(57)【要約】本開示は、ＣＤ７０に高親和性で特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。好ましくは、抗体はヒトＣＤ７０に結合する。特定の実施形態では、抗体は、ＣＤ７０発現細胞に内在化されうるかまたは抗原依存性細胞障害作用を媒介する能力がある。本開示の抗体をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞および本開示の抗体を発現するための方法も提供される。抗体−パートナー分子複合体、二重特異性分子および本開示の抗体を含有する医薬組成物も提供される。本開示はまた、ＣＤ７０を検出するための方法、ならびに本開示の抗ＣＤ７０抗体を用いて癌、例えば腎癌およびリンパ腫を治療するための方法を提供する。2010513306.tif 000081
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、パートナー分子とを含む、抗体−パートナー分子複合体であって、
前記抗体が、ヒトＣＤ７０に結合し、かつ
（ａ）ヒトＣＤ７０に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合する特性、および
（ｂ）腎細胞癌腫瘍細胞系に結合する特性、
（ｃ）リンパ腫細胞系に結合する特性、
（ｄ）ＣＤ７０発現細胞により内在化される特性、
（ｅ）ＣＤ７０発現細胞に対して抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を示す特性、および
（ｆ）細胞毒素に結合される場合、インビボでＣＤ７０発現細胞の成長を阻害する特性
のうちの少なくとも１つを示し、
前記パートナー分子が治療剤である、抗体−パートナー分子複合体。
【請求項２】
前記抗体が特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）のうちの少なくとも２つを示す、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項３】
前記抗体が特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）のうちの少なくとも３つを示す、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項４】
前記抗体が特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）のうちの少なくとも４つを示す、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項５】
前記抗体が特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）のうちの少なくとも５つを示す、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項６】
前記抗体が特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）の６つ全部を示す、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項７】
ヒトＣＤ７０に５．５×１０−９Ｍ以下の親和性で結合する、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項８】
ヒトＣＤ７０に３×１０−９Ｍ以下の親和性で結合する、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項９】
ヒトＣＤ７０に２×１０−９Ｍ以下の親和性で結合する、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項１０】
参照抗体により認識されるヒトＣＤ７０上のエピトープに結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、パートナー分子とを含む、抗体−パートナー分子複合体であって、
前記参照抗体が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｆ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、前記パートナー分子が治療剤である、抗体−パートナー分子複合体。
【請求項１１】
前記参照抗体が配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１０記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項１２】
前記参照抗体が配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１０記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項１３】
前記参照抗体が配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１０記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項１４】
前記参照抗体が配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１０記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項１５】
前記参照抗体が配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１０記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項１６】
前記参照抗体が配列番号７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１０記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項１７】
前記参照抗体が配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１０記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項１８】
ヒトＶＨ３−３０．３遺伝子、ヒトＶＨ３−３３遺伝子、ヒトＶＨ４−６１遺伝子、またはヒトＶＨ３−２３遺伝子の、産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、パートナー分子とを含む、抗体−パートナー分子複合体であって、前記抗体がＣＤ７０に特異的に結合し、前記パートナー分子が治療剤である、抗体−パートナー分子複合体。
【請求項１９】
ヒトＶＫＬ６遺伝子、ヒトＶＫＬ１８遺伝子、ヒトＶＫＬ１５遺伝子、ヒトＶＫＬ６遺伝子、またはヒトＶＫＡ２７遺伝子の、産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、パートナー分子とを含む、抗体−パートナー分子複合体であって、前記抗体がＣＤ７０に特異的に結合し、前記パートナー分子が治療剤である、抗体−パートナー分子複合体。
【請求項２０】
以下を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分：
（ａ）ヒトＶＨ３−３３遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ１５遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域、
（ｂ）ヒトＶＨ３−３０．３遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ６遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域、ここで前記抗体はヒトCD70に特異的に結合し、
（ｃ）ヒトＶＨ３−３０．３遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ１８遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域、ここで前記抗体はヒトCD70に特異的に結合し、
（ｄ）ヒトＶＨ４−６１遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域およびヒトＶＫＬ６遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域、ここで前記抗体はヒトCD70に特異的に結合し、あるいは
（ｅ）ヒトＶＨ３−２３遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域およびヒトＶＫＡ２７遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域、ここで前記抗体はヒトCD70に特異的に結合する；ならびに
治療剤であるパートナー分子
を含む、抗体−パートナー分子複合体。
【請求項２１】
（ａ）配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項２２】
（ａ）配列番号１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項２３】
（ａ）配列番号１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項２４】
（ａ）配列番号１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項２５】
（ａ）配列番号１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項２６】
（ａ）配列番号１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号７５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項２７】
（ａ）配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項２８】
（ａ）配列番号１〜６および７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号７〜１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、パートナー分子とを含む、抗体−パートナー分子複合体であって、前記抗体がヒトＣＤ７０タンパク質に特異的に結合し、前記パートナー分子が治療剤である、抗体−パートナー分子複合体。
【請求項２９】
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項２８記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項３０】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項２８記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項３１】
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項２８記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項３２】
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項２８記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項３３】
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項２８記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項３４】
（ａ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項２８記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項３５】
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項２８記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項３６】
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｆ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体により認識されるヒトＣＤ７０タンパク質上のエピトープに結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、治療剤であるパートナー分子とを含む、抗体−パートナー分子複合体。
【請求項３７】
請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体および薬学的に許容できる担体を含む、組成物。
【請求項３８】
治療剤が細胞毒素である、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項３９】
請求項３８記載の抗体−パートナー分子複合体および薬学的に許容できる担体を含む、組成物。
【請求項４０】
治療剤が放射性同位体である、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項４１】
請求項４０記載の抗体−パートナー分子複合体および薬学的に許容できる担体を含む、組成物。
【請求項４２】
ＣＤ７０発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、ＣＤ７０発現腫瘍細胞と請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体とを、ＣＤ７０発現腫瘍細胞の成長が阻害されるように接触させる工程を含む、方法。
【請求項４３】
ＣＤ７０発現腫瘍細胞が腎腫瘍細胞またはリンパ腫細胞である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
ＣＤ７０発現腫瘍細胞が腎細胞癌またはリンパ腫からなる群より選択される癌に由来する、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
対象における癌を治療する方法であって、対象に請求項１記載の抗体−パートナー分子を、対象における癌が治療されるように投与する工程を含む、方法。
【請求項４６】
癌が腎細胞癌またはリンパ腫である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
癌が、腎細胞癌（ＲＣＣ）、明細胞ＲＣＣ、グリア芽腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、多発性骨髄腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小切れ込み細胞型リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、中心芽細胞性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫癌、Ｂ細胞系のびまん性大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ関連体腔に基づくリンパ腫、胎生期癌、鼻咽腔の未分化癌、シュミンケ腫瘍、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、およびＢ細胞リンパ腫からなる群より選択される、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
対象における自己免疫疾患を治療または予防する方法であって、請求項１記載の抗体−パートナー分子を対象に投与する工程を含み、それによって対象における自己免疫疾患が治療または予防される、方法。
【請求項４９】
対象における炎症を治療または予防する方法であって、対象における炎症が治療または予防されるように、請求項１記載の抗体−パートナー分子を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項５０】
対象におけるウイルス感染を治療する方法であって、対象におけるウイルス感染が治療されるように、請求項１記載の抗体−パートナー分子を対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項５１】
パートナー分子が化学リンカーにより抗体に結合される、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項５２】
化学リンカーが、ペプチジルリンカー、ヒドラジンリンカー、およびジスルフィドリンカーからなる群より選択される、請求項５１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項５３】
腎細胞癌腫瘍細胞系が、７８６−Ｏ、Ａ−４９８、ＡＣＨＮ、Ｃａｋｉ−１およびＣａｋｉ−２細胞系からなる群より選択される、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項５４】
リンパ腫細胞系がＢ細胞腫瘍細胞系である、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項５５】
Ｂ細胞腫瘍細胞系が、Ｄａｕｄｉ、ＨｕＴ７８、ＲａｊｉおよびＧｒａｎｔａ５１９細胞系からなる群より選択される、請求項５４記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項５６】
抗体またはその抗原結合部分が非フコシル化される、請求項１記載の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項５７】
配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５８】
配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体により認識されるヒトＣＤ７０タンパク質上のエピトープに結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５９】
（ａ）配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６０】
抗体またはその抗原結合部分が非フコシル化される、請求項５７記載の抗体。
【請求項６１】
請求項５７記載の抗体またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子。
【請求項６２】
請求項６１記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項６３】
請求項６２記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００６年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／８７０，０９１号明細書、２００７年５月１日に出願された米国仮特許出願第６０／９１５，３１４号明細書および２００７年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／９９１，７０２号明細書に対する優先権を主張するものであり、それらの内容は参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
サイトカイン受容体ＣＤ２７は、細胞成長および分化ならびにアポトーシスまたはプログラム化された細胞死における役割を果たす腫瘍壊死因子受容体（ＴＦＮＲ）スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ２７に対するリガンドはＣＤ７０であり、それはリガンドの腫瘍壊死因子ファミリーに属する。ＣＤ７０は、２つの有望なＮ−結合グリコシル化部位を有する２０アミノ酸の親水性Ｎ末端ドメインおよびＣ末端ドメインを有する１９３アミノ酸ポリペプチドである（Ｇｏｏｄｗｉｎ  Ｒ．Ｇ．ら（１９９３年）Ｃｅｌｌ  ７３：４４７−５６頁（非特許文献１）；Ｂｏｗｍａｎら（１９９４年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２：１７５６−６１頁（非特許文献２））。これらの特徴に基づき、ＣＤ７０は細胞外Ｃ末端部分を有するＩＩ型膜貫通タンパク質であることが判定された。
【０００３】
ＣＤ７０は活性化され、静止していないＴおよびＢリンパ球と樹状細胞上に一時的に見出される（Ｈｉｎｔｚｅｎら（１９９４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１７６２−１７７３頁（非特許文献３）；Ｏｓｈｉｍａら（１９９８年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５１７−２６頁（非特許文献４）；Ｔｅｓｓｅｌａａｒら（２００３年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３３−４０頁（非特許文献５））。ＣＤ７０の発現は、正常細胞上での発現に加え、腎細胞癌、転移性乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫および鼻咽腔癌を含む異なるタイプの癌において報告されている（Ｊｕｎｋｅｒら（２００５年）Ｊ  Ｕｒｏｌ．１７３：２１５０−３頁（非特許文献６）；Ｓｌｏａｎら（２００４年）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１６４：３１５−２３頁（非特許文献７）；Ｈｅｌｄ−ＦｅｉｎｄｔおよびＭｅｎｔｌｅｉｎ（２００２年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９８：３５２−６頁（非特許文献８）；Ｈｉｓｈｉｍａら（２０００年）Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ．２４：７４２−６頁（非特許文献９）；Ｌｅｎｓら（１９９９年）Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０６：４９１−５０３頁（非特許文献１０））。さらに、ＣＤ７０は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤またはＥＲＫ経路阻害剤で処理されたＴ細胞上で過剰発現され、場合により薬剤誘発性および特発性のループスをもたらすことが見出されている（Ｏｅｌｋｅら（２００４年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５０：１８５０−６０頁（非特許文献１１））。ＣＤ７０とＣＤ２７の相互作用はまた、細胞媒介性自己免疫疾患およびＴＮＦ−αの生成の阻害における役割を果たすことが提示されている（Ｎａｋａｊｉｍａら（２０００年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１８８−９６頁（非特許文献１２））。
【０００４】
したがって、ＣＤ７０は、癌、自己免疫疾患およびＣＤ７０発現で特徴づけられる種々の他の疾患の治療における重要な標的を表す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｏｏｄｗｉｎ  Ｒ．Ｇ．ら（１９９３年）Ｃｅｌｌ  ７３：４４７−５６頁
【非特許文献２】Ｂｏｗｍａｎら（１９９４年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２：１７５６−６１頁
【非特許文献３】Ｈｉｎｔｚｅｎら（１９９４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１７６２−１７７３頁
【非特許文献４】Ｏｓｈｉｍａら（１９９８年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５１７−２６頁
【非特許文献５】Ｔｅｓｓｅｌａａｒら（２００３年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３３−４０頁
【非特許文献６】Ｊｕｎｋｅｒら（２００５年）Ｊ  Ｕｒｏｌ．１７３：２１５０−３頁
【非特許文献７】Ｓｌｏａｎら（２００４年）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１６４：３１５−２３頁
【非特許文献８】Ｈｅｌｄ−ＦｅｉｎｄｔおよびＭｅｎｔｌｅｉｎ（２００２年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９８：３５２−６頁
【非特許文献９】Ｈｉｓｈｉｍａら（２０００年）Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ．２４：７４２−６頁
【非特許文献１０】Ｌｅｎｓら（１９９９年）Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０６：４９１−５０３頁
【非特許文献１１】Ｏｅｌｋｅら（２００４年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５０：１８５０−６０頁
【非特許文献１２】Ｎａｋａｊｉｍａら（２０００年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１８８−９６頁
【発明の概要】
【０００６】
概要
本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合しかつ望ましい機能特性を有する単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。これらの特性は、ヒトＣＤ７０への高親和性結合、ＣＤ７０を発現する細胞による内在化、抗体依存性細胞障害作用に対する媒介能、腎細胞癌腫瘍細胞系に対する結合能、および／またはリンパ腫細胞系、例えばＢ細胞腫瘍細胞系に対する結合能を含む。本発明の抗体を用い、例えばＣＤ７０タンパク質の検出またはＣＤ７０を発現する細胞、例えばＣＤ７０を発現する腫瘍細胞の成長に対する阻害が可能である。
【０００７】
また、種々のＣＤ７０媒介性疾患を本開示の単離されたモノクローナル抗体およびその組成物を用いて治療するための方法が提供される。
【０００８】
一態様では、本開示は、ＣＤ７０に結合し、かつ、
（ａ）ヒトＣＤ７０に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合する特性、および
（ｂ）腎細胞癌腫瘍細胞系に結合する特性、
（ｃ）リンパ腫細胞系、例えばＢ細胞腫瘍細胞系に結合する特性、
（ｄ）ＣＤ７０発現細胞により内在化される特性、
（ｅ）ＣＤ７０発現細胞に対して抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を示す特性、および
（ｆ）細胞毒素に複合される場合、インビボでＣＤ７０発現細胞の成長を阻害する特性、
のうちの少なくとも１つを示す、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。
【０００９】
好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）のうちの少なくとも２つを示す。より好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）のうちの少なくとも３つを示す。より好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）のうちの４つを示す。さらにより好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）のうちの５つを示す。さらにより好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）の６つ全部を示す。さらに別の好ましい実施形態では、抗体は、細胞毒素に複合される場合、インビボでＣＤ７０発現腫瘍細胞の成長を阻害する。
【００１０】
好ましくは、抗体は、７８６−Ｏ（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１９３２）、Ａ−４９８（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−４４）、ＡＣＨＮ（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１６１１）、Ｃａｋｉ−１（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−４６）およびＣａｋｉ−２（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−４７）からなる群より選択される腎細胞癌腫瘍細胞系に結合する。
【００１１】
好ましくは、抗体は、Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−２１３）、ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ登録番号ＴＩＢ−１６１）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−８６）またはＧｒａｎｔａ−５１９（ＤＳＭＺ登録番号３４２）細胞から選択されるＢ細胞腫瘍細胞系に結合する。
【００１２】
好ましくは、抗体はヒト抗体であるが、他の実施形態では抗体はマウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体でありうる。
【００１３】
より好ましい実施形態では、抗体はヒトＣＤ７０に５．５×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するかまたはヒトＣＤ７０に３×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するかまたはヒトＣＤ７０に２×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するかまたはヒトＣＤ７０に１．５×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する。
【００１４】
別の実施形態では、抗体は７８６−Ｏ腎細胞癌腫瘍細胞により、同細胞上で発現されるＣＤ７０への結合後に内在化される。
【００１５】
別の実施形態では、本開示は参照抗体により認識されるＣＤ７０上のエピトープへの結合に対して交差競合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで参照抗体は（ａ）ヒトＣＤ７０に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合しかつ（ｂ）腎細胞癌腫瘍細胞系に結合する。
【００１６】
様々な実施形態では、参照抗体は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むか、または参照抗体は（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含むか、または参照抗体は（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むか、または参照抗体は（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むか、または参照抗体は（ａ）配列番号５または７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含むか、または参照抗体は（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【００１７】
別の実施形態では、本開示の参照抗体は抗体６９Ａ７Ｙである。６９Ａ７Ｙは、抗体６９Ａ７と同じであるが、配列番号５のＶＨアミノ酸配列内に保存的修飾を有し、アミノ酸位置１００でのＣ（システイン）からＹ（チロシン）への突然変異をもたらす。６９Ａ７ＹのＶＨアミノ酸配列は配列番号７３で示される。ＣからＹへの突然変異は、６９Ａ７のＶＨヌクレオチド配列（配列番号５３）のヌクレオチド位置３２３でのＧからＡへの単一の塩基対置換から生じる。６９Ａ７ＹのＶＨヌクレオチド配列は配列番号７４で示される。６９Ａ７Ｙは、配列番号７５で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を有する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、ヒトＶＨ３−３０．３遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、ＣＤ７０に特異的に結合する、治療剤に結合された単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。本開示はまた、ヒトＶＨ３−３３遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、ＣＤ７０に特異的に結合する、治療剤に結合されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む単離されたモノクローナル抗体を提供する。本開示はまた、ヒトＶＨ４−６１遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、ＣＤ７０に特異的に結合する、治療剤に結合されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む単離されたモノクローナル抗体を提供する。本開示はまた、ヒトＶＨ３−２３遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、ＣＤ７０に特異的に結合する、治療剤に結合されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む単離されたモノクローナル抗体を提供する。
【００１９】
本開示はまた、ヒトＶＫＬ６遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、ＣＤ７０に特異的に結合する、治療剤に結合されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む単離されたモノクローナル抗体をさらに提供する。本開示はまた、ヒトＶＫＬ１８遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、ＣＤ７０に特異的に結合する、治療剤に結合されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む単離されたモノクローナル抗体をさらに提供する。本開示は、ヒトＶＫＬ１５遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、ＣＤ７０に特異的に結合する、治療剤に結合されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む単離されたモノクローナル抗体をさらに提供する。本開示は、ヒトＶＫＡ２７遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、ＣＤ７０に特異的に結合する、治療剤に結合されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む単離されたモノクローナル抗体をさらに提供する。
【００２０】
特に好ましい抗体またはその抗原結合部分は、
（ａ）配列番号１３を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１
（ｂ）配列番号１９を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２５を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３１を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３７を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号４３を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
【００２１】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００２２】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００２３】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号１６を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２２を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２８を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３４を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号４０を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号４６を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
【００２４】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２９または７５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００２５】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００２６】
本開示の他の好ましい抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合部分を有する。
【００２７】
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２８】
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２９】
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３０】
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号５または７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３１】
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３２】
別の実施形態では、本開示の抗体は抗体６９Ａ７Ｙである。６９Ａ７Ｙは抗体６９Ａ７と同じであるが、アミノ酸位置１００でのＣ（システイン）からＹ（チロシン）への突然変異をもたらす、配列番号５のＶＨアミノ酸配列内に保存的修飾を有する。６９Ａ７ＹのＶＨアミノ酸配列は配列番号７３として示される。ＣからＹへの突然変異は、６９Ａ７のＶＨヌクレオチド配列（配列番号５３）のヌクレオチド位置３２３でのＧからＡへの単一の塩基対置換から生じる。６９Ａ７ＹのＶＨヌクレオチド配列は配列番号７４として示される。６９Ａ７Ｙは、配列番号７５として示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を有する。
【００３３】
本開示の抗体は、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの例えば完全長抗体でありうる。あるいは、抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦａｂ’２断片、または一本鎖抗体でありうる。
【００３４】
本開示は、治療物質、例えば細胞毒素または放射性同位体に連結された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体も提供する。特に好ましい実施形態では、本発明は、細胞毒素（例えば、本明細書または２００６年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／８８２，４６１号明細書または２００７年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／９９１，３００号明細書（それら全体が参照により本明細書中に援用される）に記載の細胞毒素）に（例えばチオール結合により）結合された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体を提供する。特定の実施形態では、免疫複合体の細胞毒素およびリンカーはＮ１またはＮ２の構造を有する。
【００３５】
例えば、様々な実施形態では、本発明は、
（ｉ）
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｅ）配列番号５または７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、細胞毒素に結合される、抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体、
（ｉｉ）
（ａ）配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む抗体またはその抗原結合部分、または
（ａ）配列番号１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む抗体またはその抗原結合部分、または
（ａ）配列番号１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む抗体またはその抗原結合部分、または
（ａ）配列番号１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む抗体またはその抗原結合部分、または
（ａ）配列番号１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２９または７５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む抗体またはその抗原結合部分、または
（ａ）配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含み、細胞毒素に連結される、抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体、ならびに
（ｉｉｉ）
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｅ）配列番号５または７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、細胞毒素に結合される、抗体により認識される（例えばヒトＣＤ７０への結合に対してその抗体と交差競合する）場合と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体
といった好ましい免疫複合体を提供する。
【００３６】
本開示は、抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能部分に連結された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子も提供する。
【００３７】
本開示の抗体またはその抗原結合部分あるいは免疫複合体または二重特異性分子と薬学的に許容できる担体とを含む組成物も提供される。
【００３８】
本開示の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子、ならびにかかる核酸を含む発現ベクターおよびかかる発現ベクターを含む宿主細胞も本開示によって包含される。かかる発現ベクターを含む宿主細胞を用いて抗ＣＤ７０抗体を調製するための方法も提供され、それは（ｉ）宿主細胞内で抗体を発現する工程と、（ｉｉ）宿主細胞から抗体を単離する工程とを含みうる。
【００３９】
さらに別の態様では、本発明は抗ＣＤ７０抗体を調製するための方法に関する。本方法は、
（ａ）（ｉ）配列番号１３〜１８からなる群より選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１９〜２４からなる群より選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号２５〜３０および７５からなる群より選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列；および／または（ｉｉ）配列番号３１〜３６からなる群より選択されるＣＤＲ１配列、配列番号３７〜４２からなる群より選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号４３〜４８からなる群より選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供する工程と、
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列内および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変し、少なくとも１つの改変抗体配列を作製する工程と、
（ｃ）タンパク質として改変抗体配列を発現させる工程と、
を含む。
【００４０】
本開示は、ＣＤ７０に高親和性で特異的に結合する単離された抗ＣＤ７０抗体−パートナー分子複合体、特にヒトモノクローナル抗体を含むものも提供する。特定のかかる抗体−パートナー分子複合体は、ＣＤ７０発現細胞内に内在化される能力があり、かつ抗体依存性細胞障害作用を媒介する能力がある。本開示は、本明細書中に開示される抗ＣＤ７０抗体−パートナー分子複合体を用い、癌、例えば腎細胞癌またはリンパ腫を治療するための方法も提供する。
【００４１】
本開示のパートナー分子に複合される抗体またはその抗原結合部分を含有する組成物も提供される。本明細書中に開示される抗体パートナー分子複合体中での抗体に有利に複合されうるパートナー分子として、限定はされないが、薬剤としての分子、毒素、マーカー分子（例えば放射性同位体）、タンパク質および治療剤が挙げられる。抗体−パートナー分子複合体および薬学的に許容できる担体を含有する組成物も本明細書中に開示される。
【００４２】
一態様では、かかる抗体−パートナー分子複合体は化学リンカーを介して複合される。一部の実施形態では、リンカーはペプチジルリンカーであり、本明細書中で（Ｌ４）ｐ−Ｆ−（Ｌ１）ｍとして示される。他のリンカーはヒドラジンおよびジスルフィドリンカーを含み、それぞれ本明細書中で（Ｌ４）ｐ−Ｈ−（Ｌ１）ｍまたは（Ｌ４）ｐ−Ｊ−（Ｌ１）ｍとして示される。パートナーに結合されているようなリンカーに加え、本発明は、本質的に任意の分子種への結合に適する切断可能なリンカーアームも提供する。
【００４３】
別の態様では、本発明はＣＤ７０発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法に関する。本方法は、ＣＤ７０発現腫瘍細胞を本開示の抗体−パートナー分子複合体にＣＤ７０−腫瘍細胞の成長が阻害されるように接触させる工程を含む。好ましい実施形態では、パートナー分子は治療剤、例えば細胞毒素である。特に好ましいＣＤ７０発現腫瘍細胞は腎癌細胞およびリンパ腫細胞である。
【００４４】
別の態様では、本発明は、対象における癌を治療する方法に関する。本方法は、対象に本開示の抗体−パートナー分子複合体を癌が対象において治療されるように投与する工程を含む。好ましい実施形態では、パートナー分子は治療剤、例えば細胞毒素である。治療にとって特に好ましい癌は腎癌およびリンパ腫である。
【００４５】
別の態様では、本発明は、対象における自己免疫疾患、炎症、またはウイルス感染を治療する方法に関する。本方法は、対象に本開示の抗体−パートナー分子複合体を、自己免疫疾患が対象において治療されるように投与する工程を含む。
【００４６】
本開示の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および実施例から明白となり、それらは限定するものとして解釈されるべきではない。本願の全体を通じて言及されるあらゆる参考文献の内容、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号、特許および公開された特許出願は、参照により本明細書中に明示的に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】２Ｈ５ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号４９）およびアミノ酸配列（配列番号１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１９）およびＣＤＲ３（配列番号２５）領域が図示され、かつＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図１Ｂ】２Ｈ５ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号５５）およびアミノ酸配列（配列番号７）を示す。ＣＤＲ１（配列番号３１）、ＣＤＲ２（配列番号３７）およびＣＤＲ３（配列番号４３）領域が図示され、かつＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図２Ａ】１０Ｂ４ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号５０）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１４）、ＣＤＲ２（配列番号２０）およびＣＤＲ３（配列番号２６）領域が図示され、かつＶ、Ｄ、およびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図２Ｂ】１０Ｂ４ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号５６）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号３２）、ＣＤＲ２（配列番号３８）およびＣＤＲ３（配列番号４４）領域が図示され、かつＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図３Ａ】８Ｂ５ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号５１）およびアミノ酸配列（配列番号３）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１５）、ＣＤＲ２（配列番号２１）およびＣＤＲ３（配列番号２７）領域が図示され、かつＶ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図３Ｂ】８Ｂ５ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号５７）およびアミノ酸配列（配列番号９）を示す。ＣＤＲ１（配列番号３３）、ＣＤＲ２（配列番号３９）およびＣＤＲ３（配列番号４５）領域が図示され、かつＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図４Ａ】１８Ｅ７ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号５２）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号２２）およびＣＤＲ３（配列番号２８）領域が図示され、かつＶ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図４Ｂ】１８Ｅ７ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号５８）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号３４）、ＣＤＲ２（配列番号４０）およびＣＤＲ３（配列番号４６）領域が図示され、かつＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図５Ａ】６９Ａ７ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号５３）およびアミノ酸配列（配列番号５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１７）、ＣＤＲ２（配列番号２３）およびＣＤＲ３（配列番号２９）領域が図示され、かつＶ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図５Ｂ】６９Ａ７ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号５９）およびアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号３５）、ＣＤＲ２（配列番号４１）およびＣＤＲ３（配列番号４７）領域が図示され、かつＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図６Ａ】１Ｆ４ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号５４）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１８）、ＣＤＲ２（配列番号２４）およびＣＤＲ３（配列番号３０）領域が図示され、かつＶ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図６Ｂ】１Ｆ４ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号６０）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号３６）、ＣＤＲ２（配列番号４２）およびＣＤＲ３（配列番号４８）領域が図示され、かつＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図７】２Ｈ５および１０Ｂ４の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＨ３−３０．３のアミノ酸配列（配列番号６１）とのアラインメントを示す。
【図８】８Ｂ５および１８Ｅ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＨ３−３３のアミノ酸配列（配列番号６２）とのアラインメントを示す。
【図９】６９Ａ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＨ４−６１のアミノ酸配列（配列番号６３）とのアラインメントを示す。
【図１０】１Ｆ４の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶＨ３−２３のアミノ酸配列（配列番号６４）とのアラインメントを示す。
【図１１】２Ｈ５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶｋＬ６のアミノ酸配列（配列番号６５）とのアラインメントを示す。
【図１２】１０Ｂ４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶｋＬ１８のアミノ酸配列（配列番号６６）とのアラインメントを示す。
【図１３】８Ｂ５および１８Ｅ７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶｋＬ１５のアミノ酸配列（配列番号６７）とのアラインメントを示す。
【図１４】６９Ａ７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶｋＬ６のアミノ酸配列（配列番号６５）とのアラインメントを示す。
【図１５】１Ｆ４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系ＶｋＡ２７のアミノ酸配列（配列番号６８）とのアラインメントを示す。
【図１６】ヒトＣＤ７０に対するヒトモノクローナル抗体がＣＤ７０に特異的に結合することを示すＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。
【図１７】抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体２Ｈ５が腎癌細胞系に結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１８Ａ】ヒトＣＤ７０に対するヒトモノクローナル抗体が濃度依存的に腎細胞癌（ＲＣＣ）細胞系の７８６−Ｏ  ＲＣＣ細胞系に結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１８Ｂ】ヒトＣＤ７０に対するヒトモノクローナル抗体が濃度依存的に腎細胞癌（ＲＣＣ）細胞系のＡ４９８  ＲＣＣ細胞系に結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１８Ｃ】ヒトＣＤ７０に対するヒトモノクローナル抗体が腎癌細胞系７８６−Ｏに結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１８Ｄ】ヒトＣＤ７０に対するＨｕＭＡｂ  ６９Ａ７抗体が濃度依存的に腎細胞癌（ＲＣＣ）細胞系７８６−Ｏに結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１９】抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体２Ｈ５がヒトリンパ腫細胞系に結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図２０Ａ】抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体２Ｈ５が濃度依存的にヒトリンパ腫細胞系のＲａｊｉリンパ腫細胞系に結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図２０Ｂ】抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体２Ｈ５が濃度依存的にヒトリンパ腫細胞系のＧｒａｎｔａ−５１９リンパ腫細胞系に結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図２０Ｃ】ヒトＣＤ７０に対するヒトモノクローナル抗体がＲａｊｉリンパ腫細胞系に結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図２０Ｄ】ＨｕＭＡｂ  ２Ｈ５および６９Ａ７が類似の結合エピトープを共有することを示す競合フローサイトメトリーアッセイの結果を示す。
【図２０Ｅ】ヒトＣＤ７０に対するヒトモノクローナル抗体がＤａｕｄｉリンパ腫細胞系および７８６−Ｏ腎癌細胞系に結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図２１】ヒトＣＤ７０に対するヒトモノクローナル抗体がＣＤ７０＋細胞に内在化されうることを示すＨｕｍ−Ｚａｐ内在化実験の結果を示す。
【図２２Ａ】細胞毒素に複合されたヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体が腎細胞癌（ＲＣＣ）細胞系のＣａｋｉ−２  ＲＣＣを死滅させることを示す細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図２２Ｂ】細胞毒素に複合されたヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体が腎細胞癌（ＲＣＣ）細胞系の７８６−Ｏ  ＲＣＣを死滅させることを示す細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図２２Ｃ】細胞毒素に複合されたヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体が腎細胞癌（ＲＣＣ）細胞系のＡＣＨＮ  ＲＣＣを死滅させることを示す細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図２３Ａ】ヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がＡＤＣＣ依存的に白血病・リンパ腫細胞系のＡＲＨ−７７白血病細胞系を死滅させることを示すＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【図２３Ｂ】ヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がＡＤＣＣ依存的に白血病・リンパ腫細胞系のＨｕＴ  ７８リンパ腫細胞系を死滅させることを示すＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【図２３Ｃ】ヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がＡＤＣＣ依存的に白血病・リンパ腫細胞系のＲａｊｉリンパ腫細胞系を死滅させることを示すＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【図２３Ｄ】ヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がＡＤＣＣ依存的に白血病・リンパ腫細胞系の、ＣＤ７０を発現しないＬ−５４０細胞系を死滅させることを示すＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【図２４】細胞毒素に複合されたヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がヒトリンパ腫細胞系を死滅させることを示す細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図２５Ａ】細胞毒素に複合されたヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がＲａｊｉ細胞に対する細胞毒性を示すことを示す、３時間の洗浄を伴う細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図２５Ｂ】細胞毒素に複合されたヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がＲａｊｉ細胞に対する細胞毒性を示すことを示す、連続洗浄を伴う細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図２６Ａ】細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５による治療がインビボで腎細胞癌（ＲＣＣ）腫瘍のＡ−４９８  ＲＣＣ腫瘍に対して直接の阻害効果を有することを示すインビボでのマウス腫瘍モデル試験の結果を示す。
【図２６Ｂ】細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５による治療がインビボで腎細胞癌（ＲＣＣ）腫瘍のＡＣＨＮ  ＲＣＣ腫瘍に対して直接の阻害効果を有することを示すインビボでのマウス腫瘍モデル試験の結果を示す。
【図２７Ａ】非フコシル化ヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がＡＤＣＣ依存的にヒト白血病細胞のＡＲＨ−７７細胞に対する細胞毒性を増大させていることを示すＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【図２７Ｂ】非フコシル化ヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がＡＤＣＣ依存的にヒト白血病細胞のＭＥＣ−１細胞に対する細胞毒性を増大させていることを示すＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【図２７Ｃ】非フコシル化ヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がＡＤＣＣ依存的にヒト白血病細胞の抗ＣＤ１６抗体で治療されたＭＥＣ−１細胞に対する細胞毒性を増大させていることを示すＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【図２７Ｄ】非フコシル化ヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がＡＤＣＣ依存的にヒト白血病細胞のＳＵ−ＤＨＬ−６細胞に対する細胞毒性を増大させていることを示すＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【図２７Ｅ】非フコシル化ヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がＡＤＣＣ依存的にヒト白血病細胞のＩＭ−９細胞に対する細胞毒性を増大させていることを示すＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【図２７Ｆ】非フコシル化ヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がＡＤＣＣ依存的にヒト白血病細胞のＨｕＴ７８細胞に対する細胞毒性を増大させていることを示すＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【図２８】ヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がＡＤＣＣ濃度依存的にヒト白血病細胞を死滅させることを示すＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【図２９】ヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がＡＤＣＣ濃度依存的にヒト白血病細胞を死滅させるが、細胞毒性がＣＤ１６に依存することを示す抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）アッセイの結果を示す。
【図３０】ヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がヒト活性化Ｔ細胞を死滅させかつ効果が抗ＣＤ１６抗体の添加で反転されることを示すＡＤＣＣアッセイの結果を示す。
【図３１】一部のヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がＣＤ７０のＣＤ２７への結合を遮断し、それら以外のヒトモノクローナル抗ＣＤ７０抗体がＣＤ７０のＣＤ２７への結合を遮断しないことを示す遮断アッセイの結果を示す。
【図３２Ａ】裸抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５による治療がインビボでリンパ腫Ｒａｊｉ腫瘍に対して直接の阻害効果を有することを示すインビボでのマウス腫瘍モデル試験の結果を示す。
【図３２Ｂ】裸抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５による治療がインビボでリンパ腫ＡＲＨ−７７腫瘍に対して直接の阻害効果を有することを示すインビボでのマウス腫瘍モデル試験の結果を示す。
【図３３Ａ】細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５による治療がインビボでリンパ腫ＡＲＨ−７７腫瘍に対して直接の阻害効果を有することを示すインビボでのマウス腫瘍モデル試験の結果を示す。
【図３３Ｂ】細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５による治療がインビボでリンパ腫Ｇｒａｎｔａ５１９腫瘍に対して直接の阻害効果を有することを示すインビボでのマウス腫瘍モデル試験の結果を示す。
【図３３Ｃ】細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５による治療がインビボでリンパ腫Ｒａｊｉ腫瘍に対して直接の阻害効果を有することを示すインビボでのマウス腫瘍モデル試験の結果を示す。
【図３４】抗ＣＤ７０抗体６９Ａ７がアカゲザルＣＤ７０＋Ｂリンパ腫細胞系上に発現されるＣＤ７０と交差反応することを示す試験の結果を示す。
【図３５】ヒト抗ＣＤ７０抗体が既知のマウス抗ヒトＣＤ７０抗体の結合を遮断することを示す遮断アッセイの結果を示す。
【図３６Ａ】抗ＣＤ７０抗体または非フコシル化形態の抗体のいずれかによる治療の結果を示す。抗ＣＤ７０抗体は、ＣＤ７０で共刺激された細胞増殖を用量依存的に阻害する。
【図３６Ｂ】抗ＣＤ７０抗体または非フコシル化形態の抗体のいずれかによる治療の結果を示す。抗ＣＤ７０抗体は、ＣＤ７０で共刺激されたＩＦＮ−γの分泌を用量依存的に阻害する。
【図３７Ａ】ペプチド刺激細胞に対する抗ＣＤ７０抗体または非フコシル化形態の抗体のいずれかによる治療の結果を示す。抗ＣＤ７０抗体はペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を阻害する。
【図３７Ｂ】ペプチド刺激細胞に対する抗ＣＤ７０抗体または非フコシル化形態の抗体のいずれかによる治療の結果を示す。全細胞生存度に有意な低下は全く認められなかった。
【図３７Ｃ】ペプチド刺激細胞に対する抗ＣＤ７０抗体または非フコシル化形態の抗体のいずれかによる治療の結果を示す。ＣＤ８＋細胞の総数に有意な減少は全く認められなかった。
【図３８】ペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に対する抗ＣＤ７０抗体の効果が抗ＣＤ１６抗体の添加により遮断されることを示す。
【図３９Ａ】細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５による治療がインビボで腎癌腫瘍の７８６−Ｏ腫瘍に対して直接の阻害効果を有することを示すインビボでのマウス腫瘍モデル試験の結果を示す。
【図３９Ｂ】細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５による治療がインビボで腎癌腫瘍のＣａｋｉ−１腫瘍に対して直接の阻害効果を有することを示すインビボでのマウス腫瘍モデル試験の結果を示す。
【図４０】７８６−Ｏ腎細胞癌異種移植片ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する免疫複合体の抗ＣＤ７０−Ｎ１および抗ＣＤ７０  Ｎ２のインビボでの有効性を示す。
【図４１】７８６−Ｏ腎細胞癌異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する単回用量の免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２のインビボでの有効性を示す。
【図４２】７８６−Ｏ腎細胞癌異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する様々な用量の免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２のインビボでの有効性を示す。
【図４３】Ｃａｋｉ−１腎細胞癌異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する様々な用量の免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２のインビボでの有効性を示す。
【図４４】Ｒａｊｉ細胞リンパ腫ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２のインビボでの有効性を示す。
【図４５】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２のインビボでの安全性を示す。
【図４６Ａ】イヌにおける免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２の薬剤なしに対するインビボでの安全性を示す。
【図４６Ｂ】イヌにおける免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２の薬剤なしに対するインビボでの安全性を示す。
【図４６Ｃ】イヌにおける免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２の薬剤なしに対するインビボでの安全性を示す。
【図４６Ｄ】イヌにおける免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２の薬剤なしに対するインビボでの安全性を示す。
【図４７Ａ】ＡＤＣＣアッセイの結果を示す。ｈＩｇＧ１ｎｆ  Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌ＝ヒトＩｇＧ１  ＮＦ陰性対照抗体。ｈＩｇＧ１  Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌ＝ヒトＩｇＧ１陰性対照抗体。ｍＩｇＧ１  Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌ＝マウスＩｇＧ１陰性対照抗体。２Ｈ５の活性化Ｂ細胞への結合についてのＦＡＣＳ分析。
【図４７Ｂ】ＡＤＣＣアッセイの結果を示す。ｈＩｇＧ１ｎｆ  Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌ＝ヒトＩｇＧ１  ＮＦ陰性対照抗体。ｈＩｇＧ１  Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌ＝ヒトＩｇＧ１陰性対照抗体。ｍＩｇＧ１  Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌ＝マウスＩｇＧ１陰性対照抗体。活性化ヒトＢ細胞に対する２Ｈ５  ＮＦおよび２Ｈ５についてのＡＤＣＣアッセイ。
【図４７Ｃ】ＡＤＣＣアッセイの結果を示す。ｈＩｇＧ１ｎｆ  Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌ＝ヒトＩｇＧ１  ＮＦ陰性対照抗体。ｈＩｇＧ１  Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌ＝ヒトＩｇＧ１陰性対照抗体。ｍＩｇＧ１  Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌ＝マウスＩｇＧ１陰性対照抗体。抗ＣＤ１６抗体の添加を伴うＡＤＣＣアッセイ。
【図４８】抗ＣＤ７０抗体の、刺激されたヒトＰＢＭＣ培養物中に自然に存在するエフェクター細胞による、ＡＤＣＣを介した抗原活性化ＣＤ７０＋ヒトＴ細胞の溶解に対する媒介能を示す。
【図４９】抗ＣＤ７０抗体の天然に発現するＣＤ７０＋ヒト癌細胞系７８６−Ｏ細胞に対する結合特性を示す。
【図５０】フコシル化および非フコシル化抗ＣＤ７０抗体の、ＣＤ７０＋リンパ腫細胞系ＡＲＨ７７に対するＡＤＣＣに対する媒介能を示す。
【図５１】７８６−Ｏ腎細胞癌異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する単回用量の抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥのインビボでの有効性を示す。
