(57)【要約】  ＩＧＦ‐ＩＲに結合し、Ａｓｎ２９７が糖鎖でグリコシル化された抗体であり、前記糖鎖中のフコースの量が２０％〜５０％であることにおいて特徴付けられる前記抗体は、抗腫瘍治療における特性を改善した。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＧＦ‐ＩＲに結合し、及びＡｓｎ２９７が糖鎖でグリコシル化された抗体であり、前記糖鎖中のフコースの量が２０％〜５０％であることにおいて特徴付けられる、前記抗体。
【請求項２】
前記糖鎖中のフコースの量が２０％〜４０％であることにおいて特徴付けられる、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＮＧＮＡの量が１％以下、及び／又はＮ末端アルファ‐１，３‐ガラクトースの量が１％以下であることにおいて特徴付けられる、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
ＮＧＮＡの量が０．５％以下であることにおいて特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
Ｎ末端アルファ‐１，３‐ガラクトースの量が０．５％以下であることにおいて特徴付けられる、請求項１〜４に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体がキメラ、ヒト化又はヒト抗体であることにおいて特徴付けられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が：
ａ)  ＩＧＦ‐ＩＲへのＩＧＦ‐Ｉの結合の阻害と、ＩＧＦ‐ＩＲへのＩＧＦ‐ＩＩの結合の阻害のＩＣ50値の比率が、１：３〜３：１を示す；
ｂ)  濃度５ｎＭで、０．５％非働化ウシ胎児血清(ＦＣＳ)及び１０ｎＭのヒトＩＧＦ‐１を含む培地中のＨＴ２９細胞を用いた細胞リン酸化アッセイにおけるＩＧＦ‐ＩＲリン酸化を、前記抗体を用いないアッセイと比較したとき、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％阻害する；
ｃ)  濃度１０μＭで、０．５％非働化ウシ胎児血清(ＦＣＳ)を含む培地中の細胞あたり４００，０００〜６００，０００分子のＩＧＦ‐ＩＲを提示する３Ｔ３細胞を用いた細胞リン酸化アッセイにおいて、前記抗体を用いないアッセイと比較したとき、ＰＫＢリン酸化により測定されるＩＧＦ‐ＩＲ活性を示さない(シグナルが無く、ＩＧＦ−１の模倣物的な活性が無い)
からなる群から選択される１以上の特性を示すことにおいて特徴付けられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
約１０-13〜１０-9Ｍ(ＫD)の親和性により特徴付けられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
相補性決定領域(ＣＤＲ)として、以下の配列：
ａ)   ＣＤＲとして、配列番号１又は３のＣＤＲ１(ａａ３１−３５)、ＣＤＲ２(ａａ５０−６６)及びＣＤＲ３（ａａ９９−１０７)を含む抗体重鎖；
ｂ)   ＣＤＲとして、配列番号２又は４のＣＤＲ１(ａａ２４−３４)、ＣＤＲ２(ａａ５０−５６)及びＣＤＲ３（ａａ８９−９８)を含む抗体軽鎖
を含むことにより特徴付けられる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
医薬組成物を製造するための請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
癌を治療するための医薬組成物の製造のための請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項１３】
前記抗体が、細胞毒性因子、そのプロドラッグ又は細胞毒性放射線治療と組み合わせて投与されることにおいて特徴付けられる、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体を患者に投与することにより特徴付けられる、抗腫瘍治療を要する患者を治療する方法。
【請求項１５】
前記抗体を細胞毒性因子、そのプロドラッグ又は細胞毒性放射線治療と組み合わせて投与されることにおいて特徴付けられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
組換えによりＧｎＴＩＩＩ及び抗ＩＧＦ‐１Ｒ抗体を発現することが可能となったＣＨＯ細胞。
【請求項１７】
ＩＧＦ‐ＩＲに結合し、及びＡｓｎ２９７が糖鎖でグリコシル化された抗体であり、ＦｃγＲＩＩＩへの高い結合親和性を示すことにおいて特徴付けられる、前記抗体。
【請求項１８】
癌の治療、好ましくは乳癌、膵癌、及び／又はＮＳＣＬＣの治療のための請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１９】
乳癌、膵癌、及び／又はＮＳＣＬＣを治療するための請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトインスリン様増殖因子Ｉ受容体(ＩＧＦ−ＩＲ)に対する抗体、それらを生産する方法、上記抗体を含む医薬組成物、及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリン様増殖因子Ｉ受容体(ＩＧＦ−ＩＲ、ＥＣ２．７．１１２，ＣＤ２２１抗原)は、膜貫通型タンパク質チロシンキナーゼファミリーに属する(LeRoith, D., et al., Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163;及びAdams, T.E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093)。ＩＧＦ−ＩＲは高い親和性でＩＧＦ−Ｉと結合し、インビボにおけるこのリガンドに対する生理的反応を開始する。また、ＩＧＦ−ＩＲはＩＧＦ−ＩＩとも結合するが、その親和性は若干低い。ＩＧＦ−１Ｒを含むＩＧＦ−１系は、（正常な及び腫瘍性の)細胞の増殖の過程において重要な役割を果たす。ＩＧＦ−１Ｒは、正常なヒト組織、例えば、胎盤、前立腺、膀胱、腎臓、十二指腸、小腸、胆嚢、総胆管、肝内胆管、気管支、扁桃腺、胸腺、乳房、皮脂腺、唾液腺、子宮頸部、及び卵管で見出される。ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現は細胞の腫瘍性形質転換を促進し、ＩＧＦ−ＩＲが細胞の悪性形質転換に関与することから、癌を治療するための治療剤の開発にとって有用な標的となる証拠が存在する(Adams, T.E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093)。
【０００３】
ＩＧＦ−ＩＲに対する抗体は当該技術分野において周知であって、インビトロ及びインビボでそれらの抗腫瘍効果が調査されている(Benini, S., et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001) 1790-1797; Scotlandi, K., et al., Cancer Gene Ther. 9 (2002) 296-307;Scotlandi, K., et al., Int. J. Cancer 101 (2002) 11-16; Brunetti, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989) 212-218; Prigent, S.A., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 9970-9977; Li, S.L., et al., Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243- 252; Pessino, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 1236-1243; Surinya, K.H., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 16718-16725; Soos, M.A., et al., J.Biol. Chem., 267 (1992) 12955-12963; Soos, M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 5217-5221; O'Brien, R.M., et al., EMBO J. 6 (1987) 4003-4010; Taylor, R., et al., Biochem. J. 242 (1987) 123-129; Soos, M.A., et al., Biochem. J. 235 (1986) 199-208; Li, S.L., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (1993) 92-98; Delafontaine, P., et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 26 (1994) 1659-1673; KuIl, F.C. Jr., et al. J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566; Morgan, D.O., and Roth, R.A., Biochemistry 25 (1986) 1364-1371; Forsayeth, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 3448-3451; Schaefer, E.M., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 13248-13253; Gustafson, T.A., and Rutter, WJ., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667; Hoyne, P.A., et al., FEBS Lett. 469 (2000) 57-60; Tulloch, P.A., et al., J. Struct. Biol. 125 (1999) 11-18; Rohlik, Q.T., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 149 (1987) 276- 281;及びKalebic, T., et al., Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534; Adams, T. E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093; Dricu, A., et al., Glycobiology 9 (1999)571-579; Kanter-Lewensohn, L., et al., Melanoma Res. 8 (1998) 389-397; Li, S.L., et al., Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252)。また、ＩＧＦ−ＩＲに対する抗体は、例えば、Arteaga, C.L., et al., Breast Cancer Res. Treatment 22 (1992) 101-106;及びHailey, J., et al., Mol. Cancer Ther. 1 (2002) 1349-1353等の多くの更なる文献に記載されている。
