(57)【要約】  本発明は、（１）殺生物有効量の、ビグアナイドを含む第１の非酸化性殺生物剤と（２）殺生物有効量の、ジブロモニトリロプロピオンアミド（ＤＢＮＰＡ）を含む第２の非酸化性殺生物剤とを含む、水再循環システムを処理するための組成物であって、前記組成物が実質的に酸化剤を含まない組成物に関する。本発明は、また、上記の組成物を用いて水再循環システムを処理するステップを含む、水再循環システム中の微生物の増殖を抑制する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）殺生物有効量の、ビグアナイドを含む第１の非酸化性殺生物剤と、
（２）殺生物有効量の、ジブロモニトリロプロピオンアミド（ＤＢＮＰＡ）を含む第２の非酸化性殺生物剤と
を含む、水再循環システムを処理するための組成物であって、前記組成物が実質的に酸化剤を含まない組成物。
【請求項２】
前記ビグアナイドがポリヘキサメチレンビグアナイド（ＰＨＭＢ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物中の前記ビグアナイドの量が、前記組成物の全重量を基にして、約０．１から約９９重量％の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物中の前記ビグアナイドの量が、前記組成物の全重量を基にして、約５から約６０重量％の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物中の前記ビグアナイドの量が、前記組成物の全重量を基にして、約１０から約５０重量％の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物中の前記ビグアナイドの量が、約０．１と約５００ｐｐｍの間のビグアナイドの水中最終濃度を生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物中の前記ビグアナイドの量が、約０．５と約１００ｐｐｍの間のビグアナイドの水中最終濃度を生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物中の前記ビグアナイドの量が、約１と約２０ｐｐｍの間のビグアナイドの水中最終濃度を生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物中の前記ＤＢＮＰＡの量が、前記組成物の全重量を基にして、約０．１から約９９重量％の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物中の前記ビグアナイドの量が、前記組成物の全重量を基にして、約５から約６０重量％の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物中の前記ビグアナイドの量が、前記組成物の全重量を基にして、約１０から約６０重量％の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物中の前記ＤＢＮＰＡの量が、約０．０５と約１００ｐｐｍの間のＤＢＮＰＡの水中最終濃度を生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物中の前記ＤＢＮＰＡの量が、約０．１と約５０ｐｐｍの間のＤＢＮＰＡの水中最終濃度を生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物中の前記ＤＢＮＰＡの量が、約０．２５と約２５ｐｐｍの間のＤＢＮＰＡの水中最終濃度を生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
界面活性剤、生物学的分散剤、生物学的浸透剤、ソルビタンモノステアレート、スルファミン酸、タロープロピルアミンジアミン、ココプロピルアミンジアミン、オレイルピロピルアミンジアミン、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム、ＤＴＥＡ  ＩＩ、及びこれらの組合せからなる群から選択される１種又は複数のアジュバントをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物中の前記アジュバントの量が、前記組成物の全重量を基にして、約１から約７５重量％の範囲である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物中の前記アジュバントの量が、約５と１５０ｐｐｍの間の前記アジュバントの水中最終濃度を生じる、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
組成物を用いて水再循環システムを処理するステップを含む、前記水再循環システム中の微生物の増殖を抑制する方法であって、
前記組成物が、
（１）殺生物有効量の、ビグアナイドを含む第１の非酸化性殺生物剤であって、ビグアナイドの前記水再循環システム中の最終濃度が約０．１と約５００ｐｐｍの間である第１の非酸化性殺生物剤、
（２）殺生物有効量の、ジブロモニトリロプロピオンアミド（ＤＢＮＰＡ）を含む第２の非酸化性殺生物剤であって、ＤＢＮＰＡの前記水再循環システム中の最終濃度が約０．０５と約１００ｐｐｍの間である第２の非酸化性殺生物剤、及び
（３）任意選択で、界面活性剤、生物学的分散剤、生物学的浸透剤、ソルビタンモノステアレート、スルファミン酸、タロープロピルアミンジアミン、ココプロピルアミンジアミン、オレイルピロピルアミンジアミン、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム、ＤＴＥＡ  ＩＩ、及びこれらの組合せからなる群から選択される１種又は複数のアジュバントであって、アジュバントの前記水再循環システム中の最終濃度が約５と１５０ｐｐｍの間であるアジュバントを含み、
前記組成物が実質的に酸化剤を含まない方法。
【請求項１９】
