(57)【要約】  本発明は、Ｆｃ含有タンパク質、例えば抗体及びＦｃ−融合タンパク質のＣ末端の切断の定量のための解析方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の第一タンパク質と第二タンパク質の相対量を測定、決定、そして／あるいは推定するための方法であって、
ａ）前記タンパク質を含んで成るサンプルを準備するステップ；
ｂ）前記タンパク質をＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼによって加水分解するステップ；及び
ｃ）ステップ（ｂ）で得られた加水分解物を、１アミノ酸長の違いを有するペプチド間を識別することができる方法によって分離するステップ、を含んで成り、
（ｉ）前記第一タンパク質が、そのＣ終末端において式Ｉのペプチド
式Ｉ：  Ｌｙｓ−（Ｘａａ）ｚ−Ｌｙｓ
を含んで成り；
（ｉｉ）前記第二タンパク質が、そのＣ終末端において式ＩＩのペプチド
式ＩＩ：  Ｌｙｓ−（Ｘａａ）ｚ
を含んで成り；
（ｉｉｉ）ＸａａがＬｙｓ以外の任意のアミノ酸であり；
（ｉｖ）５≦ｚ≦２０であり；且つ
（ｖ）前記第一タンパク質のプロセシングされていない配列が、前記第一タンパク質におけるＣ末端リジンの副次的な存在を除き前記第二タンパク質のプロセシングされていない配列と同一である、
方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）が式ＩＩＩのペプチドと式ＩＶのペプチド：
式ＩＩＩＩ：（Ｘａａ）ｚ−Ｌｙｓ
式ＩＶ：（Ｘａａ）ｚ
を識別する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一タンパク質がＦｃ含有タンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一タンパク質がそのＣ終末端に配列番号１の配列を含んで成る、請求項１、２及び３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第一タンパク質配列がそのＣ終末端に配列番号１の単一の多型変異体を含んで成る、請求項１、２及び３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）が、配列番号２の配列を有するペプチドと配列番号３の配列を有するペプチドとを識別する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）がクロマトグラフィーによって実施される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）が逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
クロマトグラフィーカラムの温度が約４０℃である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
以下の溶出剤：
（ｉ）０．１０％トリフルオロ酢酸／水；及び
（ｉｉ）０．０８％トリフルオロ酢酸／７０％アセトニトリル
が使用される、請求項７、８及び９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）の反応が５μｇの前記Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼ及び１００μｇの前記タンパク質を用いて実施される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）の反応が約２時間実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）の反応が約３７℃で実施される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）を実施する前にステップ（ｂ）の反応を停止するステップを更に含んで成る、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが精製したタンパク質を含んで成る、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが医薬品である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第一タンパク質が抗体である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から成る群から選択される抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体及び抗ＣＤ２５抗体から成る群から選択される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第一タンパク質がＦｃ融合タンパク質である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｆｃ融合タンパク質が、ＴＡＣＩ受容体のフラグメント又はＩＦＮ−ベータのいずれかを含んで成る、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
治療用タンパク質のロットの製造の検証のための、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆｃ含有タンパク質、例えば抗体及びＦｃ−融合タンパク質のＣ末端の切断の定量のための解析方法を提供する。より具体的には、本発明の方法は、Ｃ末端リジンが産生細胞内に存在するエンドプロテアーゼによって開裂した前記タンパク質の比率を試験することを可能にする。
【背景技術】
【０００２】
抗体及びＦｃ−融合タンパク質は、多数の疾患を処置するための治療用タンパク質として有用である。Ｆｃ含有タンパク質の非プロセシング型（non-processed）配列が知られているが、実際には、その産生されたタンパク質は異種のものである。一般に観察された修飾のうちの１つは、前記タンパク質のＦｃ鎖のＣ末端に存在するものであり、これは、前記タンパク質が産生される細胞内にある塩基性カルボキシペプチダーゼの活性によって生じる。これらの酵素は、産生したタンパク質画分からＣ末端リジン残基を除去し、これにより産生したタンパク質の２つの変異体が生成する。これらの変異体は通常リジン変異体、すなわちＬｙｓ０（Ｃ末端リジンが切断されたもの）及びＬｙｓ１（Ｃ末端リジンが存在しているもの）と称される。
【０００３】
