(57)【要約】  皮膚包帯材に関する改良。活性化に際して、包帯材中のチオールと亜硝酸塩との間の反応によって１種以上のＳ−ニトロソチオールを発生するように構成され、身体部位への酸化窒素送達のためにＣｕ２＋、Ｚｎ２＋および／またはＦｅ２＋イオン源を含む皮膚包帯材が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化に際して、包帯材中のチオールと亜硝酸塩との間の反応によって１種以上のＳ−ニトロソチオールを発生するように構成され、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋および／またはＦｅ２＋イオン源を含む皮膚包帯材。
【請求項２】
チオールを含む第１の構成要素、および亜硝酸塩を含む第２の構成要素を含む、請求項１に記載の皮膚包帯材。
【請求項３】
１．０〜４．０のｐＫａを有するいかなる追加的材料も含まない、請求項１または請求項２に記載の皮膚包帯材。
【請求項４】
亜硝酸塩とチオールが反応して１種以上のＳ−ニトロソチオールを発生するにつれて、皮膚と接する包帯材のｐＨが酸性値からより中性の値に増大する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の皮膚包帯材。
【請求項５】
ｐＫａが４．５〜７．０の緩衝液を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の皮膚包帯材。
【請求項６】
前記第１の構成要素のｐＨが２．０〜５．０である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の皮膚包帯材。
【請求項７】
前記第２の構成要素のｐＨが５．０〜１２．０である、請求項２〜６のいずれか一項に記載の皮膚包帯材。
【請求項８】
前記第１および第２の構成要素が非晶質である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の皮膚包帯材。
【請求項９】
前記第１の構成要素および／または第２の構成要素がポリマー支持体を含む、請求項２〜８のいずれか一項に記載の皮膚包帯材。
【請求項１０】
前記ポリマー支持体がポリアクリル酸を含む、請求項９に記載の皮膚包帯材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（治療的または美容目的で）皮膚の処置のためにヒトまたは動物の体の部分に適用される皮膚包帯材に関し、特に（しかし排他的でなく）損傷した皮膚、特に皮膚病変、すなわち傷害または疾患に起因するかどうかに関わらず、皮膚潰瘍、火傷、切創、刺し傷、裂傷、鈍的外傷、座瘡病変、吹出物などをはじめとする、皮膚表面のあらゆる断絶を処置するための創傷包帯に関する。「皮膚包帯材」という用語は、薬剤の経皮送達との関わりで使用するためのパッチ、プラスター、絆創膏、およびガーゼなどの包帯材を包含する。本用語はまた、非晶質のまたは液体形態の材料を含む。本用語は、内部および外部組織をはじめとする身体表面一般、特に頭皮をはじめとする皮膚に適用される包帯材を包含する。本発明は酸化窒素（ＮＯ）の有益な特性に基づく。
【背景技術】
【０００２】
酸化窒素は生体組織中で多数の効果を有する。これらの効果の機序は、ほとんど常に酸化窒素と、鍵酵素およびその他のタンパク質の金属構成要素（典型的に鉄）、またはチオール基のどちらかとの相互作用に基づく。特定の酵素次第で、このような相互作用はタンパク質の活性化または阻害のどちらかをもたらすことができる。酵素活性化に基づく効果の例は、血管拡張効果である。酸化窒素はグアニル酸環化酵素のヘム鉄に結合し、それは立体構造変化をもたらして酵素の触媒部位が露出する。これはＧＴＰのｃＧＭＰへの触媒転化をもたらす。この転化は、タンパク質のホスホリル化と筋肉弛緩（血管拡張）をもたらす、反応カスケード全体を惹起する。酸化窒素による酵素または成長因子の活性化に基づくその他の効果としては、細胞分裂（増殖）と細胞成熟の刺激、細胞分化と細胞受容体形成の刺激、血管新生、創傷中の線維芽細胞形成、そしてそれによるコラーゲン形成の増強などが挙げられる。
