(57)【要約】  ＭＭＰ−９（マトリックスメタロプロテイナーゼ９）のヘモペキシンドメインの配列におけるアミノ酸変化の存在を検出する工程を含み、前記ドメインにおけるアミノ酸変化の存在が心筋梗塞後の心臓疾患に対する感受性の指標である、心筋梗塞後の心臓疾患に対する個体の感受性を測定するための方法を、薬剤設計の方法と共に開示する。
2010515467.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋梗塞後の心臓疾患に対する個体の感受性を測定するための方法であって、ＭＭＰ−９（マトリックスメタロプロテイナーゼ−９）のヘモペキシンドメインの配列中におけるアミノ酸の変化の存在を検出する工程を含み、前記ドメイン中におけるアミノ酸の変化の存在が、前記心筋梗塞後の心臓疾患に対する感受性の指標である、方法。
【請求項２】
検出される配列が、配列番号６又は８の１４８位に相当する位置又は配列番号２又は４の６６８位に相当する位置にグルタミン（Ｇｌｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）アミノ酸残基のいずれかを含むか又はコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記位置におけるアルギニン残基の存在が、ＭＩ後に心臓疾患に罹患するリスクを有するか又は発症している個体の指標である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記位置におけるグルタミン残基の存在が保護的効果の指標である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＳＮＰ（Ａ／Ｇ）のアイデンティティーが、配列番号５若しくは７の４４３位に相当する位置又は配列番号１若しくは３の７２６５位に相当する位置において検出される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
検出される配列が、配列番号１、３、５、及び／又は７からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
検出される配列が、配列番号２、４、６、及び／又は８からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記位置におけるグルタミンアミノ酸残基の存在が、高い駆出率（ＥＦ）、心筋梗塞後の低い早期ＭＭＰ−９活性、並びに心不全が発生する確率が低いことの指標である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
低い早期ＭＭＰ−９が、個体が心筋梗塞に罹患した２４時間後まで測定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に規定のＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインの配列中においてアミノ酸変化が存在するか否かを測定する工程を含む、梗塞を有する患者のためのスクリーニング方法。
【請求項１１】
ＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインの配列中において、請求項１から９のいずれか一項に規定のアミノ酸変化が存在するか否かを測定する工程を含む、梗塞を有しない集団のためのスクリーニング方法。
【請求項１２】
心筋梗塞後のより良好な臨床転帰を示す、より低レベルのＭＭＰ−９活性と、請求項１から９のいずれか一項に規定のＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインの配列中におけるアミノ酸の変化を関連付けることによって、心筋梗塞を有する患者における診断及び／又は予後を確証する方法。
【請求項１３】
心筋梗塞後のより良好な臨床転帰を示す、より低いＭＭＰ−９レベルと、請求項１から９のいずれか一項に規定のマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）のヘモペキシンドメイン中におけるアミノ酸の変化を関連付けることによって、心室リモデリングの阻害並びに心不全の治療及び／又は予防の処置をするための方法。
【請求項１４】
心筋梗塞後のより良好な臨床転帰を示す、より低いＭＭＰ−９レベルと、請求項１から９のいずれか一項に規定のマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）のヘモペキシンドメイン中におけるアミノ酸の変化を関連付けることによって、心筋梗塞後における患者の心室リモデリングの発生を予測するための方法。
【請求項１５】
ＭＭＰ−９のアゴニスト若しくはアンタゴニスト／インヒビター、又はＭＭＰ−９の活性を阻害するか、ＭＭＰ−９のＴＩＭＰ−１との相互作用を強化するか、若しくはＭＭＰ−９の検出可能な活性若しくは発現を低減させることが可能な分子を同定するための方法であって、請求項１から９のいずれか一項に規定のマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）の変化したヘモペキシンドメインと相互作用する分子又はリガンドを設計する工程を含む、方法。
【請求項１６】
試料における心臓疾患に対する感受性と関連するＳＮＰを有する第一のポリヌクレオチドの存在をアッセイするための方法であって、配列番号１、３、５、７、９、及び／又は１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列並びに前記配列の相補的な配列を含む第二の配列と前記試料を接触させる工程を含み、前記第二のポリヌクレオチドがストリンジェントな条件下において前記第一のポリヌクレオチドとハイブリダイズする、方法。
【請求項１７】
試料における心臓疾患に対する感受性と関連するＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインにおけるＳＮＰを有する単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの存在についてアッセイするための方法であって、前記コードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体と前記試料を接触させる工程を含む、方法。
【請求項１８】
心臓疾患に対する感受性と関連するＳＮＰを含有するポリヌクレオチドの発現を変化させる薬剤を同定するための方法であって、
（ａ）（１）心臓疾患に対する感受性と関連するＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインにおけるＳＮＰ並びに（２）レポーター遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター領域を含むポリヌクレオチドを、試験する薬剤と、発現のための条件下において接触させる工程；
（ｂ）前記薬剤の存在下におけるレポーター遺伝子の発現レベルを評価する工程；
（ｃ）前記薬剤の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現レベルを評価する工程；並びに
（ｄ）発現が前記薬剤によって変化したことを示す差異ついて、工程（ｂ）における発現レベルを工程（ｃ）における発現レベルと比較する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
個体における心臓疾患に対する感受性を診断するための方法であって、
（ａ）前記個体からポリヌクレオチド試料を得る工程；並びに
（ｂ）前記心臓疾患に対する感受性に相当するハプロタイプが存在するか否かについて、前記ヌクレオチド試料を分析する工程であって、前記ハプロタイプが、心臓疾患に対する感受性と関連するＭＭＰ−９のヘモペキシンドメイン中におけるＳＮＰに由来する対立遺伝子を含む、工程
を含む、方法。
【請求項２０】
前記心臓疾患が、心筋梗塞、急性冠不全症候群、虚血性心筋症、非虚血性心筋症、及び鬱血性心不全からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記心臓疾患が鬱血性心不全である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
心臓疾患に対する感受性と関連するＭＭＰ−９のヘモペキシンドメイン中におけるＳＮＰを含有する単離されたポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記単離されたポリヌクレオチドが、調節配列、好ましくは適切なプロモーターと作動可能に連結されている、ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２４】
心臓疾患に対する感受性と関連するＭＭＰ−９のヘモペキシンドメイン中におけるＳＮＰを有するポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック動物。
【請求項２５】
心臓疾患に対する感受性と関連するＭＭＰ−９のヘモペキシンドメイン中におけるＳＮＰを含む第一のポリヌクレオチドの存在について、試料をアッセイするためのキットであって、
ａ）配列番号１、３、５、７、９、及び／又は１０によって特定される配列並びにそれらの相補的な配列からなる群から選択される配列を含む、１つ又は複数の標識された第二のポリヌクレオチド；並びに
ｂ）前記標識の検出のための試薬
を別々の容器に含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、参照によって本明細書に取り込む米国仮特許出願第６０／８８４，９９号の優先権の利益を享受する。
【０００２】
本発明は、心筋梗塞及び心不全における診断マーカー及び薬剤設計のためのプラットホームの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