抗体又はＦｃ−融合タンパク質のキャラクタリゼーション、開発、製造、及び販売には、Ｌｙｓ０及びＬｙｓ１変異体それぞれのパーセンテージを定量するための解析ツールが必要とされる。特に、治療用タンパク質がヒトへの投与に調製される場合である。例えば、かかるツールは、異なる開発ロットを解析するために、製造承認申請の枠内でのそのタンパク質のキャラクタリゼーションのために、又はロットの引渡しの試験のために使用されることがある。
【０００４】
抗体のＣ末端リジンの切断を評価する幾つかの方法が当業界で説明されている。
【０００５】
Santoraら(1999)は、組換えヒト抗腫瘍壊死因子モノクローナル抗体のＣ末端Ｌｙｓ変異体を解析するための方法を開示している。異なるＣ末端Ｌｙｓ変異体が分離され、そして陽イオン交換液体クロマトグラフィーカラムから回収され、その後、キャピラリー等電点電気泳動法及び質量分析によって解析された。
【０００６】
Lazarら(2004)は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析を用いてモノクローナル抗体のＣ末端リジン分布を解析するための方法を教示している。
【０００７】
Dillonら(2004)は、組換え抗体のキャラクタリゼーションのための分析用逆相高性能液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化質量分析法を開示しており、これによりインタクトなＩｇＧ１抗体からのリジン変異体の分離を可能にしている。
【０００８】
従って、当業界で現在利用可能な抗体のＣ末端リジンの切断を評価するための方法は、質量分析か、陽イオン交換クロマトグラフィーによる解析を伴う。かかる方法は、厳密には、分子のｐＩ範囲及び／又は変化の不均一性に依存する。要するに、その方法論自体はあらゆる抗体に使用することができるが、科学者は、解析される各特異的抗体について新規の解析条件を設定しなくてはならない。これらの条件は、解析されるその特異的抗体のｐＩ範囲及び／又は変化の不均一性に依存する。
【０００９】
従って、あらゆる抗体又はＦｃ−融合タンパク質に適用できるＦｃ−含有タンパク質のＣ末端リジンの切断を、解析される特異的抗体それぞれにつき新規の解析条件を設定する必要なしに評価することを可能にする定量分析方法についての必要性が存在している。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、配列番号１をＣ終末端に含んで成る任意のタンパク質、例えば抗体及びＦｃ−融合タンパク質のＣ末端での切断を定量するための方法の発見に起因する。この方法は、解析されるタンパク質をＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼによって加水分解する方法に基づいており、これが特に有利なのは、解析されるタンパク質のｐＩ範囲又はイソ型プロファイルに依存していないためである。従って、この方法は、ケース毎に特異的なサンプル処理又は特異的な解析条件を開発する必要なしに、配列番号１をＣ終末端に含んで成る任意のタンパク質に適用することができる。
【００１１】
従って、本発明の一態様は、サンプル中の第一タンパク質と第二タンパク質の相対量を測定、決定、そして／あるいは推定するための方法であって、
ａ）前記タンパク質を含んで成るサンプルを準備するステップ；
ｂ）前記タンパク質をＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼによって加水分解するステップ；及び
ｃ）ステップ（ｂ）で得られた加水分解物を、１アミノ酸長の違いを有するペプチド間を識別することができる方法によって分離するステップ、を含んで成り、
（ｉ）前記第一タンパク質のプロセシングされていない配列が前記第二タンパク質のプロセシングされていない配列と同一であり；
（ｉｉ）前記第一タンパク質が、そのＣ終末端において式Ｉのペプチド
式Ｉ：  Ｌｙｓ−（Ｘａａ）ｚ−Ｌｙｓ
を含んで成り；
（ｉｉｉ）前記第二タンパク質が、そのＣ終末端において式ＩＩのペプチド
式ＩＩ：  Ｌｙｓ−（Ｘａａ）ｚ
を含んで成り；
（ｉｖ）ＸａａがＬｙｓ以外の任意のアミノ酸であり；且つ
（ｖ）５≦ｚ≦２０である、
方法、である。
【００１２】
本発明の別の態様において、治療用タンパク質のロットの製造は、本明細書で開示されている方法に従い評価される。
【００１３】
本発明の第三の態様において、式ＩＩＩ（（Ｘａａ）ｚ−Ｌｙｓ）又は式ＩＶ（（Ｘａａ）ｚ）のペプチドが、それぞれインタクトなＦｃ−含有タンパク質又は切断されたＦｃ−含有タンパク質の検出に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の方法の一態様の略図である。Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼによるタンパク質分解は、Ｆｃ鎖を含んで成るタンパク質を含んで成るサンプル上で最初に実施される。続いて、そのＣ末端での切断を検出して定量することができる逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）が実施される。図１上、Ｃ末端がリジンで開裂しているフラグメント（前記タンパク質のＬｙｓ０変異体のタンパク質分解）は、溶出されたフラグメントの主要部を表しており、そして、それらはそのリジンを有するフラグメントからはっきりと分離される（前記タンパク質のＬｙｓ１変異体のタンパク質分解）。図１で描かれたＦｃ鎖は、配列表の配列番号４に相当する。インタクトなフラグメントは配列番号２に相当する。切断されたフラグメントは配列番号３に相当する。
【図２．１】図２．１は、実施例１〜３を実施して得られた典型的なＲＰ−ＨＰＬＣ解析プロファイルを表す。このプロファイルは、ＷＯ０２／０９４８５２に記載のＴＡＣＩ受容体のフラグメントを含んで成るＦｃ−融合タンパク質について得たものである。
【図２．２】図２．２は、実施例１〜３を実施して得られた典型的なＲＰ−ＨＰＬＣ解析プロファイルを表す。このプロファイルは、ＷＯ０２／０９４８５２に記載のＴＡＣＩ受容体のフラグメントを含んで成るＦｃ−融合タンパク質について得たものである。
