(57)【要約】  本発明は、老化防止剤としてのヒドロキシチロソール（を含む組成物）の使用に関する。同様に本発明が関する組成物は、本質的にレスベラトロールを含まず、好ましくは動物に対して経口投与される。本発明はさらに、老化防止方法にも関する。「老化防止」という用語は、本発明に関して、前記動物における老化プロセスを遅延させること、前記動物における加齢に関連する生理学的欠点を改善することそして／または前記動物における健康な老化を促進することを意味している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
老化防止剤としてのヒドロキシチロソールを含む組成物の使用であって、組成物が本質的にレスベラトロールを含まずかつ動物に対して経口投与される、使用。
【請求項２】
動物における老化プロセスを遅延させるため；動物における加齢に関連する生理学的欠点を改善するためおよび／または動物における健康な老化を促進するため（の組成物の製造のため）のヒドロキシチロソールを含む組成物の使用であって、組成物が本質的にレスベラトロールを含んでいない、使用。
【請求項３】
動物における所与の年令での加齢に関連する病気の有病率を低減させることによって、より長生きする確率を増加させるため；白髪、シワ、聴覚機能低下、筋肉量の低下、骨密度の低下および適切な心臓機能の低下といった（ただしこれらに限定されるわけではない）動物における老化プロセスの視覚的徴候を遅延させるため；および／または老化プロセスを加速させる動物における生活習慣病の危険性を減少させるため（の組成物の製造のため）の、ヒドロキシチロソールを含む組成物の使用であって、組成物が本質的にレスベラトロールを含んでいない、使用。
【請求項４】
ヒドロキシチロソールが組成物中の唯一の老化防止活性成分である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
組成物が、健康サプリメント、食品添加物、機能性食品、食品プレミックス、飼料添加物、機能性飼料、飼料プレミックスおよび飲料からなる群から選択される請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
動物に対して経口投与され、前記動物における老化プロセスを遅延させるため；前記動物における加齢に関連する生理学的欠点を改善するためおよび／または前記動物における健康な老化を促進するためのヒドロキシチロソールを含む組成物であって、本質的にレスベラトロールを含んでいない組成物。
【請求項７】
動物に対して経口投与され、所与の年令での加齢に関連する病気の有病率を低減させることによって、より長生きする確率を増加させるため；白髪、シワ、聴覚機能低下、筋肉量の低下、骨密度の低下および適切な心臓機能の低下といった（ただしこれらに限定されるわけではない）老化プロセスの視覚的徴候を遅延させるため；および／または老化プロセスを加速させる生活習慣病の危険性を減少させるための、ヒドロキシチロソールを含む組成物であって、本質的にレスベラトロールを含んでいない組成物。
【請求項８】
健康サプリメント、食品添加物、機能性食品、飼料添加物、機能性飼料または飲料形態である、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
動物がヒトである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
動物に有効量のヒドロキシチロソールまたは有効量のヒドロキシチロソールを含む組成物を投与することにより、動物における老化プロセスを遅延させる；動物における加齢に関連する生理学的欠点を改善するおよび／または動物における健康な老化を促進する方法であって、組成物が本質的にレスベラトロールを含んでいない、方法。
【請求項１１】
動物に有効量のヒドロキシチロソールまたは有効量のヒドロキシチロソールを含む組成物を投与することにより、動物における所与の年令での加齢に関連する病気の有病率を低減させることによって、より長生きする確率を増加させる；白髪、シワ、聴覚機能低下、筋肉量の低下、骨密度の低下および適切な心臓機能の低下といった（ただしこれらに限定されるわけではない）動物における老化プロセスの視覚的徴候を遅延させる；および／または老化プロセスを加速させる動物における生活習慣病の危険性を減少させる方法であって、組成物が本質的にレスベラトロールを含んでいない、方法。
【請求項１２】
動物がヒトである、請求項１０または１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、老化防止剤としてのヒドロキシチロソールおよびヒドロキシチロソールを含む組成物の使用に関する。本発明はさらに、老化防止方法にも関する。本発明に関して「老化防止」という用語は、動物における老化プロセスを遅延させること、動物における加齢に関連する生理学的欠点を改善することそして／または動物における健康な老化を促進することを意味する。
【０００２】
［背景技術］
ミトコンドリアは、エネルギー生成を担う細胞内の細胞小器官である。ミトコンドリア内膜には、電子を輸送しかつ酸化的リン酸化と呼ばれるプロセスである一連の酸化還元反応を介してＡＴＰを産生する複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶを含む呼吸鎖が包埋されている。
【０００３】
細胞に対しエネルギーを供給するというそれらの公知の機能に加えて、ミトコンドリアおよびその構成要素は数多くのその他の細胞活動に関与する。例えばミトコンドリアは、熱発生およびアポトーシスプロセスをも制御し、こうして老化プロセスに関与する。
【０００４】