【０００４】
特に、αＩＲ３と呼ばれるＩＧＦ−ＩＲに対するモノクローナル抗体は、ＩＧＦ−ＩＲに誘起される過程、及び癌等のＩＧＦ−Ｉに誘起される疾病を研究するための広範な調査に使用されている。アルファ−ＩＲ−３は、Kull, F.C., J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566により記載された。一方、その抗腫瘍効果に関する、単独で、並びにドキソルビシン及びビンクリスチン等の細胞増殖抑制剤と併用したαＩＲ３の調査及び治療的な使用を扱う約１００件の文献が出版されている。αＩＲ３は、マウスのモノクローナル抗体であり、ＩＧＦ−ＩのＩＧＦ受容体への結合を阻害するがＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−ＩＲへの結合を阻害しないことで知られている。αＩＲ３は、高濃度では腫瘍細胞の増殖及びＩＧＦ−ＩＲのリン酸化を刺激する(Bergmann, U., et al., Cancer Res. 55 (1995) 2007-2011; Kato, H., et al., J. Biol. Chem. 268(1993) 2655-2661)。ＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−ＩＲへの結合をＩＧＦ−Ｉより強力に阻害する他の抗体(例えば、1H7, Li, S.L., et al., Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252)が存在する。抗体の技術水準の概要並びにそれらの性質及び特徴は、Adams, T.E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093により記載される。
【０００５】
当該技術分野において記載される殆どの抗体は、マウスを起源としている。そのような抗体は、当該技術分野において周知のように、キメラ化又はヒト化等の更なる置換をしなければヒトの患者の治療にとって有用ではない。これらの欠点に基づき、ヒト抗体はヒトの患者の治療における治療剤として明確に選別される。ヒト抗体は、当該技術分野において周知である(van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)。そのような技術に基づき、非常に多様な標的に対するヒト抗体が生産され得る。ＩＧＦ−ＩＲに対するヒト抗体の例は、国際公開第2002/053596号、国際公開第2004/071529号、国際公開第2005/016967号、国際公開第2006/008639号、米国公開特許第2005/0249730号、米国公開特許第2005/0084906号、国際公開第2005/058967号、国際公開第2006/013472号、米国公開特許第2003/0165502号、国際公開第2005/082415号、国際公開第2005/016970号、国際公開第2003/106621号、国際公開第2004/083248号、国際公開第2003/100008号、国際公開第2004/087756号、国際公開第2005/005635号、及び国際公開第2005/094376号において開示されている。
【０００６】
国際公開第2004/087756号は、ＩＧＦ−１Ｒに結合し、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害し、ヒトＩｇＧ１のアイソタイプであることにおいて特徴付けられ、並びにＩＧＦ‐ＩＲへのＩＧＦ‐Ｉの結合の阻害とＩＧＦ‐ＩＲへのＩＧＦ‐ＩＩの結合の阻害の比率が１：３〜３：１を示し、並びに１００ｎＭの濃度で前記抗体を加えてから２４時間後に、ＩＧＦ−ＩＲを発現する細胞の調製物のうち細胞の２０％以上をＡＤＣＣにより細胞死に誘導する抗体を記載する。
【０００７】
モノクローナル抗体の細胞誘起性エフェクターの機能は、Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180;及び米国特許第6,602,684号に記載されているように、それらのオリゴ糖成分を操作することにより高められ得る。癌の免疫治療において最も日常的に使用される抗体であるＩｇＧ１タイプの抗体は、各ＣＨ２ドメインにおいてＡｓｎ２９７の保存的なＮ-結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合した２つの二本鎖複合型オリゴ糖はＣＨ２ドメインの間に埋め込まれ、ポリペプチド骨格との広範な接触を形成し、及びそれらの存在は抗体が抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ)等のエフェクター機能を誘起するために必須である(Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A. and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32)。Umana, P., et al.. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及び国際公開第99/54342号は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞におけるβ(１，４)−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ(ＧｎＴＩＩＩ)(バイセクト化オリゴ糖の形成を触媒するグリコシル転移酵素)の過剰発現が、インビトロでの抗体のＡＤＣＣ活性を顕著に上昇させることを示した。また、Ｎ２９７における糖質の構成の置換又はその除去は、ＦｃγＲと結合したＦｃとＣ１ｑとの結合に影響する(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons,LC, et al., J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147)。
【０００８】
Iida, S., et al., Clin. Cancer Res. 12 (2006) 2879-2887は、非フコシル化抗ＣＤ２０抗体の有効性がフコシル化抗ＣＤ２０の添加により阻害されたことを示す。非フコシル化及びフコシル化抗ＣＤ２０の１：９の混合物(１０ｍｉｃｒｏｇ／ｍｌ)の有効性は、単独の非フコシル化抗ＣＤ２０を１０００倍に希釈したもの(０．０１ｍｉｃｒｏｇ／ｍＬ)より劣っていた。それらにより、フコシル化対照物を含まない、非フコシル化ＩｇＧ１は、その高いＦｃガンマＲＩＩＩａ結合を通じて、血漿中のＩｇＧのＡＤＣＣ阻害効果を回避し得ることが結論付けられる。Natsume, A., et al.,はJ. Immunol. Methods 306 (2005) 93-103において、ヒトＩｇＧ１タイプ抗体の複合型オリゴ糖が抗体依存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)の著しい増強をもたらすことを示す。Satoh, M., et al., Expert Opin. Biol. Ther. 6 (2006) 1161-1173は、非フコシル化治療用抗体を次世代の治療用抗体として考察する。Satohは、非フコシル化ヒトＩｇＧ１形態のみからなる抗体が理想的と思われると結論付ける。Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2004) 680-688は、フコシル化ＣＤ２０抗体(９６％フコシル化、ＣＨＯ／ＤＧ１４４  １Ｈ５)と非フコシル化ＣＤ２０抗体の比較を行った。Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294は、ＣＤ２０抗体はＦｃγＲＩＩＩへの結合に関連してＡＤＣＣを増進させたことを報告する。
【０００９】
モノクローナル抗体の細胞誘起性エフェクター機能を増強させる方法は、例えば、国際公開第2005/018572号、国際公開第2006/116260号、国際公開第2006/114700号、国際公開第2004/065540号、国際公開第2005/011735号、国際公開第2005/027966号、国際公開第1997/028267号、米国公開特許第2006/0134709号、米国公開特許第2005/0054048号、米国公開特許第2005/0152894号、国際公開第2003/035835号、国際公開第2000/061739号に記載される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
抗腫瘍治療を必要とする患者にとって有力な利益をもたらすＩＧＦ−ＩＲに対する抗体は今後も必要となる。患者に関連する利益とは、単純に言えば、腫瘍の増殖の抑制及び抗腫瘍剤を用いた治療により起こる無増悪期間の顕著な延長である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本発明は、ＩＧＦ−ＩＲに結合し、及びＡｓｎ２９７が糖鎖でグリコシル化された抗体であり、前記糖鎖中のフコースの量が２０％〜５０％、好ましくは２０％〜４０％であることにおいて特徴付けられる前記抗体を含む。
【００１２】
フコースのそのような量を含む本発明に係る抗体は、更に「部分的にフコシル化された」と呼称される。
