(57)【要約】  本発明は、チオペプチド生合成のための前駆体タンパク質および対応する構造遺伝子ならびにその使用に関する。本発明はまた、チオペプチド前駆体タンパク質またはチオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子を発現する宿主細胞を遺伝的に操作してチオペプチド化合物またはそれらの誘導体を生産する方法に関する。本発明はさらに、チオペプチド生合成に関与する遺伝子のクローニングおよび特徴付けならびにチオペプチド化合物生産におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号１；
（ｉｉ）配列番号５；
（ｉｉｉ）配列番号１１；
（ｉｖ）または配列番号１、配列番号５または配列番号１１と比較して、１、２、３、４、５、６または１０個以下の欠失、挿入および／または置換アミノ酸を有する前記アミノ酸の変異体
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むチオペプチド前駆体タンパク質。
【請求項２】
前駆体がＥｆ−ｔｕチオペプチド阻害剤の生合成前駆体である、請求項１のチオペプチド前駆体タンパク質。
【請求項３】
Ｅｆ−ｔｕ阻害剤がＧＥ２２７０Ａ、ＧＥ３７６４８Ａ、アミチアマイシンまたは下記式Ｉ−ＸＩ
【化１】
2010535481.tif 000021
【化２】
2010535481.tif 000022
【化３】
2010535481.tif 000023
【化４】
2010535481.tif 000024
【化５】
2010535481.tif 000025
【化６】
2010535481.tif 000026
の何れかで示される化合物から成る群から選択される、請求項２のチオペプチド前駆体タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかのチオペプチド前駆体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５】
配列番号５のヌクレオチド配列を含む請求項４の核酸。
【請求項６】
配列番号６のヌクレオチド配列または少なくとも配列番号５を含むその何れかのフラグメントを含む、請求項５の核酸。
【請求項７】
核酸配列が異種転写および翻訳制御配列と作動可能に連結している、請求項４〜６の何れかの核酸。
【請求項８】
核酸が発現ベクターである、請求項７の核酸。
【請求項９】
チオペプチドの生合成のためのポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号２３〜３４の何れか１種、
（ｉｉ）（ｉ）に列挙した対応する野生型アミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６または１０個以下の欠失、挿入または置換アミノ酸を有し、実質的に同じ酵素機能を保持している（ｉ）に列挙したアミノ酸配列の変異体
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１０】
請求項９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１１】
核酸配列が異種転写および翻訳制御配列と作動可能に連結している、請求項１０の核酸。
【請求項１２】
核酸が天然には宿主細胞のゲノム中に見出されない、請求項４〜６の何れかの核酸を含む宿主細胞。
【請求項１３】
さらにチオペプチドの生合成に必要な他の遺伝子を含む、請求項１２の宿主細胞。
【請求項１４】
チオペプチドの生合成に必要な他の遺伝子が請求項１０〜１１の何れかに定義の核酸を含む、請求項１３の宿主細胞。
【請求項１５】
ノノムラエ（Nonomuraea）属菌株、プラノビスポラ（Planobispora）属菌株、アミコラトプシス（Amycolatopsis）属菌株、大腸菌、コリネバクテリウム属菌株、バチルス属菌株およびストレプトマイセス属菌株、例えばストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・セリカラー、ストレプトマイセス・アルブス、ストレプトマイセス・ラモシシムス（ramocissimus）、ストレプトマイセス・コリヌス、ストレプトマイセス・フラディアエ、ストレプトマイセス・アズレウスまたはストレプトマイセス・グリセウスから成る種の群から選択される請求項１３または１４の何れかの宿主細胞であって、当該宿主細胞がチオペプチドに耐性を有する宿主細胞。
【請求項１６】
変異微生物であって、対応する野生型微生物と比較して、請求項１〜８の何れかに定義のチオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子を発現しない変異微生物。
【請求項１７】
変異が対応する野生型微生物において請求項１〜８の何れかに定義のチオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子の破壊（disruption）である、請求項１６の変異微生物。
【請求項１８】
微生物がノノムラエ（Nonomuraea）属菌株であり、変異が配列番号１５または配列番号１６を含む遺伝子の破壊である、請求項１７の変異微生物。
【請求項１９】
変異がさらに、請求項１〜８の何れかの核酸で形質転換されている、請求項１６〜１８の何れかの変異微生物。
【請求項２０】
請求項９に定義の１種以上のポリペプチドをコードする１個以上の遺伝子を発現しない、変異微生物。
【請求項２１】
チオペプチドの生合成のためのポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号４７〜６０の何れか１種、
（ｉｉ）（ｉ）に列挙した対応する野生型アミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６または１０個以下の欠失、挿入または置換アミノ酸を有し、実質的に同じ酵素または制御機能を保持している（ｉ）に列挙したアミノ酸配列の変異体
（ｉｉｉ）（ｉ）に列挙した対応するポリペプチドの１種と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有し、実質的に同じ酵素または制御機能を保持している（ｉ）に列挙したアミノ酸配列の変異体
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２２】
請求項２１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項２３】
核酸が異種転写および翻訳制御配列と作動可能に連結している、請求項２２の核酸。
【請求項２４】
核酸が天然には宿主細胞のゲノム中に見出されない、請求項２２または２３の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２５】
さらにチオペプチドの生合成に必要な他の遺伝子を含む、請求項２４の宿主細胞。
【請求項２６】
チオペプチドの生合成に必要な他の遺伝子が、請求項４〜８の何れかのチオペプチド前駆体タンパク質をコードする核酸および請求項１０〜１１の何れかの核酸からなる群の１個以上から選択される、請求項２５の宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２１に定義の１個以上のポリペプチドをコードする改変（tailoring）遺伝子の１個以上の発現を欠いた、チオペプチドの生産が可能な変異微生物。
【請求項２８】
チオペプチド前駆体タンパク質を生産する方法であって、請求項１２、１３、１５または２４〜２６の宿主細胞を前記チオペプチド前駆体タンパク質の生産に適した条件下で培養する工程を含む方法。
【請求項２９】
チオペプチド化合物を生産する方法であって、請求項１２、１３、１４、１５または２４〜２６の宿主細胞を前記チオペプチド化合物の生産に適した条件下で培養する工程を含む方法。
【請求項３０】
さらにチオペプチド前駆体またはチオペプチド化合物を実質的に純粋な形態に単離することを含む、請求項２８または２９の方法。
【請求項３１】
チオペプチド化合物がＧＥ２２７０Ａ、ＧＥ３７６４８Ａ、請求項５に示す式Ｉ〜ＸＩの何れかで示す化合物、アミチアマイシン、マイクロコクシン、チオストレプトン、ノシヘプタイド、チオシリン、チオシン類、ノカチアシン類、ベルニナマイシン、Ａ１０２５５Ｂおよびラダマイシンから成る群から選択される、請求項２９または３０の何れかの方法。
【請求項３２】
チオペプチド誘導体を生産する方法であって、
（ｉ）宿主細胞内での変異チオペプチド前駆体をコードする配列の遺伝子発現によって、宿主細胞内で変異チオペプチド前駆体を合成し、
（ｉｉ）変異チオペプチド前駆体からチオペプチド誘導体を合成すること
を含む方法。
【請求項３３】
変異チオペプチド誘導体前駆体が請求項１〜１１の何れかに定義の配列番号１、配列番号５または配列番号１１の変異体である、請求項３２の方法。
【請求項３４】
工程ｉｉ）がインビトロで実施される、請求項３２または３３の方法。
【請求項３５】
工程ｉｉ）が工程ｉ）と同じ宿主細胞中でインビボで実施される、請求項３２または３３の方法。
【請求項３６】
チオペプチドまたはチオペプチド誘導体を生産する方法であって、
（ｉ）請求項１〜３の何れかに定義のチオペプチド前駆体タンパク質を含む培養培地を得て、
（ｉｉ）さらにチオペプチドの生合成に必要な他の遺伝子を含む微生物を、前記培養培地中で培養すること
を含む方法。
【請求項３７】
チオペプチドの生合成に必要な他の遺伝子が配列番号２３〜３４および配列番号４７〜６０から選択されるポリペプチドをコードするものから選択される、請求項３６の方法。
【請求項３８】
微生物がノノムラエ（Nonomuraea）属菌株、プラノビスポラ（Planobispora）属菌株、アミコラトプシス（Amycolatopsis）属菌株およびストレプトマイセス属菌株、例えばストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・セリカラー、ストレプトマイセス・アルブス、ストレプトマイセス・ラモシシムス（ramocissimus）、ストレプトマイセス・コリヌス、ストレプトマイセス・フラディアエ、ストレプトマイセス・アズレウスもしくはストレプトマイセス・グリセウスから成る種の群から選択される請求項３６または３７の方法であって、前記微生物がチオペプチドまたはチオペプチド誘導体に対する耐性について選択された菌株である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チオペプチド生合成のための前駆体タンパク質および対応する構造遺伝子ならびにそれらの使用に関する。本発明はまた、チオペプチド前駆体タンパク質またはチオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子を発現する宿主細胞を遺伝的に操作してチオペプチド化合物またはそれらの誘導体を生産する方法に関する。本発明はさらに、チオペプチド生合成に関与する遺伝子のクローニングおよび特徴付けならびにチオペプチド化合物生産におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
チオペプチドは天然に生じる、硫黄の豊富な、高度に修飾された大環状ペプチドであり、これらの多くは強力な抗菌活性を有する。これらの複雑な天然生成物は、Berdyによる抗生物質の化学的分類に従ってチアゾリルペプチドとして分類され（Berdy J. ‘Recent developments of antibiotic research and classification of antibiotics according to chemical structure. ’Adv Appl Microbiol. 1974;18(0):309-406）、チオストレプトン、ノシヘプタイド、マイクロコクシン、ノカチアシン、アミチアマイシン、ＧＥ２２７０Ａ等を含む。チオペプチドは多数の共通した構造的特徴：チアゾール、オキサゾールおよびインドールを含む修飾ヘテロ環式残基とデヒドロアミノ酸から成る大環状フレームワークの一部である中心ポリアゾールドメインに集合した三または四置換窒素ヘテロ環を有する。このチオペプチドの大環状構造がチオペプチドを他のチアゾリル、例えばブレオマイシン、バシトラシンまたはマイクロシンＢ１７と区別する特徴である。チオペプチド抗生物質を中心ヘテロ環式ドメインの構造および酸化状態に従ってグループ分けすることを最初に提案したのはHensensであった（O.D. Hensens and G. Albers-Schoengerg. ‘Total structure of the peptide antibiotic components of thiopeptin by 1H and 13C NMR spectroscopy.’Tetrahedron Lett. 1978, 3649）。Cardiff UniversityのMark Bagleyらによる最近のレビューは、５種類の異なる中心ヘテロ環式ドメイン：四置換デヒドロピペリジンまたは飽和ピペリジン、ジヒドロイミダゾピペリジン、三置換ピリジンおよび四置換ヒドロキシピリジンを説明するためHensensの分類システムを敷衍している（Bagley et al. ‘Thiopeptide antibiotics.’ Chem Rev. 2005 Feb;105(2):685-714）。
