(57)【要約】本発明は、糖尿病、およびメタボリック症候群（インスリン抵抗性を含む）などの関連障害を、抗体、抗体フラグメント、ｓｉＲＮＡおよびアプタマーを含むオステオポンチン（ＯＰＮ）の阻害剤を投与することにより治療するための方法を、提供する。さらに開示されるのは、ＯＰＮの阻害剤を投与することによって、対象における細胞によるグルコース取込みを増加させるための方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン抵抗性である対象におけるインスリン感受性を増加させる方法であって、対象におけるオステオポンチン活性を減少させることを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
前記対象がＩＩ型糖尿病である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オステオポンチン活性がオステオポンチン阻害剤の投与によって減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
阻害剤が、抗体、抗体フラグメント、ｓｉＲＮＡおよびアプタマーからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗体がヒト抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
抗体がヒト化抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記対象におけるグルコースの細胞取込みを増加させることをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記対象の体液におけるサイトカイン減少を測定することをさらに含んでなり、ここで、サイトカインが、レプチン、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、Ｃｘｃｌ１、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
対象における細胞によるグルコース取込みを増加させる方法であって、該対象にオステオポンチン阻害剤を投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項１１】
細胞が脂肪細胞またはその前駆体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
治療を必要とする対象におけるメタボリック症候群を治療する方法であって、該対象にオステオポンチン阻害剤を投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項１３】
前記メタボリック症候群が糖尿病である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記オステオポンチン阻害剤が、抗体、抗体フラグメント、ｓｉＲＮＡまたはアプタマーである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が抗体フラグメントまたは誘導体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
インスリン感受性、および筋肉もしくは肝細胞によるグルコース取込みを増加させる方法であって、筋肉または肝細胞それぞれにオステオポンチン阻害剤を投与することを含んでなる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[001]  本出願は、2007年4月17日に出願された米国仮出願第60/912,385の利益を主張し、該出願は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
[002]  本発明は、細胞によるグルコース取込みおよび対象におけるインスリン感受性を、オステオポンチン（ＯＰＮ）阻害剤の投与により制御する方法に関する。本発明は、さらに、ＯＰＮ阻害剤の投与による、２型糖尿病を含む糖尿病、およびメタボリック症候群（インスリン抵抗性を含む）などの関連障害の治療に関する。ＯＰＮ阻害剤は、α−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン増感剤、インスリン分泌促進剤、肝グルコース生産を低下させる化合物、Ｂ−３アゴニストまたはインスリンと併用投与されてもよい。また、ＯＰＮ阻害剤は、体重低減剤と併用投与されてもよい。
【背景技術】
【０００３】
[003]  肥満、加齢および２型糖尿病を伴うインスリン抵抗性は、骨格筋、肝臓、脂肪組織および免疫細胞に影響を及ぼす、ますます広まっている疾患である。チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）ファミリーの薬物は、２型糖尿病、多嚢胞性卵巣症候群および「シンドロームＸ」を含む多様な病理学的状態におけるインスリン抵抗性を治療するために用いられる（Berger JPら、PPARs: therapeutic targets for metabolic disease. Trends in Pharmacological Sciences 26: 244-251、2005年；Bruemmer Dら、Angiotensin II-accelerated atherosclerosis and aneurysm formation is attenuated in osteopontin-deficient mice. J Clin Invest 112:1318-1331、2003年）。ＴＺＤは、筋肉、肝臓、結腸およびマクロファージに発現し、かつ脂肪組織に高発現している核内受容体タンパク質である、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）の合成リガンドである。活性化されたＰＰＡＲγは、正および負双方の遺伝子調節を仲介することが可能であり、そして、遺伝子プロモーター領域内ＤＮＡとの直接的および間接的な結合を介して遺伝子発現を調節する。ＰＰＡＲγの転写活性は、細胞型によって様々であり、そして、他のホルモンシグナル伝達経路および核内受容体活性によって調整される。ＴＺＤは、ＰＰＡＲγリガンドとして、多くの遺伝子の発現を調節し、そして、インスリンの作用を調節する正確な遺伝子はまだ同定されていないものの、特定の遺伝子の発現を変えることによってインスリン感受性を増強させる可能性がある。
[004]  脂肪細胞は、マクロファージの活性化および遊走を誘導する炎症性タンパク質を分泌することが可能である（Giorgino,F.ら、2005年、Acta Physiol Scand 183:13-30；Neels,J.G.ら、2006年、J Clin Invest 116:33-35）。肥満およびインスリン抵抗性は、ヒトおよびげっ歯類モデルにおける脂肪組織のマクロファージ浸潤と関連している（Bouloumie,A.ら、2005年、Curr Opin Clin Nutr Metab Care 8:347-354；Wellen,K.E.ら、2005年、J Clin Invest 115:1111-1119）。マクロファージおよび脂肪細胞により分泌される炎症促進性因子は、インスリン感受性を阻害し、肥満および２型糖尿病患者の血漿中で上昇しており、そして、ＰＰＡＲγの活性を抑制する（Grimble,R.F.、2002年、Curr Opin Clin Nutr Metab Care 5:551-559）。インスリン抵抗性のヒトおよびマウスのＴＺＤにより誘導されるインスリン感作は、脂肪組織における炎症性マーカー遺伝子発現およびマクロファージの低減を伴い（Xu,H.ら、2003年、J Clin Invest 112:1821-1830；Di Gregorio,G.B.ら、2005年、Diabetes 54:2305-2313）、これは、マクロファージおよび／もしくは脂肪細胞でＴＺＤによりＰＰＡＲγが活性化されたことによる可能性がある。マクロファージおよび脂肪細胞におけるＰＰＲＡγの活性化は、サイトカイン発現を抑圧し（Welch,J.S.ら、2003年、Proc Natl Acad Sci USA 100:6712-6717）、そしてそれによってインスリン感受性を増強し、そして脂肪組織におけるマクロファージの活性化および補充を低減させるであろう。脂肪組織の炎症およびマクロファージ浸潤を開始する正確な遺伝子は、分かっていない。
[005]  分泌型細胞外マトリックス結合タンパク質であるＯＰＮは、多様な生物活性を有し、その多くは、インスリン抵抗性および２型糖尿病に関連した研究に非常に重要である（（Wai,P.Y.ら、The role of osteopontin in tumor metastasis. 2004年、J Surg Res 121:228-241；Bruemmer,D.ら、2003年、Angiotensin II-accelerated atherosclerosis and aneurysm formation is attenuated in osteopontin-deficient mice. J Clin Invest 112:1318-1331）およびその中の参考文献）。例えば、ＯＰＮは、細胞の遊走および接着、マクロファージ活性化、炎症、組織石灰化、ならびにマトリックスリモデリングに関わる（Denhardt,D.T.ら、2001年、Role of osteopontin in cellular signaling and toxicant injury. Annu Rev Pharmacol Toxicol 41:723-749）。ＯＰＮは、高血糖性糖尿病の大動脈、アテローム性動脈硬化症、活性化マクロファージ、脂肪性肝炎、末期腎不全および骨粗しょう症などの、インスリン抵抗性および２型糖尿病に伴う多くの病態生理学的状態において、過剰発現している。しかしながら、これまで、ＯＰＮとインスリン抵抗性発症との関連性は報告されていない。ＯＰＮ発現の正のレギュレーターには、例えばＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦα、ＬＰＳ、レプチンおよびアンギオテンシンＩＩなどのサイトカイン類、活性酸素種、ならびに低酸素が含まれ（Bruemmer,D.ら、2003年；Denhardt,D.T.ら、2001年；Ogawa,D.ら、2005年、Liver X receptor agonists inhibit cytokine-induced osteopontin expression in macrophages through interference with activator protein-1 signaling pathways. Circ Res 96:e59-67）、これらがインスリン感受性を低下させる。ＰＰＡＲγおよびＬＸＲリガンドは、マクロファージモデル（Ogawa,D.ら、2005年；Oyama,Y.ら、2002年、PPARγ ligand inhibits osteopontin gene expression through interference with binding of nuclear factors to A/T-rich sequence in THP-1 cells. Circ Res 90:348-355）およびマウス大動脈（Keen,H.L.ら、2004年、Gene expression profiling of potential PPARγ target genes in mouse aorta. Physiol Genomics 18:33-42）において、ＯＰＮ発現をアンタゴナイズすることが示されている。ＯＰＮは、広範かつ不均一にリン酸化、グリコシル化およびタンパク質分解される（Christensen,B.ら、2005年、Post-translationally modified residues of native human osteopontin are located in clusters: identification of 36 phosphorylation and five O-glycosylation sites and their biological implications. Biochem J 390:285-292）。ＯＰＮの翻訳後修飾は、細胞型によって様々であって、かつ、その生物活性を差次的に調整する（Christensen,B.ら、2005年；Weber,G.F.ら、2002年、Phosphorylation-dependent interaction of osteopontin with its receptors regulates macrophase migration and activation. J Leukoc Biol 72:752-761）。ＯＰＮは、インテグリン類およびＣＤ４４に結合し、それらを介して、ホスファチジルイノシトール ３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ｓｒｃキナーゼおよびＮＦＬＢを含む下流の標的へとシグナル伝達することが可能である。
[006]  したがって、本発明は、ＯＰＮ阻害剤の投与によりグルコース取込みおよび／またはインスリン感受性を制御するための方法を提供する。さらに、本発明は、糖尿病および関連障害の新規治療、すなわち、ＯＰＮ阻害剤の投与を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Berger JPら、PPARs: therapeutic targets for metabolic disease. Trends in Pharmacological Sciences 26: 244-251、2005年
【非特許文献２】Bruemmer Dら、Angiotensin II-accelerated atherosclerosis and aneurysm formation is attenuated in osteopontin-deficient mice. J Clin Invest 112:1318-1331、2003年
【非特許文献３】Giorgino,F.ら、2005年、Acta Physiol Scand 183:13-30
【非特許文献４】Neels,J.G.ら、2006年、J Clin Invest 116:33-35
【非特許文献５】Bouloumie,A.ら、2005年、Curr Opin Clin Nutr Metab Care 8:347-354
【非特許文献６】Wellen,K.E.ら、2005年、J Clin Invest 115:1111-1119
【非特許文献７】Grimble,R.F.、2002年、Curr Opin Clin Nutr Metab Care 5:551-559
【非特許文献８】Xu,H.ら、2003年、J Clin Invest 112:1821-1830
【非特許文献９】Di Gregorio,G.B.ら、2005年、Diabetes 54:2305-2313
【非特許文献１０】Welch,J.S.ら、2003年、Proc Natl Acad Sci USA 100:6712-6717
【非特許文献１１】Wai,P.Y.ら、The role of osteopontin in tumor metastasis. 2004年、J Surg Res 121:228-241
【非特許文献１２】Bruemmer,D.ら、2003年、Angiotensin II-accelerated atherosclerosis and aneurysm formation is attenuated in osteopontin-deficient mice. J Clin Invest 112:1318-1331
【非特許文献１３】Denhardt,D.T.ら、2001年、Role of osteopontin in cellular signaling and toxicant injury. Annu Rev Pharmacol Toxicol 41:723-749
