(57)【要約】  治療核酸の標的細胞への送達のための方法および組成物が提供される。核酸分子を封入、結合、もしくは標的細胞に運搬するためのキメラ抗原が提供され、標的細胞において、該キメラ抗原および核酸は、例えば、受容体仲介エンドサイトーシスにより内在化される。キメラ抗原は、核酸相互作用ドメイン、標的結合ドメイン、および標的抗原を含み得る免疫応答ドメインを有する。標的化は、一般に、特定の標的細胞受容体のための標的結合ドメインの特異性により提供されるが、また、免疫応答ドメイン内に標的化抗原を包含することにより提供され得る。キメラ抗原および核酸(siRNAであり得る)の組み合わせ送達は、特定の適用において、例えば、ウイルスに対する宿主免疫寛容を破壊すること、または免疫刺激を提供することにおいて相乗作用を示し得る。
2010536392.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞内の標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、
標的遺伝子のRNAiを生じさせるのに適当な核酸分子を提供し;
HBVコアタンパク質もしくはその断片に相当するアミノ酸配列を含む核酸結合ドメインおよび標的細胞上の受容体に結合するためのリガンドを含む標的結合ドメインを含む、キメラ抗原を提供し; そして
核酸分子およびキメラ抗原を標的細胞に投与する
工程を含む、方法。
【請求項２】
核酸分子およびキメラ抗原を標的細胞に投与する工程が、核酸分子を適当な量のキメラ抗原と混合して核酸送達複合体を形成させ、その後、核酸送達複合体を標的細胞に投与することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
HBVコアタンパク質断片が、HBVコアタンパク質の集合ドメインである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
HBVコアタンパク質断片が、HBVコアタンパク質のプロタミン様ドメインである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
核酸結合ドメインが、標的結合ドメインのN末端に操作可能に結合している、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
核酸結合ドメインが、標的結合ドメインのC末端に操作可能に結合している、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
標的細胞が哺乳類宿主細胞であり、核酸分子およびキメラ抗原を標的細胞に投与する工程が、該核酸分子およびキメラ抗原を哺乳類宿主に投与することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
標的結合ドメインが異種抗体断片を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
標的抗原に対する免疫応答を誘発させるための方法であって、
標的遺伝子のRNAiを生じさせるのに適当な核酸分子を提供し;
HBVコアタンパク質もしくはその断片に相当するアミノ酸配列を含む核酸結合ドメイン、抗原提示細胞上の受容体に結合するためのリガンドを含む標的結合ドメインおよび標的抗原を含む免疫応答ドメインを含む、キメラ抗原を提供し; そして
核酸分子およびキメラ抗原を標的細胞に投与する
工程を含む、方法。
【請求項１０】
核酸分子およびキメラ抗原を標的細胞に投与する工程が、最初に、核酸分子を適当な量のキメラ抗原と混合して核酸送達複合体を形成させ、その後、核酸送達複合体を標的細胞に投与することを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
HBVコアタンパク質断片が、HBVコアタンパク質の集合ドメインである、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
HBVコアタンパク質断片が、HBVコアタンパク質のプロタミン様ドメインである、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
核酸結合ドメインが、標的結合ドメインのN末端に操作可能に結合している、請求項9に記載の方法。
【請求項１４】
核酸結合ドメインが、標的結合ドメインのC末端に操作可能に結合している、請求項9に記載の方法。
【請求項１５】
標的結合ドメインが異種抗体断片を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１６】
標的遺伝子が免疫モジュレーター遺伝子である、請求項9に記載の方法。
【請求項１７】
標的抗原がウイルス抗原である、請求項9に記載の方法。
【請求項１８】
標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項9に記載の方法。
【請求項１９】
標的抗原が癌抗原である、請求項9に記載の方法。
【請求項２０】
標的細胞内の標的遺伝子の発現を抑制することにおける使用のための組成物であって、
標的遺伝子に対応する核酸配列; および
HBVコアタンパク質もしくはその断片に相当する核酸相互作用ドメインおよび核酸相互作用ドメインに操作可能に結合した標的結合ドメイン(ここで、該標的結合ドメインは、標的細胞表面上の受容体に結合するためのリガンドを含む)を含む、キメラ抗原
を含む、組成物。
【請求項２１】
標的遺伝子が免疫モジュレーター遺伝子である、請求項20に記載の組成物。
【請求項２２】
標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項20に記載の組成物。
【請求項２３】
標的結合ドメインが異種Fc断片である、請求項20に記載の組成物。
【請求項２４】
核酸配列が標的遺伝子の発現を阻害するためのsiRNAである、請求項20に記載の組成物。
【請求項２５】
核酸配列が標的遺伝子の発現を阻害するためのshRNAを含む、請求項20に記載の組成物。
【請求項２６】
核酸配列が標的遺伝子の発現を阻害するためのアンチセンスDNA配列を含む、請求項20に記載の組成物。
【請求項２７】
核酸配列がプラスミドである、請求項20に記載の組成物。
【請求項２８】
HBVコアタンパク質断片が、HBVコアタンパク質の集合ドメインである、請求項20に記載の組成物。
【請求項２９】
HBVコアタンパク質断片が、HBVコアタンパク質のプロタミンドメインである、請求項20に記載の組成物。
【請求項３０】
リガンドの受容体への結合が、キメラ抗原および核酸の内在化を開始する、請求項20に記載の組成物。
【請求項３１】
標的細胞への核酸送達における使用のためのキメラ抗原であって、
HBVコアタンパク質もしくはその断片に相当する核酸相互作用ドメイン; および
核酸相互作用ドメインに操作可能に結合した標的結合ドメイン(ここで、該標的結合ドメインは、標的細胞表面上の受容体に結合するためのリガンドを含む)
を含む、キメラ抗原。
【請求項３２】
HBVコアタンパク質断片が、HBVコアタンパク質のプロタミンドメインである、請求項31に記載のキメラ抗原。
【請求項３３】
HBVコアタンパク質断片が、HBVコアタンパク質の集合ドメインである、請求項31に記載のキメラ抗原。
【請求項３４】
核酸相互作用ドメインが、標的結合ドメインのC末端に結合している、請求項31に記載のキメラ抗原。
【請求項３５】
さらに、標的結合ドメインに操作可能に結合した第2核酸相互作用ドメインを含み、該第2核酸相互作用ドメインが、HBVコアタンパク質もしくはその断片に相当する、請求項31に記載のキメラ抗原。
【請求項３６】
さらに、核酸相互作用ドメインに操作可能に結合した免疫応答ドメインを含み、該免疫応答ドメインが、抗原性アミノ酸配列を含む、請求項31に記載のキメラ抗原。
【請求項３７】
さらに、標的結合ドメインに操作可能に結合した免疫応答ドメインを含み、該免疫応答ドメインが、抗原性アミノ酸配列を含む、請求項31に記載のキメラ抗原。
【請求項３８】
免疫応答ドメインが、二次的な標的細胞への標的化を提供する、請求項36に記載のキメラ抗原。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の送達における使用のための組成物に関する。より特には、核酸を封入、結合、もしくは標的細胞に運搬および送達するためのキメラ抗原が提供される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
最近の核酸治療の同定および改良の発展にも関わらず、さまざまな適用におけるこれらの分子のための適当な送達手段を発見することは、困難であり続けている。さらに、核酸治療を関心のある組織/細胞に局在化させるか、もしくは標的化させることにより、これらの高価な分子の投与量を最小限にすることが望まれているが、研究されている多くの技術において、有望な結果はほとんど得られていない。
【０００３】
