(57)【要約】  本発明は、ＥＧＦＲキナーゼ、ＰＤＧＦＲキナーゼ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による癌患者の治療効果を予測するための診断および予後診断方法を提供する。ＥＭＴが生じた後、腫瘍細胞は、間葉状であるが、依然として、上皮および間葉細胞の両方の特徴を発現し、このような細胞が、受容体タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤による阻害に対する感受性を変化させた、という驚くべき発見に基づいて、それらは、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して比較的感受性が無くなってきたが、しばしば、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲ等の他の受容体タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を得たという点において、諸方法を、このような「ハイブリッド」腫瘍細胞を同定する（例えば、ビメンチンおよび上皮ケラチンの共発現の決定）、ひいては、ＥＧＦＲキナーゼ、ＰＤＧＦＲキナーゼ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する腫瘍の考えられる感受性を予測する、特異的上皮および間葉バイオマーカーのレベルを決定するために発明した。このような方法を取り入れるＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いて癌患者を治療するための改善した方法も提供する。
2010533836.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測するための方法であって、腫瘍細胞により発現した上皮バイオマーカーのレベルを評価すること、腫瘍細胞により発現した間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測すること、を含み、同様のレベルの上皮および間葉バイオマーカーの共発現は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する低い感受性と相関し、前記上皮バイオマーカーは、上皮ケラチン１−２８および７１−８０から選択される１つ以上のケラチンを含み、前記間葉バイオマーカーは、ビメンチンである、方法。
【請求項２】
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、エルロチニブを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測するための方法であって、腫瘍細胞により発現した上皮バイオマーカーのレベルを評価すること、腫瘍細胞により発現した間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測すること、を含み、同様のレベルの上皮および間葉バイオマーカーの共発現は、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する高い感受性と相関し、前記上皮バイオマーカーは、上皮ケラチン１−２８および７１−８０から選択される１つ以上のケラチンを含み、前記間葉バイオマーカーは、ビメンチンである、方法。
【請求項４】
ＰＤＧＦＲの阻害剤は、イマチニブ、リンゴ酸スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｂ  ｍａｌａｔｅ）、ダサチニブ、ソラフェニブ、アキシチニブ、ＲＰＲ１２７９６３、ＣＰ−８６８５９６、タンデュチニブ（ｔａｎｄｕｔｉｎｉｂ）、モテサニブ（ｍｏｔｅｓａｎｉｂ）、レフルノミド、ＯＳＩ−９３０、ＸＬ−９９９、ＳＵ６６６８、ＣＨＩＲ−２５８、ＲＯ４３８３５９６、およびＢＩＢＦ−１１２０から選択される、請求項３の方法。
【請求項５】
ＦＧＦＲの阻害剤は、ＲＯ−４３９６６８６、ＣＨＩＲ−２５８、ＰＤ  １７３０７４、ＰＤ  １６６８６６、ＥＮＫ−８３４、ＥＮＫ−８３５、ＳＵ５４０２、ＸＬ−９９９、ＳＵ６６６８、ＣＨＩＲ−２５８、ＲＯ４３８３５９６、およびＢＩＢＦ−１１２０から選択される、請求項３の方法。
【請求項６】
患者における腫瘍または腫瘍転移を治療するための方法であって、
ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測することによって、患者のＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して考えられる反応性を診断するステップであって、腫瘍細胞により発現した上皮バイオマーカーのレベルを評価すること、腫瘍細胞により発現した間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測すること、を含み、同様のレベルの上皮および間葉バイオマーカーの共発現は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する低い感受性およびＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する高い感受性に相関し、前記上皮バイオマーカーは、上皮ケラチン１−２８および７１−８０から選択される１つ以上のケラチンを含み、前記間葉バイオマーカーは、ビメンチンである、ステップと、
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する高い感受性が予測される際、治療有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を前記患者に投与するステップ、あるいは
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する低い感受性が予測される際、治療有効量のＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤を前記患者に投与するステップと、を含む、方法。
【請求項７】
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、エルロチニブを含む、請求項６の方法。
【請求項８】
ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤は、イマチニブ、リンゴ酸スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｂ  ｍａｌａｔｅ）、ダサチニブ、ソラフェニブ、アキシチニブ、ＲＰＲ１２７９６３、ＣＰ−８６８５９６、タンデュチニブ（ｔａｎｄｕｔｉｎｉｂ）、モテサニブ（ｍｏｔｅｓａｎｉｂ）、レフルノミド、ＯＳＩ−９３０、ＸＬ−９９９、ＳＵ６６６８、ＣＨＩＲ−２５８、ＲＯ４３８３５９６、およびＢＩＢＦ−１１２０から選択される、請求項６の方法。
【請求項９】
ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ＲＯ−４３９６６８６、ＣＨＩＲ−２５８、ＰＤ  １７３０７４、ＰＤ  １６６８６６、ＥＮＫ−８３４、ＥＮＫ−８３５、ＳＵ５４０２、ＸＬ−９９９、ＳＵ６６６８、ＣＨＩＲ−２５８、ＲＯ４３８３５９６、およびＢＩＢＦ−１１２０を含む、請求項６の方法。
【請求項１０】
１つ以上の追加の抗癌剤または治療が、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤とともに、同時に、または続けて、併用投与される、請求項６の方法。
【請求項１１】
追加の抗癌剤は、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤を含む、請求項１０の方法。
【請求項１２】
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、エルロチニブを含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
上皮バイオマーカーは、ケラチン８および／またはケラチン１８を含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
上皮ケラチンは、腫瘍細胞により発現した全てまたは大部分の前記ケラチンバイオマーカーを検出する方法を使用して評価される、請求項１の方法。
【請求項１５】
上皮バイオマーカーは、ケラチン８および／またはケラチン１８を含む、請求項３の方法。
【請求項１６】
上皮ケラチンは、腫瘍細胞により発現した全てまたは大部分の前記ケラチンバイオマーカーを検出する方法を使用して評価される、請求項３の方法。
【請求項１７】
上皮バイオマーカーは、ケラチン８および／またはケラチン１８を含む、請求項６の方法。
【請求項１８】
上皮ケラチンは、腫瘍細胞により発現した全てまたは大部分の前記ケラチンバイオマーカーを検出する方法を使用して評価される、請求項６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、癌患者の診断および治療のための方法を対象とする。特に、本発明は、どの患者が受容体タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療から最も恩恵を受けるかを決定するための方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
癌とは、無秩序な増殖、分化の欠如、および局部組織に浸潤ならびに転移する能力を特徴とする、細胞悪性腫瘍の幅広い総称である。これらの新生悪性腫瘍は、程度の差は有るものの、体内のあらゆる組織および臓器に影響を与える。
【０００３】
