(57)【要約】  本発明は、診断、予後のための、また治療方法を決定するための方法および組成物を対象とする。サンプル（例えば、臨床サンプル）中に存在する細胞の生理学的状態を、状態（例えば、慢性リンパ性白血病）の診断または予後において、治療のための患者選択において、治療をモニターするために、治療計画を改変または最適化するために用いることができる。細胞の生理学的状態は、細胞（例えば、癌細胞）中の１種以上の活性化成分の細胞内状態（例えば、シグナル伝達分子のリン酸化状態）を、別の細胞（例えば、正常細胞）のものと比較することによって決定できる。細胞の生理学的状態は、問題の細胞に１種以上のモジュレーター（例えば、阻害剤またはアクチベーター）を加えることによってさらに分類できる。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞の集団の表現型プロフィールを決定する方法を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を分類する方法であって、
前記細胞を阻害剤と接触させるステップと、
前記細胞中の活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無を決定するステップと、
前記活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無に基づいて、前記細胞を分類するステップと
を含む方法。
【請求項２】
活性化可能成分の活性化レベルの変化が、活性化可能成分の活性化レベルの増大である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無が、前記阻害剤と接触した正常細胞と比較される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、造血由来細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
複数の活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無が、前記の決定ステップで決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記の分類ステップが、前記細胞を、臨床転帰と相関している細胞として分類することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記臨床転帰が、腫瘍性疾患および／または造血疾患の有無である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍性状態および／または造血状態が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂリンパ球系統白血病、Ｂリンパ球系統リンパ腫、多発性骨髄腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、前駆細胞Ｂリンパ芽球性白血病、ヘアリーセル白血病および形質細胞障害からなる群から選択される、Ｂ細胞またはＢ細胞系統由来の障害である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記臨床転帰が、腫瘍性疾患および／または造血疾患のステージ分類または類別である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記の分類ステップが、治療方法を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞をモジュレーターに付すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記モジュレーターが、Ｂ細胞受容体モジュレーターである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記阻害剤が、キナーゼまたはホスファターゼ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記キナーゼまたはホスファターゼ阻害剤が、アダフォスチン、ＡＧ４９０、ＡＧ８２５、ＡＧ９５７、ＡＧ１０２４、アロイシンＡ、アルステルパウロン、アミノゲニステイン、ＡＰＩ−２、アピゲニン、アルクチゲニン、ＡＹ−２２９８９、ＢＡＹ６１−３６０６、ビスインドリルマレイミドＩＸ、チェレリスリン、１０−［４’−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル］−２−クロロフェノキサジンヒドロクロリド、ダサチニブ、２−ジメチルアミノ−４，５，６，７−テトラブロモ−１Ｈ−ベンズイミダゾール、５，７−ジメトキシ−３−（４−ピリジニル）キノリンジヒドロクロリド、エデルホシン、エラグ酸、エンザスタウリン、マレイン酸ＥＲ２７３１９、エルロチニブ、ＥＴ１８ＯＣＨ３、ファスジル、フラボピリドール、ゲフィチニブ、ＧＷ５０７４、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−８９、ＨＡ−１００、ＨＡ−１００４、ＨＡ−１０７７、ＨＡ−１１００、ヒドロキシファスジル、インジルビン−３’−オキシム、５−ヨードツベルシジン、ケンパウロン、ＫＮ−６２、ＫＹ１２４２０、ＬＦＭ−Ａ１３、ラベンダスチンＡ、ルテオリン、ＬＹ−２９４００２、ＬＹ２９４００２、マロトキシン、ＭＬ−９、ＮＳＣ−１５４０２０、ＮＳＣ−２２６０８０、ＮＳＣ−２３１６３４、ＮＳＣ−６６４７０４、ＮＳＣ−６８０４１０、ＮＵ６１０２、オロモウシン、オキシインドールＩ、ＰＤ−１５３０３５、ＰＤ−９８０５９、ＰＤ１６９３１６、フロレチン、フロリジン、ピセタノール、ピクロポドフィリン、ＰＫＩ、ＰＰ１、ＰＰ２、プルバラノールＡ、ケルセチン、Ｒ４０６、Ｒ７８８、ラパミューン、ラパマイシン、Ｒｏ３１−８２２０、ロスコビチン、ロットレリン、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、シロリムス、ソラフェニブ、ＳＬ３２７、ＳＰ６００１２５、スタウロスポリン、ＳＴＩ−５７１、ＳＵ−１１２７４、ＳＵ１４９８、ＳＵ４３１２、ＳＵ６６５６、４，５，６，７−テトラブロモトリアゾール、ＴＧ１０１３４８、トリシリビン、チロホスチンＡＧ４９０、チロホスチンＡＧ８２５、チロホスチンＡＧ９５７、チロホスチンＡＧ１０２４、チロホスチンＳＵ１４９８、Ｕ０１２６、ＶＸ−５０９、ＶＸ−６６７、ＶＸ−６８０、Ｗ−７、ワートマニン、ＸＬ−０１９、ＸＬ−１４７、ＸＬ−１８４、ＸＬ−２２８、ＸＬ−２８１、ＸＬ−５１８、ＸＬ−６４７、ＸＬ−７６５、ＸＬ−８２０、ＸＬ−８４４、ＸＬ−８８０、Ｙ−２７６３２、ＺＤ−１８３９、ＺＭ−２５２８６８、ＺＭ−４４７４３９、Ｈ２Ｏ２、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、カンタリジン、（−）−ｐ−ブロモテトラミゾール、ミクロシスチンＬＲ、オルトバナジウム酸ナトリウム、過バナジン酸ナトリウム、硫酸バナジル、ナトリウムオキソジペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）バナデート、ビス（マルトラト）オキソバナジウム（ＩＶ）、モリブデン酸ナトリウム、過モリブデン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、イミダゾール、フッ化ナトリウム、β−グリセロフォスフェート、ピロリン酸ナトリウム十水和物、カリクリンＡ、ディスコデルミア・カリックス（Ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｉａ  ｃａｌｙｘ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ｍｐＶ（ｐｉｃ）、ＤＭＨＶ、シペルメトリン、デフォスタチン、オカダ酸、Ｎ��ＰＰ−１、Ｎ−（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロ−フェナントレン−２−イル）−２，２−ジメチル−プロピオンアミド、α−ブロモ−４−ヒドロキシアセトフェノン、４−ヒドロキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−メトキシアセトフェノン、４−メトキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−（カルボキシメトキシ）アセトフェノン、４−（カルボキシメトキシ）フェナシルＢｒおよびビス（４−トリフルオロメチルスルホンアミドフェニル）−１，４−ジイソプロピルベンゼン、フェニアルシンオキシド、ピロリジンジチオカルバメートおよびアルミニウムフルオリドからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
活性化レベルが、細胞外または細胞内プロテアーゼ曝露による切断、新規ヘテロ−オリゴマー形成、グリコシル化レベル、リン酸化レベル、アセチル化レベル、メチル化レベル、ビオチン化レベル、グルタミル化レベル、グリシル化レベル、水酸化レベル、異性化レベル、プレニル化レベル、ミリストイル化レベル、リポイル化レベル、ホスホパンテテイン化レベル、硫酸化レベル、ＩＳＧ化レベル、ニトロシル化レベル、パルミトイル化レベル、ＳＵＭＯ化レベル、ユビキチン化レベル、ＮＥＤＤ８化（ｎｅｄｄｙｌａｔｉｏｎ）レベル、シトルリン化レベル、脱アミド化レベル、ジスルフィド結合形成レベル、タンパク質分解切断レベル、転位レベル、タンパク質代謝回転における変化、多タンパク質複合体レベル、酸化レベル、多脂質複合体および細胞膜における生化学的変化からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記活性化可能成分が、リン酸化または脱リン酸化を受けるタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質が、ＰＩ３−キナーゼ（ｐ８５、ｐ１１０ａ、ｐ１１０ｂ、ｐ１１０ｄ）、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、ＳＯＣｓ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｃｄｃ４２、Ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｖａｖ、Ｔｉａｍ、Ｓｏｓ、Ｄｂｌ、Ｎｃｋ、Ｇａｂ、ＰＲＫ、ＳＨＰ１およびＳＨＰ２、ＳＨＩＰ１、ＳＨＩＰ２、ｓＳＨＩＰ、ＰＴＥＮ、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ＰＤＫ１、ＳＧＫ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、ＴＳＣ１，２、Ｒｈｅｂ、ｍＴｏｒ、４ＥＢＰ−１、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、Ｓ６、ＬＫＢ−１、ＡＭＰＫ、ＰＦＫ、アセチル−ＣｏＡａカルボキシラーゼ、ＤｏｋＳ、Ｒａｆ、Ｍｏｓ、Ｔｐｌ２、ＭＥＫ１／２、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ＭＫＫ３／６、ＭＥＫＫ１，４、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＭＫＫ４／７、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ１、２、３、ｐ３８、Ｅｒｋ１／２、Ｓｙｋ、Ｂｔｋ、ＢＬＮＫ、ＬＡＴ、ＺＡＰ７０、Ｌｃｋ、Ｃｂｌ、ＳＬＰ−７６、ＰＬＣγ１、ＰＬＣγ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ＦＡＫ、ｐ１３０ＣＡＳ、ＰＡＫｓ、ＬＩＭＫ１／２、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ２７、ＳＭＡＤｓ、Ｒｅｌ−Ａ（ｐ６５−ＮＦκＢ）、ＣＲＥＢ、ヒストンＨ２Ｂ、ＨＡＴｓ、ＨＤＡＣｓ、ＰＫＲ、Ｒｂ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、Ｐ１６、ｐ１４Ａｒｆ、ｐ２７ＫＩＰ、ｐ２１ＣＩＰ、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ６、Ｃｄｋ７、Ｃｄｋ１、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ９、Ｃｄｃ２５，Ａ／Ｂ／Ｃ、Ａｂｌ、Ｅ２Ｆ、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＲＩＰ、Ｍｙｄ８８、ＢＡＤ、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ＸＬ、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ＰＡＲＰ、ＩＡＰ、Ｓｍａｃ、フォドリン、アクチン、Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、ＮＩＫ、ＩκＢ、ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ＩＫＫα、ＰＫＡ、ＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣθ、ＰＫＣδ、ＣＡＭＫ、Ｅｌｋ、ＡＦＴ、Ｍｙｃ、Ｅｇｒ−１、ＮＦＡＴ、ＡＴＦ−２、Ｍｄｍ２、ｐ５３、ＤＮＡ−ＰＫ、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、β−カテニン、ＣｒｋＬ、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３βおよびＦＯＸＯからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
個体における疾患の有無を決定する方法であって、
前記個体由来の細胞を阻害剤に付すステップと、
前記細胞中の活性化可能成分の活性化レベルを決定するステップと、
前記活性化レベルに基づいて前記疾患の有無を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
前記個体由来の細胞をモジュレーターに付すステップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記決定ステップにおいて複数の活性化可能成分の活性化レベルが決定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞中の複数の活性化可能成分の活性化レベルのパターンを同定するステップを含み、前記パターンが疾病または疾患と相関している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患が、腫瘍性疾患および／または造血疾患である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍性疾患および／または造血疾患が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂリンパ球系統白血病、Ｂリンパ球系統リンパ腫、多発性骨髄腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、前駆細胞Ｂリンパ芽球性白血病、ヘアリーセル白血病および形質細胞障害からなる群から選択される、Ｂ細胞またはＢ細胞系統由来の障害である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記モジュレーターが、アクチベーターまたは阻害剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記モジュレーターが、Ｂ細胞受容体複合体またはＢ細胞共受容体複合体のＢ細胞受容体アクチベーターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記阻害剤が、アダフォスチン、ＡＧ４９０、ＡＧ８２５、ＡＧ９５７、ＡＧ１０２４、アロイシン、アロイシンＡ、アルステルパウロン、アミノゲニステイン、ＡＰＩ−２、アピゲニン、アルクチゲニン、ＡＹ−２２９８９、ＢＡＹ  ６１−３６０６、ビスインドリルマレイミドＩＸ、チェレリスリン、１０−［４’−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル］−２−クロロフェノキサジンヒドロクロリド、ダサチニブ、２−ジメチルアミノ−４，５，６，７−テトラブロモ−１Ｈ−ベンズイミダゾール、５，７−ジメトキシ−３−（４−ピリジニル）キノリンジヒドロクロリド、エデルホシン、エラグ酸、エンザスタウリン、マレイン酸ＥＲ２７３１９、エルロチニブ、ＥＴ１８ＯＣＨ３、ファスジル、フラボピリドール、ゲフィチニブ、ＧＷ５０７４、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−８９、ＨＡ−１００、ＨＡ−１００４、ＨＡ−１０７７、ＨＡ−１１００、ヒドロキシファスジル、インジルビン−３’−オキシム、５−ヨードツベルシジン、ケンパウロン、ＫＮ−６２、ＫＹ１２４２０、ＬＦＭ−Ａ１３、ラベンダスチンＡ、ルテオリン、ＬＹ−２９４００２、ＬＹ２９４００２、マロトキシン、ＭＬ−９、ＮＳＣ−１５４０２０、ＮＳＣ−２２６０８０、ＮＳＣ−２３１６３４、ＮＳＣ−６６４７０４、ＮＳＣ−６８０４１０、ＮＵ６１０２、オロモウシン、オキシインドールＩ、ＰＤ−１５３０３５、ＰＤ−９８０５９、ＰＤ１６９３１６、フロレチン、フロリジン、ピセタノール、ピクロポドフィリン、ＰＫＩ、ＰＰ１、ＰＰ２、プルバラノールＡ、ケルセチン、Ｒ４０６、Ｒ７８８、ラパミューン、ラパマイシン、Ｒｏ３１−８２２０、ロスコビチン、ロットレリン、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、シロリムス、ソラフェニブ、ＳＬ３２７、ＳＰ６００１２５、スタウロスポリン、ＳＴＩ−５７１、ＳＵ−１１２７４、ＳＵ１４９８、ＳＵ４３１２、ＳＵ６６５６、４，５，６，７−テトラブロモトリアゾール、ＴＧ１０１３４８、トリシリビン、チロホスチンＡＧ４９０、チロホスチンＡＧ８２５、チロホスチンＡＧ９５７、チロホスチンＡＧ１０２４、チロホスチンＳＵ１４９８、Ｕ０１２６、ＶＸ−５０９、ＶＸ−６６７、ＶＸ−６８０、Ｗ−７、ワートマニン、ＸＬ−０１９、ＸＬ−１４７、ＸＬ−１８４、ＸＬ−２２８、ＸＬ−２８１、ＸＬ−５１８、ＸＬ−６４７、ＸＬ−７６５、ＸＬ−８２０、ＸＬ−８４４、ＸＬ−８８０、Ｙ−２７６３２、ＺＤ−１８３９、ＺＭ−２５２８６８、ＺＭ−４４７４３９、Ｈ２Ｏ２、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、カンタリジン、（−）−ｐ−ブロモテトラミゾール、ミクロシスチンＬＲ、オルトバナジウム酸ナトリウム、過バナジン酸ナトリウム、硫酸バナジル、ナトリウムオキソジペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）バナデート、ビス（マルトラト）オキソバナジウム（ＩＶ）、モリブデン酸ナトリウム、過モリブデン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、イミダゾール、フッ化ナトリウム、β−グリセロフォスフェート、ピロリン酸ナトリウム十水和物、カリクリンＡ、ディスコデルミア・カリックス（Ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｉａ  ｃａｌｙｘ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ｍｐＶ（ｐｉｃ）、ＤＭＨＶ、シペルメトリン、デフォスタチン、オカダ酸、ＮＩＰＰ−１、Ｎ−（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロ−フェナントレン−２−イル）−２，２−ジメチル−プロピオンアミド、α−ブロモ−４−ヒドロキシアセトフェノン、４−ヒドロキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−メトキシアセトフェノン、４−メトキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−（カルボキシメトキシ）アセトフェノン、４−（カルボキシメトキシ）フェナシルＢｒおよびビス（４−トリフルオロメチルスルホンアミドフェニル）−１，４−ジイソプロピルベンゼン、フェニルアルシンオキシド、ピロリジンジチオカルバメートおよびアルミニウムフルオリドからなる群から選択されるキナーゼまたはホスファターゼ阻害剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記活性化可能成分が、リン酸化または脱リン酸化を受けるタンパク質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質が、ＰＩ３−キナーゼ（ｐ８５、ｐ１１０ａ、ｐ１１０ｂ、ｐ１１０ｄ）、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、ＳＯＣｓ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｃｄｃ４２、Ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｖａｖ、Ｔｉａｍ、Ｓｏｓ、Ｄｂｌ、Ｎｃｋ、Ｇａｂ、ＰＲＫ、ＳＨＰ１およびＳＨＰ２、ＳＨＩＰ１、ＳＨＩＰ２、ｓＳＨＩＰ、ＰＴＥＮ、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ＰＤＫ１、ＳＧＫ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、ＴＳＣ１，２、Ｒｈｅｂ、ｍＴｏｒ、４ＥＢＰ−１、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、Ｓ６、ＬＫＢ−１、ＡＭＰＫ、ＰＦＫ、アセチル−ＣｏＡａカルボキシラーゼ、ＤｏｋＳ、Ｒａｆｓ、Ｍｏｓ、Ｔｐｌ２、ＭＥＫ１／２、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ＭＫＫ３／６、ＭＥＫＫ１、４、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＭＫＫ４／７、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ１、２、３、ｐ３８、Ｅｒｋ１／２、Ｓｙｋ、Ｂｔｋ、ＢＬＮＫ、ＬＡＴ、ＺＡＰ７０、Ｌｃｋ、Ｃｂｌ、ＳＬＰ−７６、ＰＬＣγ１、ＰＬＣγ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ＦＡＫ、ｐ１３０ＣＡＳ、ＰＡＫ、ＬＩＭＫ１／２、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ２７、ＳＭＡＤ、Ｒｅｌ−Ａ（ｐ６５−ＮＦＫＢ）、ＣＲＥＢ、ヒストンＨ２Ｂ、ＨＡＴ、ＨＤＡＣ、ＰＫＲ、Ｒｂ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、Ｐ１６、ｐ１４Ａｒｆ、ｐ２７ＫＩＰ、ｐ２１ＣＩＰ、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ６、Ｃｄｋ７、Ｃｄｋ１、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ９、Ｃｄｃ２５，Ａ／Ｂ／Ｃ、Ａｂｌ、Ｅ２Ｆ、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＲＩＰ、Ｍｙｄ８８、ＢＡＤ、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ＸＬ、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ＰＡＲＰ、ＩＡＰｓ、Ｓｍａｃ、フォドリン、アクチン、Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、ＮＩＫ、ＩκＢ、ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ＩＫＫα、ＰＫＡ、ＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣθ、ＰＫＣδ、ＣＡＭＫ、Ｅｌｋ、ＡＦＴ、Ｍｙｃ、Ｅｇｒ−１、ＮＦＡＴ、ＡＴＦ−２、Ｍｄｍ２、ｐ５３、ＤＮＡ−ＰＫ、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、βカテニン、ＣｒｋＬ、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３βおよびＦＯＸＯからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細胞の持続性シグナル伝達状態を決定する方法であって、
前記細胞をモジュレーターに付すステップと、
前記細胞中の持続性シグナル伝達経路に関与する活性化可能成分の活性化レベルを決定するステップと、
前記活性化レベルから前記細胞における持続性シグナル伝達経路の状態を決定するステップと
を含む方法。
【請求項３１】
個体の疾患を決定するステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記状態が、腫瘍性疾患および／または造血疾患である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記腫瘍性疾患および／または造血疾患が、Ｂ細胞またはＢ細胞系統由来の障害である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
臨床転帰を決定するステップをさらに含み、前記臨床転帰が、腫瘍性疾患および／または造血疾患のステージ分類または類別である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ステージ分類が、侵襲性、緩徐進行型、良性、難治性、ローマ数字ステージ分類、ＴＮＭステージ分類、Ｒａｉステージ分類、Ｂｉｎｅｔステージ分類、ＷＨＯ分類、ＦＡＢ分類、ＩＰＳＳスコア、ＷＰＳＳスコア、限局期、進行期、ＺＡＰ７０およびＣＤ３８などの細胞マーカーによるステージ分類、進行までの時間、無進行生存、全生存および無再発生存に関して知らせ得る情報を含む潜在性からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記活性化可能成分の活性化レベルを、治療に対する個体の応答と相関させるステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記モジュレーターが、キナーゼまたはホスファターゼ阻害剤である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記活性化レベルがリン酸化レベルである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
個体において、ＣＬＬ細胞の活性化状態を、臨床転帰と相関させる、および／または、臨床転帰を用いて分類する方法であって、
前記個体に由来する、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を含む前記ＣＬＬ細胞を、モジュレーターに付すステップと、
複数の活性化可能成分の活性化レベルを決定するステップと、
前記の複数の活性化可能成分の活性化レベルのパターンを同定して、ＢＣＲの近位にあるシグナル伝達における変化の有無を決定し、前記変化の存在が臨床転帰を示すステップと
を含む方法。
【請求項４０】
細胞の集団の表現型プロフィールを決定する方法であって、
別個の培養物中の細胞の集団を複数のモジュレーターに曝露し、モジュレーターの少なくとも１種が阻害剤であるステップと、
前記の別個の培養物の各々に由来する前記細胞集団において活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無を決定するステップと、
前記の別個の培養物の各々に由来する前記活性化可能成分の活性化における変化の有無に基づいて、前記細胞集団を分類するステップと
を含む方法。
【請求項４１】
前記阻害剤が、前期細胞中のシグナル伝達カスケードに関与する、一細胞因子または複数の因子の阻害剤である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記阻害剤が、キナーゼまたはホスファターゼ阻害剤である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記キナーゼまたはホスファターゼ阻害剤が、アダフォスチン、ＡＧ４９０、ＡＧ８２５、ＡＧ９５７、ＡＧ１０２４、アロイシンＡ、アルステルパウロン、アミノゲニステイン、ＡＰＩ−２、アピゲニン、アルクチゲニン、ＡＹ−２２９８９、ＢＡＹ６１−３６０６、ビスインドリルマレイミドＩＸ、チェレリスリン、１０−［４’−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル］−２−クロロフェノキサジンヒドロクロリド、ダサチニブ、２−ジメチルアミノ−４，５，６，７−テトラブロモ−１Ｈ−ベンズイミダゾール、５，７−ジメトキシ−３−（４−ピリジニル）キノリンジヒドロクロリド、エデルホシン、エラグ酸、エンザスタウリン、マレイン酸ＥＲ２７３１９、エルロチニブ、ＥＴ１８ＯＣＨ３、ファスジル、フラボピリドール、ゲフィチニブ、ＧＷ５０７４、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−８９、ＨＡ−１００、ＨＡ−１００４、ＨＡ−１０７７、ＨＡ−１１００、ヒドロキシファスジル、インジルビン−３’−オキシム、５−ヨードツベルシジン、ケンパウロン、ＫＮ−６２、ＫＹ１２４２０、ＬＦＭ−Ａ１３、ラベンダスチンＡ、ルテオリン、ＬＹ−２９４００２、ＬＹ２９４００２、マロトキシン、ＭＬ−９、ＮＳＣ−１５４０２０、ＮＳＣ−２２６０８０、ＮＳＣ−２３１６３４、ＮＳＣ−６６４７０４、ＮＳＣ−６８０４１０、ＮＵ６１０２、オロモウシン、オキシインドールＩ、ＰＤ−１５３０３５、ＰＤ−９８０５９、ＰＤ１６９３１６、フロレチン、フロリジン、ピセタノール、ピクロポドフィリン、ＰＫＩ、ＰＰ１、ＰＰ２、プルバラノールＡ、ケルセチン、Ｒ４０６、Ｒ７８８、ラパミューン、ラパマイシン、Ｒｏ３１−８２２０、ロスコビチン、ロットレリン、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、シロリムス、ソラフェニブ、ＳＬ３２７、ＳＰ６００１２５、スタウロスポリン、ＳＴＩ−５７１、ＳＵ−１１２７４、ＳＵ１４９８、ＳＵ４３１２、ＳＵ６６５６、４，５，６，７−テトラブロモトリアゾール、ＴＧ１０１３４８、トリシリビン、チロホスチンＡＧ４９０、チロホスチンＡＧ８２５、チロホスチンＡＧ９５７、チロホスチンＡＧ１０２４、チロホスチンＳＵ１４９８、Ｕ０１２６、ＶＸ−５０９、ＶＸ−６６７、ＶＸ−６８０、Ｗ−７、ワートマニン、ＸＬ−０１９、ＸＬ−１４７、ＸＬ−１８４、ＸＬ−２２８、ＸＬ−２８１、ＸＬ−５１８、ＸＬ−６４７、ＸＬ−７６５、ＸＬ−８２０、ＸＬ−８４４、ＸＬ−８８０、Ｙ−２７６３２、ＺＤ−１８３９、ＺＭ−２５２８６８、ＺＭ−４４７４３９、Ｈ２Ｏ２、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、カンタリジン、（−）−ｐ−ブロモテトラミゾール、ミクロシスチンＬＲ、オルトバナジウム酸ナトリウム、過バナジン酸ナトリウム、硫酸バナジル、ナトリウムオキソジペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）バナデート、ビス（マルトラト）オキソバナジウム（ＩＶ）、モリブデン酸ナトリウム、ナトリウム過モリブデン酸、酒石酸ナトリウム、イミダゾール、フッ化ナトリウム、β−グリセロフォスフェート、ピロリン酸ナトリウム十水和物、カリクリンＡ、ディスコデルミア・カリックス（Ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｉａ  ｃａｌｙｘ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ｍｐＶ（ｐｉｃ）、ＤＭＨＶ、シペルメトリン、デフォスタチン、オカダ酸、Ｎ��ＰＰ−１、Ｎ−（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロ−フェナントレン−２−イル）−２，２−ジメチル−プロピオンアミド、α−ブロモ−４−ヒドロキシアセトフェノン、４−ヒドロキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−メトキシアセトフェノン、４−メトキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−（カルボキシメトキシ）アセトフェノン、４−（カルボキシメトキシ）フェナシルＢｒおよびビス（４−トリフルオロメチルスルホンアミドフェニル）−１，４−ジイソプロピルベンゼン、フェニルアルシンオキシド、ピロリジンジチオカルバメートおよびアルミニウムフルオリドからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記モジュレーターが、アクチベーターまたは阻害剤である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記活性化可能成分が、リン酸化または脱リン酸化を受けるタンパク質である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記タンパク質が、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ１，２，３、ｐ３８ｓ、Ｅｒｋ１／２、Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０、Ｂｔｋ、ＢＬＮＫ、Ｌｃｋ、ＰＬＣγ１、ＰＬＣγ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ＣＲＥＢ、Ｌｙｎ、ｐ−Ｓ６、Ｃｂｌ、ＮＦ−κＢ、ＧＳＫ３β、ＣＡＲＭＡ／Ｂｃｌ１０およびＴｃｌ−１からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
細胞集団を分類する方法であって、
前記細胞集団を、少なくとも１種のモジュレーターと接触させ、モジュレーターが、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ、リツキサン、アレムツズマブ、抗ＣＤ２２（エピラツズマブ）、抗ＣＤ２３（ルミリキシマブ）、キャンパス、Ｈ２Ｏ２、ＰＭＡ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＤＦ１ａ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＧＦ−１、イミキモド、ポリＣｐＧ、フルダラビン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ＩＬ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、タプシガーギンまたはそれらの組合せであるステップと、
前記細胞集団において、活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無を決定するステップと、
前記活性化可能成分の活性化の変化の有無に基づいて、前記細胞集団を分類するステップと
を含む方法。
【請求項４８】
前記活性化可能成分が、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ１，２，３、ｐ３８ｓ、Ｅｒｋ１／２、Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０、Ｂｔｋ、ＢＬＮＫ、Ｌｃｋ、ＰＬＣγ、ＰＬＣ１γ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ＣＲＥＢ、Ｌｙｎ、ｐ−Ｓ６、Ｃｂｌ、ＮＦ−κＢ、ＧＳＫ３β、ＣＡＲＭＡ／Ｂｃｌ１０およびＴｃｌ−１からなる群から選択されるタンパク質である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記分類が、前記細胞集団を、臨床転帰と相関している細胞集団として分類するステップを含む請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記臨床転帰が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂリンパ球系統白血病、Ｂリンパ球系統リンパ腫、多発性骨髄腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、前駆細胞Ｂリンパ芽球性白血病、ヘアリーセル白血病および形質細胞障害からなる群から選択される、Ｂ細胞またはＢ細胞系統由来の障害の有無である、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年８月２１日に出願された米国特許出願第６０／９５７，１６０号および２００８年４月２９日に出願された米国特許出願第６１／０４８，９２０号の出願日の利益を主張し、これらの仮出願の各々は、参照によってその全文が本明細書に明確に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
多数の疾患は、例えば、細胞過程の異常な制御または細胞の制御されない成長および増殖につながる細胞経路の混乱を特徴とする。これらの混乱は、細胞経路に関与している分子の活性の変化によって引き起こされることが多い。例えば、多数の癌について、特定のシグナル伝達経路変化が記載されている。細胞経路の混乱が有害な形質転換を媒介するという証拠が増えているにもかかわらず、これらの形質転換の根底にある正確な分子事象は解明されていない。結果として、あまり理解されていない細胞経路が関与する疾患の治療において治療学が有効でない場合がある。したがって、疾患の診断および療法の使用の成功には、疾患の病理の原因である細胞事象の知識が必要となる。
【０００３】
さらに、異なる疾患を患う患者は、不均一な臨床経過をたどる。例えば、癌患者において、１種の治療経過の後に生じるものでさえ、寛解の間で著しい臨床変動性も観察される。白血病患者の中には、根治治療を行わなくても長期間生存するものもあり、積極的治療にもかかわらず急速に死亡するものもある。治療に抵抗性である患者には、何時、抵抗性が生じるかにかかわらず、極めて短い生存時間しかない。この臨床的不均一性に対応するために、種々のステージ分類システムが開発されているが、それらは、初期または中期のステージの患者が、緩徐進行型の疾患の経過をたどるか、侵襲性の疾患の経過をたどるかを正確に予測することはできない。
【０００４】
したがって、臨床医が、治療に応答する患者、疾患のより進行した状態に進む患者および治療に対する耐性が出現する患者を同定するのに役立つ、個々の予測される疾患経過の信頼性のある指標が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本明細書に記載される方法および組成物のその他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかし、当業者には、この詳細な説明から本発明の趣旨および範囲内の種々の変法および改変が明らかとなるので、詳細な説明および特定の実施例は、特定の実施形態を示すものの、単に例示として示されるということは理解されなければならない。
【０００６】
本明細書に記載されるすべての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が明確に、個々に参照により組み込まれると示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００７】
方法が、細胞を分類する方法であって、細胞を阻害剤と接触させるステップと、細胞中の活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無を決定するステップと、活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無に基づいて、細胞を分類するステップとを含む方法が、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、活性化可能成分の活性化レベルの変化は、活性化可能成分の活性化レベルの増大である。いくつかの実施形態では、活性化可能成分は、リン酸化または脱リン酸化を受けるタンパク質である。
【０００８】
方法のいくつかの実施形態では、本発明は、細胞を阻害剤と接触させ、細胞中の複数の活性化可能成分の活性化レベルを決定し、活性化レベルに基づいて細胞を分類することによって細胞を分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、阻害剤は、キナーゼまたはホスファターゼ阻害剤、例えば、アダフォスチン、ＡＧ４９０、ＡＧ８２５、ＡＧ９５７、ＡＧ１０２４、アロイシン（ａｌｏｉｓｉｎｅ）、アロイシンＡ、アルステルパウロン（ａｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ）、アミノゲニステイン（ａｍｉｎｏｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、ＡＰＩ−２、アピゲニン、アルクチゲニン（ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ）、ＡＹ−２２９８９、ＢＡＹ６１−３６０６、ビスインドリルマレイミドＩＸ、チェレリスリン、１０−［４’−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル］−２−クロロフェノキサジン  ヒドロクロリド、ダサチニブ、２−ジメチルアミノ−４，５，６，７−テトラブロモ−１Ｈ−ベンズイミダゾール、５，７−ジメトキシ−３−（４−ピリジニル）キノリンジヒドロクロリド、エデルホシン（ｅｄｅｌｆｏｓｉｎｅ）、エラグ酸、エンザスタウリン、マレイン酸ＥＲ２７３１９、エルロチニブ、ＥＴ１８ＯＣＨ３、ファスジル、フラボピリドール、ゲフィチニブ、ＧＷ  ５０７４、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−８９、ＨＡ−１００、ＨＡ−１００４、ＨＡ−１０７７、ＨＡ−１１００、ヒドロキシファスジル、インジルビン−３’−オキシム、５−ヨードツベルシジン、ケンパウロン（ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＫＮ−６２、ＫＹ１２４２０、ＬＦＭ−Ａ１３、ラベンダスチンＡ、ルテオリン、ＬＹ−２９４００２、ＬＹ２９４００２、マロトキシン（ｍａｌｌｏｔｏｘｉｎ）、ＭＬ−９、ＮＳＣ−１５４０２０、ＮＳＣ−２２６０８０、ＮＳＣ−２３１６３４、ＮＳＣ−６６４７０４、ＮＳＣ−６８０４１０、ＮＵ６１０２、オロモウシン、オキシインドールＩ、ＰＤ−１５３０３５、ＰＤ−９８０５９、ＰＤ−１６９３１６、フロレチン、フロリジン、ピセタノール、ピクロポドフィリン（ｐｉｃｒｏｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎ）、ＰＫＩ、ＰＰ１、ＰＰ２、プルバラノールＡ、ケルセチン、Ｒ４０６、Ｒ７８８、ラパミューン、ラパマイシン、Ｒｏ３１−８２２０、ロスコビチン、ロットレリン、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、シロリムス、ソラフェニブ、ＳＬ３２７、ＳＰ６００１２５、スタウロスポリン、ＳＴＩ−５７１、ＳＵ−１１２７４、ＳＵ１４９８、ＳＵ４３１２、ＳＵ６６５６、４，５，６，７−テトラブロモトリアゾール、ＴＧ１０１３４８、トリシリビン、チロホスチンＡＧ４９０、チロホスチンＡＧ８２５、チロホスチンＡＧ９５７、チロホスチンＡＧ１０２４、チロホスチンＳＵ１４９８、Ｕ０１２６、ＶＸ−５０９、ＶＸ−６６７、ＶＸ−６８０、Ｗ−７、ワートマニン、ＸＬ−０１９、ＸＬ−１４７、ＸＬ−１８４、ＸＬ−２２８、ＸＬ−２８１、ＸＬ−５１８、ＸＬ−６４７、ＸＬ−７６５、ＸＬ−８２０、ＸＬ−８４４、ＸＬ−８８０、Ｙ−２７６３２、ＺＤ−１８３９、ＺＭ−２５２８６８、ＺＭ−４４７４３９、Ｈ２Ｏ２、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、カンタリジン、（−）−ｐ−ブロモテトラミゾール、ミクロシスチンＬＲ、オルトバナジウム酸ナトリウム、過バナジン酸ナトリ��ム、硫酸バナジル、ナトリウムオキソジペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）バナデート、ビス（マルトラト）オキソバナジウム（ＩＶ）、モリブデン酸ナトリウム、過モリブデン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｅｒｍ  ｏｌｙｂｄａｔｅ）、酒石酸ナトリウム、イミダゾール、フッ化ナトリウム、β−グリセロフォスフェート、ピロリン酸ナトリウム十水和物、カリクリンＡ、ディスコデルミア・カリックス（Ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｉａ  ｃａｌｙｘ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ｍｐＶ（ｐｉｃ）、ＤＭＨＶ、シペルメトリン、デフォスタチン、オカダ酸、ＮＩＰＰ−１、Ｎ−（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロ−フェナントレン−２−イル）−２，２−ジメチル−プロピオンアミド、α−ブロモ−４−ヒドロキシアセトフェノン、４−ヒドロキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−メトキシアセトフェノン、４−メトキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−（カルボキシメトキシ）アセトフェノン、４−（カルボキシメトキシ）フェナシルＢｒおよびビス（４−トリフルオロメチルスルホンアミドフェニル）−１，４−ジイソプロピルベンゼン、フェニルアルシンオキシド、ピロリジンジチオカルバメートまたはアルミニウムフルオリドである。いくつかの実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は、Ｈ２Ｏ２である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、細胞は、造血由来細胞である。いくつかの実施形態では、造血由来細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌ）は、多能性造血幹細胞、Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞、Ｔリンパ球系統前駆細胞または由来細胞、ＮＫ細胞系統前駆細胞または由来細胞、顆粒球系統前駆細胞または由来細胞、単球系統前駆細胞または由来細胞、巨核球系統前駆細胞または由来細胞および赤血球系統前駆細胞または由来細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、造血由来細胞は、Ｂリンパ球系統前駆細胞およびＢリンパ球由来細胞、例えば、初期プロＢ細胞、後期プロＢ細胞、大型プレＢ細胞、小型プレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、形質細胞および記憶Ｂ細胞、ＣＤ５＋Ｂ細胞、ＣＤ３８＋Ｂ細胞、Ｂ細胞受容体の変異したもしくは変異していない重鎖を有するＢ細胞またはＺａｐ７０を発現するＢ細胞である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、分類は、臨床転帰と相関している細胞として細胞を分類することを含む。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、疾患の予後および／または診断である。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性疾患または造血疾患、例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンまたはその他のリンパ種、急性または慢性白血病、赤血球増加症、血小板血症、多発性骨髄腫または形質細胞障害、例えば、アミロイドーシスおよびワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨髄異形成障害、骨髄増殖性障害、骨髄線維症または非定型免疫性リンパ球増殖の有無である。いくつかの実施形態では、腫瘍性または造血疾患は、非Ｂ系統由来のもの、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非Ｂ細胞リンパ腫、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患、骨髄線維症、赤血球増加症、血小板血症または非Ｂ非定型免疫性リンパ球増殖である。いくつかの実施形態では、腫瘍性または造血疾患は、Ｂ細胞またはＢ細胞系統由来障害、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂリンパ球系統白血病、Ｂリンパ球系統リンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、前駆細胞Ｂリンパ芽球性白血病、ヘアリーセル白血病または形質細胞障害、例えば、アミロイドーシスまたはワルデンシュトレームマクログロブリン血症、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、それだけには限らないが、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ球性リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、疾患はＣＬＬである。いくつかの実施形態では、ＣＬＬは、ＣＤ１９およびＣＤ２３とともにＣＤ５を、またはＣＤ２０およびＣＤ２３とともにＣＤ５を同時発現するモノクローナルＢ細胞集団によって、ならびに表面免疫グロブリン発現によって定義される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性または造血疾患のステージ分類または類別である。本発明によって提供される方法におけるステージ分類の例として、侵襲性、緩徐進行型、良性、難治性、ローマ数字ステージ分類、ＴＮＭステージ分類、Ｒａｉステージ分類、Ｂｉｎｅｔステージ分類、ＷＨＯ分類、ＦＡＢ分類、ＩＰＳＳスコア、ＷＰＳＳスコア、限局期、進行期、ＺＡＰ７０およびＣＤ３８などの細胞マーカーによるステージ分類、潜在性、例えば、進行までの時間、無進行生存、全生存または無再発生存に関して情報を提供し得る情報が挙げられる。
【００１２】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、活性化可能成分の活性化レベルに基づいて細胞を分類することは、細胞を、治療に対する患者の応答、例えば、完全応答、部分応答、結節性部分応答、応答なし、進行性疾患、安定疾患、再発または有害反応と相関している細胞として分類することを含む。方法は、治療方法、例えば、化学療法、生物療法、放射線療法、骨髄移植、末梢幹細胞移植、臍帯血移植、自家幹細胞移植、同種異系幹細胞移植、同系幹細胞移植、手術、導入療法、維持療法、待機療法またはホリスティック療法／代替療法の決定をさらに含み得る。
