(57)【要約】本発明は、正常な器官と比較してＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の過剰発現を検出することにより、前立腺癌、特にホルモン不応性前立腺癌（ＨＲＰＣ）又は去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）を検出する方法を特徴とする。前立腺癌におけるＰＫＩＢ若しくはＮＡＡＬＡＤＬ２の過剰発現、ＰＫＩＢ若しくはＮＡＡＬＡＤＬ２の細胞増殖機能、ＰＫＩＢ若しくはＮＡＡＬＡＤＬ２の細胞内局在、又はＰＫＩＢ及びＰＫＡ−Ｃの間の相互作用に基づき、ＨＲＰＣを含む前立腺癌を治療及び防止するための化合物を同定する方法も開示される。また、ＰＫＩＢ遺伝子又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子に対する二本鎖分子を投与することにより前立腺癌を治療する方法が提供される。本発明はまた、提供される方法において有用な、二本鎖分子とそれらをコードするベクターとを含む生成物と、その分子又はベクターを含む組成物とを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に導入した場合にＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のｉｎ  ｖｉｖｏ発現、及び細胞増殖を阻害する単離二本鎖分子であって、互いにハイブリダイズすることで該二本鎖分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖を含む、二本鎖分子。
【請求項２】
前記センス鎖が、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含む、請求項１に記載の二本鎖分子。
【請求項３】
ヌクレオチド数約１９〜約２５の長さを有する、請求項２に記載の二本鎖分子。
【請求項４】
介在一本鎖によって連結したセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドから成る、請求項２に記載の二本鎖分子。
【請求項５】
下記一般式を有する、請求項４に記載の二本鎖分子：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］は配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である。
【請求項６】
請求項１に記載の二本鎖分子を発現するベクター。
【請求項７】
前記二本鎖分子が下記一般式を有する、請求項６に記載のベクター：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］は配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である。
【請求項８】
ＰＫＩＢ遺伝子又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子を過剰発現する細胞において該遺伝子の発現を阻害する少なくとも１つの単離二本鎖分子を投与する工程を含む、癌を治療する方法であって、該二本鎖分子が、互いにハイブリダイズすることで該二本鎖分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖を含む、方法。
【請求項９】
前記センス鎖が配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記二本鎖分子が、ヌクレオチド数約１９〜約２５の長さを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結したセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドから成る、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記二本鎖分子が下記一般式を有する、請求項１１に記載の方法：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］は配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である。
【請求項１３】
前記二本鎖分子がベクターによりコードされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベクターによりコードされる前記二本鎖分子が下記一般式を有する、請求項１３に記載の方法：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］は配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である。
【請求項１５】
治療すべき前記癌が前立腺癌又はホルモン不応性前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現を阻害する少なくとも１つの単離二本鎖分子を含む、癌を治療するための組成物であって、該二本鎖分子が、互いにハイブリダイズすることで該二本鎖分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖を含む、組成物。
【請求項１７】
前記センス鎖が配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記二本鎖分子が、約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの長さを有する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結したセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む単一のポリヌクレオチドから成る、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記二本鎖分子が下記一般式を有する、請求項１９に記載の組成物：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］は配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される配列を含むセンス鎖配列であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である。
【請求項２１】
前記二本鎖分子が、ベクターによりコードされ、かつ前記組成物中に含有される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２２】
前記二本鎖分子が下記一般式を有する、請求項２１に記載の組成物：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
式中、［Ａ］は配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である。
【請求項２３】
治療すべき前記癌が前立腺癌又はホルモン不応性前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２４】
（ａ）以下：
（ｉ）配列番号１、配列番号３又は配列番号５に対応する配列を含むｍＲＮＡを検出すること、
（ｉｉ）配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出すること、及び
（ｉｉｉ）配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出すること、
から成る群から選択される方法のいずれか１つにより被験体由来の生体試料中における遺伝子の発現レベルを決定する工程と、
（ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比較した前記発現レベルの増大を、前立腺癌と関連づける工程と、
を含む、前立腺癌を診断する方法。
【請求項２５】
前記前立腺癌がホルモン不応性前立腺癌又は去勢抗性前立腺癌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記発現レベルが前記正常対照レベルより少なくとも１０％大きい、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記発現レベルが、前記被験体由来の生体試料の遺伝子転写産物へのプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ハイブリダイゼーション工程がＤＮＡアレイ上で実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記発現レベルが、前記配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質に対する抗体の結合を検出することにより決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が、配列番号３２、配列番号３３又は配列番号３４から成るポリペプチドと結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記被験体由来の生体試料が、生検材料、痰、血液又は尿を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号３３又は配列番号３４のアミノ酸配列を含むタンパク質と結合する抗体。
【請求項３３】
配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質と結合する抗体を含む、前立腺癌を検出するための組成物。
【請求項３４】
前記抗体が配列番号３２、配列番号３３又は配列番号３４と結合する、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
ａ）試験化合物を、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程と、
ｂ）前記ポリペプチドと前記試験化合物との間の結合活性を検出する工程と、
ｃ）前記ポリペプチドと結合する前記試験化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
【請求項３６】
ａ）試験化合物を、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程と、
ｂ）工程（ａ）の該ポリペプチドの生物活性を検出する工程と、
ｃ）該試験化合物の非存在下で検出される該ポリペプチドの該生物活性と比較して、該ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のポリヌクレオチドによりコードされる該ポリペプチドの該生物活性を抑制する該試験化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
【請求項３７】
前記生物活性が細胞増殖の促進又はＰＫＡ−Ｃ核内蓄積活性である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ａ）候補化合物を、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２を発現する細胞と接触させる工程と、
ｂ）前記試験化合物の非存在下で検出される前記発現レベルと比較して、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現レベルを低減する前記候補化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
【請求項３９】
ａ）候補化合物を、ベクターが導入されている細胞と接触させる工程であって、該ベクターが、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含む、接触させる工程と、
ｂ）前記レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程と、
ｃ）対照と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レベル又は活性レベルを低減する候補化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
【請求項４０】
ａ）試験化合物の存在下で、ＰＫＩＢポリペプチド又はその機能的等価物を、ＰＫＡ−Ｃポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる工程と、
ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する工程と、
ｃ）前記ポリペプチド間の結合を阻害する前記試験化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
【請求項４１】
前記ＰＫＩＢポリペプチドの機能的等価物が、配列番号３１から成るポリペプチドを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＰＫＡ−Ｃポリペプチドの機能的等価物が、ＰＫＩＢ結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
（ａ）試験化合物の存在下で、ＰＫＩＢポリペプチド又はその機能的等価物と、ＰＫＡ−Ｃポリペプチド又はその機能的等価物と、Ａｋｔとを、該ＰＫＩＢポリペプチドによるＡｋｔのリン酸化に適した条件下で、インキュベートする工程と、
（ｂ）前記Ａｋｔのリン酸化レベルを検出する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で測定される該Ａｋｔの該リン酸化レベルを対照レベルと比較する工程と、
（ｄ）該対照レベルと比較して該Ａｋｔの該リン酸化レベルを減少させる化合物を選択する工程と、
を含む、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法。
【請求項４４】
前記Ａｋｔのリン酸化レベルが、配列番号３５のアミノ酸配列の４７３位のセリン残基において検出される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＰＫＩＢポリペプチド又はその機能的等価物と、前記ＰＫＡ−Ｃポリペプチド又はその機能的等価物と、Ａｋｔとが、細胞において発現され、該細胞又はその可溶化物を試験化合物と接触させることにより試験化合物の存在下でインキュベートされる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記前立腺癌がホルモン不応性前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌である、請求項３５、３６、３８、３９、４０及び４３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物科学分野、より具体的には癌診断及び癌治療の分野に関する。特に本発明は、前立腺癌を検出及び診断する方法と、前立腺癌を治療及び予防する方法とに関する。さらに本発明は、前立腺癌を予防するための作用物質をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、２００７年８月２４日付で出願された米国仮特許出願第６０／９５７，８５３号明細書及び２００８年３月１２日付で出願された米国仮特許出願第６１／０３６，０３０号明細書の恩典を主張するものである。その内容全体が全ての目的のために参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００３】
前立腺癌（ＰＣ）は、男性における最も一般的な悪性病変であり、米国及び欧州における癌に関連する死因の第２位である（Gronberg H, Lancet 2003 361:859-64.（非特許文献１））。ＰＣの発症率は、西欧式の食事の普及と老齢人口の急増とにより、ほとんどの先進国で顕著に増大している（Gronberg H, Lancet 2003 361:859-64.（非特許文献１）及びHsing AW et al., Epidemiol Rev 2001 23:3-13.（非特許文献２））。血清前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を使用するスクリーニングは、ＰＣの早期検出の劇的な改善をもたらし、外科的療法及び放射線療法により治癒させることができる局所的疾患を有する患者の比率の増大をもたらした（Gronberg H, Lancet 2003 361:859-64.（非特許文献１）及びHsing AW et al., Epidemiol Rev 2001 23:3-13.（非特許文献２））。しかし、これらのＰＣ患者の２０％〜３０％は、いまだにこの疾患の再発に苦しんでいる（Feldman BJ et al., Nat Rev Cancer 2001 1:34-45.（非特許文献３）及びHan M et al., J Urol 2001 166:416-9.（非特許文献４））。
【０００４】
アンドロゲン／アンドロゲン受容体（ＡＲ）シグナル経路は、ＰＣの発症及び進行において中心的な役割を果たし、ＰＣの増殖は比較的初期の段階では通常アンドロゲン依存性である（Feldman BJ et al., Nat Rev Cancer 2001 1:34-45.（非特許文献３）及びHan M et al., J Urol 2001 166:416-9.（非特許文献４））。したがって、疾患が再発又は進行した患者のほとんどは、外科的又は内科的な去勢により精巣のアンドロゲン産生を抑制するアンドロゲン除去療法によく反応する。しかしながらこれらの患者は最終的に、ホルモン不応性前立腺癌（ＨＲＰＣ）と呼ばれているアンドロゲン非依存性且つより侵襲性の表現型を獲得する。代替的に、これらの患者は最終的に、基本的に致死性の疾患である去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）と呼ばれる、アンドロゲン除去療法（去勢）に対する耐性と、より侵襲性の表現型とを獲得し得る（Scher HI, Sawyers CL. J Clin Oncol 2006 23:8253-61.（非特許文献５））。近年、ＨＲＰＣ患者に対する治療の新標準としてドセタキセルとプレドニゾンとの併用が確立された（Tannock IF et al., N Engl J Med 2004 351:1502-12.（非特許文献６））が、これらは治癒をもたらすものではなく、ＨＲＰＣ患者におけるそれらの延命効果は非常に制限されている。したがって、多くのグループが現在、ＨＲＰＣの増殖に寄与する新規な分子標的又はシグナル経路を同定するための様々なアプローチを試みている（Scher HI, Sawyers CL. J Clin Oncol 2006 23:8253-61.（非特許文献５））。
【０００５】
この去勢抵抗性進行のメカニズムは、ＡＲを含む経路と、ＡＲをバイパスする又はＡＲに非依存性の経路との２つの経路に分けられると推定されている。これらは相互に排他的ではなく、しばしばＣＲＰＣ細胞中に共存する（Feldman BJ et al., Nat Rev Cancer 2001 1:34-45.（非特許文献３）、Scher HI, Sawyers CL. J Clin Oncol 2006 23:8253-61.（非特許文献５）。ＡＲをバイパスする又はＡＲに非依存性の経路の多くは、ＣＲＰＣ細胞中で活性化されることが報告されており、それらはより高悪性度又は侵襲性の表現型に寄与し得る。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ及びＩＬ−６／ＳＴＡＴ３のような、ＡＲ経路と非依存性経路との間のクロストークも、発生し得る（Feldman BJ et al., Nat Rev Cancer 2001 1:34-45.（非特許文献３）、Scher HI, Sawyers CL. J Clin Oncol 2006 23:8253-61.（非特許文献５）、Grossmann ME, et al. JNCI 2001 93:1687-97（非特許文献７）、Yang L, et al. BBRC 2003 305: 462-469.（非特許文献８））。
【０００６】
非依存性経路のうち、ＰＴＥＮ−ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路は、ＣＲＰＣ表現型を説明することができる最も重要な経路の１つである可能性がある。Ａｋｔは、ホスファチジルイノシトール（３，４，５）リン酸（ＰＩＰ３）により活性化されるセリン／トレオニンキナーゼであり、活性化又はリン酸化したＡｋｔは、ＧＳＫ３β、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ及びｍＴＯＲを調節することにより、細胞増殖及び細胞生存の両方を促進する（Sharma M, et al. J Biol Chem 2002 277: 30935-41（非特許文献９）、Pap M, Cooper GM. J Biol Chem 1998 273:19929-32（非特許文献１０）、Downward J. 1998 Curr Opin Cell Biol 10:262-67（非特許文献１１）、Datta SR, et al. Cell 1997 91: 231-41（非特許文献１２）、Downward J. Cell Develop Biol 2004 15:177-82（非特許文献１３）、Vivanco I and Sawyers C. Nat Rev Cancer 2002 2: 289-501（非特許文献１４）、Hay N. Cancer Cell 2005 8:179-83（非特許文献１５））。
【０００７】
正常な細胞では、ＰＩＰ３からリン酸を除去する脂質ホスファターゼである腫瘍抑制因子ＰＴＥＮはＡｋｔの活性化を阻害し細胞をアポトーシスの対象とすることができるのに対して、腫瘍細胞の中にはＡｋｔの活性化を引き起こすＰＴＥＮの突然変異、又はＰＴＥＮの発現の欠失を保有するものがある。その抗アポトーシス機能に加えて、前立腺癌細胞では、活性化したＡｋｔはＡＲと直接結合し、アンドロゲンの非存在下でＡＲをリン酸化し、ＣＲＰＣ表現型にも寄与し得る（Wen Y, et al. Cancer Res 2000 60: 6841-45（非特許文献１６））。
【０００８】
実際に、リン酸化したＡｋｔのレベルはＧｌｅａｓｏｎグレードの高いＰＣでは上昇し、ＰＣの進行、又はＣＲＰＣの進行と関連した（Malik SN, et al. Clin Cancer Res 2002 8: 1168-71（非特許文献１７）、Kreisberg JI, et al. Cancer Res 2004 64:5232-36（非特許文献１８））。
【０００９】
Ａｋｔは、その活性化のために、３０８位のＴｈｒ残基と４７３位のＳｅｒ残基とにおけるリン酸化を必要とする。ホスホイノシタイド依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１）は３０８位のＴｈｒのリン酸化を触媒することができ、多数のキナーゼが４７３位のＳｅｒのリン酸化を触媒するいわゆるＰＤＫ２として機能することが示唆されているが、それらのいずれか又は全てが癌細胞において生理学的なＰＤＫ２として働くかどうかは、まだ立証されていない（Grossmann ME, et al. JNCI 2001 93:1687-97（非特許文献７）、Tasken K, Aandahl EM. Physol Review 2004 84: 137-67.（非特許文献１９））。
【００１０】
一方で、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）は、しばしば、ｃＡＭＰにより開始される広範な生理学的効果又は病理学的効果を媒介するために、及びＧ−タンパク質と結合するために、必須と考えられる。多数のリガンド−受容体系がＰＫＡシグナル経路を活性化し、その活性化は細胞増殖及び分化の制御と関連する（Tasken K, Aandahl EM. Physol Review 2004 84: 137-67.（非特許文献１９）、Stork PJ, Schmitt JM. Trends Cell Biol 2002 12:258-66（非特許文献２０））。
【００１１】
前立腺癌では、複数の報告が、アンドロゲン非依存性増殖及び神経内分泌分化へのＰＫＡの関与を示唆した（Cox ME, et al. J Biol Chem 2000 275: 13812-8（非特許文献２１）、Deeble PD, Cox ME, et al. Cancer Res 2007 67:663-72（非特許文献２２））。ＰＫＡ経路とＡＲ経路との間のクロストークも、ＰＣ細胞のアンドロゲン非依存性増殖又は去勢抵抗性増殖に関与することが示唆されている（Stork PJ, Schmitt JM. Trends Cell Biol 2002 12:258-66（非特許文献２０）、Sadar MD. J Biol Chem 1999 274: 7777-83（非特許文献２３））。
【００１２】
このＰＫＡ経路はＰＫＡ調節性サブユニット（ＰＫＡ−Ｒ）又はＰＫＡ阻害因子等の多数種の因子により調節され（Taylor SS, Kim C, Vigil D, et al. BBA 2005 1754: 25-37（非特許文献２４）、Dalton GD, Dewey WL. Neuropeptides 2006 40: 23-34（非特許文献２５））、癌細胞ではこれらの調節因子は異常に発現してＰＫＡ経路を修飾し、それらの因子の幾つかは癌治療のために標的とされる（Miller WR. Ann NY Acad Sci 2002 968: 37-48, 2002（非特許文献２６））。
【００１３】
過去に、臨床的なＨＲＰＣ又はＣＲＰＣの分子特徴を特徴づけ、且つＨＲＰＣ又はＣＲＰＣの治療のための分子標的を同定するために、ＬＭＭ（レーザーマイクロビームマイクロダイセクション）によりＨＲＰＣ又はＣＲＰＣの組織から純化した癌細胞に対して全ゲノムｃＤＮＡマイクロアレイ解析を行い、ＨＲＰＣ細胞又はＣＲＰＣ細胞において、調節解除された多数の遺伝子を同定し、それらのうち幾つかはアンドロゲン非依存性及び侵襲性の表現型に関与し得た（Tamura K et al., Cancer Res 2007 67: 5117-25.（非特許文献２７））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Gronberg H, Lancet 2003 361:859-64.
【非特許文献２】Hsing AW et al., Epidemiol Rev 2001 23:3-13.
【非特許文献３】Feldman BJ et al., Nat Rev Cancer 2001 1:34-45.
【非特許文献４】Han M et al., J Urol 2001 166:416-9.
【非特許文献５】Scher HI, Sawyers CL. J Clin Oncol 2006 23:8253-61.
【非特許文献６】Tannock IF et al., N Engl J Med 2004 351:1502-12.
【非特許文献７】Grossmann ME, et al. JNCI 2001 93:1687-97
【非特許文献８】Yang L, et al. BBRC 2003 305: 462-469.
【非特許文献９】Sharma M, et al. J Biol Chem 2002 277: 30935-41
【非特許文献１０】Pap M, Cooper GM. J Biol Chem 1998 273:19929-32
【非特許文献１１】Downward J. 1998 Curr Opin Cell Biol 10:262-67
【非特許文献１２】Datta SR, et al. Cell 1997 91: 231-41
【非特許文献１３】Downward J. Cell Develop Biol 2004 15:177-82
【非特許文献１４】Vivanco I and Sawyers C. Nat Rev Cancer 2002 2: 289-501
【非特許文献１５】Hay N. Cancer Cell 2005 8:179-83
【非特許文献１６】Wen Y, et al. Cancer Res 2000 60: 6841-45
【非特許文献１７】Malik SN, et al. Clin Cancer Res 2002 8: 1168-71
【非特許文献１８】Kreisberg JI, et al. Cancer Res 2004 64:5232-36
【非特許文献１９】Tasken K, Aandahl EM. Physol Review 2004 84: 137-67.
【非特許文献２０】Stork PJ, Schmitt JM. Trends Cell Biol 2002 12:258-66
【非特許文献２１】Cox ME, et al. J Biol Chem 2000 275: 13812-8
【非特許文献２２】Deeble PD, Cox ME, et al. Cancer Res 2007 67:663-72
【非特許文献２３】Sadar MD. J Biol Chem 1999 274: 7777-83
【非特許文献２４】Taylor SS, Kim C, Vigil D, et al. BBA 2005 1754: 25-37
【非特許文献２５】Dalton GD, Dewey WL. Neuropeptides 2006 40: 23-34
【非特許文献２６】Miller WR. Ann NY Acad Sci 2002 968: 37-48, 2002
【非特許文献２７】Tamura K et al., Cancer Res 2007 67: 5117-25.
