(57)【要約】  本発明は、真核細胞から興味のあるたんぱく質（「ＰＯＩ」という。）の分泌を増加させる方法に関する。この方法は、たんぱく質分泌を増加させる１以上のたんぱく質と、ＰＯＩとを共発現させることを含む。ここで、たんぱく質の分泌を増加させるたんぱく質は、BMH2、BFR2、C0G6、C0Y1、CUP5、IMH1、KIN2、SEC31、SSA4、及び、SSE1からなる群から選択される。また、本発明は、プロモーター配列、特に、匹敵する条件の下で、ＧＡＰたんぱく質のプロモーターに比べて、プロモーター活性が増加されたＰ．パストリスのＰＥＴ９遺伝子のプロモーター配列に関する。また、本発明は、前記プロモーター配列を含む発現ベクター、及び、宿主細胞におけるＰＯＩの発現のための前記発現ベクターの使用に関する。また、本発明は、Ｐ．パストリスから得た遺伝子の新たなイーストプロモーター配列に関する。この配列は、イーストにおけるＰＯＩの発現に用いられる。
2010524440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列と、たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列と、を含む宿主細胞を提供するステップと、
前記宿主細胞において、前記ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列と、前記たんぱく質の分泌を増加させるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列と、を発現するステップ
を含む真核細胞からＰＯＩの分泌を増加させる方法であって、
たんぱく質の分泌を増加させる前記たんぱく質を、BMH2、BFR2、C0G6、C0Y1、CUP5、IMH1、KIN2、SEC31、SSA4、SSE1、及び、これらのたんぱく質のいずれか１つの生物活性断片からなる群から選択することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＰＯＩが、真核生物のたんぱく質、又は、その生物活性断片、好ましくは、Ｆａｂ断片、最も好ましくは、モノクローナル抗−ＨＩＶ抗体２Ｆ５のＦａｂ断片であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞が、真菌細胞、好ましくは、イースト細胞、又は、高等真核細胞、好ましくは、哺乳類細胞又は植物細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記イースト細胞が、コマガタエラ属の細胞、特に、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス、又は、コマガタエラ・ファフィー菌株の細胞であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列を、イースト、好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ、又はピチア・パストリス種から得ることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列が、サッカロマイセス・セレビシエから得たもので、配列番号３２〜４１からなる群から選択されたいずれか一つであるか、又は、前記配列番号３２〜４１からなる群から選択されたいずれか一つに相当する配列を有するとともに、前記選択された配列の機能的特性を有するものであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列が、ピチア・パストリスから得たもので、配列番号４２〜５１からなる群から選択されたいずれか一つであるか、又は、前記配列番号４２〜５１からなる群から選択されたいずれか一つに相当する配列を有するとともに、前記選択された配列の機能的特性を有するものであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列を、前記宿主細胞のゲノムへ組み込むのに適したプラスミド、又は、前記宿主細胞における自己複製に適したプラスミド上に提供することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記プラスミドが、真核細胞発現ベクター、好ましくは、イースト発現ベクターであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現ベクターが、前記宿主細胞から前記ＰＯＩの分泌を引き起こすのに有効な分泌リーダー配列を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記発現ベクターが、前記宿主細胞における前記ＰＯＩの発現を調節するのに有効なプロモーター配列を含むことを特徴とする請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列を、配列番号１２５のピチア・パストリスのPET９遺伝子の５’−非コーディング領域からの１０００ｂｐ断片、又は、前記断片と機能的に同等な変異体であるプロモーター配列で調節し、そして、前記宿主細胞が、コマガタエラ属の細胞、特に、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス、又は、コマガタエラ・ファフィー菌株の細胞であることを特徴と請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
分泌エンヘンサー、特に真核細胞、好ましくは、イースト細胞、最も好ましくは、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス、又は、コマガタエラ・ファフィー菌株の細胞におけるＰＯＩ分泌のエンヘンサーとしての、たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質をコードする、サッカロマイセス・セレビシエから単離された、ヌクレオチド配列の使用であって、
前記たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質が、BMH2、BFR2、COG6、C0Y1、CUP5、IMH1、KIN2、SEC31、SSA4、SSE1、及び、これらのたんぱく質のうちいずれか一つの生物活性断片からなる群から選択されることを特徴とする使用。
【請求項１４】
前記たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列が、配列番号３２〜１１からなる群から選択されたいずれか一つであるか、又は、前記配列番号３２〜４１からなる群から選択されたいずれか一つに相当する配列を有するとともに、前記選択された配列の機能的特性を有するものであることを特徴とする請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
分泌エンヘンサー、特に真核細胞、好ましくは、イースト細胞、最も好ましくは、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス、又は、コマガタエラ・ファフィー菌株の細胞におけるＰＯＩ分泌のエンヘンサーとしての、たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質をコードする、ピチア・パストリスから単離された、ヌクレオチド配列の使用であって、
前記たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質が、BMH2、BFR2、COG6、C0Y1、CUP5、IMH1、KIN2、SEC31、SSA4、SSE1、及び、これらのたんぱく質のうちいずれか一つの生物活性断片からなる群から選択されることを特徴とする使用。
【請求項１６】
前記たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列が、配列番号４２〜５１からなる群から選択されたいずれか一つであるか、又は、前記配列番号４２〜５１からなる群から選択されたいずれか一つに相当する配列を有するとともに、前記選択された配列の機能的特性を有するものであることを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法における請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
宿主細胞からのたんぱく質の分泌を増加させるたんぱく質をコードするヌクレオチド配列であって、
前記ヌクレオチド配列が、ピチア・パストリスから単離されたものであり、たんぱく質ＢＭＨ２をコードするヌクレオチド配列（配列番号４２）、たんぱく質ＢＦＲ２をコードするヌクレオチド配列（配列番号４３）、たんぱく質ＣＯＧ６をコードするヌクレオチド配列（配列番号４４）、たんぱく質ＣＯＹ１をコードするヌクレオチド配列（配列番号４５）、たんぱく質ＣＵＰ５をコードするヌクレオチド配列（配列番号４６）、たんぱく質ＩＭＨ１をコードするヌクレオチド配列（配列番号４７）、たんぱく質ＫＩＮ２をコードするヌクレオチド配列（配列番号４８）、たんぱく質ＳＥＣ３１をコードするヌクレオチド配列（配列番号４９）、たんぱく質ＳＳＡ４をコードするヌクレオチド配列（配列番号５０）、及び、たんぱく質ＳＳＥ１をコードするヌクレオチド配列（配列番号５１）からなる群から選択された配列と同じであるか、又は、前記選択された配列に相当し、かつ、前記選択された配列の機能的特性を有していることを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項１９】
ピチア・パストリスから単離された配列番号１２５に相当するPET9遺伝子の５’−非コーディング領域からの１０００ｂｐのイーストプロモーター配列、又は、前記配列と機能的に同等な変異体。
【請求項２０】
前記イーストプロモーター配列、又は、前記配列と機能的に同等な変異体が、匹敵する条件の下で、従来のイーストプロモーター、特に、ピチア・パストリスから単離されたGAPプロモーターよりも、イースト、好ましくは、コマガタエラ属の菌株、特に、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス、又は、コマガタエラ・ファフィー菌株におけるＰＯＩの発現を増加させることを特徴とする請求項１９に記載のイーストプロモーター配列、又は、前記配列と機能的に同等な変異体。
【請求項２１】
前記イーストプロモーター配列、又は、前記配列と機能的に同等な変異体が、匹敵する条件の下で、従来のイーストプロモーター、特に、ピチア・パストリスから単離されたGAPプロモーターに比べて、約１倍以上、約１．５倍以上、約２倍以上、約４倍以上、約７倍以上、約１０倍以上、１５倍以上のプロモーター活性を有することを特徴とする請求項２０に記載のイーストプロモーター配列、又は、前記配列と機能的に同等な変異体。
【請求項２２】
（A）ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列（宿主細胞からＰＯＩの分泌を引き起こすのに有効なリーダー配列に作動的に連結されていても良い。）と、
（B）宿主細胞におけるたんぱく質発現を調節するのに効果的なプロモーターと、
（C）転写終結因子と、
（D）選択マーカーと、
（E）相同の組み込み配列又は自己複製配列のうちいずれか１つと、含むｐＰｕｚｚｌｅバックボーンに基づく真核生物発現ベクターであって、
前記（A）〜（E）の成分が互いに作動的に連結され、
前記プロモーターが、ピチア・パストリスのPET９遺伝子の５’−非コーディング領域からの１０００ｂｐ断片（配列番号１２５）、又は、前記断片と機能的に同等な変異体であり、
前記転写終結因子が、S.セレビシエから得たシトクロムＣの転写終結因子であり、
前記選択マーカーは、ゼオシン抵抗性遺伝子であり、そして、
前記宿主細胞が、イースト細胞、好ましくは、コマガタエラ属の菌株の細胞、特に、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス、又は、コマガタエラ・ファフィー菌株の細胞であることを特徴とする真核生物発現ベクター。
【請求項２３】
宿主細胞におけるＰＯＩの組み換え発現のための請求項２２に記載の発現ベクターの使用。
【請求項２４】
ピチア・パストリスから単離されたイーストプロモーター配列であって、ＧＮＤ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１２６）、GPM1遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１２７）、ＨＳＰ９０遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１２８）、KAR2遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１２９）、MCM 1遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３０）、RAD2遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３１）、RPS2遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３２）、RPS31遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３３）、ＳＳＡ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３４）、THI3遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３５）、ＴＰＭ遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３６）、UBI4遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３７）、ＥＮＯ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３８）、RPS7A遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３９）、ＲＰＬ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４０）、TKL1遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４１）、ＰＩＳ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４２）、FET3遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４３）、ＦＴＲ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４４）、NMT1遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４５）、ＰＨＯ８遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４６）、及び、FET3 前駆体（FET3pre）ＧＮＤ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４７） からなる群から選択された配列と同一であるか、若しくは、前記選択された配列に相当し、かつ、前記選択された配列の機能的特性を有する配列であるか、又は、前記配列のうちいずれか一つと機能的に同等な変異体であることを特徴とするイーストプロモーター配列。
【請求項２５】
（A）ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列（宿主細胞からＰＯＩの分泌を引き起こすのに有効なリーダー配列に作動的に連結されていても良い。）と、
（B）宿主細胞におけるたんぱく質発現を調節するのに効果的なプロモーターと、
（C）転写終結因子と、
（D）選択マーカーと、
（E）相同の組み込み配列又は自己複製配列のうちいずれか１つと、含むｐＰｕｚｚｌｅバックボーンに基づく真核生物発現ベクターであって、
前記（A）〜（E）の成分が互いに作動的に連結され、
前記プロモーターは、ピチア・パストリスから単離されたイーストプロモーター配列で、配列番号１２５〜１４７からなる群から選択された配列であるか、前記選択された配列に相当するとともに、前記選択された配列の機能的特性を有するものであるか、又は、前記配列のうちいずれか一つと機能的に同等な変異体であり、そして、
前記宿主細胞が、イースト細胞、好ましくは、コマガタエラ属の菌株の細胞、特に、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス、又は、コマガタエラ・ファフィー菌株の細胞であることを特徴とする真核生物発現ベクター。
【請求項２６】
宿主細胞におけるＰＯＩの組み換え発現のための請求項２５に記載の発現ベクターの使用。
【請求項２７】
宿主細胞における相当のＰＯＩの発現を調節するためのピチア・パストリスから単離されたイーストプロモーター配列の使用であって、前記プロモーター配列が、配列番号１２５〜１４７からなる群から選択された配列であるか、前記選択された配列に相当するとともに、前記選択された配列の機能的特性を有するものであるか、又は、前記配列のうちいずれか一つと機能的に同等な変異体であることを特徴とするイーストプロモーター配列の使用。
【請求項２８】
前記イーストプロモーター配列が、前記ＰＯＩの天然プロモーター配列よりも増加されたプロモーター活性を有することを特徴とする請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記イーストプロモーター配列が、前記ＰＯＩの天然プロモーター配列よりも減少されたプロモーター活性を有することを特徴とする請求項２７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生命工学分野、特に、遺伝子発現に関し、また、真核細胞から興味のあるたんぱく質（protein of interest; ＰＯＩ）の分泌を増加させる方法に関する。この方法は、たんぱく質分泌を増加あせるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列と、興味のあるたんぱく質をコードする組み換えヌクレオチド配列とを共発現させることを含む。本発明は、イーストプロモーター配列、特に、ピチア・パストリス（P. pastoris）のＰＥＴ９遺伝子のプロモーター配列に関する。このプロモーター配列は、イースト、好ましくは、コマガタエラ属の菌株（コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス、又は、コマガタエラ・ファフィー）において興味のあるたんぱく質を発現させるのに有用であり、かつ、匹敵する条件の下でピチア・パストリスのグリセロールアルデヒドリン酸塩デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子のプロモーター配列に比べて増加されたプロモーター活性を有する。本発明は、Ｐ．パストリスから得たＰＥＴ９プロモーター配列を含むｐＰｕｚｚｌｅバックボーンに基づく発現ベクター、並びに、宿主細胞、特に、コマガタエラ属の菌株（コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス又はコマガタエラ・ファフィー）において興味のあるたんぱく質を発現させるための前記発現ベクターの使用に関する。
【０００２】
本発明は、イースト、特に、コマガタエラ属の菌株（コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス、又は、コマガタエラ・ファフィー）において興味のあるたんぱく質を発現するのに用いられるＰ．パストリスから得た遺伝子の新規なイーストプロモーター配列に関する。
【背景技術】
【０００３】
たんぱく質の良好な分泌は、原核生物及び真核生物の両方で行われてきた。最も注目を集めているのがバクテリア（例えば、Ｅ．コリ）、イースト（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ、ピチア・パストリス、又はハンセヌラ・ポリモルファ）、糸状菌（例えば、アスペルギルス・アワモリ又はトリコデルマ・リーゼイ）、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）等である。一部のたんぱく質は高収率で分泌されるが、多くのたんぱく質は比較的低いレベルでしか分泌されない。文献［Punt et al., 2002; Macauley-Patrick et al., 2005; Porro et al., 2005］参照。
【０００４】
宿主有機における異種遺伝子発現（heterologous expression）は、宿主生物の安定した形質転換を可能にするベクターを必要とする。このベクターは、コード配列の５’末端に隣接した機能性プロモーターを有する遺伝子を提供しなければならない。こうして転写が調節され、このプロモーター配列によって転写が開始される。現在使われている大部分のプロモーターは、概して細胞内に高濃度で存在する代謝酵素をコードする遺伝子に由来する。
【０００５】
ＥＰ第０１０３４０９号には、解糖経路において特定の酵素（例えば、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ヘキソキナーゼ１及び２、グルコキナーゼ、ホスホフルクトースキナーゼ、アルドラーゼ、並びに、解糖調節遺伝子）の発現にかかわるイーストプロモーターを使用することが記載されている。
【０００６】
ＷＯ第９７／４４４７０号には、イーストにおける異種たんぱく質の発現に適したリボソームたんぱく質Ｓ７及び翻訳延長因子１（ＴＥＦ１）たんぱく質のためのヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）から得たイーストプロモーターが記載されている。
【０００７】
ＷＯ第２００５／００３３１０号には、油性のイーストであるヤロウィア・リポリチカから得たグリセルアルデヒド−３−リン酸塩脱水素酵素、又は、ホスホグリセリン酸塩ムターゼのプロモーターを用いて、イーストにおいて興味のあるコード配列を発現させる方法が記載されている。
【０００８】
組み換えたんぱく質の分泌を改善させる一つのアプローチは、ランダムな突然変異誘発（random mutagenesis）である。文献［Archer et al., 1994; Lang and Looman,1995］参照。この方法の主な難点は、ポジティブ結果を別の菌株に移す（transfer）ことができないということである。
【０００９】
真核生物、例えば、イーストの分泌経路（たんぱく質の折りたたみ及びプロセッシング）は、相互作用する多くのものが関与する非常に複雑なものである。
【００１０】
一部のこれらのたんぱく質は、ジスルフィドイソメラーゼ（disulfide isomerase; PDI）のようなたんぱく質に対して触媒活性を有するが、それ以外のこれたのたんぱく質は、たんぱく質に結合して、これらが凝集（シャペロン、例えば、ＢｉＰ）しないようにすることによって、又は、分泌経路におけるより後半のステップにおいて細胞外部へのたんぱく質の放出を促すことによって（ＳＳＯタンパク質）、作用する。この相互依存に基づいて、分泌経路において１つの反応ステップの速度が増加されても、興味のあるたんぱく質の分泌が自動的に増加されるものではなく、その代わり、２以上の次の反応ステップに律速（rate-limitation）をもたらし、それにより、発現系のボトルネックを除去することはできず、単にそれを移動させるだけである。
【００１１】
分泌経路は、小胞体内腔へ分泌されるポリペプチド及び膜貫通ポリペプチドの転座（転位）によって始まるのが通常である。この目的のために、これらのたんぱく質は、アミノ末端信号配列（amino-terminal signal sequence）を有している。この信号配列（リーダー配列とも呼ばれる。）は、通常13〜36個のより疎水性のアミノ酸で構成されているが、特別なコンセンサス配列については全く知られていない。ＥＲ内腔において、この信号配列は、信号ぺプチダーゼによって除去されるが、新生（初期の）ポリペプチドは、シャペロンに結合して、翻訳が完了するまでミスコイル現象（miscoling）を防止する。ＥＲ固有のたんぱく質は、正しい折りたたみに関与する。これは、例えば、calnexin, calreticulin, Erp72, GRP94、及び、PDIを含む。これらは、ジスルフィド結合、及び、牡プロイルイソメラーゼ（prolyl-isomerase）の形成反応を触媒する。その他、ＥＲ内腔においてISIグリコシル化のような一部の翻訳後の修飾反応（post-translational modification）を開始する。このたんぱく質は、ＥＲ質制御メカニズムによってたんぱく質の正しい構造（形態）が確認された場合のみ、小胞輸送によってゴルジ装置の方へ運ばれる。異なる信号が存在しない限り、分泌たんぱく質は、特有の輸送小胞によってゴルジ装置から細胞膜の外部の方へ向かう。
【００１２】
大部分の場合において、真核生物の分泌経路における律速段階は、ＥＲからゴルジ装置へたんぱく質が移動する段階であることが判明された（Shuster, 1991）。ＥＲ関連たんぱく質の分解（ER-associated protein degradation: ERAD）は、ＥＲにおいて異常な折り畳み構造の又は無修飾の非機能性たんぱく質を保存（保持）し、後ほどそれを除去する役割をする。
【００１３】
一部の場合において、異種たんぱく質の分泌プロセスが、分泌経路に関与し、かつ、別のたんぱく質の折り畳み及び／又はプロセッシングを支持する特定のたんぱく質の共過剰発現（co-overexpression）によって促されることが知られている（Mattanovich et al., 2004）。
【００１４】
ＰＤＩをコードする遺伝子及び異種のジスルフィド結合を有するたんぱく質をコードする遺伝子の共発現（co-expression）は、ＷＯ第９３／２５６７６号において、異種たんぱく質の産生を増加させる手段として始めて示唆された。この文献によれば、アンチスタシン（antistasin）及びチック（tick）抗凝血たんぱく質の組み換え発現を、ＰＤＩとの共発現によって増加させることができる。
【００１５】
ＷＯ第９４／０８０１２号には、Ｈｓｐ７０シャペロンたんぱく質、即ち、ＫＡＲ２、及び、ＢｉＰ、又は、ＰＤＩシャペロンたんぱく質の発現を増加させることによって、イーストにおけるたんぱく質の分泌を増加させる方法が記載されている。
【００１６】
イーストシンタキシン（syntaxin）相同体ＳＳ０１及びＳＳ０２は、ｔ−ＳＮＡＲＥとして作用することによって、細胞膜に対する分泌ベシクルの融合に必要である。
【００１７】
ＷＯ第９４／０８０２４号には、遺伝子ＳＳＯ１及びＳＳＯ２の共発現によって分泌された外因性（foreign）又は内因性たんぱく質の量を増やす方法が記載されている。
【００１８】
ＷＯ第０３／０５７８９７号には、シャペロンたんぱく質であるGroEL、GroES、Dnak、DnaJ、Grpe、CipB、及び、これらの相同体からなる群から選ばれたたんぱく質をコードする２以上の遺伝子を共発現することによって、興味のあるたんぱく質の組み換え発現法が記載されている。
【００１９】
ＷＯ第２００５／０６１７８７８号及びＷＯ第２００６／０６７５１１号には、2μm系発現プラスミドを用いてイーストにおいて所望の異種タンパク質を産生する方法が記載されている。異種たんぱく質の産生が、１以上のシャペロンたんぱく質の遺伝子及び異種たんぱく質が同じプラスミド上において共発現されるときに、実質的に増加されることが証明された。
【００２０】
分泌経路を刺激する（即ち、促す）ための別のアプローチとして、折り畳まれないたんぱく質の応答（UPR）活性化転写因子ＨＡＣ１を過剰発現させる方法がある。転写分析の結果、３３０個以下の遺伝子は、ＨＡＣ１によって調節され、それらの大部分は、分泌細胞器官（例えば、ＥＲに存在するシャペロン、フォールダーゼ（foldase）、トランスロコンの成分）の生合成又は分泌の官能基（functional group）に属することが分かった。
【００２１】
ＷＯ第０１／７２７８３号には、上昇された変性（折り畳まれていない）タンパク質反応（ＵＰＲ）を誘導することによって、真核細胞から分泌された異種たんぱく質の量を増やす方法が記載されている。ここで、ＵＰＲは、ＨＡＣ１、ＰＴＣ２、及び、ＩＲＥＩからなる群から選択されたたんぱく質との共発現によって調節される。
【００２２】
フラボ酵素（flavoenzyme）ＥＲ０１は、ＥＲにおけるたんぱく質ジチオール（dithiol）の酸化に必要とされる。これは、分子酸素によって酸化されて、ＰＤＩの特異的酸化剤としてはたらくものである。ＥＲ０１内で新たに生成されたジスルフィドは、ＰＤＩの方に移動され、その後、ジチオール−ジスルフィド交換反応によって基質たんぱく質の方に移動される。
【００２３】
ＷＯ第９９／０７７２７号には、ジスルフィド結合形成を向上させて、適切に折り畳まれた組み換えタンパク質の収率を上げるためのＥＲ０１の使用が記載されている。
【００２４】
これらのアプローチは、別の菌株にも適用することができ、かつ、別のたんぱく質に対しても利用することができるが、他のたんぱく質の分泌を支持するこれらのたんぱく質の機能に関する実際の知識によって限られているのが現状である。
【００２５】
組み換えたんぱく質を高度に発現させることは、多数の異なるステップ、例えば、折り畳みステップ、ジスルフィド結合の形成ステップ、グリコシル化、細胞内輸送、又は、細胞からの放出によって制限されることが予想される。これらのプロセスのうち多くが依然として完全に解明されていないために、たんぱく質の分泌を支持する多くのたんぱく質は今後より明確になるだろう。しかしながら、宿主生物の全ゲノムのＤＮＡ配列が利用可能となった現時点においても、そのようなヘルパー機能は予想できない。
【００２６】
イースト分泌経路に関与すると知られたたんぱく質は、たんぱく質の折り畳みプロセス、及び、その後に行われる分泌プロセスにおける各ステップにしばしば影響を与える。
【００２７】
したがって、簡単かつ効果的に真核細胞において分泌されたたんぱく質の産生を増加させる新規の方法が望まれている。また、分泌たんぱく質の産生量を増加させる方法に用いられる新たな遺伝子を提供することが望まれている。新たなイーストプロモーター、特に、イースト（特に、コマガタエラ属のイースト）における異種又は同種遺伝子の発現、及び、その他の真核生物発現系における所望の遺伝子の発現に用いることができる新たなイーストプロモーターを提供することが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】ＷＯ第９４／０８０１２号
【特許文献２】ＷＯ第９４／０８０２４号
【特許文献３】ＷＯ第０３／０５７８９７号
【特許文献４】ＷＯ第２００５／０６１７８７８号
【特許文献５】ＷＯ第２００６／０６７５１１号
【特許文献６】ＷＯ第０１／７２７８３号
【特許文献７】ＷＯ第９９／０７７２７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
本発明は、真核細胞から興味のあるたんぱく質の分泌を増加させる方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は、たんぱく質分泌を増加あせるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列と、ＰＯＩ（興味のあるたんぱく質）をコードする組み換えヌクレオチド配列とを共発現させることを含む真核細胞からＰＯＩの分泌を増加させる方法を提供する。ＰＯＩの分泌増加は、たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質の共発現の有無による分泌量（分泌収率）の比較に基づいて決められる。
【００３１】
本発明は、たんぱく質分泌を増加あせるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列と、ＰＯＩ（興味のあるたんぱく質）をコードする組み換えヌクレオチド配列とを共発現させることを含む前記方法において、たんぱく質の分泌を増加させる前記たんぱく質を、BMH2、BFR2、C0G6、C0Y1、CUP5、IMH1、KIN2、SEC31、SSA4、SSE1、及び、これらのたんぱく質のいずれか１つの生物活性断片からなる群から選択することを特徴とする。
【００３２】
本発明は、前記方法において、前記たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列を、イースト、好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ、又はピチア・パストリス種から得ることを特徴とする。
【００３３】
本発明は、前記方法において、前記たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列が、サッカロマイセス・セレビシエから得たもので、配列番号３２〜４１からなる群から選択されたいずれか一つであるか、又は、前記配列番号３２〜４１からなる群から選択されたいずれか一つに相当する配列を有するとともに、前記選択された配列の機能的特性を有するものであることを特徴とする。
【００３４】
本発明は、前記方法において、前記たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列が、ピチア・パストリスから得たもので、配列番号４２〜５１からなる群から選択されたいずれか一つであるか、又は、前記配列番号４２〜５１からなる群から選択されたいずれか一つに相当する配列を有するとともに、前記選択された配列の機能的特性を有するものであることを特徴とする。
【００３５】
本発明は、たんぱく質分泌エンハンサー、特に、真核細胞におけるＰＯＩの分泌エンハンサーとしての、たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質をコードするヌクレオチド配列の使用に関する。
【００３６】
本発明の別の目的は、宿主細胞からたんぱく質分泌を増加させるたんぱく質をコードするヌクレオチド配列を提供することである。ここで、前記ヌクレオチド配列は、ピチア・パストリスから単離されたものであり、たんぱく質ＢＭＨ２をコードするヌクレオチド配列（配列番号４２）、たんぱく質ＢＦＲ２をコードするヌクレオチド配列（配列番号４３）、たんぱく質ＣＯＧ６をコードするヌクレオチド配列（配列番号４４）、たんぱく質ＣＯＹ１をコードするヌクレオチド配列（配列番号４５）、たんぱく質ＣＵＰ５をコードするヌクレオチド配列（配列番号４６）、たんぱく質ＩＭＨ１をコードするヌクレオチド配列（配列番号４７）、たんぱく質ＫＩＮ２をコードするヌクレオチド配列（配列番号４８）、たんぱく質ＳＥＣ３１をコードするヌクレオチド配列（配列番号４９）、たんぱく質ＳＳＡ４をコードするヌクレオチド配列（配列番号５０）、及び、たんぱく質ＳＳＥ１をコードするヌクレオチド配列（配列番号５１）からなる群から選択された配列と同じであるか、又は、前記選択された配列に相当し、かつ、前記選択された配列の機能的特性を有していることを特徴とする。
【００３７】
本発明の別の目的は、ピチア・パストリスのPET9遺伝子のイーストプロモーター配列を提供することである。ここで、前記イーストプロモーター配列は、匹敵する条件の下で、ピチア・パストリスのGAPプロモーター配列よりも、イースト、好ましくは、コマガタエラ属の菌株、特に、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス、又は、コマガタエラ・ファフィー菌株におけるＰＯＩの発現を増加させるものである。
【００３８】
本発明の別の目的は、かかるプロモーター配列、特に、配列番号１２５と同じであるか、若しくは、配列番号１２５の機能的特徴を有するとともに、前記配列番号125に相当する配列を有するイーストプロモーター配列、又は、これと機能的に同等な変異体を提供することである。
【００３９】
本発明は、前記ピチア・パストリスから得たＰＥＴ９遺伝子のイーストプローター配列を含むpPuzzleバックボーンに基づく配列ベクターに関する。ここで、前記イーストプロモーター配列は、配列番号１２５と同じであるか、若しくは、配列番号１２５の機能的特徴を有するとともに、前記配列番号125に相当する配列を有するイーストプロモーター配列、又は、これと機能的に同等な変異体である。
【００４０】
本発明は、宿主細胞におけるＰＯＩの発現に用いる前記プラスミドの使用に関する。ここで、前記宿主細胞は、コマガタエラ属の細胞、特に、Ｋ．パストリス、Ｋ．シュードパストリス 又は、Ｋ．ファフィー種の細胞であり得る。
【００４１】
本発明の別の目的は、イースト、特に、コマガタエラ属の菌株におけるＰＯＩの発現に用いるピチア・パストリスから単離されたイーストプロモーター配列を提供することである。ここで、前記イーストプロモーター配列は、ＧＮＤ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１２６）、GPM1遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１２７）、ＨＳＰ９０遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１２８）、KAR2遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１２９）、MCM 1遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３０）、RAD2遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３１）、RPS2遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３２）、RPS31遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３３）、ＳＳＡ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３４）、THI3遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３５）、ＴＰＩ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３６）、UBI4遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３７）、ＥＮＯ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３８）、RPS7A遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３９）、ＲＰＬ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４０）、TKL1遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４１）、ＰＩＳ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４２）、FET3遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４３）、ＦＴＲ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４４）、NMT1遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４５）、ＰＨＯ８遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４６）、及び、FET3 前駆体（FET3pre）遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４７）からなる群から選択された配列と同一であるか、若しくは、前記選択された配列に相当し、かつ、前記選択された配列の機能的特性を有する配列であるか、又は、前記配列のうちいずれか一つと機能的に同等な変異体であることを特徴とする。
【００４２】
本発明は、前記イーストプロモーター配列を含むpPuzzleバックボーンに基づく発現ベクターに関する。ここで、前記イーストプロモーター配列は、配列番号１２６〜配列番号１４７からなる群から選択された配列と同一であるか、若しくは、前記選択された配列に相当し、かつ、前記選択された配列の機能的特性を有する配列であるか、又は、前記配列のうちいずれか一つと機能的に同等な変異体である。
【００４３】
本発明は、宿主細胞におけるＰＯＩの発現に用いる前記プラスミドの使用に関する。ここで、前記宿主細胞は、コマガタエラ属の細胞、特に、Ｋ．パストリス、Ｋ．シュードパストリス、又は、Ｋ．ファフィー種の細胞であり得る。
【発明の効果】
【００４４】
本発明によれば、たんぱく質分泌を増加あせるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列と、ＰＯＩ（興味のあるたんぱく質）をコードする組み換えヌクレオチド配列とを共発現させることにより、真核細胞からＰＯＩの分泌を増加させることができる。また、本発明のプロモーターは、ピチア・パストリスから単離されたＧＡＰプロモーターに比べて、同等の条件の下で、改善されたプロモーター活性を有する。
【００４５】
本発明の原理（原則）は、特許請求の範囲の独立項に記載されているが、本発明に係る様々な具体例が従属項に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、pPuzzleのベクターバックボーンの構造及び関連制限酵素切断部位を示したものである。ここには、クローニングベクターpBR322から増幅されたＥ．コリに対するAmpR選択マーカー、及び、クローニングベクターpUC19から増幅された複製起点（ORI）が含まれている。pPuzzleベクターバックボーンのクローニングについての詳細は、実施例３に記載されている。
【図２】図２は、ベクター pPuzzle＿zeoR＿PPET9＿eGFP＿AOXTTの構造及び制限酵素切断部位を示したものである。このベクターにおいて、レポーター遺伝子GFP（グリーン蛍光たんぱく質）は、P.パスとリスのPET9遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片の調節下にある。このベクターは、pUC１９から増幅されたE.coli ORI、5. セレビシエのシトクロムC遺伝子の転写終結因子(eye 1 TT)、ゼオシン選択マーカー、及び、P.パストリスのAOX1遺伝子のプロモーター配列(AOXTT part 1 及び2)を含んでいる。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
たんぱく質産生時における宿主生物の遺伝子調節をより良く理解するために、非生産菌株（Sauer et al., 2004）に比べて、組み替えヒト（ｒｈ）トリプシノーゲンを発現するＰ．パストリスクローンを用いたＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション分析を行った。分析方法の詳細は、実施例１に記載されている。これらの実験から、Ｐ．パストリスの全遺伝子の約１／３の転写レベルの測定が可能あるものの、これまでに分泌を増進すると同定されないたんぱく質の可能性に関する直接的な情報は得られなかった。
【００４８】
ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーションより得たデータをさらに分析することによって、候補としての分泌支持たんぱく質、又は、その遺伝子をそれぞれ同定することができる。これを得るために、ｒｈトリプシノーゲンの遺伝子を運ぶプラスミドで形質転換されたＰ．パストリス菌株における測定された全遺伝子のうち相対的な発現量を、同じ条件の下で培養した野生型菌株に比較した。その後、これらの発現量の相対的な差異によって整列し、そして、次の分析のために最も差異の大きい５２４個の遺伝子を選んだ。これらの実験に用いられるＤＮＡマイクロアレイは、 サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）遺伝子配列由来のものであったので、S. セレビシエとの相同性によって、単にＰ．パストリスの遺伝子の推定上の機能が得られただけである。この推定上の細胞内位置及び機能に基づいて、５２４個の個別に調節される遺伝子を位置付けるとともに、分泌及び／又は一般的なストレス反応に関与するものに焦点を当てて、６４個の興味のある候補遺伝子のうち、次の分析のために１５個を選択した。ＰＣＲによってS.セレビシエからこれらの遺伝子をクローニングし、Ｐ．パストリス発現ベクター内へサブクローニングした。その後、ＨＩＶ１に対するモノクローナル抗体（2F5mAb）のＦａｂ断片を発現するＰ．パストリス菌株へ形質転換させた。（Ｆａｂ断片のみを産生するクローンに対して）Ｆａｂ断片及び異なる推定上の分泌ヘルパーたんぱく質の両方を産生するクローンを培養することによって、Ｆａｂ断片の分泌に対して推定上のヘルパーたんぱく質をコードする以下の遺伝子の過剰発現の有利な効果を確認することができた：PDM、CUP5、SSA4、BMH2、KIN2、KAR2、HAC1、ERO1、SSE1、BFR2、COG6、SSO2、COY1、IMH1及びSEC31。
【００４９】
たんぱく質 PDI1、KAR2、HAC1、ERO1及びSSO2は、異種たんぱく質の組み換え発現の際に共発現されると、適用可能な折りたたみ／分泌ヘルパー因子として当業者に既に知られたものである。ＤＮＡマイクロアレイ分析において同定されたその他のたんぱく質、即ち、CUP5、SSA4、BMH2、KIN2、SSE1、BFR2、COG6、COY1、IMH1及びSEC31は組み換えによって産生されたＰＯＩの分泌に有利な効果をもたらすものとして全く知られていないものである。
【００５０】
したがって、本発明は、たんぱく質の分泌を増加させるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列、及び、ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供するステップと、前記宿主細胞において、たんぱく質の分泌を増加させるたんぱく質をコードする前記１以上の組み換えヌクレオチド配列、及び、ＰＯＩをコードする前記組み換えヌクレオチド配列を発現するステップと、を含む真核細胞からＰＯＩの分泌を増加させる方法に関する。
【００５１】
ここで、たんぱく質の分泌を増加させる前記たんぱく質は、BMH2、BFR2、C0G6、C0Y1、CUP5、IMH1、KIN2、SEC31、SSA4、SSE1、及び、これらのたんぱく質のいずれか１つの生物活性断片からなる群から選択する。
【００５２】