RNAi [Fire A., et al (1998) Nature 391:801-11]は、サイレンシングのために標的化される遺伝子に相同な低分子干渉RNA(siRNA)により仲介される、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのための手段として現れてきている。しかしながら、薬剤として有効に使用されるために、siRNA(またはそれらの巨大RNA前駆体)は、標的細胞に直接送達されなければならない。関心のある特定の細胞へのsiRNAの標的化送達は、RNAi技術によるインビボ遺伝子サイレンシングを達成するための主な障害である。特異的送達、用量低減、および毒性の最小化はすべて、当分野において満たされていない重要な課題である。
【０００４】
潜在的な標的化siRNA送達系、例えば、抗体仲介送達およびリポソーム送達が現れてきている。抗体仲介siRNA送達は、標的細胞へのsiRNAの選択的蓄積を可能にし得て(正常組織においてより低い蓄積を有する)、そのようなリガンドをさらにリポソームのような送達剤と結合させて、受容体仲介エンドサイトーシスによる標的細胞への取り込みを促進し得ることが示めされている。
【０００５】
特定の標的細胞へのsiRNAのインビボ送達のためのさらなる潜在的な方法は、プロタミンの核酸結合特性を抗体仲介送達の特異性と組み合わせて使用する。抗体断片-プロタミン融合タンパク質と結合させたsiRNAの注入を使用して、該抗体により認識される細胞表面受容体を発現する標的細胞にsiRNAを選択的に送達させた[Dykxhoorn, D.M., et al (2006) Gene Therapy 13-541-552; Song E. et al (2005) Nature Biotech. 23(6):709-717を参照]。
【０００６】
特定の細胞型もしくは標的化器官は、一般に、送達される治療剤の型に応じて変わる。例えば、樹状細胞は、これらの有力な抗原提示細胞が独自に免疫を誘導し、癌抗原に対する免疫寛容を破壊することができるので、癌免疫療法適用における最重要点であり得る。RNAiは、樹状細胞での遺伝子発現を標的化することにより、免疫調節のために使用され得ることが示されている[Hill, J.A., et al (2003) J. Immunol. 171:691-696]。
【０００７】
SOCS-1は、樹状細胞の寛容原性および免疫原性状態、ならびに抗原提示の程度(すなわち、適応免疫の大きさ)を制御することが示されている[Yoshimura, A., et al (2007) Nature Rev. Immunol. 7:454-465を参照]。siRNAによるSOCS-1のサイレンシングは、樹状細胞による抗原提示および抗原特異的抗腫瘍免疫を促進し、宿主の免疫寛容を破壊し、抗原特異的抗腫瘍および抗ウイルス免疫を促進し、樹状細胞に基づく癌ワクチンの効率を高める選択的手段を提供し得る。樹状細胞でのSOCS-1のサイレンシングは、内因性刺激に対する細胞応答の閾値を低下させ、インビボで抗原特異的T細胞の持続的活性化を可能にし、T細胞の抗癌活性を促進し得る。
【０００８】
エクスビボ試験において、樹状細胞は、SOCS-1が癌抗原でのワクチン接種前に樹状細胞で抑制されると、抗原特異的抗腫瘍免疫が高められることを示した[Shen, T. (2004) Nature Biotech 22(12): 1546-1553]。マウスでのインビボ試験において、SOCS-1のサイレンシングは、抗-HIV-1 CD8+およびCD4+ T細胞応答ならびに抗体応答を誘導した[Song, X-T. et al (2006) PLoS Med 3:1-18]。
【０００９】
ウイルス疾患の処置におけるsiRNAの使用がまた示されている。特に、慢性的なウイルス疾患の兆候は、宿主免疫系の回避に依存している。ウイルス遺伝子発現は、感染宿主へのウイルス特異的siRNAの投与により抑制され得ることが推測されている。
【００１０】
ウイルスもしくは寄生虫感染(ここで、生命体は、その生活環の間、いくつかの時点で、宿主細胞内に住み着く)を有する対象において、抗原は、宿主細胞内で産生され、発現し、分泌された抗原は、血液循環中に存在する。例えば、慢性ヒトB型肝炎ウイルス(HBV)感染キャリアの場合には、ビリオン、HBV表面抗原、およびコア抗原のサロゲート(e抗原の形態である)が血中に検出され得るが、明らかに宿主免疫系に寛容である。
【００１１】
同様に、癌において、腫瘍が免疫監視および攻撃から回避することは、宿主内での腫瘍生存のための主な決定要因である。感染性疾患もしくは癌に対する免疫応答を誘発するか、もしくは促進するか、または感染性疾患もしくは癌に対する免疫寛容を破壊するための新規の治療上有効な化合物、組成物および方法についての必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１２】
要約
最初の局面において、本発明は、標的細胞内の標的遺伝子の発現を阻害する方法を提供し、該方法は、標的遺伝子のRNAiを生じさせるのに適当な核酸分子を提供し; HBVコアタンパク質もしくはその断片に相当するアミノ酸配列を含む核酸結合ドメインおよび標的細胞上の受容体に結合するためのリガンドを含む標的結合ドメインを含む、キメラ抗原を提供し; そして核酸分子およびキメラ抗原を標的細胞に投与する工程を含む。
【００１３】
1つの態様において、核酸分子およびキメラ抗原を標的細胞に投与する工程は、核酸分子を適当な量のキメラ抗原と混合して核酸送達複合体を形成させ、その後、核酸送達複合体を標的細胞に投与することを含む。
【００１４】
さまざまな態様において、HBVコアタンパク質断片は、HBVコアタンパク質の集合ドメイン、HBVコアタンパク質のプロタミンドメイン、または他の適当なHBVコアタンパク質断片であり得る。
【００１５】
ある態様において、核酸結合ドメインは、標的結合ドメインのN末端もしくはC末端に操作可能に結合し得る。
【００１６】
ある態様において、標的細胞は、哺乳類宿主細胞であり、核酸分子およびキメラ抗原を標的細胞に投与する工程が、該核酸分子およびキメラ抗原を哺乳類宿主に投与することを含む。そのような態様において、標的結合ドメインは、異種抗体断片を含み得る。
【００１７】
第2の局面において、本発明は、標的抗原に対する免疫応答を誘発させるための方法を提供し、該方法は、標的遺伝子のRNAiを生じさせるのに適当な核酸分子を提供し; HBVコアタンパク質もしくはその断片に相当するアミノ酸配列を含む核酸結合ドメイン、標的細胞上の受容体に結合するためのリガンドを含む標的結合ドメインおよび標的抗原を含む免疫応答ドメインを含む、キメラ抗原を提供し; そして核酸分子およびキメラ抗原を標的細胞に投与する工程を含む。
【００１８】
1つの態様において、核酸分子およびキメラ抗原を標的細胞に投与する工程は、最初に、核酸分子を適当な量のキメラ抗原と混合して核酸送達複合体を形成させ、その後、核酸送達複合体を標的細胞に投与することを含む。
【００１９】
さまざまな態様において、HBVコアタンパク質断片は、HBVコアタンパク質の集合ドメイン、HBVコアタンパク質のプロタミンドメイン、または他の適当なHBVコアタンパク質断片であり得る。
【００２０】
ある態様において、核酸結合ドメインは、標的結合ドメインのN末端もしくはC末端に操作可能に結合し得る。
【００２１】
ある態様において、標的結合ドメインは、異種抗体断片を含む。
【００２２】
特定の態様において、標的遺伝子は、免疫モジュレーター遺伝子またはウイルス遺伝子であり、標的抗原は、癌抗原、ウイルス抗原、または他の任意の適当な抗原であり得る。
【００２３】
他の局面において、本発明は、標的細胞内の標的遺伝子の発現を抑制することにおける使用のための組成物を提供し、該組成物は、標的遺伝子に対応する核酸配列; およびHBVコアタンパク質もしくはその断片に相当する核酸相互作用ドメインおよび核酸相互作用ドメインに操作可能に結合した標的結合ドメイン(ここで、該標的結合ドメインは、標的細胞表面上の受容体に結合するためのリガンドを含む)を含む、キメラ抗原を含む。
【００２４】
ある態様において、標的遺伝子は、免疫モジュレーター遺伝子またはウイルス遺伝子であり得る。
【００２５】
ある態様において、標的結合ドメインは、異種Fc断片を含む。
【００２６】
さまざまな態様において、核酸配列は、標的遺伝子の発現を阻害するためのsiRNA、shRNA、アンチセンスDNAもしくはプラスミドである。
【００２７】
適当な態様において、HBVコアタンパク質断片は、HBVコアタンパク質の集合ドメイン、プロタミンドメイン、または他の断片であり得る。
【００２８】
ある態様において、リガンドの受容体への結合は、例えば、受容体仲介エンドサイトーシスにより、キメラ抗原および核酸の内在化を開始する。
【００２９】
さらなる局面において、本発明は、標的細胞への核酸送達における使用のためのキメラ抗原を提供し、該キメラ抗原は、HBVコアタンパク質もしくはその断片に相当する核酸相互作用ドメイン; および核酸相互作用ドメインに操作可能に結合した標的結合ドメイン(ここで、該標的結合ドメインは、標的細胞表面上の受容体に結合するためのリガンドを含む)を含む。
【００３０】
適当な態様において、HBVコアタンパク質断片は、HBVコアタンパク質のプロタミンドメインまたはHBVコアタンパク質の集合ドメインである。
【００３１】
ある態様において、核酸相互作用ドメインは、標的結合ドメインのC末端に結合している。
【００３２】