【発明の概要】
【００１５】
ＨＲＰＣ細胞又はＣＲＰＣ細胞の全ゲノム発現プロファイルに基づき、ＰＫＩＢ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１８１７９５）及びＮＡＡＬＡＤＬ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿２０７０１５及びＡＫ０２１７５４）という２つの分子標的が、ＰＣの治療及び診断に有用であるとして同定された。加えて、該タンパク質は、ＨＲＰＣの新規治療の開発のための分子標的として有用である。
【００１６】
ＰＫＩＢは、ＣＲＰＣにおいて過剰発現する遺伝子として、ＰＫＡ経路における調節因子の１つである。本発明者らは、ＰＫＩＢが、ＰＫＡ経路とＡｋｔ経路との間の機能的連結を介してＰＣ細胞の生存度とその悪性表現型とに寄与することを証明した。
【００１７】
ＰＫＩＢは、ＰＫＩ（タンパク質キナーゼＡ阻害因子）ファミリーに属する。ＰＫＩＡは、タンパク質キナーゼＡ触媒サブユニット（ＰＫＡ−Ｃ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２７３０）のキナーゼ活性を阻害し、ＰＫＡ−Ｃと直接結合することによりＰＫＡ−Ｃを核から細胞質へ排出すると考えられる（Glass DB et al., J Biol Chem 1986 261: 12166-71.及びWen W et al., J Biol Chem 1994 269: 32214-20.）。タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼＡは、しばしば、ｃＡＭＰにより開始される広範な生理学的効果又は病理学的効果を媒介するために、及びＧ−タンパク質と結合するために、必須と考えられ、多数のリガンド及び受容体の系がＰＫＡシグナル経路を活性化し、その活性化は細胞増殖及び分化の制御と関連する（Tasken K, Aandahl EM. Physol Review 2004 84: 137-67.及びStork PJ, Schmitt JM. Trends Cell Biol 2002 12:258-66）。前立腺癌では、複数の報告により、アンドロゲン非依存性増殖及び神経内分泌分化へのその関与が示唆され（Cox ME, et al. J Biol Chem 2000 275: 13812-8）、ＰＫＡ経路とＡＲ経路との間のクロストークがＨＲＰＣ細胞のアンドロゲン非依存性増殖に関与することが示唆されている（Stork PJ, Schmitt JM. Trends Cell Biol 2002 12:258-66及びSadar MD. J Biol Chem 1999 274: 7777-83）。
【００１８】
ＮＡＡＬＡＤＬ２は、新規なＩＩ型膜タンパク質であり、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）ファミリーに属する。前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）と呼ばれるＧＣＰＩＩの前立腺形態は前立腺癌において発現し、ＰＳＭＡレベルの増大は、ＰＣの進行とＨＲＰＣとに関連する（Rajasekaran AK et al., Am J Physiol Cell Physiol 2005 288: C975-81.及びMurphy GP et al., Prostate 2000 42: 145-9.）。そのＰＳＭＡとの相同性と、その類似する発現パターンとを考慮すると、ＮＡＡＬＡＤＬ２は「ＰＳＭＡ２」と呼ぶべきである。ＰＳＭＡはＦＤＡに承認された前立腺癌造影剤である１１１Ｉｎ標識７Ｅ１１モノクローナル抗体（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ、Cytogen、Princeton、NJ）の標的である。ＰＭＳＡは、ＰＳＭＡを発現する細胞への造影剤又は治療薬の特異的送達を目的とする臨床試験にある、Ｊ５９１等のモノクローナル抗体により標的とされる（Murphy GP et al., Prostate 2000 42: 145-9.及びHolmes EH, Expert Opin Investig Drugs 2001 10: 511-9.）。腫瘍マーカーとしてのその特徴に加えて、ＰＳＭＡは、その基質がポリ−γ−グルタミン酸型葉酸を含む、ＧＰＣ活性を有する（Zhou J et al., Nature Review Drug Disc 2005 4: 1015-26.）。ＰＳＭＡの酵素活性はプロドラッグの設計のために利用することができ、該プロドラッグでは薬剤の不活性なグルタミン酸型形態が選択的に切断されることにより、ＰＳＭＡを発現する細胞でのみ活性化される（Denny WA et al., Eur J Med Chem 2001 36: 577-95.）。しかし、ＰＳＭＡが前立腺癌の進行とどのように関連するのかは全く未知であり、ＰＳＭＡの機能又は活性それ自体を標的とする可能性はさらに未知である。
【００１９】
本発明は、患者由来の生体試料中のＰＩＫＢ及びＮＡＡＬＡＤＬ２の発現レベルを決定することにより、被験体における前立腺癌に対する素因を診断又は決定する方法を特徴とする。正常対照レベルと比較した該遺伝子のいずれかの発現レベルの増大は、被験体が前立腺癌を患っているか、又は発症するリスクを有することを示す。
【００２０】
本発明は、特定の配列（特に、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９）を含む二本鎖分子が前立腺癌細胞の細胞増殖を阻害するのに有効であるという発見に、少なくとも部分的に基づく。具体的には、ＰＩＫＢ遺伝子及びＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子を標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、本発明により提供される。
【００２１】
本発明の一態様によれば、二本鎖分子は、ベクター中でコードされてもよく、ベクターから発現してもよい。
【００２２】
したがって本発明は、本発明の二本鎖分子又はベクターを投与することにより細胞増殖を阻害し前立腺癌を治療する方法を提供する。このような方法は、１つ又は複数の二本鎖分子又はベクターを含む組成物を被験体に投与することを含む。
【００２３】
本発明の別の態様は、本発明の二本鎖分子又はベクターの少なくとも１つを含有する癌を治療する組成物に関する。代替的に、本発明は、前立腺癌を治療又は防止する化合物をスクリーニングする方法であって、ＰＩＫＢタンパク質又はＮＡＡＬＡＮＤＬ２タンパク質を発現する細胞と試験化合物を接触させる工程と、続いてＰＩＫＢタンパク質又はＮＡＡＬＡＮＤＬ２タンパク質の発現レベルを低減する試験化合物を選択する工程とを含む、方法をさらに提供する。さらに、本発明は、前立腺癌を治療又は防止する化合物をスクリーニングする方法であって、ＰＩＫＢとタンパク質キナーゼＡ触媒サブユニット（ＰＫＡ−Ｃ）との間の結合が検出される、方法を提供する。ＰＩＫＢとＰＫＡ−Ｃとの間の結合を阻害する化合物は、前立腺癌の症状を低減することが期待される。さらに本発明は、癌を検出する抗体をスクリーニングする方法であって、ＮＡＡＬＡＮＤＬ２が細胞表面で検出される、方法を提供する。ＮＡＡＬＡＮＤＬ２を認識した抗体が、前立腺癌を検出するために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】半定量ＲＴ−ＰＣＲにより、同様にマイクロダイセクションされた正常な前立腺上皮細胞（ＮＰｍｉｘ）、正常な前立腺の全組織、及び重要な器官（心臓、肺、肝臓及び腎臓）と比較して、ＨＲＰＣ細胞中ではＰＫＩＢの過剰発現が確認された（５／５）が、ＨＳＰＣ細胞では確認されなかったことを示す図である。ＡＣＴＢを、各々のｃＤＮＡ含有量を定量するために使用した。
【図１Ｂ】ＰＫＩＢの発現についての多組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロット分析により、ヒト成体の器官のうち、胎盤では約１．５ｋｂのバンドが示されたが、重要な器官（心臓、肺、肝臓及び腎臓）では示されなかったことを示す図である。ＰＫＩＢの発現についてのノーザンブロット分析は、幾つかのＰＣ細胞株（２２Ｒｖ１及びＰＣ−３）がＰＫＩＢを強く発現するのに対して、他の正常な成体の器官はＰＫＩＢを発現しないことを示した。
【図１Ｃ】ＰＣ組織についての免疫組織化学的分析を示す図である。前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）が、ＰＫＩＢについての弱い染色（＋）を示した。
【図１Ｄ】ＰＣ組織についての免疫組織化学的分析を示す図である。Ｇｌｅａｓｏｎグレードが３のＰＣは弱い染色（＋）を示したが、正常な前立腺上皮（Ｎ）は陰性の染色を示した。
【図１Ｅ】ＰＣ組織についての免疫組織化学的分析を示す図である。Ｇｌｅａｓｏｎグレードが５のＰＣは、ＰＫＩＢについての強い陽性の染色（＋＋＋）を示した。
【図１Ｆ】ＰＣ組織についての免疫組織化学的分析を示す図である。ＨＲＰＣも、ＰＫＩＢについての強い陽性の染色（＋＋＋）を示した。
【図２Ａ】半定量ＲＴ−ＰＣＲにより、同様にマイクロダイセクションされた正常な前立腺上皮細胞（ＮＰｍｉｘ）、正常な前立腺の全組織、及び重要な器官（心臓、肺、肝臓及び腎臓）と比較して、ＨＲＰＣ細胞中においてＮＡＡＬＡＤＬ２の過剰発現が確認された（７／１１）ことを示す図である。ＡＣＴＢを、各々のｃＤＮＡ含有量を定量するために使用した。
【図２Ｂ】ＮＡＡＬＡＤＬ２の発現についてのＭＴＮブロット分析により、ヒト成体の器官のうちＰＣ細胞株でのみ約１０ｋｂ、６ｋｂ及び５ｋｂの３本のバンドが示されたが、重要な器官（心臓、肺、肝臓及び腎臓）では示されなかったことを示す図である。
【図３Ａ】ＰＣ細胞の増殖に及ぼすＰＫＩＢ−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。ＲＴ−ＰＣＲにより、２２Ｒｖ１細胞（左）及びＬＮＣａＰ（ＨＰ）細胞（右）において、ｓｉ１及びｓｉ２によるＰＫＩＢ発現に及ぼすノックダウン効果が確認されたが、ｓｉ３及び陰性対照ｓｉＥＧＦＰによっては確認されなかった。ＡＣＴＢを、ＲＮＡを定量するために使用した。
【図３Ｂ】ＰＣ細胞の増殖に及ぼすＰＫＩＢ−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。表示したＰＫＩＢに対するｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｓｉ１、ｓｉ２及びｓｉ３）と、陰性対照ベクター（ｓｉＥＧＦＰ）とでトランスフェクトした２２Ｒｖ１細胞（左）及びＬＮＣａＰ（ＨＰ）細胞（右）の各々のＭＴＴアッセイ。ジェネテシンと共に２０日間インキュベートした後で、ＳＤ（標準偏差）を示すエラーバーと共に各平均値をプロットする。Ｙ軸のＡＢＳは、マイクロプレートリーダーで６３０ｎｍを基準として測定した、４９０ｎｍでの吸光度を意味する。これらの実験は、三連で実施した。２２Ｒｖ１細胞（左）及びＬＮＣａＰ（ＨＰ）細胞（右）においてｓｉ２及びｓｉ３でトランスフェクトすると、ノックダウン効果が観察されないｓｉ３及びｓｉＥＧＦＰと比較して、生細胞数の劇的な低減がもたらされた（Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。
【図３Ｃ】ＰＣ細胞の増殖に及ぼすＰＫＩＢ−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。表示したＰＫＩＢに対するｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｓｉ１、ｓｉ２及びｓｉ３）と、陰性対照ベクター（ｓｉＥＧＦＰ）との各々でトランスフェクトした２２Ｒｖ１細胞（左）及びＬＮＣａＰ（ＨＰ）細胞（右）のコロニー形成アッセイ。ジェネテシンと共に２０日間インキュベートした後で、細胞を、０．１％のクリスタルバイオレットでの染色で可視化した。
【図４Ａ】ＰＣ細胞の増殖に及ぼすＮＡＡＬＡＤＬ２−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。ＲＴ−ＰＣＲにより、２２Ｒｖ１細胞における、ｓｉ＃６９０によるＮＡＡＬＡＤＬ２の発現に及ぼすノックダウン効果が確認されたが、ｓｉ＃９１３、ｓｉ＃１３２８及び陰性対照ｓｉＥＧＦＰによっては確認されなかった。ＡＣＴＢを、ＲＮＡを定量するために使用した。
【図４Ｂ】ＰＣ細胞の増殖に及ぼすＮＡＡＬＡＤＬ２−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。表示したＮＡＡＬＡＤＬ２に対するｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｓｉ＃６９０、ｓｉ＃９１３及びｓｉ＃１３２８）と、陰性対照ベクター（ｓｉＥＧＦＰ）とでトランスフェクトした２２Ｒｖ１細胞の各々のＭＴＴアッセイ。ジェネテシンと共に２０日間インキュベートした後で、ＳＤ（標準偏差）を示すエラーバーと共に各平均値をプロットする。Ｙ軸のＡＢＳは、マイクロプレートリーダーで６３０ｎｍを基準として測定した、４９０ｎｍでの吸光度を意味する。これらの実験は、三連で実施した。２２Ｒｖ１細胞においてｓｉ＃６９０でトランスフェクトすると、ノックダウン効果が観察されない他のｓｉＲＮＡと比較して、生細胞数の劇的な低減がもたらされた（Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。
【図４Ｃ】ＰＣ細胞の増殖に及ぼすＮＡＡＬＡＤＬ２−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。表示したＮＡＡＬＡＤＬ２に対するｓｉＲＮＡ発現ベクター（ｓｉ＃６９０、ｓｉ＃９１３及びｓｉ＃１３２８）と、陰性対照ベクター（ｓｉＥＧＦＰ）との各々でトランスフェクトした２２Ｒｖ１細胞のコロニー形成アッセイ。ジェネテシンと共に２０日間インキュベートした後で、細胞を、０．１％のクリスタルバイオレットでの染色で可視化した。
【図４Ｄ】ＰＣ細胞の増殖に及ぼすＮＡＡＬＡＤＬ２−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。ＲＴ−ＰＣＲにより、ＮＡＡＬＡＤＬ２を発現する別のＣ４−２Ｂ細胞における、ｓｉ＃６９０に対応する合成ＲＮＡ二本鎖によるＮＡＡＬＡＤＬ２発現に及ぼすノックダウン効果が確認された。ＡＣＴＢを、ＲＮＡを定量するために使用した。
【図４Ｅ】ＰＣ細胞の増殖に及ぼすＮＡＡＬＡＤＬ２−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。ｓｉ＃６９０に対応する合成ＲＮＡ二本鎖は、対照ＲＮＡ二本鎖ｓｉＥＧＦＰと比較して、Ｃ４−２Ｂ細胞の細胞生存度を抑制した（Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。
【図５Ａ】ＰＫＩＢタンパク質の細胞内局在を示す図である。抗タグ抗体を使用する免疫細胞化学的分析は、外来性ＰＫＩＢが細胞質に局在し、外来性ＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質が細胞膜に主に局在することを示した。
【図５Ｂ】ＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質の細胞内局在を示す図である。抗タグ抗体を使用する免疫細胞化学的分析は、外来性ＰＫＩＢが細胞質に局在し、外来性ＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質が細胞膜に主に局在することを示した。
【図５Ｃ】ＰＫＩＢ−Ｍｙｃ及びＨＡ−ＰＫＡ−Ｃの発現ベクターを２２Ｒｖ１細胞に同時トランスフェクトし、それらの細胞可溶化物を各々のタグ抗体により免疫沈降した結果を示す図である。ＰＫＩＢ−ＭｙｃはＰＫＡ−Ｃで共免疫沈降を行い、及びその逆も行った。それらの結果は、ＰＫＩＢとＰＫＡ−Ｃとの間の直接の相互作用を示した。
【図５Ｄ】免疫細胞化学的分析により、対照ｓｉＲＮＡをＰＣ−３細胞にトランスフェクトした場合には、ほとんどのＰＫＡ−Ｃが細胞質中に局在し、ＰＫＡ−Ｃタンパク質の幾つかのシグナルが核内に局在することが観察された（左）。一方、ｓｉＲＮＡがＰＣ−３細胞において内在性ＰＫＩＢをノックダウンした場合には、免疫細胞化学的分析は、核内にＰＫＡ−Ｃのシグナルを全く又はほとんど示さなかった（右）。
【図５Ｅ】ＰＣ細胞中でｓｉＲＮＡ二本鎖を処理した後、核のＰＫＡ−Ｃをより定量的に分析するために、細胞を核画分と細胞質画分とに分画した。タンパク質量３０μｇの分画した細胞可溶化物を、抗ＰＫＡ−Ｃ抗体、及びローディングと核画分の対照のために抗ラミンＢ抗体を使用して、ウェスタンブロットした。核内のＰＫＡ−Ｃの量は、対照ｓｉＲＮＡと比較して、ｓｉＲＮＡによるＰＫＩＢノックダウンにおいて明らかに減少したが、細胞質中のＰＫＡ−Ｃの量は、ＰＫＩＢノックダウンにおいて少し増大した。
【図６Ａ】ＲＴ−ＰＣＲにより、ＤＵ１４５由来のクローン（ＰＫＩＢ＃１、＃２及び＃３）におけるＰＫＩＢの構成的発現を確認したことを示す図である。
【図６Ｂ】ウェスタンブロット分析により、ＤＵ１４５由来のクローン（ＰＫＩＢ＃１、＃２及び＃３）におけるＰＫＩＢの構成的発現を確認したことを示す図である。
【図６Ｃ】高レベルの外来性ＰＫＩＢを発現するＤＵ１４５クローン（クローン１〜クローン３）と、モック（ｍｏｃｋ）ベクターをトランスフェクトしたＤＵ１４５（＃１、＃２、＃３の混合物）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖速度を示す図である。Ｘ軸及びＹ軸は、播種後の日数と、対照としての１日目の吸光度の値との比較により直径の吸光度で算出した相対増殖速度とを表す。ＰＫＩＢを過剰発現する細胞はモック細胞より迅速に増殖し、前立腺癌におけるＰＫＩＢの増殖促進効果を示唆した。
【図６Ｄ】２×１０６個の、ＰＫＩＢを安定的に発現したＤＵ１４５細胞（右）、又はモック細胞（左）を、雄のヌードマウスの側腹部に接種した結果を示す図である。接種の１５週後、右側（ＰＫＩＢ＋＋；矢印）にのみ腫瘍が見出されたが、左側（モック）には見出されなかった。
【図６Ｅ】ＰＫＩＢ発現ベクターでのトランスフェクション後におけるＮＩＨ３Ｔ３細胞の浸潤性を実証するマトリゲル浸潤アッセイを示す図である。Ｙ軸は、マトリゲルコーティングしたフィルタを通って移動した細胞数を表す。アッセイを３回実施し、ＳＤ（標準偏差）を示すエラーバーと共に各平均値をプロットする。ＰＫＩＢの過剰発現は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の浸潤性を有意に促進した（Ｐ＝０．００５２）。
【図７Ａ】ＬＮＣａＰ細胞及びＰＣ−３細胞におけるｓｉＲＮＡ二本鎖（ｓｉＰＫＩＢ）によるＰＫＩＢのノックダウンが、Ａｋｔの４７３位のＳｅｒにおけるリン酸化の減少をもたらしたことを示す図である。ｓｉＥＧＦＰ二本鎖のトランスフェクションは、陰性対照として用意された。ＰＫＩＢのノックダウンをＲＴ−ＰＣＲにより確認し、ＡＣＴＢはローディング対照として用意した。
【図７Ｂ】ＰＫＩＢの過剰発現が、ＰＣ−３細胞及び２２Ｒｖ１細胞におけるＡｋｔの４７３位のＳｅｒにおけるリン酸化を増強したことを示す図である。ＰＫＩＢの過剰発現は、ＨＡタグ抗体を使用するウェスタンブロット法により確認された。
【図７Ｃ】ＰＫＡ−Ｃの過剰発現も、ＰＣ−３細胞におけるＡｋｔの４７３位のＳｅｒにおけるリン酸化を増強したことを示す図である。ＰＫＡ−Ｃの過剰発現はＨＡタグ抗体を使用するウェスタンブロット法により確認され、Ａｋｔの総量はローディング対照として用意された。
【図７Ｄ】組換えＰＫＩＢタンパク質及び組換えＰＫＡ−Ｃタンパク質を使用するＡｋｔのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのキナーゼアッセイを示す図である。Ａｋｔの４７３位のＳｅｒのリン酸化は、抗ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（細胞シグナリング）により検出され、Ａｋｔの総量は抗Ａｋｔ抗体により検出された。ＰＫＡ−ＣキナーゼへのＰＫＩＢの添加は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡｋｔの４７３位のＳｅｒのリン酸化を顕著に増大した。
【図８Ａ】ＰＫＩＢの発現が、臨床ＰＣ組織においてＡｋｔのリン酸化と相関したことを示す図である。写真は、ＰＫＩＢについてのＰＣ組織における免疫組織化学的分析を表す。写真は、図８Ｂのリン酸化Ａｋｔのスライドと対面している。
【図８Ｂ】ＰＫＩＢの発現が、臨床ＰＣ組織においてＡｋｔのリン酸化と相関したことを示す図である。写真は、リン酸化したＡｋｔについての、ＰＣ組織における免疫組織化学的分析を表す。写真は、図８ＡのＰＫＩＢのスライドと対面している。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の開示
定義
単語「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、本明細書中で使用される場合、特に指定のない限り、「少なくとも１つの」を意味する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「生体試料」という用語は生物体全体又はその組織、細胞又は構成部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血（amniotic cord blood）、尿、膣液、及び精液を含む（これらに限定されない）体液）のサブセットを指す。「生体試料」という用語はさらに、生物体全体又はその細胞、組織又は構成部分のサブセット、又はその画分若しくは一部分から調製されるホモジネート、可溶化物、抽出物、細胞培養物、又は組織培養物を指す。最後に、「生体試料」は、タンパク質又はポリヌクレオチド等の細胞成分を含有する、生物を繁殖させたニュートリエントブロス又はゲル等の培地を指す。
【００２７】
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、特に指定のない限り、本明細書中で互換可能に使用され、一般的に許容される１文字コードで表される。この用語は、１つ又は複数の核酸がエステル結合で連結する核酸（ヌクレオチド）ポリマーに適用される。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの組合せから構成され得る。
【００２８】
二本鎖分子
「単離二本鎖分子」という用語は、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、例えば二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））及び低分子干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ、例えばＤＮＡとＲＮＡとの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）又はＤＮＡとＲＮＡとの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を表す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぐ二本鎖ＲＮＡ分子を表す。ｓｉＲＮＡを細胞に導入する標準的な技法（ＤＮＡが、ＲＮＡが転写される鋳型であるものを含む）が用いられる。ｓｉＲＮＡは、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）又はその両方を含む。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方を有するように（例えばヘアピン）、ｓｉＲＮＡを構築してもよい。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡ又はｓｈＲＮＡのいずれであってもよい。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列を含み、且つその相補的な配列を介して共にアニーリングして二本鎖ＲＮＡ分子を形成している、２つのＲＮＡ分子の構築物を表す。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」又は「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子も含み得る。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに相補的である、第１の領域及び第２の領域、即ちセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む、ステム−ループ構造を有するｓｉＲＮＡを表す。領域の相補性及び配向性の程度は、塩基の対合が領域間で起こるのに十分であり、第１の領域及び第２の領域がループ領域によって連結し、そのループは、ループ領域内のヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠失によって生じる。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡとＤＮＡとの両方から成る二本鎖ポリヌクレオチド分子を表し、ＲＮＡ及びＤＮＡのハイブリッド及びキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぐ。本明細書中で、ハイブリッドは、ＤＮＡから成るポリヌクレオチドとＲＮＡから成るポリヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する分子を示し、キメラは、二本鎖分子を含む鎖の一方又は両方がＲＮＡ及びＤＮＡを含有し得ることを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技法が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）又はその両方を含む。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方を有するように（例えばヘアピン）、ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを構築してもよい。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ又はｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれであってもよい。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列を含み、且つその相補的な配列を介して共にアニーリングして二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成している、２つの分子の構築物を表す。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」又は「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の１つ又は両方が、ＲＮＡとＤＮＡとの両方から成るか（キメラ分子）、又は代替的に分子の１つがＲＮＡから成り、もう一方がＤＮＡから成る（ハイブリッド二本鎖）。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的である、第１の領域及び第２の領域、即ちセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む、ステム−ループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを表す。領域の相補性及び配向性の程度は、塩基の対合が領域間で起こるのに十分であり、第１の領域及び第２の領域がループ領域によって連結し、そのループは、ループ領域内のヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠失によって生じる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「単離核酸」は、その元の環境（例えば、天然物の場合は自然環境）から取り出した核酸、したがって、その自然状態から合成的に変化させた核酸である。本発明においては、単離核酸としてはＤＮＡ、ＲＮＡ、及びその誘導体が挙げられる。
【００３６】
標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする、ＰＫＩＢ、又はＮＡＡＬＡＤＬ２に対する二本鎖分子は、遺伝子の通常は一本鎖のｍＲＮＡ転写産物と結合し、それにより翻訳を妨げ、したがってタンパク質の発現を阻害することによりＰＫＩＢ、又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子によりコードされるＰＫＩＢ、又はＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質の産生を低減又は阻害する。前立腺癌細胞株におけるＰＫＩＢの発現が１つ又は２つの異なるｄｓＲＮＡにより阻害され（図３）、前立腺癌細胞株におけるＮＡＡＬＡＤＬ２の発現がｄｓＲＮＡにより阻害された（図４）。
【００３７】
したがって、本発明はＰＫＩＢ、又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子を発現する細胞に導入した場合に、該遺伝子の発現を阻害する能力がある単離二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、下記で述べるようなｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムにより設計される。
ＰＫＩＢ標的配列は、例えば、
配列番号１６、
配列番号１７のヌクレオチドを含み、
ＮＡＡＬＡＤＬ２標的配列は、例えば、
配列番号１９のヌクレオチドを含む。
【００３８】
具体的には、本発明は以下の二本鎖分子［１］〜［１６］を提供する：
［１］細胞に導入した場合にＰＫＩＢ遺伝子又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の発現、及び細胞増殖を阻害する単離二本鎖分子であって、センス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成し、且つセンス鎖が配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される標的配列を含む、単離二本鎖分子。
［２］約１００ヌクレオチド未満の長さを有する、［１］に記載の二本鎖分子。
［３］約７５ヌクレオチド未満の長さを有する、［２］に記載の二本鎖分子。
［４］約５０ヌクレオチド未満の長さを有する、［３］に記載の二本鎖分子。
［５］約２５ヌクレオチド未満の長さを有する、［４］に記載の二本鎖分子。
［６］約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの間の長さを有する、［５］に記載の二本鎖分子。
［７］介在一本鎖によって連結したセンス鎖とアンチセンス鎖との両方を含む単一ポリヌクレオチドから成る、［１］に記載の二本鎖分子。
［８］一般式：５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’（式中、［Ａ］は配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、［Ａ’］は［Ａ］と相補的な配列を含むアンチセンス鎖である）を有する、［７］に記載の二本鎖分子。
［９］ＲＮＡを含む、［１］に記載の二本鎖分子。
［１０］ＤＮＡとＲＮＡとの両方を含む、［１］に記載の二本鎖分子。
［１１］ＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１０］に記載の二本鎖分子。
［１２］センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれＤＮＡ及びＲＮＡから成る、［１１］に記載の二本鎖分子。
［１３］ＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１０］に記載の二本鎖分子。
［１４］アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、又はセンス鎖の５'末端に隣接する領域及びアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方がＲＮＡから成る、［１３］に記載の二本鎖分子、
［１５］隣接領域が９個〜１３個のヌクレオチドから成る、［１４］に記載の二本鎖分子、
［１６］３’オーバーハングを含有する、［１］に記載の二本鎖分子。
【００３９】
本発明の二本鎖分子は以下でより詳細に説明される。
【００４０】
細胞において標的遺伝子発現を阻害する能力がある二本鎖分子を設計する方法が知られている（例えば米国特許第６，５０６，５５９号明細書（その全体が本明細書中で参照により援用される）を参照されたい）。例えば、ｓｉＲＮＡを設計するコンピュータプログラムは、Ambionのウェブサイトから入手可能である（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）。
【００４１】
コンピュータプログラムは、以下のプロトコルに基づき、二本鎖分子に対する標的ヌクレオチド配列を選択する。
【００４２】
標的部位の選択
１．  転写産物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として、それぞれのＡＡの存在とその３’側に隣接した１９個のヌクレオチドとを記録する。Tuschl et al.は、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び開始コドン近くの領域（７５塩基以内）に対してｓｉＲＮＡを設計することを避けることを推奨している。これらの領域は調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、ＵＴＲ結合タンパク質及び／又は翻訳開始複合体が、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
２．  潜在的な標的部位と、適当なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）とを比較し、他のコード配列との相同性が大きい任意の標的配列を考慮から外す。基本的には、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/でのＮＣＢＩサーバーにあるＢＬＡＳＴを用いる（Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25（17）:3389-402）。
３．  合成のために条件を満たす（qualifying）標的配列を選択する。評価するために、遺伝子の長さに沿って標的配列を幾つか選択するのが一般的である。
【００４３】
該プロトコルにより、本発明の単離二本鎖分子の標的配列は、以下のように設計された。
ＰＫＩＢ遺伝子に関して配列番号１６及び配列番号１７；ヌクレオチド
ＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子に関して配列番号１９；ヌクレオチド。
【００４４】
上述の標的配列を標的とする二本鎖分子をそれぞれ、標的遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制する能力について検査した。したがって、本発明は以下の群から選択される配列のいずれかを標的とする二本鎖分子を提供する：
ＰＫＩＢ遺伝子に対して配列番号１６及び配列番号：配列番号１７；ヌクレオチド
ＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子に対して配列番号１９；ヌクレオチド。
【００４５】
本発明の二本鎖分子は単一の標的ＰＫＩＢ若しくはＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子配列を対象としてもよく、又は複数の標的ＰＫＩＢ、又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子配列を対象としてもよい。
【００４６】
ＰＫＩＢ標的配列又はＮＡＡＬＡＤＬ２標的配列とは、ＰＫＩＢ遺伝子又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の一部分（すなわち、ｓｉＲＮＡと長さが等しく且つ相補的なＰＫＩＢ遺伝子又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子内のポリヌクレオチド）と同一のヌクレオチド配列を意味する。標的配列は、ヒトのＰＫＩＢ遺伝子若しくはＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の５’非翻訳（ＵＴ）領域、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又は３’非翻訳領域を含み得る。代替的に、ｓｉＲＮＡは、ＰＫＩＢ遺伝子又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の発現の上流又は下流の修飾因子と相補的な核酸配列である。上流及び下流の修飾因子の例としては、ＰＫＩＢ遺伝子又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子のプロモーターと結合する転写因子、ＰＫＩＢポリペプチド又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドと相互作用するキナーゼ又はホスファターゼ、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のプロモーター又はエンハンサーが挙げられる。
【００４７】
上述のＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の標的配列を標的とする本発明の二本鎖分子は、標的配列の核酸配列及び／又は標的配列に相補的な配列のいずれかを含有する単離ポリヌクレオチドを含む。ＰＫＩＢ遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例としては、配列番号１６若しくは配列番号１７の配列、及び／又はこれらのヌクレオチドに相補的な配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられ、ＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例としては、配列番号１９の配列、及び／又はこれらのヌクレオチドに相補的な配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。しかしながら、本発明はこれらの例に限定されず、上述の核酸配列における軽微な修飾は、修飾された分子がＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の発現を抑制する能力を保持する限りは許容可能である。ここで、核酸配列の「軽微な修飾」は、配列への核酸の１つ、２つ又は幾つかの置換、欠失、付加、又は挿入を示す。典型的に、軽微な修飾は、配列への４個以下、場合によっては３個以下、及び多くは２個以下の核酸の置換、欠失、付加又は挿入である。
【００４８】
本発明によれば、本発明の二本鎖分子は、実施例で利用される方法を用いて、その能力に関して試験することができる。実施例では、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子のｍＲＮＡの様々な部分のセンス鎖又はそれに対して相補的なアンチセンス鎖を含む二本鎖分子を、標準的な方法に従って、前立腺癌細胞株（例えば、２２Ｒｖ１、ＬＮＣａＰ（ＨＰ）及びＣ４−２Ｂを用いて）におけるＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子産物の産出を低減させる能力に関してｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。さらに例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞に比べて、候補二本鎖分子と接触させた細胞でのＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子産物の低減は、例えば、実施例１における「半定量ＲＴ−ＰＣＲ」で述べられたＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のｍＲＮＡに対するプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより検出することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞ベースのアッセイにおいてＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子産物の産生を低減する配列は、続いて、細胞増殖に及ぼすこれらの阻害効果に関して試験することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞ベースのアッセイにおいて細胞増殖を阻害する配列は、続いて、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２産物の産生の低減及び癌細胞増殖の低減を確認するために、癌を有する動物、例えばヌードマウス異種移植片モデルを用いてこれらのｉｎ  ｖｉｖｏ能力に関して試験することができる。
【００４９】
単離ポリヌクレオチドがＲＮＡ又はそれらの誘導体である場合、ヌクレオチド配列において塩基「ｔ」は「ｕ」に置き換えるものとする。本明細書で使用される場合、「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチドユニット間のワトソンクリック型又はフーグスティーン型の塩基対合を表し、「結合」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の物理的な又は化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが修飾ヌクレオチド及び／又は非ホスホジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドもまた同じように互いに結合することができる。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件下でハイブリダイズして、ほとんど又は全くミスマッチを含有しない安定二本鎖を形成する。さらに、本発明の単離ポリヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子又はヘアピンループ構造を形成することができる。好ましい実施形態において、このような二本鎖は１０個のマッチ毎にわずか１個のマッチしか含有していない。特に好ましい実施形態では、二本鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二本鎖はミスマッチを含有しない。