【００１３】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、活性化レベルに基づく細胞の分類は、細胞を、最小残存病変または耐性の出現と相関している細胞として分類することを含む。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態では、細胞中の複数の活性化可能成分の活性化レベルは、細胞外または細胞内プロテアーゼ曝露による切断、新規ヘテロ−オリゴマー形成、グリコシル化レベル、リン酸化レベル、アセチル化レベル、メチル化レベル、ビオチン化レベル、グルタミル化レベル、グリシル化レベル、水酸化レベル、異性化レベル、プレニル化レベル、ミリストイル化レベル、リポイル化レベル、ホスホパンテテイン化レベル、硫酸化レベル、ＩＳＧ化レベル、ニトロシル化レベル、パルミトイル化レベル、ＳＵＭＯ化レベル、ユビキチン化レベル、ＮＥＤＤ８化レベル、シトルリン化レベル、脱アミド化レベル、ジスルフィド結合形成レベル、タンパク質分解切断レベル、転位レベル、タンパク質代謝回転における変化、多タンパク質複合体レベル、酸化レベル、多脂質複合体および細胞膜における生化学的変化からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、活性化レベルはリン酸化レベルである。いくつかの実施形態では、活性化可能成分は、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸および代謝産物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、活性化可能成分は、タンパク質である。いくつかの実施形態では、活性化可能成分は、代謝状態、温度または局所イオン濃度の変化である。活性化可能成分がタンパク質である実施形態では、いくつかの実施形態では、タンパク質は、リン酸化または脱リン酸化を受けるタンパク質、例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、アダプター／スキャフォールドタンパク質、ユビキチン化酵素、接着分子、収縮タンパク質、細胞骨格タンパク質、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、低分子量ＧＴＰアーゼ、グアニンヌクレオチド交換因子、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質、カスパーゼおよびアポトーシスに関与しているタンパク質（例えば、ＰＡＲＰ）、イオンチャンネル、分子輸送体、分子シャペロン、代謝酵素、小胞輸送タンパク質、ヒドロキシラーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、脱アセチル化酵素、メチル化酵素、脱メチル化酵素、プロテアーゼ、エステラーゼ、加水分解酵素、ＤＮＡ結合タンパク質または転写因子である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＰＩ３−キナーゼ（ｐ８５、ｐ１１０ａ、ｐ１１０ｂ、ｐ１１０ｄ）、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、ＳＯＣｓ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｃｄｃ４２、Ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｖａｖ、Ｔｉａｍ、Ｓｏｓ、Ｄｂｌ、Ｎｃｋ、Ｇａｂ、ＰＲＫ、ＳＨＰ１、およびＳＨＰ２、ＳＨＩＰ１、ＳＨＩＰ２、ｓＳＨＩＰ、ＰＴＥＮ、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ＰＤＫ１、ＳＧＫ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、ＴＳＣ１，２、Ｒｈｅｂ、ｍＴｏｒ、４ＥＢＰ−１、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、Ｓ６、ＬＫＢ−１、ＡＭＰＫ、ＰＦＫ、アセチル−ＣｏＡａカルボキシラーゼ、ＤｏｋＳ、Ｒａｆｓ、Ｍｏｓ、Ｔｐｌ２、ＭＥＫ１／２、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ＭＫＫ３／６、ＭＥＫＫ１，４、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＭＫＫ４／７、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ１，２，３、ｐ３８ｓ、Ｅｒｋ１／２、Ｓｙｋ、Ｂｔｋ、ＢＬＮＫ、ＬＡＴ、ＺＡＰ７０、Ｌｃｋ、Ｃｂｌ、ＳＬＰ−７６、ＰＬＣγ１、ＰＬＣγ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ＦＡＫ、ｐ１３０ＣＡＳ、ＰＡＫｓ、ＬＩＭＫ１／２、Ｈｓｐ９０、Ｈｓ��７０、Ｈｓｐ２７、ＳＭＡＤｓ、Ｒｅｌ−Ａ（ｐ６５−ＮＦＫＢ）、ＣＲＥＢ、ヒストンＨ２Ｂ、ＨＡＴｓ、ＨＤＡＣｓ、ＰＫＲ、Ｒｂ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、Ｐ１６、ｐ１４Ａｒｆ、ｐ２７ＫＩＰ、ｐ２１ＣＩＰ、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ６、Ｃｄｋ７、Ｃｄｋ１、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ９、Ｃｄｃ２５，Ａ／Ｂ／Ｃ、Ａｂｌ、Ｅ２Ｆ、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＲＩＰ、Ｍｙｄ８８、ＢＡＤ、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ＸＬ、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ＰＡＲＰ、ＩＡＰｓ、Ｓｍａｃ、フォドリン、アクチン、Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、ＮＩＫ、ＩκＢ、ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ＩＫＫα、ＰＫＡ、ＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣθ、ＰＫＣδ、ＣＡＭＫ、Ｅｌｋ、ＡＦＴ、Ｍｙｃ、Ｅｇｒ−１、ＮＦＡＴ、ＡＴＦ−２、Ｍｄｍ２、ｐ５３、ＤＮＡ−ＰＫ、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、βカテニン、ＣｒｋＬ、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３βおよびＦＯＸＯからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、Ｅｒｋ、Ｓｙｋ、Ｚａｐ７０、Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、ＢＬＮＫ、Ｃｂｌ、ＰＬＣγ２、Ａｋｔ、ＲｅｌＡ、ｐ３８、Ｓ６からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、Ｓ６である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＨＥＲ受容体、ＰＤＧＦ受容体、Ｋｉｔ受容体、ＦＧＦ受容体、Ｅｐｈ受容体、Ｔｒｋ受容体、ＩＧＦ受容体、インスリン受容体、Ｍｅｔ受容体、Ｒｅｔ、ＶＥＧＦ受容体、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＦＡＫ、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、Ｊａｋ３、Ｔｙｋ２、Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｆｇｒ、Ｙｅｓ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｂｔｋ、ＺＡＰ７０、Ｓｙｋ、ＩＲＡＫｓ、ｃＲａｆ、ＡＲａｆ、ＢＲＡＦ、Ｍｏｓ、Ｌｉｍキナーゼ、ＩＬＫ、Ｔｐｌ、ＡＬＫ、ＴＧＦβ受容体、ＢＭＰ受容体、ＭＥＫＫ、ＡＳＫ、ＭＬＫ、ＤＬＫ、ＰＡＫ、Ｍｅｋ１、Ｍｅｋ２、ＭＫＫ３／６、ＭＫＫ４／７、ＡＳＫ１、Ｃｏｔ、ＮＩＫ、Ｂｕｂ、Ｍｙｔ１、Ｗｅｅ１、カゼインキナーゼ、ＰＤＫ１、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、ｐ９０Ｒｓｋｓ、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、Ｐｒｋ、ＰＫＣ、ＰＫＡ、ＲＯＣＫ１、ＲＯＣＫ２、オーロラ、ＣａＭＫ、ＭＮＫ、ＡＭＰＫ、ＭＥＬＫ、ＭＡＲＫ、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＬＫＢ−１、ＭＡＰＫＡＰＫ、Ｐｉｍ１、Ｐｉｍ２、Ｐｉｍ３、ＩＫＫ、Ｃｄｋ、Ｊｎｋ、Ｅｒｋ、ＩＫＫ、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、Ｃｄｋ、ＣＬＫ、ＰＫＲ、ＰＩ３−キナーゼクラス１、クラス２、クラス３、ｍＴｏｒ、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ１，２，３、ｐ３８、ＰＫＲ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）、ＬＡＲホスファターゼ、ＣＤ４５、非受容体チロシンホスファターゼ（ＮＰＲＴＰ）、ＳＨＰ、ＭＡＰキナーゼホスファターゼ（ＭＫＰ）、二重特異性ホスファターゼ（ＤＵＳＰ）、ＣＤＣ２５ホスファターゼ、低分子量チロシンホスファターゼ、Ｅｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔ（ＥＹＡ）チロシンホスファターゼ、Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔホスファターゼ（ＳＳＨ）、セリンホスファターゼ、ＰＰ２Ａ、ＰＰ２Ｂ、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ１、ＰＰ５、イノシトールホスファターゼ、ＰＴＥＮ、ＳＨＩＰ、ミオチューブラリン、ホスホイノシチドキナーゼ、ホスホリパーゼ、プロスタグランジンシンターゼ、５−リポキシゲナーゼ、スフィンゴシンキナーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、アダプター／スキャフォールドタンパク質、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ＢＬＮＫ、ＬＡＴ、ＰＩ３−キナーゼのＢ細胞アダプター（ＢＣＡＰ）、ＳＬＡＰ、Ｄｏｋ、ＫＳＲ、ＭｙＤ８８、Ｃｒｋ、ＣｒｋＬ、ＧＡＤ、Ｎｃｋ、Ｇｒｂ２関連バインダー（ＧＡＢ）、Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＲＩＰ、Ｔ細胞白血病ファミリー、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−６、インターフェロンγ、インターフェロンα、サイトカインシグナル伝達の抑制因子（ＳＯＣ）、Ｃｂｌ、ＳＣＦユビキチン化リガーゼ複合体、ＡＰＣ／Ｃ、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン様接着分子、セレクチン、カドヘリン、カテニン、接着斑キナーゼ、ｐ１３０ＣＡＳ、フォドリン、アクチン、パキシリン、ミオシン、ミオシン結合タンパク質、チューブリン、ｅｇ５／ＫＳＰ、ＣＥＮＰ、β−アドレナリン受容体、ムスカリン性受容体、アデニニルシクラーゼ受容体、低分子量ＧＴＰアーゼ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｒａｎ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｃｄｃ４２、Ａｒｆｓ、ＲＡＢ、ＲＨＥＢ、Ｖａｖ、Ｔｉａｍ、���ｏｓ、Ｄｂｌ、ＰＲＫ、ＴＳＣ１，２、Ｒａｓ−ＧＡＰ、Ａｒｆ−ＧＡＰ、Ｒｈｏ−ＧＡＰ、カスパーゼ、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ＰＡＲＰ、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ａ１、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂｉｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｂｍｆ、Ｈｒｋ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＩＡＰｓ、ＸＩＡＰ、Ｓｍａｃ、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ６、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ１、Ｃｄｋ７、サイクリンＤ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、Ｒｂ、ｐ１６、ｐ１４Ａｒｆ、ｐ２７ＫＩＰ、ｐ２１ＣＩＰ、分子シャペロン、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ２７、代謝酵素、アセチル−ＣｏＡａカルボキシラーゼ、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、一酸化窒素合成酵素、カベオリン、エンドソーム輸送選別複合体（ＥＳＣＲＴ）タンパク質、小胞タンパク質選別（Ｖｓｐ）、ヒドロキシラーゼ、プロリル−ヒドロキシラーゼＰＨＤ−１、２および３、アスパラギンヒドロキシラーゼＦＩＨトランスフェラーゼ、Ｐｉｎ１プロリルイソメラーゼ、トポイソメラーゼ、脱アセチル化酵素、ヒストン脱アセチル化酵素、サーチュイン、ヒストンアセチル化酵素、ＣＢＰ／Ｐ３００ファミリー、ＭＹＳＴファミリー、ＡＴＦ２、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンＨ３Ｋ４脱メチル化酵素、Ｈ３Ｋ２７、ＪＨＤＭ２Ａ、ＵＴＸ、ＶＨＬ、ＷＴ−１、ｐ５３、Ｈｄｍ、ＰＴＥＮ、ユビキチンプロテアーゼ、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）およびｕＰＡ受容体（ｕＰＡＲ）システム、カテプシン、メタロプロテイナーゼ、エステラーゼ、加水分解酵素、セパラーゼ、カリウムチャネル、ナトリウムチャネル、多剤耐性タンパク質、Ｐ−糖タンパク質、ヌクレオシド輸送体、Ｅｔｓ、Ｅｌｋ、ＳＭＡＤ、Ｒｅｌ−Ａ（ｐ６５−ＮＦＫＢ）、ＣＲＥＢ、ＮＦＡＴ、ＡＴＦ−２、ＡＦＴ、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ、Ｓｐ１、Ｅｇｒ−１、Ｔ−ｂｅｔ、β−カテニン、ＨＩＦ、ＦＯＸＯ、Ｅ２Ｆ、ＳＲＦ、ＴＣＦ、Ｅｇｒ−１、β−カテニン、ＦＯＸＯ  ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ｐ５３、ＷＴ−１、ＨＭＧＡ、ｐＳ６、４ＥＰＢ−１、ｅＩＦ４Ｅ−結合タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼ、阻害因子、延長因子からなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、個体に由来する細胞を、モジュレーターまたは阻害剤に付すステップと、細胞中の活性化可能成分の活性化レベルを測定するステップと、活性化レベルに基づいて疾患の有無を決定するステップとによって、個体における疾患の有無を決定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は造血由来細胞である。いくつかの実施形態では、造血由来細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌ）は、多能性造血幹細胞、Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞、Ｔリンパ球系統前駆細胞または由来細胞、ＮＫ細胞系統前駆細胞または由来細胞、顆粒球系統前駆細胞または由来細胞、単球系統前駆細胞または由来細胞、巨核球系統前駆細胞または由来細胞および赤血球系統前駆細胞または由来細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、造血由来細胞は、Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞、例えば、初期プロＢ細胞、後期プロＢ細胞、大型プレＢ細胞、小型プレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、形質細胞および記憶Ｂ細胞、ＣＤ５＋Ｂ細胞、ＣＤ３８＋Ｂ細胞、Ｂ細胞受容体の変異したもしくは変異していない重鎖を有するＢ細胞またはＺａｐ７０を発現するＢ細胞である。いくつかの実施形態では、疾患は、腫瘍性疾患または造血疾患である。
【００１７】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、細胞が付されるモジュレーターは、アクチベーターまたは阻害剤である。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、例えば、増殖因子、サイトカイン、接着分子モジュレーター、ホルモン、小分子、ポリヌクレオチド、抗体、天然化合物、ラクトン、化学療法薬、免疫モジュレーター、炭水化物、プロテアーゼ、イオン、反応性酸素種または放射線照射である。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、Ｂ細胞受容体モジュレーター、例えば、Ｂ細胞受容体複合体またはＢ細胞共受容体複合体のクロスリンカーなどのＢ細胞受容体アクチベーターである。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、抗体または分子結合実体である。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、多価抗体などの抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、固体表面との結合によってより多価にされた、またはエピトープ結合ドメインの局所結合価を増大するようナノ粒子表面に繋ぎ止められた、一価、二価または多価抗体である。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、分子結合実体、例えば、炭水化物または複合体中のエピトープを介してＢ細胞受容体複合体に作用または結合する実体である。いくつかの実施形態では、分子結合実体は、固体表面との結合によってより多価にされた、またはエピトープ結合ドメインの局所結合価を増大するようナノ粒子表面に繋ぎ止められた、一価、二価または多価結合実体である。モジュレーターが、Ｂ細胞受容体モジュレーター、例えば、Ｂ細胞受容体複合体またはＢ細胞共受容体複合体のクロスリンカーなどのＢ細胞受容体アクチベーターであるいくつかの実施形態では、クロスリンクすることは、抗体または分子結合実体と細胞を結合させること、次いで、抗体または分子結合実体によるＢＣＲ複合体のクロスリンクを引き起こす、細胞と固体表面の相互作用によってそのクロスリンクを引き起こすことを含む。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ポリクローナルＢＣＲ抗体、モノクローナルＢＣＲ抗体、Ｆｃ受容体由来結合成分からなる群から選択される。Ｉｇは、マウス、ヤギ、ウサギ、ブタ、ラット、ウマ、ウシ、サメ、ニワトリまたはラマからなる群から選択される種に由来するものであり得る。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭ、ポリクローナルＩｇＭ抗体、モノクローナルＩｇＭ抗体、ビオチン化Ｆ（ａｂ）２ＩｇＣＭ、ビオチン化ポリクローナルＩｇＭ抗体、ビオチン化モノクローナルＩｇＭ抗体および／またはそれらの組合せである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、阻害剤は、キナーゼまたはホスファターゼ阻害剤、例えば、アダフォスチン、ＡＧ４９０、ＡＧ８２５、ＡＧ９５７、ＡＧ１０２４、アロイシン、アロイシンＡ、アルステルパウロン、アミノゲニステイン、ＡＰＩ−２、アピゲニン、アルクチゲニン、ＡＹ−２２９８９、ＢＡＹ６１−３６０６、ビスインドリルマレイミドＩＸ、チェレリスリン、１０−［４’−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル］−２−クロロフェノキサジンヒドロクロリド、ダサチニブ、２−ジメチルアミノ−４，５，６，７−テトラブロモ−１Ｈ−ベンズイミダゾール、５，７−ジメトキシ−３−（４−ピリジニル）キノリンジヒドロクロリド、エデルホシン、エラグ酸、エンザスタウリン、ＥＲ２７３１９マレイン酸塩、エルロチニブ、ＥＴ１８ＯＣＨ３、ファスジル、フラボピリドール、ゲフィチニブ、ＧＷ５０７４、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−８９、ＨＡ−１００、ＨＡ−１００４、ＨＡ−１０７７、ＨＡ−１１００、ヒドロキシファスジル、インジルビン−３’−オキシム、５−ヨードツベルシジン、ケンパウロン、ＫＮ−６２、ＫＹ１２４２０、ＬＦＭ−Ａ１３、ラベンダスチンＡ、ルテオリン、ＬＹ−２９４００２、ＬＹ２９４００２、マロトキシン、ＭＬ−９、ＮＳＣ−１５４０２０、ＮＳＣ−２２６０８０、ＮＳＣ−２３１６３４、ＮＳＣ−６６４７０４、ＮＳＣ−６８０４１０、ＮＵ６１０２、オロモウシン、オキシインドールＩ、ＰＤ−１５３０３５、ＰＤ−９８０５９、ＰＤ−１６９３１６、フロレチン、フロリジン、ピセタノール、ピクロポドフィリン、ＰＫＩ、ＰＰ１、ＰＰ２、プルバラノールＡ、ケルセチン、Ｒ４０６、Ｒ７８８、ラパミューン、ラパマイシン、Ｒｏ３１−８２２０、ロスコビチン、ロットレリン、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、シロリムス、ソラフェニブ、ＳＬ３２７、ＳＰ６００１２５、スタウロスポリン、ＳＴＩ−５７１、ＳＵ−１１２７４、ＳＵ１４９８、ＳＵ４３１２、ＳＵ６６５６、４，５，６，７−テトラブロモトリアゾール、ＴＧ１０１３４８、トリシリビン、チロホスチンＡＧ４９０、チロホスチンＡＧ８２５、チロホスチンＡＧ９５７、チロホスチンＡＧ１０２４、チロホスチンＳＵ１４９８、Ｕ０１２６、ＶＸ−５０９、ＶＸ−６６７、ＶＸ−６８０、Ｗ−７、ワートマニン、ＸＬ−０１９、ＸＬ−１４７、ＸＬ−１８４、ＸＬ−２２８、ＸＬ−２８１、ＸＬ−５１８、ＸＬ−６４７、ＸＬ−７６５、ＸＬ−８２０、ＸＬ−８４４、ＸＬ−８８０、Ｙ−２７６３２、ＺＤ−１８３９、ＺＭ−２５２８６８、ＺＭ−４４７４３９、Ｈ２Ｏ２、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、カンタリジン、（−）−ｐ−ブロモテトラミゾール、ミクロシスチンＬＲ、オルトバナジウム酸ナトリウム、過バナジン酸ナトリウム、硫酸バナジル、ナトリウムオキソジペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）バナデート、ビス（マルトラト）オキソバナジウム（ＩＶ）、モリブデン酸ナトリウム、過モリブデン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、イミダゾール、フッ化ナトリウム、β−グリセロフォスフェート、ピロリン酸ナトリウム十水和物、カリクリンＡ、ディスコデルミア・カリックス（Ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｉａ  ｃａｌｙｘ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ｍｐＶ（ｐｉｃ）、Ｄ��ＨＶ、シペルメトリン、デフォスタチン、オカダ酸、ＮＩＰＰ−１、Ｎ−（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロ−フェナントレン−２−イル）−２，２−ジメチル−プロピオンアミド、α−ブロモ−４−ヒドロキシアセトフェノン、４−ヒドロキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−メトキシアセトフェノン、４−メトキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−（カルボキシメトキシ）アセトフェノン、４−（カルボキシメトキシ）フェナシルＢｒおよびビス（４−トリフルオロメチルスルホンアミドフェニル）−１，４−ジイソプロピルベンゼン、フェニルアルシンオキシド、ピロリジンジチオカルバメートまたはアルミニウムフルオリドである。いくつかの実施形態では、ホスファターゼ阻害剤はＨ２Ｏ２である。
【００１９】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、細胞を、Ｂ細胞受容体アクチベーターおよびホスファターゼ阻害剤またはキナーゼ阻害剤、例えば、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭまたはビオチン化Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭおよびホスファターゼ阻害剤（例えば、Ｈ２Ｏ２）に付す。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞を、モジュレーターに付すステップと、細胞中の持続性シグナル伝達経路に関与する活性化可能成分の活性化レベルを決定するステップと、活性化レベルから細胞における持続性シグナル伝達経路の状態を決定するステップとによって、細胞の持続性シグナル伝達状態を決定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞の持続性シグナル伝達状態に基づいて個体の疾患を決定する。いくつかの実施形態では、疾患は、腫瘍性疾患および／または造血疾患である。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患または造血疾患は、非ホジキンリンパ腫、ホジキンまたはその他のリンパ腫、急性または慢性白血病、赤血球増加症、血小板血症、多発性骨髄腫および形質細胞障害、例えば、アミロイドーシスおよびワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患、骨髄線維症および非定型免疫性リンパ球増殖からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患または造血疾患は、非Ｂ系統由来、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非Ｂ細胞リンパ腫、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患、骨髄線維症、赤血球増加症、血小板血症および非Ｂ非定型免疫性リンパ球増殖である。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患または造血疾患は、Ｂ細胞またはＢ細胞系統由来障害であり、例えば、Ｂ細胞またはＢ細胞系統由来障害は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂリンパ球系統白血病、Ｂリンパ球系統リンパ腫、多発性骨髄腫および形質細胞障害、例えば、アミロイドーシスおよびワルデンシュトレームマクログロブリン血症からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、疾患はＣＬＬである。いくつかの実施形態では、ＣＬＬは、ＣＤ１９およびＣＤ２３とともにＣＤ５を、またはＣＤ２０およびＣＤ２３とともにＣＤ５を同時発現するモノクローナルＢ細胞集団によって、ならびに表面免疫グロブリン発現によって定義される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、細胞の持続性シグナル伝達状態は、疾患の予後または診断などの臨床転帰と相関している。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性疾患または造血疾患のステージ分類または類別、例えば、侵襲性、緩徐進行型、良性、難治性、ローマ数字ステージ分類、ＴＮＭステージ分類、Ｒａｉステージ分類、Ｂｉｎｅｔステージ分類、ＷＨＯ分類、ＦＡＢ分類、ＩＰＳＳスコア、ＷＰＳＳスコア、限局期、進行期、ＺＡＰ７０などの分子マーカーによるステージ分類、Ｂ細胞受容体の重鎖（ＩｇＶＨ）の変異状態およびＣＤ３８、潜在性、例えば、進行までの時間、無進行生存、全生存または無再発生存に関して知らせ得る情報を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、相関は、治療に対する患者の応答、例えば、正常レスポンダー、高レスポンダー、低レスポンダー、耐性の出現を有すること、不従順および有害反応を決定することである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、相関は、最小残存病変または耐性の出現として細胞を分類することを含む。相関は、治療方法、例えば、化学療法、生物療法、放射線療法、骨髄移植、末梢幹細胞移植、臍帯血移植、自家幹細胞移植、同種異系幹細胞移植、同系幹細胞移植、手術、導入療法、維持療法または待機療法を決定することをさらに含み得る。
【００２４】
この態様のいくつかの実施形態では、本発明は、個体に由来するＢリンパ球系統由来細胞をモジュレーターに付すステップと、Ｂリンパ球系統由来細胞中の持続性シグナル伝達経路に関与する複数の活性化可能成分の活性化レベルを決定するステップと、特定の治療の成績の予測、特定の疾患（例えば、腫瘍性疾患）の予後または診断などの臨床転帰と相関する、細胞中の持続性シグナル伝達経路中の複数の活性化可能成分の活性化レベルのパターンを同定するステップとによって、Ｂリンパ球系統由来細胞の活性化レベルを、個体における腫瘍性疾患または造血疾患と相関させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞は、初期プロＢ細胞、後期プロＢ細胞、大型プレＢ細胞、小型プレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、形質細胞および記憶Ｂ細胞、ＣＤ５＋Ｂ細胞、ＣＤ３８＋Ｂ細胞、Ｂ細胞受容体の変異したもしくは変異していない重鎖を有するＢ細胞およびＺａｐ７０を発現するＢ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、相関は、臨床転帰、例えば、疾患の予後または診断を決定することである。
【００２５】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、細胞が付されるモジュレーターは、アクチベーターまたは阻害剤である。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、例えば、増殖因子、サイトカイン、接着分子モジュレーター、ホルモン、小分子、ポリヌクレオチド、抗体、天然化合物、ラクトン、化学療法薬、免疫モジュレーター、炭水化物、プロテアーゼ、イオン、反応性酸素種または放射線照射である。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、Ｂ細胞受容体モジュレーター、例えば、Ｂ細胞受容体アクチベーター、例えば、Ｂ細胞受容体複合体またはＢ細胞共受容体複合体のクロスリンカーである。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、抗体または分子結合実体である。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、抗体、例えば、多価抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、固体表面との結合によってより多価にされた、またはエピトープ結合ドメインの局所結合価を増大するようナノ粒子表面に繋ぎ止められた、一価、二価または多価抗体である。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、分子結合実体、例えば、炭水化物または複合体中のエピトープを介してＢ細胞受容体複合体に作用または結合する実体である。いくつかの実施形態では、分子結合実体は、固体表面との結合によってより多価にされた、またはエピトープ結合ドメインの局所結合価を増大するようナノ粒子表面に繋ぎ止められた、一価、二価または多価結合実体である。モジュレーターが、Ｂ細胞受容体モジュレーター、例えば、Ｂ細胞受容体複合体またはＢ細胞共受容体複合体のクロスリンカーなどのＢ細胞受容体アクチベーターであるいくつかの実施形態では、クロスリンクすることは、抗体または分子結合実体と細胞を結合させること、次いで、抗体または分子結合実体によるＢＣＲ複合体のクロスリンクを引き起こす、細胞と固体表面の相互作用によってそのクロスリンクを引き起こすことを含む。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ポリクローナルＢＣＲ抗体、モノクローナルＢＣＲ抗体、Ｆｃ受容体由来結合成分および／またはそれらの組合せからなる群から選択される。Ｉｇは、マウス、ヤギ、ウサギ、ブタ、ラット、ウマ、ウシ、サメ、ニワトリまたはラマからなる群から選択される種に由来するものであり得る。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭ、ポリクローナルＩｇＭ抗体、モノクローナルＩｇＭ抗体、ビオチン化Ｆ（ａｂ）２ＩｇＣＭ、ビオチン化ポリクローナルＩｇＭ抗体、ビオチン化モノクローナルＩｇＭ抗体および／またはそれらの組合せである。
【００２６】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、細胞が付されるモジュレーターは、細胞中のシグナル伝達カスケードに関与する、一細胞因子または複数の因子の阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、キナーゼまたはホスファターゼ阻害剤、例えば、アダフォスチン、ＡＧ４９０、ＡＧ８２５、ＡＧ９５７、ＡＧ１０２４、アロイシン、アロイシンＡ、アルステルパウロン、アミノゲニステイン、ＡＰＩ−２、アピゲニン、アルクチゲニン、ＡＹ−２２９８９、ＢＡＹ６１−３６０６、ビスインドリルマレイミドＩＸ、チェレリスリン、１０−［４’−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル］−２−クロロフェノキサジンヒドロクロリド、ダサチニブ、２−ジメチルアミノ−４，５，６，７−テトラブロモ−１Ｈ−ベンズイミダゾール、５，７−ジメトキシ−３−（４−ピリジニル）キノリンジヒドロクロリド、エデルホシン、エラグ酸、エンザスタウリン、マレイン酸ＥＲ２７３１９、エルロチニブ、ＥＴ１８ＯＣＨ３、ファスジル、フラボピリドール、ゲフィチニブ、ＧＷ５０７４、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−８９、ＨＡ−１００、ＨＡ−１００４、ＨＡ−１０７７、ＨＡ−１１００、ヒドロキシファスジル、インジルビン−３’−オキシム、５−ヨードツベルシジン、ケンパウロン、ＫＮ−６２、ＫＹ１２４２０、ＬＦＭ−Ａ１３、ラベンダスチンＡ、ルテオリン、ＬＹ−２９４００２、ＬＹ２９４００２、マロトキシン、ＭＬ−９、ＮＳＣ−１５４０２０、ＮＳＣ−２２６０８０、ＮＳＣ−２３１６３４、ＮＳＣ−６６４７０４、ＮＳＣ−６８０４１０、ＮＵ６１０２、オロモウシン、オキシインドールＩ、ＰＤ−１５３０３５、ＰＤ−９８０５９、ＰＤ−１６９３１６、フロレチン、フロリジン、ピセタノール、ピクロポドフィリン、ＰＫＩ、ＰＰ１、ＰＰ２、プルバラノールＡ、ケルセチン、Ｒ４０６、Ｒ７８８、ラパミューン、ラパマイシン、Ｒｏ３１−８２２０、ロスコビチン、ロットレリン、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、シロリムス、ソラフェニブ、ＳＬ３２７、ＳＰ６００１２５、スタウロスポリン、ＳＴＩ−５７１、ＳＵ−１１２７４、ＳＵ１４９８、ＳＵ４３１２、ＳＵ６６５６、４，５，６，７−テトラブロモトリアゾール、ＴＧ１０１３４８、トリシリビン、チロホスチンＡＧ４９０、チロホスチンＡＧ８２５、チロホスチンＡＧ９５７、チロホスチンＡＧ１０２４、チロホスチンＳＵ１４９８、Ｕ０１２６、ＶＸ−５０９、ＶＸ−６６７、ＶＸ−６８０、Ｗ−７、ワートマニン、ＸＬ−０１９、ＸＬ−１４７、ＸＬ−１８４、ＸＬ−２２８、ＸＬ−２８１、ＸＬ−５１８、ＸＬ−６４７、ＸＬ−７６５、ＸＬ−８２０、ＸＬ−８４４、ＸＬ−８８０、Ｙ−２７６３２、ＺＤ−１８３９、ＺＭ−２５２８６８、ＺＭ−４４７４３９、Ｈ２Ｏ２、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、カンタリジン、（−）−ｐ−ブロモテトラミゾール、ミクロシスチンＬＲ、オルトバナジウム酸ナトリウム、過バナジン酸ナトリウム、硫酸バナジル、ナトリウムオキソジペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）バナデート、ビス（マルトラト）オキソバナジウム（ＩＶ）、モリブデン酸ナトリウム、過モリブデン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、イミダゾール、フッ化ナトリウム、β−グリセロフォスフェート、���ロリン酸ナトリウム十水和物、カリクリンＡ、ディスコデルミア・カリックス（Ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｉａ  ｃａｌｙｘ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ｍｐＶ（ｐｉｃ）、ＤＭＨＶ、シペルメトリン、デフォスタチン、オカダ酸、ＮＩＰＰ−１、Ｎ−（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロ−フェナントレン−２−イル）−２，２−ジメチル−プロピオンアミド、α−ブロモ−４−ヒドロキシアセトフェノン、４−ヒドロキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−メトキシアセトフェノン、４−メトキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−（カルボキシメトキシ）アセトフェノン、４−（カルボキシメトキシ）フェナシルＢｒおよびビス（４−トリフルオロメチルスルホンアミドフェニル）−１，４−ジイソプロピルベンゼン、フェニルアルシンオキシド、ピロリジンジチオカルバメートまたはアルミニウムフルオリドである。いくつかの実施形態では、ホスファターゼ阻害剤はＨ２Ｏ２である。
【００２７】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、細胞を、第２のモジュレーターにさらに付し、例えば、細胞を、Ｂ細胞受容体アクチベーターおよびホスファターゼ阻害剤、例えば、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭまたはビオチン化Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭおよびホスファターゼ阻害剤（例えば、Ｈ２０２）に付してもよい。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態では、細胞中の複数の活性化可能成分の活性化レベルは、細胞外または細胞内プロテアーゼ曝露による切断、新規ヘテロ−オリゴマー形成、グリコシル化レベル、リン酸化レベル、アセチル化レベル、メチル化レベル、ビオチン化レベル、グルタミル化レベル、グリシル化レベル、水酸化レベル、異性化レベル、プレニル化レベル、ミリストイル化レベル、リポイル化レベル、ホスホパンテテイン化レベル、硫酸化レベル、ＩＳＧ化レベル、ニトロシル化レベル、パルミトイル化レベル、ＳＵＭＯ化レベル、ユビキチン化レベル、ＮＥＤＤ８化レベル、シトルリン化レベル、脱アミド化レベル、ジスルフィド結合形成レベル、タンパク質分解切断レベル、転位レベル、タンパク質代謝回転における変化、多タンパク質複合体レベル、酸化レベル、多脂質複合体および細胞膜における生化学的変化からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、活性化レベルは、リン酸化レベルである。いくつかの実施形態では、活性化可能成分は、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸および代謝産物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、活性化可能成分は、タンパク質である。いくつかの実施形態では、活性化可能成分は、代謝状態、温度または局所イオン濃度の変化である。活性化可能成分がタンパク質である実施形態では、いくつかの実施形態では、タンパク質は、リン酸化または脱リン酸化を受けるタンパク質、例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、アダプター／スキャフォールドタンパク質、ユビキチン化酵素、接着分子、収縮タンパク質、細胞骨格タンパク質、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、低分子量ＧＴＰアーゼ、グアニンヌクレオチド交換因子、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質、カスパーゼおよびアポトーシスに関与するタンパク質（例えば、ＰＡＲＰ）、イオンチャンネル、分子輸送体、分子シャペロン、代謝酵素、小胞輸送タンパク質、ヒドロキシラーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、脱アセチル化酵素、メチラーゼ、脱メチル化酵素、プロテアーゼ、エステラーゼ、加水分解酵素、ＤＮＡ結合タンパク質または転写因子である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＰＩ３−キナーゼ（ｐ８５、ｐ１１０ａ、ｐ１１０ｂ、ｐ１１０ｄ）、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、ＳＯＣｓ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｃｄｃ４２、Ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｖａｖ、Ｔｉａｍ、Ｓｏｓ、Ｄｂｌ、Ｎｃｋ、Ｇａｂ、ＰＲＫ、ＳＨＰ１およびＳＨＰ２、ＳＨＩＰ１、ＳＨＩＰ２、ｓＳＨＩＰ、ＰＴＥＮ、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ＰＤＫ１、ＳＧＫ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、ＴＳＣ１，２、Ｒｈｅｂ、ｍＴｏｒ、４ＥＢＰ−１、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、Ｓ６、ＬＫＢ−１、ＡＭＰＫ、ＰＦＫ、アセチル−ＣｏＡａカルボキシラーゼ、ＤｏｋＳ、Ｒａｆｓ、Ｍｏｓ、Ｔｐｌ２、ＭＥＫ１／２、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ＭＫＫ３／６、ＭＥＫＫ１，４、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＭＫＫ４／７、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ１，２，３、ｐ３８ｓ、Ｅｒｋ１／２、Ｓｙｋ、Ｂｔｋ、ＢＬＮＫ、ＬＡＴ、ＺＡＰ７０、Ｌｃｋ、Ｃｂｌ、ＳＬＰ−７６、ＰＬＣγ１、ＰＬＣγ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ＦＡＫ、ｐ１３０ＣＡＳ、ＰＡＫｓ、ＬＩＭＫ１／２、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０��Ｈｓｐ２７、ＳＭＡＤ、Ｒｅｌ−Ａ  （ｐ６５−ＮＦＫＢ）、ＣＲＥＢ、ヒストンＨ２Ｂ、ＨＡＴ、ＨＤＡＣ、ＰＫＲ、Ｒｂ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、Ｐ１６、ｐ１４Ａｒｆ、ｐ２７ＫＩＰ、ｐ２１ＣＩＰ、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ６、Ｃｄｋ７、Ｃｄｋ１、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ９、Ｃｄｃ２５，Ａ／Ｂ／Ｃ、Ａｂｌ、Ｅ２Ｆ、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＲＩＰ、Ｍｙｄ８８、ＢＡＤ、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ＸＬ、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ＰＡＲＰ、ＩＡＰｓ、Ｓｍａｃ、フォドリン、アクチン、Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、ＮＩＫ、ＩκＢ、ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ＩＫＫα、ＰＫＡ、ＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣθ、ＰＫＣδ、ＣＡＭＫ、Ｅｌｋ、ＡＦＴ、Ｍｙｃ、Ｅｇｒ−１、ＮＦＡＴ、ＡＴＦ−２、Ｍｄｍ２、ｐ５３、ＤＮＡ−ＰＫ、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、βカテニン、ＣｒｋＬ、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３βおよびＦＯＸＯからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、Ｅｒｋ、Ｓｙｋ、Ｚａｐ７０、Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、ＢＬＮＫ、Ｃｂｌ、ＰＬＣγ２、Ａｋｔ、ＲｅｌＡ、ｐ３８、Ｓ６からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、Ｓ６である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＨＥＲ受容体、ＰＤＧＦ受容体、Ｋｉｔ受容体、ＦＧＦ受容体、Ｅｐｈ受容体、Ｔｒｋ受容体、ＩＧＦ受容体、インスリン受容体、Ｍｅｔ受容体、Ｒｅｔ、ＶＥＧＦ受容体、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＦＡＫ、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、Ｊａｋ３、Ｔｙｋ２、Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｆｇｒ、Ｙｅｓ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｂｔｋ、ＺＡＰ７０、Ｓｙｋ、ＩＲＡＫｓ、ｃＲａｆ、ＡＲａｆ、ＢＲＡＦ、Ｍｏｓ、Ｌｉｍキナーゼ、ＩＬＫ、Ｔｐｌ、ＡＬＫ、ＴＧＦβ受容体、ＢＭＰ受容体、ＭＥＫＫｓ、ＡＳＫ、ＭＬＫ、ＤＬＫ、ＰＡＫ、Ｍｅｋ１、Ｍｅｋ２、ＭＫＫ３／６、ＭＫＫ４／７、ＡＳＫ１、Ｃｏｔ、ＮＩＫ、Ｂｕｂ、Ｍｙｔ１、Ｗｅｅ１、カゼインキナーゼ、ＰＤＫ１、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、ｐ９０Ｒｓｋｓ、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、Ｐｒｋｓ、ＰＫＣ、ＰＫＡ、ＲＯＣＫ１、ＲＯＣＫ２、オーロラ、ＣａＭＫ、ＭＮＫ、ＡＭＰＫ、ＭＥＬＫ、ＭＡＲＫ、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＬＫＢ−１、ＭＡＰＫＡＰＫ、Ｐｉｍ１、Ｐｉｍ２、Ｐｉｍ３、ＩＫＫ、Ｃｄｋ、Ｊｎｋ、Ｅｒｋ、ＩＫＫ、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、Ｃｄｋ、ＣＬＫ、ＰＫＲ、ＰＩ３−キナーゼクラス１、クラス２、クラス３、ｍＴｏｒ、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ１、２、３、ｐ３８、ＰＫＲ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）、ＬＡＲホスファターゼ、ＣＤ４５、非受容体チロシンホスファターゼ（ＮＰＲＴＰ）、ＳＨＰ、ＭＡＰキナーゼホスファターゼ（ＭＫＰ）、二重特異性ホスファターゼ（ＤＵＳＰ）、ＣＤＣ２５ホスファターゼ、低分子量チロシンホスファターゼ、Ｅｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔ（ＥＹＡ）チロシンホスファターゼ、Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔホスファターゼ（ＳＳＨ）、セリンホスファターゼ、ＰＰ２Ａ、ＰＰ２Ｂ、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ１、ＰＰ５、イノシトールホスファターゼ、ＰＴＥＮ、ＳＨＩＰ、ミオチューブラリン、ホスホイノシチドキナーゼ、ホスホリパーゼ、プロスタグランジンシンターゼ、５−リポキシゲナーゼ、スフィンゴシンキナーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、アダプター／スキャフォールドタンパク質、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ＢＬＮＫ、ＬＡＴ、ＰＩ３−キナーゼのＢ細胞アダプター（ＢＣＡＰ）、ＳＬＡＰ、Ｄｏｋ、ＫＳＲ、ＭｙＤ８８、Ｃｒｋ、ＣｒｋＬ、ＧＡＤ、Ｎｃｋ、Ｇｒｂ２関連バインダー（ＧＡＢ）、Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＲＩＰ、Ｔ細胞白血病ファミリー、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−６、インターフェロンγ、インターフェロンα、サイトカインシグナル伝達の抑制因子（ＳＯＣ）、Ｃｂｌ、ＳＣＦユビキチン化リガーゼ複合体、ＡＰＣ／Ｃ、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン様接着分子、セレクチン、カドヘリン、カテニン、接着斑キナーゼ、ｐ１３０ＣＡＳ、フォドリン、アクチン、パキシリン、ミオシン、ミオシン結合タンパク質、チューブリン、ｅｇ５／ＫＳＰ、ＣＥＮＰ、β−アドレナリン受容体、ムスカリン性受容体、アデニニルシクラーゼ受容体、低分子量ＧＴＰアーゼ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｒａｎ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｃｄｃ４２、Ａｒｆｓ、ＲＡＢ、ＲＨＥＢ、Ｖａｖ、Ｔｉａ���、Ｓｏｓ、Ｄｂｌ、ＰＲＫ、ＴＳＣ１，２、Ｒａｓ−ＧＡＰ、Ａｒｆ−ＧＡＰｓ、Ｒｈｏ−ＧＡＰ、カスパーゼ、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ＰＡＲＰ、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ａ１、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂｉｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｂｍｆ、Ｈｒｋ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＩＡＰｓ、ＸＩＡＰ、Ｓｍａｃ、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ６、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ１、Ｃｄｋ７、サイクリンＤ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、Ｒｂ、ｐ１６、ｐ１４Ａｒｆ、ｐ２７ＫＩＰ、ｐ２１ＣＩＰ、分子シャペロン、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ２７、代謝酵素、アセチル−ＣｏＡａカルボキシラーゼ、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、一酸化窒素合成酵素、カベオリン、エンドソーム輸送選別複合体（ＥＳＣＲＴ）タンパク質、小胞タンパク質選別（Ｖｓｐｓ）、ヒドロキシラーゼ、プロリル−ヒドロキシラーゼＰＨＤ−１、２および３、アスパラギンヒドロキシラーゼＦＩＨトランスフェラーゼ、Ｐｉｎ１プロリルイソメラーゼ、トポイソメラーゼ、脱アセチル化酵素、ヒストン脱アセチル化酵素、サーチュイン、ヒストンアセチル化酵素、ＣＢＰ／Ｐ３００ファミリー、ＭＹＳＴファミリー、ＡＴＦ２、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンＨ３Ｋ４脱メチル化酵素、Ｈ３Ｋ２７、ＪＨＤＭ２Ａ、ＵＴＸ、ＶＨＬ、ＷＴ−１、ｐ５３、Ｈｄｍ、ＰＴＥＮ、ユビキチンプロテアーゼ、ウロキナーゼ−型プラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）およびｕＰＡ受容体（ｕＰＡＲ）システム、カテプシン、メタロプロテイナーゼ、エステラーゼ、加水分解酵素、セパラーゼ、カリウムチャネル、ナトリウムチャネル、多剤耐性タンパク質、Ｐ−糖タンパク質、ヌクレオシド輸送体、Ｅｔｓ、Ｅｌｋ、ＳＭＡＤ、Ｒｅｌ−Ａ（ｐ６５−ＮＦＫＢ）、ＣＲＥＢ、ＮＦＡＴ、ＡＴＦ−２、ＡＦＴ、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ、Ｓｐ１、Ｅｇｒ−１、Ｔ−ｂｅｔ、β−カテニン、ＨＩＦ、ＦＯＸＯ、Ｅ２Ｆ、ＳＲＦ、ＴＣＦ、Ｅｇｒ−１、β−カテニン、ＦＯＸＯ  ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ｐ５３、ＷＴ−１、ＨＭＧＡ、ｐＳ６、４ＥＰＢ−１、ｅＩＦ４Ｅ−結合タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼ、阻害因子、延長因子からなる群から選択される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、細胞を分類する方法は、活性化可能なタンパク質の活性化レベルを決定することに加え、さらなる細胞内マーカーおよび／または細胞表面マーカーのレベルを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞を分類する方法は、さらなる細胞内マーカーのレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、細胞内マーカーは、捕獲された細胞内サイトカインである。いくつかの実施形態では、細胞を分類する方法は、さらなる細胞表面マーカーのレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、細胞表面リガンドまたは受容体である。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、Ｂ細胞受容体の成分である。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７９、ＣＤ３８、ＣＤ９６、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラス１またはＭＨＣクラス２である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、予後、診断または治療の決定についての本発明の方法は、さらなる血清マーカーのレベルを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、血清マーカーは、タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、血清マーカーは、サイトカイン、増殖因子、ケモカイン、可溶性受容体、小化合物または医薬品である。いくつかの実施形態では、血清マーカーは、病原体または寄生生物の成分または産物を含む。いくつかの実施形態では、血清マーカーは、β−２−ミクログロブリン、カルシトニン、チミジンキナーゼおよびフェリチンからなる群から選択される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、個体に由来するＢリンパ球系統由来細胞をモジュレーターに付すステップと、Ｂリンパ球系統由来細胞中の複数の活性化可能成分の活性化レベルを決定するステップと、腫瘍性疾患と相関している、細胞中の複数の活性化可能成分の活性化レベルのパターンを同定するステップとによって、個体中のＢリンパ球系統由来細胞の活性化レベルを、腫瘍性疾患または造血疾患と相関させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、活性化可能成分は、Ｅｒｋ、Ｓｙｋ、Ｚａｐ７０、Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、ＢＬＮＫ、Ｃｂｌ、ＰＬＣγ２、Ａｋｔ、ＲｅｌＡ、ｐ３８、Ｓ６からなる群から選択される成分からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、活性化可能成分は、Ｃｂｌ、ＰＬＣγ２およびＳ６からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、活性化可能成分はＳ６である。いくつかの実施形態では、Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞は、初期プロＢ細胞、後期プロＢ細胞、大型プレＢ細胞、小型プレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、形質細胞および記憶Ｂ細胞、ＣＤ５＋Ｂ細胞、ＣＤ３８＋Ｂ細胞、Ｂ細胞受容体の変異したもしくは変異していない重鎖を有するＢ細胞またはＺａｐ７０を発現するＢ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、個体に由来する、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現するＣＬＬ細胞を、モジュレーターに付すステップと、複数の活性化可能成分の活性化レベルを決定するステップと、複数の活性化可能成分の活性化レベルのパターンを同定して、ＢＣＲの近位にあるシグナル伝達における変化の有無を決定し、変化の存在が臨床転帰を示すステップとによって、個体において、ＣＬＬ細胞の活性化状態を、臨床転帰と相関させる、および／または、臨床転帰を用いて分類する方法を提供する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、方法は、前記細胞中の前記の複数の活性化可能成分の前記活性化レベルのパターンを同定するステップを含み、ここで前記パターンは疾病または疾患と相関する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、相関は、臨床転帰、例えば、予後を決定することまたは疾患の治療を決定することである。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患または造血疾患は、非ホジキンリンパ腫、ホジキンまたはその他のリンパ腫、急性または慢性白血病、赤血球増加症、血小板血症、多発性骨髄腫および形質細胞障害、例えば、アミロイドーシスおよびワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患、骨髄線維症または非定型免疫性リンパ球増殖からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患または造血疾患は、非Ｂ系統由来、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非Ｂ細胞リンパ腫、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患、骨髄線維症、赤血球増加症、血小板血症および非Ｂ非定型免疫性リンパ球増殖である。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患または造血疾患は、Ｂ細胞またはＢ細胞系統由来障害であり、例えば、Ｂ細胞またはＢ細胞系統由来障害は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂリンパ球系統白血病、Ｂリンパ球系統リンパ腫、多発性骨髄腫または形質細胞障害、例えば、アミロイドーシスおよびワルデンシュトレームマクログロブリン血症からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、疾患はＣＬＬである。いくつかの実施形態では、ＣＬＬは、ＣＤ１９およびＣＤ２３とともにＣＤ５を、またはＣＤ２０およびＣＤ２３とともにＣＤ５を同時発現するモノクローナルＢ細胞集団によって、およびかすかな表面免疫グロブリン発現によって定義される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性疾患または造血疾患のステージ分類または類別、例えば、侵襲性、緩徐進行型、良性、難治性、ローマ数字ステージ分類、ＴＮＭステージ分類、Ｒａｉステージ分類、Ｂｉｎｅｔステージ分類、ＷＨＯ分類、ＦＡＢ分類、ＩＰＳＳスコア、ＷＰＳＳスコア、限局期、進行期、ＺＡＰ７０などの細胞マーカーによるステージ分類、ＩｇＶＨ変異状態およびＣＤ３８、潜在性、例えば、進行までの時間、無進行生存、全生存または無再発生存に関して知らせうる情報を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、相関は、特定の治療に対する個体の応答を決定すること、例えば、正常レスポンダー、高レスポンダー、低レスポンダー、耐性の発現を有すること、不従順および有害反応を決定することである。
【００３７】
いくつかの実施形態では、相関は、細胞を、最小残存病変または耐性の出現として分類することを含む。相関は、治療方法、例えば、化学療法、生物療法、標的療法、放射線療法、骨髄移植、末梢幹細胞移植、臍帯血移植、自家幹細胞移植、同種異系幹細胞移植、同系幹細胞移植、手術、導入療法、維持療法または待機療法を決定することをさらに含み得る。さらなる実施形態では、相関は、適当な投与量または所与の治療のタイミングを決定することをさらに含み得る。
