(57)【要約】  関心対象の組換えポリペプチドを調製するための方法には、宿主細胞の周辺質の中へ関心対象のポリペプチドの分泌をもたらすことのできる組換え発現系で形質転換された宿主細胞を発酵させることが含まれる。関心対象のポリペプチドは、連続的な浸透圧ショックを発酵培地に含まれる宿主細胞に加えることにより周辺質から抽出される。浸透圧によって細胞にショックを与えるための装置には、第１の溶液中の細胞を含有する第１のリザーバおよび第２の溶液を含有する第２のリザーバが含まれ、第１の溶液は第２の溶液よりも高いモル浸透圧濃度を有する。第１および第２の溶液を用いる、浸透圧によって細胞にショックを与える方法も開示される。関心対象の組換えポリペプチドを細胞から単離する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞の周辺質の中へ関心対象のポリペプチドの分泌をもたらすことのできる組換え発現系で形質転換された宿主細胞を発酵させることであって、前記発酵が、関心対象の前記ポリペプチドが前記宿主細胞の周辺質の中に分泌されるような条件下、発酵培地で行われることと；
連続的な浸透圧ショックを前記発酵培地中に含まれる前記宿主細胞に加えることにより、関心対象のポリペプチドを前記周辺質から抽出することと
を含む、関心対象の組換えポリペプチドを調製するための方法。
【請求項２】
連続的な浸透圧ショックを前記宿主細胞に加えることが、
細胞を含む第１の溶液を準備することと；
第２の溶液を準備することであって；
前記第１の溶液のモル浸透圧濃度が、前記第２の溶液の浸透圧よりも高いことと；
前記第１の溶液を含む第１の流体流を生成することと；
前記第２の溶液を含む第２の流体流を生成することと；
前記第１および第２の流体流を混合して第３の流体流とすることと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記連続的な浸透圧ショックが、高モル濃度のスラリーと低モル濃度のショックバッファの連続混合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記高モル濃度のスラリーが、高い糖もしくは塩濃度からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記低モル濃度のショックバッファが、約５〜約９のｐＨを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞から浸透圧が放出される前または後に熱交換器を運用する(administering)ことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞から浸透圧が放出される前または後に溶媒を投与する(administering)ことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞から浸透圧が放出される前または後に化学的処置を施す(administering)ことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
浸透圧によって細胞にショックを与えるための装置であって、前記装置が、
第１および第２のリザーバと；
第１の溶液中の細胞を含有する前記第１のリザーバと；
第２の溶液を含有する前記第２のリザーバとを備え；
前記第１の溶液は、前記第２の溶液の浸透圧よりも高く；
前記第１の溶液および前記細胞を含む第１の流体流を生成するための手段と；
前記第２の溶液を含む第２の流体流を生成するための手段と；
前記第１および第２の流体流を混合して第３の流体流とするための手段と
を備える、装置。
【請求項１０】
前記第１のリザーバが、バイオリアクターである、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記細胞が、微生物細胞、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、細菌細胞、哺乳類細胞、および酵母細胞からなる群より選択される、請求項９に記載の装置。
【請求項１２】
前記細胞が、シュードモナス属の種(Pseudomonas sp.)、大腸菌(E. coli)、クレブシエラ属の種(Klebsialla sp.)、サッカロマイセス属の種(Saccharomyces sp.)、ピキア属の種(Pichia sp.)、およびハンゼヌラ属の種(Hansenuela sp.)からなる群より選択される、請求項９に記載の装置。
【請求項１３】
前記細胞が、細胞膜周辺腔を有する、請求項９に記載の装置。
