(57)【要約】  本発明は、心不全の治療における新規のバイオマーカー及び治療標的としての特定のｍｉＲＮＡを開示する。これらの特定のｍｉＲＮＡの模倣物又はインヒビターを投与することにより、被験者において心不全を治療又は予防する方法が開示される。１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することにより、被験者において心不全を診断又は予後予測する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者において心不全を診断又は予後予測する方法であって、
ａ．前記被験者からの生体試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することと、
ｂ．前記生体試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを、標準試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルと比較することと、
を含み、
前記標準試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルと比較した前記生体試料における少なくとも１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルの差が、心不全の診断又は予後の指標となる、方法。
【請求項２】
前記１つ又は複数のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号４８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ（配列番号４９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ（配列番号５０）、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（配列番号５１）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ又は複数のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ又は複数のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号１６）から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｃ．前記標準試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルと比較した前記生体試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルに基づき、心不全のタイプを診断すること、
をさらに含み、
前記１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルが、虚血性心筋症又は特発性拡張型心筋症の診断の指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ又は複数のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号１６）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
被験者において心不全又は心不全に関連した疾患若しくは病態を治療又は予防する方法であって、
治療有効量のｍｉＲＮＡ模倣物又はｍｉＲＮＡインヒビターを、前記被験者の心臓細胞に投与すること、
を含む、方法。
【請求項８】
前記ｍｉＲＮＡ模倣物又は前記ｍｉＲＮＡインヒビターが、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号４８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ（配列番号４９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ（配列番号５０）、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（配列番号５１）からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの１つ又は複数の模倣物又はインヒビターである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｍｉＲＮＡ模倣物が、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）の配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｍｉＲＮＡ模倣物が、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）の配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｍｉＲＮＡインヒビターが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、又はｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）と相補的な配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｍｉＲＮＡインヒビターが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）と相補的な配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｍｉＲＮＡインヒビターがアンタゴmirである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験者に第２の心臓治療薬を投与することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の心臓治療薬が、強心薬、神経液性遮断薬、アルドステロン拮抗薬、利尿薬、血管拡張薬、エンドセリン受容体拮抗薬、及びＨＤＡＣ阻害薬からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の心臓治療薬が、前記ｍｉＲＮＡ模倣物又は前記ｍｉＲＮＡインヒビターと併用投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の心臓治療薬が、前記ｍｉＲＮＡ模倣物又は前記ｍｉＲＮＡインヒビターの前又は後に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
被験者において心不全又は心不全に関連した疾患若しくは病態を治療又は予防する方法であって、
前記被験者に医薬組成物を投与することであって、前記医薬組成物が、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ模倣物又は少なくとも１つのｍｉＲＮＡインヒビターと、薬学的に許容可能な担体とを含む、こと、
を含む方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡ模倣物又は前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡインヒビターが、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号４８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ（配列番号４９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ（配列番号５０）、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（配列番号５１）からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの１つ又は複数の模倣物又はインヒビターである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡ模倣物が、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）の配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡインヒビターが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、又はｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）と相補的な配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡインヒビターがアンタゴmirである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記医薬組成物が、強心薬、神経液性遮断薬、アルドステロン拮抗薬、利尿薬、血管拡張薬、エンドセリン受容体拮抗薬、及びＨＤＡＣ阻害薬のうちの１つ又は複数をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
細胞における胎児心臓遺伝子プログラム（ＦＧＰ）の再活性化を調節する方法であって、
心臓細胞に１つ又は複数のｍｉＲＮＡインヒビター又はｍｉＲＮＡ模倣物を提供することを含み、前記１つ又は複数のｍｉＲＮＡインヒビター又はｍｉＲＮＡ模倣物が、前記胎児心臓遺伝子プログラムの少なくとも１つのマーカーの発現を調整する、方法。
【請求項２５】
前記１つ又は複数のｍｉＲＮＡインヒビター又はｍｉＲＮＡ模倣物が、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号４８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ（配列番号４９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ（配列番号５０）、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（配列番号５１）からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの模倣物又はインヒビターである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記１つ又は複数のｍｉＲＮＡインヒビター又はｍｉＲＮＡ模倣物が、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）の模倣物又はインヒビターである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記胎児心臓遺伝子プログラムの少なくとも１つのマーカーが、αＭｙＨＣ、βＭｙＨＣ、ＡＮＦ、ＢＮＰ、ＳＥＲＣＡ２ａ、及び骨格筋α-アクチンからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
被験者において心不全の治療をモニタする方法であって、
ａ．第１の時点で前記被験者から第１の生体試料を採取することであって、前記第１の時点が心不全の薬物治療プロトコルの開始前である、ことと、
ｂ．第２の時点で前記被験者から第２の生体試料を採取することであって、前記第２の時点が心不全の薬物治療プロトコルの開始後である、ことと、
ｃ．前記第１の生体試料及び前記第２の生体試料を、ｍｉＲＮＡ配列解析、ｍＲＮＡ配列解析及び標的プロテオーム発現解析によって処理することと、
ｄ．前記第１の生体試料からのｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びタンパク質の発現データを、前記第２の生体試料からの発現データと比較して、前記薬物治療プロトコルの有効性の指標となる遺伝子発現パターンの変化を測定することと、
を含む、方法。
【請求項２９】
前記第１の時点と前記第２の時点との間隔が、約３〜９ヶ月である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｍＲＮＡ解析が、Affymetrixプロトコルによって実施される、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、全体として参照により本明細書に援用される２００７年７月１８日出願の米国仮特許出願第６０／９５０，５６５号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
心不全は、心臓が十分な血液を拍出することができず、組織又は細胞の代謝に必要な栄養及び酸素が満たされない病態生理学的状態である。心不全は、多くの心疾患における主要な合併症である。４０歳超の成人は、心不全を発症する生涯リスクが推定２１％であり（Lloyd-Jones et al., 2002, Circulation 106, 3068-72）、いかなる癌合併形態と比べても入院期間をより長引かせる原因となる病態である（American Heart Association. Heart Disease and Stroke Statistics-2003 Update）。
【０００３】
心不全は、多くの疾患過程の最後に共通する終末点を表す総称である。心不全の最も一般的な原因は冠動脈疾患であり、これは心筋梗塞（心発作）に至り得るもので、結果として心臓の細胞死を招くことが多い。このとき心臓は、代償するため、残りの生組織で同じ作業を行わなければならない。心筋梗塞がない場合に、慢性の閉塞性冠動脈疾患も心不全を引き起こし得る。弁膜症又は高血圧は、心臓の仕事量が増加することによって心不全に至り得る。心不全の原因となることが少ないものは、主として心筋が関わり、心筋症として分類される（この用語は、心不全のあらゆる原因を網羅して、より総称的に使用される）。これらの疾病のうち最も良く特徴付けられているのは、サルコメアの単一遺伝子病群であり、これは多くの場合に「肥大型心筋症」の表現型を生じる（実際には、多くの患者は肥大がなく、すなわち表現型の浸透度は様々であるため誤称である）。対照的に、「拡張型心筋症」の患者は全て、心室が拡張して壁が薄くなる。この病態の遺伝学はいまだ特徴付けられておらず、多因子性である可能性が高いが、多くの場合に非遺伝的原因（例えば、感染症、アルコール、化学療法剤）が大きく関与し得る。容易に特定可能な原因が分からない場合に用いられる診断は、特発性拡張型心筋症（概して除外診断）である。
