。ＰＴＵはＣＡＭモデルにおいて使用したすべてのフィルターディスクに適用した。即ち、Ｔ４及びＴ３は成長因子の試験のために以前から標準化されているＣＡＭモデルにおいて新しい血管の分枝形成を促進する。
【０３０３】
実施例２：Ｔ４−アガロース及びテトラックの作用：
本発明者等は以前に、Ｔ４−アガロースがＴ４と同じ態様において原形質膜において開始される細胞シグナルトランスダクション経路を刺激すること、及び、Ｔ４及びＴ４−アガロースの作用は原形質膜へのＴ４の結合を抑制することが分かっている脱アミノ化されたヨードチロニン類縁体であるテトラックによりブロックされることを明らかにしている。ＣＡＭモデルにおいては、テトラック（０．１μｍｏｌ／Ｌ）の添加はＴ４の作用を抑制した（図２Ａ）が、テトラック単独では血管形成に対する作用は有していなかった（図２Ｃ）。０．１μｍｏｌ／Ｌのホルモン濃度において添加されたＴ４−アガロースの作用はＣＡＭモデルにおいてＴ４のものに匹敵するものであり（図２Ｂ）、そしてＴ４−アガロースの作用も又、テトラックの作用により抑制された（図２Ｂ；総括は２Ｃ）。
【０３０４】
実施例３：Ｔ４の最大未満の濃度によるＦＧＦ２の前血管形成活性の増強：
血管形成はポリペプチド成長因子の関与を通常は要する複雑な過程である。ＣＡＭ試験は血管の成長を顕在化させるまで少なくとも４８時間を要し；即ち、このモデルにおける甲状腺ホルモンの明らかな原形質膜作用はホルモンに対する複雑な転写応答をもたらすと考えられる。従って本発明者等はＦＧＦ２がホルモン応答に関与しているか、そして生理学的レベル未満のこの成長因子の作用をホルモンが強化するかについて調べた。Ｔ４（０．０５μｍｏｌ／Ｌ）及びＦＧＦ２（０．５μｇ／ｍｌ）は個別に中程度まで血管形成を刺激した（図３）。この最大未満の濃度のＦＧＦ２の血管形成性の作用は１．０μｇのＦＧＦ２単独によりもたらされたレベルにまで生理学的濃度未満のＴ４により増強された。即ち、最大未満のホルモン及び成長因子の濃度の作用は相加的であると考えられる。血管形成の甲状腺ホルモン刺激におけるＦＧＦ２の役割をより精密に定義するために、ＦＧＦ２に対するポリクローナル抗体をＦＧＦ２又はＴ４の何れかで処理したフィルターに添加し、そして血管形成を７２時間後に計測した。図４はＦＧＦ２抗体が外因性ＦＧＦ２の非存在下でＦＧＦ２によるか、又はＴ４によるかの何れかで刺激された血管形成を抑制していることを示しており、ＣＡＭ試験におけるＴ４の作用が増大したＦＧＦ２発現により媒介されたことを示唆している。対照ＩｇＧ抗体はＣＡＭ試験において刺激性又は抑制性の作用を有していない。
【０３０５】
実施例４：甲状腺ホルモンによる内皮細胞からのＦＧＦ２放出の刺激：
ＦＧＦ２のレベルを３日間Ｔ４（０．１μｍｏｌ／Ｌ）又はＴ３（０．０１μｍｏｌ／Ｌ）の何れかを投与したＥＣＶ３０４内皮細胞の培地中で計測した。以下の表に示す通りＴ３は３．６倍培地中のＦＧＦ２濃度を刺激したが、Ｔ４は１．４倍の増大をもたらした。この所見は甲状腺ホルモンは少なくとも部分的には内皮細胞が使用可能な成長因子の濃度を増大させることによりＦＧＦ２の血管形成作用を増強する場合があることを示している。
【表Ｂ】
2010513526.tif 000042
【０３０６】
実施例５：甲状腺ホルモン及びＦＧＦ２による血管形成の刺激におけるＥＲＫ１／２シグナルトランスダクション経路の役割：
Ｔ４が細胞に対して非ゲノム性の作用を発揮する経路はＭＡＰＫシグナルトランスダクションカスケード、特にＥＲＫ１／２活性化に関するものである。本発明者等の知見によればＴ４が表皮成長因子によるＥＲＫ１／２活性化を増強する。ＦＧＦ２発現の甲状腺ホルモンによる刺激におけるＭＡＰＫ経路の役割を、チロシン−スレオニンキナーゼＭＡＰＫキナーゼ−１（ＭＥＫ１）及びＭＥＫ２によるＥＲＫ１／２活性化の抑制剤であるＰＤ９８０５９（２〜２０μｍｏｌ／Ｌ）を使用することにより調べた。表中のデータはＰＤ９８０５９がＴ４又はＴ３の何れかを投与したＥＣＶ３０４内皮細胞からのＦＧＦ２の放出の増大を効果的にブロックしたことを示している。ＥＲＫ１／２抑制の並行した試験をＣＡＭ試験において実施し、代表的な結果を図５に示した。それぞれ生理学的な濃度におけるＴ３及びＴ４の組み合わせは３μｍｏｌ／ＬのＰＤ９８０５９により完全にブロックされた作用である血管の分枝形成の２．４倍増大をもたらした（図５Ａ）。分枝形成のＦＧＦ２刺激（２．２倍）はまたＥＲＫ１／２活性化のこの抑制剤により効果的にブロックされた（図５Ｂ）。即ち、甲状腺ホルモンの前血管形成性の作用は原形質膜において開始し、そして内皮細胞からのＦＧＦ２の放出を促進するＥＲＫ１／２経路の活性化が関与している。ＥＲＫ１／２活性化はここでも又、ＦＧＦ２シグナルを伝達し、そして新しい血管の形成をもたらすために必要となる。
【０３０７】
実施例６：ＭＡＰＫ活性化に対する甲状腺ホルモン及びＦＧＦ２の作用：ＥＲＫ１／２ＭＡＰＫのホスホリル化及び核転座の刺激を、１５分間〜６時間Ｔ４（１０−７ｍｏｌ／Ｌ）を投与したＥＣＶ３０４細胞において試験した。細胞の核中のホスホリル化ＥＲＫ１／２の出現はＴ４投与１５分以内に起こり、３０分で最大レベルに到達し、そして６時間においてもなお出現していた（図６Ａ）。ホルモンのこの作用はＰＤ９８０５９により抑制され（図６Ｂ）、これはこの化合物がＭＡＰＫキナーゼによるＥＲＫ１／２のホスホリル化をブロックすることから期待される結果である。伝統的な蛋白キナーゼＣ（ＰＫＣ）−α、ＰＫＣ−β、及びＰＫＣ−γの抑制剤ＣＧＰ４１２５１も又これらの細胞において、本発明者等が他の細胞系統でＴ４を用いた場合に観察した通り、ＭＡＰＫ活性化に対するホルモンの作用をブロックしていた。甲状腺ホルモンは数種のサイトカイン及び成長因子、例えばインターフェロン−γ１３及び表皮成長因子の作用を増強する。ＥＣＶ３０４細胞においては、Ｔ４は１５分間の同時インキュベーションにおいてＦＧＦ２によりもたらされたＭＡＰＫ活性化を増強している（図６Ｃ）。ＥＣＶ３０４細胞で得られた観察結果をＣＡＭモデルに適用した場合、本発明者等は、ホルモンが血管形成を誘導する複雑な機序はＦＧＦ２の内皮細胞放出及び放出されたＦＧＦ２の血管形成に対するオートクリン作用を包含していることを提案する。
【０３０８】
実施例７：甲状腺ホルモンを投与したＥＣＶ３０４細胞におけるＲＴ−ＰＣＲ：
Ｔ４の前血管形成性の作用の機序の検討において着目するべき最後の問題点はホルモンがＦＧＦ２遺伝子発現を誘導するかどうかである。内皮細胞に６〜４８時間Ｔ４（１０−７ｍｏｌ／Ｌ）を投与し、そしてＦＧＦ２及びＧＡＰＤＨのＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲに基づく推定（ｃＤＮＡ計測から推量；図７）を行った。ＧＡＰＤＨに関して補正したＦＧＦ２ｃＤＮＡの増量度はホルモン投与６時間まで著明であり、４８時間までに更に増強された。実施例８Ａ：マウスにおける網膜血管新生モデル（糖尿病性及び非糖尿病性）：
網膜の血管新生に対する被験物質の薬理学的活性を評価するために、幼若マウスを７日間高酸素環境に曝露し、そして回復させ、これにより網膜の新しい血管の形成を刺激する。被験物質は網膜血管新生が抑制されるかどうかを調べるために評価する。網膜はヘマトキシリン−エオシン染色により、そして血管新生を示す少なくとも１つの染色（通常はセレクチン染色）により検査する。他の染色（例えばＰＣＮＡ、ＰＡＳ、ＧＦＡＰ、血管形成のマーカー等）も使用できる。モデルの総括を以下に示す。
【０３０９】
動物モデル
●幼若マウス（Ｐ７）及びその母動物を高酸素付与環境（７０〜８０％）に７日間置く。
●Ｐ１２において、マウスを酸素付与環境から取り出し、通常の環境に置く。
●マウスを５〜７日間回復させる。
●次にマウスを屠殺し、眼を採集する。
●眼は適宜、凍結するか、固定する。
●眼を適切な組織化学的染色により染色する。
●眼を適切な免疫組織化学的染色により染色する。
●血液、血清又は他の組織を採集する。
●眼を、特に微小血管の改変に関して、全ての所見について検討する。新血管の成長は半定量的に採点する。画像分析も使用できる。
【０３１０】
実施例８Ｂ：甲状腺ホルモン及び糖尿病性網膜症：
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）−誘導実験的糖尿病及び糖尿病性網膜症を有するラットへのテトラックの投与のために、Ｊ  ｄｅ  ｌａ  Ｃｒｕｚ等、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ２８０：４５４−４５９，１９９７に開示されているプロトコルを使用する。エンドポイントは増殖性網膜症の出現（血管形成）のテトラックによる抑制である。
【０３１１】
実施例９Ａ：甲状腺ホルモン及び類縁体の新しい医薬品重合体製剤を用いた創傷治癒及び止血治療：
本発明は又、固定化された甲状腺ホルモン類縁体、好ましくはＴ４類縁体、塩化カルシウム、及びコラーゲンを包含する新規な創傷治癒及び止血の治療を包含する。この新規な製剤は静脈及び動脈の出血の両方を有意に制御し、出血時間を低減し、フィブリン／血小板栓子を形成し、低レベルコラーゲン存在下に持続性の態様において血小板誘導創傷治癒因子を放出し、そして安全である。そのような創傷治癒及び止血ドレシングの開発は戦場負傷者治療における短期及び長期の使用のために極めて価値あるものとなり得る。コラーゲン及び塩化カルシウムを含有するヒドロゲル又はドレシング中の固定化されたＬ−チロキシン（Ｔ４）及び球状の６糖類の医薬品製剤を最適化することができる。ヒドロゲル又はドレシング中のこの新規な創傷治癒及び止血剤（ＷＨ製剤）の投与は又、殺微生物剤の添加も包含できる。
【０３１２】
重合体にコンジュゲートした、又はアガロース上に固定化したＬ−チロキシンは接着細胞表面受容体（インテグリンαＶβ３）の活性化を介した血管形成の強力な刺激を示すことにより細胞内シグナリング事象の活性化をもたらし、次にこれが種々の成長因子の生産のアップレギュレーションをもたらす。更に又、固定化されたＴ４は上皮、線維芽細胞、及びケラチノサイトの細胞遊走を誘導した。固定化されたＴ４は対象自身の血小板栓子の形成を促進するコラーゲン誘導血小板凝集及び分泌を増強したが、Ｔ３及び他の類縁体は増強しなかった。甲状腺ホルモンは見かけ上は膜受容体を介してヒト多形核白血球におけるフリーラジカル生産を刺激することが知られており（Ｅ．Ｍｅｚｏｓｉ等、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８５：１２１−１２９，２００５）、そしてこれは感染に対抗するために重要な作用である。
【０３１３】
即ち、Ｔ４又はＴ４−アガロース（１０〜１００ｎＭ）は血小板凝集及び分泌（脱顆粒化）を増強する場合に有効であるが、Ｔ３、ＤＩＰＴＡ又はＧＣ−１は有効ではない。従って、Ｔ４（又はその類縁体及び重合体コンジュゲート、例えばＴ４−アガロース）は１０ｍＭ塩化カルシウムと組み合わせて、そしてコラーゲンの存在下又は非存在下において、創傷治癒のために好ましいものである。図２３Ａ〜Ｅを参照できる。
血栓弾性記録計：
血栓弾性記録計（ＴＥＧ）が１９４８年においてＨａｒｔｅｒｔによりそれが開発されてから種々の病院状況において使用されている。ＴＥＧの原理は血塊の物理的粘弾性の特性の計測に基づいている。凝塊の形成はコンピューター化された血栓弾性記録計（ＴＥＧ３０００型、Ｈａｅｍｏｓｃｏｐｅ、Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬ）を用いながら、振動プラスチックシリンダー型キュベット（「カップ」）及び表面間に１ｍｍのクリアランスを有する同軸の懸垂型のステーショナリーピストン（「ピン」）中で３７℃においてモニタリングした。カップは４．５秒毎に何れかの方向に振動し、１秒のサイクル間不動期間を設け；０．１Ｈｚの周波数及び秒当たり０．１の最大剪断速度となるようにした。ピンはトルク伝達機として作用する捻転ワイアにより懸垂させる。凝塊の形成により、フィブリンフィブリルが物理的にカップをピンに連結し、そして凝塊の粘弾性により影響される状態でのカップの回転（ピンに伝達される）がＩＢＭ互換パーソナルコンピューターおよびカスタマイズされたソフトウエア（Ｈａｅｍｏｓｃｏｐｅ  Ｃｏｒｐ，Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬ）を用いてオンラインで表示される。ピンにより経験されたトルク（カップの振動との相対において）を時間の関数としてプロットする（図５８）。
【０３１４】
ＴＥＧは凝塊の初回開始のための潜時（Ｒ）、約２０ｍｍ振幅の固定された凝塊堅固性（ｋ）の開始までの時間、角度により計測される凝塊発生の動態（α）、及び凝塊の最大振幅（ＭＡ）のような種々のパラメーターを計測することにより凝集を評価する。パラメーターＡはＭＡの何れかの点におけるトレーシングの幅を計測する。ｍｍ単位の振幅Ａは凝塊の強度又は弾性の関数である。ＴＥＧトレーシング上の振幅は凝塊の剛性の尺度であり；凝塊により達成されるピーク強度又は剪断弾性係数Ｇは凝塊の剛性の関数であり、そしてＴＥＦトレーシングの最大振幅（ＭＡ）から計算できる。以下のパラメーターをＴＥＦトレーシングから計測した。
●Ｒ、即ち反応時間（ゲル化時間）は三次元のフィブリンゲルネットワーク（約２ｍｍの計測可能な剛性を有する）の樹立の前の潜時を示す。
●最大振幅（ＭＡ、ｍｍ単位）は凝塊により顕在化されるピーク剛性である。
●剪断弾性計数又は凝塊強度（Ｇ、ダイン／ｃｍ２）は以下により定義される。
【０３１５】
Ｇ＝（５０００Ａ）／（１００−Ａ）
血塊の堅固度は、凝塊は血管傷害の部位において剪断応力に耐えなければならないため、インビボの血栓及び止血に関する重要なパラメーターである。ＴＥＧは凝塊の形成及び収縮に関与する種々の要因（凝固活性化、トロンビン形成、フィブリン形成、血小板活性化、血小板−フィブリン相互作用、及びフィブリン重合）に対する異なる種々の薬理学的介入の薬効を評価することができる。ヒト全血におけるコンピューター化されたＴＥＧにより計測される種々の凝塊パラメーターに対する内毒素（０．６３ｕｇ）、Ｘａ（０．２５ｎＭ）、トロンビン（０．３ｍＵ）、及びＴＦ（２５ｎｇ）の作用を表３に示す。
【０３１６】
採血：
血液はＨｕｍａｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｂｅａｕｍｏｎｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌにより認可されているプロトコルの下に同意を得たボランティアから得た。２シリンジ法を用いながら、試料を２１ゲージのバタフライニードルを介して採取し、そして最初の３ｍｌの血液は廃棄した。全血（ＷＢ）は、１：９（ｖ／ｖ）のクエン酸塩と全血の比が維持されるように３．８％クエン酸３ナトリウムを含有するシリコーン処理されたＶａｃｕｔａｉｎｅｒ試験管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）中に採集した。ＴＥＧは採決後３時間以内に実施した。カルシウムを添加して１〜２．５ｍＭに戻し、その後異なる刺激物質を添加した。塩化カルシウム自体は使用濃度において、凝塊形成及び凝塊郷土に対しては最小限の作用のみ示していた。
【０３１７】
凝塊形成はフィブリノーゲンに由来するフィブリノペプチドＡのトロンビン誘導分解により開始する。生成するフィブリン単量体は自発的に重合してフィブリル鎖を形成し、これは直鎖伸長、分枝、及び側方会合を起こし、フィブリン繊維の三次元ネットワークの形成をもたらす。ネットワーク構造の独特の性質は、それらが変形させる剪断応力に抵抗することができる剛性の弾性固体として挙動することである。この変形に対する抵抗性は、弾性率、即ち凝塊強度の指標により計測できる。凝塊形成の開始までの時間にのみ基づいていた従来の凝固試験（例えばプロトロンビン時間及び部分トロンボプラスチン時間）とは異なり、ＴＥＧは凝塊により達成される最大強度の計測を可能にする定量的情報の獲得を可能にする。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を介して、血小板はフィブイン（フィブリノーゲン）に結合し、そして凝塊の粘弾性特性をモジュレートする。本発明者等の結果は、ＴＦ−ＴＥＧにおける凝塊強度は明確に血小板濃度の関数であり、そして血小板は剪断力下で８倍まで凝塊強度を強化することを示している。異なる血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗剤（クラスＩｖｓクラスＩＩ）が剪断力下にＴＦ−ＴＥＧを用いた場合に血小板−フィブリン媒介凝塊強度の抑制において区別可能な薬効を伴って挙動している。
【０３１８】
統計学的分析：
データは平均±ＳＥＭで表示する。データは適宜スチューデントのｔ検定又はＡＮＯＶＡを用いながら一対又は群分析の何れかにより分析し；差はｐ＜０．０５で有意とみなした。
【表Ｃ】
2010513526.tif 000043
【０３１９】
インピーダンス手法を用いた全血における血小板凝集及び脱顆粒化：
Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより入手した５６０型の全血凝集計及び関連するアグロリンクソフトウエアを本試験において使用した。２つの電極を希釈した血液中に入れ、そして電気インパルスを一方から他方に送る。電極の周囲に血小板が凝集するに従って、Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇは抵抗のオームにおいて電気シグナルのインピーダンスを計測する。
【０３２０】
採血：
全血を３．８％緩衝クエン酸ナトリウムの入った４．５ミリリットルのＶａｃｕｔａｉｎｅｒバイアル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）内に１７〜２１歳の健常ドナーより毎日採取した。血液は血小板の寿命を延長するためにロッカー上に維持し、そして実験は静脈切開から５時間以内に実施した。