【非特許文献１４】Ogawa,D.ら、2005年、Liver X receptor agonists inhibit cytokine-induced osteopontin expression in macrophages through interference with activator protein-1 signaling pathways. Circ Res 96:e59-67
【非特許文献１５】Oyama,Y.ら、2002年、PPARγ ligand inhibits osteopontin gene expression through interference with binding of nuclear factors to A/T-rich sequence in THP-1 cells. Circ Res 90:348-355
【非特許文献１６】Keen,H.L.ら、2004年、Gene expression profiling of potential PPARγ target genes in mouse aorta. Physiol Genomics 18:33-42
【非特許文献１７】Christensen,B.ら、2005年、Post-translationally modified residues of native human osteopontin are located in clusters: identification of 36 phosphorylation and five O-glycosylation sites and their biological implications. Biochem J 390:285-292
【非特許文献１８】Weber,G.F.ら、2002年、Phosphorylation-dependent interaction of osteopontin with its receptors regulates macrophase migration and activation. J Leukoc Biol 72:752-761
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
[007]  本発明は、ＯＰＮの阻害剤の投与によりグルコース取込みおよび／またはインスリン感受性を制御する方法を提供する。さらに、本発明は、対象にＯＰＮの阻害剤を投与することにより糖尿病、および肥満などの関連疾患を治療する方法を提供する。本発明の方法において使用可能な適切なＯＰＮの阻害剤には、これに限定されないが、ＯＰＮ（またはＯＰＮの受容体）に結合し、その受容体へのＯＰＮの結合を阻害する抗体および抗体フラグメント、ＯＰＮ受容体ペプチドアンタゴニスト、ＯＰＮ  ｍＲＮＡに向けられたアンチセンス核酸、ならびに抗ＯＰＮリボザイムが含まれる。
[008]  別の側面において、本発明は、ＯＰＮ阻害剤を投与することにより細胞によるグルコース取込みを増加させる方法を提供する。このような方法は、糖尿病および関連疾患を治療するためだけでなく、高血糖などの不十分なグルコース代謝に起因するいくつかの全身性問題を治療するためにも用いることが可能である。
[009]  別の側面において、本発明は、低インスリン感受性である対象におけるインスリン感受性を増加させる方法であって、対象におけるＯＰＮ活性を減少させることを含んでなる方法を提供する。
[010]  本発明の方法はまた、ＯＰＮに対する構造および活性において関連している他の細胞外マトリックス結合タンパク質を、標的として用いて行うことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、ラットおよびヒトの脂肪組織におけるＯＰＮ  ＲＮＡレベルを示すグラフを表す。（１Ａ）は、ズッカー痩身（ｆａ／＋）、肥満（ｆａ／ｆａ）およびピオグリタゾンで治療された肥満ラットから得た脂肪組織のＯＰＮ  ＲＮＡレベルを表す。１群につき６動物である。（１Ｂ）は、正常なインスリン感受性を有する痩身患者およびインスリン抵抗性を有する肥満患者における、ピオグリタゾン治療前（黒色バー）および後（灰色バー）の脂肪組織のＯＰＮ  ＲＮＡレベルを表す。１群につき４〜７患者である。値は、平均±標準誤差である：＊ｐ＜０．０５  ｖｓ痩身；＃＜０．０５  ｖｓ治療前肥満。（１Ｃ）は、ピオグリタゾン治療前の個々の痩身患者（黒塗りシンボル）および肥満患者（白抜きシンボル）における、脂肪組織のＯＰＮ  ＲＮＡレベルとグルコース処理（Ｒｄ）率との相関を示す。
【図２】図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、インスリン感受性の特性評価を示すグラフを表す。正常血糖高インスリンクランプ試験を用いて、通常飼料または高脂肪食餌（ＨＦＤ）を与えられたＷＴ（黒色バー）およびＯＰＮ  ＫＯ（灰色バー）マウスにおける、（２Ａ）グルコース注入（Ｇｉｎｆ）、（２Ｂ）グルコース処理（ＧＤＲ）、および（２Ｃ）肝グルコース生産（ＨＧＯ）を計算した。値は、平均±標準誤差である。１群につき７〜９動物で試験した：＊ｐ＜０．０５  ｖｓ食餌が同じであるＷＴ、＃＜０．０５  ｖｓ系統が同じである、通常飼料。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、脂肪細胞の大きさを表す。（３Ａ）は、通常飼料（ＮＣ）またはＨＦＤを与えられたマウス群から得た、表皮白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）の代表的な組織像を示す。（３Ｂ）は、鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）およびｅＷＡＴの脂肪細胞の大きさの定量化を示す。ＷＴ  ｉＷＡＴ（黒色バー）、ＷＴ  ｅＷＡＴ（暗灰色バー）、ＯＰＮ  ＫＯ  ｉＷＡＴ（薄灰色バー）、ＯＰＮ  ＫＯ  ｅＷＡＴ（白色バー）。値は、平均±標準誤差である。１群につき７動物で試験した：＊ｐ＜０．０５  ｖｓ食餌が同じであるＷＴ、＃＜０．０５  ｖｓ系統が同じである、通常飼料。図３Ｃは、ＷＴ（黒塗りシンボル）およびＨＦＤを与えられたＯＰＮ  ＫＯマウス（白抜きシンボル）（ｎ＝７）における、脂肪体量と脂肪細胞の大きさとの相関を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、血漿中レプチンを表す。（４Ａ）は、ＥＬＩＳＡにより測定されたレプチンレベルを示す。ＷＴ（黒色バー）およびＯＰＮ  ＫＯ（灰色バー）マウスは、通常飼料またはＨＦＤを与えられた。値は、平均±標準誤差である。１群につき８〜１０動物で試験した：＊ｐ＜０．０５  ｖｓ食餌が同じであるＷＴ、＃＜０．０５  ｖｓ系統が同じである、通常飼料。（４Ｂ）は、ＷＴ（黒塗りシンボル）およびＯＰＮ  ＫＯマウス（白抜きシンボル）における、血漿中レプチンレベルと細胞の大きさとの相関を示す。（４Ｃ）は、血漿中レプチンレベルとｅＷＡＴの脂肪細胞の大きさとの相関である。（４Ｄ）は、ＨＦＤでのマウスの食餌摂取を、４回の暗周期にわたる３．５日間をかけて測定したものを示す。ＷＴマウス、ｎ＝５（黒色バー）、ＯＰＮ  ＫＯマウス、ｎ＝６（ハッシュバー）。値は、平均±標準誤差である：＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＷＴ。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、骨髄間質細胞の骨形成および脂肪生成分化を表す。ＮＣまたはＨＦＤを与えられたＷＴおよびＯＰＮ  ＫＯマウスの骨髄から得たＢＭＳＣを、１４日間培養し、そして次いで、示した日数の間、骨形成もしくは脂肪生成分化カクテルで晒した。（５Ａ）では、骨形成分化を、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）発現と比較したＡｋｐ２およびＯＳＸ  ＲＮＡ発現により、判断した。（５Ｂ）では、脂肪生成分化を、ＰＰＡＲγ  ＲＮＡ発現により判断した。挿入された棒グラフは、ＷＴ  ＢＭＳＣから得たデータを示す。実験は、１群につき４動物より単離した骨髄由来間葉系間質細胞（ＢＭＳＣ）を用いて、トリプリケートで実施した。遺伝子発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定し、そして、すべての遺伝子のデータを、ＧＡＰＤＨ  ＲＮＡ発現で正規化した。群は：ＮＣを与えられたＷＴマウス（黒色バー）、ＨＦＤを与えられたＷＴマウス（白色バー）、ＮＣを与えられたＯＰＮ  ＫＯマウス（暗灰色バー）、ＨＦＤを与えられたＯＰＮ  ＫＯマウス（薄灰色バー）である。値は、平均±標準誤差である：＊ｐ＜０．０５  ｖｓ食餌が同じであるＷＴ、＃ｐ＜０．０５  ｖｓ系統が同じである、通常飼料。
【図６】図６は、脂肪組織のサイトカインレベルを示すグラフを表す。サイトカインタンパク質レベルを、通常飼料またはＨＦＤを与えられたＷＴ（黒色バー）およびＯＰＮ  ＫＯ（灰色バー）マウスから得たｅＷＡＴライセートにおいて測定した。値は、平均±標準誤差である。１群につき８〜１０動物を試験した：＊ｐ＜０．０５  ｖｓ食餌が同じであるＷＴ、＃ｐ＜０．０５  ｖｓ系統が同じである、通常飼料。サイトカイン類は、ＩＬ−１β、一番目のパネル、上部左；ＩＬ−１２ｐ７０、二番目のパネル、左；ＩＦＮγ、三番目のパネル、左；ＩＬ−６、四番目のパネル、下部左；Ｃｘｃｌ１、一番目のパネル、上部右；ＩＬ−１０、二番目のパネル、右；ＴＮＦα、三番目のパネル、左；および、ＯＰＮ、四番目のパネル、下部右；である。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ＨＦＤを与えられたマウスにおける、インスリンにより刺激されたＡｋｔリン酸化を表す。１５分間ｉｎ  ｖｉｖｏでインスリン刺激した後のＳｅｒ４７３−Ａｋｔのリン酸化を、組織ライセートにおいて、ウェスタンブロッティング（７Ａ）およびＥＬＩＳＡ（７Ｂ）により測定した。ＥＬＩＳＡデータをグラフ化し、そして、全Ａｋｔタンパク質で正規化する：ＨＦＤを与えられたＷＴ（黒色バー）、ＨＦＤを与えられたＯＰＮ  ＫＯ（灰色バー）。各組織から得た代表的なウェスタンブロットを、対応する棒グラフの真上に示す。組織は、筋肉−腓腹筋、ｉＷＡＴ−鼠径部白色脂肪組織、ｅＷＡＴ−表皮白色脂肪組織；である。値は、平均±標準誤差である。１群につき８〜１０動物を試験した：＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＷＴ。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
定義
[018]  本明細書では、「ＯＰＮ阻害剤」または「ＯＰＮの阻害剤」の語は、ＯＰＮ活性を阻害可能な任意の剤を含み、これに限定されないが、ペプチド（ＯＰＮまたは他の関連しない配列に由来）、ドミナントネガティブタンパク質突然変異体、ペプチド模倣体、抗体もしくはそのフラグメント、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＯＰＮの作用を特異的に阻害する他の小分子が含まれる。
[019]  本明細書では、「ＯＰＮ活性」の語は、ＯＰＮにより仲介される任意の生物活性を含む。例えば、ＯＰＮは、細胞遊走および接着、マクロファージ活性化、炎症、組織石灰化、ならびにマトリックスリモデリングに関わることが知られている（Denhardtら、2001年）。ＯＰＮは、高血糖性糖尿病の大動脈、アテローム性動脈硬化症、活性化マクロファージ、脂肪性肝炎、末期腎不全および骨粗しょう症などの、インスリン抵抗性および２型糖尿病に伴う多くの病態生理学的状態において、過剰発現している。
[020]  本明細書では、「阻害する」の語は、部分的あるいは全体的な機能の減少を指す。例えば、遺伝子転写または発現の阻害は、これらの機能の完全な排除を含む、任意のレベルでのこれらの機能のダウンレギュレーションを指す。タンパク質活性の調整は、活性の完全な排除を含む、任意の活性減少を指す。
[021]  本明細書では、「糖尿病」の語は、Abelら、Diabetes Mellitus: A Fundamental and Clinical Text（1996年）530〜543ページに記載のような、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病を含む、すべての公知の糖尿病形態を含む。
[022]  本明細書では、「メタボリック症候群」の語は、特段に示されない限り、乾癬、真性糖尿病、創傷治癒、炎症、神経変性疾患、ガラクトース血症、メイプルシロップ尿症、フェニルケトン尿症、高サルコシン血症、チミン−ウラシル尿症（thymine uraciluria）、スルホニル尿症、イソ吉草酸血症、サッカロピン尿症、４−ヒドロキシ酪酸尿症、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損症を意味する。
[023]  本発明のＯＰＮ阻害剤は、典型的には、「実質的に純粋な」形態で対象に投与される。ＯＰＮ阻害剤は、当該技術分野において公知の任意の適切な手段により、実質的に精製されることが可能である。
[024]  「実質的に純粋な」の語は、本明細書では、自然界で付随している他のタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質を実質的に含まないＯＰＮを指すことが可能である。当業者は、標準的なタンパク質精製技術を用いて、ＯＰＮを精製することが可能である。実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上に単一の主要バンドを生じるであろう。ＯＰＮポリペプチドの純度は、アミノ末端アミノ酸配列解析によっても測定することが可能である。
[025]  本明細書では、「ＯＰＮ活性の調整」または「ＯＰＮレベルの調整」の語は、その天然状態と比較したＯＰＮ活性もしくはレベルの変化を指す。この変化は、正（アップレギュレーション）であっても、または負（ダウンレギュレーション）であってもよいが、ただし本発明の目的上、後者が望ましい。
[026]   筋、脂肪および肝細胞などの、本発明の方法によって標的とされる細胞には、培養維持されている単離細胞、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでの自然な状況にある細胞（例えば、胸筋、三頭筋、腓腹筋、四頭筋および腸肋筋などの脂肪組織または筋組織中、ならびに肝細胞）が含まれる。
[027]  「アンチセンス核酸」の語は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分と相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を指す（Weintraub、Scientific American 262:40（1990年））。細胞内で、アンチセンス核酸は、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。細胞が二本鎖のｍＲＮＡを翻訳しないことから、アンチセンス核酸はｍＲＮＡの翻訳を妨げる。簡単に合成でき、そして、標的のＯＰＮ産生細胞に導入する際により大きな分子よりも問題の起こる可能性が少ないことから、約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳を阻害するためのアンチセンス法の使用は、当該技術分野において周知である（Marcus-Sakura, Anal.Biochem. 172:289（1988年））。
[028]  本明細書では、「リボザイム」は、特定の核酸配列に対するヌクレアーゼ活性を有する核酸分子である。例えば、ＯＰＮ  ｍＲＮＡに特異的なリボザイムは、ＯＰＮ  ｍＲＮＡの特定領域に結合し、そしてそれを切断することによって、それを翻訳できないようにさせ、そしてＯＰＮポリペプチド産生の欠如となる。