【０００４】
心不全を発症すると、心臓に様々な病態生理学的変化が起こる。生体内における仕事量の増加に応じ、直接的な結果として、但し心筋細胞肥大（すなわち、細胞分裂がないなかでの細胞サイズの増加）による続発性の心臓サイズの増加（心肥大）がよく認められる。細胞及び分子レベルでは、心肥大は収縮タンパク質の発現増加及び様々なシグナル伝達経路の活性化によって特徴付けられるが、心不全の病態生理学におけるその役割は、依然として完全には理解されていない。
【０００５】
心不全に対する現行の治療としては、薬理学的方法、補助人工心臓（ＶＡＤ）などの装置、心臓再同期療法（ＣＲＴ）、及び心臓移植が挙げられる。薬理学的手法としては、限定はされないが、強心薬（すなわち、心収縮能を増加させる化合物）、神経液性遮断薬（neurohumoral blocker）（例えば、β遮断薬、アンジオテンシン変換酵素阻害薬）、アルドステロン拮抗薬、利尿薬、及び血管拡張薬の使用が挙げられる。しかしながら、このような薬剤のいずれも、単用するにしろ、又は併用するにしろ、完全には有効でない。移植の利用可能性は極めて限られており、且つ心不全を患う人の多くは健康状態が悪いため、外科手術の対象としては不適当であることが多い。このような理由から、特に先進国世界において、心不全は依然として罹病率及び死亡率の主な原因である。加えて、上記に指摘されるとおり、心不全の正確な病因を決定することは困難であるといってよく、より特異的な治療法の開発を妨げる要因となっている。加えて、分子レベルにおける診断技術が全般的に欠如している。従って、当該技術分野では、心不全の治療に向けて、さらなる診断マーカー及び新規治療手法を開発するための薬理学的標的を開発する必要がある。加えて、当該技術分野では、心不全の重症度及びその治療に対する反応の評価技術について、現行のものも、及びいまだ記載がなされていないものも、改良する必要がある。本発明は、とりわけ前述の必要性に対処する。
【０００６】
心肥大及びそれが心不全に進行する可能性は、高血圧症、虚血性心疾患、弁膜症、及び内分泌障害を含む様々な心血管疾患に対する共通の病理学的反応である。心肥大は心筋（心筋層）の肥厚を指し、その結果、血流の遮断及び／又は心機能（拡張期弛緩）の低下が生じ得る。心肥大は、正常な生理学的過程（厳密な運動）か、或いは、高血圧症、弁狭窄症若しくは弁閉鎖不全症、虚血、又は代謝疾患などの病態生理学的過程のいずれかの帰結として心臓が負荷を受けるときに起こり得る；二次的には、心肥大はプログラム細胞死（アポトーシス）及び／又は組織壊死を伴うことが多くある。心臓細胞はほとんどが分裂不可能であることから、細胞は代償しようとしてより大きくなる；最初のうちは、この代償は有用であるが、過度に肥大すると次第に他の様々な病態生理学的なカスケードを活性化し、結果として進行性心機能不全を生じ、最終的には非代償性心不全に至り得る。心肥大は、高血圧などの他の心疾患リスク要因に追加される独立したリスク要因であり得るため、高血圧が治療されても、肥大は退縮することも、又はしないこともある。従って、心肥大の直接的な治療があれば有益であろう。
【０００７】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、調節ＲＮＡのなかの近年発見されたクラスであり、遺伝子発現を転写後調節する。ｍｉＲＮＡは、約１８〜２５ヌクレオチド長の、進化的に保存された低分子の非コードＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは特定の「標的」ｍＲＮＡと塩基対を形成し、そうすることによって翻訳を阻害したり、又はｍＲＮＡ分解を促進したりする（Bartel, 2004 Cell, 116, 281-297）。
【０００８】
ｍｉＲＮＡは、生体の発生に関与することが報告されている（Ambros, Cell 113: 673-676）。ｍｉＲＮＡは、様々な組織において発現が異なる（Xu et al, 2003 Curr. Biol. 13:790-795；Landgraf et al, 2007 Cell 129: 1401-14）。ｍｉＲＮＡはまた、ウイルス感染過程に関与すること（Pfeffer et al., 2004 Science 304: 734-736）、及び腫瘍形成に関連すること（Calin, et al., 2004 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 2999-3004；Calin et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(24): 15524-15529）も報告されている。心臓においては特定のｍｉＲＮＡが高い存在量で発現するものの、様々な心疾患におけるこのようなｍｉＲＮＡの役割は、依然として定義されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、被験者において心不全を診断又は予後予測する（prognose）方法を提供する。一実施形態において、本方法は、被験者からの生体試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することと、前記生体試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを、標準試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルと比較することとを含み、ここで、前記標準試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルと比較した前記生体試料における少なくとも１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルの差が、心不全の診断又は予後の指標となる。
【００１０】
別の実施形態において、心不全を診断又は予後予測する方法に用いられる１つ又は複数のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知；配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号４８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ（配列番号４９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ（配列番号５０）、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（配列番号５１）から選択される。
【００１１】
別の実施形態において、心不全を診断又は予後予測する方法に用いられる１つ又は複数のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）から選択される。
【００１２】
好ましい実施形態において、心不全を診断又は予後予測する方法に用いられる１つ又は複数のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知；配列番号１６）から選択される。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態において、前記標準試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルと比較した前記生体試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルに基づき、心不全のタイプが診断され、ここで１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルは、虚血性心筋症又は特発性拡張型心筋症の診断の指標となる。好ましくは、虚血性心筋症又は特発性拡張型心筋症の診断の指標となる１つ又は複数のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知；配列番号１６）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）から選択される。
【００１４】
本発明はまた、被験者において心不全又は心不全に関連した疾患若しくは病態を治療又は予防する方法も提供する。一実施形態において、本方法は、治療有効量のｍｉＲＮＡ模倣物又はｍｉＲＮＡインヒビターを被験者の心臓細胞に投与することを含む。
【００１５】
別の実施形態において、心不全又は心不全に関連した疾患若しくは病態を治療又は予防する方法に用いられるｍｉＲＮＡ模倣物又はｍｉＲＮＡインヒビターは、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知；配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号４８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ（配列番号４９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ（配列番号５０）、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（配列番号５１）からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの１つ又は複数の模倣物又はインヒビターである。別の実施形態において、本方法は、被験者に第２の心臓治療薬を投与することをさらに含む。第２の心臓治療薬としては、強心薬、神経液性遮断薬、アルドステロン拮抗薬、利尿薬、又は血管拡張薬を挙げることができる。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態では、被験者において心不全又は心不全に関連した疾患若しくは病態を治療又は予防する方法は、被験者に医薬組成物を投与することを含み、ここで前記医薬組成物は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ模倣物又は少なくとも１つのｍｉＲＮＡインヒビターと、薬学的に許容可能な担体とを含む。ｍｉＲＮＡ模倣物又はｍｉＲＮＡインヒビターは、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知；配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号４８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ（配列番号４９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ（配列番号５０）、又はｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（配列番号５１）の模倣物又はインヒビターであってもよい。別の実施形態において、医薬組成物は、強心薬、神経液性遮断薬、アルドステロン拮抗薬、利尿薬、及び血管拡張薬のうちの１つ又は複数をさらに含む。
【００１７】
本発明はまた、細胞における胎児心臓遺伝子プログラム（fetal cardiac gene program）（ＦＧＰ）の再活性化を調節する方法も提供する。一実施形態において、本方法は、心臓細胞に１つ又は複数のｍｉＲＮＡインヒビター又はｍｉＲＮＡ模倣物を提供することを含み、ここで１つ又は複数のｍｉＲＮＡインヒビター又はｍｉＲＮＡ模倣物は、胎児心臓遺伝子プログラムの少なくとも１つのマーカーの発現を調整する。１つ又は複数のｍｉＲＮＡインヒビター又はｍｉＲＮＡ模倣物は、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知；配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号４８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ（配列番号４９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ（配列番号５０）、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（配列番号５１）からなる群から選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡの模倣物又はインヒビターであってもよい。好ましい実施形態において、１つ又は複数のｍｉＲＮＡインヒビター又はｍｉＲＮＡ模倣物は、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）の模倣物又はインヒビターである。別の実施形態において、胎児心臓遺伝子プログラムの少なくとも１つのマーカーは、αＭｙＨＣ、βＭｙＨＣ、ＡＮＦ、ＢＮＰ、ＳＥＲＣＡ２ａ、及び骨格筋α-アクチン（skeletal α-actin）からなる群から選択される。
【００１８】
本発明はまた、被験者において心不全の治療をモニタする方法も包含する。一実施形態において、本方法は、第１の時点で被験者から第１の生体試料を採取することであって、第１の時点が心不全の薬物治療プロトコルの開始前である、ことと；第２の時点で被験者から第２の生体試料を採取することであって、第２の時点が心不全の薬物治療プロトコルの開始後である、ことと；第１の生体試料及び第２の生体試料を、ｍｉＲＮＡ配列解析、ｍＲＮＡ配列解析及び標的プロテオーム発現解析によって処理することと；第１の生体試料からのｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びタンパク質の発現データを、第２の生体試料からの発現データと比較して、遺伝子発現パターンの変化を測定することであって、遺伝子発現の変化が薬物治療プロトコルの有効性の指標となる、こととを含む。別の実施形態において、第１の時点と第２の時点との間隔は、約３〜９ヶ月である。別の実施形態において、ｍＲＮＡ解析は、Affymetrixプロトコルによって実施される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
図面の簡単な説明