【００３８】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、細胞が付されるモジュレーターは、アクチベーターまたは阻害剤である。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、例えば、増殖因子、サイトカイン、接着分子モジュレーター、ホルモン、小分子、ポリヌクレオチド、抗体、天然化合物、ラクトン、化学療法薬、免疫モジュレーター、炭水化物、プロテアーゼ、イオン、反応性酸素種または放射線照射である。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、細胞表面上の抗原を認識する抗体、例えば、抗ＣＤ２０（リツキサン）、抗ＣＤ２２（エピラツズマブ）、抗ＣＤ２３（ルミリキシマブ）または抗ＣＤ５２（アレムツズマブ）である。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、Ｂ細胞受容体共複合体またはＢ細胞受容体アクチベーターの成分、例えば、Ｂ細胞受容体複合体またはＢ細胞共受容体複合体のクロスリンカーを認識するＢ細胞受容体複合体モジュレーター、例えば、抗ＣＤ２０である。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、抗体または分子結合実体である。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、抗体、例えば、多価抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、固体表面との結合によってより多価にされた、またはエピトープ結合ドメインの局所結合価を増大するようナノ粒子表面に繋ぎ止められた、一価、二価または多価抗体である。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、分子結合実体、例えば、複合体中の炭水化物またはエピトープを介してＢ細胞受容体複合体に作用または結合する実体である。いくつかの実施形態では、分子結合実体は、固体表面との結合によってより多価にされた、またはエピトープ結合ドメインの局所結合価を増大するようナノ粒子表面に繋ぎ止められた、一価、二価または多価結合実体である。モジュレーターが、Ｂ細胞受容体モジュレーター、例えば、Ｂ細胞受容体複合体またはＢ細胞共受容体複合体のクロスリンカーなどのＢ細胞受容体アクチベーターであるいくつかの実施形態では、クロスリンクすることは、抗体または分子結合実体と細胞を結合させること、次いで、抗体または分子結合実体によるＢＣＲ複合体のクロスリンクを引き起こす、細胞と固体表面の相互作用によってそのクロスリンクを引き起こすことを含む。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ポリクローナルＢＣＲ抗体、モノクローナルＢＣＲ抗体、Ｆｃ受容体由来結合成分および／またはそれらの組合せからなる群から選択される。Ｉｇは、マウス、ヤギ、ウサギ、ブタ、ラット、ウマ、ウシ、サメ、ニワトリまたはラマからなる群から選択される種に由来するものであり得る。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ、ポリクローナルＩｇＭ抗体、モノクローナルＩｇＭ抗体、ビオチン化Ｆ（ａｂ）２ＩｇＣＭ、ビオチン化ポリクローナルＩｇＭ抗体、ビオチン化モノクローナルＩｇＭ抗体および／またはそれらの組合せである。
【００３９】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、細胞が付されるモジュレーターは、細胞中のシグナル伝達カスケードに関与する、一細胞因子または複数の因子の阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、キナーゼまたはホスファターゼ阻害剤、例えば、アダフォスチン、ＡＧ４９０、ＡＧ８２５、ＡＧ９５７、ＡＧ１０２４、アロイシン、アロイシンＡ、アルステルパウロン、アミノゲニステイン、ＡＰＩ−２、アピゲニン、アルクチゲニン、ＡＹ−２２９８９、ＢＡＹ６１−３６０６、ビスインドリルマレイミド  ＩＸ、チェレリスリン、１０−［４’−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル］−２−クロロフェノキサジンヒドロクロリド、ダサチニブ、２−ジメチルアミノ−４，５，６，７−テトラブロモ−１Ｈ−ベンズイミダゾール、５，７−ジメトキシ−３−（４−ピリジニル）キノリンジヒドロクロリド、エデルホシン、エラグ酸、エンザスタウリン、マレイン酸ＥＲ２７３１９、エルロチニブ、ＥＴ１８ＯＣＨ３、ファスジル、フラボピリドール、ゲフィチニブ、ＧＷ５０７４、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−８９、ＨＡ−１００、ＨＡ−１００４、ＨＡ−１０７７、ＨＡ−１１００、ヒドロキシファスジル、インジルビン−３’−オキシム、５−ヨードツベルシジン、ケンパウロン、ＫＮ−６２、ＫＹ１２４２０、ＬＦＭ−Ａ１３、ラベンダスチンＡ、ルテオリン、ＬＹ−２９４００２、ＬＹ２９４００２、マロトキシン、ＭＬ−９、ＮＳＣ−１５４０２０、ＮＳＣ−２２６０８０、ＮＳＣ−２３１６３４、ＮＳＣ−６６４７０４、ＮＳＣ−６８０４１０、ＮＵ６１０２、オロモウシン、オキシインドールＩ、ＰＤ−１５３０３５、ＰＤ−９８０５９、ＰＤ−１６９３１６、フロレチン、フロリジン、ピセタノール、ピクロポドフィリン、ＰＫＩ、ＰＰ１、ＰＰ２、プルバラノールＡ、ケルセチン、Ｒ４０６、Ｒ７８８、ラパミューン、ラパマイシン、Ｒｏ３１−８２２０、ロスコビチン、ロットレリン、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、シロリムス、ソラフェニブ、ＳＬ３２７、ＳＰ６００１２５、スタウロスポリン、ＳＴＩ−５７１、ＳＵ−１１２７４、ＳＵ１４９８、ＳＵ４３１２、ＳＵ６６５６、４，５，６，７−テトラブロモトリアゾール、ＴＧ１０１３４８、トリシリビン、チロホスチンＡＧ４９０、チロホスチンＡＧ８２５、チロホスチンＡＧ９５７、チロホスチンＡＧ１０２４、チロホスチンＳＵ１４９８、Ｕ０１２６、ＶＸ−５０９、ＶＸ−６６７、ＶＸ−６８０、Ｗ−７、ワートマニン、ＸＬ−０１９、ＸＬ−１４７、ＸＬ−１８４、ＸＬ−２２８、ＸＬ−２８１、ＸＬ−５１８、ＸＬ−６４７、ＸＬ−７６５、ＸＬ−８２０、ＸＬ−８４４、ＸＬ−８８０、Ｙ−２７６３２、ＺＤ−１８３９、ＺＭ−２５２８６８、ＺＭ−４４７４３９、Ｈ２Ｏ２、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、カンタリジン、（−）−ｐ−ブロモテトラミゾール、ミクロシスチンＬＲ、オルトバナジウム酸ナトリウム、過バナジン酸ナトリウム、硫酸バナジル、ナトリウムオキソジペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）バナデート、ビス（マルトラト）オキソバナジウム（ＩＶ）、モリブデン酸ナトリウム、過モリブデン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、イミダゾール、フッ化ナトリウム、β−グリセロフォスフェート��ピロリン酸ナトリウム十水和物、カリクリンＡ、ディスコデルミア・カリックス（Ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｉａ  ｃａｌｙｘ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ｍｐＶ（ｐｉｃ）、ＤＭＨＶ、シペルメトリン、デフォスタチン、オカダ酸、ＮＩＰＰ−１、Ｎ−（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロ−フェナントレン−２−イル）−２，２−ジメチル−プロピオンアミド、α−ブロモ−４−ヒドロキシアセトフェノン、４−ヒドロキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−メトキシアセトフェノン、４−メトキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−（カルボキシメトキシ）アセトフェノン、４−（カルボキシメトキシ）フェナシルＢｒおよびビス（４−トリフルオロメチルスルホンアミドフェニル）−１，４−ジイソプロピルベンゼン、フェニルアルシンオキシド、ピロリジンジチオカルバメートまたはアルミニウムフルオリドである。いくつかの実施形態では、ホスファターゼ阻害剤はＨ２Ｏ２である。
【００４０】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、細胞を、第２のモジュレーターにさらに付し、例えば、細胞を、Ｂ細胞受容体アクチベーターおよびキナーゼ阻害剤またはホスファターゼ阻害剤、例えば、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭまたはビオチン化Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭおよびＨ２０２に付してもよい。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態では、細胞中の活性化可能成分の活性化レベルは、細胞外または細胞内プロテアーゼ曝露による切断、新規ヘテロ−オリゴマー形成、グリコシル化レベル、リン酸化レベル、アセチル化レベル、メチル化レベル、ビオチン化レベル、グルタミル化レベル、グリシル化レベル、水酸化レベル、異性化レベル、プレニル化レベル、ミリストイル化レベル、リポイル化レベル、ホスホパンテテイン化レベル、硫酸化レベル、ＩＳＧ化レベル、ニトロシル化レベル、パルミトイル化レベル、ＳＵＭＯ化レベル、ユビキチン化レベル、ＮＥＤＤ８化レベル、シトルリン化レベル、脱アミド化レベル、ジスルフィド結合形成レベル、タンパク質分解切断レベル、転位レベル、タンパク質代謝回転における変化、多タンパク質複合体レベル、酸化レベル、多脂質複合体および細胞膜における生化学的変化からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、活性化レベルは、リン酸化レベルである。いくつかの実施形態では、活性化可能成分は、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸および代謝産物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、活性化可能成分はタンパク質である。いくつかの実施形態では、活性化可能成分は、代謝状態、温度または局所イオン濃度の変化である。活性化可能成分がタンパク質である実施形態では、いくつかの実施形態では、タンパク質は、リン酸化または脱リン酸化を受けるタンパク質、例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、アダプター／スキャフォールドタンパク質、ユビキチン化酵素、接着分子、収縮タンパク質、細胞骨格タンパク質、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、低分子量ＧＴＰアーゼ、グアニンヌクレオチド交換因子、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質、カスパーゼおよびアポトーシスに関与しているタンパク質（例えば、ＰＡＲＰ）、イオンチャンネル、分子輸送体、分子シャペロン、代謝酵素、小胞輸送タンパク質、ヒドロキシラーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、脱アセチル化酵素、メチラーゼ、脱メチル化酵素、プロテアーゼ、エステラーゼ、加水分解酵素、ＤＮＡ結合タンパク質または転写因子である。
【００４２】
別の態様では、本発明は、別個の培養物において、細胞の集団を複数のモジュレーターに曝露することによって細胞の集団の表現型プロフィールを決定し、ここで、少なくとも１種のモジュレーターが阻害剤であり、別個の培養物の各々に由来する細胞集団において活性化可能成分の活性化レベルの増大の有無を決定し、別個の培養物の各々に由来する活性化可能成分の活性化の有無に基づいて細胞集団を分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、阻害剤は、細胞中のシグナル伝達カスケードに関与する、一細胞因子または複数の因子の阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ホスファターゼまたはキナーゼ阻害剤である。キナーゼ阻害剤の例として、アダフォスチン、ＡＧ４９０、ＡＧ８２５、ＡＧ９５７、ＡＧ１０２４、アロイシン、アロイシンＡ、アルステルパウロン、アミノゲニステイン、ＡＰＩ−２、アピゲニン、アルクチゲニン、ＡＹ−２２９８９、ＢＡＹ６１−３６０６、ビスインドリルマレイミドＩＸ、チェレリスリン、１０−［４’−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル］−２−クロロフェノキサジンヒドロクロリド、ダサチニブ、２−ジメチルアミノ−４，５，６，７−テトラブロモ−１Ｈ−ベンズイミダゾール、５，７−ジメトキシ−３−（４−ピリジニル）キノリンジヒドロクロリド、エデルホシン、エラグ酸、エンザスタウリン、マレイン酸ＥＲ２７３１９、エルロチニブ、ＥＴ１８ＯＣＨ３、ファスジル、フラボピリドール、ゲフィチニブ、ＧＷ５０７４、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−８９、ＨＡ−１００、ＨＡ−１００４、ＨＡ−１０７７、ＨＡ−１１００、ヒドロキシファスジル、インジルビン−３’−オキシム、５−ヨードツベルシジン、ケンパウロン、ＫＮ−６２、ＫＹ１２４２０、ＬＦＭ−Ａ１３、ラベンダスチンＡ、ルテオリン、ＬＹ−２９４００２、ＬＹ２９４００２、マロトキシン、ＭＬ−９、ＮＳＣ−１５４０２０、ＮＳＣ−２２６０８０、ＮＳＣ−２３１６３４、ＮＳＣ−６６４７０４、ＮＳＣ−６８０４１０、ＮＵ６１０２、オロモウシン、オキシインドールＩ、ＰＤ−１５３０３５、ＰＤ−９８０５９、ＰＤ１６９３１６、フロレチン、フロリジン、ピセタノール、ピクロポドフィリン、ＰＫＩ、ＰＰ１、ＰＰ２、プルバラノール  Ａ、ケルセチン、Ｒ４０６、Ｒ７８８、ラパミューン、ラパマイシン、Ｒｏ３１−８２２０、ロスコビチン、ロットレリン、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、シロリムス、ソラフェニブ、ＳＬ３２７、ＳＰ６００１２５、スタウロスポリン、ＳＴＩ−５７１、ＳＵ−１１２７４、ＳＵ１４９８、ＳＵ４３１２、ＳＵ６６５６、４，５，６，７−テトラブロモトリアゾール、ＴＧ１０１３４８、トリシリビン、チロホスチンＡＧ４９０、チロホスチンＡＧ８２５、チロホスチンＡＧ９５７、チロホスチンＡＧ１０２４、チロホスチンＳＵ１４９８、Ｕ０１２６、ＶＸ−５０９、ＶＸ−６６７、ＶＸ−６８０、Ｗ−７、ワートマニン、ＸＬ−０１９、ＸＬ−１４７、ＸＬ−１８４、ＸＬ−２２８、ＸＬ−２８１、ＸＬ−５１８、ＸＬ−６４７、ＸＬ−７６５、ＸＬ−８２０、ＸＬ−８４４、ＸＬ−８８０、Ｙ−２７６３２、ＺＤ−１８３９、ＺＭ−２５２８６８、ＺＭ−４４７４３９、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡが挙げられる。���スファターゼ阻害剤の例として、それだけには限らないが、Ｈ２Ｏ２、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、カンタリジン、（−）−ｐ−ブロモテトラミゾール、ミクロシスチンＬＲ、オルトバナジウム酸ナトリウム、過バナジン酸ナトリウム、硫酸バナジル、ナトリウムオキソジペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）バナデート、ビス（マルトラト）オキソバナジウム（ＩＶ）、モリブデン酸ナトリウム、過モリブデン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、イミダゾール、フッ化ナトリウム、β−グリセロフォスフェート、ピロリン酸ナトリウム十水和物、カリクリンＡ、ディスコデルミア・カリックス（Ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｉａ  ｃａｌｙｘ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ｍｐＶ（ｐｉｃ）、ＤＭＨＶ、シペルメトリン、デフォスタチン、オカダ酸、ＮＩＰＰ−１、Ｎ−（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロ−フェナントレン−２−イル）−２，２−ジメチル−プロピオンアミド、α−ブロモ−４−ヒドロキシアセトフェノン、４−ヒドロキシフェナシル  Ｂｒ、α−ブロモ−４−メトキシアセトフェノン、４−メトキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−（カルボキシメトキシ）アセトフェノン、４−（カルボキシメトキシ）フェナシルＢｒおよびビス（４−トリフルオロメチルスルホンアミドフェニル）−１，４−ジイソプロピルベンゼン、フェニルアルシンオキシド、ピロリジンジチオカルバメートおよびアルミニウムフルオリドが挙げられる。いくつかの実施形態では、ホスファターゼ阻害剤はＨ２Ｏ２である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、モジュレーターは、アクチベーターまたは阻害剤である。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、独立に、増殖因子、サイトカイン、接着分子モジュレーター、ホルモン、小分子、ポリヌクレオチド、抗体、天然化合物、ラクトン、化学療法薬、免疫モジュレーター、炭水化物、プロテアーゼ、イオン、反応性酸素種および放射線照射からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のモジュレーターは、Ｂ細胞受容体モジュレーターである。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体モジュレーターは、Ｂ細胞受容体アクチベーター、例えば、リツキサンまたはＢ細胞受容体複合体もしくはＢ細胞共受容体複合体のクロスリンカーである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、モジュレーターは、ＰＭＡ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＤＦ１ａ、ＳＣＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＧＦ−１、イミキモド、ポリＣｐＧ、フルダラビン、シクロホスファミド、クロラムブシルＩＬ−７、ＩＬ−６、１Ｌ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、タプシガーギンおよび／またはそれらの組合せである。
【００４５】
いくつかの実施形態では、活性化可能成分はタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ１，２，３、ｐ３８ｓ、Ｅｒｋ１／２、Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０、Ｂｔｋ、ＢＬＮＫ、Ｌｃｋ、ＰＬＣγ１、ＰＬＣ１γ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ＣＲＥＢ、Ｌｙｎ、ｐ−Ｓ６、Ｃｂｌ、ＮＦ−κＢ、ＧＳＫ３β、ＣＡＲＭＡ／Ｂｃｌ１０およびＴｃｌ−１からなる群から選択される。
【００４６】
別の態様では、本発明は、細胞集団を、少なくとも１種のモジュレーターと接触させることによって細胞集団を分類し、ここで、モジュレーターが、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ、リツキサン、アレムツズマブ、抗ＣＤ２２（エピラツズマブ）、抗ＣＤ２３（ルミリキシマブ）、キャンパス、Ｈ２Ｏ２、ＰＭＡ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＤＦ１ａ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＧＦ−１、イミキモド、ポリＣｐＧ、フルダラビン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ＩＬ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、タプシガーギンおよび／またはそれらの組合せであり、細胞集団中において活性化可能成分の活性化レベルの増大の有無を決定し、活性化可能成分の活性化の増大の有無に基づいて細胞集団を分類する方法を提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、細胞集団は造血由来細胞集団である。いくつかの実施形態では、造血由来細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌ）集団は、多能性造血幹細胞、Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞、Ｔリンパ球系統前駆細胞または由来細胞、ＮＫ細胞系統前駆細胞または由来細胞、顆粒球系統前駆細胞または由来細胞、単球系統前駆細胞または由来細胞、巨核球系統前駆細胞または由来細胞および赤血球系統前駆細胞または由来細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、造血由来細胞集団は、Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞集団、例えば、初期プロＢ細胞集団、後期プロＢ細胞集団、大型プレＢ細胞集団、小型プレＢ細胞集団、未熟Ｂ細胞集団、成熟Ｂ細胞集団、形質細胞および記憶Ｂ細胞集団、ＣＤ５＋Ｂ細胞集団、ＣＤ３８＋Ｂ細胞、Ｂ細胞受容体の変異したもしくは変異していない重鎖を有するＢ細胞またはＺａｐ７０を発現するＢ細胞集団である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、分類は、細胞集団を、臨床転帰と相関している細胞集団として分類することを含む。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、特定の療法に対する予測される応答または疾患の予後および／もしくは診断である。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性または造血疾患、例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンまたはその他のリンパ腫、急性または慢性白血病、赤血球増加症、血小板血症、多発性骨髄腫または形質細胞障害、例えば、アミロイドーシスおよびワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患、骨髄線維症または非定型免疫性リンパ球増殖の有無である。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患または造血疾患は、非Ｂ系統由来、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非Ｂ細胞リンパ腫、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患、骨髄線維症、赤血球増加症、血小板血症または非Ｂ非定型免疫性リンパ球増殖である。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患または造血疾患は、Ｂ細胞またはＢ細胞系統由来障害、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂリンパ球系統白血病、Ｂリンパ球系統リンパ腫、多発性骨髄腫または形質細胞障害、例えば、アミロイドーシスまたはワルデンシュトレームマクログロブリン血症である。いくつかの実施形態では、疾患はＣＬＬである。いくつかの実施形態では、ＣＬＬは、ＣＤ１９およびＣＤ２３とともにＣＤ５を、またはＣＤ２０およびＣＤ２３とともにＣＤ５を同時発現するモノクローナルＢ細胞集団およびかすかな表面免疫グロブリン発現によって定義される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性疾患または造血疾患のステージ分類または類別である。本発明によって提供される方法におけるステージ分類の例として、侵襲性、緩徐進行型、良性、難治性、ローマ数字ステージ分類、ＴＮＭステージ分類、Ｒａｉステージ分類、Ｂｉｎｅｔステージ分類、ＷＨＯ分類、ＦＡＢ分類、ＩＰＳＳスコア、ＷＰＳＳスコア、限局期、進行期、ＺＡＰ７０などの細胞マーカーによるステージ分類、ＩｇＶＨ変異状態およびＣＤ３８、潜在性、例えば、進行までの時間、無進行生存、全生存または無再発生存に関して知らせうる情報を含む。
【００５０】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、活性化レベルに基づいて細胞集団を分類することは、細胞集団を、患者の応答、例えば、完全応答、部分応答、結節性部分応答、応答なし、進行性疾患、安定疾患、再発または有害反応と相関している細胞集団として分類することを含む。方法は、治療方法、例えば、化学療法、生物療法、標的療法、放射線療法、骨髄移植、末梢幹細胞移植、臍帯血移植、自家幹細胞移植、同種異系幹細胞移植、同系幹細胞移植、手術、導入療法、維持療法、待機療法またはホリスティック／代替療法を決定することをさらに含み得る。
【００５１】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、活性化レベルに基づいて細胞集団を分類することは、細胞集団を、最小残存病変または耐性の出現と相関している細胞集団として分類することを含む。
【００５２】
本発明の新規特徴は、特に添付の特許請求の範囲に説明される。本発明の原理が利用される、例示的実施形態を示す以下の詳細な説明を参照して本発明の特徴および利点のより良好な理解が得られ、添付の図面は以下のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭ刺激後のＲａｍｏｓ細胞におけるｐ−Ｅｒｋおよびｐ−Ｓｙｋ／ｐＺａｐ７０の活性化を示すヒストグラムを表す。
【図２】Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭで処理した後のＲａｍｏｓ細胞系統におけるＢＬＮＫ、Ｃｂｌ、ＰＬＣγ２、Ｌｃｋおよびｐ３８のリン酸化を示すヒストグラムを表す。
【図３】ＰＭＡ活性化後の、フェレーシスによって得た（Ｐｈｅｒｅｓｅｄ）ＣＬＬサンプルにおける、およびＲａｍｏｓ細胞系統におけるＥｒｋのリン酸化の増大を示すヒストグラムを表す。
【図４】漸増量のＦ（ａｂ）２ＩｇＭを用いた１５分間の活性化後の、フェレーシスによって得た（Ｐｈｅｒｅｓｅｄ）ＣＬＬサンプルおよびＲａｍｏｓ細胞におけるＥｒｋの活性化を示すヒストグラムを表す。
【図５】ＰＭＡまたはＦ（ａｂ）２ＩｇＭで処理した後の、ＥｒｋおよびＳｙｋ／Ｚａｐ７０のリン酸化の増大を示す等高線図を表す。
【図６】Ｈ２Ｏ２を用いて、単独またはＦ（ａｂ）２ＩｇＭと組み合わせて処理した後のＣＬＬサンプルにおけるＥｒｋおよびＳｙｋ／Ｚａｐ７０のリン酸化を示す等高線図を表す。
【図７】Ｈ２Ｏ２を用いて処理した後の健常Ｂ細胞におけるＥｒｋおよびＳｙｋ／Ｚａｐ７０のリン酸化を示すヒストグラムを表す。
【図８】Ｈ２Ｏ２およびＦ（ａｂ）２ＩｇＭを用いて処理した際のＣＬＬ細胞におけるＥｒｋおよびＳｙｋ／Ｚａｐ７０のリン酸化を示す等高線図を表す図である。
【図９】ＰＭＡまたはＦ（ａｂ）２ＩｇＭを用いて活性化後のＣＬＬサンプルにおけるＥｒｋおよびＳｙｋを示す等高線図を表す図である。
【図１０】Ｈ２Ｏ２を単独またはＦ（ａｂ）２ＩｇＭと組み合わせて用いて処理した後のＥｒｋおよびＳｙｋ／Ｚａｐ７０のリン酸化を示す等高線図を表す。
【図１１】Ｈ２Ｏ２を単独またはＦ（ａｂ）２ＩｇＭと組み合わせて用いて処理した後の、低頻度および高頻度ＺＡＰ７０のＣＬＬサンプルＥｒｋおよびＳｙｋ／Ｚａｐ７０のリン酸化を比較する等高線図を表す。
【図１２】ＣＬＬサンプルにおける種々の時点でのＦ（ａｂ）２ＩｇＭおよびＨ２Ｏ２処理後の、Ｓｙｋ／Ｚａｐ７０およびＥｒｋリン酸化を示す等高線図を表す図である。
【図１３】ＣＬＬサンプルにおけるＦ（ａｂ）２ＩｇＭおよびＨ２Ｏ２を用いて処理した後のＳｙｋ／Ｚａｐ７０およびＥｒｋリン酸化を示す等高線図を表す図である。
【図１４】ＣＬＬにおけるＦ（ａｂ）２ＩｇＭおよびＨ２Ｏ２によって媒介されるシグナル伝達の動態学を示すヒストグラムを表す。
【図１５】Ｈ２Ｏ２を単独またはＦ（ａｂ）２ＩｇＭと組み合わせて用いて処理した後のＢＬＮＫリン酸化に対する％ＺＡＰ７０の影響を示す等高線図を表す図である。
【図１６】ＢＬＮＫリン酸化に対するＺＡＰ７０状態の影響を示すヒストグラムを表す。
【図１７】ＣＬＬサンプルのＣＤ２０＋／ＣＤ５＋集団におけるＦ（ａｂ）２ＩｇＭ単独によるＢ細胞受容体クロスリンク後のｐＰＬＣγ２、ｐｒｐＳ６およびｐＣｂｌのリン酸化の動態学を示すヒストグラムを表す。
【図１８】ＣＬＬサンプル中のＣＤ２０＋／ＣＤ５＋集団におけるＦ（ａｂ）２ＩｇＭおよびＨ２Ｏ２によるＢ細胞受容体クロスリンク後のｐＰＬＣγ２、ｐｒｐＳ６およびｐＣｂｌのリン酸化の動態学を示すヒストグラムを表す。
【図１９】ＣＬＬサンプル中のＣＤ２０＋／ＣＤ５＋集団におけるＦ（ａｂ）２ＩｇＭ単独によるＢ細胞受容体クロスリンク後のｐＰＬＣγ２、ｐｒｐＳ６およびｐＣｂｌのリン酸化の動態学を示すヒストグラムを表す。
【図２０】ＣＬＬサンプル中のＣＤ２０＋／ＣＤ５＋集団におけるＦ（ａｂ）２ＩｇＭおよびＨ２Ｏ２によるＢ細胞受容体クロスリンク後のｐＰＬＣγ２、ｐｒｐＳ６およびｐＣｂｌのリン酸化の動態学を示すヒストグラムを表す。
【図２１】Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭ単独によるＳｙｋ／Ｚａｐ７０およびＥｒｋのリン酸化を経時的に示す等高線図を表す。
【図２２】Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭ単独に応じたＳｙｋ／Ｚａｐ７０およびＥｒｋのリン酸化を経時的に示す等高線図を表す。
【図２３】ＣＬＬサンプルのＣＤ２０＋／ＣＤ５＋集団における、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭに応じたＳｙｋ、ＥｒｋおよびＢＬＮＫのリン酸化を経時的に示すヒストグラムを表す。
【図２４】ＣＬＬサンプルのＣＤ２０＋／ＣＤ５＋集団におけるＨ２Ｏ２処理後のｐＰＬＣγ２、ｐｒｐＳ６およびｐＣｂｌのリン酸化の動態学を示すヒストグラムを表す。
【図２５】ＣＬＬサンプルのＣＤ２０＋／ＣＤ５＋集団におけるＨ２Ｏ２処理後のｐＰＬＣγ２、ｐｒｐＳ６およびｐＣｂｌのリン酸化の動態学を示すヒストグラムを表す。
【図２６】ＢＣＲおよび／またはＨ２Ｏ２刺激に対するＣＬＬ患者末梢血サンプルの細胞内応答を示すヒートマップを表す。ＣＬＬは、サンプルがＣＬＬと診断された患者から採取されたことを示す。ＣＯＮは、サンプルが健常被験者から採取されたことを示す。患者サンプル数は、ヒートマップの上部に示されており、各カラムは単一の患者を表す。カラム内の網掛けの四角は、リンタンパク質ノードを表す。種々の網掛けは、各ノードのリン酸化の程度を表す（図の上部のスケールを参照のこと）。明るい白色（スケールのかなり右に位置する）は、最大の増大（すなわち、＋３．０Ｌｏｇ変化）を表す。黒色（スケールの中心に位置する）は、変化をほとんど示さないか、または全く示さず、濃い灰色（スケールのかなり左に位置する）は、リン酸化状態の最大の減少（すなわち、-３．０Ｌｏｇ変化）を表す。リン酸化のレベルは、未刺激のサンプルのＭＦＩで除した、刺激されたサンプルの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）のｌｏｇ１０倍の増大または減少を算出する方程式から導かれる。ヒートマップの列は、分析されたリンタンパク質の正体を示す。例えば、表示「ｐ−Ｂｌｎｋ／Ｈ２Ｏ２／Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭ」は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）およびＩｇＭ（Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭ）を認識するＦａｂ断片に応じた、リン酸化ＢＬＮＫのリン酸化状態が測定されたことを示す。「ＵＳ」は、サンプルが刺激されなかったことを示す。
【図２７】図２６に示されるヒートマップの下部を表す。白色の囲まれた四角は、シグナル伝達が、Ｈ２Ｏ２処理に応じて増大する（左側）またはシグナル伝達が、Ｈ２Ｏ２処理に応じて減少する（右側）、ＣＬＬ患者サンプルの２種の別個のクラスターを示す。
【図２８】Ｈ２Ｏ２処理によって区別される、２種の患者クラスター、１０／２２人の患者（上部左側の白色の囲まれた四角）および１１／２２人の患者（下部右側の白色の囲まれた四角）をさらに示す、図２６に示されたヒートマップの下部を表す。図の右側の挿絵は、Ｂ細胞受容体シグナル伝達経路を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明は、その他の出願および教本に開示された情報を組み込む。以下の特許およびその他の刊行物は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる：Ｈａｓｋｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、第５版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏ．、２００１年；Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第４版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年；ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ、第２版、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、２００２年；Ｍｉｃｈａｅｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐａｔｈｗａｙｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９年；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、２００７年；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊａｎｅｗａｙら、第７版、ＧａｒｌａｎｄならびにＬｅｒｏｉｔｈおよびＢｏｎｄｙ、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ａ  Ｍｕｌｔｉ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｔｒｅａｔｉｓｅ、第１Ａ巻および１Ｂ巻、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、１９９６年。参照により同様に組み込まれる特許および出願として、米国特許第７，３８１５３５号および同７，３９３，６５６号および米国特許出願番号（ＵＳＳＮ）第１０／１９３，４６２号、同１１／６５５，７８５号、同１１／６５５，７８９号、同１１／６５５，８２１号、同１１／３３８，９５７号、同６１／０４８，８８６号、同６１／０４８，９２０号、同６１／０４８，６５７号、同６１／０７９，７６６号、同６１／１５５，３６２号、同６１／０７９，５７９号、同６１／０７９，５３７号、同６１／０７９，５５１号、同６１／０８７，５５５号および同６１／０８５，７８９号が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態において有用である、いくつかの市販の試薬、プロトコール、ソフトウェアおよび機器は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｗｅｂｓｉｔｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｆｅａｔｕｒｅｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／およびＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｗｅｂｓｉｔｅ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｅｃｋｍａｎｃｏｕｌｔｅｒ．ｃｏｍ／Ｄｅｆａｕｌｔ．ａｓｐ？ｂｈｆｖ＝７で入手可能である。関連論文として、Ｈｉｇｈ−ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｄｒｕｇ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｋｒｕｔｚｉｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１２月２３日（２００７年）；Ｉｒｉｓｈら、ＦＬｔ３  ｌｉｇａｎｄ  Ｙ５９１  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｃｌ−２  ｏｖｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｒｅ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｐ５３、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ、（２００７年）、ＩｒｉｓｈらＭａｐｐｉｎｇ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ：ｔｏｗａｒｄｓ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、Ｎａｔｕｒｅ（２００６年）６：１４６〜１５５頁；およびＩｒｉｓｈら、Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ、Ｃｅｌｌ、（２００４年）１１８、１〜２０頁；Ｓｃｈｕｌｚ，Ｋ．  Ｒ．ら、Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、（２００７年）７８：８  ８．１７．１〜２０；Ｋｒｕｔｚｉｋ，Ｐ．Ｏ．ら、Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００５年）１７５（４）：２３５７〜６５頁；Ｋｒｕｔｚｉｋ，Ｐ．Ｏ．ら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００５年）１７５（４）：２３６６〜７３頁；Ｓｈｕｌｚら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００７年）７８：８．１７．１〜２０；ＳｔｅｌｚｅｒらＵｓｅ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ、Ｗｉｌｅｙ、２０００年；およびＫｒｕｔｚｉｋ，Ｐ．Ｏ．およびＮｏｌａｎ，Ｇ．Ｐ．、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｖｅｎｔｓ、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａ．（２００３年）５５（２）：６１〜７０頁；Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｔｈｅ  Ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、ＣＥＬＬ（２０００年）１００：５７〜７０頁；Ｋｒｕｔｚｉｋら、Ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  薬物ｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  （２００８年）４：１３２〜４２頁が挙げられる。実験および工程のプロトコールおよびその他の役立つ情報は、ｈｔｔｐ：／ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｅｓ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕで見出すことができる。以下に引用される論文およびその他の参考文献も、すべての目的のために、参照によりその全文が組み込まれる。
【００５５】
序論
いくつかの実施形態では、本発明は、診断、予後のための方法および組成物ならびに治療方法を対象とする。いくつかの実施形態では、例えば、疾患の診断または予後、治療のための患者選択において、治療をモニターし、治療計画を修正するために、また１種または薬剤の組合せとして投与してもよい治療薬の選択をさらに最適化するために、サンプル（例えば、臨床サンプル）中に存在する細胞の生理学的状態が用いられる。したがって、治療計画は、治療の経過に先立って、また治療の経過にわたって種々の時点で得られたデータによって、個別化し、目的に合わせ、それによって、個別に適当である計画を提供することができる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明は、疾患、例えば、腫瘍性疾患または造血疾患を有するか、有すると疑われる個体に由来するサンプルを分類する方法を対象とする。本発明は、予後的に、および治療上関連する、疾患のサブグループの同定ならびに個体の臨床経過の予測を可能にする。本発明の方法は、疾患を患っている個体の治療において有用なツール、例えば、それだけには限らないが、個体のための治療を選択する方法、個体の治療に対する応答を予測する方法、個体における治療の有効性決定する方法、リスク群を指定する方法、再発の危険の増大を予測する方法、続発性の合併症を発症する危険の増大を予測する方法および個体の予後を決定する方法を提供する。本発明は、疾患の経過、例えば、個体における腫瘍性状態または造血状態の経過が、侵襲性となるか、または緩徐進行型となるかどうかを予測するための予後指標として役立ち、それによって、患者を管理し、使用されるべき治療の様式を評価することにおいて臨床医を補助できる方法を提供する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本発明は、１種以上のモジュレーターを用いる治療の際の、細胞中の１種以上の活性化可能成分の活性化レベルを決定する方法を対象とする。１種以上のモジュレーターを用いる治療の際の、細胞中の活性化可能成分の活性化は、疾患において作用している経路を示すことができ、次いで、これを用いて、例えば、個体の治療を選択、個体の治療に対する応答を予測、個体における治療の有効性を決定できる。いくつかの実施形態では、モジュレーターそれ自体を、治療薬として個体内に直接使用してもよい。いくつかの実施形態では、活性化可能な物質の活性化を、疾患の経過を予測するための、危険群を同定するための、続発性合併症を発症する危険の増大を予測するための、および個体の予後を決定するための指標として用いてもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞を阻害剤と接触させるステップと、細胞中の活性化可能成分の活性化レベルの増大の有無を決定するステップと、活性化可能成分の活性化の増大の有無に基づいて細胞を分類するステップとによって、細胞を分類する方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、個体から得た細胞をモジュレーターおよび阻害剤に付すステップと、細胞中の活性化可能成分の活性化レベルを決定するステップと、モジュレーターおよび阻害剤を用いた治療の際の活性化レベルに基づいて状態の有無を決定するステップとによって、個体において状態の有無を決定する方法を対象とする。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞を阻害剤と接触させるステップと、細胞中の活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無を決定するステップと、活性化可能成分の活性化の変化の有無に基づいて細胞を分類するステップとによって、細胞を分類する方法を対象とする。いくつかの実施形態では、変化は増大である。いくつかの実施形態では、変化は減少である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞をモジュレーターに付すステップと、細胞中の持続性シグナル伝達経路に関与する活性化可能成分の活性化レベルを決定するステップと、活性化レベルから細胞における持続性シグナル伝達経路の状態を決定するステップとによって、細胞の持続性シグナル伝達状態を決定する方法を対象とする。細胞中の持続性シグナル伝達は、例えば、特定の分化した細胞特性または機能を維持するための、機能的結果を有し得る。本発明のいくつかの実施形態では、持続性シグナル伝達経路の状態を用いて、状態を集団における相違と相関させる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本発明は、別個の培養物中の細胞の集団を複数のモジュレーターに曝露し、モジュレーターの少なくとも１種が阻害剤であるステップと、別個の培養物の各々に由来する細胞集団において活性化可能成分の活性化レベルの増大の有無を決定するステップと、別個の培養物中の細胞の集団に由来する活性化可能成分の活性化の増大の有無に基づいて細胞集団を分類するステップとによって、細胞の集団の表現型プロフィールを決定する方法を対象とする。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞集団を、少なくとも１種のモジュレーターと接触させ、ここで、モジュレーターが、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ、Ｈ２Ｏ２、ＰＭＡ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＤＦ１ａ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＧＦ−１、イミキモド、ポリＣｐＧ、ＩＬ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、タプシガーギンおよび／またはそれらの組合せであるステップと、細胞集団における活性化可能成分の活性化レベルの増大の有無を決定するステップと、活性化可能成分の活性化の増大の有無に基づいて細胞集団を分類するステップとによって、細胞集団を分類する方法を対象とする。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本発明は、個体に由来する、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現するＣＬＬ細胞を、モジュレーターに付すステップと、複数の活性化可能成分の活性化レベルを決定するステップと、複数の活性化可能成分の活性化レベルのパターンを同定して、ＢＣＲの近位にあるシグナル伝達における変化の有無を決定し、変化の存在が臨床転帰を示すステップとによって、個体において、ＣＬＬ細胞の活性化状態を臨床転帰と相関させる、および／または、臨床転帰を用いて分類する方法を対象とする。
【００６４】
いくつかの実施形態では、細胞を分類する方法は、細胞を阻害剤と接触させるステップと、前記細胞中の少なくとも１種の活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無を決定するステップと、前記の少なくとも１種の活性化可能成分の活性化レベルの前記変化の前記有無に基づいて前記細胞を分類するステップとを含む。いくつかの実施形態では、変化は増大である。いくつかの実施形態では、変化は減少である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、細胞を分類する方法は、細胞内マーカー、細胞表面マーカーのレベルまたはそれらの任意の組合せを決定するステップをさらに含む。例えば、細胞は、活性化可能成分の活性化レベルの変化によって、また１種以上の細胞表面マーカーのレベルによって分類できる。さらに、細胞は、活性化可能成分の活性化レベルの変化によって、また細胞内マーカーのレベルによって分類できる。組合せも使用してよい。血清マーカーはまた、診断方法、予後方法、治療効果を決定する方法および／または治療を選択する方法においても有用である。
【００６６】
細胞内マーカー（例えば、リンタンパク質）に加え、１種以上の細胞表面マーカーもまた、本発明の方法において使用してよい。いくつかの実施形態では、方法は、複数の細胞表面マーカーのレベルを決定するステップを含む。細胞表面マーカーとして、フローサイトメトリーによって検出される任意の細胞表面分子を挙げることができる。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、ヒト白血球分化抗原である。いくつかの実施形態では、ヒト白血球分化抗原は、以下の一覧：ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ１００、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４およびＣＤ２８９から選択される。いくつかの実施形態では、ヒト白血球分化抗原は、ＣＤ１からＣＤ３００を含む一覧から選択される。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、任意の細胞表面受容体またはリガンドである。細胞表面リガンドおよび受容体の例として、それだけには限らないが、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー、インターロイキン、ホルモン、神経伝達物質、インターフェロン、増殖因子、ケモカイン、インテグリン、ｔｏｌｌ受容体リガンド、プロスタグランジンまたはロイコトリエンファミリーが挙げられる。細胞表面マーカーのその他の例として、それだけには限らないが、メタロプロテアーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、膜結合型ＩｇＭである。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）またはＢＣＲの成分である。いくつかの実施形態では、マーカーは、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７９、ＣＤ３８、ＣＤ９６、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラス１またはＭＨＣクラス２である。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、膜結合型ＩｇＤである。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、膜結合型ＩｇＧである。いくつかの実施形態では、細胞を分類する方法は、前記細胞上の少なくとも１種の細胞表面マーカーのレベルおよび前記細胞上の少なくとも１種の活性化可能成分の活性化レベルを決定するステップを含む。いくつかの実施形態では、細胞を分類する方法は、前記細胞上の細胞表面ＩｇＭのレベルを決定するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、前記細胞上の細胞表面ＩｇＤのレベルを決定するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、前記細胞上のＢＣＲのレベルを決定するステップを含む。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、疾病または疾患と関連している。いくつかの実施形態では、マーカーは、ＣＤ３８またはＣＤ９６である。いくつかの実施形態では、マーカーはＣＤ３８であり、疾患は白血病である。いくつかの実施形態では、マーカーはＣＤ９６であり、疾患は白血病である。
【００６７】
本発明の方法において、１種以上の細胞内マーカーを用いてもよい。これらのマーカーのレベルは、それらが分泌される前に決定でき、「捕獲される」と呼ばれる。捕獲される細胞内マーカーの例として、それだけには限らないが、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー、インターロイキン、ホルモン、神経伝達物質、インターフェロン、増殖因子、ケモカイン、インテグリン、プロスタグランジン、ロイコトリエンおよび上記のもののすべての受容体が挙げられる。細胞内マーカーの例としてまた、それだけには限らないが、メタロプロテアーゼが挙げられる。細胞内マーカーの例としてまた、それだけには限らないが、プログラム細胞死および増殖に関与するタンパク質が挙げられる。細胞内マーカーの例としてまた、それだけには限らないが、ウイルス、病原体、寄生生物およびそれらの成分または産物が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞を分類する方法は、細胞内病原体または病原体の成分のレベルを決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞内病原体はＨＩＶである。いくつかの実施形態では、細胞内病原体はＥＢＶである。いくつかの実施形態では、病原体の細胞内成分は、前記病原体に由来する核酸配列である。いくつかの実施形態では、病原体の細胞内成分は、病原体由来ポリペプチドである。
【００６８】
本発明の方法は、１種以上の血清マーカーのレベルを決定するステップを含み得る。いくつかの実施形態では、血清マーカーは、疾患のマーカーである。いくつかの実施形態では、血清マーカーは、炎症のマーカーである。いくつかの実施形態では、血清マーカーは、可溶性サイトカイン、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー、インターロイキン、ホルモン、神経伝達物質、インターフェロン、増殖因子、ケモカイン、インテグリン、プロスタグランジン、ロイコトリエンまたはそれらの任意の可溶性受容体である。いくつかの実施形態では、血清マーカーは、特定の疾病または疾患のマーカーである。いくつかの実施形態では、血清マーカーは、癌マーカーである。いくつかの実施形態では、血清マーカーは、白血病マーカーである。いくつかの実施形態では、血清マーカーは、β−２−ミクログロブリン、カルシトニン、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ５２、ＩＬ６、ＩＬ２Ｒ、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ１４、ＩｇＧ、チミジンキナーゼまたはフェリチンである。いくつかの実施形態では、血清マーカーは、医薬品、病原体、ウイルス、寄生生物、小化合物または毒素である。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、診断、予後、被験者または患者のための治療方法の決定のためのものである。いくつかの実施形態では、方法は、細胞または細胞の集団を分類するステップを含む。特定の実施形態では、診断、予後または治療方法を決定する方法は、被験者または患者に由来する少なくとも１種の血清マーカーのレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態では、血清マーカーは、サイトカイン、ケモカイン、可溶性受容体、増殖因子、抗体または結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、血清マーカーは病原体である。いくつかの実施形態では、血清マーカーは、薬剤化合物または医薬品である。
【００６９】
発明はまた、サンプル中の細胞の生理学的状態の決定において使用するためのキットを提供し、このキットは、シグナル伝達分子の１種以上の特異的結合成分を含み、１種以上の治療薬をさらに含み得る。キットは、生理学的状態のデータ分析のためのソフトウェアパッケージをさらに含む場合があり、これは、試験プロフィールと比較するための参照プロフィールを含み得る。
【００７０】
方法
いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、１種以上のモジュレーターと接触した際の活性化可能成分の活性化レベルを決定することによる、細胞の生理学的状態を決定する方法をはじめとする方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞経路中の活性化可能成分の状態によって細胞を分類する方法をはじめとする方法を提供する。情報は、予後および診断、例えば、疾患（単数または複数）に対する感受性、病状の状態および継代時間などの環境における変化に対する応答、薬物またはその他のモダリティーを用いた治療において使用できる。サンプル（例えば、臨床サンプル）中に提供される細胞の生理学的状態は、注目する細胞経路の活性化によって分類できる。細胞はまた、治療薬および治療に応じるその能力について分類できる。
【００７１】