様々な種類の癌の治療のために、多数の治療薬が過去２０から３０年間に開発されてきた。最も一般的に使用する種類の抗癌剤としては、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド）、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、葉酸拮抗薬、および５フルオロウラシル、ピリミジン拮抗薬）、微小管阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル）、ＤＮＡインタカレータ（例えば、ドキソルビシン、ダウノマイシン、シスプラチン）、およびホルモン治療（例えば、タモキシフェン、フルタミド）が挙げられる。
【０００４】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーは、分化および増殖等の細胞応答に関係する４つの密接に関係した受容体（ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４）を含む。ＥＧＦＲキナーゼ、またはそのＴＧＦ−αの過剰発現は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、腎細胞癌、膀胱癌、頭頸部癌、膠芽細胞種、および星状細胞種を含む多くの癌としばしば関連し、これらの腫瘍の悪性増殖の一因となると考えられている。ＥＧＦＲ遺伝子の特異的な欠失突然変異体（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）は、細胞腫瘍形成を促進することも発見されている。ＥＧＦＲ誘導シグナル伝達経路の活性は、例えば、増殖、血管形成、細胞運動および浸潤、アポトーシスの減少、および薬剤耐性誘導等の潜在的に癌を促進する複数のプロセスを促進する。増加したＨＥＲ１／ＥＧＦＲの発現は、進行疾患、転移、予後不良としばしば関係する。例えば、ＮＳＣＬＣおよび胃癌における増加したＨＥＲ１／ＥＧＲＦの発現は、高い転移率、低い腫瘍分化、および腫瘍増殖の増進と相関することが示されている。
【０００５】
受容体の内在性タンパク質チロシンキナーゼ活性を活性化、および／または下流シグナル伝達を増大する突然変異体は、ＮＳＣＬＣおよび膠芽細胞種内に見られる。しかしながら、例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））またはゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））等のＥＧＦ受容体阻害剤に対する感受性の授与における主な仕組みとしての突然変異体の役割が、問題となっている。最近、完全な長さのEGF受容体の突然変異型がEGF受容体チロシン・キナーゼ阻害剤ゲフィチニブに対する反応性を予測することが報告されている。（Ｐａｅｚ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１４９７−１５００、Ｌｙｎｃｈ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：２１２９−２１３９）。細胞培養研究は、ＥＧＦ受容体（すなわち、Ｈ３２５５）の突然変異型を発現する細胞株が、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤ゲフィチニブにより、増殖阻害に対してより敏感であること、および野生型ＥＧＦ受容体を発現する腫瘍細胞株を阻害するには、非常に高濃度のゲフィチニブが必要とされることを示した。これらの観測結果は、ＥＧＦ受容体の特異的突然変異型が、ＥＧＦ受容体阻害剤に対してより優れた感受性を示し得るが、完全に非反応性の表現型を同定しないことを示唆している。
【０００６】
ＥＧＦＲのキナーゼ活性を直接阻害する化合物、およびＥＧＦＲ活性を妨げることによってＥＧＦＲキナーゼ活性を減衰する抗体の抗癌剤としての使用法の開発は、熱心な研究の取り組みが行われている領域である（ｄｅ  Ｂｏｎｏ  Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｒｏｗｉｎｓｋｙ，Ｅ．Ｋ．（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ＭｏＩ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ８：Ｓ１９−Ｓ２６、Ｄａｎｃｅｙ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ，Ｅ．Ａ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ２：９２−３１３）。いくつかの研究は、一部のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、特定の他の抗癌剤または化学療法薬もしくは治療と併用する際、腫瘍細胞または新生組織形成の殺滅を向上する可能性があることを立証、開示、または示唆している（例えば、Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：７１９−７３２、Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．５５：７１３−７２３、Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ８，ｅｌ−１３、Ｇｒｕｎｗａｌｄ，Ｖ．ａｎｄ  Ｈｉｄａｌｇｏ，Ｍ．（２００３）Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９５：８５１−８６７、Ｓｅｙｍｏｕｒ  Ｌ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ４（６）：６５８−６６６、Ｋｈａｌｉｌ，Ｍ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．３：３６７−３８０、Ｂｕｌｇａｒｕ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．３：２６９−２７９、Ｄａｎｃｅｙ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ，Ｅ．Ａ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２：９２−３１３、Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６：２０５３−２０６３、および特許公開ＵＳ２００３／０１５７１０４）。
【０００７】
エルロチニブ（例えば、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）またはＯＳＩ‐７７４としても知られるエルロチニブＨＣ１）は、ＥＧＦＲキナーゼの経口で利用可能な阻害剤である。生体外において、エルロチニブは、結腸直腸癌および乳癌を含むいくつかのヒト癌細胞株におけるＥＧＦＲキナーゼに対して、相当な阻害活性を呈し（Ｍｏｙｅｒ  Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４８３８）、前臨床評価は、いくつかのＥＧＦＲを示しているヒト癌異種移植片に対する活性を呈している（Ｐｏｌｌａｃｋ，Ｖ．Ａ．ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９１：７３９）。さらに最近、エルロチニブは、頭頸部癌（Ｓｏｕｌｉｅｒｅｓ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：７７）、ＮＳＣＬＣ（Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０：３１０ａ，ａｂｓｔｒａｃｔ１２３５）、ＣＲＣ（Ｏｚａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：１９６ａ，ａｂｓｔｒａｃｔ７８５）、およびＭＢＣ（Ｗｉｎｅｒ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．７６：５１１５ａ，ａｂｓｔｒａｃｔ４４５）を含む数々の兆候における第Ｉ相および第ＩＩ層試験において、有望な活性を呈している。第ＩＩＩ相試験において、エルロチニブ単一治療は、進行した治療難治性のＮＳＣＬＣを有する患者の生存期間を有意に延長し、疾患の進行を有意に遅延し、肺癌に関連する症状の悪化を有意に遅延した（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２２：１４Ｓ（Ｊｕｌｙ  １５  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ａｂｓｔｒａｃｔ７０２２）。エルロチニブの臨床試験データの多くが、ＮＳＣＬＣにおけるそれの使用と関係する一方、第Ｉ相および第ＩＩ層研究から得られた予備段階の結果は、ＣＲＣ（Ｏｚａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：１９６ａ，ａｂｓｔｒａｃｔ７８５）およびＭＢＣ（Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：４５ａ，ａｂｓｔｒａｃｔ１８０）を含む幅広い固形癌種を有する患者におけるエルロチニブおよびカペシタビン／エルロチニブの併用治療に対する有望な活性を呈している。少なくとも１つの従来の化学療法レジメンに失敗後、２００４年１１月、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、局所的に進行した、または転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者の治療に、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）を認可した。ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）部類中、第ＩＩＩ相臨床試験において、進行したＮＳＣＬＣ患者の生存期間を延長した唯一の薬剤である。
【０００８】