ある態様において、キメラ抗原はさらに、標的結合ドメインに操作可能に結合した第2核酸相互作用ドメインを含み、該第2核酸相互作用ドメインは、HBVコアタンパク質もしくはその断片に相当する。
【００３３】
さらなる態様において、キメラ抗原はさらに、核酸相互作用ドメインまたは標的結合ドメインに操作可能に結合した、抗原性アミノ酸配列を含む免疫応答ドメインを含む。免疫応答ドメインは、二次的な標的細胞への標的化を提供し得る。
【００３４】
本発明の他の局面および特徴は、添付の図面と共に、本発明の特定の態様についての下記の記載を参照することにより、当業者に明らかになるであろう。
【００３５】
図面の簡単な説明
本発明の態様は、添付の図面に関して、例示としてのみ本明細書に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図1は、キメラ抗原の概略図である。
【図２】図2aは、HBVコアタンパク質の概略図である。
【図３】図2bは、HBVコアタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図４】図3a-cは、HBVコアのプロタミンドメインがNAIDを提供する、3個のキメラ抗原を示す概略図である。
【図５】図3dは、図3cで示されるキメラ抗原のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図６】図3dは、図3cで示されるキメラ抗原のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図７】図4aは、HBVコアタンパク質配列が免疫応答ドメイン内に含まれ、NAIDを提供するキメラ抗原の概略図を示す。
【図８】図4bは、図4aで示されるキメラ抗原のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図９】図4bは、図4aで示されるキメラ抗原のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図１０】図5は、核酸分子についてのキメラ抗原凝集の概略図である。
【図１１】図6a-cは、キメラ抗原粒子の写真である。図6dは、粒子の平均サイズを示す図式である。
【図１２】図7a-cは、キメラ抗原粒子の写真である。図7dは、粒子の平均サイズを示す図式である。
【図１３】図8aは、試験で使用されるGFPベクタープラスミドの構造を示す。図8bは、DNase消化結果の写真であり、DNAは、キメラ抗原ワクチンとの複合体の形成により、分解から保護される。
【図１４】図9は、キメラ抗原ワクチンの樹状細胞への結合を示す。
【図１５】図10は、キメラ抗原ワクチンのHepG2細胞への結合を示す。
【図１６】図11は、封入されたshRNAを有するChimigen(登録商標)S1/S2コアワクチンの樹状細胞への結合を示す。
【図１７】図11bは、封入されたsiRNAを有するChimigen(登録商標)S1/S2コアワクチンの樹状細胞への結合を示す。
【図１８】図12aおよびbは、封入shRNAプラスミド(SOCS1もしくは非標的化)を有するChimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンでの1回または2回の刺激後のIFN-γの産生を示す。
【図１９】図13a-dは、封入shRNAプラスミド(SOCS1もしくは非標的化)を有するChimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンでの刺激後のCD8+およびCD4+T細胞におけるIFN-γおよびTNF-αの産生を示す。
【図２０】図14は、キメラ抗原処理後のT細胞増殖を示す。
【図２１】図15は、キメラ抗原処理後の樹状細胞におけるCD86発現を示す。
【図２２】図16は、キメラ抗原処理後のT細胞培養物におけるIFN-γの産生を示す。
【図２３】図17は、キメラ抗原での2回目の処理後のCD8+およびCD4+T細胞におけるIFN-γおよびTNF-αの産生を示す。
【図２４】図18は、キメラ抗原処理後のT細胞増殖を示す。
【図２５】図19は、CD86siRNAを有するか、もしくは有さないキメラ抗原での処理後のCD86発現を示す。
【図２６】図20は、Chimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンおよびsiRNA複合体の樹状細胞への結合を示す。
【図２７】図21は、Chimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンおよびCD86 siRNA複合体で処理した後の樹状細胞蛍光(内在化)を示す。
【図２８】図22は、Chimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンによるsiRNAのbenzonase処理からの保護を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
詳細な説明
一般に、図面を参照して、本発明は、標的細胞への核酸の送達における使用のためのキメラ抗原組成物を提供する。該組成物は、核酸相互作用ドメイン(NAID)を含み、核酸を封入、結合もしくは運搬するために使用され得る。該組成物は、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞に直接送達することが可能であるので、特に、免疫治療剤の送達において有用であり得る。他の細胞型、例えば血球に対する標的化も可能である。
【００３８】
Chimigen(登録商標)ワクチン
出願人は、以前、例えば、US 2004/0001853; US 2005/0013828; PCT/CA2004/001469; およびUS2005/0031628(George et al)において、キメラ抗原および該抗原の製造法を開示している(それらの全体は引用により本明細書の一部とする)。これらの先行特許出願は、抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)を標的化および活性化し、細胞性および/または体液性免疫応答を誘導すること、ならびに慢性および/またはウイルス感染に対する宿主免疫寛容を破壊することにおける使用のためのキメラ抗原を開示している。また、関心のある抗原を異種抗体断片と結合させ、免疫原性を改善し、免疫応答を高めるキメラ抗原を開示している。B型肝炎ウイルス(HBV)およびC型肝炎ウイルス(HCV)タンパク質を含むキメラ抗原がまた、開示されている。
【００３９】
図1に関して、以前に開示されたキメラ抗原構造(Chimigen(登録商標)分子として既知である)は、抗原および抗体の両方の特性を有し、任意の望まれる抗原または抗原の組み合わせを組み込むことが可能な適応性プラットフォームを提供する。異種抗体断片は、抗原のための標的結合ドメイン20を形成し、異物としてのChimigen(登録商標)分子の認識を可能とし、その結果、より免疫原性が高まる。結果として、Chimigen(登録商標)分子の投与は、宿主内の拡大した免疫反応を生じる。Chimigen(登録商標)分子の抗原部分もしくは免疫応答ドメイン10は、宿主免疫応答が望まれるアミノ酸配列を提供する。したがって、細胞性免疫応答(MHCクラスI)が誘発され、感染細胞、癌細胞、または以前に誤って“自己”と認識されていた関心のある細胞を除去する。体液性免疫応答(MHCクラスII)がまた誘発され、宿主が関心のある抗原に対する抗体を産生するのを可能にする。
【００４０】
さらに、Chimigen(登録商標)分子が昆虫細胞で産生されると、非哺乳類グリコシル化が分子に与えられ、それは、宿主レクチン受容体を介したワクチンの取り込みを促進し、宿主での免疫原性を増加させる。基本的なChimigen(登録商標)分子の構造は、任意の抗原を取り込むことが可能であり、APCもしくは関心のある他の細胞上の複数の特異的受容体を標的化するために使用され得る。
【００４１】
C型肝炎、B型肝炎、西部ウマ脳炎およびインフルエンザに向けられたワクチンを含む、予防的および/または治療的使用のためのさまざまなChimigen(登録商標)ワクチンが、出願人により開示されている。
【００４２】
US 20050013828(引用により本明細書の一部とする)を参照すると、HBVタンパク質をChimigen(登録商標)ワクチンに組み込む方法が開示されている。特に、HBVコアタンパク質は、Chimigen(登録商標)分子の免疫応答部分10中に置かれた。
【００４３】
HBVコアタンパク質
図2aに関して、HBVコアタンパク質30は、一般に、集合ドメイン31(N末端から約143アミノ酸)およびプロタミンドメイン32(約144アミノ酸から約183アミノ酸)を含む。HBVコアタンパク質30の核酸およびアミノ酸配列は、図2bで示される。注目すべきは、集合ドメイン31は、さまざまなコアタンパク質粒子のカプシド型への凝集を可能にし、一方、プロタミンドメイン32は、核酸への結合を可能にする。これらのドメインの上記特性は、当分野において一般に議論されているが、これらの特性は、対応するペプチド/部分がより巨大な分子、例えば、Chimigen(登録商標)分子内に包含されるときでさえ保持されることが本明細書で示される。さらに、これらの特性は、新規送達系を産生するために利用され得る。
