(57)【要約】  本発明は、成分に結合する臓器ホーミング分子、組織ホーミング分子又は腫瘍細胞ホーミング分子を含むコンジュゲートを提供する。かかる成分は、例えば、オリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ、遺伝子、ウイルス、タンパク質、医薬品、又は検出剤とすることができる。また、本発明は、病理を有する又は有することが疑われる対象に、脳細胞、神経細胞、又は神経系起源若しくは神経外胚葉起源の腫瘍細胞にホーミングし、かかる細胞と結合し、かかる細胞に取り込まれる分子又はコンジュゲートを投与することにより、神経系疾患若しくは神経筋疾患、又は脳疾患又は神経系起源若しくは神経外胚葉起源の腫瘍を診断又は治療する方法を提供する。本発明は、神経細胞中の神経突起成長を同定し、かつ測定する方法も提供する。
2010533170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
LPWKPLG(配列番号２)及びTHRPPMWSPVWP（配列番号１）からなるグループから選択される配列を含み、又は前記配列からなり、生物活性成分及び診断成分から選択される成分に結合しているペプチド若しくはペプチド模倣体のコンジュゲート。
【請求項２】
生物活性成分が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は、それらのアナログであって、特に２’−Ｏ−メトキシエチル−及び２’−Ｏ−メチルである２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−Ｏ−アルケニル（アリル）ヌクレオチド、又は２’−Ｏ−アルキニルヌクレオチドを含む化合物等であるアナログ、固定化核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、モリホリノに基づくヌクレオチド、並びにその組合せからなるグループから選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
配列番号２又は１のペプチドと治療上活性なタンパク質及び／又は診断タンパク質との融合タンパク質である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
核局在化シグナルをさらに含む、請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
血液脳関門を通過して、脳細胞、神経細胞、又は神経細胞起源若しくは神経外胚葉起源の腫瘍細胞に、生物活性成分又は診断成分を標的化するための薬剤の調製における、請求項１〜４のいずれかに記載のコンジュゲートの使用。  
【請求項６】
薬剤が脳障害の治療のためである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
薬剤が神経系疾患又は神経筋疾患の治療のためである、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
薬剤が神経細胞起源又は神経外胚葉起源の腫瘍の治療のためである、請求項５に記載の使用。
【請求項９】
LPWKPLG及びTHRPPMWSPVWPからなるグループから選択される配列を含む又は前記配列からなるペプチド若しくはペプチド模倣体と、分子を生物活性成分又は診断成分に結合するための、ペプチドではないリンキング部とを含む分子。
【請求項１０】
神経細胞中の神経突起成長をモニターするための組成物の調製における、配列THRPPMWSPVWPを含む、又は前記配列からなるペプチド若しくはペプチド模倣体を含むコンジュゲートの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボターゲッティング分野に関し、種々の臓器、組織又は腫瘍細胞にホーミングし、それらと結合し、それらに取り込まれる分子を提供する。
【背景技術】
【０００２】
大部分の治療用化合物は、血液循環を介して標的とする臓器や組織へ送達される。しかしながら、大部分の場合、薬物又はその他の処置は、病変した臓器又は組織のみを標的とするのみならず、身体内でその他の臓器及び組織によって取り込まれてしまう。この結果、例えば患者の全身に、毒作用等に起因する望ましくない副作用が生じることがある。したがって、特定の臓器若しくは組織、又は特定の種類の腫瘍細胞を選択的に標的とすることが望ましいであろう。また、治療用化合物を、標的化（targeting）分子とカップリングさせると、かかる化合物の標的とする組織又は細胞への取込み特性を高めることができ、結果として、より効果的な分子が得られる。したがって、治療用化合物を標的化分子とカップリングさせると、親化合物よりも効果的かつ毒性が低い化合物が得られる。Curnis et al., 2000, Nature Biotechnol. 18, 1185-1190を参照。これは、ペプチド、タンパク質、細胞増殖抑制剤、抗生物質、抗ウイルス物質等、化合物の広範にわたって適用できる。
【０００３】
筋強直性ジストロフィー症（ＭＤ）又は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）等の神経筋疾患の場合、血液脳関門を横断して運搬され、神経細胞に取り込まれることが、効果的な治療のために必須である。ニューロン特異的ペプチドは、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）及び低分子干渉ＲＮＡ(ＳｉＲＮＡ)に接合させる（conjugate）ことができる。かかるＡＯＮ及びＳｉＲＮＡは、望ましくない遺伝子転写を阻止することによって、特定の疾患の治療用の新種の薬剤としての適用上、高い効力を有する。ＳＭＡ治療の分野において、アンチセンスによって誘導されたエクソン包含は、ＳＭＮ２（生存運動ニューロンタンパク質２：survival of motor neuron 2）転写産物の翻訳リーディングフレーム修正のための、新規かつ有望なツールとして注目を集めている。その目的は、標的エクソンが（ｍＲＮＡ前駆体へのＡＯＮの結合を介して）含まれるようにスプライシングを操作することである。これにより、翻訳リーディングフレーム修正及び完全長ＳＭＮタンパク質の合成の誘導が可能となるであろう。
