(57)【要約】  製剤のイオン強度を修飾することによって、タンパク質製剤の乳白色外観を低減するための方法、ならびに乳光が減少した、濃縮タンパク質の組成物、例えば、医薬組成物が開示されている。選択された工程で塩濃度をモニターおよび／または低減する精製方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体製剤の乳光を減少させる方法であって、抗体製剤の乳白色外観が低減するように、抗体製剤中のイオン強度と抗体濃度の比を修飾する工程を含み、イオン強度を修飾する前の抗体製剤が、約１００ｍｇ／ｍｌの医薬として有効な濃度で、約２の欧州薬局方基準を超える乳光を示す、方法。
【請求項２】
抗体製剤中の高分子量種の形成を低減する方法であって、タンパク質製剤中の高分子量種が低減するように、抗体製剤中のイオン強度と抗体濃度の比を修飾する工程を含む、方法。
【請求項３】
抗体製剤が、ヒト、ヒト化、キメラ、ＣＤＲ移植、もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成抗体、またはこれらの抗原結合性断片を含む、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
抗体製剤がＩｇＧ１またはＩｇＧ４重鎖定常領域を含む、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
抗体製剤が抗ＧＤＦ８抗体を含む、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
抗体製剤の抗体が、約５０から２００ｍＭの範囲の塩濃度中で負の第２ビリアル係数を有する、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
抗体の第２ビリアル係数が、１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する抗体製剤中で、約−１から−１０×１０−３、または約−１から−１０×１０−４ｍｏｌ−ｍｇ／ｇ２である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
抗体製剤の抗体が、約５０から２００ｍＭの範囲の塩濃度中で正のビリアル係数を有する、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
抗体の第２ビリアル係数が、１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する抗体製剤中で、約１から１０×１０−４、または約１から１０×１０−３ｍｏｌ−ｍｇ／ｇ２である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
方法を実行する前および／または実行した後に、抗体が抗体製剤中に約５から３００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
抗体製剤のイオン強度が、製剤中に存在する塩の濃度を減少させることによって低減する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
抗体製剤のイオン強度が、製剤中に存在する塩の濃度を減少させることによって低減し、製剤中に存在する塩は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムおよびリン酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
抗体製剤のイオン強度が、製剤中に存在する塩の濃度を減少させることによって低減し、塩の濃度が乳白色製剤中の濃度の約２、３、５、１０、または１００分の１以下になる、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
抗体製剤のイオン強度が、第１の塩を第２の塩と置換することによって修飾され、第１の塩はＮａＣｌであり、第２の塩は、ＮａＨＰＯ４、ＭｇＣｌ２、およびＣａＣｌ２からなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
抗体製剤のイオン強度が、第１の塩を第２の塩と置換することによって修飾され、第１の塩はＮａＨＰＯ４であり、第２の塩は、ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２からなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
抗体製剤のイオン強度が、限外濾過または透析によって修飾される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
抗体製剤の乳光を評価する工程、または
抗体製剤中の塩濃度を求める工程をさらに含み、抗体製剤中のイオン強度が、１つもしくは複数の濾過方法を適用する工程、または抗体を精製するプロセス中の１つもしくは複数の工程の塩濃度を低減する工程のうちの１つまたは複数を含むプロセスによって修飾される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
抗体を精製するプロセスが、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、凍結乾燥または復元のうちの１つまたは複数を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
抗体製剤の乳光を評価する工程をさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
抗体製剤の乳光が、溶液の濁度を評価する、第２ビリアル係数の変化を評価する、または高分子量種の形成の変化を評価することによって検出される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
乳光が、約２または１の欧州薬局方基準またはそれ未満に低減する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
第２ビリアル係数が、約−１〜−１０×１０−３から約−１〜−１０×１０−４に変化する、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
高分子量種の量が、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０または１００分の１になる、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
抗体製剤中の高分子量種の形成を減少させる方法であって、タンパク質製剤中の高分子量種の形成が低減するように、抗体製剤中のイオン強度と抗体濃度の比を修飾する工程を含み、製剤中の抗体は、１００ｍＭの塩化ナトリウム溶液中で負のビリアル係数を有する、方法。
【請求項２５】
抗体製剤の精製プロセスの効率を改善する方法であって、
１つまたは複数の塩濃度で、タンパク質製剤が乳白色溶液を形成するかどうかを（適宜）評価する工程と、
抗体製剤中の高分子量種が低減するように、製剤中のイオン強度と抗体濃度の比を修飾し、それによって抗体製剤の精製プロセスの効率を改善する工程と
を含み、
溶液のイオン強度は、１つもしくは複数の濾過方法を適用する工程、タンパク質製剤中に使用された塩を、より低い乳光誘発物質と置換する工程、または精製プロセス中の１つもしくは複数の工程のイオン強度を低減する工程のうちの１つまたは複数によって修飾される、方法。
【請求項２６】
抗体の作製を改善する方法であって、
第１の抗体溶液を回収する工程と、
第１の抗体溶液中の乳光または高分子量種の存在のレベルを評価する工程と
を含み、
（ａ）乳光もしくは高分子量種のレベルが所定レベル以下である場合、抗体製品での使用に前記第１の抗体溶液を選択し、または（ｂ）乳光もしくは高分子量種のレベルが所定レベルより高い場合、第２のイオン強度を有する第２の抗体溶液を選択する、方法。
【請求項２７】
溶液中の乳光レベルが、所定レベル以下になるまで評価工程を繰り返す工程をさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
抗体溶液が、マトリックスからの抗体溶出、透析された溶液もしくは他の濾液の回収、乾燥製剤の可溶化、またはクロマトグラフィー法のうちの１つまたは複数から選択されるタンパク質精製方法によって回収される、請求項２６または２７記載の方法。
【請求項２９】
抗体溶液が、クロマトグラフィー法によって回収され、クロマトグラフィー法は、プロテインＡクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、限外濾過、ウイルス除去濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
所定レベルの抗体溶液が約２の濁度値を有する、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
抗体製剤の乳白色外観を有する性向を判定する方法であって、
抗体を自己凝集する傾向を有すると（適宜）認定する工程と、
抗体製剤の１つまたは複数の試料を提供する工程と、
１つまたは複数の試料中の塩濃度を増加させた後の高分子量種の形成を検出する工程とを含み、塩濃度を増加させた後の高分子量種の形成の増大により、製剤中の抗体の乳白色外観を有する性向の増大が示される、方法。
【請求項３２】
抗体試料の乳光を評価する方法であって、
抗体試料を提供する工程と、
１つまたは複数の塩濃度で、濁度または高分子量種の存在を判定する工程と、
１つまたは複数の塩濃度での濁度または高分子量種の存在の関数として、抗体試料中の乳光レベルについて報告する工程と
を含む、方法。
【請求項３３】
請求項１、２、２５または２６のいずれかに記載の方法によって作製される抗体製剤。
【請求項３４】
約５０ｍＭ未満のＮａＣｌ中に少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で抗体を含む、医薬上許容される抗体製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、２００６年１０月１２日に出願された米国出願第６０／８５１，６５１号に対して優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、タンパク質製剤の乳光を低減するための方法、ならびに乳光が減少した濃縮タンパク質製剤の組成物、例えば医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗体を含めたタンパク質は、過去２０年間、薬物療法において使用されてきた。高治療用量を達成するために、抗体は、高濃度（約１０ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌ以上）で一般に製剤化される（Ｂｒｅｋｋｅ，Ｏ．Ｈ．およびＳａｎｄｌｉｅ，Ｉ．（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２：５２〜６２）。ある特定のタンパク質投与様式では、高度に濃縮されたタンパク質製剤が一般に必要とされる。例えば、治療抗体の皮下投与は、約１００ｍｇ／ｍｌ超の濃度で処方されることが多い。これらの濃縮タンパク質製剤の一部は、高濃度で乳白色外観、すなわち、多くの場合乳光と呼ばれる性質を持つようになる（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ，Ｈ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１：４５７〜４６２）。
【０００４】
濃縮タンパク質溶液における乳白色外観は、とりわけ、タンパク質濃度、レイリー散乱におけるその効果、温度、溶質−溶質相互作用の性質を含めた、様々な要因から生じ得る。タンパク質が乳光の影響を受けやすい場合、乳白色外観は、タンパク質濃度が増加するにつれて、通常増大する。乳白色溶液の凝集タンパク質溶液との類似性により、医薬製剤において、タンパク質活性、および免疫原性をもたらす潜在性を喪失することに関する懸念が生じている（Ｐｉｎｃｋａｒｄら（１９６７）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１〜３４０；Ｒｏｂｂｉｎｓら（１９８７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：８３８〜８４５；Ｃｌｅｌａｎｄら（１９９３）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０：３０７〜３７７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【特許文献１】Ｂｒｅｋｋｅ，Ｏ．Ｈ．ら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２：５２〜６２（２００３）
【特許文献２】Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ，Ｈ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１：４５７〜４６２（２００２）
【特許文献３】Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１〜３４０（１９６７）
【特許文献４】Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：８３８〜８４５（１９８７）
【特許文献５】Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０：３０７〜３７７（１９９３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、乳光が低減した、高度に濃縮された治療タンパク質、例えば、治療抗体の製剤を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、抗体製剤中の塩、例えば、塩化ナトリウムの濃度を低減することにより、製剤の乳白色外観および／または製剤中の高分子量種の形成が低減するという発見に、少なくともある程度基づく。したがって、タンパク質、例えば抗体の製剤の乳白色外観を、例えば、製剤のイオン強度を修飾することによって低減する方法、ならびに乳光が減少した濃縮タンパク質の組成物、例えば、医薬組成物が開示されている。精製プロセスにおいて選択された工程で、塩濃度（複数も）をモニターおよび／または低減する精製方法も開示されている。
【０００８】
したがって、一態様では、本発明は、タンパク質製剤、例えば、抗体製剤（例えば、タンパク質、例えば抗体を含む溶液）の乳光を減少させ、またはこの製剤中の高分子量種の量を低減する方法を特徴とする。この方法は、タンパク質製剤の乳白色外観、および／またはこの製剤中の高分子量種の量が低減および／または排除されるように、製剤のイオン強度を修飾する工程、例えば、減少または増大させる工程を含む。実施形態では、タンパク質製剤の乳白色外観、および／またはこの製剤中の高分子量種の量が低減および／または排除されるように、タンパク質製剤中のイオン強度とタンパク質濃度、例えば抗体濃度の比を修飾しまたは変化させ、例えば、減少または増大させる。実施形態では、タンパク質製剤は、医薬として有効な濃度、例えば、抗体製剤について、約５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０ｍｇ／ｍｌで、イオン強度を低減する前に、望まれない乳光および／または高分子量種を示す（例えば、約１、２、３、４もしくは５、もしくはそれ以上の欧州薬局方基準を超える濁度、および／または約２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、もしくはそれ以上のタンパク質製剤の質量百分率に相当する高分子量種の割合）。
【０００９】
実施形態では、製剤中のタンパク質は、本明細書で以下により詳細に説明するように、分泌タンパク質、例えば、抗体、抗体の抗原結合性断片、結合ドメイン−免疫グロブリン融合物（例えば、ＳＭＩＰ（商標））、可溶性受容体、受容体融合物、サイトカイン、成長因子、酵素、または凝固因子である。タンパク質が抗体である実施形態では、抗体は、少なくとも１本、好ましくは２本の全長重鎖、および少なくとも１本、好ましくは２本の軽鎖を含むことができる。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、抗原結合性断片などの抗体断片または変異体分子（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ断片、および重鎖断片（例えば、ラクダＶＨＨ））を含む。抗体は、モノクローナルまたは単一特異性抗体とすることができる。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、ＣＤＲ移植、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成抗体とすることもできる。さらに他の実施形態では、抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有する。別の実施形態では、抗体は、例えば、κまたはλから選択される軽鎖を有する。一実施形態では、定常領域を変化させ、例えば突然変異させて抗体の性質を修飾する（例えば、Ｆｃ受容体結合性、抗体のグリコシル化、システイン残基数、エフェクター細胞機能、または補体機能のうちの１つまたは複数を増大または減少させる）。一般に、抗体は、所定の抗原、例えば、障害、例えば、神経変性障害、代謝性障害、炎症性障害、自己免疫障害および／または悪性障害と関連する抗原に特異的に結合する。本発明の方法において使用することができる例示的な抗体として、それだけに限らないが、Ａβペプチド、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）、５Ｔ４、ならびに成長および分化因子−８（ＧＤＦ−８）に対する抗体が挙げられる。実施形態では、抗体は、抗ＧＤＦ−８抗体、例えば、Ｍｙｏ−０２９である。
【００１０】
実施形態では、タンパク質は、より高いタンパク質および／または塩の濃度で自己凝集し、例えば、高塩製剤（例えば、約５０から２００ｍＭの塩濃度（例えば、約１００から１５０ｍＭの塩）を有する製剤）において、負の第２ビリアル係数を有する。例えば、タンパク質は、例えば、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する製剤において、約−１×１０−１から−１、約−１×１０−２から−１０×１０−２、約−１×１０−３から−１０×１０−３、約−１×１０−４から−１０×１０−４、約−１×１０−５から−１０×１０−５ｍｏｌ−ｍｇ／ｇ２の第２ビリアル係数を有する。他の実施形態では、タンパク質は、例えば、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する製剤において、正のビリアル係数、例えば、約１×１０−５から１０×１０−５、約１×１０−４から１０×１０−４、約１×１０−３から１０×１０−３、約１×１０−２から１０×１０−２ｍｏｌ−ｍｇ／ｇ２を有する。タンパク質が抗体またはその断片である実施形態では、抗体は、本発明の方法を実行する前および／または実行した後に、約０．１から約１，０００ｍｇ／ｍｌ、一般に、約０．５から約５００、約１から４００、約５から３００、約１０から２５０、約１５から２００、約２０から１５０、約５０から１００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００１１】