【請求項１４】
前記細胞が、関心対象のタンパク質を産生する、請求項９に記載の装置。
【請求項１５】
前記第１の溶液が、前記第１の溶液中に約０．５Ｍ〜約１０Ｍのモル濃度で存在する第１の溶質セットを含み、前記第１の溶質セットが少なくとも１種類の溶質を含む、請求項９に記載の装置。
【請求項１６】
前記第２の溶液が、前記第２の溶液中に約０Ｍ〜約１Ｍのモル濃度で存在する第２の溶質セットを含み、前記第２の溶質セットが少なくとも１種類の溶質を含む、請求項９に記載の装置。
【請求項１７】
前記第２の溶質セットが、グリセロール、糖、または塩を含む、請求項１５および１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記糖または前記塩が、グルコース、スクロース、ナトリウムクロライド、ナトリウムスルフェート、ナトリウムホスフェート、ナトリウムニトラート、カリウムクロライド、カリウムスルフェート、カリウムホスフェート、カリウムニトラート、マグネシウムクロライド、マグネシウムスルフェート、マグネシウムホスフェート、マグネシウムニトラート、カルシウムクロライド、カルシウムスルフェート、カルシウムホスフェート、カルシウムニトラート、アンモウニウムスルフェート、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記第２の溶質セットが、スクロースまたはナトリウムクロライドを含む、請求項１５および１６に記載の装置。
【請求項２０】
第１の流体流を生成するための前記手段および第２の流体流を生成するための前記手段が、前記第１のリザーバおよび／または第２のリザーバ中の孔に付加された管および／またはパイプを含む、請求項９に記載の装置。
【請求項２１】
前記第１および第２の流体流を混合するための前記手段が、Ｔ継手を含む、請求項９に記載の装置。
【請求項２２】
前記Ｔ継手が、
第１の入口、第２の入口および出口を備え；
前記第１の入口および前記出口が、実質的に一直線の流路を形成し；
前記第２の入口が、前記実質的に一直線の流路に対してほぼ直角に、前記実質的に一直線の流路への入口をもたらし；
前記第１の流体流が、前記第２の入口を通って前記Ｔ継手に入り；かつ
前記第２の流体流が、前記第１の入口を通って入る、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
混合器をさらに含む、請求項に１記載の装置。
【請求項２４】
前記混合器がスタティックミキサーを含む、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
遠心機、フィルター、または熱交換器をさらに含む、請求項９に記載の装置。
【請求項２６】
化学的処置の溶媒を添加するための場所をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項２７】
連続的な浸透圧ショックを前記発酵培地中に含まれる宿主細胞に加える手段をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項２８】
浸透圧によって細胞にショックを与える方法であって、前記方法が、
細胞を含む第１の溶液を準備することと；
第２の溶液を準備することとを含み；
前記第１の溶液のモル浸透圧濃度は前記第２の溶液のモル浸透圧濃度よりも高く；
前記第１の溶液を含む第１の流体流を生成することと；
前記第２の溶液を含む第２の流体流を生成することと；
前記第１および第２の流体流を連続的に混合して第３の流体流とすることと
を含む、方法。
【請求項２９】
前記細胞が、微生物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、哺乳類細胞、および酵母細胞からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、シュードモナス属の種(Pseudomonas sp.)、大腸菌(E. coli)、クレブシエラ属の種(Klebsialla sp.)、サッカロマイセス属の種(Saccharomyces sp):、ピキア属の種(Pichia sp.)、およびハンゼヌラ属の種(Hansenuela sp.)からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、細胞膜周辺腔を有し、前記細胞が、関心対象のタンパク質を産生する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の溶液が、前記第１の溶液中に約０．