(57)【要約】  生体細胞及びその他の膜構造物を流入システムでトランスフェクトする。まず構造物を磁場に反応し得る程度に磁気的に活性化し、トランスフェクトに用いる外因性種の溶液に構造物を懸濁させ、次いで懸濁物をチャンネル内に配置し、チャンネル壁に沿って可動磁化パターンを印加し、構造物をチャンネル壁に沿って移動させる。移動経路において構造物はトランスミッタを通過し、トランスミッタが発するトランスフェクションエネルギーによって、懸濁物中の外因性種が構造物の膜を浸透し、構造物内に導入される。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁気的に活性な複数の膜構造物を、前記構造物に対して外因性種によりトランスフェクトする方法であって：
（ａ）トランスフェクションエネルギートランスミッタを搭載した、線形配列の磁化可能な表面領域を有する縦壁を含んでなるチャネル内に、前記膜構造物の前記外因性種の溶液中分散液を導入する工程；
（ｂ）前記表面領域を連続的に磁化し、磁化された前記表面領域と前記膜構造物の間に、前記膜構造物を前記縦壁に沿って、且つ前記トランスフェクションエネルギートランスミッタを越えて進行させるような可動磁化パターンで、磁力を発生させる工程；及び
（ｃ）各膜構造物が前記トランスフェクションエネルギートランスミッタを通過したら、前記トランスフェクションエネルギートランスミッタを作動させ、前記トランスフェクションを達成する工程
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記可動磁化パターンが、前記膜構造物を誘引しない表面領域と、前記膜構造物を誘引する表面領域とを交互に含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記可動磁化パターンが、前記膜構造物を誘引しない２以上の表面領域の群と、前記膜構造物を誘引する２以上の表面領域の群とを交互に含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記表面領域が、前記膜構造物を縦一列で前記トランスフェクションエネルギートランスミッタを越えて進行させ得る程度に小さい、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記トランスフェクションエネルギートランスミッタが、一対のエレクトロポレーション電極である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記エレクトロポレーション電極が、前記チャネルの反対側に位置する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記トランスフェクションエネルギートランスミッタがレーザダイオードである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｂ）が、１秒あたり構造物１００から１０，０００の一定の速度で、前記トランスフェクションエネルギートランスミッタを越えて前記膜構造物を１つずつ進行させるよう、前記表面領域を一定レートで連続的に磁化する工程を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
磁気的に活性な複数の膜構造物を連続的にトランスフェクションする装置であって：
トランスフェクションエネルギートランスミッタを搭載するチャネルであって、磁化可能な表面領域の線形配列を担持する縦壁と隣接するチャネル；
前記トランスフェクションエネルギートランスミッタにエネルギーを印加し、前記膜構造物がエネルギー場内に存在する場合に前記膜構造物のトランスフェクションを誘発し得る十分なエネルギー場を発生させる、トランスフェクション手段；及び
前記表面領域を連続的に磁化することにより、前記膜構造物を誘引する可動磁場を発生させ、前記エネルギー場を介して前記膜構造物を連続的に運搬する手段
を含んでなる装置。
【請求項１０】
