(57)【要約】本発明は、簡便かつ急速なプロトコルによって単子葉植物を形質転換して、４〜８週間程度で土壌に植え付けることができる再生植物を得る方法を提供する。関連する細胞培養培地および生育条件も提供する。さらに、本発明の方法による形質転換可能性につき、抵抗性植物遺伝子型をスクリーニングする方法も提供する。また、本発明の方法によってトランスジェニック植物を作製するための優先開発ウィンドウを拡張するシステムも提供する。
2010502196.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック単子葉植物を作製する方法であって、
（ａ）少なくとも第１の選択されたＤＮＡで外植体を形質転換し；
（ｂ）根および／または苗条の形成ができる再生可能構造体の発育を促進するために、有効な比率でサイトカイニンおよびオーキシンを含む第１の培養培地中で、前記外植体を培養し；次いで、
（ｃ）少なくとも、根および苗条組織の同時成長を支持する第２および／または第３の培養培地中で前記外植体を培養して、再生トランスジェニック単子葉植物を作製することを特徴とし、
ここに、前記再生形質転換単子葉植物は、前記外植体を形質転換する約４〜８週間以内で作製される、方法。
【請求項２】
前記再生トランスジェニック単子葉植物を植物生育培地へ移すことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生育培地は非滅菌マトリクスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記非滅菌マトリクスはプラグに含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
再生可能構造体は、前記外植体を形質転換する約６〜１４日間以内で作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）は、前記外植体を形質転換する約６〜１４日以内に完了する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）および（ｂ）は、カルスを増殖させることなく、約１０日間から約２週間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第１の培養培地は殺菌性化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第２および／または第３の培養培地は、第１の培養培地に見出されるよりも高い濃度にて、スクロースを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第１の培養培地はLynx 1947を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）は、根および苗条組織の同時成長を支持する植物成長調節物質フリーの液体培養培地中で前記外植体を培養して、再生トランスジェニック単子葉植物を作製する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
根および苗条組織の同時成長を支持する前記培養培地はLynx 2067を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）は、約６から約１２日間の長さで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）は、前記外植体を形質転換する約４〜８週間以内に開始される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
第１の培養培地中のオーキシンに対するサイトカイニンの比は、約０．００５から約０．０３（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
第１の培養培地中のオーキシンに対するサイトカイニンの比は、モル換算で約０．００５から約０．０３である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記サイトカイニンは、BAP、ゼアチン (zeatin)、カイネチン (kinetin)、およびTDZよりなる群から選択され；オーキシンは、IAA、2,4-D、NAA、IBA、およびジカンバ (dicamba)よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｃ）は、第１の培地と比較して、オーキシンに対する比が増大した苗条形成成長調節物質を含む第２の培養培地中で前記外植体を培養して、根および苗条の発育を同時に促進することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｃ）の培地はLynx 2068および／または Lynx 2202である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
添加植物成長調節物質を欠如する第２および／または第３の培養培地中で前記外植体を培養することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
第２の培地中のオーキシンに対する苗条形成成長調節物質の比は、約０．０２から約０．０６（ｗ／ｗ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
第２の培地はLynx 2202またはLynx 2068である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｃ）の開始後、新鮮な生育培地は添加されない、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
第１の培養培地は、約０．００１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌのサイトカイニンおよび約０．１ｍｇから約１５ｍｇ／Ｌのオーキシンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記外植体は、第１および第２の培地上での培養の間に第４の培地上でさらに培養され、ここに、前記第４の培地は、有効量のオーキシンおよびサイトカイニンを含み、カルス増殖を促進する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
第４の培地はLynx 2063である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記外植体は、第２および第３の培地上での培養の間に第５の培地上でさらに培養され、ここに、前記第５の培地は、苗条生長を促進するのに有効な量のサイトカイニンを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
第５の培地はLynx 2066である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記外植体を形質転換することが細菌媒介形質転換を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記バクテリア媒介形質転換は、アグロバクテリウム種 (Agrobacterium sp.)、リゾビウム種 (Rhizobium sp.)、シノリゾビウム種 (Sinorhizobium sp.)、メゾリゾビウム種 (Mesorhizobium sp.)、およびブラディリゾビウム種 (Bradyrhizobium sp.)よりなる群から選択されるバクテリアを用いて行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
第２および／または第３の培養培地は、第１の培地中の量と比較して低減された量のオーキシン、サイトカイニン、アブシジン酸、またはその組合せを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
第２および／または第３の培養培地は、第１の培地の半分未満のオーキシンまたはオーキシン様植物成長調節物質活性を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第１の培養培地ならびに、根および苗条組織の同時成長を支持する培養培地は、液体培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
第１の培養培地は半固体培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