実施形態では、タンパク質製剤のイオン強度は修飾される、例えば、製剤中に存在する塩の濃度を減少させる、および／または製剤中に使用された塩を、より少ない乳光しか誘発しない塩と置換することによって低減される。製剤中の塩は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムまたはリン酸ナトリウムのうちの１つまたは複数から選択することができる。製剤中の塩濃度は、より低濃度、例えば、乳白色製剤中の濃度の約２、３、５、１０、または１００分の１にすることができる。例えば、タンパク質製剤中の塩（例えば、塩化ナトリウム）濃度は、約３００ｍＭ未満、一般に、約２００、１５０、１００、７５、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、１ｍＭ未満、または０ｍＭに低減することができる。タンパク質製剤中の塩濃度は、例えば、限外濾過または透析のうちの１つまたは複数から選択される、１つまたは複数の濾過方法を適用することによって修飾する、例えば低減することができる。あるいは、またはさらに、タンパク質製剤中のイオン強度は、例えば、１つまたは複数の第１の塩、例えば、高い乳光誘発物質を、１つまたは複数の第２の塩、例えば、より低い乳光誘発物質と置換することによって修飾され、例えば、減少または増大される。高乳光誘発物質から低乳光誘発物質の以下の順序で、抗体製剤中の乳光誘発のレベルによって、以下の例示的な塩が位置づけられた：塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸ナトリウム（ＮａＨＰＯ４）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）および塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）。したがって、実施形態では、第１の塩はＮａＣｌであり、例えば、ＮａＨＰＯ４、ＭｇＣｌ２、またはＣａＣｌ２のうちの１つまたは複数から選択される第２の塩と置換され、第１の塩はＮａＨＰＯ４であり、例えば、ＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２のうちの１つまたは複数から選択される第２の塩と置換され、第１の塩はＭｇＣｌ２であり、第２の塩であるＣａＣｌ２と置換される。実施形態では、例えば、透析または限外濾過によって第１の塩を除去し、タンパク質製剤に第２の塩を加えることによって、第１の塩が、タンパク質製剤中で第２の塩によって置換される。実施形態では、第２の塩の濃度は、第１の塩の濃度より高い。実施形態では、第２の塩の濃度は、第１の塩の濃度に等しい。他の実施形態では、第２の塩の濃度は、第１の塩の濃度より低い。
【００１２】
他の実施形態では、タンパク質製剤のイオン強度は、例えば、使用された高乳光誘発物質塩の濃度を減少させることによって、タンパク質の製造および／または精製プロセス中に修飾され、例えば、減少または増大される。本実施形態は、（ｉ）（所望により）タンパク質製剤が、１つまたは複数のタンパク質濃度および／または塩濃度で、乳白色溶液を形成するかどうかを評価する工程；（ｉｉ）（所望により）タンパク質製剤に塩濃度を提供する工程；および／または（ｉｉｉ）タンパク質製剤のイオン強度を修飾し、例えば低減する工程（例えば、タンパク質製剤中のイオン強度とタンパク質濃度の比を修飾する工程）を含む。工程（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）は、必要な場合、任意の順序で繰り返す、および／または実施することができる。工程（ｉ）は、例えば、本明細書の実施例に記載されているように、様々な濃度のタンパク質および／または塩を含有する１つまたは複数の試料中の乳光および／または高分子量種の存在を検出することによって実施することができる。タンパク質製剤のイオン強度は、例えば、本明細書に記載される１つまたは複数の濾過方法を適用することによって修飾し、例えば低減することができる。あるいは、またはさらに、タンパク質製剤のイオン強度は、タンパク質の製造および／または精製プロセスにおける、１つまたは複数の工程のイオン強度、例えば塩濃度を低減することによって減少させることができる。タンパク質の製造および／または精製プロセスにおけるイオン強度のそのような低減は、１つまたは複数の工程で使用された塩濃度を減少させることによって行うことができる。他の実施形態では、イオン強度は、１つまたは複数の工程で使用された塩を、低乳光誘発物質と置換することによって修飾される。ある特定の実施形態では、製剤中のタンパク質は、例えば、細胞結合タンパク質、可溶性タンパク質、または分泌タンパク質として組換えで作製される、例えば、組換え技術を使用して発現される。そのような実施形態では、タンパク質は、組換え宿主から発現され、分離される（例えば、培地中に分泌され、例えば、遠心分離または濾過によって分離される）。分離されたタンパク質は、それだけに限らないが、プロテインＡクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、限外濾過、ウイルス除去濾過（ｖｉｒａｌ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、陰イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび／または陽イオン交換クロマトグラフィーを含めた、当技術分野で既知の方法によってさらに精製される。タンパク質は、さらに凍結乾燥し、および／または緩衝溶液中で復元することができる。本発明の方法は、前述の工程の１つまたは複数において使用される溶液（例えば、洗浄、添加、溶出、復元溶液）のイオン強度、例えば塩濃度を修飾し、例えば低減する工程を含む。
【００１３】
理論によって束縛されることなく、限外濾過および透析などの濾過方法を適用した後でも、残留量の塩がタンパク質製剤中に存在する場合があると考えられる。そのような残留塩量は、「ドナン効果」として当技術分野で特徴づけられている（Ｍｉｒｏ，Ｍら（２００４）Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ５１２（２）：３１１〜３１７）。そのような残留塩量は、特に製剤中のタンパク質が自己凝集する傾向を有する、例えば、負のビリアル係数を有する場合、乳白色外観を有するタンパク質製剤に至る場合があるであろう。したがって、本明細書に開示される方法を使用してイオン濃度を修飾する工程は、タンパク質精製技法に対して広い適応性を有することができる。
【００１４】
実施形態では、タンパク質製剤の乳光の低減は、溶液の濁度を評価することによって検出される。例えば、タンパク質製剤の濁度は、約５、４、３、２、１またはそれ未満の欧州薬局方基準に低減される。
【００１５】
他の実施形態では、タンパク質製剤の乳光の低減は、タンパク質の第２ビリアル係数の変化を評価することによって判定される。例えば、タンパク質の第２ビリアル係数の、２、３、５、１０または１００倍の変化、例えば、増加または減少が、タンパク質製剤のイオン強度を修飾し、例えば低減した後に検出される。例えば、ビリアル係数は、約１×１０−２と１×１０−３の間の任意の値から、約１×１０−３と１×１０−４の間の任意の値に変化し、例えば減少する。
【００１６】
さらに他の実施形態では、タンパク質製剤の乳光の低減は、高分子量種の量を求めることによって検出される。高分子量種は、一般に約１０４、より一般には、約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、またはそれ以上の分子量を有する。製剤中のタンパク質種の重量平均分子量は、例えば、以下の実施例に記載されるような、光散乱法、例えば、静的および動的光散乱、非対称フローフィールドフローフラクショネーション、またはＳＥＣ−ＨＰＬＣのうちの１つまたは複数を使用して検出することができる。実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、または１００分の１になる高分子量種は、タンパク質製剤中の乳光の低減を示す。例えば、非凝集タンパク質の質量百分率が、全タンパク質質量の約６０〜７０％から約９５％以上に増加すると同時に、高分子量種の質量百分率が、全タンパク質質量の約３０〜４０％から約５％未満に減少した（動的光散乱によって検出した場合）。
【００１７】
別の態様では、本発明は、タンパク質、例えば抗体の製剤（例えば、本明細書に記載されるような、タンパク質、例えば抗体の製剤）中の高分子量種の形成を減少させる、および／または高分子量種の量を低減する方法を特徴とする。この方法は、タンパク質製剤中の高分子量種の量が低減および／または排除されるように、製剤のイオン強度を修飾する、例えば減少または増加させる工程（例えば、タンパク質製剤中のイオン強度とタンパク質濃度の比を修飾する工程）を含む。
【００１８】
実施形態では、高分子量種は、タンパク質凝集体であり、これは、タンパク質および／または塩濃度を低減すると、実質的に可逆的に解離することができる。高分子量種は、一般に約１０４ｋＤａ、より一般には、約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３ｋＤａ、またはそれ以上の分子量を有する。製剤中のタンパク質種の重量平均分子量は、例えば、以下の実施例に記載されるような、光散乱法、例えば、静的および動的光散乱、非対称フローフィールドフローフラクショネーション、またはＳＥＣ−ＨＰＬＣのうちの１つまたは複数を使用して検出することができる。実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、または１００分の１になる高分子量種は、タンパク質製剤中の乳光の低減を示す。例えば、非凝集タンパク質の質量百分率が、全タンパク質質量の約６０〜７０％から約９５％以上に増加すると同時に、高分子量種の質量百分率が、全タンパク質質量の約３０〜４０％から約５％未満に減少する（動的光散乱によって検出した場合）。
【００１９】
実施形態では、製剤のイオン強度の減少は、本明細書に開示される方法によって行われる。
【００２０】
別の態様では、本発明は、タンパク質、例えば抗体の製剤（例えば、本明細書に記載されるような、タンパク質、例えば抗体の製剤）の製造および／または精製プロセスの効率を改善する方法を特徴とする。この方法は、（ｉ）（所望により）タンパク質製剤が、１つまたは複数のタンパク質濃度および／または塩濃度で、乳白色溶液を形成するかどうかを評価する工程；（ｉｉ）タンパク質製剤中の高分子量種の量が低減および／または排除されるように、製剤のイオン強度を修飾する、例えば減少させる工程を含む。工程（ｉ）は、例えば、本明細書の実施例に記載されているように、様々な濃度のタンパク質および／または塩を含有する１つまたは複数の試料中の乳光および／または高分子量種の存在を検出することによって実施することができる。タンパク質製剤のイオン強度は、例えば、本明細書に記載される１つまたは複数の濾過方法を適用する、例えば、本明細書に記載されるように、タンパク質製剤中に使用された塩を、低乳光誘発物質と置換する、および／または例えば、本明細書に記載されるように、タンパク質の製造および／もしくは精製プロセスにおける、１つまたは複数の工程のイオン強度を低減することによって修飾し、例えば低減することができる。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、例えば、抗体を作製するプロセスにおいて使用するための塩または塩濃度を選択して、抗体の作製を改善する方法を特徴とする。この方法は、（ｉ）抗体溶液を回収する工程（例えば、マトリックスから抗体を溶出する工程、透析された溶液または他の濾液を回収する工程、および／または乾燥製剤、例えば、凍結乾燥または乾燥した製剤を、第１のイオン強度、例えば第１の塩濃度を有する第１の溶液で可溶化する工程）、（ｉｉ）抗体溶液中の乳光および／または高分子量種の存在のレベルを評価する工程であって、（ａ）乳光および／もしくは高分子量種のレベルが、所定レベル以下である場合、抗体製品、例えば、抗体溶液を含む医薬組成物において使用するために、前記抗体溶液を選択し、または（ｂ）乳光および／もしくは高分子量種のレベルが、所定レベルより高い場合、第２の、例えば、より低いイオン強度（例えば、第２の、例えば、より低い塩濃度）を有する第２の溶液を選択する工程を含む。抗体を含有する第２の溶液中の乳光および／または高分子量種の存在のレベルは、必要な場合評価することができ、乳光のレベルが所定レベル（または所定レベル未満）に到達するまで、追加の溶液を加えることができる。
【００２２】
実施形態では、抗体溶液は、それだけに限らないが、プロテインＡクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、限外濾過、ウイルス除去濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび／または陽イオン交換クロマトグラフィーを含めた、当技術分野で既知の１つまたは複数のタンパク質精製方法から回収される。タンパク質は、さらに凍結乾燥し、および／または緩衝溶液中で復元することができる。
【００２３】
実施形態では、抗体（第１、第２および追加の）溶液の所定レベルは、医薬として有効な濃度、例えば、抗体製剤について約５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、または１５０ｍｇ／ｍｌで、約１、２、３、４、５もしくはそれ以上の欧州薬局方基準よりほぼ大きい、一般に約３の濁度値、および／または１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％もしくはそれ以上のタンパク質製剤の質量百分率、一般に約２％への高分子量種の増加である。
【００２４】
別の態様では、本発明は、抗体に結合した残留塩濃度の量が、抗体が徹底的に透析された後、例えば、０ｍＭの塩で透析された後に見られる量未満である、抗体精製方法または抗体製剤を特徴とする。
【００２５】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるようなタンパク質、例えば、抗体製剤が乳白色外観を有する性向を判定する方法を特徴とする。この方法は、（ｉ）（所望により）例えば、表面タンパク質電荷および／もしくは第２ビリアル係数を求めることによって、タンパク質を自己凝集する傾向を有すると認定する工程、ならびに／または（ｉｉ）溶液中にタンパク質を含有する１つもしくは複数の試料中の、タンパク質濃度および／もしくは塩濃度を増加および／もしくは減少させた後の、それぞれ高分子量種の形成および／もしくは消失を検出する工程を含む。塩濃度および／またはタンパク質濃度を増加させた後の、負のビリアル係数および／または高分子量種の増加により、製剤中のタンパク質が乳白色外観を有する性向の増大が示される。
【００２６】
さらに別の態様では、本発明は、タンパク質、例えば抗体の試料の乳光を評価する方法を特徴とする。この方法は、タンパク質、例えば抗体の試料を提供する工程；１つまたは複数（例えば、少なくとも２つ、３つまたはそれ以上）の塩、例えばＮａＣｌの濃度で、濁度および／または高分子量種の存在を求める工程；１つまたは複数の塩、例えばＮａＣｌの濃度での濁度および／または高分子量種の存在の関数として、タンパク質、例えば抗体の試料中の乳光レベルについて報告する工程を含む。
【００２７】
他の態様では、乳光が低減した、タンパク質、例えば抗体の製剤（ならびに本明細書に開示されるタンパク質製剤を含む、医薬組成物および／または製剤）も、本発明の範囲内である。実施形態では、タンパク質製剤は、本明細書で説明される方法によって作製される。
【００２８】
他の実施形態では、タンパク質製剤は、１つまたは複数の高分子量種の除去、例えば、濾過または遠心分離工程の前に、高分子量種と比較して、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の質量百分率の非凝集種を含む（例えば、動的光散乱によって検出される場合）。実施形態では、タンパク質製剤のイオン強度の修飾し、例えば減少により、高分子量種と比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０または１００倍、非凝集タンパク質の割合が増加する。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は、約５０、４０、３０、２０、１０、５、または１ｍＭ未満の塩、例えばＮａＣｌにおいて、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、または１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、抗体、例えば、ヒトまたはヒト化抗体を含む、医薬上許容される抗体製剤を特徴とする。
【００３０】
別の態様では、本発明は、抗体製剤を提供する方法であって、（ｉ）１つまたは複数の高分子量種の除去、例えば、濾過または遠心分離工程の前に、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の質量百分率の非凝集種を有する、例えばヒトまたはヒト化抗体の抗体溶液を提供する工程、（ｉｉ）１つまたは複数の精製工程を実施することによって、中間体抗体溶液を提供する工程、および（ｉｉｉ）この中間体溶液を処理することによって、少なくとも約５０から１５０ｍｇ／ｍｌの濃度、および約５、４、３、２、１未満、またはそれ未満の欧州薬局方基準の濁度を有する抗体製剤を提供する工程を含む方法を特徴とする。
【００３１】
他の態様、特徴、および利点は、それらの好ましい実施の説明および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】漸増ＮａＣｌ濃度に曝された抗体Ｍ１（本明細書では「Ｍｙｏ−０２９」とも呼ばれる）溶液の画像である（視覚的に認知できる乳光の増大を示している）。
【図２】０ｍＭのＮａＣｌおよび１００ｍＭのＮａＣｌ中の抗体Ｍ１溶液についての、動的光散乱のプロットを示すグラフである。
【図３】１００ｍＭのＮａＣｌ中の抗体Ｍ１溶液についての、非対称フローフィールドフローフラクショネーションのプロットを示すグラフである。
【図４】１００ｍＭのＮａＣｌ中の抗体Ｍ１溶液についてのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラフを示すグラフである。
【図５】０ｍＭのＮａＣｌから１００ｍＭのＮａＣｌまで、および０ｍＭのＮａＣｌに戻って透析された抗体Ｍ１溶液の画像である（塩濃度の変化とともに、明白に可逆的な乳光を示している）。
【図６】乳白色種の可逆的形成を示す、抗体Ｍ１溶液の動的光散乱のプロットを示すグラフである：（ａ）０ｍＭのＮａＣｌから透析された、１００ｍＭのＮａＣｌ、および（ｂ）１００ｍＭのＮａＣｌから透析された０ｍＭのＮａＣｌ。
【図７】漸増ＮａＣｌ濃度での抗体Ｍ２溶液の画像である（視覚的に認知できる乳光の増大がないことを示している）。
【図８】０ｍＭのＮａＣｌおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ中の抗体Ｍ２溶液についての、動的光散乱のプロットを示すグラフである。
【図９】０ｍＭのＮａＣｌおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ中の抗体Ｍ３溶液についての動的光散乱のプロットを示すグラフである。
【図１０】１００ｍＭのＮａＣｌでの、抗体Ｍ１についての第２ビリアル係数のプロットを示すグラフである。
【図１１】１００ｍＭのＮａＣｌでの、抗体Ｍ２についての第２ビリアル係数のプロットを示すグラフである。
【図１２】１時間後の乳光を示す、様々な塩を含有する抗体Ｍ１溶液の画像である。
【図１３】２週間後の乳光を示す、様々な塩を含有する抗体Ｍ１溶液の画像である。
【図１４】様々な塩を含有する抗体Ｍ１溶液についての、ＯＤ４００ｎｍ対温度サイクル数のプロットを示すグラフである。
【図１５】様々な塩を含有する抗体Ｍ１溶液についての、高分子量の百分率対塩濃度のプロットを示すグラフである。
【図１６】様々な塩を含有する抗体Ｍ１溶液についての、ＯＤ４００ｎｍ対塩濃度のプロットを示すグラフである。
【図１７】図１６に示したプロットを拡大した領域を示すグラフである。
【図１８】ＯＤ４００ｎｍ対２０ｍＭのＣａＣｌ２中の抗体Ｍ１濃度のプロットを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本願は、製剤のイオン強度を修飾することによって、タンパク質製剤の乳白色外観を低減する方法、ならびに乳光が減少した濃縮タンパク質の組成物、例えば医薬組成物を開示する。選択された工程で塩濃度をモニターおよび／または低減する精製方法も開示されている。
【００３４】
一実施形態では、３つの抗体、すなわち、抗体Ｍ１（本明細書では「Ｍｙｏ−０２９」とも呼ばれる）、抗体Ｍ２、および抗体Ｍ３について、塩濃度、すなわちイオン強度の、濃縮抗体製剤の乳白色外観への影響が評価された。添付した実施例により詳細に説明されるように、すべての３つの抗体は、ｐＨ６．０のちょうど１０ｍＭのヒスチジン中で、極端に大きな種を比較的少量しか含有していないことが判明した。この大きな種は、大きすぎてＳＥＣ−ＨＰＬＣカラムを使用して分離することができなかった。抗体Ｍ１について、抗体製剤中の塩化ナトリウム量を増加させることによってイオン強度を増大させることにより、乳光、ならびに液液相分離の出現が増大する（例えば、図１〜４を参照されたい）。抗体Ｍ１について図５〜６で示したように、この乳白色外観は、塩を除去すると可逆的になる。非対称フローフィールドフローフラクショネーション（ａＦＦＦＦ）を使用して、抗体Ｍ１について大きな種が観察され、これは、後に動的光散乱法を使用して確認された（図２を参照されたい）。抗体Ｍ１と比較して、抗体Ｍ２とＭ３は、目視検査によって検出可能な乳光の著しい増大を示さなかったが（例えば、図７を参照されたい）、光散乱法を使用して、両方の抗体について高分子量種が検出された（図８および９に示した）。
