(57)【要約】  本発明は、ピキアパストリスにおいて生物学的機能性ヘプシジンを生産する新規な方法を提供する。本発明は、さらに、新規な標識ヘプシジン、抗体、並びに、治療及び免疫学的分析においてそれらを使用する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的機能性ヘプシジン又は生物学的機能性ヘプシジン誘導体を生産する方法において、真核性メチロトローフ酵母（好ましくはピキアパストリス）であることを特徴とする発現系内において外因的にヘプシジン又はヘプシジン誘導体を発現させるステップを具える方法。
【請求項２】
生物学的機能性ヘプシジン又は生物学的機能性ヘプシジン誘導体を生産する方法において、発現系内においてヘプシジン又はヘプシジン誘導体を発現させるステップを具え、Ｃ末端に少なくとも１つの標識を有するように前記ヘプシジンを提供する方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、前記標識はポリヒスチジン標識（６ＸＨｉｓ−標識）である方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法において、前記標識はｍｙｃ−Ｈｉｓ標識である方法。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載の方法において、リンカーを介して間接的に前記標識を設けたことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項２、３、４又は５のいずれかに記載の方法において、前記発現系内において生物学的機能性標識ヘプシジン又は生物学的機能性標識ヘプシジン誘導体を外因的に発現させるステップを具え、該発現系が、真核性メチロトローフ酵母（好ましくはピキアパストリス）である方法。
【請求項７】
請求項１又は６のいずれかに記載の方法において、発現に先立って、前記発現系（好ましくは真核性メチロトローフ酵母、より好ましくはピキアパストリス）にヘプシジンをコードするポリヌクレオチド挿入物を含むベクターを導入するステップ具える方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記ベクターがｐＰＩＣＺａＡ、ｐＰＩＣＺａＢ又はｐＰＩＣＺａＣである方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法において、該方法は、発現されたヘプシジンを精製するための２段階の工程をさらに具える方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記第１段階は金属親和性クロマトグラフィーを具える方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記金属がニッケル又はコバルトである方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記ニッケルがＮＴＡで配位されている方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法において、前記第２段階はゲル濾過クロマトグラフィーを具える方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記クロマトグラフィーはセファロースペプチドカラムを用いる方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法において、発現されるヘプシジンがヒトヘプシジンである方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記発現されるヘプシジンが配列番号１〜８のアミノ酸配列からなる群より選択される方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、前記発現されるヘプシジンが配列番号６の配列を有する方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって得られるヘプシジン。
【請求項１９】
請求項１８に記載のヘプシジンにおいて、該ヘプシジンが配列番号６の配列を有するヘプシジン。
【請求項２０】
ヘプシジンを発現させるための真核性メチロトローフ酵母（好ましくはピキアパストリス）の使用方法。
【請求項２１】
請求項２０の使用方法において、前記ヘプシジンが配列番号１〜８の配列からなる群より選択されるヒトヘプシジンである使用方法。
【請求項２２】
配列番号５〜８の配列からなる群より選択される標識ヘプシジン。
【請求項２３】
請求項２１に記載の標識ヘプシジンにおいて、該ヘプシジンが配列番号６であるヘプシジン。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の標識ヘプシジンに特異的に結合する抗体。
【請求項２５】
抗体を上昇させるために請求項２１又は２２のいずれかに記載の標識ヘプシジンを使用する方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の抗体又は請求項２５に記載の方法において、前記抗体がモノクローナル又はポリクローナルである抗体又は方法。
【請求項２７】
抗菌物質として使用される請求項２２又は２３に記載のヘプシジン。
【請求項２８】
鉄代謝を制御するために用いられる請求項２２又は２３に記載のヘプシジン。
【請求項２９】
サンプル内のヘプシジンを検知するための請求項２４又は２６に記載の抗体の使用。
【請求項３０】
請求項２９に記載の使用において、前記サンプルが血清サンプル、好ましくはヒト血清又は尿である使用。
【請求項３１】
請求項２９〜３０のいずれか１項に記載の使用において、検知される前記ヘプシジンが配列番号１又は２の配列を有するヒトヘプシジンである使用。
【請求項３２】
サンプル（好ましくはヒト血清サンプル）内のヘプシジン量を測定するための競合ＥＬＩＳＡ分析における請求項２４又は２６に記載の抗体を使用。
【請求項３３】
請求項３２に記載の使用において、前記抗体が、配列番号１又は２の配列を有するヒトヘプシジンのサンプル内の量を決定するために用いられる使用。
【請求項３４】
血清サンプル内のヘプシジン量を測定する方法において、
ａ）抗体を含む血清サンプルと固定化されたヘプシジンとを接触させるステップであって、該抗体は血清サンプル内の固定化されたヘプシジン及びヘプシジンに特異的に結合するステップ；
ｂ）固定化されたヘプシジンに結合している抗体量を決定するステップ；及び、
ｃ）測定された量と基準とを比較して血清サンプル内のヘプシジンの量を測定するステップを具える方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法において、前記基準が：
ａ）ヘプシジン及び固定化されたヘプシジンの両方に特異的に結合する抗体を含む既知濃度のヘプシジンを含むサンプルと、固定化されたヘプシジンとを接触させるステップ；
ｂ）固定化されたヘプシジンに結合している抗体量を決定するステップ；
ｃ）結果を記録するステップ；
ｄ）前のサイクルのステップａ）において用いられた濃度とは異なる既知濃度のヘプシジンを含むさらなるサンプルを用いてステップａ）〜ｃ）のサイクルを繰り返すステップ；及び、
ｅ）適切な標準曲線が生成されるまでステップｄ）を繰り返すステップ、
によって生成される阻害曲線である方法。
【請求項３６】
請求項３４又は３５に記載の方法において、前記固定化されたヘプシジンが配列番号６の配列を有する方法。
【請求項３７】
請求項３４〜３６のいずれかに記載の方法において、前記基準が、配列番号６の配列を有する既知量のヘプシジンを含むサンプルを用いて得られる方法。
【請求項３８】
血清サンプル内のヘプシジン量を測定するために用いられるＥＬＩＳＡキットにおいて：
ヘプシジン；及び、
ヘプシジン及び測定されるヘプシジンに特異的に結合する抗体、
を具えるキット。
【請求項３９】
請求項３８に記載のキットにおいて、前記ヘプシジンが固定化されているキット。
【請求項４０】
請求項３８又は３９のいずれかに記載のキットであって、
前記キットがさらに複数の容器又は管を具え、
該複数の容器又は管が、それぞれ、異なる濃度のヘプシジンを含むキット。
【請求項４１】
血色素症若しくは血色素症から生じる疾患又は鉄過剰に関連する他の任意の病状の治療又は防止に用いる請求項２２又は２３のいずれか１項に記載の標識ヘプシジン。
【請求項４２】
請求項４１に記載の標識ヘプシジンにおいて、前記疾病が、肝細胞癌、心筋症又は糖尿病からなる群より選択される標識ヘプシジン。
【請求項４３】
貧血若しくは貧血から生じる疾患又は鉄不足に関連する病状の治療又は防止に用いる請求項２２又は２３のいずれか１項に記載の標識ヘプシジンの阻害剤。
【請求項４４】
請求項４３に記載の阻害剤において、該阻害剤が請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の抗体である阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はペプチドホルモン、特にヘプシジンを生産する工程に関する。本発明は、特にヒトヘプシジン−２０及び−２５並びにそれらの標識形態を含む類似化合物を生産する工程に関する。また、本発明のヘプシジンを診断薬及び治療薬としての使用を提供する。
【０００２】
鉄は、酸素運搬、細胞増殖、呼吸及びＤＮＡ合成に関与していることから、すべての生命体の必須微量元素である。しかし、遊離鉄は非常に有毒であり、酸化ストレスを促進する。哺乳動物は生理的な排出経路を有しておらず、鉄のバランスは、その吸収及び貯蔵の制御によって維持されている（Ｈｅｎｔｚｅ，Ｍ．Ｗ．，Ｍ．Ｕ．Ｍｕｃｋｅｎｔｈａｌｅｒ及びＡｎｄｒｅｗｓ  Ｎ．Ｃ．（２００４）Ｃｅｌｌ，１１７，２８５−９７）。
【０００３】
ヒトの鉄代謝の重要な制御要因の１つは、ペプチドホルモンであるヘプシジンである（Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｒ．Ｅ．及びＳｌｙ  Ｗ．Ｓ．（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国，９８，８１６０−２）。ヘプシジンは、システインを多く含み、主に肝臓中で発現される小さいペプチドであり（Ｐｉｇｅｏｎ，Ｃ，ｌｌｙｉｎ，Ｇ．，Ｃｏｕｒｓｅｌａｕｄ，Ｂ．，Ｌｅｒｏｙｅｒ，Ｐ．，Ｔｕｒｌｉｎ，Ｂ．，Ｂｒｉｓｓｏｔ，Ｐ．，Ｌｏｒｅａｌ，Ｏ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，７８１１−９)、８４個のアミノ酸プレプロペプチドとして合成される。プレプロペプチドのカルボキシル末端部位に対応する成熟した生成物は、２０及び２５のアミノ酸の２つの優位型で循環しており、ヒトの血清及び尿中で検出可能である（Ｋｒａｕｓｅ，Ａ．，Ｎｅｉｔｚ，Ｓ．，Ｍａｇｅｒｔ，Ｈ．Ｊ．，Ｓｃｈｕｌｚ，Ａ．，Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ，Ｗ．Ｇ．，Ｓｃｈｕｌｚ−Ｋｎａｐｐｅ，Ｐ．，Ａｄｅｒｍａｎｎ，Ｋ．（２０００）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４８０，１４７−５０  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，ＣＨ．，Ｖａｌｏｒｅ，Ｅ．Ｖ．，Ｗａｒｉｎｇ，Ａ．Ｊ．，Ｇａｎｚ，Ｔ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，７８０６−１０)。両方のアイソフォームは、８つのシステイン残基を含んでおり、抗菌性及び抗真菌活性を有するデフェンシン様ペプチドを生じさせる（Ｋｒａｕｓｅ，Ａ．，Ｎｅｉｔｚ，Ｓ．，Ｍａｇｅｒｔ，Ｈ．Ｊ．，Ｓｃｈｕｌｚ，Ａ．，Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ，Ｗ．Ｇ．，Ｓｃｈｕｌｚ−Ｋｎａｐｐｅ，Ｐ．，Ａｄｅｒｍａｎｎ，Ｋ．（２０００）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４８０，１４７−５０  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｈ．，Ｖａｌｏｒｅ，Ｅ．Ｖ．，Ｗａｒｉｎｇ，Ａ．Ｊ．，Ｇａｎｚ，Ｔ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，７８０６−１０）。ＮＭＲ構造解析により、ヘプシジンは４つのジスルフィド結合によって安定化された単純なヘアピン構造に折り重なっており、該４つのジスルフィド結合の１つは、通常みられないものであり、２つの隣接するシステインの間に形成されていることが明らかにされている（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｈ．Ｎ．，Ｆｕｌｔｏｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｇａｎｚ，Ｔ．，Ｖｏｇｅｌ，Ｈ．Ｊ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，３７５９７−６０３）。