【０００３】
かなりの構造的相同性にも拘わらず、チオペプチド抗生物質の作用部位および形態（タンパク質合成の阻害）は２個の機能的クラス：Ｌ１１結合ドメインとして知られる２３ＳリボソームＲＮＡの領域と結合するものと、伸長サイクルに関与するＥｆ−Ｔｕタンパク質複合体に結合するものとに分類することができる。ストレプトマイセス・アズレウスの二次代謝産物として１９５４年に初めて単離されたチオストレプトンは、典型的なチオペプチド群の化合物としばしば見なされる（Donovick et al. ‘Thiostrepton, a new antibiotic.’ Antibiot Annu. 1955-1956;3:554-9 および Bagley et al.  ‘Thiopeptide antibiotics.’ Chem Rev. 2005 Feb;105(2):685-714）。
【０００４】
チオペプチドは、非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）と呼ばれる大きな多酵素複合体を用いる非リボソームプロセスによって合成されると仮定された（Mocek et al. ‘Biosynthesis of the modified peptide antibiotic thiostrepton in Streptomyces azureus and Streptomyces laurentii'. J.Am.Chem.Soc.1993, 115, 7992 - 8001）。ＮＲＰＳ集合大環状分子の例は、真菌トリポクラジウム・インフラタムによって生産される免疫抑制ペプチド、シクロスポリンである。ＮＲＰＳ集合ペプチドはタンパク質において典型的に見出される一般の２０個のＬ−アミノ酸に制限されない。むしろ、これらの酵素は数百の異常アミノ酸および派生残基のより広いレパートリーを組み込む生合成能を有する。
【０００５】
University of WashingtonのHeinz Flossらの実施した予備試験は、チオペプチドが実際に非リボソーム経路によって生産されることを示唆する。このグループは、リボソームタンパク質合成を阻害するレベルのクロラムフェニコールで培地を処理した。しかし、チオペプチドのデノボ合成が継続した。チオストレプトンまたは関連ノシヘプタイドを表わすアミノ酸配列に由来するオリゴヌクレオチドは、それぞれの生産生物由来のゲノムＤＮＡのサザンブロットを探索するために用いるとき、何れの相同配列ともハイブリダイズしなかった（T. M. Smith, Y.-F. Jiang, H. G. Floss. “Biotechnology of Antibiotics”の‘Thiopeptide Antibiotics” W. R. Strohl, Ed., 2nd Ed., Marcel-Dekker, New York, 1997, pp 393-413）。
【０００６】
さらに、マイクロコクシン合成酵素複合体のモジュールをコードすると仮定されているＮＲＰＳ遺伝子フラグメントが生産株で同定されている（Carnio et al. ‘Pyridinyl polythiazole class peptide antibiotic micrococcin P1, secreted by foodborne Staphylococcus equorum WS2733, is biosynthesized nonribosomally.’ Eur J Biochem. 2001 Dec;268(24):6390-401.）。
【０００７】
しかし今日まで、チオペプチド生合成経路の説明は公開されていない。
【０００８】
したがって、チオペプチド生合成に関与する遺伝子を同定して、効果的なチオペプチド生産のためのツールおよび別のチオペプチド構造を創出する可能性を提供する必要がある。本発明はこの必要を満たし、染色体にコードされるチオペプチドの生合成のための主鎖（backbone）およびチオペプチドの生合成に関与する重要な生合成酵素を初めて開示する。
【発明の概要】
【０００９】
１．  チオペプチド生合成の出発物質としての、染色体にコードされた主鎖
本発明において、例えば放線菌類において、染色体にコードされた主鎖がチオペプチド生合成のための出発物質であるという明確な証拠を実際に見出した。
【００１０】
第１の局面において、本発明は、
（ｉ）配列番号１；
（ｉｉ）配列番号５；
（ｉｉｉ）配列番号１１；および
（ｉｖ）前記アミノ酸配列の何れかの変異体
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むチオペプチド前駆体タンパク質に関する。
【００１１】
本明細書において使用するとき、用語「チオペプチド」は、他のチアゾリル化合物、例えばブレオマイシン、バシトラシンまたはマイクロシンＢ１７と異なり、チアゾール、オキサゾールおよびインドールを含む修飾ヘテロ環式残基とデヒドロアミノ酸から成る大環状フレームワークの一部である中心ポリアゾールドメインに集合した三または四置換窒素ヘテロ環によって特徴付けられるBerdyによる抗生物質の化学的分類に従うチアゾリルペプチドを意味する。
【００１２】
用語「チオペプチド前駆体タンパク質」は、インビトロまたはインビボチオペプチド合成の出発物質として使用することができる遺伝子にコードされたポリペプチド主鎖を意味する。好ましくは、該チオペプチド前駆体は細菌伸長因子Ｅｆ−Ｔｕの阻害剤の前駆体である。Ｅｆ−ｔｕ阻害剤は例えば、Hogg T, Mesters JR および Hilgenfeld R.によるレビューに記載されている（‘Inhibitory mechanisms of antibiotics targeting elongation factor Tu.’ Curr Protein Pept Sci. 2002 Feb;3(1):121-31）。周知のＥｆ−ｔｕ阻害剤の例は、ＧＥ２２７０Ａ（Selva et al. ‘Antibiotic GE2270A: a novel inhibitor of bacterial protein synthesis. I. Isolation and characterization.’ J Antibiot (Tokyo). 1991 Jul; 44(7): 693-701. に定義されている）、ＧＥ３７６４８Ａ（Stella et al. ‘Antibiotic GE37468 A: a new inhibitor of bacterial protein synthesis. I. Isolation and characterization.’ J Antibiot (Tokyo). 1995 Aug; 48(8): 780-6. Erratum in: J Antibiot (Tokyo) 1995 Dec; 48(12): C-3に定義されている）およびアミチアマイシン（‘Novel antibiotics, amythiamicins.' J Antibiot (Tokyo). 1994 Jun;47(6):668-74, 1145-52 および 1153-9.に定義されている）である。新規なＥｆ−ｔｕ阻害剤はまた、国際特許出願番号第PCT/US07/025955号（２００７年１２月１９日出願）にも記載されている。かかる新規なＥｆ−ｔｕ阻害剤は、より具体的には、次に示す式Ｉ〜ＸＩの化合物（その薬学的に許容される塩、ならびにそのエナンチオマー、立体異性体、回転異性体、互変異性体、ジアステレオマーまたはラセミ体を含む）を含む：
【化１】
2010535481.tif 000002
【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【００１３】
かかる前駆体タンパク質のアミノ酸配列は、チオペプチドの最終構造に重要である。これは後記に詳細に説明されるとおり、本発明のチオペプチド前駆体タンパク質は、新規に同定されたチオペプチドの主鎖を複製し、例えば改善された特性を有する既知のチオペプチドの新規な誘導体を創出するために使用することができる。
【００１４】
したがって本発明は、配列番号１、配列番号５または配列番号１１の前駆体タンパク質だけでなく、チオペプチド誘導体の生合成に有用であり得る何れかの変異体にも関する。当業者は合成するチオペプチドのアミノ酸主鎖によってどのように前記変異体を設計するかを知っている。配列番号１において、１４個のアミノ酸主鎖に含まれる６個のシステインは、これらの分子を修飾するチアゾールヘテロ環の前駆体である。さらに、２個のセリン残基は、大環状構造と側鎖の連接でのピリジン環系の形成に関与する。ＧＥ２２７０Ａ分子のチオペプチド側鎖においてさらなるオキサゾリンおよびが見出され、式Ｉ〜ＸＩの新規なＥｆ−Ｔｕ阻害剤において、セリンアミノ酸のヘテロ環化および脱水によって形成されるデヒドロアラニン残基が、それぞれ見出される。
【００１５】
具体的な態様において、配列番号１、配列番号５または配列番号１１の変異体は、元の配列と比較して、１、２、３、４、５、６または１０個以下の欠失、挿入または置換アミノ酸を有する。置換アミノ酸は同等の官能基もしくは異なる官能基を有する天然アミノ酸または非天然アミノ酸の何れかであってよい。
【００１６】
次の表１は、対応する特定のチオペプチドの生合成に使用することができるチオペプチド前駆体タンパク質配列（配列番号１〜１４）を示す。
表１．  チオペプチドアミノ酸主鎖の一次配列アラインメント。該アラインメントは、特徴的な多置換窒素ヘテロ環を形成する２個の不変セリン分子によって拘束される大環状構造に集中させる。チオストレプトンは４アミノ酸の付加的アミノ酸伸長を有する。
【表１】
2010535481.tif 000008
【００１７】
任意のアミノ酸、ペプチドおよびタンパク質配列を記述するために、本明細書において次の標準コード文字を用いる：Ａ、アラニン；Ｒ、アルギニン；Ｎ、アスパラギン；Ｄ、アスパラギン酸；Ｃ、システイン；Ｑ、グルタミン；Ｅ、グルタミン酸；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉ、イソロイシン；Ｌ、ロイシン；Ｋ、リシン；Ｍ、メチオニン；Ｆ、フェニルアラニン；Ｐ、プロリン；Ｓ、セリン；Ｔ、スレオニン；Ｗ、トリプトファン；Ｙ、チロシン；Ｖ、バリン。
【００１８】
より一般に、一つの具体的な態様において、配列番号１のアミノ酸配列の変異体は次の式：ＳＸＮＣＸＣＸＸＣＣＳＣＳＸ（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）を有する。より好ましくは、配列番号１の変異体は次の式：ＳＸ１ＮＣＸ２ＣＸ３Ｘ４ＣＣＳＣＳＸ５（式中、Ｘ１はＣまたはＳであり、Ｘ２はＶまたはＦであり、Ｘ３はＧまたはＹであり、Ｘ４はＦ、Ｐ、ＩまたはＶであり、Ｘ５はＰまたはＳである）を含む。かかる変異体の例は、配列番号２〜４の前駆体タンパク質である。
【００１９】
別の具体的な態様において、配列番号５のアミノ酸配列の変異体は、次の式：ＳＣＸ１Ｘ２Ｘ３ＣＸ４ＣＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（式中、Ｘ１はＴまたはＶ、好ましくはＴであり、Ｘ２はＴまたはＧ、好ましくはＴであり、Ｘ３はＣまたはＳ、好ましくはＣであり、Ｘ４は任意のアミノ酸、好ましくはＶ、Ｉ、ＥまたはＡであり、Ｘ５は任意のアミノ酸、好ましくはＴ、Ｃ、ＶまたはＡであり、Ｘ６およびＸ７は、独立してＣまたはＳ、好ましくはＣであり、Ｘ８はＣまたはＳであり、Ｘ９はアミノ酸残基が存在しないかあるいはＴまたはＳである）を含む。かかる変異体の例は、配列番号６〜１０の前駆体タンパク質である。
【００２０】