本明細書に使用された用語「興味のあるたんぱく質（protein of interes；tＰＯＩ）」とは、宿主細胞において組み換え技術によって産生されるたんぱく質をいう。より具体的に、このたんぱく質は、宿主細胞に自然発生されないポリペプチド、すなわち、異種たんぱく質であるか、又は、宿主細胞の自然発生的なポリペプチド、即ち、宿主細胞と同種の（相同の）たんぱく質であり得る。後者の場合、例えば、ＰＯＩをコードする核酸配列を含んだ自己複製ベクターを用いて形質変換することによって、組み換え技術を用いて、宿主細胞のゲノムへＰＯＩをコードする核酸配列の１以上のコピーを組み込む際に、又は、ＰＯＩをコードする遺伝子の発現を調節する１以上の調節配列（例えば、プロモーター配列）の組み換え変異（recombinant modification）によって産生される。
【００５３】
ＰＯＩは、真核たんぱく質又は原核たんぱく質であり得る。たんぱく質は、自然分泌たんぱく質又は細胞内たんぱく質（即ち、自然に分泌されないたんぱく質）であり得る。本発明は、自然分泌されるたんぱく質又は自然分泌されないたんぱく質の生物活性断片を含む。
【００５４】
本明細書に使用された用語「分泌ＰＯＩ（secreted ＰＯＩ）」は、酵素のように産業用に用いられるたんぱく質、抗体若しくは抗体断片、成長因子、ホルモン、酵素、又は、ワクチンのように生物医薬品として適したものに限られない。
【００５５】
本明細書に使用された用語「ＰＯＩ」は、たんぱく質分泌のヘルパー因子、又は、代謝操作目的（metabolic engineering purpose）に用いられる酵素に限られない。
【００５６】
別の具体例において、ＰＯＩは、真核たんぱく質又はその生物活性断片であり、好ましくは、Ｆｃ断片又はＦａｂ断片のような免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片である。最も好ましくは、ＰＯＩは、モノクロなーる抗体−ＨＩＶ１抗体２Ｆ５のＦａｂ断片である。
【００５７】
一般的に、この明細書に使用された興味のあるたんぱく質（protein of interest）は、当業者に知られた組み換え発現法によって産生され得る。
【００５８】
本明細書に記載された方法は、ＰＯＩの発現を可能にする条件の下で前記組み換え宿主細胞を培養することを含む。その後、組み換え技術によって産生され、かつ、分泌されたＰＯＩを細胞培地から分離した後、当業者に知られた技術によってそれを精製する。
【００５９】
本明細書に使用されたたんぱく質の「生物活性断片（biologically active fragment）」とは、全長たんぱく質に類似し、又は、それに匹敵する生物学的効果を奏するたんぱく質の断片をいう。このような断片は、例えば、内部欠損（internal deletion）、アミノ−及びカルボキシ−末端欠損等によって得ることができる。
【００６０】
一般的に、たんぱく質を分泌する宿主細胞は、ＰＯＩの組み換え発現に適したいずれかの真核細胞であり得る。
【００６１】
好ましい具体例において、本発明は、前記方法において、前記宿主細胞が、イースト細胞のような真菌細胞、又は、高等真核細胞（例えば、哺乳類細胞又は植物細胞）であることを特徴とする。
【００６２】
イースト細胞の例として、サッカロマイセス属（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ）、コマガタエラ属（コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス、又は、コマガタエラ・ファフィー)、ピチアポチア・メタノリカ、ハンセヌラ・ポリモルファ又はクリベロマイセス・ラクティスなどがあるが、それらに限られない。
【００６３】
本発明の前記方法に係る好ましい具体例において、前記イースト細胞は、コマガタエラ属の細胞、特に、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス、又は、コマガタエラ・ファフィーの細胞である。
【００６４】
以前の種ピチア・パストリスは、分かれて、コマガタエラ・パストリス、及び、コマガタエラ・ファフィーに命名された(Kurtzman, 2005)。したがって、ピチア・パストリスは、コマガタエラ・パストリス、及び、コマガタエラ・ファフィーの両方の同意語である。
【００６５】
たんぱく質の分泌を増加させるたんぱく質をコードするヌクレオチド配列は様々なソースから得ることができる。前記たんぱく質は、真核生物たんぱく質の分泌経路に関与し得る。
【００６６】
本発明は、前記方法において、たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列が、イーストヌクレオチド配列、好ましくは、イースト種であるサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）又はピチア・パストリス（Pichia pastoris）のヌクレオチドであることを特徴とする。また、その他の適切なイースト、若しくは、それ以外の真菌、又は、その他の生物（例えば、脊椎動物）から得た相同のヌクレオチド配列を用いることもできる。
【００６７】
本明細書に使用された用語「相同の（同種の）ヌクレオチド配列（homologous nucleotide sequence）」とは、そのヌクレオチド配列が所定のヌクレオチド配列と関連しているが、同じではなく、かつ、実質的に同じ機能を果たすヌクレオチド配列をいう。
【００６８】
本発明は、前記方法において、たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質をコードする１以上の組み換えヌクレオチド配列が、サッカロマイセス・セレビシエから得たもので、配列番号３２〜４１からなる群から選択された配列と同一であるか、又は、それに相当し、かつ、その選択された配列の機能的特性を有することを特徴とする。
【００６９】
本明細書に使用された用語「〜に相当し、そして、〜機能的特性を有するヌクレオチド配列」は、遺伝子コードの縮退（degeneracy）に基づく変異（variation）を含むヌクレオチド組成物における変異を含む。それにより、このヌクレオチド配列は、実質的に同じ機能を果たす。
【００７０】
サッカロマイセス・セレビシエから単離された分泌ヘルパー因子のヌクレオチド配列を用いてＰ．パストリスゲノムデータベース（ERGOTM、IG-66、Integrated Genomics）をスクリーニングすることによって、Ｐ．パストリスにおける相同ヌクレオチド配列を同定した。予備実験では、ピチア・パストリスから単離されたこれらの相同ヌクレオチド配列が、サッカロマイセス・セレビシエから単離された相応するヌクレオチド配列に比べて、宿主細胞のたんぱく質分泌に類似した効果を奏することが明らかになった。
【００７１】
本発明は、前記方法において、たんぱく質分泌を増加させる１以上の組み換えヌクレオチド配列が、ピチア・パストリスから得られたもので、配列番号４２〜５１からなる群から選択された配列と同じであるか、又は、その選択された配列に相当し、かつ、その選択された配列の機能的特性を有することを特徴とする。
【００７２】
本発明は、前記方法において、ＰＯＩをコードする組み換えたんぱく質ヌクレオチド配列を、細胞あたり単一コピー又は多重コピーとして、宿主細胞のゲノムに組み込むのに適したプラスミド上に提供することを特徴とする。
【００７３】
或いは、ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列、及び、たんぱく質の分泌を増加させるたんぱく質をコードする組み換えヌクレオチド配列は、細胞あたり単一コピー又は多重コピーとして同じプラスミド上に存在する。
【００７４】
本明細書に使用された用語「プラスミド」及び「ベクター」は、自己複製ヌクレオチド配列及びゲノム組み込み用ヌクレオチド配列（genome integrating nucleotide sequence）を含む。
【００７５】
本発明は、前記方法において、プラスミドが真核生物発現ベクター、好ましくは、イースト発現ベクターであることを特徴とする。
【００７６】
本明細書に使用された用語「発現ベクター」は、適切な宿主生物において、クローン化組み換えヌクレオチド配列（即ち、組み換え遺伝子）の転写、及び、そのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列として定義される。かかる発現ベクターは、一般的に宿主細胞における自己複製起点、選択マーカー（例えば、ゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８、又は、ハイグロマイシンのような抗生物質に抵抗性を示す遺伝子、又は、アミノ酸合成遺伝子）、複数の制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列、及び、転写終結因子を含むが、これらの要素は、互いに作動的に連結されている（operably linked）。
【００７７】
本明細書に使用された用語「作動的に連結された（operably linked）」とは、単一の核酸分子（例えば、ベクター）上における複数の核酸配列が、１以上のヌクレオチド配列の機能が、前記核酸分子上に存在する１以上のそれ以外の別のヌクレオチド配列によって影響を受けるように連関していることを意味する。例えば、プロモーターは、組み換え遺伝子をコードする配列を発現させることができるときに、前記配列に作動的に連結されている。
【００７８】
発現ベクターは、クローニングベクター、改質クローニングベクター、及び、特別に作られたプラスミドを含むが、それらに限られるものではない。本発明の発現ベクターは、宿主細胞における組み換え遺伝子の発現に適したいかなる発現ベクターであっても良く、宿主生物に基づいて選択される。
【００７９】
本発明は、前記方法において、発現ベクターが、前記宿主細胞からＰＯＩの分泌を引き起こるのに有効な分泌リーダー配列を含むことを特徴とする。
【００８０】
発現ベクターにおけるかかる分泌リーダー配列の存在は、組み換え発現及び分泌されるべきＰＯＩが、天然的に分泌されないために、天然分泌リーダー配列を欠いたたんぱく質であるとき、又は、そのヌクレオチド配列がその天然分泌リーダー配列なしにはクローンされたときに必要とされる。一般的に、宿主細胞からＰＯＩの分泌を引き起こすのに有効ないかなる分泌リーダー配列をも本発明に用いることができる。これらの分泌リーダー配列は、イーストソース（例えば、サッカロマイセス・セレビシエのMFαのようなα因子、若しくはイーストホスファターゼ）、哺乳類ソース、又は、植物ソースに由来し得る。適切な分泌リーダー配列の選択は、当業者にとって明らかであろう。
【００８１】
その他、分泌リーダー配列は、発現ベクターにおいてヌクレオチド配列をクローニングする前に、又は、天然分泌リーダー配列を含むＰＯＩをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターでクローニングする前に、当業者に知られた従来のクローニング法によって、組み換え発現用のＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に融合され得る。これらの場合において、発現ベクターに分泌リーダー配列は不要である。
【００８２】
宿主細胞のおける組み換えヌクレオチドの発現を可能にするために、発現ベクターは、前記組み換えヌクレオチド配列に、コードする配列の５’末端に隣接した機能性プロモーター（functional promoter）を提供すべきである。それによって転写が調節され、このプロモーター配列によって転写が開始される。
【００８３】
本発明は、前記方法において、前記発現ベクターが、宿主細胞におけるＰＯＩの発現を調節するのに有効なプロモーター配列を含むことを特徴とする。
本明細書に使用された用語「プロモーター配列」は、コードする配列（coding sequence）又は機能的RNA（functional RNA）の発現を調節できるDNA配列をいう。
【００８４】
イースト宿主細胞に適したプロモーターとして、細胞に高濃度で存在すると知られている代謝酵素をコードする遺伝子から得たプロモーター、例えば、トリオースリン酸イソメラーゼ(TPI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、アルコールオキシダーゼ(AOX)、ラクターゼ(LAC) 及びガラクトシダーゼ(GAL)のような解糖酵素が挙げられるが、これらに制限されない。
【００８５】
哺乳類細胞に適したプロモーターとして、ウイルス、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び、熱ショックたんぱく質プロモーターなどが挙げられるが、これらに制限されない。
【００８６】
ＰＯＩの組み換え発現用のイースト宿主細胞、好ましくは、コマガタエラ属、特に、Ｋ．パストリス、Ｋ．シュードパストリス、又は、Ｋ．ファフィー菌株において使用するに適した新規のプロモーター配列を同定するために、実施例１に記載したDNAマイクロアレイハイブリダイゼーション（DNA microarray hybridization）から得たデータを所定の方法に基づいて評価した。
【００８７】
この分析法によって同定された２３個の最も興味のある遺伝子のプロモーター配列（各遺伝子の５’−領域の１０００ｂｐまで）を、Ｐ．パストリスからPCRによって増幅させ、Ｐ．パストリス発現ベクターの方にクローニングした。ここで、発現ベクターは、レポーター遺伝子として向上されたグリーン蛍光たんぱく質（ｅＧＦＰ）をさらに有する。その後、異なるプロモーターの特性（即ち、プロモーター活性）をテストするために、２５個のベクター（２つの対照群ベクターを含む）を、Ｐ．パストリス菌株の方に形質転換させた。このクローンを、異なる培養条件の下で培養して、組み換えｅＧＦＰの量を流動血球計算器分析（flow cytometer analysis）に基づいて定量化した。ウェルの比較分析によってＧＡＰのイーストプロモーターを確立し、その２３個のプロモーター配列を実施例５に用いた。
【００８８】
本明細書に使用された用語「プロモーター活性」は、プロモーターの転写効率の評価値を意味する。これは、プロモーターから発現された遺伝子産物の量を測定することによって間接的に、又は、例えばノーザンブロット法を用いて、プロモーターからmRNA転写量を測定することによって直接的に決定することができる。
【００８９】
Ｐ．パストリスのＰＥＴ９遺伝子の５’−非コーディング領域（non-coding region）から１０００ｂｐの断片が、予想外に、実施例５に記載された実験条件下での培養の際に、炭素源に依存して、組み換えｅＧＦＰを高度に（ＧＡＰプロモーター活性の約７００％〜１６００％）発現させることが分かった。
【００９０】
PET９は、ミトコンドリア内膜の主なＡＤＰ／ＡＴＰキャリアとしてS. セレビシエから知られたもので、サイトゾルＡＤＰをミトコンドリアによって合成されたＡＴＰと交換する。
【００９１】
本発明は、真核細胞からＰＯＩの分泌を増加させる方法に関する。ここで、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター配列によって調節されるが、そのプロモーター配列は、配列番号１２５に相当するピチア・パストリスのＰＥＴ９遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片、又は、その機能的に同等な変異体（functionally equivalent variant）である。また、宿主細胞は、コマガタエラ属の細胞、特に、Ｋ．パストリス、Ｋ．シュードパストリス 又は、Ｋ．ファフィー種の細胞である。
【００９２】
本発明は、サッカロマイセス・セレビシエから単離された、たんぱく質の分泌を増加させるたんぱく質をコードする、ヌクレオチド配列の使用に関する。ここで、前記たんぱく質は、好ましくは、イースト細胞、最も好ましくは、Ｋ．パストリス、Ｋ．シュードパストリス又はＫ．ファフィーの細胞において、分泌エンハンサー（secretion enhancer）、特に、真核細胞からのＰＯＩの分泌エンハンサーとして、BMH2、BFR2、COG6、C0Y1、CUP5、IMH1、KIN2、SEC31、SSA4、SSE1、及び、これらのたんぱく質のいずれか一つの生物活性断片からなる群から選択される。
【００９３】
本発明は、前記使用において、たんぱく質の分泌を増加させるたんぱく質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号３２〜４１からなる群から選ばれた配列と同一であるか、又は、これらの配列に相当し、かつ、これらの配列の機能的特徴を有するものである。
【００９４】
本発明は、前記使用において、前記ヌクレオチド配列が、ピチア・パストリスから単離され、かつ、たんぱく質の分泌を増加させるたんぱく質をコードする、ヌクレオチド配列であることを特徴とする。ここで、前記たんぱく質は、好ましくは、イースト細胞、最も好ましくは、Ｋ．パストリス、Ｋ．シュードパストリス、又は、Ｋ．ファフィーの細胞において、分泌エンハンサー（secretion enhancer）、特に、真核細胞からＰＯＩ分泌のエンハンサーとして、BMH2、BFR2、COG6、C0Y1、CUP5、IMH1、KIN2、SEC31、SSA4、SSE1、及び、これらのたんぱく質のいずれか一つの生物活性断片から選択される。
【００９５】
本発明は、前記使用において、たんぱく質分泌を増加させるたんぱく質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号４２〜５１からなる群から選択された配列と同一であるか、又は、前記配列に相当し、かつ、前記配列の機能的特性を有するものであることを特徴とする。
【００９６】
ＳＳＡ４は、分子シャペロンのＨＳＰ７０科に属する。ＳＳＡ４は、たんぱく質が小胞体内腔（ER-lumen）への共翻訳的転座（cotranslational translocation）に先立って、たんぱく質のＥＲ膜へのＳＲＰ−依存的ターゲッティングに関与し、かつ、ストレス反応時に誘導される。
【００９７】
ＨＳＰ７０科のＳＳＥ／ＨＳＰ１１０サブクラスのシャペロニン（ＳＳＥ１及びＳＳＥ２によってコードされる。）は、新生ペプチドに結合し、それらを折り畳み受容状態（folding-competent state）に保持することによって、折り畳みを助けるが、折り畳み反応を積極的に促進させるものではない。これらの「ホルダーゼ（holdase）」活性に基づいて、ＨＳＰ７０科のＳｓａｉ１ｐ及びＳｓｂ１ｐのようなシャペロンとの相互作用でけでなく、ＨＳＰ９０複合体との相互作用は、もっともらしく思われる。
【００９８】
Ｓｅｃ３１ｐは、Ｓｅｃ１３ｐと複合した、分泌経路ベシクルの外被たんぱく質複合体ＩＩ（ＣＯＰＩＩ）の必修の燐たんぱく質（phosphoprotein）成分である。
【００９９】
Ｓｅｃ１３又はＳｅｃ２３（Ｓｅｃ１６及びＹｐｔ１も）のいずれかにおける突然変異に基づく増殖欠陥（発育異常）は、必修のS.セレビシエ遺伝子ＢＲＦ２を過剰発現させることによって、克服することができる。それは、ゴルジ及びゴルジ装置自体の構造へのたんぱく質の流入を乱す真菌代謝体である、ブレフェルジンＡ（Brefeldin A）の多コピーサプレッサーとして単離された。
【０１００】
ＢＭＨ１及びＢＭＨ２によってコードされた１４−３−３たんぱく質は、ベシクル輸送（trafficking）の多段階、特に、ＥＲから出るたんぱく質における多量体細胞表面膜（multimeric cell surface memberane）の正輸送（forward trafficking）、及び、ゴルジ装置内の逆輸送（retrograde transportation）に関与することが分かった。
【０１０１】
ＣＯＧ６は、保存されたオリゴマーゴルジ（Conserved Oligomeric Golgi；ＣＯＧ）複合体（８個のサブユニットの周囲ゴルジたんぱく質）をコードする８個の遺伝子のうち一つである。この複合体は、複合糖質（glycoconjugate）の膜輸送（membrane trafficking）及び合成に関与する。また、ＣＯＧ複合体は、正常なゴルジ構造及び機能を保つのに必要とされ、かつ、ゴルジ装置内でのベシクルの逆輸送にも直接的にかかわっている。
【０１０２】
Ｃｏｙ１（哺乳類ＣＡＳＰとの類似性によって同定されたたんぱく質）の分子機能は、未だに確立されていないが、Ｇｏｓ１との相互作用を通じてゴルジベシクル輸送に一定の役割をするものと考えられる。Ｇｏｓ１は、S．セレビシエにおいてゴルジの後期コンパートメント（later compartment）のマーカーとして広く使われるＳＮＡＲＥたんぱく質（可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子付着たんぱく質受容体）である。
【０１０３】
IMH1/SYS3遺伝子の産物は、後期ゴルジ（late golgi）とprevacuolarエンドソーム様のコンパートメント間のベシクル輸送に関与する表在性膜ゴルギン（Golgin）の一つである。Imh1は、２つのARF様の（ＡＲＬ）ＧＴＰアーゼであるArI I p及びArl3pによってゴルジの方に補充される。
【０１０４】
Kin2及び密接に関連したKin1は、細胞膜の細胞質に局在する２つのセリン／トレオニンたんぱく質キナーゼである。Ｋｉｎ２の触媒活性は、細胞膜t-SNARESec9（エキソサイトーシスの最後のステップで作用するたんぱく質）のリン酸化によってエキソサイトーシスの調節に不可欠のものである。遺伝子分析によれば、ＫＩＮキナーゼが、エキソサイトーシスの下流において、エキソサイトーシス部位におけるベシクル連結因子（vesicle tethering factor）及びその調節因子Ｓｅｃ４（Ｒａｓ類のＧＴＰ結合たんぱく質）を活性化することが分かった。
【０１０５】
ＣＵＰ５は、イースト空胞性(H)-ATPアーゼ（V-ATPアーゼ）V0ドメインのｃサブユニットをコードし、イースト中心空胞を酸性化するＡＴＰ依存性プロトンポンプ類に属する。このV0ドメインは、膜を横切ってプロトンを輸送する５個のサブユニットからなる不可欠な膜構造である。
【０１０６】
V0ドメインの組み立ては、Ｃｕｐ５ないにはできない。Ｖ−ＡＴＰアーゼの機能は、エンドサイトーシス、たんぱく質の分解（degradation）、及び、空胞を横切っての輸送を含めて様々なプロセスにおいて重要である。また、銅の解毒、鉄の代謝、及び、ミトコンドリア機能におけるＶ−ＡＴＰアーゼの作用（機能）については、既に報告されている。
【０１０７】
本発明は、宿主細胞からたんぱく質の分泌を増加させるたんぱく質をコードするヌクレオチド配列に関する。ここで、前記ヌクレオチド配列は、ピチア・パストリスから単離されたもので、たんぱく質ＢＭＨ２をコードするヌクレオチド配列（配列番号４２）、たんぱく質ＢＦＲ２をコードするヌクレオチド配列（配列番号４３）、たんぱく質ＣＯＧ６をコードするヌクレオチド配列（配列番号４４）、たんぱく質ＣＯＹ１をコードするヌクレオチド配列（配列番号４５）、たんぱく質ＣＵＰ５をコードするヌクレオチド配列（配列番号４６）、たんぱく質ＩＭＨ１をコードするヌクレオチド配列（配列番号４７）、たんぱく質ＫＩＮ２をコードするヌクレオチド配列（配列番号４８）、たんぱく質ＳＥＣ３１をコードするヌクレオチド配列（配列番号４９）、たんぱく質ＳＳＡ４をコードするヌクレオチド配列（配列番号５０）、及び、たんぱく質ＳＳＥ１をコードするヌクレオチド配列（配列番号５１）からなる群から選ばれた配列と同じであるか、又は、それに相当し、かつ、その配列の機能的特性を有する。
【０１０８】
本発明は、配列番号１２５に相当するＰＥＴ９遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片、又は、その機能的に同等な変異体であるイーストプロモーターに関する。ここで、前記イーストプロモーター配列は、ピチア・パストリスから単離されたものである。
【０１０９】
減っていく様々な長さ（various diminishing length）を有するプロモーター配列が、同じプロモーター活性を有することが確認されたために、本発明には、これらのプロモーター配列を含めるべきである。なぜならば、ＰＥＴ９遺伝子の５’−非コーディング領域の調節配列の明確な境界は、未だに定められていないからである。
【０１１０】
したがって、本明細書に使用された用語「機能的に同等な変異体（functionally equivalent variant）」は、その配列内における、又は、配列における一方若しくは両方の末端における１以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は、置換によって、このヌクレオチドの変異から得られたヌクレオチド配列を意味する。この変異（modification）は、このヌクレオチド配列のプロモーター活性に影響を与えない（特に、そのプロモーター活性を損なわない。）。
【０１１１】
本発明は、当業者に知られたイーストプロモーター、特に、ピチア・パストリスから単離されたＧＡＰプロモーターに比べて、同等の条件下で、イースト、好ましくは、コマガタエラ属の菌株、特に、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス又はコマガタエラ・ファフィーの菌株におけるＰＯＩの発現を向上させるイーストプロモーター配列に関する。
【０１１２】
本発明は、ピチア・パストリスから単離されたＧＡＰプロモーターに比べて、同等の条件下で、同等以上、約１．５倍以上、約２倍以上、約４倍以上、約７倍以上、約１０倍以上〜約１５倍以上のプロモーター活性を有する前記イーストプロモーターに関する。
【０１１３】
宿主生物、特に、イースト宿主、特に、コマガタエラ属の菌株内にヌクレオチド配列の組み換え発現用の発現系を有することが望ましい。ここで、コマガタエラ属の菌株は、例えば、ゼオシン（zeocin）、カナマイシン／ゲネチシン（kanamycin/geneticin）、ハイグロマイシン（hygromycin）などの選択マーカー、プロモーター、又は、転写終結因子などのベクターの異なる部分を容易に交換できる機会を提供する。異種遺伝子発現に重要でないベクターの一部を交換することによって、ベクターがエピソームに配置されるか、又は、（同種（相同）組込み配列を用いて）ゲノムに組み込まれるのであれば、有利である。
【０１１４】
前述の利点を提供する新規なベクター系ｐＰｕｚｚｌｅを構成するために、先ずＥ．コリに対する選択マーカー及び複製起点を有するｐＰｕｚｚｌｅのベクターのバックボーンを生成する。これにより、Ｅ．コリにおけるベクターバックボーンの増幅が可能となる。また、ｐＰｕｚｚｌｅのベクターバックボーンは、多重クローニング部位を有する（実施例１及び３参照）。
【０１１５】
第２ステップにおいて、真核細胞選択カーカー、異種若しくは同種ヌクレオチド配列の組み換え発現用のプロモーター、転写終結因子、及び、選択的に宿主ゲノムへのそのベクターの同種組み込み用の配列を有するｐＰｕｚｚｌｅ発現ベクターを作製する（実施例４）。このプロモーター配列及び選択マーかーは、ヌクレオチド配列の組み換え発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択される。転写終結因子は、原則として、各機能性転写終結因子であり、Ｓ．セレビシエから得たシトクロムの転写終結因子であり得る。また、同種（相同）組み込み配列の存在は、そのヌクレオチド配列が宿主細胞のゲノムに組み込まれるべきか否かによる。選択マーカー、プロモーター配列、及び、同種組込み配列は、ユニークな制限切断部位によって認識されるので、それらは容易に変更され（即ち、切断され、かつ、置き換えられて）、それにより、このベクターは、選択された宿主生物に簡単かつ効率的に変更され、又は、適合され得る。
【０１１６】
より詳細に、選択マーカーは、ユニークなKpnl制限部位でクローニングされ、相同組込み配列（homologous integration sequence）は、ユニークなNotl制限部位でクローニングされ、プロモーターは、Apal及びSbfl/Aarl制限部位を用いてクローニングされ、そして、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列は、制限部位Sbfl及びSfIIを用いてＭＣＳ（多重クローニング部位）でクローニングされる。
【０１１７】
また、本発明は、互いに作動的に連結された次の成分を含むｐＰｕｚｚｌｅバックボーンに基づく真核発現ベクターに関する：
ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列（宿主細胞からＰＯＩの分泌を引き起こすのに有効なリーダー配列に作動的に連結されていても良い。）；
宿主細胞におけるたんぱく質発現を調節するのに効果的なプロモーター；
転写終結因子；
選択マーカー；及び
相同の組み込み配列又は自己複製配列のうちいずれか１つ。
ここで、プロモーターは、ピチア・パストリスのＰＥＴ９遺伝子の５’−非コーディング領域からの１０００ｂｐ断片（配列番号１２５）、又は、それと機能的に同等な変異体（functionally equivalent variant）であり、転写終結因子は、S.セレビシエからのシトクロムＣの転写終結因子であり、選択マーカーは、ゼオシン抵抗性遺伝子であり、そして、宿主細胞は、イースト細胞、好ましくは、コマガタエラ属の細胞、特に、Ｋ．パストリス、Ｋ．シュードパストリス、又は、Ｋ．ファフィー菌株の細胞である。
【０１１８】
かかるベクター（レポーター遺伝子として向上されたグリーン蛍光たんぱく質ｅＧＦＰをさらに含む。）（pPuzzle＿zeoR＿Ppet9＿eGFP＿AOXTT）を作製する手順の詳細は、実施例３〜５、並びに、図２に示されている。
【０１１９】
宿主細胞における組み換え発現のためのいかなる異種又は同種（相同）ヌクレオチド配列をもｅＧＦＰの位置にて使用することができる。
【０１２０】
本発明は、宿主細胞におけるＰＯＩの組み換え発現のための前記真核生物発現ベクターの使用に関する。
【０１２１】
解決しようとする問題次第で、宿主細胞で興味のあるたんぱく質を強く発現させたり（例えば、宿主細胞におけるＰＯＩの組み換え産生）、或いは、宿主細胞で興味のあるたんぱく質を弱く又はその程度を和らげて発現させたり（例えば、宿主細胞においてＰＯＩの分子機能を分析しようとするとき）することができる。
【０１２２】
特に、細胞ＰＯＩの分子機能を分析しようとするとき、又は、代謝工学向けのＰＯＩであるとき（このたんぱく質は分泌されないが、前記細胞の所定のコンパートメント内でその活性を示す。）、プロモーター活性を介して興味のあるこのたんぱく質の発現レベルを調節することができれば、最も魅力的であろう。ＰＯＩをより強く発現させること（GAPプロモーターに匹敵するか、又は、それより強く）も、ＰＯＩを弱く若しくは減少された程度で発現させること（GAPプロモーターよりも弱く）も可能である。したがって、匹敵する細胞培養条件の下で異なるプロモーター活性（GAPプロモーターに比べて、より強いプロモーター活性〜より弱いプロモーター活性）を示す、宿主生物、特に、イースト細胞、好ましくは、コマガタエラ属の細胞、特に、Ｋ．パストリス、Ｋ．シュードパストリス 又は、Ｋ．ファフィー菌株の細胞における異種又は同種ヌクレオチド配列の組み換え発現に適した異なるプロモーター配列を選択することが有用である。実験条件に基づいて適切なプロモーター配列を選択することによって、興味のあるたんぱく質の発現レベルを調節することを可能となる。
【０１２３】
実施例５に示したプロモーター配列の比較分析（即ち、プロモーター活性分析）によれば、実施例５に記載された実験条件の下で、異なるプロモーター活性（ピチア・パストリスから単離されたＧＡＰプロモーターの０％〜約１３５％）を有する幾つかのプロモーター配列が見出された。
【０１２４】
実施例５においてテストされたイーストプロモーターのプロモーター活性（GAPプロモーター下でのｅＧＦＰの発現に対するレポーター遺伝子産物ｅＧＦＰの相対発現レベル（％）を測定して、それを標準化することによって決められる。）の要約は、表８に示す。
【０１２５】
具体的に、実施例５の実験条件の下で、ＧＮＤ１遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０〜約６７％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、ＧＰＭ１遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の約１９％〜約４１％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、ＨＳＰ９０遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の約６％〜約８１％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、ＫＡＲ２遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の約１１％〜約１３５％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、ＭＣＭ１遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０％〜約６％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、ＲＡＤ２遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０％〜約５％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、ＲＰＳ２遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０％〜約１２％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、ＲＰＳ３１遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０％〜約８％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、ＳＳＡ１遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０％〜約３０％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、THI3遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０％〜約４２％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、TPI1遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０％〜約９２％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、UBI4遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０％〜約４％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、ＥＮＯ１遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の約１７％〜約４７％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、RPS7A遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の約１％〜約１８％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、RPL1遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０％〜約１１％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、TKL1遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０％〜約９％のプロモーター活��を有する。実施例５の実験条件の下で、PIS1遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０％〜約７％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、FET3遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０％〜約７％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、FTR1遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０％〜約６％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、NMT1遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０％〜約５％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、PHO8遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０％〜約６％のプロモーター活性を有する。実施例５の実験条件の下で、FET3前駆体（ＦＥＴ３ｐｒｅ）遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片は、ＧＡＰプロモーターのプロモーター活性の０％〜約７％のプロモーター活性を有する。
【０１２６】
本発明は、ピチア・パストリスから単離され、そして、ＧＮＤ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１２６）、GPM1遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１２７）、ＨＳＰ９０遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１２８）、KAR2遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１２９）、MCM 1遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３０）、RAD2遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３１）、RPS2遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３２）、RPS31遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３３）、ＳＳＡ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３４）、THI3遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３５）、ＴＰＩ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３６）、UBI4遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３７）、ＥＮＯ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３８）、RPS7A遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１３９）、ＲＰＬ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４０）、TKL1遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４１）、ＰＩＳ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４２）、FET3遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４３）、ＦＴＲ１遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４４）、NMT1遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４５）、ＰＨＯ８遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４６）、FET3前駆体（FET3pre）遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐの断片（配列番号１４７）、又は、これらの配列のいずれか一つと機能的に同等な変異体からなる群から選択された配列と同一であるか、又は、これに相当し、かつ、前記配列の機能的特性を有するイーストプロモーター配列に関する。
【０１２７】
エノラーゼ１（ＥＮＯ１）は、解糖における２−ホスホグリセリン酸塩から２−ホスホエノールピルビン酸塩への転換及び、グルコース新生におけるその逆反応を触媒するホスホピルビン酸塩ヒドラターゼである。
【０１２８】
TPI1（トリオースリン酸イソメラーゼ）は、豊富な解糖酵素である。これは、解糖においてグリセルアルデヒド−３−燐酸塩及びジヒドロキシアセトン燐酸塩の相互変換を触媒する。
【０１２９】
THI3は、チアミンな生合成に関与する酵素の発現に必要とされる推定デカルボキシラーゼであり、アミノ酸の長鎖の複雑なアルコールへの異化に一定の役割をし得る。
【０１３０】
ＳＳＡ１は、たんぱく質折り畳み及び核局在化信号（ＮＬＳ）指向性核輸送に関与するＡＴＰアーゼである。ＳＳＡ１は、熱ショックたんぱく質（ＨＳＰ７０）類の一つである。
【０１３１】
ＲＰＳ７Ａは、小さい（４０Ｓ）リボソームサブユニットのたんぱく質成分である。
【０１３２】
GND1（６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ）は、ペントースリン酸塩経路におけるNADPH再生反応を触媒し、かつ、酸化的ストレスに対する適応及びD−グルコノ−デルタ−ラクトン上の成長に必要とされる。
【０１３３】
ＧＰＭ１は、解糖における３−ホスホグリセリン酸塩から２−ホスホグリセリン酸塩への転換、及び、グルコース新生におけるその逆反応を触媒するテトラマー酵素であるホスホグリセリン酸塩ムターゼをコードする。
【０１３４】
TKL1（トランスケトラーゼ）は、ペントースリン酸塩経路におけるキシルロースー５−リン酸塩及びリボース−５−リン酸塩のセドヘプツロース−７−リン酸塩及びグリセルアルデヒド−３−リン酸塩への転換を触媒し、かつ、芳香族アミノ酸の合成に必要とされる。
【０１３５】
熱ショックたんぱく質９０（ＨＳＰ９０）は、細胞質のシャペロン（Ｈｓｐ９０類）である。
【０１３６】
ＲＰＳ２は、小さいリボゾーム（４０Ｓ）サブユニットのたんぱく質成分である。
【０１３７】
ＲＰＳ３１は、分裂されて小さいサブユニット（４０Ｓ）のリボゾームたんぱく質及びユビキチン（ubiquitin）を生成する融合たんぱく質である。
【０１３８】
ＲＰＬ１Ａは、大きいリボゾーム（６０Ｓ）サブユニットのたんぱく質成分である。
【０１３９】
ホスファチジルイノシトール・シンターゼ(PIS1)は、ホスファチジルイノシトールの生合成に必要とされるが、そのホスファチジルイノシトールは、一部の細胞膜たんぱく質に対する糖脂質アンカー、ポリリン酸化イノシチド、及び、スフィンゴリピドの前駆体である。
【０１４０】
FET3（Ferro-02-oxidoreductase）は、内膜マルチ銅オキシダーゼの一つであり、高親和性イオンの取り込みに必要とされ、銅イオン毒性に対する抵抗性を調節する機能に関与する。
【０１４１】
FTR1(高親和性鉄パーミアーゼ)は、細胞膜を横切っての鉄の輸送に関与し、Fet3pと複合体を形成する。
【０１４２】
PHO8は、アルカリ性のホスファターゼである。
【０１４３】
N-ミリストイルトランスフェラーゼ(NMT1)は、細胞成長及び信号変換に関与するいくつかのたんぱく質のN-末端グリシン残基へのミリスチン酸の共翻訳性の共有結合（cotranslational, covalent attachment）を触媒する。
【０１４４】
転写因子MCM1は、細胞型特異的転写及びフェロモン反応に関与する。
【０１４５】
ユビキチン（UBI4）は、たんぱく質に接合されて、ユビキチン−２６Sプロテアソーム系を介しての選択的分解（selective degradation）に対し、そのたんぱく質の印となる。
【０１４６】
RAD2（一本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）は、ヌクレオチド除去修復の際に１本鎖のDNAを切断して、損傷したDNAを除去する。
【０１４７】
本発明は、互いに作動的に連結された次の成分を含むpPuzzleバックボーンに基づく真核生物発現ベクターに関する：
ＰＯＩをコードする組み換えヌクレオチド配列（宿主細胞からＰＯＩの分泌を引き起こすのに有効なリーダー配列に作動的に連結されていても良い。）；
宿主細胞におけるたんぱく質発現を調節するのに効果的なプロモーター；
転写終結因子；
選択マーカー；
相同の組み込み配列又は自己複製配列のうちいずれか１つ。
ここで、前記プロモーターは、ピチア・パストリスから単離されたイーストプロモーター配列で、配列番号１２５〜１４７からなる群から選択された配列であるか、その選択された配列に相当するとともに、これらの機能的特性を有するものであるか、又は、前記配列のうちいずれか一つの機能的に同等な変異体（functionally equivalent variant）であり、そして、前記宿主細胞は、イースト細胞、好ましくは、コマガタエラ属の細胞、特に、Ｋ．パストリス、Ｋ．シュードパストリス、又は、Ｋ．ファフィー菌株の細胞である。
【０１４８】
本発明は、宿主細胞の組み換え発現のためのこうした真核生物発現ベクターの使用にも関する。
【０１４９】
ここで、ＰＯＩが代謝工学用途、即ち、宿主細胞の所定のコンパートメント内で発現してその活性を示すための細胞内たんぱく質であれば、ＰＯＩは、宿主細胞からＰＯＩの分泌を引き起こすのに有効なリーダー配列を有しないpPuzzleバックボーン由来の真核細胞発現ベクターから発現され得る。
【０１５０】
細胞ＰＯＩが宿主細胞に相同の（同種の）たんぱく質、即ち、宿主細胞に自然に分泌されるたんぱく質であれば、この宿主細胞におけるＰＯＩの発現は、その天然プロモーター配列をピチア・パストリスから単離されたイーストプロモーター配列で置き換えることによって調節され得る。このピチア・パストリスから単離されたイーストプロモーター配列は、 配列番号１２５〜１４７群から選択された配列、若しくは、この選択された配列に相当するとともに、この選択された配列の機能的特性を有する配列、又は、前記配列のいずれか一つの機能的に同等な変異体（functionally equivalent variant）である。
【０１５１】
この目的は、部位特異的組み換えを可能にするターゲット遺伝子の相同配列と、所定のイーストプロモーター配列と、宿主細胞に適した選択マーカーと、を含む組み換えDNA分子で宿主細胞を形質転換させることによって、達成され得る。こうした部位特異的組み換えが起こると、イーストプロモーター配列とＰＯＩをコードスするヌクレオチド配列とが作動的に連結される。その結果として、天然プロモーター配列ではなく、イーストプロモーター配列からＰＯＩが発現されるようになる。