【００３５】
抗体Ｍ１について計算された負のビリアル係数は、抗体Ｍ３と抗体Ｍ２（両方とも正のビリアル係数を有する）と比較して、抗体Ｍ１の凝集／会合傾向と一致する（図１０を図１１と比較されたい）。
【００３６】
本明細書に示される結果は、研究した抗体の乳白色外観は、主に可逆的自己会合によるものであることを示し、これは、イオン強度を増大させることによってさらに誘発される。したがって、本発明によって開示されるように、濃縮抗体製剤（特に、凝集する傾向を有するもの）の乳白色外観を低減するためには、抗体製剤のイオン強度は、製剤から減少され、および／または処理方法において制限されるべきである。
【００３７】
本発明をより容易に理解することができるように、ある特定の用語を最初に定義する。追加の定義は、詳細な説明の全体にわたって示される。
【００３８】
用語「乳光」または「乳白色外観」は、溶液、例えばタンパク質製剤中で検出される濁度の、この溶液中の１つまたは複数の成分の濃度、例えば、タンパク質濃度および／または塩濃度の関数としての程度を指す。濁度の程度は、既知の濁度の懸濁液を使用して作成される標準曲線を参照して計算することができる。医薬組成物についての濁度の程度を求めるための参照基準は、欧州薬局方基準（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ、４版、Ｄｉｒｅｃｔｏｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅ（ＥＤＱＭ）、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）に基づくことができる。欧州薬局方基準によれば、透明溶液は、欧州薬局方基準による約３の濁度を有する参照懸濁液未満またはこれに等しい濁度を有するものとして定義される。比濁分析の濁度測定により、レイリー散乱を検出することができ、これは一般に、会合または非理想効果のない状態で、濃度とともに直線的に変化する。
【００３９】
例えば、理想的な溶液は、以下の式と一致して挙動する：
【００４０】
【数１】
2010506839.tif 000002
（式中、Ｍは分子量であり、Ｋは定数であり、Ｒθはレイリー比（いくつかの実験的パラメーターを合わせる）であり、Ｃは濃度である）。一方、非理想的な溶液は、以下の式を使用して記述することができる：
【００４１】
【数２】
2010506839.tif 000003
（式中、Ｂは第２ビリアル係数である）。Ｍを得るために、ＫＣ／Ｒθをゼロ角度およびゼロ濃度に外挿する。ジムプロットにより、ＫＣ／Ｒθを縦軸に配置し、ｓｉｎ２（θ／２）＋ｋＣ（式中、ｋは、任意定数である）を横軸に配置する。したがって、ジムプロットにより、ＫＣ／Ｒθのゼロ角度とゼロ濃度の両方の外挿を同じグラフ上に作成することが可能になる。このジムプロットで、ＭとＢはそれぞれ、ゼロ角度の線の切片と傾きである。
【００４２】
用語「第２ビリアル係数」は、排除体積効果と分子間相互作用の尺度を指すことが当技術分野で認知されている（Ｔｅｓｓｉｅｒ，Ｐ．Ｍ．ら（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４（５）：５１２〜５１６）。正の第２ビリアル係数は、排除体積効果と分子間反発的相互作用の両方を一般に示す。対照的に、負の第２ビリアル係数は、誘引性分子間相互作用を一般に示す。これらの分子内および分子間相互作用の平衡により、第２ビリアル係数の符号と大きさが決まる。
【００４３】
用語「イオン強度」は、溶液中のイオン濃度を指す。「Ｉ」をイオン強度とすると
【００４４】
【数３】
2010506839.tif 000004
（式中、ｃｉはイオンｉのモル濃度であり、ｚｉはそのイオンの電荷であり、和は、溶液中のすべてのイオンにわたってとられる）である。（ＩＵＰＡＣ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ、２版（１９９７）。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」は、ユニットとして機能することができる１つまたは複数のポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって一緒に連結した、アミノ酸の連続鎖を指す。この用語「ポリペプチド」は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すのに使用されるが、当業者は、この用語は、非常に長い鎖に制限されず、ペプチド結合によって一緒に連結した２個のアミノ酸を含む、最小の鎖も指すことができることを理解するであろう。単一のポリペプチドがユニットとして機能することができる場合、用語「ポリペプチド」と「タンパク質」は、互換的に使用することができる。このタンパク質とポリペプチドという用語には、以下により詳細に説明されるように、抗体、受容体融合物、ＳＭＩＰ（商標）、成長因子、サイトカイン、凝固因子および酵素が含まれる。
【００４６】
用語「抗体」は、任意の免疫グロブリンまたはその断片を指し、抗原結合部位を含む任意のペプチドまたはポリペプチドを包含する。この用語には、それだけに限らないが、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多特異性、二重特異性、ヒト化、脱免疫化、ヒト、ラクダ、げっ歯類、単鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、突然変異、移植、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成抗体が含まれる。この用語「抗体」には、抗体断片および変異体分子、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＶＨＨなど、ならびに抗体結合機能を保持する他の抗体断片および変異体分子も含まれる。一般に、そのような断片は、抗原結合ドメインを含む。
【００４７】
用語「タンパク質製剤」は、製剤のイオン強度を増大させると高分子量種を形成することができる、溶液中に少なくとも１つのタンパク質、例えば抗体を含有する任意の組成物を指す。タンパク質製剤は、同じ、または異なるタンパク質、例えば異なる結合特異性を有する抗体を含有することができる。
【００４８】
用語「高分子量種」は、少なくとも２つのタンパク質、例えば抗体の会合物を指す。実施形態では、タンパク質会合により、単量体タンパク質の高次の凝集物が形成される。この会合は、非共有結合性（例えば、静電気的、ファンデルワールス）タンパク質−タンパク質相互作用の結果として生じ得る。この会合は、タンパク質製剤のイオン強度を低減すると、一般に可逆的になる。タンパク質は、同じ、または異なる、例えば異なる結合特異性を有する抗体とすることができる。高分子量種は、一般に約１０４、より一般には約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、またはそれ以上の分子量を有する。
【００４９】
高分子量種を形成するためのタンパク質の凝集は、それだけに限らないが、本明細書でより詳細に説明される、光学濃度、非対称フローフィールドフローフラクショネーション、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、静的光散乱、および動的光散乱を含めた、いくつかの分析技法を使用してモニターすることができる。
【００５０】
タンパク質試料の濁度は、光学濃度（特定波長での光の吸光度）として測定することができる。光学濃度測定は、分光光度法を使用して（例えば、４００ｎｍの波長でＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ＵＶ−Ｖｉｓを使用して）行うことができる。光学濃度の測定方法のより詳細な説明については、例えば、Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ＢＭ（１９９４）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：６４〜７０を参照されたい。
【００５１】
非対称フローフィールドフローフラクショネーション（ＡＦ４）は、非対称フィールドフローフラクショネーションの種類である。ＡＦ４は、生体分子を含めた様々な粒子の高速分別と高分解能の特徴づけができる方法である（Ｇｉｄｄｉｎｇｓ，Ｊ．Ｃ．；Ｙａｎｇ，Ｆ．Ｊ．；Ｍｙｅｒｓ，Ｍ．Ｎ．、Ｆｌｏｗ−ｆｉｅｌｄ−ｆｌｏｗ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ：ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｎｅｗ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ、１９３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２４４〜１２４５（１９７６）；Ｇｉｄｄｉｎｇｓ，Ｊ．Ｃ．；Ｙａｎｇ，Ｆ．Ｊ．；Ｍｙｅｒｓ，Ｍ．Ｎ．、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｏｗ  ｆｉｅｌｄ−ｆｌｏｗ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ、４８  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１１２６〜１１３２（１９７６））。ＡＦ４は、数ナノメートルから数マイクロメートルの範囲の粒子を分離することができる。フィールドフローフラクショネーション分離は、薄いフローチャネル（クロマトグラフィー分離カラムに相当する）中で起こる。水性または有機溶媒により、試料がこのチャネルを通って搬送される。試料に作用する第１の力である、チャネルを通るこの流れは、チャネルの高さが低いため層流である。第２の力は、チャネル流に垂直に生じる。ＡＦ４では、フローチャネルの一面は膜であり、第２の力は、この膜を通ってチャネルを横切る流体の流れである。粒子の分離は、これら２つの力の結果として、この系内で起こる。第１に、チャネル内の層流による速度勾配により、チャネルの中心にある粒子が、チャネルに沿ってより急速に移動し、チャネルの両側に近い粒子から分離される。第２に、第２の力により、試料が膜に向かわされる。サイズの分離が起こるが、これは、チャネルの中心に向かうより急速な溶媒の流れのために、小さな分子が、大きな粒子より急速にチャネルの中心に向かって拡散して戻り、したがって、大きな粒子から分離されるためである。
【００５２】
頭字語ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィーを表す。ＳＥＣおよびＨＰＬＣは、組合せのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析技法と同様に、個々に周知の分析技法である（Ｇａｒｎｉｃｋ，Ｒ．Ｌ．、Ｒｏｓｓ，Ｍ．Ｊ．、Ｄｕ  Ｍｅｅ，Ｃ．Ｐ．、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ、Ｊ．Ｃ．，Ｂｏｙｌａｎ編、１巻：２５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８））。各技法の背景にある理論を掘り下げることなく、ゲル浸透クロマトグラフィーとしても知られるＳＥＣでは、ゲルマトリックスを通って移動する分子の能力によって、サイズに基づいて分子が分離され、ＨＰＬＣでは、分子が高圧下で固定媒質を通過して移動する場合の拡散係数に基づいて、分子が分離される。
【００５３】
静的および動的光散乱は、溶媒／溶質系から散乱される光のパターンを測定するための、２つの異なる実験方法である（Ｂｅｒｎｅ，Ｂ．およびＰｅｃｏｒａ，Ｒ．Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ（Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７６））。静的および動的光散乱により、情報の相補的な断片が得られ、この理由で、これらは、溶液の特徴づけのために一般に相前後して使用される。
【００５４】
静的光散乱では、溶液中の粒子によって散乱されるレーザー光の時間平均強度の角度依存性を測定する。粒子のサイズと構造は、検出器の角度の関数として、光散乱強度に影響する。低散乱ベクトルと低濃度の限界では、散乱強度の角度分布は、粒子の形状に無関係になることが十分に確立している（Ｚｉｍｍ、Ｂ．、Ｔｈｅ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｌｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒａｄｉａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、１６  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１０９３〜９（１９４８））。上記に考察したように、（Ｋｃ／Ｒθ）をゼロ角度とゼロ濃度に外挿することによって、平均分子量、回転運動半径、および第２ビリアル定数を含めたいくつかの因子を推定することができる。
【００５５】
動的光散乱では、溶液中の粒子が、この場合タンパク質であるが、ランダムブラウン運動を起こすために起こる、散乱光強度の時間依存変動を測定する。こうした強度変動を分析することによって、粒子の拡散係数の分布を求めることができる。次いで、この拡散係数の分布は、周知の理論を使用してサイズ分布に変換することができる。動的光散乱に対するサイズの上限は、試料の密度に依存し、すなわち、粒子は移動することができなければならず、したがって上限は、多くの場合、粒子の沈降が拡散プロセスより優位になる点である。下限は、懸濁媒質と比較して、試料が生成する過剰の散乱光、ならびに試料濃度、相対屈折率、レーザーパワー、レーザー波長、検出器感度などを含めた他の要因に依存することになる。
【００５６】
タンパク質
ある特定の実施形態では、タンパク質製剤中のタンパク質は、組換えで作製される。本明細書で使用される場合、用語「組換えで発現されたタンパク質」、および「組換えタンパク質」は、宿主細胞から発現されるポリペプチドを指し、この宿主細胞は、そのポリペプチドを発現するように人手によって操作されたものである。ある特定の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態では、この操作は、１つまたは複数の遺伝的修飾を含むことができる。例えば、宿主細胞は、発現されるポリペプチドをコードする、１つまたは複数の異種遺伝子を導入することによって、遺伝的に修飾することができる。異種の組換えで発現されたポリペプチドは、宿主細胞中で正常に発現されるポリペプチドと同一となり得るか、類似し得る。異種の組換えで発現されたポリペプチドは、宿主細胞に対して異質、例えば、宿主細胞中で正常に発現されるポリペプチドに対して異種にもなり得る。ある特定の実施形態では、異種の組換えで発現されたポリペプチドは、キメラである。例えば、ポリペプチドの一部は、宿主細胞中で正常に発現されるポリペプチドと同一であるか、類似するアミノ酸配列を含有することができ、一方他の部分は、宿主細胞と異質であるアミノ酸配列を含有する。さらに、またはあるいは、ポリペプチドは、両方とも宿主細胞中で正常に発現される、２つ以上の異なるポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含有することができる。さらに、ポリペプチドは、両方とも宿主細胞に対して異質である、２つ以上のポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含有することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、１つまたは複数の内在性遺伝子を活性化、または上方制御することによって、遺伝的に修飾される。
【００５７】
望ましくない程度の乳光を示し、および／または高分子量種を形成する任意のタンパク質を、本発明によって使用することができる。例えば、本発明を使用することによって、とりわけ、任意の医薬的、または商業的に関連した抗体、受容体、サイトカイン、成長因子、酵素、凝固因子、ホルモン、制御因子、抗原、結合剤の乳光を低減することができる。本発明によって分離することができるタンパク質の以下のリストは、本来単に例示的であり、限定する列挙であることを意図していない。当業者は、任意のタンパク質を、本発明によって発現することができることを理解し、必要に応じて、作製される特定のタンパク質を選択することができるであろう。
【００５８】
抗体および結合性断片
免疫グロブリンとしても知られる抗体は、一般に、それぞれ約２５ｋＤａの２本の軽（Ｌ）鎖と、それぞれ約５０ｋＤａの２本の重（Ｈ）鎖からなる、四量体のグリコシル化タンパク質である。λとκと呼ばれる２種類の軽鎖を、抗体中に見出すことができる。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、５つの主分類、すなわちＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＭに割り当てることができ、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。それぞれの軽鎖は、Ｎ末端可変（Ｖ）ドメイン（ＶＬ）と定常（Ｃ）ドメイン（ＣＬ）を含む。それぞれの重鎖は、Ｎ末端Ｖドメイン（ＶＨ）、３つまたは４つのＣドメイン（ＣＨ）、およびヒンジ領域を含む。ＶＨに最も近位のＣＨドメインは、ＣＨ１と呼ばれる。ＶＨとＶＬドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）と呼ばれる比較的保存された配列の４つの領域からなり、このフレームワーク領域は、高頻度可変配列（相補性決定領域、ＣＤＲ）の３つの領域の骨格を形成する。ＣＤＲは、抗体の抗原との特異的相互作用に関与する残基の大部分を含有する。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる。したがって、重鎖上のＣＤＲ成分は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３と呼ばれ、一方、軽鎖上のＣＤＲ成分は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３と呼ばれる。ＣＤＲ３は、一般に、抗体結合部位内で、最も大きな分子多様性の供給源である。例えば、Ｈ３は、２個のアミノ酸残基と短い場合もあり、または２６アミノ酸より大きい場合もある。免疫グロブリンの異なる分類のサブユニット構造と３次元配置は、当技術分野で周知である。抗体構造の総説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｒｌｏｗら編、１９８８を参照されたい。当業者は、それぞれのサブユニット構造、例えば、ＣＨ、ＶＨ、ＣＬ、ＶＬ、ＣＤＲ、ＦＲ構造は、活性断片、例えば、抗原に結合するＶＨ、ＶＬ、もしくはＣＤＲサブユニットの一部、すなわち、抗原結合性断片、または例えば、Ｆｃ受容体および／もしくは補体に結合し、および／またはこれらを活性化するＣＨサブユニットの一部を含むことを認識するであろう。ＣＤＲは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）、Ｋａｂａｔら編に記載されているように、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲを一般に指す。抗原結合部位を特徴づけるための別の基準は、Ｃｈｏｔｈｉａによって説明されているような高頻度可変ループを参照することである。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９〜８１７；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：４６２８〜４６３８を参照されたい。さらに別の基準は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ抗体モデル化ソフトウェアで使用されるＡｂＭ定義である。一般に例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇ��ｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）中のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ．を参照されたい。Ｋａｂａｔ  ＣＤＲに関して説明した実施形態は、Ｃｈｏｔｈｉａの高頻度可変ループまたはＡｂＭで定義されるループに関する、同様の説明した関係を使用して、もう１つの選択肢として実行することができる。