【０００４】
鉄代謝におけるヘプシジンの関与は、食物中の鉄によってその発現が誘導されることを示す試験によって示唆された（Ｐｉｇｅｏｎ，Ｃ１  ｌｌｙｉｎ，Ｇ．，Ｃｏｕｒｓｅｌａｕｄ，Ｂ．，Ｌｅｒｏｙｅｒ，Ｐ．，Ｔｕｒｌｉｎ，Ｂ．，Ｂｒｉｓｓｏｔ，Ｐ．，Ｌｏｒｅａｌ，Ｏ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，７８１１−９）。さらに、ヘプシジンが欠損しているマウスは、肝臓に鉄を堆積する血色素症表現型を発現し、マクロファージを欠乏していることがわかった（Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｇ．，Ｂｅｎｎｏｕｎ，Ｍ．，Ｄｅｖａｕｘ，Ｉ．，Ｂｅａｕｍｏｎｔ，Ｃ，Ｇｒａｎｄｃｈａｍｐ，Ｂ．，Ｋａｈｎ，Ａ．，Ｖａｕｌｏｎｇ，Ｓ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９８，８７８０−５）。一方で、ヘプシジンを過剰発現する遺伝子組み換えマウスは、重篤な鉄欠乏性貧血により誕生後数時間内の死亡率が増加した（Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｇ．，Ｂｅｎｎｏｕｎ，Ｍ．，Ｐｏｒｔｅｕ，Ａ．，Ｍａｔｉｖｅｔ，Ｓ．，Ｂｅａｕｍｏｎｔ，Ｃ，Ｇｒａｎｄｃｈａｍｐ，Ｂ．，Ｓｉｒｉｔｏ，Ｍ．，Ｓａｗａｄｏｇｏ，Ｍ．，Ｋａｈｎ，Ａ．，Ｖａｕｌｏｎｔ，Ｓ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９９，４５９６−６０１）。唯一の既知の細胞鉄排出体であるフェロポルチン（Ｄｏｎｏｖａｎ，Ａ．，Ｌｉｍａ，Ｃ．Ａ．，Ｐｉｎｋｕｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｐｉｎｋｕｓ，Ｇ．Ｓ．，Ｚｏｎ，Ｌ．Ｉ．，Ｒｏｂｉｎｅ，Ｓ．，Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｎ．Ｃ．（２００５）Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．１，１９１−２００）にヘプシジンが結合すること、また、細胞質中において内在化及び分解を引き起こす（Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，Ｔｕｒｔｌｅ，Ｍ．Ｓ．，Ｐｏｗｅｌｓｏｎ，Ｊ．，Ｖａｕｇｈｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｄｏｎｏｖａｎ，Ａ．，Ｗａｒｄ，Ｄ．Ｍ．Ｇａｎｚ，Ｔ．，Ｋａｐｌａｎ，Ｊ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６，２０９０−３）ことが近年発見されたとき、ヘプシジン作用の分子機構が明らかになった。フェロポルチンは、肝細胞、マクロファージ及び腸細胞の中で発現する（Ｄｏｎｏｖａｎ，Ａ．，Ｌｉｍａ，Ｃ．Ａ．，Ｐｉｎｋｕｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｐｉｎｋｕｓ，Ｇ．Ｓ．，Ｚｏｎ，Ｌ．Ｉ．，Ｒｏｂｉｎｅ，Ｓ．，Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｎ．Ｃ．（２００５）Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．１，１９１−２００）。多量のヘプシジンは、フェロポルチンの発現を減少させ、それにより、摂食による鉄吸収、マクロファージから再利用される鉄の放出、及び、肝臓からの鉄貯蔵の移行を阻害する。
【０００５】
いくつかの研究は、鉄の恒常性の制御におけるヘプシジンの重要な役割を示した。ヘプシジンの突然変異は、若年型血色素症（ＪＨ）の患者に関係していた（Ｒｏｅｔｔｏ，Ａ．，Ｄａｒａｉｏ，Ｆ．，Ｐｏｒｐｏｒａｔｏ，Ｐ．，Ｃａｒｕｓｏ，Ｒ．，Ｃｏｘ，Ｔ．Ｍ．，Ｃａｚｚｏｌａ，Ｍ．，Ｇａｓｐａｒｉｎｉ，Ｐ，Ｐｉｐｅｒｎｏ，Ａ．，Ｃａｍａｓｃｈｅｌｌａ，Ｃ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０３，２４０７−９  ａｎｄ  Ｒｏｅｔｔｏ，Ａ．，Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ，Ｇ．，Ｐｏｌｉｔｏｕ，Ｍ．，Ａｌｂｅｒｔｉ，Ｆ．，Ｇｉｒｅｌｌｉ，Ｄ．，Ｃｈｒｉｓｔａｋｉｓ，Ｊ．，Ｌｏｕｋｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．，Ｃａｍａｓｃｈｅｌｌａ，Ｃ．（２００３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３，２１−２）。さらに、ＨＦＥ、ＴＦＲ２又はＨＪＶ遺伝子の突然変異によって生じる他のタイプの遺伝性血色素症もまた、ヘプシジン発現の異常に関係している（Ｂｒｉｄｌｅ，Ｋ．Ｒ．，Ｆｒａｚｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｐｕｒｄｉｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｄ．Ｈ．，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ，Ｖ．Ｎ．，Ｐｏｗｅｌｌ，ＬＷ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｒａｍｍ，Ｇ．Ａ．（２００３）Ｌａｎｃｅｔ  ３６１，６６９−７３；Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，Ｒｏｅｔｔｏ，Ａ．，Ｇａｒｏｚｚｏ，Ｇ．，Ｇａｎｚ，Ｔ．，Ｃａｍａｓｃｈｅｌｌａ，Ｃ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０５，１８０３−６  ａｎｄ  Ｂａｂｉｔｔ，Ｊ．Ｌ．，Ｈｕａｎｇ，Ｆ．Ｗ．，Ｗｒｉｇｈｔｉｎｇ，Ｄ．Ｍ．，Ｘｉａ，Ｙ．，Ｓｉｄｉｓ，Ｙ．，Ｓａｍａｄ，Ｔ．Ａ．，Ｃａｍｐａｇｎａ，Ｊ．Ａ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｒ．Ｔ．，Ｓｃｈｅｙｅｒ，Ａ．Ｌ．，Ｗｏｏｌｆ，Ｃ．Ｊ．，Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｎ．Ｃ，Ｌｉｎ，Ｈ．Ｙ．（２００６）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ  ３８，５３１−９）。
【０００６】
慢性炎症性疾患において、ヘプシジンの上方制御は、慢性疾患性貧血の一因となる（Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，Ｖａｌｏｒｅ，Ｅ．Ｖ．，Ｔｅｒｒｉｔｏ，Ｍ．，Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，Ｇ．，Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ，Ｇａｎｚ，Ｔ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１，２４６１−３；Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，Ｒｉｖｅｒａ，Ｓ．，Ｇａｂａｙａｎ，Ｖ．，Ｋｅｌｌｒｅ，Ｃ，Ｔａｕｄｏｒｆ，Ｓ．，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｂ．Ｋ．，Ｇａｎｚ，Ｔ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３，１２７１−６  ａｎｄ  Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｇ．，Ｃｈａｕｖｅｔ，Ｃ，Ｖｉａｔｔｅ，Ｌ１  Ｄａｎａｎ，Ｊ．Ｌ，Ｂｉｇａｒｄ，Ｘ．，Ｄｅｖａｕｘ，Ｉ．，Ｂｅａｕｍｏｎｔ，Ｃ１  Ｋａｈｎ，Ａ．，Ｖａｕｌｏｎｔ，Ｓ．（２００２）Ｊ．ＣＨｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０，１０３７−４４）。
【０００７】
その深遠な生物医学的重要性から、ヘプシジンは、集中的に生化学的研究対象とされた。しかしながら、そのような研究は、機能性ペプチドの限定された利用性により妨げられている。化学的に合成されたヘプシジンは商業的に入手可能であるが、この物質は、生物学的分析においてほとんどの場合不活性である。尿からのヘプシジンの単離は、その低い濃度により困難であると分かった。生物学的に活性なヘプシジンの大量生産のための異種系の開発は、重要なステップになるであろう。現在まで、大腸菌中で組み換えヘプシジンを発現させるために、様々な種類のアプローチが用いられてきた。第１のアプローチでは、封入体中の１０．５ｋＤａの融合タンパク質（Ｈｉｓ−ヘプシジン）として発現され、変性された形態で精製され、リフォールディングし、エンテロキナーゼによって開裂し、逆相クロマトグラフィーにより更に精製した（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｙｕａｎ，Ｑ．，Ｚｈｕ，Ｙ．，Ｍａ，Ｒ．，（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４１，４０９−１６）。このペプチドは抗菌活性を示した。第２のアプローチにおいては、ＧＳＴ若しくはマウスのＨフェリチンのＣ末端に対する融合タンパクとして、又は、フェリチンの螺旋Ｄと螺旋Ｅとの間のループの真中にそれを挿入することによりヘプシジン−２０を複製した（Ｇｅｒａｒｄｉ，Ｇ．，Ｂｉａｓｉｏｔｔｏ，Ｇ．，Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏ，Ｐ．，Ｚａｎｅｌｌａ，Ｉ．，Ｉｎｇｒａｓｓｉａ，Ｒ．，Ｃｏｒｒａｄｏ，Ｍ．Ｃａｖａｄｉｎｉ，Ｐ．，Ｄｅｒｏｓａｓ，Ｍ．，Ｌｅｖｉ，Ｓ．，Ａｒｏｓｉｏ，Ｐ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  ＭｏＩ．Ｄｉｓ．３５，１７７−８１）。これらのキメラタンパクは、鉄と共に分離され、ヘプシジンの生物学的機能を再現しなかった。最後のアプローチでは、Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−標識ヒトヘプシジンが、ＨＥＫ−２９３細胞中で発現された。組み換えペプチドは、処理され、正確に分泌され、抗菌分析において生物学的に活性であった（Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｆ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．，Ｒｉｖａｓ，Ｌ．，Ｓｌｙ，Ｌ．Ｉ．，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ，Ｖ．Ｎ．（２００６）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８８，３１−７）。しかし、鉄代謝の制御における上述の組み換え生成物の機能的分析については何ら記載されていない。
【０００８】