１種以上の細胞または１種以上の細胞を含有するサンプルを、身体サンプル、例えば、それだけには限らないが、スメア、痰、生検、分泌物、脳脊髄液、胆汁、血液、リンパ液、尿および糞便、組織もしくは器官（例えば、肺）の洗浄液または乳房、肺、腸、皮膚、子宮頸部、前立腺および胃などの臓器から摘出された組織から単離できる。例えば、組織サンプルは、機能的に関連する細胞または隣接する細胞の領域を含み得る。このようなサンプルは、複雑な細胞の集団を含む場合があり、これは集団としてアッセイすることもでき、小集団に分けることもできる。このような細胞サンプルおよび無細胞サンプルは、遠心分離、水簸、密度勾配分離、アフェレーシス、親和性選択、パニング、ＦＡＣＳ、Ｈｙｐａｑｕｅを用いる遠心分離などによって分けることができる。特定の細胞種を用いて同定されるマーカーに特異的な抗体を使用することによって、相対的に均一な細胞の集団を得ることができる。あるいは、不均一な細胞集団を使用してもよい。細胞はまた、フィルターを使用することによって分離してもよい。例えば、全血を、所望の細胞種またはクラスを選択する孔径を含むよう操作されたフィルターに適用してもよい。米国特許出願番号０９／７９０，６７３号に開示されるように、５〜１０μｍの間の孔径のフィルターを使用することによって、稀な病原細胞を、希釈した、赤血球の溶解後の全血から濾過できる。その他の装置は、腫瘍細胞と血流を分けることができる、Ｄｅｍｉｒｃｉ  Ｕ、Ｔｏｎｅｒ  Ｍ．、Ｄｉｒｅｃｔ  ｅｔｃｈ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｎｄ  ｎａｎｏｈｅｉｇｈｔ  ｐｏｓｔ−ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ  ｄｒｏｐｌｅｔｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００６年；８８（５）、０５３１１７およびＩｒｉｍｉａ  Ｄ、Ｇｅｂａ  Ｄ、Ｔｏｎｅｒ  Ｍ．、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｇｒａｄｉｎｅｔ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００６年；７８：３４７２〜３４７７頁参照のこと。サンプルを得ると、直接使用してもよく、凍結してもよく、または適当な培養培地で短期間維持してもよい。本発明の方法に従って使用するための１種以上の細胞を単離する方法は、標準技術および当技術分野で十分に確立されたプロトコールに従って実施する。
【００７２】
適した細胞として、さまざまな病状、疾患でない状態とでさえ関連している細胞種が挙げられる。したがって、適した真核細胞種として、それだけには限らないが、すべての種類の腫瘍細胞（例えば、黒色腫、骨髄性白血病、肺、乳房、卵巣、結腸、腎臓、前立腺、膵臓および精巣の癌腫）、心筋細胞、樹状細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ細胞（Ｔ細胞およびＢ細胞）、肥満細胞、好酸球、血管内膜細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、赤血球、肝細胞、単核白血球をはじめとする白血球、造血系、神経、皮膚、肺、腎臓、肝臓などの幹細胞および筋幹細胞（分化および脱分化因子についてのスクリーニングにおいて使用するための）、破骨細胞、軟骨細胞およびその他の結合組織細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、肝臓細胞、腎臓細胞および脂肪細胞が挙げられる。適した細胞としてまた、原発疾患状態の細胞、例えば、原発腫瘍細胞が挙げられる。適した細胞としてまた、既知の研究細胞、例えば、それだけには限らないが、ＪｕｒｋａｔＴ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳなどが挙げられる。参照により本明細書に明確に組み込まれる、ＡＴＣＣ細胞系統カタログ参照のこと。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ウシ胎児血清、ウシ血清、ヒト血清、ブタ血清、ウマ血清またはヤギ血清などの血清の存在下または非存在下で、活性化可能成分（例えば、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ）の活性化レベルを示すのに適した培地で採取後に細胞を培養する。培地中に血清が存在する場合には、０．０００１％〜１００％の範囲のレベルで存在し得る。いくつかの実施形態では、血清は、．０００１％〜９０％の範囲のレベルで培地中に存在する。いくつかの実施形態では、血清は、０．０１％〜３０％の範囲のレベルで培地中に存在する。いくつかの実施形態では、血清は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０％で培地中に存在する。いくつかの実施形態では、血清は、任意の適したレベルで培地中に存在する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、細胞は、造血細胞である。造血細胞の例として、それだけには限らないが、多能性造血幹細胞、Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞、Ｔリンパ球系統前駆細胞または由来細胞、ＮＫ細胞系統前駆細胞または由来細胞、顆粒球系統前駆細胞または由来細胞、単球系統前駆細胞または由来細胞、巨核球系統前駆細胞または由来細胞および赤血球系統前駆細胞または由来細胞が挙げられる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明に用いられる細胞は、患者から採取される。本発明に用いられる細胞は、任意の適した方法によって全血から精製してもよい。
【００７６】
用語「患者」または「個体」は、本明細書において、ヒトならびにその他の哺乳類を含む。方法は、通常、活性化可能成分の状態を決定するステップを含む。方法はまた、複数の活性化可能成分の状態を決定するステップを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本発明は、１種以上のモジュレーターを用いる治療の際の細胞中の活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無を決定するステップと、活性化可能成分の活性化の変化の有無に基づいて細胞を分類するステップとによって細胞を分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、変化は減少である。いくつかの実施形態では、変化は増大である。本発明のいくつかの実施形態では、活性化可能成分の活性化レベルは、細胞を、活性化可能成分の活性化状態に特異的である結合成分と接触させるステップによって決定する。いくつかの実施形態では、細胞を、細胞をモジュレーターに付した後に、複数の活性化可能成分の活性化レベルによって分類する。本発明のいくつかの実施形態では、複数の活性化可能成分の活性化レベルは、細胞を、複数の結合成分を接触させるステップによって決定し、各結合成分は、活性化可能成分の活性化状態に特異的である。
【００７８】
活性化可能成分の状態による細胞の分類は、細胞を、臨床転帰と相関している細胞として分類することを含み得る。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、疾患の予後および／または診断である。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性疾患または造血疾患、例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンもしくはその他のリンパ腫、急性もしくは慢性白血病、赤血球増加症、血小板血症、多発性骨髄腫または形質細胞障害、例えば、アミロイドーシスおよびワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患、骨髄線維症または非定型免疫性リンパ球増殖の有無である。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患または造血疾患は、非Ｂ系統由来、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非Ｂ細胞リンパ腫、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患、骨髄線維症、赤血球増加症、血小板血症または非Ｂ非定型免疫性リンパ球増殖、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂリンパ球系統白血病、Ｂリンパ球系統リンパ腫、多発性骨髄腫または形質細胞障害、例えば、アミロイドーシスまたはワルデンシュトレームマクログロブリン血症である。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性疾患または造血疾患、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂリンパ球系統白血病、Ｂリンパ球系統リンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、前駆細胞Ｂリンパ芽球性白血病、ヘアリーセル白血病または形質細胞障害、例えば、アミロイドーシスまたはワルデンシュトレームマクログロブリン血症、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、それだけには限らないが、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫および辺縁帯リンパ腫の有無である。いくつかの実施形態では、疾患はＣＬＬである。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性疾患または造血疾患のステージ分類または類別である。ステージ分類の例として、それだけには限らないが、侵襲性、緩徐進行型、良性、難治性、ローマ数字ステージ分類、ＴＮＭステージ分類、Ｒａｉステージ分類、Ｂｉｎｅｔステージ分類、ＷＨＯ分類、ＦＡＢ分類、ＩＰＳＳスコア、ＷＰＳＳスコア、限局期、進行期、ＺＡＰ７０およびＣＤ３８などの細胞マーカーによるステージ分類、潜在性、例えば、進行までの時間、無進行生存、全生存または無再発生存に関して知らせうる情報を含む。
【００７９】
活性化可能成分の状態による細胞の分類は、細胞を、治療に対する患者の応答と相関している細胞として分類することを含み得る。いくつかの実施形態では、患者の応答は、完全応答、部分応答、結節性部分応答、応答なし、進行性疾患、安定疾患および有害反応からなる群から選択される。
【００８０】
活性化可能成分の状態による細胞の分類は、細胞を、最小残存病変または耐性の出現と相関している細胞として分類することを含み得る。
【００８１】
活性化可能成分の状態による細胞の分類は、治療方法を選択することを含み得る。治療方法の例として、それだけには限らないが、化学療法、生物療法、放射線療法、骨髄移植、末梢幹細胞移植、臍帯血移植、自家幹細胞移植、同種異系幹細胞移植、同系幹細胞移植、手術、導入療法、維持療法、待機療法およびホリスティック／代替療法が挙げられる。
【００８２】
モジュレーターとして、細胞シグナル伝達ネットワークに影響を及ぼし得る化合物または状態が挙げられる。モジュレーターは、アクチベーターまたは阻害剤であり得る。モジュレーターは、さまざまな環境入力の形をとり得る。モジュレーターの例として、それだけには限らないが、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、可溶性受容体、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド、病原体、寄生生物、病原体または寄生生物の成分、接着分子モジュレーター、薬剤化合物、薬物、ホルモン、小分子、ポリヌクレオチド、抗体、天然化合物、ラクトン、化学療法薬、免疫モジュレーター、炭水化物、プロテアーゼ、イオン、反応性酸素種、放射線照射、物理的パラメータ、例えば、熱、冷たさ、ＵＶ放射線照射、単独または細胞との関連でのペプチドおよびタンパク質断片、細胞自体、ウイルスならびに生物学的および非生物学的複合体（例えば、ビーズ、プレート、ウイルス外被、主要組織適合性複合体などの抗原提示分子）が挙げられる。モジュレーターの例として、それだけには限らないが、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ、リツキサン、アレムツズマブ、フルダラビン、シクロホスファミド、クロラムブシル、抗ＣＤ２２（エピラツズマブ）、抗ＣＤ２３（ルミリキシマブ）、Ｈ２Ｏ２、ＰＭＡ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＤＦ１ａ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＧＦ−１、イミキモド、ポリＣｐＧ、ＩＬ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−４、ＩＬ−２およびＩＬ−３が挙げられる。さらなるモジュレーター、阻害剤およびアクチベーターは、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＵＳ６１／０８５，７８９に開示されている。
【００８３】
いくつかの実施形態では、モジュレーターはアクチベーターである。いくつかの実施形態では、モジュレーターは阻害剤である。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞を阻害剤と接触させるステップと、細胞中の活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無を決定するステップと、活性化可能成分の活性化の変化の有無に基づいて細胞を分類するステップとによって、細胞を分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、変化は減少である。いくつかの実施形態では、変化は増大である。いくつかの実施形態では、細胞を、細胞を阻害剤に付した後の複数の活性化可能成分の活性化レベルにしたがって分類する。いくつかの実施形態では、阻害剤は、細胞中のシグナル伝達カスケードに関与する、細胞因子または複数の因子の阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、キナーゼまたはホスファターゼ阻害剤である。キナーゼ阻害剤の例として、アダフォスチン、ＡＧ４９０、ＡＧ８２５、ＡＧ９５７、ＡＧ１０２４、アロイシン、アロイシンＡ、アルステルパウロン、アミノゲニステイン、ＡＰＩ−２、アピゲニン、アルクチゲニン、ＡＹ−２２９８９、ＢＡＹ６１−３６０６、ビスインドリルマレイミドＩＸ、チェレリスリン、１０−［４’−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル］−２−クロロフェノキサジンヒドロクロリド、ダサチニブ、２−ジメチルアミノ−４，５，６，７−テトラブロモ−１Ｈ−ベンズイミダゾール、５，７−ジメトキシ−３−（４−ピリジニル）キノリンジヒドロクロリド、エデルホシン、エラグ酸、エンザスタウリン、マレイン酸ＥＲ２７３１９、エルロチニブ、ＥＴ１８ＯＣＨ３、ファスジル、フラボピリドール、ゲフィチニブ、ＧＷ５０７４、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−８９、ＨＡ−１００、ＨＡ−１００４、ＨＡ−１０７７、ＨＡ−１１００、ヒドロキシファスジル、インジルビン−３’−オキシム、５−ヨードツベルシジン、ケンパウロン、ＫＮ−６２、ＫＹ１２４２０、ＬＦＭ−Ａ１３、ラベンダスチンＡ、ルテオリン、ＬＹ−２９４００２、ＬＹ２９４００２、マロトキシン、ＭＬ−９、ＮＳＣ−１５４０２０、ＮＳＣ−２２６０８０、ＮＳＣ−２３１６３４、ＮＳＣ−６６４７０４、ＮＳＣ−６８０４１０、ＮＵ６１０２、オロモウシン、オキシインドールＩ、ＰＤ−１５３０３５、ＰＤ−９８０５９、ＰＤ１６９３１６、フロレチン、フロリジン、ピセタノール、ピクロポドフィリン、ＰＫＩ、ＰＰ１、ＰＰ２、プルバラノールＡ、ケルセチン、Ｒ４０６、Ｒ７８８、ラパミューン、ラパマイシン、Ｒｏ３１−８２２０、ロスコビチン、ロットレリン、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、シロリムス、ソラフェニブ、ＳＬ３２７、ＳＰ６００１２５、スタウロスポリン、ＳＴＩ−５７１、ＳＵ−１１２７４、ＳＵ１４９８、ＳＵ４３１２、ＳＵ６６５６、４，５，６，７−テトラブロモトリアゾール、ＴＧ１０１３４８、トリシリビン、チロホスチンＡＧ４９０、チロホスチンＡＧ８２５、チロホスチンＡＧ９５７、チロホスチンＡＧ１０２４、チロホスチンＳＵ１４９８、Ｕ０１２６、ＶＸ−５０９、ＶＸ−６６７、ＶＸ−６８０、Ｗ−７、ワートマニン、ＸＬ−０１９、ＸＬ−１４７、ＸＬ−１８４、ＸＬ−２２８、ＸＬ−２８１、ＸＬ−５１８、ＸＬ−６４７、ＸＬ−７６５、ＸＬ−８２０、ＸＬ−８４４、ＸＬ−８８０、Ｙ−２７６３２、ＺＤ−１８３９、ＺＭ−２５２８６８、ＺＭ−４４７４３９が挙げられる。ホスファターゼ阻害剤の例として、それだけには限らないが、Ｈ２Ｏ２、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、カンタリジン、（−）−ｐ−ブロモテトラミゾール、ミクロシスチンＬＲ、オルトバナジウム酸ナトリウム、過バナジン酸ナトリウム、硫酸バナジル、ナトリウムオキソジペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）バナデート、ビス（マルトラト）オキソバナジウム（ＩＶ）、モリブデン酸ナトリウム、過モリブデン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、イミダゾール、フッ化ナトリウム、β−グリセロフォスフェート、ピロリン酸ナトリウム十水和物、カリクリンＡ、ディスコデルミア・カリックス（Ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｉａ  ｃａｌｙｘ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ｍｐＶ（ｐｉｃ）、ＤＭＨＶ、シペルメトリン、デフォスタチン、オカダ酸、ＮＩＰＰ−１、Ｎ−（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロ−フェナントレン−２−イル）−２，２−ジメチル−プロピオンアミド、α−ブロモ−４−ヒドロキシアセトフェノン、４−ヒドロキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−メトキシアセトフェノン、４−メトキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−（カルボキシメトキシ）アセトフェノン、４−（カルボキシメトキシ）フェナシルＢｒおよびビス（４−トリフルオロメチルスルホンアミドフェニル）−１，４−ジイソプロピルベンゼン、フェニルアルシンオキシド（ｐｈｅｎｙａｒｓｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ）、ピロリジンジチオカルバメートおよびアルミニウムフルオリドが挙げられる。いくつかの実施形態では、ホスファターゼ阻害剤はＨ２Ｏ２である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、個体に由来する細胞を、モジュレーターおよび阻害剤に付すステップと、細胞中の活性化可能成分の活性化レベルを決定するステップと、活性化レベルに基づいて状態の有無を決定するステップとによって、個体において疾患の有無を決定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞中の複数の活性化可能成分の活性化レベルを決定する。阻害剤は、本明細書に記載される阻害剤であり得る。いくつかの実施形態では、阻害剤はホスファターゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤はＨ２Ｏ２である。モジュレーターは、本明細書に記載される任意のモジュレーターであり得る。いくつかの実施形態では、モジュレーターはＢ細胞受容体モジュレーターである。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体モジュレーターはＢ細胞受容体アクチベーターである。Ｂ細胞受容体アクチベーターの一例として、Ｂ細胞受容体複合体またはＢ細胞共受容体複合体のクロスリンカーがある。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、抗体または分子結合実体である。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は多価抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、固体表面との結合によってより多価にされた、またはエピトープ結合ドメインの局所結合価を増大するようナノ粒子表面に繋ぎ止められた、一価、二価または多価抗体である。
【００８５】
クロスリンカーは、分子結合実体であり得る。いくつかの実施形態では、分子結合実体は、炭水化物または複合体中のエピトープを介してＢ細胞受容体複合体に作用または結合する。いくつかの実施形態では、分子は、固体表面との結合によってより多価にされた、またはエピトープ結合ドメインの局所結合価を増大するようナノ粒子表面に繋ぎ止められた、一価、二価または多価である。
【００８６】
Ｂ細胞受容体複合体またはＢ細胞共受容体複合体のクロスリンクは、抗体または分子結合実体と細胞を結合させること、次いで、抗体または分子結合実体によるＢＣＲ複合体のクロスリンクを引き起こす、細胞と固体表面の相互作用によって、そのクロスリンクを引き起こすことを含み得る。
【００８７】
クロスリンカーは、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ポリクローナルＢＣＲ抗体、モノクローナルＢＣＲ抗体、Ｆｃ受容体由来結合成分および／またはそれらの組合せであり得る。Ｉｇは、マウス、ヤギ、ウサギ、ブタ、ラット、ウマ、ウシ、サメ、ニワトリ、ラマまたはヒトからなる群から選択される種に由来するものであり得る。Ｉｇまたは結合成分は、完全にヒトまたは部分的にヒトであり得、当技術分野で公知の任意の適した方法によって作製できる。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ、ポリクローナルＩｇＭ抗体、モノクローナルＩｇＭ抗体、ビオチン化Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＣＭ、ビオチン化ポリクローナルＩｇＭ抗体、ビオチン化モノクローナルＩｇＭ抗体および／またはそれらの組合せである。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、２種以上のモジュレーターの使用を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｂ細胞受容体アクチベーターおよびホスファターゼ阻害剤を利用する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭまたはビオチン化Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭおよびＨ２０２を利用する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、別個の培養物において、細胞の集団を複数のモジュレーターに曝露するステップと、細胞集団における活性化可能成分の状態を決定するステップとによって、細胞集団を分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞集団において複数の活性化可能成分の状態を決定する。いくつかの実施形態では、複数のモジュレーターのうちの少なくとも１種のモジュレーターは、阻害剤である。モジュレーターは、本明細書に記載される任意のモジュレーターであり得る。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ、Ｈ２Ｏ２、ＰＭＡ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＤＦ１ａ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＧＦ−１、イミキモド、ポリＣｐＧ、ＩＬ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、タプシガーギンおよびそれらの組合せからなる群から選択される。本発明のいくつかの実施形態では、細胞集団を、活性化可能成分の活性化状態に特異的である結合成分と接触させるステップによって、活性化可能成分の状態を決定する。いくつかの実施形態では、細胞集団を、複数の結合成分と接触させるステップによって複数の活性化可能成分の状態を決定し、ここで各結合成分は、活性化可能成分の活性化状態に特異的である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞集団を、少なくとも１種のモジュレーターと接触させるステップ（モジュレーターは、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ、リツキサン、アレムツズマブ、抗ＣＤ２２（エピラツズマブ）、抗ＣＤ２３（ルミリキシマブ）、キャンパス、Ｈ２Ｏ２、ＰＭＡ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＤＦ１ａ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＧＦ−１、イミキモド、ポリＣｐＧ、フルダラビン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ＩＬ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、タプシガーギンおよび／またはそれらの組合せに対するものである）と、細胞集団における活性化可能成分の状態を決定するステップとによって、細胞集団を分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞集団において複数の活性化可能成分の状態を決定する。本発明のいくつかの実施形態では、細胞集団を、活性化可能成分の活性化状態に特異的である結合成分と接触させるステップによって活性化可能成分の状態を決定する。いくつかの実施形態では、細胞集団を、各結合成分が、活性化可能成分の活性化状態に特異的である複数の結合成分と接触させるステップによって、複数の活性化可能成分の状態を決定する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、別個の培養物において、細胞の集団を複数のモジュレーターに曝露し、モジュレーターの少なくとも１種が阻害剤であるステップと、別個の培養物の各々に由来する細胞集団における活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無を決定するステップと、別個の培養物の各々に由来する活性化可能成分の活性化の変化の有無に基づいて細胞集団を分類するステップによって、細胞の集団の表現型プロフィールを決定することを提供する。いくつかの実施形態では、変化は減少である。いくつかの実施形態では、変化は増大である。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ、リツキサン、アレムツズマブ、抗ＣＤ２２（エピラツズマブ）、抗ＣＤ２３（ルミリキシマブ）、キャンパス、Ｈ２Ｏ２、ＰＭＡ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＤＦ１ａ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＧＦ−１、イミキモド、ポリＣｐＧ、フルダラビン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ＩＬ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、タプシガーギンおよびそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞集団において複数の活性化可能成分の状態を決定する。いくつかの実施形態では、細胞の集団の表現型プロフィールを用いて、本明細書に記載される集団を分類する。いくつかの実施形態では、細胞集団を、活性化可能成分の活性化状態に特異的である結合成分と接触させるステップによって、活性化可能成分の活性化レベルの増大の有無を決定する。いくつかの実施形態では、細胞集団を、各結合成分が、活性化可能成分の活性化状態に特異的である複数の結合成分と接触させるステップによって、複数の活性化可能成分の状態を決定する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞をモジュレーターと接触させるステップと、細胞中の活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無を決定するステップと、活性化可能成分の活性化の変化の有無に基づいて細胞を分類するステップとによって、本明細書に記載されるＢリンパ球前駆細胞または由来細胞を分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、変化は減少である。いくつかの実施形態では、変化は増大である。いくつかの実施形態では、活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無を、細胞を、活性化可能成分の活性化状態に特異的である結合成分と接触させるステップによって決定する。いくつかの実施形態では、Ｂリンパ球前駆細胞または由来細胞を、細胞をモジュレーターに付した後の、複数の活性化可能成分の活性化レベルによって分類する。いくつかの実施形態では、複数の活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無を、細胞集団を、各結合成分が活性化可能成分の活性化状態に特異的である複数の結合成分と接触させるステップによって決定する。いくつかの実施形態では、Ｂリンパ球前駆細胞または由来細胞を分類する方法は、少なくとも１種の細胞表面マーカーのレベルを決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｂリンパ球前駆細胞または由来細胞を分類する方法は、少なくとも１種の細胞内マーカー、例えば、捕獲された細胞内サイトカインのレベルを決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｂリンパ球前駆細胞または由来細胞は、腫瘍性または造血疾患のような疾患と関連している。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、細胞をモジュレーターと接触させるステップと、細胞中の１種以上の活性化可能成分の活性化レベルの変化の有無を決定するステップと、１種以上の活性化可能成分の活性化の変化の有無に基づいて細胞を分類するステップとによって、疾患（例えば、腫瘍性または造血疾患）と関連するＢリンパ球前駆細胞または由来細胞を分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、変化は減少である。いくつかの実施形態では、変化は増大である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明は、個体に由来するＣＬＬ細胞をモジュレーターに付し、ここでＣＬＬ細胞がＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現するステップと、複数の活性化可能成分の活性化レベルを決定するステップと、複数の活性化可能成分の活性化レベルのパターンを同定して、ＢＣＲの近位にあるシグナル伝達における変化の有無を決定し、変化の存在が臨床転帰を示すステップとによって、個体において、ＣＬＬ細胞の活性化状態を、臨床転帰と相関させる、および／または、臨床転帰を用いて分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、複数の活性化可能成分の活性化レベルを、細胞を複数の結合成分を接触させ、各結合成分が、活性化可能成分の活性化状態に特異的であるステップによって決定する。臨床転帰は、本明細書に記載される任意の臨床転帰であり得る。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞をモジュレーターに付すステップと、細胞中の持続性シグナル伝達経路に関与する活性化可能成分の活性化レベルを決定するステップと、活性化レベルから細胞における持続性シグナル伝達経路の状態を決定するステップとによって、細胞の持続性シグナル伝達状態を決定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞集団中の複数の活性化可能成分の状態を決定する。いくつかの実施形態では、細胞を、活性化可能成分の活性化状態に特異的である結合成分と接触させるステップによって、活性化可能成分の活性化レベルを決定する。いくつかの実施形態では、細胞を、複数の結合成分と接触させ、各結合成分が、活性化可能成分の活性化状態に特異的であるステップによって、複数の活性化可能成分の活性化レベルを決定する。いくつかの実施形態では、持続性シグナル伝達は、細胞受容体持続性シグナル伝達である。いくつかの実施形態では、持続性シグナル伝達は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）持続性シグナル伝達である。いくつかの実施形態では、持続性シグナル伝達は、ＢＣＲ持続性シグナル伝達である。いくつかの実施形態では、細胞における持続性シグナル伝達状態を使用して、本明細書に記載される細胞を分類する。
【００９５】
本明細書に記載されるものを含めた当技術分野で公知の方法を用いて、１種以上の活性化可能成分パターンおよびプロフィールを検出する。いくつかの実施形態では、細胞経路の細胞成分である活性化可能成分のパターンおよびプロフィールを、本明細書に記載される方法を用いて検出する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路の細胞成分である活性化可能成分のパターンおよびプロフィールを、本明細書に記載される方法を用いて検出する。いくつかの実施形態では、持続性シグナル伝達経路の細胞成分である活性化可能成分のパターンおよびプロフィールを、本明細書に記載される方法を用いて検出する。例えば、１種以上のリン酸化ポリペプチドのパターンおよびプロフィールを、本明細書に記載されるものを含めた当技術分野で公知の方法を用いて検出する。
【００９６】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、疾患と関連している細胞（例えば、癌細胞）以外の細胞（例えば、正常な非形質転換細胞）を用いて、臨床判断を行うことができる。すなわち、疾患と関連している細胞（例えば、癌細胞）以外の細胞は、実際、疾患過程を反映している。正常細胞（例えば、健常細胞または非形質転換細胞）を、例えば、危険群を割り当てること、再発の危険の増大を予測すること、続発性の合併症を発症する危険の増大を予測すること、個体のための治療を選択すること、個体の治療に対する応答を予測すること、個体における治療の効力を予測すること、および／または、個体の予後を決定することにおいて使用してもよい。すなわち、疾患と関連している細胞（例えば、癌細胞）以外の細胞は、実際、疾患過程を反映している。例えば、癌の場合には、浸潤性免疫細胞は、疾患の転帰を決定し得る。別の態様では、癌患者の血液中の癌細胞および応答している免疫細胞からの情報の組合せは癌の診断または予後のために使用できる。
【００９７】
状態
本発明の方法は、細胞における生理学的状態の変化を伴う、それによって示される、および／または、全体または一部においてそれに起因する、個体における任意の疾患に適用できる。用語「生理学的状態」は、細胞における機械的機能、物理的機能および生化学的機能を含む。いくつかの実施形態では、細胞の生理学的状態は、細胞経路の細胞成分の特徴を測定することによって決定される。細胞経路は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、細胞経路は、シグナル伝達経路である。シグナル伝達経路もまた、当技術分野で周知である（例えば、Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ．、Ｃｅｌｌ（２０００年）１００（１）：１１３〜２７頁；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、２００２年カタログ、Ｐａｔｈｗａｙ  Ｄｉａｇｒａｍｓ  ｐｇｓ．  ２３２〜２５３参照のこと）。本明細書において教示されるように、生理学的状態の変化を伴う、またはそれを特徴とする疾患は、例えば、１種以上の活性化可能成分の細胞における状態を容易に同定できる。
【００９８】
本発明の特定の実施形態では、疾患は、腫瘍性疾患または造血疾患である。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患または造血疾患は、非ホジキンリンパ腫、ホジキンまたはその他のリンパ腫、急性または慢性白血病、赤血球増加症、血小板血症、多発性骨髄腫および形質細胞障害、例えば、アミロイドーシスおよびワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨髄異形成障害、骨髄増殖性障害、骨髄線維症および非定型免疫性リンパ球増殖からなる群から選択される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患または造血疾患は、非Ｂ系統由来のものである。非Ｂ系統由来腫瘍性疾患または造血疾患の例として、それだけには限らないが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非Ｂ細胞リンパ腫、骨髄異形成障害、骨髄増殖性疾患、骨髄線維症、赤血球増加症、血小板血症および非Ｂ非定型免疫性リンパ球増殖が挙げられる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患または造血疾患は、Ｂ細胞またはＢ細胞系統由来障害である。Ｂ細胞またはＢ細胞系統由来腫瘍性疾患または造血疾患の例として、それだけには限らないが、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂリンパ球系統白血病、Ｂリンパ球系統リンパ腫、多発性骨髄腫および形質細胞障害、例えば、アミロイドーシスおよびワルデンシュトレームマクログロブリン血症が挙げられる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、疾患はＣＬＬである。いくつかの実施形態では、ＣＬＬは、ＣＤ１９およびＣＤ２３とともにＣＤ５を、またはＣＤ２０およびＣＤ２３とともにＣＤ５を同時発現するモノクローナルＢ細胞集団によって、ならびに表面免疫グロブリン発現によって定義される。いくつかの実施形態では、ＣＬＬは、ＣＤ１９およびＣＤ２３とともにＣＤ５を、またはＣＤ２０およびＣＤ２３とともにＣＤ５を同時発現するモノクローナルＢ細胞集団によって、ならびにかすかな表面免疫グロブリン発現によって定義される。
【０１０２】
本発明の範囲内のその他の疾患として、それだけには限らないが、神経膠腫、肺癌、結腸癌および前立腺癌などの癌が挙げられる。多数の癌について、特定のシグナル伝達経路の変化が記載されている。例えば、前立腺癌におけるＰＴＥＮの喪失および結果として起こるＡｋｔシグナル伝達の活性化（Ｗｈａｎｇ  Ｙ  Ｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９８年４月２８日；９５（９）：５２４６〜５０頁）、前立腺癌におけるＩＧＦ−１発現の増大（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８年１０月９日、２８２：１９９ａ）、神経膠腫癌におけるＥＧＦＲ過剰発現および結果として起こるＥＲＫ活性化（Ｔｈｏｍａｓ  Ｃ  Ｙ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍａｒ．  １０、２００３年；１０４（１）：１９〜２７頁）、乳癌におけるＨＥＲ２の発現（Ｍｅｎａｒｄら．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００３年９月２９日、２２（４２）：６５７０〜８頁）ならびに結腸癌におけるＡＰＣ変異およびＷｎｔシグナル伝達の活性化（Ｂｉｅｎｚ  Ｍ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  １９９９年１０月、９（５）：５９５〜６０３頁）。
【０１０３】
生理学的状態の変化を伴う癌以外の疾患も、本発明によって包含される。例えば、糖尿病は、根底にあるシグナル伝達の変化、すなわち、インスリンに対する耐性およびＩＲＳを介して下流シグナル伝達を活性化できないことを含むことがわかっている（Ｂｕｒｋｓ  Ｄ  Ｊ、Ｗｈｉｔｅ  Ｍ  Ｆ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００１年２月；５０  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ１４０−５）。同様に、心血管疾患は、ＰＫＣファミリーなどの複数の経路に関与する心臓細胞の肥大を伴うことがわかっている（Ｍａｌｈｏｔｒａ  Ａ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００１年９月；２２５（１−）：９７〜１０７頁）。関節リウマチなどの炎症性疾患は、ケモカイン受容体および下流シグナル伝達の混乱を伴うことがわかっている（Ｄ’Ａｍｂｒｏｓｉｏ  Ｄ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２００３年２月；２７３（１−２）：３〜１３頁）。本発明は、細胞機能の変化を伴うと現在わかっている疾患に制限されず、生理学的変化または異常を伴うと後に示される疾患を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本発明は、疾患を有するか、有すると疑われる個体に由来するサンプル中の１種以上の細胞を分類する方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、予後的に、また治療上関連のある、疾患のサブグループの同定および個体の臨床経過の予測を可能にする。いくつかの実施形態では、本発明は、疾患を有するか、有すると疑われる個体に由来する細胞中の１種以上の活性化可能成分の活性化レベルにしたがって、細胞を分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、分類は、細胞を、臨床転帰と相関している細胞として分類することを含む。臨床転帰は、疾患の予後および／もしくは診断ならびに／または疾患のステージ分類または類別であり得る。いくつかの実施形態では、細胞を分類することは、細胞を、治療に対する患者の応答と相関している細胞として分類することを含む。いくつかの実施形態では、細胞を分類することは、細胞を、最小残存病変または耐性の出現と相関している細胞として分類することを含む。
【０１０５】
活性化可能成分
本発明の方法および組成物を使用して、細胞経路の任意の活性化可能成分またはこのような活性化可能成分の集合の状態を調べ、プロファイルすることができる。単一または複数の別個の経路をプロファイルすることができる（逐次または同時に）、単一経路内の、または複数の経路にわたる活性化可能成分のサブセットを調べることができる（やはり、逐次または同時に）。
【０１０６】
当業者には明らかであろうが、さまざまな活性化事象を本発明において使用できる。一般に、基本的な要件は、活性化が、いくつかの表れ（「活性化状態指標」と呼ばれる）によって、好ましくは、標識された結合成分の結合の変化によって、または検出可能な生物学的活性の変化によって検出可能である活性化可能なタンパク質における変化をもたらすことである（例えば、活性化状態は、測定して非活性化状態における活性の不足と比較できる酵素活性を有する）。重要なことは、検出可能な事象または部分を用いて、２種以上の活性化状態間（例えば、「オフ」と「オン」）を区別することである。
【０１０７】
個々の活性化可能成分の活性化状態は、オンまたはオフ状態のいずれかである。例示的実施例として、いずれの理論にも制限されようとは思わないが、タンパク質上の個々のリン酸化可能部位は、タンパク質を活性化または不活化できる。用語「オン」および「オフ」は、細胞構成成分の一部である活性化可能成分に適用される場合は、活性化可能成分の状態を説明するよう本明細書において使用され、一部である細胞構成成分の全体的な状態を説明しない。一般に、細胞は、特定の活性化可能成分とともに複数の特定のタンパク質またはその他の構成成分を有し、この複数のタンパク質または構成成分は、通常、その個々の活性化可能成分がオン状態にあるいくつかのタンパク質または構成成分と、その個々の活性化可能成分がオフ状態にあるその他のタンパク質または構成成分とを有する。特定の活性化状態を認識する結合成分の使用によって活性化可能成分各々の活性化状態が測定されるので、活性化可能成分の総数のいくつかの画分を表す、結合成分によって認識される特定の活性化状態にある活性化可能成分のみが、結合成分によって結合されて、測定可能なシグナルを生じる。単細胞において活性化される特定の種類の個々の活性化可能成分の合計に相当する測定可能なシグナルが、その細胞中のその活性化可能成分の「活性化レベル」である。
【０１０８】
特定の活性化可能成分の活性化レベルは、個々の細胞間で変わる場合があり、その結果、複数の細胞が分析される場合には、活性化レベルは分布をなす。分布は、ガウス分布としても知られる正規分布である場合も、別の種類である場合もある。種々の細胞集団が、活性化レベルの種々の分布を有し得、次いで、これは集団間を区別するのに役立ち得る。いくつかの実施形態では、細胞を分類する根拠は、１種以上の特定の活性化可能成分の活性化レベルの分布は、異なる表現型間で異なるということである。細胞または細胞の集団における１種以上の活性化可能成分の特定の活性化レベル、またはより通常は、活性化レベルの範囲は、その細胞または細胞の集団が特徴的な表現型に属することを示す。活性化可能成分の活性化レベルに加えて、活性化可能成分を含まない可能性がある生体分子の細胞レベル（例えば、発現レベル）などのその他の測定値を用いて、細胞を分類することもでき、当然のことではあるが、これらのレベルも、活性化可能成分と同様に分布をなす。したがって、細胞または細胞の集団の、１種以上の活性化可能成分の活性化レベル（単数または複数）は、場合により、活性化可能成分を含まない可能性がある生体分子の１種以上のレベルとともに用いて、細胞または細胞の集団をクラスに分類してもよい。個々の単細胞の細胞内活性化可能成分の活性化レベルは、それらを１種以上のクラス、例えば、一表現型に対応するクラスに分類することができることがわかっている。クラスは、どの細胞も、１種以上の細胞内活性化可能成分の、同一または実質的に同一の既知活性化レベル、または活性化レベルの範囲を有する、細胞のクラスを包含する。例えば、５種の細胞内活性化可能成分の活性化レベルが分析される場合には、１種以上の細胞内活性化可能成分を包含する所定のクラスが、これら５種の成分の各々の活性化レベルまたは活性化レベルの範囲に基づいて構築され得る。活性化レベルは、分布として存在し得ること、および細胞を分類するために使用される特定の成分の活性化レベルは、分布上の特定の点であり得、より通常は、分布の部分であり得るということは理解される。
【０１０９】
細胞内活性化可能成分の活性化レベルに加え、細胞内または細胞外生体分子、例えば、タンパク質の発現レベルを単独または活性化可能成分の活性化状態と組み合わせて用いて、細胞を分類できる。さらに、さらなる細胞成分、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、炭水化物、代謝産物などといった生体分子または分子複合体を、活性化可能な状態または発現レベルと組み合わせて、本明細書に包含される細胞の分類に用いてもよい。
【０１１０】
また、いくつかの実施形態では、細胞構成成分の状態に影響を及ぼすその他の特徴を用いて細胞を分類してもよい。例として、生体分子の転位またはその代謝回転速度の変化ならびに生体分子の複合体の形成および解離が挙げられる。このような複合体として、多タンパク質複合体、多脂質複合体、ホモまたはヘテロ二量体またはオリゴマーおよびそれらの組合せを挙げることができる。その他の特徴として、例えば、細胞外プロテアーゼに対する細胞の曝露に由来する、または生体分子の細胞内タンパク質切断に由来するタンパク質切断が挙げられる。
【０１１１】
また、細胞外または細胞内マーカーの発現レベル、核内抗原、酵素活性、タンパク質発現および局在性、細胞周期分析、染色体分析、細胞容積および核の粒度および大きさのような形態的特徴またはその他の際立った特徴などのさらなる要素を用いて細胞を分類してもよい。例えば、Ｂ細胞を、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７９、ＣＤ３８、ＣＤ９６、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラス１またはＭＨＣクラス２などの細胞表面マーカーの発現に基づいてさらに細分類できる。
【０１１２】
あるいは、所定のクラスの細胞を、１種以上のさらなる所定のクラスに含まれることまたは細胞外および／もしくは細胞内マーカーの存在、類似の遺伝子発現プロフィール、変異状態、エピジェネティックサイレンシング、核内抗原、酵素活性、タンパク質発現および局在性、細胞周期分析、染色体分析、細胞容積および核の粒度および大きさのような形態的特徴またはその他の際立った特徴を含み得る、共有される特徴に基づいて分類できる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、１種以上の細胞の生理学的状態を、細胞経路中の１種以上の活性化可能成分の活性化レベルを調べることおよびプロファイリングすることによって決定する。いくつかの実施形態では、細胞を、複数の活性化可能成分の活性化レベルに従って分類する。いくつかの実施形態では、造血細胞を、複数の活性化可能成分の活性化レベルに従って分類する。いくつかの実施形態では、造血細胞の１種以上の活性化可能成分の活性化レベルは、疾患と相関している。いくつかの実施形態では、造血細胞の１種以上の活性化可能成分の活性化レベルは、本明細書に記載されるような腫瘍性疾患または造血疾患と相関している。造血細胞の例として、それだけには限らないが、多能性造血幹細胞、骨髄系前駆細胞、Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞、Ｔリンパ球系統前駆細胞または由来細胞、ＮＫ細胞系統前駆細胞または由来細胞、顆粒球系統前駆細胞または由来細胞、単球系統前駆細胞または由来細胞、巨核球系統前駆細胞または由来細胞および赤血球系統前駆細胞または由来細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、造血細胞は、本明細書に記載されるようなＢリンパ球系統前駆細胞または由来細胞である。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、サンプル内の単細胞中の１種以上の活性化可能成分の活性化レベルを決定する。活性化可能成分を含み得る細胞構成成分として、限定するものではないが、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸および代謝産物が挙げられる。活性化可能成分は、細胞構成成分の一部、例えば、リン酸化を受け得るタンパク質中のアミノ酸残基であり得、または細胞構成成分自体、例えば、細胞の一部から別の部分への転位、コンホメーションの変化（例えば、ｐＨまたはイオン濃度の変化による）によって、タンパク質切断などによって活性化されるタンパク質であり得る。活性化すると、活性化可能成分に変化、例えば、活性化可能成分の共有結合修飾（例えば、活性化可能成分への分子またはグループの結合、例えば、それだけには限らないが、リン酸化、アセチル化、メチル化、ユビキチン化）またはコンホメーション変化が生じる。このような変化は、通常、活性化可能成分を含む細胞構成成分の特定の生物学的、生化学的または物理的特性の変化の一因となる。活性化可能成分を含む細胞構成成分の状態は、必ずしも完全にではないが、ある程度は、細胞構成成分の特定の活性化可能成分の活性化の状態によって決定される。例えば、タンパク質は、複数の活性化可能成分を有する場合があり、これらの成分の特定の活性化状態が、タンパク質の活性化状態を全体的に決定し得、単一の活性化可能成分の状態は必ずしも決定的なものではない。その他のタンパク質の結合、ｐＨ、イオン濃度、その他の細胞構成成分との相互作用などといったさらなる因子も、細胞構成成分の状態に影響を及ぼし得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、単細胞中の複数の細胞内活性化可能成分の活性化レベルを決定する。いくつかの実施形態では、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０種を超える細胞内活性化可能成分を決定する。
【０１１６】
活性化可能成分の活性化状態は、生体分子の化学物質付加または修飾に起因し得、そのようなものとして、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、メチル化、ビオチン化、グルタミル化、グリシル化、水酸化、異性化、プレニル化、ミリストイル化、リポイル化、ホスホパンテテイン化、硫酸化、ＩＳＧ化、ニトロシル化、パルミトイル化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化、ＮＥＤＤ８化、シトルリン化、アミド化およびジスルフィド結合形成、ジスルフィド結合還元などの生化学的過程が挙げられる。その他の可能性ある、生体分子の化学物質付加または修飾として、タンパク質カルボニルの形成、ｏ−チロシン、クロロ−、ニトロチロシンおよびジチロシンなどのタンパク質側鎖の直接修飾ならびに炭水化物および脂質誘導体との反応に起因するタンパク質付加体が挙げられる。その他の修飾は、リガンドの結合またはアロステリックモジュレーターの結合などの非共有結合であり得る。
【０１１７】