【０００３】
酸化窒素の局所送達は、創傷治癒、皮膚または爪感染症の処置、性的機能不全などをはじめとする、様々な治療的または美容用途において、非常に有用な特徴となることができる。
【０００４】
通常の状態では、酸化窒素（ＮＯ）は短寿命の不安定なガス状物質である。その不安定性は窒素の不対電子に起因する。したがって身体部位中に拡散して、自然にまたは活性化時のどちらかで、酸化窒素を放出する酸化窒素供与体の形態で、局所的に酸化窒素を送達することは有益である。
【０００５】
特に有用な酸化窒素供与体はニトロソチオールである。ニトロソチオールは、自然分解によって酸化窒素を放出できる供与体である。
【０００６】
【化１】
2010535566.tif 000002
【０００７】
分解速度はチオールの側鎖次第で大幅に変動する。例えばニトロソシステインは通常の状態では数分以内にほぼ完全に分解できるのに対し、ニトロソグリセロールのほぼ完全な分解を達成するには数時間／数日間かかる。分解はＣｕ２＋およびＨｇ２＋の存在下で著しく加速できる。ニトロソチオールはまた、別のチオール基上に酸化窒素を直接供与できる。ニトロソ交換と称されるこの過程は、生体内でかなり一般的である。
【０００８】
【化２】
2010535566.tif 000003
【０００９】
ニトロソチオールは、酸性環境内でチオールと亜硝酸塩との反応によって生成できる。反応機序はニトロソニウムカチオン（ＮＯ＋）の形成を伴い、それは次にチオールと反応して対応するニトロソチオールが生成する。
【００１０】
【化３】
2010535566.tif 000004
【００１１】
したがってＳ−ニトロソチオールは、好都合には酸性溶液中でチオール（例えばチオグリセロール）と亜硝酸塩源（例えば亜硝酸カリウム）とを混合することで生成できる。反応はｐＨ＜６で進行し、反応速度は溶液の酸性度と共に増大する。
【００１２】
【化４】
2010535566.tif 000005
【００１３】
国際公開第２００６／０９５１９３号パンフレットは、活性化に際して１種以上のＳ−ニトロソチオールを放出するように構成された皮膚包帯材を開示する。包帯材は、亜硝酸塩源、チオール源、およびプロトン源を含有する、１つ以上の構成要素を含む。
【００１４】
ニトロソチオール発生速度がｐＨによって制御できることは周知である。原則として亜硝酸塩源およびチオールを含有する調合物の酸性度増大と共に、速度は増大する。しかし単にｐＨを調節することでこのような迅速なニトロソチオールの発生を確実にできるものの、必要とされる酸性度はこのような調合物の適用性（例えば無傷のまたは創傷皮膚上に適用する場合）を妨げるかもしれない。
【００１５】
用途によっては遅いニトロソチオール発生速度のみが必要であるかもしれないが、迅速なニトロソチオールのバーストから恩恵を受けるその他の用途がある。単にｐＨを調節することでこのような迅速なニトロソチオールの発生を確実にできるが、必要とされる酸性度はこのような調合物の適用性（例えば無傷のまたは創傷皮膚上に適用する場合）を妨げるかもしれない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、活性化に際して包帯材中のチオールと亜硝酸塩との反応によって、１種以上のＳ−ニトロソチオールを発生するように構成された皮膚包帯材に関し、皮膚包帯材はＣｕ２＋、Ｚｎ２＋および／またはＦｅ２＋イオン源を含む。
【００１７】