【００１３】
本発明は、ＩＧＦ−ＩＲに結合し、及びＡｓｎ２９７が糖鎖でグリコシル化された抗体であり、ＦｃγＲＩＩＩとの高い結合親和性を示すことにおいて特徴付けられる前記抗体を含む。
【００１４】
好ましくは、前記抗体はヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４タイプである。特に好ましい前記抗体は、ヒトのＩｇＧ１又はＩｇＧ３タイプである。
【００１５】
好ましくは、ＮＧＮＡの量は１％以下であり、及び／又はＮ末端アルファ−１，３−ガラクトースの量は１％以下である。
【００１６】
好ましくは、ＮＧＮＡの量は０．５％以下であり、更に好ましくは０．１％以下、あるいは検出不能でもあり得る(ＬＣＭＳ)。
【００１７】
好ましくは、Ｎ末端アルファ−１，３−ガラクトースの量は０．５％以下であり、更に好ましくは０．１％以下、あるいは検出不能でもあり得る(ＬＣＭＳ)。
【００１８】
本発明によれば、「フコースの量」とは、Ａｓｎ２９７の糖鎖中の前記糖の量を意味し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計により測定され、そして平均値として計算された（実施例４を参照されたい)Ａｓｎ２９７に結合する全ての糖構造(例えば、複合型、ハイブリッド型及びマンノース型構造)の合計に関連する。
【００１９】
前記糖鎖は、好ましくはＣＨＯ細胞において組換え発現されたＩＧＦ−ＩＲに結合する抗体のＡｓｎ２９７に結合するＮ−結合型グリカンの特徴を示す。
【００２０】
本発明は、好ましくはＩＧＦ−ＩＲに結合し、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩとＩＧＦ−ＩＲとの結合を阻害し、前記抗体が：
ａ)  ＩＧＦ‐ＩＲへのＩＧＦ‐Ｉの結合の阻害と、ＩＧＦ‐ＩＲへのＩＧＦ‐ＩＩの結合の阻害のＩＣ50値の比率が、１：３〜３：１を示す、
ｂ)  濃度５ｎＭで、０．５％非働化ウシ胎児血清(ＦＣＳ)及び１０ｎＭのヒトＩＧＦ‐１を含む培地中のＨＴ２９細胞を用いたＩＧＦ‐ＩＲの細胞リン酸化アッセイにおけるＩＧＦ‐ＩＲリン酸化を、前記抗体を用いないアッセイと比較したとき、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％阻害する。
ｃ)  濃度１０μＭで、０．５％非働化ウシ胎児血清(ＦＣＳ)を含む培地中の細胞あたり４００，０００〜６００，０００分子のＩＧＦ‐ＩＲを提示する３Ｔ３細胞を用いた細胞リン酸化アッセイにおいて、前記抗体を用いないアッセイと比較したとき、ＰＫＢリン酸化により測定されるＩＧＦ‐ＩＲ活性を示さない(シグナルが無く、ＩＧＦ−１の模倣物的な活性が無い)。
からなる群から選択される１つ以上の特性を示すことにおいて特徴付けられる部分的にフコシル化された抗体を含む。
【００２１】
本発明に係る抗体は、抗腫瘍治療を必要とする患者にとって利益を示し、そして腫瘍の増殖の抑制及び無増悪期間の顕著な延長を提供する。本発明に係る抗体は、ＩＧＦの脱制御と関連した疾病、特に腫瘍性疾患に苦しむ患者にとって利益をもたらす、新規かつ独創的な特性を有する。本発明に係る抗体は、上述の特性により特徴付けられる。
【００２２】
好ましくは前記抗体は、ＩＧＦ−ＩＲに特異的に結合し、上述の比率でＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩとＩＧＦ−ＩＲとの結合を阻害し、ＩｇＧ１のアイソタイプであり、及び部分的にフコシル化されており、並びにそのＩＣ50値の２００倍の濃度で、又は２０，０００倍の濃度であっても、ＩＧＦ−ＩＲ過剰発現細胞においてでさえＩＧＦ−ＩＲシグナルを活性化しない。
【００２３】
好ましくは、本発明の抗体は５ｎＭの濃度で腫瘍細胞においてＩＧＦ−Ｉにより誘起されるＩＧＦ−ＩＲのシグナル伝達を完全に阻害する。
【００２４】
前記抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であり、それに加え、キメラ抗体(ヒト定常鎖)、ヒト化抗体、並びに特に好ましくはヒト抗体である。
【００２５】
前記抗体は好ましくは、抗体１８と競合してＩＧＦ−ＩＲ ｈｕｍａｎ(EC 2.7.1.112, SwissProt P08069)に結合する。
【００２６】
前記抗体は好ましくは、１０-8Ｍ(ＫD)以下の、好ましくは約１０-9〜１０-13Ｍの親和性により更に特徴付けられる。
【００２７】
前記抗体は、好ましくはインスリンの濃度依存的なインスリン受容体への結合の阻害を検出不能な程度にしか示さない。
【００２８】
前記抗体は、好ましくはＩｇＧ１タイプである。
【００２９】
本発明に係る抗体は、関連した異種移植腫瘍モデルにおいて、ビヒクルで処理された動物と比較して無増悪期間が大幅に延長し、及び腫瘍の増殖が減少する。前記抗体は、インビトロ及びインビボでＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩとＩＧＦ−ＩＲとの結合を、好ましくはＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩにおいておよそ等しい態様で阻害する。
【００３０】
好ましくは、本発明に係る抗体は、相補性決定領域ＣＤＲ３として、配列番号１又は３からなる群から選択される配列を含む。
【００３１】
好ましくは、本発明に係る抗体は、相補性決定領域(ＣＤＲ)として、以下：
ａ)  ＣＤＲとして、配列番号１又は３のＣＤＲ１(ａａ３１−３５)、ＣＤＲ２(ａａ５０−６６)及びＣＤＲ３（ａａ９９−１０７)を含む抗体重鎖；
ｂ)  ＣＤＲとして、配列番号２又は４のＣＤＲ１(ａａ２４−３４)、ＣＤＲ２(ａａ５０−５６)及びＣＤＲ３（ａａ８９−９８)を含む、抗体軽鎖；
の配列を含む。
【００３２】
本発明の好ましい可変領域及びＣＤＲ、特に重鎖のＣＤＲ３は、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン１８(抗体１８)及び＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＵＭＡＢクローン２２(抗体２２)により提供され、ドイツのDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ)に寄託されている。
【００３３】
【表１】
2010513352.tif 000003
【００３４】
好ましくは、本発明に係る抗体は、配列番号１を含む抗体重鎖及び配列番号２を含む抗体軽鎖、又は配列番号３を含む抗体重鎖及び抗体軽鎖配列番号４を含む。前記抗体は、好ましくはＩｇＧ１タイプである。
【００３５】
これらの抗体は、国際公開第2005/005635号に詳細に記載される。
【００３６】
本発明は、更にそのような抗体を組換えにより生産する方法を提供する。
【００３７】
本発明に係る抗体に個別の他の抗体鎖を集合させることが可能なポリペプチドの好ましい核酸は、以下：
ａ)  ＣＤＲとして、配列番号１又は３のＣＤＲ１(ａａ３１−３５)、ＣＤＲ２(ａａ５０−６６)及びＣＤＲ３（ａａ９９−１０７)を含む抗体重鎖；
ｂ)  ＣＤＲとして、配列番号２又は４のＣＤＲ１(ａａ２４−３４)、ＣＤＲ２(ａａ５０−５６)及びＣＤＲ３（ａａ８９−９８)を含む抗体軽鎖；
に定義される。
【００３８】
好ましくは、前記核酸は、配列番号１を含む抗体重鎖及び配列番号２の抗体軽鎖、又は配列番号３を含む抗体重鎖及び配列番号４の抗体軽鎖を含む本発明に係る抗体をコードする。
【００３９】
本発明は更に、癌、好ましくは乳癌、膵癌、前立腺癌、膀胱癌、悪性(Ｍａｌｉｇｎａｌ)黒色腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、及び／又はＮＳＣＬＣの治療方法であり、癌が発症したと診断された(そしてそれにより抗腫瘍治療が必要となる)患者に本発明に係るＩＧＦ−ＩＲに対する抗体を投与することを含む前記治療方法を提供する。前記抗体は単独で、医薬組成物として、あるいはＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ又はエストロゲン受容体等の癌関連シグナル経路の他の阻害剤と組み合わされ、あるいは放射線治療若しくは細胞毒性剤又はそれらのプロドラッグ等の細胞毒性治療と組み合わされて投与され得る。前記抗体は、医薬として有効な量で投与される。
【００４０】
本発明は更に、癌、好ましくは乳癌、膵癌及び／又はＮＳＣＬＣを治療するための、並びに本発明に係る医薬組成物を製造するための本発明に係る抗体の使用を含む。加えて、本発明は、本発明に係る医薬組成物の製造方法を含む。
【００４１】
本発明は更に、癌、好ましくは乳癌、膵癌、前立腺癌、膀胱癌、悪性(Ｍａｌｉｇｎａｌ)黒色腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、横紋筋肉腫及び／又はＮＳＣＬＣを治療するための本発明に係る抗体を含む。
【００４２】
本発明は更に、本発明に係る抗体を、任意に医薬的用途の抗体の製剤に有用な緩衝剤及び／又は補助剤と共に含む医薬組成物を含む。
【００４３】
本発明は更に、本発明に係る抗体を含む医薬組成物を含む。
【００４４】
本発明は更に、医薬として許容される担体中にそのような抗体を含む医薬組成物を提供する。一の態様において、前記医薬組成物は製品又はキットに同梱され得る。本発明は更に、癌を治療するための医薬組成物の製造のための本発明に係る抗体の使用を提供する。前記抗体は、医薬として有効な量で使用される。
【００４５】
本発明は更に、癌、好ましくは乳癌、膵癌及び／又はＮＳＣＬＣを治療するための医薬組成物を製造するための本発明に係る抗体の使用を含む。前記抗体は、医薬として有効な量で使用される。
【００４６】
前記発明は更に、ＣＨＯ宿主細胞においてＩＧＦ−１Ｒに結合する抗体をコードする核酸を発現し、前記抗体を部分的にフコシル化し、及び前記細胞から前記抗体を回収することにより特徴付けられる、本発明に係る組換えヒト抗体の生産方法を含む。本発明は更に、そのような組換え手法により収得可能な抗体を含む。
【００４７】
本発明は更に、組換えによりＧｎＴＩＩＩ及び抗ＩＧＦ‐１Ｒ抗体を発現することが可能となったＣＨＯ細胞を含む。そのようなＣＨＯ細胞は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列、少なくとも前記抗体の重鎖の可変ドメインを含む第二のＤＮＡ配列、及び少なくともＩＧＦ−ＩＲに対する抗体の軽鎖の可変ドメインを含む第三のＤＮＡ配列で形質転換されたＣＨＯ細胞である。好ましくは、第二及び第三のＤＮＡ配列は、ヒトＩｇＧ１タイプのＩＧＦ−ＩＲに対する抗体の重鎖及び軽鎖をコードする。