【図１】(図１Ａ）ｍｉＲＮＡの相対的発現。非不全心（ＮＦ、ｎ＝６）と特発性拡張型心筋症の不全心（ＩＤＣ、ｎ＝５）との対比。解析は、LC Sciences（Houston,TX）のSanger human miRBase 9.0対応ｍｉＲＮＡ発現アレイチップ、４７０個のｍｉＲＮＡのデータセットで実施した。データは擬似温度尺度で表され、赤色が発現の増加を表し、緑色が発現の減少を表す。有意にアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされた（ｐ＜０．０５）ｍｉＲＮＡのみを示す。（図１Ｂ）ｍｉＲＮＡの相対的発現。ＮＦ心と虚血性心筋症の不全心（ＩＳＣ、ｎ＝５）との対比。解析は、LC Sciences（Houston,TX）のSanger human miRBase 9.0対応ｍｉＲＮＡ発現アレイチップ、４７０個のｍｉＲＮＡのデータセットで実施した。データは擬似温度尺度で表され、赤色が発現の増加を表し、緑色が発現の減少を表す。有意にアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされた（ｐ＜０．０５）ｍｉＲＮＡのみを示す。
【図２】ヒトの非不全心（ＮＦ、ｎ＝６）と不全心（ＩＤＣ又はＩＳＣＨ、ｎ＝５，５）との対比における相対的なｍｉＲＮＡ発現をグラフで表したもの。特定のｍｉＲＮＡはいずれのタイプの不全心においてもアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされるのに対し、他のｍｉＲＮＡは心不全のタイプによって発現が異なることに留意されたい。
【図３】差次的発現（differential expression)がｐ＜０．０５に達したｍｉＲＮＡのサブセットの相対的発現。
【図４】非不全（ＮＦ）、特発性心筋症（ＩＤＣ）又は虚血性心筋症（ＩＳＣ）の被験者から抽出されたＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲによって評価したときのｍｉＲＮＡ発現レベル。ｍｉＲＮＡ発現は、非不全心と不全心とで発現が変わらないｍｉＲ−２４の発現に対して基準化した。統計解析はＡＮＯＶＡを用いて行った。
【図５】ｍｉＲ−９２模倣物又はｍｉＲ−９２インヒビターをトランスフェクトした新生仔ラット心室筋細胞における胎児遺伝子発現の変化。細胞は、トランスフェクション後２４時間で１０−７Ｍのイソプロテレノール（ＩＳＯ；黒色バー）により処置し、処置後４８時間で回収した。遺伝子発現はＲＴ−ＰＣＲによって計測した。結果は１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現レベルに対して基準化し、１と定義した対照の模倣物又はインヒビター（１のライン）をトランスフェクト細胞と比較した。グラフは、３〜４回の個別の実験の平均値を表す。
【図６】ｍｉＲ−１００模倣物又はｍｉＲ−１００インヒビターをトランスフェクトした新生仔ラット心室筋細胞における胎児遺伝子発現の変化。細胞は、トランスフェクション後２４時間で１０−７Ｍのイソプロテレノール（ＩＳＯ；黒色バー）により処置し、処置後４８時間で回収した。遺伝子発現はＲＴ−ＰＣＲによって計測した。結果は１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現レベルに対して基準化し、１と定義した対照の模倣物又はインヒビター（１のライン）をトランスフェクト細胞と比較した。グラフは、３〜４回の個別の実験の平均値を表す。
【図７】ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物又はｍｉＲ−１３３ｂインヒビターをトランスフェクトした新生仔ラット心室筋細胞における胎児遺伝子発現の変化。細胞は、トランスフェクション後２４時間で１０−７Ｍのイソプロテレノール（ＩＳＯ；黒色バー）により処置し、処置後４８時間で回収した。遺伝子発現はＲＴ−ＰＣＲによって計測した。結果は１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現レベルに対して基準化し、１と定義した対照模倣物又はインヒビター（１のライン）をトランスフェクト細胞と比較した。グラフは、３〜４回の個別の実験の平均値を表す。
【図８】模倣物ｍｉＲＮＡ又はインヒビターｍｉＲＮＡをトランスフェクトしたときのｍｉＲＮＡレベル。ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１００及びｍｉＲ−１３３ｂの模倣物及びインヒビターを、新生仔ラット心室筋細胞にトランスフェクトした。各ｍｉＲＮＡの発現レベルはＲＴ−ＰＣＲによって評価した。
【図９】新生仔ラット心室筋細胞においてｍｉＲＮＡ−１３３ｂを過剰発現させるか、又はダウンレギュレーションすると、細胞肥大が調節される。細胞は、ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物（下側パネル）又はｍｉＲ−１３３ｂインヒビター（上側パネル）をトランスフェクトし、イソプロテレノール処置に供するか（右側パネル）、又はそれ以上の処置は行わなかった（左側パネル）。図は、抗アクチニン抗体による免疫蛍光を示す。
【図１０】新生仔ラット心室筋細胞においてｍｉＲＮＡ−１３３ｂを過剰発現させるか、又はダウンレギュレーションすると、細胞肥大が調節される。細胞は、ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物又はｍｉＲ−１３３ｂインヒビターをトランスフェクトし、トランスフェクト細胞のサブセットをイソプロテレノールに曝露した（黒色バー）。細胞サイズはImage Jソフトウェアを使用して計測した。３つの異なる領域からの合計３０個の細胞を計測した。
【図１１】ｍｉＲＮＡに基づく標的発見方法に向けた統合的な手法としての連続的遺伝子発現解析（serial analysis of gene expression：ＳＡＧＥ）の概略図。ｍｉＲＮＡ配列解析、ｍＲＮＡ（Afflymetrix）配列解析、及び（標的）プロテオーム発現解析用の生体試料の提供には、心不全（ＨＦ）患者からの心内膜心筋生検が用いられる。
【図１２】β遮断薬で処置したヒト患者におけるｍｉＲ−１３３の発現。β遮断薬で処置した患者からの試料に対してＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。末期心不全（Ａ）、処置後３ヶ月（Ｂ）及び処置後１２ヶ月（Ｃ）において一連の生検を採取した。ｍｉＲ−１３３ｂ（上のパネル）及びｍｉＲ−１３３ａ（下のパネル）の発現レベルは、ｍｉＲ−３７０（右のパネル）及び低分子ＲＮＡ  ＲＮＵ６６（左のパネル）の発現に対して基準化した。患者２０、２１、２５及び３４はβ遮断薬処置に反応したが、患者１０３はこの処置に反応しなかった。
【図１３】β遮断薬で処置したヒト患者におけるｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１９ｂの発現。β遮断薬で処置した患者からの試料に対してＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。末期心不全（Ａ）、処置後３ヶ月（Ｂ）及び処置後１２ヶ月（Ｃ）において一連の生検を採取した。ｍｉＲ−１（上のパネル）及びｍｉＲ−１９ｂ（下のパネル）の発現レベルは、ｍｉＲ−３７０（右のパネル）及び低分子ＲＮＡ  ＲＮＵ６６（左のパネル）の発現に対して基準化した。患者２０、２１、２５及び３４はβ遮断薬処置に反応したが、患者１０３はこの処置に反応しなかった。
【図１４】β遮断薬で処置したヒト患者におけるｍｉＲ−３０ｄ及びｍｉＲ−９２ａの発現。β遮断薬で処置した患者からの試料に対してＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。末期心不全（Ａ）、処置後３ヶ月（Ｂ）及び処置後１２ヶ月（Ｃ）において一連の生検を採取した。ｍｉＲ−３０ｄ（上のパネル）及びｍｉＲ−９２ａ（下のパネル）の発現レベルは、ｍｉＲ−３７０（右のパネル）及び低分子ＲＮＡ  ＲＮＵ６６（左のパネル）の発現に対して基準化した。患者２０、２１、２５及び３４はβ遮断薬処置に反応したが、患者１０３はこの処置に反応しなかった。
【図１５】β遮断薬で処置したヒト患者におけるｍｉＲ−２０８ｂ及びｍｉＲ−４９９の発現。β遮断薬で処置した患者からの試料に対してＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。末期心不全（Ａ）、処置後３ヶ月（Ｂ）及び処置後１２ヶ月（Ｃ）において一連の生検を採取した。ｍｉＲ−２０８ｂ（上のパネル）及びｍｉＲ−４９９（下のパネル）の発現レベルは、ｍｉＲ−３７０（右のパネル）及び低分子ＲＮＡ  ＲＮＵ６６（左のパネル）の発現に対して基準化した。患者２０、２１、２５及び３４はβ遮断薬処置に反応したが、患者１０３はこの処置に反応しなかった。
【図１６】β遮断薬で処置したヒト患者におけるｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｇの発現。β遮断薬で処置した患者からの試料に対してＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。末期心不全（Ａ）、処置後３ヶ月（Ｂ）及び処置後１２ヶ月（Ｃ）において一連の生検を採取した。ｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｇの発現レベルは、ｍｉＲ−３７０（右のパネル）及び低分子ＲＮＡ  ＲＮＵ６６（左のパネル）の発現に対して基準化した。患者２０、２１、２５及び３４はβ遮断薬処置に反応したが、患者１０３はこの処置に反応しなかった。
【図１７】（図１７Ａ）ｍｉＲ−９２ａはＰＫＣεを標的とする。ｍｉＲ−９２ａ模倣物、ｍｉＲ−９２ａインヒビター、又はスクランブル対照配列をトランスフェクトしたラット新生仔心筋細胞のウエスタンブロット解析。ＰＫＣε（ｎ＝２）を探索したブロット。ローディング対照としてカルネキシン発現を用いた。（図１７Ｂ）ｍｉＲ−９２ａはＰＤＥ１Ａを標的とする。ｍｉＲ−９２ａ模倣物、ｍｉＲ−９２ａインヒビター、又はスクランブル対照配列をトランスフェクトしたラット新生仔心筋細胞のウエスタンブロット解析。ＰＤＥ１Ａ（ｎ＝ｌ）を探索したブロット。ローディング対照としてカルネキシン発現を用いた。
【図１８】（図１８Ａ）ｍｉＲ−１３３ｂはカルモジュリンを標的とする。ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物、ｍｉＲ−１３３ｂインヒビター、又はスクランブル対照配列をトランスフェクトしたラット新生仔心筋細胞におけるカルモジュリンのｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ解析。カルモジュリン発現レベルは、１８Ｓリボソームサブユニットの発現レベルに対して基準化した。ｎ＝３。（図１８Ｂ）ｍｉＲ−１３３ｂはカルモジュリンを標的とする。カルモジュリン３’ＵＴＲに結合したルシフェラーゼコード領域を含む構築物と共に、ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物、ｍｉＲ−１３３ｂインヒビター、又はスクランブル対照配列を共トランスフェクトしたラット新生仔心筋細胞におけるルシフェラーゼ活性。ｎ＝３。（図１８Ｃ）ｍｉＲ−１３３ｂはカルモジュリンを標的とする。ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物、ｍｉＲ−１３３ｂインヒビター、又はスクランブル対照配列をトランスフェクトしたラット新生仔心筋細胞のカルモジュリンについてのウエスタンブロット解析。ローディング対照としてカルネキシン発現を用いた。ｎ＝３。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
本発明は、ある部分、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の特定のサブセットの発現が、健常心と不全心とで異なるという発見に基づく。興味深いことに、あるｍｉＲＮＡは、特発性拡張型心筋症又は虚血性心筋症などの特有のタイプの不全心においてアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされる。このような発現の異なるｍｉＲＮＡは、新規の心不全バイオマーカー並びに心不全の有効な治療を開発するための標的を提供する。従って、本発明は、被験者において心不全を診断又は予後予測する方法を提供する。被験者において心不全を治療又は予防する方法も提供される。
【００２１】
ｍｉＲＮＡは、約１８〜約２５ヌクレオチド長、特に約２１〜約２２ヌクレオチド長の低分子の非コードＲＮＡであり、それより大きい前駆体に由来する。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの配列が完全に相補的であるときにはその分解を促進することによって、又はその配列がミスマッチを含むときには翻訳を阻害することによって、そのリプレッサーとして働く。
【００２２】
ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ；Qi et al. (2006) Cellular & Molecular Immunology Vol. 3:411-419を参照）によって転写され、タンパク質コード遺伝子のイントロンか、又は複数の密接に関連するｍｉＲＮＡをコードすることの多いポリシストロン性の転写産物からの個別のｍｉＲＮＡ遺伝子に由来し得る。ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩ又はｐｏｌ  ＩＩＩによるｍｉＲＮＡ遺伝子の転写によって初期転写産物が生じ、これは一次ｍｉＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と称され、概して数千塩基長である。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは核内でＲＮａｓｅのDroshaによるプロセシングを受け、その結果、７０〜１００ヌクレオチドのヘアピン形状の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が生じる。ヘアピンｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、細胞質に輸送された後、さらにDicerによるプロセシングを受けて二本鎖ｍｉＲＮＡを産生する。次に、成熟ｍｉＲＮＡ鎖はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、そこでその標的ｍＲＮＡと、塩基対の相補性によって結合する。ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡ標的と完全な塩基対を形成する比較的まれな例では、ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡの分解を促進する。より一般的には、ｍｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡと不完全なヘテロ二本鎖を形成し、これがｍＲＮＡの翻訳に影響を与える。「シード」領域と称されるｍｉＲＮＡの塩基２〜８位にわたる５’部分は、標的認識に特に重要である（Krenz and Robbins (2004) J. Am. Coll. Cardiol, Vol. 44:2390-2397；Kiriazis and Kranias (2000) Annu. Rev. Physiol, Vol. 62:321-351）。シード配列は、標的配列の系統発生的保存と共に、現行の標的予測モデルの多くの基礎をなしている。