操作法：対照用に全血５００マイクロリットル、０．９％食塩水５００マイクロリットル、及び磁気攪拌子をキュベット中に混合し、そして３７℃において５分間加熱した。閾値未満の凝集を１〜２μｇ／ｍｌコラーゲンの５マイクロリットルで誘導し、これは凝集計では６〜７分で計測される。コラーゲン誘導凝集及び分泌に対するＴ４、Ｔ４−アガロースｖｓＴ３及び他の甲状腺ホルモン類縁体の作用を試験した。Ｉｎｇｅｒｍａｎ−Ｗｏｊｅｎｓｋｉ  Ｃ，Ｓｍｉｔｈ  ＪＢ，Ｓｉｌｖｅｒ  ＭＪ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｒｙ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｃａｌ  ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｒｙ，ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＴＰ，ａｎｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ．１９８３Ｊａｎ；１０１（１）：４４−５２．
細胞遊走試験：
ヒト顆粒球をＭｏｕｓａ等の方法により流出血液から単離し、そして細胞遊走試験を以前に報告されているとおり実施する（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９（３）：１７９−１８７，１９９７、及びＭｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ１９（３）：１８９−１９５，１９９７）。慨すれば、８μｍの孔径を有するＮｅｕｒｏｐｒｏｂｅの９６穴の使い捨て化学遊走チャンバーを使用する。このチャンバーはケモカイン、サイトカイン又は細胞外マトリックス蛋白の勾配に向かう細胞遊走の定量を可能にする。細胞懸濁液（２ｘ１０６を４５μｌ）を、フラバノイド又は甲状腺ホルモン誘導体のような被験物質の５μｌを含有するポリプロピレンプレートに添加し、そして２２℃で１０分間インキュベートする。ＩＬ８（０．１〜１００ｎｇ）を０．００１〜０．１μＭのＴ３／Ｔ４の存在下又は非存在下に使い捨て化学遊走チャンバーの下方のウェルに添加し、次に予備フレーム付きのフィルターを用いてチャンバーを組み立てる。細胞／被験物質懸濁液２５μｌを上側のフィルターに添加し、次に湿潤した細胞培養インキュベーター中で一夜インキュベートする（２２時間、３７℃、５％ＣＯ２）。一夜インキュベートした後、１２チャンネルのピペット及び細胞スクレーパーを用いながら非遊走細胞及び過剰な培地を穏やかに除去する。次にフィルターをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で二回洗浄し、そしてＰＢＳ緩衝液中１％ホルムアルデヒドで固定する。遊走細胞の膜をＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．２％）で透過性とし、次にＰＢＳで２〜３回洗浄する。遊走細胞のアクチンフィラメントを３０分間（２２℃）ローダミンファロイジン（１２．８ＩＵ／ｍｌ）で染色する。ローダミンファロイジンは毎週新しく作成し、３日以内に使用し、保存する場合は４℃で遮光する。化学遊走はＣｙｔｏｆｌｕｏｒＩＩマイクロフィルターフロリメーター（５３０励起／５９０発光）を用いながら蛍光検出により定量的に測定する。全ての細胞の投与及びその後の洗浄は専用に設計された投与／洗浄ステーションを用いて実施する（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９（３）：１７９−１８７，１９９７）。この手法は細胞遊走の正確な定量を可能にし、そして試験内及び試験間の変動が最小限である再現性の良い結果を与える。
【０３２１】
細胞遊走試験：
これらの試験は８μｍの孔径を有するＮｅｕｒｏｐｒｏｂｅの９６穴の使い捨て化学遊走チャンバーを使用して実施した。このチャンバーはビトロネクチン又はオステオポンチンの何れかの勾配に向かう細胞遊走の定量を可能にする。ＥＤＴＡ／トリプシン（０．０１％／０．０２５％）を用いながら標準化された方法に従って培養細胞を除去した。除去後、細胞を二回洗浄し、そしてＥＢＭ（内皮細胞基礎培地、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）中に再懸濁した（２ｘ１０６／ｍｌ）。０．０１２５〜１００μｇ／ｍｌのビトロネクチン又はオステオポンチンの何れか（３３μｌ）を使い捨て化学遊走チャンバーの下方のウェルに添加し、次に予備フレーム付きのフィルターを用いてチャンバーを組み立てた。細胞懸濁液（４５μｌ）を種々の濃度で被験物質５μｌを含有するポリプロピレンプレートに添加し、２２℃で１０分間インキュベートした。細胞／被験物質懸濁液２５μｌを上側のフィルターに添加し、次に湿潤した細胞培養インキュベーター中で一夜インキュベートした（２２時間、３７℃）。一夜インキュベートした後、１２チャンネルのピペット及び細胞スクレーパーを用いながら非遊走細胞及び過剰な培地を穏やかに除去した。次にフィルターをＰＢＳ（Ｃａ＋２又はＭｇ＋２非含有）中で二回洗浄し、そして１％ホルムアルデヒドで固定した。遊走細胞の膜をＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．２％）で透過性とし、次にＰＢＳで２〜３回洗浄した。遊走細胞のアクチンフィラメントを３０分間（２２℃）ローダミンファロイジン（１２．８ＩＵ／ｍｌ）で染色した。ローダミンファロイジンは毎週新しく作成し、３日以内に使用し、保存する場合は４℃で遮光した。化学遊走はＣｙｔｏｆｌｕｏｒＩＩ（５３０励起／５９０発光）を用いながら蛍光検出により定量的に測定した。全ての細胞の投与及びその後の洗浄は専用に設計された投与／洗浄ステーションを用いて実施した。このステーションは６つの個別の試薬ユニットからなり、その各々が３０ｍｌの容量を有するものであった。個々のユニットには以下の試薬、即ち：ＰＢＳ、ホルムアルデヒド、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、又はローダミン−ファロイジンの１つを充填した。この手法を用いながら、フィルターを適切な溶液中に穏やかに浸漬し、これにより遊走した細胞の損失を最小限とした。この手法は細胞遊走の最大の定量を可能にし、そして試験内及び試験間の変動が最小限である再現性の良い結果を与えた。
【表Ｄ】
2010513526.tif 000044
【０３２２】
ＬＣ＝下側チャンバー、ＵＣ＝上側チャンバー
ＬＭ６０９及びＳＭ２５６のような他の強力で特異的なａｖｂ３拮抗剤を用いた場合も同様なデータが得られた。
【０３２３】
実施例９Ｂ：インビトロのヒト上皮及び線維芽細胞の創傷治癒：
インビトロの２次元創傷治癒法は参照により全体が本明細書に組み込まれるＭｏｈａｍｅｄ  Ｓ，Ｎａｄｉｊｃｋａ  Ｄ，Ｈａｎｓｏｎ，Ｖ．Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｄｒｕｇ  Ｉｎｔｅｌｌ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍ２０：９７３−９７５；１９８６に記載の通りである。更に又、本発明者等の研究室において既に確立されている３次元の創傷治癒法を本試験において使用する（下記参照）。データは甲状腺ホルモンによる創傷治癒の強力な刺激を示している。
【０３２４】
ヒト皮膚線維芽細胞のインビトロ３Ｄ創傷治癒試験：
工程１：委縮コラーゲンゲルを製造する。
１）２時間室温で３５０ｕＬの２％ＢＳＡで２４穴プレートをコーティングする。
２）８０％コンフルエントのＮＨＤＦ（正常ヒト皮膚線維芽細胞、５〜９継代）をトリプシン処理し、成長培地で中和し、遠心分離し、ＰＢＳで１回洗浄する。
３）コラーゲン−細胞混合物を製造し、穏やかに混合し、常時氷上に置く。
保存溶液                    終濃度
５ｘＤＭＥＣ                １ｘＤＭＥＭ
３ｍｇ／ｍｌビトロゲン      ２ｍｇ／ｍｌ
ｄｄＨ２Ｏ                  最適
ＮＨＤＦ                    ２ｘ１０〜５細胞／ｍｌ
ＦＢＳ                      １％
４）２４穴プレートから２％ＢＳＡを吸引し、コラーゲン−細胞混合物を３５０ｕｌ／ウェル添加し、プレートを３７℃のＣＯ２インキュベーター中でインキュベートする。
５）１時間後、ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ培地を０．５ｍｌ／ウェル添加し、１０ｕｌチップを使用する。各ウェルの端部からコラーゲンゲルを脱着し、次に２日間インキュベートする。線維芽細胞をコラーゲンゲルと接触させる。
【０３２５】
工程２：３Ｄフィブリン創傷凝塊を製造し、創傷コラーゲン培養物を包埋する。
１）フィブリノーゲン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を被験物質の存在下又は非存在下に製造する。エッペンドルフ試験管中の各ウェルに対し３５０ｕＬのフィブリノーゲン溶液とする。
保存溶液            終濃度
５ｘＤＭＥＣ        １ｘＤＭＥＭ
フィブリノーゲン    １ｍｇ／ｍｌ
ｄｄＨ２Ｏ          最適
被験試薬            最適濃度
ＦＢＳ              １％又は５％
２）鋏を用いて中央から各委縮コラーゲンゲルを切り出す。ゲルをＰＢＳで洗浄し、そしてゲルを２４穴プレートの各ウェルの中央に移す。
３）各試験管にヒトトロンビン（０．２５Ｕ／ｕｌ）１．５ｕＬを添加し、十分混合し、そして次にコラーゲンゲル周囲の溶液を添加し、溶液を１０分間重合させる。
２０分後、被験物質存在下又は非存在下のＤＭＥＭ＋１％（又は５％）ＦＢＳを４５０ｕＬ／ウェル添加し、そして５日間まで３７℃のＣＯ２インキュベーター中でプレートをインキュベートする。毎日写真を撮る。
【０３２６】
糖尿病ラットにおけるインビボ創傷治癒：
糖尿病ラットにおいて急性の切開創傷モデルを用いながら、甲状腺ホルモン類縁体及びそのコンジュゲート型の作用を試験する。創傷閉塞の速度、破壊強度分析及び組織学的検討を第３〜第２１日に周期的に実施する。
【０３２７】
方法：
試験における動物（マウス及びラット）に２つの小型穿刺創傷を作成し、ＷＨを創傷の一方に適用し、そして他方は対照としての食塩水で被覆する。別様には、創傷を放置して自然治癒させる。
【０３２８】
動物は創傷作成後５日に安楽死させる。小面積の皮膚、即ち１〜１．５ミリメートルを投与及び未投与の創傷の端部から切り出す。
【０３２９】
創傷の閉塞及び創傷閉塞までの時間を測定する。更に又、創傷の肉芽組織中の結合組織の構築を支援する蛋白であるテナシンのレベルを測定する。肉芽組織の性質（即ち、創傷が治癒するに従い通常形成される粗放なピンク色の組織、新しい毛細血管及び結合組織）も測定する。
【０３３０】
材料及び方法：
慢性肉芽化創傷を当該分野で良く知られている方法を用いて作成する。体重３００〜３５０グラムの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、使用に先立ち、本発明者等の施設において１週間馴化させる。腹腔内ネンブタール麻酔（３５ｍｇ／ｋｇ）下に、ラットの背部を剃毛及び脱毛する。動物を個別ケージに入れ、飼料及び水を自由摂取させる。全ての実験はＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｌｂａｎｙ，ＮＹ  のＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従って実施した。
【０３３１】
ヒトの慢性肉芽形成創傷との比較によるこの創傷の組織学的特性化は以前に実施されている。次に６４匹のラットを８投与群に分割する（ｎ＝８／群）。第５、９、１２、１５及び１８日にベヒクル（ベヒクル対照）の局所適用により動物に投与する。ベヒクル対照はアガロース（第１群）又はＬ−チロキシンのコンジュゲートに使用される重合体型（第２群）とすることができる。１０μｇの球状６糖類、１０μｇのコラーゲン、及び１０ｍＭの塩化カルシウムの存在下に１、１０、１００μｇ／ｃｍ２でＴ４−アガロース（第３〜５群）又はＴ４−重合体（第６〜８群）を投与する創傷は第５、９、１２、１５及び１８日に局所適用する。全ての創傷は曝露状態で放置する。４８時間毎に、創傷の外郭をアセテートシートにトレースし、そして面積の計算はコンピューター化されたデジタル平面面積測定法を用いて実施できる。
【０３３２】
次に肉芽化組織の３つの完全な厚みの横断ストリップを第１９日に創傷の頭方向、中央、及び尾方向の末端から採取し、１０％緩衝ホルマリン中に固定する。横断切片（５μｍ）を各標本から採取し、そしてヘマトキシリン及びエオシンで染色する。肉芽化組織の厚みは低倍率の眼用マイクロメーターを用いて推定できる。高倍率の視野は肉芽化組織の表面炎症層の直下において検査する。肉芽化組織の各々のストリップから、５つの隣接する高倍率視野を写真撮影し、コード化することができる。次にこれらの曝露の拡大した印刷物を用いて盲検方式で組織測定分析を行う。線維芽細胞、「丸型」細胞（マクロファージ、リンパ球、及び好中球）、及び毛細血管を計数する。更に又、各切片の細胞性を１（低減した細胞数）〜５（高度に細胞性である）の尺度上で細胞性に関して等級付けする。
【０３３３】
統計学的分析：
連続面積計測を時間に対してプロットした。各動物のデータにつき、Ｇｏｍｐｅｒｔｚの等式をフィットさせる（典型的なｒ２＝０．８５）。この曲線を用いながら、創傷の半減期を推定することができる。群間の比較は生命表分析及びウイルコクスン検定を用いながら行う。これらの統計学的分析は、ＳＡＳ（ＳＡＳ／ＳＴＡＴ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ６Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃａｒｙ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，１９８７，ｐ１０２８）及びＢＭＤＰ（ＢＭＤＰ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＢＭＤＰ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．１９８８）パッケージを用いながらパーソナルコンピューター上で行う。
【０３３４】
異なる投与群に関する細胞数をプールし、一元分散分析を用いて分析する。群間の差のポストホック分析はＴｕｋｅｙ検定（全対多重比較検定）を用いながらｐ＜０．０５を有意とみなしながら行うことができる。Ｓｉｇｍａ  Ｓｔａｔ統計ソフトウエア（Ｊａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｏｒｔｅ  Ｍａｄｅｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）をデータ分析のために使用する。
【０３３５】
実施例１０：心筋梗塞のげっ歯類モデル
心筋梗塞の冠動脈結紮モデルを用いてラットにおける心臓機能を検討する。ラットをまずキシラジン及びケタミンで麻酔し、そして明確な麻酔が達成された後、気管に挿管し、陽圧換気を開始する。動物を仰臥位とし、その四肢を緩慢にテーピングし、正中胸骨切開を行う。心臓を穏やかに肱置し、そして６−Ｏ縫合糸を左前下行冠動脈の周囲にしっかり結びつける。心臓を迅速に胸内に再設置し、開胸切開部を３−Ｏ巾着縫合により閉鎖し、その後、断続縫合又は外科用クリップで皮膚を閉鎖する。動物を温度調節加熱パッド上に置き、回復中は緊密に観察する。補給酸素及び心肺蘇生は必要に応じて行う。回復後、ラットを動物飼育施設に戻す。ラットにおけるこのような冠動脈結紮は大型の前壁心筋梗塞をもたらす。この操作法に関する４８時間死亡率は５０％もの高値であり、そしてこの操作法により形成される梗塞の大きさには変動がある。これらの事項及び以前の経験に基づけば、以下に考察する甲状腺ホルモン送達の２つのモデルが比較できるような大型の梗塞を有するラット１６〜２０匹を得るためには、約４００匹のラットが必要になる。
【０３３６】
これらの実験は、冠動脈結紮の前又は後の何れかに甲状腺ホルモンを全身投与することが、心エコー検査により評価される血行力学的異常の程度及び血行力学的計測、及び梗塞の大きさの低減を包含する、未損傷の動物において有利な作用をもたらすことを示すために設計されている。結果の計測は梗塞後３週間に提案される。一部のラットは梗塞を有さないか、又は小型の梗塞のみが形成される場合があるが、それらのラットは正常な心エコー検査図及び正常な血行力学的特徴（ＬＶ拡張末期血圧＜８ｍｍＨｇ）により識別できる。
【０３３７】
甲状腺ホルモン送達：
２つの送達の方策が存在する。第１には、甲状腺ホルモンを梗塞周囲の心筋に直接注射する。正常及び虚血の心筋の間の境界画定は急性開胸閉塞の間に容易に識別されるため、この方策は血管形成作用を検出するためのホルモンの十分な送達をもたらす。
【０３３８】
第１のモデルは冠動脈バイパス手術を行っている患者において有用であり、そして１回の局部注射が血管形成を誘導するという原則の証拠を構成しているが、第２のモデルを使用するより広範な方策も使用できる。第２のモデルにおいては、心筋梗塞を誘導する前に、麻酔されたラットにおいて頸動脈を介して左心室内に逆行カテーテルを入れる。或いは、大動脈弁の真上で大動脈に直接穿刺を行う。次に、数秒間冠動脈の血管の起点の上方で大動脈を突然閉塞し等容積収縮をもたらすことにより、甲状腺ホルモンの冠動脈内注射をシミュレーションする。次に甲状腺ホルモンを左心室内又は大動脈内に、大動脈収縮直後に注射する。結果として生じる等容積収縮は血液を冠動脈血管から強制下行させ、全心筋を甲状腺ホルモンで灌流する。この操作法は効果を達成するまで必要に応じて何回も実施できる。注射の回数は使用する用量及び新しい血管の形成に応じたものとなる。
【０３３９】
心エコー検査：
非麻酔下のラットの２Ｄ及びＭ−モードの心エコー検査図を得るための方法が開発されている。左心室の大きさ、機能、壁厚及び壁運動性を高再現性及び高信頼性で計測できる。計測は甲状腺ホルモンの投与に関して偏りを排除するために盲検方式で実施する。
【０３４０】
血行力学的検討：