第１の培養培地の後に用いる各培地は液体培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｂ）および（ｃ）は、単一の容器の中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記単子葉植物は、トウモロコシ、コメ、ソルガム (sorghum)、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキビ、オーツムギ、ライコムギ (triticale)、スイッチグラス (switchgrass)、またはシバ (turfgrass) 植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記単子葉はトウモロコシ植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
トランスジェニック植物を作製するための優先開発ウィンドウを拡張するシステムであって、
（ａ）少なくともある程度、第１のフィールドテストで収集されたデータに基づいて、トランスジェニック植物を作製するための対象の候補ＤＮＡセグメントを選択し；
（ｂ）請求項１に記載の方法によって、前記ＤＮＡセグメントを含むトランスジェニック単子葉植物を調製し；ついで、
（ｃ）少なくとも、第１のフィールドテストが実行される時期に引き続く生育時期に実行される第２のフィールドテストにおける所望の発現型および／または遺伝子型について、前記トランスジェニック植物をアッセイすることを特徴とする、システム。
【請求項４０】
第１のフィールドテストまたは第２のフィールドテストのうち一方または双方をアメリカ合衆国中西部で行う、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記トランスジェニック植物のアッセイは農業形質の測定を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
第２のフィールドテストはハイブリッド収率テストであるである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
第２のフィールドテストは第１のフィールドテスト後の２つの生育時期に行われる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
形質転換可能性について穀物植物系統の細胞をスクリーニングする方法であって、
（ａ）苗条始原体の作製を支持する生育培地上で、穀物植物の外植体を約１〜２週間以内培養し；
（ｂ）苗条伸張を支持する条件下、少なくともさらに約１週間、暗闇中で前記苗条始原体を培養して、生育中の苗条組織および／または小植物を獲得し；ついで、
（ｃ）少なくともさらに約１週間、植物育生倍地上で、ステップ（ｂ）の組織または小植物を培養して、苗条芽および／または植物を得、
ここに、ステップ（ｃ）の後に、苗条始原体が苗条芽および／または植物を作製する能力によって、前記細胞の形質転換可能性を測定する、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００６年８月３１日に出願され、出典明示して全体が本明細書の一部とみなされる、米国仮出願第６０／８４１,５１９号を基礎とする優先権を主張する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、概略、植物バイオテクノロジーに関する。より詳しくは、本発明は、対象の遺伝子で単子葉を形質転換するための改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
植物バイオテクノロジーにおけるゲノム科学に基づく手法は、多数の遺伝子の同定および単離を可能とし、かつ、これらの遺伝子の有用性を試験するために、それらをトウモロコシのごとき経済的に重要な単子葉に形質転換することによる、信頼性があり、かつ、効率的な高スループット形質転換作製システムを必要としてきた。トウモロコシ、コメおよびコムギのごとき単子葉のアグロバクテリウム媒介形質転換は、しばしば、未成熟胚のごとき分裂組織の外植体としての使用と共に、広く用いられている実験的手法である（例えば、［Ishida et al., 1996; Zhao et al., 2001; Frame et al., 2002］）。コメについては、吸水種子の形質転換も報告されている［Toki et al., 2006］。現在まで、アグロバクテリウムに細胞を接触させる最もありふれた方法は、未成熟胚のごとき外植体組織を培養（「共培養」）し、可能であれば、「遅延 (delay)」または「休止 (resting)」の（非選択的）ステップを含み、その後、細胞の脱分化を許容してカルスを形成するオーキシンを含有する選択培地上で培養することを含む。カルス形成期の間、選択培地上で適当な選択剤の存在下、形質転換抵抗性カルス組織を選択する。この後、再生および発根用の培地上でカルスの分化およびカルスの植物への再生を促進する条件下、細胞成長がある。この方法は、典型的には、さらなる成長のために土壌に移せる植物を作製するのには少なくとも１０〜１２週間が必要である。この方法は、この形質転換法全体にわたって、組織を何回も手動で移す必要もあり、いくつかの異なるタイプの培地を用いる。
【０００４】
参考文献
以下の参考文献は、ここに記載されたものを追補する代表的な手続き上その他の詳細を提供し、出典明示して本明細書の一部であるとみなされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
米国特許第4,769,061号
米国特許第4,757,011号
米国特許第4,971,908号
米国特許第4,940,835号
米国特許第4,971,908号
米国特許第5,352,605号
米国特許第5,641,876号
米国特許第6,294,714号
米国特許第7,150,993号
米国特許出願公開第2004/0244075号
米国特許出願公開第2005/0246786号
米国特許出願第11/749,583号
【非特許文献】
【０００６】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
かくして、初期調査で得られた結果に基づいてどの遺伝子構築物をより大きなスケールの形質転換作業に用いるか優先順位付けに関する決定を行うための時期限定「優先開発ウィンドウ (priority development window)」が普通はあるとの前提のもと、標準形質転換および再生プロトコルの使用は、時間がかかり、不十分であり、かつ、前記トランスジェニック製品開発のスケジュールにマイナスの影響を与える。それゆえ、単子葉形質転換の分野で、トランスジェニック植物を即座に作製して、優先開発ウィンドウの間に調査および作製を行うために、より多くの時間と柔軟性を与える必要がある。トウモロコシ形質転換についてのそのような高いスループットシステムは、遺伝子を試験し、有用な植物を創出する多数のトランスジェニック植物を生み出しつつ、材料や労働コストを低減した。
【０００８】
さらに、異なる繁殖系統の胚形成応答は大いに異なり、形質転換可能なトウモロコシのごとき穀物の遺伝子型を制限する。したがって、いくつかの系統は胚形成カルスを容易に形成するが、一般的に、多くは何ら胚形成カルスを形成することがない。そのような系統は、しばしば、抵抗性 (recalcitrant)系統とみなされる。これは形質転換に非有望系統の使用を必要とし、農業的に有望なトランスジェニック変種を生み出すために何世代もの繁殖を必要とする。かくして、今までの「抵抗性」トウモロコシ遺伝子型の形質転換を可能として、製品開発のために、ならびに、そのような遺伝子型をその潜在的形質転換可能性についてスクリーニングするために、形質転換可能な系統の幅広い選択を可能とする形質転換法がさらに必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ひとつの局面において、本発明は、トランスジェニック単子葉植物を作製する方法であって、（ａ）少なくとも第１の選択されたＤＮＡで外植体を形質転換し；（ｂ）根および／または苗条の形成ができる再生可能構造体の発育を促進するために、有効な比率でサイトカイニンおよびオーキシンを含む第１の培養培地中で、前記外植体を培養し；次いで、（ｃ）少なくとも、根および苗条組織の同時成長を支持する第２および／または第３の培養培地中で前記外植体を培養して、再生トランスジェニック単子葉植物を作製することを特徴とし、ここに、前記再生形質転換単子葉植物は、前記外植体を形質転換する約４〜８週間以内で作製される、方法を提供する。この方法は、さらに、ひとつの具体例において、前記再生トランスジェニック単子葉植物を植物生育培地へ移すことを含むことができる。特定の具体例において、前記生育培地は非滅菌マトリクスであって、プラグに含まれる非滅菌マトリクスを含む。
【００１０】
ある具体例において、再生可能構造体は、前記外植体を形質転換する約６〜１４日間以内で作製される。他の具体例において、ステップ（ｂ）は、前記外植体を形質転換する約６〜１４日以内に完了する。他の具体例において、ステップ（ｂ）は、約６から約１２日間の長さで行われる。なおかつ他の具体例において、ステップ（ａ）および（ｂ）は、カルスを増殖させることなく、約１０日間から約２週間行われ、その後前記外植体を形質転換する。ある具体例において、第１の培養培地は、カルベニシリン (carbenicillin)その他の化合物のごとき、アグロバクテリウムを含むリゾビウム根粒菌属 (Rhizobia)の成長を阻害する殺菌性化合物を含み、前記外植体を形質転換するために用いられる。他の具体例において、第２および／または第３の培養培地は、第１の培養培地に見出されるよりも高い濃度にて、スクロースを含む。特定の具体例において、第１の培養培地はLynx 1947を含む。