５Ｍ〜約１０Ｍのモル濃度で存在する第１の溶質セットを含み、前記第１の溶質セットが少なくとも１種類の溶質を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２の溶液が、前記第２の溶液中に約０Ｍ〜約１Ｍのモル濃度で存在する第２の溶質セットを含み、前記第２の溶質セットが少なくとも１種類の溶質を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の溶質セットまたは前記第２の溶質セットが、糖または塩を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記糖または前記塩が、グルコース、スクロース、グリセロール、ナトリウムクロライド、ナトリウムスルフェート、ナトリウムホスフェート、ナトリウムニトラート、カリウムクロライド、カリウムスルフェート、カリウムホスフェート、カリウムニトラート、マグネシウムクロライド、マグネシウムスルフェート、マグネシウムホスフェート、マグネシウムニトラート、カルシウムクロライド、カルシウムスルフェート、カルシウムホスフェート、カルシウムニトラートアンモウニウムスルフェート、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１および第２の流体流を前記第３の流体流に混合することが、
前記第１の流体流の流路に沿って第１の流路を規定することと；
前記第１の流路と交差し、これまでの前記第１の流路に進まない、前記第１の流路に対してほぼ直角に第２の流路を規定して、前記第１および第２の流路の交点を形成することと；
前記第１および第２の流路の前記交点に接続された第３の流路を規定することであって、前記第３の流路と前記第１の流路が実質的に一直線の流路を形成する、ことと；
前記第１の溶液を前記第２の流路にもたらすことと；
前記第２の溶液を前記第１の流路にもたらすことと；
前記第１および第２の流路の前記交点で、前記第３の流体流が前記第３の流路から出るように、前記第１および第２の溶液を混合することと
を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の溶液が、前記第１の溶液が前記第１および第２の流路の前記交点にもたらされるよりもより速い速度で、前記第１および第２の流路の前記交点にもたらされる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
スタティックミキサーで前記第３の流体流を混合することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が、関心対象のポリペプチドを産生し、前記細胞の細胞膜周辺腔の中に前記関心対象のポリペプチドを分泌する、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００７年１月１２日に出願された米国特許仮出願第６０／８８０，１９５号、標題「APPARATUS AND METHODS FOR OSMOTICALLY SHOCKING CELLS」の利益を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は一般にバイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、細胞の周辺質からの分子の単離のための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
多数の市販のバイオプロセスにおいて、細胞内の内容物を放出するためには機械的細胞破壊が使用される。この手順は、全ての細胞内の内容物を放出してさらなる下流の単位操作に重要な課題をもたらす。細菌の細胞膜周辺腔におけるタンパク質分子に関して、完全な細胞破壊をせずに原形質周辺の内容物を選択的に放出するために実験室規模のバッチ式浸透圧ショック手順が用いられている。そのようなプロセスは、一般に、発酵培養液と高モル濃度の塩または糖溶液（浸漬バッファ）を平衡化して細胞内に高い浸透圧を樹立することにより開始される。この後に、原形質周辺の内容物を放出するための時間の限定された周期の間、バッチモードでの低いモル浸透圧濃度のバッファ（ショックバッファ）との混合が続く。放出に続いて、細胞が遠心分離により除去される。この伝統的なバッチ法は時間がかかり、その他の制限、例えばスケールアップが困難なこと、暴露時間を正確に制御すること、および処理量が少ないこと、を有する。これらの要素は、関心対象の分子を大規模放出するためのその適用性を制限する。そのようなものとして、これらの制限を克服する方法および装置は、当技術分野における改善点であると思われる。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の一実施形態では、関心対象の組換えポリペプチドを調製するための方法には、宿主細胞の周辺質の中へ関心対象のポリペプチドの分泌をもたらすことのできる組換え発現系で形質転換された宿主細胞を発酵させることが含まれる。発酵は、関心対象のポリペプチドが宿主細胞の周辺質の中に分泌されるような条件下、発酵培地中で行われる。関心対象のポリペプチドは、連続的な浸透圧ショックを発酵培地中に含まれる宿主細胞に加えることにより、周辺質から抽出される。