【００４８】
本発明は更に、宿主細胞、好ましくはＣＨＯ細胞を、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列、少なくとも前記抗体の重鎖の可変ドメインを含む第二のＤＮＡ配列、及び少なくともＩＧＦ−ＩＲに対する抗体の軽鎖の可変ドメインを含む第三のＤＮＡ配列で形質転換する段階、好ましくは前記細胞が発酵培地中に前記抗体を分泌する条件下で、前記第一、第二、及び第三のＤＮＡ配列を好ましくは独立して発現する前記細胞を発酵培地で培養する段階、並びに前記抗体を単離する段階を含む、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体を生産する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】放出オリゴ糖の試料１及び２のＭＡＬＤＩ−ＭＳ解析を示す。
【図２】実施例３により測定された腫瘍値を示す（曲線１：コントロール)
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明の詳細な記載
「抗体」という用語は、様々な形態の抗体、限定されないが、本発明に特徴的な特性を保有する限りにおいて、完全な抗体、抗体断片、ヒト抗体、ヒト化抗体及び遺伝子組換え抗体を包含する。
【００５１】
「抗体断片」という用語は、完全な長さの抗体の一部分であり、一般的には少なくとも抗原に結合する部分又はその可変領域を含む。例えば、抗体断片には、二重特異性抗体、一本鎖抗体分子、抗毒素、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００５２】
「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書中で使用されるとき、単一のアミノ酸組成物の抗体分子の生産物を指す。故に、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。
【００５３】
「キメラ抗体」という用語は、１つの供給源又は種に由来する可変領域、即ち結合領域及び異なる供給源又は種に由来する定常領域の少なくとも一部を含み、通常組換えＤＮＡ技術により生産されるモノクローナル抗体を指す。マウス可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が、特に好ましい。そのようなマウス／ヒトキメラ抗体は、マウスのイムノグロブリン可変領域及びヒトのイムノグロブリン定常領域をコードするＤＮＡ断片を含む、イムノグロブリン遺伝子の発現産物である。本発明により包含される「キメラ抗体」の他の形態は、それらのクラス又はサブクラスが改変され、又は元の抗体から変化したものである。また、そのような「キメラ」抗体は、「クラススイッチ抗体」と別称される。キメラ抗体を生産する方法には、現在当該技術分野において周知な確立された組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション技術が含まれる。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; 米国特許第5,202,238号及び5,204,244号を参照されたい。
【００５４】
「ヒト化抗体」という用語は、そのフレームワーク又は「相補性決定領域」(ＣＤＲ)が改変され、元のイムノグロブリンのものと比較して特異性が異なるイムノグロブリンのＣＤＲを含む抗体を指す。一の好ましい態様において、マウスのＣＤＲはヒト抗体のフレームワーク領域に移植され、「ヒト化抗体」が生産される。例えば、Riechmann, L, et al., Nature 332 (1988) 323-327;及びNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照されたい。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体及び二機能抗体に関して上記される抗原を認識する配列を示すものに対応する。
【００５５】
本明細書中で用いられるとき、「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが意図される。その可変重鎖は、好ましくは、生殖系列配列ＤＰ−５０(GenBank LO6618)に由来し、その可変軽鎖は、好ましくは、生殖系列配列Ｌ６(GenBank X01668)に由来し、又はその可変重鎖は、好ましくは、生殖系列配列ＤＰ−６１(GenBank M99682)に由来し、その可変軽鎖は、好ましくは、生殖系列配列Ｌ１５(GenBank K01323)に由来する。その抗体の定常領域はヒトＩｇＧ１タイプの定常領域である。そのような領域はアロタイプであり得て、そして、例えば、Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218及び本明細書中に参照されるデータベースにより記載される。
【００５６】
「組換えヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を再配列された形態で有する抗体を指す。本発明に係る組換えヒト抗体は、インビボで体細胞超変異を受けている。従って、組換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬに由来し及び関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー中に天然に存在し得ない配列である。
【００５７】
本明細書中で使用されるとき、「結合」とは、ＩＧＦ−ＩＲと約１０-13〜１０-8Ｍ(ＫD)、好ましくは約１０-13〜１０-9Ｍの親和性で結合する抗体を指す。
【００５８】
本明細書中で用いられるとき、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００５９】
ＩｇＧ１又はＩｇＧ３タイプのヒト定常ドメインは、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)、及びBrueggemann, M., et al, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527により詳細に記載されている。配列番号５〜８において例証されている。他の有用かつ好ましい定常ドメインは、本発明のためにＤＳＭＺに寄託されているハイブリドーマ細胞株から収得可能な抗体の定常ドメインである。
【００６０】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３タイプの定常ドメインは、Ａｓｎ２９７でグリコシル化される。本発明による「Ａｓｎ２９７」は、Ｆｃ領域におけるおよそ２９７位に配置されたアミノ酸であるアスパラギンを意味する；抗体の軽微な配列変異に基づいて、Ａｓｎ２９７はまた、数個のアミノ酸（通常は±３個未満のアミノ酸)分の上流又は下流に位置され得る。例えば、本発明に係る１つの抗体(ＡＫ１８)において「Ａｓｎ２９７」はアミノ酸の２９８位に配置される。
【００６１】
本明細書中で用いられる場合、「可変領域」(軽鎖の可変領域(ＶＬ)、重鎖の可変領域(ＶＨ))は、抗体の抗原への結合に直接関与する軽鎖及び重鎖の各組を意味する。可変ヒト軽鎖及び重鎖のドメインは同一の一般構造を有し、各ドメインは、その配列が広範囲に保存され、３つの「超可変領域」(又は相補性決定領域、ＣＤＲ)により連結される４つのフレームワーク(ＦＲ)領域を含む。そのフレームワーク領域はβ−シート立体構造をとり、そしてＣＤＲは、そのβ−シート構造を連結するループを形成し得る。各鎖のＣＤＲは、そのフレームワーク領域によりそれらの三次元構造に保持され、そして他の鎖のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に係る抗体の結合特異性／親和性において重要な役割を果たし、それにより、本発明の更なる目的を提供する。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、「超可変領域」又は「抗体の抗原結合部位」は、抗原への結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書中で定義された超可変領域以外の可変ドメイン領域である。よって、抗体の軽鎖及び重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４のドメインを含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原への結合に最も寄与し、抗体を特徴付ける領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、上記Kabat, E.A., et al.,の標準的な定義により判定される。
【００６３】
ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化は、最大２つのＧａｌ残基で終わるコアフコシル化（ｃｏｒｅ  ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ)二本鎖複合型オリゴ糖グリコシル化としてＡｓｎ２９７で起こるこれらの構造は、終末のＧａｌ残基の量に依存して、Ｇ０、Ｇ１（α１，６若しくはα１，３)又はＧ２グリカン残基として指定される(Raju, T.S., BioProcess Int. 1 (2003) 44-53)。抗体Ｆｃ部分のＣＨＯタイプのグリコシル化は、例えば、Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207により記載されている。非糖修飾（ｎｏｎｇｌｙｃｏｍｏｄｕｆｉｅｄ)ＣＨＯ宿主細胞において組換え発現される抗体は、通常少なくとも８５％の量がＡｓｎ２９７においてフコシル化される。
【００６４】
本発明に係る部分的にフコシル化されたＩＧＦ−１Ｒ抗体は、Ｆｃ領域におけるオリゴ糖を部分的にフコシル化するために十分な量でＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸を発現するように操作された糖修飾宿主細胞において発現され得る。一の態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは融合ポリペプチドである。あるいは、米国公開特許第6,946,292によると、宿主細胞のα１，６−フコシル転移酵素活性を低下、又は停止させることで、糖修飾宿主細胞を生産し得る。抗体フコシル化の量は、例えば発酵条件（例えば発酵時間)により、又はフコシル化の量が異なる少なくとも２つの抗体を組み合わせることにより推定され得る。