【００５９】
用語、抗体の「抗原結合性断片」の中に包含される結合性断片の例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の１本のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片、（ｖｉ）ラクダまたはラクダ化可変ドメイン、例えば、ＶＨＨドメイン、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ならびに（ｖｉｉｉ）二重特異性抗体が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬとＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、合成リンカーによって、組換え法を使用してこれらを結合することができ、この合成リンカーは、ＶＬ領域とＶＨ領域が対を形成することによって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる、例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９〜８３）を参照されたい）になることを可能にする。そのような単鎖抗体も、用語、抗体の「抗原結合性断片」の範囲内に包含されることが意図されている。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技法を使用して得られ、これらの断片は、インタクトな抗体と同じ様式で機能を評価される。
【００６０】
「二重特異性」または「二機能性」抗体以外、抗体は、それぞれのその結合部位は同一であると理解される。「二重特異性」または「二機能性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖対と２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合、またはＦａｂ’断片の連結を含めた、様々な方法によって作製することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８、１５４７〜１５５３（１９９２）を参照されたい。
【００６１】
抗体を得るために、当業者に既知の多数の方法が利用可能である。例えば、モノクローナル抗体は、既知の方法によってハイブリドーマを生成することにより、作製することができる。次いでこの様式で形成されたハイブリドーマは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などの標準的な方法を使用してスクリーニングされることによって、特定の抗原に特異的に結合する抗体を産生する、１つまたは複数のハイブリドーマが同定される。任意の形態の特定の抗原、例えば、組換え抗原、自然発生形態、それらの任意の変異体または断片、ならびにそれらの抗原ペプチドを免疫原として使用することができる。
【００６２】
抗体を作製する一例示的方法は、タンパク質発現ライブラリー、例えば、ファージまたはリボソームディスプレイライブラリーをスクリーニングすることを含む。ファージディスプレイは、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５〜１３１７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；ＷＯ９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／０９６９０；およびＷＯ９０／０２８０９に記載されている。
【００６３】
ディスプレイライブラリーの使用に加えて、特定の抗原は、非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えば、マウス、ハムスター、またはラットを免疫するのに使用することができる。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、マウス抗体産生が欠損しているマウス系統を、ヒトＩｇ遺伝子座の大きな断片を用いて操作することが可能である。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル抗体を作製し、選択することができる。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３〜２１、ＵＳ２００３−００７０１８５、１９９６年１０月３１日に公開されたＷＯ９６／３４０９６、および１９９６年４月２９日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８号を参照されたい。
【００６４】
別の実施形態では、モノクローナル抗体は非ヒト動物から得られ、次いで修飾、例えば、ヒト化、脱免疫化され、キメラは、当技術分野で既知の組換えＤＮＡ技法を使用して作製することができる。キメラ抗体を作製するための様々な手法が記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１、１９８５；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２、１９８５、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｔａｎａｇｕｃｈｉら、欧州特許公開第ＥＰ１７１４９６号；欧州特許公開第０１７３４９４号、英国特許第ＧＢ２１７７０９６Ｂ号を参照されたい。ヒト化抗体は、例えば、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現するが、内在性マウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができないトランスジェニックマウスを使用しても作製することができる。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載されるヒト化抗体を調製するのに使用することができる、例示的なＣＤＲ移植法を記述している（米国特許第５，２２５，５３９号）。特定のヒト抗体のＣＤＲのすべては、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部と置換することができ、またはこのＣＤＲの一部のみを、非ヒトＣＤＲと置換することができる。ヒト化抗体を所定の抗原に結合するのに必要なＣＤＲの数を置換するだけでよい。
【００６５】
ヒト化抗体は、抗原結合に直接関与していないＦｖ可変ドメインの配列を、ヒトＦｖ可変ドメインに由来する等価な配列と置換することによって生成することができる。ヒト化抗体またはその断片を生成するための例示的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２〜１２０７によって；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４によって；ならびにＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ５，６９３，７６１；ＵＳ５，６９３，７６２；ＵＳ５，８５９，２０５；およびＵＳ６，４０７，２１３によって提供されている。これらの方法は、重鎖または軽鎖のうちの少なくとも１つから、免疫グロブリンＦｖ可変ドメインのすべてまたは一部をコードする核酸配列を単離、操作し、発現させる工程を含む。そのような核酸は、上述したように、所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマ、ならびに他の供給源から得ることができる。次いで、ヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡは、適切な発現ベクター中にクローン化することができる。
【００６６】
ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、同類置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換および／または逆突然変異の導入によって最適化される。そのような変化した免疫グロブリン分子は、当技術分野で既知のいくつかの技法のいずれによっても作製することができ（例えば、Ｔｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：７３０８〜７３１２、１９８３；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２７９、１９８３；Ｏｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９２：３〜１６、１９８２）、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１９３号またはＥＰ０２３９４００の教示によって作製することができる。
【００６７】
抗体は、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失、またはＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に開示されている方法による「脱免疫化」によって修飾することもできる。簡単に言えば、抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインは、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて分析することができ、これらのペプチドは、潜在的Ｔ細胞エピトープを表す（ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に定義されているように）。潜在的Ｔ細胞エピトープの検出のために、「ペプチドスレッディング（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」と呼ばれるコンピューターモデル化手法を適用することができ、さらに、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に記載されているように、ＶＨおよびＶＬ配列中に存在するモチーフについて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを探索することができる。これらのモチーフは、１８の主要ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのいずれにも結合し、したがって、潜在的Ｔ細胞エピトープを構成する。検出される潜在的Ｔ細胞エピトープは、可変ドメイン中の少数のアミノ酸残基を置換することによって、または好ましくは、１個のアミノ酸を置換することによって排除することができる。一般に、同類置換が行われる。多くの場合、しかしもっぱらではなく、ヒト生殖系列の抗体配列中の１つの位置に共通なアミノ酸を使用することができる。ヒト生殖系列配列は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６巻（５）：２３７〜２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９〜８１７；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：４６２８〜４６３８に開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリーは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的ディレクトリーを提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら（ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）によって編集された）。これらの配列は、例えば、フレームワーク領域およびＣＤＲのためのヒト配列の供給源として使用することができる。Ｕ．Ｓ．６，３００，０６４に記載されているように、コンセンサスヒトフレームワーク領域も使用することができる。
【００６８】
ある特定の実施形態では、抗体は、変化した免疫グロブリンの定常領域またはＦｃ領域を含有することができる。例えば、本明細書の教示によって作製される抗体は、補体および／もしくはＦｃ受容体などのエフェクター分子に、より強く、またはより特異性を伴って結合することができ、これは、抗体のいくつかの免疫機能、例えば、エフェクター細胞活性、溶解、補体媒介性活性、抗体クリアランス、および抗体半減期などを制御することができる。抗体（例えば、ＩｇＧ抗体）のＦｃ領域に結合する一般的なＦｃ受容体には、それだけに限らないが、対立遺伝子変異体を含めた、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎサブクラスの受容体、ならびにこれらの受容体の選択的にスプライスされた形態が含まれる。Ｆｃ受容体は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７〜９２、１９９１；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５〜３４、１９９４；ならびにｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０〜４１、１９９５に総説されている。
【００６９】
本発明の方法によって分離することができる抗体の非限定的な例として、それだけに限らないが、Ａβ、ＩＬ−１３、ＩＬ−２２、ＧＤＦ８および５Ｔ４に対する抗体が挙げられる。これらの抗体のそれぞれは、以下および添付した実施例により詳細に説明される。
【００７０】
抗ＧＤＦ８抗体
本発明の方法に使用することができる例示的な抗体は、抗ＧＤＦ８抗体である。用語「ＧＤＦ−８」は、成長および分化因子−８、および適切な場合、構造的または機能的にＧＤＦ−８に関係する因子、例えば、ＢＭＰ−１１、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する他の因子を指す。この用語は、ＧＤＦ−８の全長の未処理前駆体形態、ならびに翻訳後切断から生じる成熟形態およびプロペプチド形態を指す。この用語は、修飾された配列を含む、成熟ＧＤＦ−８に関連する、少なくともいくつかの生物活性を維持する、ＧＤＦ−８の任意の断片および変異体も指す。アミノ酸配列ヒトＧＤＦ−８、ならびに多くの他の脊椎動物種（マウス、ヒヒ、ウシ、ニワトリを含む）は、例えば、Ｕ．Ｓ．０４／０１４２３８２、ＵＳ０２／０１５７１２５、およびＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：１２４５７〜１２４６１）に開示されている。ＧＤＦ−８に対する中和抗体の例、例えばＭｙｏ−０２９は、例えば、Ｕ．Ｓ．２００４／０１４２３８２に開示されており、本明細書に添付した実施例全体にわたって参照されている。例示的な疾患および障害として、筋肉障害および神経筋障害、例えば、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む）など；筋萎縮性側索硬化症；筋萎縮；臓器萎縮；虚弱；管症候群；うっ血性閉塞性肺疾患；筋肉減少症、カヘキシー、および他の筋肉消耗症候群；脂肪組織障害（例えば、肥満症）；２型糖尿病；耐糖能障害；代謝症候群（例えば、シンドロームＸ）；やけどまたは窒素不均衡（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｉｍｂａｌａｎｃｅ）などの外傷によって誘発されたインスリン抵抗性；ならびに骨変性疾患（例えば、骨関節炎および骨粗鬆症）が挙げられる。
【００７１】
抗Ａβ抗体
抗Ａβ抗体製剤の乳光の低減は、本発明の教示に従って実行することができる。用語「ＡＢ抗体」、「Ａβ抗体」、「抗Ａβ抗体」、および「抗Ａβ」は、ＡＰＰ、Ａβタンパク質、またはその両方の１つまたは複数のエピトープまたは抗原決定基に結合する抗体を指すために、本明細書で互換的に使用される。例示的なエピトープまたは抗原決定基は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）内に見出すことができるが、ＡＰＰのＡβペプチド内に見出されることが好ましい。ＡＰＰの多数のイソ型、例えば、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０が存在する。ＡＰＰ内のアミノ酸は、ＡＰＰ７７０イソ型の配列による、割り当てられた数である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｐ０５０６７を参照されたい）。Ａβ（本明細書では、ベータアミロイドペプチドおよびＡベータとも呼ばれる）ペプチドは、ＡＰＰ（Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、およびＡβ４３）の３９〜４３アミノ酸の約４ｋＤａの内部断片である。例えば、Ａβ４０は、ＡＰＰの残基６７２〜７１１からなり、Ａβ４２は、ＡＰＰの残基６７２〜７１３からなる。ｉｖ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕでの異なるセクレターゼ酵素によるＡＰＰのタンパク質分解プロセシングの結果として、Ａβは、長さで４０個のアミノ酸の「短形態」、および長さで４２〜４３個のアミノ酸の範囲の「長形態」の両方で見出される。エピトープまたは抗原決定基は、ＡβペプチドのＮ末端内に位置し、Ａβのアミノ酸１〜１０内、好ましくはＡβ４２の残基１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、２〜７、３〜６、もしくは３〜７から、あるいはＡβの残基２〜４、５、６、７、もしくは８、Ａβの残基３〜５、６、７、８、もしくは９、またはＡβ４２の残基４〜７、８、９、もしくは１０内の残基を含むことができる。「中央」エピトープまたは抗原決定基は、Ａβペプチドの中央または中間部分内に位置し、Ａβのアミノ酸１６〜２４、１６〜２３、１６〜２２、１６〜２１、１９〜２１、１９〜２２、１９〜２３、または１９〜２４内の残基を含む。「Ｃ末端」エピトープまたは抗原決定基は、ＡβペプチドのＣ末端内に位置し、Ａβのアミノ酸３３〜４０、３３〜４１、または３３〜４２内の残基を含む。
【００７２】
様々な実施形態では、Ａβ抗体は末端特異的である。本明細書で使用される場合、用語「末端特異的」は、ＡβペプチドのＮ末端またはＣ末端残基に特異的に結合するが、この残基を含むより長いＡβ種またはＡＰＰ内に存在する場合、同じ残基を認識しない抗体を指す。
【００７３】
様々な実施形態では、Ａβ抗体は「Ｃ末端特異的」である。本明細書で使用される場合、用語「Ｃ末端特異的」は、抗体が、Ａβペプチドの遊離Ｃ末端を特異的に認識することを意味する。Ｃ末端特異的Ａβ抗体の例には、残基４０で終わるＡβペプチドを認識するが、残基４１、４２、および／または４３で終わるＡβペプチドを認識しないもの、残基４２で終わるＡβペプチドを認識するが、残基４０、４１、および／または４３で終わるＡβペプチドを認識しないものなどが含まれる。
【００７４】
一実施形態では、抗体は、３Ｄ６抗体もしくはその変異体、または１０Ｄ５抗体もしくはその変異体とすることができ、その両方は、米国特許公開第２００３／０１６５４９６Ａ１号、米国特許公開第２００４／００８７７７７Ａ１号、国際特許公開第ＷＯ０２／４６２３７Ａ３号に記載されている。３Ｄ６および１０Ｄ５の記述は、例えば、国際特許公開ＷＯ０２／０８８３０６Ａ２号および国際特許公開第ＷＯ０２／０８８３０７Ａ２号にも見出すことができる。３Ｄ６は、ヒトβ−アミロイドペプチド内に位置するＮ末端エピトープ、特に残基１〜５に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。比較して、１０Ｄ５は、ヒトβ−アミロイドペプチド内に位置するＮ末端エピトープ、特に残基３〜６に特異的に結合するｍＡｂである。別の実施形態では、抗体は、米国特許公開第２００４００８２７６２Ａ１号、および国際特許公開第ＷＯ０３／０７７８５８Ａ２号に記載されているような、１２Ｂ４抗体またはその変異体とすることができる。１２Ｂ４は、ヒトβ−アミロイドペプチド内に位置するＮ末端エピトープ、特に残基３〜７に特異的に結合するｍＡｂである。さらに別の実施形態では、抗体は、米国特許出願第１０／８５８，８５５号、および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１７５１４号に記載されているような、１２Ａ１１抗体またはその変異体とすることができる。１２Ａ１１は、ヒトβ−アミロイドペプチド内に位置するＮ末端エピトープ、特に残基３〜７に特異的に結合するｍＡｂである。さらに別の実施形態では、抗体は、米国特許出願第１０／７８９，２７３号、および国際特許出願第ＷＯ０１／６２８０１Ａ２号に記載されているような、２６６抗体とすることができる。本発明で使用するための、ヒトβ−アミロイドペプチド内に位置するＣ末端エピトープに特異的に結合するように設計された抗体には、それだけに限らないが、米国特許第５，７８６，１６０号に記載されているような、３６９．２Ｂが含まれる。