前記トランスフェクショントランスミッタがエレクトロポレーション電極を含んでなり、前記エネルギー場が電場である、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記トランスフェクションエネルギートランスミッタがレーザダイオードを含んでなり、前記エネルギー場が光エネルギー場である、請求項９に記載の装置。
【請求項１２】
前記磁化可能な表面領域が、前記膜構造物を、前記エネルギー場を通じて縦一列で進行させ得る程度に小さい、請求項９に記載の装置。
【請求項１３】
前記磁化可能な表面領域の中心間距離が約０．１ミクロン〜約１０ミクロンである、請求項９に記載の装置。
【請求項１４】
前記磁化可能な表面領域の中心間距離が約０．３ミクロン〜約３ミクロンである、請求項９に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は２００７年２月１４日付米国特許仮出願第６０／８８９，８６９号に基づく利益を請求する。当該出願の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、生体細胞、リポソーム、及び小胞等の膜構造物の、外因性種によるトランスフェクションの分野に属する。特に本発明は、連続流トランスフェクション系を生じる膜構造物の可動化に関する。
【背景技術】
【０００３】
トランスフェクションは、生物学及び生化学の研究者が、例えばｓｉＲＮＡ実験、ｃＤＮＡライブラリーを用いた研究、その他の臨床及び研究実験等の様々な調査や研究を実施する上で有用である。エレクトロポレーションは最先端のトランスフェクション技術の１つであり、膜構造物を外因性種の溶液に懸濁した懸濁物に（通常はパルス状の）電場を印加するものである。電場が膜構造物を一時的に浸透性にすることで、物質が膜に入ることが可能になると考えられる。トランスフェクションの使用が増加するに伴い、その用途を制限する懸案事項が幾つか生じた。その１つは本手法の効率の悪さであり、他の懸案事項はそのばらつきである。これらは何れも、膜構造物の凝集性、構造物の配向性の違い、並びに（構造物の配向性が異なる場合は）構造物の電場への暴露性の違いに起因するものと考えられる。また、斯かる効率の悪さ及びばらつきは、個々の構造物の遮蔽効果によって、電場や外因性種に対する遮蔽構造物の暴露が制限されてしまう結果であるとも考えられる。
【０００４】
さらなる懸案事項は、特にトランスフェクションを大量の細胞やその他の膜構造物に対して実行される場合における、スループット率である。細胞の種類、注入される物質の種類、又はそれら双方が異なる多数のサンプルを同時にトランスフェクションするために、ハイスループット系が開発されてきた。多数のサンプルを収容可能なエレクトロポレーションプレートが、斯かるトランスフェクション用に特別に設計されてきた。斯かるプレートに関する説明は、特許協力条約の下で２００４年６月１７日に公開された国際特許出願公開ＷＯ２００４／０５０８６６Ａｌ、表題「Large-Scale Electroporation Plates, Systems, and Methods of Use」（出願人Genetronics, Inc.；発明者Gamelin, A.等）；及び２００７年１０月２５日公開の米国特許出願公開ＵＳ２００７／０２４９０３６Ａｌ、表題「Apparatus for High-Throughput Electroporation」（発明者Ragsdale, C. W.等）に記載されており、本明細書でも共有される。また、ハイスループットの試みは、例えば単一のエレクトロポレーションキュベットに収容し得る量を超える、大量の膜構造物の同時処理によってもなされてきた。
【０００５】