[029]  本明細書では、「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）は、その内在性の細胞対応物の遺伝子／ｍＲＮＡの発現を減少させるかまたはサイレンシング（防止）させるＲＮＡ分子を意味する。当該用語は、「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）を包含することが理解される。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって仲介される、哺乳動物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程を指す（Fireら、1998年、Nature 391,806）。ＲＮＡ干渉応答は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般に称される、ｓｉＲＮＡを含有するエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とする場合があり、これは、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を仲介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央部で起こり得る（Elbashirら、2001年、Genes Dev.,15,188）。これらの用語および提唱されるメカニズムについての最近の情報に関しては、Bernstein E., Denli AM., Hannon GJ：The rest is silence. RNA. 2001 Nov;7(11):1509-21；および、Nishikura K.：A short primer on RNAi: RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst. Cell. 2001 Nov 16;107(4):415-8を参照されたい。
[030]  「ドミナントネガティブ突然変異体」とは、その自然状態から変異したＯＰＮタンパク質であって、かつ、ＯＰＮまたはＯＰＮ遺伝子と相互作用することによりその産生および／もしくは活性を阻害するタンパク質を指す。
[031]  本発明の「抗体」には、ＯＰＮポリペプチドまたはその機能的フラグメントと免疫反応性の抗体が含まれる。異なるエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体から本質的になる抗体、ならびに、別個のモノクローナル抗体調製物が、提供される。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により、抗原を含有するタンパク質フラグメントから作製される（Kohlerら、Nature 256:495（1975年））。本発明での「抗体」の語には、ＯＰＮ上のエピトープ決定基と結合可能な、無傷の分子、ならびに、ＦａｂおよびＦ(ａｂ’)２、ＦｖおよびＳＣＡフラグメントなどのそれらのフラグメントを含むことが意図される。
[032]  「Ｆａｂフラグメント」は、抗体分子の一価抗原結合フラグメントからなり、そして、全抗体分子を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖および重鎖の一部分からなるフラグメントを生じさせることにより、作製可能である。
[033]  抗体分子の「Ｆａｂ’フラグメント」は、全抗体分子をペプシンで処理し、続いて還元して、無傷の軽鎖および重鎖の一部分からなる分子を生じさせることにより、得ることが可能である。この方法で処理した一抗体分子につき、二つのＦａｂ’フラグメントが得られる。
[034]  抗体の「(Ｆａｂ’)２」は、全抗体分子を酵素ペプシンで処理し、それに続いて還元しないことにより、得ることが可能である。(Ｆａｂ’)２フラグメントは、二つのジスルフィド結合により結び付いた二つのＦａｂ’フラグメントの二量体である。
[035]  「Ｆｖフラグメント」は、二つの鎖として表される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する、遺伝子操作されたフラグメントとして定義される。
[036]  「一本鎖抗体」（ＳＣＡ）は、適切な可動性ポリペプチドリンカーにより連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する、遺伝子操作された一本鎖分子である。
【０００８】
本発明の方法における使用のためのＯＰＮ阻害剤
[037]  本発明における使用に適したＯＰＮ阻害剤には、これに限定されないが、ＯＰＮ由来ペプチド（例えば、成熟ＯＰＮまたはＯＰＮのプロドメイン）、またはＯＰＮ（もしくはＯＰＮの受容体）と結合し、そしてＯＰＮとその受容体との結合を阻害する非ＯＰＮペプチド、ＯＰＮドミナントネガティブ突然変異体、ＯＰＮ（もしくはＯＰＮの受容体）と結合し、そしてＯＰＮとその受容体との結合を阻害する抗体および抗体フラグメント、ＯＰＮ受容体ペプチドアンタゴニスト、ＯＰＮ  ｍＲＮＡに向けられたアンチセンス核酸、ならびに抗ＯＰＮリボザイムが含まれる。このように、ＯＰＮ阻害剤は、メッセージ（転写）レベルまたはタンパク質（発現もしくは活性）レベルにて作用することが可能である。
[038]  ＯＰＮ阻害性ペプチドを、当該技術分野において公知のペプチドもしくはタンパク質精製技術を用いて、ＯＰＮを発現している細胞の培地から同定および単離することが可能であり、それらの技術には、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、限外ろ過、電気泳動、および、ＯＰＮ阻害剤に特異的な抗体もしくはその一部分を用いた免疫親和性精製が含まれる。一実施態様では、ＯＰＮを発現する細胞の培養物から得た培地を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）にかける。次いで、得られた試料を、以下に記載のようにＯＰＮ阻害活性について試験する。
[039]  あるいは、ＯＰＮペプチド阻害剤を、ＯＰＮのフラグメントを阻害活性についてスクリーニングすることにより、同定することが可能である。ＯＰＮ活性の適切なアッセイは、例えば、細胞遊走、細胞接着またはマクロファージ活性化に基づくことが可能である。例えば、Wai,P.Y.ら、2004年；およびBruemmer,D.ら、2003年、同上、ならびに該文献中に引用されている方法を参照されたい。ＯＰＮフラグメントは、多様な公知の技術により作製可能である。例えば、ＯＰＮ配列にかかる特異的なオリゴペプチド（およそ１０〜２５アミノ酸長）を（例えば、化学的または組換えによって）合成し、そして、例えば本明細書に記載されるアッセイを用いて、そのＯＰＮ阻害能につき試験することが可能である。ＯＰＮペプチドフラグメントを、Bodansky,M. Principles of Peptide Synthesis、スプリンガー・ヴェルラグ、ベルリン（1993年）およびGrant,G.A（編）−Synthetic Peptides: A User's Guide、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー、ニューヨーク（1992年）に記載されたものなどの標準的な技術を用いて、合成することが可能である。自動ペプチド合成機は、市販されている（例えば、Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600）。
[040]  あるいは、天然の、もしくは組換えにより作製されたＯＰＮを、例えばプロテアーゼ（例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシンまたはペプシン）を用いることによって消化することにより、ＯＰＮフラグメントを作製することが可能である。コンピュータ解析（例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、モレキュラー・シミュレーションＩｎｃ．などの市販のソフトウェアを用いる）を、タンパク質分解性切断部位を同定するために用いることが可能である。
[041]  本発明の方法において用いられるＯＰＮ阻害剤は、好ましくは単離されている。本明細書では、「単離された」もしくは「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性なペプチドは、ＯＰＮタンパク質もしくはペプチドが由来する細胞または組織源からの細胞物質または他の混入タンパク質を実質的に含まないか、あるいは、化学合成された場合は、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」の言語は、ＯＰＮタンパク質またはそのペプチドの調製物であって、該タンパク質またはそのペプチドが、それが単離される、もしくは組換えによって作製される細胞の細胞構成成分から分離されているものを含む。一実施態様において、「細胞物質を実質的に含まない」の言語は、非ＯＰＮタンパク質またはそのペプチド（「混入タンパク質」とも称される）が約３０％未満（乾燥重量による）、より好ましくは非ＯＰＮタンパク質もしくはそのペプチドが約２０％未満、よりいっそう好ましくは非ＯＰＮタンパク質もしくはそのペプチドが約１０％未満、そして最も好ましくは非ＯＰＮタンパク質もしくはそのペプチドが約５％未満である、ＯＰＮタンパク質またはそのペプチドの調製物を含む。ＯＰＮタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換えによって作製される場合、それは培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地が、タンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満である。
[042]  このようなタンパク質分解性切断されたＯＰＮペプチドを作製および単離するために、二工程の方法を用いることが可能である。第一工程は、ＯＰＮタンパク質の酵素消化を伴う。ＯＰＮは、ＣＨＯ細胞条件培地等から二量体として、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくは酵母において単量体として産生させるか、あるいは、天然にＯＰＮを産生する細胞から単離することが可能である。例えばＨＰＬＣクロマトグラフィによる、ＯＰＮ単量体もしくは二量体の精製に続いて、その酵素消化を、以下に記載のように実施する。消化中に切断されるアミノ酸は、当該技術分野において公知のように、実験に用いる特定のプロテアーゼに応じて決まる。例えば、選択したプロテアーゼがトリプシンであるならば、切断部位はアミノ酸アルギニンおよびリジンとなるであろう。ＯＰＮタンパク質を、このようなプロテアーゼの１またはそれより多くを用いて消化することが可能である。
[043]  消化後に、第二工程は、タンパク質消化によって得られるペプチド画分の単離を伴う。これは、例えば、以下に記載のような高分解能ペプチド分離によって成し遂げることが可能である。画分を単離した後に、そのＯＰＮ阻害活性を、以下に記載のように、適切なバイオアッセイにより試験することが可能である。
[044]  タンパク質分解によるか、もしくは合成のＯＰＮフラグメントは、例えば部分的もしくは完全に、ＯＰＮの機能を阻害するために必要な数のアミノ酸残基を含んでなることが可能であり、そして好ましくは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれより多くのアミノ酸長を含んでなる。
[045]   他の好ましいＯＰＮのペプチド阻害剤は、ＯＰＮタンパク質の表面（例えば、親水性領域）にあり、そして、高抗原性の領域または高い表面可能性スコアのフラグメントを、当業者に周知のコンピューター解析プログラムを用いて同定することが可能である（HoppおよびWood（1983年）Mol.Immunol. 20,483-9、KyteおよびDoolittle（1982年）J.Mol.Biol. 157,105-32、CorriganおよびHuang（1982年）Comput.Programs Biomed 3,163-8）。
[046]  あるいは、抗ＯＰＮ抗体または抗体フラグメントを、ＯＰＮ活性を阻害するために対象に直接投与することが可能である。好ましい抗体には、ヒト化、キメラおよびヒトモノクローナルまたはそのフラグメントを含む、モノクローナル抗体が含まれる。
[047]  あるいは、米国特許第5,795,872、Riciglianoら、「DNA construct for immunization」（1998年）および米国特許第5,643,578、Robinsonら、「Immunization by inoculation of DNA transcription unit」（1997年）に開示されるものなどのＤＮＡ免疫テクノロジーを用いて、対象（例えば、ＯＰＮノックアウトマウス）をＯＰＮを発現するプラスミドで免疫することも可能である。
[048]  ＯＰＮに向けられた抗体分子を、哺乳動物から単離し（例えば、血液から）、そして、ＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィなどの周知の技術により、さらに精製することが可能である。例えば、抗ＯＰＮ力価が最も高いときなどの免疫後の適切な時点で、抗体産生細胞を対象から得て、そして、これを用いて、例えば、KohlerおよびMilstein（1975年）Nature 256:495-497により最初に記載されたハイブリドーマ技術（Brownら（1981年）J.Immunol 127:539-46；Brownら（1980年）J.Biol.Chem. 255:4980-83；Yehら（1976年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:2927-31；およびYehら（1982年）Int.J.Cancer 29:269-75もまた参照されたい）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら（1983年）Immunol Today 4:72)、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Coleら（1985年）、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss,Inc.、77〜96ページ）、あるいはトリオーマ技術などの標準技術により、モノクローナル抗体を調製することが可能である。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製するためのテクノロジーは、周知である（一般的に、R.H.Kenneth、Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses、プレナム・パブリッシングＣｏｒｐ．、ニューヨーク、ニューヨーク州、（1980年）；E.A.Lerner（1981年）Yale J.Biol.Med. 54:387-402；M.L.Gefterら（1977年）Somatic Cell Genet. 3:231-36を参照されたい）。簡潔には、不死細胞株（典型的には、骨髄腫）を、ＯＰＮ免疫原で上述のように免疫した哺乳動物から得たリンパ球（典型的には、脾細胞）と融合させ、そして、生じたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、ＯＰＮと結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
