(57)【要約】  本発明は、プロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチド及び前記ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物、ベクター及び宿主細胞、及びポリペプチドの生成及び使用方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５のアミノ酸２〜148と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を有する単離されたプロテアーゼ。
【請求項２】
配列番号５のアミノ酸配列を含んで成る、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１又は２記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を破壊するか、又は除去し、親細胞よりも前記ポリペプチドを少なく生成する変異体をもたらすことを含んで成る、親細胞の変異体の生成方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法により生成される変異体細胞。
【請求項６】
生来の又は異種タンパク質をコードする遺伝子をさらに含んで成る、請求項５記載の変異体細胞。
【請求項７】
１つのドメインが炭水化物結合モジュールである、複数のドメインを含んで成るポリペプチドを含んで成るタンパク質生成物の生成方法であって、
ａ）請求項１又は２記載のポリペプチドの低められた発現を有する、複数のドメインを含んで成る前記ポリペプチドを生成する細胞を発酵し、そして
ｂ）発酵ブイヨンから生成物を回収する段階を含んで成る方法。
【請求項８】
請求項１又は２記載のポリペプチドのプロテアーゼ活性を実質的に有さないタンパク質生成物の生成方法であって、
ａ）請求項１又は２記載のポリペプチド、及び興味あるタンパク質生成物を発現する細胞を発酵し、
ｂ）本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害できる剤を、発酵の前、間又は発酵が完結した後、前記発酵ブイヨンに添加し、そして
ｃ）前記発酵ブイヨンから興味ある生成物を回収する段階を含んで成る方法。
【請求項９】
請求項１又は２記載のポリペプチドのプロテアーゼ活性を実質的に有さないタンパク質生成物の生成方法であって、
ａ）前記タンパク質生成物の発現を可能にする条件下で細胞を培養し、
ｂ）培養物ブイヨンを、組合されたpH及び温度処理にゆだね、そして
ｃ）培養物ブイヨンから前記生成物を回収する段階を含んで成る方法。
【請求項１０】
前記プロテアーゼ活性が少なくとも60％除去される、請求項８又は９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチド及び前記ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物、ベクター及び宿主細胞、及びポリペプチドの生成及び使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチド及び前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを供給することが本発明の目的である。
洗剤産業においては、酵素は30年以上の間、洗浄配合において実施されて来た。そのような配合に使用される酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、マンノシダーゼ、及び他の酵素又はそれらの混合物を含んで成る。商業的に最も重要な酵素はプロテアーゼである。
【０００３】
WO89/06270号（Novozymes A/S）は、狭い基質特異性を有するプロテアーゼ、すなわちリシン又はアルギニンのC−末端側でペプチド結合を切断できるトリプシン−様プロテアーゼを含んで成る洗剤組成物を開示する。
さらに、WO94/25583号は、フサリウム（Fusarium）トリプシン−様プロテアーゼをコードするDNA配列のクローニング、及び前記DNA配列からの活性トリプシン−様プロテアーゼの入手を開示する。
【０００４】
しかしながら、多くの有用なプロテアーゼ及びプロテアーゼ変異体がこれまで記載されているが、多くの産業的使用のためのプロテアーゼ又はプロテアーゼ変異体のさらなる改良のための必要性がまだ存在する。
特に、典型的な洗剤組成物の他の成分の存在下で高い活性を維持する問題は、プロテアーゼの性能を低める傾向があることである。
【０００５】
従って、本発明の目的は、例えば洗濯及び/又は硬質表面の清浄への使用のための洗剤への使用のために適切である新規プロテアーゼを供給することである。
菌類、及び特に糸状菌は、著しく高いレベルのタンパク質を分泌するそれらの能力のために、広く商業的に使用される。
中でも、アスペルギラス（Aspergillus）属に属する糸状菌類は、内因性及び異種タンパク質の生成のために商業的に長く使用されて来た。
【０００６】
タンパク質の生成のために使用されるほとんどの微生物に関する１つの欠点は、タンパク質分解による興味あるタンパク質生成物の分解にゆだねるプロテアーゼの固有の生成である。
これを回避する種々の手段が想定されて来た。他の解決策の中で、種々のプロテアーゼをコードする遺伝子を除去するか又は破壊することが提案されて来た。
【０００７】
WO2006/110677号は、染色体遺伝子derA、derB、 htmA、mnn9、 mnn10、ochA、pepAa、pepAb、 pepAc、 pepAd、 pepF及び組合せが異種的に生成されたタンパク質の分解を低めるために不活性化されている、アスペルギラスニガー種に属する組換え菌類宿主細胞を開示する。
【０００８】
不運なことには、いくつかの菌類は、多数の異なったプロテアーゼを生成する。
従って、プロテアーゼを生成しないか又は非常に低いレベルのプロテアーゼ生成を示す糸状菌の株のための持続した必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、配列番号５のアミノ酸２〜148と少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を有する単離されたプロテアーゼに関する。
本発明はまた、（ａ）プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んで成る核酸構造体を含んで成る組換え宿主細胞を、前記ポリペプチドの生成の助けになる条件下で培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、そのようなポリペプチドの生成方法にも関する。
【００１０】
本発明はまた、本発明のプロテアーゼを含んで成る清浄又は洗剤組成物、好ましくは洗濯又は皿洗い用組成物にも関する。
本発明のさらなる観点は、清浄又は洗剤組成物への本発明のプロテアーゼの使用；硬質表面又は洗濯物と本発明の組成物とを接触することを含んで成る、硬質表面又は洗濯物の清浄又は洗浄方法に関する。
【００１１】
本発明はまた、修飾されていない菌類に比較して、本発明のプロテアーゼの発現が低められているか又は完全に除去されているよう修飾された菌類にも関する。好ましくは、前記修飾は、組換えDNA技法を用いて実施されて来た。
【００１２】
従って、さらに本発明は、下記から成る群から選択された、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも一部の欠失により得られる、前記菌類の生成方法に関する：
（ａ）配列番号５のアミノ酸２〜148と、少なくとも60％、例えば少なくとも65％、例えば少なくとも70％、例えば少なくとも75％、例えば少なくとも80％、例えば少なくとも85％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも96％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも98％、例えば少なくとも99％、例えば少なくとも99.5％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４のヌクレオチド１〜515と、少なくとも中位の緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はその相補鎖。
【００１３】
これは、
ｉ）（ａ）配列番号５のアミノ酸２〜148と、少なくとも60％、例えば少なくとも65％、例えば少なくとも70％、例えば少なくとも75％、例えば少なくとも80％、例えば少なくとも85％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも96％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも98％、例えば少なくとも99％、例えば少なくとも99.5％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
【００１４】
（ｂ）配列番号４のヌクレオチド１〜515と、少なくとも中位の緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はその相補鎖、から成る群から選択された、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、興味ある菌類からクローニング、
ii) ｉ）でクローン化されたポリヌクレオチドを含んで成るDNA構造体を生成し、ここで内部部分が置換され、欠失され、又は付加的DNAが挿入されており；
iii)前記構造体により前記菌類を形成転換し；そして
iv)修飾されていない菌類により発現される量に比較して、低められた量の本発明のプロテアーゼを発現する形質転換体を単離することを含んで成る方法により得られる。
【００１５】
さらに、本発明は、下記から成る群から選択された、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから転写されたmRNAに相補的なRNA分子の合成を、親菌類への導入に基づいてもたらすベクターを構成することにより、本発明のプロテアーゼの発現が、良く知られているアンチセンス技法を用いて、修飾されていない親菌類に比較して低められている菌類を生成するための方法に関する：
【００１６】
（ａ）配列番号５のアミノ酸２〜148と、少なくとも60％、例えば少なくとも65％、例えば少なくとも70％、例えば少なくとも75％、例えば少なくとも80％、例えば少なくとも85％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％、例えば少なくとも96％、例えば少なくとも97％、例えば少なくとも98％、例えば少なくとも99％、例えば少なくとも99.5％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４のヌクレオチド１〜515と、少なくとも中位の緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はその相補鎖。
【００１７】
さらに、本発明は、上記方法への使用のために意図されたDNA構造体にも関する。
さらに、本発明は、興味あるタンパク質又は遺伝子生成物をコードするDNA配列を少なくとも含んで成るDNA構造体が適切な条件下で適切な増殖培地において培養され、そして所望する遺伝子生成物が回収され、そして精製される、所望するタンパク質又は遺伝子生成物、特に分泌されたタンパク質の生成方法に関する。
【００１８】
本発明を実施する場合、本発明の菌類がそのような分泌されるタンパク質を、より改良された収率で生成することが、驚くべきことには見出された。特に、本発明のポリペプチドが、触媒部分及びCBM（炭水化物結合モジュール）を含んで成るポリペプチドからのCBMの分解を担当すると思われ、そして本発明のポリペプチドの発現が低められている宿主細胞が、本発明のポリペプチドの発現が低められていない同じ宿主細胞に比較して、CBMの低い分解をもたらすことが驚くべきことには見出された。
【００１９】
従って、本発明のもう１つの観点は、１つのドメインが炭水化物結合モジュールである、複数のドメインを含んで成るポリペプチドを含んで成るタンパク質生成物の生成方法に関し、ここで前記方法は、
ａ）請求項１又は２記載のポリペプチドの低められた発現を有する、複数のドメインを含んで成る前記ポリペプチドを生成する細胞を発酵し、そして
ｂ）発酵ブイヨンから生成物を回収する段階を含んで成る。
さらに、本発明はまた、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を実質的に有さないタンパク質生成物の生成方法に関し、ここで前記方法は、
【００２０】
ａ）請求項１〜８のいずれか１項記載のポリペプチド、及び興味あるタンパク質生成物を発現する細胞を発酵し、
ｂ）本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害できる剤を、発酵の間又は発酵が完結した後、前記発酵ブイヨンに添加し、そして
ｃ）前記発酵ブイヨンから興味ある生成物を回収する段階を含んで成る。
【００２１】
本発明はまた、
ａ）前記タンパク質生成物の発現を可能にする条件下で細胞を培養し、
ｂ）培養物ブイヨンを、組合されたpH及び温度処理にゆだね、そして
ｃ）培養物ブイヨンから前記生成物を回収する段階を含んで成る方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、例１に記載されるような、本発明の19kDaの精製されたプロテアーゼを示すSDS−PAGEゲルを示す。
【図２】図２は、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）の19kDaのプロテアーゼのゲノムDNA配列及び推定されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号４及び５）を示す。
【００２３】
【図３】図３は、本発明のポリヌクレオチドを含んで成る発現プラスミドにより形質転換されたA. オリザエのゲル透過クロマトグラフィーを示す。
【図４】図４は、図３に開示されるゲル透過クロマトグラフィーの選択された画分により負荷されたSDS−PAGEゲルを示す。
【図５】図５は、配列番号３を有するプロテアーゼのpHプロフィールを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義：
プロテアーゼ活性：
用語“プロテアーゼ活性”とは、ペプチドにおける２つのアミノ酸を連結するペプチド結合の加水分解を触媒するタンパク質分解活性として、本明細書においては定義される。本発明のためには、プロテアーゼ活性は、S.lshiura, et al, FEBS Lett,. 189, 1 19 (1985)により記載される方法に従って決定される。１単位のプロテアーゼ活性は、37℃、pH6.7で１分当たり基質Suc-LLVY-MCA (Peptide Inc. (Osaka, Japan)から入手できる)から生成される1.0μモルのアミノメチルクマリンとして定義される。
【００２５】
本発明のポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸２〜148として示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドのプロテアーゼ活性の少なくとも20％、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％、及びさらに最も好ましくは少なくとも100％を有する。
【００２６】
単離されたポリペプチド：用語“単離されたポリペプチド”とは、本明細書において使用される場合、天然において結合される少なくとも１つの成分から除去されるポリペプチドを言及する。この用語は、本明細書において使用される場合、SDS−PAGEにより決定される場合、少なくとも20％の純度、好ましくは40％の純度、より好ましくは少なくとも60％の純度、さらにより好ましくは少なくとも80％の純度、最も好ましくは少なくとも90％の純度、及びさらなる最も好ましくは少なくとも95％の純度であるポリペプチドを言及する。
【００２７】
実質的に純粋なポリペプチド：
用語“実質的に純粋なポリペプチド”とは、本明細書において、多くとも10％、好ましくは多くとも８％、より好ましくは多くとも６％、より好ましくは多くとも５％、より好ましくは多くとも４％、多くとも３％、さらにより好ましくは多くとも２％、最も好ましくは多くとも１％及びさらに最も好ましくは多くとも0.5％（重量による）の天然において結合される他のポリペプチド材料を含むポリペプチド調製物を示す。従って、好ましくは、実質的に純粋なポリペプチドは、調製物の存在する合計ポリペプチド材料の少なくとも92％の純度、好ましくは少なくとも94％の純度、好ましくは少なくとも95％の純度、好ましくは少なくとも96％の純度、好ましくは少なくとも97％の純度、好ましくは少なくとも98％の純度、さらに好ましくは少なくとも99％の純度、最も好ましくは少なくとも99.5％の純度、及びさらに最も好ましくは少なくとも100％（重量による）の純度である。
【００２８】
本発明のポリペプチドは好ましくは、実質的に純粋な形で存在する。特に、好ましくはポリペプチドは、“実質的に純粋な形”で存在し、すなわちポリペプチド調製物は、天然において結合される他のポリペプチド材料を実質的に有さない。これは、例えば、良く知られている組換え方法、又は従来の精製方法によりポリペプチドを調製することにより達成され得る。
本明細素においては、用語“実質的に純粋なポリペプチド”とは、用語“単離されたポリペプチド”及び“単離された形でのポリペプチド”と同じ意味である。
【００２９】
同一性：
２種のアミノ酸配列間の関連性が、パラメーター“同一性”により記載される。
本発明のためには、２種のアミノ酸配列は、EMBOSSパッケージ (http://emboss.org)バージョン2.8.0からのNeedleプログラムを用いることにより決定される。このNeedle−プログラムは、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48, 443-453に記載される世界的一列整列アルゴリズムを実行する。使用される置換マトリックスはBLOSUM62であり、ギャップ開放ペナルティーは10であり、そしてギャップ延長ペナルティーは0.5である。
【００３０】
本発明のアミノ酸配列（“発明の配列”、例えば配列番号５のアミノ酸２−148）と、異なったアミノ酸配列（“外来性配列”）との間の同一性の程度は、“発明の配列”の長さ、又はいずれにせよ、最も短い“外来性配列”の長さにより割り算された、２種の配列一列整列での正確な適合の数として計算される。結果は、％同一性で表される。
【００３１】
正確な適合は、“発明の配列”及び“外来性配列”がオーバーラップの同じ位置において同一のアミノ酸残基を有する場合、発生する（下記一列整列の例においては、これは“|”により表される）。配列の長さは、配列におけるアミノ酸残基の数である（例えば、配列番号５の長さは148である）。
【００３２】
下記純粋に仮説の一列整列の例においては、オーバーラップは、配列１のアミノ酸配列“HTWGER-NL”又は配列番号２のアミノ酸配列“NGWGEDANL”である。この例においては、ギャップは、“−”により示される。
【００３３】
仮説の一列整列の例：
【化１】
2010539964.tif 000002
【００３４】