別の具体的な態様において、配列番号１１のアミノ酸配列の変異体は、次の式：ＳＣＸ１Ｘ２ＳＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＳＳＳＳＳＳ（式中、Ｘ１はＴまたはＶ、好ましくはＴであり、Ｘ２はＴまたはＧ、好ましくはＴであり、Ｘ３はＳ、ＧまたはＡであり、Ｘ４はＶ、ＣまたはＡであり、Ｘ５はＳ、ＴまたはＡであり、Ｘ６はＣまたはＳである）を含む。かかる変異体の例は、配列番号１２〜１４の前駆体タンパク質である。
【００２１】
２．  チオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子の核酸
本発明はさらに、チオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子および／またはオープンリーディングフレームの核酸を提供する。より具体的には、本発明は上記定義のチオペプチド前駆体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００２２】
「核酸」は、一本鎖形態または二本鎖らせん形態のリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態またはその何れかのホスホエステルアナログ、例えばホスホロチオエートおよびチオエステルを意味する。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡらせんが可能である。用語核酸および特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、該分子の１次または２次構造のみを意味し、何れかの具体的な３次形態によって限定されない。したがって、この用語は、特に直線状（例えば制限断片）または環状ＤＮＡ分子、プラスミドおよび染色体において見られる二本鎖ＤＮＡを含む。
【００２３】
「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を実施したＤＮＡ分子である。
【００２４】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸における連続ヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）であり、２個以上のヌクレオチドのあらゆる鎖を意味する。ヌクレオチド配列は典型的には、タンパク質および酵素を生産する細胞機構によって使用される情報を含む、遺伝情報を担持する。これらの用語は、二本鎖または一本鎖ゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、何れかの合成および遺伝子的に操作されたポリヌクレオチドならびに（本明細書においてセンス鎖のみが示されていても）センスおよびアンチセンス両方のポリヌクレオチドを含む。これは一本鎖および二本鎖分子、すなわちＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む。これはまた、修飾塩基、例えばチオウラシル、チオグアニンおよびフルオロウラシルを含む核酸を含む。
【００２５】
本明細書において、核酸は天然制御（発現制御）配列に隣接するか、あるいはプロモーターを含む異種配列、他のリボソーム結合部位配列、制御応答因子、シグナル配列等と関連していてもよい。核酸はまた、当該技術分野において既知の多様な方法で修飾されていてもよい。かかる修飾の例は、メチル化、「キャップ」、１個以上の天然に生じるヌクレオチドのアナログでの置換、ならびにヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合によるもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメート等）および荷電結合によるもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
用語「遺伝子」あるいは「構造遺伝子」は、１個以上のタンパク質の全部または一部を含む特定のアミノ酸配列をコードするか、あるいはそれに対応するＤＮＡ配列を意味し、例えば遺伝子が発現される条件を決定する制御ＤＮＡ配列、例えばプロモーターを含んでいても、含んでいなくともよい。構造遺伝子でない遺伝子がＤＮＡからＲＮＡに転写されることもあるが、アミノ酸に翻訳されない。他の遺伝子は、構造遺伝子の制御因子としてまたはＤＮＡ転写の制御因子として機能し得る。
【００２７】
「コード配列」または発現生成物を「コードする」配列、例えばＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素は、発現されたとき当該ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素を生産するヌクレオチド配列であり、すなわち該ヌクレオチド配列は当該ポリペプチド、タンパク質または酵素のアミノ酸配列をコード化する。あるタンパク質のコード配列は、開始コドン（通常ＡＴＧまたはＧＴＧ）および終止コドンを含んでいてもよい。
【００２８】
ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をＲＮＡ、特にｍＲＮＡに転写し、該コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳されるとき、コード配列は細胞内で発現制御配列の「制御下にある」か、あるいは「作動可能に連結している」。
【００２９】
用語「異種」は、天然には生じない要素の組合せを意味する。例えば、異種ＤＮＡは当該細胞または細胞の染色体位置において天然には存在しないＤＮＡを意味する。好ましくは、異種ＤＮＡは細胞にとって異質な遺伝子を含む。例えば本発明は、ＤＮＡ配列と該ＤＮＡ配列の一部ではない異種ＤＮＡ配列を含むキメラＤＮＡ分子を含む。この文脈において、異種ＤＮＡ配列はチオペプチド生合成遺伝子クラスター配列内に天然には位置しないＤＮＡ配列を意味する。あるいは、異種ＤＮＡ配列は天然には生じない位置で生合成遺伝子クラスター内に天然に存在し得る。異種発現制御因子は天然で作動可能に連結しているものとは異なる遺伝子と作動可能に連結している因子である。本発明の文脈において、興味のあるタンパク質をコードする遺伝子は、クローニングまたは発現のために挿入されるベクターＤＮＡに対して異種であり、それを発現させるベクターを含む宿主細胞に対して異種である。
【００３０】
用語「発現制御配列」は、組み合わさってコード配列の転写を制御するプロモーター、何れかのエンハンサー因子または抑制因子（例えば複製起点）を意味する。用語「発現する」および「発現」は、遺伝子またはＤＮＡ配列内の情報を明らかにする、例えば対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化してタンパク質を生産することができるか、あるいはそれを引き起こすことを意味する。ＤＮＡ配列は細胞においてまたはそれによって発現されて、タンパク質のような「発現生成物」を形成する。発現生成物それ自体、例えば得られるタンパク質は、細胞によって「発現された」と言うこともできる。発現生成物は細胞内、細胞外または分泌として特徴付けることができる。用語「細胞内」は、細胞内に存在するものを意味する。用語「細胞外」は、細胞の外に存在するものを意味する。細胞上または中から細胞の外へ、顕著にそれが測定されるとき、物質は細胞によって「分泌」されている。
【００３１】
用語「形質転換」は、宿主細胞が導入された遺伝子または配列を発現して所望の物質、典型的には導入遺伝子または配列によってコードされるタンパク質または酵素を生産する、「外来」（すなわち外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の細胞への導入を意味する。導入された遺伝子または配列はまた、「クローン化」または「外来」遺伝子または配列と呼ぶこともでき、制御または調節配列、例えば開始、終止、プロモーター、シグナル、分泌または細胞遺伝的機構によって使用される他の配列を含んでいてもよい。遺伝子または配列は、非機能的配列または未知の機能を有する配列を含んでいてもよい。導入ＤＮＡまたはＲＮＡを受け取って発現する宿主細胞は、「形質転換され」ており、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されたＤＮＡまたはＲＮＡは、あらゆる供給源、例えば宿主細胞と同じ属または種の細胞または異なる属または種の細胞に由来していてよい。
【００３２】
発明者らは、Ｅｆ−ｔｕ阻害剤チオペプチド産生ノノムラエ（Nomomuraea）属菌株のゲノムの小さな構造遺伝子であって、配列番号１および配列番号３の全ペプチド主鎖をコード化する遺伝子を同定することに成功した。該前駆体プレプロタンパク質の予測サイズはそれぞれ５７および４９アミノ酸であり、それぞれ配列番号１９および配列番号２０に示す。しかし、別の翻訳開始部位を指示し得る多数の開始コドンが存在する。この１４アミノ酸チオペプチド前駆体配列は、Ｃ末端に存在する。
【００３３】
非関連チオペプチドチオストレプトンの類似の構造遺伝子はまた、実施例４に示すとおり、ストレプトマイセス・アズレウスＥＴＨ２８５５５属菌株から同定し、これは配列番号６の全ペプチド主鎖をコードする。チオストレプトンの前駆体プレプロタンパク質の予測サイズは６０アミノ酸であり、配列番号６５に示す。
【００３４】
一つの態様において、本発明の核酸は、配列番号１の１４アミノ酸チオペプチド前駆体をコードする配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。他の態様において、本発明の核酸は、配列番号３の１４アミノ酸チオペプチド前駆体をコードする配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。本発明はさらに、配列番号１、配列番号５および配列番号１１およびその何れかの変異体、例えば表１に示す前記前駆体変異体のチオペプチド前駆体タンパク質をコードする何れかのヌクレオチド配列を含む。かかるヌクレオチド配列の例は、配列番号１および配列番号３および配列番号６のチオペプチド前駆体タンパク質をそれぞれコードする配列番号１７および１８または配列番号６５に示されている。
【００３５】
配列番号１５〜１９に由来するプローブまたはプライマーから開始して、既知のチオペプチド産生株から本発明のかかるヌクレオチド配列を単離および同定する方法は、当該技術分野において周知であり、かかる方法の一つの例が実施例４に示されている。例えば、本明細書に記載のとおり、チオペプチド産生株のゲノムＤＮＡは、１４アミノ酸前駆体タンパク質をコードする領域に隣接するプライマーを用いて増幅し、配列番号１７または配列番号１８から決定することができる。
【００３６】
他の態様において、本発明の核酸は、５７アミノ酸または４９アミノ酸プレプロタンパク質をそれぞれコードする配列番号１７または配列番号１８のヌクレオチド配列または少なくとも配列番号１５または配列番号１６を含むその何れかのフラグメントを含む。
【００３７】
また、該核酸の修飾も含む。かかる修飾は例えば、当該技術分野において既知のラベル、メチル化および縮重ヌクレオチドによる天然に生じるヌクレオチドの１個以上の置換を含む。これらの修飾は、発現、収率を増加し、そして／または選択した発現系での精製を改善し、または他の望ましい目的のためであり得る。
【００３８】
一つの態様において、本発明の核酸は、異種転写および翻訳制御配列と作動可能に連結している。より好ましくは、それは発現ベクターである。
【００３９】
本明細書において使用するとき、用語「発現ベクター」は、核酸を宿主細胞に導入して、導入した配列の発現をもたらすビークルを意味する。一つの態様において、ベクターは導入された核酸に対して異種であるが、宿主細胞によって認識され、使用されるプロモーターおよび１個以上の制御因子（例えばエンハンサー因子）を含む。他の態様において、ベクターに導入された配列は、宿主細胞によって認識され、使用され得る天然プロモーターを保持している。一つの態様において、本発明に適合するベクターは、シャトルベクターｐＳＥＴ１５２、ｐＯＪ４３６、ｐＯＪ４４６（Bierman et al. ‘Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp.' Gene. 1992 Jul 1;116(1):43-9）、ｐＨＭ１１ａ（Motamedi et al. ‘Integrative vectors for heterologous gene expression in Streptomyces spp.’ Gene. 1995 Jul 4;160(1):25-31）およびｐＩＪ８６００（Sun et al. ‘Green fluorescent protein as a reporter for spatial and temporal gene expression in Streptomyces coelicolor A3(2).'Microbiology. 1999 Sep;145 ( Pt 9):2221-7）ならびにそれらの誘導体である。他の態様において、ベクターはコスミドである。