抗新生物薬は、理想的には、非悪性細胞に対するその毒性に相対する、幅広い治療指数を用いて、癌細胞を選択して殺滅する。またこれは、長期間に渡り薬剤にさらされた後でも、悪性細胞に対するその有効性も保持する。あいにく、現行の化学療法には、そのような理想的なプロファイルを有するものはない。それどころか、ほとんどは、非常に限られた治療指標を有する。さらに、わずかに亜致死濃度の化学療法薬にさらされた癌細胞は、非常に多くの場合、そのような薬剤に対する抵抗性、さらにかなり頻繁にいくつかの他の抗新生物薬に対する交差耐性を発現する。さらに、任意の癌種類において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤等のより新規の遺伝子を標的とした治療を用いても、どの患者が特定の治療に応答する可能性が高いかを予測できない場合が多いため、多くの場合、患者にかなりの危険性と不快を与え、最も有効な治療を見つけるために、かなりの試行錯誤を余儀なくさせる。
【０００９】
従って、新生組織形成および他の増殖性疾患により有効な治療、およびどの腫瘍がどの治療に応答するかを決定する、より有効な方法が必要である。従来の薬剤の治療効果を向上するための戦略は、それらの投与計画の変更、および他の抗癌剤または生化学的修飾薬との併用におけるそれらの使用も伴う。併用療法は、各薬剤を単独で使用した場合の治療的に相当する投与量を使用した場合と比較し、より優れた有効性および副作用の低減をもたらす方法として公知である。時には、薬剤併用の有効性は、付加的（併用の有効性は、各薬剤の単独の効果の合計にほぼ等しい）であるが、時には、効果は相乗的（併用の有効性は、各薬剤が単独で投与された場合の効果の合計よりも優れている）である。
【００１０】
エルロチニブ等の標的特異性の治療的アプローチは、一般的に、従来の細胞毒性薬と比較し、毒性の減少を伴い、従って、併用療法の使用に役立つ。ベバシズマブ（Ｍｉｎｉｎｂｅｒｇ，Ｅ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：６２７ａ，ａｂｓｔｒａｃｔ２５２１）およびゲムシタビン（Ｄｒａｇｏｖｉｃｈ，Ｔ．，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：２２３ａ，ａｂｓｔｒａｃｔ８９５）を併用したエルロチニブの第Ｉ／ＩＩ相研究で、有望な結果が認められている。ＮＳＣＬＣ第ＩＩＩ相試験の最近のデータは、標準化学療法と併用した際の第１選択のエルロチニブ、またはゲフィチニブが、生存期間を向上しなかったことを示している（Ｇａｔｚｅｍｅｉｅｒ，Ｕ．，（２００４）Ｐｒｏｃ．Ａｍ，Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：６１７（Ａｂｓｔｒａｃｔ７０１０）、Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．，（２００４）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：６１７（Ａｂｓｔｒａｃｔ７０１１）、Ｇｉａｃｃｏｎｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：７７７、Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：７８５）。
【００１１】
しかしながら、膵臓癌第ＩＩＩ相試験は、ゲムシタビンと併用した際の第１選択エルロチニブが、生存期間を向上したことを示している（ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｐｒｅｓｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ，９／２０／０４）。
【００１２】
いくつかのグループは、ＥＧＦＲ阻害剤に対する患者の応答を予測するために、可能性のあるバイオマーカーを研究している（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０６３７０９、ＷＯ２００５／０１７４９３、ＷＯ２００４／１１１２７３、ＷＯ２００４／０７１５７２、ＷＯ２００５／１１７５５３、およびＷＯ２００５／０７００２０、米国特許出願公開ＵＳ２００５／００１９７８５、ＵＳ２００４／０１３２０９７を参照されたい）。しかしながら、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた患者の治療において、開業医を誘導し得る、診療または予後検査は、未だに出現していない。
【００１３】
線維芽細胞増殖因子のシグナルカスケードは、４つの膜貫通チロシンキナーゼ受容体（ＦＧＦＲ１−４）および少なくとも２０の異なるリガンドから成り、非常に複雑かつ文脈依存のシグナル軸を提供する。この受容体を通してシグナルは、ＭＡＰキナーゼおよびＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を含む、細胞の生存および増殖の複数の重要なレギュレータを活性化する（Ｏｒｎｔｉｚ，．ＤＭ．ａｎｄ  Ｉｔｏｈ，Ｎ．（２００１）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２：３００５）。ＦＧＦＲシグナルが、癌の発生および進行において役割を果たすことを示す膨大なデータがある。ＦＧＦ受容体は、様々な異なる固体腫瘍に由来する複数の異なる癌細胞株に過剰発現する（Ｃｈａｎｄｌｅｒ，ＬＡ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）ｈｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：４５１）。これらの細胞株内の本経路の機能阻害は、優性阻害受容体の過剰発現によって（Ａｏｋｉ，Ｔ．．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２１：６２９）、またはｓｉＲＮＡもしくはアンチセンスノックダウン法によって（Ｅｓｔｅｓ  Ｌｉ，ＮＲ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．１５：１４０７、Ｙａｍａｄａ，ＳＭ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｇｌｉａ  ２８：６６）、腫瘍細胞の増殖および発癌の可能性を阻害した。これらの体外観察と一致して、腫瘍組織切片の多重免疫組織化学的染色は、乳癌（Ｗｕｌｆｉｎｇ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９２：１７２０）、前立腺癌（Ｇｉｒｉ，ＤＦ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：１０６３）、およびＮＳＣＬＣ癌（ＶｏＩｍ，ＭＲ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３３：６９１）患者において、ＦＧＦ受容体の高発現を示している。さらに、高いＦＧＦＲ１の発現は、ＮＳＣＬＣ癌（ＶｏＩｍ，ＭＲ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３３：６９１）および膵臓癌（Ｏｈｔａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７２：８２４）患者において、低い生存率の予測であることを示した。これらの観察をさらに支持して、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｔｕｄｌｏｗおよび同僚たちは、５０の異なる受容体チロシンキナーゼの一団と比較する際、ＦＧＦＲ１発現が、ＮＳＣＬＣにおいて低い生存率を予測する最善のものの１つであることを観察した（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｔｉｄｏｗ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：１７７８）。これらの観察は、さらに進行した転移癌において、ＦＧＦ受容体の潜在的な役割と一致する。
【００１４】
この文脈において、ＦＧＦＲシグナルは、癌細胞が、さらに侵襲性であり、転移を開始するプロセスである、上皮間葉転換（ＥＭＴ）に関与していることを指摘することは、興味深い。ＦＧＦシグナルは、マウスの成長において、ＳＮＡＩＬおよびＥカドヘリン値の重要なレギュレータであり（Ｃｉｒｕｎａ，Ｂ．ａｎｄ  Ｒｏｓｓａｎｔ，Ｊ．（２００１）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  １：３７）、腫瘍細胞内のＥＭＴを誘発することも示されている（Ｖａｌｌｅｓ，ＡＭ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＰＮＡＳ  ８７：１１２４）。ＴＧＦβとともに、ＦＧＦ−２は、尿細管上皮細胞において、ＥＭＴを誘発することを示した（Ｓｔｒｕｔｚ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４６：１１４５）。最も興味深いことは、ＦＧＦ−２とＮカドヘリン発現の組み合わせにより、通常、弱々しい変型乳癌細胞株ＭＣＦ７の転移能力が増大したことである（Ｈａｚａｎ，ＲＢ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４８：７７９）。全体として見ると、これらの結果は、ＦＧＦＲシグナルが、ＥＭＴを促進するための癌の進行の役割を潜在的に通して、癌の進行に重要な役割を果たし、結果として、腫瘍細胞の転移を示す。
【００１５】
