(57)【要約】  ＨＩＶに対する細胞表面受容体の標的化突然変異誘発のための組成物およびそれらの使用方法を本発明において提供する。該組成物は、標的部位において配列特異的に二重らせんＤＮＡに結合して三本鎖構造を形成する三重らせん形成性分子を含む。該三重らせん形成性分子は三重らせん形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）でありうる。該三重らせん形成性分子は、供与オリゴヌクレオチドと組合せて使用された場合に哺乳類細胞において部位特異的相同組換えを誘導するのに有用である。該三重らせん形成性分子は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する細胞表面受容体をコードする遺伝子内の又は該遺伝子に隣接した部位を標的化する。この結合は供与オリゴヌクレオチドの相同組換えを刺激して、ＨＩＶ細胞表面受容体遺伝子における突然変異を引き起こし、該突然変異は、ＨＩＶに結合し該細胞へのその輸送を可能にするコード化受容体の能力における１以上の欠損をもたらす。開示されている組成物を使用するＨＩＶ感染のエクスビボおよびインビボ予防および治療方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重らせんＤＮＡに配列特異的に結合して三本鎖構造を形成する三重らせん形成性分子と、供与オリゴヌクレオチドとを含んでなる組換え誘発性または突然変異誘発性組成物であって、該三重らせん形成性分子が、ＨＩＶに対する細胞表面受容体をコードするヒト遺伝子内の又は該遺伝子に隣接した標的部位に結合する、組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
【請求項２】
該三重らせん形成性分子が、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸よりなる群から選ばれる、請求項１記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
【請求項３】
該ペプチド核酸が二本鎖ビス−ペプチド核酸である、請求項２記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
【請求項４】
該三重らせん形成性オリゴヌクレオチドが１以上の化学修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項２記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
【請求項５】
該標的部位がヒトケモカイン遺伝子中又は該遺伝子内に存在する、請求項１記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
【請求項６】
該ヒトケモカイン遺伝子が、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ２ｂ、ＣＣＲ３およびＣＣＲ１よりなる群から選ばれる、請求項５記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
【請求項７】
該ヒトケモカイン遺伝子がＣＣＲ５である、請求項５記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
【請求項８】
該標的部位がＣＣＲ５遺伝子中のΔ３２突然変異の部位を含む、請求項７記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
【請求項９】
該供与オリゴヌクレオチドが、該標的二重らせんＤＮＡヌクレオチド配列と比較して１以上のヌクレオチド突然変異、欠失または挿入を含む、請求項１記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
【請求項１０】
該供与オリゴヌクレオチドが、該標的二重らせんＤＮＡヌクレオチド配列中のミスセンスまたはナンセンス突然変異を引き起こす１以上の点突然変異を含み、該ミスセンスまたはナンセンス突然変異が該標的二重らせんＤＮＡにおいてフレームシフトまたは欠失を引き起こす、請求項９記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
【請求項１１】
該突然変異、欠失または挿入が、ＨＩＶに対する細胞表面受容体欠損を引き起こし、該欠損が、該受容体の発現の低下、該細胞表面への該受容体の輸送の欠陥、該受容体タンパク質の安定性の低下、該受容体によるＨＩＶの結合の低下および該受容体のエンドサイトーシスの欠陥よりなる群から選ばれる、請求項９記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
【請求項１２】
細胞を請求項１記載の組成物と接触させることを含んでなる、ＨＩＶに対する細胞表面受容体をコードする遺伝子の標的化組換えまたは突然変異のための方法であって、該供与オリゴヌクレオチドが、該標的二重らせんＤＮＡヌクレオチド配列と比較して１以上のヌクレオチド突然変異、欠失または挿入を含む、方法。
【請求項１３】
ＨＩＶ感染した又はその発生の危険性がある対象におけるＨＩＶ感染の予防または治療方法であって、
ａ）細胞を宿主から単離し、
ｂ）該細胞を請求項１記載の組成物とエクスビボで接触させ（該供与オリゴヌクレオチドは、該標的二重らせんＤＮＡヌクレオチド配列と比較して１以上のヌクレオチド突然変異、欠失または挿入を含む）、
ｃ）該細胞を培養中で増殖させ、
ｄ）該細胞を、それを要する対象に投与すること、を含んでなる方法。
【請求項１４】
該細胞が１以上のＨＩＶ株による感染に対して耐性である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該細胞がＲ５指向性ＨＩＶ株に対して耐性である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
治療すべき対象または同系宿主から該細胞を単離する、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
該細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
段階ｄ）の前に該細胞をＣＤ４＋細胞に分化させることを更に含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
ＨＩＶ感染した又はその発生の危険性がある対象におけるＨＩＶ感染の予防または治療方法であって、予防又は治療方法を必要とする対象に請求項１記載の組成物を投与することを含んでなり、該供与オリゴヌクレオチドが、該標的二重らせんＤＮＡヌクレオチド配列と比較して１以上のヌクレオチド突然変異、欠失または挿入を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１２記載の方法により製造された細胞系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、全般的には、ＨＩＶの細胞表面受容体をコードするＤＮＡに結合する組成物、およびこれらの組成物を使用する方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ−１は、レンチウイルス属に属するレトロウイルス科のメンバーである。レトロウイルス科は、点突然変異およびゲノム間組換えの両方により分離体の多様性をもたらすエラー高頻発ウイルス逆転写酵素によりｄｓＤＮＡに変換される２つのプラス鎖ＲＮＡを含有する包膜ウイルスである。ＨＩＶ−１分離体は３つの群、すなわち、Ｍ（主要／中心的）、Ｎ（非Ｍ、非Ｏ／新規）およびＯ（アウトライアー）に分けられ、これらのうち、示唆されるとおり、Ｍ群が最も一般的である。Ｍ群は幾つかのサブタイプまたはクレード（Ａ〜Ｄ、Ｆ〜Ｈ、ＪおよびＫ）に細分され、これらのうち、Ｂが西洋では最も一般的であり、Ｃが、インド、中国およびサハラ以南のアフリカにおいて主として見出される最も優勢なサブタイプである。残りのサブタイプ、および幾つかの異なるサブタイプ、いわゆる循環組換え形態（ＣＲＦ）の特性を有するＨＩＶ−１変異体は、アフリカおよび世界のその他の地域に散在している。
【０００３】
ＨＩＶ−１は外部エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０および膜貫通糖タンパク質ｇｐ４１を含有する。これらのタンパク質は、ゴルジ装置を通る輸送中にフリン様酵素による高グリコシル化前駆体タンパク質ｇｐ１６０の切断により生じる。細胞表面に輸送されたら、三量体ｇｐ１２０／ｇｐ４１エンベロープ糖タンパク質スパイクが、新たなＨＩＶ−１粒子の放出のために出芽ウイルス内に取り込まれる。外部エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０が、潜在的標的細胞の表面上の細胞膜に包埋されている一次受容体ＣＤ４に結合すると、それぞれの新たな感染周期が開始する。ｇｐ１２０とＣＤ４との相互作用の後、Ｅｎｖにおける一連のコンホメーション変化が生じて、該スパイクがその受容体（通常はＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４）と相互作用するのを可能にする一過性結合部位の露出が生じる。これが今度は、ｇｐ４１がその融合ペプチドを標的細胞膜内に挿入してプレヘアピン構造を形成するのを可能にする更なるコンホメーション変化を促し、ついで該プレヘアピン構造は、エネルギー的に安定な６ヘリックス束状構造へと崩壊し、ウイルス−細胞膜融合および標的細胞内へのＨＩＶ−１コアの侵入を導く。この一連の事象は中性ｐＨで細胞膜において生じる。
【０００４】
最近、治療状況を潜在的に変化させうるＨＩＶ療法の新規クラスとして、侵入インヒビターが登場している。これらの薬物は、Ｔ細胞内へのＨＩＶの侵入に必要な細胞表面受容体、例えば、ＣＣＲ５遺伝子によりコードされるタンパク質を遮断する。ＣＣＲ５ケモカイン受容体は、初期急性ＨＩＶ感染のほとんどのケースをもたらすＲ５指向性ＨＩＶ−１株に対する主要共受容体である。ＣＣＲ５遺伝子内にホモ接合不活性化突然変異（デルタ３２突然変異と称される）を有する個体は、Ｒ５指向性ＨＩＶ−１株による感染に対してほぼ完全に抵抗性であり、他の有意な悪影響を伴わない。エイズに罹患しながら現在生きている４０００万を超える人々に関して、産業アナリストは、ＣＣＲ５を標的化する療法の成功は年間５００〜７００ＭＭドルの売上高をもたらすと推定している。多数の製薬会社が、該受容体タンパク質を遮断する侵入インヒビター薬を開発しようと現在試みているが、毒性、効力および薬物耐性により進展が阻まれている。
【０００５】
かなり以前にＦｅｌｓｅｎｆｅｌｄら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７９：２０２３（１９５７）により三本鎖ＤＮＡが初めて観察されて以来、オリゴヌクレオチド指向性三重らせん形成が分子生物学における重要な手段として登場している。現在の知見は、オリゴヌクレオチドは、二重らせんＤＮＡ内のポリプリン／ポリピリミジン伸長における主溝において、配列特異的に、ＤＮＡの第３鎖として結合しうることを示唆している。ＭｏｓｅｒおよびＤｅｒｖａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：６４５（１９８７），Ｐｒａｓｅｕｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：１３４９（１９８８）ならびにＭｅｒｇｎｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：９７９１（１９９１）に記載されているとおり、１つのモチーフにおいて、ポリピリミジンオリゴヌクレオチドは該二重らせん内のプリン鎖に平行な方向で結合する。ＢｅａｌおよびＤｅｒｖａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３６０（１９９１）に記載されているとおり、代わりのプリンモチーフにおいては、ポリプリン鎖が該プリン鎖に逆平行で結合する。三重らせん形成の特異性は、水素結合により形成される塩基トリプレット（該プリンモチーフ内のＡＡＴおよびＧＧＣ）から生じ、ミスマッチは該三重らせんを不安定化する（Ｍｅｒｇｎｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：９７９１（１９９１）ならびにＢｅａｌおよびＤｅｒｖａｎ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：２７７３（１９９２）に記載されている）。
【０００６】