【００６５】
本発明に係るＩＧＦ−１Ｒ抗体は：(ａ)ＧｎＴＩＩＩ活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現するように操作された宿主細胞の、前記抗体のＦｃ領域上に存在するオリゴ糖が部分的にフコシル化された前記抗体の生産が可能な条件での培養；及び(ｂ)前記抗体の単離を含む方法により、宿主細胞において生産され得る。一の態様において、ＧｎＴＩＩ活性を有するポリペプチドは融合タンパク質であり得て、好ましくはＧｎＴＩＩＩの触媒ドメイン、並びにマンノシダーゼＩＩの局在化ドメイン、β(１，２)−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素Ｉ（「ＧｎＴＩ」) の局在化ドメイン、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、β(１，２)−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素ＩＩ（「ＧｎＴＩＩ」)の局在化ドメイン、及びα１−６コアフコシル転移酵素の局在化ドメインからなる群から選択される異種ゴルジ常駐ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む。好ましくは、そのゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩ又はＧｎＴＩである。一の更なる側面において、本発明は、そのような方法を用いることにより抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のグリコシル化プロフィールを修飾する方法に関する。
【００６６】
もう一つの側面において、本発明は、ＧｎＴＩＩＩ活性を有し、異種ゴルジ常駐ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインを含む融合ポリペプチドを使用することにより、ＩＧＦ−１Ｒ抗体のグリコシル化を修飾する方法に関する。一の態様において、本発明の融合ポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む。もう一つの態様において、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩの局在化ドメイン、ＧｎＴＩの局在化ドメイン、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、ＧｎＴＩＩの局在化ドメイン及びα１−６コアフコシル転移酵素の局在化ドメインからなる群から選択される。好ましくは、そのゴルジ局在化ドメインはマンノシダーゼＩＩ又はＧｎＴＩに由来する。
【００６７】
本発明により、これらのＩＧＦ−１Ｒ抗体の修飾されたオリゴ糖は、ハイブリッド型又は複合型であり得る。好ましくは、バイセクト化、非フコシル化オリゴ糖はハイブリッド型である。もう一つの態様において、バイセクト化、非フコシル化オリゴ糖は複合型である。
【００６８】
本明細書中で用いられるとき、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、Ｎ結合型オリゴ糖のトリマンノシルコアのβ結合型マンノシドへのβ−１−４結合におけるＮ−アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)残基の付加を触媒することが可能なポリペプチドを指す。これは、用量依存的な又は非依存的な特定の生物学的アッセイにおいて測定されたとき、β(１，４)−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素ＩＩＩ｛Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (ＮＣ−ＩＵＢＭＢ)によるところの、β−１，４−マンノシル−グリコプロテイン ４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニル−転移酵素（ＥＣ ２．４．１．１４４)としても知られる｝の活性と類似する(同一である必要は無いが)、酵素活性を呈する融合ポリペプチドを含む。用量依存性が存在する場合、それはＧｎＴＩＩＩの活性と同一であることを要しないが、ＧｎＴＩＩＩと比較されたときの所定の活性における用量依存性と実質的に類似であるほうがよい(即ち、候補ポリペプチドはＧｎＴＩＩＩと比較して、より強い活性又は約２５倍を下らない、及び好ましくは、活性が約１０倍を下らない、及び最も好ましくは、活性が約３倍を下らない。)。本明細書中で使用される場合、ゴルジ局在化ドメインという用語は、ゴルジ複合体内の位置にポリペプチドを繋ぎ止める役割を果たすゴルジ常駐ポリペプチドのアミノ酸配列を指す。一般的に、局在化ドメインは、酵素のアミノ末端「尾部」を含む。
【００６９】
本発明に係る抗体は、ＦｃｙＲＩＩＩ(ＣＤ１６ａ)に対する高い結合親和性を示す。ＦｃγＲＩＩＩに対する高い親和性とは、１００ｍＭの抗体濃度で固定化ＣＤ１６ａを使用した表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)による測定（実施例５を参照されたい)により、ＣＤ１６ａ／Ｆ１５８の結合が、ＣＨＯ ＤＧ１４４宿主細胞において発現される標準の（実施例５を参照されたい)ｗｔ抗体(９５％フコシル化)に関して少なくとも１０倍に高められ、及びＣＤ１６ａ／Ｆ１５８の結合が、ｗｔ抗体に関して少なくとも２０倍に高められることを意味する。ＦｃγＲＩＩＩ結合は、前記抗体のＦｃ部分のアミノ酸配列の改変、又はＦｃ部分のグリコシル化等の、当該技術分野による方法により高められる。好ましい方法は前述されている。
【００７０】
本明細書中で使用されるとき、「ＩＧＦ−ＩＲへの結合」という用語は、インビトロのアッセイにおける、好ましくは抗体が表面に固定され、ＩＧＦ−ＩＲの結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ)により測定される結合アッセイにおける、ＩＧＦ−ＩＲへの抗体の結合を意味する。結合とは、結合親和性(ＫD)が１０-8Ｍ以下、好ましくは１０-13〜１０-9Ｍであることを意味する。
【００７１】
ＩＧＦ−１Ｒ又はＦｃγＲＩＩＩへの抗体の結合は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)により調査され得る。結合の親和性は、ｋａ(標的の抗体への結合(ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ)に関する速度定数)、ｋｄ(解離定数)、及びＫD(ｋｄ／ｋａ)の用語により定義される。本発明に係る抗体は、ＩＧＦ−１Ｒへの結合においてＫDが１０-9Ｍ以下、好ましくはＫDが１０-10Ｍ以下を示す。
【００７２】
また、ＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩの結合は、本発明に係る抗体により阻害される。その阻害は、腫瘍細胞上のＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦ−ＩＩの結合のアッセイにおけるＩＣ50として測定される。そのようなアッセイにおいて、該腫瘍細胞（例えばＴＨ２９)の表面で提供される、放射性ラベルされたＩＧＦ−Ｉ若しくはＩＧＦ−ＩＩ又はそれらのＩＧＦ−ＩＲ結合断片がＩＧＦ−ＩＲに結合する量は、抗体濃度の上昇を伴わず、及び伴って測定される。ＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩの結合における本発明に係る抗体のＩＣ50値は、２ｎＭ未満であり、そしてＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦ−ＩＩの結合におけるＩＣ50値の比率は、約１：３〜３：１である。ＩＣ50値は、少なくとも３つの独立した測定の平均値又は中間値として測定された。単一のＩＣ50値は検出不能であり得る。
【００７３】
本明細書中で用いられるとき、「ＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩの結合の阻害」という用語は、インビトロのアッセイにおいてＨＴ２９(ATCC HTB-38)腫瘍細胞表面上に存在するＩＧＦ−ＩＲへのＩ125ラベルされたＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−ＩＩの結合の阻害を指す。阻害とは、ＩＣ50値が２ｎＭ以下であることを指す。
【００７４】
「ＩＧＦ−ＩＲ発現細胞」という用語は、細胞あたり少なくとも約２０，０００分子のＩＧＦ−Ｉ受容体を過剰発現する細胞を指す。そのような細胞は、例えば、Ｈ３２２Ｍ若しくはＨＴ２９等の細胞株、又はＩＧＦ−ＩＲの発現ベクターをトランスフェクションした後のＩＧＦ−ＩＲを過剰発現する細胞株｛例えば、３Ｔ３(ATCC CRL1658)｝である。細胞あたりの受容体の量は、Lammers, R., et al., EMBO J. 8 (1989) 1369-1375により測定される。
【００７５】
「ＩＧＦ−ＩＲリン酸化の阻害」という用語は、非働化ウシ胎児血清(ＦＣＳ)及び１０ｎＭのヒトＩＧＦ−１を含む培地中の、細胞あたり４００，０００〜６００，０００分子のＩＧＦ‐ＩＲ、好ましくは細胞あたり１，０００，０００〜１，５００，０００分子のＩＧＦ‐ＩＲを提示する３Ｔ３細胞を使用して、前記抗体を用いないアッセイと比較したときの、細胞リン酸化アッセイを指す。リン酸化は、チロシンリン酸化されたタンパク質に特異的な抗体を使用したウェスタンブロッティングにより検出される。ＦＣＳの非働化は、補体系を不活性化するため、短時間、５６℃で処理される。
【００７６】
「ＰＫＢリン酸化の阻害」という用語は、非働化ウシ胎児血清(ＦＣＳ)及び１０ｎＭのヒトＩＧＦ−１を含む培地中の、細胞あたり４００，０００〜６００，０００分子のＩＧＦ‐ＩＲ、好ましくは細胞あたり１，０００，０００〜１，５００，０００分子のＩＧＦ‐ＩＲを提示する３Ｔ３細胞を使用して、前記抗体を用いないアッセイと比較したときの、細胞リン酸化アッセイを指す。リン酸化は、ＰＫＢのセリン４７３がリン酸化されたＰＫＢに特異的な抗体を使用したウェスタンブロッティングにより検出される(Akt 1, Swiss Prot Ace. No. P31749)。