ＰＤＧＦ受容体シグナルネットワークは、ホモまたはヘテロニ量化することができる、２つの受容体（ＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβ）、ならびに４つのリガンド（ＰＤＧＦ  Ａ−Ｄ）から成り、それらはまた、ホモまたはヘテロニ量化し、異なる受容体二量体を特異的に活性化する（Ｐｉｅｔｒａｓ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：４３９）。これらの受容体のリガンド占拠は、ＲａｓおよびＰＩ３Ｋを含む、複数の異なる細胞内シグナル伝達経路の活性化をもたらす（Ｙｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．３６：４９）。ＰＤＧＦＲによる異常シグナルは、癌の発生および進行に関係している。ＰＤＧＦＲβ遺伝子の増幅は、高悪性神経膠腫（Ｆｌｅｍｍｉｎｇ，ＴＰ．ｅｔ  ａｌ．．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４５５０）に関係し、ＰＤＧＦＲβ遺伝子を伴う遺伝子融合は、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）において報告されている（Ｇｏｌｕｂ，ＴＲ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７７：３０７）。ＰＤＧＦＲα遺伝子における活性化点突然変異および欠失もまた、ＧＩＳＴ患者において報告されている（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ，ＭＣ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：７０８）。さらに、ＰＤＧＦリガンドの発現増加を通して、オートクリンＰＤＧＦＲシグナルの増加は、多数のグリオーマ細胞株において重要であることが報告されている（Ｓｈａｍａｈ，ＳＭ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：７２０３）。オートクリンＰＤＧＦＲはまた、卵巣癌（Ｍａｔｅｉ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５：２０６０）および乳房癌（Ｊｅｃｈｌｉｎｇｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：１５６１）等の上皮性起源の腫瘍の進行および転移を促進するのに重要であることも報告されている。
【００１６】
これらの情報は、原発腫瘍生物学においてＰＤＧＦ受容体に対する役割を支持する証拠となるが、癌においてこれらの受容体に対する重要な役割は、パラクリンシグナルを通して腫瘍微環境の調節にある。ＰＤＧＦＲは、間葉性系統の細胞に古典的に限定されるため、結合組織線維芽細胞において発現する。腫瘍細胞からのＰＤＧＦリガンドの発現は、血管新生の原発腫瘍の発生および促進へと導く、間質細胞を発現するＰＤＧＦＲに対して、化学誘引物質とマイトジェンの両方として役割を果たす。例えば、ＮＳＣＬＣ細胞株Ｃａｌｕ６の増殖は、異種移植設定において、マウス間質細胞の採用によって原発腫瘍増殖をサポートするＰＤＧＦ−ＡＡの腫瘍細胞産生に依存していた（Ｔｅｊａｄａ，ＭＬ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１２：２６７６）。さらに、進行した乳癌においてパラクリンＰＤＧＦＲシグナルの潜在的重要性は、ＰＤＧＦ−ＢＢリガンド発現が、腫瘍上皮細胞に限定され、それは、主に、高レベルのＰＤＧＦ受容体を発現した腫瘍に隣接した間質細胞であったという観察によって示唆された（Ｃｏｌｔｒｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。したがって、ＰＤＧＦＲによって媒介されたパラクリンシグナルは、原発腫瘍増殖および遠隔臓器部位における転移の構築をサポートする条件を可能にする微環境を調整する際に重要であり得る。
【００１７】
別の興味深い、関連した、ＰＤＧＦＲ生物学の態様は、ＥＭＴに関与していることである。ＰＤＧＦを伴う、上皮結腸直腸癌細胞株、ＨＴ２９の処置は、全ＥＭＴの全ての特質を誘発した（Ｙａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ  １２７：１３９）。さらに、ＴＧＦβで刺激されたマウス上皮細胞は、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、およびＰＤＧＦ−ＡＡの発現の著しい増加を示す。この軸を通るシグナルは、間葉状表現型を維持するのに重要であった（Ｊｅｃｈｌｉｎｇｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：１５６１）。総合すれば、これらのデータは、オートクリンまたはパラクリン的方法のいずれかにおいてＰＤＧＦＲシグナルは、多くの異なる癌型の発生および進行に重要な役割を果たすことを示す。これらは、適切な腫瘍微環境を提供するための間質細胞の採用および血管新生の促進、ならびに腫瘍進行および転移を促進するためのＥＭＴの刺激および維持を含む。
【００１８】
ほとんどの癌の転移中、重要な変化は、上皮間葉移行（ＥＭＴ）として公知の腫瘍細胞において生じる（Ｔｈｉｅｒｙ，Ｊ．Ｐ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：４４２−４５４、Ｓａｖａｇｎｅｒ，Ｐ．（２００１）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２３：９１２−９２３、Ｋａｎｇ  Ｙ．ａｎｄ  Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．（２００４）Ｃｅｌｌ  １１８：２７７−２７９、Ｊｕｌｉｅｎ−Ｇｒｉｌｌｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：２１７２−２１７８、Ｂａｔｅｓ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：１７２１−１７２７、Ｌｕ  Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．４（６）：４９９−５１５））。ともに堅く結合し、極性を示す上皮細胞は、ともにさらに緩く結合し、極性の欠失を示し、移動能力を有する間葉細胞を生み出す。これらの間葉細胞は、原発腫瘍を取り囲む組織に浸透し、腫瘍から離れ、血液およびリンパ管に浸潤し、それらが分裂し、さらなる腫瘍を形成する新規の位置まで移動することができる。ＥＭＴは、胚形成中を除く、正常な細胞に生じない。正常な状況下で、ＴＧＦ−βは、増殖阻害剤としての役割を果たす。しかしながら、癌転移中、ＴＧＦ−βは、ＥＭＴを促進し始めることが考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１５７１０４号
【特許文献２】国際公開第２００４／０６３７０９号
【特許文献３】国際公開第２００５／０１７４９３号
【特許文献４】国際公開第２００４／１１１２７３号
【特許文献５】国際公開第２００４／０７１５７２号
【特許文献６】国際公開第２００５／１１７５５３号
【特許文献７】国際公開第２００５／０７００２０号
【特許文献８】米国特許出願公開第２００５／００１９７８５号
【特許文献９】米国特許出願公開第２００４／０１３２０９７号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｐａｅｚ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４：１４９７−１５００
【非特許文献２】Ｌｙｎｃｈ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：２１２９−２１３９
【非特許文献３】ｄｅ  Ｂｏｎｏ  Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｒｏｗｉｎｓｋｙ，Ｅ．Ｋ．（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ＭｏＩ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ８：Ｓ１９−Ｓ２６
【非特許文献４】Ｄａｎｃｅｙ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ，Ｅ．Ａ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ２：９２−３１３
【非特許文献５】Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：７１９−７３２
【非特許文献６】Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．５５：７１３−７２３
【非特許文献７】Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ８，ｅｌ−１３
【非特許文献８】Ｇｒｕｎｗａｌｄ，Ｖ．ａｎｄ  Ｈｉｄａｌｇｏ，Ｍ．（２００３）Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９５：８５１−８６７
【非特許文献９】Ｓｅｙｍｏｕｒ  Ｌ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ４（６）：６５８−６６６
【非特許文献１０】Ｋｈａｌｉｌ，Ｍ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．３：３６７−３８０
【非特許文献１１】Ｂｕｌｇａｒｕ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．３：２６９−２７９
【非特許文献１２】Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６：２０５３−２０６３
【非特許文献１３】Ｍｏｙｅｒ  Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４８３８
【非特許文献１４】Ｐｏｌｌａｃｋ，Ｖ．Ａ．ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９１：７３９