【００４４】
再び図1に関して、Chimigen(登録商標)分子は、免疫応答ドメイン10および標的結合ドメイン20を含む。本明細書で記載されているとおり、本明細書におけるキメラ抗原はさらに、核酸相互作用ドメイン(NAID)を含み、それは、核酸の封入、核酸への結合または核酸の誘因および保持のための他の手段を提供する。NAIDは上記免疫応答ドメイン10および標的結合ドメイン20内に、もしくはそれを補助するように内在し得る。特に、NAIDは、Chimigen(登録商標)分子内のHBVコアタンパク質もしくはその断片の包含により提供され得る。したがって、本明細書に記載されたキメラ抗原は、治療核酸を標的細胞に運搬するのに使用され得る。
【００４５】
免疫応答ドメイン
キメラ抗原の免疫応答ドメイン10は、望まれる抗原特性を提供する。一般には、免疫応答ドメインは、1種もしくはそれ以上の抗原もしくは抗原性断片、または1種もしくはそれ以上の組み換え抗原を含む。特に、免疫応答ドメインは、以前に免疫系により“自己”として認識されていた抗原11を含み得る。さらに、免疫ドメインは、免疫が望まれる一連の抗原を含み得る。
【００４６】
免疫応答ドメインは、感染因子、例えば、ウイルスもしくは偏性細胞内粒子の抗原性部分、または癌抗原の抗原性部分を含み得る。感染性ウイルス、偏性細胞内粒子および癌抗原は、公開特許出願PCT/CA2004/001469に記載されたものを含む。キメラ抗原の免疫応答ドメインはさらに、1種もしくはそれ以上の抗原性部分と融合した6xHisタグ12を含み得る。
【００４７】
ある態様において、免疫応答ドメイン内に、標的細胞へのある程度の結合を提供し、送達の特異性を改善し得る抗原を含むことが望まれ得る。例えば、HBV S1/S2は、肝臓由来HepG2細胞に結合し、キメラ抗原を肝細胞に標的化するのに有用であり得る。
【００４８】
標的結合ドメイン
標的結合ドメイン20は、標的細胞に結合するか、またはキメラ抗原を標的細胞に標的化する。一般には、標的結合ドメインは、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞上の受容体への結合を可能にし、次いで、受容体仲介取り込みによるキメラ抗原の抗原提示細胞への取り込みを可能にする抗体断片である。さらに、標的結合ドメインのグリコシル化は、抗原提示細胞を含むさまざまな細胞型上のC型レクチン受容体へのキメラ抗原の受容体特異的結合を促進する。
【００４９】
標的結合ドメイン20は、異種Fc断片から形成され、それは、C末端から免疫応答ドメインまで延長され得て、一般に、宿主により異物と認識され、その結果、キメラ抗原の免疫原性を増加させる。標的結合ドメインは、特定の細胞型上の特定の受容体、例えば、抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)上のFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIII (CD64、32および16)への特異的送達を提供し、抗原性エピトープへの結合、内在化、その加工、およびMHCクラスIおよびMHCクラスII経路を介したTおよびB細胞への提示、ならびに広域な免疫応答の誘発を行い得る。この場合に、最終的に抗原提示細胞により提示されたエピトープは、キメラ抗原の免疫応答ドメイン由来のエピトープであり得る。
【００５０】
キメラ抗原がNAIDを含むとき、キメラ抗原に付随する核酸は同様に、抗原提示細胞内へ内在化され得る。さらに、標的結合ドメインは、望まれる標的細胞型上の特定の受容体との選択的結合を提供するためのリガンドとして設計され得て、その結果、キメラ抗原および付随する核酸の標的細胞内への内在化を生じる。例えば、標的結合ドメインは、樹状細胞もしくは他の抗原提示細胞上のFcγ受容体に結合するように設計され得るか、またはレクチン受容体を標的化するように設計され得る。
【００５１】
適当な態様において、標的結合ドメイン20は、Fc断片21、ヒンジ領域22、およびCH1領域の一部23を含む。キメラ抗原はまた、標的結合ドメイン20を免疫応答ドメイン10と結合するのに適当なペプチドリンカー24を含む。標的結合ドメインは、免疫グロブリン重鎖断片を含み得て、ヒンジ領域を含むものも含まないものも存在し得る。詳細は、例えば、PCT/CA2004/001469に記載されている。
【００５２】
今日までの試験は、異種FcドメインおよびCD86を標的とするsiRNAを含むChimigen(登録商標) Bionanoparticlesが、樹状細胞におけるCD86の下方調節により明らかなとおり、樹状細胞への核酸の送達を可能にし、RNAiを生じさせることができることを示した(下記実施例を参照)。Chimigen(登録商標) Bionanoparticlesは、T細胞で、RNAiおよび免疫調節を生じさせることができる。
【００５３】
核酸相互作用ドメイン(NAID)
核酸相互作用ドメイン(NAID)は、核酸との相互作用を提供する、本明細書に記載されたキメラ抗原の一部であり、核酸を封入、捕捉、もしくはそれとの結合を行うか、または核酸がキメラ抗原により標的細胞に輸送されるのを可能にする(ここで、標的結合ドメインと標的細胞との会合により、キメラ抗原は内在化され得る)。
【００５４】
NAIDは、キメラ抗原構造内、例えば、Chimigen(登録商標)分子内にHBVコアタンパク質配列を組み込むことにより提供され得る。HBVコアタンパク質30の集合ドメイン31に相当する配列が、キメラ抗原の免疫応答ドメイン10内もしくは標的結合ドメイン20内に組み込まれるとき、HBVコアタンパク質の固有の封入能力は、キメラ抗原内に保持され、キメラ抗原分子の凝集を可能にする。HBVコアタンパク質のプロタミンドメイン32がキメラ抗原構造内に組み込まれるとき、HBVコアタンパク質の固有の核酸結合能は、キメラ抗原内に保持される。HBVコアタンパク質30の全体がキメラ抗原内に存在するとき、核酸が結合し、カプシドが核酸の周囲に形成される。集合ドメイン31およびプロタミンドメイン32の各々は、標的細胞への送達のために核酸と相互作用するので、NAIDと呼ばれ得る。特に、プロタミンドメイン32は、核酸に結合し、一方で、集合ドメイン31は、結合した核酸を封入する。
【００５５】
核酸を封入するためのキメラ抗原
HBVコアタンパク質30またはその断片は、Chimigen(登録商標)分子構造の免疫応答内に組み込まれ得て、核酸の凝集を可能にし得る。HBVコア断片がこの目的のためにChimigen(登録商標)分子構造に組み込まれるとき、該断片は、HBVコアの集合ドメイン(約1-143アミノ酸)を含むことが好ましい。プロタミンドメイン(約144-183アミノ酸)がまた、含まれ得る。HBVコア配列または断片は、好ましくは、C末端もしくは免疫応答ドメイン内で、Chimigen(登録商標)分子に挿入される。
【００５６】
さらなる抗原が、HBVコアタンパク質のN末端もしくはC末端に、またはHBVコアタンパク質もしくは断片内の適当な位置に、例えば、HBVコアの79残基(プロリン)および80残基(アラニン)間の抗原決定部位に付加され得る。
【００５７】
同様に、HBVコアまたはその断片は、Chimigen(登録商標)分子の標的結合ドメイン内に組み込まれ得て、また、核酸についてChimigen(登録商標)分子の凝集を可能にし得る。HBVコア断片が、例えば、Chimigen(登録商標)分子のC末端にこの方法で結合するとき、該断片は、少なくとも、集合ドメイン(約1-143アミノ酸)を含むことが好ましい。プロタミンドメイン(約144-183アミノ酸)がまた、含まれ得る。
【００５８】
核酸についてのChimigen(登録商標) HBV Core Bionanoparticlesの凝集は、図5で概略的に示される。
【００５９】
核酸を結合するためのキメラ抗原
HBVコアタンパク質30またはそのプロタミン様断片33は、キメラ抗原構造内に組み込まれ得て、核酸分子への直接的な結合を可能にする。HBVコアプロタミン様断片がこの目的のためにChimigen(登録商標)分子に組み込まれるとき、該断片は、HBVコアのプロタミン様ドメイン(例えば、144-184アミノ酸: ETTVVRRRDRGRSPRRRTP SPRRRRSQSPRRRRSQSR ESQC)の重要な部分を含むことが好ましい。HBVコアまたはプロタミン様断片は、好ましくは、キメラ抗原の免疫応答ドメイン内に、またはC末端に含まれる。
【００６０】
図3a-cに関して、概略図は、3個の融合タンパク質を示し、各々は、該融合タンパク質のさまざまな位置にHBVコアプロタミン様ドメインを組み込み、HBV NS5Aタンパク質は、免疫応答ドメイン10に位置している。図3cに関して、プロタミン様断片33は、C末端からCH3ドメインまで延長される。このChimigen(登録商標)ワクチンは、図3dで示された核酸配列を用いて、プラスミドpFastBacHTA-gp64で産生され得る。生じたChimigen(登録商標)は、そのC末端で核酸に結合し、核酸を抗原提示細胞に送達するために使用され得る。
【００６１】
この特定の融合タンパク質は、実際に核酸に結合することができるが、予備データは、このC末端プロタミンテールおよび核酸結合部位が標的細胞受容体とキメラ抗原Fc部分との相互作用を妨げ得ることを示す。