低効率で働いている場合またはエネルギー脱共役の間、呼吸鎖は例えばスーパーオキシドアニオンといった反応種を生成することから、ミトコンドリアは高レベルの酸化体を含有する。反応性の高い遊離ラジカルが中間体（Ｑ・−）として形成される複合体ＩＩＩ内の補酵素Ｑの還元などの電子伝達系の複数のステップにおける副産物として、スーパーオキシドアニオンが生成される。この不安定な中間体は、電子が、電子伝達系の充分に制御された正常な一連の反応を通して移動する代りに酸素まで直接飛んでいきスーパーオキシドアニオンを形成する場合に電子の「漏出」を導く可能性がある。
【０００５】
抗酸化物質は、その他の分子の酸化を減速させるかまたは防止することのできる分子である。抗酸化物質は、遊離ラジカル中間体を除去することによって酸化連鎖反応を終結させ、それ自体酸化された状態にあることによってその他の酸化反応を阻害する。チオールまたはポリフェノールなどの還元剤は多くの場合、抗酸化特性を及ぼす。ビタミンＡ、ＣおよびＥなどの周知の抗酸化物質は、遊離ラジカルを除去し、ＤＮＡ、タンパク質および脂質を損傷から保護する。抗酸化物質は同様に、ＡＴＰ保護中に生成された反応性酸素種および遊離ラジカルからミトコンドリアを保護する。
【０００６】
過去において、抗酸化物質の投与がミトコンドリア生合成を促進する上で有益であろうとの考えが一般に受け入れられてきたものの、これが事実であることはいまだ示されていない。ゴメス・カルベラ（Ｇｏｍｅｚ−Ｃａｒｂｅｒａ）ら、２００８年、Ａｍ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．第８７号（１）：１４２〜１４９頁は、２重盲検無作為化臨床試験において、一日あたり１ｇのビタミンＣの経口投与が、骨格筋内のミトコンドリア生合成を減少させるということを実証した。
【０００７】
ヒドロキシチロソールは、過去においてプラスの心臓血管効果を有するものとして記載されてきた（例えばゴンザレス・サンチアゴ（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｓａｎｔｉａｇｏ）ら、２００６年、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、第１８８号：３５〜４２頁；またはミトロ（Ｍｉｔｒｏ）ら、２００３年ＮＭＣＤ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第１３号（５）：３０６頁；を参照のこと）が、これらは、ヒドロキシチロソールのアテローム動脈硬化防止効果および／または抗酸化物質としてのその状態に関するものである。
【０００８】
本発明は、その抗酸化物質として作用する能力とは全く異なるものである、ヒドロキシチロソールの老化防止特性に関する。
【０００９】
［発明の詳細な説明］
本発明は、老化防止剤としてのヒドロキシチロソールを含む組成物の使用であって、組成物が本質的にレスベラトロールを含まずかつ動物に対して経口投与される使用に関する。
【００１０】
老化は、恐らくはさまざまな細胞構成要素内の蓄積された損傷によってひき起こされる生理学的機能の漸進的低下をその特徴としている。ミトコンドリアは、正常な細胞の機能および維持のために用いられるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）分子内の栄養素を転化することによって細胞内でエネルギーを生成する遍在的細胞小器官である。ミトコンドリアは同様に、細胞の生存を調節することにも関与する。最近になって、ミトコンドリア機能の低下が疾病に寄与するばかりでなく老化プロセスにおいても重要な役割を果たすということが示唆された。一部の器官内のミトコンドリア数の減少およびミトコンドリア呼吸鎖の機能障害が、多くの場合老化プロセスに結びつき、老化に対する主要な寄与因子とみなされている。６５才〜７５才の健康な対象は、酸化的酵素活性および組織ミトコンドリア含量の損失を特徴とするミトコンドリア特性変化の兆候を示す。その上、高齢の動物から得られた組織は、エネルギー生成の減少に関連するミトコンドリア構造の変化を示す。高齢のヒトおよび動物の器官は、組織内のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）レベルが上昇しており、ｍｔＤＮＡ損傷は、最大寿命に反比例する。寿命を延ばすためのものと認められる最良の方法である栄養失調とならない程度のカロリー制限も同様に、ヒトの骨格筋内のミトコンドリア機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子を増加させ、細胞老化の指標となるＤＮＡ損傷を低減させる。こうして、老化は、ミトコンドリア生合成の低下とミトコンドリア損傷の蓄積と結びつけられる。
【００１１】
「ミトコンドリア生合成」とは、ミトコンドリアの成長、増幅および健常な維持のプロセスを意味する。ミトコンドリア生合成は、核およびミトコンドリアの両方の活動因子が関与する複雑なプロセスである。ミトコンドリアＤＮＡは、ミトコンドリアリボソーム上で翻訳される少数のタンパク質をコードする。これらのタンパク質の大部分は、内部ミトコンドリア膜の中に局在化されている呼吸鎖のきわめて疎水性の高いサブユニットである。核でコードされたタンパク質は、細胞質リボソーム上で翻訳され、ミトコンドリア内に移入される。これらのタンパク質には、構造タンパク質、酵素または酵素サブユニット、移入、複製、転写および翻訳機構の構成要素およびシャペロンが含まれる。
【００１２】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γ共活性化因子（ＰＧＣ−１）は、ミトコンドリア機能の制御に関与しミトコンドリア生合成を誘発する細胞エネルギー代謝の同時転写調節因子である。老化中の組織内におけるＰＧＣ−１の減少は、ミトコンドリア生合成の増加を導くＰＧＣ１の上昇により防止することのできるミトコンドリア機能障害の主要な要因である。