【図３】図３は、配列番号１の配列をＣ終末端に含んで成る６つの異なるタンパク質に対して実施例１〜３の方法を実施して得られたＲＰ−ＨＰＬＣ解析プロファイルを表す。「ＴＡＣＩ−Ｆｃ」は、ＷＯ０２／０９４８５２に記載の膜貫通性活性化因子／カルシウム調節因子／シクロフィリンリガンド相互作用因子（transmembrane activator and calcium-modulator and cyclophilin ligand interactor）（ＴＡＣＩ）受容体のフラグメントを含んで成るＦｃ−融合タンパク質を表す。「抗ＣＤ４  Ｍａｂ」は、ＷＯ９７／１３８５２に記載の抗ＣＤ４抗体６Ｇ５である。「抗ＣＤ２５  Ｍａｂ」は、ＷＯ２００４／０４５５１２に記載の抗ＣＤ２５抗体ＡＢ１２である。「ＩＦＮ−Ｆｃ  Ｎｏ．１」は、ＷＯ２００５／００１０２５に記載のＩＦＮ−ベータのフラグメントを含んで成るＦｃ−融合タンパク質である「ＩＦＮ−Ｆｃ  Ｎｏ．２」は、ＩＦＮ−ベータのフラグメントを含んで成る第二のＦｃ−融合タンパク質である。「抗ＣＤ１１ａ  Ｍａｂ」は、ＷＯ９８／２３７６１に記載の抗ＣＤ１１ａ抗体Ｆ（ａｂ）−８である。
【００１５】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、抗体の重鎖及びＦｃ鎖に通常存在している９個のＣ末端アミノ酸に相当する。
【００１６】
配列番号２は、抗体の重鎖及びＦｃ鎖に存在しているインタクトな配列に相当する（Ｌｙｓ１変異体）。
【００１７】
配列番号３は、抗体の重鎖及びＦｃ鎖に存在している切断された配列に相当する（Ｌｙｓ０変異体）。
【００１８】
配列番号４は、配列番号１をＣ終末端に含んで成る例示的なＦｃ領域の配列に相当する。
【００１９】
本発明の詳細な説明
抗体の重鎖及びＦｃ鎖のプロセシングされていない配列は、それらのＣ終末端に配列番号１を含んで成る。抗体の重鎖及びＦｃ鎖のＣ末端は、細胞内に存在しているカルボキシペプチダーゼによってタンパク質分解処理され、それによりＣ末端リジンを欠く重鎖及びＦｃ鎖を生成することがある。本発明は、抗体及び／又はＦｃ鎖の重鎖のＣ末端切断がＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼを使用する方法によって決定することができるという知見に起因している。Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼによる重鎖又はＦｃ鎖の加水分解時に、前記鎖が細胞内で任意のカルボキシペプチダーゼによって全くプロセシングされなかった場合、配列番号２のフラグメントが生成する。一方、配列番号３のフラグメントは、前記鎖が細胞内でカルボキシペプチダーゼによってプロセシングされた場合に生成する。配列番号２及び３のかかるフラグメントは、その後、クロマトグラフィーによって分離されることがあり、これにより、Ｃ末端リジンが切断されているタンパク質のパーセンテージを推定することが可能になる（図１を参照のこと）。更に、驚いたことに、この方法は、実験条件を変更する必要なしにあらゆるＦｃ−含有タンパク質の解析に応用できることが明らかとなった（図３を参照のこと）。
【００２０】
従って、本発明の一態様は、サンプル中の第一タンパク質と第二タンパク質の相対量を測定、決定、そして／あるいは推定するための方法であって、
ａ）前記タンパク質を含んで成るサンプルを準備するステップ；
ｂ）前記タンパク質をＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼによって加水分解するステップ；及び
ｃ）ステップ（ｂ）で得られた加水分解物を、１アミノ酸長の違いを有するペプチド間を識別することができる方法によって分離するステップ、を含んで成り、
（ｉ）前記第一タンパク質のプロセシングされていない配列が前記第二タンパク質のプロセシングされていない配列と同一であり；
（ｉｉ）前記第一タンパク質が、そのＣ終末端において式Ｉのペプチド
式Ｉ：  Ｌｙｓ−（Ｘａａ）ｚ−Ｌｙｓ
を含んで成り；
（ｉｉｉ）前記第二タンパク質が、そのＣ終末端において式ＩＩのペプチド
式ＩＩ：  Ｌｙｓ−（Ｘａａ）ｚ
を含んで成り；
（ｉｖ）ＸａａがＬｙｓ以外の任意のアミノ酸であり；且つ
（ｖ）５≦ｚ≦２０である、
方法、である。
【００２１】
本明細書で使用する場合、タンパク質についての用語「プロセシングされていない配列」とは、当該タンパク質が発現する細胞内で、当該タンパク質の任意なタンパク質分解プロセシングが起こる前の、相当のメッセンジャーＲＮＡがコードするアミノ酸配列を指す。具体的な一態様において、前記第二タンパク質はＣ末端リジンが開裂している第一タンパク質に相当する。従って、本願の枠組みにおいて、「前記第一タンパク質のプロセシングされていない配列は前記第二タンパク質のプロセシングされていない配列と同一である」という特徴は、換言すると、以下のように定義されることもある：「前記第一タンパク質の配列は、前記第一タンパク質のＣ末端リジンの副次的な存在を除いて、前記第二タンパク質の配列と同一である」。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「本発明のタンパク質」とは、前記第一及び第二タンパク質の両方を指す。
【００２３】
第一タンパク質と第二タンパク質の相対量は、例えば、パーセンテージとして又は比率として表されることがある。パーセンテージとして表す場合、１００％は、本発明のタンパク質の合計量、すなわち、第一タンパク質と第二タンパク質の量に相当する。
【００２４】
本発明の方法において、ｚは、３〜５０、３〜４０、３〜３０、３〜２０、３〜１５、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、４〜５０、４〜４０、４〜３０、４〜２０、４〜１５、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、又は５〜６、の範囲内に含まれるあらゆる値を有することがある。具体的な態様において、ｚは７の値を有する。
【００２５】