血行力学的計測を用いることにより左心室の損傷の程度を測定する。ラットをイソフルランで麻酔する。右前頚部に沿った切開部を介して、右頸動脈及び右頸静脈を単離し、圧力伝達カテーテル（Ｍｉｌｌａｒ，ＳＰＲ−６１２、１．２Ｆｒ）を挿入した。次に以下の計測、即ち：心拍数、収縮期及び拡張期のＢＰ、平均心房圧、左心室収縮期及び拡張末期圧、及び＋及び−のｄＰ／ｄｔを行った。特に有用なものは、左心室拡張末期圧であり、その進行性の上昇は心筋の損傷の程度と相関している。
【０３４１】
梗塞の大きさ：
ラットをＴＴＣ法による梗塞の大きさの計測のために屠殺した。
【０３４２】
形態測定：
微小血管密度［微小血管／ｍｍ２］は梗塞区域、梗塞周囲区域において、そして梗塞に対向している拡張した心筋、通常は後壁において計測する。各ラットより、横断面の筋細胞を有する７〜１０個の顕微鏡高倍率視野［ｘ４００］をＩｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウエアを用いながらデジタル記録した。微小血管は盲検で検査者が計数する。微小循環は細動脈と細静脈の間の組織に供給する１５０マイクロメートル以下の直径を有する第３オーダーの細動脈を超えた血管として定義される。左心室肥大における相違を補正するために、微小血管の密度を体重で補正したＬＶ重量で割る。シャム処置したラット由来の心筋を対照として使用する。
【０３４３】
実施例１１．Ｔ４又はＦＧＦ２の前血管形成作用に対するαＶβ３拮抗剤の作用：
αＶβ３抑制剤ＬＭ６０９は１０マイクログラムにおいてＣＡＭモデルにおいてＦＧＦ２又はＴ４誘導の両方の前血管形成性の作用を完全に抑制した（図１６）。
【０３４４】
実施例１２．癌関連の新血管の成長の抑制：
Ｊ．Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９９：２２１１−２２１５，２００２に開示されているプロトコルを、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ−７）の移植を受けているＳＣＩＤマウスへのテトラヨードチロ酢酸（テトラック）の投与のために使用する。テトラックは飲料水中に与えることにより１０−６Ｍまでマウスモデル中のホルモン類縁体の循環系中レベルを上昇させる。エンドポイントは移植腫瘍に関する血管形成に対するテトラックの抑制作用である。
【０３４５】
実施例１３．インビトロの３次元微小血管内皮新芽形成モデルにおけるＶＥＧＦ及びＦＧＦ２の閾値未満レベルの甲状腺ホルモン及びその類縁体の前血管形成促進作用：
Ｔ３、Ｔ４、Ｔ４−アガロース、又は線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）の何れか＋血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）はインビトロの３次元微小血管内皮新芽形成モデルにおいて相互に匹敵する前血管形成作用をもたらした。甲状腺ホルモン類縁体の前血管形成作用は窒素活性化蛋白キナーゼ（ＭＡＰＫ；ＥＲＫ１／２）シグナルトランスダクションカスケードの抑制剤であるＰＤ９８０５９によりブロックされた。更に又、特異的なαＶβ３インテグリン拮抗剤（ＸＴ１９９）は甲状腺ホルモン類縁体又はＴ４−アガロースの何れかの前血管形成作用を抑制した。データは又甲状腺ホルモン拮抗剤テトラックが甲状腺類縁体の前血管形成応答を抑制することも示している。即ち、試験したこれらの甲状腺ホルモン類縁体は前血管形成性であり、それは原形質膜において開始され、αＶβ３インテグリン受容体が関与しており、そしてＭＡＰＫ依存性である作用である。
【０３４６】
本発明はインビトロの３次元微小血管内皮新芽形成モデルにおけるＶＥＧＦ及びＦＧＦ２の閾値未満レベルにおけるＴ３、Ｔ４、又はＴ４−アガロースの前血管形成促進作用を記載している。本発明は又、ホルモン作用は内皮細胞の原形質膜において開始され、そしてαＶβ３インテグリン及びＥＲＫ１／２のシグナルトランスダクション経路の活性化により媒介されるという証拠を提示する。
【０３４７】
３次元新芽形成試験におけるＶＥＧＦ及びＦＧＦ２の低濃度の血管形成活性のＴ３、Ｔ４、又はＴ４−アガロースによる増強が観察された。何れかのＴ３、Ｔ４は１０−７〜１０−８Ｍ、或いはＴ４−アガロースは１０−７Ｍの総ホルモン濃度は、このインビトロのモデルにおいてはＶＥＧＦ及びＦＧＦ２の最大濃度に匹敵する前血管形成活性を有していた。ラット心臓における新しい血管の成長はＴ４の高用量による心筋肥大の誘導と同時に起こることが報告されているが、甲状腺ホルモンは血管形成因子とはみなされていない。本実施例は生理学的濃度におけるホルモンが心臓以外の状況において前血管形成性であることを明確にしている。
【０３４８】
Ｔ４−アガロースはＴ４の作用を再現しており、そしてこの甲状腺ホルモン誘導体は細胞内部への進入ができないと考えられており；それは本発明者等の研究室においてはヨードチロニンの可能な細胞表面開始作用に関するホルモン作用のモデルを検討するために使用されている。更に又、Ｔ４及びテトラックを用いて実施した実験も又このモデルにおけるＴ４の作用は原形質膜において開始されるという結論を裏付けている。テトラックはＴ４の膜開始作用をブロックする。
【０３４９】
甲状腺ホルモンはＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）シグナルトランスダクション経路を非ゲノム的に活性化するため、血管形成に対するホルモンの作用はＭＡＰＫ媒介であるはずである。ＣＡＭモデルに添加した場合、ＭＡＰＫカスケードの抑制剤であるＰＤ９８０５９はＴ４の前血管形成作用を抑制している。この結果はＦＧＦ２同化に対するＴ４の作用の上流の甲状腺ホルモンシグナルのトランスダクションに対する作用と合致していたが、ＦＧＦ２は又ＭＡＰＫ依存性の機序を介しても作用することが知られている。Ｔ４及びＦＧＦ２は個別に内皮細胞においてＥＲＫ１／２のホスホリル化及び核転座をもたらし、そして最大未満の用量において使用された場合、組み合わせられてＥＲＫ１／２の活性化を更に増強する。血管形成のホルモン刺激のＭＡＰＫ依存性の成分のみが血管の成長に対するＦＧＦ２の作用に排他的に関連していた可能性を調べるために、ＰＤ９８０５９の存在下のＴ４に応答したＦＧＦ２の細胞放出を計測した。後者の試薬は成長因子濃度のホルモン誘導増大をブロックしており、そしてＭＡＰＫの活性化が内皮細胞からのＦＧＦ２の放出に対するＴ４の作用、並びに、その結果として生じる血管形成に対するＦＧＦ２の作用に関与していることを示唆していた。
【０３５０】
血管形成に対する甲状腺ホルモンの作用：
０．０１〜０．１μＭにおけるＴ４、Ｔ３又はＴ４−アガロースの何れかは以下の表に示す通り血管形成の有意（ｐ＜０．０１）な刺激をもたらした。これはＦＧＦ２（５０ｎｇ／ｍｌ）＋ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）の前血管形成薬効に匹敵することが示されている。
【表Ｅ】
2010513526.tif 000045
【０３５１】
甲状腺前血管形成作用に対するテトラックの作用
Ｔ３は原形質膜において開始される細部シグナルトランスダクション経路を刺激する。これらの前血管形成作用は原形質膜へのＴ４の結合を抑制することが知られている脱アミノ化ヨードチロニン類縁体であるテトラックによりブロックされる。テトラックの添加（０．１μＭ）はＴ３、Ｔ４又はＴ４−アガロースの何れかの前血管形成作用を抑制している（表５〜７）。これは微小血管内皮細胞遊走の数及び血管長の抑制により示される（表５〜７）。
【０３５２】
甲状腺ホルモンによる血管形成の刺激におけるＥＲＫ１／２シグナルトランスダクション経路の役割：
ＥＲＫ１／２抑制の並行試験を３次元微小血管新芽形成試験において実施した。０．０１〜０．１μＭの甲状腺ホルモン及び類縁体はＰＤ９８０５９により有意（ｐ＜０．０１）にブロックされた作用である管長及び遊走細胞数の有意な増大をもたらした（表５〜７）。これは微小血管内皮細胞遊走の数及び血管長の抑制により示される（表５〜７）。
【０３５３】
甲状腺ホルモンによる血管形成の刺激におけるインテグリンαＶβ３の役割
閾値未満のレベルのＶＥＧＦ及びＦＧＦ２の存在下の０．０１〜０．１μＭにおけるＴ３、Ｔ４又はＴ４−アガロースの何れかに媒介された前血管形成は、αＶβ３インテグリン拮抗剤ＸＴ１９９により有意（ｐ＜０．０１）にブロックされた（表５〜７）。これは以下の表に示す通り、微小血管内皮細胞遊走の数及び血管長の抑制により示される。
【０３５４】
即ち、甲状腺ホルモン及びその類縁体の前血管形成作用は原形質膜αＶβ３インテグリンにおいて開始され、そしてＥＲＫ１／２の活性化が関与している。
【表Ｆ】
2010513526.tif 000046
【０３５５】
【表Ｇ−１】
2010513526.tif 000047
【０３５６】
【表Ｇ−２】
2010513526.tif 000048
【０３５７】
【表Ｈ】
2010513526.tif 000049
【０３５８】
実施例１４：血液脳関門を通過する重合体甲状腺類縁体輸送を評価するためのインビトロのモデル
以下に記載するものは選択された単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺類縁体が血液脳関門を通過すると考えられる場合の容易度を評価するためのインビトロの方法である。モデル及びプロトコルの詳細な説明は参照により全体が本明細書に組み込まれるＡｕｄｕｓ等、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ５０７：９−１８（１９８７）に記載されている。
【０３５９】
慨すれば、微小血管内皮細胞を新鮮ウシ脳の大脳灰白質から単離する。脳は地域の屠殺場から入手し、抗生物質を添加した氷冷最少必須培地（ＭＥＭ）中で実験室まで輸送する。滅菌条件下、大型表面血管及び髄膜を標準的な切除の操作法により除去する。皮質灰白質は吸引により除去し、次いで、約１ｍｍの立方体にまで粉砕する。次に粉砕した灰白質を振とうウォーターバス中３７℃で３時間０．５％ジスパーゼ（ＢＭＢ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）と共にインキュベートする。３時間の消化の後、混合物を遠心分離（１０００ｘｇ、１０分間）により濃縮し、次に１３％デキストラン中に再懸濁し、そして１０分間５８００ｘｇで遠心分離する。上澄みの脂肪、細胞粉砕物及びミエリンを廃棄し、粗製の微小血管ペレットを１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ／ジスパーゼ中に再懸濁し、３７℃で５時間振とうウォーターバス中でインキュベートする。５時間の消化ののち、微小血管懸濁液を予め作成された５０％Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配に適用し、そして１０００ｘｇで１０分間遠心分離する。精製された内皮細胞を含有するバンド（勾配の最上部から２番目のバンド）を取り出し、培地（例えば５０％ＭＥＭ／５０％Ｆ−１２栄養混合物）で２回洗浄する。細胞は後の使用のために２０％ＤＭＳＯ及び１０％ウマ血清を含有する培地中で凍結（−８０℃）する。
【０３６０】
単離の後、約５ｘ１０５個／ｃｍ２の細胞を培養皿又は５〜１２ｍｍ孔径のポリカーボネートフィルターをラットコラーゲン及びフィブロネクチンでコーティングしたものの上にプレーティングする。細胞を播種してから１０〜１２日後に細胞の単層を顕微鏡によりコンフルエント度に関して検査する。
【０３６１】
これらの細胞の形態学的、組織化学的及び生化学的な特質の特性化によれば、これらの細胞は血液脳関門の突出した特徴の多くを保有していることが示される。これらの特徴は堅固な細胞間の接合、膜有窓性の欠如、低レベルの飲食活性、及びガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、アルカリホスファターゼ、及び第ＶＩＩＩ因子抗原活性を包含する。
【０３６２】
培養された細胞は極性の結合又は輸送のためのモデルが必要な広範な種類の実験に使用することができる。マルチウェルのプレートに細胞をプレーティングすることにより、大型及び小型の両方の分子の受容体及び非受容体結合が実施できる。内皮細胞経由のフラックスの計測を行うためには、細胞を多孔質のポリカーボネートメンブレンフィルター（例えばＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，Ｃａｌｉｆ．より入手）上で成長させる。大孔径のフィルター（５〜１２ｍｍ）を使用することにより、フィルターが分子のフラックスに対する律速障壁となる可能性を回避できる。これらの大孔径フィルターの使用はフィルター下の細胞の成長を可能とせず、そして細胞単層の目視検査を可能とする。
【０３６３】
細胞がコンフルエントに達した時点で、それらを横並び拡散セル装置（例えばＣｒｏｗｎ  Ｇｌａｓｓ，Ｓｏｍｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｊ．）中に入れる。フラックスの計測のためには、拡散セルのドナーチャンバーを被験物質でパルスし、次にパルス後の種々の時点において、レシーバーチャンバーから小分量を取り出し、分析に付す。放射性又は蛍光標識された物質は分子フラックスの信頼性の高い定量を可能にする。単層の一体性はスクロース又はイヌリンのような非輸送性の被験物質の添加により同時に計測し、少なくとも４連で測定することにより統計学的有意を確認する。
【０３６４】
実施例１５．外傷性傷害モデル
流体打診脳傷害モデルを用いることにより、単独、又は神経成長因子又は他の神経発生因子と組み合わせた重合体甲状腺ホルモン類縁体が多大な外傷性の脳傷害の後の脳神経系の機能を回復させる能力を評価した。
【０３６５】
１．流体打診脳傷害操作法
本試験において使用した動物は体重２５０〜３００グラムの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）であった。流体打診脳傷害に関する基本的な外科的準備は参照により本明細書に組み込まれるＤｉｅｔｒｉｃｈ等、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．８７：２５０−２５８（１９９４）において以前に記載されている。慨すれば、ラットを３％ハロタン、３０％酸素、及び残余分の亜酸化窒素で麻酔した。気管に挿管し、ラットを定位フレーム上に置いた。次に右壁皮質に重複し、ブレグマの後方３．８ｍｍ、そして正中線から側方２．５ｍｍのところに４．８ｍｍの開頭術を行った。傷害管を露出した硬膜上に置き、そして接着剤で固定した。次に歯科用アクリルを傷害管周囲に注ぎ込み、そして次に傷害管にゲルフォームスポンジを充填した。頭皮を縫合閉鎖し、動物を自室ケージに戻し、一夜回復させた。
【０３６６】
翌日、流体打診脳傷害を本質的にはＤｉｘｏｎ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．６７：１１０−１１９（１９８７）及びＣｌｉｆｔｏｎ等、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１１：１１４−１２１（１９９１）により記載される通り作成した。流体打診装置はトランスデューサーハウジングに取り付けた食塩水充填プレクシガラスシリンダー及びラットの頭蓋に適合させた傷害スクリューよりなるものであった。金属スクリューを挿管麻酔（７０％亜酸化窒素、１．５％ハロタン、及び３０％酸素）ラットのプラスチック傷害管にしっかり連結し、そしてピストンを打つ振り子の下降により傷害を誘導した。ラットに１．６〜１．９ａｔｍの範囲の軽度〜中等度の頭部傷害を与えた。脳の温度は右側頭筋内に挿入したサーミスタープローブにより間接的にモニタリングし、そして、３７〜３７．５℃に維持した。直腸温度も又、計測し、そしてモニタリング期間の前及びモニタリング中を通じて３７℃に維持した。
【０３６７】
挙動試験：
３種の標準機能／挙動試験を用いることにより脳傷害の後の感覚運動及び反射機能を評価した。試験はＢｅｄｅｒｓｏｎ等、（１９８６）Ｓｔｒｏｋｅ  １７：４７２−４７６；ＤｅＲｙｃｋ等、（１９９２）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５７３：４４−６０；Ｍａｒｋｇｒａｆ等、（１９９２）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５７５：２３８−２４６；及びＡｌｅｘｉｓ等、（１９９５）Ｓｔｒｏｋｅ  ２６：２３３８−２３４６を包含する文献に詳細に記載されている。
【０３６８】
Ａ．前脚位置付け試験
３種の別個の刺激（視覚、触覚、及び固有受容）に対する前脚の位置付けを計測することにより感覚運動の統合を評価した。ＤｅＲｙｃｋ等、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５７３：４４−６０（１９９２）。視覚位置付けサブテストに関しては、実験者が動物を直立させ、卓上に接近させる。卓上への四肢の正常な位置付けを「０」と採点し、遅延した位置付け（＜２秒）を「１」と採点し、そして位置付けが無いか、極めて遅延した位置付け（＞２秒）を「２」と採点する。別個の評点を、先ず動物を前方に移動させ、そして次に再度動物を横方向に卓まで移動させながら得る（四肢当たり最大評点＝４；何れの場合も、より高値の数がより大きい欠陥を示す）。触覚位置付けのサブテストに関しては、動物が卓上を見ることができないか自身の鬚で触れることができないように動物を保持する。動物を先ず前方に移動させ、そして次に横方向に卓まで移動させながら、背中側の前脚を卓上に軽く触れさせる。各時の位置付けを上記の通り採点する（四肢当たり最大評点＝４）。固有受容のサブテストに関しては、動物を前方のみに移動させ、そしてより大きい圧力を背中側の前脚に適用し；位置付けを上記の通り採点する（四肢当たり最大評点＝２）。最後に卓上による鬚の刺激に応答して前脚を位置づける動物の能力を試験する（四肢当たり最大評点＝２）。次にサブ評点を加算して四肢当たりの総前脚位置付け評点とする（範囲＝０〜１２）。
【０３６９】
Ｂ．ビームバランス試験