鉄の恒常性におけるヘプシジンの重要な役割及び鉄欠乏症の病因に基づいて、血液又は尿中の測定用の簡便な分析は、血色素症又は慢性疾患性貧血の患者の診断に非常に有用であることは明らかであろう。現在、尿ヘプシジンの濃度は免疫ドット分析法を用いて測定されている（Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，Ｒｉｖｅｒａ，Ｓ．，Ｇａｂａｙａｎ，Ｖ，Ｋｅｌｌｒｅ，Ｃ，Ｔａｕｄｏｒｆ，Ｓ，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｂ．Ｋ，Ｇａｎｚ，Ｔ（２００４）Ｊ  ＣＩｍ Ｉｎｖｅｓｔ  １１３，１２７１−６），ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ（Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ，Ｖａｌｏｒｅ，Ｅ．Ｖ．，Ｔｅｒｒｉｔｏ，Ｍ，Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，Ｇ，Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ，Ｇａｎｚ，Ｔ（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１，２４６１−３），ｏｒ  ａ  ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｋｅｍｎａ，Ｅ，Ｔｊａｌｓｍａ，Ｈ．，Ｌａａｒａｋｋｅｒｓ，Ｃ，Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｗｉｎｋｅｌｓ，Ｄ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０６，３２６８−３２７０）。最近、２つの報告において、ヒト血漿及び血清中のヘプシジン濃度を測定するためのＳＥＬＤＩＴＯＦ−ＭＳの使用が記載されている（Ｔｏｍｏｓｕｇｉ，Ｎ．，Ｋａｗａｂａｔａ，Ｈ．，Ｗａｋａｔａｂｅ，Ｒ，Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｍ，Ｙａｍａｙａ，Ｈ．，Ｕｍｅｈｅｒａ，Ｈ．，Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｉ（２００６）Ｂｌｏｏｄ  １０８，１３８１−７  ａｎｄ  Ｋｅｍｎａ，Ｅ，Ｔｊａｌｓｍａ，Ｈ，Ｐｏｄｕｓｔ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｓｗｉｎｋｅｌｓ，Ｄ（２００７）ＣＩｍ  Ｃｈｅｍ  ５３，１−９）。一方で、別の報告によれば、ヒト及びマウスの血清中の活性ヘプシジンは、通常のヒトヘプシジンについて１〜５００ｎｇ／ｍＬの血清の量的範囲でＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて測定された（Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｔ．，Ｗｉｔｃｈｅｒ，Ｄ．Ｒ．，Ｌｕａｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ，Ｖ．Ｊ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ  １１０，１０４８−５４）。
【０００９】
研究目的用のこれらの方法の利用にもかかわらず、質量分析法の先進技術は、臨床的用途において幅広く利用し易いものではない。これまでに記載された唯一の免疫学的検定方法は、プロヘプシジン（８４個のアミノ酸の活性ヘプシジンペプチド前駆体）を測定するものであり、血清ヘプシジン濃度がプロヘプシジン測定濃度に直接的に相関するという仮定に基づいている（Ｈａｄｌｅｙ，Ｋ．Ｂ，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｋ，ａｎｄ  Ｈｕｎｔ，Ｊ  Ｒ（２００６）ＡＭ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．８４，１５０−１５５）。しかしながら、プロヘプシジンＥＬＩＳＡを用いた別の研究によれば、血清プロヘプシジンレベルは、ＬＰＳ注入後の尿ヘプシジンレベルと相関しておらず、そのことが、診断のためのプロヘプシジン測定の利用を疑わしいものにしている（Ｋｅｍｎａ，Ｅ．，Ｐｉｃｋｋｅｒｓ，Ｐ，Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｅｖｅｎ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｗｉｎｋｅｌｓ，Ｄ（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０６，１８６４−１８６６）。
【００１０】
上記観点から、先端研究又は臨床的用途のために充分な量で機能的組み換えヘプシジンを生産することができる工程を提供する必要性、及び／又は、生体試料中で（すなわち診断目的のために）ヘプシジンの量を測定することができる信頼性のある分析法を提供する必要性があることは明らかである。
【００１１】
そのような工程及び／又は分析法を提供することが本発明の目的である。
【００１２】
本発明の第１の態様において、生物学的機能性ヘプシジン又は生物学的機能性ヘプシジン誘導体を生産する方法であって、真核性メチロトローフ酵母（好ましくはピキアパストリス）であるという点で特徴づけられる発現系内において、ヘプシジン又はヘプシジン誘導体を外因的に発現させるステップを具える方法を提供する。
【００１３】
本発明の第２の態様において、生物学的機能性ヘプシジン又は生物学的機能性ヘプシジン誘導体を生産する方法であって、該方法は発現系内においてヘプシジン又はヘプシジン誘導体を発現させるステップを具え、前記ヘプシジンがＣ末端に少なくとも１つの標識を有するように与えられる方法を提供する。
【００１４】
実験プロトコル及び添付された図面を参照してわかるように、本発明者らは、初めて、生物学的機能性組み換えヘプシジン又は生物学的機能性組み換えヘプシジン誘導体の成功した異種性発現を提供した。生物学的機能により、ヘプシジン及びヘプシジン誘導体のいずれもが殺菌性を有し、細胞の鉄代謝をコントロールする能力を有することが理解される。以前の組み換えヘプシジンを生産する試みと比較して、本方法又は本工程は、いかなる復元工程をも必要とせずに、可溶性発現及び高収率という長所を有することが理解されるだろう（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｙｕａｎ，Ｑ．，Ｚｈｕ，Ｙ．，Ｍａ，Ｒ．，（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４１，４０９−１６  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｆ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．，Ｒｉｖａｓ，Ｌ．，Ｓｌｙ，Ｌ．Ｉ．，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ，Ｖ．Ｎ．（２００６）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８８，３１−７）。より重要なことに、結果として生じるヘプシジン及び誘導体は、抗菌性ペプチドとしてのみでなく又は主として、細胞の鉄代謝を制御するものとして機能的であり、すなわち、それらは生物学的に機能性である。
【００１５】
ここで使用されているように、「ヘプシジン」という用語又は「Ｈｅｐ」という略語は、別段の定めがない限り、ヒトヘプシジン−２０及びヘプシジン−２５の両方、すなわち、それぞれ２０個及び２５個の成熟優勢型アミノ酸残基長のヒトホルモンヘプシジン、又は、ヘプシジン誘導体を包含する。この点で、ヒトヘプシジン−２０は、Ｈｅｐ２０と称され、配列番号のアミノ酸配列の配列番号１を有し、ヒトヘプシジン−２５は、Ｈｅｐ２５と称され、アミノ酸配列の配列番号２のアミノ酸配列を有する。ここで使用されているように、「誘導体」という用語は、別段の定めがない限り、ヒトヘプシジン−２０及びヘプシジン−２５の２０個及び２５個のアミノ酸残基の両方であって、Ｎ末端に位置する１以上の付加アミノ酸を有するものを包含する。また、「ヘプシジン」という用語、「Ｈｅｐ」という略語又は「誘導体」は、別段の定めがない限り、ヒトＨｅｐ−２０及びヒトＨｅｐ−２５を包含するヒトヘプシジンに限定されないことは理解されるであろう。
【００１６】
誘導体は、好ましくは、Ｎ末端に位置する２個の付加アミノ酸を有するヘプシジン−２０又はヘプシジン−２５である。好ましい実施形態において、誘導体は、付加アミノ酸であるグリシン及びアラニンをＮ末端に有するヘプシジン−２０であり；この誘導体は、本明細書中でヘプシジン−２０ｄと称され、配列番号３のアミノ酸配配列を有している。さらに好ましい実施形態において、誘導体は、付加アミノ酸であるグリシン及びアラニンをＮ末端に有するヘプシジン−２５であり；この誘導体は、本明細書においてヘプシジン−２５ｄと称され、配列番号４のアミノ酸配列を有している。
【００１７】
標識は、好ましくは、ポリヒスチジン標識である。理解されるように、ポリヒスチジン標識は、少なくとも６つのヒスチジン（Ｈｉｓ）からなる特徴的なアミノ酸の配列である。また、ポリヒスチジン標識は、ヘキサヒスチジン標識、６ｘＨｉｓ−標識、及び、登録商標名であるＨｉｓ−ｔａｇ（登録商標）として知られている。「Ｈｉｓ」という略語は、別段の定めがない限り、使用されるすべての箇所において、ポリヒスチジン標識を意味することは理解されるであろう。
【００１８】
標識は、さらに好ましくは、ｍｙｃ−Ｈｉｓ−標識である。上述したように、「Ｈｉｓ」という呼称は、別段の定めがない限り、ポリヒスチジン標識を意味する。「ｍｙｃ」という呼称は、ｃ−ｍｙｃエピトープである。
【００１９】
標識は、直接的又は間接的にヘプシジン又はヘプシジン誘導体のＣ末端に提供されていてもよいことが理解されるであろう。直接的に提供する場合は、標識は、ヘプシジン−２０、ヘプシジン−２５又はヘプシジン誘導体の末端のアミノ酸に連続して位置する。標識は、リンカーを介して間接的に位置してもよい。
【００２０】
好ましくは、リンカーは、ヘプシジン−２０、ヘプシジン−２５又はヘプシジン誘導体の末端のアミノ酸に連続して位置する１個以上のアミノ酸である。より好ましくは、リンカーは、２個のアミノ酸の長さであり、さらに好ましくは、アミノ酸は、フェニルアラニンとアスパラギン酸との組み合わせである。
【００２１】
代替的に、リンカーは、ヘプシジン−２０、ヘプシジン−２５又はヘプシジン誘導体の末端の１個以上のアミノ酸がアミノ酸で置換されたものである。より好ましくは、リンカーは、ヘプシジン−２０、ヘプシジン−２５又はヘプシジン誘導体の末端アミノ酸が１個のアミノ酸で置換されたものであり、さらに好ましくは、末端アミノ酸であるトレオニンがロイシンで置換されたものである。
【００２２】
好ましくは、Ｈｉｓ−標識は、ヘプシジン−２０又はヘプシジン−２５に、フェニルアラニンとアスパラギン酸とからなるリンカーを用いて提供される。さらに好ましくは、ｍｙｃ−Ｈｉｓ−標識は、ヘプシジン−２０又はヘプシジン−２５に、末端アミノ酸であるトレオニンを置換したロイシンのリンカーを用いて提供される。
【００２３】
好ましい実施形態において、Ｈｉｓ−標識は、末端アミノ酸であるトレオニンを置換したロイシンのリンカーにより、Ｎ末端に位置するグリシン及びアラニンを有するヘプシジン−２０誘導体に提供される。この生物学的機能性標識ヘプシジン誘導体は、ここにおいてヘプシジン−２０Ｈｉｓ（Ｈｅｐ−２０Ｈｉｓ）と称され、配列番号５のアミノ酸配列を有する。
【００２４】
さらに好ましい実施形態において、Ｈｉｓ−標識は、フェニルアラニンとアスパラギン酸とからなるリンカーにより、Ｎ末端に位置するグリシン及びアラニンを有するヘプシジン−２５誘導体に提供される。この生物学的機能性標識ヘプシジン誘導体は、ヘプシジン−２５Ｈｉｓ（Ｈｅｐ−２５Ｈｉｓ）と称され、配列番号６のアミノ酸配列を有する。
【００２５】
さらに好ましい実施形態において、ｍｙｃ−Ｈｉｓ標識は、末端のアミノ酸であるトレオニンを置換したロイシンのリンカーにより、Ｎ末端に位置するグリシン及びアラニンを有するヘプシジン−２０誘導体に提供される。この生物学的機能性標識ヘプシジン誘導体は、ヘプシジン−２０ＭｙｃＨｉｓ（Ｈｅｐ−２０ＭｙｃＨｉｓ）と称され、配列番号７のアミノ酸配列を有する。
【００２６】
さらに好ましい実施形態において、ｍｙｃ−Ｈｉｓ−標識は、末端のアミノ酸トレオニンを置換したロイシンのリンカーにより、Ｎ末端に位置するグリシン及びアラニンを有するヘプシジン−２５誘導体に対して提供される。この生物学的機能性標識ヘプシジン誘導体は、ヘプシジン−２５ＭｙｃＨｉｓ（Ｈｅｐ−２５ＭｙｃＨｉｓ）と称され、配列番号８のアミノ酸配列を有する。
【００２７】
好ましくは、生物学的機能性標識ヘプシジン又は生物学的機能性標識ヘプシジン誘導体は、発現系内において外因的に発現され、該発現系は、真核性メチロトローフ酵母（好ましくはピキアパストリス）である。以下に与えられる結果を参照すると、真核性メチロトローフ酵母であるピキアパストリス発現系は、細胞外可溶タンパク、真核性翻訳後修飾（ジスルフィド結合成形など）を生産する能力により、特に有利であることは理解されるであろう。また、その発現系は、取扱が容易であり、生産において高収率である。
【００２８】
本発明の方法は、好ましくは、ヘプシジン又はヘプシジン誘導体の発現に先立って、発現系（好ましくは真核性メチロトローフ酵母発現系、より好ましくはピキアパストリス）の中にヘプシジンをコードするポリヌクレオチド挿入物を含むベクターを導入するステップを具える。
【００２９】
ここで使用されているように、ヘプシジンをコードするポリヌクレオチド挿入物は、それぞれ配列番号１及び２の配列を有するヒトヘプシジン−２０及び−２５（ヒトＨｅｐ２０及びＨｅｐ２５）を含むヘプシジン、又は、それぞれ配列番号３及び４の配列を有するヘプシジン−２０ｄ及びヘプシジン−２５ｄを含むヘプシジン誘導体をコードすることができるポリヌクレオチドであることは理解されるであろう。また、ヘプシジンをコードするポリヌクレオチド挿入物は、好ましい標識（すなわち、Ｍｙｃ及び６ｘＨｉｓ）を有する標識ヘプシジン又は標識ヘプシジン誘導体、並びに／又は、配列番号５の配列を有するヘプシジン−２０Ｈｉｓ、配列番号６の配列を有するヘプシジン−２５Ｈｉｓ、配列番号７の配列を有するヘプシジン−２０ＭｙｃＨｉｓ、及び、配列番号８の配列を有するヘプシジン−２５ＭｙｃＨｉｓを含むリンカー（すなわち、フェニルアラニンとアスパラギン酸又はロイシン）でヘプシジン−２０及び−２５の末端アミノ酸が置換されたものをコードすることができるポリヌクレオチドを含む。