これらの用語はそれぞれ明確な意味を有するが、用語「含んで成る」及び「から成る」は、本願を通じて互いに置き換えられることがある。用語「有する」は、「含んで成る」と同一の意味を持つ。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼ」は、用語「リシルエンドペプチダーゼ」と同義語であり、これは、ポリペプチド及び／又はタンパク質内のリジンと任意のアミノ酸との間の結合を開裂する酵素を指す（ENZYME/UniProtKB/Swiss-ProtアクセッションナンバーEC 3.4.21.50を参照のこと）。かかる酵素には、限定しないが、エンドプロテイナーゼであって、リソバクター・エンザイモジェネス（Lysobacter enzymogenes）（UniProtKB/Swiss-ProtアクセッションナンバーQ7M135）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）(Ps-1 ; UniProtKB/Swiss-ProtアクセッションナンバーQ9HWK6)及びアクロモバクター・リチカス（Achromobacter lyticus）(UniProtKB/Swiss-ProtアクセッションナンバーP15636)からクローニングしたコード配列を用いて遺伝子組換えによって産生したエンドプロテイナーゼが含まれる。本発明の具体的な一態様において、Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼは、リソバクター・エンザイモジェネスのエンドプロテイナーゼに相当する。別の態様において、Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼは、Ｌ．エンザイモジェネス、Ｐ．アエルギノサ及びＡ．リチカスから精製されたものである。
【００２７】
ある態様において、本発明のタンパク質は、Ｆｃ含有タンパク質、例えば抗体又はＦｃ融合タンパク質である。具体的な態様において、Ｆｃ含有タンパク質は、タンパク質のエフェクター領域、例えばある抗体のＦａｂ領域又はある受容体の結合領域と、イムノグロブリン、例えば、限定しないが、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ領域とが融合したもの、から成るキメラタンパク質である。
【００２８】
用語「Ｆｃ含有タンパク質」は、本明細書で使用する場合、タンパク質、特に治療用タンパク質であって、本明細書で「Ｆｃ部分」と称されるイムノグロブリン由来部分、及び、疾患の治療が意図されているか否かに関係なく本明細書で「治療用部分」と称される、Ｆｃ部分と同一又は異なるタンパク質に由来する別の部分、を含んで成るタンパク質を包含することを意味している。Ｆｃ部分は、例えば、配列番号４の配列を有することがある。他のＦｃ部分は、配列番号４の配列と少なくとも９９％、９８％、９５％、９０％、８５％又は８０％同一のアミノ酸配列を有していてもよい。Ｆｃ部分と融合した組換えポリペプチドは、細胞性分泌及び／又は細胞内産生が所望とされるタンパク質について注目の任意のポリペプチドに相当することがある。本明細書で使用する場合、Ｆｃ含有タンパク質という用語は、抗体及びＦｃ融合タンパク質の両方を包含する。
【００２９】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」とは、その治療用部分がイムノグロブリン（Ｉｇ）の少なくとも１つの可変ドメインを含んで成る、Ｆｃ含有タンパク質を指す。好ましいイムノグロブリンは、哺乳類のイムノグロブリンである。より好ましいイムノグロブリンは、ラクダ科のイムノグロブリンである。より更に好ましいイムノグロブリンは、げっ歯類のイムノグロブリン、特にラット又はマウス由来のものである。最も好ましいイムノグロブリンは、霊長類のイムノグロブリン、特にヒトイムノグロブリンである。
【００３０】
用語「Ｆｃ融合タンパク質」とは、その治療用部分がイムノグロブリンの可変ドメイン以外のタンパク質、例えば受容体の細胞外ドメイン又は可溶性タンパク質のドメインである、Ｆｃ含有タンパク質を指す。
【００３１】
Ｆｃ部分は、ヒト又は動物のイムノグロブリン（Ｉｇ）、好ましくはＩｇＧに由来してもよい。ＩｇＧは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3又はＩｇＧ4であってもよい。Ｆｃ部分は、イムノグロブリンの定常領域ドメインの全部又は一部を含んで成ることがある。Ｆｃ部分は少なくともＣＨ2及びＣＨ3ドメインを含んで成ることが好ましい。より好ましくは、Ｆｃ部分は、Ｉｇヒンジ領域、ＣＨ2及びＣＨ3を含んで成る。特に好ましくは、Ｆｃ部分は、ＩｇＧのＣＨ2及びＣＨ3を、ヒンジ領域と一緒に又はヒンジ領域無しに含んで成る。
【００３２】
本発明のＦｃ含有タンパク質は、モノマー又はダイマーであってもよい。Ｆｃ含有タンパク質は、一方のみが治療用タンパク質と融合している二量体Ｆｃ部分を含む、「シュードダイマー(pseudo-dimer)」（例えば、２つのジスルフィド架橋ヒンジＣＨ２−ＣＨ３コンストラクトのダイマー）であってもよい。Ｆｃ含有タンパク質は、２つの異なる治療用部分を含むヘテロダイマー、又は単一の治療用部分を２コピー含むホモダイマーであってもよい。好ましくは、Ｆｃ含有タンパク質はダイマーである。本発明のＦｃ含有タンパク質がホモダイマーであることも好ましい。
【００３３】
本発明によれば、Ｆｃ部分は、エフェクター機能を調節するために修飾されることもある。例えば、ＥＵインデックスポジション(Kabat et al., 1991)によれば、Ｆｃ部分がＩｇＧ1由来である場合、以下のＦｃ突然変異を導入することができる：
- T250Q/M428L
- M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F
- E233P/L234V/L235A/ΔG236 + A327G/A330S/P331S
- E333A; K322A.
【００３４】
その他のＦｃ突然変異は、例えば、３３０、３３１、２３４、又は２３５、あるいはそれらの組合せから選択されるＥＵインデックスポジションでの置換であってもよい。ＣＨ２ドメインにあるＥＵインデックスポジション２９７でのアミノ酸置換を本発明のＦｃ部に導入して、潜在的なＮ結合型糖鎖付着部位を排除してもよい。ＥＵインデックスポジション２２０にあるシステイン残基を、セリン残基と置換して、イムノグロブリン軽鎖定常領域とジスルフィド結合を通常形成するシステイン残基を排除してもよい。
【００３５】
Ｆｃ含有タンパク質の治療用部分は、例えば、ＥＰＯ、ＴＰＯ、成長ホルモン、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、ＰＤＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８結合タンパク質、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、又はＴＮＦ−ベータであるか、あるいはこれらに由来するものであってもよい。
【００３６】