ビームバランスは運動皮質傷害に対して感受性である。ラットに狭いビーム上で安定して均衡を保たせることにより前庭運動機能を目視評価するためにこの作業を用いる。Ｆｅｅｎｅｙ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１７：８５５−８５７（１９８２）；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ等、Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０４：３１８−３２５（１９９０）。試験では手術前２４時間に３回の６０秒訓練試行を行うことによりベースラインデータを取得する。装置は３／４インチ幅のビーム、長さ１０インチのものを卓上の上方１フィートに懸垂させたものよりなる。ラットをビーム上に位置付け、そして６０秒間ビーム上に全四肢を置いた状態で安定な姿勢を維持させる。動物の機能は、正常が評点１、そして動物がビーム上に自身を支持することができなかったことを示す評点６までの１〜６の範囲となるＣｌｉｆｔｏｎ等、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１１：Ｉ１１４−１２１（１９９１）の尺度を用いて格付けする。
【０３７０】
Ｃ．ビーム歩行試験
これは後肢の機能を特に検査する感覚運動統合の試験であった。試験の装置及び格付けの操作法はＦｅｅｎｅｙ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１７：８５５−８５７（１９８２）から採用した。１インチ幅のビーム、長さ４フィートのものを薄明かりの部屋において床上３フィートに懸垂する。ビームの遠方側の末端には狭い入り口の付いた暗いゴールボックスを設けた。ビームに沿って等しい距離で４つの３インチの金属スクリューをビームの中心から離れる角度で位置付けた。ビーム始点におけるホワイトノイズ発生器及び高輝度光源は、ビームを渡ってゴールボックスに入るように動物に動議づけさせている。ゴールボックス内に入れば、刺激は終了する。ゴールボックスに到達するまでのラットの潜時（秒）及びそれがビームを渡る際の後肢の機能（１〜７の格付け尺度に基づく）を記録した。評点７は２回未満の足のすべりを伴った正常なビーム歩行を示し、そして評点１はラットが８０秒未満でビームを渡ることができなかったことを示す。各ラットは３連続試行に関して作業獲得のため、そして清浄機能（評点７）を達成するために手術前３日間訓練させている。３つのベースライン試行を手術前２４時間に収集し、そして３試験試行をその後毎日記録した。各々の日の潜時及び評点の平均値を計算した。
【０３７１】
実施例１６．Ｔ４はαＶβ３インテグリンのリガンドである。
【０３７２】
Ｔ４がαＶβ３インテグリンのリガンドであるかどうかを調べるために、市販の精製された蛋白２μｇを［１２５Ｉ］Ｔ４と共にインキュベートし、そして混合物を非変性ポリアクリルアミドゲル上に移動した。αＶβ３は放射標識Ｔ４に結合し、そしてこの相互作用は濃度依存的な態様において、［１２５Ｉ］Ｔ４インキュベーションの前にαＶβ３に添加しておいた未標識Ｔ４により競合的に途絶された（図２４）。未標識Ｔ４の添加は、総Ｔ４濃度合計１０−７Ｍ総（３ｘ１０−１０Ｍ遊離Ｔ４）で１３％、合計１０−６Ｍ総（１．６ｘ１０−９Ｍ遊離）で５８％まで放射標識リガンドへのインテグリンの結合を低減し、そして結合の抑制は１０−５Ｍの未標識Ｔ４で最大となった。非直線回帰を用いた場合、遊離のＴ４とのαＶβ３の相互作用は３３３ｐＭのＫｄ及び３７１ｐＭのＥＣ５０を有することが分かった。未標識Ｔ３はαＶβ３への［１２５Ｉ］Ｔ４結合を置き換えることにおいては効果がより低く、１０−４Ｍの総Ｔ３で２８％までシグナルを低減した。
【０３７３】
実施例１７：αＶβ３へのＴ４の結合はテトラック、ＲＧＤペプチド及びインテグリン抗体によりブロックされる。
【０３７４】
本発明者等は以前に、細胞表面において活性化されたＴ４刺激シグナリング経路は原形質膜へのＴ４の結合を防止することが分かっているヨードチロニン類縁体テトラックにより抑制することができることを示した。本発明者等の放射性リガンド結合試験においては、１０−８Ｍのテトラックは精製されたαＶβ３への［１２５Ｉ］Ｔ４結合に対して作用を有していなかったが、Ｔ４とαＶβ３の会合は１０−７Ｍテトラックの存在下では３８％まで、そして１０−５Ｍテトラックの存在下では９０％まで低減された（図２５）。相互作用の特異性を測定するために、αＶβ３上の細胞外マトリックス結合部位に結合するＲＧＤペプチド、及びアスパラギン酸残基の代わりにグルタミン酸残基を有し、そしてこのためαＶβ３には結合しないＲＧＥペプチドを添加することにより、Ｔ４をインテグリンとの結合から排除することを試みた。ＲＧＤペプチドの適用は用量依存的な態様においてαＶβ３との［１２５Ｉ］Ｔ４の相互作用を低減したが、ＲＧＥペプチドは低減しなかった（図２５）。
【０３７５】
αＶβ３とのＴ４の相互作用を更に特性化するために、αＶβ３又はαＶβ５に対する抗体を、［１２５Ｉ］Ｔ４の添加の前に精製されたαＶβ３に添加した。αＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９、１μｇ／ｍｌの添加は未投与対照試料と比較して５２％までインテグリンとＴ４との間の複合体形成を低減した。２μｇ、４μｇ、及８μｇ／ｍｌまでＬＭ６０９の量を増大させると、それぞれ６４％、６３％及び８１％までバンドの強度が減衰した（図２６）。同様の結果は、異なるαＶβ３モノクローナル抗体ＳＣ７３１２をインテグリンと共にインキュベートした場合にも観察された。ＳＣ７３１２は１μｇ／ｍｌの抗体が存在する場合は２０％、２μｇでは４６％、４μｇでは４７％、そして８μｇ／ｍｌの抗体が存在する場合は５９％まで、αＶβ３に結合するＴ４の能力を低減した。αＶ及びβ３の個別に対するモノクローナル抗体とのインキュベーションはαＶβ３への［１２５Ｉ］Ｔ４結合に影響しておらず、会合がαＶβ３のヘテロ２量体複合体から生じる結合ポケットを必要とし、何れかの単量体上の特定の領域を必ずしも必要としないことが示唆された。バンド強度の低減がαＶβ３抗体の特異的認識によるものであったことを確認するために、精製されたαＶβ３を［１２５Ｉ］Ｔ４の添加の前にαＶβ３へのモノクローナル抗体（ＰＩＦ６）又はマウスＩｇＧと共にインキュベートしたところ、何れも、インテグリンと放射性リガンドとの間の複合体形成に影響しなかった（図２６）。
【０３７６】
実施例１８．Ｔ４刺激ＭＡＰＫ活性化はホルモン結合の、そしてインテグリンαＶβ３の抑制剤によりブロックされる。
【０３７７】
ホスホリル化ＭＡＰＫ（ｐＥＲＫ１／２）の核転座を３０分間１０−７Ｍの総ホルモン濃度、１０−１０Ｍの遊離ホルモンのＴ４の生理学的レベルを投与したＣＶ−１細胞において試験した。本発明者等が以前に報告した結果と合致して、Ｔ４は３０分以内にＣＶ−１細胞におけるホスホリル化ＭＡＰＫの核蓄積を誘導した（図２７）。１６時間αＶβ３拮抗剤の指定された濃度と共にＣＶ−１細胞を予備インキュベートした場合、ＭＡＰＫの活性化及び転座を誘導するＴ４の能力は低減された。１０−８及び１０−７ＭにおけるＲＧＤペプチドの適用はＭＡＰＫ活性化に対して最小限の作用を有していた。しかしながら、１０−６ＭのＲＧＤペプチドは対照培養物と比較して６２％までＭＡＰＫホスホリル化を抑制しており、そして活性化は１０−５ＭのＲＧＤ（８５％低減）及び１０−４ＭのＲＧＤ（８７％低減）が培地中に存在していた場合に最大に低減された。培地への非特異的ＲＧＥペプチドの添加はＣＶ−１細胞においてＴ４投与後のＭＡＰＫホスホリル化及び核転座に対して作用を有していなかった。
【０３７８】
原形質膜へのＴ４の結合を防止するテトラックはＴ４誘導ＭＡＰＫ活性化の効果的な抑制剤である。Ｔ４と共に１０−６Ｍの濃度で存在する場合、テトラックはＴ４単独を投与した培養物と比較して８６％までＭＡＰＫホスホリル化及び転座を低減した（図２７）。Ｔ４の適用の１６時間前に培地に１０−４Ｍのテトラックを添加した場合、抑制は９７％まで増大した。Ｔ４による刺激の１６時間目に培地にαＶβ３モノクローナル抗体ＬＭ６０９を添加したところ、やはり、Ｔ４誘導ＭＡＰＫ活性化は低減された。培地中０．０１及び０．００１μｇ／ｍｌのＬＭ６０９はＴ４投与後のＭＡＰＫ活性化に影響しなかった。０．１、１、及び１０μｇ／ｍｌまで培地中の抗体の濃度を増大させたところ、Ｔ４単独投与細胞と比較して、それぞれ２９％、８０％、及び８８％まで細胞の核画分中に存在するホスホリル化ＭＡＰＫのレベルを低減した。
【０３７９】
ＣＶ−１細胞をαＶ、β３、又はαＶとβ３両方へのｓｉＲＮＡで一過性にトランスフェクトし、そして１６時間回復させた後、血清非含有培地中に入れた。３０分間Ｔ４投与の後、細胞を採取し、核蛋白又はＲＮＡの何れかを抽出した。図２８Ａは標的インテグリンサブユニットに対する各々のｓｉＲＮＡの特異性を示している。αＶｓｉＲＮＡ又はαＶ及びβ３両方のｓｉＲＮＡの何れかでトランスフェクトしたＣＶ−１細胞は低下したαＶサブユニットＲＴ−ＰＣＲ産物を示したが、β３に特異的なｓｉＲＮＡで細胞をトランスフェクトした場合、又は外因性ｓｉＲＮＡの非存在下にトランスフェクション試薬に曝露した場合はαＶｍＲＮＡの発現に差はなかった。同様に、β３ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞はβ３ｍＲＮＡの低減したレベルを有していたが、αＶｓｉＲＮＡのレベルは相対的に不変であった。３０分間Ｔ４を添加した場合、細胞にトランスフェクトされたｓｉＲＮＡに関わらず、αＶ又はβ３の何れに関してもｍＲＮＡレベルは改変されなかった。
【０３８０】
活性化されたＭＡＰＫレベルは、αＶ及びβ３に対するｓｉＲＮＡで、個別に、又は組み合わせて、トランスフェクトしたＣＶ−１細胞におけるウエスタンブロットにより計測した（図２８Ｂ）。スクランブルド陰性対照ｓｉＲＮＡを投与したＣＶ−１細胞は親細胞系統と比較してＴ４誘導活性化ＭＡＰＫの僅かに上昇したレベルを有していた。トランスフェクション試薬単独に曝露した細胞は非トランスフェクトＣＶ−１細胞と同様のＭＡＰＫホスホリル化のレベル及びパターンを示した。αＶｓｉＲＮＡ又はβ３ｓｉＲＮＡの何れかを単独又は組み合わせてＣＶ−１細胞にトランスフェクトした場合、ベヒクル投与培養物中のホスホリル化ＭＡＰＫのレベルは上昇したが、活性化ＭＡＰＫレベルのそれ以上の上昇を誘導するＴ４の能力は抑制された。
【０３８１】
実施例１９．ホルモン誘導血管形成はαＶβ３への抗体によりブロックされる。
【０３８２】
血管形成は生理学的濃度のＴ４の適用によりＣＡＭ試験において刺激される（図２９Ａ及び総括は図２９Ｂ）。ＣＡＭフィルターディスク上に置いた１０−７ＭのＴ４はＰＢＳ投与膜と比較して２．３倍（ｐ＜０．００１）まで血管分枝形成を誘導した。Ｔ４からＴ３への変換を防止するプロピルチオウラシルはＴ４によりもたらされる血管形成に対する作用は有していない。αＶβ３に対して指向されたモノクローナル抗体ＬＭ６０９（１０μｇ／フィルターディスク）の添加はＴ４への前血管形成性の応答を抑制した。
【０３８３】
実施例２０．テトラックナノ粒子製剤の製造及び使用−ＰＬＧＡ
テトラックをカプセル化している乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子は単分散エマルジョン法により製造した。ＰＬＧＡとテトラックの均質な溶液は、アセトン１ｍｌ中にＰＬＧＡ３０ｍｇ及びテトラック１．６ｍｇを混合することにより得た。ＰＬＧＡナノ粒子は安定化剤の存在下及び非存在下に製造した（ポリビニルアルコールを安定化剤として使用した）。ＰＬＧＡ及びテトラックの両方を含有するこの溶液１００ｕＬを脱イオン水１０ｍｌに添加し、そして２時間攪拌した。安定化剤を用いたナノ粒子の合成のためには、上記した溶液１００ｕＬを１％ＰＶＡ溶液に一定の攪拌を行いながら滴下した。ナノ粒子は適当な透析膜を用いて約１２時間透析することにより精製した。安定化剤を添加することは水溶液中のナノ粒子に対して単分散性及び安定性を与える。結果は図３３に示す。
【０３８４】
ｂ−ＦＧＦ誘導血管形成のＣＡＭモデルにおける試験は図３４に示す通り遊離テトラック及びテトラック−ＰＬＧＡナノ粒子に関わる強力な抗血管形成薬効を明らかにしている。更に又、ＣＡＭモデルにおけるＴ４媒介血管形成に対するテトラックｖｓテトラックナノ粒子の抗血管形成薬効の試験を以下の表及び図５９に示す。
【表Ｉ】
2010513526.tif 000050
【０３８５】
実施例２１．テトラック及びテモゾロミド同時カプセル化ＰＬＧＡナノ粒子の製造
他の適当なナノ粒子はテトラック及びテモゾロミドを同時カプセル化しているＰＬＧＡナノ粒子を包含する。ナノ粒子の主要な利点の１つは多数のカプセル化物質をその内部に一緒に同時カプセル化する能力である。模式図を図３５に示す。
【０３８６】
実施例２２．リン酸カルシウムを含有するＴ４コラーゲンコンジュゲートナノ粒子
コラーゲンナノ粒子内部からの放出の動態は図３６Ｂに示す通り、最初の２時間内の４０％放出と２０時間に渡る持続性の緩徐な放出を示している。ナノ粒子の製造は図３６Ａに示す。Ｔ４は以下に示す通り＞９９％の安定性でナノ粒子の外部に固定化された。創傷治癒のための製剤はコラーゲンナノ粒子上に固定化されたＴ４及び内部のリン酸カルシウムナノ粒子を含有するか、又は、局所用製剤のためのコラーゲンナノ粒子の外部に置くことができる。クロマトグラムの結果を図３７Ａ〜Ｂ及び図３８Ａ〜Ｂに示す。
【０３８７】
実施例２３．ＧＣ−１カプセル化ＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子の製造
ＧＣ−１をカプセル化しているＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子は単分散エマルジョン法により製造する。ＰＥＧ−ＰＬＧＡの溶液はＤＭＳＯ中に製造する（例えば８０ｍｇ／ｍＬ）。ＧＣ−１の別の溶液をＤＭＳＯ中に別途製造する（例えば１５ｇ／ｍＬ）。ここで等しい量の両方の溶液を混合する（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ及びＧＣ−１）。ここでこの溶液１００ｕＬを一定の攪拌を行いながら１％ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）溶液に添加する。４時間後、ＧＣ−１をカプセル化しているナノ粒子を含有する全溶液を透析に付すことにより不純物を除去する。ＧＣ−１カプセル化ＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子の製造のための模式的ダイアグラムを図３９に示す。
【０３８８】
実施例２４．ＧＣ−１又はＴ３カプセル化ＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子の製造
ＧＣ−１又はＴ３をカプセル化しているＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子を単分散エマルジョン法により製造する。ＰＥＧ−ＰＬＧＡの溶液はＤＭＳＯ中に製造する（例えば８０ｍｇ／ｍＬ）。ＧＣ−１又はＴ３の別の溶液をＤＭＳＯ中に別途製造する（例えば１５ｇ／ｍＬ）。次に、等しい量の両方の溶液を混合する（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ及びＧＣ−１又はＴ３）。この溶液１００μＬを一定の攪拌を行いながら１％ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）溶液に添加する。４時間後、ＧＣ−１又はＴ３をカプセル化しているナノ粒子を含有する全溶液を透析に付すことにより不純物を除去する。Ｔ３カプセル化ＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子の製造のための模式的ダイアグラムを図４０に示す。
【０３８９】
テトラックの新しい製剤は細胞内へのテトラックの進入を排除し、そしてその活性を原形質膜インテグリン受容体に限定する構造であるナノ粒子への連結を包含する。
【０３９０】
捕獲のために使用される疎水性薬品は溶液形態又は粉末形態であり、そして薬品を溶解するために使用される溶媒はジメチルホルムミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジクロロメタン、酢酸エチル、エタノールから選択される。
【０３９１】
ブロック共重合体ミセルは粘膜接着性及び熱感受性の重合体成分から作成され、そして滴下されるとそれはムチン膜を貫通し、膜の細孔に付着し、そして体温においてはそれはより疎水性となり薬品をより迅速に放出する。
【０３９２】
本発明のミセルのランダムブロック共重合体はビニルピロリドン（ＶＰ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡＭ）及びアクリル酸（ＡＡ）のような単量体をＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ）の存在下に混合すること、及び混合物を触媒として過硫酸アンモニウムを用いながらフリーラジカル重合反応により重合することにより製造してよい。重合体鎖の疎水性の部分は薬剤の溶解を支援するミセルの内部に埋没したまま残存し、そしてカルボン酸のような親水性の部分はミセルの表面外部に伸長される。水溶液中のミセル分散液の透明溶液ははるかに効果的に患者の眼に滴下することができ、そしてミセル内部にカプセル化された薬品の持続放出が薬品の治療効果を増強する。
【０３９３】
ブロック共重合体ミセル内に上記した薬品１つ以上を配合するためには、以下に記載する種々の方法を単独又は組み合わせて使用してよい。
（ｉ）攪拌：薬品をブロック共重合体の水溶液に添加し、そして２〜２４時間攪拌することにより薬品を含有するミセルが得られる。
（ｉｉ）加熱：薬品及びブロック共重合体の水溶液を混合し、３０℃〜８０℃において５分間〜数時間攪拌し、次に攪拌しながら室温に冷却することにより薬品を含有するミセルが得られる。
（ｉｉｉ）超音波処理：薬品及びブロック共重合体の水溶液の混合物を１０分間〜３０分間超音波処理に付し、次に室温で攪拌することにより薬品を含有するミセルが得られる。
（ｉｖ）溶媒蒸発：薬品をクロロホルムのような有機溶媒に溶解し、そしてミセルの水溶液に添加する。その後、攪拌しながら有機溶媒を緩徐に蒸発させ、次に濾過して遊離の薬品を除去する。
（ｖ）透析：重合体ミセル溶液を薬品の有機溶液に添加し、混合物を緩衝溶液、次いで水に対して透析する。