【０１５２】
解決しようとする問題次第で、選択されたイーストプロモーターは、宿主細胞においてＰＯＩの発現を増加させるように、前記天然プロモーター配列に比べてより増加されたプロモーター活性を有することも、宿主細胞においてＰＯＩの発現を減少させるように、前記天然プロモーター配列に比べて減少されたプロモーター活性を有することもあり得る。
【０１５３】
本発明は、宿主細胞における同種の（相同の）ＰＯＩの発現調節に使用されるピチア・パストリスから単離されたイーストプロモーター配列であって、配列番号１２５〜１４７群から選択された配列、若しくは、この選択された配列に相当するとともに、この選択された配列の機能的特性を有する配列、又は、前記配列のいずれか一つの機能的に同等な変異体（functionally equivalent variant）である。
【０１５４】
本発明は、前記使用において、前記イーストプロモーター配列が、ＰＯＩの天然プロモーター配列に比べて増加されたプロモーター活性を有することを特徴とする。
本発明は、前記使用において、前記イーストプロモーター配列が、ＰＯＩの天然プロモーター配列に比べて減少されたプロモーター活性を有することを特徴とする。
【０１５５】
前述した本発明の理解を助けるために、実施例を提供する。この実施例は、本発明を制限するものではない。本発明は、開示された具体例に基づいて当業者に明らかな変形及び変更を含むものとする。
【０１５６】
実施例１及び２は、興味のある異種たんぱく質の収率（Ｐ．パストリスにおけるモノクローナル抗−ＨＩＶ抗体２Ｆ５のＦａｂ断片の分泌）に対する真核生物の分泌経路に関与する異なるたんぱく質の共発現の効果を知るために用いられた材料及び方法について説明する。
【実施例１】
【０１５７】
サッカロマイセス・セレビシエから幾つかの分泌ヘルパーの同定及びクローニング
たんぱく質の産生の際に、例えば、Ｐ．パストリスのたんぱく質分泌経路において潜在的な役割をするたんぱく質及び遺伝子を同定するために、ヒトトリプシノーゲン１の遺伝子を含有するＰ．パストリス菌株の遺伝子発現パターンを、異種たんぱく質産生の導入（導入は、唯一の炭素源としてグリセロールをメタノールにスイッチすることによって行われた。）（即ち、マイクロアレイ分析によるトリプシノーゲンの産生）前後において比較した。
【０１５８】
Ｐ．パストリスのゲノム配列は公開されてなく、また、Ｐ．パストリスＤＮＡマイクロアレイについて多くの遺伝子が特徴付けられたわけでもないので、Ｐ．パストリスcDNAとの異種ハイブリダイゼーションのためにS.セレビシエのＤＮＡマイクロアレイを用いた。マイクロアレイハイブリダイゼーションの実験方法、及び、得られたデータの評価は、文献（Sauer et al. (2004)）に基づいて行われた。その詳細は次のとおりである。
【０１５９】
ａ）菌株
発現菌株は、サプリメントなしに最小培地で成長することができる野生型菌株であるＰ．パストリス菌株X33(Invitrogen社製)であった。これの選択メカニズムは、形質転換ベクターのゼオシン（Zeocin：登録商標）抵抗性に基づくものであった。菌株の形質転換は、ヒトトリプシノーゲン１遺伝子を含んだpPICZαB (Invitrogen社製)由来のプラスミドを用いて行った(Hohenblum et al., 2003)。pPICZαBは、P.パストリスのAOX1プロモーターを利用するが、このプロモーターは、グルコース、グリセロール、又は、エタノールのような多くの炭素源によって抑制されるが、炭素源としてのメタノール、及び、生成物分泌のためのS．セレビシエのα−因子リーダー配列によって誘導される。こうして選択された菌株は、メタノール利用陽性(mut+) 表現型のものであったが、それは、唯一の炭素源としてメタノールを代謝することができることを意味する。
【０１６０】
ｂ）細胞培養
Ｐ．パストリスの醗酵
流加培養醗酵（fed batch fermentation）は、ＭＢＲミニバイオリアクターを用いて行われた。文献［a final working volume of 2 I, Hohenblum et al.(2003)］参照。ここで、培地は、次の成分を含むものであった。
【０１６１】
PTM1微量（追跡）塩原液（trace salts stock solution）は、１リットル当たり、6.0 gのCuSO4.5H2O、0.08 gのNaI、3.0 gのMnSO4- H2O、0.2 gのNa2MoO4. 2H2O、0.02 gのH3BO3、0.5gのCoCI2、20.0gの ZnCI2、65.0gのFeSO4.7H2O、0.2gのビオチン、及び、5.0mlのH2SO4 (95 %-98 %)を含むものであった。PTM1トレーサ塩原液用の成分（化学物質）全ては、Riedel-de Haen社から購入した（ビオチン(Sigma社製)及びH2SO4 (Merck Eurolab社製)を除く。）。
【０１６２】
培地は、１リットルあたり、23.7 mlのH3PO4 (85 %)、0.6gのCaSO4.2H2O、9.5gのK2SO4、7.8gのMgSO4.7H2O、2.6gのKOH、40gのグリセロール、4.4mlのPTM1PTM1トレーサ塩原液を含むものであった。
【０１６３】
グリセロール流加培養液（glycerol fed-batch solution）は、１リットル当たり、632 gのグリセロール(100 %) 及び12 mlのPTM1 微量塩源液を含むものであった。
【０１６４】
メタノール流加培養液（methanol fed-batch solution）は、１リットルあたり、988 mlのメタノール（100 %）及び12 mlのPTM1微量塩源液を含むものであった。
【０１６５】
溶解酸素は、攪拌速度（６００〜１２００ｒｐｍ）によって、ＤＯ＝３０％で調節された。エアレーション速度は、100lh-1（空気）であった。これに、流加培地の開始後、酸素（２５％まで）が補充された。温度は、２５℃であり、ｐＨはNH3 (25 %)によって調節された。
【０１６６】
醗酵を始める前に、NH3(25 %)を用いて、１．２リットルの培地のｐＨを５に設定した。３２時間のこの培地相に続き、グリセロール培地（供給速度：15.6 ml Ir1）を備えた流加培地にて４時間維持させて、約40glh-1の乾燥バイオマス濃度を得た。その後、メタノール培地の供給が始まった（供給速度：6.4 mlh-1）。メタノールは、異種たんぱく質であるトリプシノーゲンの産生を誘導すると共に、炭素源としてはたらく。その醗酵は、メタノール供給を始めてから１４時間後終了された。培養時のｐＨは５であり、その数値（ｐＨ５）は、醗酵を通して維持された。
【０１６７】
グリセロール流加培地相の終期（トリプシノーゲン非発現細胞）、及び、メタノール流加培地相の終期（トリプシノーゲン発現細胞）においてサンプルを採取した。細胞を遠心分離機にかけて細胞培養上清を分離した後、細胞ペレットをＴＲＩ試薬（シグマ社製）（１０倍体積）中に再懸濁させた。その後、それを凍結させた。
【０１６８】
ｃ）ＲＮＡ単離
そのサンプルをアイス上で解凍し、アシッド・ウォッシュド・ガラスビーズ（acid washed glass beads）を加えてから、アイス上での冷却の間にRibolyser (Hybaid Ltd.)で２ｘ２０秒間均質にした。クロロフォルムを加えてから、サンプルを遠心分離機にかけて、イソプロパノールを加えて水相からＲＮＡ全体を沈殿させた。このペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥し、ＲＮアーゼを含まない水で再懸濁させた。ＭｉｃｒｏＰＯｌｙ（Ａ）ＰｕｒｉｓｔｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用い、メーカーのご指示に従って、ｍＲＮＡを分離した。
【０１６９】
ｄ）ｃＤＮＡの合成及びラベリング（標識）
5μgのmRNA及び0.5 μgのoligodT primerを7 μlの水中で混合し、７０℃にて５分間インキュベートし、その後４２℃にて３分間インキュベートした。前記混合物5μlに次の成分を加えた：Superscript Il 逆転写酵素(Invitrogen)用の4 μlの反応緩衝液(5 x) 、2μlのdTTP (2 mM)、2μlのdATP、dGTP、dCTP (5 mM)、2 μlのDTT (100 mM)、2.5μlのRNasin (40U、Promega) 、及び、2μlのFluoriLink Cy3-dUTP (1 mM)又は2μlのFluoriLink Cy5-dUTP(1mM、Amersham Biosciences)のうちいずれか一つ、並びに、1μlのSuperscript Il逆転写酵素(200U、Invitrogen)。その結果、19.5μlの混合物が得られた。この混合物を４２℃にて１時間インキュベートした。さらに200 UのSuperscript Il逆転写酵素を加えてから、その混合物を４２℃にてさらに１時間インキュベートした。7μlの0.5M NaOH/50 mM EDTAを加えて、その混合物を７０℃にて１５分間インキュベートした。10 μlのTris-HCI pH 7.5 (1 M)を加えて、その反応混合物を中和した。メーカーに指示に従って、この標識ｃＤＮＡを、Qiaquick精製カラム(Qiagen) で精製した。
【０１７０】
ｅ）チップハイブリダイゼーション及びマイクロアレイの準備:
この研究に用いられたS.セレビシエcDNAマイクロアレイは、Hyper Gene Yeast Chips（Hitachi Software Engineering Europe AG社製）であった。メーカーの指示に従って、約0.1〜0.3ngのPCR増幅されたcDNA (約200bp〜8000bp) を、poly-L-lysine被覆ガラススライド上にスポットし、ベーキング（baking）、無水コハク酸遮断、及び、熱変性によってそれを固定した。
【０１７１】
標識ｃＤＮＡを約70μlの5 x SSC/0.05% SDS中に再懸濁し、９５℃にて３分間変性し、アイス上で冷却させた。現れたSDS結晶を短時間少しだけ加熱することによって溶かし、その混合物をYeast Chipに適用した。スポットした領域をカバーガラスで覆い、そのチップを気密容器（加湿雰囲気、６０℃）内に１６時間置いた。
【０１７２】
2 x SSC/0.1 % SDSでカバーガラスを取り除き、そのチップをそれぞれ2 x SSC/0.1 % SDS、0.5 x SSC/0.1 % SDS、及び0.2xSSC/0.1 % SDS（RT）中で５〜１０分間連続的に洗浄した。このチップを遠心分離機（６００ｒｐｍ、３分）にかけて、乾燥させた。洗浄条件は、メーカーの指示に基づいて選択された。
【０１７３】
各サンプル（トリプシノーゲン非発現細胞及びトリプシノーゲン発現細胞から得た標識ｃＤＮＡ）は、２つの平行ｃＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーションに用いられた。それにより、信号の再現性（reproducibility）をテストした。
【０１７４】
ｆ）データ獲得及びマイクロアレイデータの統計評価
イメージは、G2565AAマイクロアレイスキャナー(Agilent社製)を用いて解像度 50 μmでスキャンし、GenePix Pro 4.1(Axon Instruments社製)マイクロアレイ分析ソフトウェアの方に運び込んだ。GenePix Pro 4.1は、スポット強度の定量化のための用いられた。現れたそれぞれの遺伝子スポットの平均（値）を求めた。正規化及びデータ分析のために、そのデータ組をGeneSpring 6.1 (Silicon Genetics社製)の方に運び込んだ。
【０１７５】
各チップ上の各チャネルの値全てをそれぞれの正規化の中央値（平均）で割った。次に、各値から推定されたTEスポット（緩衝液でスポットされたDNAを含まないもの）全ての中央強度値（平均強度値）、及び、前記閾値の標準偏差より少ないスポット値全ては、有意でないものとされ、かつ、標準偏差値に設定された。遺伝子活性の誘導及び抑制を決めるために、各スポット上の正規化された信号を比較し、両方の平行自立マイクロアレイ（parallel independent microarray）上で前記閾値（１．５倍）を超える信号差を示す遺伝子全てを、有意に調節されたものとして判断した。
【０１７６】
測定された遺伝子全ての相対発現レベルを決めてから、その発現レベルの相対差によってその遺伝子を整列し、次の分析のために最も差異が大きい５２４個を選んだ。これらの実験に用いられたDNAマイクロアレイはサッカロマイセス・セレビシエの配列から得られたものであるために、S.セレビシエとの相当性に基づくP.パストリスの推定上の遺伝子機能が得られるだけである。この推定上の細胞内位置及び機能に基づいて、５２４個の個別に調節される遺伝子を並べるとともに、分泌及び／又は一般的なストレス反応に関与するものに焦点を当てて、６４個の興味のある候補遺伝子のうち、次の分析のために１５個を選択した：PDM、CUP5、SSA4、BMH2、KIN2、KAR2、HAC1、ERO1、SSE1、BFR2、COG6、SSO2、COY1、IMH1及びSEC31。
【０１７７】
ｇ）同定された分泌ヘルパー因子のクローニング用の発現ベクターの作製
GAPプロモーター、及び、選択マーカーとしてのhis4遺伝子を含むベクターを作製するために、 Notl and Mph1 1031を用いた両方のベクターの制限分解によって、ベクター pPIC9 (Invitrogen) のA0X1プロモーターをpGAPZ B (Invitrogen)のGAPプロモーターに変えて、標準プロトコールに基づいて連結した。新たに作製されたベクターをpGAPHisと命名した。
【０１７８】
ｈ）サッカロマイセス・セレビシエから得たヘルパー因子遺伝子の単離及びpGAPHisへのクローニング
Hac1から得た遺伝子全てについて、表１に示したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCRによって、サッカロマイセス・セレビシエゲノムDNAから直接的に増幅した。ATGの開始コドンのすぐ前にP.パストリスKozac配列（ACG）を挿入した。
【０１７９】
それぞれのフォワード及びバックワードプライマー（表１）を用いて、非鋳型コード制限部位Sacll (遺伝子PDI1に対しXhol)、及び、PmII又はSfil (PDI1遺伝子に対しEcoR1)のいずれ１つかを加えた。表１に示したSacll(遺伝子PDI1に対しXhol)及びPmII又はSfil(遺伝子PDI1に対しEcoR1)のいずれかを用いて、正確な長さを有するPCR断片の制限酵素分解を行った後、これらの断片をｐGAPHisベクター（それぞれ制限酵素で分解され、かつ、アルカリ性ホスファターゼで処理されたもの）の方へクローニングした。S.セレビシエのHAC１遺伝子の（誘導）変異体を作製するために、２段階PCR反応において、最初の２２０アミノ酸をコードするDNA断片を、誘導されたHac1ｐ(Mori et al., 2000)の１８アミノ酸エキソンをコードする断片と組み合わせた。それにより得られた断片をｐGAPHisのほうにつなげた。
【０１８０】
連結したプラスミド全てをE. coli Top 10F'(Invitrogen)の方に形質転換させ、アンピシリンを含んだLB寒天上にプレートした。制限酵素分析を行って、各プラスミドの正確な同一性（identity）を確認した。
【０１８１】
【表１】
2010524440.tif 000003
2010524440.tif 000004
2010524440.tif 000005
【実施例２】
【０１８２】
Ｐ．パストリスにおける組み換え2F5断片の異種たんぱく質の産生に対する分泌ヘルパー因子の効果
実施例１のE．コリから得たプラスミドDNAを用いて、Ｐ．パストリス菌株SMD1168（GAPプロモーターの調節下の２F5 Fabの発現カセットを含んだもの）を形質転換させた。ここで、前記菌株は、高いFab分泌水準に基づいて予め選択したものであった。この菌株SMD1168は、Ｐ．パストリスのhis4欠損菌株（pep4突然変異体）であった。選択は、抗体遺伝子に対するゼオシン抵抗性、及び、その他の遺伝子に対するヒスチジン要求性に基づいて行われた。
【０１８３】
ａ）モノクローナル抗−HIV1抗体２F5のFab断片を分泌するＰ．パストリス菌株SDM1168の作製
Fabの軽鎖及び重鎖に対する２F5抗体断片配列は、ヒト化IgG1 mAbを含むpRC/RSVからPCRによって増幅された（Gasser et al., 2006）。クローニングには、制限部位EcoRI及びSacllを用いた。
【０１８４】
より詳細に、Fabを産生するために、全体の軽鎖（ｖL及びｃL）及び重鎖のｖH及びｃH1領域をPCRによって増幅させた。pGAPZαA変異体（ここで、部位特異的突然変異によって、Avrll制限部位がNdelへ変わった。）へ軽鎖断片をつなげた。それによって、2つのカセットを含んだプラスミドの線形化（linearization）が可能となった。
【０１８５】
pGAPZαA（変異体ではない）の方に重鎖断片を挿入した。ここで、pGAPZαAには、Ｐ．パストリスのグリセロールリン酸アルデヒドデヒドロゲナーゼ（GAP）プロモーターの後にS.セレビシエのMfαリーダー配列（Invitrogen）が配されていた。
【０１８６】
１つのベクター上にある両方のFab鎖に対する発現カセットを組み合わせたプラスミドを、BglII及びBamHIを用いた軽鎖ベクターの二重分解によって生じさせた。その後、重鎖断片の発現カセットの単一コピーを予め含ませたpGAPZαAベクターのユニークなBamHI部位に挿入させた。その後、Ｐ．パストリスへの電界形質転換（electrotransformation）の前に、Avrllを用いて前記プラスミドを線状にした。
【０１８７】
GAP forw/AOX3 バックプライマー(Invitrogen)を用いたＤＮＡシークエンシングによって、作製された発現カセット全てをチェックした。
【０１８８】
ｂ）２Ｆ５Ｆａｂ及び分泌ヘルパー因子を共発現させるＰ．パストリス菌株の作製
上記ステップａ）から得たＰ．パストリス菌株の形質転換は、実施例１のプラスミドを用いて行われた。このプラスミドは、HIS4（座）において線形化されている。電界形質変換によってこのプラスミドを細胞の方へ導入した。Ｈｉｓ−原栄養のクローンを選択するために、 この形質変換された細胞をＲＤＢ−寒天（ヒスチジン欠如）上で培養した。このクローンは、分泌ヘルパー因子に対する発現カセットを含む。
【０１８９】
ｃ）振とうフラスコにおける形質変換Ｐ．パストリス菌株の培養
２０ｇ／ｌのグリセロールを含有する５ｍｌのＹＰ−培地（１０ｇ／ｌのイースト抽出物、２０ｇ／ｌのペプトン）に、ＲＤＢプレートから選択したＰ．パストリスの単一のコロニーで接種し、２８℃にて一晩成長させた。最終OD6000.1に相当するこれらの培養物のアリコートを、１０ｍｌの主な培地の方に移し（１リットルあたり、10 gのイースト抽出物、10 gのペプトン、100mMのリン酸カリウム緩衝液pH 6.0、硫酸アンモニウムを有する13.4gのイースト窒素塩基、0.4mgのビオチン）、そして、１００ｍｌの三角フラスコで激しく振とうしながら２８℃にて４８時間インキュベートした。組み換えたんぱく質発現を引き起こすために、ＧＡＰプロモーターを有する培養物に１０ｇ／ｌのグルコースを補充した。同量の基質を１２時間毎に４回繰り返し加えた。その後、室温における遠心分離（２５００×ｇ）によって細胞を収集し、分析（６００ｎｍにおいて光学濃度を測定することによるバイオマス測定、培養上清におけるＦａｂ定量化のためのＥＬＩＳＡ）のために用意した。
【０１９０】
ｄ）２Ｆ５Ｆａｂの定量化による単一のフォルティングヘルパー因子（folding helper factor）の共過剰発現の効果の評価
組み換え発現された２Ｆ５Ｆａｂの分泌量を測定するために、９６ウェルマイクロタイタープレート（MaxiSorb、Nunc、Denmark）をＲＴ（Sigma l-5260; ＰＢＳ中1:1000、pH7.4）において一晩抗−hlgG（Fab特異的）で被覆した。その後、ステップｃ）から得た２Ｆ５Ｆａｂを分泌するＰ．パストリスの連続希釈上清（PBS/ツイーン20 (0.1 %) + 1 % BSA中の１：２００希釈から始まる。）を加えて、ＲＴにおいて２時間インキュベートした。２００ｎｇ／ｍｌの最初濃度の標準たんぱく質として正常なＩｇＧのヒトＦａｂ（Rockland社製）を用いた。各インキュベーションステップが終わったら、ｐＨ７．４に調整した０．１％ツイーン２０を含有するＰＢＳで前記プレートを４回洗浄した。２次抗体として100 μlの抗−カッパ軽鎖−AP接合体（ＰＢＳ／ツイーン中1: 1000+1%のBSA）を各ウェルに加えて、ＲＴにおいて１時間インキュベートした。洗浄後、そのプレートをpNPP (被覆緩衝液中1 mg/mlのリン酸ｐ−ニトロフェニル、0.1のN Na2C(VNaHCO3、pH 9.6)で染色して、４０５ｎｍにおいて読んだ（規準波長６２０ｎｍ）。
【０１９１】
１５個の各々の異なる分泌ヘルパー因子作製物から得た１６個の個別のクローンを、ステップｃ）と同様に振とうフラスコ内で培養して、対照群菌株の１６個のクローンに比べてみた。ここで、対照群菌株は、遺伝子を欠如したpGAPHisベクターで形質転換された。分析された培養物全てに対し２Ｆ５Ｆａｂ生産性（μg Fab/biomass）を測定した（第１スクリーニング）。その後、第２スクリーニングでは、同様のシステムを用いて、各作製物のうち最も優れた６個のクローンを再び分析した。その結果は、表２に示す。
【０１９２】
表２は、対照群作製物（空っぽのpGAPHisベクター）を含んでテストされた各分泌ヘルパー因子作製物のうち最も優れた６個のクローンの相対生産性の平均値（mean relative productivity）を示す。この表は、対照群培養物に対する、分泌ヘルパー因子の共過剰発現によって得られた２回のスクリーニングの２Ｆ５Ｆａｂ分泌の平均改善度（mean improvement factor）を示す。表２には、比較のために、共過剰発現の際に異種たんぱく質の分泌を向上させるものとして知られている分泌ヘルパー因子（PDM、KAR2、HAC1、ERO1、及び、SSO2）を含ませた。
【０１９３】
【表２】
2010524440.tif 000006
【０１９４】
異種たんぱく質の分泌に有利な効果をもたらすものとして従来より知られていた分泌ヘルパー因子とは別に、分泌ヘルパー因子であるCUP5、SSA4、BMH2、KIN2、SSE1及びBFR2の共過剰発現は、異種たんぱく質の分泌量を著しく増加させ、そして、C0G6、COY1及びIMH1の共過剰発現は、異種たんぱく質の分泌量を有意に増加させた。
【０１９５】
表２に示したように、異種たんぱく質の分泌、即ち、２Ｆ５Ｆａｂの分泌は、分析した分泌ヘルパー因子の大部分において増加された（約１．２倍〜１．７倍）。
【０１９６】
分泌ヘルパー因子PDI1、KAR2、HAC1、ERO1、及びSSO2の配列情報は、先行技術において知られている。
【０１９７】
共発現されると異種たんぱく質の分泌を増加されるものとして従来に知られていない分泌ヘルパー因子のヌクレオチド配列を表３に示す。
【０１９８】
【表３】
2010524440.tif 000007
2010524440.tif 000008
2010524440.tif 000009
2010524440.tif 000010
2010524440.tif 000011
2010524440.tif 000012
2010524440.tif 000013
2010524440.tif 000014
2010524440.tif 000015
2010524440.tif 000016
2010524440.tif 000017
2010524440.tif 000018
【０１９９】
サッカロマイセス・セレビシエから単離された分泌ヘルパー因子のヌクレオチド配列（配列番号３２〜４１）を用いて、Ｐ．パストリスゲノムデータベース(ERGOTM、IG-66、Integrated Genomics)をスクリーニングすることによって、ピチア・パストリスにおける相同ヌクレオチドが同定された。その配列を表４に示す。
【０２００】
【表４】
2010524440.tif 000019
2010524440.tif 000020
2010524440.tif 000021
2010524440.tif 000022
2010524440.tif 000023
2010524440.tif 000024
2010524440.tif 000025
2010524440.tif 000026
2010524440.tif 000027
2010524440.tif 000028
2010524440.tif 000029
2010524440.tif 000030
2010524440.tif 000031
【実施例３】
【０２０１】
pPuzzleのベクターバックボーンのクローニング
新規のベクター系pPuzzleを作製するために、複製起点及びE.コリに対する選択マーカー（AmpRカセット）を有する２８８４ｂｐ断片を、クローニングベクターｐBR322（Fermentas Life Science、Germany、#SD0041 pBR322 DNA）からPCRによって増幅させた。フォワードプライマーpBR322＿FOR＿Notl及びバックワードプライマーpBR322＿BACK＿Notlを用いて、２つの非−鋳型コードNotl制限部位を加えた。一時的な複製起点、及び、E.コリにおいて人工的な多重クローニング部位を増幅させるための選択マーカーを提供するシャトルとしてこの断片を用いた。244bpの合成DNA断片（pUC57プラスミドのEcoRV部位において合成され、かつ、サブクローニングされたもの、米国、NJ０８８５４、ピスキャタウェイに所在するGeneScript Corp社製）を、Notlで切断し、Notl及びアルカリ性ホスファターゼ処理したシャトル断片でつなげて、E.コリで増幅させた。これにより得られた産物をpBR32272artMCSと呼んだ。pBR32272artMCS＿ORIを生成するために、フォワードプライマーpUC19ORI #1 -Sacl及びバックワードプライマーpUC19ORI #2-Saclを用いて、市販されるクローニングベクターpUC19 (Fermentas Life Science Germany; #SD0061 pUC19 DNA; bases 812- 1481)から複製起点を有する６７０ｂｐ断片を増幅させ、かつ、pBR322V2artMCSのユニークなSacl部位においてクローニングした。
【０２０２】
pPuzzleのベクターバックボーンを作製するために（図１）、アンピシリン抵抗性遺伝子（プライマー ampR#1 Hindlll and ampR#2Hindlllを用いてｐUC１９から増幅されたPCR）をpBR32272artMCS＿ORIのHindIII制限部位へクローニングし、それにより得られたプラスミドをNotIで切断し、再び連結した。
【０２０３】
次のクローニングステップにおいて、ゲノムDNAに対して、S.セレビシエから得たシトクロムｃ遺伝子の転写終結因子（シトクロムcの３’領域の276 bp断片、S.セレビシエ染色体X塩基526663-526937から得たイソフォーム１CYC 1遺伝子)をPCRによって増幅させ、それをpBR32272artMCS＿ORIのBamHI及びAgel（アルカリ性干すファターゼ処理したもの）部位の方へ挿入した。その結果、 pBR32272artMCS＿ORI＿cyc1 TTのベクターを得た。
【実施例４】
【０２０４】
pPuzzle zeoR eGFP発現ベクターの作製
E．コリ及びＰ．パストリスのためのゼオシン選択マーカーは、S.セレビシエからのTEF1（翻訳延長因子１）プロモーター及びE.コリプロモーター配列EM7の調節下の Streptoalloteichus hindustanusから得たSh ble遺伝子で構成されている。このSh ble遺伝子は、S.セレビシエのシトクロムｃ（CYC１）の転写終結因子の側面に位置する。TEF1プロモーター（S.セレビシエの染色体XVI bases 700170-7005785のTEF1アルファの５’プロモーター領域）は、フォワードプライマー zeoR＿neu＿#1＿kpn1（非鋳型コードKpnI 部位を加えたもの）及びリバースプライマー TEF1＿back:＿#1を用いて、S.セレビシエゲノムDNAからPCRによって増幅された。フォワードプライマーzeoR＿neu＿#1＿kpn 1及びリバースプライマーTEF1 ＿back:＿#2Ncolを用いるプライマー伸張法によって、ＴＥＦ１プロモーターの３’末端に人工的なＥ．コリＥＭ７プロモーター配列及びNcol制限部位を加えた。得られたＰＣＲ断片をNcolで処理して、Sh ble ORFの５’末端のNcol部位に融合させた。Sh ble ORFは、pUT737プラスミド（Cayla Toulouse、France pUT737 catalog # VECT 7371）からフォワードプライマーSh ble＿FOR＿#1＿Ncol（非鋳型コードNcol部位を加える。）、及び、リバースプライマーSh ble＿back＿#2＿Aatl（非鋳型コードAatl部位を加える。）を用いるＰＣＲによって増幅させた。この融合により得られた産物をＰＣＲの鋳型として用いて（フォワードプライマーzeoR＿neu＿#1＿kpn1、及び、リバースプライマーSh ble＿back＿#2＿Aatl）、８９３ｂｐの断片を得た。
【０２０５】
フォワードプライマーcyc1 TT＿FOR＿#1＿aat1（非鋳型コードAatl部位を加える。）及びリバースプライマーcyc1 TT＿neu＿back＿Kpn 1（非鋳型コードKpn I部位を加える。）を用いて、ＰＣＲによりゲノムＤＮＡからＳ．セレビシエ （サイトクロムｃ、Ｓ．セレビシエ染色体Ｘ塩基526663-526937から得たイソフォーム１遺伝子）から得たサイトクロムＣ（ＣＹＣ１）の転写終結因子を増幅させ、Aatlで処理し、そして、Aatlで処理した８９３ｂｐのＴＥＦ１プロモーターとSh ble ORFとのハイブリッド（hybrid）に融合させた。フォワードプライマーzeoR＿neu＿#1＿kpn1及びリバースプライマーeye 1 TT＿neu＿back＿Kpn 1を用いて、最終サイズ１１７０ｂｐのゼオシンカセットをＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって精製し、そして、第２ＰＣＲの鋳型として正確なサイズの断片を用いた。この第２ＰＣＲ断片を、Kpnlで処理し、pBR322y2artMCS＿C)RI＿cyc1 TTベクターのKpnl部位においてクローニングし、ベクターpBR3221/2artMCS＿ORI＿cyc1 TT＿zeoRを得た。
【０２０６】
Ｐ．パストリスのゲノムにpPuzzleベクター系を組み込むために、Ｐ．パストリスのA0X1遺伝子の３’領域にターゲット配列を用いることにした。Ｐ．パストリスのゲノムＤＮＡからAOXTTparti及びAOXTTpart2と呼ばれる２つの４００ｂｐの断片（Integrated-Genomics社（Chicago USA）から得た配列、ERGO データベース、Ｐ．パストリス IG66コンティグ1471塩基52189-52588及び52589-52979）をＰＣＲ増幅させた。フォワードプライマー5 A0X TT #1 Hindlll/Notl及びリバースプライマー5 A0X TT #2 Ascl/BamHIを用いて、Asclの５’側に非鋳型コードHindlll及びNotl制限部位を加え、かつ、フラグメントAOXTTpartiの３’側にAscl 及びBamHI制限部位を加えた。A0XTTpart2断片に5５’BamHI部位、３’Notl部位、及び、５’EcoRI部位を加えるために、フォワードプライマー3 A0X TT #3 BamHI、及び、リバースプライマー3 A0X TT #4aNotl/EcoRIを用いた。ゲノムにおけるそれらの方向（orientation）に基づいてAOXTTparti及びAOXTTpart2を組み立てるために、Novogen Perfectly BluntR Cloning Kits、pSTBIue-1(Merck Biosciences, Germany)を用いて、pSTBIue-1のEcoRV部位において断片AOXTTpartiをサブクローにグした。フォワードプライマーT7及びリバースプライマー5 A0X TT #2 Ascl/BamHIを用いて、５００ｂｐの断片をＰＣＲにより増幅した。この断片をBamHIで切断し、BamHI処理したAOXTTpart2断片につなげた（連結）。この連結混合物は、フォワードプライマーT7、及び、リバースプライマー3 A0X TT #4Notl/EcoRIを用いるＰＣＲの鋳型として直接的に用いられた。正確なサイズ（〜９００ｂｐ）のこの断片は、アガロースゲル電気泳動によって精製され、かつ、5 A0X TT #1 Hindlll/Notl及び3 A0X TT #4Notl/EcoRIを用いる第２ＰＣＲのための鋳型として用いられた。ＰＣＲ断片の中央におけるAscl制限部位の存在は、得られた８００ｂｐの断片（AOXTTparti + 2と呼ばれる。）のAsclエンドヌクレアーゼ分解によってチェックされた。pBR32272artMCS＿ORI＿cyc1 TT＿zeoRベクターにおいてpBR322シャトルを取り除くために、Notlで切断され、かつ、アガロースゲル電気泳動（アルカリ性ホスファターゼで処理し、かつ、Notlで処理したＰＣＲ断片AOXTTparti + 2につなげたもの）によりpPuzzle zeoRにおける２２７０ｂｐのベクターバックボーンを２２８４ｂｐのpBR322シャトル断片から分離された。それにより得たベクターをpPuzzle zeoR AOXTTと呼んだ。
【０２０７】
pPuzzle zeoR AOXTTベクターのバックボーンから始まって、制限酵素Sbfl及びSfIIを用いて、向上されたグリーン蛍光たんぱく質（eGFP）遺伝子をMCSの方へ挿入した。このeGFP遺伝子（７１８ｂｐ）を、例えばベクターpcDNATM6.2n-EmGFP-DEST (Invitrogen Austria)から、PCRによって増幅させた。２つの非鋳型コード制限部位Sbfl及びSfilを、フォワードプライマーeGFP#1 Aarl/Sbfl及びリバースプライマーeGFP#2Sfilを用いるプライマー伸長によって付加した。このsbfl及びsfil処理されたｅＧＦＰのＰＣＲ産物を、pPuzzle zeoR AOXTTにおけるアルカリ性ホスファターゼで処理されたSbfl及びSfil部位の方に挿入した。それにより得られたベクターをpPuzzle zeoR eGFPと呼んだ。
【０２０８】
実施例３及び４に記載したクローニングに用いられたPCRプライマーを表５に整理した。
【０２０９】
【表５】
2010524440.tif 000032
2010524440.tif 000033
【実施例５】
【０２１０】
Ｐ．パストリスにおけるイーストプロモーター活性の比較分析
ａ）Ｐ．パストリスからぷろもーた配列の増幅及びクローニング
異種たんぱく質の組み換え発現のためにコマガタエラ属の菌株における使用に適した新規のプロモーター配列を同定するために、実施例１に記載したDNAマイクロアレイハイブリダイゼーションから得たトリプシノーゲン産生細胞及び非産生細胞のそれぞれの測定された全体の遺伝子の正規化した信号を、その相対的な発現レベルに基づいて整列させた。
【０２１１】
また、トリプシノーゲン産生細胞と非産生細胞間においてそれぞれ測定された遺伝子の相対的な発現レベルを比較した。これらのデータから、とリプシノーゲン産生細胞及び非産生細胞において最も高い発現レベルを示す２３個の遺伝子について次の分析を行った。こうした更なる分析のために選択された遺伝子のリストを表６に示した。また、この選択にはそのゲノム配列データを利用可能な遺伝子だけを含ませた。これらの２３個の興味のある候補遺伝子のプロモーター配列（各遺伝子の５’−非コーティング領域から１０００ｂｐまで）は、Ｐ．パストリスゲノムデータベース（ERGOTM、IG-66、Integrated Genomics社製）を用いて同定され、かつ、PCRによってＰ．パストリスから増幅された。また、比較のために、PCRによってＰ．パストリスからAOX及びGAPの周知のプロモーター配列を増幅させた（そのプライマー及びプライマー配列は表６及び７に示した）。最後のクローニングステップにおいて、Ｐ．パストリスから得た２５個のプロモーター（２つの対照群プロモーター配列を含む。）を、ベクターpPuzzle-ZeoR-eGFPの多重クローニング部位のApal及びSbfl制限部位を用いて、eGFP遺伝子の開始コドンの上流に挿入した。FET3preプロモーターの場合には、Apal及びAarl制限部位を用いた（表６）。
【０２１２】
【表６】
2010524440.tif 000034
2010524440.tif 000035
【０２１３】
【表７】
2010524440.tif 000036
2010524440.tif 000037
2010524440.tif 000038
2010524440.tif 000039
【０２１４】
ｂ）Ｐ．パストリスにおけるプロモーター活性の分析
異なるプロモーターの特性及び活性をテストするために、ステップa)で作製した２５個のベクターをAsclで分解し、エレクトロポレーションを介してＰ．パストリスを形質転換させるのに用いた（Ｐ．パストリスに対する標準形質転換プロトコールに基づく。）。形質転換されたＰ．パストリス細胞を、100 mg/lのゼオシンを含んだYPD-培地（1 %のイースト抽出物、2%のペプトン、2%のグルコース）上で成長させた。YPD−ゼオシン寒天プレート上で、それぞれの形質転換物から１０個の単一コロニーを選択して、１０ｍｌの液体培養物を植菌するのに用いた。単一の炭素源としてのグルコース、又は、単一の炭素源としてのグリセロール／メタノール上で細胞を培養させるときのeGFP発現を測定した。流動血球計算器（flow cytometer）分析法を用いて組み換えeGFPの量を定量化し、次のとおり相対的なeGFP発現レベルを計算した。
【０２１５】
pPuzzle＿zeoR＿PAOχJacZ＿AOXTTベクターで形質転換させたＰ．パストリス、及び、形質転換されていないＰ．パストリス野生型菌株は、eGFP発現の陰性対照群（negative control）として用いた。
【０２１６】
相対的なeGFP発現レベルの計算：
FL1（蛍光チャネル１）: １０００回の幾何平均（geoMean of 10000 events）
FSC（フォワード・スキャター）：１０００回の幾何平均
【０２１７】
【数１】
2010524440.tif 000040
【０２１８】
上記数１において、rfuは、相対的な蛍光ユニットであり、rel.Exp[%]は、GAPプロモーターに対して正規化した相対的なeGFP発現である。
【０２１９】
単一の炭素源としてのグルコース上でのGFP発現
１０ｍｌの培地（1 %のイースト抽出物、2%のペプトン、100mMのリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）、硫酸アンモニウムを有する１．３４％のイースト窒素塩基（yeast nitrogen base）、4x10-5%のビオチン、2%のグルコース）上の１００ｍｌの三角フラスコに入った振とうフラスコ培養物に、ＹＰＤ−ゼオシン寒天マスタープレート（master plate）から得た単一のコロニーを接種し、２８℃、１８０ｒｐｍにて培養した。１２時間毎に最終濃度０．５％となるようにグルコースを加えた。接種後１６時間、４０時間、及び、６７時間経過した時点で取ったサンプルを滅菌ＰＢＳで希釈して、約０．１〜０．２のOD600Ｏとし、そして、流動血球計算器分析（BD Facs Calibur）によってＧＦＰ発現について分析した。その結果を表８に示す。
【０２２０】
単一の炭素源としてのグリセロール／メタノール上でのeGFPの発現
１０ｍｌのＹＰＧ培地（１％のイースト抽出物、２％のペプトン、１％のグリセロールを含む。）上の１００ｍｌの三角フラスコ内に入った振とうフラスコ培養物に、ＹＰＤ−ゼオシン寒天マスタープレートから得た単一のコロニーを接種し、２８℃、１８０ｒｐｍにて培養した。２２時間後遠心分離（1 500xg ５分）によって細胞を収集し、１０ｍｌのＭＭ−培地（100mMのリン酸カリウム緩衝液pH 6.0、硫酸アンモニウムを有する1.34%のイースト窒素塩基、4x10-5%のビオチン、0.5%のメタノール）に再び懸濁した。１２時間毎に最終濃度０．５％となるようにグルコースを加えた。接種後２２時間、４２時間、６４時間、及び、９０時間経過した時点で取ったサンプルを滅菌ＰＢＳで希釈して、約０．１〜０．２のOD600Ｏとし、そして、流動血球計算器分析によってＧＦＰ発現について分析した。その結果を表８に示す。
【０２２１】
【表８】
2010524440.tif 000041
【０２２２】
表８から、異なる炭素源に対し異なる転写レベル（０〜１６００％）を有するプロモーターが存在することが分かる。ここで、転写レベルは、周知のＧＡＰプロモーターの下でのｅＧＦＰ発現を１００％としたときの相対的な数値である。ベクターpPuzzle＿zeoR＿PPET9＿eGFP＿AOXTTから得た高度のｅＧＦＰ発現レベルは予想外のものであった（図２）。ここで、ｅＧＦＰはＰＥＴ９プロモーター（即ち、ＰＥＴ９遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片）の調節下にある。前述の実験条件の下でこのベクターpPuzzle＿zeoR＿PPET9＿eGFP＿AOXTTから得たｅＧＦＰ発現レベルは、Ｐ．パストリス細胞が単一の炭素源としてグルコース上で培養されたときに、約４８０％〜約１７００％であり、Ｐ．パストリス細胞が単一の炭素源としてグリセロール／メタノール上で培養されたときに、約７４０％〜約１２００％であった（ＧＡＰプロモーターの下でのｅＧＦＰ発現に対して標準化したもの）。Ｐ．パストリスのＰＥＴ９遺伝子の５’−非コーディング領域から１０００ｂｐの断片のヌクレオチド配列を表９に示す。
【０２２３】
【表９】
2010524440.tif 000042
【０２２４】
異なる炭素源に対し異なる転写レベル（０％〜１３５％、ＧＡＰプロモーター下のｅＧＦＰ発現に対する相対的な数値）を有する更なる興味のあるプロモーター配列を表１０に示す。
【０２２５】
【表１０】
2010524440.tif 000043
2010524440.tif 000044
2010524440.tif 000045
2010524440.tif 000046
2010524440.tif 000047
2010524440.tif 000048
2010524440.tif 000049
2010524440.tif 000050
2010524440.tif 000051
2010524440.tif 000052
2010524440.tif 000053
2010524440.tif 000054
2010524440.tif 000055
2010524440.tif 000056
【０２２６】
［参考文献］
Archer, D., Jeenes, D. and Mackenzie, D. ( 1994). Strategies for improving heterologous protein production from filamentous fungi. Antonie Van Leeuwenhoek 65, 245-50.
Gasser, B., Maurer, M., Gach, J., Kunert, R. and Mattanovich, D. (2006). Engineering of Pichia pastoris for improved production of antibody fragments. Biotechnol Bioeng 94, 353-61 .
Gething, M. and Sambrook, J. (1992). Protein folding in the cell. Nature 355, 33-45.
Hohenblum, H., et al. (2003) Assessing viability and cell-associated product of recombinant protein producing Pichia pastoris with flow cytometry. J Biotechnol 102, 281 -290
Kurtzman CP. (2005). Description of Komagataella phaffiee sp. nov. and the transfer of Pichia pseudopastoris to the methylotrophic yeast genus Komagataella. lnt J Syst Evol Microbiol 55, 973-976.
Lang, C. and Looman, A. ( 1995). Efficient expression and secretion of Aspergillus niger RH5344 polygalacturonase in Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol 44, 147-56.
Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B. and Harvey, L. M. (2005). Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast 22, 249-70. 
Mattanovich, D., Gasser, B., Hohenblum, H. and Sauer, M. (2004). Stress in recombinant protein producing yeasts. J Biotechnol 1 13, 121 -35.
Mori, Ｋ．, Ogawa, N., Kawahara, T., Yanagi, H. and Yura, T. (2000). mRNA splicing-mediated C-terminal replacement of transcription factor Had p is required for efficient activation of the unfolded protein response. ProcNatl Acad Sci U S A 97, 4660-5.
Porro, D., Sauer, M., Branduardi, P. and Mattanovich, D. (2005). Recombinant protein production in yeasts. MoI Biotechnol 31 , 245-59.
Punt, P. J., van Biezen, N., Conesa, A., Albers, A., Mangnus, J. and van den Hondel, C. (2002). Filamentous fungi as cell factories for heterologous protein production. Trends Biotechnol 20, 200-6.