【０００４】
いくつかの報告は、完全長ＳＭＮタンパク質の産生を回復するためのエクソン包含戦略の治療上の可能性を示してきた（Hua et al., 2007, PLoS Biol. 5, e73; Baughan et al., 2006, Mol. Ther. 14, 54-62）。しかしながら、克服すべき最大のハードルは、これらのＡＯＮのインビボでの神経への取込み及び血液脳関門を横断する輸送力が弱いことである。その他の神経疾患又は脳障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病等）においても、問題点は極めて類似している。すなわち、治療化合物又は診断用化合物のインビボでの取込みが弱いという問題を有する。
【０００５】
神経性又は神経外胚葉性腫瘍（例えば神経芽細胞腫、グリア芽腫等）の場合は、標的化ということも、副作用のない効果的な治療法を生み出すために非常に重要である。化学療法薬は、癌組織のみならず正常組織にも作用し得るために、この標的化要件が必要となる。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ-）又は低分子干渉(Ｓｉ)ＲＮＡに基づく薬剤に関しては、薬物速度論的特性は、遊離薬物が腫瘍の場所に十分な水準で到達するうえで好ましくないことが既知である。なぜなら、かかる薬物の大部分が肝臓及び腎臓で吸収されるからである。化学療法薬を送達する媒体（vehicle）は、所望の細胞へ、また血液脳関門を越えて治療薬を効果的に送達するために十分な半減期を示さなければならない。
【０００６】
上記に照らし、ＡＯＮ等の作用物質をインビボで特異的に取り込むことを達成するためには、送達システムにおいてさらなる改善が必要であることは十分明らかである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Curnis et al., 2000, Nature Biotechnol. 18, 1185-1190
【非特許文献２】Hua et al., 2007, PLoS Biol. 5, e73
【非特許文献３】Baughan et al., 2006, Mol. Ther. 14, 54-62
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、所望の臓器、組織若しくは細胞型、特に脳細胞若しくは神経細胞、又は神経起源若しくは神経外胚葉起源の腫瘍細胞にホーミングする化合物、好ましくはペプチド又はペプチド模倣体を提供することである。診断成分又は生物活性を有する成分をかかるホーミング化合物とカップリングさせることによって、前記成分を特定の臓器又は組織又は細胞に標的化する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
広範囲にわたる研究の末、本発明者らは、脳細胞、神経細胞及び神経起源若しくは神経外胚葉起源の腫瘍細胞に選択的に結合し、又は取り込まれる２つのペプチドを同定した。したがって、本発明は、オリゴヌクレオチドとこれら特定のペプチドとの接合によって、例えば（アンチセンス）オリゴヌクレオチド等のインビボでの取込みを改善するというニーズを満たす。かかる分子は、神経筋疾患、脳疾患又は神経起源若しくは神経外胚葉起源の腫瘍の治療のためのアンチセンス治療法、及び血液脳関門を横断して脳細胞へ、神経細胞へ又は神経起源若しくは神経外胚葉起源の腫瘍細胞への多種多様の診断薬又は薬剤の送達において特に有用である。
【００１０】
したがって、本発明は、THRPPMWSPVWP（配列番号１）及びLPWKPLG(配列番号２)からなるグループから選択される配列を含む、又はかかる配列からなるペプチド若しくはペプチド模倣体に関する。
【００１１】
また、本発明は、THRPPMWSPVWP（配列番号１）及びLPWKPLG(配列番号２)からなるグループから選択される配列を含む、又はかかる配列からなるペプチド若しくはペプチド模倣体のコンジュゲートに関連し、並びに、生物活性成分及び診断成分から選択される成分であってコンジュゲートに結合している成分に関する。
【００１２】
上記の薬剤としての使用のためのコンジュゲートは、本発明の一態様である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、診断成分又は生物活性成分を臓器、組織又は、特に、血液脳関門を横断して脳細胞、神経細胞、又は神経起源若しくは神経外胚葉起源の腫瘍細胞等の対象となる細胞に標的化するペプチド又はペプチド模倣体を提供する。
【００１４】