【００２３】
本発明は、被験者から採取された生体試料中の特定のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することにより、被験者において心不全を診断又は予後予測する方法を提供する。本明細書で使用されるとき、用語「心不全」は、広義に、心臓の血液拍出能力を低下させる任意の病態を指す。結果として、組織にうっ血及び浮腫が生じる。心不全は、冠動脈の血流が減少した結果として心筋層の収縮能が低下することによって引き起こされる場合が最も多い；しかしながら、心不全は、心臓弁の損傷、ビタミン欠乏、及び原発性心筋疾患を含む他の多くの要因によっても起こり得る。
【００２４】
本発明の一実施形態において、本方法は、被験者からの生体試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することと；前記生体試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを、標準試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルと比較することとを含み、ここで、前記標準試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルと比較した前記生体試料における少なくとも１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルの差が、心不全の診断又は予後の指標となる。生体試料としては、限定はされないが、血液試料、血清試料、血漿試料、及び組織試料を挙げることができる。好ましい実施形態において、生体試料は心筋組織（例えば、心耳、心内膜心筋生検等）である。「標準試料」とは、疾患のない状態、特に、心不全又は任意の他の関連病態がない状態（すなわち、健常な状態）を代表する試料を指す。例として、標準試料は心筋組織などの生体試料であってもよく、診断又は予後の提供を受ける被験者と同様の年齢の健常被験者から採取される。標準試料は複合試料であってもよく、ここでは数人の健常被験者（すなわち、心不全の症状のない対照被験者）の生体試料から得られたデータが平均され、それによって複合試料が作成される。
【００２５】
試料中のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する方法は、当業者に公知である。かかる方法としては、逆転写酵素ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、ノーザンブロッティング、及びマイクロアレイ解析が挙げられる。本発明の別の実施形態において、本方法は、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知；配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（ｕａｕｕｇｃａｃｕｃｇｕｃｃｃｇｇｃｃｕｃｃ；配列番号４８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ（ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｇｕｕｇｕｇｕｇｇｕｕ；配列番号４９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ（ｕｇａｇｇｕａｇｇａｇｇｕｕｇｕａｕａｇｕｕ；配列番号５０）、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｕｕｕｇｕａｃａｇｕｕ；配列番号５１）からなる群から選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することを含む。別の実施形態において、１つ又は複数のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）から選択される。さらに別の実施形態において、１つ又は複数のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知；配列番号１６）から選択される。
【００２６】
本発明の別の実施形態において、本方法は、前記標準試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルと比較した前記生体試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルに基づき、心不全のタイプを診断することをさらに含み、ここで１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルは、虚血性心筋症又は特発性拡張型心筋症の診断の指標となる。本明細書で使用されるとき、「特発性拡張型心筋症」（ＩＤＣ）は、原因不明の収縮性障害を伴う、左心室、右心室、又は双方の心室の拡張として定義される。ＩＤＣは拡張型心筋症の一般的な形態であり、心不全の症状を生じる。ＩＤＣでは、顕性うっ血性心不全は認められることも、又は認められないこともあって、不整脈が一般的であり、及び予後は不良であることが多い。「虚血性心筋症」（ＩＳＣ）は、本明細書で使用されるとき、多くの場合に冠動脈疾患が原因となって心筋層に十分な酸素が供給されないことにより心臓の筋肉が弱った患者を指す。ＩＳＣはうっ血性心不全の一般的な原因であり、この病態を有する患者は、心発作、アンギナ、又は不安定狭心症をかつて経験したことが考えられる。ＩＳＣは、米国で最もよく見られるタイプの心筋症である；およそ１００人に１人がＩＳＣに罹患し、最も多くは中年から老年の男性である。
【００２７】
ＩＤＣ又はＩＳＣの診断に有用な１つ又は複数のｍｉＲＮＡとしては、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）；ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知；配列番号１６）；ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）が挙げられる。
【００２８】
本発明はまた、被験者において心不全又は心不全に関連した疾患若しくは病態を治療又は予防する方法も提供する。一実施形態において、本方法は、治療有効量のｍｉＲＮＡ模倣物又はｍｉＲＮＡインヒビターを、被験者の心臓細胞に投与することを含む。「治療有効量」は、心不全の少なくとも１つの症状を寛解させるか、又は予防するのに十分な量である。心不全の症状としては、限定はされないが、呼吸困難、起坐呼吸、眩暈、錯乱、発汗、末梢性浮腫、腹水、肝腫大、疲労、悪心、心拍数の増加、及び肺水腫が挙げられる。
【００２９】
別の実施形態において、本方法は、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知；配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（ｕａｕｕｇｃａｃｕｃｇｕｃｃｃｇｇｃｃｕｃｃ；配列番号４８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ（ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｇｕｕｇｕｇｕｇｇｕｕ；配列番号４９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ（ｕｇａｇｇｕａｇｇａｇｇｕｕｇｕａｕａｇｕｕ；配列番号５０）、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｕｕｕｇｕａｃａｇｕｕ；配列番号５１）からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの１つ又は複数のｍｉＲＮＡ模倣物又はｍｉＲＮＡインヒビターを投与することを含む。
【００３０】
「ｍｉＲＮＡ模倣物」は、ｍｉＲＮＡの発現及び／又は機能を増強させるために用いられる薬剤である。ｍｉＲＮＡ模倣物はまた、天然ｍｉＲＮＡの機能を増強、補足、又は代替することもできる。一実施形態において、ｍｉＲＮＡ模倣物は、成熟ｍｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドであり得る。別の実施形態において、ｍｉＲＮＡ模倣物は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドであり得る。ｍｉＲＮＡ模倣物は、ロックド核酸、ペプチド核酸などの化学修飾、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）修飾、２’−フルオロ修飾、及び４’チオ修飾などの糖修飾、並びに、１つ又は複数のホスホロチオエート結合、モルホリノ結合、又はホスホノカルボキシレート結合などの骨格修飾を含み得る。特定のｍｉＲＮＡ模倣物は、Dharmacon（Lafayette, CO）及びAmbion, Incなどの企業から市販されている。
【００３１】
ある実施形態において、ｍｉＲＮＡ模倣物は、インビボでベクターから発現させてもよい。「ベクター」は、目的の核酸を細胞内部に送達するために用いることができる物質の組成物である。数々のベクターが当該技術分野において公知であり、限定はされないが、線状ポリヌクレオチド、イオン化合物又は両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが挙げられる。従って、用語「ベクター」は、自己複製プラスミド又はウイルスを含む。ウイルスベクターの例としては、限定はされないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。発現構築物は生細胞中で複製させることができ、又は合成によって作製することもできる。本願の目的上、用語「発現構築物」、「発現ベクター」、及び「ベクター」は、本発明の適用を一般的で例示的な意味で示すために同義的に用いられ、本発明を限定する意図はない。
【００３２】
一実施形態において、ｍｉＲＮＡ模倣物を発現させるための発現ベクターは、特定のｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと「作動可能に連結された」プロモーターを含む。語句「作動可能に連結された」又は「転写調節下にある」は、本明細書で使用されるとき、そのプロモーターがＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチドの発現を制御するのに、ポリヌクレオチドに対して正しい位置及び向きにあることを意味する。ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、一次マイクロＲＮＡ配列（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）、前駆体マイクロＲＮＡ配列（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）又は成熟ｍｉＲＮＡ配列をコードし得る。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）の配列を含む。特定のｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、約１８〜約２０００ヌクレオチド長、約７０〜約２００ヌクレオチド長、約２０〜約５０ヌクレオチド長、又は約１８〜約２５ヌクレオチド長であり得る。他の実施形態において、特定のｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、イントロンをコードする核酸若しくはｍＲＮＡの非翻訳領域をコードする核酸又は非コードＲＮＡに位置する。
【００３３】
ある実施形態において、ｍｉＲＮＡ模倣物は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知；配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）の配列を含む。好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡ模倣物は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）の配列を含む。
【００３４】
「ｍｉＲＮＡインヒビター」は、ｍｉＲＮＡ機能を配列特異的な形で阻害する薬剤である。一実施形態において、ｍｉＲＮＡインヒビターはアンタゴmir（antagomir）である。「アンタゴmir」は、ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも部分的に相補的な、化学修飾された一本鎖のリボヌクレオチドであり、Kruetzfeldt及び共同研究者ら（Kruetzfeldt et al. (2005) Nature, Vol. 438:685-689）によって初めて記載された。アンタゴmirは、１つ又は複数の修飾ヌクレオチド、例えば２’−Ｏ−メチル−糖修飾を含み得る。ある実施形態において、アンタゴmirは修飾ヌクレオチドのみを含む。アンタゴmirはまた、１つ又は複数のホスホロチオエート結合を含み、結果として部分的又は完全なホスホロチオエート骨格を作り得る。インビボでの送達及び安定性を促進するため、アンタゴmirはその３’末端でコレステロール部分と結合させてもよい。ｍｉＲＮＡの阻害に好適なアンタゴmirは、約１５〜約５０ヌクレオチド長、より好ましくは約１８〜約３０ヌクレオチド長、及び最も好ましくは約２０〜約２５ヌクレオチド長であり得る。「部分的に相補的な」とは、標的ポリヌクレオチド配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的な配列を指す。アンタゴmirは、成熟ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的であり得る。ある実施形態において、アンタゴmirは、成熟ｍｉＲＮＡ配列と１００％相補的である。
