(57)【要約】  本発明は、遺伝子増幅技術をより効率よく改善することが可能なＧＣ−ｒｉｃｈ繰り返し配列の全部または一部を除去したジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のプロモーターを含む高発現誘導カセットに関する。また、前記発現誘導カセットおよび選択的に目的の組み換えタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む発現ベクター、これらの発現ベクターによって形質転換された動物細胞株、並びに前記形質転換された動物細胞株を培養して組み換えタンパク質を大量生産および精製する方法に関する。本発明は、低濃度のジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤を短期間使用して目的の組み換えタンパク質を高濃度で生産することが可能な細胞株の開発期間を短縮させることができるので、より効率的な組み換えタンパク質の生産が可能である。
2010506586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする塩基配列、および該塩基配列に連結された、一つ以上のＣＣＧＣＣＣ繰り返し配列が除去されたジヒドロ葉酸還元酵素プロモーターの塩基配列を含む、高発現誘導カセット。
【請求項２】
前記ジヒドロ葉酸還元酵素のプロモーターが１つ以下のＣＣＧＣＣＣ繰り返し配列を含む、請求項１に記載の高発現誘導カセット。
【請求項３】
配列番号７〜１０よりなる群から選ばれる塩基配列を有する、請求項１に記載の高発現誘導カセット。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項の高発現誘導カセットを含む発現ベクター。
【請求項５】
生理活性ポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記生理活性ポリペプチドがヒトのエリトロポエチンであることを特徴とする、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
配列番号１〜４よりなる群から選ばれる塩基配列を有する、請求項６に記載の 発現ベクター。
【請求項８】
配列番号５または６の塩基配列を有する、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項９】
請求項８の発現ベクターによって形質転換された細胞株。
【請求項１０】
受託番号がＫＣＴＣ１０９９１ＢＰまたはＫＣＴＣ１０９９２ＢＰである、請求項９に記載の細胞株。
【請求項１１】
請求項５〜７のいずれか１項の発現ベクターによって形質転換された細胞株。
【請求項１２】
前記細胞株がＣＨＯ細胞株であることを特徴とする、請求項１１に記載の細胞株。
【請求項１３】
前記ＣＨＯ細胞株はジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が欠損したものであることを特徴とする、請求項１２に記載の細胞株。
【請求項１４】
受託番号がＫＣＴＣ１０９９３ＢＰ、ＫＣＴＣ１０９９４ＢＰまたはＫＣＴＣ１０９９５ＢＰである、請求項１２に記載の細胞株。
【請求項１５】
（ａ）ＣＣＧＣＣＣ繰り返し配列が一部または全部除去されたプロモーターを含むジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターで動物細胞株を形質転換する段階と、
（ｂ）ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤の存在下に、前記形質転換された動物細胞株を培養する段階とを含む、組み換えタンパク質の製造方法。
【請求項１６】
組み換えタンパク質がヒトのエリトロポエチンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
シアル酸高含有のエリトロポエチンを精製する段階をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
発現ベクターが図１に記載の発現ベクターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
段階（ａ）の動物細胞株がジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ細胞株であることを特徴とする、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２０】
段階（ｂ）の形質転換された動物細胞株が受託番号ＫＣＴＣ１０９９３ＢＰ、ＫＣＴＣ１０９９４ＢＰまたはＫＣＴＣ１０９９５ＢＰの動物細胞株である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換えタンパク質を大量生産するためのベクター、組み換えタンパク質を生産するための発現細胞株、並びにこれを用いた組み換えタンパク質を生産および精製する方法に関する。より詳しくは、本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素(dihydrofolate reductase)の転写調節部位であるプロモーターを人為的に弱化させて遺伝子の増幅効率を大幅改善させることが可能なベクター、このベクターで形質転換された動物細胞株、およびこの動物細胞株を用いてタンパク質を発現させ、発現したタンパク質の高糖化型のみを精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えタンパク質を大量生産するために、多様なベクターと宿主が用いられており、一般に大腸菌を用いた方法などが広く使われている。糖化が必須的でありあるいは複雑な構造を有するタンパク質を製造する場合は、利用が制限的であるという欠点を持っている。かかる問題点を解決するために、動物細胞株や酵母菌、形質転換動物、形質転換植物などを用いる。
酵母菌の場合、タンパク質の大量生産が容易であるという利点を持っているが、糖化の度合いおよびパターンがヒトとは非常に相違して高い免疫原性を示すものと知られている(Hermeling et al., Pharm. Res. 21(6):897-903(2004))。形質転換動物の場合は、動物自体の管理および病原菌による汚染可能性に関する問題のため、商用化には至っていない。
【０００３】
これに対し、動物細胞株を利用する方法は、生産コストが高く、細胞株の製作
に多くの時間と費用がかかるが、生産される組み換えタンパク質がヒトの形態と非常に類似するうえ、安定的な生産および管理が可能なので、組み換えタンパク質の生産に最も広く採用されている。ところが、動物細胞株では、組み換えタンパク質を生産するために形質転換を試みるとき、大部分発現量が少なくて高い生産性を示すことが難しい。したがって、このような問題を解決するために、細胞株内の遺伝子増幅法を利用する。その最も代表的な方法がジヒドロ葉酸還元酵素またはグルタミン合成酵素を用いた遺伝子増幅法であって、組み換えタンパク質の生産量を大きく増加させることができるため、広く使われている。このような遺伝子増幅技術は、生産性を改善させることができるという利点はあるが、高濃度のメトトレキサート（以下、「ＭＴＸ」と略称する）を使用するために多段階の遺伝子増幅過程を経ることにより製作に多くの時間がかかり、細胞株の長期間継代培養によって遺伝子が消失するうえ、発現量が不安定であるなどの問題点を持っていると知られている。
【０００４】
このような短所を改善するために多くの試みが行われている。例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子のプロモーターとして、ＳＶ４０プロモーターの一部を除去して作ったプロモーターを使用し（韓国登録特許第０１６２０２１号）、あるいはＣＭＶ(cytomegalovirus)プロモーターのメチル化ＤＮＡ結合タンパク質に対する親和性を調節するために塩基配列に突然変異を導入する方法（韓国登録特許第０４９３７０３号）などが報告されている。場合に応じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の単独プロモーターを使用せず、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質の５’−非コード領域をＩＲＥＳ(Internal ribosome entry site)として用いて組み換えタンパク質の転写調節因子によって調節されるようにする方法（韓国登録特許第０１８４７７８号）などが報告されている。