鬱血性心不全（ＣＨＦ）は、特異的疾患ではないが、必要とされる心拍出量を適当に増大させる心臓の機能の不全によって生じる兆候及び症状の集合である。患者は、典型的には、息切れ、浮腫、及び疲労を有する。ＣＨＦは大流行している疾患となっており、成人人口の３％に影響を与えている。ＣＨＦの死亡率は、３０％未満の５年生存率であり、多数の形態の癌よりも悪い値である。心筋梗塞（ＭＩ）はＣＨＦの主な病因の１つである。左心室リモデリングは、ＣＨＦに多大に寄与する。
【０００４】
現在、心筋細胞外マトリックス（ＥＣＭ）における変化が、進行性リモデリングプロセスに寄与することが認識されている。ＥＣＭ合成及び分解のバランス、すなわちＥＣＭターンオーバーが、組織構造の維持を担っている。心臓におけるＥＣＭ合成の正常な速度は非常に遅い。ＭＩなどの病的状態の間に、コラーゲン合成及び沈着が、梗塞した心筋だけでなく非梗塞心筋においても促進される。次第に増えてきた証拠によって、繊維状コラーゲンネットワーク及びコラーゲンマトリックスの組織崩壊における変化がＬＶリモデリングに寄与することを示唆している。マトリックスの組織崩壊が、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現増大に寄与して、マトリックスタンパク質を分解させ、プロテアーゼインヒビターのファミリーであるＴｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＴＩＭＰ）の発現を低減させる。多形核白血球及びマクロファージは、ＭＭＰの豊富な供給源である。梗塞心筋における単球／マクロファージのリクルート及び活性化は、ＭＩ後に生じるプロセスに大きく寄与することが示されている。
【０００５】
したがって、神経ホルモン及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）などの前炎症サイトカインと同様に、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、心不全進行に寄与し得る生物学的活性を有する分子の他の異なる種類を表わすようである。次第に増えてきた一連の証拠によって、炎症性サイトカイン及びＭＭＰのレベルを制御が、心不全患者を治療するための新しい枠組みである可能性を示されている。
【０００６】
これまでの２５のメンバーを含むＭＭＰファミリーの中で、ＭＭＰ−９は、心室リモデリングに関与する重要なタンパク質のようである。ＭＭＰ活性がＭＩ後の早期に有害であるが、ＭＩ後の後期には有益であることが最近示され、リモデリングの予防又は治療のための治療戦略を提供する際に注意深く考慮する必要がある治療域の存在を示唆している。多数の試験が、ＭＭＰファミリーの他のメンバーが心室リモデリングに有益な役割を担っているため、特異的なＭＭＰ−９インヒビターの使用が必要であることを示唆している。同じ問題のある状況、すなわち、他のＭＭＰではなくＭＭＰ−９を阻害することには、マトリックス分解が関与する他の疾患の治療を目的とする際に直面する。複数の医薬品会社が、その様なＭＭＰ−９特異的インヒビターの可能性を試験しているが、早期の治験で様々な結果がもたらされている。したがって、特異的なＭＭＰ−９インヒビターを開発するための新しい戦略を見出す必要がある。
【０００７】
ＭＭＰ−９及びＴＮＦ−α遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）が、急性ＭＩの発症の感受性因子として働く可能性がある。予備的研究において、本発明者は、循環している白血球由来のＭＭＰ−９及びＴＮＦ−α遺伝子におけるＳＮＰの存在を測定した。ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）技術を、急性ＭＩを有する９８人の患者並びに非典型的胸痛及び正常な冠状動脈を有する９２の患者の集団に対して実施した。試験した１４７のＳＮＰのうち、９つが、双方の群の間で非常に異なる頻度を示した。
【０００８】
一方で、本出願人は臨床試験を実施して、ＭＭＰ−９血漿レベルが心不全の発生に相関していることを初めて示すことができた。事実、ＭＭＰ−９レベルから、ＭＩ後の後期発症ＣＨＦが予測される。本発明者の研究では、早期に低いＭＭＰ−９レベルを有する患者は、後の結果が良好であり、ＣＨＦがなく、正常な駆出率及び拡張末期容積である。しかしながら、早期に高いＭＭＰ−９レベルを有する患者は、後期発生ＣＨＦの顕著なリスクがあり（６．５のオッズ比、ｐ＜０．００６）、左心室リモデリングが残る（駆出率の低減、拡張末期容積の増大）。２００６年の２月の本発明者の最初の論文発表（Ｗａｇｎｅｒ ＤＲ，Ｄｅｌａｇａｒｄｅｌｌｅ Ｃ，Ｅｒｎｅｎｓ Ｉ，Ｒｏｕｙ Ｄ，Ｖａｉｌｌａｎｔ Ｍ，Ｂｅｉｓｓｅｌ Ｊ．Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ｉｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ａｆｔｅｒ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｃａｒｄ Ｆａｉｌ．２００６ Ｆｅｂ；１２（１）：６６−７２）から、本発明者の観察結果は複数の他のグループによって再現されている。さらに、ＭＭＰ−９レベルは、リモデリングから回復し、且つ、心臓再同期療法に続発する心不全から良くなった患者においてＭＭＰ−９レベルが低下することが最近示された。したがって、ＭＭＰ−９の血漿レベルから、再灌流ＭＩ後のＣＨＦ及び心室リモデリングが予測されることがよく認識されている。
【０００９】
しかしながら、患者におけるＭＭＰ−９レベルをアッセイすることは可能であるが、適当な治療が処置されるか又は患者教育を開始するために、患者がＭＩ後の心不全に感受性があるか否か予測するための技術が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｗａｇｎｅｒ ＤＲ，Ｄｅｌａｇａｒｄｅｌｌｅ Ｃ，Ｅｒｎｅｎｓ Ｉ，Ｒｏｕｙ Ｄ，Ｖａｉｌｌａｎｔ Ｍ，Ｂｅｉｓｓｅｌ Ｊ．Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ｉｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ ａｆｔｅｒ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｃａｒｄ Ｆａｉｌ．２００６ Ｆｅｂ；１２（１）：６６−７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の主題は、２つ存在する。
【００１２】
１．診断ツールの提供
心不全の悪化を減少させ、且つ、生存期間を延ばすために、鬱血性心不全の発生の早期診断のための方法を提供することは、本発明の主題である。
【００１３】
当該診断ツールを使用して、心室リモデリング及び心不全の発症リスクを有する、罹患しやすい患者を同定することは、本発明の他の主題である。
【００１４】
当該診断ツールを使用して、心筋梗塞後の心不全及び心室リモデリングの発症をより良好に予防する処置を適応させることは、本発明の他の主題である。
【００１５】
２．薬剤設計のためのプラットホームの提供
薬剤設計のためのプラットホームを提供して、ＭＭＰ−９活性を特異的に阻害し得る分子を提供又は同定することは、本発明の他の主題である。
【００１６】
心筋梗塞又は心不全を有する患者における活性ＭＭＰ−９のレベルを低減させることは、本発明の他の主題である。
【００１７】
線維症、アポトーシス、及び壊死を含む心筋の不適応リモデリングを予防するために、当該薬剤を使用して心筋梗塞後の患者を処置することは、本発明の更なる主題である。
【００１８】
心不全の発症を予防するために、当該薬剤を使用して心筋梗塞後の患者を処置することは、本発明の他の主題である。さらに、心筋梗塞、急性心不全、又は慢性心不全を有する患者に、治療上有効量の当該薬剤を投与することも、本発明の主題である。
【００１９】
おどろくべきことに、本発明者は、一塩基多型（ＳＮＰ）がＭＭＰ−９遺伝子のコード配列に存在し、心筋梗塞に続発する心不全について良好又は不良な予後を有する患者において異なる頻度で認められることを見出した。特に驚くべきことに、本発明者は、前記ＳＮＰが、転写された活性ＭＭＰ−９のヘモペキシンドメイン中における１つのアミノ酸変化を生じさせ、結果としてＴＩＭＰ−１に結合するＭＭＰ−９の部位に静電気的変化を引き起こすことを示した。ＴＩＭＰ−１はＭＭＰ−９活性の最大のインヒビターであるため、このことは重要である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
かくして、第一の態様では、本発明は、ＭＭＰ−９（マトリックスメタロプロテイナーゼ９）のヘモペキシンドメインの配列中のアミノ酸の変化の存在を検出する工程を含み、前記ドメイン中のアミノ酸の変化の存在が心筋梗塞後の心臓疾患に対する感受性の指標である、心筋梗塞後の心臓疾患に対する個体の感受性を測定するための方法を提供する。
【００２１】
特に好ましくは、検出される配列は、アルギニン（Ａｒｇ）又はグルタミン（Ｇｌｕ）アミノ酸残基を配列番号６若しくは８の１４８位に相当する位置又は配列番号２若しくは４の６６８位に相当する位置に含むか又はコードする。ここでのＡｒｇ残基の存在は、ＭＩ後の心蔵疾患に罹患するリスクを有するか又は発症している個体の指標である。ここでのＧｌｎ残基の存在は、保護効果、すなわちより低いリスクを有する個体の指標である。
【００２２】
好ましくは、ＳＮＰ（Ａ／Ｇ）のアイデンティティーが、配列番号５若しくは７の４４３位に相当する位置又は配列番号１若しくは３の７２６５位に相当する位置で検出される。ここでのグアニジン（Ｇ）ヌクレオチドの存在は、ＭＩ後の心臓疾患に罹患するリスクがあるか又は発症している個体の指標である。ここでのアデニン（Ａ）ヌクレオチドの存在は、保護効果、すなわちより低いリスクを有する個体の指標である。
【００２３】
ＰＥＸ９ドメインとしても知られている、ＭＭＰ−９（マトリックスメタロプロテイナーゼ９）のヘモペキシンドメインの配列は、配列番号５から８に示しており、そのうち配列番号６及び８はアミノ酸配列であり、配列番号５及び７はポリヌクレオチド配列である。前記ドメインの配列は、タンパク質配列自体を評価するか又はタンパクドメインをコードするヌクレオチド配列を評価することによって検出されてよい。遺伝子コードの縮重によって、ヌクレオチド配列（好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡ）は、配列番号６又は８をコードする任意のものであってよい。しかしながら、好ましくは、前記ヌクレオチド配列は配列番号５又は７に係るものである。