【００７５】
例示的な実施形態では、抗体は、Ａβペプチドを選択的に結合するヒト化抗Ａβペプチド３Ｄ６抗体である。より具体的には、ヒト化抗Ａβペプチド３Ｄ６抗体は、脳内（例えば、アルツハイマー病に罹患している患者中の）のプラーク沈着物中に見出される、ヒトβ−アミロイドの１〜４０または１〜４２ペプチド内に位置するＮＨ２末端エピトープに特異的に結合するように設計される。
【００７６】
抗Ａβ抗体は、アミロイド形成疾患、特にアルツハイマー病を治療するのに使用することができる。用語「アミロイド形成疾患」は、不溶性のアミロイド原線維の形成または沈着に関連する（またはこれによって引き起こされる）任意の疾患を含む。例示的なアミロイド形成疾患として、それだけに限らないが、全身性アミロイド症、アルツハイマー病、成人発症型糖尿病（ｍａｔｕｒｅ  ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ）、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭認知症、およびプリオン関連（ｐｒｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ）伝染性海綿状脳症（ヒトにおけるクールー病およびクロイツフェルト−ヤコブ病、ならびにそれぞれヒツジおよびウシにおける、スクレイピーおよびＢＳＥ）が挙げられる。沈着した原線維のポリペプチド成分の性質によって、様々なアミロイド形成疾患が定義され、または特徴づけられている。例えば、アルツハイマー病を有する対象または患者において、β−アミロイドタンパク質（例えば、野生型、変異体、または切断されたβ−アミロイドタンパク質）は、アミロイド沈着物の特徴ポリペプチド成分である。したがって、アルツハイマー病は、例えば、対象または患者の脳内における、「Ａβの沈着物によって特徴づけられる疾患」、または「Ａβの沈着物に関連する疾患」の一例である。用語「β−アミロイドタンパク質」、「β−アミロイドペプチド」、「β−アミロイド」、「Ａβ」、および「Ａβペプチド」は、本明細書で互換的に使用される。
【００７７】
抗５Ｔ４抗体
５Ｔ４抗原は、以前に特徴づけられている（例えば、ＷＯ８９／０７９４７を参照されたい）。ヒト５Ｔ４の全核酸配列は知られている（Ｍｙｅｒｓら（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １６９：９３１９〜２４およびアクセション番号Ｚ２９０８３のＧｅｎＢａｎｋ）。他の種に由来する５Ｔ４抗原の配列も知られており、例えば、マウス５Ｔ４（ＷＯ００／２９４２８）、イヌ５Ｔ４（ＷＯ０１／３６４８６）、またはネコ５Ｔ４（ＵＳ０５／０１００９５８）が知られている。
【００７８】
ヒト５Ｔ４は、癌において広く発現されるが、正常な成人組織において高度に制限された発現パターンを有する、約７２ｋＤａの糖タンパク質である。これは、直腸結腸癌および胃癌における転移に強く相関すると思われる。５Ｔ４抗原の発現は、乳癌および卵巣癌においても高頻度で見出される（Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１０：４７９〜８４；Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａら（１９９４）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６９：８９９〜９０２；Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａら（１９９２）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６６：８６７〜９）。５Ｔ４は、腫瘍進行および転移の可能性に関して、機構的関与の可能性を有するマーカーとして提案された（Ｃａｒｓｂｅｒｇら（１９９６）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ６８：８４〜９２）。５Ｔ４は、免疫療法剤として使用することも提案された（ＷＯ００／２９４２８を参照されたい）。５Ｔ４の抗原ペプチドも、例えば、ＵＳ０５／０１００９５８に開示されており、この内容は参照により組み込まれている。
【００７９】
いくつかの係属中の出願、例えば、米国出願公開第２００３／００１８００４号および同第２００５／００３２２１６号は、一般に、抗５Ｔ４モノクローナル抗体をコードする核酸、そのベクターおよび宿主細胞に関する。一般に、ヒト化抗５Ｔ４  Ｈ８モノクローナル抗体、およびそのカリケアマイシンコンジュゲート、ならびにこれらのカリケアマイシンコンジュゲートを使用する治療方法に関係する仮特許出願が出願された（米国出願公開第２００６／００８８５２２号）。これらすべての出願の内容は、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。
【００８０】
抗ＩＬ１３抗体
インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）は、Ｔリンパ球およびマスト細胞によって分泌される、以前に特徴づけられたサイトカインである（ＭｃＫｅｎｚｉｅら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７３５〜３９；Ｂｏｓｔら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８７：６６３〜４１）。用語「ＩＬ−１３」は、ＩＬ−１３の全長の未処理前駆体形態、ならびに翻訳後切断から生じる成熟形態を含めたインターロイキン−１３を指す。この用語は、修飾された配列を含む、成熟ＩＬ−１３に関連する、少なくともいくつかの生物活性を維持する、ＩＬ−１３の任意の断片および変異体も指す。用語「ＩＬ−１３」は、ヒトＩＬ−１３、ならびに他の脊椎動物種を含む。いくつかの係属中の出願、例えば、米国出願公開第２００６／００６３２２８Ａ号および同第２００６／００７３１４８号には、ヒトおよびサルＩＬ−１３、ＩＬ−１３ペプチド、これらを産生するベクターおよび宿主細胞が開示されている。これらすべての刊行物の内容は、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。
【００８１】
ＩＬ−１３は、ＩＬ−４といくつかの生物活性を共有する。例えば、ＩＬ−４またはＩＬ−１３のいずれも、Ｂ細胞中でＩｇＥアイソタイプ転換を引き起こす（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５７９２〜５８００）。さらに、細胞表面ＣＤ２３と血清ＣＤ２３（ｓＣＤ２３）のレベルの増大が、喘息患者において報告されている（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｇｕｅｒｅｒｒｏら（１９９４）Ａｌｌｅｒｇｙ  ４９：５８７〜９２；ＤｉＬｏｒｅｎｚｏら（１９９９）Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｐｒｏｃ．２０：１１９〜２５）。さらに、ＩＬ−４またはＩＬ−１３のいずれも、Ｂ細胞および単球上でのＭＨＣクラスＩＩおよび低親和性ＩｇＥ受容体（ＣＤ２３）の発現を上方制御することができ、これにより、抗原提示が増強され、マクロファージ機能が制御される（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、上記を参照されたい）。これらの観察結果は、ＩＬ−１３が、気道好酸球増加症および気道過敏症（ＡＨＲ）の発症において重要なプレイヤーとなり得ることを示す（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、上記を参照されたい；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２２５８〜６１）。したがって、ＩＬ−１３の阻害は、それだけに限らないが、呼吸器障害、例えば、喘息；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；気道炎症、好酸球増加症、線維症および粘液過剰産生を伴う他の状態、例えば、嚢胞性線維症および肺線維症；アトピー性障害、例えば、アトピー性皮膚炎、じん麻疹、湿疹、アレルギー性鼻炎；皮膚（例えば、アトピー性皮膚炎）、消化管臓器（例えば、潰瘍性大腸炎および／またはクローン病などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ））、肝臓（例えば、肝硬変、肝細胞癌）の炎症および／または自己免疫状態；強皮症；腫瘍または癌（例えば、軟部組織腫瘍または固形腫瘍）、例えば、白血病、グリア芽細胞腫、およびリンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫など；ウイルス感染症（例えば、ＨＴＬＶ−１由来）；他の臓器の線維症、例えば、肝臓の線維症、（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスおよび／またはＣ型肝炎ウイルスによって生じる線維症）を含めた、いくつかの炎症および／またはアレルギー状態の病状を回復させるのに有用となり得る。
【００８２】
抗ＩＬ−２２抗体
インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）は、ＩＬ−１０と配列相同性を示す、以前に特徴づけられたクラスＩＩサイトカインである。その発現は、ＩＬ−９またはＣｏｎＡによってＴ細胞中で上方制御される（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ  Ｌ．ら（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７（１８）：１０１４４〜９）。研究により、ＩＬ−２２  ｍＲＮＡの発現は、ＬＰＳ投与に応答してｉｎ  ｖｉｖｏで誘発され、ＩＬ−２２は、急性期応答を示すパラメーターを調節し（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ  Ｌ．ら（２０００）上記を参照されたい；Ｐｉｔｔｍａｎ  Ｄ．ら（２００１）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２：１７２）、中和抗ＩＬ−２２抗体を使用することによってＩＬ−２２抗体の活性を低減することにより、マウスコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて炎症症状が回復することが示された。したがって、ＩＬ−２２アンタゴニスト、例えば、中和抗ＩＬ−２２抗体およびその断片は、例えば、自己免疫障害（例えば、関節リウマチなどの関節炎障害）；呼吸器障害（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））；例えば、皮膚（例えば、乾癬）、心血管系（例えば、アテローム性動脈硬化症）、神経系（例えば、アルツハイマー病）、腎臓（例えば、腎炎）、肝臓（例えば、肝炎）および膵臓（例えば、膵炎）の炎症状態を治療するための、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫抑制を誘発するのに使用することができる。
【００８３】
用語「ＩＬ−２２」は、ＩＬ−２２の全長の未処理前駆体形態、ならびに翻訳後切断から生じる成熟形態を含めたインターロイキン−２２を指す。この用語は、修飾された配列を含む、成熟ＩＬ−２２に関連する、少なくともいくつかの生物活性を維持する、ＩＬ−２２の任意の断片および変異体も指す。用語「ＩＬ−２２」は、ヒトＩＬ−２２、ならびに他の脊椎動物種も含む。ヒトおよびげっ歯類ＩＬ−２２、ならびにＩＬ−２２に対する抗体のアミノ酸ならびにヌクレオチド配列は、例えば、米国出願公開第２００５−００４２２２０号および同第２００５−０１５８７６０号、ならびに米国特許第６，９３９，５４５号に開示されている。これらすべての刊行物の内容は、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。
【００８４】
小モジュール免疫薬剤（Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ＳＭＩＰ（商標））
本発明は、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ（商標））にも適用することができる。これは、免疫グロブリンヒンジまたはヒンジ作用領域（ｈｉｎｇｅ−ａｃｔｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）ポリペプチドに融合または別の方法で接続された結合ドメインポリペプチドを含む結合ドメイン融合タンパク質を一般に指し、この結合ドメインポリペプチドは、さらにはＣＨ１以外の免疫グロブリン重鎖由来の、１つまたは複数の天然または操作された定常領域、例えば、ＩｇＧおよびＩｇＡのＣＨ２およびＣＨ３領域、またはＩｇＥのＣＨ３およびＣＨ４領域を含む領域に、融合または別の方法で接続されている（より完全な説明については、例えば、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．らによるＵ．Ｓ．０５／０１３６０４９を参照されたい）。結合ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質は、ヒンジ領域ポリペプチドと、ＣＨ２定常領域ポリペプチド（またはＩｇＥに全体的または部分的に由来するコンストラクトの場合、ＣＨ３）に融合または別の方法で接続されている、天然または操作された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域ポリペプチド（またはＩｇＥに全体的または部分的に由来するコンストラクトの場合、ＣＨ４）とに融合または別の方法で接続されている、天然または操作された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域ポリペプチド（またはＩｇＥに全体的または部分的に由来するコンストラクトの場合、ＣＨ３）を含む領域をさらに含むことができる。一般に、そのような結合ドメイン−免疫グロブリン融合タンパク質は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害、補体結合、および／または標的、例えば標的抗原への結合からなる群から選択される、少なくとも１つの免疫学的活性の能力がある。
【００８５】
可溶性受容体および受容体融合物
本発明は、可溶性受容体またはその断片にも適用することができる。可溶性受容体の例には、受容体の細胞外ドメイン、例えば、可溶性腫瘍壊死因子αおよびβ受容体（ＴＮＦＲ−１；１９９１年３月２０日に公開されたＥＰ４１７，５６３；ＴＮＦＲ−２；１９９１年３月２０日に公開されたＥＰ４１７，０１４；ならびにＮａｉｓｍｉｔｈおよびＳｐｒａｎｇ、Ｊ  Ｉｎｆｌａｍｍ．４７（１〜２）：１〜７、１９９５〜９６の総説であり、そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）などが含まれる。他の実施形態では、可溶性受容体には、例えばＵＳ２００３−０１０８５４９（その内容も、参照により組み込まれている）に記載されているような、インターロイキン−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）の細胞外ドメインが含まれる。
【００８６】
融合タンパク質は、標的化部分、例えば、可溶性受容体断片またはリガンド、ならびに免疫グロブリン鎖、Ｆｃ断片、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含めた様々なアイソタイプの重鎖定常領域を含むことができる。例えば、融合タンパク質は、受容体の細胞外ドメインを含むことができ、例えば、ヒト免疫グロブリンＦｃ鎖（例えば、ヒトＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４、またはそれらの突然変異形態）に融合することができる。一実施形態では、ヒトＦｃ配列は、１つまたは複数のアミノ酸で突然変異している、例えば、野生型配列からの残基２５４と２５７で突然変異していることによって、Ｆｃ受容体結合性を低減している。融合タンパク質は、第１部分を第２部分、例えば免疫グロブリン断片に結合するリンカー配列をさらに含むことができる。例えば、融合タンパク質は、ペプチドリンカー、例えば、長さがアミノ酸の個数で約４から２０個、より好ましくは５から１０個のペプチドリンカーを含むことができ、ペプチドリンカーは、長さがアミノ酸の個数で８個である。例えば、融合タンパク質は、式（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｙ（式中、ｙは、１、２、３、４、５、６、７、または８である）を有するペプチドリンカーを含むことができる。他の実施形態では、追加のアミノ酸配列を、融合タンパク質のＮまたはＣ末端に添加することによって、発現、立体的柔軟性、検出および／または単離もしくは精製を促進することができる。
【００８７】
ある特定の実施形態では、可溶性受容体融合物は、可溶性ＴＮＦＲ−Ｉｇ（例えば、ＴＮＦ受容体、例えば、ｐ５５もしくはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体、またはそれらの誘導体の可溶性断片、例えば、７５ｋｄのＴＮＦＲ−ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１の２３５アミノ酸Ｆｃ部分に融合した、７５ｋＤのＴＮＦ受容体））を含む。
【００８８】
本発明のキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技法によって作製することができる。例えば、様々なポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、従来の技法によって、例えば、連結用の平滑末端またはジグザグ末端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ  ｔｅｒｍｉｎｉ）、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合、付着末端の補充、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を使用することによって、インフレームで一緒に連結される。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含めた従来の技法によって合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子断片の間に相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して実施することができ、これは引き続いてアニールし、再増幅することによってキメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照されたい）。さらに、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターは、市販されている。免疫グロブリン融合ポリペプチドは、当技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，５１６，９６４号；同第５，２２５，５３８号；同第５，４２８，１３０号；同第５，５１４，５８２号；同第５，７１４，１４７号；および同第５，４５５，１６５号に記載されている。
【００８９】
成長因子およびサイトカイン
医薬剤および／または市販薬剤として有効であることが示され、望ましくは、本発明の教示によって作製することができる別の分類のポリペプチドには、成長因子、およびサイトカインなどの他のシグナル分子が含まれる。
【００９０】