活性化可能成分を含み得るタンパク質の例として、それだけには限らないが、キナーゼ、ホスファターゼ、脂質シグナル伝達分子、アダプター／スキャフォールドタンパク質、サイトカイン、サイトカイン調節物質、ユビキチン化酵素、接着分子、細胞骨格／収縮タンパク質、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、低分子量ＧＴＰアーゼ、グアニンヌクレオチド交換因子、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質、カスパーゼ、アポトーシスに関与するタンパク質（例えば、ＰＡＲＰ）、細胞周期調節物質、分子シャペロン、代謝酵素、小胞輸送タンパク質、ヒドロキシラーゼ、イソメラーゼ、脱アセチル化酵素、メチラーゼ、脱メチル化酵素、腫瘍抑制遺伝子、プロテアーゼ、イオンチャンネル、分子輸送体、転写因子／ＤＮＡ結合因子、転写の調節物質および翻訳の調節物質が挙げられる。活性化可能成分、活性化状態および活性化可能成分の活性化レベルを決定する方法の例は、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、「単細胞中の複数のタンパク質の活性化状態を検出するための方法および組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ）」と題された米国公開番号第２００６００７３４７４号および「リスク層別化のための方法および組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｒｉｓｋ  ｓｔｒａｔｆｉｃａｔｉｏｎ）」と題されたＵＳ７，３９３，６５６に記載されている。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＨＥＲ受容体、ＰＤＧＦ受容体、Ｋｉｔ受容体、ＦＧＦ受容体、Ｅｐｈ受容体、Ｔｒｋ受容体、ＩＧＦ受容体、インスリン受容体、Ｍｅｔ受容体、Ｒｅｔ、ＶＥＧＦ受容体、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＦＡＫ、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、Ｊａｋ３、Ｔｙｋ２、Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｆｇｒ、Ｙｅｓ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｂｔｋ、ＺＡＰ７０、Ｓｙｋ、ＩＲＡＫｓ、ｃＲａｆ、ＡＲａｆ、ＢＲＡＦ、Ｍｏｓ、Ｌｉｍキナーゼ、ＩＬＫ、Ｔｐｌ、ＡＬＫ、ＴＧＦβ受容体、ＢＭＰ受容体、ＭＥＫＫ、ＡＳＫ、ＭＬＫ、ＤＬＫ、ＰＡＫ、Ｍｅｋ１、Ｍｅｋ２、ＭＫＫ３／６、ＭＫＫ４／７、ＡＳＫ１、Ｃｏｔ、ＮＩＫ、Ｂｕｂ、Ｍｙｔ１、Ｗｅｅ１、カゼインキナーゼ、ＰＤＫ１、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、ｐ９０Ｒｓｋｓ、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、Ｐｒｋｓ、ＰＫＣ、ＰＫＡ、ＲＯＣＫ１、ＲＯＣＫ２、オーロラ、ＣａＭＫ、ＭＮＫ、ＡＭＰＫ、ＭＥＬＫ、ＭＡＲＫ、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＬＫＢ−１、ＭＡＰＫＡＰＫ、Ｐｉｍ１、Ｐｉｍ２、Ｐｉｍ３、ＩＫＫ、Ｃｄｋ、Ｊｎｋ、Ｅｒｋ、ＩＫＫ、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、Ｃｄｋ、ＣＬＫ、ＰＫＲ、ＰＩ３−キナーゼクラス１、クラス２、クラス３、ｍＴｏｒ、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ１，２，３、ｐ３８、ＰＫＲ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）、ＬＡＲホスファターゼ、ＣＤ４５、非受容体チロシンホスファターゼ（ＮＰＲＴＰ）、ＳＨＰ、ＭＡＰキナーゼホスファターゼ（ＭＫＰ）、二重特異性ホスファターゼ（ＤＵＳＰ）、ＣＤＣ２５ホスファターゼ、低分子量チロシンホスファターゼ、Ｅｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔ（ＥＹＡ）チロシンホスファターゼ、Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔホスファターゼ（ＳＳＨ）、セリンホスファターゼ、ＰＰ２Ａ、ＰＰ２Ｂ、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ１、ＰＰ５、イノシトールホスファターゼ、ＰＴＥＮ、ＳＨＩＰ、ミオチューブラリン、ホスホイノシチドキナーゼ、ホスホリパーゼ、プロスタグランジンシンターゼ、５−リポキシゲナーゼ、スフィンゴシンキナーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、アダプター／スキャフォールドタンパク質、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ＢＬＮＫ、ＬＡＴ、ＰＩ３−キナーゼのＢ細胞アダプター（ＢＣＡＰ）、ＳＬＡＰ、Ｄｏｋ、ＫＳＲ、ＭｙＤ８８、Ｃｒｋ、ＣｒｋＬ、ＧＡＤ、Ｎｃｋ、Ｇｒｂ２関連バインダー（ＧＡＢ）、Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＲＩＰ、Ｔ細胞白血病ファミリー、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−６、インターフェロンγ、インターフェロンα、サイトカインシグナル伝達の抑制因子（ＳＯＣ）、Ｃｂｌ、ＳＣＦユビキチン化リガーゼ複合体、ＡＰＣ／Ｃ、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン様接着分子、セレクチン、カドヘリン、カテニン、接着斑キナーゼ、ｐ１３０ＣＡＳ、フォドリン、アクチン、パキシリン、ミオシン、ミオシン結合タンパク質、チューブリン、ｅｇ５／ＫＳＰ、ＣＥＮＰｓ、β−アドレナリン受容体、ムスカリン性受容体、アデニニルシクラーゼ受容体、低分子量ＧＴＰアーゼ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｒａｎ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｃｄｃ４２、Ａｒｆ、ＲＡＢ、ＲＨＥＢ、Ｖａｖ、Ｔｉａｍ���Ｓｏｓ、Ｄｂｌ、ＰＲＫ、ＴＳＣ１、２、Ｒａｓ−ＧＡＰ、Ａｒｆ−ＧＡＰｓ、Ｒｈｏ−ＧＡＰｓ、カスパーゼ、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ＰＡＲＰ、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ａ１、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂｉｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｂｍｆ、Ｈｒｋ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＩＡＰｓ、ＸＩＡＰ、Ｓｍａｃ、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ６、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ１、Ｃｄｋ７、サイクリンＤ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、Ｒｂ、ｐ１６、ｐ１４Ａｒｆ、ｐ２７ＫＩＰ、ｐ２１ＣＩＰ、分子シャペロン、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ２７、代謝酵素、アセチル−ＣｏＡａカルボキシラーゼ、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、一酸化窒素合成酵素、カベオリン、エンドソーム輸送選別複合体（ＥＳＣＲＴ）タンパク質、小胞タンパク質選別（Ｖｓｐ）、ヒドロキシラーゼ、プロリル−ヒドロキシラーゼＰＨＤ−１、２および３、アスパラギンヒドロキシラーゼＦＩＨトランスフェラーゼ、Ｐｉｎ１プロリルイソメラーゼ、トポイソメラーゼ、脱アセチル化酵素、ヒストン脱アセチル化酵素、サーチュイン、ヒストンアセチル化酵素、ＣＢＰ／Ｐ３００ファミリー、ＭＹＳＴファミリー、ＡＴＦ２、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンＨ３Ｋ４脱メチル化酵素、Ｈ３Ｋ２７、ＪＨＤＭ２Ａ、ＵＴＸ、ＶＨＬ、ＷＴ−１、ｐ５３、Ｈｄｍ、ＰＴＥＮ、ユビキチンプロテアーゼ、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）およびｕＰＡ受容体（ｕＰＡＲ）システム、カテプシン、メタロプロテイナーゼ、エステラーゼ、加水分解酵素、セパラーゼ、カリウムチャネル、ナトリウムチャネル、多剤耐性タンパク質、Ｐ−糖タンパク質、ヌクレオシド輸送体、Ｅｔｓ、Ｅｌｋ、ＳＭＡＤ、Ｒｅｌ−Ａ（ｐ６５−ＮＦＫＢ）、ＣＲＥＢ、ＮＦＡＴ、ＡＴＦ−２、ＡＦＴ、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ、Ｓｐ１、Ｅｇｒ−１、Ｔ−ｂｅｔ、β−カテニン、ＨＩＦ、ＦＯＸＯ、Ｅ２Ｆ、ＳＲＦ、ＴＣＦ、Ｅｇｒ−１、ＦＯＸＯ  ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ｐ５３、ＷＴ−１、ＨＭＧＡ、ｐＳ６、４ＥＰＢ−１、ｅＩＦ４Ｅ−結合タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼ、阻害因子、延長因子からなる群から選択される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、例えば、細胞経路中の活性化可能成分の活性化レベルによる細胞の分類は、細胞を、臨床転帰と相関している細胞として分類することを含む。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、疾患の予後および／または診断である。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性疾患または造血疾患の有無である。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性疾患または造血疾患のステージ分類または類別である。ステージ分類の例として、それだけには限らないが、侵襲性、緩徐進行型、良性、難治性、ローマ数字ステージ分類、ＴＮＭステージ分類、Ｒａｉステージ分類、Ｂｉｎｅｔステージ分類、ＷＨＯ分類、ＦＡＢ分類、ＩＰＳＳスコア、ＷＰＳＳスコア、限局期、進行期、ＺＡＰ７０などの細胞マーカーによるステージ分類、ＩｇＶＨ変異状態およびＣＤ３８、潜在性、例えば、進行までの時間、無進行生存、全生存または無再発生存に関して知らせうる情報を含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、例えば、細胞経路中の活性化可能成分の活性化レベルによって細胞を分類するための、方法および組成物を提供し、分類は、細胞を、治療に対する患者の応答と相関している細胞として分類することを含む。いくつかの実施形態では、患者の応答は、完全応答、部分応答、結節性部分応答、応答なし、進行性疾患、安定疾患および有害反応からなる群から選択される。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、例えば、細胞経路中の活性化可能成分の活性化レベルによって細胞を分類するための、方法および組成物を提供し、分類は、細胞を、最小残存病変または耐性の出現と相関している細胞として分類することを含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、例えば、細胞経路中の活性化可能成分の活性化レベルによって細胞を分類するための、方法および組成物を提供し、分類は、治療方法を選択することを含む。治療方法の例として、それだけには限らないが、化学療法、生物療法、放射線療法、骨髄移植、末梢幹細胞移植、臍帯血移植、自家幹細胞移植、同種異系幹細胞移植、同系幹細胞移植、手術、導入療法、維持療法および待機療法が挙げられる。
【０１２３】
通常、本発明の方法は、サンプル中の複数の単細胞中の活性化可能成分の活性化レベルを決定することを含む。
【０１２４】
Ａ．シグナル伝達経路
いくつかの実施形態では、本発明の方法を使用して、シグナル伝達経路中の活性化可能成分の状態を決定する。いくつかの実施形態では、１種以上のシグナル伝達経路中の１種以上の活性化可能成分の活性化レベルによって、本明細書に記載される細胞を分類する。シグナル伝達経路およびそのメンバーは、幅広く記載されている。（Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ．  Ｃｅｌｌ（２０００年）１００（１）：１３〜２７頁）参照のこと。例示的シグナル伝達経路として、以下の経路およびそのメンバーが挙げられる：Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫおよびｅｌｋを含むＭＡＰキナーゼ経路；ＰＩ−３−キナーゼ、ＰＤＫ１、ＡｋｔおよびＢａｄを含むＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路；ＩＫＫ、ＩｋＢおよびＮＦ−κＢを含むＮＦ−κＢ経路ならびにｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体、β−カテニン、ＡＰＣおよびその他の補助因子およびＴＣＦを含むＷｎｔ経路（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．  ２００２年カタログ頁２３１〜２７９およびＨｕｎｔｅｒ  Ｔ．、前掲を参照のこと）。本発明のいくつかの実施形態では、アッセイされる相関している活性化可能成分（または調べられているシグナル伝達タンパク質）として、ＭＡＰキナーゼ、Ａｋｔ、ＮＦｋＢ、ＷＮＴ、ＳＴＡＴおよび／またはＰＫＣシグナル伝達経路のメンバーがある。本発明の方法はまた、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＵＳ６１／０８５，７８９に開示される、方法、シグナル伝達経路およびシグナル伝達分子を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法を使用して、本明細書に記載されるものを含めた当技術分野で公知のシグナル伝達経路中のシグナル伝達タンパク質の状態を決定する。本発明の範囲内のシグナル伝達タンパク質の例示的種類として、それだけには限らないが、キナーゼ、キナーゼ基質（すなわち、リン酸化される基質）、ホスファターゼ、ホスファターゼ基質、結合タンパク質（例えば、１４−３−３）、受容体リガンドおよび受容体（細胞表面受容体チロシンキナーゼおよび核内受容体））が挙げられる。例えば、キナーゼおよびタンパク質結合ドメインは、十分に記載されている（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、２００２年カタログ「Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅｓｓ」および「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ」２５４〜２７９頁参照のこと）。
【０１２６】
例示的シグナル伝達タンパク質として、それだけには限らないが、キナーゼ、ＨＥＲ受容体、ＰＤＧＦ受容体、Ｋｉｔ受容体、ＦＧＦ受容体、Ｅｐｈ受容体、Ｔｒｋ受容体、ＩＧＦ受容体、インスリン受容体、Ｍｅｔ受容体、Ｒｅｔ、ＶＥＧＦ受容体、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＦＡＫ、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、Ｊａｋ３、Ｔｙｋ２、Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｆｇｒ、Ｙｅｓ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｂｔｋ、ＺＡＰ７０、Ｓｙｋ、ＩＲＡＫ、ｃＲａｆ、ＡＲａｆ、ＢＲＡＦ、Ｍｏｓ、Ｌｉｍキナーゼ、ＩＬＫ、Ｔｐｌ、ＡＬＫ、ＴＧＦβ受容体、ＢＭＰ受容体、ＭＥＫＫ、ＡＳＫ、ＭＬＫ、ＤＬＫ、ＰＡＫ、Ｍｅｋ１、Ｍｅｋ２、ＭＫＫ３／６、ＭＫＫ４／７、ＡＳＫ１、Ｃｏｔ、ＮＩＫ、Ｂｕｂ、Ｍｙｔ１、Ｗｅｅ１、カゼインキナーゼ、ＰＤＫ１、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、ｐ９０Ｒｓｋ、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、Ｐｒｋ、ＰＫＣ、ＰＫＡ、ＲＯＣＫ１、ＲＯＣＫ２、オーロラ、ＣａＭＫ、ＭＮＫ、ＡＭＰＫ、ＭＥＬＫ、ＭＡＲＫ、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＬＫＢ−１、ＭＡＰＫＡＰＫ、Ｐｉｍ１、Ｐｉｍ２、Ｐｉｍ３、ＩＫＫ、Ｃｄｋ、Ｊｎｋ、Ｅｒｋ、ＩＫＫ、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、Ｃｄｋ、ＣＬＫ、ＰＫＲ、ＰＩ３−キナーゼクラス１、クラス２、クラス３、ｍＴｏｒ、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ１、２、３、ｐ３８、ＰＫＲ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ホスファターゼ、受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）、ＬＡＲホスファターゼ、ＣＤ４５、非受容体チロシンホスファターゼ（ＮＰＲＴＰ）、ＳＨＰ、ＭＡＰキナーゼホスファターゼ（ＭＫＰ）、二重特異性ホスファターゼ（ＤＵＳＰ）、ＣＤＣ２５ホスファターゼ、低分子量チロシンホスファターゼ、Ｅｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔ（ＥＹＡ）チロシンホスファターゼ、Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔホスファターゼ（ＳＳＨ）、セリンホスファターゼ、ＰＰ２Ａ、ＰＰ２Ｂ、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ１、ＰＰ５、イノシトールホスファターゼ、ＰＴＥＮ、ＳＨＩＰ、ミオチューブラリン、脂質シグナル伝達、ホスホイノシチドキナーゼ、ホスホリパーゼ、プロスタグランジンシンターゼ、５−リポキシゲナーゼ、スフィンゴシンキナーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、アダプター／スキャフォールドタンパク質、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ＢＬＮＫ、ＬＡＴ、ＰＩ３−キナーゼのＢ細胞アダプター（ＢＣＡＰ）、ＳＬＡＰ、Ｄｏｋ、ＫＳＲ、ＭｙＤ８８、Ｃｒｋ、ＣｒｋＬ、ＧＡＤ、Ｎｃｋ、Ｇｒｂ２関連バインダー（ＧＡＢ）、Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＲＩＰ、Ｔ細胞白血病ファミリー、サイトカイン、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−６、インターフェロンγ、インターフェロンα、サイトカイン調節物質、サイトカインシグナル伝達の抑制因子（ＳＯＣ）、ユビキチン化酵素、Ｃｂｌ、ＳＣＦユビキチン化リガーゼ複合体、ＡＰＣ／Ｃ、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン様接着分子、セレクチン、カドヘリン、カテニン、接着斑キナーゼ、ｐ１３０ＣＡＳ、細胞骨格／収縮タンパク質、フォドリン、アクチン、パキシリン、ミオシン、ミオシン結合タンパク質、チューブリン、ｅｇ５／ＫＳＰ、ＣＥＮＰ、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、β−アドレナリン受容体、ムスカリン性受容体、���デニニルシクラーゼ受容体、低分子量ＧＴＰアーゼ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｒａｎ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｃｄｃ４２、Ａｒｆｓ、ＲＡＢ、ＲＨＥＢ、グアニンヌクレオチド交換因子、Ｖａｖ、Ｔｉａｍ、Ｓｏｓ、Ｄｂｌ、ＰＲＫ、ＴＳＣ１、２、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質、Ｒａｓ−ＧＡＰ、Ａｒｆ−ＧＡＰ、Ｒｈｏ−ＧＡＰ、カスパーゼ、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ＰＡＲＰ、アポトーシスに関与するタンパク質、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ａ１、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂｉｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｂｍｆ、Ｈｒｋ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＩＡＰ、ＸＩＡＰ、Ｓｍａｃ、細胞周期調節物質、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ６、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ１、Ｃｄｋ７、サイクリンＤ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、Ｒｂ、ｐ１６、ｐ１４Ａｒｆ、ｐ２７ＫＩＰ、ｐ２１ＣＩＰ、分子シャペロン、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ２７、代謝酵素、アセチル−ＣｏＡａカルボキシラーゼ、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、一酸化窒素合成酵素、小胞輸送タンパク質、カベオリン、エンドソーム輸送選別複合体（ＥＳＣＲＴ）タンパク質、小胞タンパク質選別（Ｖｓｐｓ）、ヒドロキシラーゼ、プロリル−ヒドロキシラーゼＰＨＤ−１、２および３、アスパラギンヒドロキシラーゼＦＩＨトランスフェラーゼ、イソメラーゼ、Ｐｉｎ１プロリルイソメラーゼ、トポイソメラーゼ、脱アセチル化酵素、ヒストン脱アセチル化酵素、サーチュイン、アセチラーゼ、ヒストンアセチル化酵素、ＣＢＰ／Ｐ３００ファミリー、ＭＹＳＴファミリー、ＡＴＦ２、メチラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、脱メチル化酵素、ヒストンＨ３Ｋ４脱メチル化酵素、Ｈ３Ｋ２７、ＪＨＤＭ２Ａ、ＵＴＸ、腫瘍抑制遺伝子、ＶＨＬ、ＷＴ−１、ｐ５３、Ｈｄｍ、ＰＴＥＮ、プロテアーゼ、ユビキチンプロテアーゼ、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）およびｕＰＡ受容体（ｕＰＡＲ）システム、カテプシン、メタロプロテイナーゼ、エステラーゼ、加水分解酵素、セパラーゼ、イオンチャンネル、カリウムチャネル、ナトリウムチャネル、分子輸送体、多剤耐性タンパク質、Ｐ−糖タンパク質、ヌクレオシド輸送体、転写因子／ＤＮＡ結合タンパク質、Ｅｔｓ、Ｅｌｋ、ＳＭＡＤ、Ｒｅｌ−Ａ（ｐ６５−ＮＦＫＢ）、ＣＲＥＢ、ＮＦＡＴ、ＡＴＦ−２、ＡＦＴ、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ、Ｓｐ１、Ｅｇｒ−１、Ｔ−ｂｅｔ、ＨＩＦ、ＦＯＸＯ、Ｅ２Ｆ、ＳＲＦ、ＴＣＦ、Ｅｇｒ−１、β−カテニン、ＦＯＸＯ  ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ｐ５３、ＷＴ−１、ＨＭＧＡ、翻訳の調節物質、ｐＳ６、４ＥＰＢ−１、ｅＩＦ４Ｅ−結合タンパク質、転写の調節物質、ＲＮＡポリメラーゼ、阻害因子および延長因子が挙げられる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＰＩ３−キナーゼ（ｐ８５、ｐ１１０ａ、ｐ１１０ｂ、ｐ１１０ｄ）、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、ＳＯＣ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｃｄｃ４２、Ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｖａｖ、Ｔｉａｍ、Ｓｏｓ、Ｄｂｌ、Ｎｃｋ、Ｇａｂ、ＰＲＫ、ＳＨＰ１およびＳＨＰ２、ＳＨＩＰ１、ＳＨＩＰ２、ｓＳＨＩＰ、ＰＴＥＮ、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ＰＤＫ１、ＳＧＫ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、ＴＳＣ１、２、Ｒｈｅｂ、ｍＴｏｒ、４ＥＢＰ−１、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、Ｓ６、ＬＫＢ−１、ＡＭＰＫ、ＰＦＫ、アセチル−ＣｏＡａカルボキシラーゼ、ＤｏｋＳ、Ｒａｆ、Ｍｏｓ、Ｔｐｌ２、ＭＥＫ１／２、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ＭＫＫ３／６、ＭＥＫＫ１、４、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＭＫＫ４／７、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ１、２、３、ｐ３８、Ｅｒｋ１／２、Ｓｙｋ、Ｂｔｋ、ＢＬＮＫ、ＬＡＴ、ＺＡＰ７０、Ｌｃｋ、Ｃｂｌ、ＳＬＰ−７６、ＰＬＣγ１、ＰＬＣγ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ＦＡＫ、ｐ１３０ＣＡＳ、ＰＡＫ、ＬＩＭＫ１／２、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ２７、ＳＭＡＤ、Ｒｅｌ−Ａ（ｐ６５−ＮＦＫＢ）、ＣＲＥＢ、ヒストンＨ２Ｂ、ＨＡＴ、ＨＤＡＣ、ＰＫＲ、Ｒｂ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、Ｐ１６、ｐ１４Ａｒｆ、ｐ２７ＫＩＰ、ｐ２１ＣＩＰ、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ６、Ｃｄｋ７、Ｃｄｋ１、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ９、Ｃｄｃ２５、Ａ／Ｂ／Ｃ、Ａｂｌ、Ｅ２Ｆ、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＲＩＰ、Ｍｙｄ８８、ＢＡＤ、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ＸＬ、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ＰＡＲＰ、ＩＡＰ、Ｓｍａｃ、フォドリン、アクチン、Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、ＮＩＫ、ＩκＢ、ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ＩＫＫα、ＰＫＡ、ＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣθ、ＰＫＣδ、ＣＡＭＫ、Ｅｌｋ、ＡＦＴ、Ｍｙｃ、Ｅｇｒ−１、ＮＦＡＴ、ＡＴＦ−２、Ｍｄｍ２、ｐ５３、ＤＮＡ−ＰＫ、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、βカテニン、ＣｒｋＬ、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３βおよびＦＯＸＯからなる群から選択される。
【０１２８】
ＭＡＰキナーゼ経路：いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて、ＭＡＰキナーゼ経路中の活性化可能成分の状態を決定する。何らかの理論に制限されようとは思わないが、ＭＡＰキナーゼ経路は、細胞内反応を、増殖因子と細胞表面受容体の結合につなげるシグナル伝達経路である。この経路は極めて複雑であり、多数のタンパク質成分を含む。多数の細胞種では、この経路の活性化が、細胞分裂を促進する。
【０１２９】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）などの受容体結合型チロシンキナーゼは、細胞外リガンドによって活性化される。上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲの結合は、受容体の細胞質ドメインのチロシンキナーゼ活性を活性化する。ＥＧＦＲは、チロシンでリン酸化型となる。ＧＲＢ２などのドッキングタンパク質は、活性化された受容体のホスホチロシンと結合するＳＨ２ドメインを含む。ＧＲＢ２は、ＧＲＢ２のＳＨ３ドメインによってグアニンヌクレオチド交換因子ＳＯＳと結合する。ＧＲＢ２−ＳＯＳ複合体が、リン酸化ＥＧＦＲとドッキングすると、ＳＯＳが活性化型となる。活性化ＳＯＳは、ＲａｓからのＧＤＰの除去を促進する。次いで、Ｒａｓは、ＧＴＰと結合し、活性化型となることができる。その他の小さいＧタンパク質は、同様に活性化され得るが、本明細書ではさらには議論されない。活性化Ｒａｓは、ＲＡＦキナーゼ、セリン／トレオニン選択的プロテインキナーゼのプロテインキナーゼ活性を活性化する。ＲＡＦキナーゼは、ＭＥＫ、別のセリン／トレオニンキナーゼをリン酸化および活性化する。ＭＥＫは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）をリン酸化および活性化する。
【０１３０】
技術的には、ＲＡＦ、ＭＥＫおよびＭＡＰＫはすべて、ＭＮＫ同様、マイトジェン活性化キナーゼである。ＭＡＰＫは、最初は、「細胞外シグナル調節キナーゼ」（ＥＲＫ）および微小管結合型プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）と呼ばれていた。ＥＲＫによってリン酸化されることがわかった最初のタンパク質のうち１種が、微小管結合型タンパク質である。ＭＡＰＫによるリン酸化の多数のさらなる標的が見つかっており、これらのタンパク質は、「マイトジェン活性化プロテインキナーゼ」（ＭＡＰＫ）と新に命名された。ＲＡＦからＭＥＫ、ＭＡＰＫへの一連のキナーゼは、プロテインキナーゼカスケードの一例である。このような一連のキナーゼは、フィードバック調節およびシグナル増幅の機会を提供する。ＲＡＳは、さまざまな癌において活性化される（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．カタログ、前掲、２３１〜２７９頁およびＨｕｎｔｅｒ  Ｔ、前掲およびその中の参考文献を参照のこと）。
【０１３１】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路：いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路中の活性化可能成分の状態を決定する。何らかの理論に制限されようとは思わないが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路は、細胞外シグナルに応じた広範な細胞機能の変化の達成において役割を果たす。ＰＩ３Ｋの下流エフェクターとして、セリン−トレオニンキナーゼＡｋｔがあり、これは、ＰＩ３Ｋ活性化に応じ、キナーゼ、転写因子およびその他の調節分子をはじめとするいくつかの標的をリン酸化し、調節する。セリン／トレオニンキナーゼＡｋｔは、ＩＧＦ−１Ｒ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒなどの受容体チロシンキナーゼの刺激およびメンブレン受容体−ＰＩ３Ｋの膜局在型複合体の構築およびセカンドメッセンジャーＰＩＰ３を介したＡｋｔの活性化を含む、上流シグナル伝達経路のさまざまな変換の節点として細胞内に機能する。Ａｋｔおよびそのキナーゼ活性のレベルでのこれらの細胞内シグナルの組込みは、そのいくつかの下流エフェクター、例えば、ＮＦ−Ｂ、ｍＴＯＲ、Ｆｏｒｋｈｅａｄ、Ｂａｄ、ＧＳＫ−３およびＭＤＭ−２のリン酸化を調節する。これらのリン酸化事象は、順に、細胞成長、増殖、アポトーシス促進性刺激からの保護および血管新生の刺激に対するＡｋｔの効果を媒介する。Ａｋｔおよびその上流調節物質は、さまざまな固形腫瘍および血液悪性腫瘍では調節解除されている。Ａｋｔ経路は、中心的な細胞生存経路であり、ＥＧＦＲなどの上流受容体チロシンキナーゼの過剰発現（同書）またはＰＴＥＮなどの上流調節タンパク質の喪失（同書）などによって活性化される。
【０１３２】
ＮＦ−κＢ経路：いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて、ＮＦ−κＢ経路中の活性化可能成分の状態を決定する。何らかの理論に制限されようとは思わないが、ＮＦ−κＢ経路は、細胞活性の多数の態様の調節に、ストレス、傷害に、特に、免疫応答の経路に関与している。いくつかの例は、ＩＬ−２の応答および誘導、ＮＦ−κＢによるＴＡＰ１およびＭＨＣ分子の誘導、ならびに炎症反応の多数の態様、例えば、ＩＬ−１（αおよびβ）、ＴＮＦ−αおよび白血球接着分子（Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１）の誘導である。さらに、ＮＦ−κＢは、特定の成長および転写因子（例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｒａｓおよびｐ５３）の誘導による細胞成長、分化および増殖の多数の態様に関与している。ＮＦ−κＢシグナル伝達経路は、種々のヒト癌、特に、リンパ球細胞起源のものにおいて誤調節されている。いくつかのヒトリンパ系癌細胞は、ＮＦ−κＢ転写因子をコードする遺伝子の変異または増幅を有すると報告されている。ほとんどの癌細胞では、ＮＦ−κＢは、構成的に活性であり、核中に存在する。これは、ＩＫＫ経路の慢性刺激によるものである場合もあり、ＩｋＢａをコードする遺伝子が欠陥のあるものである場合がある。このような持続的なＮＦ−κＢ活性は、癌細胞をアポトーシス細胞死から保護するだけではなく、その成長活性を増強する場合さえある。ＮＦ−κＢ活性を遮断し、従来の化学療法に対するその感受性を増大するための抗腫瘍薬を設計することは、大きな治療的価値を有し得る。
【０１３３】
ＷＮＴ経路：いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて、ＷＮＴ経路中の活性化可能成分の状態を決定する。何らかの理論に制限されようとは思わないが、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、胚発生および癌におけるその役割が最もよく知られているタンパク質の複雑なネットワークを表すが、成体動物における正常な生理学的過程にも関与している。標準的なＷｎｔ経路は、Ｗｎｔタンパク質が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリーの細胞表面受容体と結合し、受容体が、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄファミリータンパク質を活性化させ、最終的に、核に達するβ−カテニン量の変化をもたらするときに生じる一連の事象を表す。Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（ＤＳＨ）は、膜結合型Ｗｎｔ受容体複合体の重要な成分であり、これは、Ｗｎｔ結合によって活性化されると、アキシン、ＧＳＫ−３およびタンパク質ＡＰＣを含むタンパク質の第２の複合体を阻害する。アキシン／ＧＳＫ−３／ＡＰＣ複合体は、通常、β−カテニン細胞内シグナル伝達分子のタンパク質分解を促進する。この「β−カテニン破壊複合体」が阻害された後、細胞質β−カテニンのプールは安定化し、一部のβ−カテニンは、核に入り、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリー転写因子とと相互作用し、特定の遺伝子発現を促進することができる。
【０１３４】
ＰＫＣ経路：いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて、ＰＫＣ経路中の活性化可能成分の状態を決定する。何らかの理論に制限されようとは思わないが、ＰＫＣ経路は、細胞増殖、分化およびアポトーシスと関連している。その構造、生化学的特性、組織分布、細胞内局在性および基質特異性において異なっている、少なくとも１１種の密接に関連したＰＫＣアイソザイムが報告されている。それらは、従来の（α、β１、β２、γ）、新規（δ、ε、η、θ、μ）および非定型（ζ、λ）アイソザイムとして分類されている。従来のＰＫＣアイソザイムは、Ｃａ２＋依存性であるが、新規および非定型アイソザイムは、その活性化にＣａ２＋を必要としない。ζおよびλを除く、すべてのＰＫＣアイソザイムは、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）によって活性化される。ＰＫＣアイソザイムは、重大な細胞周期移行、例えば、細胞周期に入ることおよび出ることならびにＧ１およびＧ２チェックポイントを、負または正に調節する。ＰＫＣ活性の変更は、種々の種類の悪性腫瘍に関連している。乳房腫瘍、下垂体アデノーマ、甲状腺癌組織、白血病細胞および肺癌細胞において、より高レベルのＰＫＣおよび種々のＰＫＣアイソザイムの活性化の差異が報告されている。ＰＫＣαのダウンレギュレーションが結腸腺癌の大多数において、また早期の腸管発癌において報告されている。したがって、ＰＫＣ阻害剤は、癌の治療における重要なツールとなった。アポトーシスの調節におけるＰＫＣの関与は、ＰＫＣを特異的に標的とする薬物を開発する取り組みに別の次元を加える。ＰＫＣ経路活性化はまた、心血管疾患および糖尿病などの疾患において役割を果たすと考えられる。
【０１３５】
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて、シグナル伝達経路中の活性化可能成分の状態を決定する。シグナル伝達経路中の活性化可能成分の状態によって細胞を分類するための方法および組成物を提供する。細胞は、造血細胞であり得る。造血細胞の例として、それだけには限らないが、多能性造血幹細胞、Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞、Ｔリンパ球系統前駆細胞または由来細胞、ＮＫ細胞系統前駆細胞または由来細胞、顆粒球系統前駆細胞または由来細胞、単球系統前駆細胞または由来細胞、巨核球系統前駆細胞または由来細胞および赤血球系統前駆細胞または由来細胞が挙げられる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路中の活性化可能成分の状態による細胞の分類は、細胞を、臨床転帰と相関している細胞として分類することを含む。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、疾患の予後および／または診断である。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性疾患または造血疾患の有無である。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性疾患または造血疾患のステージ分類または類別である。ステージ分類の例として、それだけには限らないが、侵襲性、緩徐進行型、良性、難治性、ローマ数字ステージ分類、ＴＮＭステージ分類、Ｒａｉステージ分類、Ｂｉｎｅｔステージ分類、ＷＨＯ分類、ＦＡＢ分類、ＩＰＳＳスコア、ＷＰＳＳスコア、限局期、進行期、ＺＡＰ７０などの細胞マーカーによるステージ分類、ＩｇＶＨ変異状態およびＣＤ３８、潜在性、例えば、進行までの時間、無進行生存、全生存および無再発生存に関して知らせうる情報を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路中の活性化可能成分の状態によって細胞を分類するための、方法および組成物を提供し、分類は、細胞を、治療に対する患者の応答と相関している細胞として分類することを含む。いくつかの実施形態では、患者の応答は、完全応答、部分応答、結節性  部分応答、応答なし、進行性疾患、安定疾患および有害反応からなる群から選択される。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路中の活性化可能成分の状態によって細胞を分類するための、方法および組成物を提供し、分類は、細胞を、最小残存病変または耐性の出現と相関している細胞として分類することを含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、シグナル伝達経路中の活性化可能成分の状態によって細胞を分類するための、方法および組成物を提供し、分類は、治療方法を選択することを含む。治療方法の例として、それだけには限らないが、化学療法、生物療法、放射線療法、骨髄移植、末梢幹細胞移植、臍帯血移植、自家幹細胞移植、同種異系幹細胞移植、同系幹細胞移植、手術、導入療法、維持療法、待機療法およびホリスティック／代替療法が挙げられる。
【０１４０】
本発明は、現在解明されているシグナル伝達経路およびシグナル伝達タンパク質に制限されず、引き続いて同定されるシグナル伝達経路およびタンパク質を包含する。
【０１４１】
Ｂ．Ｂ細胞受容体経路
いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物を用いて、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達中の任意の活性化成分またはＢリンパ球系統前駆細胞または由来細胞中のこのような活性化可能成分の収集物の状態を調べ、プロファイルすることができる。いくつかの実施形態では、１種以上のＢリンパ球系統前駆細胞または由来細胞の生理学的状態を、ＢＣＲシグナル伝達中の１種以上の活性化可能成分の状態を調べ、プロファイリングすることによって決定する。いくつかの実施形態では、ＢＣＲシグナル伝達中の１種以上の活性化可能成分の活性化レベルに従って、本明細書に記載されるように、Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞を分類する。Ｂリンパ球系統由来細胞の例として、それだけには限らないが、Ｂリンパ球系統初期プロＢ細胞、後期プロＢ細胞、大型プレＢ細胞、小型プレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、形質細胞、記憶Ｂ細胞、ＣＤ５＋Ｂ細胞、ＣＤ３８＋Ｂ細胞、Ｂ細胞受容体の変異したもしくは変異していない重鎖を有するＢ細胞およびＺａｐ７０を発現するＢ細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞は、本明細書に記載される状態と関連している細胞である。
【０１４２】
いずれの理論にも制限されようとは思わないが、ＢＣＲクロスリンクは、Ｓｒｃファミリーメンバーチロシンキナーゼ（例えば、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｆｙｎ）による、ＩｇαおよびＩｇβのＩＴＡＭモチーフドメイン内のチロシンのリン酸化を引き起こす。Ｉｇαβのリン酸化ＩＴＡＭは、Ｓｙｋ（直接）およびＢｔｋ（Ｓｙｋを介して）を動員し、そのリン酸化を増強する。ＢＣＲクロスリンクはまた、多数のレギュレーターおよびアダプター分子（例えば、ＳＬＰ−６５／ＢＬＮＫ、Ｇｒｂ２、ＣＤ２２、ＳＨＰ−１）をまとめ、ＢＣＲを、共受容体ＣＤ１９およびＣＤ２１とともに脂質ラフトに区分する。ＳｙｋおよびＢｔｋ活性化に続き、酵素ホスホリパーゼ−Ｃγ２（ＰＬＣγ２）およびＰＩ３Ｋが、ＢＣＲシグナル伝達を伝播する。ＰＬＣγ２活性化によって、カルシウム流、イノシトール−１，４，５−三リン酸およびジアシルグリセロールが生じ、プロテインキナーゼＣおよびＮＦ−κＢの活性化をもたらす。Ｓｙｋは、アダプターを介してＰＬＣγ２と相互作用するのに対し、Ｂｔｋは、直接相互作用することができ、各々が、ＢＣＲクロスリンク後のＰＬＣγ２活性にとって必要である。ＳｙｋおよびＢｔｋは両方とも、ＢＣＲクロスリンク後にＰＩ３Ｋを活性化し得る。ＰＩ３Ｋの活性化によって、Ａｋｔ媒介性生存シグナル伝達が可能となり、ＰＩ３Ｋは、Ｂ細胞の発達の間のＢＣＲ媒介性生存にとって必要である。ＰＬＣγ２およびＰＩ３Ｋはまた、ＭＡＰＫファミリータンパク質ＥＲＫ１／２およびｐ３８のリン酸化をもたらすキナーゼカスケードを開始する。Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＥＲＫ１／２シグナル伝達カスケードの活性化は、ＢＣＲシグナル伝達における中心的な事象と考えられており、マウスにおけるＲａｓＧＲＰ１およびＲａｓＧＲＰ３喪失によるＲａｓ活性化の減少は、Ｂ細胞増殖を損なう。対照的に、ｐ３８は、ｐ５３と相互作用し、細胞周期チェックポイントを調節するストレス応答タンパク質である。ＥＲＫ１／２およびｐ３８の活性化の差異によって、ＢＣＲが多様な細胞転帰を推進することが可能となる可能性があるが、所与のＢ細胞が、これら２種の経路を同時に活性化するのか、またはさらなるシグナル伝達状況に応じて一方の経路に有利に働くのかどうかという疑義が生じる。
【０１４３】
ＢＣＲシグナル伝達の効率的な活性化は、Ｈ２Ｏ２の生成および負調節タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）の不活性化に依存する。ＢＣＲクロスリンクに続いて、カルシウム依存性ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）タンパク質、例えば、ＮＯＸ５の動員および活性化によって、Ｈ２Ｏ２の生成が可能となり、ＢＣＲのシグナル伝達閾値を低下させる。ＢＣＲ誘導性Ｈ２Ｏ２は、触媒システインのスルフェン酸への可逆的な酸化によって、ＰＴＰ、例えば、ＳＨＰ−１に近い膜を一時的に不活化する。昆虫細胞においてＢＣＲシグナル伝達経路を再構成する素晴らしい研究によって、Ｈ２Ｏ２がＰＴＰを不活化し、Ｓｙｋリン酸化およびＩＴＡＭ結合などの初期シグナル伝達事象の増幅を可能にする酸化還元フィードバックループのモデルが示唆されている。最近の研究によって、内因的に生成したＨ２Ｏ２が、ＢＣＲシグナル伝達によって生じた第一次の酸化還元種として特性決定され、Ｈ２Ｏ２のＮＯＸ依存性生成は、マウスＡ２０Ｂ細胞においてＢＣＲシグナル伝達の波を開始するのに重要であるということを示した。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本発明は、モジュレーターおよび／または阻害剤を用いた治療の際に、Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞を分類する方法を提供する。Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞の例として、それだけには限らないが、初期プロＢ細胞、後期プロＢ細胞、大型プレＢ細胞、小型プレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、形質細胞および記憶Ｂ細胞、ＣＤ５＋Ｂ細胞、ＣＤ３８＋Ｂ細胞、Ｂ細胞受容体の変異したもしくは変異していない重鎖を有するＢ細胞またはＺａｐ７０を発現するＢ細胞が挙げられる。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、分類は、細胞を、ＢＣＲ経路中の活性化可能成分の状態に従って、臨床転帰と相関している細胞として分類することを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＢＣＲの近位にあるシグナル伝達の変化に基づいて、Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞を分類する方法を提供する。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、疾患の予後および／または診断である。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性疾患または造血疾患、例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂリンパ球系統白血病、Ｂリンパ球系統リンパ腫、多発性骨髄腫または形質細胞障害、例えばアミロイドーシスまたはワルデンシュトレームマクログロブリン血症の有無である。いくつかの実施形態では、疾患はＣＬＬである。いくつかの実施形態では、本発明は、ＢＣＲの近位にあるシグナル伝達の変化に基づいて、ＣＬＬ細胞を分類する方法を提供する。変化の存在は、臨床転帰を示す。いくつかの実施形態では、ＣＬＬは、ＣＤ１９およびＣＤ２３とともにＣＤ５を、またはＣＤ２０およびＣＤ２３とともにＣＤ５を同時発現するモノクローナルＢ細胞集団によって、ならびに表面免疫グロブリン発現によって定義される。いくつかの実施形態では、ＣＬＬは、ＣＤ１９およびＣＤ２３とともにＣＤ５を、またはＣＤ２０およびＣＤ２３とともにＣＤ５を同時発現するモノクローナルＢ細胞集団によって、ならびにかすかな表面免疫グロブリン発現によって定義される。さらなるＢ細胞マーカーを用いて、Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞を同定または分類してもよい。このようなマーカーの限定されない例として、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７９、ＣＤ３８、ＣＤ９６、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラス１およびＭＨＣクラス２が挙げられる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性疾患または造血疾患のステージ分類または類別である。本発明によって提供される方法におけるステージ分類の例として、侵襲性、緩徐進行型、良性、難治性、ローマ数字ステージ分類、ＴＮＭステージ分類、Ｒａｉステージ分類、Ｂｉｎｅｔステージ分類、ＷＨＯ分類、ＦＡＢ分類、ＩＰＳＳスコア、ＷＰＳＳスコア、限局期、進行期、ＺＡＰ７０などの細胞マーカーによるステージ分類、ＩｇＶＨ変異状態およびＣＤ３８、潜在性、例えば、進行までの時間、無進行生存、全生存または無再発生存に関して知らせうる情報を含む。
【０１４７】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＢＣＲ経路中の活性化可能成分の活性化レベルに基づくＢリンパ球系統前駆細胞または由来細胞の分類は、細胞を、治療に対する患者の応答、例えば、完全応答、部分応答、結節性部分応答、応答なし、進行性疾患、安定疾患、再発または有害反応と相関している細胞として分類することを含む。方法は、治療方法、例えば、化学療法、生物療法、放射線療法、骨髄移植、末梢幹細胞移植、臍帯血移植、自家幹細胞移植、同種異系幹細胞移植、同系幹細胞移植、手術、導入療法、維持療法、待機療法またはホリスティック／代替療法を決定することをさらに含み得る。
【０１４８】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＢＣＲ経路中の活性化可能成分の活性化に基づくＢリンパ球系統前駆細胞または由来細胞の分類は、細胞を、最小残存病変または耐性の出現と相関している細胞として分類することを含む。
【０１４９】
Ｃ．持続性シグナル伝達
いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物を用いて、細胞中の持続性シグナル伝達経路の状態を決定できる。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物を用いて、持続性シグナル伝達経路、または細胞中のこのような活性化可能成分の収集物中の任意の活性化可能成分の状態を調べ、プロファイリングすることができる。いくつかの実施形態では、細胞の生理学的状態を、持続性シグナル伝達経路中の１種以上の活性化可能成分の状態を調べ、プロファイルすることによって決定する。いくつかの実施形態では、持続性シグナル伝達経路中の１種以上の活性化可能成分の状態に従って、本明細書に記載されるように、細胞を分類する。用語「持続性シグナル伝達」は、抗原独立性シグナル伝達、独立性基礎シグナル伝達および非誘導性またはリガンド独立性シグナル伝達を含む。
【０１５０】
いずれの理論にも制限されようとは思わないが、最近の証拠は、細胞受容体によって調節されるほとんどのシグナル伝達システムにおいて、シグナル伝達のいくつかの基礎レベルは、リガンド独立的に連続的に生じるが、このようなシステムを通る流れは、大きく変わり得るという考えを支持している。未刺激細胞におけるシグナル伝達の基礎緊張度または定常状態レベルは、シグナル伝達経路内の正および負調節物質の平衡の結果である。したがって、シグナル伝達の正および負調節物質の平衡のとれた作用は、定常状態平衡を定める。次いで、受容体刺激が、種々の方法で平衡状態を混乱させて、細胞応答を開始する。未刺激状態におけるシグナル伝達の定常状態レベルは、それ自体、機能的結果を有し、例えば、特定の細胞特性の差異または機能を維持し得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞の持続性シグナル伝達状態を決定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、持続性シグナル伝達は、細胞受容体持続性シグナル伝達である。いくつかの実施形態では、持続性シグナル伝達は、ＢＣＲ持続性シグナル伝達である。持続性シグナル伝達経路中の活性化可能成分の状態に従って、細胞を分類するための方法および組成物が提供される。細胞は、造血細胞であり得る。造血細胞の例として、それだけには限らないが、多能性造血幹細胞、Ｂリンパ球系統前駆細胞または由来細胞、Ｔリンパ球系統前駆細胞または由来細胞、ＮＫ細胞系統前駆細胞または由来細胞、顆粒球系統前駆細胞または由来細胞、単球系統前駆細胞または由来細胞、巨核球系統前駆細胞または由来細胞および赤血球系統前駆細胞または由来細胞が挙げられる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、持続性シグナル伝達経路中の活性化可能成分の状態に従って細胞を分類することは、細胞を、臨床転帰と相関している細胞として分類することを含む。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、疾患の予後および／または診断である。いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性疾患または造血疾患の有無である。腫瘍性疾患または造血疾患の例として、それだけには限らないが、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂリンパ球系統白血病、Ｂリンパ球系統リンパ腫、多発性骨髄腫または形質細胞障害、例えば、アミロイドーシスまたはワルデンシュトレームマクログロブリン血症などが挙げられる。いくつかの実施形態では、疾患はＣＬＬである。いくつかの実施形態では、ＣＬＬは、ＣＤ１９およびＣＤ２３とともにＣＤ５を、またはＣＤ２０およびＣＤ２３とともにＣＤ５を同時発現するモノクローナルＢ細胞集団によって、ならびに表面免疫グロブリン発現によって定義される。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、臨床転帰は、腫瘍性疾患または造血疾患のステージ分類または類別である。ステージ分類の例として、それだけには限らないが、侵襲性、緩徐進行型、良性、難治性、ローマ数字ステージ分類、ＴＮＭステージ分類、Ｒａｉステージ分類、Ｂｉｎｅｔステージ分類、ＷＨＯ分類、ＦＡＢ分類、ＩＰＳＳスコア、ＷＰＳＳスコア、限局期、進行期、ＺＡＰ７０などの細胞マーカーによるステージ分類、ＩｇＶＨ突然変異状態およびＣＤ３８、例えば、進行までの時間、無進行生存、全生存または無再発生存に関して知らせ得る情報が挙げられる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本発明は、持続性シグナル伝達の存在を示す、ＢＣＲの近位にあるシグナル伝達の変化に基づいてＣＬＬ細胞を分類する方法を提供する。変化の存在は、臨床転帰を示し、ここで、臨床転帰は、本明細書に記載されるとおりである。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、分類は、細胞を、治療に対する患者の応答と相関している細胞として分類することを含む、持続性シグナル伝達経路中の活性化可能成分の状態に従って細胞を分類するための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態では、患者の応答は、完全応答、部分応答、結節性部分応答、応答なし、進行性疾患、安定疾患および有害反応からなる群から選択される。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、分類が、細胞を、最小残存病変または耐性の出現と相関している細胞として分類することを含む、持続性シグナル伝達経路中の活性化可能成分の状態に従って、細胞を分類するための方法および組成物を提供する。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、分類が、治療方法を選択することを含む、持続性シグナル伝達経路中の活性化可能成分の状態に従って細胞を分類するための方法および組成物を提供する。治療方法の例として、それだけには限らないが、化学療法、生物療法、放射線療法、骨髄移植、末梢幹細胞移植、臍帯血移植、自家幹細胞移植、同種異系幹細胞移植、同系幹細胞移植、手術、導入療法、維持療法、待機療法およびホリスティック／代替療法が挙げられる。
【０１５８】
結合成分
本発明のいくつかの実施形態では、活性化可能成分の活性化レベルは、細胞を、活性化可能成分の活性化状態に特異的である結合成分と接触させることによって決定する。用語「結合成分」は、別の活性化可能成分の活性化状態を超えて活性化可能成分の活性化状態を検出できる、任意の分子、例えば、ペプチド、核酸、小有機分子を含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、結合成分は、ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチドまたはタンパク質である。ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合または合成ペプチド模倣構造で構成されているものであり得る。したがって、本明細書において「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸の両方を含む。本発明の目的のためには、例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンが考慮されるアミノ酸である。側鎖は、（Ｒ）または（Ｓ）立体配置のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、（Ｓ）またはＬ−立体配置である。天然に存在しない側鎖が用いられる場合には、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ分解を防ぎ、または遅らせるために非アミノ酸置換基を用いてもよい。天然に存在しないアミノ酸を含むタンパク質を合成してもよく、または、いくつかの場合には、組換えによって作製してもよい、ｖａｎ  Ｈｅｓｔら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４２８：（１−２）６８〜７０頁、１９９８年５月２２日およびＴａｎｇら、Ａｂｓｔｒ．Ｐａｐ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ２１８：Ｕ１３８パート２、１９９９年８月２２日を参照のこと、これらの両方とも、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０１６０】
本発明の方法を用いて、抗原性によって検出可能であり、サンプル中に存在するその他の活性化可能成分から抗原性によって識別可能である、サンプル中の任意の特定の活性化可能成分を検出できる。例えば、本明細書において実証され（例えば、実施例を参照のこと）、記載されるように、本方法で、本発明の活性化状態特異的抗体を用いて、複雑な細胞集団のサブセットまたは亜集団の個別のシグナル伝達カスケード、および可能性あるシグナル伝達階層におけるタンパク質活性化（例えば、キナーゼ活性化）の順序を同定できる。したがって、いくつかの実施形態では、１種以上のポリペプチドの発現およびリン酸化を、本発明の方法を用いて検出し、定量化する。いくつかの実施形態では、本発明の方法を用いて、細胞経路の細胞成分である、１種以上のポリペプチドの発現およびリン酸化を検出し、定量化する。本明細書において、用語「活性化状態特異的抗体」または「活性化状態抗体」またはその文法的同等物は、対応する特異的抗原と特異的に結合する抗体を指す。好ましくは、対応する、特異的抗原は、活性化可能成分の特異的な形である。また、好ましくは、活性化状態特異的抗体の結合は、特異的活性化可能成分の特異的活性化状態を示す。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、結合成分は抗体である。いくつかの実施形態では、結合成分は、活性化状態特異的抗体である。いくつかの実施形態では、結合成分は、リン酸化部位特異的抗体である。
