(57)【要約】本発明は、ｎモノマーから形成されるポリマーの液相合成方法に関する。
2010539215.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎモノマーから形成される第１のポリマーの液相合成方法であって、以下の工程：
ａ）溶解された第１の化合物を提供すること、ここで該第１の化合物は、第１のモノマーおよび第１の特定の溶解度を有する第２のポリマーから形成され、ここで前記第１のモノマーおよび前記第２のポリマーは、第１の結合によって互いに結合し、ここで該第１の結合は、第１の開裂反応によって開裂することができ、ここで前記第１のモノマーは、活性なまたは活性化可能な第１の基を有する、
ｂ）溶解された第２の化合物を提供すること、ここで該第２の化合物は、第２のモノマーおよび第２の特定の溶解度を有する第３のポリマーから形成され、ここで前記第２のモノマーおよび前記第３のポリマーは、第２の結合によって互いに結合し、ここで該第２の結合は、第２の開裂反応によって開裂することができ、ここで前記第２のモノマーは、架橋反応によって第１およびな第２のモノマーの間に第３の結合の形成を伴って第１の基と反応することができる、活性なまたは活性化可能な第２の基を有し、ここで前記第１および第２の特定の溶解度は異なる、
ｃ）架橋反応を起こすために第１および第２の化合物を接触させること、ここで活性化可能な第１および／または第２の基が存在する場合、前記第１および／または第２の基を、活性化剤の添加により活性化させる、
ｄ）第２または第３のポリマーに対して特異的な沈殿反応を行うこと、ならびに本工程において沈殿した第１または第２の化合物、および工程ｃ）において形成された反応生成物のいずれをも分離すること、
ｅ１）分離された第１または第２の化合物および反応生成物を溶媒中に溶解し、工程ｄ）において行われた沈殿反応においては特異的ではなかった第１または第２のポリマーに対して特異的な沈殿反応を行い、当該工程で沈殿した反応生成物を分離すること、および反応生成物を前記溶媒または別の溶媒に溶解すること、
または、
ｅ２）分離された第１または第２の化合物および反応生成物を、本質的に反応生成物のみが溶解するが、工程ｄ）で沈殿した第１または第２の化合物は本質的に溶解しない溶媒に接触させること
ｆ）反応生成物の第２の開裂反応を行うこと、ここでさらなる反応生成物および第３のポリマーが形成され、ここで第１の活性基は前記さらなる反応生成物上に形成される、および
ｇ）工程ｂ）〜ｄ）を（ｎ−２）回繰り返すこと、ここで第１の化合物は、工程ｆ）において形成されたさらなる反応生成物に置き換えられ、第２の化合物は、その都度さらなる化合物と置き換えられ、ここで前記さらなる化合物は、さらなるモノマーおよび第３のポリマーから形成される、
を含む前記方法。
【請求項２】
工程ｇ）の後または工程ｆ）とｇ）との間に、
第２のポリマーに対して特異的な沈殿を行い、本処理で沈殿し、工程ｆ）で形成されたさらなる反応生成物を分離する、
または
第３のポリマーに対して特異的な沈殿を行い、本処理で沈殿し、工程ｆ）で形成された第３のポリマーを分離する、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１および第２の両モノマーがヌクレオチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
活性化可能な第１の基が、ヌクレオチドの５’炭素原子に結合した酸素原子および保護基、特にジメトキシトリチル基、第３のポリマーまたはジメトキシトリチル基に結合している第３のポリマーからなり、ここで保護基が前記酸素原子に結合している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
活性化可能な第１の基が、特に活性化剤としての有機酸によって、酸素原子の還元を伴って保護基を切り離すことによって活性化される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
活性な第１の基が、第１のモノマーを形成しているヌクレオチドの５’炭素原子上に配置されたＯＨ基である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