Sauer, M., Branduardi, P., Gasser, B., VaIIi, M., Maurer, M., Porro, D. and Mattanovich, D. (2004). Differential gene expression in recombinant Pichia pastoris analysed by heterologous DNA microarray hybridisation. Microb Cell Fact 3, 1 7. 
Shuster, J. (1991 ). Gene expression in yeast: protein secretion. Curr Opin Biotechnol 2, 685-90. 
Stryer, L. (1995). Biochemie. Spektrum der Wissenschaft Verlags GmbH. 
SEQUENCE LISTING
<110>  Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH
<120>  EXPRESSION SYSTEM
<130>  BEP-10289-WO
<140>  PCT/EP2008/003076
<141>  2008-04-17
<150>  EP 07008051.0
<151>  2007-04-20
<160>  147
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  32
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Forward primer BFR2 FORW  PmlI
<400>  1
taaacacgtg agcatggaaa aatcactagc gg                                   32
<210>  2
<211>  31
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Backward primer BFR2 BACK SacII
<400>  2
tacaccgcgg tcaaccaaag atttggatat c                                    31
<210>  3
<211>  32
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Forward primer BMH2 FORW PmlI
<400>  3
taaccacgtg agcatgtccc aaactcgtga ag                                   32
<210>  4
<211>  31
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Backward primer BMH2 BACK SacII
<400>  4
tatgccgcgg ttatttggtt ggttcacctt g                                    31
<210>  5
<211>  34
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Forward primer COG6 FORW PmlI
<400>  5
taagcacgtg agcatggatt tcgttgtaga ctat                                 34
<210>  6
<211>  32
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Backward primer COG6 BACK SacII
<400>  6
taagccgcgg tcagtgatca atacctatca ac                                   32
<210>  7
<211>  33
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Forward primer COY1 FORW PmlI
<400>  7
tagtcacgtg agcatggata cgtcagtata ttc                                  33
<210>  8
<211>  31
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Backward primer COY1 BACK SacII
<400>  8
tacaccgcgg ctatcgattt atgccatgaa c                                    31
<210>  9
<211>  32
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Forward primer CUP5 FORW PmlI
<400>  9
tatccacgtg agcatgactg aattgtgtcc tg                                   32
<210>  10
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Backward primer CUP5 BACK SacII
<400>  10
tacaccgcgg ttaacagaca acatcttgag                                      30
<210>  11
<211>  42
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Forward primer ERO1 FORW SfiI
<400>  11
tataggccca gccggccacg atgagattaa gaaccgccat tg                        42
<210>  12
<211>  33
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Backward primer ERO1 BACK SacII
<400>  12
tgtcccgcgg ttattgtata tctagcttat agg                                  33
<210>  13
<211>  39
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Forward primer IMH1 FORW SfiI
<400>  13
tataggccca gccggccacg atgttcaaac agctgtcac                            39
<210>  14
<211>  31
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Backward primer IMH1 BACK SacII
<400>  14
tagaccgcgg ttacttcaga gacataacca g                                    31
<210>  15
<211>  42
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Forward primer KIN2 FORW SfiI
<400>  15
tcaaggccca gccggccacg atgcctaatc cgaatacagc ag                        42
<210>  16
<211>  38
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Backward primer KIN2 BACK SacII
<400>  16
tctgccgcgg ctataggttt aattctttta aaatatac                             38
<210>  17
<211>  34
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Forward primer KAR2 FORW PmlI
<400>  17
taagcacgtg acgatgtttt tcaacagact aagc                                 34
<210>  18
<211>  29
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Backward primer KAR2 BACK SacII
<400>  18
tatgccgcgg ctacaattcg tcgtgttcg                                       29
<210>  19
<211>  33
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Forward primer PDI1 FORW EcoRI
<400>  19
cgccgaattc acgatgaagt tttctgctgg tgc                                  33
<210>  20
<211>  31
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Backward primer PDI1 BACK XhoI
<400>  20
cctcctcgag ttacaattca tcgtgaatgg c                                    31
<210>  21
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Forward primer SEC31 FORW SfiI
<400>  21
tataggccca gccggccacg atggtcaaac ttgctgagtt                           40
<210>  22
<211>  31
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Backward primer SEC31 BACK SacII
<400>  22
tatgccgcgg ttaattcaaa gtcgcttcag c                                    31
<210>  23
<211>  35
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Forward primer SSA4 FORW PmlI
<400>  23
tatgcacgtg acgatgtcaa aagctgttgg tattg                                35
<210>  24
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Backward primer SSA4 BACK SacII
<400>  24
tatcccgcgg ctaatcaacc tcttcaaccg                                      30
<210>  25
<211>  35
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Forward primer SSO2 FORW PmlI
<400>  25
tacacacgtg acgatgagca acgctaatcc ttatg                                35
<210>  26
<211>  32
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Backward primer SSO2 BACK SacII
<400>  26
tatgccgcgg ttactttctt gtttccacaa cg                                   32
<210>  27
<211>  35
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Forward primer SSE1 FORW PmlI
<400>  27
tagacacgtg acgatgagta ctccatttgg tttag                                35
<210>  28
<211>  31
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Backward primer SSE1 BACK SacII
<400>  28
tatcccgcgg ttagtccatg tcaacatcac c                                    31
<210>  29
<211>  42
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Forward primer HAC1 FORW SfiI
<400>  29
gcaaggccca gccggccacg atggaaatga ctgattttga ac                        42
<210>  30
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Backward primer HAC BACK1
<400>  30
tggtcatcgt aatcacggc                                                  19
<210>  31
<211>  88
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Backward primer HAC BACK2 SacII
<400>  31
cctcccgcgg tcatgaagtg atgaagaaat cattcaattc aaatgaattc aaacctgact     60
gcgcttctgg attacgccaa ttgtcaag                                        88
<210>  32
<211>  822
<212>  DNA
<213>  Saccharomyces cerevisiae
<400>  32
atgtcccaaa ctcgtgaaga ttctgtttac ctagctaaat tagctgaaca agccgaacgt     60
tatgaagaaa tggtcgaaaa catgaaggcc gttgcttcat caggtcaaga gttatctgtc    120
gaagaacgga atctattgtc ggttgcttac aagaacgtca tcggtgctcg ccgtgcttca    180
tggagaatag tttcttcgat cgaacaaaaa gaagaatcaa aggagaaatc tgaacatcaa    240
gttgaattaa tccgttctta ccgttctaaa attgaaactg aattgaccaa aatctctgac    300
gacattttat ctgtgttaga ttctcattta atcccttctg ctactactgg tgagtctaaa    360
gtattttact ataagatgaa gggtgactac caccgttatt tagctgaatt ttccagcgga    420
gatgcaagag aaaaggcaac caactcctct ttggaggctt ataaaaccgc ttccgaaatc    480
gccacaactg aattgcctcc aactcaccca attcgtttag gtctagcttt gaatttctcc    540
gtcttctatt acgaaattca aaactctcct gataaggctt gccacttggc caaacaagcc    600
tttgatgatg ctattgctga gttagatact ttatctgaag aatcatacaa ggatagcact    660
ttgatcatgc aattattaag ggacaacttg accttatgga cctctgatat ttctgaatct    720
ggtcaagaag atcaacaaca acaacaacaa cagcaacagc aacagcaaca acagcaacaa    780
caagctccag ctgaacaaac tcaaggtgaa ccaaccaaat aa                       822
<210>  33
<211>  1605
<212>  DNA
<213>  Saccharomyces cerevisiae
<400>  33
atggaaaaat cactagcgga tcaaatttcc gatatcgcca ttaaaccggt caataaagac     60
ttcgatattg aagatgagga aaatgcatct ttatttcaac acaatgaaaa aaatggagaa    120
agtgatttaa gcgactatgg aaatagcaac acagaagaaa ccaagaaggc gcactatttg    180
gaggtggaaa agtctaagtt aagagcagaa aaaggtttag aactaaacga tccaaaatat    240
acaggtgtta aaggttcaag acaagcatta tatgaagaag tttccgagaa tgaggacgaa    300
gaagaagaag aagaagagga agaagaaaaa gaggaagatg ctctttcatt caggacagat    360
tctgaagatg aagaagtaga gattgatgaa gaagaatcag acgcggacgg cggtgaaacg    420
gaggaggctc aacagaaaag gcatgcacta tcgaaactaa ttcaacaaga gactaaacaa    480
gctattaaca aactgtctca atcagttcaa agagatgctt cgaagggtta ttccatttta    540
caacagacaa aattatttga caacatcatt gatttgagaa taaaactaca aaaagctgta    600
attgcagcaa ataagctccc attaactaca gagtcctggg aagaggctaa aatggatgat    660
tcagaggaaa caaagcgttt gctgaaggaa aacgaaaaac tgttcaataa tttattcaat    720
cggttgataa atttcagaat aaaattccaa cttggcgatc atatcactca aaatgaagag    780
gtggcgaagc ataaattgtc caaaaaaaga tctctcaaag agctttacca agaaactaat    840
agcttagact cagaactaaa agagtacagg actgccgtat taaacaagtg gtctaccaaa    900
gtttcttctg catcaggtaa cgctgcttta tcatctaaca aattcaaagc tatcaactta    960
cctgcagatg tacaagtcga aaaccaatta tccgatatgt cccgtttgat gaaaagaaca   1020
aagttgaaca ggagaaacat aacgcctttg tatttccaaa aagactgtgc taatggcagg   1080
ctaccagaat tgatttctcc cgttgtcaaa gatagtgttg atgacaatga gaattcggat   1140
gatgggcttg atatcccgaa aaactatgac ccaagaagaa aggataacaa tgccattgac   1200
attaccgaaa acccatatgt ttttgatgac gaagattttt accgtgtttt actaaacgat   1260
ttaattgaca aaaagatttc caacgctcac aattctgaaa gtgcagcaat tacaatcacc   1320
tcaactaatg ctcgttcgaa caacaagcta aagaagaata tcgatactaa ggcttccaag   1380
ggtaggaaat tgaactactc agttcaagat ccaattgcga attatgaagc ccccatcaca   1440
tccggataca aatggtcaga cgaccaaatc gatgaattct ttgcgggatt gttaggtcaa   1500
cgagtgaact ttaatgaaaa tgaggatgag gaacaacatg ccagaataga aaatgacgaa   1560
gaattagagg ctgttaaaaa cgatgatatc caaatctttg gttga                   1605
<210>  34
<211>  2520
<212>  DNA
<213>  Saccharomyces cerevisiae
<400>  34
atggatttcg ttgtagacta tcagacctac gcaatggcgg atactgccac gccagaatta     60
ccagaacctg agccaagact aaacttaacc tcagatgcac agtcacagcc caccggtaaa    120
ctagatctac agtttaagtt gcccgacctt caacgttatt ccaataataa tgcaactttg    180
ccagtagata atgatggtgc tggttcgaaa gacctacata agaaaatgac acattacgca    240
atgtcttcca ttgataaaat acagctttca aatccaagca aacaattagg gcaaaattcc    300
caggatgaaa aactatcgca gcaagaatct caaaatttca cgaattacga gccaaaaaac    360
cttgatttat caaaattagt atccccgtca agtggttcca acaaaaatac cacaaatttg    420
gttctttcga ataaactatc caagatattg aacaattaca cattgattaa ctatcaggcc    480
acagtccaac taagaaaatc cctaaaggtt ctagaagaga ataaagagag attgtccctt    540
gatgaacaaa agctcatgaa tcctgaatat gtaggtactt tggcaagaag agcattgagg    600
actgatttgg aatctcaact gctaaaggaa catattacgg tacttgagga attcaaacct    660
atcattagaa ggattaaacg attatcttct tccgtcgaaa aaatacaaag aacgagcgaa    720
aaattactaa gtaatgagac aaatgaggtt ccaacaaata acgtggtact tcaggaaata    780
gatcaatacc gtttaaaggc agagcagttg aagctgaaaa aaaaaatact gttatctata    840
agggataggt ttactttgaa tcaggtagag gacgatgtaa tcaccaatgg tactatagac    900
aacatctttt tcgaggtagt aaagaaagta atcaatatta aagatgaatc aagtttcttg    960
ctgacgcttc ctaatttgaa tgctggaaat gctttgataa tgggagttaa tgaaatttta   1020
gaaaagacaa acaaaaaaat cttcaattat ttgatcgatt ttttatatag ttttgaatcc   1080
tcttcaaatt tattaaatga ccatggtact actgaacaag aaagcttaaa catttttcgg   1140
aagagtctgg tcttcctgtc aagtgatcta gaattattta atgagttgtt gaaaagagtg   1200
accacactga gatccaagag tattctggat gagtttttgt ctcaattcga tatgaattca   1260
actacctcta aacccatcat attatcggca cacgatccaa ttaggtatat tggtgacgta   1320
ctagcgtccg ttcattccat catcgcaaat gaagctgatt tcgtgaagtc actatttgac   1380
tttcaggatg aagacttaaa agatacccca atttctatac ttcaacaaaa caagacattc   1440
ttgaaaggca tcgacaacaa attgctgaac gatatcatcc agtcgctatc caattcgtgt   1500
cgtattcgta tcgagcaaat cgtgaggttt gaagaaaatc cgatcatcaa tttcgagatt   1560
gtgaggctgc tgaaacttta cagagttatg ttcgagagaa agggaattca ggacgatagt   1620
tctattatta acaatttaaa gtcgttggaa gacatttcca aaaacagaat tattggatac   1680
tatgaagact atatgaagca aacagtcatg gcggaaacaa aaaattcttc agatgattta   1740
ctgccaccag agtggctatc agagtatatg aataaattgg tagagttatt tgaaatttat   1800
gaaaagacac atgctgccga agatgaggaa tcagaagata ataaattgct ctcatctaag   1860
aatttacaaa caattgtaga acaaccaata aaagatgttc tgttaaaaca attgcaaaca   1920
tcttttcctt tggcgaaaaa aaatgaaaaa gaaaaggcat cattgctaac tatagagata   1980
aactgtttcg atttaattaa atctagactt caaccttttg agggattgtt tgcacaagat   2040
gatgacagcc ggaaaatcac catctgggtt tgtgataaac tgaaggaata tactaagcaa   2100
atgctaactt tacaaataaa attcctattt gagaatacag gtttagacct ttacagcaat   2160
ttggtcaata tgatttttcc tgtggactca gtaaaggatg aattggatta tgatatgtac   2220
ttagccctga gggataattc attgatggaa ttagacatgg tcagaaaaaa tgtgcatgat   2280
aagttgaact attatctacc tcaggcgtta acagatgttc aaggtaattt actatttaaa   2340
ttaacgtcac caatgatagc tgatgaaata tgcgatgaat gtttcaagaa gttgtcgcta   2400
ttttataata tcttcaggaa actgttgatt catttgtatc cgaacaagaa ggatcaggta   2460
ttcgaaattt taaatttttc cactgatgaa tttgacatgt tgataggtat tgatcactga   2520
<210>  35
<211>  2039
<212>  DNA
<213>  Saccharomyces cerevisiae
<400>  35
atggatacgt cagtatattc tcatgcattg gatatttggg ccaaggcaga tttaacgaat     60
cttcaaagag aattggatgc tgatgttata gagattaagg ataaagaaac cctgtccttg    120
aattcaagaa agtcattagc cactgagact aaaaaattta aaaaactcga acctgaggaa    180
aaattgaaca atgtgaataa aataattaag cagtaccaac gtgaaattga taatttgaca    240
cagagatcaa aattctctga aaaggttctt tttgacgtat acgaaaagct ttcagaggct    300
cctgatccac agccgctact acaaagttcg ttggaaaaat tgggcaaaat tgatgactcg    360
aaggaactta aggaaaaaat aagctaccta gaagataagc tagccaaata tgcagattat    420
gagactttga aatcaaggtt actggaccta gagcaaagct ctgcaaaaac attggcaaaa    480
agactgactg cgaaaactca agaaatcaat tctacctggg aggaaaaagg aagaaattgg    540
aaagagagag aagcagatct attgaaacaa ttaacaaatg tacaggagca aaacaaggca    600
ctagaggcca aaatatctaa aaatatagat atagaaggta atggaaacga agatggtgac    660
caagaaaaca atcaaaaaga agtatctaca aggattgctg aatataatct agtaacacag    720
gagttggaaa ctacgcaggc tagaatatat cagttagaga aaagaaatga ggaactaagt    780
ggtgctcttg caaaggcaac tagtgaagca gaaaaagaaa ctgagttaca tgcaaaggaa    840
ctaaaactta accagctgga aagcgaaaat gcattgttga gtgcatccta tgagcaggaa    900
cggaaatcaa catcacatgc aataaatgag ttaaaagaac aattaaatag cgttgtggcg    960
gaatcggaat cttacaagtc ggagctagaa actgttagaa gaaaactaaa caattattct   1020
gattacaata agataaaaga agaactttct gcattgaaaa aaattgagtt tggggtaaac   1080
gaagatgatt ctgataatga cattcgctct gaagacaaga atgataatac tttcgaaagt   1140
tccttactat ctgcaaataa gaagctccag gctactttgg cggaataccg ctcaaaaagt   1200
acggctcaag aggaagaacg aaacgaattg aaaaaatctg tggaccaatt gaagcagcaa   1260
atagctactc tcaaagaagc aaatgaaaaa ttagagacgg acctagaaaa agtagagaac   1320
gtcagtcctc acttcaacga gactgcaagt atgatgtctg gtgtaacaag acaaatgaac   1380
aatcgtacgt cccataaaat gtccccaacg agttctatta ttggtattcc agaagatggg   1440
gaactttctg gaaaccaatc aaccatttta ccaatagtta ctaaacaaag agacagattt   1500
cgttcgagaa atatggatct ggaaaagcaa ctaagacaag gaaactcaga aaagggtaag   1560
cttaaactag aaatttcgaa gctaaaaggc gacaatacga agctttatga acggattagg   1620
tatctgcaat cctataataa taacaacgct cccgttaatc aaagtacaga gcgtattgac   1680
gtggaatccc aatactcaag ggtgtatgat gaatcgttgc atccaatggc aaattttaga   1740
cagaacgaat taaaccacta caaaaacaag aaattatcag ctttagagaa gttattttcc   1800
agttttgcaa aagtcatttt acaaaataaa atgacaagga tggtattcct cttttactgt   1860
atcggtttac acggactcgt attcatgatg agcatgtatg tgattaatat tagcggctac   1920
atgacacctg aggttggtat agtacaatcg gcaaagtctt cttcaaatct caacggagga   1980
cttgggggag cagaaaaagt agctgcaggc gttggttcag ttcatggcat aaatcgata    2039
<210>  36
<211>  483
<212>  DNA
<213>  Saccharomyces cerevisiae
<400>  36
atgactgaat tgtgtcctgt ctacgcccct ttctttggtg ccattggttg tgcctctgca     60
attatcttca cctcattagg tgctgcttac ggtactgcta agtctggtgt tggtatctgt    120
gccacttgtg tgttgagacc agacctatta ttcaagaaca ttgttcctgt tattatggct    180
ggtatcattg ccatttacgg tttagttgtt tccgttttgg tttgttattc gttgggtcaa    240
aagcaagctt tgtacaccgg tttcatccaa ttgggtgccg gtctatcagt cggtttgagt    300
ggtctagctg ctggtttcgc tattggtatt gtcggtgatg caggtgttag aggttcctct    360
caacaaccaa gattattcgt cggtatgatt ttgattttga tttttgctga agttttgggt    420
ctatacggtt tgattgttgc tttgttgttg aactccaggg ctactcaaga tgttgtctgt    480
taa                                                                  483
<210>  37
<211>  2736
<212>  DNA
<213>  Saccharomyces cerevisiae
<400>  37
atgttcaaac agctgtcaca aattggtaag aatcttaccg atgaattagc gaagggctta     60
gccgatgata tgagccctac cccgtcagaa caacaaatcg aagatgataa gagtggcttg    120
ccaaaagaaa tacaagctaa attaagaaaa tttgagaaat atgaacaaaa ataccctttg    180
ctactctccg catacaaaaa tgaaaaatta aagtcagaga agttagaggc tgttgaaaag    240
attttagcgg aaaatacacc catatctaat attgacgacg cagtggatac gttgccagct    300
tttttccagg atttaaacaa caaaaataac ctattgaatg atgagatcaa gagattaact    360
aagcagaact cggaaattcc agaaagcgcc tctagtgaaa ctctgaagga taaagaagag    420
gaatttttga aaaaagagca aaattataaa aatgacatag acgatctaaa aaaaaaaatg    480
gaagctttaa acatagaatt ggatactgta caaaaagaaa aaaatgatac tgtttcaggt    540
ttgagagaaa aaatagttgc actggaaaat atactaaagg aagaaaggga ggccaaaaaa    600
cagaaagaag aagtatctat atccgaactg aaggaagaat tggctataaa gaaccattct    660
ctcgaggaca gtcgaatgaa gataaccgaa ttggagcaaa atttgtcttc gaaaagtact    720
ataatggagg aaaagtcctc agagttggca gaactaaata ttactttaaa agagaaagag    780
cgcaagctga gtgaattgga aaaaaaaatg aaggagttac cgaaggcgat atctcatcaa    840
aatgtaggaa acaataacag aaggaaaaag aatagaaaca agggaaagaa aaataaggga    900
ggcataacta cgggtgatat cagtgaagag gaaacggtcg ataactcaat caatactgaa    960
gaatatgata agcttaaaga aaatttgcaa gaattacaag aaaaatataa agattgtgaa   1020
gattggaagc aaaagtatga agatatagaa gcagaactaa aagatgctaa agaattggaa   1080
aactcacagc tcgaaaaatc agcaaaggag ctggaaaccc ttaacaccga gttgatcgat   1140
accaagaagt cattgaaaga aaaaaattcg gagctagagg aggtgagaga tatgctgagg   1200
actgtaggca atgagcttgt ggacgcaaaa gatgagatta aagagtcttc gagtaaacaa   1260
aatgaagaag tgaaaaccgt taagctggag ctcgatgatt tacgccataa aaatgcaacg   1320
atgatcgagg cctacgaagc taaaaatact gagttgagaa gtaagataga gttattgagc   1380
aagaaagtag agcatctgaa gaatttatgt acagaaaagg agaaagagca gactacatcg   1440
cagaacaagg tagccaaatt aaatgaggag atatctcaac ttacctacga aaaatcaaac   1500
ataacaaagg agcttacttc tttaagaacc tcttataaac aaaaggagaa aactgtgagt   1560
tacttggagg aacaagttaa acaatttagt gagcaaaagg acgtggctga aaaatccaca   1620
gaacagctga gaaaagatca tgctaaaatt tctaacagat tagacttatt aaaaaaggaa   1680
aatgagacac tgcataatga tatcgcaaag aattctaatt cctacgagga gtatttgaaa   1740
gaaaatggta aattatcgga aagattgaat attttgcaag aaaaatacaa taccttgcaa   1800
aatgtaaaaa gtaattcgaa tgaacacata gattctatca aaagacaatg tgaggaacta   1860
aatgtcaagt tgaaggaatc tacaaaaaaa attttatctt tagaagatga actaaatgaa   1920
tatgctaata ttgttcaaga caaaaccaga gaagctaaca cattgagaag gttagtttcg   1980
gacagtcaga cagatgattc gagcaaacaa aaagagttgg agaataaatt ggcctattta   2040
acggatgaaa agaataaatt ggaagcagaa ttagacttac aaacatccag aaaggccact   2100
gaattacaag agtggaagca tacagtaact gagctgaaat cggaaataca cgctttaaag   2160
cttcgtgaag agggactaaa atcagaggtt gacgcattga aacatgttaa caatgacatc   2220
aaaaggaaga ctcaagccac ttcagatgat tccgatcagt tggaacagat cacatctaat   2280
ttaaaactct cattgtctaa ggctgatgaa aagaattttg agctacagtc tgccaatgag   2340
aaacttctga atttaaataa cgaacttaac aagaaatttg atcgattact aaaaaattat   2400
cgttcattgt cctctcaatt gaatgcttta aaggaaagac aatacagtga caagtcagga   2460
agagttagta ggtctggttc tatcggtact ctagctaacg cgaatattga ttcctcacca   2520
gcgaataact ctaatccaac taaattagag aagatacgat catcaagttc attggagtta   2580
gactctgaga aaaatgaaaa aattgcatat ataaaaaatg ttttgttggg atttttggag   2640
cacaaggaac aacggaacca attacttcct gtaatttcta tgttgttaca actggacagt   2700
actgatgaaa aaagactggt tatgtctctg aagtaa                             2736
<210>  38
<211>  3444
<212>  DNA
<213>  Saccharomyces cerevisiae
<400>  38
atgcctaatc cgaatacagc agattacttg gtgaatccaa atttcaggac cagtaagggc     60
ggatctttat cgccgacgcc agaagctttc aacgacacgc gagttgctgc accagccact    120
cttcgcatga tgggcaagca atctggacca agaaatgacc agcaacaagc accactgatg    180
cctcctgcag atatcaaaca gggcaaggaa caggcagctc agagacaaaa tgatgcatcg    240
aggcctaatg gcgccgtgga attaaggcaa tttcatagaa gatctttggg agattgggag    300
ttccttgaaa cggttggcgc aggctctatg ggtaaagtta aattggtcaa gcatcgtcaa    360
acaaaggaaa tttgtgtaat aaagattgtt aatagggctt ccaaggctta tctccataaa    420
cagcactctt taccttcccc aaagaatgag agtgagatat tagaaagaca aaagcggtta    480
gaaaaagaaa ttgcgaggga taaaaggact gttagggaag cctctttggg ccaaatcctt    540
taccatcctc atatctgtcg tttatttgaa atgtgcacta tgtcaaacca tttttatatg    600
ctttttgaat acgtttccgg tggacagctg ttagattata ttattcagca tggctcatta    660
aaggaacacc atgcgaggaa atttgccaga ggtatagcta gtgcgctgca atacttacat    720
gccaataata ttgttcatcg agatctgaaa attgagaata taatgatatc tagttcaggt    780
gaaattaaga tcattgattt tggtctttcc aacatttttg attataggaa acaattacat    840
acgttttgtg gttccttgta ctttgcagca ccagaactat taaaagcgca gccatacaca    900
ggacctgagg tagatatttg gtcgtttggt attgttcttt atgtcttggt ctgcggtaaa    960
gtaccatttg atgatgagaa ctcaagcatt ttacatgaaa aaataaaaaa aggtaaagta   1020
gactatcctt cacacttatc cattgaagtt atatctttat taaccaggat gattgttgtc   1080
gacccattaa gaagagcaac attaaagaat gtcgttgagc atccatggat gaacagagga   1140
tacgatttta aggctccatc atatgttcct aatcgtgttc cattaacccc tgaaatgata   1200
gatagccaag ttctgaagga aatgtatcgc ctagaattta ttgacgatat tgaagataca   1260