【非特許文献１５】Ｓｏｕｌｉｅｒｅｓ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：７７
【非特許文献１６】Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０：３１０ａ，ａｂｓｔｒａｃｔ１２３５
【非特許文献１７】Ｏｚａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：１９６ａ，ａｂｓｔｒａｃｔ７８５
【非特許文献１８】Ｗｉｎｅｒ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．７６：５１１５ａ，ａｂｓｔｒａｃｔ４４５
【非特許文献１９】Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２２：１４Ｓ（Ｊｕｌｙ  １５  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ａｂｓｔｒａｃｔ７０２２
【非特許文献２０】Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：４５ａ，ａｂｓｔｒａｃｔ１８０
【非特許文献２１】Ｍｉｎｉｎｂｅｒｇ，Ｅ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：６２７ａ，ａｂｓｔｒａｃｔ２５２１
【非特許文献２２】Ｄｒａｇｏｖｉｃｈ，Ｔ．，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：２２３ａ，ａｂｓｔｒａｃｔ８９５
【非特許文献２３】Ｇａｔｚｅｍｅｉｅｒ，Ｕ．，（２００４）Ｐｒｏｃ．Ａｍ，Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：６１７（Ａｂｓｔｒａｃｔ７０１０）
【非特許文献２４】Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．，（２００４）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：６１７（Ａｂｓｔｒａｃｔ７０１１）
【非特許文献２５】Ｇｉａｃｃｏｎｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：７７７
【非特許文献２６】Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：７８５
【非特許文献２７】ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｐｒｅｓｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ，９／２０／０４
【非特許文献２８】Ｏｒｎｔｉｚ，．ＤＭ．ａｎｄ  Ｉｔｏｈ，Ｎ．（２００１）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２：３００５
【非特許文献２９】Ｃｈａｎｄｌｅｒ，ＬＡ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）ｈｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：４５１
【非特許文献３０】Ａｏｋｉ，Ｔ．．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２１：６２９
【非特許文献３１】Ｅｓｔｅｓ  Ｌｉ，ＮＲ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．１５：１４０７
【非特許文献３２】Ｙａｍａｄａ，ＳＭ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｇｌｉａ  ２８：６６
【非特許文献３３】Ｗｕｌｆｉｎｇ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９２：１７２０
【非特許文献３４】Ｇｉｒｉ，ＤＦ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：１０６３
【非特許文献３５】ＶｏＩｍ，ＭＲ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３３：６９１
【非特許文献３６】Ｏｈｔａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７２：８２４
【非特許文献３７】Ｍｕｌｌｅｒ−Ｔｉｄｏｗ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：１７７８
【非特許文献３８】Ｃｉｒｕｎａ，Ｂ．ａｎｄ  Ｒｏｓｓａｎｔ，Ｊ．（２００１）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  １：３７
【非特許文献３９】Ｖａｌｌｅｓ，ＡＭ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＰＮＡＳ  ８７：１１２４
【非特許文献４０】Ｓｔｒｕｔｚ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４６：１１４５
【非特許文献４１】Ｈａｚａｎ，ＲＢ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４８：７７９
【非特許文献４２】Ｐｉｅｔｒａｓ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：４３９
【非特許文献４３】Ｙｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．３６：４９
【非特許文献４４】Ｆｌｅｍｍｉｎｇ，ＴＰ．ｅｔ  ａｌ．．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４５５０
【非特許文献４５】Ｇｏｌｕｂ，ＴＲ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７７：３０７
【非特許文献４６】Ｈｅｉｎｒｉｃｈ，ＭＣ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：７０８
【非特許文献４７】Ｓｈａｍａｈ，ＳＭ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：７２０３
【非特許文献４８】Ｍａｔｅｉ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５：２０６０
【非特許文献４９】Ｊｅｃｈｌｉｎｇｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：１５６１
【非特許文献５０】Ｔｅｊａｄａ，ＭＬ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１２：２６７６
【非特許文献５１】Ｙａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ  １２７：１３９
【非特許文献５２】Ｊｅｃｈｌｉｎｇｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：１５６１
【非特許文献５３】Ｔｈｉｅｒｙ，Ｊ．Ｐ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：４４２−４５４
【非特許文献５４】Ｓａｖａｇｎｅｒ，Ｐ．（２００１）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２３：９１２−９２３
【非特許文献５５】Ｋａｎｇ  Ｙ．ａｎｄ  Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．（２００４）Ｃｅｌｌ  １１８：２７７−２７９
【非特許文献５６】Ｊｕｌｉｅｎ−Ｇｒｉｌｌｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：２１７２−２１７８
【非特許文献５７】Ｂａｔｅｓ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：１７２１−１７２７
【非特許文献５８】Ｌｕ  Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．４（６）：４９９−５１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
したがって、任意の所与の癌患者のための治療の最良なモードを決定し、このような阻害剤を、単剤として、または他の抗癌剤と併用して使用するかにかかわらず、そのような決定を癌患者のためのさらに有効な治療レジメンへ取り組むための改良された方法の必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、ＥＧＦＲキナーゼ、ＰＤＧＦＲキナーゼ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による癌患者の治療効果を予測するための診断および予後診断方法を提供する。ＥＭＴを行った後、腫瘍細胞は、間葉状であるが、依然として、上皮および間葉細胞の両方の特徴を発現し、このような細胞が、受容体タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤による阻害に対する感受性を変化させ、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する比較的感受性が低くなるが、しばしば、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲ等の他の受容体タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を得るという驚くべき知見に基づいて、このような「ハイブリッド」腫瘍細胞を同定する（例えば、ビメンチンおよび上皮ケラチンの共発現の決定）、ひいては、ＥＧＦＲキナーゼ、ＰＤＧＦＲキナーゼ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する腫瘍の考えられる感受性を予測する方法が、特異的上皮および間葉バイオマーカーのレベルを決定するために考案された。