【図５２】Ａ４９８腎細胞癌異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する単回用量の抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥのインビボでの有効性を示す。
【図５３】Ｃａｋｉ−１腎細胞癌異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する単回用量の抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥのインビボでの有効性を示す。
【図５４】Ｒａｊｉ細胞リンパ腫ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する単回用量の抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥのインビボでの有効性を示す。
【図５５】Ｄａｕｄｉ細胞リンパ腫ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する単回用量の抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥのインビボでの有効性を示す。
【図５６】Ｃａｋｉ−１腎細胞癌異種移植片ラットモデルにおける腫瘍形成に対する抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥのインビボでの有効性を示す。
【図５７】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥのインビボでの安全性を示す。
【図５８】イヌにおける抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥのインビボでの安全性を示す。
【図５９】サルにおける抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥのインビボでの安全性を示す。
【図６０】７８６−Ｏ腎細胞癌異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する単回用量の抗ＣＤ７０−サイトトキシンＦのインビボでの有効性を示す。
【図６１】Ｃａｋｉ−１腎細胞癌異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する単回用量の抗ＣＤ７０−サイトトキシンＦのインビボでの有効性を示す。
【図６２】Ｒａｊｉ細胞リンパ腫ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する単回用量の抗ＣＤ７０−サイトトキシンＦのインビボでの有効性を示す。
【図６３】７８６−Ｏ腎細胞癌異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する単回用量の抗ＣＤ７０−サイトトキシンＧのインビボでの有効性を示す。
【図６４】Ｃａｋｉ−１腎細胞癌異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する単回用量の抗ＣＤ７０−サイトトキシンＧのインビボでの有効性を示す。
【図６５】Ａ４９８腎細胞癌異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する単回用量の抗ＣＤ７０−サイトトキシンＨのインビボでの有効性を示す。
【図６６】Ｃａｋｉ−１腎細胞癌異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する単回用量の抗ＣＤ７０−サイトトキシンＨのインビボでの有効性を示す。
【図６７】７８６−Ｏ腎細胞癌異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する単回用量の抗ＣＤ７０−サイトトキシンＩのインビボでの有効性を示す。
【図６８】Ｃａｋｉ−１腎細胞癌異種移植片ラットモデルにおける腫瘍形成に対する単回用量の抗ＣＤ７０−サイトトキシンＩのインビボでの有効性を示す。
【図６９】７８６−Ｏ腎細胞癌異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する単回用量の抗ＣＤ７０−サイトトキシンＪのインビボでの有効性を示す。
【図７０】抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５のＣＤ７０で刺激されたヒトＴ細胞の増殖の機能的遮断を示す。
【図７１】サイトトキシンＢの構造である。
【図７２】サイトトキシンＣの構造である。
【図７３】サイトトキシンＤの構造である。
【図７４】サイトトキシンＥの構造である。
【図７５】サイトトキシンＦの構造である。
【図７６】サイトトキシンＧの構造である。
【図７７】サイトトキシンＨの構造である。
【図７８】サイトトキシンＩの構造である。
【図７９】サイトトキシンＪの構造である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
詳細な説明
本開示は、ヒトＣＤ７０に結合しかつ望ましい機能特性を有する単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体に関する。特定の実施形態では、本開示の抗体は、特定の重鎖および軽鎖生殖細胞系配列に由来し、および／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域などの特定の構造的特徴を含む。本開示は、単離された抗体や、かかる抗体、抗体−パートナー分子複合体、およびかかる抗体を含む二重特異性分子を作製する方法、ならびに本開示の抗体、抗体−パートナー分子複合体または二重特異性分子を含有する医薬組成物を提供する。本開示はまた、抗体を用いて例えばＣＤ７０タンパク質を検出する方法、ならびに本発明の抗ＣＤ７０抗体を用いてＣＤ７０発現細胞、例えば腫瘍細胞の成長を阻害する方法に関する。したがって、本開示はまた、本開示の抗ＣＤ７０抗体および抗体−パートナー分子複合体を用いて様々なタイプの癌、例えば腎細胞癌またはリンパ腫を治療する方法を提供する。
【００４９】
本開示がより十分に理解されうるように、最初に特定の用語が定義される。詳細な説明を通じてさらなる定義が示される。
【００５０】
本明細書で用いられる「ＣＤ７０」という用語は、変異体、アイソフォーム、相同体、オルソログおよびパラログを含む。例えば、ヒトＣＤ７０タンパク質に特異的な抗体は、特定の場合、ヒト以外の種由来のＣＤ７０タンパク質と交差反応しうる。他の実施形態では、ヒトＣＤ７０タンパク質に特異的な抗体は、ヒトＣＤ７０タンパク質に対して完全に特異的でありかつ種または他のタイプの交差反応性を示さないか、または特定の他の種由来であってそれ以外のあらゆる種に由来しないＣＤ７０と交差反応する（例えばマウスＣＤ７０ではなく霊長類ＣＤ７０と交差反応する）場合がある。「ヒトＣＤ７０」という用語は、ヒトＣＤ７０配列、例えばＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ３２９７０（配列番号７６）を有するヒトＣＤ７０の完全なアミノ酸配列を示す。「マウスＣＤ７０」という用語は、マウスＣＤ７０配列、例えばＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０３５７４７を有するマウスＣＤ７０の完全なアミノ酸配列を示す。ヒトＣＤ７０配列は例えば保存された変異または非保存領域内の変異を有することによりＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ３２９７０のヒトＣＤ７０と異なる場合があり、ＣＤ７０はＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ３２９７０のヒトＣＤ７０と実質的に同じ生物学的機能を有する。例えば、ヒトＣＤ７０の１つの生物学的機能はサイトカイン受容体ＣＤ２７に結合することである。
【００５１】
特定のヒトＣＤ７０配列は、一般にアミノ酸配列がＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ３２９７０のヒトＣＤ７０に対して少なくとも９０％同一となり、アミノ酸配列が他の種（例えばマウス）のＣＤ７０アミノ酸配列と比較される場合にヒトであることが同定されたアミノ酸残基を有する。特定の場合、ヒトＣＤ７０は、アミノ酸配列がＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ３２９７０のＣＤ７０に対して少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一でありうる。特定の実施形態では、ヒトＣＤ７０配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ３２９７０のＣＤ７０配列とは１０個以下のアミノ酸の差を示すことになる。特定の実施形態では、ヒトＣＤ７０は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ３２９７０のＣＤ７０配列とは５個以下、またはさらに４個以下、３、２、もしくは１個のアミノ酸の差を示しうる。同一性パーセントは、本明細書中に記載のように決定されうる。
【００５２】
「免疫応答」という用語は、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合での正常なヒト細胞もしくは組織に対する選択的損傷、それらの破壊または人体からの除去をもたらす、例えば、（抗体、サイトカイン、および補体を含む）上記の細胞または肝臓によって生成されるリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および可溶性高分子の作用を示す。
【００５３】
「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達を担う種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を示す。本明細書で用いられる「細胞表面受容体」という語句は、例えばシグナルの受け取りおよび細胞の原形質膜を通過するかかるシグナルの伝達が可能な分子および分子の複合体を含む。本発明の「細胞表面受容体」の例として、ＣＤ７０受容体が挙げられる。
【００５４】
本明細書で記載の「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）またはその一本鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖またはその抗原結合部分を含む糖タンパク質を示す。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと略記）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３という３つのドメインからなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬまたはＶｋと略記）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域はＣＬという１つのドメインからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに再分化され、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存される領域が組み入れられうる。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配列される。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介しうる。
【００５５】
本明細書で用いられる抗体の「抗体断片」および「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えばＣＤ７０）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を示す。抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片により果たされうることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片の例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂであるＦａｂ’断片（「ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ」（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３年）を参照）；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｖ）抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６頁）；（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；ならびに（ｖｉｉｉ）１つの可変ドメインおよび２つの定常ドメインを有する重鎖可変領域であるナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインのＶＬおよびＶＨが別々の遺伝子でコードされるが、ＶＬおよびＶＨ領域が、それらの一価分子を形成するように対をなす場合の単一のタンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーによる組換え方法を用いて連結されうる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６頁、およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３頁を参照）。かかる一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されるようにも意図されている。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を用いて得られ、断片における有用性が無傷抗体の場合と同様の方法でスクリーニングされる。
【００５６】
本明細書で用いられる「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示すように意図されている（例えば、ＣＤ７０に対して特異的に結合する単離された抗体は、ＣＤ７０以外の抗原に対して特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＣＤ７０に対して特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば他の種由来のＣＤ７０分子に対する交差反応性を有しうる。特定の実施形態では、単離された抗体はヒトＣＤ７０に対して特異的に結合し、他の非ヒトＣＤ抗原と交差反応しない。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００５７】
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成物の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００５８】
本明細書で用いられる「ヒト抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する場合の可変領域を有する抗体を含むように意図されている。さらに、抗体が定常領域を有する場合、定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、天然修飾または合成修飾を含む後の修飾を含みうる。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされることのないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的な突然変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）を含みうる。しかし、本明細書で用いられる「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳類種、例えばマウスの生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている場合の抗体を含むように意図されていない。
【００５９】
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する場合の可変領域を有する単一の結合特異性を提示する抗体を示す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖トランス遺伝子および軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
【００６０】
本明細書で用いられる「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段により調製、発現、作製または単離されるすべてのヒト抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子におけるトランスジェニックまたはトランスクロモゾーム（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えばマウス）あるいはそれから調製されるハイブリドーマから単離される抗体（さらに下記に記載）、（ｂ）形質転換されることでヒト抗体を発現する宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離される抗体、（ｃ）組換えられたコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離される抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、作製または単離される抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する場合の可変領域を有する。しかし、特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体に対し、インビトロでの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物が用いられる場合、インビボでの体細胞突然変異誘発）を実施可能であり、それ故、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列に由来しかつそれらに関連する一方、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリーの範囲内に天然に存在することがない配列である。
【００６１】
本明細書で用いられる「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えばＩｇＭまたはＩｇＧｌ）を示す。
【００６２】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」という語句は、本明細書中で「抗原に対して特異的に結合する抗体」という用語と同義的に用いられる。
【００６３】
「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒト抗体の任意の修飾形態、例えば抗体と別の作用物質または抗体との複合体を示す。
【００６４】
「ヒト化抗体」という用語は、別の哺乳類種、例えばマウスの生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている場合の抗体を示すように意図されている。さらなるフレームワーク領域の修飾がヒトフレームワーク配列内でなされうる。
【００６５】
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１種に由来しかつ定常領域配列が別種に由来する場合の抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来しかつ定常領域配列がヒト抗体に由来する場合の抗体を示すように意図されている。
【００６６】
「抗体模倣体」は、抗体の抗原に対する結合能を模倣する能力があるが、天然の抗体構造に限定されない分子を示すように意図されている。かかる抗体模倣体の例として、限定はされないが、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、ダルピン（ＤＡＲＰｉｎｓ）、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒｓ）、およびバーサボディ（Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ）が挙げられ、これらのすべては従来式の抗体結合を模倣する間に異なる機序から生成されかつそれを介して機能する結合構造を用いる。
【００６７】
本明細書で用いられる「パートナー分子」という用語は、抗体−パートナー分子複合体内で抗体に複合された実体を示す。パートナー分子の例として、薬剤、毒素、（限定はされないが、ペプチドおよび蛍光色素マーカーなどの小分子マーカーと放射性同位体などの単一原子マーカーとを含む）マーカー分子、タンパク質ならびに治療剤が挙げられる。
【００６８】
本明細書で用いられる「ヒトＣＤ７０に特異的に結合する」抗体は、ヒトＣＤ７０に５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは６×１０−９Ｍ以下、より好ましくは３×１０−９Ｍ以下、さらにより好ましくは２×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する抗体を示すように意図されている。
【００６９】
本明細書で用いられる「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語は特定の抗体−抗原相互作用の結合速度を示すように意図されている一方、本明細書で用いられる「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」という用語は特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を示すように意図されている。本明細書で用いられる「ＫＤ」という用語は解離定数を示すように意図されており、それはＫｄ対Ｋａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、かつモル濃度（Ｍ）として表現されるものである。抗体におけるＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立された方法を用いて決定可能である。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムの利用によるものである。
【００７０】
本明細書で用いられる「ＩｇＧ抗体への高親和性」という用語は、標的抗原に対して１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−９Ｍ以下、およびさらにより好ましくは１×１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。しかし、「高親和性」結合は他の抗体アイソタイプに対しては変化しうる。例えば、ＩｇＭアイソタイプへの「高親和性」結合は、１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは１×１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。
【００７１】
本明細書で用いられるタンパク質または細胞に「実質的に結合しない」という用語は、タンパク質または細胞に結合しないかまたは高親和性で結合しない、すなわちタンパク質または細胞に１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫＤで結合することを意味する。
【００７２】
本明細書で用いられる「対象」という用語は任意のヒトまたは非ヒト動物を示す。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、魚、爬虫類などを含む。
【００７３】
結合として用いられるかまたは結合に垂直に示される記号「−」は、示される部分が固体支持体などの分子の残りに結合される点を示す。
【００７４】
「アルキル」という用語は、それ単独でまたは別の置換基の一部として、他に明記しない限り、直鎖または分岐鎖または環状の炭化水素基、またはそれらの組み合わせを意味し、それは完全に飽和、単不飽和もしくはポリ不飽和の場合があり、かつ規定数の炭素原子を有する（すなわちＣ１〜Ｃ１０は１〜１０個の炭素を意味する）二価および多価基を含みうる。飽和炭化水素基の例として、限定はされないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチルなどの基や、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの相同体および異性体が挙げられる。不飽和アルキル基は１つ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例として、限定はされないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにより高級な相同体および異性体が挙げられる。「アルキル」という用語はまた、他に明記しない限り、下記により詳細に定義されるアルキルの誘導体、例えば「ヘテロアルキル」を含むように意図されている。炭化水素基に限定されたアルキル基は「ホモアルキル」と称される。
【００７５】
単独でのまたは別の置換基の一部としての「アルキレン」という用語は、限定はされないが、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−として例示される、アルカンから誘導される二価基を意味し、下記に「ヘテロアルキレン」として記述される基をさらに含む。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を有することになり、本発明では１０個以下の炭素原子を有する基が好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に８個以下の炭素原子を有する、鎖がより短いアルキルまたはアルキレン基である。
【００７６】
単独でのまたは別の用語と組み合わせられた「ヘテロアルキル」という用語は、他に明記しない限り、安定な直鎖または分岐鎖または環状の炭化水素基、またはそれらの組み合わせを意味し、規定数の炭素原子とＯ、Ｎ、Ｓｉ、およびＳからなる群より選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなり、ここで窒素、炭素および硫黄原子は場合により酸化され、窒素ヘテロ原子は場合により四級化されうる。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓ、およびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置または分子の残りに結合されたアルキル基の位置に配置されうる。例として、限定はされないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。最大で２つのヘテロ原子、例えば−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３などが連続しうる。同様に、単独でのまたは別の置換基の一部としての「ヘテロアルキレン」という用語は、限定はされないが−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−として例示される、ヘテロアルキルから誘導される二価基を意味する。ヘテロアルキレン基においては、ヘテロ原子はまた鎖末端の一方または両方を占有しうる（例えばアルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。「ヘテロアルキル」および「ヘテロアルキレン」という用語は、ポリ（エチレングリコール）およびその誘導体を包含する（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｃａｔａｌｏｇ、２００１年を参照）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基においては、連結基の方向は連結基の式が記された方向を全く意味していない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’は−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２の双方を表す。
【００７７】
「アルキル」または「ヘテロアルキル」という用語と併用される「低級」という用語は、１〜６個の炭素原子を有する部分を示す。
【００７８】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、「アルキルスルホニル」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という用語は、それらの従来の意味で用いられ、それぞれ酸素原子、アミノ基、ＳＯ２基または硫黄原子を介して分子の残りに結合されたアルキル基を示す。「アリールスルホニル」という用語はＳＯ２基を介して分子の残りに結合されたアリール基を示し、「スルフヒドリル」という用語はＳＨ基を示す。
【００７９】
一般に「アシル置換基」もまた上記の基から選択される。本明細書で用いられる「アシル置換基」という用語は、本発明の化合物の多環核に結合された基を示し、それに直接的または間接的に結合されたカルボニル炭素の原子価を満たしている。
【００８０】
単独でのまたは別の用語と組み合わせられた「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、他に明記しない限り、それぞれ置換もしくは未置換「アルキル」および置換もしくは未置換「ヘテロアルキル」の環状バージョンを示す。さらに、ヘテロシクロアルキルにおいては、ヘテロ原子が分子の残りに結合された複素環の位置を占有しうる。シクロアルキルの例として、限定はされないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例として、限定はされないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。環状構造のヘテロ原子および炭素原子は場合により酸化される。
【００８１】
単独でのまたは別の置換基の一部としての「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、他に明記しない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むように意図されている。例えば、「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」という用語は、限定はされないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むように意図されている。
【００８２】
「アリール」という用語は、他に明記しない限り、置換もしくは未置換のポリ不飽和の芳香族炭化水素置換基を意味し、これは共に縮合されるかまたは共有結合される単一環または複数環（好ましくは１〜３つの環）でありうる。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有するアリール基（または環）を示し、ここで窒素、炭素および硫黄原子は場合により酸化され、かつ窒素原子は場合により四級化される。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りに結合されうる。アリールおよびヘテロアリール基の非限定例として、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上記のアリールおよびヘテロアリール環系の各々における置換基は、下記の許容できる置換基の群から選択される。「アリール」および「ヘテロアリール」は、縮合されるかまたはそれ以外ではアリールまたはヘテロアリール系に結合された１つ以上の非芳香環系といった環系も包含する。
【００８３】
簡略化のため、「アリール」という用語は、他の用語（例えばアリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と併用される場合、上で定義されたアリールおよびヘテロアリール環の双方を含む。したがって、「アリールアルキル」という用語は、炭素原子（例えばメチレン基）が例えば酸素原子（例えばフェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）で置換されているアルキル基を含むアルキル基（例えばベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）に結合されたアリール基といった基を含むように意図されている。
【００８４】
上記の各用語（例えば「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は、指定される基の置換および未置換形態の双方を含む。基の各タイプにおける好ましい置換基は下記に提供される。
【００８５】
アルキルにおける置換基およびヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとも称されることが多い基を含む）はそれぞれ一般に「アルキル置換基」および「ヘテロアルキル置換基」と称され、限定はされないが、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から、０〜（２ｍ’＋１）（式中、ｍ’はかかる基内での炭素原子の総数である）の範囲の数で選択される種々の基のうちの１つ以上でありうる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’の各々は、好ましくは独立して、水素、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、例えば１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換もしくは未置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を示す。本発明の化合物が例えば２つ以上のＲ基を含む場合、Ｒ基の各々はＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基の各々としてこれらの基の２つ以上が存在する場合に独立して選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結合される場合、それらは窒素原子と結合し、５、６、もしくは７員環が形成されうる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、限定はされないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むように意図されている。置換基についての上の考察から、当業者は、「アルキル」という用語が水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基、例えばハロアルキル（例えば−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）を含むように意図されることを理解するであろう。
【００８６】
アルキル基について記述される置換基と同様、アリール置換基およびヘテロアリール置換基はそれぞれ、一般に「アリール置換基」および「ヘテロアリール置換基」と称され、例えば、ハロゲン、ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、ならびにフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから、０から芳香環系上の開放原子価（ｏｐｅｎ  ｖａｌｅｎｃｅ）の総数の範囲の数で選択され、ここでＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、好ましくは水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、未置換アリールおよびヘテロアリール、（未置換アリール）−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ならびに（未置換アリール）オキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから独立して選択される。本発明の化合物が例えば２つ以上のＲ基を含む場合、各Ｒ基はＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基の各々としてこれらの基の２つ以上が存在する場合に独立して選択される。
【００８７】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上のアリール置換基のうちの２つが、場合により、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−（式中、ＴおよびＵは独立に−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、かつｑは０〜３の整数である）の置換基と置換されうる。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つが、場合により式−Ａ（ＣＨ２）ｒＢ−（式中、ＡおよびＢは独立して−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、かつｒは１〜４の整数である）の置換基と置換されうる。そのように形成された新環の単結合のうちの１つが、場合により二重結合と置換されうる。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つが、場合により式（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−（式中、ｓおよびｄは独立して０〜３の整数であり、かつＸはＯ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である）の置換基と置換されうる。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、好ましくは水素または置換もしくは未置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから独立して選択される。
【００８８】
本明細書で用いられる「ジホスフェート」という用語は、限定はされないが、２つのリン酸基を有するリン酸のエステルを含む。「トリホスフェート」という用語は、限定はされないが、３つのリン酸基を有するリン酸のエステルを含む。例えば、ジホスフェートまたはトリホスフェートを有する特定の薬剤は、
2010513306.tif 000002
を含む。
【００８９】
本明細書で用いられる「ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）およびケイ素（Ｓｉ）を含む。
【００９０】
記号「Ｒ」は、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクリル基から選択される置換基を表す一般的略語である。
【００９１】
本開示の様々な態様は、以下のサブセクションでさらに詳述される。
【００９２】
特定の機能特性を有する抗ＣＤ７０抗体
本開示の抗体は、抗体の特定の機能的特徴または特性により特徴づけられる。例えば、抗体は細胞の表面上に発現されるヒトＣＤ７０、例えばヒトＣＤ７０に特異的に結合する。好ましくは、本開示の抗体は、ＣＤ７０に高親和性、例えば１×１０−７Ｍ以下のＫＤ、より好ましくは５×１０−８Ｍ以下のＫＤ、およびさらにより好ましくは１×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する。抗体のＣＤ７０に対する結合能を評価するための標準アッセイは当該技術分野で既知であり、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよびＲＩＡを含む。適切なアッセイは実施例において詳述される。抗体の結合動態、（例えば結合親和性）はまた、当該技術分野で既知の標準アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、スキャッチャードおよびＢｉａｃｏｒｅ分析により評価可能である。別の例としては、本開示の抗体は、腎癌腫瘍細胞系、例えば７８６−Ｏ、Ａ−４９８、ＡＣＨＮ、Ｃａｋｉ−１またはＣａｋｉ−２細胞系に結合しうる。さらに別の例としては、本開示の抗体は、Ｂ細胞腫瘍細胞系、例えばＤａｕｄｉ、ＨｕＴ７８、ＲａｊｉまたはＧｒａｎｔａ−５１９細胞系に結合しうる。
【００９３】
本開示の抗ＣＤ７０抗体は、ヒトＣＤ７０に結合し、かつ好ましくは
（ａ）ヒトＣＤ７０に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合する特性、および
（ｂ）腎細胞癌腫瘍細胞系に結合する特性、
（ｃ）リンパ腫細胞系、例えばＢ細胞腫瘍細胞系に結合する特性、
（ｄ）ＣＤ７０発現細胞により内在化される特性、
（ｅ）ＣＤ７０発現細胞に対して抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を示す特性、および
（ｆ）細胞毒素に複合される場合、インビボでＣＤ７０発現細胞の成長を阻害する特性、
のうちの１つ以上を示す。
【００９４】
好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）のうちの少なくとも２つを示す。より好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）のうちの少なくとも３つを示す。より好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）のうちの４つを示す。さらにより好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）のうちの５つを示す。さらにより好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）の６つ全部を示す。
【００９５】
別の好ましい実施形態では、抗体はＣＤ７０に５×１０−９Ｍ以下の親和性で結合する。さらに別の好ましい実施形態では、抗体は、細胞毒素に複合される場合、インビボでＣＤ７０発現腫瘍細胞の成長を阻害する。
【００９６】
本発明の抗体のＣＤ７０への結合は、当該技術分野で十分に確立された１つ以上の技術を用いて評価されうる。例えば、好ましい実施形態では、抗体はフローサイトメトリーアッセイにより試験可能であり、そこでは抗体はヒトＣＤ７０を発現する細胞系、例えばＣＤ７０を細胞表面上で発現するように形質移入されているＣＨＯ細胞あるいは７８６−Ｏ、Ａ４９８、ＡＣＨＮ、Ｃａｋｉ−１、および／またはＣａｋｉ−２などのＣＤ７０発現細胞系と反応する（適切なアッセイおよび細胞系のさらなる説明については、例えば実施例４および５を参照）。さらにまたはその他として、結合動態（例えばＫＤ値）を含む抗体の結合については、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで試験可能である。さらに他の適切な結合アッセイは、例えば組換えＣＤ７０タンパク質を用いるＥＬＩＳＡアッセイを含む（適切なアッセイについては、例えば実施例１を参照）。
【００９７】
好ましくは、本開示の抗体は、ＣＤ７０タンパク質に５×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するか、ＣＤ７０タンパク質に３×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するか、ＣＤ７０タンパク質に１×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するか、ＣＤ７０タンパク質に７×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、ＣＤ７０タンパク質に６×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、またはＣＤ７０タンパク質に５×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する。ＣＤ７０に対する抗体の結合親和性は、例えば標準ＢＩＡＣＯＲＥ分析により評価可能である。
【００９８】
ＣＤ７０発現細胞により抗ＣＤ７０抗体の内在化を評価するための標準アッセイは当該技術分野で既知である（例えば、実施例７および２１に記載のＨｕｍ−Ｚａｐおよび免疫蛍光アッセイを参照）。ＣＤ７０のＣＤ２７への結合および抗ＣＤ７０抗体によるその阻害を評価するための標準アッセイもまた当該技術分野で既知である（例えば、実施例１７に記載のアッセイを参照）。ＣＤ７０発現細胞に対するＡＤＣＣを評価するための標準アッセイもまた当該技術分野で既知である（例えば、実施例９に記載のＡＤＣＣアッセイを参照）。抗ＣＤ７０抗体およびその細胞毒素複合体によるインビボでの腫瘍細胞成長の阻害を評価するための標準アッセイもまた当該技術分野で既知である（例えば、実施例１８、１９、２４〜３１および３６〜４１に記載の腫瘍異種移植片マウスモデルを参照）。
【００９９】
本発明の好ましい抗体はヒトモノクローナル抗体である。さらにまたはその他として、抗体は例えばキメラまたはヒト化モノクローナル抗体でありうる。
【０１００】
モノクローナル抗体２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙおよび１Ｆ４
例示される本開示の抗体は、実施例１および２に記載のように単離および構造的特徴づけがなされたヒトモノクローナル抗体２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙおよび１Ｆ４を含む。２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙおよび１Ｆ４のＶＨアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３、４、５、７３、および６で示される。２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙおよび１Ｆ４のＶＬアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７、８、９、１０、１１、１１、および１２で示される（６９Ａ７および６９Ａ７Ｙの双方は配列番号１１のＶＬアミノ酸配列を有する）。これらの各抗体がＣＤ７０に結合しうると仮定すると、ＶＨおよびＶＬ配列は「混合され、一致する」ことで本開示の他の抗ＣＤ７０結合分子の作製が可能である。かかる「混合され、一致する」抗体のＣＤ７０への結合は、上記でかつ実施例に記載の結合アッセイ（例えばＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡ）を用いて試験されうる。好ましくは、ＶＨおよびＶＬ鎖が混合され、一致する場合、特定のＶＨ／ＶＬ対由来のＶＨ配列は構造的に類似のＶＨ配列と交換される。同様に、好ましくは特定のＶＨ／ＶＬ対由来のＶＬ配列は構造的に類似のＶＬ配列と交換される。
【０１０１】
したがって、一態様では、本開示は、
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、および７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号７、８、９、１０、１１、および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、ＣＤ７０に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１０２】
好ましい重鎖および軽鎖の組み合わせは、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号５または７３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【０１０３】
別の態様では、本開示は、２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙおよび１Ｆ４の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはそれらの組み合わせを含む抗体を提供する。２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙおよび１Ｆ４のＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１７および１８で示される（６９Ａ７および６９Ａ７Ｙの双方は配列番号１７のＶＨＣＤＲ１配列を有する）。２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙおよび１Ｆ４のＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２３および２４で示される（６９Ａ７および６９Ａ７Ｙの双方は配列番号２３で示されるＶＨＣＤＲ２配列を有する）。２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙおよび１Ｆ４のＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、７５、および３０で示される。
【０１０４】
２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙおよび１Ｆ４のＶｋＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３５および３６で示される（６９Ａ７および６９Ａ７Ｙの双方は配列番号３５で示されるＶｋＣＤＲ１配列を有する）。２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙおよび１Ｆ４のＶｋＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４１および４２で示される（６９Ａ７および６９Ａ７Ｙの双方は配列番号４１で示されるＶｋＣＤＲ２配列を有する）。２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙおよび１Ｆ４のＶｋＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４７および４８で示される（６９Ａ７および６９Ａ７Ｙの双方は配列番号４７で示されるＶｋＣＤＲ３配列を有する）。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステム（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）」、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）を用いて図示される。
【０１０５】
これらの各抗体がＣＤ７０に結合可能でありかつ抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域により提供されると仮定すると、ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列とＶｋＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列が「混合されて一致する」（すなわち、各抗体がＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とＶｋＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を有する必要があるが、異なる抗体由来のＣＤＲが混合されて一致する）ことで、本開示の他の抗ＣＤ７０結合分子の作製が可能である。かかる「混合されて一致する」抗体のＣＤ７０への結合は、上記や実施例に記載の結合アッセイ（例えば、ＦＡＣＳ  ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ分析）を用いて試験可能である。好ましくは、ＶＨＣＤＲ配列が混合されて一致する場合、特定のＶＨ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は構造的に類似のＣＤＲ配列と置換される。同様に、ＶｋＣＤＲ配列が混合されて一致する場合、特定のＶｋ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、好ましくは構造的に類似のＣＤＲ配列と置換される。新規のＶＨおよびＶＬ配列の作製が、１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ領域配列を２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙおよび１Ｆ４のモノクローナル抗体ＣＤＲ１における本明細書中に開示されるＣＤＲ配列由来の構造的に類似の配列と置換することにより可能であることは当業者に容易に理解されるであろう。
【０１０６】
したがって、別の態様では、本開示は、
（ａ）配列番号１３、１４、１５、１６、１７、および１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、および７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３１、３２、３３、３４、３５、および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３７、３８、３９、４０、４１、および４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号４３、４４、４５、４６、４７、および４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３；
を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＣＤ７０、好ましくはヒトＣＤ７０に対して特異的に結合する。
【０１０７】
好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号１３を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１９を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２５を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３１を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３７を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号４３を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
【０１０８】
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号１４を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２０を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２６を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３２を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３８を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号４４を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
【０１０９】
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号１５を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２１を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２７を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３３を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３９を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号４５を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
【０１１０】
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１１１】
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２９または７５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１１２】
別の好ましい実施形態では、抗体は、
（ａ）配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号４８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１１３】
ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインから独立したＣＤＲ３ドメインが単独で抗体の同族抗原に対する結合特異性を決定しうることと、共通のＣＤＲ３配列に基づく同じ結合特異性を有する複数の抗体が予測通りに産生されうることは、当該技術分野で周知である。例えば、（マウス抗ＣＤ３０抗体Ｋｉ−４の重鎖可変ドメインＣＤＲ３のみを用いるヒト化抗ＣＤ３０抗体の産生について記載する）Ｋｌｉｍｋａら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３（２）：２５２−２６０頁（２０００年）；（親マウスＭＯＣ−３１抗ＥＧＰ−２抗体の重鎖ＣＤＲ３配列のみを用いる組換え上皮糖タンパク質−２（ＥＧＰ−２）抗体について記載する）Ｂｅｉｂｏｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３−８４９頁（２０００年）；（マウス抗インテグリンαｖβ３抗体ＬＭ６０９の重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ３ドメインを用いる一群のヒト化抗インテグリンαｖβ３抗体においては、各メンバー抗体は、ＣＤＲ３ドメイン外部の異なる配列を含み、親マウス抗体と同じエピトープに親マウス抗体と同程度に高いまたはそれより高い親和性で結合可能である点について記載する）Ｒａｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０−８９１５頁（１９９８年）；（ＣＤＲ３ドメインが抗原結合に対して最も有意な寄与をもたらす点を開示する）Ｂａｒｂａｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１−２１６２頁（１９９４年）；（ヒト胎盤ＤＮＡに対する３つのＦａｂ（ＳＩ−１、ＳＩ−４０、およびＳＩ−３２）の重鎖ＣＤＲ３配列の抗破傷風トキソイドＦａｂの重鎖上への移植により既存の重鎖ＣＤＲ３が置換される点を記載し、ＣＤＲ３ドメインが単独で結合特異性を与えた点について示している）Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９−２５３３頁（１９９５年）；および（単一特異性ＩｇＧ破傷風トキソイドに結合するＦａｂ  ｐ３１３抗体の重鎖に対する親多重特異性Ｆａｂ  ＬＮＡ３の重鎖ＣＤＲ３のみの転移が親Ｆａｂの結合特異性を保持するのに十分であったという移植試験について記載する）Ｄｉｔｚｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９−７４９頁（１９９６年）を参照のこと。（抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体のＣＤＲ３に基づくペプチドミメティクスについて記載する）Ｂｅｒｅｚｏｖら、ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ  ８：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  ８（２００１年）；（抗ホスファチジルセリン抗体のＣＤＲ３ドメインに対応する１２個のアミノ酸合成ポリペプチドについて記載する）Ｉｇａｒａｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２−７頁（１９９５年）；（抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗体の重鎖ＣＤＲ３ドメインに由来する単一のペプチドがインビトロでウイルスを中和可能であることを示す）Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７２：８０７−１０頁（１９９８年）；（マウス抗ＨＩＶ抗体の重鎖ＣＤＲ３ドメインに基づくペプチドについて記載する）Ｌｅｖｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４−８頁（１９９３年）；（ｓｃＦｖの結合をＺ−ＤＮＡ結合抗体の重鎖ＣＤＲ３領域の移植によ���可能にすることについて記載する）ＰｏｌｙｍｅｎｉｓおよびＳｔｏｌｌｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８−５３２９頁（１９９４年）；ならびに（重鎖ＣＤＲ３での多様性が通常では同一のＩｇＭ分子における種々のハプテンとタンパク質抗原との識別を可能にするのに十分であることについて記載する）ＸｕおよびＤａｖｉｓ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５頁（２０００年）。さらに、単一のＣＤＲドメインによって定義される特許化された抗体について記載する米国特許第６，９５１，６４６号明細書；米国特許第６，９１４，１２８号明細書；米国特許第６，０９０，３８２号明細書；米国特許第６，８１８，２１６号明細書；米国特許第６，１５６，３１３号明細書；米国特許第６，８２７，９２５号明細書；米国特許第５，８３３，９４３号明細書；米国特許第５，７６２，９０５号明細書および米国特許第５，７６０，１８５号明細書を参照のこと。これらの各参考文献はその全体が参照により本明細書中に援用される。
【０１１４】
したがって、本開示は、ヒトまたは非ヒト動物に由来する抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでモノクローナル抗体はＣＤ７０に特異的に結合可能である。特定の態様の範囲内で、本開示は、非ヒト抗体、例えばマウスまたはラット抗体に由来する１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでモノクローナル抗体はＣＤ７０に特異的に結合可能である。一部の実施形態の範囲内で、非ヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む本発明の抗体は、（ａ）結合に対して競合可能であり、（ｂ）機能特性を保持し、（ｃ）同じエピトープに結合し、および／または（ｄ）対応する親非ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。
【０１１５】
他の態様の範囲内で、本開示は、例えば非ヒト動物から得られるヒト抗体などのヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでヒト抗体はＣＤ７０に特異的に結合可能である。他の態様の範囲内で、本開示は、例えば非ヒト動物から得られるヒト抗体などの第１のヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここで第１のヒト抗体はＣＤ７０に特異的に結合可能であり、かつ第１のヒト抗体由来のＣＤＲ３ドメインはＣＤ７０への結合特異性が欠如したヒト抗体内のＣＤＲ３ドメインを置き換えることでＣＤ７０に特異的に結合可能な第２のヒト抗体が産生される。一部の実施形態の範囲内で、第１のヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ３ドメインを含む本発明の抗体は、（ａ）結合に対して競合可能であり、（ｂ）機能特性を保持し、（ｃ）同じエピトープに結合し、および／または（ｄ）対応する第１の親ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。
【０１１６】
特定の生殖細胞系配列を有する抗体
特定の実施形態では、本開示の抗体は、特定の生殖細胞系重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。
【０１１７】
例えば、好ましい実施形態では、本開示は、ヒトＶＨ３−３０．３遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＣＤ７０に特異的に結合する。別の好ましい実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合する、ヒトＶＨ３−３３遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。別の好ましい実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合する、ヒトＶＨ４−６１遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。別の好ましい実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合する、ヒトＶＨ３−２３遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１１８】
別の好ましい実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合する、ヒトＶＫＬ６遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。別の好ましい実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合する、ヒトＶＫＬ１８遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。別の好ましい実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合する、ヒトＶＫＬ１５遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。別の好ましい実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合する、ヒトＶＫＡ２７遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１１９】
さらに別の好ましい実施形態では、本開示は、
（ａ）ヒトＶＨ３−３０．３、３−３３、４−６１、または３−２３遺伝子（各遺伝子は配列番号６１、６２、６３、および６４で示されるアミノ酸配列をコードする）の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、
（ｂ）ヒトＶＫＬ６、Ｌ１８、Ｌ１５、またはＡ２７遺伝子（各遺伝子は配列番号６５、６６、６７、および６８で示されるアミノ酸配列をコードする）の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｃ）ＣＤ７０に特異的に結合する、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１２０】
かかる抗体はまた、上で詳述された機能特性、例えばヒトＣＤ７０への高親和性結合、ＣＤ７０発現細胞による内在化、ＣＤ７０発現細胞に対するＡＤＣＣに対する媒介能、および／または細胞毒素に複合される場合におけるインビボでのＣＤ７０発現腫瘍細胞の腫瘍成長に対する阻害能のうちの１つ以上を保有しうる。
【０１２１】
ＶＨ３−３０．３およびＶＫＬ６のＶＨおよびＶＫを有する抗体の例として、２Ｈ５が挙げられる。ＶＨ３−３０．３およびＶＫＬ１８のＶＨおよびＶＫを有する抗体の例として、１０Ｂ４が挙げられる。ＶＨ３−３３およびＶＫＬ１５のＶＨおよびＶＫを有する抗体の例として、８Ｂ５および１８Ｅ７が挙げられる。ＶＨ４−６１およびＶＫＬ６のＶＨおよびＶＫを有する抗体の例として、６９Ａ７および６９Ａ７Ｙが挙げられる。ＶＨ３−２３およびＶＫＡ２７のＶＨおよびＶＫを有する抗体の例として、１Ｆ４が挙げられる。
【０１２２】
かかる抗体はまた、上で詳述された機能特性、例えばヒトＣＤ７０への高親和性結合、ＣＤ７０発現細胞による内在化、腎細胞癌腫瘍細胞系への結合、リンパ腫細胞系への結合、ＣＤ７０発現細胞に対するＡＤＣＣに対する媒介能、および／または細胞毒素に複合される場合におけるインビボでのＣＤ７０発現腫瘍細胞の腫瘍成長に対する阻害能のうちの１つ以上を保有しうる。
【０１２３】
本明細書で用いられるヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、特定の生殖細胞系配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含む。かかる系は、目的の抗原とともにヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫する工程または目的の抗原とともにファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングする工程を含む。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体が、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列においてヒト抗体の配列に対して最も近い（すなわち最大の同一性％がある）ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を選択することにより、かかるものとして同定されうる。特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば自然発生的体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的導入に起因し、生殖細胞系配列と比べてアミノ酸の差を有しうる。しかし、選択されたヒト抗体は、典型的にはアミノ酸配列においてヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、かつ、ヒト抗体が他種の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列（例えばマウス生殖細胞系配列）と比較される場合にヒトであるものと同定されるアミノ酸残基を有する。特定の場合、ヒト抗体は、アミノ酸配列において生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一でありうる。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列とは１０個以下のアミノ酸の差を示すことになる。特定の場合、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列とは５個以下またはさらには４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸の差を示しうる。
【０１２４】
相同抗体
さらに別の実施形態では、本開示の抗体は、本明細書中に記載の好ましい抗体のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで抗体は本開示の抗ＣＤ７０抗体の所望の機能特性を保持する。
【０１２５】
例えば、本開示は、
（ａ）重鎖可変領域は配列番号１、２、３、４、５、６および７３からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域は配列番号７、８、９、１０、１１、および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、
（ｃ）抗体はヒトＣＤ７０に特異的に結合する、
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１２６】
さらにまたはその他として、抗体は、上で考察された機能特性、例えばヒトＣＤ７０への高親和性結合、ＣＤ７０発現細胞による内在化、腎細胞癌腫瘍細胞系への結合、リンパ腫細胞系への結合、ＣＤ７０発現細胞に対するＡＤＣＣに対する媒介能、および／または細胞毒素に複合される場合におけるインビボでのＣＤ７０発現腫瘍細胞の腫瘍成長に対する阻害能のうちの１つ以上を保有しうる。
【０１２７】
様々な実施形態では、抗体は例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でありうる。
【０１２８】
他の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、上で示される配列に８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相同でありうる。上で示される配列のＶＨおよびＶＬ領域に対して高い（すなわち８０％以上の）相同性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体が、配列番号１〜１２および７３をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的またはＰＣＲによる突然変異誘発）と、その後の本明細書中に記載の機能アッセイを用いてのコードされた改変抗体の保持された機能（すなわち上記に示される機能）についての試験により得られうる。
【０１２９】
本明細書で用いられる２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、２つの配列間の同一性パーセントに相当する。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列で共有される同一位置の数の関数（すなわち相同性％＝同一位置の数／位置の全体数×１００）であり、２つの配列の最適なアラインメントにおいて導入される必要がある。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、下記の非限定例にて記載のように数学的アルゴリズムを用いて行われうる。