【００２４】
好ましくは、検出される配列は、リスク（感受性）がある群に由来するＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインのＤＮＡ配列である配列番号７である（４４３位にＧヌクレオチドを示す）。
【００２５】
好ましくは、検出される配列は、リスク（感受性）がある群に由来するＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインのアミノ酸配列である配列番号８である（アミノ酸１４８位にＡｒｇを示す）。
【００２６】
検出される配列が、ＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインのＤＮＡ配列である配列番号５であることも好ましい（４４３位にアデニンヌクレオチドを示す）。好ましくは、検出される配列は、保護群に由来するＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインのアミノ酸配列である配列番号６である（アミノ酸１４８位にＧｌｎアミノ酸を示す）。
【００２７】
好ましくは、ヘモペキシンドメインの配列におけるアミノ酸の変化の存在を検出することは、個体に由来するＭＭＰ−９のヌクレオチド配列を配列番号１又は３と比較することによって実施されてよい。
【００２８】
特に好ましくは、当該検出が、配列番号１又は３の７２６５位に相当する位置における少なくとも１つのヌクレオチドの存在を評価することによって実施されてよい。上述のように、当該位置又はそれに相当する位置におけるグアニジンヌクレオチドの存在は、心筋梗塞後の心臓疾患に対する個体の感受性の指標である。したがって、好ましくは、前記個体は、前記位置においてグアニジンを含む配列番号３に示すＭＭＰ−９配列を有する。
【００２９】
代替的には、当該検出は、配列番号１の７２６５位に相当する位置におけるアデニンの存在を観察することによって実施されてよく、当該位置又はそれに相当する位置におけるアデニンヌクレオチドは、心筋梗塞後の心臓疾患に対して保護的である。換言すると、前記位置におけるアデニンヌクレオチドは、心筋梗塞後の前記心臓疾患に感受性を有する可能性が低い個体の指標である。好ましくは、前記個体は、前記位置にアデニンを含む配列番号１に示すＭＭＰ−９配列を有する。
【００３０】
代替的に又は加えて、前記検出は、前記遺伝子から転写されたＲＮＡ中の前記ドメインにおけるアミノ酸変化の存在を検出することによって実施されてよい。好ましくは、これはｍＲＮＡである。
【００３１】
しかしながら、より好ましくは、前記検出は、活性又は機能的なタンパク質における前記ドメイン中のアミノ酸の変化の存在を検出することによって実施されてよい。好ましくは、個体又は患者は、心筋梗塞後の心不全に対して保護的である、配列番号の６６８位又はそれに相当する位置にグルタミン（Ｇｌｎ）を含む配列番号２のＭＭＰ−９タンパク質を有する。代替的には、前記個体又は患者は、心筋梗塞後の心不全に対する感受性の指標である、配列番号２の６６８位又はそれに相当する位置にアルギニン（Ａｒｇ）を含む配列番号４のＭＭＰ−９タンパク質を有する。
【００３２】
前記個体又は患者は、リスクを示すか又は保護的な対立遺伝子についてホモ接合型であるか又はヘテロ接合型であってよい。
【００３３】
好ましくは、前記心臓疾患は、心筋梗塞、急性冠不全症候群、虚血性心筋症、非虚血性心筋症、又は鬱血性心不全である。最も好ましくは、前記心臓疾患は鬱血性心不全である。
【００３４】
タンパク質配列のサンプリングが、好ましくは、任意にヌクレオチド分析に加えて実施されてよく、すなわち、遺伝子型と活性又は機能的タンパク質のタンパク質配列との双方が評価されてよい（ゲノム及びプロテオーム分析）。
【００３５】
前記アミノ酸配列における変化は、好ましくは、ＳＮＰ７２６５として本明細書で示すＳＮＰの結果生じるものである。
【００３６】
本発明のＳＮＰは、上述のような配列番号１又は３の７２６５に相当する位置における、より頻度の高いグアニジンヌクレオチドからより頻度の低いアデニンヌクレオチドへの変化を伴う。当該変化は、上述のような配列番号２又は４の６６８に相当する位置におけるアルギニンアミノ酸からグルタミンアミノ酸へのアミノ酸の変化を生じさせる。
【００３７】
好ましくは、本発明は、所定の位置にＧが存在するリスクを示す対立遺伝子の存在を評価又は測定する工程を含む。代替的に又は加えて、本発明は、好ましくは、前記位置にＡが存在する保護的な対立遺伝子の存在を評価又は測定する工程を含む。
【００３８】
配列番号１及び又は３を参照する場合には、明らかにそうではない場合を除き、ヘモペキシンドメインの配列（配列番号５及び／又は７）並びにそのヌクレオチドの対応する番号を参照することを含むと解されるであろう。同様に、配列番号２及び／又は４を参照する場合には、明らかにそうではない場合を除き、ヘモペキシンドメイン配列（配列番号６及び／又は８）並びにそのアミノ酸の対応する番号を参照することを含むと解されるであろう。
【００３９】
ＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインは、好ましくは、本発明のＳＮＰによってもたらされるアミノ酸の変化を有するか又は有しない、上述のような配列番号５〜８で規定されるものである。ヘモペキシンドメインは、好ましくは、ＴＩＭＰ結合と関連するものであり、最も好ましくはＴＩＭＰ−１結合と関連するものである。
【００４０】
本発明のＳＮＰにより生じるアミノ酸の変化は、戦略的に、ＭＭＰ−９のヘモペキシン様ドメイン中に位置し（図１〜３参照のこと）、そのため、コラーゲン線維だけでなくＭＭＰ−９の主要なインヒビターであるＴｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ −１（ＴＩＭＰ−１）に対する結合に関与する可能性が高い。したがって、当該ＳＮＰ及び結果として生じるアミノ酸の変化は、心室リモデリング及び心臓疾患、特に心不全の発症又は進行における役割を担っている可能性が非常に高い。これは、保護的な対立遺伝子の存在と、心不全、特に鬱血性心不全（ＣＨＦ）又は左心室（ＬＶ）リモデリングの非常に低い発生率、正常なＥＦ及びＥＤＶと共に高いＥＦ、低い早期のＭＭＰ−９活性（ＭＩ後）との間の統計的に有意な相関関係を示す本願の実施例によって実証されている。
【００４１】
ＭＭＰ−９の早期の活性についての時期は、好ましくはＭＩ後の１〜２日であり、好ましくはＭＩ後の２４時間未満である。したがって、ＭＭＰ−９活性レベルを評価するために、ＭＩ後２４時間まで回収した血漿試料中でＭＭＰ−９を測定することが好ましい。
【００４２】
評価されるタンパク質配列は、好ましくは、任意の翻訳後修飾のあとである。
【００４３】
好ましくは、前記患者は心筋梗塞に既に罹患している。しかしながら、前記患者が心筋梗塞にまだ罹患していないことも意図され、その場合、本発明のＳＮＰ又は結果として生じるアミノ酸の変化は、その後に前記個体が心筋梗塞を有する場合における、心筋梗塞後に心臓疾患が発生する可能性の指標であろう。これは、例えば、家族に病歴があること、弱い心臓を有すること、又は他のリスク因子によるＭＩのリスクがあり得る患者を評価するために、及び／又は心筋梗塞を生じさせる可能性がある手術の前に特に有用であろう。
【００４４】
かくして、本発明は、上記アミノ酸変化が存在するか否かを測定する工程を含む、梗塞を有する患者のためのスクリーニング方法を提供する。同様に、本発明は、梗塞を有するか又は有しない一般的な集団のためのスクリーニング方法も提供する。
【００４５】
マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）におけるアミノ酸の変化を、心筋梗塞後のより良好な臨床転帰を示す、低レベルのＭＭＰ−９活性と関連付けることによって、心筋梗塞を有する患者における診断及び／又は予後を確立するための方法も提供する。
【００４６】
かくして、ＭＭＰ−９の測定可能な活性が低減すること、最も好ましくはＭＭＰ−９タンパク質の低減によって低減することが好ましい。これは前記遺伝子の発現のダウンレギュレーションによる可能性があり、又はこれは競合又は阻害（例えば、活性部位などにおけるインヒビターの結合による立体的な効果など）による可能性がある。これまでに得られた証拠は、前記ＳＮＰによって、ＭＭＰ−９の発現が低減し、そのため測定可能な活性が低減することである。
【００４７】
前記活性は、例えば蛍光マーカーの切断アッセイであってよい、プロテアーゼについての技術分野において知られている多数の方法によって測定することが可能である。ザイモグラフィー及び／又はＥＬＩＳＡが特に好ましい。
【００４８】
本明細書に示すように、ＭＭＰ−９の活性は、最も好ましくはドメインの配列の変化、特に本発明のＳＮＰによる変化によって、ヘモペキシンドメインが変化する際に低減する。これは、特に、上述のＭＩ後の早期の時期の場合である。
【００４９】
本発明者の過去の研究から続いて、本発明者は、ＭＭＰ−９遺伝子多型及びその心不全に対する影響を調査した。この目的のために、本発明者は、ＭＭＰ−９遺伝子の配列全体においてＳＮＰが存在するか否かを規定する目的で配列分析実験を開始した。極端なフェノタイプを有する２２の患者の２つの群を選択した：１つの群は、ＭＩ後に良好な臨床転帰を有し、且つ、左心室リモデリング及び心不全の兆候が見られず（５５％超の左心室の駆出率によって特徴付けられる）、１つの群は、ＭＩ後に不良な臨床転帰を有し、且つ、左心室リモデリング及び心不全の兆候を有する（４０％未満の左心室の駆出率によって特徴付けられる）。複数のＳＮＰがこれらの患者において同定された。これらのうち、ＭＭＰ−９遺伝子のコード配列の７２６５位に位置する１つのＳＮＰが、特に興味深いものであると思われた。事実、ＳＮＰ７２６５の頻度は、２つの群の患者の間で異なっていた。このことは、ＳＮＰ７２６５がＭＩ後の心不全の発生と関連している可能性があり、予後のツールとして使用し得ることを示唆した。