agaagatcat tgatccgatt agtaactgaa aaggaataca tccaactttc ccaagaatac   1320
tgggacaaat tatccaacgc caaggggttg agttcaagtt taaataataa ctacctaaat   1380
tcaacggcac aacaaacctt aatacaaaat catattacaa gtaatccatc gcaaagtggt   1440
tataatgaac cagatagtaa ttttgaagat cctactttag catatcatcc attactatca   1500
atatatcact tggtttcaga aatggttgca cggaaattag cgaagttgca aagaaggcaa   1560
gcattggccc tgcaagcgca agctcagcaa aggcaacaac agcaacaagt agcacttggc   1620
actaaggtcg ccttaaataa taactccccg gatattatga ccaaaatgag gagccctcag   1680
aaagaagtag tacctaatcc tggtattttt caagtgccgg caattggaac atcgggaacc   1740
tcaaacaaca ctaatacctc aaacaaacct ccactgcatg taatggttcc tcctaaacta   1800
acaataccgg aacaagcgca tacttctcca acatctagga agagttccga cattcatacg   1860
gaattaaatg gtgttttgaa atcaacacca gtccccgtgt ctggcgaata tcagcaacgt   1920
tctgcttcac ccgtagtagg tgaacatcag gaaaagaata caataggcgg catattcaga   1980
agaatatcac aaagtggaca atctcagcat cccacacggc aacaggaacc tcttccagaa   2040
agagaacctc caacatatat gtcaaaatca aatgaaattt ccatcaaagt accgaaaagc   2100
catagtcgta ctatatcaga ttatattcct agcgctagaa gatatccatc ttacgtgcca   2160
aattctgttg atgtaaaaca gaaacccgct aaaaacacta ccatagcacc tcctataagg   2220
tcagtatcac aaaagcaaaa cagtgatctt ccagctttac ctcagaacgc cgaactaatt   2280
gttcaaaaac aacggcaaaa actattacag gaaaatctcg acaaattaca aattaatgat   2340
aatgataaca acaatgtgaa cgctgtagtc gatggtatca ataatgataa tagtgaccat   2400
tatctctccg ttccgaaggg tcgtaagtta catcctagtg caagggctaa atcggtgggg   2460
catgctcgtc gtgaatcttt gaaatttact aggccgccta taccagcagc ccttccgcca   2520
tcagatatga caaacgataa cggctttttg ggagaggcaa acaaggagag atacaatcct   2580
gttagcagta acttttcgac cgttcctgaa gattctacca catacagtaa cgatactaac   2640
aatagactga cttcggtgta ttctcaggag cttactgaga agcaaatttt ggaggaagct   2700
tcaaaggcac cccccgggtc tatgccatca attgattatc caaagtcaat gtttttgaag   2760
ggttttttct ctgtacaaac aacctcctct aaaccattgc ctattgttcg tcacaatatc   2820
atatctgttt taacaagaat gaatattgat ttcaaagaag tgaaaggcgg gttcatatgt   2880
gtccaacaaa ggccatctat tgagactgca gctgtccctg ttataaccac tactggcgtg   2940
ggtttggatt ccggaaaggc gatggatctg caaaatagtt tagacagtca attatcatcc   3000
agttaccata gtacagcgtc ctcagcatca agaaatagtt cgataaaacg ccaaggttct   3060
tataagaggg gccagaataa tataccacta acacctttag cgaccaatac acatcaaaga   3120
aattcatcta tcccaatgtc tccaaactac ggaaaccaaa gtaatggtac atcaggggaa   3180
ctatcttcca tgtcattaga ttatgttcaa caacaggatg atattttaac aacatcaaga   3240
gcccaaaata taaataacgt aaatggtcaa acagagcaaa ccaatacttc tggtataaaa   3300
gaaaggcctc ctattaaatt tgagattcac attgtaaagg ttcgtatcgt cggcctagca   3360
ggtgtacatt tcaaaaaggt ttctggtaat acgtggctat ataaagaatt ggcatcgtat   3420
attttaaaag aattaaacct atag                                          3444
<210>  39
<211>  3822
<212>  DNA
<213>  Saccharomyces cerevisiae
<400>  39
atggtcaaac ttgctgagtt ttctcgaaca gccacgtttg cgtggtcaca tgataaaatt     60
ccattattgg tctctggtac cgtatctggt acggtggatg ctaatttctc cactgattca    120
tctctagaat tgtggtcatt gttggctgct gattcggaga agcctattgc ttccttgcaa    180
gtggattcca aattcaatga tttggattgg tctcataata acaagattat tgctggtgct    240
ctggataacg gtagtttgga attgtactcc accaatgaag caaacaacgc tatcaactcc    300
atggccagat ttagcaacca ttcttcctct gtgaagacgg taaagtttaa cgcaaagcaa    360
gacaacgttc ttgcttcggg tggtaacaac ggtgaaattt ttatttggga catgaataaa    420
tgcactgaat cgccctccaa ttatactcca ttgacaccgg gtcaatcgat gtcgtccgtt    480
gacgaggtca tttccctagc atggaaccaa tctttggccc atgtttttgc atctgccggg    540
tcgtctaatt tcgcatctat ttgggatttg aaggctaaga aggaagtcat tcatctaagt    600
tacacttcac ctaattcagg tatcaagcaa cagctgtccg ttgttgaatg gcacccaaaa    660
aactccacaa gagtggcaac ggctactggt agcgataatg atccatctat cctgatctgg    720
gatttaagaa acgccaacac accattgcag actttaaatc aaggccatca aaagggtatt    780
ttgtcattag attggtgtca tcaggacgaa catctattat tgtccagtgg tagagataat    840
accgttcttc tatggaaccc tgagtcagcc gaacaactgt cccaattccc agctcgtgga    900
aactggtgtt ttaagaccaa atttgcacca gaggctccag acctatttgc ttgtgcctcc    960
tttgataaca aaattgaggt acagactttg caaaatctca caaacacttt ggatgagcaa   1020
gaaaccgaaa ctaagcagca agaatctgaa acagattttt ggaataatgt ttcccgagag   1080
gaatcaaaag agaagccatc tgttttccat ttacaagccc caacttggta tggggaacca   1140
tctcccgcag ctcattgggc tttcggtggt aaattggttc aaattactcc agatggtaaa   1200
ggtgtatcta taacaaaccc aaaaatttca ggcttagaat caaacactac tttgagtgaa   1260
gcgttgaaaa ctaaggattt caaaccatta ataaatcaaa gactggtcaa agttattgat   1320
gacgttaatg aagaagattg gaatttattg gaaaagttat caatggacgg tactgaggag   1380
ttcttgaaag aggctcttgc attcgacaac gatgaatcag atgcacaaga cgatgccaac   1440
aatgagaaag aagacgatgg ggaagaattc tttcaacaaa ttgaaaccaa tttccaaccc   1500
gagggcgatt tctccttgtc tggtaatatc gaacaaacta tttccaagaa cttggtttct   1560
ggcaacatta agagcgctgt gaaaaattct ctagagaatg acttactaat ggaggccatg   1620
gtgatcgcat tagattcaaa taacgaaaga ttaaaggaaa gtgtcaagaa tgcctatttt   1680
gcgaagtatg gatctaaatc atcgctctcg aggatactat actccatttc taagagggaa   1740
gtagatgatt tggttgaaaa tttggatgtc tctcagtgga agtttatctc taaagcaatt   1800
caaaacttat atccaaatga tatcgcccag aggaatgaaa tgttgattaa attgggagac   1860
aggttaaagg aaaatggtca tagacaagat tctttgactt tgtacttggc tgccggatca   1920
ttagataagg tggcttcaat ttggttatca gaatttccag atttggagga taaattgaag   1980
aaagataata agacaattta tgaagctcat tccgaatgtc taactgagtt cattgaaaga   2040
ttcaccgtat tttccaactt cattaatgga agctctacca ttaataatga gcaattaatt   2100
gccaaatttt tggaatttat caacttaact acttccacag gaaatttcga actagccact   2160
gaattcttaa atagtttacc aagtgacaat gaagaggtta aaacagaaaa ggcacgtgtc   2220
ttgattgctt ccggcaaatc attaccggca caaaatcctg cgacagcgac gaccagcaaa   2280
gccaagtata caaacgccaa gacaaataag aacgttcctg tactaccaac tcctggaatg   2340
ccttctacta cttctattcc tagtatgcag gcaccatttt atggtatgac accaggcgcc   2400
tctgcaaatg ctctacctcc aaagccgtac gttccagcaa ccaccactag tgctcctgtt   2460
catacagaag gtaaatatgc gccaccaagc caaccttcga tggcgtcacc ttttgttaac   2520
aaaacaaata gctcgaccag attgaattct tttgctcctc cgcctaaccc atatgccact   2580
gcaacagttc ctgcaacgaa cgtatctaca acgtcgattc cgcaaaacac ttttgctcct   2640
atacaacctg gtatgcctat tatgggcgac tataatgctc aatctagctc tattccttca   2700
caacctccaa ttaatgctgt atcgggtcaa acgccacatc tcaaccgtaa agccaatgat   2760
ggttggaatg atttgccttt gaaggtcaaa gaaaaaccat ctcgtgccaa ggctgtatct   2820
gttgcccctc caaatatcct atcgacacca actccattaa atggtatccc tgcaaatgct   2880
gctagtacca tgcctccgcc acctctttcc agagctccct cttctgtgtc aatggtatca   2940
ccacctcctc tacacaaaaa ttctagagtc ccatccttgg ttgcaacttc tgagtcacca   3000
agggcatcca tatcaaatcc atacgctcct cctcaatcat cacaacaatt cccaataggt   3060
actatttcta cagcaaacca aacgtcaaac accgctcagg tagcttcatc gaacccctat   3120
gctccaccac cacaacaaag agtagcaacc ccattatctg gaggcgtgcc tccagctccg   3180
ttgccaaagg cctctaatcc atatgctcca actgcaacca ctcaacccaa cggttcctcc   3240
tatcctccaa ccggtccgta tactaataac cataccatga cctctcctcc tcccgttttt   3300
aacaaacctc ccactggccc ccctccgatt agcatgaaga agagaagcaa caagttagct   3360
agtatagaac aaaacccatc tcaaggtgct acttatcctc caaccctttc cagctcggcc   3420
tctccattgc agccttctca accgccaact ttggcttctc aggttaatac ctccgctgag   3480
aatgtcagtc atgaaattcc agctgatcaa caacccattg tcgacttctt gaaagaagaa   3540
ctggctcgcg taacaccatt gaccccaaag gagtactcca aacaattaaa ggattgtgat   3600
aaacgattaa agattctttt ctaccatttg gaaaagcagg atttattaac ccaaccaaca   3660
atcgattgtt tacatgacct cgtcgcatta atgaaggaaa agaaatacaa agaagctatg   3720
gtcatccatg ctaatatcgc tacaaaccat gctcaagagg gtggtaactg gctgacagga   3780
gtgaagaggt tgattggcat agctgaagcg actttgaatt aa                      3822
<210>  40
<211>  1929
<212>  DNA
<213>  Saccharomyces cerevisiae
<400>  40
atgtcaaaag ctgttggtat tgatttaggt acaacctatt catgtgttgc tcattttgca     60
aacgataggg ttgaaattat cgctaacgat caaggtaata gaacgacgcc ttcttatgtg    120
gcttttactg acacagaaag gctaattggt gacgctgcga agaatcaagc tgcgatgaac    180
ccacataata cagtattcga tgctaagcgt ctgatcggac gtaaattcga tgatccagaa    240
gtgacgaacg atgctaagca ttacccattc aaagtgattg acaagggagg taaaccggta    300
gtgcaagtgg aatataaagg cgagacaaag acatttactc cagaagaaat ttcctcaatg    360
atcttgacaa agatgaagga gactgctgag aactttttag gaacagaagt gaaagatgct    420
gtagtaacgg ttccagccta tttcaacgat tcacaaaggc aagcaacaaa agatgccggt    480
acaatcgcgg gcttgaacgt tcttcgtatc attaatgaac ctacagctgc cgctattgcg    540
tatgggctgg acaagaaatc gcagaaggag cacaacgtct tgatctttga tttaggtggt    600
ggtacttttg atgtctctct gctatccata gatgaaggtg tctttgaggt taaggctact    660
gctggtgaca ctcacttggg tggtgaagat ttcgatagta ggctggttaa ctttctagcc    720
gaggagttca aaagaaaaaa taaaaaggat ctaacaacta accaaaggtc cctaaggagg    780
ttaaggaccg ccgctgaaag ggccaagaga actctgtctt cgtctgctca gacatctata    840
gaaatagatt cattatttga gggtatcgat ttctatactt ccattacaag ggcaagattt    900
gaagaattat gtgctgattt gtttagatct acattggagc cagtggaaaa agttttggct    960
gattcaaaat tagataagtc acaaattgat gaaattgtac ttgttggtgg ttcaacaaga   1020
attccaaaag tacaaaaact ggtttctgat tttttcaatg gtaaagaacc aaaccgttcg   1080
attaaccctg atgaggccgt cgcttatggt gctgccgtac aggctgccat cttaacgggt   1140
gaccagtcgt cgacgaccca agatttactg ttgctggatg ttgcaccatt atctctaggt   1200
attgaaactg caggtggtat tatgacaaag ttgatcccaa gaaattcgac tatcccaaca   1260
aaaaaatcgg aagtgttttc cacctacgct gacaaccaac ctggtgtgtt gatacaagtt   1320
tttgagggtg aaaggacaag gacaaaagac aacaatctac tgggtaaatt tgagttgagc   1380
ggtattccac ccgctccaag aggcgtacca caaattgaag ttacatttga tatcgatgca   1440
aatggtattc tgaacgtatc tgccgttgaa aaaggtactg gtaaatctaa caagattaca   1500
attactaacg ataagggaag attatcgaag gaagatatcg ataaaatggt tgctgaggca   1560
gaaaagttca aggccgaaga tgaacaagaa gctcaacgtg ttcaagctaa gaatcagcta   1620
gaatcgtacg cgtttacttt gaaaaattct gtgagcgaaa ataacttcaa ggagaaggtg   1680
ggtgaagagg atgccaggaa attggaagcc gccgcccaag atgctataaa ttggttagat   1740
gcttcgcaag cggcctccac cgaggaatac aaggaaaggc aaaaggaact agaaggtgtt   1800
gcaaacccca ttatgagtaa attttacgga gctgcaggtg gtgccccagg agcaggccca   1860
gttccgggtg ctggagcagg ccccactgga gcaccagaca acggcccaac ggttgaagag   1920
gttgattag                                                           1929
<210>  41
<211>  2082
<212>  DNA
<213>  Saccharomyces cerevisiae
<400>  41
atgagtactc catttggttt agatttaggt aacaataact ctgtccttgc cgttgctaga     60
aacagaggta tcgacattgt cgttaatgaa gtctctaacc gttccacccc atctgttgtt    120
ggttttggtc caaagaacag atacttgggt gaaactggta agaacaagca gacttccaac    180
atcaagaaca ctgtcgccaa cttgaaaaga attattggtt tggattacca ccatccagat    240
ttcgagcaag aatctaagca cttcacctct aagttggttg aattggatga caagaagact    300
ggtgccgaag ttagattcgc tggtgagaaa catgtttttt cagctactca actagctgcc    360
atgttcatcg acaaagtcaa ggacaccgtc aagcaggaca caaaggcaaa tattaccgat    420
gtttgtattg ctgtcccacc ttggtacacc gaagaacaac gttacaacat tgctgatgct    480
gctagaattg ctggtttgaa ccctgttaga attgtcaacg acgttactgc tgccggtgtt    540
tcttacggta tcttcaagac tgatttgcct gaaggcgaag aaaagccaag aattgttgcc    600
tttgttgata ttggtcactc ttcctacacc tgttctatca tggccttcaa gaagggtcaa    660
ttgaaagtct taggaactgc ctgcgacaag cattttggtg gtagggactt cgatttggct    720
ataacagaac atttcgccga tgagttcaaa actaaataca agattgacat cagagaaaat    780
ccaaaggctt acaacagaat tctaactgct gctgaaaagt tgaagaaagt tttgtctgct    840
aatactaatg ccccattctc tgttgaatcc gtcatgaacg acgttgatgt ttcctctcaa    900
ttatctcgtg aagaattaga agaattggtc aagccattgt tggaacgtgt tactgaacca    960
gttaccaaag ctttagctca agccaaatta tctgctgaag aagttgattt tgttgaaatt   1020
attggtggta ctactcgtat cccaacattg aaacaatcca tttctgaagc cttcggcaag   1080
ccattgtcca ccactttgaa ccaagatgaa gccatcgcca agggtgccgc ctttatttgc   1140
gccattcact ctccaactct aagagttaga ccattcaagt ttgaggatat ccatccttac   1200
tctgtctctt actcttggga caagcaagtt gaggacgaag accacatgga agttttccca   1260
gctggttcat ccttcccatc tactaaattg atcactttga accgtacggg tgacttttca   1320
atggctgcta gctacactga catcacacag ttaccaccaa acactccaga acaaatcgct   1380
aactgggaga tcactggtgt tcaattacca gaaggtcaag actctgttcc tgttaagtta   1440
aagttgagat gcgacccctc tggtttacac acaattgaag aggcttacac tattgaagat   1500
attgaagttg aagaacctat tccattacca gaagatgctc cagaagatgc tgagcaagaa   1560
tttaagaagg ttactaaaac tgtaaagaag gatgacttaa ccatcgttgc acacaccttt   1620
ggcctagacg ctaaaaagtt gaatgaatta attgaaaaag aaaatgaaat gcttgctcaa   1680
gataagctag ttgctgagac agaagaccgt aagaacactc ttgaagagta catctacaca   1740
ttgcgtggta agttggaaga agagtatgct ccatttgctt ccgatgctga aaagacgaag   1800
ttacaaggta tgttaaacaa ggccgaagag tggttatacg atgaaggttt cgattccatc   1860
aaagctaagt acattgccaa atacgaagaa ttggcttctc taggtaacat tattagaggt   1920
agatacttgg ctaaagaaga agaaaagaag caagctataa gatctaagca agaagcatcc   1980
caaatggctg ctatggctga aaagttggct gctcaaagaa aggcagaagc tgaaaagaag   2040
gaagaaaaga aggacactga aggtgatgtt gacatggact aa                      2082
<210>  42
<211>  777
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<400>  42
atgtcaagag aagattctgt ttatttagca aaactagctg agcaagctga gcgttatgag     60
gagatggtcg agaacatgaa gaccgtcgcc tcttccggct tagagttgtc tgtcgaagag    120
agaaacttgc tttctgttgc atacaaaaac gtaattggag ctagaagagc ttcttggaga    180
atcgtctcct caattgaaca gaaagaggaa gccaagggta accaatcaca agtgtctttg    240
atcagagaat accgctccaa gattgagacc gaattggcca acatttgtga ggatattttg    300
tctgttttga gtgagcacct tattccttct gccagaactg gcgaatccaa ggtcttctac    360
tttaagatga agggtgatta ccaccgttat ttggccgaat tcgctgttgg tgacaagcga    420
aaggaagctg ctaatttgtc attggaggct tacaagtctg cctctgacgt tgctgttacg    480
gagctacctc caactcatcc aattagattg ggtctggctc tgaatttctc agtcttctac    540
tacgagattc taaactctcc tgaccgcgcc tgtcatttag ccaagcaagc tttcgacgat    600
gctattgctg agttagaaac cctatctgaa gaatcttaca aagactccac tttgattatg    660
caactgctgc gtgacaactt gactttgtgg acctcagaca tgtctgaaac tggacaagaa    720
gagtcatcca atagccaaga taagacagaa gctgctccca aagatgaaga gtgaata       777
<210>  43
<211>  1500
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<400>  43
atggctagaa agacattggc tgaaacattg gcagaattgt ctcaaccagc gtctggagat     60
tttgatatag aagaccaaga aggaggagca gtacttgact atggagataa tagttctttt    120
ggctccgaga gtgaagagga taaaagtaac cactatgtta aagttggcaa gtcaaggata    180
agagagaacg cagttaaatt gggaggacaa tacgagggaa aaaagagtag tagagccgat    240
gtttttggag acgaggacga tgaggaggag gacgatgagg atgttgaaca ttcggaaact    300
gaagatgcac tttcggtttc aggatcagag tccgaatcgg atgaaaaaaa tagtgatcaa    360
agccaaggtg attctgagag tgaagaagaa tctaactcag gtgaagatct agactacaag    420
agatcaaaac tacagcaact tataagctcc gaaaggaaaa ccattgtaaa ccaattatca    480
acttccaata aacaagatgc actgaaaggg tttgcagtgt tgaatcagca gatacagtat    540
gatcaattgg ttgacctcag aataaaatta cagaaaggat tagtagcatc gaatggtcta    600
cccattaaca aagaatatta cgaacagaat aaagcaccaa agtcttccaa acacctggat    660
aagctacaag ataaactata caatttattg gatgtcactt tagaactgag aggcaagcta    720
ttaaacaaaa gcaagattgt gagccaagag tttcccccta ttccaagtaa gaaacgtagt    780
ttacagcatt atttggagga atcttccaag ttggataaca tagttaatga atatagaagg    840
aacgtcctcg ttaaatggtc tcaaaaagtc caaaatgctt ccggagcaac tgctttgagc    900
tcatccaaat tcaaggctat taaccaagat agttcgactc aagtggacaa ctatttggca    960
gacatggata gattaatcaa aagaaccaga ctcaacagaa gaagcgtagt gccattagga   1020
tacaccgaga cagaagaagt agtagatgat gatgaattga tcgacaacga taaagataac   1080
aatgagacca aatacttcag caacattgac cgatctttga aggaaaacaa atatatctat   1140
gatgatgacg atttctatag agttcttctg aacgatctag tcgataagaa agtttctgat   1200
acacagaagc tgacatctac atcaactgtt attacatttt cgaaatccaa attgcataaa   1260
agttatgaaa gaaaagcgac taagggtcgt aagctgaggt atacagttca agatccatta   1320
ttgaattttg aagcctccaa cccacatgcc tacaagtgga acgactacca aattgacgag   1380
ttttttgcgt cattatttgg gcaaaaggtc aacatgaacg aggatgagca taacgaagag   1440
gtacaaggtg aatcagaagg agaggacatt ttgaaggatg atatcaaact gtttggataa   1500
<210>  44
<211>  2351
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<400>  44
atggactttg tatatgagta ctcagatgct acccctagtg gcacatttga tgacccattg     60
cctgcagagc ccgaaccacc attcaatttg tcaaacttaa actcgtacaa agatgatttg    120
actaaaaaat tctccaaaat gagcattctg aaaagtctga aaaatgacac caattcagtt    180
gacgatgtcg acgactcaca atcgatctcc aatgacgggc agagggctta taaatacgcc    240
aatcagtctc tggatctggt taaccagcac accactaata aatcaatcag aaccaccagc    300
gatgaacaac cttcggtgtc cactgttttg agcaacagac tgagcagagt gctcaataat    360
actaattacg acccttcaac caaggaacta ctctccattg tggagaagaa aataaaagaa    420
gatacggcgc atgaatacga caaagttact gacccaagtt ttgttggaaa ccttgctaga    480
agaaagttgc gtaacgacat tgaacatgat gttgtagatg ccaacttcaa tttcttgaaa    540
caattgcaac ccttaagaaa gaccttgggc cagattgaaa gtgacttgaa tgaaatgaac    600
gagctcaaca atcaaatcac tgaaaagttg tcctctagag ttgaagatac cactaggttg    660
gataattcca tacacgagtt gcatgcaact tccaagatta tttccatcaa aaagaagctt    720
ttgcagaatt tccagaaccg ctatactctc tcccatttcg aagcacatca attagagttt    780
ggtgaaattg acgattcctt tctagaaata ctgaaaaaag ctgagtcaat tcatgatgat    840
tgttcaattt tgttaaccat ggagaatgct actgtgggta ttaatattat gaacgacatg    900
aaaaagcttt ccaataatgc catcgacaga ttgtcgacat ttgtcaccaa acatttttct    960
aggttaagtt cgtccaacaa tacctccgcc tccatagagg ataaggcatt cctgaaaaga   1020
tctatactct tcatttccga aagatacccg gagcagctct ctggaatcac caaccaaata   1080
gtcgaatcaa ggtcaaagtc tttgcttgac gagttccaaa tacaattgaa tggttatgca   1140
gattcagcat caagaaacga aagggatgtt aataaaccat tgttcctttc cgcatatgat   1200
tcagaaaggt ttctcggaga tttacttgct tatattcatg gcacaattgt taatgaaaga   1260
gaaaccgtcg aaagcttgtt cagtttgcaa gatgaggaga aagataatat cgttttgaca   1320
acactcgtag agtcaattgt ttcaaagaac atcgaatctc tagctacccc cctgaattta   1380
aagattgaac agatcatcag aaatgagtct aagctgacag cgatccaagc tttttatgac   1440
ctgctctcac tttattccat gatgcttgaa aaaactttag gttctaagaa tgcccttttg   1500
agtacaatca actctttaaa agtttcggct ttgggtaaga ttcaaagttc aatcaacatt   1560
aaacttaaaa acatagagcg gactgccaat gagagcatgt catattataa tgaagatgaa   1620
caactagatg gtacaaacca caactttgtt tcagaaactc attacattga agaaatcaca   1680
cctgagctag ctgtgcctga ttggttgatc aatttctatg gtgacgtact tcccatcttt   1740
gataatgaaa aggtgacaaa tgccaaagaa ctgtatgagg atttactcaa atactgtttt   1800
gaacaaatca ttcaacttat cgagaaacaa atagctcaga ataaattgaa tgatgctaga   1860
gagatattga ttttcaaatc aaactgttac gattttgttt attccaaaat tgtgaccctg   1920
aacatcttta aggagaaact ggatcgatta gaggtaatga taaaggaatg cgaatcaaaa   1980
ttgaccgaaa ttcagtacac ttatcttctc aaacaatcag ggttatatga tattcacaac   2040
cttgtcaaca tgatatcctc aactagggaa gatttctttg acgtctccgt ttatgaacca   2100
attacggaga actcactatt caatggtgac aaattcaaag aaatatcaga tcgccttcaa   2160
gattttcttc caattgcatt aattgattac caagaggagc gattgttgta tctattacct   2220
cccacgcttg ttaactctat cattcaaaac tcctctgtgg attttgtcaa cttttatttc   2280
aaattatcgt tgatcgtgaa ggaatatttg aaagccagtg aaggatgtct cagatgggat   2340
gacatggagg t                                                        2351
<210>  45
<211>  1443
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<222>  (1)..(546)
<223>  partial nucleotide sequence from the 5エ-end of COY1
<220>
<221>  misc＿feature
<222>  (547)..(1443)
<223>  partial nucleotide sequence from the 3エ-end of COY1
<400>  45
aaaagttaag taatgagttg gttagctaca gatcgataac aagaggacat ggttaattca     60
attcaggaac tggaagagaa gcttgcgttt tctcaaaagc aagtagagca gttacagcag    120
ttaaaccagg atttggagaa ggagactagt gtggaaaaat gggatgcaat ttcaatgatt    180
tctgccaggc cggacacttc aatacaggac aattcgttga ttacaatggt atcacaacaa    240
agagatcgat ttaagcaaag gaacaaagat cttgaaaaag acgttagatt acaattgaac    300
aaaatttctg agcttcaaag aaaggtccaa tcactttctt cagacaataa tcaattatac    360
gagagaatca ggtttttgtc atcctatgac agtaataaga atcagtccaa ggagagccag    420
tcggaagagt actacaagag aagttacgaa gacaaattgc atccgataga acaatttagc    480
atattgcatc agcctgcact taattgtgat gtcaatgacg atgtatgtga tgaatatcca    540
taatgaaatt cataccgttg tcacgtaatc gcgggggtag tgtgcatcgc atcgtattgg    600
agacatctgt ctgttttctt ccctcacatc gaaatacaac ttcaccatga ctgacgctga    660
cttccaagta gtatttgaag cgtggcaagc tgtcgatcta cagggtgtta agaagcttgt    720
agatgatgag gcaaaagaga ttgaaagttc gaagtcttca agtttggatc aaagaaagca    780
gttgagtttt aagacgaagg agttcaagaa attggacgat gagcgtaaat tgacacaatg    840
gaggtcgttg ttgaaggagt atcaaaacta cattgatgat ttgaccaagg gaaataatcg    900
tgttgtacag acattcttgg aattgcataa agtagtggtg gatttgaagg atcctacaag    960
tactttgagc aaggagcaag agacgaatac cgaattacag aaagctgtga aaaaactttc   1020
cacagaactg aggcattcag aacaacactg ggcttccgag aagaaaggat tggaagaaaa   1080
atttaacgta cgtaaaaggg aaacggaaga gaaaagtctt gatcagatta agacagccca   1140
aactgaaata gtccaattga gggatgagct gaagcaaaaa tcttcagaaa atgaagagct   1200
tcaagtggtg attgaaaccc ttgatgccaa gctaaaaaag aacagccaag gacaaaataa   1260
tgatgataca tactccaatt atgacatgtt aaatagagat ttggagtcca ataaactaaa   1320
gatccttgaa ttggaaaggt tgaacaactc tctaaaggag gaattagcaa agaaagatga   1380
caaagcctac caggagaggg tcaccgaact cgaaaaggag agtgtggagt atctctctta   1440
aag                                                                 1443
<210>  46
<211>  473
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<400>  46
gtcctgttta tgctccattc tttggatcca ttggttgtgc tgcggccatc atctttacct     60
gttttggtgc cgcctatggt actgctaagt cgggtgtagg tatttgtgcc acctgtgtct    120
tgcgtccaga cttactgatc aagaatacag tgcctgttat tatggctggt atcattgcta    180
tttatgggtt ggtggtgtct gtgttgatct cttcatcgtt gcaacagaag caggctttgt    240
atactggctt tatccaattg ggtgccggtt tatcagttgg tctgtcaggt ctggctgctg    300
gttttgccat cggaattgtt ggtgatgctg gtgtcagagg tactgctcaa cagccaagac    360