【０１３０】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１−１７頁（１９８８年））を用いて決定可能であり、同アルゴリズムはＰＡＭ１２０重み残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ（Ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）および４のギャップペナルティを用いてＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に導入されている。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３頁（１９７０年））アルゴリズムを用いて決定可能であり、同アルゴリズムはブロッサム（Ｂｌｏｓｓｕｍ）６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４のギャップ重量および１、２、３、４、５もしくは６の長さ重量を用いてＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラム中に包含されている。
【０１３１】
さらにまたはその他として、本開示のタンパク質配列をさらに「クエリー配列」として用い、公的データベースで探索を行い、例えば関連配列を同定することが可能である。かかる探索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０頁のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行可能である。ＢＬＡＳＴタンパク質の探索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことで、本開示の抗体分子に相同なアミノ酸配列が得られうる。比較目的でギャップドアラインメント（ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）を得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２頁に記載のようにギャップドＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）が用いられうる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）プログラムを用いる場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）が有用である。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
【０１３２】
保存的修飾を有する抗体
特定の実施形態では、本開示の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここでこれらのＣＤＲ配列のうちの１つ以上は公知の抗ＣＤ７０抗体に基づく特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾を含み、かつここで抗体は本開示の抗ＣＤ７０抗体の所望の機能特性を保持する。抗原結合を除去することのない特定の保存的配列修飾の作製が可能であることは当該技術分野で理解されている。例えば、（サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に特異的な抗体のＣＤＲ３重鎖ドメインにおける突然変異分析について記載する）Ｂｒｕｍｍｅｌｌら（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３２：１１８０−８頁；（抗ＵＡ１抗体における突然変異試験について記載する）ｄｅ  Ｗｉｌｄｔら（１９９７年）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５−４１頁；（ＨＣＤＲ３の中央における変異が親和性の欠如または低下をもたらしたことを示す）Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖら（１９９７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４−２６８７０頁；（ＣＤＲ３領域内での単一のアミノ酸変化により結合活性が失われたことを記載する）Ｈａｌｌら（１９９２年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５−１２頁；（抗原結合におけるＴｙｒ残基の寄与について記載する）ＫｅｌｌｅｙおよびＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２−３５頁；（結合における疎水性の効果について記載する）Ａｄｉｂ−Ｃｏｎｑｕｙら（１９９８年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１−６頁；ならびに（ＨＣＤＲ３アミノ酸変異体について記載する）Ｂｅｅｒｓら（２０００年）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５−４３頁を参照のこと。したがって、本開示は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、および７５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号４３、４４、４５、４６、４７、および４８のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ
（ｃ）抗体はヒトＣＤ７０に特異的に結合する。
【０１３３】
さらにまたはその他として、抗体は、上記の機能特性、例えばヒトＣＤ７０への高親和性結合、ＣＤ７０発現細胞による内在化、腎細胞癌腫瘍細胞系への結合、リンパ腫細胞系への結合、ＣＤ７０発現細胞に対するＡＤＣＣに対する媒介能、および／または細胞毒素に複合される場合におけるインビボでのＣＤ７０発現腫瘍細胞の腫瘍成長に対する阻害能のうちの１つ以上を保有しうる。
【０１３４】
好ましい実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、および２４のアミノ酸配列およびその保存的修飾体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、および４２のアミノ酸配列およびその保存的修飾体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、および１８のアミノ酸配列およびその保存的修飾体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、および３６のアミノ酸配列およびその保存的修飾体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１３５】
様々な実施形態では、抗体は、例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でありうる。
【０１３６】
本明細書で用いられる「保存的配列修飾（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」という用語は、アミノ酸配列を有する抗体の結合特性に対して有意に作用または改変することのないアミノ酸修飾を示すように意図されている。かかる保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、当該技術分野で既知の標準技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲによる突然変異誘発により本開示の抗体に導入されうる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換される場合の置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーについては当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置換可能であり、改変抗体は保持された機能（すなわち上記に示される機能）について本明細書中に記載の機能アッセイを用いて試験可能である。
【０１３７】
本開示の抗ＣＤ７０抗体と同じエピトープに結合する抗体
別の実施形態では、本開示は、本開示のＣＤ７０モノクローナル抗体（すなわち、ＣＤ７０への結合に対して本開示のモノクローナル抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体）のいずれかにより認識されるようなヒトＣＤ７０上のエピトープに結合する抗体を提供する。好ましい実施形態では、交差競合試験における参照抗体は、（配列番号１および７でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）モノクローナル抗体２Ｈ５または（配列番号２および８でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）モノクローナル抗体１０Ｂ４または（配列番号３および９でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）モノクローナル抗体８Ｂ５または（配列番号４および１０でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）モノクローナル抗体１８Ｅ７または（配列番号５および１１でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）モノクローナル抗体６９Ａ７または（配列番号７３および１１でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）モノクローナル抗体６９Ａ７Ｙまたは（配列番号６および１２でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）モノクローナル抗体１Ｆ４でありうる。
【０１３８】
かかる交差競合抗体は、標準ＣＤ７０結合アッセイにおける２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙまたは１Ｆ４と交差競合するその能力に基づいて同定されうる。例えば、標準ＥＬＩＳＡアッセイの利用が可能であり、ここでは組換えヒトＣＤ７０タンパク質がプレート上に固定化され、抗体のうちの１つが蛍光標識され、かつ非標識抗体における標識抗体の結合から競合する能力が評価される。さらにまたはその他として、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を用い、抗体の交差競合能力の評価が可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅを用いるエピトープ結合実験は、２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙまたは１Ｆ４抗体がＣＤ７０上の異なるエピトープに結合することを示した。試験抗体の、例えば２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙまたは１Ｆ４のヒトＣＤ７０への結合に対する阻害能により、試験抗体がヒトＣＤ７０への結合に対して２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙまたは１Ｆ４と競合しうることから、（配列番号１および７でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）２Ｈ５、（配列番号２および８でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）１０Ｂ４、（配列番号３および９でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）８Ｂ５、（配列番号４および１０でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）１８Ｅ７、（配列番号５および１１でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）６９Ａ７、（配列番号７３および１１でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）６９Ａ７Ｙ、または（配列番号６および１２でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）１Ｆ４により認識される場合と同じヒトＣＤ７０上のエピトープに結合することが示される。
【０１３９】
好ましい実施形態では、２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙまたは１Ｆ４により認識される場合と同じヒトＣＤ７０上のエピトープに結合する抗体はヒトモノクローナル抗体である。かかるヒトモノクローナル抗体は、実施例に記載のように調製され、単離されうる。
【０１４０】
改変され修飾された抗体
さらに、本開示の抗体を出発原料として本明細書中に開示されるＶＨおよび／またはＶＬ配列のうちの１つ以上を有する抗体を用いて調製し、修飾抗体を改変することが可能であり、ここで修飾抗体は最初の抗体からの改変された特性を有しうる。抗体は、一方もしくは両方の可変領域（すなわちＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば１つ以上のＣＤＲ領域内および／または１つ以上のフレームワーク領域内での１つ以上の残基の修飾によって改変可能である。さらにまたはその他として、抗体は、例えば定常領域内で残基を修飾し、抗体のエフェクター機能を改変することによって改変可能である。
【０１４１】
特定の実施形態では、ＣＤＲ移植を用いて抗体の様々な領域を改変することが可能である。抗体は、６つの重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基全体に支配的な標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、各抗体間でＣＤＲ外部の配列よりも多様である。ＣＤＲ配列が大部分の抗体−抗原相互作用に関与することから、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上に移植された特定の天然抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターの作成により発現することは可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７頁；Ｊｏｎｅｓ  Ｐ．ら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５頁；Ｑｕｅｅｎ  Ｃ．ら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３頁；Ｗｉｎｔｅｒに交付された米国特許第５，２２５，５３９号明細書ならびにＱｕｅｅｎらに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
【０１４２】
したがって、本開示の別の実施形態は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、および１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１配列、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２配列、ならびに配列番号２５、２６、２７、２８、２９、７５および３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、および４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、ならびに配列番号４３、４４、４５、４６、４７、および４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、かかる抗体は、モノクローナル抗体２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙ、または１Ｆ４のＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を有するが、これらの抗体由来の異なるフレームワーク配列を有しうる。
【０１４３】
かかるフレームワーク配列は、生殖細胞系の抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベースまたは出版された参考文献から得られうる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子における生殖細胞系ＤＮＡ配列は、（インターネット上のｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで入手可能な）「Ｖベース（ＶＢａｓｅ）」ヒト生殖細胞系配列データベースや、Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）」、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  Ｉ．Ｍ．ら（１９９２年）「Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐｓ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；ならびにＣｏｘ  Ｊ．Ｐ．Ｌ．ら（１９９４年）「Ａ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂｉａｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓａｇｅ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６頁（これら各々の内容は参照により本明細書中に明示的に援用される）において見出されうる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子における生殖細胞系ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース内に見出されうる。例えば、ＨＣｏ７  ＨｕＭＡｂマウス内で見出される以下の重鎖生殖細胞系配列は、付属のＧｅｎｂａｎｋ登録番号：１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７およびＢＣ０７０３３３）、３−３３（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）ならびに３−７（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）にて入手可能である。別の例として、ＨＣｏ１２  ＨｕＭＡｂマウス内で見出される以下の重鎖生殖細胞系配列は、付属のＧｅｎｂａｎｋ登録番号：１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７およびＢＣ０７０３３３）、５−５１（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）、４−３４（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）、３−３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）ならびに３−２３（ＡＪ４０６６７８）にて入手可能である。ヒト重鎖および軽鎖生殖細胞系配列のさらに別の供給源は、ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）から入手可能なヒト免疫グロブリン遺伝子のデータベースである。
【０１４４】
抗体タンパク質配列は、当業者に周知のギャップドＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）と称される配列類似性を探索する方法（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：３３８９−３４０２頁）の１つを用いて集められたタンパク質配列データベースに対して比較される。ＢＬＡＳＴは、抗体配列とデータベース配列の間での統計的に有意なアラインメントが整列されたワードの高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を有する傾向が高いという点でヒューリスティックアルゴリズムである。スコアが延長またはトリミングにより改善されえないセグメント対はヒットと称される。つまり、Ｖベース（ＶＢＡＳＥ）由来のヌクレオチド配列（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ１／ｌｉｓｔ２．ｐｈｐ）が翻訳され、かつＦＲ１〜ＦＲ３フレームワーク領域の間の領域および同領域を含む領域が保持される。データベース配列は平均９８残基長を有する。タンパク質の全長にわたり正確に一致する二重配列が除去される。オフの低複雑性フィルタを除くデフォルトの標準パラメータおよびＢＬＯＳＵＭ６２の置換マトリックスを備えたｂｌａｓｔｐプログラムを用いるタンパク質におけるＢＬＡＳＴ探索では、配列一致をもたらす上位５つのヒットがフィルタにかけられる。ヌクレオチド配列は全部で６つのフレームで翻訳され、データベース配列の一致するセグメント内に停止コドンを全く有しないフレームはヒットの可能性があると考えられる。次いで、これはＢＬＡＳＴプログラムｔｂｌａｓｔｘを用いて確認され、これにより全部で６つのフレーム内で抗体配列が翻訳され、全部で６つのフレーム内で動的に翻訳されたＶベース（ＶＢＡＳＥ）ヌクレオチド配列に対する翻訳が比較される。ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）から入手可能なものなどの、他のヒト生殖細胞系配列のデータベースは、上記のＶＢＡＳＥと同様に検索することができる。
【０１４５】
同一性は、抗体配列と配列の全長にわたるタンパク質データベースとの間の正確なアミノ酸の一致である。正（同一性＋置換の一致）は同一ではなく、アミノ酸置換はＢＬＯＳＵＭ６２置換行列によって導かれる。抗体配列がデータベース配列のうちの２つと同じ同一性で一致する場合、大部分の正を伴うヒットであれば一致する配列ヒットであることが決定されることになる。
【０１４６】
本開示の抗体で用いられる好ましいフレームワーク配列は、本開示の選択される抗体で用いられるフレームワーク配列に構造的に類似するもの、例えば本開示の好ましいモノクローナル抗体で用いられるＶＨ３−３０．３フレームワーク配列（配列番号６１）および／またはＶＨ３−３３フレームワーク配列（配列番号６２）および／またはＶＨ４−６１フレームワーク配列（配列番号６３）および／またはＶＨ３−２３フレームワーク配列（配列番号６４）および／またはＶＫＬ６フレームワーク配列（配列番号６５）および／またはＶＫＬ１８フレームワーク配列（配列番号６６）および／またはＶＫＬ１５フレームワーク配列（配列番号６７）および／またはＶＫＡ２７フレームワーク配列（配列番号６８）に類似するものである。
【０１４７】
ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにＶＫ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子内に見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域上に移植されうるか、またはＣＤＲ配列は、生殖細胞系配列と比較して１つ以上の変異を有するフレームワーク領域上に移植されうる。例えば、場合によりフレームワーク領域内の残基を突然変異させ、抗体の抗原への結合能を維持または促進することが有益であることが見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
【０１４８】
可変領域修飾の別のタイプは、アミノ酸残基をＶＨおよび／またはＶＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内で変異させ、それにより目的の抗体の１つ以上の結合特性（例えば親和性）を改善するものである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲによる突然変異誘発を行い、突然変異を導入可能であり、かつ、目的の抗体の結合または他の機能特性に対する効果が、本明細書中に記載されかつ実施例に提供されるインビトロまたはインビボアッセイにおいて評価されうる。好ましくは、（上で考察の）保存的修飾が導入される。突然変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失でありうるが、好ましくは置換である。さらに典型的には、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ以下の残基が改変される。
【０１４９】
したがって、別の実施形態では、本開示は、（ａ）配列番号１３、１４、１５、１６、１７、および１８からなる群より選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号１３、１４、１５、１６、１７、および１８と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号１９、２０、２１、２２、２３、および２４と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｃ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９、７５および３０からなる群より選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号２５、２６、２７、２８、２９、７５および３０と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；（ｄ）配列番号３１、３２、３３、３４、３５、および３６からなる群より選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号３１、３２、３３、３４、３５、および３６と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号３７、３８、３９、４０、４１、および４２からなる群より選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号３７、３８、３９、４０、４１、および４２と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ２領域；ならびに（ｆ）配列番号４３、４４、４５、４６、４７、および４８からなる群より選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号４３、４４、４５、４６、４７、および４８と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む単離された抗ＣＤ７０モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１５０】
本開示の改変抗体は、例えば抗体の特性を改善するためにＶＨおよび／またはＶＫ内のフレームワーク残基に修飾が施されている場合の抗体を含む。典型的には、かかるフレームワーク修飾を施すことで抗体の免疫原性が低下する。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列に「復帰突然変異する（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」ことである。より詳細には、体細胞突然変異を経ている抗体は、抗体が由来する生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を有しうる。かかる残基は、抗体フレームワーク配列を抗体が由来する生殖細胞系配列と比較することにより同定されうる。かかる「復帰突然変異された」抗体はまた、本開示により包含されるように意図されている。例えば、１０Ｂ４においては、ＶＨのアミノ酸残基番号２（ＦＲ１内）がイソロイシンである一方、対応するＶＨ３−３０．３生殖細胞系配列内でのこの残基はバリンである。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系配置に復帰させるため、体細胞突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲによる突然変異誘発により生殖細胞系配列に「復帰突然変異される」可能性がある（例えば１０Ｂ４のＶＨのＦＲ１の残基２はイソロイシンからバリンに「復帰突然変異される」可能性がある）。
【０１５１】
別の例として、１０Ｂ４においては、ＶＨのアミノ酸残基番号３０（ＦＲ１内）がグリシンである一方、対応するＶＨ３−３０．３生殖細胞系配列内でのこの残基はセリンである。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系配置に復帰させるため、例えば１０Ｂ４のＶＨのＦＲ１の残基３０はグリシンからセリンに「復帰突然変異される」可能性がある。
【０１５２】
別の例として、８Ｂ５においては、ＶＨのアミノ酸残基番号２４（ＦＲ１内）がトレオニンである一方、対応するＶＨ３−３３生殖細胞系配列内でのこの残基はアラニンである。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系配置に復帰させるため、例えば８Ｂ５のＶＨのＦＲ１の残基２４はトレオニンからアラニンに「復帰突然変異される」可能性がある。
【０１５３】
別の例として、８Ｂ５においては、ＶＨのアミノ酸残基番号７７（ＦＲ３内）がリジンである一方、対応するＶＨ３−３３生殖細胞系配列内でのこの残基はアスパラギンである。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系配置に復帰させるため、例えば８Ｂ５のＶＨのＦＲ３の残基１１はリジンからアスパラギンに「復帰突然変異される」可能性がある。
【０１５４】
別の例として、８Ｂ５においては、ＶＨのアミノ酸残基番号８０（ＦＲ３内）がセリンである一方、対応するＶＨ３−３３生殖細胞系配列内でのこの残基はチロシンである。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系配置に復帰させるため、例えば８Ｂ５のＶＨのＦＲ３の残基１４はセリンからチロシンに「復帰突然変異される」可能性がある。
【０１５５】
別の例として、６９Ａ７においては、ＶＨのアミノ酸残基番号５０（ＦＲ２内）がロイシンである一方、対応するＶＨ４−６１生殖細胞系配列内でのこの残基はイソロイシンである。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系配置に復帰させるため、例えば６９Ａ７のＶＨのＦＲ２の残基１３はロイシンからイソロイシンに「復帰突然変異される」可能性がある。
【０１５６】
別の例として、６９Ａ７においては、ＶＨのアミノ酸残基番号８５（ＦＲ３内）がアルギニンである一方、対応するＶＨ４−６１生殖細胞系配列内でのこの残基はセリンである。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系配置に復帰させるため、例えば６９Ａ７のＶＨのＦＲ３の残基１８はアルギニンからセリンに「復帰突然変異される」可能性がある。
【０１５７】
別の例として、６９Ａ７においては、ＶＨのアミノ酸残基番号８９（ＦＲ３内）がトレオニンである一方、対応するＶＨ４−６１生殖細胞系配列内でのこの残基はアラニンである。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系配置に復帰させるため、例えば６９Ａ７のＶＨのＦＲ３の残基２２はトレオニンからアラニンに「復帰突然変異される」可能性がある。
【０１５８】
別の例として、１０Ｂ４においては、ＶＬのアミノ酸残基番号４６（ＦＲ２内）がフェニルアラニンである一方、対応するＶＬＬ１８生殖細胞系配列内でのこの残基はロイシンである。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系配置に復帰させるため、例えば１０Ｂ４のＶＬのＦＲ２の残基１２はフェニルアラニンからロイシンに「復帰突然変異される」可能性がある。
【０１５９】
別の例として、６９Ａ７においては、ＶＬのアミノ酸残基番号４９（ＦＲ２内）がフェニルアラニンである一方、対応するＶＬＬ６生殖細胞系配列内でのこの残基はチロシンである。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系配置に復帰させるため、例えば６９Ａ７のＶＬのＦＲ２の残基１５はフェニルアラニンからチロシンに「復帰突然変異される」可能性がある。
【０１６０】
別のタイプのフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内部またはさらに１つ以上のＣＤＲ領域内部の１つ以上の残基を突然変異させ、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチはまた「脱免疫（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」と称され、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書にさらに詳述されている。
【０１６１】
本開示の改変抗体はまた、アミノ酸残基に対して修飾がなされ、抗体上でのＴ細胞エピトープの相互作用を改変するアミノ酸修飾を通じて免疫原性応答の増大または低下がなされているものを含む（例えば、米国特許第６，８３５，５５０号明細書；米国特許第６，８９７，０４９号明細書および米国特許第６，９３６，２４９号明細書を参照）。
【０１６２】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内でなされる修飾に加えまたはその他として、本開示の抗体は、Ｆｃ領域内で修飾を含み、典型的には抗体の１つ以上の機能特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合性および／または抗原依存性の細胞毒性を変化させるように改変されうる。さらに、本開示の抗体は、化学的に修飾されうる（例えば１つ以上の化学的部分が抗体に結合されうる）か、または修飾によりそのグリコシル化が改変されさらに抗体の１つ以上の機能特性が改変されうる。これらの各実施形態は下記にさらに詳述されている。Ｆｃ領域内の残基の番号付与はＫａｂａｔのＥＵ指数のものである。
【０１６３】
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域が、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化する、例えば増加または減少するように修飾される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号明細書にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化することで、例えば軽鎖および重鎖の構築が促進されるかあるいは抗体の安定性が増大または低下する。
【０１６４】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域の突然変異により抗体の生物学的半減期が減少する。より詳細には、抗体により天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合に対するブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合が低下している程度に、１つ以上のアミノ酸変異がＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入される。このアプローチは、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳述されている。
【０１６５】
別の実施形態では、抗体の修飾によりその生物学的半減期が増加する。様々なアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄに交付された米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載のように、１つ以上の以下の変異、すなわちＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆが導入可能である。あるいは、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書および米国特許第６，１２１，０２２号明細書に記載のように、生物学的半減期を増加させるため、抗体はＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）受容体結合エピトープを有するようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変されうる。
【０１６６】
さらに他の実施形態では、Ｆｃ領域は少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換し、抗体のエフェクター機能を改変することによって改変される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸が、抗体がエフェクターリガンドに対して改変された親和性を有しても親抗体の抗原への結合能を保持する程度に異なるアミノ酸残基と置換されうる。親和性が改変される対象のエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１号明細書および米国特許第５，６４８，２６０号明細書（いずれもＷｉｎｔｅｒらによる）にさらに詳述されている。
【０１６７】
別の例では、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸が、抗体がＣ１ｑ結合を改変しおよび／または補体依存性の細胞障害（ＣＤＣ）を低減または根絶している程度に異なるアミノ酸残基と置換されうる。このアプローチは、米国特許第６，１９４，５５１号明細書（Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる）にさらに詳述されている。
【０１６８】
別の例では、アミノ酸位置２３１および２３９内の１つ以上のアミノ酸残基が改変されることにより、抗体の補体を固定する能力が改変される。このアプローチは、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開、国際公開第９４／２９３５１号パンフレットにさらに記載されている。
【０１６９】
さらに別の例では、以下の位置、すなわち２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８もしくは４３９での１つ以上のアミノ酸の修飾によるＦｃ領域の修飾により、抗体の抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を媒介する能力が増大しおよび／または抗体のＦｃγ受容体に対する親和性が増大する。このアプローチは、ＰＣＴ公開、国際公開第００／４２０７２号パンフレット（Ｐｒｅｓｔａによる）にさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位がマッピングされており、かつ結合が改善された変異体についての記載がなされている（Ｓｈｉｅｌｄｓ  Ｒ．Ｌ．ら（２００１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４頁を参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特異的変異がＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。さらに、以下の変異体の組み合わせ、すなわちＴ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４ＡがＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。
【０１７０】
さらに別の実施形態では、本発明の抗体のＣ末端は、米国仮特許出願第６０／９５７，２７１号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載のようにシステイン残基の導入によって修飾される。かかる修飾は、限定はされないが、完全長重鎖配列のＣ末端またはその近傍での既存のアミノ酸残基の置換ならびに完全長重鎖配列のＣ末端に対するシステインを有する延長部の導入を含む。好ましい実施形態では、システインを有する延長部は、（Ｎ末端からＣ末端にかけて）アラニン−アラニン−システイン配列を含む。
【０１７１】
好ましい実施形態では、かかるＣ末端システイン修飾体の存在は、パートナー分子、例えば治療剤またはマーカー分子との複合における位置を提供する。特に、Ｃ末端システインの修飾に起因する反応性チオール基の存在を利用し、下記に詳述されるジスルフィドリンカーを用いたパートナー分子の複合が可能である。この方法での抗体とパートナー分子との複合は、結合の特異的部位全体にわたり制御性を高めることを可能にする。さらに、Ｃ末端またはその近傍での結合の部位の導入により、複合が、抗体の機能特性との干渉を低減または除去しかつ簡素化された分析および複合製剤の質の制御を可能にするように最適化されうる。
【０１７２】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体が作製されうる（すなわち抗体におけるグリコシル化が失われる）。グリコシル化の改変により、例えば抗体の抗原に対する親和性が増大しうる。かかる糖質修飾は、例えば抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を改変することによりなされうる。例えば、１つ以上のアミノ酸置換がなされうる結果、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去によりその部位でのグリコシル化が失われる。かかるアグリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が増大しうる。かかるアプローチは、米国特許第５，７１４，３５０号明細書および米国特許第６，３５０，８６１号明細書（Ｃｏらに付与）にさらに詳述されている。グリコシル化を改変するためのさらなるアプローチが、Ｈａｎａｉらに交付された米国特許第７，２１４，７７５号明細書、Ｐｒｅｓｔａに交付された米国特許第６，７３７，０５６号明細書、Ｐｒｅｓｔａに交付された米国特許出願公開第２００７００２０２６０号明細書、Ｄｉｃｋｅｙらに交付されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０８４９２６号パンフレット、Ｚｈｕらに交付されたＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０８９２９４号パンフレット、およびＲａｖｅｔｃｈらに交付されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０５５９１６号パンフレットにおいてさらに詳述されており、これら各々はその全体が参照により本明細書中に援用される。
【０１７３】
さらにまたはその他として、グリコシル化の改変タイプを有する抗体、例えば減量されたフコシル残基を有する低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体または増強されたＧｌｃＮａｃ二分構造を有する抗体が作製されうる。かかる改変されたグリコシル化パターンにより、抗体のＡＤＣＣ能力が増大することが示されている。かかる糖質修飾は、例えばグリコシル化機構が改変された宿主細胞内で抗体を発現することにより行われうる。グリコシル化機構が改変された細胞については当該技術分野で記載がなされており、本開示の組換え抗体を発現することによりグリコシル化が、改変抗体が産生される宿主細胞として用いられうる。例えば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９は、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９細胞系内で発現される抗体がその糖質上にフコースを含まないように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（α（１、６）フコシルトランスフェラーゼ）を含まない。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９  ＦＵＴ８−／−細胞系は、２つの置換ベクターを用いたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞内での標的化されたＦＵＴ８遺伝子の破壊により作製された（Ｙａｍａｎｅらによる米国特許出願公開第２００４０１１０７０４号明細書およびＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら（２００４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７：６１４−２２頁を参照）。別の例として、Ｈａｎａｉらによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、機能的に破壊されたフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系について記載している。かかる細胞系内で発現される抗体は、α１，６結合に関連した酵素の低減または除去により低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を示す。Ｈａｎａｉらは、フコースを抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンに添加するのに低い酵素活性を有するかまたは酵素活性を有することのない細胞系、例えばラット骨髄腫細胞系ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）についても記載している。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開、国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットには、フコースをＡｓｎ（２９７）に連結された糖質に結合させる能力が低下した（その宿主細胞内で発現される抗体の低フコシル化ももたらす）変異ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃ１３細胞について記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ  Ｒ．Ｌ．ら（２００２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０頁も参照）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ公開、国際公開第９９／５４３４２号パンフレットには、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えばβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を、改変された細胞系内で発現される抗体が抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらすＧｌｃＮａｃ二分構造の増大を示すように発現するように改変された細胞系について記載されている（Ｕｍａｎａら（１９９９年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０頁も参照）。あるいは、抗体のフコース残基はフコシダーゼ酵素を用いて切断されうる。例えば、フコシダーゼのα−Ｌ−フコシダーゼはフコシル残基を抗体から除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ  Ａ．��．ら（１９７５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−２３頁）。
【０１７４】
さらにまたはその他として、グリコシル化の改変タイプを有する抗体の作製が可能であり、ここでその改変は抗体のシアル化のレベルに関係する。かかる改変は、Ｄｉｃｋｅｙらに交付されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０８４９２６号パンフレットおよびＲａｖｅｔｃｈらに交付されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０５５９１６号パンフレットに記載されており、それら双方はそれら全体が参照により援用される。例えば、アルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼなどのシアリダーゼとの酵素反応を用いることができる。かかる反応の条件は、一般に米国特許第５，８３１，０７７号明細書に記載されており、その全体が参照により本明細書中に援用される。適切な酵素の他の非限定例として、ノイラミニダーゼおよびＮ−グリコシダーゼＦ（それぞれＳｃｈｌｏｅｍｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５（４）、８８２−８９３頁（１９７５年）およびＬｅｉｂｉｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、３３８、５２９−５３８頁（１９９９年）に記載）が挙げられる。脱シアル化抗体が親和性クロマトグラフィーを用いてさらに精製可能である。あるいは、本方法を用い、例えばシアリルトランスフェラーゼ酵素の使用によりシアル化のレベルを上昇させることができる。かかる反応の条件は、一般にＢａｓｓｅｔら、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５１（３）、３０７−３１１頁（２０００年）に記載されている。
【０１７５】
本開示で検討される本明細書中の抗体の別の修飾がペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）である。抗体をペグ化することで、例えば抗体の生物学的（例えば血清）半減期が増加されうる。抗体をペグ化するため、抗体またはその断片は典型的にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１つ以上のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に結合した状態になるという条件下で反応する。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似反応性の水−可溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われる。本明細書で用いられる「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを誘導体化するのに用いられているＰＥＧの形態のいずれかを包含するように意図されている。特定の実施形態では、ペグ化されるべき抗体はアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当該技術分野で既知であり、本開示の抗体に適用可能である。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０１５４３１６号明細書およびＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照のこと。
【０１７６】
抗体断片および抗体模倣体
本発明は、従来の抗体に限定されることなく、抗体断片および抗体模倣体の使用を通じて実施可能である。下記に詳述のように、多種多様な抗体断片および抗体模倣技術が現在では開発されており、当該技術分野で広く知られている。多数のこれら技術、例えばドメイン抗体、ナノボディ、およびユニボディでは従来の抗体構造の断片またはそれに対する他の修飾が用いられる一方、他の技術、例えば従来の抗体結合を模倣する一方、異なる機序から産生され、それを介して機能する結合構造を用いるアフィボディ、ダルピン、アンチカリン、アビマー、およびバーサボディも存在する。
【０１７７】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）は抗体の最小の機能結合単位であり、ヒト抗体の重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に対応するものである。ドメイン抗体は約１３ｋＤａの分子量を有する。Ｄｏｍａｎｔｉｓは、完全ヒトＶＨおよびＶＬ  ｄＡｂにおける一連の大規模かつ高度に機能的なライブラリ（各ライブラリ内に１００億超の異なる配列）を開発しており、これらのライブラリを用いて治療標的に特異的なｄＡｂを選択する。多数の従来の抗体に対し、ドメイン抗体は細菌、酵母、および哺乳類細胞系内で十分に発現される。ドメイン抗体およびその産生方法のさらなる詳細については、米国特許第６，２９１，１５８号明細書；米国特許第６，５８２，９１５号明細書；米国特許第６，５９３，０８１号明細書；米国特許第６，１７２，１９７号明細書；米国特許第６，６９６，２４５号明細書；米国特許出願公開第２００４／０１１０９４１号明細書；欧州特許出願第１４３３８４６号明細書および欧州特許第０３６８６８４号明細書および欧州特許第０６１６６４０号明細書；国際公開第０５／０３５５７２号パンフレット、国際公開第０４／１０１７９０号パンフレット、国際公開第０４／０８１０２６号パンフレット、国際公開第０４／０５８８２１号パンフレット、国際公開第０４／００３０１９号パンフレットおよび国際公開第０３／００２６０９号パンフレットの参照により得られうる（これら各々はその全体が参照により本明細書中に援用される）。
【０１７８】
ナノボディは、天然の重鎖抗体の固有の構造および機能特性を有する抗体由来の治療タンパク質である。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）および２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を有する。重要なことには、クローン化され、単離されたＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能を内在する完全に安定的なポリペプチドである。ナノボディは、ヒト抗体のＶＨドメインとの高い相同性を有し、かつ活性の任意の低下を伴うことなくさらにヒト化されうる。重要なことには、ナノボディは免疫原性の低い可能性を有し、霊長動物試験でナノボディのリード化合物を用いて確認されている。
【０１７９】
ナノボディでは、従来の抗体の利点を小分子薬物の重要な特徴と組み合わされる。ナノボディは、従来の抗体と同様、その標的および低い固有の毒性に対し、高い標的特異性、高親和性を示す。しかし、ナノボディは、小分子薬物と同様、酵素を阻害し、受容体のクレフトに容易に接近可能である。さらに、ナノボディは極めて安定的であり、注射以外の手段で投与可能であり（例えば国際公開第０４／０４１８６７号パンフレットを参照（その全体が参照により本明細書中に援用される）、製造が容易である。ナノボディの他の利点は、小さいサイズに起因するまれであるかまたは隠されたエピトープの認識、タンパク質標的の空洞または活性部位へのその固有の三次元構造に起因する高い親和性および選択性による結合性、薬物形式の柔軟性、半減期の調整ならびに薬物発見の容易性および速度を含む。
【０１８０】
ナノボディは、単一の遺伝子によりコードされ、ほぼすべての原核生物および真核生物宿主、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば米国特許第６，７６５，０８７号明細書を参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））、かび（例えばコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ））ならびに酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ））（例えば米国特許第６，８３８，２５４号明細書を参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））において効率的に産生される。産生プロセスは拡張可能であり、数キログラム量のナノボディが産生されている。ナノボディは、従来の抗体と比べて優れた安定性を示すことから、貯蔵寿命が長く即使用可能な溶液として調合可能である。
【０１８１】
ナノクローン（Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ）法（例えば国際公開第０６／０７９３７２号パンフレットを参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））は、Ｂ細胞の自動化された高スループットな選択に基づき所望の標的に対するナノボディを産生するための独自の方法であり、場合により本発明との関連で用いられうる。
【０１８２】
ユニボディは別の抗体断片技術であるが、この技術はＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去に基づくものである。ヒンジ領域の欠失により、従来のＩｇＧ４抗体に対して本質的に半分のサイズでありかつＩｇＧ４抗体の二価結合領域ではなく一価結合領域を有する分子が生成される。ＩｇＧ４抗体が不活性であることから免疫系と相互作用することがないことも周知であり、これは免疫応答が望ましくない場合の疾患の治療において有利な場合があり、この利点はユニボディ上に受け継がれる。例えば、ユニボディは、その結合対象の細胞を死滅させることなく阻害または静めるように機能しうる。さらに、癌細胞に結合するユニボディは、それらを刺激して増殖させることはない。さらに、ユニボディが従来のＩｇＧ４抗体の約半分のサイズであることから、それは大きい固形腫瘍全体により適切な分布を示すとともに有利な有効性を発揮する可能性がある。ユニボディは、全ＩｇＧ４抗体と同様の速度で身体から除去され、その抗原に対して全抗体と同様の親和性で結合可能である。ユニボディのさらなる詳細は、特許出願国際公開第２００７／０５９７８２号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）の参照により得られうる。
【０１８３】
アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子は、スタフィロコッカル（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つに由来する、５８−アミノ酸残基のタンパク質ドメインに基づく親和性タンパク質の新しいクラスを表す。この３つのヘリックスバンドル（ｈｅｌｉｘ  ｂｕｎｄｌｅ）ドメインはコンビナトリアルファージミドライブラリの作成物における足場として用いられており、それから所望の分子を標的にするアフィボディ変異体がファージディスプレイ技術を用いて選択されうる（Ｎｏｒｄ  Ｋ．、Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ  Ｅ．、Ｒｉｎｇｄａｈｌ  Ｊ．、Ｓｔａｈｌ  Ｓ．、Ｕｈｌｅｎ  Ｍ．、Ｎｙｇｒｅｎ  Ｐ．Ａ．、「Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  ａｎ  α−ｈｅｌｉｃａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎ」、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９７年；１５：７７２−７頁、Ｒｏｎｍａｒｋ  Ｊ．、Ｇｒｏｎｌｕｎｄ  Ｈ．、Ｕｈｌｅｎ  Ｍ．、Ｎｙｇｒｅｎ  Ｐ．Ａ．、「Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ（ＩｇＡ）−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００２年；２６９：２６４７−５５頁）。アフィボディ分子におけるその低い分子量（６ｋＤａ）とともに単純で強固な構造により、それが例えば検出試薬のような多種多様な用途に適するようになり（Ｒｏｎｍａｒｋ  Ｊ．、Ｈａｎｓｓｏｎ  Ｍ．、Ｎｙｇｒｅｎ  Ｔ．ら、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｆｆｉｂｏｄｙ−Ｆｃ  ｃｈｉｍｅｒａｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００２年；２６１：１９９−２１１頁）、かつ受容体相互作用が阻害される（Ｓａｎｄｓｔｏｒｍ  Ｋ．、Ｘｕ  Ｚ．、Ｆｏｒｓｂｅｒｇ  Ｇ．、Ｎｙｇｒｅｎ  Ｐ．Ａ．、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ２８−ＣＤ８０  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｂｙ  ａ  ＣＤ２８−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ｌｉｇａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ２００３年；１６：６９１−７頁）。アフィボディおよびそれを産生する方法のさらなる詳細が、米国特許第５，８３１，０１２号明細書により得られうる（その全体が参照により本明細書中に援用される）。
【０１８４】
標識されたアフィボディは、多数のアイソフォームを判定するためのイメージング用途においても有用でありうる。
【０１８５】
ダルピン（設計されたアンキリンリピートタンパク質）は、非抗体ポリペプチドの結合能を用いるように開発された抗体模倣ＤＲＰ（設計されたリピートタンパク質）技術の一例である。アンキリンまたはロイシンリッチのリピートタンパク質などのリピートタンパク質は、偏在する結合分子であり、抗体と異なり細胞内および細胞外に生じる。それら固有のモジュール構造は、構造単位の反復（リピート）を特徴とし、共に蓄積され、可変でかつモジュール式の標的に結合する表面を示す伸長されたリピートドメインが形成される。このモジュール性に基づき、非常に多様化された結合特異性を有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリが生成されうる。この方法は、可変の表面残基およびリピートドメインへのランダムアセンブリを示す自家和合性リピートに共通の設計を含む。
【０１８６】
ダルピンは、細菌発現系内で極めて高収量に産生可能であり、既知の最も安定なタンパク質に属する。ヒト受容体、サイトカイン、キナーゼ、ヒトプロテアーゼ、ウイルスおよび膜タンパク質を含む広範囲の標的タンパク質に対して極めて特異的な高親和性のダルピンが選択されている。１桁のナノモル〜ピコモルの範囲内の親和性を有するダルピンが得られうる。
【０１８７】
ダルピンは、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、チップ用途、親和性精製またはウエスタンブロッティングを含む広範囲の用途で用いられている。ダルピンは、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合された細胞内マーカータンパク質としての細胞内区画内で活性が高いことも判明した。ダルピンは、ｐＭ範囲内のＩＣ５０でウイルスの侵入を阻害するのにさらに用いられた。ダルピンは、タンパク質−タンパク質相互作用の遮断に望ましいだけでなく酵素の阻害に望ましい。プロテアーゼ、キナーゼおよびトランスポーターの阻害に奏功しており、ほとんどの場合、アロステリック阻害様式である。腫瘍に対する極めて迅速で特異的な濃縮および極めて好ましい腫瘍対血液比により、インビボでの診断的または治療的アプローチに十分に適合するダルピンが作製される。
【０１８８】
ダルピンおよび他のＤＲＰ技術に関するさらなる情報が、米国特許出願公開第２００４／０１３２０２８号明細書および国際特許出願公開、国際公開第０２／２０５６５号パンフレットに見出されうる（それら双方はそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
【０１８９】
アンチカリンはさらなる抗体模倣技術であるが、この場合、結合特異性は、ヒト組織内および体液中で自然にかつ豊富に発現される低分子量タンパク質のファミリーであるリポカリンに由来する。リポカリンは、進化することで、化学的感受性があるかまたは不可溶性の化合物の生理的輸送および保存に関連したインビボでの機能の範囲を果たしている。リポカリンは、タンパク質の一末端で４つのループを支持する高度に保存されたβ−バレルを含む強固な固有の構造を有する。これらのループは結合ポケットに対する入口（ｅｎｔｒａｎｃｅ）を形成し、分子のこの部分における高次構造上の差は各リポカリン間の結合特異性におけるばらつきを示している。
【０１９０】
保存されたβシートフレームワークにより支持される超可変ループの全体構造から免疫グロブリンが連想されるが、リポカリンはサイズの観点で抗体とはかなり異なり、単一の免疫グロブリンドメインよりもわずかに大きい１６０−１８０個のアミノ酸の単一のポリペプチド鎖からなる。
【０１９１】
リポカリンはクローン化され、アンチカリンの作製のため、そのループには改変がなされる。構造的に多様なアンチカリンのライブラリが生成されており、アンチカリンの提示は、結合機能の選択およびスクリーニング、それに続く、原核系または真核系におけるさらなる分析のための可溶性タンパク質の発現および産生を可能にする。試験によると、仮想的に任意のヒト標的タンパク質に特異的なアンチカリンの開発が可能で、その単離が可能であり、ナノモルのまたはより高い範囲での結合親和性が得られうることを示すことに奏功している。
【０１９２】
アンチカリンは、二重標的化された（ｄｕａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）タンパク質、いわゆるデュオカリンとしても形式化されうる。デュオカリンは、標準の作製プロセスを用いて１つの容易に生成される単量体タンパク質内の２つの別々の治療標的に結合する一方、その２つの結合ドメインの構造的方向性にかかわらず標的の特異性および親和性を保持する。
【０１９３】
単一の分子を通じての複数の標的の調節は、２つ以上の病原因子を含むことで知られる疾患において特に有利である。さらに、デュオカリンなどの二価または多価の結合形式は、疾患における細胞表面分子の標的化において有意な可能性を有し、シグナル伝達経路に対してアゴニスト作用を媒介するか、または細胞表面受容体の結合およびクラスタリングを介して内在化効果の増大を誘発する。さらに、デュオカリンの固有の高い安定性は単量体アンチカリンに匹敵し、デュオカリンに対して柔軟な製剤および送達の可能性をもたらす。
【０１９４】
アンチカリンに関するさらなる情報が、米国特許第７，２５０，２９７号明細書および国際特許出願公開番号、国際公開第９９／１６８７３号パンフレットに見出されうる（それら双方はそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
【０１９５】
本発明との関連で有用な別の抗体模倣技術がアビマーである。アビマーは、インビトロでのエクソンシャッフリングおよびファージディスプレイによりヒト細胞外受容体ドメインの大きいファミリーから進化したものであり、結合および阻害特性を備えた多重ドメインタンパク質を生成する。複数の独立した結合ドメインの連結により結合活性がもたらされることが示されており、結果として従来の単一のエピトープ結合タンパク質に対して親和性および特異性が改善される。他の有望な利点として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）内での多重標的に特異的な分子の単純かつ効率的な産生、プロテアーゼに対する改善された熱安定性および耐性が挙げられる。ナノメートル以下の親和性を有するアビマーが種々の標的に対して得られている。
【０１９６】
アビマーに関するさらなる情報が、米国特許出願公開第２００６／０２８６６０３号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２３４２９９号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２２３１１４号明細書、米国特許出願公開第２００６／０１７７８３１号明細書、米国特許出願公開第２００６／０００８８４４号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２２１３８４号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１６４３０１号明細書、米国特許出願公開第２００５／００８９９３２号明細書、米国特許出願公開第２００５／００５３９７３号明細書、米国特許出願公開第２００５／００４８５１２号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１７５７５６号明細書に見出されうる（それらすべてはそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
【０１９７】
バーサボディは、本発明との関連で利用可能な別の抗体模倣技術である。バーサボディは、１５％を超えるシステインを有する３〜５ｋＤａの小さいタンパク質であり、高いジスルフィド密度の足場を形成し、典型的なタンパク質が有する疎水性コアの代わりとなる。疎水性コアを含む多数の疎水性アミノ酸の少数のジスルフィドとの置換により、より小さくより親水性が高く（低下した凝集および非特異的結合）、プロテアーゼおよび熱に対してより耐性があり、かつＭＨＣ提示の大部分に寄与する残基が疎水性であることからより低いＴ細胞エピトープの密度を有するタンパク質が生成される。これらの特性の４つすべてが免疫原性に作用することで周知であり、それらは共に免疫原性の大幅な低下の原因になると予想される。
【０１９８】
バーサボディについての着想は、ヒル、ヘビ、クモ、サソリ、カタツムリ、およびアネモネにより生成される天然の注射可能な生物医薬品から得られるものであり、予想外に低い免疫原性を示すことが知られている。選択された天然タンパク質ファミリーから、サイズの設計およびスクリーニングにより、疎水性、タンパク質分解の抗原プロセシング、およびエピトープ密度が注射可能な天然タンパク質における平均を大幅に下回るレベルまで最小化される。
【０１９９】
バーサボディの構造を仮定すると、これらの抗体模倣体は多価、多重特異性、半減期機構の多様性、組織標的化モジュールおよび抗体Ｆｃ領域の非存在を含む多目的形式を提供する。さらに、バーサボディは、高収量で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で作製され、かつ、バーサボディはその親水性および小サイズ故に可溶性が高く、高濃度に調合されうる。バーサボディは、特に熱安定的であり（それは沸騰可能であり）、長い貯蔵寿命をもたらす。
【０２００】
バーサボディに関するさらなる情報が、米国特許出願公開第２００７／０１９１２７２号明細書に見出されうる（その全体が参照により本明細書中に援用される）。
【０２０１】
上で提供された抗体断片および抗体模倣技術の詳細な説明は、本明細書との関連で用いられうるあらゆる技術の包括的リストであるように意図されていない。例えば、また限定を目的としない場合、他のポリペプチドに基づく技術、例えばＱｕｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５（８）９２１−９２９頁（２００７年）（その全体が参照により本明細書中に援用される）で概説された相補性決定領域の融合、ならびに核酸に基づく技術、例えば米国特許第５，７８９，１５７号明細書、米国特許第５，８６４，０２６号明細書、米国特許第５，７１２，３７５号明細書、米国特許第５，７６３，５６６号明細書、米国特許第６，０１３，４４３号明細書、米国特許第６，３７６，４７４号明細書、米国特許第６，６１３，５２６号明細書、米国特許第６，１１４，１２０号明細書、米国特許第６，２６１，７７４号明細書、および米国特許第６，３８７，６２０号明細書（これらのすべては参照により本明細書中に援用される）に記載のＲＮＡアプタマー技術を含む種々のさらなる技術が本発明との関連で利用可能である。
【０２０２】
抗体の物理的特性
本開示の抗体は、抗ＣＤ７０抗体の様々な物理的特性によりさらに特徴づけられうる。様々なアッセイを用い、これらの物理的特性に基づいて抗体の異なるクラスの検出および／または識別が可能である。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかにおいて１つ以上のグリコシル化部位を有しうる。可変領域内に１つ以上のグリコシル化部位が存在する結果、抗原結合の改変により抗体の免疫原性または抗体のｐＫの変化が増大しうる（Ｍａｒｓｈａｌｌら（１９７２年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４１：６７３−７０２頁；Ｇａｌａ  Ｆ．Ａ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  Ｓ．Ｌ．（２００４年）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：５４８９−９４頁；Ｗａｌｌｉｃｋら（１９８８年）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８：１０９９−１０９頁；Ｓｐｉｒｏ  Ｒ．Ｇ．（２００２年）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：４３Ｒ−５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：４５２−７頁；Ｍｉｍｕｒａら（２０００年）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７：６９７−７０６頁）。グリコシル化はＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を有するモチーフで生じることが知られている。可変領域のグリコシル化はグライコブロット（Ｇｌｙｃｏｂｌｏｔ）アッセイを用いて試験可能であり、同アッセイでは、抗体の切断によりＦａｂが産生され、次いで過ヨウ素酸酸化およびシッフ塩基形成を測定するアッセイを用いてグリコシル化が試験される。あるいは、可変領域のグリコシル化はディオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）光クロマトグラフィー（ディオネックス−ＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ−ＬＣ））を用いて試験可能であり、そこでは糖類がＦａｂから切断されて単糖類にされ、各糖類の含量が分析される。いくつかの例では、可変領域のグリコシル化を有することのない抗ＣＤ７０抗体を有することが好ましい。これは、可変領域内にグリコシル化モチーフを有することのない抗体を選択するかまたはグリコシル化モチーフ内の残基を当該技術分野で周知の標準技術を用いて突然変異させることにより実現されうる。
【０２０４】
好ましい実施形態では、本開示の抗体はアスパラギン異性部位を有することがない。脱アミドまたはイソアスパラギン酸効果が各々、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列上で生じうる。脱アミドまたはイソアスパラギン酸効果の結果、主鎖ではなく側鎖のカルボキシ末端から離れてキンク構造を生成することにより抗体の安定性を低下させるイソアスパラギン酸が生成される。イソアスパラギン酸の生成は異性体定量分析（ｉｓｏ−ｑｕａｎｔ  ａｓｓａｙ）を用いて測定可能であり、そこでは逆相ＨＰＬＣを用いてイソアスパラギン酸についての試験が行われる。