Ｆｃ含有タンパク質の治療用部分は、受容体、例えば膜貫通受容体に由来することがあり、好ましくは、受容体の細胞外ドメイン、特に所定の受容体の細胞外部分又はドメインのリガンド結合フラグメントであるか、あるいはこれに由来することがある。治療上注目の受容体の例として、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４７、ＣＤ１６４、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット（ＩＬ−１８Ｒ−アルファ、ＩＬ−１８Ｒ−ベータ）、ＥＧＦ受容体、ＭＩＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、インテグリンアルファ４  １０ベータ７、インテグリンＶＬＡ４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原）、ＦｃガンマＩ受容体、ＨＬＡ−ＤＲ  １０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、ＴＮＦＲスーパーファミリーに属するフラグメント又は受容体、例えばＴＮＦＲ１（ｐ５５）、ＴＮＦＲ２（ｐ７５）、ＯＸ４０、オステオポンチン、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、ＤＲ３、Ｆａｓリガンド、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＮＧＦＲ、ＡＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ又はＴＡＣＩに属する受容体のフラグメントがある。
【００３７】
本発明の一つの態様として、前記方法のステップ（ｃ）が式ＩＩＩと式ＩＶ：
式ＩＩＩＩ：（Ｘａａ）ｚ−Ｌｙｓ
式ＩＶ：（Ｘａａ）ｚ
のペプチド間を識別する方法がある。
【００３８】
本発明の別の態様として、前記タンパク質のプロセシングされていない配列がそのＣ終末端に配列番号１の多型変異体を含んで成る方法（但し、配列番号１の前記多型変異体は式Ｉの範囲内に含まれる）がある。
【００３９】
本明細書で使用する場合、所定の配列についての用語「多型変異体」は、１又は複数アミノ酸が、前記所定の配列と比較した場合に異なるアミノ酸で置換されている配列を指す。具体的な態様において、前記置換は、以下の表１〜表３に示す保存的置換である。別の具体的な態様において、前記多型変異体は、前記所定の配列と比較して７、６、５、４、３又は２未満の多型的変化を含んで成る。別の具体的な態様において、前記多型変異体は単一の多型変異体である。別の具体的態様において、前記多型変異体は、少なくとも前記所定の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。
【００４０】
【表１】
2010512770.tif 000002
【００４１】
【表２】
2010512770.tif 000003
【００４２】
【表３】
2010512770.tif 000004
【００４３】
本発明の別の態様は、前記タンパク質のプロセシングされていない配列が、そのＣ終末端に配列番号１の配列を含んで成る、方法である。
【００４４】
本発明の別の態様は、ステップ（ｃ）が配列番号２の配列を有するペプチドと配列番号３の配列を有するペプチドとを識別する方法である。
【００４５】
本発明の方法のステップ（ｃ）は、１アミノ酸長の違いを有するペプチド間を識別が可能な任意の方法を用いて実施される。このような方法は当業界で周知であり、例えばクロマトグラフィー及び質量分析などである。
【００４６】
本発明の一態様は、ステップ（ｃ）がクロマトグラフィーによって実施される方法である。具体的な一態様において、ステップ（ｃ）は逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって実施される方法である。
【００４７】
ステップ（ｃ）がＲＰ−ＨＰＬＣで実施される場合、例えば以下の条件を使用してもよい。溶出剤は例えば以下のものであってもよい：
−０．１０％トリフルオロ酢酸／水（溶出剤Ａと称する）
−０．０８％トリフルオロ酢酸／７０％アセトニトリル（溶出剤Ｂと称する）
カラム温度は、例えば約＋４０℃であってもよい。実行期間は例えば約１５分であってもよい。カラムの流速は、例えば約１ｍＬ／分であってもよい。線形グラジエントは、例えば実施例２の表４に示すように設定してもよい。
【００４８】
具体的な態様において、本発明のステップ（ｃ）に従うＲＰ−ＨＰＬＣは実施例２で詳述するように実施される。しかしながら。ＲＰ−ＨＰＬＣを実施する多数の方法が当業界で知られており、当業者は、式ＩＶのペプチドから式ＩＩＩのペプチドを分離するための異なる条件をルーチンに設定することができる。
【００４９】
本発明の別の態様は、ステップ（ｂ）の反応が約２０〜１、１５〜２又は１０〜４μｇの前記Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼの範囲内で且つ約５００〜２５、４００〜５０、３００〜７５又は２００〜１２５μｇの前記タンパク質の範囲内で実施される方法である。具体的な一態様において、ステップ（ｂ）の反応は、（ｉ）前記Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼが約２〜約１０μｇという範囲内で；且つ（ｉｉ）前記タンパク質が約１００μｇで実施される。別の具体的な態様において、ステップ（ｂ）の反応は、（ｉ）前記Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼが約２．５μｇ〜約５μｇという範囲内で；且つ（ｉｉ）前記タンパク質が約１００μｇで実施される。
【００５０】
本発明の別の態様は、ステップ（ｂ）の反応が約５、４、３、２又は１時間実施される方法である。具体的な態様において、ステップ（ｂ）の反応は約２時間実施される。
【００５１】
本発明の追加の態様は、ステップ（ｂ）の反応が約４２、４０、３７、３５又は３０℃で実施される方法である。具体的な態様において、ステップ（ｂ）の反応は約３７℃で実施される。
【００５２】
本発明の具体的な一態様は、ステップ（ｂ）が、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含んで成る約ｐＨ７．５の緩衝液を用いて実施される。あるいは、当業者は他の緩衝液を使用することができる。
【００５３】