第２のモノマーがヌクレオシドホスホラミダイトである、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ヌクレオシドホスホラミダイトが、工程ｃ）による接触前または接触中に、特にＨ−テトラゾール、エチルチオテトラゾールもしくは別のテトラゾール誘導体またはジシアノイミダゾールによるプロトン化によって活性化される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
リン酸トリエステルを形成する亜リン酸トリエステルを酸化するために、特に酸化剤としてヨウ素によって、工程ｃ）とｇ）との間に酸化工程が行われる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
第１のモノマーが、特にエーテル結合中またはエステル結合中の酸素原子を介して、第２のポリマーに結合している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｂ）〜ｆ）を（ｎ−２）回繰り返した後、工程ｇ）による第１の開裂反応を行う、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の形成されたリン酸トリエステルが、第１の開裂反応の過程において還元される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第１の開裂反応が、水酸化アンモニウム溶液によって行われる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
第２または第３のポリマーがポリエチレングリコールであり、ここで第２および第３のポリマーは常に異なる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
第２または第３のポリマーがポリスチレンであり、ここで第２および第３のポリマーは常に異なる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｎモノマーから形成されるポリマーの液相合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術には、３’末端を介して固体担体に固定されたヌクレオチドに、所望の長さのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが形成されるまで、各工程において存在するかまたは新しく生成された５’末端へヌクレオチドを結合させることによって、デオキシリボ核酸ポリマーを合成することが開示されている。その後、このオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは固体担体から切り放される。固体担体は、ここでは典型的にクロマトグラフィーカラム中にある。ここで用いられるカラム充填が大きくなればなるほど、プロセスの管理はより困難になる。より具体的に言えば、カラムの均一な充填を得るのが困難であり、また大きいカラムの流路に伴う圧力損失のため、強力なポンプを必要とする。別の問題は、カラムには常に存在するエッジ効果であり、これは前方の移動が、カラムの中心部よりもカラムの壁に近接してより遅くなり、プロセスの効率を減少させる。
【０００３】
Bonora, G.M. et al., Nucleic Acids Research, 1993, Volume 21, No. 5, pages 1213 to 1217には、大量のＤＮＡ合成法の代替法として、オリゴヌクレオチドの液相合成方法が開示され、これはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を可溶性担体として、およびホスホラミダイト誘導体をシントンとして用いることを含む。これは、ポリエチレングリコールが、合成反応中に伸長するヌクレオシドの３’末端に結合することを伴う。ヌクレオシド上のジメトキシトリチル保護基が除去された後、前記ヌクレオシドの５’末端で、ヌクレオシドホスホラミダイトとの縮合が起こる。反応生成物を沈殿させ、再結晶する。
【０００４】