【００３５】
別の実施形態において、ｍｉＲＮＡインヒビターは、成熟ｍｉＲＮＡ配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドからなり得る。ある実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の「ロックド核酸（locked nucleic acid)」からなり得る。「ロックド核酸」（ＬＮＡ）は、リボース糖部分の２位と４位との炭素間に追加的な架橋を含む修飾リボヌクレオチドであり、結果としてＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドに熱的安定性の亢進をもたらす「ロックされた」コンホメーションを作る。或いは、アンチセンスオリゴヌクレオチドはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含んでもよく、これは糖リン酸骨格ではなく、ペプチドベースの骨格を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドが含み得る他の化学修飾としては、限定はされないが、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）修飾、２’−フルオロ修飾、及び４’チオ修飾などの糖修飾、並びに、１つ又は複数のホスホロチオエート結合、モルホリノ結合、又はホスホノカルボキシレート結合などの骨格修飾が挙げられる（例えば、米国特許第６，６９３，１８７号及び同第７，０６７，６４１号を参照、これらは全体として参照により本明細書に援用される）。ある実施形態において、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’末端及び３’末端の双方に２’−Ｏ−メトキシエチル修飾リボヌクレオチドを含み、少なくとも１０個のデオキシリボヌクレオチドを中央に有する２’−Ｏ−メトキシエチル「ギャップマー（gapmer）」である。このような「ギャップマー」は、ＲＮＡ標的のＲＮａｓｅ  Ｈ依存性分解機序を開始させる能力を有する。安定性を亢進し、且つ効力を向上させるためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾、例えば、全体として参照により本明細書に援用される米国特許第６，８３８，２８３号に記載されるものは、当該技術分野において公知であり、本発明の方法における使用に好適である。ｍｉＲＮＡの活性を阻害するのに有用な好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１９〜約２５ヌクレオチド長である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも部分的に相補的な、例えば成熟ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的な配列を含み得る。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列と１００％相補的な配列を含む。
【００３６】
ある実施形態において、ｍｉＲＮＡインヒビターは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、又はｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）と相補的な配列を含む。好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡインヒビターは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）と相補的な配列を含む。
【００３７】
さらに別の実施形態において、ｍｉＲＮＡインヒビターは、成熟ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも部分的な配列同一性を有する阻害性ＲＮＡ分子である。阻害性ＲＮＡ分子は、二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）か、又はステム−ループ構造を含むショートヘアピンＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）であり得る。阻害性ＲＮＡ分子の二本鎖領域は、成熟ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含み得る。ある実施形態において、阻害性ＲＮＡ分子の二本鎖領域は、標的ｍｉＲＮＡ配列と１００％の同一性を含み得る。阻害性ＲＮＡ分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、又はｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）と少なくとも部分的な配列同一性を有する配列を含み得る。
【００３８】
ｍｉＲＮＡインヒビターは、インビボで発現ベクターから産生してもよい。一実施形態において、ｍｉＲＮＡインヒビターを発現させるための発現ベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターを含み、ここで発現したアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、成熟ｍｉＲＮＡ配列と相補的である。別の実施形態において、ｍｉＲＮＡインヒビターを発現させるための発現ベクターは、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された１つ又は複数のプロモーターを含み、ここで発現したｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡ配列と同一の、又は実質的に同一の配列を含む。「実質的に同一」とは、標的ポリヌクレオチド配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を指す。
【００３９】
本発明の別の実施形態では、被験者において心不全又は心不全に関連した疾患若しくは病態を治療又は予防する方法は、被験者に第２の心臓治療薬を投与することをさらに含む。心臓治療法は、心不全又は心不全に関連した疾患若しくは病態の１つ又は複数の症状を治療するために典型的に用いられる任意の治療薬を包含する。第２の心臓治療薬としては、限定なしに、いわゆる「β遮断薬」、降圧薬、強心薬、抗血栓薬、血管拡張薬、ホルモン拮抗薬、変力作用薬、利尿薬、エンドセリン受容体拮抗薬、カルシウムチャネル遮断薬、ホスホジエステラーゼ阻害薬、ＡＣＥ阻害薬、アンジオテンシン２型拮抗薬及びサイトカイン遮断薬／阻害薬、ＨＤＡＣ阻害薬、並びにヒストンアセチル化転移酵素（ＨＡＴ）モジュレーターを挙げることができる。一実施形態において、第２の心臓治療薬は、強心薬、神経液性遮断薬、アルドステロン拮抗薬、利尿薬、血管拡張薬、エンドセリン受容体拮抗薬、又はＨＤＡＣ阻害薬である。
【００４０】
「強心薬」は、筋収縮の力又はエネルギーを増加又は減少させる薬剤、特に、心筋収縮能の強度を増加させる薬物を指す。陽性強心薬としては、カルシウム；カルシウムセンシタイザーのレボシメンダン；強心配糖体のジゴキシン；カテコールアミン、例えば、ドーパミン、ドブタミン、ドペキサミン、エピネフリン、イソプロテレノール、及びノルエピネフリン；並びにホスホジエステラーゼ阻害薬、例えば、エノキシモン、ミルリノン、及びテオフィリンを挙げることができる。陰性強心薬としては、βアドレナリン作動性遮断薬、例えば、ラベタロール及びカルベジロール；並びにカルシウムチャネル遮断薬、例えば、ジルチアザム及びベラパミルが挙げられる。
【００４１】
「神経液性遮断薬」とは、神経液性反応を遮断する薬物を指し、βアドレナリン作動性遮断薬、例えば、ビソプロロール、カルベジロール、及びメトプロロール；並びにアンジオテンシン変換酵素阻害薬、例えば、エナラプリル、リシノプリル、ラミプリル、及びカプトプリルが挙げられる。
【００４２】
「利尿薬」とは、体液貯留、並びに、足、下腿及び腹部の腫脹に処方される薬物を指す。利尿薬は、腎臓を促して血液からより多くのナトリウム及び水をろ過させる。体内の体液が少なくなると、心臓はより小さい仕事量で血液を拍出し、循環させることができる。加えて、利尿薬は、肺、足首、下腿及び他の体の一部における体液貯留を減少させることができる。利尿薬としては、例えば、フロセミド、ブメタニド、メトラゾン、スピロノラクトン、及びエプレレノンが挙げられる。
【００４３】
「アルドステロン拮抗薬」とは、ミネラルコルチコイド受容体にあるアルドステロンの作用に拮抗する薬物を指す。この薬物群は、慢性心不全を管理するための補助治療薬として、他の薬物と組み合わせて用いられることが多い。アルドステロン拮抗薬としては、例えば、スピロノラクトン及びエプレレノンが挙げられる。
【００４４】
「血管拡張薬」とは、血管を拡張する、すなわちその直径を増加させる薬物を指す。血管拡張薬としては、例えば、ヒドララジン、硝酸イソソルビド及び一硝酸イソソルビド、カプトプリル並びにより長時間持続性の薬剤、例えば、メタミン、パベリル（paveril）、ニトログリン及びペリトレートが挙げられる。
【００４５】
エンドセリン（ＥＴ）は、２１アミノ酸のペプチドであり、心不全の発症に関与すると思われる強力な生理学的及び病態生理学的作用を有する。ＥＴの作用は、２つの細胞表面受容体クラスとの相互作用によって媒介される。Ａ型受容体（ＥＴ−Ａ）は血管収縮及び細胞成長に関連し、一方、Ｂ型受容体（ＥＴ−Ｂ）は内皮細胞媒介性の血管拡張及びアルドステロンなどの他の神経ホルモンの放出に関連する。ＥＴの産生、又はその関連する細胞を刺激する能力のいずれかを阻害することのできる薬理作用剤は、当該技術分野において公知である。ＥＴの産生の阻害には、活性ペプチドをその前駆体からプロセシングすることに関与する、エンドセリン変換酵素と称される酵素を遮断する薬剤の使用が関わる。ＥＴの細胞刺激能の阻害には、ＥＴのその受容体との相互作用を遮断する薬剤の使用が関わる。エンドセリン受容体拮抗薬（ＥＲＡ）の非限定的な例としては、ボセンタン、エンラセンタン、アンブリセンタン、ダルセンタン、テゾセンタン、アトラセンタン、アボセンタン、クラゾセンタン、エドネンタン、シタクスセンタン、ＴＢＣ  ３７１１、ＢＱ  １２３、及びＢＱ  ７８８が挙げられる。
【００４６】
第２の心臓治療薬は、被験者に対し、ｍｉＲＮＡ模倣物又はｍｉＲＮＡインヒビターと（例えば同時に）併用投与されてもよい。或いは、第２の心臓治療薬は、ｍｉＲＮＡ模倣物又はｍｉＲＮＡインヒビターの前又は後に投与されてもよい。ｍｉＲＮＡ模倣物又はｍｉＲＮＡインヒビターの投与と第２の心臓治療薬の投与との間の時間間隔は、数分から数週間の範囲であり得る。ある実施形態において、２つの治療薬は、互いに１２〜２４時間以内に、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に、及び最も好ましくは互いに約１２時間以内に投与され得る。ある状況において、治療期間の大幅な延長が望ましいこともあるが、しかしながら、各投与の間に経過するのは、数日間（２、３、４、５、６又は７日間）から数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８週間）である。
【００４７】
本発明はまた、被験者において心不全又は心不全に関連した疾患若しくは病態を治療又は予防する方法も包含し、この方法は、被験者に医薬組成物を投与することを含み、ここで前記医薬組成物は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ模倣物又は少なくとも１つのｍｉＲＮＡインヒビターと、薬学的に許容可能な担体とを含む。一実施形態において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ模倣物又は少なくとも１つのｍｉＲＮＡインヒビターは、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知；配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（ｕａｕｕｇｃａｃｕｃｇｕｃｃｃｇｇｃｃｕｃｃ；配列番号４８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ（ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｇｕｕｇｕｇｕｇｇｕｕ；配列番号４９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ（ｕｇａｇｇｕａｇｇａｇｇｕｕｇｕａｕａｇｕｕ；配列番号５０）、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｕｕｕｇｕａｃａｇｕｕ；配列番号５１）からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの１つ又は複数の模倣物又はインヒビターである。本医薬組成物は、上記のとおりの心不全の治療に典型的に処方される第２の心臓治療薬を含み得る。一実施形態において、本医薬組成物は、強心薬、神経液性遮断薬、アルドステロン拮抗薬、利尿薬、血管拡張薬、エンドセリン受容体拮抗薬、又はＨＤＡＣ阻害薬のうちの１つ又は複数をさらに含む。
【００４８】
別の実施形態において、本医薬組成物は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ模倣物を含み、ここで前記ｍｉＲＮＡ模倣物は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知；配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）の配列を含む。なお別の実施形態において、本医薬組成物は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡインヒビターを含み、ここで前記ｍｉＲＮＡインヒビターは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、又はｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）と相補的な配列を含む。
