(57)【要約】  本発明は、新規なエポキシコンブレタスタチン及びそのプロドラッグの全合成を開示する。コンブレタスタチンの芳香族環 B の4'位にエトキシ基で化学修飾し、同時に3′位のヒドロキシ基をリン酸塩又はリン酸コリン内塩に改造した水溶性プロドラッグ。同様に、3′-アミノエトキシコンブレタスタチンに対して、4'位のエトキシ基の化学修飾を行う。さらに、アミノ基にアミノ酸の側鎖を導入し、アミノ酸アミドである水溶性プロドラッグを形成する。構造は構造式(I)で示される。エポキシコンブレタスタチンは、比較的に強いチューブリン重合を抑制する能力を持ち、抗腫瘍と抗新生血管の治療に有用である。【化１】2010502656.tif 000030
2010502656.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）で示される化合物。
【化１】
2010502656.tif 000023
ここで、R はヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、ハロゲン族元素、アルコキシ基、リン酸、リン酸コリン、アミノ酸の側鎖、或はその薬学的に許容される塩である。
【請求項２】
前記R はヒドロキシ基、アミノ基、リン酸、リン酸コリン、アミノ酸の側鎖、或はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記R はヒドロキシ基、アミノ基、リン酸二ナトリウム塩、リン酸アンモニウム塩、リン酸コリン内塩、或は-NH(COCHR′NH)m-H(ここで、R′は水素、天然アミノ酸の側鎖、フェニル基で、ｍは1〜3 の整数を表す。)であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記R は-OH、-NH2、-OPO2Na2、-OPO3CH2CH2NMe3、-NHCOCH2NH2、或は-NHCOCHNH2CH2OHであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物の製造方法であって、
（１）相間移動触媒作用で、p-ヒドロキシ-m-メトキシベンズアルデヒドIIをブロムエタンでエチル化反応させ、4-エトキシ-3-メトキシベンズアルデヒドIIIを形成する工程と、
【化２】
2010502656.tif 000024
（２）リチウムジフェニルホスフィドを用い、m-メチル基を選択的に脱離させてヒドロキシ基とし、4-エトキシ-3-ヒドロキシベンズアルデヒドIVを得る工程と、
【化３】
2010502656.tif 000025
（３）4-エトキシ-3-ヒドロキシベンズアルデヒドIVのヒドロキシ基を保護した後、3,4,5-トリメトキシベンジルトリフェニルホスホニウムイリドとウィッティヒ反応させ、脱保護後、エトキシコンブレタスタチンVIを得る工程と、
【化４】
2010502656.tif 000026
（４）リン酸化試薬の作用で、エトキシコンブレタスタチンVIからエトキシコンブレタスタチンリン酸エステル誘導体を形成する工程と、
（５）アルカリ条件で、エトキシコンブレタスタチンリン酸エステル誘導体からエトキシコンブレタスタチンリン酸塩或はエトキシコンブレタスタチンリン酸コリン内塩を形成する工程と、
を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項６】
工程（４）における前記リン酸化試薬は、亜リン酸ジベンジルと2-クロロ-1,3,2-ジオキサホスホランから選ばれることを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物の製造方法であって、
（ａ）相間移動触媒の作用で、p-ヒドロキシ-m-ニトロベンズアルデヒドIXをブロムエタンでエチル化反応させ、4-エトキシ-3-ニトロベンズアルデヒドXを形成する工程と、
【化５】
2010502656.tif 000027
（ｂ）254nm の紫外線の触媒作用で、4-エトキシ-3-ニトロベンズアルデヒドＸを3,4,5-トリメトキシベンジルトリフェニルホスホニウムイリドとウィッティヒ反応させ、(Z)-1-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-2-(3′-ニトロ-4′-エトキシフェニル)エチレンXIを形成する工程と、
【化６】
2010502656.tif 000028
（ｃ）(Z)-1-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-2-(3′-ニトロ-4′-エトキシフェニル)エチレンXIのニトロ基を還元剤でアミノ基に還元し、3′-アミノエトキシコンブレタスタチンXIIを形成する工程と、
【化７】
2010502656.tif 000029
（ｄ）3′-アミノエトキシコンブレタスタチンXIIをアミノ酸誘導体と反応させ、そのアミノ酸アミド誘導体を形成する工程と、
（ｅ）アルカリ条件で、前述アミノ酸アミド誘導体から3′-アミノエトキシコンブレタスタチンアミノ酸アミドを形成する工程と、
を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項８】
治療有効量の請求項１に記載の化合物と薬学的に許容される担体を含有することを特徴とする医薬品組成物。
【請求項９】
チューブリン重合阻害剤を製造するための請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項１０】
異常血管新生に起因する疾病の治療薬物を製造するための請求項１に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬物合成分野、特に抗癌薬物の合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
シクンシ科(Combretastaceae)植物は、一種類の熱帯や亜熱帯に分布する潅木や喬木で、とても重要な医学応用価値がある。既知のヨツバネカズラ(Combretum)属の植物には、アフリカとインドでらい病とガン等の治療に使われているものが25 種類ある。しかし、中では、主にCombretum micratbum とCombretum zeyberi という何種かだけが少し研究された。Combretum caffrum という植物はヨツバネカズラ属における一種であって、南アフリカではズールー人にムデゥル(Mdulu)と、他の地域ではブッシュフェルト・ウィロー(Bushveld willow)、ブッシュウィロー(Bushwillow)やルーイブラアル(Rooiblaar)と呼ばれている。1970 年代末期、米国国立癌腫研究所は、スクリーニングにおいてこの植物がマウスのP388 リンパ性白血病細胞に対する強い抑制作用を持つことを見出した。80 年代から、この植物に対する研究は幅広く注目された。この期間中、米国アリゾナ大学癌腫研究所所長である化学者のG. Robert Pettit と四人の同僚は、以前「ズールー人に敵を退散させる護符として使われていた」学名が「Combretum caffrum」の南アフリカの樹種からコンブレタスタチンを抽出し、Journal of Canadian Chemistry では、G. Robert Pettit は根の外皮が確かに抗腫効果があると述べた。その後、多くの高活性の化合物が分離して同定されただけではなく、その薬理作用機構と構造修飾に対しても深く研究されてきた(Pettit, G.R.; et al.1) Can. J. Chem. 1987, 65, 2390-2396. 2) J. Nat. Prod.1987, 50, 119-131. 3) Experieutia 1989,45, 209-211)。コンブレタスタチンの一連の化合物は、シス型1,2-ジフェニルエチレンの構造を持つ。なかでも、コンブレタスタチンA-4(CA-４、コンブレタスタチン、シス-1-(3,4,5-トリメトキシ)フェニル-2-(3′-ヒドロキシ-4′-メトキシ)フェニルエチレン)は、構造式が一般式XVIIの通りで、一番強いチューブリン重合の抑制作用を持つ(Pettit G R, et al. J.Med.Chem(1995) 381666-1672)。
【０００３】
【化１】
2010502656.tif 000003
【０００４】