【０００５】
本発明の一実施形態では、浸透圧によって細胞にショックを与えるための装置が開示される。この装置には第１の溶液中の細胞を含有する第１のリザーバおよび第２の溶液を含有する第２のリザーバが含まれ得る。第１の溶液は、第２の溶液よりも高いモル浸透圧濃度を有し得る。装置には、第１の溶液を含む第１の流体流を生成するための手段、第２の溶液を含む第２の流体流を生成するための手段、ならびに第１および第２の流体流を第３の流体流に混合するための手段がさらに含まれる。
【０００６】
もう１つの実施形態では、浸透圧によって細胞にショックを与えるための方法が開示される。この方法には、細胞を含む第１の溶液および第２の溶液を準備することが含まれ得る。第１の溶液のモル浸透圧濃度は、第２の溶液のモル浸透圧濃度よりも高くてもよい。この方法には、第１の溶液を含む第１の流体流を生成すること、第２の溶液を含む第２の流体流を生成すること、ならびに第１および第２の流体流を第３の流体流に混合することがさらに含まれ得る。
【０００７】
さらにもう一つの実施形態では、関心対象の組換えポリペプチドを細胞から単離する方法が開示される。この方法には、関心対象のポリペプチドを産生する細胞を含む第１の溶液を準備することが含まれ得る。この細胞は関心対象のポリペプチドを細胞の細胞膜周辺腔に分泌する。この方法には、第２の溶液を準備することがさらに含まれ得、この際、第１の溶液のモル浸透圧濃度は第２の溶液のモル浸透圧濃度よりも高い。この方法には、第１の溶液を含む第１の流体流を生成すること、第２の溶液を含む第２の流体流を生成すること、第１および第２の流体流を第３の流体流に混合すること、ならびに、第３の流体流の中に、関心対象の組換えポリペプチドを細胞の周辺質から放出することがさらに含まれ得る。細胞は、その後、第３の流体流から取り出すことができる。
【０００８】
様々な図面に表現される要素は縮尺通りではなく、説明目的のためだけのものであることが、当業者には理解されるであろう。本発明の性質、ならびに本発明の実施形態例は、以下の発明の詳細な説明、添付される特許請求の範囲、および以下のいくつかの図面を参照することにより一層明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】浸透圧によって細胞にショックを与えるための装置例の模式図である。
【図２】浸透圧によって細胞にショックを与えるためのさらなる装置例の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、細胞を浸透圧ショックに供するための装置および方法に関する。本発明はさらに、浸透圧ショックの使用による組換えペプチドの調製のための方法および装置に関する。明細書に開示される実施形態は、例示的なものであり、本発明または添付される特許請求の範囲をそのように限定することを意図しないことは、当業者には明白であろう。当業者は、本明細書に提示される実施形態の様々な組合せまたは変更例が、本発明の範囲から逸脱することなく行われてもよいことを理解するであろう。
【００１１】
本発明の一実施形態によれば、関心対象の組換えポリペプチドを調製するための方法には、宿主細胞の周辺質の中へ関心対象のポリペプチドの分泌をもたらすことのできる組換え発現系で形質転換された宿主細胞を発酵させることが含まれる。発酵は、関心対象のポリペプチドが宿主細胞の周辺質の中に分泌されるような条件下、発酵培地中で行われる。関心対象のポリペプチドは、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、増殖因子、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、抗体および抗体フラグメントからなる群より選択されてもよい。関心対象のポリペプチドは、連続的な浸透圧ショックを発酵培地中に含まれる宿主細胞に加えることにより、周辺質から抽出される。