【０００５】
韓国登録特許第０１６２０２１号では、ＳＶ４０転写調節因子の１２８〜２７０部位を除去してプロモーターの活性を調節しようとした。ところが、除去された配列の役割が不明確であり、残存する配列の役割についても言及していない。特に対照群の設定がない条件下に２０ｎＭ以上の濃度で増幅がそれ以上行われないことを示していないため、既存のジヒドロ葉酸還元酵素プロモーターの活性にどんな変化が起こったのかは勿論のこと、低濃度のＭＴＸを用いて最適の発現を示していないかに関する根拠を提示していない。韓国登録特許第０４９３７０３号では、ＣＭＶプロモーターのメチル化ＤＮＡ結合タンパク質に対する結合配列を変異させて効率よく遺伝子を増幅させようとしたが、増幅が発現に及ぼす効果はその他の方法に比べて微弱である。また、韓国登録特許第０１８４７７８号のように単独のプロモーターを使用せずＩＲＥＳ配列を用いて発現する場合でも、遺伝子の増幅に用いられるＭＴＸの濃度が数μＭに達するだけであり、発現量の増加も３０倍の水準に止まっていることが分かる。このように一般なプロモーターの変形のみではジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の増幅を予測することができず、その適用可能性は実質的に多様な種類のプロモーターを用いて遺伝子増幅を行った場合にのみ判断することができるといえる。
【０００６】
本発明の組み換えタンパク質として例示しているヒトのエリトロポエチンは、純粋分子量が約１８ｋＤａ程度であるが、糖化する場合には約３４ｋＤａ程度の分子量を有する。これらのエリトロポエチンは、貧血または出血などが発生しあるいは大気中の酸素分圧が低い場合には腎臓で合成され、赤血球の生産を促進しかつ恒常性を維持する役割を果たす。正常人の生体内では約１０〜２０ｍＩＵ／ｍＬの濃度で存在し、腎臓に異常が発生する場合には激しい貧血を生じさせる(Jacobsonm et al., Nature, 179:633-634(1957))。したがって、エリトロポエチンは、慢性腎不全および多様な原因による貧血などの治療剤として使われている。過去、エリトロポエチンは動物の血漿、または正常人より高い濃度のエリトロポエチンが生成される再生不良性貧血などの疾患がある患者の血液または尿などから分離して使用したが、これらのエリトロポエチンは安定性が低く、量が足りない。正常人の尿から出るエリトロポエチンの場合は、その濃度が低いうえ、尿に含有されているエリトロポエチン活性阻害剤を除去するための高純度の精製が要求されるという欠点があった（米国特許第４３９７８４０号、同第４３０３６５０号および同第３８６５８１０号参照）。このような方法としては、純粋な高収率のエリトロポエチンを得ることが難しいため、遺伝子組み換え法を用いた方法が開発された。ところが、エリトロポエチンは、生体内の活性に糖化が必須的であって、エリトロポエチン遺伝子をクローニングして大腸菌または酵母で発現させる場合には、糖化がまともに起こらないため、エリトロポエチンの生活性が現れないという問題点がある。したがって、エリトロポエチンの生産には組み換え動物細胞株を用いた方法が必須的に要求される。組み換え動物細胞株を用いてエリトロポエチンを生産する場合には、前述したジヒドロ葉酸還元酵素を用いた遺伝子増幅技術が一般に使われる(Malik et al. DNA and Cell Bio., 6:453-459(1992))。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国登録特許第０１６２０２１号
【特許文献２】韓国登録特許第０４９３７０３号
【特許文献３】韓国登録特許第０１８４７７８号
【特許文献４】米国特許第４３９７８４０号
【特許文献５】米国特許第４３０３６５０号
【特許文献６】米国特許第３８６５８１０号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hermeling et al., Pharm. Res. 21(6):897-903(2004)
【非特許文献２】Jacobsonm et al., Nature, 179:633-634(1957)
【非特許文献３】Malik et al. DNA and Cell Bio., 6:453-459(1992)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような事実に基づき、本発明者は、ジヒドロ葉酸還元酵素構造遺伝子に連結されたプロモーター部位に存在する６個のＧＣ−ｒｉｃｈ繰り返し配列の役割が転写活性に重要であるというＭｉｃｈｅｌ ＦｒｏｍｍとＰａｕｌ Ｂｅｒｇの研究結果(J. Mol. Appl. Genet. 1983. 2(1):127-135)に基づき、順次ＧＣ−ｒｉｃｈ繰り返し配列を除去することにより、遺伝子増幅および発現がさらに効率的である、動物細胞用発現ベクターを製作し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで、本発明の目的は、動物細胞内で組み換えタンパク質を生産するにおいて、より効果的に遺伝子を増幅させることが可能な発現ベクターを提供することにある。
本発明の他の目的は、前記発現ベクターによって形質転換された動物細胞株を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記動物細胞株を用いて組み換えタンパク質を大量生産する方法を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１はＧＣ−ｒｉｃｈ配列が順次除去された発現ベクターＸ１ＧＣ／ｄｈｆｒ、Ｘ３ＧＣ／ｄｈｆｒおよびＸ６ＧＣ／ｄｈｆｒのクローニング過程の模式図である。
【図２】図２は６個のＧＣ−ｒｉｃｈ配列が完全に除去された発現ベクターＸ０ＧＣ／ｄｈｆｒのクローニング過程の模式図である。
【図３】図３は図１および図２の発現ベクターにｇＥＰＯ遺伝子をクローニングする過程の模式図である。
【図４】図４は本発明の発現ベクターで形質転換されたそれぞれの細胞株のＥＰＯ発現量をＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図５】図５は本発明の発現ベクターで形質転換されたそれぞれの細胞株のＥＰＯ発現量をＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図６】図６は本発明の発現ベクターで形質転換されたそれぞれの細胞株のＥＰＯ発現量をＥＬＩＳＡで測定した結果である。  図８は増幅されたジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の発現量をウエスタンブロットで示す結果である。
【図７】図７は本発明の発現ベクターで形質転換されたそれぞれの細胞株のＥＰＯ発現量をＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図８】図８は増幅されたジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の発現量をウエスタンブロットで示す結果である。
【図９】図９は実施例６で選別された単クローン細胞株Ｘ０ＧＣ／ＧＥＰＯ９６４７（ＤＸＢ１１）を大量培養して合計９回にわたってヒトのエリトロポエチン発現上清液を回収して間接ＥＬＩＳＡ法で発現量を測定した結果である。
【図１０】図１０は実施例８で精製された組み換えエリトロポエチのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析結果である。
【図１１】図１１は実施例４で精製された組み換えエリトロポエチンの等電集束分析結果である。
【図１２】図１２は無血清培地に完全適応されたＸ１ＧＣ／ＧＥＰＯ９６２９（ＤＧ４４）およびＸ０ＧＣ／ＧＥＰＯ９６０３（ＤＧ４４）を培養して発現したエリトロポエチンの等電集束分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素のＧＣ−ｒｉｃｈ繰り返し配列欠損プロモーターを含む動物細胞株用発現ベクターを提供する。