ビグアナイドの前記水再循環システム中の最終濃度が約０．５と約１００ｐｐｍの間である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ビグアナイドの前記水再循環システム中の最終濃度が約１と約２０ｐｐｍの間である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＤＢＮＰＡの前記水再循環システム中の最終濃度が約０．１と約５０ｐｐｍの間である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ＤＢＮＰＡの前記水再循環システム中の最終濃度が約０．２５と約２５ｐｐｍの間である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は水処理に関し、さらに具体的には、バイオフィルムを含む水の処理に関する。
【背景技術】
【０００２】
水に曝された表面上に微生物が増殖すると高い頻度でバイオフィルムが形成される。バイオフィルムは、微生物が分泌するスライムによって取り囲まれた微生物の集合体であって、不活性の又は生体の表面上に付着している。バイオフィルムは、通常、何らかの水性溶液に浸され又は曝された固体基材の上に見出されるが、液体表面上にも浮遊するマットとして生成し得る。増殖のための十分な資源が与えられると、バイオフィルムは巨視的な大きさにすぐに増殖するであろう。水と接触している表面上にバイオフィルムが発生することによって様々な問題が起こる。
【０００３】
バイオフィルムは、水泳プール及び温泉の水の中に十分な消毒剤濃度が維持されている場合でも、水泳プール及び温泉の再循環システム中に蓄積することが観察されてきた。このバイオフィルムの蓄積は、水泳プール及び温泉の水を衛生的に又は透明に保つために使用される消毒剤及び／又は酸化剤の大量消費につながり得る。また、フィルターを顕著に詰まらせ、その結果、循環量を減らし、ろ砂のチャネリングを起こし、カートリッジと珪藻土グリッドの故障を起こして水を濁らせ得る。バイオフィルムが限界レベルに達すると、シート状となって管壁からはがれ、水の透明さにも影響を与え得る。
【０００４】
バイオフィルムの形成（汚染）は、工業用水設備、例えば、水再循環システム、熱交換器、冷却機、パルプと紙の加工工程などにおいても問題となる。バイオフィルムはパイプの内部に発生し、詰まり及び腐食を引き起こし得る。極端な場合には、バイオフィルムは、蓄積してスライムとして知られている大きな塊になり、弁、流量計及びその他の制御機器を妨げることがある。スライムの蓄積は、熱交換を減らし、又は熱交換表面の冷却効率を下げることがある。
【０００５】
化学的及び物理的な処理を用いてバイオフィルムの増殖を抑制する試みが行われてきた。これまで、バイオフィルムの繁殖を除去し、防止し、又は減少させるために、抗菌剤（殺生物剤と総称される）が使用されてきた。この目的に使用される典型的な殺生物剤としては、四級アンモニウム化合物、ホルムアルデヒド、並びに陰イオン性及び非イオン性界面活性剤のような非酸化性の殺生物剤だけでなく、オゾン、二酸化塩素、塩素、よう素、及び過酸化水素のような酸化能力のある殺生物剤が含まれる。バイオフィルムに対する処理の例としては以下のようなものが含まれる。
【０００６】
米国特許第４，２９７，２２４号には、再循環水中のバイオフィルムの形成の抑制のための処理として、１−ブロモ−３−クロロ−５，５−ジメチルヒダントインの使用が開示されている。
【０００７】
米国特許第４，６０４，４０５号には、微生物の増殖を阻止するために、２−ブロモ−２−ブロモメチルグルタロニトリル及び２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミドの相乗性のある組合せの使用が開示されている。
【０００８】
米国特許第５，２８４，８４４号には、材料の保護及び水システムにおける殺生物剤として、３，５−ジハロゲノ−１，２，６−チアジアジン−４−オン類の使用が開示されている。
【０００９】
米国特許第６，３９５，１８９号には、水システム中でのバイオフィルム被膜及び類似の有機沈積物を減少させるための方法、並びにさらに詳細には、冷却水システム中での生物用分散剤として有用な組成物を提供するために、任意選択で界面活性剤と混合してもよいアミン−ホルムアルデヒド縮合物が開示されている。
【００１０】
米国特許第６，３８０，１７４号には、リン酸ポリヘキサメチレンビグアニジン及び２−ブロモ−２−ニトロ−１，３−プロパンジオールを含むスライムを除去する組成物が開示されている。
【００１１】
米国特許第７，００８，５４５号には、酸化剤で活性化された含窒素化合物及び非酸化性の殺生物剤との相乗性のある殺生物剤混合物が開示されている。しかし、そのような組合せでは含窒素化合物を活性化させるのに酸化剤の使用が必要であり、一部の用途では酸化剤は望ましくない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
当業界においては、バイオフィルムの発生を減少させ、抑制し、又は除去するための改善された組成物の必要性がある。本発明はその必要性に対する解答となると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一実施形態では、本発明は、（１）殺生物有効量の、ビグアナイドを含む第１の非酸化性殺生物剤と、（２）殺生物有効量の、ジブロモニトリロプロピオンアミド（ＤＢＮＰＡ）を含む第２の非酸化性殺生物剤とを含む、水再循環システムを処理するための組成物であって、実質的に酸化剤を含まない組成物を対象とする。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、（１）殺生物有効量の、ビグアナイドを含む第１の非酸化性殺生物剤と、（２）殺生物有効量の、ジブロモニトリロプロピオンアミド（ＤＢＮＰＡ）を含む第２の非酸化性殺生物剤とを含む、水再循環システムを処理するための組成物であって、実質的に酸化剤を含まない組成物を用いて、水再循環システムを処理するステップを含む、水再循環システム中の微生物の増殖を抑制する方法を対象とする。
【００１５】
これらの実施形態及び他の実施形態は、以下の図面と本発明の詳細な記述から理解されよう。
【００１６】
本発明は、付随の図面と関連させて行う次の詳細な記述から一層完全に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】改善処理及び生存細菌量の対応する減少を示すグラフである。
【図２】改善処理及び生存細菌量の対応する減少を示す別のグラフである。