キャッピングおよびその後の酸化後、得られたＰＥＧ−リン酸塩誘導体を沈殿させ、ろ過し、再結晶する。脱トリチル、縮合、沈殿、再結晶、キャッピング、酸化、沈殿、ろ過および再結晶という前記プロセス工程は、ポリマーが所望の長さになるまでその後繰り返される。最終的に、ポリエチレングリコールは切り放され、得られたオリゴヌクレオチドが沈殿する。オリゴヌクレオチドは、その後溶解され、イオン交換クロマトグラフィーによって精製される。
【０００５】
上述した両方法は、鎖長の増加に応じて不適当なポリヌクレオチドの生成確率が急激に増加するという不利点を有する。これは、カップリングまたは縮合工程のいずれかにおいて、わずかな比率の、伸長されるべきヌクレオチド鎖が反応しないという事実による。カップリング効率を９８％と仮定すると、これは１０個のヌクレオチドのみから形成されるオリゴマーに対してすでに１８．３％の不適当なオリゴマーをもたらす。１００個のヌクレオチドから形成されるポリマーに対しては、形成されたポリマーの８６．７％がすでに不適当である。
【０００６】
不適当なポリマーはこうして適当に合成されたポリマーの量を上回り得る。結果として、純粋な形態で所望のポリマーを得るためには、不適当なポリマーを除去するために、例えばクロマトグラフィーを用いるなどの多大な労力が必要とされる。必要とされる精製および不適当なポリマーを生成するために不可避的に用いられる大量の試薬により、所望のポリマーの生成は割高である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的は、モノマーから形成されるポリマーの液相合成方法を提供することであり、本方法により、前記ポリマーを大量におよび高純度で、安価に生成することができる。
この目的は請求項１の構成により達成される。本発明の有益な態様は請求項２から１５の構成にある。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、３’炭素原子において酸素原子を介してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合しているヌクレオシドを示す図である。
【図２】図２は、第１の化合物を示す図である。
【図３】図３は、第１の化合物と第２化合物を接触させる工程を示す図である。
【図４】図４は、縮合反応において形成する二量体を示す図である。
【図５】図５は、酸化された反応生成物を示す図である。
【図６】図６は、開裂反応によりＯＨ基が生成した二量体を示す図である。
【図７】図７は、縮合によって生成する三量体を示す図である。
【図８】図８は、縮合によって生成する四量体を示す図である。
【図９】図９は、ポリスチレンを切り放した後に残存する反応生成物を示す図である。
【図１０】図１０は、反応性生成物（第１のポリマー）を示す図である。
【図１１】図１１は、保護基の例を示す図である。
【０００９】
本発明はｎモノマーから形成される第１のポリマーの液相合成方法を提供し、これは以下の工程を含む：
ａ）溶解された第１の化合物を提供すること、ここで該第１の化合物は、第１のモノマーおよび第１の特定の溶解度を有する第２のポリマーから形成され、ここで前記第１のモノマーおよび前記第２のポリマーは第１の結合によって互いに結合し、ここで該第１の結合は第１の開裂反応によって開裂することができ、ここで前記第１のモノマーは活性なまたは活性化可能な第１の基を有する、
【００１０】
ｂ）溶解された第２の化合物を提供すること、ここで該第２の化合物は、第２のモノマーおよび第２の特定の溶解度を有する第３のポリマーから形成され、ここで前記第２のモノマーおよび前記第３のポリマーは第２の結合によって互いに結合し、ここで前記第２の結合は第２の開裂反応によって開裂することができ、ここで前記第２のモノマーは活性なまたは活性化可能な第２の基を有し、ここで前記第１および第２の特定の溶解度は異なる、
【００１１】
ｃ）架橋反応を起こすために第１および第２の化合物を接触させること、ここで活性化可能な第１および／または第２の基が存在する場合、前記第１および／または第２の基を、活性化剤の添加により活性化させる、
ｄ）第２または第３のポリマーに対して特異的な沈殿反応を行うこと、ならびに本工程で沈殿した第１または第２の化合物、および工程ｃ）において形成された反応生成物のいずれをも分離すること、
【００１２】