【００５０】
ポリヌクレオチドはＰＫＩＢでは１９０９ヌクレオチド長未満、ＮＡＡＬＡＤＬ２では４９１２ヌクレオチド長未満である。例えば、ポリヌクレオチドは、全ての遺伝子に関して、５００ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、又は２５ヌクレオチド長未満である。本発明の単離ポリヌクレオチドは、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子に対する二本鎖分子を形成するのに、又は該二本鎖分子をコードする鋳型ＤＮＡを調製するのに有用である。ポリヌクレオチドが二本鎖分子を形成するのに使用される場合、ポリヌクレオチドは１９ヌクレオチドより長く、好ましくは２１ヌクレオチドより長く、より好ましくは約１９ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの長さを有し得る。
【００５１】
本発明の二本鎖分子は、１つ又は複数の修飾ヌクレオチド及び／又は非ホスホジエステル結合を含有し得る。当該技術分野に既知の化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性及び／又は細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に取り込むことができる他の種類の化学修飾にも気づくであろう（国際公開第０３／０７０７４４号パンフレット、国際公開第２００５／０４５０３７号パンフレット）。一実施形態では、分解耐性の改善又は取り込みの改善を与えるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例としては、ホスホロチオエート結合、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上で）、２’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基（universal base）」ヌクレオチド、５’−Ｃ−メチルヌクレオチド、及び逆デオキシ脱塩基残基（inverted deoxyabasic residue）の組み込みが挙げられる（米国特許出願第２００６０１２２１３７号明細書）。別の実施形態では、二本鎖分子の安定性を向上させるために、又は標的化の効率を増大させるために修飾を用いることができる。修飾としては、二本鎖分子の２つの相補鎖間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の３’末端又は５’末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾及び／又は骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチド及び２’−デオキシリボヌクレオチドが挙げられる（国際公開第２００４／０２９２１２号パンフレット）。別の実施形態では、標的ｍＲＮＡにおける、及び／又は相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性の増減に修飾を用いることができる（国際公開第２００５／０４４９７６号パンフレット）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、又は５−プロピルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを７−デザプリン、７−アルキルプリン、又は７−アルケニルプリンに置換することができる。別の実施形態では、二本鎖分子が３’オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３’末端のヌクレオチドが突き出た（overhanging）ヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに置き換えることができる（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15（2）: 188-200）。さらに詳細には、公開文献、例えば米国特許出願第２００６０２３４９７０号明細書が利用可能である。本発明は、これらの例には限定されず、得られた分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持していれば、任意の既知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に利用することができる。
【００５２】
さらに、本発明の二本鎖分子はＤＮＡとＲＮＡとの両方を含み得る（例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ又はｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）。特に、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドポリヌクレオチド又はＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは安定性の増大を示す。ＤＮＡとＲＮＡとの混合物、即ちＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とから成るハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖（ポリヌクレオチド）の一方又は両方上でＤＮＡとＲＮＡとの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成することができる。ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現する細胞に導入した場合に標的遺伝子の発現を阻害する活性があれば、センス鎖がＤＮＡであり、アンチセンス鎖がＲＮＡであるか、又はその反対のいずれであってもよい。好ましくは、センス鎖のポリヌクレオチドはＤＮＡであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドはＲＮＡである。また、キメラ型二本鎖分子は、標的遺伝子を発現する細胞に導入した場合に標的遺伝子の発現を阻害する活性があれば、センス鎖とアンチセンス鎖との両方がＤＮＡとＲＮＡとから成るか、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖のいずれか一方がＤＮＡとＲＮＡとから成るか、いずれであってもよい。二本鎖分子の安定性を向上するためには、分子は可能な限り多くのＤＮＡを含有する方が好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、分子には発現の十分な阻害を誘導する範囲内でＲＮＡが必要である。キメラ型二本鎖分子の好ましい例では、二本鎖分子の上流部分領域（即ちセンス鎖又はアンチセンス鎖内の標的配列又はその相補配列に隣接する領域）がＲＮＡである。好ましくは、上流部分領域は、センス鎖の５’側（５’末端）及びアンチセンス鎖の３’側（３’末端）を示す。代替的には、センス鎖の５’末端及び／又はアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域が、上流部分領域と称される。即ち、好ましい実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、又はセンス鎖の５’末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域との両方がＲＮＡから成る。例えば、本発明のキメラ又はハイブリッド型二本鎖分子は以下の組み合わせを含む。
センス鎖：            ５’−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ]−５’：アンチセンス鎖、
センス鎖：５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’：アンチセンス鎖、及び
センス鎖：５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−５’：アンチセンス鎖。
【００５３】
上流部分領域は、好ましくは、二本鎖分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖内で、標的配列又はこれに対する相補配列の末端から数えて９個〜１３個のヌクレオチドから成るドメインである。さらに、かかるキメラ型二本鎖分子の好ましい例としては、少なくともポリヌクレオチドの上流半分の領域（センス鎖では５’側領域及びアンチセンス鎖では３’側領域）がＲＮＡであり、もう半分がＤＮＡである１９個〜２１個のヌクレオチド鎖長を有するものが挙げられる。かかるキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合、標的遺伝子の発現阻害効果がかなり高くなる（米国特許出願第２００５０００４０６４号明細書）。
【００５４】
本発明において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えばショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及びＤＮＡとＲＮＡとから成るショートヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成することができる。ｓｈＲＮＡ又はｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができる、タイトなヘアピンカーブ（tight hairpin turn）を作る、ＲＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡとの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡ又はｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、一本鎖上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分けられる。一般的に、ヘアピン構造は、細胞機構によってｄｓＲＮＡ又はｄｓＤ／Ｒ−ＮＡに切断され、続いてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列に一致するｍＲＮＡと結合してこれを切断する。
【００５５】
任意のヌクレオチド配列から成るループ配列は、ヘアピンループ構造を形成するために、センス配列とアンチセンス配列との間に位置し得る。したがって、本発明は、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’（式中、［Ａ］は標的配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は介在一本鎖であり、［Ａ’］は［Ａ］に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である）を有する二本鎖分子も提供する。標的配列は、例えば、
ＰＫＩＢに関してヌクレオチド配列番号１６、又は
配列番号１７；ヌクレオチド
ＮＡＡＬＡＤＬ２に関してヌクレオチド配列番号１９；ヌクレオチド
から成る群から選択され得る。
【００５６】
本発明はこれらの例には限定されず、［Ａ］における標的配列は、二本鎖分子が標的となるＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の発現を抑制する能力を保持していれば、これらの例から修飾された配列であってもよい。［Ａ］領域は［Ａ’］領域とハイブリダイズし、［Ｂ］領域から成るループを形成する。介在一本鎖部分［Ｂ］、即ちループ配列は、好ましくは３ヌクレオチド長〜２３ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列から成る群から選択することができる（http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html）。さらに、２３個のヌクレオチドから成るループ配列は活性ｓｉＲＮＡも提供する（Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435-8, Epub 2002 Jun 26）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、又はＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435- 8, Epub 2002 Jun 26；
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100（4）: 1639-44, Epub 2003 Feb 10；及び
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4（6）: 457-67。
【００５７】
本発明のヘアピンループ構造を有する例示的な好ましい二本鎖分子は以下に示される。以下の構造では、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣ及びＵＵＣＡＡＧＡＧＡから成る群から選択することができるが、本発明はこれらに限定されない：
ｇａｕａｕｇｃｃａｕｃｃｃａｇａｕｕｕ−［Ｂ］−ａａａｕｃｕｇｇｇａｕｇｇｃａｕａｕｃ（標的配列番号１６）；
ｇｕｃａａａｕｕｃｃｃｃａａａｕｕａａ−［Ｂ］−ｕｕａａｕｕｕｇｇｇｇａａｕｕｕｇａｃ（標的配列番号１７）；及び
ｇｕｇｕｃｃａｇａｇｇｃｃａａｕａｕｕ−［Ｂ］−ａａｕａｕｕｇｇｃｃｕｃｕｇｇａｃａｃ（標的配列番号１９）。
【００５８】
さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、ヌクレオチド「ｕ」を３’オーバーハングとして標的配列のアンチセンス鎖の３’末端に付加することができる。付加される「ｕ」の数は少なくとも２、概して２〜１０、好ましくは２〜５である。付加される「ｕ」は二本鎖分子のアンチセンス鎖の３’末端で一本鎖を形成する。
【００５９】
二本鎖分子を調製する方法は特に限定されないが、当該技術分野で既知の化学合成方法を使用するのが好ましい。化学合成方法に従って、センス及びアンチセンスの一本鎖ポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。アニーリングの具体的な例では、合成一本鎖ポリヌクレオチドは好ましくは少なくとも約３：７、より好ましくは約４：６、最も好ましくは実質的に等モル量（即ち約５：５のモル比）のモル比で混合される。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリング二本鎖ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の通常利用される方法によって精製することができる。精製方法の例としては、アガロースゲル電気泳動を利用するか、又は残存一本鎖ポリヌクレオチドが、例えば適当な酵素による分解によって任意に取り除かれる方法が挙げられる。
【００６０】
ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２配列に隣接する制御配列は同一であっても又は異なっていてもよく、このためこれらの発現は別々に又はある時間的に又は空間的様式で制御することができる。二本鎖分子は、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２鋳型を、例えば低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリＩＩＩ転写ユニット又はヒトＨ１  ＲＮＡプロモーターを含有するベクターにクローニングすることによって細胞内で転写することができる。
【００６１】
二本鎖分子を含有するベクター
本明細書に記載の二本鎖分子を１つ又は複数含有するベクター、及び該ベクターを含有する細胞も本発明に包含される。本発明のベクターは、好ましくは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする。本明細書中で、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入された場合に、ベクターが前記分子を発現するであろうことを示す。好ましい実施形態では、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な制御要素を含む。かかる本発明のベクターは、本発明の二本鎖分子を生成するのに、又は癌を治療するための活性成分として直接使用することができる。
【００６２】
本発明のベクターは、例えば、両方の鎖が（ＤＮＡ分子の転写によって）発現されるような方法で制御配列がＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２配列と機能的に連結するように、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２配列を発現ベクターにクローニングすることによって生成することができる（Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5）。例えば、ｍＲＮＡに対するアンチセンスであるＲＮＡ分子が第１のプロモーター（例えばクローニングＤＮＡの３’末端と隣接するプロモーター配列）によって転写され、ｍＲＮＡに対するセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えばクローニングＤＮＡの５’末端に隣接するプロモーター配列）によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがｉｎ  ｖｉｖｏでハイブリダイズし、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を生成する。代替的に、二本鎖分子のセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれコードする２つのベクター構築物は、センス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ発現した後、二本鎖分子構築物を形成するために利用する。さらに、クローニング配列は二次構造（例えばヘアピン）を有する構築物、即ち標的遺伝子のセンス配列と相補的なアンチセンス配列との両方を含有するベクターの単一転写産物をコードすることができる。
【００６３】
本発明のベクターは、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するためにそのようなものを具備することもできる（例えば相同的な組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第５，５８０，８５９号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書、同第５，８０４，５６６号明細書、同第５，７３９，１１８号明細書、同第５，７３６，５２４号明細書、同第５，６７９，６４７号明細書、及び国際公開第９８／０４７２０号パンフレットを参照されたい。ＤＮＡベースの送達技法の例としては、「ネイキッド（naked：裸）ＤＮＡ」、促進性（ブピバカイン（bupivicaine）、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、及び粒子媒介性（「遺伝子銃」）又は圧力媒介性の送達が挙げられる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号明細書を参照されたい）。
【００６４】
本発明のベクターは例えば、ウイルス又は細菌ベクターであり得る。発現ベクターの例としては、弱毒化ウイルス宿主、例えば牛痘又は鶏痘が挙げられる（例えば米国特許第４，７２２，８４８号明細書を参照されたい）。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしての牛痘ウイルスの使用を含む。標的遺伝子を発現する細胞に導入すると、組換え牛痘ウイルスは前記分子を発現し、それにより細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例としてはカルメット・ゲラン桿菌（Bacille Calmette Guerin）（ＢＣＧ）が挙げられる。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載される。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与及び生成に有用である。例としては、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクター等が挙げられる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、及びHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【００６５】
二本鎖分子を使用して癌を治療する方法
本発明では、ＰＫＩＢについての３つの異なるｄｓＲＮＡと、ＮＡＡＬＡＤＬ２についての３つの異なるｄｓＲＮＡとを構築し、細胞増殖を阻害するそれらの能力を試験した。ＰＫＩＢについての２つのｄｓＲＮＡは、２つの前立腺癌細胞株における遺伝子の発現を効果的にノックダウンし、同時に細胞増殖を抑制した（図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃ）。ＮＡＡＬＡＤＬ２についての１つのｄｓＲＮＡは、前立腺細胞株における発現レベル及び細胞増殖活性を有意に減少させた（図４Ａ〜図４Ｅ）。
【００６６】
したがって本発明は、ＰＫＩＢ遺伝子又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の発現を阻害することを通じてＰＫＩＢ遺伝子又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の機能障害を誘発することにより、細胞増殖、すなわち、前立腺癌細胞増殖を阻害する方法を提供する。ＰＫＩＢ遺伝子又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の発現は、ＰＫＩＢ遺伝子若しくはＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子を特異的に標的とする上述の本発明の二本鎖分子、又は二本鎖分子のいずれかを発現することができる本発明のベクターのいずれかにより阻害され得る。
【００６７】
癌細胞の細胞増殖を阻害する本発明の二本鎖分子及びベクターのこのような能力は、これらを癌を治療する方法のために使用することができることを示す。したがって本発明は、ＰＫＩＢ遺伝子若しくはＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子に対する二本鎖分子、又は該分子を発現するベクターを投与することにより、副作用なしに（理由は、これらの遺伝子は正常な器官中にほとんど検出されなかったためである（図１及び図２））、前立腺癌患者を治療する方法を提供する。
【００６８】
阻害性のポリヌクレオチド及びポリペプチドとの関連では、「特異的に阻害する」という用語は、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現又は生物学的機能を阻害するための作用物質又はリガンドの能力を表す。特異的な阻害は、ＰＫＩＢ若しくはＮＡＡＬＡＤＬ２の発現（例えば転写若しくは翻訳）、又は測定される生物学的機能（例えば細胞増殖（growth）若しくは細胞増殖（proliferation）、アポトーシスの阻害）の、典型的にはバックグラウンドに対して少なくとも約２倍の阻害、好ましくは約１０倍より大きい阻害、最も好ましくは１００倍より大きい阻害をもたらす。発現レベル及び／又は生物学的機能は、処理後及び未処理の細胞、又は処理前後の細胞集団の比較との関連で、測定することができる。幾つかの実施形態では、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現又は生物学的機能は、完全に阻害される。典型的には、特異的な阻害は、適当な統計試験を使用しての、ＰＫＩＢ若しくはＮＡＡＬＡＤＬ２の発現、又は生物学的機能における統計的に有意な低減（例えばｐ≦０．０５）である。
【００６９】
特に本発明は、以下の方法［１］〜［２３］を提供する：
［１］前立腺癌を治療する方法であって、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２を過剰発現する細胞におけるＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現、及び細胞増殖を阻害する少なくとも１つの単離二本鎖分子を投与する工程を含み、該分子がセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成する、治療する方法。
［２］センス鎖が配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含む、［１］に記載の方法。
［３］治療すべき前立腺癌がホルモン不応性前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌である、［１］に記載の方法。
［４］複数種の二本鎖分子が投与される、［１］に記載の方法。
［５］複数種の二本鎖分子が同じ遺伝子を標的とする、［４］に記載の方法。
［６］二本鎖分子がヌクレオチド数約１００未満の長さを有する、［１］に記載の方法。
［７］二本鎖分子がヌクレオチド数約７５未満の長さを有する、［６］に記載の方法。
［８］二本鎖分子がヌクレオチド数約５０未満の長さを有する、［７］に記載の方法。
［９］二本鎖分子がヌクレオチド数約２５未満の長さを有する、［８］に記載の方法。
［１０］二本鎖分子がヌクレオチド数約１９〜約２５の長さを有する、［９］に記載の方法。
［１１］二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結したセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドから成る、［１］に記載の方法。
［１２］二本鎖分子が、一般式：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
（式中、［Ａ］は配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である）を有する、［１１］に記載の方法。
［１３］二本鎖分子がＲＮＡを含む、［１］に記載の方法。
［１４］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡとの両方を含む、［１］に記載の方法。
［１５］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１４］に記載の方法。
［１６］センス鎖ポリヌクレオチド及びアンチセンス鎖ポリヌクレオチドがそれぞれＤＮＡ及びＲＮＡから成る、［１５］に記載の方法。
［１７］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１４］に記載の方法。
［１８］アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、又はセンス鎖の５'末端に隣接する領域及びアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方がＲＮＡから成る、［１７］に記載の方法。
［１９］隣接領域が９個〜１３個のヌクレオチドから成る、［１８］に記載の方法。
［２０］二本鎖分子が３’オーバーハングを含有する、［１］に記載の方法。
［２１］二本鎖分子がベクターによりコードされる、［１］に記載の方法。
［２２］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、一般式：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
（式中、［Ａ］は配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である）を有する、［２１］に記載の方法。
［２３］二本鎖分子が、該分子に加えてトランスフェクション増強剤と薬学的に許容可能な担体とを含む組成物に含有される、［１］に記載の方法。
【００７０】
本方法は以下でより詳細に説明される。
【００７１】
ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子を発現する細胞の増殖は、該細胞を、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子に対する二本鎖分子、該分子を発現するベクター、又はこれを含む組成物に接触させることによって阻害される。さらに前記細胞を、トランスフェクション剤に接触させる。好適なトランスフェクション剤は当該技術分野で既知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、前記細胞が、前記分子に曝露されない細胞に比べて、より遅い速度で増殖するか、又は生存率が低減することを示す。細胞増殖は、例えばＭＴＴ細胞増殖アッセイを用いた当該技術分野で既知の方法によって測定することができる。
【００７２】
細胞が本発明の二本鎖分子の標的遺伝子を発現又は過剰発現していれば、いずれの種類の細胞の増殖も本発明に従って抑制することができる。例示的な細胞としては前立線癌細胞が挙げられる。
【００７３】
したがって、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２に関連する疾患を患う又は発症する危険性がある患者は、少なくとも１つの本発明の二本鎖分子、少なくとも１つの該分子を発現する少なくとも１つのベクター、又は少なくとも１つの該分子を含む少なくとも１つの組成物を投与することによって治療することができる。例えば、前立腺癌患者は本方法に従って治療することができる。癌の種類は、診断される特定種類の腫瘍に従って、標準的な方法によって同定することができる。前立腺癌は、例えば前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）又は直腸指診によって診断され得る。より好ましくは、本方法によって治療される患者は、ＲＴ−ＰＣＲ又はイムノアッセイによって、患者由来の生検材料で、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現を検出することによって選択される。好ましくは、本発明の治療の前に、被験体由来の生検標本が、当該技術分野で既知の方法、例えば免疫組織化学解析又はＲＴ−ＰＣＲによって、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子を過剰発現することが確認される。
【００７４】
細胞増殖を阻害し、それにより癌を治療する本方法によれば、複数の種類の二本鎖分子（又はこれを発現するベクター又はこれを含有する組成物）を投与する場合、それぞれの分子は、ＰＫＩＢ及び／又はＮＡＡＬＡＤＬ２の同じ標的配列、又はＰＫＩＢ及び／又はＮＡＡＬＡＤＬ２の異なる標的配列に指向性を有し得る。例えば、本方法は、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２に指向性を有する二本鎖分子を利用することができる。代替的に例えば、本方法は、ＰＫＩＢ及びＮＡＡＬＡＤＬ２から選択される１つ、２つ又はそれ以上の標的配列に指向性を有する二本鎖分子を利用することができる。
【００７５】
細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子は、該分子と対応するｍＲＮＡ転写産物との結合を達成する形態で、細胞に直接導入することができる。代替的に、上記のように、二本鎖分子をコードするＤＮＡは、ベクターとして細胞に導入することができる。二本鎖分子及びベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション増強剤、例えばＦｕＧＥＮＥ（Roche diagnostices）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Invitrogen）及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（和光純薬工業株式会社）を利用することができる。
【００７６】
治療は、臨床的利点、例えばＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の発現の低減、又は被験体における癌のサイズ、有病率若しくは転移能の減少をもたらすかどうかで有効であるかを求められる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、治療が癌の形成を遅らせる若しくは防ぐか、又は癌の臨床症状を防ぐか若しくは緩和するという意味である。有効性（Efficaciousness）は、特定の腫瘍型を診断又は治療する任意の既知の方法に関連して求められる。
【００７７】
防止（Prevention）及び予防（prophylaxis）は、疾患による死亡又は罹患の負担を低減する任意の活動を含む。防止及び予防は、「一次的、二次的及び三次的な防止レベルで」行うことができる。一次的な防止及び予防は疾患の発症を回避するのに対して、二次的及び三次的なレベルの防止及び予防は、機能を回復すること及び疾患に関連する合併症を低減することにより、疾患の進行及び症状の出現の防止及び予防、並びに既に確立された疾患の悪影響の低減を目的とする活動を包含する。代替的に、防止及び予防は、特定の障害の重症度を軽減すること（例えば、腫瘍の増殖及び転移を低減すること、血管新生を低減すること）を目的とする広範な予防的療法を含む。
【００７８】
癌の治療、及び／又は癌の予防及び／又は手術後のその再発の防止のための処置は、以下の工程のいずれかを含む：癌細胞の外科的除去、癌細胞の増殖阻害、腫瘍の退縮又は退行、癌の発生の寛解及び抑制の誘導、腫瘍退行、並びに転移の低減又は阻害等。癌の効果的な治療及び／又は予防は、死亡率を減少させ、癌を有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを減少させ、癌に付随する検出可能な症状を軽減する。
【００７９】
本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量で標的ｍＲＮＡ（ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２）を分解することが理解される。理論に束縛されないが、本発明の二本鎖分子によって、触媒的に標的ｍＲＮＡの分解が起こると考えられている。したがって、標準的な癌治療に比べて、治療効果を発揮するために癌部位又はその近くに送達される必要のある二本鎖分子は、有意に少ない。
【００８０】
当業者は、例えば被験体の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状及び他の状態；投与経路；並びに投与が局所的又は全身的のいずれであるかなどの因子を考慮して、所定の被験体に投与されるべき本発明の二本鎖分子の有効量を容易に求めることができる。概して、本発明の二本鎖分子の有効量は、癌部位又はその近くにおける細胞内濃度が約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭを含む。より多くの又はより少ない量の二本鎖分子を投与することができることが考慮される。
【００８１】
本発明の方法は、癌（例えば前立腺癌、特にホルモン不応性前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌）の増殖又は転移を阻害するために使用することができる。特に、ＰＫＩＢの標的配列（すなわち、配列番号１６及び配列番号１７）を含む二本鎖分子は、前立腺癌の治療に特に好ましい。ＮＡＡＬＡＤＬ２の標的配列（すなわち、配列番号１９）を含む二本鎖分子は、前立腺癌の治療に特に好ましい。
【００８２】
癌を治療するために、本発明の二本鎖分子は、該二本鎖分子とは異なる薬剤と併用して被験体に投与することもできる。代替的に、本発明の二本鎖分子は、癌を治療するために設計される別の治療法と併用して被験体に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、癌を治療する又は癌転移を予防するのに現在利用されている治療法（例えば放射線療法、外科的手術及び化学療法剤（例えばシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン又はタモキシフェン）を用いた治療）と併用して投与することができる。
【００８３】
本方法において、二本鎖分子は、送達試薬と共にネイキッド二本鎖分子として、又は該二本鎖分子を発現する組換えプラスミド若しくはウイルスベクターとしてのいずれかで被験体に投与することができる。
【００８４】
本発明の二本鎖分子と共に投与するのに好適な送達試薬としては、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ（登録商標）脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、又はポリカチオン（例えばポリリシン）又はリポソームが挙げられる。好ましい送達試薬はリポソームである。
【００８５】
リポソームは、特定の組織、例えば前立腺腫瘍組織への二本鎖分子の送達に役立ち、二本鎖分子の血液半減期も増大させ得る。本発明での使用に好適なリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、概してこれには、中性又は負に帯電したリン脂質とステロール、例えばコレステロールとが含まれる。一般的には、所望のリポソームサイズ及び血流中におけるリポソームの半減期などの因子を考慮して、脂質の選択が導かれる。リポソームを調製するのに、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、及び米国特許第４，２３５，８７１号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、同第４，８３７，０２８号明細書、及び同第５，０１９，３６９号明細書（その開示全体が参照により本明細書に引用される）で記載されるような様々な方法が知られている。
【００８６】
好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、リポソームを癌部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍又は血管内皮細胞に広まった受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原又は内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体が好ましい。
【００８７】
特に好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン阻害部分を有することによって、単核マクロファージ及び網内系によるクリアランスを避けるように修飾される。一実施形態では、本発明のリポソームは、オプソニン阻害部分とリガンドとの両方を含み得る。
【００８８】
本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用される場合、オプソニン阻害部分は、例えば脂質−可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、又は膜脂質の活性基への直接結合によって、膜と化学的に又は物理的に接着する場合に、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン阻害親水性ポリマーは、例えば米国特許第４，９２０，０１６号明細書（その開示全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）及び網内系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン阻害部分で修飾されたリポソームは非修飾リポソームよりもかなり長く循環血液中に留まる。このため、かかるリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
【００８９】
ステルスリポソームは、多孔性又は「漏出性（leaky）」微小血管系によって送り込まれる組織中で集積することが知られている。したがって、かかる微小血管系の欠陥を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍は、効率的にこれらのリポソームを集積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの低減が、肝臓及び脾臓における有意な集積を防ぐことによって、ステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン阻害部分で修飾された本発明のリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。
【００９０】