【００６２】
キメラ抗原の核酸の導入
望まれるキメラ抗原は、最初に融合タンパク質として産生され得て、例えば、バキュロウイルス系を用いて昆虫細胞で発現させ得る。核酸は、別々に合成され、キメラ抗原と混合され、キメラ抗原/核酸複合体を形成する。
【００６３】
キメラ抗原が核酸を封入することが意図されるとき、精製した融合タンパク質が産生され、核酸が変性条件下で加えられる。次いで、変性剤が透析またはゲルろ過により除去され、キメラ抗原が復元され、Chimigen(登録商標)分子/核酸複合体を形成する。複合体は、十分に安定的であり、その結果、標的結合ドメインは、標的細胞上の受容体に結合し、核酸、例えば、siRNAは、細胞質に送達される。次いで、キメラ抗原は、抗原提示経路を介して加工され、一方で、siRNAは、細胞質内でRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)と相互作用し、その結果、siRNAと標的mRNAのアニーリングおよびmRNA分解による遺伝子発現の抑制を生じる。
【００６４】
キメラ抗原がC末端プロタミンテールを含むとき、核酸は、単に製造され、精製キメラ抗原に付加され得る。
【００６５】
核酸
Chimigen(登録商標)分子は、標的細胞に結合し、内在化されるように設計され、関連する(封入された、または結合した)核酸分子を標的細胞の細胞質に運搬する。したがって、送達される核酸に基づいて、適当な標的細胞型が選択され、標的結合ドメインが標的細胞上の特定の受容体に結合するように設計される。多くの場合に、関心のある標的細胞に特異的であり、適当な標的結合ドメインが特異的に結合し得る標的受容体を選択することが望ましい。そのような設計における配慮は、必要とされるキメラ抗原および核酸の量を最小限にし、有効性を改善し、また非特異的オフターゲット効果を最小化し得る。キメラ抗原分子の特定の細胞型への標的化はまた、免疫応答ドメインの特定の設計により達成され得ることに注目すべきである。例えば、HBV S1/S2タンパク質が免疫応答ドメイン内の抗原として使用されるとき、肝細胞への標的化が観察される。
【００６６】
望まれるNAIDでの使用のための核酸は、siRNA、dsRNA、shRNA、およびプラスミド、例えば、shRNAをコードするプラスミド(それは、インサイチュで、望まれるsiRNA配列を形成する)を含む。今日までに、5.3 kbまでのプラスミドDNA配列がChimigen(登録商標)分子に封入されている。
【００６７】
特許US 7,078, 196 B2およびUS 7,056,704 B2には、RNAiのための材料および方法が記載されている(それらは、引用により本明細書の一部とする)。特許US7,056,704 B2は、哺乳類細胞でのsiRNA仲介遺伝子サイレンシングを証明する。特許US7,056,704 B2にはまた、効率的なサイレンシングのためのsiRNAの好ましい構造; RNAiでの使用のためにdsRNAを製造する方法; および細胞または生物内で、標的特異的核酸修飾、特に、RNAiおよび/またはDNAメチル化を仲介する方法が記載されている。
【００６８】
RNAiは、樹状細胞での遺伝子発現を標的化することにより、免疫調節のために使用され得る[Hill, J.A., et al (2003) J. Immunol. 171:691-696]。siRNAによるSOCS-1のサイレンシングはまた、樹状細胞による抗原提示および抗原特異的抗腫瘍免疫を促進することが示された。エクスビボ試験において、樹状細胞は、癌抗原でのワクチン接種前にSOCS-1が樹状細胞で抑制されるとき、抗原特異的抗腫瘍免疫を促進することを示した[Shen, T. (2004) Nature Biotech 22(12): 1546-1553]。マウスでのインビボ試験において、SOCS-1のサイレンシングは、高められたHIV-1 CD8+およびCD4+ T細胞応答ならびに抗体応答を誘導した[Song, X-T. et al (2006) PLoS Med 3:1-18]。
【００６９】
SOCS-1発現を抑制するための核酸分子は、実施例の節に記載されたとおり、本明細書に記載されたChimigen(登録商標)分子を用いて送達された。多くの他の標的遺伝子が本明細書に記載されたキメラ抗原を用いて送達されるために適当であり得て、それは、本明細書の記載および当分野における技術常識に基づいて、当業者に明らかである。
【００７０】
キメラ抗原および核酸を用いる方法
上記したとおり、核酸相互作用ドメインを組み込んだキメラ抗原が、核酸と共に、細胞、組織、標的、または宿主に投与され得る。そのような共投与されるキメラ抗原および核酸は、抗原に対する宿主免疫寛容を破壊するか、免疫応答を促進するか、または抗原提示細胞または関心のある他の細胞型において、他の望まれる効果を産生するために使用され得る。また、核酸相互作用ドメインなしのキメラ抗原組成物は、核酸と共に単に共投与され得ることが意図される。これは、ある程度の有効性を提供し得るが、キメラ抗原および核酸が同じ細胞もしくは細胞群に同時に提供されるとき、核酸とNAIDを組み込んだキメラ抗原の共投与は、より特異的かつ望まれる効果を提供し得る。
【００７１】
キメラ抗原(それは、Chimigen(登録商標)分子であり得る)は、慢性感染の間、以前に“自己”と認識されており、その後、“異物”として認識されるようになった標的抗原に対する細胞性および/または体液性免疫応答の産生を可能にする。したがって、宿主の免疫系は、細胞毒性Tリンパ球応答を開始し、標的抗原感染細胞を除去する。同時に、投与された抗原に対する応答で、宿主により産生された抗体は、標的抗原もしくは感染因子に結合し、それを血液循環から除去するか、または標的抗原もしくは感染因子の宿主細胞への結合を妨害する。したがって、特定の遺伝子に対するsiRNAを伴うキメラ抗原の投与は、宿主免疫系により認識されないか、または免疫寛容である慢性感染を有する宿主において、広範な免疫応答を誘導し得る。そのような投与は、感染因子に慢性的に感染しているか、または癌もしくは他の免疫障害を患っている宿主において、標的抗原に対する免疫寛容を破壊するために使用され得る。例えば、siRNAがウイルス遺伝子産物を抑制するように設計されると、そのような処置は、RNAiを介してウイルス血症を減少させ得て、感染を除去するのを助けることができる。これはまた、Chimigen(登録商標)ワクチンの投与により産生された免疫応答により、補助され得る。
【００７２】
Chimigen(登録商標)分子は、免疫応答を誘発するか、もしくは促進するのに有用であるが、siRNAはさらに、特定の宿主遺伝子を抑制する。例えば、siRNAはさらに、標的遺伝子、例えば、サイトカインシグナル伝達の阻害剤をコードする遺伝子の発現を抑制することにより、例えば、SOCS遺伝子発現を抑制し、サイトカインシグナル伝達のSOCS仲介阻害を減少させることにより、Chimigen(登録商標)分子に対する免疫応答を促進し得る。
【００７３】
キメラ抗原および核酸は、リポソーム内に一緒に封入され得る。すなわち、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフィア、もしくはナノ粒子などに封入されるか、もしくはそれらと結合した送達のために製剤化され得る。あるいは、本発明の組成物は、そのような担体ベシクルの表面に、共有的もしくは非共有的に結合され得る。
【００７４】
キメラ抗原および核酸は、インビボもしくはエクスビボで、抗原提示細胞を活性化するか、または抗原提示細胞(APC)における抗原提示を促進するために使用され得る。キメラ抗原および核酸と接触した抗原提示細胞は、APCによるキメラ抗原の結合および内在化を生じ、APCを活性化し、2種以上のエピトープの抗原提示を促進する。この多重エピトープ応答は、1種もしくはそれ以上の免疫応答ドメインのエピトープおよび/または1種もしくはそれ以上の標的結合ドメインのエピトープの提示を含み得る。
【００７５】
免疫処置可能な状態(immune-treatable conditions)は、治療上有効量のキメラ抗原およびsiRNAをそれを必要とする対象に共投与することにより処置され得る。免疫処置可能な状態の例は、ウイルス感染、例えば、HBVもしくはHCV; 寄生性感染; および癌を含む。HBVの処置について、Chimigen(登録商標)分子の免疫応答ドメインへの組み込みのために適当な抗原は、HBVコアタンパク質、HBV Sタンパク質、HBV S1タンパク質、HBV S2タンパク質、HBVポリメラーゼタンパク質、HBV Xタンパク質、および/またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の少なくとも1種の抗原性部分を含み得る。HCVの処置について、免疫応答ドメインは、HCVコアタンパク質、Elタンパク質、E2タンパク質、NS2タンパク質、NS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、NS54Bタンパク質および/またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の少なくとも1種の抗原性部分を含み得る。HBVコアタンパク質もしくはその断片はまた、核酸の封入および/または結合を提供するために、免疫応答ドメイン内に含まれ得る。