本発明のためには、２種のヌクレオチド配列間の同一性の程度は、同一性表及び次の複数の一列整列パラメーターと共に、LASERGENETM MEGALIGN TM ソフトウエアー(DNASTAR, Inc., Madison, Wl)を用いて、Wilbur-Lipman method (Wilbur and Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730)により決定される：10のギャップペナルティー及び10のギャップ長ペナルティー。対様一列整列パラメーターは、Ktuple＝３、ギャップペナルティー＝３及び窓＝20である。
【００３５】
特定の態様においては、配列番号５のアミノ酸２−148に対するポリペプチドのアミノ酸配列の同一性の％は、i)２種のアミノ酸を、BLOSUM62置換マトリックス、10のギャップ開始ペナルティー及び0.5のギャップ延長ペナルティーを伴って、Needleプログラムを用いて、一列整列し；ii)前記一列整列における正確な適合の数を計数し；iii)２種のアミノ酸配列の最短の長さにより前記正確な適合の数を割り算し；そしてiv) iii)の割り算の結果を％に転換することにより決定される。
【００３６】
ポリペプチドフラグメント：
用語“ポリペプチドフラグメント”とは本明細書においては、配列番号５、又はその相同配列のアミノ及び/又はカルボキシル末端から欠失された１又は複数のアミノ酸を有するポリペプチドとして定義され、ここで前記フラグメントはプロテアーゼ活性を有する。
【００３７】
副配列：
用語“副配列”とは本明細書においては、配列番号４、又はその相同配列の5’及び/又は3’末端から欠失される１又は複数のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列として定義され、ここで前記副配列はリパーゼ活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする。
【００３８】
対立遺伝子変異体：
本明細書においては、用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の他の形のいずれかを示す。対立遺伝子変動は、天然においては、突然変異を通して発生し、そして集団内の多形現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異はサイレントであり得るか（コードされるポリペプチドの変化が存在しない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子によりコードされるポリペプチドである。
【００３９】
実質的に純粋にポリヌクレオチド：
用語“実質的に純粋なポリペプチド”とは、本明細書において使用される場合、他の外来性の又は所望しないヌクレオチドを有さず、そして遺伝子構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在するポリヌクレオチド調製物を言及する。従って、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、それが天然において結合される他のポリヌクレオチド材料を、多くとも10重量％、好ましくは多くとも８重量％、より好ましくは多くとも６重量％、より好ましくは多くとも５重量％、より好ましくは多くとも４重量％、より好ましくは多くとも３重量％、さらにより好ましくは多くとも２重量％、最も好ましくは多くとも１重量％、及びさらに最も好ましくは多くとも0.5重量％含む。
【００４０】
しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然に存在する5’及び3’未翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含むことができる。好ましくは、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、少なくとも90％の純度、好ましくは少なくとも92％の純度、より好ましくは少なくとも94％の純度、より好ましくは少なくとも95％の純度、より好ましくは少なくとも96％の純度、より好ましくは少なくとも97％の純度、さらにより好ましくは少なくとも98％の純度、最も好ましくは少なくとも99％の純度、及びさらに最も好ましくは少なくとも99.5％（重量による）の純度が好ましい。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドは好ましくは、実質的に純粋な形で存在する。特に、好ましくは、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、“実質的に純粋な形”で存在し、すなわちポリヌクレオチド調製物は、それが天然において結合される他のポリヌクレオチドは、用語“単離されたポリヌクレオチド”及び“単離された形でのポリヌクレオチド”と同じ意味である。ポリヌクレオチドは、ゲノム、cDNA、RNA、半合成、合成起源、又はそれらのいずれかの組合せのものであり得る。
【００４２】
cDNA：
用語“cDNA”とは、本発明において使用される場合、真核細胞に由来する成熟のスプライスされたmRNA分子から逆転写により調製され得るDNA分子を包含する。cDNAは、その対応するゲノムDNAに通常存在するイントロン配列を欠いている。初期一次RNA転写体は、mRNAに対する前駆体であり、そしてそれは、成熟のスプライスされたmRNAとして出現する前、一連のプロセッシング現象を通して進行する。この現象は、スプライシングと呼ばれる工程によるイントロン配列の除去を包含する。従って、cDNAがmRNAに由来する場合、それはイントロン配列を欠いている。
【００４３】
核酸構造体：
本明細書において使用される場合、用語“核酸構造体”とは、天然に存在する遺伝子から単離され、又は他方では、天然に存在しない態様で核酸のセグメントを含むように修飾されている、一本鎖又は二本鎖核酸分子として定義される。用語“核酸構造体”とは、核酸構造体が本発明のコード配列の発現のために必要とされるすべての制御配列を含む場合、用語“発現カセット”と同じ意味である。
【００４４】
制御配列：
用語“制御配列”とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために必要であるか、又はそのために好都合であるすべての成分を包含するよう定義される。個々の制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して生来であっても又は外来性であっても良い。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。最少で、制御配列は、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを包含する。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配列との連結を促進する特定の制限部位を導入するためにリンカーを提供され得る。
【００４５】
作用可能に連結される：
用語“作用可能に連結される”とは、制御配列が、ポリペプチドのコード配列の発現を指図するようポリヌクレオチド配列のコード配列に対する位置で適切に配置されている配置として本明細書において定義される。
【００４６】
コード配列：
本明細書において使用される場合、用語“コード配列”とは、そのタンパク質生成物のアミノ酸配列を直接的に特定するヌクレオチド配列を包含する。コード配列の境界は一般的に、ATG開始コドン又は他の開始コドン、例えばGTG及びTTGにより通常開始する読取枠により決定される。コード配列は、DNA、cDNA、又は組換えヌクレオチド配列であり得る。
【００４７】
発現：
用語“発現”とは、ポリペプチドの生成に包含されるいずれかの段階、例えば転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾及び分泌（但し、それらだけには制限されない）を包含する。
【００４８】
発現ベクター：
本明細書においては、用語“発現ベクター”とは、本発明のポリペプチドとコードするポリヌクレオチドを含んで成り、そしてその発現を提供する追加のヌクレオチドに作用可能に連結される線状又は環状DNA分子を包含する。
【００４９】
宿主細胞：
用語“宿主細胞”とは、本明細書において使用される場合、本発明のポリヌクレオチドを含んで成る核酸構造体による形質転換、トランスフェクション、トランスダクション及び同様のものに対して感受性であるいずれかの細胞型を包含する。
【００５０】
修飾：
用語“修飾”とは本明細書において、配列番号５のアミノ酸２〜148から成るポリペプチドのいずれかの化学的修飾、及びそのようなポリペプチドをコードするDNAの遺伝子操作を意味する。前記修飾は、アミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入、及びアミノ酸側鎖の置換であり得る。
【００５１】
人工変異体：
本明細書において使用される場合、用語“人工変異体”とは、配列番号４の修飾されたヌクレオチド配列を発現する生物により生成されるプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。修飾されたヌクレオチド配列は、配列番号４に開示されるヌクレオチド配列の修飾により、ヒト介在を通して得られる。
【００５２】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチド：
第１の観点においては、本発明は、配列番号５のアミノ酸２〜148（すなわち、成熟ポリペプチド）に対して、少なくとも95％、例えば好ましくは96％、例えば好ましくは少なくとも97％、例えば好ましくは98％、例えば好ましくは99％及び例えば好ましくは99.5％の程度の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る、プロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチド（この後、“相同ポリペプチド”）に関する。好ましい観点においては、相同ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸２〜148とは、５個のアミノ酸、好ましくは４個のアミノ酸、より好ましくは３個のアミノ酸、さらにより好ましくは２個のアミノ酸、及び最も好ましくは１個のアミノ酸で異なるアミノ酸配列を有する。
【００５３】
本発明のポリペプチドは好ましくは、配列番号５のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体；又はプロテアーゼ活性を有するそのフラグメントを含んで成る。好ましい観点においては、ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含んで成る。もう１つの好ましい観点においては、ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸２〜148、又はその対立遺伝子変異体；又はプロテアーゼ活性を有するそのフラグメントを含んで成る。もう１つの好ましい観点においては、ポリペプチドは配列番号５のアミノ酸２〜148を含んで成る。
【００５４】
もう１つの好ましい観点においては、ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体；又はプロテアーゼ活性を有するそのフラグメントから成る。もう１つの好ましい観点においては、ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列から成る。もう１つの好ましい観点においては、ポリペプチドは、配列番号２の成熟ポリペプチドから成る。もう１つの好ましい観点においては、ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸２〜148又はその対立遺伝子変異体；又はプロテアーゼ活性を有するそのフラグメントから成る。もう１つの好ましい観点において、ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸２〜148から成る。
【００５５】
配列番号４又はその副配列、及び配列番号５のアミノ酸配列又はそのフラグメントは、当業界において良く知られている方法に従って、異なった属又は種の株からのプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを同定し、そしてクローン化するための核酸プローブを企画するために使用され得る。特に、そのようなプローブは、そこにおける対応する遺伝子を同定し、そして単離するために、標準のサザンブロット方法に従って、興味ある属又は種のゲノム又はcDNAとのハイブリダイゼーションのために使用され得る。
【００５６】
そのようなプローブは、完全な配列よりも相当に短いが、しかし少なくとも１４個、好ましくは少なくとも25個、より好ましくは少なくとも35個、及び最も好ましくは少なくとも70個の長さのヌクレオチドであるべきである。しかしながら、好ましくは、核酸プローブは少なくとも100個の長さのヌクレオチドである。例えば、核酸プローブは、少なくとも200個、好ましくは少なくとも300個、より好ましくは少なくとも400個、又は最も好ましくは少なくとも500個の長さのヌクレオチドであり得る。
【００５７】
さらに長いプローブ、例えば少なくとも600個、好ましくは少なくとも700個、より好ましくは少なくとも800個、又は最も好ましくは少なくとも900個の長さのヌクレオチドである核酸プローブが使用され得る。DNA及びRNAの両プローブが使用され得る。プローブは典型的には、対応する遺伝子を検出するためにラベルされる（例えば、32P, 3H, 35S, ビオチン、又はアビジンにより）。そのようなプローブは、本発明により包含される。
【００５８】
従って、そのような他の生物から調製されたゲノムDNAライブラリーは、上記に記載されるプローブとハイブリダイズし、そしてプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAについてスクリーンされ得る。そのような生物からのゲノム又は他のDNAは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技法により分離され得る。ライブラリーからのDNA又は分離されたDNAが、ニトロセルロース又は他の適切なキャリヤー材料に移行され、そしてその上に固定され得る。配列番号４と相同であるクローン又はDNA、又はその副配列を同定するためには、キャリヤー材料がサザンブロットに使用される。
【００５９】
本発明のためには、ハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド配列が、非常に低い〜非常に高い緊縮条件下で、配列番号４で示されるヌクレオチド配列、その相補的鎖、又はその副配列に対応するラベルにされた核酸プローブにハイブリダイズすることを示す。核酸プローブがそれらの条件下でハイブリダイズする分子は、X−線フィルムを用いて検出される。
【００６０】
少なくとも100個の長さのヌクレオチドの長さの長いプローブに関して、中位〜非常に高い緊縮条件は、最適には12〜24時間の標準のサザンブロット方法に従っての、５×SSPE、 0.3%SDS、 200μg/ml の剪断され、そして変性されたサケ精子DNA、及び35％ホルムアミド（中位及び中−高緊縮に関して）、又は50％ホルムアミド（高い及び非常に高い緊縮に関して）における42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義される。
【００６１】
少なくとも100個の長さのヌクレオチドの長いプローブに関しては、キャリヤー材料は最終的に、２×SSC、 0.2%SDS溶液を用いて、好ましくは少なくとも55℃（中位の高い緊縮）、より好ましくは少なくとも60℃（中くらいに高い緊縮）、さらにより好ましくは少なくとも65℃（高い緊縮）及び最も好ましくは少なくとも70℃（非常に高い緊縮）で、それぞれ15分間、３度洗浄される。
【００６２】
特定の態様においては、洗浄は、２×SSC、 0.2%SDS溶液を用いて、好ましくは少なくとも55℃（中位の高い緊縮）、より好ましくは少なくとも60℃（中くらいに高い緊縮）、さらにより好ましくは少なくとも65℃（高い緊縮）及び最も好ましくは少なくとも70℃（非常に高い緊縮）で行われる。もう１つの特定の態様においては、洗浄は、0.1×SSC、 0.2%SDS溶液を用いて、好ましくは少なくとも55℃（中位の高い緊縮）、より好ましくは少なくとも60℃（中くらいに高い緊縮）、さらにより好ましくは少なくとも65℃（高い緊縮）及び最も好ましくは少なくとも70℃（非常に高い緊縮）で行われる。
【００６３】
約15個〜約70個の長さのヌクレオチドである短いプローブに関しては、緊縮条件は、0.9MのNaCl、0.09Mのトリス−HCl, pH7.6、 ６mM のEDTA、 0.5のNP-40, 1×Denhardt’s溶液、１mMのピロリン酸ナトリウム、１mMの一塩基性リン酸ナトリウム、0.1mMのATP及び0.2mgの酵母RNA（ml当たり）における、Bolton and McCarthy（1962、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390）に従って計算されたTmよりも約５℃〜約10℃低い温度での、最適には12〜24時間の標準のサザンブロット方法に従ってのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及び後−ハイブリダイゼーション洗浄として定義される。
【００６４】
約15個〜約70個の長さのヌクレオチドである短いプローブに関しては、キャリヤー材料は、６×SSC及び0.1％SDSにより15分間、1度、及び６×SSCを用いて、計算されたTmよりも約５℃〜約10℃低い温度でそれぞれ15分間、２度、洗浄される。
【００６５】
塩含有のハイブリダイゼーション条件下で、効果的Tmは、好結果を生むハイブリダイゼーションのためにプローブとフィルター結合されたDNAとの間で必要とされる同一性の程度を調節するものである。効果的Tmは、種々の緊縮条件下での２種のDNAのハイブリダイゼーションのために必要とされる同一性の程度を決定するために、下記式を用いて決定され得る。
【００６６】
効果的 Tm = 81.5 + 16.6(log M[Na+]) + 0.41 (%G+C) - 0.72(% ホルムアミド)
(www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htmを参照のこと)。
配列番号４、又は配列番号４のヌクレオチド１〜518のG＋C含有率は、55％である。中位の緊縮性のためには、ホルムアミドは35％であり、そして５×SSPEのためのNa＋濃度は0.75Mである。この式をそれらの値に適用すると、効果的Tmは77℃である。
【００６７】
もう１つの適切な関係は、２種のDNAの１％のミスマッチがTmを1.4℃低めることである。42℃で中位の緊縮性条件下でハイブリダイズする２種のDNAのために必要とされる同一性の程度を決定するために、次の式が使用される。
%相同性= 100 - [(効果的Tm - ハイブリダイゼーション温度)/1.4]
（www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htmを参照のこと)。
【００６８】
この式を値に適用すると、42℃で中位の緊縮性条件下でハイブリダイズする２種のDNAのために必要とされる同一性の程度は、100-[(77-42)/1.4]=75％である。
第２の観点においては、本発明は、ユニークモチーフとして、配列番号４のヌクレオチド１〜515を含んで成るポリヌクレオチドによりコードされるプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００６９】