上述したように、動物細胞株における組み換えタンパク質の高発現を誘導するための一つの方法として、ジヒドロ葉酸還元酵素による遺伝子増幅法が広く使われてきたが、従来の技術によれば、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤を高濃度で長期間使用することによる細胞株安定化および時間と費用上の問題があった。本発明は、このようなジヒドロ葉酸還元酵素のプロモーター中のＧＣ−ｒｉｃｈ繰り返し配列を一部または全部欠損させて変異させたジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を用いた発現ベクターがより短い時間にさらに低いジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤を使用する場合にも、より高い効率でジヒドロ葉酸還元酵素および／または前記ベクターに含まれた目的の組み換え遺伝子の発現を誘導することができることを見出した。
【００１３】
ここで、ＧＣ−ｒｉｃｈ繰り返し配列とは、ジヒドロ葉酸還元酵素の転写調節因子であるプロモーターに含まれたＣＣＧＣＣＣ繰り返し配列を意味する。この繰り返し配列の全部または一部を欠損、変異などによる方法によって人為的に欠損させると、ジヒドロ葉酸還元酵素の発現は最小限に抑えられる。この際、発現が最小に維持された状態でジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤を添加する場合、細胞は生存のためにさらに多数のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を増幅し、よって、前記ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現ベクター内に含まれた目的の組み換え遺伝子も同時に増幅されて高発現するものと観察された。
したがって、本発明の具体的な一様態では、ＣＣＧＣＣＣ繰り返し配列が少なくとも一つ除去されたプロモーターを含むジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の塩基配列を含む高発現誘導カセットを提供する。好ましくは、前記高発現誘導カセットは、６個以下のＣＣＧＣＣＣ繰り返し配列を含むジヒドロ葉酸還元酵素のプロモーターを含み、さらに好ましくは３個以下のＣＣＧＣＣＣ繰り返し配列を含むプロモーターを含み、特に好ましくは１個以下のＣＣＧＣＣＣ繰り返し配列を含むプロモーターを含み、さらに特に好ましくはＣＣＧＣＣＣ繰り返し配列が全部除去されたプロモーターを含む。
【００１４】
これらのＣＣＧＣＣＣ繰り返し配列の除去は、当業界における公知の遺伝子組み換え技術による塩基配列の置換や欠損などの方法によって行われ得る。本発明の具体的実施例では、ＣＣＧＣＣＣ繰り返し配列を含む塩基配列の一部または全部を欠損させる方法によってプロモーター内のＧＣ−ｒｉｃｈ配列の一部または全部を除去した。
本発明の他の様態では、前記高発現誘導カセットを含む発現ベクターを提供する。
用語「ベクター」は、宿主細胞で目的の遺伝子を発現させるためのビヒクルである。本発明のベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターなどを含み、好ましくはプラスミドベクターである。
前記発現ベクターは、好ましくは目的の組み換えタンパク質をコードする遺伝子をさらに含むことができる。このような発現ベクターを発現させることにより、目的の組み換えタンパク質を高効率で発現させることができる。
【００１５】
前記目的の組み換えタンパク質とは、一般に、生理活性ポリペプチドを含む概念である。生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質または受容体、細胞表面抗原、受容体拮抗物質などの様々なタンパク質、並びにこれらの誘導体および類似体を含むことができる。そして、生理活性ポリペプチドは、具体的にヒト成長ホルモン、インターフェロン類およびインターフェロン受容体類、コロニー刺激因子、インターロイキン類、エリトロポエチン、インスリン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、神経成長因子類、細胞表面抗原、モノクローナル抗体、およびウイルス由来ワクチン抗原などを含み、これらに制限されるものではない。当業者は、現在の技術水準でジヒドロ葉酸還元酵素による増幅技術を適用することが可能な組み換えタンパク質を容易に選択することができる。本発明の好適な実施様態において、前記組み換えタンパク質はヒトのエリトロポエチンである。
前記目的の組み換えタンパク質は、前記ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子のプロモーターあるいは別途のプロモーターによって発現が調節できる。好ましくは、前記目的の組み換えタンパク質は別途のプロモーターによって発現が調節される。このようなプロモーターは、当業界に広く知られているもの、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＥＦαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、およびＴＫプロモーターよりなる群から当業者が容易に選択して使用することができ、これらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明の発現ベクターは、動物細胞株における高発現を誘導するためのものであって、好ましくは動物細胞における永久的な発現のための選択標識因子として使われる動物細胞株用抵抗性遺伝子をさらに含むことができる。前記動物細胞株用抵抗性遺伝子としては、通常、当業界で使用する動物細胞株用抵抗性遺伝子であるネオマイシン抵抗性遺伝子、ゼオマイシン抵抗性遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子およびブラストマイシン抵抗性遺伝子などがあり、これらに限定されるものではない。
この他にも、本発明の発現ベクターは、一般なベクターの構成要素、例えば複製原点や多重アデニル化信号、その他の転写調節因子などをさらに含むことができ、これらに限定されるものではない。
本発明の別の様態では、本発明に係る前記発現ベクターで形質転換された細胞株を提供する。
【００１７】
具体的な一様態として、本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素のプロモーター中のＣＣＧＣＣＣ繰り返し配列を一つのみ有する高発現誘導カセット、およびＣＣＧＣＣＣ繰り返し配列を全く含まない高発現誘導カセットをそれぞれ製造し、これらの発現カセットを含む発現ベクターによって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞株を提供する。このような形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞株は、２００６年１０月２日付で韓国大田広域市儒城区に所在の生命工学研究院内の遺伝子銀行に受託番号ＫＣＴＣ１０９９１ＢＰおよびＫＣＴＣ１０９９２ＢＰとしてそれぞれ寄託した。これらのＥ．ｃｏｌｉ細胞株は、所望する目的の組み換えタンパク質の高発現を誘導するために、前記細胞株から、前記高発現誘導カセットを含む発現ベクターを分離し、遺伝子組み換え技術などによるクローニング方法によって目的の組み換えタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む発現ベクターの製作に利用可能である。
【００１８】
本発明の別の具体的な様態では、目的の組み換えタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む発現ベクターによって形質転換された細胞株を提供する。
好適な一様態において、これら目的の組み換えタンパク質は動物細胞株における発現が要求される。このような目的に鑑みて、本発明で使用可能な好適な動物細胞株としては、ＣＨＯ細胞株、ＣＯＳ７(Monkey kidney cells)細胞株、ＮＳＯ細胞株、ＳＰ２／Ｏ細胞株、Ｗ１３８細胞株、ＢＨＫ(Baby hamster kidney)細胞株、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞株、および２９３細胞株などを含むことができ、これらに限定されない。当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明のジヒドロ葉酸還元酵素を用いた増幅技術に適用可能な適正の動物細胞株を容易に選択することができる。