【０２０５】
各抗体は特有の等電点（ｐＩ）を有することになるが、一般に抗体は６〜９．５のｐＨ範囲に収まることになる。ＩｇＧ１抗体におけるｐＩは典型的には７〜９．５のｐＨ範囲内に収まり、かつＩｇＧ４抗体におけるｐＩは典型的には６〜８のｐＨ範囲内に収まる。抗体はこの範囲外のｐＩを有する場合がある。効果は一般に未知であるが、正常な範囲外のｐＩを有する抗体がインビボ条件下である程度のアンフォールディングおよび不安定性を有しうることが推定される。等電点はキャピラリー等電点電気泳動アッセイを用いて試験可能であり、それはｐＨ勾配を生成し、そこでは精度向上のためにレーザー集光が用いられうる（Ｊａｎｉｎｉら（２００２年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２３：１６０５−１１頁；Ｍａら（２００１年）Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ  ５３：Ｓ７５−８９頁；Ｈｕｎｔら（１９９８年）Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ８００：３５５−６７頁）。いくつかの例では、正常な範囲内に収まるｐＩ値を有する抗ＣＤ７０抗体を有することが好ましい。これは正常な範囲内のｐＩを有する抗体を選択するかまたは帯電した表面残基を当該技術分野で周知の標準の技術を用いて突然変異することによりなされうる。
【０２０６】
各抗体は、熱安定性を示す融解温度を有することになる（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ  Ｒ．およびＭａｎｎｉｎｇ  Ｍ．Ｃ．（２００２年）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３：３６１−７１頁）。より高い熱安定性は、インビボで全体的により高い抗体安定性を示す。抗体の融解点は、示差走査熱量測定などの技術を用いて測定されうる（Ｃｈｅｎら（２００３年）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２０：１９５２−６０頁；Ｇｈｉｒｌａｎｄｏら（１９９９年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６８：４７−５２頁）。ＴＭ１は抗体の初期のアンフォールディングの温度を示す。ＴＭ２は抗体の完全なアンフォールディングの温度を示す。一般に、本開示の抗体のＴＭ１が６０℃より高く、好ましくは６５℃より高く、さらにより好ましくは７０℃より高いことが好ましい。あるいは、抗体の熱安定性は円二色性を用いて測定されうる。（Ｍｕｒｒａｙら（２００２年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｓｃｉ  ４０：３４３−９頁）。
【０２０７】
好ましい実施形態では、急速に分解することのない抗体が選択される。抗ＣＤ７０抗体の断片化は、当該技術分野で十分に理解されているようにキャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて測定されうる（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ａ．Ｊ．およびＨｕｇｈｅｓ  Ｄ．Ｅ．（１９９５年）Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６７：３６２６−３２頁）。
【０２０８】
別の好ましい実施形態では、最小の凝集効果を有する抗体が選択される。凝集が、望ましくない免疫応答および／または改変されるかもしくは好ましくない薬物動態学的特性の誘因となりうる。一般に、抗体では、２５％以下、好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１５％以下、さらにより好ましくは１０％以下およびさらにより好ましくは５％以下の凝集が許容される。凝集は、単量体、二量体、三量体または多量体を同定するためのサイズ排除カラム（ＳＥＣ）高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および光散乱を含む、当該技術分野で周知のいくつかの技術により測定されうる。
【０２０９】
抗体を改変する方法
上で考察のように、本明細書中に開示されるＶＨおよびＶＫ配列を有する抗ＣＤ７０抗体を用い、新しい抗ＣＤ７０抗体の作製がＶＨおよび／またはＶＫ配列またはそれに結合された定常領域の修飾により可能である。したがって、本開示の別の態様では、本開示の抗ＣＤ７０抗体、例えば２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙまたは１Ｆ４の構造的特徴を用い、本開示の抗体の少なくとも１つの機能特性、例えばヒトＣＤ７０への結合を保持する構造的に関連性がある抗ＣＤ７０抗体が作製される。上で考察のように、例えば、２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙもしくは１Ｆ４の１つ以上のＣＤＲ領域またはその変異体を既知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組換え的に結合させ、組換え操作されたさらなる本開示の抗ＣＤ７０抗体の作製が可能である。修飾の他のタイプとして、前セクションに記載のタイプが挙げられる。改変方法における出発原料は、本明細書中に提供される１つ以上のＶＨおよび／もしくはＶＫ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域である。改変抗体を作製するのに、本明細書中に提供される１つ以上のＶＨおよび／もしくはＶＫ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわちタンパク質として発現させる）必要はない。それに対し、配列内に含まれる情報を出発原料として用い、元の配列に由来する「第二世代」配列が作製され、次いで「第二世代」配列が調製され、タンパク質として発現される。
【０２１０】
したがって、別の実施形態では、本開示は、抗ＣＤ７０抗体を調製するための方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号１３、１４、１５、１６、１７、および１８からなる群より選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群より選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号２５、２６、２７、２８、２９、７５、および３０からなる群より選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列；および／または（ｉｉ）配列番号３１、３２、３３、３４、３５、および３６からなる群より選択されるＣＤＲ１配列、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、および４２からなる群より選択されるＣＤＲ２配列および／または配列番号４３、４４、４５、４６、４７、および４８からなる群より選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供する工程と、
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列内および／または軽鎖可変領域抗体配列内で少なくとも１つのアミノ酸残基を改変し、少なくとも１つの改変抗体配列を作製する工程と、
（ｃ）タンパク質として改変抗体配列を発現する工程と、
を含む方法を提供する。
【０２１１】
標準の分子生物学技術を用い、改変抗体配列の調製および発現が可能である。
【０２１２】
好ましくは、改変抗体配列によりコードされる抗体は、本明細書中に記載の抗ＣＤ７０抗体の機能特性のうちの１つ、一部または全部を保持するものであり、ここでの機能特性は、限定はされないが、
（ａ）ヒトＣＤ７０に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合する特性、および
（ｂ）腎細胞癌腫瘍細胞系に結合する特性、
（ｃ）リンパ腫細胞系、例えばＢ細胞腫瘍細胞系に結合する特性、
（ｄ）ＣＤ７０発現細胞により内在化される特性、
（ｅ）ＣＤ７０発現細胞に対して抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を示す特性、および
（ｆ）細胞毒素に複合される場合、インビボでＣＤ７０発現細胞の成長を阻害する特性
を含む。
【０２１３】
改変抗体の機能特性は、当該技術分野で使用可能でありおよび／または本明細書中に記載の標準アッセイ、例えば実施例で示されるアッセイ（例えば、フローサイトメトリー、結合アッセイ）を用いて評価可能である。
【０２１４】
本開示の抗体を改変する方法の特定の実施形態では、変異が、抗ＣＤ７０抗体のコード配列の全部もしくは一部に沿ってランダムまたは選択的に導入可能であり、かつ、得られる修飾された抗ＣＤ７０抗体における結合活性および／または本明細書中に記載の他の機能特性についてスクリーニング可能である。突然変異方法については当該技術分野で記載がなされている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ公開、国際公開第０２／０９２７８０号パンフレットでは、抗体変異を飽和突然変異誘発、合成的ライゲーションアセンブリー（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）またはそれらの組み合わせを用いて作製しスクリーニングするための方法が記載されている。あるいは、ＬａｚａｒらによるＰＣＴ公開、国際公開第０３／０７４６７９号パンフレットでは、コンピュータによるスクリーニング方法を用いて抗体の生理化学的特性を最適化する方法が記載されている。
【０２１５】
本開示の抗体をコードする核酸分子
本開示の別の態様は、本開示の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞内に、細胞溶解液中にまたは部分精製形態もしくは実質的に純粋な形態で存在しうる。核酸は、当該技術分野で周知のアルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他を含む標準技術により、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞核酸もしくはタンパク質から除去精製される場合、「単離される」かまたは「実質的に純粋な状態にされる」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７年）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）のＧｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅを参照のこと。本開示の核酸が例えばＤＮＡまたはＲＮＡでありうるとともに、イントロン配列を有するかまたは有しない場合がある。好ましい実施形態では核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０２１６】
本開示の核酸は、標準の分子生物学技術を用いて得られうる。ハイブリドーマ（例えばさらに下記のヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）により発現される抗体においては、ハイブリドーマにより作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡが標準のＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得られうる。（例えばファージディスプレイ技術を用いる）免疫グロブリン遺伝子ライブラリから得られる抗体については、かかる抗体をコードする核酸が遺伝子ライブラリから回収されうる。
【０２１７】
本開示の好ましい核酸分子は、２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙまたは１Ｆ４モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするものである。２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙおよび１Ｆ４のＶＨ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号４９、５０、５１、５２、５３、７４および５４で示される。２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７、６９Ａ７Ｙおよび１Ｆ４のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号５５、５６、５７、５８、５９、５９および６０で示される（６９Ａ７および６９Ａ７Ｙは配列番号５９で示される場合と同じＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列を有する）。
【０２１８】
一旦ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片を標準の組換えＤＮＡ技術によりさらに操作することで、例えば可変領域遺伝子が完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換されうる。これらの操作では、ＶＬもしくはＶＨをコードするＤＮＡ断片が別のタンパク質、例えば抗体の定常領域またはフレキシブルリンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｌｉｎｋｅｒ）をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。これに関連して用いられる「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、２つのＤＮＡ断片が連結されることを意味するように意図されている。
【０２１９】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより完全長重鎖遺伝子に変換されうる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で既知であり（例えばＫａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片が標準のＰＣＲ増幅により得られうる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＱ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域でありうるが、最も好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡは重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結されうる。
【０２２０】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより完全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換されうる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で既知であり（例えばＫａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅により得られうる。好ましい実施形態では、軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域でありうる。
【０２２１】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するのに、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片がフレキシブルリンカー、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結されることで、ＶＨおよびＶＬ配列はフレキシブルリンカーで連結されたＶＬおよびＶＨ領域を有する隣接した一本鎖タンパク質として発現されうる（例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６頁；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３頁；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０年）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４頁を参照）。
【０２２２】
本開示のモノクローナル抗体の産生
本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体の方法、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５頁の標準の体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む種々の技術により産生可能である。原理上、体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、モノクローナル抗体を産生するための他の技術、例えばＢリンパ球のウイルス性または発癌性の形質転換が用いられうる。
【０２２３】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ生成は極めて十分に確立された方法である。融合のために免疫された脾細胞を単離するための免疫プロトコルおよび技術は当該技術分野で既知である。融合相手（例えばマウス骨髄腫細胞）および融合方法についても既知である。
【０２２４】
本開示のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製される非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製されうる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的の非ヒトハイブリドーマから得られ、標準の分子生物学技術を用いて非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を有するように改変されうる。例えば、キメラ抗体を作製するため、マウス可変領域は当該技術分野で既知の方法を用いてヒト定常領域に連結されうる（例えばＣａｂｉｌｌｙらに交付された米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。ヒト化抗体を作製するため、マウスＣＤＲ領域は当該技術分野で既知の方法を用いてヒトフレームワークに挿入されうる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに交付された米国特許第５，２２５，５３９号明細書ならびにＱｕｅｅｎらに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
【０２２５】
好ましい実施形態では、本開示の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＣＤ７０に特異的なかかるヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックまたはトランスクロモゾームマウスを用いて産生されうる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモゾームマウスは、本明細書中で各々ＨｕＭＡｂＭｏｕｓｅ（登録商標）およびＫＭＭｏｕｓｅ（登録商標）と称されるマウスを含み、本明細書中で総称して「ヒトＩｇマウス」と称される。
【０２２６】
ＨｕＭＡｂＭｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された変異とともに未転位のヒト重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｉ）を有する（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら  １９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁を参照）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、免疫に応答し、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランス遺伝子がクラススイッチおよび体細胞突然変異を受け、高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナル抗体が産生される（Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．ら（１９９４年）上記；Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．（１９９４年）「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」１１３：４９−１０１頁にレビュー；Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．およびＨｕｓｚａｒ  Ｄ．（１９９５年）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３頁；ならびにＨａｒｄｉｎｇ  Ｆ．およびＬｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．（１９９５年）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６頁）。ＨｕＭａｂＭｏｕｓｅ（登録商標）の調製および使用ならびにかかるマウスにより保有されるゲノム修飾については、Ｔａｙｌｏｒ  Ｌ．ら（１９９２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５頁；Ｃｈｅｎ  Ｊ．ら（１９９３年）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６頁；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７２０−３７２４頁；Ｃｈｏｉら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３頁；Ｃｈｅｎ  Ｊ．ら（１９９３年）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２１−８３０頁；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０頁；Ｔａｙｌｏｒ  Ｌ．ら（１９９４年）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１頁；ならびにＦｉｓｈｗｉｌｄ  Ｄ．ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１頁にさらに記載されている（これらすべての内容はそれら全体が参照により本明細書中に具体的に援用される）。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；米国特許第５，５６９，８２５号明細書；米国特許第５，６２５，１２６号明細書；米国特許第５，６３３，４２５号明細書；米国特許第５，７８９，６５０号明細書；米国特許第５，８７７，３９７号明細書；米国特許第５，６６１，０１６号明細書；米国特許第５，８１４，３１８号明細書；米国特許第５，８７４，２９９号明細書；および米国特許第５，７７０，４２９号明細書（すべてはＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに交付）、Ｓｕｒａｎｉらに交付された米国特許第５，５４５，８０７号明細書；ＰＣＴ公開、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９７／１３８５２号パンフレット、国際公開第９８／２４８８４号パンフレットおよび国際公開第９９／４５９６２号パンフレット（すべてはＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに交付）、ならびにＫｏｒｍａｎらに交付されたＰＣＴ公開、国際公開第０１／１４４２４号パンフレットを参照のこと。例えばＢｒｕｇｇｅｍａｎｎによるＰＣＴ公開の国際公開第００／２６３７３号パンフレットに記載のヒトλ軽鎖遺伝子を有するトランスジェニックマウスも用いられうる。例えば、ヒトλ軽鎖トランス遺伝子を有するマウスを、ヒト重鎖トランス遺伝子（例えばＨＣｏ７）を有し、場合によりヒトκ軽鎖トランス遺伝子（例えばＫＣｏ５）も有するマウスと交配させ、ヒト重鎖および軽鎖トランス遺伝子の双方を有するマウスの作製が可能である（例えば実施例１を参照）。
【０２２７】
別の実施形態では、本開示のヒト抗体は、トランス遺伝子およびトランスクロモゾーム上でヒト免疫グロブリン配列を保有するマウス、例えばヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランスクロモゾームを保有するマウスを用いて産生されうる。このマウスは、本明細書中で「ＫＭＭｏｕｓｅ（登録商標）」と称され、Ｉｓｈｉｄａらに交付されたＰＣＴ公開、国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに詳述されている。
【０２２８】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスジェニック動物系は当該技術分野で使用可能であり、その使用により、本開示の抗ＣＤ７０抗体が産生されうる。例えば、ゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）として称される他のトランスジェニック系の使用が可能であり、かかるマウスは、例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらに交付された米国特許第５，９３９，５９８号明細書；米国特許第６，０７５，１８１号明細書；米国特許第６，１１４，５９８号明細書；米国特許第６，１５０，５８４号明細書および米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。
【０２２９】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスクロモゾーム動物系は当該技術分野で使用可能であり、その使用により、本開示の抗ＣＤ７０抗体の産生が可能である。例えば、「ＴＣマウス」と称される、ヒト重鎖トランスクロモゾームとヒト軽鎖トランスクロモゾームとの双方を保有するマウスの使用が可能であり、かかるマウスについてはＴｏｍｉｚｕｋａら（２０００年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：７２２−７２７頁に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモゾームを保有するウシについての記載が当該技術分野でなされており（例えば、Ｋｕｒｏｉｗａら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４頁およびＰＣＴ出願の国際公開第２００２／０９２８１２号パンフレット）、その使用により、本開示の抗ＣＤ７０抗体の産生が可能である。
【０２３０】
本開示のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いても調製可能である。ヒト抗体を単離するためのかかるファージディスプレイ法は、当該技術分野で確立されたものである。例えば、Ｌａｄｎｅｒらに交付された米国特許第５，２２３，４０９号明細書；米国特許第５，４０３，４８４号明細書；および米国特許第５，５７１，６９８号明細書；Ｄｏｗｅｒらに交付された米国特許第５，４２７，９０８号明細書および米国特許第５，５８０，７１７号明細書；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらに交付された米国特許第５，９６９，１０８号明細書および米国特許第６，１７２，１９７号明細書；ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらに交付された米国特許第５，８８５，７９３号明細書；米国特許第６，５２１，４０４号明細書；米国特許第６，５４４，７３１号明細書；米国特許第６，５５５，３１３号明細書；米国特許第６，５８２，９１５号明細書および米国特許第６，５９３，０８１号明細書を参照のこと。
【０２３１】
本開示のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト抗体反応が免疫時に生成されうるようにヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを用いて調製されうる。かかるマウスは、例えばＷｉｌｓｏｎらに交付された米国特許第５，４７６，９９６号明細書および米国特許第５，６９８，７６７号明細書に記載されている。
【０２３２】
別の実施形態では、ヒト抗ＣＤ７０抗体が、Ｂｕｅｃｈｌｅｒらによる米国特許第６，７９４，１３２号明細書に記載のようにヒトＩｇマウスとファージディスプレイ技術を併用して調製される。より詳細には、本方法は最初に、（上記のＨｕＭａｂマウスまたはＫＭマウスなどの）ヒトＩｇマウスにおけるマウスの１つ以上のＣＤ７０抗原での免疫による抗ＣＤ７０抗体応答の生成と、その後のマウスのリンパ細胞由来のヒト抗体鎖をコードする核酸の単離およびこれらの核酸のディスプレイベクター（例えばファージ）への導入によるディスプレイパッケージのライブラリの提供を含む。したがって、各ライブラリメンバーはヒト抗体鎖をコードする核酸を含み、各抗体鎖がディスプレイパッケージから提示される。次いで、ライブラリを、ＣＤ７０タンパク質を用いてスクリーニングし、ＣＤ７０に特異的に結合するライブラリメンバーが単離される。次いで、選択されたライブラリメンバーの核酸挿入物が単離され、標準の方法により配列決定され、選択されたＣＤ７０結合剤の軽鎖および重鎖可変配列が決定される。可変領域は、標準の組換えＤＮＡ技術、例えば可変領域のヒト重鎖および軽鎖定常領域をＶＨ領域がＣＨ領域に動作可能に連結されかつＶＬ領域がＣＬ領域に動作可能に連結されるように保有する発現ベクターへのクローニングにより、完全長抗体鎖に変換されうる。
【０２３３】
ヒトＩｇマウスの免疫
ヒトＩｇマウスを用いて本開示のヒト抗体が産生される場合、かかるマウスは、Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  Ｄ．ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１頁；ならびにＰＣＴ公開の国際公開第９８／２４８８４号パンフレットおよび国際公開第０１／１４４２４号パンフレットに記載のように、ＣＤ７０発現細胞系、ＣＤ７０抗原の精製もしくは濃縮調製物および／または組換えＣＤ７０もしくはＣＤ７０融合タンパク質で免疫されうる。好ましくは、マウスは１回目の注入時に６〜１６週齢となる。例えば、ＣＤ７０抗原の精製または組換え調製物（５〜５０μｇ）を用い、ヒトＩｇマウスの腹腔内および／または皮下への免疫が可能である。
【０２３４】
ＣＤ７０に結合する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するための詳細な方法が下記の実施例１に記載されている。様々な抗原を用いる試験を重ねることで、トランスジェニックマウスが、最初に完全フロイントアジュバント中の抗原で腹腔内（ＩＰ）に免疫され、それに続き、不完全フロイントアジュバント中の抗原で隔週、最大で全６回ＩＰ免疫される時、応答することが示されている。しかし、フロイント以外のアジュバント（例えば、ＲＩＢＩアジュバント）についても有効であることが見出されている。さらに、アジュバントの非存在下では全細胞における免疫原性が高いことが見出されている。免疫応答は、後眼窩（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ）の出血により得られる血漿試料を用いる免疫プロトコルを通して監視可能である。血漿はＥＬＩＳＡでスクリーニング可能であり（後述するように）、十分な力価の抗ＣＤ７０ヒト免疫グロブリンを有するマウスが融合において用いられうる。マウスは、屠殺および脾臓摘出の例えば３日前、抗原で静脈内に追加免疫されうる。免疫ごとに２〜３の融合がなされる必要がありうることが想定される。典型的にはマウス６〜２４匹が各抗原に対して免疫される。通常、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２株の双方が用いられる。ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２マウス株の生成はそれぞれ、米国特許第５，７７０，４２９号明細書およびＰＣＴ公開の国際公開第０１／０９１８７号パンフレットの実施例２に記載されている。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２トランス遺伝子は共に２つの異なるヒト重鎖トランス遺伝子（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）を有する単一のマウスに育種されうる。その他としてまたはさらに、ＫＭＭｏｕｓｅ（登録商標）株がＰＣＴ公開の国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに記載のように用いられうる。
【０２３５】
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するため、免疫されたマウス由来の脾細胞および／またはリンパ節細胞が単離され、適切な不死化細胞系、例えばマウス骨髄腫細胞系に融合されうる。生成されたハイブリドーマでは、抗原特異的な抗体の産生についてスクリーニング可能である。例えば、免疫されたマウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液が、５０％ＰＥＧとともにＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）の数の１／６に融合されうる。あるいは、免疫マウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液は、ＣｙｔｏＰｕｌｓｅ大型チャンバ細胞融合エレクトロポレーター（ＣｙｔｏＰｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ））を用いる、電場に基づく電気融合法を用いて融合されうる。細胞は、平底マイクロタイタープレート内に約２×１０５でプレーティング後、２０％胎仔クローン血清、１８％「６５３」馴化培地、５％オリゲン（ｏｒｉｇｅｎ）（ＩＧＥＮ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのヘペス、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１×ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地（Ｓｉｇｍａ；ＨＡＴは融合の２４時間後に添加される）を含有する選択培地内で１週間インキュベートされる。約２週間後、細胞はＨＡＴがＨＴと交換された培地内で培養されうる。次いで、各ウェルにおけるヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてはＥＬＩＳＡによりスクリーニング可能である。一旦多数のハイブリドーマの成長が生じると、培地は通常１０〜１４日後に観察されうる。抗体を分泌するハイブリドーマは、再プレーティングされ、再びスクリーニングされ、依然としてヒトＩｇＧ陽性である場合、モノクローナル抗体は限界希釈により少なくとも２回サブクローニングされうる。次いで、特徴づけのため、安定なサブクローンをインビトロで培養することで、組織培地内に少量の抗体が産生されうる。
【０２３６】
ヒトモノクローナル抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマはモノクローナル抗体の精製用の２リットルのスピナーフラスコ内で成長されうる。親和性クロマトグラフィー前、上清がプロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．））を用いて濾過され、濃縮される。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーで検査することで純度が保証されうる。緩衝溶液はＰＢＳに交換可能であり、濃度は１．４３の減衰係数を用い、ＯＤ２８０により判定可能である。モノクローナル抗体は、一定量に分割され、−８０℃で保存されうる。
【０２３７】
本開示のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの生成
本開示の抗体は、例えば当該技術分野で周知のように組換えＤＮＡ技術と遺伝子形質移入方法を併用し、宿主細胞のトランスフェクトーマ内でも産生されうる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２頁）。
【０２３８】
例えば、抗体またはその抗体断片を発現するため、部分長または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡが標準の分子生物学技術（例えば目的の抗体を発現するハイブリドーマを用いるＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング）により得られ、ＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入されうる。これに関連し、「作動可能に連結される」という用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図された機能を果たすようにベクターにライゲートされることを意味するように意図されている。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いられる発現宿主細胞と適合可能であるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入されうるかまたは、より典型的には両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準の方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上での相補的制限部位のライゲーションまたは制限部位が全く存在しない場合での平滑末端ライゲーション）により発現ベクターに挿入される。本明細書中に記載の抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用い、それらを、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結されかつＶＫセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製可能である。さらにまたはその他として、組換え発現ベクターは、抗体鎖の宿主細胞からの分泌を促進するシグナルペプチドをコードしうる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームに連結されるようにベクターにクローン化されうる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種のシグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でありうる。
【０２３９】
抗体鎖遺伝子に加え、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞内で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。「調節配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御因子（例えばポリアデニル化シグナル）を含むように意図されている。かかる調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ（「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）（１９９０年））に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が形質転換対象の宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの要素に依存しうることが当業者により理解されるであろう。哺乳類宿主細胞の発現における好ましい調節配列は、哺乳類細胞内で高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス因子、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えばアデノウイルスメジャー後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。あるいは、非ウイルス調節配列、例えばユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターが用いられうる。さらに、異なる供給源由来の配列からなる調節因子、例えばＳＲαプロモーター系は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１のＳＶ４０初期プロモーターおよび長い末端リピートに由来する配列を有するものである（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ら（１９８８年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２頁）。
【０２４０】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加え、本開示の組換え発現ベクターは、追加配列、例えば宿主細胞内でのベクターの複製（例えば複製の起点）を調節する配列および選択可能マーカー遺伝子を保有しうる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号明細書、米国特許第４，６３４，６６５号明細書および米国特許第５，１７９，０１７号明細書（いずれもＡｘｅｌらによる）を参照）。例えば典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上で薬物、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートに耐性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、（メトトレキセートの選択／増幅の場合にｄｈｆｒ−宿主細胞内で用いられる）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子および（Ｇ４１８の選択用の）ネオ遺伝子を含む。
【０２４１】
軽鎖および重鎖の発現においては、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準技術により宿主細胞に形質移入される。「形質移入」という用語の様々な形態は、外因性ＤＮＡの原核または真核宿主細胞への導入のための一般に用いられる多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、カルシウム−リン酸塩の沈降、ＤＥＡＥ−デキストランによる形質移入などを包含するように意図されている。原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて本開示の抗体を発現することは理論的に可能であるが、真核細胞内および最も好ましくは哺乳類宿主細胞内での抗体の発現が、かかる真核細胞および特に哺乳類細胞が適切に折り畳まれ免疫学的に活性な抗体を構築し分泌する可能性が原核細胞よりも高いことから最も好ましい。原核生物での抗体遺伝子の発現は、高収量の活性抗体の産生にとって無効であることが報告されている（Ｂｏｓｓ，Ｍ．Ａ．およびＷｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．（１９８５年）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３頁）。
【０２４２】
本開示の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばＲ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２年）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１頁に記載のように、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに用いられる、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：４２１６−４２２０頁に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞の場合の使用においては、別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号パンフレット、国際公開第８９／０１０３６号パンフレットおよび欧州特許第３３８，８４１号明細書に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞内での抗体の発現またはより好ましくは抗体の宿主細胞が成長される培地への分泌を実現するのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準のタンパク質精製方法を用いて培地から回収されうる。
【０２４３】
抗体の抗原への結合の特徴づけ
本開示の抗体のＣＤ７０への結合については、例えばフローサイトメトリーにより試験可能である。つまり、ＣＤ７０発現細胞は組織培養フラスコおよび調製された単一の細胞懸濁液から新たに採取される。ＣＤ７０を発現する細胞懸濁液は、直接にまたはＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒドでの固定後に一次抗体で染色される。約１００万個の細胞は、０．５％ＢＳＡおよび５０〜２００μｇ／ｍｌの一次抗体を含有するＰＢＳ中に再懸濁され、氷上で３０分間インキュベートされる。細胞は０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３を含有するＰＢＳで２回洗浄され、１：１００に希釈されＦＩＴＣと複合されたヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）１００μｌ中に再懸濁され、氷上でさらに３０分間インキュベートされる。細胞は２回再洗浄され、洗浄用緩衝液０．５ｍｌ中に再懸濁され、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）上で蛍光染色について分析される。
【０２４４】
あるいは、本開示の抗体のＣＤ７０への結合については標準ＥＬＩＳＡにより試験可能である。つまり、マイクロタイタープレートは、ＰＢＳ中０．２５μｇ／ｍｌでの精製ＣＤ７０でコートされ、次いでＰＢＳ中の５％ウシ血清アルブミンでブロッキングされる。抗体の希釈物（例えばＣＤ７０免疫マウス由来の血漿の希釈物）は各ウェルに添加され、３７℃で１〜２時間インキュベートされる。プレートは、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄され、次いでアルカリホスファターゼに複合された二次試薬（例えばヒト抗体においてはヤギ−抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃに特異的なポリクローナル試薬）とともに３７℃で１時間インキュベートされる。洗浄後、プレートをｐＮＰＰ基質（１ｍｇ／ｍｌ）で発色させ、ＯＤ４０５〜６５０で分析される。好ましくは、融合においては最高の力価を示したマウスが用いられることになる。
【０２４５】
上記のＥＬＩＳＡアッセイを用い、ＣＤ７０免疫原との陽性反応性を示すハイブリドーマについてのスクリーニングも可能である。ＣＤ７０に高い結合活性で結合するハイブリドーマはサブクローン化され、さらに特徴づけられる。−１４０℃で保存された５〜１０バイアルの細胞バンクの作製および抗体精製のため、（ＥＬＩＳＡにより）親細胞の反応性を保持する各ハイブリドーマから１つのクローンが選択されうる。
【０２４６】
抗ＣＤ７０抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマを２リットルのスピナーフラスコ内で成長させ、モノクローナル抗体の精製を行ってもよい。上清を、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））を用いる親和性クロマトグラフィー前に濾過し、濃縮してもよい。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーにより検査し、純度を保証してもよい。緩衝溶液をＰＢＳに交換し、濃度を、１．４３消衰係数を用いるＯＤ２８０によって決定してもよい。モノクローナル抗体を一定量に分割し、−８０℃で保存してもよい。
【０２４７】
選択された抗ＣＤ７０モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するか否かを判定するため、各抗体が市販の試薬（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ））を用いてビオチン化されうる。未標識のモノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を用いる競合試験が、上記のようなＣＤ７０でコートされるＥＬＩＳＡプレートを用いて実施可能である。ビオチン化ｍＡｂの結合がストレプトアビジン−アルカリホスファターゼプローブで検出可能である。あるいは、下記の実施例でさらに記載されるように、競合試験は放射性標識抗体を用いて実施可能であり、非標識競合抗体はスキャッチャード分析で検出可能である。
【０２４８】
精製抗体アイソタイプを判定するため、アイソタイプＥＬＩＳＡを特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を用いて行ってもよい。例えば、ヒトモノクローナル抗体アイソタイプを判定するため、マイクロタイタープレートのウェルを１μｇ／ｍｌの抗ヒト免疫グロブリンで４℃で一晩コートしてもよい。１％  ＢＳＡでブロック後、プレートを１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプ対照と周囲温度で１〜２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭのいずれかに特異的なアルカリホスファターゼと複合されたプローブと反応させてもよい。プレートを発色させ、上記のように分析する。
【０２４９】
抗ＣＤ７０ヒトＩｇＧでは、ウエスタンブロッティングにより、ＣＤ７０抗原との反応性についてさらに試験してもよい。つまり、ＣＤ７０に対し、調製し、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ってもよい。電気泳動後、分離された抗原はニトロセルロース膜に移され、１０％ウシ胎仔血清でブロックされ、試験対象のモノクローナル抗体でプローブされる。ヒトＩｇＧの結合性を、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを用いて検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．））を用いて発色させてもよい。
【０２５０】
本開示の抗体の結合特異性はまた、例えばフローサイトメトリーにより抗体のＣＤ７０タンパク質を発現する細胞への結合を監視することにより測定可能である。ＣＤ７０タンパク質を天然に発現する細胞または細胞系、例えば７８６−Ｏ、Ａ４９８、ＡＣＨＮ、Ｃａｋｉ−１、および／またはＣａｋｉ−２細胞（実施例４および５でさらに記載）の使用が可能であるか、あるいは、ＣＤ７０が細胞の表面上に発現されるように、細胞系、例えばＣＨＯ細胞系に対するＣＤ７０をコードする発現ベクターの形質移入が可能である。タグに対する抗体を用いて検出するため、形質移入されたタンパク質は、タグ、例えばｍｙｃタグまたはｈｉｓタグを好ましくはＮ末端に含みうる。本開示の抗体のＣＤ７０タンパク質への結合については、形質移入細胞を抗体とともにインキュベートし、結合された抗体を検出することにより測定可能である。形質移入されたタンパク質上のタグへの抗体の結合は、陽性対照として用いられうる。
【０２５１】
二重特異性分子
別の態様では、本開示は、本開示の抗ＣＤ７０抗体またはその断片を含む二重特異性分子を特徴とする。本開示の抗体またはその抗原結合部分が別の機能分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば別の抗体または受容体のリガンド）に誘導体化または連結され、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子が生成されうる。本開示の抗体が実際に２つ以上の他の機能分子に誘導体化または連結され、３つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子が生成される可能性があり、かかる多重特異性分子は本明細書で用いられる「二重特異性分子」という用語に包含されるようにも意図されている。本開示の二重特異性分子を作製するため、本開示の抗体は、二重特異性分子が生成されるように、１つ以上の他の結合分子、例えば別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣体（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｉｍｅｔｉｃ）に（例えば化学結合、遺伝子融合、非共有結合またはその他により）機能的に連結されうる。
【０２５２】
したがって、本開示は、ＣＤ７０に対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。本開示の特定の実施形態では、第２の標的エピトープはＦｃ受容体、例えばヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）またはヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）である。したがって、本開示は、ＦｃγＲまたはＦｃαＲを発現するエフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージまたは多形核球細胞（ＰＭＮ））とＣＤ７０を発現する標的細胞の双方に結合可能な二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子は、エフェクター細胞に対するＣＤ７０発現細胞を標的にし、かつ、Ｆｃ受容体媒介性のエフェクター細胞活性、例えばＣＤ７０発現細胞の食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出あるいはスーパーオキシドアニオンの生成を引き起こす。
【０２５３】
二重特異性分子が多重特異性である場合の本開示の実施形態では、同分子は、抗Ｆｃ結合特異性および抗ＣＤ７０結合特異性に加え、第３の結合特異性をさらに含みうる。一実施形態では、第３の結合特異性は、抗促進因子（ａｎｔｉ−ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）（ＥＦ）部分、例えば細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、それにより標的細胞に対する免疫応答を高める分子である。「抗促進因子部分」は、所与の分子、例えば抗原または受容体に結合し、それによりＦｃ受容体または標的細胞抗原における結合決定因子の効果の促進をもたらす抗体、機能抗体断片またはリガンドでありうる。「抗促進因子部分」はＦｃ受容体または標的細胞抗原に結合しうる。あるいは、抗促進因子部分は、第１および第２の結合特異性の結合対象である実体とは異なる実体に結合しうる。例えば、抗促進因子部分は、（例えば標的細胞に対する免疫応答の増大をもたらすＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１または他の免疫細胞を介して）細胞毒性Ｔ細胞に結合しうる。
【０２５４】
一実施形態では、本開示の二重特異性分子は、結合特異性として、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、または一本鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体またはその抗体断片を含む。Ｌａｄｎｅｒらに交付された米国特許第４，９４６，７７８号明細書（その全体は参照により明示的に援用される）に記載のように、抗体は、Ｆｖまたは一本鎖コンストラクトなどの軽鎖または重鎖二量体またはその任意の最小断片でもありうる。
【０２５５】
一実施形態では、Ｆｃγ受容体に対する結合特異性はモノクローナル抗体により提供され、その結合はヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）により遮断されることはない。本明細書で用いられる「ＩｇＧ受容体」という用語は、染色体１上に位置する８つのγ鎖遺伝子のいずれかを示す。これらの遺伝子は、３つのＦｃγ受容体クラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）にグループ化された全部で１２の膜貫通または可溶性受容体アイソフォームをコードする。好ましい一実施形態では、Ｆｃγ受容体はヒト高親和性ＦｃγＲＩである。ヒトＦｃγＲＩは７２ｋＤａの分子であり、単量体ＩｇＧに対して高い親和性を示す（１０８〜１０９Ｍ−１）。
【０２５６】
特定の好ましい抗Ｆｃγモノクローナル抗体の産生および特徴づけについては、Ｆａｎｇｅｒらによって、ＰＣＴ公開、国際公開第８８／０００５２号パンフレットおよび米国特許第４，９５４，６１７号明細書において記載されており、それらの教示内容は参照により本明細書中に十分に援用される。これらの抗体は受容体のＦｃγ結合部位から離れた部位でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩのエピトープに結合することから、それらの結合がＩｇＧの生理的レベルにより実質的に遮断されることはない。本開示で有用な特異的な抗ＦｃγＲＩ抗体は、ｍＡｂ２２、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ４４、ｍＡｂ６２およびｍＡｂ１９７である。ｍＡｂ３２を産生するハイブリドーマは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ９４６９から入手可能である。他の実施形態では、抗Ｆｃγ受容体抗体はモノクローナル抗体２２のヒト化形態である（Ｈ２２）。Ｈ２２抗体の産生および特徴づけについては、Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．Ｆ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１５５（１０）：４９９６−５００２頁およびＰＣＴ公開、国際公開第９４／１０３３２号パンフレットに記載されている。Ｈ２２抗体産生細胞系は、ＨＡ０２２ＣＬ１の指定の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されたものであり、登録番号ＣＲＬ１１１７７を有する。
【０２５７】
さらに他の好ましい実施形態では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性はヒトＩｇＡ受容体、例えばＦｃ−α受容体（ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９））に結合する抗体により提供され、その結合は好ましくはヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）により遮断されることはない。「ＩｇＡ受容体」という用語は、染色体１９上に位置する１つのα遺伝子の遺伝子産物（ＦｃαＲＩ）を含むように意図されている。この遺伝子は、５５〜１１０ｋＤａの数種の交互にスプライスされた膜貫通アイソフォームをコードすることが知られている。ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は、単球／マクロファージ、好酸性および好中性顆粒球上に構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団上に発現されることはない。ＦｃαＲＩは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２の双方に対して中程度の親和性（約５×１０７Ｍ−１）を有し、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインへの暴露時に増加する（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｃ．ら（１９９６年）、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６：４２３−４４０頁）。Ａ３、Ａ５９、Ａ６２およびＡ７７として同定された４つのＦｃαＲＩに特異的なモノクローナル抗体は、ＩｇＡリガンド結合ドメイン外部のＦｃαＲＩに結合するものであり、記載がなされている（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｒ．Ｃ．ら（１９９２年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１７６４頁）。
【０２５８】
ＦｃαＲＩおよびＦｃγＲＩは、（１）主に免疫エフェクター細胞、例えば単球、ＰＭＮ、マクロファージおよび樹状細胞の上で発現され、（２）高レベルで発現され（例えば１細胞当たり５，０００−１００，０００）、（３）細胞毒性活性のメディエーター（例えばＡＤＣＣ、食作用）であり、かつ（４）それらに対して標的とされる、自己抗原を含む抗原の抗原提示の促進を媒介することから、本開示の二重特異性分子において用いられる要因となる好ましい誘発受容体である。
【０２５９】
ヒトモノクローナル抗体が好ましい一方、本開示の二重特異性分子において用いられうる他の抗体がマウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
【０２６０】
本開示の二重特異性分子は、構成要素の結合特異性、例えば抗ＦｃＲおよび抗ＣＤ７０結合特異性を当該技術分野で既知の方法を用いて複合することにより調製されうる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は、別々にもたらされ、次いで互いに複合されうる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、種々のカップリング剤または架橋剤が共有結合に用いられうる。架橋剤の例として、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら（１９８４年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６頁；Ｌｉｕ  Ｍ．Ａ．ら（１９８５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８６４８頁を参照）。他の方法として、Ｐａｕｌｕｓ（１９８５年）Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８：１１８−１３２頁；Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３頁およびＧｌｅｎｎｉｅら（１９８７年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５頁に記載の方法が挙げられる。好ましい複合剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれもＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手可能である。
【０２６１】
結合特異性が抗体である場合、それらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して複合されうる。特に好ましい実施形態では、ヒンジ領域は、複合に先立ち、奇数、好ましくは１つのスルフヒドリル残基を有するように修飾される。
【０２６２】
あるいは、両方の結合特異性は同じベクター内にコードされ、かつ同じ宿主細胞内で発現され、構築されうる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本開示の二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合決定因子を含む一本鎖分子、または２つの結合決定因子を含む一本鎖二重特異性分子でありうる。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含みうる。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば米国特許第５，２６０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；および米国特許第５，４８２，８５８号明細書に記載されており、これら全部は参照により本明細書中に明示的に援用される。
【０２６３】
二重特異性分子のその特異的な標的に対する結合は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば成長阻害）またはウエスタンブロットアッセイによって確認されうる。これらの各アッセイでは、一般に、特別な目的のタンパク質−抗体複合体の存在が目的の複合体に対して特異的な標識試薬（例えば抗体）の使用により検出される。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば、抗体−ＦｃＲ複合体を認識しかつそれに対して特異的に結合する酵素結合抗体または抗体断片を用いて検出されうる。あるいは、複合体は種々の他のイムノアッセイのいずれかを用いて検出されうる。例えば、抗体は放射活性物質で標識され、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で用いられうる（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  Ｂ．、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９８６年３月（参照により本明細書中に援用される）を参照）。放射性同位体は、ガンマカウンタまたはシンチレーションカウンタの使用などの手段あるいはオートラジオグラフィーにより検出されうる。
【０２６４】
リンカー
本発明は、抗体が化学リンカーを介してパートナーに連結された抗体−パートナー複合体を提供する。一部の実施形態では、リンカーはペプチジルリンカーであり、本明細書中で（Ｌ４）ｐ−Ｆ−（Ｌ１）ｍとして表される。他のリンカーは、ヒドラジンおよびジスルフィドリンカーを含み、それぞれ本明細書中で（Ｌ４）ｐ−Ｈ−（Ｌ１）ｍまたは（Ｌ４）ｐ−Ｊ−（Ｌ１）ｍとして表される。本発明は、パートナーに結合されているようなリンカーに加え、本質的に任意の分子種への結合に適する切断可能なリンカーアームも提供する。本発明のリンカーアームの態様は、本明細書中でその治療部分への結合を参照することにより例示される。しかし、リンカーが限定はされないが診断剤、分析剤、生体分子、標的化剤、検出可能な標識などを含む多様な種に結合可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。
【０２６５】
抗体−パートナー複合体におけるペプチジルおよび他のリンカーの使用については、米国仮特許出願第６０／２９５，１９６号明細書；米国仮特許出願第６０／２９５，２５９号明細書；米国仮特許出願第６０／２９５３４２号明細書；米国仮特許出願第６０／３０４，９０８号明細書；米国仮特許出願第６０／５７２，６６７号明細書；米国仮特許出願第６０／６６１，１７４号明細書；米国仮特許出願第６０／６６９，８７１号明細書；米国仮特許出願第６０／７２０，４９９号明細書；米国仮特許出願第６０／７３０，８０４号明細書；および米国仮特許出願第６０／７３５，６５７号明細書および米国特許出願第１０／１６０，９７２号明細書；米国特許出願第１０／１６１，２３４号明細書；米国特許出願第１１／１３４，６８５号明細書；米国特許出願第１１／１３４，８２６号明細書、米国特許出願第１１／３９８，８５４号明細書および米国特許第６，９８９，４５２号明細書、ならびにＰＣＴ特許出願のＰＣＴ／ＵＳ２００６／３７７９３号明細書において記載され、これら全部は参照により本明細書中に援用される。
【０２６６】
さらなるリンカーが、米国特許第６，２１４，３４５号明細書（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、米国特許出願公開第２００３／００９６７４３号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１３０１８９号明細書（いずれもＳｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓに付与）、ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２、５２７７頁（１９９９年）；ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３、３０９３頁（２０００年）；ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６６、８８１５頁、（２００１年）；国際公開第０２／０８３１８０号パンフレット（Ｓｙｎｔａｒｇａ）；Ｃａｒｌら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２４、４７９頁、（１９８１年）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、Ｂｉｏｏｒｇ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８、３３４７頁（１９９８年）；および米国仮特許出願第６０／８９１，０２８号明細書（２００７年２月２１日出願）において記載されている。
【０２６７】
一態様では、本発明は、治療剤およびマーカーに対する標的化基への結合に有用なリンカーに関する。別の態様では、本発明は、化合物に安定性をもたらすか、そのインビボでの毒性を低減するか、またはそれ以外ではその薬動力学、バイオアベイラビリティおよび／または薬力学に好ましい作用をもたらすといったリンカーを提供する。かかる実施形態では、一旦薬剤がその作用部位に送達されると、リンカーが切断され活性薬剤が放出されることが一般に好ましい。したがって、本発明の一実施形態では、本発明のリンカーは、一旦治療剤またはマーカーから除去されると（活性化される間など）リンカーの存在の痕跡が全く残らないようにトレースレスである。
【０２６８】
本発明の別の実施形態では、リンカーは、治療作用またはマーカー活性の部位など、標的細胞内またはその近傍の部位でのその切断される能力により特徴づけられる。かかる切断は事実上酵素的でありうる。この特徴は、治療剤またはマーカーの全身活性化の低減や、毒性および全身性副作用の低減に役立つ。酵素的切断にとって好ましい切断可能な基は、ペプチド結合、エステル結合、およびジスルフィド結合を含む。他の実施形態では、リンカーはｐＨに感受性があり、ｐＨの変化を通じて切断される。
【０２６９】
本発明の重要な態様は、リンカーの切断速度を制御する能力である。速やかに切断されるリンカーが望ましい場合が多い。しかし、一部の実施形態では、より緩やかに切断されるリンカーが好ましい場合がある。例えば、徐放製剤または速やかな放出成分と緩やかな放出成分の双方を有する製剤では、より緩やかに切断されるリンカーを提供することが有用でありうる。国際公開第０２／０９６９１０号パンフレットは、ヒドラジンリンカーを有する数種の特異的リガンド−薬剤複合体を提供する。しかし、リンカー組成物を要求される環化速度に応じて「調節する（ｔｕｎｅ）」見込みはなく、リガンドを記載の特定の化合物よりも緩やかな速度で薬剤から切断することが多数の薬剤−リンカー複合体にとって好ましい。それに対し、本発明のヒドラジンリンカーが環化速度の非常に高速から非常に低速までの範囲を備えることにより、所望の環化速度に基づく特定のヒドラジンリンカーの選択が可能になる。
【０２７０】
例えば、切断時に単一の５員環を生成するヒドラジンリンカーの場合、非常に高速な環化が得られうる。細胞毒性物質の細胞への標的化送達にとって好ましい環化速度は、切断時にジェミナル（ｇｅｍｉｎａｌ）位置に２つのメチル基を有するリンカーから得られる２つの５員環または単一の６員環のいずれかを生成するヒドラジンリンカーを用いて得られる。ｇｅｍ−ジメチル効果により、ジェミナル位置に２つのメチル基を有しない単一の６員環の場合と比べて環化反応の速度が加速されることが示されている。これは同環内に解放されている株から得られる。しかし時として、置換基は反応速度を高めるのではなく低下させうる。遅延の理由が立体障害に帰着されうることが多い。例えば、ｇｅｍジメチル置換により、ジェミナル炭素がＣＨ２である場合よりも極めて迅速な環化反応が生じうる。
【０２７１】
しかし、一部の実施形態ではより緩やかに切断されるリンカーが好ましい場合があることに着目することが重要である。例えば、徐放製剤または速やかな放出および緩やかな放出成分の双方を有する製剤では、より緩やかに切断されるリンカーを提供することが有用でありうる。特定の実施形態では、低速の環化が、切断時にｇｅｍ−ジメチル置換基を有しない単一の６員環、または単一の７員環を生成するヒドラジンリンカーを用いてなされる。
【０２７２】
リンカーはまた、治療剤またはマーカーを循環中での分解に対して安定化させるのに役立つ。この特徴は、かかる安定化の結果、結合された治療剤またはマーカーの循環半減期が延長されることから有意な効果をもたらす。リンカーはまた、結合された治療剤またはマーカーの活性を複合体が循環中に比較的良性であるように弱めるのに役立ち、かつ、所望の作用部位での活性化後に望ましい効果を有し、例えば毒性を示す。治療剤複合体においては、リンカーのこの特徴は同剤の治療指数を改善するのに役立つ。
【０２７３】
安定化基は、好ましくは、治療剤またはマーカーのクリアランスおよび代謝を血液中または非標的組織内に存在しうる酵素により制限するように選択され、さらに同剤またはマーカーの細胞への輸送を制限するように選択される。安定化基は、同剤またはマーカーの分解を遮断するのに役立ち、また同剤またはマーカーの他の物理的特性をもたらすように作用しうる。安定化基はまた、同剤またはマーカーの安定性を製剤または非製剤形態のいずれかで保存される間に改善しうる。
【０２７４】