【００７６】
免疫応答の大きさは、例えば、(i) 対象内の抗原特異的抗体の量; (ii) キメラ抗原もしくは免疫応答ドメインを単独で搭載してAPCに曝露された応答において、T細胞により分泌されたIFN-γの量; または (iii) キメラ抗原もしくは免疫応答ドメインを単独で搭載してAPCに曝露された応答において誘発された抗原特異的CD8+ T細胞の量により測定され得る。
【００７７】
キメラ抗原はまた、エクスビボまたはインビボでキメラ抗原をDCに提供することにより、免疫応答を産生する効率について評価され得る。DCは、キメラ抗原を加工してT細胞に提示し、それが、T細胞の増殖およびT細胞のマーカーとしてのIFN-γの産生について評価される。特に、エクスビボ状況下において、末梢血単球細胞(PBMC)が未感作ドナーから単離され、樹状細胞(DC)の作製およびT細胞の単離のために使用される。DCによるT細胞の活性化は、既知の手順[例えば、Berlyn, et al., (2001) Clin. Immunol. 3:276-283を参照のこと]により、マーカー、例えば、IFN-γレベルを測定することにより評価される。エクスビボで、IFN-γを産生するために誘導されるT細胞の割合の著しい増加は、インビボで効率を予測するのを助ける。インビボ状況下において、キメラ抗原は、非経腸で宿主に直接導入され、利用可能なDCおよびAPCは、抗原と相互作用し、それらを適宜加工する能力を有する。
【００７８】
キメラ抗原および核酸はまた、予防上または治療上、感染に対して対象にワクチン接種するのに使用され得る。該分子の二機能の性質により、抗原がAPC、例えば、DCに標的化されるのを助け、それは、抗原の抗体に対する最も効率的な化学量論でAPCを特異的に標的化することにより、慢性の感染性疾患の治療において優れた方法である。そのようなワクチンは、HBV、HCV、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペスウイルス、アルファウイルス、インフルエンザウイルス、他の型のウイルス、偏性細胞内寄生体により引き起こされる感染に対するワクチンの開発において有用であり得て、それはまた、癌および自己免疫疾患のような疾患におけるすべての自己抗原に対して適用可能であり得る。これらの融合タンパク質の投与は、細胞性および体液性応答を含む、広範な宿主からの免疫応答を誘発し得る。したがって、それらは、特定の感染を発症するリスクのある対象を免疫化するための予防的ワクチンとして有用であることに加えて、既存の感染に対して免疫寛容である対象を処置するための治療ワクチンとして使用され得る。
【実施例】
【００７９】
実施例
実施例1: C末端プロタミンテールを有するキメラ抗原のクローニングおよび発現 
工程1. クローニング
5'Not I部位および3'Xba I部位を含む標的結合ドメイン(TBD)をコードするDNAを、以前に作製したpFastBacHTa-TBDを鋳型として用いて、各制限酵素部位を付加した特定のプライマーで、PCRにより作製した。プライマーは、下記を使用した: 
5'プライマー 
5' TGTCATTCTGCGGCCGCAAGGCGGCGGGATCCGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGG 3' 
3'プライマー 
5' CCGGTCTAGATTCAGCCCAGGAGAGTGGGAGAG 3'。
【００８０】
PCR断片を単離し、Not IおよびXba Iで消化し、Not I/Xba I消化pFastBacHTa-gp64プラスミドにクローン化した。
【００８１】
HBVコアプロタミンテールについては、該配列を、以前に作製したpFastBacHTa HBVコア-TBDを鋳型として用いて、5'末端に特定のXba I部位および3'末端に特定のHind III部位を付加したプライマーで、PCRにより得た。プライマーは、下記を使用した: 
5'プライマー: 
5' CCGGTCTAGAGGAAACTACTGTTGTTAGACGAC 3'および 
3'プライマー: 
5' GCGCAAGCTTTGACATTGAGATTCCCGAGATTG 3'。
【００８２】
PCR生成物を単離し、Xba I/Hind IIIで消化し、上記した再クローン化TBDプラスミドのXba I/Hind III部位にクローン化し、pFastBacHTa-gp64 TBD-HBVコアプロタミンを作製した。
【００８３】
免疫応答ドメインの抗原としてHCV NS5Aを含むキメラ抗原を、プラスミドpFastBacHTa-gp64 TBD-HBVコアプロタミンをXba IおよびHind IIIで消化することにより作製し、TBD-HBVコアプロタミンテール断片を単離した。プラスミドpFastBacHTa-gp64 HCV NS5A-TBDをXba IおよびHind IIIで消化し、TBD- HBVコアプロタミンテール断片をクローン化した。
【００８４】
分子内のさまざまな部位に位置するHBVコアプロタミンテールドメインを含むキメラ抗原を、下記のとおり決定した(概略図について、図3を参照のこと)。HBVコアプロタミンテールドメインのDNA配列を合成し、一般的なpUCベクターにサブクローン化した。次いで、HBVコアドメインを、Bam HI/Eco RIもしくはNot I制限酵素で各々消化し、pFastBacHTa-gp64 NS5A TBD構築体にサブクローン化し、2個の異なるクローンを作製した: (1) pFastBacHTa-gp64-プロタミンNS5A TBDおよび(2) pFastBacHTa-gp64 NS5a-プロタミンTBD。
【００８５】
工程2. キメラ抗原の発現のための組み換えバキュロウイルスの作製
キメラ抗原NS5A-TBD-HBVコアプロタミンドメインタンパク質の発現を、Sf9昆虫細胞で、バキュロウイルス発現系を用いて行った。発現のためのキメラ抗原をコードする組み換えバキュロウイルスを作製するために、Bac-To-Bac系(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を使用した。この系は、細菌トランスポゾンTn7を用いた部位特異的転移を使用しており、E. coli株DH10Bacで組み換えバキュロウイルスを作製する。pFastBacHTa-gp64 HCV NS5A-TBD-HBVコアプロタミンプラスミドは、クローニング部位に近接したmini-Tn7要素を有する。該プラスミドを用いて、LacZα遺伝子内にTn7結合部位を含むバキュロウイルスシャトルプラスミド(bacmid)を有するE. coli株DH10Bacを形質転換した。転移は、LacZα遺伝子を破壊し、その結果、組み換えbacmidのみがX-gal/IPTGを含むプレート上で白色コロニーを産生し、容易に選択される。E. coliでの転移を用いた利点は、単一コロニーが組み換えbacmidのみを含むことである。組み換えbacmidを標準的な単離プロトコールを用いて単離し、Sf9昆虫細胞のトランスフェクションのために使用し、キメラ抗原を発現するバキュロウイルスを作製した。導入効率を、PCRでバキュロウイルスDNAの産生を調べることにより証明し、関心のある挿入遺伝子についてスクリーニングした。導入されたSf9細胞での異種タンパク質の発現は、プローブとして6xHisタグモノクローナル抗体または抗マウスIgG1 (Fc特異的)抗体を用いて、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびウエスタンブロッティングにより証明された。組み換えバキュロウイルスの産生およびキメラタンパク質の発現を確認した後、組み換えウイルスを増幅し、バキュロウイルスの濃縮ストックを作製した。
【００８６】
工程3. 昆虫細胞でのキメラ抗原の作製
高力価組み換えバキュロウイルスストックを用いて、昆虫細胞(例えば、Sf9, High Five(商標))に感染させた。バキュロウイルスのMOI、感染期間および宿主細胞の生存率に関して、感染を最適化した。組み換えタンパク質の分解を妨げるために、高レベルで昆虫細胞の生存率を維持することが重要である。発現したタンパク質を、アフィニティークロマトグラフィー法を用いて、6xHisタグ化タンパク質について開発したプロトコールにより精製した。
【００８７】
試験において使用されたChimigen(登録商標)分子のいくつかは、下記を含む: Chimigen(登録商標)HBVコアワクチン−抗原11およびNAIDとして免疫応答ドメイン10に存在するHBVコアタンパク質を有するChimigen(登録商標)分子構造。
【００８８】
Chimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチン−免疫応答ドメイン内にHBVコアタンパク質およびHBV S1/S2タンパク質を有するChimigen(登録商標)分子構造。このワクチンの構造は、図4aで示されており、該配列は、図4bで示されている。
【００８９】