【００３０】
当業者は、ベクターが任意の適切なベクターであってもよいことを理解するであろう。ベクターは、例えば、ｐＰＩＣＺａＡ、ｐＰＩＣＺａＢ又はｐＰＩＣＺａＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア）であってもよい。ベクターは、好ましい標識（すなわちＭｙｃ及び６ｘＨｉｓ）、及び／又は、リンカー（すなわち、フェニルアラニンとアスパラギン酸、又は、ロイシンのみからなるアミノ酸）でヘプシジン−２０及び−２５の末端アミノ酸が置換されたものをコードすることができる。
【００３１】
ヘプシジンをコードするポリヌクレオチド挿入物は、好ましくは、Ｆｏｋｌ制限部位を有するように提供される。該挿入物のＦｏｋｌ制限特異的部位は、ベクターから制限部位と組み合わされて、Ｈｅｐ−２５ＭｙｃＨｉｓ、Ｈｅｐ−２０ＭｙｃＨｉｓ、Ｈｅｐ−２５Ｈｉｓ及びＨｅｐ−２０Ｈｉｓプラスミドであって、該プラスミドはＨｉｓ−エピトープのみと又はｃ−ＭｙｃＨｉｓに融合したヘプシジン−２５及びヘプシジン−２０並びにヘプシジン誘導体の発現を許容するものの構築を可能にする。
【００３２】
ヘプシジンをコードするポリヌクレオチド挿入物は、好ましくは、ヒトヘプシジン−２５ｄをコードする。また、前記方法は、ここにおいてＦｏｒＨｅｐ２５及びＲｅｖＨｅｐと称される重複オリゴヌクレオチドの伸長よって得られる生成物のＰＣＲ増幅によってヘプシジン−２５ｄをコードする挿入物を得るステップを具える。それらの配列は、図１に示されている。ＰＣＲ増幅は、さらに好ましくは、ここにおいてＦｏｒＸｈｏｌ及びＲｅｖＮｏｔｌと称されるプライマーを用いて行なわれる。それらの配列は、図１に示されている。
【００３３】
ヘプシジンをコードするポリヌクレオチド挿入物は、ヒトヘプシジン−２０ｄをコードすることが好ましい。また、前記方法は、好ましくは、ここにおいてＦｏｒｈｅｐ２０（５−ＧＣＧＡＧＴＧＣＡＴＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＣＡＴＣＴＴＣＴＧＣＴＧ−Ｓ）と称されるプライマー、及び、図１に配列が示されているＲｅｖＮｏｔｌを用いて、得られるベクターのＰＣＲ増幅を実行するステップを具える。
【００３４】
本発明の方法は、好ましくは、発現されたヘプシジンを精製するステップをさらに具える。好ましい実施形態において、精製ステップは２段階の精製工程を具える。精製工程の第１段階は、好ましくは、金属親和性クロマトグラフィーを含む。前記金属は、好ましくは、ニッケル、コバルト、ＮＴＡで配位されたニッケル（ニトリロ三酢酸）である。好ましい実施形態において、精製工程の第２段階は、ゲル濾過クロマトグラフィーを含む。好ましくは、セファロース又はスーパーデックス（商標）ペプチドカラムを用いる。
【００３５】
発現されたヘプシジンは、さらに好ましくはヒトヘプシジンであり、配列番号１の配列を有するヘプシジン−２０、配列番号２の配列を有するヘプシジン−２５、配列番号３の配列を有するヘプシジン−２０ｄ、配列番号４の配列を有するヘプシジン−２５ｄ、配列番号５の配列を有するヘプシジン−２０Ｈｉｓ、配列番号６の配列を有するヘプシジン−２５Ｈｉｓ、配列番号７の配列を有するヘプシジン−２０ＭｙｃＨｉｓ、及び、配列番号８の配列を有するヘプシジン−２５ＭｙｃＨｉｓからなる群より好適に選択される。
【００３６】
本発明のさらなる態様において、本発明の方法を実行することにより入手可能なヘプシジンを提供する。
【００３７】
ヘプシジンは、好ましくは、配列番号６の配列を有するヒトヘプシジン−２５Ｈｉｓである。下記実験プロトコルに準拠して、ヒトヘプシジン−２５Ｈｉｓ（Ｈｅｐ−２５Ｈｉｓ）が最も機能性であることは明らかであった。それは、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＬ３５に対する最大の殺菌力を示し、尿から単離された天然ヘプシジン−２５又は合成ヘプシジンに非常に似ていた。Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｈ．，Ｖａｌｏｒｅ，Ｅ．Ｖ．，Ｗａｒｉｎｇ，Ａ．Ｊ．，Ｇａｎｚ，Ｔ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，７８０６−１０によれば、ｈｅｐ２５及びｈｅｐ２０のいずれもが３０μＭの濃度において生存するバクテリアＭＬ３５ｐを１０００倍の減少を達成した。また、Ｈｅｐ−２５Ｈｉｓは、生存するバクテリアの数を３０μＭで１０００倍減少させた。更に、Ｈｅｐ−２５Ｈｉｓペプチドもまた、標的ＲＡＷ２６４．７マクロファージにおいて、フェロポルチンレベルを５０％まで減少させることができた。この効果は、明らかに輸送体フェロポルチン（ＦＰＮ１）の内在化及び分解のためであった。この作用機構は、安定した細胞系ＨＥＫ２９３−Ｆｐｎにおいて試験され、組み換えペプチドＨｅｐ２５−Ｈｉｓを用いた処理は、合成ヘプシジンとの類似性により、ＦＰＮ１−ＧＦＰの内在化を生じさせることを示した（Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，Ｔｕｒｔｌｅ，Ｍ．Ｓ．，Ｐｏｗｅｌｓｏｎ，Ｊ．，Ｖａｕｇｈｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｄｏｎｏｖａｎ，Ａ．，Ｗａｒｄ，Ｄ．Ｍ．Ｇａｎｚ，Ｔ．，Ｋａｐｌａｎ，Ｊ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６，２０９０−３）。Ｈｅｐ−２５Ｈｉｓで媒介されてＴｆＲ１発現が５０％まで付随的に減少することは、鉄分子を搬出する分子を比較的少なく発現する細胞内において予想される鉄蓄積に対する恒常的反応と一致している。Ｈｅｐ−２５Ｈｉｓ−で処理されたＲＡＷ２６４．７マクロファージ内の鉄の保持率は、ＬＩＰレベルの増加によって実証される。ピキアパストリスの中でベクターのみで生産され、Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−標識を有する、４．８ｋＤａの陰性ペプチドを用いたデータは、この反応の特異性を示す。さらに、架橋及びプルダウンアッセイにより、組み換えペプチドが受容体（フェロポルチン）に特異的に結合できることを実証する。
【００３８】
以下の結果によって、配列番号６の配列を有するＨｅｐ−２５Ｈｉｓは、ヘプシジン−２５の非常に良い類似化合物であり、挙動がよく似ていることが明確である。それは、発酵規模が大きくなるにつれてさらに増大した量で発現される。組み換えヘプシジンを生産するための以前の試みと比較して、この系には、いかなる復元処理をも必要とせずに、高収率な可溶性発現を提供するという長所がある（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｙｕａｎ，Ｑ．，Ｚｈｕ，Ｙ．，Ｍａ，Ｒ．，（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４１，４０９−１６  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｆ．，ｇ，Ｈ．，Ｍ．Ｄ．，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．，Ｒｉｖａｓ，Ｌ．，Ｓｌｙ，Ｌ  Ｉ．，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ，Ｖ．Ｎ．（２００６）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８８，３１−７）。ピキアパストリスにおいて発現される配列番号６の配列を有する組み換えＨｅｐ−２５Ｈｉｓは、抗菌性ペプチドとしてだけでなく、細胞の鉄代謝のレギュレーターとしても機能性であることをより重要なこととして報告する。
【００３９】
本発明の別の態様において、ＦｏｒＨｅｐ２０、ＦｏｒＨｅｐ２５、ＲｅｖＨｅｐ、ＦｏｒＸｈｏｌ及びＲｅｖＮｏｔｌからなる群より選択されるプライマーのいずれか１つの使用を提供する。これらの配列は、図１に示されており、ポリヌクレオチドをコードするヘプシジンを増幅させるために、好ましくは、配列番号１の配列を有するヒトヘプシジン−２０、配列番号２の配列を有するヘプシジン−２５、配列番号３の配列を有するヘプシジン−２０ｄ、及び、配列番号４の配列を有するヘプシジン−２５ｄをコードするポリヌクレオチドである。
【００４０】
また、ヘプシジン（好ましくは、配列番号１の配列を有するヘプシジン−２０、配列番号２の配列を有するヘプシジン−２５、配列番号３の配列を有するヘプシジン−２０ｄ、配列番号４の配列を有するヘプシジン−２５ｄ、配列番号５の配列を有するヘプシジン−２０Ｈｉｓ、配列番号６の配列を有するヘプシジン−２５Ｈｉｓ、配列番号７の配列を有するヘプシジン−２０ＭｙｃＨｉｓ、及び、配列番号８の配列を有するヘプシジン−２５ＭｙｃＨｉｓを含むヒトヘプシジン）を発現させるために、真核性メチロトローフ酵母（好ましくはピキアパストリス）使用をする方法を提供する。
【００４１】
本発明のある別の態様において、標識ヘプシジン（好ましくは、配列番号５の配列を有するヘプシジン−２０Ｈｉｓ、配列番号６の配列を有するヘプシジン−２５Ｈｉｓ、配列番号７の配列を有するヘプシジン−２０ＭｙｃＨｉｓ、及び、配列番号８の配列を有するヘプシジン−２５ＭｙｃＨｉｓからなる群より選択されるヒトヘプシジン）を提供する。ヘプシジンは、好ましくは、配列番号６の配列を有するヒトヘプシジン−２５Ｈｉｓである。
【００４２】
本発明のさらなる態様において、本発明の標識ヘプシジン又は標識ヘプシジン誘導体に特異的に結合する抗体を提供する。「特異的に結合する」とは、２つの分子間の特有で正確な相互作用であって、該２つの分子構造に依存する相互作用を指す。
【００４３】
また、抗体、好ましくはモノクローナル又はポリクローナル抗体を上昇させるに本発明の標識ヘプシジン又は標識ヘプシジン誘導体を使用する方法を提供する。抗体は、好ましくは、ヒトヘプシジン−２５Ｈｉｓを用いてウサギに免疫を付与することにより得られるポリクローナル抗体である。本発明の方法に適する抗体又はその断片には、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｃ断片、抗体ペプチド融合タンパク、並びに、軽鎖及び重鎖の単量体若しくは二量体又はこれらの混合物が含まれる。
【００４４】
本発明のさらなる態様において、抗菌物質としての用途を含む治療用途のための本発明のヘプシジン又はヘプシジン誘導体を提供する。
【００４５】
本発明のさらなる態様において、鉄代謝をコントロールにおける用途のための本発明のヘプシジン又はヘプシジン誘導体を提供する。ヘプシジン又はヘプシジン誘導体は、鉄の吸収を阻害する。また、鉄代謝のコントロールに用いる本発明のヘプシジン又はヘプシジン誘導体の阻害剤を使用する方法を提供する。前記阻害剤は鉄吸収を増加させる。
【００４６】
また、サンプル内のヘプシジン又はヘプシジン誘導体レベルを検知する本発明の抗体の使用方法を提供する。好ましい実施形態において、サンプルは血清サンプルであり、好ましくはヒト血清又は尿である。検知されるヘプシジンは、好ましくは、サンプル内のヒトヘプシジン−２０ｄ又は−２５ｄである。
【００４７】
本発明の別の態様において、サンプル（好ましくは、ヒト血清サンプル）内のヘプシジン又はヘプシジン誘導体の量を決定するためにＥＬＩＳＡ競合試験に本発明の抗体を使用する方法を提供する。好ましくは、この抗体を用いてサンプル内のヒトヘプシジン−２０ｄ又は−２５ｄの量を測定する。
【００４８】
本発明のさらなる態様において、血清サンプル内のヘプシジンの量を測定する方法であって、該方法は、以下のステップ：
ａ）血清サンプル内の固定化されたヘプシジン及びヘプシジンに特異的に結合する抗体を含む血清サンプルと固定化されたヘプシジンとを接触させるステップ；
ｂ）固定化されたヘプシジンに結合した抗体の量を測定するステップ；及び、
ｃ）測定量と標準とを比較することによって、血清サンプル内のヘプシジンの量を測定するステップと、
を具える方法を提供する。
【００４９】
本発明の分析法、すなわち、ヘプシジン測定のエリザ法は、サンプル予備処理を不要にし、単純であり、高速であり、高度に再現可能であり、特異的であり、すべての臨床及び研究室において広く適用できることを含めたいくつかの長所を有している。鉄に関連する疾病のタンパク指標として、臨床及び研究室において日常的にヘプシジンを測定することを可能とし、さらに、それらの進行の迅速な診断及びモニタリングに寄与する。
【００５０】
好ましい実施形態において、標準は、以下のステップ：