望ましくは、安定化基は、治療剤またはマーカーのヒト血液中、３７℃で２時間の保存により試験される場合に同剤またはマーカーを分解から保護するのに役立ち、かつ所与のアッセイ条件下でヒト血液中に存在する酵素により、２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満およびさらにより好ましくは２％未満の同剤またはマーカーの切断をもたらす場合、治療剤またはマーカーの安定化に有用である。
【０２７５】
本発明は、これらのリンカーを有する複合体にも関する。より詳細には、本発明は疾患の治療、特に癌化学療法に用いられうるプロドラッグの使用に関する。詳細には、本明細書中に記載のリンカーの使用により、類似構造のプロドラッグと比べて、活性の高い特異性、低下した毒性、および血中での改善された安定性を示すプロドラッグが提供される。
【０２７６】
本明細書中に記載の本発明のリンカーは、パートナー分子内部の種々の位置に存在しうる。
【０２７７】
したがって、インビボ、例えば血流中で、かかる基が欠如した構築物の速度よりも高い速度で切断されることになる、種々の基のいずれかをその鎖の一部として有しうるリンカーが提供される。リンカーアームと治療剤および診断剤との複合体も提供される。リンカーは、治療剤のプロドラッグ類似体を形成しかつ治療剤または診断剤を標的化剤、検出可能な標識、または固体支持体に可逆的に連結するのに有用である。リンカーは、細胞毒素を含む複合体に組み込まれうる。
【０２７８】
抗体へのプロドラッグの結合から、従来の細胞毒性薬剤の抗体複合体よりもさらに優れた安全性の利点が得られうる。腫瘍細胞内および血漿を含むいくつかの正常組織内の双方で、プロドラッグの活性化がエステラーゼにより得られうる。ヒトにおける関連のエステラーゼ活性のレベルは、ラットおよび非ヒト霊長類で観察されるレベルに酷似するがマウスで観察されるレベルより低いことが示されている。プロドラッグの活性化はまた、グルクロニダーゼによる切断により得られうる。
【０２７９】
切断可能なペプチド、ヒドラジン、またはジスルフィド基に加え、１つ以上の自己犠牲リンカー（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ  ｌｉｎｋｅｒ）基Ｌ１が場合により細胞毒素と標的化剤の間に導入される。これらのリンカー基はまた、スペーサー基として記述され、少なくとも２つの反応官能基を有しうる。典型的には、スペーサー基の一方の化学官能基が治療剤の化学官能基、例えば細胞毒素に結合する間、スペーサー基の他方の化学官能基は標的化剤または切断可能なリンカーの化学官能基に結合するように用いられる。スペーサー基の化学官能基の例として、ヒドロキシ基、メルカプト基、カルボニル基、カルボキシ基、アミノ基、ケトン基、およびメルカプト基が挙げられる。
【０２８０】
Ｌ１で表される自己犠牲リンカーは、一般に置換もしくは未置換アルキル基、置換もしくは未置換アリール基、置換もしくは未置換ヘテロアリール基または置換もしくは未置換ヘテロアルキル基である。一実施形態では、アルキルまたはアリール基は１〜２０個の炭素原子を含みうる。それらはまた、ポリエチレングリコール部分を含みうる。
【０２８１】
典型的なスペーサー基として、例えば、６−アミノヘキサノール、６−メルカプトヘキサノール、１０−ヒドロキシデカン酸、グリシンおよび他のアミノ酸、１，６−ヘキサンジオール、β−アラニン、２−アミノエタノール、システアミン（２−アミノエタンチオール）、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、３−マレイミド安息香酸、フタリド、α−置換フタリド、カルボニル基、アミナールエステル、核酸、ペプチドなどが挙げられる。
【０２８２】
スペーサーは、さらなる分子量および化学官能基を細胞毒素−標的化剤複合体に導入するのに役立ちうる。一般に、さらなる分子量および官能基は複合体の血清半減期および他の特性に作用することになる。したがって、スペーサー基の注意深い選択を通じ、ある範囲の血清半減期を有する細胞毒素複合体が生成されうる。
【０２８３】
薬剤部分の直近に位置するスペーサーは、（Ｌ１）ｍ（式中、ｍは０、１、２、３、４、５、および６から選択される整数である）としても示される。複数のＬ１スペーサーが存在する場合、同一のまたは異なるスペーサーのいずれかが用いられうる。Ｌ１は任意の自己犠牲的な基でありうる。
【０２８４】
Ｌ４は好ましくは複合体に同部分を有するリンカーを用いて溶解度の増大または凝集特性の低下をもたらすかまたは複合体の加水分解速度を変化させるリンカー部分である。Ｌ４リンカーは自己犠牲的である必要がない。一実施形態では、Ｌ４部分は、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアルキル、または未置換ヘテロアルキルであり、これらのいずれかが直鎖状、分岐鎖状、または環状でありうる。置換基は、例えば、低級（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノでありうる。特定の実施形態では、Ｌ４は非環状部分を含む。別の実施形態では、Ｌ４は任意の正または負に帯電したアミノ酸重合体、例えばポリリジンまたはポリアルギニンを含む。Ｌ４はポリエチレングリコール部分などの重合体を含みうる。さらに、Ｌ４リンカーは、例えば重合体成分と小さい化学的成分の双方を含みうる。
【０２８５】
好ましい実施形態では、Ｌ４はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む。Ｌ４のＰＥＧ部分は１〜５０単位の長さでありうる。好ましくは、ＰＥＧは１〜１２の繰り返し単位、より好ましくは３〜１２の繰り返し単位、より好ましくは２〜６の繰り返し単位、またはさらにより好ましくは３〜５の繰り返し単位および最も好ましくは４の繰り返し単位を有することになる。Ｌ４は、単にＰＥＧ部分からなりうるか、あるいはさらなる置換もしくは未置換のアルキルまたはヘテロアルキルも有しうる。ＰＥＧとＬ４部分の一部として結合し、複合体の水溶性を高めることは有用である。さらに、ＰＥＧ部分は薬剤と抗体との複合の間に生じうる凝集の程度を低下させる。
【０２８６】
一部の実施形態では、Ｌ４は、（ＡＡ１）ｃのＮ末端に直接結合される、
2010513306.tif 000003
を含む。Ｒ２０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６、およびＲ２６’の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択され、かつｓおよびｔは独立して１〜６の整数である。好ましくは、Ｒ２０、Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６およびＲ２６’は疎水性である。一部の実施形態では、Ｒ２０はＨまたはアルキル（好ましくは未置換低級アルキル）である。一部の実施形態では、Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６およびＲ２６’は、独立してＨまたはアルキル（好ましくは未置換Ｃ１〜Ｃ４アルキル）である。一部の実施形態では、Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６およびＲ２６’はすべてがＨである。一部の実施形態では、ｔは１でありかつｓは１または２である。
【０２８７】
ペプチドリンカー（Ｆ）
上で考察のように、本発明のペプチジルリンカーは、一般式：（Ｌ４）ｐ−Ｆ−（Ｌ１）ｍ（式中、Ｆはペプチジル部分を含むリンカー部分を表す）により表されうる。一実施形態では、Ｆ部分は任意の追加の自己犠牲リンカーＬ２およびカルボニル基を含む。別の実施形態では、Ｆ部分はアミノ基および任意のスペーサー基Ｌ３を含む。
【０２８８】
したがって、一実施形態では、ペプチジルリンカーを含む複合体は、下記式（ａ）
2010513306.tif 000004
の構造を含む。
【０２８９】
この実施形態では、Ｌ１は上記のような自己犠牲リンカーであり、かつ、Ｌ４は上記のように好ましくは溶解度の増大または凝集特性の低下をもたらすかあるいは加水分解速度を変化させる部分である。Ｌ２は自己犠牲リンカーを表す。さらに、ｍは０、１、２、３、４、５、もしくは６であり、かつｏおよびｐは独立して０もしくは１である。ＡＡ１は１種以上の天然アミノ酸および／または非天然α−アミノ酸を表し、ｃは１〜２０の整数である。一部の実施形態では、ｃは２〜５の範囲内であるかまたは２もしくは３である。
【０２９０】
上記式（ａ）の本発明のペプチドリンカーにおいては、ＡＡ１は、そのアミノ末端で、Ｌ４に直接連結されるか、またはＬ４が不在の場合にはＸ４基（すなわち、標的化剤、検出可能な標識、保護反応官能基または非保護反応官能基）に直接連結される。一部の実施形態では、Ｌ４が存在する場合、Ｌ４は（ＡＡ１）ｃのＮ末端に直接結合されたカルボン酸アシル基を含まない。したがって、これらの実施形態では、米国特許第６，２１４，３４５号明細書に記載のペプチドリンカーにおいて必要であるように、Ｌ４またはＸ４のいずれかとＡＡ１の間に直接カルボン酸アシル単位が必ずしも存在する必要がない。
【０２９１】
別の実施形態では、ペプチジルリンカーを含む複合体は、式（ｂ）：
2010513306.tif 000005
の構造を含む。
【０２９２】
この実施形態では、Ｌ４は上記のように、好ましくは溶解度の増大または凝集特性の低下をもたらすかあるいは加水分解速度を変化させる部分であり、Ｌ３は第一級もしくは第二級アミンまたはカルボキシル官能基を含むスペーサー基であり、かつＬ３のアミンがＤの懸垂カルボキシル官能基とアミド結合を形成するか、またはＬ３のカルボキシル基がＤの懸垂アミン官能基とアミド結合を形成し、かつｏおよびｐは独立して０または１である。ＡＡ１は１種以上の天然アミノ酸および／または非天然α−アミノ酸を表し、ｃは１〜２０の整数である。この実施形態では、Ｌ１は存在しない（すなわち一般式中でｍは０である）。
【０２９３】
上記式（ｂ）の本発明のペプチドリンカーにおいては、ＡＡ１は、そのアミノ末端で、Ｌ４に直接連結されるか、またはＬ４が不在の場合にはＸ４基（すなわち、標的化剤、検出可能な標識、保護反応官能基または非保護反応官能基）に直接連結される。一部の実施形態では、Ｌ４が存在する場合、Ｌ４は（ＡＡ１）ｃのＮ末端に直接結合されたカルボン酸アシル基を含まない。したがって、これらの実施形態では、米国特許第６，２１４，３４５号明細書に記載のペプチドリンカーにおいて必要であるように、Ｌ４またはＸ４のいずれかとＡＡ１の間に直接カルボン酸アシル単位が必ずしも存在する必要がない。
【０２９４】
自己犠牲リンカーＬ２
自己犠牲リンカーＬ２は、２つの距離が離れた化学的部分を共に通常は安定なトリパーテート（ｔｒｉｐａｒｔａｔｅ）分子に共有結合可能な二機能の化学的部分であり、それにより酵素切断を用いてトリパーテート分子から前記距離が離れた化学的部分のうちの一方が放たれ、前記酵素切断後、分子の残りから自発的切断が生じ、前記距離が離れた化学的部分の他方が放たれる。本発明によると、自己犠牲スペーサーは、その一方の末端でペプチド部分に共有結合されかつその他方の末端で薬剤部分（その誘導化が薬理学的活性を阻害する）の化学反応性がある部位に共有結合されることで、距離が離れ、ペプチド部分および薬剤部分を共に標的酵素の不在下で安定でかつ薬理学的に不活性であるトリパーテート分子に共有結合させるが、それはスペーサー部分およびペプチド部分に共有結合することによりトリパーテート分子からのペプチド部分の放出に作用する結合でかかる標的酵素により酵素的に切断可能である。次いで、かかる酵素切断は、スペーサー部分の自己犠牲的特徴を活性化し、スペーサー部分を薬剤部分に共有結合させることにより薬理活性形態での薬剤の放出に作用する結合の自発切断を開始させることになる。
【０２９５】
自己犠牲リンカーＬ２は任意の自己犠牲的な基でありうる。好ましくは、Ｌ２は、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換および未置換アリール、ならびに置換および未置換ヘテロアリールである。  
【０２９６】
１つの特に好ましい自己犠牲スペーサーＬ２は、式（ｃ）：
2010513306.tif 000006
で表されうる。
【０２９７】
アミノベンジル基の芳香環は１つ以上の「Ｋ」基で置換されうる。「Ｋ」基は、通常では環構造の一部である４つの非置換炭素のうちの１つに結合される水素を置き換える芳香環上の置換基である。「Ｋ」基は単一の原子、例えばハロゲンでありうるか、または多重原子群、例えばアルキル、ヘテロアルキル、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、およびシアノでありうる。各Ｋは、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ２１Ｒ２２、ＮＲ２１ＣＯＲ２２、ＯＣＯＮＲ２１Ｒ２２、ＯＣＯＲ２１、およびＯＲ２１（式中、Ｒ２１およびＲ２２は独立してＨ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキルおよび未置換ヘテロシクロアルキルからなる群より選択される）からなる群より独立して選択される。典型的なＫ置換基は、限定はされないが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３およびメチルを含む。「Ｋｉ」においては、ｉは０、１、２、３、もしくは４の整数である。好ましい一実施形態では、ｉは０である。
【０２９８】
上記の構造のエーテル酸素原子はカルボニル基に結合される。ＮＲ２４官能基から芳香環への系統は、アミンの官能基が５個の炭素（いずれも環を形成し、−ＣＨ２−Ｏ−基で置換されない）のいずれかに結合されうることを示す。好ましくは、ＸのＮＲ２４官能基は−ＣＨ２−Ｏ−基に対するパラ配位で芳香環に共有結合される。Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群より選択されるメンバーである。特定の実施形態では、Ｒ２４は水素である。
【０２９９】
一実施形態では、本発明は、上記の式（ａ）のペプチドリンカーを提供し、ここでＦは構造：
2010513306.tif 000007
を含み、ここでＲ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群より選択される）を提供する。各Ｋは、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ２１Ｒ２２、ＮＲ２１ＣＯＲ２２、ＯＣＯＮＲ２１Ｒ２２、ＯＣＯＲ２１、およびＯＲ２１（式中、Ｒ２１およびＲ２２は独立してＨ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキルからなる群より選択される）からなる群より独立して選択されるメンバーであり、かつｉは０、１、２、３、もしくは４の整数である。
【０３００】
別の実施形態では、上記式（ａ）のペプチドリンカーは、構造：
2010513306.tif 000008
を含む−Ｆ−（Ｌ１）ｍ−を含み、ここで各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群より独立して選択されるメンバーである。
【０３０１】
一部の実施形態では、自己犠牲スペーサーＬ１またはＬ２は、
2010513306.tif 000009
を含み、ここでＲ１７、Ｒ１８、およびＲ１９の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換のヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールから独立して選択され、かつｗは０〜４の整数である。一部の実施形態では、Ｒ１７およびＲ１８は独立してＨまたはアルキル（好ましくは未置換Ｃ１〜Ｃ４アルキル）である。好ましくは、Ｒ１７およびＲ１８はＣ１〜Ｃ４アルキル、例えばメチルまたはエチルである。一部の実施形態では、ｗは０である。任意の特定の理論に拘束されたくないが、この特定の自己犠牲スペーサーが比較的速やかに環化することが実験的に見出されている。
【０３０２】
一部の実施形態では、Ｌ１またはＬ２は、
2010513306.tif 000010
を含む。
【０３０３】
スペーサー基Ｌ３
スペーサー基Ｌ３は第一級もしくは第二級アミンまたはカルボキシル官能基を含むように特徴づけられ、かつ、Ｌ３基のアミンがＤの懸垂カルボキシル官能基とアミド結合を形成するか、またはＬ３のカルボキシルがＤの懸垂アミン官能基とアミド結合を形成する。Ｌ３は、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、または置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルからなる群より選択されうる。好ましい実施形態では、Ｌ３は芳香族性基を含む。より好ましくは、Ｌ３は安息香酸基、アニリン基またはインドール基を含む。−Ｌ３−ＮＨ−スペーサーとして機能しうる構造の非限定例として、
2010513306.tif 000011
といった構造が挙げられ、ここでＺはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり、かつＲ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
【０３０４】
Ｌ３を有する本発明のリンカーの切断時、Ｌ３部分は薬剤Ｄに結合されたままである。したがって、Ｌ３部分はＤに結合されたその存在がＤの活性を有意に変化させないように選択される。別の実施形態では、薬剤Ｄ自体の一部がＬ３スペーサーとして機能する。例えば、一実施形態では、薬剤Ｄは薬剤の一部がＬ３スペーサーとして機能するデュオカルマイシン誘導体である。かかる実施形態の非限定例として、ＮＨ２−（Ｌ３）−Ｄが
2010513306.tif 000012
からなる群より選択される構造を有する場合が挙げられ、ここでＺはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり、Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり、かつ各構造上のＮＨ２基は（ＡＡ１）ｃと反応して−（ＡＡ１）ｃ−ＮＨ−を形成する。
【０３０５】
ペプチド配列ＡＡ１
ＡＡ１基は、単一のアミノ酸またはアミド結合により結合された複数のアミノ酸を表す。アミノ酸は天然アミノ酸および／または非天然α−アミノ酸でありうる。
【０３０６】
ペプチド配列（ＡＡ１）ｃは、機能的に、単一のアミノ酸（ｃ＝１の場合）またはアミド結合により互いに結合された複数のアミノ酸のアミド化残基である。本発明のペプチドは、生体系における目的の位置で酵素によるペプチドの酵素触媒化切断を誘導するように選択される。例えば、標的化剤を用いて細胞に標的化されるがその細胞により内在化されない複合体においては、例えばペプチドが細胞外で切断されるように近隣での死滅に向かう細胞の細胞内容物の放出により、細胞外マトリックス内に存在しうる１種以上のプロテアーゼにより切断されるペプチドが選択される。ペプチド内部のアミノ酸の数は１〜２０個の範囲でありうるが、より好ましくは（ＡＡ１）ｃを含む、１〜８個のアミノ酸、１〜６個のアミノ酸または１、２、３もしくは４個のアミノ酸が存在することになる。特異的酵素により切断されやすいペプチド配列または酵素のクラスは当該技術分野で周知である。
【０３０７】
血清、肝臓、腸管などにおける酵素により切断される多数のペプチド配列は、当該技術分野で既知である。本発明の典型的なペプチド配列は、プロテアーゼにより切断されるペプチド配列を含む。プロテアーゼ感受性配列の使用についてなされる考察の中心は、図示の簡素化を意図したものであり、本発明の範囲を限定することに役立つものではない。
【０３０８】
ペプチドを切断する酵素がプロテアーゼである場合、リンカーは一般にプロテアーゼに対する切断認識配列を有するペプチドを含む。プロテアーゼに対する切断認識配列は、タンパク質分解切断の間にプロテアーゼにより認識される特定のアミノ酸配列である。多数のプロテアーゼ切断部位が当該技術分野で既知であり、これらおよび他の切断部位は、リンカー部分内に含まれうる。例えば、Ｍａｔａｙｏｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：９５４頁（１９９０年）；Ｄｕｎｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４１：２５４頁（１９９４年）；Ｓｅｉｄａｈら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：１７５頁（１９９４年）；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：６１５頁（１９９４年）；Ｗｅｂｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：５９５頁（１９９４年）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：４１２頁（１９９４年）；Ｂｏｕｖｉｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４８：６１４頁（１９９５年）、Ｈａｒｄｙら、ｉｎ  Ａｍｉｌｏｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｇｉｎｇ，ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍａｓｔｅｒｓら編、１９０−１９８頁（１９９４年）を参照のこと。
【０３０９】
ペプチド配列（ＡＡ１）ｃのアミノ酸は、腫瘍関連プロテアーゼなどの特定の分子による選択的酵素切断に対するその適合性に基づいて選択される。用いられるアミノ酸は天然または非天然アミノ酸でありうる。それらはＬまたはＤ配置でありうる。一実施形態では、少なくとも３種の異なるアミノ酸が用いられる。別の実施形態では、２種のアミノ酸のみが用いられる。
【０３１０】
好ましい実施形態では、ペプチド配列（ＡＡ１）ｃはリソソームプロテアーゼにより切断されるその能力に基づいて選択され、その非限定例としてカテプシンＢ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、ＬおよびＳが挙げられる。好ましくは、ペプチド配列（ＡＡ１）ｃはインビトロでカテプシンＢにより切断可能であり、それは当該技術分野で既知のインビトロでのプロテアーゼ切断アッセイを用いて試験されうる。
【０３１１】
別の実施形態では、ペプチド配列（ＡＡ１）ｃは、腫瘍関連プロテアーゼ、例えば腫瘍細胞近傍で細胞外に見出されるプロテアーゼにより切断されるその能力に基づいて選択され、その非限定例として、チメット（ｔｈｉｍｅｔ）オリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）およびＣＤ１０が挙げられる。ペプチドのＴＯＰまたはＣＤ１０により切断される能力は、当該技術分野で既知のインビトロでのプロテアーゼ切断アッセイを用いて試験されうる。
【０３１２】
本発明の複合体での使用に適するペプチド配列の適例として、限定はされないが、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号７７）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号７８）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号７９）、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号９１）、Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ、ならびにＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌが挙げられる。好ましいペプチド配列はＶａｌ−ＣｉｔおよびＶａｌ−Ｌｙｓである。
【０３１３】
別の実施形態では、薬剤部分の直近に位置するアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｉｔ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群より選択される。さらに別の実施形態では、薬剤部分の直近に位置するアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群より選択される。
【０３１４】
プロテアーゼは癌転移に関与している。プロテアーゼウロキナーゼの合成の増大が、多数の癌内での転移能の増強と相関していた。ウロキナーゼは細胞外空間内に偏在するプラスミノゲンからプラスミンを活性化し、その活性化により転移性腫瘍細胞の浸潤を媒介する細胞外マトリックス内でタンパク質の分解が引き起こされうる。プラスミンはまたコラゲナーゼを活性化する故、毛細管およびリンパ系の周囲の基底膜内でのコラーゲンの分解を促進可能であり、それにより腫瘍細胞の標的組織への浸潤が可能になる（Ｄａｎｏら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．、４４：１３９頁（１９８５年））。したがって、ウロキナーゼにより切断されるペプチド配列のリンカーとしての使用は本発明の範囲内に含まれる。
【０３１５】
本発明は、トリプターゼによる切断に感受性があるペプチド配列の使用についても提供する。ヒトマスト細胞は、α、βＩ、βＩＩ、およびβＩＩＩと称される少なくとも４種の異なるトリプターゼを発現する。これらの酵素は血漿プロテアーゼ阻害剤により制御されることがなく、インビトロで数種の生理的基質を切断するだけである。セリンプロテアーゼのトリプターゼファミリーは、マスト細胞を含む種々のアレルギー性および炎症性疾患に関与しており、その理由はこれらの障害を有する患者由来の体液中で見出されるトリプターゼレベルの上昇にある。しかし、疾患の病態生理におけるトリプターゼの正確な役割はいまだに明らかにされていない。トリプターゼの生物学的機能および対応する生理学的結果の範囲は、それらの基質特異性により実質的に画定される。
【０３１６】
トリプターゼは、腫瘍転移および浸潤に関連したプロテアーゼのチモーゲン形態であるプロウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）の強力な活性化因子である。細胞溢出および移動において細胞外マトリックスの破壊をまねくプラスミノゲンカスケードの活性化は、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＬｙｓのＰ４〜Ｐ１配列（配列番号８０）のプロウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子のトリプターゼ活性化の機能でありうる（Ｓｔａｃｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６９（１３）：９４１６−９４１９頁（１９９４年））。血管透過性の調節に関与する神経ペプチドＶＩＰ（血管作動性腸管ペプチド）もまた主にＴｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号８１）配列でトリプターゼにより切断される（Ｔａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３：２７−３２頁（１９９０年））。Ｇタンパク質共役受容体ＰＡＲ−２をＳｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号８２）配列でトリプターゼにより切断し活性化することで、線維芽細胞の増殖が促進されうる一方、トロンビン活性化受容体ＰＡＲ−１がＰｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号８３）配列でトリプターゼにより不活性化される（Ｍｏｌｉｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７２（７）：４０４３−４０４９頁（１９９７年））。総合すれば、このエビデンスは、トリプターゼにおける疾患の結果としての組織リモデリングでの中心的役割を示唆する。これはいくつかのマスト細胞媒介性の障害において観察される重大な変化に合致する。慢性喘息および他の長期の呼吸器疾患の１つの特質は、その生理的標的のトリプターゼ活性化の結果でありうる下層組織の線維化および肥厚である。同様に、血管新生が種々の癌におけるマスト細胞密度、トリプターゼ活性および予後不良に関連することを一連の報告が示している（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３（１１）：１３８２−９７頁（１９９９年））；Ｔａｋａｎａｍｉら、Ｃａｎｃｅｒ  ８８（１２）：２６８６−９２頁（２０００年）；Ｔｏｔｈ−Ｊａｋａｔｉｃｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３１（８）：９５５−９６０頁（２０００年）；Ｒｉｂａｔｔｉら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８５（２）：１７１−５頁（２０００年））。
【０３１７】
特定のプロテアーゼが選択されたペプチド配列を切断するか否かを評価するための方法は当該技術分野で既知である。例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）蛍光発生ペプチド基質の使用は、プロテアーゼ特異性を測定するための十分に確立された方法である（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  Ｍ．ら（１９７７年）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７８：４７−５１頁）。アニリド結合の特異的切断により蛍光発生ＡＭＣ脱離基が遊離し、各基質における切断速度の簡易な測定が可能になる。より最近では、ＡＭＣペプチド基質ライブラリのアレイ（Ｌｅｅ  Ｄ．ら（１９９９年）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ９：１６６７−７２頁）および位置走査ライブラリ（Ｒａｎｏ  Ｔ．Ａ．ら（１９９７年）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：１４９−５５頁）を用い、単一の実験での広範囲の基質のサンプリングによるプロテアーゼのＮ末端特異性の迅速なプロファイリングが行われている。したがって、当業者は、過度の実験に依存することなく、ペプチド配列のアレイを評価し、本発明におけるその有用性を判定することが容易にできる。
【０３１８】
本発明の抗体−パートナー複合体は、場合により２種以上のリンカーを有しうる。これらのリンカーは同じかまたは異なる場合がある。例えば、ペプチジルリンカーを用いて薬剤のリガンドへの連結が可能であり、第２のペプチジルリンカーにより診断剤の複合体への結合が可能である。追加のリンカーにおける他の使用として、分析剤、生体分子、標的化剤、および検出可能な標識の抗体−パートナー複合体への連結が含まれる。
【０３１９】
また、例えば本発明の化合物の二量体、三量体、四量体およびより高級な相同体またはそれらの反応類似体などの種を含む多価種である本発明の化合物は、本発明の範囲内に含まれる。多価種は、本発明の単一種または２種以上の種から構築可能である。例えば、二量体構築物は「ホモ二量体」または「ヘテロ二量体」でありうる。さらに、本発明の化合物またはその反応類似体がオリゴマーまたはポリマーフレームワーク（例えばポリリジン、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプンなど）に結合された多価構築物は本発明の範囲内に含まれる。フレームワークは、好ましくは多官能性である（すなわち本発明の化合物に結合するための一連の反応部位を有する）。さらに、フレームワークは、本発明の単一種または本発明の２種以上の種で誘導体化されうる。
【０３２０】
さらに、本発明は、類似官能基でない類似化合物よりも高い水溶性を有する化合物が得られる官能化された化合物を含む。したがって、本明細書中に示される置換基のいずれかが水溶性を高めている類似基と置換されうる。例えば、水酸基をジオールまたは第４級アミン、ヒドロキシアミンもしくは類似の水溶性がより高い部分を有するアミンと置換することは本発明の範囲内に含まれる。好ましい実施形態では、さらなる水溶性が、本明細書中に示される化合物のイオンチャネルに対する活性にとって本質的でない部位での、親化合物の水溶性を高める部分との置換により与えられる。有機化合物の水溶性を高める方法は当該技術分野で既知である。かかる方法は、限定はされないが、常に帯電した部分、例えば第４級アンモニウムまたは生理学的関連ｐＨで帯電した基、例えばカルボン酸、アミンで有機核を官能化する工程を含む。他の方法は、有機核にヒドロキシルまたはアミンを有する基、例えばアルコール、ポリオール、ポリエーテルなどを付加する工程を含む。代表例は、限定はされないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）を含む。これらの化合物に適する官能化の化学反応および戦略は当該技術分野で既知である。例えば、Ｄｕｎｎ  Ｒ．Ｌ．ら編、「ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  第４６９巻」、ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９１年を参照のこと。
【０３２１】
ヒドラジンリンカー（Ｈ）
第２の実施形態では、本発明の複合体はヒドラジン自己犠牲リンカーを含み、ここで複合体は構造：
2010513306.tif 000013
を有し、ここで、Ｄ、Ｌ１、Ｌ４、およびＸ４は上で定義された通りであり、かつ本明細書中にさらに記載され、かつＨは構造
2010513306.tif 000014
を含むリンカーであり、ここで、ｎ１は１〜１０の整数であり、ｎ２は０、１、もしくは２であり、各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群より独立して選択されるメンバーであり、かつＩは結合（すなわち骨格の炭素と隣接窒素の間の結合）かまたは
2010513306.tif 000015
のいずれかであり、ここで、ｎ３が０である場合、ｎ２が０でないという条件でｎ３は０もしくは１であり、かつｎ４は１、２、もしくは３であり、ここでＩが結合である場合、ｎ１は３でありかつｎ２は１であり、Ｄは
2010513306.tif 000016
である可能性がなく、ここで、ＲはＭｅまたはＣＨ２−ＣＨ２−ＮＭｅ２である。
【０３２２】
一実施形態では、フェニル環上での置換はパラ置換である。好ましい実施形態では、ｎ１は２、３、もしくは４であるかまたはｎ１は３である。好ましい実施形態では、ｎ２は１である。好ましい実施形態では、Ｉは結合（すなわち骨格の炭素と隣接窒素の間の結合）である。一態様では、ヒドラジンリンカーＨは、例えばｎ３が０でかつｎ４が２である場合、切断時に６員の自己犠牲リンカーを形成しうる。別の態様では、ヒドラジンリンカーＨは切断時に２つの５員の自己犠牲リンカーを形成しうる。さらに他の態様では、切断時、Ｈは５員の自己犠牲リンカーを形成するか、Ｈは７員の自己犠牲リンカーを形成するか、またはＨは５員の自己犠牲リンカーおよび６員の自己犠牲リンカーを形成する。切断の速度は、切断時に形成される環の大きさに影響される。したがって、望まれる切断の速度に依存して切断時に形成されるべき適切な大きさの環が選択されうる。
【０３２３】
５員のヒドラジンリンカー
一実施形態では、ヒドラジンリンカーは５員のヒドラジンリンカーを含み、ここでＨは構造
2010513306.tif 000017
を含む。
【０３２４】
好ましい実施形態では、ｎ１は２、３、もしくは４である。別の好ましい実施形態では、ｎ１は３である。
【０３２５】
上記の構造では、各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群より独立して選択されるメンバーである。一実施形態では、各Ｒ２４はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。別の実施形態では、各Ｒ２４は独立してＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキル、より好ましくはＨまたはＣＨ３である。別の実施形態では、少なくとも１つのＲ２４はメチル基である。別の実施形態では、各Ｒ２４はＨである。各Ｒ２４は、化合物の立体効果を調整しかつ溶解度を変化させるように選択される。
【０３２６】
５員のヒドラジンリンカーは、薬剤をリンカーから分離する１つ以上の環化反応を受ける可能性があり、例えば
2010513306.tif 000018
で記述されうる。
【０３２７】
本発明の５員のリンカーを調製するための典型的な合成経路は、
2010513306.tif 000019
である。
【０３２８】
Ｃｂｚで保護されたＤＭＤＡ  ｂは塩化チオニルを含有する溶液中の２，２−ジメチル−マロン酸ａと反応し、Ｃｂｚ−ＤＭＤＡ−２，２−ジメチルマロン酸ｃが形成される。化合物ｃはＥＤＣの存在下でＢｏｃ−Ｎ−メチルヒドラジンｄと反応し、ＤＭＤＡ−２，２−ジメチルマロニック（ｄｉｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｉｃ）−Ｂｏｃ−Ｎ−メチルヒドラジンｅが形成される。
【０３２９】
６員のヒドラジンリンカー
別の実施形態では、ヒドラジンリンカーは６員のヒドラジンリンカーを含み、ここでＨは構造：
2010513306.tif 000020
を含む。
【０３３０】
好ましい実施形態では、ｎ１は３である。上記構造では、各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群より独立して選択されるメンバーである。一実施形態では、各Ｒ２４は独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。別の実施形態では、各Ｒ２４は独立してＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキル、より好ましくはＨまたはＣＨ３である。別の実施形態では、少なくとも１つのＲ２４はメチル基である。別の実施形態では、各Ｒ２４はＨである。各Ｒ２４は、化合物の立体効果を調整しかつ溶解度を変化させるように選択される。好ましい実施形態では、Ｈは構造：
2010513306.tif 000021
を含む。
【０３３１】
一実施形態では、Ｈはジェミナルジメチル置換を含む。上記構造の一実施形態では、各Ｒ２４は独立してＨまたは置換もしくは未置換アルキルである。
【０３３２】
６員のヒドラジンリンカーは薬剤をリンカーから分離する環化反応を受けることになり、
2010513306.tif 000022
のように記述されうる。
【０３３３】
本発明の６員のリンカーを調製するための典型的な合成経路は、
2010513306.tif 000023
である。
【０３３４】
ジクロロメタンを含有する溶液中のＣｂｚで保護されたジメチルアラニンａはＨＯＡｔおよびＣＰＩと反応し、Ｃｂｚで保護されたジメチルアラニンヒドラジンｂが形成された。ヒドラジンｂはメタノールの作用により脱保護され、化合物ｃが形成される。
【０３３５】
他のヒドラジンリンカー
本発明が７員を有するリンカーを含む点が検討される。このリンカーであれば５員または６員のリンカーと同程度に速やかに環化しない可能性が高いことになるが、これは一部の抗体−パートナー複合体にとって好ましい場合がある。同様に、ヒドラジンリンカーは２つの６員環を含むか、またはヒドラジンリンカーは１つの６員および１つの５員の環化生成物を有しうる。５員および７員のリンカーならびに６員および７員のリンカーについても検討される。
【０３３６】
別のヒドラジン構造Ｈは、式
2010513306.tif 000024
を有し、ここで、ｑは０、１、２、３、４、５、もしくは６であり、かつ各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群より独立して選択されるメンバーである。このヒドラジン構造は５員環、６員環、または７員環も形成し、追加成分の添加によって複数の環が形成される可能性がある。
【０３３７】
ジスルフィドリンカー（Ｊ）
さらに別の実施形態では、リンカーは酵素的に切断可能なジスルフィド基を含む。一実施形態では、本発明は、式（ｄ）：
2010513306.tif 000025
による構造を有する細胞毒性抗体−パートナー化合物を提供し、ここで、Ｄ、Ｌ１、Ｌ４、およびＸ４は上で定義された通りであり、かつ本明細書中にさらに記載され、かつＪは構造：
2010513306.tif 000026
を有する基を含むジスルフィドリンカーであり、ここで、各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群より独立して選択されるメンバーであり；各Ｋは、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ２１Ｒ２２、ＮＲ２１ＣＯＲ２２、ＯＣＯＮＲ２１Ｒ２２、ＯＣＯＲ２１、およびＯＲ２１（式中、Ｒ２１およびＲ２２は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキルおよび未置換ヘテロシクロアルキルからなる群より独立して選択される）からなる群より独立して選択されるメンバーであり；ｉは０、１、２、３、もしくは４の整数であり；ならびにｄは０、１、２、３、４、５、もしくは６の整数である。
【０３３８】
ジスルフィドリンカーの芳香環は１つ以上の「Ｋ」基と置換されうる。「Ｋ」基は、通常では環構造の一部である４つの非置換炭素のうちの１つに結合される水素を置換する芳香環上の置換基である。「Ｋ」基は、単一原子、例えばハロゲンでありうるか、または多原子基、例えばアルキル、ヘテロアルキル、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、およびシアノでありうる。典型的なＫ置換基は、限定はされないが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３およびメチルを独立して含む。「Ｋｉ」においては、ｉは０、１、２、３、もしくは４の整数である。特定の実施形態では、ｉは０である。
【０３３９】
好ましい実施形態では、リンカーは、式：
2010513306.tif 000027
の、酵素的に切断可能なジスルフィド基を含む。
【０３４０】
この実施形態では、Ｌ４、Ｘ４、ｐ、およびＲ２４の属性は上で定義された通りであり、かつｄは０、１、２、３、４、５、もしくは６である。特定の実施形態では、ｄは１または２である。
【０３４１】
より特異的なジスルフィドリンカーは下記の式で示される。
2010513306.tif 000028
【０３４２】
この実施形態の具体例は以下の通りである。
2010513306.tif 000029
【０３４３】
好ましくは、ｄは１もしくは２である。
【０３４４】
別のジスルフィドリンカーは下記の式で示される。
2010513306.tif 000030
【０３４５】
この実施形態の具体例は以下の通りである。
2010513306.tif 000031
【０３４６】
好ましくは、ｄは１または２である。
【０３４７】
様々な実施形態では、ジスルフィドはアミンに対してオルトである。別の特定の実施形態では、ａは０である。好ましい実施形態では、Ｒ２４はＨおよびＣＨ３から独立して選択される。
【０３４８】
本発明のジスルフィドリンカーを調製するための典型的な合成経路は以下の通りである。
2010513306.tif 000032
【０３４９】
３−メルカプトプロピオン酸ａの溶液はアルドリチオール−２と反応し、３−メチルベンゾチアゾリウムヨージドｂが形成される。３−メチルベンゾチアゾリウムヨージドｃは水酸化ナトリウムと反応し、化合物ｄが形成される。メタノールを含有する化合物ｄの溶液はさらに化合物ｂと反応し、化合物ｅが形成される。化合物ｅは塩化アセチルおよびメタノールの作用により脱保護され、化合物ｆが形成される。
【０３５０】
数種の細胞毒素、リンカーおよび治療剤を抗体に複合させるための他の方法についてのさらなる考察として、Ｇａｎｇｗａｒらに交付され、「Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ａｎｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」という表題のＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０５９４０４号パンフレット、Ｓａｉｔｏ  Ｇ．ら（２００３年）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９−２１５頁；Ｔｒａｉｌ  Ｐ．Ａ．ら（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８−３３７頁；Ｐａｙｎｅ  Ｇ．（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２頁；Ａｌｌｅｎ  Ｔ．Ｍ．（２００２年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：７５０−７６３頁；Ｐａｓｔａｎ  Ｉ．およびＫｒｅｉｔｍａｎ  Ｒ．Ｊ．（２００２年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ３：１０８９−１０９１頁；Ｓｅｎｔｅｒ  Ｐ．Ｄ．およびＳｐｒｉｎｇｅｒ  Ｃ．Ｊ．（２００１年）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７−２６４頁（これら各々はそれら全体が参照により本明細書中に援用される）も参照のこと。
【０３５１】
パートナー分子
本発明は、パートナー分子、例えば細胞毒素、薬剤（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素に複合された抗体を特徴とする。かかる複合体は、本明細書中で「免疫複合体」とも称される。１種以上の細胞毒素を含有する免疫複合体は「免疫毒素」と称される。細胞毒素または細胞毒性物質は、細胞に対して有害な（例えば死滅させる）任意の作用物質を含む。
【０３５２】
本発明のパートナー分子の例として、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または相同体が挙げられる。パートナー分子の例として、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（元はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（元はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）も挙げられる。
【０３５３】
本発明の抗体に複合可能なパートナー分子の他の好ましい例として、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシンおよびアウリスタチン、ならびにこれらの誘導体が挙げられる。カリケアマイシン抗体複合体の例は市販されている（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。
【０３５４】
パートナー分子の好ましい例として、ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシンが挙げられる。ＣＣ−１０６５は、Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏｍｐａｎｙにより１９８１年にストレプトマイセス・ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｚｅｌｅｎｓｉｓ）から最初に単離され（Ｈａｎｋａら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３１：１２１１頁（１９７８年）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３３：９０２頁（１９８０年）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３４：１１１９頁（１９８１年））、インビトロおよび実験動物の双方で強力な抗腫瘍および抗菌活性を有することが見出された（Ｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４２：９９９頁（１９８２年））。ＣＣ−１０６５は、好ましくは５’−ｄ（Ａ／ＧＮＴＴＡ）−３’および５’−ｄ（ＡＡＡＡＡ）−３’の配列を有するマイナーグルーブ内の二本鎖Ｂ−ＤＮＡに結合し（Ｓｗｅｎｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４２：２８２１頁（１９８２年））、３’−アデニンのＮ３位を分子内に存在するそのＣＰＩの左側ユニットによりアルキル化する（Ｈｕｒｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６：８４３頁（１９８４年））。ＣＣ−１０６５は、その強力かつ広範な抗腫瘍活性に反し、実験動物において遅発性死亡を引き起こすことからヒトでは使用できない。
【０３５５】
ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシンの多数の類似体および誘導体は当該技術分野で既知である。多数の化合物の構造、合成および特性の研究についてのレビューがなされている。例えば、Ｂｏｇｅｒら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５：１４３８頁（１９９６年）およびＢｏｇｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：７８７頁（１９９７年）を参照のこと。
【０３５６】
Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙａ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．のあるグループが多数のＣＣ−１０６５誘導体を調製している。例えば、米国特許第５，１０１，０３８号明細書；米国特許第５，６４１，７８０号明細書；米国特許第５，１８７，１８６号明細書；米国特許第５，０７０，０９２号明細書；米国特許第５，７０３，０８０号明細書；米国特許第５，０７０，０９２号明細書；米国特許第５，６４１，７８０号明細書；米国特許第５，１０１，０３８号明細書および米国特許第５，０８４，４６８号明細書、ならびにＰＣＴ出願の国際公開第９６／１０４０５号パンフレットおよび欧州特許出願公開第０５３７５７５Ａ１号明細書を参照のこと。
【０３５７】
Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｕｐｊｏｈｎ）はまた、ＣＣ−１０６５の誘導体の調製に積極的に取り組んでいる。例えば、米国特許第５，７３９，３５０号明細書；米国特許第４，９７８，７５７号明細書、米国特許第５，３３２，８３７号明細書および米国特許第４，９１２，２２７号明細書を参照のこと。
【０３５８】
本発明の特に好ましい態様は、式（ｅ）：
2010513306.tif 000033
による構造を有する細胞毒性化合物を提供し、ここで環系Ａは、置換もしくは未置換アリール置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーである。典型的な環系はフェニルおよびピロールを含む。
【０３５９】
記号ＥおよびＧは、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立して選択されるか、またはＥおよびＧは、場合により結合し、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから選択される環系が形成される。
【０３６０】
記号Ｘは、Ｏ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーを表す。Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
【０３６１】
記号Ｒ３は、（＝Ｏ）、ＳＲ１１、ＮＨＲ１１およびＯＲ１１から選択されるメンバーを表し、ここでＲ１１は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、スルホン酸塩、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２またはＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４である。記号Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールを独立して表し、ここでＲ１２およびＲ１３は、それらの結合対象である窒素または炭素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成される。Ｒ１２、Ｒ１３、またはＲ１４のうちの１つ以上は、その構造内部に切断可能な基を含みうる。
【０３６２】
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２（式中、ｎは１〜２０の整数である）から独立して選択されるメンバーであるか、またはＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の任意の隣接対は、それらの結合対象の炭素原子とともに結合し、４〜６員を有する置換もしくは未置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環系が形成される。Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルおよび置換もしくは未置換ペプチジルを独立して表し、ここでＲ１５およびＲ１６は、それらの結合対象の窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成される。１つの典型的な構造がアニリンである。
【０３６３】
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５およびＲ１６は、場合によりそれらの構造内部に１つ以上の切断可能な基、例えば切断可能なリンカーまたは切断可能な基質を有する。典型的な切断可能な基は、限定はされないが、ペプチド、アミノ酸、ヒドラジン、ジスルフィド、およびセファロスポリン誘導体を含む。
【０３６４】
一部の実施形態では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５およびＲ１６の少なくとも１つを用い、本明細書中に記載のように、薬剤が本発明のリンカーまたは酵素切断可能な基質、例えばＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２、またはＪに結合される。
【０３６５】
さらなる典型的な実施形態では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５およびＲ１６の少なくとも１つは化合物への複合に適する反応基を担持する。さらなる典型的な実施形態では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換アルキルおよび置換ヘテロアルキルから独立して選択され、かつアルキルまたはヘテロアルキル部分の遊離末端に反応官能基を有する。Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５およびＲ１６のうちの１つ以上は、別種、例えば標的化剤、検出可能な標識、固体支持体などに複合されうる。
【０３６６】
Ｒ６は、存在するかまたは存在しない単結合である。Ｒ６が存在する場合、Ｒ６およびＲ７は結合し、シクロプロピル環が形成される。Ｒ７はＣＨ２−Ｘ１もしくは−ＣＨ２−である。Ｒ７が−ＣＨ２−である場合、それはシクロプロパン環の成分である。記号Ｘ１は、ハロゲン、例えばＣｌ、ＢｒもしくはＦなどの脱離基を表す。Ｒ６およびＲ７の結合は、化学価の原理に反しないように解釈される。
【０３６７】
Ｘ１は任意の脱離基でありうる。有用な脱離基は、限定はされないが、ハロゲン、アジド、スルホン酸エステル（例えばアルキルスルホニル、アリールスルホニル）、オキソニウムイオン、アルキル過塩素酸塩、アンモニオアルカンスルホン酸エステル、アルキルフルオロスルホン酸塩およびフッ素化物（例えばトリフレート、ノナフレート、トレシレート）などを含む。脱離基として有用な特定のハロゲンは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒである。特定の一連の反応条件に適するこれらおよび他の脱離基の選択は当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｍａｒｃｈ  Ｊ．、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９２年；Ｓａｎｄｌｅｒ  ＳＲ、Ｋａｒｏ  Ｗ、「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８３年；およびＷａｄｅ  ＬＧ、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９８０年を参照）。
【０３６８】
６員環内部の曲線は、環が１以上の不飽和度を有し、それは芳香族性でありうることを示す。したがって、下記などの環構造およびそれに関連する構造が、式（ｆ）：
2010513306.tif 000034
の範囲内に含まれる。
【０３６９】
一部の実施形態では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、およびＲ５’の少なくとも１つは前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させ、かつ
2010513306.tif 000035
を含み、ここで、ｖは１〜６の整数であり；かつＲ２７、Ｒ２７’、Ｒ２８、およびＲ２８’の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択される。一部の実施形態では、Ｒ２７、Ｒ２７’、Ｒ２８、およびＲ２８’はすべてＨである。一部の実施形態では、ｖは１〜３の整数（好ましくは１）である。この単位を用い、アリール置換基を薬剤から分離することで、多剤耐性のための基質である化合物の生成に対する抵抗または回避がなされうる。
【０３７０】
一実施形態では、Ｒ１１は、自己環化することなく、薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させる部分Ｘ５を含む。部分Ｘ５は、好ましくは酵素を用いて切断可能であり、切断される場合、活性薬剤を提供する。例として、Ｒ１１は構造（右側が薬剤の残りに結合した状態）：
2010513306.tif 000036
を有しうる。
【０３７１】
典型的な実施形態では、式（ｅ）の環系Ａは、置換もしくは未置換フェニル環である。環系Ａは、本明細書中の定義セクションで示される１つ以上のアリール置換基で置換されうる。一部の実施形態では、フェニル環は、ＣＮまたはメトキシ部分で置換される。
【０３７２】
一部の実施形態では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、およびＲ５’の少なくとも１つは前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させ、かつＲ３はＳＲ１１、ＮＨＲ１１およびＯＲ１１から選択される。Ｒ１１は、ＳＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＡＡｎ、−Ｓｉ（ＣＨ３）２Ｃ（ＣＨ３）３、−Ｃ（Ｏ）ＯＰｈＮＨ（ＡＡ）ｍ、
2010513306.tif 000037
または任意の他の糖もしくは糖の組み合わせ、
2010513306.tif 000038
およびその薬学的に許容できる塩から選択され、ここでｎは１〜１０の範囲内の任意の整数であり、ｍは１〜４の範囲内の任意の整数であり、ｐは１〜６の範囲内の任意の整数であり、かつＡＡは任意の天然または非天然アミノ酸である。一部の実施形態では、ＡＡｎまたはＡＡｍはペプチドリンカー（Ｆ）における上記と同じアミノ酸配列から選択され、場合によりＲ４、Ｒ４’、Ｒ５、もしくはＲ５’のリンカー部分で用いられるアミノ酸配列と同じである。少なくとも一部の実施形態では、Ｒ３はインビボで切断可能であることで活性薬剤化合物がもたらされる。少なくとも一部の実施形態では、Ｒ３はインビボでの化合物の溶解度を増大させる。一部の実施形態では、血中での活性薬剤の濃度の低下速度はＲ３の切断速度よりも実質的に速いことで活性薬剤がもたらされる。これは、活性薬剤の毒性がプロドラッグ形態の毒性よりも実質的に高い場合、特に有用でありうる。他の実施形態では、活性薬剤をもたらすためのＲ３の切断の速度は血中での活性薬剤の濃度の低下の速度よりも速い。
【０３７３】
別の典型的な実施形態では、本発明は、式（ｇ）：
2010513306.tif 000039
による構造を有する化合物を提供する。
【０３７４】
この実施形態では、置換基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｒ７およびＸの属性は式（ａ）における上記と実質的に同じであるとともに、特定の実施形態において好ましい。記号Ｚは、Ｏ、ＳおよびＮＲ２３から独立して選択されるメンバーである。記号Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーを表す。各Ｒ２３は独立して選択される。記号Ｒ１は、Ｈ、置換もしくは未置換低級アルキル、またはＣ（Ｏ）Ｒ８もしくはＣＯ２Ｒ８を表す。Ｒ８は、置換アルキル、未置換アルキル、ＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ９ＮＨＲ１０およびＯＲ９から選択されるメンバーである。Ｒ９およびＲ１０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアルキルから独立して選択される。Ｒ２はＨまたは置換もしくは未置換低級アルキルである。Ｒ２が置換アルキルである場合、それはパーフルオロアルキル、例えばＣＦ３以外であることが一般に好ましい。一実施形態では、Ｒ２は置換アルキルであり、ここでは置換基はハロゲンではない。別の実施形態では、Ｒ２は未置換アルキルである。
【０３７５】
一部の実施形態では、Ｒ１はエステル部分、例えばＣＯ２ＣＨ３である。一部の実施形態では、Ｒ２は低級アルキル基であり、それは置換もしくは未置換でありうる。ここで好ましい低級アルキル基はＣＨ３である。一部の好ましい実施形態では、Ｒ１はＣＯ２ＣＨ３でありかつＲ２はＣＨ３である。
【０３７６】
一部の実施形態では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、およびＲ５’は、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ２、ＯＭｅ、Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｒ２９）２およびＮＯ２から独立して選択されるメンバーである。各Ｒ２９は、独立してＨまたは低級アルキル（例えばメチル）である。
【０３７７】
一部の実施形態では、薬剤は、脱離基Ｘ１がハロゲン、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、およびアジドから選択されるメンバーであるように選択される。一部の実施形態では、Ｘ１はＦ、Ｃｌ、またはＢｒである。
【０３７８】
一部の実施形態では、ＺはＯまたはＮＨである。一部の実施形態では、ＸはＯである。
【０３７９】
さらに別の典型的な実施形態では、本発明は、式（ｈ）または（ｉ）：
2010513306.tif 000040
による構造を有する化合物を提供する。
【０３８０】
式（ｅ）のデュオカルマイシン類似体の別の好ましい構造は、環系Ａが未置換もしくは置換フェニル環である場合の構造である。環系Ａがピロールである場合での式７の構造における上記の薬剤分子上の好ましい置換基はまた、環系Ａが未置換もしくは置換フェニル環である場合での好ましい置換基である。
【０３８１】
例えば、好ましい実施形態では、薬剤（Ｄ）は、構造（ｊ）：
2010513306.tif 000041
を含む。
【０３８２】
この構造では、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ７、Ｘは式（ｅ）において上記の通りである。さらに、ＺはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり、ここでＲ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり；
Ｒ１は、Ｈ、置換もしくは未置換低級アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ８、またはＣＯ２Ｒ８であり、ここでＲ８はＮＲ９Ｒ１０およびＯＲ９から選択されるメンバーであり、ここでＲ９およびＲ１０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーであり；
Ｒ１’は、Ｈ、置換もしくは未置換低級アルキル、またはＣ（Ｏ）Ｒ８であり、ここでＲ８はＮＲ９Ｒ１０およびＯＲ９から選択されるメンバーであり、ここでＲ９およびＲ１０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーであり；
Ｒ２は、Ｈ、または置換もしくは未置換低級アルキルまたは未置換ヘテロアルキルまたはシアノまたはアルコキシであり、かつＲ２’は、Ｈ、または置換もしくは未置換低級アルキルまたは未置換ヘテロアルキルである。
【０３８３】
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５またはＲ１６の少なくとも１つは、薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させる。
【０３８４】
薬剤（Ｄ）の別の実施形態は構造（ｋ）を含み、ここでＲ４およびＲ４’は結合し、ヘテロシクロアルキル：
2010513306.tif 000042
が形成される。
【０３８５】
この構造では、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｒ７、Ｘは式（ｅ）において上記の通りである。さらに、ＺはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり、ここでＲ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
【０３８６】
Ｒ３２は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２から選択され、ここでｎは１〜２０の整数である。Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルおよび置換もしくは未置換ペプチジルを独立して表し、ここでＲ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成される。Ｒ３２は、場合により、その構造内部に１つ以上の切断可能な基、例えば切断可能なリンカーまたは切断可能な基質を有する。典型的な切断可能な基は、限定はされないが、ペプチド、アミノ酸、ヒドラジン、ジスルフィド、およびセファロスポリン誘導体を含む。さらに、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１５、およびＲ１６に対する本明細書中に記載の置換基の選択はＲ３２にも適用可能である。
【０３８７】
Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５、Ｒ１６、またはＲ３２の少なくとも１つは、薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させる。少なくとも一部の実施形態では、Ｒ３２は薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させる。
【０３８８】
この化合物の好ましい一実施形態は、
2010513306.tif 000043
であり、
Ｒ１は、Ｈ、置換もしくは未置換低級アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ８、またはＣＯ２Ｒ８であり、ここでＲ８はＮＲ９Ｒ１０およびＯＲ９から選択されるメンバーであり、ここでＲ９およびＲ１０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーであり；
Ｒ１’は、Ｈ、置換もしくは未置換低級アルキル、またはＣ（Ｏ）Ｒ８であり、ここでＲ８はＮＲ９Ｒ１０およびＯＲ９から選択されるメンバーであり、ここでＲ９およびＲ１０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーであり；
Ｒ２は、Ｈ、または置換もしくは未置換低級アルキルまたは未置換ヘテロアルキルまたはシアノまたはアルコキシであり、かつＲ２’は、Ｈ、または置換もしくは未置換低級アルキルまたは未置換ヘテロアルキルである。
【０３８９】
さらなる実施形態は、式：
2010513306.tif 000044
を有する。
【０３９０】
この構造では、Ａ、Ｒ６、Ｒ７、Ｘ、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、およびＲ５’は式（ｅ）において上記の通りである。さらに、ＺはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり、ここでＲ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり；
Ｒ３３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、ならびにＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２から選択され、ここでｎは１〜２０の整数である。Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルおよび置換もしくは未置換ペプチジルを独立して表し、ここでＲ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成される。Ｒ３３は薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させる。
【０３９１】
好ましくは、Ａは置換もしくは未置換フェニルまたは置換もしくは未置換ピロールである。さらに、Ｒ１１に対する本明細書中に記載の置換基の選択はＲ３３にも適用可能である。
【０３９２】
リガンド
Ｘ４は保護反応官能基、非保護反応官能基、検出可能な標識、および標的化剤からなる群より選択されるリガンドを表す。好ましいリガンドは標的化剤、例えば抗体およびその断片である。
【０３９３】
一部の実施形態では、Ｘ４基はＲ２９、ＣＯＯＲ２９、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２９、およびＣ（Ｏ）ＮＮＲ２９から選択されるメンバーとして記述可能であり、ここでＲ２９は、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアリールから選択されるメンバーである。さらに別の典型的な実施形態では、Ｒ２９はチオール反応性メンバーである。さらに典型的な実施形態では、Ｒ２９は、ハロアセチルおよびアルキルハロゲン化誘導体、マレイミド、アジリジン、およびアクリロイル誘導体から選択されるチオール反応性メンバーである。上記チオール反応性メンバーは、例えば標的化剤のアミノ酸の側鎖、例えば抗体と反応しうる反応性保護基として作用することで、標的化剤をリンカー−薬剤部分に結合させうる。
【０３９４】
検出可能な標識
本発明の化合物および方法と併用される特定の標識または検出可能な基は、本発明の化合物の活性または有用性と有意に干渉することがない限り、一般に本発明の重要な態様ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の材料でありうる。かかる検出可能な標識はイムノアッセイの分野で十分に開発されており、一般にかかる方法で有用な大部分の任意の標識が本発明に適用可能である。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物である。本発明で有用な標識は、磁気ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光色素（例えばフルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡで一般に用いられるその他のもの）、ならびにコロイド状金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）などの比色標識を含む。
【０３９５】
標識は、当該技術分野で周知の方法に従い、本発明の化合物に直接的または間接的に結合されうる。上記のように、多種多様な標識の使用が可能であり、そこでの標識の選択は、要求される感受性、化合物との複合の容易性、安定性の要求、使用可能な器具類、および使い捨ての設備（ｄｉｓｐｏｓａｌ  ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）に依存する。
【０３９６】
本発明の化合物が検出可能な標識に複合される場合、標識は好ましくは放射性同位体、蛍光物質、蛍光物質前駆体、発色団、酵素およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるメンバーである。様々な基を抗体に複合するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、抗体に複合されることが多い検出可能な標識は、酵素、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼである。
【０３９７】
非放射性標識は間接的手段により結合されることが多い。一般に、リガンド分子（例えばビオチン）は複合体の成分に共有結合される。次いで、リガンドは別の分子（例えばストレプトアビジン分子）に結合し、それは本質的に検出可能であるかあるいはシグナル系、例えば検出可能な酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物に共有結合される。
【０３９８】
本発明の複合体の成分はまた、例えば酵素またはフルオロフォアとの複合により、シグナル生成化合物に直接複合されうる。標識としての目的の酵素は、主に加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドターゼ（ｏｘｉｄｏｔａｓｅｓ）、特にペルオキシダーゼとなる。蛍光化合物は、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどを含む。化学発光化合物は、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールを含む。使用可能な様々な標識またはシグナル生成系についてのレビューとしては、米国特許第４，３９１，９０４号明細書を参照のこと。
【０３９９】
標識を検出する手段は当業者に周知である。したがって、例えば、標識が放射性標識である場合、検出用手段はオートラジオグラフィーなどではシンチレーションカウンタまたは写真フィルムを含む。標識が蛍光標識である場合、それは蛍光色素を適切な光の波長で励起し、得られる蛍光を検出することで検出可能である。蛍光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管などの電子検出器の使用により、写真フィルムを用いて視覚的に検出可能である。同様に、酵素標識は、酵素に適する基質を提供し、得られた反応生成物を検出することにより検出可能である。最後に、簡素な比色標識は、単に標識に関連する色を観察することにより検出可能である。したがって、様々なディップスティックアッセイでは、複合された金がピンク色を呈することが多い一方、様々な複合ビーズがビーズの色を呈する。