本発明の追加の態様は、ステップ（ｃ）を実施する前にステップ（ｂ）の反応を停止するステップを含んで成る方法である。ステップ（ｂ）の反応は、当業者に知られている任意の方法によって停止され得る。具体的な一態様において、ステップ（ｂ）の反応は、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加することによって停止される。別の具体的な態様において、ステップ（ｂ）の反応は、１０％の濃度のＴＦＡを添加することによって停止される。
【００５４】
前記タンパク質を含んで成るサンプルは、例えば、開発ロットを試験する場合、例えば精製したタンパク質に相当することがあり、あるいは、製造承認申請の枠内でタンパク質をキャラクタライズする場合、又はロットの引渡し試験を実施する場合、例えば医薬品に相当することがある。
【００５５】
本発明の一態様において、本発明のタンパク質は抗体である。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体又はヒト抗体であってもよい。抗体は、当該抗体をコードする１、２又はそれ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクションした宿主細胞で産生してもよく、あるいは、ハイブリドーマから産生してもよい。
【００５６】
好ましくは、前記抗体は、ＣＤ３（例えばＯＫＴ３、ＮＩ−Ｏ４０１）、ＣＤ１１ａ（例えばエファリズマブ）、ＣＤ４（例えばザノリムマブ、ＴＮＸ−３５５）、ＣＤ２０（例えばイブリツモマブ  チウキセタン、リツキシマブ、トシツモマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、ＩＭＭＵ−１０６、ＴＲＵ−０１５、ＡＭＥ−１３３、ＧＡ−１０１）、ＣＤ２３（例えばルミリキシマブ）、ＣＤ２２（例えばエプラツズマブ）、ＣＤ２５（例えばバシリキシマブ、ダクリズマブ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（例えばパニツムマブ、セツキシマブ、ザルツムマブ、ＭＤＸ−２１４）、ＣＤ３０（例えばＭＤＸ−０６０）、細胞表面糖タンパク質ＣＤ５２（例えばアレムツズマブ）、ＣＤ８０（例えばガリキシマブ）、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩａ受容体（例えばアブシキシマブ）、ＴＮＦアルファ（例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ）、インターロイキン−６受容体（例えばトシリズマブ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）（例えば９９ｍＴｃ−ベシレソマブ）、アルファ−４／ベータ−１インテグリン（ＶＬＡ４）（例えばナタリズマブ）、アルファ−５／ベータ−１インテグリン（ＶＬＡ５）（例えばボロシキシマブ(Volociximab)）、ＶＥＧＦ（例えばベバシズマブ、ラニビズマブ）、イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）（例えばオマリズマブ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（トラスツズマブ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）（例えば１１１Ｉｎ−カプロマブペンデチド、ＭＤＸ−０７０）、ＣＤ３３（例えばゲムツズマブ  オゾガミシン）、ＧＭ−ＣＳＦ（例えばＫＢ００２、ＭＴ２０３）、ＧＭ−ＣＳＦ受容体（例えばＣＡＭ−３００１）、ＥｐＣＡＭ（例えばアデカツムマブ）、ＩＦＮ−ガンマ（例えばＮＩ−０５０１）、ＩＦＮ−アルファ（例えばＭＥＤＩ−５４５／ＭＤＸ−１１０３）、ＲＡＮＫＬ（例えばデノスマブ）、肝細胞増殖因子（例えばＡＭＧ１０２）、ＩＬ−１５（例えばＡＭＧ７１４）、ＴＲＡＩＬ（例えばＡＭＧ６５５）、インスリン様増殖因子受容体（例えばＡＭＧ４７９、Ｒ１５０７）、ＩＬ−４及びＩＬ−３（例えばＡＭ３１７）、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ受容体３（ＢＲ３）（例えばＣＢ１）、ＣＴＬＡ−４（例えばイピリムマブ）から成る群から選択されるタンパク質に対するものである。
【００５７】
具体的な態様において、前記抗体は、抗ＣＤ４抗体（例えばＷＯ９７／１３８５２を参照のこと）、抗ＣＤ１１ａ抗体（例えばＷＯ９８／２３７６１を参照のこと）及び抗ＣＤ２５抗体（例えばＷＯ２００４／０４５５１２を参照のこと）から成る群から選択される。
【００５８】
本発明の別の態様において、本発明のタンパク質はＦｃ融合タンパク質である。
【００５９】
具体的な態様において、前記Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＮＦのフラグメント（例えばオネルセプト、エタネルセプト）、ＣＤ２８のフラグメント（例えばアバタセプト）、ＴＡＣＩ受容体のフラグメント、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ受容体３（ＢＲ３）のフラグメント、インターフェロン（ＩＦＮ）又はそのフラグメント、及びＦＳＨ又はそのフラグメントから成る群から選択されるフラグメントを含んで成る。
【００６０】
具体的な一態様において、前記Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＡＣＩ受容体のフラグメントを含んで成る（例えばＷＯ０２／０９４８５２を参照のこと）。別の具体的な態様において、前記Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＦＮ−ベータを含んで成る（例えばＷＯ２００５／００１０２５を参照のこと）。
【００６１】
本発明の更に別の態様において、本発明のタンパク質は、ＷＯ２００５／００１０２５に記載のキメラタンパク質のいずれかである。具体的な態様において、かかるキメラポリペプチドは：
ａ）第一及び第二ポリペプチド鎖を含んで成るキメラタンパク質であって、前記第一鎖が生体活性分子、及びイムノグロブリン定常領域の少なくとも一部を含んで成り、且つ前記第二鎖がイムノグロブリン定常領域の少なくとも一部を、生体活性分子又はイムノグロブリン可変領域を伴わずに含んで成るキメラタンパク質；
ｂ）第一及び第二ポリペプチド鎖を含んで成るキメラタンパク質であって、前記第一鎖が生体活性分子、及びイムノグロブリン定常領域の少なくとも一部を含んで成り、且つ前記第二鎖がイムノグロブリン定常領域の少なくとも一部及び任意にアフィニティータグから成るキメラタンパク質；