エレクトロポレーション及びトランスフェクションの文献の多数、並びに、市販のエレクトロポレーション系の全てにおいて、その操作はキュベットによりバッチ形式で実行される。バッチ式の手法には高度な操作と反復が必要となる上、通常のキュベットにはサイズの制限があるため、大量のサンプルや多数の構造物の処理には費用がかかり、且つエラーが生じ易い。バッチ式操作用に設計されたエレクトロポレーションチャンバーは、連続使用するとチャンバーが過熱し、処理対象の細胞膜が修復不能なほどに破壊されてしまう危険がある。連続流系も検討されてきたものの、あまり実用はされてない。連続流系の説明は、１９９７年３月１８日発行のNicolau等（CBR Laboratories, Inc.）による米国特許第５，６１２，２０７号、「Method and Apparatus for Encapsulation of Biologically-Active Substances in Cells」、及び、２０００年７月１８日発行のMeserol, P.（EntreMed, Inc.）による米国特許第６，０９０，６１７号、「Flow Electroporation Chamber With Electrodes Having a Crystalline Metal Nitride Coating」に記載されている。これらの特許では、電極として細長いストリップ電極が使用されており、単純な機械的ポンプを用いて、細胞を電極間のスペースを通じてポンピングすることにより、エレクトロポレーションが達成される。エレクトロポレーション率はポンプ率によって制限され、流路内の任意の特定点における懸濁物密度等の因子を制御することは、殆ど或いは全く不可能であり、個々の細胞間での電場への暴露性の違いを取り除く方法はない。可動部を有する別の系に関する説明は、２００４年２月１２日発行のAcker, J.L.等による米国特許出願公開ＵＳ２００４／００２９２４０Ａｌに記載されている。しかし、Acker等が使用する系は可動電極を有し、流入系ではない。可動電極を使用する目的は、細胞に剪断応力を加えて細胞の配向性を継続的に変化させるためである。
【０００６】
本発明の背景に関連し得る更なる技術として、光パルス等の電磁放射の使用によるトランスフェクションの達成がある。エレクトロポレーションと同様の手法で、膜構造物を光パルスエネルギーに暴露することにより、膜を破壊することなく膜を一時的に透過性とすることができる。細胞に対して外因性の分子物質の溶液中に細胞を懸濁し、斯かる懸濁液を光エネルギーに暴露してエレクトロポレーションを実行することによって、透過膜を通じて物質を細胞内に導入することができる。この技術の説明は、２００６年６月２２日発行のKoller, M.R.等（Oncosis LLC）による米国特許ＵＳ６，７５３，１６１Ｂ２、「Optoinjection Methods」に記載されている。この技術において、光への暴露及びそれによる一時的な透過性は、細胞が「実質的に固定された」状態で達成される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、連続流方式で構造物をトランスフェクションする系及び方法に関する。かかる系及び方法は、膜構造物を磁力により、チャネルを通じて移動させ、チャネル内のトランスフェクションエネルギーのトランスミッタを通過させる。構造物は磁気的に活性化される。これは、磁性材料又は磁気応答性材料を構造物に注入することにより、或いは、磁性材料若しくは磁気的応答性材料で作製された、又はかかる材料を含有するビーズ、粒子、又は部分的封入物を、構造物に付着させることによりなされる。従来のトランスフェクションの場合と同様、磁気的に活性な構造物を、トランスフェクション用の外因性種の溶液に懸濁し、懸濁物をチャネルに導入する。その後、線形配列で配置されたチャネル内部の縦壁上の領域を連続的に磁化し、壁に沿った可動磁化パターンを発生させる。この磁化パターンによって、膜構造物、又は構造物が連結されたビーズ、粒子、封入物は、磁力により壁に引き付けられる。パターンが壁に沿って移動すると、構造物はパターンに伴って移動する。磁化パターンは、構造物の動きを補助するべく、引力に加えて反発力を含んでいてもよい。可動磁化パターンによって、構造物はチャネルを通じて、制御下で移動する。好適には、構造物間の間隔が制御されるとともに、速度が制御されることが好ましく、また、壁との接触が維持されることが好ましい。進行中に、膜構造物はトランスフェクションエネルギートランスミッタを通過する。トランスミッタが発生させるエネルギー場に到達すると、構造物は１つずつ、或いは予め選択されたサイズの群で、予め選択された時間間隔で、また、予め選択された空間的隔離を伴ってトランスフェクションに供される。本発明のある態様によれば、構造物は壁に沿って縦一列で、且つトランスフェクションエネルギートランスミッタを通過して移動する。本発明の他の態様によれば、構造物は複数のクラスタ又は群として、或いは２以上の平行経路を通じて移動する。