特定の実施形態によれば、連続的な浸透圧ショックを宿主細胞に加えることには、細胞を含む第１の溶液を準備すること、および第２の溶液を準備することが含まれ、この際、第１の溶液のモル浸透圧濃度は、第２の溶液の浸透圧よりも高い。第１の溶液を含む第１の流体流が生成され、前記第２の溶液を含む第２の流体流が生成される。次に、第１および第２の流体流は第３の流体流に混合される。連続的な浸透圧ショックは、高モル濃度のスラリーと低モル濃度のショックバッファの連続混合により達成され得る。高モル濃度のスラリーは、例えば、高い糖もしくは塩濃度からなる群より選択することができる。低モル濃度のショックバッファは、例えば、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓおよびホスフェートからなる群より選択することができる。この方法には、所望により、浸透圧が細胞から放出される(released)前または後に熱交換剤を運用する(administering)こと、浸透圧が細胞から放出される前または後に溶媒を投与する(administering)こと、および細胞から浸透圧が放出される前または後に化学的処置を施す(administering)ことも含まれてもよい。
【００１２】
図１を参照すると、本発明に従って浸透圧によって細胞にショックを与えるための装置１００の実施形態例の概略図が例示される。例示されるように、装置１００には、第１の溶液１０６を含有する第１のリザーバ１０２が含まれる。第１の溶液１０６中に表されているものは細胞１０８である。装置１００には、第２の溶液１１０を含有する第２のリザーバ１０４がさらに含まれる。第１のリザーバ１０２および第２のリザーバ１０４の底部に表されているものは、流体流を生成するための手段１１１Ａおよび１１１Ｂである。第１の流体流を生成するための手段１１１Ａは、第１の溶液１０６および細胞１０８を含む第１の流体流１１２を生成する。流体流を生成するための手段１１１Ｂは、第２の溶液１１０を含む第２の流体流１１４を生成する。さらに表されているものは、第１の流体流１１２と第２の流体流１１４を混合して第３の流体流１１８を形成する、流体流を混合するための手段１１６である。
【００１３】
流体流を生成するための手段１１１Ａおよび１１１Ｂは、第１および第２のリザーバ１０２および１０４の孔として表されているが、当業者に公知の流体流を生成するための任意の手段を用いてもよい。流体流を生成するための手段１１１Ａおよび１１１Ｂの例としては、限定されるものではないが、孔、スピゴット、注ぎ口、弁、注入口(pouring)、管、ポンプ、およびそれらの組合せが挙げられる。
【００１４】
当業者には明らかなように、流体流を混合するための手段１１６は、第１の流体流１１２と第２の流体流１１４を混合して第３の流体流１１８を形成することのできるいずれの装置または機器であってもよい。本発明の実施形態例で用いることのできる、流体流を混合するための適した手段１１６の例としては、限定されるものではないが、Ｔ継手、Ｙ継手、および漏斗が挙げられる。特定の実施形態では、流体流を混合するための手段１１６は、第３の流体流１１８の形成の前に第１の流体流１１２と第２の流体流１１４の組合せを長時間保有することが可能でない装置または機器であってもよい。特定の実施形態では、第１の溶液１０６および第２の溶液１１０は、１：４の比で混合され得る。
【００１５】
もう１つの実施形態では、第１の溶液１０６は、第２の溶液１１０よりも高いモル浸透圧濃度を有し得る。第１の溶液１０６は、約０．５Ｍ〜約１０Ｍの溶質濃度を有し得る。第１の溶液１０６は、例えば、約２Ｍ〜約６Ｍの溶質濃度を有し得、より具体的には、約１Ｍ〜約３Ｍの溶質濃度を有し得る。
【００１６】
第２の溶液１１０は、約０Ｍ〜約１Ｍの溶質濃度を有し得、より具体的には、約０Ｍ〜約０．５Ｍの溶質濃度、または約０Ｍ〜約０．１Ｍの溶質濃度を有し得る。
【００１７】
第１の溶液１０６および第２の溶液１１０の成分として有用であり得る溶質の例としては、限定されるものではないが、糖、塩、グルコース、スクロース、グリセロール、ナトリウムクロライド、ナトリウムスルフェート、ナトリウムホスフェート、ナトリウムニトラート、カリウムクロライド、カリウムスルフェート、カリウムホスフェート、カリウムニトラート、マグネシウムクロライド、マグネシウムスルフェート、マグネシウムホスフェート、マグネシウムニトラート、カルシウムクロライド、カルシウムスルフェート、カルシウムホスフェート、カルシウムニトラート、アンモウニウムスルフェート、およびそれらの組合せが挙げられる。特定の実施形態では、第１の溶液１０６および第２の溶液１１０としては、グリセロールおよび／またはナトリウムクロライドが挙げられる。
【００１８】