ｃ）第一及び第二ポリペプチド鎖を含んで成るキメラタンパク質であって、前記第一鎖が生体活性分子、及びイムノグロブリン定常領域の少なくとも一部を含んで成り、且つ前記第二鎖が、イムノグロブリン定常領域の少なくとも一部及び任意にアフィニティータグから本質的に成るキメラタンパク質；
ｄ）第一及び第二ポリペプチド鎖を含んで成るキメラタンパク質であって、ａ）前記第一鎖が生体活性分子、イムノグロブリン定常領域の少なくとも一部、及び少なくとも１つの特異的結合パートナーを有する第一ドメインを含んで成り；且つｂ）前記第二鎖が、イムノグロブリンの少なくとも一部を、生体活性分子又はイムノグロブリン可変領域を伴わずに含んで成り、そして更に、前記第一ドメインの特異的結合パートナーである第二ドメインを含んで成るキメラタンパク質；
ｅ）第一及び第二ポリペプチド鎖を含んで成るキメラタンパク質であって、ａ）前記第一鎖が生体活性分子、イムノグロブリン定常領域の少なくとも一部、及び少なくとも１つの特異的結合パートナーを有する第一ドメインを含んで成り；且つｂ）前記第二鎖が、イムノグロブリンの少なくとも一部、前記第一ドメインの特異的結合パートナーである第二ドメイン及び任意にアフィニティータグを含んで成るキメラタンパク質；
ｆ）第一及び第二ポリペプチド鎖を含んで成るキメラタンパク質であって、ａ）前記第一鎖が生体活性分子、イムノグロブリン定常領域の少なくとも一部、及び少なくとも１つの特異的結合パートナーを有する第一ドメインを含んで成り；且つｂ）前記第二鎖が、イムノグロブリンの少なくとも一部、前記第一ドメインの特異的結合パートナーである第二ドメイン及び任意にアフィニティータグから本質的に成るキメラタンパク質；
ｇ）式Ｘ−Ｌａ−Ｆ：Ｆ又はＦ：Ｆ−Ｌａ−Ｘのキメラタンパク質であって、Ｘが生体活性分子であり、Ｌがリンカーであり、Ｆがイムノグロブリン定常領域の少なくとも一部であり、そしてａが任意の整数又はゼロである、キメラタンパク質；
ｈ）第一ポリペプチド鎖と第二ポリペプチド鎖とが一緒に連結したものを含んで成るキメラタンパク質であって、前記第一鎖が生体活性分子、及びイムノグロブリン定常領域の少なくとも一部を含んで成り、且つ前記第二鎖がイムノグロブリン定常領域の少なくとも一部を、第一鎖の生体活性分子を伴わずに含んで成り、前記第二鎖が、２ｋＤ超の分子量を有する任意の分子と共有結合していない、キメラタンパク質；
ｉ）第一ポリペプチド鎖と第二ポリペプチド鎖とが一緒に連結したものを含んで成るキメラタンパク質であって、前記第一鎖が生体活性分子、及びイムノグロブリン定常領域の少なくとも一部を含んで成り、且つ前記第二鎖が、前記第一ポリペプチド鎖のイムノグロブリンの一部を除くあらゆる分子と共有結合していないイムノグロブリン定常領域の少なくとも一部を含んで成る、キメラタンパク質；
ｊ）第一ポリペプチド鎖と第二ポリペプチド鎖とが一緒に連結したものを含んで成るキメラタンパク質であって、前記第一鎖が生体活性分子、及びイムノグロブリン定常領域の少なくとも一部を含んで成り、且つ前記第二鎖が、イムノグロブリン定常領域の少なくとも一部から成る、キメラタンパク質；及び
ｋ）第一ポリペプチド鎖と第二ポリペプチド鎖とが一緒に連結したものを含んで成るキメラタンパク質であって、前記第一鎖が生体活性分子、及びイムノグロブリン定常領域の少なくとも一部を含んで成り、且つ前記第二鎖がイムノグロブリン定常領域の少なくとも一部を、第一鎖の生体活性分子及び共有結合した２ｋＤ未満の分子量を有する分子を伴わずに含んで成る、キメラタンパク質、
から成る群から選択される。
【００６２】
具体的な態様において、本発明の方法は、（ｉ）サンプル中の第一タンパク質量対第二タンパク質量の相対比；又は（ｉｉ）サンプル中の第二タンパク質量対第一タンパク質の相対比、を算出するステップを更に含んで成る。別の具体的な態様において、本発明の方法は、前記第一及び第二タンパク質の合計量に対する第一又は第二タンパク質の相対的なパーセンテージを算出するステップを更に含んで成る。例えば、これは、ステップ（ｃ）を実施する場合に使用されるクロマトグラフィーシステム（例えばＲＰ−ＨＰＬＣシステム）のソフトウェアを用いて行うことができる。多くのそのようなソフトウェアが当業界で知られており、そして、例えばＷａｔｅｒｓによって商品化されているＥｍｐｏｗｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅなどがある。
【００６３】
別の観点は、治療用タンパク質のロットの製造の検証のための、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法の使用に関する。
【００６４】
更に別の観点は、インタクトなＦｃ含有タンパク質の検出のための式ＩＩＩのペプチドの使用に関する。前記ペプチドは、例えば、配列番号２の配列を有してもよく、又はその単一の多型変異体であってもよい。
【００６５】
追加の観点は、切断されたＦｃ含有タンパク質の検出のための式ＩＶのペプチドの使用に関する。前記ペプチドは、例えば配列番号３、又はその単一の多型変異体であってもよい。
【００６６】
本明細書で引用する全ての文献は、引用によりそれらの内容全てが援用される。
【００６７】
具体的な態様についての上記説明は、当業者の技術範囲内の知識（本明細書で引用する文献の内容を含む）を応用することにより、第三者が、本発明の一般的概念から逸脱することなく、種々の応用をするために直ちにかかる具体的な態様を改良し、そして／あるいはそれらを採用することができるように十分に本発明の一般的性質について明らかにするものである。従って、そのような採用及び改良は、本明細書で提示する教示及び手引きに基づき、開示した態様と均等であることを意図した範囲内であることが意図される。本明細書で使用する語法及び用語は、説明目的であって、限定するためのものでなく、その結果、本明細書の用語又は語法は、本明細書で提示する教示及び手引きに鑑み、当業者の知識と組み合わせて当業者によって解釈されるべきものである。
【００６８】
本発明を説明してきたが、以下の実施例を参照することでより容易に本発明が理解されるであろう。同実施例は、例示目的であって、本発明を限定することを意図していない。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例１〜３は、本発明の方法を用いた、ＷＯ０２／０９４８５２に記載のＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質のＣ末端切断の解析を説明するものである。実施例４は、本発明の方法を用いて、異なる抗体及びＦｃ融合タンパク質について得られた結果を比較するものである。