【０１６２】
用語「抗体」は、全長抗体および抗体断片を含み、任意の生物に由来する天然抗体、改変抗体または以下にさらに定義されるような、実験目的、治療目的もしくはその他の目的のために組換えによって作製した抗体を指し得る。抗体断片の例として、当技術分野で公知であるように、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたは全抗体の修飾によって製造した、もしくは組換えＤＮＡ技術を用いてｄｅ  ｎｏｖｏで合成されたもののいずれかの、抗体のその他の抗原−結合性部分配列などがある。用語「抗体」は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。抗体は、アンタゴニスト、アゴニスト、中和性、阻害性または刺激性であり得る。
【０１６３】
本発明の抗体は、非ヒト、キメラ、ヒト化または全ヒトであり得る。キメラおよびヒト化抗体の概念の説明については、Ｃｌａｒｋら、２０００年およびそれに引用される参考文献（Ｃｌａｒｋ、（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ２１：３９７〜４０２頁）を参照のこと。キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域と作動可能に連結された、非ヒト抗体の可変領域、例えば、マウスまたはラット起源のＶＨおよびＶＬドメインを含む（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ヒト化である。本明細書において「ヒト化」抗体とは、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）と、非ヒト（通常、マウスまたはラット）抗体に由来する１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む抗体を意味する。ＣＤＲを提供する非ヒト抗体は、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。ヒト化は、主に、ドナーＣＤＲをアクセプター（ヒト）ＶＬおよびＶＨフレームワークへグラフトすることによる（Ｗｉｎｔｅｒ  米国特許第５，２２５，５３９号）。この戦略は、「ＣＤＲグラフティング」と呼ばれる。選択されたアクセプターフレームワーク残基の対応するドナー残基への「復帰突然変異」は、最初のグラフトされた構築物において失われている親和性を回復するために必要であることが多い（米国特許第５，５３０，１０１号；同５，５８５，０８９号；同５，６９３，７６１号；同５，６９３，７６２号；同６，１８０，３７０号；同５，８５９，２０５号；同５，８２１，３３７号；同６，０５４，２９７号；同６，４０７，２１３号）。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンのものを含むことが最適であり、従って、通常、ヒトＦｃ領域を含む。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野で周知であり、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３〜３２９頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６頁）に従って実施され得る。ヒト化ネズミモノクローナル抗体のさらなる例も、当技術分野で公知であり、例えば、抗体結合ヒトタンパク質Ｃ（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９８年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １１：３２１〜８頁）、インターロイキン２受容体（Ｑｕｅｅｎら、１９８９年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ  ８６：１００２９〜３３頁）およびヒト上皮成長因子受容体２（Ｃａｒｔｅｒら、１９９２年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５〜９頁）がある。代替実施形態では、本発明の抗体は、完全にヒトとする、つまり抗体の配列を完全にまたは実質的にヒトとしてもよい。トランスジェニックマウスの使用（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９９７、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ８：４５５〜４５８頁）または選択方法を伴うヒト抗体ライブラリー（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９８年、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ９：１０２〜１０８頁）をはじめ、完全ヒト抗体を作製するための���くつかの方法が、当技術分野で公知である。
【０１６４】
具体的には、「抗体」の定義内に、非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体が含まれる。本明細書において「非グリコシル化抗体」とは、Ｆｃ領域の２９７位に結合している糖を欠いている抗体を意味し、ここで、番号づけは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵシステムに従っている。非グリコシル化抗体は、Ｆｃ糖が、例えば、化学的に、または酵素的に除去されている抗体である、脱グリコシル化抗体であり得る。あるいは、非グリコシル化抗体は、例えば、グリコシル化パターンをコードするものまたは残基の突然変異によって、または糖をタンパク質に結合しない生物、例えば、細菌における発現によって、Ｆｃ糖を伴わずに発現された抗体である、非グリコシル化（ｎｏｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）または非グリコシル化（ｕｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体であり得る。
【０１６５】
上記で指摘したように、活性化状態特異的抗体を用いて、キナーゼ活性を検出できるが、本発明によって、キナーゼ活性化を決定するためのさらなる手段が提供される。例えば、プロテインキナーゼによって特異的に認識されるか、それによって特異的にリン酸化される基質が知られている。このようなリン酸化された基質と特異的に結合するが、このようなリン酸化されていない基質とは結合しない抗体（ホスホ−基質抗体）を用いて、サンプル中の活性化されたキナーゼの存在を決定してもよい。
【０１６６】
さらなる実施形態では、成分活性化プロフィールを、固定化されている、多様な活性化状態の抗体を用いて決定する。抗体は、単離サンプル受容領域を有する不溶性支持体（例えば、マイクロタイタープレート、アレイなど）と非拡散性に結合しているものであり得る。不溶性支持体は、組成物が結合され得、可溶性物質から容易に分離され、そうでなければ、スクリーニング法全体と適合する任意の組成からなるものであってもよい。。このような支持体の表面は固体または多孔質であり得、任意の好都合な形のものであり得る。適した不溶性支持体の例として、マイクロタイタープレート、アレイ、メンブレンおよびビーズが挙げられる。これらは、通常、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、テフロン（登録商標）などで作られたものであり得る。マイクロタイタープレートおよびアレイは、少量の試薬およびサンプルを用いて、多数のアッセイを同時に実施できるので特に好都合である。いくつかの場合には、磁性ビーズなどが含まれる。
【０１６７】
組成物の特定の結合法は、発明の試薬および方法全体と適合し、組成物の活性を維持し、非拡散性である限りは、決定的なものではない。結合方法は、抗体（タンパク質が支持体と結合される際にリガンド結合部位または活性化配列のいずれかを立体的に妨害しない）、「粘着性」との直接結合またはイオン支持体、化学的クロスリンク、表面上での抗体の合成の使用などを含む。抗体の結合後、過剰の結合していない材料を、洗浄によって除去する。次いで、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたはその他の非侵害性タンパク質またはその他の部分とのインキュベーションによって、サンプル受容性領域をブロッキングしてもよい。
【０１６８】
活性化可能成分の活性型アイソフォームの抗原性は、活性化可能成分の非活性型アイソフォームの抗原性、または異なる活性化状態のアイソフォームの抗原性から区別される。いくつかの実施形態では、成分の活性型アイソフォームは、成分の非活性型アイソフォームには存在しないエピトープを有し、逆もまた同様である。いくつかの実施形態では、この差は、成分への、リン酸部分などの部分の共有結合による付加による、または、タンパク質切断による成分における構造変化による、またはそうでなければ成分に抗原的に識別可能な方法で同一配列を提示させる成分において誘導されたコンホメーション変化によるものである。いくつかの実施形態では、このようなコンホメーション変化は、成分の活性型アイソフォームに、非活性型アイソフォームには存在しない少なくとも１種のエピトープを提示させるか、または成分の非活性型アイソフォームによって提示される１種のエピトープを提示させない。いくつかの実施形態では、識別抗体は、成分の活性部位を中心とするが、当技術分野で公知のように、成分の一領域におけるコンホメーション変化は、成分の異なる領域における変化を同様に引き起こし得る。
【０１６９】
タンパク質のリン酸化アイソフォームと特異的に結合するが、タンパク質の非リン酸化アイソフォームとは特異的に結合しない、多数の抗体は、その多くが市販されており（例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｌｔａｇ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｂｃａｍ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｉｇｍａ  ａｎｄ  Ａｎａｓｐｅｃ参照のこと）、製造されている。多数のこのような抗体は、可逆的にリン酸化されるシグナル伝達タンパク質の研究のために製造されている。特に、タンパク質のリン酸化、活性型アイソフォームと特異的に結合する多数のこのような抗体が製造されている。本明細書に記載される方法で分析できるタンパク質の例として、それだけには限らないが、キナーゼ、ＨＥＲ受容体、ＰＤＧＦ受容体、Ｋｉｔ受容体、ＦＧＦ受容体、Ｅｐｈ受容体、Ｔｒｋ受容体、ＩＧＦ受容体、インスリン受容体、Ｍｅｔ受容体、Ｒｅｔ、ＶＥＧＦ受容体、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＦＡＫ、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、Ｊａｋ３、Ｔｙｋ２、Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｆｇｒ、Ｙｅｓ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｂｔｋ、ＺＡＰ７０、Ｓｙｋ、ＩＲＡＫｓ、ｃＲａｆ、ＡＲａｆ、ＢＲＡＦ、Ｍｏｓ、Ｌｉｍキナーゼ、ＩＬＫ、Ｔｐｌ、ＡＬＫ、ＴＧＦβ受容体、ＢＭＰ受容体、ＭＥＫＫ、ＡＳＫ、ＭＬＫ、ＤＬＫ、ＰＡＫ、Ｍｅｋ１、Ｍｅｋ２、ＭＫＫ３／６、ＭＫＫ４／７、ＡＳＫ１、Ｃｏｔ、ＮＩＫ、Ｂｕｂ、Ｍｙｔ１、Ｗｅｅ１、カゼインキナーゼ、ＰＤＫ１、ＳＧＫ１、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、ｐ９０Ｒｓｋｓ、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、Ｐｒｋ、ＰＫＣ、ＰＫＡ、ＲＯＣＫ１、ＲＯＣＫ２、オーロラ、ＣａＭＫ、ＭＮＫ、ＡＭＰＫ、ＭＥＬＫ、ＭＡＲＫ、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＬＫＢ−１、ＭＡＰＫＡＰＫ、Ｐｉｍ１、Ｐｉｍ２、Ｐｉｍ３、ＩＫＫ、Ｃｄｋ、Ｊｎｋ、Ｅｒｋ、ＩＫＫ、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、Ｃｄｋ、ＣＬＫ、ＰＫＲ、ＰＩ３−キナーゼクラス１、クラス２、クラス３、ｍＴｏｒ、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ１、２、３、ｐ３８、ＰＫＲ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ホスファターゼ、受容体タンパク質チロシンホスファターゼ（ＲＰＴＰ）、ＬＡＲホスファターゼ、ＣＤ４５、非受容体チロシンホスファターゼ（ＮＰＲＴＰ）、ＳＨＰ、ＭＡＰキナーゼホスファターゼ（ＭＫＰ）、二重特異性ホスファターゼ（ＤＵＳＰ）、ＣＤＣ２５ホスファターゼ、低分子量チロシンホスファターゼ、Ｅｙｅｓ  ａｂｓｅｎｔ（ＥＹＡ）チロシンホスファターゼ、Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔホスファターゼ（ＳＳＨ）、セリンホスファターゼ、ＰＰ２Ａ、ＰＰ２Ｂ、ＰＰ２Ｃ、ＰＰ１、ＰＰ５、イノシトールホスファターゼ、ＰＴＥＮ、ＳＨＩＰ、ミオチューブラリン、脂質シグナル伝達、ホスホイノシチドキナーゼ、ホスホリパーゼ、プロスタグランジンシンターゼ、５−リポキシゲナーゼ、スフィンゴシンキナーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、アダプター／スキャフォールドタンパク質、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ＢＬＮＫ、ＬＡＴ、ＰＩ３−キナーゼのＢ細胞アダプター（ＢＣＡＰ）、ＳＬＡＰ、Ｄｏｋ、ＫＳＲ、Ｍ��Ｄ８８、Ｃｒｋ、ＣｒｋＬ、ＧＡＤ、Ｎｃｋ、Ｇｒｂ２関連バインダー（ＧＡＢ）、Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＲＩＰ、Ｔ細胞白血病ファミリー、サイトカイン、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−６、インターフェロンγ、インターフェロンα、サイトカイン調節物質、サイトカインシグナル伝達の抑制因子（ＳＯＣ）、ユビキチン化酵素、Ｃｂ１、ＳＣＦユビキチン化リガーゼ複合体、ＡＰＣ／Ｃ、接着分子、インテグリン、免疫グロブリン様接着分子、セレクチン、カドヘリン、カテニン、接着斑キナーゼ、ｐ１３０ＣＡＳ、細胞骨格／収縮タンパク質、フォドリン、アクチン、パキシリン、ミオシン、ミオシン結合タンパク質、チューブリン、ｅｇ５／ＫＳＰ、ＣＥＮＰ、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、β−アドレナリン受容体、ムスカリン性受容体、アデニニルシクラーゼ受容体、低分子量ＧＴＰアーゼ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｒａｎ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｃｄｃ４２、Ａｒｆ、ＲＡＢ、ＲＨＥＢ、グアニンヌクレオチド交換因子、Ｖａｖ、Ｔｉａｍ、Ｓｏｓ、Ｄｂｌ、ＰＲＫ、ＴＳＣ１、２、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質、Ｒａｓ−ＧＡＰ、Ａｒｆ−ＧＡＰ、Ｒｈｏ−ＧＡＰ、カスパーゼ、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ＰＡＲＰ、アポトーシスに関与しているタンパク質、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ａ１、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂｉｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｂｍｆ、Ｈｒｋ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＩＡＰ、ＸＩＡＰ、Ｓｍａｃ、細胞周期調節物質、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ６、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ１、Ｃｄｋ７、サイクリンＤ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、Ｒｂ、ｐ１６、ｐ１４Ａｒｆ、ｐ２７ＫＩＰ、ｐ２１ＣＩＰ、分子シャペロン、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ２７、代謝酵素、アセチル−ＣｏＡａカルボキシラーゼ、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、一酸化窒素合成酵素、小胞輸送タンパク質、カベオリン、エンドソーム輸送選別複合体（ＥＳＣＲＴ）タンパク質、小胞タンパク質選別（Ｖｓｐｓ）、ヒドロキシラーゼ、プロリル−ヒドロキシラーゼＰＨＤ−１、２および３、アスパラギンヒドロキシラーゼＦＩＨトランスフェラーゼ、イソメラーゼ、Ｐｉｎ１プロリルイソメラーゼ、トポイソメラーゼ、脱アセチル化酵素、ヒストン脱アセチル化酵素、サーチュイン、アセチラーゼ、ヒストンアセチル化酵素、ＣＢＰ／Ｐ３００ファミリー、ＭＹＳＴファミリー、ＡＴＦ２、メチラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、脱メチル化酵素、ヒストンＨ３Ｋ４脱メチル化酵素、Ｈ３Ｋ２７、ＪＨＤＭ２Ａ、ＵＴＸ、腫瘍抑制遺伝子、ＶＨＬ、ＷＴ−１、ｐ５３、Ｈｄｍ、ＰＴＥＮ、プロテアーゼ、ユビキチンプロテアーゼ、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）およびｕＰＡ受容体（ｕＰＡＲ）システム、カテプシン、メタロプロテイナーゼ、エステラーゼ、加水分解酵素、セパラーゼ、イオンチャンネル、カリウムチャネル、ナトリウムチャネル、分子輸送体、多剤耐性タンパク質、Ｐ−糖タンパク質、ヌクレオシド輸送体、転写因子／ＤＮＡ結合タンパク質、Ｅｔｓ、Ｅｌｋ、ＳＭＡＤ、Ｒｅｌ−Ａ（ｐ��５−ＮＦＫＢ）、ＣＲＥＢ、ＮＦＡＴ、ＡＴＦ−２、ＡＦＴ、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ、Ｓｐ１、Ｅｇｒ−１、Ｔ−ｂｅｔ、β−カテニン、ＨＩＦ、ＦＯＸＯ、Ｅ２Ｆ、ＳＲＦ、ＴＣＦ、Ｅｇｒ−１、β−カテニン、ＦＯＸＯ  ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ｐ５３、ＷＴ−１、ＨＭＧＡ、翻訳の調節物質、ｐＳ６、４ＥＰＢ−１、ｅＩＦ４Ｅ−結合タンパク質、転写の調節物質、ＲＮＡポリメラーゼ、阻害因子、延長因子が挙げられる。いくつかの実施形態では、タンパク質はＳ６である。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、全抗体よりも活性化状態の抗体のエピトープ認識断片を用いる。いくつかの実施形態では、エピトープ認識断片を固定化する。いくつかの実施形態では、エピトープを認識する抗体軽鎖を用いる。エピトープを認識する軽鎖遺伝子産物をコードする組換え核酸を用い、当技術分野で周知の組換え手段によって、このような抗体断片を製造してもよい。
【０１７１】
非活性化状態抗体もまた本発明において使用してもよい。いくつかの実施形態では、非活性化状態抗体は、活性型および非活性型の成分中のエピトープと結合する。このような抗体を用いて、サンプル中の非活性型および活性型成分の量を決定してもよい。いくつかの実施形態では、非活性化状態抗体は、非活性型の成分中に存在するが、活性型の成分中には存在しないエピトープと結合する。このような抗体を用いて、サンプル中の非活性型の成分の量を決定してもよい。両種類の非活性化状態抗体を用いて、例えば、本明細書に記載される候補生物活性剤を用いた治療前後のサンプルから、活性化状態成分の量の変化が、非活性化状態成分の量の変化と一致するかどうかを決定してもよい。例えば、このような抗体を用いて、活性型成分の増大が、活性化状態成分の活性化によるか、または、成分の発現の増大によるか、または両方によるかどうかを決定できる。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、抗体を、フローサイトメトリーにおける標準化のために知られ、用いられるものと類似のビーズを用いて固定する。多様な活性化状態に特異的な抗体とビーズの結合は、当技術分野で公知の方法および／または本明細書に記載される方法によって行うことができる。このようなコンジュゲートしているビーズを、もし存在すれば多数の活性化成分が多数の固定化抗体と結合するのを可能にする条件下で、サンプル、好ましくは、細胞抽出物と接触させてもよい。独特に標識された非活性化状態抗体を含む第２の多数の抗体を、固定化された活性化状態に特異的な抗体−活性化成分複合体に添加してもよく、ビーズを、各標識の存在に基づいてＦＡＣＳによって選別してもよく、ここで、標識の存在は、対応する第２の抗体の結合および対応する活性化成分の存在を示す。
【０１７３】
本発明の代替実施形態では、タンパク質結合成分の芳香族アミノ酸を、Ｄ−またはＬ−ナフチルアラニン、Ｄ−またはＬ−フェニルグリシン、Ｄ−またはＬ−２−チエニルアラニン、Ｄ−またはＬ−１−、２−、３−または４−ピレ二ルアラニン、Ｄ−またはＬ−３−チエ二ルアラニン、Ｄ−またはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−またはＬ−（３−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−またはＬ−（２−ピラジニル）−アラニン、Ｄ−またはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン、Ｄ−ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−ｐ−メトキシビフェニルフェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−２−インドール（アルキル）アラニンならびにアルキルが、置換または非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−イソチル、イソ−ペンチルおよびＣ１〜Ｃ２０の非酸性アミノ酸であり得るＤ−またはＬ−アルキルアラニンで置換してもよい。
【０１７４】
酸性アミノ酸は、負の電荷を維持しながら、非カルボキシレートアミノ酸、ならびにその誘導体または類似体、例えば、（ホスホノ）アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、トレオニンもしくはセリン、または硫酸化（例えば、−−ＳＯ３Ｈ）トレオニン、セリンもしくはチロシンという限定されない例で置換されていてもよい。
【０１７５】
その他の置換として、「アルキル」を任意の天然アミノ酸と組み合わせることによって作製することができる非天然水酸化アミノ酸を挙げることができる。本明細書において、用語「アルキル」とは、１〜２４個の炭素原子の分岐または非分岐飽和炭化水素基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラシシルなどを指す。アルキルとして、窒素、酸素および硫黄の原子を含むへテロアルキルが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書においてアルキル基は、１〜１２個の炭素原子を含む。塩基性アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸リシン、アルギニン、オルニチン、シトルリンまたは（グアニジノ）−酢酸またはその他の、「アルキル」が上記のように定義されるその他の（グアニジノ）アルキル−酢酸の任意の位置で、アルキル基で置換されていてもよい。ニトリル誘導体（例えば、ＣＯＯＨの代わりにＣＮ−部分を含有する）もまた、アスパラギンまたはグルタミンと置換されていてもよく、メチオニンスルホキシドもまた、メチオニンと置換されていてもよい。このようなペプチド誘導体の調製方法は、当業者に周知である。
【０１７６】
さらに、任意のポリペプチド中の任意のアミド結合が、ケトメチレン部分によって置換されてもよい。このような誘導体は、酵素による分解に対する安定性の増大という特性を有し、従って、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、局所、直腸の、眼球内またはその他の経路によって投与される際に、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増大した可能性のある化合物の製剤にとって利点を有すると予測される。
【０１７７】
本発明の変異体ポリペプチドのアミノ酸のさらなるアミノ酸修飾として、以下を挙げることができる：システイニル残基を、α−ハロアセテート（および対応するアミン）、例えば、２−クロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得てもよい。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールなどの化合物との反応によって誘導体化してもよい。
【０１７８】
ヒスチジル残基は、例えば、ｐＨ５．５〜７．０でジエチルプロカルボネートなどの化合物との反応によって誘導体化してもよく、これはこの薬剤がヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるためであり、またパラ−ブロモフェナシルブロミドを用いてもよく、例えば、この反応は、ｐＨ６．０で、０．１Ｍ  カコジル酸ナトリウム中で実施することが好ましい。
【０１７９】
リシニル（ｌｙｓｉｎｙｌ）およびアミノ末端残基は、コハク酸またはその他のカルボン酸無水物などの化合物と反応させてもよい。これらの薬剤を用いる誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有すると期待される。
【０１８０】
α−アミノ含有残基を誘導体化するためのその他の適した試薬として、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミデート；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４ペンタンジオン；およびグリオキシル酸とのトランスアミナーゼによって触媒される反応などの化合物が挙げられる。アルギニル残基は、１種または数種の従来試薬、中でも、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよび公知の方法ステップに従うニンヒドリンとの反応によって修飾してもよい。アルギニン残基の誘導体化には、グアニジン官能基の高ｐＫａのために、反応がアルカリ状態で実施されること必要である。さらに、これらの試薬は、リシンの基ならびにアルギニンε−アミノ基と反応させてもよい。芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入するためなどのチロシル残基の特定の修飾は、それ自体、よく知られている。
【０１８１】
Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成してもよい。カルボキシル側基（アルパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−−Ｎ−−Ｃ−−Ｎ−−Ｒ’）、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニ−ｌ−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応によって選択的に修飾してもよい。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換してもよい。
【０１８２】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に、脱アミドされ得ることが多い。あるいは、これらの残基は、弱酸性状態下で脱アミドされる場合もある。これらの残基のいずれかの形も、本発明の範囲内にある。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、活性化状態特異的結合成分は、活性化可能なタンパク質上の標的構造と結合する認識構造を含むペプチドである。種々の認識構造が、当技術分野で周知であり、ファージディスプレイライブラリーをはじめ、当技術分野で公知の方法を用いて作製できる（例えば、各々、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｇｕｒｕｒａｊａら（２０００年）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：５１５〜２７頁；Ｈｏｕｉｍｅｌら、（２００１年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：３５３５〜４５頁；Ｃｏｃｈｒａｎら（２００１年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：６２５〜３２頁；Ｈｏｕｉｍｅｌら（２００１年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ９２：７４８〜５５頁を参照のこと）。さらに、本発明の方法において使用するためのような抗体に、フルオロフォアを結合させてもよい。
【０１８４】
種々の認識構造が当技術分野で公知であり（例えば、各々、参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｃｏｃｈｒａｎら、（２００１年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：６２５〜３２頁；Ｂｏｅｒら、（２００２年）Ｂｌｏｏｄ１００：４６７〜７３頁）、例えば、活性化可能なタンパク質上の標的構造に対する親和性を有するポリマーなどの認識構造を作製するためのコンビナトリアルケミストリー法（例えば、各々、参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｂａｒｎら、（２００１年）Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．３：５３４〜４１頁；Ｊｕら、（１９９９年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４：２３２〜９参照のこと）をはじめ、当技術分野で公知の方法を用いて製造できる（例えば、各々、参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｂｏｅｒら、（２００２年）  Ｂｌｏｏｄ１００：４６７〜７３頁；Ｇｕａｌｉｌｌｏら、（２００２年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９０：８３〜９頁参照のこと）。別の実施形態では、活性化状態特異的抗体は、リン酸化されている、特定の活性化可能なタンパク質のアイソフォームとのみ結合し、リン酸化されていないか、非リン酸化型である場合には、この活性化可能なタンパク質のアイソフォームと結合しないタンパク質である。別の実施形態では、活性化状態特異的抗体は、細胞内の活性化可能なタンパク質のアイソフォームとのみ結合し、細胞外のとは結合しないタンパク質であり、または逆も同様である。いくつかの実施形態では、認識構造は、抗ラミニン単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）である（例えば、各々、参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｓａｎｚら、（２００２年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ９：１０４９〜５３頁；Ｔｓｅら、（２００２年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１７：８５〜９４頁参照のこと）。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、結合成分は核酸である。用語「核酸」は、核酸類似体、例えば、ホスホラミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら、（１９９３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４９（１０）：１９２５頁およびその中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｊ．（１９７０年）Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００頁；Ｓｐｒｉｎｚｌら、（１９７７年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９頁；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、（１９８６年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７頁；Ｓａｗａｉら、（１９８４年）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５頁、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、（１９８８年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０頁；およびＰａｕｗｅｌｓら、（１９８６年）Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ２６：１４１〜９頁）、ホスホロチオエート（Ｍａｇら、（１９９１年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７頁；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら、（１９８９年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１頁、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ参照のこと）、およびペプチド核酸骨格および結合（そのすべてが参照により組み込まれる、Ｅｇｈｏｌｍ、（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５頁；Ｍｅｉｅｒら、（１９９２年）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８頁；Ｎｉｅｌｓｅｎ、（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ、３６５：５６６頁；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ３８０：２０７頁参照のこと）を含む。その他の類似体核酸として、正の骨格（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅｓ）を含むもの（Ｄｅｎｐｃｙら．、（１９９５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６０９７頁；非イオン性骨格を含むもの（米国特許第５，３８６，０２３号、同５，６３７，６８４号、同５，６０２，２４０号、同５，２１６，１４１号および同４，４６９，８６３号；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３（１９９１年）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、（１９８８年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０頁；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ１３：１５９７頁；第２および３章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、（１９９４年）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５頁；Ｊｅｆｆｓら、（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ３４：１７；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３頁（１９９６年））および非リボース骨格を含むもの、例えば、米国特許第５，２３５，０３３号および同５，０３４，５０６号ならびに第６および７章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編に記載されるものが挙げられる。１種以上の炭素環式糖を含有する核酸も、核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら、（１９９５年）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．１６９〜１７６頁参照のこと）。いくつかの核酸類似体は、Ｒａｗｌｓ、Ｃ  ＆  Ｅ  Ｎｅｗｓ  Ｊｕｎ．  ２、１９９７年３５頁に記載されている。これらの参考文献のすべては、参照により本明細書に明確に組み込まれる。リボース−ホスフェート骨格のこれらの修飾は、標識などのさらなる部分の付加を容易にするように、または生理学的環境におけるこのような分子の安定性および半減期を増大するように行ってもよい。
【０１８６】
当業者には明らかなように、これらの核酸類似体のすべてを本発明において使用してよい。さらに、天然に存在する核酸および類似体の混合物を作製してもよい。あるいは、種々の核酸類似体の混合物ならびに天然に存在する核酸および類似体の混合物を作製してもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド核酸類似体を含むペプチド核酸（ＰＮＡ）を使用する。これらの骨格は、天然に存在する核酸の高度に帯電しているホスホジエステル骨格とは対照的に、中性状態下で実質的に非イオン性である。
【０１８７】
核酸は、明記されるように、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、または二本鎖もしくは一本鎖配列の両方の部分を含んでもよい。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡまたはハイブリッドであり得、ここで、核酸は、デオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドの任意の組合せ、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサニン（ｘａｔｈａｎｉｎｅ）ヒポキサニン（ｈｙｐｏｘａｔｈａｎｉｎｅ）、イソシトシン、イソグアニンなどをはじめとする塩基の任意の組合せを含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、結合成分は、合成化合物である。ランダム化オリゴヌクレオチドの発現をはじめ、さまざまな有機化合物および生体分子のランダム合成および指向性合成のために、任意の数の技術が利用可能である。例えば、ランダムケミストリー法ならびに酵素法をはじめとする新規化合物を作製する方法を方法を論じる、参照により本明細書に明確に組み込まれるＷＯ９４／２４３１４参照のこと。
【０１８９】
あるいは、いくつかの実施形態は、結合成分として、入手可能であるか、容易に作製される細菌、真菌、植物および動物抽出物の形の天然化合物を利用する。
【０１９０】
さらに、天然のまたは合成によって作製した化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に修飾される。公知の薬理作用物質を、指向性またはランダムケミストリー修飾、例えば、酵素的修飾に付して、本発明において使用してよい結合成分を作製してもよい。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、結合成分は、小有機化合物である。結合成分は、化学的に修飾され得る一連の基質から合成できる。本明細書において「化学的に修飾された」とは、従来の化学反応ならびに酵素反応を含む。これらの基質として、通常、それだけには限らないが、アルキル基（アルカン、アルケン、アルキンおよびヘテロアルキルを含む）、アリール基（アレンおよびヘテロアリールを含む）、アルコール、エーテル、アミン、アルデヒド、ケトン、酸、エステル、アミド、環状化合物、複素環式化合物（プリン、ピリミジン、ベンゾジアゼピン、β−ラクタム、テトラサイクリン、セファロスポリンおよび糖を含む）、ステロイド（エストロゲン、アンドロゲン、コルチゾン、エコジソン（ｅｃｏｄｙｓｏｎｅ）などを含む）、アルカロイド（麦角、ビンカ、クラーレ、ピロリジンおよびマイトマイシンを含む）、有機金属化合物、ヘテロ原子含有化合物、アミノ酸およびヌクレオシドが挙げられる。これらの部分で、化学反応（酵素反応を含む）を実施し、次いで、本発明において使用できる新規基質または結合成分を形成してもよい。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、結合成分は糖である。本明細書において、用語糖とは、一般式（ＣＨ２Ｏ）ｎを有する任意の化合物を含むものとする。糖の例として、ジ−、トリ−およびオリゴサッカライドならびにポリサッカライド、例えば、グリコーゲン、セルロースおよびスターチがある。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、結合成分は脂質である。本明細書において、用語脂質とは、非極性有機溶媒に可溶性である、任意の水に不溶性の有機分子を含むものとする。脂質の例として、ステロイド、例えば、コレステロールおよびリン脂質、例えば、スフィンゴミエリンがある。
【０１９４】
活性化可能成分、活性化状態および活性化可能成分の活性化レベルを決定する方法は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ」と題された米国公開番号２００６００７３４７４および「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｒｉｓｋ  ｓｔｒａｆｉｃａｔｉｏｎ」と題された米国公開番号２００５０１１２７００に記載されており、それらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９５】
Ａ．標識
本発明の方法および組成物は、標識またはタグを含む結合成分を提供する。標識は直接（すなわち、一次標識）または間接的に（すなわち、二次標識）検出され得る分子を意味し、例えば、標識は、その有無を知ることができるよう、可視化および／または測定、そうでなければ同定され得る。化合物は、検出可能なシグナル、例えば、放射性同位元素、蛍光物質、酵素、抗体、磁性粒子などの粒子、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）または特定の結合分子などを提供する標識と直接結合しても間接的に結合してもよい。特定の結合分子として、ビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシンなどといった対が挙げられる。標識の例として、それだけには限らないが、標識を含む光学蛍光発色色素、標識酵素および放射性同位元素が挙げられる。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、１種以上の結合成分は一意的に標識される。２種の活性化状態特異的抗体の例を用いると、「一意的に標識された」とは、第１の活性化された成分を認識する第１の活性化状態抗体は、第１の標識を含み、第２の活性化された成分を認識する第２の活性化状態抗体は、第２の標識を含み、第１および第２の標識は、検出可能であり、識別可能であり、第１の抗体および第２の抗体を一意的に標識されるようにするということを意味する。
【０１９７】
通常、標識は４つのクラスに分類される：ａ）放射性同位元素または重同位体であり得る同位体標識；ｂ）磁性、電気的、熱的標識；ｃ）有色標識、発光、亜リン酸および蛍光色素または部分を含む光標識；およびｄ）結合パートナー。標識としてまた、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）および磁性粒子を挙げることができる。いくつかの実施形態では、検出標識は、一次標識である。一次標識は、直接検出され得るもの、例えば、フルオロフォアである。
【０１９８】
標識として、光標識、例えば、蛍光色素または部分が挙げられる。フルオロフォアは、「小分子」蛍光またはタンパク質性蛍光（例えば、緑色蛍光タンパク質およびそのすべての変形）のいずれかであり得る。
【０１９９】
適した蛍光標識として、それだけには限らないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラサイトグリーン（Ｍａｌａｃｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ）、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー（商標）、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣ  Ｒｅｄ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ  Ｒｅｄ７０５およびオレゴングリーンが挙げられる。適した光色素は、参照により本明細書に明確に組み込まれるＲｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄによる１９９６年Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されている。適した蛍光標識としてまた、それだけには限らないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｈａｌｆｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３（５１４８）：８０２〜８０５頁（１９９４年２月１１日）；およびＥＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ−−Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ；１．  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．  １８０１  ｄｅ  Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ  Ｂｌｖｄ．  Ｗｅｓｔ、８ｔｈ  Ｆｌｏｏｒ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ  （Ｑｕｅｂｅｃ）  Ｃａｎａｄａ  Ｈ３Ｈ  １Ｊ９；２．Ｓｔａｕｂｅｒ，Ｒ．Ｈ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（３）：４６２〜４７１頁（１９９８年）；３．Ｈｅｉｍ，Ｒ．およびＴｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８〜１８２頁（１９９６年））、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ；１．Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、１０２０  Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．  ９４３０３）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１２）：５４０８〜５４１７頁（１９９３年））、β−ガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５（８）：２６０３〜２６０７頁（１９８８年４月））およびウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ＷＯ９２／１５６７３；ＷＯ９５／０７４６３；ＷＯ９８／１４６０５；ＷＯ９８／２６２７７；ＷＯ９９／４９０１９；米国特許第５，２９２，６５８号；同５，４１８，１５５号；同５，６８３，８８８号；同５，７４１，６６８号；同５，７７７，０７９号；同５，８０４，３８７号；同５，８７４，３０４号；同５，８７６，９９５号；および同５，９２５，５５８号）が挙げられる。上記に列挙した参考文献はすべて、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。
【０２００】
いくつかの実施形態では、本発明において使用するための標識として、以下が挙げられる：Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０）、カスケードブルー、カスケードイエローおよびＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）  （Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）、ＦＩＴＣ、ローダミンおよびテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、Ｐａ．）。Ｃｙ５ＰＥ、Ｃｙ５．５ＰＥ、Ｃｙ７ＰＥ、Ｃｙ５．５ＡＰＣ、Ｃｙ７ＡＰＣのためのタンデムコンジュゲートプロトコールは、当技術分野で公知である。蛍光プローブコンジュゲーションの定量化を評価して、標識化の程度を決定でき、色素スペクトル特性を含むプロトコールも当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、蛍光標識を、結合成分または抗体とコンジュゲートしているアミノデキストランリンカーとコンジュゲートさせる。列挙されるさらなる標識は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＡｎａＳｐｅｃ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｌｔａｇ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＡｂｃａｍおよびＳｉｇｍａのオンラインおよびハードコピーカタログから入手可能であり、それらの内容物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、蛍光標識は、ＧＦＰ、より好ましくは、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）、プチロサルカス（Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ）またはオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）種のＧＦＰである。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、第２の検出可能な標識を用いる。第２の標識は、間接的に検出されるものであり、例えば、第２の標識は、検出のために第１の標識と結合または反応でき、さらなる生成物に作用し、第１の標識（例えば、酵素）などを生じ得る。第２の標識として、それだけには限らないが、結合パートナー対の一方；化学修飾可能な部分；ヌクレアーゼ阻害剤、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの酵素などが挙げられる。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、第２の標識は、結合パートナー対である。例えば、標識は、その結合パートナーと結合する、ハプテンまたは抗原であり得る。例えば、適した結合パートナー対として、それだけには限らないが、抗原（例えば、タンパク質（ペプチドを含む）および小分子）および抗体（その断片（ＦＡｂなど）を含む）；タンパク質および小分子、例えば、ビオチン／ストレプトアビジン；酵素および基質または阻害剤；その他のタンパク質−タンパク質相互作用対；受容体−リガンド；ならびに糖およびその結合パートナーが挙げられる。核酸−−核酸結合タンパク質対も有用である。結合パートナー対として、それだけには限らないが、ビオチン（またはイミノ−ビオチン）およびストレプトアビジン、ジゲオキシニン（ｄｉｇｅｏｘｉｎｉｎ）およびＡｂならびにＰｒｏｌｉｎｘ（商標）試薬が挙げられる。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、結合パートナー対は、抗原および抗原と特異的に結合する抗体を含む。本明細書において、「特異的に結合する」とは、パートナーが、対と、系のその他の成分または混入物質間を区別するのに十分な特異性で結合することを意味する。結合は、非特異的結合を除去するための洗浄ステップを含むアッセイの条件下で結合したままであるのに十分でなければならない。いくつかの実施形態では、対の解離定数は、約１０−４〜１０−９Ｍ−１未満となり、約１０−５〜１０−９Ｍ−１未満が好ましく、約１０−７〜１０−９Ｍ−１が特に好ましい。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、第２の標識は、化学修飾可能な部分である。この実施形態では、反応性官能基を含む標識を、標識されるべき分子に組み込む。次いで、続いて官能基を、第１の標識を用いて（例えば、アッセイの前または後のいずれかで）標識してよい。適した官能基として、それだけには限らないが、アミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、オキソ基およびチオール基が挙げられ、アミノ基およびチオール基が特に好ましい。例えば、アミノ基を含有する第１の標識を、例えば、当技術分野で公知のリンカー、例えば、ホモ−またはヘテロ−二官能性リンカーが周知である（参照により本明細書に組み込まれる、１９９４年  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙカタログ、ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ、１５５〜２００頁参照のこと）を用いて、アミノ基を含む第２の標識と結合させることができる。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物に複数の蛍光標識を使用する。いくつかの実施形態では、各標識は、別個であり、その他の標識と区別可能である。
【０２０７】
当技術分野では明らかなように、抗体−標識コンジュゲーションは、標準的な手順を用いて、またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  （Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）製のタンパク質−タンパク質／タンパク質−色素クロスリンクキットを用いることによって実施してよい。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、細胞中の活性化可能なタンパク質の機能分析のために標識抗体を用いる。このような分析の実施において、いくつかの実験の領域が考慮される：（１）染色のための抗体カクテルの適切な組合せの同定（２）、注目する抗原（すなわち、活性化可能なタンパク質）および抗体クローンを用いて染色するための逐次手順の同定、および（３）細胞刺激に対する細胞培養条件の効果の評価によって。抗原クローン選択は、ヒト細胞の表面抗原にとって特に重要であるが、これは、異なる抗体クローンは異なる結果をもたらし、異なるプロトコールでは同様に染色しないためである。細胞種の選択および培養条件の最適化も、差異の検出において重要な成分である。例えば、いくつかの細胞系統は、培養条件に適合し、不均一な応答をもたらし得る能力を有する。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ，Ｐ．Ｋ．ら、Ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｂｙ  ｐｏｌｙｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２、９７２〜９７７頁（２００６年）によって開示されるように、活性化状態特異的抗体を量子ドットを用いて標識する。量子ドット標識は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｂｅｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｑｄｏｔ／から市販されている。