本発明の文脈において、ペプチドは、少なくとも上記で特定した配列番号１又は配列番号２を含む。一実施形態において、本発明の文脈におけるペプチドは、配列番号１の部分を含むが、配列番号１の前記部分は、配列番号１の１１、１０、９、８又は７個のアミノ酸と同一である。一実施形態において、本発明の文脈におけるペプチドは、配列番号３〜１２を含む又はかかる配列番号からなる。一実施形態において、本発明の文脈におけるペプチドは、配列番号１の変異体(variant)を含み、前記変異体には、配列番号１における任意のアミノ酸1個のその他の任意のアミノ酸又はその誘導体への置換が含まれる。一実施形態において、本発明の文脈におけるペプチドは、配列番号１３〜２３を含み、又はかかる配列番号からなる。かかるペプチドは、天然型Ｌ−アミノ酸から完全に構成されることができ、又はバックボーン及び/又は側鎖に１又は２以上の改変を含むこともできる。これらの改変は、天然アミノ酸との類似を示すアミノ酸模倣体を組み込むことによって導入できる。１又は２以上のアミノ酸模倣体を含む上記一群のペプチドは、ペプチド模倣体と呼ばれる。本発明の文脈において、アミノ酸模倣体には、β２−及びβ３−アミノ酸、β２,２−、β２,３−及びβ３,３−二置換アミノ酸、α,α−二置換アミノ酸、アミノ酸のスタチン誘導体、Ｄ−アミノ酸、α−ヒドロキシ酸、α−アミノニトリル、Ｎ−アルキルアミノ酸等が含まれるが、これらに限定されない。また、ペプチドのＣ末端は、カルボン酸若しくはカルボキサミド又は上記アミノ酸模倣体の１つを組み込むことによって得られるその他のものであってもよい。さらに、上記ペプチドは、ネイティブなペプチド結合をスルホンアミド、レトロアミド、アミノオキシ含有結合、エステル、アルキルケトン、α,α−ジフルオロケトン、α−フルオロケトン、ペプトイド結合（Ｎ−アルキル化グリシルアミド結合）の１又は２以上に置換したものを含んでいてもよいが、これに限定されない。さらに、上記のペプチドは、アミノ酸側鎖に置換を含んでいてもよく（対応する天然アミノ酸の側鎖に関して）、例えば４−フルオロフェニルアラニン、４−ヒロドキシリシン、３−アミノプロリン、２−ニトロチロシン、Ｎ−アルキルヒスチジン又はβ−分岐アミノ酸又は、天然のキラリティーに対向してβ側鎖炭素原子にキラリティーを有するβ−分岐アミノ酸模倣体等（例えば、アロ−トレオニン、アロ−イソロイシン及び誘導体）がある。その他の一実施形態において、上記一群のペプチドは、例えばリシンの代わりにオルニチン、フェニルアラニンの代わりにホモフェニルアラニン又はフェニルグリシン、グリシンの代わりにβ−アラニン、グルタミン酸の代わりにピログルタミン酸、ロイシン又はメチオニン及び/又はシステインの硫黄酸化物の代わりにノルロイシン等、アミノ酸の構造的に類似したアナログ又はアミノ酸模倣体のアナログを含んでいてもよい。さらに、上記の線状ペプチド及び環状ペプチドは、そのレトロアナログ、インベルソアナログ及び/又はレトロ逆アナログ同様、本特許に包含される。当業者には、遥かに多くの類似したバリエーションが既知であるかもしれないが、それらが本明細書に記載されていないことをもって本特許の範囲が制限される���のではない。一実施形態において、本発明にかかるペプチド又はペプチド模倣体は、最大３０アミノ酸長であり、又は少なくとも２５アミノ酸長又は２０アミノ酸長、又は１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８又は７アミノ酸長である。
【００１５】
生物活性成分は、生物学的機能、好ましくは治療的機能を（直接的又は間接的に）発揮する化合物であるため、治療上活性な化合物であることが好ましい。かかる治療上活性な化合物は、当技術分野で既知の任意の化合物であり得、細胞間のプロセスを調整することによって、治療上の効果を有する化合物であることが好ましい。（直接的な）調整効果又は（直接的な）生物学的機能を有する治療上活性な化合物は、例えば、任意のタンパク質、酵素抑制剤、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、遺伝子又は医薬品とすることができる。本発明のペプチド又はペプチド模倣体に結合可能であるか、結合するのに適したように作製される限り、任意の生物学的に活性な化合物又は治療上活性な化合物を使用することができる。このようにして前記の生物学的に活性な化合物又は治療上活性な化合物は、本発明の化合物の成分となる。当業者であれば、適切な生物学的に活性な又は治療上活性な化合物を同定できるであろう。一実施形態において、生物学的に活性な化合物は、例えば、（ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンを含む）アントラサイクリン、（シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、メクロエタミン、シクロフォスファミド、イフォスファミドを含む）アルキル化剤、（アザチオプリン、メルカプトプリンを含む）代謝拮抗剤、（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシンポドフィロトキシン、エトポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、テノポシド等のビンカアルカロイド及びタキサンを含む）植物アルカロイド類及び/又はテルペノイド類、（カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、アムサクリンを含む）トポイソメラーゼ阻害剤、ダクチノマイシン、ダカルバジン、ゲムシタビン、テモゾロマイド、（トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、リツクシマブを含む）ｍＡｂｓのような抗癌性を示す化合物等の細胞増殖抑制剤である。
【００１６】