【００２３】
従って、本発明は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害への腫瘍細胞増殖の感受性を予測するための方法を提供し、腫瘍細胞により発現した上皮バイオマーカーのレベルを評価すること、腫瘍細胞により発現した間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測すること、を含み、同様のレベルの上皮および間葉バイオマーカーの共発現は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する低い感受性と相関し（または、低い感受性を予測し）、該上皮バイオマーカーは、該上皮ケラチン１−２８および７１−８０から選択される１つ以上のケラチンを含み、該間葉バイオマーカーは、ビメンチンである。一実施形態において、該上皮ケラチンは、（例えば、多または汎特異抗体を使用することにより）該腫瘍細胞により発現した全てまたは大部分（すなわち、５０％以上）の該ケラチンバイオマーカーを検出する方法を使用して評価される。別の実施形態において、該上皮バイオマーカーは、ケラチン８および／またはケラチン１８を含む。
【００２４】
本発明はまた、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測するための方法も提供し、腫瘍細胞により発現した上皮バイオマーカーのレベルを評価すること、腫瘍細胞により発現した間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測すること、を含み、同様のレベルの上皮および間葉バイオマーカーの共発現は、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する高い感受性と相関し（または、高い感受性を予測し）、該上皮バイオマーカーは、該上皮ケラチン１−２８および７１−８０から選択される１つ以上のケラチンを含み、該間葉バイオマーカーは、ビメンチンである。一実施形態において、該上皮ケラチンは、（例えば、多または汎特異抗体を使用することにより）該腫瘍細胞により発現した全てまたは大部分（すなわち、５０％以上）の該ケラチンバイオマーカーを検出する方法を使用して評価される。別の実施形態において、該上皮バイオマーカーは、ケラチン８および／またはケラチン１８を含む。
【００２５】
上記の方法を取り入れるＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた癌患者を治療するための改善された方法も提供する。したがって、本発明は、患者における腫瘍または腫瘍転移を治療するための方法をさらに提供し、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測することによって、患者のＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する考えられる反応性を診断するステップであって、腫瘍細胞により発現した上皮バイオマーカーのレベルを評価すること、腫瘍細胞により発現した間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測すること、を含み、同様のレベルの上皮および間葉バイオマーカーの共発現は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する低い感受性と、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する高い感受性とに相関し（または、それらを予測し）、該上皮バイオマーカーは、該上皮ケラチン１−２８および７１−８０から選択される１つ以上のケラチンを含み、該間葉バイオマーカーは、ビメンチンである、ステップと、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する高い感受性が予測される際、治療有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を該患者に投与するステップ、あるいはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する低い感受性が予測される際、治療有効量のＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤を前記患者に投与するステップと、を含む。本方法の一実施形態において、１つ以上の追加の抗癌剤または治療は、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤とともに、同時に、または続けて、併用投与し得る。該追加の抗癌剤または治療は、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤、あるいは他の細胞毒性薬、化学療法薬、抗ホルモン剤、抗血管形成剤、抗増殖剤、プロアポートシス、抗ＨＥＲ２、放射線または放射性医薬品、シグナル伝達阻害剤のいずれか、あるいは本明細書に記載の他の抗癌剤、または治療を含み得る。上記の方法の一実施形態において、該上皮ケラチンは、（例えば、多または汎特異抗体を使用することにより）該腫瘍細胞により発現した全てまたは大部分（すなわち、５０％以上）の該ケラチンバイオマーカーを検出する方法を使用して評価される。別の実施形態において、該上皮バイオマーカーは、ケラチン８および／またはケラチン１８を含む。
【００２６】
上記の方法のいずれかの望ましい一実施形態において、該ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、エルロチニブを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＮＳＣＬＣにおけるＰＤＧＦシグナル伝達経路の上方調節。総ＲＮＡは、示したＮＳＣＬＣ細胞株から単離した。ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤＧＦａ、およびＰＤＧＦｂの発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。データは、それぞれの細胞株においてＧＡＰＤＨ発現において修正し、相対的発現（任意の単位）としてプロットした。
【図２】間葉状ＮＳＣＬＣにおける、増大したＰＤＧＦ受容体発現。タンパク質抽出物は、示したＮＳＣＬＣ細胞株から調製した。溶解物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に移転させた。該膜は、抗ＰＤＧＦＲα抗体または抗ＰＤＧＦＲβ抗体をプローブとして用いて精査した。
【図３】ＮＳＣＬＣにおけるＰＤＧＦＲ活性の阻害。Ａ．Ｈ１７０３細胞は、ＰＤＧＦＲ阻害剤１（ＯＳＩ−９３０）（■）、ＰＤＧＦＲ阻害剤２（▲）、またはＥＧＦＲ阻害剤（エルロチニブ）（▼）の増加する濃度で処理した。７２時間のインキュベーション後、細胞の増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｒｅＧｌｏ分析により測定し、未処理の細胞と比較して増殖率としてプロットした。Ｂ．Ｈ１７０３細胞は、２時間、ＰＤＧＦＲ阻害剤ＯＳＩ−９３０で処理し、その後、１５分間、ＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で未処理または処理した。タンパク質抽出物を、調製し、示した抗体をプローブとして用いて免疫ブロットを精査した。Ｃ．Ｈ１７０３およびＣａｌｕｌ細胞は、１μＭまたは５μＭのＰＤＧＦＲ阻害剤ＯＳＩ−９３０で処理し、創傷の閉塞における効果を、２４時間後、分析した。
【図４】ＮＳＣＬＣにおけるＦＧＦＲシグナル伝達経路の上方調節。総ＲＮＡは、示したＮＳＣＬＣ細胞株から単離した。ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２の発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。データは、それぞれの細胞株においてＧＡＰＤＨ発現において修正し、相対的発現（任意の単位）としてプロットした。
【図５】ＮＳＣＬＣにおけるＦＧＦＲ受容体発現。タンパク質抽出物は、示したＮＳＣＬＣ細胞株から調製した。溶解物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に移転させた。該膜は、抗ＦＧＦＲ２、抗ＦＧＦＲ３、または抗ＦＧＦＲ４抗体をプローブとして用いて精査した。
【図６】ＮＳＣＬＣにおけるＦＧＦＲ活性の阻害。Ａ．Ｈ１７０３（■）、Ｃａｌｕｌ（▲）、およびＨ２２６（▼）細胞は、ＦＧＦＲ阻害剤（ＰＤ１７３０７４）の増加する濃度で処理した。７２時間のインキュベーション後、細胞の増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｒｅＧｌｏ分析により測定し、未処理の細胞と比較して増殖率としてプロットした。
【図７】Ｈ１７０３およびＨ２２６  ＮＳＣＬＣ細胞におけるＦＧＦＲシグナルの阻害。Ｈ１７０３およびＨ２２６細胞は、２時間、１μＭまたは１０μＭのＰＤ１７３０７４で処理し、その後、１５分間、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦで未処理（ＣＯＮ）または処理した（ＦＧＦ）。細胞溶解物を調製し、ｐＥＲＫ、総ＥＲＫ、ｐＡＫＴ（ｓｅｒ４７３）、総ＡＫＴ、およびβアクチンに対する抗体を使用して、免疫ブロットを実施した。