[049]  リンパ球と不死化細胞株とを融合させるために用いられる多くの周知のプロトコールのいずれもを、抗ＯＰＮモノクローナル抗体を作出する目的で適用することが可能である（例えば、G.Galfreら（1977年）Nature 266:55052；Gefterら、Somatic Cell Genet、上記に引用；Lerner、Yale J.Biol.Med.、上記に引用；Kenneth、Monoclonal Antibodies、上記に引用、を参照されたい）。さらに、当業者は、同じく有用であろうこのような方法の多くの変形形態があることを、理解するであろう。典型的には、不死細胞株（たとえば、骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えば、本発明の免疫原性調製物で免疫したマウスから得たリンパ球を不死化マウス細胞株と融合させることによって、ネズミハイブリドーマを作製することが可能である。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン含有培養培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性のマウス骨髄腫細胞株である。例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株などの、多数の骨髄腫細胞株のいずれもを、標準技術による融合パートナーとして用いることが可能である。これらの骨髄腫株は、ＡＴＣＣより入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞を、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾細胞と融合させる。次いで、融合により生じたハイブリドーマ細胞を、融合していない、および非産生的に融合している骨髄腫細胞（融合していない脾細胞は、形質転換されていないため数日後に死ぬ）を死滅させるＨＡＴ培地を用いて、選択する。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、例えば標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ハイブリドーマ培養上清をＯＰＮと結合する抗体についてスクリーニングすることにより、検出する。次いで、抗体を、例えば本明細書に記載したアッセイを用いて、ＯＰＮ阻害活性につき試験することが可能である。
[050]  本明細書では、「バイオアッセイ」の語には、ＯＰＮ阻害剤を同定するように設計された任意のアッセイが含まれる。アッセイは、ＯＰＮ阻害剤がＯＰＮの生物学的機能の１またはそれより多くを阻害可能であるかどうかを同定するのに適した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイであることが可能である。適切なバイオアッセイの例には、ＤＮＡ複製アッセイ、転写ベースのアッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞前駆体の分化に基づくアッセイ、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース取込み制御に基づくアッセイ、および免疫学的アッセイが含まれる。
【０００９】
使用
[051]  一実施態様において、本発明の方法をｉｎ  ｖｉｖｏで用いて、インスリン感受性および／または細胞によるグルコース取込みを増加させることが可能である。
[052]  別の実施態様では、本発明の方法を用いて、インスリン機能不全（例えば、抵抗性、不活性または欠損症）および／または細胞内への不十分なグルコース輸送を特徴とする疾患を治療することが可能である。このような疾患には、これに限定されないが、糖尿病、高血糖および肥満が含まれる。他の疾患には、インスリン抵抗性などの、肥満により誘導され得るメタボリック症候群、多嚢胞性卵巣症候群および加齢が含まれる。
[053]  別の実施態様では、本発明の方法を用いて、インスリン機能不全（例えば、抵抗性、不活性または欠損症）および／または細胞内への不十分なグルコース輸送を特徴とする疾患を治療することが可能である。このような疾患には、これに限定されないが、糖尿病、高血糖および肥満が含まれる。
[054]  別の実施態様では、本発明の方法を用いて、ＯＰＮを利用して脂肪細胞におけるグルコース取込みまたはグルコース代謝を検討する、新規ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを創出することが可能である。Ｉｎ  ｖｉｖｏで筋肉および脂肪に特異的に発現しているＯＰＮは、脂肪細胞特異的遺伝子の発現を直接もしくは間接的に抑制することによって、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の分化を阻害する。したがって、３Ｔ３−Ｌ１細胞系において、ＯＰＮをこれらの遺伝子のプロトタイプレギュレーターとして用いることが可能である。この系は、脂肪細胞特異的遺伝子発現の調節および分子のタンパク質活性におけるＯＰＮの役割を理解するためのモデルであることが可能であり、該分子には、これに限定されないが、転写因子、シグナル伝達タンパク質、レプチン、脂肪酸結合タンパク質、脂肪酸合成酵素、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体、脱共役タンパク質１および２、ならびに、ＯＰＮの作用によって活性化、不活化または修飾される分子が含まれる。
[055]  別の実施態様において、ＯＰＮ阻害剤は、ｓｉＲＮＡであることが可能である。近年、ＲＮＡｉが、遺伝子不活化の最も効率的な方法の一つとして出現してきた（Nature Reviews、2002年、v.3、737〜47ページ；Nature、2002年、v.418、244〜51ページ）。方法として、それは、特定のタンパク質複合体に入り込み、次いで相補的な細胞ＲＮＡを標的とし、そしてそれを特異的に分解する、ｄｓＲＮＡ種の能力に基づく。より詳細には、ｄｓＲＮＡは、ＩＩＩ型ＲＮＡｓｅ（ＤＩＣＥＲ、Ｄｒｏｓｈａ等）によって短い（１７〜２９ｂｐ）阻害的ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと消化される（Nature、2001年、v.409、363〜6ページ；Nature、2003年、425、415〜9ページ）。これらのフラグメントおよび相補的ｍＲＮＡは、特定のＲＩＳＣタンパク質複合体によって認識される。全過程の結果として、標的ｍＲＮＡがエンドヌクレアーゼ切断される（Nature reviews、2002年、v.3、737〜47ページ；Curr Opin Mol Ther. 2003年6月；5(3):217-24）。既知の遺伝子に対してｓｉＲＮＡをどのように設計および調製するかに関する開示については、例えば、Chalk AM, Wahlestedt C, Sonnhammer EL. Improved and automated prediction of effective siRNA. Biochem.Biophys.Res.Commun. 2004年6月18日;319(1):264-74；Sioud M., Leirdal M., Potential design rules and enzymatic synthesis of siRNAs, Methods Mol  Biol. 2004年；252:457-69；Levenkova N, Gu Q, Rux JJ：Gene specific siRNA selector Bioinformatics. 2004年2月12日:20(3):430-2、および、Ui-Tei K, Naito Y, Takahashi F, Haraguchi T, Ohki-Hamazaki H, Juni A, Ueda R, Saigo K., Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference, Nucleic Acids Res. 2004年2月9日;32(3):936-48を参照されたい。Liu Y, Braasch DA, Nulf CJ, Corey DR. Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids Biochemistry, 2004年2月24日;43(7):1921-7もまた参照されたい。修飾された／より安定なｓｉＲＮＡの作製に関しては、ＰＣＴ公開WO 2004/015107（Atugen）およびWO 02/44321（Tuschlら）、ならびに、Chiu YL, Rana TM. siRNA function in RNAi: a chemical modification analysis, RNA 2003年9月;9(9):1034-48、ならびに米国特許第5898031および6107094（Crooke）もまた参照されたい。
[056]  細胞内でｓｉＲＮＡを作出可能なＤＮＡベースのベクターが、開発された。方法は、一般的には、効率的にプロセシングされて細胞内でｓｉＲＮＡを形成する、短いヘアピンＲＮＡの転写を伴う。Paddisonら、PNAS 2002年、99:1443-1448；Paddisonら、Genes & Dev 2002年、16:948-958；Suiら、PNAS 2002年、8:5515-5520；および、Brummelkampら、Science 2002年、296:550-553。これらの報告は、多数の内因性および外因性発現遺伝子を特異的に標的とすることが可能なｓｉＲＮＡを作出するための方法を記載している。
[057]  ｓｉＲＮＡの送達に関しては、例えば、Shenら（FEBS letters 539:111-114（2003年））、Xiaら、Nature Biotechnology 20:1006-1010（2002年）、Reichら、Molecular Vision 9:210-216（2003年）、Sorensenら（J.MoI.Biol. 327:761-766（2003年）、Lewisら、Nature Genetics 32:107-108（2002年）、および、Simeoniら、Nucleic Acids Research 31, 11:2717-2724（2003年）を参照されたい。近年、ｓｉＲＮＡを、霊長類における阻害に用いることに成功した；さらなる詳細については、Tolentinoら、Retina 24(1) 2004年2月、132〜138ページを参照されたい。
[058]  本発明の方法についてのその他の使用に関しては、以下の実施例および特許請求の範囲から、当業者に明らかであろう。
【００１０】
医薬組成物中ＯＰＮ阻害剤の投与
[059]  本発明の方法において用いられるＯＰＮ阻害剤は、一般的に、適切な医薬組成物の形態で対象に投与される。このような組成物は、典型的には、阻害剤および医薬的に許容可能なキャリアを含有する。本明細書では、「医薬的に許容可能なキャリア」の言語は、医薬投与に適合する任意およびすべての溶剤、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含むことが意図される。医薬的に活性な物質へのこのような媒質および剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の慣用の媒質または剤がＯＰＮ阻害剤と不適合である場合を除き、組成物中でのその使用が企図される。補助的な活性化合物もまた、組成物中に組み入れることが可能である。
[060]  本発明の医薬組成物は、その目的とする投与経路と適合するように処方物化される。適切な投与経路の例には、例えば静脈内、皮内、皮下などの非経口、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が含まれる。非経口、皮内もしくは皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、以下の構成成分を含むことが可能である：注射用水などの無菌希釈剤、生理食塩液、固定油、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン類などの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液、ならびに、塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの浸透圧調整剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することが可能である。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数回投与用バイアルに封入することが可能である。
[061]  注射使用に適した医薬組成物には、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、ならびに、無菌注射用溶液または分散液の即時調製用無菌粉末が含まれる。静脈内投与に関しては、適切なキャリアには、生理食塩液、静菌水、クレモフォアＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー州）またはリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）が含まれる。あらゆる場合において、組成物は無菌でなければならず、かつ、容易な注入可能性（syringability）が存在する程度の液体であるべきである。それは、製造および保管条件下で安定でなければならず、かつ、細菌および真菌などの微生物の混入作用に抗して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適切な混合物を含有する、溶剤または分散媒であることが可能である。適切な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合においては必要とされる粒子の大きさの維持によって、および、界面活性剤の使用によって、維持することが可能である。微生物の作用の阻止を、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の種々の抗菌剤および抗真菌剤によって成し遂げることが可能である。多くの場合、例えば糖類、マンニトール（manitol）、ソルビトールなどのポリアルコール類、塩化ナトリウムなど、等張剤を組成物中に含むことが好ましいであろう。注射用組成物の吸収延長を、吸収を遅延させる剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物中に含むことによってもたらすことが可能である。
[062]   必要量のＯＰＮ阻害剤を上記に列挙した成分の一つまたは組み合わせとともに適切な溶剤中に組み入れた後、必要に応じてろ過滅菌することにより、無菌注射用溶液を調製することが可能である。一般的に、分散液は、基本的な分散媒と上記に列挙したもののうち必要な他成分とを含有する無菌媒体にＯＰＮ阻害剤を組み入れることにより、調製される。無菌注射用溶液調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であって、あらかじめ無菌ろ過したその溶液から、任意のさらなる所望の成分の加えられた活性成分の粉末を得る。
[063]  経口組成物には、一般的に、不活性希釈剤または可食性キャリアが含まれる。それらは、ゼラチンカプセルに封入されるか、または錠剤へと圧縮されることが可能である。経口治療投与の目的で、ＯＰＮ阻害剤を賦形剤とともに組み入れ、そして、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で用いることが可能であり、経口組成物はまた、マウスウォッシュとしての使用のための液体キャリアを用いても調製可能であって、その場合、液体キャリア中の化合物を経口適用し、そしてゆすぎ、そして吐き出すかもしくは飲み込む。医薬的に適合性の結合剤および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれることが可能である。錠剤、ピル、カプセル、トローチ等は、任意の以下の成分、または同様な性質の化合物を含有することが可能である：微結晶性セルロース、トラガントガムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、プリモジェルまたはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステローツ（Sterotes）などの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；ショ糖またはサッカリンなどの甘味料；あるいは、ハッカ、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料などの着香料。