Chimigen(登録商標)HBVコアプロタミンテール−抗原11およびNAIDとして免疫応答ドメイン10に存在するHBVコアタンパク質、ならびにNAIDとしてChimigen(登録商標)分子のC末端に位置するHBVコアプロタミンドメイン32を有するChimigen(登録商標)分子構造。
【００９０】
Chimigen(登録商標)HBV NS5Aプロタミンワクチン−抗原11として免疫応答ドメイン10に存在するHCV NS5Aタンパク質、ならびにNAIDとしてChimigen(登録商標)分子のC末端に位置するHBVコアプロタミンドメイン32を有するChimigen(登録商標)分子構造。
【００９１】
Chimigen(登録商標)HBVプロタミンテールHCV NS5Aワクチン−免疫応答ドメイン10内にHBVコアのプロタミンドメイン32およびHCV NS5Aを有するChimigen(登録商標)分子構造。
【００９２】
実施例2: Chimigen凝集の視覚化
Chimigen(登録商標)HBVコアワクチンおよびChimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンを、Tapping Mode Atomic Force Microscopy (TM-AFM)を用いて視覚化した。作製された画像を、各々図6a-dおよび図7a-dに示す。示されたとおり、形成された凝集体/ナノ粒子は、統一された大きさおよび楕円形であり、直径30-40nmおよび高さ2nmを有する。
【００９３】
実施例3: Chimigen(登録商標)S1/S2コアワクチンによるshRNAプラスミドの封入
SureSilencing shRNAプラスミドを、変性条件下、Chimigen HBV S1/S2コアワクチンと混合した。変性条件を除去した後、封入を、DNase処理およびGFP DNAのPCR増幅により評価した。shRNAベクタープラスミドおよび結果を、各々図8aおよび図8bに示す。注目すべきことに、ワクチンは、DNAse処理からGFP DNAを保護し、これは、ワクチンが核酸の周辺に封入送達ビヒクルを形成可能であることを示す。
【００９４】
実施例4: 未成熟樹状細胞への結合
Chimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンの未成熟DCへの結合を調べた。1-50 μg/mlのワクチンを、2日間培養したPBMC由来未成熟DCに、4℃で1時間、加えた。結合したワクチンを、フローサイトメトリーにより、抗マウスIgG1-ビオチンおよびSA-PECy5を用いて検出した。図9に示されたとおり、ワクチンは、相対的に高い平均蛍光強度(MFI)で示されたように未成熟DCに高いレベルで結合し、それは、用量依存的であった。
【００９５】
実施例5: HepG2細胞への結合
Chimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンの肝臓細胞株HepG2への結合を調べた。1-50 μg/mlのワクチンを、4℃で1時間、HepG2細胞に加えて、結合したワクチンを、フローサイトメトリーにより、抗マウスIgG1-ビオチンおよびSA-PECy5を用いて検出した。図10に示されたとおり、ワクチンは、HepG2細胞に相対的に高いレベルで結合し、それは、用量依存的であった。
【００９６】
実施例6: ワクチンと核酸の組み合わせ
封入shRNAプラスミドを有するChimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンの未成熟DCへの結合を調べた。封入shRNAプラスミドを有する、および有さない1-50 μg/mlのワクチンを、2日間培養したPBMC由来未成熟DCに、4℃で1時間、加えた。ワクチン結合を、フローサイトメトリーにより、抗マウスIgG1-ビオチンおよびSA-PECy5を用いて検出した。図11aに示されたとおり、封入shRNAプラスミド、すなわち、SOCS1 shRNAプラスミド(プラスミド1-4)または非標的化(コントロール)shRNAプラスミド(プラスミド5)を有するワクチンは、未成熟DCに結合した。比較すると、封入shRNAプラスミドを有さないワクチン(prep7)は、封入shRNAプラスミドを有するワクチン(prep8および9)よりも高いレベルで結合した。
【００９７】
Chimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンを、SOCS1 shRNAプラスミド(Thermo Fisher Scientific)またはコントロールプラスミドと組み合わせた。
【００９８】
Chimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンを、SOCS1 siRNA(市販で利用可能である)と組み合わせた。非標的化コントロールsiRNAに関して、下記の4つの二本鎖RNAを提供した: GCAUCCGCGUGCACUUUCA; GGUGGCAGCCGACAAUGCA; GGACGCCUGCGGAUUCUAC; およびUGUUAUUACUUGCCUGGAA。SOCS siRNAに関して、4つの二本鎖RNAを提供した。センス配列は、下記のとおりであった: GACACGCACUUCCGCACAUUU; GCAUCCGCGUGCACUUUCAUU; GGUGGCAGCCGACAAUGCAUU; およびGGACGCCUGCGGAUUCUACUU。
【００９９】
封入siRNAを有するChimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンの未成熟DCへの結合を調べた。封入siRNA (GAPDH)を有する、および有さないChimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチン(1-50 μg/ml)を、2日間培養したPBMC由来未成熟DCに、4℃で1時間、加えた。ワクチン結合を、フローサイトメトリーにより、抗マウスIgG1-ビオチンおよびSA-PECy5を用いて検出した。ワクチンでGAPDH siRNAを封入するか、またはGAPDHと共に、室温で60分間、インキュベートした(モル比が、siRNA:ワクチン=6:1)。図11bに示されたとおり、ワクチンで封入されたsiRNAは、未成熟DCに高いレベルで結合し、それは、用量依存的であった。比較すると、封入siRNAを有さないワクチンは、封入siRNAを有するワクチンよりも高いレベルで結合した。
【０１００】
Chimigen(登録商標)HCV NS5A-プロタミンテールワクチンをCD86 siRNAと組み合わせた。ワクチンをCD86siRNAと6:1のモル比で、室温で1時間、インキュベートした。
【０１０１】
実施例7: 抗原提示アッセイ
PBMC由来単球を未成熟樹状細胞に分化させ、次いで、ワクチン; shRNAプラスミド; またはshRNAプラスミド(SOCS1もしくは非標的化)を有するワクチンで処理した(loaded)。T細胞を自己PBMCから単離し、抗原処理樹状細胞と共に培養した。培養の11日後に、T細胞を再刺激した。
【０１０２】
T細胞を、Chimigen(登録商標)shRNAプラスミド封入ワクチンで処理したDCに対する機能性応答について調べた。PBMC由来単球を未成熟DCに分化させ、次いで、ワクチン、shRNAプラスミド、またはshRNAプラスミド(SOCS1もしくは非標的化)を封入したChimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンで処理した。T細胞を自己PBMCから単離し、抗原処理樹状細胞と共に培養した。培養の11日後に、抗原処理DCで、T細胞を再刺激した。これらの実験に関して、DCは、未成熟であり、外因性IL-2は、細胞培養物に添加されなかった。
【０１０３】
IFN-γ分泌を、1回または2回の刺激後にELISAにより測定した。結果を、図12aおよび図12bに示す。
【０１０４】
1回または2回の刺激後、T細胞培養物中のIFN-γの産生を、ELISAにより評価した。図12aおよび図12bで示されたとおり、shRNAプラスミド(SOCS1もしくは非標的化)を封入したChimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンで刺激した培養物は、コントロールバッファーで刺激した培養物と比較して、IFN-γの著しい増加を産生した。さらに、封入ワクチンで処理した培養物は、非封入ワクチンで処理した培養物と比較して、より多量のIFN-γを産生した。これらの予備結果は、非標的化shRNAプラスミドに比べて、封入SOCS1 shRNAプラスミドで刺激した培養物中におけるIFN-γ分泌量の増加を示した。
【０１０５】
CD8+およびCD4+T細胞におけるIFN-γおよびTNF-α発現を、2回刺激後、細胞内サイトカイン標識により測定した。結果を、図13a-dに示す。
【０１０６】
2回目の刺激の6時間後、CD8+およびCD4+T細胞におけるIFN-γおよびTNF-αを、フローサイトメトリーによる検出を用いて、細胞内サイトカイン標識により評価した。図13a-dで示されたとおり、shRNAプラスミド(SOCS1もしくは非標的化)を封入したChimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンで刺激した培養物は、コントロールバッファーで刺激した培養物と比較して、IFN-γ+およびTNF-α＋であるCD8＋およびCD4＋T細胞の割合の著しい増加を示した。さらに、封入ワクチンで処理した培養物は、非封入ワクチンで処理した培養物と比較して、より多量のIFN-γを産生した。