【０００８】
チャネル壁の可動磁化パターンによって、膜構造物の移動を十分に制御することができ、各構造物に同一の強度及び持続時間のパルスを適用することが可能となる。よって、全ての構造物、又は実質的に全ての構造物を、高い効率で均一にトランスフェクトすることができ、過度のエネルギーへの暴露による構造物の破壊による損失を最小限に抑えることが可能となる。また、壁の表面領域の磁化を自動制御すれば、磁化パターンにおいて帯電される領域の数及び間隔を選択することにより、種々のサイズ及び寸法の膜構造物を系に収容させることも可能となる。また、自動制御を用いれば、連続する膜構造物間の間隔を変化したり、任意の時点でトランスミッタに暴露される構造物の数を変更したりすることも可能となる。
【０００９】
上記のように、本発明の可動磁化パターンを用いれば、個々の膜構造物を互いに隔離した状態で維持することができ、また、構造物が縦一列でトランスフェクションエネルギー場を通過するので、各構造物に対して均一にトランスフェクションを実施することが可能となる。好適には、磁力によって、膜構造物のチャネル壁との物理的接触が確立され、且つ、チャネル内を進行する際の接触が維持される。それによって、構造物の凝集、構造物によるチャネルの目詰まり、及び、他の構造物による遮蔽が阻止される。また、磁化（又は磁気的応答性）ビーズの表面に、多数の構造物を結合させ、又は成長させることにより、構造物をクラスタ化させてもよい。ビーズがトランスフェクションエネルギー放射域内に存在する間、ビーズを回転させることによって、単一の支持ビーズが有する全ての構造物を首尾よく均一にトランスフェトすることができる。トランスフェクションの達成後、磁化パターンを移動させてビーズを放射域から離し、他のビーズと交替させる。回転は、アルミニウムやその他の伝導性且つ非磁性の材料の平板片をビーズに取り組み、ビーズに交流電流（ＡＣ）印加することにより、達成することができる。電流によってアルミニウム内に渦電流が生じ、これによってアルミニウムとＡＣ場との間に反発力が発生する。これによってビーズを回転させることができるが、これは所望の流通方向にビーズを移動させる独立した手段としても機能し得る。２以上の膜構造物をビーズに付着する場合には、回転によって、同一ビーズ上の異なる構造物を連続的にトランスフェクションエネルギー放射に暴露することができ、構造物の全て、或いは少なくとも大部分にトランスフェクションを行うことが可能となる。更にはこの系を用いて、単一の構造物をトランスフェクションエネルギーパルスに対し、多数回に亘って暴露することも可能となる。
【００１０】
以上に加えて、本発明の他の操作、機能、及び利点を、以下に更に詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明に係るトランスフェクション装置の透視図である。
【図２】図１のトランスフェクション装置の透視図において、チャネル壁の一部を除去して内部を示した図である。
【図３】本発明に係る更に別のトランスフェクション装置の透視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に適用され得る膜構造物は、少なくとも高分子の寸法の物体であり、且つ標準条件下で注目の物質を通さない囲いのある膜を含む。かかる膜構造物の例は、リポソーム、小胞、細胞小器官、及び生体細胞である。生体細胞について本発明は、原核細胞及び真核細胞の両方を適用し、そしてこれらの細胞は、例えば動物細胞、植物細胞、酵母細胞、ヒト細胞、又はバクテリアであり得る。磁性又は磁気的応答性は、当業界において公知の方法にて膜構造物に与えることができる。これらは１以上の磁性粒子又は磁気的応答性材料の粒子の膜構造物への注入、或いは共有結合、疎水性相互作用、又は親和性型結合のいずれかを介した磁性又は磁気的応答性ビーズとの複合体を形成するための膜構造物の表面機能化によるビーズへの構造物の付着を含む。生体細胞の磁性又は磁気的応答性ビーズへの付着は、慣用の細胞育成技術を用いてビーズ上で細胞を育成することによって達成され得る。更に本発明によって取り組まれる任意の膜構造物は、ケージに封入されていても、又は他の磁性もしくは磁気的応答性物質の部分的封入物であってもよい。封入物はしっかりと構造物を保持するが、それでもやはり構造物への外因性種を含む周囲媒質の接近を提供する。