【００４９】
本医薬組成物は、本明細書に記載されるいずれの使用についても、任意の好適な手段によって、例えば、錠剤、カプセル、顆粒又は粉末などの形態で経口的に；舌下に；頬側に；皮下、静脈内、筋内、又は嚢内注射又は注入技術によるなどして（例えば、無菌注射用の水溶性又は非水溶性の溶液又は懸濁液として）非経口的に；吸入スプレーなどによる鼻粘膜への投与を含め、経鼻的に；クリーム又は軟膏などの形態で局所的に；又は坐薬などの形態で経直腸的に；非毒性の薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含有する投薬単位製剤で投与することができる。本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体」とは、医薬品、例えばヒトへの投与に好適な医薬品の製剤化に使用することが許容される溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗細菌薬及び抗真菌薬、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。
【００５０】
ｍｉＲＮＡインヒビター又はｍｉＲＮＡ模倣物を含む医薬組成物はまた、カテーテルシステム又は心臓に治療剤を送達するため冠動脈循環を隔離するシステムによって投与されてもよい。心臓及び冠血管系に治療剤を送達するための様々なカテーテルシステムが当該技術分野において公知である。本発明で使用するのに好適なカテーテルに基づく送達方法又は冠動脈の隔離方法のいくつかの非限定的な例は、米国特許第６，４１６，５１０号；米国特許第６，７１６，１９６号；米国特許第６，９５３，４６６号、国際公開第２００５／０８２４４０号、国際公開第２００６／０８９３４０号、米国特許出願公開第２００７／０２０３４４５号、米国特許出願公開第２００６／０１４８７４２号、及び米国特許出願公開第２００７／００６０９０７号に開示され、これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される。ｍｉＲＮＡ模倣物又はｍｉＲＮＡインヒビターは、例えば、即時放出又は持続放出に好適な形態で投与することができる。即時放出又は持続放出は、ｍｉＲＮＡ模倣物若しくはｍｉＲＮＡインヒビターを含む好適な医薬組成物を使用することによって、又は、特に持続放出の場合には、皮下インプラント若しくは浸透圧ポンプなどの装置を使用することによって、実現することができる。
【００５１】
コロイド分散システム、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、並びに、水中油乳剤、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースの系が、ｍｉＲＮＡ模倣物又はｍｉＲＮＡインヒビター用の送達媒体として用いられ得る。本発明の核酸を心臓組織及び骨格筋組織に送達するのに好適な市販の脂肪乳剤としては、Intralipid（登録商標）、Liposyn（登録商標）、Liposyn（登録商標）II、Liposyn（登録商標）III、Nutrilipid、及び他の同様の脂質乳剤が挙げられる。インビボでの送達媒体として使用するのに好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。かかる系の調製及び使用は、当該技術分野において周知である。例示的製剤は、米国特許第５，９８１，５０５号；米国特許第６，２１７，９００号；米国特許第６，３８３，５１２号；米国特許第５，７８３，５６５号；米国特許第７，２０２，２２７号；米国特許第６，３７９，９６５号；米国特許第６，１２７，１７０号；米国特許第５，８３７，５３３号；米国特許第６，７４７，０１４号；及び国際公開第０３／０９３４４９号にも開示され、これらは全体として参照により本明細書に援用される。
【００５２】
経口投与用の例示的組成物としては、例えば、バルク性を与えるための微結晶性セルロース、懸濁剤としてのアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてのメチルセルロース、及び当該技術分野において公知のものなどの甘味料又は香味剤を含有し得る懸濁液；並びに、例えば、微結晶性セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム及び／又はラクトース及び／又は当該技術分野において公知のものなどの他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤及び潤滑剤を含有し得る即時放出性錠剤が挙げられる。ｍｉＲＮＡ模倣物及びｍｉＲＮＡインヒビターはまた、舌下投与及び／又は頬側投与によって口腔を介して送達することもできる。成形錠剤、圧縮錠剤又は凍結乾燥錠剤が、用いられ得る例示的形態である。例示的組成物としては、本化合物を、マンニトール、ラクトース、スクロース及び／又はシクロデキストリンなどの速溶性希釈剤と共に製剤化するものが挙げられる。かかる製剤のなかには、セルロース（アビセル）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子量賦形剤も含まれ得る。かかる製剤はまた、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＳＣＭＣ）、無水マレイン酸コポリマー（例えば、Gantrez）などの粘膜付着を促進する賦形剤、及びポリアクリル酸コポリマー（例えばCarbopol 934）などの放出を制御するための薬剤も含むことができる。潤滑剤、流動促進剤、香料、着色剤及び安定剤も、製造及び使用を容易にするため添加され得る。
【００５３】
経鼻エアロゾル又は吸入投与用の例示的組成物としては、例えば、ベンジルアルコール若しくは他の好適な防腐剤、バイオアベイラビリティを亢進するための吸収促進剤、及び／又は当該技術分野において公知のものなどの他の可溶化剤又は分散剤を含有し得る生理食塩水中の溶液が挙げられる。
【００５４】
非経口投与用の例示的組成物としては、例えば、マンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、又は他の好適な分散剤若しくは湿潤剤及び合成モノグリセリド若しくはジグリセリドを含む懸濁剤などの、非経口的に許容可能な非毒性の好適な希釈剤又は溶媒、並びに、オレイン酸を含む脂肪酸又はCremaphorを含有し得る注射用溶液又は懸濁液が挙げられる。
【００５５】
直腸投与用の例示的組成物としては、例えば、カカオバター、合成グリセリドエステル又はポリエチレングリコールなどの、常温では固体だが、直腸腔内で液化及び／又は溶解して薬物を放出する好適な非刺激性賦形剤を含有し得る坐薬が挙げられる。局所投与用の例示的組成物としては、Plastibase（ポリエチレンでゲル化した鉱油）などの局所用担体が挙げられる。
【００５６】
任意の特定の被験者についての具体的な用量レベル及び投薬頻度は、用いられる特定の化合物（例えば、特定のｍｉＲＮＡ模倣物又はｍｉＲＮＡインヒビター）の活性、当該化合物の代謝安定性及び作用時間、被験者の人種、年齢、体重、全般的な健康状態、性別及び食生活、投与様式及び投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、並びに特定の病態の重症度を含む様々な要因によって異なってもよく、及び異なるであろうことは理解されるであろう。
【００５７】
本発明はまた、細胞における胎児心臓遺伝子プログラム（ＦＧＰ）の再活性化を調節する方法も企図する。一実施形態において、本方法は、心臓細胞に１つ又は複数のｍｉＲＮＡインヒビター又はｍｉＲＮＡ模倣物を提供することを含み、ここで１つ又は複数のｍｉＲＮＡインヒビター又はｍｉＲＮＡ模倣物は、胎児心臓遺伝子プログラムの少なくとも１つのマーカーの発現を調整する。用語「心臓細胞」とは、心筋細胞及び／又は心臓内皮細胞を指す。本発明の特定の実施形態に従えば、この用語は、心臓線維芽細胞及び／又は心臓内に存在する他の細胞型、例えば平滑筋細胞（例えば、心臓血管壁内の）、心臓神経のニューロン及びグリア細胞等を含む。胎児心臓遺伝子プログラム（ＦＧＰ）の再活性化は、肥大心及び不全心に特有の特徴であり、心機能障害及び予後不良と相関がある（Kuwahara et ah, 2003, EMBO J. 22 (23): 6310-6321）。ＦＧＰの活性化を反映してその発現が心不全で変化し、疾患の進行に悪影響を及ぼし得るマーカー遺伝子には、βミオシン重鎖（βＭｙＨＣ）、αミオシン重鎖（αＭｙＨＣ）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、ＳＥＲＣＡ２ａ、及び骨格筋α-アクチン（Ｓｋ  α−アクチン）がある。ある実施形態において、胎児心臓プログラムの少なくとも１つのマーカーの発現が調整され、ここで胎児心臓遺伝子プログラムの少なくとも１つのマーカーは、βＭｙＨＣ、αＭｙＨＣ、ＡＮＦ、ＢＮＰ、ＳＥＲＣＡ２ａ、及び骨格筋α-アクチンからなる群から選択される。
【００５８】
ＦＧＰの再活性化の調節に使用するのに好適なｍｉＲＮＡインヒビター又はｍｉＲＮＡ模倣物としては、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知；配列番号１６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（ｕａｕｕｇｃａｃｕｃｇｕｃｃｃｇｇｃｃｕｃｃ；配列番号４８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ（ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｇｕｕｇｕｇｕｇｇｕｕ；配列番号４９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ（ｕｇａｇｇｕａｇｇａｇｇｕｕｇｕａｕａｇｕｕ；配列番号５０）、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（ｕｇａｇｇｕａｇｕａｇｕｕｕｇｕａｃａｇｕｕ；配列番号５１）からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの１つ又は複数のｍｉＲＮＡインヒビター又はｍｉＲＮＡ模倣物が挙げられる。一実施形態において、１つ又は複数のｍｉＲＮＡインヒビター又はｍｉＲＮＡ模倣物は、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）の模倣物又はインヒビターである。
【００５９】
本発明はまた、被験者において心不全の治療をモニタする方法も企図する。一実施形態において、本方法は、第１の時点で被験者から第１の生体試料を採取することであって、第１の時点が心不全の薬物治療プロトコルの開始前である、ことと；第２の時点で被験者から第２の生体試料を採取することであって、第２の時点が心不全の薬物治療プロトコルの開始後である、ことと；第１の生体試料及び第２の生体試料を、ｍｉＲＮＡ配列解析、ｍＲＮＡ配列解析及び標的プロテオーム発現解析によって処理することと；第１の生体試料からのｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びタンパク質の発現データを、第２の生体試料からの発現データと比較して、薬物治療プロトコルの有効性の指標となる遺伝子発現パターンの変化を測定すること、とを含む。第１の時点と第２の時点との間隔は、約３〜約１８ヶ月、約３〜約１２ヶ月、又は好ましくは約３〜約９ヶ月であってもよい。薬物治療プロトコルの開始後いくつかの時点で、各患者から追加の生体試料が採取されてもよい。ある実施形態において、薬物治療プロトコルの開始後２つ以上の試料が採集される。他の実施形態において、薬物治療プロトコルの開始後３つ以上の試料が採集される。試料は、約３ヶ月毎、約６ヶ月毎、約９ヶ月毎、又は約１２ヶ月毎に採集されてもよい。
【００６０】
被験者の治療に用いられる薬物治療プロトコルは、ＡＣＥ阻害薬（例えば、カプトプリル、リシノプリル等）、β遮断薬（例えば、メトプロロール、カルベジロール）、アルドステロン拮抗薬、利尿薬（例えば、フロセミド、スピロラクトン、エプレレノン）、及びジゴキシンなどの、心不全を治療するための任意の標準的な薬物治療プロトコルであってよい。薬物治療プロトコルはまた、本明細書に開示される１つ又は複数のｍｉＲＮＡ模倣物又はｍｉＲＮＡインヒビターを投与することを含む治療方法のいずれであってもよい。薬物治療の投薬量又はタイプは、処置後の１つ又は複数の時点で得られた発現プロファイルデータに基づき調整され得る。本発明の方法は、特定の患者において心不全を治療するための特定の薬物治療レジメンの作成を可能とする。
【００６１】
本発明は以下のさらなる実施例によってさらに説明され、この実施例は限定と見なされてはならない。本願全体を通じて引用される全ての参考文献、特許、及び公開された特許出願の内容、並びに図は、全体として参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【００６２】
実施例
実施例１．ｍｉＲＮＡは、ヒトの不全心と非不全心とで発現が異なる。
アレイベースの技術を用いて、心臓由来のｍｉＲＮＡの発現レベルを、ヒトの非不全（ＮＦ）心及び不全心由来のヒト心臓組織において比較した。不全心としては、特発性拡張型心筋症（ＩＤＣ）及び虚血性心筋症（ＩＳＣ）から生じたものを含んだ。４７０個のマイクロＲＮＡ（Sanger miRBase Release 9.0）のバイオインフォマティクス解析を使用して、非不全心と不全心との対比において発現の異なる多数のｍｉＲＮＡを同定した。特定のｍｉＲＮＡの発現の増加又は減少のいずれかによって、ｍｉＲＮＡ発現の固有の「フィンガープリント」が明らかとなった。これらのｍｉＲＮＡが、心不全のバイオマーカー、並びに心不全の治療における新規治療標的となる。
【００６３】
ＮＦ心とＩＤＣ心とのｍｉＲＮＡ発現の比較では、図１Ａ及び図２に示されるとおり、２２個のｍｉＲＮＡについて発現の変化が認められ、そのうち６個はＮＦ心と比較してＩＤＣ心において増加し（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−３８２）、及びそのうち１６個はＮＦ心と比較してＩＤＣ心において減少した（ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ）。対象となる成熟ｍｉＲＮＡの配列は表１（下掲）に示され、これらはSanger miRBase ver. 9.2に基づいている。