リポソームを修飾するのに好適なオプソニン阻害部分は、好ましくは、分子量が約５００ダルトン〜約４０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンの水溶性ポリマーであり得る。かかるポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧ又はＰＰＧ、及びＰＥＧ又はＰＰＧステアレート；合成ポリマー、例えばポリアクリルアミド又はポリＮ−ビニルピロリドン；直鎖、分岐又は樹状のポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えばカルボン酸基又はアミノ基が化学結合したポリビニルアルコール及びポリキシリトール、並びにガングリオシド、例えばガングリオシドＧＭ１が挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ若しくはメトキシＰＰＧのコポリマー、又はそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン阻害ポリマーは、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、又はポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン阻害ポリマーは、アミノ酸又はカルボン酸を含有する天然多糖（例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン）；アミノ化多糖又はオリゴ糖（直鎖又は分岐）；又はカルボン酸基の連結を有するカルボン酸の誘導体と反応させたカルボキシル化多糖又はカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。
【００９１】
好ましくは、オプソニン阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ又はその誘導体である。ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体によって変性したリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。
【００９２】
オプソニン阻害部分は、多くの既知の技法のいずれか１つによってリポソーム膜と結合することができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、６０℃でＮａ（ＣＮ）ＢＨ３及び溶媒混合物（例えばテトラヒドロフランと水とを３０：１２の比で）を用いて還元アミノ化によってステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
【００９３】
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で検討される。少なくとも１つの本発明の二本鎖分子を発現するかかるベクターもまた、直接又は好適な送達試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１（登録商標）脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン（例えばポリリシン）又はリポソームを含む）と共に投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者の癌領域に送達する方法は当該技術分野内である。
【００９４】
本発明の二本鎖分子は、二本鎖分子を癌部位に送達するのに好適な任意の手段によって、被験体に投与することができる。例えば、二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、又は他の好適な非経口投与経路若しくは腸内投与経路によって投与することができる。
【００９５】
好適な腸内投与経路としては、経口、直腸又は鼻腔送達が挙げられる。
【００９６】
好適な非経口投与経路としては、静脈内投与（例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入及び血管系へのカテーテル点滴）；傍組織及び組織内注射（例えば傍腫瘍及び腫瘍内注射）；皮下注入を含む皮下注射又は皮下沈着（例えば浸透圧ポンプによって）；例えばカテーテル若しくは他の留置装置（placement device）（例えば、多孔性、非孔性又はゼラチン様材料を含む、坐剤又はインプラント）による癌部位の領域又はその近くの領域への直接適用；並びに吸入が挙げられる。二本鎖分子又はベクターの注射又は注入は、癌の部位で又はその近くで行われる（be given）ことが好ましい。
【００９７】
本発明の二本鎖分子は、単回投与又は複数回の投与で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入によるものである場合、注入は、単回の持続投与で行うか、又は複数回の注入によって送達することができる。作用物質の注射は、癌部位の組織、又は癌部位の近くの組織に直接行うことが好ましい。癌部位の組織に又は癌部位の近くの組織に作用物質を複数回注射することが特に好ましい。
【００９８】
当業者は容易に、本発明の二本鎖分子を所定の被験体に投与するのに適当な投与計画（dosage regimen）を決定することもできる。例えば、二本鎖分子は、例えば癌部位での又はその近くでの単回注射又は沈着として、被験体に１回で投与することができる。代替的に、二本鎖分子は、約３日〜約２８日、より好ましくは約７日〜約１０日の間、１日１回又は２回、被験体に投与することができる。好ましい投与計画では、二本鎖分子は７日間、１日１回、癌部位に又はその近くに注射される。投与計画に複数回の投与が含まれる場合、被験体に投与される二本鎖分子の有効量は、投与計画全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことが理解される。
【００９９】
二本鎖分子を含む組成物
さらに本発明は、本発明の二本鎖分子又は該分子をコードするベクターの少なくとも１つを含む医薬組成物を提供する。特に本発明は、以下の組成物［１］〜［２３］を提供する：
［１］前立腺癌を治療するための組成物であって、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現、及び細胞増殖を阻害する少なくとも１つの単離二本鎖分子を含み、該分子がセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズすることで二本鎖分子を形成する、組成物。
［２］センス鎖が、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含む、［１］に記載の組成物。
［３］治療すべき前立腺癌がホルモン不応性前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌である、［１］に記載の組成物。
［４］複数種の二本鎖分子を含有する、［１］に記載の組成物。
［５］複数種の二本鎖分子が同じ遺伝子を標的とする、［４］に記載の組成物。
［６］二本鎖分子がヌクレオチド数約１００未満の長さを有する、［１］に記載の組成物。
［７］二本鎖分子がヌクレオチド数約７５未満の長さを有する、［６］に記載の組成物。
［８］二本鎖分子がヌクレオチド数約５０未満の長さを有する、［７］に記載の組成物。
［９］二本鎖分子がヌクレオチド数約２５未満の長さを有する、［８］に記載の組成物。
［１０］二本鎖分子がヌクレオチド数約１９〜約２５の長さを有する、［９］に記載の組成物。
［１１］二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結したセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む単一のポリヌクレオチドから成る、［１］に記載の組成物。
［１２］二本鎖分子が、一般式：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
（式中、［Ａ］は配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される配列を含むセンス鎖配列であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である）を有する、［１１］に記載の組成物。
［１３］二本鎖分子がＲＮＡを含む、［１］に記載の組成物。
［１４］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡとの両方を含む、［１］に記載の組成物。
［１５］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１４］に記載の組成物。
［１６］センス鎖ポリヌクレオチド及びアンチセンス鎖ポリヌクレオチドがそれぞれＤＮＡ及びＲＮＡから成る、［１５］に記載の組成物。
［１７］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１４］に記載の組成物。
［１８］アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、又はセンス鎖の５'末端に隣接する領域及びアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方がＲＮＡから成る、［１７］に記載の組成物。
［１９］隣接領域が９個〜１３個のヌクレオチドから成る、［１８］に記載の組成物。
［２０］二本鎖分子が３’オーバーハングを含有する、［１］に記載の組成物。
［２１］二本鎖分子がベクターによりコードされ、組成物中に含有される、［１］に記載の組成物。
［２２］二本鎖分子が一般式：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
（式中、［Ａ］は配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である）を有する、［２１］に記載の組成物。
［２３］トランスフェクション増強剤と薬学的に許容可能な担体とを含む、［１］に記載の組成物。
【０１００】
本方法は以下でより詳細に説明される。
【０１０１】
本発明の二本鎖分子は、好ましくは、当該技術分野で既知の技法に従って、被験体に投与する前に医薬組成物として配合することができる。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌であり且つパイロジェンフリーであることを特徴とする。本明細書で使用される場合、「薬学的製剤（pharmaceutical formulation）」は、ヒト及び獣医学的使用のための製剤を含む。本発明の医薬組成物を調製する方法は、例えばRemington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.（1985）（その開示全体が参照により本明細書に援用される）に記載のように当該技術分野内である。
【０１０２】
本発明の薬学的製剤は、生理学的に許容可能な担体媒体と混合して、本発明の二本鎖分子又はこれをコードするベクターの少なくとも１つ（例えば０．１重量％〜９０重量％）、又は該分子の生理学的に許容可能な塩を含む。好ましい生理学的に許容可能な担体媒体としては、水、緩衝水、生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等が挙げられる。
【０１０３】
本発明によれば、組成物は、複数種類の二本鎖分子を含有することができ、その分子のそれぞれが、ＰＫＩＢ及び／又はＮＡＡＬＡＤＬ２の同じ標的配列又は異なる標的配列に指向性を有し得る。例えば、組成物は、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２に指向性を有する二本鎖分子を含有することができる。代替的に、例えば組成物は、ＰＫＩＢ及びＮＡＡＬＡＤＬ２から選択される、１つ、２つ又はそれ以上の標的配列に指向性を有する二本鎖分子を含有することができる。
【０１０４】
さらに本発明の組成物は、１つ又は複数の二本鎖分子をコードするベクターを含有することができる。例えばベクターは、１つ、２つ又は幾つかの種類の本発明の二本鎖分子をコードすることができる。代替的に本発明の組成物は、複数種類のベクターを含有することができ、そのベクターのそれぞれが異なる二本鎖分子をコードする。
【０１０５】
その上、本発明の二本鎖分子は、本発明の組成物中にリポソームとして含有され得る。リポソームの詳細に関しては、「二本鎖分子を使用して癌を治療する方法」の項を参照されたい。
【０１０６】
本発明の医薬組成物は、従来の薬学的賦形剤及び／又は添加剤も含み得る。好適な薬学的賦形剤としては、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、バッファ及びｐＨ調整剤が挙げられる。好適な添加剤としては、生理学的に生体適合性があるバッファ（例えば塩酸トロメタミン）、キレート剤（chelant）の添加物（例えばＤＴＰＡ又はＤＴＰＡ−ビスアミド）又はカルシウムキレート錯体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）、又は任意でカルシウム塩若しくはナトリウム塩の添加物（例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム又は乳酸カルシウム）が挙げられる。本発明の医薬組成物は、液体形態での使用のために包装されていても、又は凍結乾燥されていてもよい。
【０１０７】
固体組成物には、従来の非毒性固体担体、例えば医薬品品質のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用することができる。
【０１０８】
例えば、経口投与するための固体医薬組成物は、上記で列挙された担体及び賦形剤のいずれかと、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の１つ又は複数の本発明の二本鎖分子とを含み得る。エアロゾル（吸入）投与のための医薬組成物は、上記のようにリポソームに封入される０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％の１つ又は複数の本発明の二本鎖分子と、噴霧剤とを含み得る。所望に応じて、担体、例えば鼻内送達ではレシチンが含まれ得る。
【０１０９】
上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のｉｎ  ｖｉｖｏ機能を阻害しなければ、他の薬学的に活性のある成分を含有することができる。例えば組成物は、癌を治療するのに従来使用される化学療法剤を含有することができる。
【０１１０】
別の実施形態では、本発明は、ＰＫＩＢ遺伝子及び／又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子（複数可）を発現する癌を治療するための医薬組成物の製造における本発明の二本鎖核酸分子の使用も提供する。例えば、本発明は、ＰＫＩＢ遺伝子及び／又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子（複数可）を発現する癌を治療するための医薬組成物を製造するための、細胞中でのＰＫＩＢ遺伝子及び／又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子（複数可）の発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用であって、該分子が、互いとハイブリダイズし二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、且つ配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される配列を標的とする、使用に関する。
【０１１１】
代替的に、本発明は、ＰＫＩＢ遺伝子及び／又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子（複数可）を発現する癌を治療するための医薬組成物を製造する方法又はプロセスであって、該方法又はプロセスは、細胞中でのＰＫＩＢ遺伝子及び／又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子（複数可）の発現を阻害する二本鎖核酸分子と共に薬学的又は生理学的に許容可能な担体を配合する工程を含み、該分子は活性成分として、互いとハイブリダイズし二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖とを含み且つ配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される配列を標的とする、医薬組成物を製造する方法又はプロセスをさらに提供する。
【０１１２】
別の実施形態では、本発明は、ＰＫＩＢ遺伝子及び／又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子（複数可）を発現する癌を治療するための医薬組成物を製造する方法又はプロセスであって、該方法又はプロセスは薬学的又は生理学的に許容可能な担体と活性成分を混和させる工程を含み、該活性成分が細胞中でのＰＫＩＢ遺伝子及び／又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子（複数可）の発現を阻害する二本鎖核酸分子であり、該分子が、互いとハイブリダイズし二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖とを含み且つ配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１９から成る群から選択される配列を標的とする、製造する方法又はプロセスも提供する。
【０１１３】
代替的に、本発明によれば、前立腺癌を治療するための医薬組成物を製造するための本発明の二本鎖分子の使用が提供される。さらに本発明は、前立腺癌を治療するための本発明の二本鎖分子も提供する。
【０１１４】
前立腺癌を診断する方法
ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現が、前立腺癌細胞において特異的に上昇することが見出された（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｆ、及び図２Ａ、図２Ｂ）。したがって本明細書で同定される遺伝子とその転写産物及び翻訳産物とは、前立腺癌のためのマーカーとしての診断上の有用性が見出され、細胞試料におけるＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現を測定することにより前立腺癌を診断することができる。具体的には、本発明は、被験体におけるＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現レベルを決定することにより、前立腺癌を診断する方法を提供する。本発明の方法により診断することができる前立腺癌は、ホルモン不応性前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌を含む。
【０１１５】
本発明の方法は、被験体の状態を決定する初期結果を提供することができる。かかる初期結果は、医者、看護師又は他の療法士（practitioner）が、疾患を診断するのを補助する付加的情報と組み合わせることができる。代替的に、本発明は、被験体由来の組織において癌性細胞を検出するため、及び疾患を診断するのに有用な情報を医者に与えるために使用することができる。
【０１１６】
特に本発明は、以下の方法［１］〜［１０］を提供する：
［１］前立腺癌の存在を診断又は検出する方法であって、
（ａ）生体試料において、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現レベルを検出する工程と、
（ｂ）遺伝子の正常対照レベルと比較した前記発現レベルの増大を疾患と関連付ける工程とを含む、方法。
［２］前記発現レベルが正常対照レベルよりも少なくとも１０％大きい、［１］に記載の方法。
［３］前記発現レベルが、
（ａ）ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の配列を含むｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出すること、及び
（ｃ）ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出すること
から成る群から選択されるいずれか１つの方法によって検出される、［１］に記載の方法。
［４］前立腺癌がホルモン不応性前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌である、［１］に記載の方法。
［５］前記発現レベルが、該遺伝子の遺伝子転写産物へのプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより決定される、［３］に記載の方法。
［６］前記発現レベルが、或る遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体の結合を該遺伝子の発現レベルとして検出することにより決定される、［３］に記載の方法。
［７］生体試料が、生検材料、痰、血液又は尿を含む、［１］に記載の方法。
［８］被験体由来の生体試料が上皮細胞を含む、［１］に記載の方法。
［９］被験体由来の生体試料が癌細胞を含む、［１］に記載の方法。
［１０］被験体由来の生体試料が癌性上皮細胞を含む、［１］に記載の方法。
【０１１７】
前立腺癌の存在を診断又は検出する方法が以下でより詳細に説明される。
【０１１８】
本方法によって診断される被験体は哺乳動物であり得る。例示的な哺乳動物としては例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ及びウシが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
診断を行うために、診断すべき被験体から生体試料を収集することが好ましい。目的のＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の転写産物又は翻訳産物を含む限りは、いかなる生体材料も決定のための生体試料として使用することができる。生体試料としては、体組織及び体液（例えば血液、痰及び尿）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは生体試料は、上皮細胞を含む細胞集団を、より好ましくは癌性上皮細胞、又は癌性である疑いがある前立腺組織由来の上皮細胞を含有する。さらに、必要な場合には、得られた体組織及び体液から細胞を純化し、その後生体試料として使用してもよい。
【０１２０】
本発明によれば、被験体由来の生体試料におけるＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現レベルが求められる。発現レベルは、当該技術分野で既知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで求めることができる。例えば、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション法（例えばノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを用いて定量することができる。検出は、チップ又はアレイで実施することができる。アレイの使用は、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２を含む複数の遺伝子（例えば様々な癌特異的遺伝子）の発現レベルを検出するために好ましい。当業者は、ＰＫＩＢ（配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１８１７９５）、又はＮＡＡＬＡＤＬ２（配列番号３、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿２０７０１５若しくは配列番号５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＫ０２１７５４）の配列情報を利用して、かかるプローブを調製することができる。例えば、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のｃＤＮＡはプローブとして使用することができる。必要であれば、プローブは、好適な標識、例えば染料、蛍光色素及びアイソトープで標識することができ、遺伝子の発現レベルは、ハイブリダイズされた標識の強度として検出することができる。さらに、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の転写産物は、増幅ベースの検出法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）でプライマーを用いて定量することができる。かかるプライマーは、利用可能な遺伝子の配列情報に基づき調製することもできる。例えば、実施例で使用されるプライマー（配列番号８〜配列番号１５）は、ＲＴ−ＰＣＲ又はノーザンブロット解析による検出に利用することができるが、本発明はそれらに限定されない。
【０１２１】
特に、本発明の方法で使用されるプローブ又はプライマーは、ストリンジェント、中程度ストリンジェント、又は低ストリンジェントの条件下でＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブ又はプライマーがその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を表す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、様々な状況下で異なる。長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般的に、ストリンジェント条件の温度は、規定のイオン強度及びｐＨで特定の配列に関して、熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、（規定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度で）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度である。一般的にＴｍでは標的配列が過剰に存在するので、プローブの５０％が平衡状態で占められる。典型的に、ストリンジェント条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的に約０．０１Ｍ〜１．０Ｍのナトリウムイオン（又はその他の塩）であり、温度が、短いプローブ又はプライマー（例えば１０個〜５０個のヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であり、長いプローブ又はプライマーでは少なくとも約６０℃である。ストリンジェント条件は、脱安定化剤、例えばホルムアミドの添加によっても達成することができる。
【０１２２】
代替的に翻訳産物は、本発明の診断のために検出することができる。例えば、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質の量を求めることができる。翻訳産物としてタンパク質の量を求める方法としては、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が挙げられる。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。さらに、抗体の任意の断片又は修飾物（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）は、断片がＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質との結合能を保持していれば、検出に使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当該技術分野で既知であり、かかる抗体及びそれらの等価物を調製するために、任意の方法を本発明で利用することができる。好ましくはＰＫＩＢと結合する抗体は、ＳＡＲＡＧＲＲＮＡＬＰＤＩＱＳＳＡＡＴＤ（配列番号３３）又はＫＥＫＤＥＫＴＴＱＤＱＬＥＫＰＱＮＥＥＫ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むエピトープペプチドを用いて調製される。一方、ＮＡＡＬＡＤＬ２と結合する抗体は、細胞外ドメイン（配列番号３２）を含むエピトープペプチドを用いて調製される。
【０１２３】
その翻訳産物に基づきＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の発現レベルを検出する別の方法として、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質に対する抗体を用いて、免疫組織化学解析によって染色の強度を観察することができる。即ち、強い染色の観察は、タンパク質の存在の増大と同時に、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の高い発現レベルとを示す。
【０１２４】
さらに、診断の正確性を改善するために、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の発現レベルに加えて、他の癌関連遺伝子、例えば前立腺癌において異なる発現をすることが知られる遺伝子の発現レベルも求めることができる。
【０１２５】
生体試料におけるＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の発現レベルは、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の対照レベルから、例えば１０％、２５％若しくは５０％増大していれば、又は１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超若しくはそれ以上に増大していれば、増大していると考えることができる。
【０１２６】
疾患状態（癌性又は非癌性）が既知の被験体（複数可）からこれまでに採取し、保管した試料（複数可）を使用することによって、対照レベルを試験生体試料と同時に求めることができる。代替的に、疾患状態が既知の被験体の試料において、これまでに求められたＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の発現レベル（複数可）を解析することによって得られた結果に基づき、統計的方法によって対照レベルを求めることができる。さらに、対照レベルは、これまでに試験された細胞からの発現パターンのデータベースであり得る。その上、本発明の一態様によれば、生体試料におけるＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の発現レベルは、複数の参照試料から求められる複数の対照レベルと比較することができる。患者由来の生体試料のものと類似の組織型に由来する参照試料から求められる対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が既知である集団におけるＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の発現レベルの標準値を用いることが好ましい。標準値は、当該技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±２Ｓ．Ｄ．又は平均±３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用することができる。本発明に関して、癌性でないことが既知の生体試料から求められる対照レベルは「正常対照レベル」と呼ばれる。他方で、対照レベルが癌性生体試料から求められる場合、これは「癌性対照レベル」と呼ばれる。
【０１２７】
ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子の発現レベルが正常対照レベルに比べて増大しているか、又は癌性対照レベルと同程度である場合、被験体は、癌を患っているか又は発症する危険性があると診断され得る。さらに、複数の癌関連遺伝子の発現レベルを比較する場合、試料と癌性である参照との間の遺伝子発現パターンの類似は、被験体が、癌を患っているか又は発症する危険性があることを示す。
【０１２８】
試験生体試料の発現レベルと対照レベルとの間の相違は、発現レベルが細胞の癌性状態又は非癌性状態に応じて変わらないことが知られている対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子としては、βアクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ及びリボソームタンパク質Ｐ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
抗前立腺癌化合物のスクリーニング
本発明に関して、本スクリーニング法により同定される薬剤は任意の化合物であっても、又は幾つかの化合物を含む組成物であってもよい。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞又はタンパク質に曝露される試験薬剤は、単一の化合物であっても、又は化合物の組み合わせであってもよい。化合物の組み合わせを方法に使用する場合、化合物は順次又は同時に接触させることができる。
【０１３０】
本発明のスクリーニング法においては、任意の試験薬剤、例えば細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵産物、海洋生物の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質又は粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム等の核酸構築物等を含む）、及び天然化合物を使用することができる。本発明の試験薬剤はまた、（１）生物学的ライブラリ法、（２）空間的にアドレス可能なパラレル固相又は溶液相ライブラリ法、（３）デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、（４）「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、及び（５）アフィニティクロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む、当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができる。アフィニティクロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチは化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、又は低分子ライブラリにも適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67）。分子ライブラリを合成する方法の例は、当該技術分野において見つけることができる（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13、Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6、Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994、Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061、Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51）。化合物のライブラリは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照）、又はビーズ（Lam, Nature 1991, 354: 82-4）、チップ（Fodor, Nature 1993, 364: 555-6）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号明細書、同第５，４０３，４８４号明細書、及び同第５，２２３，４０９号明細書）、プラスミド（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9）、若しくはファージ（Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90、Devlin, Science 1990, 249: 404-6、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10、米国特許出願第２００２１０３３６０号明細書）上で提示され得る。
【０１３１】
本スクリーニング法のいずれかによってスクリーニングした化合物の構造の一部を付加、欠失、及び／又は置換により変換した化合物は、本発明のスクリーニング法により得られる薬剤に含まれる。
【０１３２】
さらに、スクリーニングした試験薬剤がタンパク質である場合、タンパク質をコードするＤＮＡを得るために、タンパク質の全アミノ酸配列を決定して、タンパク質をコードする核酸配列を推測するか、又は得られるタンパク質の部分アミノ酸配列を分析して、該配列に基づいてオリゴＤＮＡをプローブとして調製し、該プローブを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。得られるＤＮＡについて、癌を治療又は予防するための候補である試験薬剤を調製する上でのその有用性を確認する。
【０１３３】
本明細書中に記載されるスクリーニングに有用な試験薬剤はまた、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質、又はｉｎ  ｖｉｖｏで元のタンパク質の生物活性を欠くその部分ペプチドに特異的に結合する抗体であり得る。
【０１３４】
試験薬剤ライブラリの構築は当該技術分野で既知であるが、以下に本スクリーニング法のための試験薬剤、及びかかる薬剤のライブラリ構築を同定する際のさらなる指針を提供する。
【０１３５】
（ｉ）分子モデリング
試験薬剤ライブラリの構築は、求められる特性を有することが知られる化合物の分子構造、及び／又は阻害される標的分子、すなわちＰＫＩＢ及びＮＡＡＬＡＤＬ２の分子構造の情報により容易になる。さらなる評価に適切な試験薬剤を予備スクリーニングする一アプローチは、試験薬剤とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングである。
【０１３６】
コンピュータモデリング技術により、選択した分子の三次元原子構造の可視化、及び該分子と相互作用する新たな化合物の合理的設計が可能になる。三次元構成は典型的には選択した分子のＸ線結晶学的分析又はＮＭＲイメージングのデータに依存する。分子ダイナミクスは力場データを必要とする。コンピュータグラフィックスシステムは、新たな化合物が標的分子にどのように結合するかを予測可能にし、結合特異性を完全なものにする化合物及び標的分子の構造の実験的操作を可能にする。軽微な変化がその一方又は両方に加えられる場合に、分子−化合物相互作用が何であるか予測するには、通常は分子設計プログラムと使用者との間にユーザーフレンドリーなメニュー形式のインターフェースを備えた、分子力学ソフトウェア及び計算主体の（computationally intensive）コンピュータが必要とされる。
【０１３７】
上記に概説される分子モデリングシステムの例には、ＣＨＡＲＭｍプログラム及びＱＵＡＮＴＡプログラム（Polygen Corporation，Waltham，Mass）が含まれる。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化及び分子ダイナミクスの機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング、及び分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子の互いの相互作用的構築、修飾、可視化、及び挙動分析を可能にする。
【０１３８】
Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66、Ripka, New Scientist 1988, 54-8、McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22、Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93、Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62、及び核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90等の多数の論文が、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングを概説している。
【０１３９】
化学物質をスクリーニング及び図式化する他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc.（Pasadena，Calif.）、Allelix, Inc.（Mississauga，Ontario，Canada）、及びHypercube, Inc.（Cambridge，Ontario）等の会社から入手可能である。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9、Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24、Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78、Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
【０１４０】
（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成
試験薬剤のコンビナトリアルライブラリは、既知の化合物中に存在するコア構造の情報を含む、合理的薬物設計プログラムの一部として作製される。このアプローチにより、ハイスループットスクリーニングを促す適度なサイズにライブラリを維持することが可能になる。代替的には、単純にライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を合成することにより単純な、特に短い重合体分子ライブラリが構築され得る。この後者のアプローチの一例は、６アミノ酸長の全ペプチドのライブラリである。かかるペプチドライブラリは６アミノ酸おきの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
【０１４１】