三重らせん形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）は幾つかの分子生物学技術に有用である。例えば、ＤＮＡ結合性タンパク質を遮断し、インビトロおよびインビボの両方で転写を遮断するために、遺伝子プロモーター内の部位に結合するよう設計された三重らせん形成性オリゴヌクレオチドが使用されている（Ｍａｈｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：７２５（１９８９），Ｏｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３４３５（１９９１），Ｐｏｓｔａｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８２２７（１９９１），Ｃｏｏｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６（１９８８），Ｙｏｕｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１００２３（１９９１），Ｍａｈｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：７０（１９９２），Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｅｎｔｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５０４（１９９２），Ｂｌｕｍｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１７７７（１９９２），Ｄｕｒｌａｎｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：９２４６（１９９１），Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖら，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．２６７：３３８９（１９９２）およびＴａｋａｓｕｇｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５６０２（１９９１））。ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）のような反応性部分に結合した三重らせん形成性オリゴヌクレオチドを使用することにより、またはＤＮＡ修飾酵素と共に三重らせん形成性オリゴヌクレオチドを使用することにより、ＤＮＡの部位特異的切断が達成されている（Ｐｅｒｒｏｕａｕｌｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：３５８（１９９０），Ｆｒａｎｃｏｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９７０２（１９８９），Ｌｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：１０５４（１９８９），Ｐｅｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９８５８（１９９０），Ｓｔｒｏｂｅｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６３９（１９９１）ならびにＰｏｓｖｉｃおよびＤｅｒｖａｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：９４２８（１９９２））。三重らせんアフィニティー捕捉を利用する配列特異的ＤＮＡ精製も示されている（Ｉｔｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４９５（１９９２））。アクリジンのようなインターカレーション剤またはｐ−アジドフェナシルおよびプソラレンのような架橋剤に結合した三重らせん形成性オリゴヌクレオチドが使用されているが、三重らせん結合の安定性を増強するために使用されているに過ぎない（Ｐｒａｓｅｕｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：１３４９（１９８８），Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖら，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．２６７：３３８９（１９９２），Ｔａｋａｓｕｇｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５６０２（１９９１））。
【０００７】
遺伝子治療は、宿主細胞内に異種ＤＮＡを導入するために用いる方法により、または細胞内の内在性遺伝子の発現を改変するために用いる方法により定義されうる。そのようなものとして、遺伝子治療は、細胞の表現型および／または遺伝子型を改変するために用いられうる。
【０００８】
遺伝子置換によるゲノムの標的化修飾は研究手段として及び遺伝子治療において重要である。しかし、哺乳類細胞内に新規遺伝子を導入するための簡便な方法が存在するが、相同組換えの頻度は限られたものであり（Ｈａｎｓｏｎら，（１９９５）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５（１），４５−５１）、部位特異的遺伝子挿入を有する細胞の単離は典型的には選択操作を要する（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４（４９１０），１２８８−１２９２）。稀有切断エンドヌクレアーゼによる二本鎖切断の形態の部位特異的ＤＮＡ損傷は幾つかの細胞系における染色体遺伝子座における相同組換えを促進しうるが、このアプローチは該遺伝子座内への該認識配列の前挿入を要する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄら著，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７９：２０２３（１９５７）
【非特許文献２】ＭｏｓｅｒおよびＤｅｒｖａｎ著，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：６４５（１９８７）
【非特許文献３】Ｐｒａｓｅｕｔｈら著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：１３４９（１９８８）
【非特許文献４】Ｍｅｒｇｎｙら著，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：９７９１（１９９１）
【非特許文献５】ＢｅａｌおよびＤｅｒｖａｎ著，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３６０（１９９１）
【非特許文献６】ＢｅａｌおよびＤｅｒｖａｎ著，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：２７７３（１９９２）
【非特許文献７】Ｍａｈｅｒら著，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：７２５（１９８９）
【非特許文献８】Ｏｒｓｏｎら著，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３４３５（１９９１）
【非特許文献９】Ｐｏｓｔａｌら著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８２２７（１９９１）
【非特許文献１０】Ｃｏｏｎｅｙら著，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６（１９８８）
【非特許文献１１】Ｙｏｕｎｇら著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１００２３（１９９１）
【非特許文献１２】Ｍａｈｅｒら著，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：７０（１９９２）
【非特許文献１３】Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｅｎｔｉｎら著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５０４（１９９２）
【非特許文献１４】Ｂｌｕｍｅら著，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１７７７（１９９２）
【非特許文献１５】Ｄｕｒｌａｎｄら著，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：９２４６（１９９１）
【非特許文献１６】Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖら著，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．２６７：３３８９（１９９２）
【非特許文献１７】Ｔａｋａｓｕｇｉら著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５６０２（１９９１）
【非特許文献１８】Ｐｅｒｒｏｕａｕｌｔら著，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：３５８（１９９０）
【非特許文献１９】Ｆｒａｎｃｏｉｓら著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９７０２（１９８９）
【非特許文献２０】Ｌｉｎら著，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：１０５４（１９８９）
【非特許文献２１】Ｐｅｉら著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９８５８（１９９０）
【非特許文献２２】Ｓｔｒｏｂｅｌら著，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６３９（１９９１）
【非特許文献２３】ＰｏｓｖｉｃおよびＤｅｒｖａｎ著，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：９４２８（１９９２）
【非特許文献２４】Ｉｔｏら著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４９５（１９９２）
【非特許文献２５】Ｐｒａｓｅｕｔｈら著，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５（１），４５−５１
【非特許文献２６】Ｔａｋａｓｕｇｉら著，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４（４９１０），１２８８−１２９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
細胞の遺伝子型を改変する方法は、典型的には、ヒト、動物および植物の遺伝的障害を治療するために欠損遺伝子の完全置換コピー、異種遺伝子または小核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）を細胞内に導入することに基づく。導入された遺伝子または核酸分子は遺伝的組換えにより内在性遺伝子を置換する。このアプローチは、遺伝的に操作されたウイルスまたはウイルスベクターのような、置換遺伝子を細胞内に導入するための複雑な運搬系を要する。
【００１１】
あるいは、内在性遺伝子の発現を改変するために遺伝子治療方法が用いられうる。このタイプの方法の一例はアンチセンス療法である。アンチセンス療法においては、特異的タンパク質をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズまたは結合するよう、特異的核酸配列の核酸分子である核酸分子を細胞内に導入する。ｍＲＮＡ種へのアンチセンス分子の結合は該ｍＲＮＡの翻訳の効率および速度を減少させる。
【００１２】
ヒトのよく知られた遺伝的障害、例えば網膜芽細胞腫、嚢胞性線維症、およびグロビン異常、例えば鎌状赤血球貧血を治療するために、遺伝子治療が実験的に用いられている。しかし、欠損遺伝子の置換を実際に引き起こす組換え事象の数が限られているため、インビボ効率は低い。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ＨＩＶに対する細胞表面受容体をコードする遺伝子の標的化突然変異誘発のための組成物および方法は、エクスビボおよびインビボでの予防および治療用途において用いる遺伝子治療の手段として有用であろう。そのような組成物および方法は、研究手段として用いる、ＨＩＶに対する細胞表面受容体をコードする遺伝子における或るスペクトルの突然変異を有する細胞を作製するのにも有用であろう。
【発明の効果】
【００１４】
したがって、ＨＩＶに対する細胞表面受容体をコードする遺伝子の部位または隣接部位におけるインビボおよびエクスビボ標的化組換えのための組成物およびその使用方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１５】
ＨＩＶに対する細胞表面受容体をコードする遺伝子の部位または隣接部位における標的化突然変異誘発を誘導する組成物およびその使用方法を提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【００１６】
ＨＩＶに対する細胞表面受容体をコードする遺伝子の部位または隣接部位に突然変異を含有する細胞を提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【００１７】
ウイルスベクターの必要性を伴わない遺伝子治療によりＨＩＶ感染を治療または予防するための組成物および方法を提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【００１８】
エクスビボ遺伝子治療によりＨＩＶ感染を治療または予防するための組成物および方法を提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【００１９】
インビボ遺伝子治療によりＨＩＶ感染を治療または予防するための組成物および方法を提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【００２０】
発明の要約
ＨＩＶに対する細胞表面受容体の標的化突然変異誘発のための組成物およびそれらの使用方法を本発明において提供する。該組成物は、標的部位において配列特異的に二重らせんＤＮＡに結合して三本鎖構造を形成する三重らせん形成性分子を含む。
【００２１】
該標的部位は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する細胞表面受容体をコードする遺伝子内に存在するか、または該遺伝子に隣接している。ＨＩＶ細胞表面受容体は、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ２ｂ、ＣＣＲ３およびＣＣＲ１を含むケモカイン受容体でありうる。該標的部位は該遺伝子のコード領域内に存在しうる。該標的配列は、好ましくは、細胞内へのＨＩＶ侵入を可能にするＨＩＶ細胞表面受容体遺伝子の機能に重要な、該ＨＩＶ細胞表面受容体遺伝子の部分（例えば、該受容体の効率的発現、該細胞表面への該受容体の輸送、該受容体の安定性、該受容体によるウイルス結合または該受容体のエンドサイトーシスに関与するヌクレオチドまたはヌクレオチド配列）内に存在するか、または該部分に隣接している。１つの実施形態においては、該三重らせん形成性分子の標的部位はヒトＣＣＲ５遺伝子内に存在するか、または該遺伝子に隣接している。好ましい実施形態においては、該標的部位は、Δ３２突然変異と称される、天然に存在するナンセンス突然変異の部位を含むか、または該部位に隣接している。