【０３９４】
ブロック共重合体のミセルは、両親媒性の単量体を水性媒体に溶解することによりミセルとし、そのミセルに交差結合剤、活性化剤及び開始剤の水溶液を添加し、その混合物を３０℃〜４０℃で不活性ガスの存在下でミセルの重合が完了するまで重合に付すことにより製造する。
【０３９５】
精製工程は透析により行う。透析は水相中に未反応の単量体及び遊離疎水性化合物が存在する場合にそれを排除するために２〜１２時間行う。疎水性薬品は重合時間中に本発明の重合体ミセル内に取り込んでよく、その場合、薬品は水溶液の単量体のミセル内に溶解され、そして重合は薬剤の存在下に行われる。ミセルの疎水性コア部内に保持された薬品が長時間制御された態様において角膜表面で放出されるため、本発明の組成物は、従来の製剤化手法には適し、或いは粘膜接着性のミセルを用いていた薬品を製剤化する場合に適さない。
【０３９６】
実施例２５．眼科用のナノ粒子製剤の設計
初期の実験においては、異なる重合体に基づく３種の異なるナノ粒子製剤を製造することになる。表面電荷、大きさ及び粘膜接着性のような異なる変動性を有するこれらのナノ粒子の薬効を検討する。テトラックはこれらのナノ粒子製剤の全てにカプセル化する。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、塩酸Ｎ−３−アミノプロピルメタクリルアミド、及びアクリル酸の異なる比を有する広範なＰＬＧＡ、キトサン及び専用に作成された共重合体のナノ粒子を合成する。目標はテトラック増強眼内動態のための異なるナノ製剤を設計することである。ナノ粒子が角膜上に滞留してテトラックを送達し、そして別の選択肢が角膜を通過するナノ取り込みを増大させることである場合の２つの異なる選択肢を本発明者等は定義する。ナノ物質の大きさ及び表面電荷並びに性質はテトラックのための最適な点眼製剤を得るために調節する。
【０３９７】
【化３６】
2010513526.tif 000051
ナノ粒子の分析：
ＰＲＩにより開発されたオリジナルの方法に基づいて、テトラックナノ粒子に特化した変法のＨＰＬＣ分析方法を開発する。ナノ粒子内部のテトラックの間接的な定量のための分析方法の開発も課題とする。１つのセットからナノ粒子の総量の半分を５０％アセトン中で崩壊させ、遊離及びカプセル化テトラックの総量に関するＨＰＬＣにより直接分析する。一方、残りの半分のナノ粒子は１００ＫＤ遠心分離フィルター膜装置を通して濾過し、そして濾液をＨＰＬＣにより遊離テトラック総量に関して分析する。即ち、２つの分析におけるテトラックの量の間の差はナノ粒子内部のテトラックの量を示すことになる。
【０３９８】
試料製造プロトコルはナノ粒子の各種類に対して試験し、そして相応に調節する必要がある。
【０３９９】
インビトロ放出動態：
放出動態を試験するために、テトラックをカプセル化しているナノ粒子製剤既知量の放出動態を試験すべき所望の媒体中に懸濁する。溶液をマイクロ遠沈管中５００ｕＬの小分量ずつとして分注する。所定の時間感覚において、溶液を上記した通り遠心分離フィルター膜装置（１００ＫＤカットオフ）を通して濾過することによりロードしたナノ粒子から遊離のテトラックを分離する。遊離テトラックの濃度はＨＰＬＣにより測定する。
【０４００】
【化３７】
2010513526.tif 000052
式中、［ＴＥＴＲＡＣ］ｆ，ｔは時間ｔにおけるテトラックの濃度であり、そして［ＴＥＴＲＡＣ］０はカプセル化されたテトラックの総量である。
【０４０１】
インビボ実験
ニュージーランド白ウサギの眼中のナノ粒子製剤の薬効をナノ粒子を伴わない薬品の対照と比較しながら試験するために予備的なインビボの実験を行う。適用方法、房水の収集等のような操作法は動物プロトコルに詳述されている。眼の残余部分は−８０℃で凍結保存することにより将来の分析に備えておく。２匹のウサギから得た４眼を各試験時において各製剤につき使用する（ｎ＝４）。房水試料は局所薬品投与後３０及び９０分に収集し、その際、各時点につき２匹を屠殺する。これには試験の過程を通じて少なくとも４０匹のウサギを屠殺する必要がある。
【０４０２】
収集した房水に由来する試料は必要に応じて分析時まで−８０℃で凍結する。
【０４０３】
全試料はＨＰＬＣで分析する。ナノ粒子中のテトラックの分析のための新しい特定の方法は遊離及びカプセル化の両方のテトラックを分析するために使用される。１００ＫＤのフィルターを通した房水の濾過はテトラックの２つの形態を調べるために以前に記載されている通り使用する。
【０４０４】
インビボの放出動態からの結果に応じて、３つの製剤を第ＩＩ相のために選択する。各製剤につき１つのパイロットバッチを製造する。これらの選択された製剤の特性及び安定性を更に検討する。
【０４０５】
実施例２６．テトラック又は類縁体を含有するナノ粒子の製造：
ＰＫに関する懸濁液製剤及び毒性学的試験を以下の操作法により行う。
１．テトラック５０ｍｇを量り取り、１０ｍｌの０．５％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）に添加する。
２．テトラックが懸濁するまで十分混合する。
３．使用前に混合する。
【０４０６】
静脈内投与のために作成して使用した別の製剤は以下に概説する操作法を用いて製造した。
１．ＤＭＳＯ１．０ｍｌ中にテトラック２００ｍｇを溶解する。
２．１．０ｍｌのＴｗｅｅｎ８０を添加し、そして５分間攪拌する。Ｔｗｅｅｎ８０が全て溶解していることを確認する。
３．１０ｍｌのＰＢＳを（攪拌しながら）滴下する。
４．１．０Ｍの２塩基性リン酸ナトリウムをゆっくり攪拌しながら添加することによりｐＨを７．４に調節する。
５．ＰＢＳで２０ｍｌとする。
６．ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬまで希釈する（１：１希釈）。
【０４０７】
実施例２７．動的光散乱実験による粒径の測定：ナノ粒子は適切な透析膜を用いながら約１２時間透析することにより精製する。安定化剤を添加することにより水溶液中のナノ粒子に単分散性及び安定性が付与される。粒径分布及びゼータ電位をゼータサイズアナライザーを用いて測定した。結果を図４１Ａ〜Ｂに示す。
【０４０８】
実施例２８．テトラヨードチロ酢酸（テトラック）による血管形成の抑制
脱アミノ化甲状腺ホルモン類縁体、テトラヨードチロ酢酸（テトラック）は新規で安価な抗血管形成剤であり、その活性は甲状腺ホルモン受容体とＲＧＤ認識部位との間のインテグリンαＶβ３上での相互作用を示していることが提案されている。
【０４０９】
本試験はＶＥＧＦ及びＦＧＦ２により誘導された血管形成に対するテトラックの作用を検査するために設計された。ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２による血管形成の誘導には内皮細胞上のインテグリンαＶβ３へのこれらの成長因子の結合が関与している。そのような結合にはインテグリン上のリガンド蛋白特異的ドメイン並びにαＶβ３及び数種の他のインテグリンの蛋白リガンドを包括的に識別するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）認識部位が関与している。ＲＧＤペプチドは又、Ｔ４及びＴ３の前血管形成作用をブロックし、インテグリンαＶβ３上のＲＧＤ認識部位と甲状腺ホルモン−テトラック受容体部位が相互に近傍であることを示唆している。理論に制約されることを意図しないが、ＲＧＤ認識部位とホルモンテトラック結合ドメインはαＶβ３上で接近していることから、テトラックは甲状腺ホルモンの非存在下で抗血管形成性である。即ち、甲状腺ホルモン受容体部位の閉鎖はＲＧＤ部位においてインテグリンと相互作用するＶＥＧＦ及びＦＧＦ２の能力を改変すると考えられる。
【０４１０】
材料及び方法
試薬
Ｔ４（ＨＰＬＣにより≧９８％純粋）、Ｔ３、テトラック、酢酸コルチゾン、及びプロピルチオウラシル（ＰＴＵ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。ＦＧＦ２及びＶＥＧＦはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より購入した。マトリゲルはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）より購入した。
【０４１１】
細胞培養
ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−ｄ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）はＩ型コラーゲン（１ｍｇ／ｍＬ）でコーティングした培養フラスコ上で成長させ、そしてウシ脳抽出物（１２μｇ／ｍｌ）、組み換えヒト表皮成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ）、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒドロコルチゾン（１μｇ／ｍｌ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び２ｍＭＬ−グルタミンを添加した内皮成長培地−２（ＥＧＭ−２ＭＶ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）上で維持した。全ての培養添加物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。培養物は５％ＣＯ２において３７℃の湿潤チャンバー中に維持した。培地は３日毎に交換し、細胞系統は８０％コンフルエントで継代した。
【０４１２】
ニワトリ絨毛尿膜試験（ニワトリＣＡＭ試験）：
１０日齢のニワトリの胚をＳＰＡＦＡＳ（Ｐｒｅｓｔｏｎ，ＣＴ）より購入し、３７℃相対湿度５５％でインキュベートした。ニワトリＣＡＭ試験は以前に記載したとおり実施した。慨すれば、皮下注射針を使用しながら卵の平滑な端部に小孔を開け、そして第２の孔部を卵の広範な側面上で、胚膜の無血管の部分の上に直接形成した。第１の孔部において穏やかな陰圧を適用することにより気嚢を排除し、そしてＣＡＭを殻から脱落させた。Ｄｒｅｍａｌモデルの工作研磨機（Ｄｒｅｍｅｌ、Ｒａｃｉｎｅ，ＷＩ）を用いながら、約１．０ｃｍ２のウインドウを疑似気嚢上の殻に切り込み、ＣＡＭに出入りできるようにした。１番のフィルターペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ）の滅菌ディスクに３ｍｇ／ｍＬの酢酸コルチゾン及び１ｍＭのプロピルチオウラシルを予備適用し、そして滅菌条件下で風乾した。甲状腺ホルモン、対照溶媒、及び被験投与物をディスクに適用し、その後乾燥させた。次にディスクをＰＢＳ中に懸垂し、成長中のＣＡＭ上に置いた。３日間インキュベーションした後、フィルターディスク下部のＣＡＭを摘出し、ＰＢＳで洗浄した。各膜を３５ｍｍのペトリ皿に入れ、ＳＶ６立体顕微鏡下に５０倍の倍率で検査した。デジタル画像をキャプチャーし、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏソフトウエア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を用いて分析した。フィルターディスクに等しい環状の領域中に含有される血管分枝点の数を計数した。
【０４１３】
インビトロ新芽形成試験
コンフルエントのＨＭＶＥＣ（５〜１０継代）をゼラチンコーティングＣｔｏｄｅｘ−３ビーズ（Ｓｉｇｍａ）とビーズ当たり細胞４０個の比率で混合した。細胞及びビーズ（２４穴プレートのウェル当たり１５０〜２００ビーズ）を５ｍｌの内皮基礎培地（ＥＢＭ）＋１５％（ｖ／ｖ）正常ヒト血清（ＨＳ）で懸濁させ、室温で４時間穏やかに混合し、次に一夜ＣＯ２インキュベーター中３７℃で培養した。培養物を新しいＥＢＭ＋５％ＨＳ１０ｍｌで３時間処理した。１００μｌのＨＭＶＥＣ／ビーズ培養物をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）５００μｌと混合し、そして２４穴プレートの１つのウェルに添加した。ビーズ／ウェルの数を計数し、そしてビーズ／ＥＣの濃度を計算した。
【０４１４】
前述の通り単離したヒトフィブリノーゲンを１ｍｇ／ｍＬの濃度でＥＢＭ中に溶解し（ｐＨ７．４）、そして濾過滅菌し、そして試験すべき血管形成因子を添加した。ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）＋ＦＧＦ２（２５ｎｇ／ｍＬ）を陽性対照として使用した。ＨＭＶＥＣ／ビーズ培養物をＥＢＭ培地で２回洗浄し、そしてフィブリノーゲン溶液に添加した。培養物を穏やかに混合し、そして２．５μｌのヒトトロンビン（０．０５Ｕ／μＬ）を添加し、そして培養物３００μｌを２４穴プレートの各ウェルに移し、２０分間インキュベートした。ＥＢＭ＋２０％正常ＨＳ及び１０μｇ／ｍｌのアプロチニンを添加し、プレートを４８時間ＣＯ２インキユベーター中でインキュベートした。各条件につき実験を３連で実施した。
【０４１５】
毛細血管新芽形成が観察され、そしてＮｉｋｏｎ  ＮＰ−２サーモスタット及びＳｈｅｌｄｏｎ＃２００４二酸化炭素フローミキサーを有するインキュベーターハウジングの装着されたＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ−ＴＭＤ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｃ．；Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて記録した。顕微鏡はＭａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｇ３コンピューターに連結したＤａｇｅ−ＭＴＩＣＣＤ−７２５ビデオカメラ及びＳｏｎｓ  １２”ＰＶＭ−１２Ｚビデオモニターよりなるビデオシステムと直接インターフェイス連絡した。画像はＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いながら種々の倍率でキャプチャーした。新芽血管形成に対する血管形成性の因子の作用は毛細血管の新芽を有するＢＣ−ビーズの数及びパーセントを測定することにより目視により定量した。３連のウェルの各々中１００個のビーズ（５〜６のランダムな低倍率の視野）が各実験条件について計数された。全ての実験は少なくとも３回反復した。
【０４１６】
リアルタイム逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応
全ＲＮＡをＡｍｂｉｏｎ  Ａｑｕｅｏｕｓキット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて単離した。単離したＲＮＡの性質及び量はＢｉｏ−ＲａｄのＥｘｐｅｒｉｏｎ自動電気泳動システム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により測定した。１μｇの全ＲＮＡをＡｄｖａｎｔａｇｅ  ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いながら逆転写した。ＰＣＲは２μＬｃＤＮＡ、１０μＬＳｙｂｅｒｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）及び０．５μＬの２０μＭ遺伝子特異的プライマーを混合することによりＣｅｐｈｅｉｄ  Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて実施した。試料を２０分間２５℃でインキュベートし、そして３０秒９５℃、及び９０秒６０℃による３５ＰＣＲサイクルにおいて増幅した（２工程ＰＣＲ）。閾値サイクル値（Ｃｔ）は片対数増幅プロット（蛍光の対数増大ｖｓサイクル数）から求めた。ＰＣＲ産物の特異性及び大きさは増幅終了時に溶融曲線を付加することにより、そして２％アガロースゲル上にＰＣＲ産物を泳動させ、そしてバンドを配列決定することにより、試験した。全ての値はシクロフィリンＡに対して規格化した。ＰＣＲプライマーは以下の通り、即ち：アンジオ−１，５’−ＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＡＣＡＣＡ−３’（配列番号１１）（センス）及び５’−ＣＡＴＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＡＡＴＧＧＴ−３’（配列番号１２）（アンチセンス）、アンプリコン１１６ｂｐ；アンジオ−２，５’−ＴＧＧＧＡＴＴＴＧＧＴＡＡＣＣＣＴＴＣＡ−３’（配列番号１３）（センス）及び５’−ＧＴＡＡＧＣＣＴＣＡＴＴＣＣＣＴＴＣＣＣ−３’（配列番号１４）（アンチセンス）、アンプリコン１２２ｂｐ；インテグリンαｖ，５’−ＴＴＧＴＴＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＧ−３’（配列番号１５）（センス）及び５’−ＴＣＣＣＴＴＴＣＴＴＧＴＴＣＴＴＣＴＴＧＡＧ−３’（配列番号１６）（アンチセンス）、アンプリコン８９ｂｐ；インテグリンβ３，５’−ＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１７）（センス）及び５’−ＴＴＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＣＴＧＧＣＣ−３’（配列番号１８）（アンチセンス）、アンプリコン１８４ｂｐ；及びシクロフィリンＡ，５’−ＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＴ−３’（配列番号１９）（センス）及び５’−ＣＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡＧＣＡＣＧＡＡＡ−３’（配列番号２０）（アンチセンス）、アンプリコン１１６ｂｐとした。
【０４１７】