ａ）ヘプシジンと固定化されたヘプシジンとに特異的に結合する抗体を含む既知濃度のヘプシジンを含むサンプルと、固定化されたヘプシジンとを接触させるステップ；
ｂ）固定化されたヘプシジンに結合した抗体の量を測定するステップ；
ｃ）結果を記録するステップ；
ｄ）前のサイクルのステップａ）において用いられた濃度とは異なる既知の濃度のヘプシジンを含むさらなるサンプルを用いてステップａ）〜ｃ）のサイクルを繰り返すステップ；及び、
ｅ）適切な標準曲線が生成されるまでステップｄ）を繰り返すステップ、
により生成される阻害曲線である。
【００５１】
固定化ヘプシジンは、配列番号１の配列を有するヘプシジン−２０、配列番号２の配列を有するヘプシジン−２５、配列番号３の配列を有するヘプシジン−２０ｄ、配列番号４の配列を有するヘプシジン−２５ｄ、配列番号５の配列を有するヘプシジン−２０Ｈｉｓ、配列番号６の配列を有するヘプシジン−２５Ｈｉｓ、配列番号７の配列を有するヘプシジン−２０ＭｙｃＨｉｓ、及び、配列番号８の配列を有するヘプシジン−２５ＭｙｃＨｉｓであってもよいことは理解されるであろう。固定化ヘプシジンは、好ましくは、配列番号６の配列を有するヘプシジン−２５Ｈｉｓである。
【００５２】
前記標準は、好ましくは、配列番号６の配列を有する既知量のヘプシジン−２５Ｈｉｓを含むサンプルを用いて得られる。
【００５３】
本発明のさらなる態様において、ヘプシジンを含む血清サンプル内のヘプシジンの量を測定するために用いられるＥＬＩＳＡキット、並びに、ヘプシジン及び測定するヘプシジンに特異的に結合する抗体を提供する。ヘプシジンは固定化されていることが好ましい。前記キットは、好ましくは、さらに、互いに異なる様々な濃度でヘプシジンを含む複数の容器又は管を具えている。
【００５４】
また、血色素症若しくは血色素症から生じる疾患又は鉄過剰に関連する他の病状を治療又は防止する用途のために本発明の標識ヘプシジンを使用する方法を提供する。前記血色素症から生じる疾患は、肝細胞癌、心筋症又は糖尿病からなる群より選択されうる。標識ヘプシジン及び標識ヘプシジン誘導体は、鉄吸収を阻害することにより鉄代謝を制御する。
【００５５】
また、貧血若しくはそこから結果として生じる疾患又は鉄不足に関連する病状を治療又は防止する用途に本発明の標識ヘプシジンの阻害剤を使用する方法を提供する。好ましい実施形態において、この阻害剤は、本発明の抗体である。阻害剤は、鉄吸収を増加させるか又は高いレベルのヘプシジンを失活させることにより鉄代謝を制御する。
【００５６】
本発明の標識ヘプシジンは、配列番号５の配列を有するヘプシジン２０Ｈｉｓ、配列番号６の配列を有するヘプシジン−２５Ｈｉｓ、配列番号７の配列を有するヘプシジン−２０ＭｙｃＨｉｓ、及び、配列番号８の配列を有するヘプシジン−２５ＭｙｃＨｉｓを含むことが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
以下において本発明者らが実行した限定的でない下記実験プロトコルと共に下記図面を参照して本発明を例示する。
【図１】図１．ピキアパストリスのベクターｐＰｉｃＺａＣにおけるＨｅｐ２５及びＨｅｐ２０のクローニング処理  伸長に用いた長い重複するオリゴヌクレオチド（ＦｏｒＨｅｐ２５及びＲｅｖＨｅｐ）を太字イタリックで示す。Ｈｅｐ２５のＰＣＲ用の短いプライマー（ＦｏｒＸｈｏ、ＲｅｖＮｏｔｌ）及びＨｅｐ２０のＰＣＲに用いられたＦｏｒＨｅｐ２０を長い矢印で示す。構築された標識ペプチドのために用いられたＦｏｋｌ部位だけでなく、ｐＰｉｃＺａＣベクター内にヘプシジンＰＣＲ生成物を複製するために用いたＸｈｏｌ及びＮｏｔｌ制限部位を記載した。付加的にテトラペプチドを含む分泌タンパクを結果として生じさせるＳＴＥ１３プロテアーゼの無効化が従来の研究において観察されたので、Ｋｅｘ２切断部位をヘプシジンのＤＮＡ塩基配列よりも前方に位置させた。
【図２】図２．Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー後における精製された標識ヘプシジンの分析  Ｎｕ−ＰＡＧＥ４−１２％ゲルを用いた変性させない条件下でのＮｉ−ＮＴＡ精製後の標識ヘプシジンの電気泳動の後、クマシーブルー染色Ａ及び抗Ｈｉｓ−ｍＡｂＢを用いたウェスタンブロットを行い、予想したよりも高い分子量を有し、おそらくオリゴマーに対応するバンドが検出された。ペプチドの単量体形態を矢印で示す。Ｍ：ＳｅｅＢｌｕｅ予備染色マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２：Ｈｅｐ−２５Ｈｉｓ（配列番号６の配列を有する。）、３：Ｈｅｐ−２５ＭｙｃＨｉｓ（配列番号８の配列を有する。）、４：Ｈｅｐ−２０ＭｙｃＨｉｓ（配列番号７の配列を有する。）
【図３】図３．スーパーデックスペプチドカラムを用いたＨｅｐ２５−Ｈｉｓのサイズ排除クロマトグラフィー  ペプチドスーパーデックスカラムを用いたＦＰＬＣ  ＡＫＴＡシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により、Ｎｉ−ＮＴＡ精製されたＨｅｐ−２５Ｈｉｓ（配列番号６の配列を有する。）のサイズ排除クロマトグラフィーをおこなった。２１５ｎｍの吸収において、第１ピーク（＊＊）は、Ｎｉ−ＮＴＡ精製されたペプチドのオリゴマーに対応し、また、第２ピーク（＊）は、モノマー画分に対応する。
【図４】図４．サイズ排除クロマトグラフィー後の精製された標識ヘプシジン単量体の分析  精製された標識ヘプシジンをクマシーブルー染色を後に伴って、変性させない条件下でＮｕ−ＰＡＧＥ４−１２％ゲルを用いて分析した。Ｍ：ＳｅｅＢｌｕｅ予備染色マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１：合成ヘプシジン（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、２：配列番号６の配列を有するＨｅｐ−２５Ｈｉｓ（４ｋＤａ）、３：配列番号８の配列を有するＨｅｐ−２５ＭｙｃＨｉｓ（４．８ｋＤａ）、４：配列番号７の配列を有するＨｅｐ−２０ＭｙｃＨｉｓ（５．２ｋＤａ）最終的に精製された組み換えヘプシジンは、予想される分子量を有する単量体のように泳動する。
【図５】図５．組み換え標識ヘプシジンの抗菌活性  配列番号２の配列を有する合成ヘプシジン２５（ｓ．Ｈｅｐ２５）、配列番号６の配列を有するＨｅｐ−２５Ｈｉｓ、配列番号８の配列を有するＨｅｐ−２５ＭｙｃＨｉｓ、配列番号７の配列を有するＨｅｐ−２０ＭｙｃＨｉｓ、及び、配列番号９の配列を有する陰性ペプチドの抗菌活性を決定するために、記載されている濃度、３７℃、２時間において大腸菌ＭＬ３５株をＣＦＵ分析に供した。リン酸ナトリウム緩衝液をネガティブコントロールとして用いた。
【図６】図６．組み換え標識ヘプシジンは、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ中の不安定鉄貯蔵（Ｌａｂｉｌｅ  Ｉｒｏｎ  Ｐｏｏｌ、ＬＩＰ）を増加させる。  配列番号６の配列を有する１０μＭのＨｅｐ−２５Ｈｉｓ、配列番号８の配列を有する１０μＭのＨｅｐ−２５ＭｙｃＨｉｓ、配列番号７の配列を有する１０μＭのＨｅｐ−２０ＭｙｃＨｉｓ、及び、配列番号９の配列を有する１０μＭの陰性のペプチドを用いてＲＡＷ２６４．７マクロファージを３７℃で４時間処理した。ＰＢＳをネガティブコントロールとして用い、３０μｇ／ｍｌのＦＡＣをポジティブコントロールとして用いた。イソニコチノイル−ヒドラクソンサルチルアルデヒドを添加して、ＬＩＰの相対的な変化をカルセインを用いてモニターした。データは、３回おこなった２つの独立した実験の平均±標準偏差により、コントロールと対比して表す。  ＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５    ｔ検定を用いて統計分析をおこなった。
【図７】図７．組み換え標識ヘプシジンは、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ中のフェロポルチン及びＴｆＲ１を減少させるように下方制御する。  Ａ  ＲＡＷ２６４．７マクロファージを１μＭ及び１０μＭの合成ヘプシジン−２５（配列番号２の配列を有する。）、Ｈｅｐ−２５Ｈｉｓ（配列番号６の配列を有する。）、又は、ネガティブコントロールとしてＰＢＳを用いて３７℃で４時間処理した。細胞溶解物を、８％のＳＤＳ  ＰＡＧＥ、並びに、ＴｆＲ１、フェロポルチン、及び、ローディングコントロールとしてアクチンに対する抗体を用いたウェスタンブロットに供した。  Ｂ  ２つの独立した実験に由来するフェロポルチンのバンド、ＴｆＲ１のバンド、及び、アクチンタンパクのバンドの信号密度をデンシトメトリにより定量し、また、これらのアクチンに対する相対強度を算出した。データは、各実験条件について、ＴｆＲ１の比率の平均値、又は、アクチンレベル±標準偏差に対する平均値として示す。  ＊ｐ＜０．０１  ｔ検定を用いて統計分析をおこなった。  Ｃ  Ｈｅｐ２５−ＨｉｓはＦＰＮ１に特異的に結合する。Ｈｅｐ２５−Ｈｉｓ、陰性ペプチド及びＰＢＳをＲａｗ２６４．７マクロファージと共に培養し、その後、ＤＳＳを用いて架橋させた。細胞溶解物をＮｉ２−ＮＴＡと共に培養し、溶出液を抗ＦＰＮ１Ａｂを用いたウェスタンブロットにより分析した。  Ｄ  Ｈｅｐ２５−ＨｉｓはＦＰＮ１−ＧＦＰの内在化を引き起こす。ＨＥＫ２９３−Ｆｐｎ細胞を、ポナステロンを用いて２４時間誘導し、その後、Ｈｅｐ２５−Ｈｉｓ又は合成ヘプシジン２５（ｓ．Ｈｅｐ２５）を用いて３時間処理した。Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ共焦点顕微鏡を用いて螢光を視覚化した。
【図８】図８．ヘプシジン−２５に対するポリクローナル血清の特異性。  ポリクローナル血清を、配列番号６の配列を有するＨｅｐ−２５Ｈｉｓ、６ｘＨｉｓ（ｃｏｖａｎｃｅ社製）、及び、ネガティブコントロールとしてのＢＳＡに結合するかについて、各精製ステップ前後にＥＬＩＳＡにより評価した。重複して行った実験の平均値±標準偏差としてデータを表す。
【図９】図９．肝組織切片のヘプシジン２５−Ｈｉｓ（ａ−Ｈｅｐ２５）に対するポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学的染色。  第２の抗ウサギ抗体をネガティブコントロール（陰性）として用いた。ポリクローナル抗体の特異性は、ヘプシジン２５−Ｈｉｓを用いた予備培養の後に続く信号の遮断後に確認された。
【図１０】図１０．可溶性組み換えＨｅｐ２５−Ｈｉｓの濃度上昇を用いた阻害ＥＬＩＳＡの標準曲線。  Ｈｅｐ２５に対するポリクローナル抗血清を３％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：３０００に希釈し、様々な量（０．００５〜０．５ｎｇ／ｍｌ）の配列番号６の配列を有するＨｅｐ−２５Ｈｉｓと共に溶液で４℃で予備培養した。翌日、複合体をＨｅｐ−２５Ｈｉｓでコーティングした穴に入れ、競合させるために３７℃で１時間放置した。濃度に依存した抗血清結合の阻害が観察された。すべてのサンプルを４回反復して評価した。
【図１１】図１１．健康な対照（コントロール）及び若年性血色素症（ＪＨ）患者におけるヘプシジン血清中濃度。ボックスプロットは、各グループについて、メジアン値の百分順位の第２５番目及び第７５番目を示している。また、最小値及び最大値が図示されている。コントロールと比較した差は、非パラメーター性マンホイットニー検定（ＳＰＳＳ  １６．０ソフトウェア）により有意である。
【図１２】図１２は、ヘプシジン−２０（配列番号１）、ヘプシジン−２５（配列番号２）、ヘプシジン誘導体であるヘプシジン−２０ｄ（配列番号３）、ヘプシジン−２５ｄ（配列番号４）、並びに、標識ヘプシジン誘導体であるヘプシジン−２０Ｈｉｓ（配列番号５）、ヘプシジン−２５Ｈｉｓ（配列番号６）、ヘプシジン−２０ＭｙｃＨｉｓ（配列番号７）、ヘプシジン−２５ＭｙｃＨｉｓ（配列番号８）、及び、陰性ペプチド（配列番号２）：配列番号１  ＩＣＩＦＣＣＧＣＣＨＲＳＫＣＧＭＣＣＫＴ  配列番号２  ＤＴＨＦＰＩＣＩＦＣＣＧＣＣＨＲＳＫＣＧＭＣＣＫＴ  配列番号３  ＧＡＩＣＩＦＣＣＧＣＣＨＲＳＫＣＧＭＣＣＫＴ  配列番号４  ＧＡＤＴＨＦＰＩＣＩＦＣＣＧＣＣＨＲＳＫＣＧＭＣＣＫＴ  配列番号５  ＧＡＩＣＩＦＣＣＧＣＣＨＲＳＫＣＧＭＣＣＫＴＦＤＨＨＨＨＨＨ  配列番号６  ＧＡＤＴＨＦＰＩＣＩＦＣＣＧＣＣＨＲＳＫＣＧＭＣＣＫＴＦＤＨＨＨＨＨＨ  配列番号７  ＧＡＩＣＩＦＣＣＧＣＣＨＲＳＫＣＧＭＣＣＫＬＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＳＡＶＤＨＨＨＨＨＨ  配列番号８  ＧＡＤＴＨＦＰＩＣＩＦＣＣＧＣＣＨＲＳＫＣＧＭＣＣＫＬＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＡＶＤＨＨＨＨＨＨ  配列番号９  ＳＭＮＳＲＧＰＡＧＲＬＧＳＶＰＲＡＡＡＡＡＳＦＬＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＳＡＶＤＨＨＨＨＨＨのアミノ酸配列を列挙する。