【００２２】
該三重らせん形成性分子は三重らせん形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）でありうる。ＴＦＯは、約７〜約４０ヌクレオチド長の一本鎖オリゴヌクレオチドである。ＴＦＯは、二重らせんＤＮＡの主溝内にポリプリン、ホモプリン、ポリピリミジンまたはホモピリミジン塩基組成を含有する標的部位に結合する。ＴＦＯは、それらのヌクレオチド構成成分に対する化学修飾、例えば、それらの複素環塩基、糖部分またはホスファート部分の化学修飾を含有しうる。これらの修飾は標的部位へのＴＦＯの結合アフィニティーまたは形成される三重らせんの安定性を増加させうる。
【００２３】
該三重らせん形成性分子はまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）でありうる。２本のＰＮＡ鎖での二重らせんＤＮＡの鎖侵入により、非常に安定なＰＮＡ：ＤＮＡ：ＰＮＡ三重らせん構造が形成されうる。その２本のＰＮＡ鎖は互いに結合してビスＰＮＡ分子を形成しうる。また、ＰＮＡは、ポリプリンまたはホモプリン配列を有する標的部位に結合するが、ＴＦＯより短い標的配列において、より大きな安定性で結合しうる。
【００２４】
供与オリゴヌクレオチドと組合せて使用された場合に該三重らせん形成性分子は、哺乳類細胞において部位特異的相同組換えを誘導するのに有用である。供与オリゴヌクレオチドは三重らせん形成性分子に係留されることが可能であり、あるいは該三重らせん形成性分子から分離していることが可能である。該供与オリゴヌクレオチドは、標的二重らせんＤＮＡと比較して少なくとも１つのヌクレオチド突然変異、挿入または欠失を含有しうる。コード化受容体がＨＩＶに結合し細胞内へのその輸送を可能にする能力における１以上の欠損をもたらす、ＨＩＶ細胞表面受容体遺伝子における突然変異を引き起こすために、供与オリゴヌクレオチドと共に三重らせん形成性分子が使用されうる。適当な突然変異としては、細胞表面ＨＩＶ受容体の発現、細胞表面へのその輸送、その安定性、ＨＩＶへのその結合能またはそのエンドサイトーシス能の低下を引き起こすものが挙げられる。
【００２５】
また、ＨＩＶに対する細胞表面受容体における少なくとも１つの突然変異を含有する供与オリゴヌクレオチドおよび三重らせん形成性分子と細胞を接触させることにより作製される細胞系を提供する。該細胞は、好ましくは、造血細胞由来である。有用な造血細胞には、Ｔ細胞、および造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞が含まれる。該細胞系は、他のＨＩＶ治療剤、例えば、細胞内へのＨＩＶの侵入を軽減または抑制する他の物質のスクリーニングおよび開発のために使用されうる。
【００２６】
また、ＨＩＶ感染を有する又はその発生のリスクを有する対象を、本明細書に開示されている組成物を使用して治療するための予防および治療方法を提供する。該方法は、ＨＩＶでの個体の感染を予防するために、またはＨＩＶに既に感染している個体のウイルス負荷を減少させるために使用されうる。１つの実施形態においては、ＨＩＶ感染の治療または予防のために、本明細書に開示されている組成物を使用するエクスビボ療法が用いられる。これらの方法は、標的細胞を単離し、該標的細胞を三重らせん形成性分子および供与オリゴヌクレオチドとエクスビボで接触させてＨＩＶ細胞表面受容体遺伝子の標的化突然変異誘発を引き起こし、該修飾細胞を培養内で増殖させ、該修飾細胞を、その投与を要する対象に投与することを含む。該細胞は、治療すべき対象から単離されることが可能であり、あるいは同系または同種異系宿主から単離されることが可能である。該細胞は造血幹細胞であることが可能であり、好ましくは、ＣＤ３４＋細胞である。もう１つの実施形態においては、該修飾細胞をエクスビボ培養内で分化させ、対象への投与前に多数に増殖させる。該細胞を、好ましくは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞に分化させる。また、本明細書に開示されている組成物を投与することによりＨＩＶ感染を治療または予防するための方法も提供する。
【００２７】
発明の詳細な説明
Ｉ．ＨＩＶに対する細胞表面受容体をコードする二本鎖ＤＮＡに結合する組成物
二重らせんＤＮＡに配列特異的に結合して三本鎖構造を形成する「三重らせん形成性分子」と称される分子を含有する組成物を本明細書において開示する。該三重らせん形成性分子は、供与ＤＮＡ分子と組合された場合に哺乳類細胞において部位特異的相同組換えを誘導するために使用されうる。該供与ＤＮＡ分子は標的ＤＮＡ配列に対する突然変異核酸を含有しうる。これは、標的化二重らせんＤＮＡによりコードされるポリペプチドまたはタンパク質の機能を活性化、不活性化または改変するのに有用である。三重らせん形成性分子には、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸が含まれる。
【００２８】
Ａ．三重らせん形成性分子で標的化される遺伝子
三重らせん形成性分子が結合する所定領域は、本明細書においては、「標的配列」、「標的領域」または「標的部位」と称される。本明細書に開示されている三重らせん形成性分子の標的配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する細胞表面受容体をコードするヒト遺伝子内に存在するか、または該遺伝子に隣接している。好ましくは、該三重らせん形成性分子の標的配列は、細胞内へのＨＩＶ侵入を可能にするＨＩＶ受容体遺伝子の機能に重要な、該ＨＩＶ受容体遺伝子の部分（例えば、該受容体の効率的発現、該細胞表面への該受容体の輸送、該受容体の安定性、該受容体によるウイルス結合または該受容体のエンドサイトーシスに関与する配列）内に存在するか、または該部分に隣接している。標的配列は該遺伝子のコードＤＮＡ配列内またはイントロン内に存在しうる。標的配列は、プロモーターまたはエンハンサー配列を含む、該標的遺伝子の発現を調節するＤＮＡ配列内にも存在しうる。
【００２９】
標的配列は、細胞内へのＨＩＶの侵入を促進する細胞表面受容体をコードする任意の遺伝子内に存在する、または該遺伝子に隣接しうる。細胞内へのＨＩＶ侵入の分子的メカニズムはウイルスエンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖ）と２つの標的細胞タンパク質（ＣＤ４およびケモカイン受容体）との間の特異的相互作用を含む。ＨＩＶ細胞指向性は、７回膜貫通伸長Ｇタンパク質共役受容体である個々のケモカイン受容体に対するｅｎｖの特異性により決定される（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：８０５−１０（２０００））。ケモカイン受容体の２つの主要ファミリーはＣＸＣケモカイン受容体およびＣＣケモカイン受容体（ＣＣＲ）であり、これらは、それぞれＣＸＣおよびＣＣケモカインに結合することにちなんで命名されている。ＣＸＣケモカイン受容体は伝統的には急性炎症応答に関連づけられており、一方、ＣＣＲは、大抵は、慢性炎症およびＴ細胞媒介性炎症反応に関連して見出される細胞型（好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞およびＴ細胞）上で発現される（Ｎａｎｓｅｎら，２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９：４）。１つの実施形態においては、標的配列は、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ２ｂ、ＣＣＲ３およびＣＣＲ１を含む（これらに限定されるものではない）ケモカイン受容体をコードするヒト遺伝子内に存在するか、または該遺伝子に隣接している。
【００３０】
好ましい実施形態においては、標的配列はヒトＣＣＲ５遺伝子内に存在するか、または該遺伝子に隣接している。ＣＣＲ５ケモカイン受容体は、初期急性ＨＩＶ感染のほとんどのケースをもたらすＲ５指向性ＨＩＶ−１株に対する主要共受容体である。Δ３２突然変異と称されるホモ接合不活性化突然変異をＣＣＲ５遺伝子内に有する個体は、Ｒ５指向性ＨＩＶ−１株による感染に対してほぼ完全に抵抗性である。Δ３２突然変異はＣＣＲ５コード領域内に３２塩基対の欠失を生成する。
【００３１】
ＣＣＲ５遺伝子内のもう１つの天然に存在する突然変異は、ヌクレオチド３０３における、オープンリーディングフレームの単一のＴからＡへの塩基対トランスバージョンにより特徴づけられるｍ３０３突然変異であり、これは、アミノ酸１０１（Ｃ１０１Ｘ）における、ケモカイン受容体タンパク質の最初の細胞外ループにおけるシステインから終止コドンへの変化を示す（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎら，１９９７）。突然変異誘発アッセイは、感染アッセイにおいてＨＩＶ−１  Ｒ５分離体に対して非感受性であることが判明したＣＣＲ５ヌルトランスフェクト化細胞の表面上のｍ３０３共受容体の発現を検出していない（Ｂｌａｎｐａｉｎら，（２０００））。
【００３２】
ＣＣＲ５遺伝子内にホモ接合Δ３２不活性化突然変異を有する個体は有意な有害な表現型を示さない。このことは、この遺伝子が、正常なヒトの健康にほとんど必要でないことを示唆している。これは、該ＣＣＲ５遺伝子を、本明細書に開示されている三重らせん形成性分子を使用する標的化突然変異誘発のための特に魅力的な標的とする。ヒトＣＣＲ５の遺伝子は当技術分野で公知であり、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＭ ０００５７９として提供される。ヒトＣＣＲ５遺伝子のコード領域はＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＭ ０００５７９のヌクレオチド３５８−１４１６により提供される。
【００３３】
Ｂ．三重らせん形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）
１つの実施形態においては、該三重らせん形成性分子は三重らせん形成性オリゴヌクレオチドである。三重らせん形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）は、配列特異的に二重らせんＤＮＡに第３鎖として結合するオリゴヌクレオチドと定義される。該オリゴヌクレオチドは、細胞表面ＨＩＶ受容体をコードするヒト遺伝子内または該遺伝子に隣接した所定標的配列、標的領域または標的部位に選択的に結合またはハイブリダイズして三本鎖構造を形成する合成または単離された核酸分子である。
【００３４】
好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、７〜４０ヌクレオチド長、最も好ましくは、インビトロ突然変異誘発には１０〜２０ヌクレオチド長、インビボ突然変異誘発には２０〜３０ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子である。その塩基組成はホモプリンまたはホモピリミジンでありうる。あるいは、該塩基組成はポリプリンまたはポリピリミジンでありうる。しかし、他の組成も有用である。
【００３５】
該オリゴヌクレオチドは、好ましくは、公知ＤＮＡ合成法を用いて作製される。１つの実施形態においては、オリゴヌクレオチドは合成により作製される。また、オリゴヌクレオチドは、当技術分野でよく知られた標準的な方法を用いて化学修飾されうる。
【００３６】
該オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的配列の配列、標的領域の主溝内の該オリゴヌクレオチドの結合を達成するための必要性により課される物理的制約、およびオリゴヌクレオチド／標的配列に関する低い解離定数（Ｋｄ）を有する必要性に基づいて選択される。該オリゴヌクレオチドは、三重らせん形成に適した塩基組成を有し、第３鎖結合のための公知構造モチーフの１つに基づいて作製される。最も安定な複合体は、哺乳類ゲノムに比較的豊富に存在するポリプリン：ポリピリミジン要素上で形成される。ＴＦＯによる三重らせん形成は、二重らせんのプリン鎖に平行または逆平行に配向した第３鎖と共に生じうる。逆平行プリンモチーフにおいては、トリプレットはＧ．Ｇ：ＣおよびＡ．Ａ：Ｔであり、平行ピリミジンモチーフにおいては、規定（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）トリプレットはＣ＋．Ｇ：ＣおよびＴ．Ａ：Ｔである。三重らせん構造は、ＴＦＯ鎖と二重らせん内のプリン鎖とにおける塩基間の２つのフーグスティーン水素結合により安定化される。第３鎖結合オリゴヌクレオチドのための塩基組成の総説が米国特許第５，４２２，２５１号に記載されている。
【００３７】
好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、高いストリンジェンシーおよび特異性の条件下、標的配列に結合またはハイブリダイズする。最も好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、配列特異的に、二重らせんＤＮＡの主溝内に結合する。核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーのインビトロ三重らせん形成のための反応条件は、オリゴヌクレオチド長、Ｇ：ＣおよびＡ：Ｔ塩基対の数およびハイブリダイゼーション反応において使用されるバッファーの組成のような要因に応じて、オリゴヌクレオチドによって異なる。二本鎖核酸分子の標的領域に第３鎖結合コードに基づいた実質的に相補的なオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３８】