【００１１】
他の具体例において、ステップ（ｃ）は、根および苗条組織の同時成長を支持する植物成長調節物質フリーの液体培養培地中で前記外植体を培養して、再生トランスジェニック単子葉植物を作製することを含む。特定の具体例において、根および苗条組織の同時成長を支持する前記培養培地はLynx 2067を含む。さらなる具体例において、ステップ（ｃ）は、前記外植体を形質転換する約４〜８週間以内に開始される。
【００１２】
ある具体例において、第１の培養培地中のオーキシンに対するサイトカイニンの比は、約０．００５から約０．０３（ｗ／ｗ）である。他の具体例において、第１の培養培地中のオーキシンに対するサイトカイニンの比は、モル換算で約０．００５から約０．０３である。特定の具体例において、サイトカイニンは、BAP、ゼアチン (zeatin)、カイネチン (kinetin)、およびTDZよりなる群から選択することができ；オーキシンは、IAA、2,4-D、NAA、IBA、およびジカンバ (dicamba)よりなる群から選択することができる。他の具体例において、第１の培養培地中のサイトカイニンおよび／またはオーキシンは、上記したサイトカイニンまたはオーキシンの量や比に相当する植物成長調節効果を含む。
【００１３】
なおかつ他の具体例において、ステップ（ｃ）は、第１の培地と比較して、オーキシンに対する比が増大した苗条形成成長調節物質を含む第２の培養培地中で前記外植体を培養して、根および苗条の発育を同時に促進することをさらに含む。特定の具体例において、ステップ（ｃ）の培地はLynx 2068および／または Lynx 2202である。
【００１４】
本発明の方法のある具体例は、添加植物成長調節物質を欠如する第２および／または第３の培養培地中で前記外植体を培養することをさらに含むことができる。いくつかの具体例において、第２の培地中のオーキシンに対する苗条形成成長調節物質の比は、約０．０２から約０．０６（ｗ／ｗ）である。特定の具体例において、第２の培地はLynx 2202またはLynx 2068である。ある具体例において、ステップ（ｃ）の開始後、新鮮な生育培地は添加されない。
【００１５】
なおかつ他の具体例において、第１の培養培地は、約０．００１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌのサイトカイニンおよび約０．１ｍｇから約１５ｍｇ／Ｌのオーキシン、例えば、約０．００５ｍｇ／Ｌのサイトカイニンから約０．０５ｍｇ／Ｌのサイトカイニン、および約０．１ｍｇ／Ｌのオーキシンまたは０．２ｍｇ／Ｌのオーキシンから約０．５ｍｇ／Ｌのオーキシンを含む。なおさらなる具体例において、外植体は、第１および第２の培地上での培養の間に第４の培地上でさらに培養される。ここに、前記第４の培地は、有効量のオーキシンおよびサイトカイニンを含み、カルス増殖を促進する。特定の具体例において、第４の培地はLynx 2063である。
【００１６】
他の具体例において、外植体は、第２および第３の培地上での培養の間に第５の培地上でさらに培養される。ここに、前記第５の培地は、苗条生長を促進するのに有効な量のサイトカイニンを含む。特定の具体例において、第５の培地はLynx 2066である。
【００１７】
ある具体例において、外植体の形質転換は、バクテリア媒介形質転換を含む。特定の具体例において、バクテリア媒介形質転換は、アグロバクテリウム種 (Agrobacterium sp.)、リゾビウム種 (Rhizobium sp.)、シノリゾビウム種 (Sinorhizobium sp.)、メゾリゾビウム種 (Mesorhizobium sp.)、およびブラディリゾビウム種 (Bradyrhizobium sp.)よりなる群から選択されるバクテリアを用いて行われる。
【００１８】
他の具体例において、第２および／または第３の培養培地は、第１の培地中の量と比較して低減された量のオーキシン、サイトカイニン、アブシジン酸、またはその組合せを含む。特定の具体例において、第２および／または第３の培養培地は、第１の培地の半分未満のオーキシンまたはオーキシン様植物成長調節物質活性を含む。
【００１９】
ある具体例において、第１の培養培地ならびに、根および苗条組織の同時成長を支持する培養培地は、液体培地である。他の具体例において、第１の培養培地は半固体培地である。特定の具体例において、第１の培養培地の後に用いる各培地は液体培地である。ある具体例において、ステップ（ｂ）および（ｃ）は、単一の容器の中で行われる。
【００２０】
ある具体例において、単子葉植物は、トウモロコシ、コメ、ソルガム (sorghum)、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキビ、オーツムギ、ライコムギ (triticale)、スイッチグラス (switchgrass)、またはシバ (turfgrass) 植物である。特定の具体例において、単子葉はトウモロコシ植物である。
【００２１】
もうひとつの局面において、本発明は、（ａ）少なくともある程度、第１のフィールドテストで収集されたデータに基づいて、トランスジェニック植物を作製するための対象の候補ＤＮＡセグメントを選択し；（ｂ）請求項１に記載の方法によって、前記ＤＮＡセグメントを含むトランスジェニック単子葉植物を調製し；ついで、（ｃ）少なくとも、第１のフィールドテストが実行される時期に引き続く生育時期に実行される第２のフィールドテストにおける所望の発現型および／または遺伝子型について、前記トランスジェニック植物をアッセイすることを特徴とする、トランスジェニック植物を作製するための優先開発ウィンドウを拡張するシステムを提供する。特定の具体例において、第１のフィールドテストまたは第２のフィールドテストのうち一方または双方をアメリカ合衆国中西部で行う。ある具体例において、トランスジェニック植物のアッセイは農業形質 (agronomic performance)の測定を含む。特定の具体例において、第２のフィールドテストはハイブリッド収率テストである。なおかつ他の具体例において、第２のフィールドテストは第１のフィールドテスト後の２つの生育時期に行われる。
【００２２】
本発明のさらなる局面は、形質転換可能性について穀物植物系統の細胞をスクリーニングする方法であって、（ａ）苗条始原体の作製を支持する生育培地上で、穀物植物の外植体を約１〜２週間以内培養し；（ｂ）苗条伸張を支持する条件下、少なくともさらに約１週間、暗闇中で前記苗条始原体を培養して、生育中の苗条組織および／または小植物を獲得し；ついで、（ｃ）少なくともさらに約１週間、植物育生倍地上で、ステップ（ｂ）の組織または小植物を培養して、苗条芽および／または植物を得、ここに、ステップ（ｃ）の後に、苗条始原体が苗条芽および／または植物を作製する能力によって、前記細胞の形質転換可能性を測定する、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】培養ステップおよび組織移動ステップおよび培地移動／交換ステップの数を示す、対照の形質転換法（「BPD」）および本発明の２つの代表的な具体例に対する線図。ひとつの小ブロックは約１週間の継続時間を表す。黒矢印は外植体の新たな容器への物理的な移動を表す。パターン付き矢印は吸引および培地交換を示す。縞模様の矢印は吸引なしの培地添加を表す。
【図２】第１の培地のサイトカイニンの存在は、苗条始原体の作製を容易にすることによって、効率的かつ急速な形質転換を可能とする。外植体は、形質転換から１０日間後にＧＵＳ発現について組織化学的に評価され、大きなトランスジェニックセクター（ＴＳ）および苗条始原体（ＳＰ）を示した。
【図３】本発明の方法によって作製された、４週齢（Ａ）、６週齢（Ｂ）および７週齢（Ｃ）のトランスジェニックトウモロコシ植物。
【図４】培養ステップおよび組織移動ステップおよび培地移動／交換ステップの数のさらなる削減を示す線図。ひとつの小さなブロックは約１週間の継続時間を表す。黒矢印は外植体の新たな容器への物理的な移動を表す。パターン付き矢印は吸引および培地交換を示す。縞模様の矢印は吸引なしの培地添加を表す。
【図５】「優先開発ウィンドウ」の間の形質転換開始についての急速液体培養（RLC）プロトコルの影響。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、トランスジェニック植物の作製に必要な時間を実質的に削減し、形質転換可能な遺伝子型の範囲を拡張する改良形質転換法を提供する。ひとつの具体例において、効果的な植物−取扱い方法および簡略化された培地および培養ステップと組み合わせた液体培地の使用は、より短い作製時間、より高いスループット、より低い材料および労働コスト、ならびに人間工学的安全性の利益などの利点を与えつつ、形質転換頻度（ＴＦ）を普通のレベルに維持するか、または、ＴＦを向上しさえする。
【００２５】