第４の観点においては、本発明は、下記生理化学的性質を有する単離されたポリペプチドに関する：
−８〜９のpH最適性；
−約19kDaの分子量：
−ロイペプチン、ペプスタチン、４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニル弗化物（AEBSF）、ZnSO4及びEDTAにより阻害されない；
−基質Sue- LLVY- MCAに対する高い活性及び基質Glt-AAF-MCA、Boc-FSR-MCA、Suc(OMe)-AAPV-MCA 及びZ-LLE-MCAに対する低い活性を有する。
【００７０】
第４の観点においては、本発明は、配列番号５又はその成熟ポリペプチドの１又は複数のアミノ酸の保存性置換、欠失及び/又は挿入を含んで成る、少なくとも1.1のBR及び少なくとも0.8のRPを有する人工変異体に関する。好ましくは、アミノ酸変化は、マイナーな性質のもの、すなわち保存性アミノ酸置換又は置換；１〜約30個のアミノ酸の小さな欠失；小さなアミノ−又はカルボキシル−末端、例えばアミノ末端メチオニン残基の延長；約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチド；又は実行電荷又は他の機能、例えばポリ−ヒスチジン路、抗原性エピトープ又は結合ドメインを変えることにより精製を促進する小さな延長のものであり；換言すれば、タンパク質の折りたたみ及び/又は活性に有意に影響を及ぼさない変化である。
【００７１】
保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）のグループ内である。一般的に、比活性を変更しないアミノ酸置換は当業界において知られており、そしてたとえば、H. Neurath and R.L. Hill, 1979, The Proteins, Academic Press, New York により記載されている。最も通常生じる交換は次のものである： Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/ Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu及びAsp/Gly。
【００７２】
20の標準アミノ酸の他に、非標準のアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、６−N−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン及びα−メチルセリン）は、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基により置換され得る。限定された数の非保存性アミノ酸、すなわち遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸は、アミノ酸残基により置換され得る。不自然なアミノ酸は、化学的に合成され得、そして好ましくは、市販されており、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン及び３，３−ジメチルプロリンを包含する。
【００７３】
他方では、アミノ酸変化は、ポリペプチドの生理化学的性質が変更されるような性質のものである。例えば、アミノ酸変化は、ポリペプチドの熱安定性を改良し、基質変異性を変更し、pH最適性を変え、そして同様のことをする。
【００７４】
親ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発、又はアラニン−走査突然変異誘発に従って同定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085, 1989）。後者の技法においては、単一のアラニンの突然変異が分子におけるあらゆる残基に導入され、そして得られる変異体分子は、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、生物学的活性（すなわち、プロテアーゼ活性）について試験される。また、Hilton など., J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996を参照のこと。
【００７５】
酵素又は他の生物学的相互作用の活性部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、構造の物理的分析によっても決定され得る。例えば、de Vos など., Science 255: 306-312, 1992; Smith など., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver など., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の本体はまた、本発明のポリペプチドに関連するポリペプチドとの同一性の分析からも推定され得る。
【００７６】
単一又は複数のアミノ酸置換は、突然変異誘発、組換え及び/又はシャフリング、続く適切なスクリーニング方法、例えばReidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53-57, 1988), Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989), WO95/17413号又はWO95/22625号により開示される既知の方法を用いて、生成され、そして試験され得る。使用され得る他の方法は、エラープロンPCR、ファージ表示（例えば、Lowman など., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner など., アメリカ特許第5,223,409号；Huse, WIPO Publication WO92/06204号）及び特定領域の突然変異誘発（Derbyshire など., Gene 46: 145, 1986; Ner など., DNA 7: 127, 1988）を包含する。
【００７７】
突然変異誘発/シャフリング方法は、宿主細胞においてクローン化され、突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために、高い処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る(Ness など., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896)。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発されたDNA分子は、宿主細胞から回収され、そして近代装置を用いて急速に配列決定され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける重要な個々のアミノ酸残基の急速な決定を可能にし、そして未知の構造体のポリペプチドに適用され得る。
【００７８】
配列番号５のアミノ酸２〜148のアミノ酸置換、欠失及び/又は挿入の合計数は、多くても６、好ましくは多くても５、より好ましくは４、さらにより好ましくは３、最も好ましくは２、及びさらに最も好ましくは１である。
【００７９】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチド源：
本発明のポリペプチドは、いずれかの属の微生物から得られる。本発明のためには、用語“〜から得られる”とは、所定の源に関して本明細書において使用される場合、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが前記源により、又はその源からのヌクレオチド配列が挿入されている細胞により生成されることを意味する。好ましい態様においては、所定の源から得られるポリペプチドは細胞外に分泌される。
【００８０】
本発明のポリペプチドは、菌類ポリペプチド、及びより好ましくは、酵母ポリペプチド、例えばカンジダ（Candida）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizos accharomyces）、又はヤロウイア（Yarrowia）ポリペプチド；又はより好ましくは、糸状菌ポリペプチド、例えばアクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、クリプトコーカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、マグナポリス（Magnaporthe）、ムコル（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ネオカノマスチックス（Neocallimastix）、ネウロスポラ（Neurospora）、パエシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ピロミセス（Piromyces）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）又はトリコダーマ（Trichoderma）ポリペプチドであり得る。
【００８１】
好ましい観点においては、ポリペプチドは、プロテアーゼ活性を有する、サッカロミセス・カルスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）又はサッカロミセス・オビホルミス（Saccharomyces oviformis）ポリペプチドである。
【００８２】
好ましい観点においては、ポリペプチドは、アスペルギラス・アキュレアタス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギラス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギラス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギラス・ホエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギラス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギラス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、フサリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フサリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フサリウム・クロックウェレンズ（Fusarium crookwellense）、フサリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）、フサリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearium）、フサリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フサリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フサリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・レチキュラタム（Fusarium reticulatum）、フサリウム・ロゼウム（Fusariumu roseum）、フサリウム・サムブシウム（Fusarium sambucinum）、フサリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フサリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フサリウム・トルロサム（Fusarium torulosaum）、フサリウム・トリコセシオイデス（Fusarium trichothecioides）、フサリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、サーモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）、ムコル・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオプラソ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ネウロスポラ・クラサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Penicillium purpurogenum）、トリコダーマ・ハルジアナル（Trichoderma harzianum）、トリコダーマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコダーマ・ロンジブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコダーマ・レセイ（Trichoderma reesei）、又はトリコダーマ・ビリデ（Trichoderma viride）ポリペプチドである。
【００８３】
もう１つの好ましい観点においては、ポリペプチドは、アスペルギラス、アスペルギラス・ニガー、又はアスペルギラス・オリザエポリペプチドである。
より好ましい観点においては、ポリペプチドは、アスペルギラス・ニガーポリペプチド、例えば配列番号５のポリペプチドである。
【００８４】
前述の種に関しては、本発明は完全及び不完全状態の両者、及び他の分類学的同等物、例えばアナモルフを、それらが知られている種の名称にかかわらず、包含することが理解されるであろう。当業者は適切な同等物の正体を容易に理解するであろう。
【００８５】
それらの種の株は、次の多くの培養物寄託所から容易に入手できる：American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcaltures (CBS), 及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL)。
【００８６】
さらに、そのようなポリペプチドは、他の源、例えば天然源（例えば、土壌、培養土、水、等）から単離された微生物から、上記プローブを用いて同定され、そして得られる。天然の生息地から微生物を単離する技法は当業界において良く知られている。次に、ポリヌクレオチドは、そのような微生物のゲノム又はcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることにより得られる。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列がプローブにより検出されると、ポリヌクレオチドは当業者に知られている技法を用いることによって同定され、又はクローン化され得る（例えば、J. Sambrook,など, 1989,前記を参照のこと）。
【００８７】
本発明のポリペプチドはまた、もう１つのポリペプチドがそのポリペプチド又はそのフラグメントのN−末端又はC−末端で融合されている、融合されたポリペプチド又は分解できる融合ポリペプチドを包含する。融合されたポリペプチドは、もう１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその一部）を、本発明のヌクレオチド配列（又はその一部）に融合することによって生成される。融合ポリペプチドを生成するための技法は、当業界において知られており、ポリペプチドをコードするコード配列の連結を包含し、その結果、それらは読み取り枠を整合して存在し、そして融合されたポリペプチドの発現は、同じプロモーター及びターミネーターの制御下にある。
【００８８】
ポリヌクレオチド：
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドにも関する。好ましい観点においては、前記ヌクレオチド配列は配列番号４で示される。もう１つの好ましい観点においては、前記ヌクレオチド配列は配列番号４の成熟ポリペプチドコード領域である。本発明はまた、遺伝子コードの縮重により、配列番号４とは異なる、配列番号５のアミノ酸配列、又はその成熟ポリペプチドを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本発明はまた、プロテアーゼ活性を有する配列番号５のフラグメントをコードする配列番号４の副配列にも関する。
【００８９】
本発明はまた、配列番号４の成熟ポリペプチドコード配列に少なくとも１つの突然変異を含んで成る変異体ポリヌクレオチドにも関し、ここで前記変異体ヌクレオチド配列は、配列番号２のアミノ酸２〜148から成るポリペプチドをコードする。
【００９０】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離し、又はクローン化するために使用される技法は、当業界において知られており、そしてゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、又はそれらの組み合わせを包含する。そのようなゲノムDNAからの本発明のポリヌクレオチドのクローニングは、例えば良く知られているポリメラーゼ鎖反応（PCR）、又は共有する構造特徴を有するクローン化されたDNAフラグメントを検出するために発現ライブラリーの抗体スクリーニングを用いることによってもたらされ得る。例えば、Innisなど., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application; Academic Press, New York を参照のこと。他の核酸増幅方法、例えばリガーゼ鎖反応（LCR）、連結された活性化転写（LAT）及び核酸配列に基づく増幅（NASBA）が使用され得る。ポリヌクレオチドは、アスペルギラス、又は他の又は関連する生物からクローン化され得、そして従って、ヌクレオチド配列のポリペプチドコード領域の対立遺伝子又は種変異体であり得る。
【００９１】
本発明はまた、配列番号４の成熟ポリペプチドコード配列（すなわち、ヌクレオチド４〜518）に対して、少なくとも60％、好ましくは少なくとも65％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくも80％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは95％、及び最も好ましくは少なくとも97％の程度の同一性を有する活性ポリペプチドをコードするヌクレオチドにも関する。
【００９２】
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の修飾は、そのポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドの合成のために必要である。用語、ポリペプチドに“実質的に類似する”とは、ポリペプチドの天然に存在しない形を言及する。それらのポリペプチドは、その天然源から単離されたポリペプチドとは、いくつかの構築された態様で異なり、例えば非活性、熱安定性、pH最適性又は同様のものにおいて異なる変異体であり得る。
【００９３】
変異体配列は、配列番号４のポリペプチドコード部分として提供されるヌクレオチド配列、例えばその副配列に基づいて、及び/又はヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのもう1つのアミノ酸配列を生ぜしめないが、しかし酵素の生成のために意図された宿主生物のコドン使用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なったアミノ酸配列を生ぜしめることができるヌクレオチド置換の導入により構成され得る。ヌクレオチド置換の一般的記載のためには、Fordなど., 1991, Protein Expression and Purification 2:95-107を参照のこと。