本明細書において用いるオリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドが、標的領域と三重らせん形成を可能にする複素環塩基組成を有する場合に、該標的領域に実質的に相補的であると言える。そのようなものとして、オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチド中に非相補的塩基が存在する場合であっても、標的領域に実質的に相補的である。前記のとおり、実質的に相補的なオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するために使用されうる、利用可能な種々の構造モチーフが存在する。
【００３９】
１つの実施形態においては、標的領域は、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ２ｂ、ＣＣＲ３およびＣＣＲ１を含むケモカイン受容体をコードする遺伝子内の又は該遺伝子に隣接したポリプリン部位である。好ましい実施形態においては、標的領域はヒトＣＣＲ５遺伝子のコード領域内のポリプリンまたはホモプリン部位である。三重らせん形成性分子に対する標的部位として特に有用であるＣＣＲ５遺伝子のコード領域内の３つのホモプリン部位はＡＴＧ開始コドンに対して５０９−５１８位、６７９−６９０位および９００−９０８位である。
【００４０】
６７９−６９０位のホモプリン部位は、Δ３２突然変異により生成されるナンセンス突然変異の部位を部分的に含む。この標的部位に結合するＴＦＯは特に有用である。ＣＣＲ５遺伝子に結合させるために使用される代表的なＴＦＯには、限定的なものではないが、以下の配列が含まれる。
【００４１】
【化１】
2010515464.tif 000002
【００４２】
括弧内の数字は、示されているＴＦＯが結合する、開始ＡＴＧに対するＣＣＲ５遺伝子の位置を示す。
【００４３】
化学修飾
本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、定められた塩基配列の複数のヌクレオチドサブユニットを含む核酸重合体である。オリゴヌクレオチドは、リン酸エステル結合により互いに結合したヌクレオチドの鎖を含む。各ヌクレオチドは、典型的には、複素環塩基（核酸塩基）、該複素環塩基に結合した糖部分、および該糖部分のヒドロキシル基をエステル化するホスファート部分を含む。天然に存在する主なヌクレオチドは、ウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニンを複素環塩基として含み、リボースまたはデオキシリボースを糖部分として含む。
【００４４】
三重らせん形成性オリゴヌクレオチドは、それらのヌクレオチド構成成分に対する化学修飾を含みうる。当技術分野で公知の修飾された塩基および塩基類似体、修飾された糖および糖類似体ならびに／またはホスファート類似体および修飾されたホスファート部分も、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドにおける使用に適している。生理的条件下ではカリウムレベルは高く、マグネシウムレベルは低く、ｐＨは中性である。これらの条件は、一般に、二重らせんＤＮＡへのＴＦＯの有効な結合を可能にするのに不利である。例えば、高いカリウムはグアニン（Ｇ）四分子（ｑｕａｒｔｅｔ）形成を促進し、これは、Ｇに富むプリンモチーフＴＦＯの活性を抑制する。また、生理的条件下で低濃度で存在するマグネシウムは、電荷の中和により第３鎖の結合を補助する。最後に、中性ｐＨは、ピリミジンモチーフ第３鎖結合に必要なシトシンプロトン化に不利に働く。隣接シトシンを有する標的配列は特に問題である。三重らせんの安定性は、連続的なシトシンにより、著しく損なわれる。これは、Ｎ３プロトン化から生じる正電荷間の反発によるもの、または恐らくは隣接シトシンによるプロトンに関する競合によるものであると考えられている。
【００４５】
ＴＦＯを含むヌクレオチドの化学修飾は、生理的条件下でのＴＦＯの結合アフィニティーおよび／または三重らせんの安定性を増加させるのに有用でありうる。修飾ヌクレオチドは、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチドの１以上を含みうる。本明細書中で用いる「修飾ヌクレオチド」または「化学修飾ヌクレオチド」は、複素環塩基、糖部分またはホスファート部分構成成分の１以上の化学修飾を有するヌクレオチドを意味する。好ましくは、ＴＦＯにおける修飾オリゴヌクレオチドは、標的配列の塩基とフーグスティーン型および／または逆フーグスティーン型塩基対を形成しうる。より好ましくは、修飾オリゴヌクレオチドは標的二重らせんＤＮＡに対するＴＦＯの結合アフィニティーまたは形成された三重らせんの安定性を増加させる。
【００４６】
複素環塩基または複素環塩基類似体の化学修飾は、ヌクレオチドの結合アフィニティーまたは三重らせんにおけるその安定性を増加させるのに有効でありうる。化学修飾複素環塩基には、イノシン、５−（１−プロピニル）ウラシル（ｐＵ）、５−（１−プロピニル）シトシン（ｐＣ）、５−メチルシトシン、８−オキソ−アデニン、プソイドシトシン、プソイドイソシトシン、５および２−アミノ−５−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピリジン（２−アミノピリジン）ならびに種々のピロロ−およびピラゾロピリミジン誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＴＦＯにおいてシトシンの代わりに５−メチルシトシンまたはプソイドイソシトシンを使用することは、単離シトシンを含有するＴＦＯにおいては特に、中性ｐＨにおける三重らせん形成を安定化するのを助ける。これは、正電荷がＴＦＯと標的二重らせんとの間の負電荷反発を部分的に減少させるからである。シチジンの代わりに２’−Ｏ−メチルプソイドシチジンを使用することは、標的配列が隣接シチジンを含有する場合に、ＴＦＯおよび標的二重らせんにより形成された三重らせんを安定化するのに特に有用である。
【００４７】
また、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドは、修飾糖部分または糖部分類似体を伴うヌクレオチドを含有しうる。糖部分の修飾には、２’−Ｏ−アミノエトキシ、２’−Ｏ−アモニオエチル（２’−ＯＡＥ）、２’−Ｏ−メトキシ、２’−Ｏ−メチル、２−グアニドエチル（２’−ＯＧＥ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−（メトキシエチル）（２’−ＯＭＥ）および２’−Ｏ−（Ｎ−（メチル）アセトアミド）（２’−ＯＭＡ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。２’−Ｏ−アミノエチル糖部分の置換は特に好ましい。なぜなら、それらは中性ｐＨにおいてプロトン化されて、ＴＦＯと標的二重らせんとの間の電荷反発を抑制するからである。この修飾は該リボースまたはデオキシリボースのＣ３’−エンドコンホメーションを安定化し、また、該二重らせんのプリン鎖におけるｉ−ｌ  ホスファートとの架橋を形成する。
【００４８】
三重らせん形成性オリゴヌクレオチドのホスファートバックボーンの修飾もＴＦＯの結合アフィニティーを増加させ、またはＴＦＯと標的二重らせんとの間で形成された三重らせんを安定化しうる。ジエチル−エチレンジアミド（ＤＥＥＤ）またはジメチル−アミノプロピルアミン（ＤＭＡＰ）を含む（これらに限定されるものではない）カチオン性修飾は、ＴＦＯと二重らせん標的ホスファートとの間の静電的反発の減少のため、特に有用でありうる。
【００４９】
該ホスファートバックボーンの修飾は、ホスホジエステル結合における非架橋酸素の１つの、硫黄原子での置換をも含みうる。この置換は、ホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオアートヌクレオシド間結合を生成する。ホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドは、インビボで、より安定であることが示されている。
【００５０】
オリゴヌクレオチドは、３’プロピルアミン基を使用して分解を防ぐために末端キャップ化されるよう、更に修飾されうる。オリゴヌクレオチドの３’または５’キャップ化のための方法は当技術分野でよく知られている。
【００５１】
Ｃ．ペプチド核酸
もう１つの実施形態においては、該三重らせん形成性分子はペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ペプチド核酸は、オリゴヌクレオチドのホスファートバックボーンの全体が反復性Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位により置換されており、ホスホジエステル結合がペプチド結合により置換されている分子である。種々の複素環塩基がメチレンカルボニル結合により該バックボーンに連結される。ＰＮＡは、オリゴヌクレオチドに類似した複素環塩基の配置を維持しているが、アキラルな中性荷電分子である。ペプチド核酸はペプチド核酸単量体から構成される。複素環塩基は、標準的な塩基（ウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニン）のいずれか、または三重らせん形成性オリゴヌクレオチドにおける使用に関して前記で説明した修飾複素環塩基のいずれかでありうる。
【００５２】
ＰＮＡはワトソン・クリック型水素結合を介してＤＮＡに結合しうるが、対応オリゴヌクレオチドの場合より有意に高い結合アフィニティーでＤＮＡに結合しうる。ＰＮＡの中性バックボーンはＰＮＡと標的ＤＮＡホスファートとの間の静電的反発を減少させる。二重らせんＤＮＡの開裂を促進するインビトロまたはインビボ条件下、ＰＮＡは、Ｄループを形成するよう一方のＤＮＡの置換を引き起こす二重らせんＤＮＡの鎖侵入を媒介しうる。
【００５３】
ホモプリンＤＮＡ鎖および２つのＰＮＡ鎖から、高安定性三重らせんＰＮＡ：ＤＮＡ：ＰＮＡ構造が形成されうる。それらの２つのＰＮＡ鎖は一緒になって、二重らせん標的の他方の鎖を置換する一方で標的二重らせんの鎖の１つと三重らせん「クランプ」を形成するビス−ＰＮＡ分子を形成するのに十分な柔軟性のリンカーに結合しうる。この構造においては、一方の鎖は逆平行配向でＤＮＡ鎖とワトソン・クリック型塩基対を形成し、もう一方の鎖は該ＤＮＡ−ＰＮＡ二重らせんにおけるホモプリン鎖に対してフーグスティーン型塩基対を形成する。三重らせん形成性オリゴヌクレオチドの場合と同様に、安定なＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡ三重らせんの形成を可能にするためにはホモプリン鎖が必要であるが、ＰＮＡクランプは、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドに要求されるものより短いホモプリン配列において形成可能であり、また、より大きな安定性でこれを行いうる。
【００５４】
ビス−ＰＮＡ分子のリンカーにおける使用に適当な分子には、Ｏ−リンカーと称される８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸、および６−アミノヘキサン酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。ポリ（エチレン）グリコール単量体もビス−ＰＮＡリンカーにおいて使用されうる。ビス−ＰＮＡリンカーは任意の組合せで複数のリンカー分子単量体を含有しうる。
【００５５】
また、ＰＮＡは、該ＰＮＡの溶解度を増加させるため及び二重らせんＤＮＡに対する該ＰＮＡのアフィニティーを増加させるための他の正荷電部分を含みうる。一般に使用される正荷電部分は、アミノ酸であるリシンおよびアルギニンを含むが、他の正荷電部分も有用でありうる。リシンおよびアルギニン残基はビス−ＰＮＡリンカーに付加されることが可能であり、あるいはＰＮＡ鎖のカルボキシ末端に付加されることが可能である。
【００５６】
１つの実施形態においては、ＰＮＡによる結合のための標的領域は、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ２ｂ、ＣＣＲ３およびＣＣＲ１を含むケモカイン受容体をコードする遺伝子内の又は該遺伝子に隣接したポリプリン部位である。好ましい実施形態においては、標的領域はヒトＣＣＲ５遺伝子のコード領域内のポリプリンまたはホモプリン部位である。三重らせん形成性分子に対する標的部位として特に有用であるＣＣＲ５遺伝子のコード領域内の３つのホモプリン部位はＡＴＧ開始コドンに対して５０９−５１８位、６７９−６９０位および９００−９０８位である。
【００５７】
６７９−６９０位のホモプリン部位は、Δ３２突然変異により生成されるナンセンス突然変異の部位を部分的に含む。この標的部位に結合するＰＮＡは特に有用である。この標的配列に結合する１つのＰＮＡはＰ−６７９と称され、以下の配列により表される：ＪＴＪＴＴＪＴＴＪＴ−ｅ−ｅ−ｅ−ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ここで、Ｊ＝プソイドイソシトシンおよびｅ＝柔軟性リンカー）（配列番号７）。該柔軟性リンカー分子は８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸、６−アミノヘキサン酸またはポリ（エチレン）グリコール単量体でありうる。この二量体ビス−ＰＮＡは２つの結合ＰＮＡセグメントを含有し、６７４部位のプリンに富むＤＮＡ鎖上（特に６７９位）でＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡ三重らせんクランプを形成するよう設計される。細胞内の染色体標的においてビス−ＰＮＡがそのようなクランプ構造を形成しうることは既に実証されている。ＰＮＡ−６７９の、ＣＣＲ５遺伝子内のその結合部位に対するアフィニティーをインビトロで試験するためにゲル移動度シフトアッセイを用いる後記実施例は、この分子によるＣＣＲ５遺伝子内のその標的部位への強力な結合を示した。対立遺伝子特異的ＰＣＲを用いる後記実施例も、ＰＮＡ−６７９（ナンセンス突然変異を含有するＤＮＡ供与体と組合せたもの）がヒト単球性急性白血病細胞系ＴＨＰ−１における内在性ＣＣＲ５遺伝子の突然変異を誘導しうることを示している。
【００５８】