ｅ１）分離された第１または第２の化合物および反応生成物を溶媒中に溶解し、工程ｄ）において行われた沈殿反応においては特異的ではなかった第１または第２のポリマーに対して特異的な沈殿反応を行い、本工程で沈殿した反応生成物を分離すること、および反応生成物を前記溶媒または別の溶媒に溶解すること、または、
【００１３】
ｅ２）分離された第１または第２の化合物および反応生成物を、本質的に反応生成物のみが溶解するが、工程ｄ）で沈殿した第１または第２の化合物は本質的に溶解しない溶媒に接触させること
【００１４】
ｆ）反応生成物との第２の開裂反応を行うこと、ここでさらなる反応生成物および第３のポリマーが形成され、ここで第１の活性基は前記のさらなる反応生成物上に形成される、および
ｇ）工程ｂ）〜ｄ）を（ｎ−２）回繰り返すこと、ここで第１の化合物は、工程ｆ）において形成されたさらなる反応生成物に置き換えられ、第２の化合物は、その都度さらなる化合物と置き換えられ、ここで前記さらなる化合物はさらなるモノマーおよび第３のポリマーから形成される。
【００１５】
さらなるモノマーおよび第２のモノマーは異なっていても、同一でもよい。第１のポリマーはまたオリゴマーであってもよい。第２のポリマーに特異的な沈殿反応は、第３のポリマーが本質的に溶液中に残存する沈殿反応を意味する。第３のポリマーに特異的な沈殿反応は、第２のポリマーが本質的に溶液中に残存する沈殿反応を意味する。
【００１６】
反応相手および反応生成物およびさらなる反応生成物は、単一分子だけではなく、多数の同一タイプの分子（たとえ単数形がこれらの分子を言及するのに用いられたとしても）を意味するものと理解される。したがって、たとえば、多数の同一の第１化合物および多数の同一の第２化合物が提供されると、工程ｃ）の実施において多数の同一の反応生成物がもたらされる。
【００１７】
本発明の方法の本質的な特徴は、新生第１ポリマーの特徴であり、そこへ結合する第２および第３のポリマー（これは特異的な方法で沈殿させることができ、未反応のモノマーおよび未伸長のさらなる反応生成物から簡単な方法で分離される）により、合成終了時の複雑な精製が省略される。
【００１８】
沈殿物は、遠心分離またはろ過により簡単に除去される。これはクロマトグラフィー分離と比較して、大規模でも費用効果が高い方式で達成され得る。また、本発明の方法は蓄積する不適当な反応生成物を生じず、これにより、従来の固相合成の場合のように、鎖長の増加に応じた不適当なポリマーの急激な増加を防ぐ。複雑な精製を省略することおよび不適当なポリマーの大量生成を防ぐことによって、前記ポリマーの製造コストは、従来の方法を用いて製造されたポリマーよりも極めて低い。
【００１９】
沈殿反応は様々な方法で行ってもよい。例えば、第２または第３のポリマーの溶解度は、それぞれのポリマーが溶けない溶媒を添加することによって減少させてもよい。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、例えば、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭｔＢＥ）の補助により沈殿させてもよい。さらに、沈殿のために「下限臨界溶解温度」を利用してもよい。これは、適切な媒体における沈殿を生じる温度の上昇を伴う。例えば、水に溶解されたポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は、３０．２℃を越えた温度で沈殿し得る。
【００２０】
また、「上限臨界溶解温度」を利用することも可能である。これは、適切な媒体における沈殿を生じる温度の低下を伴う。例えば、アセトンに溶解されたＰＥＧは３０℃を下回る温度で沈殿する。さらに、沈殿物をさらなるカップリング工程のために再度溶解させなければならないため、沈殿が可逆的である場合は、ポリマーを化学沈殿剤によって沈殿させてもよい。
【００２１】
オリゴヌクレオチド合成の場合において、本発明の別の利点は、従来のオリゴヌクレオチド合成において必要とされるキャッピング工程を必要としないことである。前記キャッピング工程は、従来の方法においては、縮合において反応しなかった５’炭素原子上のＯＨ基を、例えば無水酢酸によるアセチル化によって抑止し、そしてこれによりこれらを任意のさらなる反応から排除するために行われる。しかしながら、抑止のために用いられるこの手法は、前記のさらなる反応を妨げるため、キャッピング後にさらなる沈殿工程を必要とする。