【００９４】
そのような置換は、分子の機能に対して決定的である領域外で行われ、そしてさらに活性ポリペプチドをもたらすことは、当業者に明らかであろう。本発明の単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの活性に必須であり、そして従って、好ましくは置換を受けやすくないアミノ酸残基は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発に従って同定され得る（例えば、Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085を参照のこと）。
【００９５】
後者の技法においては、突然変異は分子における正に荷電された残基ごとに導入され、そしてその得られる変異体分子は、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するためにプロテアーゼ活性について試験される。基質−酵素相互作用の部位はまた、核磁気共鳴分析、クリスタログラフィー又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、立体構造体の分析により決定され得る（例えば、de Vos など., 1992, 前記; Smith など., 1992,前記; Wlodaver など., 1992, 前記を参照のこと）。
【００９６】
本発明はまた、配列番号４のヌクレオチド４〜518、その相補的鎖；又はその対立遺伝子変異体及び副配列に対しいて、中位の緊縮条件、より好ましくは中くらいの高い緊縮条件、さらにより好ましくは高い緊縮条件、及び最も好ましくは非常に高い緊縮条件下でハイブリダイズする（Sambrookなど., 1989、前記）、本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。
【００９７】
核酸構造体：
本発明はまた、制御配列と適合できる条件下で、適切な宿主細胞におけるコード配列の発現を指図する１又は複数の制御配列に作用可能に連結される本発明の単離されたポリヌクレオチドを含んで成る核酸構造体にも関する。
【００９８】
本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を提供するために種々の手段で操作され得る。ベクター中へのその挿入の前、ポリヌクレオチド配列の操作は、発現ベクターに依存して、所望されるか又は必要とされる。組換えDNA方法を用いてポリヌクレオチド配列を修飾するための技法は、当業界において良く知られている。
【００９９】
制御配列は、適切なプロモーター配列、すなわち本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞により認識されるヌクレオチド配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含む。プロモーターは、宿主細胞において転写活性を示すいずれかのヌクレオチド配列、例えば変異体の、切断された、及びハイブリッドのプロモーターであり得、そして宿主細胞に対して相同であるか又は異種である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。
【０１００】
糸状菌宿主細胞における本発明の核酸構造体の転写を方向づけるための適切なプロモーターの例は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ  アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・アワモリグルコアミラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、アスペルギラス・オリザエ  アルカリプロテアーゼ、アスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアセトアミダーゼ、フサリウム・ベネナタムアミログルコシダーゼ（WO00/56900号）、フサリウム・ベネナタムDaria（WO00/56900号）、フサリウム・ベネナタムQuinm（WO00/56900号）、フサリウム・オキシスポラムトリプシン様プロテアーゼ（WO96/00787号）、トリコダーマ・レセイβ−グルコシダーゼ、トリコダーマ・レセイセロビオヒドロラーゼI、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼI、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼII、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼIII 、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼIV、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼV、トリコダーマ・レセイキシラナーゼI、トリコダーマ・レセイキシラナーゼII、トリコダーマ・レセイβ−キシロシダーゼ、並びにNA2-tpiプロモーター（アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ及びアスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッ）ド、及びそれらの変異体の切断され、及びハイブリッドのプロモーターである。
【０１０１】
酵母宿主においては、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO−１）、サッカロミセス・セレビシアエガラクトキナーゼ（GAL１）、サッカロミセス・セレビシアエアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH1、ADH2/GAP）、サッカロミセス・セレビシアエトリオースホスフェートイソメラーゼ(TPI)、サッカロミセス・セレビシアエ金属チオニン(CUP1)、サッカロミセス・セレビシアエ３−ホスホグリセレートキナーゼ及びピチア・パストリスアルコールオキシダーゼ(AOX1)から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Romunosなど., 1992, Yeast8：423−488により記載される。
【０１０２】
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結するために宿主細胞により認識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の3’側末端に作用可能に連結される。選択の宿主細胞において機能的であるいずれかのターミネーターが本発明において使用され得る。
【０１０３】
糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼ及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼについての遺伝子から得られる。
【０１０４】
酵母宿主細胞のための好ましいターミネーターは、サッカロミセス・セレビシアエエノラーゼ、サッカロミセス・セレビシアエチトクロムC（CYC１）、及びサッカロミセス・セレビシアエグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼについての遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、Romanosなど., 1992, 前記により記載される。
【０１０５】
制御配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち宿主細胞による翻訳のために重要であるmRNAの非翻訳領域でもあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5’末端に作用可能に連結される。選択の宿主細胞において機能的であるいずれかのリーダー配列が、本発明において使用され得る。
【０１０６】
糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランストリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子から得られる。
【０１０７】
酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、サッカロミセス・セレビシアエエノラーゼ（ENO−１）、サッカロミセル・セレビシアエ３−ホスホグリセレートキナーゼ、サッカロミセス・セレビシアエα−因子及びサッカロミセス・セレビシアエアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH2/GAP）についての遺伝子から得られる。
【０１０８】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわちヌクレオチド配列の3’末端に操作可能に連結され、そして転写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するためにシグナルとして宿主細胞により認識される配列でもあり得る。選択の宿主細胞において機能的であるいずれかのポリアデニル化配列が，本発明において使用される。
【０１０９】
糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギキラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、フサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼ及びアスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼについての遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990により記載されている。
【０１１０】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードし、そしてそのコードされたポリペプチドを細胞の分泌路中に方向づけるシグナルペプチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列の5’側末端は、本来、分泌されたポロペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み取り枠を整合して、天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。他方では、コード配列の5’側末端は、そのコード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。そのコード配列が天然において、シグナルペプチドコード領域を含まない外来性シグナルペプチドコード領域が必要とされる。他方では、外来性シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの増強された分泌を得るために、天然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換することができる。しかしながら、分泌路中に発現されたポリペプチドを方向づけるいずれかのシグナルペプチドコード領域が、本発明に使用され得る。
【０１１１】
糸状菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガー中性アミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイアスペラギン酸プロテイナーゼ、ヒューミコラ・インソレンスセルラーゼ、ヒューミコラ・インソレンスエンドグカナーゼV及びヒューミコラ・ラヌギノサリパーゼについての遺伝子から得られたシグナルペプチドコート領域である。
【０１１２】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシアエα−因子及びサッカロミセル・セレビシアエインバーターゼについての遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Romanos など., 1992, 前記により記載される。
【０１１３】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端で位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は多くの場合、チモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは一般的に不活性であり、そしてプロポリペプチドからプロペプチドの触媒又は自己触媒分解により成熟した活性ポリペプチドに転換され得る。プロペプチドコード領域は、バチルス・サブチリスアルカリプロテアーゼ（aprE）、バチルス・サブチリス中性プロテアーゼ（nprT）、サッカロミセス・セレビシアエα−因子、リゾムコル・ミエヘイ  アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、及びミセリオプソラ・サーモフィリア  ラッカーゼについての遺伝子から得られる（WO95/33836号）。
【０１１４】
シグナルペプチド及びプロペプチド領域の両者がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、そのプロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そしてシグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
【０１１５】
宿主細胞の増殖に関して、ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することがまた所望される。調節システムの例は、調節化合物の存在を包含する、化学的又は物理的刺激に応答して、遺伝子の発現の開始又は停止を引き起こすそれらのシステムである。酵母においては、ADH2システム又はGAL1システムが使用され得る。糸状菌においては、TAKAα−アミラーゼプロモーター、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼプロモーター及びアスペルギラス・オリザエグルコアミラーゼプロモーターが、調節配列として使用さえ得る。調節配列の他の列は、遺伝子増幅を可能にするそれらの配列である。真核システムにおいては、それらはメトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及び重金属と共に増幅されるメタロチオネイン遺伝子を包含する。それらの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列が、調節配列により作用可能に連結される。
【０１１６】
発現ベクター：
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記の種々の核酸及び制御配列は、１又は複数の便利な制限部位でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入又は置換を可能にするためにそれらの部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、本発明のヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列又は前記配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、そのコード配列はベクターに位置し、その結果、コード配列は発現のための適切な制御配列により作用可能に連結される。
【０１１７】
組換え発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられ得、そしてヌクレオチド配列の発現をもたらすことができるいずれかのベクター（例えば、プラスミド又はウィルス）であり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入される予定である宿主細胞とベクターとの適合性に依存するであろう。ベクターは、線状又は閉環された環状プラスミドであり得る。
【０１１８】
ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色体存在物として存在するベクター（その複製は染色体複製には無関係である）、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニクロモソーム又は人工染色体であり得る。ベクターは自己複製を確かめるためのいずれかの手段を含むことができる。他方では、ベクターは、糸状菌細胞中に導入される場合、ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。さらに、宿主細胞のゲノム中に導入される全DNA又はトランスポゾンを一緒に含む、単一のベクター又はプラスミド、又は複数のベクター又はプラスミドが使用され得る。
【０１１９】
本発明のベクターは好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、１つの遺伝子であり、その生成物は、殺生物剤又はウィルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養要求性、及び同様のものを提供する。
【０１２０】
酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1及びURA3である。糸状菌宿主細胞に使用するための選択マーカーは、次の群から選択されるが、但しそれらだけには限定されない；amdS (アセトアミダーゼ)、argB (オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar (ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hph (ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD (硝酸レダクターゼ)、pyrG (オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ)、sC (硫酸アデニルトランスフェラーゼ) 及びtrpC (アントラニル酸シンターゼ)、並びにそれらの同等物。アスペルギラス・ニジュランス又はアスペルギラス・オリザエのamdS及びpyrG遺伝子及びストレプトミセス・ヒグロスコピカスのbar遺伝子が、アスペルギラス細胞への使用のために好ましい。
【０１２１】
本発明のベクターは好ましくは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの安定した組み込み、又は細胞のゲノムに無関係に細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする要素を含む。
【０１２２】