マイクロアレイ分析：ＨＭＶＥＣ−ｄ細胞由来の全ＲＮＡ１０マイクログラムを増幅し、そして、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に従ってビオチン標識した。フラグメント化したｃＲＮＡをヒト遺伝子チップＵ１３３  ＰＬＵＳ２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にハイブリダイズし；チップを洗浄し、そしてストレプトアビジンＲ−フィコエリスリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で染色した。チップをスキャンし、そしてデータをＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で分析した。
【０４１８】
ホルモン刺激血管形成のテトラック抑制：血管形成はＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、及びＴ３の生理学的濃度の適用によりＣＡＭ試験において刺激される。図４２に示す通り、ＣＡＭフィルターディスク上に置いたＦＧＦ２（１μｇ／ｍｌ）はＰＢＳ投与膜と比較して２．４倍（ｐ＜０．００１）まで血管分枝形成を誘導した。テトラックの添加（７５ｎｇ／フィルターディスク）はＦＧＦ２に応答した前血管形成を抑制していたが、テトラック単独では血管形成に対する影響を有していなかった。
【０４１９】
テトラックの用量応答曲線はＦＧＦ２刺激血管形成の最大抑制を発見するために実施した。図４３に示す通り、７５ｎｇ／フィルターディスク及び１００ｎｇ／フィルターディスクはそれぞれ５７％及び５９％まで血管形成を抑制した。テトラック濃度を１μｇ／フィルターディスクまで上昇させたところ、ＦＧＦ２刺激血管形成は７４％抑制された。最大抑制はテトラック濃度を３μｇ／フィルターディスクまで更に上昇させた場合に観察され、そしてこれは５μｇ／フィルターディスクにおいて維持されていた。
【０４２０】
テトラックは同様にＶＥＧＦ及びＴ３の前血管形成作用を、図４４に示す通り、それぞれ５２％及び６６％まで抑制した。
【０４２１】
管形成のテトラック抑制：ＨＭＶＥＣ−ｄ細胞を２４時間マトリゲル上で培養し、そしてテトラック漸増量の存在下又は非存在下においてＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。図４５に示す通り、テトラックは接合部の数および管の数における低減、及び、総管長における低下により明らかな通りＶＥＧＦにより誘導された管形成を抑制している。この作用を図４６において写真で示す。
【０４２２】
管接合部の数は１μＭ、２．５μＭ、及び１０μＭのテトラックにおいてそれぞれ、１８．０±１．５、４．７±１．８、及び３．０±２．５まで３２．０±９．６（０μＭテトラック）から低下した。同様に、管の数は２１２．３±２１．３（０μＭテトラック）から１８０．０±４．０（１μＭテトラック）、１５０．０±８．１（２．５μＭテトラック）、及び８１．３±２４．８（１０μＭテトラック）まで低下した。総管長も又用量依存的な態様で低下しており；管長の最大低下７０％が１０μＭテトラックにおいて観察されており、２５μＭ及び５０μＭテトラックで維持されていた（データ示さず）。
【０４２３】
インテグリンαＶ、β３及びアンジオポエチン−２のｍＲＮＡ発現はテトラックにより低下される：ＨＭＶＥＣ−ｄ細胞をマトリゲル上に成長させ、２時間テトラックの存在下及び非存在下にＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。メッセンジャーＲＮＡを単離し、図４７Ａ〜Ｂに示す通りインテグリンαＶ及びインテグリンβ３に対してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０４２４】
テトラックは用量依存的な態様でインテグリンαＶ及びインテグリンβ３の両方のｍＲＮＡ発現を抑制した。αＶｍＲＮＡのレベルはＶＥＧＦ投与細胞において０．１１４９±０．０１２４相対蛍光単位（ＲＦＵ）から１μＭテトラック投与後の０．０６１８±０．００９２７ＲＦＵまで低下し、そして３μＭテトラック投与後は更に低下した。インテグリンβ３の発現は、インテグリンαＶよりはるかに低値の発現であるが、テトラック投与後はインテグリンαＶと同様の態様において低下した。ＶＥＧＦ投与細胞は０．０２９９±０．００２６ＲＦＵのβ３を発現した。１μＭ及び３μＭのテトラックを用いた場合は発現はそれぞれ０．０１６０±０．００１３及び０．０１５９±０．００１６ＲＦＵまで低下した。アンジオポエチン−１及びアンジオポエチン−２に対するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施し、そして図４８Ａ〜Ｂに示す通り、テトラックが用量応答性の態様でアンジオポエチン−２のｍＲＮＡ発現を抑制し、そしてアンジオポエチン−１のｍＲＮＡレベルには影響しなかったことが分かった。更に又、ＨＭＶＥＣ−ｄ細胞をテトラック及びＶＥＧＦと共に一夜インキュベートしても更にアンジオポエチン−１及びアンジオポエチン−２の発現を改変することはなかった（データ示さず）。
【０４２５】
マイクロアレイ分析
ＶＥＧＦ刺激血管形成のテトラック抑制の考えられる機序を更に発見するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘより入手したＨｕｍａｎＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０アレイを用いながら実施したマイクロアレイ分析を実施した。ＨＤＭＥＣ細胞をテトラック（３μＭ）の存在下及び非存在下で２４時間５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと共にインキュベートした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ分析の結果は３種の異なるアンジオポエチン様転写物がＨＭＶＥＣ−ｄ細胞において異なって発現されたことを示していた。図４９Ａ〜Ｃに示す通り、アンジオポエチン様１（ＡＮＧＰＴＬ−１、プローブセットＩＤ＃２３１７７３）の発現はＶＥＧＦ投与後に５．９倍増大した。発現の刺激増大は細胞にテトラック及びＶＥＧＦで同時投与した場合にはベースラインレベル未満に低下した。アンジオポエチン様２（ＡＮＧＰＴＬ−２、プローブセットＩＤ＃２３９０３９）の発現は未投与対照と比較してＶＥＧＦ投与後に１．６倍増大した。テトラックの添加によりＡＮＧＰＴＬ−２の発現はベースラインレベル近傍まで低減した。興味深いことに、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ−３、プローブセットＩＤ＃２３１６８４）の発現はＶＥＧＦのＨＭＶＥＣ−ｄ細胞への投与により影響されなかった。しかしながら、テトラックは未投与対照及びＶＥＧＦ投与試料の両方と比較して１．９倍ＡＮＧＰＴＬ−３の発現を低減した。これらのデータはテトラックが血管形成の刺激のために必要な標的遺伝子の発現を抑制できることを示唆している。
【０４２６】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は血管形成に明確に関与している。合成及び内因性のＭＭＰ阻害剤の両方がインビトロ及びインビボの両方のモデルにおいて血管形成をブロックしている。本発明者等はテトラックの存在下及び非存在下のＶＥＧＦ投与の後のＭＭＰ発現における変化を検査するためにマイクロアレイを使用した。ＶＥＧＦ投与ＨＭＶＥＣ−ｄ細胞はＭＭＰ−１５発現の５．１倍増大及びＭＭＰ−１９発現の２．９倍増大を示している。図５０Ａ〜Ｄに示す通り、細胞にテトラック（３μＭ）を同時投与した場合、ＭＭＰ−１５及びＭＭＰ−１９の発現はそれぞれ３．２倍及び８．７倍低下した。興味深いことに、ＭＭＰ−２４の発現はＶＥＧＦ投与により僅かに低下するが、テトラックの添加により更に低下している。ＭＭＰファミリーの数メンバーの強力な阻害剤であるメタロプロテイナーゼ３（ＴＩＭＰ−３）の組織阻害剤の発現はＶＥＧＦ投与ＨＭＶＥＣ−ｄ細胞と比較してＶＥＧＦ及びテトラック投与後に５．４倍増大している。このことはＶＥＧＦ刺激血管形成のテトラック抑制の機序の一部はＴＩＭＰ発現の増大により調節され、そしてこれが次に血管形成中に発生する細胞骨格再組織化におけるＭＭＰの役割をブロックすることを示唆している。
【０４２７】
現在、主に癌の状況における副次的使用に関して、抗血管形成化合物における多大な臨床的関心が存在する。上記した通り、甲状腺ホルモンの原形質膜受容体に指向された小分子テトラックは強力な抗血管形成活性を有している。テトラックは甲状腺ホルモンの細胞表面開始作用の拮抗剤であるが、甲状腺ホルモンの非存在下のテトラックはここではニワトリ及びヒトの内皮細胞試験ではＶＥＧＦ及びＦＧＦ２の血管形成活性を抑制することが分かった。即ち、テトラックは血管形成性のＶＥＧＦ及びＦＧＦ２のシグナルを内皮細胞に伝達するためのインテグリンをターゲティングする望ましい性質を有しているが、更に、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌ＭＣＦ−７細胞及びネズミの神経膠芽腫の神経膠腫細胞モデルを包含する特定の腫瘍細胞の増殖に対する甲状腺ホルモンの生理学的濃度の栄養性作用を抑制する。
【０４２８】
如何なる理論にも制約されることを意図しないが、甲状腺ホルモンは細胞又は分子のレベルにおいて腫瘍に対する幾つかの作用を有すると推定される。これらの作用は腫瘍細胞に対する直接の増殖作用、転移を支援する可能性のある癌細胞の遊走に対する直接の作用、及び、前血管形成作用を介した腫瘍成長の間接的な支援を包含する。癌の状況においては、抗甲状腺ホルモン剤として作用する、未修飾のテトラック及びトリアック、又はナノ粒子又は重合体コンジュゲートとして修飾されたものが治療用とを有する場合がある。
【０４２９】
最近、ネズミ神経膠腫細胞の頭蓋内移植のマウスモデルへのテトラックの投与により有意な生存利益が得られている（Ｒ．Ａ．Ｆｅｎｓｔｅｒｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｃｉｅｓｉｅｌｓｋｉ，Ｆ．Ｄａｖｉｓ及びＰ．Ｊ．Ｄａｖｉｓ，未発表観察結果）。更に又、最近の予測的臨床試験によれば甲状腺ホルモンは多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）の成長因子であること、そして、ＧＢＭ患者における軽度の甲状腺機能低下症の誘導は多大な生存利益を有することが示された。Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒにおける甲状腺低下患者における乳癌実験の回顧的分析は、甲状腺機能低下症は乳癌の危険性を低減し、そしてこれが甲状腺低下女性において生じた場合、疾患の攻撃性は低値であることを示している。如何なる理論にも制約されることを意図しないが、甲状腺ホルモンの２つの作用、即ち腫瘍細胞に対する直接の増殖作用、及び血管形成を介した腫瘍の成長の間接的支援が推測される。これらの２つの型の癌の状況では、テトラックは治療用途を有すると考えられる。
【０４３０】
実施例２９．新しいＴ４／重合体コンジュゲート及びＴ４／ナノ粒子コンジュゲート：
甲状腺はホルモンの２つの基本的に異なる型の発生源である。ヨードチロニンホルモンはチロキシン（Ｔ４）及び３，５’，３−トリヨードチロニン（Ｔ３）を包含する。これらは正常な成長及び発達に必須であり、そしてエネルギー代謝においても重要な役割を果たしている。甲状腺ホルモンは最終的にはチロシンから誘導される芳香族アミノ酸である。それらは化学的及び生合成的には、Ｌ−ＤＯＰＡ及び５−ヒドロキシトリプトファン、即ちそれぞれ神経伝達物質ドーパミン及びセロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）の生合成前駆体と同様である。Ｔ４及びＴ３及びそれらの生合成類縁体の化学構造を以下に示す。
【０４３１】
【化３８】
2010513526.tif 000053
【０４３２】
【化３９】
2010513526.tif 000054
Ｔ３又はＴ４の何れかの重合体とのコンジュゲーション又はＴ３又はＴ４のナノ粒子との固定化はコンジュゲートが核膜を通過できなくなるような直径を有する粒子を与える。即ち、如何なる望ましくないゲノム作用も伴うことなくＴ３又はＴ４の細胞表面活性のみが得られる。
【０４３３】
Ｔ３及びＴ４は両方とも、反応して重合体コンジュゲートを形成する３つの官能基：１カルボン酸基、１アミン基、及び１ヒドロキシル基を有する。Ｔ３又はＴ４／重合体コンジュゲートを合成するためには、説明目的でＴ４を使用すれば、反応部位は以下の何れかとなるはずである。
１）カルボン酸基：酸基を反応させてエステル又はアミドを形成することができる。Ｔ４におけるアミン基の高い反応性のため、これはコンジュゲート反応の前に保護し、その後、脱保護しなければならない。別様には、自己重合によりＴ４オリゴマーを形成することになる。候補となる重合体はＰＶＡ、ＰＥＧ−ＮＨ２、ポリ（リジン）及び関連の重合体を包含する。
２）アミン基：アミン基をカルボン酸官能基又はハロゲン基を有する重合体と反応させる。重合体が大量の活性化酸基を有する場合は、反応は直接進行できる。ポリ（メタクリル酸）及びポリ（アクリル酸）をこの方法で使用できる。
３）ヒドロキシル基：より高度な反応性のアミノ基の存在のために、カルボン酸を有する重合体とのＴ４の直接の反応は困難である。このアミノ基は反応の前に保護し、そしてコンジュゲート反応の後に脱保護しなければならない。共通する保護基は無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）、Ｎ−メチル、Ｎ−エチル、Ｎ−トリフェニル、又はジ−ｔ−ブチルジカーボネート（ＢＯＣ２Ｏ）基であることができる。
【０４３４】
以下の実施形態の各々に対し、Ｔ３をＴ４の代わりに使用してよい。
【０４３５】
Ｌ−Ｔ４のアミノ基の保護
Ｌ−Ｔ４のアミノ基の保護は保護剤として無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）、ジ−ｔ−ブチルジカーボネート（ＢＯＣ２Ｏ）及び無水酪酸（Ｂｕ２Ｏ）を用いながら、又は何れかの適当な長鎖脂肪族基を用いながら行うことができる。長鎖脂肪族基、パルミトイルクロリドを用いた合成スキームの例を以下の合成スキームに示す。
【０４３６】
【化４０】
2010513526.tif 000055
ジ−ｔ−ブチルジカーボネート（ＢＯＣ２Ｏ）を用いたＬ−Ｔ４のアミノ基の保護のスキームを（Ｔ４−ＢＯＣ）を以下に示す。
【０４３７】
【化４１】
2010513526.tif 000056
Ｌ−Ｔ４はアミノ基の反応性を、フェノールのもの及び市販のＬ−Ｔ４の対イオン型と比較した場合を考慮して選択的に保護した。これは極性溶媒（ＤＭＡ又はＤＭＦ）中、等モル量の生成物、無機の塩基（Ｎａ２ＣＯ３）又は有機の塩基（ＴＥＡ）を使用しながら行った。化合物ＰＲＩＡＢ１、ＰＲＩＡＢ４及びＰＲＩＡＢ５を以下に示す反応条件下に合成した。
【０４３８】
【化４２】
2010513526.tif 000057
例としてＰＲＩＡＢ１を用いた場合の試験のための分析的に純粋な試料を得るための一般的な操作法を以下に記載する。
２−［（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−３−［４−（４−ヒドロキシ−３，５−ジヨードフェノキシ）−３，５−ジヨードフェニル］プロパン酸（ＰＲＩＡＢ１）。
白色固体；収率５０％；再結晶溶媒：ＡｃＯＥｔ；Ｒｆ＝０．７９（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ５／５）；Ｍｐ＝２１２℃；ＩＲ（νｃｍ−１）：３４０７．４１（ＮＨ）；１７０１．６５（ＣＯ）；１６６０．４９（ＣＯ）；１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．３４（ｓ，９Ｈ，３ＣＨ３）；２．７１−２．７９（ｔ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ）；３．０４−３．０８（ｄｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）；４．１６（ｂｒ，１Ｈ，ＮＨ）；７．０５（ｓ，２Ｈ，ＡｒＨ）；７．８２（ｓ，２Ｈ，ＡｒＨ）；１１．６８（ｂｒ，１Ｈ，ＯＨ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）：８９９．７［Ｍ＋Ｎａ］＋；８２１．７［Ｍ−ｔＢｕ］＋；７７７．７［Ｍ−Ｂｏｃ］＋。
ＰＲＩＡＢ２、ＰＲＩＡＢ６及びＰＲＩＡＢ１２（下記）も又、上記と同様の態様において合成し、脱保護し、そして純度について試験した。
【０４３９】
【化４３】
2010513526.tif 000058
【０４４０】
【化４４】
2010513526.tif 000059
これらの新規なＮ−置換基（Ｎ−メチル、Ｎ−エチル又はＮ−トリフェニル）はＣＡＭモデルにおいて以下の表に示す通りｂ−ＦＧＦ又はＬ−Ｔ４に匹敵する前血管形成薬効を示した。
【表Ｊ】
2010513526.tif 000060
【０４４１】
Ｔ４−ＢＯＣの活性化
Ｔ４−ＢＯＣはエピクロロヒドリン、又は他の適当な活性化剤（例えばエピブロモヒドリン）を用いて活性化してよい。例えば、活性化Ｔ４−ＢＯＣ中間物の合成スキームは以下に示す通りである。
【０４４２】
【化４５】
2010513526.tif 000061
新規なＴ４／重合体コンジュゲートの合成：活性化されたＴ４−ＢＯＣは種々の重合体、例えば限定しないがＰＶＡ、ＰＥＧ、ポリリジン、ポリアルギンにコンジュゲートできる。フェノール性のヒドロキシル基を介した重合体へのＴ４のコンジュゲーションは、Ｔ４及びＴ３が各々分解中に肝臓においてグルクロン酸及びスルホン酸にコンジュゲートされることから、望ましい場合がある。例えば、ポリリジンへの活性化Ｔ４−ＢＯＣのコンジュゲーションの合成スキームを以下に示す。
【０４４３】
【化４６】
2010513526.tif 000062
ポリアルギニンへのＴ４−ＢＯＣのコンジュゲーションの合成スキームを以下に示す。
【０４４４】
【化４７】
2010513526.tif 000063
無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）又はジ−ｔ−ブチルジカーボネート（ＢＯＣ２Ｏ）を用いたＴ４の保護、脱保護、及びその後のＰＶＡ又はＰＥＧへのコンジュゲーションを示すスキームを以下に示す。