【図３】プールの改善処理の経時的な結果を示すグラフである。
【図４】プールの改善処理の経時的な結果を示す別のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
バイオフィルムは、これらに限定されるわけではないが、水泳プール、温泉、熱交換器、冷却システム、クーリングタワーなどを含む、水再循環システムの至る所に形成され、繁殖することが観察されてきた。バイオフィルムは、プールと温泉の水の中に十分な消毒剤の濃度が維持されている場合でも、水泳プールと温泉の再循環システム中に蓄積することが観察されてきた。このバイオフィルムの蓄積は、プールと温泉の水を衛生的に又は透明に保つために使われる消毒剤及び／又は酸化剤の大量消費につながり得る。また、フィルターを顕著に詰まらせ、その結果、循環量を減らし、ろ砂のチャネリングを起こし、カートリッジと珪藻土グリッドの故障を起こして水を濁らせ得る。バイオフィルムが限界レベルに達すると、シート状となって管壁からはがれ、水の透明さにも影響を与え得る。
【００１９】
ビグアナイドを含む第１の非酸化性殺生物剤とジブロモニトリロプロピオンアミド（ＤＢＮＰＡ）を含む第２の非酸化性殺生物剤との、酸化剤を含まない組合せが、水再循環システムにおいて、又は、可視的なバイオフィルムにおいて通常の細菌と真菌の定着を防止する際に、殺生物剤いずれか単独の使用では達成できないと思われる相乗効果を示すことが思いがけなく発見された。本発明の組成物を定期的に適用することにより、循環システムとろ過システムを損なうこと、又は水の透明度に対して負の影響を与えることがないように、バイオフィルムを改善し得ること、及びその増殖を顕著に減少させ得ることが示された。バイオフィルム問題が顕在してしまった場合においても、本発明の処理方法は、循環システムとろ過システムから顕著な量のバイオフィルムを除去することにより、配管、ろ過操作及び水の透明度を回復できる。
【００２０】
上記に示したように、１つの実施形態では、本発明は、（１）殺生物有効量の、ビグアナイドを含む第１の非酸化性殺生物剤と、（２）殺生物有効量の、ジブロモニトリロプロピオンアミド（ＤＢＮＰＡ）を含む第２の非酸化性殺生物剤とを含む、水再循環システムを処理するための組成物であって、実質的に酸化剤を含まない組成物である。これらの成分の各々について以下に詳述する。
【００２１】
本発明の組成物の第１の成分は、ビグアナイド化合物を含む第１の非酸化性殺生物剤である。この第１の非酸化性殺生物剤には、ポリヘキサメチレンビグアナイド（ＰＨＭＢ）のような高分子ビグアナイドを含めて、任意のビグアナイド化合物（又はビグアナイド化合物の混合物）を含み得る。高分子ビグアナイドは、好ましくは、少なくとも１個のメチレン（ＣＨ２）基を含む架橋基で連結された、式（１）の少なくとも２つのビグアナイド単位を含む。
【化１】
2010513275.tif 000003
架橋基は、好ましくは、ポリメチレン鎖を含み、任意選択で、酸素、硫黄、又は窒素のようなヘテロ原子の１個又は複数が組み込まれるか又はそれによって置換されている。架橋基は、また、１個又は複数の、飽和又は不飽和の環状部分を含んでもよい。好ましくは、架橋基は、式（１）の２つの隣接ビグアナイド単位の間に、少なくとも３個、特に少なくとも４個の炭素原子が直接介在しているようなものである。好ましくは、式（１）の隣接する２つのビグアナイド単位の間に、１０個以下、特に８個以下の炭素原子が介在している。
【００２２】
高分子ビグアナイドは、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビルのような任意の好適な基、又はアミン基、又は次式のシアノグアニジン基を末端としてもよい。
【化２】
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【００２３】
末端基がヒドロカルビルである場合、アルキル、シクロアルキル、アリール、又はアラルキルであることが好ましい。末端基が置換ヒドロカルビルである場合、置換基は、高分子ビグアナイドの微生物学的な特性に好ましくない副作用を示さない任意の置換基であり得る。好ましいアリール基には、フェニル基が含まれる。好適な置換基の例は、アリールオキシ、アルコキシ、アシル、アシロキシ、ハロゲン、及びニトリルである。
【００２４】
高分子ビグアナイドが、式（１）の２個のビグアナイド基を含む場合、２個のビグアナイド基は、ポリメチレン基で、特別には、ヘキサメチレン基で連結されていることが好ましい。このようにして得られる構造はビスビグアナイドと名付け得る。
【００２５】
そのようなビスビグアナイドにおける末端基は、好ましくは、直鎖状、分岐状いずれでもよいＣ１〜１０アルキル基であり、任意選択で置換アリール基であり、特別には任意選択で置換フェニル基である。そうした末端基の例は、２−エチルヘキシル及び４−クロロフェニルである。そのようなビスビグアナイドの具体例は、式（２）と式（３）で表される遊離塩基形の化合物である。
【化３】
2010513275.tif 000005
及び
【化４】
2010513275.tif 000006
【００２６】
高分子ビグアナイドは、好ましくは、式（１）のビグアナイド単位を３個以上含み、好ましくは、式（４）で表される高分子繰返し鎖又はその塩を有する、線状高分子ビグアナイドである。
【化５】
2010513275.tif 000007
ここで、Ｘ及びＹは、同じであっても異なっていてもよい架橋基を表し、Ｘによって連結されている窒素原子対の間に直接介在する炭素原子の個数と、Ｙによって連結されている窒素原子対の間に直接介在する炭素原子の個数との合計が、合わせて９を超え１７未満である。
【００２７】
架橋基Ｘ及びＹは、好ましくは、ポリメチレン鎖からなり、任意選択で、例えば、酸素、硫黄、又は窒素のようなヘテロ原子で中断されていてもよい。Ｘ及びＹはまた、飽和又は不飽和であってもよい環状部分を組み込んでいてもよい。この場合、Ｘ及びＹによって連結されている窒素原子対の間に直接介在する炭素原子の個数は、１個又は複数の環状基の最短である当該セグメントを含むものとする。したがって、次式の基において、窒素原子の間に直接介在する炭素原子の個数は、４であり、８ではない。
【化６】
2010513275.tif 000008
【００２８】