一実施形態において、生物学的に活性な又は治療上活性な化合物は、核酸若しくはそのアナログを含む又はかかる核酸若しくはそのアナログからなる化合物である。かかる化合物は、特に、タンパク質の産生レベルで細胞内の遺伝機構を調整することによって、（間接的に）生物学的機能、好ましくは治療的機能を発揮すると考えられ得る。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は、例えば、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−Ｏ−アルケニル（アリル）ヌクレオチド若しくは２’−Ｏ−アルキニルヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＭＯＥ）及び２’−Ｏ−アリル−ヌクレオチド）等を含む化合物等である前記ＤＮＡ又はＲＮＡのアナログ、固定化核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエートＲＮＡヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートＲＮＡヌクレオチド等のホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、モリホリノに基づくヌクレオチド、並びにその組合せ等であってもよい。核酸又はそれらのアナログを含む又はかかる核酸又はそれらのアナログからなる化合物は、種々の核酸又はそのアナログの混合物を含んでいてもよい。かかる化合物は、例えば２’−Ｏ−メチルＲＮＡとＲＮＡとの混合物のキメラ、ＤＮＡとＬＮＡとの混合物のキメラ等であってもよい。かかる化合物は、例えば、末端に２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチド、内部にＤＮＡヌクレオチドを有するギャップマーであってもよい。かかる化合物は、遺伝子、プラスミド、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ等である。かかる化合物は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００１７】
一実施形態において、診断成分が、本発明のペプチド又はペプチド模倣体に結合する。かかる診断成分は、インビボ又はインビトロでの診断用目的であってもよい。一般的に使用される画像標識、放射標識、又はＣｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５等の蛍光標識など、或いは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその他の診断タンパク質が、場合によっては組換え発現を介して、診断成分として使用できる。
【００１８】
本発明によるコンジュゲートを調製するために、生物活性成分又は診断成分を本発明のペプチド又はペプチド模倣体にカップリングすることは、化合物をアミノ酸又はペプチドにカップリングするための既知の方法によって行われる。一般的な方法は、かかる成分をペプチド又はペプチド模倣体中の遊離アミノ基、又は遊離ヒドロキシル基、遊離カルボン酸基、若しくは遊離チオール基に結合させることである。一般的な接合方法は、チオール/マレイミドカップリング、アミド又はエステル結合形成又は異種ジスルフィド形成を含む。当業者は、要求されるカップリングを得るために使用可能な標準的な化学を熟知している。かかる生物活性成分又は診断成分は、ペプチド又はペプチド模倣体に直接的にカップリングされてもよいし、或いはスペーサーやリンカー分子を介してカップリングされてもよい。生物活性成分又は診断成分は、本発明のペプチド又はペプチド模倣体に共有結合する必要はなく、静電相互作用を介して接合させてもよい。一実施形態において、本発明はまた、本発明のペプチド若しくはペプチド模倣体を含む分子、及びペプチドではないリンキング部であって、かかる分子を生物活性成分又は診断成分に結合するためのリンキング部に関する。かかるリンキング部は、例えば、生物学的に活性なポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと複合体を形成する（ポリ）カチオン基であってもよい。かかる（ポリ）カチオン基は、スペルミン又はポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−リシン等とすることができる。
【００１９】
一実施形態において記載したように、本発明のペプチド又はペプチド模倣体は、生物活性成分に結合する。例えば、ペプチド又はペプチド模倣体は、生物学的に活性なペプチド又は治療用ペプチドに結合することができ、一実施形態においては、ペプチド又はペプチド模倣体の基本構造の一部分であってもよい。例えば、治療用ペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端は、上記のペプチドを含む又はかかるペプチドからなる配列によって延長されることができる。本発明のペプチド又はペプチド模倣体で延長されたかかるペプチドは、本発明のコンジュゲートに包含される点が理解されなければならない。かかるペプチドは、標準的なアミノ酸又はペプチドのカップリング手順を介して調製することができる。
【００２０】