【００４０】
「プロモーター」または「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合して下流（３’方向）コード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ制御領域である。本発明を定義するため、該プロモーター配列は、転写開始部位の３％末端で結合しており、バックグラウンド以上の検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基または因子を含むように上流（５’方向）に伸長する。プロモーター配列内で、転写開始部位（簡便に、例えばヌクレアーゼＳ１でのマッピングによって定義される）ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。該プロモーターはエンハンサーおよびリプレッサー配列を含む他の発現制御配列と作動可能に連結していてもよい。
【００４１】
一般型のベクターは「プラスミド」であり、これは一般に、通常は細菌起源の二本鎖ＤＮＡ（環であってもよい）の自己含有分子であり、容易に付加的（外来）ＤＮＡを受け入れることができ、好適な宿主細胞に容易に導入することができる。プラスミドベクターはしばしば、コードＤＮＡとプロモーターＤＮＡを含み、外来ＤＮＡの挿入に適した１個以上の制限部位を有する。組換えクローニングベクターはしばしば、クローニングまたは発現のための１個以上の複製システム、宿主における選択のための１個以上のマーカー、例えば抗生物質耐性および１個以上の発現カセットを含む。
【００４２】
ベクター構築物は、既知の技術の範囲内の常套の分子生物学および組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる。かかる技術は文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (herein “Sambrook et al., 1989”); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照されたい。あるいは、ベクター構築物は、CodonDevices（Cambridge, MA, USA; http://www.codondevices.com/）またはBlue Heron Biotechnology（Bothwell, WA, USA; http://www.blueheronbio.com/)のような構成生物学関連企業のＤＮＡ合成技術を用いて部分的にまたは完全に合成することができる。
【００４３】
３．  チオペプチド前駆体のコア大環状構造を作製するための重要な生合成酵素
２種の異なるチオペプチド産生株由来の２種のチオペプチド生合成遺伝子クラスターの特徴付けによって、本発明者らは、２種の株間で高度に保存的な遺伝子を同定し、したがってこれは、これらの遺伝子がチオペプチド前駆体からコアチオペプチド分子を合成するために必要な酵素をコードしていることを示唆している。図２および３は、２種の異なるチオペプチド産生株から特徴付けた生合成遺伝子クラスターのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の位置を示す。
【００４４】
別の局面において、本発明は、チオペプチドの生合成のためのポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号２３〜３４のいずれか１個；および
（ｉｉ）（ｉ）に列挙した対応する野生型アミノ酸配列と比較して、１，２、３、４、５、６または１０個以下の欠失、挿入または置換アミノ酸を有する（ｉ）に列挙したアミノ酸配列の変異体
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。
【００４５】
これらのポリペプチドは、チオペプチド分子の合成のための出発分子としてチオペプチド前駆体タンパク質を用いる１個以上の反応工程を実施するために、インビトロまたはインビボで使用することができる。変異体ポリペプチドは、対応する野生型配列と実質的に同じ触媒活性を有しているか、あるいは改善もしくは修飾された触媒活性を有していてもよい。単に読みやすくするために、これらのポリペプチドを以後「コア生合成酵素」と称する。
【００４６】
次の表２は、チオペプチド生合成に使用することができるコア生合成酵素（配列番号２３〜３４）の例と、それらの生合成経路における目的とする機能を説明する。目的とする機能は、後記実施例５．１および５．２に更に詳細に説明する。
【００４７】
表２：  チオペプチド前駆体タンパク質から開始するチオペプチド生合成のためのコア酵素の例
【表２】
2010535481.tif 000009
【００４８】
４．  コア生合成酵素をコードする遺伝子
本発明はさらに、コア生合成酵素をコードする遺伝子および／またはオープンリーディングフレームの核酸を提供する。より具体的には、本発明は、上記定義のコア生合成酵素の何れか１個をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００４９】
本発明者らは、Ｅｆ−ｔｕ阻害剤チオペプチド産生ノノムラエ（Nomomuraea）属菌株のゲノムの、対応するＥｆ−Ｔｕ阻害剤の生合成のために必須の酵素をコードしていると思われる構造遺伝子を同定することに成功した。
【００５０】
一つの態様において、Ｅｆ−ｔｕ阻害剤の生合成のための酵素をコードする核酸は、表２に記載のとおり、配列番号６２のゲノムフラグメントのＯＲＦ９、ＯＲＦ１０、ＯＲＦ１１、ＯＲＦ１２、ＯＲＦ１３およびＯＲＦ１５から成る群から選択される核酸を含む。他の態様において、本発明の核酸は、表２に記載のとおり、配列番号６３のゲノムフラグメントのＯＲＦ６、ＯＲＦ７、ＯＲＦ８、ＯＲＦ９、ＯＲＦ１０およびＯＲＦ１１から成る群から選択される核酸を含む。対応するゲノムフラグメント（５’から３’）における各遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）のヌクレオチド位置（コーディネート）も表２に示されている。
【００５１】
配列番号３５〜４６由来のプローブまたはプライマーを用いて、既知のチオペプチド産生株から本発明のヌクレオチド配列を単離し、同定する方法は当該技術分野において周知である。例えばチオペプチド産生株のゲノムＤＮＡは、各遺伝子の保存領域をコードする領域に隣接するプライマーを用いて増幅し、開示したヌクレオチド配列から決定することができる。
【００５２】
また、該核酸の修飾も含む。かかる修飾は例えば、当該技術分野において既知のラベル、メチル化および縮重ヌクレオチドによる天然に生じるヌクレオチドの１個以上の置換を含む。これらの修飾は、発現、収率を増加し、そして／または選択した発現系での精製を改善し、または他の望ましい目的のためであり得る。
【００５３】
一つの態様において、本発明の核酸は異種転写または翻訳制御配列に作動可能に連結している。より好ましくは、それはコア生合成酵素の全体または一部の宿主細胞における発現に好適な発現ベクターである。
【００５４】
５．  チオペプチド前駆体タンパク質および対応するチオペプチドの生産：
本発明者らによる染色体コード化主鎖の決定およびその結果チオペプチド生合成のためのリボソーム経路の決定は、一つの態様において、チオペプチド生合成経路、すなわち生合成遺伝子クラスターのクローン化および発現、したがって修飾宿主細胞または異種生物においてチオペプチド化合物の生産を当業者に可能とする。本発明はまた、異種宿主細胞、すなわち天然産生株とは別の株において発現されるチオペプチド前駆体の生産を可能とする。実施例は細菌株の使用を例示するが、本明細書に記載のとおり、あらゆる生物または発現系を用いることができる。生物の選択は当業者の必要に従う。例えば、チオペプチド化合物の修飾および生産を容易にするため、遺伝子操作に適した株が使用される。
【００５５】
したがって、他の局面において本発明は、チオペプチド前駆体タンパク質および／またはコア生合成酵素をコードする１個以上の上記核酸を含む宿主細胞であって、当該核酸が前記宿主細胞のゲノムに天然には見られず、そして／または前記宿主細胞は天然には対応するチオペプチドを生産しない、宿主細胞に関する。
【００５６】
あるいは、チオペプチドまたはチオペプチド誘導体の生産は、適切な量の上記定義のチオペプチド前駆体タンパク質を含む培養培地を得て、当該培養培地中でチオペプチド生合成に必要な他の遺伝子、例えばコア生合成酵素をコードする遺伝子をさらに含む微生物を培養することによって可能となる。
【００５７】
本明細書において使用するとき、用語「宿主細胞」または「微生物」は、細胞によるチオペプチド前駆体またはチオペプチドおよびそれらの誘導体の生産のための何れかの方法において、選択され、修飾され、形質転換され、増殖され、あるいは使用または操作される、あらゆる生物の何れかの細胞を意味する。例えば宿主細胞は、特定の遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、タンパク質または酵素を発現するように操作されているものであってよい。宿主細胞はさらに、次に記載されているスクリーニングまたは他のアッセイに使用することができる。宿主細胞はインビトロまたは非ヒト動物（例えばトランスジェニック動物または一時的にトランスフェクトした動物）の１個以上の細胞において培養することができる。
【００５８】
宿主細胞または微生物それ自体は、原核（例えば細菌）細胞、植物細胞ならびに真核細胞、例えば昆虫細胞、酵母細胞および哺乳類細胞を含むあらゆる生物から選択することができる。適切な宿主細胞の代表例は、細菌細胞、例えば大腸菌、ストレプトマイセス属および枯草菌細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞、例えばピチア属細胞またはサッカロマイセス属細胞、糸状菌、例えばトリコデルマ属細胞またはアスペルギルス属細胞；ならびに昆虫細胞、例えばショウジョウバエＳ２細胞およびスポドプテラＳｆ９細胞を含む。好ましくは、宿主細胞はチオペプチド誘導体を合成することが知られているか、あるいはストレプトマイセス・ラモシシムス（ramocissimus）株およびストレプトマイセス・セリカラー株のような前記チオペプチドに耐性であると記載されている、宿主細胞から選択される（Olsthoorn-Tieleman et al. ‘Elongation factor Tu3 (EF-Tu3) from the kirromycin producer Streptomyces ramocissimus is resistant to three classes of EF-Tu-specific inhibitors.’ J Bacteriol. 2007 May;189(9):3581-90.）。ある態様において、宿主細胞はチオペプチドに耐性となった株から選択される。株を耐性にする方法は当該技術分野において周知であり［Kieser T, Bibb MJ, Buttner MJ, Chater KF, Hopwood D. Practical Streptomyces Genetics. John Innes Foundation, Norwich (2000)］、かかる方法の例は後記実施例に記載されている。
【００５９】