【０４００】
蛍光標識は取扱い上の注意がほとんど要求されないという利点を有し、高スループット画像化技術（コンピュータを含む集積システムにおける分析用の画像のデジタル化を含む光学分析）への適合性が高いことから、ここでは好ましい。好ましい標識は、典型的には、標識における高い感受性、高い安定性、低いバックグラウンド、低い環境感受性および高い特異性のうちの１つ以上で特徴づけられる。多数の蛍光標識が、ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ（Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ならびに当業者に既知の多数の他の市販元から市販されている。さらに、当業者は、特定の用途に適するフルオロフォアの選択方法を理解し、市販品として容易に入手できない場合、必要なフルオロフォアを新規に合成するかまたは市販の蛍光化合物を合成的に修飾し、所望の蛍光標識の入手に至ることができるであろう。
【０４０１】
小分子のフルオロフォアに加え、天然蛍光タンパク質およびかかるタンパク質の改変類似体は本発明で有用である。かかるタンパク質として、例えば、刺胞動物の緑色蛍光タンパク質（Ｗａｒｄら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３５：８０３−８０８頁（１９８２年）；Ｌｅｖｉｎｅら、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、７２Ｂ：７７−８５頁（１９８２年））、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）株由来の黄色蛍光タンパク質（Ｂａｌｄｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：５５０９−１５頁（１９９０年））、渦鞭毛藻のシンビオジニウム種（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）由来のペリジニン−クロロフィル（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４：６７３：７７頁（１９９４年））、海洋シアノバクテリア、例えばシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）由来のフィコビリンタンパク質、例えばフィコエリトリンおよびフィコシアニン（Ｗｉｌｂａｎｋｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２２６−３５（１９９３年））などが挙げられる。
【０４０２】
一般に、細胞毒素と標的化剤（または他の作用物質）、場合によりスペーサー基の間での結合の形成に先立ち、化学官能基の少なくとも１つが活性化されることになる。当業者は、ヒドロキシ、アミノ、およびカルボキシ基を含む種々の化学官能基が種々の標準の方法および条件を用いて活性化されうることを理解するであろう。例えば、細胞毒素または標的化剤の水酸基がホスゲンでの処理を通じて活性化され、対応するクロロホルマートまたはｐ−ニトロフェニルクロロホルマートが形成され、対応する炭酸塩が形成されうる。
【０４０３】
典型的な実施形態では、本発明ではカルボキシル官能基を含む標的化剤が使用される。カルボキシル基は、例えば対応するアシルハロゲン化物または活性エステルへの変換により活性化されうる。この反応は、Ｍａｒｃｈ、上記、３８８−８９頁で例示のように種々の条件下で行われうる。典型的な実施形態では、ハロゲン化アシルは、カルボキシル含有基と塩化オキサリルとの反応を通じて調製される。活性化剤は細胞毒素または細胞毒素−リンカーアーム複合体と反応し、本発明の複合体が形成される。当業者は、カルボキシル含有標的化剤の使用はあくまで例示であり、多数の他の官能基を有する作用物質が本発明のリンカーに複合されうることを理解するであろう。
【０４０４】
反応官能基
例示の簡素化のため、以下の考察では細胞毒素と標的化剤との複合について着目される。その着目により本発明の一実施形態が例示され、その他は当業者により容易に推定される。本発明が単一の実施形態に関する考察に着目することによって限定されることは全く意図されていない。
【０４０５】
本発明の典型的な化合物は一般に置換もしくは未置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖上に位置する反応官能基を担持することから、それらの別種への容易な結合が可能になる。反応基にとって好都合な位置は鎖の末端位置である。
【０４０６】
本発明の実施において有用な反応の反応基およびクラスは、一般にバイオコンジュゲート化学の技術分野で周知のものである。反応官能基は保護または非保護の場合があり、基の保護性は有機合成の技術分野で既知の方法により変化しうる。反応性の細胞毒素類似体の場合に使用可能な好ましい反応のクラスは比較的穏やかな条件下で進行するものである。これらは、限定はされないが、求核置換基（例えばアミンおよびアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換基（例えばエナミン反応）、ならびに炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子の複数の結合の付加（例えばマイケル反応、ディールス−アルダー付加）を含む。これらおよび他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８５年；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、１９９６年、およびＦｅｅｎｅｙら、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ」、第１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）、１９８２年において考察されている。
【０４０７】
典型的な反応タイプは、カルボキシル基と、限定はされないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルを含むその様々な誘導体との反応を含む。水酸基は、エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換されうる。ハロアルキル基は、例えば、アミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンとの反応により新種に変換される。求ジエン体（例えばマレイミド）基はディールス−アルダー付加に関与する。アルデヒドまたはケトン基は、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンもしくはオキシムにまたはグリニャール付加またはアルキルリチウム付加のような機序を介して変換されうる。ハロゲン化スルホニルは例えばアミンと容易に反応し、スルホンアミドが形成される。アミンまたはスルフヒドリル基は、例えばアシル化、アルキル化または酸化される。アルケンは、付加環化、アシル化、マイケル付加などを用いて一連の新種に変換されうる。エポキシドは、アミンおよびヒドロキシル化合物と容易に反応する。
【０４０８】
当業者は、これら結合の多数が種々の方法でかつ種々の条件を用いて生成可能であることを容易に理解するであろう。エステルの調製においては例えばＭａｒｃｈ、上記、１１５７頁を参照し；チオエステルにおいてはＭａｒｃｈ、上記、３６２−３６３頁、４９１頁、７２０−７２２頁、８２９頁、９４１頁、および１１７２頁を参照し；炭酸塩においてはＭａｒｃｈ、上記、３４６−３４７頁を参照し；カルバメートにおいてはＭａｒｃｈ、上記、１１５６−５７頁を参照し；アミドにおいてはＭａｒｃｈ、上記、１１５２頁を参照し；尿素およびチオ尿素においてはＭａｒｃｈ、上記、１１７４頁を参照し；アセタールおよびケタールにおいてはＧｒｅｅｎｅら、上記、１７８−２１０頁およびＭａｒｃｈ、上記、１１４６頁を参照し；アシルオキシアルキル誘導体においては「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ｔｏｐｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｋ．Ｂ．Ｓｌｏａｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９２年を参照し；エノールエステルにおいてはＭａｒｃｈ、上記、１１６０頁を参照し；Ｎ−スルホニルイミデートにおいてはＢｕｎｄｇａａｒｄら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３１：２０６６頁（１９８８年）を参照し；無水物においてはＭａｒｃｈ、上記、３５５−５６頁、６３６−３７頁、９９０−９１頁、および１１５４頁を参照し；Ｎ−アシルアミドにおいてはＭａｒｃｈ、上記、３７９頁を参照し；Ｎ−マンニッヒ塩基においてはＭａｒｃｈ、上記、８００−０２頁および８２８頁を参照し；ヒドロキシメチルケトンエステルにおいてはＰｅｔｒａｃｅｋら、Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、５０７：３５３−５４頁（１９８７年）を参照し；ジスルフィドにおいてはＭａｒｃｈ、上記、１１６０頁を参照し；かつホスホン酸エステルおよびホスホンアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｍｉｄａｔｅ）においては。
【０４０９】
反応官能基は非保護であり、反応に関与または干渉しないように選択されうる。あるいは、反応官能基は保護基の存在により反応への関与から保護されうる。当業者は、特定の官能基を選択された一連の反応条件への干渉から保護する方法を理解するであろう。有用な保護基の例として、Ｇｒｅｅｎｅら、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９１年を参照のこと。
【０４１０】
典型的には、標的化剤は、その各化学官能基による標準の化学技術を用いて細胞毒素に共有結合される。場合により、リンカーまたは作用物質は１つ以上のスペーサー基を介して作用物質に結合される。スペーサー基は、併用される場合、等しいかまたは異なりうる。
【０４１１】
一般に細胞毒素と反応官能基、場合によりスペーサー基の間での結合の形成に先立ち、化学官能基の少なくとも１つが活性化されることになる。当業者は、ヒドロキシ、アミノ、およびカルボキシ基を含む種々の化学官能基が種々の標準の方法および条件を用いて活性化されうることを理解するであろう。典型的な実施形態では、本発明は反応官能基としてカルボキシル官能基を含む。カルボキシル基は上記のように活性化されうる。
【０４１２】
切断可能な基質
本発明の切断可能な基質は「Ｘ２」として表される。好ましくは、切断可能な基質は酵素により切断されうる切断可能な酵素基質である。好ましくは、酵素は、治療されるべき腫瘍または他の標的細胞と直接的または間接的に優先的に結合される。酵素は、治療されるべき腫瘍または他の標的細胞により生成されうる。例えば、切断可能な基質は、腫瘍または他の標的細胞の近傍もしくは内部に見出される酵素により優先的に切断可能なペプチドでありうる。さらにまたはその他として、酵素は、腫瘍細胞に特異的に結合する標的化剤、例えば腫瘍抗原に特異的な抗体に結合されうる。
【０４１３】
上記の薬剤への結合に適する酵素切断可能な基質の例として、ＰＣＴ特許出願公開の国際公開第００／３３８８８号パンフレット、国際公開第０１／９５９４３号パンフレット、国際公開第０１／９５９４５号パンフレット、国際公開第０２／００２６３号パンフレット、および国際公開第０２／１００３５３号パンフレット（これらのすべては参照により本明細書中に援用される）は、切断可能なペプチドの薬剤への結合について開示している。ペプチドは、腫瘍に関連した酵素、例えばｔｒｏｕａｓｅ（チメットオリゴペプチダーゼなど）、ＣＤ１０（ネプリリシン）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ２またはＭＭＰ９など）、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（ヘプシン、テスチシン、ＴＭＰＲＳＳ４、またはマトリプターゼ／ＭＴ−ＳＰ１など）、またはカテプシンにより切断可能である。この実施形態では、プロドラッグは、上記の薬剤、ペプチド、安定化基、また場合により薬剤とペプチドの間の連結基を含む。安定化基がペプチドの末端に結合されることで、プロドラッグが腫瘍または他の標的細胞に到達するまで分解から保護される。適切な安定化基の例として、非アミノ酸、例えばコハク酸、ジグリコール酸、マレイン酸、ポリエチレングリコール、ピログルタミン酸、酢酸、ナフチルカルボン酸、テレフタル酸、およびグルタル酸誘導体；ならびにアスパラギン酸のβ−カルボキシ基またはグルタミン酸のγ−カルボキシル基でのペプチドのＮ末端に結合された遺伝的にコードされないアミノ酸またはアスパラギン酸またはグルタミン酸が挙げられる。
【０４１４】
ペプチドは、典型的には３〜１２個（またはそれより多数）のアミノ酸を含む。特定のアミノ酸の選択は、少なくとも部分的にペプチドの切断に用いられる酵素、ならびにインビボでのペプチドの安定性に依存することになる。適切な切断可能なペプチドの一例がβ−ＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号９２）である。これが安定化基と結合することで、スクシニル−β−ＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号９２）が形成されうる。適切な切断可能なペプチドの他の例が上記の参考文献にて提供される。
【０４１５】
一具体例として、ネプリリシン、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）、および急性リンパ芽球性白血病共通抗原（ＣＡＬＬＡ）としても知られるＣＤ１０はＩＩ型細胞表面亜鉛依存性メタロプロテアーゼである。ＣＤ１０との使用に適する切断可能な基質として、ＬｅｕＡｌａＬｅｕおよびＩｌｅＡｌａＬｅｕが挙げられる。ＣＤ１０に対する他の既知の基質が最大で５０アミノ酸長のペプチドを含むが、基質が大きくなると触媒効率は低下することが多い。
【０４１６】
別の具体例はマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に基づく。おそらくは最良に特徴づけられたタンパク質分解酵素は腫瘍に関連し、腫瘍微小環境内でのＭＭＰの活性化には明らかな相関がある。特に、可溶性のマトリックス酵素ＭＭＰ２（ゼラチナーゼＡ）およびＭＭＰ９（ゼラチナーゼＢ）については徹底した試験が行われ、腫瘍成長を含む組織リモデリングの間に選択的に活性化されることが示されている。デキストランとメトトレキサートの複合体については、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９により切断されるように設計されたペプチド配列の設計および試験が行われている（Ｃｈａｕら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１５：９３１−９４１頁（２００４年））；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）およびドキソルビシン（Ｂａｅら、Ｄｒｕｇｓ  Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．２９：１５−２３頁（２００４年））、ならびにアルブミンおよびドキソルビシン（Ｋｒａｔｚら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１：２００１−２００６頁（２００１年））。ＭＭＰとの使用に適する配列の例として、限定はされないが、ＰｒｏＶａｌＧｌｙＬｅｕＩｌｅＧｌｙ（配列番号８４）、ＧｌｙＰｒｏＬｅｕＧｌｙＶａｌ（配列番号８５）、ＧｌｙＰｒｏＬｅｕＧｌｙＩｌｅＡｌａＧｌｙＧｌｎ（配列番号８６）、ＰｒｏＬｅｕＧｌｙＬｅｕ（配列番号８７）、ＧｌｙＰｒｏＬｅｕＧｌｙＭｅｔＬｅｕＳｅｒＧｌｎ（配列番号８８）、およびＧｌｙＰｒｏＬｅｕＧｌｙＬｅｕＴｒｐＡｌａＧｌｎ（配列番号８９）が挙げられる（例えば上記の参考文献ならびにＫｌｉｎｅら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．１：９−２２頁（２００４年）およびＬｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６０６１−６０６７頁（２０００年）を参照）。他の切断可能な基質の使用も可能である。
【０４１７】
さらに別の例がＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼである。この酵素の基として、例えばヘプシン、テスチシン、およびＴＭＰＲＳＳ４が挙げられる。ＧｌｎＡｌａＡｒｇは（乳癌および卵巣癌において過剰発現される）マトリプターゼ／ＭＴ−ＳＰ１の場合に有用な１つの基質配列であり、ＬｅｕＳｅｒＡｒｇは（前立腺癌および一部の他の腫瘍タイプにおいて過剰発現される）ヘプシンの場合に有用である（例えば、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３６７２０−３６７２５頁およびＫｕｒａｃｈｉおよびＹａｍａｍｏｔｏ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  Ｖｏｌ．２」、第２版（Ｂａｒｒｅｔｔ  ＡＪ、Ｒａｗｌｉｎｇｓ  ＮＤおよびＷｏｅｓｓｎｅｒ  ＪＦ編）、１６９９−１７０２頁（２００４年）を参照）。他の切断可能な基質の使用も可能である。
【０４１８】
切断可能な基質配列の別のタイプとして、腫瘍または細胞と結合状態になる切断可能な基質を切断する能力がある別の酵素の調製が含まれる。例えば、酵素が腫瘍特異抗体（または腫瘍もしくは受容体リガンドなどの他の標的細胞に優先的に引き付けられる他の実体）に結合され、次いで酵素−抗体複合体が患者に提供されうる。酵素−抗体複合体は、腫瘍に関連した抗原に誘導され、結合される。次いで、薬剤−切断可能な基質複合体がプロドラッグとして患者に提供される。薬剤は、薬剤−切断可能な基質複合体が腫瘍と結合状態になっている酵素と、切断可能な基質が切断されかつ薬剤が遊離されるように相互作用する場合に、腫瘍の近傍でのみ放出される。例えば、米国特許第４，９７５，２７８号明細書；米国特許第５，５８７，１６１号明細書；米国特許第５，６６０，８２９号明細書；米国特許第５，７７３，４３５号明細書、および米国特許第６，１３２，７２２号明細書（これらのすべては参照により本明細書中に援用される）はかかる配列を開示している。適切な酵素および基質の例として、限定はされないが、β−ラクタマーゼおよびセファロスポリン誘導体、カルボキシペプチダーゼＧ２およびグルタミン酸およびアスパラギン酸および葉酸誘導体が挙げられる。
【０４１９】
一実施形態では、酵素−抗体複合体は、目的の標的細胞上または標的部位で発現される抗原に対するその特異性に基づいて選択される抗体または抗体断片を含む。抗体についての考察が上記に与えられる。適切なセファロスポリン−切断可能な基質の一例が、
2010513306.tif 000045
である。
【０４２０】
複合体の例
本発明のリンカーおよび切断可能な基質は、種々のパートナー分子を有する複合体内で用いられうる。本発明の複合体の例が、下記にさらに詳述される。他に指定がない限り、置換基は、細胞毒素、リンカー、および切断可能な基質に関するセクションで上記のように定義される。
【０４２１】
Ａ．リンカー複合体
適切な複合体の一例が、式：
2010513306.tif 000046
の化合物であり、ここでＬ１は自己犠牲リンカーであり；ｍは０、１、２、３、４、５、もしくは６の整数であり；Ｆは構造：
2010513306.tif 000047
を含むリンカーであり、ここでＡＡ１は天然アミノ酸および非天然α−アミノ酸からなる群より独立して選択される１種以上のメンバーであり；ｃは１〜２０の整数であり；Ｌ２は自己犠牲リンカーでありかつ
2010513306.tif 000048
を含み、ここでＲ１７、Ｒ１８、およびＲ１９の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールから独立して選択され、かつｗは０〜４の整数であり；ｏは１であり；Ｌ４はリンカーメンバーであり；ｐは０もしくは１であり；Ｘ４は保護反応官能基、非保護反応官能基、検出可能な標識、および標的化剤からなる群より選択されるメンバーであり；かつＤは構造：
2010513306.tif 000049
を含み、ここで環系Ａは、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーであり；ＥおよびＧは、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立して選択されるメンバーであるか、またはＥおよびＧは結合し、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから選択される環系が形成され；ＸはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり；Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり；Ｒ３はＯＲ１１であり、ここでＲ１１は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、スルホン酸塩、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２およびＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４からなる群より選択されるメンバーであり、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２からなる群より独立して選択されるメンバーであるか、またはＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の任意の隣接対はそれらの結合対象である炭素原子とともに結合し、４〜６員を有する置換もしくは未置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環系が形成され；ここでｎは１〜２０の整数であり；Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、および置換もしくは未置換ペプチジルから独立して選択され、ここでＲ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；Ｒ６は存在するかまたは存在しない単結合であり、存在する場合、Ｒ６およびＲ７は結合し、シクロプロピル環が形成され；かつＲ７はＲ６と前記シクロプロピル環内でＣＨ２−Ｘ１もしくは−ＣＨ２−で結合され、ここでＸ１は脱離基であり、ここでＲ１１は前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦに結合させる。
【０４２２】
一部の実施形態では、薬剤は上記の構造（ｃ）または（ｆ）を有する。複合体としての使用に適する化合物の一例として、
2010513306.tif 000050
が挙げられる。
【０４２３】
複合体のタイプの別の例が、式
2010513306.tif 000051
の化合物であり、ここでＬ１は自己犠牲リンカーであり；ｍは０、１、２、３、４、５、もしくは６の整数であり；Ｆは構造：
2010513306.tif 000052
を含むリンカーであり、ここでＡＡ１は天然アミノ酸および非天然α−アミノ酸からなる群より独立して選択される１種以上のメンバーであり；ｃは１〜２０の整数であり；Ｌ２は自己犠牲リンカーであり；ｏは０もしくは１であり；Ｌ４はリンカーメンバーであり；ｐは０もしくは１であり；Ｘ４は保護反応官能基、非保護反応官能基、検出可能な標識、および標的化剤からなる群より選択されるメンバーであり；かつＤは構造：
2010513306.tif 000053
を含み、ここで環系Ａは、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーであり；ＥおよびＧは、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立して選択されるメンバーであるか、またはＥおよびＧは結合し、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから選択される環系が形成され；ＸはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり；Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり；Ｒ３は（＝Ｏ）、ＳＲ１１、ＮＨＲ１１およびＯＲ１１からなる群より選択されるメンバーであり、ここでＲ１１は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、スルホン酸塩、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２およびＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４からなる群より選択されるメンバーであり、ここでＲ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールから独立して選択されるメンバーであり、ここでＲ１２およびＲ１３はそれらの結合対象である窒素または炭素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２からなる群より独立して選択されるメンバーであるか、またはＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の任意の隣接対はそれらの結合対象である炭素原子とともに結合し、４〜６員を有する置換もしくは未置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環系が形成され、ここでｎは１〜２０の整数であり；Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、および置換もしくは未置換ペプチジルから独立して選択され、ここでＲ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；ここでＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の少なくとも１つは前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦに結合させ、かつ
2010513306.tif 000054
を含み、ここでｖは１〜６の整数であり；かつＲ２７、Ｒ２７’、Ｒ２８、およびＲ２８’の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択され；Ｒ６は存在するかまたは存在しない単結合であり、存在する場合、Ｒ６およびＲ７は結合し、シクロプロピル環が形成され；かつＲ７はＲ６と前記シクロプロピル環内でＣＨ２−Ｘ１もしくは−ＣＨ２−で結合され、ここでＸ１は脱離基である。
【０４２４】
一部の実施形態では、薬剤は上記の構造（ｃ）または（ｆ）を有する。複合体としての使用に適する化合物の１つの具体例が、
2010513306.tif 000055
であり、ここでｒは０〜２４の範囲内の整数である。
【０４２５】
適切な複合体の別の例が、式
2010513306.tif 000056
の化合物であり、ここでＬ１は自己犠牲リンカーであり、ｍは０、１、２、３、４、５、もしくは６の整数であり、Ｆは構造
2010513306.tif 000057
を含むリンカーであり、ここでＡＡ１は天然アミノ酸および非天然α−アミノ酸からなる群より独立して選択される１つ以上のメンバーであり；ｃは１〜２０の整数であり；Ｌ３は第一級もしくは第二級アミンを含むスペーサー基またはカルボキシル官能基であり；ここでＬ３が存在する場合、ｍは０でありかつＬ３のアミンがＤの懸垂カルボキシル官能基とアミド結合を形成するか、またはＬ３のカルボキシルがＤの懸垂アミン官能基とアミド結合を形成し；ｏは０もしくは１であり；Ｌ４はリンカーメンバーであり、ここでＬ４は（ＡＡ１）ｃのＮ末端に直接結合された
2010513306.tif 000058
を含み、ここでＲ２０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり、Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６、およびＲ２６’の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択され、かつｓおよびｔは独立して１〜６の整数であり；ｐは１であり；Ｘ４は保護反応官能基、非保護反応官能基、検出可能な標識、および標的化剤からなる群より選択されるメンバーであり、かつＤは構造：
2010513306.tif 000059
を含み、ここで環系Ａは、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーであり；ＥおよびＧは、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立して選択されるメンバーであるか、またはＥおよびＧは結合し、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから選択される環系が形成され；ＸはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり；Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり；Ｒ３は（＝Ｏ）、ＳＲ１１、ＮＨＲ１１およびＯＲ１１からなる群より選択されるメンバーであり、ここでＲ１１は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、スルホン酸塩、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２およびＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４からなる群より選択されるメンバーであり、ここでＲ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールから独立して選択されるメンバーであり、ここでＲ１２およびＲ１３はそれらの結合対象である窒素または炭素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２からなる群より独立して選択されるメンバーであるか、またはＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の任意の隣接対はそれらの結合対象である炭素原子とともに結合し、４〜６員を有する置換もしくは未置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環系が形成され、ここでｎは１〜２０の整数であり；Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、および置換もしくは未置換ペプチジルから独立して選択され、ここでＲ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；Ｒ６は存在するかまたは存在しない単結合であり、存在する場合、Ｒ６およびＲ７は結合し、シクロプロピル環が形成され；かつＲ７はＲ６と前記シクロプロピル環内でＣＨ２−Ｘ１もしくは−ＣＨ２−で結合され、ここでＸ１は脱離基であり、ここでＲ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１５またはＲ１６のうちの少なくとも１つは前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦに結合させる。
【０４２６】
一部の実施形態では、薬剤は上記の構造（ｃ）または（ｆ）を有する。複合体としての使用に適する化合物の１つの具体例が、
2010513306.tif 000060
であり、ここでｒは０〜２４の範囲内の整数である。
【０４２７】
複合体としての使用に適する化合物の他の例として、
2010513306.tif 000061
2010513306.tif 000062
2010513306.tif 000063
2010513306.tif 000064
2010513306.tif 000065
が挙げられ、ここでＲは
2010513306.tif 000066
であり、かつｒは０〜２４の範囲内の整数である。
【０４２８】
複合体はまた、構造（ｇ）、例えば化合物：
2010513306.tif 000067
2010513306.tif 000068
を有する薬剤を用いて形成可能であり、ここでｒは０〜２４の範囲内の整数である。
【０４２９】
複合体はまた、構造：
2010513306.tif 000069
2010513306.tif 000070
2010513306.tif 000071
および
2010513306.tif 000072
を有する薬剤を用いて形成されうる。
【０４３０】
かかる毒素の合成に加え、抗体へのその結合に関する詳細が、２００７年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／９９１，３００号明細書に開示されている。
【０４３１】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７０は、構造Ｎ１のリンカーおよび治療剤に複合される。
2010513306.tif 000073
【０４３２】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７０は、構造Ｎ２のリンカーおよび治療剤に複合される。
2010513306.tif 000074
【０４３３】
Ｂ．切断可能なリンカー複合体
適切な複合体の一例が、構造：
2010513306.tif 000075
を有する化合物であり、ここでＬ１は自己犠牲スペーサーであり、ｍは０、１、２、３、４、５、もしくは６の整数であり；Ｘ２は切断可能な基質であり；かつＤは構造：
2010513306.tif 000076
を含み、ここで環系Ａは、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーであり；ＥおよびＧは、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立して選択されるメンバーであるか、またはＥおよびＧは結合し、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから選択される環系が形成され；ＸはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり；Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり；Ｒ３は（＝Ｏ）、ＳＲ１１、ＮＨＲ１１およびＯＲ１１からなる群より選択されるメンバーであり、ここでＲ１１は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、スルホン酸塩、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２およびＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４からなる群より選択されるメンバーであり、ここでＲ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールから独立して選択されるメンバーであり、ここでＲ１２およびＲ１３はそれらの結合対象である窒素または炭素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；Ｒ６は存在するかまたは存在しない単結合であり、存在する場合、Ｒ６およびＲ７は結合し、シクロプロピル環が形成され；かつＲ７はＲ６と前記シクロプロピル環内でＣＨ２−Ｘ１もしくは−ＣＨ２−で結合され、ここでＸ１は脱離基であり、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２からなる群より独立して選択されるメンバーであるか、またはＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の任意の隣接対はそれらの結合対象である炭素原子とともに結合し、４〜６員を有する置換もしくは未置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環系が形成され、ここでｎは１〜２０の整数であり；Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、および置換もしくは未置換ペプチジルから独立して選択され、ここでＲ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され、ここでＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’のメンバーうちの少なくとも１つは前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＸ２に結合させ、かつ
2010513306.tif 000077
からなる群より選択され、ここでＲ３０、Ｒ３０’、Ｒ３１、およびＲ３１’は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択され；かつｖは１〜６の整数である。
【０４３４】
適切な切断可能なリンカーの例として、β−ＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号９２）および
2010513306.tif 000078
が挙げられる。
【０４３５】
医薬組成物
別の態様では、本開示は、組成物、例えば薬学的に許容できる担体とともに調合された本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分のうちの１つまたは組み合わせを含有する医薬組成物を提供する。かかる組成物は、本開示の（例えば２種もしくは３種以上の異なる）抗体または免疫複合体または二重特異性分子のうちの１つまたはそれらの組み合わせを含有しうる。例えば、本開示の医薬組成物は、標的抗原上で異なるエピトープに結合するかまたは相補的活性を有する抗体（または免疫複合体または二重特異性抗体）の組み合わせを含有しうる。
【０４３６】
本開示の医薬組成物は、併用療法、すなわち他の作用物質との併用であっても投与可能である。例えば、併用療法は、本開示の抗ＣＤ７０抗体と、少なくとも１つの他の抗癌剤、抗炎症物質または免疫抑制剤との併用を含みうる。併用療法で用いられうる治療物質の例が、本開示の抗体の使用に関する下記セクションにおいてより詳細に記載される。
【０４３７】
本明細書で用いられる「薬学的に許容できる担体」は、生理学的に適合可能な、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば注射または注入による）に適する。投与経路に依存し、活性化合物、すなわち抗体、免疫複合体または二重特異性分子は、化合物を酸の活性および化合物を不活性化しうる他の天然条件から保護するための材料でコートされうる。
【０４３８】
本開示の医薬化合物は、１つ以上の薬学的に許容できる塩を含む。「薬学的に許容できる塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持する塩を示し、任意の望ましくない毒物学的効果を与えることがない（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら（１９７７年）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９頁を参照）。かかる塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性無機酸や、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸から誘導される塩を含む。塩基付加塩は、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどや、非毒性有機アミン、例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどから誘導される塩を含む。
【０４３９】
本開示の医薬組成物は、薬学的に許容できる酸化防止剤も含有しうる。薬学的に許容できる酸化防止剤の例として、（１）水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
【０４４０】
本開示の医薬組成物中に用いられうる適切な水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油ならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適切な液性が、例えば、コーティング材料、例えばレシチンの使用、分散の場合に必要とされる粒径の維持ならびに界面活性剤の使用により維持されうる。
【０４４１】
これらの組成物は、防腐剤、浸潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有しうる。微生物の出現の防止は、滅菌法と、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの封入との双方により保証されうる。組成物中に等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含めることも望ましい場合がある。さらに、注射可能な医薬形態の吸収遅延がモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる作用物質の封入によりもたらされうる。
【０４４２】
薬学的に許容できる担体は、注射可能な無菌溶液または分散系の即時調製のための無菌水溶液または分散系および無菌粉末を含む。医薬活性物質におけるかかる媒体および作用物質の使用については当該技術分野で既知である。任意の従来の媒体または作用物質が活性化合物と混合できない場合を除き、本開示の医薬組成物におけるそれらの使用が検討される。補助活性化合物も組成物中に組み込み可能である。
【０４４３】
治療組成物は、典型的には製造および保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、高い薬物濃度に適する溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の規則的構造として調合されうる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散系でありうる。適切な液性が、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散の場合に必要とされる粒径の維持ならびに界面活性剤の使用により維持されうる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコールまたは塩化ナトリウムを含めることが好ましいことになる。注射可能な組成物の遅延された吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによりもたらされうる。
【０４４４】
注射可能な無菌溶液は、必要に応じ、上掲の原料の１つもしくは組み合わせを有する適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、その後に滅菌および精密濾過を施すことにより調製されうる。一般に、分散系は、塩基性分散系および上掲の原料由来の必要な他の原料を含有する無菌溶媒に活性化合物を組み込むことにより調製される。注射可能な無菌溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加え任意の所望の追加原料をその予め無菌濾過された溶液から生成する真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０４４５】
担体材料と組み合わせることで単一の剤形を生成可能な活性成分の量は、治療される対象および特定の投与方法に依存して変化することになる。単一の剤形を生成するための担体材料と併用可能な活性成分の量は、一般に治療効果をもたらす組成物の量となる。一般に、この量は、薬学的に許容できる担体との併用で、１００％のうち、活性成分の約０．０１％〜約９９％、好ましくは活性成分の約０．１％〜約７０％、最も好ましくは活性成分の約１％〜約３０％の範囲となる。
【０４４６】
投与計画を調節することで最適な所望の応答（例えば治療応答）がもたらされる。例えば、単回ボーラスが投与されうるか、数回の分割用量が長期にわたり投与されうるかまたは同用量が治療状況の要件で示されるように比例的に漸減または増加されうる。投与の容易さおよび用量の均一性を意図し、非経口組成物を投与単位形態で調製することが特に有利である。本明細書で用いられる投与単位形態は、試験されるべき対象に対する単一の用量として適合する物理的に別々の単位であり、各単位は必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された既定量の活性化合物を有する。本開示の投与単位形態における仕様は、（ａ）活性化合物固有の特性および達成されるべき特定の治療効果と、（ｂ）個体における感受性を治療するためにかかる活性化合物を配合する当該技術分野に内在する制限により決定づけられ、かつそれらに直接依存している。
【０４４７】
抗体の投与においては、用量は、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、およびより一般的には０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。必要に応じて、例えば、１５ｍｇ／ｋｇ体重、２０ｍｇ／ｋｇ体重または２５ｍｇ／ｋｇ体重といったより高い用量を使用することができる。典型的な治療計画では、毎週１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、１か月に１回、３か月ごとに１回または３〜６か月ごとに１回の投与が必要とされる。本開示の抗ＣＤ７０抗体に対する特定の投与計画は、抗体の静脈内投与を介した１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、ここで抗体は（ｉ）６回投与を４週ごと、次いで３か月ごと；（ｉｉ）３週ごと；（ｉｉｉ）１回の３ｍｇ／ｋｇ体重、次いで３週ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重といった投与計画のうちの１つを用いて投与される。
【０４４８】
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する、本開示の２つ以上の抗ＣＤモノクローナル抗体が同時投与され、いずれの場合でも投与される各抗体の用量は指定範囲内に含まれる。多くの場合、抗体が通常投与される。単回投与間の間隔は、例えば、週単位、月単位、３か月単位または年単位であってもよい。患者における抗体の標的抗原に対する血中濃度の測定により示されるように、間隔は不規則であってもよい。用量は、ある方法では約１〜１０００μｇ／ｍｌ、またある方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を得るように調節される。
【０４４９】
あるいは、抗体は徐放製剤として投与可能であり、いずれの場合でも低頻度の投与が必要とされる。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般に、ヒト抗体は最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体がそれに続く。投与の用量および頻度は、治療が予防的であるかまたは治療的であるかに依存して変化しうる。予防的適用においては、比較的低用量が長期にわたり比較的低頻度の間隔で投与される。一部の患者が、余生にわたって治療を受け続けている。治療的適用においては、疾患の進行が低下または終結されるまで、好ましくは患者が疾患の徴候の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が必要とされる場合がある。その後、患者は予防計画通りに投与されうる。
【０４５０】
異常な細胞増殖に関連する疾患の予防および／または治療での使用においては、約０．００１μＭ〜２０μＭの投与化合物の血中濃度が好ましく、ここで約０．０１μＭ〜５μＭが好ましい。
【０４５１】
本明細書中に記載の化合物の経口投与における患者への用量は、典型的には約１ｍｇ／日〜約１０，０００ｍｇ／日、より典型的には約１０ｍｇ／日〜約１，０００ｍｇ／日、および最も典型的には約５０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日の範囲である。患者の体重について述べると、典型的用量は、約０．０１〜約１５０ｍｇ／ｋｇ／日、より典型的には約０．１〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日、および最も典型的には約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば５ｍｇ／ｋｇ／日または３ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【０４５２】
少なくとも一部の実施形態では、腫瘍成長を遅らせるかまたは阻害する患者への用量は１μｍｏｌ／ｋｇ／日以下であってもよい。例えば、患者への用量は、（薬剤のモルについては）０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４５、０．３、０．２、０．１５、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１もしくは０．００５μｍｏｌ／ｋｇ以下であってもよい。好ましくは、抗体−薬剤複合体は、少なくとも５日間にわたり日用量で投与される場合、腫瘍の成長を遅らせる。少なくとも一部の実施形態では、腫瘍はＳＣＩＤマウスにおけるヒト型腫瘍である。例として、ＳＣＩＤマウスは（Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）から入手可能な）ＣＢ１７．ＳＣＩＤマウスであってもよい。
【０４５３】
本開示の医薬組成物中での活性成分の実際の用量レベルは、患者に毒性をもたらすことなく、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を得るのに有効な活性成分の量を得るように変化しうる。選択される用量レベルは、用いられる本開示の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、用いられる特定の化合物の投与経路、投与時間、排出速度、用いられる特定の組成物と併用される治療薬、他の薬物、化合物および／または材料の持続時間、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および過去の病歴、ならびに医術において周知の要素のようなものを含む種々の薬物動態学的因子に依存することになる。
【０４５４】
本開示の抗ＣＤ７０抗体の「治療的有効用量」は、好ましくは疾患徴候の重症度の低下、疾患徴候のない期間の頻度および持続時間の増大あるいは疾患の苦しみに起因する機能障害または身体障害の予防をもたらす。例えば、ＣＤ７０＋腫瘍の治療における「治療的有効用量」は、好ましくは細胞成長または腫瘍成長を、未治療の対象に対し、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害する。化合物の腫瘍成長に対する阻害能は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価可能である。あるいは、組成物のこの特性は、化合物の細胞成長に対する阻害能の試験により評価可能であり、かかる阻害は当業者に既知のアッセイによりインビトロで測定可能である。治療有効量の治療化合物により、腫瘍サイズが低減しうるかまたはそうでなくても対象における徴候が改善しうる。当業者であれば、対象の大きさ、対象の徴候の重症度および選択された投与における特定の組成物または経路などの要素に基づき、かかる量を決定できるであろう。
【０４５５】
本開示の組成物は、種々の当該技術分野で既知の方法のうちの１つ以上を用い、１つ以上の投与経路を介して投与されうる。当業者に理解されるように、投与の経路および／または方法は所望の結果に応じて変化することになる。本開示の抗体における好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、例えば注射もしくは注入によるものを含む。本明細書で用いられる「非経口投与」という語句は、経腸および局所投与以外の投与方法、通常は注射によるものを意味し、限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内への注射および注入を含む。
【０４５６】
あるいは、本開示の抗体は、非経口でない（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路、例えば局所経路、表皮または粘膜の投与経路を介し、例えば、経鼻的、経口的、経膣的、経直腸的、舌下的または局所的に投与されうる。
【０４５７】
活性化合物は、迅速な放出に対する化合物、例えばインプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤を保護することになる担体とともに調製されうる。生体分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が用いられうる。かかる製剤を調製するための多数の方法が特許化されているかまたは一般に当業者に既知である。例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９７８年を参照のこと。
【０４５８】
治療組成物は、当該技術分野で既知の医療器具を用いて投与可能である。例えば、好ましい実施形態では、本開示の治療組成物は、ニードルレス皮下注射器具、例えば米国特許第５，３９９，１６３号明細書；米国特許第５，３８３，８５１号明細書；米国特許第５，３１２，３３５号明細書；米国特許第５，０６４，４１３号明細書；米国特許第４，９４１，８８０号明細書；米国特許第４，７９０，８２４号明細書；または米国特許第４，５９６，５５６号明細書に開示された器具を用いて投与可能である。本開示において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例として、薬物を制御された速度で投与するための埋め込み式マイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号明細書、皮膚を通して薬剤（ｍｅｄｉｃａｎｔｓ）を投与するための治療器具を開示する米国特許第４，４８６，１９４号明細書、薬物を正確な注入速度で送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号明細書、連続的な薬物送達のための流量可変型の埋め込み式注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号明細書、マルチチャンバ式の区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号明細書、ならびに浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号明細書が挙げられる。これらの特許は参照により本明細書中に援用される。多数の他のかかるインプラント、送達システムおよびモジュールは当業者に既知である。
【０４５９】
特定の実施形態では、本開示のヒトモノクローナル抗体を調合し、インビボで適切な分布を保証することが可能である。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多数の親水性の高い化合物を排除する。（必要に応じて）本開示の治療化合物がＢＢＢを通過することを保証するため、それらを例えばリポソームの形で調合してもよい。リポソームを作製する方法については、例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書；米国特許第５，３７４，５４８号明細書；および米国特許第５，３９９，３３１号明細書を参照のこと。リポソームは特定の細胞または器官に選択的に輸送される１つ以上の部分を含みうることから、標的化された薬剤送達が促進される（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５頁を参照）。典型的な標的化部分は、葉酸塩またはビオチン（例えばＬｏｗらに交付された米国特許第５，４１６，０１６号明細書を参照）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら（１９８８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８頁）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら（１９９５年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０頁；Ｍ．Ｏｗａｉｓら（１９９５年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０頁）；界面活性剤のプロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅら（１９９５年）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４頁）；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０頁）を含み、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３頁；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４年）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２７３頁も参照のこと。
【０４６０】
本開示の使用および方法
本開示の抗体、特にヒト抗体、抗体組成物、抗体−パートナー分子複合体組成物および方法は、ＣＤ７０媒介性障害の診断および治療を含む、極めて多数のインビトロおよびインビボでの診断的および治療的有用性を有する。例えば、これらの分子を、インビトロまたは生体外で培地内の細胞にまたは例えばインビボでヒト対象に投与し、種々の障害を治療し、予防し、かつ診断してもよい。本明細書で用いられる「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むように意図されている。「非ヒト動物」は、あらゆる脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含む。好ましい対象は、ＣＤ７０活性に媒介されるかまたは調節される障害を有するヒト患者を含む。本方法は、異常なＣＤ７０の発現を伴う疾患を有するヒト患者の治療に特に適する。ＣＤ７０に対する抗体−パートナー分子複合体が別の作用物質とともに並行投与される場合、２者においては順次投与または同時投与のいずれでもよい。
【０４６１】
本開示の抗体のＣＤ７０に対する特異的結合を仮定すると、本開示の抗体を用い、細胞の表面上でのＣＤ７０の発現の特異的検出が可能であり、さらにそれを用い、免疫親和性精製を介したＣＤ７０の精製が可能である。
【０４６２】
ＣＤ７０は、腎細胞癌、転移性乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫および鼻咽腔癌を含む種々のヒト癌において発現される（Ｊｕｎｋｅｒら（２００５年）Ｊ  Ｕｒｏｌ．１７３：２１５０−３頁；Ｓｌｏａｎら（２００４年）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１６４：３１５−２３頁；Ｈｅｌｄ−ＦｅｉｎｄｔおよびＭｅｎｔｌｅｉｎ（２００２年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９８：３５２−６頁；Ｈｉｓｈｉｍａら（２０００年）Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ．２４：７４２−６頁；Ｌｅｎｓら（１９９９年）Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０６：４９１−５０３頁）。抗ＣＤ７０抗体を単独で用い、癌性腫瘍の成長を阻害することが可能である。あるいは、下記のように、抗ＣＤ７０抗体を他の免疫原性物質、標準の癌治療薬または他の抗体と併用することが可能である。
【０４６３】
成長が本開示の抗体を用いて阻害可能な好ましい癌は、典型的には免疫療法に応答性がある癌を含む。治療にとって好ましい癌の非限定例として、腎癌（例えば腎細胞癌）、乳癌、脳腫瘍、急性脊髄性白血病、慢性脊髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む慢性または急性白血病、リンパ腫（例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫）、および鼻咽腔癌が挙げられる。本開示の方法を用いて治療可能な他の癌の例として、メラノーマ（例えば転移性悪性黒色腫）、前立腺癌、大腸癌、肺癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、睾丸癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓癌または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍（ｓｐｉｎａｌ  ａｘｉｓ  ｔｕｍｏｒ）、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、例えば中皮腫などアスベストにより誘発される癌を含む環境的に誘発される癌（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒｓ）、ならびに前記癌の併発が挙げられる。
【０４６４】
さらに、様々な腫瘍細胞上でのＣＤ７０の発現を仮定すると、本開示のヒト抗体、抗体組成物および方法を用い、発癌性疾患、例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ）、例えば明細胞ＲＣＣ、グリア芽腫、乳癌、脳腫瘍、鼻咽腔癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、多発性骨髄腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小切れ込み細胞型リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、中心芽細胞性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞系のびまん性大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ関連体腔に基づくリンパ腫、胎生期癌、鼻咽腔の未分化癌（例えばシュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、および他のＢ細胞リンパ腫を含む、例えばＣＤ７０を発現する腫瘍細胞の存在により特徴づけられる疾患を有する対象の治療が可能である。
【０４６５】
したがって、一実施形態では、本開示は、対象における腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、対象に治療有効量の抗ＣＤ７０抗体またはその抗原結合部分を投与する工程を含む、方法を提供する。好ましくは、抗体はヒト抗ＣＤ７０抗体（本明細書中に記載のヒト抗ヒトＣＤ７０抗体のいずれかなど）である。さらにまたはその他として、抗体はキメラまたはヒト化抗ＣＤ７０抗体でありうる。
【０４６６】
さらに、ＣＤ７０とＣＤ２７の相互作用は、細胞媒介性自己免疫疾患、例えば実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に関与することが提示されている（Ｎａｋａｊｉｍａら（２０００年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１８８−９６頁）。この効果は、ＴＮＦ−αの産生の阻害により部分的に媒介されると考えられた。さらに、ＣＤ７０シグナル伝達の遮断は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＣＤ４０媒介性のクローン性増殖を阻害し、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞の生成を低下させる（Ｔａｒａｂａｎら（２００４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：６５４２−６頁）。そのようなものとして、本開示のヒト抗体、抗体組成物および方法を用い、自己免疫疾患、例えばＣＤ７０を発現するＢ細胞の存在により特徴づけられる疾患（例えば実験的自己免疫性脳脊髄炎を含む）を有する対象の治療が可能である。本開示の抗体の使用が可能なさらなる自己免疫疾患は、限定はされないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病、潰瘍性大腸炎およびセリアック病を含む）、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、自己免疫性甲状腺炎、関節リウマチ（ＲＡ）および糸球体腎炎を含む。さらに、移植拒絶反応の阻害または予防あるいは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療において、本開示の抗体組成物の使用が可能である。
【０４６７】
さらに、ＣＤ７０とＣＤ２７の相互作用はまた、ＣＤ４＋Ｔ細胞上でのシグナル伝達に関与することが提示されている。一部のウイルスが、ＣＤ２７経路でのシグナル伝達により、中和抗体応答の破壊をもたらすことが示されている（Ｍａｔｔｅｒら（２００６年）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：２１４５−５５頁）。そのようなものとして、本開示のヒト抗体、抗体組成物および方法は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、（Ａ型、Ｂ型、およびＣ型）肝炎、ヘルペスウイルス、（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩおよびＣＭＶ、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス（ｃｏｒｎｏｖｉｒｕｓ）、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、種痘ウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、モルスカムウイルス（ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ  ｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスおよびリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）からの感染を含むウイルス感染を有する対象の治療かまたはＨＩＶ感染症／ＡＩＤＳの治療において用いられうる。さらに、本開示のヒト抗体、抗体組成物および方法を用い、ＴＮＦ−αの産生の阻害が可能である。
【０４６８】
一実施形態では、本開示の抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびに組成物）を用い、ＣＤ７０のレベルまたは膜表面上にＣＤ７０を有する細胞のレベルの検出が可能であり、ここでは同レベルは特定の疾患徴候に関連しうる。あるいは、抗体を用い、ＣＤ７０の機能の阻害または遮断が可能であり、ここでは同機能は特定の疾患徴候の予防または改善に関連する可能性があることから、ＣＤ７０は疾患のメディエーターとして関与している。これは、実験試料および対照試料を抗ＣＤ７０抗体と、抗体とＣＤ７０との間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させることによりなされうる。抗体とＣＤ７０との間で形成される任意の複合体が検出され、それは実験試料および対照において比較される。
【０４６９】
別の実施形態では、本開示の抗体（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびに組成物）の、治療用途または診断用途に関連した結合活性についてはインビトロで最初に試験されうる。例えば、本開示の組成物は、下記の実施例に記載のフローサイトメトリーアッセイを用いて試験可能である。
【０４７０】
本開示の抗体（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子、免疫複合体ならびに組成物）は、ＣＤ７０関連疾患の治療および診断においてさらなる有用性を有する。例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性または二重特異性分子および免疫複合体を用い、ＣＤ７０を発現する細胞の、成長の阻害および／または死滅、ヒトエフェクター細胞の存在下でのＣＤ７０を発現する細胞の食作用またはＡＤＣＣの媒介、またはＣＤ７０リガンドのＣＤ７０への結合の遮断といった生物学的活性のうちの１つ以上のインビボまたはインビトロでの誘発が可能である。
【０４７１】
特定の実施形態では、抗体（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびに組成物）をインビボで用い、種々のＣＤ７０関連疾患の治療、予防または診断がなされる。ＣＤ７０関連疾患の例として、特に、自己免疫疾患、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、例えば明細胞ＲＣＣ、グリア芽腫、乳癌、脳腫瘍、鼻咽腔癌、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、多発性骨髄腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小切れ込み細胞型リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、中心芽細胞性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞系のびまん性大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ関連体腔に基づくリンパ腫、胎生期癌、鼻咽腔の未分化癌（例えばシュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、および他のＢ細胞リンパ腫が挙げられる。
【０４７２】
本開示の抗体組成物（例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）をインビボおよびインビトロで投与する適切な経路は当該技術分野で周知であり、当業者により選択されうる。例えば、抗体組成物を注射（例えば静脈内または皮下）により投与してもよい。用いられる分子の適切な用量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および／または調合に依存することになる。
【０４７３】
上記のように、本開示のヒト抗ＣＤ７０抗体を、１つ以上の治療物質、例えば細胞毒性物質、放射性毒性物質（ｒａｄｉｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ）または免疫抑制剤と同時投与してもよい。抗体を（免疫複合体としての）作用物質に連結するかまたは作用物質とは別々に投与してもよい。後者（別々の投与）の場合、作用物質の前、後またはそれと同時に抗体を投与するかまたは他の既知の治療、例えば抗癌治療、例えば放射線と併せて同時投与してもよい。かかる治療物質は、特にドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシルおよびシクロホスファミドヒドロキシウレア（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）などの抗悪性腫瘍薬を含み、それら単独では患者に対して毒性または亜毒性のレベルでのみ有効である。シスプラチンは、４週ごとに１回、１００ｍｇ／用量で静脈内投与され、アドリアマイシンは、２１日ごとに１回、６０−７５ｍｇ／ｍｌ用量で静脈内投与される。本開示のヒト抗ＣＤ７０抗体またはそれらの抗原結合断片と化学療法剤の同時投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性効果をもたらす異なる機序を介して作用する２つの抗癌剤を提供する。かかる同時投与は、抗体に反応しなくなる薬剤に対する耐性または腫瘍細胞の抗原性における変化が生じることによる問題を解決しうる。
【０４７４】
標的特異的なエフェクター細胞、例えば本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）に連結したエフェクター細胞は、治療物質としても用いられうる。標的化のためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球または単球などのヒト白血球でありうる。他の細胞は、好酸球、ナチュラルキラー細胞および他のＩｇＧ−もしくはＩｇＡ−受容体担持細胞を含む。必要に応じ、エフェクター細胞を試験されるべき対象から得てもよい。標的特異的なエフェクター細胞を生理学的に許容できる溶液中の細胞の懸濁液として投与してもよい。投与される細胞の数は１０８−１０９程度でありうるが、治療目的に応じて変化することになる。一般に、数は、標的細胞、例えばＣＤ７０を発現する腫瘍細胞で局在化を得、かつ例えば食作用による細胞死を有効にするのに十分な数となる。投与経路もまた変化しうる。
【０４７５】
標的特異的なエフェクター細胞による治療を、標的化細胞を除去するための他の技術と併せて行ってもよい。例えば、本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）および／またはこれらの組成物が備えられたエフェクター細胞を用いる抗腫瘍療法を化学療法と併用してもよい。さらに、併用免疫療法を用い、２つの異なる細胞毒性のあるエフェクター集団を指令し、腫瘍細胞を拒絶することが可能である。例えば、抗Ｆｃ−γ  ＲＩまたは抗ＣＤ３に連結された抗ＣＤ７０抗体は、ＩｇＧ−またはＩｇＡ−受容体に特異的な結合剤と併用可能である。
【０４７６】
本開示の二重特異性および多重特異性分子を用い、エフェクター細胞上のＦｃγＲまたはＦｃγＲレベルの例えば細胞表面上の受容体のキャッピングおよび除去による調節も可能である。抗Ｆｃ受容体の混合物もこの目的で用いられうる。
【０４７７】