最近、CA-4 は腫瘍血管のターゲッティング薬剤として腫瘍血管を遮断する優れた特性を示した(Thorpe PE. Clin Cancer Res. 2004 Jan 15，10(2):415-27；West CM, Price P. Anticancer Drugs.2004 Mar，15(3):179-87；Young SL, Chaplin DJ. Expert Opin Investig Drugs. 2004 Sep，13(9):1171-82.)ため、米 Oxigene, Inc.社はCA-4 を新規な抗腫瘍薬として用い、すでに第3 相臨床研究まで進んだ。1997 年に、味の素株式会社のT. Hatanaka らは、CA-4 の3′位のヒドロキシ基をアミノ基に換え、かつアミノ酸アミドに修飾して水溶性プロドラッグとした後、抗癌活性が大幅に向上するのに対し、毒性がCA-4 よりもだいぶ降下した(USP5,674,906)。現在、仏Aventis Pharma 社によって開発された3′-アミノのCA-4 アミノ酸アミド(AVE8062)はすでに第2 相臨床研究まで進んだ。
【０００５】
本分野では、より高い活性を持つコンブレタスタイン系化合物の新規誘導体の発見は切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、構造が一般式Iで示されるエトキシコンブレタスタチン誘導体を提供することを目的とする。
本発明のもう一つの目的は、一般式Iの化合物の製造方法を提供することである。
【０００７】
本発明の三つ目の目的は、一般式Iの化合物を含有する医薬品組成物を提供することである。
本発明の四つ目の目的は、一般式Iの化合物の医薬用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第一は、一般式Iで示される化合物を提供する。
【０００９】
【化２】
2010502656.tif 000004
【００１０】
ここで、R はヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、ハロゲン族元素、アルコキシ基、リン酸、リン酸コリン、アミノ酸の側鎖、或はその薬学的に許容される塩である。
別の好ましい例において、前述のR はヒドロキシ基、アミノ基、リン酸、リン酸コリン、アミノ酸の側鎖、或はその薬学的に許容される塩である。
【００１１】
別の好ましい例において、前述のR はヒドロキシ基、アミノ基、リン酸二ナトリウム塩、リン酸アンモニウム塩、リン酸コリン内塩、或は-NH(COCHR′NH)m-H であり、ここで、R′は水素、天然アミノ酸の側鎖、フェニル基で、ｍは1〜3 の整数を表す。
【００１２】
別の好ましい例において、前述のR は-OH、-NH2、-OPO2Na2、-OPO3CH2CH2NMe3、-NHCOCH2NH2、或は-NHCOCHNH2CH2OH である。
本発明の第二は、
(1)相間移動触媒作用で、p-ヒドロキシ-m-メトキシベンズアルデヒドIIブロムエタンでエチル化反応させ、4-エトキシ-3-メトキシベンズアルデヒドIIIを形成する工程と、
【００１３】
【化３】
2010502656.tif 000005
【００１４】
(2)リチウムジフェニルホスフィドを用い、m-メチル基を選択的に脱離させてヒドロキシ基とし、4-エトキシ-3-ヒドロキシベンズアルデヒドIVを得る工程と、
【００１５】
【化４】
2010502656.tif 000006
【００１６】
(3)4-エトキシ-3-ヒドロキシベンズアルデヒドIVのヒドロキシ基を保護した後、3,4,5-トリメトキシベンジルトリフェニルホスホニウムイリドとウィッティヒ反応させ、脱保護後、エトキシコンブレタスタチンVIを得る工程と、
【００１７】
【化５】
2010502656.tif 000007
【００１８】
(4)リン酸化試薬の作用で、エトキシコンブレタスタチンVIからエトキシコンブレタスタチンリン酸エステル誘導体を形成する工程と、
(5)アルカリ条件で、エトキシコンブレタスタチンリン酸エステル誘導体からエトキシコンブレタスタチンリン酸塩或はエトキシコンブレタスタチンリン酸コリン内塩を形成する工程と、を含む一般式Iで示される化合物の製造方法を提供する。
【００１９】
別の好ましい例において、工程(4)におけるリン酸化試薬は、亜リン酸ジベンジルと2-クロロ-1,3,2-ジオキサホスホランから選ばれる。
別の好ましい例において、工程(3)において、トリチルクロリドでm-ヒドロキシ基の保護反応を行う。
【００２０】
別の好ましい例において、工程(3)において、(Z)-1-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-2-(3′-トリフェニルメトキシ-4′-エトキシフェニル)エチレンは、濃塩酸とトリフルオロ酢酸の作用で、トリチル基が脱離し、エトキシコンブレタスタチンVIが形成される。
【００２１】
別の好ましい例において、工程(5)において、リン酸エステル誘導体が分解反応によりアルカリ条件で、より好ましくはpH=8〜10 の条件で、エトキシコンブレタスタチンリン酸塩であるプロドラッグに転化される。
【００２２】
別の好ましい例において、工程(5)において、リン酸エステル誘導体が三級アミンの作用で、エトキシコンブレタスタチンリン酸コリン内塩であるプロドラッグに形成される。
別の好ましい例において、一般式Iで示される化合物の製造方法は、
(a)相間移動触媒の作用で、p-ヒドロキシ-m-ニトロベンズアルデヒドIXブロムエタンでエチル化反応させ、4-エトキシ-3-ニトロベンズアルデヒドXを形成する工程と、
【００２３】
【化６】
2010502656.tif 000008
【００２４】
(b)254nm の紫外線の触媒作用で、4-エトキシ-3-ニトロベンズアルデヒドXを3,4,5-トリメトキシベンジルトリフェニルホスホニウムイリドとウィッティヒ反応させ、(Z)-1-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-2-(3′-ニトロ-4′-エトキシフェニル)エチレンXIを形成する工程と、
【００２５】
【化７】
2010502656.tif 000009
【００２６】
(c)(Z)-1-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-2-(3′-ニトロ-4′-エトキシフェニル)エチレンXIのニトロ基を還元剤でアミノ基に還元し、3′-アミノエトキシコンブレタスタチンXIIを形成する工程と、
【００２７】
【化８】
2010502656.tif 000010
【００２８】
(d)3′-アミノエトキシコンブレタスタチンXIIをアミノ酸誘導体と反応させ、そのアミノ酸アミド誘導体を形成する工程と、
(e)アルカリ条件で、前述アミノ酸アミド誘導体から3′-アミノエトキシコンブレタスタチンアミノ酸アミドを形成する工程と、を含む。
【００２９】
別の好ましい例において、工程(c)における還元剤は、塩化第一スズ、亜鉛粉/酢酸、チオ硫酸ナトリウム、或は二塩化ニッケル/水素化ホウ素ナトリウムからなる群から選ばれる。
【００３０】
別の好ましい例において、工程(d)において、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)と1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)或はベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP 試薬)の触媒作用で、(Z)-1-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-2-(3′-アミノ-4′-エトキシフェニル)エチレンがN-α-9-フルオレニルメトキシカルボニルアミノ酸誘導体(FmocAA)と反応し、3′位のアミノ基がFmoc-アミノ酸アミドに転化される。
【００３１】
別の好ましい例において、工程(e)において、(Z)-1-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-2-(3′-アミノ-4′-エトキシフェニル)エチレン-Fmoc-アミノ酸アミドは、Fmoc が脱離し、3′-アミノエトキシコンブレタスタチンアミノ酸アミドである水溶性プロドラッグが形成される。前述アルカリ条件は、水酸化ナトリウム水溶液であることが好ましい。