【００６４】
ＮＦ心とＩＳＣ心とのｍｉＲＮＡ発現の比較では、図１Ｂ及び図２に示されるとおり、２２個のｍｉＲＮＡについて発現の変化が認められ、そのうち６個はＮＦ心と比較してＩＳＣ心において増加し（ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ）、及びＮＦ心と比較してそのうち１６個はＩＳＣ心において減少した（ｈｓａ−ｍｉＲ−９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知）、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９４、及びｌｅｔ−７ｄ）。選択された成熟ｍｉＲＮＡの配列は表１（下掲）に示され、これらはSanger miRBase ver. 9.2に基づいている。
【００６５】
【表１】
2010533503.tif 000002
【００６６】
図３は、ＮＦ対ＩＤＣ及びＮＦ対ＩＳＣについて、ｐ＜０．０５（対応のないｔ検定）のヒト心臓ｍｉＲ発現データの比較を示す。３個のｍｉＲＮＡの発現が、ＩＤＣ心においてＮＦ心を上回って有意に増加し（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５及びｈｓａ−ｍｉＲ−１００）、一方、６個のｍｉＲＮＡの発現が、ＮＦ心と比較してＩＤＣ心において有意に減少した（ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ）。５個のｍｉＲＮＡの発現が、ＩＳＣ心においてＮＦ心を上回って有意に増加し（ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ）、一方、１０個のｍｉＲＮＡの発現が、ＮＦ心と比較してＩＳＣ心において有意に減少した（ｈｓａ−ｍｉＲ−９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８としても公知）、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２２２）。
【００６７】
ｍｉＲＮＡ発現レベルをＮＦ心対ＩＤＣ心とＮＦ心対ＩＳＣ心との間で比較する複合解析の結果、調節が一致するいくつかのｍｉＲＮＡ、並びに心不全サブタイプ特異的な固有の形で調節されるｍｉＲＮＡが示された（図２）。ｍｉＲＮＡのｈｓａ−ｍｉＲ−９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０及びｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂは、ＩＤＣ心及びＩＳＣ心の双方において有意にダウンレギュレーションされ、一方、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５及びｈｓａ−ｍｉＲ−１００は、ＩＤＣ心及びＩＳＣ心の双方においてアップレギュレーションされた。後者の結果は、ヒト不全（ＩＤＣ）心において、並びに機械的又は遺伝的に誘発した病理学的肥大を伴うトランスジェニックマウスにおいても、ｍｉＲ−１９５がアップレギュレーションされることを以前に示したRooij et al, 2006と一致している。
【００６８】
Sanger human miRBase 9.0データセットから検出可能なｍｉＲＮＡの各々の相対的発現の詳細な解析は、完全なデータセットから得た。全ての心臓が、（可能な４５４個のうち）８７〜２３８個の定量的に検出可能なｍｉＲ転写産物を有した（データは示さず）。
【００６９】
具体的方法
マイクロＲＮＡ抽出：６人の非不全（ＮＦ）患者、５人の特発性拡張型心筋症（ＩＤＣ）患者及び５人の虚血性心筋症（ＩＳＣ）患者のヒト心臓の左心室から、ｍｉＲＮＡを抽出した。全ての患者は、５０〜６５歳の男性であった。心臓外植時、患者は、ＡＣＥ阻害薬、利尿薬、β遮断薬、ジギタリス製剤、抗凝固剤、インスリン、β作動薬、及び硝酸薬を含む様々な薬理作用剤を与えられていた。心エコー法により、心臓外植時における各患者の心仕事量を評価した。各群の駆出分画率は以下のとおりであった：ＮＦ：６４±４．３％；ＩＤＣ：１２±３．１％；及びＩＳＣ：１８．６±３．５（平均値±ＳＥＭ）。抽出はmirVana（商標）キット（Ambion）を使用して、製造者の推奨に従い実施した。
【００７０】
配列解析：試料をLC Sciences, LLC, Houston, Texasに提出してmicroRNA Detection Microarray Serviceに供した。バイオインフォマティクス解析を用いて４７０個のマイクロＲＮＡ（Sanger miRBase Release 9.0）の相対的発現を同定した。この解析により、非不全（ＮＦ）心と不全（ＩＳＣ及び／又はＩＤＣ）心との対比において様々に発現の異なるｍｉＲＮＡが同定された。２種類の不全心、特発性拡張型心筋症（ＩＤＣ）を有する患者に由来するもの、又は虚血性心筋症（ＩＳＣ）を有するものを調べた。ＮＦ群では、６つの心臓（ｎ＝６）を調べた。ＮＦ心をＩＤＣ心（ｎ＝５）と比較すると、図１Ａに示されるとおり、１２個のｍｉＲＮＡについて統計的に有意な変化（ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）が認められ、そのうち３個は増加し、そのうち９個は減少した。ＮＦ心とＩＳＣ心（ｎ＝５）との間で同様に解析すると、図１Ｂに示されるとおり、１６個のｍｉＲＮＡの発現の変化が明らかとなり、そのうち５個は増加し、そのうち１１個は減少した。ヒト心臓におけるＮＦをＩＤＣ又はＩＳＣのいずれかと比較したときのｍｉＲ発現のあらゆる有意な変化について、マイクロアレイによる平均したｍｉＲ発現を図２に示す。
【００７１】
ｍｉＲＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲ：TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（ABI）を使用して、製造者の推奨に従いｍｉＲＮＡの逆転写を実施した。簡潔には、５ｎｇのｍｉＲＮＡを、ｄＮＴＰ、MultiScribe逆転写酵素及び標的ｍｉＲＮＡに特異的なプライマーと組み合わせた。得られたｃＤＮＡは１５倍希釈してＰＣＲ反応に使用した。製造者（Applied Biosystems）の推奨に従いＰＣＲを実施した。簡潔には、ｃＤＮＡを標的ｍｉＲＮＡに特異的なTaqManアッセイと組み合わせ、ABI7300を使用してＰＣＲ反応を実施した。
【００７２】
図４は、６人の非不全（ＮＦ）患者、５人の特発性心筋症（ＩＤＣ）患者及び５人の虚血性心筋症（ＩＳＣ）患者のヒト心臓におけるｍｉＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲによる検証を示す。ｍｉＲＮＡ−２４の発現レベルは変化しなかったため、データはこのマイクロＲＮＡに対して基準化した。ＩＤＣ不全心及びＩＳＣ不全心におけるｍｉＲ−９２及びｍｉＲ−１３３ｂの発現が、ＮＦ心と比較したとき有意に減少し、一方、ｍｉＲ−１００及びｍｉＲ−１９５の発現が、ＮＦ心と比較したとき有意に増加した。
【００７３】
ｍｉＲ−１３３ａとｍｉＲ−１３３ｂとは配列が極めて似ているため、ｍｉＲ−１３３ａ又はｍｉＲ−１３３ｂのインヒビター又は模倣物のいずれかを過剰発現させる実験を実施した。ＲＴ−ＰＣＲによって得られたデータから、検出が各ｍｉＲに特異的であったことの確認がとれた。従って、ｍｉＲ−１３３ａの過剰発現は、ｍｉＲ−１３３ｂの存在量が変化することなくｍｉＲ−１３３ａの発現が増加したことを示した。逆の実験の結果からも、同程度の特異性を得た。
【００７４】
実施例２．胎児心臓遺伝子プログラムは、特定のｍｉＲＮＡを制御することによって調整することができる。
胎児心臓遺伝子プログラム（ＦＧＰ）の再活性化は、肥大心及び不全心に特有の特徴であり、心機能障害及び予後不良と相関がある（Kuwahara et al, 2003, EMBO J. 22 (23): 6310-6321）。その発現がＦＧＰ活性化を示していて心不全では変化し、疾患の進行に悪影響を及ぼし得る遺伝子には、心臓のα−ミオシン重鎖（αＭｙＨＣ）、β−ミオシン重鎖（βＭｙＨＣ）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、骨格筋α-アクチン（Ｓｋ  α−アクチン）及びカルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）がある。例えば、βアドレナリン作動性シグナル伝達は、拡張型心筋症の自然歴において重要な役割を果たすことが知られている。心臓が負荷を受ける間にβアドレナリン作動性受容体（β１−ＡＲ及びβ２−ＡＲ）が慢性的に活性化すると、最終的には、遺伝子発現の変化を含む機序によって不全心に害が及ぶ。新生仔ラット心室筋細胞においてβ−ＡＲをイソプロテレノール（βアドレナリン作動性受容体作動薬）で刺激すると、ヒト心臓胎児及び／又は成人遺伝子プロモーターの相対的活性において「胎児（fetal）」反応が生じ、この反応はヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）の活性化を同時に伴うヒト及びラットのαミオシン重鎖（αＭｙＨＣ）プロモーターと、ラットβＭｙＨＣプロモーターとの抑制を含むことが、Sucharov et al., 2006によって以前に示されている（Sucharov et al, 2006, A beta1-adrenergic receptor CaM kinase II-dependent pathway mediates cardiac myocyte fetal gene induction Am J Physiol Heart Circ Physiol 291 : H1299-H1308）。また、ｍＲＮＡの発現によって計測したとき、プロモーターの変化が内在性遺伝子発現の変化と相関することも以前に示されている。
【００７５】
この実施例に記載された実験の目的は、βアドレナリン作動性受容体の刺激の不在下及び存在下における、胎児遺伝子プログラムの活性化に対する特定のｍｉＲＮＡの発現又は阻害の効果を測定することであった。
【００７６】
Amaxaの技術（Amaxa AG、Cologne、独国）を用いて、miRIDIAN（商標）マイクロＲＮＡ模倣物及びインヒビター（Dharmacon）を新生仔ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）にトランスフェクトした。使用したDharmacon模倣物及びインヒビターの製品番号は、以下のとおりである：ｈｓａ−ｍｉＲ−９２模倣物：C-00030-02；ｍｉＲ−９２のSanger配列の二本鎖ｍｉＲＮＡをベースとする；ｈｓａ−ｍｉＲ−９２インヒビター：I-300030-02、ｍｉＲ−９２のSangerベースの配列の一本鎖ｍｉＲＮＡをベースとする：ｕａｕｕｇｃａｃｕｕｇｕｃｃｃｇｇｃｃｕｇｕ（配列番号５）。ｈｓａ−ｍｉＲ−１００模倣物：C-300036-01；ｍｉＲ１００のSanger配列の二本鎖ｍｉＲＮＡをベースとする；ｈｓａ−ｍｉＲ−１００インヒビター：I-300036-01；ｍｉＲ−１００のSangerベースの配列の一本鎖ｍｉＲＮＡをベースとする：ａａｃｃｃｇｕａｇａｕｃｃｇａａｃｕｕｇｕｇ（配列番号７）。ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物：C-300199-01；ｍｉＲ１３３ｂのSanger配列の二本鎖ｍｉＲＮＡをベースとする；ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂインヒビター：I-300199-01；ｍｉＲ１３３ｂのSangerベースの配列の一本鎖ｍｉＲＮＡをベースとする：ｕｕｇｇｕｃｃｃｃｕｕｃａａｃｃａｇｃｕａ（配列番号１９）。
【００７７】
２．４×１０６個のＮＲＶＭを心筋細胞に適切なAmaxa溶液中に懸濁し、２０マイクロモルの模倣物又はインヒビターと加え合わせた。心筋細胞プログラムを用いて細胞を電気穿孔し、その結果、短鎖ＲＮＡについて９５％のトランスフェクション効率が得られた。血清含有培地を細胞に添加した。２４時間後、その培地を無血清培地と交換した。トランスフェクション後７２時間で細胞を回収した。トランスフェクション後４８時間にわたり、細胞のサブセットをβアドレナリン作動薬のイソプロテレノール（１０−７Ｍ）で処置した。
【００７８】
TRIZol（Invitrogen）を使用して回収した細胞からｍＲＮＡを抽出した。iScript（Bio-Rad）を使用して、本質的に製造者によって記載されるとおりにポリＡ含有ｍＲＮＡのｃＤＮＡを調製した。典型的には、０．１ｎｇのｃＤＮＡ、１２．５ｎＭの各プライマー及びPower Syber Green PCR Master Mix（ABI）をＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。反応は、ABI7300システムを使用して実施した。使用したプライマーは、表２（下掲）に示される。実施例１に記載されるとおり、ｍｉＲＮＡ  ｃＤＮＡを合成し、ABIに従いＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。
【００７９】
【表２】
2010533503.tif 000003
【００８０】
上記のとおり、βアドレナリン作動性受容体を受容体作動薬イソプロテレノール（ＩＳＯ）で刺激すると、胎児遺伝子プログラム（ＦＧＰ）が活性化される。ＩＳＯの媒介によるＦＧＰの誘導は、成人遺伝子、α−ミオシン重鎖（αＭｙＨＣ）及びＳＥＲＣＡの発現の抑制、並びに、胎児遺伝子、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、骨格筋α-アクチン及びβ−ミオシン重鎖（βＭｙＨＣ）のアップレギュレーションを呈する。図５は、イソプロテレノールの不在下及び存在下でｍｉＲ−９２模倣物又はｍｉＲ−９２インヒビターをトランスフェクトした新生仔心筋細胞における胎児遺伝子プログラム（ＦＧＰ）の発現を示す。模倣物及びインヒビターをスクランブルしたｍｉＲ（Dharmacon）を対照として使用した（それぞれ、Ｃｏｎ−Ｍ及びＣｏｎ−Ｉ）。模倣物又はインヒビター対照をトランスフェクトしたＩＳＯ処置ＮＲＶＭは、αＭｙＨＣ及びＳＥＲＣＡの発現の低下、並びに、ＡＮＦ、ＢＮＰ、骨格筋α-アクチン、及びβＭｙＨＣの発現の増加を示し、これらはＦＧＰの活性化に特徴的である。