【００２２】
本発明の方法はまたこの工程を省略する。本発明の方法においては、工程ｅ１）において反応生成物のみが沈殿し、工程ｅ２）において反応生成物のみが溶解するため、カップリングを必要としない。結果として、先に反応せず、遊離ＯＨ基をもったヌクレオチドが反応混合物中に残存しない。
【００２３】
しかしながら、少量の未反応ヌクレオチドが、工程ｅ１）による特異的沈殿反応において、または工程ｅ２）による特異的溶解反応中に持ち越された場合には、反応生成物の純度を上げるために追加のキャッピング工程を行ってもよい。
【００２４】
本方法の好ましい態様においては、第２のポリマーに対する特異的な沈殿反応を工程ｇ）の後または工程ｆ）とｇ）との間に行い、本プロセスにおいて沈殿し、工程ｆ）において形成されるさらなる反応生成物を分離する。あるいは、工程ｆ）とｇ）との間に第３のポリマーに対して特異的な沈殿を行ってもよく、そして本プロセスで沈殿し、工程ｆ）において形成された第３のポリマーを分離してもよい。工程ｆ）とｇ）との間に沈殿を行うことは、工程ｆ）が行われた後に混入を示す第３のポリマーが別の反応工程に持ち越されないため、さらに高純度の最終生成物をもたらす。
【００２５】
第１および第２の両方のモノマーは、好ましくはヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、次第に標識製品として用いられつつあるため、従来技術を用いては高コストでしか満たすことができない、これらに対する多大な需要がある。本発明の方法における比較的少量の精製は、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの製造において、特に注目すべきである。従来技術によって製造されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの製造コストの５０％が生成物のクロマトグラフィー精製のコストである。
【００２６】
活性化可能な第１の基は、ヌクレオチドの５’炭素原子に結合した酸素原子および該酸素原子に結合している保護基、特にジメトキシトリチル基、からなってもよい。保護基はまた第３のポリマーであってもよく、特に好ましくは、ジメトキシトリチル基に結合している第３のポリマーである。
【００２７】
活性化可能な第１の基は、特に活性化剤として有機酸によって、酸素原子の還元を伴って、保護基を切り放すことによって活性化されてもよい。結果として、形成される活性基は、例えばＯＨ基であり得る。有機酸は、弱有機酸、例えばジクロロ酢酸などであってもよい。保護基がジメトキシトリチル基である場合、開裂は脱トリチル化と呼ばれる。
【００２８】
活性な第１の基は、第１のモノマーを形成するヌクレオチドの５’炭素原子上に配置されたＯＨ基であってもよい。第２のモノマーはヌクレオシドホスホラミダイトであってもよい。特に工程ｃ）による接触前または接触中に、Ｈ−テトラゾール、エチルチオテトラゾールもしくは別のテトラゾール誘導体またはジシアノイミダゾールによるプロトン化によって活性化されたヌクレオシドホスホラミダイトが好ましい。
【００２９】
ホスホラミダイトを用いる場合には、リン酸トリエステルを形成する亜リン酸トリエステルを酸化するために、特に酸化剤としてヨウ素によって、工程ｃ）とｇ）との間に酸化工程が行われてもよい。これは続く脱トリチル化においてホスホラミダイトが切り放されるのを防ぐことができる。ここで好ましくは、酸化剤は、存在し得るジメトキシトリチル基との結合もまた酸化反応によって開裂されるように選択される。
【００３０】
第１のモノマーが、特にエーテル結合中またはエステル結合中の酸素原子を介して、第２のポリマーに結合しているのが好ましい。架橋反応において、第１の化合物は、特にエーテル結合中またはエステル結合中のさらなる酸素原子を介して第２の化合物と架橋しても良い。反応工程ｂ）〜ｆ）を（ｎ−２）回繰り返した後、第１のポリマーを第２のポリマーから分離するために、第１の開裂反応を行ってもよい。
【００３１】
第２のポリマーが、第１のポリマーと結合し、該第１のポリマーのさらなる使用を妨げないまたはそのために有用である場合、これは必須ではない。これは、特に、形成されたポリマーが、捕捉分子として用いられたポリヌクレオチドであり、これにハイブリダイズする標的ポリヌクレオチドが特異的な反応によって沈殿する場合であり得る。