宿主細胞のゲノム中への組み込みのためには、ベクターは、相同又は非相同組換えによるゲノム中へのベクターの安定した組み込みのためのベクター中のポリペプチド、又はいずれか他の要素をコードするポリヌクレオチド配列に依存する。他方では、ベクターは、染色体における正確な位置で、宿主細胞のゲノム中への相同組換えによる組み込みを方向づけるための追加のヌクレオチド配列を含むことができる。正確な位置での組み込みの可能性を高めるために、組み込み要素は好ましくは、相同組換えの可能性を高めるためにその対応する標的配列と高い程度の同一性を示す十分な数の核酸、例えば100〜10,000個の塩基対、好ましくは400〜10,000個の塩基対、及び最も好ましくは800〜10,000個の塩基対を含むべきである。組み込み要素は、宿主細胞のゲノムにおける標的配合と相同であるいずれかの配列であり得る。さらに、組み込み要素は、非コード又はコードヌクレオチド配列であり得る。他方では、ベクターは非相同組換えにより宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
【０１２３】
自律複製のためには、ベクターはさらに、問題の宿主細胞においてのベクターの自律的な複製を可能にする複製の起点を含んで成る。複製の起点は、細胞において機能する自律複製を仲介するいずれかのプラスミド複製体であり得る。用語“複製の起点”又は“プラスミド複製体”とは、本明細書においては、プラスミド又はベクターのインビボでの複製を可能にするヌクレオチド配列として定義される。
【０１２４】
酵母宿主細胞への使用のための複製の起点の例は、複製の２ミクロン起点、すなわちARS1, ARS4, ARS1及びCEN3の組み合わせ、及びARS4及びCEN6の組み合わせである。
糸状菌細胞において有用な複製の起点の例は、AMA1及びANS1である（Gems など., 1991 , Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883号）。AMA1遺伝子の単離及び前記遺伝子を含んで成るプラスミド又はベクターの構成は、WO00/24883号に開示される方法に従って達成され得る。
【０１２５】
本発明のポリヌクレオチドの１以上のコピーが、遺伝子生成物の生成を高めるために宿主細胞中に挿入され得る。ポリヌクレオチドのコピー数の上昇は、宿主細胞ゲノム中に配列の少なくとも１つの追加のコピーを組み込むことによって、又はポリヌクレオチドと共に増幅可能な選択マーカー遺伝子を含むことによって得られ、ここで細胞は選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含み、そしてそれにより、ポリヌクレオチドの追加のコピーが、適切な選択剤の存在下で前記細胞を培養することによって選択され得る。
本発明の組換え発現ベクターを構成するために上記要素を連結するために使用される方法は、当業者に良く知られている（例えば、Sambrookなど., 1989, 前記を参照のこと）。
【０１２６】
宿主細胞；
本発明はまた、ポリペプチドの組換え生成において都合良く使用される、本発明のポリヌクレオチドを含んで成る組換え宿主にも関する。本発明のポリヌクレオチドを含んで成るベクターは、そのベクターが染色体組み込み体として、又は前記のような自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入される。用語“宿主細胞”とは、複製の間に生じる突然変異のために、親細胞と同一ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその源に、かなりの程度依存するであろう。
【０１２７】
宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は単細胞微生物、真核生物であり得る。
宿主細胞は、真核生物、例えば哺乳類、昆虫、植物、又は菌類細胞であり得る。
【０１２８】
好ましい態様においては、宿主細胞は菌類細胞である“菌類”とは、本明細書において使用される場合、門アスコミコタ（Ascomycota）、バシジオミコタ（Basidiomycota）、キトリジオミコタ（Chytridiomycota）及びヅイゴミコタ（Zygomycota）（Hawksworth など., Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義される）、及びオーミコタ（Oomycota）（Hawksworth など., 1995, 前記、171ページに引用される）、並びに栄養胞子菌（Hawksworh など., 1995, 前記）を包含する。
【０１２９】
より好ましい態様においては、菌類宿主細胞は酵母細胞である“酵母”とは、本明細書において使用される場合、子嚢胞子酵母（Endomycetals）、担子胞子酵母、及び不完全菌類（Blastomycetes）に属する酵母を包含する。酵母の分類は未来において変化し得るので、本発明のためには、酵母は、Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds. Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980) に記載のようにして定義されるであろう。
【０１３０】
さらにより好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、カンジダ（Candida）、ハンセヌラ（Hunsenula）、クレベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）又はヤロウィア（Yarrowia）である。
【０１３１】
最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カルスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyses cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイビリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensisi）、又はサッカロミセス・オビホルミス（Saccharomyces oviformis）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、クルベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）である。もう１つの最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、ヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）細胞である。
【０１３２】
もう１つのより好ましい態様においては、菌類宿主細胞は糸状菌細胞である。“糸状菌”とは、ユーミコタ（Eumycota）及びオーミコタ（Oomycota）のすべての糸状形を包含する（Hawksworthなど., 1995, 前記により定義されるような）。糸状菌は一般的に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複合多糖類から構成される菌子体壁により特徴づけられる。成長増殖は、菌子拡張によってであり、そして炭素代謝は絶対好気性である。対照的に、酵母、例えばサッカロミセス・セレビシアエによる成長増殖は、単細胞葉状体の発芽によってであり、そして炭素代謝は発酵性である。
【０１３３】
さらにより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、アウレオバシジュウム（Aureobasidium）、ベルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、コプリナス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、クリプトコーカス（Cryptococcus）、フィロバシジウム（Filobasidium）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、マグナポルセ（Magnaporthe）、ムコル（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ネオカリマスチックス（Neocallimastix）、ネウロスポラ（Neurospora）、、パエシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicilium）、ファネロカエト（Phanerochaete）、フェビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）又はトリコダーマ（Trichoderma）の種の細胞であるが、但しそれらだけには限定されない。
【０１３４】
最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アスペルギラス・アワモリ、アスペルギラス・フミガタス、アスペルギラス・ホエチダス、アスペルギラス・ジャポニカ、アスペルギラス・ニジュランス、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・オリザエ細胞である。
【０１３５】
もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、フサリウム・バクトリジオイデス、フサリウム・クロックウェレンズ 、フサリウム・セレアリス、フサリウム・クルモラム、フサリウム・グラミネアラム、フサリウム・グラミナム、フサリウム・ヘテロスポラム、フサリウム・ネグンジ、フサリウム・オキシスポラム、フサリウム・レチキュラタム、フサリウム・ロゼウム、フサリウム・サムブシウム、フサリウム・サルコクロウム、フサリウム・ソラニ、フサリウム・スポロトリキオイデス、フサリウム・スルフレウム、フサリウム・トルロサム、フサリウム・トリコセシオイデス又はフサリウム・ベネナタム細胞である。
【０１３６】
さらに最も好ましい観点においては、糸状菌親宿主細胞は、ベルカンデラ・アダスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）又はセリポリオプシス・スベルミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、コプリナス・シネレス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ヒルスタス（Coriolus hirsutus）、ヒューミコラ・インソレンス、ヒューミコラ・ラヌギノサ、ムコル・ミエヘイ、ミセリオプソラ・サーモフィリア、ネウロスポラ・クラサ、ペニシリウム・プルプロゲナム、ファネロカエト・キソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フェビア・ラジアタ（Phlebia radiata）、プレウロタス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、チエラビア・テレストリス、トラメテス・ビロサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）、トリコダーマ・ハルジアナム、トリコダーマ・コニンギ、トリコダーマ・ロンジブラキアタム、トリコダーマ・レセイ又はトリコダーマ・ビリデ細胞である。
【０１３７】
菌類細胞は、プロトプラスト形質転換、プロトプラストの形質転換、及びそれ自体知られている態様での細胞壁の再生を包含する工程により形質転換され得る。アスペルギラス及びトリコダーマ宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許第238023号及びYeltonなど., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81; 1474-1874に記載される。
【０１３８】
フラリウム種を形質転換するための適切な方法は、Malardierなど., 1989, Gene78: 147-156, 及びWO96/00787号により記載される。酵母は、Becker and Guarente. In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito など, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; 及びHinnen など, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75; 1920により記載される方法を用いて形質転換され得る。
【０１３９】
生成方法：
本発明はまた、（ａ）その野生型において、前記ポリペプチドの生成の助けと成る条件下でポリペプチドを生成することができる細胞を培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドの生成方法にも関する。好ましくは、細胞は、アスペルギラス属、及びより好ましくは、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・オリザエのものである。
【０１４０】
本発明はまた、（a）ポリペプチドの生成を助ける条件下で宿主細胞を培養し；そして（b）ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。
【０１４１】
本発明はまた、（a）ポリペプチドの生成を助ける条件下で宿主細胞を培養し；そして（b）ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関し、ここで前記宿主細胞は配列番号４の成熟ポリペプチドコード領域に少なくとも１つの突然変異を有する変異体ヌクレオチド配列を含んで成り、ここで前記変異体ヌクレオチド配列は配列番号５のアミノ酸２〜148から成るポリペプチドをコードする。
【０１４２】
本発明の生成方法においては、細胞は、当業界において知られている方法を用いて、ポリペプチドの生成のために適切な栄養培地において培養される。例えば、細胞は、ポリペプチドの発現及び/又は単離を可能にする、適切な培地において、及び条件下で行われる実験室用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給バッチ、又は団体状態発酵を包含する）により培養され得る。培養は、炭素及び窒素源及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において、当業界において知られている方法を用いて行われる。適切な培地は、市販されているか、又は公開されている組成（例えば、American Type Culture Collection のカタログにおける）に従って調製され得る。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接的に回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収され得る。
【０１４３】
ポリペプチドは、そのポリペプチドに対して特異的である、当業界において知られている方法を用いて検出され得る。それらの検出方法は、特定の抗体、ポリペプチド生成物の形成、又は酵素基質の消出の使用を包含する。例えば、酵素アッセイは、本明細書に記載されるようなポリペプチドの活性を決定するために使用され得る。
【０１４４】
得られるポリペプチドは、当業界において知られている方法により回収され得る。例えば、ポリペプチドは、従来の方法、例えば遠心分離、濾過、抽出、噴霧−乾燥、蒸発又は沈殿（但し、それらだけには限定されない）により、栄養培地から回収され得る。
【０１４５】
本発明のポリペプチドは、当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動）、示差溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、SDS−PAGE又は抽出（但し、それらだけには限定されない）により精製され得る（例えば、Protein Purification, J.C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publlishers, New York, 1989を参照のこと）。
【０１４６】
植物：
本発明はまた、ポリペプチドを、回収できる量で発現し、そして生成するために、本発明のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列により形質転換されているトランスジェニック植物、その植物部分又は植物細胞にも関する。ポリペプチドは、植物又は植物部分から回収され得る。他方では、組換えポリペプチドを含む植物又は植物部分は、食物又は飼料の品質を改良し、例えば栄養価値、嗜好性及び流動性質を改良するために、又は抗栄養因子を破壊するために使用され得る。
【０１４７】
トランスジェニック植物は、双子葉植物又は単子葉植物であり得る。単子葉植物の例は、草、例えば湿潤地の草本（ブルーグラス、イチゴツナギ属）、飼草、例えばウシノケグサ、ドクムギ、温帯性草本、例えばヌカボ、及び穀類、例えば小麦、オート麦、ライ麦、イネ、モロコシ、及びトウモロコシ（サトウモロコシ）である。
【０１４８】
双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物、例えばルピナス、ジャガイモ、砂糖大根、エンドウ、インゲン豆及び大豆、及びアブラナ科植物（ブラシカセアエ科（Brassicaceae））、例えばカリフラワー、ナタネ種子及び密接に関連するモデル生物アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）である。
【０１４９】
植物部分の例は、茎、カルス、葉、根、果物、種子及び塊茎、並びにそれらの部分を含んで成る個々の組織、例えば表皮、葉肉、柔組織、維管束組織、分裂組織である。また特定の植物細胞区画、例えばクロロプラスト、アポプラスト、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシゾーム及び細胞質が、植物部分であると思われる。さらに、組織起源が何であろうと、いずれの植物細胞でも、植物部分であると思われる。同様に、植物部分、例えば本発明の利用を促進するために単離された特定の組織及び細胞はまた、植物部分、例えば胚、内生精子、アリューロン及び被膜であると思われる。
【０１５０】
そのような植物、植物部分及び植物細胞の子孫はまた、本発明の範囲内に包含される。
本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物又は植物細胞は、当業界において知られている方法に従って構成され得る。手短には、植物又は植物細胞は、本発明のポリペプチドをコードする、１又は複数の発現構造体を、植物宿主ゲノム中に導入し、そして得られる修飾された植物又は植物細胞をトランスジェニック植物又は植物細胞中に成長せしめることによって構成される。
【０１５１】
便利には、発現構造体は、選択の植物又は植物におけるヌクレオチド配列の発現のために必要とされる適切な調節配列により作用可能に連結される本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んで成る核酸構造体である。さらに、発現構造体は、発現構造体が組み込まれている宿主細胞を同定するために有用な選択マーカー、及び問題の植物中への構造体の導入のために必要なDNA配列を含んで成る（後者は、使用されるDBA導入方法に依存する）。
【０１５２】