本発明の具体的な様態では、前記動物細胞株としてＣＨＯ細胞株を使用し、より具体的にはジヒドロ葉酸還元酵素が欠損したチャイニーズハムスター卵巣細胞 株（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−）を使用した。すなわち、ジヒドロ葉酸還元酵素が欠損したＣＨＯ細胞株を、ヒトの組み換えエリトロポエチンをコードする遺伝子を含む本発明に係る発現ベクターで形質転換することにより、１００ｎＭ以下、好ましくは５０ｎＭ以下の低いメトトレキサート濃度でも十分な数の遺伝子が増幅されて生産性が検証された動物細胞株を提供する。後述の実施例に詳しく記述するようなこれらの細胞株は、２００６年１０月２日付で韓国大田広域市儒城区に所在の生命工学研究院内の遺伝子銀行に受託番号ＫＣＴＣ１０９９３ＢＰ、ＫＣＴＣ１０９９４ＢＰおよびＫＣＴＣ１０９９５ＢＰとして寄託した。
【００１９】
本発明の別の様態では、本発明に係るＧＣ−ｒｉｃｈ配列が一部または全部除去されたプロモーターを含むジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子を含む本発明の動物細胞用発現ベクターで動物細胞株を形質転換する段階と、前記形質転換された動物細胞株を培養する段階とを含む、組み換えタンパク質の製造方法を提供する。
本発明において、動物細胞株への「形質転換」は、核酸を有機体、細胞、組織または器官に導入するいずれの方法も含み、当分野における公知の動物細胞株に応じて適切な標準技術を選択して行うことができる。細胞壁がない哺乳動物細胞の場合、リン酸カルシウム沈殿法を使用することができる(Graham et al., 1978, Virology, 52:456-457)。哺乳動物宿主細胞への形質転換の一般な方法および特徴は、米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。具体的に、本発明では、組み換えタンパク質を発現させるベクターをリポフェクタミンを用いてＣＨＯ細胞内に取り込んだ。また、本発明において、動物細胞株の培養は当業界における公知の適切な培地と培養条件に応じて行われ得る。このような培養過程は、当業者であれば、選択される動物細胞株に応じて容易に調整して使用することができる。細胞の成長方式によって、懸濁培養または付着培養を回分培養式、流加培養式および連続培養式の方法で行う。培養に使用される培地は、特定細胞株の要求条件を適切に満足させなければならない。
【００２０】
動物細胞培養において、前記培地は、様々な炭素源、窒素源および微量元素成分を含む。使用可能な炭素源の例には、例えばグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースなどの炭水化物、例えば大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油およびココナツ油などの脂肪、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸などの脂肪酸、例えばグリセロールおよびエタノールなどのアルコール、および例えば酢酸などの有機酸が含まれる。これらの炭素源は単独でまたは組み合わせて使用可能である。使用可能な窒素源の例には、例えばペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）および大豆ホエーなどの有機窒素源、および例えば尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどの無機窒素源が含まれる。これらの窒素源は単独でまたは組み合わせて使用できる。その他に、アミノ酸、ビタミンおよび適切な前駆体などが含まれ得る。
また、前記培地には、メトトレキサートなどのジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤が添加できる。なぜなら、前述したように、本発明の好適な実施例に係るタンパク質組み換え方法は、ジヒドロ葉酸還元酵素が欠損した動物細胞株を本発明に係る発現ベクターで形質転換し、組み換え遺伝子を増幅するためにジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤を添加してベクター内のジヒドロ葉酸還元酵素が増幅されて選択できるようにするシステムを短期間に効率よく実現することを目的とするためである。
【００２１】
本発明の好適な具現例によれば、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤の場合、細胞株の安定性と経済性を考慮して出来る限り低濃度で短期間使用することが好ましい。すなわち、低濃度でジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤を使用することにより、大量生産する場合の安定性を確保し、生産細胞株の開発期間を短くすることを可能にする。具体的に、本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素が欠損したＣＨＯ細胞を前記組み換えタンパク質発現ベクターで形質転換し、濃度１００ｎＭ以下、好ましくは５０ｎＭ以下のメトトレキサートを使用することにより、組み換えタンパク質を製造する方法を提供する。
また、本発明の更なる一様態において、前述した細胞株からエリトロポエチンを生産する場合、生産されたエリトロポエチンのうち、シアル酸を大量含有して優れた物性を有するシアル酸高含有エリトロポエチンを大量で精製する段階をさらに含むことができる。
【００２２】
本発明の一実施例では、ジヒドロ葉酸還元酵素のプロモーターのうち、ＧＣ−ｒｉｃｈ配列を人為的に欠損させて発現が最小限に抑えられるようにした後、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤を添加して遺伝子を増幅させた。遺伝子増幅された細胞株の一つの細胞から起源したクローンを得るために限界希釈を行って単クローン細胞株を獲得し、これを大量培養して無血清培地で組み換えヒトエリトロポエチンを生産した。この際、低塩濃度で溶出されるエリトロポエチンがシアル酸含有量の高い分画であり、高塩濃度で溶出されるエリトロポエチンがシアル酸含有量の低い分画であることを利用して、カラムボリュームの濃度勾配を適用してエリトロポエチンを溶出させてシアル酸高含有エリトロポエチンを精製して活性を確認した。
【００２３】
以下、実施例によって本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は本発明を具体的に例示するためのものに過ぎず、限定するものではない。
実施例１：ＧＣ−ｒｉｃｈ繰り返し配列が順次除去された発現ベクターの製造
ＧＣ−ｒｉｃｈ繰り返し配列が欠損したプロモーターによって発現するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子カセット構造を次のように作る。ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を増幅させるために、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３７１４６）プラスミドからＳｍａＩ制限酵素認識部位を有するプライマーｄｈｆｒ ０１（５’−ＧＣＧ ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＴＧ ＧＴＴ ＣＧＡ ＣＣＡ ＴＴＧ ＡＡＣ ＴＧＣ−３’）とＢｓｔＢＩ制限酵素認識部位を有するプライマーｄｈｆｒ−０２（５’−ＣＡＣ ＴＴＡ ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＴＴ ＡＧＴ ＣＴＴ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＧＴ ＡＧＡ Ｃ−３’）を用いてＰＣＲを行う。そして、ＰＣＲによって得られた約２００ｂｐの増幅産物を１％アガロースゲルで電気泳動した後、ＱＩＡＧＥＮ社のゲル抽出キット（ｃａｔ Ｎｏ．２８７０６）を用いて回収した。回収した遺伝子断片は、Ｑｉａｇｅｎ社のｐＤＲＩＶＥベクターに直接挿入してクローニングし、塩基配列分析を行って誤りがないことを確認した。