コンビナトリアル化学ライブラリの調製は当業者に既知であり、化学合成又は生物学的合成のいずれかにより作り出すことができる。コンビナトリアル化学ライブラリとしては、ペプチドライブラリ（例えば米国特許第５，０１０，１７５号明細書、Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93、Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。化学的多様性ライブラリを作り出すための他の化学を使用することもできる。かかる化学としては、ペプチド（例えば国際公開第９１／１９７３５号パンフレット）、コード化ペプチド（例えば国際公開第９３／２０２４２号パンフレット）、ランダムバイオオリゴマー（random bio-oligomer）（例えば国際公開第９２／０００９１号パンフレット）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第５，２８８，５１４号明細書）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、及びジペプチド等のダイバーソマー（diversomer）（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13）、ビニル性ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568）、グルコース骨格を有する非ペプチド性（nonpeptidal）ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8）、低分子化合物ライブラリの類似有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661）、オリゴカルバメート（oligocarbamate）（Cho et al., Science 1993, 261: 1303）、及び／又はペプチジルホスホネート（peptidylphosphonate）（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658）、核酸ライブラリ（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば米国特許第５，５３９，０８３号明細書を参照）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号明細書を参照）、炭水化物ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22、米国特許第５，５９３，８５３号明細書を参照）、並びに有機小分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン（Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.）、イソプレノイド（米国特許第５，５６９，５８８号明細書）、チアゾリジノン及びメタチアザノン（metathiazanone）（米国特許第５，５４９，９７４号明細書）、ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号明細書及び同第５，５１９，１３４号明細書）、モルホリノ化合物（米国特許第５，５０６，３３７号明細書）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号明細書）等を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
（ｉｉｉ）ファージディスプレイ
別のアプローチは、ライブラリを作製するために組換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」（Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6）を用いて、非常に大きいライブラリを構築することができる（例えば１０６個〜１０８個の化学物質）。第２のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74）、及びFodor et al.の方法（Science 1991, 251: 767-73）がその例である。Furka et al.（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93）、Houghten（米国特許第４，６３１，２１１号明細書）、及びRutter et al.（米国特許第５，０１０，１７５号明細書）は、アゴニスト又はアンタゴニストとして試験することのできるペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
【０１４３】
コンビナトリアルライブラリを調製するための装置は市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ（Advanced Chem Tech，Louisville KY）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Rainin，Woburn，MA）、４３３Ａ（Applied Biosystems，Foster City，CA）、９０５０  Ｐｌｕｓ（Millipore，Bedford，MA）を参照）。また、多数のコンビナトリアルライブラリ自体も市販されている（例えば、ComGenex（Princeton，N.J.）、Tripos, Inc.（St. Louis，MO）、3D Pharmaceuticals（Exton，PA）、Martek Biosciences（Columbia，MD）等を参照）。
【０１４４】
ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２と結合する化合物についてのスクリーニング
正常な器官においては発現しなかったにも関わらず、本発明では、前立腺癌においてＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の過剰発現が検出された（図１及び図２）。したがって、ＰＫＩＢ遺伝子若しくはＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子、該遺伝子によりコードされるタンパク質、又は該遺伝子の転写調節領域を使用して、遺伝子の発現、又は該遺伝子によりコードされるポリペプチドの生物活性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。このような化合物は、前立腺癌を治療又は防止するための医薬として使用される。
【０１４５】
本発明は、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２と結合する作用物質をスクリーニングする方法を提供する。前立腺癌においてＰＫＩＢ及びＮＡＡＬＡＤＬ２が発現することから、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２と結合する作用物質は前立腺癌細胞の増殖を抑制するのに有用であり、したがって前立腺癌を治療又は防止するのに有用である。したがって、本発明はまた、前立腺癌細胞の増殖を抑制する作用物質をスクリーニングする方法と、ＰＫＩＢポリペプチド又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドを使用して前立腺癌を治療又は防止する作用物質をスクリーニングする方法とを提供する。具体的にはこのスクリーニングする方法の一実施形態は、
ａ）試験化合物を、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程と、
ｂ）該ポリペプチドと該試験化合物との間の結合活性を検出する工程と、
ｃ）該ポリペプチドと結合する上記試験化合物を選択する工程と、
を含む。
【０１４６】
本発明の方法を、以下により詳細に説明する。
【０１４７】
スクリーニングに使用すべきＰＫＩＢポリペプチド又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドは、組換えポリペプチド、又は自然界由来のタンパク質、又はそれらの部分的なペプチドであり得る。試験化合物と接触させるべきポリペプチドは、例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、又は他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
【０１４８】
ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドを用いて、例えばＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、当業者に既知の多くの方法を使用することができる。かかるスクリーニングは、例えば免疫沈降法（例えば以下の実施例１における「ＰＫＩＢとＰＫＡ−Ｃとの相互作用」）により、具体的には以下のように行なうことができる。ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドをコードする遺伝子を、遺伝子をｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、及びｐＣＤ８等の外来遺伝子用の発現ベクターにインサートすることにより、宿主（例えば動物）細胞において発現させる。発現に使用するプロモーターは一般に使用され得る任意のプロモーターであり、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141 (1982)）、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91: 217-23 (1990)）、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108: 193 (1991)）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466 (1988)）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9 (1987)）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94 (1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946 (1989)）、ＨＳＶ  ＴＫプロモーター等を含み得る。外来遺伝子を発現するための宿主細胞への遺伝子の導入は、当業者に既知の任意の方法、例えばエレクトロポレーション法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26 (1987)）、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52 (1987)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17 (1984)、Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3 (1984)）、リポフェクチン法（Derijard B., Cell 76: 1025-37 (1994)、Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30 (1993)、Rabindran et al., Science 259: 230-4 (1993)）等によって行なうことができる。ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子によりコードされるポリペプチドは、該ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に対する特異性が明らかとなっているモノクローナル抗体のエピトープを導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を含有する融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ−抗体システムを使用することができる（Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)）。その複数のクローニング部位を使用して、例えばβガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等との融合タンパク質を発現することのできるベクターは市販されている。また、融合によりＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドの特性が変化しないように、数個〜十数個のアミノ酸から成るわずかなエピトープのみを導入することにより調製される融合タンパク質も使用することができる。ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−タグ）、インフルエンザウイルスの血球凝集素（influenza aggregate）ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７−タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−タグ）、Ｅ−タグ（モノクローナルファ��ジ（monoclonal phage）上のエピトープ）等のエピトープ、及びこれらを認識するモノクローナル抗体をエピトープ−抗体システムとして、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドに結合するタンパク質のスクリーニングに使用することができる（Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)）。
【０１４９】
免疫沈降においては、これらの抗体を適当な界面活性剤を用いて調製される細胞可溶化物に添加することにより免疫複合体を形成する。免疫複合体はＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチド、該ポリペプチドと結合する能力を有するポリペプチド、及び抗体から成る。免疫沈降は、上記エピトープに対する抗体を使用する以外に、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドに対する抗体を用いて行なうこともでき、この抗体は後述するように調製することができる。抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、免疫複合体は、例えばプロテインＡセファロース又はプロテインＧセファロースにより沈降し得る。ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子によりコードされるポリペプチドをＧＳＴ等のエピトープを有する融合タンパク質として調製する場合、免疫複合体は、グルタチオン−セファロース４Ｂ等のこれらのエピトープと特異的に結合する物質を用いて、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドに対する抗体を使用する場合と同じようにして形成することができる。
【０１５０】
免疫沈降は、例えば文献（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988)）における方法に従って又は準じて行なうことができる。
【０１５１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、免疫沈降タンパク質の分析に一般に使用され、結合したタンパク質は、適当な濃度のゲルを用いてタンパク質の分子量により分析され得る。ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドに結合したタンパク質は、クマシー染色又は銀染色等の一般の染色法によって検出することが困難であるため、タンパク質に対する検出感度は、細胞を、細胞中の該タンパク質を標識する放射性同位体３５Ｓ−メチオニン又は３５Ｓ−システインを含有する培養培地中で培養し、該タンパク質を検出することにより改善され得る。タンパク質の分子量が明らかである場合、標的タンパク質はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、その配列を決定することができる。
【０１５２】
ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドに結合するタンパク質を、該ポリペプチドを用いてスクリーニングする方法として、例えばウエストウエスタンブロット分析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90 (1991)）を使用することができる。具体的には、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドに結合するタンパク質は、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドに結合するタンパク質を発現することが期待される培養細胞（例えばＬＮＣａＰ、２２Ｒｖ１、ＰＣ−３、ＤＵ−１４５、及びＣ４−２Ｂ）からｃＤＮＡライブラリを、ファージベクター（例えばＺＡＰ）を用いて調製し、ＬＢ−アガロース上でタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質をフィルタ上に固定し、精製及び標識したＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドを該フィルタと反応させ、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドに結合したタンパク質を発現するプラークを標識によって検出することにより得ることができる。本発明のポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの間の結合を利用するか、又はＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドと特異的に結合する抗体、又はＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドに融合させたペプチド若しくはポリペプチド（例えばＧＳＴ）を利用することにより標識してもよい。放射性同位体又は蛍光等を用いる方法も使用することができる。
【０１５３】
代替的には、本発明のスクリーニング法の別の実施形態では、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Clontech）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Stratagene）；参考文献は"Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)"、"Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)"）。
【０１５４】
ツーハイブリッドシステムにおいては、本発明のポリペプチドをＳＲＦ−結合領域又はＧＡＬ４−結合領域に融合させ、酵母細胞において発現させる。ｃＤＮＡライブラリを、本発明のポリペプチドに結合するタンパク質を発現することが期待される細胞から、ライブラリが発現される場合に、ＶＰ１６転写活性化領域又はＧＡＬ４転写活性化領域に融合するように調製する。次に、ｃＤＮＡライブラリを上記酵母細胞に導入し、ライブラリに由来するｃＤＮＡを検出される陽性クローンから単離する（本発明のポリペプチドに結合するタンパク質が酵母細胞において発現される場合、その２つの結合がレポーター遺伝子を活性化するため、陽性クローンが検出可能となる）。ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質は、上記で単離されるｃＤＮＡを大腸菌に導入し、タンパク質を発現させることにより調製することができる。レポーター遺伝子として、ＨＩＳ３遺伝子に加えて、例えばＡｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等も使用することができる。
【０１５５】
ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合する化合物は、アフィニティクロマトグラフィーを用いてもスクリーニングすることができる。例えば、本発明のポリペプチドをアフィニティカラムの担体上に固定化させ、本発明のポリペプチドに結合することが可能なタンパク質を含有する試験化合物をカラムに適用してもよい。本明細書における試験化合物は、例えば細胞抽出物、細胞可溶化物等であり得る。試験化合物を投入した後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドに結合した化合物を調製することができる。試験化合物がタンパク質である場合、得られるタンパク質のアミノ酸配列を分析して、該配列に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、オリゴＤＮＡをプローブとして用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするＤＮＡを得る。
【０１５６】
本発明においては、表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサーを、結合した化合物を検出又は定量化する手段として使用してもよい。かかるバイオセンサーを使用する場合、本発明のポリペプチドと試験化合物との間の相互作用は、わずかな量のポリペプチドを用いて、標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとして即時に観察することができる（例えばＢＩＡｃｏｒｅ（Pharmacia））。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いて、本発明のポリペプチドと試験化合物との間の結合を評価することが可能である。
【０１５７】
タンパク質だけでなくＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質に結合する化学物質（アゴニスト及びアンタゴニストを含む）をも単離するために、固定化したＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドを合成化学物質、又は天然物質バンク、又はランダムファージペプチド提示ライブラリに曝露する場合に結合する分子をスクリーニングする方法、及びコンビナトリアル化学技法に基づくハイスループット技法を用いてスクリーニングする方法（Wrighton et al., Science 273: 458-64 (1996)、Verdine, Nature 384: 11-13 (1996)、Hogan, Nature 384: 17-9 (1996)）が当業者に既知である。
【０１５８】
好ましい実施形態では、本発明の方法により選択される試験化合物は、その治療効果を評価するためのさらなるスクリーニングのための候補であり得る。
【０１５９】
ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の生物活性を抑制する化合物についてのスクリーニング
本発明では、ＰＫＩＢタンパク質又はＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質が前立腺癌細胞の細胞増殖を促進する活性を有することが示された（図３Ｃ、図４Ｃ及び図６）。さらに、ＰＫＩＢは、ＰＫＡ−Ｃ核内蓄積活性を有することが示された（図５Ｄ及び図５Ｅ）。本発明では、ＰＫＡ−Ｃの核内蓄積は、核からのＰＫＡ−Ｃの排出を阻害すること、又は核へのＰＫＡ−Ｃの輸送を加速することを意味する。これらの生物活性を使用して、これらのタンパク質のこれらの活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができ、その化合物は前立腺癌を治療又は防止するのに有用である。したがって、本発明はまた、前立腺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法と、前立腺癌を治療又は防止する化合物をスクリーニングする方法とを提供する。したがって、本発明は、ＰＫＩＢ遺伝子又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子によりコードされるポリペプチドを用いて、前立腺癌を治療又は防止するための化合物についてスクリーニングする方法であって、
ａ）試験化合物を、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程と、
ｂ）工程（ａ）の上記ポリペプチドの生物活性を検出する工程と、
ｃ）上記試験化合物の非存在下で検出される該ポリペプチドの上記生物活性と比較して、該ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のポリヌクレオチドによりコードされる該ポリペプチドの該生物活性を抑制する該試験化合物を選択する工程と、
を含む、スクリーニングする方法を提供する。
【０１６０】
本発明の方法を、以下により詳細に説明する。
【０１６１】
ＰＫＩＢタンパク質又はＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質の生物活性を含む限りにおいては、任意のポリペプチドをスクリーニングに使用することができる。例えば、ＰＫＩＢタンパク質又はＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質を使用することができ、これらのタンパク質と機能的に同等なポリペプチドも使用することができる。このようなポリペプチドは、細胞により内在的に又は外来的に発現され得る。さらに、このような生物活性は、ＰＫＩＢタンパク質若しくはＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質の細胞増殖活性、又はＰＫＩＢタンパク質のＰＫＡ−Ｃ核内蓄積活性を含む。
【０１６２】
このスクリーニングにより単離される化合物は、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子によりコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドの機能を、それに結合することにより阻害する分子を指す。該用語はまた、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２をコードする遺伝子の発現を低下させるか又は阻害する分子を指す。さらに、このスクリーニングにより単離される化合物は、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドと分子（ＤＮＡ及びタンパク質を含む）とのｉｎ  ｖｉｖｏ相互作用を阻害する化合物の候補である。
【０１６３】
本発明の方法において検出すべき生物活性が細胞増殖である場合には、それは例えば、ＰＫＩＢポリペプチド又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドを発現する細胞を調製し、試験化合物の存在下で前記細胞を培養して、細胞周期等を測定して細胞増殖の速度を決定することにより、並びに例えば図３Ｃ及び図４Ｃに示すコロニー形成活性を測定することにより、検出することができる。本明細書で規定される「生物活性を抑制する」は、その化合物が存在しない場合と比較したＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の生物活性の、好ましくは少なくとも１０％の抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％又は７５％の抑制、最も好ましくは９０％の抑制である。
【０１６４】
本発明の方法において検出すべき生物活性がＰＫＡ−Ｃ核内蓄積である場合には、それは例えば、ＰＫＩＢポリペプチドを発現する細胞を調製し、試験化合物の存在下で前記細胞を培養して、例えば図５Ｄ及び図５Ｅに示す免疫細胞化学分析又はウェスタンブロット法を使用して核内のＰＫＡ−Ｃタンパク質の量を決定することにより、検出することができる。本明細書で規定される「生物活性を抑制する」は、その化合物が存在しない場合と比較したＰＫＩＢの生物活性の、好ましくは少なくとも１０％の抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％又は７５％の抑制、最も好ましくは９０％の抑制である。
【０１６５】
好ましい実施形態では、本発明の方法により選択される試験化合物は、その治療効果を評価するためのさらなるスクリーニングのための候補であり得る。
【０１６６】
ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現を変化させる化合物についてのスクリーニング
本発明では、ｓｉＲＮＡによるＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現の減少が、癌細胞増殖を阻害することが示された（図３及び図４）。したがって本発明は、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現を阻害する作用物質についてスクリーニングする方法を提供する。ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現を阻害する作用物質は、前立腺癌細胞の増殖を抑制するのに有用であり、したがって前立腺癌を治療又は防止するのに有用である。したがって本発明はまた、前立腺癌細胞の増殖を抑制する作用物質をスクリーニングする方法と、前立腺癌を治療又は防止するための作用物質をスクリーニングする方法とを提供する。本発明に関して、かかるスクリーニングには、例えば、
ａ）候補化合物を、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２を発現する細胞と接触させる工程、及び
ｂ）対照と比較して、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現レベルを低下させる候補化合物を選択する工程が含まれ得る。
【０１６７】
本発明の方法を下記により詳細に記載する。
【０１６８】
ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２を発現する細胞には、例えば前立腺癌から樹立される細胞株が含まれ、かかる細胞は本発明の上記スクリーニングに使用することができる（例えばＬＮＣａＰ、２２Ｒｖ１、ＰＣ−３、ＤＵ−１４５及びＣ４−２Ｂ）。発現レベルは当業者に既知の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫染色、及びフローサイトメトリー分析により予想することができる。本明細書中に規定する「発現レベルを低下させる」とは、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現レベルを、化合物の非存在下での発現レベルと比較して、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、又は７５％、最も好ましくは９５％低下させることである。本明細書における化合物は化学物質、二本鎖ヌクレオチド等を含む。二本鎖ヌクレオチドの調製は上述の記載にある。スクリーニング法においては、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現レベルを低下させる化合物を前立腺癌の治療又は予防に使用される候補作用物質として選択することができる。
【０１６９】
代替的には、本発明のスクリーニング法には、
ａ）候補化合物を、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の転写調節領域及び転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子から成るベクターを導入した細胞と接触させる工程、
ｂ）上記レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、及び
ｃ）上記レポーター遺伝子の発現又は活性を低下させる候補化合物を選択する工程が含まれ得る。
【０１７０】
適切なレポーター遺伝子及び宿主細胞は当該技術分野で既知である。例えばレポーター遺伝子の例としては、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イソギンチャクモドキ（Discosoma sp.）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、及びβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）であり、宿主細胞はＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列とＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の転写調節領域とを連結することにより調製することができる。本明細書におけるＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の転写調節領域は、開始コドンから少なくとも５００ｂｐ上流、好ましくは１０００ｂｐ、より好ましくは５０００ｂｐ又は１００００ｂｐ上流までの領域である。転写調節領域を含有するヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離することができ、又はＰＣＲによって増幅させる（propagate）ことができる。転写調節領域を同定する方法、さらにアッセイプロトコルは既知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。上記レポーター構築物を含有するベクターを、宿主細胞に感染させ、レポーター遺伝子の発現又は活性を当該技術分野で既知の方法により（例えばルミノメーター、吸光度計、フローサイトメーター等を用いて）検出する。本明細書中に規定する「発現又は活性を低下させる」とは、レポーター遺伝子の発現又は活性を、化合物の非存在下での発現又は活性と比較して、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、又は７５％、最も好ましくは９５％低下させることである。
【０１７１】
好ましい実施形態では、本発明の方法により選択される試験化合物は、その治療効果を評価するためのさらなるスクリーニングのための候補であり得る。
【０１７２】
ＰＫＩＢとＰＫＡ−Ｃとの間の結合を減少させる化合物についてのスクリーニング
本発明では、ＰＫＩＢとＰＫＡ−Ｃとの間の相互作用が、免疫沈降法により示される（図５Ｃ）。さらにＰＫＡ−Ｃは、ＰＫＩＢの非存在下で、核から細胞質に排出される（図５Ｄ）。本発明は、ＰＫＩＢとＰＫＡ−Ｃとの間の結合を阻害する化合物についてスクリーニングする方法を提供する。ＰＫＩＢとＰＫＡ−Ｃとの間の結合を阻害する化合物は、前立腺癌細胞の増殖を抑制するのに有用であり、したがって前立腺癌を治療又は防止するのに有用である。したがって本発明はまた、前立腺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法と、前立腺癌を治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法とを提供する。
【０１７３】
より具体的には、本方法は、
ａ）試験化合物の存在下で、ＰＫＩＢポリペプチド又はその機能的等価物をＰＫＡ−Ｃポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる工程と、
ｂ）該ポリペプチド間の結合を検出する工程と、
ｃ）該ポリペプチド間の結合を阻害する該試験化合物を選択する工程と、
を含む。
【０１７４】
本明細書における「ＰＫＩＢポリペプチドの機能的等価物」は、ＰＫＡ−Ｃ結合ドメインすなわち偽基質モチーフのアミノ酸配列（ＲＲＮＡ：配列番号３１）を含むポリペプチドを表す。同様に、「ＰＫＡ−Ｃポリペプチドの機能的等価物」は、ＰＫＩＢ結合ドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドを表す。
【０１７５】
本発明の方法を、以下により詳細に説明する。
【０１７６】
ＰＫＩＢとＰＫＡ−Ｃとの間の結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当業者に既知の多くの方法を使用することができる。このようなスクリーニングを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイ系として実施することができる。より具体的には、最初に、ＰＫＡ−Ｃポリペプチド又はＰＫＩＢポリペプチドを支持体に結合し、これに他方のポリペプチドを試験化合物と共に添加する。次に、混合物をインキュベートし、洗浄し、支持体に結合した他方のポリペプチドを検出及び／又は測定する。有望な候補化合物は、他方のポリペプチドの検出量を低減することができる。ここでＰＫＡ−Ｃポリペプチド又はＰＫＩＢポリペプチドは、天然タンパク質としてのみでなく、遺伝子組換え法により調製される組換えタンパク質としても調製することができる。天然タンパク質は、例えばアフィニティクロマトグラフィーにより調製することができる。一方、組換えタンパク質は、ＰＫＡ−ＣをコードするＤＮＡで形質転換した細胞を培養してその中でタンパク質を発現させること、及びその後それを回収することにより、調製され得る。
【０１７７】
タンパク質を結合するのに使用され得る支持体の例は、不溶性多糖（アガロース、セルロース及びデキストラン等）と、合成樹脂（ポリアクリルアミド、ポリスチレン及びシリコン等）とを含み、好ましくは上記材料から調製される市販のビーズ及びプレート（例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップ等）が使用され得る。ビーズを使用する場合には、ビーズはカラムに充填され得る。代替的に、当業者にも既知の磁気ビーズの使用は、磁力によりビーズに結合したタンパク質を容易に単離することを可能とする。
【０１７８】
タンパク質の支持体への結合は、化学的結合及び物理的吸着等の日常的な方法に従って行われ得る。代替的に、タンパク質は、該タンパク質を特異的に認識する抗体を介して支持体と結合され得る。さらに、タンパク質の支持体への結合は、アビジン及びビオチンにより行うこともできる。タンパク質間の結合は、緩衝液がタンパク質間の結合を阻害しない限りにおいて、緩衝液（例えばリン酸緩衝液及びＴｒｉｓ緩衝液を含むがこれらに限定されない）中で実施される。
【０１７９】
本発明では、表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーが、結合したタンパク質を検出又は定量する手段として使用され得る。このようなバイオセンサーが使用される場合には、ごく微量のポリペプチドを使用して、且つ標識することなく、タンパク質間の相互作用を表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、Pharmacia）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを使用して、ＰＫＡ−ＣとＰＫＩＢとの間の結合を評価することが可能である。
【０１８０】
代替的に、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢは標識されてもよく、ポリペプチドの標識は、結合活性を検出又は測定するために使用され得る。具体的には、ポリペプチドの１つを事前に標識した後で、標識したポリペプチドを試験化合物の存在下で他のポリペプチドと接触させ、その後結合したポリペプチドを、洗浄後、標識により検出又は測定する。放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ）、蛍光物質（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン）及びビオチン／アビジン等の標識物質が、本発明の方法においてタンパク質を標識するために使用され得る。タンパク質を放射性同位体で標識した場合には、検出又は測定を、液体シンチレーションにより実施することができる。代替的に、酵素で標識したタンパク質を、該酵素の基質を添加し基質の酵素的変化を（例えば発色を吸光光度計で）検出することにより検出又は測定することができる。さらに、蛍光物質が標識として使用される場合には、結合したタンパク質は、蛍光光度計を使用して検出又は測定され得る。
【０１８１】
さらに、ＰＫＡ−ＣとＰＫＩＢとの間の結合は、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢに対する抗体を使用して検出又は測定することもできる。例えば、支持体上に固定化したＰＫＡ−Ｃポリペプチドを試験化合物及びＰＫＩＢと接触させた後、混合物をインキュベートし、洗浄し、ＰＫＩＢに対する抗体を使用して検出又は測定を行うことができる。代替的に、ＰＫＩＢを支持体に固定化してもよく、ＰＫＡ−Ｃに対する抗体を抗体として使用してもよい。本発明のスクリーニングにおいて抗体を使用する場合には、抗体は好ましくは、上で言及した標識物質のうち１つで標識され、標識物質に基づき検出又は測定される。代替的に、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢに対する抗体を、標識物質で標識した二次抗体で検出すべき一次抗体として使用してもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいてタンパク質と結合した抗体は、プロテインＧカラム又はプロテインＡカラムを使用して検出又は測定してもよい。
【０１８２】
代替的に、本発明のスクリーニング方法の別の実施形態では、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Clontech）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Stratagene）、参考文献は“Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 （1992）”、“Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 （1994）”）。