本発明は、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋またはＦｅ２＋、好ましくはＣｕ２＋などの遷移金属カチオンの存在が、亜硝酸塩源およびチオールを含有する系内のニトロソチオール生成速度を増大できるという意外な発見に基づく。これは調合物のｐＨのいかなる変更もなしに達成される。この効果はニトロソチオール発生速度に対する代案の制御を提供し、皮膚に刺激や害が少ないより穏和なｐＨにおいて、より迅速なニトロソチオール発生が達成できるようにする。
【００１８】
ニトロソチオール分解速度に対する２種の金属カチオン（Ｈｇ＋およびＣｕ＋）の影響は数十年にわたって確立されているが、ニトロソチオールの生成速度を増大させる遷移金属の使用は、かつて考察されていない。
【００１９】
亜硝酸塩が３．４のｐＫａ（２５℃）を有する化合物であることは、理解されるであろう。したがって亜硝酸塩は系内で緩衝液の役割を果たすことができ、ｐＨを３〜４の範囲内に維持できる。
【００２０】
例えば皮膚部位において２つの構成要素を一緒にすることで包帯材を活性化させた後、Ｓ−ニトロソチオールが発生し始めるようなｐＨになる。この反応中に亜硝酸塩は酸性環境を維持するのを助ける。しかしその緩衝能力は反応が進行するにつれて低下する。
【００２１】
好ましくは包帯材中にはｐＫａが１〜４の追加的緩衝液はないので、反応が進行するにつれて包帯材のｐＨは上昇し、ｐＨは酸性値（例えば５未満、例えば３〜４）からより中性の値（例えば５超、例えば６〜７）に増大する。
【００２２】
ｐＨの上昇は減少し、最終的にはＳ−ニトロソチオールの生成を停止させるかもしれないが、Ｃｕ２＋イオン源、Ｚｎ２＋イオン源および／またはＦｅ２＋イオン源、特にＣｕ２＋イオン源の存在はＳ−ニトロソチオールの生成を加速させ、より高いｐＨ値で生成が持続できるようにする。
【００２３】
例えば局在的な血管拡張および結果的な血流量増大を達成するために、酸化窒素の迅速な発生が必要とされる場合、チオールのニトロシル化が非常に容易に進行するように、活性化直後の調合物のｐＨは非常に低くなくてはならない。しかし遷移金属カチオンの存在下では、より穏やかなｐＨで同様の迅速なチオールニトロシル化速度を達成できる。
【００２４】
チオールは、好ましくは１−チオグリセロール、１−チオグルコース、システインのメチル−エステルまたはエチル−エステルからなる群から選択されてもよい。
【００２５】
その他の適切なチオールとしては、グルタチオン（生理学的に重要な形態であることからＬ−グルタチオン）、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエチルアミン、３−メルカプトプロパン酸が挙げられる。
【００２６】
包帯材中の試薬を共に反応させることで、１種以上のＳ−ニトロソチオールが発生する。
【００２７】
包帯材は、例えば亜硝酸カリウムなどの亜硝酸塩、および例えば１−チオグリセロールなどのチオールを含み、活性化に際して包帯材中で共に反応してＳ−ニトロソチオールを発生させ放出する。
【００２８】
試薬は、使用前には離しておかれる包帯材の別々の構成要素中で適切に提供される。包帯材を活性化するためには、２つの包帯材構成要素を接触させて（必要ならば水源およびプロトン源の存在下で）、包帯材中でＳ−ニトロソチオールの生成をもたらし、それは次に典型的に包帯材から放出される。好ましくは２つの包帯材構成要素は、別々に包装される。あるいは、それらは密封容器内で接触させて一緒に包装でき、包みから出すと一成分系として即座に使える。
【００２９】
好ましくは包帯材は、チオールを含む第１の構成要素、および亜硝酸塩を含む第２の構成要素を含む。
【００３０】
この二成分系では、典型的に第１の構成要素は酸性で、２〜５、好ましくは３〜４の範囲のｐＨを有する。第２の構成要素は、５〜１２、好ましくは６〜１１、より好ましくは７〜１０の範囲のｐＨを有してもよい。ｐＫａが７〜１２の範囲内である少量の緩衝液が、任意に第２の構成要素中に存在する。
【００３１】