当業者には明らかなように、細胞１０８は、浸透圧ショックに供することを望まれる任意の種類の生体細胞であってもよい。浸透圧によってショックを与えることのできる細胞種の例としては、限定されるものではないが、微生物細胞、細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞、シュードモナス属の種(Pseudomonas sp.)、大腸菌(E. coli)、クレブシエラ属の種(Klebsialla sp.)、サッカロマイセス属の種(Saccharomyces sp.)、ピキア属の種(Pichia sp.)、およびハンゼヌラ属の種(Hansenuela sp.)が挙げられる。細胞１０８には、細胞膜周辺腔が含まれてよく、関心対象の分子を産生することもできる。特定の実施形態では、関心対象の分子はポリペプチドであってよく、細胞１０８は細胞膜周辺腔に局在する関心対象のポリペプチドを産生することができる。代表的な関心対象のポリペプチドは、例えば、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、増殖因子、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、抗体および抗体フラグメントからなる群より選択してもよい。
【００１９】
本発明の特定の実施形態の通常の運用では、リザーバ１０２は、細胞１０８を含む第１の溶液１０６を含む。リザーバ１０４は、第１の溶液１０６よりも低いモル浸透圧濃度の第２の溶液１１０を含む。流体流を生成するための手段１１１Ａは、第１の溶液１０６および細胞１０８を含む第１の流体流１１２を生成する。流体流を生成するための手段１１１Ｂは、第２の溶液１１０を含む第２の流体流１１４を生成する。第１の流体流１１２および第２の流体流１１４は、相互に流体連通されて第３の流体流１１８を生成する。例えば、第１の流体流１１２および第２の流体流１１４は、流体流を混合するための手段１１６を用いて混合されて第３の流体流１１８を形成することができる。
【００２０】
図２を参照すると、本発明に従って浸透圧によって細胞にショックを与えるための装置２００の実施形態例の概略図が例示される。図２から分かるように、装置２００は、装置１００と同じ特徴をいくつか有する。流体流を生成するための手段１１１Ａには、第１の溶液１０６の中に挿入されているポンプ１２２Ａおよび管１２０Ａが含まれる。ポンプ１２２Ａおよび管１２０Ａは、ともに管１２０Ａの中を流れる第１の流体流１１２（図２には図示せず）を生成する。流体流を生成するための手段１１１Ｂは、第２の溶液１１０の中に挿入されているポンプ１２２Ｂおよび管１２０Ｂを含む。ポンプ１２２Ｂおよび管１２０Ｂは、ともに管１２０Ｂの中を流れる第２の流体流１１４（図示せず）を生成する。ポンプ１２２ＡおよびＢは、別々に、かつ可変的に第１の流体流１１２および／または第２の流体流１１４の各々が管１２０Ａおよび１２０Ｂの中を流れる速度を制御することができる。管１２０Ａおよび１２０Ｂは、Ｔ継手１２４に流体によって連結されている。Ｔ継手１２４は、管１２８を介してミキサー１２６に接続されている。ミキサー１２６は、管１３２を介して浄化装置(clarifier)１３０に接続されている。
【００２１】
当業者には明らかなように、管１２０Ａおよび１２０Ｂ、１２８、および１３２は、流体流を導くためのあらゆる種類の機器または材料であってもよい。管１２０Ａおよび１２０Ｂ、１２８、および１３２としての使用に適した品目の例としては、限定されるものではないが、チャネル、パイプ、管、ゴム管、タイゴンチューブ、およびそれらの組合せが挙げられる。
【００２２】
ポンプ１２２ＡおよびＢは、流体流を移動させるために有用なあらゆる種類のポンプであってもよい。本発明に従う実施形態において有用であり得るポンプ１２２Ａおよび１２０Ｂの例としては、限定されるものではないが、蠕動ポンプ、ホースポンプ、計量型ポンプ、ギヤーポンプ、ヘリカルポンプ、磁気ドライブポンプ、回転動力式(rotodynamic)ポンプ、容量形ポンプ、ジェットポンプ、ガスリフトポンプ、電磁ポンプ、エダクタージェットポンプ、回転ポンプ、回転翼ポンプ、往復ポンプ、およびダイヤフラムポンプが挙げられる。特定の実施形態では、ポンプ１２２Ａおよび１２０Ｂは、第１の溶液１０６および第２の溶液１１０をＴ継手１２４に１：４の比で提供し、第１の溶液１０６および第２の溶液１１０は、Ｔ継手１２４に図２に示される方向で提供される。
【００２３】