【００３２】
本発明の第三は、治療有効量の一般式Iの化合物と薬学的に許容される担体を含有する医薬品組成物を提供する。
別の好ましい例において、前述の医薬品組成物の剤形は、冷凍乾燥粉剤、粉剤、顆粒剤、タブレット剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、乳剤、チンキ剤、懸濁液、溶液の形態による静脈内注射又は経口投与から選ばれる。
【００３３】
本発明の第四は、チューブリン重合阻害剤を製造するための一般式Iの化合物の使用を提供する。
本発明の第五は、異常血管新生に起因する疾病の治療薬物を製造するための一般式Iの化合物の使用を提供する。
【００３４】
別の好ましい例において、一般式Iの化合物は、主として、肺癌、非小細胞肺癌、肝癌、膵臓癌、胃癌、骨癌、食道癌、乳癌、前立腺癌、睾丸癌、結腸癌、卵巣癌、膀胱癌、子宮頸癌、黒色腫、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞性腺癌、嚢胞性癌、髄様癌、気管支癌、骨細胞癌、上皮癌、胆管癌、絨毛膜癌、胎生期癌、精原細胞癌、ウィルムス腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭管腫、上衣細胞腫、松果体腫、血球芽細胞腫、声帯神経腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、視神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経繊維腫、繊維肉腫、繊維芽細胞腫、繊維腫、繊維腺腫、繊維軟骨腫、繊維嚢腫、繊維粘液腫、繊維骨腫、繊維粘液肉腫、繊維乳頭状腫、粘液肉腫、粘液嚢腫、粘液軟骨腫、粘液軟骨肉腫、粘液軟骨繊維肉腫、粘液腺腫、粘液芽細胞腫、脂肪肉腫、脂肪腫、脂肪腺腫、脂肪芽細胞腫、脂肪軟骨腫、脂肪繊維腫、脂肪血管腫、粘液脂肪腫、軟骨肉腫、軟骨腫、軟骨筋腫、脊索腫、絨毛腺腫、絨毛膜上皮腫、絨毛膜芽細胞腫、骨肉腫、骨芽細胞腫、骨軟骨繊維腫、骨軟骨肉腫、骨軟骨腫、骨嚢腫、骨象牙質腫、骨繊維腫、骨繊維肉腫、血管肉腫、血管腫、血管脂肪腫、血管軟骨腫、血管芽細胞腫、血管角化腫、血管神経膠腫、血管内皮腫、繊維性血管腫、血管筋腫、血管脂肪腫、血管リンパ管腫、血管脂肪平滑筋腫、血管筋脂肪腫、血管筋神経腫、血管粘液腫、血管細網腫、リンパ管肉腫、リンパ肉芽腫、リンパ管腫、リンパ腫、リンパ性粘液腫、リンパ肉腫、リンパ管繊維腫、リンパ細胞腫、リンパ上皮腫、リンパ芽球腫、内皮腫、内皮芽細胞腫、滑膜腫、滑膜肉腫、中皮腫、結合組織腫、ユーイング腫瘍、平滑筋腫、平滑筋肉腫、平滑筋芽細胞腫、平滑筋繊維腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、横紋筋粘液腫、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性白血病、赤血球増加症、リンパ腫、多発性骨髄腫を含む、異常血管新生に起因する様々の腫瘍の成長と転移の治療に使用することができる。
【００３５】
別の好ましい例において、一般式Ｉの化合物は、主として、リウマチ性関節炎、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞、乾癬、酒さ性座瘡、カポジー肉腫、アトピー性角膜炎、流行性角結膜炎、血管新生緑内障、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、帯状疱疹感染症、原生動物感染症、マイコバクテリア感染症、多発動脈炎、類肉腫、強膜炎、潮紅、シェーグレン症候群、全身性紅斑狼瘡、エイズ病、梅毒を含む異常血管新生に起因する様々の関連疾病の治療に使用することができる。
【００３６】
これによって、本発明は生物活性が大幅に向上したコンブレタスタチン系化合物の新規誘導体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】エトキシコンブレタスタチン及びその水溶性プロドラッグの合成経路である。
【図２】3′-アミノエトキシコンブレタスタチン及びそのアミノ酸アミド誘導体の合成経路である。
【００３８】
ここで、PTC は相間移動触媒、Cat.は触媒、Wittig reaction はウィッティヒ反応、Ph2PLi はリチウムジフェニルホスフィド、n-BuLi はn-ブチルリチウム、TFA はトリフルオロ酢酸、iPr2EtNはジイソプロピルエチルアミン、(PhCH2O)2P(O)H は亜リン酸ジベンジル、TMBS はトリメチルブロムシラン、Fmoc-L-Ser はN-α-9-フルオレニルメトキシカルボニル-L-セリン誘導体、Fmoc-GlyはN-α-9-フルオレニルメトキシカルボニルグリシン誘導体、BOP はベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、DCC はジシクロヘキシルカルボジイミド、HOBt は1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、DMF はジメチルホルムアミド、NMe3 はトリメチルアミン、aq.NaOH は希水酸化ナトリウム、conc. HCl は濃塩酸を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明者らは幅広く深く研究した結果、天然産物であるコンブレタスタチンの芳香族環 B の4'位のアルコキシ基が活性作用点で、コンブレタスタチンの芳香族環 B の4'位の元のメチル基をエチル基に換えることにより、腫瘍血管に対するターゲティングの活性を向上させることができることを意外に見出した。
【００４０】
上述化合物の合成は、リチウムジフェニルホスフィドでの選択的な脱メチル化の要件反応を利用し、エトキシ基を芳香族環B の4'位に導入することに成功した。
同時に、上述化合物の合成において、254nm の紫外線の触媒作用によるウィッティヒ反応を利用することにより、反応の立体選択性を向上させ、Z 型立体配置の産物の収率を大幅に増加させた。
【００４１】
これらの新規化合物は比較的に強いチュービュリン重合を抑制する機能を持ち、抗腫瘍と抗異常血管新生の治療には有用である。
（化合物）
本発明によって提供されるエトキシコンブレタスタチン誘導体は、コンブレタスタチンの芳香族環B の4'位にエトキシ基が導入され、3′位が主にヒドロキシ基及びそれから誘導されるリン酸塩又はリン酸コリン内塩、並びにアミノ基及びそれから誘導されるアミノ酸アミドである水溶性プロドラッグである。構造は一般式Iの通りである。
【００４２】
【化９】
2010502656.tif 000011
【００４３】
式中、R はヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、ハロゲン族元素、アルコキシ基、リン酸塩、リン酸コリン内塩、アミノ酸の側鎖、或は薬学的に許容される塩である。
R としてリン酸塩、リン酸コリン内塩、アミノ酸の側鎖、或は薬学的に許容される塩が選ばれる場合、その水溶性プロドラッグが形成される。
【００４４】
R がヒドロキシ基である場合、リン酸塩、或はリン酸コリン内塩である水溶性プロドラッグが誘導される。
R がアミノ基である場合、アミノ酸アミドのNH(COCHR′NH)n-H である水溶性プロドラッグが誘導される。ここで、R′は天然アミノ酸の側鎖である。
【００４５】
より好ましくは、R がヒドロキシ基である場合、エトキシコンブレタスタチンであることが好ましい。R がアミノ基である場合、3′-アミノエトキシコンブレタスタチンであることが好ましい。構造は一般式Iの通りで、ここのR は-OH、-NH2、-OP(O)(ONa) 2、-OP(O)(O-)(OCH2CH2NMe3)、-NH(COCHR′NH)m-H(R′は水素、天然アミノ酸の側鎖、フェニル基で、ｍは1〜3 の整数を表す。)である。
【００４６】
本発明によって提供されるエトキシコンブレタスタチン誘導体は、水酸化カリウムと水酸化アンモニウムのような無機塩基、又は脂肪族アミン(例えばトリエチルアミン)、アルコールアミン(例えばエタノールアミン)、アミノ酸(例えば、ヒスチジン)、アミノグリコシド(例えば、ネアミン)のような有機塩基と薬学的に許容される塩基付加塩を形成してもよい。
【００４７】