好ましくは第１の構成要素は、ｐＫａが４．５〜７．０、好ましくは５〜６、最も好ましくは約５．５の緩衝液をさらに含む。上で考察したように第１の構成要素のｐＨは、好ましくは３〜４の値を有する。このｐＨでは非常に高比率の緩衝液がプロトン化形態で存在し、したがって有用なプロトン源（またはレザバー）の役割を果たすことができる。
【００３２】
この緩衝液の緩衝能力は、約３〜４のｐＨでは最小であるので、活性化に続いて、組成物中では亜硝酸塩が優勢な緩衝液である。プロトンの消費を伴う、亜硝酸塩のＳ−ニトロソチオールへの転化が進行するにつれて、亜硝酸塩の緩衝能力は減少しｐＨが増大する。プロトン源緩衝液（例えばｐＫａ約５．５）の緩衝への寄与は初期段階では最小であるが、それはｐＨが亜硝酸塩のＳ−ニトロソチオールへの転化がかなり非効率的になる４．５を超えて、あまりにも激しく上昇するのを防止する。ｐＨはほとんどの亜硝酸塩が転化された場合にのみこれらのレベルに達し、その時点では酸化窒素の蓄積が達成されるので、低いｐＨはもはや必要でない。
【００３３】
したがってプロトン交換の観点から亜硝酸塩（ｐＫａ３．４）とプロトン源緩衝液（ｐＫａ約５．５）の間に協調があり、穏やかなｐＨ環境を維持しながら亜硝酸塩の効率的な転化を確実にする。
【００３４】
１種以上のＳ−ニトロソチオールの所望の生成速度および収率を達成するための適切な試薬量は、容易に判定できる。一般に包帯材を基準にして、０．１％〜５％（ｗ／ｗ）範囲の各試薬量が適切である可能性が高い。
【００３５】
本包帯材構成要素または各包帯材構成要素は、例えばいかなる固定形態または形状も有さず、ノズルを通して絞り出すことをはじめとして、三次元に変形および成形できる、非晶質材料から製造されるシート、スラブまたはフィルム形態の層形態であってもよい。
【００３６】
本包帯材構成要素または各包帯材構成要素は、好都合には典型的にポリマーマトリックスの形態のキャリアまたは支持体を含む。系の本構成要素または各構成要素は、液体、非晶質ゲル形態、例えばシート、スラブまたは乾燥フィルム形態の層形態であることができる。特に都合よい支持体は、５〜６の間のｐＫａを有する解離基を含有するポリアクリル酸ベースのポリマーを含む。
【００３７】
キャリアまたは支持体は、好都合には水和ヒドロゲルを含む。水和ヒドロゲルは、水和形態にある１つ以上の水ベースのまたは水性のゲルを意味する。したがって水和ヒドロゲルは、包帯材を活性化するための水源を含む。水和ヒドロゲルはまた、創傷部位から滲出する水およびその他の物質を吸収する役割を果たすことができ、創傷部位からこのような物質を除去することで、包帯材が有益で有用な機能を果たせるようにする。水和ヒドロゲルはまた、使用時に機能して創傷部位を湿潤に保ち治癒を助ける、水分源も提供する。
【００３８】
適切な水和ヒドロゲルは、国際公開第０３／０９０８００号パンフレットで開示されている。水和ヒドロゲルは、好都合には親水性ポリマー材料を含む。適切な親水性ポリマー材料としては、ポリ２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ｐｏｌｙ−ＡＭＰＳ）および／またはそれらの塩類（例えば国際公開第０１／９６４２２号パンフレットで述べられているような）と、例えば多糖類ガムのような多糖類、特にキサンタンガム（例えばＫｅｌｔｒｏｌの商標の下に入手できる）と、様々な糖類と、ポリカルボン酸（例えばＩＳＰ  ＥｕｒｏｐｅからＧａｎｔｒｅｚ  ＡＮ−１６９  ＢＦの商標の下に入手できる）と、ポリ（メチルビニルエーテル−ｃｏ−マレイン酸無水物）（例えばＧａｎｔｒｅｚ  ＡＮ  １３９の商標の下に入手でき２０，０００〜４０，０００の範囲の分子量を有する）と、ポリビニルピロリドン（例えばＰＶＰ  Ｋ−３０およびＰＶＰ  Ｋ−９０として知られている市販等級の形態の）と、ポリエチレンオキシド（例えばＰｏｌｙｏｘ  ＷＳＲ−３０１の商標の下に入手できる）と、ポリビニルアルコール（例えばＥｌｖａｎｏｌの商標の下に入手できる）と、架橋ポリアクリルポリマー（例えばＣａｒｂｏｐｏｌ  ＥＺ−１の商標の下に入手できる）と、ヒドロキシプロピルセルロース（例えばＫｌｕｃｅｌ  ＥＥＦの商標の下に入手できる）およびカルボキシメチルセルロースナトリウム（例えばＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｇｕｍ  ７ＬＦの商標の下に入手できる）およびヒドロキシエチルセルロース（例えばＮａｔｒｏｓｏｌ  ２５０  ＬＲの商標の下に入手できる）をはじめとするセルロースおよび変性セルロースをはじめとする、例えばＦｉｒｓｔ  Ｗａｔｅｒ  Ｌｔｄ．