一実施形態において、本発明のペプチド又はペプチド模倣体は核局在化シグナル（ＮＬＳ）と結合(combine)される。一実施形態において、本発明のコンジュゲートはＮＬＳと結合される。本発明の文脈において、かかるＮＬＳは、例えば生物学的成分又は診断成分等の本発明のコンジュゲートを、恐らくは細胞質核輸送受容体（cytosolic nuclear transport receptors）による認識を介して細胞核へ向けるように機能する。かかるＮＬＳは、本発明のペプチド又はペプチド模倣体の一部分であってもよく、例えば、ＮＬＳのアミノ末端又はカルボキシ末端は、上記のペプチドを含む、又はかかるペプチドからなる配列によって延長させることができる。また、かかるＮＬＳは、本発明のペプチド又はペプチド模倣体とは異なる位置で、生物活性成分又は診断成分にカップリングさせてもよい。ＮＬＳ配列は、当該技術分野で既知である。通常、ＮＬＳシグナルは、プラスに帯電したリシン及び/又はアルギニンの（少数の）短い配列からなり、又はかかる配列を含んでおり、例えば、ＮＬＳは、(K)KKR(K)、（K)KRS(K)、(K)(S)RK(R)(K)からなり、又はこれらを含む。既知のＮＬＳは、PKKKRKV、GKKRSKV、KSRKRKLである。一実施形態において、本発明のペプチド又はペプチド模倣体は、配列番号２４〜３９からなるグループから選択されるＮＬＳと結合する。
【００２１】
一実施形態において、生物活性成分がタンパク質又はポリペプチドであり、かつ、ペプチド又はペプチド模倣体がタンパク質又はポリペプチドバックボーンに含まれている本発明のコンジュゲートは、生物学的に活性なタンパク質と、ペプチド及びペプチド模倣体との組換え発現によって調製される。ＤＮＡコンストラクトは、本発明のペプチド又はペプチド模倣体が生物学的に活性なペプチドの末端で、好ましくは生物学的に活性なペプチドのＣ末端で発現されるよう調製されていることが好ましい。組換えＤＮＡ法によるかかるＤＮＡコンストラクトの調製ならびに適切な宿主における発現は、当業者が通常に行うことである。
【００２２】
したがって、一実施形態において、本発明のコンジュゲートは、例えば配列番号１又は配列番号２のペプチド等の本発明のペプチドと、抗体若しくは診断用（例えば蛍光）タンパク質又はその両方等の治療上活性なタンパク質との融合タンパク質であり、必要に応じてＮＬＳも含む。かかる融合タンパク質は、適切なＤＮＡコンストラクトの発現によって調製されることができる。
【００２３】
一実施形態において、本発明は、血液脳関門を通過して脳細胞に、神経細胞に又は神経細胞起源若しくは神経外胚葉起源の腫瘍細胞に、生物活性成分又は診断成分を標的化するための薬剤の調製用の本発明にかかるコンジュゲートの使用に関する。一実施形態において、薬剤は、脳障害の治療のためである。一実施形態において、薬剤は、神経疾患又は神経筋疾患の治療のためである。一実施形態において、薬剤は、神経起源又は神経外胚葉起源の腫瘍の治療のためである。
【００２４】
脳障害の例は、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症等、神経変性及び/又は神経炎症の発症を伴うものである。また、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＥＰＯ（エリスロポエチン）及び（例えばエンブレル(R)及びレミケード(R)等の）抗炎症抗体等の神経栄養因子から利益を受ける（ＣＮＳ−）障害の治療法も本発明に包含される。
【００２５】
遺伝性リソソーム蓄積症（セレザイム（登録商標）、アルドラザイム（登録商標）、ファブラザイム（登録商標））及びポンペ病（マイオザイム（登録商標））の神経成分を治療するために酵素補充療法によって治療され得る疾患の治療法も、本発明に包含される。
【００２６】
例えば、治療用抗癌抗体（例えば、リツキサン（登録商標）、ハーセプチン（登録商標）及びアービタックス（登録商標））及び抗癌化合物（例えば、グリベック（登録商標）、イレッサ（登録商標））によって治療され得る腫瘍等の脳に転移する腫瘍の治療法も、本発明に包含される。
【００２７】
神経疾患又は神経筋疾患の例として、筋強直性ジストロフィー症（ＭＤ）又は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ＤＮＡリピート病等がある。かかる例として、ハンチントン病、サンザシ川症候群、ケネディー病/球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症等のポリグルタミン（ＣＡＧ）リピートを有するコード領域リピート病、又は乳児けいれん症候群、鎖骨頭蓋異形成症、眼裂縮小/下垂/内眼角贅皮症候群、手・足・性器症候群、合多指症、眼咽頭筋ジストロフィー症、全前脳症等のポリアラニン（ＧＣＧ）リピートを有する疾患があるが、これらに限定されない。本発明が治療対象とする遺伝子の非コード領域にリピートを伴う疾患は、筋強直性ジストロフィー症１型、筋強直性ジストロフィー症２型、フリードライヒ失調症、脊髄小脳失調症、自閉症等のトリヌクレオチドリピート病（大部分はＣＴＧリピート及びＣＡＧリピート）を含む。さらに、本発明のコンジュゲートは、ミオクローヌスてんかん、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー症及びII型糖尿病の特定の形態等、種々の脆弱性Ｘ症候群、ヤコブセン症候群、及びその他の不安定なリピート要素障害を含む染色体上の脆弱部位に関連するリピート病の治療法に適用される。
【００２８】
神経起源の又は神経外胚葉起源の腫瘍の例は、全てのＣＮＳ新生物及びＰＮＳ新生物、例えば神経芽細胞腫、髄芽細胞腫、グリア芽腫、未分化希突起グリオーマ、乏突起星細胞腫、星状細胞腫、神経線維腫、上衣細胞腫、ＭＰＮＳＴ（悪性末梢神経鞘腫瘍）、神経節細胞腫又は神経鞘腫を含むが、これらに限定されない。また、神経外胚葉起源の腫瘍には、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、小細胞肺癌、副腎褐色細胞腫、原始ＰＮＥＴ(末梢神経上皮腫)、ユーイング肉腫及びメラノーマ等がある。一実施形態において、薬剤は、神経芽細胞腫髄芽細胞腫、グリア芽腫、未分化希突起グリオーマ、乏突起星細胞腫、星状細胞腫、神経線維腫、上衣細胞腫、ＭＰＮＳＴ（悪性末梢神経鞘腫瘍）、神経節細胞腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、小細胞肺癌、副腎褐色細胞腫、原始ＰＮＥＴ(末梢神経上皮腫)、ユーイング肉腫、及びメラノーマの治療のためである。