[064]  吸入による投与では、化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素などの気体）を含有する加圧型容器もしくはディスペンサーからエアゾールスプレーの形態で、あるいはネブライザーの形態で、送達される。
[065]  全身性投与は、経粘膜もしくは経皮的手段によっても可能である。経粘膜または経皮投与では、関門を透過するのに適した浸透剤が処方物中に用いられる。このような浸透剤は、一般的に、当該技術分野において公知であり、そして、例えば、経粘膜投与に関しては、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐剤の使用によって成し遂げることが可能である。経皮投与に関しては、活性化合物は、当該技術分野において一般的に公知のように、軟膏（ointment）、軟膏（salve）、ジェルまたはクリーム中に処方物化される。
[066]  ＯＰＮ阻害剤を、坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリド類などの慣用の坐剤基剤を用いる）または停留浣腸の形態で、直腸への送達用に調製することもまた可能である。
[067]  一実施態様において、ＯＰＮ阻害剤は、植込錠およびマイクロカプセル送達システムを含む徐放性処方物などの、化合物を体内からの急速な排泄に対して保護するであろうキャリアを用いて、調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物類、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類およびポリ乳酸などの、生分解性の生体適合性ポリマーを用いることが可能である。このような処方物の調製方法は、当業者に明らかであろう。材料はまた、アルザ・コーポレーションおよびノバ・ファーマシューティカルズＩｎｃ．からも商品として入手することが可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する、感染細胞を標的とするリポソームを含む）もまた、医薬的に許容可能なキャリアとして使用可能である。これらは、例えば、米国特許第4,522,811に記載のような当業者に公知の方法にしたがって、調製することが可能である。
[068]   投与の容易性および投与量の均一性のために、投与量単位形態で経口もしくは非経口組成物を処方物化することが、特に好都合である。投与量単位形態とは、本明細書では、治療される対象に対する単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要とされる医薬キャリアと併せて、所望の治療効果を作り出すように計算されたあらかじめ決められた量の活性化合物を含有する。本発明の投与量単位形態の詳細は、活性化合物の独自の特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに個体治療用にこのような活性化合物を配合する技術に固有の限界により決定され、かつ直接的に依存する。
[069]  このような化合物の毒性および治療有効性を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療効果的な用量）を決定するための、細胞培養物もしくは実験動物における標準的な医薬的手順によって、測定することが可能である。毒性効果と治療効果の用量比は、治療指数であって、かつ、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことが可能であり、大きな治療指数を呈するＯＰＮ阻害剤が好ましい。毒性副作用を呈するＯＰＮ阻害剤を使用してもよいが、このようなＯＰＮ阻害剤に罹患組織の部位を標的とさせる送達システムを設計するには、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小化し、そしてそれにより副作用を低減させるために、注意が払われるべきである。
[070]  細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトにおける使用のための投与量範囲を処方するのに用いることが可能である。このような化合物の投与量は、ほとんどもしくは全く毒性を伴わない、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用する剤形および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変化してもよい。本発明の方法において用いられる任意のＯＰＮ阻害剤について、治療有効用量を、まず、細胞培養アッセイから推定することが可能である。細胞培養において測定されたＩＣ５０（すなわち、徴候の最大阻害の半分を達成する試験ＯＰＮ阻害剤の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲に達するように、動物モデルにおいて、用量を処方してもよい。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することが可能である。血漿中レベルを、例えば高速液体クロマトグラフィにより、測定してもよい。
[071]  医薬組成物は、投与のための説明書とともに、容器、パックまたはディスペンサーに含まれることが可能である。
[072]  例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤などの、本発明のＯＰＮ阻害剤を、さらに、ベクター内に挿入し、そして遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療用ベクターを、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第5,328,470を参照されたい）または定位注射（例えば、Chenら（1994年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3054-3057を参照されたい）により、対象に送達することが可能である。遺伝子治療用ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈剤中に遺伝子治療用ベクターを含むか、あるいは、遺伝子送達媒体が埋め込まれた徐放性マトリックスを含んでなることが可能である。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを組換え細胞から完全な状態で産生可能である場合（例えば、レトロウイルスベクター）、医薬調製物は、遺伝子送達システムを産生する１またはそれより多くの細胞を含むことが可能である。
[073]  遺伝子治療における使用に適したベクターは、当該技術分野において公知である。例えば、アデノウイルス由来ベクターを用いることが可能である。アデノウイルスのゲノムを、それが目的とする遺伝子産物をコードし、そして発現するが、ただし正常な溶解ウイルス生活環におけるその複製能に関して不活化されるように、操作することが可能である。例えば、Berknerら（1988年）BioTechniques 6:616；Rosenfeldら（1991年）Science 252:431-434；および、Rosenfeldら（1992年）Cell 68:143-155を参照されたい。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄｌ３２４またはアデノウイルスのその他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）に由来する適切なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。組換えアデノウイルスは、それらが非分裂細胞に感染できないことから、一定の環境において好都合であり得る。さらに、ウイルス粒子は、比較的安定であって、かつ精製および濃縮が可能であり、そして、上記のように、感染性の範囲（the spectrum of infectivity）に影響を及ぼすように修飾されることが可能である。加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびそれに含有される外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれないが、しかし、エピソーム性のままであることによって、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）内に組み込まれるようになる状況における挿入突然変異の結果として生じ得る問題が回避される。さらに、アデノウイルスゲノムが外来ＤＮＡを保有する能力は、他の遺伝子送達ベクターと比較して大きい（８キロベースまで）（Berknerら、上記に引用；Haj-AhmandおよびGraham（1986年）J.Virol. 57:267）。現在使用されており、かつそれゆえに本発明に好ましいほとんどの複製欠損性アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全部もしくは一部が欠失しているが、しかし、アデノウイルス遺伝物質の８０％ほどを保持している（例えば、Jonesら（1979年）Cell 16:683；Berknerら、同上；および、Grahamら、Methods in Molecular Biology、E.J.Murray編（ヒューマナ社、クリフトン、ニュージャージー州、1991年）第7巻、109〜127ページを参照されたい）。核酸分子内に含まれる目的とする遺伝子の発現は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）および関連するリーダー配列、Ｅ３プロモーター、または外来的に付加されたプロモーター配列の制御下にあり得る。
[074]  本発明のＯＰＮ阻害剤の送達に有用なさらに別のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および生産的な生活環のために、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスをヘルパーウイルスとして必要とする、自然界に存在する欠損ウイルスである（総説に関しては、Muzyczkaら、Curr.Topics in Micro. and Immunol.（1992年）158:97-129を参照されたい）。アデノ随伴ウイルスは、高頻度の安定な組込みを呈する（例えば、Flotteら（1992年）Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol. 7:349-356；Samulskiら（1989年）J.Virol. 63:3822-3828；および、McLaughlinら（1989年）J.Virol. 62:1963-1973を参照されたい）。わずか３００塩基対のＡＡＶを含有するベクターがパッケージされ、そして組み込むことが可能である。外因性ＤＮＡのためのスペースは、約４．５ｋｂに限定される。Tratschinら（1985年）Mol.Cell.Biol. 5:3251-3260に記載されたものなどのＡＡＶベクターを用いて、ＤＮＡをＴ細胞に導入することが可能である。多様な核酸が、ＡＡＶベクターを用いて、異なる細胞型に導入されている（例えば、Hermonatら（1984年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470；Tratschinら（1985年）Mol.Cell.Biol. 4:2072-2081；Wondisfordら（1988年）Mol.Endocrinol. 2:32-39；Tratschinら（1984年）J.Virol. 51:611-619；および、Flotteら（1993年）J.Biol.Chem. 268:3781-3790を参照されたい）。本発明のＯＰＮ阻害剤の送達に有用な可能性のある他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびいくつかのＲＮＡウイルスに由来する。
[075]  インスリン抵抗性（ＩＲ）は、筋肉、脂肪組織（ＡＴ）および肝臓に現れ、そして、ＡＴにおける炎症を伴う。インスリンに対する応答が正常な対象における応答の半分であるならば、対象はＩＲを有している。ＩＲは、高インスリン正常血糖クランプの使用、Ｒｅａｖｅｎ改変インスリン抑制試験、恒常性モデル評価、または定量的インスリン感受性検査指数によって測定することが可能である。本発明は、炎症促進性タンパク質ＯＰＮのｍＲＮＡ発現が肥満でインスリン抵抗性のヒトおよびラットのＡＴにおいて上昇し、そして、チアゾリジンジオン治療後に両種で正常化されたとの発見に、部分的に基づいている。本発明者は、ＯＰＮノックアウトマウス（ＯＰＮ  ＫＯ）およびＩＲの２週間高脂肪食餌（ＨＦＤ）モデルを用いて、ＩＲにおけるＯＰＮの役割を研究した。ＯＰＮ  ＫＯは、野生型マウス（ＷＴ）に認められた、ＨＦＤにより誘導される、インスリン刺激によるグルコース処理率および肝グルコース生産の著しい変化から、完全に保護された。ＨＦＤは、体重、ＡＴマクロファージ浸潤、または血漿中遊離脂肪酸およびサイトカイン類を変化させなかった。ＨＦＤにより誘導される高レプチン血症、ＡＴサイトカイン分泌および脂肪細胞肥大は、ＯＰＮ  ＫＯでは、ＷＴと比較して鈍化したか、またはなかった。筋肉およびｅＷＡＴでのインスリン刺激によるＡｋｔリン酸化は、ＨＦＤを与えられたＯＰＮ  ＫＯで、ＷＴと比較して大きかった。ＯＰＮ  ＫＯの骨髄間質細胞は、ＷＴ細胞よりも骨形成が多く、かつ脂肪生成が少なかった。ＷＴ細胞では、両方の分化経路がＨＦＤにより影響を受けた。これらのＯＰＮ  ＫＯフェノタイプは、ＩＲからの保護と一致する。ＯＰＮは、肥満およびＡＴマクロファージ浸潤が起こる前の、食餌により誘導されるＩＲの主要な構成成分である。ＯＰＮが細胞遊走、マクロファージ活性化、炎症および細胞外マトリックスリモデリングに関わることが、本発明の一部としてさらに発見された。これらの生物活性はすべて、インスリン抵抗性の動物およびヒトモデルの脂肪組織において活性化される。
【実施例】
【００１１】
[076]  以下の実施例を、本発明を実施するほんの一例として示す。これらの実施例は、例示することを目的とするが、しかし、本発明を限定することを目的としない。それらは、用いられてもよい典型的なものであるが、当業者に公知の他の手順を代替的に用いてもよい。
【００１２】
実施例１．遺伝子発現：インスリン抵抗性への介入治療の潜在的な標的としてのＯＰＮの同定
[077]  インスリン抵抗性は遺伝子発現の変化を伴うため、アフィメトリクスを用いて全体的な遺伝子発現プロファイリングを行い、インスリン抵抗性ヒト患者（ｎ＝３４）の脂肪組織においてインスリン感受性の痩身患者（ｎ＝６）と比較して差次的に調節され、かつインスリン感作性チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）での治療により正常化される遺伝子を同定した。インスリン抵抗性患者とインスリン感受性患者との間で差次的発現を示す、３００を超える遺伝子が同定された。同様なアプローチを、インスリン抵抗性げっ歯類ｆａ／ｆａモデルを利用して実施した。差次的遺伝子発現を、ズッカー痩身（ｆａ／ｆ）、ズッカー肥満（ｆａ／ｆａ）および１４日間ＴＤＺ治療肥満ラットの脂肪組織において測定した。このモデルにおける脂肪組織の全体的な遺伝子発現プロファイリングによって、インスリン抵抗性ｆａ／ｆａラットでその痩身対照と比較して差次的に調節されている、１００を超える遺伝子が同定された。ヒトとラットとの発現プロファイリング試験の重複部分を用いて、発明者は、インスリン抵抗性ヒトおよびラットの脂肪組織において差次的発現を示し、かつＴＺＤ治療により正常化された４遺伝子を、介入治療の潜在的な標的として同定することができた。ＯＰＮ、ＡＬＣＡＭ、ＧＬＩＰＲ１およびＳ１００  Ａ４が、候補遺伝子として同定された。ＯＰＮは公知の分泌タンパク質であって、かつ同定された統計学的に最も有意な転写物であることから、結果を確認するために、発明者は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、インスリン感作性ＴＺＤであるピオグリタゾンでの治療前および治療後の、痩身および肥満のヒトおよびズッカーラットから得た脂肪組織におけるＯＰＮ発現を比較した。