【図８】ＴＧＦβで処理したＨ３５８細胞における、遺伝子発現の変化。総ＲＮＡは、ＴＧＦβ３で処理したＨ３５８およびＨ３５８細胞に対して単離した（１４日）。示した遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって分析し、データは、それぞれの細胞株においてＧＡＰＤＨ発現において修正した。データは、未処理のＨ３５８細胞と比較してＴＧＦβ処理されたＨ３５８細胞の倍率変化として示す。
【図９】生体内のエルロチニブに対するＮＳＣＬＣ細胞株の感受性。雌ＣＤ−１  ｎｕ／ｎｕマウスに、Ｈ２９２またはＣａｌｕ６細胞をインプラントし、腫瘍を２００ｍｍ３まで増殖させた。その後、マウスを、１４日間、１日に１回、１００ｍｇ／ｋｇのエルロチニブで、未処理または処理した。腫瘍容積を、１週間に２回測定した。
【図１０】ＮＳＣＬＣ異種移植切片の多重免疫組織化学的染色。Ｃａｌｕ６およびＨ２９２細胞を使用して、ヌードマウスの腫瘍を増殖させた。腫瘍を採取し、切片を切断する前に、パラホルムアルデヒドに保存した。個々の切片を、ＤＡＰＩ（左下）および抗サイトカイン（左上）、ならびに抗Ｅカドヘリンまたは抗ビメンチン抗体（右上）で染色した。全ての３つの染色の合併した表現を、右下のパネルに示す。
【図１１】ヒトＮＳＣＬＣ組織の多重染色。ＮＳＣＬＣ患者生検サンプルを、パラフィン包埋し、切片を切断し、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を生成した。該ＴＭＡを、サイトケラチンおよびビメンチンに対する抗体で染色し、示した画像は、両方の染色の合併した画像である。矢印で示したエリアは、サイトケラチンおよびビメンチンの共発現を示す、両方の抗体染色の重複の選択された領域である。
【図１２】間葉状のＮＳＣＬＣ細胞株におけるサイトケラチンおよびビメンチン。Ａ．タンパク質抽出物は、示したＮＳＣＬＣ細胞株から調製し、示した抗体を用いて免疫ブロットを実行した。エルロチニブの感受性が低い細胞株（Ｈ１７０３、Ｈ２３、およびＨｏｐ９２）は、サイトカイン８／１８とビメンチンの両方を発現する。Ｂ．Ａに示したウエスタンブロットのグラフ表示。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
動物における「癌」という用語は、無制御増殖、不死、転移能力、急速な成長および増殖率、および特定の形態機能等の癌を誘発する細胞に特有の特徴を有する、細胞の存在を指す。多くの場合、癌細胞は、腫瘍の形態であるが、そのような細胞は、動物体内に単独で存在すること、または白血病細胞等のように、独立細胞として血流中を循環することがあり得る。
【００２９】
本明細書で使用する「異常細胞増殖」は、別途指示がない限り、正常な調節メカニズムとは独立な細胞の増殖を意味する（例えば、接触阻害の喪失）。これは、（１）突然変異型のチロシンキナーゼの発現または受容体チロシンキナーゼの過剰発現により増殖する腫瘍細胞（腫瘍）、（２）異常チロシンキナーゼ活性が発現する他の増殖性疾患の良性および悪性細胞、（４）受容体チロシンキナーゼにより増殖するすべての腫瘍、（５）異常セリン／トレオニンキナーゼ活性により増殖するすべての腫瘍、および（６）異常セリン／トレオニンキナーゼ活性が発現する他の増殖性疾患の良性ならびに悪性細胞の異常増殖を含む。
【００３０】
本明細書で使用する「治療する」は、別途指示がない限り、患者における腫瘍の増殖、腫瘍転移の増加、または他の癌を誘発する、あるいは新生細胞の増殖を、部分的に、または完全に逆転、軽減、進行の阻害、または予防することを意味する。本明細書で使用する「治療」という用語は、別途指示がない限り、治療行為を指す。
【００３１】
「治療法」という用語、またはそれに相当する用語は、例えば、癌に適用する際、動物体内の多数の癌細胞減少または排除すること、または癌の症状を緩和することを目的とする手順または一連の行為を示す。癌または別の増殖性疾患の「治療法」は、必ずしも癌細胞または他の疾患が、事実上排除されること、多数の細胞または疾患が、事実上減少すること、または癌あるいは他の疾患の症状が、事実上緩和されることを必ずしも意味する必要はない。多くの場合、癌治療法は、成功の可能性は低いが、動物の病歴および生存の見込みを考慮し、それでも全般的に有益な一連の行為と見なされた場合に、実行する。
【００３２】
「治療効果のある薬剤」という用語は、研究者、獣医、医師、または他の臨床関係者が模索している、組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医療的反応、を誘発する組成物を意味する。
【００３３】
「治療効果のある治療量」または「有効量」という用語は、研究者、獣医、医師、または他の臨床関係者が模索している、組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医療的反応、を誘発する対象化合物または組み合わせの量を意味する。
【００３４】
本明細書で使用する「血小板由来増殖因子」または「ＰＤＧＦ」という用語は、２つの関連した受容体チロシンキナーゼである、［α］−受容体（ＰＤＧＦＲ−［α］）および［β］−受容体（ＰＤＧＦＲ−［β］）への結合を介する活性、およびそれらのニ量化をもたらす、Ａ−鎖（ＰＤＧＦ−Ａ）およびＢ−鎖（ＰＤＧＦ−Ｂ）のホモまたはヘテロダイマーを含むポリペプチドファミリーのメンバーを指す。それはまた、ダイマーとしても機能する、ＰＤＧＦＲ複合体に対する２つのプロテアーゼで活性化されたリガンドである、ＰＤＧＦ−ＣおよびＰＤＧＦ−Ｄも含む（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，（２０００）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：３０２−９、Ｂｅｒｇｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ，（２００１）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：５１２−６、およびＵｕｔｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ，（２００１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：２２４２−４７を参照）。
【００３５】
本明細書で使用する「ＰＤＧＦ受容体」および「ＰＤＧＦＲ」という用語は、細胞表面ＰＤＧＦ結合タンパク質を指す。高親和性を有するＰＤＧＦを結合する２つのタンパク質は、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βと同定されている（Ｈｅｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７８：３６６４、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：５８６７）。両方の種は、５つの免疫グロブリン様細胞外ドメイン、単一膜貫通ドメイン、およびキナーゼ挿入ドメインにより分けられる細胞内チロシンキナーゼドメインを含み、結合ＰＤＧＦ上にホモまたはヘテロダイマーを形成することができる。ＰＤＧＦＲの異なるリガンド結合特異性のため、ＰＤＧＦＲ−［α］［α］は、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、およびＰＤＧＦ−ＣＣを結合し、ＰＤＧＦＲ−［β］［β］は、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＤＤを結合するのに対して、ＰＤＧＦＲ−［α］［β］は、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、およびＰＤＧＦ−ＤＤを結合することが知られている（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ，（２００１）ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ２３：４９４−５０７を参照）。
【００３６】
本明細書で使用する「線維芽細胞増殖因子」または「ＦＧＦ」は、増殖、分化、移動、形態形成、組織維持、創傷治癒や修復を含む、様々な細胞過程の重要なレギュレータであるポリペプチドファミリーのメンバーを指す（Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０６：１２１−１３３、Ｃｕｅｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５６：６１１−６１８、Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｗ．Ｈ．ａｎｄ  Ｍａｃｉａｇ，Ｔ（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：５７５−６０６、Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ，Ｄ．（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０９：１−６）。ＦＧＦファミリーは、現在、少なくとも２０の構造的および機能的に関連したタンパク質を含み、これには、それぞれ、酸性および塩基性ＦＧＦ、ＦＧＦ−Ｉ、およびＦＧＦ−２、ｉｎｔ２（ＦＧＦ−３）、ｈｓｔ（ＦＧＦ−４）、ＦＧＦ−５、ｈｓｔ２（ＦＧＦ−６）、ケラチノサイト増殖因子（ＦＧＦ−７）、アンドロゲン誘発性増殖因子（ＦＧＦ−８）、グリア活性化因子（ＦＧＦ−９）、ＦＧＦ−１０−１９を含む（Ｇａｌｚｉｅ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７５：６６９−６８５、Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７１：１５９１８−１５９２１、Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９３：９８５０−９８５７、ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２４：３２２１−３２３２、Ｈｏｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２４４：１８７−１９１、Ｈｕ，Ｍ．Ｃ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８：６０６３−６０７４、およびＮｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ，１４４４：１４８−１５１）。望ましくは、ＦＧＦという用語は、それぞれ、酸性および塩基性ＦＧＦ、ＦＧＦ−Ｉ、およびＦＧＦ−２を指す（（Ｇａｌｚｉｅ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７５：６６９−６８５およびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｗ．Ｈ．ａｎｄ  Ｍａｃｉａｇ，Ｔ（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：５７５−６０６において概説）。