【０２１０】
量子ドット標識された抗体は、単独で用いてもよいし、利用可能な標識の総数を増大するよう有機蛍光色素がコンジュゲートしている抗体とともに使用してもよい。標識抗体の数が増大するにつれ、既知細胞集団を再分類する能力も増大する。したがって、活性化状態特異的抗体は、Ｅｒｋｋｉ，Ｊ．ら、Ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ  ｃｈｅｌａｔｅｓ  ａｓ  ｎｅｗ  ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ  ｌａｂｅｌｓ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：１４４９〜１４５１頁、１９８８年およびＳａｌｉｃｙｌａｍｉｄｅ−Ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ａｓ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｍａｒｋｅｒｓと題された米国特許第７，０１８８５０号によって開示されるように、キレート化またはケージドランタニドを用いて標識できる。蛍光を検出するその他の方法もまた使用してよく、例えば、量子ドット法（例えば、各々参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２年）１２４：６３７８〜８２頁；Ｐａｔｈａｋら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００１年）１２３：４１０３〜４頁；およびＲｅｍａｄｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００年）１８：５５３〜８頁参照のこと）ならびに共焦点顕微鏡がある。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、活性化可能成分を、Ｔａｎｎｅｒら  Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  Ｐａｒｔ  Ｂ：  Ａｔｏｍｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、２００７年３月；６２（３）：１８８〜１９５頁；Ｏｒｎａｔｓｋｙら、ｍＲＮＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｔａｌ−Ｔａｇｇｅｄ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙ、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｏｎｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  （２００６年）：１、１〜９頁；Ｏｒｎａｔｓｋｙら、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＩＣＰ−ＭＳ、Ｊ．  Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０８（２００６年）６８〜７６頁；およびＬｏｕら、Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｂａｓｅｄ  Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｔａｇｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、（２００７年）４６、６１１１〜６１１４頁に開示されるように、誘導結合プラズマ質量分析装置（ＩＣＰ−ＭＳ）に適したタグを用いて標識する。
【０２１２】
あるいは、以下に詳細に論じる、ＦＲＥＴに基づく検出系を使用してもよい。ＦＲＥＴは本発明において、例えば、クラスター化または多量体化を含む活性化状態の検出において使用でき、ここでは、２種のＦＲＥＴ標識の近接が活性化によって変化する。いくつかの実施形態では、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対のメンバーである少なくとも２種の蛍光標識が用いられる。
【０２１３】
ＦＲＥＴは、一方の蛍光色素の励起が、光子の放出を伴わずにもう一方に移される当技術分野で公知の事象である。ＦＲＥＴ対は、ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアからなる。ドナーの蛍光発光スペクトルおよびアクセプターの蛍光吸収スペクトルは、重複しなければならず、２種の分子は、極接近していなければならない。ドナーの５０％が不活化される、ドナーとアクセプター間の距離（アクセプターへの移動エネルギー）は、フェルスター半径（Ｒｏ）によって定義され、これは、通常、１０〜１００Åである。ＦＲＥＴ対を含む蛍光発光スペクトルの変化を検出でき、極接近している（すなわち、互いに１００  ５２１内）数の変化を示す。これは、通常、一方がＦＲＥＴドナーで標識され、もう一方がＦＲＥＴアクセプターで標識される、２種の分子の結合または解離に起因し、このような結合は、ＦＲＥＴ対を極接近させる。このような分子の結合は、アクセプターの蛍光発光の増大および／またはドナーの蛍光発光の消光をもたらす。
【０２１４】
本発明において有用なＦＲＥＴ対（ドナー／アクセプター）として、それだけには限らないが、ＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、フルオレセイン／ＬＣ  Ｒｅｄ６４０、フルオレセイン／Ｃｙ５、フルオレセイン／Ｃｙ５．５およびフルオレセイン／ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５が挙げられる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴを用いる場合には、蛍光ドナー分子および非蛍光アクセプター分子（「消光剤」）を使用してよい。本出願では、ドナーの蛍光発光は、消光剤が、ドナーに極接近したところから離れている場合に増大し、蛍光発光は、消光剤がドナーと極接近する場合に減少する。有用な消光剤として、それだけには限らないが、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、ＱＳＹ７およびＱＳＹ３３が挙げられる。有用な蛍光ドナー／消光剤対として、それだけには限らないが、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、テキサスレッド／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬおよびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が挙げられる。
【０２１６】
当業者には、ＦＲＥＴおよび蛍光消光によって、標識された分子の結合を経時的にモニターすることが可能になり、結合反応の経時変化に関する連続的な情報を提供するということは明らかであろう。
【０２１７】
ＦＲＥＴの程度の変化を、ドナーおよびアクセプター部分からの蛍光量の比率の変化の関数として求めること、「比率決定（ｒａｔｉｏｎｉｎｇ）」と呼ばれる過程が好ましい。基質の絶対量、励起強度および濁度または励起波長でのサンプル中のその他のバックグラウンド吸光度の変化は、ドナーおよびアクセプター両方からの蛍光の強度にほぼ同時に影響を及ぼす。したがって、２種の発光強度の比率は、いずれかの強度単独よりも、頑強で、好ましい開裂の尺度である。
【０２１８】
本明細書に記載されるレシオメトリック蛍光リポーター系は、発現している単一の生細胞および発現していない単一の生細胞両方の高感度な検出および単離を可能にするので、タンパク質組み込み分析のための既存のレポーターを上回る大きな利点を有する。いくつかの実施形態では、アッセイ系は、細胞内に容易に運ばれ、次いで、トラップされる非毒性、非極性蛍光基質を用いる。同族タンパク質による蛍光基質の修飾は、基質が生成物に変換される時に蛍光発光シフトをもたらす。リポーター読み出しはレシオメトリックであるので、個々の細胞内に負荷された基質の量などの変数について制御するリポータータンパク質アッセイ間で独特である。安定な、容易に検出される、細胞内読み出しは、発現解析に先立ってクローン細胞系統を確立する必要を排除する。この系およびその他の類似のフローソーティング系を用いて、特定の受容体成分クラスター化、および／または活性化プロフィールを有する細胞を何百万もの生細胞のプールから単離できる。
【０２１９】
本発明の方法および組成物はまた、標識酵素を使用してもよい。標識酵素とは、検出可能な生成物を生じる標識酵素基質の存在下で反応し得る酵素を意味する。本発明において使用するための適した標識酵素として、それだけには限らないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼが挙げられる。このような基質の使用方法は、当技術分野で周知である。標識酵素の存在は、通常、同定可能な生成物を生じる標識酵素基質を用いた反応の酵素触媒作用を介して示される。このような生成物は不透明である場合、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼのテトラメチルベンゼジンとの反応もあり、また種々の色を有する場合もある。蛍光反応生成物を生成するその他の標識酵素基質、例えば、ルミノール（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手可能）が開発されている。標識酵素を、標識酵素基質を用いて同定する方法は、当技術分野で周知であり、多数の市販のキットが利用可能である。種々の標識酵素の例および使用方法は、Ｓａｖａｇｅら、Ｐｒｅｖｉｅｗｓ２４７：６〜９頁（１９９８年）、Ｙｏｕｎｇ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２４：２２７〜２３６頁（１９８９年）に記載されており、それらは各々その全文が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２０】
放射性同位元素とは、任意の放射性分子を意味する。本発明において使用するための適した放射性同位元素として、それだけには限らないが、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉおよび１３１Ｉが挙げられる。標識としての放射性同位元素の使用は、当技術分野で周知である。
【０２２１】
記載したように、標識は間接的に検出され得る、すなわち、タグは、結合対のパートナーである。「結合対のパートナー」とは、第１および第２の部分の一方を意味し、第１および第２の部分は、互いに特異的結合親和性を有する。本発明において使用するための適した結合対として、それだけには限らないが、抗原／抗体（例えば、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）／抗ＤＮＰ、ダンシル−Ｘ−抗ダンシル、フルオレセイン／抗フルオレセイン、ルシファーイエロー／抗ルシファーイエローおよびローダミン抗ローダミン）、ビオチン／アビジン（またはビオチン／ストレプトアビジン）およびカルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）／カルモジュリンが挙げられる。その他の適した結合対として、ＦＬＡＧ−ペプチド［Ｈｏｐｐら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１２０４〜１２１０頁（１９８８年）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５：１９２〜１９４頁（１９９２年）］；チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１５１６３〜１５１６６頁（１９９１年）］；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３９３〜６３９７頁（１９９０年）］などのポリペプチドおよび各々に対する抗体が挙げられる。当業者には明らかであろうが、結合対パートナーは、本明細書に記載されるように、標識のため以外の適用において使用できる。
【０２２２】
当業者には明らかであろうが、一結合対のパートナーはまた、別の結合対のパートナーであり得る。例えば、抗原（第１の部分）は、次いで、第２の抗体（第３の部分）の抗原であり得る、第１の抗体（第２の部分）と結合し得る。このような状況によって、各々に対する結合対パートナーである中間の第２の部分を介して、第１の部分および第３の部分の間接的な結合が可能になることは、さらに明らかである。
【０２２３】
当業者には当然であろうが、結合対のパートナーは、上記のように標識を含み得る。これによって、標識を含む結合パートナーの結合時に、タグが間接的に標識されることが可能になることは、さらに明らかである。ちょうど記載したように、標識を、結合対のパートナーであるタグと結合することは、本明細書において「間接標識」と呼ばれる。
【０２２４】
「表面基質結合分子」または「結合タグ」およびその文法上の同等物は、特異的表面基質に対する結合親和性を有する分子を意味し、その基質は、通常、表面に組み込まれているか、そうでなければ結合している、適用される結合対のメンバーである。適した表面基質結合分子およびその表面基質として、それだけには限らないが、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグおよびニッケル基質；グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼタグおよびその抗体基質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手可能）；インフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５基質［Ｆｉｅｌｄら．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８：２１５９〜２１６５頁（１９８８年）］；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体基質［Ｅｖａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５：３６１０〜３６１６頁（１９８５年）］；および単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体基質［Ｐａｂｏｒｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３（６）：５４７〜５５３頁（１９９０年）］が挙げられる。概して、本発明において有用な表面結合基質分子として、それだけには限らないが、ニッケル基質と結合するポリヒスチジン構造（Ｈｉｓ−タグ）、抗体を含む表面基質と結合する抗原、アビジン基質（例えば、ビオチン）と結合するハプテンおよびカルモジュリンを含む表面基質と結合するＣＢＰが挙げられる。
【０２２５】
抗体が埋め込まれた基質の製造はよく知られている；Ｓｌｉｎｋｉｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．、２：３４２〜３４８頁（１９９１年）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎら、前掲；Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．３：３２３〜３２７頁（１９９２年）；Ｋｉｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：６１７６〜６１８５頁（１９９４年）；およびＷｉｌｂｕｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：２２０〜２３５頁（１９９４年）を参照のこと（そのすべては、参照により明確に本明細書に組み込まれる）、抗原を含むタンパク質の結合または製造は上記で記載されている。カルモジュリンが埋め込まれた基質は、市販されており、ＣＢＰを含むタンパク質の製造は、その全文が参照により本明細書に組み込まれるＳｉｍｃｏｘら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ８：４０〜４３頁（１９９５年）に記載されている。
【０２２６】
当業者には明らかであろうが、本発明のタグ成分は、広く、タグの形態に応じて種々の方法で作製してよい。本発明の成分およびタグは、共有結合によって結合されることが好ましい。
【０２２７】
タグもまたポリペプチドである場合の、組換え手段によるタグ−ポリペプチドの製造を以下に記載する。タグ標識されたタンパク質の製造は、当技術分野で周知であり、このような製造のためのキットが市販されている（例えば、ＫｏｄａｋおよびＳｉｇｍａ製）。タグ標識されたタンパク質の例として、それだけには限らないが、Ｆｌａｇ−ポリペプチドおよびＨｉｓ−ポリペプチドが挙げられる。タグ標識されたタンパク質の製造および使用のための方法は、例えば、その全文が本明細書に組み込まれる、Ｗｉｎｓｔｏｎら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１３：２７０〜２８３頁（１９９９年）ならびに上記のキットとともに提供される製品ハンドブックに見られる。
【０２２８】
標的分子および基質のビオチン化はよく知られており、例えば、タンパク質、核酸、糖、カルボン酸のビオチン化のために、アミン反応性およびチオール反応性薬剤をはじめとする多数のビオチン化剤が知られている；参照により本明細書に組み込まれる、第４章、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログ、Ｈａｕｇｌａｎｄ、第６版１９９６年参照のこと。ビオチン化基質は、アビジンまたはストレプトアビジンを介してビオチン化成分と結合され得る。同様に、多数のハプテン化試薬も知られている（同文献）。
【０２２９】
放射性同位元素を用いてタンパク質を標識する方法は、当技術分野で公知である。例えば、このような方法は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Ｏｈｔａら、（１９９９）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ３：５３５〜５４１頁に見られる。
【０２３０】
組換え手段によるタグを有するタンパク質の製造は周知であり、このようなタンパク質を製造するためのキットが市販されている。例えば、このようなキットおよびその使用は、参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｊｏａｎｎｅ  ＣｒｏｗｅらによるＱｉａｇｅｎ製のＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されている。
【０２３１】
チオール、アミン、カルボキシルなどといった化学的反応性基を用いた標識の官能基付与は、全般的に、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、タグは、共有結合を容易にするよう官能基付与される。タグの共有結合は、直接またはリンカーを介してのいずれかであり得る。一実施形態では、リンカーは、相対的に短いカップリング部分であり、これを用いて分子を結合する。カップリング部分は、本発明の成分上で直接合成してもよく、タグの結合を容易にするよう、少なくとも１種の官能基を含んでもよい。あるいは、カップリング部分は、少なくとも２種の官能基を有してもよく、例えば、これらを用いて、官能基付与された成分を、官能基付与されたタグと結合する。さらなる実施形態では、リンカーはポリマーである。この実施形態では、共有結合は、直接的にまたは成分またはタグからポリマーへのカップリング部分の使用によってのいずれかで達成される。いくつかの実施形態では、共有結合は、直接である、すなわち、リンカーは用いない。この実施形態では、成分は、官能基付与されたタグとの直接結合に用いられるカルボン酸などの官能基を含むことが好ましい。成分およびタグは、上記で列挙されるものを含めた種々の方法で結合され得るということは理解されなければならない。いくつかの実施形態では、タグは、ポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に結合される。当業者には明らかであろうが、標識の共有結合の上記の記載は、本開示内容の実質的に任意の２種の分子の結合に当てはまる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、上記で大まかに概説されるように、共有結合を容易にするようタグに官能基付与する。したがって、それだけには限らないが、イソチオシアネート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステルおよびスルホニルハライドをはじめとする官能基を含むさまざまなタグが市販されており、本明細書に記載されるように、そのすべてを、タグを第２の分子と共有結合によって結合するために用いてよい。タグの官能基の選択は、上記で概説されるリンカーまたは本発明の成分のいずれかとの結合の部位に応じて変わる。したがって、例えば、タンパク質のカルボン酸基との直接結合には、カルボジイミド化学による、例えば、当技術分野で公知のように、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いるカップリングのために、アミノ修飾またはヒドラジン修飾されたタグを用いる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログ、前掲のセット９およびセット１１参照のこと；Ｐｉｅｒｃｅ  １９９４  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｔ−１５５〜Ｔ−２００頁も参照のこと、その両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、カルボジイミドをまず、タグと結合させ、本明細書に記載されるタグの多くについては、例えば、市販されている。
【０２３３】
代替活性化状態指標
本発明とともに有用な代替活性化状態指標として、このような活性化の結果を示すことによって活性化の検出を可能にするものがある。例えば、基質のリン酸化を用いて、その基質のリン酸化に関与するキナーゼの活性化を検出できる。同様に、基質の切断を、このような切断に関与するプロテアーゼの活性化の指標として使用できる。このような指標を検出可能なシグナル、例えば、結合成分と関連した上記の標識およびタグと結びつける方法は、当技術分野で周知である。例えば、基質の切断は、消光部分の除去をもたらし、ひいては、以前は消光していた標識から検出可能なシグナルが生じることを可能にし得る。
【０２３４】
モジュレーター
いくつかの実施形態では、方法および組成物は、モジュレーターを利用する。モジュレーターは、アクチベーター、阻害剤または細胞経路に影響を及ぼし得る化合物であり得る。モジュレーターは、環境信号および入力の形をとり得る。
【０２３５】
調節は、種々の環境において実施できる。いくつかの実施形態では、細胞を収集の直後にモジュレーターに曝露する。細胞の混合集団があるいくつかの実施形態では、調節後に細胞の精製を実施する。いくつかの実施形態では、全血を採取し、それにモジュレーターを加える。いくつかの実施形態では、細胞を、単細胞または単細胞の精製画分を処理した後に調節する。例示的実施例として、全血を採取し、リンパ細胞の豊富な画分のために処理することができ、次いで、それをモジュレーターに曝露する。調節は、２種以上のモジュレーターに細胞を曝露することを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、細胞を少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０種のモジュレーターに曝露する。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、細胞を採取後に適した培地で培養し、その後、モジュレーターに曝露する。いくつかの実施形態では、培地は、増殖培地である。いくつかの実施形態では、増殖培地は、血清を含み得る複合培地である。いくつかの実施形態では、増殖培地は血清を含む。いくつかの実施形態では、血清は、ウシ胎児血清、ウシ血清、ヒト血清、ブタ血清、ウマ血清およびヤギ血清からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、血清レベルは、０．０００１％〜３０％の範囲である。いくつかの実施形態では、任意の適した血清量を用いる。いくつかの実施形態では、増殖培地は、化学的に定義される最小培地であり、血清を含まない。いくつかの実施形態では、細胞を、分化培地で培養する。
【０２３７】
モジュレーターとして、化学的および生物学的実体ならびに物理的または環境刺激が挙げられる。モジュレーターは、細胞外にまたは細胞内に作用し得る。化学的および生物学的モジュレーターとして、増殖因子、サイトカイン、神経伝達物質、接着分子、ホルモン、小分子、無機化合物、ポリヌクレオチド、抗体、天然化合物、レクチン、ラクトン、化学療法薬、生物反応修飾物質、糖、プロテアーゼおよびフリーラジカルが挙げられる。モジュレーターは、細胞性または植物抽出物、細胞性または腺性分泌物、血清、羊水または毒液などの生理液を含み得る、複雑な、未定義の生物学的組成物を含む。物理的および環境刺激として、電磁、紫外、赤外または特定の放射線照射、酸化還元電位およびｐＨ、栄養分の有無、温度の変化、酸素部分圧の変化、イオン濃度の変化および酸化ストレスの適用が挙げられる。モジュレーターは、内因性である場合も、外因性である場合もあり、濃度および単細胞に対する曝露期間、またはそれらが、その他のモジュレーターと組み合わせて用いられるか、もしくは逐次用いられるかどうかに応じて、異なる作用を生じ得る。モジュレーターは、活性化可能成分に対して直接的に、または１種以上の中間生体分子との相互作用を介して間接的に作用し得る。間接調節は、発現される遺伝子産物が活性化可能成分であるか、または活性化可能成分のモジュレーターである、遺伝子発現の変化を含む。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、モジュレーターは、モジュレーターの濃度、曝露期間またはそれらが、その他のモジュレーターと組み合わせて用いられるか、もしくは逐次用いられるかに応じて、種々の活性化状態を引き起こす。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、モジュレーターは、増殖因子、サイトカイン、接着分子モジュレーター、薬物、ホルモン、小分子、ポリヌクレオチド、抗体、天然化合物、ラクトン、化学療法薬、免疫モジュレーター、糖、プロテアーゼ、イオン、反応性酸素種、単独または細胞との関連でのペプチドおよびタンパク質断片、細胞自体、ウイルスならびに生物学的および非生物学的複合体（例えば、ビーズ、プレート、ウイルス外被、主要組織適合性複合体などの抗原提示分子）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、物理的刺激、例えば、熱、冷たさ、ＵＶ放射線照射および放射線照射である。モジュレーターの例として、それだけには限らないが、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭ、リツキサン、アレムツズマブ、抗ＣＤ２２（エピラツズマブ）、抗ＣＤ２３（ルミリキシマブ）、キャンパス、Ｈ２Ｏ２、ＰＭＡ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＤＦ１ａ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＧＦ−１、イミキモド、ポリＣｐＧ、フルダラビン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ＩＬ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびタプシガーギンが挙げられる。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、モジュレーターはアクチベーターである。いくつかの実施形態では、モジュレーターは阻害剤である。いくつかの実施形態では、細胞を１種以上のモジュレーターに対して曝露する。いくつかの実施形態では、細胞を、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０種のモジュレーターに対して曝露する。いくつかの実施形態では、細胞を、少なくとも２種のモジュレーターに曝露し、ここで、１種のモジュレーターはアクチベーターであり、１種のモジュレーターは阻害剤である。いくつかの実施形態では、細胞を、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０種のモジュレーターに対して曝露し、ここで、少なくとも１種のモジュレーターは阻害剤である。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、モジュレーターは、Ｂ細胞受容体モジュレーターである。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体モジュレーターは、Ｂ細胞受容体アクチベーターである。Ｂ細胞受容体アクチベーターの例として、Ｂ細胞受容体複合体のクロスリンカーまたはＢ細胞共受容体複合体のクロスリンカーがある。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、抗体または分子結合実体である。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は多価抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、固体表面との結合によってより多価にされた、もしくはエピトープ結合ドメインの局所結合価を増大するようナノ粒子表面に繋ぎ止められた、一価、二価または多価抗体である。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、クロスリンカーは分子結合実体である。いくつかの実施形態では、分子結合実体は、複合体中の糖またはエピトープを介してＢ細胞受容体複合体に作用または結合する。いくつかの実施形態では、分子は、固体表面との結合によってより多価にされた、またはエピトープ結合ドメインの局所結合価を増大するようナノ粒子表面に繋ぎ止められた、一価、二価、または多価である。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、Ｂ細胞受容体複合体またはＢ細胞共受容体複合体のクロスリンクは、抗体または分子結合実体と細胞を結合させること、次いで、抗体または分子結合実体によるＢＣＲ複合体のクロスリンクを引き起こす、細胞と固体表面との相互作用によってそのクロスリンクを引き起こすことを含む。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ポリクローナルＢＣＲ抗体、モノクローナルＢＣＲ抗体、Ｆｃ受容体由来結合成分および／またはそれらの組合せである。Ｉｇは、マウス、ヤギ、ウサギ、ブタ、ラット、ウマ、ウシ、サメ、ニワトリまたはラマからなる群から選択される種に由来するものであり得る。いくつかの実施形態では、クロスリンカーは、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ、ポリクローナルＩｇＭ抗体、モノクローナルＩｇＭ抗体、ビオチン化Ｆ（ａｂ）２ＩｇＣＭ、ビオチン化ポリクローナルＩｇＭ抗体、ビオチン化モノクローナルＩｇＭ抗体および／またはそれらの組合せである。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、阻害剤は、細胞中の細胞経路（例えば、シグナル伝達カスケード）に関与する、一細胞因子または複数の因子の阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、キナーゼまたはホスファターゼ阻害剤である。キナーゼ阻害剤の例として、アダフォスチン、ＡＧ４９０、ＡＧ８２５、ＡＧ９５７、ＡＧ１０２４、アロイシン、アロイシンＡ、アルステルパウロン、アミノゲニステイン、ＡＰＩ−２、アピゲニン、アルクチゲニン、ＡＹ−２２９８９、ＢＡＹ６１−３６０６、ビスインドリルマレイミドＩＸ、チェレリスリン、１０−［４’−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル］−２−クロロフェノキサジンヒドロクロリド、ダサチニブ、２−ジメチルアミノ−４，５，６，７−テトラブロモ−１Ｈ−ベンズイミダゾール、５，７−ジメトキシ−３−（４−ピリジニル）キノリンジヒドロクロリド、エデルホシン、エラグ酸、エンザスタウリン、マレイン酸ＥＲ２７３１９、エルロチニブ、ＥＴ１８ＯＣＨ３、ファスジル、フラボピリドール、ゲフィチニブ、ＧＷ５０７４、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−８９、ＨＡ−１００、ＨＡ−１００４、ＨＡ−１０７７、ＨＡ−１１００、ヒドロキシファスジル、インジルビン−３’−オキシム、５−ヨードツベルシジン、ケンパウロン（ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＫＮ−６２、ＫＹ１２４２０、ＬＦＭ−Ａ１３、ラベンダスチンＡ、ルテオリン、ＬＹ−２９４００２、ＬＹ２９４００２、マロトキシン、ＭＬ−９、ＮＳＣ−１５４０２０、ＮＳＣ−２２６０８０、ＮＳＣ−２３１６３４、ＮＳＣ−６６４７０４、ＮＳＣ−６８０４１０、ＮＵ６１０２、オロモウシン、オキシインドールＩ、ＰＤ−１５３０３５、ＰＤ−９８０５９、ＰＤ１６９３１６、フロレチン、フロリジン、ピセタノール、ピクロポドフィリン、ＰＫＩ、ＰＰ１、ＰＰ２、プルバラノールＡ、ケルセチン、Ｒ４０６、Ｒ７８８、ラパミューン、ラパマイシン、Ｒｏ３１−８２２０、ロスコビチン、ロットレリン、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、シロリムス、ソラフェニブ、ＳＬ３２７、ＳＰ６００１２５、スタウロスポリン、ＳＴＩ−５７１、ＳＵ−１１２７４、ＳＵ１４９８、ＳＵ４３１２、ＳＵ６６５６、４，５，６，７−テトラブロモトリアゾール、ＴＧ１０１３４８、トリシリビン、チロホスチンＡＧ４９０、チロホスチンＡＧ８２５、チロホスチンＡＧ９５７、チロホスチンＡＧ１０２４、チロホスチンＳＵ１４９８、Ｕ０１２６、ＶＸ−５０９、ＶＸ−６６７、ＶＸ−６８０、Ｗ−７、ワートマニン、ＸＬ−０１９、ＸＬ−１４７、ＸＬ−１８４、ＸＬ−２２８、ＸＬ−２８１、ＸＬ−５１８、ＸＬ−６４７、ＸＬ−７６５、ＸＬ−８２０、ＸＬ−８４４、ＸＬ−８８０、Ｙ−２７６３２、ＺＤ−１８３９、ＺＭ−２５２８６８、ＺＭ−４４７４３９、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡが挙げられる。ホスファターゼ阻害剤の例として、それだけには限らないが、Ｈ２Ｏ２、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、カンタリジン、（−）−ｐ−ブロモテトラミゾール、ミクロシスチンＬＲ、オルトバナジウム酸ナトリウム、過バナジン酸ナトリウム、硫酸バナジル、ナトリウムオキソジペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）バナデート、ビス（マルトラト）オキソバナジウム（ＩＶ）、モリブデン酸ナトリウム、過モリブデン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、イミダゾール、フッ化ナトリウム、β−グリセロフォスフェート、ピロリン酸ナトリウム十水和物、カリクリンＡ、ディスコデルミア・カリックス（Ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｉａ  ｃａｌｙｘ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ｍｐＶ（ｐｉｃ）、ＤＭＨＶ、シペルメトリン、デフォスタチン、オカダ酸、ＮＩＰＰ−１、Ｎ−（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロ−フェナントレン−２−イル）−２，２−ジメチル−プロピオンアミド、α−ブロモ−４−ヒドロキシアセトフェノン、４−ヒドロキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−メトキシアセトフェノン、４−メトキシフェナシルＢｒ、α−ブロモ−４−（カルボキシメトキシ）アセトフェノン、４−（カルボキシメトキシ）フェナシルＢｒおよびビス（４−トリフルオロメチルスルホンアミドフェニル）−１，４−ジイソプロピルベンゼン、フェニルアルシンオキシド、ピロリジンジチオカルバメートおよびアルミニウムフルオリドが挙げられる。いくつかの実施形態では、ホスファターゼ阻害剤はＨ２Ｏ２である。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｏ２を、阻害剤として投与する。いくつかの実施形態では、０．０１から５０ｍＭの間でＨ２Ｏ２を投与する。いくつかの実施形態では、０．１から１０ｍＭの間でＨ２Ｏ２を投与する。いくつかの実施形態では、１から１０ｍＭの間でＨ２Ｏ２を投与する。いくつかの実施形態では、１から５ｍＭの間でＨ２Ｏ２を投与する。いくつかの実施形態では、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０ｍＭでＨ２Ｏ２を投与する。特定の実施形態では、３．０ｍＭでＨ２Ｏ２を投与する。特定の実施形態では、３．３ｍＭでＨ２Ｏ２を投与する。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｏ２の曝露期間は、０．０１から３６０分の間である。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｏ２の曝露期間は、０．１から２４０分の間である。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｏ２の曝露期間は、０．５から１８０分の間である。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｏ２の曝露期間は、０から１２０分の間である。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｏ２の曝露期間は、５から１５分である。いくつかの実施形態で、Ｈ２Ｏ２の曝露期間は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１４０、１６０または１８０分である。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｏ２の曝露期間は、１０分である。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｏ２を、少なくとも１種のその他のモジュレーターとともに阻害剤として投与する。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｏ２を、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭまたは任意の適したＢＣＲアゴニストとともに阻害剤として投与する。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｏ２をＦ（ａｂ）２  ＩｇＭの投与の前に投与する。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｏ２をＦ（ａｂ）２  ＩｇＭと同時に投与する。いくつかの実施形態では、Ｈ２Ｏ２を、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭの後で投与する。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、細胞を、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０種のモジュレーターと接触させた後に、細胞中の活性化可能成分の活性化レベルを決定する。いくつかの実施形態では、細胞を、少なくとも１種のモジュレーターが阻害剤である、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０種のモジュレーターと接触させた後に、細胞中の活性化可能成分の活性化レベルを決定する。いくつかの実施形態では、細胞を、阻害剤および、阻害剤またはアクチベーターであり得るモジュレーターと接触させた後に、細胞中の活性化可能成分の活性化レベルを決定する。いくつかの実施形態では、細胞を、阻害剤およびアクチベーターと接触させた後に、細胞中の活性化可能成分の活性化レベルを決定する。いくつかの実施形態では、細胞を、２種以上のモジュレーターと接触させた後に、細胞中の活性化可能成分の活性化レベルを決定する。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、別個の培養物中の細胞の集団を、複数のモジュレーターに曝露させる時に活性化可能成分の活性化レベルを測定することによって、細胞の集団の表現型プロフィールを決定する。いくつかの実施形態では、モジュレーターとして、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ、リツキサン、アレムツズマブ、抗ＣＤ２２（エピラツズマブ）、抗ＣＤ２３（ルミリキシマブ）、キャンパス、Ｈ２Ｏ２、ＰＭＡ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＤＦ１ａ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＧＦ−１、イミキモド、ポリＣｐＧ、フルダラビン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ＩＬ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、タプシガルジン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｄｉｎ）および／またはそれらの組合せが挙げられる。例えば、以下のモジュレーターの組合せのうち１以上、すべてまたは組合せに細胞の集団を曝露させることができる：（ｉ）Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ；（ｉｉ）リツキサン；（ｉｉｉ）キャンパス；（ｉｖ）Ｈ２Ｏ２；（ｖ）ＰＭＡ；（ｖｉ）ＢＡＦＦ；（ｖｉｉ）Ａｐｒｉｌ；（ｖｉｉｉ）ＳＤＦ１ａ；（ｉｘ）ＣＤ４０Ｌ；（ｘ）ＩＧＦ−１；（ｘｉ）イミキモド；（ｘｉｉ）ポリＣｐＧ；（ｘｉｉｉ）フルダラビン；（ｘｉｖ）シクロホスファミド；（ｘｖ）クロラムブシル；ＩＬ−７；（ｘｖｉ）ＩＬ−６；（ｘｖｉｉ）ＩＬ−１０；（ｘｖｉｉｉ）ＩＬ−２７；（ｘｘ）ＩＬ−４；（ｘｘ）ＩＬ−２；（ｘｘｉ）ＩＬ−３；（ｘｘｉｉ）アレムツズマブ、（ｘｘｉｉｉ）抗ＣＤ２２（エピラツズマブ）、（ｘｘｉｖ）抗ＣＤ２３（ルミリキシマブ）、（ｘｘｖ）タプシガーギン；および（ｘｘｖｉ）Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭおよびＨ２Ｏ２。いくつかの実施形態では、細胞の集団の表現型プロフィールを用いて、本明細書に記載されるように集団を分類する。
【０２４９】
検出
本発明の方法の実施では、１種以上の活性化可能成分の状態の検出は、ヒト、例えば、実験室の技術者によって実施され得る。あるいは、１種以上の活性化可能成分の状態の検出は、自動化システムを用いて実施され得る。いずれの場合においても、本発明の方法に従って使用するための１種以上の活性化可能成分の状態の検出は、当技術分野で確立された標準技術および手順に従って実施する。
【０２５０】
１種以上の活性化可能成分は、注目する活性化可能成分の存在を検出および／または定量化する任意の方法によって、検出および／または定量化できる。このような方法として、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、共焦点顕微鏡を用いるか、用いない免疫蛍光組織化学、逆相測定法（ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｐｈａｓｅ  ａｓｓａｙｓ）、均一系酵素免疫測定法および関連非酵素技術、ウエスタンブロット、全細胞染色、免疫電子顕微鏡、核酸増幅、遺伝子アレイ、タンパク質アレイ、質量分析、パッチクランプ、２次元ゲル電気泳動、ディファレンシャルディスプレイゲル電気泳動、ミクロスフェアベースのマルチプレックスタンパク質アッセイ、標識不含細胞アッセイおよびフローサイトメトリーなどが挙げられる。米国特許第４，５６８，６４９号には、シンチレーション計数を使用するリガンド検出システムが記載されている。これらの技術は、修飾されたタンパク質パラメータにとって特に有用である。タンパク質のための細胞読み出しおよびその他の細胞決定因子を、蛍光またはほかのタグをつけたリポーター分子を用いて得ることができる。フローサイトメトリー法は、細胞内パラメータを測定するために有用である。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、本発明は、単細胞について活性化可能成分の活性化プロフィールを決定する方法を提供する。方法は、少なくとも２種の活性化可能成分の活性化レベルに基づいて、フローサイトメトリーによって細胞を分析することを含み得る。結合成分（例えば、活性化状態特異的抗体）を用い、活性化可能成分活性化レベルに基づいて細胞を分析し、以下に記載するように検出することができる。あるいは、上記の非結合成分システムを、本明細書に記載される任意のシステムに用いることができる。
【０２５２】
本発明の方法および組成物において蛍光標識された成分を用いる場合には、異なる種類の蛍光モニタリングシステム、例えば、サイトメトリー測定装置システムを用いて本発明を実施してもよいということは認識されよう。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーシステムまたはハイスループットスクリーニングのために設けられるシステム、例えば、９６ウェルもしくはそれより多いマイクロタイタープレートを用いる。蛍光物質でアッセイを実施する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８３年）；Ｈｅｒｍａｎ，Ｂ．、Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ｉｎ：  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｐａｒｔ  Ｂ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３０巻、Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．Ｌ．  ＆  Ｗａｎｇ、Ｙ．−Ｌ．編、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９年）、２１９〜２４３頁；Ｔｕｒｒｏ，Ｎ．Ｊ．、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ：Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｌ、Ｉｎｃ．（１９７８年）、２９６〜３６１頁に記載されている。
【０２５３】
サンプル中の蛍光は、蛍光光度計を用いて測定できる。通常、第１の波長を有する励起供給源からの励起放射線照射は、励起オプティクスによって通過する。励起オプティクスは、励起放射線を引き起こし、サンプルを励起する。それに応じて、サンプル中の蛍光タンパク質は、励起波長とは異なる波長を有する放射線を放出する。次いで、収集オプティクスがサンプルからの発光を集める。装置は、スキャンされている間、特定の温度でサンプルを維持するよう、温度制御装置を含んでもよい。一実施形態によれば、曝露されるべき種々のウェルの位置を合わせるため、多軸トランスレーションステージが、複数のサンプルを入れたマイクロタイタープレートを動かす。多軸トランスレーションステージ、温度制御装置、オートフォーカス特徴およびイメージングおよびデータ収集と関連するエレクトロニクスは、適当にプログラムされたデジタルコンピュータによって管理され得る。コンピュータはまた、アッセイの間に収集されたデータを提示のために別のフォーマットに変換できる。通常、既知ロボットシステムおよび構成要素を使用できる。
【０２５４】
蛍光を検出するその他の方法、例えば、量子ドット法（例えば、各々、参照により本明細書に明確に組み込まれる、Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２年）１２４：６３７８〜８２頁；Ｐａｔｈａｋら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００１年）１２３：４１０３〜４頁；およびＲｅｍａｄｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００年）１８：５５３〜８頁参照のこと）ならびに共焦点顕微鏡を用いてもよい。一般に、フローサイトメトリーは、レーザービームの経路を通る個々の細胞の通過を含む。ビームを散乱することおよび細胞と結合している、または細胞内に見られる任意の蛍光分子を励起することは、光電子増倍管によって検出され、読み取り可能なアウトプット、例えば、大きさ、粒度または蛍光強度を作製する。
【０２５５】
本発明の方法の検出、選別または単離ステップは、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）技術を伴うことがあり、ここで、ＦＡＣＳは、特定の表面マーカーを含有する集団から細胞を選択するために用いられ、選択ステップは、標的細胞捕獲および／またはバックグラウンド除去のための回収可能支持体としての磁気的に応答する粒子の使用を伴うことがある。種々のＦＡＣＳシステムは、当技術分野で公知であり、本発明の方法において使用してよい（例えば、各々、参照により本明細書に明確に組み込まれる、１９９９年４月１６日に出願されたＷＯ９９／５４４９４；２００１年７月５日に出願された米国出願番号第２００１０００６７８７号を参照のこと）。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳセルソーター（例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（商標）セルソーター、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）を用いて、モジュレーターに応じた活性化可能成分における活性化レベルの変化の有無における、その活性化プロフィールに基づいて（陽性細胞）、細胞を選別し、収集する。いくつかの実施形態では、変化は減少である。いくつかの実施形態では、変化は増大である。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、細胞をまず、特異的活性化可能成分の特異的活性化状態に対して向けられた蛍光標識された活性化状態特異的結合成分（例えば、抗体）と接触させる。このような一実施形態では、細胞を含有している液滴をセルソーターを通して通過させることによって、各細胞上に結合している結合成分の量を測定できる。陽性細胞を含有する液滴に電磁電荷を付与することによって、それらの細胞を、他の細胞から分離することができる。次いで、正に選択された細胞を、滅菌収集容器中に回収することができる。これらの細胞ソーティング手順は、例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（商標）に詳細に記載されている。その全文が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ、３−１１〜３−２８および１０−１〜１０−１７節が特に参照される。
【０２５８】
別の実施形態では、活性化可能成分のアイソフォームの存在に基づく細胞の磁気分離を用いて、陽性細胞を選別できる。このような分離技術では、正に選択される細胞をまず、特異的結合成分（例えば、活性化可能成分のアイソフォームと結合する、抗体または試薬）と接触させる。次いで、細胞を、特異的成分と結合する試薬とカップリングしている回収可能粒子（例えば、磁気的に応答する粒子）と接触させる。次いで、例えば、磁場を用いて、細胞−結合成分−粒子複合体を、非陽性または非標識細胞から物理的に分離できる。磁気的に応答する粒子を用いる場合には、磁場を用いて、陽性または標識細胞を容器中に保有することができ、一方で陰性細胞が除去される。これらおよび同様の分離手順は、例えば、その全文が本明細書に組み込まれるＢａｘｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｓｏｌｅｘ  ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｍａｎｕａｌに記載されている。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、単細胞について受容体成分活性化状態プロフィールを決定する方法が提供される。方法は、細胞の集団を提供することおよびフローサイトメトリーによって細胞の集団を分析することを含む。少なくとも２種の活性化可能成分の活性化レベルに基づいて、細胞を分析することが好ましい。いくつかの実施形態では、多様な活性化可能成分活性化状態抗体を用いて、多様な成分の活性化レベルを同時に決定する。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、少なくとも２種の成分の活性化レベルに基づくフローサイトメトリーによる細胞分析を、表面マーカーの存在、粒度および細胞の大きさなどのその他のフローサイトメトリー読み取り可能アウトプットの決定と組み合わせて、多様な成分の活性化レベルと、単細胞についてフローサイトメトリーによって測定可能なその他の細胞の質間の相関を提供する。
【０２６１】
当然のことであろうが、本発明はまた、シグナル伝達において成分クラスター化事象を順序付けることを提供する。特に、本発明によって、技術者が、単細胞内の多様な成分のクラスター化および活性化のレベルの相関に基づいて、成分クラスター化および活性化階層を構築することが可能となる。順序付けは、単一の時点で、細胞または細胞集団の活性化レベルを、対照と比較することによって、または複数の時点で細胞を比較して、他のものから生じた亜集団を観察することによって達成できる。
【０２６２】
本発明は、細胞集団内の細胞のサブセットの存在を決定する価値のある方法を提供する。理想的には、均一な細胞集団においてシグナル伝達経路を評価して、細胞間のシグナル伝達の変動が、質的にも、量的にもシグナル伝達事象およびその中の変化を隠さないことを確実にする。最高の均一系は、単細胞であり、本発明は、細胞の個々の評価を可能にし、真の相違が意義深い方法で同定されることを可能にする。
【０２６３】
したがって、本発明は、大きな細胞集団内の細胞のサブセットを区別する方法を提供する。本明細書に概説されるように、これらの細胞のサブセットは、集団内のその他のサブセットと比較した場合に、生物学的特徴の変化（例えば、活性化レベル、モジュレーターに対する応答の変化）を示すことが多い。例えば、本明細書に概説されるように、本発明の方法によって、他のサブセットと比較した場合に、一次細胞集団などの集団から、細胞のサブセット、例えば、応答（例えば、状態の存在と関連している応答）の変化を示す末梢血単核細胞を同定することが可能となる。さらに、この種の評価は、異なる活性化状態、モジュレーターに対する応答の変化、細胞系統、細胞分化状態などの間を区別する。
【０２６４】
当然のことであろうが、これらの方法は、末梢血単核細胞または未処理および記憶リンパ細胞のような複雑な細胞集団における、人工状態および刺激状態両方の個々のシグナル伝達カスケードの同定を提供する。
【０２６５】
必要な場合には、細胞を、単細胞懸濁液に分散する（例えば、適したプロテアーゼ、コラゲナーゼ、ディスパーゼなどを用いる酵素的消化などによって）。分散物または懸濁液に適当な溶液を用いる。このような溶液は、通常、低濃度の、通常、５〜２５ｍＭの許容されるバッファーとともに、ウシ胎児血清またはその他の天然に存在する因子を都合よく補給した、平衡塩溶液、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、Ｈａｎｋｓ緩衝塩溶液などであり得る。好都合なバッファーとして、ＨＥＰＥＳ１リン酸バッファー、乳酸塩バッファーなどが挙げられる。当技術分野で公知のように、また本明細書に記載される方法に従って、細胞を、例えば、３％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、通常、例えば、氷冷メタノール；０．１％サポニン、３％  ＢＳＡを含有するＨＥＰＥＳ緩衝ＰＢＳを用いて透過処理し；−２００℃のアセトン中で２分間カバーされる。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、１種以上の細胞を、９６ウェルプレートまたはその他の市販のマルチウェルプレートのウェルに含める。代替実施形態では、反応混合物または細胞はサイトメトリー測定装置中にある。本発明において有用なその他のマルチウェルプレートとして、それだけには限らないが、３８４ウェルプレートおよび１５３６ウェルプレートが挙げられる。反応混合物または細胞を含有するための、本発明において有用な、さらにその他の容器は、当業者には明らかであろう。