【００８１】
ｍｉＲ−９２は心不全でダウンレギュレーションされるため、本発明者は、ｍｉＲ−９２を阻害（すなわち、ｍｉＲ−９２インヒビターにより処置）すれば、胎児遺伝子プログラムを誘導する結果となり、及びｍｉＲ−９２をアップレギュレーション（すなわち、ｍｉＲ−９２模倣物により処置）すれば、胎児遺伝子プログラムの誘導が妨げられるという仮説を立てた。対照と比較したとき、ｍｉＲ−９２模倣物をトランスフェクトした細胞では、ＡＮＦ、ＢＮＰ及び骨格筋α-アクチンの発現の僅かな増加、並びにＳｅｒｃａ  ｍＲＮＡの減少が認められた（図５）。しかしながら、一般に、ｍｉＲ−９２の阻害又はアップレギュレーションは、胎児又は成人遺伝子発現の調節に対して最小限の効果しか有しない。これらの結果は、心不全におけるｍｉＲ−９２のダウンレギュレーションが、心不全表現型を調整する他の経路に関与し得ることを示唆している。
【００８２】
図６は、イソプロテレノールの存在下及び不在下でｍｉＲ−１００模倣物又はｍｉＲ−１００インヒビターをトランスフェクトした新生仔心筋細胞における胎児遺伝子プログラム（ＦＧＰ）の発現を示す。模倣物及びインヒビターをスクランブルしたｍｉＲ（それぞれ、Ｃｏｎ−Ｍ及びＣｏｎ−Ｉ、Dharmacon）を対照として使用した。心室筋細胞にｍｉＲ−１００模倣物をトランスフェクトすると、結果として成人遺伝子αＭｙＨＣ及びＳＥＲＣＡの抑制、並びにＩＳＯの媒介による胎児遺伝子ＡＮＦ及びβＭｙＨＣのアップレギュレーションの亢進が生じた。興味深いことに、ｍｉＲ−１００のダウンレギュレーションはＩＳＯの媒介によるαＭｙＨＣ及びＳＥＲＣＡの抑制を妨げたが、ＩＳＯによる胎児アイソフォームの誘導は妨げなかった（図６）ことから、ｍｉＲ−１００の阻害によって、ＩＳＯの媒介による成人アイソフォームの抑制に関与する遺伝子の発現が特異的に調節されることが示唆される。
【００８３】
図７は、イソプロテレノールの存在下又は不在下でｍｉＲ−１３３ｂ模倣物又はｍｉＲ−１３３ｂインヒビターをトランスフェクトした新生仔心筋細胞における胎児遺伝子プログラム（ＦＧＰ）の発現を示す。模倣物及びインヒビターをスクランブルしたｍｉＲ（Dharmacon）を対照として使用した（それぞれ、Ｃｏｎ−Ｍ及びＣｏｎ−Ｉ）。ｍｉＲ−１３３ｂを阻害した結果、対照（Ｃｏｎ−Ｉ）と比較して、遺伝子の小さいながら全般的なアップレギュレーションが分析された。しかしながら、ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物をトランスフェクトすることによってｍｉＲ−１３３ｂをアップレギュレーションすると、ＩＳＯの媒介によるαＭｙＨＣ及びＳＥＲＣＡのダウンレギュレーション、ＩＳＯの媒介によるβＭｙＨＣのアップレギュレーションが妨げられ、且つＩＳＯの媒介によるＢＮＰのアップレギュレーションが低下した（図７）。ｍｉＲ−１３３ｂの過剰発現も、対照（Ｃｏｎ−Ｍ）と比較して、骨格筋α-アクチン及びβＭｙＨＣが抑制される結果となり、ＢＮＰ及びＡＮＦの発現に変化はなかった。これらの結果は、ｍｉＲ−１３３のアップレギュレーションがα−アドレナリン作動性の肥大型遺伝子プログラム誘導（hypertrophic gene program）を阻止又は低減したことを実証したCare et al.（Nat Med (2007), Vol. 13(5):613-618）によって示されたものと同様の、胎児遺伝子プログラムの調節における重要な役割を、ｍｉＲ−１３３ｂの発現の変化が有することを示唆している。これらの知見は、ｍｉＲ−１３３ファミリーが心疾患における遺伝子発現の全般的な調節因子であり得ることを示唆している。
【００８４】
ｍｉＲＮＡ模倣物又はインヒビターの各々が、標的ｍｉＲＮＡのそれぞれアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを生じることを確認するため、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１００及びｍｉＲ−１３３ｂの模倣物及びインヒビターを上記のとおりＮＲＶＭにトランスフェクトした。各ｍｉＲＮＡの発現レベルをＲＴ−ＰＣＲによって試験した。結果は図８に示され、ｍｉＲＮＡ模倣物により結果として標的ｍｉＲＮＡが過剰発現した一方、ｍｉＲＮＡインヒビターは特定のｍｉＲＮＡの発現を抑えたとともに、この変化したｍｉＲ発現レベルが７２時間維持されることを示している。
【００８５】
実施例３．ｍｉＲ−１３３ｂ及び細胞肥大
ｍｉＲ−１３３ｂを阻害すると、胎児アイソフォームであるＢＮＰ、α−骨格アクチン及びＡＮＦの発現が誘導され、及びｍｉＲ−１３３ｂを過剰発現させると、胎児遺伝子プログラムのＩＳＯ媒介活性化が遮断された（実施例２）ことから、細胞肥大に対するｍｉＲ−１３３ｂの過剰発現又は阻害の効果を試験した。ＮＲＶＭに模倣物及びインヒビターを実施例２に記載されるとおりトランスフェクトし、抗α−アクチニン抗体で染色した。一部の細胞はトランスフェクション後にイソプロテレノールで処置した。Harrison et al.（Molecular & Cellular Biology (2004) Vol. 24(24): 10636-10649）に従い免疫蛍光法を実施した。簡潔には、細胞をＴＢＳＴで洗浄し、１０％ホルムアルデヒドで２０分間固定した。細胞をＴＢＳＴで再び洗浄し、さらに３０分間、０．１％Triton-Xと共にインキュベートした。次に細胞をＴＢＳＴ中１％ＢＳＡで１時間ブロックし、続いて１：５００希釈の抗α−アクチニン抗体と共に１時間インキュベートした。次に細胞を、１：１０００希釈のAlexa 594抗マウス抗体及び２μｇ／ｍｌのHoechst染料と共に１時間インキュベートした。デジタルカメラ（Zeiss AxioCam）及びZeiss AxioVision ver. 3.0.6.36イメージングソフトウェアを備えた蛍光顕微鏡（Nikon E800）により、拡大率４０倍の画像を取得した。Image Jソフトウェアプログラム（NIH）を使用して、各条件下につき３つの異なる領域から３０個の細胞の細胞表面積を定量した。
【００８６】
図９及び図１０に示されるとおり、ｍｉＲ−１３３ｂをダウンレギュレーションすると細胞サイズの増加が引き起こされ、一方、ｍｉＲ−１３３ｂを過剰発現させると、ＩＳＯの媒介による心筋細胞の細胞サイズの増加が劇的に低減した。これらの結果は、ｍｉＲ−１３３ｂが心筋細胞肥大の全般的な調節因子であり得るという見解をさらに支持するものである。
【００８７】
実施例４．ｍｉＲに基づく標的発見に向けたＳＡＧＥ手法
図１１に表される概略図は、心不全の治療標的を同定するための連続的遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）の手法を説明する。心不全臨床治験に関連した心不全（ＨＦ）患者が、３つの異なる時点で選択的な心内膜心筋生検を受ける。第１の時点はβ遮断薬（ＢＢ）治療の開始前であり、その他の時点は治療開始後３ヶ月及び１２ヶ月である。各患者からの各時点の生検は、ｍｉＲＮＡ配列解析、ｍＲＮＡ（Afflymetrix）配列解析、及び（標的）プロテオーム発現解析のために処理される。同じ試料からのｍｉＲ／ｍＲＮＡ／タンパク質発現の固有の組み合わせは、同時に、複数のレベルで遺伝子発現パターンの変化を調べる固有の機会となる。ｍｉＲＮＡ発現がｍＲＮＡ発現に影響し、続いてそれがタンパク質発現に影響するため、これまでに定義されていない調節制御の制御ポイント間の関連を調べることができる。さらには、ある期間にわたる同じ患者からの試料を解析することで、個人間の遺伝的差異に関連する重要な問題が回避される。治療標的は、同じ患者からの遺伝子発現レベルを異なる時点で比較することによって同定され得る（例えば、治療後３ヵ月と治療前等）。遺伝子発現レベルはまた、臨床転帰とも相関し得る。
【００８８】
実施例５．β遮断薬治療で処置したヒト患者におけるｍｉＲＮＡ発現の変化
心不全におけるｍｉＲＮＡの重要性をさらに例証するため、ヒト患者においてβ遮断薬による処置前及び処置後にｍｉＲＮＡ発現を評価した。末期心不全（処置前）、β遮断薬治療による処置後３ヶ月、及び処置後１２ヶ月において、５人の患者から一連の心生検を採取した。各患者の試料の各々に対してｍｉＲＮＡ配列解析を実施し、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−４９９、及びｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｇを含む、不全心でダウンレギュレーションされるいくつかのｍｉＲＮＡについての発現レベルを測定した。ｍｉＲＮＡ配列解析で測定された発現レベルを、実施例１に記載されるとおりＲＴ−ＰＣＲによって確認した。ＲＴ−ＰＣＲの結果が図１２〜１６に示される。特定のｍｉＲＮＡの発現レベルは、対照として使用したｍｉＲ−３７０（右のパネル）又は低分子ＲＮＡ  ＲＮＵ６６（左のパネル）のいずれかに対して基準化した。末期心不全（Ａ）、処置後３ヶ月（Ｂ）及び処置後１２ヶ月（Ｃ）において、ｍｉＲＮＡ発現を評価した。β遮断薬治療に反応した４人の患者（２０、２１、２５及び３４）の処置後の試料において、ｍｉＲＮＡ発現がアップレギュレーションされた。処置に反応しなかった患者（患者１０３）から採取された試料では、特定のｍｉＲＮＡのアップレギュレーションは認められなかった。この結果は、ｍｉＲＮＡのサブセットの発現レベルが心不全の重症度と相関し、実施例４に記載されるとおり特定の薬物治療に対する患者の反応をモニタするためのバイオマーカーとして使用することができることを示している。薬物治療の投薬量又はタイプは、このようなｍｉＲＮＡの１つ又は複数の発現レベルに基づき調整され得る。
【００８９】
実施例６．プロテインキナーゼＣε、ホスホジエステラーゼ１Ａ、及びカルモジュリンは、ｍｉＲ−９２及びｍｉＲ−１３３の標的である。
Target Scan 4.2（target scanのウェブサイトで入手可能）によるプロテインキナーゼＣε（ＰＫＣε）及びホスホジエステラーゼ１Ａ（ＰＤＥ１Ａ）のｍＲＮＡの３’ＵＴＲ解析から、ｍｉＲ−９２ａ（旧名ｍｉＲ−９２）の標的部位である可能性が明らかとなった。ｍｉＲ−９２ａがこれらの２つのｍＲＮＡを標的とするかどうかを試験するため、ｍｉＲ−９２ａの過剰発現をもたらすｍｉＲ−９２ａ模倣物、又はｍｉＲ−９２ａのダウンレギュレーションをもたらすｍｉＲ−９２ａインヒビターをラット新生仔心筋細胞にトランスフェクトした。細胞はトランスフェクション後７２時間で回収し、ウエスタンブロットにより細胞溶解物を分析した。ｍｉＲ−９２ａインヒビターによるｍｉＲ−９２ａのダウンレギュレーションの結果、ＰＫＣε（図１７Ａ）及びＰＤＥ１Ａ（図１７Ｂ）のタンパク質レベルがアップレギュレーションされた。ｍｉＲ−９２ａ模倣物によるｍｉＲ−９２ａのアップレギュレーションの結果、ＰＫＣε（図１７Ａ）及びＰＤＥ１Ａ（図１７Ｂ）の発現が抑制された。
【００９０】
Target Scanにより、カルモジュリンのｍＲＮＡの３’ＵＴＲについて同様の解析を実施した。この解析から、ｍｉＲ−１３３ｂの標的部位である可能性が明らかとなった。ｍｉＲ−１３３ｂがカルモジュリンを標的とするかどうかを試験するため、ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物（ｍｉＲ−１３３ｂの過剰発現をもたらす）又はｍｉＲ−１３３ｂインヒビター（ｍｉＲ−１３３ｂのダウンレギュレーションをもたらす）をラット新生仔心筋細胞にトランスフェクトした。細胞はトランスフェクション後７２時間で回収し、ＲＴ−ＰＣＲによりカルモジュリンのｍＲＮＡ発現を分析した（図１８Ａ）。ウエスタンブロットによりカルモジュリンのタンパク質発現を分析した（図１８Ｃ）。ｍｉＲ−１３３ｂインヒビターによるｍｉＲ−１３３ｂのダウンレギュレーションの結果、カルモジュリンのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルがアップレギュレーションされたが、一方、ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物によるｍｉＲ−１３３ｂのアップレギュレーションは、カルモジュリンの発現に対して最小限の効果しか有しなかった。
【００９１】
ｍｉＲ−１３３ｂがカルモジュリン３’ＵＴＲに対して直接的な効果を有したかどうかを判定するため、ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物又はｍｉＲ−１３３ｂインヒビターと、ルシフェラーゼに結合させたカルモジュリン３’ＵＴＲを含有する構築物とをラット新生仔心臓細胞に共トランスフェクトした（図１８Ｂ）。ルシフェラーゼアッセイの結果から、ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現解析の知見が確認された。ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物をトランスフェクトしても、ルシフェラーゼレベルに有意な変化は生じなかった。しかしながら、ｍｉＲ−１３３ｂインヒビターをトランスフェクトした結果、ルシフェラーゼはアップレギュレーションされたことから、カルモジュリンがｍｉＲ−１３３ｂの直接的な標的であることが示される。
【００９２】
まとめると、これらの結果は、ＰＫＣε及びＰＤＥ１ＡがｍｉＲ−９２ａの標的であり、一方、カルモジュリンはｍｉＲ−１３３ｂの標的であることを示している。これらの標的の３つ全てが、心不全に至る心筋症の発症に関連している。
【００９３】
記載された特定の方法論、プロトコル及び材料は異なってもよいため、本開示の発明はそれらに限定されないことが理解される。また、本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明することを目的としているに過ぎず、本発明の範囲を限定する意図はないことも理解され、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【００９４】
当業者は、日常の範囲を超えた実験を用いなくとも、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識し得るか、又は確認することができるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【００９５】
参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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