【００２９】
一態様において、生物活性成分は、（ＣＡＧ）ｎ、（ＧＣＧ）ｎ、（ＣＵＧ）ｎ、（ＣＧＧ）ｎ、（ＣＣＵＧ）ｎからなるグループから選択される反復ストレッチに相補的な、及び/又はかかる反復ストレッチにハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであって、ｎは１〜５０、好ましくは２〜２０から選択される。整数ｎは、好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドが反復エレメントに相補的な少なくとも１０〜約５０の連続ヌクレオチド、より好ましくは、１２〜４５のヌクレオチド、さらにより好ましくは、１２〜３０のヌクレオチド、そして最も好ましくは反復ストレッチに相補的な１２〜２５のヌクレオチドとなるように選択される。
【００３０】
転写産物におけるポリグルタミン（ＣＡＧ）ｎ トラクトに相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、ＨＤ、ＨＤＬ２/ＪＰＨ３、ＳＢＭＡ/ＡＲ、ＳＣＡ１/ＡＴＸ１、ＳＣＡ２/ＡＴＸ２、ＳＣＡ３/ＡＴＸ３、ＳＣＡ６/ＣＡＣＮＡＩＡ、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７又はＤＲＰＬＡヒト遺伝子における反復増幅により引き起こされるヒト疾患、例えばハンチントン病、脊髄小脳失調症又はサンザシ川症候群の諸形態の診断、治療及び/又は予防において特に有用である。
【００３１】
転写産物におけるポリアラニン（ＧＣＧ）ｎトラクトに相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、ＡＲＸ、ＣＢＦＡ１、ＦＯＸＬ２、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＤ１３、ＯＰＤＭ/ＰＡＢＰ２、ＴＣＦＢＲ１又はＺＩＣ２ヒト遺伝子における反復増幅により引き起こされるヒト疾患、例えば乳児けいれん症候群、鎖骨頭蓋異形成症、瞼裂縮小、手・足・性器症候群、合多指症、眼咽頭型筋ジストロフィー症及び/又は全前脳症の診断、治療及び/又は予防において特に有用である。
【００３２】
転写産物における（ＣＵＧ）ｎ反復に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、各々ＤＭ１/ＤＭＰＫ又はＳＣＡ８ヒト遺伝子における反復増幅により引き起こされる筋強直性ジストロフィー症１型、脊髄小脳失調症等のヒト遺伝性疾患の診断、治療及び/又は予防において特に有用である。
【００３３】
転写産物における（ＣＣＵＧ）ｎ反復に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、ＤＭ２/ＺＮＦ９遺伝子における反復増幅により引き起こされる筋強直性ジストロフィー症２型等のヒト遺伝性疾患の診断、治療及び/又は予防において特に有用である。
【００３４】
転写産物における（ＣＧＧ）ｎ反復に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、ＦＲＡＸＡ/ＦＭＲ１、ＦＲＡＸＥ/ＦＭＲ２及びＦＲＡＸＦ/ＦＡＭ１１Ａ遺伝子における反復増幅により引き起こされるヒト脆弱性Ｘ症候群の診断、治療及び/又は予防において特に有用である。
【００３５】
転写産物における（ＣＣＧ）ｎ反復に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、ＦＲＡ１１Ｂ/ＣＢＬ２遺伝子における反復増幅により引き起こされるヤコブセン症候群等のヒト遺伝性疾患の診断、治療及び/又は予防において特に有用である。
【００３６】
一実施形態において、本発明のペプチド又はペプチド模倣体中の生物活性成分は、以下の表の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡである。一実施形態において、本発明のペプチド又はペプチド模倣体のコンジュゲートは、以下の表１から選択される標的となる遺伝子及び/又はタンパク質の調節（発現）のためである、及び/又は治療用、特に以下の表から選択される疾患の治療のためである。
【００３７】
【表１】
2010533170.tif 000003
2010533170.tif 000004
【００３８】
当業者であれば、標的配列への相補性を保持しつつ、上記の表における配列のバリエーションが可能である旨、容易に認識するであろう。ウラシルヌクレオチド及びチミジンヌクレオチドは、標的配列への相補性を保持しつつ置換可能である。重要な点は、オリゴヌクレオチドが意図された標的配列に十分効率的に結合可能であることである。同様に、イノシン（すなわち、ゆらぎ塩基対を形成可能な塩基を含むヌクレオチド）は、相補性を保持しつつ、ヌクレオチドを置き換えることができる。（トリプレット）ヌクレオチド反復配列を含む他の実施形態においては、効果的な結合相補性のために、オリゴヌクレオチドは、反復配列の任意のヌクレオチドによって開始し、かつ終了することができ、かかるオリゴヌクレオチドは、反復配列の正確な倍数であることを要求しない点、容易に認識される。説明のための実施例として、上記の表における（ＣＵＧ）ｎは、特に（ＵＧＣ）ｎ、（ＣＴＧ）ｎ、（ＣＩＧ）ｎ、（ＣＵＧ）ｎＣＵ又は（ＣＵＧ）ｎ（ＣＴＧ）ｍ（ＣＵＧ）ｐ（ｎ、ｍ、ｐは整数）等で表される。
【００３９】