ヒトＣＣＲ５遺伝子に結合しうる追加的な典型的なＰＮＡには、以下の配列：Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＪＴＪＴＴＪＴＴＪＴ−ｅ−ｅ−ｅ−ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（６７９−６８８）（ここで、Ｊ＝プソイドイソシトシンおよびｅ＝柔軟性リンカー）（配列番号８）により表されるビス−ＰＮＡ、および以下の配列：ＣＴＴＧＴＣＡＴＧＧ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（５２２−５３１）により表されるＰＮＡ（配列番号９）が含まれるが、これらに限定されるものではない。括弧内の数字は、ＰＮＡが結合する、開始ＡＴＧに対する部位を示す。
【００５９】
Ｄ．供与オリゴヌクレオチド
該三重らせん形成性オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸は、供与オリゴヌクレオチドと組合せて、または混合配列リンカーを介して供与オリゴヌクレオチドに係留して投与されることが可能であり、あるいは標的配列に相同である非係留供与オリゴヌクレオチドと共に使用されることが可能である。供与オリゴヌクレオチドは本明細書においては供与断片、供与核酸、供与ＤＮＡまたは供与ＤＮＡ断片とも称される。この方法は、三重らせん自体がＤＮＡ修復を誘発して相同供与ＤＮＡとの組換えの確率を潜在的に増加させうることを利用するものである。供与断片内の相同位置が多くなるほど、該供与断片が標的配列、標的領域または標的部位内に組換えられる確率が増加する、と当技術分野において理解されている。三重らせん形成性分子への供与オリゴヌクレオチドの係留は三重らせんの形成により標的部位の認識を促し、同時に、該係留供与断片を、可能な組換え及び情報転移のために配置する。また、三重らせん形成性分子は非係留供与オリゴヌクレオチドの相同組換えを有効に誘導する。本明細書中で用いる「組換え誘発性」なる語は、ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸または組成物を、標的部位または配列内に組換え可能であり別のＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチドまたは組成物の組換えを誘導しうるものと定めるために用いられる。
【００６０】
非係留または非連結断片は２０ヌクレオチド長〜数千ヌクレオチド長の範囲でありうる。供与オリゴヌクレオチド分子は、連結されているか連結されていないかには無関係に、一本鎖または二本鎖形態で存在しうると理解されるべきである。組換えられるべき供与断片は三重らせん形成性オリゴヌクレオチドに連結されても連結されなくてよいと理解されるべきである。該連結供与断片は４ヌクレオチド長〜１００ヌクレオチド長、好ましくは４〜５０ヌクレオチド長の範囲でありうる。しかし、非連結供与断片は２０ヌクレオチド〜数千ヌクレオチドの遥かに広い範囲を有する。三重らせん形成性組換え誘発性オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド長であることが好ましい。該オリゴヌクレオチドは少なくとも２０ヌクレオチド長であることが、より好ましい。
【００６１】
供与オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡ配列と比べて、少なくとも１つの突然変異した、または挿入された、または欠失したヌクレオチドを含有する。標的配列は、好ましくは、細胞内へのＨＩＶ侵入におけるＨＩＶ受容体遺伝子の機能に重要な、該ＨＩＶ受容体遺伝子の部分（例えば、該受容体の効率的発現、該細胞表面への該受容体の輸送、該受容体の安定性、該受容体によるウイルス結合または該受容体のエンドサイトーシスに関与する配列）内に存在するか、または該部分に隣接している。標的配列は該遺伝子のコードＤＮＡ配列内またはイントロン内に存在しうる。標的配列は、プロモーターまたはエンハンサー配列を含む、該標的遺伝子の発現を調節するＤＮＡ配列内にも存在しうる。
【００６２】
供与オリゴヌクレオチドは、標的配列と比べて、種々の突然変異を含有しうる。代表的なタイプの突然変異には、点突然変異、欠失および挿入が含まれるが、これらに限定されるものではない。点突然変異はミスセンスまたはナンセンス突然変異を引き起こしうる。欠失および挿入はフレームシフト突然変異または欠失を引き起こしうる。そのような突然変異は、ＨＩＶに結合して細胞内へのその輸送を可能にする細胞表面ＨＩＶ受容体の能力における１以上の欠損を引き起こしうる。標的配列内の又は標的配列に隣接した突然変異の最終的な効果は、ウイルス粒子に結合し細胞内への該ウイルス粒子の侵入を可能にする細胞表面ＨＩＶ受容体の能力を抑制または軽減することである。
【００６３】
Ｅ．三重らせん形成の決定方法
三本鎖構造が形成する好ましい条件はインビトロ突然変異誘発のための標準的なアッセイ条件およびインビボ突然変異誘発のための生理的条件である（例えば、ＭｏｓｅｒおよびＤｅｒｖａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：６４５（１９８７）；Ｐｒａｓｅｕｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：１３４９（１９８８）；Ｍｅｒｇｎｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：９７９１（１９９１）；ＢｅａｌおよびＤｅｒｖａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３６０（１９９１）；Ｍｅｒｇｎｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：９７９１（１９９１）ならびにＢｅａｌおよびＤｅｒｖａｎ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：２７７３（１９９２）を参照されたい）。
【００６４】
三重らせん形成の有用な尺度は、三重らせん形成が半最大である三重らせん形成性分子の濃度として推定されうる、三重らせんの平衡解離定数Ｋｄである。好ましくは、該三重らせん形成性分子は、生理的相互作用の範囲内の、標的配列に対する結合アフィニティーを有する。好ましい結合アフィニティーは、約１０−７Ｍ未満またはそれに等しいＫｄである。最も好ましくは、有意な分子内相互作用を達成するために、Ｋｄは２×１０−８Ｍ未満またはそれに等しい。
【００６５】
オリゴヌクレオチド／標的ペアのＫｄを決定するためには、種々の方法が利用可能である。後記の実施例においては、ゲル移動度シフトアッセイ（Ｒ．Ｈ．Ｄｕｒｌａｎｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０，９２４６（１９９１））を用いてＫｄを推定した。この方法を用いる後記実施例においては、ヒトＣＣＲ５遺伝子の（ＡＴＧ開始コドンに対して）６７４位に位置する配列に対応するビス−ペプチド核酸（ＰＮＡ）をアニーリングさせて、標的部位のプリンに富む鎖上でＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡ三重らせんクランプを形成させた。アリーリングしたオリゴヌクレオチドを、既知制限酵素部位に隣接したＰＮＡ結合部位を含有する２μｇのプラスミドおよび漸増濃度のビス−ＰＮＡと共に、３７℃で一晩（約１８〜２４時間）インキュベートした。ついで該反応を制限酵素に付し、ついで、ＢｉｏＲａｄ  Ｍｉｎｉ  ＰＲＯＴＥＡＮ  ３装置を６５Ｖで〜４時間使用して、８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ、８９ｍＭ  ホウ酸（ｐＨ７．２）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．２の条件のため）を含有する１０％  非変性ポリアクリルアミド（１９：１  アクリルアミド：ビスアクリルアミド）ゲル中のゲル電気泳動に付した。ついで可視化のために該ゲルを銀染色で染色した。半分が標的配列に結合し半分が未結合であったビス−ＰＮＡの濃度として、解離定数（Ｋｄ）が決定されうる。
【００６６】
Ｆ．細胞標的化部分およびタンパク質トランスダクションドメイン
三重らせん形成性分子の製剤は該三重らせん形成性分子または該三重らせん形成性分子の修飾体の融合体を含み、ここで、該三重らせん形成性分子は別の部分に融合している。そのような類似体は、改善された特性、例えば、細胞膜透過性、活性および／または安定性の増強を示しうる。該オリゴヌクレオチドに連結している又は連結していないことが可能である部分の具体例には、例えば、特定の細胞へのオリゴヌクレオチドの運搬をもたらす標的化部分、例えば、造血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、Ｔ細胞または任意の他の好ましい細胞型に対する抗体、ならびに好ましい細胞型上で発現される受容体およびリガンドが含まれる。好ましくは、該部分は造血幹細胞を標的化する。該オリゴヌクレオチドが具備しうる他の部分には、タンパク質トランスダクションドメイン（ＰＴＤ）が含まれ、これらは、細胞膜を横切る輸送を媒介する多数の細胞性およびウイルス性タンパク質に存在する短い塩基性ペプチド配列である。当技術分野でよく知られているタンパク質トランスダクションドメインの具体例には、アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）ＰＴＤおよびＴＡＴ（転写のトランスアクチベーター）ＰＴＤが含まれる。
【００６７】
Ｇ．追加的な突然変異誘発因子
本明細書に開示されている三重らせん形成性分子は、単独で、または他の突然変異誘発因子と組合せて使用されうる。この場合に用いる２つの因子が、組合せて使用される、と表現されるのは、それらの２つの因子が共投与される場合、または両方の因子が細胞または血清中に同時に存在するような様式でそれらの２つの因子が投与される場合である。好ましい実施形態においては、追加的な突然変異誘発因子は三重らせん形成性分子にコンジュゲート化または連結される。三重らせん形成性分子と組合せて使用されうる追加的な突然変異誘発因子には、突然変異誘発を導きうる因子、核酸架橋剤である因子、放射活性物質である因子、アルキル化基である因子、ＤＮＡ損傷細胞酵素を呼び寄せうる分子である因子が含まれる。他の適当な因子には、化学的突然変異誘発因子、例えばアルキル化、ビアルキル化またはインターカレーション因子が含まれるが、これらに限定されるものではない。共投与のための好ましい因子は、Ｙａｌｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙによりＰＣＴ／ＵＳ／９４／０７２３４に記載されているプソラレン連結オリゴヌクレオチドである。
【００６８】
Ｈ．追加的な予防用または治療用物質
本明細書に開示されている三重らせん形成性分子は、単独で、または他の予防用もしくは治療用物質と組合せて使用されうる。この場合に用いる２つの物質が、組合せて使用される、と表現されるのは、それらの２つの物質が共投与される場合、または両方の物質が細胞または血清中に同時に存在するような様態でそれらの２つの物質が投与される場合である。適当な追加的な予防用または治療用物質には、ＨＩＶ感染を治療または予防するのに有用な物質が含まれる。適当な治療用物質には、「ＨＡＡＲＴ」（これは、ＨＩＶ−１感染の治療のための高活性抗レトロウイルス療法の頭字語である）のために典型的に使用される物質が含まれる。ＨＡＡＲＴ療法は、典型的には、二重ヌクレオシド（ＮＲＴＩ）バックボーンに加え、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（ＮＮＲＴＩ）またはリトナビル薬理学的増強プロテアーゼインヒビター（ＰＩ／ｒ）のいずれかとを含む。しかし、クラスおよび活性物質の両方の点での実際の治療用組成物は、とりわけ、各物質の利用可能性、および各成分に関する患者の個々の耐性に応じて様々である。したがって、「ＨＡＡＲＴ」なる語の使用は、当技術分野においてこの語に該当するものとされている活性治療用物質の全ての組合せを広く包含する意である。典型的なＨＡＡＲＴ治療用物質には、ヌクレオシドおよびヌクレオチド逆転写酵素インヒビター（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（ｎＮＲＴＩ）、プロテアーゼインヒビター、インテグラーゼインヒビター、侵入インヒビターおよび成熟インヒビターが含まれる。
【００６９】
適当な侵入インヒビターには、ＣＣＲ５を含むＨＩＶ細胞表面受容体のアンタゴニストとして機能する他の治療用物質が含まれる。ＣＣＲ５アンタゴニストには、ＴＡＫ−７７９、ＴＡＫ−２２０、ＴＡＫ−６５２、アプラビロック（ａｐｌａｖｉｒｏｃ）、マラビロック（ｍａｒａｖｉｒｏｃ）およびビクロビロック（ｖｉｃｒｏｖｉｒｏｃ）を含む（これらに限定されるものではない）、ＣＣＲ５タンパク質の幾つかの膜貫通ヘリックス間で形成される腔において結合する小分子非競合性アロステリックアンタゴニストが含まれる。
【００７０】
ＩＩ．使用方法
Ａ．ＨＩＶに対する細胞表面受容体の不活性化
三重らせん形成性分子は、ＨＩＶに対する細胞表面受容体をコードするヒト遺伝子内の又は該遺伝子に隣接した標的配列に結合／ハイブリダイズして、三重らせん構造を形成する。標的領域への該三重らせん形成性分子の結合は、細胞性ＤＮＡ合成、組換え及び修復メカニズムを用いて、標的領域内の又は標的領域に隣接した突然変異を刺激する。標的化組換えにおいては、三重らせん形成性分子は、標的領域または標的領域に隣接する領域に実質的に相補的な配列を最小限度に含有する別の供与オリゴヌクレオチド断片（本明細書においては供与断片と称される）と組合せて細胞に投与される。該供与断片は、標的領域内に挿入すべき核酸配列を更に含有しうる。組換えられるべき断片との三重らせん形成性オリゴヌクレオチドの共投与は、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドを使用しない方法と比較して、標的領域内の該供与断片の挿入の頻度を増加させる。
【００７１】
供与オリゴヌクレオチドと組合された三重らせん形成性分子は、標的配列内の又は標的配列に隣接した核酸配列の部位特異的突然変異または改変を誘発する。標的配列は、好ましくは、細胞内へのＨＩＶ侵入におけるＨＩＶ受容体遺伝子の機能に重要な、該ＨＩＶ受容体遺伝子の部分（例えば、該受容体の効率的発現、該細胞表面への該受容体の輸送、該受容体の安定性、該受容体によるウイルス結合または該受容体のエンドサイトーシスに関与する配列）内に存在するか、または該部分に隣接している。標的配列は該遺伝子のコードＤＮＡ配列内またはイントロン内に存在しうる。標的配列は、プロモーターまたはエンハンサー配列を含む、該標的遺伝子の発現を調節するＤＮＡ配列内にも存在しうる。