調節配列、例えばプロモーター及びターミネーター配列、及び任意には、シグナル又はトランスジット配列の選択は、例えばポリペプチドがいつ、どこで及びいかにして発現されることを所望するかに基づかれる。例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、構成的又は誘発的であり、又は進行的、段階又は組織特異的であり、そして遺伝子生成物は、特定組織又は植物部分、例えば種子又は葉に標的化され得る。調節配列は、Taqueなど., 1988, Plant Physiology 86: 506により記載される。
【０１５３】
構成的発現のために、次のプロモーターが使用され得る：35S−CaMVプロモーター（Franck など., 1980, Cell 21: 285-294）、トウモロコシユビキチン１（Christensen AH, Sharrock RA and Quail 1992. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation）、又はイネアクチン１プロモーター（Plant Mo. Biol. 18,675-689. ; Zhang W, McElroy D. and Wu R 1991, Analysis of rice Act1 5'region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3,1155-1165）。
【０１５４】
器官特異的プロモーターは例えば、貯蔵吸込み組織、例えば種子、ジャガイモ塊茎及び果物（Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303）、又は代謝吸込み組織、例えば分裂組織（Ito など., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878）からのプロモーター、種子特異的プロモーター、例えばイネからのグルテリン、プロラミン、グロブリン又はアルブミンプロモーター（Wu など., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885- 889）、Vicia fabaからのレグニンB4及び未知の種子タンパク質遺伝子からのVicia fabaプロモーター（Conrad など., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711）、種子油体タンパク質からのプロモーター（Chen など., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941）、ブラシカ・ナパス（Brassica napus）からの貯蔵タンパク質napAプロモーター又は当業界において知られている、例えばWO91/14772号に記載されるようないずれか他の種子特異的プロモーターであり得る。
【０１５５】
さらに、プロモーターは、葉特異的プロモーター、例えばイネ又はトマトからのrbcsプロモーター（Kyozuka など., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000）、クロレラウィルスアデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93）、又はイネからのaldP遺伝子プロモーター（Kagaya など., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674）、又は創傷誘発性プロモーター、例えばジャガイモpin2プロモーター（Xu など., 1993, Plant Molecular Biology 22 : 573-588）であり得る。同様に、プロモーターは、非生物学的処理、例えば温度、渇水又は塩分の変更により誘発できるか、又はプロモータを活性化する外部的に適用される物質、例えばエタノール、エストロゲン、植物ホルモン様エチレン、アブシジン酸、ジベレリン酸及び/又は重金属により誘発できる。
【０１５６】
プロモーターエンハンサー要素がまた、植物におけるポリペプチドのより高い発現を達成するために使用され得る。例えば、プロモーターエンハンサー要素は、プロモーターと、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に位置するイントロンであり得る。例えば、Xuなど., 1993（前記）は、発現を増強するためへのイネアクチン１遺伝子の最初のイントロンの使用を開示する。
【０１５７】
発現構造体の選択マーカー遺伝子及びいずれか他の部分は、当業界において入手できるそれらから選択され得る。
核酸構造体は、当業界において知られている従来の技法、例えばアグロバクテリウム介在性形質転換、ウィルス介在性形質転換、マイクロインジェクション、粒子衝撃、バイオリステック形質転換及びエレクトロポレーションに従って、植物ゲノム中に組込まれる（Gasserなど., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, BiolTechnology 8 : 535; Shimamoto など., 1989, Nature 338: 274）。
【０１５８】
現在、アグロバクテリウム・ツメファシエンス介在性遺伝子トランスファーは、トランスジェニック双子葉類を生成するための選択方法であり（再考のためには、Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38を参照のこと）、そして、それはまた、単子葉類を形質転換するためにも使用され得るが、しかし他の形質転換方法が一般的にそれらの植物のために好ましい。現在、アグロバクテリウムアプローチを補足する、トランスジェニック単子葉類を生成するための選択方法は、胚細胞又は成長胚の粒子衝撃である（形質転換DNAにより被覆された微小金又はタングステン粒子）（Christou, 1992, Plant Journal 2 : 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil など., 1992, BiolTechnology 10: 667-674）。単子葉類の形質転換のための他の方法は、Omirullehなど., 1993, Plant Molecular Biology21: 415-428により記載されるようにプロトプラスト形質転換に基づかれる。
【０１５９】
形質転換に続いて、そこに組込まれた発現構造体を有する形質転換体が選択され、そして当業界において良く知られていた方法に従って、完全な植物に再生される。しばすば、形質転換方法は、２種の別々のT-DNA構造体による同時形質転換を用いることによる、再生の間又は次の生成において、選択遺伝子の選択的排除、又は特異的組換え酵素による選択遺伝子の部位特異的排除のために企画される。
【０１６０】
本発明はまた、（ａ）本発明のプロテアーゼ活性有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成るトランスジェニック植物又は植物細胞を、前記ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で栽培し、そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。
【０１６１】
プロテアーゼ活性の除去又は低減：
本発明はまた、同じ条件下で培養される場合、親細胞よりもポリペプチドを低く生成する変異体細胞をもたらす、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列又はその一部を破壊するか又は削除することを含んで成る、親細胞の変異体の生成方法にも関する。
【０１６２】
変異体細胞は、当業界において良く知られている方法、例えば挿入、破壊、置換又は欠失を用いて、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を低めるか又は排除することにより構成され得る。好ましい観点においては、ヌクレオチド配列は不活性化される。修飾されるか又は不活性化されるヌクレオチド配列は、例えば活性のために必須であるコード領域又はその一部、又はコード領域の発現のために必要とされる調節要素であり得る。そのような調節又は制御配列の例は、プロモーター配列又はその機能的部分、すなわちヌクレオチド配列の発現に影響を及ぼすのに十分である部分であり得る。可能な修飾のための他の制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、転写ターミネーター、及び転写活性化因子を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１６３】
ヌクレオチド配列の修飾又は不活性化は、親細胞を突然変異誘発にゆだね、そしてヌクレオチド配列の発現が低められているか又は排除されている変異体細胞を選択することにより行われ得る。特異的又はランダムであり得る突然変異誘発は、例えば適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の使用により、適切なオリゴヌクレオチドの使用により、又はDNA配列をPCR生成された突然変異誘発にゆだねることにより行われ得る。さらに、突然変異誘発は、それらの突然変異誘発剤のいずれかの組み合わせの使用により行われ得る。
【０１６４】
本発明のために適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の例は、紫外線（UV）照射、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（MNNG）、O−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（EMS）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチド類似体を包含する。
【０１６５】
そのような剤が使用される場合、突然変異誘発は典型的には、選択の突然変異誘発の存在下で突然変異誘発されるベき親細胞をインキュベートし、そして低められた遺伝子の発現を示すか又は発現を示さない変異体細胞をスクリーニングし、そして/又は選択することによって行われる。
【０１６６】
ヌクレオチド配列の修飾又は不活性化は、その転写又は翻訳のために必要とされる遺伝子又は調節要素における１又は複数のヌクレオチドの導入、置換又は除去により達成され得る。例えば、ヌクレオチドは、停止コドン導入、開始コドンの除去又は読み取り枠の変更をもたらすために、挿入され又は除去され得る。そのような修飾又は不活性化は、当業者において知られている方法に従って、特定部位の突然変異誘発又はPCR生成された突然変異誘発により達成され得る。主に、修飾はインビボで、すなわち修飾されるべきヌクレオチド配列を発現する細胞に対して直接的に行われ得るが、修飾は下記に例示されるようにインビトロで行われ得ることが好ましい。
【０１６７】
細胞によるヌクレオチド配列の発現を排除するか又は低めるための便利な手段の例は、遺伝子置換、遺伝子削除又は遺伝子破壊の技法に基づかれる。例えば、遺伝子破壊方法においては、内因性ヌクレオチドに対応する核酸配列が、欠失遺伝子を生成するために、親細胞を形質転換する欠失性核酸配列を生成するようインビトロで突然変異誘発される。相同組換えにより、その欠失性核酸配列は、その内因性遺伝子又は遺伝子フラグメントを置換する。その欠失性ヌクレオチド配列はまた、ヌクレオチド配列が修飾されているか又は破壊されている形質転換体の選択のために使用され得るマーカーをコードする。特に好ましい観点においては、ヌクレオチド配列は、選択マーカー、例えば本明細書に記載されるようなそれらにより破壊される。
【０１６８】
他方では、ヌクレオチド配列の修飾又は不活性化は、ヌクレオチド配列に対して相補的な配列を用いて、確立されたアンチセンス技法により行われ得る。より特定には、細胞によるヌクレオチド配列の発現は、細胞において転写され得、そして細胞において生成されるポリペプチドmRNAに対してハイブリダイズすることができる遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を導入することによって低められるか又は排除され得る。相補的アンチセンスヌクレオチド配列のポリペプチドmRNAへのハイブリダイズを可能にする条件下で、翻訳されるタンパク質の量が低められ又は排除される。
【０１６９】
本発明はさらに、親細胞よりもポリペプチドを少なく生成する変異体細胞をもたらす、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はその制御配列の破壊又は欠失を含んで成る親細胞の変異体細胞に関する。
【０１７０】
そのようにして創造されたポリペプチド欠失変異体細胞は、相同及び/又は異種ポリペプチドの発現のための宿主として特に有用である。本発明のプロテアーゼが不十分である宿主細胞において発現される相同及び/又は異種ポリペプチドのより高い収率が、同じ宿主細胞であるが、しかし正常レベルの本発明のプロテアーゼを有する細胞におけるその対応する収率に比較して、得られることが見出された。従って、本発明はさらに、（ａ）ポリペプチドの生成のために適切な条件下で変異体細胞を培養し；そして（ｂ）ポリペプチドを回収することを含んで成る、相同体又は異種ポリペプチドの生成方法に関する。用語“異種ポリペプチド”とは、宿主細胞に対して生来ではないポリペプチド、生来の配列を変更するために修飾が行われている生来のタンパク質、又はその発現が組換えDNA技法による宿主細胞の操作の結果として定量的に変更されている生来のタンパク質として本明細書において定義される。
【０１７１】
本発明のポリペプチドは、１つのドメインがCBMC（炭水化物結合分子）である、複数のドメインを含んで成る少なくともいくつかのポリペプチドのCBMの切断を担当できることが見出された。従って、さらなる観点においては、本発明は、１つのドメインがCBMである、複数のドメインを含んで成るポリペプチドを含んで成るタンパク質生成物の生成方法に関し、ここで前記方法は、本発明のポリペプチドの低められた発現を有する、複数のドメインを含んで成る前記ポリペプチドを生成する細胞を発酵し、そして発酵ブイヨンから生成物を回収し、そして任意には、回収された生成物を、さらなる精製にゆだねることを含んで成る。
【０１７２】
さらなる観点においては、本発明は、本発明のポリペプチド及び興味あるタンパク質生成物の両者を生成する細胞の発酵により本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を実質的に有さないタンパク質生成物の生成方法に関し、ここで前記方法は、発酵が完結される前、その間、又は完結された後、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害することができる、有効量の剤を、発酵ブイヨンに添加し、その発酵ブイヨンから興味ある生成物を回収し、そして任意には、回収された生成物を、さらなる精製にゆだねることを含んで成る。
【０１７３】
さらなる観点においては、本発明は本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を実質的に有さないタンパク質生成物の生成方法に関し、ここで前記方法は、細胞を、生成物の発現を可能にする条件下で培養し、プロテアーゼ活性を実質的に低めるために、前記得られる培養物ブイヨンを、組み合わされたpH及び温度処理にゆだね、そして培養物ブイヨンから生成物を回収することを含んで成る。他方では、前記組み合わされたpH及び温度処理は、培養物ブイヨンから回収された酵素調製物に対して行なわれ得る。前記組み合わされたpH及び温度処理は任意には、プロテアーゼインヒビターによる処理と組合して使用され得る。
【０１７４】
本発明のこの観点によれば、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性の少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、好ましくは少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％、さらにより好ましくは少なくとも98％、及び最も好ましくは少なくとも99％を除去することが可能である。
【０１７５】
興味ある生成物の培養及び精製のために使用される方法は、当業界において知られている方法により行われ得る。
【０１７６】
プロテアーゼを実質的に有さない生成物、又は１つのドメインがCBMである、複数のドメインを含んで成るポリペプチドを含んで成る生成物（ここでCBMを有さない前記ポリペプチドの量は相当に低い）を生成するための本発明の方法は、真核生物ポリペプチド、特に菌類タンパク質、例えば酵素の生成において特に興味あるものである。前記酵素は、例えば澱粉分解酵素、脂肪分解酵素、タンパク質分解酵素、細胞分解酵素、オキシドレダクターゼ又は植物細胞壁分解酵素から選択され得る。
【０１７７】
そのような酵素の例は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン、グルコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼを包含する。プロテアーゼ欠失細胞はまた、医薬的に興味あるもの、例えばホルモン、成長因子、受容体及び同様のものの異種タンパク質を発現するために使用され得る。
【０１７８】
用語“真核生物ポリペプチド”とは、生来のポリペプチドのみだけではなく、またアミノ酸置換、欠失又は付加、又は活性、熱安定性、pH耐性及び同様のものを増強するための他のそのような修飾により修飾されているそれらのポリペプチド、例えば酵素を包含する。
もう１つの観点においては、本発明は、本発明の方法により生成される、プロテアーゼ活性を実質的に有さないタンパク質生成物に関する。
【０１７９】
組成物：
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含んで成る組成物にも関する。好ましくは、組成物はそのようなポリペプチドにおいて富化される。用語“富化される”とは、組成物中のプロテアーゼ活性が、少なくとも1.1の富化因子、高められていることを示す。
【０１８０】
組成物は、主要酵素成分、例えば単一成分組成として本発明のポリペプチドを含んで成る。他方では、組成物は、複数の酵素活性、例えばアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インバーターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼを含んで成る。
【０１８１】