【００５８】
実験手順
非標識ヘプシジン及び標識ヘプシジンの発現のためのプラスミド構築−特異的プライマーを用いて、７８及び８０の塩基長の２つの重複するオリゴヌクレオチドの伸長、及び、その後のＰＣＲ増幅により、ヘプシジン−２５（７５ｂｐ）を合成的に構築した。
【００５９】
図１は、重複するオリゴヌクレオチドＦｏｒＨｅｐ２５の配列を示しており、該配列は、信号配列のＫＥＸ２切断部位と共にＸｈｏｌ部位を含んでおり、さらに、Ｎｏｔｌ部位及び停止コドンを含むＲｅｖＨｅｐｌｏｎｇを含んでいた。
【００６０】
重複するオリゴヌクレオチドの伸長後に、ＦｏｒＸｈｏｌ及びＲｅｖＮｏｔｌプライマー（図１）を用いてＰＣＲ増幅を行った。組み換えペプチドがＡＯＸプロモーターの転写制御下でリーダーペプチドａ−ｆａｃｔｏｒにより可溶性発現に誘導されるように、得られるＰＣＲ生成物をｐＰＩＣＺａＣベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバード、カリフォルニア）のＸｈｏｌ−Ｎｏｔｌ部位に挿入した。
【００６１】
特異的な上流プライマーを用いて、クローンされたＨｅｐ−２５−ｐＰＩＣＺａＣベクターを鋳型としてヘプシジン−２０（６０ｂｐ）のＰＣＲ増幅に用いた。Ｆｏｒｈｅｐ２０（５−ＧＣＧＡＧＴＧＣＡＴＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＣＡＴＣＴＴＣＴＧＣＴＧ−３）及び前述したＲｅｖＨｅｐｌｏｎｇプライマー。
【００６２】
非標識ヘプシジンを発現させるために、両方の構築物は、ｐＰＩＣＺａＣベクターのｃ−ｍｙｃ及び６ｘＨｉｓエピトープの直前に停止コドンを有していた。標識された構築物を生産するために、得られる組換プラスミドＨｅｐ−２５及びＨｅｐ−２０を適切な酵素修飾に供した。ベクター由来のＸｂａｌ及びＳａｌｌ制限部位と組み合わせて、前記挿入物のＦｏｋｌ制限部位を、配列番号１の配列を有するヘプシジン−２０、配列番号２の配列を有するヘプシジン−２５、配列番号３の配列を有するヘプシジン−２０ｄ、及び、ｃ−ＭｙｃＨｉｓエピトープ又はＨｉｓのみのエピトープに結合した配列番号４の配列を有するヘプシジン−２５ｄ（配列番号５〜８の配列を有する標識ヘプシジン及び標識ヘプシジン誘導体）を発現させるＨｅｐ−２５ＭｙｃＨｉｓ、Ｈｅｐ−２０ＭｙｃＨｉｓ、Ｈｅｐ−２５Ｈｉｓ及びＨｅｐ−２０Ｈｉｓプラスミドの構築に用いた。
【００６３】
すべてのＤＮＡ操作を記載されているように実行した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）。また、ＤＮＡ塩基配列決定によってすべての構築物を確認した。
【００６４】
すべての組換プラスミドをＰｍｅｌ制限酵素を用いて線形化し、さらに、電気穿孔法（Ｂｉｏｒａｄ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア）によりピキアパストリス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア）のＸ３３株に転換した。３０℃、３日間の培養後に、１００μｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、カリフォルニア）を含むＹＰＤ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％デキストロース）寒天平板上で選択を行った。
【００６５】
ピキアパストリスにおける発現−各電気穿孔に由来するいくつかの個々のクローンを２ｍｌ  ＢＭＧＹ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、１．３４％ＹＮＢ、４×１０−５％ビオチン及び１％グリセロール）の中で３０℃で１６時間培養した。続いて、発現を誘導するために２ｍｌのＢＭＭＹ（グリセロールに代えて０．５％メタノール）中で細胞を再懸濁した。
【００６６】
０．５体積％メタノールを毎日添加して５日間誘導した後に、非標識ペプチド用のポリクローナル抗ヘプシジン抗体（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、サンアントニオ、テキサス）、又は、標識されたペプチド用の抗Ｈｉｓ−（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー）若しくは抗Ｍｙｃ  ９Ｅ．１０  ｍＡｂ（ＡＴＣＣ）を用いたドットブロット分析によって、ヘプシジンの発現について培養液上清を評価した。最も高収率のクローンを大規模発現に用いた。以後すべての調製において、メタノール誘導から３６時間経過時に細胞を採集した。
【００６７】
ペプチドの精製及び分析−培養液上清を０．２２μｍフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ベッドフォード、マサチューセッツ）を通して濾過し、濃縮し、１ｋＤａフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ベッドフォード、マサチューセッツ）を具えるＴＦＦプレップスケール限外濾過システムを用いて５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析した。前述したように、セファデックスＧ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社  ピスカタウェイ、ニュージャージー）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーに非標識ヘプシジンを供した（Ｔｏｍｏｓｕｇｉ，Ｎ．，Ｋａｗａｂａｔａ，Ｈ．，Ｗａｋａｔａｂｅ，Ｒ．，Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．Ｙａｍａｙａ，Ｈ．，Ｕｍｅｈｅｒａ，Ｈ．，Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｉ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ  １０８，１３８１−７）。製造会社の使用説明書（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、カリフォルニア）に従ってＮｉ−ＮＴＡ金属親和性クロマトグラフィーを用いてペプチドを含む６ｘＨＩＳの第１段階精製を行なった。５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾールを用いて陰性条件下で溶出させた。溶出液を凍結乾燥によって濃縮し、さらに、ヘプシジン単量体を分離するために、製造会社の使用説明書に従って、１００−７０００Ｄａのペプチドの分離に特異的なペプチドスーパーデックスカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー）を具えるサイズ排除クロマトグラフィーに供した。ＦＰＬＣ  ＡＫＴＡシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー）を用いてすべてのサイズ排除クロマトグラフィー分析を行った。ペプチドを製造会社の使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、カリフォルニア）に従って非還元条件下で４−１２％のＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘビス／トリスゲルを用いた電気泳動に供し、その後にクマシーブリリアントブルー染色を行った。製造会社の使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバード、カリフォルニア）に従ってＸＣｅｌｌ  ＩＩブロットモジュールを用いて標識ヘプシジンのウェスタンブロットを行った。０．１μｍの細孔径を有するプロトラン（Ｐｒｏｔｒａｎ）ニトロセルロース膜（シュライヒャー＆シュル社、ダッセル、ドイツ）をペプチドの輸送に用い、その後に１：１０００の希釈した抗Ｈｉｓ−ＭＡｂを用いてプローブした。ＨＲＰ（１：５０００に希釈したもの）と結合した抗マウス二次抗体は、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（カーピンテリア、カリフォルニア）によって購入された。製造会社の使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、カリフォルニア）に従って蛍光定量化システム（Ｑｕａｎｔ−Ｉｔ  Ｑｕｂｉｔ）を用いて精製されたヘプシジンの定量を行った。Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（ルイビル、ケンタッキー）からコントロールとして用いた合成ヘプシジン２５を購入した。
【００６８】
抗菌分析−大腸菌ＭＬ３５に対する抗菌活性について精製された組み換えヘプシジンのすべてを評価した。また、ＢＬ２１（ＤＥ）はＣＦＵ分析である（Ｐｏｒｔｅｒ  Ｅ．Ｍ．，ｖａｎ  Ｄａｍ  Ｅ．，Ｖａｌｏｒｅ  Ｅ．Ｖ．，Ｇａｎｚ  Ｔ．，ヒト腸由来デフェンシン５の広域スペクトル抗菌活性，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５（１９９７）２３９６−２４０１）。細菌性細胞培養は、ＯＤ６００＝０．２（５×１０７ｃｆｕ／ｍｌ）に増殖し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で最終濃度１０６ｃｆｕ／ｍｌで再懸濁させた。様々な濃度ペプチドを加えて最終体積が１００μｌとなるようにして、３７℃、２時間の培養後に生存細胞を３枚のＬＢ／寒天プレートに被覆させた。
【００６９】
細胞系−ＴＨＰ−１ヒト単球細胞系及びＪ７７４マウス単球細胞系を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液を含むＲＰＭＩの中において３７℃で保持した。５％ＣＯ２  ＲＡＷ２６４．７マウス単球細胞系、及び、ＥｃＲ２９３Ｔが核酸に導入された細胞（Ｄｒ．Ｋａｐｌａｎの厚意により提供されたもの）（Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，Ｔｕｔｔｌｅ，Ｍ．Ｓ．，Ｐｏｗｅｌｓｏｎ，Ｊ．，Ｖａｕｇｈｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｄｏｎｏｖａｎ，Ａ．，Ｗａｒｄ，Ｄ．Ｍ．Ｇａｎｚ，Ｔ．，Ｋａｐｌａｎ，ｊ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６，２０９０−３)を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液を補完したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、米国）の中において３７℃で保持した。核酸に導入されたフェロポルチン−ＧＦＰのエクジソンプロモーターの下における選択を維持するために、５％のＣＯ２  ４００μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、カリフォルニア）及び４００μｇ／ｍｌ  ジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ、米国）を、安定的に核酸が導入されたＥｃＲ２９３Ｔ細胞系に添加した。１０μＭ  ポナステロン（ｓｉｇｍａ  ｃｈｅｍ社、セントルイス  マサチューセッツ）の添加はフェロポルチン−ＧＦＰ［１０］の発現を誘導した。
【００７０】
ウェスタンブロッティング−１×１０６細胞（ＲＡＷ２６４．７、ＴＨＰ−１又はＪ７７４）を６穴プレート内に被覆させ、さらに、１２−２０時間後に細胞を無血清ＤＭＥＭ中のヘプシジンを用いて３７℃で４時間処理した。その後に、細胞を、溶解緩衝剤（１％トリトン、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、タンパク阻害剤（ロッシュ社、マンハイム、ドイツ））の中で再懸濁し、さらに、ブラッドフォード分析法（Ｂｉｏｒａｄ社、ヘラクレス、カリフォルニア）によって定量した。３０μｇの細胞溶解産物を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。タンパクをハイボンドＣニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー）に移し、さらに、一次抗体であるウサギ抗フェロポルチン（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、サンアントニオ、テキサス）、マウス抗ＴｆＲ１（Ｚｙｍｅｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、カリフォルニア）及びマウス抗βアクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、サンタクルーズ、カリフォルニア）の１：１０００の希釈液で、その膜を４℃で一晩培養した。洗浄後に、ＨＲＰと結合した抗ウサギ二次抗体、及び、ＨＲＰと結合した抗マウス二次抗体の１：５０００の希釈液（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社、カーピンテリア、カリフォルニア）でその膜を室温で１時間培養した。化学発光分析キット（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー）を用いて特異的信号を検知した。Ｑｕａｎｔｉｔｙ−Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ社、ヘラクレス、カリフォルニア）を使用してデンシトメトリーによりバンドを定量した。データを平均値±標準偏差で示す。スチューデントのｔ検定により統計分析を行った。