【０２６７】
活性化可能成分の活性化レベルもしくは活性を検出するアッセイの成分の添加またはこのような活性化レベルもしくは活性の調節は、連続的であってもよく、またはアッセイされる活性にとって適当な条件下で所定の順序またはグループ化してもよい。このような状態は、本明細書に記載されており、当技術分野で公知である。さらに、さらなる指導が以下に提供される（例えば、実施例において参照のこと）。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、活性化可能成分の活性化レベルを、誘導結合プラズマ質量分析装置（ＩＣＰ−ＭＳ）を用いて測定する。特異的成分を用いて標識されている結合成分は、活性化可能成分と結合する。細胞がＩＣＰに入れられると、霧化およびイオン化される。活性化可能成分と結合している標識された結合成分を含む細胞の成分組成物を測定する。結合成分上の標識に対応するシグナルの存在および強度は、その細胞上の活性化可能成分のレベルを示す（Ｔａｎｎｅｒら  Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  Ｐａｒｔ  Ｂ：  Ａｔｏｍｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、（２００７年）、６２（３）：１８８〜１９５頁。）。
【０２６９】
当業者には当然のことであろうが、本方法および組成物は、フローサイトメトリー解析に加え、種々のその他のアッセイ形式において使用される。例えば、ＤＮＡチップと類似のチップを、本発明の方法において用いることができる。核酸を、予め考えていたアレイのチップにスポッティングするためのアレイヤー（Ａｒｒａｙｅｒ）および方法は公知である。さらに、合成するためのタンパク質チップおよび方法も公知である。これらの方法および材料は、活性化状態結合成分を、予め考えていたアレイのチップに加えるという目的のために適合させてもよい。いくつかの実施形態では、このようなチップは、多様な成分活性化状態結合成分を含み、細胞の表面上に存在する成分の成分活性化状態プロフィールを決定するために用いられる。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、チップは、「第２セット結合成分」の多重度を含み、この場合には通常標識されていない。このようなチップを、サンプル、好ましくは、細胞抽出物と接触させ、サンドイッチアッセイにおいて成分活性化状態特異的結合成分の第２の多重度を用い、同時に、サンプル中の活性化された成分の多重度の存在を決定する。検出を容易にするよう、活性化状態特異的結合成分の多重度の各々は、独自に標識されることが好ましい。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、個々の細胞の活性化プロフィールを検出するために、共焦点顕微鏡を使用してよい。共焦点顕微鏡は、空間的に濾過された個体試料点からの光の連続収集に頼るものであり、次いで、これを電子的に処理して、試料の拡大像を提供する。シグナル処理と関与する共焦点顕微鏡は、単細胞内の標識された結合成分の検出というさらなる能力を有し、したがって、この実施形態では、細胞を、１種以上の結合成分を用いて標識してよい。いくつかの実施形態では、共焦点顕微鏡とともに用いられる結合成分は、蛍光標識とコンジュゲートしている抗体であるが、その他の結合成分、例えば、その他のタンパク質または核酸も可能性がある。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物を、「インセルウェスタンアッセイ（Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｓｓａｙ）」とともに使用してよい。このようなアッセイでは、細胞をまず、標準組織培養技術を用いて標準組織培養フラスコ中で増殖させる。最適なコンフルエンシーに増殖すると、増殖培地を除去し、細胞を洗浄し、トリプシン処理する。次いで、細胞をカウントし、適当な数の細胞を移すのに十分な容積を、マイクロウェルプレート中でアリコートとする（例えば、Ｎｕｎｃ（商標）９６  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ（商標）プレート）。次いで、個々のウェルを、完全培地で最適コンフルエンシーに増殖させ、すぐに、培地を血清不含培地と置き換える。この時点で、対照には触れないが、実験ウェルは、モジュレーター、例えば、ＥＧＦとともにインキュベートする。モジュレーターとともにインキュベートした後、調べられる活性化成分に対する標識された抗体を用いて細胞を固定化し、染色する。細胞を標識すると、プレートを、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ第１．２巻に記載される技術を用い、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｅｒ（ＬｉＣｏｒ、Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｎｅｂｒ．）などの画像装置を用いてスキャンしてよい。マルチウェルプレートのスキャニングによって得られたデータを分析し、以下に記載されるように活性化プロフィールを決定することができる。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、検出は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、例えば、逆相ＨＰＬＣによるものであり、さらなる態様では、検出は、質量分析によるものである。
【０２７４】
これらの機器は、無菌層流またはドラフトに収めることができ、またはマルチウェルプレートもしくは試験管における細胞培養増殖および形質転換のための、また有害な操作のための、取り囲まれた、内蔵型のシステムである。生細胞を、制御された増殖条件下で増殖させ、生細胞アッセイの時系列の間、温度、湿度およびガスについて制御を行う。細胞の自動化形質転換および自動化コロニーピッカーは、所望の細胞の迅速なスクリーニングを促進し得る。
【０２７５】
磁性ビーズおよびその他のビーズ、粒子、細胞および生物の個々の捕獲のために、フローサイトメトリーまたはキャピラリー電気泳動形式を用いてもよい。
【０２７６】
適応性のあるハードウェアおよびソフトウェアによって、複数の適用に対する機器適応性が可能となる。ソフトウェアプログラムモジュールによって、方法の作製、改変および作動が可能となる。システム診断モジュールによって、機器配置、正しい接続およびモーター運転が可能となる。特注のツール、実験機器および液体、粒子、細胞および生物トランスファーパターンによって、異なる適用が実施されるのが可能となる。データベースによって、方法およびパラメータ保存が可能となる。ロボットおよびコンピュータインターフェースによって、機器間の連絡が可能となる。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、液体取り扱い成分の使用を含む。液体取り扱いシステムとして、任意の数の成分を含むロボットシステムを挙げることができる。さらに、本明細書に概説される、ありとあらゆるステップを自動化してもよく、しがたて、例えば、システムは完全にまたは部分的に自動化してもよい。
【０２７８】
当業者には当然であろうが、使用され得るさまざまな成分、例えば、それだけには限らないが、１種以上のロボットアーム；マイクロプレートの位置を合わせるためのプレートハンドラー；相互汚染していないプレートでウェルの蓋を除去し、元の位置に戻すための自動化蓋またはキャップハンドラー；ディスポーザブルチップを用いたサンプル分布のためのチップアセンブリー；サンプル分布のための洗浄可能なチップアセンブリー；９６ウェルローディングブロック；冷却試薬ラック；マイクロタイタープレートピペット位置（所望により、冷却された）；プレートおよびチップのスタッキングタワー；ならびにコンピュータシステムがある。
【０２７９】
完全なロボットシステムまたはマイクロ流体システムは、スクリーニング適用のすべてのステップを実施するために、ハイスループットピペッティングを含む自動化液体−、粒子−、細胞−および生物−取り扱いを含む。これは、吸引、分注、混合、希釈、洗浄、正確な容量測定移動、ピペットチップの回収および廃棄；および単回サンプル吸引からの複数の送達のための同一容積の反復ピペッティングなどの液体、粒子、細胞および生物操作を含む。これらの操作は、相互汚染を含まない液体、粒子、細胞および生物移動である。この機器は、マイクロプレートサンプルのフィルター、メンブレンおよび／またはドータープレートへの自動化複製、高密度トランスファー、完全プレート段階希釈および大容量操作を行う。自動化、自動化サンプル収集および分析のさらなる例は、その全文が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ６１／０４８，６５７に論じられている。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、アッセイ成分に対して特異性を有する、化学的に誘導体化した粒子、プレート、カートリッジ、チューブ、磁性粒子またはその他の固相マトリックスを用いる。マイクロプレート、チューブまたは任意の固相マトリックスの結合表面は、非極性面、高度に極性の表面、共有結合を促進するための修飾デキストランコーティング、抗体コーティング、融合タンパク質またはペプチドを結合するための親和性媒体、組換えタンパク質ＡまたはＧなどの表面に固定されたタンパク質、ヌクレオチド樹脂またはコーティングおよびその他の親和性マトリックスを含み、本発明において有用である。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、マルチウェルプレート、マルチチューブ、ホルダー、カートリッジ、ミニチューブ、ディープウェルプレート、ミクロチューブ、クリオバイアル、スクエアウェルプレート、フィルター、チップ、光ファイバー、ビーズおよびその他の固相マトリックスのプラットフォームまたは種々の容積を有するプラットフォームが、さらなる能力のためのアップグレード可能なモジュラープラットフォームで提供される。このモジュラープラットフォームは、可変速度軌道シェーカーおよび供給源サンプルのための多位置作業デッキ、サンプルおよび試薬希釈物、アッセイプレート、サンプルおよび試薬リザーバー、ピペットチップおよび活性洗浄ステーションを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、プレートリーダーの使用を含む。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、制御ブロックまたはプラットフォームなどの熱交換器の温度を安定化させるために、サーモサイクラーおよび温度調節システムを用いて、０℃から１００℃へのサンプルのインキュベーションの正確な温度コントロールを提供する。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、単一または複数の磁性プローブ、親和性プローブを有する互換性ピペットヘッド（単一またはマルチチャネル）またはピペッターは、液体、粒子、細胞および生物をロボット制御で操作する。マルチウェルまたはマルチチューブ磁性セパレーターまたはプラットフォームが、単一または複数のサンプル形式で、液体、粒子、細胞および生物を操作する。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、機器の使用は、標識およびアッセイに応じて、さまざまな異なる検出器であり得る検出器を含む。いくつかの実施形態では、有用な検出器は、多重チャネルの蛍光を用いる顕微鏡（単数または複数）；単一および二波長エンドポイントおよび動態学能力、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、発光、消光、２光子励起および強度再分布を用いる、蛍光、紫外および可視分光光度的検出を提供するためのプレートリーダー；データおよび画像を捕獲し、数量化できる形式に変換するためのＣＣＤカメラ；ならびにコンピュータワークステーションを含む。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、ロボット装置は、バスによってメモリーおよびインプット／アウトプット装置（例えば、キーボード、マウス、モニター、プリンターなど）のセットと連絡する中央演算処理装置を含む。やはり、以下に概説されるように、これは、本発明の多重化装置のＣＰＵに加えた、またはＣＰＵの代わりであり得る。中央演算処理装置、メモリー、インプット／アウトプット装置間の全体的な相互作用およびバスは、当技術分野で公知である。したがって、実施される実験に応じて種々の異なる手順が、ＣＰＵメモリーに保存される。
【０２８６】
これらのロボット流体取り扱いシステムは、任意の数の種々の試薬、例えば、バッファー、試薬、サンプル、洗浄液、標識プローブなどのアッセイ成分などを利用することができる。
【０２８７】
分析
フローサイトメトリーにおける進歩によって、最大１３の同時パラメータの個々の細胞を数え上げることが可能になり（Ｄｅ  Ｒｏｓａら、２００１年）、ゲノムおよびプロテオミクスデータサブセットの研究へと移つりつつある（ＫｒｕｔｚｉｋおよびＮｏｌａｎ、２００３年；ＰｅｒｅｚおよびＮｏｌａｎ、２００２年）。同様に、その他の技術（例えば、マイクロアレイ）における進歩によって、複数の活性化可能成分の同定が可能になる。パラメータ、エピトープおよびサンプルの数が増大したのにつれ、実験の複雑性およびデータ解析の挑戦は急激に増大した。データの複雑性のさらなる層は、ますます増大する実験条件のセット下で活性化可能成分の研究を可能にする刺激の開発によって付加された。複数のパラメータの解析のための方法は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリー適用に、操作および解析の種々の相のためのソフトウェアが必要である、その全文が参照により本明細書に組み込まれる、第６１／０７９，５７９号；同６１／０７９，５５１号；同６１／０７９，５３７号；同６１／０８７，５５５号；同６１／０８５，７８９号参照のこと。
【０２８８】
フローサイトメトリーが用いられるいくつかの実施形態では、フローサイトメトリー実験を配置し、ヒートマップを用いて、結果を倍数変化として近似させ、評価を容易にする。一般的にいえば、配置されたフローサイトメトリー実験は、実験設計およびフローサイトメトリーサンプル間の観察された相違に基づいて多次元フローサイトメトリーデータを単純化する。フローサイトメトリーサンプルのセットにおける変化を比較する１つの共通の方法は、サンプルプロット上の１種のパラメータのヒストグラムを重ね合わせることである。配置されたフローサイトメトリー実験は、それに対して実験サンプルが比較される参照サンプルを含むことが理想的である。この参照サンプルは、アレイの第１の位置に位置し、その後の実験サンプルは対照に順に続く。参照サンプルは、正常および／または疾患と関連している細胞（例えば、腫瘍細胞）を含み得る。
【０２８９】
フローサイトメトリーが用いられるいくつかの実施形態では、データを分析する前に、注目する集団およびこれらの集団を特性決定する方法を決定する。例えば、少なくとも２種のデータ解析のための集団を同定する一般法がある。：（ｉ）個々のサンプルまたはサブセット（例えば、試験中の患者）のパラメータセットの「アウトサイド−イン」比較。このよりよくある場合には、細胞集団は、同種であるか、または注目する標的に対して同種であると考えられる個別のセットを作製するような方法でゲート開閉された系統である。サンプル−レベル比較の例は、患者の腫瘍細胞におけるシグナル伝達プロフィールを同定することおよびこれらのプロフィールを、臨床応答の非ランダム分布と相関させることである。これは、注目する集団が、そのプロフィールの他の集団に対するマッピングおよび比較の前に予め定義されているので、アウトサイド−インアプローチと考えられる。（ｉｉ）不均一な集団中の個々の細胞のレベルでのパラメータの「インサイド−アウト」比較。この例は、特定の条件下混合造血細胞のシグナル伝達状態マッピングと、それに続く、系統特異的マーカーを用いる、コンピュータによって同定された細胞クラスターの比較である。これは、分類に先立って特定の集団の存在を推測しないので、単一細胞研究へのインサイド−アウトアプローチと考えられ得る。このアプローチの大きな欠点は、少なくとも最初は、数え上げるために複数の一時的なマーカーを必要とし、単一の細胞表面エピトープを用いては決して到達できない集団を作製することである。結果として、このような集団の生物学的重要性は、調べることが困難である場合がある。この非従来アプローチの主な利点は、系統または細胞種間を恣意的に区別を付ける可能性を伴わない、細胞集団の偏りのない追跡である。
【０２９０】
これらの技術の各々は、フローサイトメトリーの単細胞レベルで多量のマルチパラメータデータを送達する能力を利用する。疾患と関連している細胞（例えば、腫瘍性または造血性疾患）については、疾患と関連している細胞（例えば、癌細胞）が、歴史的技術に従って、通常、単一実体として処理され、分類されるので、第３の「メタ−レベル」のデータが存在する。これらの技術は、起源の臓器または組織、分化の程度、増殖指数、転移拡散および患者に関する遺伝子データまたは代謝データを含んでいた。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、本発明は、疾患シグナル伝達空間をマッピングする分散マッピング技術を使用する。これらの方法は、推定正常対照と無関係に疾患の比較を可能にするので、疾患生物学の研究における大きな進歩を表す。従来の差次的疾患解析法（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ、サブトラクティブノーザンブロッティング）は、通常、各患者サンプルから得た疾患と関連している細胞の、正常対照、通常、隣接する、理論的に形質転換されていない組織との比較に依存する。あるいは、それらは、グループへのマルチプルクラスター化および再クラスター化に依存し、次いで、さらに、表現型によって、患者サンプルを層別化する。対照的に、疾患状況の分散マッピングは、疾患サンプルをまず、それ自身と、次いで、親疾患集団に対して比較する。結果として、疾患間のほとんどの多様性を含む活性化疾患が、差次的疾患分析においてコアパラメータを提供する。多様な疾患のプールを考えると、疾患と提案される正常対照間の差異とは対照的に、この技術によって、研究者が、差次的疾患病理学の根底にある分子事象（例えば、化学療法に対する癌の応答）を同定することが可能となる。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、分散マッピングを用いて、患者サンプルのシグナル伝達空間をプロファイルする場合には、モジュレーターに対するそのシグナル伝達応答が同様である疾患を、起源の組織または細胞種にかかわらず、一緒にグループ化する。同様に、系統マーカーまたは起源の組織に基づいて相対的に似ていると考えられる２種の疾患（例えば、２種の腫瘍）は、環境刺激を解釈するための大きく異なる能力を有する場合があり、２種の異なるグループにプロファイルされる。
【０２９３】
シグナル伝達プロファイルのグループが同定される場合には、臨床応答、遺伝子変異の存在およびタンパク質発現レベルなどのその他の因子が、グループ内に作為的に分配されているかどうかを決定することが有用であることが多い。実験または文献によって、配置されたフローサイトメトリー実験においてこのような仮説が示唆される場合には、スチューデントのｔ検定およびＸ２検定などの簡単な統計試験を用いて判断できる。同様に、実験内の２種の可変因子が、関連していると考えられる場合には、線形回帰から得たｒ２相関係数を用いてこの関連の程度を表す。
【０２９４】
活性化可能成分の解析の例は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ」と題された米国公開番号第２００６００７３４７４号および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｒｉｓｋ  ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題された米国公開番号第２００５０１１２７００号に記載されており、それらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９５】
ＣＬＬは、本発明の方法の一例として役立つ。図２６、２７および２８に示されるデータは、２２人のＣＬＬ患者および４人の対照患者において複数の活性化可能成分の活性化状態を比較するヒートマップである。このデータは、種々のＣＬＬ患者から得たＢ細胞が、ヒートマップによって可視化されるように、活性化可能成分の識別可能なパターンを示すことを実証する。阻害剤または阻害剤および別のモジュレーターは、潜在性、または異常な造血集団の同定、分類およびグループ化（すなわち、患者クラスター化）を可能にする、活性化可能成分のさらなるパターンをさらに定義する。図２６、２７および２８には、ヒートマップの上部に患者サンプルが示されている。各列は単一の患者に相当する。ＣＬＬは、サンプルが、ＣＬＬと診断されたから患者から得られたことを示す。ＣＯＮは、サンプルが、対照患者から得られたことを示す。ヒートマップ説明文は、図の上部に示され、未刺激対照（０分）に対して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）のｌｏｇ１０倍増大、または減少に基づいて陰つきのスケールを用いる。
【０２９６】
ヒートマップは、阻害剤および／またはさらなるモジュレーターの存在によって示される、活性化可能成分のレベルにおける変化またはそれがないことを示すことによって、種々の活性化可能成分の活性化状態を定義する。したがって、ヒートマップは、細胞中の複数の活性化可能成分の活性化レベルの、前記細胞を阻害剤またはモジュレーターと接触させた際の、増大の有無を定義し得る。ヒートマップの右の表示は、検出される活性化可能成分、例えば、リンタンパク質を示す。右の表示はまた、その行のモジュレーターまたは阻害剤処理も示す。「ＵＳ」とは、未刺激または未処理を示す。図２８は、細胞中の複数の活性化可能成分の活性化レベルのパターンを示す。図２８は、患者クラスター化グループ（すなわち、クラスター化グループ）の同定をさらに示す。患者クラスター化グループは、１種以上のモジュレーター（例えば、阻害剤または阻害剤および別のモジュレーター）に応じた、１種以上の活性化可能成分の活性化レベルの類似の、または別個のパターンを示す患者から得たサンプルからなる。図２８は、同じ刺激に応じた、ｐ−ＰＬＣγ２、ｐ−ＳｙＫ／Ｚａｐ−７０、ｐ−ＢＬＮＫおよびｐ−Ｌｃｋの活性化レベルが同様である、患者から得たサンプルからなるクラスター化グループを示す。いくつかの患者クラスター化グループは、囲まれた領域によって示される、阻害剤での調節または処理時に示される。Ｈ２Ｏ２を用いた処理は、４種の対照患者のもの（図２８、下部中央の四角）と同様である、ｐ−ＰＬＣγ２、ｐ−ＳｙＫ／Ｚａｐ−７０、ｐ−ＢＬＮＫおよびｐ−Ｌｃｋのレベルによって定義される患者クラスター化グループを示す（図２８、下の右の囲まれた領域）。Ｈ２Ｏ２を用いた処理は、対照（図２８、下部の四角で囲まれた領域の左の９人の患者）とは異なる患者クラスター化グループをさらに示す。Ｈ２Ｏ２を用いた調節およびＢＣＲクロスリンクは、対照患者（上部中央の四角）と同様である、活性化レベルのｐ−ＢＬＮＫ、ｐ−Ｓｙｋおよびｐ−ＰＬＣγ２を示す患者から得たサンプルからなる別の患者クラスター化グループ（図２８、上部左の四角で囲まれた領域）を定義する。さらに、Ｈ２Ｏ２を用いた調節およびＢＣＲクロスリンクは、対照（上部の四角で囲まれた領域の右の１０人の患者）とは異なるクラスター化グループをさらに示す。
【０２９７】
したがって、本明細書において、分類を導き出す方法も提供される。分類を導き出すことは、クラスター化グループを定義することを含む。クラスター化グループは、複数の細胞から、複数の活性化可能成分の活性化状態を決定することによって定義され、各細胞は、既知状態および／または既知臨床転帰を有する個体に由来する。クラスター化グループは、既知疾患または既知臨床転帰と関連しているパターンを定義し得る。その活性化レベルが、患者の既知疾患または臨床転帰に関する有用な情報を提供する、任意の適した活性化可能成分を使用できる。未知疾患および／または未知臨床転帰を有する患者に由来する細胞を、それを用いて同定されるクラスター化グループに応じて分類できる。これは、患者の診断、予後および／または評価または治療の選択にさらにつながり得る。
【０２９８】
キット
いくつかの実施形態では、本発明はキットを提供する。本発明によって提供されるキットは、本明細書に記載される１種以上の状態特異的結合成分、例えば、リン酸化部位特異的抗体を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、ＰＩ３−キナーゼ（ｐ８５、ｐ１１０ａ、ｐ１１０ｂ、ｐ１１０ｄ）、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、ＳＯＣｓ、Ｒａｃ、Ｒｈｏ、Ｃｄｃ４２、Ｒａｓ−ＧＡＰ、Ｖａｖ、Ｔｉａｍ、Ｓｏｓ、Ｄｂｌ、Ｎｃｋ、Ｇａｂ、ＰＲＫ、ＳＨＰ１およびＳＨＰ２、ＳＨＩＰ１、ＳＨＩＰ２、ｓＳＨＩＰ、ＰＴＥＮ、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ＰＤＫ１、ＳＧＫ、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、ＴＳＣ１、２、Ｒｈｅｂ、ｍＴｏｒ、４ＥＢＰ−１、ｐ７０Ｓ６キナーゼ、Ｓ６、ＬＫＢ−１、ＡＭＰＫ、ＰＦＫ、アセチル−ＣｏＡａカルボキシラーゼ、ＤｏｋＳ、Ｒａｆｓ、Ｍｏｓ、Ｔｐｌ２、ＭＥＫ１／２、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ＭＫＫ３／６、ＭＥＫＫ１，４、ＭＬＫ３、ＡＳＫ１、ＭＫＫ４／７、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ１、２、３、ｐ３８、Ｅｒｋ１／２、Ｓｙｋ、Ｂｔｋ、ＢＬＮＫ、ＬＡＴ、ＺＡＰ７０、Ｌｃｋ、Ｃｂｌ、ＳＬＰ−７６、ＰＬＣγ１、ＰＬＣγ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ＦＡＫ、ｐ１３０ＣＡＳ、ＰＡＫ、ＬＩＭＫ１／２、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ２７、ＳＭＡＤ、Ｒｅｌ−Ａ（ｐ６５−ＮＦＫＢ）、ＣＲＥＢ、ヒストンＨ２Ｂ、ＨＡＴ、ＨＤＡＣ、ＰＫＲ、Ｒｂ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、Ｐ１６、ｐ１４Ａｒｆ、ｐ２７ＫＩＰ、ｐ２１ＣＩＰ、Ｃｄｋ４、Ｃｄｋ６、Ｃｄｋ７、Ｃｄｋ１、Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ９、Ｃｄｃ２５、Ａ／Ｂ／Ｃ、Ａｂｌ、Ｅ２Ｆ、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＲＩＰ、Ｍｙｄ８８、ＢＡＤ、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ＸＬ、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ＰＡＲＰ、ＩＡＰｓ、Ｓｍａｃ、フォドリン、アクチン、Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、ＮＩＫ、ＩκＢ、ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ＩＫＫα、ＰＫＡ、ＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣθ、ＰＫＣδ、ＣＡＭＫ、Ｅｌｋ、ＡＦＴ、Ｍｙｃ、Ｅｇｒ−１、ＮＦＡＴ、ＡＴＦ−２、Ｍｄｍ２、ｐ５３、ＤＮＡ−ＰＫ、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＡＴＭ、ＡＴＲ、βカテニン、ＣｒｋＬ、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３βおよびＦＯＸＯからなる群から選択されるタンパク質に特異的な、１種以上のリン酸化部位特異的抗体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、Ｅｒｋ、Ｓｙｋ、Ｚａｐ７０、Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、ＢＬＮＫ、Ｃｂｌ、ＰＬＣγ２、Ａｋｔ、ＲｅｌＡ、ｐ３８、Ｓ６からなる群から選択されるタンパク質に特異的な、１種以上のリン酸化部位特異的抗体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ１、２、３、ｐ３８、Ｅｒｋ１／２、Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０、Ｂｔｋ、ＢＬＮＫ、Ｌｃｋ、ＰＬＣγ、ＰＬＣ１γ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ＣＲＥＢ、Ｌｙｎ、ｐ−Ｓ６、Ｃｂｌ、ＮＦ−κＢ、ＧＳＫ３β、ＣＡＲＭＡ／Ｂｃｌ１０およびＴｃｌ−１からなる群から選択されるタンパク質に特異的な、１種以上のリン酸化部位特異的抗体を含む。
【０２９９】
本発明によって提供されるキットは、本明細書に記載される１種以上のモジュレーターを含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ、Ｈ２Ｏ２、ＰＭＡ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＤＦ１ａ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＧＦ−１、イミキモド、ポリＣｐＧ、ＩＬ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、タプシガーギンおよびそれらの組合せからなる群から選択される、１種以上のモジュレーターを含む。
【０３００】
本発明の状態特異的結合成分は、固相支持体と、また検出可能な基と、直接的にまたは間接的にコンジュゲートしてよい。試薬はまた、補助剤、例えば、緩衝剤および安定化剤、例えば、多糖などを含み得る。キットは、必要に応じ、系の検出可能な基がメンバーである、シグナルを生じる系のその他のメンバー（例えば、酵素基質）、試験におけるバックグラウンド干渉を低減する薬剤、対照試薬、試験を実施するための装置などをさらに含んでもよい。キットは、通常、単一容器中の成分を、試験を実施するための印刷された使用説明書のシートとともに任意の適した方法で包装してよい。
【０３０１】
このようなキットは、臨床検出、予後および経路シグナル伝達の変化を含む疾患を有する白血病患者などの患者に由来する細胞および組織のスクリーニングに適している、高感度細胞アッセイ法、例えば、ＩＨＣおよびフローサイトメトリーによって活性化可能成分の検出を可能にする。
【０３０２】
このようなキットはさらに、１種以上の治療薬を含み得る。キットは、試験プロファイルとの比較のための参照プロファイルを含み得る、生理学的状態のデータ解析のためのソフトウェアパッケージをさらに含み得る。
【０３０３】
このようなキットはまた、組成物の活性および／または利点を示すまたは確立し、および／または投与、副作用、薬物相互作用または医療提供者にとって有用なその他の情報を記載する、科学文献参考文献、添付文書材料、臨床試験結果および／またはこれらの要約などの情報を含み得る。このようなキットはまた、注目する経路に特異的な抗体を選択するためにＵＳＳＮ６１／０８７，５５５に記載されるものなどのデータベースに接続するための使用説明書も含み得る。このような情報は、種々の研究、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルが関与する実験動物を用いる研究およびヒト臨床試験に基づいた研究の結果に基づくものであり得る。本明細書に記載されるキットは提供され、市販され、および／または医師、看護師、薬剤師、処方職員などをはじめとする医療提供者に奨励され得る。キットはまた、いくつかの実施形態では、消費者に直接市販されてもよい。
【０３０４】
以下の実施例は、上記の発明を用いる方法を、より十分に説明するために、ならびに本発明の種々の態様を実施するために考慮される最良の様式を示すために役立つ。これらの実施例は、本発明の真の範囲を制限するよう働くことは全くなく、むしろ例示目的で提示されるということは理解される。本明細書に引用されるすべての参考文献は、その全文が参照により明確に組み込まれる。
【実施例】
【０３０５】
実施例１：ＣＬＬサンプル中のシグナル伝達経路
Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）によって伝播されたシグナルは、Ｂ細胞の成熟および生存を導き、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の発病および進行における因子であり得る。この実施例では、マルチパラメータフローサイトメトリーを用いて、ＣＬＬ細胞におけるＢＣＲシグナル伝達を単一細胞レベルで調べた。蛍光色素がコンジュゲートしている、Ｂ細胞表面抗原に特異的な抗体および細胞内シグナル伝達タンパク質の選択された群内の特異的ホスホ−ペプチドエピトープを認識する抗体のパネルを用いて、同時解析を実施した。患者から得たＣＬＬサンプル（Ｎ＝６）は、抗μ−クロスリンクを用いてＢＣＲで刺激された場合にのみ、ｐ７２ＳＹＫ／ｐ７０ＺＡＰ、Ｅｒｋ１／２、Ｂ細胞リンカータンパク質（ＢＬＮＫ）およびホスホリパーゼ−Ｃγ−２（ＰＬＣγ２）で弱いまたは最小のシグナル伝達活性を示したのに対し、対照Ｒａｍｏｓ  Ｂ細胞系統では強固なシグナルが観察された。ＣＬＬ細胞における低レベルのシグナル伝達は、シグナル伝達に必要な重要なタンパク質の活性化の欠陥によってか、ＳＨＩＰ−１、ＳＨＩＰ−２、ＳＨＰ−１またはＳＨＰ−２などのホスファターゼによって媒介される阻害の増強のいずれかによって説明され得る。ホスファターゼが、ＣＬＬサンプルにおいてＢＣＲ活性化を妨げているか、低下させているかどうかを調べるために、ＣＬＬ細胞を、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、濾胞性リンパ腫において調節不全になったＢＣＲシグナル伝達を示すためにこれまでに使用されている、ＢＣＲシグナル伝達の間に生成される生理学的ホスファターゼ阻害剤で処理した（Ｓｉｎｇら、（２００５年）Ｃｅｌｌ；Ｒｅｔｈ（２００２年）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；Ｉｒｉｓｈら、（２００６年）Ｂｌｏｏｄ。ＣＬＬ細胞のＨ２Ｏ２処理は、表面Ｆ（ａｂ）２抗μ結合とは無関係に何人かの患者で、高レベルのリン酸化されたｐ７２ＳＹＫ／ｐ７０ＺＡＰ、ＥＲＫ１／２、ＢＬＮＫおよびＰＬＣγ２を誘発した。対照的に、その他のＣＬＬ−Ｂ細胞は、Ｆ（ａｂ）２抗μの存在下でさえ、この処理に対する反応がかなり悪かった。健常ドナーから得た血液Ｂ細胞の、Ｈ２Ｏ２に対する曝露は、これらの同じ細胞内シグナル伝達タンパク質のリン酸化の実質的な増大を誘発できなかった。これらの研究は、一部のＣＬＬ細胞における、表面ＩｇＭ連結後にこれらの細胞において観察されるシグナル伝達の減弱の一員である可能性がある、これまでには認識されていなかった恒常的な高レベルホスファターゼ活性を示す。
【０３０６】
ＣＬＬ細胞におけるシグナル伝達経路の解析
当技術分野で公知の方法を用いて、Ｒａｍｏｓ細胞を維持し、培養した。ＣＬＬ患者に由来する細胞は、当技術分野で公知の方法を用いて入手した。
【０３０７】
ＢＣＲクロスリンクおよび染色のための調製：細胞を、部分的に解凍される（約５０％）まで水浴中３７℃で解凍した。細胞を、室温で５％  ＦＢＳ／ＲＰＭＩに解凍した。細胞懸濁液を培地中に滴加した。細胞を９００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、ブレーキをかけなかった。上清をデカントし、ペレットを２５ミリリットル（ｍｌ）の培地に再懸濁した。細胞を、９００ＲＰＭで１０分間再度遠心分離し、再度デカントし、５ｍｌの１％ＦＢＳ／ＲＰＭＩに再懸濁した。細胞を、トリパンブルー染色を用い、血球算定器を用いてカウントした。必要に応じて、細胞の濃度を調整し、密集を減少させた。細胞を３７℃で２時間インキュベートした。添加物および試薬（例えば、刺激物質、Ｆａｂ断片、Ｈ２０２、水など）を含む最終細胞濃度は、１６０万個／ｍｌとした。細胞をウェルに分注した。Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭ単独、３．３ｍＭ  Ｈ２０２単独またはＦ（ａｂ）２ＩｇＭおよびＨ２０２（Ｈ２０２はＦ（ａｂ）２ＩｇＭの３０秒以内に加えた）を、適当なチューブに加え、サンプルをボルテックス処理することによって混合した。経時変化が実施されるまで、細胞を種々の処理とともに１５分間インキュベートした。経時変化が実施された場合には、細胞を、種々の処理とともに５、１０、３０、６０または１２０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を１．６％パラホルムアルデヒドを用いて室温、暗所で５分間固定し、次いで、０．１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ（２ｍｌ）を用いて細胞を洗浄し、２０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを１ｍｌの１００％  ＭｅＯＨ（メタノール）に再懸濁した。
【０３０８】
染色：０．４％  ＢＳＡ  ＰＢＳ２ｍｌ（氷冷）でチューブを洗浄し、４℃、２０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。細胞を２回洗浄した。次いで、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５、ｐ−Ｅｒｋ、ｐ−ＢＬＮＫ、ｐ−ｓｙｋ／Ｚａｐ７０に特異的な、蛍光がコンジュゲートしている抗体を用いて、室温で２５分間細胞を染色した。細胞を、２プレートの総数をなす８０ウェルに入れた。染色に使用したカクテルミックスを以下に記載する：
ａ．カクテル
（ｉ）ＣＤ３  ｐａｃ  ｂｌｕｅ＝１６０μｌ
（ｉｉ）ＣＤ４  ＡＰＣ＝８０μｌ
（ｉｉｉ）ＣＤ８  ＰＥ  Ｃｙ７＝８０μｌ
（ｉｖ）ＣＤ５  ＰＥ  Ｃｙ５＝４００μｌ
（ｖ）ＣＤ２０  ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５＝８００μｌ
（ｖｉ）ｐ−Ｅｒｋ＝８００μｌ
（ｖｉｉ）ｐ−ＢＬＮＫ＝８００μｌ
（ｖｉｉｉ）ｐ−Ｓｙｋ／ＺＡＰ７０＝８００μｌ
ｂ．カクテルミックス中の総抗体容積は、３９２０μｌとした。ＰＢＳを加え、総容積を８．０ｍｌとした。各ウェルに、１００μｌのこのカクテルミックスを加えた。
【０３０９】
フローサイトメトリーによる解析：ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ  フローサイトメトリー機器で各サンプルの、１０，０００から１００，０００の間のゲート開閉されない事象を集めた。細胞外マーカー（すなわち、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５およびＣＤ２０）に対する蛍光抗体を用いて、以下に記載されるように、細胞をマークし、階層的ゲート開閉戦略を用いて、記録された事象の間でＢ細胞および成熟Ｂ細胞集団を同定した：
ａ．まず、前方および側方散乱を用いて、リンパ球（リンパ）集団をゲート開閉した
ｂ．次いで、この「リンパ」集団をＣＤ２０およびＣＤ３軸上にディスプレイし、高ＣＤ３発現細胞（ＣＤ３＋）および高ＣＤ２０発現細胞（ＣＤ２０＋）に対してゲート開閉した。
ｃ．「ＣＤ２０＋」集団をさらにゲート開閉し、それらをＣＤ２０およびＣＤ５軸上にディスプレイすることによって成熟Ｂ細胞（高ＣＤ５発現細胞−ＣＤ５＋）集団を同定した。
ｄ．細胞内マーカーｐ−Ｅｒｋ、ｐ−Ｓｙｋ／Ｚａｐ７０およびｐ−ＢＬＮＫをたどることによって、すべての記録された事象をマークした。
【０３１０】
各細胞内マーカーの蛍光強度値のｌｏｇ１０の密度推定値の見込みを、ＣＤ２０＋およびＣＤ５＋中の細胞について、Ｒ−Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）のカーネル密度推定関数を用いてコンピュータで計算した。次いで、提供された密度推定値の見込みをプロットし、ベースラインからの種々のマーカーのホスホレベルの変化を可視化した。
【０３１１】
結果：図１は、Ｒａｍｏｓ細胞において、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭおよびＰＭＡの両方が、ｐ−Ｅｒｋおよびｐ−Ｓｙｋ／ｐＺａｐ７０を活性化することを示す。ヒストグラム上の大きな破線は、本明細書において以下、自己蛍光と呼ばれる、未刺激および未染色細胞の蛍光のレベルを表す。濃い実線は、本明細書において以下、バックグラウンドと呼ばれる未刺激で染色された細胞の蛍光のレベルを表す。ＰＭＡ（点線）およびＦ（ａｂ）２  ＩｇＭ（細い実線）を用いた両刺激後、ｐ−Ｅｒｋおよびｐ−Ｓｙｋ蛍光は、自己蛍光およびバックグラウンドシグナルを上回り、このことは、刺激でそれらのタンパク質が活性化したことを示す。図２は、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ（点線）はまた、Ｒａｍｏｓ細胞において、ｐＢＬＮＫ、ｐＣｂｌ、ｐＰＬＣγ２、ｐＬｃｋ、ｐ３８を活性化することを示す。  Ｒａｍｏｓ細胞（Ｒａｍｏｓ細胞系統）を、本明細書において実施される実験を通じて陽性対照として用いる。
【０３１２】
ＣＬＬ患者から得た細胞を分析した。図３は、ＰＭＡ（細い実線）は、フェレーシスによって得た（Ｐｈｅｒｅｓｅｄ）ＣＬＬサンプルにおいてＥｒｋを活性化することを示す。しかし、１５分間の漸増量のＦ（ａｂ）２ＩｇＭは、ＣＬＬサンプル中のシグナル伝達を最小に活性化した（図４）。
【０３１３】
ＣＬＬサンプルを、低および高頻度ＺＡＰ７０を有する集団に分ける。Ｚａｐ７０は、ＣＬＬに用いられる予後指標であり得る。しかし、ＺＡＰ７０を含むＣＬＬサンプルの臨床的意義は、明確ではない。ＣＬＬサンプルは、ＰＭＡを用いて活性化されると中程度のｐ−Ｅｒｋ（ｙ軸）およびｐ−Ｓｙｋ（ｘ軸）リン酸化を示す（図５）。これらの細胞は、図５に示されるように、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭで活性化されると弱い活性化を示す。
【０３１４】
ＣＬＬサンプルを、Ｈ２Ｏ２で、またはＦ（ａｂ）２ＩｇＭと組み合わせて処理した。Ｈ２Ｏ２は、ホスファターゼの既知阻害剤である。図６に示されるように、ホスファターゼの阻害は、ＥｒｋおよびＳｙｋを活性化する。いずれの理論にも制限されようとは思わないが、ホスファターゼの阻害は、強力な持続性ＢＣＲシグナル伝達を示す。この持続性シグナル伝達は、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭ単独によっては明らかではない（図４〜５）。Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭおよびＨ２Ｏ２は、ＣＬＬ患者間の異なる動態学亜集団（不均一）の相違を示す（図６）。対照的に、正常Ｂ細胞では、Ｈ２Ｏ２は、ホスファターゼを妨げたが、自身ではＢＣＲ後を活性化できない（図７）。任意の理論に制限されるものではないが、これらの結果は、これらのＣＬＬが、ＢＣＲの近位にあるシグナル伝達に変化を有するということを示唆する。図８に示されるように、ＣＬＬでは、Ｈ２Ｏ２は、根底にあるシグナル伝達事象、おそらくは持続性シグナル伝達を示し、これがＢＣＲの下流（例えば、ＳｙｋおよびＥｒｋ）のシグナル伝達事象を駆動し得る。
【０３１５】
その他のＣＬＬサンプルは、それぞれ、ＰＭＡおよびＦ（ａｂ）２ＩｇＭを用いて活性化されると、中程度および弱いＥｒｋおよびＳｙｋリン酸化を示す（図９）。これらのＣＬＬサンプルを、Ｈ２Ｏ２で処理すると、ホスファターゼの阻害は、強力な持続性ＢＣＲシグナル伝達を示さない（図１０）。Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭおよびＨ２Ｏ２を用いた処理は、図１０に示されるように（ｉ）異なる動態学（ｉｉ）亜集団不均一性および（ｉｉｉ）  ＣＬＬ患者間の相違を示す。
【０３１６】
ＣＬＬ試料におけるシグナル伝達の動態学
細胞を、上記のように調製し、染色した。
【０３１７】
図１２は、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭおよびＨ２Ｏ２によるＳｙｋおよびＥｒｋリン酸化の異なる動態学を示す。ＳｙｋおよびＢＬＮＫのピークリン酸化は、活性化５分後に起きたのに対し、Ｅｒｋのピークリン酸化は３０分後であった。
【０３１８】
図１３は、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭおよびＨ２Ｏ２によるＳｙｋ／Ｚａｐ７０およびＥｒｋの中程度の活性化を示す。図１４は、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭおよびＨ２Ｏ２によるシグナル伝達の動態学を示す。図２１は、Ｆ（ａｂ）２  ＩｇＭ単独によるＳｙｋ／Ｚａｐ７０およびＥｒｋの最小活性化を経時的に示す。図２２は、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭ単独に応じたＳｙｋ／Ｚａｐ７０およびＥｒｋの最小活性化を経時的に示す。図２３は、Ｈ２Ｏ２を伴わない、ＣＤ２０＋／ＣＤ５＋集団のＦ（ａｂ）２経時変化を示す。
【０３１９】
図１５および１６は、異なるレベルのＺＡＰ７０を有する細胞における外部刺激に応じた異なるレベルのＢＬＮＫリン酸化を示す。
【０３２０】
図１７〜２１は、過酸化物を用いるか用いないＢ細胞受容体クロスリンクに応じた、ＣＬＬサンプルのＣＤ２０＋／ＣＤ５＋細胞集団におけるＰＬＣγ２、Ｓ６およびＣｂｌｉｎ  のリン酸化の動態学を示す。図２４は、ＣＬＬサンプルのＣＤ２０＋／ＣＤ５＋集団におけるＨ２Ｏ２処理の動態学を示す。図２５は、ＣＬＬサンプルのＣＤ２０＋／ＣＤ５＋集団におけるＨ２Ｏ２処理の動態学を示す。これらの結果は、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭは、これまでに評価されたシグナル伝達分子とは対照的に、単独でｒｐＳ６のリン酸化の増大を媒介することを示す。Ｈ２Ｏ２は、単独またはＦ（ａｂ）２ＩｇＭと組み合わせて、このリン酸化を減弱する。ＰＬＣγ２リン酸化は、Ｈ２Ｏ２単独に応じて、またはＦ（ａｂ）２ＩｇＭとの組合せに応じて増大した。Ｃｂ１は、すべての処理に対して最小の応答を有する。いずれの理論にも制限されるものではないが、これらの結果は、ｐｒｐＳ６を調節する別個の経路が、ＢＣＲから生じ、個別のネガティブフィードバックループを有する、Ｅｒｋ、Ｓｙｋ／Ｚａｐ、ＢＬＮＫおよびＰＬＣγ２を調節する経路（単数または複数）とは異なっているということを示唆する。
【０３２１】
要約すると、これらの結果は、ＣＬＬ患者サンプルについては、ｐ−ＥｒｋのＰＭＡの活性化は、ＺＡＰ７０発現にかかわらず、すべての患者において同程度であり、Ｆ（ａｂ）２ＩｇＭ単独は、シグナル伝達を活性化しなかったということを示す。６種のＣＬＬ試料のうち２種において、個別のシグナル伝達プロフィールを有する２つの細胞の亜集団が観察された。最後に、活性化の動態学は、Ｓｙｋ／ＺＡＰ７０、ＢＬＮＫおよびＥｒｋによって異なる。
【０３２２】
実施例２：ＣＬＬ患者は識別可能なパターンを示す
初代細胞の単離、保存、解凍および平衡。ＰＢＭＣを、密度勾配分離（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ；  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて単離した。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣを低速遠心分離によってペレットにし、９０％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）＋１０％  ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からなる培地に再懸濁し、複数のクリオチューブ中で液体窒素の気相中でゆっくりと凍結し、液体窒素中で保存した。凍結サンプルのシグナル伝達分析のために、個々のクリオチューブをＲＭＰＩ＋１％血清５ｍｌに解凍し、カウントし、ペレットにし、３．３×１０６個細胞／ｍｌで再懸濁した。解凍したＰＢＭＣを、ＣＯ２インキュベーター中３７℃で２時間休息させ、その後刺激した。
【０３２３】
調節
刺激の少なくとも３０分前に、１×１０６個ＰＢＭＣを含有する３００μｌの培地をフローサイトメトリーチューブ（Ｆａｌｃｏｎ  ２０５２；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に分注し、ＣＯ２インキュベーター中３７℃で休息させた。Ｂ細胞受容体のクロスリンクは、ヤギポリクローナル抗−ＩｇＭおよび抗−ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて達成した。Ｈ２Ｏ２は、用いる場合には、３．３ｍＭ終濃度とし、ＢＣＲクロスリンクの直後に２μｌの５００ｍＭ保存溶液として加えた。シグナル伝達の際には、細胞を３７℃のＣＯ２インキュベーターで維持し、シグナル伝達およびリン酸化を可能にした。１０分後、細胞を固定することによってシグナル伝達を停止した。リン酸化の基礎レベルを決定するために、未刺激細胞を、刺激細胞と並行して維持し、時間ゼロで固定した。固定のために、細胞の各チューブに、終濃度１．４％のパラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）を加えた。細胞を室温で５分間固定し、ペレットにし、２ｍｌのメタノールに１０分間再懸濁することによって透過処理し、フローサイトメトリーのために染色されるまで４℃で保存した。
【０３２４】
フローサイトメトリー
パラホルムアルデヒド固定され、メタノール透過処理された細胞を、２ｍｌのＰＢＳを加え、穏やかに再懸濁し、次いで、遠心分離することによって再水和した。細胞は、リン酸化部位特異的ａｌｅｘａ（Ａｘ）色素Ａｘ４８８およびＡｘ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）またはＲ−ＰＥ−がコンジュゲートしたＡｂも用いた点を除き、実施例Ｉにおけるように、洗浄し、染色した。染色カクテルは、ｐ−ＥＲＫ１／２（Ｔ２０２／Ｙ２０４）およびｐ−Ｓｙｋ（Ｙ３５２）／Ｚａｐ７０（Ｙ３１９）、ｐ−Ｌｃｋ／ｐ−Ｌｙｎ、ｐ−ＢＬＮＫ、ｐ−ＰＬＣγ２（ＰＬＣｒ２）またはｐ−Ｓ６に特異的な蛍光コンジュゲート抗体からなっていた。細胞サブセットの検出、選択およびゲートの開閉は、実施例Ｉに記載されるとおりとした。ＭｅＶ（ＭｕｌｔｉＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｖｉｅｗｅｒ）ソフトウェアを用いてヒートマップを作製した（図２６、２７および２８）。
【０３２５】
結果
図２６、２７および２８に示されるデータは、種々のＣＬＬ患者から得たＢ細胞は、ヒートマップによって可視化されるように活性化可能成分の識別可能なパターンを示すことを実証する。リン酸化のモジュレーターは、潜在性、または異常な造血集団の同定、分類およびグループ化を可能にする、活性化可能成分のさらなるパターンをさらに定義する。図２６、２７および２８では、ヒートマップの上部に患者サンプルが示されている。各列は単一の患者を示す。ＣＬＬは、サンプルがＣＬＬと診断されたから患者から得られたことを示す。ＣＯＮ、サンプルが、対照患者から得られたことを示す。ヒートマップ説明文は、図の上部に示され、未刺激対照（０分）に対して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）のｌｏｇ１０倍増大、または減少に基づいて陰つきのスケールを用いる。ヒストグラムの右の表示は、その行の染色されたリンタンパク質およびモジュレーター処理を示す。「ＵＳ」は、未刺激を示す。図２８は、同様のまたは別個のレベルのｐ−ＰＬＣγ２、ｐ−ＳｙＫ／Ｚａｐ−７０、ｐ−ＢＬＮＫおよびｐ−Ｌｃｋからなるいくつかの患者クラスター化グループの同定を示す。いくつかの患者クラスター化は、四角で囲まれた領域によって示されるように、調節時に明らかとなる。
【０３２６】
図２８では、Ｈ２Ｏ２を用いた処理は、４種の対照患者のもの（下部中央の四角）と同様である、ｐ−ＰＬＣγ２、ｐ−ＳｙＫ／Ｚａｐ−７０、ｐ−ＢＬＮＫおよびｐ−Ｌｃｋのレベルによって定義される患者クラスター化を示す（下部右、四角で囲まれた領域）。Ｈ２Ｏ２を用いた処理は、対照（下部の四角で囲まれた領域の左の９人の患者）とは異なる患者クラスター化をさらに示す。Ｈ２Ｏ２を用いた調節およびＢＣＲクロスリンクは、対照患者（上部中央の四角）と同様である、ｐ−ＢＬＮＫ、ｐ−Ｓｙｋおよびｐ−ＰＬＣγ２のレベル（上部左の四角で囲まれた領域）ならびにレスポンダーの異常な集団（上部の四角で囲まれた領域の右の１０人の患者）からなる別の患者クラスター化を定義する。
【０３２７】
実施例３：ＣＬＬ患者サンプル中のアポトーシス経路の評価
ＣＬＬのための現在の治療的アプローチは、リツキシマブなどのモノクローナル抗体を組み合わせた、フルダラビンベースの治療計画を含む。フルダラビン、プリン類似体は、リボヌクレオチドレダクターゼおよびＤＮＡポリメラーゼを干渉することによってＤＮＡ合成を阻害する。リツキシマブは、キメラＣＤ２０特異的体であり、補体と結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することが機構的にわかっており、いくつかの状態では、リツキシマブは、ＣＤ２０と結合し、増殖を阻害し、細胞アポトーシスを誘導する（アポトーシスの考察については、ＵＳＳＮ６１／０８５，７８９を参照のこと）。
【０３２８】
治療薬、例えば、それだけには限らないが、フルダラビンなどのＤＮＡ損傷剤またはリツキシマブなどの生物剤に応じた細胞アポトーシスは、アポトーシス機構の細胞内タンパク質成分またはノードを認識する、フルオロフォアがコンジュゲートしている抗体を用いるマルチパラメータフローサイトメトリーによって測定できる。このようなノードとして、それだけには限らないが、カスパーゼ３、カスパーゼ８、シトクロムＣ、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ、ｐ−Ｃｈｋ２、ｐ−ＢＡＤを挙げることができる。カスパーゼ依存性および／または非依存性経路を示すために、細胞を、汎カスパーゼ阻害剤ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）フルオロメチルケトン（Ｚ−ＶＡＤ．ＦＭＫ）で処理することによって、さらなる情報を集めてもよい。アポトーシスタンパク質が、治療薬を用いた治療にどのように応答するかのプロフィールを用いて、臨床決定に情報を与えることができる。
【０３２９】
フルダラビンおよびリツキシマブで処理したサンプルのアポトーシスへの応答を測定するための試験手順
細胞を水浴中、３７℃で、部分的に解凍するまで（約５０％）解凍し、次いで、室温でＲＰＭＩ／１％  ＦＢＳに加える。細胞を、９００ＲＰＭで１０分間遠心分離し上清をデカントし、ペレットを２５ミリリットルの培地に再懸濁する。このステップを反復する。細胞のアリコートを、トリパンブルー染色を用い、血球算定器でカウントする。細胞を、所望の濃度でＲＰＭＩ／１％または１０％／ＦＢＳに再懸濁する。３７℃で２時間インキュベーションした後、細胞を、９６ウェルプレートのウェルあたり１×１０６個細胞という濃度で分注する。細胞を、ＺＶＡＤの存在下または不在下で、単独または組み合わせた、フルダラビン（０〜５０μＭの濃度の）、リツキシマブ（０〜５００μＭの濃度の）および／またはスタウロスポリンとともに種々の時間インキュベートする。薬物とともにインキュベートした後、細胞を、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（細胞外マーカー）を含む蛍光色素がコンジュゲートしている抗体および上記で記載されるアポトーシスのノード／マーカーに対する蛍光色素がコンジュゲートしている抗体のカクテルを用いて染色するために処理する。細胞をフローサイトメトリーによって分析する。細胞処理およびフローサイトメトリー解析の詳細は、ＵＳＳＮ６１／０８５，７８９に与えられている。
【０３３０】
本明細書において、本発明の好ましい実施形態を示し、記載してきたが、当業者には、このような実施形態が単に例として提供されることは明らかである。ここで、当業者には、本発明から逸脱することなく、多数の変法、変化および置換が思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態への種々の代替を、本発明の実施において使用してもよいということは理解されなければならない。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定することならびにこれらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにその等価物がそれによって網羅されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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