【０１８３】
ツーハイブリッドシステムでは、例えば、ＰＫＡ−Ｃポリペプチドは、ＳＲＦ−結合領域又はＧＡＬ４−結合領域と融合され、酵母細胞中で発現される。ＰＫＡ−Ｃポリペプチドと結合するＰＫＩＢポリペプチドは、ＶＰ１６転写活性化領域又はＧＡＬ４転写活性化領域と融合され、同様に試験化合物の存在下で酵母細胞中で発現される。代替的に、ＰＫＩＢポリペプチドをＳＲＦ−結合領域又はＧＡＬ４−結合領域と融合し、ＰＫＡ−ＣポリペプチドをＶＰ１６転写活性化領域又はＧＡＬ４転写活性化領域と融合してもよい。これら２つの結合はレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンが検出可能になる。レポーター遺伝子として、ＨＩＳ３遺伝子に加えて、例えば、Ａｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を、使用することができる。
【０１８４】
さらに、ＰＫＡ−ＣはＰＫＩＢが存在する場合には核内に、ＰＫＩＢが存在しない場合には細胞質中に局在するので、本発明のスクリーニング方法は、ＰＫＡ−Ｃの核内局在を検出する。例えば、ＰＫＡ−Ｃ及びＰＫＩＢの両方を発現する細胞を、試験化合物と接触させ、洗浄する。細胞は、例えば、７０％のエタノール、又は４％のパラホルムアルデヒドにより固定され、抗ＰＫＡ−Ｃ抗体で検出される。ＰＫＡ−Ｃが細胞質中でほぼ検出される場合には、前立腺癌を防止するために試験化合物が使用される。ここでＰＫＡ−Ｃ及びＰＫＩＢは、当業者に既知の方法により細胞に強制発現（force-express）させてもよい。したがって、ＰＫＡ−Ｃ及びＰＫＩＢの両方を発現する細胞を、試験化合物と接触させ、既知の方法により（例えば、Merck Bioscienceにより製造されるＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ  Ｋｉｔ（Ｓ−ＰＥＫ）を使用して）細胞の核抽出物を調製する。核抽出物中のＰＫＡ−Ｃの量は、ウェスタンブロットアッセイにより検出される。
【０１８５】
好ましい実施形態では、本発明の方法により選択される試験化合物は、その治療効果を評価するためのさらなるスクリーニングのための候補であり得る。すなわち、上記のスクリーニングする方法は、以下：
ｄ）工程ｃ）で選択した候補化合物を、ＰＫＩＢ及びＰＫＡ−Ｃを発現する細胞と接触させる工程と、
ｅ）候補化合物が存在しない場合に検出される発現レベルと比較してＡｋｔのリン酸化レベルを低減する候補化合物を選択する工程と、
をさらに含む。
【０１８６】
当業者に既知のＡｋｔのリン酸化の検出方法を、使用することができる。例えば、以下の実施例の節で説明されるウェスタンブロット分析を使用することができる。より好ましくは、Ａｋｔ（配列番号３５）のリン酸化レベルが、４７３位のセリン残基で検出される。
【０１８７】
ＰＫＩＢ機能の阻害を通じてＡｋｔのリン酸化を減少させる化合物についてのスクリーニング
本発明では、Ａｋｔのリン酸化はＰＫＩＢ  ｓｉＲＮＡにより低減される（図７Ａ）。さらに、Ａｋｔのリン酸化は、ＰＫＩＢ及びＰＫＡ−Ｃの両方又はいずれかの過剰発現により増強される（図７Ｂ及び図７Ｃ）。本発明は、ＰＫＩＢとＰＫＡ−Ｃとの間の結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。Ａｋｔのリン酸化は、ＨＲＰＣの進行とその悪性表現型とにおいて重要な役割を果たす可能性がある（Sellers, W. R. & Sawyers, C. L. （2002） in Somatic Genetics of Prostate Cancer: Oncogenes and Tumor Suppressors ed. Kantoff, P. （Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia）、Wang Y, Kreisberg JI, Ghosh PM., Curr Cancer Drug Targets. 2007 Sep;7（6）:591-604、Lin HK, Yeh S, Kang HY, Chang C, Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98（13）:7200-5、Feldman BJ, Feldman D, Nat Rev Cancer 2001;1（1）:34-45、Malik SN, Brattain M, Ghosh PM, Troyer DA, Prihoda T, Bedolla R, Kreisberg JI., Clin Cancer Res. 2002;8（4）:1168-71）ので、ＰＫＩＢ機能の阻害を通じてＡｋｔのリン酸化を減少させる化合物は、前立腺癌細胞の増殖を抑制することが期待され、したがって前立腺癌を治療又は防止するのに有用である。したがって本発明はまた、前立腺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法と、前立腺癌、好ましくはＨＲＰＣを治療又は防止するための化合物をスクリーニングする方法とを提供する。
【０１８８】
より具体的には、本方法は、
ａ）候補化合物をＰＫＩＢ及びＰＫＡ−Ｃを発現する細胞と接触させる工程と、
ｂ）候補化合物が存在しない場合に検出される発現レベルと比較してＡｋｔのリン酸化レベルを低減する候補化合物を選択する工程と、
を含む。
【０１８９】
代替的に、前立腺癌の治療及び／又は防止に適した候補化合物は、本発明により同定され得る。このような方法は、
（ａ）ＰＫＩＢによるＡｋｔのリン酸化に適した条件下で、試験化合物の存在下で、ＰＫＩＢ又はその機能的等価物、及びＡｋｔを、ＰＫＡ−Ｃ又はその機能的等価物と共にインキュベートする工程、ここでＡｋｔは以下のｉからｉｉｉから成る群から選択されるポリペプチドである、
ｉ．配列番号３５（Ａｋｔ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｉｉ．１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失若しくは挿入された配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ただし、該ポリペプチドは配列番号３５のアミノ酸配列から成るポリペプチドと同等の生物活性を有する）、
ｉｉｉ．配列番号３６のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド（ただし、該ポリペプチドは配列番号３５のアミノ酸配列から成るポリペプチドと同等の生物活性を有する）
（ｂ）Ａｋｔのリン酸化レベルを検出する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で測定されるＡｋｔのリン酸化レベルを対照レベルと比較する工程、および
（ｄ）対照レベルと比較してＡｋｔのリン酸化レベルを減少させる化合物を選択する工程、とを含む。
【０１９０】
好ましい実施形態では、本発明の方法により選択される試験化合物は、その治療効果を評価するためのさらなるスクリーニングのための候補であり得る。
【０１９１】
好ましくはＡｋｔのリン酸化レベルは、配列番号３５のアミノ酸配列の４７３位のセリン残基、又は該ポリペプチドの相同な位置で検出され得る。当業者に既知のＡｋｔのリン酸化の検出方法を使用することができる。例えば、以下の実施例の節で説明するウェスタンブロット分析を使用することができる。
【０１９２】
本発明との関連では、ＰＫＩＢによるＡｋｔのリン酸化に適した条件は、リン酸ドナー（例えばＡＴＰ）の存在下でＰＫＡ−Ｃと共にＡｋｔ及びＰＫＩＢをインキュベートすることで、もたらされ得る。ＰＫＩＢによるＡｋｔのリン酸化に適した条件は、ＰＫＩＢ、ＰＫＡ−Ｃ及び該ポリペプチドを発現する細胞を培養することも含む。例えば、該細胞は、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを保有する形質転換細胞であり得る。インキュベーション後、リン酸化したＡｋｔを認識する抗体で、Ａｋｔのリン酸化レベルを検出することができる。
【０１９３】
リン酸化したＡｋｔの検出の前に、Ａｋｔは、他の要素、すなわちＡｋｔを発現する細胞の細胞可溶化物から分離され得る。例えば、残存する成分からのＡｋｔの分離のために、ゲル電気泳動法が使用され得る。代替的に、Ａｋｔは、Ａｋｔを抗Ａｋｔ抗体を有する担体と接触させることにより、捕捉され得る。標識したリン酸ドナーを使用する場合には、Ａｋｔのリン酸化レベルを、標識を追跡することにより検出することができる。例えば、放射標識したＡＴＰ（例えば３２Ｐ−ＡＴＰ）をリン酸ドナーとして使用する場合には、分離したＡｋｔの放射能は、Ａｋｔのリン酸化レベルと相関する。代替的に、リン酸化していないＡｋｔからリン酸化したＡｋｔを特異的に認識する抗体が、リン酸化したＡｋｔを検出するために使用され得る。好ましくはその抗体は、４７３位のＳｅｒ残基でリン酸化したＡｋｔを認識する。
【０１９４】
所定のタンパク質に対して機能的に同等なポリペプチドを調製する方法は、当業者に既知であり、タンパク質に突然変異を導入する既知の方法を含む。一般的に、タンパク質中の１つ又は複数のアミノ酸の修飾がタンパク質の機能に影響を与えないことは既知である（Mark DF et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6、Zoller MJ & Smith M, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500、Wang A et al., Science 1984, 224:1431-3、Dalbadie-McFarland G et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。実際に、突然変異又は修飾したタンパク質、或る特定のアミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加することにより修飾したアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 （1984）、Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 （1982）、Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 （1982））。したがって、当業者は、タンパク質の変化が類似の機能を有するタンパク質をもたらす、アミノ酸配列に対する一個のアミノ酸、若しくは低い百分率のアミノ酸を変化させる個々の付加、欠失、挿入若しくは置換、又は「保存的修飾」であるとみなされるそれらの付加、欠失、挿入若しくは置換が、本発明との関連で意図されることを認識するだろう。
【０１９５】
例えば、当業者は、例えば部位特異的な突然変異誘発を使用して、これらのタンパク質のいずれかのアミノ酸配列に適当な突然変異を導入することにより、Ａｋｔ、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる（Hashimoto-Gotoh et al., Gene 152:271-5 （1995）、Zoller and Smith, Methods Enzymol 100: 468-500 （1983）、Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441-56 （1984）、Kramer and Fritz, Methods Enzymol 154: 350-67 （1987）、Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-92 （1985）、Kunkel TA, et al., Methods Enzymol. 1991;204:125-39.）。本発明のポリペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸が突然変異した（ただし、得られる突然変異したポリペプチドはそれぞれ、Ａｋｔ、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢと機能的に同等である）Ａｋｔ、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。タンパク質がその活性を維持する限りにおいては、アミノ酸突然変異の数は特に限定されない。しかし、５％以下のアミノ酸配列を変化させることが一般的に好ましい。したがって好ましい一実施形態では、このような突然変異体において突然変異すべきアミノ酸の数は、一般的にはアミノ酸数３０以下、典型的にはアミノ酸数２０以下、より典型的にはアミノ酸数１０以下、好ましくはアミノ酸数５〜６以下、より好ましくはアミノ酸数１〜３である。
【０１９６】
変異させるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の性質が保存された異なるアミノ酸に変異させるのが好ましい（保存的アミノ酸置換として知られるプロセス）。アミノ酸側鎖の性質の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、及び以下の官能基又は共通の特性を有する側鎖である：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、ヒドロキシル基を含有する側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子を含有する側鎖（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミドを含有する側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基を含有する側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、並びに芳香族を含有する側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。なお、（）内の文字はアミノ酸の１文字コードを示す。さらに機能的に同様のアミノ酸を規定する保存的置換表は当該技術分野で既知である。例えば、以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
【０１９７】
このように保存的に修飾されたポリペプチドが本発明のＡｋｔ、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢタンパク質に含まれる。しかしながら、本発明は、これらに限定されず、Ａｋｔ、ＰＫＡ−Ｃ及びＰＫＩＢタンパク質は、元のタンパク質の結合活性を保持していれば非保存的修飾を含む。さらに、修飾タンパク質には、多型変異体、種間相同体、これらのタンパク質の対立遺伝子でコードされるものは除外されない。
【０１９８】
Ａｋｔ、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢのアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基が付加されたポリペプチドの例は、Ａｋｔ、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢをそれぞれ含有する融合タンパク質である。したがって融合タンパク質（すなわち、Ａｋｔ、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢと、他のペプチド又はタンパク質との融合タンパク質）が、本発明に含まれる。融合タンパク質は、当業者に既知の技法により（例えば、Ａｋｔ、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢをコードするＤＮＡを他のペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡとフレームが適合するように連結し、融合ＤＮＡを発現ベクター中に挿入すること、及びそれを宿主中で発現することにより）、作製することができる。本発明のタンパク質と融合させるペプチド又はタンパク質に関して、制限はない。
【０１９９】
Ａｋｔタンパク質、ＰＫＡ−Ｃタンパク質又はＰＫＩＢタンパク質と融合すべきペプチドとして使用することができる既知のペプチドは、例えば、ＦＬＡＧ（Hopp TP et al., Biotechnology 1988 6: 1204-10）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基を含有する６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザアグルチニン（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃ断片、ＶＳＰ−ＧＰ断片、ｐ１８ＨＩＶ断片、Ｔ７−タグ、ＨＳＶ−タグ、Ｅ−タグ、ＳＶ４０Ｔ抗原断片、ｌｃｋタグ、α−チューブリン断片、Ｂ−タグ、プロテインＣ断片等を含む。本発明のタンパク質と融合させることができるタンパク質の例は、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、インフルエンザアグルチニン（ＨＡ）、免疫グロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等を含む。
【０２００】
融合タンパク質は、上で論じた融合ペプチド又は融合タンパク質をコードする市販のＤＮＡを、Ａｋｔタンパク質、ＰＫＡ−Ｃタンパク質又はＰＫＩＢタンパク質をコードするＤＮＡと融合し、調製した融合ＤＮＡを発現することにより、調製することができる。
【０２０１】
機能的に同等なポリペプチドを単離するための当業者に既知の代替方法は、例えばハイブリダイゼーション法（Sambrook et al., Molecular Cloning 2nd ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press （1989））を含む。当業者は、Ａｋｔ（すなわち配列番号３６）、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢと高い相同性を有するＤＮＡを容易に単離することができ、該単離したＤＮＡからＡｋｔ、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢと機能的に同等なポリペプチドを単離することができる。本発明のタンパク質は、Ａｋｔ、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢをコードするＤＮＡ配列の全体又は一部分とハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、且つＡｋｔ、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢと機能的に同等なタンパク質を含む。これらのポリペプチドは、ヒト由来のタンパク質に対応する哺乳動物の相同体（例えば、サル、ラット、ウサギ及びウシの遺伝子によりコードされるポリペプチド）を含む。動物由来のＡｋｔ、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢをコードするＤＮＡと高度に相同なｃＤＮＡを単離する際には、前立腺癌組織を使用するのが特に好ましい。
【０２０２】
ヒトのＡｋｔタンパク質、ＰＫＡ−Ｃタンパク質又はＰＫＩＢタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者が日常的に選択することができる。「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、典型的には核酸の混成物中において、或る核酸分子がその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列と検出可能にはハイブリダイズしない条件を表す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる環境下では異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” （1993）に見出される。本発明との関連では、好適なハイブリダイゼーション条件は、当業者が日常的に選択することができる。
【０２０３】
一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びｐＨでの特定の配列についての熱融解点（thermal melting point）（Ｔｍ）より約５℃〜１０℃低いように選択される。Ｔｍは、平衡状態で標的に相補的なプローブの５０％が標的配列にハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下で）である（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍでは、平衡状態で５０％のプローブが占拠される）。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によっても実現され得る。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションにおいて、正のシグナルは、好ましくはバックグラウンドの少なくとも２倍の、より好ましくはバックグラウンドの１０倍のハイブリダイゼーションである。
【０２０４】
例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下を含む：５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％のＳＤＳにおいて４２℃でインキュベートする、又は５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳにおいて６５℃でインキュベートし、０．２×ＳＳＣ、及び０．１％のＳＤＳにおいて５０℃で洗浄する。好適なハイブリダイゼーション条件は、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ  ｂｕｆｆｅｒ」（Amersham LIFE SCIENCE）を使用する６８℃で３０分間以上のプレハイブリダイゼーション、標識したプローブを添加すること、及び６８℃で１時間以上加温することも含み得る。
【０２０５】
洗浄する工程は、例えば、ストリンジェンシーの低い条件下で行うことができる。したがって例示的なストリンジェンシーの低い条件は、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、又は好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含み得る。代替的に、例示的なストリンジェンシーの高い条件は、例えば、室温で２０分間、２×ＳＳＣ、０．０１％のＳＤＳにおいて３回洗浄すること、その後３７℃で２０分間、１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいて３回洗浄すること、及び５０℃で２０分間、１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにおいて２回洗浄することを含み得る。しかし、温度及び塩濃度等の複数の因子が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼすことがあり、当業者は必要なストリンジェンシーを実現するために該因子を好適に選択することができる。
【０２０６】
好ましくは、機能的に同等なポリペプチドは、本明細書で開示される天然のＡｋｔ、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢの配列と少なくとも約８０％の相同性（配列同一性と称することもある）、より好ましくは少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する。ポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30（1983）」におけるアルゴリズムに従うことにより決定することができる。他の実施形態では、機能的に同等なポリペプチドは、ストリンジェントな条件（以下で規定）下で、このような機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ得る。
【０２０７】
ハイブリダイゼーションの代わりに、遺伝子増幅方法（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法）を、Ａｋｔ又はＰＫＩＢについての配列情報に基づき合成されるプライマーを使用して、Ａｋｔ、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢと機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するために、利用することができる。
【０２０８】
本発明との関連で有用なＡｋｔ、ＰＫＡ−Ｃ又はＰＫＩＢの機能的等価物は、それを製造するのに使用する細胞若しくは宿主、又は利用する精製方法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、又は形態における変動を有し得る。しかしながら、Ａｋｔポリペプチド、ＰＫＡ−Ｃポリペプチド又はＰＫＩＢポリペプチドのいずれかの機能的等価物である限りにおいては、本発明の範囲内である。
【０２０９】
ＮＡＡＬＡＤＬ２と結合する抗体についてのスクリーニング
ＮＡＡＬＤＡＬ２は、新規なＩＩ型膜タンパク質であり、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）ファミリーに属する。有名な前立腺癌マーカーである前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）も、ＧＣＰＩＩファミリーに属する（Rajasekaran AK et al., Am J Physiol Cell Physiol 2005 288: C975-81.及びMurphy GP et al., Prostate 2000 42: 145-9.）。ＮＡＡＬＤＡＬ２はＰＳＭＡと相同性を示し、1つの膜貫通を有し、細胞膜に局在する（図５Ｂ）。ＰＭＳＡは、ＦＤＡに承認された前立腺癌造影剤である１１１Ｉｎ標識７Ｅ１１モノクローナル抗体（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ、Cytogen、Princeton、NJ）の標的であり、ＰＭＳＡは、ＰＳＭＡを発現する細胞への造影剤又は治療薬の特異的送達を目的とする臨床試験にある、Ｊ５９１等のモノクローナル抗体により標的とされる（Murphy GP et al., Prostate 2000 42: 145-9.及びHolmes EH, Expert Opin Investig Drugs 2001 10: 511-9.）。したがって、前立腺癌の診断又は防止に使用され得る抗ＮＡＡＬＤＡＬ２抗体を、細胞表面におけるＮＡＡＬＤＡＬ２の結合能力を指標として使用するスクリーニングを通じて、同定することができる。このスクリーニング方法の実施形態は、
ａ）候補抗体を、ＮＡＡＬＡＤＬ２を発現する細胞と接触させる工程と、
ｂ）細胞表面上でＮＡＡＬＡＤＬ２と結合する試験抗体を選択する工程と、
を含む。
【０２１０】
本発明の方法を、以下により詳細に説明する。
【０２１１】
代替的に、ＮＡＡＬＡＤＬ２の推定細胞外ドメインは、配列番号３２である。したがって、細胞外で（at extracelluar）ＮＡＡＬＡＤＬ２と結合する抗体をスクリーニングする方法は、
ａ）候補抗体を、配列番号３２から成るポリペプチドと接触させる工程と、
ｂ）該ポリペプチドと結合する試験抗体を選択する工程と、
を含むものであった。
【０２１２】
以下の節で説明される抗体又は抗体断片又は非抗体結合タンパク質は、前立腺癌細胞のようなＮＡＡＬＡＤＬ２を発現する細胞の親和性を検出することにより選択される。これらの細胞に対する非特異的結合は、室温で３０分間の、３％のＢＳＡを含有するＰＢＳでの処理により阻害される。細胞を、候補抗体又は抗体断片と共に室温で６０分間インキュベートする。ＰＢＳで洗浄した後、室温で６０分間ＦＩＴＣ結合型二次抗体により細胞を染色し、蛍光光度計を使用して検出する。代替的に、表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーが、本発明の抗体又は抗体断片を検出又は定量するための手段として使用され得る。細胞表面上でＮＡＡＬＡＤＬ２ペプチドを検出することができる抗体又は抗体断片が、本発明において選択される。
【０２１３】
好ましい実施形態では、本発明の方法により選択される試験化合物は、その治療効果を評価するためのさらなるスクリーニングのための候補であり得る。
【０２１４】
抗体
「抗体」という用語は本明細書中で使用される場合、指定のタンパク質又はそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリン及びその断片を含むことが意図される。抗体はヒト抗体、霊長類化（primatized）抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質又は放射性標識と融合させた抗体、及び抗体断片を含み得る。さらに、本明細書において「抗体」は広義で使用され、具体的には無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成される多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）包含し、また所望の生物活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は全てのクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）を意味する。
【０２１５】
主題発明では、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２に対する抗体を使用する。より好ましくは、配列番号３３又は配列番号３４のアミノ酸配列を含むタンパク質に対する抗体を、ＰＫＩＢに対する抗体として使用することができ、配列番号３２のアミノ酸配列を含むタンパク質に対する抗体を、ＮＡＡＬＡＤＬ２に対する抗体として使用することができる。これらの抗体は既知の方法により提供され得る。本発明に従って使用される抗体を生成するための例示的な技法は、本明細書中に記載される。
【０２１６】
（ｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、動物において関連抗原及びアジュバントの頻回皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射により生じさせるのが好ましい。二官能性物質又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する共役）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣ１２、又はＲ’Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲは異なるアルキル基である）を用いて、免疫化される種において免疫原性のあるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害因子と関連抗原とを共役させることが有用であり得る。
【０２１７】
例えば１００μｇ又は５μｇのタンパク質又は複合体（それぞれウサギ又はマウスの場合）を３倍量の完全フロイントアジュバントと合わせ、この溶液を複数の部位で皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性のある複合体、又は誘導体に対して免疫化する。１ヵ月後、ペプチド又は複合体の初期量の１／５〜１／１０量を完全フロイントアジュバントに加え、複数の部位で皮下注射することにより動物を追加免疫する。７日〜１４日後、動物から採血し、血清を抗体力価について検定する。力価が平衡に達するまで動物を追加免疫する。同じ抗原の異なるタンパク質を共役させた複合体及び／又は異なる架橋試薬による複合体で動物を追加免疫するのが好ましい。
【０２１８】
複合体は、融合タンパク質（protein fusion）として、組換え細胞培養物においても作製することができる。また、ミョウバン等の凝集剤が、免疫反応を増強するのに適切に使用される。
【０２１９】
（ｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は実質的に均質な抗体集団、すなわち、集団内に含有される個々の抗体が、起こり得る自然発生突然変異（若干存在し得る）以外は同一である集団から得られる。したがって、「モノクローナル」という修飾詞は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を意味する。
【０２２０】
例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)に初めて記載されたハイブリドーマ法を用いて作製され得るか、又は組換えＤＮＡ法により作製され得る（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。
【０２２１】
ハイブリドーマ法においては、マウス又は他の適当な宿主動物（ハムスター等）を以上に記載されるように免疫化して、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を生成するか、又は生成することが可能なリンパ球を誘導する。代替的には、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化してもよい。リンパ球を次に、ポリエチレングリコール等の適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。
【０２２２】
このように調製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは非融合親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１つ又は複数の物質を含有する、適切な培養培地に播種して増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。
【０２２３】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択される抗体産生細胞による安定な高レベルでの抗体の産生を支持し、且つＨＡＴ培地等の培地に対して感受性を有する細胞である。これらの中でも好ましい骨髄腫細胞株は、Salk Institute Cell Distribution Center（San Diego，California USA）から入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、並びにAmerican Type Culture Collection（Manassas，Virginia，USA）から入手可能なＳＰ−２細胞又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞等のマウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫細胞株及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133: 300 1 (1984)、Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【０２２４】
ハイブリドーマ細胞が増殖している細胞培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関して検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって求められる。
【０２２５】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)の３０スキャッチャード解析によって求めることができる。
【０２２６】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、そのクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）によって増殖させてもよい。この目的に適した培養培地には、例えばＤ−ＭＥＭ培地又はＲＰＭＬ−１６４０培地が含まれる。また、ハイブリドーマ細胞を動物において腹水腫瘍として、ｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させてもよい。
【０２２７】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィー等によって培養培地、腹水、又は血清から適切に分離することができる。
【０２２８】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて）容易に単離及び配列決定され得る。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源となる。ＤＮＡを単離した後、発現ベクターに入れ、それを次に宿主細胞（免疫グロブリンタンパク質を本来産生しない、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞等）にトランスフェクトすることにより、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する総説としては、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993)及びPluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)が挙げられる。
【０２２９】
ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２に対して反応性を有する、特異的な抗体又は抗体断片を産生する別の方法は、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のタンパク質又はポリペプチドと共に細菌中で発現させた免疫グロブリン遺伝子又はその一部分をコードする発現ライブラリをスクリーニングすることである。より好ましくは、配列番号３３又は配列番号３４のアミノ酸配列を含むＰＫＩＢ断片を、ＰＫＩＢの代替物として使用することができ、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＮＡＡＬＡＤＬ２断片を、ＮＡＡＬＡＤＬ２の代替物として使用することができる。例えば、完全なＦａｂ断片、ＶＨ領域及びＦｖ領域を、ファージ発現ライブラリを使用して細菌中で発現させることができる。例えば、Ward et al., Nature 341: 544-546 （1989）; Huse et al., Science 246: 1275- 1281 （1989）及びMcCafferty et al., Nature 348: 552-554 （1990）を参照されたい。例えば、ＰＫＩＢペプチド、配列番号３３若しくは配列番号３４のアミノ酸配列を含むＰＫＩＢ断片、ＮＡＡＬＡＤＬ２ペプチド、又は配列番号３２のアミノ酸配列を含むＮＡＡＬＡＤＬ２断片を有するこのようなライブラリをスクリーニングすることは、ＰＫＩＢ、ＰＫＩＢ断片、ＮＡＡＬＡＤＬ２又はＮＡＡＬＡＤＬ２断片と反応性を有する、免疫グロブリン断片を同定することができる。代替的に、抗体又は抗体断片を製造するために、ＳＣＩＤ−ｈｕマウス（Genpharmから入手可能）を使用することができる。
【０２３０】
さらなる実施形態においては、抗体又は抗体断片を、McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)に記載されている技法を用いて作り出される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)及びMarks et al., J Mol Biol, 222: 581-597 (1991)はそれぞれ、ファージライブラリを用いたマウス抗体及びヒト抗体の単離について記載している。その後の刊行物には、鎖シャフリング（chain shuffling）による高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992)）、並びに非常に大きいファージライブラリを構築する戦略として、組合せ感染（combinatorial infection）及びｉｎ  ｖｉｖｏ組換え（Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)）が記載されている。したがって、これらの技法は、モノクローナル抗体の単離のための、伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替手段である。
【０２３１】
また、例えば、コード配列を相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインで置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号明細書、Morrison, et al., Proc. Natl Acad. ScL USA, 81: 6851 (1984)）、又は非免疫グロブリンポリペプチドに関するコード配列の全部又は一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって、ＤＮＡを修飾してもよい。
【０２３２】
典型的には、かかる非免疫グロブリンポリペプチドで、抗体の定常ドメインを置換するか、又は抗体の一抗原結合部位の可変ドメインを置換することによって、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作製する。
【０２３３】