から独自仕様のヒドロゲルの形態で提供されるようなポリアクリレートおよびメタクリレートが挙げられる。
【００３９】
親水性ポリマー材料の混合物をゲル中で使用してもよい。
親水性ポリマー材料の水和ヒドロゲル中では、親水性ポリマー材料は、ゲル総重量を基準として、望ましくは少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％、より好ましくは少なくとも５％、なおもより好ましくは少なくとも１０％、または少なくとも２０％、望ましくは少なくとも２５％、そしてなおもより望ましくは少なくとも３０重量％の濃度で存在する。ゲル総重量を基準として約４０重量％までのさらに多くの量を使用してもよい。
【００４０】
ゲル総重量の約３０重量％の量のｐｏｌｙ−ＡＭＰＳおよび／またはそれらの塩類の水和ヒドロゲルの使用によって、良好な結果が得られている。
【００４１】
水和ヒドロゲル材料は典型的に材料の固体層、シートまたはフィルムの形態であり、典型的に架橋されており、機械的強化構造物に組み込まれてもよい。層、シートまたはフィルムのサイズと形状は、意図される包帯材の使用に適合するように選択できる。０．０５〜５ｍｍ、好ましくは０．５〜３ｍｍの範囲の厚さが特に適切である。
【００４２】
あるいは、水和ヒドロゲルは、いかなる固定形態または形状も有さず、ノズルを通して絞り出すことをはじめとして、三次元に変形および成形できる、固定された形態または形状を有さない非晶質ゲルの形態であってもよい。非晶質ゲルは典型的に架橋されておらず、または低い架橋レベルを有する。剪断減粘性非晶質ゲルを使用してもよい。このようなゲルは剪断応力をかけると（例えばノズルを通して注ぎ出すまたは絞り出すと）液体であるが、静止時には固化する。したがってゲルは、例えば典型的に約３ｍｍ径のノズルがあるピストンおよびシリンダーを含む圧縮管またはシリンジ様計量分配装置から分注されてもよい、注入できるまたは絞れる構成要素の形態であってもよい。非晶質ゲルは、二成分系の効率的混合を可能にする。このようなゲルは表層の形態で、または利用可能空間を充填して創面に接触する完全に順応性のゲルとして創腔内に適用されてもよい。
【００４３】
非晶質ゲル調合物の典型的な例は、１５％ｗ／ｗ  ＡＭＰＳ（ナトリウム塩）、０．１９％ポリエチレングリコールジアクリレート、および０．０１％ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトンを分析等級ＤＩ水で１００％容積に満たしたものである。試薬を完全に混合して溶解し、次におよそ１００ｍＷ／ｃｍ２を送達するＵＶ−Ａ灯を使用して３０〜６０秒間重合し、必要なヒドロゲルを形成する。これはプラスチックシリンジ内に収容されてもよく、次にそれから表層として、または創腔を充填するために、シリンジから標的部位に非晶質ゲルを分注してもよい。
【００４４】
包帯材の構成要素は、乾燥形態であることもできる。適切な乾燥支持体ポリマー材料の例としては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギネートまたはカルボキシメチルセルロースが挙げられる。活性物質、特にチオールの安定性は、一般に乾燥形態の方がより良い。
【００４５】