【００１３】
本明細書において使用される用語「外因性種」とは、膜構造物に由来せず、その他の点では膜構造物中に存在する任意の分子又は分子のクラスタを意味するが、また構造物の内部に限られた量、又は限られた濃度だけ存在する分子を意味し、そしてその量又は濃度の増加は割り出される。トランスフェクションによって典型的に膜構造物中に挿入される外因性種の分類の例は、一般的に核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、及び低分子である。核酸の例は、発現プラスミド、発現カセット、及び他の発現可能なＤＮＡ及びＲＮＡである。ポリペプチドは、一般的に抗体、抗体フラグメント、酵素、又はタンパク質であり得る。炭水化物は、一般的に同位体標識された糖類等の天然に発生しない代謝産物、標識されたデキストラン、並びに単糖、オリゴ糖、及び多糖であり得る。低分子の例は、薬物、染料、及び内因性受容体のためのリガンドである。リポソームは、膜構造物がリポソームよりも大きい物体の場合は外因性種として供され得る。
【００１４】
本明細書において使用される用語「トランスフェクションエネルギー」とは、膜構造物に適用されるエネルギーの任意の形態を意味し、膜を可逆的に多孔質させ、さもなければ懸濁液中の外因性種が膜を通り、そして構造物の内部に入ることができるのに十分な限られた時間だけ膜を浸透性にさせ、且つ膜を破断せず、さもなければ回復困難な損傷を構造物にもたらさずにそれらを成し得る。トランスフェクションエネルギーの例は、電気エネルギー(エレクトロポレーションをもたらす)、光エネルギー(レーザ光源由来及び非レーザ光源由来)、熱エネルギー、RFエネルギー、超音波、及び電子ビームエネルギーである。トランスフェクションエネルギーの好適な形態は、電気エネルギー及びレーザ光エネルギーであり、個々に又は組み合わせて適用される。電気エネルギー(エレクトロポレーション)は特に好適である。「トランスフェクションエネルギートランスミッタ」とは、任意のデバイス又は部品であり、トランスフェクションエネルギー場を生じ得る。好適なものの１つは、一度でのトランスフェクションを予め選定された数の膜構造物に制限するために十分に小さい空間容積の中に集中される。トランスフェクションエネルギー場は、一度に１つの構造物のみに対応するために十分に小さくてもよく、又は２以上の構造物等の限定された複数に対応するために十分に広くてもよく、或いは１つの構造物のみにぶつけるために十分に狭いエネルギー線であってもよい。各特定のエネルギー型について当業界において公知であるトランスミッタが使用され得る。エレクトロポレーションについてのトランスミッタは光又は熱エネルギーのための電極であってよく、これらのトランスミッタはレーザダイオードであり得る。これら及び他の形態のトランスフェクションエネルギーのための他のトランスミッタは、当業者には明らかである。
【００１５】
チャネルの縦壁上の磁化可能領域は、固定された安定領域であり、電磁的手段によって個々に及び選択的に磁化され得る。領域は好適には導体であり、平行に細長く、又はポールの末端に曝されて（例えば北又は南の極性、或いは中性の磁性を与えるために個々に通電され得るコイルで巻かれたエクステンションを有する）チャネル壁の中に埋め込まれるか、さもなければチャネル壁に取り付けられる。所定の時点での磁化パターンは、反対の極性領域又は群、或いは非磁化領域又は群により交互に与えられる極性を有する領域又は領域群から成るであろう。コイルを通る電流の変化により引き起こされる極性の経時的変化により、磁化パターンは壁に沿って領域を動き、チャネル中に可動磁場を作り出し、可動磁場により膜構造物が運搬される。各領域は、領域の磁性を制御している別個の個々のコイルを有することができ、又は領域は、２つ以上の領域群において、他の群のコイルとは別の共通のコイルの影響下で各群と連結され得る。