（ｉｉｉ）ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において記載されている。好ましくは、ヒト化抗体には、ヒト以外の供給源に由来する１つ又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入（import）」残基と称されることが多く、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は基本的に、Winter及び共同研究者らの方法（Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986)、Reichmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988)、Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)）に従って、超可変領域配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行なうことができる。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、無傷ヒト可変ドメインよりかなり小さな部分が、ヒト以外の種に由来する対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）である。実際には、ヒト化抗体は典型的に、幾つかの超可変領域残基、及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が、齧歯動物抗体中の類似部位に由来する残基で置換されているヒト抗体である。
【０２３４】
抗原性を低下させるためには、ヒト化抗体の作製に使用するヒト可変ドメイン（軽鎖及び重鎖の両方）の選択が非常に重要である。いわゆる「最良適合（best-fit）」法によれば、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。次に、齧歯動物の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体に関するヒトフレームワーク領域（ＦＲ）とする（Suns et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993)、Chothia et al., J. Mol. Biol, 196: 901 (1987))。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。幾つかの異なるヒト化抗体に同じフレームワークを使用してもよい（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992)、Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993))。
【０２３５】
ヒト化される抗体は、抗原に対する高い親和性、及び他の好適な生物学的特性を保持していることがさらに重要である。この目標を達成するには、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親配列及び様々な概念的ヒト化生成物を、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いて分析するプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の、考え得る三次元立体配座構造を図解及び表示するコンピュータプログラムが入手可能である。これらの表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する増大した親和性等の所望の抗体特徴が達成されるように、受容（recipient）配列及び移入配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は抗原結合の影響に直接的且つ最も実質的に関与する。
【０２３６】
（ｉｖ）ヒト抗体
ヒト化の代替手段として、ヒト抗体を作り出すことができる。例えば、免疫化の際に内因性免疫グロブリンを産生することなく、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製することが可能である。例えば、キメラマウス及び生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。かかる生殖系列突然変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入（transfer）は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を引き起こす。例えば、Jakobovits et al., Proc. Mad. Acad. Sci. USA, 90: 255 1 (1993)、Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993)、Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993)、並びに米国特許第５,５９１，６６９号明細書、同第５，５８９，３６９号明細書、及び同第５，５４５，８０７号明細書を参照されたい。
【０２３７】
代替的には、ファージ提示法（McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)）を使用して、非免疫化ドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト抗体及び抗体断片を生成することができる。この技法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３又はｆｄ等の糸状バクテリオファージの主要又は微量コートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として提示される。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能的特性に基づく選択は、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択ももたらす。したがって、ファージはＢ細胞の特性の幾つかを模倣する。ファージ提示は多様な形式で行なうことができるが、それらの概説については、例えば、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-57 1 (1993)を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントの幾つかの供給源をファージ提示に使用することができる。
【０２３８】
Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)は、免疫化したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小ランダムコンビナトリアルライブラリから抗オキサゾロン抗体の種々のアレイを単離した。Marks et al., J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991)、又はGriffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)によって記載される技法に基本的に従って、非免疫化ヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築し、抗原（自己抗原を含む）の種々のアレイに対する抗体を単離することができる。また、米国特許第５，５６５，３３２号明細書及び同第５，５７３，９０５号明細書を参照されたい。
【０２３９】
ヒト抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって作り出してもよい（米国特許第２０５，５６７，６１０号明細書及び同第５，２２９，２７５号明細書を参照）。ＳＣＩＤマウスを用いてヒト抗体を作り出す好ましい手段は、共願の（commonly-owned）同時係属中の出願に開示されている。
【０２４０】
（ｖ）抗体断片
抗体断片の生成について、様々な技法が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷抗体のタンパク分解によって誘導されていた（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照されたい）。しかしながら、現在では、これらの断片は組換え宿主細胞によって直接生成することができる。例えば、上述の抗体ファージライブラリから抗体断片を単離することができる。代替的には、Ｆａｂ'−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的カップリングを行なってＦ（ａｂ’）２断片を形成することもできる（Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992))。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片を生成するための他の技法は、当業者には明らかである。他の実施形態において、好適な抗体は一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号パンフレット、米国特許第５，５７１，８９４号明細書、及び米国特許第５，５８７，４５８号明細書を参照されたい。抗体断片はまた、例えば米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されるような「線状抗体」であってもよい。かかる線状抗体断片は単一特異的であっても、又は二重特異的であってもよい。
【０２４１】
（ｖｉ）非抗体結合タンパク質
「非抗体結合タンパク質」又は「非抗体リガンド」又は「抗原結合タンパク質」という用語は下記でより詳細に論じられる、アドネクチン、アビマー、一本鎖ポリペプチド結合分子、及び抗体様結合ペプチド模倣体を含む非免疫グロブリンタンパク質骨格を使用する抗体模倣体を互換可能に指す。
【０２４２】
抗体と同様に標的化し、標的に結合する他の化合物も開発されている。これらの「抗体模倣体」の一部は、非免疫グロブリンタンパク質骨格をタンパク質フレームワークの代替として抗体の可変領域に使用する。
【０２４３】
例えば、Ladner et al.（米国特許第５，２６０，２０３号明細書）には、凝集しているが分子的には分離した、抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域と同様の結合特異性を有する一本鎖ポリペプチド結合分子が記載されている。該一本鎖結合分子は、ペプチドリンカーにより連結した抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方の抗原結合部位を含有し、２つのペプチド抗体と同様の構造に折り畳まれる。一本鎖結合分子は、サイズがより小さい、安定性がより大きい、及びより容易に修飾される等、従来の抗体に優る幾つかの利点を示す。
【０２４４】
Ku et al.（Proc Natl Acad Sci USA 92(14): 6552-6556 (1995)）は、シトクロムｂ５６２に基づく、抗体の代替手段を開示している。Ku et al. (1995)は、シトクロムｂ５６２のループの２つを無作為化し、ウシ血清アルブミンに対する結合に関して選択したライブラリを作り出した。個々の突然変異体は、抗ＢＳＡ抗体と同様に選択的にＢＳＡに結合することが見出された。
【０２４５】
Lipovsek et al.（米国特許第６，８１８，４１８号明細書及び同第７，１１５，３９６号明細書）は、フィブロネクチン又はフィブロネクチン様タンパク質骨格、及び少なくとも１つの可変ループを特徴とする抗体模倣体を開示している。アドネクチンとして知られるこれらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、任意の標的リガンドに関する高い親和性及び特異性を含む、自然抗体又は改変抗体と同じ特徴の多くを示す。新たな又は改善された結合タンパク質を発展させる任意の技法を、これらの抗体模倣体と共に使用することができる。
【０２４６】
これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造は、ＩｇＧ重鎖の可変領域の構造と同様である。したがって、これらの模倣体は、天然抗体と本質的に同様の抗原結合特性及び親和性を示す。さらに、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、抗体及び抗体断片に優る或る特定の利点を示す。例えば、これらの抗体模倣体は固有の折り畳み安定性に関してジスルフィド結合に依存せず、したがって、通常は抗体を分解する可能性のある条件下で安定である。また、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造は、ＩｇＧ重鎖の構造と同様であるため、ループの無作為化及びシャフリングのプロセスは、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ親和性成熟のプロセスと同様、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで採用することができる。
【０２４７】
Beste et al.（Proc Natl Acad Sci USA 96(5): 1898-1903 (1999)）は、リポカリン骨格（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標））に基づく抗体模倣体を開示している。リポカリンは、タンパク質末端に４つの超可変ループを有するβバレルから成る。Beste（1999）は、該ループにランダム突然変異誘発を行ない、例えばフルオレセインとの結合に関して選択した。３つの変異体がフルオレセインと特異的な結合を示し、うち１つの変異体が抗フルオレセイン抗体と同様の結合を示した。さらなる分析によって、無作為化位置が全て可変であることが明らかとなったが、これはＡｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）が抗体の代替手段としての使用に適切であり得ることを意味する。
【０２４８】
Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）は、典型的には１６０残基〜１８０残基の小さな一本鎖ペプチドであり、生産コストの減少、貯蔵安定性の増大、及び免疫反応の減少を含む、抗体に優る幾つかの利点を提供する。
【０２４９】
Hamilton et al.（米国特許第５，７７０，３８０号明細書）は、結合部位として使用される複数の可変ペプチドループが付着した、カリックスアレーンの強固な非ペプチド有機骨格を使用した合成抗体模倣体を開示している。ペプチドループは全て、互いにカリックスアレーンの幾何学的に同じ側から突出する。この幾何学的構造のために、全てのループが結合に利用可能であり、リガンドに対する結合親和性が増加する。しかしながら、他の抗体模倣体と比較して、カリックスアレーンベースの抗体模倣体はペプチドのみから成るものではなく、したがってプロテアーゼ酵素による攻撃を受けにくい。上記骨格も純粋にペプチド、ＤＮＡ、又はＲＮＡから成るものではなく、これはこの抗体模倣体が厳しい環境条件において比較的安定であり、寿命が長いことを意味する。さらに、カリックスアレーンベースの抗体模倣体は比較的小さいため、免疫原性反応をもたらす可能性は低い。
【０２５０】
Murali et al.（Cell Mol Biol. 49(2): 209-216 (2003)）は、抗体をより小さいペプチド模倣体にする方法論を記載しており、該ペプチド模倣体は「抗体様結合ペプチド模倣体」（ＡＢｉＰ）と称され、これも抗体に対する代替手段として有用であり得る。
【０２５１】
Silverman et al.（Nat Biotechnol. (2005), 23: 1556-1561）は、「アビマー」と称される複数のドメインを含む一本鎖ポリペプチドである融合タンパク質を開示している。アビマーは、ヒト細胞外受容体ドメインからｉｎ  ｖｉｔｒｏエキソンシャフリング及びファージ提示により開発されたため、様々な標的分子に対する親和性及び特異性において抗体と幾らか類似した結合タンパク質群である。得られたマルチドメインタンパク質は、単一エピトープ結合タンパク質と比較して改善された親和性（場合によってはｎＭ以下の）及び特異性を示し得る、複数の独立した結合ドメインを含み得る。アビマーを構築及び使用する方法に関するさらなる詳細は、例えば米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号明細書、同第２００５００４８５１２号明細書、同第２００５００５３９７３号明細書、同第２００５００８９９３２号明細書、及び同第２００５０２２１３８４号明細書に開示されている。
【０２５２】
非免疫グロブリンタンパク質フレームワークに加えて、抗体特性はまた、いずれも本発明による使用に適切である、ＲＮＡ分子及び非天然オリゴマー（例えばプロテアーゼ阻害剤、ベンゾジアゼピン、プリン誘導体、及びβターン模倣体）を含む化合物において模倣されてきた。
【０２５３】
試験薬剤ライブラリの構築は当該技術分野においてよく知られているが、以下に、本スクリーニング方法のための試験薬剤の同定及びかかる薬剤のライブラリの構築に関するさらなる指針を与える。
【０２５４】
（ｖｉｉ）抗体複合体及び他の改変体
本明細書における方法に使用される抗体、又は製造物に含まれる抗体は、任意で細胞毒性物質又は治療剤と共役される。
【０２５５】
抗体と１つ又は複数の小さな毒素分子（カリチアマイシン、マイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号明細書）、トリコテシン、及びＣＣ  １０６５等）との複合体も本明細書において考慮されている。本発明の好ましい一実施形態では、抗体は１つ又は複数のマイタンシン分子（例えば抗体１分子当たり約１個〜約１０個のマイタンシン分子）と共役させる。マイタンシンを、例えばＭａｙ−ＳＨ３へと還元され得るＭａｙ  ＳＳ−Ｍｅに変換し、修飾抗体（Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)）と反応させて、マイタンシノイド−抗体複合体を作出してもよい。
【０２５６】
代替的には、抗体は１つ又は複数のカリケアマイシン分子と共役させてもよい。抗生物質のカリケアマイシン群は、ｐＭ以下の濃度で二本鎖ＤＮＡ切断をもたらすことが可能である。使用され得るカリケアマイシンの構造類似体としてはγ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ、及びθ１Ｉが挙げられるが、これらに限定されない（Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993)及びLode et al, Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)）。
【０２５７】
使用することのできる酵素的に活性な毒素及びその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の結合活性のない断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌に由来する）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、及びトリコテセン。例えば、１９９３年１０月２８日付で公開された国際公開第９３／２１２３２号パンフレットを参照されたい。
【０２５８】
本発明は、多様な放射性同位体と共役させた抗体をさらに考慮する。例としては、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。
【０２５９】
抗体と細胞毒性物質との複合体は、多様な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチル塩酸塩（dimethyl adipimidate HCL）等）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビスジアゾニウム誘導体（ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を用いて作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987)に記載されるように調製することができる。炭素１４標識１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種を抗体に共役させるための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号パンフレットを参照されたい。リンカーは、細胞における細胞毒性薬の放出を促す「開裂可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性のリンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Charm et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)）が使用され得る。  
【０２６０】
代替的には、抗体及び細胞毒性物質を含有する融合タンパク質を、例えば組換え技法又はペプチド合成により作製してもよい。
【０２６１】
さらに別の実施形態では、抗体を腫瘍プレターゲティング（pretargeting）に利用するために「受容体」（ストレプトアビジン等）と共役させてもよいが、その場合、抗体−受容体複合体を患者に投与した後、非結合複合体を循環系から除去剤（clearing agent）を用いて除去し、次に細胞毒性物質（例えば放射性核種）と共役させた「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【０２６２】
本発明の抗体はまた、プロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤、国際公開第８１／０１１４５号パンフレットを参照）を活性抗癌薬に変換するプロドラッグ活性化酵素と共役させてもよい。例えば、国際公開第８８／０７３７８号パンフレット及び米国特許第４，９７５，２７８号明細書を参照されたい。
【０２６３】
かかる複合体の酵素成分には、プロドラッグをより活性な細胞毒性型に変換するようにプロドラッグに作用することが可能な任意の酵素が含まれる。
【０２６４】
本発明の方法において有用な酵素の例としては、リン酸塩を含有するプロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸塩を含有するプロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬（フルオロウラシル）に変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチドを含有するプロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なプロテアーゼ、例えばセラチア菌（serratia）プロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、並びにカテプシン（カテプシンＢ及びカテプシンＬ等）；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用な炭水化物分解酵素、例えば13−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ；13−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用な13−ラクタマーゼ；並びにアミン窒素がフェノキシアセチル基又はフェニルアセチル基で誘導体化された薬物を、遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。代替的には、当該技術分野において「抗体酵素」としても知られる、酵素活性を有する抗体を、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換するために使用することができる（例えば、Massey, Nature 328: 457-458 (1987)を参照）。抗体−抗体酵素複合体は、抗体酵素を腫瘍細胞集団に送達するために、本明細書中に記載されるように調製することができる。
【０２６５】
本発明の酵素は、上述のヘテロ二官能性架橋試薬の使用等、当該技術分野で既知の技法により抗体に共有結合させることができる。代替的には、少なくとも本発明の酵素の機能的に活性な一部分に結合した、少なくとも本発明の抗体の抗原結合領域を含有する融合タンパク質は、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技法を用いて構築することができる（例えば、Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)を参照）。
【０２６６】
他の抗体修飾も本明細書において考慮されている。例えば、抗体は、多様な非タンパク性重合体、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体の１つに結合し得る。
【０２６７】
本明細書中に開示される抗体はまた、リポソームとして作製してもよい。抗体を含有するリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)、Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)、米国特許第４，４８５，０４５号明細書及び同第４，５４４，５４５号明細書、並びに１９９７年１０月２３日付で公開された国際公開第９７／３８７３１号パンフレットに記載されるような当該技術分野で既知の方法によって調製される。循環時間が増大したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号明細書に開示されている。
【０２６８】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びホスファチジルエタノールアミンで誘導体化されたＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作り出すことができる。リポソームを規定の孔径のフィルタから押し出し、所望の直径を有するリポソームを生じさせる。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martin et al., J Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されるように、ジスルフィド交換反応によりリポソームと共役させることができる。化学療法剤は、リポソーム中に任意で含有される。Gabizon et al. J National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)を参照されたい。
【０２６９】
本明細書中に記載される抗体のアミノ酸配列修飾も考慮されている。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善するのが望ましい場合もある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードする核酸に適当なヌクレオチド変化を導入すること、又はペプチド合成により調製される。かかる修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列における残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終的な構築物が所望の特徴を有する限り、最終的な構築物を達成するために欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが作られる。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数又は位置の変化等のように、抗体の翻訳後過程を変更し得る。
【０２７０】
突然変異誘発に好ましい配置にある、抗体の或る特定の残基又は領域を同定するのに有用な方法は、Cunningham and Wells Science, 244: 1081-1085 (1989)により記載されるように「アラニン走査突然変異誘発」と呼ばれる。ここでは、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を与えるために、残基又は標的残基群（例えばアルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リシン、及びグルタミン酸等の荷電残基）を同定し、中性アミノ酸又は負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）で置き換える。次に、置換に対する機能感受性を示すこれらのアミノ酸配置を、さらなる又は他の変異体を置換部位に導入することにより精査する。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め定められているが、突然変異自体の性質は予め定められている必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能（performance）を分析するために、アラニン走査（ala scanning）突然変異誘発又はランダム突然変異誘発を標的のコドン又は領域で行ない、発現された抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【０２７１】
アミノ酸配列挿入は、１つの残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドにわたる長さのアミノ末端融合及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入（intrasequence insertion）を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、又は細胞毒性ポリペプチドと融合させた抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のＮ末端又はＣ末端への酵素の融合、又は抗体の血清中半減期を延長させるポリペプチドの融合を含む。
【０２７２】
別のタイプの変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子中に異なる残基で置換された少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。抗体の置換突然変異誘発として最も興味深い部位は超可変領域を含むが、ＦＲ変化もまた考慮されている。
【０２７３】
抗体の生物学的特性における実質的な変更は、（ａ）例えばシート立体配座又はらせん立体配座といった置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖のかさ高さの維持に対する効果において有意に異なる置換を選択することによって達成される。
【０２７４】
天然残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下の群に分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、
（２）中性親水性：システイン、セリン、トレオニン、
（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸、
（４）塩基性：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、アルギニン、
（５）鎖配向に影響を与える残基：グリシン、プロリン、及び
（６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。
【０２７５】
非保存的置換は、これらのクラスの１つの成員を別のクラスと交換することを伴う。
【０２７６】
また、抗体の適切な立体配座の維持に関与しない任意のシステイン残基は、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を妨げるために、通常セリンで置換され得る。逆に、システイン結合を抗体の安定性を改善するために抗体に付加させてもよい（特に抗体がＦｖ断片等の断片である場合）。
【０２７７】
特に好ましいタイプの置換変異体は、親抗体の１つ又は複数の超可変領域残基の置換を含む（例えばヒト化抗体又はヒト抗体）。通常、さらなる開発のために選択される得られた変異体は、それらの変異体が生じた親抗体に対して生物学的特性が改善されている。かかる置換変異体を作り出す簡便な方途は、ファージ提示を用いた親和性成熟である。簡潔には、幾つかの超可変領域部位（例えば６つ〜７つの部位）を突然変異させて、各部位において全ての起こり得るアミノ置換を作り出す。このように作り出した抗体変異体は、糸状ファージ粒子により、各々の粒子内に入ったＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として一価の形で提示される。ファージに提示された変異体を次に、本明細書中に開示されるそれらの生物活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。修飾の候補超可変領域部位を同定するために、アラニン走査突然変異誘発を行なって、抗原結合に大きく寄与する超可変領域残基を同定することができる。代替的又は付加的には、抗体と抗原との接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析するのが有益であり得る。かかる接触残基及び隣接残基は、本明細書中に詳述した技法による置換の候補である。かかる変異体を作り出してから、変異体のパネルを本明細書中に記載されるようにスクリーニングし、１つ又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択してもよい。
【０２７８】
抗体の別のタイプのアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。変更するとは、抗体に見られる１つ又は複数の炭水化物部分を削除すること、及び／又は抗体に存在しない１つ又は複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【０２７９】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ−結合型又はＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付加を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付加に対する認識配列である。
【０２８０】
したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することで、潜在的グリコシル化部位が生じる。Ｏ−結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般にはセリン又はトレオニン（５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリシンも使用することができる）への、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの１つの付加を指す。
【０２８１】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、１つ又は複数の上述のトリペプチド配列を含有するように（Ｎ−結合型グリコシル化部位のため）変更することにより都合良く達成される。また、元の抗体配列への１つ又は複数のセリン残基又はトレオニン残基による付加又は置換（Ｏ−結合型グリコシル化部位のため）によって変更してもよい。
【０２８２】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野で既知の多様な方法により調製される。これらの方法としては、自然供給源からの単離（天然アミノ酸配列変異体の場合）、又は先に調製した変異体若しくは非変異体バージョンの抗体のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的（site-directed））突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット式突然変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８３】
エフェクター機能を改善して、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を増強するために、本発明において使用される抗体を修飾するのが望ましいこともある。これは、１つ又は複数のアミノ酸置換を抗体のＦｃ領域に導入することにより達成され得る。代替的又は付加的には、システイン残基（複数可）をＦｃ領域に導入して、それによりこの領域において鎖間ジスルフィド結合を形成させてもよい。このように作り出したホモ二量体型抗体は、改善された内在化能（internalization capability）及び／又は増大した補体媒介性殺細胞効果及び抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J linmunol 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。
【０２８４】
また、抗腫瘍活性の向上したホモ二量体型抗体を、Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されるようにヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製してもよい。代替的には、抗体を二重のＦｃ領域を有するように操作することができ、それにより補体溶解能及びＡＤＣＣ能を向上させてもよい。Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
【０２８５】
抗体の血清中半減期を増大させるために、例えば米国特許第５，７３９，２７７号明細書に記載されるように、サルベージ受容体（salvage receptor）結合エピトープを抗体（特に抗体断片）に組み込んでもよい。本明細書中で使用される場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ血清中半減期の増大に関与する、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
【０２８６】
本発明の態様を以下の実施例で説明するが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定する意図はない。
【０２８７】
他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術を有する者（当業者）により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載のものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料を以下で説明する。
【０２８８】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０２８９】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【０２９０】
実施例１  一般的方法
細胞株
ＣＯＳ７細胞と、ＰＣ細胞株であるＬＮＣａＰ、２２Ｒｖ１、ＰＣ−３、ＤＵ−１４５及びＣ４−２Ｂはアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、Rockville、MD）から購入し、ＬＮＣａＰ由来のＨＲＰＣ細胞株Ｃ４−２ＢはViroMed Laboratories（Minnetonka、MN）から購入した。３０回より多くの回数継代したＬＮＣａＰをＬＮＣａＰ（ＨＰ）と定義したが、ＬＮＣａＰ（ＨＰ）は継代回数の少ないＬＮＣａＰ細胞と、形態学的に及びその遺伝子発現パターンにおいて、異なっていた。ダルベッコ変法イーグル培地（Invitrogen、Carlsbad、CA）（この培地には、１０％のウシ胎児血清（Gemini Bio-Products、West Sacramento、CA）と、１％の抗生剤／抗真菌剤溶液（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）とを添加した）中でこれらを培養した。細胞を、５％のＣＯ２を有する加湿空気雰囲気中において３７０Ｃで維持した。
【０２９１】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
凍結したＰＣ組織からのＰＣ細胞と、正常な前立腺上皮細胞との精製は、以前に説明した（Tamura K et al., Cancer Res 2007 67: 5117-25.）。組織試料を、インフォームドコンセントを得た上で、前立腺針生検、骨生検、ＴＵＲ−Ｐ（経尿道的前立腺切除）及び「迅速」剖検（“warm” autopsy）を受けているＨＲＰＣ患者から取得した。同時に、ホルモンナイーブ前立腺癌（ＨＮＰＣ）試料も根治的前立腺全摘出術を受けている、未処理の手術可能な症例から取得し、正常な前立腺上皮細胞（ＮＰＥＣ）も、明白な前立腺癌又はＰＩＮがないことを組織病理学的に確認した良性前立腺過形成（ＢＰＨ）患者及び膀胱癌患者から取得した。ＨＲＰＣ細胞と、ホルモンナイーブ前立腺癌細胞と、正常な前立腺上皮細胞のマイクロダイセクションについては、以前に説明した（Tamura K et al., Cancer Res 2007 67: 5117-25.）。これらの試料由来のＲＮＡを、２ラウンドの、Ｔ７に基づくＲＮＡ増幅（Epicentre Technologies、Madison、WI）と、その後の一本鎖ｃＤＮＡの合成とに供した。ヒトＨＲＰＣ細胞株由来の全ＲＮＡは、製造業者の推奨に従い、ＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ（QIAGEN、Valencia、CA）を使用して抽出した。抽出したＲＮＡを、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（QIAGEN）で処理し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Invitrogen）と共にｄ（Ｔ）１２−１８プライマーを使用して、一本鎖ｃＤＮＡへ逆転写した。以下のプライマー配列を使用した：