一実施態様では本発明は、例えば亜硝酸カリウムなどの亜硝酸塩源を含む、好ましくはｐｏｌｙ−ＡＭＰＳおよび／またはそれらの塩類である水和ヒドロゲルの層を含む第１の構成要素と、例えば１−チオグリセロールなどのチオールを含有する、好ましくは乾燥ＰＶＡである乾燥ポリマーマトリックスを含む第２の構成要素とを含有する。上で考察したように水和ヒドロゲルは皮膚接触に有益な特性を有するので、第１の構成要素は皮膚と接して使用されてもよく、第２の構成要素は第１の構成要素の上に載せられる。２つの構成要素を接触させると、これは包帯材を活性化する効果を有する。第１の構成要素の水和ヒドロゲル中の水は適切な水性環境を提供する働きをして、Ｓ−ニトロソチオールを発生させる。
【００４６】
別の実施態様では、包帯材は非晶質である２つの構成要素を含む。構成要素は、例えばゲル、半固体、ペースト、クリーム、ローション、または例えば水溶液などの液体の形態であることができる。水和ヒドロゲルは、上で考察したように好都合に用いられてもよい。このタイプの実施態様では、各構成要素は好ましくは、一緒にすると活性化されて１種以上のＳ−ニトロソチオールを放出する試薬を含有する。好ましくは１つの構成要素は亜硝酸塩を含有し、もう１つはチオールを含有する。あるいは、亜硝酸塩およびチオールは、例えば７を超えるｐＨなど、その反応を防止するのに十分高いｐＨで一緒にすることができ、第２の構成要素が酸性度の供給源を含有する。別の可能性は、１つの構成要素が無水Ｓ−ニトロソチオールを含有して、第２の構成要素が水を含有することである。
【００４７】
２つの非晶質構成要素は、身体表面に包帯材を適用することが所望されるまで離しておかれる。好都合にはそれらは、それを通じて非晶質構成要素を送達できるノズルを有する容器内に包装される。好ましくは２つの構成要素は、好ましくは双方の構成要素を同時に送達するように作動可能である、２区画計量分配装置内に包装される。２つの構成要素はまた、密封容器内で接触させて一緒に包装でき、包みから出す一成分系として即座に使える。
【００４８】
さらに別の実施態様では、包帯材は２つの乾燥構成要素を含む。適切な乾燥支持体ポリマー材料の例は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギネートまたはカルボキシメチルセルロースである。２つの構成要素は保存中に離しておかれ、それらを一緒にして水分を添加することで活性化される。あるいは、それらは保存中に一緒にでき、水分を添加することで活性化される。
【００４９】
好ましい実施態様は、２つの包帯材構成要素を含み、１つは亜硝酸塩を含有し、もう１つは例えばグルタチオンなどのチオールを含有する。２つの構成要素は、上で考察したように、多種多様な材料形態を取ることができる。しかし次の組み合わせ例が、目下好ましいとされている。
【００５０】
【表１】
2010535566.tif 000006
【００５１】
包帯材は上述のように任意に、好ましくはｐｏｌｙ−ＡＭＰＳの水和ヒドロゲルおよび／またはそれらの塩類を含む皮膚接触層を含み、またはそれと共に使用される。
【００５２】
包帯材は任意に、既知の様式で包帯材をヒトまたは動物の皮膚に接着するための被覆または外層を含み、またはそれと共に使用される。
【００５３】
本発明に係る包帯材は、例えば異なるサイズおよび形状の創傷などの皮膚領域の処置のために、様々な異なるサイズおよび形状で製造できる。特定の包帯材に適した試薬の量は、実験によって容易に判定できる。
【００５４】
包帯材構成要素は、例えば二重チャンバープラスチック管またはラミネートアルミ箔包装などの無菌密封水不浸透性包装内に、使用前に適切に保存される。
【００５５】
使用時には、１つまたは複数の包帯材構成要素をそれらの包装から取り出して、例えば創傷、または美容または治療的目的で処置されるその他の皮膚領域上などのヒトまたは動物の皮膚の上に整然と配置する。包帯材はまた、上述のように経皮送達のためのアジュバントとして使用されてもよい。複合成分包帯材の場合、包帯材は構成要素を接触させることで活性化され、（活性化後の包帯材中での発生後に）包帯材からの１種以上のＳ−ニトロソチオールの放出がもたらされる。Ｓ−ニトロソチオールは自然に分解して酸化窒素を生じ、それは組織に対して有益な効果を有して血管拡張もまた引き起こす。