【００７７】
「抗体依存性細胞毒性(ＡＤＣＣ)」という用語は、エフェクター細胞の存在下での、本発明に係る抗体による、ヒトの腫瘍標的細胞の溶解を指す。ＡＤＣＣは、好ましくは、新たに単離されたＰＢＭＣ、又は単球若しくはＮＫ細胞様の精製された軟膜由来エフェクター細胞等のエフェクター細胞の存在下で、本発明に係る抗体で、ＩＧＦ−ＩＲを発現細胞の調製物を処理することにより測定される。
【００７８】
「ＩＧＦ−Ｉにより誘起されるシグナル伝達の完全な阻害」という用語は、ＩＧＦ−Ｉにより誘起されるＩＧＦ−ＩＲのリン酸化の阻害を指す。そのようなアッセイにおいて、ＩＧＦ−ＩＲ発現細胞(好ましくはＨ３２２Ｍ細胞)はＩＧＦ−Ｉで刺激され、そして本発明に係る抗体で処理される(抗体濃度は５ｎＭ以上が有用である)。続いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが実行され、そしてＩＧＦ−ＩＲのリン酸化がリン酸化チロシンに特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティング解析により測定される。シグナル伝達の完全な阻害は、ウェスタンブロットにおいて、リン酸化ＩＧＦ−ＩＲを示すバンドが視覚的に検出され得ないことで見出される。
【００７９】
本発明に係る抗体は、好ましくは抗体１８と同一のＩＧＦ−ＩＲのエピトープに結合を示し、又は抗体１８の結合の立体障害によりＩＧＦ−ＩＲへの結合が阻害される。結合阻害は、固定化した抗体１８、及び２０〜５０ｎＭの濃度のＩＧＦ−ＩＲ、及び１００ｎＭの濃度で検出されるべき抗体を用いるＳＰＲアッセイにより検出され得る。５０％以上のシグナルの減少は、前記抗体が抗体１８と競合することを示す。そのようなアッセイは、固定化した抗体２２を用いることにより、同一の方式で実行され得る。
【００８０】
「エピトープ」という用語は、ある抗体に特異的に結合可能なタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面基から成り、通常特異的な三次元的な構造上の特性、及び特異的な電荷特性を有する。立体構造エピトープ及び非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下で、前者の結合が失われ、後者の結合が失われないことにおいて区別される。
【００８１】
本発明に係る抗体は、ＩＧＦ−ＩＲのチロシンリン酸化を阻害し、また、好ましくはＰＫＢのセリンリン酸化も同程度阻害する。
【００８２】
本発明に係る抗体は、好ましくは、腫瘍細胞及び異種移植腫瘍等の腫瘍における、ＩＧＦ−ＩＲのレベルを下方制御する。
【００８３】
本発明に係る抗体は好ましくは、コロニー形成アッセイにおける腫瘍細胞の三次元的成長、及びＩＧＦ−ＩＲ発現細胞(例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞)の増殖を阻害する。
【００８４】
本発明に係る抗体は、好ましくは、２００ｎｍｏｌ／ｌの濃度の抗体を使用するインスリン受容体過剰発現３Ｔ３細胞についての結合競合アッセイにおいて、インスリン受容体へのインスリンの結合を阻害しない。
【００８５】
本明細書中で使用されるとき、宿主細胞という用語は、本発明のポリペプチド及び抗原結合分子を生産するよう操作され得る、任意の種類の細胞系を対象とする。一の態様において、宿主細胞は、糖形態が操作された抗原結合分子の生産を可能とし、そのように操作されている。宿主細胞は、更に操作され、ＧｎＴＩＩＩ活性を有する1つ以上のポリペプチドのレベルが高められている。宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞が好ましい。
【００８６】
宿主細胞においてそのタンパク質を発現させるため、軽鎖及び重鎖、又はそれらの断片をコードする核酸が標準的な方法により発現ベクター中に挿入される。発現はそのような宿主細胞中で実行され、そして抗体がその細胞から回収される(上澄又は溶解後の細胞)。
【００８７】
抗体を組換えにより生産する一般的な方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G.,Arzneimittelforschung Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説において記載されている。
【００８８】
前記抗体は、完全な細胞中に、細胞の溶解物中に、又は部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在する。精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野において周知な他の方法を含む標準的な技術により、他の細胞成分又は他の汚染物、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質を除去するために実行される。Ausubel, F., et al. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照されたい。
【００８９】
例えば原核生物に適する調節配列は、プロモーター、任意的にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００９０】
核酸は、それが他の核酸配列と機能的な関連性をもって配置されるとき、「操作可能な形で連結され」ている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるとき、ポリペプチドに関してＤＮＡと操作可能な形で連結している；プロモーター又はエンハンサーは、それがその配列の転写に影響するとき、コード配列と操作可能な形で連結されている； 又は、リボソーム結合部位は、それが転写を促進するように配置されているとき、コード配列に操作可能な形で連結されている。一般的に、「操作可能な形で連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が隣接し、そして、分泌リーダーの場合は、隣接し、且つ読み枠にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要は無い。連結は、都合の良い制限部位でライゲーションを行うことにより達成される。そのような部位が存在しなければ、確立された手段に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【００９１】
モノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、水酸化アパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等の、確立されたイムノグロブリン精製手段により、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、確立された手段を用いて、容易に単離され、配列が決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源としての機能を果たし得る。
【００９２】
また、本発明は免疫抱合体に関連し、これには化学治療剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物若しくは動物が起源の酵素的に活性な毒素、又はそれらの断片)、放射性同位体｛例えば、放射性抱合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ)｝、あるいは細胞毒性剤のプロドラッグ等の、細胞毒性剤を抱合した本発明に係る抗体が含まれる。このような免疫抱合体の製造に有用な薬剤は、前掲されている。使用され得る酵素的に活性な毒素及びそれらの断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片（ｎｏｎｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ)、エキソトキシンＡ鎖｛シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)由来｝、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アロイライテス・フォルディイ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルジカ・チャランチア（momordica charantia）阻害因子、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトチン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが含まれる。
【００９３】
抗体と細胞毒性剤の抱合体は、Ｎ−スクシンイミジル-３-（２-ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体；（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジススクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（グルタルデヒド等）、ビス−アジド化合物｛ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等｝、ビス−ジアゾニウム誘導体｛ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリレン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ化化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）等の様々な二機能性タンパク質カップリング剤を用いて生産される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta, E.S., et al., Science 238 (1987) 1098-1104)に記載されるようにして生産され得る。炭素１４でラベルされた１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に抱合させるためのキレート剤の一例である。