β−アクチン（ＡＣＴＢ）  フォワードプライマー：ＴＴＧＧＣＴＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＴＴＴＡ（配列番号６）
β−アクチン（ＡＣＴＢ）  リバースプライマー：ＡＴＧＣＴＡＴＣＡＣＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧ（配列番号７）
ＰＫＩＢ  フォワードプライマー：ＧＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＧＡＡＧＣＡＡＡＡＴＡＣＧ（配列番号８）
ＰＫＩＢ  リバースプライマー：ＧＡＴＧＧＧＣＡＡＡＴＣＡＴＴＣＴＴＧＧＴＡ（配列番号９）
ＮＡＡＬＡＤＬ２  フォワードプライマー：ＧＡＡＡＧＣＡＴＣＴＣＡＣＡＴＴＧＧＴＴＴＴＣ（配列番号１０）
ＮＡＡＬＡＤＬ２  リバースプライマー：ＧＧＧＴＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＣＴＣＴＧＣＴ（配列番号１１）
ＮＡＡＬＡＤＬ２−２  フォワードプライマー：ＧＡＡＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＡＧＡＴＧＧＴ（配列番号１２）
ＮＡＡＬＡＤＬ２−２  リバースプライマー：ＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＴＴＣＴＡＧＡＡＡＧＧ（配列番号１３）
【０２９２】
このＥＳＴとＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子との間の関連は、ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。ＲＴ−ＰＣＲの対数期は、同一の反応から発生したｃＤＮＡ間の半定量比較を可能とするために決定した。各ＰＣＲの計画は、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（PE Applied Biosystems、Foster、CA）により、９８０Ｃで３０秒の初期変性工程と、その後、９８０Ｃで１０秒、５５０Ｃで５秒、７２０Ｃで３０秒の２２サイクル（ＡＣＴＢに対して）、２３サイクル（ＰＫＩＢ、ＮＡＡＬＡＤＬ２に対して）とを含むものとした。
【０２９３】
ノーザンブロット分析
７種類のＰＣ細胞株由来の全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ（QIAGEN）を使用することにより抽出し、ノーザンブロット分析を行った。製造業者のプロトコルに従い、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（GE Healthcare）を用いてｍＲＮＡを精製した。ＰＣ細胞株由来の１μｇアリコートの各ｍＲＮＡと、正常なヒトの心臓、肺、肝臓、腎臓、脳及び前立腺（BD Biosciences、Palo Alto、CA）から単離したｍＲＮＡとを１％の変性アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜上に移行させた。ＰＫＩＢに特異的な２６１塩基対のプローブを、上述のプライマーセットを使用するＰＣＲにより調製し、ＮＡＡＬＡＤＬ２に特異的な７０６塩基対のプローブを、以下のプライマーセット：フォワードプライマー  ５’−ｃｃａｇｔｇｃｃｃａｇａａａｃｃａａｔａ−３’（配列番号１４）及びリバースプライマー  ５’−ｔｃａａｔｔｃｔｔｃｃｃａｔｃｃａａｇａｃａ−３’（配列番号１５）を使用するＰＣＲにより調製した。ランダムプライムドα３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識プローブでのハイブリダイゼーションを、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（GE bioscience、UK）についての取扱説明書に従って実施した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗浄を、供給業者の推奨に従って行った。ブロットを、−８０℃、７日間の増感スクリーンでのオートラジオグラフィーに供した。
【０２９４】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）発現構築物及びトランスフェクション
ＰＣ細胞中において内在性のＰＫＩＢ及びＮＡＡＬＡＤＬ２の発現をノックダウンするために、ｐｓｉＵ６ＢＸ３．０ベクターを、以前に説明した（Tamura K et al., Cancer Res 2007 67: 5117-25.）ように標的遺伝子に対する低分子ヘアピン型ＲＮＡの発現のために使用した。ＰＫＩＢに対するｓｉＲＮＡに関する合成オリゴヌクレオチドの標的配列は、以下の通りであった：
ｓｉ１：ＧＣＣＣＴＡＡＧＣＡＧＣＡＴＧＴＧＴＡ（配列番号１６）
ｓｉ２：ＧＣＡＧＴＡＧＧＣＡＣＴＴＡＡＧＣＡＴ（配列番号１７）
ｓｉ３：ＧＡＴＧＣＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＴＧ（配列番号１８）。
ＮＡＡＬＡＤＬ２に対するｓｉＲＮＡに関する合成オリゴヌクレオチドの標的配列は、以下の通りであった：
ｓｉ＃６９０：ＧＡＣＴＣＡＧＴＧＧＡＣＣＴＣＴＴＴＧ（配列番号１９）
ｓｉ＃９１３：ＧＴＣＡＴＣＧＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡＴＧ（配列番号２０）
ｓｉ＃１３２８：ＧＡＧＴＣＧＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＡＧＴ（配列番号２１）。
また、ｓｉＥＧＦＰ（陰性対照としての）は、ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣ（配列番号２２）であった。ＰＣ細胞株である２２Ｒｖ１細胞及びＬＮＣａＰ（ＨＰ）細胞又はＣ４−２Ｂ細胞を、１０ｃｍのディッシュ又は６ウェルのプレート上にプレーティングし、製造業者の取扱説明書に従ってＦｕＧＥＮＥ６（Roche）を使用して、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２に対するｓｉＲＮＡを発現するように設計されたプラスミド（８μｇ／ディッシュ、３μｇ／ウェル）をトランスフェクトした。０．８ｍｇ／ｍｌのジェネテシン（Sigma-Aldrich）により７日間細胞を選択し、その後、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２の発現に及ぼすノックダウン効果を分析するために回収した。上述のプライマーを使用することにより、ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２についてのＲＴ−ＰＣＲを行った。コロニー形成アッセイのために、ｓｉＲＮＡを発現するトランスフェクタントを、ジェネテシンを含有する培地中で２０日間培養した。１００％メタノールでの固定後、コロニー形成を評価するために、トランスフェクトした細胞を０．１％のクリスタルバイオレットＨ２０で染色した。細胞生存度を、Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（同仁化学研究所、熊本県、日本）を使用して定量した。ジェネテシン含有培地中での２０日間の培養の後、溶液を、最終濃度が１０％となるように添加した。３７℃で２時間のインキュベーション後、４９０ｎｍと、基準としての６３０ｎｍとでの吸光度を、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ５５０（Bio-Rad、Hercules、CA）で測定した。本発明者らはまた、ｓｉ＃６９０に対応するＲＮＡ二本鎖を５’−ＧＡＣＵＣＡＧＵＧＧＡＣＣＵＣＵＵＵＧＧＧ−３’（配列番号２３）及び５’−ＣＡＡＡＧＡＧＧＵＣＣＡＣＵＧＡＧＵＣＵＵ−３’（配列番号２４）として、又は陰性対照ｓｉＲＮＡ二本鎖（ＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＵＵＣＴＵＵＣＡＡＧＴＴ（配列番号２５）及びＣＵＵＧＡＡＧＡＡＧＵＣＧＵＧＣＵＧＣＴＴ（配列番号２６））を合成し、それらの各々を、ＮＡＡＬＡＤＬ２を発現する別のＰＣ細胞株であるＣ４−２Ｂ細胞にトランスフェクトした。
【０２９５】
免疫細胞化学
ＰＫＩＢ又はＮＡＡＬＡＤＬ２のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ増幅産物をｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ｍｙｃ−ＨｉｓＡベクター（Invitrogen）又はｐＩＲＥＳ／ＨＡ（Clontech/BD Bioscience）中にクローニングした。製造業者が推奨する手順に従いＦｕＧＥＮＥ６（Roche）を使用して、プラスミドをＣＯＳ７細胞中にトランスフェクトし、ガラスカバースリップ（Becton Dickinson Labware、Franklin Lakes、NJ）上にプレーティングした。４８時間のインキュベーション後、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００での室温で１分間の処理により、透過性を付与した。非特異的結合は、室温で３０分間の、３％のＢＳＡを含有するＰＢＳでの処理により阻害した。細胞を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで希釈した抗Ｍｙｃ抗体（Santa Cruz）又は抗ＨＡ抗体（Sigma）と共に室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、室温で６０分間ＦＩＴＣ結合型二次抗体（Santa Cruz）により細胞を染色した。ＰＢＳで洗浄した後、検体を、４’，６’−ジアミジン−２’−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含有するＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（VECTOR Laboratories,Inc、Burlingame、CA）と共にマウントし、Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Leica、Bensheim、Germany）で可視化した。
【０２９６】
ＰＫＩＢとＰＫＡ−Ｃとの間の相互作用
ＰＫＩＢ−Ｍｙｃ及びＨＡ−ＰＫＡ−Ｃの発現ベクターを２２Ｒｖ１細胞中に同時トランスフェクトし、トランスフェクション後４８時間、これらの細胞を可溶化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２５０ｍＭ  スクロース、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で溶解した。細胞可溶化物を、抗Ｍｙｃ抗体（Santa Cruz）又は抗ＨＡ抗体（Sigma）により免疫沈降し、これらの免疫沈降物を、抗Ｍｙｃ抗体又は抗ＨＡ抗体でのウェスタンブロット分析の対象とした。
【０２９７】
ＰＫＡ−Ｃの局在
本発明者らは、配列ｓｉ１に対応するＲＮＡ二本鎖（５’−ＧＣＣＣＵＡＡＧＣＡＧＣＡＵＧＵＧＵＡＵＡ−３’（配列番号２７）及び５’−ＵＡＣＡＣＡＵＧＣＵＧＣＵＵＡＧＧＧＣＵＵ−３’（配列番号２８））を合成し、より効率的に内在性ＰＫＩＢをノックダウンした。このＲＮＡ二本鎖を、製造業者が推奨する手順に従いＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００（Invitrogen）を使用して、ＰＣ−３細胞中にトランスフェクトした。４８時間のインキュベーション後、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００での室温で１分間の処理により、透過性を付与した。非特異的結合は、室温で３０分間の、３％のＢＳＡを含有するＰＢＳでの処理により阻害した。細胞を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳにより１：２００に希釈した抗ＰＫＡ−Ｃ抗体（Ｃ−２０、Santa Cruz）と共に室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、室温で６０分間ＦＩＴＣ結合型二次抗体（Santa Cruz）により細胞を染色し、Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓで可視化した。細胞可溶化物を分画するために、ＲＮＡ二本鎖を、製造業者が推奨する手順に従いＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００（Invitrogen）を使用して、ＬＮＣａＰ（ＨＰ）細胞中にトランスフェクトした。４８時間のインキュベーション後、細胞を回収し、これらの細胞可溶化物をＮＥ−ＰＥＲ  Ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（PIERCE）により分画した。タンパク質量３０μｇの分画した細胞可溶化物を、ローディング対照及び核分画対照のために、抗ＰＫＡ−Ｃ抗体及び抗ラミンＢ抗体（Calbiochem）を使用することによりウェスタンブロット分析に供した。
【０２９８】
ＰＫＩＢ過剰発現細胞の生成、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖アッセイ
ＰＫＩＢのオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ増幅産物をｐＩＲＥＳ／ＨＡ（Clontech/BD Bioscience）中にクローニングした。製造業者が推奨する手順に従いＦｕＧＥＮＥ６（Roche）を使用して、プラスミドをＰＫＩＢヌルＰＣ細胞株ＤＵ１４５中にトランスフェクトした。０．６ｍｇ／ｍｌのジェネテシン（Invitrogen）で細胞の集団を選択し、クローンのＤＵ１４５細胞を、限界希釈によりサブクローニングした。ＰＫＩＢの発現は上述のＲＴ−ＰＣＲにより確認し、ＰＫＩＢを構成的に発現した３種類のクローンを確立した。空の（empty）ｐＩＲＥＳ／ＨＡベクターをトランスフェクトした対照ＤＵ１４５細胞も、モック細胞として確立した。これらの確立したクローンの増殖曲線を、Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を使用することにより測定した。
【０２９９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖アッセイのために、２×１０６個の、２種類の安定なクローン細胞と、２種類のモッククローン細胞とを、それぞれ、雄のヌードマウスの右側腹部と左側腹部とに接種した。
【０３００】
抗体産生及び免疫組織化学
ヒトＰＫＩＢ由来の２つのペプチド（ＳＡＲＡＧＲＲＮＡＬＰＤＩＱＳＳＡＡＴＤ（配列番号３３）及びＫＥＫＤＥＫＴＴＱＤＱＬＥＫＰＱＮＥＥＫ（配列番号３４））をウサギに免疫し、基礎的な方法論に従い各ペプチド抗原を結合するＡｆｆｉ−Ｇｅｌ  １０  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍｅｄｉａ（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を充填したアフィニティカラムで免疫血清を精製した。ＰＣ組織由来の通常の切片を外科的検体から取得し、ＨＲＰＣ組織を剖検及びＴＵＲ−Ｐにより取得した（Tamura et al. Cancer Res 67,5117-25, 2007）。切片を脱パラフィン処理し、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  ｐＨ（Dako、Carpinteria、CA）中で、１０８℃で１５分間オートクレーブ処理した。内在性のペルオキシダーゼ及びタンパク質の阻害後、切片を抗ＰＫＩＢ抗体（１：１００に希釈した）と共に室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ免疫グロブリン（Envision kit、Dako）で免疫検出を行った。最後に、３，３’−ジアミノベンジジン（Dako）で反応物を発色させた。対比染色を、ヘマトキシリンを使用して行った。
【０３０１】
Ａｋｔのリン酸化
２２Ｒｖ１細胞、ＬＮＣａＰ細胞又はＰＣ−３細胞を、配列ｓｉ１又はＰＫＩＢに対応するＰＫＩＢオリゴｓｉＲＮＡの上述の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／ＨＡ−ＰＫＩＢ）でトランスフェクトし、４８時間後又は２４時間後に回収した。該細胞を、プロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］）で溶解した。タンパク質試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより分離し、ＰＶＤＦトランスファー膜（GE Healthcare Bio-sciences）上に電気的にブロットした。ブロットを、ウサギモノクローナル抗ホスホＡｋｔ１（Ｓｅｒ４７３）抗体（細胞シグナリング）、ウサギモノクローナル抗Ａｋｔ１抗体（細胞シグナリング）、又はマウスモノクローナルβアクチン（ＡＣＴＢ）抗体（Sigma）と共にインキュベートした。タンパク質のバンドを、増強化学発光（ＥＣＬ）ウェスタンブロット検出試薬（GE Healthcare Bio-sciences）により可視化した。
【０３０２】
マトリゲル浸潤アッセイ
ＰＫＩＢを発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１／ＨＡ−ＰＫＩＢ）、又はモックプラスミドのいずれかでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中でコンフルエンス近くまで培養した。細胞をトリプシン処理により回収し、血清又はプロテイナーゼ阻害剤を添加しないＤＭＥＭ中で洗浄し、５×１０５／ｍｌの濃度となるようにＤＭＥＭ中に懸濁した。細胞懸濁液を調製する前に、マトリゲルマトリクス（Becton Dickinson Labware）の乾燥層を、室温で２時間、ＤＭＥＭで再水和した。１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（０．７５ｍｌ）の各下部チャンバに添加し、処理した。マトリゲルを通って侵入した細胞を、上述のように、固定化し、Ｇｉｍｓａにより染色した。
【０３０３】
実施例２  ＰＣ細胞におけるＰＫＩＢ及びＮＡＡＬＤＬ２の過剰発現
ＨＲＰＣ細胞の全ゲノムｃＤＮＡマイクロアレイ解析（Tamura K et al., Cancer Res 2007 67: 5117-25.）によりスクリーニングされた数十のトランス活性化した遺伝子のうち、本発明ではＰＫＩＢ及びＮＡＡＬＤＬ２に焦点を合わせた。ＰＫＩＢの過剰発現は９つの顕微解剖したＨＲＰＣ細胞集団のうち５つにおいてＲＴ−ＰＣＲにより確認し（図１Ａ）、ＮＡＡＬＤＬ２の過剰発現は９つのうち５つにおいてＲＴ−ＰＣＲにより確認した（図２Ａ）。
【０３０４】
心臓、肺、肝臓及び腎臓を含む正常な器官における両遺伝子の発現は最小であり、ＨＲＰＣ細胞は、ホルモン感受性ＰＣ細胞又はホルモンナイーブＰＣ細胞と比較して、両遺伝子についてより高い発現を示した。プローブとしてＰＫＩＢのｃＤＮＡ断片を使用するノーザンブロット分析は、胎盤及びＰＣ細胞株において特異的に約１．３ｋｂの転写産物を同定したが、肺、心臓、肝臓、腎臓及び脳を含む他のどの器官においても発現は観察されなかった（図１Ｂ）。プローブとしてＮＡＡＬＡＤＬ２のｃＤＮＡ断片を使用するノーザンブロット分析は、ＰＣ細胞株において特異的に約１０ｋｂ、６ｋｂ及び５ｋｂの転写産物の３つのバンドを同定したが、肺、心臓、肝臓、腎臓及び脳を含む他のどの器官においても発現は観察されなかった（図２Ｂ）。
【０３０５】
ＮＡＡＬＡＤＬ２のコード領域に及ぶデータベース解析とこのＲＴ−ＰＣＲとは、これらの３つのバンドが３’ＵＴＲの変異を反映することを示唆した。ヒトＰＫＩＢに特異的なポリクローナル抗体が産生され、ＰＣ細胞におけるＰＫＩＢタンパク質の発現を確認するために、３２個のホルモン感受性又はホルモンナイーブのＰＣ組織と９個のＨＲＰＣ組織とを含む４１個の臨床的なＰＣ組織を使用して免疫組織化学的分析を行った。ノーザンブロット分析及びＲＴ−ＰＣＲ分析により示されたように、ＰＩＮ（図１Ｃ）と正常な前立腺上皮（図１Ｄ、Ｎで示される）とがＰＫＩＢについての弱い染色（＋）を示し、ホルモンナイーブＰＣ組織の３２個のうち１０個（３１％）が同様にＰＫＩＢについての弱い染色を示した又は染色を示さなかった（＋）（図１Ｄ）。一方で、ホルモンナイーブＰＣの３２個のうち２２個（６９％）（図１Ｅ）と、６個のＨＲＰＣの全て（図１Ｆ）とがＰＫＩＢの強い正の染色（＋＋又は＋＋＋）を示し、ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果と矛盾しなかった。さらに、Ｇｌｅａｓｏｎグレードが５のホルモンナイーブＰＣの全て（９／９）（図１Ｅ）がＨＲＰＣと同様に、ＰＫＩＢについて強い正の染色を示し、ＰＫＩＢの発現はＧｌｅａｓｏｎグレードと強く相関し（表１、カイ二乗検定、Ｐ＝１．３５×１０−６）、ＰＫＩＢの発現がＰＣの悪性表現型及び予後不良を示し得ることを示唆した。
【０３０６】
（表１）臨床的なＰＣ組織におけるＰＫＩＢの発現とＧｌｅａｓｏｎスコア（ＧＳ）との間の相関関係
2010536365.tif 000002
【０３０７】
実施例３  ＰＣ細胞株におけるｓｉＲＮＡによるＰＫＩＢのノックダウン
ＰＫＩＢの異常発現の増殖促進の役割の可能性を調査するために、複数のｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、ＰＫＩＢを発現するＰＣ細胞株である２２Ｒｖ１細胞及びＬＮＣａＰ（ＨＰ）細胞に及ぼすそのノックダウン効果を検証した。ｓｉ１構築物及びｓｉ２構築物を２２Ｒｖ１細胞（左）及びＬＮＣａＰ（ＨＰ）細胞（右）にトランスフェクトすると、顕著なノックダウン効果が半定量ＲＴ−ＰＣＲにより観察されたが、＃３ｓｉ及び陰性ｓｉＲＮＡ構築物であるｓｉＥＧＦＰでは観察されなかった（図３Ａ）。ジェネテシンを含有する培養培地における選択後、ＭＴＴアッセイ（図３Ｂ）及びコロニー形成アッセイ（図３Ｃ）により、２２Ｒｖ１細胞（左）及びＬＮＣａＰ（ＨＰ）細胞（右）におけるｓｉ１及びｓｉ２の導入がその細胞増殖又は生存度を劇的に減少させるが、ＰＫＩＢ発現に影響を及ぼさない他のｓｉＲＮＡの導入は細胞増殖に影響を及ぼさないことが実証され、ＰＫＩＢがＰＣ細胞生存度に重要な役割を果たす可能性があることが示された。
【０３０８】
実施例４  ＰＣ細胞株におけるｓｉＲＮＡによるＮＡＡＬＡＤＬ２のノックダウン
ＮＡＡＬＡＤＬ２の異常発現の増殖促進の役割の可能性を調査するために、複数のｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、ＮＡＡＬＡＤＬ２を発現するＰＣ細胞株である２２Ｒｖ１細胞に及ぼすそのノックダウン効果を検証した。ｓｉ＃６９０構築物を２２Ｒｖ１細胞にトランスフェクトすると、顕著なノックダウン効果が半定量ＲＴ−ＰＣＲにより観察されたが、他の構築物では観察されなかった（図４Ａ）。ジェネテシンを含有する培養培地における１４日間の選択後、ＭＴＴアッセイ（図４Ｂ）及びコロニー形成アッセイ（図４Ｃ）により、２２Ｒｖ１細胞におけるｓｉ＃６９０の導入がその細胞増殖又は生存度を劇的に減少させるが、ＮＡＡＬＡＤＬ２の発現のノックダウン効果を示さない他のｓｉＲＮＡの導入は細胞増殖に影響を及ぼさないことが実証され、ＮＡＡＬＡＤＬ２が癌細胞生存度に重要な役割を果たす可能性があることが示された。ｓｉ＃６９０に対応する合成ＲＮＡ二本鎖、又は陰性対照ｓｉＲＮＡ二本鎖を、別のＮＡＡＬＡＤＬ２を発現するＰＣ細胞株であるＣ４−２Ｂ細胞にトランスフェクトした。ＲＴ−ＰＣＲはｓｉ＃６９０ＲＮＡ二本鎖がＣ４−２Ｂ細胞において内在性ＮＡＡＬＡＤＬ２発現を明らかにノックダウンすることを示し（図４Ｄ）、ＭＴＴアッセイはｓｉ＃６９０ＲＮＡ二本鎖がＣ４−２Ｂ細胞の増殖を同様に抑制することを実証した（図４Ｅ）。
【０３０９】
実施例５  ＰＫＩＢタンパク質及びＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質の細胞内局在
タグを付した全長ＰＫＩＢタンパク質及びＮＡＡＬＡＤＬタンパク質を発現するために構築した哺乳動物の発現ベクターを使用して、抗タグ抗体を使用する免疫細胞化学的分析により、その細胞内局在を調査した。図５に示すように、外来性ＰＫＩＢは細胞質に局在し（図５Ａ）、外来性ＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質は細胞膜に局在した（図５Ｂ）。ＮＡＡＬＡＤＬ２は１つの膜貫通を有し、ＩＩ型膜タンパク質として細胞膜に局在すると予想される。このデータはこのことを支持し、ＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質はＩＩ型膜タンパク質であると考えられる。
【０３１０】
実施例６  ＰＫＩＢ及びＰＫＡ−Ｃの間の相互作用、並びにＰＫＩＢをノックダウンすることによるＰＫＡ−Ｃの転位
ＰＫＩＢはＰＫＩ（タンパク質キナーゼＡ阻害剤）ファミリーに属する。また、ＰＫＩＡは、タンパク質キナーゼＡ触媒サブユニット（ＰＫＡ−Ｃ）のキナーゼ活性を阻害し、ＰＫＡ−Ｃと直接結合することによりその偽基質モチーフ（ＲＲＮＡ：配列番号３１）を介してＰＫＡ−Ｃを核から細胞質へ排出し得る（Glass DB et al., J Biol Chem 1986 261: 12166-71.及びWen W et al., J Biol Chem 1994 269: 32214-20.）。ＰＫＩＢも偽基質モチーフ（ＲＲＮＡ）を有するが、その阻害活性はＰＫＩＡの阻害活性よりずっと小さく（Gamm DM et al., J Biol Chem 1995 270: 7227-32.）、細胞中におけるそのＰＫＡ−Ｃ転位活性は未知である。ＰＫＩＢがＰＫＡ−Ｃの局在と関与するかどうかを調査するために、最初に、ＰＫＩＢとＰＫＡ−Ｃとの間の直接の相互作用を確認した。ＰＫＩＢ−Ｍｙｃ及びＨＡ−ＰＫＡ−Ｃの発現ベクターを２２Ｒｖ１細胞に同時トランスフェクトし、その細胞可溶化物を各タグ抗体により免疫沈降させた。図５Ｃは、ＰＫＩＢ−ＭｙｃがＰＫＡ−Ｃで同時免疫沈降したこと、およびＰＫＡ−ＣがＰＫＩＢ−Ｍｙｃで同時免疫沈降した（vice versa）ことを示し、ＰＫＩＢとＰＫＡ−Ｃとの間の直接の相互作用を示した。
【０３１１】
次に、ＰＫＩＢについてノックダウンしたＰＣ−３細胞又はＬＮＣａＰ（ＨＰ）細胞中における内在性ＰＫＡ−Ｃの細胞内局在を、免疫細胞化学的分析及び細胞分画により確認した。免疫細胞化学的分析により、対照ｓｉＲＮＡをＰＣ−３細胞にトランスフェクトした場合には、ほとんどのＰＫＡ−Ｃが細胞質中に局在し、ＰＫＡ−Ｃタンパク質の幾つかのシグナルが核内に局在することが観察された（図５Ｄ、左）。一方、ｓｉＲＮＡがＰＣ−３細胞において内在性ＰＫＩＢをノックダウンした場合には、免疫細胞化学的分析は、核内にＰＫＡ−Ｃのシグナルを全く又はほとんど示さなかった（図５Ｄ、右）。ＰＫＩＢを発現する他のＰＣ細胞株であるＬＮＣａＰ（ＨＰ）細胞において、同じ現象が観察された。核内のＰＫＡ−Ｃをより定量的に分析するために、ＰＫＩＢ  ｓｉＲＮＡで処理したＬＮＣａＰ（ＨＰ）細胞由来の可溶化物を分画した。
【０３１２】
図５Ｅに示すように、核内のＰＫＡ−Ｃの量は、対照ｓｉＲＮＡと比較して、ＰＫＩＢノックダウンでは明らかに減少したが、細胞質中のＰＫＡ−Ｃの量はＰＫＩＢノックダウンでは少し増大した。これらの知見は、ＰＫＩＡの核排出機能と異なり、ＰＫＩＢがＰＫＡ−Ｃの核内への移入を促進し得るか、又は核からのＰＫＡ−Ｃの排出を阻害し得ることに関係する。
【０３１３】
実施例７  ＰＫＩＢの過剰発現が、ＰＣ細胞の増殖を促進した。
ＰＫＩＢの発癌機能を調査するために、内在性ＰＫＩＢを全く又はほとんど発現しないＤＵ１４５細胞から、外来性ＰＫＩＢを構成的に発現した３種類のクローンを確立し、これらのクローンをその増殖についてモックＤＵ−１４５細胞と比較した。示したように、３種類のクローン全てが外来性ＰＫＩＢを構成的に発現し（図６Ａ、図６Ｂ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（図６Ｃ）及びｉｎ  ｖｉｖｏ（図６Ｄ）においてモック細胞よりも迅速に増殖し、前立腺癌におけるＰＫＩＢの増殖促進効果を示唆した。本明細書において免疫組織化学的分析が示したように、ＰＫＩＢの過剰発現はＧｌｅａｓｏｎスコアの高さと強く相関し、ＰＫＩＢが前立腺癌細胞の悪性度又は浸潤度に寄与し得ることを示した。その後、細胞浸潤におけるＰＫＩＢの考え得る役割を、マトリゲル浸潤アッセイにより検証した。図６Ｅに示すように、ＰＫＩＢ発現ベクターでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞は、モックベクターでトランスフェクトした細胞と比べて、マトリゲルを通るその移動を有意に増強した。
【０３１４】
実施例８  ＰＫＩＢは、ＰＣにおけるＡｋｔのリン酸化に関与した。
複数の報告が、ＰＴＥＮの機能の喪失とＡｋｔの活性化とが前立腺癌の進行と有意に相関し、ＰＴＥＮ−ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路がＨＲＰＣの進行とその悪性表現型とにおいて重要な役割を果たす可能性があることを示唆した（Sellers, W. R. & Sawyers, C. L. （2002） Somatic Genetics of Prostate Cancer: Oncogenes and Tumor Suppressors ed. Kantoff, P. （Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia）、Wang Y, Kreisberg JI, Ghosh PM., Curr Cancer Drug Targets. 2007 Sep;7（6）:591-604、Lin HK, Yeh S, Kang HY, Chang C, Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98（13）:7200-5、Feldman BJ, Feldman D, Nat Rev Cancer 2001;1（1）:34-45、Malik SN, Brattain M, Ghosh PM, Troyer DA, Prihoda T, Bedolla R, Kreisberg JI., Clin Cancer Res. 2002;8（4）:1168-71）。そこで、ＰＫＩＢがＡｋｔのリン酸化に影響を及ぼし得るか及ぼし得ないかについて調査した。最初に、ｓｉ１に対応するＲＮＡ二本鎖によりＰＣ細胞株（ＬＮＣａＰ細胞及びＰＣ−３細胞）におけるＰＫＩＢの発現をノックダウンし、Ａｋｔの４７３位のＳｅｒについてのＡｋｔリン酸化を、ウェスタンブロット分析により確認した。ＲＮＡ二本鎖によるＰＫＩＢのノックダウンをＲＴ−ＰＣＲにより確認した（データは示していない）。結果として、ＰＫＩＢのノックダウンは、ＰＣ細胞におけるＡｋｔのリン酸化に明確に影響を及ぼした（図７Ａ）。さらに、図７Ｂに示すように、ＰＣ細胞におけるＰＫＩＢの過剰発現が、４７３位のＳｅｒにおけるＡｋｔのリン酸化を顕著に増強したことも観察された。ＰＫＩＢがＰＫＡ−Ｃキナーゼと直接相互作用すること、及びその機能を改変することができる可能性があることが実証され、ＰＫＡ−Ｃキナーゼの過剰発現も４７３位のＳｅｒにおけるＡｋｔのリン酸化を増強することが確認された（図７Ａ）。これらの知見は、ＰＫＩＢが、おそらくＰＫＡ−Ｃキナーゼ機能の改変を介して、ＰＣ細胞においてＡｋｔのリン酸化（Ｓｅｒ４７３）に関与し得ることを示唆した。
【０３１５】
次に、図７Ｂに示すように、ＰＣ細胞におけるＰＫＩＢの過剰発現がＡｋｔのリン酸化を増強することが観察された。ＰＫＩＢがＰＫＡ−Ｃキナーゼと直接相互作用しその機能を改変し得ることが実証され、ＰＫＡ−Ｃキナーゼの過剰発現もＡｋｔのリン酸化を増強することが確認された（図７Ｃ）。これらの知見は、ＰＫＩＢが、おそらくＰＫＡ−Ｃキナーゼの改変を介して、Ａｋｔのリン酸化に関与し得ることを示唆した。
【０３１６】
加えて、Ａｋｔの４７３位のＳｅｒにおけるリン酸化が直接ＰＫＡ−Ｃ及び／又はＰＫＩＢによるものかどうかを確認するために、組換えＰＫＩＢタンパク質、組換えＰＫＡ−Ｃキナーゼタンパク質及び組換えＡｋｔタンパク質を使用することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを行った。図７Ｄに示すように、ＰＫＡ−Ｃキナーゼが組換えＡｋｔと反応した場合にはリン酸化Ｓｅｒ４７３特異的抗体がリン酸化したＡｋｔを検出し、Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）のリン酸化レベルはＰＫＩＢの添加により明らかに増強した。このことは、ＰＫＡ−Ｃキナーゼは、ＰＫＩＢと共に直接的に且つ効果的に、ＰＣ細胞の増殖促進及び進行に寄与し得るＡｋｔの４７３位のＳｅｒをリン酸化することができることを示唆した。
【０３１７】
実施例９  ＰＣ組織における、Ａｋｔのリン酸化、及びＰＫＩＢの過剰発現
最後に、ＰＫＩＢの発現と、４７３位のＳｅｒにおけるＡｋｔのリン酸化との間の相関を、臨床的なＰＣ組織において検証した。図８は、ＰＣ組織の向かい合わせた（face-on-face）スライドにおいてＰＫＩＢの染色パターンとｐＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）の染色パターンとを比較したＰＣ組織の代表的な写真を示しており、これはこのＰＣ組織におけるＰＫＩＢの発現とＡｋｔのリン酸化の間の相関関係を示す。表２に、臨床的なＰＣ組織におけるＰＫＩＢの発現とＡｋｔのリン酸化の間の相関関係を要約した（Ｐ＝０．０１５６、カイ二乗検定）。
【０３１８】
（表２）臨床的なＰＣ組織における、ＰＫＩＢの発現と４７３位のＳｅｒにおけるＡｋｔのリン酸化との間の相関関係
2010536365.tif 000003
【０３１９】
考察
本発明では、臨床的なＨＲＰＣ細胞の全ゲノム遺伝子発現プロファイルを使用して、前立腺癌に対する、特にホルモン不応性前立腺癌に対する２つの分子標的を同定した。前立腺癌は比較的良好な予後を示し、ホルモン除去療法が再発又は進行したＰＣのほとんどに効果的である。しかし一度ＨＲＰＣ細胞が出現すると、ＰＣ患者の治療のために利用可能な選択肢はほとんどない。結果として従来技術は、ＨＲＰＣ患者のための新規な分子標的の同定と、これらの新規な分子を標的とすることによるＨＲＰＣの新規療法の開発とに対する必要性を認識していた。
【０３２０】
ＰＫＩＢは、ＰＫＩ（タンパク質キナーゼＡ阻害剤）ファミリーに属する。ＰＫＩＡは、タンパク質キナーゼＡ触媒サブユニット（ＰＫＡ−Ｃ）のキナーゼ活性を阻害し、ＰＫＡ−Ｃと直接結合することによりＰＫＡ−Ｃを核から細胞質へ排出し得る（Glass DB et al., J Biol Chem 1986 261: 12166-71.及びWen W et al., J Biol Chem 1994 269: 32214-20.）。タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼＡは、しばしば、ｃＡＭＰにより開始される広範な生理学的効果又は病理学的効果を媒介するために、及びＧ−タンパク質と結合するために、必須と考えられ、複数のリガンド及び受容体の系がＰＫＡシグナル経路を活性化し、その活性化は細胞増殖及び分化の制御と関連する（Tasken K et al., Physol Review 2004 84: 137-67.及びStork PJ et al., Trends Cell Biol 2002 12:258-66.）。
【０３２１】
前立腺癌では、複数の報告が、アンドロゲン非依存性増殖及び神経内分泌分化へのその関与を示唆し（Cox ME et al., J Biol Chem 2000 275: 13812-8.）、ＰＫＡ経路とＡＲ経路との間のクロストークがＨＲＰＣ細胞のアンドロゲン非依存性増殖に関与することが示唆されている（Stork PJ et al., Trends Cell Biol 2002 12:258-66.及びSadar MD, J Biol Chem 1999 274: 7777-83.）。
【０３２２】
本発明では、ＰＫＩＢが、ＰＫＩファミリーメンバーとしてＰＫＡ−Ｃ活性又はＰＫＡ経路を阻害するよりもむしろ、ＰＫＡ−Ｃの核内局在を促進しＰＣ細胞増殖を促進し得ることが実証された。過去の報告は、ＰＫＩＢがｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＫＡ−Ｃの阻害活性を或る程度有するがそのＫｍはＰＫＩＡよりずっと高く、ＰＫＡ−Ｃの核内への移入を促進すること、又はその核外への排出を阻害することがＰＣ細胞におけるＰＫＩＢの機能として支配的であり得ることを示唆した。さらにＰＫＩＢは、ＣＲＰＣの侵襲性且つ悪性の表現型において重要な役割を果たし得るＡｋｔの４７３位のＳｅｒにおけるリン酸化と強力に関連し得る。
【０３２３】
ＮＡＡＬＡＤＬ２は新規なＩＩ型膜タンパク質であり、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）ファミリーに属する。前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）と呼ばれるＧＣＰＩＩの前立腺形態は前立腺癌において発現し、ＰＳＭＡレベルの増大は、ＰＣの進行とＨＲＰＣとに関連する（Rajasekaran AK et al., Am J Physiol Cell Physiol 2005 288: C975-81.及びMurphy GP et al., Prostate 2000 42: 145-9.）。そのＰＳＭＡとの相同性と、その類似する発現パターンとを考慮すると、この新規な分子ＮＡＡＬＡＤＬ２は「ＰＳＭＡ２」と呼ぶべきである。ＰＭＳＡはＦＤＡに承認された前立腺癌造影剤である１１１Ｉｎ標識７Ｅ１１モノクローナル抗体（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ、Cytogen、Princeton、NJ）の標的であり、ＰＭＳＡは、ＰＳＭＡを発現する細胞への造影剤又は治療薬の特異的送達を目的とする臨床試験にある、Ｊ５９１等のモノクローナル抗体により標的とされる（Murphy GP et al., Prostate 2000 42: 145-9.及びHolmes EH, Expert Opin Investig Drugs 2001 10: 511-9.）。
【０３２４】
腫瘍マーカーとしてのその特徴に加えて、ＰＳＭＡは、その基質がポリ−γ−グルタミン酸型葉酸を含む、ＧＰＣ活性を有する（Zhou J et al., Nature Review Drug Disc 2005 4: 1015-26.）。ＰＳＭＡの酵素活性はプロドラッグの設計のために利用することができ、該プロドラッグでは薬剤の不活性なグルタミン酸型形態が選択的に切断されることにより、ＰＳＭＡを発現する細胞でのみ活性化される（Denny WA et al., Eur J Med Chem 2001 36: 577-95.）。しかし、ＰＳＭＡが前立腺癌の進行とどのように関連するのかは全く未知であり、ＰＳＭＡの機能又は活性それ自体を標的とする可能性も未知である。ＮＡＡＬＡＤＬ２はＨＲＰＣ細胞において強く発現し、正常な成体の器官におけるその発現は、図２Ｂに示したようにきわめて限定されている。腫瘍マーカーとしてのその限定的な発現に加えて、それはＰＣの生存度又は増殖と関与する可能性があり、このことはこのｓｉＲＮＡ実験により支持される。したがって、ＰＭＳＡ２に対する特異的なモノクローナル抗体は、腫瘍マーカーと共に、ＰＭＳＡ２活性を阻害することにより、ＰＣ療法に利用可能だろう。
【０３２５】
産業上の利用可能性
ヒト遺伝子ＰＫＩＢ及びＮＡＡＬＡＤＬ２の発現は、正常な器官と比較して、前立腺癌、特にホルモン不応性前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌において顕著に上昇する。したがってこれらの遺伝子は前立腺癌の診断マーカーとして便利に使用することができ、これらによりコードされるタンパク質は、前立腺癌の診断アッセイに使用され得る。
【０３２６】
本発明者らは、ＰＫＩＢ遺伝子及びＮＡＡＬＡＤＬ２遺伝子を特異的に標的とする二本鎖分子により細胞増殖が抑制されることを示した。したがって、これらの新規な二本鎖分子は、抗癌薬の開発に有用である。例えば、ＰＫＩＢタンパク質若しくはＮＡＡＬＡＤＬ２タンパク質の発現を阻害し、又はそれらの活性を防止する作用物質は、抗癌剤、特に前立腺癌、特にホルモン不応性前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌の治療のための抗癌剤として治療上の有用性を有する。
【０３２７】
さらにＰＫＩＢポリペプチド又はＮＡＡＬＡＤＬ２ポリペプチドのいずれかは、抗癌薬の開発に有用な標的である。例えば、ＰＫＩＢ若しくはＮＡＡＬＡＤＬ２と結合する、又はＰＫＩＢ若しくはＮＡＡＬＡＤＬ２の発現を阻害する、又はその活性を防止する、又はＰＫＩＢとＰＫＡ−Ｃとの間の結合を阻害する作用物質、又は抗ＮＡＡＬＡＤＬ２抗体は、抗癌剤、特に前立腺癌、特にホルモン不応性前立腺癌又は去勢抵抗性前立腺癌の治療のための抗癌剤として、治療上の有用性を見出し得る。
【０３２８】
本発明をその具体的な実施形態を参照して詳細に記載したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更及び改変をその実施形態に加えることができることは当業者には明らかである。
【図１Ａ】
2010536365.tif 000004
【図１Ｂ】
2010536365.tif 000005
【図１Ｃ】
2010536365.tif 000006
【図１Ｄ】
2010536365.tif 000007
【図１Ｅ】
2010536365.tif 000008
【図１Ｆ】
2010536365.tif 000009
【図２】
2010536365.tif 000010
【図３】
2010536365.tif 000011
【図４】
2010536365.tif 000012
【図５】
2010536365.tif 000013
【図６】
2010536365.tif 000014
【図７】
2010536365.tif 000015
【図８】
2010536365.tif 000016
【配列表】
2010536365000001.app
【国際調査報告】
2010536365.tif 000017
2010536365.tif 000018