【００１３】
ヒドロキシチロソールは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体の活性化およびミトコンドリア生合成の増加を通してミトコンドリア機能を改善させる。こうしてミトコンドリア機能の改善が、細胞の老化ひいては身体の老化を防止できると思われる。したがって、ヒドロキシチロソールを、老化および加齢に関連する疾病を予防するための有用な作用物質とみなすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＰＧＣ−１αの発現を示す。Ａ）ＰＧＣ−１αの脂肪細胞におけるウェスタンブロット分析。Ｂ）デンシトメトリを用いたＰＧＣ−１α：α−チュブリン比について作表された定量値。値は、５つの実験の平均±ＳＥである。＊ｐ＜０．０５対対照；＊＊Ｐ＜０．０１対対照。
【図２】ミトコンドリアタンパク質の発現を示す。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を４８時間ヒドロキシチロソールで処理した。その後細胞をＳＤＳ試料緩衝液中に可溶化させ、α−チュブリン、ミトコンドリア電子輸送複合体Ｉ、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩおよび複合体Ｖに対する抗体を用いたウェスタンブロット法により分析した。定常状態レベルのタンパク質についての代表的な免疫ブロットが上部（Ａ）に示されている。デンシメトリによるバンドの定量分析は、それぞれミトコンドリア複合体Ｉ、複合体ＩＩ、複合体ＩＩＩおよび複合体ＶについてＢ、Ｃ、ＤおよびＥに示されている。示されている結果は、対照細胞の場合と比較した４つの独立した実験に由来する対照に比べた増加倍数である。＊ｐ＜０．０５対対照。＊＊ｐ＜０．０１対対照。
【図３】ミトコンドリアＤＮＡの発現を示す。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を４８時間ヒドロキシチロソールで処理した。ＳＹＢＲグリーンを用いてＰＣＲ産物を蛍光定量化した。Ｄ−ループ：１８ｓＲＮＡ比について定量比を作表した。結果は、対照の増加倍数として表現されている。データは平均±ＳＥ（ｎ＝５）である。＊Ｐ＜０．０５対対照；＊＊ｐ＜０．０１対対照。
【図４】３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中の酸素消費量を示す。９６ウェルのＢＤオキシジェンバイオセンサー（Ｏｘｙｇｅｎ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）平板のウェル内で等体積の細胞をアリコートに分けた。平板を被覆し、各ウェル内の蛍光を、蛍光マイクロプレート分光光度計を用いて経時的に記録した。Ａ）代表的酸素消費曲線。Ｂ）各々の条件の間の脂肪細胞の呼吸数の定量的変化を、反応速度測定値の判定によって計算した。値は、平均±ＳＥである。示されている結果は、対照細胞と比べた３つの独立した実験由来の対照の増加倍数である。＊ｐ＜０．０５対対照。
【図５】脂肪細胞中の複合体の活性に対するヒドロキシチロソールを用いた処理の効果を示す。（Ａ）複合体Ｉ、（Ｂ）複合体ＩＩ、および（Ｃ）複合体ＩＩＩ。脂肪細胞を、４８時間、異なる濃度のヒドロキシチロソールで処理した。値は、複合体Ｉについての３つの別々の実験および複合体ＩＩおよびＩＩＩについての６つの別々の実験からのデータの平均値±ＳＥであり、各実験をデュプリケートで実施した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１対対照。
【００１５】
転写共活性化因子であるＰＧＣ１αつまりペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）ガンマ共活性化因子１アルファは、幅広い代謝および生理学的プロセスの主調節因子として機能し、ミトコンドリア生合成プロセスにおける不可欠な因子である。ＰＧＣ−１α過剰発現は、ミトコンドリアの質量および活性の増加により示される通り、３Ｔ３細胞内のミトコンドリア生合成を刺激する。
【００１６】
好ましくは、ヒドロキシチロソールは組成物中唯一の活性な老化防止成分である。
【００１７】
こうして本発明に係わる組成物およびヒドロキシチロソール自体は、若さおよび／または健康を維持し、老化防止解決法をもたらし、老化プロセスを防止し、かつ／または老化しながらも人に喜びと満足を与える。
【００１８】
本発明の別の態様は、動物における所与の年令での加齢に関連する病気の有病率を低減させることによって、より長生きする確率を増加させるため；白髪、シワ、聴覚機能低下、筋肉量の低下、骨密度の低下および適切な心臓機能の低下といった（ただしこれらに限定されるわけではない）動物における老化プロセスの視覚的徴候を遅延させるため；および／または老化プロセスを加速させる動物における生活習慣病の危険性を減少させるための組成物の製造のための、ヒドロキシチロソールを含む組成物の使用であって、組成物が本質的にレスベラトロールを含んでいない、使用にある。
【００１９】
本発明の１つの目的は、老化防止剤としてのヒドロキシチロソールを含む組成物の使用であって、組成物が本質的にレスベラトロールを含まずかつ動物に対して経口投与される、使用にある。
【００２０】
ヒドロキシチロソール（３，４−ジヒドロキシフェニルエタノール）は合成由来のものであってよく、あるいはオリーブの葉、オリーブの実およびオリーブ油生産の油廃液の抽出物から単離してもよい。