【００９４】
もう一つの側面において、本発明は、本発明の抗体を含み、医薬として許容される担体と共に製剤された医薬組成物を一例とする組成物を提供する。
【００９５】
また、本発明の医薬組成物は、併用療法、即ち化学治療剤、又は細胞毒性剤、又はプロドラッグのような他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、併用療法には、本発明の組成物と少なくとも１つの抗腫瘍剤又は他の確立された治療の組合せが含まれ得る。
【００９６】
「化学治療剤」は、癌の治療に有用な化学物である。化学治療剤の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、(「Ａｒａ−Ｃ」)、シクロホスファミド、チオテパ、タキソテール(ドセタキセル)、ブスルファン、ゲムシタビン、サイトキシン（Ｃｙｔｏｘｉｎ)、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクレイスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カーミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、エスペラマイシン類(米国特許第4,675,187号)メルファラン及び他の関連するナイトロジェンマスタードが含まれる。
【００９７】
本明細書中で使用されるとき、「細胞毒性剤」という用語は、細胞の機能を阻害若しくは抑制する、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を指す。前記用語には、放射性同位体、及び化学治療剤、細菌、真菌、植物若しくは動物等を起源とする酵素的に活性な毒素、又はそれらの断片が含まれることが意図される。
【００９８】
この出願において用いられるとき、「プロドラッグ」という用語は、親薬物と比較して腫瘍細胞に対する細胞毒性が少なく、酵素的により活性な親の形態に活性化又は変換され得る、医薬活性物質の前駆体又は誘導体を指す。例えば、Wilman, D. E., Biochem. Soc.Trans. 14 (1986) 375-382及びStella, VJ. and Himmelstein, K.J., Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, In: Directed Drug Delivery, Borchardt, R.T., et al. (ed.), Humana Press, Clifton, NJ (1985), pp. 247-267を参照されたい。本発明のプロドラッグは、限定されないが、より活性な細胞毒性遊離薬剤に変換され得るリン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸改変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム環プロドラッグ、任意的に置換されるフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ若しくは任意的に置換されるフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグを含む。本発明において使用するためのプロドラッグ形態に誘導体化され得る細胞毒性剤の例は、限定されないが、前記の化学治療剤を含む。
【００９９】
本明細書中で使用されるとき、「医薬として許容される担体」は、生理的に適合する任意の、及び全ての溶媒、分散媒、被覆剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含む。好ましくは、前記担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与又は脊髄投与(例えば注射又は点滴による)に適切である。
【０１００】
「医薬として許容される塩」は、抗体の所望の生物学的活性を保持し、いかなる望ましくない毒性の効果も与えない塩を指す(例えば、Berge, S.M., et al., J. Pharm. Sci. 66 (1977) 1-19を参照されたい)。そのような塩は本発明に含まれる。そのような塩の例には、酸付加塩及び塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸塩等の、非毒性の無機酸から誘導される塩が含まれる。
【０１０１】
本発明の組成物は、当該技術分野において知られる様々な方法により投与され得る。当業者に認識されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望される結果に依存して異なる。
【０１０２】
ある投与径路により本発明の組成物を投与するためには、その組成物を、その不活性化を防止する材料で被覆し、又はその組成物と共に同時に投与する必要がある。例えば、前記組成物は、例えばリポソーム、又は希釈剤等の適切な担体に加えられて被験者に投与され得る。医薬として許容される希釈剤には、生理食塩水及び水性緩衝溶液が含まれる。
【０１０３】
医薬として許容される担体には、滅菌水性溶液又は分散剤、滅菌済みの注射可能な溶液又は分散剤を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。そのような医薬活性物質のための媒体及び薬剤は、当該技術分野において知られている。
【０１０４】
本明細書中で使用されるとき、「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という語句は、腸内投与及び局所投与以外の投与様式を意味し、通常は注射により、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、皮膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内注射及び点滴を含む。
【０１０５】
また、これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤等の補助剤を含み得る。微生物の発生の防止は、上記の滅菌手順並びに、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の様々な抗菌剤及び抗真菌剤を含有させることのいずれによっても保証され得る。また、糖、塩化ナトリウム等の等張剤が上記組成物中に含まれることが望ましい場合がある。加えて、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の、吸収を遅延させる薬剤を含めることにより、注射可能な医薬形態の持続的吸収が引き起こされ得る。
【０１０６】
選択された投与経路にかかわらず、適切な水和物形態で用いられる本発明の化合物、及び／又は本発明の医薬組成物は、当業者に知られる確立された方法により、医薬として許容される剤形に製剤化される。
【０１０７】
本発明の医薬組成物における活性成分の正確な投薬レベルは、特定の患者、組成物、及び投与の様式による所望の治療反応を達成するために有効であり、患者への毒性を有しない、活性成分の量を求めるように変更され得る。選択される投薬レベルは、本発明が採用する特定の組成物の活性、採用された特定の化合物の排出率、治療期間、採用された組成物と組み合わせて用いられる他の薬剤、化合物及び／又は材料、治療を受ける患者の年齢、性別、体重、健康状態、総体的な健康及び過去の病歴、及びそれらに類する医療分野で周知な要因を含む薬物動態学的要因の多様性に依存し得る。好ましい投薬量は、ＣＨＯ ＤＧ４４のような非糖修飾ＣＨＯ宿主細胞で生産された抗体の投薬量よりも大幅に少ない。
【０１０８】
上記組成物は、無菌状態であり、それがシリンジにより提供され得る程度に流動的でなければならない。水に加え、等張な緩衝生理食塩溶液が担体として好ましい。
【０１０９】
好ましい流動性は、例えばレシチン等の被覆の使用により、分散溶液の場合における望ましい粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により維持される。多くの場合、例えば糖、マンニトール又はソルビトール等の多価アルコール、及び塩化ナトリウム等の等張剤を組成物中に含むことが好ましい。
【０１１０】
好ましくは、本発明に係る部分的にフコシル化された抗体は、エルロチニブ｛タルセバ（登録商標）｝と組み合わせてＮＳＣＬＣの治療に、ヘルセプチン（登録商標）(トラスツズマブ)と組み合わせて乳癌の治療に、及びゲムシタビン｛ジェムザール（登録商標）｝と組み合わせて膵臓腫瘍の治療に有用である。
【０１１１】
以下の実施例、図及び配列表は、添付された特許請求の範囲に記載の本発明の実際の範囲の理解を補助するために提供される。記載された手順の改変は、本発明の精神から逸脱すること無くなされ得ることが理解される。
【実施例】
【０１１２】
プラスミド
発現系はＣＭＶプロモーター系(欧州特許第0323997号)を含み、そして表１及び２に記載されている。抗体として、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩｇＧ１抗体(国際公開第2005/005635号; AK18又はAK22)が使用され得る。
【０１１３】
【表２】
2010513352.tif 000004
【０１１４】
【表３】
2010513352.tif 000005
【０１１５】
いずれのプラスミドも、グルタミン原栄養ＣＨＯ又はＨＥＫ２９３宿主細胞(欧州特許第0256055号)に共トランスフェクションされた。前記細胞株は無血清培地の供給バッチ培養で１４日まで培養され、フコシル化の量が異なる抗体群を生産した(試料１〜２、ＣＨＯ)。前記抗体は上澄から単離され、そしてクロマトグラフィー法により精製された。
【０１１６】
野生型抗体(９５％のフコシル化を示すＡＫ１８)は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞株、ＣＨＯ−ＤＧ４４において組換え的に生産される(Flintoff, W.F., et al., Somat. Cell Genet. 2 (1976) 245-261; Flintoff, W.F., et al., Mol. Cell. Biol. 2 (1982) 275-285; Urlaub, G., et al., Cell 33 (1983) 405-412; Urlaub, G., et al., Somat. Cell Mol. Genet. 12 (1986) 555-566)。ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞は、ＭＥＭ ａｌｐｈａ Ｍｉｎｕｓ Ｍｅｄｉｕｍ(Gibco No. 22561)、１０％透析済ＦＣＳ(Gibco No. 26400-044)及びＬ−グルタミン２ｍｍｏｌ／Ｌ、ヒポキサンチン１００μＭ、チミジン１６μＭ(ＨＴサプリメント)中で増殖した。