【０４４５】
【化４８】
2010513526.tif 000064
ナノ粒子カプセル化Ｔ４の製造
コンジュゲーション、例えばＰＥＧへのコンジュゲーションの後、Ｔ４／ＰＥＧコンジュゲートを用いて当業者の知る何れかの方法によりナノ粒子に固定化する。例えば、限定しないが、Ｎ−保護Ｔ４をカプセル化しているＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子は以下の通り（そして図５１に示す通り）単分散エマルジョン法により製造する。ＰＥＧ−ＰＬＧＡ及びＮ−保護Ｔ４の溶液は別個にＤＭＳＯ中に製造（例えば８０ｍｇ／ｍＬＰＥＧ−ＰＬＧＡ及び１５ｍｇ／ｍＬＮ−保護Ｔ４）し、そして等量において混合する。この溶液１００ｕＬを１％ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）溶液に一定の攪拌を行いながら添加する。４時間後、Ｔ４をカプセル化しているナノ粒子を含有する全溶液を透析に付すことにより不純物を除去する。
【０４４６】
Ｔ４コンジュゲートＰＥＧ−ＰＬＧＡナノ粒子の製造
Ｔ４／ＰＥＧコンジュゲートは、当該分野で知られた適当なコンジュゲーション方法を用いながらナノ粒子にコンジュゲートすることによりナノ粒子に固定化するために使用してよい。例示すれば、以下のスキームに示す通り、Ｔ４中に存在する高度に反応性のアミノ基を先ず無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）又はジ−ｔ−ブチルジカーボネート（ＢＯＣ２Ｏ）を用いてブロックし、次にエピクロロヒドリンで活性化し、そしてナノ粒子にコンジュゲートする。
【０４４７】
【化４９】
2010513526.tif 000065
薬理学的試験
上記したＰＲＩＡＢ１、ＰＲＩＡＢ４及びＰＲＩＡＢ５をコンジュゲーションの前にニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）試験を用いて試験した。結果はここに、そして図５２においてＰＲＩＡＢ１に関して示す通りである。
【表Ｋ】
2010513526.tif 000066
【０４４８】
試験の結果は意外なものであった。試験結果は保護されたＴ４類縁体による明確な前血管形成作用を示しており、そして最も嵩高の保護基が最も低い活性を示していた。アミド結合の形成のため、これらの分子の第２窒素により担持される自由ダブレット電子がカルボニルに向けて排除され、これによりアミンが非親核性となっている（カルボニル基によるアミンの脱活性化は以下に示す）。しかしなお、これは塩基性である。
【０４４９】
【化５０】
2010513526.tif 000067
アミンを塩基性及び親核性にする保護されたアミノ基を担持するように設計された新しい類縁体（嵩において異なる）を以下に示す。
【０４５０】
【化５１】
2010513526.tif 000068
Ｔ４類縁体及びそのナノ粒子相応物に関する本明細書及び将来の研究の結果は、新血管形成の刺激を指向するＴ４の非ゲノム性の作用の知見を増強する場合の主要な工程となる。確認されれば、アルキル化Ｔ４類縁体の結果は多くの新しい生物学的試験の開始をもたらすことになる。これらの結果は新しい二重ＴＲ−αＶβ３アゴニスト又は拮抗剤の設計に寄与すると考えられる。
【０４５１】
実施例３０．冠状動脈、頸動脈又は末梢組織における側副再生実験的四肢虚血モデル：
本試験はウサギ（８〜１２か月齢）の３つの主要な群：ａ）虚血、未投与、対照群として使用、及びｂ）虚血、Ｌ−Ｔ４類縁体を投与、及びｃ）虚血群、ＤＩＴＰＡ類縁体を投与、に対して実施した。動物は水及び飼料を自由摂取させ、そして個別ケージ内に２２℃の周囲温度において１２時間の照明／消灯周期において飼育した。手術直後にウサギにテトラサイクリンの単回筋肉内用量を注射した。甲状腺類縁体をローディング皮下用量（１ｍｇ／動物）として与えた後、薬品（１ｍｇ／動物）を毎日経口投与した。
【０４５２】
血管形成を刺激し、そしてインビボの側副血管発生を強化するための甲状腺類縁体を使用することの実現可能性を調べるために、本発明者等は後肢虚血のウサギモデルを用いた。慨すれば、麻酔（ケタミン１０ｍｇ／ｋｇ及びキシラジン２．５ｇ／ｋｇの混合物、ｉ．ｍ．）下、ウサギを鼠径靭帯から膝蓋骨の直近点まで下行しながら伸長する縦方向の切開に付した。この切開部を介して、大腿動脈をその全長に沿って解離させ；大腿動脈の全ての分枝（下腹壁動脈、大腿深動脈、外側旋回動脈及び浅腹壁動脈を包含する）を解離させた。膝窩及び伏在動脈の広範な解離と、その後の外部腸骨動脈及び全ての上記動脈の結紮を行った。その後、大腿動脈を外腸骨動脈の分枝としてのその近位の起点からそれが分岐して伏在及び膝窩動脈となる遠位の点まで完全に切開する。従って、遠位の四肢への血液の供給は同側の内腸骨動脈を起点とする側副動脈に依存することになる。筋肉試料は内側太腿から採取した。
【０４５３】
血管撮影：
虚血四肢における側副血管の発生は手術又は投与ののち１か月の大動脈血管撮影により評価した。試験期間の終了時に血管撮影を実施したため、注射は大動脈内に導入したカテーテルを介して行った。造影剤（５ｍｌ  Ｉｓｏｖｕｅ−３７０）は動脈内注射した。異なる群からの虚血四肢の画像を記録した。
【０４５４】
血管撮影の後、動物を屠殺し、血液試料を収集し、そして組織切片を後肢の筋肉から作成し、パラフィン包埋して後の免疫染色に備えた。
【０４５５】
免疫組織化学試験：
ＣＤ３１の発現：
パラフィン包埋した切片を脱パラフィン処理し、再水和させ、そしてマイクロ波及びクエン酸塩緩衝役、ｐＨ６．１、１０分間による抗原賦活に付した。次に切片をトリス緩衝食塩水中１：１０００に希釈したＣＤ３１モノクローナルマウス抗ヒト（ＤＡＫＯ）と共にインキュベートした。この抗体は内皮細胞を強力に標識し、そして毛細血管を測定する場合の良好なマーカーである。抗原−抗体複合体はＤＡＢを使用しながら可視化し、その後逆染色した。
【０４５６】
毛細血管密度の評価：
ＣＤ３１による陽性染色により識別された毛細血管を４０倍の対物レンズの下に投与計画に関して盲検とした単一の観察者により計数した（筋肉線維当たり毛細血管の平均数）。組織切片から合計１０種の異なる視野を無作為に選択し、毛細血管の数を計数し、そして毛細血管／筋肉繊維の比を計算することにより、毛細血管の密度を求めた。
【０４５７】
実施例３１．癌化学物質感作剤としてのテトラック
腫瘍細胞に関連する甲状腺ホルモンに対する細胞表面受容体はインテグリンαＶβ３上にあり、そして、ホルモンシグナルはＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路により伝達される。ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）モデル及びヒト皮膚微細血管内皮細胞試験を用いながら、本発明者等は甲状腺ホルモンの前血管形成作用におけるαＶβ３受容体−ＭＡＰＫ機序の関与を示唆している。本発明者等の実験室における試験によれば、Ｔ４の脱アミノ化非アゴニスト類縁体であるテトラックは原形質膜におけるαＶβ３へのアゴニストＴ４及びＴ３の結合を防止し、そして血管形成に対するホルモンの作用を抑制することが示された。本試験は腫瘍細胞の挙動の別の成分、即ち、化学療法剤に対する癌の耐性を探求するために実施した。耐性の機序には、遺伝子産物が原形質膜内に挿入されると癌化学療法剤を細胞外空間に移出する多剤耐性（ＭＤＲ）ポンプ遺伝子の発現を包含する数種類が存在する。本発明者等は甲状腺ホルモンはそのインテグリン受容体を介して作用し、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターのような原形質膜イオン輸送系に対する作用を有する。従って、本発明者等は化学療法剤の細胞での取扱に関連する膜作用をテトラックが有する可能性を本試験において探求した。
【０４５８】
材料及び方法
細胞及び試薬
ヒト神経芽細胞ＳＫＮ−ＳＨ、肉腫ＳａＯＳ２、及び乳癌ＭＣＦ−７細胞をＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＡ）から購入した。ダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）はＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手した。以下の薬品及び試薬を記載会社より入手した。ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びテトラヨーロチロ酢酸（テトラック）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；［１４Ｃ］ドキソルビシン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）；薬品トランスポーターＰ−糖蛋白（Ｐ−ｇｐ）に対する抗体（Ｓｉｇｎｅｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）、ＳＯＤ及びＧＳＴ−π抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、β−アクチンに対する抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、及びセイヨウワサビパーオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。
【０４５９】
増強ケミルミネセンス試薬（ＥＣＬ）はＡｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）から購入し、そしてウエスタンブロット用のＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ転移膜はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手した。耐性細胞は３〜６か月の期間に渡り、１０−９Ｍ〜１０−５Ｍの範囲の薬品濃度において段階的に増大させながら親細胞系統を連続的にインキュベートすることにより作成した。選択終了時に、ＭＴＴ生存性試験を用いることにより薬品への耐性に関して細胞を試験した。細胞を１０４個／ウェルで９６穴ウェル中に播種し、９６時間薬品と共にインキュベートした。１０μＬのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、４時間３７℃でインキュベートした。次に１００μＬの１０％ＳＤＳ／０．０１ＭＨＣｌを添加することにより細胞を可溶化し、そして１５時間３７℃でインキュベートした。各ウェルの光学密度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定し、その際、活性化波長は５７０ｎｍ及びレファレンス波長は６５０ｎｍとした。生存細胞のパーセントは未投与対照細胞との比較により求めた。
【０４６０】
ウエスタンブロッティング
細胞の単層を９０％コンフルエントとなるまで２５ｃｍ２の成長器中で成長させ、次にＰＢＳで洗浄し、そして細胞を１５０ｍＭＮａＣｌ、１００ｍＭＮａＦ、１ｍＭＭｇＣｌ２、１．５ｍＭＥＧＴＡ、１０％グリセロール、１％トリトンＸ１００、１μｇ／ｍｌロイペプチン及び１ｍＭフェニルメチルスルホニルフロリドを含有する５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中で溶解させた。等しい量の蛋白を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の電気泳動で分離し、そしてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜に移した。目的の蛋白はセイヨウワサビパーオキシダーゼに連結した特異的な一次及び二次抗体との反応により識別し、化学発光にて検出した。
【０４６１】
ドキソルビシン蓄積の計測
ドキソルビシン耐性細胞を１２穴プレートに播種し、２４時間インキュベートした後に、［１４Ｃ］ドキソルビシン（５ｎＣｉ）をテトラック（３０ｕｇ／ｍＬ）の非存在下又は存在下に添加し、２４時間インキュベートした。次に細胞を氷冷ＰＢＳで４回洗浄し、溶解させた。細胞薬品蓄積に相当する溶解物中の放射能をシンチレーションスペクトル分析により計測した。
【０４６２】
老化関連−β−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）染色
細胞をＤＭＥＭ培地中２４穴プレートに播種し、そして２４時間後、ドキソルビシン、テトラック、又は両方を添加し、そして細胞を５日間インキュベートし、ＳＡ−β−Ｇａｌ染色を実施した。慨すれば、細胞を３％ホルムアルデヒド中で５分間固定し、洗浄し、Ｘ−ｇａｌ（１ｍｇ／ｍＬ）と共に３７℃でインキュベートし、４０ｍＭクエン酸ｐＨ６．５、５ｍＭフェロシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、及び２ｍＭＭｇＣｌ２を含有する溶液中に溶解した。２４時間インキュベートした後、位相差顕微鏡下に写真を撮影した。
【０４６３】
アポトーシスの検出
細胞を１００ｍｍの培養皿に播種し、ドキソルビシン、テトラック、又は両方を２４時間投与し、その後細胞を３７℃で３分間トリプシン処理に付し、ＰＢＳ中４％ホルマリンで固定し、そしてＰＢＳで洗浄した。次にこれらを０．１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３２４８（ビスベンズイミド、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共にインキュベートし、顕微鏡観察用にスライド上にスポットした。陽性細胞を計数し、その画分を未投与及び投与集団で比較する。
【０４６４】
動物試験
ＣＤ１ヌードマウス系統を約５〜６週齢及び体重約３０ｇにおいてＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手した。動物にドキソルビシン耐性ＭＣＦ７／Ｒ細胞を皮下移植した（１００μＬ中細胞１０６個）。腫瘍が約５０ｍｍ３の大きさになった時点で、動物をペアマッチさせ、以下の通り、即ちａ）ベヒクル投与対照、ｂ）テトラック投与マウス（３０ｍｇ／ｋｇ）、ｃ）ドキソルビシン投与マウス（２ｍｇ／ｋｇ）、ｄ）両方の薬品の組み合わせを投与したマウス、のマウス５匹の４群に分割した。合計３回の注射（３日間隔）を実施した。マウスを計量し、薬剤毒性の臨床兆候及び致死性に関して確認した。腫瘍計測は３週間まで週３回カリパスを用いて実施し、式ＷｘＬ２／２を用いて腫瘍体積に変換した。腫瘍の成長曲線を作成した。
【０４６５】
統計学的分析
統計学的分析は各実験群の分枝点の平均±ＳＤをその該当する対照群と比較しながら、Ｓｔａｔｖｉｅｗソフトウエア（Ａｄｅｐｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）を用いながら一元ＡＮＯＶＡにより実施した。統計学的有意性はｐ＜０．０５と定義した。
【０４６６】
結果
薬品感受性及び薬品耐性の細胞の増殖に対するテトラックの作用
本発明者等は神経芽腫（ＳＫＮ−ＳＨ）、骨肉腫（ＳａＯＳ２）、及び乳癌（ＭＣＦ７）から誘導した薬品感受性及び耐性の細胞系統の増殖に対するテトラックの作用を試験している。耐性系統は経時的にドキソルビシン濃度を段階的に増大させることにより選択した。図５３（パネルＡ、Ｃ及びＥ）に示す通り、ドキソルビシンに対する細胞の応答は耐性細胞では有意に低減した。これらの細胞は又、エトポシド、ビンブラスチン及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤トリコスタチンＡのような他の関連及び未関連の薬剤に対しても耐性であることが分かった。しかしながら、細胞増殖に対するテトラックの作用は感受性及び耐性の系統の両方で同様であり（パネルＢ、Ｄ及びＦ）、ホルモン拮抗剤が薬品耐性をバイパスできることを示唆していた。興味深いことに、ＳａＯＳ２細胞の場合は、薬品耐性細胞はその親薬品感受性細胞よりもテトラックに対してより感受性であるように観察された。これはテトラックに対してより高い感受性を細胞に付与する甲状腺ホルモンシグナリング経路の改変が薬品選択の過程において生じていることを示唆している。
【０４６７】
テトラックによる伝統的抗癌剤に対する癌細胞応答の増強
ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン及びＴＳＡを包含する既知の抗癌剤への細胞の応答に対するテトラックの作用を薬品感受性及びそれらの薬品耐性の対応物において検討した。このために、細胞に先ずテトラック（３０μｇ／ｍｌ）を予備投与し、次に伝統的な抗癌剤の投与に付し、そして４日間インキュベートした。図５４に示す通り、テトラックは３つの耐性細胞系統においてこれらの薬品に対する細胞応答を一貫して増強した。同様の作用が薬品感受性細胞系統においても観察された。ドキソルビシン及びエトポシドに対する耐性が薬品トランスポーターＰ−ｇｐの過剰発現に関連することが知られているため、テトラックがこのトランスポーターの機能を抑制する可能性が存在するが、しかしながら、シスプラチンに対する耐性はこのトランスポーターからは独立していることが分かっているため、Ｐ−ｇｐ非依存性の機序がやはりテトラックの作用を媒介していることが示唆される。別の可能性はテトラックが細胞内ｐＨを変化させることによりＭＤＲポンプ活性に影響していることである。
【０４６８】
テトラックが薬品への癌細胞の感受性を増強する推定される機序
上記した通り、トランスポーターＰ−ｇｐの過剰発現はドキソルビシン及びエトポシドのようなトポイソメラーゼ阻害剤に対する耐性の決定づけるものである。本発明者等はこのトランスポーターが実際に、親薬品感受性細胞と比較してドキソルビシン耐性ＭＣＦ７／Ｒにおいて過剰発現されることを観察している（図５５Ａ）。これと比較して、ＳＯＤ及びＧＳＴ−πのような他の薬品耐性分子の発現は２種類の細胞系統の間で有意に変化せず（図５５Ａ）、薬剤の輸送の改編はこれらの細胞における薬品耐性の主要な機序であることを示唆している。Ｐ−ｇｐ、ＳＯＤ及びＧＳＴ−πの発現に対するテトラックの作用の分析はこの拮抗剤及び／又はドキソルビシンに付すか、又は投与しない以下の何れかのＭＣＦ／Ｒ細胞におけるウエスタンブロットにより実施した。データ（図５５Ｂ）は投与の何れもこれらの薬品耐性遺伝子の発現に影響しなかったことを示している。しかしながら、放射標識ドキソルビシンを用いたテトラックの存在下の薬品の輸送の計測によれば、この薬品の蓄積は投与細胞において有意に増強され（図５５Ｃ）、Ｐ−ｇｐの機能がこのホルモン拮抗剤により抑制されることを示唆している。この観察結果はテトラックの以前には未知であった機能を明確化するものであり、そしてこの類縁体が薬品耐性腫瘍の治療において考慮すべき潜在性を有していることの説得力のある証拠を与えている。