【００５０】
本発明者は、次いで、ＳＮＰ７２６５と、ＭＩを有する患者の小標本（４４人の患者）において認められた心不全との関連を、大きな集団において実証し得るか測定しようとした。本発明者は、本発明者の実験室に保存しているルクセンブルグ急性心筋梗塞（ＬＵＣＫＹ）登録を使用して、遺伝子型決定実験を実施して、２２９の患者にＳＮＰ７２６５の存在を検出した。第一に、これらの実験によって、統計的に有意な様式で、ＳＮＰ７２６５がＭＭＰ−９の血清レベルと関連していることを示すことができた。第二に、ＳＮＰ７２６５が、実際に、ＭＩ後の心不全の発症及び駆出率と有意に関連していることを示すことができた。
【００５１】
これらの実験によって、ＭＩ後の心不全の発症を予測する診断ツールとしてのＳＮＰ７２６５の潜在的な有用性が明らかにされた。また、本発明者は、ＳＮＰ７２６５は、ＭＩ患者の心臓における有害なＭＭＰ−９活性を低減させる目的の治療戦略を開発する出発点である可能性があると思料する。
【００５２】
本発明の更なる態様によれば、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）のヘモペキシンドメインにおけるアミノ酸の変化を、心筋梗塞後のより良好な臨床転帰を示すより低いＭＭＰ−９レベルと関連付けることによって、心筋梗塞を有する患者における診断及び予後を確立するための方法を提供する。
【００５３】
前記アミノ酸の変化は、好ましくはＭＭＰ−９のコード配列の７２６５位に位置する、ＭＭＰ−９における一塩基多型（ＳＮＰ）であってよい。前記ＳＮＰは、グアニジンからアデニンへのヌクレオチドの変化であってよい。前記ＳＮＰは、アルギニンからグルタミンへのアミノ酸変化を誘導する。
【００５４】
好ましくは、前記心臓疾患は、心筋梗塞、急性冠不全症候群、虚血性心筋症、非虚血性心筋症、又は鬱血性心不全である。最も好ましくは、前記心臓疾患は鬱血性心不全である。
【００５５】
本発明の他の態様によれば、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）のヘモペキシンドメインにおけるアミノ酸の変化を、心筋梗塞後のより良好な臨床転帰を示す、より低いＭＭＰ−９レベルと関連付けることによって、心室リモデリングを阻害するため、並びに心不全を治療及び予防するための処置方法が提供される。
【００５６】
本発明の更なる態様によれば、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）のヘモペキシンドメインにおけるアミノ酸の変化を、心筋梗塞後のより良好な臨床転帰を示す、より低いＭＭＰ−９レベルと関連付けることによって、心筋梗塞後の患者における心室リモデリングの発生を予測する方法が提供される。
【００５７】
本発明の更なる他の態様によれば、マトリクッスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）のヘモペキシンドメインにおけるアミノ酸の変化を、より良好な臨床転帰を示すより低いＭＭＰ−９レベルと関連付けることに基づく、心筋梗塞後の患者の治療戦略を改善するための方法が提供される。
【００５８】
本発明の他の態様によれば、マトリックスプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）のヘモペキシンドメインのアミノ酸変化を、心筋梗塞後のより良好な臨床転帰を示す、より低いＭＭＰ−９レベルと関連付けることに基づく、心室リモデリングを治療するための薬剤設計のためのプラットホームを提供する。
【００５９】
本発明の更なる他の態様によれば、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９上のアミノ酸変化をより低いＭＭＰ−９レベルと関連付けて、心筋梗塞後のより良好な臨床転帰を示す、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）活性を特異的に阻害するための薬剤開発のためのプラットホームが提供される。
【００６０】
好ましくは、当該プラットホームは、ＭＭＰ−９タンパク質の二次又は三次構造における立体構造及び静電気的変化を用いることに関連して、ＳＮＰのアミノ酸変化によるものであり、ＭＭＰ−９の新規アンタゴニスト／インヒビター、特に「変化させた」ＴＩＭＰ結合部位を摸倣するか又は結合することが可能なものを提供する。
【００６１】
代替的には、本発明は、ＭＭＰ−９活性を阻害するか又はＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−１との相互作用を強化する戦略を開発するために使用されてよい。
【００６２】
かくして、本発明は、ＭＭＰ−９のアゴニスト又はアンタゴニスト／インヒビター、或いはＭＭＰ−９活性を阻害するか又はＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−１との相互作用を強化するか若しくはＭＭＰ−９の検出可能な活性若しくは発現を低減させることが可能な分子を同定するための方法を提供する。
【００６３】
本発明は、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）の変化したヘモペキシンドメインと相互作用する分子又はリガンドを設計する工程を含む、ＭＭＰ−９のアゴニスト又はアンタゴニスト／インヒビター或いはＭＭＰ−９活性を阻害するか又はＭＭＰ−９とＴＩＭＰ−１との相互作用を強化することが可能な分子を同定するための方法も提供する。
【００６４】
本発明の他の態様によれば、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）のヘモペキシンドメインにおけるアミノ酸の変化をより低いＭＭＰ−９レベルと関連付けて、心筋梗塞後のより良好な臨床転帰を示すことによる、天然のインヒビターである、Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＭＭＰ−１（ＴＩＭＰ−１）に対するＭＭＰ−１の結合を改善するための方法が提供される。
【００６５】
本発明の更なる態様によれば、治療上有効量の薬剤を投与する工程を含む、末期の心臓疾患と関連する心筋組織の分解を予防するための方法であって、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）のヘモペキシンドメインにおけるアミノ酸の変化を、より低いＭＭＰ−９レベルと関連付けて、心筋梗塞後のより良好な臨床転帰を示す、方法が提供される。
【００６６】
本発明の更なる態様によれば、心筋組織におけるＭＭＰ−９の活性を低減させる薬剤を投与する工程を含む、鬱血性心不全の症状を示す患者を治療するための方法であって、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）のヘモペキシンドメインにおけるアミノ酸の変化を、より低いＭＭＰ−９レベルと関連付けて、心筋梗塞後のより良好な臨床転帰を示す、方法が提供される。
【００６７】
前記症状は慢性又は急性心不全を示すものであってよく、前記心筋組織におけるＭＭＰ−９の生産を低減させる薬剤は治療上効果的な薬剤を含んでよい。
【００６８】
誤解を避けるために、前記アミノ酸の変化は、本発明の任意の態様において、ＭＭＰ−９の一塩基多型であってよく、好ましくはＭＭＰ−９のコード配列の７２６５位に位置する。前記ＳＮＰは、グアニジンからアデニンへのヌクレオチドの変化であってよい。前記ＳＮＰは、上述のようにアルギニンからグルタミンへのアミノ酸変化を誘導する。好ましくは、前記心臓疾患は、心筋梗塞、急性冠不全症候群、虚血性心筋症、非虚血性心筋症、又は鬱血性心不全である。最も好ましくは、前記心臓疾患は鬱血性心不全である。前記薬剤は、経口、静脈内、皮内、若しくは経皮的に投与するか又は適切なベクターで発現させてよい。
【００６９】
リスクを示すＳＮＰの対立遺伝子を検出する工程を含む、個体における心臓疾患に対する感受性を測定するための方法であって、前記ＳＮＰが活性ＭＭＰ−９タンパク質のヘモペキシンドメインをコードする領域内に位置する、方法も提供される。
【００７０】
試料中で心臓疾患に対する感受性と関連するＳＮＰを有する第一のポリヌクレオチドの存在についてアッセイするための方法であって、前記ポリヌクレオチドを第二のポリヌクレオチドと接触する工程を含み、前記第二のポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、及び／又は１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列又は前記配列に相補的な配列を含み、且つ、ストリンジェントな条件下で前記第一のポリヌクレオチドとハイブリダイズする、方法も提供される。前記ストリンジェントな条件は、好ましくは高度にストリンジェントであり、好ましくは６×ＳＳＣである。
【００７１】
心臓疾患に対する感受性と関連するＳＮＰを含有する単離されたポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記単離されたポリヌクレオチドが制御配列、好ましくは適切なプロモーターに作動可能に連結されている、ベクターも提供される。前記ベクターを含む宿主細胞も提供される。
【００７２】
全ての態様において、心臓疾患の感受性と関連するＳＮＰは、転写された活性ＭＭＰ−９タンパク質のヘモペキシンドメインにおけるアミノ酸の変化を生じさせ、好ましくは上述のＳＮＰ７２６５、つまり前記ドメインにおいてＡｒｇからＧｌｎへのアミノ酸変化を生じさせるＧからＡへのヌクレオチドの変化を生じさせる。本発明は、心臓疾患に対する感受性に関連するＳＮＰを有する単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを生産するための方法であって、前記ポリペプチドの発現に適切な条件下で上記組換え宿主細胞を培養する工程を含む、方法も提供する。
【００７３】