ミキサー１２６は、流体の内容物を混合するために有用ないずれの種類のミキサーであってもよい。本発明に従う実施形態において有用であり得るミキサー１２６の例としては、限定されるものではないが、ディスパーサー(dispersers)、高剪断ミキサー、多軸ミキサー、遊星形ミキサー、リボンパドルミキサー、バーチカルブレンダー、およびスタティックミキサーが挙げられる。スタティックミキサーを用いることにより、異なる物理的属性および流動属性の流れを混合するために効果的な機器を得ることができる。スタティックミキサーは可動部分がないので、比較的低剪断を作り出し、機器の中の接触／滞留時間を効果的に制御する。
【００２４】
浄化装置１３０は、サイズまたは密度に基づく流体の内容物の分離に有用ないずれの種類の機器であってもよい。本発明に従う実施形態において有用であり得る浄化装置１３０の例としては、限定されるものではないが、フィルター、遠心機、マイクロフィルター、タンジェンシャルフローマイクロフィルター(tangential flow microfilters)、連続遠心機、およびディスクスタック連続遠心機(disc stack continuous centrifuge)が挙げられる。現在好ましいものは、ディスクスタック連続遠心機である。
【００２５】
その上、本発明に従う装置の実施形態は、熱交換器、あるいは、第１の溶液１０６および第２の溶液１１０の一方もしくは両方、かつ／または、第１の流体流１１２、第２の流体流１１４、および第３の流体流１１８の中の１またはそれ以上の温度を変更するためのその他の温度変更機器を含んでもよい。当業者には明らかなように、熱交換器またはその他の温度変更機器は、第１の溶液１０６および／または第２の溶液１１０の一方もしくは両方、かつ／または、第１、第２、および第３の流体流１１２、１１４、および１１８の中の１またはそれ以上の温度をその場所で変更するために、装置内のどこに置いてもよい。熱交換器またはその他の温度変更機器の配置の限定されない例としては、Ｔ継手１２４とミキサー１２６の間、ミキサー１２６と浄化装置１３０の間、およびリザーバ１０２と１０４の一方または両方の中が挙げられる。本発明の実施形態で用いることのできる、適した熱交換器またはその他の温度変更機器の例としては、限定されるものではないが、ヒーター、冷却または加熱ブランケット、冷却または加熱ジャケット、シェル熱交換器、チューブ熱交換器、プレート熱交換器、プレートアンドフレーム熱交換器、再生熱交換器、動的熱交換器、表面かき取り式熱交換器、断熱ホイール(adiabatic wheel)熱交換器、およびヒートポンプが挙げられる。
【００２６】
その上、本発明に従う装置の実施形態は、所望のアクセスポートまたは機器を含んでもよい。かかるアクセスポートまたは機器は、さらなる成分または化学物質を第１および第２の溶液１０６および１１０の一方または両方、かつ／または、第１、第２、および第３の流体流１１２、１１４、および１１８の中の１またはそれ以上に任意の時点で添加することを可能にするものであろう。本発明において使用することのできる、適したアクセスポートまたは機器としては、限定されるものではないが、ドア、ポート、ダイアフラム、弁、ジャンクション、およびそれらの組合せが挙げられる。
【００２７】
通常の運転では、図２に表される装置は、ポンプ１２２Ａを用いて管１２０Ａを通って細胞１０８を含有する第１の溶液１０６をくみ上げ、第１の溶液１０６をＴ継手１２４に送出する。第２の溶液１１０も、ポンプ１２２Ｂを用いて管１２０Ｂを通ってくみ上げられ、Ｔ継手１２４に送出される。第１の溶液１０６、細胞１０８、および第２の溶液１１０はＴ継手１２４の中で混合される。細胞１０８は、第１の溶液１０６と第２の溶液１１０の組合せによって浸透圧ショックに供され、浸透圧ショックは、細胞の細胞膜周辺腔中の分子の周囲の溶液への放出をもたらす。第１の溶液１０６、細胞１０８、および第２の溶液１１０の組合せの結果生じる溶液は、ミキサー１２６を通過し、かつ浄化装置１３０の上を通過する。
【００２８】
本発明の実施形態例は、関心対象の組換えポリペプチドを単離する方法を提供する。この方法には、関心対象の組換えポリペプチドを産生する細胞を増殖または発酵させることが含まれ、該細胞は関心対象の組換えポリペプチドを細胞の周辺質に分泌する。細胞は、高モル浸透圧濃度溶液中でインキュベートされる。高モル浸透圧濃度溶液中の細胞の流体流は、低モル浸透圧濃度溶液の流体流と混合されて、新しい流体流を形成し、この際、高モル浸透圧濃度溶液中の細胞を低浸透圧溶液の流体流と混合することにより、細胞に関心対象の組換えポリペプチドを新しい流体流に放出させる。新しい流体流は、次に混合され（例えば、スタティックミキサーで）、次に細胞は、浄化するための機器、例えばフィルターまたは遠心機などを用いて関心対象の組換えポリペプチドを含有する新しい流体流から分離される。