【００５６】
例示として以下の実施例で、添付図を参照して本発明についてさらに詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ｐＨ４．０における１−チオグリセロールのニトロシル化速度に対する第二銅カチオンの効果を示す、吸光度（３３８ｎｍ）対時間（分）のグラフである。吸光度（３３８ｎｍ）は溶液中のＳ−ニトロソ−１−チオグリセロールの濃度に正比例する。
【図２】ｐＨ４．５における１−チオグリセロールのニトロシル化速度に対する第二銅カチオンの効果を示す、吸光度（３３８ｎｍ）対時間（分）のグラフである。吸光度（３３８ｎｍ）は溶液中のＳ−ニトロソ−１−チオグリセロールの濃度に正比例する。
【図３】ｐＨ５．０における１−チオグリセロールのニトロシル化速度に対する第二銅カチオンの効果を示す、吸光度（３３８ｎｍ）対時間（分）のグラフである。吸光度（３３８ｎｍ）は溶液中のＳ−ニトロソ−１−チオグリセロールの濃度に正比例する。
【図４】ｐＨ４．０における１−チオグリセロールのニトロシル化速度に対する亜鉛カチオンの効果を示す、吸光度（３３８ｎｍ）対時間（分）のグラフである。吸光度（３３８ｎｍ）は溶液中のＳ−ニトロソ−１−チオグリセロールの濃度に正比例する。
【図５】ｐＨ４．０における１−チオグリセロールのニトロシル化速度に対する第一鉄カチオンの効果を示す、吸光度（４９６ｎｍ）対時間（分）のグラフである。吸光度（４９６ｎｍ）は溶液中のＳ−ニトロソ−１−チオグリセロールの濃度に正比例する。
【図６】ｐＨ４．５における１−チオグリセロールのニトロシル化速度に対する第一鉄カチオンの効果を示す、吸光度（４９６ｎｍ）対時間（分）のグラフである。吸光度（４９６ｎｍ）は溶液中のＳ−ニトロソ−１−チオグリセロールの濃度に正比例する。
【実施例】
【００５８】
材料と方法
化学薬品およびその他の材料
水（導電率＜１０μＳｃｍ−１；分析試薬等級、ＦｉｓｈｅｒまたはＳａｎｙｏ  Ｆｉｓｔｒｅｅｍ  ＭｕｌｔｉＰｕｒｅのどちらか）
亜硝酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ製（Ｓ２２５２）
１−チオグリセロール、Ｆｌｕｋａ製（８８６４１）
塩酸、Ｆｉｓｈｅｒ製（Ｊ／４３１０／１７）
硫酸第一鉄、Ａｌｄｒｉｃｈ製（２１，５４２−２）
硝酸第二銅、Ａｌｄｒｉｃｈ製（４６７８５５）
硫酸亜鉛、Ｓｉｇｍａ製（Ｚ４７５０）
クエン酸ナトリウム、Ｆｉｓｈｅｒ製（ＢＰＥ３２７−５００）
３３８ｎｍにおける直接吸光度測定を使用した水溶液中のＳ−ニトロソチオール濃度の測定
ニトロソチオールは、３３８ｎｍ（ε３３８＝およそ９００Ｍ−１ｃｍ−１）前後でＵＶ光を吸収することが知られている。したがってニトロシル化速度は、３３８ｎｍでの直接吸光度測定によって追跡できる（Ｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３８，１５０−１５８，１９９６）。クエン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ４．０またはｐＨ４．５のどちらか）中で、亜硝酸塩（５ｍＭ）および所定濃度の遷移金属（Ｃｕ２＋またはＺｎ２＋のどちらか）を含有する溶液を調製し、吸光度（３３８ｎｍ）を測定した。１−チオグリセロールを混合物に添加して５ｍＭの濃度を得て、吸光度（３３８ｎｍ）の変化を時間の関数として追跡した。鉄化学種の干渉のために、ニトロシル化速度に対するＦｅ２＋カチオンの効果を研究する際には、この方法は使用できなかった。
【００５９】
Ｇｒｉｅｓｓ法を使用した水溶液中のＳ−ニトロソチオール濃度測定