試料において心臓疾患に対する感受性と関連するＳＮＰを有する単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの存在をアッセイするための方法であって、前記コードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体と前記試料とを接触させる工程を含む、方法も提供される。
【００７４】
本発明は、さらに、心臓疾患に対する感受性と関連するＳＮＰを有するポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物を提供する。
【００７５】
心臓疾患に対する感受性と関連するＳＮＰを含有するポリヌクレオチドの発現を変化させる薬剤を同定するための方法であって、
（ａ）発現のための条件下において、試験する薬剤とポリヌクレオチドを接触させる工程であって、前記ポリヌクレオチドが（１）心臓疾患に対する感受性と関連するＳＮＰ及び（２）レポーター遺伝子と作動可能に連結されたプロモーター領域を含む、工程；
（ｂ）前記薬剤の存在下においてレポーター遺伝子の発現レベルを評価する工程；
（ｃ）前記薬剤の非存在下においてレポーター遺伝子の発現レベルを評価する工程；並びに
（ｄ）発現が前記薬剤によって変化したことを示す差異について、工程（ｂ）における発現レベルを工程（ｃ）における発現レベルと比較する工程
を含む、方法も提供される。
【００７６】
本発明は、第二のポリヌクレオチドの一部に少なくとも部分的に相補的である第一のポリヌクレオチドの存在について試料をアッセイするための方法であって、前記第二のポリヌクレオチドが、配列番号１、３、５、７、９、及び／又は１０によって特定される配列並びにその相補的な配列からなる群から選択される配列を含み、前記方法が、
ａ）ハイブリダイゼーションに適当な条件下で前記第二のポリヌクレオチドと前記試料とを接触させる工程；及び
ｂ）ハイブリダイゼーションが前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドとの間で生じるか否かを評価する工程、
を含み、ハイブリダイゼーションが生じた場合には、前記第一のポリヌクレオチドが前記試料に存在する、方法も提供する。ハイブリダイゼーションの適切なマーカーは、当該技術分野で既知である。
【００７７】
心臓疾患に対する感受性と関連するＳＮＰを含む第一のポリヌクレオチドの存在について試料をアッセイするための試薬であって、前記ポリヌクレオチドの一部に対して少なくとも部分的に相補的な接触ヌクレオチド配列を含む第二のポリヌクレオチドを含む、試薬も提供する。
【００７８】
本発明は、さらに、心臓疾患に対する感受性と関連するＳＮＰを含む第一のポリヌクレオチドの存在について試料をアッセイするための試薬キットであって、
ａ）配列番号１、３、５、７、９、及び／又は１０によって特定される配列及びその相補的な配列からなる群から選択される配列を含む、１つ又は複数の標識した第二のポリヌクレオチド；及び
ｂ）前記標識を検出するための試薬
を別々の容器に含む、試薬キットを提供する。
【００７９】
個体における心臓疾患に対する感受性を診断するための方法であって、前記疾患と関連するハプロタイプを検出する工程を含み、前記ハプロタイプが本発明のＳＮＰ及び少なくとも１つの他のハプロタイプを含む、方法も提供する。好ましくは、前記少なくとも１つの更なるハプロタイプは、ＭＩ後の症状、特に心臓疾患とも関連する。
【００８０】
好ましくは、前記ハプロタイプの存在を検出する工程は、前記個体に由来する核酸の酵素的増幅を含む。好ましくは、前記ハプロタイプの存在を検出する工程は、さらに、電気泳動分析を含む。前記ハプロタイプの存在を検出する工程は、制限断片長多型分析を更に含んでよい。前記ハプロタイプの存在を検出する工程は、配列分析を更に含んでよい。
【００８１】
個体における心臓疾患に対する感受性を診断するための方法であって、
ａ）前記個体に由来するポリヌクレオチド試料を得る工程；及び
ｂ）ハプロタイプの存在又は非存在について前記ポリヌクレオチドを分析する工程
を含み、前記ハプロタイプの存在が前記心臓疾患に対する感受性に相当する、方法も提供する。
【００８２】
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、及び／又は１０によって特定される配列並びにその相補的な配列からなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含有する遺伝子を同定する工程、並びに（ｂ）リスクを示す対立遺伝子を有する抗体における前記遺伝子の発現を、リスクを示す対立遺伝子を有しない個体における前記遺伝子の発現と、前記遺伝子が前記心臓疾患に対する感受性と関連することを示す差異について比較する工程を含む、心臓疾患に対する感受性と関連する遺伝子を同定するための方法も提供する。
【００８３】
本発明は、（ａ）配列番号１、３、５、７、９、及び／又は１０によって特定される配列並びにその相補的な配列からなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含有するポリヌクレオチドを試験する薬剤と接触させる工程、並びに（ｂ）前記薬剤が、心臓疾患を治療するために有用であろう様式において前記ポリヌクレオチドに結合するか、前記ポリヌクレオチドを変化させるか、又は前記ポリヌクレオチドに作用するか否かを測定する工程を含む、心臓疾患を治療するために適切な薬剤を同定するための方法をさらに提供する。
【００８４】
心臓疾患を治療するために適切な薬剤を同定するための方法であって、
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、及び／又は１０によって特定される配列並びにその相補的な配列からなる群から選択される配列内に位置するＳＮＰを含有するポリヌクレオチドによってコードされるか又は配列番号２又は４のポリペプチドを試験する薬剤と接触させる工程；並びに
（ｂ）前記薬剤が、前記心臓疾患を治療するために有用であろう様式において前記ポリペプチドに結合するか、前記ポリペプチドを変化させるか、又は前記ポリペプチドに作用するか否かを測定する工程
を含む、方法も提供する。
【００８５】
前記方法によって同定される薬剤、治療上有効量で前記薬剤を含有する医薬組成物も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】アルギニンの位置をハイライトしたＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインの三次元構造を示す。
【図２】同じ（すなわち、対応する）位置にグルタミンを含有するヒトＭＭＰ−２ヘモペキシンドメインの三次元構造を示す。
【図３Ａ】変異を有しないＭＭＰ−９の構造の三次元構造予測を示す。
【図３Ｂ】変異を有するＭＭＰ−９の構造の三次元構造予測を示す。
【図４Ａ】急性ＭＩ後の患者における血漿ＭＭＰ−９のレベルとＳＮＰ７２７５との間の統計的に有意な関係を示す。
【図４Ｂ】ＭＩの４ヵ月後の患者の駆出率とＳＮＰ７２７５との間の統計的に有意な関係を示す。
【図５Ａ】ヒトＭＭＰ−９の完全なゲノムＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。ハイライトした部分は、グアニジン（Ｇ）からアデニン（Ａ）に変化する際に、アミノ酸配列において太字及び下線でハイライトしたアルギニン（Ｒ）からグルタミン（Ｑ）へのアミノ酸変化（アミノ酸６６８）を誘導するヌクレオチド配列（エクソン１２）の７２６５位のＳＮＰである。
【図５Ｂ】ヒトＭＭＰ−９の完全なゲノムＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。ハイライトした部分は、グアニジン（Ｇ）からアデニン（Ａ）に変化する際に、アミノ酸配列において太字及び下線でハイライトしたアルギニン（Ｒ）からグルタミン（Ｑ）へのアミノ酸変化（アミノ酸６６８）を誘導するヌクレオチド配列（エクソン１２）の７２６５位のＳＮＰである。
【図５Ｃ】ヒトＭＭＰ−９の完全なゲノムＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。ハイライトした部分は、グアニジン（Ｇ）からアデニン（Ａ）に変化する際に、アミノ酸配列において太字及び下線でハイライトしたアルギニン（Ｒ）からグルタミン（Ｑ）へのアミノ酸変化（アミノ酸６６８）を誘導するヌクレオチド配列（エクソン１２）の７２６５位のＳＮＰである。
【図５Ｄ】ヒトＭＭＰ−９の完全なゲノムＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示す。ハイライトした部分は、グアニジン（Ｇ）からアデニン（Ａ）に変化する際に、アミノ酸配列において太字及び下線でハイライトしたアルギニン（Ｒ）からグルタミン（Ｑ）へのアミノ酸変化（アミノ酸６６８）を誘導するヌクレオチド配列（エクソン１２）の７２６５位のＳＮＰである。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、心筋細胞外マトリックス分解の原動力である非常に重要な化合物である。最近の研究によって、心臓では、ＭＭＰが心室リモデリング及び心不全に寄与していることが明確に実証されている。臨床レベルにおいて、近年他のグループによって確認された本発明者のグループによる研究によって、ＭＭＰの血中レベルの上昇はＭＩ後の心不全の発症と関連することが示されている。したがって、ＭＩ又はＣＨＦを有する患者におけるＭＭＰ、特にＭＭＰ−９の測定は、ＴＮＦ−α、アンジオテンシンＩＩ、又はノルエピネフリンと類似の予後測定を与える。好中球及びマクロファージは、少なくとも部分的には大量のＭＭＰ−９の生産によって、心筋障害及び線維症を生じさせる炎症反応において重要な役割を担っている。
【００８８】
本発明者は、リモデリングの間におけるＭＭＰ−９の制御に関わるメカニズムを調査し、ＭＭＰ−９遺伝子の遺伝的多型がＭＭＰ−９の活性を変化させ得るという仮説を検証した。
【００８９】
この目的のために、本発明者は、はじめに、好ましい転帰（ＥＦ>５５%）を有する２２人の患者と好ましくない転帰（ＥＦ＜４０%）を有する２２人の患者からなる、心筋梗塞を有する４４人の患者を選択した。ゲノムDNAを、これらの患者の静脈血から単離した末梢血単核細胞から抽出した。ＭＭＰ−９遺伝子全体（９ｋＢ）の配列を決定した。同時に、ＭＭＰ−９血漿濃度を、ゼラチンザイモグラフィーを用いて測定した。