【００１６】
上記のように、膜構造物は、構造物と磁気的応答性材料の粒子との衝突によって磁気的に活性化され、その後に磁気分離法を用いることによって粒子を首尾よく含浸し続ける構造物を回収することができる。粒子衝突技術は当業界において公知であり、そして例えばガスの加圧流、爆破装置、又は粒子を推し進めるための可動キャリアプレートの使用を含む。或いは構造物は、浸透せずに、表面機能化及びカップリングによって、又は粒子もしくはビーズの表面上に構造物を育成することによって磁気的応答性材料の粒子又はビーズと結合され得る。磁気的応答性金属及びポリマーは、磁気的応答性材料として使用され得る。磁気的応答性粒子、特にポリマーは、細胞への表面カップリングのために、粒子表面への化学的部位（細胞又は細胞上の特定の受容体に結合又は付着するものが存在する部位）の付着によって機能化され得る。これらの部位に含まれるのは、共有結合のための官能基、又は細胞表面との親和性結合において関与する部位である。更に公知の細胞表面受容体に特異的に結合するリガンドのような健常哺乳動物の免疫系によって分泌される化学誘引物質も官能基として使用され得る。更に細胞、粒子、又は両者は、付着を助ける材料（電荷群又は疎水性結合を促進する群等）でコーティングされ得る。他の例は、当業者には容易に理解される。
【００１７】
壁上の可動磁化パターンは、好適には膜構造物を誘引する２以上の磁化可能領域、又は構造物が付着するビーズもしくは粒子から成る。更に磁化パターンは、１つ以上の磁気的反発領域又は磁気的中性領域との組み合せにある２以上の磁気的誘引領域から成り得る。極性反発領域が含まれる場合、反発領域は、誘引極性を担持する領域の上流（すなわち終端）に位置し、チャネルを介して進む方向に向かって膜構造物を推し進めることを助け得る。それによって２つの極性は、各通過構造物に押す力と引く力の両方をかける。チャネルを介して膜構造物が進む間のそれらの位置の最適な制御は、誘引極性により磁化される２つの隣接領域を含む磁化パターンによって達成され得る。これらの隣接誘引領域間の間隔が膜構造物の長さ又は直径とほぼ同等又は若干小さい場合は、これらの２つの領域は、構造物の位置を固定する。特定の態様では、系は、異なる磁化パターンの間で選定を行い、異なる大きさの膜構造物に対応するオペレーターを可能にすることによって適合され得る。従って２つの磁化領域は、パターン中の１つ以上の介在する非磁化領域によって分離され得る。介在領域の数は、荷電領域の間隔を決定する。多くの場合における最良の結果は、磁化領域又は磁化可能領域の間で、約０．１ミクロン〜約１０ミクロン、及び好適には約０．３ミクロン〜約３ミクロンの中心間距離で得られる。
【００１８】
本明細書において使用される用語「線形配列」とは、線形に配置された磁化可能領域を示し、磁化パターンが配列に沿って動く場合に得られる磁場が行程の一方向の経路に沿って膜構造物を導くように、曲がっていても直線でもよい。最も多くの場合において直線の配列が最も都合がよい。２以上の平行な線形配列も同様に使用でき、チャネル能及びトランスフェクションレートを２倍、さもなければ多数倍させる。
【００１９】
本明細書において使用される用語「磁気的に活性」とは、壁の磁化領域が磁化された時に領域によって誘引又は反発されることによって領域に対して感受性となる任意の材料を意味する。かかる材料は、強磁性材料、フェリ磁性材料、常磁性材料、超常磁性材料、及び反磁性材料を含む。鉄、ニッケル、及びコバルトは、強磁性材料の例である。磁赤鉄鉱、磁鉄鉱、及びフェライトは、フェリ磁性材料の例である。アルミニウム、バリウム、及びカルシウムは、常磁性材料の例である。磁気的に活性な材料のさらなる例及び他の群の例は、当業者には公知である。
【００２０】