本発明の一実施形態は、ウイルス又はウイルス性粒子を細胞に標的化することである。本発明のコンジュゲートにおいて、かかるウイルス又はウイルス性粒子は、生物活性成分である。一実施形態において、本発明のペプチド又はペプチド模倣体は、ペプチド又はペプチド模倣体がウイルス又はウイルス性粒子の外表面で発現されるように、ウイルスのゲノム内にペプチド又はペプチド模倣体のＤＮＡ/ＲＮＡ配列を含むことによってウイルス性の生物活性成分に結合する。かかる発現をもたらす組換え法は、当業者に周知である。このように、かかるペプチド又はペプチド模倣体は、ウイルス又はウイルス性粒子を特定の細胞/組織に標的化する。これは、標的ワクチン接種、遺伝子治療、遺伝子置換又はウイルス性エクソン包含コンストラクト（Ｕ１又はＵ７低分子核内ＲＮＡのいずれかに融合するアンチセンス配列を発現するＡＡＶベクター；Baughan et al., 2006, Mol. Ther.14, 54-62）において、特に興味深い。
【００４０】
一実施形態において、本発明のペプチド又はペプチド模倣体は、THRPPMWSPVWPである。別の態様において、本発明のペプチド又はペプチド模倣体は、LPWKPLGである。
【００４１】
本発明のペプチドをコードする配列からなるＤＮＡ又はかかる配列を含むＤＮＡ及びそれらの相補的ＤＮＡ配列、並びに本発明のペプチドをコードする配列からなるＤＮＡ配列又はかかる配列を含むＤＮＡ配列のＲＮＡ転写産物及びそれらの相補的ＲＮＡ配列も、本発明によって包含される。
【００４２】
また、本発明は、本発明のコンジュゲートと薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物にも関連する。
【００４３】
また、ペプチドTHRPPMWSPVWPが、神経細胞又は神経系に分化した細胞における神経突起成長をモニタリングし、特に同定し、測定するために使用できることがわかった。
【００４４】
さらに、ペプチドTHRPPMWSPVWP（配列番号１）、及びその特定の切断型変異体、特にHRPPMWSPVWP（配列番号３）、THRPPMWS（配列番号１０）及びHRPPMWSPVW（配列番号１１）が筋細胞に、また最も高い可能性として神経芽腫細胞にも、選択的に取り込まれることが見い出された。したがって、これらは、診断成分又は生物活性成分が、臓器、組織又は対象となる種類の細胞、特に筋細胞、又は血液脳関門を横断して脳細胞、神経細胞又は神経起源若しくは神経外胚葉起源の腫瘍細胞を標的とするために使用されてもよい。
【００４５】
したがって、さらなる態様において、本発明は生物活性成分及び診断成分から選択される成分に結合するHRPPMWSPVWP（配列番号３）、THRPPMWS（配列番号１０）及びHRPPMWSPVW（配列番号１１）からなるグループから選択される配列を含む、又はかかる配列からなるペプチド又はペプチド模倣体のコンジュゲートに関する。
【００４６】
一実施形態において、生物活性成分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は特に２’−Ｏ−メトキシエチル−及び２’−Ｏ−メチルである２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−Ｏ−アルケニル（アリル）ヌクレオチド、又は２’−Ｏ−アルキニルヌクレオチドを含む化合物等である前記ＤＮＡ又はＲＮＡのアナログ、固定化核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、モリホリノに基づくヌクレオチド、並びにその組合せからなるグループから選択されるそれらのアナログからなるグループから選択される。コンジュゲートは、配列番号１、３、１０又は１１のペプチドと治療上活性なタンパク質及び/又は診断タンパク質との融合タンパク質であってもよい。かかるコンジュゲートは、核局在化シグナルをさらに含んでいてもよい。
【００４７】
かかるコンジュゲートは、生物活性成分又は診断成分を筋細胞に標的化するための薬剤の調製用に有利に使用できる。かかる状況により、薬剤は、心疾患を含む筋細胞に関連する疾患の治療に有利である。かかる薬剤は、例えば、ミオパシー、筋ジストロフィー症又は筋肉消耗病の治療のためとしてもよいし、II型糖尿病又は肥満の治療のためとしてもよい。
【００４８】
本明細書で言及される配列番号３、１０及び１１のペプチドは、神経芽腫細胞によっても選択的に取り込まれることが想定される。かかるペプチドは、筋細胞及び神経芽腫細胞の両者に特異的に取り込まれるため、神経筋疾患の治療のために生物活性成分又は診断成分を神経筋細胞に有利に標的化することができる。神経疾患又は神経筋疾患の例は、配列番号１及び２のペプチドに関して上述されている。  
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１ａ】図１は、２０分後（図１Ａ）及び２４時間後（図１Ｂ）のペプチドの取込みを示す。図１Ａ及び図１Ｂの右側に、マウスの明るい光の画像が、薄青色の染色で示した、検出されたＣｙ５標識と一体化している。図１Ａ及び図１Ｂの左側には、検出されたＣｙ５パターンが定量のために別個に赤色で示されている。左側の数値は、検出されたＣｙ５標識の分量を示している。
【図１ｂ】図１は、２０分後（図１Ａ）及び２４時間後（図１Ｂ）のペプチドの取込みを示す。図１Ａ及び図１Ｂの右側に、マウスの明るい光の画像が、薄青色の染色で示した、検出されたＣｙ５標識と一体化している。図１Ａ及び図１Ｂの左側には、検出されたＣｙ５パターンが定量のために別個に赤色で示されている。左側の数値は、検出されたＣｙ５標識の分量を示している。
【実施例１】
【００５０】
神経芽細胞腫細胞及び神経系に分化した細胞へのインビトロでの取込み