式（４）の高分子繰返し単位を有する線状高分子ビグアナイドは、典型的には、それら高分子鎖が異なる長さである高分子の混合物として得られる。好ましくは、次式の個々のビグアナイド単位の数は、両者を合わせて、３から約８０である。
【化７】
2010513275.tif 000009
【００２９】
好ましい線状高分子ビグアナイドは、ＸとＹは同じであり、及び個々の高分子鎖が、末端基を除いて、式（５）又はその塩である高分子鎖の混合物である。
【化８】
2010513275.tif 000010
ここで、ｎは４から４０、及び特別には４から１５である。ｎの平均値が約１２であることが特別に好ましい。好ましくは、高分子の平均分子量は、遊離塩基形で、１１００から３３００である。
【００３０】
線状高分子ビグアナイドは、次式を有するビスジシアンジアミドと
【化９】
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ジアミンＨ２Ｎ−Ｙ−ＮＨ２、（ここで、ＸとＹは上記で規定した意味を有する）との反応か、又は、ジアミン塩若しくは次式を有するジシアンイミドとジアミンＨ２Ｎ−Ｙ−ＮＨ２（ここで、ＸとＹは上記で規定した意味を有する）との反応により調製できる。
【化１０】
2010513275.tif 000012
これらの調製方法は、英国特許第７０２，２６８号及び第１，１５２，２４３号にそれぞれ記載されており、同特許に記載されている高分子ビグアナイドのいずれをも使用することができる。これらの英国特許は、参照によりその全体を本明細書に組み込む。
【００３１】
上述したように、線状高分子ビグアナイドの高分子鎖は、アミノ基又はシアノグアニジン基のどちらかを末端としてよい。
【化１１】
2010513275.tif 000013
【００３２】
このシアノグアニジン基は、線状高分子ビグアナイドの調製中に加水分解され末端グアニジン基を与え得る。個々の高分子鎖において末端基は同じか又は異なり得る。
【００３３】
上述した高分子ビグアナイドの調製において、ジアミンＨ２Ｎ−Ｙ−ＮＨ２と共に、低率の一級アミンＲ−ＮＨ２（ここで、Ｒは１個から１８個の炭素原子を含むアルキル基を表す）を含んでいてもよい。一級アミンは連鎖停止剤として働き、したがって高分子ビグアナイドの高分子鎖の一方又は両方の末端は−ＮＨＲ基で終わり得る。−ＮＨＲで連鎖停止されたこうした高分子ビグアナイドもまた使用し得る。
【００３４】
高分子ビグアナイドは、無機及び有機の酸と容易に塩を形成する。好ましい高分子ビグアナイドの塩は水溶性である。高分子ビグアナイドが遊離塩基形である式（２）の化合物で表される場合、好ましい水溶性の塩は、ジグルコネートである。高分子ビグアナイドが遊離塩基形である式（３）の化合物で表される場合、好ましい水溶性の塩は、ジアセテートである。高分子ビグアナイドが遊離塩基形である式（５）で表される線状高分子の混合物である場合、好ましい塩は、塩酸塩である。
【００３５】
高分子ビグアナイドが、その個々の高分子鎖が、末端基を除いて、塩酸塩の形で式（５）によって表される線状高分子の混合物であることが特に好ましい。この化合物は、Ａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）から、ＢＡＱＵＡＣＩＬの商標名で商業的に入手できる。
【００３６】
高分子ビグアナイドは、好ましくは１から２００ｐｐｍ、より好ましくは３から１５０ｐｐｍ、特別には４から７５ｐｐｍ、さらに特別には６から２０ｐｐｍのその水中濃度を与えるように、水再循環システムに加える。
【００３７】
本発明の組成物中のビグアナイドの量は、水再循環システムに加えた場合に殺生物の効果が起こるような任意の量である。さらに具体的な実施形態では、組成物中のビグアナイドの量は、液体として、重量で０．１％から４０％の範囲であるか、又は固体（顆粒又は圧縮形）として、重量で１％から９９％の範囲である。好ましくは、液体として、重量で３％から３０％の範囲であるか、又は固体として、重量で１０％から７５％の範囲であり、より好ましくは、液体として、重量で５％から２５％の範囲であるか、又は固体として、重量で１５％から６０％の範囲であり、最も好ましくは液体として、重量で１０％から２０％の範囲であり、固体として、重量で２５％から５０％の範囲である。重量パーセントはすべて、組成物の全重量に基づいている。
【００３８】
殺生物効果をもたらすために、組成物中のビグアナイドの殺生物有効量は、好ましくは、約０．１と約５００ｐｐｍの間、より好ましくは約０．５と１００ｐｐｍの間の、最も好ましくは約１と２０ｐｐｍの間の、ビグアナイドの水中の最終殺生物剤濃度になる。
【００３９】
本発明の組成物の第２の成分は、ジブロモニトリロプロピオンアミド（ＤＢＮＰＡ）を含む第２の非酸化性殺生物剤である。本発明の組成物中のＤＢＮＰＡの量は、水再循環システムに加えた場合に殺生物効果が起こるような任意の量である。さらに具体的な実施形態では、組成物中のＤＢＮＰＡの量は、液体として、重量で０．１％から４０％の範囲であるか、又は固体（顆粒又は圧縮形）として、重量で１％から９９％の範囲である。好ましくは、液体として、重量で３％から３０％の範囲であるか、又は固体として、重量で１０％から７５％の範囲であり、より好ましくは、液体として、重量で５％から２５％の範囲であるか、又は固体として、重量で１５％から６０％の範囲であり、最も好ましくは液体として、重量で１０％から２０％の範囲であり、固体として、重量で２５％から５０％の範囲である。重量パーセントはすべて、組成物の全重量に基づいている。
【００４０】
殺生物効果をもたらすために、組成物中のＤＢＮＰＡの殺生物有効量は、好ましくは、約０．０５と約１００ｐｐｍの間、より好ましくは、約０．１と５０ｐｐｍの間、最も好ましくは、約０．２５と２５ｐｐｍの間の、ビグアナイドの水中の最終殺生物剤濃度になる。
【００４１】
さらに、ＰＨＭＢ：ＤＢＮＰＡの最も好ましい濃度比（処理水中のＰＰＭで測定する場合）は、バイオフィルムの蓄積を防止するには、３：０．２５から２０：６であり、すでに存在するバイオフィルムを抑制するには１：１から１：３である。
【００４２】