系は、一度にチャネルを通過する単一細胞もしくは他の膜構造物、又は複数の構造物のいずれかに対応するように設計され得る。チャネルが２以上の構造物に対応するのに十分に長い場合、磁化プロトコルは、構造物の数に等しい多くの可動磁化パターンを含む。隣接する磁化パターン間の間隔は、好適にはチャネルを介する構造物の動きの中で、及びトランスミッタからのトランスフェクションエネルギーへの構造物の暴露の中で、連続する構造物間の干渉を回避するのに十分な程度とする。多くの場合、構造物の直径の１０倍以上、好適には５０倍以上に等しい間隔が適切である。
【００２１】
磁化パターンは、膜構造物を縦一列、二列縦隊、又はそれ以上で進ませるように設計され得る。縦一列での進行は、一般的に殆どの適用に十分であり、且つ磁化可能領域の寸法、チャネルの寸法、又は両方を制限することによって達成され得る。単位時間あたりでチャネルを通過する構造物の進行速度及び数もまた変えることができる。好適には進行レートは、１秒あたり１０以上の構造物、好適には１秒あたり１００〜１０，０００の構造物、最適には１秒あたり３００〜３，０００の構造物をトランスフェクションエネルギートランスミッタに通すのに十分な速さである。
【００２２】
それにもかかわらずチャネルの直径は、構造物がチャネルを目詰まりさせずに自由にチャネルを流れることを可能にする程度に十分に大きい。少なくとも約１０ミクロン、好適には約２０ミクロン、又はそれを超えるチャネル幅又は直径は、多くの場合において、特に生体細胞に適切である。１ｍｍを超えるチャネルもまた使用され得る。
【００２３】
トランスフェクションエネルギートランスミッタは、膜構造物がチャネルを介すそれらの進行行程の間にトランスミッタの範囲内に来るようにチャネル中の固定された場所に置かれる。トランスミッタは、エレクトロポレーションによりトランスフェクションを引き起こす一対の電極であってよく、且つ電極は、磁化可能領域として働く表面上の領域であってもよい。膜構造物がトランスフェクションの際にこれらの領域に近づく時、これらの領域は磁化されるよりも、むしろ帯電されることによって電極として働く。従って電極は、チャネルの同じ側、又は反対側上の一対の磁化可能領域であり得る。エレクトロポレーションの際に領域間に印加される電圧は、膜構造物の型、チャネルの寸法、及び電極の間隔に応じて変化させてよい。多くの場合において電圧は、０．３〜３０Ｖ、好適には１〜５ボルトの範囲内とする。
【００２４】
エレクトロポレーションの代替例としては、温度誘発ポレーション及び光誘発ポレーションがある。いずれもレーザダイオード又は他の光エネルギーのトランスミッタの使用によって達成され得る。同様にこれらのトランスミッタは、チャネルの片側又は逆側、及び最も効果的なものとしては一対の隣接する磁化可能表面領域間に設置され得る。レーザダイオードは、膜構造物へのそれらの近接近を考慮して、ほとんどもしくはまったく光学でないことが要求される。
【００２５】
金属ストリップ及びチャネル壁特徴を含む膜構造物がビーズに付着するという本発明の態様は、金属ストリップの中で渦動拡散を引き起こすＡＣ電流を形成する能力を含む。ＡＣ電流は、磁化可能領域に電気を流すことによって与えられ得る。適切にプログラム化されたコントローラは、膜構造物がトランスフェクション放射域内に侵入すると、チャネルを介した構造物の線形の動きと構造物の回転を調整するようにＡＣ電流及び磁化を調節できる。
【００２６】
本発明を規定する特徴は種々の構成で実現可能であるが、本発明の全体は、特定の態様を詳細に説明することにより、最もよく理解し得るであろう。かかる態様を、添付の図面に示す。
【００２７】
図１は連続流トランスフェクション装置11を示し、図２は同一の装置において、内部が見えるように壁の一部を取り除いたものを示す。以下の説明ではこれらの図の両方を参照する。
【００２８】