本発明によって提供されるエトキシコンブレタスタチン誘導体は塩酸、硫酸及びリン酸のような無機酸、又はシュウ酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸及びグルタミン酸のような有機酸と薬学的に許容される酸付加塩を形成してもよい。
【００４８】
（化合物の製造）
本発明において、相間移動触媒作用で、エチル化反応を行い、さらにリチウムジフェニルホスフィドを用いて選択的な脱メチル化反応を行うことにより、一連の新規なp-エトキシベンズアルデヒド誘導体が製造される。そして、これらの新規なp-エトキシベンズアルデヒド誘導体を原料として高立体選択性のウィッティヒ反応をおこなうことにより、一連のエトキシコンブレタスタチン誘導体が得られる。そして、リン酸塩化、或はアミノ酸化などの合成プロセスで最適化することにより、一連のエトキシコンブレタスタチン誘導体の水溶性プロドラッグが製造される。
【００４９】
(一)p-エトキシベンズアルデヒド誘導体の製造
無機塩基と相間移動触媒の作用下、ブロムエタンを用い、4-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒド(バニリン)IIは4-ヒドロキシ-3-ニトロベンズアルデヒドIXら、4-エトキシ-3-メトキシベズアルデヒドIII又は4-エトキシ-3-ニトロベンズアルデヒドXが製造される。
【００５０】
【化１０】
2010502656.tif 000012
【００５１】
前述の無機塩基は水酸化物、炭酸塩から選ばれる一種又は多種で、水酸化カリウム及び/又は炭酸カリウムが好ましい。前述の相間移動触媒は第四アンモニウム塩、第四ホスホニウム塩、クラウンエーテル、ポリエチレングリコール(PEG)から選ばれ、塩化ベンジルトリエチルアンモニウム、重硫酸テトラブチルアンモニウム(TBAB)、18-クラウン-6、ジフェニル-18-クラウン-6、ジシクロヘキシル-18-クラウン-6-エーテルとPEG−400 が好ましい。
【００５２】
グリコール系化合物を用いて、4-エトキシ-3-メトキシベンズアルデヒドIIIのアルデヒド基を保護し、さらにリチウムジフェニルホスフィドを3 位のメトキシ基の選択的な脱メチル化試薬としてメトキシ基をヒドロキシ基とし、4-エトキシ-3-ヒドロキシベンズアルデヒドIVが得られる。
【００５３】
【化１１】
2010502656.tif 000013
【００５４】
(二)エトキシコンブレタスタチンの製造
有機塩基の触媒作用で、4-エトキシ-3-ヒドロキシベンズアルデヒドIVをトリチルクロリドと反応させ、3 位のヒドロキシ基が保護されたp-エトキシベンズアルデヒド誘導体Vが得られる。臭化3,4,5-トリメトキシベンジルトリフェニルホスホニウムをn-ブチルリチウムの作用で対応するリンイリドに変換し、上述の3 位のヒドロキシ基が保護されたエトキシベンズアルデヒド誘導体とウィッティヒ反応させ、シス型のジフェニルエチレン誘導体を高収率で形成し、濃塩酸とトリフルオロ酢酸の共同作用でトリチル基を脱離させ、エトキシコンブレタスタチンVIが得られる。
【００５５】
【化１２】
2010502656.tif 000014
【００５６】
前述の有機塩基は、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンから選ばれる。
(三)3′-アミノエトキシコンブレタスタチンの製造
254nm の紫外線の触媒作用で、4-エトキシ-3-ニトロベンズアルデヒドXを上述リンイリドとウィッティヒ反応させ、シス型の3′-ニトロエトキシコンブレタスタチンXIが高選択性で形成される。そして、3′位のニトロ基を還元剤でアミノ基に還元し、3′-アミノエトキシコンブレタスタチンXIIが得られる。前述還元剤は、塩化第一スズ、亜鉛粉/酢酸、チオ硫酸ナトリウム、二塩化ニッケル/水素化ホウ素ナトリウムが好ましい。
【００５７】
【化１３】
2010502656.tif 000015
【００５８】
(四)エトキシコンブレタスタチンのリン酸塩の製造
図1 で示すように、上記エトキシコンブレタスタチンVIの3’位のヒドロキシ基を四塩化炭素、ジイソプロピルエチルアミン、亜リン酸ジベンジル、臭化トリメチルシラン、ナトリウムメトキシドの作用によってリン酸二ナトリウム塩に転化し、エトキシコンブレタスタチンのリン酸塩VIIが形成される。
【００５９】
【化１４】
2010502656.tif 000016
【００６０】
(五)エトキシコンブレタスタチンのリン酸コリン内塩の製造
或は、同図1 で示すように、リン酸化試薬の2-クロロ-1,3,2-ジオキサホスホラン-2-オキシドで上記エトキシコンブレタスタチンVIの3’位のヒドロキシ基と反応させ、エトキシコンブレタスタチンの環状リン酸エステル誘導体が得られる。トリメチルアミンの作用で、その環状リン酸エステル誘導体が開環し、エトキシコンブレタスタチンのリン酸コリン内塩VIIIが形成される。
【００６１】
【化１５】
2010502656.tif 000017
【００６２】
(六)3′-アミノエトキシコンブレタスタチンアミノ酸アミドの製造
図2 で示すように、上記3′-アミノエトキシコンブレタスタチンXIIは、N-α-9-フルオレニルメトキシカルボニルアミノ酸誘導体(FmocAA)とBOP 試薬、或はジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)と1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)の作用で、3′位アミノ基にアミノ酸の側鎖を導入し、構造が例えばXIIIとXIVになり、さらに水酸化ナトリウムの作用で、Fmoc 保護が脱離してアミノ酸アミドに転化し、構造が例えばXVとXVIのような一連の3′-アミノエトキシコンブレタスタチンアミノ酸アミド誘導体が得られる。
【００６３】
【化１６】
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【００６４】
【化１７】
2010502656.tif 000019
【００６５】
（医薬品組成物）
治療有効量の一般式Iの化合物を薬学的に許容される担体と混合して、組成物の形態に調製する。ここで、治療有効量の一般式Iの化合物は組成物の0.1〜99％(w/w)である。本発明の組成物は多様な剤形とすることができる。前述の剤形は、冷凍乾燥粉剤、顆粒剤、粉剤、タブレット剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、乳剤、チンキ剤、懸濁液、溶液の形態による静脈内注射又は経口投与の剤形がある。
【００６６】
静脈内注射投与の場合、冷凍乾燥粉剤を用い、生理食塩水又はグルコース溶液で溶液とし、静脈内投与を行うことができる。
経口投与の場合、タブレット剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉剤、顆粒剤、泥膏剤、懸濁剤、乳剤又は溶液剤を採用することができる。
【００６７】
用いられる活性成分の有効使用量は投与方法と治療しようとする疾病の重篤度によって異なるが、通常は、本発明の化合物をおよそ0.5-500mg/kg 動物体重/日の量で投与すると、満足できる効果が得られ、好ましくは毎日2〜4 回に分けて、又は緩慢放出の形式で投与する。大部分の大型哺乳類に対して、１日の総投薬量は約1〜100mg である。内服に適用する投与量の様態には、固体又は液体の薬学的に許容される担体と混合した約0.5〜500mg の活性化合物の様態が含まれる。この投与量の方案を調節することにより、最適な治療応答を提供することができる。例えば、治療状況の切望によって、毎日多回に分けた投与量、又は比率的に減少する投与量で投与することができる。通常、大人の１日の適当な臨床の経口投薬量は1〜1000mg、好ましくは10〜200mg の範囲に、大人の１日の非経口投薬量は0.1〜100mg、好ましくは1〜100mg の範囲にある。
【００６８】
上記の方法によって合成された本発明のエトキシコンブレタスタチン誘導体は、血管ターゲティング薬物として使われるとき、経口或いは静脈内注射によって投与することができる。薬剤の投与量は疾病の発達程度によって異なるが、大人は通常1〜3000mg の範囲にある。
【００６９】