【００７１】
ＬＩＰ分析法−ＬＩＰ（不安定鉄貯蔵）レベルの変化を測定するために蛍光性金属検出カルセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージン、オレゴン）を用いた（Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｔ．，Ｗｉｔｃｈｅｒ，Ｄ．Ｒ．，Ｌｕａｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ，Ｖ．Ｊ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ１１０，１０４８−５４）。１×１０６ＲＡＷ２６４．７マクロファージを６穴プレート内に被覆させた。培養の１６時間後に、３７℃の無血清ＤＭＥＭに組み換えヘプシジンを１０μＭで４時間にわたって加え、続いて、０．２５μＭカルセインを２５℃において３０分間加えた。結合していないカルセインを洗い落とし、さらに、冷却したＰＢＳ中に細胞を再懸濁させた。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５５  蛍光性プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社、ボストン、マサチューセッツ）（４８８ｎｍ励起、５１７ｎｍ発光）を用いて螢光を測定した。１００μＭ  ＤＦＯの添加によって細胞外カルセインの消光を達成した。カルセインに拘束された細胞内鉄は、浸透速度が速い鉄キレート剤ＳＩＨ（イソニコチニル  ヒドラゾン  サルチルアルデヒド）を１００μＭ添加することによって放出された。相対的変化をコントロールに対するパーセンテージで表す。
【００７２】
架橋及びプルダウンアッセイ−Ｒａｗ２６４．７細胞を２×１０７細胞／ｍｌの濃度で氷冷ＰＢＳ及びＨｅｐ２５−Ｈｉｓの中に再懸濁させ、さらに、最終濃度が１０ｍＭとなるように陰性ペプチド又はＰＢＳを４℃において１時間添加した。二コハク酸イミジルスベリン酸塩（ＤＳＳ、ピアス、ロックフォード、イリノイ）を室温で２０分間加え、続いて、２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いて２０分間消光した。上述したようにタンパク溶解物を抽出し、Ｎｉ２−ＮＴＡアガロースを用いて４℃で一晩培養した。結合タンパクを１Ｍイミダゾールを用いて溶出し、上述したように抗ＦＰＮ１抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した。
【００７３】
免疫付与−０．４ｍｌのＰＢＳに溶解し、等しい体積のフロイント完全抗原性補強剤（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ社、セントルイス、マサチューセッツ）で乳化された１００μｇのＨｉｓ−２５Ｈｅｐを用いてウサギに皮下免疫付与を行った。免疫付与プロトコルには、１回の注入からなる３つ免疫向上が含まれており、これは、それぞれ、配列番号６の配列を有する１００μｇのＨｅｐ−２５Ｈｉｓが０．４ｍｌのＰＢＳに溶解して、等しい体積のフロイント不完全抗原性補強剤（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ社、セントルイス、マサチューセッツ）で乳化されている。最初の注入前に耳静脈から免疫化前の血清サンプルを得た。最後の免疫付与の１０日後に耳静脈から評価採血を実行した。ＥＬＩＳＡ分析を用いて抗体活性について血清を評価した。
【００７４】
抗体精製−１ｍｇの６ｘＨｉｓ合成ペプチド（Ｃｏｖａｎｃｅ、プリンストン、ニュージャージー）、又は、０．５ｍｇの配列番号６の配列を有するＨｅｐ−２５Ｈｉｓペプチドを、製造会社の取扱説明書（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカタウェイ、ニュージャージー）に従って０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．４）、０．５Ｍ  ＮａＣｌにおいて、ＣＮＢｒ活性化されたセファロースに結合させた。
【００７５】
配列番号６の配列を有するＨｅｐ−２５Ｈｉｓペプチドに対するポリクローナル抗血清を、３３％飽和硫酸アンモニウム沈殿（Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｇ．Ａ．，Ｐ．Ｌ．Ｐｅｌｈａｍ，ａｎｄ  Ｐｉｔｔｍａｎ，Ｂ．（１９７３）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２５，２６−３６）に供し、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析した。その後、その血清を６ｘＨｉｓが結合したセファロースビーズと共に４０℃で一晩培養し、その後、上清を保持した。その一方で、カラムを０．２ＮのＨＣｌグリシン（ｐＨ２．８）を用いて２回洗浄することにより再生成し、１ＭのＫ２ＨＰＯ４で中和した。最後にカラムを５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、ＰＢＳ（０．０２％アジ化物）中において４℃で保管した。上記精製処理を５回繰り返した。結果物の精製された血清を、Ｈｅｐ−２５Ｈｉｓが結合したセファロースカラムを用いて培養することにより４℃で一晩さらに精製した。翌日、ＰＢＳを用いてカラムを２回洗浄した後に、特異的な抗Ｈｅｐ２５抗体を等しい体積の０．２Ｎ  ＨＣｌグリシン（ｐＨ２．７）で溶出し、１ＭトリスｐＨ９、５Ｍ  ＮａＣｌを用いて中和した。
【００７６】
免疫組織化学−ヘプシジン２５−Ｈｉｓに対する抗体が天然ヘプシジンをも識別することができるか否かを決定するために、通常のマウス肝組織を用いて免疫組織化学的分析を行った。組織に対して、それぞれ、キシレン中で５分間の脱パラフィン処理を２回行い、さらに、エタノール希釈物（１００％、９５％、７０％）中で２分間脱水を行った。３％過酸化水素に３０分間沈め、その後に水道水に５分間沈めることによって内因性ペルオキシダーゼ活性を消滅させた。スライドを１０ｍＭシトラート緩衝液（ｐＨ６．０）中での浸漬させ、電子レンジで各５分の加熱を３回行い、さらに、その後に該スライドを２０分間室温まで冷ますことによって抗原回復を実現した。その後、それらのスライドをブロッキング溶液（３％ＦＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）が含まれるＴＢＳ）中で３０分間培養し、さらに、精製された一次抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）を用いて４℃で１６時間培養した。さらに、それらのスライドをＨＲＰ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、カーピンテリア、カリフォルニア）に結合した二次抗ウサギ抗体（ブロッキング緩衝液中に１：１００で希釈されているもの）中で１時間培養した。３’３ジアミノベンジジン基質（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ）を５分間添加した後に染色の視覚化を実行した。水道水で洗浄することによってその反応を停止させ、さらに、ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ）を用いてスライドを１分間対比染色した。その後、それらを７０％、９５％及び１００％のエタノール系においてそれぞれ２分間ずつ脱水し、それぞれ５分間キシレンに２回浸漬することにより除去し、さらに、ＤＰＸ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ）に据え付けた。ネガティブコントロールとして二次抗体を単独で用いた。さらに、Ｈｅｐ２５−Ｈｉｓ−ペプチド（１ｍｇ／ｍｌ）を含むポリクローナル抗体を４℃で一晩予備培養することにより競合試験を行った。
【００７７】
酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）−微量定量プレート（９６穴）（Ｃｏｓｔａｒ、コーニング、ニューヨーク）を、５０μｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）の中の（配列番号６の配列を有する）Ｈｅｐ−２５Ｈｉｓ、６ｘＨｉｓ又はＢＳＡ（０．５μｇ／ｍｌ）により４℃で一晩被覆させた。プレートを洗浄し、さらに、非特異的結合部位をブロッキング緩衝液（３％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を用いて３７℃で１時間閉鎖した。抗血清（３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：３０００に希釈されたもの）を、各穴に添加し、その穴を３７℃で１時間培養した。競合試験のために、精製された抗血清（３％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：３０００に希釈されたもの）を、８μｌヒト血清又は様々な既知濃度のＨｅｐ−２５Ｈｉｓペプチド（配列番号６の配列を有する。）と共に４℃で一晩培養した。翌日に複合体を穴に入れ、同様に３７℃で１時間培養した。結合していない抗体をＰＢＳＴを用いて１０回洗浄することにより除去した。さらに、それらのプレートを、ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ複合体（３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：２０００に希釈されたもの）（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、カーピンテリア、カリフォルニア）と共に室温で１時間培養した。前と同様にプレートを洗浄し、さらに、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ）を室温において１０分間添加した後に信号の視覚化を達成した。０．２Ｎ硫酸を添加し、マイクロプレートリーダ（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｍｏｄｅｌ  ６８０）を用いて４５０ｎｍにおいて測光分析的に発色現像を測定した後に、その反応を停止させた。すべての試験を４回繰り返して行った。
【００７８】
結果
酵母ピキアパストリスにおける組み換えヘプシジンの可溶性発現及び精製−メチロトローフ酵母ピキアパストリス中で、ヘプシジン−２０及び２５の組み換え可溶性発現のために、３つの異なる構築を連続して行った。ａ）非標識ペプチド（配列番号１及び２の配列を有するＨｅｐ−２０及びＨｅｐ−２５）、ｂ）ｍｙｃ−Ｈｉｓを有するペプチド（Ｈｅｐ−２０ＭｙｃＨｉｓ及びＨｅｐ−２５ＭｙｃＨｉｓ（配列番号７及び８の配列を有する））、並びに、ｃ）ヘプシジン配列の３’末端にＨｉｓ標識を有するペプチド（図１）（配列番号５及び６の配列を有するＨｅｐ−２０Ｈｉｓ及びＨｅｐ−２５Ｈｉｓ）。それぞれの構築物について、いくつかのクローンをメタノールによって３日間誘発した。また、ドットブロット免疫学的検定によってヘプシジン発現について培養液上清を分析した。最も高く発現するクローンを大規模生産用に選択した。組み換えペプチドを、液上清から採収し、濃縮し、限外濾過システム（１ＫＤａを遮断するフィルタ）により透析し、さらに、非標識ペプチド及び標識されているペプチドを、それぞれ、サイズ排除クロマトグラフィー又はＮｉ２−ＮＴＡ金属親和性クロマトグラフィーによって精製した。簡潔に、Ｈｅｐ−２０Ｈｉｓペプチドを発現する陽性クローンは検出されなかった。しかし、精製された非標識ヘプシジン−２０及び−２５の収率は、２０μｇ／ｌ未満であった。培地１リットル当たり約２０ｎｇという、精製された非標識ペプチドの低い収率は、精製及び検出の難しさのためであり、発現しているペプチドの潜在的毒性のためではないように考えられる。対照的に、Ｈｅｐ−２５ＭｙｃＨｉｓ、Ｈｅｐ−２０ＭｙｃＨｉｓ及びＨｅｐ−２５Ｈｉｓで標識されたペプチドの収率は、培地当たり約５−７ｍｇ／ｌであった。４−１２％のＮｕＰＡＧＥゲル及びクーマシーブリリアントブルー染色（図２Ａ）により精製された標識生成物を分析した。Ｈｅｐ−２５Ｈｉｓの分子量は４ｋＤａであると推定され、Ｈｅｐ−２５ＭｙｃＨｉｓの分子量は５．２ｋＤａであると推定され、Ｈｅｐ−２０ＭｙｃＨｉｓの分子量は４．８ｋＤａであると推定される。溶出したペプチドは、さらに高い高分子量のバンドであって、抗ｍｙｃ又は抗Ｈｉｓ−ｍＡｂｓ（図２Ｂ）を用いたウェスタンブロットによって確認されるオリゴマー形態に対応するバンドをいくつか含んでいた。標識ヘプシジンをさらに精製するために、スーパーデックスペプチドカラム（アマシャム生物科学、ピスカタウェイ、ニュージャージー）を用いてＦＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーを実行した（図３）。４−１２％Ｎｕ−ＰＡＧＥゲルを用いて、目的の分子量に対応する結果物の画分を分析した（図４）。ペプチドは、アミノ酸配列から予想されるのと一致する分子量を有する単量体のように移動した。精製された組み換え標識ヘプシジン単量体の収率は、０．５−１ｍｇ／ｌの培養であった。