追加の酵素は、例えばアスペルギラス属、好ましくはアスペルギラス・アキュレアタス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギラス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギラス・ホエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギラス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギラス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）、又はアスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、フサリウム属、例えばフサリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フサリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フサリウム・クロックウェレンズ（Fusarium crookwellense）、フサリウム・クルモラム（Fusarium culmorum）、フサリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearium）、フサリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フサリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フサリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・レチキュラタム（Fusarium reticulatum）、フサリウム・ロゼウム（Fusariumu roseum）、フサリウム・サムブシウム（Fusarium sambucinum）、フサリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フサリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フサリウム・トルロサム（Fusarium torulosaum）、フサリウム・トリコセシオイデス（Fusarium trichothecioides）、又はフサリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、ヒュミコラ属、好ましくはヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、又はヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、トリコダーマ属、好ましくはトリコダーマ・ハルジアナル（Trichoderma harzianum）、トリコダーマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコダーマ・ロンジブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコダーマ・レセイ（Trichoderma reesei）又はトリコダーマ・ビリデ（Trichoderma viride）に属する微生物により生成され得る。
【０１８２】
ポリペプチド組成物は、当業界において知られている方法に従って調製され得、そして液体又は乾燥組成物の形で存在することができる。例えば、ポリペプチド組成物は、顆粒又は微粒子の形で存在することができる。組成物に包含されるべきポリペプチドは、当業界において知られている方法に従って安定化され得る。
本発明のポリペプチド組成物の好ましい使用の例は下記に与えられる。本発明のポリペプチド組成物の用量、及び組成物が使用される他の条件は、当業界において知られている方法に基づいて決定され得る。
【０１８３】
使用：
本発明はまた、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドの使用方法にも向けられる。
【０１８４】
洗剤組成物：
本発明の酵素は、洗剤組成物に添加され得、そして従って、洗剤組成物の成分に成ることができる。
本発明の洗剤組成物は、手動又は機械洗濯用洗剤組成物、例えば染色された布の前処理のために適切な洗濯用添加剤組成物及びすすぎ用布ソフトナー組成物として配合され得、又は一般的な家庭用硬質表面洗浄操作における使用のための洗剤組成物として配合され得、又は手動又は機械皿洗い操作のために配合され得る。
【０１８５】
特定の観点においては、本発明は、本発明の酵素を含んで成る洗剤添加剤を提供する。前記洗剤添加剤及び洗剤組成物は、１又は複数の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カーボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ及び/又はポロキシダーゼを含んで成ることができる。
【０１８６】
一般的に、選択された酵素の性質は、選択された洗剤と適合できるべきであり（すなわち、他の酵素及び非酵素の成分、等とのpH−最適適合性）、そして酵素は効果的な量で存在すべきである。
【０１８７】
プロテアーゼ：
適切なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物起源のものを包含する。微生物起源が好ましい。化学的に修飾された、又はタンパク質構築された変異体が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ又は金属プロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン−様プロテアーゼであり得る。アルカリプロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバチルスに由来するそれらのもの、例えばスブチリシンNovo、スブチリシンCarlsberg、スブチリシン309、スブチリシン147及びスブチリシン168（WO89/06279号に記載される）である。トリプシン−様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源のもの）、及びWO89/06270号及びWO94/25583号に記載されるフサリウムプロテアーゼである。
【０１８８】
有用なプロテアーゼの例は、WO92/19729号、WO98/20115号、WO98/20116号及びWO98/34946号に記載される変異体、特に１又は複数の次の位置での置換を有する変異体である：27, 35, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235及び274−特定の配列及び位置を参照のこと。
【０１８９】
好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、AlcalaseTM, SavinaseTM, PrimaseTM, DuralaseTM, EsperaseTM及びKannaseTM (Novo Nordisk A/S), MaxataseTM, MaxacalTM, MaxapemTM, ProperaseTM, PurafectTM, Purafect OxPTM, FN2TM及びFN3TM (Genencor International Inc.) を包含する。
【０１９０】
リパーゼ：
適切なリパーゼは、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。有用なリパーゼの例は、ヒューミコラ（別名、サーモミセス）、例えばヨーロッパ特許第258068号及び第305216号に記載のようなヒューミコラ・ラウギノサ（T.ラウギノサ）、又はWO96/13580号に記載のようなヒューミコラ・インソレンス、P.アルカリゲネス又はP.プソイドアルカリゲネス（ヨーロッパ特許第218272号）、P.セパシア（ヨーロッパ特許第331376号）、P.スツゼリ（P.stutzeri）(イギリス特許第1,372,034号)、P.フルオレセンス、プソイドモナスsp. SD705株（WO75/06720号及びWO96/27002号）、P.ウイスコンシネンシス（WO96/12012号）からのリパーゼ、バチルスリーパーゼ、例えばB.スブチリス（Dartoisなど. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360）、B. ステアロサーモフィラス（日本特許64/744992）又はB.プミラス（WO91/16422号）からのリーパーゼを包含する。
【０１９１】
他の例は、リパーゼ変異体、例えばWO92/05249号、WO94/01541号、ヨーロッパ特許第407225号、ヨーロッパ特許第206105号、WO95/35381号、WO96/00292号、WO95/30744号、WO94/25576号、WO95/14783号、WO95/22615号、WO97/04079号及びWO97/0720号に記載されるものを包含する。
好ましい市販のリパーゼ酵素は、LipolaseTM 及びLipolase UltraTM (Novo Nordisk A/S) を包含する。
【０１９２】
アミラーゼ：
適切なアミラーゼ（α−及び/又はβ）は、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。アミラーゼは、バチルス、例えばイギリス特許第1,296,839号により詳細に記載される、B.リケニルホルミスの特許株から得られるα−アミラーゼを包含する。
【０１９３】
有用なアミラーゼの例は、WO94/02597号、WO94/18314号、WO96/23873号及びWO/43424号に記載される変異体、特に１又は複数の次の位置での置換を有する変異体である：15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408及び444−特定の配列及び位置を参照のこと。
市販のアミラーゼは、DuramylTM, TermamaylTM, FungamylTM 及びBAMTM (Novo Nordisk A/S), RapidaseTM 及びPurastarTM (Genencor International Inc.)である。
【０１９４】
セルラーゼ：
適切なセルラーゼは、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。適切なセルラーゼは、バチルス、ヒューミコラ、フサリウム、チエラビア、アクレモニウム属からのセルラーゼ、例えばアメリカ特許第4,435,307号、アメリカ特許第5,648,263号、アメリカ特許第5,691,178号、アメリカ特許第5,776,757号及びWO89/09259号に開示されるヒューミコラ・インソレンス、マイセリオプソラ・サーモフィラ/オキシスポラムから生成される菌類セルラーゼを包含する。
【０１９５】
特に適切なセルラーゼは、色彩保護有益性を有するアルカリ又は中性セルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、ヨーロッパ特許第0495257号、ヨーロッパ特許第0531372号、WO96/11262号、WO96/29397号、WO98/08940号に記載されるセルラーゼである。例の例は、WO94/07998号、ヨーロッパ特許第0531315号、アメリカ特許第5,457,046号、アメリカ特許第5,685,593号、アメリカ特許第5,763,254号、WO95/24471号、WO98/12307号及びWO・1999/001544号に記載されるそれらのものである。
【０１９６】
市販のセルラーゼは、CelluzymeTM 及びCarezymeTM (Novo Nordisk A/S), ClazinaseTM 及びPuradex HATM (Genencor International Inc.) 及びKAC−500 (B)TM (Kao Corporation) を包含する。
【０１９７】
ペルオキシダーゼ/オキシダーゼ：
適切なペルオキシダーゼ/オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。有用なペルオキシダーゼの例は、コプリナス、例えばコプリナス・シネレウス、及びWO93/24618 号、WO95/10602号及びWO98/15257号に記載されるそれらのようなそれらの変異体からのペルオキシダーゼを包含する。
市販のペルオキシダーゼは、GuardzymeTM (Novo Nordisk A/S) を包含する。
【０１９８】
洗剤酵素は、１又は複数の酵素を含む別々の添加剤を添加することにより、又はそれらの酵素のすべてを含んで成る組合された添加剤を添加することにより洗剤組成物に包含され得る。本発明の洗剤添加剤、すなわち別々の添加剤又は組合された添加剤が、例えば粒質物、液体、スラリー、等として配合され得る。好ましくは洗剤添加剤配合物は、粒質物、特に非−ダスチング粒質物、液体、特に安定された液体又はスラリーである。
【０１９９】
非−ダスチング粒質物は、アメリカ特許第4,106,991号及び第4,661,452号に開示のようにして生成され得、そして任意には、当業界において知られている方法により被覆され得る。蝋被覆材料の例は、1000〜20,000の平均モル重量を有するポリ（酸化エチレン）生成物（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50の酸化エチレン単位を有する、エトキシル化されたノニルフェノール；12〜20個の炭素原子を有するアルコールを有し、そして15〜80の酸化エチレン単位を有する、エトキシ化された脂肪アルコール；脂肪アルコール、脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドである。
【０２００】
流動層技法による適用のために適切なフィルム形成被覆材料の例は、イギリス特許第1483591号に与えられている。例えば、液体酵素調製物は、確立された方法に従って、ポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、硫酸又は硼酸を添加することによって、安定化される。保護された酵素は、ヨーロッパ特許第238,216号に開示される方法に従って調製され得る。
【０２０１】
本発明の洗剤組成物は、いずれかの便利な形、例えば棒状、錠剤、粉末、顆粒、ペースト又は液体の形で存在することができる。液体洗剤は、水性であり、典型的には、70％までの水及び０〜30％の有機溶媒を含み、又は非水性であり得る。
洗剤組成物は、非イオン性、例えば半−極性及び/又はアニオン性及び/又はカチオン性及び/又は両性イオンであり得る１又は複数の界面活性剤を含んで成る。界面活性剤は典型的には、0.1〜60重量％のレベルで存在する。
【０２０２】
そこに含まれる場合、洗剤は通常、約１％〜約40％のアニオン性界面活性剤、例えば線状アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート（脂肪酸スルフェート）、アルコールエトキシスルフェート、第二アルカンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニル琥珀酸又は石鹸を含むであろう。
【０２０３】
そこに含まれる場合、界面活性剤は通常、約0.2％〜約40％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化された脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのN−アシルN−アルキル誘導体（“グルコサミド”）を含むであろう。
【０２０４】
洗剤は、０〜65％の洗剤ビルダー又は錯生成剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、三リン酸、ホスホネート、カーボネート、シトレート、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン六酢酸、アルキル−又はアルキニル琥珀酸、可溶性シリケート又は層化されたシリケート（例えばHoechstからのSKS−６）を含むことができる。
【０２０５】
洗剤は、１又は複数のポリマーを含んで成る。例としては、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−N−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート（例えばポリアクリレート、マレイン酸/アクリル酸コポリマー及びラウリルメタクリレート/アクリル酸コポリマーを含んで成る。
【０２０６】
洗剤は、H2O2源を含んで成る漂白システム、例えば過酸形成漂白活性化剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネートと共に組合され得る過硼酸塩又は過炭酸塩を含むことができる。他方では、漂白システムは、例えばアミド、イミド又はスルホン型のペルオキシ酸を含むことができる。
【０２０７】
本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステル又はフェニル硼素酸誘導体、例えば４−ホルミルフェニル硼素酸を用いて安定化され得、そして前記組成物は、例えばWO92/19709号及びWO92/19708号に記載のようにして配合され得る。
【０２０８】
洗剤はまた、他の従来の洗剤組成物、例えば布コンディショナー、例えばクレー、泡増強剤、石鹸泡抑制剤、抗腐蝕剤、土壌懸濁剤、抗−土壌再沈着剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトロープ、曇りインヒビター、又は香料を含むことができる。
【０２０９】
洗剤組成物においては、いずれかの酵素、特に本発明の酵素は、洗浄液体１L当たり0.01−100mgの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液体１L当たり0.05−5mgの酵素タンパク質、特に洗浄液体１L当たり0.1−1mgの酵素タンパク質に対応する量で添加され得ることが、現在企画される。
【０２１０】
本発明の酵素はさらに、WO97/07202号（引例として本明細書組み込まれる）に開示される洗剤配合物に導入され得る。
本発明は次の例により、さらに記載されるが、それらは本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０２１１】
緩衝液及び基質として使用される化学物質は、少なくとも試薬品種の市販の製品であった。
材料及び溶液：
【０２１２】
方法：
特にことわらない限り、DNA操作及び形質転換は、Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 1995;Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990に記載されるように、分子生物学の標準方法を用いて実施された。
【０２１３】
酵素：
DNA操作のための酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、等）は、New England Biolabs, Inc.から入手でき、そしてその製造業者の説明書に従って使用された。
【０２１４】
微生物株：
E. コリDH5α（TOYOBO）。
使用されるアスペルギラス・ニガー株は、Copenhagen, Denmarkに集められた土壌サンプルからNovozymesにより単離されたオリジナル単離物C40からの子孫であった。
A. オリザエBECh-2が、WO2006/069289号（Novozymes）に記載されている。
【０２１５】
培地及び試薬：
Cove: 342.3 g/L スクロース、 20 ml/L COVE 塩溶液、 1OmM アセトアミド、 30 g/L 不活性寒天。
Cove 塩溶液: １L当たり26 g KCI、 26 g MgSO4-7aq、 76 g KH2PO4、 50ml Cove微量金属。 
Cove微量金属: １L当たり0.04 g NaB4O7-10aq、 0.4 g CuSO4-5 aq、 1.2 g FeSO4-7 aq、 0.7 g MnSO4- aq、 0.7 g Na2MoO2-2 aq、 0.7 g ZnSO4-7 aq。 
【０２１６】
YPG: 4 g/L 酵母抽出物、 1 g/L KH2PO4、 0.5 g/L MgSO4-7aq、 5 g/L グルコース、 pH6.0。 
STC: 0.8 M ソルビトール、 25 mM トリス pH 8、 25 mM CaCl2。
STPC: STC 緩衝液中、40 % PEG4000。
Cove 上部アガロース: 342.3 g/L スクロース、 20 ml/L COVE 塩溶液、 10mM アセトアミド、 10 g/L 低溶融アガロース。 