さらに、そのような高速方法での形質転換トウモロコシ植物の作製を可能とすることによって、今や、より効率的に時期に影響される優先開発ウィンドウを使用すること、すなわち、様々な地域での植栽時期の観点から、ならびに、それらの地域で実行されたフィールドテストの結果に基づき、形質転換の構築物およびイベントに関する決定を行うことが可能である。これらの地域は、例えば、米国トウモロコシベルト地帯を含み、ここには、アイオワ州、インディアナ州、イリノイ州およびオハイオ州の全てまたはほとんど、ならびに、サウス・ダコタ州、ネブラスカ州、カンザス州、ミネソタ州、ウィスコンシン州、ミシガン州、ミズーリ州およびケンタッキー州の一部が含まれる。これは、遺伝子−構築物および植物形質転換−イベント研究の計画および優先順位付けに対する障害を低減する。かくして、トウモロコシ形質転換プロトコルを１０〜１２週間から６〜７週間以下に短縮することによって、効率的に製品開発ウィンドウを５〜６週間延長し、優先開発ウィンドウ中に開始するさらなる形質転換体の収率テストが形質転換イベントの発生に引き続く第２の生育時期に可能であるように、時間枠において、２倍にまで形質転換能を引き上げる。
【００２６】
ある局面において、本発明者らは、よく使用される半固体培地に代えて、様々なステップにおいてマトリクスとともに液体培地を使用することが、より低いＴＦを生じることを見出した。しかしながら、サイトカイニンを含有する遅延培地とともに液体の選択再生培地を使用すると、半固体の選択再生培地と同様のＴＦを生じた。それゆえ、ひとつの培地の使用によって、元来別々の遅延ステップと共培養ステップとを組合せつつ、ＴＦを維持／向上する、より高速な方法が開発された。共培養および遅延培地（第１の培地）におけるサイトカイニンの存在は、早期再生応答を誘発しつつ、カルス形成または同時のカルス形成および植物形成を低減し、かくして、より高速の再生を生じる。共培養培地における殺菌性化合物カルベニシリンの存在は、アグロバクテリウム媒介形質転換によるＤＮＡデリバリー後、長い期間、すなわち、７〜１４日間、同一培地上で外植体を培養することを可能とする。さらに、従来の別々のカルス増殖と選択ステップを排除しつつ、許容されるＴＦを達成できる。苗条芽始原体の生育および発育を促進する第２および／または第３の培地に、外植体を直接移動することができるからである。かくして、重要なことは、カルス−ベースの手法では、限定された胚形成応答および形質転換性を示していた、以前「抵抗性」であった遺伝子型は、今や、外植体要素のさらなる物理的操作、すなわち、ここに記載する培養体制を用いて手動で別の培地に移動する継代培養なくして、形質転換標的として直接用いることができる。
【００２７】
ここに記載する形質転換法は、当該分野で公知の現行形質転換法に対する顕著な改善を与える。そのような方法を用いることによって、驚くべきことに、形質転換植物は、プラグおよび／または土壌のごとき生育マトリクスに移植するように調整された形質転換剤に細胞を接触させてから４〜６週間以内に作製でき、より効率的な手順によって、かつ、より広い範囲の遺伝子型で、作製される。いくつかの局面において、これらの方法は、適当な支持マトリクス入りの液体培地も採用する。液体培養の使用は、移動ステップ数を６から２や３程度にまで削減する。なおさらに、形質転換細胞を選択し、再生するステップは、植物が土壌に移されるまで、単一容器内で達成できる。これらの方法は、かくして、高スループット自動作製システムに適している。
【００２８】
ある単子葉遺伝子型は、胚形成培養条件にあまり応答しない。すなわち、胚、または十分な再生を生じる胚形成カルスは、これらの条件下では作製されない。そのような「抵抗性」遺伝子型は、以前に記載された方法の試みでは、ゼロまたはそれに近い形質転換頻度を示す。かくして、多様な遺伝子型、特に、抵抗性系統を形質転換するために使用できる最新の方法は、より広い形質転換可能系統の選択を提供し、当該分野において顕著な進歩を示す。
【００２９】
さらに、単子葉穀物植物系統の細胞の形質転換可能性を評価する方法は、典型的には、所定の系統が正しい条件下、胚形成カルスを作製する能力を測定することに集中する。胚形成カルス形成についてスクリーニングするこれらの従来の手法は、単離され、胚形成カルス形成を支持可能な組織培養培地上で生育される未成熟胚を利用する。形質転換可能性と同じくらい重要なことは、細胞系統がそのような胚形成カルス生育を長時間維持する能力である。いくつかの細胞系統は短時間でカルス形成し出すが、その後、それらの胚形成可能性を維持しないからである。
【００３０】
かくして、本発明の一つの具体例は、形質転換可能性について穀物植物をスクリーニングする新規方法を含む。この方法は、ひとつの局面において、短時間（例えば、１〜２週間以内、例えば、１週間以内）、苗条始原体を作製可能な培地上で、外植体（例えば、トウモロコシ未成熟胚）を培養することを特徴とする。ついで、それらの組織を、暗条件下で、約２〜３週間、再生／伸張培地に移し、その後、さらに約２〜３週間、生育培地上に置く。これらの条件下で系統が苗条芽および／または植物を再生する能力は、本発明の方法によるそれらの形質転換適正を示し、カルス生育期が与えられないか、または、カルス生育の期間が以前の細胞培養再生方法から実質的に削減されているものを含む。
【００３１】
本発明の方法は、ひとつの具体例において、形質転換可能な外植体を形質転換剤に暴露することも含む。適当な外植体は、カルス、細胞および胚のごとき形質転換可能な植物の部分を含む。特別の具体例において、前記外植体は、約１．０〜３．０ｍｍの長さの未成熟胚でよく、例えば、胚のサイズは、受粉後約８〜１４日目（ＤＡＰ）で約１．６〜２．６ｍｍの間の長さでよく、受粉後約１０〜１２日目で約２．０ｍｍの胚サイズを含む。これらの段階のトウモロコシ胚発育およびモルホロジーが記載されている（例えば、［Matthys-Rochon et al., 1998］およびその引用文献）。適当な形質転換剤は、移植すべきＤＮＡ構築物を持つ植物形質転換バクテリアを含む。そのようなバクテリアの例は、アグロバクテリウム種 (Agrobacterium sp.)、リゾビウム種 (Rhizobium sp.)、シノリゾビウム種 (Sinorhizobium sp.)、メゾリゾビウム種 (Mesorhizobium sp.)、およびブラディリゾビウム種 (Bradyrhizobium sp.)を含む（例えば、［Broothaerts et al., 2005; 米国特許出願第11/749,583号］）。外植体は、直接取込み、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、および微粒子銃撃、または、当業者に知られたいずれかの他の方法によって、前記ＤＮＡ構築物に暴露もできる。
【００３２】
典型的には、ＤＮＡ構築物は１以上の発現ユニットを含む。これらの発現ユニットは、概して、５′から３′方向に、プロモータ、有用な特質または遺伝子抑制をコードする核酸、３′非翻訳領域を含む。一般に、５′ＵＴＲ、オルガネラ輸送ペプチド配列、およびイントロン（特に、単子葉に対する）のごときいくつかの他の発現エレメントが添加され、前記特質の発現を容易にする。発現を促進するか、または、植物中の遺伝子の転写または翻訳に影響するように機能する他の遺伝的要素を用いることも考えられる。
【００３３】
多数の植物プロモータが当該分野で知られている。そのようなプロモータは、限定されないが、とりわけ、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモータ、カリフラワーモザイクウィルス (CaMV) 19Sおよび35S プロモータ（例えば、［米国特許第5,352,605号］を参照）、促進CaMV 35S プロモータ (e35S)、ssRUBISCO プロモータ、およびアクチンプロモータ（例えば、コメ・アクチンプロモータ；［米国特許第5,641,876号］を参照）を含む。前記ＤＮＡ構築物は、核酸が、形質転換細胞を選択し、スクリーニングし、または採点するマーカタンパク質をコードする第２の発現ユニットを含むことができる。
【００３４】
本発明の実施に関して、構築物および宿主細胞を調製し、使用するための組成物および方法は、当業者によく知られている（例えば、［Sambrook, et al. (2000)］を参照）。特に植物形質転換に適した形質転換構築物を作る方法は、限定されず、出典明示してその全体が本明細書に含まれるとみなされる［米国特許第4,971,908, 4,940,835, 4,769,061および4,757,011号］に記載されたものを含む。
【００３５】