【００７９】
組み換えヘプシジンの抗菌活性−精製された組み換えヘプシジン形態の大腸菌株ＭＬ３５に対する抗菌活性を測定するために、コロニー形成単位分析（Ｅ．Ｍ．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｅ．ｖａｎ  Ｄａｍ，Ｅ．Ｖ．Ｖａｌｏｒｅ，Ｔ．Ｇａｎｚ，Ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ５，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５（１９９７）２３９６−２４０１）を用いた。ヘプシジンに耐性を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ）株をネガティブコントロールとして用いた。様々な濃度を有する組み換えヘプシジン製剤、合成ヘプシジン又は陰性のペプチドと共に３７℃で２時間培養した後で、生存する微生物をカウントした。ヘプシジン−２５（配列番号２の配列を有する。）は、充分な量の中で生産されなかった（データは示されず）ので、評価することができなかったが、組み換え非標識ヘプシジン−２０（配列番号１の配列を有する。）は、１０ｍＭより高い濃度において殺菌力を有していた。標識形態（図３）において、組み換えＨｅｐ２５−Ｈｉｓ（配列番号６の配列を有する。）が最も高い抗菌活性（ＩＣ５０＝１５ｍＭ）を示したが、Ｍｙｃエピトープを含むペプチドであるＨｅｐ２５−ＭｙｃＨｉｓ（配列番号８の配列を有する。）は、おそらくその立体構造の著しい変化により、それほど有効ではなかった（ＩＣ５０＝５８．６ｍＭ）。Ｈｅｐ２５−Ｈｉｓの抗菌活性（配列番号６の配列を有する。）は、図３に示されているように合成ヘプシジン２５（配列番号２の配列を有する。）（ＩＣ５０＝９ｍＭ）と同等であった。それらのすべてがヘプシジン耐性大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ）に対して何の効果もなかった。
【００８０】
組み換えヘプシジンを用いた治療後にＲＡＷｍ２６４．７マクロファージに鉄が蓄積される−不安定鉄貯蔵（ＬＩＰ）分析により、組み換えヘプシジンを用いた治療後の細胞の鉄恒常性の変化も研究した（Ｋｏｎｉｊｎ  Ａ．Ｍ．，Ｇｌｉｃｋｓｔｅｉｎ  Ｈ．，Ｖａｉｓｍａｎ  Ｂ．，Ｍｅｙｒｏｎ−Ｈｏｌｔｚ  Ｅ．Ｇ．，Ｓｌｏｔｋｉ  Ｉ．Ｎ．，Ｃａｂａｎｔｃｈｉｋ  Ｚ．Ｉ，（１９９９）Ｂｌｏｏｄ  ９４，２１２８−３４）。種々の形態の組み換え標識ヘプシジンを１０μＭで用いてＲＡＷｍ  ２６４．７マクロファージを３７℃で４時間処理した。ＦＡＣ（３０μｇ／ｍｌ）をポジティブコントロールとして用いた。処理していない細胞と比較して、ＬＩＰは３倍（±０．２）増加した（ｐ＜０．００１）（図６）。Ｈｅｐ−２５Ｈｉｓ（配列番号６の配列を有するペプチド）が存在する状態で、ＬＩＰは、約２．５倍（±０．２１）増加した（ｐ＜０．００１）。しかし、Ｈｅｐ−２５ＭｙｃＨｉｓ（配列番号８の配列を有するペプチド）は、ＬＩＰの約２倍（±０．４４）（ｐ＜０．０５）に増加させた（図７）。Ｈｅｐ−２０ＭｙｃＨｉｓ（配列番号７の配列を有するペプチド）は、ＬＩＰに対して相対的に低い効果、１．８５倍（±０．５２）（ｐ＜０．０５）を示した。Ｍｙｃを含むペプチド及び試験間で大きな分散があったものの、Ｈｅｐ２５−Ｈｉｓは、ＬＩＰ分析において最も顕著で一貫した変化を示した。
【００８１】
マクロファージにおいて組み換えヘプシジンがフェロポルチン及びＴｆＲ１を抑制するように制御する−マクロファージ細胞系において、フェロポルチン（ＦＰＮ１）及びＴｆＲ１の発現レベルを測定することにより、細胞の鉄代謝に対する組み換えヘプシジンの効果を評価した。１μＭ及び１０μＭのヘプシジン２５（配列番号２の配列を有する。）及び３７℃で４時間行った抗菌性分析及びＬＩＰ分析において最も活性の高いペプチドであるＨｅｐ−２５Ｈｉｓ（配列番号６の配列を有する。）を用いてＲＡＷ  ２６４．７細胞を処理し、ウエスタンブロット解析によって細胞溶解産物中のＦＰＮ１及びＴｆＲ１の発現を検出した（図７）。処理されていない細胞との比較すると、それぞれ、１μＭの濃度のＨｅｐ−２５Ｈｉｓは、ＦＰＮ１を３７％±７％減少させることができた一方で、１０μＭの濃度のＨｅｐ−２５Ｈｉｓは、ＴｆＲ１を４８％±１７．７％減少させ、ＦＰＮ１を４８％±３％減少させた（図７Ａ、Ｂ）。合成ペプチドは、１０μＭにおいて、ＴｆＲ１を３７％±６阻害し、ＦＰＮ１を３６％±１０．６阻害した。組み換えペプチドをより高い濃度にしても、より強い効果は得られなかった（データを示さず）。また、Ｈｅｐ２５−Ｈｉｓのオリゴマー画分を評価したが、細胞の鉄代謝に対する効果は認められなかった（データを示さず）。組み換えペプチド（データを示さず）でヒトＴＨＰ−１及びマウスＪ７７４の単球の細胞を処理したときにも同様の結果が得られた。これらの結果は、組み換えヘプシジンがＦＰＮ１に結合し、ＦＰＮ１の内在化及び分解を誘導することができ（Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，Ｔｕｔｔｌｅ，Ｍ．Ｓ．，Ｐｏｗｅｌｓｏｎ，Ｊ．，Ｖａｕｇｈｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｄｏｎｏｖａｎ，Ａ．，ａｒｄ，Ｄ．Ｍ．Ｇａｎｚ，Ｔ．，Ｋａｐｌａｎ，Ｊ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６，２０９０−３）、さらに、鉄吸収を最小化するためにＴｆＲ１発現を減少させることを示唆している。
【００８２】
Ｈｅｐ２５−Ｈｉｓはフェロポルチンに結合して機能し、その後の内在化を誘導する−Ｈｅｐ２５−Ｈｉｓ（配列番号６の配列を有する。）のＦＰＮ１に対する特異的結合を架橋及びプルダウンアッセイにより研究した。Ｈｅ２５−Ｈｉｓ（配列番号６の配列を有する。）又は陰性のペプチド（配列番号９の配列を有する。）を１０ｎＭで用いてＲＡＷ２６４．７を処理し、その後に、ＤＳＳ用いた架橋及びＮｉ２−ＮＴＡアガロースを用いたプルダウンアッセイを行った。Ｎｉ２−ＮＴＡから溶出させたタンパク複合体を抗フェロポルチン抗体を用いたウエスタンブロット法に供した。図７Ｃに示されているように、架橋及びプルダウンアッセイ後に、ＦＰＮ１をＨｅｐ２５−Ｈｉｓと共に共精製したところ、組み換えＨｅｐ２５−ＨｉｓペプチドがＦＰＮ１に特異的に結合することが示唆された。
【００８３】
更に、ＨＥＫ２９３−Ｆｐｎ細胞において、Ｈｅｐ２５−Ｈｉｓ（配列番号６の配列を有する。）の存在下でのＦＰＮ１の内在化を共焦点顕微鏡によって分析した。これらの細胞は、ＦＰＮ１−ＧＦＰ融合構造物を細胞膜表面に発現する（Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，Ｔｕｔｔｌｅ，Ｍ．Ｓ．，Ｐｏｗｅｌｓｏｎ，Ｊ．，Ｖａｕｇｈｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｄｏｎｏｖａｎ，Ａ．，Ｗａｒｄ，Ｄ．Ｍ．Ｇａｎｚ，Ｔ．，Ｋａｐｌａｎ，Ｊ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６，２０９０−３）。組み換えＨｅｐ２５−Ｈｉｓ（配列番号６の配列を有する。）の添加によりＦＰＮ１−ＧＦＰ（図７Ｄ）の内在化が促進された。合成Ｈｅｐ−２５ペプチドをポジティブコントロールとして用いたとき、同様の結果が得られた。
【００８４】
ヘプシジンに対するポリクローナル抗体の産生及び精製−ウサギにおいてＨｅｐ−２５Ｈｉｓ（配列番号６の配列を有するペプチド。）に対するポリクローナル血清を調達した。３回強化した後に、ＥＬＩＳＡ（図８）を用いて血清の抗体活性について評価した。ＩｇＧ免疫グロブリンを特異的に沈殿させるためにポリクローナル抗血清を３３％アンモニウム硫酸塩沈殿に供した。沈殿及び透析された抗血清はヘプシジン及びＨｉｓ−ペプチドの両方に対する抗体を含んでいた。抗Ｈｉｓ−抗体をすべて除去するために、６Ｈｉｓが結合したセファロースカラムに由来する通路の繰り返しに抗血清を供した。各精製ステップからの上澄みを、Ｈ２５Ｈｉｓ、６ｘＨｉｓペプチド及びＢＳＡ（図８）に対するＥＬＩＳＡ分析法において評価した。５回精製された抗血清はＨ２５Ｈｉｓペプチドを特異的に認識した（データは示されず）。Ｈｅｐ−２５Ｈｉｓセファロースを用いてさらに精製した抗血清についても同様にした。天然ヘプシジンに対する結合活性を測定するために、パラフィン表面に埋め込まれたマウス肝切片について免疫組織化学を行った（図９）。抗体は、強い細胞質染色を示したが、該染色は、ヘプシジン２５−Ｈｉｓを用いた予備培養後に消失した。
【００８５】
競合ＥＬＩＳＡ分析−組み換えペプチドをそれに対して調達された抗体とともにヒト血清中ヘプシジンの定量用の免疫学的分析の発展のために用いた。（Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｔｈｅ  ＥＬＩＳＡ  ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４９（２０００）ＩＩＩ−ＩＶ，１−４１３）に従って抗原及び抗体の最適濃度を決定した後、ＥＬＩＳＡシステムの特性評価に移行した。
【００８６】
この阻害ＥＬＩＳＡ法により、組み換えヘプシジン２５−Ｈｉｓについての標準検量線（図１０に示されているもの）を作り出した。ＥＬＩＳＡ分析の分析的検出限界であって、１０回のゼロキャリブレーションの平均信号＋３（標準偏差）に対応する濃度として定義される分析的検出限界は、５．４μｇ／Ｌであった。測定範囲は１０―１５００μｇ／Ｌであった。ヘプシジンＥＬＩＳＡ分析の再現性、線形性及び回復の統計的分析のために、評価された多数のサンプルから選択した低いレベル（２２μｇ／Ｌ）から高いレベル（１５０μｇ／Ｌ）までの３つの濃度の血清サンプルを用いた。各サンプルを単一の分析法によって１０回反復して評価したとき、測定内変動係数（ｉｎｔｒａ−ａｓｓａｙ  ＣＶ）は８−１５％であった。７つの試験サンプルの事後測定によって評価したとき、測定内変動係数は５−１６％であった。分析的な回復は各血清サンプルにおいて７．５、３０及び７５μｇ／Ｌで目盛りを加えることにより研究され、９０から１２０％まで変動し、平均回復指数は１０５％であることが分かった。３つの血清サンプルの３つの系列希釈物（１：２、１：４、１：８）を測定した後に、平均の線形性は９７％と推定された。
【００８７】
この分析法が生物学的に意味のある測定を提供するものであるか否かを判断するために、健康なコントロールと比較して、低いヘプシジンレベルを有すると予想される患者（ＨＪＶ関連若年性血色素症）に由来する血清サンプルを評価した。
【００８８】
図１１に示されているように、平均ヘプシジン濃度は、年齢が一致する健康なコントロール（３４．３μｇ／Ｌ）と比較して、７人の若年性血色素症患者において有意に低かった（１２．８μｇ／Ｌ及びｐ＜０．０５）。この結果は、この病気におけるヘプシジンのレベルに関する以前の発見と一致しており、この新しいＥＬＩＳＡシステムにより血清中のヘプシジン量を有効に測定することができると考えられる。しかし、他の定量化技術を用いた以前の報告と比較して、この分析法においてグループ間又はグループ内で折り目変化がはるかに低かったことに注目することは重要である。これは、ばらつきが大きいサンプル間の違いの識別における制限である可能性がある。更に、ポリクローナル抗体と先端を切断された２０個のアミノ酸のヘプシジンのようなヘプシジンの他の形態との相互作用の可能性を排除することができない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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