【００１３】
実施例２．インスリン感受性
[078]  ラットおよびヒト群の末梢インスリン感受性（グルコース処理率Ｒｄとして測定）を、高インスリン正常血糖クランプ手順を用いて測定した。ラットおよびヒトの臨床的特徴を、表１に列挙する。脂肪組織におけるＯＰＮ発現は、インスリン感受性痩身対照と比較して、肥満のインスリン抵抗性ラット（１７倍）およびヒト（４．６倍）で上昇した。ピオグリタゾン治療によって、肥満ラットおよびヒトのインスリン感受性は増加し（表１）、そして、両種の脂肪組織におけるＯＰＮ発現は正常化された（図１Ａおよび１Ｂ）。実際に、治療前の患者データを併せると、脂肪組織のＯＰＮ  ＲＮＡレベルとＲｄとの間に有意な相関があった（図１Ｃ）。
【００１４】
【表１−１】
2010524961.tif 000002
【００１５】
【表１−２】
2010524961.tif 000003
【００１６】
実施例３．ＯＰＮ  ＫＯマウスは食餌により誘導されるインスリン抵抗性から保護される
[079]  早期発症型の食餌により誘導されるインスリン抵抗性における全身ＯＰＮ遺伝子ノックアウトのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を、Ｃ５７ＢＬ／６  ＷＴおよび系統が同じであるＯＰＮ  ＫＯマウスを用いて評価した。正常血糖高インスリンクランプ試験を、ＮＣまたはＨＦＤを２週間与えられたＷＴおよびＯＰＮ  ＫＯマウスで行い、そして、両食餌を与えられたマウス系統から得たクランプデータに、有意差が認められた（図２Ａ〜Ｃ）。クランプ中のグルコース注入率（Ｇｉｎｆ）は、ＮＣを与えられたＯＰＮ  ＫＯマウスにおいて、ＷＴマウスと比較して２７％大きかった。ＮＣを与えられたＯＰＮ  ＫＯマウスにおけるクランプ中のグルコース処理率（ＧＤＲ）も同様に、大きい傾向にあった。ＮＣを与えられたＯＰＮ  ＫＯマウスのクランプ中の肝グルコース生産率（ＨＧＯ）は、ＷＴマウスと比較して５２％低かった。加えて、ＯＰＮ  ＫＯマウスは、ＷＴマウスにおいて認められた、ＨＦＤにより誘導されたＧｉｎｆ（７３％）およびＧＤＲ（５７％）の著しい減少、ならびにＨＧＯの増加（６６％）から保護された。これらのデータは、ＯＰＮの欠失が、マウスにＮＣを与えた場合は肝臓のインスリン感受性の改善を、そして、マウスにＨＦＤを与えた場合は肝臓および骨格筋のインスリン抵抗性からの保護をもたらすことを、示している。
[080]  ＷＴとＯＰＮ  ＫＯマウスにおいてＨＦＤにより誘導された変化の間には、正常血糖高インスリンクランプにより検出されたインスリン感受性の差を除いては、多くの類似性が認められた。また、インスリン抵抗性の２週間ＨＦＤモデルは、より長期のＨＦＤモデルにおいて認められる二次的異常の多くを示さない。総体重は、マウス系統間で差はなく、そして、ＨＦＤにより変化しなかった（表２）。表皮白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）の脂肪体重量は、ＨＦＤの全動物で同様に増加し、そして、総体重のパーセントとして系統間で差はなかった（表２）。空腹時血漿中インスリンレベルは、ＮＣおよびＨＦＤを与えられたＷＴマウスにおいて、ＯＰＮ  ＫＯマウス群と比較して高い傾向にあったが、しかし、ＡＮＯＶＡ分析による差は有意でなかった（ｐ＝０．０６８）（表２）。空腹時血漿中インスリンレベルは、ＮＣおよびＨＦＤを与えられたＷＴマウスにおいて、ＯＰＮ  ＫＯマウス群と比較して高い傾向にあったが、しかし、ＡＮＯＶＡ分析による差は有意でなかった（ｐ＝０．０６８）（表２）。
【００１７】
【表２】
2010524961.tif 000004
【００１８】
[081]  空腹時血漿中グルコースレベルは、ＨＦＤを与えられたＯＰＮ  ＫＯマウスのみでわずかに上昇した。本発明者は、４動物群において、ＯＰＮ、アディポカイン類、サイトカイン類、ケモカイン類および脂質類を含む、他の血漿中構成成分のレベルを測定した（表３）。総コレステロールを除けば、表３の血漿中構成成分はいずれも、ＨＦＤを与えられたＷＴまたはＯＰＮ  ＫＯマウスで上昇しなかった。血漿中総コレステロールは、ＨＦＤを与えられた両マウス系統で上昇したが、ＯＰＮ  ＫＯマウスではわずかに低かった。
【００１９】
【表３−１】
2010524961.tif 000005
【００２０】
【表３−２】
2010524961.tif 000006
【００２１】
実施例４ 
[082]  ＯＰＮ  ＫＯマウスにおけるＷＡＴの差次的組織学的検査および血漿中レプチンレベル  ｅＷＡＴ（内臓脂肪蓄積）および鼠径部脂肪組織（ｉＷＡＴ、皮下脂肪蓄積）の組織切片を検査し、そして、ＷＴマウスから得たｅＷＡＴおよびｉＷＡＴにおいてＨＦＤにより誘導される脂肪細胞肥大が、ＯＮＰ  ＫＯマウスでは、それぞれ２３％および３０％鈍化することが見いだされた（図３）。ＨＦＤを与えられた二つの系統におけるｅＷＡＴ脂肪体量が同程度であると仮定すると、ＯＰＮ  ＫＯマウスにおいて、より小さな脂肪細胞の過形成があり得る。ＯＰＮ  ＫＯとＷＴのＷＡＴ組織切片を比較した場合、細胞外マトリックスまたは他の非脂肪細胞構造に、著しい差は認められなかった。ｅＷＡＴおよびｉＷＡＴ切片を、脂肪組織マクロファージの存在について、マクロファージ特異的マーカーＭａｃ−２を検出するための免疫組織化学的検査を用いて検査した。Ｍａｃ−２染色は、肥満マウスおよびヒトから得た脂肪組織において増加することが、先に示されている（Cinti,S.ら、2005年、J Lipid Res 46:2347-2355）。ＮＣを与えられたマウスとＨＦＤを与えられたマウスから得た切片を比較した場合、王冠型構造およびＭａｃ−２染色細胞数の差は検出されず、かつ、両系統間に差はなく、２週間ＨＦＤ後のインスリン抵抗性に、脂肪へのマクロファージ浸潤が関与していないことが示唆された。複数種の肥満モデルにおいて、血漿中レプチンレベルは、脂肪量と相関する（Fruhbeck,G. 2006年、Biochem J 393:7-20）。したがって、血漿中レプチンレベルを４マウス群において測定し、そして、ＷＴマウスにおいてＨＦＤにより誘導される血漿中レプチンの増加（４．６倍）が、ＯＰＮ  ＫＯマウスでは４５％鈍化することが見いだされた（図４Ａ）。ＨＦＤを与えられたＷＴとＯＰＮ  ＫＯマウスとの間で平均脂肪体量に有意差はなかったが（表２および図４Ｂ）、血漿中レプチンレベルは、個々のマウスにおいて、ｅＷＡＴ脂肪細胞の大きさと有意に相関している（図４Ｃ）。
【００２２】
実施例５
[083]  インスリン抵抗性に関連する組織構成成分の分析  本発明者は、インスリン抵抗性に関連する系統および／もしくは食餌依存性の差を同定するために、マウス群で組織構成成分について研究した。食餌により誘導されるインスリン抵抗性のいくつかのモデルにおいて、トリグリセリド蓄積が、筋肉および肝臓で認められる。表３に、筋肉および肝臓において測定された組織トリグリセリドレベルを示す。トリグリセリドレベルは、ＮＣを与えられたＯＰＮ  ＫＯマウスから得た骨格筋において、ＷＴマウスと比較して有意に低かった。しかしながら、ＨＦＤを与えられた系統間では、筋肉トリグリセリドに差はなく、ＨＦＤの結果としてトリグリセリドの有意な増加もなかった。肝臓におけるトリグリセリドレベルは、ＨＦＤを与えられたＷＴおよびＯＰＮ  ＫＯマウスにおいて増加する傾向にあったが、ただし、この傾向は有意ではなく、かつ系統間で差はなかった。脂肪組織が肥満における局所炎症の部位であるため、サイトカインタンパク質レベルを、この組織において検査した。いずれの系統でも、ＨＦＤにより血漿中サイトカインレベルは増加しなかったが、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＩＬ−６およびＩＬ−１０レベルの上昇が、ＷＴマウスから得たｅＷＡＴライセートにおいて認められた（図５）。Ｃｘｃｌ１（ＫＣ）およびＴＮＦαレベルもまた、ＷＴマウスにおいてＨＦＤ後に増加する傾向にあったが、ただし、この増加は統計学的有意には達しなかった。ＨＦＤを与えられたＯＰＮ  ＫＯマウスは、ｅＷＡＴライセートでのＩＬ−１β、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、Ｃｘｃｌ１およびＴＮＦαレベルの増加から、完全に保護された。
[084]  ＨＦＤ後のＡｋｔリン酸化の差次的な活性化  ＨＦＤを与えられたマウスにおいてインスリンシグナル伝達に及ぼすＯＰＮ  ＫＯの効果を検討するために、本発明者は、インスリン０．８５ｍＵ／ｋｇの腹腔内注射により群を急性にインスリン刺激し、そして、１５分後に組織を回収した。これらの試験における、筋肉および脂肪のインスリン刺激によるＡｋｔリン酸化のＥＬＩＳＡ定量を、図６に示す。筋肉におけるインスリン刺激によるＡｋｔリン酸化は、ＯＰＮ  ＫＯマウスで、ＷＴマウスと比較して５８％大きかった。ｉＷＡＴにおけるインスリン刺激によるＡｋｔリン酸化に系統間で差はなかったが、しかし、ＯＰＮ  ＫＯマウスから得たｅＷＡＴでは、ＷＴマウスと比較して７３％大きかった。並行して、本発明者は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにより組織ライセートを分析した。ＥＬＩＳＡの結果と同様に、インスリン刺激によるＡｋｔリン酸化は、ＯＰＮ  ＫＯマウスから得た筋肉およびｅＷＡＴで、ＷＴマウスと比較して有意に大きかった。
【００２３】
実施例６
[085]  骨髄間質細胞の分化  骨髄由来間葉系間質細胞（ＢＭＳＣ）は、多能性（multi-potent）であり、かつ、骨形成、脂肪生成および軟骨形成経路へと分化することが可能である（Gimble,J.M.ら、2006年、J Cell Biochem 98:251-266）。ＯＰＮ発現の欠如および／食餌がこれらの経路のうちの二つへと分化するＢＭＳＣの性向に影響を及ぼすかどうかを分析するために、研究を行った。
[086]  ＢＭＳＣを４マウス群から回収し、そして、それらに骨形成プロトコールと脂肪生成プロトコールの双方を行った。各分化プログラムによる進行を、骨芽細胞遺伝子アルカリホスファターゼ(Ａｋｐ２）およびオステリックス（Ｏｓｘ）、ならびに脂肪細胞遺伝子ＰＰＡＲγの発現により測定した（図７）。骨形成分化中のＡｋｐ２およびＯｓｘの発現は、ＯＰＮ  ＫＯ  ＢＭＳＣで、ＷＴ  ＢＭＳＣよりも有意に大きかった（図７Ａ）。ＨＦＤは、ＷＴ  ＢＭＳＣの骨形成分化を有意に鈍化させたが、しかし、ＯＰＮ  ＫＯの骨形成分化には影響を与えなかった。脂肪生成プロトコール中のＰＰＡＲγの発現は、ＯＰＮ  ＫＯ  ＢＭＳＣで１０００倍増加したが、しかし、ＷＴ  ＢＭＳＣでは９桁増加した（図７Ｂ）。ＨＦＤは、ＷＴ  ＢＭＳＣの脂肪生成分化を有意に増強したが（１０００倍多くのＰＰＡＲγ発現）、しかし、ＯＰＮ  ＫＯの脂肪生成分化には影響を与えなかった。２週間のＨＦＤが、４週間を超えるｅｘ  ｖｉｖｏ培養後にＷＴ  ＢＭＳＣの骨形成および脂肪生成分化にこのような影響を与えたことは、注目すべきである。ＨＦＤが、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＢＭＳＣにおける分化の潜在的バイアスをプログラムする可能性は高い。つまり、これらのデータは、ＯＰＮの欠失がＢＭＳＣの骨形成分化を増強し、かつ脂肪生成分化を阻害し、そして逆に、ＨＦＤがＢＭＳＣの骨形成分化を阻害し、かつ脂肪生成分化を増強することを、示唆している。
[087]  インスリン抵抗性は、脂肪組織における低度の慢性炎症を伴う。ＯＰＮの既知の生物学的役割には炎症の調節が含まれるが、脂肪組織生物学および／または全身代謝の調節におけるＯＰＮの役割は、ごく最近になって記載された（Nomiyama Tら、Osteopontin mediates obesity-induced adipose tissue macrophage infiltration and insulin resistance in mice. J Clin Invest 117: 2877-2888、2007年）。本結果は、ＯＰＮ  ＲＮＡ発現が肥満のインスリン抵抗性ラットおよびヒトから得た脂肪組織で上昇し、ヒトにおいてはＲｄと相関し、そしてＴＺＤ治療後に正常化したことを、示している。全体的な転写プロファイリング解析において、Xuらは、ＯＰＮが５つのマウス肥満モデルから得たＷＡＴに過剰発現している５０の炎症性遺伝子の一つであることを、見いだした（Xu Hら、2003年）。肥満のインスリン抵抗性対象の脂肪組織におけるＯＰＮ過剰発現は、レプチン、サイトカイン類または脂質モジュレーターの活性化に応答した脂肪細胞および／または間質血管細胞に起因する可能性がある。ＯＰＮは、多くの細胞型に発現し（Denhardt DTら、2001年、同上）、そして、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞にも発現している（Ross SEら、Microarray analyses during adipogenesis: understanding the effects of Wnt signaling on adipogenesis and the roles of liver X receptor alpha in adipocyte metabolism. Mol Cell Biol 22:5989-5999, 2002年；および、発明者のデータ）。ＴＺＤにより仲介されるインスリン感作は、脂肪組織炎症の減少を伴う（Di Gregorio GBら、2005年）。ＯＰＮ発現は、マクロファージモデルにおいて、ＰＰＡＲγおよびＬＸＲリガンドによりダウンレギュレートされる（Ogawa Dら、2005；Oyama Yら、2002；Oyama Yら、Troglitazone, a PPARgamma ligand, inhibits osteopontin gene expression in human monocytes/macrophage THP-1 cells. J Atheroscler Thromb 7:77-82、2000年）。上記に開示されたＯＰＮ  ＫＯデータは、脂肪組織におけるＯＰＮ発現の正常化が、炎症を低減することにより、ＴＺＤにより仲介される感作において役割を果たし得ることを、示唆している。
[088]  本発明者は、早期発症型の２週間ＨＦＤモデルにおいて、インスリン抵抗性の発症におけるＯＰＮの役割を検討した。注目すべきことに、２週間のＨＦＤは、体重、肝臓もしくは骨格筋トリグリセリド、脂肪組織へのマクロファージ浸潤、血漿中ＦＦＡもしくはトリグリセリド、または血漿中炎症性マーカー（レプチンを除く）の検出可能な変化を伴わなかった。本明細書に開示した早期発症型の高脂肪食によるフェノタイプは、ＨＦＤにより誘導されるインスリン抵抗性の経時的試験においてParkらにより観察されたものと同様である（Park SYら、Unraveling the temporal pattern of diet-induced insulin resistance in individual organs and cardiac dysfunction in C57BL/6 mice. Diabetes 54:3530-3540、2005年）。２週間後に、ＨＦＤは、ＷＴマウスにおいて重度の肝臓および骨格筋のインスリン抵抗性、ならびに、両マウス系統において高インスリン血症、高コレステロール血症および脂肪体増大を誘導した。ＯＰＮ  ＫＯマウスは、ＨＦＤにより誘導される肝臓および骨格筋のインスリン抵抗性から保護され、そして、ＮＣを与えられた場合、ＷＴマウスよりも大きい肝臓のインスリン感受性を有した。ＯＰＮ  ＫＯマウスもまた、ＷＴマウスと比較して、ＨＦＤ後にインスリンにより刺激された骨格筋およびｅＷＡＴのＡｋｔリン酸化の有意な増強を呈し、このことは、それらのインスリン感受性の増強と一致する。興味深いことに、インスリンにより刺激されたｉＷＡＴのＡｋｔリン酸化は、ＨＦＤを与えられた系統間で差がなく、この皮下脂肪蓄積が、ｅＷＡＴ蓄積とは違いインスリン抵抗性でないことが、示される。