通常、前記発現ユニットは、形質転換構築物上の１以上のＴ−ＤＮＡ境界間にある。前記形質転換構築物は、Ｔ−ＤＮＡ境界間にある発現ユニットの植物細胞のゲノムへの融合を許容する。前記構築物は、バクテリア細胞中に再生機能および抗生物質選択を与えるプラスミド骨格ＤＮＡセグメント、例えば、ori322のごときエシェリキア・コリ (Escherichia coli)複製開始点、oriVまたはoriRiのごとき広宿主域複製開始点、およびスペクチノマイシンまたはストレプトマイシンに対する抵抗性を与えるTn7 アミノグリコシド・アデニルトランスフェラーゼ (aadA)をコードするSpec/Strpのごとき選択的マーカーまたはゲンタマイシン (Gm, Gent) 選択的マーカー遺伝子のコード領域も含有することができる。植物形質転換に関して、前記宿主細菌株は、しばしば、発現ユニットの輸送機能を有するプラスミドを持つアグロバクテリウム・ツメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens) ABI、C58、LBA4404、EHA101、またはEHA105である。植物形質転換の当業者に知られた他の株は本発明において機能する。
【００３６】
外植体を形質転換剤に接触させた後、前記外植体は、カルベニシリンのごとき殺菌性化合物の存在により、共培養および遅延培地の属性を併せ持つ第１の培地（例えば、Lynx #1947）上で培養することができる。そのような培地は、サイトカイニンおよびオーキシンを含む。有効量の植物成長調節物質およびオーキシンに対するサイトカイニンの適当な比または、カルス形成および／または苗条芽形成に影響することが知られているいずれかの他の成長調節物質を付与することによって、そのような培地は、形質転換組織を含む組織の次なる再生が別のカルス増殖期または持続性胚形成応答を必要とせずに開始することを許容する。有効な成長調節物質濃度および／またはオーキシンに対するサイトカイニンの比は、用いる植物種の遺伝子型およびタイプごとに異なるであろう。第１の培地に引き続き、ある具体例において、前記外植体を成長調節物質フリーの培地上で培養して、植物再生を促進することができる。ある具体例において、この培地は液体培地である。
【００３７】
本発明が提供する方法は、他の以前から知られている培養方法で、典型的な胚形成カルス応答を生じることができる遺伝子型ならびに相当な量の胚形成培養応答、または持続性培養応答を示さない抵抗性遺伝子型を用いて行うことができる。第１の培地上での培養期間は特定のＴＦの必要に応じて変化する。ひとつの具体例において、第１の培地上での培養期間は約６または７日間ないし約１０〜１４日間である。より早期の再生は、カルス形成後に生じ易く、ダウンストリーム・スクリーニングの効率を下げるような非形質転換植物を含むクローン（すなわち、播種または共−培養培地に添加することができる。あるいは、形質転換系統の外植体内で、イソプロピルトランスフェラーゼの遺伝子のごときサイトカイニン合成遺伝子（例えば、［米国特許第6,294,714号］）によって、サイトカイニンを生成することができる。
【００３８】
本発明で単独または組み合わせのいずれかで用いるのに適した様々なサイトカイニンの例は、６−ベンジルアミノプリン（BAP）、カイネチン、ゼアチン、リン酸アデノシン、チジアズロン (thidiazuron) （TDZ）その他のサイトカイニン様化合物を含む。本発明で単独または組合せのいずれかで用いるのに適した様々なオーキシンの例は、IAA、2,4-D、NAA、IBA、ジカンバ (dicamba)その他のオーキシン様化合物を含む。植物細胞培養および形質転換の当業者は、本発明で用いるのに適した、苗条形成植物成長調節物質およびオーキシンの適当なレベルおよびそれらふたつの適当な比率を決定できるであろう。例えば、トウモロコシまたは別の穀物植物中のBAPおよび／または2,4-Dに機能的に相当するレベルの活性を有するこれらのまたはその他の植物成長調節物質のレベルは、成長培地に存在するそのような成長調節物質のレベルを変えつつ、外植体を前記培地で成長させ、前記外植体の成長後、そこから組織を誘発することによって、決定することができる。かくして、他の植物成長調節物質を用いれば、それらは、予測された量および比率の上記サイトカイニンまたはオーキシンに相当する植物成長調節効果を含むであろう。
【００３９】
第１の培地上の共培養／遅延後に、少なくとも一つの苗条始原体を含む分化外植体を作製することができ、サイトカイニンまたはABAのごとき苗条形成成長調節物質のオーキシンに対する比が第１の培地よりも大きい第２の培地上で培養することもできる。あるいは、第２および／または第３の培地は、第１の培地よりも少ない量のオーキシンを含むことができ、カルスの増殖を減少させ、より速い再生のために、第１の培地よりも多い有効量のスクロースをさらに含むことができる。例えば、第２の培地に５０ｇ／Ｌおよび第３の培地に６０ｇ／Ｌのスクロースを用いることができる。もうひとつの代替物において、第２の培地および／または第３の培地は、添加したオーキシンまたはオーキシン様活性なしにサイトカイニンおよび／またはABAのごとき有効量の苗条形成成長調節物質のみを含むことができる。その後、苗条伸張および発根のための植物成長調節物質をほとんどまたは全く含まない第３の培養培地上で、前記外植体を培養することができる。
【００４０】
ひとつの具体例において、この方法は伝統的な共培養および遅延培地を第１の培地と組合せ、それによって、形質転換およびその後の培養に必要な培地数を５から４に低減する。他の具体例において、この方法は、カルス増殖／選択培地、２つの再生培地、一つの発根培地を排除し、相当な量の添加植物成長調節物質を欠如するであろう改良再生／伸張培地を与え、それによって、形質転換に必要な培地数を６から３に削減する。さらに他の具体例において、この方法は、第１の培地および第３の培地のみを使用し、それによって、形質転換に必要な培地数を６から２に削減する。
【００４１】
他の具体例において、第１の培地は半固体培地であって、別の培地は液体培地である。さらに他の具体例において、用いるすべての培地が液体培地である。しかしながら、半固体または液体培地の組合せを用いること、および、必要に応じて、ここで提供される１以上の修正のみを用いることは、当業者にとって明白である。
【００４２】
特別の具体例において、Lynx #1947のごとき第１の培養培地上で約７〜１４日間、Lynx#2202のごとき第２の培養培地上で約７日間、次いで、Lynx# 2067のごとき第３の培養培地上で約１４〜１８日間、前記外植体を培養する。しかしながら、１以上の培地上での日数は、当業者によるトランスジェニック植物の成長の目視検査で増減できる。もうひとつの具体例において、第１の培地とその培地との間に第４の培地上で約１４日間、それと第３の培地との間に第５の培地上で約７日間、前記外植体を追加的に培養する。Lynx #2063のごとき第４の培地は、オーキシン、サイトカイニン、およびＡｇＮＯ３を含む植物成長調節物質を含有でき、カルス増殖を支持するように配合される。Lynx #2066のごとき第５の培地は、サイトカイニンを含有できるが、一般的にはオーキシン含有せず、苗条の成長および伸張を支持するように配合する。ある具体例において、追加された第２、第３、第４および／または第５の培地は、非有効量の植物成長調節物質を含みつつ、再生植物の発育を促進することができる。第２または他の次なる培地は液体、半固体または固体の培地であってよい。特定の具体例において、形質転換再生植物を４〜８週間以内の形質転換（培地組成については、例えば、表２、３参照）で得る方法で、ふたつの培地のみ、すなわち、例えばLynx 1947のごとき共培養／遅延培地と、次なる培地、例えば、Lynx 2067およびLynx 2066の誘導体（それぞれ、「第３」および「第５」の培地とも記載する）とを採用することができる。
【００４３】
１以上の培地上での日数は、当業者による外植体の目視検査で増減できる。本発明は、かくして、再生植物、およびその部分を提供し、それは、それが誘導される外植体を、選択されたDNAで外植体を形質転換することによってなど、形質転換剤に接触した後４〜６週間以内に、土壌ベースの培地またはその他いずれかの非滅菌マトリクスで成長できる。特定の具体例において、さらなる成長および発育および、例えば、対照のトランスジーンについてのそれらの遺伝子型および／または発現型を決定する初期スクリーニングのために、４〜８週齢の再生植物をプラグ(Q Plugs by International Horticultural Technologies, Hollister, CA)に移植する。
【００４４】
他の具体例において、第２、第３、第４および／または第５の培地は、 細胞、組織またはその中に前記ＤＮＡ構築物がまだデリバリーされていない器官のほとんどの成長を停止するか、少なくとも遅延させる、除草剤グリフォサート (glyphosate)のごとき選択剤も含む。単独または組合せで用いることができる他の適当な選択剤は、限定されないが、ジカンバまたは2,4-D、MCPA、2,4-DB、グルフォシナート (glufosinate)、アセトラクテーテト・シンターゼ阻害剤、プロトポルフィリノーゲン・オキシダーゼ阻害剤、およびヒドロキシフェニル−ピルベート−ジオキシゲナーゼ阻害剤、ネオマイシン (neomycin)、カナマイシン (kanamycin)、パラモマイシン (paramomycin)、G418、アミノグリコシド類、スぺクチノマイシン (spectinomycin)、ストレプトマイシン (streptomycin)、ハイグロマイシンＢ (hygromycin B)、ブレオマイシン (bleomycin)、フレオマイシン (phleomycin)、スフホナミド類、ストレプトスリシン (streptothricin)、クロラムフェニコール (chloramphenicol)、メトトレキサート (methotrexate)、２−デオキシグルコース、ベタインアルデヒド、Ｓ−アミノエチルＬ−シスチン、４−メチルトリプトファン、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、ベンジルアデニン−Ｎ−３−グルクロニダーゼのごときオーキシン様除草剤を含む。そのような選択剤に耐性をもたらす遺伝子の例は、［Miki and McHugh, (2004)］に開示される。