ある生産方法の態様において、宿主細胞はさらに、チオペプチド生合成に必要な他の遺伝子を含む。生合成に必要な他の遺伝子は、例えば上記コア生合成酵素をコードする１個以上の遺伝子を含んでいてもよい。宿主細胞は例えば、ノノムラエ（Nonomuraea）属菌株、プラノビスポラ（Planobispora）属菌株、アミコラトプシス（Amycolatopsis）属菌株およびストレプトマイセス属菌株から成る種の群から選択される。本明細書において考慮される具体的な宿主細胞生物は、放線菌ストレプトスポランギウム亜目（Streptosporangineae）の生物、例えばノカルジオプシス科、ストレプトスポランギウム科およびサーモモノスポラ科を含み、その好ましい属はアクロカポスポラ（Acrocarpospora）、アクチノマヅラ（Actinomadura）、ハービドスポラ（Herbidospora）、ミクロビスポラ（Microbispora）、ミクロテトラスポラ（Microtetraspora）、ノカルディオプシス（Nocardiopsis）、ノノムラエ（Nonomuraea）（（ノノムライアはChiba et al (1999)によってノノムラエに訂正された）Zhenshui Zhang, Yue Wang and Jisheng Ruanの the International Journal of Systematic Bacteriology (1998), 48, 411-422)に報告された再分類種）、プラノビスポラ（Planobispora）、プラノモノスポラ（Planomonospora）、プラノポリスポラ（Planopolyspora）、プラノテトラスポラ（Planotetraspora）またはストレプトスポランギウム（Streptosporangium）を含むが、これらに限定されない。より一般に、該用語は、チオペプチド化合物を生産するために必要な遺伝情報を含む全ての生物を含むことを意図する。かかる宿主細胞の例は、受託番号ＤＳＭ１８８３１として２００６年１１月３０日に寄託された、ノノムラエ微生物株Ｂｐ３７１４−３９を含む。
【００６０】
本発明のチオペプチド前駆体タンパク質のようなタンパク質の好適な生産技術は、当業者に周知である。例えば、Sambrook et al, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, N.Y.)を参照されたい。本明細書において提供される何れかのアミノ酸配列の配列は、多様な技術を用いて容易に作成することができる。これらおよび他の好適な生産方法は当業者の技術知識に含まれる。
【００６１】
一つの局面において、本発明のアミノ酸配列は、選択した宿主細胞における１個以上のＯＲＦまたは遺伝子の発現によって生産される。したがって本発明は、チオペプチド前駆体タンパク質を生産する方法であって、上記チオペプチド前駆体タンパク質をコードする核酸および所望によりコア生合成酵素をコードする１個以上の核酸を発現することができる宿主細胞を、前記チオペプチド前駆体タンパク質の生産に好適な条件下で培養する工程を含む。当該方法において、宿主細胞はチオペプチド前駆体タンパク質の天然生産株ではないか、あるいは宿主細胞がチオペプチド前駆体タンパク質の天然生産株であるとき、チオペプチド前駆体タンパク質をコードする核酸が組換えまたは異種核酸である。使用する宿主細胞に基づいて、チオペプチド前駆体からチオペプチド化合物生合成を宿主細胞によって達成することができる。このため、当業者はチオペプチド前駆体タンパク質の翻訳後修飾に必要な酵素を天然に合成するか、または生産株にチオペプチド生合成のための翻訳後修飾に必要な遺伝子を導入した宿主細胞を使用することができる。一つの具体的な態様において、上記定義の方法はさらに、実質的に純粋な形態でチオペプチド前駆体またはチオペプチド化合物を単離することを含む。
【００６２】
具体的な態様において、本発明は、ＧＥ２２７０Ａ、ＧＥ３７６４８Ａ、アミチアマイシンおよび上記式Ｉ〜ＸＩで示される新規Ｅｆ−ｔｕ阻害剤、マイクロコクシン、チオストレプトン、ノシヘプタイド、チオシリン、チオシン類、ノカチアシン類、ベルニナマイシン、Ａ１０２５５Ｂおよびラダマイシンから成る群から選択されるチオペプチド化合物の生産のための、本発明の宿主細胞の使用に関する。
【００６３】
一つの局面において、本発明は、チオペプチド誘導体を生産する方法であって
ｉ）宿主細胞内での変異チオペプチド前駆体をコードする配列の遺伝子発現によって、宿主細胞内で変異チオペプチド前駆体を合成し、
ｉｉ）変異チオペプチド前駆体からチオペプチド誘導体を合成し、そして／または
ｉｉｉ）１種以上のコア生合成酵素を用いて変異チオペプチド前駆体を修飾すること
を含む方法を提供する。
【００６４】
本明細書において使用するとき、「変異チオペプチド前駆体」は、それを生産する株、すなわち産生株において天然には見られないチオペプチド前駆体である。
【００６５】
変異チオペプチド前駆体を合成する方法はさらに後に記載されている。好ましくは、変異チオペプチド誘導体前駆体は、上記配列番号１、配列番号５または配列番号１１の変異体である。工程ｉｉ）はインビトロ、すなわち宿主細胞の外で；あるいはインビボで、工程ｉ）と同じ宿主細胞内で実施される。後者において、前記宿主細胞によって、天然にまたは組換えＤＮＡから、１個以上のコア生合成酵素が合成される。
【００６６】
チオペプチド誘導体を生産する方法において、本発明の宿主細胞を播種した培養培地は、例えば回転振盪機または撹拌タンク発酵槽を用いて、好気的条件下でインキュベートすることができる。インキュベーション中に播種培養培地に空気、酸素または適切な気体混合物を注入して、通気を行うことができる。十分量のチオペプチド誘導体が蓄積すると、これを常套の通常の方法で、例えば抽出およびクロマトグラフ法、沈殿または結晶化および／または本明細書に記載の方法で、培養物から濃縮し、単離することができる。抽出の例として、培養物をｎ−ブタノール、酢酸エチル、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、トルエン、ｎ−ブチルアセテートまたは４−メチル−２−ペンタノンのような好適な有機溶媒と混合し、撹拌して、減圧下で溶媒を除去して、有機層中のチオペプチド誘導体を回収することができる。得られた残留物は、所望により、例えば水、エタノール、メタノールまたはそれらの混合物で再構成して、ヘキサン、四塩化炭素、塩化メチレン、ジクロロメタンまたはそれらの混合物のような好適な有機溶媒で再抽出することができる。溶媒を除去した後、例えばクロマトグラフ法によって化合物をさらに精製してもよい。クロマトグラフィーの例として、エーテル、ケトン、エステル、ハロゲン化炭化水素またはアルコールを含む有機溶出溶媒またはそれらの混合物によるシリカゲルまたは酸化アルミナのような固定相、あるいは多様な官能基を有する修飾シリカゲルでの、多様なｐＨのアセトニトリル、メタノールまたはテトロヒドロフランのような有機溶媒またはその水性混合物で溶出する逆相クロマトグラフィーを適用することができる。別の例は、例えば固体−液体または液体−液体モードの分配クロマトグラフィーである。また、例えばSephadex LH-20（Sigma-Aldrich）を用いて、多様な溶媒、好ましくはアルコールで溶出するサイズ排除クロマトグラフィーが適用される。
【００６７】
この分野において一般的である通り、生産ならびに回収および精製プロセスは、多様な分析方法、例えばバイオアッセイ、ＴＬＣ、ＨＰＬＣまたはそれらの組合せによって、そして異なる検出方法（ＴＬＣには典型的にはＵＶ光、ヨウ素蒸気または着色剤スプレー、ＨＰＬＣには典型的にＵＶ光、質量感知または光散乱法）を適用して、モニターすることができる。例えば、ＨＰＬＣ技術は、機能化シリカゲルでの逆相カラムを用いて、極性水混和性溶媒と水の特定のｐＨでの直線グラジエント混合物である溶離剤および多様な波長でのＵＶ光または質量感知検出器による検出方法を適用することによって代表される。
【００６８】
得られた精製化合物は、細胞および細胞性物質、副生成物、反応剤および研究および／または臨床目的で当該化合物の取り扱いおよび製剤を行うために必要な他の外来物質を含まない。好ましくは、本発明に使用される化合物の純度は８０重量％以上、より好ましくは少なくとも９０重量％、さらにより好ましくは、９５重量％以上、より好ましくは少なくとも９９重量％である。一つの態様において、本発明は、どのように化合物が生産されたかに拘わらず、本発明の化合物を含む組成物を提供する。
【００６９】
宿主細胞によって生合成された化合物は、所望により、無作為および／または点化学修飾を施して、誘導体または構造アナログである化合物を形成することができる。化合物は所望により、当該技術分野において既知の方法および本明細書に記載の方法を用いて修飾してもよい。
【００７０】
６．  チオペプチド誘導体生産のためのチオペプチド前駆体タンパク質を生産することができる変異微生物
本発明の教示に従って、本発明において、例えばチオペプチド生産を改善し、チオペプチド構造を修飾する目的で、チオペプチド前駆体タンパク質を生産することができる微生物を遺伝的に操作することができる。したがって、さらなる局面において本発明は、チオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子および／またはコア生合成酵素をコードする１個以上の遺伝子における変異を有する、変異微生物を提供する。該変異は１個または複数のヌクレオチド欠失、挿入または置換であってよい。これはまた、チオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子のフラグメントまたは全体の欠失であってもよい。好ましくは、変異微生物は、対応する野生型微生物と比較して、本発明のチオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子を発現しない。好ましくは、極性が作用することを回避するため、該変異はチオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子内のインフレーム欠失である。
【００７１】
かかる変異生物は、例えばノカルジオプシス（Nocardiopsaceae）科、ストレプトスポランギウム（Streptosporangiaceae）科およびサーモモノスポラ科を含み、その好ましい属はアクロカポスポラ（Acrocarpospora）、アクチノマヅラ（Actinomadura）、ハービドスポラ（Herbidospora）、ミクロビスポラ（Microbispora）、ミクロテトラスポラ（Microtetraspora）、ノカルディオプシス（Nocardiopsis）、ノノムラエ（Nonomuraea）（（ノノムライアはChiba et al (1999)によってノノムラエに訂正された）Zhenshui Zhang, Yue Wang and Jisheng Ruanの the International Journal of Systematic Bacteriology (1998), 48, 411-422)に報告された再分類種）、プラノビスポラ（Planobispora）、プラノモノスポラ（Planomonospora）、プラノポリスポラ（Planopolyspora）、プラノテトラスポラ（Planotetraspora）またはストレプトスポランギウム（Streptosporangium）を含む放線菌ストレプトスポランギウム（Streptosporangiaceae）亜目である。
【００７２】
具体的な態様において、該変異微生物は、ノノムラエ（Nonomuraea）属菌株、例えば受託番号ＤＳＭ１８８３１として２００６年１１月３０日に寄託された、ノノムラエ微生物株Ｂｐ３７１４−３９であり、該変異は、配列番号１５または配列番号１６を含む遺伝子の破壊（disruption）、例えば配列番号１７または配列番号１８を含む遺伝子の変異である。
【００７３】
別の具体的な態様において、本発明の変異微生物は、さらに上記チオペプチド前駆体タンパク質の何れかをコードする核酸で形質転換されていてもよい。この方法によって、上記配列番号１、配列番号５または配列番号１１の変異体を含む何れかのチオペプチド前駆体タンパク質からチオペプチドの生合成を行うことができる微生物を得ることができる。さらなる態様において、かかる変異微生物はさらに、天然または組換え的に、コア生合成酵素をコードする少なくとも１個以上の遺伝子、例えば配列番号２３〜３４の何れかをコードする１個以上の遺伝子を発現する。一つの態様において、該変異微生物は、少なくとも配列番号２３〜２８のポリペプチドをコードする遺伝子を天然または組換え的に発現する。他の態様において、該変異微生物は、少なくとも配列番号３５〜４６のポリペプチドをコードする遺伝子を天然または組換え的に発現する。
【００７４】
７．  チオペプチド化合物を生産する新規株のスクリーニング
本発明によって同定した遺伝子はさらに、チオペプチド誘導体を生産することができる他の微生物を同定するためのツールとして使用することができる。例えば、本発明は、