蛍光標識（ＦＡＭ）を用いて各種ペプチドを合成して提供し、マウス神経芽腫細胞へのインビトロでの取込みに関してスクリーニングを行った。
Ｎ１Ｅ−１１５マウス神経芽腫細胞を、ＦＡＭ標識されたペプチドとともにインキュベートし、事前に固定化せずに倒立蛍光顕微鏡にて撮影した。写真が示すように、ペプチドLPWKPLG及びTHRPPMWSPVWPは、神経細胞腫細胞に効率的に取り込まれた唯一のペプチドであった。かかる取り込みの結果、細胞核同様に細胞質も均一に染色されたことがわかった。
【００５１】
神経突起成長因子（ＮＧＦ）を加えることによって神経細胞型に分化したラット神経褐色細胞腫ＰＣ１２細胞をＦＡＭ標識されたペプチドTHRPPMWSPVWPとともにインキュベートし、事前に固定化せずに倒立蛍光顕微鏡にて撮影した。写真により、前記ペプチドがラット神経細胞に取り込まれたことが示された。興味深いことに、本実験においてかかるペプチドは、これらの神経分化したＰＣ１２細胞において細胞質と細胞核を染色しただけでなく、ＮＧＦにより誘導された神経突起をも効果的に染色した。
【実施例２】
【００５２】
脳細胞へのインビボでの標的
ペプチドTHRPPMWSPVWPをＣｙ５蛍光標識で標識し、その７ｎｍｏｌをヌードマウスの尾静脈に注入した。Ｃｙ５検出用フィルターを用いて、マエストロ画像システムで写真撮影を行った。
図１は、２０分後（図１Ａ）及び２４時間後（図１Ｂ）のペプチドの取込みを示す。図１Ａ及び図１Ｂの右側に、マウスの明るい光の画像が、薄青色の染色で示した、検出されたＣｙ５標識と一体化している。図１Ａ及び図１Ｂの左側には、検出されたＣｙ５パターンが定量のために別個に赤色で示されている。左側の数値は、検出されたＣｙ５標識の分量を示している。かかるマウスは、うつ伏せにし、注入の２０分後には脳内に鮮やかなシグナルが検出できた。このことは、ペプチドTHRPPMWSPVWPが血液脳関門を横断でき、その後脳細胞に取り込まれていることを示す。
【実施例３】
【００５３】
Ｎ１１５神経芽細胞腫細胞中のペプチド−ＡＯＮコンジュゲートによるＤＣＬダウンレギュレーション
ペプチドTHRPPMWSPVWPとLPWKPLGとが、ｓｉＲＮＡ分子又はＤＮＡホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に接合した。かかるｓｉＲＮＡ及びＡＯＮは、Ｎ１１５神経芽細胞腫細胞中のＤＣＬ（ダブルコルチン様）遺伝子をダウンレギュレート可能であることが示された（未発表の知見）。Ｎ１１５神経芽細胞腫細胞をコンジュゲートとともに５００ｎＭにてインキュベートした。４８時間後、細胞を採取して、文献（Vreugdenhil et al., 2007, Eur. J. Neurosci. 25, 635-648）記載のように、ウエスタンブロット分析にて遺伝子サイレンシングを検出した。表１に、異なる濃度における各々のコンジュゲートのＤＣＬダウンレギュレーションの割合を示す。Ｎ１１５細胞において、全てのコンジュゲートがＤＣＬダウンレギュレーションを誘導できた。
【００５４】
【表２】
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【実施例４】
【００５５】
THRPPMWSPVWPの変異体の取込み
ペプチドTHRPPMWSPVWPの数種の変異体（表２参照）を選択して、蛍光標識を用いて合成し、ＫＭ１０９細胞について取込み試験を実施した。ペプチド３、７、８、９、１０、及び１１に関して試験を実施した。ペプチドHRPPMWSPVWP（配列番号３）が極めて効率的に細胞内に取り込まれた。ペプチドHRPPMWSPVWPに比較して低水準ではあるが、ペプチドTHRPPMWS（配列番号１０）及びペプチドHRPPMWSPVW（配列番号１１）も取り込まれた。以下の表に表示されたその他のペプチドに関しては、ＫＭ１０９細胞上での取込み試験がまだ実施されていない。さらに、全てのペプチドに関して、同様の方法で神経芽細胞腫細胞上での取込み試験が実施予定である。
【００５６】
【表３】
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【実施例５】
【００５７】
全身送達後のTHRPPMWSPVWP−ＡＯＮコンジュゲートのインビボでの取込み
ペプチドTHRPPMWSPVWPを、２０−ｍｅｒの２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）Ｍ２３に接合させた。ＡＯＮ  Ｍ２３単独及びTHRPPMWSPVWP−ＡＯＮ  Ｍ２３コンジュゲートをｍｄｘマウスに静脈注入した。かかるマウスに４８時間の間隔をあけてＡＯＮ単独又はそのコンジュゲート５０ｍｇ/ｋｇを３度注射し、１０日後に屠殺した。その後、大腿四頭筋及び心筋におけるＡＯＮ  Ｍ２３レベルを、ＡＯＮ  Ｍ２３に特異的なハイブリダイゼーション−ライゲーションＥＬＩＳＡで測定した。
【００５８】
表３において、ＡＯＮ  Ｍ２３−ペプチドコンジュゲートの大腿四頭筋及び心筋への取込みをＡＯＮ  Ｍ２３単独への取込みに対する割合（ＡＯＮ  Ｍ２３単独への取込みを１００％に設定）として示す。これによれば、かかるコンジュゲートの大腿四頭筋及び心筋への取込みが、ＡＯＮ  Ｍ２３単独への取込みと比較して４０〜５０％高いことがわかる。
【００５９】
【表４】
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【図１ａ】
2010533170.tif 000008
【図１ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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