成長因子は、一般に、細胞によって分泌され、他の細胞上の受容体に結合し、これを活性化させ、受容体細胞中で代謝的または発生的変化を開始する糖タンパク質である。哺乳動物成長因子および他のシグナル分子の非限定的な例として、サイトカイン；上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、例えば、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦなど；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−α、およびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、もしくはＴＧＦ−β５を含めたＴＧＦ−βなど；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、ＣＤ−１９など；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−β、および−γなど；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＴＬｓ）、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１３（例えば、ＩＬ−１１）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αおよびβ；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォンウィルブランド因子など；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；プラスミノーゲンアクチベーター、例えば、ウロキナーゼもしくはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）など；ボンベシン；トロンビン、造血成長因子；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ミュラー管阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン（ｐｒｏｒｅｌａｘｉｎ）；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）など、またはＮＧＦ−βなどの神経成長因子が挙げられる。当業者は、本発明の方法および組成物によって発現することができる、他の成長因子またはシグナル分子を認識するであろう。
【００９１】
成長因子または他のシグナル分子のグリコシル化パターンにおける特定の変化は、その治療特性に劇的な効果があることが示された。一例として、慢性貧血に罹患している患者に対する治療の一般的な方法は、その患者に組換えエリトロポピエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｐｉｅｔｉｎ）（ｒＨｕＥＰＯ）を頻繁に注射することによって、患者の赤血球の産生を増強することである。ｒＨｕＥＰＯの類似体であるダルベポエチンα（ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標））は、通常のｒＨｕＥＰＯよりも長い持続期間を有するように開発された。ダルベポエチンαとｒＨｕＥＰＯの間の主な差異は、２本の追加のシアル酸含有Ｎ結合型オリゴ糖鎖の存在である。ダルベポエチンαの作製は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ糖鎖工学を使用して達成された（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｅｌｌｉｏｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（４）：４１４〜２１、２００３を参照されたい）。Ｅｌｌｉｏｔｔらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発を使用することによって、ｒＨｕＥＰＯポリペプチド主鎖中に追加のグリコシル化部位を組み込み、ダルベポエチンα類似体の発現をもたらした。追加のオリゴ糖鎖は、ＥＰＯ受容体結合部位の遠位に位置し、見かけ上受容体結合を妨害しない。しかし、ダルベポエチンαの半減期は、ｒＨｕＥＰＯよりも最大３倍長く、はるかに有効な治療剤になっている。
【００９２】
凝固因子
凝固因子は、医薬剤および／または市販薬剤として有効であることが示されている。血友病Ｂは、患者の血液が凝固することができない障害である。したがって、出血をもたらすどんな小さな創傷も、潜在的に生命を脅かす事象である。例えば、凝固第ＩＸ因子（第ＩＸ因子または「ＦＩＸ」）は単鎖糖タンパク質であり、これが欠乏すると血友病Ｂになる。ＦＩＸは、活性化ペプチドを放出することによって、活性化されて２本鎖のセリンプロテアーゼ（第ＩＸａ因子）になることができる、単鎖酵素原として合成される。第ＩＸａ因子の触媒ドメインは、重鎖中に位置する（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｃｈａｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：４、１９９７を参照されたい）。ＦＩＸは、Ｎ結合型およびＯ結合型炭水化物の両方を含む、多数のグリコシル化部位を有する。セリン６１での一特定のＯ結合型構造（Ｓｉａ−α２、３−Ｇａｌ−β１、４−ＧｌｃＮＡｃ−β１、３−Ｆｕｃ−α１−Ｏ−Ｓｅｒ）は、ＦＩＸに特有であると以前に考えられたが、それ以来、哺乳動物およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）中のノッチタンパク質を含む、いくつかの他の分子上で見出されてきた（Ｍａｌｏｎｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５（１３）、２０００）。細胞培養で、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞によって産生されるＦＩＸは、セリン６１オリゴ糖鎖中でいくつかの変異性を示す。これらの異なる糖型、および他の潜在的な糖型は、ヒトまたは動物に投与される場合、凝固を誘発するための異なる能力を有することができ、および／または血液中で異なる安定性を有し、効果の弱い凝固をもたらす場合がある。
【００９３】
血友病Ｂと臨床的に識別不能な血友病Ａは、単鎖として合成され、次いで処理されて２本鎖の活性形態になる別の糖タンパク質である、ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子の欠損によって引き起こされる。本発明を使用して、凝固第ＶＩＩＩ因子のグリコシル化パターンを制御しまたは変化させることによって、その凝固活性を調節することもできる。本発明によって作製することができる他の凝固因子には、組織因子およびフォンウィルブランド因子が含まれる。
【００９４】
酵素
医薬剤および／または市販薬剤として有効であることが示され、望ましくは、本発明の教示によって作製することができる別の分類のポリペプチドには、酵素が含まれる。酵素は、糖タンパク質とすることができ、そのグリコシル化パターンが酵素活性に影響する。したがって、本発明は、細胞培養で酵素を作製するのに使用することもでき、作製された酵素は、より広範な、またはさもなければより望ましいグリコシル化パターンを有する。
【００９５】
１つの非限定的な例として、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＲ）の欠乏により、ゴーシェ病として知られる状態がもたらされ、これは、ある特定の細胞のリソソーム中にグルコセレブロシダーゼが蓄積することによって引き起こされる。ゴーシェ病を有する対象は、脾腫、肝腫、骨障害、血小板減少症および貧血を含めた、一連の症状を示す。ＦｒｉｅｄｍａｎとＨａｙｅｓは、一次アミノ酸配列中に１個の置換を含む組換えＧＣＲ（ｒＧＣＲ）は、自然に存在するＧＣＲと比較して、変化したグリコシル化パターン、特に、フコースおよびＮ−アセチルグルコサミン残基の増加を示すことを示した（米国特許第５，５４９，８９２号を参照されたい）。
【００９６】
ＦｒｉｅｄｍａｎとＨａｙｅｓは、このｒＧＣＲは、自然に存在するｒＧＣＲと比較して、改善された薬物動態学的性質を示すことも実証した。例えば、自然に存在するＧＣＲが標的にするよりも、約２倍のｒＧＣＲが、肝臓クッパー細胞を標的にした。この２つのタンパク質の一次アミノ酸配列は、１個の残基で異なるが、ＦｒｉｅｄｍａｎとＨａｙｅｓは、ｒＧＣＲの変化したグリコシル化パターンも、クッパー細胞への標的化に影響し得ると仮定した。当業者は、酵素のグリコシル化パターンの変化から生じる、変化した酵素的、薬物動態学的、および／または薬力学的性質を示す酵素の他の既知の例を認識するであろう。
【００９７】
タンパク質作製
本発明によってタンパク質を作製する組換え方法は、当技術分野で知られている。タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、所望量の修飾抗体を作製するのに使用することができる宿主細胞中に導入するために、発現ベクター中に一般に挿入され、これはさらには、ポリペプチドを提供する。用語「ベクター」は、核酸、例えば遺伝子を多くの場合含み、核酸複製、転写、安定性、および／または宿主細胞からのタンパク質発現もしくは分泌に必要な最低限のエレメントを含む、核酸コンストラクトを含む。そのようなコンストラクトは、染色体外エレメントとして存在することができ、または宿主細胞のゲノム中に組み込むことができる。
【００９８】
用語「発現ベクター」は、核酸コンストラクトが、所望のタンパク質産物の高レベルな発現のために最適化された、特定の種類のベクターを含む。発現ベクターは、特定の細胞型中での高レベルな転写のために最適化され、および／または発現が、特定の誘発剤の使用に基づいて恒常的であるように最適化された、転写調節剤、例えば、プロモーターおよびエンハンサーエレメントなどを多くの場合有する。発現ベクターは、タンパク質の適切および／または増強された翻訳を提供する配列をさらに有する。当業者に知られているように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から容易に選択することができる。用語「発現カセット」は、遺伝子を含み、遺伝子に加えて、宿主細胞中でのその遺伝子の適切および／または増強された発現を可能にするエレメントを有する核酸コンストラクトを含む。抗体を作製するために、軽鎖および重鎖をコードする核酸を、発現ベクター中に挿入することができる。そのような配列は、同じ核酸分子（例えば、同じ発現ベクター）中に存在することができ、あるいは別々の核酸分子（例えば、別々の発現ベクター）から発現することができる。
【００９９】
用語「作動可能に連結した」は、成分が、それらの意図した様式で機能することを可能にする関係にある（例えば、機能的に連結した）近位を含む。例として、対象とするポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーター／エンハンサーは、プロモーター／エンハンサーによって誘導される発現を活性化する条件下で、対象とするポリヌクレオチドの発現が達成されるように、前記ポリヌクレオチドに連結される。
【０１００】
発現ベクターは、エピソームまたは宿主染色体ＤＮＡの必須部分のいずれかとして、宿主生物体中で一般に複製可能である。一般に、発現ベクターは、選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含有することによって、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にする（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，７０４，３６２号を参照されたい）。免疫グロブリンＤＮＡカセット配列、挿入配列、および制御配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、追加の配列、例えば、宿主細胞中のベクターの複製を制御する配列（例えば、複製開始点）および選択可能マーカー遺伝子などを担持することができる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を促進する（例えば、すべてＡｘｅｌらによる、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、および同第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、一般に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、薬物、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートなどに対する耐性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅を伴うｄｈｆｒ−宿主細胞中で使用するため）、およびネオ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が含まれる。
【０１０１】
ベクターが適切な宿主細胞中に組み込まれた場合、この宿主細胞は、ヌクレオチド配列の高レベル発現、ならびに所望の抗体の採取および精製に適した条件下で維持される。細胞培養、およびタンパク質またはポリペプチドの発現が可能な任意の宿主細胞を、本発明によって利用することができる。ある特定の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物である。本発明によって使用することができる哺乳動物細胞の非限定的な例として、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系統（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統；ヒト胚腎臓系統（２９３細胞、または、懸濁培養で成長させるためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．、３６：５９、１９７７）；新生仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３〜２５１、１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４〜６８、１９８２）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫系統（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。
【０１０２】
さらに、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する、いくつもの市販の、および市販されていないハイブリドーマ細胞系統を、本発明によって利用することができる。当業者は、ハイブリドーマ細胞系統は、最適な成長およびポリペプチドまたはタンパク質発現のために、様々な栄養必要量を有し、および／または様々な培養条件を必要とする場合があり、必要に応じて条件を修飾することができることを理解するであろう。
【０１０３】
これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製開始点、プロモーター、およびエンハンサー、（Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））など、ならびに必要なプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などを含むことができる。好ましい発現調節配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターである（例えば、Ｃｏら、（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９を参照されたい）。哺乳動物宿主細胞発現に好ましい制御配列には、哺乳動物細胞中での高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルスエレメント、例えば、ＦＦ−１ａプロモーターおよびＢＧＨポリＡ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどが含まれる。ウイルス制御エレメント、およびその配列のさらなる記述については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４，５１０，２４５号、およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。例示的な実施形態では、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子は、エンハンサー／プロモーター制御エレメント（例えば、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター制御エレメント、またはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター制御エレメントなどの、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来した）に作動可能に連結することによって、遺伝子の高レベルの転写を推進する。本発明の例示的な実施形態では、コンストラクトは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含むことによって、真核宿主細胞中で比較的高レベルの本発明のポリペプチドを提供する。適合性のＩＲＥＳ配列は、米国特許第６，１９３，９８０号に開示されており、これも本明細書に組み込まれている。
【０１０４】
あるいは、コード配列は、導入遺伝子中に組み込んで、トランスジェニック動物のゲノム中に導入し、引き続いてこのトランスジェニック動物の乳中で発現させることができる（例えば、Ｄｅｂｏｅｒら、ＵＳ５，７４１，９５７、Ｒｏｓｅｎ、ＵＳ５，３０４，４８９、およびＭｅａｄｅら、ＵＳ５，８４９，９９２を参照されたい）。適当な導入遺伝子は、カゼインまたはβラクトグロブリンなどの、乳腺特異的遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーと作動可能に連結した軽鎖および／または重鎖のコード配列を含む。
【０１０５】
原核宿主細胞も、本発明の抗体を作製するのに適当となり得る。イー・コリは、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列）をクローン化するのに特に有用な一原核宿主である。使用するのに適した他の微生物宿主として、バシルス・スブチリスなどのバシリ、エンテロバクテリアセアエ、例えば、エスケリキア、サルモネラ、およびセラチアなど、ならびに様々なシュードモナス種が挙げられる。これらの原核宿主中で、発現ベクターも作製することができ、これは、宿主細胞と適合した発現制御配列（例えば、複製開始点）を一般に含有する。さらに、いくつもの様々な周知のプロモーター、例えば、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはλファージ由来のプロモーター系などが存在する。プロモーターは、転写および翻訳を開始し、完了するために、所望によりオペレーター配列とともに発現を一般に制御し、リボソーム結合部位配列などを有する。
【０１０６】
原核生物中でのタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を誘導する、構成的または誘導的プロモーターを含有するベクターを含むイー・コリ中で実施されることが最も多い。融合ベクターは、その中でコードされた抗体、多くの場合、組換え抗体の定常領域に、この抗体の特異性または抗原認識に影響することなく、いくつかのアミノ酸を添加する。融合ペプチドのアミノ酸の添加により、例えばマーカー（例えば、ｍｙｃまたはフラッグなどのエピトープタグ）としての抗体に、追加の機能を加えることができる。
【０１０７】
イーストなどの他の微生物も発現に有用である。サッカロミセスは好ましいイースト宿主であり、適当なベクターは、望まれる通りに、発現制御配列（例えば、プロモーター）、複製開始点、終止配列などを有する。典型的なプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の糖分解酵素が含まれる。誘導的イーストプロモーターには、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームＣ、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用に関与する酵素に由来するプロモーターが含まれる。
【０１０８】