【００９０】
本発明者は、２つの患者群の間で有意に異なる５つのＳＮＰを同定した。これらのうち、ＭＭＰ−９のコード配列の７２６５位における１つのＳＮＰ（ＳＮＰ７２６５と称する）は、ＭＭＰ−９の構造及び活性の改変と強く関係している。このＳＮＰは、ＴＩＭＰ−１がＭＭＰ−９と相互作用するのと同じドメインであるＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインのアミノ酸組成における変化を誘導する。ＴＩＭＰ−１は、ＭＭＰ−９の最も重要な天然の抑制因子である。単に当該ＳＮＰが存在することは既に知られていた。しかしながら、その臨床的及び治療的重要性は全く認識されていなかった。
【００９１】
本発明者は、次いで、急性ＭＩを有する患者のより大きな集団（２２９人の患者）においてＳＮＰ７２６５の重要性を検証した。本発明者は、ＳＮＰ７２６５、血漿ＭＭＰ−９レベル、及び駆出率の間の統計的に有意な関係を明らかにすることができた。変異の存在は、より低い血漿ＭＭＰ−９レベル及びより高い駆出率と関係するため、ＭＩ患者の臨床転帰を改善する。そのため、前記変異は保護的であり、ＭＩ後に心不全を発症する可能性を低減させる。
【００９２】
したがって、本発明者は、２つの補完的な方法で当該ＳＮＰを使用する新規方法を提案する。第一に、心筋梗塞後に心不全を発送するリスクを有する患者を同定するための診断及び予後方法として、第二に、ＭＭＰ−９活性を特異的に阻害する目的の薬剤設計のためのプラットホームとしての方法を提案する。
【００９３】
ＭＭＰ−９に対する本発明者の最初の論文発表は、２００６年の２月に為されており（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ，上述のもの）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）が急性心筋梗塞後の心不全のマーカーであることを示した。しかしながら、本論文では、ＭＩ後の心臓疾患に対して保護的であるか又は前記疾患に対する感受性の指標であるＳＮＰ又はヌクレオチド若しくはアミノ酸変化については全く言及されていない。
【００９４】
単なる当該ＳＮＰ（ここでは、ＳＮＰ７２６５と称する）の存在は知られていたが、その機能と関連するものではなかった。それは、ＳＮＰが、異なる集団に由来する数百ものヒトのゲノムの配列決定をした複数の研究グループによって多数のＳＮＰと共に同定され（及びＳＮＰ ＩＤ ｒｓ２２７４７５６として与えれ）ているためである。これらの個体は、疾患状態と関連していなかったため、２以上の患者の群（例えば、正常ｖｓ疾患；又は疾患ｖｓ非疾患）の間におけるＳＮＰの頻度の比較は全くされていなかった。すなわち、前記ＳＮＰは、ゲノム配列決定プロジェクトの一部として同定され、ＭＩ後の心臓疾患の発生と関連するものではなかった。
【００９５】
天然のインヒビターであるＴｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＭＭＰ−１（ＴＩＭＰ−１）に対するＭＭＰ−９の結合を改善するための方法、治療上有効量の薬剤を投与する工程を含む末期の心臓疾患と関連する心筋組織の分解を予防するための方法、並びに心筋組織におけるＭＭＰ−９の活性を低減させる薬剤を投与する工程を含む鬱血性心不全の症状を示す患者を治療するための方法も提供する。
【００９６】
ＳＮＰを参照する場合には、明らかにそうではないと示さない限り、ヌクレオチド変化及び結果として生じるアミノ酸変化の双方を包含するものと解されるであろう。
【００９７】
一塩基多型又はＳＮＰは、ゲノムにおいて１つのヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧが、１つの種のメンバーの間（又は個体の一対の染色体の間）で異なる際に生じるＤＮＡ配列変化であると一般的に解されている。例えば、異なる個体に由来する２つの配列決定されたＤＮＡフラグメント、ＡＡＧＣＣＴＡとＡＡＧＣＴＴＡは、１つのヌクレオチドにおける差異を含む。この例では、２つの対立遺伝子：Ｃ及びＴが存在すると称される。
【００９８】
本発明では、保護的な対立遺伝子（アデニンを含み、Ｇｌｎをコードする）及びリスク／感受性を示す対立遺伝子（グアニジンを含む、Ａｒｇをコードする）の２つの対立遺伝子が存在する。
【００９９】
Ｇｌｎをコードするコドンすべて（ＣＡＡ又はＣＡＧ）が検出される可能性があると解されるであろう。代替的又は付加的に、Ａｒｇをコードするコドンすべて（ＣＧＡ又はＣＧＧ）が検出される可能性がある。任意に、追加のフランキングヌクレオチドが、好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２０、並びにより好ましくは少なくとも２５で検出されても良い。ＳＮＰヌクレオチド又はコドンの双方の末端の数は、同じであるか又は異なるものであってよい。
【０１００】
ＳＮＰは、多数のヒトの疾患の原因であることが認められており、特に薬理遺伝学の分野で興味が持たれている。かくして、薬理遺伝学的研究及び各個体に対する治療及び薬物投与のテイラーメイドも、本発明の範囲に包含される。
【０１０１】
本発明のＳＮＰは、同一性試験において使用するための遺伝子パターンも提供し得る。
【０１０２】
検出工程は、タンパク質又はポリヌクレオチド配列を単離する工程、及び１つ又は複数の関連するヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を測定する。
【０１０３】
ＳＮＰを検出するための適切な方法は、当業者に既知であるが、下記のものの任意のものを含んでよい。本発明は、その様な方法のいずれかに限定されない。
【０１０４】
適切な方法は、ミスマッチの塩基対の不安定性に由来するＤＮＡの融点における差異を利用するダイナミックアレルスペシフィックハイブリダイゼーション法（ＤＡＳＨ）を含む、ハイブリダイゼーションに基づく方法を含んでよい。前記方法は、大規模に自動化されてよく、数少ない単純な原理を含むものである。第一の工程では、ゲノム断片を増幅して、ビオチン化プライマーを用いたＰＣＲ反応でビーズに結合させる。第二工程では、増幅産物をストレプトアビジンカラムに結合させて、ＮａＯＨで洗浄して、非ビオチン化鎖を除去する。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを、次いで、二本鎖ＤＮＡに結合する際に蛍光を発する分子の存在下で添加する。次いで、Ｔｍが測定されるまで温度を上昇させながら、強度を測定する。ＳＮＰでは、予測されるＴｍよりも低い。
【０１０５】
分子ビーコンによるＳＮＰ検出は、特別に作製した単鎖オリゴヌクレオチドプローブを利用する。前記オリゴヌクレオチドは、各末端に相補的な配列が存在し、その間にプローブ配列が存在するように設計される。この設計によって、前記プローブがヘアピン又はステムループ構造を天然の単離された状態で呈することを可能にする。前記プローブの一方の末端にフルオロフォアを結合させ、他方の末端に蛍光消光剤を結合させる。前記プローブのステムループ構造のために、フルオロフォアが消光剤に近接し、かくして、前記分子が蛍光を発することを妨げる。前記分子は、プローブ配列のみが、アッセイで使用するゲノムＤＮＡと相補的であるようにも作製される。
【０１０６】
前記分子ビーコンのプローブ配列がアッセイの間に標的ゲノムＤＮＡと遭遇すると、アニールしてハイブリダイズするであろう。前記プローブ配列の長さのために、前記プローブのヘアピン配列が、より長く、より安定なプローブ−標的ハイブリッドの形成に有利に変性するであろう。この立体構造変化が、フルオロフォア及び消光剤を、ヘアピン構造によるそれらの近接した状態から遊離させ、前記分子が蛍光を発することを可能にするであろう。一方で、前記プローブ配列が１つの非相補的なヌクレオチドのみを有する標的配列と遭遇する場合には、前記分子ビーコンはその天然のヘアピン構造に好適に留まり、傾向は観察されず、フルオロフォアは消光されたままであろう。
【０１０７】
これらの分子ビーコンの特有の設計は、単純な診断アッセイによって、所定の位置のＳＮＰを同定することを可能にする。１つの分子ビーコンが野生型の対立遺伝子に適合するように設計され、他の分子ビーコンが前記対立遺伝子の変異体に適合するように設計される場合には、その２つを使用して、個体の遺伝子型を同定し得る。第一のプローブのフルオロフォアの波長のみがアッセイの間で検出される場合には、個体が野生型と同型である。第二のプローブの波長のみが検出される場合には、個体が変異型対立遺伝子と同型である。最後に、双方の波長が検出される場合には、双方の分子ビーコンがそれらの相補的な配列にハイブリダイズしているに違いなく、個体が対立遺伝子とヘテロ接合型の双方を含むに違いない。
【０１０８】
ＳＮＰマイクロアレイも使用されてよい。高密度のオリゴヌクレオチドＳＮＰアレイにおいて、数百数千ものプローブを小さなチップにアレイ化して、多数のＳＮＰによって同時に探索することを可能にし、かくして、本発明に加え、他のリスク因子の検出も可能にする。
【０１０９】
ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びヌクレアーゼを含む酵素に基づく方法は高精度のＳＮＰ遺伝子型決定方法であると解されるため、これらの方法を使用してもよい。
【０１１０】
制限断片長多型（ＲＦＬＰ）は、ＳＮＰを検出するための最も単純且つ初期の方法の１つであると解される。ＳＮＰ−ＲＦＬＰは、多数の異なる複数の制限エンドヌクレアーゼ及びそれらの特有且つ特異的な制限酵素部位に対する高いアフィニティーを利用する。ゲノム試料に対する消化の実施及びゲルアッセイによる断片長の決定によって、期待される制限酵素部位において酵素が切断したか否かを確認することを可能にする。ゲノム試料を切断できないと、同定可能な期待される断片よりも長い断片を生じさせ、制限酵素部位のある点に変異が存在し、ヌクレアーゼ活性に対する保護を与えたことが示される。
【０１１１】