塩基配列が確認されたｐＤＲＩＶＥ−ｄｈｆｒプラスミドからジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を制限酵素ＳｍａＩ／ＢｓｔＢＩで切断し、１．５％アガロースゲルで電気泳動した後、約２００ｂｐの遺伝子断片をＱＩＡＧＥＮ社のゲル抽出キット（ｃａｔ Ｎｏ．２８７０６）を用いて回収した。このような方法で得られたジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子断片は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐｃＤＮＡ３．１ベクターのネオマイシン遺伝子配列を同一の制限酵素で切断して置換した。このようにクローニングされたｐｃＤＮＡ３．１−ｄｈｆｒプラスミドを鋳型として、ＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を有しかつジヒドロ葉酸還元酵素プロモーターのそれぞれ異なるＧＣ−ｒｉｃｈ繰り返し配列に相補的なプライマー×１ＧＣ（５’−ＴＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＴＴ ＣＴＣ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＡＣ ＴＡＡ−３）、×３ＧＣ（５’−ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＡＡ ＣＴＣ ＧＧＣ ＣＣＡ ＧＴＴ ＣＣＧ ＣＣＣ ＡＴＴ ＣＴ−３’）、×６ＧＣ（５’−ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＡＴ ＡＧＴ ＣＣＣ ＧＣＣ ＣＣＴ ＡＡＣ ＴＣＣ ＧＣＧ Ｃ−３’）と、ＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を有しかつジヒドロ葉酸還元酵素に構造的に連結されたポリアデニル化信号配列に相補的なプライマーＢＩＳＶｐＡＲ（５’−ＴＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＡＧ ＡＣＡ ＴＧＡ  ＴＡＡ ＧＡＴ ＡＣＡ ＴＴＧ ＡＴＧ−３’）を用いたＰＣＲを行うことにより、ＧＣ−ｒｉｃｈ繰り返し配列が順次一部損失したそれぞれ異なる３つの大きさの遺伝子カセットを得た。この遺伝子カセットを、ＢｇｌＩＩ制限酵素で切断したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入してクローニングした後、制限酵素地図法を用いて、ベクターのＣＭＶプロモーターと同一の方向性を持つクローンを選別した。これにより、Ｘ１ＧＣ／ｄｈｆｒ、Ｘ３ＧＣ／ｄｈｆｒおよびＸ６ＧＣ／ｄｈｆｒプラスミドを製造した。それぞれのプラスミドは、ヒトゲノムＤＮＡ由来のエリトロポエチン遺伝子をクローニングすることに使用した。また、ＧＣ−ｒｉｃｈ繰り返し配列が完全に除去された対照群発現ベクターを製作するために、次のようにクローニングを行った。
【００２４】
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子とＳＶ４０ウイルスポリアデニル化配列を得るために、ＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を含むプライマーＸ０ＧＣ（５’−ＣＧＡ  ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＧＡ ＣＡＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＡＴＡ ＣＡＴ ＴＧＡ Ｔ−３’）とＸ０ＧＣＲＲ（５’−ＣＧＴ ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＡＣ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＧＧ ＣＴＧ ＣＧＡ ＴＴＴ Ｃ−３’）を製作した。ｐＳＶ２−ｄｈｆ２プラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ＳＶ４０ウイルスポリアデニル化配列からジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の５’−非コード領域に至る配列１．５ｋｂの増幅産物を得た。この遺伝子断片を１％アガロースゲルで電気泳動した後、ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、ｃａｔ Ｎｏ．２８７０６）を用いて回収し、制限酵素ＢｇｌＩＩで切断したｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）部位に挿入した。制限酵素地図法を用いて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子がＣＭＶプロモーターと反対方向に位置したクローンを選別した。幾つかの制限酵素認識部位を除去するために、ベクターのマルチクローニグサイトを制限酵素ＮｄｅＩとＤｒａＩＩＩで切断し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＲｃＣＭＶベクターを、同一の方法で切断した断片に置換した。これにより、Ｘ０ＧＣ／ｄｈｆｒベクターを製作した。
以上のクローニング模式図を図１および図２にまとめた。
【００２５】
実施例２：ｇＥＰＯ遺伝子のクローニング
ｐＣＩ−ｎｅｏ／ｇＥＰＯプラスミドをＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ制限酵素で切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片(DNA polymerase Ｉ Klenow fragment)で接着末端を平滑末端に作った後、０．７％アガロースゲルで電気泳動して、ヒトのエリトロポエチンゲノム遺伝子に該当する約２．２ＫｂのＤＮＡ断片をゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社、ｃａｔ Ｎｏ．２８７０６）を用いて回収した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＲｃＣＭＶベクターをＥｃｏＲＶで切断し、ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ精製キット（ｃａｔ Ｎｏ．２８１０６）で回収した後、ＥｃｏＲＶ切断部位に前記エリトロポエチンゲノム遺伝子を接合させてクローニングした。制限酵素地図法を用いて、ベクターのエリトロポエチンゲノム遺伝子がＣＭＶプロモーターと同一の方向性を持つクローンを選別した。実施例１のＸ０ＧＣ／ｄｈｆｒ、ｘ１ＧＣ／ｄｈｆｒ、ｘ３ＧＣ／ｄｈｆｒ、ｘ６ＧＣ／ｄｈｆｒベクターをＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ制限酵素で切断し、０．７％アガロースゲルで電気泳動した後、ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社、ｃａｔ Ｎｏ．２８７０６）を用いて回収した。同一の方法で、ｐＲｃＣＭＶベクターにクローニングしたエリトロポエチンゲノム遺伝子断片を回収し、切断したｘ０ＧＣ／ｄｈｆｒ、ｘ１ＧＣ／ｄｈｆｒ、ｘ３ＧＣ／ｄｈｆｒおよびｘ６ＧＣ／ｄｈｆｒベクターのマルチクローニングサイトのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ位置に挿入してサブクローニングを行った。得られたクローンの塩基配列を分析て誤りのないことを確認し、これをそれぞれＸ０ＧＣ／ＧＥＰＯ、Ｘ１ＧＣ／ＧＥＰＯ、Ｘ３ＧＣ／ＧＥＰＯおよびＸ６ＧＣ／ＧＥＰＯと命名した。以上のクローニング過程を図３にまとめ、それぞれの最終配列を配列目録に表示した。
【００２６】
実施例３：ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損ＣＨＯ細胞株の形質転換