（ｉ）配列番号１７または配列番号１８の遺伝子、より好ましくは配列番号１５または配列番号１６のフラグメント、または
（ｉｉ）配列番号３５〜４６の何れかに定義のコア遺伝子
と実質的に類似する遺伝子を有する細胞を同定することができるあらゆる方法に関する。
【００７５】
具体的な態様において、配列比較アルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ等で測定して、定義のＤＮＡ配列の長さにわたって、少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％または９５％のヌクレオチドがマッチするとき、２個のＤＮＡ配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。かかる配列の例は、本発明の特定の遺伝子の対立遺伝子変異体または種変異体である。実質的に相同である配列は、配列データバンクにおいて利用可能な標準的ソフトウェアを用いて配列を比較するか、あるいは例えば特定の系について定義のストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション試験において、同定することができる。
【００７６】
核酸配列の文脈における用語「配列同一性」、「配列一致率」または「一致率」は、最大一致について整列したとき、同じである２個の配列における残部を意味する。配列同一性比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長または少なくとも約５００〜５０００ヌクレオチドのフラグメントであってよく、それが望まれる。しかし、例えば少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約２０〜２４ヌクレオチド、少なくとも約２８〜３２ヌクレオチド、少なくとも約３６またはそれ以上のヌクレオチドのより小さなフラグメントでの同一性も望まれ得る。同様に、「配列一致率」は、全長タンパク質またはそのフラグメントにわたってアミノ酸配列について容易に決定することができる。好適には、フラグメントは少なくとも約８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約１４アミノ酸であり、約７００アミノ酸までであってよい。好適なフラグメントの例は、本明細書に記載されている。
【００７７】
一つの態様において、チオペプチド誘導体を生産することができる細胞を同定する方法は次の工程
（ｉ）単離細胞由来のゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを、相同ＤＮＡ領域とプローブの特異的ハイブリダイゼーションのための、配列番号１５または配列番号１６の核酸プローブまたはその特異的フラグメントと共にインキュベートし；そして
（ｉｉ）工程（ｉ）のプローブと特異的にハイブリダイズするゲノムＤＮＡ領域またはＲＮＡを含む細胞を同定すること
を含む。
【００７８】
一本鎖形態の核酸分子が他の核酸分子と適切な温度および溶液イオン強度条件下でアニーリングすることができるとき、核酸分子はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのような他の核酸分子と「特異的にハイブリダイズ」することができる。（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (本明細書において“Sambrook et al., 1989”)参照）。温度およびイオン強度条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同な核酸の予備スクリーニングのためには、５５℃のＴｍ（融解温度）に対応する、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、例えば５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、０．２５％のミルクおよびホルムアミドを含まない；または３０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳを用いることができる。中度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ、例えば４０％のホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに対応する。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴｍ、例えば５０％のホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに対応する。ＳＣＣは０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーションは、２個の核酸分子が相補配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによって、塩基間のミスマッチが許容される。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度、当該技術分野において周知の可変条件による。２個のヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きければ、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ値が大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、次の順に低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長以上のハイブリッドについて、Ｔｍを計算する式が導かれる（Sambrook et al., supra, 9.50-9.51参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションには、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Sambrook et al., supra, 11.7-11.8参照）。ハイブリダイズ可能な核酸の最低の長さは少なくとも約１０ヌクレオチド；好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド；より好ましくは長さは少なくとも約２０ヌクレオチドである。
【００７９】
具体的な態様において、標準的なハイブリダイゼーション条件が使用される。用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、５５℃のＴｍを意味し、上記条件を用いる。好ましい態様において、Ｔｍが６０℃であり；より好ましい態様において、Ｔｍは６５℃である。特定の態様において、「高いストリンジェンシー」の条件が使用される。
【００８０】
オリゴヌクレオチドの融解温度がより低いため、オリゴヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー）に好適なハイブリダイゼーション条件は、典型的に、全長核酸（例えば全長ｃＤＮＡ）とは幾分異なっている。オリゴヌクレオチドの融解温度は含まれるオリゴヌクレオチド配列の長さに依存するため、好適なハイブリダイゼーション温度は使用するオリゴヌクレオチド分子によって変化する。例えば、温度は３７℃（１４塩基オリゴヌクレオチドについて）、４８℃（１７塩基オリゴヌクレオチドについて）、５５℃（２０塩基オリゴヌクレオチドについて）および６０℃（２３塩基オリゴヌクレオチドについて）であってよい。例えば、オリゴヌクレオチドの好適なハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ／０．０５％のピロリン酸ナトリウムでの洗浄または同等のレベルのハイブリダイゼーションが可能な他の条件を含む。
【００８１】
本方法の好ましい態様において、チオペプチド前駆体をコードする遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドは、チオペプチド化合物を生産することができる新規な細胞の同定のために使用する。かかるオリゴヌクレオチドは、チオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子のフラグメントのＰＣＲ増幅のために使用することができる。好ましくは、低級真核細胞、より好ましくは放線菌種由来の細胞をスクリーニングする。
【００８２】
８．  チオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子操作および新規チオペプチド誘導体のスクリーニングのための使用
他の態様において、本発明は、チオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子および／またはオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列の１個以上を修飾する方法を提供する。例えば、かかる修飾または変異は、選択した発現系における発現の改善または新規チオペプチド誘導体の生産を目的とし得る。他の変異は、抗菌機能の改善または望ましくない特性の減少を含む、チオペプチド化合物の機能の消去、修飾または向上のために行うことができる。
【００８３】
一つの局面において、変異チオペプチド前駆体の合成は、チオペプチド前駆体タンパク質をコードする核酸配列の修飾によって達成される。一つの態様において、変異核酸配列は、選択した宿主細胞における好適なベクターを介して、上記の通り異種宿主細胞を得て、対応する産物を発現するために使用することができる。あるいは、チオペプチドを生産する株によって担持される天然遺伝子に直接、例えば当該株の遺伝子操作によって変異を行うことができる。
【００８４】
本発明は、本発明の前駆体タンパク質をコードする核酸配列の何れかを変化させるあらゆる方法を意図する。より具体的には、本発明は、本発明のタンパク質にアミノ酸を挿入し、アミノ酸を欠失させまたはアミノ酸を置換するあらゆる方法を意図する。修飾は核酸レベルで実施してもよい。これらの修飾は、標準的な技術によって実施され、当該技術分野において周知である。
【００８５】
したがって、本発明は、チオペプチド誘導体の前駆体をコードする核酸ライブラリーを作製する方法であって、配列番号１〜１４のいずれかをコードする配列の少なくとも１個のコドンにおいて、それぞれの核酸について、ヌクレオチド置換を実施して、変化したヌクレオチド配列を有する多様な核酸を作製する工程を含む方法を提供する。かかる核酸ライブラリーは、改善された特性を有する新規なチオペプチド誘導体、例えばＥｆ−ｔｕ阻害剤をスクリーニングするために有利に使用することができる。
【００８６】
次いで、変異核酸または核酸ライブラリーは、上記のとおり、チオペプチド生産のための宿主細胞を形質転換するために使用することができる。
【００８７】
好ましくは、核酸ライブラリーの核酸はそれぞれ、対応する野生型配列と比較して配列番号１〜１４の何れかをコードする配列の１個のコドンのみが変異されているように、１個のヌクレオチド置換を有する。位置指定変異誘発または核酸ライブラリーの作成方法は当該技術分野において周知であり、例えばBiotechniquesで公開されたHogrefe et alの文献に記載されている（‘Creating randomized amino acid libraries with the QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit.’ 2002 Nov;33(5):1158-60, 1162, 1164-5）。
【００８８】
一つの具体的な態様において、ヌクレオチド置換は、配列番号１〜４の何れかの２、５、７、８、１４位のアミノ酸残基をコードするコドンの１個以上において実施される。
【００８９】
好ましくは、宿主細胞はチオペプチド化合物を合成することができ、すなわちチオペプチドの生合成に必要な他の遺伝子を含む。例えば、チオペプチドの生合成に必要な他の遺伝子は、配列番号２３〜３４から選択されるポリペプチドをコードする１個以上の遺伝子を含んでいてよい。より好ましくは、変異核酸は、発現ベクターから形質転換された後、対応するチオペプチド前駆体タンパク質が合成されるように、発現ベクターで形質転換される。得られた発現ライブラリーは、新規なチオペプチド誘導体、例えば新規なＥｆ−ｔｕ阻害剤をスクリーニングするためのツールとして使用することができる。