ニトロシル化速度に対するＦｅ２＋カチオンの効果を研究する際は、この方法を使用した。クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０またはｐＨ４．５またはｐＨ５．０のいずれか）中で、亜硝酸塩（５ｍＭ）および所定濃度のＦｅ２＋を含有する溶液を調製した。１−チオグリセロールを混合物に添加して５ｍＭの濃度を得て、以下の手順（Ｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３８，１５０−１５８，１９９６に基づく）を使用して、Ｓ−ニトロソ−１−チオグリセロールの濃度を時間の関数として測定した。
【００６０】
次の試薬を調製した。
試薬１：Ｎａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．１Ｍ）
試薬２：Ｇｒｉｅｓｓ試薬：２ｍＬのＤＭＳＯに溶解された２０ｍｇのＮ−（１−ナフチル）エチレンジアミン二塩酸塩（ＮＡＤＤ）＋５００ｍｇのスルファニルアミド（注記：この溶液は感光性であり、できる限り暗所に保存すること）
試薬３：ＤＭＳＯ中の塩化第二水銀（１０ｍＭ）（５ｍＬのＤＭＳＯ中に１３．５８ｍｇのＨｇＣｌ２）
次に下述の通りである６段階の手順が続いた。
１．５ｍＬの試薬１をプラスチックキュベットに分注する。
２００μＬのサンプル（すなわちその中でＳ−ニトロソ−１−チオグリセロール濃度を判定するサンプル）を添加する。
１．１７ｍＬのＤＩ水を添加する。
１００μＬの試薬２を添加する。
３０μＬの試薬３を添加して溶液をよく混合する。
得られた混合物の吸光度を４９６ｎｍで１０分間読み取る。
【００６１】
ニトロソチオールの濃度は、ニトロソチオールのモル吸収係数＝およそ１０，０００Ｍ−１ｃｍ−１を使用して、吸光度の読み取りから推定できる。
【００６２】
実施例１：１−チオグリセロールのニトロシル化速度に対するＣｕ２＋の効果
この実施例は、ｐＨ４．０（図１）、ｐＨ４．５（図２）、およびｐＨ５．０（図３）における、ニトロソチオール発生速度に対する第二銅カチオンの効果を実証する。３３８ｎｍでサンプルの吸光度を測定して追跡すると、ニトロシル化速度は１０μＭ〜１００μＭの濃度範囲の第二銅カチオンの存在下で大幅に増大した。
【００６３】
実施例２：１−チオグリセロールのニトロシル化速度に対するＺｎ２＋の効果
この実施例は、ｐＨ４．０におけるニトロソチオール発生速度に対する亜鉛カチオンの効果を実証する（図４）。３３８ｎｍでサンプルの吸光度を測定して追跡すると、ニトロシル化速度は１００μＭ亜鉛カチオンの存在下で増大した。ニトロシル化速度の増大は、２５０μＭの亜鉛カチオンの存在下でより著しかった。
【００６４】
実施例３：１−チオグリセロールのニトロシル化速度に対するＦｅ２＋の効果
この実施例は、ｐＨ４．０（図５）およびｐＨ４．５（図６）における、ニトロソチオール発生速度に対する第一鉄カチオンの効果を実証する。鉄化学種からの干渉のために、ニトロシル化速度は、３３８ｎｍにおけるサンプルの吸光度測定では追跡できなかった。代わりに、Ｓ−ニトロソ−１−チオグリセロールの発生は、Ｇｒｉｅｓｓ法（Ｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３８，１５０−１５８，１９９６）によって追跡した。ニトロシル化速度は、１００μＭおよび２５０μＭの第一鉄カチオンの存在下の双方で増大することが分かった。
【図１】
2010535566.tif 000007
【図２】
2010535566.tif 000008
【図３】
2010535566.tif 000009
【図４】
2010535566.tif 000010
【図５】
2010535566.tif 000011
【図６】
2010535566.tif 000012
【国際調査報告】
2010535566.tif 000013
2010535566.tif 000014