【００３２】
第１の開裂反応の過程において、形成されたリン酸トリエステルは還元される。第１の開裂反応は、例えば、水酸化アンモニウム溶液によって行ってもよい。
本発明の方法の好ましい態様において、第２または第３のポリマーはポリエチレングリコールである。第３または第２のポリマーはまたポリスチレンであってもよい。しかしながら、いかなる場合にも、第２および第３のポリマーは異なる。
本発明を、図１〜１１の図表および例示的態様に基づき、以下により詳細に説明する。
【００３３】
以下に記載の全反応において、アセトニトリルを溶媒として用いる。図１は、その３’炭素原子において酸素原子を介してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合しているヌクレオシドを示す。その５’炭素原子に、該ヌクレオシドはさらなる酸素原子を介してジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を有する。ＤＭＴ保護基を有する５’酸素原子は活性化可能な基を示す。ＤＭＴ保護基は、弱有機酸、例えばジクロロ酢酸などによって切り放され、これにより活性基として遊離ＯＨ基が形成される。対応する反応生成物を、図２に第１の化合物として示す。
【００３４】
沈殿反応、および必要な場合には少なくとも１回の洗浄工程後、図３に示す次の工程は、第１の化合物とその５’炭素原子にポリスチレン（ＰＳ）基が結合している第２化合物としてのヌクレオチドホスホラミダイトとを接触させることを含む。Ｒ１は液相合成中の求核攻撃からリン酸基を保護する保護基である。
【００３５】
保護基は合成後に、好ましくはＰＥＧまたはＰＳ基の除去を伴って、切り放されてもよい。この種の保護基の例を図１１に示す。Ｒ２は、ジイソプロピルアミン部分である。ホスホラミダイト基は、３’酸素原子上に配置される。ホスホラミダイト基は、縮合反応において第１のヌクレオチドの遊離ＯＨ基と反応し、図４に示す二量体の形成をもたらし、ここでリンは酸化数＋３を有する。
【００３６】
リンにおける、その後のポリスチレン除去中の開裂を防ぐために、前者を、水性ヨウ素溶液の添加によって酸化数５に酸化させる。対応する反応生成物を図５に示す。この反応生成物は、前記水性ヨウ素溶液の添加によりすでに特異的に沈殿し得る。代替的にまたは追加して、非沈殿反応生成物を、ポリスチレンに対して特異的な沈殿反応によって未反応の第２の化合物と共に沈殿させてもよい。
【００３７】
反応生成物を、依然として存在するが反応しなかった第１の化合物から、例えば遠心分離によって分離し、必要であれば洗浄する。第２の化合物は溶解しない溶媒に、反応生成物を溶解した後、開裂反応を行い、ここでポリスチレンは除去され、二量体の５’末端上に活性基としてＯＨ基が生成する。対応する二量体を図６に示す。
【００３８】
その後、第１の化合物の代わりに前記二量体と、さらなる化合物としてその５’末端に結合するポリスチレン基を有するヌクレオシドホスホラミダイトとを接触させる。縮合は、図７に示す三量体を生成する。酸化数＋３から酸化数＋５を有するリンを酸化し、ポリスチレンに特異的な沈殿、さらなる化合物が溶解しない溶媒中に、再度三量体を溶解させ、およびポリスチレンを切り放した後、三量体はさらなる縮合反応に用いることができ、特異的な長さのポリマーを形成することができる。
【００３９】
これの１つの例は、図８に示す四量体である。該四量体は、ポリスチレンに対して特異的な沈殿反応において沈殿し、再度特異的に溶解される。ポリスチレンを切り放した後に残存する反応生成物を図９に示す。それを、ポリエチレングリコールに対して特異的な沈殿反応において沈殿させ、分離し、再度溶解する。その後、ポリエチレングリコールを開裂反応において切り放し、ポリエチレングリコールに対して特異的な沈殿反応において溶液中に残存する、図１０に示す反応性生成物（第１のポリマー）から分離する。後者は、その後例えばアルコールによって、同様に沈殿によって、沈殿させる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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2010539215.tif 000015