本発明の組成物は、塩素、アルカリとアルカリ土類の次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、塩素化イソシアヌル酸塩、臭素、アルカリとアルカリ土類の次亜臭素酸塩、次亜臭素酸、塩化臭素、ハロゲン化ヒダントイン、オゾンのような酸化剤及び酸化性の試薬、並びにアルカリとアルカリ土類の過ホウ酸塩、アルカリとアルカリ土類の過炭酸塩、アルカリとアルカリ土類の過硫酸塩、過酸化水素、過カルボン酸、及び過酢酸のような過酸化化合物を実質的に含んでいない。本明細書で用いる場合、「実質的に含んでいない」というのは、重量で０．１％未満である。
【００４３】
本発明の組成物は、界面活性剤、生物学的分散剤、生物学的浸透剤、ソルビタンモノステアレート、スルファミン酸、タロープロピルアミンジアミン、ココプロピルアミンジアミン、オレイルピロピルアミンジアミン、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム、ＤＴＥＡ  ＩＩ、及びこれらの組合せからなる群から選択される１種又は複数のアジュバントをも含んでもよい。
【００４４】
本発明の組成物に含み得るアジュバントの量は、液体として、重量で１％から７５％の範囲であるか、又は固体（顆粒又は圧縮形）として、重量で５％から７５％の範囲である。好ましくは、液体として、重量で５％から７０％の範囲であるか、又は固体として、重量で１０％から７０％の範囲であり、より好ましくは、液体として、重量で１０％から６０％の範囲であるか、又は固体として、重量で１５％から６０％の範囲であり、最も好ましくは液体として、重量で２０％から５０％の範囲であり、固体として、重量で２５％から５０％の範囲である。さらに、ＰＨＭＢ：ＤＢＮＰＡ：アジュバントの最も好ましい濃度比（処理水中のＰＰＭで測定する場合）は、１０：０．５：１０から２０：３：５０である。
【００４５】
使用される場合、本発明の組成物中の好ましいアジュバント量は、好ましくは、約５と約１５０ｐｐｍの間、より好ましくは、約１５と１００ｐｐｍの間、最も好ましくは、約２０と５０ｐｐｍの間のアジュバントの最終水中濃度を生じる。
【００４６】
本発明の組成物は、水処理業界で公知の添加剤も含んでもよい。このような添加剤としては、顔料、染料、溶解速度調整剤、結合剤、潤滑剤、含色塩などが含まれるがこれらに限定されるわけではない。このような添加剤は、混合物に加えられるどれかの殺生物成分に予備的に混合してもよい。さらに、水又はライムのような不活性の副生成物が組成物中に存在してもよい。
【００４７】
本発明の組成物の作成は、数種の異なる方法によって達成できる。例えば、本発明の組成物を混合するのに、タンブラ混合機、Ｖ型混合機、リボン型混合機などをバッチ方式で使用できる。さらに、組成物を混合するのに、スクリューオーガー（ａｕｇｕｒ）、コンベアなどを連続方式で使うこともできる。そのような装置と技法は当業界で一般に公知である。代替として、組成物は層状又は均一混合の固体成形品に成形することもできる。本発明の組成物は、様々な固体成形品に成形してもよい。このような成形品としては、錠剤、ブリック、ブリケット、ペレット、顆粒などがあるが、これらに限定されるわけではない。本発明の組成物の成分は、融解し、共に混合し、次いで金型の中に注入し、融解物を室温に冷やしてもよい。この製造法によれば、組成物を１層又は異なる複数層に作製することもできる。ＰＨＭＢとＤＢＮＰＡを製剤化する別の方法は、該固体の一方又は複数を融解し、それらを共に混合し、金型の中に注入し、融解物を室温に冷却することであろう。この場合も、異なる２層として達成することができる。
【００４８】
本発明の組成物と方法は、バイオフィルムが蓄積する任意の水再循環システム、例えば水泳プール、温泉、装飾用の池にだけでなく、製紙工場、クーリングタワー、熱交換器、廃水処理装置、木材防腐用途などの工業的な用途においても使用し得る。意義深いことに、本発明の組成物は、それぞれの活性成分を個別に検討したときは当業者に予測されないと思われる、活性成分２種間の相乗効果を発揮する。
【００４９】
水泳プール用の処理として使用する場合、本発明の組成物は、上述した濃度範囲になるように、水泳プールの水再循環システムに加えられ、２つの殺生物剤の間の相乗効果を発揮する。ポリヘキサメチレンビグアナイド（１〜２０ｐｐｍ）と毎日添加されるジブロモニトリロプロピオンアミド（０．１〜６ｐｐｍ）と任意選択で用いるアジュバントとの組合せは、日常的に適用（予防的に適用）することにより、水中又は可視的なバイオフィルム中での通常の水泳プール内細菌及び真菌の定着を防止する際に、殺生物剤いずれか単独の使用では達成できないと思われる相乗効果を示した。アジュバントを用い又は用いずに、ポリヘキサメチレンビグアナイド（１〜２０ｐｐｍ）及びジブロモニトリロプロピオンアミド（３〜２４ｐｐｍ）の添加の組合せを含む改善処理もまた、水中での並びに配管及びフィルター中での、通常の水泳プール内細菌及び真菌の定着集団を改善する際に、それぞれの殺生物剤の単独使用では達成できないと思われる相乗効果を示す。
【実施例】
【００５０】
（実施例１）
改善策
ペシロマイセス・リラシヌス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｌａｃｉｎｕｓ）、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）などの水泳プールに見出される通常真菌の真菌分離株、及び水泳プールにやはり一般的な細菌分離株、即ちアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）種、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）種を用いてバイオフィルムを作製し、それを次の方法を用いて殺生物剤で処理した。
【００５１】
真菌胞子の懸濁液の混合物を１０％Ｒ２Ａブロス中に３．６５×１０４個／ｍｌの濃度で調製した。列１２を除いて９６ウェルプレートの各ウェルに胞子懸濁液の一定分量を加えた。プレートを１８時間、２８℃でインキュベートした。また、細菌懸濁液の混合物を２０％Ｒ２Ａブロス中に２．３４×１０５個／ｍｌの濃度で調製した。真菌胞子を入れた９６ウェルプレートの各ウェルに、細菌懸濁液の一定分量を加えた。プレートを２４時間、２８℃でインキュベートした。
【００５２】