ttttcgtcgg tatgattctg attttgattt ttgctgaagt tttgggtctt tacggtctga    420
ttgttgctct tctactgaac tctagagctt cccaagatgt cacttgttaa agc           473
<210>  47
<211>  3466
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<400>  47
atgttctcaa aactttccca gttatcccag aatttaggcg aagagctctc taggattaat     60
gaggaggttg ctgcctctag aaggaaccaa ctaaagaaaa gcagggattc ggagagggat    120
acaaagttcc ttaacatcaa aactcccgat cctgaagctc tacaacaacc gggtcatgag    180
gtgaatgaag gcgctgaaac cgaaacagat gctactgagt caaagggcca agtggttcca    240
aacacaaata tacacttcaa tgatctgcct atggagatta gggcccgctt gaaaaagttt    300
gcgaaatatg agcagaaata tccgttgttg ttggacgctt acaaaactga gaaggccaaa    360
tctgaaatag ttcatgcttt tgaatcaact ttacaagaag tcactccttt gcagacaatt    420
ggagaaattg aacaattcaa agactttatc agcaatatga cccaaaaggc taaattaatg    480
gatgaagaat tgagagccaa aactggcgag ttgaatggcc taaaaaacga agtgacagaa    540
atgaaagaga aattgaaggc tgttcaaggt gagatgaaag ccaagtctgc tttagcagaa    600
gaatctgcga tgaaagccga tcaacttagt gtggatcttg aacgagttgt gagtgagcta    660
gaaaatttga aaaaggaaag ggaagagatt gttacggagc gtgatgaggc aaccaaggaa    720
cgtgacgagt caacaagaga aagagatatc attctagaag aagtcaaatc taataaaaat    780
caagaacttt tggaggaata caagtctgag ttagaagaag caaagaacgc tcttgcattg    840
agaactgagg agattgaaaa tctaaacttg aagttggagt ctgaaaagtc ggcaaagtta    900
tcattagagg gtgtagcaga tgagcgagat ggccttaaag caaagttaga agcgcaaaca    960
acttccttcc aggaagaatt agaccaactt tctcaagaac gggatcgttt gaattctcaa   1020
ctaacaatag gagaaaagtc acagatagaa attgagcaag aaaaaaatga gctcaagagt   1080
cagtacaatt ctgagattaa gtcatcgctt agtaaactgg aatccgtaat taaagaaaga   1140
aatgagctac aacagcaatt ggaatctcaa gagtctttaa ctttcgaagt ggataagctc   1200
tctaaagaga gagatgagct aaggatgcag ttggatagag aaaaagaaaa ttctgcaaag   1260
gctagcatca cgccccagaa ctttgaggtt aaaactaaag ttgaatccaa caagaacatt   1320
gaagcacctt tatctgaaga actcaggcaa gtcaccagag aaagagatga gctaaaagct   1380
cagttgttgc tcattcaaaa gaacccagga ccaagtaaga agaccaatga aggaaaccgt   1440
aacttagagc ggaacggtga aaaaaagtcc catgaccaaa atggtgctga cgatgatctt   1500
atcgaacgga agggtgaaag cggtacagat gattcaaagg ataatcagct gaaactaata   1560
gagcagtcaa ccactattac gatgttgaat gaagagattg aaaacttgaa agatatgctg   1620
cgtgacgtcg gagacgatct tgtagtggct aaagacaagc tttcacaggt ctctgctgtt   1680
gatgaaaaaa aacagcacgc tcttgaaagg gaactggaat cctcaaagtt gaagcttgct   1740
gagattgaaa aggattacaa cgacgataga gttgacctca agaatgaatt gaaactcgtt   1800
accgaggaaa aggaaaatct tgaacatgag aatgaaacat tgagtcaaag cttgaccgag   1860
cttgaaaagc tgaaacaaga agtcaaggag aaagctcaag ccgttcagaa ttatgaatct   1920
aagtattcga cactatcgga tgaattatct ttagtcctct ccaaacgaga tgaattggaa   1980
aaagacaagg aaagtttcag gctgaaattg aaagatttgg aacagaaaaa ttccgagact   2040
gaacaacaag aggaatcgca gagaactgga actgcagaaa tggaagagga gttgcagact   2100
ttgaaaaggg agctagaagc aagctcccag cgcattgagg attataagca aaagcaacta   2160
gaactagatg atgaaatatc tcttgtacgt tctcaaaaag atgaattaca gaaaacgata   2220
actagcctgc aagaagacct ggggaaagag aaagagaatg ttaagttact ccgtgaaaat   2280
atcattgccg aagaaaaagc caaaaattcc caaaaactgg cagaaaatgt ggcgcagcta   2340
gacaaattca aaaagcagga gatatcactc aagcttgaga ttgcaaacct tgaaaatcta   2400
aatgctgaaa aaggctcaaa gatcaaaagt ttggaagagc atatcactta tcttaataca   2460
gagaggcaat ctaattatga tgagaatcag aaactgatct cccatactaa tgagaaatgg   2520
aagcaggatt acacggagtt agtcataaaa ttgaacaagt gtcagtcaga gaacaataga   2580
cttacaaaag aattgaacga atacaaagat aaactaaaag atatgaacac ctcaaagctg   2640
aacagtagcg agacaatcga gtcaatcaga agacaatgcg aagaacttaa aatgatgaat   2700
aatgaatatt ctttgaagat tgaaagtcta catgaagaac taagttcttc gagttcaatt   2760
ttacaggaac gttccagaga aatgaatact atacgtaaac tgctagctga tactgagtcc   2820
aaatgtgacg aaagaatcaa acagttaaaa gcaagaattg ataggttaga agaagaaaag   2880
gagacgacta gccatgaaag ctctgtccag gcaagaaagc tgagtaaaac aatcgaccag   2940
ttaaagaaag gcaagaatga attgtcagtg cagctagaac aatgtaagct agagctggaa   3000
catctgaaat ccgtcccatc tagagtggat gttgacaata aaaacggtgc ttcaaatgaa   3060
aacagtgatg aaaaccaatc tgatattgaa tctggaatta tcgaacagct cagaaactcg   3120
ctaaagggat atgaagaaca actaaaacaa taccaagatt ccaacgtctt actcaagaag   3180
gttaacgaag agcagttgct gaagttcgag agactgcatt caaatttcaa gattgtatct   3240
aaacaatata gaatgctgaa agatcaaaag gacgaagtca atacgagaag tagaaacaat   3300
tcagttataa gttcaacgag cgcggggagt gatgaaaatg agagagataa agttgcctat   3360
attaagaacg tccttctagg atttttggaa cacaaagatc aacgagctat gctttttcct   3420
gtagtgaaga tgctacttat gctggacgat gatgaagaga gaaggt                  3466
<210>  48
<211>  3324
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<400>  48
atggatagag aacagggtat tctgccacag gatcccttct ccaactcggt gcatgtacca     60
aagttgagag cttcttctgg tggccagcca cagaagcctg taatacaaaa ttctgctcct    120
gctactgcta ggatgcttcg caatgcaagt tcaagtacgt cagcagcttt gttgaaagaa    180
ttaaacacac atgaacactc tcaacgtcaa catactccac agaaacaacc atcattggat    240
gccccggcag cattggttcc agttgaatct gccacaaaac aattccaccg aacctccatt    300
ggagactggg aatttagtaa tacaattggg gcaggctcga tgggtaaggt caaagtcgcc    360
aaacatagag tcactcacga ggtatgtgcc atcaaaatag tcattaggtc agccaaaatc    420
tggcagagaa atcaccaaaa cgatccagaa cctgaaactg aagaaaaaag aaagaagctg    480
cgtgatgaat acaagaagga attggaacgc gatgaacgta ctgtcagaga ggcagcacta    540
ggaaaaataa tgtaccaccc aaatatttgt cggttgttcg aatgctatac aatgtctaat    600
cactactaca tgctttttga aatagtccag ggggtacagt tactggatta tattgtttct    660
catggcaaat tgaaggaaac acgcgttcgc cagtttgcca gaagcattgc ttctgcttta    720
gattactgcc attctaataa catcgttcac agagatctga aaattgaaaa cataatgatt    780
aacaaacagg gtgaaatcaa gttgattgac tttggccttt ccaacatgta tgatagaaga    840
aatctcctga aaaccttttg cggctcccta tactttgcag caccggagct tttgtcttgc    900
cgtccttaca ttggtcctga aattgatgtc tggtcttttg gggttgtatt atttgtcctt    960
gtttccggta aggttccctt tgatgacgac agcgtgccaa agcttcatgc taaaatcaaa   1020
agaggaaaag ttgagtatcc tgagtttatt tcacctttat gtcattcatt gctatctcag   1080
atgttagtcg ttaatccaga tcatagagtc actttgaaag ctgcaatgga gcacccttgg   1140
atgaccttag gatttgcagg gcctccatca aactatctcc ctcagcggtc acctattgta   1200
ttaccgttgg atttaagtgt agtaagagag attgcaaatc tgggtttagg aaatgaagaa   1260
caaattgctc gagatatcac aaacctgatc tcgagcagag aatatgaagc gtgtgttgag   1320
aggtggaaac ttgatcaaca gaaagctaat atcaagggct attccgcgcg tgacgattct   1380
gctatcatcg ccttccaccc gttactttca acgtactacc tcgtggatga aatgaggaag   1440
aggaagctag caaaaggtgc tctcaaggga cagacctcgg tattagacac tgtcaaggtg   1500
tctccagaca ttccaaagac accagctatt ccccagaaac tagaaactac ggatgtggaa   1560
cagccattgc ttgccactgt cccacctgct tatacatctc cgcatggaca gccagctgaa   1620
ctggaagcga tgattgaacc ggcacagcca ttatctagtg ctcatccttt cgagatggat   1680
atgacgcagc aacaacatgc tagcagaaag acccatatca agcatgctcc agaacgacaa   1740
gatcgtggcg gctataatgt acacaagaat aactctggtg gtcttaactc tttattccga   1800
agactcagtg gaaaacgacc ccataagaat gaggctgaat gggagccttc atctccccca   1860
cctcaagttc atccattttc agttaatgat gcggacagga cttcagtacg tggcgtttca   1920
ccaattactc aaccagctgc tgtgaagaat gtgacctcca ataactccaa aaactacctg   1980
gaccctgttg atgatagtaa attagttcgt cgtgtaggaa gtttgagaat taccaacaaa   2040
gaaaagcaac aagtgacatc tgactttccc cgactgccca attttacgat tccagagcaa   2100
ccgcctaaga atgctcccat accgatacat gcccaaccta ccactacagg tacaaccttt   2160
caatccaatg atcatgaaat caaaaagaag ttacaggctt cgactagtcc aaacgaacaa   2220
cgtgggcctc caacattggc tcctagtcaa cagagacggc tacatcccac tgcgagagcc   2280
aagtcacttg gccattctcg caagcaatcg cttaatttca aattcggagg accagcaaac   2340
aatcaattac ctgcgttgcc tactaaagaa aattatgatg tgtttgaaga tgcccaaatt   2400
accgataaca atttattaaa cccagaaggg aaatactctg ctaatactaa cgtgcatatc   2460
aaaccaatga cagaatccca aattttattt gaggcagaac atgctccacc tggaactatg   2520
ccctcagttg agtaccccag gaccttgttt ctcaaaggat ttttctctgt tcagactaca   2580
tcctcgaagc cgttacctgt tattcgatac aacattatag cagctctctg caaacttaac   2640
attcaattca ctgaagttaa cggtgggttt gtttgcgttt acagaaaaac tgaaaattta   2700
caaattgggg atatcagatc tccagttata gagtcaagag tgaccgatga cactgactcc   2760
gatgttgcaa actcttccaa attgtcatct tcgtcaacag ccaataccag agtcaatgtt   2820
attgaggatg atagttcatc gccgtcctca gcaagattga aacatcgccg aaagttttct   2880
cttggaaacg gaatccttaa ccatataagg aaacccacgc ttgacgggac agaatttgat   2940
gactacgatg caaccgtaaa tacccctgtt actcctgcac ctgcaaatgt tcattctcgt   3000
tcatcgtctt atcataccga gagtgataat gagtccatgg agtcgctgca tgatataaga   3060
ggtggcagtg atatgatctt gaaaaatgtt ccagaaagaa atgctagaca gatagacaca   3120
gtcaaggaag aggaaacaga tgatgatgat cttggtagta tcaacgaagg atcaacacac   3180
cgtacacctt tgaaatttga aattcatatt gtcaaagtcc ctctggttgg actatatggt   3240
gtgaggttca agaaaattct gggaaatgct tggatttaca aaaggttggc gtcaaagctg   3300
ctacaagaat tgaatttata gttc                                          3324
<210>  49
<211>  3086
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<222>  (1)..(2215)
<223>  partial nucleotide sequence from the 5エ-end of SEC31
<220>
<221>  misc＿feature
<222>  (2216)..(3086)
<223>  partial nucleotide sequence from the 3エ-end of SEC31
<400>  49
atggtgaaaa taagtgaaat aaaaagtact tcaacatttg catggtcgtc tgtagactct     60
aatgtcttgg ctacagggac cttggctggg gctgttgacg actcattctc taccacttcg    120
tcattggaac tttgggatgt cctgaacacc tcagctccca tattccgaac caatgttggt    180
gcaagatttc atgatcttgc gtggagtaat ccaatctcta agtaccagag aggactactt    240
gcaggtgctt ttgataatgg aacaattcaa ttgtgggatt cctcatcatt gctgaatgga    300
tcatctgaca gtttaataga gctaaagaaa cacactgcgc ctgttaaaac aatatctttc    360
aatcctacag agtcacagat atttgcatct ggtgcttcca atggccaatt attcatttgg    420
gatataaatc atctttcaga gcctatttca ccgggtgctt ctactacccc tattaatgac    480
ataaactcca ttgcttggaa ctccaagata cgtcatattt tggcctctgc tggaacctca    540
ggctacgcat ccatttggga tttaaagacc aagaaagaac tattgaactt gagttacact    600
gctccatcag gtcaaagagc taacttaagc accgttgcat ggcatcctac taattcgaca    660
agtgtaataa cagcttctga ttcggacgct gtaccattga taatgacttg ggatttaagg    720
aatactaatg tacctgtagc tactcttgaa ggtcatcaaa agggtgtatt gtccctggat    780
tggtgttcgt gggactcaga actattactt tcttctggaa aggataactc taccctattg    840
tggaatccca tcagaggctc tttgttagcg gaatacccaa ccaccactaa ttgggccttc    900
aagacccgct tttcttccaa gcttcctgac atttttgcaa ccagttcatt tgatggtaag    960
ataacggtgc agaccttaca ggatactaca cctgcagagg ctcaacaagc aaaagctatc   1020
aacgatgacg aattctgggc agacctgtcc aacagcgata agaaacatcc taatttttta   1080
caacgtcaaa ctccggcctg gcttaaagtg ccttccagcg tttcatttgg atttggtgga   1140
aagattgtaa aagtttccaa ggcctctgat aaccagtcaa ttgttgtaat tgataatttc   1200
acaactaacg atacgctggc caagtccact tcccttcttg caagcaccat cagcacaaac   1260
gattaccaaa ctcttgtcga cgaaaaactt cgtaccgaag caaataacca cgactggcaa   1320
ttattgaacg atctattaaa agcggatgat gtgaaagatt atttcagatt tcagattgtg   1380
gatccttccg tattgaaaca tgacaagtct gaacaaaagg ttgaaaacgg acaagacata   1440
tttgaaaaca ttgagcaaac tgatgaagac tttttcaaca atcttgaaag ggaaaagaat   1500
tcagtttctg tcaacattcc atcatactct ccaactgctc tcagccaggg actaatccag   1560
gaggctctag tattggcttt aggtgcatct gaatcattac aggctaaagt taggaatgcc   1620
tattttaacc aaacgcaaaa gtcctctcta ccaagattga tttacagtgc tactgctaac   1680
gatgttaatg acctcgttgc taatggtact atctctggtt ggagggatat agcagctgct   1740
atttttgctt actctacgga gaaagaagag ttttcaaagt tcattgtgga actaggtgat   1800
aggctattag ccagttccct ttcagataga cgctctgatg ctctgctttg cttccttgct   1860
ggtggtgcgc tcaacaaggc gtctacaatt tggaatgccg agttgagttc tcgtgaagag   1920
gttctcaaat ctgaaaaccc tcagctctca tcttatgaag ctcataatat tgtgttgact   1980
gagtttgttg aaaaaattgc cgcattcaag tatgcattaa ggatcagcaa taagttcagt   2040
gggcagggcg ttaatacgtt gaacaattca ttcctagagt ttgcttcttt ggtgtcatct   2100
caagggcaat ttgatttggc cttgaactta ttggagaact tatctaccga ggatgaagac   2160
attaaacttg agataaagcg aatctcaaca gcatcaggaa aaactctttc cagtatcctc   2220
ccncgctcac ccctcccgnc cttcccctat cgcatttcca aaggtcttct cgtggaggct   2280
cattctccgt tccacctcct aatccatacg taggtagctc agtgaatggg aatggaggag   2340
tgcacggagg cgcaccagct atccctgttg ccaacaaccc ttatgctaac aacaatcaaa   2400
atgcatcata tggccaagca aacggtccac taaatggatt tgtacctccg ccaccaatgc   2460
ctgagaaaat gggaggactt tcctcacaga attaccccaa gagagcagca agtagagcaa   2520
atagcactgc tggatatgcg ccatcactaa gatcgcccag tgtgcaacaa tttcaaccac   2580
caccacctcc ggcactagct caacatgtgc aaccgccacc acctcctgaa ctagttcagc   2640
aggtacctcc acccgcgccg tctgtacaac accaagtatc acaaggatct caaggatctc   2700
aaggtgggcc ccctgcacaa caacagacca gatttcccag tggagataga tcacatataa   2760
gtgatgaggc tttccctatt tatgagtacc tgagtaagga gttggaaaat gttaagccta   2820
agattccaga aagatttacc aaacaactcg tagacgctga gaagagattg aatatcttgt   2880
ttgatcattt gaataacaat gagctgttaa ccgctcctac gattacactg ttgtctaatc   2940
tttcaaagtc tctagctgac catgacttta agactgctga atcgttactg attcaaatta   3000
ctaccattca taacaacgag gcaggaaact ggagcgttgg tgtgaaacgt cttatccaga   3060
tgtcctcggc tctgagtagc taagaa                                        3086
<210>  50
<211>  1974
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<400>  50
atgggtaaat caattggaat tgatttgggt accacatact cttgtgtggc acattttgct     60
aatgatcgtg ttgagatcat agctaacgac caaggtaaca ggacgactcc atcgttcgtc    120
gcctttaccg acactgaaag attgattggt gatgctgcaa agaaccaagc tgccatgaat    180
ccagctaaca ctgttttcga tgccaaacgt ttaatcggta gaaaattcga cgacccggaa    240
actcaggccg atattaagca cttccctttc aaagttatca acaagggggg aaagcctaat    300
atccaagtcg aatttaaggg tgagactaag gttttcagcc ccgaagagat ttcctccatg    360
gttctaacaa aaatgaagga tactgctgag cagtatttgg gtgagaaaat caacgatgca    420
gttgtcactg ttcctgctta cttcaatgac tctcaaagac aagccaccaa ggatgctggt    480
ttgattgctg gtttgaacgt tcaaagaatc attaatgagc ccaccgctgc cgcaattgct    540
tacgggttgg acaagaagga tgcaggccac ggtgagcaca acattctaat cttcgatcta    600
ggtggaggaa ctttcgatgt ttctctacta tctattgatg agggtatttt cgaagtcaag    660
gccaccgcag gtgacaccca cttgggtggt gaggacttcg ataacagatt agtcaaccac    720
tttatcgccg agttcaagag aaagaccaag aaagatcttt ctacaaacca gagatccctt    780
agaagactaa gaaccgcttg tgagcgtgca aagagaactt tgtcttcttc tgctcagacc    840
tccatcgaga ttgattcttt gttcgagggt atcgacttct acacctcgat cactagagct    900
agattcgagg agctctgtgc cgacttgttc agatccacca tcgagcctgt tgagagagtc    960
ttgaaagact ccaagttgga caaatctcaa gttcatgaga ttgttttggt tggtggttct   1020
accagaattc caaaggttca gaaattagtt tctgactttt tcaatggtaa ggagccaaac   1080
aagtccatca acccagacga agccgttgca tatggtgctg ctgtccaagc agctattttg   1140
tctggagata cttcttccaa gacacaagac ttgttattgc tggatgttgc tcctctatct   1200
ttgggtattg aaaccgctgg tggtatcatg accaagctga tcccaagaaa ctccacaatc   1260
ccagccaaaa agtcagaaat cttttcgaca tatgctgaca accaaccagg tgttttgatt   1320
caagtctttg aaggtgagag aactagaacc aaggacaaca acctgttggg taagtttgaa   1380
ctttctggta ttcctcctgc tccaagaggt gttcctcaaa ttgaggtcac cttcgatatg   1440
gatgccaacg gtattttgaa tgtatctgct gttgagaagg gtaccggtaa gactcaaaag   1500
attactatta ccaacgataa gggaagattg tccaaggaag acatcgagag aatggtttct   1560
gaagctgaaa aattcaagga tgaagacgag aaggaagccg agagagttgc tgccaagaat   1620
ggcttggaat catatgctta ctctctgaag aactctgcag ctgaatctgg attcaaggac   1680
aaggttggag aggatgatct tgccaagttg aacaagtcag ttgaagagac aatatcttgg   1740
ttagatgagt cacaatctgc ttccacagac gagtacaagg acaggcaaaa ggaattggaa   1800
gaagttgcta acccaataat gagcaagttc tatggagctg ctggtggagc tcctggtgga   1860
gctcctggtg gcttccctgg aggtttccct ggcggagctg gcgcagctgg cggtgcccca   1920
ggtggtgctg ccccaggcgg agacagcgga ccaaccgtgg aagaagtcga ttaa         1974
<210>  51
<211>  2124
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<400>  51
atgagtgttc catttggagt agatctaggt aacaacaaca ctgtgatcgg tgttgcccgt     60
aacagaggta ttgatattct tgtcaatgaa gtctctaatc gtcagacccc cagcattgtc    120
ggatttggcg ctaagtctag agccatcggg gaatcaggaa agacccaaca gaactctaac    180
ttgaagaata ccgttgaaca tttggtccgt attctcgggc ttcctgcaga ctctcctgac    240
tatgaaattg agaagaagtt cttcacttcg cccctgattg agaaggacaa tgagatcctg    300
tctgaagtta acttccaagg taagaagact accttcacac ccattcagct ggttgccatg    360
tacctgaaca agattaagaa cactgccata aaggaaacaa agggaaagtt cactgatatc    420
tgtcttgctg tccctgtttg gttcaccgag aaacagagaa gtgctgcttc cgatgcttgt    480
aaggttgctg gtctgaaccc agttagaatt gtcaacgaca tcacagctgc tgcagttgga    540
tatggtgtct tcaagactga cctaccagag gatgaaccca agaaggttgc aatcgttgat    600
ataggccact ctacctattc tgttttgatt gctgctttca agaaaggtga gctgaaagtg    660
ttaggatctg cttctgacaa gcatttcggt ggtcgtgatt tcgactatgc catcaccaag    720
cactttgcag aggagttcaa gagcaaatac aagattgata tcactcaaaa tcctaaggct    780
tggtctcgtg tttacactgc tgccgaaagg ttgaagaagg ttttgtccgc taacactaca    840
gctccattca atgttgaatc tgttatgaac gacgttgatg tttcttcttc gctgactaga    900
gaggagttag aaaagctggt gcaaccatta ttagaccgtg ctcatattcc cgttgagcgt    960
gctctggcca tggcaggtct caaggctgaa gatgtggaca ctgttgaggt tgtcggaggt   1020
tgtactcgtg ttccaacctt gaaagctact ctatctgaag tctttggaaa gcccttatct   1080
ttcactttaa accaagatga ggcaattgct cgtggtgcag ctttcatctg tgcaatgcac   1140
tcccctacac ttagagttcg tccattcaag tttgaggacg ttaaccctta ctctgtgtca   1200
tattattggg acaaagatcc tgccgctgag gacgatgacc acttagaggt cttcccagtg   1260
ggtggttctt tcccatcaac taaggtgatc acactttacc gttcacaaga tttcaacatt   1320
gaagcccgct acacggacaa gaatgcactt ccagctggca ctcaggagtt cattggcagg   1380
tggagcatca agggtgttgt tgtcaatgaa ggtgaagata ctatccagac taagattaag   1440
ctgagaaatg atccatctgg tttccatatc gtcgaatctg cttacacagt cgagaagaag   1500
actattcaag agccaatcga ggatccagaa gctgatgaag atgcagaacc tcagtacagg   1560
acagttgaga agctcgtcaa aaagaacgac ttggagatta ctggacagac actccaccta   1620
ccagatgagc tattaaactc ttatcttgag acagaggctg ccttagaggt ccaagacaaa   1680
cttgttgcag acaccgagga gcgcaagaac gctctggagg agtacattta cgagcttaga   1740
ggtaagttgg aagaccagta caaggagttt gctagcgaac aggaaaaaac caagcttaca   1800
gctaagctag agaaagctga ggaatggctt tacgacgaag gttatgattc tactaaagct   1860
aagtacattg ctaaatacga agagcttgcc tccattggaa atgttatccg aggtcgttat   1920
cttgccaaag aggaggagaa gaaacaagct atccgtgaaa aggaagaatc taagaaggct   1980
tctgctatcg ctgaaaagat ggctgccgag cgtgcttctc gtgaagctgc tggttctaca   2040
aatgaacaag cccagaagaa tgaagaaaac accaaagatg ccgacggtga tgtttctatg   2100
aaccaagatg agctagatta aact                                          2124
<210>  52
<211>  37
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer pBR322＿FOR＿NotI
<400>  52
aatagcggcc gcgcatctcg ggcagcgttg ggtcctg                              37
<210>  53
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer pBR322＿BACK＿NotI
<400>  53
gattgcggcc gcgacgtcag gtggcacttt tcggggaaat                           40
<210>  54
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer puc19ORI #1-SacI
<400>  54
gatcgagctc tgagcaaaag gccagcaaag                                      30
<210>  55
<211>  29
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer puc19ORI #2-SacI
<400>  55
gaaagagctc ccgtagaaaa gatcaaagg                                       29
<210>  56
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer ampR #1 Hind III
<400>  56
gccgaagctt acaataaccc tgataaatgc                                      30
<210>  57
<211>  29
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer ampR #2 Hind III
<400>  57
gccgaagctt aaatcaatct aaagtatat                                       29
<210>  58
<211>  42
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer cyc1TT＿neu＿FOR＿BamH1
<400>  58
caatggatcc ccttttcctt tgtcgatatc atgtaattag tt                        42
<210>  59
<211>  34
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer cyc1TT #2-Age I
<400>  59
gtggaccggt agcttgcaaa ttaaagcctt cgag                                 34
<210>  60
<211>  43
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer zeoR＿neu＿#1＿kpn1
<400>  60
gatcggtacc cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact cct                       43
<210>  61
<211>  62
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer TEF1＿back:＿#1
<400>  61
tactatgccg atgattaatt gtcaacaccg cccttagatt agattgctat gctttctttc     60
ta                                                                    62
<210>  62
<211>  81
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer TEF1＿back:＿#2＿Nco1
<400>  62
ttggccatgg tttagttcct caccttgtcg tattatacta tgccgatata ctatgccgat     60
gattaattgt caacaccgcc c                                               81
<210>  63
<211>  43
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Sh ble＿FOR＿#1＿Nco1
<400>  63
taaaccatgg ccaagttgac cagtgccgtt ccggtgctca ccg                       43
<210>  64
<211>  70
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Sh ble＿back＿#2＿aat1
<400>  64
tccgaggcct gggacccgtg ggccgccgtc ggacgtgtca gtcctgctcc tcggccacga     60
agtgcacgca                                                            70
<210>  65
<211>  62
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer cyc1TT＿FOR＿#1＿aat1
<400>  65
tcccaggcct cggagatccg tccccctttt cctttgtcga tatcatgtaa ttagttatgt     60
ca                                                                    62
<210>  66
<211>  45
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer cyc1TT＿neu＿back＿Kpn1
<400>  66
acatggtacc tgcaaattaa agccttcgag cgtcccaaaa ccttc                     45
<210>  67
<211>  29
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer kanR #1-Kpn I
<400>  67
ccgaggtacc gacatggagg cccagaata                                       29
<210>  68
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer kanR #2-Kpn I
<400>  68