【００９０】
９．  改変（tailoring）生合成遺伝子のクローニング
異なるチオペプチド化合物を生産する２種の株から生合成遺伝子クラスターを特徴付けて、本発明者らは、チオペプチド生合成に関与すると思われるが、株特異的であるＯＲＦを同定した。したがって、これらの遺伝子はコアチオペプチド構造の遺伝子制御および酵素的修飾に関与している改変ポリペプチド、主に酵素および転写制御因子をコードして、最終株特異的チオペプチド化合物を生産する可能性があることが示唆される。
【００９１】
表３および４は、本発明のこれらの改変ポリペプチドの核酸および対応するポリペプチド配列を記載する。
表３：  株Ｉからのチオペプチド生合成のための改変ポリペプチドの例
【表３】
2010535481.tif 000010
【００９２】
表４：  株ＩＩからのチオペプチド生合成のための改変ポリペプチドの例
【表４】
2010535481.tif 000011
【００９３】
一つの態様において、表３または４に列挙したポリペプチドの１個以上は、上記定義の式Ｉ〜ＸＩの化合物のインビトロまたはインビボ合成に使用される。
【００９４】
本発明はまた、実質的に同じ酵素活性を保持した、表３または４に示す酵素のあらゆる機能的変異体に関する。本発明はまた、実質的に同じ転写活性を保持した、表３または４に示す何れかの転写制御因子のあらゆる機能変異体に関する。一つの態様において、かかるポリペプチドは、上記表に列挙した元のポリペプチドと比較して、少なくとも１、２、３、４または５個のアミノ酸欠失、挿入または置換を含む。他の態様において、かかる機能的変異体は、上記に列挙したポリペプチドの１個と少なくとも８０％または９０％同一である。
【００９５】
これらの配列は、特定の改変段階を含まない変異株を作製するため、例えば望ましくない副化合物の生産を回避するために使用することができる。一つの態様において、本発明は、上記表に列挙した修飾（tailoring）遺伝子の１個以上の発現が欠損しているチオペプチドを生産することができる変異株に関する。具体的な態様において、変異株はＯＲＦ２−ＩＩまたはＯＲＦ３−ＩＩ（それぞれ配列番号５８および配列番号５９）またはＯＲＦ４−Ｉ（配列番号５０）によってコードされる遺伝子の発現が欠損している。
【００９６】
本明細書において使用するとき、「発現の欠損」は、野生型株と比較して、変異株によっては対応するポリペプチドが発現されないか、あるいはｍＲＮＡ発現を定量する常套の方法で測定したとき、野生型株の安定状態ｍＲＮＡと比較して、５０％以上、または９０％以上、安定状態ｍＲＮＡ量が減少していることを意味する。例えば、機能的タンパク質が合成されないように、遺伝子が破壊されるか、あるいは部分的または全体的に欠失している。
【００９７】
これらの配列はさらに、前駆体タンパク質をコードする遺伝子およびコア酵素をコードする遺伝子との組合せで使用して、特定のチオペプチド誘導体を生産することができる宿主細胞を改変することができる。一つの態様において、本発明は、表２、３および４に記載のように、組換えオープンリーディングフレームＯＲＦ１−ＩＩ乃至ＯＲＦ１２−ＩＩまたは対応する野生型配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有する機能的変異体を含む宿主細胞であって、ＥＦ−Ｔｕ阻害剤を生産することができる宿主細胞に関する。他の態様において、本発明は、表２、３および４に記載のように、組換えＯＲＦ１−Ｉ乃至ＯＲＦ１８−Ｉまたは対応する野生型配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を有する機能的変異体を含む宿主細胞であって、ＥＦ−Ｔｕ阻害剤を生産することができる宿主細胞に関する。
【００９８】
他の態様において、単離改変酵素は、個別でまたは組合せにおいて、例えばチオペプチド前駆体タンパク質を出発物質として用いるインビトロ方法における、例えばチオペプチド化合物を生産する方法における、例えばＥＦ−Ｔｕ阻害剤を生産する方法における、化学反応段階の触媒として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】チオペプチド構造遺伝子。潜在的開始位置は太字で示す。１４個のアミノ酸主鎖は下線を付されている。
【図２】チオペプチド産生株Ｉ由来の生合成遺伝子クラスター。矢印は仮想プロモーターを示す。白矢印はオープンリーディングフレームを意味する：黒矢印はシリーズＩ構造遺伝子を示し、灰色矢印はシリーズＩおよびシリーズＩＩチオペプチド遺伝子クラスターの両方によって共有されるシンテノス（syntenous）遺伝子である。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩはクラスターに隣接する固有の制限部位である。
【図３】チオペプチド産生株ＩＩ（Ｂｐ３７１４−３９株）由来の生合成遺伝子クラスター。矢印は仮想多岐プロモーターを示す。白矢印はオープンリーディングフレームを意味する：黒矢印はシリーズＩＩ構造遺伝子を示し、灰色矢印はシリーズＩおよびシリーズＩＩチオペプチド遺伝子クラスターの両方によって共有されるシンテノス（syntenous）遺伝子である。遺伝子クラスターはＰｓｔＩ制限部位に隣接する。
【実施例】
【０１００】
実施例
本発明はまた、特定の実施例によっても説明される。しかし、かかる実施例は説明のみに使用され、本発明または何れかの例示された用語の範囲及び意味を如何なる方法においても限定しない。
【０１０１】
１．  チオペプチド産生ノノムラエ（Nonomuraea）属菌株のゲノムにおける、全ペプチド主鎖をコードする小構造遺伝子の同定
ＰＣＲ法を用いて、チオペプチド主鎖をコードする染色体配列を単離した。中国湖北省から得たチオペプチド産生ノノムラエ株からゲノムＤＮＡを精製し、制限酵素ＮａｒＩで消化した。QiaQuick DNAクリーンアップカラム（Qiagen）に通して消化した染色体ＤＮＡを精製した。断片化ＤＮＡに５００倍モル過剰の次のアダプター：５’−ＣＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＡ（５’末端でリン酸化し、３’Ｃ６−ＴＦＡ−アミノ修飾を含む）および５’−ＡＧＴＣＴＣＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＡＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴに結合してアダプター結合ライブラリーを作製した。チオペプチド構造遺伝子をこのライブラリーから、アダプタープライマー（５’−ＧＴＣＣＡＧＴＣＴＣＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＡＧＧ）を用いて増幅し、縮重プライマーをチオペプチド大環状構造に基づいて設計した（ＣＦＧＣＶＣＮＣ：５’−ＣＡＲＡＡＩＣＣＲＣＡＩＡＣＲＣＡＲＴＴＲＣＡ）。縮重を減少させるためにオリゴヌクレオチドにイノシンを含めた。HotStarポリメラーゼミックス（Qiagen）を用いて、次のサイクル条件で特異的ＰＣＲ産物を得た：９５℃で１５分；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で１分間を３０サイクル；そして７２℃で１０分。アダプター上の３’アミノ−修飾が伸長を阻止し、アダプタープライマーによるアダプター−アダプター増幅を防止する。縮重オリゴヌクレオチドがアニールし、アダプタープライマーの相補配列を作製するポリメラーゼ伸長を刺激するときにのみ、増幅が行われる。
【０１０２】
チオペプチド産生ノノムラエ（Nonomuraea）属菌株のゲノムにおける、全ペプチド主鎖をコードする小構造遺伝子を同定する実験は成功した（図１）。この前駆体タンパク質の予想サイズは５７アミノ酸である。しかし、別の翻訳開始部位を示し得る多数の開始コドンが存在する。１４アミノ酸チオペプチド配列はＣ末端に存在し、合成の方向を確立する。該チオペプチド主鎖の１次アミノ酸配列は、ピリジン環に取り込まれるセリンで始まり、大環状構造の反時計回りで続き、側鎖の末端の最終アミノ酸で終止する。公共データベースにおける相同性検索では、近い相同物は示されなかった。
【０１０３】
２．  チオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子破壊
自殺（suicide）ベクターｐＳＥＴ１５２−Ｈｉｎｄは大腸菌内で複製することができ、アプラマイシン耐性を与え、大腸菌から放線菌種への属間の接合を可能とするトランスファーオリジン（ｏｒｉＴ）を担持する。ｐＳＥＴ１５２−Ｈｉｎｄは広い宿主範囲のベクターｐＳＥＴ１５２の誘導体である。ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを除去することによって、ｐＳＥＴ１５２から部位特異的組み込み（ｉｎｔ）を可能とする遺伝子が欠失している。チオペプチド前駆体タンパク質をコードする遺伝子は、２つの方法（挿入不活性化または欠失）の何れかで破壊され得る。第一の方法は、開始コドンまたは終止コドンを含まない遺伝子の内部フラグメントをｐＳＥＴ１５２−Ｈｉｎｄにクローン化する必要がある。次いで、このプラスミドはチオペプチド産生株に接合によって導入することができる。アプラマイシンによる選択によって、チオペプチド構造遺伝子に挿入されたベクター主鎖を有する変異を同定する。かかる事象は転写および翻訳を阻害し、チオペプチドの生産を防止する。第二の方法は、変異誘発遺伝子をｐＳＥＴ１５２−ＨｉｎｄＩＩＩに構成し、次いで生産株に移すことが必要である。該変異誘発遺伝子は構造遺伝子の上流または下流の配列を含むが、オープンリーディングフレーム、好ましくはインフレーム欠失を有する。この欠失はヒグロマイシンまたはチオストレプトンのような抗生物質に対する耐性を与える遺伝子でマークし／置換することができる。産生株に接合させた後、プラスミド抗生物質マーカーで選択して、野生型および染色体に変異誘発遺伝子の両方を有する株を選択する。メロジプロイジル（Merodiploidy）は上流または下流配列におけるプラスミドと染色体間の相同的組換えによって得られる。ベクター抗生物質マーカーの選択、次いで欠失についてのＰＣＲスクリーニングまたはマークした変異誘発遺伝子についての抗生物質選択によって、所望の二次組換え事象を同定し、これは野生型遺伝子を除外し、構造遺伝子の欠失遺伝子を排除する。
【０１０４】
あるいは、ＤＮＡ合成技術における利点は、今や大きなＤＮＡを合成的に構築できることであり、かかるサービスは商業的に入手可能である。チオペプチド遺伝子クラスターは、代替宿主における異種発現およびチオペプチド生産のためのデノボ化学合成によって操作することができる。かかる宿主は遺伝学的ツール、例えばストレプトマイセス・セリカラーまたはストレプトマイセス・リビダンスとして十分に確立されており、チオペプチド耐性であるか、あるいはチオペプチド耐性にされなければならない。耐性菌は、チオペプチド最低阻害濃度を超える濃度のチオペプチドを含む寒天プレートに１０１０〜１０１１細胞／胞子を播種して単離する。集団内に前から存在する希少な耐性獲得型自然発生的突然変異は、選択プレート上でのコロニー増殖によって同定される。変異の頻度は細胞を化学変異源に曝すことによって増加し得る。チオペプチド遺伝子クラスターの化学合成は、よりよい制御因子の導入、遺伝子の欠失、耐性部位の除去もしくは導入およびコドン利用の変化を許容する。組込みシャトルベクターｐＯＪ４３６またはエピソームシャトルベクターｐＯＪ４４６にクローン化した遺伝子クラスターの機能的合成コピーは、構造遺伝子に導入された制限部位を有し、インフレーム欠失の作製が可能となる。
【０１０５】
さらに、該チオペプチド遺伝子クラスターのクローン化したコピーまたは合成版は、ファージ由来タンパク質対、Ｒａｃプロファージ由来のＲｅｃＥ／ＲｅｃＴまたはλファージ由来のＲｅｄα／Ｒｅｄβを発現する大腸菌株において相同的組換えによって正確に操作することができる。この技術はＲｅｄ／ＥＴ組換えまたはλ介在組換えと呼ばれている（Muyrers, J.P.P., Zhang, Y., Stewart, A.F. ET cloning: Think recombination first. Genetic Engineering, Principles and Methods (Ed. J.K. Setlow), 22, 77-98 Kluwer Academic/Plenum Publishers, NY. (2000)）。