新しい９６ウェルプレートに、列１と１２を除いて、各ウェルに６ｐｐｍのＰＨＭＢ溶液を加えた。殺生物剤又はアジュバントの１００ｐｐｍ溶液を、６ｐｐｍのＰＨＭＢ溶液に加えた。この薬品溶液の一定分量を、列１と２の各ウェルに加えた。列２の各ウェル中で溶液を混合し、溶液の一定分量を列２の各ウェルから列３の各ウェルへ移液した。希釈を列１１まで繰り返し、希釈後の列１１の各ウェルからの溶液は捨てた。
【００５３】
インキュベートしたプレートの各ウェルから培養ブロスを除いた。０．８％塩化ナトリウム溶液の一定分量を、列１２を除いて各ウェルに加えた。次いで、塩化ナトリウム溶液を各ウェルから除いた。調製した薬品溶液をバイオフィルムプレートの対応するウェルへ移した。プレートを２４時間、２８℃でインキュベートした。
【００５４】
プレートから薬品溶液を除き、レサズリン溶液の一定分量を列１２も含めて各ウェルに加えた。プレートを実験台上で２４〜４８時間維持した。プレートを５４０ｎｍ及び６２０ｎｍで読み取った。この２波長間の吸光度の差が殺生物剤の性能を示した。表１は試験した殺生物剤の効力を示す。
表１  ＰＨＭＢ  ６ｐｐｍと共に試験した殺生物剤の有効濃度
【表１】
2010513275.tif 000014
【００５５】
表１で示したように、６ｐｐｍのＰＨＭＢの存在下、およそ３ｐｐｍのＤＢＮＰＡは、バイオフィルムマトリックス内の全生物を抑制できたが、他方、表１の他の候補品は無効であることが示された。
【００５６】
表２は、同じバイオフィルムマトリックス内の全生物に対するＤＢＮＰＡの効力に及ぼす、様々なアジュバントの効果を示す。
表２．ＰＨＭＢ及びアジュバントの存在下でのＤＢＮＰＡの有効濃度
【表２】
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【００５７】
表２は、バイオフィルム中の全生物を抑制するのに必要なＤＢＮＰＡ濃度の低下に対して、スルファミン酸が最も有意な効果を示したこと、及びワーム（特許品の酵素ブレンド）、ＳＡＤＡ及びＤＳＰＯが、ＤＢＮＰＡ濃度を低下させたことを示している。他のアジュバントはどれも、より低い濃度でバイオフィルム中の生物を抑制するＤＢＮＰＡの能力に正の効果を与えなかった。
【００５８】
（実施例２）
予防―二次スクリーン
二次スクリーン法は水泳プールの実験規模のモデルに基づいている。ある容量（８００ｍｌ）の水泳プール合成水（塩化カルシウム二水和物と炭酸水素ナトリウムの溶液）を蠕動ポンプによって水泳プール用ろ砂塊中を圧送する。各システムの水温は８０〜９０°Ｆの範囲に保つ。この実験の目的は、微生物が水中及び砂ろ媒体中でコロニーを定着させるのを防止し、それによってシステム中でのバイオフィルムの形成を防止する殺生物剤の強健性又は能力を、単独で又は組合せで評価することである。殺生物剤候補品の性能は、水の透明度が１．０ＮＴＵ未満に保たれた日数、並びにこの濁度の読取値を超えたときの細菌及び真菌のカウント数により決定した。濁度が１．０ＮＴＵを超えるときには、水と砂の両方の中に細菌及び真菌の有意な集団が存在することが示された。また、濁度が１．０ＮＴＵを超えるときには、砂と配管の中に可視的なバイオフィルムが観察された。
【００５９】
この水に、必要に応じて化学薬品を加えてもよい。典型的には、ポリヘキサメチレンビグアナイド（ＰＨＭＢ）の濃度は、殺生物剤の毎日又は毎週用量の添加により、活性成分が０〜１０ｐｐｍの範囲に保たれる。実験の開始時に、過酸化水素が０〜２７．５ｐｐｍの濃度で加えられ、各システムにおける過酸化水素の損失分を比色分析法でモニターした。２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミド（ＤＢＮＰＡ）を０〜６ｐｐｍの間の濃度範囲で毎日又は毎週のどちらかで加える。
【００６０】
二次モデルシステムで、水泳プールの水中で典型的に見出される８種の細菌種及び４種の真菌種を毎日の頻度で投入する。これらの微生物には、ペシロマイセス属及びトリコデルマ属の真菌種、並びにアルカリゲネス属、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及びスフィンゴモナス属の細菌種を含む。各播種は、モデル装置当たり０．８×１０６個の微生物を全体で加えたことに相当する。
【００６１】
システム中に存在する微生物の栄養源として、ある量（５ｍｌ）の合成水泳者負荷液をシステムに毎日の頻度で加える。水泳者負荷液は、尿素、アルブミン、クレアチニン、乳酸、尿酸、グルクロン酸、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化アンモニウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸カリウムのような、炭素、窒素及び主要／微量栄養源からなる。
【００６２】
各二次モデルシステム中に存在する生存細菌及び真菌の総数を寒天プレートカウント法で毎週測定する。各装置から水試料を取り、この試料を用いて一連の希釈液（各段１０−１で元の試料の１０−５にまで）を調製する。次いで、希釈液の一定分量を、乾燥したシスチンラクトース電解質欠乏寒天プレート（細菌の計数用）、及びサブロー（Ｓａｂａｒｏｕｄ）ブドウ糖乾燥寒天プレート（真菌の計数用）の上に広げる。細菌と真菌のプレートは、生存生物数の計数に先立ち、３０℃でそれぞれ３日と５日インキュベートする。
【００６３】
モデル水濁度を、Ｈａｃｈ  ２１００Ｐ濁度計を用いて、試料水の比濁分析濁度単位（ＮＴＵ）の測定によって毎日の頻度で測定した。ＮＴＵの測定は装置製造者の使用説明書に従って行った。ＰＨＭＢ濃度の測定は、０．０２４％（Ｗ／Ｖ）のエオシンＹ及び１０％（Ｗ／Ｖ）の酢酸ナトリウム三水和物の溶液との反応により、並びにその結果生成する５４０ｎｍの発色の測定により、比色分析法で毎日行った。始めに、既知濃度のＰＨＭＢ溶液を用いて、ＰＨＭＢに対するＢｅｅｒ則プロットを作成する。次いで、得られたプロットを二次モデル試料水中のＰＨＭＢ濃度の決定に用いる。過酸化水素の濃度は、装置製造者の使用説明書に従って操作したＬｏｖｉｂｏｎｄ  ＰＣ２２光度計と連動して、Ｌｏｖｉｂｏｎｄ過酸化水素低濃度域テスト錠剤を用いることにより追跡した。
【００６４】
殺生物剤候補品の性能は、水の透明度が１．０ＮＴＵ未満に保たれている日数によって決定される。濁度が１．０ＮＴＵを超えるときには、水と砂の両方の中に細菌及び真菌の有意な集団が存在することが示された。可視的なバイオフィルムも、砂と配管の中に観察されよう。