ＰＣＲに基づく方法も想定される。例えば、テトラプライマーＡＲＭＳ−ＰＣＲは、２つのペアのプライマーを使用して、１つのＰＣＲ反応で２つの対立遺伝子を増幅する。前記プライマーは、２つのプライマーのペアがＳＮＰの位置でオーバーラップするが、各々、存在する可能性があるＳＮＰの１つのみに完全に適合するように設計される。結果として、所定の対立遺伝子がＰＣＲ反応に存在する場合には、その対立遺伝子特異的なプライマーのペアは増幅産物を生じさせるが、異なるＳＮＰを有する代替的な対立遺伝子に対しては生じさせない。前記２つのプライマーのペアは、それらのＰＣＲ産物がゲル電気泳動によって簡単に識別可能なバンドを生じさせ得る顕著に異なる長さのものであるようにも設計される。
【０１１２】
その結果を試験する際に、ゲノム試料がホモ接合型である場合には、ＰＣＲ産物はＳＮＰの位置に適合するプライマーから外側の逆の鎖のプライマーまでのもの、並びに２つの逆側の外側のプライマーからのものである。ゲノム試料がヘテロ接合型である場合には、ＰＣＲ産物は、各対立遺伝子のプライマーからそれらの個々の外側の対応するプライマーまでのもの、並びに２つの逆側の外側のプライマーからのものである。
【０１１３】
フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）は、構造特異的な切断を触媒するエンドヌクレアーゼである。当該切断は、ミスマッチに対する感度がよく、高い特異性をもってＳＮＰを探索するために使用し得る。
【０１１４】
基礎的なインベーダーアッセイにおいて、ＦＥＮによる切断を、切断酵素によって認識される３つの要素からなる構造を標的ＤＮＡと共に形成し得る２つの特異的なオリゴヌクレオチドプローブと組み合わせる。第一のプローブは、インベーダーオリゴヌクレオチドとも称され、標的ＤＮＡの３’末端に相補的である。インベーダーオリゴヌクレオチドの最後の塩基は、標的ＤＮＡにおけるＳＮＰヌクレオチドとオーバーラップする非適合塩基である。第二のプローブは、標的ＤＮＡの５’末端と相補的な対立遺伝子特異的プローブであるが、ＳＮＰヌクレオチドの３’末端を過ぎて伸長している。対立遺伝子特異的プローブは、ＳＮＰヌクレオチドに対して相補的な塩基を含有するであろう。標的ＤＮＡが所望の対立遺伝子を含有する場合には、インベーダープローブ及び対立遺伝子特異的プローブは、標的ＤＮＡに結合して、３つの成分からなる構造を形成するであろう。この構造は、対立遺伝子特異的プローブの３’末端を切断及び放出する切断酵素によって認識される。標的ＤＮＡにおけるＳＮＰヌクレオチドが対立遺伝子特異的プローブに相補的でない場合には、正しい３つの成分からなる構造が形成されず、切断が生じない。インベーダーアッセイは、通常、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）システムと組み合わせて、切断を検出する。この設定では、消光剤分子を３’末端に結合させ、フルオロフォアを対立遺伝子特異的プローブの５’末端に結合させる。切断が生じた場合には、フルオロフォアが消光剤分子から分離して、検出可能なシグナルを生じさせるであろう。
【０１１５】
ミスマッチのプローブを用いて最小限の切断のみが生じるため、インベーダーアッセイは非常に特異的である。しかしながら、その本来の形式では、１つのＳＮＰ対立遺伝子のみを反応試料ごとに探索し、現実的な時間内に検出可能なシグナルを生じさせるには大量の標的ＤＮＡを必要とした。様々な開発によって、本来のインベーダーアッセイが改善された。第二のＦＥＮ切断反応を実施することによって、Ｓｅｒｉａｌ Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＳＩＳＡＲ）が、双方のＳＮＰ対立遺伝子を１回の反応で探索することを可能にした。ＳＩＳＡＲインベーダーアッセイは、より少ないＤＮＡを必要とし、本来のインベーダーアッセイの感度を改善している。前記アッセイは、ハイスループットの形式において使用する幾つかの方法にも適合している。１つのプラットホームでは、対立遺伝子特異的プローブは、マイクロスフェアに固定化している。ＦＥＮによる切断が検出可能な蛍光シグナルを発生させる際に、前記シグナルはフローサイトメトリーを用いて測定される。フローサイトメトリーの感度は、標的ＤＮＡをＰＣＲによって増幅することを必要としない。これらのハイスループットプラットホームは、原理の証明の段階を超えて進歩しているものではなく、これまでインベーダーシステムは大規模なＳＮＰ遺伝子型決定プロジェクトで使用されていない。
【０１１６】
他の適切な方法は、プライマー伸長分析、５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＳＮＰ遺伝子型決定のためのＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイ）、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ、単鎖構造多型アッセイ、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）、増幅産物全体の高解像度融解、ＳＮＰｌｅｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって市販されている遺伝子型決定プラットホーム）、又は配列決定による（特にピロシーケンスによる）ものさえ含む。
【０１１７】
用語「ＳＮＰ」は、個体の集団の間で変化するヒトゲノムの特定の位置における一塩基多型を示す。本明細書で使用するように、ＳＮＰは、その名称で特定されるか又は特定の配列内の位置で特定され得る。
【０１１８】
本明細書で使用するように、本発明の配列番号１、３、５、７、９、及び１０によって開示されるヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列の相補的な配列も包含する。加えて、本明細書で使用するように、用語「ＳＮＰ」は一連の対立遺伝子のうちの任意の対立遺伝子を包含する。
【０１１９】
用語「対立遺伝子」は、ＳＮＰを特定するヌクレオチドの選択肢のうちの特定のヌクレオチドを示す。用語「マイナー対立遺伝子」は、メジャー対立遺伝子よりも個体の集団において低頻度で生じているＳＮＰの対立遺伝子、例えば、本発明の保護的な対立遺伝子（Ａを含む）を示す。用語「メジャー対立遺伝子」は、マイナー対立遺伝子よりも個体の集団において高頻度で生じているＳＮＰの対立遺伝子、例えば、本発明のリスクを示す対立遺伝子（Ｇを含む）を示す。
【０１２０】
用語「リスクを示す対立遺伝子」は、ＭＩ後における心臓疾患に対する感受性と関連する対立遺伝子を示す。用語「ハプロタイプ」は、２以上のＳＮＰに由来する特定の対立遺伝子の組み合わせを示す。
【０１２１】
用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を示す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／又はそれらのアナログを含んでよい。ポリヌクレオチドは、単鎖、二本鎖、及び三本鎖の分子構造を含む任意の三次元構造を有してよく、既知又は未知の任意の機能を奏してよい。以下：遺伝子又は遺伝子断片、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、低分子干渉核酸分子（ｓｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーは、ポリヌクレオチドの非限定的な実施態様である。ポリヌクレオチドは、修飾核酸分子、例えば、メチル化核酸分子及び核酸分子アナログも含んでよい。
【０１２２】
「実質的に単離された」又は「単離された」ポリヌクレオチドは、天然では結合している配列から実質的に遊離のものである。実質的に遊離とは、天然で結合している物質から少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％遊離であることを意味する。「単離されたポリヌクレオチド」は、本来又は操作によって、（１）天然で結合しているポリヌクレオチドの全体又は一部と結合していないか、（２）天然で結合しているもの以外のポリヌクレオチドに結合しているか、又は（３）天然には存在しない組換えポリヌクレオチドも含む。
【０１２３】
用語「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」は、互いに少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％の同一性のヌクレオチド配列が、典型的に互いにハイブリダイズした状態を保つハイブリダイゼーション及び洗浄の条件について説明することを意図する。そのようなストリンジェントな条件は当業者に既知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ（１９８９），６．３．１〜６．３．６．において認められる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイズして、５０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて一回以上洗浄することである。
【０１２４】
特定の配列、アミノ酸、又はヌクレオチドを参照する場合には、明らかにそうではない場合を除き、好ましくは、前記参照配列に対して少なくとも７０％の配列相同性、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％、更に好ましくは少なくとも９９．９％の相同性を含むと解される。これを規定するための適切な方法はＢＬＡＳＴプログラムを含む。
【０１２５】
用語「ベクター」は、挿入ＤＮＡを有することが可能であり、且つ、宿主細胞内で留まることが可能なＤＮＡ分子を示す。用語「ベクター」は、細胞に核酸分子を挿入するために主に機能するベクター、核酸の複製のために主に機能する複製ベクター、並びにＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを含む。上記の機能の２つ以上を提供するベクターも含まれる。
【０１２６】