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞株ＣＨＯ／ＤＸＢ１１ストレインとＣＨＯ／ＤＧ４４ストレインを、１０％ウシ胎仔血清（Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｓ１０１−０１）と１％フェニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ Ｎｏ．１５１４０−１２２）が含まれたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＬＭ００２−０４）に接種して３７℃、５％ＣＯ２恒温器で継代培養した。前記Ｘ０ＧＣ／ＧＥＰＯ、Ｘ１ＧＣ／ＧＥＰＯ、Ｘ３ＧＣ／ＧＥＰＯおよびＸ６ＧＣ／ＧＥＰＯプラスミドでそれぞれのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損ＣＨＯ細胞株を形質転換するために、直径６ｃｍの細胞培養皿に１×１０６細胞を接種し、３７℃、５％ＣＯ２恒温器で２４時間培養した後、Ｇｉｂｃｏ社のＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ Ｎｏ．３１９８５−０７０）で２回洗浄した。１０μｇのそれぞれのプラスミドが入っている３つの１ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ Ｎｏ．１８３２４−０２０）１ｍＬを混合して常温で２０分間静置反応させた後、準備されたジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損ＣＨＯ細胞に均一に点滴し、１８時間３７℃、５％ＣＯ２恒温器で培養する。そして、さらに１０％ウシ胎仔血清と１％フェニシリン−ストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地で交換して４８時間培養した。形質転換された細胞株を選別するために、１０％透析ウシ胎仔血清（Ｗｅｌｇｅｎｅ）、１％フェニシリン−ストレプトマイシンおよび８００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｃａｔ Ｎｏ．６１−２３４ＲＧ）が入っているα−ＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＬＭ００８−０２）選別培地で０．５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ Ｎｏ．１５４００−０５４）処理と遠心分離によって得られた細胞株を全てＴ２５細胞培養容器に移して接種する。そして、３７℃、５％ＣＯ２恒温器で培養し、形質転換されてジェネティシン(geneticin)で選別された細胞株が培養容器に９０％以上となるように培養した。同一濃度のジェネティシンと培養条件で細胞株を選別し、ＧＣ繰り返し配列がさらに多く除去された細胞株で選別効果が速く現れることを観察することができた。ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子欠損ＣＨＯ細胞株のストレイン間の有意的差異は発見されなかった。
【００２７】
実施例４：組み換え細胞株の選別とエリトロポエチン遺伝子の増幅
前記で形質転換されてジェネティシン(geneticin)で選別されたそれぞれの細胞株（ＣＨＯ／ＤＸＢ１１ストレイン）またはＣＨＯ／ＤＧ４４ストレイン）のエリトロポエチン発現量を増加させるために、メトトレキサート（ＭＴＸ、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｍ−８４０７）が２０ｎＭの濃度で添加された選別培地（前記選別培地と同一）を含む２４−ｗｅｌｌ培養容器に２×１０４細胞を接種した後、３７℃、５％ＣＯ２恒温器で２週間培養した。エリトロポエチンの発現量が高い細胞株を選別するために、ウェルの底部が１００％覆われるように培養された細胞株をＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＬＢ００１−０２）で２回洗浄した後、エリトロポエチン生産培地であるＣＨＯ−Ａ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ Ｎｏ．０５−５０７２ＥＦ）を２００μＬ／ウェルとなるように添加する。そして、２４時間培養した培養上清液を回収して間接ＥＬＩＳＡ（ＥＰＯ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ、Ｃａｔ  Ｎｏ．ＤＥＰ００）方法で発現量を測定した。メトトレキサート濃度を３０ｎＭに上げた後、同一の選別培地で再び２週間培養を行い、それぞれの細胞株のエリトロポエチン発現量をＥＬＩＳＡ(Enzyme linked immunosorbent assay)キット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ＃ＤＥＰ００）で測定して比較した。ＥＬＩＳＡで測定された発現量は、図４〜図７に示すように、全般的にＸ０ＧＣ／ＧＥＰＯとＸ１ＧＣ／ＧＥＰＯが同一濃度のＭＴＸ条件で最も高い発現量を示しており、これに続いてＸ３ＧＣ／ＧＥＰＯとＸ６ＧＣ／ＧＥＰＯがある。このような事実は、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子のＧＣ繰り返し配列を多く除去すればするほど、同一濃度のメトトレキサート存在の際に遺伝子増幅が多く起こる場合を示している。また、ＧＣ繰り返し配列が完全に除去されたＸ０ＧＣ／ＧＥＰＯでも効率的な遺伝子増幅が起こることを確認することができた。したがって、ＧＣ繰り返し配列は最小に維持されるときにその増幅効果が最大に維持されるということを確認することができた。また、最大に遺伝子発現が起こるメトトレキサートの濃度を確認するために、選別培地内のメトトキレサートの濃度をさらに４０ｎＭから６０ｎＭまで増加させてみたが、有意すべき水準の発現量増加または酸性異性体の含量変化は起こらないことを確認した。本結果に基づき、実施例６と同様に、Ｘ０ＧＣ／ＧＥＰＯおよびＸ１ＧＣ／ＧＥＰＯで形質転換された２つの細胞株ストレインに対して限界希釈を施した。
【００２８】
実施例５：ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の増幅確認
実施例４で得られたそれぞれの細胞をＤ−ＰＢＳ溶液で１回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを処理して培養フラスコから回収した後、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞を得た。これをさらにＤ−ＰＢＳで１回洗浄し、血球計（Ｉｎｃｙｔｏ社）で細胞数を数えて３×１０６個の細胞を分離し、遠心分離して細胞沈殿を得た。得られた細胞は、それぞれ１．５ｍＬの細胞溶解緩衝液（ＰＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０）で懸濁し、４℃で３０分間溶解させた後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清液を得た。
１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを製作し、それぞれの細胞溶解液と陰性対照群としてのＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞溶解液を２０μＬずつ取ってサンプル緩衝液１０μＬと混合して１００℃で５分間前処理した後、ゲルにロードした。陽性対照群として、２０ｎｇ〜１００ｎｇのジヒドロ葉酸還元酵素（Ｓｉｇｍａ社、ｃａｔ Ｎｏ．Ｄ６５６６）をサンプル緩衝液と混合してＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードした。ロードしたゲルを３０ｍＡの電流で電気泳動した後、ゲルを分離してセミポアウエスタンブロットユニット（ＳＥＭＩ−ＰＨＯＲ、Ｈｏｅｆｅｒ社）にＰＶＤＦ濾紙およびＷｈａｔｍａｎ３Ｍ紙と重ねて装着し、９０ｍＡで１時間タンパク質をＰＶＤＦ濾紙に移動させた。その後、タンパク質が移動したＰＶＤＦ濾紙を分離し、０．５％脱脂油が含まれたＴＢＳ−Ｔ溶液１０ｍＬに抗−ジヒドロ葉酸還元酵素マウス抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ｃａｔ Ｎｏ．６１０６９７）を１：５００の割合で添加した溶液で１時間攪拌しながら反応させた。ＴＢＳ−Ｔ溶液で１０分ずつ５回洗浄した後、０．５％脱脂油の含まれたＴＢＳ−Ｔ溶液１０ｍＬに、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)が標識された抗−マウス抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ｃａｔ Ｎｏ．ＲＰＮ２１０８に含む）を１：３０００の割合で添加した溶液で１時間攪拌しながら反応させた。さらにＴＢＳ−Ｔ溶液で１０分ずつ５回洗浄した後、ＥＣＬウエスタンブロット分析システム(ECL Western Blotting Analysis System)（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ｃａｔ Ｎｏ．ＲＰＮ２１０８）の試薬１と試薬２を１：１で混合してＰＶＤＦ濾紙上に撒いて１分間放置して反応させた。反応直後、Ｘ線フィルムで感光し、現像して判読した。ウエスタンブロット結果は図９に示した。図９の結果より、形質転換によってｄｈｆｒ遺伝子の発現量が増加したことが分かった。同一の細胞数でＸ０ＧＣ／ＧＥＰＯまたはＸ１ＧＣ／ＧＥＰＯにおけるｄｈｆｒ発現がさらに高いことが分かった。