【０１１７】
実施例１：  抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体のＩＧＦ−ＩＲに対する親和性の判定
装置：  ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００
チップ：  ＣＭ５
カップリング：  アミンカップリング
バッファー：  ＨＢＳ(ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ)、ｐＨ７．４、２５℃
親和性測定に関しては、ＩＧＦ−ＩＲに対するグリコール操作された抗体を提示するため、抗ヒトＦｃγ抗体(ヤギ由来)がチップ表面にカップリングされた。ＩＧＦ−ＩＲの細胞外ドメインが、様々な液中濃度で加えられた。２分間のＩＧＦ−ＩＲ注入で、結合が測定され；３分間のバッファーによるチップ表面洗浄で、解離が測定された。抗体１８及び２２の親和性データは、表３に示される。
【０１１８】
【表４】
2010513352.tif 000006
【０１１９】
実施例２：  抗ＩＧＦ−ＩＲ ＨｕＭＡｂによる、抗体誘起性エフェクター機能の判定
生産されたＨｕＭＡｂ抗体がイムノエフェクター機構を導く能力を判定するため、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ)実験が実行された。
【０１２０】
ＡＤＣＣにおける上記抗体の効果を実験するため、Ｈ３２２Ｍ、ＤＵ１４５又は他の適切なＩＧＦ−ＩＲ発現細胞(１ｘ１０6細胞／ｍｌ)が、セルインキュベーターで３７℃、２５分間１ｍｌあたり１μｌのＢＡＴＤＡ溶液(Perkin Elmer)でラベルされた。その後、細胞は１０ｍｌのＲＰＭＩ−ＦＭ／ＰｅｎＳｔｒｅｐで４回洗浄され、そして２００ｘｇで１０分間スピンダウンされた。最後の遠心段階の前に細胞数が判定され、その後のペレットからＲＰＭＩ−ＦＭ／ＰｅｎＳｔｒｅｐ培地中に細胞を１ｘ１０5細胞／ｍｌになるように希釈した。前記細胞は、１ウェルあたり５，０００個で、丸底プレートに５０μｌの体積でプレーティングされた。ＨｕＭＡｂ抗体は、細胞培養培地５０μｌの体積中の終濃度が２５〜０．１μｇ／ｍｌの範囲となるよう、５０μｌの細胞懸濁液に加えられた。続いて、５０μｌのエフェクター細胞(単離直後のＰＢＭＣ)が、２５：１のＥ：Ｔ比で加えられた。前記プレートは１分間、２００ｘｇで遠心され、２時間、３７℃のインキュベーション段階がそれに続いた。インキュベーションの後、前記細胞は１０分間、２００ｘｇでスピンダウンされ、そして２０μｌの上澄が回収され、Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ９６−Ｆプレートに移された。２００μｌのＥｕｒｏｐｉｕｍ溶液(Perkin Elmer、室温)が加えられ、そしてプレートは１５分間振盪台の上でインキュベーションされた。Perkin ElmerのＥｕ−ＴＤＡプロトコルを使用する時間分解蛍光測定装置(Victor 3, Perkin Elmer)中で、蛍光を定量化した。
【０１２１】
ＡＤＣＣによる細胞溶解の度合は、各標的細胞におけるＴＤＡの自然の放出率に対して補正された、界面活性剤により溶解された標的細胞における最大のＴＤＡ蛍光エンハンサーの放出率の％として表される。結果は、表４に示される：
【０１２２】
【表５】
2010513352.tif 000007
【０１２３】
実施例３：  抗体の糖構造の解析
フコースを含む、及びフコースを含まない（ａ−ｆｕｃｏｓｅ)オリゴ糖構造の相対比率を判定するため、精製された抗体材料の放出されたグリカンが、ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−マススペクトロメトリーにより解析された。ここで、抗体の試料(約５０μｇ)が一昼夜３７℃で、ｐＨ６．０の０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー中で５ｍＵのＮ−グリコシダーゼ Ｆ(Prozyme# GKE-5010B)と共にインキュベーションされ、タンパク質のフレームワークからオリゴ糖が放出された。続いて、放出されたグリカン構造が単離され、ＮｕＴｉｐ−Ｃａｒｂｏｎピペットチップ(Glygen社製: NuTipl-10 μl, Cat.Nr#NT1CAR)を用いて脱塩された。第一の段階として、ＮｕＴｉｐ−Ｃａｒｂｏｎピペットチップは、１Ｍの水酸化ナトリウム３μＬ、続いて２０μＬの純水(例えばBaker社製ＨＰＬＣ勾配グレード# 4218)、３０％ｖ／ｖの酢酸３μｌ及び再び２０μｌの純水で洗浄され、オリゴ糖が結合するように準備された。ここで、各溶液はＮｕＴｉｐ−Ｃａｒｂｏｎピペットチップ中のクロマトグラフィー材の上に重層され、それを通して加圧された。その後、上記Ｎ−グリコシダーゼＦ消化物を４〜５回上下させることにより、抗体１０μｇ分に相当するグリカン構造がＮｕＴｉｐ−Ｃａｒｂｏｎピペットチップ中の上記材に結合した。ＮｕＴｉｐ−Ｃａｒｂｏｎピペットチップ中の上記材に結合したグリカンは、上記のような方法により２０μＬの純水で洗浄され、それぞれ１０％アセトニトリル０．５μＬ及び２０％アセトニトリル２．０μＬで段階的に溶出された。この段階で、溶出溶液は０．５ｍｌ反応バイアル中に封入され、それぞれ４〜５回上下された。ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−マススペクトロメトリーによる解析において、両方の溶出物が組み合わされた。この測定で、０．４μＬの合わされた溶出物が、ＭＡＬＤＩターゲット上で１．６μｌのＳＤＨＢマトリックス溶液｛２０％エタノール／５ｍＭ  ＮａＣｌ中に溶解された５ｍｇ／ｍｌ  ２．５−ジヒドロキシ安息香酸／２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸(Bruker Daltonics #209813)｝と混合され、そして適切に調整されたＢｕｎｋｅｒ Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＴＯＦ／ＴＯＦ装置で解析された。５０〜３００回が繰り返して記録され、その合計が一の試験結果とされた。取得された波形は、ｆｌｅｘ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ(Bruker Daltonics)により評価され、検出されたそれぞれのピークにおいて質量が判定された。続いてそれらのピークは、計算された質量とそれぞれの構造から理論的に推定される質量(例えば、複合型、ハイブリッド型、及びオリゴ又は高マンノース、フコースを有する、及びフコースを有しない)とを比較することにより、フコースを含む、又はａ−ｆｕｃｏｓｅ(フコースを含まない)糖構造に振り分けられた。
【０１２４】
ハイブリッド型構造の比率を判定するため、抗体試料がＮ−グルコシダーゼＦ及びエンドグルコシダーゼＨを併用して消化された。Ｎ−グルコシダーゼＦは、タンパク質フレームワークから全てのＮ−結合型グリカン構造(複合型、ハイブリッド型、並びにオリゴ及び高マンノース構造)を放出し、及びエンドグルコシダーゼＨは、全てのハイブリッド型グリカンを、そのグリカンの還元末端にある２つのＧｌｃＮＡｃ残基の間において付加的に開裂させる。この消化物は、続いて、ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−マススペクトロメトリーにより、上記のＮ−グルコシダーゼＦ消化試料における場合と同一の方法で処理され、解析された。Ｎ−グルコシダーゼＦ消化とＮ−グルコシダーゼＦ／エンドＨの組合せの消化のパターンを比較することにより、特定の糖構造のシグナルの減少の程度が、ハイブリッド型構造の相対的な含有量の推定に用いられる。
【０１２５】
それぞれの糖構造の相対量は、個別のグリコール構造のピークの高さと、検出された全ての糖構造のピークの高さの合計との比率から計算された。ａｆｕｃｏｓｅの相対量は、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理試料において同定された全ての糖構造(例えば、複合型、ハイブリッド型、並びにオリゴ及び高マンノース構造のそれぞれ)に対する、フコースを欠如した構造のパーセンテージであり、表５を参照されたい。
【０１２６】
【表６】
2010513352.tif 000008
【０１２７】
実施例４：  ＦｃｇＲＩＩＩ(ＣＤ１６ａ)に対する抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の親和性の判定
Ｈｉｓ−ＣＤ１６ａが、ＣＭ５チップの表面にアミンカップリングされた(〜６６０ＲＵ)。
装置：Ｂｉａｃｏｒｅ３０００
泳動及び希釈バッファー：ＨＢＳ−Ｐ
測定：２５℃で、１００ｎＭの抗体を５分間注入し；５０μｌ／分の流量で５分間解離を行い；試料を１２℃で予冷却し；７．５ｍＭ ＮａＯＨ／１Ｍ ＮａＣｌで１分間表面の再生を行った。結果：ｗｔのＲＵは：１１であり；４５％フコシル化のＲＵは：６５であり；６０％フコシル化のＲＵは：７２であった。
【０１２８】
実施例５：  毒性実験
カニクイザルにおいて、２週間の毒性実験が実行された。部分的にフコシル化された抗体は、１０ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で、１、４、７、１０日目に投与された。ｗｔ抗体と比較して、総体的な健康状態及び行動、体重、摂食、血液学、ＥＣＧ、臨床化学(excl. ALAT)、肉眼検査、又は臓器重量において、薬剤に関連した変化は認められなかった。
【図１】
2010513352.tif 000009
【図２】
2010513352.tif 000010
【配列表】
2010513352000001.app
【国際調査報告】
2010513352.tif 000011
2010513352.tif 000012
2010513352.tif 000013
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