「宿主細胞」は、ベクターの受容体となり得る又は受容体となっている細胞又は細胞培養物或いは核酸分子及び／又はタンパク質を組み込むための細胞又は細胞培養物を含む。宿主細胞は単独の宿主細胞の子孫を含み、前記子孫は、天然、偶発的、又は故意的な変異により本来の親と完全に（形態又はＤＮＡ相補性全体において）同一である必要はなくてよい。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトされた細胞を含む。「単離された宿主細胞」は、その由来とする生物から物理的に分離されているものである。
【０１２７】
用語「個体」、「宿主」、及び「対象」は、本明細書で互換的に使用されており、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを示す。
【０１２８】
用語「形質転換」、「トランスフェクト」、及び「遺伝子形質転換」は、本明細書で互換的に使用されており、挿入に使用する方法、例えば、リポフェクション、形質導入、感染、エレクトロポレーション、ＣａＰＵ４沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、粒子、照射などにかかわらず、外来性のポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入又は導入することを示す。外来性のポリヌクレオチドは、インテグレートされないベクター、例えば、プラスミドとして維持されてよく、代替的には、宿主細胞のゲノムにインテグレートしてよい。遺伝子形質転換は、一過性又は安定的なものであってよい。
【０１２９】
本発明は、他に示さない限り、当該技術分野の技術のうちである分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来技術を利用する。
【０１３０】
本明細書で使用するように、任意の用語の単数形は代替的には複数形を包含してよく、その逆であってもよい。本明細書に記載した全ての文献及び参照例は、任意の目的のためのその全体を参照することによって本明細書に取り込まれる。
【０１３１】
本発明を、以下の非限定的な実施例と関連して説明する。
【実施例】
【０１３２】
患者及び方法
心室リモデリングの背景において関連するＳＮＰを検出する可能性を高めるために、本発明者は、心筋梗塞後に「極端な」フェノタイプを有する患者の２つの群、すなわち、心筋梗塞後に非常に良好に経過している患者（ＥＦ＞５５％、平均６０％）及び不良な経過を示す患者（ＥＦ＜４０％、平均２９％）を選択した。各群に２２人の患者が含まれた。
【０１３３】
ゲノムＤＮＡを、フィコール分離後の末梢血単核細胞から抽出した。抽出は、ＦｌｅｘｉＧｅｎｅ ＤＮＡ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造業者の説明書に従って実施した。ＤＮＡの量及び質は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を用いて評価した。ＤＮＡの完全性は、アガロースゲル電気泳動によって評価した。
【０１３４】
患者のフェノタイプを知ること無く、プロモーター、コード配列、及び非翻訳領域を含む完全なＭＭＰ−９遺伝子（９ｋｂ）を、全ての患者において配列決定した。
【０１３５】
ＭＭＰ−９の血漿レベルを、ゼラチンザイモグラフィーによって測定した。
【０１３６】
図１を参照すると、アルギニンの位置が（点線で囲って）ハイライトされたＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインが認められる。その正味の正電荷は、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１相互作用に関与するはずである。アルギニンが負電荷アミノ酸であるグルタミンに置き換わる推定上の修飾が予測される。
【０１３７】
図２に示すように、ヒトＭＭＰ−２ヘモペキシンドメインは、同じ位置にグルタミンを含む。三次元構造は、当該アミノ酸（点線で囲っている）がインヒビターとの相互作用に関与する可能性があることを示している。
【０１３８】
ＭＡＧＯＳソフトウェアを用いたＭＭＰ−９の構造の予測を図３Ａ及び３Ｂに示す。（明るい色で丸い印をつけて）ハイライトしたところは、正に荷電したアミノ酸である。
【０１３９】
本発明者は、ＳＮＰがグルタミン（図３Ｂ）からアルギニン（図３Ａ）にアミノ酸を変化させる際に、タンパク質の電荷における変化を明示している。
【０１４０】
ＳＮＰ７２６５の存在を検出するための追加の遺伝子型決定実験を、ルクセンブルグ急性心筋梗塞（ＬＵＣＫＹ）登録に由来するより大きな集団に対して実施した。当該登録は、地域の倫理委員会及びデータプロテクション委員会によって認められている。２２９人の患者を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）技術及び以下のプローブ：ＧＡＣＡＣＧＣＡＣＧＡＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＴＡＣＣ［Ａ／Ｇ］ＡＧＧＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＣＴＴ（２６位にＡを含む配列番号９及び２６位にＧを含む配列番号１０）を用いて遺伝子型を決定した。
【０１４１】
全ての患者は、（酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した）ＭＭＰ−９の血漿レベルを記録し、１２５人の患者は、（心エコー検査法によって測定される）ＭＩの４ヵ月後の駆出率を記録した。
【０１４２】
結果
１．ＭＭＰ−９の血漿レベルは、低いＥＦの群では６６０ピクセル２であり、高いＥＦの群では４３７ピクセル２であった。これは、ＭＭＰ−９が心筋梗塞後のＥＦの予測因子であることを示した本発明者の過去の研究に従うものである。
【０１４３】
２．双方の群の間で異なる頻度を有する５つのＳＮＰが同定された。これらのうち、１つのＳＮＰは、コード領域の７２６５位に位置し、アルギニンからグルタミンへのアミノ酸変化を誘導するグアニジンからアデニンへのヌクレオチド変化を有する既知のＳＮＰ（ｒｓ２２７４５６）であった。この変化は、低いＥＦの群の２人の患者に存在し、高いＥＦの群の６人の患者に存在していた。Ａ／Ｇヘテロ接合型の患者における平均のＭＭＰ−９のレベルは、２１５ピクセル２であり、それと比較してホモ接合型のＧ／Ｇ患者では６７５ピクセル２であった（ｐ＝０．００４）。前記アミノ酸変化は、したがって、より低いＭＭＰ−９レベル及びより良好なＭＩ後の臨床転帰と相関している（６０％の６人のＥＦ患者ｖｓ３５％の２人のＥＦ患者）。
【０１４４】
３．急性ＭＩを有する患者に対する遺伝子型決定実験は、一方でＳＮＰ７２６５の存在とＭＭＰ−９血漿レベルとの間、他方でＳＮＰ７２６５と駆出率との間の統計的に有意な関係を明らかにした。血漿ＭＭＰ−９についての平均値は、非変異患者において５６２．４１ｎｇ／ｍＬ（ｎ＝１７６）であり、変異患者において４４０．５５ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝０．０３）であった（Ｐ＝０．０３）。図４Ａ参照のこと。これは、ＳＮＰ７２６５の存在が、より低い血漿ＭＭＰ−９レベルと関連することを示す。駆出率の平均値は、非変異患者で４８．６５％（ｎ＝９３）であり、変異患者で５２．２３％（ｎ＝３２）であった（Ｐ＝０．０４）。図４Ｂ参照のこと。これは、ＳＮＰ７２６５の存在が、より高い駆出率、したがってＭＩ後のより良好な臨床転帰と関連することを示す。
【０１４５】
コラーゲン線維だけでなくＭＭＰ−９の主要なインヒビターであるＴｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ −１（ＴＩＭＰ−１）に対する結合に関与する、ＭＭＰ−９のヘモペキシン様ドメインにおけるその戦略的な位置（図面参照のこと）により、このＳＮＰは、心室リモデリング及び心不全の発症において重要な役割を担っている可能性が高い。
【０１４６】
配列表の簡単な説明
配列番号１：保護的な群に由来するＭＭＰ−９のＤＮＡ配列−７２６５位がアデニン（Ａ）；
配列番号２：保護的な群に由来するＭＭＰ−９のアミノ酸配列−６６８位がＧｌｎ（Ｇ）；
配列番号３：リスク（感受性）を示す群に由来するＭＭＰ−９のＤＮＡ配列−７２６５位がグアニジン（Ｇ）；
配列番号４：リスク（感受性）を示す群に由来するＭＭＰ−９のアミノ酸配列−６６８位がＡｒｇ（Ｒ）；
配列番号５：保護的な群に由来するＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインのＤＮＡ配列−４４３位がアデニン（Ａ）；
配列番号６：保護的な群に由来するＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインのアミノ酸配列−１４８位がＧｌｎ（Ｑ）；
配列番号７：リスク（感受性）を示す群に由来するＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインのＤＮＡ配列−４４３位がグアニジン（Ｇ）；
配列番号８：リスク（感受性）を示す群に由来するＭＭＰ−９のヘモペキシンドメインのアミノ酸配列−１４８位がアルギニン（Ｒ）；
配列番号９：２６位にＡを含むプローブ；
配列番号１０：２６位にＧを含むプローブ。
【図１】
2010515467.tif 000003
【図２】
2010515467.tif 000004
【図３Ａ】
2010515467.tif 000005
【図３Ｂ】
2010515467.tif 000006
【図４Ａ】
2010515467.tif 000007
【図４Ｂ】
2010515467.tif 000008
【図５Ａ】
2010515467.tif 000009
【図５Ｂ】
2010515467.tif 000010
【図５Ｃ】
2010515467.tif 000011
【図５Ｄ】
2010515467.tif 000012
【配列表】
2010515467000001.app
【国際調査報告】
2010515467.tif 000013
2010515467.tif 000014
2010515467.tif 000015
2010515467.tif 000016
2010515467.tif 000017