[089]  ＷＴマウスにおいて、ＨＦＤは血漿中レプチンレベルを増加させ、そして、この増加はＯＰＮ  ＫＯマウスにおいて鈍化した。本発明者は、これらの系統から得た脂肪組織において、レプチンＲＮＡ発現に対するＨＦＤの効果に同様な差を認めた。加えて、血漿中レプチンレベルは、ＷＴマウスおよびＯＰＮ  ＫＯマウス双方において、ｅＷＡＴ脂肪細胞の大きさと相関した。いくつかの肥満モデルにおいて、レプチンレベルは上昇し、脂肪量を反映し、そして、ヒトにおいて脂肪細胞の大きさと相関した（Frederich RCら、Expression of ob mRNA and its encoded protein in rodents. Impact of nutrition and obesity. J Clin Invest 96: 1658-1663、1995年；Fruhbeck、2006年；Lofgren Pら、Long-term prospective and controlled studies demonstrate adipose tissue hypercellularity and relative leptin deficiency in the post-obese state. J Clin Endocrinol Metab 90:6207-6213、2005年）。ＴＺＤおよび体重減少は、双方とも、血漿中レプチンレベルおよび脂肪細胞の大きさを低減させた（Lofgrenら、2005年、同上；Yamauchi Tら、The mechanisms by which both heterozygous peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) deficiency and PPARgamma agonist improve insulin resistance. J Biol Chem 276:41245-41254、2001年）。レプチンは炎症性活性を有し、そして、炎症促進性サイトカイン類の分泌を活性化することが可能である（Fruhbeck、2006年、同上；Sanchez-Margalet Vら、Role of leptin as an immunomodulator of blood mononuclear cells: mechanisms of action. Clin Exp Immunol 133:11-19、2003年）。レプチンは、リンパ球および骨格筋においてＩＲＳ１のＳｅｒ−３１８リン酸化を誘導し、筋肉においてインスリンシグナル伝達を阻害する（Hennige AMら、Leptin down-regulates insulin action through phosphorylation of serine-318 in insulin receptor substrate 1. FASEB J 20:1206-1208、2006年）。ｄｂ／ｄｂマウスから得た培養肝細胞では、レプチンで治療した後、ＯＰＮのｍＲＮＡおよびタンパク質発現が増加した（Sahai Aら、Obese and diabetic db/db mice develop marked liver fibrosis in a model of nonalcoholic steatohepatitis: role of short-form leptin receptors and osteopontin. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 287:G1035-1043、2004年）。このように、ＨＦＤを与えられたＷＴマウスの血漿中、およびおそらく脂肪組織中の高いレプチンレベルが、ＯＰＮ  ＫＯマウスと比較してこれらのマウスにおいて認められる複数組織でのインスリン抵抗性の一因である可能性がある。さらなる研究が、種々の組織におけるＯＰＮとレプチンとの間の機構的関連について進行中である。
[090]  ＯＰＮ  ＫＯから得た脂肪細胞は、ＷＴマウスから得た脂肪細胞よりも、ＨＦＤ後の肥大が有意に少なかった。ＨＦＤにより誘導されるＯＰＮ  ＫＯ脂肪細胞の肥大の減少は、ＷＴ  ＢＭＳＣと比較した場合のＯＰＮ  ＫＯ  ＢＭＳＣの脂肪生成の潜在性の減少と関連している可能性があり、そして、以下により詳細に論じる。より大きな脂肪細胞はより小さな脂肪細胞よりも、多くのレプチンを分泌することに加えて、インスリン感受性が低く、多くの炎症性サイトカイン類およびＦＦＡを分泌し、そして、多くの活性酸素種を産生する（Pausova Z.、From big fat cells to high blood pressure: a pathway to obesity-associated hypertension. Curr Opin Nephrol Hypertens 15:173-178、2006年）。本知見は、ＨＦＤを与えられたＷＴマウスから得たｅＷＡＴにおいて、ＯＰＮ  ＫＯマウスと比較して、インスリン感受性が減少し、かつサイトカイン分泌が増加することを示す。サイトカイン分泌の増加は、常在性マクロファージ、脂肪細胞、または内皮細胞および脂肪細胞前駆体などのｅＷＡＴ中の他の細胞型に起因し得る。レプチンおよびＯＰＮは、双方とも、炎症性サイトカイン分泌を誘導し（Denhardt、2001年、同上；Fruhbeck、2006年、同上）、そして、ＨＦＤを与えられたＷＴ  ｅＷＡＴにおいて認められたサイトカイン分泌増加のメディエーターであり得る。他の系にて示されたように、差次的なグリコシル化、リン酸化および／またはタンパク質分解によって仲介される、ＯＰＮの生物活性において、ＨＦＤにより誘導されるシフトはあり得るが、ＷＴマウスから得たｅＷＡＴ  ＯＰＮタンパク質では、ＨＦＤ後に変化は認められなかった（Christensen Bら、2005年；Weber GFら、2002年）。本明細書に開示したヒトおよびラットでの発現データ、ならびにXuら（2003年）のデータに基づくと、ＯＰＮ発現は、より長期のＨＦＤ後に増加するようである。
[091]  ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ双方の試験により、ＢＭＳＣの骨芽細胞と脂肪細胞への分化の間に逆相関が示された（Gimble JMら、2006年、同上；Rosen CJら、Mechanisms of disease: is osteoporosis the obesity of bone? Nat Clin Pract Rheumatol 2:35-43、2006年）。骨髄における骨と脂肪細胞の生成間の平衡は、加齢、骨粗しょう症、およびＰＰＡＲγの活性化を含む要因によって影響を受ける。本発明者は、ｑＰＣＲを用いて、ＯＰＮ  ＫＯマウスから単離されたＢＭＳＣで、ＷＴマウスから単離されたＢＭＳＣよりも骨形成が多く、かつ脂肪生成が少ないことを示し、これにより、ＯＰＮが両分化経路の重要なレギュレーターであることが示唆される。同様な骨髄フェノタイプは、欠失変異体ＦｏｓＢ導入遺伝子を発現しているマウスにおいて報告された（Kveiborg Mら、DeltaFosB induces osteosclerosis and decreases adipogenesis by two independent cell-autonomous mechanisms. Mol Cell Biol 24:2820-2830、2004年）。本明細書のデータは、ＯＰＮ  ＫＯマウスは、ＷＴマウスよりも骨石灰化が多く（Harmey Dら、Elevated skeletal osteopontin levels contribute to the hypophosphatasia phenotype in Akp2(-/-) mice. J Bone Miner Res 21:1377-1386、2006年）、そして、骨減少のモデルに抵抗性である（Ishijima Mら、Osteopontin is associated with nuclear factor kappaB gene expression during tail-suspension-induced bone loss. Exp Cell Res 312:3075-3083、2006年；Yoshitake Hら、Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption. Proc Natl Acad Sci USA 96:8156-8160、1999年）との報告と相関している。
[092]  脂肪組織由来間質細胞（ＡＴＳＣ）およびＢＭＳＣは、類似した遺伝子発現パターン、ならびに骨形成および脂肪生成分化の潜在性を有する（Lee RHら、Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem 14:311-324、2004年）。したがって、ＯＰＮ  ＫＯ  ＡＴＳＣは、ＯＰＮ  ＫＯ  ＢＭＳＣと同様に、ＷＴ  ＡＴＳＣよりも脂肪生成が少ない可能性がある。脂肪細胞の肥大を調節するメカニズムについては、ほとんど分かっていない。ＨＦＤを与えられたＯＰＮ  ＫＯマウスでは、ＷＴマウスと比較して脂肪細胞の肥大が減少しており、このことは、脂肪細胞の完全に成熟分化する能力が減少（肥大する可能性が低減）すること、および、ＨＦＤの高脂質負荷に順応するために代償的に脂肪細胞過形成が起こり得ることによる可能性がある。脂肪細胞の肥大および分化には、広範な細胞外マトリックスリモデリングが必要である（Chun THら、A pericellular collagenase directs the 3- dimensional development of white adipose tissue. Cell 125:577-591、2006年；Gregoire FM、Adipocyte differentiation: from fibroblast to endocrine cell. Exp Biol Med (Maywood) 226:997-1002、2001年；Nakajima Iら、Adipose tissue extracellular matrix: newly organized by adipocytes during differentiation. Differentiation 63:193-200、1998年）。細胞外マトリックスリモデリングにおけるＯＰＮのよく特徴付けられた役割を考えると、ＯＰＮ欠損によって、細胞外マトリックスの調節不全により脂肪細胞の肥大／分化が損なわれる可能性がある。注目すべきことに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＢＭＳＣの脂質生成分化に対するＯＰＮ欠損の効果は、インスリン抵抗性および脂肪細胞生物学におけるＯＰＮの役割が、免疫細胞機能を調整する役割を越えていることを、示している。
[093]  本発明者は、２週間の高脂肪食餌が、それに続くｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＢＭＳＣ骨形成分化を妨害し、そしてＷＴマウスで脂肪生成分化を増強し、ＯＰＮ  ＫＯマウスでは増強しないとの新規の知見を得た。ＷＴマウスにおいて、この効果は、ＢＭＳＣの分化潜在性に長期の効果がある、ＰＰＡＲγリガンド、ＨＦＤの構成成分もしくは代謝物により仲介される可能性がある。この発見は、骨髄脂肪蓄積と骨密度との間の平衡に関する公表されたｉｎ  ｖｉｖｏ試験と相関する（Gimbleら、2006年）。興味深いことに、ＢＭＳＣの分化潜在性に対する高脂肪食餌の効果は、ＯＰＮ  ＫＯマウスでは認められず、そして、ＯＰＮが脂肪生成の正のレギュレーターであって、かつ骨芽細胞分化の負のレギュレーターであるとのさらなるエビデンスである。これらのマウス群から得たＢＭＳＣの脂肪生成および骨形成分化の潜在性を、さらなる分化マーカーを用いて、さらに探求する必要がある。
[094]  要約すれば、我々は、ＯＰＮが、肝臓、筋肉および脂肪組織において高脂肪食餌により誘導されるインスリン抵抗性の早期発症型の重要なモジュレーターであることを見いだしている。我々は、ＯＰＮ  ＫＯマウスがＨＦＤにより誘導されるインスリン抵抗性から保護されるメカニズムが、レプチン発現の低減、脂肪細胞の肥大の減少、および脂肪組織における炎症性サイトカイン分泌の抑制を伴うとのエビデンスを、提供する。ＯＰＮ  ＫＯマウスは、アテローム性動脈硬化促進性のマウス背景においてアテローム性動脈硬化から保護され、そして、Bruemmerらは、これが白血球由来のＯＰＮにより仲介されることを示した（Bruemmerら、2003年；Matsui Yら、Osteopontin deficiency attenuates atherosclerosis in female apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vase Biol 23:1029-1034、2003年）。Nomiyamaらは、ＯＰＮ欠損が、長期に高脂肪を与えられた後に誘導されるインスリン抵抗性を、脂肪組織へのマクロファージ浸潤を低減させることによって部分的に軽減することを、最近示した（J Clin Invest 117:2877-2888、2007年）。我々の２週間ＨＦＤモデルにおいてインスリン抵抗性におけるＯＰＮの役割を仲介する細胞型は、現時点では不明瞭であり、そして、我々の研究所における現在の研究の焦点である。ＯＰＮは、食餌により誘導されるインスリン抵抗性の早期発病およびインスリンを標的とする組織生物学における新規関与体である。そのようなものとして、ＯＰＮは、ヒトインスリン抵抗性および２型糖尿病の治療のための魅力ある治療標的である可能性がある。
[095]  したがって、一実施態様において、本発明は、真性糖尿病、ならびに肥満もしくは高血糖などの関連障害を治療するための方法であって、該疾患の症状を改善するのに十分な量のＯＰＮの阻害剤を対象に投与することによる方法を提供する。２型またはインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、具体的には、（１）末梢組織、特に骨格筋および脂肪細胞におけるグルコース取込みへのインスリンの作用に対する抵抗性、（２）インスリンの作用の不全による肝グルコース産生の阻害、ならびに（３）インスリン分泌の調節不全；の三徴候を特徴とする（DeFronzo（1997年）Diabetes Rev.5:177-269）。したがって、２型糖尿病を患う対象を、本発明にしたがって、インスリンに対する感受性および細胞によるグルコース取込みを増加させるＯＰＮ阻害剤の投与により治療することが可能である。同様に、インスリン機能不全（例えば、抵抗性、不活性または欠損症）および／または細胞内への不十分なグルコース輸送を特徴とする他の疾患もまた、本発明にしたがって、インスリンに対する感受性および細胞によるグルコース取込みを増加させるＯＰＮ阻害剤の投与により治療することが可能である。
【００２４】
材料および方法
実施例ＭＭ１：ヒト試験
[096]  ５例の痩身インスリン感受性対象および６例の肥満インスリン抵抗性対象を、ピオグリタゾン（４５ｍｇ／日）で３ヶ月間治療した。患者の臨床的特徴を、表１に示す。ピオグリタゾン治療の前および後に、各患者から皮下脂肪組織生検を回収し、そして液体窒素中で瞬間冷凍し、そして、各患者に６０ｍＵ／ｍ２／分の高インスリン正常血糖クランプを５時間行った。ベースラインの血漿試料を採取し、そして、高インスリン正常血糖クランプを、先に記載されたように（Frias,JPら、2000年、Diabetes Care 23,64-69；Yu,JGら、2002年、Diabetes 51,2968-2974）、１０時間絶食後の朝に行った。実験プロトコールは、カリフォルニア大学サンディエゴ校の治験審査委員会により認可された。書面によるインフォームドコンセントを、各対象から得た。