補体結合部位、例えば補体に結合するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＭ由来の部分を有する本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）も補体の存在下で用いられうる。一実施形態では、本開示の結合剤および適切なエフェクター細胞による標的細胞を含む細胞の集団の生体外治療は、補体または補体を含有する血清の添加により補完されうる。本開示の結合剤でコートされた標的細胞の食作用は補体タンパク質の結合により増進されうる。別の実施形態では、本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）でコートされた標的細胞も補体により溶解されうる。さらに別の実施形態では、本開示の組成物は補体を活性化することがない。
【０４７８】
本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）はまた、補体とともに投与可能である。したがって、ヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子および血清または補体を含有する組成物は本開示の範囲内に含まれる。これらの組成物は、補体がヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子の近接位置に存在する点で有利である。あるいは、本開示のヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子と補体または血清を別々に投与してもよい。
【０４７９】
本開示の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性または多重特異性分子または免疫複合体）と使用説明書を含むキットも本開示の範囲内に含まれる。キットは、１つ以上の追加試薬、例えば免疫抑制試薬、細胞毒性物質または放射性毒性物質あるいは１つ以上の追加の本開示のヒト抗体（例えば、第１のヒト抗体とは異なる、異なるＣＤ７０抗原内のエピトープに対して結合する相補活性を有するヒト抗体）をさらに含みうる。
【０４８０】
したがって、本開示の抗体組成物で治療される患者に、別の治療物質、例えばヒト抗体の治療効果を促進または増強する細胞毒性物質または放射性毒性物質を（本開示のヒト抗体の投与の前、投与と同時または投与後に）さらに投与してもよい。
【０４８１】
他の実施形態では、対象をさらに、ＦｃγまたはＦｃγ受容体の発現または活性を調節する、例えば促進または阻害する作用物質で治療する、例えば対象をサイトカインで治療することが可能である。多重特異性分子による治療の間での投与における好ましいサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。
【０４８２】
本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）を用い、ＦｃγＲまたはＣＤ７０を発現する細胞を、例えばかかる細胞を標識する目的で標的にすることも可能である。かかる使用においては、結合剤を検出可能な分子に連結してもよい。したがって、本開示は、ＦｃγＲまたはＣＤ７０などのＦｃ受容体を発現する細胞を生体外またはインビトロで局在化するための方法を提供する。検出可能な標識は、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素共同因子でありうる。
【０４８３】
特定の実施形態では、本開示は、試料中でのＣＤ７０抗原の存在を検出するかまたはＣＤ７０抗原の量を測定するための方法であって、試料および対照試料を、ＣＤ７０に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、抗体またはその一部とＣＤ７０との複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程を含む、方法を提供する。次いで、複合体の形成は検出され、ここで対照試料と比較した場合での試料の複合体形成の差は試料中にＣＤ７０抗原が存在することを示す。
【０４８４】
さらに別の実施形態では、本開示の免疫複合体を用い、化合物（例えば、治療剤、ラベル、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剤など）をかかる化合物の抗体への結合によりＣＤ７０細胞表面受容体を有する細胞に対して標的化することが可能である。例えば、抗ＣＤ７０抗体は、米国特許第６，２８１，３５４号明細書および米国特許第６，５４８，５３０号明細書、米国仮特許出願第６０／９９１，３００号明細書、米国特許出願公開第２００３００５０３３１号明細書、米国特許出願公開第２００３００６４９８４号明細書、米国特許出願公開第２００３００７３８５２号明細書および米国特許出願公開第２００４００８７４９７号明細書に記載されるかまたは国際公開第０３／０２２８０６号パンフレットに公開された（これら全体が参照により本明細書中に援用される）細胞毒素化合物のいずれかに複合されうる。したがって、本開示はまた、（例えば検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素共同因子を用いて）生体外またはインビボでＣＤ７０を発現する細胞を局在化するための方法を提供する。あるいは、免疫複合体を用い、ＣＤ７０細胞表面受容体を有する細胞を、細胞毒素または放射性毒素をＣＤ７０に対して標的化することにより死滅させることが可能である。
【０４８５】
本開示は、以下の実施例によりさらに例示され、それらはさらに限定するものとして解釈されるべきものではない。本願全体を通して言及されるあらゆる図面およびあらゆる参考文献の内容、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開された特許出願は、それら全体が参照により本明細書中に明示的に援用される。
【実施例】
【０４８６】
実施例１．ＣＤ７０に対するヒトモノクローナル抗体の産生
抗原
免疫プロトコルでは、抗原として二重ｍｙｃ−Ｈｉｓタグと融合した組換えヒトＣＤ７０を用いた。あるいは、腎癌細胞系７８６−Ｏ（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１９３２）を用い、腎癌細胞系Ａ−４９８（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−４４）で追加免疫した全細胞免疫を一部の免疫で用いた。
【０４８７】
トランスジェニックＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）
ＣＤ７０に対する完全ヒトモノクローナル抗体を、ＨｕＭａｂトランスジェニックマウスのＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＨＣｏ１７株とトランスジェニックトランスクロモゾームマウスのＫＭ株（それぞれヒト抗体遺伝子を発現する）を用いて調製した。これらのマウス株においては、内因性マウスκ軽鎖遺伝子がＣｈｅｎら（１９９３年）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０頁に記載のようにホモ接合的に破壊されており、かつ内因性マウス重鎖遺伝子がＰＣＴ公開の国際公開第０１／０９１８７号パンフレットの実施例１に記載のようにホモ接合的に破壊されている。さらに、このマウス株は、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１頁に記載のヒトκ軽鎖トランス遺伝子ＫＣｏ５およびＰＣＴ公開の国際公開第０１／０９１８７号パンフレットの実施例２に記載のヒト重鎖トランス遺伝子ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２またはＨＣｏ１７を有する。ＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）株は、ＰＣＴ公開の国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに記載のＳＣ２０トランスクロモゾームを有する。
【０４８８】
ＨｕＭａｂおよびＫＭの免疫
ＣＤ７０に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するため、ＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）のマウスを、抗原としての組換えヒトＣＤ７０または細胞表面上のＣＤ７０を発現する全細胞で免疫した。ＨｕＭａｂマウスにおける一般的免疫スキームは、Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  Ｄ．ら（１９９６年）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１頁およびＰＣＴ公開の国際公開第９８／２４８８４号パンフレットに記載されている。マウスは抗原の１回目の注入時に６〜１６週齢であった。５〜１０×１０６個の細胞を用い、ＨｕＭａｂマウスを、腹腔内に（ＩＰ）、皮下に（Ｓｃ）または足蹠注射を介して免疫した。
【０４８９】
トランスジェニックマウスを、完全フロイントまたはＲｉｂｉアジュバント中の抗原で腹腔内に２回免疫し、３〜２１日後に不完全フロイントまたはＲｉｂｉアジュバント中の抗原で腹腔内に免疫した（最大、全部で１１回の免疫）。免疫応答を眼窩後方からの採血（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ  ｂｌｅｅｄ）により監視した。血漿を（下記のように）ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによりスクリーニングし、抗ＣＤ７０ヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合に用いた。屠殺および脾臓の摘出の３日前、マウスの静脈内に抗原で追加免疫した。典型的には、各抗原に対して１０〜３５回の融合を行った。数十匹のマウスに対し、各抗原を免疫した。
【０４９０】
抗ＣＤ７０抗体を産生するＨｕＭａｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）またはＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）の選択
ＣＤ７０に結合した抗体を産生するＨｕＭａｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）またはＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）を選択するため、免疫マウス由来の血清の、組換えヒトＣＤ７０を発現する細胞系に結合してもＣＤ７０を発現しない対照細胞系に結合しないことについてフローサイトメトリーによりスクリーニングした。さらに、血清の７８６−ＯまたはＡ−４９８細胞への結合についてフローサイトメトリーによりスクリーニングした。つまり、抗ＣＤ７０抗体の結合を、ＣＤ７０発現ＣＨＯ細胞、７８６−Ｏ細胞またはＡ４９８細胞を１：２０の希釈で抗ＣＤ７０抗体とともにインキュベートすることにより評価した。細胞を洗浄し、結合をＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて行った。ＣＤ７０発現ＣＨＯ細胞に結合してもＣＤ７０を発現しない親ＣＨＯ細胞に結合しない抗体のＣＤ７０への結合について、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  Ｄ．ら（１９９６年）に記載のようにＥＬＩＳＡによりさらに試験した。つまり、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１〜２μｇ／ｍｌでの形質移入ＣＨＯ細胞由来の精製組換えＣＤ７０融合タンパク質でコートし、１００μｌ／ウェルを４℃で一晩インキュベートし、次いでＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中、２００μｌ／ウェルの５％ニワトリ血清でブロッキングした。ＣＤ７０免疫マウス由来の血清の希釈物を各ウェルに添加し、周囲温度で１〜２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と複合したヤギ−抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ、Ａ−１８８８、０．２２ｍｇ／ｍｌ）で発色させ、分光光度計によりＯＤ４１５〜４９５で分析した。最高の力価の抗ＣＤ７０抗体を示すマウスを融合に用いた。融合を下記のように行い、ハイブリドーマ上清の抗ＣＤ７０活性についてＥＬＩＳＡにより試験した。
【０４９１】
ＣＤ７０に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成
ＨｕＭａｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）および／またはＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）から単離したマウス脾細胞を、標準プロトコルに基づくＰＥＧまたはＣｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅの大型チャンバ式の細胞融合エレクトロポレーター（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ）を用いる電場に基づく電気融合のいずれかを用い、マウス骨髄腫細胞系と融合した。次いで、生成されたハイブリドーマにおける抗原特異的な抗体の産生についてスクリーニングした。免疫マウス由来の脾細胞の単一の細胞懸濁液を、ＳＰ２／０非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８１）の数の１／４と、５０％ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いて融合した。細胞を、平底マイクロタイタープレート内に約１×１０５細胞／ウェルでプレーティングした後、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを有するＤＭＥＭ高グルコース培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）（さらに、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１８％Ｐ３８８ＤＩ条件培地、５％Ｏｒｉｇｅｎハイブリドーマクローニング因子（ＢｉｏＶｅｒｉｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＶＡ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５ｍＭヘペス、０．０５５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１×ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地（Ｓｉｇｍａ；融合の２４時間後にＨＡＴが添加される）を含有する）内で１週間インキュベートした。１週間後、細胞を、用いたＨＡＴをＨＴと交換した培地中で培養した。次いで、各ウェルにおけるヒト抗ＣＤ７０モノクローナルＩｇＧ抗体について、ＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡ（上記）によりスクリーニングした。大規模にハイブリドーマが増殖すると、通常で１０〜１４日後、培地を監視した。抗体を分泌するハイブリドーマを再プレーティングし、再びスクリーニングし、ヒトＩｇＧが依然として陽性である場合、抗ＣＤ７０モノクローナル抗体を限界希釈により少なくとも２回サブクローン化した。次いで、さらなる特徴づけのため、安定なサブクローンをインビトロで培養し、組織培地中で少量の抗体を産生した。
【０４９２】
さらなる分析のため、ハイブリドーマクローン２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７および６９Ａ７を選択した。
【０４９３】
実施例２．ヒトモノクローナル抗体２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７および１Ｆ４の構造的特徴づけ
２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７および１Ｆ４モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を、標準ＰＣＲ技術を用いてそれぞれ２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、１８Ｅ７、６９Ａ７および１Ｆ４ハイブリドーマから得て、標準のＤＮＡ配列決定技術を用いて配列決定した。
【０４９４】
２Ｈ５の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図１Ａとそれぞれ配列番号４９および１に示す。
【０４９５】
２Ｈ５の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図１Ｂとそれぞれ配列番号５５および７に示す。
【０４９６】
２Ｈ５重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、２Ｈ５重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ３−３０．３由来のＶＨセグメント、未確定のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ４ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。２Ｈ５  ＶＨ配列と生殖細胞系ＶＨ３−３０．３配列のアラインメントを図７に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる２Ｈ５  ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図１Ａおよび７とそれぞれ配列番号１３、１９および２５に図示されるに至った。
【０４９７】
２Ｈ５軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、２Ｈ５軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ６由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ４由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。２Ｈ５  ＶＬ配列と生殖細胞系ＶＫＬ６配列のアラインメントを図１１に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる２Ｈ５  ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図１Ｂおよび１１とそれぞれ配列番号３１、３７、および４３に図示されるに至った。
【０４９８】
１０Ｂ４の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図２Ａとそれぞれ配列番号５０および２に示す。
【０４９９】
１０Ｂ４の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図２Ｂとそれぞれ配列番号５６および８に示す。
【０５００】
１０Ｂ４重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、１０Ｂ４重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ３−３０．３由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系４−１１由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ４ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。１０Ｂ４  ＶＨ配列と生殖細胞系ＶＨ３−３０．３配列のアラインメントを図７に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる１０Ｂ４  ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図２Ａおよび７とそれぞれ配列番号１４、２０、および２６に図示されるに至った。
【０５０１】
１０Ｂ４軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、１０Ｂ４軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１８由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ３由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。１０Ｂ４  ＶＬ配列と生殖細胞系ＶＫＬ１８配列のアラインメントを図１２に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる１０Ｂ４  ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図２Ｂおよび１２とそれぞれ配列番号３２、３８、および４４に図示されるに至った。
【０５０２】
８Ｂ５の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図３Ａとそれぞれ配列番号５１および３に示す。
【０５０３】
８Ｂ５の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図３Ｂとそれぞれ配列番号５７および９に示す。
【０５０４】
８Ｂ５重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、８Ｂ５重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ３−３３由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−１０由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ４ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。８Ｂ５  ＶＨ配列と生殖細胞系ＶＨ３−３３配列のアラインメントを図８に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる８Ｂ５  ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図３Ａおよび８とそれぞれ配列番号１５、２１、および２７に図示されるに至った。
【０５０５】
８Ｂ５軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、８Ｂ５軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１５由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ４由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。８Ｂ５  ＶＬ配列と生殖細胞系ＶＫＬ１５配列のアラインメントを図１３に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる８Ｂ５  ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図３Ｂおよび１３とそれぞれ配列番号３３、３９、および４５に図示されるに至った。
【０５０６】
１８Ｅ７の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図４Ａとそれぞれ配列番号５２および４に示す。
【０５０７】
１８Ｅ７の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図４Ｂとそれぞれ配列番号５８および１０に示す。
【０５０８】
１８Ｅ７重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、１８Ｅ７重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ３−３３由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−１０由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ４ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。１８Ｅ７  ＶＨ配列と生殖細胞系ＶＨ３−３３配列のアラインメントを図８に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる１８Ｅ７  ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図４Ａおよび８とそれぞれ配列番号１６、２２、および２８に図示されるに至った。
【０５０９】
１８Ｅ７軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、１８Ｅ７軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１５由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ４由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。１８Ｅ７  ＶＬ配列と生殖細胞系ＶＫＬ１５配列のアラインメントを図１３に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる１８Ｅ７  ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図４Ｂおよび１３とそれぞれ配列番号３４、４０、および４６に図示されるに至った。
【０５１０】
６９Ａ７の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図５Ａとそれぞれ配列番号５３および５に示す。
【０５１１】
６９Ａ７の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図５Ｂとそれぞれ配列番号５９および１１に示す。
【０５１２】
６９Ａ７重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、６９Ａ７重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ４−６１由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系４−２３由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ４ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。６９Ａ７  ＶＨ配列と生殖細胞系ＶＨ４−６１配列のアラインメントを図９に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる６９Ａ７  ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図５Ａおよび９とそれぞれ配列番号１７、２３、および２９に図示されるに至った。
【０５１３】
６９Ａ７軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、６９Ａ７軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ６由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ４由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。６９Ａ７  ＶＬ配列と生殖細胞系ＶＫＬ６配列のアラインメントを図１４に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる６９Ａ７  ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図５Ｂおよび１４とそれぞれ配列番号３５、４１、および４７に図示されるに至った。
【０５１４】
１Ｆ４の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図５Ａとそれぞれ配列番号５４および６に示す。
【０５１５】
１Ｆ４の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図５Ｂとそれぞれ配列番号６０および１２に示す。
【０５１６】
１Ｆ４重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、１Ｆ４重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ３−２３由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系４−４由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ４ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。１Ｆ４  ＶＨ配列と生殖細胞系ＶＨ３−２３配列のアラインメントを図１０に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる１Ｆ４  ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図５Ａおよび１０とそれぞれ配列番号１８、２４、および３０に図示されるに至った。
【０５１７】
１Ｆ４軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、１Ｆ４軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ２由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。１Ｆ４  ＶＬ配列と生殖細胞系ＶＫＡ２７配列のアラインメントを図１５に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる１Ｆ４  ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図５Ｂおよび１５とそれぞれ配列番号３６、４２、および４８に図示されるに至った。
【０５１８】
実施例３．抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体の結合特異性の特徴づけ
抗ＣＤ７０抗体の免疫精製ＣＤ７０への結合についての比較を標準ＥＬＩＳＡにより行い、ＣＤ７０に対する結合の特異性について試験した。
【０５１９】
組換えｍｙｃ−タグ化されたＣＤ７０をプレート上で一晩コートし、次いで抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５、および１８Ｅ７に対する結合について試験した。標準ＥＬＩＳＡ法を実施した。抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で添加し、１：２の段階希釈で減量して力価判定した。西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と複合したヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃまたはκ鎖に特異的な）ポリクローナル抗体を二次抗体として用いた。結果を図１６に示す。抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体２Ｈ５、１０Ｂ４、８Ｂ５および１８Ｅ７はＣＤ７０に対して高い特異性で結合した。
【０５２０】
実施例４．抗ＣＤ７０抗体の腎癌細胞系の表面上に発現されるＣＤ７０への結合の特徴づけ
抗ＣＤ７０抗体のＣＤ７０を発現する腎細胞癌細胞へのその細胞表面上での結合についてフローサイトメトリーにより試験した。
【０５２１】
腎細胞癌細胞系Ａ−４９８（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−４４）、７８６−Ｏ（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１９３２）、ＡＣＨＮ（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１６１１）、Ｃａｋｉ−１（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−４６）およびＣａｋｉ−２（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−４７）の抗体結合についてそれぞれ試験した。ＨｕＭＡｂ  ２Ｈ５抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体の結合を、１×１０５個の細胞を１μｇ／ｍｌの濃度の２Ｈ５とともにインキュベートすることにより評価した。細胞を洗浄し、結合をＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて行った。結果を図１７に示す。抗ＣＤ７０モノクローナル抗体２Ｈ５は、腎癌細胞系Ａ−４９８、７８６−Ｏ、ＡＣＨＮ、Ｃａｋｉ−１およびＣａｋｉ−２に結合した。
【０５２２】
腎細胞癌細胞系７８６−ＯおよびＡ−４９８に対するＨｕＭＡｂ抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体２Ｈ５、８Ｂ５、１０Ｂ４および１８Ｅ７の異なる濃度での結合について試験した。抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体の結合を、５×１０５個の細胞を５０μｇ／ｍｌの開始濃度の抗体とともにインキュベートし、抗体を１：３の希釈で段階希釈することにより評価した。細胞を洗浄し、結合をＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて行った。結果を図１８Ａ（７８６−Ｏ）および図１８Ｂ（Ａ−４９８）に示す。染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）による測定によると、抗ＣＤ７０モノクローナル抗体２Ｈ５、８Ｂ５、１０Ｂ４および１８Ｅ７は、腎癌細胞系７８６−ＯおよびＡ−４９８に濃度依存的に結合した。抗ＣＤ７０モノクローナル抗体におけるＥＣ５０値は、７８６−Ｏ細胞系においては１．８４４ｎＭ〜６．６６９ｎＭであり、Ａ−４９８細胞系においては３．９８４ｎＭ〜１１．８４ｎＭの範囲であった。
【０５２３】
ＨｕＭＡｂ  ２Ｈ５および６９Ａ７  抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体の腎細胞癌細胞系７８６−Ｏへの結合を、２×１０５個の細胞を１０μｇ／ｍｌの濃度での２Ｈ５または６９Ａ７のいずれかとともにインキュベートすることにより評価した。アイソタイプ対照抗体を陰性対照として用いた。細胞を洗浄し、結合をＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて行った。結果を図１８Ｃに示す。両方の抗ＣＤ７０モノクローナル抗体は、腎癌細胞系７８６−Ｏに結合した。
【０５２４】
腎細胞癌細胞系７８６−Ｏに対する異なる濃度でのＨｕＭＡｂ抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体６９Ａ７の結合について試験した。抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体の結合を、５×１０５個の細胞を１０μｇ／ｍｌの開始濃度の抗体とともにインキュベートし、抗体を１：３の希釈で段階希釈することにより評価した。細胞を洗浄し、結合をＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて行った。結果を図１８Ｄに示す。染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）による測定によると、抗ＣＤ７０モノクローナル抗体６９Ａ７は、腎癌細胞系７８６−Ｏに濃度依存的に結合した。抗ＣＤ７０モノクローナル抗体６９Ａ７の７８６−Ｏ細胞への結合におけるＥＣ５０値は６．９２７ｎＭであった。
【０５２５】
これらのデータは、抗ＣＤ７０  ＨｕＭＡｂが腎細胞癌細胞系に結合することを示す。
【０５２６】
実施例５．抗ＣＤ７０抗体のリンパ腫細胞系の表面上に発現されるＣＤ７０への結合についての特徴づけ
抗ＣＤ７０抗体のＣＤ７０を細胞表面上に発現するリンパ腫細胞への結合についてフローサイトメトリーにより試験した。
【０５２７】
リンパ腫細胞系Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−２１３）、ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ登録番号ＴＩＢ−１６１）およびＲａｊｉ（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−８６）の抗体結合についてそれぞれ試験した。ＨｕＭＡｂ  ２Ｈ５抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体の結合を、１×１０５個の細胞を１μｇ／ｍｌの濃度での２Ｈ５とともにインキュベートすることにより評価した。細胞を洗浄し、結合をＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。ＣＤ７０を細胞表面上に発現しないＪｕｒｋａｔ細胞系を陰性対照として用いた。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて行った。結果を図１９に示す。染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）による測定によると、抗ＣＤ７０モノクローナル抗体２Ｈ５は、リンパ腫細胞系Ｄａｕｄｉ、ＨｕＴ７８およびＲａｊｉに結合した。
【０５２８】
リンパ腫細胞系ＲａｊｉおよびＧｒａｎｔａ５１９（ＤＳＭＺ登録番号３４２）に対するＨｕＭＡｂ抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体２Ｈ５の様々な濃度での結合について試験した。抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体の結合を、５×１０５個の細胞を５０μｇ／ｍｌの開始濃度の抗体とともにインキュベートし、抗体を１：３の希釈で段階希釈することにより評価した。アイソタイプ対照抗体を陰性対照として用いた。細胞を洗浄し、結合をＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて行った。結果を図２０Ａ（Ｒａｊｉ）および２０Ｂ（Ｇｒａｎｔａ５１９）に示す。染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）による測定によると、抗ＣＤ７０モノクローナル抗体２Ｈ５は、リンパ腫細胞系ＲａｊｉおよびＧｒａｎｔａ５１９に濃度依存的に結合した。抗ＣＤ７０抗体におけるＥＣ５０値は、Ｒａｊｉ細胞においては１．３３２ｎＭであり、Ｇｒａｎｔａ５１９細胞においては１．３３０ｎＭであった。
【０５２９】
ＨｕＭＡｂ  ２Ｈ５および６９Ａ７  抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体のＲａｊｉリンパ腫細胞系への結合を、２×１０５個の細胞を１０μｇ／ｍｌの濃度のＨｕＭＡｂとともにインキュベートすることにより評価した。細胞を洗浄し、結合をＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。アイソタイプ対照抗体および二次抗体単独を陰性対照として用いた。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて行った。結果を図２０Ｃに示す。染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）による測定によると、両方の抗ＣＤ７０モノクローナル抗体はＲａｊｉリンパ腫細胞系に結合した。
【０５３０】
競合ＦＡＣＳアッセイを行い、２Ｈ５に対する６９Ａ７の結合特異性を解明した。Ｒａｊｉ細胞を、１０μｇ／ｍｌの濃度の裸６９Ａ７、２Ｈ５、アイソタイプ対照抗体または抗体なしのいずれかとともにインキュベートした。洗浄後、細胞を１０μｇ／ｍｌの濃度のＦＩＴＣと複合した６９Ａ７とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、結合をＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて行った。結果を図２０Ｄに示す。抗ＣＤ７０抗体６９Ａ７および２Ｈ５の双方はＦＩＴＣ標識６９Ａ７の結合を遮断し、それは２Ｈ５および６９Ａ７の双方が類似の結合エピトープを共有することを示す。
【０５３１】
Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞系および７８６−Ｏ腎癌細胞の抗体結合についてさらに試験した。ＨｕＭＡｂ  ６９Ａ７抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体の結合を、２×１０５個の細胞を１μｇ／ｍｌの濃度の６９Ａ７とともにインキュベートすることにより評価した。細胞を洗浄し、結合をＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。ＣＤ７０を細胞表面上に発現しないＪｕｒｋａｔ細胞系を陰性対照として用いた。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて行った。結果を図２０Ｅに示す。染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）による測定によると、抗ＣＤ７０モノクローナル抗体６９Ａ７はＤａｕｄｉリンパ腫細胞系および７８６−Ｏ腎癌細胞系に結合した。
【０５３２】
これらのデータは、抗ＣＤ７０  ＨｕＭＡｂがリンパ腫細胞系に結合することを示す。
【０５３３】
実施例６．抗ＣＤ７０モノクローナル抗体の結合親和性のスキャッチャード分析
２Ｈ５、８Ｂ５、１０Ｂ４および１８Ｅ７モノクローナル抗体のＣＤ７０形質移入ＣＨＯ細胞系への結合親和性についてスキャッチャード分析を用いて試験した。
【０５３４】
ＣＨＯ細胞に完全長ＣＤ７０を標準の技術を用いて形質移入し、それを１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ培地中で成長させた。細胞をトリプシン処理し、トリスに基づく結合緩衝液（２４ｍＭトリス  ｐＨ７．２、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭグルコース、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡ）で１回洗浄し、細胞を結合緩衝液中で２×１０６細胞／ｍｌに調節した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅプレート（ＭＡＦＢ  ＮＯＢ）を水中の１％脱脂粉乳でコートし、４℃で一晩保存した。プレートを結合緩衝液０．２ｍｌで３回洗浄した。緩衝液５０μｌのみを最大結合のウェル（全結合）に添加した。緩衝液２５μｌのみを対照ウェル（非特異的結合）に添加した。様々な濃度の１２５Ｉ−抗ＣＤ７０抗体をすべてのウェルに２５μｌの容量で添加した。様々な濃度の１００倍過剰な未標識抗体を２５μｌの容量で対照ウェルに添加し、結合緩衝液中のＣＤ７０形質移入ＣＨＯ細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）２５μｌをすべてのウェルに添加した。プレートを、振とう器上、２００ＲＰＭで、４℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの完了時、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅプレートを冷却洗浄用緩衝液（２４ｍＭトリス  ｐＨ７．２、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭグルコース、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡ）０．２ｍｌで３回洗浄した。フィルタを除去し、ガンマカウンタで計数した。平衡結合の評価を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で単一の部位結合パラメータを用いて行った。
【０５３５】
上記のスキャッチャード結合アッセイを用い、抗体のＣＤ７０形質移入ＣＨＯ細胞に対するＫＤは、２Ｈ５においては約２．１ｎＭ、８Ｂ５においては５．１ｎＭ、１０Ｂ４においては１．６ｎＭおよび１８Ｅ７においては１．５ｎＭであった。
【０５３６】
実施例７：抗ＣＤ７０モノクローナル抗体の内在化
抗ＣＤ７０  ＨｕＭＡｂのＣＤ７０発現腎癌細胞への内在化能力について、Ｈｕｍ−Ｚａｐ内在化アッセイを用いて試験した。Ｈｕｍ−Ｚａｐアッセイでは、二次抗体の細胞毒素サポリンに複合されたヒトＩｇＧに対する親和性結合を介した一次ヒト抗体の内在化について試験する。
【０５３７】
ＣＤ７０を発現する腎癌細胞系７８６−Ｏを、ウェル１００μｌ内に１．２５×１０４細胞／ウェルで一晩播種した。抗ＣＤ７０  ＨｕＭＡｂ抗体２Ｈ５、８Ｂ５、１０Ｂ４または１８Ｅ７をウェルに３０ｎＭの開始濃度で添加し、１：３の段階希釈で減量して力価判定した。ＣＤ７０に非特異的なアイソタイプ対照抗体を陰性対照として用いた。Ｈｕｍ−Ｚａｐ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＩＴ−２２−２５）を１１ｎＭの濃度で添加し、プレートを７２時間インキュベートしておいた。次いで、プレートに１．０μＣｉの３Ｈ−チミジンを２４時間パルスし、採取し、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）で読み取った。結果を図２１に示す。抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５、８Ｂ５、１０Ｂ４および１８Ｅ７は、ＣＤ７０を発現する７８６−Ｏ腎癌細胞内で３Ｈ−チミジン取り込みにおける抗体濃度依存性の低下を示した。抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５におけるＥＣ５０値は０．９ｎＭであった。このデータは、抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５、８Ｂ５、１０Ｂ４および１８Ｅ７が腎癌細胞系に内在化することを示す。
【０５３８】
実施例８．腎細胞癌細胞系上での細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体の細胞死の評価
本実施例では、細胞増殖アッセイにおいて、サイトトキシンＤに複合された抗ＣＤ７０モノクローナル抗体（図７３）のＣＤ７０＋腎細胞癌細胞系を死滅させる能力について試験した。サイトトキシンＤはエステラーゼ活性化を必要とするプロドラッグである。
【０５３９】
抗ＣＤ７０  ＨｕＭＡｂ抗体２Ｈ５、８Ｂ５、１０Ｂ４または１８Ｅ７を、リンカー、例えばペプチジル、ヒドラゾンまたはジスルフィドリンカーを介してサイトトキシンＤに複合させた。ＣＤ７０発現腎癌細胞系ＡＣＨＮおよびＣａｋｉ−２を２．５×１０４細胞／ウェルで播種し、ＣＤ７０発現腎癌細胞系７８６−Ｏをウェル１００μｌ内に１．２５×１０４細胞／ウェルで３時間播種した。抗ＣＤ７０抗体−細胞毒素複合体をウェルに３０ｎＭの開始濃度で添加し、１：３の段階希釈で減量して力価判定した。ＣＤ７０に非特異的なアイソタイプ対照抗体を陰性対照として用いた。プレートを６９時間インキュベートしておいた。次いで、プレートに１．０μＣｉの３Ｈ−チミジンを２４時間パルスし、採取し、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）で読み取った。結果を図２２Ａ（Ｃａｋｉ−２）、２２Ｂ（７８６−Ｏ）および２２Ｃ（ＡＣＨＮ）に示す。抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５、８Ｂ５、１０Ｂ４および１８Ｅ７は、ＣＤ７０を発現するＣａｋｉ−２、７８６−ＯおよびＡＣＨＮ腎癌細胞内で３Ｈ−チミジン取り込みにおける抗体−細胞毒素の濃度依存性の低下を示した。抗ＣＤ７０抗体におけるＥＣ５０値は、ＣＡＫＩ−２細胞においては６ｎＭ〜７６ｎＭ、７８６−Ｏ細胞においては１．６ｎＭ〜３．９ｎＭ、およびＡＣＨＮ細胞においては９ｎＭ〜１０８ｎＭの範囲であった。このデータは、抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５、８Ｂ５、１０Ｂ４および１８Ｅ７が、細胞毒素に複合される場合、腎癌細胞に対して細胞毒性があることを示す。
【０５４０】
実施例９：抗ＣＤ７０抗体のＡＤＣＣ活性の評価
本実施例では、蛍光細胞毒性アッセイにおいて、抗ＣＤ７０モノクローナル抗体が抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を介してエフェクター細胞の存在下でＣＤ７０＋細胞系を死滅させる能力について試験した。
【０５４１】
ヒトエフェクター細胞を以下のように全血から調製した。ヒト末梢血単核球を標準のＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ分離によりヘパリン化全血から精製した。細胞を１０％ＦＢＳおよび２００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を採取し、培地中で４回洗浄し、２×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。標的ＣＤ７０＋細胞を、１×１０６個の標的細胞／ｍＬ当たりＢＡＴＤＡ２．５μｌでのＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）とともに３７℃で２０分間インキュベートした。標的細胞を、４回洗浄し、スピンダウンし、最終容量を１×１０５細胞／ｍｌにした。
【０５４２】
ＣＤ７０＋細胞系ＡＲＨ−７７（ヒトＢリンパ芽球性白血病；ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１６２１）、ＨｕＴ７８（ヒト皮膚リンパ球性リンパ腫；ＡＴＣＣ登録番号ＴＩＢ−１６１）、Ｒａｊｉ（ヒトＢリンパ球性バーキットリンパ腫；ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−８６）および陰性対照細胞系Ｌ５４０（ヒトホジキンリンパ腫；ＤＳＭＺ寄託番号ＡＣＣ７２）の、ヒト抗ＣＤ７０モノクローナル抗体に対する抗体特異的なＡＤＣＣについて、以下のＤｅｌｆｉａ蛍光放射分析を用いて試験した。各標的細胞系（標識標的細胞１００μｌ）を、エフェクター細胞５０μｌおよび抗体５０μｌとともにインキュベートした。実験を通じて標的対エフェクター比として１：５０を用いた。すべての試験において、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を陰性対照として用いた。２０００ｒｐｍのパルス回転および３７℃で１時間のインキュベーション後、上清を採取し、再び迅速に回転させ、上清２０μｌを平底プレートに移し、それに対してＥｕ溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）１８０μｌを添加し、ＲｕｂｙＳｔａｒリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）で読み取った。溶解率を、（試料放出−自然放出＊１００）／（最大放出−自然放出）（式中、自然放出は標的細胞のみを有するウェルからの蛍光であり、かつ最大放出は標的細胞を含有し、２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで処理されているウェルからの蛍光である）に従って計算した。ＡＲＨ−７７、ＨｕＴ７８、ＲａｊｉおよびＬ−５４０細胞系における細胞毒性の溶解率をそれぞれ図２３Ａ〜Ｄに示す。ＣＤ７０＋発現細胞系ＡＲＨ−７７、ＨｕＴ７８およびＲａｊｉの各々は、ＨｕＭＡｂ抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５および１８Ｅ７による抗体媒介性細胞毒性を示した一方、陰性対照細胞系Ｌ−５４０は抗ＣＤ７０抗体の存在下で有意な細胞毒性を有しなかった。このデータは、ＨｕＭＡｂ抗ＣＤ７０抗体がＣＤ７０＋発現細胞に対して特異的な細胞毒性を示すことを示す。
【０５４３】
実施例１０．ヒトリンパ腫細胞系上での細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体の細胞死の評価
本実施例では、細胞増殖アッセイにおいて、サイトトキシンＣに複合された抗ＣＤ７０モノクローナル抗体２Ｈ５（図７２）がＣＤ７０＋ヒトリンパ腫細胞系を死滅させる能力について試験した。サイトトキシンＣはエステラーゼ活性化を必要とするプロドラッグである。
【０５４４】
抗ＣＤ７０  ＨｕＭＡｂ抗体２Ｈ５を、リンカー、例えばペプチジル、ヒドラゾンまたはジスルフィドリンカーを介してサイトトキシンＣに複合させた。本開示の抗体に複合可能な細胞毒素化合物の例が、２００５年９月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／７２０，４９９号明細書と同時出願された出願および２００６年９月２６日に出願されたＰＣＴ公開の国際公開第０７／０３８６５８号パンフレット（これらの内容は参照により本明細書中に援用される）に記載されている。ＣＤ７０を発現するヒトリンパ腫癌細胞系Ｄａｕｄｉ、ＨｕＴ７８、Ｇｒａｎｔａ５１９およびＲａｊｉを、ウェル１００μｌ内、１０５細胞／ウェルで３時間播種した。抗ＣＤ７０抗体−細胞毒素複合体をウェルに３０ｎＭの開始濃度で添加し、１：２の段階希釈で減量して力価判定した。ＨｕＭＡｂ抗体２Ｈ５−細胞毒素複合体の試験を、細胞表面上でＣＤ７０を発現しない陰性対照細胞系のＪｕｒｋａｔ細胞に対しても行った。プレートを７２時間インキュベートしておいた。次いで、培養の終結前、プレートに０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンを８時間パルスし、採取し、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で読み取った。図２４は、２Ｈ５−複合体のＤａｕｄｉ、ＨｕＴ７８、Ｇｒａｎｔａ５１９およびＪｕｒｋａｔ細胞に対する効果を示した。抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５は、ＣＤ７０を発現するＤａｕｄｉ、ＨｕＴ７８およびＧｒａｎｔａ５１９  Ｂ細胞リンパ腫癌細胞内で３Ｈ−チミジン取り込みにおける抗体−細胞毒素の濃度依存性の低下を示したが、Ｊｕｒｋａｔ細胞内では示さなかった。
【０５４５】
別々のアッセイにおいては、ＣＤ７０を発現するヒトリンパ腫癌細胞系Ｒａｊｉをウェル１００μｌ内、１０４細胞／ウェルで３時間播種した。抗ＣＤ７０抗体−細胞毒素複合体をウェルに３０ｎＭの開始濃度で添加し、１：３の段階希釈で減量して力価判定した。細胞毒素複合体アイソタイプ対照抗体を対照として用いた。プレートを、３時間経過時の洗浄または連続洗浄のいずれかを伴い、７２時間インキュベートさせた。次いで、培養の終結前、プレートに０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンを８時間パルスし、採取し、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で読み取った。図２５Ａおよび２５Ｂの各々は、３時間洗浄または連続洗浄に伴う、Ｒａｊｉ細胞上で３Ｈ−チミジン取り込みにおける抗体−細胞毒素の濃度依存性の低下を示した。
【０５４６】
このデータは、細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体がヒトリンパ腫癌細胞に対して特異的な細胞毒性を示すことを示す。
【０５４７】
実施例１１．裸および細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体を用いるインビボでの腫瘍異種移植片モデルの治療
腎細胞癌腫瘍を移植したマウスを細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体を用いてインビボで治療し、腫瘍成長に対する抗体のインビボ効果を試験した。
【０５４８】
Ａ−４９８（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−４４）およびＡＣＨＮ（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１６１１）細胞を、標準の実験方法を用いてインビトロで増殖させた。６〜８週齢の雄Ｎｃｒ胸腺欠損ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）の右側腹に、マウス１匹当たりＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）０．２ｍｌ中、７．５×１０６個のＡＣＨＮまたはＡ−４９８細胞を皮下移植した。移植後、週２回、マウスを秤量し、その腫瘍について電子キャリパーを用いて三次元的に測定した。腫瘍体積を高さ×幅×長さとして計算した。平均２７０ｍｍ３のＡＣＨＮ腫瘍または平均１１０ｍｍ３のＡ４９８腫瘍を有するマウスを治療群に無作為化した。０日目、マウスに対し、ＰＢＳ媒体、細胞毒素に複合されたアイソタイプ対照抗体または細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０  ＨｕＭＡｂ  ２Ｈ５を腹腔内投与した。本開示の抗体に複合可能な細胞毒素化合物の例が、米国仮特許出願第６０／７２０，４９９号明細書および２００６年９月２６日に出願されたＰＣＴ公開の国際公開第０７／０３８６５８号パンフレット（これら全体は参照により本明細書中に援用される）に記載されている。Ａ−４９８試料群中のマウスを、３種の異なる細胞毒素化合物（サイトトキシンＡ（Ｎ１）、サイトトキシンＢ（図７１）、およびサイトトキシンＣ（図７２））で試験した。投与後６０日間、マウスの腫瘍成長について監視した。腫瘍が腫瘍エンドポイント（２０００ｍｍ３）に達した時、マウスを安楽死させた。
【０５４９】
結果を図２６Ａ（Ａ−４９８腫瘍）および２６Ｂ（ＡＣＨＮ腫瘍）に示す。細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５は、腫瘍エンドポイント体積（２０００ｍｍ３）に達するまでの平均時間を延長し、腫瘍成長の進行を遅延させた。したがって、抗ＣＤ７０抗体−細胞毒素複合体による治療は、腫瘍成長に対して直接のインビボ阻害効果を有した。
【０５５０】
実施例１２．２Ｈ５の場合での免疫組織化学
抗ＣＤ７０  ＨｕＭＡｂ  ２Ｈ５の免疫組織化学によるＣＤ７０に対する認識能について、明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）、リンパ腫およびグリア芽腫の患者由来の臨床生検を用いて試験した。
【０５５１】
免疫組織化学においては、５μｍの凍結切片を用いた（Ａｒｄａｉｓ  Ｉｎｃ、ＵＳＡ）。３０分間乾燥後、切片をアセトンで固定し（室温で１０分間）、５分間風乾した。スライドをＰＢＳですすぎ、次いでＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清とともに２０分間予備インキュベートし、次いで１０％正常ヤギ血清を有するＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ化（ｆｉｔｃｙｌａｔｅｄ）２Ｈ５とともに室温で３０分間インキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳで３回洗浄し、マウス抗ＦＩＴＣ（１０μｇ／ｍｌのＤＡＫＯ）とともに室温で３０分間インキュベートした。スライドをＰＢＳで再洗浄し、ヤギ抗マウスＨＲＰ複合体（ＤＡＫＯ）とともに室温で３０分間インキュベートした。スライドをＰＢＳで３回再洗浄した。ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ）を基質として用いた結果、茶色の染色が得られた。スライドを、蒸留水で洗浄後、ヘマトキシリンで１分間対比染色した。次いで、スライドを流れる蒸留水で１０秒間洗浄し、グリセルゲル（ＤＡＫＯ）でマウントした。臨床生検の免疫組織化学染色は、非ホジキンリンパ腫、形質細胞腫、ｃｃＲｃｃおよびグリア芽腫切片においては陽性染色を呈した。各場合において、悪性細胞のみが陽性であり、隣接する正常組織は染色されなかった。
【０５５２】
実施例１３．脱フコシル化ＨｕＭＡｂの産生
フコシル残基の量が減少した抗体が抗体のＡＤＣＣ能を増大させることが示されている。本実施例では、フコシル残基が欠損している２Ｈ５  ＨｕＭＡｂが産生されている。
【０５５３】
フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）が欠損したＣＨＯ細胞系Ｍｓ７０４−ＰＦを、抗体２Ｈ５の重鎖および軽鎖を発現するベクターでエレクトロポレートした。薬剤耐性クローンを、６ｍＭのＬ−グルタミンおよび５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を有するＥｘ−Ｃｅｌｌ  ３２５−ＰＦ  ＣＨＯ培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）内での成長により選択した。クローンにおけるＩｇＧの発現を標準ＥＬＩＳＡアッセイによりスクリーニングした。２つの別々のクローンＢ８Ａ６およびＢ８Ｃ１１が産生され、それらは１．０〜３．８ピコグラム／細胞／日の範囲の産生速度を有した。
【０５５４】
実施例１４．脱フコシル化抗ＣＤ７０抗体のＡＤＣＣ活性の評価
本実施例では、蛍光細胞毒性アッセイにおいて、脱フコシル化されたまた脱フコシル化されていない抗ＣＤ７０モノクローナル抗体が、抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を介してエフェクター細胞の存在下でＣＤ７０＋細胞系を死滅させる能力について試験した。
【０５５５】
ヒト抗ＣＤ７０モノクローナル抗体２Ｈ５を上記のように脱フコシル化した。ヒトエフェクター細胞を以下のように全血から調製した。ヒト末梢血単核球を、標準のＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ分離によりヘパリン化全血から精製した。細胞を１０％ＦＢＳ（培地）および２００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ１６４０倍地中に再懸濁し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を回収し、培地中で１回洗浄し、２×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。標的ＣＤ７０＋細胞を、２．５ｍＭのプロベネシドを補充した培地（アッセイ培地）中で、１×１０６個の標的細胞／ｍＬ当たりＢＡＴＤＡ２．５μｌでのＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）とともに３７℃で２０分間インキュベートした。アッセイ培地中で、標的細胞を、２０ｍＭヘペスおよび２．５ｍＭプロベネシドを有するＰＢＳで４回洗浄し、スピンダウンし、最終容量を１×１０５細胞／ｍｌにした。
【０５５６】
ＣＤ７０＋細胞系ＡＲＨ−７７（ヒトＢリンパ芽球性白血病；ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１６２１）、ＭＥＣ−１（ヒト慢性Ｂ細胞白血病；ＤＳＭＺ登録番号ＡＣＣ４９７）、ＳＵ−ＤＨＬ−６（ヒトＢ細胞リンパ腫、ＤＳＭＺ登録番号Ａｃｃ５７２）、ＩＭ−９（ヒトＢリンパ芽球性；ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−１５９）およびＨｕＴ７８（ヒト皮膚リンパ球性リンパ腫；ＡＴＣＣ登録番号ＴＩＢ−１６１）の、脱フコシル化されたまた脱フコシル化されていないヒト抗ＣＤ７０モノクローナル抗体２Ｈ５に対する抗体特異的なＡＤＣＣについて、以下のＤｅｌｆｉａ蛍光放射分析を用いて試験した。標的細胞系ＡＲＨ７７（標識標的細胞１００μｌ）を、５０μｌのエフェクター細胞および５０μｌの２Ｈ５または脱フコシル化２Ｈ５抗体のいずれかとともにインキュベートした。実験を通じて標的対エフェクター比として１：５０を用いた。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を陰性対照として用いた。２１００ｒｐｍのパルス回転および３７℃で１時間のインキュベーション後、上清を採取し、再び迅速に回転させ、上清２０μｌを平底プレートに移し、それに対してＥｕ溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）１８０μｌを添加し、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  ＴＲＦプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。溶解率を、（試料放出−自然放出＊１００）／（最大放出−自然放出）（式中、自然放出は標的細胞のみを有するウェルからの蛍光であり、かつ最大放出は標的細胞を含有し、３％Ｌｙｓｏｌで処理されているウェルからの蛍光である）に従って計算した。ＡＲＨ−７７細胞系における細胞毒性の特異的溶解率を図２７Ａ〜Ｆに示す。ＣＤ７０＋発現細胞系ＡＲＨ−７７、ＭＥＣ−１、ＳＵ−ＤＨＬ−６、ＩＭ−９およびＨｕＴ７８は、ＨｕＭＡｂ抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５での抗体媒介性細胞毒性と、抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５の脱フコシル化形態に関連した特異的溶解率の増加を示した。さらに、抗ＣＤ１６抗体はＭＥＣ−１細胞系におけるＡＤＣＣ効果を遮断することが示された。このデータは、脱フコシル化ＨｕＭＡｂ抗ＣＤ７０抗体がＣＤ７０＋発現細胞に特異的な細胞毒性の増大を示すことを示す。
【０５５７】
実施例１５．５１Ｃｒ−放出アッセイを用いての抗ＣＤ７０抗体のＡＤＣＣ活性の評価
本実施例では、５１Ｃｒ−放出アッセイにおいて、抗ＣＤ７０モノクローナル抗体が、抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）によりエフェクター細胞の存在下でＣＤ７０＋Ｒａｊｉ  Ｂリンパ球細胞を死滅させる能力について試験した。
【０５５８】
ヒト末梢血単核球（エフェクター細胞）を、標準のＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ分離によりヘパリン化全血から精製した。細胞を１０％ＦＢＳおよび２００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ１６４０倍地中に２×１０６／ｍＬで再懸濁し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を回収し、培地中で１回洗浄し、２×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。２００万個の標的Ｒａｊｉ細胞（ヒトＢリンパ球性バーキットリンパ腫；ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−８６）を、全容量１ｍｌでの２００μＣｉ５１Ｃｒとともに３７℃で１時間インキュベートした。標的細胞を、１回洗浄し、培地１ｍｌ中に再懸濁し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。最終のインキュベーション後、標的細胞を１回洗浄し、最終容量を１×１０５細胞／ｍｌにした。最終のＡＤＣＣアッセイにおいては、標識Ｒａｊｉ細胞１００μｌをエフェクター細胞５０μｌおよび抗体５０μｌとともにインキュベートした。実験を通じて標的対エフェクター比として１：１００を用いた。すべての試験において、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を陰性対照として用いた。一部の試験では、ＰＢＭＣのアッセイプレートへの添加に先立ち、ＰＢＭＣ培養物を、２０μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ１６抗体、無関係のマウスＩｇＧ１抗体、または抗体なしのいずれかを含有するチューブに等しく分離した。２７℃で１５分間のインキュベーション後、血球を洗浄なしで上記のように用いた。３７℃で４時間のインキュベーション後、上清を採取し、２４０〜４００ｋｅＶの読み取り窓を備えたＣｏｂｒａ  ＩＩ自動ガンマカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上で計数した。１分当たりの計数値を抗体濃度の関数としてプロットし、データを、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用い、非線形回帰、Ｓ字形用量応答（ｓｉｇｍｏｉｄａｌ  ｄｏｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（可変性の傾き（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ））により分析した。溶解率を、方程式：溶解率＝（試料ＣＰＭ−抗体なしのＣＰＭ）／（ＴｒｉｔｏｎＸ  ＣＰＭ−抗体なしのＣＰＭ）×１００により決定した。Ｒａｊｉ細胞系における細胞毒性の特異的溶解率に対する抗体適定曲線を図２８に示す。このデータは、抗ＣＤ７０抗体がＲａｊｉ細胞系に対してＡＤＣＣ効果を有することを示す。Ｒａｊｉ細胞に対する抗ＣＤ７０抗体におけるＥＣ５０値は３６ｎＭであった。抗ＣＤ１６抗体の存在下でのＲａｊｉ細胞に対する細胞毒性のグラフを図２９に示す。このデータは、Ｒａｊｉ細胞に対する抗ＣＤ７０抗体のＡＤＣＣ効果がＣＤ１６に依存することを示す。
【０５５９】
実施例１６．活性化Ｔ細胞に対する抗ＣＤ７０抗体のＡＤＣＣ活性の評価
本実施例では、蛍光細胞毒性アッセイにおいて、脱フコシル化されたまた脱フコシル化されていない抗ＣＤ７０モノクローナル抗体が、抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）によりエフェクター細胞の存在下で活性化Ｔ細胞を死滅させる能力について試験した。
【０５６０】
ヒト抗ＣＤ７０モノクローナル抗体２Ｈ５を上記のように脱フコシル化した。ヒトエフェクター細胞を上記のように調製した。ヒト脾臓Ｔ細胞を抗ＣＤ３がコートされた磁気ビーズ（純度＞９０％）で陽性選択した。細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８がコートされたビーズおよびＩｓｃｏｖｅ培地＋１０％熱不活性化ＦＣＳ中の２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２で６日間刺激した。ＡＤＣＣアッセイに含める前に、細胞を採取し、ヨウ化プロピジウム取り込みにより生存度をアッセイし（６０％生存）、生存細胞でのＣＤ７０の発現についてゲーティングし、分析した（生存細胞上に約６５％のＣＤ７０＋）。
【０５６１】
活性化Ｔ細胞の、脱フコシル化されたまた脱フコシル化されていないヒト抗ＣＤ７０モノクローナル抗体２Ｈ５に対する抗体特異的なＡＤＣＣについて、以下のＤｅｌｆｉａ蛍光放射分析を用いて試験した。標的活性化Ｔ細胞（標識標的細胞１００μｌ）を、エフェクター細胞５０μｌおよび５０μｌの２Ｈ５または脱フコシル化２Ｈ５抗体のいずれかとともにインキュベートした。実験を通じて標的対エフェクター比として１：５０を用いた。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を陰性対照として用いた。２１００ｒｐｍのパルス回転および３７℃で１時間のインキュベーション後、上清を採取し、再び迅速に回転させ、上清２０μｌを平底プレートに移し、それに対してＥｕ溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）１８０μｌを添加し、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  ＴＲＦプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。溶解率を、（試料放出−自然放出＊１００）／（最大放出−自然放出）（式中、自然放出は標的細胞のみを有するウェルからの蛍光であり、かつ最大放出は標的細胞を含有し、３％Ｌｙｓｏｌで処理されているウェルからの蛍光である）に従って計算した。活性化Ｔ細胞における細胞毒性の特異的溶解率を図３０に示す。活性化Ｔ細胞は、ＨｕＭＡｂ抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５での抗体媒介性細胞毒性と、抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５の脱フコシル化形態に関連した特異的溶解率の増加を示した。抗ＣＤ７０抗体の脱フコシル化されたまた脱フコシル化されていないの双方の形態での抗ＣＤ１６抗体の添加により、抗体媒介性細胞毒性は遮断された。対照ＩｇＧは細胞毒性に対する効果を全く有しなかった。このデータは、脱フコシル化ＨｕＭＡｂ抗ＣＤ７０抗体が活性化Ｔ細胞に特異的な細胞毒性の増大を示すことを示す。
【０５６２】
実施例１７．受容体−リガンドＣＤ７０−ＣＤ２７結合についての遮断アッセイ
本実施例では、抗ＣＤ７０モノクローナル抗体の、ＣＤ７０とリガンドＣＤ２７との相互作用に対する遮断能について、遮断アッセイを用いて試験した。
【０５６３】
ウェルを、４℃、２μｇ／ｍｌでの１００μｌ／ウェルの抗ＩｇＧ抗体（Ｆｃ−ｓｐ．）で一晩コートした。ウェルを、２００μｌ／ウェルの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで、室温で１時間遮断した。各ウェルに対し、０．１６μｇ／ｍｌでの１００μｌ／ウェルのＣＤ２７−Ｆｃ−ｈｉｓを、振とうしながら３７℃で１時間添加した。各ウェルを２００μｌ／ウェルのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％（ｖ：ｖ））で５回洗浄した。抗ＣＤ７０抗体を１０％ＮＨＳ＋１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で希釈し、０．０５μｇ／ｍｌでのＣＤ７０−ｍｙｃ−ｈｉｓと混合し、室温で１時間インキュベートし、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％（ｖ：ｖ））で５回洗浄した。ＣＤ７０／ＣＤ２７相互作用を遮断する既知の抗体を陽性対照として用い、アイソタイプ対照抗体を陰性対照として用いた。ＣＤ７０および抗ＣＤ７０抗体の混合物を抗Ｆｃ抗体で遮断し、１００μｌ／ウェルのＣＤ７０−ｍｙｃ−ｈｉｓ＋抗体を、ＣＤ２７−Ｆｃ−ｈｉｓを含有するウェルに添加した。混合物を３７℃で振とうしながら１時間インキュベートした。混合物に対し、１００μｌ／ウェルの抗ｍｙｃ−ＨＲＰ（１０％ＮＨＳ＋１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、１：１０００の希釈）を添加し、３７℃で振とうしながら１時間インキュベートした。シグナルを１００μｌのＴＭＢ基質の添加により検出し、室温で５〜１０分間インキュベートし、次いで７５μｌの０．２５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加し、結果をＡ４５０ｎｍで読み取った。結果を図３１に示す。このデータは、２Ｈ５、８Ｂ５、および１８Ｅ７を含む一部の抗ＣＤ７０抗体がＣＤ７０のＣＤ２７への結合を遮断する一方、他の抗体がＣＤ７０とＣＤ２７の間の相互作用に作用しないことを示す。