好ましい例において、本発明の化合物は、経口或いは静脈内投与の形態で投与することができる。固体担体は、澱粉、ラクトース、リン酸水素カルシウム、微晶質セルロース、ショ糖とカオリンを含む。液体担体は、滅菌水、ポリエチレングリコール、マンニトール、ノニオン性界面活性剤と食用油(例えばトウモロコシ油、落花生油と胡麻油)を含む。活性成分の特性と所期の特定の投与形態に適すればよい。例えば、矯味剤、色素、防腐剤及びビタミンE、ビタミンC、BHT とBHA のような酸化防止剤などの、医薬品組成物の製造に通常用いられる佐剤も有利的に含まれる。
【００７０】
本文で用いられるように、静脈内注射には腹膜内注射と点滴注射が含まれ、冷凍乾燥粉剤を生理食塩水又はグルコース溶液に溶解させて得る溶液が使用される。ここで、冷凍乾燥粉剤は本分野の通常の方法で調製される。
【００７１】
本発明のエトキシコンブレタスタチン誘導体は経口投与製剤に調製され、タブレット剤、カプセル剤が含まれる。このような剤型は、有効成分と、賦形剤、バインダー、崩壊剤、潤滑剤、着色剤、矯味剤を含む少なくとも1 種の添加剤と、を混合して形成し、そして形成された混合物を粉剤、顆粒剤、タブレット剤、被覆タブレット剤、丸剤、カプセル剤などの剤型とする。賦形剤は、ラクトース、コーン澱粉、糖類、ブドウ糖、ソルビトールと結晶質セルロースの一種又は多種を含む。バインダーは、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガカントゴム、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル澱粉とポリビニルピロリドンの一種又は多種を含む。崩壊剤は、澱粉、寒天、ゼラチン粉、結晶質セルロース、炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、シクロデキストリンとペクチンの一種又は多種を含む。潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカと硬化植物油の一種又は多種を含む。着色剤は、薬への添加が許容された色素を含む。矯味剤は、カカオパウダー、メントール、薄荷油、精製ボルネオールとシナモンを含む。必要ならば、これらのタブレット剤と顆粒剤はショ糖、ゼラチンなどでコートされてもよい。通常、これらの剤型は、不活性希釈剤、パラオキシ安息香酸エステル類、ソルビン酸のような防腐剤、ビタミンＣ、α-ビタミンE とシステインのような酸化防止剤、分解剤、粘着剤、増粘剤、緩衝液、甘味剤、調味剤と香料を含む他の添加剤を含有してもよい。タブレット剤と丸剤は腸溶性コートで覆われてもよい。経口投与の液体剤型は薬用が可能な乳剤、シロップ、チンキ剤、懸濁液と溶液を含み、水のような常用の不活性希釈剤を含有してもよい。
【００７２】
本発明の主な利点は、天然産物であるコンブレタスタチンの芳香族環 B の4'位にエトキシ基を導入し、その腫瘍血管に対するターゲティングの活性を向上させたことである。
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いるもので、発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例に特に具体的な条件を説明しない実験方法は通常の条件、或いはメーカーの薦めの条件で行われる。特に説明しない限り、すべての％と部は重量基準である。
【実施例１】
【００７３】
4-エトキシ-3-メトキシベンザアルデヒドの製造:
温度計、撹拌機、還流冷却管を装着した1000mL の四つ口フラスコに4-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒド62g(0.41mol)、イソプロピルアルコール400mL を入れ、20 分間撹拌し、定圧滴下漏斗で18-クラウン-6 エーテル5g と水酸化ナトリウム106.3g(2.66mol)の120ml 水溶液をゆっくり滴下し、30 分間撹拌し、反応系を60℃に加熱し、同温度でブロムエタン67.3g(0.62mol)を5〜6 時間滴下し、TLC でモニターした。反応完成後、反応系を冷却し(15℃)、水400ml を加えて反応を停止させ、ジエチルエーテル(3×300ml)で産物を抽出し、中性になるまで有機層を水で洗浄し、無水MgSO4 で乾燥した。一部のジエチルエーテルを留去し、石油エーテルを大量に入れ、粗製品が沈殿した。ジエチルエーテル/石油エーテルで再結晶し、4-エトキシ-3-メトキシベンザアルデヒドが67g得られ、収率は91％であった。1H-NMR(ppm)δ:9.87(1H,s；-CHO)；7.31(1H,m；2-ArH)；7.26(1H,m；6-ArH)；6.86(1H,m；5-ArH); 3.98(2H,q; -CH2); 3.73(3H,s; -OCH3); 1.42(3H,t; -CH3)。MS（m/Z）: 180 (M+)。
【実施例２】
【００７４】
4-エトキシ-3-ニトロベンズアルデヒドの製造:
実施例１に従って、4-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒドの代わりに、4-ヒドロキシ-3-ニトロベンズアルデヒド68.5g(0.41mol)を用いて、4-エトキシ-3-ニトロベンズアルデヒドが68.7ｇ得られ、収率は86％であった。1H-NMR(ppm)δ: 9.96(1H,s；-CHO)；7.73(1H,m；2-ArH)；7.58(1H,m；6-ArH)；7.33(1H,m；5-ArH);4.15 (2H,q; -CH2); 3.82 (3H,s; -OCH3); 1.53 (3H,t; -CH3)。MS（m/Z）:195 (M+)。
【実施例３】
【００７５】
4-エトキシ-3-ヒドロキシベンズアルデヒドの製造:
ステップ 1：アルゴンの保護下、4-エトキシ-3-メトキシベンズアルデヒド54g(0.3mol)を取って三つ口フラスコに入れ、さらにエチレングリコール130g(2.1mol)とオルトギ酸トリエチル133g(0.9mol)を加え、約100℃で還流し、触媒として三フッ化ホウ素のジエチルエーテル溶液1mlを添加した。24 時間反応させ、この反応をTLC でモニターした。室温まで冷却し、15％の水酸化ナトリウム水溶液200ml を加え、300ml のジエチルエーテルで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧蒸留でエチレングリコールとオルトギ酸トリエチルを除去し、黄色油状物が得られた。
【００７６】
ステップ 2： 1.28M のリチウムジフェニルホスフィドのテトラヒドロフラン溶液 200ml にバッチで上述のアセタール56g(0.25mol)を加えた。室温で3〜4 時間撹拌し、この反応をTLC でモニターした。水を加えて反応を中止させ、30％の水酸化ナトリウム溶液200ml を加えてから、300mlのジエチルエーテルで抽出した。冷却下水層を塩酸によって酸性化してpH 値を3〜4 程度に調節した。その後、500ml のジエチルエーテルで抽出し、ジエチルエーテル抽出液を合併し、水と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧で溶媒を除去し、黄色固体が得られた。ベンゼン/石油エーテルで再結晶を行い、浅黄色の結晶が35.3g 得られ、収率は85％であった。1H-NMR(ppm)δ:9.90(1H,s；-CHO)；7.32(1H,m；2-ArH)；7.27(1H,m；6-ArH)； 6.89(1H,m；5-ArH)；4.88(1H,br；-OH)；4.17 (2H,q; -CH2)；1.53 (3H,t; -CH3)。13C-NMR(ppm)δ：192.0(CHO)，
157.6(4-ArC)，143.3(3-ArC)，129.6(1-ArC)，124.5(6-ArC)，116.7(2-ArC)，116.6(5-ArC)，82.1(-OCH2), 23.5(-CH3)。MS（m/Z）: 166 (M+)。
【実施例４】
【００７７】
(Z)-1-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-2-(3'-ヒドロキシ-4'-エトキシフェニル)-エチレン(エトキシコンブレタスタチン)の製造:
ステップ 1：アルゴン雰囲気下、4-エトキシ-3-ヒドロキシベンズアルデヒド11.0ｇ(0.066mol)、トリチルクロリド21.1ｇ(0.076mol)、乾燥テトラヒドロフラン42ml を500ml の四つ口フラスコに入れ、室温で均一に撹拌した。その後、トリエチルアミン1.3ml をゆっくり滴下した。滴下後、1 時間撹拌を継続し、この反応をTLC でモニターし、反応完成後、水50ml を加えて反応を中止させた。30 分間撹拌し、酢酸エチル100ml を添加して綿状の沈殿物を溶解させた。n-ヘプタン250ml を加えて、顆粒状の浅黄色の粗製品が沈殿した。ろ過し、得られた固体を水で二回洗浄し、さらに酢酸エチル/石油エーテル(10ml/20ml)で洗浄し、浅白色の結晶が得られた。この結晶を酢酸エチル/石油エーテルで再結晶し、白色の大粒の結晶が25g 得られ、収率は93％であった。1H-NMR(ppm)δ: 9.91(1H,s ； -CHO) ；7.33(1H,m ； 2-ArH) ； 7.26(1H,m ； 6-ArH) ；7.19(m,15H,Tr-H)；6.89(1H,m；5-ArH)；4.17 (2H,q; -CH2)；1.53 (3H,t; -CH3)。
【００７８】
ステップ 2：アルゴンの保護で、臭化トリメトキシフェニルメチレントリフェニルホスホニウム15g(28.7mmol)をTHF 300ml に懸濁させ、-15℃程度に冷却した。1.6mol/L のn-ブチルリチウムのシクロヘキサン溶液22ml を滴下し、1 時間反応させた。上述で得られたアルデヒド11.8ｇ(29mmol)をTHF 24ml に溶解させ、ゆっくり反応系に滴下した。この反応をTLC でモニターし、一夜撹拌し、反応温度が室温まで上がった。次の日、溶液の温度を-5 ℃に冷却し、飽和食塩水を加えて反応を中止させた。有機層を分取し、溶媒を除いた。快速カラムクロマトグラフィー(シリカゲルカラム、n-へキサン/酢酸エチル=4:1)によって、白色の結晶を13.7ｇ分離し、収率は83.5％であった。1H-NMR(ppm)δ ： 7.12 (m,15H,Tr-H) ； 6.97(d,1H,2'-H) ；6.81(dd,1H, 6'-H) ；6.75(d,1H,5'-H)；6.59(s,2H,2,6-H)；6.47(d,1H,J=12Hz,1a-H)；6.41(d,1H, J=12Hz,1a'-H)；4.13(2H,q; -CH2)；3.88(s,3H,4-OCH3)；3.71(s,6H,3,5-OCH3 )； 1.55 (3H,t; -CH3)。
【００７９】
ステップ３： 室温で、上述ウィッティヒ反応産物9.6g(16.8mmol)をトルエン20ml に溶解させた。その後、37％のHCｌ4ml(トリフルオロ酢酸0.2ml 含有)を滴下し、この反応をTLC でモニターし、反応完成後、水を添加して反応を中止させた。反応系を0〜5℃に冷却した。撹拌しながら、再結晶を行った。ろ過し、白色の結晶が5.1ｇ得られ、収率は92％であった。1H-NMR(ppm)δ：7.02(d,1H,2'-H) ；6.94(dd,1H,6'-H) ； 6.80(d,1H,5'-H) ； 6.62(s,2H,2,6-H) ；6.46(d,1H,J=12Hz,1a-H) ； 6.40(d,1H,J=12Hz,1a'-H) ；5.51(broad,1H ； OH) ； 4.16 (2H,q; -CH2) ；3.86(s,3H,4-OCH3)；3.70(s,6H,3,5-OCH3)；1.52 (3H,t; -CH3)。MS（m/Z）: 330(M+)。高分解能質量分析、計算値：330.15、実測値：330.16。
【実施例５】
【００８０】
(Z)-1-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-2-(3'-アミノ-4'-エトキシフェニル)-エチレン(3′-アミノエトキシコンブレタスタチン)の製造:
ステップ 1：光化学合成器内において、アルゴンの保護で、臭化トリメトキシフェニルメチレントリフェニルホスホニウム15g(28.7mmol)をTHF 300ml に懸濁させ、-15℃程度に冷却した。1.6mol/L のn-ブチルリチウムのシクロヘキサン溶液22ml を滴下し、1 時間反応させた。その後、254nm の紫外線ランプをつけ、UV 放射下、4-エトキシ-3-ニトロベンズアルデヒド5.7ｇ(29mmol)のTHF 溶液24ml をゆっくり反応系に滴下した。この反応をTLC でモニターし、一夜撹拌し、反応温度が室温まで上がった。次の日、紫外線ランプを消し、溶液の温度を-5 ℃に冷却し、飽和食塩水を加えて反応を中止させた。有機層を分取し、溶媒を除いた。常圧カラムクロマトグラフィー(シリカゲルカラム、n-へキサン/酢酸エチル=4:1)によって、浅黄色の結晶6.5ｇを分離し、収率は63 ％であった。1H-NMR(ppm)δ ： 7.32(d,1H,2'-H) ； 7.16(dd,1H,6'-H) ；6.90(d,1H,5'-H) ；6.64(s,2H,2,6-H )；6.49(d,1H, J=12.2Hz,1a-H)；6.43(d,1H,J=12.2Hz,1a'-H)；4.18(2H,q; -CH2)；3.86(s,3H,4-OCH3)；3.70(s,6H,3,5-OCH3 )；1.55 (3H,t; -CH3)。MS（m/Z）: 359(M+)。高分解能質量分析、計算値：359.14、実測値：359.13。
【００８１】
ステップ 2：攪拌しながら、(Z)-1-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-2-(3'-ニトロ-4'-エトキシフェニル)-エチレン4.1ｇ(10.8mmol)を取って酢酸350ml に溶解させ、さらに亜鉛粉(＜10μm＝を100g 入れた。撹拌を6 時間継続した。反応中止後、ブフナー漏斗上に厚さ1cm 程度のセライトを敷いて反応液を減圧ろ過し、ろ液をロータリーエバポレータで濃縮した。その後、快速カラムクロマトグラフィー(n-へキサン/酢酸エチル=4:1)によって、製品が得られ、約9:1 のn-へキサン/酢酸エチルで再結晶を行った。無色の結晶が2.7ｇ得られ、収率は77％であった。1H-NMR(ppm)δ：7.08(d,1H,2'-H)；6.92(dd,1H,6'-H )；6.76(d,1H,5'-H)；6.62(s,2H,2,6-H )；6.49(d,1H,J=12.2Hz,1a-H)；6.43(d,1H,J=12.2Hz,1a'-H)；4.73-4.25 (broad,2H,NH2)；4.18 (2H,q;-CH2)；3.86(s,3H,4-OCH3)；3.70(s,6H,3,5-OCH3)；1.55 (3H,t; -CH3)。MS（m/Z）: 329(M+)。高分解能質量分析、計算値：329.16、実測値：329.18。
【実施例６】
【００８２】
エトキシコンブレタスタチンリン酸二ナトリウム塩の製造:
ステップ 1：アルゴン雰囲気下、1000ml の四つ口フラスコにエトキシコンブレタスタチン41.6g(126mmol)を入れて400mL の無水アセトニトリルで溶解させ、-25℃に冷却した後、四塩化炭素61ml を入れ、撹拌を5 分間継続した後、ジイソプロピルエチルアミン47ml と4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)1.5g を入れ、1 分間後に亜リン酸ジベンジル(80％)41ml をゆっくり加えた。温度を-10℃以下に保持し、3.5 時間反応を継続し、TLC でモニターし、反応完成後、0.5M のKH2PO4を100ml 入れ、室温に自然昇温した。酢酸エチルで抽出し、有機層を合併し、蒸留水、飽和食塩水の順で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧蒸留で溶媒を除去し、混濁の油状物が得られた。快速カラムクロマトグラフィー(シリカゲルカラム、石油エーテル/酢酸エチル=3:2)によって、浅黄色の油状物を75ｇ分離した。酢酸エチル-n-ヘキサンで再結晶することにより、無色の針状の結晶が68.4g 得られた。収率は92％であった。
【００８３】