ccgaggtacc agtatagcga ccagcattca                                      30
<210>  69
<211>  45
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer 5＿AOX TT #1 HindIII/NotI
<400>  69
gattaagctt gcggccgcag aggatgtcag aatgccattt gcctg                     45
<210>  70
<211>  48
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer 5＿AOX TT #2 AscI/BamHI
<400>  70
gattggatcc ggcgcgccga tactcgagaa ttatggctta atcaagtg                  48
<210>  71
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer 3＿AOX TT #3 BamHI
<400>  71
gattggatcc tatgattgga agtatgggaa tggtgatacc                           40
<210>  72
<211>  46
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer 3＿AOX TT #4 NotI/EcoR I
<400>  72
taaagaattc gcggccgcag caacgttgtc actgaagttg gcatca                    46
<210>  73
<211>  44
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer eGFP#1 Aar I/Sbf I
<400>  73
gatccacctg caggccatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttca                      44
<210>  74
<211>  46
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer eGFP#2 SfiI
<400>  74
ggatggccga ggcggcctta cttgtacagc tcgtccatgc cgagag                    46
<210>  75
<211>  32
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Paox #1 Apa I
<400>  75
aaccgggccc tctaacatcc aaagacgaaa gg                                   32
<210>  76
<211>  36
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Paox #2 Sbf I
<400>  76
catggcctgc aggtgtcgtt tcgaataatt agttgt                               36
<210>  77
<211>  31
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pgap #1 Apa I
<400>  77
aaccgggccc agatcttttt tgtagaaatg t                                    31
<210>  78
<211>  48
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pgap #2 Sbf I
<400>  78
catggcctgc aggtgatagt tgttcaattg attgaaatag ggacaaat                  48
<210>  79
<211>  34
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pgnd1 #1 Apa I
<400>  79
tatcgggccc tatggtagaa tcatcaattg gaat                                 34
<210>  80
<211>  43
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pgnd1 #2 Sbf I
<400>  80
catggcctgc aggtgatttg tatcagtctt gtttcttttc ttt                       43
<210>  81
<211>  39
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pgpm1 #1 Apa I
<400>  81
tattgggccc gaaagaaggt ttatctgact gttgcgcac                            39
<210>  82
<211>  39
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pgpm1 #2 Sbf I
<400>  82
catggcctgc aggtgtgttt gtttgtgtaa ttgaaagtt                            39
<210>  83
<211>  35
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer PHSP90 #1 Apa I
<400>  83
gactgggccc ttcaagatct tttgaggact agaga                                35
<210>  84
<211>  45
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer PHSP90 #2 Sbf I
<400>  84
catggcctgc aggtgattga tatttttcca aaattaaaaa gttaa                     45
<210>  85
<211>  45
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pkar2 #1 Apa I
<400>  85
atcagggccc actatcaaag ctatcaattg tggaaatgga cagca                     45
<210>  86
<211>  48
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pkar2 #2 Apa I
<400>  86
catggcctgc aggtgtcttg agtgttggaa ttgaaattaa ggaagaag                  48
<210>  87
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pmcm1 #1 Apa I
<400>  87
gtacgggccc acagctttgg cttgaacaat                                      30
<210>  88
<211>  42
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pmcm1 #2 Sbf I
<400>  88
catggcctgc aggtggctaa atgaatgcgg gttagtgttt ga                        42
<210>  89
<211>  37
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer PPpet9 #1 Apa I
<400>  89
agtacgggcc ctagaaaatt caccactgtc ggaaagt                              37
<210>  90
<211>  45
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Ppet9 #2 Sfi I
<400>  90
catggcctgc aggtggaagt cgacgaagaa gttagacttg ttgtt                     45
<210>  91
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Prad2 #1 Apa I
<400>  91
gtaagggccc gtatagtttg cagacatagt aggagagttt                           40
<210>  92
<211>  44
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Prad2 #2 Sbf I
<400>  92
cattgcctgc aggtgatcct tagcccaacc tgatggaaaa acgg                      44
<210>  93
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Prps2 #1 Apa I
<400>  93
gtacgggccc tcctgagaac ggacagcagc                                      30
<210>  94
<211>  45
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Prps2 #2 Sbf I
<400>  94
catggcctgc aggtgattaa ctacactgaa aaagtcggaa tgtac                     45
<210>  95
<211>  34
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Prps31 #1 Apa I
<400>  95
gtacgggccc ttgtttatag cctataatcg caga                                 34
<210>  96
<211>  45
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Prps31 #2 Sbf I
<400>  96
catggcctgc aggtgtttgg cttcgtcggc aatacgtgaa tgctt                     45
<210>  97
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pssa1＿2 #1 Apa I
<400>  97
gtaagggccc gttgtatcca ttcactattt                                      30
<210>  98
<211>  43
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pssa1＿2 #2 Sbf I
<400>  98
catggcctgc aggtgaatgt ttaactttgt ttaatttcta tgc                       43
<210>  99
<211>  32
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pthi1 #1 Apa I
<400>  99
gtaagggccc atcttttcag cttcatcgtc ag                                   32
<210>  100
<211>  42
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pthi1 #2 Sbf I
<400>  100
catggcctgc aggtggatga tttattgaag tttccaaagt tg                        42
<210>  101
<211>  33
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Ptpi #2 Apa I
<400>  101
gtaagggccc ttcaacgaga cactcttccg tca                                  33
<210>  102
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Ptpi #2 Sbf I
<400>  102
catggcctgc aggtgtgtgt ttgtgataga tcttgtatat                           40
<210>  103
<211>  32
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pubi4 #1 Apa I
<400>  103
agaagggccc agaagattac cataaattga ga                                   32
<210>  104
<211>  43
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pubi4 #2 Sbf I
<400>  104
catggcctgc aggtgaaagc gacaaacgtc acgtgaacaa aag                       43
<210>  105
<211>  32
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Peno #1 Apa I
<400>  105
tatcgggccc aaagagtgag aggaaagtac ct                                   32
<210>  106
<211>  43
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Peno #2 Sbf I
<400>  106
catggcctgc aggtgtttta gatgtagatt gttataattg tgt                       43
<210>  107
<211>  34
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Prsp7 #1 Apa I
<400>  107
tatcgggccc tttcatccag ctctttaacc ttat                                 34
<210>  108
<211>  45
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Prsp7 #2 Sbf I
<400>  108
catggcctgc aggtgcttgt gatactgctg ttaccgtgtg agttt                     45
<210>  109
<211>  46
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Prpl1 #1 Apa I
<400>  109
tatcgggccc ataagtccta gaacaccact tgttagtaaa accggt                    46
<210>  110
<211>  45
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Prpl1 #2 Sbf I
<400>  110
catggcctgc aggtgtttct attaattcgt ctccctagca aaaag                     45
<210>  111
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Ptkl #1 Apa I
<400>  111
tttagggccc gatatcgatt ccactgctca gagtcttttc                           40
<210>  112
<211>  43
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Ptkl #2 Sbf I
<400>  112
catggcctgc aggtgtgtgt agagtggatg tagaatacaa gtc                       43
<210>  113
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Ppis #1 Apa I
<400>  113
aaccgggccc tttttcctct tcgttgtgtg gtaaactcgg                           40
<210>  114
<211>  46
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Ppis #2 Sbf I
<400>  114
tgatgcctgc aggtggacta tctagagaca agtaaatttc catgtt                    46
<210>  115
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pfet3 #1 Apa I
<400>  115
aaccgggccc tttcgtacca aatggaaaaa tcacgtacaa                           40
<210>  116
<211>  44
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pfet3 #2 Sbf I
<400>  116
taatgcctgc aggtgaaaac tagatcctct ttggaacagg ccgt                      44
<210>  117
<211>  36
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pftr1 # 1 Apa
<400>  117
aaccgggccc tcgagtaaca cactactaac ttttta                               36
<210>  118
<211>  42
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pftr1 # 2 Sbf I
<400>  118
taatgcctgc aggtgtttga aaagaactac aacgaccact ga                        42
<210>  119
<211>  47
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pnmt1 #1 Apa I
<400>  119
aaccgggccc taacatgata tcatgatgta cgtacaaact aggatct                   47
<210>  120
<211>  36
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pnmt1 #2 Sbf I
<400>  120
taatgcctgc aggtggattg gtgattttga tggtca                               36
<210>  121
<211>  35
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Ppho8 #1 Apa I
<400>  121
attagggccc ggtataagta tagcacatgt tgacg                                35
<210>  122
<211>  45
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Ppho8 #2 Sbf I
<400>  122
taatgcctgc aggtgtgctt tgaaattgaa ggggagagga cgcta                     45
<210>  123
<211>  37
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pfet3pre #1 Apa I
<400>  123
agcagggccc ttgtggtcct atgaattaac catttaa                              37
<210>  124
<211>  48
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer Pfet3pre #2 Aar I
<400>  124
ctagtcatgg cctgcaggtg tcgatggagt gttggcggca gtggttac                  48
<210>  125
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<400>  125
caggtagaaa attcaccact gtcggaaagt tgtctacttc cgtcggttgg aaatacgagt     60
ctgttgttga gaagttggag gagaagagaa aggctgagga agctgagtac caggagaaga    120
agagagctta cacccagaga ttagacgcag ctagtgccga gtttgcccaa accgaggagg    180
gaaagcagtt ggctgccttt ggttactaaa tagtaaagta gggtatcttc aagtaatagt    240
atactaacca tctgaaataa ccaccgtcct gtagtttttt ttcgatatcg aagagcctat    300
gctagtactg tggatttgcg ctccatccaa catctgtgcg caaactaaaa cttccgagac    360
tgacatctac catcgctaga ccctaagtaa aaccaatctc gcgtccgaac ttttaaattt    420
cagtccttaa aacttcagag cattggttgt agtttccgga tctgaggggt cgtattggag    480
tcaagagacg gagctgcctc cacagcgcga aacgtcaacc ccaacaccaa cctgaatttg    540
caatcaccat ggggacaagt ttcagcagtc aatgggcaat tcagacgttg atacggtacc    600
catttgctaa gctcaatgac gatccatcca acttcagaga aaggcctttc tctggtatgc    660
tctggtattc attcgtcttt tatcactctc gttgcacaat gcccgggtac tcccggaaca    720
agggagtctt ccagccaagc tgtacagagt gaaaaataga aatacacctt tgcaatcaag    780
acgcgcgttg gccaatcaca agacttaatc ggtgcaaaga aggattacca aatttttttt    840
tcccaaaatc gctatataga aataatggag gaaaaagggt taatataaag gagaattccc    900
ccgtttttct ccccttgtct tttcttcttc aggctttctt acaaatctat aatattccaa    960
aatggctgac aacaacaagt ctaacttctt cgtcgacttc atg                     1003
<210>  126
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  GND1 promoter
<400>  126
tatggtagaa tcatcaattg gaatgaccct atcgttgcta tacagactcg tagccccatt     60
tcttgtttgt tggttttcgt cgtcaattgc ctccaaaatt gaagagatgg cacttcgtcg    120
cgtgggttcc tgggaaatat tttgaagtgg aacatcgttg aaataaggca gtatatcatg    180
ctgattctca gcattggagt cagtagcttc aagtgaatct atactgtatg agtcggaaga    240
ggatttccgg ctcgtttttg tcttcatttt gttattagaa ggaatgataa cgttgggaaa    300
ccggaggttg gagattttgt atatataaaa ctttcttgga gcttattaat aaatgcggga    360
tgcagtaaac ttgcatatat ctattgtaac acttttgcaa tagctgcatg ccttgactca    420
tcattcagta tcgtgtgaaa accaatgata catccgtaca ttcaaactac aaccttcctc    480
attagtaatt ctttttgaat ttttcggaac ccgaagctcc gcctatcccc ccaactaaca    540
catcttccaa tttgggtggg agaacaccta gcaacatcac gatcattgcg cgaacgttcg    600
cactgtattt ttttctccca aacacccaac ttctaggcca aatatccact tctcggggtt    660
ctattcaccc atttaattgt tggccttaaa agtcaattga gttccaatca tagtccctag    720
ttgattgctt gtagcaaatg ccacaacagt aggcatttac gtcctcacag tctcttccct    780
tgtccctcat tgatacctct ttattctccc ccaccaccat acactacctt cctcgcaccc    840
ctgtcatcac aaccgcaata taatcgatgc gcggtttctt gcctaatcca tcgtccaaca    900
gagaggtcgc tctccttata tatatagttg atcccccttt ttttctaccc ttgcaatttt    960
ttttttggga ccaaagaaaa gaaacaagac tgatacaaat atg                     1003
<210>  127
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  GPM1 promoter
<400>  127
gaaagaaggt ttatctgact gttgcgcacc accgaaacca aaagcgggtt tagctgcaga     60
actttcagtg gccggcttgt tgcccaaaga gactgttact gcctccatcg gtcttggtag    120
cgcctgaacc aaacgaaaaa gcaccactgg gattattgtt tcctccaaaa gacgcggtcg    180
tgtttgatgc tgttgaggcc gcaggcgctt gaccaaaact aaacgctttt gatgtattgt    240
ttgtaggggc tgttgcgttg ttagaagctg gctggttgtt cccaaaggaa aaagcacctg    300
ttgatccagt gttagatcca cctgcggcat tcccttgagc tgcggagcca aaaattgatc    360
cttggtttga gctctgtgta ccaaataaag atgaattggc cttagctccg tcagcaggag    420
cgtttgcttg tccaaagggg cctccagacg acgtttgcgt gttgttggca ttactagtat    480
tggcaggctg atttccaaac aatgagggct tggaggcgtt ctgggagtta ccaaatgaga    540
accctgtatt tccttggcca gagcctgaga aactgaaccc tgatccagac attatcaata    600
ccttgggtta ttagtagtgt ccgttatttt tctgtttagg ttacgatttt gccagatttt    660
ttgggaggag ggaaacaaaa gaaccagtgc tacacgacct ttaagtgcca tcaggcatcc    720
tgttttctcg acctcatctc atcacatccg tcagtctgag ctttcagttc tcagttttcg    780
attgactctt gccctgctgc gcgcacacca taccctggct ccctctcatg cttctggcgt    840
taccccggga atcgtacatc catgccgcga atcccggaca ggactcagac ggatttcact    900
attcctagtg ggcacaacct ccatatataa ggatacttct gccccctagc ttaagtgcct    960
ctattttgtc agtaacaact ttcaattaca caaacaaaca atg                     1003
<210>  128
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  HSP90 promoter
<400>  128
ttcaagatct tttgaggact agagagcaag acctgcattt gatagtcgaa gaggagaggc     60
aatttaaaga tctagtattg gagaaggaca gactgctcga tgttcaagat aagaatgctt    120
tgaatctaag gctacaacta ggttttgctt cccacaaggt aattgatcta aaccaattac    180
ttcctgtgca aaaaacactt ggagccacta ctagtctgga gttaatcaac tttcaaacag    240
acatcaaaac tttacacgtc gtaaacaatg tcatggacaa aatccgggtt aaggtcactg    300
gggagaagcg actcgtgaca ctgactcctg acagcaccaa caaggctcta gaatttccca    360
ctgagaatga taggccactg caagaacaac aaaatacaga gcatgaaaac gaaaacggtg    420
ctcaagatcc catagactca aaccaaacga atgattctca gacatactcc acacctagcc    480
gtatccatta tacgactaac gaggagagtt cctctaagaa ggttaaaata tcaaattgag    540
catgatacga tagcccgctg gcaaggaatt aagtgacact agatcgcaaa taattcggaa    600
tcactttatg tggaatcatc attcttgata aattgtgata aagtatcgtt cgcgagatgg    660
tttttccaga aatttcttgt ggatcaatat ctttaaacga tagtaaacga tgttgacagc    720
tccaacaatg tcggaactgc tcatcaaaga cggacaattt ccctattagc agaaaaatag    780
cccatttatc atcaccgcag cgctattact gaatgatttt tttgaatttt tccttgtctg    840
tgaagccgca aaccacattt tctggcgcgg ttacccggtc atagaagctg gtggaatatt    900
ccatgctacc tcgacgatga gcttgcgaaa tatatttaag tgtaagaact ccgcgtcatt    960
aagactctgg ttaacttttt aattttggaa aaatatcaat atg                     1003
<210>  129
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  KAR2 promoter
<400>  129
ccactatcaa agctatcaat tgtggaaatg gacagcaaaa cggaaacgca gtcaatgacg     60
atgatttcag agctaagcga ttgtgcgaaa ggtggttgga caatctgttt atgcttcttt    120
atgaagatct gagggtgtat acgatgtatc gtgccgaaca catgcacttg acggcacagc    180
aaatggaatt caagaagacc actttagaat gggagttaat agggatggtt tcatggaggt    240
taaaacactt caaggaggca tctgaagcat tcaagtatgc actaggtctg aggttttcgg    300
tcaaggcatg caagaaatta attgaattct atctgaacga acgctccaga atgaaccagc    360
cagaaacctc aattgccctc aacaacttaa atcaatccac attatccatc caagagattc    420
tcaagtatcg ttcgttcctc gatatcaacc taatttcaaa cttggtcaaa ctaggagttt    480
ggaatcaccg ctggtatgct gagttttctc caaaactcat agaaagcctt gcggttgttg    540
tggagaacgg agggcttatc aaggtagaaa acgaggttaa ggctacctat ttcgattcac    600
aagatggagt ttacgacttg atgaacgagg tattcaagtt catgaagcat tacgattatc    660
ctgggactga caactaagag ctcctagtga agacttgaga tggacatgat aaacaattat    720
agtgaaaata gaaaccataa tacaatattc taatagagga accgtttacc tgtggttcct    780
attgtggcct actgttacta gctagtgtaa tacacccttg cctcagcttt gcaagttgac    840
aactcagcca aatgatcttt gaatgcgcga aacctcaagg tccatcgaat tttctcgaat    900
tttcagtgtt ttcatacagc gtgtcatctt ctttcgcgta cttatttaaa tcgtacccag    960
atcccttctt cttccttaat ttcaattcca acactcaaga atg                     1003
<210>  130
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  MCM1 promoter
<400>  130
acagctttgg cttgaacaat agtggttgga tgttacccgg tgcgacaagt gctgagttgc     60
ggtaatttac gatttcagcg tccaccagaa tgggaattcc gggtaacacg cataccaggg    120
gaagaatatc acaaagatca cagagattgg ataaaactgg accagaaact accaaataag    180
tagaccgtca tactcagctc ctacaccaag aggtacttca gccttttacc ggtttaaaaa    240
gccccccgaa atcgactaat taccgaggca ttatgtttac tactgatgga gatttcgaaa    300
tatccttccc gattagtcca acatctcgaa attaaactgc gcagcactat gccgaaagct    360
atataaacaa tcatttcccc aactggaaca tcttttttct cttttcttcg tgtatcatcc    420
tttggtcttt taatctttca gaaaagtttt cattaaaatg cttccagctg gtgttatttt    480
agtcttttgt ctacttttca ttatcggggt aattatcgca gttatcctgg gcatgaagtg    540
gtacaagaag agaaagaact gagcatggac gaagaaaatt actagaccaa agatgtatca    600
ccaaacaaac ccccccaaga atctgtcata aacgaagttg ttataggatg gttatcactc    660
tcacatttta atacaggaat accctaattt ttcctcagtt cggtgacgaa tggagttgta    720
gttatctttc tttccctcgt ttctgctctt atttccccct ctcgtcgcat catttgcatc    780
aaattggtgc aacgtgcgcg cacgctcggc tttggctgca acgactttct gtcgtgtacc    840
gacccatatt ctatcgcttc gggtagtccg caacaccctc aacttcctaa ttttgtgttc    900
ttacaagctg caaaaaagta ggactcactc aataaggtaa gtccccaaac atcaatccca    960
attgggtaat ccatcaaaca ctaacccgca ttcatttagc atg                     1003
<210>  131
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  RAD2 promoter
<400>  131
atggtatagt ttgcagacat agtaggagag tttgcgggct tgcaactcta acaagtctct     60
gtagtcgctg agactaatgc aatcgtcaag actactgggc tcgttatccg aaaaagtccc    120
ggagtaacta gtcggtaact ctctgtaccg aatcatattc atcctggggt tgatctgatc    180
ttggtccatg tcatcattct ctccatttcc cgtagggtag ggcaatccca ccagccactt    240
gttaaccttt tctttatgcg gcatattggg agtctgcttg gggttgaagc tttctggaaa    300
ctcctttttc ttgatcagat cgctgtcact acagaaccca ggatgctgct gataagggga    360
agaaacatag cccatgccca ttgagttgaa attgaagggt tcctgtgctg cacctgcatt    420
caacggatat acatgtatag gatgatggat catgtggctg taagaggggc cagacgctga    480
gttatcacca ttaacattgt taggagatcc tgagccttga aagggcacat tgctagtctt    540
tcccgtagtc attacaaaca gcgggccata gttcccgttg tcacaaggat atgcaattcc    600
tgtaggggta tagatgtgtc tgttgaatgg ggtcatggcg ggattctaga aaagagacgg    660
cccgttagtt aaatccaccc accgattatt gaggtccaac ttacaatttg gttttgacgg    720
tcttccattg gaggatatgt tgttctgagt tggtggtagt tacgtttatt tctccttcct    780
ttttggtttg tgttagagca aggacacgga gcactgacta ccttcaaggc catttgttaa    840
gaatccacag atagacacta ccacatggga aatgttgtta gggaagagct gatgctgagg    900
ctcaacatcg cgcgactcct tttagtcagt ttccaagtac ggttcactgt agacatttct    960
ctttttagtt tccgtttttc catcaggttg ggctaaggat atg                     1003
<210>  132
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  RPS2 promoter
<400>  132
ctcctgagaa cggacagcag cgctggaggc ggcctcttta acggtggcgg cgaagtcaac     60
aagggtagtt ttgattttgc ctaacaactg ttgcaggtcc ttctcagtct ttgggtggct    120
cttcttgaac tcgtccgatg catccttgac gaccttctca gcgtcgtcgg caatctcgtc    180
gacaacttgc actgatccat gagggtcttg ggtttgttcg acttctggaa ctggttttgg    240
cttgccagcg gaaactcctt ctgggggtgt ggcagcttcg gcgtaggtac tatcagtgtt    300
aatatcgggg attggttgat gtgcgagacg aggcaggcgg gagatccgtc tgcctcgtcc    360
aactgcgata gctcttactt acctcatgat gcttgtaaaa aagttaactg aaagatggaa    420
atgggagggg gaaaagaatt gtggtcaaat ccacgtcttg cgataacctc atacatttgc    480
tgcatgattg ggggatcatc gcaatttcgg tccttgtgac acacgcgagc tttccgcctg    540
gggttagagc gcggagcaag catactatca agcaagaaaa aatggtatgg agaaacctaa    600
ttggttaaga tatatgaaaa ctacgacggc ttcatacgtg gtatctctgg ttgagctact    660
acgaaccatt ttcccccttc aaaccctttg gcccatgcca ttcatgcctt gcctctctct    720
caagcaacta agcaatcaag caatttcccg ccttgctgca catgactgtt cggaaatcgg    780
agacccaaac accacttgtt atctatgcac gtgattttta tccagggcaa taaatactca    840
cttttgcttc aaaacgcttg gggcgcgcga gcggcaggct gggaaaaaaa taatctcaga    900
cttttcaaaa gactctcctc tttaatcatt gaataccgtc gatcgaaaac caccaccatc    960
ggctttccac gtacattccg actttttcag tgtagttaat atg                     1003
<210>  133
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  RPS31 promoter
<400>  133
ttgtttatag cctataatcg cagactttgt taacccgtag gaataatcct acccactaga     60
attagatctt ccaaccatac atagcgtgta ctacaactta agctggtcct cttcttttat    120
cattcgcgcg gctctatctc atctacacct ccattgaact aatggaaagc aaatacgccg    180
aaaaatatca agatcgattg attcttggag atgatggcga tgaggacgaa ttgtttgacg    240
agctggaaaa agatattgag gatcaattct tggccaaata cagagcagag agaatccaac    300
agttaaaaca ggagattacc aagatcaagg accatagttc aaacatcaac ctcaatgacc    360
acggtaacat gaaaacaata gatactgatg acgaactatt gaaagaaact gttgatagcg    420
aacgtgttgt gatccatttc tttaacccat cgtttagcac ttgccgtatc atggatgaga    480
agctgtctat aatcagcacc aaacatattg gaacgcgttt tttcagaatt gaagcacata    540
gagctccatt tttagttgca aagcttggta tcaaagtgct tccatgtgtt gtattgtact    600