対象とするポリヌクレオチド配列（例えば、重鎖および軽鎖をコードする配列、ならびに発現制御配列）を含むベクターは、周知の方法によって宿主細胞中に移すことができ、この方法は、細胞宿主の種類に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核細胞に対して一般に利用され、一方、リン酸カルシウム処理、電気穿孔、リポフェクション、微粒子銃またはウイルスベースのトランスフェクションは、他の細胞宿主に対して使用することができる。（一般に、すべての目的に対してその全体が本明細書に参照により組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、２版、１９８９）を参照されたい）。哺乳動物細胞を形質転換するのに使用される他の方法には、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔、および微量注入の使用が含まれる（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい）。トランスジェニック動物を作製するために、導入遺伝子を、受精卵母細胞中に微量注入することができ、または胚幹細胞のゲノム、および除核卵母細胞中に移されたそのような細胞の核中に組み込むことができる。
【０１０９】
重鎖および軽鎖が別々の発現ベクターでクローン化される場合、ベクターは、同時形質移入されることによって、インタクトな免疫グロブリンを発現し、構築する。発現されると、抗体全体、その二量体、個々の軽鎖および重鎖、または本発明の他の免疫グロブリン形態は、本明細書で説明したように分離し、および／または硫安塩析、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動などを含めた、当技術分野で既知の手順によってさらに精製することができる（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．、（１９８２）を参照されたい）。医薬品用途のためには、少なくとも約９０から９５％の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８から９９％またはそれ以上の均一性が最も好ましい。
【０１１０】
タンパク質精製
本発明によって発現されたタンパク質を単離および／または精製することが望ましい。ある特定の実施形態では、発現されたタンパク質は、培地中に分泌され、したがって、精製プロセスの第１工程として、例えば遠心分離またはフィルタリングによって、細胞および他の固形物を除去することができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、発現されたタンパク質は、宿主細胞の表面に結合される。そのような実施形態では、精製プロセスの第１工程として、培地は除去され、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する宿主細胞は溶解される。哺乳動物宿主細胞の溶解は、ガラスビーズによる物理的破壊および高ｐＨ状態への暴露を含む、当業者に既知のいくつもの手段によって達成することができる。
【０１１２】
タンパク質は、それだけに限らないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、サイズ排除、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過、遠心分離、または示差溶解度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、エタノール沈殿、またはタンパク質精製のための任意の他の利用可能な技法を含めた、標準的な方法によって単離し、精製することができる（例えば、そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７；  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９；ならびにＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．、Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．、Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．（編）、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、１８２巻）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７を参照されたい）。特に免疫アフィニティークロマトグラフィーについては、タンパク質は、そのタンパク質に対して産生され、固定支持体に固定された抗体を含むアフィニティーカラムにこれを結合することによって、単離することができる。アフィニティータグ、例えば、インフルエンザコート配列、ポリヒスチジン、またはグルタチオンＳトランスフェラーゼなどを、標準的な組換え技術によりタンパク質に結合させることによって、適切なアフィニティーカラムを通過させることによる容易な精製を可能にすることができる。精製プロセスの間のポリペプチドまたはタンパク質の分解を低減または排除するために、プロテアーゼ阻害剤、例えば、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチンまたはアプロチニンなどを、任意のまたはすべての段階で加えることができる。プロテアーゼ阻害剤は、発現されたポリペプチドまたはタンパク質を単離し、精製するために、細胞を溶解しなければならない場合、特に有利である。
【０１１３】
本発明のある特定の方法によって発現されるタンパク質は、本発明ではない細胞培養条件下で生じた場合に有するよりも、広範な、および／または修飾されたグリコシル化パターンを有することができる。したがって、精製工程で利用することができる本発明の１つの実用的な利点は、ある特定の本発明の方法および／または組成物によって生じさせた糖タンパク質上に存在する追加の、および／または修飾された糖残基により、その糖タンパク質をより容易に精製するため、または本発明ではない方法および／もしくは組成物によって生じさせた糖タンパク質について可能であるよりも高く精製するために専門家が使用することができる、異なる生化学的性質を糖タンパク質に与えることができることである。
【０１１４】
当業者は、正確な精製技法が、精製されるポリペプチドもしくはタンパク質の特性、ポリペプチドもしくはタンパク質が発現される細胞の特性、および／または細胞が成長した培地の組成物に応じて様々となり得ることを理解するであろう。
【０１１５】
医薬製剤
本発明のタンパク質製剤は、医薬上許容される担体または賦形剤の存在下で医薬組成物として製剤化することができる。本明細書で説明されるような、タンパク質製剤を含有する組成物は、対象に投与することができ、またはそれだけに限らないが、非経口、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、経口、頬側、舌下、経鼻、気管支、眼（ｏｐｔｈａｌｍｉｃ）、経皮（局所的）、経粘膜、直腸、および膣の経路を含めた任意の利用可能な経路によるデリバリーのために最初に製剤化することができる。本発明の医薬組成物は、哺乳動物細胞系統から発現された、精製されたポリペプチドまたはタンパク質、医薬上許容される担体と組み合わせたデリバリー剤（すなわち、上述したような、陽イオンポリマー、ペプチド分子トランスポーター、界面活性剤など）を一般に含む。本明細書で使用される場合、用語「医薬上許容される担体」として、医薬投与に適合した、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。補助的な活性化合物も、本発明の組成物中に組み込むことができる。例えば、本発明によって作製されたタンパク質またはポリペプチドは、全身性薬物療法用薬物、例えば、トキシン、低分子量細胞毒性薬、生物学的応答調節物質、および放射性核種にコンジュゲートすることができる（例えば、Ｋｕｎｚら、Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ−ｃａｒｒｉｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、ＵＳ０４／００８２７６４Ａ１を参照されたい）。本発明による医薬組成物を調製するのに有用な追加の成分として、例えば、香味剤、滑剤、可溶化剤、懸濁剤、増量剤、流動促進剤、圧縮助剤、結合剤、錠剤崩壊剤、封入材料、乳化剤、緩衝液、保存剤、甘味料、増粘剤、着色剤、粘性調節剤、安定剤もしくは浸透圧調節剤、またはこれらの組合せが挙げられる。
【０１１６】
あるいは、またはさらに、本発明によって作製されたタンパク質またはポリペプチドは、１つまたは複数の追加の医薬として活性な薬剤と組み合わせて（同時にでも、経時的にでも）投与することができる。これらの医薬として活性な薬剤の例示的なリストは、参照により本明細書に組み込まれている、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ、２００１によって出版された医師用卓上参考書、５５版に見出すことができる。これらのリストされた薬剤の多くについては、医薬として有効な投与量およびレジメンは、当技術分野で知られており、多くは、医師用卓上参考書自体に示されている。
【０１１７】
固体の医薬組成物は、１つまたは複数の固体担体、および所望により１つまたは複数の他の添加剤、例えば、香味剤、滑剤、可溶化剤、懸濁剤、増量剤、流動促進剤、圧縮助剤、結合剤または錠剤崩壊剤または封入材料などを含有することができる。適当な固体担体として、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスもしくはイオン交換樹脂、またはこれらの組合せが挙げられる。粉末医薬組成物では、担体は、微粉化した固体とすることができ、これは、微粉化した活性成分と混合されている。錠剤では、活性成分は、適当な比率で必要な圧縮特性を有する担体、および所望により他の添加剤と一般に混合され、圧縮されて所望の形状およびサイズにされる。
【０１１８】
液体医薬組成物は、本発明によって発現されたポリペプチドまたはタンパク質、および１つまたは複数の液体担体を含有することによって、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル剤、または加圧組成物を形成することができる。医薬上許容される液体担体として、例えば、水、有機溶媒、医薬上許容される油もしくは脂肪、またはこれらの組合せが挙げられる。液体担体は、他の適当な医薬添加剤、例えば、可溶化剤、乳化剤、緩衝液、保存剤、甘味料、香味剤、懸濁剤、増粘剤、染料、粘性調節剤、安定剤もしくは浸透圧調節剤、またはこれらの組合せを含有することができる。液体製剤が、小児科での使用のために意図されている場合、アルコールを含めることを回避するか、アルコールの量を制限することが一般に望ましい。
【０１１９】
経口または非経口投与に適した液体担体の例として、水（所望により、ナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体などの添加剤を含有する）、アルコールもしくはその誘導体（一価アルコールもしくはグリコールなどの多価アルコールを含む）、または油（例えば、ヤシ油およびラッカセイ油）が挙げられる。非経口投与については、担体は、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルとすることもできる。加圧組成物用の液体担体は、ハロゲン化炭化水素、または他の医薬上許容される噴霧剤とすることができる。
【０１２０】
滅菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、腹腔内、硬膜外、くも膜下腔内、静脈内または皮下の注射によって、非経口的に投与することができる。経口または経粘膜投与用の医薬組成物は、液体または固体の組成物形態のいずれであってもよい。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、その投与の意図した経路と適合するように製剤化される。非経口、皮内、または皮下用途に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒など；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；緩衝液、例えば、酢酸、クエン酸またはリン酸など、および張性を調節するための作用剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースなど。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調節することができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の多回用量バイアル中に封入することができる。
【０１２２】
注射可能用途に適した医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散系、および滅菌注射溶液または分散系の即時調製用の滅菌粉末を一般に含む。静脈内投与については、適当な担体として、生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は無菌的であるべきであり、容易に注射ができる程度まで流動性であるべきである。有利には、ある特定の医薬製剤は、製造および貯蔵条件下で安定であり、細菌および菌類等の微生物の汚染作用から保護されていなければならない。一般に、関連する担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）グリコールなど）、およびこれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散系媒質とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散系の場合、要求される粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。ある特定の場合では、組成物中に等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトールなど、または塩化ナトリウムを含めることが有用になる。注射可能組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンをこの組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【０１２３】
滅菌注射溶液は、必要に応じて上記に列挙した成分の１つまたは組合せとともに、適切な溶媒中に必要量の精製されたポリペプチドまたはタンパク質を組み込み、その後に濾過滅菌を行うことによって調製することができる。一般に、分散系は、哺乳動物細胞系統から発現された、精製されたポリペプチドまたはタンパク質を、基本分散媒質と上記に列挙したものからの必要とされる他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液調製用の滅菌粉末の場合、有利な調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これらにより、あらかじめ滅菌濾過された、活性成分と任意の追加の所望の成分との溶液から、これらの成分の粉末が得られる。
【０１２４】
経口組成物は、不活性な希釈剤と食用の担体を一般に含む。経口治療投与の目的のために、精製されたポリペプチドまたはタンパク質を、賦形剤とともに組み込み、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態で使用することができる。経口組成物は、例えば、口内洗剤として使用するために、流体担体を使用して調製することもできる。医薬として適合した結合剤、および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分、または類似した性質の化合物のいずれも含有することができる：結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなど；賦形剤、例えば、デンプンもしくはラクトースなど、崩壊剤、例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、もしくはコーンスターチなど；滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）など；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；甘味剤、例えば、スクロースもしくはサッカリンなど；または香味剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料など。そのような製剤は、望ましい場合、例えば、小児、錠剤を嚥下する能力が損なわれた個体、または動物への投与を促進するため、混合された咀しゃく製剤もしくは液体製剤、または食品材料もしくは食品液体とすることができる。経口デリバリー用製剤は、消化管内での安定性を改善し、および／または吸収を高めるための作用剤を有利に組み込むことができる。
【０１２５】
吸入による投与については、哺乳動物細胞系統から発現されたタンパク質製剤とデリバリー剤を含む本発明の組成物は、鼻腔内、または吸入によっても投与することができ、乾燥粉末吸入器、または適当な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４Ａ（商標））、もしくは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡ（商標））など、二酸化炭素もしくは他の適当なガスを使用する、しないにかかわらず、加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザーもしくはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で送達されることが好都合である。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量された、例えば、治療有効量を送達するためのバルブを提供することによって決定することができる。本発明は、経鼻スプレー、吸入器、または上気道および／もしくは下気道への他の直接デリバリーを使用する、本発明の組成物のデリバリーを特に企図している。インフルエンザウイルスに向けられたＤＮＡワクチンの鼻腔内投与により、ＣＤ８  Ｔ細胞応答が誘発されることが示され、この経路によって送達される場合、呼吸器内の少なくとも一部の細胞は、ＤＮＡを取り込むことができ、本発明のデリバリー剤により、細胞取り込みが増強されることを示している。ある特定の実施形態によれば、哺乳動物細胞系統から発現された、精製されたポリペプチドとデリバリー剤を含む組成物は、エアロゾル投与用の大きな多孔質粒子として製剤化される。
【０１２６】
調節放出およびパルス放出経口剤形は、放出速度調節物質として作用する賦形剤を含有することができ、これらは、デバイスの本体上にコーティングされており、および／または本体中に含まれている。放出速度調節物質として、まったくそれだけに限るものではないが、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、ポリエチレンオキシド、キサンタンガム、カルボマー、アンモニオメタクリレートコポリマー、硬化ヒマシ油、カルナウバワックス、パラフィンワックス、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸コポリマー、およびこれらの混合物が挙げられる。調節放出およびパルス放出経口剤形は、放出速度調節賦形剤の１つまたは組合せを含有することができる。放出速度調節賦形剤は、剤形内、すなわちマトリックス内、および／または剤形上、すなわち表面もしくはコーティング上の両方に存在してもよい。
【０１２７】
全身投与は、経粘膜または経皮手段によるものとすることもできる。経粘膜または経皮投与については、浸透されるバリアーに適切な浸透剤が、製剤中に使用される。そのような浸透剤は当技術分野で一般に知られており、これには、例えば、経粘膜投与について、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは坐剤の使用により達成することができる。経皮投与については、精製されたポリペプチドまたはタンパク質とデリバリー剤は、例えば、以下のうちの１つまたは複数の混合物中に懸濁または溶解した活性化合物を含有する適当な軟膏剤として製剤化することができる：鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、および水。あるいは、これらは、例えば、以下のうちの１つまたは複数の混合物中に懸濁または溶解した、適当なローション剤またはクリームとして製剤化することができる：鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水。