【００２５】
実施例ＭＭ２：動物系統
[097]  雄性Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  ＷＴマウス（カタログ番号０００６６４）およびＯＰＮ  ＫＯマウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｓｐｐ１ｔｍ２ｂｌｈ／Ｊ、カタログ番号００４９３６）を、ジャクソン・ラボラトリーズ社から購入した。このＯＰＮ  ＫＯマウス系は、＞１０世代、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ背景に戻し交配されている。マウス食餌は以下のとおりであった：通常飼料食餌（脂肪から１２％ｋｃａｌ；Ｐｕｒｉｎａ５００１、ラボダイエット（ＬａｂＤｉｅｔ）社）および高脂肪食餌（脂肪から４１％ｋｃａｌ；ＴＤ９６１３２、ハーラン・テクラド（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ）社）。マウスは、全試験において４〜６ヶ月齢であり、かつ、年齢を一致させた。雄性痩身ズッカー（ｆａ／＋）および脂肪質ズッカー（ｆａ／ｆａ）は、チャールズ・リバー社より購入した。痩身ラットには通常飼料を与え、脂肪質ラットには通常飼料、または１０ｍｇ／ｋｇ／日のピオグリタゾンを送達する用量を添加された通常試料を３週間与えた。すべてのラットは、代謝試験終了および組織回収時に９週齢であった。すべての動物を、光（１２：１２の光：暗）および天候条件の制御下で、１ケージにつき１〜３例収容した。動物は、食物および水に無制限にアクセスした。
[098]  すべての手順は、国立衛生研究所の「Guide for Care and Use of Laboratory Animals」にしたがって実施され、そして、カリフォルニア大学サンディエゴ校の実験動物委員会（Animal Subjects Committee）により承認された。
【００２６】
実施例ＭＭ３：ラットにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ代謝試験
[099]  インスリン感受性を、高インスリン正常血糖クランプにより、先に公表されたように（Hevener,ALら、2001年、Diabetes 50, 2316-2322）測定した。グルコース（５０％ブドウ糖；アボット・ラボラトリーズ）の可変注入は、トレーサー（０．１６μＣｉ／分）およびインスリン（２５ｍＵ／ｋｇ／分、ノブリンＲ；ノボノルディスク社、コペンハーゲン）の注入とともに用いられた。クランプ手順終了時に、致死量のペントバルビタールナトリウム注射（１００ｍｇ／ｋｇ；ネンブタール；アボット・ラボラトリーズ）を動物に投与した。血漿中グルコース特異的活性を、水酸化バリウムおよび硫酸亜鉛で除タンパク質を行った後に測定した（Revers,RR、1984年、J Clin Invest 73, 664-672）。肝グルコース生産（ＨＧＯ）およびグルコース処理率（ＧＤＲ）を、ベース期間およびグルコースクランプの定常状態部分について、定常状態条件に関するスティール方程式を用いて計算した（Steele R. Influences of glucose loading and of injected insulin on hepatic glucose output. Ann N Y Acad Sci 82:420-430年、1959年）。高インスリン正常血糖クランプ試験を行わなかった、同じであるラット群を、脂肪組織分析に用いた。これらのラットから得た組織を、致死量の注射後に切除し、液体窒素中で直ちに瞬間冷凍し、そして、続いて行うｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析用に−８０℃で保管した。
【００２７】
実施例ＭＭ４：マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ代謝試験
[100]  インスリン感受性を、先に記載した最大下高インスリン正常血糖グルコースクランプ技術（４６）を以下のように改変して用い、評価した：１）イソフルランを麻酔剤に用いた、２）グルコーストレーサーを、２μＣｉ／時間で注入した、および、３）インスリンを３ｍＵ／ｋｇ／分で注入した。動物を、回復させた。４日後に、マウスを５時間絶食させ、そして次いで、麻酔（イソフルラン）して血液を回収し（心穿刺）、そして次いで、屠殺（ペントバルビタール）して腓腹筋、肝臓、精巣上体および鼠径部脂肪を回収した。各組織試料の半分を液体窒素中で瞬間冷凍し、そして、半分をＺｎ−ホルマリン中で固定した。血漿中グルコース特異的活性、ＧＤＲおよびＨＧＯを、上述のように計算した。急性インスリン刺激を、６時間絶食させたマウスに０．８５Ｕ／ｋｇのインスリンを腹腔内注射することにより、成し遂げた。１５分後に、上記のように組織を回収した。
【００２８】
実施例ＭＭ５：血漿および組織の分析
[101]  血漿中インスリンは、ラジオイムノアッセイキット（Ｌｉｎｃｏリサーチ社、セント・チャールズ、ミズーリ州）により測定した。血漿中ＦＦＡレベルは、市販のキット（ＮＥＦＡ  Ｃ；和光ケミカル社、米国）を用いて、酵素的に測定した。トリグリセリド類は、トリグリセリド−ＳＬアッセイ（ダイアグノスティック・ケミカルズＬｔｄ）を用いて測定した。コレステロールは、Ｃｈｏｌキットおよびロシュ／日立アナライザー（ロシュ社）を用いて測定した。組織ライセートは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティングおよび化学発光、ならびにＥＬＩＳＡにより、分析した。化学発光オートラジオグラフのシグナル強度は、デジタル・コダック３Ｄイメージステーションおよび付随するデジタルイメージ解析ソフトウェア（コダック社、ニューヘイブン、コネチカット州)を用いて、デンシトメトリーにより定量した。血漿中および組織ライセート中のＩＬ−１β、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、Ｃｘｃｌ１およびＴＮＦαレベルは、マルチプレックス（７プレックス）ＥＬＩＳＡ（メソ・スケール・ディスカバリー社）を用いて測定した。
【００２９】
実施例ＭＭ６：組織学的試験
[102]  切除した脂肪体を、直ちにＺｎ−ホルマリン中で一晩固定し、７０％エタノールへ移し、そしてそれに続き、パラフィン包理した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色したパラフィン切片を、細胞の大きさを測定するため、先に記載されたように（Miles,PDら、2000年、J Clin Invest 105, 287-292）用いた。組織切片のすべてのデジタル像を、同じ顕微鏡拡大率を用いて捉えた。非脂肪細胞物質がわずかである顕微鏡視野を、１視野あたりの細胞数を定量するために選択した。選択したものの中の非脂肪細胞物質に、マウス群間で明白な差はなかった。各群の５例のマウスより、１マウス脂肪体につき３つの視野を捉えた。切片像を可視化し、そして、１視野像あたりの細胞を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨフリーウェア）を用いてカウントした。脂肪細胞の大きさは、１視野あたりの脂肪細胞数の逆数によって表される。免疫組織化学的検査を、Ｍａｃ−２抗体(セダーレーン・ラボラトリーズＬｔｄ．、ホーンビー、オンタリオ州、カナダ)を用いて実施し、マクロファージを同定した。
【００３０】
実施例ＭＭ７：プラスチック付着性骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）の単離および分化
[103]  示したマウス群から得た大腿骨を、１％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ低グルコース培地で洗い流した。洗浄された大腿骨由来細胞を、続いて、５００ｘｇにて１０分間遠心分離し、そして、１％グルタミン（ｗ／ｖ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％  ＦＣＳを添加されたベース間葉系幹細胞（ＭＳＣ）培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、ウォーカーズビル、メリーランド州）中で１４日間培養した。培養ＢＭＳＣの分化を、先に記載されたもの（Sciaudone,Mら、2003年、Endocrinology 144, 5631-5639；Sekiya,Iら、2004年、J Bone Miner Res 19, 256-264）をわずかに改変して実施した。脂肪生成分化に関しては、ＢＭＳＣを０．５μＭデキサメタゾン、５０μＭインドメタシンおよび０．５ｍＭ  ＩＢＭＸを加えたＭＳＣ培地に単層に蒔いた。細胞を示した日数生育させ、そして、培地を３日毎に交換した。骨形成分化に関しては、ＢＭＳＣを１０％  ＦＣＳ、０．５ＵＭデキサメタゾン、５０Ｕｇ／ｍｌアスコルビン酸、１０ｍＭ  β−グリセロホスフェート含有αＭＥＭ培地に単層に蒔き、そして、上記のように生育させた。
【００３１】
実施例ＭＭ８：ＲＮＡの単離および定量
[104]  全ＲＮＡを、トリゾール（Trizol）（インビトロジェン社）を用いてヒト脂肪組織およびＢＭＳＣから、そして、ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（キアゲン社）を用いてラット脂肪から単離した。ヒトおよびラット脂肪のＲＮＡ定量：ワンステップ定量的リアルタイムＰＣＲを、１０ｎｇのヒトもしくはラットＲＮＡで実施した。用いたプライマーおよびプローブは、以下のとおりであった：ヒトＯＰＮ：順方向、５’−  ＡＧＴＴＴＣＧＣＡＧＡＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＴ−３’  配列番号１；逆方向、５’−ＴＴＣＡＴＡＡＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＡＣＧＧＣＴ−３’  配列番号２；プローブ、５’ＦＡＭ  ＴＧＧＡＡＡＧＣＧＡＧＧＡＧＴＴＧＡＡＴＧＧＴＧＣＡ−ＴＡＭＲＡ−３’  配列番号３；ラットＯＰＮ：順方向、５’−ＴＡＴＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣＣＣＡＧＴＴＧＣＣＣＡ−３’  配列番号４；逆方向、５’−ＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＴＴＧＡＣＴＣＡＴＧＧＣＴ−３’  配列番号５；プローブ、５’−ＦＡＭ−ＴＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＣＧＧＧＡＡＧＡ−ＴＡＭＲＡ−３’  配列番号６。反応を、７９００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライド・バイオシステムズ社）で、４００ｎＭの順方向および逆方向プライマー、２００ｎＭのプローブ、１ｘ  ｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素および１Ｘ  ｉＴａｑ  ＲＴＰＣＲ−マスターミックス（バイオ・ラッド社）を含有する２０ＵＩの最終容量にて行った。反応は、トリプリケートにて行った。サイクリングパラメータは、以下のとおりであった：５０℃１０分間および９５℃５分間に続いて、９５℃１０秒間および６０℃３０秒間を４０サイクル。絶対量測定は、ヒトもしくはラットのユニバーサル・リファレンスＲＮＡ標準品（ストラタジーン社）を用いて構築されたＯＰＮ標準曲線と比較することにより、成し遂げた。標準曲線は、少なくとも０．９９のｒ２値を有した。加えて、ＧＡＰＤＨ発現を用いて、試料の添加が等しいことを確認した。ＢＭＳＣのＲＮＡ定量：ＢＭＳＣから単離されたＲＮＡを、逆転写酵素およびｄＮＴＰを用いてｃＤＮＡに変換した。ｑＰＣＲに関しては、特定の逆転写反応液（上記）から得たｃＤＮＡの２５倍希釈１μＬを、ライトサイクラー２．0（ロシュ・ダイアグノスティクス社、インディアナポリス、インディアナ州）中０．５μＭの各プライマーを加えた、ライトサイクラー・ファストスタートＤＮＡマスタープラスＳＹＢＲグリーンＩキット（ロシュ・ダイアグノスティクス社、インディアナポリス、インディアナ州）を用いて増幅させた。増幅に続き、標的遺伝子および参照ＧＡＰＤＨの単色相対的定量解析を行って、製造業者のライトサイクラー・ソフトウェア（バージョン４．０）により、正規化された標的遺伝子／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ複製比を決定した。以下のプライマーを用いた：マウスＧＡＰＤＨ：順方向  ５’−ＣＡＴＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＡＡＣＧ−３’  配列番号７；逆方向  ５’−ＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＴＡＧＣＣ−３’  配列番号８；マウスＯＳＸ：順方向  ５’−ＣＴＣＴＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＴＴＡＧＣ−３’  配列番号９；逆方向  ５’−ＡＧＡＡＡＧＡＴＴＡＧＡＴＧＧＣＡＡＣＧＡＧＴＴＡ−３’  配列番号１０；マウスＰＰＡＲγ：順方向：５��−ＡＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＧＣＧ−３’配列番号１１；逆方向  ５’−ＴＣＣＣＡＴＣＡＴＴＡＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧＴＡ−３’  配列番号１２；マウスＡｋａｐ２：順方向  ５’−ＡＧＡＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＣＣＣＡＣＴＡＴ−３’  配列番号１３；逆方向  ５’−ＣＡＣＣＡＴＣＴＣＧＧＡＧＡＣＣＧ−３’  配列番号１４。すべてのプライマーは、ライトサイクラー・プローブ・デザイン・ソフトウェア２．０を用いて設計された。
【００３２】
実施例ＭＭ９：統計学的解析
[105]  スチューデントｔ検定およびＡＮＯＶＡを、統計学的解析に用いた。相関のＰ値は、両側ピアソン相関係数を用いた線形相関解析（グラフパッド・プリズム）を用いて決定した。０．０５のｐ値カットオフを用いて、統計学的検定後の有意性を決定した。
[106]  本明細書に記載した実施例および実施態様が単に例示的な目的のためであること、ならびに、それを考慮した種々の改変もしくは変更が当業者に提案されるであろうし、かつ本出願の精神および範囲内に含まれるべきであることが、理解される。本明細書に引用したすべての出版物、特許および特許出願は、各個々の出版物、特許または特許出願が参照によって非常に援用されていることが具体的かつ個々に示された場合と同程度に、すべての目的のために、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【図１】
2010524961.tif 000007
【図２】
2010524961.tif 000008
【図３】
2010524961.tif 000009
【図４】
2010524961.tif 000010
【図５】
2010524961.tif 000011
【図６】
2010524961.tif 000012
【図７】
2010524961.tif 000013
【配列表】
2010524961000001.xml
【国際調査報告】
2010524961.tif 000017