【００７２】
供与オリゴヌクレオチドと組合された三重らせん形成性分子は、標的配列内で又は標的配列に隣接して、ある範囲の突然変異のいずれかを誘発しうる。代表的なタイプの突然変異には、点突然変異、欠失および挿入が含まれるが、これらに限定されるものではない。点突然変異はミスセンスまたはナンセンス突然変異を引き起こしうる。欠失および挿入はフレームシフト突然変異または欠失を引き起こしうる。そのような突然変異は、ＨＩＶに結合して細胞内へのその輸送を可能にする細胞表面ＨＩＶ受容体の能力における１以上の欠損を引き起こしうる。例えば、突然変異は標的遺伝子の発現（転写および／または翻訳）の低下を引き起こしうる。また、突然変異は細胞表面への該受容体の輸送における欠損または該タンパク質の安定性の低下を引き起こして、細胞表面におけるその提示を軽減または抑制しうる。また、突然変異は、該受容体がエンドサイトーシスによりインターナリゼーションされ又は適切なエンドサイトーシス経路を介して輸送される能力を低下させうる。また、突然変異は該細胞表面受容体によるＨＩＶウイルス粒子の結合を軽減または抑制しうる。
【００７３】
標的配列内の又は標的配列に隣接した突然変異の最終的な効果は、ウイルス粒子に結合し細胞内への該ウイルス粒子の侵入を可能にする細胞表面ＨＩＶ受容体の能力を抑制または軽減することである。三重らせん形成性分子により標的化される個々のＨＩＶ細胞表面受容体遺伝子は、どのＨＩＶ株が結合および細胞内侵入の軽減または抑制を示すのかを決定する。ＨＩＶ−１分離体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染するそれらの能力における顕著な相違を示す。すべての株が一次ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染し、一方、ほとんどの一次分離体がマクロファージにも感染するが（Ｍ指向性）、形質転換されたＣＤ４＋Ｔ細胞系には感染しない。他の分離体はＣＤ４＋Ｔ細胞系において良好に複製されるが（Ｔ指向性）、マクロファージには感染しない。ＭおよびＴ指向性ウイルスに対する寛容性の根拠は、ＨＩＶ株により用いられる共受容体により決定される。ＣＣＲ５は、あるＭ指向性（Ｒ５指向性）ＨＩＶ−１株による感染に対する感受性を付与し、ＣＸＣＲ４は、Ｔ指向性（Ｘ４指向性）ＨＩＶ−１株に対する補因子として働く。したがって、ＣＣＲ５遺伝子内の突然変異は、Ｒ５指向性ウイルス耐性細胞である細胞を生成することが可能であり、ＣＸＣＲ４遺伝子内の突然変異は、Ｘ４指向性ウイルス耐性細胞である細胞を生成することが可能である。いくつかの実施形態においては、２以上の細胞表面ＨＩＶ受容体において突然変異を誘発するために、三重らせん形成性分子の２以上の種を使用する。これは、２以上の指向性を有するＨＩＶ株に耐性である細胞を与えうる。
【００７４】
１つの実施形態においては、ヒトＣＣＲ５遺伝子内に突然変異を引き起こすために、本明細書に開示されている組成物および方法を用いる。好ましい実施形態においては、該突然変異は、ＣＣＲ５受容体の３２塩基対の欠失（当技術分野においては一般に、ＣＣＲ５  Δ３２突然変異と称される）を引き起こす、ヒトＣＣＲ５遺伝子における天然に存在する多型を模擬する。この突然変異はＣＣＲ５タンパク質の最後の３つの膜貫通ドメインの欠失およびフレームシフトを引き起こす。
【００７５】
Ｂ．ＨＩＶ受容体突然変異細胞系の作製
本明細書に開示されている三重らせん形成性分子は、細胞表面ＨＩＶ受容体をコードする遺伝子における多様な範囲の突然変異を含有する細胞系の作製に有用である。細胞系は、細胞表面受容体をコードする１以上の遺伝子内の若しくは該遺伝子に隣接した突然変異を含有することが可能であり、および／またはＨＩＶに対する細胞表面受容体をコードする単一の遺伝子内の若しくは該遺伝子に隣接した１以上の突然変異を含有することが可能である。そのような細胞系は、細胞内へのＨＩＶの侵入を抑制または軽減する他の物質を含む他のＨＩＶ治療剤のスクリーニングおよび開発に有用である。ＨＩＶに対する少なくとも１つの細胞表面受容体を発現し三重らせん形成性分子でトランスフェクトまたはトランスデュースされうる任意の細胞、例えば初代分離細胞および不死化細胞系が使用されうる。該細胞は、好ましくは、造血細胞由来であり、造血幹細胞でありうる。他の適当な造血細胞には、Ｔ細胞が含まれる。Ｔ細胞には、ＣＤ４およびＣＤ８をも発現するＴ細胞サブセットを含む、ＣＤ３を発現する全ての細胞が含まれる。Ｔ細胞には、ナイーブ細胞および記憶細胞の両方、ならびにエフェクター細胞、例えばＣＴＬが含まれる。Ｔ細胞には、調節細胞、例えばＴｈ１、Ｔｃ１、Ｔｈ２、Ｔｃ２、Ｔｈ３、ＴｒｅｇおよびＴｒ１細胞も含まれる。細胞表面ＨＩＶ受容体をコードする遺伝子における突然変異を含有する細胞系の作製に使用するＴ細胞は、好ましくは、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【００７６】
Ｃ．ＨＩＶ感染を有する又はその発生のリスクを有する対象の治療
一般に、本明細書に記載されている組成物および方法は、ＨＩＶ感染を有する又はその素因を有する対象を治療するのに有用である。該組成物は、対象におけるＨＩＶに対する耐性（抵抗性）を付与する予防用組成物として有用である。該組成物は、ＨＩＶ感染に対する対象の耐性を始動または増強するために使用されうる治療用組成物としても有用である。該組成物および方法は、ＨＩＶに対する少なくとも１つの細胞表面受容体の発現、局在化、安定性、結合活性および／またはエンドサイトーシスを改変することにより、ＨＩＶによる感染に耐性であるＣＤ４＋免疫細胞を与える。本明細書に開示されている組成物および方法での治療の結果は、ＨＩＶによる個体の感染を予防すること、または既にＨＩＶに感染している対象におけるウイルス負荷を減少させることである。治療のもう１つの結果は、ＨＩＶに感染した対象におけるＣＤ４数の増加でありうる。ＨＩＶウイルス負荷およびＣＤ４数を評価するための方法は当技術分野でよく知られている。
【００７７】
好ましくは、本明細書に記載されている組成物および方法は、ＨＩＶ感染から生じるいずれかの疾患または状態、例えばエイズおよびＡＲＣを治療または予防するために用いられうる。本明細書に開示されている方法は、ＨＩＶ感染ならびにＨＩＶ感染から生じる疾患および状態を有効に治療または予防するために、既存の抗ウイルス療法と共に実施されうると認識されるべきである。
【００７８】
ｉ．ＨＩＶ感染を治療または予防するためのエクスビボ遺伝子治療
１つの実施形態においては、対象におけるＨＩＶ感染の治療または予防のために、細胞のエクスビボ遺伝子治療を用いる。ＨＩＶ感染のエクスビボ予防または治療のために、細胞を対象から単離し、本明細書に開示されている組成物とエクスビボで接触させて、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ２ｂ、ＣＣＲ３およびＣＣＲ１を含むＨＩＶ細胞表面受容体をコードする遺伝子内の又は遺伝子に隣接した突然変異を含有する細胞を得る。好ましい実施形態においては、治療すべき対象または同系宿主から該細胞を単離する。三重らせん形成性分子および供与オリゴヌクレオチドと接触させる前に、対象から標的細胞を取り出す。該細胞は造血前駆または幹細胞でありうる。好ましい実施形態においては、標的細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞である。ＣＤ３４＋造血幹細胞はＨＩＶ感染に耐性であることが示されている。ＨＩＶ感染に対するＣＤ３４＋細胞の耐性は、それを、本明細書に開示されている組成物および方法を用いるＨＩＶの遺伝子治療のための特に魅力的な細胞型とする。なぜなら、それは、ＨＩＶの混入の恐れを伴うことなく、ＨＩＶ感染個体から採取され、突然変異されうるからである。
【００７９】
そのような幹細胞は当業者により単離され富化されうる。ＣＤ３４＋および他の細胞のそのような単離および富化のための方法は当技術分野で公知であり、例えば米国特許第４，９６５，２０４号、第４，７１４，６８０号、第５，０６１，６２０号、第５，６４３，７４１号、第５，６７７，１３６号、第５，７１６，８２７号、第５，７５０，３９７号および第５，７５９，７９３号に開示されている。造血前駆および幹細胞において富化された組成物の文脈において本明細書中で用いる「富化」は、該細胞の天然源において見出されるものより高い、望ましい要素（例えば、造血前駆および幹細胞）の比率を示す。細胞の組成は、該細胞の天然源と比較して、少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、より好ましくは１０、１００、２００または１０００桁、富化されうる。
【００８０】
ヒトにおいては、ＣＤ３４＋細胞は臍帯血、骨髄から取り出されることが可能であり、あるいは骨髄腔から末梢循環内への造血幹細胞の移動を引き起こすのに十分な量の例えば顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）のような造血増殖因子をドナーに皮下または静脈内注射することにより引き起こされるサイトカイン動員の後の血液から取り出されることが可能である。まず、任意の適当な骨髄源、例えば、けい骨、大腿骨、脊椎および骨腔から、骨髄細胞が得られうる。骨髄の単離のために、骨をフラッシュ（ｆｌｕｓｈ）するために適当な溶液が使用可能であり、該溶液は、低濃度（一般には約５〜２５ｍＭ）の許容されるバッファーと組合されたウシ胎児血清または天然に存在する因子で簡便に補足された平衡化塩溶液である。簡便なバッファーには、ヘペス、リン酸バッファー、乳酸バッファーなどが含まれる。
【００８１】
細胞は正および負の選択技術により選択されうる。細胞は、当業者に公知の方法を用いて、造血前駆または幹細胞表面抗原、例えばＣＤ３４に結合する商業的に入手可能な抗体を使用して選択されうる。例えば、該抗体は磁気ビーズにコンジュゲート化されることが可能であり、所望の細胞型を回収するために免疫的操作が利用されうる。他の技術は蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）の利用を含む。ＣＤ３４抗原は、非白血病個体の造血系内の前駆細胞上で見出され、モノクローナル抗体Ｍｙ−１０により認識される（すなわち、ＣＤ３４抗原を発現する）細胞の集団上で発現され、骨髄移植のための幹細胞を単離するために使用されうる。Ｍｙ−１０はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）にＨＢ−８４８３として寄託されており、抗ＨＰＣＡ  １として商業的に入手可能である。さらに、実質的に全ての所望の細胞マーカーに対して選択するために、ヒト骨髄からの分化した及び「専用の（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）」細胞の負の選択が利用されうる。例えば、前駆または幹細胞、最も好ましくはＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３−、ＣＤ７−、ＣＤ８−、ＣＤ１０−、ＣＤ１４−、ＣＤ１５−、ＣＤ１９−、ＣＤ２０−、ＣＤ３３−、クラスＩＩ  ＨＬＡ＋およびＴｈｙ−１＋のいずれかであるものとして特徴づけられうる。
【００８２】
前駆または幹細胞を単離したら、それらを、任意の適当な培地内で成育させることにより、増殖させることが可能である。例えば、ストロマ細胞（例えば、因子の分泌を伴って、骨髄または肝臓から得られうるもの）からの馴らし培地内で、または幹細胞の増殖を支持する細胞表面因子を含む培地内で、前駆または幹細胞を増殖させることが可能である。望ましくない細胞の除去のための適当なモノクローナル抗体を使用して、ストロマ細胞から造血細胞を取り出すことが可能である。
【００８３】
単離された細胞を、ＨＩＶに対する細胞表面受容体をコードする遺伝子内の又は該遺伝子に隣接した所望の突然変異を引き起こすのに有効な量の供与オリゴヌクレオチドと三重らせん形成性分子との組合せと、エクスビボで接触させる。これらの細胞は、本明細書においては、修飾細胞と称される。オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸での細胞のトランスフェクションのための方法は当技術分野でよく知られている（Ｋｏｐｐｅｌｈｕｓら，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５５（２）：２６７−２８０（２００３））。
【００８４】
該修飾細胞を、対象への投与の前に、培養内で維持し又は増殖させることが可能である。培養条件は、細胞型に応じて、当技術分野で概ね公知である。特にＣＤ３４＋の維持のための条件は十分に研究されており、いくつかの適当な方法が利用可能である。エクスビボ多能性造血細胞の増殖のための一般的なアプローチは、インターロイキン−３のような早期作用性サイトカインの存在下、精製された前駆または幹細胞を培養することである。また、造血前駆細胞をエクスビボで維持するための栄養培地内にトロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ；すなわち、ｆｌｔ３遺伝子産物のリガンド）の組合せを含有させることは、原始的（すなわち、比較的に未分化）なヒト造血前駆細胞をインビトロで増殖させるのに有用であったこと、ならびにそれらの細胞はＳＣＩＤ−ｈｕマウスにおいて移植可能であったことが示されている（Ｌｕｅｎｓら，１９９８，Ｂｌｏｏｄ  ９１：１２０６−１２１５）。他の公知方法においては、マウスプロラクチン様プロテインＥ（ｍＰＬＰ−Ｅ）またはマウスプロラクチン様プロテインＦ（ｍＰＩＰ−Ｆ；ひとまとめに、ｍＰＬＰ−Ｅ／ＩＦ）を含む栄養培地内で細胞をエクスビボで維持することが可能である（例えば、数分間、数時間、または３、６、９、１３日以上）（米国特許第６，２６１，８４１号）。他の適当な細胞培養および増殖方法も本発明において用いられうると理解されるであろう。米国特許第５，９４５，３３７号に記載されているとおり、無血清培地内でも細胞を増殖させることが可能である。