【００４５】
様々な植物組織培養培地が、適当に補充されたとき、植物組織の成長および発育を支持することが知られている。これらの組織培養培地は、市販の調製物として購入でき、または、当業者によって個別に調製または修飾できる。試薬は市販されているか、または、数多くの供給者（例えば、Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; およびPhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KSを参照）から購入できる。そのような培地の例は、限定されないが、［Murashige and Skoog (1962); Chu et al. (1975); Linsmaier and Skoog (1965); Uchimiya and Murashige (1962); Gamborg et al. (1968); Duncan et al. (1985); McCown and Lloyd (1981); Nitsch and Nitsch (1969); および Schenk and Hildebrandt (1972)］に記載されたものまたはそれ相応に補充されたこれらの培地の誘導体を含む。培地ならびに、形質転換および再生に用いる、栄養および成長調節物質のごとき培地サプリメントは、普通、対象となる特定の穀物または変種につき最適化されることを当業者は分かっている。一方または他方の培地から基本塩類、ビタミン類、炭素源のごとき様々な成分を選択して、所望の成長および発育を得ることもできる。先行技術の方法（例えば、［Cai et al.; 米国特許出願公開第20040244075号］、これらは出典明示して本明細書に含まれるとみなされる）で用いる直物成長培地を表１に示す。本発明において用いる好ましい培地組成を表２および３に列記する。本発明で用いる配合と従来方法の単子葉形質転換に用いる標準配合との間の相違点は、例えば、従来の方法が、カルス増殖および選択、その後のトランスジェニックイベントの再生および成長を許容する培地を用いることである。対照的に、本発明の培地は、単に、苗条始原体の形成に十分なだけのカルス形成を許容し、それにより、キメラ植物形成を回避し、高頻度の形質転換を許容するやり方で、同時のカルス形成および植物再生により効率的な選択を許容する。
【００４６】
一般に、第１の培地は共培養および遅延培地として機能し、オーキシン（例えば、2,4-D）、サイトカイニン（例えば、BAP）、および硝酸銀ならびにアグロバクテリウム媒介形質転換を容易にするアセトシリンゴン (acetosyringone)のごとき植物成長調節物質を含む。第１の培地は、長期間、すなわち、外植体を形質転換剤に接触させてから７〜１４日間、同一の培地上で外植体を培養することを許容するカルベニシリンのごとき殺菌性化合物を含有することもできる。第２の培地（例えば、2202）はそのような植物成長調節物質も含むことができるが、オーキシンは低減される。重要なことは、この第２の培地は再生培地として機能することもあることである。第３の培地（例えば、2067）は、成長調節物質を欠如し、再生または苗条伸張培地として作用する。第４の培地（例えば、2063）は、第１の培地と同じような量の成長調節物質を含み、カルス増殖を支持するように機能するであろう。低レベルの選択剤も存在してよく、形質転換細胞の成長に適している。第５の培地（例えば、2066）は、オーキシンおよび硝酸銀を欠如し、低レベルのサイトカイニンを有し、かつ、再生を支持する。あるいは、第１の培地に引き続き添加される培地は、有効量の植物成長調節物質を含まず、再生植物の発育および成長を支持することができる。特定の具体例において、最初に記載した第２の培地（すなわち、2202）の代わりに、再生および伸張を支持できる再生培地として、オーキシンを含まず、いくらかのサイトカイニンを含む別の第２の培地（例えば、2347、2348、2415、2414；表３を参照）を用いることもできる。培地2348、2415、2414は、本質的に2066と同じであるが、硝酸銀を含み、様々な量のグリフォサートを含有する。培地2347は、本質的に2067と同じであるが、硝酸銀およびサイトカイニンを含む。記載した細胞培養属性を維持しつつ、対象の外植体組織の種および遺伝子型に依存して、植物細胞形質転換および組織培養の当業者によって、当該培地の修飾を行うことができる。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
【表２】
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【００４９】
【表３】
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【００５０】
再生植物中のＤＮＡ構築物の存在を確認するため、様々なアッセイを実行できる。そのようなアッセイは、例えば、サザーンおよびノーザンブロットならびにＰＣＲＴＭのごとき「分子生物学的」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスターンブロット）により、または、酵素機能によりタンパク生成物の存在を検出することのごとき「生物化学的」アッセイ；葉または根アッセイのごとき植物部分アッセイ；全再生植物の表現型の分析によることも含む。
【００５１】
一旦、本発明の方法を用いて遺伝子を植物に導入すれば、その遺伝子は、第２の植物を直接形質転換する必要なく、交雑によって、第１の植物と他家受粉可能な (sexually compatible)いずれの他の植物にも導入できる。したがって、ここで用いるとき、用語「後代」とは、本発明によって調製された親植物のいずれかの世代の子孫を意味する。「トランスジェニック植物」は、かくして、いずれの世代でもよい。
【００５２】
本発明は、本発明によって作製された植物および植物部分も提供する。好ましくは、植物は単子葉植物である。より好ましくは、単子葉植物は、トウモロコシ、コメ、ソルガム (sorghum)、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキビ、オーツムギ、ライコムギ (triticale)、シバ (turfgrass)、およびスイッチグラス (switchgrass) 植物類よりなる群から選択される穀物植物である。特定の具体例において、単子葉植物はトウモロコシ植物である。植物部分は、限定なく、種、内胚乳、胚珠、花粉、葉、幹、および根を含む。特定の具体例において、植物部分は種である。本発明は、本発明によって作製された形質転換植物および細胞も含み、提供する。
【実施例】
【００５３】
以下の実施例は、この方法の開発を説明する。
以下の実施例は、本発明の具体例を説明するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、発明者によって見出された技術を代表し、本発明の実施において十分に機能することは、当業者に理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑み、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、類似または同様の結果を示す特別の具体例において、多くの変形を行えることを理解するであろう。より詳しくは、化学的かつ物理的に関連する特定の剤で、本発明に記載される剤を置き換えても同一または同様の結果を達成できることは明らかである。当業者に明白なすべての同様な代替物および変形物は、付随する特許請求の範囲に定義されるように、本発明の趣旨、範囲および概念の内にあるとみなされる。
【００５４】
実施例１
核酸構築物および形質転換剤
この実施例は、ＤＮＡ構築物の作製および、トウモロコシ未成熟胚の形質転換に使用するABI アグロバクテリウム株（ディスアーム型C58株）への前記ＤＮＡ構築物の形質転換を記載する。プラスミドpMON 97367は、選択可能マーカーとしてcp4遺伝子を、キメラコメ・アクチンおよびコメ・アクチンプロモータで駆動されるスクリーン可能マーカーとしてgus遺伝子を、それぞれ含有する。Caiら［米国特許出願公開第2004/00244075］のごとき本明細書以外に記載される手順によって、アグロバクテリウムの株を形質転換のために調製した。
【００５５】
実施例２
形質転換スループットの向上