【００２１】
したがって「ヒドロキシチロソール」という用語は同様に、植物材料または抽出物の合計重量を基準として特に少なくとも３０重量％の量、好ましくは少なくとも４０重量％の量、より好ましくは少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０重量％の量、最も好ましくは少なくとも５０重量％の量でヒドロキシチロソールを含有する（オリーブなどの）植物の任意の材料または抽出物あるいは植物の一部分の材料または抽出物あるいは植物の実の任意の抽出物／濃縮物／分泌液も包含する。本発明に関して使用される「植物の材料」および「植物材料」という用語は、植物の果実同様、任意の部分を意味する。
【００２２】
本発明のさらなる実施形態においては、ヒドロキシチロソールの代わりにまたはヒドロキシチロソールに加えてエステルおよび生理学的／薬学的に許容できる塩などのヒドロキシチロソール誘導体も使用してよい。適切な誘導体は当業者にとって公知である。ヒドロキシチロソールの好ましいエステルは、例えば酢酸エステルまたはグルクロニド抱合体であり、最も好ましいのはオレウロペインである。
【００２３】
「本質的にレスベラトロールを含んでいない」という表現は、組成物中のレスベラトロールの量が、組成物の合計重量を基準にして１重量％以下、好ましくは０．５重量％以下、より好ましくは０．１重量％以下であることを意味する。このことは同様に、レスベラトロールが意図的に組成物に添加されないことも意味している。レスベラトロールは、組成物の中で、オリーブなどの植物またはその実から得られるヒドロキシチロソール抽出物／濃縮物の副産物としてのみ存在してよい。存在する場合には、その生物活性が有意でない濃度で存在する。
【００２４】
「組成物は動物に対して経口投与される」とはすなわち、組成物が、動物が食べるかまたは飲むことのできる或いはまた口／あごを介して動物の胃の中に入ることのできる任意の形態をとっている、ということを意味している。
【００２５】
したがって組成物は好ましくは、健康サプリメント、食品添加物、機能性食品、飼料添加物、機能性飼料、食品プレミックス、飼料プレミックスおよび飲料からなる群から選択される。健康サプリメントの形態の例としては、錠剤、丸薬、顆粒、糖衣錠、カプセル、インスタントドリンクおよび発泡性処方物である。
【００２６】
食品／飼料添加物の例としては、食品／飼料に対しその製造または消費向け調製の間に添加される任意の組成物／処方物がある。
【００２７】
機能性食品の例としては、乳製品（ヨーグルト）、シリアルバーおよびベーカリー品目例えばケーキ、クッキーおよびパンがある。臨床的栄養物も同様に包含される。
【００２８】
ペットフード組成物を含めた機能性飼料の例としては、必要な食事必需品を供給するように意図された飼料、ならびにおやつ（例えばドッグビスケット）またはその他の飼料サプリンメントが含まれる。本発明による組成物を含む動物用飼料は、乾燥組成物（例えば粗びき穀物）、半湿潤組成物、湿潤組成物またはそれらの任意の混合物の形態をとっていてよい。代替的または付加的には、動物用飼料は、サプリメント、例えばグレイビー、飲料水、ヨーグルト、粉末、懸濁液、咀嚼物、おやつ（例えばビスケット）またはその他の任意デリバリー形態である。
【００２９】
食品プレミックスの例としては、乳製品、シリアルバーおよびベーカリー品目例えばケーキおよびクッキー、そしてスープの製造のためのプレミックスがある。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、例えば飼料組成物を調製する目的で１つ以上の食用飼料物質または成分に添加するための、または既存の飼料に補足して飼料組成物を形成するための飼料添加物または添加物組成物に関する。
【００３１】
いわゆるプレミックスは、本発明の動物飼料添加物の例である。プレミックスは、１つ以上の微小成分と希釈剤および／または担体の好ましくは均一な混合物を指す。プレミックスは、より大きな混合物内の微小成分の均一な分散を容易にするために用いられる。プレミックスは、顆粒またはペレットの形態をとっていてよい。
【００３２】
１つの特定の実施形態においては、食品、飼料に添加される形態でのヒドロキシチロソールまたは飼料添加物の中に含み入れられている場合のヒドロキシチロソールは明確である。「明確な（ｗｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ）」という用語は、ヒドロキシチロソール調製物が少なくとも４０％純粋であることを意味する。その他の特定の実施形態では、明確なヒドロキシチロソール調製物は、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、８８、９０、９２、９４または少なくとも９５％純粋である。
【００３３】
一般に、脂溶性および水溶性ビタミンならびに微量ミネラルが、飼料に対し添加するように意図されたいわゆるプレミックスの一部を成す一方、マクロミネラルは通常、飼料に別個に添加される。
【００３４】