【００８５】
もう１つの実施形態においては、当技術分野でよく知られた方法を用いて、対象への投与の前に、インターロイキンと増殖因子との特定の組合せを用いて、該修飾造血幹細胞をＣＤ４＋細胞培養にエクスビボで分化させる。該細胞をエクスビボで多数の細胞に増殖させることが可能であり、好ましくは、単離された造血幹細胞の元の集団と比較して少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、より一層好ましくは少なくとも２０倍の細胞に増殖させることが可能である。
【００８６】
エクスビボ遺伝子治療のためのもう１つの実施形態の細胞においては、使用する細胞は、分化した体細胞でありうる。体細胞は、造血前駆細胞となるよう誘導されうる多能性幹様細胞となるよう再プログラムされうる。ついで、ＣＤ３４＋細胞に関して前記で説明したとおりに、該造血前駆細胞を三重らせん形成性分子および供与オリゴヌクレオチドで処理して、ＨＩＶ感染に関与する機能性受容体を発現しない組換え免疫細胞を得ることが可能である。再プログラムされうる代表的な体細胞には、繊維芽細胞、脂肪細胞および筋細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。誘導された幹様細胞からの造血前駆細胞はマウスにおいて成功裏に発生されている（Ｈａｎｎａ，Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９２０−１９２３（２００７））。
【００８７】
誘導された幹様細胞から造血前駆細胞を得るために、宿主から体細胞を集める。好ましい実施形態においては、該体細胞は自己繊維芽細胞である。該細胞を培養し、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃＭｙｃ転写因子をコードするベクターを該細胞に導入する。その導入された細胞を培養し、胚幹細胞（ＥＳ）の形態、ならびにＡＰ、ＳＳＥＡ１およびＮａｎｏｇを含む（これらに限定されるものではない）ＥＳ細胞マーカーをスクリーニングする。その導入されたＥＳ細胞を培養し、誘導された幹様細胞を産生するよう誘導する。ついで細胞をＣＤ４１およびｃ−ｋｉｔマーカー（初期造血前駆マーカー）ならびに骨髄および赤芽球分化に関するマーカーをスクリーニングする。
【００８８】
ついで該修飾造血幹細胞、修飾分化ＣＤ４＋細胞または修飾誘導造血前駆細胞を対象内に導入する。該細胞の運搬は種々の方法を用いて行われることが可能であり、最も好ましくは、注入による静脈内投与、ならびに骨膜、骨髄および／または皮下部位への直接的な蓄積注射を含む。
【００８９】
該修飾細胞の投与を受ける対象は、該細胞の移植を促進するために、骨髄のコンディショニングのために処理されうる。該受容者は、該細胞の投与の前に、放射線または化学療法的処理を用いて、移植を促進するために処理されうる。該細胞は、投与されると、一般に、移植するのに或る期間を要する。造血幹または前駆細胞の有意な移植の達成は、典型的には、数週間〜数ヶ月を要する。
【００９０】
有意な予防または治療効果を達成するためには、高率の修飾造血幹細胞または修飾分化ＣＤ４＋細胞の移植が必要であるとは予想されない。後記実施例は、本明細書に記載されている組成物および方法を用いて遺伝子内に導入された突然変異が長期間にわたって安定であることを示している。移植された細胞は移植後に経時的に増殖して修飾細胞の比率を増加させると予想される。ＨＩＶに対する少なくとも１つの細胞表面受容体の発現、局在化、安定性、結合活性および／またはエンドサイトーシスの改変のため、該修飾細胞は、未処理細胞と比較して、ＨＩＶによる感染に耐性である。したがって、ＨＩＶ感染を有する対象においては、該修飾細胞は、未修飾細胞と比較して競合的な利点を有すると予想される。予防または治療効果を得るためには少数または小さな比率の修飾造血幹細胞の移植が必要とされるに過ぎないと予想される。
【００９１】
好ましい実施形態においては、対象に投与すべき細胞は、自己細胞、例えば、対象に由来する細胞または同系細胞である。それでも、同種異系細胞移植も想定され、同種異系骨髄移植は常法で行われる。抗原的に一致し遺伝的に無関係なドナー（国内登録により特定される）からの骨髄を使用することにより、あるいは６個のヒト白血球抗原中の１〜３個が患者のものと異なる移植抗原を有する遺伝的に関連した同胞または親から得た又は誘導した造血前駆または幹細胞を使用することにより、適当な同胞ドナーを欠く患者に同種異系細胞移植が施されうる。
【００９２】
ｉｉ．ＨＩＶ感染を治療または予防するためのインビボ遺伝子治療
もう１つの実施形態においては、ＨＩＶ感染を有する又はその素因を有する対象に該三重らせん形成性分子を直接的に投与する。一般に、オリゴヌクレオチドおよび関連分子の投与方法は当技術分野でよく知られている。製剤を対象に投与するために、当業者に公知の任意の許容される方法が用いられうる。該投与は局所性（すなわち、特定の領域、生理的系、組織、器官または細胞型）または全身性でありうる。三重らせん形成性分子および供与オリゴヌクレオチドは、経口、吸入（鼻または肺）、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下または直腸手段を含む（これらに限定されるものではない）多数の経路により投与されうる。注射は、例えば静脈内、皮内、皮下、筋肉内または腹腔内でありうる。いくつかの実施形態においては、注射は複数の位置で行われうる。該組成物は直接的に骨髄に、または適当なリンパ組織、例えば脾臓、リンパ節もしくは粘膜関連リンパ組織に投与されうる。
【００９３】
製剤
該組成物は、好ましくは、適当な医薬担体と組合せて、治療用途に使用される。そのような組成物は該化合物の有効量と医薬上許容される担体または賦形剤とを含む。該製剤は、投与方法に適合するよう製造される。医薬上許容される担体は、１つには、投与する個々の組成物により、および該組成物を投与するために用いる個々の方法により決定される。したがって、核酸を含有する医薬組成物の種々の適当な製剤が存在する。
【００９４】
インビボで投与されたヌクレオチドは取り込まれ、細胞および組織に分布する、と当業者により理解されている（Ｈｕａｎｇら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５５８（ｌ−３）：６９−７３（２００４））。例えば、Ｎｙｃｅらは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）が、吸入されると、内在性界面活性剤（肺細胞により産生される脂質）に結合し、追加的な担体脂質の必要性を伴うことなく肺細胞により取り込まれることを示している（ＮｙｃｅおよびＭｅｔｚｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３８５：７２１−７２５（１９９７））。小さな核酸はＴ２４膀胱癌組織培養細胞内に容易に取り込まれる（Ｍａら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．８：４１５−４２６（１９９８））。
【００９５】
該化合物は、適当な医薬担体中の局所、局部または全身投与用の製剤中に含有されうる。Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９７５）は典型的な担体および製造方法を開示している。また、該化合物は、細胞に標的化するための、生分解性もしくは非生分解性高分子またはタンパク質から形成される適当な生体適合性マイクロカプセル、微粒子またはミクロスフェアまたはリポソーム内に封入されうる。そのような系は当業者によく知られており、適当な核酸との使用のために最適化されうる。
【００９６】
核酸運搬のための種々の方法が、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＡｕｓｕｂｅｌら，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。そのような核酸運搬系は、例えば（限定的なものではない）、「裸」核酸としての「裸」形態、または運搬に適したビヒクル中に製剤化された形態、例えば、陽イオン分子もしくはリポソーム形成性脂質との複合体中、またはベクターの成分もしくは医薬組成物の成分として、所望の核酸を含む。該核酸運搬系は、直接的に、例えばそれを細胞と接触させることにより、あるいは間接的に、例えばいずれかの生物学的過程の作用を介して、細胞に供与されうる。該核酸運搬系は、エンドサイトーシス、受容体標的化、天然または合成細胞膜断片との共役、物理的手段、例えばエレクトロポレーション、高分子担体、例えばコントロールリリースフィルムまたはナノ粒子または微粒子と核酸運搬系との組合せ、ベクターの使用、該細胞を囲む流体または組織内への核酸運搬系の注射、細胞膜を通過する核酸運搬系の単純核酸により、あるいは細胞膜を越えるいずれかの能動または受動輸送メカニズムにより、細胞に供与されうる。また、該核酸運搬系は、例えば、ウイルスベクターの抗体関連標的化および抗体媒介性固体化のような技術を用いて、細胞に供与されうる。
【００９７】
局所投与用の製剤には、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、シロップ剤、液剤および散剤が含まれうる。所望により、通常の医薬担体、水性、粉末または油性基剤あるいは増粘剤が使用されうる。
【００９８】
非経口投与、例えば関節内、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路に適した製剤には、水性および非水性の等張性無菌注射溶液（これは、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および該製剤を、意図される被投与者の血液と等張にする溶質を含有しうる）、ならびに水性および非水性無菌懸濁剤、水剤（溶液剤）または乳剤（これらは、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、分散剤、安定剤および保存剤を含みうる）が含まれる。注射用製剤は、添加保存剤を含有する単位投与形、例えば、アンプル内または多用量容器内の形態で提供されうる。該組成物は、無菌水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルションのような形態をとることが可能であり、ある実施形態においては、これらは対象の血液と等張でありうる。非水性溶媒の具体例としては、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、ゴマ油、ヤシ油、ラッカセイ油、ピーナッツ油、鉱油、注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチル、または硬化油、例えば合成モノもしくはジ−グリセリドが挙げられる。水性担体には、水、アルコール性／水性溶液、エマルションまたは懸濁液、例えば塩類液および緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、１，３−ブタンジオール、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液または硬化油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補給剤、および電解質補給剤（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）が含まれる。保存剤および他の添加剤、例えば抗微生物剤、キレート剤および不活性ガスも存在しうる。また、溶媒または懸濁化媒体として、通常、無菌硬化油が使用される。この目的には、合成モノ−またはジ−グリセリドを含む任意の弱刺激性硬化油が使用されうる。また、注射剤の製造においては、脂肪酸、例えばオレイン酸が使用されうる。担体の配合は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．において見出されうる。当業者は、過度な実験に頼ることなく、該組成物を製造し製剤化するための種々のパラメーターを容易に決定することが可能である。
【００９９】
該化合物の単独体、または他の適当な成分との組合せは、吸入により投与されるエアゾール製剤（すなわち、それは「噴霧化」されうる）にも製されうる。エアゾール製剤は、加圧された許容されるプロペラント、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素および空気中に配置されうる。吸入による投与の場合、該化合物は、適当なプロペラントを使用して加圧パックまたはネビュライザーからエアゾール噴霧剤の形態で運搬される。
【０１００】
いくつかの実施形態においては、前記の化合物は、例えば塩、担体、緩衝剤、乳化剤、希釈剤、賦形剤、キレート剤、充填剤、乾燥剤、抗酸化剤、抗微生物剤、保存剤、結合剤、増量剤、シリカ、可溶化剤または安定剤のような製剤化成分と共に、医薬上許容される担体をも含みうる。１つの実施形態においては、該化合物は、コレステロールおよびラウリン酸およびリトコール酸誘導体（細胞取り込みを改善するためにＣ３２官能性を有する）のような親油性基に連結される。例えば、コレステロールは、インビトロ（Ｌｏｒｅｎｚら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４（１９）：４９７５−４９７７（２００４））およびインビボ（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２（７０１４）：１７３−１７８（２００４））でのｓｉＲＮＡの取り込みおよび血清安定性を増強することが示されている。また、血流中の種々のリポタンパク質（例えば、ＬＤＬ）へのステロイド連結オリゴヌクレオチドの結合は完全性を守り、生物分布を促進することが示されている（Ｒｕｍｐら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５９（１１）：１４０７−１４１６（２０００））。細胞取り込みを増加させるために前記の化合物に結合または連結されうる他の基には、アクリジン誘導体；架橋剤、例えばプソラレン誘導体、アジドフェナシル、プロフラビンおよびアジドプロフラビン；人工エンドヌクレアーゼ；金属複合体、例えばＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）およびポルフィリン−Ｆｅ（ＩＩ）；アルキル化部分；ヌクレアーゼ、例えばアルカリホスファターゼ；ターミナルトランスフェラーゼ；アブザイム；コレステリル部分；親油性担体；ペプチドコンジュゲート；長鎖アルコール；リン酸エステル；放射能マーカー；非放射能マーカー；炭水化物；ならびにポリリシンまたは他のポリアミンが含まれる。また、Ｌｅｖｙら，米国特許第６，９１９，２０８号は、強化された運搬のための方法を記載している。これらの医薬製剤は、自体抗体の方法で、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、粉末化、乳化、カプセル化（封入）、捕捉または凍結乾燥法により製造されうる。