【００２９】
当業者には明らかなように、細胞は、関心対象のポリペプチドを自然に発現し、それを細胞膜周辺腔に分泌する、または細胞に構築物を含めるように操作し、それをゲノムに統合して、関心対象のポリペプチドを産生し、それを細胞膜周辺腔に分泌させることができる。
【００３０】
本発明を、例として提供し、いかなる方法によっても本発明を制限することを意図しない、以下の実施例でさらに説明する。
（実施例）
【実施例１】
【００３１】
流体流の組合せによる浸透圧ショック
【００３２】
細胞膜周辺腔でヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を発現しているシュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluoresescens)細菌株（ＤＣ４５６）を使用した。２０Ｌのバイオリアクター規模での発酵の後、実験室のバッチ遠心機で培養液を遠心した。細胞ペースト（３８１１ｇ）を３．５Ｌの浸漬バッファ（２５％のスクロース、ｐＨ７．２）と３０分間混合した。ショックバッファは、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．２からなった。流体流の組合せによる浸透圧ショックのための構成は、２つの流れ（平衡化した細胞スラリーおよびショックバッファ）を連続的に流すための２つの蠕動ポンプ（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  Ｌ／Ｓ、モデル＃７７２００−６２）からなり、２つの流れはＴ継手、それに続いて、液体抽出物から細胞を分離するための連続的ディスクスタック遠心機（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ  ＳＣ−６）に取り付けられている、２つの流れを急速に混合するためのスタティックミキサー（Ｃｏｎｐｒｏｔｅｃ、ＦＭ  ０８−１０−３６）を用いて混合される。平衡化された細胞スラリーとショックバッファの流速は、それぞれ２００ｍＬ／分および８００ｍＬ／分であった。供給および抽出物流からのサンプル中のｈＧＨの量を、キャピラリー電気泳動（ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ９０）により測定した。この方法のこの工程の収率（抽出物中のｈＧＨの量を発酵培養液中のｈＧＨの量で除算した値）は約７０％であった。
【実施例２】
【００３３】
バッチ処理による浸透圧ショック
【００３４】
細胞膜周辺腔でヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を発現しているシュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluoresescens)細菌株（ＤＣ４５６）を使用した。２０Ｌのバイオリアクター規模での発酵の後、実験室のバッチ遠心機で培養液を遠心した。細胞ペースト（１５０〜２２５ｇ）を１５０〜２２５ｇの浸漬バッファ（２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓを含む２５％のスクロース、ｐＨ７．２）と３０分間混合した。平衡化されたスラリーを４倍量のショックバッファ（２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.２）と混合し、３０分間維持し、実験室のバッチ遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で遠心した。供給および抽出物流からのサンプル中のｈＧＨの量を、キャピラリー電気泳動（ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ９０）により測定した。この方法のこの工程の収率（抽出物中のｈＧＨの量を発酵培養液中のｈＧＨの量で除算した値）は約４０％であった。
【００３５】
本発明は特定の実施形態で説明されてきたが、本発明は、本開示の精神および範囲の中でさらに変更されてもよい。従ってこの適用は、その一般原則を用いる本発明のあらゆる変化例、使用例、または適合例を網羅することが意図される。さらに、本願は、本発明の属する当技術分野で公知または慣用され、添付される特許請求の範囲内に入る、本開示からの逸脱を網羅することが意図される。
【国際調査報告】
2010515459.tif 000002
2010515459.tif 000003
2010515459.tif 000004