さらに、任意の飼料添加物成分は着色剤、例えばカロテノイド例えばベータカロテン、アスタキサンチンおよびルテイン；芳香化合物；安定剤；抗菌性ペプチド；活性酸素発生種；および／またはフィターゼ（ＥＣ３．１．３．８または３．１．３．２６）；キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）；ガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．８９）；α−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２２）；プロテアーゼ（ＥＣ３．４．，ホスホリパーゼＡ１（ＥＣ３．１．１．３２）；ホスホリパーゼＡ２（ＥＣ３．１．１．４）；リゾホスホリパーゼ（ＥＣ３．１．１．５）；ホスホリパーゼＣ（ＥＣ３．１．４．３）；ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）；アミラーゼ例えばα−ミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）；および／またはベーターグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４またはＥＣ３．２．１．６）の中から選択される少なくとも１つの酵素である。
【００３５】
飲料は、ノンアルコールおよびアルコール飲料ならびに飲料水および液体食品に添加すべき液体調製物を包含する。ノンアルコール飲料は例えばインスタントドリンク、ソフトドリンク、スポーツドリンク又はスポーツ飲料全般、フルーツジュース例えばオレンジジュース、アップルジュースおよびグレープフルーツジュース；野菜ジュース例えばトマトジュース；スムージー、レモネード、機能水、ニアウォータードリンク（すなわちカロリー含量の低い水ベースの飲料）、茶およびミルクベースの飲料である。アルコール飲料は特にビールである。液体食品は、例えばスープおよび乳製品（例えばミューズリードリンク）である。
【００３６】
本発明による健康サプリメントはさらに、保護用親水コロイド、結合剤、膜形成剤、封入剤／材料、壁／シェル材料、マトリクス化合物、コーティング、乳化剤、表面活性剤、可溶化剤（油、脂肪、ろう、レシチンなど）、吸着剤、担体、充填剤、配位化合物（ｃｏ−ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、分散剤、湿潤剤、加工助剤（溶媒）、流動化剤、味覚マスキング剤、増量剤、ゼリー化剤、ゲル形成剤、抗酸化剤および抗菌剤を含有していてよい。
【００３７】
同様に使用可能であり本発明に包含されている健康サプリメントに対する代用品は、医薬組成物である。
【００３８】
上述の通りの好ましい純度（およびさらなる選好性）を有する薬学的に許容できる担体およびヒドロキシチロソール（誘導体）の他に、本発明による医薬組成物はさらに、水、任意の由来のゼラチン、植物性ガム、リグニンスルホン酸塩、タルク、糖、デンプン、アラビアゴム、植物油、ポリアルキレングリコール、着香剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝液、潤滑剤、着色剤、湿潤剤、充填剤などを含めた（ただしこれらに限定されるわけではない）従来の医薬添加物およびアジュバンド、賦形剤または希釈剤を含有していてよい。担体材料は、経口投与に適した有機または無機不活性担体材料であり得る。
【００３９】
本発明による健康サプリメントおよび医薬組成物は、例えば錠剤、丸薬、顆粒、糖衣錠、カプセルおよび発泡性処方物例えば粉末および錠剤などの固体形態、または溶液、エマルジョンまたは懸濁液例えば飲料、ペーストおよび油性懸濁液などといった液体形態など、動物の身体（好ましくは人体）への経口投与に適した任意のガレヌス剤形をとり得る。ペーストを硬または軟シェルカプセル内に充填してよい。健康サプリメントおよび医薬組成物は、制御（遅延）放出型処方物の形態をとっていてもよい。
【００４０】
本発明によると、かかる組成物は、動物（好ましくはヒト）において老化プロセスを遅延させるため、動物（好ましくはヒト）において加齢に関連する生理学的欠点を改善するためおよび／または動物（好ましくはヒト）において健康な老化を促進するために使用される。
【００４１】
したがって本発明は同様に、動物（好ましくはヒト）に対して経口投与され、動物（好ましくはヒト）における老化プロセスを遅延させるため；動物（好ましくはヒト）における加齢に関連する生理学的欠点を改善するためおよび／または、動物（好ましくはヒト）における健康な老化を促進するためのヒドロキシチロソールを含む（以上で示された形態および選好性を有する）組成物であって、本質的にレスベラトロールを含んでいない組成物にも関する。
【００４２】
さらに本発明は、動物に有効量のヒドロキシチロソールまたは有効量のヒドロキシチロソールを含む組成物を投与することにより、動物における老化プロセスを遅延させる；動物における加齢に関連する生理学的欠点を改善するおよび／または；動物における健康な老化を促進する方法であって、組成物が本質的にレスベラトロールを含んでいない方法に関する。
【００４３】
本発明に関して動物にはヒトが含まれ、哺乳動物、魚および鳥が包含される。好ましい「動物」はヒト、ペット動物そして家畜である。特に好ましい動物はヒトである。
【００４４】
ペット動物の例としては、イヌ、ネコ、鳥、観賞魚、モルモット、（ジャック）ウサギ、野ウサギおよびフェレットがある。家畜の例としては、養殖魚、ブタ、ウマ、反芻動物（畜牛、羊および山羊）そして家禽がある。
【００４５】
本発明に関して「動物における老化プロセスを遅延させる」という表現は、次のうちのいずれかを意味する：
所与の年令での加齢に関連する病気の有病率を低減させることによって、より長生きする確率を増加させること；
白髪、シワ、聴覚機能低下、筋肉量の低下、骨密度の低下および適切な心臓機能の低下といった（ただしこれらに限定されるわけではない）老化プロセスの視覚的徴候を遅延させること；および／または
老化プロセスを加速させる生活習慣病の危険性を減少させること。
【００４６】
本発明に関して「動物における加齢に関連する生理学的欠点を改善する」という表現は、所与の年令での加齢に関連する病気が発生する（平均的）危険性を減少させることを意味する。
【００４７】