【０１０１】
投与方法
一般に、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸および関連分子を含む化合物の投与方法は当技術分野でよく知られている。特に、現在使用されている製剤と共に、核酸治療剤に既に用いられている投与経路は、前記のオリゴヌクレオチドのための好ましい投与経路および製剤となる。好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、遺伝的操作を受けている生物（例えば、ＨＩＶ感染の治療または予防のために遺伝子治療を必要としているヒト）の体内に注射される。
【０１０２】
組成物は、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下または直腸手段を含む（これらに限定されるものではない）多数の経路により投与されうる。好ましい投与経路は静脈内である。化合物はリポソームによっても投与されうる。そのような投与経路および適当な製剤は当業者に概ね公知である。
【０１０３】
該製剤の投与は、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドおよび場合によっては供与オリゴヌクレオチドがその標的に到達するのを可能にする任意の許容される方法により達成されうる。
【０１０４】
製剤を対象に投与するためには、当業者に公知の任意の許容される方法が用いられうる。該投与は、治療される状態に応じて、局所性（すなわち、特定の領域、生理的系、組織、器官または細胞型）または全身性でありうる。
【０１０５】
注射は、例えば静脈内、皮内、皮下、筋肉内または腹腔内でありうる。いくつかの実施形態においては、注射は複数の位置に行われうる。移植は、移植可能な薬物運搬系（ドラッグ・デリバリー・システム）、例えばミクロスフェア、ヒドロゲル、高分子レザバー、コレステロールマトリックス、高分子系、例えばマトリックス浸食および／または拡散系、ならびに非高分子系、例えば圧縮、融合または部分融合ペレットを挿入することを含む。吸入は、単独で又は吸収されうる担体に結合させて、吸入器内のエアゾールとして該組成物を投与することを含む。全身投与の場合、該組成物はリポソーム内に封入されるのが好ましいかもしれない。
【０１０６】
該オリゴヌクレオチドは、該物質および／またはヌクレオチド運搬系の組織特異的取り込みを可能にする方法で運搬されうる。技術には、組織または器官局在化装置、例えば創傷包帯または経皮運搬系の使用、侵襲性装置、例えば血管または尿道カテーテルの使用、および介入装置、例えば、薬物運搬能を有し拡張装置またはステントグラフトとして設計されたステントの使用を含む。
【０１０７】
該製剤は、生物浸食性インプラントを使用して、拡散により、または高分子マトリックスの分解により運搬されうる。ある実施形態においては、該製剤の投与は、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドおよび場合によっては供与オリゴヌクレオチドの、ある期間、例えば数時間、数日間、数週間、数ヶ月または数年間にわたる連続的曝露がもたらされるよう設計されうる。これは、例えば、製剤の反復投与により、または反復投与を伴うことなく長期間にわたって該オリゴヌクレオチドが運搬される持続的もしくはコントロールリリース運搬系により達成されうる。そのような運搬系を使用する該製剤の投与は、例えば、経口剤形、ボーラス注射、経皮パッチまたは皮下移植によるものでありうる。いくつかの場合には、該組成物の濃度を実質的に一定に維持することが好ましいかもしれない。
【０１０８】
適当な他の運搬系には、時限放出、遅延放出、持続放出または制御放出（コントロールリリース）運搬系が含まれる。そのような系は、多くの場合、反復投与を回避して、対象および医師にとっての簡便さを高める。多数のタイプの放出運搬系が利用可能であり、当業者に公知である。それらには、例えば、高分子に基づく系、例えばポリ乳酸および／またはポリグリコール酸、ポリ無水物、ポリカプロラクトン、コポリオキサラート、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸および／またはこれらの組合せが含まれる。核酸を含有する前記高分子のマイクロカプセルは、例えば米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。他の例には、ステロール、例えばコレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸または中性脂肪、例えばモノ−、ジ−およびトリグリセリドを含む脂質に基づくものである非高分子系；ヒドロゲル放出系；リポソームに基づく系；リン脂質に基づく系；シラスチック（ｓｉｌａｓｔｉｃ）系；ペプチドに基づく系；ロウコーティング；通常の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤；または部分融合インプラントが含まれる。具体例には、マトリックス内の製剤中にｍｉＲＮＡが含有されている浸食系（例えば、米国特許第４，４５２，７７５号、第４，６７５，１８９号、第５，７３６，１５２号、第４，６６７，０１３号、第４，７４８，０３４号および第５，２３９，６６０号に記載されているもの）、または活性成分が放出速度を制御する拡散系（例えば、米国特許第３，８３２，２５３号、第３，８５４，４８０号、第５，１３３，９７４号および第５，４０７，６８６号）が含まれる。該製剤は、例えば、マイクロスフェア、ヒドロゲル、高分子レザバー、コレステロールマトリックスまたは高分子系としてのものでありうる。いくつかの実施形態においては、該系は、例えば、該オリゴヌクレオチドを含有する製剤の拡散または浸食／分解速度の制御により、該組成物の持続的な又は制御された放出が生じることを可能にしうる。また、１以上の実施形態を運搬するために、ポンプに基づく機械的（ハードウェア）運搬系が使用されうる。
【０１０９】
放出が爆発的に生じる系の具体例には、高分子マトリックス内に封入されたリポソーム（該リポソームは、特異的刺激、例えば温度、ｐＨ、光または分解酵素および系に対して感受性である）内に該組成物が捕捉されている系、およびイオン的に被覆されたマイクロカプセルによりマイクロカプセルコア分解酵素と共に該組成物が封入されている系が含まれる。インヒビターの放出が漸進的かつ連続的である系の具体例には、例えば、マトリックス内の形態で該組成物が含有されている浸食系、および制御された速度で該組成物が例えば高分子を介して浸透する浸出系が含まれる。そのような持続放出系はペレットまたはカプセルの形態でありうる。
【０１１０】
いくつかの実施形態においては、長期放出インプラントの使用が特に適しているかもしれない。本明細書中で用いる「長期放出」は、該組成物を含有するインプラントが、少なくとも３０または４５日間、好ましくは少なくとも６０または９０日間、場合によってはそれより一層長期にわたって、治療的に有効なレベルの該組成物を運搬するよう構成され配置されていることを意味する。長期放出インプラントは当業者によく知られており、前記の放出系の幾つかを包含する。
【０１１１】
特に示さない限り、本明細書中で用いられている全ての科学技術用語は、開示されている本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中で引用されている刊行物およびそれらが引用している資料を参照により本明細書に組み入れることとする。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１は、ＤＮＡでトランスフェクトされていない又は供与オリゴヌクレオチドのみ又はＣＣ５遺伝子に結合するペプチド核酸と組合された供与オリゴヌクレオチドでトランスフェクトされたＴＨＰ−１細胞におけるＣＣＲ５遺伝子相対突然変異率を示す棒グラフである。トランスフェクションの４８時間後、対立遺伝子特異的ＰＣＲを用いて、結果を得た。該結果は相対突然変異率として表されている。ＣＣＲに対する遺伝子特異的プライマーを使用した場合の結果に対してデータを正規化した。  実施例  本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、更に深く理解されうる。
【実施例１】
【０１１３】
ＣＣＲ５遺伝子の断片へのペプチド核酸の結合および供与オリゴヌクレオチド
ビス−ＰＮＡを、高いアフィニティーおよび特異性でＣＣＲ５に結合するよう設計した。該ＰＮＡは以下の配列により表される：ＪＴＪＴＴＪＴＴＪＴ−ｅ−ｅ−ｅ−ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ここで、Ｊ＝プソイドイソシトシンおよびｅ＝柔軟性リンカー）（配列番号７）。ゲルシフトアッセイを用いて、インビトロ結合を評価した。該アッセイは、該分子が標的部位にμＭ濃度で結合することを証明した。３つの一本鎖６０マー供与オリゴヌクレオチドを設計し、合成した。全ての供与体は、終止コドンを含有する６個の中央塩基を除き、ＣＣＲ５遺伝子の鋳型鎖（アンチセンス）と完全に相同であった。タンパク質のトランケート化および誤局在化によりＣＣＲ５を不活性化することが示されているΔ３２突然変異を模擬するために、この終止コドンがΔ３２突然変異部位の付近に配置されるよう、該供与体を設計した。６ｂｐ  ＤｄｅＩ制限部位（これはインフレーム終止コドンをも含有する）を導入するよう、１つの供与体（９８３）を設計した。最初の６ｂｐ部位に直に隣接（５’または３’）する６塩基が突然変異するよう、残りの２つの供与体（９８０および９８７）を設計した。これらはｃｏｍｐ  ｈｅｔの作製のために使用される。全ての６ｂｐ突然変異は、完全長ＣＣＲ５を含有するプラスミド内に、部位特異的に導入した。それらは対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳＰＣＲ）の対照として使用される。
【実施例２】
【０１１４】
ＰＮＡおよび供与オリゴヌクレオチドを使用するＴＨＰ−１ヒト白血病細胞におけるＣＣＲ５遺伝子の突然変異
突然変異体ＣＣＲ５配列の特異的増幅のために、ＡＳＰＣＲプライマーを設計した。特異的な６ｂｐ突然変異体配列をその３’末端に含有する対立遺伝子特異的フォワードプライマーを設計した。遺伝子特異的リバースプライマーとペアになった場合に、該対立遺伝子特異的プライマーは突然変異体ＣＣＲ５遺伝子を優先的に増幅するであろう。ＡＳＰＣＲ条件を決定するために、該突然変異体配列の特異的増幅のための最適Ｔｍを決定するために、プラスミド対照に関して勾配を用いた。ついで、相同組換えに関して試験するために、供与分子とビス−ＰＮＡとの組合せをＴＨＰ−１細胞内にトランスフェクトし、これらの細胞からのゲノムＤＮＡをＡＳＰＣＲにより分析した。
【０１１５】
ＴＨＰ−１細胞を、何も無し、５μｇの９８３供与体、または２μＭ  ＰＮＡを伴う５μｇの９８３供与体でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、約１００万個の細胞のアリコートを採取し、ゲノムＤＮＡを単離した。９８３対立遺伝子特異的プライマーを使用してＤＮＡサンプルに関して対立遺伝子特異的ＰＣＲを行った。ＵＰ突然変異に対応するバンドが該処理サンプルにおいて認められる。野生型または６ｂｐの９８３突然変異体配列を含有するプラスミドＤＮＡも、ＰＣＲ対照として移動させた。１％アガロースゲル上でサンプルを移動させた。リアルタイムＡＳＰＣＲアッセイを遺伝子特異的プライマーに対する正規化と共に用いて、該サンプルゲノムＤＮＡサンプルをアッセイした。これらのトランスフェクションからのゲノムＤＮＡのＡＳＰＣＲは、該突然変異体ＤＮＡに対応する特異的増幅を示した（図１）。このアニーリング温度およびサイクル閾値においては、低いバックグラウンドの増幅も認められうる。プラスミド対照は該突然変異体配列の特異的増幅を証明している。
【０１１６】
９８０または９８７供与体で処理した細胞から集めたゲノムＤＮＡのＡＳＰＣＲは、該突然変異が互いに隣接している場合であっても、このアッセイの特異性を示している。ＴＨＰ−１細胞を、何も無し、５μｇの９８０供与体または５μｇの９８７供与体でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、約１００万個の細胞のアリコートを採取し、ゲノムＤＮＡを単離した。９８０または９８７特異的プライマーを使用して、ＡＳＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応物を１％アガロースゲル上で移動させた。９８７供与体を使用した場合の９８０特異的プライマーにおいても、また、９８０供与体を使用した場合の９８７プライマーにおいても、増幅は認められなかった。
【０１１７】
また、９８３突然変異の維持が５００時間の時点でＤＮＡレベルで検出され、２２０時間の時点でＲＮＡレベルで検出されている。ＴＨＰ−１細胞を５μｇの９８３供与体または何も無しでトランスフェクトし、与えられた時点でアリコートを採取した。ゲノムＤＮＡを単離し、ＡＳＰＣＲを行い、１％アガロースゲル上で分析した。
【０１１８】
本明細書に記載されている本発明の特定の実施実施形態の多数の均等物を当業者は認識するか又は単なる通常の実験を用いて確認しうるであろう。そのような均等物も以下の特許請求の範囲に含まれると意図される。
【図１】
2010515464.tif 000003
【配列表】
2010515464000001.app
【国際調査報告】
2010515464.tif 000004
2010515464.tif 000005
2010515464.tif 000006