【００６５】
下記の表３と表４に示したデータは、水が濁るのを防止すること及びシステムに加えられた細菌及び真菌を抑制することにおける、ＰＨＭＢとＤＢＮＰＡ（後者を毎日添加したとき）の間の相乗的な性能を示している。実験１（表３）のデータは、ＰＨＭＢ単独で操作したシステムに比較して、ＰＨＭＢとＤＢＮＰＡ（後者を毎日１ｐｐｍの割合で添加して）の組合せの増大した性能を明らかにしている。ＰＨＭＢと共にＤＢＮＰＡを毎週添加することは、ＰＨＭＢ単独の処理と同程度に良好には働かず、このことは、増大した性能を生むにはＤＢＮＰＡを定期的に添加する必要性があることを明らかにした。
【００６６】
ＰＨＭＢとＤＢＮＰＡの殺生物活性の間の相乗作用は、実験２（表４）で得られたデータで明確に示されている。この実験では、ＰＨＭＢ（１ｐｐｍの割合で毎日添加）の存在しない場合は、ＤＢＮＰＡの添加はシステムの不良化をもたらし、濁り水が発現するのは、ＰＨＭＢ単独又はＰＨＭＢとＤＢＮＰＡの組合せを投与したシステムに比べて有意に早い。
【００６７】
表３と表４に示したデータは、また、０．５ｐｐｍ（毎日の添加）又はそれ以上の濃度でＤＢＮＰＡを添加しないと、水中に過酸化水素残渣が存在しない場合には水の透明度は維持できないことを明らかにしている。これと反対に、ＰＨＭＢとＤＢＮＰＡの組合せ（後者を毎日０．５及び１ｐｐｍの濃度で添加して）は、システムから過酸化水素が完全に消失した後も、水の透明度を１９日及び６９日間保持した。このデータは、酸化剤がまったく存在しない場合に、ＰＨＭＢとＤＢＮＰＡの組合せが増大した殺生物効果を有することを明確に示している。
表３：細菌と真菌の増殖の抑制に対するＰＨＭＢ、ＤＢＮＰＡ及び組合せの性能についての例１
【表３】
2010513275.tif 000016
表４：細菌と真菌の増殖の抑制に対するＰＨＭＢ、ＤＢＮＰＡ及び組合せの性能についての例２
【表４】
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【００６８】
（実施例３）
改善−二次スクリーン
二次スクリーン法は水泳プールの実験規模モデルに基づいている。ある容量（８００ｍｌ）の水泳プール合成水（塩化カルシウム二水和物と炭酸水素ナトリウムの溶液）を蠕動ポンプによって水泳プールろ砂塊中を圧送する。各システムの水温は８０〜９０°Ｆの範囲に保つ。システムを不良化するに任せると、濁り水と細菌と真菌の増殖が著しい結果となる。これは、不適正に維持されて問題がある水泳プールに類似させるためのものである。この試験の目的は、水とろ砂の両方の中に存在する生物の抑制に対してアジュバントと共に殺生物剤単独又は殺生物剤の組合せの能力を評価することである。濁度は重要な尺度ではない、なぜならば、懸濁固体は、細かすぎてろ過できず、そのためフロキュレーションのような別の化学処理で取り除く必要があると思われるからである。
【００６９】
この水に、必要に応じて化学薬品を加えてもよい。典型的には、ポリヘキサメチレンビグアナイド（ＰＨＭＢＡ）の濃度は、殺生物剤の毎日又は毎週用量の添加により、活性成分が０〜１０ｐｐｍの範囲に保たれる。実験の開始時に、過酸化水素を０〜２７．５ｐｐｍの濃度で加える。
【００７０】
二次モデルシステムで、水泳プールの水中で典型的に見出される８種の細菌種及び４種の真菌種を毎日の頻度で投入する。これらの微生物には、ペシロマイセス属及びトリコデルマ属の真菌種、並びにアルカリゲネス属、クリセオバクテリウム属及びスフィンゴモナス属の細菌種を含む。各播種は、モデル装置当たり０．８×１０６個の微生物を全体で加えたことに相当する。
【００７１】
システム中に存在する微生物の栄養源として、ある量（５ｍｌ）の合成水泳者負荷液をシステムに毎日の頻度で加える。水泳者負荷液は、尿素、アルブミン、クレアチニン、乳酸、尿酸、グルクロン酸、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化アンモニウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸カリウムのような、炭素、窒素及び主要／微量栄養源からなる。
【００７２】
システムを不良化するに任せると、濁り水（＞１．０ＮＴＵ）と細菌と真菌の増殖が著しいという結果となる。殺生物処理剤を加え、生存している微生物の減少を測定する。殺生物処理剤の２度目を加えてもよい。生存している細菌と真菌の両方の集団を有意に減少させる殺生物剤又は組合せの能力によって性能を測定する。図１及び２は、ＤＢＮＰＡが酸化剤や界面活性剤よりも有意に良好に機能する状況を示している。
【００７３】
図１及び２は、細菌及び真菌の有意な数を有し、同時に配管や砂にバイオフィルムが定着しているプールの水及び砂に対して、酸化性及び非酸化性の改善処理用化学薬品の有効性を示している。さらにそれらは、ＤＢＮＰＡが、二酸化塩素及びオキソン（モノ過硫酸カリウム）と同様の生存細菌の対数減少、並びに水中における、ＤＤＡＣ及びｎ−タローアルキルトリメチレンジアミンの非酸化性界面活性剤より改善された機能を与えたことを示している。定着したバイオフィルムのために処理がより困難な媒体である砂中の生存細菌の対数減少において、ＤＢＮＰＡの性能は、酸化性、非酸化性の両候補品より優れていると判断した。
【００７４】
（実施例４）
試験プールにおける予防
試験プールを、システム中の細菌と真菌の蓄積に対する消毒剤の効果を評価するために、予防モードで運転した。プールのポンプは１日当たり最低でも８時間運転した。各プールに、週に２回、水泳プールの水中で典型的に見出される８種の細菌及び４種の真菌を投入した。これらの微生物は、ペシロマイセス属及びトリコデルマ属の真菌種、並びにアルカリゲネス属、クリセオバクテリウム属及びスフィンゴモナス属の細菌種を含む。各播種は、試験プール当たり０．８×１０６個の微生物を全体で添加したことに相当する。
【００７５】
システム中に存在する細菌の栄養源として、合成水泳者負荷液をシステムに毎週の頻度で加える。水泳者負荷液は、尿素、アルブミン、クレアチニン、乳酸、尿酸、グルクロン酸、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化アンモニウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸カリウムのような、炭素、窒素及び主要／微量栄養源からなる。