【０２１７】
MS-9: １L当たり 30 g 大豆粉末、 20 g グリセロール、 pH 6.0。
MDU-pH5: １L当たり 45 g マルトース-1 aq、 7 g酵母抽出物、 12 g KH2PO4、 1 g MgSO4-7 aq、 2 g K2SO4、 0.5 ml AMG 微量金属溶液及び25 g 2-モルホリノエタンスルホン酸、 pH 5.0。
【０２１８】
例１：A.ニガーの19kDaプロテアーゼの半精製：
酵素サンプルの調製：
A. ニガー細胞を、凍結乾燥し、そして４℃で維持した。10gの凍結乾燥された細胞を、液体窒素により凍結し、そしてBall Mill (ステンレス鋼, 体積420 ml, lrie Syoukai Co. Ltd.)により粉砕し、次に液体窒素においてPhyscotron (Microtec Nichion Co. Ltd.)により均質化した。均質物を、120mlの20mMのトリス-HCl（pH7.5）に懸濁した。遠心分離の後、沈殿物を、120mlの同じ緩衝液に再懸濁し、そして再び遠心分離した。２種の上清液を組合し、そして膜フィルター（0.2μmの孔サイズ）を通して濾過した。濾液を同じ緩衝液に対してダイアフィルトレートし、151.5mlの粗酵素サンプルをもたらした。
【０２１９】
バシトラシン親和性ゲルの調製：
試薬：
エポキシ-活性化されたSepharose 6B (Amersham Biosciences, 17-0480-01 )
カップリング緩衝液(50 mM Na2B4O7-HCl, pH9)
バシトラシン (Wako Pure Chemical Industry Ltd., 022-07701 , Lot EWM1905)。
【０２２０】
方法；
15gのエポキシ−活性化されたSepharose6Bを懸濁し、そしてMilli-Q水により、その製造業者の説明書に従って洗浄した。次に、ゲルを200mlのカップリング緩衝液により洗浄し、そしてガラスフィルター上で濾過した。ゲルケークを、50mlのカップリング緩衝液を含む密封されたビンに移した。2.5gのバシトラシンを、50mlのカップリング緩衝液に溶解し、そして前記ゲルと共に混合した。反応混合物を、25℃で一晩、軽く振盪した。カップリング緩衝液を用いて、追加のリガンドを洗浄する。0.1Mのエタノールアミン（pH9）により25℃で５時間、残る活性基をブロックする。カップリング緩衝液により洗浄する。1MのNaCl 及び25％イソ−プロパノールを含む、20mMのイミダゾール緩衝液（pH6.5）により洗浄する。
【０２２１】
バシトラシン親和性カラムによるA. ニガーからのプロテアーゼの精製：
カラムサイズ：22×100mm
流速：4ml/分
画分サイズ：8ml/分
カラムを、20mMのトリス−HCl（pH7.5）により予備平衡化した。150mlの粗酵素サンプルを、カラムに適用した。カラムを、170mlの同じ緩衝液、次に1MのNaClを含む、120mlの同じ緩衝液により洗浄した。カラムに結合されるプロテアーゼを、前記トリス緩衝液中、120mMの１MのNaCl 及び25％イソ−プロパノールにより溶出した。UV吸収を示す画分をプールし、そしてトリス−HCl緩衝液に対してダイアフィルトレートし、NaCl及びイソ−プロパノールを除去した。56mlのプールされた画分を、限外濾過により0.6mlに濃縮した。
【０２２２】
SDS−PAGE：
SDS−PAGEを、Compact PAGE、AE7300 及び プレ−キャストゲル c- PAGEL、12.5%、 76mm (W) x 70 mm (H) (ATTO Co.)の組合せ下で実施した。ランニング緩衝液及びSDS緩衝液を、ATTOの指示マニアルに従って調製した。電気泳動の後、ゲルを、SYPRO Orange タンパク質ゲル染料 (Invitrogen Co.)により染色した。プロテアーゼ活性の同定のために、２−メルカプトエタノールを、SDS緩衝液から除去し、そしてサンプルの沸騰段階を省略した。ゲルを50mMのトリス−HCl（pH7.5）に溶解された、１％スキムミルク及び２％アガロースにより被覆した。
【０２２３】
SDS−PAGEゲルは、図１に示される。
レーン1 : LMW マーカー (97, 66, 45, 30, 20,14.4 kDa, GE Healthcare)) 
レーン2: 精製されたプロテアーゼ(Boiled) 
レーン3: 精製されたプロテアーゼ(煮沸及び2-メルカプトエタノールを伴わない) 
スキムミルク−アガロース被覆。
煮沸サンプルを伴って及びそれを伴わないでのSDS−PAGEのパターンは異なった。半−精製されたサンプルを、N−末端配列決定分析に適用した。
【０２２４】
例２：デ・ノボタンパク質配列決定：
19kDaのプロテアーゼの一部のアミノ酸配列を、N−末端配列決定により得た。サンプル調製のために、バシトラシン親和性カラムを用いて半−精製されたサンプルを、TCAにより沈殿し、SDS−PAGE上で分離し、そしてPVDF膜にブロットした。N−末端アミノ酸配列決定のために、19kDaのバンドにより負荷されたPVDF膜の断片を切除し、そしてApplied Biosystems Prociseタンパク質配列決定機のブロットカートリッジに配置した。N−末端配列決定を、PVDF膜サンプルのための整理を行う方法（パルス液体PVDF）を用いて、その製造業者の説明書に従って実施した。次のN−末端配列が得られた（１文字コード）：
SPIPSYSRPGRG      （配列番号１）
【０２２５】
例３：A. ニガーの19kDaのプロテアーゼ遺伝子のクローニング及び配列決定：
SDS−PAGEにより同定された前記一部のアミノ酸配列及び分子量に基づいて、データベース調査（JGI A. ニガーゲノムブラウザー）を行い、そして次のヒットを得た。
erseqn:zyl63155 XSCFFLDl。アスペルギラス・ニガーゲノム配列
長さ= 3970925
評点= 30.0 ビット (66)、推算= 0.98
同一性= 12/12 (100%)、陽性= 12/12 (100%)
フレーム= +1
【化２】
2010539964.tif 000003
それぞれ、BamHI及びXhoI部位を導入する次のプライマーHU941及びHU942を、A. ニガーゲノムデータベースのヌクレオチド配列情報に基づいて企画した。
HU941: TTTGGATCCACCATGTCCCCAATCCCCAGC (配列番号2) 
HU942: TTTCTCGAGTCACCCCAAGAAAACATCCAC (配列番号3)
【０２２６】
鋳型としてのアスペルギラス・ニガー株のゲノムDNAとしてのPCR反応を、HU941及びHU942を用いて、ExpandTM PCR システム (Roche Diagnostics, Japan)により実施した。増幅反応（50μl）は、１×緩衝液中、1ngの鋳型DNA/μl、それぞれ250mMのdNTP、250nMのプライマーHU941、250nMのプライマーHU942、0.1UのTaqポリメラーゼ/μlから構成された（Roche Diagnostics, Japan）。反応を、次の通りにプログラムされたDNA Engine PTC-200 (MJ-Research, Japan)においてインキュベートした：94℃で２分、１サイクル；それぞれ92℃で１分、55℃で１分、及び72℃で１分、30サイクル；72℃で10分、１サイクル；及び４℃での維持。
【０２２７】
反応生成物を、TAE緩衝液を用いて1.0％アガロースゲルから単離し、ここで0.5kbの製生成物バンドがQIAquickTM Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA)を用いて、その製造業者の説明書に従って、ゲルから切除され、そして精製された。
【０２２８】
0.5kbの増幅されたDNAフラグメントを、BamHI及びXhoIにより消化し、そしてBamHI及びXhoIにより消化されたアスペルギラス発現カセットpCaHj483中に連結した。その連結混合物を用いて、E.コリDH5α（TOYOBO）を形質転換し、発現プラスミドpHUda772を創造した。増幅されたプラスミド、QIAprep（商標） Spin Miniprep kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA)を用いて、その製造業者の説明書に従って回収した。プラスミドpCaHj483は、アスペルギラス・ニジュランストリオースホスフェートイソメラーゼ非翻訳リーダー配列に融合されるアスペルギラス・ニガー中性アミラーゼIIプロモーター（Na2/tpiプロモーター）、及びアスペルギラス・ニガーアミログリコシダーゼターミネーター（AMGターミネーター）、並びに単独の窒素源としてアセトアミド上での増殖を可能にするアスペルギラス・ニジュランスからの選択マーカーamd Sに基づかれる発現カセットを含んで成る。
【０２２９】
得られるプラスミドを配列決定し、そしてアスペルギラス・ニガーゲノムデータベースに比較し、クローンが未知の19kDaのプロテアーゼをコードすることを示した。イントロンを予測することによる（NetGene2による）、クローン化されたDNA配列及びその推定されるアミノ酸配列、及びそのアミノ酸配列に基づいての相同性調査の結果。
アスペルギラス・ニガー19kDa遺伝子の配列及びその推定されるアミノ酸配列は、図２に示される。
【０２３０】
相同性調査の結果：
データベース:uniprot_trembl
プログラム: blastp
Id         E       説明                                                        
a2q7n9    5e-82    slrO318- Synechocystisspによりコードされる仮定のタンパク質への類似性。
q2u3f4   5e-35    予測されるタンパク質。
a2qzO6   3e-31    slrO318- Synechocystisspによりコードされる仮定のタンパク質への類似性。
q2ulv3   2e-19   予測されるタンパク質。
q5axcl   6e-18   仮定のタンパク質。
q4w9x2   2e-16   L-PSPエンドリボヌクレアーゼファミリータンパク質、推定。
ald9u3   le-15   L-PSPエンドリボヌクレアーゼファミリータンパク質、推定。
a2qyq7   le-14   機能: Mmflp がミトコンドリアDNAの維持に影響を及ぼす。
【０２３１】
q55925   le-12   SlrO318 タンパク質。
q68e49   2e-12  エンドリボヌクレアーゼ L-psp ファミリータンパク質。
a0r468  6e-12   エンドリボヌクレアーゼ L-psp ファミリータンパク質。
a2qti5  1e-11   Contig An09c0050、完全なゲノム。
q5aqu2  2e−ll  仮定のタンパク質。
a0ywm9  5e-ll   エンドリボヌクレアーゼ L-PSP。
q5arf7  le-10   仮定のタンパク質。
q3mlgl  2e-10   エンドリボヌクレアーゼL-PSP。
q5b5q5  le-09   仮定のタンパク質。
q2h829  2e-09   仮定のタンパク質。
【０２３２】
q2ulll  2e-08   予測されるタンパク質。
a4qwk3  le-07   仮定のタンパク質。
q0mf29  4e-04   仮定のタンパク質。
q46me6  5e-04   エンドリボヌクレアーゼL-PSP。
q8xes9  5e-04   仮定のトランスメンブランタンパク質(仮定のタンパク質)。
qllgu9  6e-04  エンドリボヌクレアーゼL-PSP。
qOkdel  6e-04  推定上の翻訳開始インヒビター、yjgFファミリー。
相同性調査におけるヒットのいずれも、プロテアーゼ活性を有するものとして同定されたポリペプチドを示さなかった。
【０２３３】
例４：A. オリザエにおけるA. ニガー19kDaプロテアーゼ遺伝子の発現：
アスペルギラス・オリザエ株BECh−2を、100mlのYPG培地に接種し、そして80rpmで16時間、32℃でインキュベートした。ペレットを集め、そして0.6MのKClにより洗浄し、そして600μl/mlの最終濃度で、市販のβ−グルカナーゼ生成物（GLUCANEXTM, Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark）を含む、20mlの0.6MのKClに再懸濁した。その懸濁液を、プロトプラストが形成されるまで、32℃及び80rpmでインキュベートし、そして次に、STC緩衝液により２度、洗浄した。プロトプラストを、血球測定機により計数し、そして再懸濁し、そして８：２：0.1のSTC：STPC：DMSOの溶液において、2.5×107個のプロトプラスト/mlの最終濃度に調節した。
【０２３４】
約3μgのpHUda772を、100μlのプロトプラス懸濁液に添加し、軽く混合し、そして氷上で20分間インキュベートした。1mlのSPTCを添加し、そしてプロトプラスト懸濁液を37℃で30分間インキュベートした。50℃でのCOVE上部アガロース10mlの添加の後、反応物をCOVE寒天プレート上に注ぎ、そしてプレートを32℃でインキュベートした。５日後、形質転換体を、COVE培地から選択した。
【０２３５】
４個のランダムに選択された形質転換体を、100mlのMS−９培地に接種し、そして32℃で1日間、培養した。3mlのMS−９培地を、100mlのMDU−pH5培地に接種し、そして30℃で３日間、培養した。
【０２３６】
増殖した菌糸体を、SDSサンプル緩衝液により再懸濁し、そして100℃で10分間、加熱した。12,000rpmでの10分間の遠心分離の後、上清液を回収し、そしてSDS−PAGE分析に適用した（Compact PAGE, AE7300及びプレ-キャストゲルc-PAGEL, 12.5%, 76mm (W) x 70 mm (H) (ATTO Co.)）。サンプル緩衝液、ランニング懸濁液及びSDS緩衝液を、ATTOの指示マニュアルに従って調製した。電気泳動の後、ゲルをSYPRO Orange タンパク質ゲル染料 (Invitrogen Co.)により染色した。19kDaのプロテアーゼ発現クローンの１つ、すなわち772−10株を、さらなる実験のために選択した。
【０２３７】
例５：発現された19kDaのプロテアーゼのサンプル調製：
A. ニガーの19kDaプロテアーゼを細胞内発現する、選択された形質転換体の１つを、例４に開示される条件下で増殖し、菌糸体を集め、そして凍結乾燥した。
1gの凍結乾燥された細胞を、乳鉢により粉砕し、そして0.5MのNaClを含む10mMのリン酸緩衝液（pH6.7）25mlに懸濁した。無細胞抽出物を、遠心分離により得た。前記無細胞抽出物を4mlに濃縮し、そして同じ緩衝液により予備平均化されたHiLoad 26/60 Superdex 200 カラム (GE healthcare)に適用した。サンプルを、同じ緩衝液により溶出した（流速：2ml/分、画分サイズ4ml/2分/fr）。ゲル透過のためのクロマトグラムが図３に示される。
【０２３８】
SDS−PAGEを、Compact PAGE、AE7300 及び プレ−キャストゲル c- PAGEL、15%、 76mm (W) x 70 mm (H) (ATTO Co.)の組合せ下で実施した。ランニング緩衝液及びSDS緩衝液を、ATTOの指示マニアルに従って調製した。電気泳動の後、ゲルを、SYPRO Orange タンパク質ゲル染料 (Invitrogen Co.)により染色した。（図４を参照のこと）。
19kDaのプロテアーゼを含む画分55, 56, 57をプールし、そしてさらなる分析のために使用した。
【０２３９】
例６：発現された19kDaプロテアーゼの特徴化：
19kDaプロテアーゼの基質特異性：
５種の合成基質を、Peptide Institute Co., Osakaから購入した。基質はGlt-AAF-MCA、 Suc-LLVY-MCA、Boc-FSR-MCA、Suc(OMe)-AAPV-MCA及び Z-LLE-MCAである。25μlの0.04mMの基質を、37℃で５分間プレインキュベートした。20μlのプロテアーゼサンプルを、25μlの400mMのリン酸緩衝液（pH6.7）、5Mlの2MのNaCl及び25μlのMilli Q水と共に混合し、そして次に、37℃で５分間プレインキュベートした。反応を、基質溶液及び酵素溶液を混合することにより開始した。蛍光強度の上昇を、37℃で30分間、360nmの励起及び460nmの発光フィルターを有するFL600 Microplate Fluorescence Readerにより測定した。Suc-LLVY-MCAが最良の基質である。
【０２４０】
Glt-AAF-MCA        1.6%
Suc-LLVY-MCA       100.0%
Boc-FSR-MCA        0.3%
Suc(OMe)-AAPV-MCA  0.2%
Z-LLE-MCA          0.1 %
【０２４１】
インヒビターの効果：
４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニル弗化物（AEBSF）、ロイペクチン、ペプスタチンA、ZnSO4及びEDTAを、Wako Chemical Co., Osakaから購入した。インヒビターは、Milli-Q水により10倍に希釈されたDMSO中、4.5mg/10mlのロイペプチン、Milli-Q水により10倍に希釈されたDMSO中、3mg/10mlのペプスタチン、10mMのAEBSF、10mMのZnSO4及び10mMのEDTAであった。基質は、0.04mMのSuc-LLVY−MCAであった。酵素溶液は、5μlのプールされた19kDaのプロテアーゼ画分、10μlのインヒビター、25μlの400mMのKPB、pH6.7及び35μlのMilli-Q水を含む。基質溶液及び酵素溶液を、37℃で５分間、別々にプレインキュベートした。活性を、下記のようにして測定した。
【０２４２】
【表１】
2010539964.tif 000004
いずれのインヒビターによっても明白な阻害は観察されなかった。
【０２４３】
pHプロフィール：
リン酸緩衝液（pH6、7、８）及びジエタノールアミン緩衝液（pH8, 9, 10）を使用した。基質溶液は、0.04mMのSuc-LLVY−MCAであった。酵素溶液は、5μlの19kDaプロテアーゼ、25μlの緩衝液、5μlの2MのNaCl及び40μlのMilli-Q水を含む。アッセイは前記のようにして実施された。結果は、図５に示される。19kDaのプロテアーゼは、８〜９の最適pHを有するアルカリプロテアーゼである。
【０２４４】
本明細書に記載され、請求される発明は、本明細書に開示される特許の態様により範囲を限定されるものではない。何故ならば、それらの態様は本発明のいくつかの観点を例示するものであるからである。いずれかの同等の態様が本発明の範囲内で意図される。実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの修飾の他に、本発明の種々の修飾は、前述の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾はまた本発明の範囲内にある。
種々の文献が本明細書に引用されており、それらの開示は引用により本明細書に組み込まれている。
【図１】
2010539964.tif 000005
【図２】
2010539964.tif 000006
【図３】
2010539964.tif 000007
【図４】
2010539964.tif 000008
【図５】
2010539964.tif 000009
【配列表】
2010539964000001.app
【国際調査報告】
2010539964.tif 000010
2010539964.tif 000011
2010539964.tif 000012