【０５６４】
実施例１８．裸抗ＣＤ７０抗体を用いての腫瘍異種移植片モデルのインビボ治療
リンパ腫腫瘍を移植したマウスを裸抗ＣＤ７０抗体でインビボ治療し、腫瘍成長に対する抗体のインビボ効果を試験した。
【０５６５】
ＡＲＨ−７７（ヒトＢリンパ芽球性白血病；ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１６２１）およびＲａｊｉ（ヒトＢリンパ球性バーキットリンパ腫；ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−８６）細胞を、標準の実験方法を用いてインビトロで増殖させた。６〜８週齢の雄Ｎｃｒ胸腺欠損ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）の右側腹に、マウス１匹当たりＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）０．２ｍｌ中、５×１０６個のＡＲＨ−７７またはＲａｊｉ細胞を皮下移植した。移植後、週２回、マウスを秤量し、その腫瘍について電子キャリパーを用いて三次元的に測定した。腫瘍体積を高さ×幅×長さ／２として計算した。平均８０ｍｍ３のＡＲＨ−７７腫瘍または平均１７０ｍｍ３のＲａｊｉ腫瘍を有するマウスを治療群に無作為化した。０日目、マウスに対し、ＰＢＳ媒体、アイソタイプ対照抗体または裸抗ＣＤ７０  ＨｕＭＡｂ  ２Ｈ５を腹腔内投与した。腫瘍が腫瘍エンドポイント（２０００ｍｍ３）に達した時、マウスを安楽死させた。結果を図３２Ａ（Ｒａｊｉ腫瘍）および３２Ｂ（ＡＲＨ−７７腫瘍）に示す。裸抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５は、腫瘍エンドポイント体積（２０００ｍｍ３）に達するまでの平均時間を延長し、腫瘍成長の進行を遅延させた。したがって、抗ＣＤ７０抗体単独による治療は、腫瘍成長に対して直接のインビボ阻害効果を有する。
【０５６６】
実施例１９．細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体を用いてのリンパ腫腫瘍異種移植片モデルのインビボ治療
リンパ腫腫瘍を移植したマウスを細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体でインビボ治療し、腫瘍成長に対する抗体のインビボ効果を試験した。
【０５６７】
ＡＲＨ−７７（ヒトＢリンパ芽球性白血病；ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１６２１）、Ｇｒａｎｔａ５１９（ＤＳＭＺ登録番号３４２）およびＲａｊｉ（ヒトＢリンパ球性バーキットリンパ腫；ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−８６）細胞を、標準の実験方法を用いてインビトロで増殖させた。６〜８週齢の雄Ｎｃｒ胸腺欠損ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）の右側腹に、マウス１匹当たりＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）０．２ｍｌ中、５×１０６個のＡＲＨ−７７、１０×１０６個のＧｒａｎｔａ５１９または５×１０６個のＲａｊｉ細胞を皮下移植した。移植後、週２回、マウスを秤量し、その腫瘍について電子キャリパーを用いて三次元的に測定した。腫瘍体積を高さ×幅×長さ／２として計算した。平均８０ｍｍ３（ＡＲＨ−７７）、２２０ｍｍ３（Ｇｒａｎｔａ５１９）、または１７０ｍｍ３（Ｒａｊｉ）の腫瘍を有するマウスを治療群に無作為化した。０日目、マウスに対し、ＰＢＳ媒体、細胞毒素に複合されたアイソタイプ対照抗体または細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０  ＨｕＭＡｂ  ２Ｈ５を腹腔内投与した。この実験で用いた複合体は、Ｎ１におけるリンカーの切断により放出される遊離毒素であった。本開示の抗体に複合可能な細胞毒素化合物の例が、２００５年９月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／７２０，４９９号明細書および２００６年９月２６日に出願されたＰＣＴ公開の国際公開第０７／０３８６５８号パンフレット（これらの内容は参照により本明細書中に援用される）に記載されている。腫瘍が腫瘍エンドポイント（２０００ｍｍ３）に達した時、マウスを安楽死させた。結果を図３３Ａ（ＡＲＨ−７７）、３３Ｂ（Ｇｒａｎｔａ５１９）および３３Ｃ（Ｒａｊｉ腫瘍）に示す。細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５は、腫瘍エンドポイント体積（２０００ｍｍ３）に達するまでの平均時間を延長し、腫瘍成長の進行を遅延させた。したがって、抗ＣＤ７０抗体−細胞毒素複合体による治療は、リンパ腫腫瘍成長に対して直接のインビボ阻害効果を有する。
【０５６８】
実施例２０．抗ＣＤ７０抗体とアカゲザルＢリンパ腫細胞との交差反応
ＦＡＣＳ分析を用い、抗ＣＤ７０抗体６９Ａ７がアカゲザルＣＤ７０＋Ｂリンパ腫細胞系ＬＣＬ８６６４（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１８０５）と交差反応する能力を評価した。ＨｕＭＡｂ  ６９Ａ７抗ＣＤ７０ヒトモノクローナル抗体の結合を、１×１０５個の細胞を１μｇ／ｍｌの濃度での６９Ａ７とともにインキュベートすることにより評価した。細胞を洗浄し、結合をＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。アイソタイプ対照抗体を陰性対照として用いた。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて行った。結果を図３４に示す。結果は、抗ＣＤ７０抗体６９Ａ７がサルＣＤ７０＋Ｂリンパ腫細胞と交差反応することを示した。
【０５６９】
実施例２１．７８６−Ｏ腎癌細胞への結合時における抗ＣＤ７０抗体の内在化
７８６−Ｏヒト腎癌細胞系を用い、細胞への結合時におけるＨｕＭａｂ抗ＣＤ７０抗体６９Ａ７および２Ｈ５の内在化について免疫蛍光染色を用いて試験した。７８６−Ｏ細胞（９６ウェルプレート内、１×１０４細胞／１００μｌ／ウェル）を組織培養フラスコから０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡでの処理により採取し、次いでＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋５％ＦＢＳ、培地）中、５μｇ／ｍｌでの各ＨｕＭａｂ抗ＣＤ７０抗体とともに氷上で３０分間インキュベートした。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を陰性対照として用いた。培地での２回の洗浄後、細胞を培地（１００μｌ／ウェル）中に再懸濁し、次いで１：１００の希釈でのＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ）と複合したヤギ抗ヒト二次抗体とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を、０分時に蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）下で形態および免疫蛍光強度について直ちに画像化するかまたは３７℃で様々な時間インキュベートした。蛍光がＨｕＭａｂ抗ＣＤ７０抗体で染色した細胞において観察されたが、対照抗体の場合には観察されなかった。同様の結果が、アッセイにおいてＦＩＴＣと直接複合したＨｕＭａｂ抗ＣＤ７０抗体の場合に観察された。結果は、０分時に両方の抗ＣＤ７０  ＨｕＭＡｂを有する細胞表面膜上で蛍光の出現を示した。３０分間のインキュベーション後、膜蛍光強度が有意に低下する一方、内部蛍光が増大した。１２０分の時点で膜蛍光は明確でなかったのに対し、細胞内区画内に存在するように見られた。データは、ＨｕＭａｂ抗ＣＤ７０抗体がＣＤ７０を発現する内因性腫瘍細胞への結合時に特異的に内在化されうることを示す。
【０５７０】
実施例２２．ＨｕＭＡｂ抗ＣＤ７０は既知のマウス抗ＣＤ７０抗体の結合を遮断する
この実験では、ＨｕＭＡｂ抗ＣＤ７０抗体６９Ａ７の、既知のマウス抗ＣＤ７０抗体のＣＤ７０＋腎癌７８６−Ｏ細胞への結合に対する遮断能について試験した。７８６−Ｏ細胞を、１μｇ／ｍｌでのマウス抗ＣＤ７０抗体ＢＵ−６９（Ａｎｃｅｌｌ、Ｂａｙｐｏｒｔ、ＭＮ）および１、５もしくは１０μｇ／ｍｌでのＨｕＭＡｂ６９Ａ７とともに氷上で２０分間インキュベートした。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２アイソタイプ対照抗体を陰性対照として用いた。細胞を２回洗浄し、結合をＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて行った。結果を図３５に示す。抗ＣＤ７０  ＨｕＭＡｂ  ６９Ａ７は、濃度依存的にマウス抗ＣＤ７０抗体の結合を遮断する。
【０５７１】
実施例２３．ＨｕＭＡｂ抗ＣＤ７０は炎症性応答を阻害する
この実験では、ＨｕＭＡｂ抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５の炎症性応答の阻害について試験した。マウスＣＤ３２（ＣＨＯ−Ｓ／ｍＣＤ３２細胞）を安定的に形質移入したＣＨＯ−Ｓ細胞に、完全長ヒトＣＤ７０コンストラクト（ＣＨＯ−Ｓ／ｍＣＤ３２／ＣＤ７０細胞）を一時的に形質移入した。表面での発現を、２Ａ５およびＰＥと複合した抗ヒトＩｇＧ二次抗体を用いるフローサイトメトリーにより確認した（データは示さず）。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（カタログ番号１５０６１；ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）で精製したヒト末梢血ＣＤ３＋Ｔ細胞を、９６ウェルプレートの３通りのウェル内で、１×１０５個のＣＨＯ−Ｓ／ｍＣＤ３２またはＣＨＯ−Ｓ／ｍＣＤ３２／ＣＤ７０細胞／ウェル、１μｇ／ｍｌの抗ｈＣＤ３（クローンＯＫＴ３；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＨｕＭＡｂ  ２Ｈ５または非フコシル化２Ｈ５（２Ｈ５  ＮＦ）のいずれかの段階希釈物で、１×１０６個／ウェルでインビトロで刺激した。３日後、上清の一定分量を採取し、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）の分泌を定量ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により測定した。プレートに対して１μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジンをパルスし、それを８時間インキュベートし、細胞を採取し、３Ｈ−チミジン取り込みをＴｒｉｌｕｘ（登録商標）１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ，Ｉｎｃ．）で読み取った。ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を陰性対照として用いた。結果を図３６Ａ〜Ｂに示す。２Ｈ５および２Ｈ５  ＮＦの双方は、用量依存的にＣＤ７０で共刺激された増殖を完全に阻害した（図３６Ａ）。データはまた、２Ｈ５による阻害が、２Ｈ５が抗ＣＤ３＋ＣＨＯ−Ｓ／ｍＣＤ３２媒介性の増殖に対する効果を全く有しなかったことから、ＣＤ７０共刺激に対して特異的であることを示す。同様に、２Ｈ５および２Ｈ５  ＮＦの双方は用量依存的にＣＤ７０で共刺激されたＩＮＦ−γ分泌を完全に阻害した（図３６Ｂ）。データはまた、２Ｈ５阻害が、２Ｈ５が抗ＣＤ３＋ＣＨＯ−Ｓ／ｍＣＤ３２媒介性のＩＮＦ−γ分泌に対する効果を全く有しなかったようにＣＤ７０共刺激に対して特異的であることを示す。併せると、データは２Ｈ５および２Ｈ５  ＮＦがＣＤ７０ヒトＴ細胞共刺激を機能的に遮断することを示す。
【０５７２】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に特異的なＴ細胞応答について予備スクリーニングされたヒトＭＨＣクラスＩハプロタイプＢ＊３５０１＋末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（Ａｓｔａｒｔｅ，Ｉｎｃ）を、２５ｎｇ／ｍｌのＢ＊３５０１に結合するＣＭＶペプチドＩＰＳＩＮＶＨＨＹ（配列番号９０）（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）およびＨｕＭＡｂ  ２Ｈ５の段階希釈物の存在下で１１日間培養した。培養物を、フローサイトメトリーにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞についてはＰＥと複合された抗ＣＤ８染色（クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、ペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞についてはＡＰＣ標識ペプチド−ＭＨＣクラスＩ五量体オリゴマー染色（Ｆ１１４−４Ｂ；ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）によって、また生存度についてはヨウ化プロピジウム染色の欠如によって分析した。アイソタイプ対照抗体を陰性対照として用いた。結果を図３７Ａ〜Ｃに示す。２Ｈ５はペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を部分的に阻害し、かつ２Ｈ５  ＮＦおよび陽性対照の抗ＭＨＣクラスＩ抗体（クローンＷ６／３２；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）はペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を完全に阻害した（図３７Ａ）。観察された細胞全体の生存度の低下は全く有意でなかった（図３７Ｂ）。ＣＤ８＋細胞の総数に有意な減少は全く認められなかった（図３７Ｃ）。併せると、データは、２Ｈ５および２Ｈ５  ＮＦの効果がペプチドで刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞に対して特異的であったことを示す。データは、同じドナーを用いて行われた１つの追加実験を表す。
【０５７３】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に特異的なＴ細胞応答について予備スクリーニングしたヒトＭＨＣクラスＩハプロタイプＢ＊３５０１＋ＰＢＭＣ（Ａｓｔａｒｔｅ，Ｉｎｃ）を、２５ｎｇ／ｍｌのＢ＊３５０１に結合するＣＭＶペプチドＩＰＳＩＮＶＨＨＹ（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）（配列番号９０）の存在下で、また、２０μｇ／ｍｌのＨｕＭＡｂ  ２Ｈ５を、抗ヒトＣＤ１６（ＦｃＲγＩＩＩ）を機能的に遮断する抗体（クローン３Ｇ８；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の段階希釈物の存在下または不在下で１１日間培養し、次いで上記のようにペプチドに特異的なＣＤ８＋細胞数についてフローサイトメトリーにより分析した。結果を図３８に示す。抗ＣＤ１６によるペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の２Ｈ５および２Ｈ５  ＮＦ媒介性の阻害での用量依存性の反転は、２Ｈ５および２Ｈ５  ＮＦ阻害が２Ｈ５および２Ｈ５  ＮＦとＣＤ１６＋エフェクター細胞との相互作用により媒介されることを示す。２Ｈ５  ＮＦ媒介性の阻害を反転させるため、２Ｈ５に対して約１０００倍多い３Ｇ８が必要であった。３Ｇ８の濃度に無関係にアイソタイプ陰性対照によるペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の阻害は全くなく、陽性対照Ｗ６／３２の機能的遮断によるペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の阻害に対する３Ｇ８の効果はほぼ皆無であった。
【０５７４】
実施例２４．細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体を用いての腎癌腫瘍異種移植片モデルのインビボ治療
腎癌腫瘍を移植したマウスを細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体でインビボ治療し、腫瘍成長に対する抗体のインビボ効果を試験した。本実施例では、抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５をＮ２に複合させた。Ｎ２はエステラーゼ活性化を必要とするプロドラッグである。
【０５７５】
７８６−Ｏ（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１９３２）およびＣａｋｉ−１（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−４６）細胞を、標準の実験方法を用いてインビトロで増殖させた。６〜８週齢の雄ＣＢ１７．ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）の右側腹に、マウス１匹当たりＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）０．２ｍｌ中、２５０万個の７８６−ＯまたはＣａｋｉ−１細胞を皮下移植した。移植後、週２回、マウスを秤量し、その腫瘍について電子キャリパーを用いて三次元的に測定した。腫瘍体積を高さ×幅×長さとして計算した。平均２００ｍｍ３の腫瘍を有するマウスを治療群に無作為化した。０日目、マウスに対し、ＰＢＳ媒体、細胞毒素に複合されたアイソタイプ対照抗体または細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０  ＨｕＭＡｂ  ２Ｈ５を腹腔内投与した。本開示の抗体に複合可能な細胞毒素化合物の例が、２００５年９月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／７２０，４９９号明細書および２００６年９月２６日に出願されたＰＣＴ公開の国際公開第０７／０３８６５８号パンフレット（これらの内容は参照により本明細書中に援用される）に記載されている。腫瘍が腫瘍エンドポイント（２０００ｍｍ３）に達した時、マウスを安楽死させた。結果を図３９Ａ（７８６−Ｏ）および図３９Ｂ（Ｃａｋｉ−１）に示す。Ｎ２に複合された抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５は、腫瘍エンドポイント体積（２０００ｍｍ３）に達するまでの平均時間を延長し、腫瘍成長の進行を遅延させた。治療動物においては１０％未満の体重変化があった。
【０５７６】
したがって、抗ＣＤ７０抗体−細胞毒素複合体による治療は、リンパ腫腫瘍成長に対して直接のインビボ阻害効果を有する。
【０５７７】
実施例２５．抗ＣＤ７０免疫複合体を用いての腎細胞癌異種移植片モデルのインビボ治療
腎癌腫瘍を移植したマウスを細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体でインビボ治療し、腫瘍成長に対する抗体のインビボ効果を試験した。
【０５７８】
チオール化抗ＣＤ７０  ２Ｈ５抗体に結合された複合体Ｎ１またはＮ２の免疫複合体を過去に記載のように調製した（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２４３１７号明細書；およびＰＣＴ出願のＰＣＴ／ＵＳ２００６／３７７９３号明細書を参照）。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに２．５×１０６個の７８６−Ｏ細胞を皮下移植した。腫瘍形成を、平均腫瘍体積が（高精度キャリパーを用いて）約８０ｍｍ３であることが測定されるまで監視した。腫瘍担持マウス８匹からなる群を、（ａ）媒体対照、（ｂ）免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ１、または（ｃ）免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２のうちの１つの単回投与で治療した。免疫複合体の抗ＣＤ７０−Ｎ１および抗ＣＤ７０−Ｎ２を、マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に、それぞれＮ１相当の０．３μｍｏｌ／ｋｇおよびＮ２相当の０．１μｍｏｌ／ｋｇの用量で投与した。抗ＣＤ７０−Ｎ１群は、１回目の投与後の２１日目に同用量で２回目の治療を受けた。腫瘍成長を、実験の６２日間にわたって高精度キャリパーを用いた測定により監視した。
【０５７９】
図４０で明らかなように、免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ１または抗ＣＤ７０−Ｎ２による単回投与治療の結果、媒体対照のみで治療される場合に実質的な腫瘍成長を有するマウスに対し、１５日以内に腫瘍を有しないマウスが得られた（最大６２日間、腫瘍を有しない状態が維持された）。
【０５８０】
実施例２６．免疫複合体抗ＣＤ７０  Ｎ２を用いての腎細胞癌異種移植片モデルのインビボ治療
腎癌腫瘍を移植したマウスを細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体でインビボ治療し、腫瘍成長に対する抗体のインビボ効果を試験した。
【０５８１】
チオール化抗ＣＤ７０  ２Ｈ５抗体に結合された複合体Ｎ２の免疫複合体を実施例２５に記載のように調製した。ＳＣＩＤマウスに、マウス１匹当たり、ＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ０．１ｍｌ中、２．５×１０６個の７８６−Ｏ細胞を皮下移植した。腫瘍形成を、平均腫瘍体積が（高精度キャリパーを用いて）約１０５ｍｍ３であることが測定されるまで監視した。腫瘍担持マウス８匹からなる群を、（ａ）媒体対照、（ｂ）アイソタイプ対照、（ｃ）抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５単独、または（ｄ）免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２のうちの１つの単回投与で治療した。免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２およびアイソタイプ対照−Ｎ２（ＩｇＧ−Ｎ２）を、マウスの腹腔内に、Ｎ２相当の０．１μｍｏｌ／ｋｇの用量で投与した。抗ＣＤ７０抗体を１０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、免疫複合体ＣＤ７０−Ｎ２において用いられるＮ２相当に対して等しいタンパク質用量）で投与した。腫瘍成長を、実験の６２日間にわたって高精度キャリパーを用いた測定により監視した。
【０５８２】
図４１で明らかなように、免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２による単回の低用量治療の結果、対照または抗ＣＤ７０抗体単独のみで治療される場合に実質的な腫瘍成長を有するマウスに対し、１０日以内に最低限検出可能な腫瘍を有するマウスが得られた（そして最大６２日間、その状態が維持された）。
【０５８３】
実施例２７．免疫複合体抗ＣＤ７０  Ｎ２に対するインビボでの腎細胞癌異種移植片の用量応答
腎癌腫瘍を移植したマウスを細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体でインビボ治療し、腫瘍成長に対する抗体のインビボ効果を試験した。
【０５８４】
チオール化抗ＣＤ７０  ２Ｈ５抗体に結合された複合体Ｎ２の免疫複合体を実施例２５に記載のように調製した。ＳＣＩＤマウスに、マウス１匹当たり、ＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ０．１ｍｌ中、２．５×１０６個の７８６−Ｏ細胞を皮下移植した。腫瘍形成を、平均腫瘍体積が（高精度キャリパーを用いて）約２８０ｍｍ３であることが測定されるまで監視した。腫瘍担持マウス８匹からなる群を、（ａ）媒体対照または（ｂ）免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２のいずれかで治療した。免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２を、各群のマウスの腹腔内に、Ｎ２相当の０．０３μｍｏｌ／ｋｇ、０．０１μｍｏｌ／ｋｇ、または０．００５μｍｏｌ／ｋｇのうちの１つの用量で投与した。腫瘍成長を、実験を通じて高精度キャリパーを用いた測定により監視した。
【０５８５】
図４２で明らかなように、極めて低い用量の免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２により腫瘍体積が減少し、用量依存的に腫瘍体積の減少が生じた。
【０５８６】
実施例２８．別の腎細胞癌異種移植片モデルについてのインビボでの免疫複合体抗ＣＤ７０  Ｎ２の有効性
腎癌腫瘍を移植したマウスを細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体でインビボ治療し、腫瘍成長に対する抗体のインビボ効果を試験した。
【０５８７】
チオール化抗ＣＤ７０  ２Ｈ５抗体に結合された複合体Ｎ２の免疫複合体を実施例２５に記載のように調製した。ＳＣＩＤマウスに、マウス１匹当たり、ＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ０．１ｍｌ中、２．５×１０６個のＣａｋｉ−１細胞を皮下移植した。腫瘍形成を、平均腫瘍体積が（高精度キャリパーを用いて）約１０５ｍｍ３であることが測定されるまで監視した。腫瘍担持マウス８匹からなる群を、（ａ）媒体対照、（ｂ）アイソタイプ対照、（ｃ）抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５単独、または（ｄ）免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２のうちの１つの単回投与で治療した。免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２およびアイソタイプ対照−Ｎ２を、マウスの腹腔内にＮ２相当の０．３μｍｏｌ／ｋｇの用量で投与した。抗ＣＤ７０抗体を１１．５ｍｇ／ｋｇ（すなわち、免疫複合体ＣＤ７０−Ｎ２において用いられるＮ２相当に対して等しいタンパク質用量）で投与した。腫瘍成長を、実験の６２日間にわたって高精度キャリパーを用いた測定により監視した。
【０５８８】
図４３で明らかなように、免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２による単回投与治療の結果、対照または抗ＣＤ７０抗体単独のみで治療される場合に実質的な腫瘍成長を有するマウスに対し、最大約４０日間で最低限検出可能な腫瘍を有するマウスが得られた。したがって、抗ＣＤ７０免疫複合体は複数の腎癌モデルに対して有効である。
【０５８９】
実施例２９．リンパ腫モデルにおけるインビボでの免疫複合体抗ＣＤ７０  Ｎ２の有効性
リンパ腫腫瘍を移植したマウスを細胞毒素に複合された抗ＣＤ７０抗体でインビボ治療し、腫瘍成長に対する抗体のインビボ効果を試験した。
【０５９０】
チオール化抗ＣＤ７０  ２Ｈ５抗体に結合された複合体Ｎ２の免疫複合体を実施例２５に記載のように調製した。ＳＣＩＤマウスに、マウス１匹当たり、ＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ０．１ｍｌ中、１．０×１０７個のＲａｊｉ細胞を皮下移植した。腫瘍形成を、平均腫瘍体積が（高精度キャリパーを用いて）約５０ｍｍ３であることが測定されるまで監視した。腫瘍担持マウス８匹からなる群を、（ａ）媒体対照、（ｂ）アイソタイプ対照、または（ｃ）免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２のうちの１つの単回投与で治療した。免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２を、マウスの腹腔内にＮ２相当の０．３μｍｏｌ／ｋｇの用量で投与した。腫瘍成長を、実験の６０日間にわたって高精度キャリパーを用いた測定により監視した。
【０５９１】
図４４で明らかなように、免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２による単回投与治療の結果、対照または抗ＣＤ７０抗体単独のみで治療される場合に実質的な腫瘍成長を有するマウスに対し、最大約４０日間で最低限検出可能な腫瘍を有するマウスが得られた。したがって、抗ＣＤ７０免疫複合体はまた、リンパ腫に対して有効である。
【０５９２】
実施例３０．免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２の安全性試験
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｎ２相当の０．１μｍｏｌ／ｋｇ、０．３μｍｏｌ／ｋｇ、０．６μｍｏｌ／ｋｇ、または０．９μｍｏｌ／ｋｇのうちの１つの用量での免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２の腹腔内投与で治療した。マウスの重量を、最初の１２日間は毎日、またその後は投与後に最大６０日間にわたり定期的に測定した。マウスを、体重減少が開始体重の２０％を超える時、安楽死させた。図４５にプロットしたデータは各群における平均体重である。
【０５９３】
図４５で明らかなように、抗ＣＤ７０−Ｎ２免疫複合体は、Ｎ２相当の０．９μｍｏｌ／ｋｇ未満の用量で投与される場合、良好な耐性を示しかつ安全であった。したがって、免疫複合体抗ＣＤ７０−Ｎ２の有効性が示されている用量（Ｎ２相当の約０．００５〜０．３μｍｏｌ／ｋｇの範囲）は良好な安全性特性を有することになる。
【０５９４】
実施例３１．免疫複合体抗ＣＤ７０  Ｎ２のさらなる安全性試験
雄ビーグル犬における免疫複合体抗ＣＤ７０  Ｎ２のさらなる安全性試験を実施した。免疫複合体を薬剤単独の場合と比較した。ビーグル犬２匹の各々に対し、Ｎ２相当の０．１８μｍｏｌ／ｋｇでの免疫複合体抗ＣＤ７０  Ｎ２および０．１５μｍｏｌ／ｋｇでの（Ｎ２構造内にリンカーを有しない）Ｎ２薬剤単独を静脈内投与した。イヌを投与後４時間にわたり毎時監視し、２８日間にわたり１日２回臨床観察を行った。体重を、投与後８日目まで毎日、その後は週単位で測定した。標準の血液学、凝固および臨床化学について、予備投与（ｐｒｅｄｏｓｅ）期中および投与後３、７、１４および２８日目に２回実施した。結果を図４６Ａ〜Ｄに示す。薬剤なしの群におけるイヌ１匹を、毒性の臨床徴候に応じて投与後８日目に安楽死させた。図４６Ａ〜Ｄに示されるように、抗ＣＤ７０−Ｎ２免疫複合体は治療されたイヌにより良好な耐性を示した。
【０５９５】
実施例３２．活性化ヒトＢ細胞の抗ＣＤ７０抗体媒介性ＡＤＣＣ
この試験では、ＨｕＭＡｂ抗ＣＤ７０抗体および非フコシル化形態の、ヒトＢ細胞に対するＡＤＣＣ効果に対する媒介能について試験した。凍結ヒト脾臓細胞を解凍し、Ｂ細胞を磁気ビーズにより陰性として精製した。精製Ｂ細胞を、ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、β−ＭＥおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中、２×１０６／ｍｌで培養した。Ｂ細胞を１０μｇ／ｍｌのＬＰＳおよび５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０により３日間活性化した。細胞を採取し、洗浄し、一定分量をビオチンと複合した非フコシル化２Ｈ５（２Ｈ５  ＮＦ−ｂｉｏ）＋ストレプトアビジン−ＡＰＣで染色した。ヒト末梢血単核エフェクター細胞を、標準のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離によりヘパリン化全血から精製し、５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で一晩培養した。活性化Ｂ細胞を、１×１０６個の細胞当たり１００μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）で１時間標識した。エフェクター細胞を、２Ｈ５および２Ｈ５  ＮＦ（非フコシル化）の段階希釈物の存在下で標識標的細胞に１：１００の比で添加した。さらに、試験項目について、２０μｇ／ｍｌのマウス抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８またはマウスアイソタイプ対照抗体の存在下で１０μｇ／ｍｌでアッセイした。３７℃で４時間のインキュベーション後、細胞を遠心分離し、上清を、２４０〜４００ＫｅＶの読み取り窓を備えたＣｏｂｒａ  ＩＩ自動ガンマカウンタ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。特異的溶解率を、（実験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×１００に従って計算し、ここでは（ｉ）自然放出においては標的細胞はエフェクター細胞も抗体対照も全く有しないでかつ（ｉｉ）最大放出においては標的およびエフェクター細胞は３％Ｌｙｓｏｌ洗剤対照の存在下である。特異的溶解率を抗体濃度に対してプロットし、データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）３．０ソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用い、非線形回帰、Ｓ字形用量応答（可変性の傾き）により分析した。
【０５９６】
データを図４７に示す。２Ｈ５  ＮＦは活性化Ｂ細胞の約６０％に結合する。２Ｈ５  ＮＦおよび２Ｈ５の双方は、活性化ヒトＢ細胞の溶解を誘発したが、２Ｈ５  ＮＦは２Ｈ５よりも約１０倍強力でかつ有効であった。抗体誘発性溶解の抗ＣＤ１６の反転により、抗体媒介性溶解の作用機序がＮＫ細胞媒介性のＡＤＣＣであることが確認される。したがって、２Ｈ５および２Ｈ５  ＮＦの双方は、ヒト活性化Ｂ細胞のＡＤＣＣを媒介する。
【０５９７】
実施例３３．抗ＣＤ７０抗体による、ＣＭＶ抗原で刺激されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖のインビトロでの阻害
この試験では、抗ＣＤ７０抗体の、刺激されたヒトＰＢＭＣ培養物中に自然に存在するエフェクター細胞によるＡＤＣＣを介した、抗原で活性化されたＣＤ７０＋ヒトＴ細胞（自己免疫疾患および炎症性疾患における炎症性プロセスに対する主要な寄与因子である細胞）の溶解に対する媒介能が示される。
【０５９８】
ＣＭＶ陽性の予備スクリーニングされたドナーを、２４ウェル培養プレート上、１×１０６細胞／ｍｌで１０％熱不活性化ＦＣＳを補充したＡＩＭ−Ｖ培地中で培養し、２μｇ／ｍｌのビオチン化２Ｈ５、２Ｈ５  ＮＦまたはｈＩｇＧ１ｎｆ対照抗体の存在下で、５．０μｇ／ｍｌのＣＭＶ溶解物で刺激した。細胞を９日目に採取し、各培養物中の生存細胞数／ｍｌを、一定分量を血球計数器およびトリパンブルー排除を用いて計数することにより測定した。細胞を染色緩衝液で洗浄し、５％ヒト血清でブロッキングした。ビオチン化２Ｈ５、２Ｈ５  ＮＦ、またはｈＩｇＧ１ｎｆを、２０μｇ／ｍｌの最終濃度で等容量の細胞に添加した。細胞を３０分間インキュベートし、洗浄し、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣおよびＰＥ複合ストレプトアビジンで染色した。細胞を再び３０分間インキュベートし、２回洗浄し、次いでＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットを用い、固定して膜透過させた。細胞をパーム／洗浄用緩衝液で２回洗浄し、抗ＩＮＦγ−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｃｌｏｎｅ  Ｂ２７）で細胞内染色を行った。細胞を３０分間インキュベートし、洗浄し、染色緩衝液中に再懸濁した。細胞を、ＣＤ７０表面におけるフローサイトメトリーにより分析し、ＩＮＦγの細胞内発現を生存ＣＤ４＋細胞上でのゲーティングにより分析した。各条件下でのＣＤ４＋／ＣＤ７０＋およびＣＤ４＋／ＩＮＦγ＋細胞の数／ｍｌを、ＣＤ４ゲート内のＣＤ７０＋またはＩＮＦγ＋細胞のパーセント×全ＣＤ４＋細胞のパーセント×生存可能細胞の総数／ｍｌ（（％ＣＤ７０＋またはＩＮＦγ＋）×（％ＣＤ４＋）×（全生存可能細胞／ｍｌ））により計算した。
【０５９９】
データを図４８に示す。２μｇ／ｍｌでの２Ｈ５および２Ｈ５  ＮＦは、９日目、ＣＭＶで活性化されたＣＤ７０＋／ＣＤ４＋細胞をそれぞれ６７％および９７％低下させた。両方の抗体は有効であったが、抗原で活性化されたＣＤ４＋／ＣＤ７０＋Ｔ細胞のＡＤＣＣを正常なヒト血液中に存在するＣＤ１６＋エフェクター細胞により媒介するのに２Ｈ５  ＮＦは２Ｈ５よりも強力であった。
【０６００】
実施例３４．ヒトＣＤ７０抗体１Ｆ４、１Ｆ４  ＮＦおよび２Ｈ５  ＮＦのＣＤ７０＋腎癌細胞系７８６−Ｏへの結合についての相対的結合特性
この試験では、抗ＣＤ７０抗体の天然に発現するＣＤ７０＋ヒト癌細胞系７８６−Ｏ細胞に対する結合特性について検討した。ヒト腎細胞腺癌細胞系７８６−Ｏはコンフルエンスに成長し、それをトリプシンで採取し、染色緩衝液で洗浄し、１Ｆ４、１Ｆ４ＮＦ、２Ｈ５  ＮＦ、ｈＩｇＧ１−ＮＦまたはｈＩｇＧ４（それぞれ３０、１０、３、１、０．４、０．１、０．０４および０．０１μｇ／ｍｌの最終濃度）とともにインキュベートした。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、染色緩衝液で２回洗浄し、ヤギＦ（ａｂ）’２−抗ヒト−ＩｇＧ（Ｆｃ）−ＰＥ複合体で３０分間染色した。フローサイトメトリーによる分析のため、細胞を洗浄し、染色緩衝液中に再懸濁した。
【０６０１】
データを図４９に示す。２Ｈ５  ＮＦは１Ｆ４および１Ｆ４  ＮＦよりも低い濃度で結合する。２Ｈ５  ＮＦは、天然細胞表面に発現されるＣＤ７０に対して１Ｆ４および１Ｆ４  ＮＦよりも高い結合親和性を有する。１Ｆ４および１Ｆ４  ＮＦは７８６−Ｏ細胞系に等しく十分に結合し、ＮＦアイソタイプに起因して特異的結合特性の作用を全く示さない。
【０６０２】
実施例３５．１Ｆ４および１Ｆ４  ＮＦの、ＣＤ７０＋リンパ腫細胞系ＡＲＨ７７に対するＡＤＣＣを媒介する相対的能力
この試験では、フコシル化および非フコシル化（ｎｆ）抗ＣＤ７０抗体の、ＣＤ７０＋リンパ腫細胞系ＡＲＨ７７に対するＡＤＣＣを媒介する相対的能力について試験した。ヒト末梢血単核エフェクター細胞を、標準のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離によりヘパリン化全血から精製し、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で一晩培養した。ＡＲＨ７７細胞を１×１０６個の細胞当たり１００μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）で１時間標識した。エフェクター細胞を、２Ｈ５および２Ｈ５ｎｆの段階希釈物の存在下、１：１００の比での標識標的細胞に添加した。さらに、試験項目について５μｇ／ｍｌでアッセイした。３７℃で４時間のインキュベーション後、細胞を遠心分離し、上清を、２４０〜４００ＫｅＶの読み取り窓を備えたＣｏｂｒａ  ＩＩ自動ガンマカウンタ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。特異的溶解率を、（実験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×１００に従って計算した。ここでは（ｉ）自然放出においては標的細胞はエフェクター細胞も抗体対照も全く有しないでかつ（ｉｉ）最大放出においては標的およびエフェクター細胞は３％Ｌｙｓｏｌ洗剤対照の存在下である。
【０６０３】
データを図５０に示す。１Ｆ４および１Ｆ４  ＮＦの双方は、ＣＤ７０＋ＡＲＨ７７細胞に対するＡＤＣＣを媒介し、１Ｆ４  ＮＦは１Ｆ４よりも強力なＡＤＣＣのメディエーターである。
【０６０４】
実施例３６．抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥによるインビボでの腫瘍成長阻害
異なる腫瘍細胞に対する標的化治療薬としての抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥ複合体の広範な有用性を実証するため、ＳＣＩＤマウスにおける３つの腎細胞癌異種移植片モデルおよび２つのリンパ腫モデルを用い、インビボでの抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥ複合体の有効性を試験した。ＣＤ７０抗体２Ｈ５の細胞毒素複合体は本明細書中で抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥと称され、それはサイトトキシンＥに結合された組換え２Ｈ５抗ＣＤ７０抗体からなり（図７４）、２００６年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／８８２，４６１号明細書（その内容全体は参照により本明細書中に具体的に援用される）にさらに記載されている。サイトトキシンＥはプロドラッグ形態であり、活性のため、抗体からの放出だけでなく活性部分を放出するための４’カルバメート基の切断を必要とする。
【０６０５】
７８６−Ｏ細胞異種移植片上での抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥの活性を実証するため、マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中の２５０万個の７８６−Ｏ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が１１０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス８匹からなる群を、０．００５、０．０３または０．１μｍｏｌ／ｋｇ体重のいずれかでの抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥの単回投与の腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に対し、媒体単独、抗ＣＤ７０抗体単独（０．０３および０．１μｍｏｌ／ｋｇでの抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥで用いられる用量に等しい用量）、または０．０３および０．１μｍｏｌ／ｋｇの用量でのサイトトキシンＥに結合されたアイソタイプ対照抗体のいずれかを注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの重量を、試験を通じて記録し、投与後６１日間にわたって続けた。結果を図５１に示す。この免疫不全状態の特定のマウス異種移植片モデルでは、規定用量での裸ＣＤ７０抗体による治療は腫瘍体積に対する効果を示さなかった（すなわち腫瘍成長を阻害しなかった）。アイソタイプ対照もまた、腫瘍成長に対する効果をほとんど有しなかった。それに対し、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥ複合体は用量依存性の抗腫瘍有効性を明らかに示した。特異的複合体の治療効果は、０．０３μｍｏｌ／ｋｇであっても最大であるように思われる。
【０６０６】
次いで、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥの活性が、Ａ４９８腫瘍異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおいて示された。Ａ４９８細胞（マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中５００万個）をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が１１０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス８匹からなる群を、０．０３、０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重のいずれかでの抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥの単回投与の腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に媒体単独を注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの重量を、試験を通じて記録し、投与後約６０日間にわたって続けた。結果を図５２に示す。結果は、このモデルでは抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥ複合体が腎癌の治療において有効でありかつ治療が用量依存性であることを示す。
【０６０７】
次いで、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥの活性が、Ｃａｋｉ−１腫瘍異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおいて示された。Ｃａｋｉ−１細胞（マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中２５０万個）をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が１５０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス８匹からなる群を、０．０３、０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重のいずれかでの抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥの単回投与の腹腔内注射により治療した。さらに追加の群を用い、１４日で分け、０．１μｍｏｌ／ｋｇでの抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥ複合体の２用量の投与による反復投与療法の効果を試験した。さらに、対照群に媒体単独を注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの重量を、試験を通じて記録し、投与後６２日間にわたって続けた。結果を図５３に示す。結果は、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥ複合体がＣａｋｉ−１腫瘍を担持するマウスにおける腎癌の治療において有効でありかつ治療が用量依存性であることを示す。
【０６０８】
リンパ腫のモデルにおける抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥの活性を実証するため、皮下Ｒａｊｉ異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおいて治験を行った。Ｒａｊｉ細胞（マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中１０００万個）をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が２５０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス８匹からなる群を、０．０３、０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重での抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥの単回投与の腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に対し、媒体単独または０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重でのサイトトキシンＥに結合されたアイソタイプ対照抗体を注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの重量を、試験を通じて記録し、投与後約６０日間にわたって続けた。結果を図５４に示す。結果は、このモデルでは抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥ複合体がリンパ腫の治療において有効でありかつ治療が用量依存性であることを示す。
【０６０９】
第２のリンパ腫モデルについてはＤａｕｄｉ異種移植片を用いて行った。Ｄａｕｄｉ細胞（マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中１０００万個）をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が７０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス８匹からなる群を、０．１または０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重のいずれかでの抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥの単回投与の腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に対し、抗ＣＤ７０抗体単独または０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重でのアイソタイプ対照抗体サイトトキシンＥ複合体を注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの重量を、試験を通じて記録し、投与後約６０日間にわたって続けた。結果を図５５に示す。この免疫不全状態の特定のマウス異種移植片モデルでは、規定用量での裸ＣＤ７０抗体による治療は腫瘍体積に対する効果を示さなかった（すなわち腫瘍成長を阻害しなかった）。それに対し、このモデルでは抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥ複合体はリンパ腫に対して有効でありかつその治療は用量依存性である。
【０６１０】
有効性が複数の種で観察されうることを実証するため、ヌードラットにおける異種移植片モデルを試験した。このモデルでは、全身γ照射ヌードラットにＣａｋｉ−１細胞（ラット１匹当たり０．２ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０中１０００万個）を皮下移植し、腫瘍が１００ｍｍ３の平均サイズに達した時、ラット群を、０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重のいずれかでの抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥの単回投与の腹腔内注射により治療した。あるいは複数回投与治療を行い、ここではラットは８、１５および２２日目に０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重の３回の投与を受けた。さらに、対照群に対し、単回用量として０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重でまたは同複数回投与治療において、媒体単独、抗ＣＤ７０抗体単独またはアイソタイプ対照抗体サイトトキシンＥ複合体を注射した。腫瘍体積（ＬＷ２／２）およびラットの重量を、試験を通じて記録した。結果を図５６に示す。この免疫不全状態の特定のマウス異種移植片モデルでは、規定用量での裸ＣＤ７０抗体による治療は腫瘍体積に対する効果を示さなかった（すなわち腫瘍成長を阻害しなかった）。それに対し、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥ複合体は顕著な抗腫瘍効果を示した。有効性は複数回投与治療で増大するとともに、動物の体重に対して有意な効果はなかった。反復投与治療の場合でさえ、アイソタイプ対照複合体が示す腫瘍成長に対する効果ははるかに低かった。
【０６１１】
抗ＣＤ７０複合体の安全性を３つの異なる動物種において試験した。正常なｂａｌｂ／ｃマウス５匹からなる群に対し、０．１、０．３、０．６および０．９μｍｏｌ／ｋｇ体重の用量で抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥを腹腔内投与し、動物の体重を６０日間にわたり監視し、媒体単独を注射した動物と比較した。試験を通じて、対照動物は１０〜２０％の体重増加を得た。抗ＣＤ７０−サイトトキシンＥを投与したマウスは、複合体が一般に良好な耐性を示し、より低い用量では体重に対する効果がほとんどないことを示した。明確な毒性において用量依存性の増大があるとともに、高用量により回復前の動物の体重の一時的減少がもたらされた。それに対し、複合体は異種移植片モデルにおける有効性にとって必要な用量を超える用量で良好な耐性を示す。結果を図５７に示す。
【０６１２】
イヌおよびサルの双方における毒性についても試験した。イヌ３匹からなる群に対して０．１、０．２、０．３、０．４および０．６μｍｏｌ／ｋｇ体重で投与し、サル２匹からなる群に対して０．２、０．４、０．６および０．８μｍｏｌ／ｋｇ体重で投与した。各試験においては、全白血球数および血小板数が抗ＣＤ７０抗体−サイトトキシンＥ複合体における毒性に対して特に感受性が高い指標と考えられることからそれらに対して特別な注意を払った。イヌにおいては、用量が０．６μｍｏｌ／ｋｇ体重に達するまで観察される細胞数の変化は全く有意でなかった。この用量では、血小板数における一時的減少が生じ、白血球数も減少した。サルにおいては、任意の用量でこれらのパラメータの変化はほとんど観察されなかった。両方の試験は、動物における抗ＣＤ７０複合体の毒性用量が異種移植片モデルにおける有効用量よりも有意に高いことを裏付けている。結果を図５８（イヌの結果）および５９（サルの結果）に示す。
【０６１３】
実施例３７．抗ＣＤ７０−サイトトキシンＦによるインビボでの腫瘍成長阻害
本実施例では、腎癌および１つのリンパ腫の２つの異種移植片モデルにおける抗ＣＤ７０−サイトトキシンＦの有効性が示される。ＣＤ７０抗体２Ｈ５の細胞毒素複合体は本明細書中でＣＤ７０−サイトトキシンＦと称され、それはサイトトキシンＦに結合された組換え２Ｈ５抗ＣＤ７０抗体からなる（図７５）。サイトトキシンＦはエステラーゼ活性化を必要とするプロドラッグである。
【０６１４】
７８６−Ｏ細胞異種移植片に対する抗ＣＤ７０−サイトトキシンＦの活性を実証するため、マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中２５０万個の７８６−Ｏ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が１１０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス８匹からなる群を、０．００５、０．０３もしくは０．１μｍｏｌ／ｋｇ体重のいずれかでの抗ＣＤ７０−サイトトキシンＦの単回投与の腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に対し、媒体単独または０．０３および０．１μｍｏｌ／ｋｇの用量でのサイトトキシンＦに結合されたアイソタイプ対照抗体のいずれかを注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの重量を、試験を通じて記録し、投与後６２日間にわたって続けた。結果を図６０に示す。この免疫不全状態の特定のマウス異種移植片モデルでは、規定用量での裸ＣＤ７０抗体による治療は腫瘍体積に対する効果を示さなかった（すなわち腫瘍成長を阻害しなかった）。アイソタイプ対照複合体もまたこの実験において腫瘍成長に対する効果をほとんど有しなかった一方、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＦで治療されたマウスは用量依存性の抗腫瘍有効性を明らかに示した。特定の複合体の治療効果は、０．０３μｍｏｌ／ｋｇであっても最大であるように思われた。
【０６１５】
次いで、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＦの活性がＣａｋｉ−１腫瘍異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおいて示された。Ｃａｋｉ−１細胞（マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中２５０万個）をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が１２０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス８匹からなる群を、０．０３、０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重のいずれかでの抗ＣＤ７０−サイトトキシンＦの単回投与の腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に媒体単独を注射した。腫瘍体積およびマウスの重量を、試験を通じて記録し、投与後６２日間にわたって続けた。結果を図６１に示す。結果は、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＦ複合体がＣａｋｉ−１腫瘍を担持するマウスにおいて有効でありかつ治療が用量依存性であることを示す。
【０６１６】
リンパ腫のモデルにおける抗ＣＤ７０−サイトトキシンＦの活性を実証するため、皮下Ｒａｊｉ異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおいて治験を行った。Ｒａｊｉ細胞（マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中１０００万個）をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が２５０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス８匹からなる群を、０．０３、０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重のいずれかでの抗ＣＤ７０−サイトトキシンＦの単回投与の腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に対し、媒体単独または０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重でのサイトトキシンＦに結合されたアイソタイプ対照抗体を注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの重量を、試験を通じて記録し、投与後約６０日間にわたって続けた。結果を図６２に示す。結果は、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＦ複合体がリンパ腫に対しても有効でありかつ治療が用量依存性であることを示す。
【０６１７】
実施例３８．抗ＣＤ７０−サイトトキシンＧによるインビボでの腫瘍成長阻害
本実施例では、腎癌の２つの異種移植片モデルにおける抗ＣＤ７０−サイトトキシンＧの有効性が示される。ＣＤ７０抗体２Ｈ５の細胞毒素複合体は本明細書中でＣＤ７０−サイトトキシンＧと称され、それはサイトトキシンＧに結合された組換え２Ｈ５抗ＣＤ７０抗体からなる（図７６）。サイトトキシンＧはエステラーゼ活性化を必要とするプロドラッグである。
【０６１８】
７８６−Ｏ細胞異種移植片に対する抗ＣＤ７０−サイトトキシンＧの活性を実証するため、マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中、２５０万個の７８６−Ｏ細胞をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が１１０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス８匹からなる群を、０．００５、０．０３もしくは０．１μｍｏｌ／ｋｇ体重のいずれかでの抗ＣＤ７０−サイトトキシンＧの単回投与の腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に対し、媒体単独または０．０３および０．１μｍｏｌ／ｋｇの用量でのサイトトキシンＧに結合されたアイソタイプ対照抗体のいずれかを注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの重量を、試験を通じて記録し、投与後６１日間にわたって続けた。結果を図６３に示す。結果は、この実験において抗ＣＤ７０抗体単独またはアイソタイプ対照複合体が腫瘍の成長に対する効果をほとんど有しない一方、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＧで治療されたマウスが用量依存性の抗腫瘍有効性を明らかに示すことを示す。
【０６１９】
次いで、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＧの活性がＣａｋｉ−１腫瘍異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおいて示された。Ｃａｋｉ−１細胞（マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中２５０万個）をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が１２０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス８匹からなる群を、０．０３、０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重のいずれかでの抗ＣＤ７０−サイトトキシンＧの単回投与の腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に媒体単独を注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの重量を、試験を通じて記録し、投与後６１日間にわたって続けた。結果を図６４に示す。結果は、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＧ複合体がＣａｋｉ−１腫瘍を担持するマウスにおける腎癌に対して有効でありかつ治療が用量依存性であることを示す。
【０６２０】
実施例３９．抗ＣＤ７０−サイトトキシンＨによるインビボでの腫瘍成長阻害
本実施例では、腎癌の２つの異種移植片モデルにおける抗ＣＤ７０−サイトトキシンＨの有効性が示される。ＣＤ７０抗体２Ｈ５の細胞毒素複合体は本明細書中でＣＤ７０−サイトトキシンＨと称され、それはサイトトキシンＨに結合された組換え２Ｈ５抗ＣＤ７０抗体からなる（図７７）。
【０６２１】
抗ＣＤ７０−サイトトキシンＨの活性がＡ４９８腫瘍異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおいて示された。Ａ４９８細胞（マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中５００万個）をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が１１０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス８匹からなる群を、０．１μｍｏｌ／ｋｇ体重での抗ＣＤ７０−サイトトキシンＨの単回投与の腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に媒体単独を注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの重量を、試験を通じて記録し、投与後約６０日間にわたって続けた。これらの結果を図６５に示す。結果は、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＨ複合体が腎癌に対して有効であることを示す。
【０６２２】
Ｃａｋｉ−１細胞異種移植片に対する抗ＣＤ７０−サイトトキシンＨの活性を実証するため、マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中、２５０万個のＣａｋｉ−１細胞をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が１３０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス８匹からなる群を、０．０３、０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重のいずれかでの抗ＣＤ７０−サイトトキシンＨの単回投与の腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に対し、媒体単独または０．１および０．３μｍｏｌ／ｋｇの用量でのサイトトキシンＨに結合されたアイソタイプ対照抗体のいずれかを注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの重量を、試験を通じて記録し、投与後６１日間にわたって続けた。結果を図６６に示す。この免疫不全状態の特定のマウス異種移植片モデルでは、規定用量での裸ＣＤ７０抗体による治療は腫瘍体積に対する効果を示さなかった（すなわち腫瘍成長を阻害しなかった）。アイソタイプ対照複合体もまた、この実験において腫瘍の成長に対する効果をほとんど有しない。それに対し、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＨ複合体は用量依存性の抗腫瘍有効性を明らかに示す。
【０６２３】
実施例４０．抗ＣＤ７０−サイトトキシンＩによるインビボでの腫瘍成長阻害
本実施例では、ＳＣＩＤマウスにおける７８６−Ｏ細胞およびヌードラットにおけるＣａｋｉ−１細胞といった腎癌の２つの異種移植片モデルにおける抗ＣＤ７０−サイトトキシンＩの有効性が示されている。ＣＤ７０抗体２Ｈ５の細胞毒素複合体は本明細書中でＣＤ７０−サイトトキシンＩと称され、それはサイトトキシンＩに結合された組換え２Ｈ５抗ＣＤ７０抗体からなる（図７８）。
【０６２４】
抗ＣＤ７０−サイトトキシンＩの活性が７８６−Ｏ腫瘍異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおいて示された。７８６−Ｏ細胞（マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中２５０万個）をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が１７０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス６匹からなる群を、０．００５μｍｏｌ／ｋｇ体重での抗ＣＤ７０−サイトトキシンＩの単回投与の腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に媒体単独を注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの重量を、試験を通じて記録した。結果を図６７に示す。これらの結果は、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＩ複合体が低用量であっても腎癌に対して有効であることを示す。
【０６２５】
有効性が複数の種において観察されうることを実証するため、ヌードラットにおける異種移植片モデルを試験した。このモデルでは、ヌードラットにＣａｋｉ−１細胞（ラット１匹当たり０．２ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０中１０００万個）を皮下移植し、腫瘍が１００ｍｍ３の平均サイズに達した時、ラット群を０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重での抗ＣＤ７０−サイトトキシンＩの単回投与の腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に対し、媒体単独、抗ＣＤ７０抗体単独または単回用量として０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重でのアイソタイプ対照抗体サイトトキシンＩ複合体を注射した。腫瘍体積（ＬＷ２／２）およびラットの重量を、試験を通じて記録した。結果を図６８に示す。結果は、ＣＤ７０抗体単独が腫瘍成長に対する効果をほとんど有することなく、かつアイソタイプ対照複合体が腫瘍成長に対する効果を全く示さないことを示す。しかし、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＩ複合体は顕著な抗腫瘍効果を示す。腫瘍の緩解が得られた。したがって、抗ＣＤ７０−サイトトキシンＩ複合体は複数の種において抗腫瘍効果を示す。
【０６２６】
実施例４１．抗ＣＤ７０−サイトトキシンＪによるインビボでの腫瘍成長阻害
本実施例では、ＳＣＩＤマウスにおける７８６−Ｏ細胞といった腎癌の異種移植片モデルにおける抗ＣＤ７０−サイトトキシンＪの有効性が示されている。ＣＤ７０抗体２Ｈ５の細胞毒素複合体は本明細書中でＣＤ７０−サイトトキシンＪと称され、それはサイトトキシンＪに結合された組換え２Ｈ５抗ＣＤ７０抗体からなる（図７９）。サイトトキシンＪは、活性化のためのグルクロニダーゼによる切断を必要とするプロドラッグである。
【０６２７】
抗ＣＤ７０−サイトトキシンＪの活性が７８６−Ｏ腫瘍異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおいて示された。７８６−Ｏ細胞（マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中２５０万個）をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が１７０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス６匹からなる群を、０．０３μｍｏｌ／ｋｇ体重での抗ＣＤ７０−サイトトキシンＪの単回投与の腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に媒体単独を注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの重量を、試験を通じて記録した。結果を図６９に示す。結果は、このモデルにおいて抗ＣＤ７０−サイトトキシンＪ複合体が腎癌に対して有効であることを示す。
【０６２８】
実施例４２．抗ＣＤ７０抗体によるＣＤ７０で共刺激されたＴ細胞増殖の機能遮断
本実施例は、抗ＣＤ７０抗体１Ｆ４  ＩｇＧ１、１Ｆ４  ＩｇＧ４、２Ｈ５、２Ｈ５  Ｆ（ａｂ’）２および２Ｈ５  ＦａｂによるＣＤ７０で共刺激されたＴ細胞増殖の機能遮断の分析および特徴づけについて記載する。
【０６２９】
ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＭＡＣＳ  ＣＤ３  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを用いて冷凍保存したＰＢＭＣから単離し、次いで、マウスＣＤ３２およびヒトＣＤ７０の双方を安定的に形質移入したマイトマイシンＣで処理したＣＨＯ細胞の存在下、ＲＰＭＩ−１６４０完全培地＋１０％熱不活性化ＦＣＳ中、２×１０６細胞／ｍｌで培養した。細胞を１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）で３日間刺激し、１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンを６時間添加し、細胞を採取した。増殖を、シンチレーション計数により取り込まれるＣＰＭとして測定した。
【０６３０】
データは、１Ｆ４および２Ｈ５抗体が、用量依存的に、ヒト抗ＣＤ３で刺激されたＴ細胞により、ＣＤ７０媒介性のＣＤ２７シグナル伝達で誘発される増殖を遮断しうることを示す。データはまた、２Ｈ５による機能遮断が非典型的には活性の遮断に作用するためのＩｇＧ１  Ｆｃ領域媒介性の細胞表面ＣＤ７０の多量体化を必要とする一方、１Ｆ４は典型的には必要としないことを示す。図７０を参照のこと。２Ｈ５により結合されたエピトープのその異常な特性は、２Ｈ５  Ｆ（ａｂ’）２の機能遮断の有効性の低下および２Ｈ５  ＩｇＧ１に対する２Ｈ５  Ｆａｂの機能遮断活性の完全な欠如により示される。それに対し、１Ｆ４  ＩｇＧ４の１Ｆ４  ＩｇＧ１と等価な機能遮断活性は、典型的には機能遮断活性を有する抗体で観察されるように、１Ｆ４により結合されたエピトープが典型的には活性の遮断に作用するためのＩｇＧ１  Ｆｃ領域媒介性のＣＤ７０の多量体化を必要としないことを示す。
【０６３１】
したがって、これらのデータは、２Ｈ５が、ＣＤ７０媒介性のヒトＴ細胞活性化の機能遮断についての異常でかつ場合によっては固有の特性を有するエピトープに結合することを示す。さらに、２Ｈ５により結合されたエピトープはまた、好ましくは２Ｈ５  ＩｇＧ１または２Ｈ５  ＮＦ媒介性のＡＤＣＣ、内在化、親和性などの質および効力に寄与しうる。
【０６３２】
抗体１Ｆ４および２Ｈ５の、ヒト抗ＣＤ３で刺激されたＴ細胞による、ＣＤ７０媒介性のＣＤ２７シグナル伝達で誘発される増殖に対する遮断能は、ＣＤ７０機能が疾患の進行に関与する場合での任意の炎症徴候の治療に関連性がある。
【０６３３】
配列識別表
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【図１Ａ】
2010513306.tif 000082
【図１Ｂ】
2010513306.tif 000083
【図２Ａ】
2010513306.tif 000084
【図２Ｂ】
2010513306.tif 000085
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2010513306.tif 000089
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2010513306.tif 000092
【図６Ｂ】
2010513306.tif 000093
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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