【００７６】
各試験プール中に存在する生存細菌及び真菌の総数を毎週、寒天プレートカウント法を実施して測定した。各試験プールから水試料を取り、この試料を用いて一連の希釈操作（各段１０−１で元の試料の１０−５にまで）を調製する。次いで、希釈液の一定分量を、乾燥したシスチンラクトース電解質欠乏寒天プレート（細菌の計数用）、及びサブローブドウ糖乾燥寒天プレート（真菌の計数用）の上に広げる。細菌と真菌のプレートは、生存生物数の計数に先立ち、３０℃でそれぞれ３日と５日インキュベートする。
【００７７】
対照プールに、試験の開始時に、過酸化水素２７．５ｐｐｍ及び活性ＰＨＭＢ  ３ｐｐｍ（消毒剤製品として１５ｐｐｍ）の単回用量を加えた。ＰＨＭＢのみを、毎週、単回用量の添加で２〜４ｐｐｍの活性（消毒剤として１０〜１５ｐｐｍ）に保った。
【００７８】
最初の１３５日の試験期間の間、試験プールに、活性ＰＨＭＢの初回用量３ｐｐｍ、及び０．５、１．０、及び２．０ｐｐｍの活性ＤＢＮＰＡの毎日用量を加えた。ＰＨＭＢは、毎週、単回用量を加えることで２〜４ｐｐｍ（消毒剤として１０〜１５ｐｐｍ）の活性に保たれた。土曜日と日曜日には、化学薬品の投与を行わなかった。
【００７９】
１３６日目に、試験プールのすべてにおいて１０ｐｐｍの活性ＰＨＭＢ（消毒剤として５０ｐｐｍ）にＰＨＭＢの補充を行い、毎週、単回用量を加えることで６〜１０ｐｐｍの活性ＰＨＭＢを保った。
【００８０】
また、プール６は、日量で約０．３ｐｐｍの活性ＤＢＮＰＡを送達する２週毎の錠剤添加と、過酸化水素の初期用量２７．５ｐｐｍ並びに毎週用量約７ｐｐｍに切り換えた。
【００８１】
対照及び試験プールに対する、水中微生物の平均カウント数及びカウント百分率のデータを下の表５に挙げる。
表５．水中微生物の平均カウント数及びカウント百分率のデータ
【表５】
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【００８２】
かびと細菌の平均カウント数並びに０（＜１０ｃｆｕ／ｍｌ）及び＞９９９ｃｆｕ／ｍｌ（良好な抑制を維持していない処理を示す）のカウント頻度に関する、試験プールに対する対照プールの比較により、下記のことが示される。
Ａ．ＤＢＮＰＡで処理されたプールはすべて、対照に対して２〜４ｌｏｇの有意な改善機能を示した。
Ｂ．低ＰＨＭＢであったプール２では他のＤＢＮＰＡのプールに比較してかびの抑制が困難であった。これはプール２の場所の問題による可能性がある。なぜなら、豪雨の後で大量の土が観察されたからであり、このようなことは他のプールでは見られなかった。かびが土と共に入った可能性があり、このため投入量が増加した。
Ｃ．ＰＨＭＢを推奨範囲に増加した場合、ＤＢＮＰＡ処理のすべてのプールにおいて、かびと細菌の平均カウント数は有意に減少し、ＰＨＭＢとＤＢＮＰＡの間の相乗作用が示された。より高いＰＨＭＢにＤＢＮＰＡを加えた処理におけるかびの平均カウント数はすべて、対照プールに対して３ｌｏｇから１桁、より低い濃度のＰＨＭＢにＤＢＮＰＡを加えた処理のプールに対して、１〜２ｌｏｇ低下している。
【００８３】
（実施例５）
対照プールにおける改善
循環システムとろ過システム中に、細菌、真菌及びおそらくは混合バイオフィルムの蓄積を促進するように、対照プールを消毒剤の適正濃度未満で運転した。プールのポンプは１日当たり最低でも８時間運転した。各プールに、週に２回、水泳プールの水中で典型的に見出される８種の細菌及び４種の真菌を投入した。これらの微生物は、ペシロマイセス属及びトリコデルマ属の真菌種、並びにアルカリゲネス属、クリセオバクテリウム属及びスフィンゴモナス属の細菌種を含む。各播種は、試験プール当たり０．８×１０６個の微生物を全体で加えたことに相当する。
【００８４】
システム中に存在する細菌の栄養源として、合成水泳者負荷液をシステムに毎週の頻度で加える。水泳者負荷液は、尿素、アルブミン、クレアチニン、乳酸、尿酸、グルクロン酸、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化アンモニウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸カリウムのような、炭素、窒素及び、主要／微量栄養源からなる。
【００８５】
各試験プール中に存在する生存細菌及び真菌の総数を毎週、寒天プレートカウント法を実施して測定した。各試験プールから水試料を取り、この試料を用いて一連の希釈操作（各段１０−１で元の試料の１０−５にまで）を調製する。次いで、希釈液の一定分量を、乾燥したシスチンラクトース電解質欠乏寒天プレート（細菌の計数用）、及びサブローブドウ糖乾燥寒天プレート（真菌の計数用）の上に広げる。細菌と真菌のプレートは、生存生物数の計数に先立ち、３０℃でそれぞれ３日と５日インキュベートする。
【００８６】
対照プールに、試験の開始時に、過酸化水素２７．５ｐｐｍと３ｐｐｍの活性ＰＨＭＢ（消毒剤製品として１５ｐｐｍ）の単回用量を加えた。ＰＨＭＢのみを、毎週、単回用量を加えることで２〜４ｐｐｍの活性（消毒剤として１０〜１５ｐｐｍ）に保った。
【００８７】
対照プールは、濁度が１．０ＮＴＵを超え、バイオフィルムがスキマー及び／又はプール表面に見えたときに、下記に列挙した改善処理を用いて改善した。
１．バイオフィルムのある表面をブラシで掃き、
２．６ｐｐｍの活性ＤＢＮＰＡ並びに０．５ｐｐｍ及び約２ｐｐｍの塩化ポリアルミニウムを添加し、
３．水を循環し、ポンプを止めて濁りを鎮め、
４．フロックが落ち着いた後、プールを排水した。
２つの処理についての抗微生物性と水質に関する結果を図３と４に例示してある。
【００８８】
図３と４は、両プールにおける改善処理が、水中の細菌カウント数の直後の４ｌｏｇ減少、及び真菌カウント数の３ｌｏｇ減少を起こしたことを示している。水の透過度はその後まもなく回復した。このデータは、ＰＨＭＢのみの使用では抑制が困難な厄介な生物を抑制できることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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