【００２９】
実施例６：単クローン細胞株の分離および選択
実施例４で最も発現量が高かったウェルのＸ０ＧＣ／ＧＥＰＯとＸ１ＧＣ／ＧＥＰＯ細胞株を６ウェル培養容器に移して培養した。単クローンを分離するために、９６ウェル培養容器に、ウェル当たり０．５細胞となるようにメトトレキサートが添加された選別培地でそれぞれの細胞株を限界希釈して接種した。３７℃、５％ＣＯ-２２恒温器で約２〜３週間培養し、単一コロニーが生成されたウェルのみを選別し、２４ウェル培養容器に移して培養することにより、実施例４と同様に間接ＥＬＩＳＡ方法でエリトロポエチンの発現量を測定した。
これらの中から、高い発現量を示しながら等電集束二量体中の酸性異性体の割合も高いＸ０ＧＣ／ＧＥＰＯ９６４７（ＤＸＢ１１）、Ｘ１ＧＣ／ＧＥＰＯ９６２９（ＤＧ４４）およびＸ０ＧＣ／ＧＥＰＯ９６０３クローンを最終単クローン細胞株として分離および選択し、時間による発現量と等電集束二量体パターンを分析した。
Ｘ０ＧＣ／ＧＥＰＯ９６４７（ＤＸＢ１１）の場合、細胞株当たりの発現量は約８０μｇ／１０Ｅ６ｃｅｌｌ／ｄａｙで測定された。このように本実施例で使用されたＸ０ＧＣ／ＧＥＰＯまたはＸ１ＧＣ／ＧＥＰＯの場合は、２段階の遺伝子増幅のみでも高発現細胞株を獲得することが可能な方法を可能にして低いパッセージ(passage)のみでもタンパク質生産用単クローン生産細胞株を製作することが可能であることを示している。
【００３０】
実施例７：単クローン細胞株の大量培養
ヒトのエリトロポエチンを大量生産するために、実施例６で選別された単クローン細胞株のうちＸ０ＧＣ／ＧＥＰＯ９６４７（ＤＸＢ１１）を一つのＴ１７５培養容器で段階的に継代培養し、合計１２０個のＴ１７５培養容器まで増幅を行った。一つのＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ当たり約２．５×１０８個の細胞株を接種し、合計８個のＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ、Ｃａｔ Ｎｏ．１７０００９）を接種した後、３７℃、５％ＣＯ２恒温器で約４８時間培養した。リン酸緩衝液でＣｅｌl Ｆａｃｔｏｒｙ１個当たり１Ｌずつ２回水洗した後、０．３ｍＭ酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｂ−５８８７）の添加されたエリトロポエチン大量生産培地としての無血清ＣＨＯ−Ａ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ Ｆｏｍｕｌａ Ｎｏ．０５−５０７２ＥＦ）を１Ｌずつ仕込み、３３℃、５％ＣＯ-２恒温器で培養した。そして、２日ごとに合計９回ヒトのエリトロポエチン発現上清液を回収した。回収された発現上清液は遠心分離機と０．２μｍの濾紙を用いて細胞残存物などの固形浮遊物を除去した。回収された発現上清液の一部を取って間接ＥＬＩＳＡ方法で発現量を測定し、等電集束を施して酸性の等電集束二量体の含有量などを分析した。図１０の結果より、大量培養においても４０〜５０ｍｇ／Ｌ水準の発現量を維持していることが分かった。そして、シアル酸高含有量の尺度になれる６番〜８番異性体の含有量が別途の精製過程を経ていないにも拘らず高いことが分かった。
【００３１】
実施例８：シアル酸高含有ヒトエリトロポエチンの分離精製
実施例７で生産された細胞培養液内に存在する浮遊物を除去するために、Ｂｅｃｋｍａｎ社のＸＬ−９０遠心分離機を用いてＪＬＡ−８．１０００ローターで７０００ｒｐｍにて遠心分離した。そして、上清液を回収した後、０．２μｍの濾紙で濾過した後、限外濾過膜(ultrafiltration membrane)を用いて１０分の１のボリュームで濃縮を行った。濃縮液に同量の２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４バッファを混ぜ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社のＢｌｕｅ ＦＦカラムを２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４バッファで平衡化させ、前記エリトロポエチン含有液を適用する。次いで、カラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）の５カラムボリュームで洗浄した後、２Ｍ ＮａＣｌと２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）をＢバッファとして２カラムボリュームの濃度勾配を適用してエリトロポエチンを溶出させた。
【００３２】
エリトロポエチン分画が主要分画となる部分を集め、Ｓｅｐｈａｒｄｅｘ Ｇ２５カラムを用いてエリトロポエチン含有溶液の２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．４バッファで脱塩し、溶液ｐのｐＨを変えた。このエリトロポエチン含有溶液を、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．４で平衡化されたＡｍｅｒｓｈａｍ社のＳＰ ＨＰカラムに適用し、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．４バッファで５カラムボリュームだけ洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４バッファをＢバッファとして１２カラムボリュームの濃度勾配を適用してエリトロポエチンを溶出させた。この際、低塩濃度で溶出されるエリトロポエチンはシアン酸含有量の高い分画であり、高塩濃度で溶出されるエリトロポエチンはシアル酸含有量の低い分画であるが、全体分画の３０％に相当する、高塩濃度で溶出される分画は排除し、残りの分画のみを取った。ＳＰ ＨＰカラムで精製したエリトロポエチン分画は、さらに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５バッファで平衡化されたＳｅｐｈａｒｄｅｘ Ｇ２５カラムを用いて塩を除去し、バッファを変える。これを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５バッファで平衡化されたＡｍｅｒｓｈａｍ社のＳｏｕｒｃｅ１５Ｑカラムに適用し、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５バッファをＢとして６カラムボリューム  の濃度勾配を適用してエリトロポエチンを溶出させた。エリトロポエチンが溶出される部分を１５個以上に分画し、各分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電集束とキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を用いて電荷異性体分布を分析した。各分画は不純物がなく、１０個のシアル酸モイエティ(moiety)を有するエリトロポエチンが最も多く含有された分画から高塩濃度分画を集めて取った。以上の精製過程を施した結果、シアル酸が１０モル以上含有された組み換えヒトエリトロポエチンの生産性は約２０μｇ／ｍＬに達すると調査された。
【００３３】
実施例９：ヒトエリトロポエチンの特性確認
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析