acaaaggatt agaaagggat agaattgtcg gatttgacag attaagtaat tctcagacca    660
attttgagct agaagcttta gaggagttac tcttagatag tggaattgtg gaacgaagaa    720
ctgtcgattt tagcaacctg agaaacaagg tccaaaacaa ggtggatcag tcaaaatcag    780
actcagaaag tgatctagat atgtgataga tggcggatgg caggttcatt ctagtgtttc    840
acgtgacaca cgtgagcgtt taagggcaca caccctgact gacgcgcgaa catctaatct    900
gttccgcatg aaaaaaaaaa actacctcga cgaaattctc ttctagacag tttttacatt    960
ggtaagaaag aagcattcac gtattgccga cgaagccaaa atg                     1003
<210>  134
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  SSA1 promoter
<400>  134
gggttgtatc cattcactat ttactctttg tttcatttct tgaattattt ggatactact     60
ctgctggcaa ctctaccagt ctcaaacgca gaccaggttc gcaatttgat tagaatgttc    120
gtgagctctt acaatgaaaa gtccatgtac cttgcggcta gttgtgaatt atttttagtt    180
ccttctttgt tgctatcctc tttgaagtcg attatattgc tggaatggta tagggctccc    240
ttttcattta tcaggcaatt aatcgtggta ttctccgtga tctcgtttct gagattaaga    300
tatcaacaga atgtttacat gaaacaatta gttgatagtt atgatttgaa gatcagtcaa    360
ctcttatacc atccccaact tcctcaagga ttcaggttgg gatatttacg atttaagagt    420
ctattaacaa gcacgctagg atacttagaa ttggaaaaaa agaccagata atgagattga    480
actcgaaatt taggatcacc catatgacga agaattcatt tagattattg aaggtgtttt    540
catgtttacc tccatgagac catttctgtc acagcaaata caggcaacgc ttttcaccag    600
agcttgttgg tacaactttt cagatgacgc caaattctca cgcgcctcac tttgtgcggc    660
gctaacaata ggccattttt ttgtacctcc cggatggttc agctcaatca ctcgattgag    720
aggtttttgt tccgcgattt ttgttcaccc cacacttttc tcgaaggttc tagcaatcaa    780
gataaacacc gcaaagagag ccgcaggaac catatgtggt accacaagtg gtcttaaaca    840
actctggtag aattcgatgg aattcgatgg aagccgatcg actccgatcg aattgaagca    900
attcgtatat ataaggagaa cctagttcca ccccttactc gaccattagt ttacaagact    960
aacttcacag aagcatagaa attaaacaaa gttaaacatt atg                     1003
<210>  135
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  THI3 promoter
<400>  135
atcttttcag cttcatcgtc agtgatattt ctcagcccac agaccaagtc aactttggaa     60
tctaacaacc ttgttcttac aatgttagaa ctcttaagtc gcatgccatg atcttcaagc    120
tgaattttgt gaaggaggtc aaaccccaca atggcatcta gttgtttaga atacatgcct    180
tcgacaagtg tttgagtgtc caaaatcaag agctcaaaat tattgaattt gtctgccaat    240
aacgccgtaa attgattagt gtccagccca ccaacaatag gagcacctat agttaatttt    300
tcagataaat ttaagttatc aaggtaaagg agctctaagt ttaccccttc caacagggtt    360
atttgagaac tcaataaatt gttgaattca aaaccaattg tctttgaatt ctccactgga    420
gcttccttgc tgaaattgat tttgatacca ttggcatcaa agagacccgt atgataactc    480
cataaaaagg ggagatgata ggccttaaat tcatcgttaa tctgcaaatt tattcctgac    540
atgtctttgt aaatagttat agttcagaaa ctggaattga gctcaaaaaa ctggaatcga    600
gcggatattt gaagattgat gccttactca tgaattgatt gataagagct ccgtgattca    660
ctctgtcaat gattacccct ctcctacccg atttgggact ttttcttcag tcttggggac    720
tttttttcat atgacttgac cttgctttcc caatagggaa ggactcaccc atggatgatt    780
aagtttggat tactcgttta ggaaatagta gccatgaatc aatttgaatc ataccatcat    840
gaaatagggt taggctgtaa atgcctcaaa aatggctctt gaggctggat ttttgggtat    900
tggaatgttg gtagcaattg gtataaaagg ccatttgtat ttcacttttt tgtccttcat    960
actttactct tctcaacttt ggaaacttca ataaatcatc atg                     1003
<210>  136
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  TPI1 promoter
<400>  136
ttcaacgaga cactcttccg tcagttccaa aaccataagt ttgccgatgt gttggtcctt     60
gtaacgcatg gaatttgggc cagggtattt ttgatgaaat ggttcagatg gtctgtggag    120
gagtttgaag gcttacgaaa tataccacat tgccagttta tacagatggt taagggtgaa    180
aatcaacgtt acaccttgac gaccccatta ttacgatggc gtgaaggaga tgaagaccgg    240
gtagaagaaa taagaaaagc ggtacagttt aggtccggag atctagggaa ggaggcctta    300
gcttatattg tagctgctga gagagaggca gctgctggaa gatctgaagg ccctatcacg    360
tatgatgatg gtgatgacca ttagagaacg cccagagatt gatagccagt tcttggacaa    420
caattcggaa ctttattcac ggtgcaaaca tgatttgtgt ggatagcttc aagtcagaca    480
tttcatctca tccccccttt tactgctgct aatcaccgtt agtccgacag ttactctaat    540
caatatttat tagtgtttta gttgcgcaaa actcgagcct cttttcctta tctcttgaca    600
cttcctggag tcgaagtttt tcagcgcaaa ttcactctac aatgtctacc gatactagac    660
cgcctatctt ccccctctaa atagcctatt ggaagggtgc aataaggtat ataaatctgg    720
cgcgattccc ccggactttt atgatccaca tcacctcatc ttactgccct cactctcttt    780
cctgatcctc ccaggtccac cgatttcctc actatcgtcg gatttctcct tccagcgccc    840
tagagaattc cgtaaccacc gcaaaaatag cagccccccc ctcacccatt tttttattta    900
aaagaacacc ttactggccc gttttcgttt ctcctttact acaattgatt tttaattttc    960
agtttttttt cattgatata caagatctat cacaaacaca atg                     1003
<210>  137
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  UBI4 promoter
<400>  137
agaagattac cataaattga gaactcaaat gaccaagcca ggagtcaaga agaattctca     60
aaagggatac gcaaatattg attcggatga cgaagagctg actgaggctc tcgatttcaa    120
attggcacca aggtcaacaa aaagtctaga cataacacgg tctggactac cgcaacaata    180
taattttgaa aatgttctta gtagcgacga agaagatgga ggcggagagt ttcagggtga    240
ttctgtatcc ccaattaaaa acagttttca ttcaagtcca aggaagcagc gatctctact    300
ccacgtcata gacgaaggaa gtccatctat tggcccaatt tctgttcaac tgaaaagaag    360
tttgacttct cccacaaaga gacacaagaa tgctcaggaa gtgataagcc aaccagaaag    420
catgacatcc tcaaacttgt tttcgcctac acattcctcc gcctcaacta catcaataat    480
atctcccaaa ccccaagcgg caatgatccc aagtcttaac ccaaataacc ctttttatac    540
tgatactaat agctaatatg taataatgat taataaatgc accactttaa tttctttatc    600
aagaatagtt ttactatttc tctttcgggc atatacttga cccgctccat atatttcacc    660
tttatcgtga cattatctgc tgcacgaccc ggaattactt taaacttcta agaatttcca    720
aaataggaat cgggatgccg tattttccag tctgctggac agaacttgtg ctctctaaaa    780
tgaattgtag tggtcctcaa aggctactgc tactcacagt ctttactact ccagattgat    840
ccattccttg gcccatgcac agtaaattag actactgatc tgatgttgta tacttttgag    900
ctgattgatt acagttaacc tggtcttatc taatctctcg tttcttttta tctctattcc    960
catttctgta ctcttttgtt cacgtgacgt ttgtcgcttt atg                     1003
<210>  138
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  ENO1 promoter
<400>  138
atgaaagagt gagaggaaag tacctgggca aaatcacaca attccaaacc atgctaaatg     60
agatttaaag aacaaacgat ggcaaaaggc aaccgttata aatgtgatct ttcttggcag    120
ttatctgtca atttttctaa ggaacagtga attcatcata ggagagatgt tatacgttac    180
ataatcatac atactgcatg tatctcacct actttacctc atcaactcta aaacagttct    240
agtcccaacc ccagattcct agtcatgaca caagtccgca ccggacagga ctcacaacca    300
gcaagagaag ctaacaaatt tacgccccgg taaaacattc tttaggggcc gttcaatggt    360
aattttcctc tcacccgttt aaacttacct ccgggcggta tcttcaataa cctctgttgt    420
ccccgggtat cattggaaac agtgagggac gttgaacaga agagaggatc accgtaaatt    480
tgccttgcaa ttggccctaa ccacggatgg ttaacttcaa gccatcacga cagcaattga    540
gtcggcgcat agctaccctc ctcttcttga ccccatgcat aggaccaacc ttaaccgatg    600
gaacaggttc ctccgctccg tcccctggta gtgtctctgc gcaagaaata gttaaggtat    660
gaagactgat ctctcgcacc cccctcacag tactgttatg gtgaattgac aaagccattg    720
gctagattga aacatgtaat tcatatgtaa tcttgttcaa ttaacgagct tcgtacagtc    780
tcaatctaga cgtctgataa tggcgtttgt gctcctaatc gatgagccat ctcatgtgac    840
gtctatacgc ttcgatggct tccgtcgcga atatagaacc acttgaaata tgctgcaaac    900
cacgatccac cctggtcctg aaaagatata aatacagcac atctagcagg cttttgtctt    960
cttggttgaa acacacaatt ataacaatct acatctaaaa atg                     1003
<210>  139
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  RPS7A promoter
<400>  139
cctatgtaag ccttctcagc atagtcaaca aagaaacctg tttcgacgac tcctaccagt     60
cgtatcagct tttcatccag ctctttaacc ttatttaacg gaatctctcc aaaatcagca    120
tcaatgacga agttaccatt atctgtgacc actggaccag ctttcgcctt tccagcatct    180
ctcagagtgg cgctgttggc tcctagtttg aaaagatctt tcaatacttt aacataactg    240
ttgggtacaa cctcaatggg aacgcctttg cgccagaaat gacccagtct ttctggagac    300
tgtttacgaa aatctgccac cacaacgaat ttacgagaca atgatgccac caacttttct    360
tgataaagcg ctgcccctcc tccctttatc aaattcaagt tggtgtcaat ttcatcagct    420
ccatcaaagg ctacgtctat ctcatcgaac tcctccacat ttcctaaacg aaggccattg    480
tccaagataa gttgctttga ttgaaagctg gtagggatac aaataaactt ttctttattt    540
tccaactgcc ccaagcgttc ggcgacatag acaacggtgg atccagaccc aactcctata    600
attctgtcag acttcgaaac gttttcattg actgctgcga aagcagccaa tttttttgac    660
ttctcaatta gttcctcaga cattagttgt ctaagatgct agaggcaaga cgtgaataag    720
tacccacaaa ggacggtcta atttccctta cattcatcaa taggctattt caagcatgaa    780
cttacataag cgtattgtgc attagatatt aacctcttag catcccaaca ccgtactggg    840
cttcgaccct aaccacatcc cctacatcac atgactgtaa ttttttttgt tactactctt    900
ctcttgggac tgttgtgcgc gaatccagtt tttcctccag agccttaaca atcttttttc    960
aattctgtcg aaactcacac ggtaacagca gtatcacaag atg                     1003
<210>  140
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  RPL1 promoter
<400>  140
cataagtcct agaacaccac ttgttagtaa aaccggtaaa attccccatt ttctcatatt     60
caacttacaa tgctcaaaag atgatctttg aaggccatcc cagtggtgtt agccatccta    120
tggaagggtt tgttagtaat tgctgatcca aaacctgaag actgaaaaaa aggctcgcac    180
atgtcactca ttaccacatc cacagggaat tgctgcttct gcttgttact tatctcgagg    240
ttatcgtcta cttcagcctg aaagtaggaa ggtccatccg ctattggttc aatttcttga    300
agctttctaa ggtctttgtc catgttcaac tggtaaaaat gagtctttat catctcatgc    360
gtggtcttac tcaagatgtt ggcctgcatt gaagacaccc cttttggagg ctcacaggct    420
aggatatcta tcccaagaat attgcctctg gaagtcactt tatcggctgc aacttgggac    480
catgcaccag gagcaaaccc caaatccacg acattttgcc ctggacggaa gatattgaac    540
ttctcatgga tttggagcag cttaaacgct gcccttgatt tcaatgcctt tgcgtgagct    600
tcctttgtga aggggtcaga tgattgacgt tccagccatt tcctagagga tgaactcttt    660
ccttttactt tcagggaaac aaacctagca aactgcctcc gtagcagcga cacagaagga    720
tgctgtatca tgtgatgaac gtagctaagc acaacctgtg tgacaattcc gtgtcgttta    780
tcttatcttg ctagtctaga tataaagtat cacgtgacaa atattatttt tgccccaaca    840
ccggcttgaa acttagggct cgcgccctcg tcgcgagaat tcttaccttt cgttaaattt    900
tttttcagtg ttccaacttt tcccttctct atccatcgtc gaatcaaacc tttacgggat    960
tacctacaac ctttttgcta gggagacgaa ttaatagaaa atg                     1003
<210>  141
<211>  1009
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  TKL1 promoter
<400>  141
gatatcgatt ccactgctca gagtcttttc atcaagctct aagaaaagtc cggggatgga     60
ggagccagcg caacagaaaa ctatgtcggg actaaaacca acttcctcta aaacacgctc    120
acactggtca tatttggaga tatctgctgc cacgtaagaa attgtgttgc ccttctcggt    180
cccgtgaata tcaatagcgt cctttactac ctgctttagt aaggattctg ttctagccac    240
aatcacaacg gaacatcctt ttccatacaa aagtttagca aactcggctc caacaccctg    300
ggatgcaccc gtaataattg cctttttgtt ggtgacatca aaattatcaa acattccagt    360
tccctctaca ctttgtatga gaatgatagc tgaaattgtg caccagatgt tagaagataa    420
ggtcgtgtca tgaactaata tcatgaattc cgagggtggc tcaacaacta ttcacgtgac    480
ttggacgttg gaagttgagg tggttggtgg atgttgcacg gagtatcatt tgtaagcatg    540
aaatcagtct aaaaaacttg cagaatagca gagcggttcg gaaattcatt caaaaccacc    600
tcctcagatt ggatctgccc tactctgttt agctctggga gattttctcg gtcgtgttct    660
ttcgctggtc tacccacgct ataggaatcg ctgtgaacgc taccttcttc ccaacttctc    720
ggtgactatt ataagccatt cccactttgt tttcaagcac caacaaccca cccccacctt    780
atctactcca tcttgggtgt ccccgcgcct gttgcaaagt ccgaaccata gaacccccga    840
cctttgtccc actaaccctc agacacccct cggaagtcag ggagaaacca ctccgaagta    900
cattaatcat ccctcgtatt ctcgacggtg cccattttct ttataaaaag ggagacacag    960
gttgcttcac taactctaga cttgtattct acatccactc tacacaatg               1009
<210>  142
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  PIS1 promoter
<400>  142
tttttcctct tcgttgtgtg gtaaactcgg taacgaggct aaaagttttt gcaaatttga     60
gtcttcattc aaatctaaga actctgaata aatctcaaac acttctttca tttcgatcaa    120
taagtgtagt agtttctgtc tataaatttc ttcggtgttt gttctttcta gagcgtattg    180
tatactaaca aagttggata cgaccaaagt ttggagctca ttgtccattt tgtgtaatcc    240
ttcatcgtca tcaagcagaa ttcttagctc cttttggatc ttggttgtaa aaggtctcaa    300
cgttgtagta ttgttcataa gaagcttctg taacacaaaa ttagctggct tggggcaaag    360
atacatcacg ctaacaagcg attgaataat tgacggaagc cttggtgtca gtatttctct    420
ggtaagtgca accttatgcc ttattttgtc cataataaaa tctagagtgg atatagctga    480
ttccaaacag gtcatctgtc gtacatcaat ggttgatgtg atgtaacact tcgactcaat    540
aatcttggtc aaagcactaa tatagttacc agcgtccgat gcaataatcc ttgggtgaag    600
gcaaaggacg tggacaagtt ttgtgccaaa ccaacggact tcagattgat ttgatctaag    660
ataatttgca gcacgagagg taacatgcgt caagtcggct tttgaagctt cattaacggc    720
gttctcatca gcaaggatgg ggagtatttc catcagatcc gcctcaactg aattatcctt    780
caaatgcgga atgacaacgt cgagtccaac aaatccttga tatcccatcc tggaagtcca    840
attgtatgat ctaaagagat tacttcattc tatttttttt ttttttttat tggaattttt    900
cagcccaagg ctctctctat cagtgtaccg accaatacgt atcagataca gataattttg    960
agctcaggca acatggaaat ttacttgtct ctagatagtc atg                     1003
<210>  143
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  FET3 promoter
<400>  143
tgggctttcg taccaaatgg aaaaatcacg tacaagtatg cccagagcta agctaatcgg     60
atggcaagta gaaagtggat gggtttcaca gaacaataaa gaatgagtga cggatattat    120
tggctggcag gcattaaaga tgcataattt aagctttctg ttttctactt ttggaattgt    180
cacaaatttg aactgtggat gttattgaaa cacagacccg tataaatacc tcttgagaga    240
aatttgaaag tgaagctatt tcagtgaatt aatcactcgc catacacgag gtagataatt    300
cacgtagacg aatttctttt gatccatttt attcagggtg gacagtcaga agtgttcgtt    360
cacctgatat gttctagatg cagctcgaaa cgctgtaaaa aaaaaaagtc ccaaaagtca    420
cgtgcataaa ggtgtagttc aatttaatgg agataacata acatctatga ctcctttcat    480
gaatccatct caaaaacaca aactttgcta gaatatctgg tggcaccgat ttttcatcat    540
ttcacgagtt tatatagcat atgcgccaac agaacgttgc ctgacacaat gttaaggctt    600
ttaaattttg cttgtgtagt aaaaagttag tagtgtgtta ctcgatatca tatttctatc    660
agaagtggaa tattctaatc tctcctctac ctttgttaca atccgtttcg aacagaaaaa    720
agaatttatg atgattttat ggagaatcat tccaataata gcattgctaa ttagattgac    780
ggtagcaaag actcacaagt tcaatttgac agcttcttgg gtgaaagcaa atccagatgg    840
tgtttttgag agagatgtca ttggacttaa cggacagtgg cctctaccag ttctaagggt    900
gaatcaagga gacaggatcg aactgttgtt gacgaatggt cttggcaatg cgaatacatc    960
tttgcatttc cacggcctgt tccaaagagg atctagtttt atg                     1003
<210>  144
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  FTR1 promoter
<400>  144
tcgagtaaca cactactaac tttttactac acaagcaaaa tttaaaagcc ttaacattgt     60
gtcaggcaac gttctgttgg cgcatatgct atataaactc gtgaaatgat gaaaaatcgg    120
tgccaccaga tattctagca aagtttgtgt ttttgagatg gattcatgaa aggagtcata    180
gatgttatgt tatctccatt aaattgaact acacctttat gcacgtgact tttgggactt    240
ttttttttta cagcgtttcg agctgcatct agaacatatc aggtgaacga acacttctga    300
ctgtccaccc tgaataaaat ggatcaaaag aaattcgtct acgtgaatta tctacctcgt    360
gtatggcgag tgattaattc actgaaatag cttcactttc aaatttctct caagaggtat    420
ttatacgggt ctgtgtttca ataacatcca cagttcaaat ttgtgacaat tccaaaagta    480
gaaaacagaa agcttaaatt atgcatcttt aatgcctgcc agccaataat atccgtcact    540
cattctttat tgttctgtga aacccatcca ctttctactt gccatccgat tagcttagct    600
ctgggcatac ttgtacgtga tttttccatt tggtacgaaa gcccacgaac cacacgactg    660
tacttgactt ttggggtcgt taatgtgcac agcccagaga tgatctgata attaatatca    720
tttcgcacca ctgtttaaaa aattcgataa tttgttacta aaatgctatt tttgatgcaa    780
tgcgtgcatg ttcatgcacc agtagataat aatcttaaat ttacaatata gaagctagtt    840
tcttaaagtt ttattggctt atgtgtttta gggagaaaag tttcagagct atataaactc    900
gatccttcct tccacaaatc tcgccttcaa gtcatttctc gaacttcctt ccaatagcag    960
tgccactcaa cgttcagtgg tcgttgtagt tcttttcaaa atg                     1003
<210>  145
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  NMT1 promoter
<400>  145
tcgacacaca gaggaaacga gggtaacatg atatcatgat gtacgtacaa actaggatct     60
ctggtcattc cacgggccac atcaggatcg aatttgtcgc cgtcctcttc ttcagcgcca    120
tcaggggctc cagcaccgtc gtcgtatacg taaacatcta aaaaggagat atcgtcttca    180
gttctggtgg aaaggatcat attgtctgtg gggtatactt gcaactcttg tttctcttct    240
aaaatttcac gttccgttgg aagagtgatg tatgcgtcac catctgcgtt gttctcatct    300
tcgtggtaac gggcacccgt acttgataac ccaggtagca tcgagacttt gaggccattg    360
gcaacagaat cctcatacgt ttcgtcatca tcgtaatgtt ctaaatcata ttcctttaga    420
tcatcatcaa tgtcatcttg agactgtagt ttgctagcta tagatttgtt gatgttggct    480
ttcatttctg aaatatcaga atcatctttc tgtgtttcgg ccagctcatc ctgggcatct    540
ttcagtttca aattggccat ggcttcaatt ctctccatct caacatcgtt catttcatat    600
ttctcgggaa actccgaggg gaagcctctg ggaacccatg ttgtagacga aatcataagt    660
gtacaatact gtctctttaa actgaaaaaa aaaatttgag aagaaaaaaa aaattgctgg    720
tcacatgata aggtggatcc cgtaatcaag cattaacctg gttcaggttc gtggattgtt    780
taggctttat aaaattgact ggtaggtccc cagtttcaag ttttctttag taatctactc    840
gcacaaatta ttgttgggca tctcgtccta tcagattcat atagatctat aattgattcc    900
cctcctgaaa cactttcaac caacatctga gggttctcga aaattcagta agattgactc    960
ccttctcatc caggcttggt gaccatcaaa atcaccaatc atg                     1003
<210>  146
<211>  1003
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  PHO8 promoter
<400>  146
ggtataagta tagcacatgt tgacgctgat ataatcatcc caaaaaagtg tgcggtttat     60
ttagaaagga gaagaggaac tcatgaaatt tttgaaggaa cgcacccatt ctaggtgatg    120
tacgggtgtc ttttgataag tagtggatag gttttattca ctggactata tggtactgta    180
caaaagaagt tcctcttcag atggtctgta gcttgcatgc aatgttctct ctaaggaatg    240
tgtatttgaa aggtcatgac ttaccataac cagtcgcaaa atgcttttgt tccaggttct    300
cttcctgagg aacgttttga cggggtatac ataccttatc gagatcaatt ttaggaatag    360
atactttctc tccaaccgtt aaaaatttgg aaatcttcac tttggcaggt tttaactcgt    420
caagagactt gacgtctagg atcttatact tgcttatgtc gttcttggtg tcctgatcga    480
gagagtcttc cctgacttgg tatttcttac cttcgtgctt aaaactatga gccgttttgt    540
ccttaatggg catgggaaga gttttcaatg tgcttaaatc caaatctttg ggagttttca    600
acagccatac ttctttcttt cccaaatcct tgaacggaga tatttctttg aggtctgtgc    660
gctgtttgaa attagcaggt ggttcaaaag tgaaatcctc tgaatcactg ctttcagagt    720
tgtcggagct aatatcggac tctgatataa actcccttgg atattctttt catttcagag    780
acaccctaat agttgtagga aagattaaac caagtgaaaa aaaaaattca atcgcgatgg    840
tagagtctgg aaggagatgt tctccttctg gctcacatct cgctaagtgg acattcttca    900
cggaactacg cacaaatcta tgcccctttc aggatctcgc gcaatctgca ttgatatgtg    960
atatttgttt tagcgtcctc tccccttcaa tttcaaagca atg                     1003
<210>  147
<211>  1006
<212>  DNA
<213>  Pichia pastoris
<220>
<221>  misc＿feature
<223>  FET3pre promoter
<400>  147
ttgtggtcct atgaattaac catttaaaaa tattgctatt aatgattatg ttaggtggat     60
taatgttgtc attagtacat atattcgtat tttaacttaa ttactcatta attaagtgta    120
gaatgtcatt tcactggatt taacttgctt tgtaagtacg aaacaatgct cgatcaataa    180
tcaaacagtt tagttcagag attagattca aatataattc taaatttata gtatcagaaa    240
tatatattaa ggacagtgtt aattttacct catttaaact gctgctagcc attaaacgat    300
tgtgcttttt tagtccatgt ttaagaacaa atgaccattt gctaaaccta ctgtaatctt    360
attataaaaa tgaagcctac aaatcatttc ttacaagcaa atgattttac agccccttgt    420
gctgaatgta tagtacacat tggacgagga gaaacgatct aagtggccac tcgtaggtgt    480
taatgatact attcgctcga acttaacggt gcttaggatt ctacttaatc cttgcacgtg    540
acaaggctta aattaagctt gttttctgat gtgtgtcaaa aaaattttag cttgacatat    600
atcgaacgat acggcgtatt cttaggcaac aatttcaact tcttcgctta tttgcaatac    660
tggtatccac ggggtaatgc caaacttaac aaacagtaat ggatttgaag ctagcatgct    720
gtatttcaag gagcggagaa gcaaagatag ccccccttag attaaatgca tgtttaagct    780
ttcgaggcac ttttctgatt aatgcataag cctgcaggaa aggattccac ttatttagta    840
aaattatcag ttcaatcgcc aaataaaggc acaacaagaa aaagaaacaa aacaataaaa    900
tttcaacctt ctttcagcgt atataaaaga aatttactgc ccacttcctc gaagttttcc    960
tttcccctag ctgtaaccac tgccgccaac actccatcga agaatg                  1006
【図１】
2010524440.tif 000057
【図２】
2010524440.tif 000058
【手続補正書】
【提出日】平成21年4月21日(2009.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピチア・パストリスから単離されたイーストプロモーター配列であって、
前記イーストプロモーター配列が、ＴＨＩ３遺伝子の５’−非コーディング領域からの１０００ｂｐの断片（配列番号１３５）、又は、前記断片と機能的に同等な変異体であり、
前記機能的に同等な変異体のヌクレオチド配列が、前記配列内、又は、前記配列の２つの末端のうち一方若しくは両方における１以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は、置換による前記ヌクレオチド配列の変異により生じ、そして、
前記変異を通じて、前記ヌクレオチド配列のプロモーター活性が維持される
ことを特徴とするイーストプロモーター配列。
【請求項２】
（A）興味のあるたんぱく質（以下、「ＰＯＩ」という。）をコードする組み換えヌクレオチド配列（宿主細胞からＰＯＩの分泌を引き起こすのに有効なリーダー配列に作動的に連結されていても良い。）と、
（B）宿主細胞におけるたんぱく質発現を調節するのに効果的なプロモーターと、
（C）転写終結因子と、
（D）選択マーカーと、
（E）同種組み込み配列又は自己複製配列のうちいずれか１つと、を含むｐＰｕｚｚｌｅバックボーンに基づく真核生物発現ベクターであって、
前記（A）〜（E）の成分が互いに作動的に連結され、
前記プロモーターが、ピチア・パストリスから単離されたイーストプロモーター配列であり、
前記イーストプロモーター配列が、配列番号１３５、又は、前記配列番号１３５と機能的に同等な変異体であり、
前記機能的に同等な変異体のヌクレオチド配列が、前記配列内、又は、前記配列の２つの末端のうち一方若しくは両方における１以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は、置換による前記ヌクレオチド配列の変異により生じ、
前記変異を通じて、前記ヌクレオチド配列のプロモーター活性が維持され、そして、
前記宿主細胞が、イースト細胞、好ましくは、コマガタエラ属の菌株の細胞、特に、コマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス、又は、コマガタエラ・ファフィー菌株の細胞である
ことを特徴とする真核生物発現ベクター。
【請求項３】
宿主細胞におけるＰＯＩの組み換え発現のための請求項２に記載の発現ベクターの使用。
【請求項４】
宿主細胞における同種ＰＯＩの発現の調節のためのピチア・パストリスから単離されたイーストプロモーター配列の使用であって、
前記プロモーター配列が、配列番号１３５、又は、前記配列番号１３５と機能的に同等な変異体であり、
前記機能的に同等な変異体のヌクレオチド配列が、前記配列内、又は、前記配列の２つの末端のうち一方若しくは両方における１以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は、置換による前記ヌクレオチド配列の変異により生じ、そして、
前記変異を通じて、前記ヌクレオチド配列のプロモーター活性が維持される
ことを特徴とする使用。
【請求項５】
前記イーストプロモーター配列が、前記ＰＯＩの天然プロモーター配列よりも増加されたプロモーター活性を有することを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記イーストプロモーター配列が、前記ＰＯＩの天然プロモーター配列よりも減少されたプロモーター活性を有することを特徴とする請求項４に記載の使用。
【国際調査報告】
2010524440.tif 000059
2010524440.tif 000060
2010524440.tif 000061
2010524440.tif 000062
2010524440.tif 000063
2010524440.tif 000064
2010524440.tif 000065
2010524440.tif 000066
2010524440.tif 000067