【０４６９】
テトラックがシスプラチンに対する細胞応答を増強するという図５４における所見を考慮すれば、非Ｐ−ｇｐ基質、追加的な薬品耐性機序も考慮しなければならない。例えば、本発明者等の研究室の最近の試験及びその他により、ストレスに対する細胞の防御の性質とは無関係に、増殖停止、即ち老化、或いは細胞死、即ちアポトーシスを起こしやすい癌細胞の傾向は薬品耐性腫瘍の発生と進行における重要な決定要因であることが示されている。これらの経路がテトラックによっても影響されるかどうかを確認するために、本発明者等は、非投与細胞と比較した場合のこの化合物の投与に付された細胞における成長停止（細胞周期抑制物質ｐ２１／ＷＡＦ１）及びアポトーシス（活性カスパーゼ−３）の分子マーカーの発現を計測した。図５６Ａに示す通り、テトラック単独はｐ２１／ＷＡＦ１の発現には作用を有していなかったのに対し、それを比較的に低濃度のドキソルビシンと組み合わせた場合、この細胞周期抑制物質に対する強力な作用を有していた。この所見は老化関連ベータガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）の計測により更に具現化され（図５６Ｂ）、この薬品の組み合わせへの細胞の曝露はそれらを強制的に老化状態とすることを示している。更に又、これらの同じ条件下において、カスパーゼ−３の活性化の強力な増大（図５６Ａ）及びクロマチンの凝縮（図５６Ｂ）が観察され、投与細胞の一部がアポトーシス死滅に至ったことを示している。考え合わせると、これらの所見は薬品輸送に対するその作用に加えて、テトラックが細胞毒性薬品と相乗作用して細胞の老化及びアポトーシス細胞死を誘導するという証拠を与えている。
【０４７０】
インビボの薬品耐性腫瘍の増殖に対するテトラックの作用
薬品耐性の抑制におけるテトラックのインビボの関連性を更に明確化するために、本発明者等は、薬品耐性癌細胞の異種移植片を担持したヌードマウスにおいて、単独又はドキソルビシンと組み合わせた場合のその作用を試験した。マウスにドキソルビシン耐性乳癌細胞系統ＭＣＦ７／Ｒを注射し、そして腫瘍が触診可能となった時点で、マウスにドキソルビシン単独；テトラック単独；又は両方の組み合わせを３回注射した。ドキソルビシンの最大耐容用量（ＭＴＤ）は２．５ｍｇ／ｋｇであったが、テトラックの場合は６０ｍｇ／ｍＬまで毒性が検出されなかった。これらの投与の薬効に関しては、データはドキソルビシン単独（２ｍｇ／ｋｇ）は腫瘍の成長に対して検知可能な作用を有していないことを示していた。これとは対照的に、３０ｍｇ／ｍＬのテトラックは単独で約７０％まで腫瘍の成長を低減した（図５７）。この作用は両方の薬品の組み合わせにより更に悪化することはなく、使用濃度における相乗作用が無いことを示唆していた。興味深いことに、テトラックの薬品濃度には十分耐容性が示され、そして実験中投与動物において有意な毒性は観察されなかった。これらの所見はテトラックがインビボで薬品耐性腫瘍の増殖を抑制することができ、そしてこのため、薬品耐性腫瘍の治療を期待させるものであることを示唆している。最大の抗腫瘍薬効のための単独又は他の抗癌剤と組み合わせた場合のこの化合物が使用される最適用量を決定するためには更に検討が必要である。
【０４７１】
実施例３２．例示される合成経路
【０４７２】
【化５２】
2010513526.tif 000069
【０４７３】
【化５３】
2010513526.tif 000070
実施例３３．固定化されたテトラックナノ粒子の化学的特徴
以下にテトラックを固定化するための２つの手順を記載する。１つの手順においては、環状のエピクロロヒドリンを使用し、第２の手順においては直鎖の中間体を使用する。生成物はカラムクロマトグラフィーで精製した。合成した化合物はＰＬＧＡナノ粒子中に固定化することができる。
【０４７４】
【化５４】
2010513526.tif 000071
【０４７５】
【化５５】
2010513526.tif 000072
エピクロロヒドリンを用いて活性化した類縁体の合成は２％収率で合成された。出発物質２ｇから、約６０ｍｇの再結晶された生成物が白色粉末として得られた。
【０４７６】
実施例３４−Ｌ−Ｔ４コンジュゲートナノ粒子の設計及び合成経路
Ｌ−Ｔ４の細胞表面前血管形成作用は自身の末端にアミノ基を有するナノ粒子にＬ−Ｔ４分子をコンジュゲートすることにより到達可能であると考えられた。Ｌ−Ｔ４は３つの官能基、即ち１つのアミン、１つのカルボン酸及び１つのヒドロキシルを有する。インテグリン活性部位におけるＬ−Ｔ４及びテトラックの作用に関する研究を実施した後、ヒドロキシルはこれらの分子の観察された作用に強力には寄与していないことが分かった。コンジュゲーションのために従った方法は最初にアミノ基、次に第２工程においてＬ−Ｔ４のカルボン酸をマスキングし、そして次にリンカーとしてエポキシド誘導体を用いながら中間体を活性化する。エピシクロヒドリン又はエピブロモヒドリンは、高度に反応性のエポキシドはＬ−Ｔ４との縮合の後に遮蔽されずに存在し、そしてナノ粒子の如何なるアミノ基とも自由に反応できることから、この目的のために最良であることが分かった。その後、次いで穏やかな条件下のアミン及びエステルの両方のアシドリシスを用いることにより所望の生成物を得る。
【０４７７】
【化５６】
2010513526.tif 000073
第１工程：エチル−２−（エチルアミノ）−３−［４−（４−ヒドロキシ−３，５−ジヨードフェノキシ）−３，５−ジヨードフェニル］プロパノエート（ＰＲＩＡＢ２０）の合成
【０４７８】
【化５７】
2010513526.tif 000074
ＤＭＦ（２０ｍｌ）中のＬ−Ｔ４（１．０ｇ、１．２９ミリモル、１．０等量）の攪拌懸濁液に、Ｃｓ２ＣＯ３（４１９．４ｍｇ、１．２９ミリモル、１．０等量）を添加した。５分間攪拌した後、ＥｔＩ（２０６μＬ、２．５７ミリモル、２．０等量）を滴下した。１時間攪拌した後、反応溶媒を除去し、残留物を最少量のアセトンに溶解し、そして得られた溶液を水４０ｍＬに滴下した。次に沈殿を濾過して再結晶させた。
収率：５０％；オフホワイトの固体；再結晶溶媒：エタノール；ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４３（ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ９／１）；ＲＰＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４３（ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ８／２）；融点＝１３６°Ｃ；ＩＲ（υｃｍ−１）：１７３０（ＣＯ）；１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：７．７９（ｓ，２Ｈ，ＡｒＨ），７．１４（ｓ，２Ｈ，ＡｒＨ），４．０６−４．０２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．９３−３．８９（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２），３．５９−３．５６（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ），２．８０−２．７７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．８８（ｂｒ，１Ｈ，ＮＨ），１．４１−１．３９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３），１．１５−１．１２（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ９１１．７［（Ｍ＋ＤＭＳＯ）＋，１００］，８３３．７［（Ｍ＋Ｈ）＋，７５］；元素分析値：Ｃ１９Ｈ１９Ｉ４ＮＯ４の計算値：Ｃ，２７．４０；Ｈ２．３０；Ｎ，１．６８．測定値：Ｃ，２７．５４；Ｈ，１．９４；Ｎ，１．６６。ＤＭＳＯ中１０−１Ｍにおける溶液を製造した後の水中の溶解度１０−３Ｍ。Ｌ−Ｔ４の懸濁液を一夜で製造した場合は収率を上昇できることを特記する。
【０４７９】
第２工程：エチル３−（４−（３，５−ジヨード−４−（オキシラン−２−イルメトキシ）フェノキシ）−３，５−ジヨードフェニル）−２−（エチルアミノ）プロパノエート（ＰＲＩＡＢ２６）の合成
【０４８０】
【化５８】
2010513526.tif 000075
ＰＲＩＡＢ２０（８６６．４ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、１．０等量）を無水ジオキサン（３０ｍＬ）に溶解し、次に、Ｃｓ２ＣＯ３（３２５．８ｍｇ、１．０ミリモル、１．０等量）を添加し、そして次にエピブロモヒドリン（１．７８ｍＬ、２０．８ミリモル、２０．０等量）を添加した。次に反応媒体を緩徐に加熱して還流させた。混合物を一夜還流下に攪拌し、次に室温に冷却した。次に有機溶液を蒸発させ、シリカゲル（溶離剤ＤＣＭ／酢酸エチル１／９）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、得られた白色粉末を更に再結晶させた。
【０４８１】
第３工程：３−（４−（４−（２−クロロエトキシ）−３，５−ジヨードフェノキシ）−３，５−ジヨーロフェニル）−２−（エチルアミノ）プロパノエート（ＰＲＩＡＢ２７）の合成
【０４８２】
【化５９】
2010513526.tif 000076
ＰＲＩＡＢ２０（１．０等量）を無水ジクロロエタン（３０ｍＬ）に溶解し、次にＣｓ２ＣＯ３（２．５等量）を添加した。次に反応媒体を緩徐に加熱して還流させた。混合物を一夜還流下に攪拌し、次に室温に冷却し、濾過し、溶媒を真空下に除去した。次に残留油状物をカラムクロマトグラフィーで精製することにより得られた生成物を更に再結晶させた。
【０４８３】
第４工程：ナノ粒子の合成
工程１：ＤＭＳＯ中のＰＬＧＡ（ポリ−１−ラクチド−コ−グリコリド）溶液の溶液を製造した。ＤＭＳＯ中のＰＬＧＡの濃度は４０ｍｇ／ｍＬである。
工程２：ＤＭＳＯ中のこの４０ｍｇ／ｍＬのＰＬＧＡ（ポリ−１−ラクチド−コ−グリコリド）溶液１００μＬを１％ＰＶＡ（ポリビニルアルコール溶液１０ｍｌに添加し、１２時間室温で攪拌し、ナノ粒子を作成した。
工程３：次にナノ粒子懸濁液を６時間１０〜１２ｋＤ膜中で透析した。
工程４：この１０ｍｌの溶液に、１ｍｌのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ〜７．４、１０ｘ）を添加し、その後６０ｍｇの塩酸Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドを（塩酸ＥＤＣ）を添加し、少なくとも３０分〜１時間攪拌した。
工程５：上記溶液に再度６０ｍｇのエチレンジアミンを添加し、一夜攪拌した。
工程６：次に溶液全体を８時間程度透析（３．５ＫＤ膜を通す）することにより未反応物質を除去した。
【０４８４】
活性化Ｌ−Ｔ４とのナノ粒子のコンジュゲーション
工程７：ここで−ＮＨ２基を有する上記ＰＬＧＡナノ粒子に１００ｕＬの活性化Ｌ−Ｔ４（約２０ｍｇ／ｍＬＤＭＳＯ）を添加し、２４時間攪拌した。
工程８：次に精製のために溶液を少なくとも１２時間透析する。
【０４８５】
新しく製剤されたＬ−Ｔ４ナノの粒径及び粒径分布を確認した後、ＴＦＡを使用しながら穏やかな酸性条件下でｔ−ブタノールエステルを鹸化した。粒径は２００〜２５０ｎｍの範囲であった。Ｌ−Ｔ４固定化ナノ粒子をその粒径分布、表面電荷に関して特性化した。Ｌ−Ｔ４ナノ粒子の安定性は４℃に保たれた溶液中の固定化Ｌ−Ｔ４の経時的（第１日、第１週、及び第１月）な粒径分布の変化を試験することにより明らかにした。平均のナノ粒子の粒径は２００〜２５０ｎｍであり、そして１か月の期間に渡りその範囲から大きく変化せず、そして検出可能なナノ粒子からの遊離のＬ−Ｔ４は存在しなかった。５ｍＭのＮａＯＨにより、１００％の遊離のＬ−Ｔ４が一夜インキュベーションにより放出された。
【０４８６】
第５工程：ナノ粒子のアシドリシス
【０４８７】
【化６０】
2010513526.tif 000077
脱保護は１２時間水中に希釈したＴＦＡ又はＨＦの溶液中で粒子を攪拌することによりＬ−Ｔ４−ナノ粒子に対して行い、そして精製する。
【０４８８】
他の実施形態
本発明はその詳細な説明に関連して記載したが、上記した説明は例示であり、添付請求項の範囲により定義される本発明の範囲を限定しない。他の特徴、利点、及び変形例は以下の請求項の範囲に包含される。
【図１】
2010513526.tif 000078
【図２】
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【図３】
2010513526.tif 000080
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010513526.tif 000084
【図８】
2010513526.tif 000085
【図９】
2010513526.tif 000086
【図１０】
2010513526.tif 000087
【図１１】
2010513526.tif 000088
【図１２】
2010513526.tif 000089
【図１３】
2010513526.tif 000090
【図１４】
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【図１５】
2010513526.tif 000092
【図１６−１】
2010513526.tif 000093
【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
2010513526.tif 000096
【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
2010513526.tif 000099
【図２０−２】
2010513526.tif 000100
【図２１】
2010513526.tif 000101
【図２２】
2010513526.tif 000102
【図２３Ａ】
2010513526.tif 000103
【図２３Ｂ】
2010513526.tif 000104
【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
2010513526.tif 000106
【図２３Ｅ】
2010513526.tif 000107
【図２４】
2010513526.tif 000108
【図２５】
2010513526.tif 000109
【図２６】
2010513526.tif 000110
【図２７】
2010513526.tif 000111
【図２８】
2010513526.tif 000112
【図２９】
2010513526.tif 000113
【図３０Ａ】
2010513526.tif 000114
【図３０Ｂ−１】
2010513526.tif 000115
【図３０Ｂ−２】
2010513526.tif 000116
【図３１】
2010513526.tif 000117
【図３２】
2010513526.tif 000118
【図３３】
2010513526.tif 000119
【図３４】
2010513526.tif 000120
【図３５】
2010513526.tif 000121
【図３６Ａ】
2010513526.tif 000122
【図３６Ｂ】
2010513526.tif 000123
【図３７Ａ】
2010513526.tif 000124
【図３７Ｂ】
2010513526.tif 000125
【図３８Ａ】
2010513526.tif 000126
【図３８Ｂ】
2010513526.tif 000127
【図３９】
2010513526.tif 000128
【図４０】
2010513526.tif 000129
【図４１】
2010513526.tif 000130
【図４２】
2010513526.tif 000131
【図４３】
2010513526.tif 000132
【図４４】
2010513526.tif 000133
【図４５】
2010513526.tif 000134
【図４６】
2010513526.tif 000135
【図４７】
2010513526.tif 000136
【図４８】
2010513526.tif 000137
【図４９】
2010513526.tif 000138
【図５０】
2010513526.tif 000139
【図５１】
2010513526.tif 000140
【図５２】
2010513526.tif 000141
【図５３−１】
2010513526.tif 000142
【図５３−２】
2010513526.tif 000143
【図５４】
2010513526.tif 000144
【図５５】
2010513526.tif 000145
【図５６】
2010513526.tif 000146
【図５７】
2010513526.tif 000147
【図５８】
2010513526.tif 000148
【図５９】
2010513526.tif 000149
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月27日(2009.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010513526000001.app
【国際調査報告】
2010513526.tif 000150
2010513526.tif 000151
2010513526.tif 000152