本発明に関して「動物における健康な老化を促進する」という表現は、健康的な推定寿命を増大させること、すなわちより長く健康を維持する機会を増大させることを意味する。
【００４８】
かかる効果は、処置を受けた個体対未処置の対照グループにおける平均老化状態／有病率を比較する介入試験において最も良く研究されている。
【００４９】
ヒト（７０ｋｇの人）に対するヒドロキシチロソールの一日投与量は、少なくとも０．１ｍｇであってよい。それは５から５００ｍｇまで、好ましくは１０から１００ｍｇまで変動してよい。
【００５０】
ヒドロキシチロソールの好ましい用量は、哺乳動物について、代謝体重１ｋｇあたり０．２８から１．９ｍｇまで変動し、したがって、哺乳動物については、
「代謝体重」（ｋｇ単位）＝（体重［ｋｇ単位］）０．７５
である。このことは例えば、７０ｋｇのヒトについて、好ましい一日用量は６．７７〜４５．９８ｍｇの間で変動し、２０ｋｇのイヌについては好ましい一日用量は２．２３〜１５．１ｍｇの間で変動すると考えられることを意味している。
【００５１】
本発明についてここで、以下の非限定的な実施例を用いてさらに説明する。
【００５２】
［実施例］
［実施例１：軟ゼラチンカプセル］
カプセル１個あたり５０ｍｇというヒドロキシチロソール用量を提供する軟ゼラチンカプセルを従来の手順により調製する。適切な日用量は１〜５カプセルである。
【００５３】
［その他の成分：］
グリセロール、水、ゼラチン、植物油。
【００５４】
［実施例２：硬ゼラチンカプセル］
カプセル１個あたり７５ｍｇというヒドロキシチロソール用量を提供する硬ゼラチンカプセルを従来の手順により調製する。適切な日用量は１〜５カプセルである。
【００５５】
［その他の成分：］
充填剤：ラクトースまたはセルロースまたはセルロース誘導体（適量）
潤滑剤：必要に応じて、ステアリン酸マグネシウム（０．５％）
【００５６】
［実施例３：錠剤］
活性成分として錠剤一個あたり１００ｍｇのヒドロキシチロソールそして賦形剤として５００ｍｇまでの微結晶性セルロース、二酸化シリコーン（ＳｉＯ２）、ステアリン酸マグネシウム、クロスカルメロースナトリウムを提供する錠剤を、従来の手順によって調製する。
【００５７】
［実施例４：ソフトドリンク］
ヒドロキシチロソールを含むソフトドリンクを以下の通りに調製してよい：
【００５８】
【表１】
2010524876.tif 000002
【００５９】
果汁濃縮物および水溶性フレーバを、空気を取込むことなく混合する。脱イオン水の中に顔料を溶解させる。水中にアスコルビン酸およびクエン酸を溶解させる。安息香酸ナトリウムを水中に溶解させる。撹拌下でペクチンを加え、沸とうさせながら溶解させる。溶解を冷却させる。オレンジ油と油溶性フレーバを予混合する。Ｆに記されている活性成分をＡの果汁濃縮混合物中へと撹拌する。
【００６０】
ソフトドリンクを調製するために、全ての成分Ａ−Ｆを混合してから、Ｔｕｒｒａｘ及び次に高圧ホモジナイザー（ｐ１＝２００バール、ｐ２＝５０バール）を用いて均質化する。
【００６１】
［実施例５］
［ミトコンドリア生合成］
抗ウサギＰＧＣ−１αおよび抗ウサギＰＰＡＲ−γを、サンタ・クルス（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）（米国カリフォルニア州）から購入し；抗−α−チュブリンをシグマ（Ｓｉｇｍａ）（米国ミズーリ州セントルイス）から；ミトトラッカーグリーン（Ｍｉｔｏ−Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ）ＦＭ、抗酸化性複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶをインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（米国カールスバッド）から；ＳＹＢＲ（登録商標）ＧＲＥＥＮ  ＰＣＲマスターミックス（Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）をＡＢＩ（英国ウォリントン）から；ＢＤオキシジェンバイオセンサーシステム平板をＢＤバイオサイエンシーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（米国カリフォルニア州）から；ヒドロキシチロソールを（ＤＳＭニュートリショナルプロダクツ（ＤＳＭ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））から購入し、ミトコンドリアＤ−ループおよび１８ＳＲＮＡプライマをバイオエイシア・バイオテック（Ｂｉｏａｓｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（中国上海）により合成し、細胞培養のためのその他の試薬をインビトロジェン（米国カールスバッド）から入手した。
【００６２】
［細胞培養および脂肪細胞の分化］
マウス３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））を、１０％のウシ胎仔血清を追加したダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で培養し、コンフルエンスに到達させた。前脂肪細胞の分化を、１０％のウシ胎仔血清を追加したＤＭＥＭ中の１μＭのインシュリン、０．２５μＭのデキサメタゾンおよび０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチンで開始させた。４８時間後に、１０％のウシ胎仔血清および１μＭのインシュリンを追加したＤＭＥＭで培地を入れ換えた。１０％のウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭで一日おきに培地を交換した。９０％の脂肪細胞表現型を示した場合に分化誘発から９〜１０日後に細胞を使用した。