この実施例は、より少ない組織操作しか要さず、自動化可能な簡略化した高スループット方法を開発するための、カルス増殖、選択の間、および再生ステップの間に液体培地を用いる改良された方法の開発を記載する。図１は、この８週間液体培養プロトコルの実験計画を示す（「液体プラグ(Liquid Plug)」−図１中段)。表４は、本質的にCaiら［米国特許出願公開第2004/0244075号、すなわち、図１、上段］の方法と比較した結果を示す。この修正方法も実施例３に見出されるものから修正され、外植体を第１の培地の後、第４の培地 (Lynx 2063)に移植して暗闇で３０℃にて１〜３週間おき、修正された第２の培地（例えば、2068；すなわちAgNO3を添加した2202）に移し、ついで、第２の培地の後、第５の培地（例えば、Lynx 2066）に移して暗闇で２７℃にて一週間おく。
【００５６】
上記したように、特定のトウモロコシ形質転換法が［米国特許出願公開第2004/0244075号 (Cai et al.)］に記載され、用いる様々な培地組成物もそこに記載されている。表４は、第１の培養培地上で長時間培養すること、第４の培養培地上で費やす培養時間を削減すること、第５の培養培地上で費やす培養時間を削減すること、および、本発明で用いる発根培地（表１）上で費やす培養時間を削減することを含む、Caiらの方法への修正によって、トランスジェニック植物が８週間以内に作製できたことを示す。なお、第１、第２、第３、第５の培地を、それぞれ、サイトカイニンを添加し、オーキシンを削減することによって、実質的にサイトカイニンを削減し、少量のオーキシンを添加し、スクロースを増量することによって、すべての成長調節物質を取り除き、スクロースを増量することによって、および少量のサイトカイニンおよびオーキシンを添加し、スクロースを増量することによって、修飾した（表１および２を参照）。例えば、Caiらに記載される従来の方法で用いられるLynx 1233は、外植体の長期成長や発育を支持することも、本発明の第１の培地(Lynx 1947)のように苗条始原体形成を支持することもしない。CaiらのLynx 1278は本発明のLynx 2063と同様の機能を有する。これら二つの系の大きな違いは、再生の領域である。Caiらの方法による植物再生は、高サイトカイニンパルスステップ (Lynx 1073)、その後、苗条伸張 (Lynx 1071)および、最後に、Lynx 1084上でのさらなる成長および発育と共に、小植物の発根を用いる。対照的に、本発明による方法は、オーキシンステップダウン法 (Lynx 2068およびLynx 2066)による苗条および根の同時発育によって達成される。前記小植物の最終的な成長および発育は、成長調節物質フリーの培地であるLynx 2067の上で達成される。
【００５７】
【表４】
2010502196.tif 000006
【００５８】
実施例３
形質転換法
この実施例は、再生ステップ（図１、「急速形質転換」スキーム、下段）を含む形質転換法を記載し、それによって、せいぜい約６週間の成長後、固体生育培地（例えば、成長プラグ）における再生植物を得る。概略、未成熟胚（IE）を手動でまたは［米国特許第7,150,993号］または［米国特許出願公開第2005/0246786号］に記載されるような流体ジェット装置で切除し、対象のＤＮＡ構築物を含有するアグロバクテリウム細胞で接種した。接種された胚を、約７日間（所望により、約１４日間）２３℃にて１日間、次いで、３０℃にて暗所で残りの時間、第１の培地 (Lynx 1947)上で培養し、その後、外植体をフェルトおよび／またはフィルター紙（例えば、Ahlstrom grade 610, 8.22cm; Ahlstrom Corp., Helsinki, Finland）のごとき支持体および１０ｍｌの第２の培地 (Lynx 2202)を含有するペトリ皿に移植し、その皿を３０℃にて暗条件下で約１週間インキュベートした。第２の培地の存在下で１週間後、古い培地を吸引して取り除き、１０ｍｌの第３の培地 (Lynx 2067) を添加し、その皿を暗闇で３０℃にてさらに１週間インキュベートした。第３の培地に最初に移植してから約１週間のインターバルで、古い培地を吸引して取り除き、約１５〜３０ｍｌの第３の培地 を再度添加し、皿を１６／８の明−暗で２７〜３０℃にてインキュベートした。第６週ポスト形質転換の後、植物を、硬化のため非滅菌条件下で、土壌生育培地を含有するプラグに移植し、ついで、次の２週間以内さらなる成長および発育のためにポットに移植した。用いる培地組成を表２に示す。
【００５９】
実施例４
サイトカイニンの使用が苗条および植物の急速作製を容易にする
この実施例は、トランスジェニック植物のより速い作製のための早期苗条始原体形成を開始させるサイトカイニンの使用を説明する。実験は、第１の培地中ＢＡＰ有無で行い（成分に関しては表２参照）、結果を表５に示す。図２は、第１の培地上での苗条始原体の作製を示す。結果は、形質転換法のこのステップの間にサイトカイニンを用いたとき、形質転換頻度の顕著な改善を示す。
【００６０】
【表５】
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【００６１】
実施例５
カルス増殖および選択期を減少させることによる方法の簡潔化
この実施例は、Lynx 2063上で費やされる時間を１週間減少させて、カルス増殖を制限することによって、７および６週間以内にトランスジェニック植物を作製することを実証する。実験の概要と結果を表６に示す。結果は、ＴＦに影響することなく、減少したカルス形成期を使用できることを示唆する。結果は、カルス形成期のさらなる減少または排除が可能であり、それがトランスジェニック植物作製のプロセスをスピードアップできることも示唆する。
【００６２】
【表６】
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【００６３】
実施例６
選択中のカルス増殖を排除することによる６週間形質転換プロトコルの開発
この実施例は、カルス増殖および選択ステップ（Lynx 2063, 第４の培地）および、第５の培地上の再生ステップの一つを完全に排除することによって、６週間以内でトランスジェニック植物を作製することを実証する。実験計画およびその結果を表７に示す。この実験は、第４の培地上での一週間カルス増殖／選択ステップですでに短縮された方法（処理１）を含み、それと、第１の培地よりも低いレベルの２,４−Ｄを含有する第２の培地上での直接再生を含む方法とを比較する。かくして、オーキシンレベルを低減することに加えて、オーキシンに対する苗条形成成長調節物質の比率を増大させることも意図する。この実施例は、選択（第４および５の培地、例えば、2063および2066培地）の間のカルス成長および増殖ステップの必要を排除でき、削減された時間量でトランスジェニックイベントを得るのに非常に重要である。
【００６４】
【表７】
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【００６５】
実施例７
促進ＴＦのためには共培養および遅延の間にいくらかのカルス増殖が必要である
この実施例は、共培養および遅延培地（第１の培地）の間の外植体の適当な細胞増殖のＴＦに対する役割を説明する。外植体のカルス増殖は共培養／遅延培地中の2,4-Dのレベルで制御した。表８に示すように、第１の培地（例えば、2232、1947、2233または1898；表２）上での１週間培養、その後、６週間形質転換プロトコルが試験された。結果から、再生前の競売用／遅延の間のカルス形成量がＴＦを決定することは明らかである。Lynx 2232において低めの濃度、すなわち、０．２ｍｇ／ＬのオーキシンレベルではゼロＴＦであり、０．５ｍｇ／Ｌを有する1947上で培養された外植体は約３５％のＴＦを示した。これらの結果は、後期の苗条芽形成を許容するためには、（再生を含む）第２の培地上での成長の前にいくらかのカルス増殖が必要であることを示唆する。カルス形成量は、とりわけ、培地成分および成長時間を含む組織培養パラメータを変化させることによって、最適化することができる。
【００６６】
【表８】
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【００６７】
実施例８
プロトコルのさらなる簡略化
この実施例は、依然として６週間以内の植物獲得を許容しつつ、ＴＦに悪影響を与えずに、さらに方法を簡略化するために、再生培地（2202）上での外植体の成長時間を削減することを説明する。表９に示されるこの研究において、第２の培地（2202; 2068）上で各々一週間の効果（処理１）を、第２の培地2202上のみでの一週間（処理２および３）、その後、第３の培地（2067）上での伸張と比較した。第２の培地2202は、2068が３．４ｍｇ／Ｌの硝酸銀を含まないこと以外は、2068と同じである。第３の培地（2067）を定期的に添加するか（処理２）、または、消費された培地を取り除き、新鮮な培地を添加した（処理３）。2067で2202を置き換えるかまたは希釈すると、再生を促進するようである。この方法で作製された植物のサイズ範囲は、プラグへの移植に適当であり、ほぼ１００％の生存率を示した。形質転換に用いるＤＮＡ構築物の発現ユニットに存在するｐｉｎＩＩ転写終結配列遺伝子の３′領域のＴａｑｍａｎＲアッセイを用いる、ほぼ１７０イベントに対するコピー数解析から、約７８％の植物が１〜２コピーを含有することが明らかとなり、現行の方法では、典型的に、たった約６０％の植物が１〜２コピーを得ることと比べれば、より高い割合で使用可能な植物を製造することが示された。この実験からたった３つの植物のみが０コピーを示し、非常に少ないエスケープを示唆する。図３Ａに示すように、４週間以内程度で移植するためのトランスジェニック植物も作製できた。