実施例８で精製された組み換えエリトロポエチンを２つの１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。１つのゲルは、コマシーブリリアントブルー (Coomassie Brilliant Blue)染色液で染色し、脱色を施して観察した。残り一つのゲルはセミドライ電気転移機を用いてＰＶＤＦ膜に吸着させる。抗ヒトＥＰＯ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ Ｎｏ．ＡＢ−２８６−ＮＡ）を１：５，０００で処理した後、洗浄を施し、アルカリ性ホスファターゼが接合された抗マウスウサギ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ｃａｔ Ｎｏ．ＮＡ９３４Ｖ）を処理した。０．５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のリン酸緩衝液で十分に洗浄した後、Ａｍｅｒｓｈａｍ社の発色試薬（ｃａｔ Ｎｏ．ＲＰＮ２１０８）で処理し、しかる後に、暗室でフィルム感光を施し、自動現像機を用いて現像を施した。分析結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドがエリトロポエチンであることと、糖化の度合いによって大きさが異なることを確認することができた（図１０参照）。
【００３４】
２）等電集束分析（ＩＥＦ）
細胞培養濃縮液、および実施例４で精製された組み換えエリトロポエチンを試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＬＣ５３７１）と１：１で混ぜた後、等電集束ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＥＣ６６５５Ｂ）にＢＲＰ（Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ１５１５０００）標準品および等電集束基準物質と共にロードし、低電圧と高電圧で順次電気泳動を施した。電気泳動済みの等電集束ゲルを１２％ＴＣＡと３％スルホサリチル酸含有の固定溶液で３０分間振とうしながら固定し、コマシーブリリアントブルーＲ２５０（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｃａｔ Ｎｏ．６１０４−５９−２）染色液で染色を行う。そして、それぞれの等電点に該当するエリトロポエチンを観察した（図１１参照）。
【００３５】
３）ＴＦ−１細胞株を用いた力価と活性の分析
１０％ウシ胎仔血清、１０μＭ β−メルカプトエタノール、２０μｇ／ｍＬトランスフェリンおよび１２ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦなどが含有されたＲＰＭＩ１６４０（Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＬＭ ０１１−０３）で成長したＴＦ−１（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＣＲＬ−２００３）を１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して回収する。回収されたＴＦ−１細胞株はリン酸緩衝溶液で２回洗浄を行い、２％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬトランスフェリン、２ｍｇ／ｍＬプロテアーゼ−フリー(protease-free)牛血清、および１％フェニシリン／ストレプトマイシンが入っているアッセイ培地で１回洗浄した。９６ウェルプレートに５０μＬのアッセイ培地を添加し、第１のウェルに２５μＬの試料と標準品を入れて最終濃度が１μｇ／ｍＬとなるようにした後、３倍ずつ連続的に希釈を行った。各ウェルに、アッセイ培地で洗浄したＴＦ−１細胞株を、２×１０４／５０μＬ／ウェルとなるように加えた。３７℃、５％ＣＯ２培養器で約７２時間反応させた後、Ｐｒｏｍｅｇａ社のｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｏｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎキット（Ｃａｔ Ｎｏ．Ｇ４１０２）の発色溶液を各ウェル当たり２０μＬずつ添加した。４時間３７℃、５％ＣＯ２培養器で発色を施した後、よく混ぜて４９０ｎｍ波長における吸光度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社のＥＬＩＳＡリーダーで測定した。本試験によって、Ｘ０ＧＣ／ＧＥＰＯ由来の組み換えエリトロポエチン活性は標準品のそれと差異がないことを確認することができた。
【００３６】
実施例１０：単クローン細胞株の無血清培地適用
Ｘ１ＧＣ／ＧＥＰＯ９６２９（ＤＧ４４）とＸ０ＧＣ／ＧＥＰＯ９６０３（ＤＧ４４）ストレインを１０％透析ウシ胎仔血清(dialyzed fetal bovine serum)、１％フェニシリン−ストレプトマイシンおよび８００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｃａｔ Ｎｏ．６１−２３４ ＲＧ）が入っているａ−ＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＬＭ００８−０２）選別培地を用いて２つのＴ１７５培養容器で底部に９０％以上培養されるようにした。０．５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ Ｎｏ．１５４００−０５４）で処理した後、遠心分離を施す。遠心分離によって得た底部の細胞塊りを８ｍＭグルタミン入りのＪＲＨ社のＥＸ−ＣＥＬＬ ＣＤ ＣＨＯ（Ｃａｔ Ｎｏ．１４３６０）培養培地で懸濁させた。無血清培地で懸濁された細胞培養液をＴ１７５培養溶液に入れてＣＯ２培養器で静置培養を行った。培養約３日後、底部にくっ付くことなく浮遊して成長する細胞を遠心分離した後、新規のＴ２５培養容器に移す。９日後、培養容器から浮遊細胞をさらに回収して細胞数、成長曲線および生存率などを測定した。同一の作業を、細胞分裂が２４時間内外で行われ且つ生存率が８０％以上となるまで繰り返し行った。無血清培地で完全適応されたＸ０ＧＣ／ＧＥＰＯ９６０３（ＤＧ４４）およびＸ１ＧＣ／ＧＥＰＯ９６２９（ＤＧ４４）細胞株の発現様相を確認するために、５００μＬ ｓｐｉｎｎｅｒ培養容器（Ｂｅｌｌｃｏ）に１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で２００ｍＬの培養培地で５０ｒｐｍにて攪拌培養を行った。培養７日後、１００ｍＬの培養培地を新規の培養培地に変え、培養温度を３３℃に低めて低温発現を施した。２４時間間隔で培養上清液を取って等電集束を施し、発現するエリトロポエチンの酸性異性体含量を確認した。図１２に示すように、無血清培地に完全適応されたＸ０ＧＣ／ＧＥＰＯ９６０３（ＤＧ４４）およびＸ１ＧＣ／ＧＥＰＯ９６２９（ＤＧ４４）細胞株の場合、既存のｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙで生産されたエリトロポエチンと対等な水準の等電集束プロファイルを示していることを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
上述したように、本発明は、ＧＣ−ｒｉｃｈ配列が一部または全部除去されたジヒドロ葉酸還元酵素プロモーターを含むベクター、および前記ベクターによって形質転換された細胞株を提供する。本発明は、ヒトのエリトロポエチンを生産する細胞株を選別するが、低濃度のジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤を短期間使用することにより、高濃度でエリトロポエチンを生産する細胞株の開発期間を短縮させることができる。また、前記細胞株を用いて高効率で所望の組み換えタンパク質を大量生産することができるため、既存の動物細胞発現ベクターで使用する方法中の一つである遺伝子増幅技術をさらに効率よく改善させるという効果がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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