【００６３】
［ミトコンドリア質量の決定］
脂肪細胞をトリプシン処理し、５分間４℃で１０００ｒｐｍで遠心分離し、ＨＥＰＥＳおよび０．１％のＢＳＡで緩衝させたクレブス・リンガー液（Ｋｒｅｂ’ｓ  Ｒｉｎｇｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中に再懸濁させ、次に３７℃で３０分間ＤＭＥＭ中の０．１μＭのミトトラッカーグリーンＦＭと共にインキュベートした。５分間４℃で１０００ｒｐｍで細胞を遠心分離し、ＨＥＰＥＳで緩衝させた４００μｌの新鮮なクレブス・リンガー液中に再懸濁させた。画分中での相対的ミトコンドリア染色を検査するため、各画分からの２００μｌのＰＢＳ中の２０×１０３個のミトトラッカーで標識された細胞を９６ウェルの平板内に装填し、相対的蛍光強度を、蛍光マイクロプレート分光光度計（モレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ））を用いて読み取った（励起４８５±２５ｎｍ；発光５３８±２５ｎｍ）。結果は、未処理の対照細胞に比べた蛍光強度の増加倍数として表現されている。値は、４つの独立した実験からの結果の平均±ＳＥである。
【００６４】
［ウェスタンブロット分析］
処理後、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、室温で試料緩衝液（６２．５ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ６．８、２％のＳＤＳ、５ｍＭのＤＴＴ）中に溶解させ、ボルテックスした。その後細胞溶解物を５分間沸とうさせ、遠心分離（４℃で１０分間、１３，０００ｒｐｍ）によって清澄化した。バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＤＣタンパク質検定を用いてタンパク質濃度を決定した。可溶性溶解物（１レーンあたり１０μｇ）を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、次にタンパク質をニトロセルロース膜に移し、室温で１時間５％の脱脂乳／ＴＢＳＴでブロックした。５％の乳／ＴＢＳＴ中のＰＰＡＲ−γ（１：１０００）、ＰＧＣ−１α（１：１０００）、α−チュブリン（１：１０，０００）、複合体Ｉ（１：２０００）、複合体ＩＩ（１：２０００）、複合体ＩＩＩ（１：２０００）および複合体Ｖ（１：２０００）に対して向けられた一次抗体と共に一晩４℃で膜をインキュベートした。ＴＢＳＴで膜を３回洗浄した後、膜を室温で１時間、ホースラディッシュペルオキシダーゼで抱合された二次抗体と共にインキュベートした。ＥＣＬ（ロシュ・マンハイム（Ｒｏｃｈｅ  Ｍａｎｈｅｉｍ）ドイツ）を用いてウェスタンブロットを現像し、走査型デンシトメトリにより定量化した。
【００６５】
［脂肪細胞中の呼吸の測定］
ミトコンドリア呼吸活性の目安として、無傷の細胞による酸素消費を測定した。ＢＤ（商標）オキシジェンバイオセンサーシステム（米国ニュージャージ州フランクリンレークのＢＤバイオサイエンシーズ）は、マルチウェル平板の底面に常時付着させられたガス透過可能で疎水性のマトリクスの中に包埋された酸素感応性の蛍光化合物（トリス１，７−ジフェニル−１，１０フェナントロリンルテニウム（ＩＩ）クロリド）である。染料の近くの酸素濃度は、液体培地内のものと平衡状態にある。酸素は、予測可能な濃度依存型の要領で染料を急冷させる。蛍光の量は、ウェル内の酸素消費速度と直接相関関係を有し、酸素消費速度はそれ自体、酸素消費に付随し得るあらゆる種類の反応に関係する可能性がある。独特の技術により、酸素レベルの均質で瞬間的な検出が可能となる。処理後、ＫＲＨ緩衝液に１％のＢＳＡを加えたものの中で脂肪細胞を洗浄した。各条件に由来する細胞を、トリプリケートで、ＢＤオキシジェンバイオセンサーシステム平板（ＢＤバイオサイエンス）内でアリコートに分割した。平板を密封し、４８５ｎｍの励起波長そして６３０ｎｍの発光波長で６０分間、１分間隔で蛍光分光計（モレキュラープローブ）上にて「読み取り」を行った。等体積中に含まれている細胞数は、各条件間で統計的に有意な形で異なっていなかった（ウィルソン・フリッチ（Ｗｉｌｓｏｎ−Ｆｒｉｔｃｈ）ら、２００４年Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、第１１４号：１２８１〜１２８９頁）。
【００６６】
［ミトコンドリアＤＮＡの測定］
ＭＸ３０００Ｐの実時間ＰＣＲシステム（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））の中で定量的ＰＣＲを実施した。１２．５μｌのＳＹＢＲ−グリーンマスターミックス（ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）（ＡＢＩ）、各々０．５μｌずつのプライマ（１０μＭ）、１００ｎｇの鋳型（ＤＮＡ）を用いてまたは鋳型無し（ＮＴＣ）で反応を実施し、ＲＮアーゼを含まない水を、２５μｌの最終体積まで添加した。サイクリング条件は以下の通りであった：２分間５０℃、１０分間９５℃での初期変性とそれに続く３０秒間９５℃、１分間５５℃および３０秒間７２℃のサイクル４０回。各々の定量的ＰＣＲはトリプリケートで実施された。以下のプライマが用いられた：ミトコンドリアＤ−ループ順方向、
５’−ＡＡＴＣＴＡＣＣＡＴＣＣＴＣＣＧＴＧ−３’（配列番号：１）
逆方向：５’−ＧＡＣＴＡＡＴＧＡＴＴＣＴＴＣＡＣＣＧＴ（配列番号：２）
１８ＳＲＮＡ順方向：５’−ＣＡＴＴＣＧＡＡＣＧＴＣＴＧＣＣＣＴＡＴＣ−３’（配列番号：３）および