【００７０】
実施例１：Ｌｙｓ−ＣによるＴＡＣＩ−Ｆｃの加水分解
５μｇの凍結乾燥したエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ、製品番号１０４７８２５）を５１μＬの精製水中で懸濁した。
【００７１】
ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質を含んで成るサンプルを、１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるよう精製水中で希釈した。１０μＬ（１００μｇ）のこの希釈液を、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び２ｍＭ  のＥＤＴＡを含んで成るｐＨ７．５の１００μＬの緩衝溶液に添加した。２５μＬのＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼを続いて添加した。このタンパク質分解混合物を、ボルテックスを用いてゆっくり混合し、そして２時間±１０分、３７℃±２℃でインキュベートした。この反応は、１０μＬのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、製品番号９４７０）を１０％の濃度で前記タンパク質分解混合物に添加することで停止させた。
【００７２】
コントロール（ブランク）は、２５μＬのＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼを、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び２ｍＭ  のＥＤＴＡを含んで成るｐＨ７．５の１１０μＬの緩衝溶液に添加することで調製した。当該コントロールをインキュベートし、そして反応を上述のとおり停止させた。
【００７３】
実施例２：ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーによるタンパク質分解混合物の解析
２．１．材料
ＲＰ−ＨＰＬＣは、カラム用のオーブンを備えた「Ａｌｌｉａｎｃｅ」ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて実施した。このＨＰＬＣは２つのカラム：
−解析用カラムＣ１８、５μｍ（４．６ｍｍ×５０ｍｍ）（Ｖｙｄａｃ、製品番号２１８ＴＰ５４０５）；及び
−ＨＰガードカラムＣ１８、５μｍ（Ｖｙｄａｃ、製品番号２１８ＧＤ５４）
を備えている。
【００７４】
２．２．条件
ＨＰＬＣのラインは、以下の溶液で連結した：
−ラインＡ：０．１０％トリフルオロ酢酸／水（溶出剤Ａと称する）
−ラインＢ：０．０８％トリフルオロ酢酸／７０％アセトニトリル（溶出剤Ｂと称する）。
【００７５】
上記解析用カラム及びガードカラムを装置に接続し、そして以下のパラメーターをインプットした。
−ＵＶ検出：２１４ｎｍ
−カラム温度：＋４０℃
−オートサンプラー温度：＋５℃
−オートサンプラーループ：２ｍＬ
−シリンジ：２５０μＬ
−カラム流速：１ｍＬ／分
−実行期間：１５分
【００７６】
線形グラジエントは表４に記載のとおりに設定した。
【表４】
2010512770.tif 000005
【００７７】
カラムは、４０℃を維持しつつ、出発時の組成（８５％溶出剤Ａ、１５％溶出剤Ｂ）の移動相を、少なくとも１０分間１ｍＬ／分の流速で流して最初に平衡化した。平衡化は、ベースラインが安定したときに完了した。各解析につき、実施例１で得られた６０〜７５μＬのタンパク質分解混合物をカラムに注入した。
【００７８】
２．３．結果
ＴＡＣＩ−Ｆｃについて得られた典型的なＲＰ−ＨＰＬＣ解析プロファイルを図２に示す。
【００７９】
実施例３：ＴＡＣＩ−ＦｃのＣ末端切断の定量
実施例２の解析は、実施例１で得られた各タンパク質分解混合物につき２回実施し、図２に示すとおりに検出されたピークを積分、すなわち、注目のピークを同定し、それらの面積をベースラインを手動又は自動のいずれかでトレーシングすることで決定した。Ｃ末端で切断されたＴＡＣＩ−Ｆｃのパーセンテージは、ＲＰ−ＨＰＬＣシステムのソフトウェア（Ｅｍｐｏｗｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｗａｔｅｒｓ）によって直接計算した。切断した又はインタクトな分子のパーセンテージは、「面積（％）」と称する値に相当する。Ｃ末端で切断されたＴＡＣＩ−Ｆｃの最終的なパーセンテージは、２回実施した結果の平均のパーセンテージを算出することで得た。
【００８０】
図２において、ＴＡＣＩ−Ｆｃサンプルは約２０％のＬｙｓ１変異体及び約８０％のＬｙｓ０変異体を含んで成る
【００８１】
実施例４：６つの異なるタンパク質のＣ末端切断の解析
配列番号１の配列をそのＣ終末端に含んで成る以下の６つのタンパク質を実施例１〜３に記載のプロトコールを用いて解析した：
−実施例１〜３で解析したＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質；
−ＷＯ９７／１３８５２に記載の抗ＣＤ４抗体６Ｇ５（抗ＣＤ４  Ｍａｂ）；
−ＷＯ２００４／０４５５１２に記載の抗ＣＤ２５抗体ＡＢ１２（抗ＣＤ２５  Ｍａｂ）；
−ＷＯ２００５／００１０２５に記載のＩＦＮ−ベータを含んで成るＦｃ融合タンパク質（ＩＦＮ−Ｆｃ  Ｎｏ．１；
−ＩＦＮ−ベータのフラグメントを含んで成る代替のＦｃ融合タンパク質（ＩＦＮ−Ｆｃ  Ｎｏ．２）；及び
−ＷＯ９８／２３７６１に記載の抗ＣＤ１１ａ抗体Ｆ（ａｂ）−８（抗ＣＤ１１ａ  Ｍａｂ）。
【００８２】
結果を図３に示す。Ｃ末端切断のパーセンテージは、実施例１〜３に記載の実験条件を変更することなく、６つ全てのタンパク質について算出することができた。従って、本発明の方法は、モノクローナル抗体及びＦｃ融合タンパク質のＣ末端切断の解析に広く応用可能な方法である。
【００８３】
引用文献
【表５】
2010512770.tif 000006
【図１】
2010512770.tif 000007
【図２】
2010512770.tif 000008
【図３】
2010512770.tif 000009
【配列表】
2010512770000001.app
【国際調査報告】
2010512770.tif 000010
2010512770.tif 000011
2010512770.tif 000012
2010512770.tif 000013