【０１０７】
実施例8: T細胞の増殖
封入ワクチンに対するワクチンで処理した培養物中の相対的なT細胞の数の評価を、図14に示す。培養の11日後、封入ワクチンで刺激すると、非封入ワクチンに比べて、培養物中でT細胞がかなり増加していた。
【０１０８】
実施例9: Chimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチン
未成熟樹状細胞を、Chimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチン、CD86 siRNA、非標的化siRNA、Chimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンおよびCD86 siRNA、またはChimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンおよび非標的化siRNAで処理した。次いで、LPSを用いてDCを成熟させ、フローサイトメトリーにより、CD86の発現について評価した。結果を、図15に示す。CD86発現は、Chimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンおよび非標的化siRNAと比較して、Chimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンおよびCD86 siRNAで処理したDCで下方調節されていた。これらの結果は、Chimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンおよびCD86 siRNAが、CD86 siRNAのDCへの送達を生じ、その結果、CD86発現を減少させたことを示す。
【０１０９】
実施例10: プロタミンテールワクチン作製
Chimigen(登録商標)HBVコアプロタミンテールワクチンを、標的結合ドメイン内に、HBVコアタンパク質のプロタミン様ドメインを組み込むことにより作製した。特に、プロタミン様ドメインを、標的結合ドメインのC末端に組み込み、HBV NS5A抗原を、免疫応答ドメインに組み込んだ。
【０１１０】
実施例11: 抗原提示アッセイ
T細胞を、SOCS1もしくは非標的化siRNAを有する、および有しないChimigen(登録商標)NS5Aプロタミンテールワクチンで処理したDCに対する機能性応答について調べた。PBMC由来単球を未成熟DCに分化させ、次いで、ワクチン、siRNA、またはsiRNA(SOCS1もしくは非標的化)を有するChimigen(登録商標)NS5Aプロタミンテールワクチンで処理した。T細胞を自己PBMCから単離し、抗原処理DCと共に培養した。培養の11日後に、抗原処理DCで、T細胞を再刺激した。これらの実験に関して、DCは、未成熟であり、外因性IL-2は、細胞培養物に添加されなかった。
【０１１１】
1回または2回の刺激後、T細胞培養物中のIFN-γの産生を、ELISAにより評価した。図16aおよび図16aで示されたとおり、siRNA(SOCS1もしくは非標的化)を有するChimigen(登録商標)NS5Aプロタミンテールワクチンで刺激した培養物は、コントロールバッファーで刺激した培養物と比較して、IFN-γの著しい増加を産生した。さらに、ワクチンおよびsiRNAで処理した培養物は、ワクチン単独で処理した培養物と比較して、より多量のIFN-γを産生した。1回の刺激後、非標的化siRNAに比べて、ワクチンおよびSOCS1 siRNAで刺激した培養物中におけるIFN-γ分泌量の増加を示した。
【０１１２】
2回目の刺激の6時間後、CD8+およびCD4+T細胞におけるIFN-γおよびTNF-αを、フローサイトメトリーによる検出を用いて、細胞内サイトカイン標識により評価した。図17a&#8211;dで示されたとおり、siRNA(SOCS1もしくは非標的化)を有するChimigen(登録商標)NS5Aプロタミンテールワクチンで刺激した培養物は、コントロールバッファーで刺激した培養物と比較して、IFN-γ+およびTNF-α+であるCD8+およびCD4+T細胞の割合の著しい増加を示した。さらに、ワクチンおよびsiRNAで処理した培養物は、ワクチン単独で処理した培養物と比較して、より多量のIFN-γを産生した。
【０１１３】
実施例12: T細胞の増殖
ワクチンとワクチンおよびsiRNAで処理した培養物中の相対的なT細胞の数の評価を、図18に示す。培養の11日後、ワクチンおよびsiRNAで刺激すると、ワクチン単独に比べて、培養物中でT細胞がかなり増加していた。これらの予備結果は、ワクチンおよびSOCS1 siRNAのいずれかか、またはワクチンと非標的化siRNAで刺激した培養物が、大体同じくらいのT細胞の数を生じることを示した。
【０１１４】
実施例13: CD86発現のRNAi
未成熟樹状細胞を、Chimigen(登録商標)HCV NS5Aプロタミンテールワクチン、CD86 siRNA、非標的化siRNA、Chimigen(登録商標)NS5AプロタミンテールワクチンおよびCD86 siRNA、またはChimigen(登録商標)NS5Aプロタミンテールワクチンおよび非標的化siRNAで処理した。次いで、LPSを用いてDCを成熟させ、フローサイトメトリーにより、CD86の発現について評価した。結果を、図19に示す。これらの結果は、Chimigen(登録商標)NS5AプロタミンテールワクチンおよびCD86 siRNAが、CD86 siRNAのDCへの送達を生じ、その結果、CD86発現を減少させたことを示す。
【０１１５】
実施例14: Chimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンとCD86 siRNAの結合
ビオチン標識化CD86 siRNAを有するを有するChimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンの未成熟DCへの結合を調べた。ワクチン、ワクチンおよびビオチン標識化CD86 siRNA、またはCD86 siRNAを、2日間培養したPBMC由来未成熟DCに、4℃で1時間、加えた。結合を、フローサイトメトリーにより、SA-PECy5を用いて検出した。図20に示されたとおり、ビオチン標識化CD86 siRNAを有するワクチンは、未成熟DCに対して、相対的に高いレベルで結合した。ビオチン標識化CD86 siRNA単独での結合は、検出されなかった。これらの結果は、siRNAがChimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンに結合し、ワクチンおよびsiRNA複合体がDCに結合し得ることを示す。
【０１１６】
実施例15: Chimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンおよびCD86 siRNAの内在化
ビオチン標識化CD86 siRNAを有するChimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンの未成熟DCへの内在化を調べた。ワクチン、ワクチンおよびビオチン標識化CD86 siRNA、またはCD86 siRNAを、2日間培養したPBMC由来未成熟DCに、4℃で1時間、次いで、37℃で2時間、加えた。結合および内在化を、先の固定および透過処理を有する、および有さない条件下で、SA-PECy5の添加後、FACSにより検出した。図21で示されたとおり、蛍光は、37℃で、ワクチンおよびビオチン標識化CD86 siRNAで処理された細胞で検出されたが、ワクチンもしくはビオチン標識化CD86 siRNA単独で処理された細胞では検出されなかった。細胞表面上に蛍光は観察されなかったので、ワクチンおよびsiRNAが内在化されたと結論づけられる。したがって、siRNAおよびChimigen(登録商標)HBV S1/S2コアワクチンは、DCに結合し、内在化された。
【０１１７】
実施例16: Chimigen(登録商標)HBV S1/S2ワクチンによるsiRNAの保護
封入もしくは裸のsiRNAを、室温で10分間、Benzonaseで消化した。消化したsiRNAを、1mM EDTAを含むSDS-PAGEゲルで分離し、0.2%メチレンブルーで染色した。図22で示されたとおり、siRNAバンドは、裸のsiRNAカラムでは検出されず、Chimigen(登録商標)HBV S1/S2ワクチン(Multi-Ag)と組み合わせたサンプル中で検出された。
【０１１８】
本発明の上記実施態様は、例示のみを意図するものである。変更、修飾および変形は、当業者により、添付の特許請求の範囲で単に限定されている本発明の範囲から離れることなく、特定の態様に対して達成され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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