【０１０６】
３．  別のチオペプチド構造を作製するための構造遺伝子の異種発現。
チオペプチドコアおよび改変生合成遺伝子を発現するが、前駆体構造遺伝子にインフレーム欠失を有する天然産生株または異種宿主は、有用なツール株である。これらのツール株を用いて、別の構造を有するチオペプチドを作製することができる。
【０１０７】
構造遺伝子の点突然変異誘発は、チオペプチドに新たなアミノ酸を置換または導入するために使用することができる。ｐＨＭ１１ａまたはｐＳＥＴ１５２にクローン化した変異型構造遺伝子は、チオペプチド生合成酵素を発現するツール株に接合または形質転換して再導入される。
【０１０８】
あるいは、チオペプチド主鎖のあらゆる位置で別のアミノ酸をコードするライブラリーを作製することができる。この変異体ライブラリーは、遺伝子合成によって化学的に、または縮重ＰＣＲによって作製することができる。ＰＣＲ法はチオペプチド構造遺伝子を増幅して、ｐＨＭ１１ａまたはｐＳＥＴ１５２のようなプラスミドのチオペプチドコード化主鎖ならびにクローニングおよび発現のための制限部位に変異を組み込むことを必要とする。ＰＣＲプライマーの１個は、全てのアミノ酸置換を取り込むため、縮重している。縮重の程度は、主鎖の選択位置（すなわちチオペプチド大環状構造のチアゾールを形成するシステインのような不変であると見なされるアミノ酸をコードする位置ではない）における置換を許容するように変化してよい。両方のプライマーは、発現ベクターにＰＣＲ産物を直接クローニングすることができるように、制限部位で標識化されている。全ての大腸菌形質転換物をプールし、ＤＮＡを単離して変異体ライブラリーを作製する。該ライブラリーをツール株に形質転換し、バイオアッセイを用いて、変異構造を有する活性チオペプチドの生産を支持する構造遺伝子を包含するクローンを同定することができる。
【０１０９】
４．  チオストレプトン主鎖ポリペプチドをコードする遺伝子の単離
ＰＣＲ法を用いて、チオストレプトン主鎖をコードする染色体配列を単離した。チオストレプトン産生株ストレプトマイセス・アズレウス  ＥＴＨ２８５５５からゲノムＤＮＡを精製して、制限酵素ＮａｒＩで消化した。QiaQuick DNAクリーンアップカラム（Qiagen）に通して消化した染色体ＤＮＡを精製した。断片化ＤＮＡに５００倍モル過剰の次のアダプター：５’−ＣＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＡ（５’末端でリン酸化し、３’Ｃ６−ＴＦＡ−アミノ修飾を含む）および５’−ＡＧＴＣＴＣＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＡＧＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴに結合してアダプター結合ライブラリーを作製した。チオストレプトン構造遺伝子をこのライブラリーから、アダプタープライマー（５’−ＧＴＣＣＡＧＴＣＴＣＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＡＧＧ）を用いて増幅し、縮重プライマーをチオストレプトン大環状構造に基づいて設計した（ＣＴＴＣＩＣＴＣ：５’−ＣＡＣ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＴＲ  ＣＡＮ  ＧＴＮ  ＧＴＲ  ＣＡ−３’）。５’コンセンサスクランプと３’縮重コアによるＣＯＤＥＨＯＰ理論に基づいて縮重プライマーを設計した（Rose et al. CODEHOP (COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer) PCR primer design. Nucleic Acids Res. 2003 Jul 1;31(13):3763-6）。HotStarポリメラーゼミックス（Qiagen）を用いて、次のサイクル条件で特異的ＰＣＲ産物を得た：９５℃で１５分；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で１分間を３０サイクル；そして７２℃で１０分。アダプター上の３’アミノ−修飾が伸長を阻止し、アダプタープライマーによるアダプター−アダプター増幅を防止する。縮重オリゴヌクレオチドがアニールし、アダプタープライマーの相補配列を作製するポリメラーゼ伸長を刺激するときにのみ、増幅が行われる。この戦略によって、チオストレプトン大環状構造をコードするゲノムフラグメントの同定に成功した。次いで、遺伝子特異的プライマーを用いて上流下流両方を探索して、全チオストレプトン構造遺伝子を同定した。
【０１１０】
５．  チオペプチド産生株ＩおよびＩＩ由来の生合成遺伝子クラスター
５．１  株Ｉ
図２はチオペプチド合成のための生合成遺伝子クラスターを含む株ＩゲノムＤＮＡ由来の単離ＢＡＣ（配列番号６２）の一つにおけるＯＲＦ位置を説明する。
【０１１１】
何れかの好ましいモデルに限定されないが、次の経路はチオペプチド誘導体の合成におけるクローン化生合成遺伝子クラスターから特徴付けられた個々のポリペプチドの推定機能を定義する。
【０１１２】
シリーズＩの合成スキーム：
（Ａ）ＯＲＦ９、ＯＲＦ１０、ＯＲＦ１１、ＯＲＦ１２、ＯＲＦ１３およびＯＲＦ１４は、前駆体ペプチドと結合することによって連続的に機能する、複合体を形成すると思われるコア生合成酵素をコードする。対応する修飾は、該ペプチドに沿って複合体が移動するように導入される。チアゾールは前のカルボニルとシステインのチオール基の脱水環化および続くチアゾリン環の酸化によって導入される。２個のセリン残基の脱水によって、中心ピリジンヘテロ環を得るアザ−ディールス−アルダー付加環化反応の基質であるデヒドロアラニン残基を形成する。
【化７】
2010535481.tif 000012
【０１１３】
（Ｂ）ＯＲＦ２およびＯＲＦ３は尾部に導入される修飾に関与すると思われる酵素をコードする。セリン残基の脱水環化によってオキサゾリン環を得る。尾部における付加的セリンのデヒドロアラニンへの脱水は、該ペプチドの立体構造的捻れを引き起こす可能性がある尾部のプロリンの存在のため、工程を分離する必要があり得る。ＯＲＦ１８は末端配列の除去およびアミド基の保存に関与し得る。
【化８】
2010535481.tif 000013
【０１１４】
（Ｃ）ＯＲＦ４、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７、ＯＲＦ１６およびＯＲＦ１７は改変的組換えに関与していると可能性がある酵素をコードする。ＯＲＦ４：フェニルアラニンのヒドロキシル化。ＯＲＦ５：アスパラギンのメチル化。ＯＲＦ７：チアゾールのメチル化。ＯＲＦ１６およびＯＲＦ１７：メトキシエチル基のチアゾールへの付加。
【化９】
2010535481.tif 000014
【０１１５】
５．２  株ＩＩ
図３はチオペプチド合成のための生合成遺伝子クラスターを含む株ＩＩゲノムＤＮＡ由来の単離ＢＡＣ（配列番号６３）の一つにおけるＯＲＦ位置を説明する。
【０１１６】
何れかの好ましいモデルに限定されないが、次の経路はチオペプチド誘導体の合成におけるクローン化生合成遺伝子クラスターから特徴付けられた個々のポリペプチドの推定機能を定義する。
【０１１７】
シリーズＩＩの合成スキーム：
（Ａ）ＯＲＦ６、ＯＲＦ７、ＯＲＦ８、ＯＲＦ９、ＯＲＦ１０およびＯＲＦ１１は、前駆体ペプチドと結合することによって連続的に機能する、複合体を形成すると思われるコア生合成酵素をコードする。対応する修飾は、該ペプチドに沿って複合体が移動するように導入される。チアゾールは前のカルボニルとシステインのチオール基の脱水環化および続くチアゾリン環の酸化によって導入される。２個のセリン残基の脱水によって、中心ピリジンヘテロ環を得るアザ−ディールス−アルダー付加環化反応の基質であるデヒドロアラニン残基を形成する。
【化１０】
2010535481.tif 000015
【０１１８】
（Ｂ）ＯＲＦ１２は末端アラニンを切断するペプチダーゼをコードする。
【化１１】
2010535481.tif 000016
【０１１９】
（Ｃ）ＯＲＦ１、ＯＲＦ２およびＯＲＦ３は改変的組換えに関与していると可能性がある酵素をコードする。ＯＲＦ１はチアゾールをメチル化し、ＯＲＦ２とＯＲＦ３はフェニルアラニンとイソロイシンのヒドロキシル化に関与する。イソロイシンは２回ヒドロキシル化されて分解して、エポキシドを生じる。
【化１１】
2010535481.tif 000017
【０１２０】
６．  チオペプチド誘導体の生産
培地の組成
（ａ）播種培地
【表５】
2010535481.tif 000018
【０１２１】
（ｂ）生産培地Ａ
【表６】
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【０１２２】
（ｃ）微量溶液
【表７】
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【０１２３】
実施例３に記載した宿主細胞の凍結懸濁液（１．５ｍＬ）を５００ｍＬの播種培地を含む２リットルのバッフルなし（non-baffled）の振盪フラスコに播種する。該フラスコを３０℃で、回転振盪器で２００ｒｐｍ、振幅５０ｍｍで３日間インキュベートする。２回目の播種段階は、それぞれ５００ｍＬの播種培地を含む８本の２リットルバッフルなしの振盪フラスコに、１回目の播種段階のそれぞれ４０ｍＬを播種して形成される。該フラスコを３０℃で、回転振盪器で２００ｒｐｍ、振幅５０ｍｍで２日間インキュベートする。３回目の播種段階は、それぞれ１００リットルの播種培地を含む２個の１５０リットルスケール撹拌タンク発酵槽に、２回目の播種段階のそれぞれ４リットルを播種して形成される。１５０リットルスケール発酵槽は、次のパラメーターで３日間稼働する：温度＝３０℃、撹拌＝８０ｒｐｍ、気流＝２５ｓｌｐｍ、および圧力＝０．５ｂａｒ。シリコン油ベースの消泡剤の制御添加によって、過剰の泡形成を阻止する。ｐＨはモニターするが、制御しない。
【０１２４】
３回目の播種段階由来の２００リットルを、３５００リットルの生産培地Ａを含む５５００リットルスケールの撹拌タンク発酵槽に播種する。５５００リットルスケールの発酵槽の稼働パラメーターは次の通りである：温度＝３０℃、気流＝１０５０ｓｌｐｍ、および圧力＝０．５ｂａｒ。撹拌は６０ｒｐｍで制御し、４４時間後に８０ｒｐｍに上昇させる。シリコン油ベースの消泡剤の制御添加によって、過剰の泡形成を阻止する。ｐＨはモニターするが、制御しない。３５００リットルの培養液を含む発酵槽をインキュベーションの５日後に収穫する。
【０１２５】
７．  チオペプチド誘導体の単離
発酵培養液を回収し、酢酸エチルを加えて撹拌タンク中で一夜抽出する。抽出において、混合物は最大剪断力および最適混合で連続Dispax（登録商標）リアクター（Jahnke & Kunkel, Germany）を通す。連続WestfaliaセパレーターSA20（Westfalia Separator AG, Oelde, Germany）によって２つの相を分離した後、酢酸エチル相を減圧下で蒸発させて濃縮する。蒸発中に沈殿が生じ、これを濾過して分離する。
【０１２６】
上記方法に従って培養発酵液の抽出から得た沈殿物を、ジオキサン／水  ９５：５に溶解させ、濾過して不溶性成分を除去する。diatome８（Isolute(登録商標), International Sorbent Technology Ltd., Hengoed Mid Glam, UK）の存在下、減圧下で濾液を濃縮する。得られた粉末は、ジクロロメタン／メタノール／酢酸  ９０：１０：０．５中で調製したシリカゲルのクロマトグラフカラム（例えば０．０４０〜０．０６３ｍｍ、カラムサイズ５ｘ２５ｃｍ）にアプライする。該カラムをジクロロメタン／メタノール／酢酸  ９０：１０：０．５の混合物で、流速３５ｍＬ／分で展開する。３０ｍＬの分画を回収し、ＨＰＬＣで分析する。化合物Ｉを含むプール分画に２０ｍＬのイソプロパノールを加え、残留イソプロパノールから化合物が沈殿するまで、減圧下で濃縮する。遠心分離して沈殿物から溶媒を分離した後、残留物を減圧下で乾燥させて、半精製チオペプチド誘導体を得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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