ステップ 2： 1000ml の四つ口フラスコに、乾燥した上述で得られたリン酸ベンジル65g(110mmol)を入れ、250mL の無水アセトニトリルで溶解させ、15℃で、アルゴン雰囲気下撹拌した。素早くトリメチルブロムシラン(TMBS)45ml を滴下し、5〜10 分間後にナトリウムメトキシド18g の無水メタノール溶液70ml を入れ、反応系がすぐ乳白色の懸濁液になった。半時間後、無水メタノール36ml、アセトン36ml を入れ、一夜で撹拌した。減圧ろ過し、白色の固体が得られ、無水メタノールとアセトンで洗浄し、真空乾燥した。水/メタノール/アセトンで再結晶し、白色の粉末が43g 得られた。収率は86 ％であった。1H-NMR(ppm)δ ： 7.11(d,1H,2'-H) ；6.98(dd,1H,6'-H )；6.87(d,1H,5'-H)；6.64(s,2H,2,6-H )； 6.47(d,1H, J=12Hz,1a-H )；6.42(d,1H,J=12Hz,1a'-H)；4.18 (2H,q; -OCH2)；3.86(s,3H,4-OCH3)；3.70(s,6H,3,5-OCH3)；1.52 (3H,t; -CH3)。MS（m/Z）: 454(M+)。高分解能質量分析、計算値：454.08、実測値：454.06。
【実施例７】
【００８４】
エトキシコンブレタスタチンリン酸コリン内塩の製造:
ステップ 1：乾燥した500ml の三つ口フラスコに乾燥した三塩化リン68g(0.5mol)の100ml塩化メチレン溶液を注入した。体系を冷却し、0℃に保持し、乾燥したエチレングリコール31g(0.5mol)の100ml 塩化メチレン溶液を滴下した。滴下後室温に昇温し、3 時間反応を継続した。蒸留で溶媒を除去し、残液を減圧蒸留で60℃/20mmHg の留分を収集し、2-クロロ-1,3,2-ジオキサホスホランが41g 得られ、収率は65％であった。1H-NMR(CDCl3, 500M) δ: 4.46 (m, 2H, a-CHCH-),4.24 (m, 2H, e-CHCH-)。
【００８５】
ステップ 2： 100ml の三つ口フラスコに50ml の無水ベンゼンを入れ、さらに25.3g(0.2mol)の2-クロロ-1,3,2-ジオキサホスホランを加え、酸素ガスをゆっくり溶液に導入し、酸素ガスの導入を約1 時間続けた後、還流まで加熱し、還流のままで5〜6 時間反応させ、室温に冷却し、蒸留で溶媒を除去し、得られた残液を減圧蒸留で90℃/1mmHg の留分を収集し、2-クロロ-1,3,2-ジオキサホスホラン-2-オキシドが12.3g 得られ、収率は43％であった。1H-NMR(CDCl3, 500M) δ: 4.64(m, 2H, a-CHCH-), 4.56 (m, 2H, e-CHCH-)。
【００８６】
ステップ 3：アルゴン雰囲気下、エトキシコンブレタスタチン3.3g(10mmol)とトリエチルアミン1.0g(10mmol)を乾燥したベンゼン20ml に溶解させた。-40℃に冷却し、撹拌しながら、2-クロロ-1,3,2-ジオキサホスホラン-2-オキシド1.42g(10mmol)のベンゼン溶液20ml を滴下した。滴下後、半時間反応を継続した後、室温で撹拌を10 時間を続けた。ろ過でトリエチルアミンの塩酸塩を除去し、ろ液を減圧蒸留で一部の溶媒を除去し、さらに15％炭酸ナトリウム溶液15ml で洗浄し、ジエチルエーテル50ml を入れて抽出・分取した後、水層をさらにジエチルエーテル50mlで抽出し、エーテル層を合併し、10％炭酸ナトリウム溶液20ml×2 で洗浄した。乾燥、ろ過し、ジエチルエーテルを蒸留で除去した後、浅黄色の固体のリン脂質3.5g(収率81％)が得られた。前述リン脂質にアセトニトリル50ml を入れ、完全に溶解した後、トリメチルアミンの水溶液(28％)5ml を加え、室温で20 時間撹拌し、TLC でモニターした。反応完成後、アセトン50ml を入れ、-30℃に冷却し、撹拌しながら結晶化させた。減圧濾過、乾燥し、白色の粗製品が得られた。95％エタノールで再結晶し、白色の結晶が3g 得られ、収率は76％であった。1H-NMR(CDCl3, 500M)δ:7.27(d, 1H, 2′-H), 6.63(dd, 1H, 6′ -H), 6.51 (d, 1H, 5′ -H), 6.46 (d, 1H, 1a-H), 6.380(s,2H, 2, 6-H), 6.20 (d, 1H, 1a′ -H), 4.62 (m, 2H, a′CHCH-), 4.53 (m, 2H, e-CHCH-)，4.18 (2H,q;-OCH2)，3.86(s,3H,4-OCH3)；3.70(s,6H,3,5-OCH3)；3.18(s,9H, NMe3), 1.52 (3H,t; -CH3)。MS（m/Z）: 495(M+)。高分解能質量分析、計算値：495.20、実測値：495.22。
【実施例８】
【００８７】
3′-アミノエトキシコンブレタスタチングリシンアミドの製造:
ステップ 1： 3′-アミノエトキシコンブレタスタチン4.28g(13mmol)とFmoc-グリシン4.75g(16mmol)及びBOP 試薬22.7g(51.6mmol)を取ってDMF 100ml に溶解させた。撹拌しながら、反応混合物を60℃に加熱し、2 時間反応させ、TLC でモニターした。反応完成後、冷却し、飽和重炭酸ナトリウム溶液100ml を入れ、均一に混合した。塩化メチレン120ml×3 で抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。その後、快速カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、n-へキサン/酢酸エチル=2:1)によって、白色の泡沫状物質を3.3g 分離し、収率は42％であった。1H-NMR(CDCl3, 500M) δ:9.61（brs.1H, -NH）; 7.74(m, 2H, Fmoc); 7.59(d, 2H, J=6.2Hz,Fmoc); 7.37(m, 2H, Fmoc); 7.29(m, 2H, Fmoc); 7.08(d, 1H, 2'-H)； 6.92(dd, 1H, 6'-H)；6.76(d,1H, 5'-H)； 6.62(s, 2H, 2,6-H)； 6.49(d, 1H, J=12.2Hz, 1a-H)；6.43(d, 1H, J=12.2Hz, 1a'-H)；5.79（brs.1H, Gly-NH）; 4.38(d, 2H, J=7.0Hz, Fmoc); 4.22(t, 1H, J=7.0Hz, Fmoc); 4.18(2H,q; -CH2)；4.04(m, 2H, Gly-CH2); 3.86(s, 3H, 4-OCH3)； 3.70(s, 6H, 3,5-OCH3 )；1.55(3H, t;-CH3)。MS（m/Z）:608(M+)。高分解能質量分析、計算値：608.25、実測値：608.27。
【００８８】
ステップ 2：上述で得られた(Z)-1-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-2-(3′-アミノ-4′-エトキシフェニル)-エチレン-Fmoc-グリシンアミド2.2g(3.6mmol)を取ってメタノール40ml に溶解させた。撹拌しながら、2N 水酸化ナトリウム溶液を2ml 入れ、室温で3 時間反応させ、TLC でモニターした。反応完成後、冷却し、飽和重炭酸ナトリウム溶液20ml を入れ、均一に混合した。塩化メチレン50ml×3 で抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。その後、常圧カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、塩化メチレン/メタノール=9:1)によって、無色の泡沫状物質を0.97g 分離し、収率は70％であった。1H-NMR(CDCl3,500M) δ:9.61（brs.1H,-NH）;7.08(d,1H,2'-H)；6.92(dd,1H, 6'-H )；6.76(d,1H,5'-H)；6.62(s,2H,2,6-H )；6.49(d,1H, J=12.2Hz,1a-H )；6.43(d,1H, J=12.2Hz,1a'-H)；4.81′4.32 (broad,2H, Gly-NH2)； 4.18 (2H,q; -CH2)；4.04(brs,2H, Gly-CH2); 3.86(s,3H, 4-OCH3)；3.70(s,6H,3,5-OCH3 )；1.55 (3H,t; -CH3)。MS（m/Z）:
386(M+)。高分解能質量分析、計算値：386.18、実測値：386.20。
【実施例９】
【００８９】
3′-アミノエトキシコンブレタスタチンセリンアミドの製造:
ステップ 1： 3′-アミノエトキシコンブレタスタチン4.28g(13mmol)とFmoc-セリン
5.89g(16mmol)及びDCC 3.37g(16mmol)とHOBt 2.44g を取ってDMF 80ml に溶解させた。撹拌しながら、反応混合物を室温で5 時間反応させ、TLC でモニターした。反応完成後、冷却し、酢酸エチル50ml を入れて希釈し、均一に混合した。ろ過し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。その後、快速カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、n-へキサン/酢酸エチル=2:1)によって、白色の泡沫状物質を5.1g 分離し、収率は61％であった。1H-NMR(CDCl3 ,500M) δ:9.73（ brs.1H,-NH ）; 7.73(m,2H,Fmoc); 7.56 (d,2H,J=6.2Hz,Fmoc); 7.35(m,2H,Fmoc);7.22(m,2H,Fmoc); 7.05 (d,1H,2'-H)；6.91(dd,1H, 6'-H )；6.74(d,1H,5'-H)；6.60(s,2H, 2,6-H )；6.51(d,1H,J=12.2Hz,1a-H) ； 6.43(d,1H,J=12.2Hz,1a'-H) ； 5.82 （brs.1H,Ser-NH）;4.63(brs.1H,Ser-OH) 4.38 (d, 2H,J=7.0 Hz ,Fmoc); 4.22(t,1H,J=7.0 Hz ,Fmoc); 4.18(2H,q; -CH2)；3.91(m,1H, Ser-CH); 3.85(s,3H,4-OCH3)；3.71(s,6H, 3,5-OCH3 )；2.66(m,2H,Ser-CH2) 1.56 (3H,t; -CH3)。MS（m/Z）: 638(M+)。高分解能質量分析、計算値：638.26、実測値：638.27。
【００９０】
ステップ 2：上述で得られた(Z)-1-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-2-(3′-アミノ-4′-エトキシフェニル)-エチレン-Fmoc-セリンアミド1.9g(3.0mmol)を取ってメタノール20ml と塩化メチレン20ml の混合溶媒に溶解させた。撹拌しながら、2N 水酸化ナトリウム溶液を3.4ml 入れ、室温で24 時間反応させ、TLC でモニターした。反応完成後、冷却し、飽和塩化ナトリウム溶液20mlを入れ、均一に混合した。塩化メチレン50ml×3 で抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。その後、常圧カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、塩化メチレン/メタノール=9:1) によって、無色の泡沫状物質を0.62g 分離し、収率は50 ％であった。1H-NMR(CDCl3 ,500M) δ:9.75 （ brs.1H,-NH ）; 7.08 (d,1H,2'-H) ； 6.94(dd,1H, 6'-H ) ；6.75(d,1H,5'-H)；6.63(s,2H, 2,6-H )；6.53(d,1H, J=12.2Hz, 1a-H )；6.45(d,1H, J=12.2Hz,1a'-H)；5.51-4.72（brs.2H, Ser-NH2）;4.52(brs.1H,Ser-OH); 4.19 (2H,q; -CH2)；3.92(m,1H,Ser-CH); 3.86(s,3H,4-OCH3)；3.72(s,6H, 3,5-OCH3 )；2.68(m,2H, Ser-CH2) 1.57(3H,t; -CH3)。MS（m/Z）: 416(M+)。高分解能質量分析、計算値：416.19、実測値：416.20。
【００９１】
（比較例）
プロポキシコンブレタスタチンの製造
実施例１に従って、ブロムエタンの代わりに、n-ブロムプロパンを用いて、4-プロポキシ-3-メトキシベンズアルデヒドが製造された。その後、実施例3 と4 に従って、プロポキシコンブレタスタチンが製造された。1H-NMR(ppm)δ：7.02(d,1H,2'-H)；6.94(dd,1H,6'-H )；6.80(d,1H,5'-H)；6.62(s,2H,2,6-H )；6.46(d,1H, J=12Hz,1a-H )；6.40(d,1H, J=12Hz,1a'-H)；5.51(broad,1H；OH)；4.16 (q, 2H; -CH2)；3.86(s,3H,4-OCH3)；3.70(s,6H,3,5-OCH3)；2.27(m,2H; -CH2)；1.18 (3H,t; -CH3)。MS（m/Z）: 344(M+)。高分解能質量分析、計算値：344.18、実測値：344.16。
【実施例１０】
【００９２】
生体外抗腫瘍活性の評価
生体外で培養された腫瘍細胞にエトキシコンブレタスタチン誘導体で72 時間処理した後、MTT或はSRB 方法で、腫瘍増殖に対する抑制効果を評価し、CA-4 と比較した。
【００９３】
（細胞株）：H460：ヒト肺癌細胞、SGC7901：ヒト胃癌細胞、HT-29：ヒト結腸癌細胞、Bel-7402：ヒト肝臓癌細胞。
（実験設計）：細胞は異なる濃度の化合物(それぞれ100、10、1、0.1、0.01、0.001 μM)と72 時間インキュベートし、SRB 方法で、化合物の細胞増殖に対するの抑制効果を評価し、抑制率を算出して、IC50 を抑制率によってLogit 法を用いて算出し、化合物の生体外抗腫瘍活性を比較した。
【００９４】
（抑制率の計算方法）：
抑制率(%) =(対照群のOD 値−投与群のOD 値)／対照群のOD 値×100%
【００９５】
【表１】
2010502656.tif 000020
【００９６】
結果から、エトキシコンブレタスタチン誘導体の生体外抗腫瘍活性は天然化合物であるコンブレタスタチンA-4 と比べ、異なる種類の癌細胞株のいずれにおいても大きく、特に、結腸癌に対する抑制活性はCA-4 よりも50〜95 倍も大きいことがわかった。これに対し、比較例で製造された対照物であるプロポキシコンブレタスタチンは、抗腫瘍活性がほとんどないことがわかった。
【実施例１１】
【００９７】
生体外新生血管の抑制性能の評価
実施例10 の方法に従って、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を作用対象として、エトキシコンブレタスタチン誘導体の抗新生血管の性能を調べた。
【００９８】
【表２】
2010502656.tif 000021
【００９９】
結果から、エトキシコンブレタスタチン誘導体が強いチューブリン重合の抑制性能を持つことを示され、エトキシコンブレタスタチン誘導体が一種の潜在的な腫瘍血管のターゲティング薬物であることを示唆された。これに対し、比較例で製造された対照物であるプロポキシコンブレタスタチンは、この特性がほとんどないことがわかった。
【実施例１２】
【０１００】
エトキシコンブレタスタチンリン酸二ナトリウム塩の冷凍乾燥粉剤
【０１０１】
【表３】
2010502656.tif 000022
【０１０２】
配合量に従って精密に原料を秤量し、配合量のマンニトールを投入し、約全配合量の80％の注射用水を加えて完全に溶解するまで撹拌し、清澄溶液が得られ、0.1％(g/ml)の注射用活性炭を添加し、均一に撹拌し、約10 分間静置し、0.45μm のミリポア膜でろ過し、全量まで注射用水を追加した。さらに、0.22μm のミリポア膜でろ過し、ｐH 値と含有量を測定し、合格の場合、所定量で充填し、凍結乾燥し、窒素を導入し、栓を押し込み、アルミニウムの蓋をつけ、ラベルを貼り、包装し、抽選で合格であれば、製品になった(全部のプロセスは暗室状態で)。
【０１０３】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるのである。
【図１】
2010502656.tif 000031
【図２】
2010502656.tif 000032
【国際調査報告】
2010502656.tif 000033
2010502656.tif 000034
2010502656.tif 000035
2010502656.tif 000036
2010502656.tif 000037
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