【０１２８】
あるいは、化合物は、坐剤もしくはペッサリーの形態で投与することができ、またはこれらは、ゲル、ヒドロゲル、ローション剤もしくは他のグリセリド、溶液、クリーム、軟膏剤もしくは散粉剤の形態で局所的に適用することができる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、組成物は、インプラントおよびマイクロカプセル化デリバリーシステムを含めた制御放出製剤など、タンパク質を身体からの急速な排出から保護する担体ともに調製される。一般に、本発明の組成物は、即時放出、遅延放出、調節放出、徐放、パルス放出、または制御放出デリバリー用に製剤化することができる。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は、当業者に明白となるであろう。適当な材料は、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから市販で得ることもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体に感染した細胞を標的にしたリポソームを含む）も医薬上許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に既知の方法によって調製することができる。
【０１３０】
本発明によって作製されたタンパク質は、シクロデキストリンと組み合わせて使用することもできる。シクロデキストリンは、ある特定の分子と包接および非包接錯体を形成することが知られている。シクロデキストリン錯体の形成により、タンパク質またはポリペプチドの溶解度、溶解速度、バイオアベイラビリティーおよび／または安定性を修飾することができる。シクロデキストリン錯体は、ほとんどの剤形および投与経路に対して一般に有用である。タンパク質またはポリペプチドとの直接錯体形成の代替として、シクロデキストリンは、補助添加剤、例えば、担体、希釈剤、または可溶化剤として使用することができる。α−、β−、およびγ−シクロデキストリンが最も一般に使用され、適当な例は、公開国際特許出願第ＷＯ９１／１１１７２号、同第ＷＯ９４／０２５１８号および同第ＷＯ９８／５５１４８号に記載されている。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、錠剤またはカプセルなどの単位剤形で提供される。投与の容易さと投与量の均一性のために、経口または非経口組成物を単位剤形で製剤化することが有利となり得る。そのような形態では、組成物は、適切な量のポリペプチドまたはタンパク質を含有する単位用量にさらに分割される。単位剤形は、梱包された組成物、例えば、小包にした粉末、バイアル、アンプル、液体を含むプレフィルドシリンジまたはサシェとすることができる。単位剤形は、例えば、カプセルまたは錠剤自体とすることができ、またはこれは、梱包形態での適切な数の任意のそのような組成物とすることができる。当業者が認識するように、治療上有効な単位投与量は、例えば、投与方法、ポリペプチドもしくはタンパク質の効力、および／またはレシピエントの体重、および医薬組成物中の他の成分の素性を含めたいくつかの要因に依存することになる。
【０１３２】
タンパク質製剤、例えばタンパク質製剤を含有する医薬組成物は、必要に応じて様々な間隔で、異なる時間の期間にわたって、例えば、約１から１０週間の間、２から８週間の間、約３から７週間の間、約４、５、または６週間などに、１週間当たり１回投与することができる。当業者は、それだけに限らないが、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の一般的な健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含む、ある特定の要因が、対象を有効に治療するのに要求される投与量およびタイミングに影響し得ることを理解するであろう。本明細書に記載されるようなポリペプチドまたはタンパク質を用いた対象の治療は、単回の治療または一連の治療を含むことができる。適切な用量は、ポリペプチドまたはタンパク質の効力に依存する場合があり、例えば、あらかじめ選択された所望の応答が達成されるまで、漸増用量を投与することによって、特定のレシピエントに所望により適応させることができることがさらに理解される。任意の特定の動物対象についての具体的な用量レベルは、使用される特定のポリペプチドまたはタンパク質の活性、対象の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、および食餌、投与時間、投与経路、排泄速度、任意の薬物の組合せ、ならびに調節される発現または活性の程度を含む、様々な要因に依存し得ることが理解される。
【０１３３】
本発明は、非ヒト動物の治療のための、本明細書に記載される組成物の使用を包含する。したがって、用量および投与方法は、獣医薬理学および獣医医薬の既知の原則によって選択することができる。ガイダンスは、例えば、Ａｄａｍｓ，Ｒ．（編）、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８版、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８１３８１７４３９；２００１に見出すことができる。
【０１３４】
医薬組成物は、投与指示書と一緒に容器、パック、またはディスペンサー中に含めることができる。
【０１３５】
以下の実施例は例示的であり、限定的なものではない。
【実施例】
【０１３６】
抗体Ｍ１〜Ｍ３の溶液を、様々な塩濃度、すなわち、様々なイオン強度で、静的光散乱、動的光散乱、および非対称フローフィールドフローフラクショネーションによって評価した。
【０１３７】
抗体溶液の調製
すべての溶液は、適切な塩含有緩衝溶液中に、室温で、緩衝液を２回交換して一晩透析することによって調製した。
【０１３８】
機器による方法
静的光散乱
静的光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）を使用することによって、抗体溶液の重量平均分子量を測定した。静的光散乱実験のために、抗体溶液を４ｍｇ／ｍＬに希釈し、複数の試料を計測器中に手作業で注入した。この抗体溶液を、Ｗｙａｔｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＭｉｎｉ  Ｄａｗｎ計測器を使用して、複数の角度（４５、９０および１３５）での静的光散乱を利用して２０℃で測定した。９０°の散乱データを使用することによって、重量平均分子量を計算した。全データセット（複数の角度）を使用することによってジムプロットを作成し、これを使用して分子量および第２ビリアル係数を計算した。
【０１３９】
動的光散乱
動的光散乱を使用することによって、溶液中の抗体の粒径を測定した。抗体溶液は、Ｗｙａｔｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＤｙｎａＰｒｏ計測器を使用して、２５℃で９０°の角度で測定した。
【０１４０】
非対称フローフィールドフローフラクショネーション
溶液中の抗体の粒径を測定するために、非対称フローフィールドフローフラクショネーション（ＡＦ４）も使用した。ＡＦ４測定は、Ｗｙａｔｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＥｃｌｉｐｓｅ計測器で実施した。ＡＦ４分析パラメーターは以下の通りであった：温度２０℃、透析緩衝液と同じ実行緩衝液、１０ＫＤａのカットオフ膜。
【０１４１】
光学濃度
タンパク質試料の濁度は、４００ｎｍの波長でＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ＵＶ−Ｖｉｓを使用して、見かけの光学濃度（特定波長の光の吸光度）として測定した。
【実施例１】
【０１４２】
ＩｇＧ１抗体Ｍ１（Ｍｙｏ−０２９）の分析
抗体Ｍ１溶液は、塩濃度、すなわちイオン強度に応じて大きな乳光効果を示した。図１は、約２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質で、濃度が０ｍＭのＮａＣｌから１５０ｍＭのＮａＣｌまで増加する場合の、視覚的に認知できる乳光の変化を示す。０ｍＭのＮａＣｌから１００ｍＭのＮａＣｌの範囲の抗体Ｍ１溶液は、動的光散乱によっても分析し、試料は、約５ｍｇ／ｍＬに希釈した。収集したデータを表１に示す。図１は、漸増ＮａＣｌ濃度に曝された抗体Ｍ１（本明細書では、「Ｍｙｏ−０２９」とも呼ばれる）溶液の画像を示す（視覚的に認知できる乳光の増大を示している）。
【０１４３】
図２は、０ｍＭのＮａＣｌ溶液と１００ｍＭのＮａＣｌの抗体Ｍ１溶液についての動的光散乱のプロットを示し、そのデータは表１に含まれている。
【０１４４】
表１：抗体Ｍ１についての動的光散乱データ
【０１４５】
【表１】
2010506839.tif 000005
【０１４６】
ピーク２とピーク３の種の％質量の増加は、図１で視覚的に認知できる乳光の増大と相関する。０ｍＭのＮａＣｌ溶液中のピーク３の存在は、抗体Ｍ１については、低塩濃度でも少量の乳白色種が存在することを示す。
【０１４７】
抗体Ｍ１（２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質で）の１００ｍＭのＮａＣｌ溶液の非対称フローフィールドフローフラクショネーションにより、図３に示すように大きな種が示された。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（３ｍｇ／ｍＬに希釈された試料）では、図４に示すように、同様の抗体Ｍ１の１００ｍＭのＮａＣｌ溶液について、いかなる大きな種も識別することができなかった。
【０１４８】
抗体Ｍ１についての乳光効果の可逆性も検査した。抗体Ｍ１溶液を、０ｍＭのＮａＣｌから１００ｍＭのＮａＣｌまで、次いで０ｍＭのＮａＣｌに戻して透析した。抗体Ｍ１を１００ｍＭのＮａＣｌ溶液（最初は塩を含まない溶液中）中に一晩透析し、次いで１００ｍＭのＮａＣｌでの少量のこの物質を、塩を含まない溶液中に戻して一晩透析した。図５は、これら３つの抗体Ｍ１溶液についての、視覚的に認知できる乳光の変化を示す。図６は、乳白色の１００ｍＭのＮａＣｌの中間透析溶液、およびまた０ｍＭのＮａＣｌの最終透析溶液についての動的光散乱のプロットを示す。
【０１４９】
これらのデータは、抗体Ｍ１は、極端に大きな種を含有するが、この種は、０ｍＭのＮａＣｌで比較的少量で存在するだけであり、この大きな種の濃度は、塩濃度が増加すると増加することを示す。これらのデータは、大きな種は、非対称フローフィールドフローフラクショネーションを使用して識別することができるが、大きすぎてＳＥＣ−ＨＰＬＣカラム上で実行することができず、ベッディング（ｂｅｄｄｉｎｇ）によって破壊され、または希釈すると破壊されることも示す。幸いにも、この大きな種は、示したように動的光散乱を使用して分解し、分析することができる。
【実施例２】
【０１５０】
ＩｇＧ１抗体Ｍ２の分析
抗体Ｍ２溶液は、皮下抗体投与に関連した濃度範囲にわたって、大きな乳光効果を示さない。図７は、約２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質で、濃度が０ｍＭのＮａＣｌから１５０ｍＭのＮａＣｌまで増加する場合に、視覚的に認知できる乳光の変化がないことを示す。０ｍＭのＮａＣｌと１５０ｍＭのＮａＣｌの抗体Ｍ２溶液は、約５ｍｇ／ｍＬのタンパク質で動的光散乱によっても分析した。収集した動的光散乱データを表２に示す。図８は、０ｍＭのＮａＣｌ溶液と１５０ｍＭのＮａＣｌの抗体Ｍ２溶液についての動的光散乱のプロットを示し、そのデータは表２に含まれている。
【０１５１】
表２：抗体Ｍ２についての動的光散乱データ
【０１５２】
【表２】
2010506839.tif 000006
ａ「ピーク２」は、表１との比較目的のためだけに含まれている。
【０１５３】
これらのデータは、抗体Ｍ２は、皮下投与に関連する濃度範囲で、容易に認知できるほどの量の乳白色種を有していないことを示す。実際には、ピーク３の質量百分率は、１５０ｍＭのＮａＣｌレベルで、０ｍＭのＮａＣｌでの抗体Ｍについての質量百分率レベルに達するだけである。
【実施例３】
【０１５４】
抗体Ｍ３の分析
抗体Ｍ３溶液は、評価した濃度範囲にわたって大きな乳光効果を示さない。０ｍＭのＮａＣｌと１５０ｍＭのＮａＣｌの抗体Ｍ３溶液を、約５ｍｇ／ｍＬで動的光散乱によって分析した。収集した動的光散乱データを表３に示す。
【０１５５】
図９は、０ｍＭのＮａＣｌ溶液と１５０ｍＭのＮａＣｌの抗体Ｍ３溶液についての動的光散乱のプロットを示し、そのデータは表３に含まれている。
【０１５６】
表３：抗体Ｍ３についての動的光散乱データ
【０１５７】
【表３】
2010506839.tif 000007
ａ「ピーク２」は、表１との比較目的のために単に含まれている。
【０１５８】
これらのデータは、抗体Ｍ３は、評価した濃度範囲で、容易に認知できるほどの量の乳白色種を有していないことを示す。実際には、ピーク３の質量百分率は、１５０ｍＭのＮａＣｌレベルで、０ｍＭのＮａＣｌでの抗体Ｍ１についての質量百分率レベルよりもわずかに高い質量百分率レベルに達するだけである。
【実施例４】
【０１５９】
第２ビリアル係数の評価
静的光散乱を使用することによって、実施例１〜３で分析した抗体（抗体Ｍ１、抗体Ｍ２、および抗体Ｍ３）についての分子量と第２ビリアル係数（Ａ２）を求めた。第２ビリアル係数測定は、静的光散乱とジム分析を使用して求めることができる。実験は、複数の希薄なタンパク質試料を手作業で光散乱システム中に注入することによって行う。これらの複数の測定と正確な濃度を使用して、ジムプロットを構築することができる。これらのデータを表４に示す。
【０１６０】
表４：静的光散乱データから計算した分子量と第２ビリアル係数のデータ
【０１６１】
【表４】
2010506839.tif 000008
【０１６２】
第２ビリアル係数のデータは、正のビリアル係数を有する抗体Ｍ２および抗体Ｍ３と比較した場合、抗体Ｍ１の凝集／会合傾向、すなわち、負の第２ビリアル係数を示す。図１０は、１００ｍＭのＮａＣｌでの抗体Ｍ１についての第２ビリアル係数のプロットを示し、図１１は、０．１から１．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度範囲の、１５０ｍＭのＮａＣｌでの抗体Ｍ２についての第２ビリアル係数のプロットを示す。これらのデータは、第２ビリアル係数は、特定の抗体についての乳光の予測変数として使用することができることを示す。
【実施例５】
【０１６３】
抗体Ｍ１における乳光への塩の素性および塩濃度の効果
抗体Ｍ１の乳光への塩の素性の効果を評価するために、いくつかの実験を行った。
【０１６４】
時間に対する塩の素性による乳光の変化
４つの６３ｍｇ／ｍＬの抗体Ｍ１溶液、すなわち、塩をまったく含まない対照溶液、１００ｍＭのＮａＨＰＯ４を含む溶液、１００ｍＭのＮａＣｌを含む溶液、および１００ｍＭのＣａＣｌ２を含む溶液を調製した。次いでこれらの溶液を、室温で１時間静置させた。１時間後のこれらの溶液の画像を図１２に示す。図１２で分かるように、１時間後の乳光の順序は、ＮａＣｌ＞ＮａＨＰＯ４＞ＣａＣｌ２である。この画像は、乳光は、塩素イオンの存在にもっぱら関係するのではない、すなわち、ＮａＨＰＯ４溶液も乳光を増大させることを示す。
【０１６５】
次いでこれらの同じ溶液を、２〜８℃に２週間維持した。２週間後のこれらの溶液の画像を図１３に示す。図１３に示したこれらの溶液のそれぞれは、２〜８℃で２週間後にゲル化することを示し、乳光を増大させた。しかし、ゲル化および乳光の程度は、塩の種類および濃度に依存した。乳光の順序は、１時間後と同じ、すなわちＮａＣｌ＞ＮａＨＰＯ４＞ＣａＣｌ２であった。今回は示していないが、塩ＭｇＣｌ２も試験し、これは、以下のようなスキーム、すなわち、ＮａＣｌ＞ＮａＨＰＯ４＞ＭｇＣｌ２＞ＣａＣｌ２にあてはまった。
【０１６６】
塩の素性および温度サイクリングによる乳光の変化
４００ｎｍでの光学濃度の変化を使用することによって、温度サイクリングの間の乳光への塩の素性の効果をモニターした。この実験のために、４つの４０ｍｇ／ｍＬの抗体Ｍ１溶液、すなわち、塩をまったく含まない対照溶液、１００ｍＭのＮａＨＰＯ４を含む溶液、１００ｍＭのＮａＣｌを含む溶液、および１００ｍＭのＣａＣｌ２を含む溶液を調製した。これらの溶液を、２〜８℃から室温まで３サイクル繰り返した。２〜８℃から室温までと２〜８℃に戻すまでの各サイクルは、２４時間かけた。ＯＤ４００ｎｍ対サイクル数のプロットを図１４に示す。ＮａＣｌ溶液についての増加しているＯＤ４００ｎｍ値は、例えば、二次構造の形成の増大を示す。したがって、図１４のデータは、液体とゲルの間のサイクリングにより、乳光が増大する可能性があることを示す。
【０１６７】
塩の素性および塩濃度による乳光の変化
塩濃度の変化に対する高分子量の百分率を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによってモニターした。この実験のために、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、およびＮａＨＰＯ４の溶液を、０、５、１０、および２０ｍＭの濃度で調製した。高分子量物質の百分率を各試料について測定した。高分子量の百分率対濃度のプロットを図１５に示す。高分子量種の百分率は、ＣａＣｌ２を除く各塩で増加する。
【０１６８】
塩の素性および塩濃度による光学濃度の変化
４００ｎｍでの光学濃度の変化を使用することによって、乳光への塩の素性および塩濃度の効果をモニターした。この実験のために、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＮａＣｌの塩を使用して一連の抗体Ｍ１溶液を調製した。ＯＤ４００ｎｍ対塩濃度のプロットを図１６に示す。図１７は、図１６のデータの拡大した領域を示す。これらのデータは、高分子量種は、ＮａＣｌの濃度が増加すると増加するが、ＣａＣｌ２とＭｇＣｌ２についてはわずかに増加するだけであることを示す。
【０１６９】
２０ｍＭのＣａＣｌ２中の抗体Ｍ１濃度に対する光学濃度の変化
最後に、４００ｎｍでの光学濃度の変化を使用することによって、２０ｍＭのＣａＣｌ２溶液中で抗体Ｍ１の濃度を変化させることの効果をモニターした。この実験のために、１０、２０、５０、６０、および７５ｍｇ／ｍＬの抗体Ｍ１の溶液を、２０ｍＭのＣａＣｌ２中で調製した。ＯＤ４００ｎｍ対抗体Ｍ１の濃度のプロットを図１８に示す。これらのデータは、抗体Ｍ１の濃度が増加するとともに高次構造が増加することを示す。
【０１７０】
実施例５についてのすべてのデータに関して、いくつかの知見を得ることができる。乳光効果は、以下の様式、すなわち、ＮａＣｌ＞Ｎａ２ＰＯ４＞ＭｇＣｌ２＞ＣａＣｌ２で塩に依存する。所与のタンパク質濃度については、乳光は、塩濃度が増加するにつれて最初は増大し、次いで横ばい状態になるか、低下する。乳光は、タンパク質濃度とともに増大する。評価したすべての塩により、２〜８℃で抗体Ｍ１はゲル化し、ゲル化のタイミングは塩に依存し、乳光のレベルに関係するように思われる。
【０１７１】
本発明で使用される抗体は、抗体Ｍ１（本明細書では「Ｍｙｏ−０２９」とも呼ばれる）、抗体Ｍ２、および抗体Ｍ３であることが好ましい。抗体製剤（抗体Ｍ１、抗体Ｍ２、または抗体Ｍ３を含有していることが好ましい）のイオン強度が、本発明によって低減または減少する場合、イオン強度の低減または減少は、イオン強度と抗体濃度の比が低減するように通常実施される。
【０１７２】
本明細書で述べたすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。
【０１７３】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図１】
2010506839.tif 000009
【図２】
2010506839.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
2010506839.tif 000013
【図６】
2010506839.tif 000014
【図７】
2010506839.tif 000015
【図８】
2010506839.tif 000016
【図９】
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【図１０】
2010506839.tif 000018
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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2010506839.tif 000028
2010506839.tif 000029
2010506839.tif 000030
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