【００６８】
【表９】
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【００６９】
実施例９
代替的な２および３ステップ−プロトコル
この実施例は、図４ならびに表１０および１１に示されるように、移動ステップおよび／または培地の吸引／添加ステップならびに／または培地の数をさらに削減することによる、トランスジェニック植物の作製を説明する。本発明の方法の一つの重要な要素は、短いカルス期と同時に再生を加速することである。この方法において、共培養／遅延（第１の培地）後、一週間、再生培地（第２の培地；例えば、2202）に組織を移動して再生プロセスを加速した（表１０）。しかしながら、伸張を遅延するオーキシンを含む、この第２の培地は、第３の培地（例えば、成長および伸張培地2067）を添加する前に、取り除く必要がないであろうから、そのようなステップは本発明の方法の簡単な自動化に干渉し得る。この問題は、当該第２の培地（すなわち、2202）の代わりの再生、伸張および成長を支持できる再生培地として、オーキシンをまったく含まないがある程度のサイトカイニンを含む別の第２の培地を突き止めて、培地を吸引する必要を除去することによって、解決した。第１の移動後の処理２、３、４、および５において、成長調整物質フリーの2067を容器に添加した。処理５で用いる第２の培地は、少量のＢＡＰを含有するので、Lynx 2067の修正版であり、処理５の成功で分かるように、オーキシンをまったく含まないので（例えば、2347）、再生および伸張のために用いることができる。かくして、図４、下段に示されるように、優れたＴＦを示し、たった２つの培地ステップからなる急速かつ簡便な植物形質転換プロトコルが達成される。さらに、古い培地を吸引除去せずに単に培地を添加する能力がこの系の自動化を可能にする。
【００７０】
【表１０】
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【００７１】
表１１に示すように、形質転換はすべての処理に渡って達成され、オーキシン含有培地（2202）の排除がＴＦに影響を与えることなく可能であった。なお、かっこ書きの濃度でグリフォサートを含有する2347、2348、2414、および2415で示されるように、共培養／遅延後にオーキシンを含まず、いくらかのサイトカイニンを含む再生および伸張培地を用いる形質転換が可能であった。
【００７２】
【表１１】
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【００７３】
実施例１０
抵抗性トウモロコシ遺伝子型の形質転換
この実施例は、Caiらに記載された選択の間の別々のカルス形成ステップを含む方法による形質転換に普通用いられる対象の有望遺伝子型と比較してあまり胚形成培養応答を有さないことがわかっている（すなわち、「抵抗性」であると考えられる）受容有望トウモロコシ変種を用いるトランスジェニック植物の作製を説明する。たった一つのトランスジェニックイベントが、約１１７２個の外植体と対象系統を用いる６つの実験から得られ、一方、本発明の急速形質転換法を用いる２つの研究が、１６．９％および１９．５％のＴＦをもたらし、これらの方法を上手く抵抗性系統に適用できることを示している。表１２において、％ＴＦは、４つの独立した実験の平均であり、独立したトランスジェニック植物イベントの％に基づく。いくつかの実験において、約３０〜４０％のＴＦが得られた。
【００７４】
【表１２】
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【００７５】
実施例１１
トウモロコシ系統の形質転換可能性を評価する方法
この実施例は、いくつかの単純ステップにおける形質転換反応能についての急速遺伝子同定を説明する。この方法において、短時間苗条始原体を作製できる培地（1947のごとき培地；表２）上で外植体を培養する。培養１週間後、外植体を２〜３週間３０℃にて暗条件の再生／伸張培地（例えば、Lynx 2424；表１３）に移動する。小植物を作製する系統を２〜３週間生育培地（例えば、Lynx 2427；表１３）に移動できる。このスクリーニング法で苗条芽を作製および／または再生できる系統は、それらの培養の間、別々のカルス形成を必要とせず、上記したように、急速形質転換法に適用できる。
【００７６】
【表１３】
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【００７７】
実施例１２
急速形質転換による製品開発サイクル時間の削減
本発明は、トランスジェニック植物製品開発に対して拡張された優先開発ウィンドウも提供する。そのような製品開発は冗長なプロセスであり、アイディアおよび遺伝子から、育成化に販売するハイブリッドトウモロコシ種子の形態の市販品まで最低でも７〜８年かかる。植物バイオテクノロジー、特に、トランスジェニックトウモロコシ製品開発の分野は非常に競争が激しく、製品開発サイクルから１年以上を削減することは、市場シェアおよび収入の面で企業に巨大な利益をもたらす。
【００７８】
形質転換植物を作製するのに約１１〜１２週間かかる植物（例えば、トウモロコシ）形質転換プロトコルを用いれば、典型的に、開発ウィンドウは１１月遅くから１月初めに延びる。いずれかの所定の年におけるアメリカ合衆国中西部の収率データの収集および分析のあと、新たな形質転換を開始するためのデータ収集後に残存するウィンドウ時間は、そのデータに基づくが、２回目の後続の中西部成長期においてハイブリッドとして形質転換体を生じる収率テストができることは、図５に概略するその後の活動のため、一月初旬より遅くならないように限定されている。これらの活動は、Ｒ０世代植物の培養および、イベントキャラクタリゼーション、受粉および種子形成を含むＲ０植物発育の完了の実行、ホモ接合体の確認および種子の収穫を含むＲ１植物発育および、ハイブリッドを創出し、フィールドテストの場所に種子を配布するための別の世代の最終培養を含む。
【００７９】
トランスジェニックトウモロコシ製品開発の加速は、トウモロコシ形質転換に必要な時間（細胞へのＤＮＡ導入から土壌に植物を植えるまでの時間）を短縮して、トウモロコシ製品開発パイプラインの製品開発サイクルから１暦年を完全に除去することによって達成する。図５において青色で示すように、これは、トウモロコシ形質転換プロトコルを１１〜１２週間以上から６〜７週間以下にまで短縮することによって達成する。これは、「優先開発ウィンドウ」、すなわち、いずれかの所定の成長期間においてアメリカ合衆国中西部収率データが入手可能であるときから、これらの形質転換から生じた形質転換系統を、形質転換の時間に引き続く第２の連続するアメリカ合衆国成長期間において、形質転換を開始して、ハイブリッドとしてアメリカ合衆国での収率テストができる可能性のある最後の日までと定義される時間を延長する。中西部で得られた収率データは、製品によらず、アメリカ合衆国の製品開発にとって重要である。６〜７週間の形質転換プロトコルを用いて、優先開発ウィンドウを５〜６週間延長することは（図５）、ビジネス上の重大な決断をするための時間を増やす、すなわち、ある時間枠での形質転換資源を増大させることなく、形質転換能を２倍までにすることを可能とするので、２回目の後続の成長期に優先開発ウィンドウに開始する形質転換体の収率テストが可能であり（図５）、これらの形質転換体を収率テストする前に完全に１暦年も待たなくてよい。
【００８０】
ここに開示され特許請求されるすべての組成および方法は、本開示に照らして過度の実験を必要とせずに作製し、実行することができる。本発明の組成および方法は前記の例示的な具体例で説明されてきたが、本発明の真の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、その組成や方法に対して、およびここに記載される方法のステップまたはステップの連続において、変形、変更、修正および代替を行うことができることは当業者には明らかである。より詳しくは、化学的および物理的に関連する特定の剤は、同一または同様の結果を達成するならば、ここに記載する剤に置き換えることができることは明らかである。当業者に明らかなそのような同様の置換および修正のすべては、付随する特許請求の範囲に規定するように、本発明の趣旨、範囲および概念の中にあるとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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