逆方向：５’−ＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＧＡ−３’（配列番号：４）
マウス１８ＳｒＲＮＡ遺伝子は、内因性基準遺伝子として役立った。特異的増幅を確実なものとするために融解曲線を行なった。融解曲線法は相対的定量化のために使用された。次にミトコンドリアＤ−ループ対１８ＳｒＲＮＡの比率を計算した。最終結果は、対照百分率として提示されている。
【００６７】
［ミトコンドリア複合体Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの活性検定］
１００ｍｍの平板内で脂肪細胞を培養し、ＰＢＳ中で洗浄し、適切な等張緩衝液（０．２５Ｍのスクロース、５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および０．１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル）中に再懸濁させ、均質化した。細胞ホモジネートの分画遠心法によりミトコンドリアを単離した。ＮＡＤＨ−ＣｏＱ酸化還元酵素（複合体Ｉ）、スクシネート−ＣｏＱ酸化還元酵素（複合体ＩＩ）、ＣｏＱ−シトクロムｃ還元酵素（複合体ＩＩＩ）を、わずかな修正を加えた従来の検定（Ｐｉｃｋｌｏおよびモンチン（Ｍｏｎｔｉｎｅ）、２００１年Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、第１５３５号：１４５〜１５２頁；ハンフリーズ（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ），Ｋ．Ｍ．およびＳｚｗｅｄａ，Ｌ．Ｉ．１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３７号：１５８３５〜１５８４１頁））を用いて分光検定した。
【００６８】
［統計分析］
全ての定性的データが、少なくとも３つの独立した実験を代表していた。データは平均±ＳＥとして提示されている。２つのグループ間のボンフェローニのポストホック（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ）試験と共に一方向ＡＮＯＶＡを使用することによって、統計的有意性を判定した。有意性についての基準はｐ＜０．０５に設定した。
【００６９】
［結果：］
［脂肪細胞中のＰＧＣ−１αタンパク質レベルに対するヒドロキシチロソールの効果］
図１に示されている通り、ヒドロキシチロソールは、最大タンパク質発現が１．０μＭにある状態で、０．１μＭから１０．０μＭまで増大するＰＧＣ−１αに対する釣鐘状効果を示した（２０５±５２％、ｐ、０．０５対対照）。
【００７０】
［脂肪細胞内の複合体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶタンパク質発現に対するヒドロキシチロソールの効果］
ミトコンドリア複合体をウェスタンブロット法によって決定した（図２）。０．１μＭ（１３１±１６％、ｐ＜０．０５対対照）、１．０μＭ（１６３±３１％、ｐ＜０．０１対対照）および１０．０μＭ（１３８±２１％、ｐ＜０．０５対対照）でのヒドロキシチロソール処理で、ミトコンドリア電子輸送複合体Ｉタンパク質上に増加が観察された。
【００７１】
［ミトコンドリアＤＮＡに対するヒドロキシチロソールの効果］
Ｄ−ループはｍｔＤＮＡの重鎖および軽鎖の両方の上の主要な転写開始部位として知られていることから、本発明者らは、ヒドロキシチロソールがｍｔＤＮＡ発現を増大できるか否かを体外で調査した。図３に示されている通り、ｍｔＤ−ループ／１８ＳＲＮＡの比率は、１．０μＭでヒドロキシチロソールの処理を受けた脂肪細胞内で有意に増大していた。
【００７２】
［脂肪細胞内の酸素消費量に対するヒドロキシチロソールの効果］
ミトコンドリア生合成の増加に酸素消費の変化が伴うか否かを判定するために、細胞を０．１〜１０μＭのヒドロキシチロソールで処理した。図４に示されている通り、基礎酸素消費速度は、１．０〜５．０μＭのヒドロキシチロソールで処理された脂肪細胞内で有意に増加した。
【００７３】
［ミトコンドリア複合体Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの活性についての検定］
ヒドロキシチロソールは、対照に対比してそれぞれ０．１μＭおよび１．０μＭで脂肪細胞内においてミトコンドリア複合体ＩおよびＩＩの活性の有意な増加を示した（図５Ａおよび５Ｂ）。ヒドロキシチロソールは同様に、０．１μＭ〜１０μＭでも脂肪細胞内のミトコンドリア複合体ＩＩＩの活性の有意な増加を示した。
【００７４】
データは、ヒドロキシチロソールがｍｔＤＮＡでコードされたポリペプチドおよびミトコンドリア電子輸送複合体Ｉの発現を増加させることを示している。その上、複合体ＩＩおよびＶの活性および酸素消費量は増大し、こうしてミトコンドリア呼吸活性の増大を導く。最終的に、ヒドロキシチロソールは、ミトコンドリア活性およびミトコンドリア生合成の制御に関与するペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γ共活性化因子１（ＰＧＣ−１）の発現を増大させた。このＰＧＣ−１の増加は、ミトコンドリア生合成の増加を導く。
【００７５】
要約すると、ヒドロキシチロソールは、ミトコンドリア活性を促進し、これを用いて老化プロセスを防止またはそれに対処することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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