装置の中央部は、両端が開いたチャネル１２であり、便宜上、入口端１３及び出口端１４を指定する。膜構造物１５は、入口端でチャネルに入るのを示され、そして図２におけるさらなる膜構造物１６、１７は、チャネル内部に見える。構造物は、矢印１８、１９の方向でチャネルを介して移動する。チャネルの片側壁２１は、電磁性によって磁化可能である導電性材料のストリップ２２の形で一連の磁化可能領域を含む。ストリップは平行であり、且つ電気的及び磁気的に絶縁である材料のギャップ２３によって分けられるので、磁化可能ではない。８つのストリップを含んで示された態様は、４つずつの２群で配置される。各群のストリップは、フォークの歯のように形付けられ、１つの群の歯は、線形配列が２つの群の交互のストリップから成るように、他の群の歯と交互になっている。各群の４つのストリップは、チャネルから上方に伸びた第一の群の連接部２４及び下方に伸びた第二の連接部２５の共通の連接部で連結される。導電性ワイヤのコイル２６、２７は、各連接部の周りを取り囲み、コイルに電流が流れることによってストリップを磁化することができる。
【００２９】
典型的な手順では、エレクトロポレーション装置１１の中に入るのに先立ち、膜構造物は上記の任意の方法によって最初に磁気的に活性化され、そして構造物中に挿入される外因性種の溶液中に分散される。磁気的に活性な膜構造物１５は、チャネル１２の入口端１３に近づくと、入口端の最も近くにストリップ３１を含むストリップの第一の群を磁化するコイル２６を電流が通過する。このストリップ３１は磁化されると膜構造物１５を誘引し、構造物をチャネル中に引き込み、そして矢印の方向に向けて構造物に線形運動を与える。その後にコイル２６へ流れる電流は中断されて、第二の群のストリップを磁化するコイル２７に電流が流されて、膜構造物を配列における第二のストリップに引き込む。交流方法におけるコイル２６、２７への通電は継続され、チャネルの全長に渡って構造物１５を引き込む。従って本実施例における可動磁化パターンは、交流パターンである。示された構造に代わるものとして、チャネル１２は、磁化可能ストリップの２つの配列を含み得る。チャネルの各片側は、対称的な可動磁場を形成し、膜構造物が通過する際にそれらをチャネルの中心線に沿わせ続ける。
【００３０】
チャネルの反対側の壁上のストリップ３２、及び磁化可能ストリップのストリップ３３の１つは、エレクトロポレーションのための電極として働くために追加の導線（図示せず）に連結させることができ、そして、膜構造物がストリップ間を通過する時に、それらのストリップを横切って電圧が印加され得る。或いは、任意の磁化可能ストリップに関連しない独立した一対のエネルギートランスミッタ３４、３５は、エレクトロポレーション、又は温度誘発又は光誘発ポレーションを達成するために使用され得る。構造物において渦電流を生み出すことによってＡＣ電流に応答するであろう構造物に関する態様では、ＡＣ電流は、チャネルの側壁上の任意のストリップによって与えられ得る。
【００３１】
図３は、図１及び２の装置上の変形例４１を示す。図中の各ストリップ４２は、個々のコイル４３によって磁化され、そしてコイルの通電は、プログラム可能なコントローラ４４によって制御される。従ってコントローラは、どの時点においても電流が流されるコイルの数、通電が行われるレート及びその後の磁化パターン速度、並びに各ストリップで生み出される磁場の強度を選定するようにプログラムされ得る。
【００３２】
以上の説明では、図に示す部品の種々の変形例について言及したが、さらなる変形例も当業者には明白であり、本発明の範囲内にある。
【００３３】
特許請求の範囲における「１つ」（「a」及び「an」）という語は、「１つ以上」を意味する意図である。工程又は要素を列挙する場合、「含んでなる」（「comprise」）及びその活用形（「comprises」及び「comprising」）は、さらなる工程又は要素を追加してもよく、排他的でないことを意図する。本明細書に引用された全ての特許、特許出願、及び他の公開された参照資料は、それらの全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。本明細書に引用された任意の参照資料と、本明細書の明示の記載との間に相違がある場合、本明細書の記載を優先することにより解消することが意図される。これは、当業界で理解されている単語又は語句の定義と、本明細書で明示される同一の単語又は語句の定義との間に相違がある場合も同様である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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