【００３７】
本明細書で使用する「ＦＧＦ受容体」および「ＦＧＦＲ」という用語は、内在性チロシンキナーゼ活性を有するＦＧＦ結合ポリペプチドを指す。現在、ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、およびＦＧＦＲ−４）をコードする４つの公知の遺伝子があり、選択的ＲＮＡスプライシングを介して様々なタンパク質アイソフォームを生み出すことができる（Ｇａｌｚｉｅ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７５：６６９−６８５）。ＦＧＦＲの構造は、３つの免疫グロブリン様ドメインを有する細胞外領域、膜貫通領域、およびリガンド結合によって活性化される細胞質チロシンキナーゼドメインから成る。ＦＧＦ結合は、チロシン残基における受容体自己リン酸化、および細胞内シグナル伝達カスケードの活性化をもたらす、受容体の二量化を生じる。
【００３８】
本発明は、ＥＧＦＲキナーゼ、ＰＤＧＦＲキナーゼ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による癌患者の治療効果を予測するための診断および予後診断方法を提供する。本明細書の下記の実施例に示すデータは、野生型ＥＧＦＲを含有する、ＮＳＣＬＣ細胞等の腫瘍細胞が、ＥＭＴを行った後、腫瘍細胞は、間葉状であるが、依然として、上皮および間葉細胞の両方の特徴を発現し、このような細胞が、受容体タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤による阻害に対する感受性を変化させた、という驚くべき発見を立証し、それらは、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して比較的感受性が無くなってきたが、しばしば、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲ等の他の受容体タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を得た。諸方法は、このような「ハイブリッド」腫瘍細胞を特異的に同定する、ひいては、ＥＧＦＲキナーゼ、ＰＤＧＦＲキナーゼ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する腫瘍の考えられる感受性を予測する、特異的上皮および間葉バイオマーカーのレベルを決定するために発明された。
【００３９】
従って、本発明は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害への腫瘍細胞増殖の感受性を予測するための方法を提供し、腫瘍細胞により発現した上皮バイオマーカーのレベルを評価すること、腫瘍細胞により発現した間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測すること、を含み、同様のレベルの上皮および間葉バイオマーカーの共発現は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する低い感受性と相関し（または、低い感受性を予測し）、該上皮バイオマーカーは、該上皮ケラチン１−２８および７１−８０から選択される１つ以上のケラチンを含み、該間葉バイオマーカーは、ビメンチンである。一実施形態において、該上皮ケラチンは、（例えば、多または汎特異抗体を使用することにより）該腫瘍細胞により発現した全てまたは大部分（すなわち、５０％以上）の該ケラチンバイオマーカーを検出する方法を使用して評価される。別の実施形態において、該上皮バイオマーカーは、ケラチン８および／またはケラチン１８を含む。
【００４０】
本明細書に記載する本発明の方法のいずれかに使用する際、上皮ケラチン１−２８および７１−８０は、本明細書の表１に記載するすべてのケラチンを含む。
【００４１】
本発明はまた、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測するための方法も提供し、腫瘍細胞により発現した上皮バイオマーカーのレベルを評価すること、腫瘍細胞により発現した間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測すること、を含み、同様のレベルの上皮および間葉バイオマーカーの共発現は、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する高い感受性と相関し（または、高い感受性を予測し）、該上皮バイオマーカーは、該上皮ケラチン１−２８および７１−８０から選択される１つ以上のケラチンを含み、該間葉バイオマーカーは、ビメンチンである。一実施形態において、該上皮ケラチンは、（例えば、多または汎特異抗体を使用することにより）該腫瘍細胞により発現した全てまたは大部分（すなわち、５０％以上）の該ケラチンバイオマーカーを検出する方法を使用して評価する。別の実施形態において、該上皮バイオマーカーは、ケラチン８および／またはケラチン１８を含む。
【００４２】
本明細書で使用する「同様のレベルの上皮および間葉バイオマーカーの共発現」という用語は、上皮バイオマーカーレベルに対する間葉バイオマーカーレベルの比が、（それぞれのバイオマーカーを、同等の条件下で、例えば、同一の親和性の抗体、同一の長さの核酸プローブ、同一の検出方法等を使用して、分析すると仮定して）約１０：１から約１：１０の範囲内であることを意味する。
【００４３】
本明細書で使用する「上皮バイオマーカーレベルに対する間葉バイオマーカーレベルの高い割合」という用語は、上皮バイオマーカーレベルに対する間葉バイオマーカーレベルの比が、（それぞれのバイオマーカーを、同等の条件下で、例えば、同一の親和性の抗体、同一の長さの核酸プローブ、同一の検出方法等を使用して、分析すると仮定して）約２０：１よりも大きいことを意味する。
【００４４】
上記の方法を取り入れるＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた癌患者を治療するための改善された方法も提供する。したがって、本発明は、患者における腫瘍または腫瘍転移を治療するための方法をさらに提供し、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測することによって、患者のＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する考えられる反応性を診断するステップであって、腫瘍細胞により発現した上皮バイオマーカーのレベルを評価すること、腫瘍細胞により発現した間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測すること、を含み、同様のレベルの上皮および間葉バイオマーカーの共発現は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する低い感受性と、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する高い感受性と相関し（または、それらを予測し）、該上皮バイオマーカーは、該上皮ケラチン１−２８および７１−８０から選択される１つ以上のケラチンを含み、該間葉バイオマーカーは、ビメンチンである、ステップと、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する高い感受性が予測される際、治療有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を該患者に投与するステップ、あるいはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する低い感受性が予測される際、治療有効量のＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤を前記患者に投与するステップと、を含む。本方法の一実施形態において、１つ以上の追加の抗癌剤または治療は、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤とともに、同時に、または続けて、併用投与し得る。該追加の抗癌剤または治療は、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤、あるいは他の細胞毒性薬、化学療法薬、抗ホルモン剤、抗血管形成剤、抗増殖剤、プロアポートシス、抗ＨＥＲ２、放射線または放射性医薬品、シグナル伝達阻害剤のいずれか、あるいは本明細書に記載の他の抗癌剤、または治療を含み得る。上記の方法の一実施形態において、該上皮ケラチンは、（例えば、多または汎特異抗体を使用することにより）該腫瘍細胞により発現した全てまたは大部分（すなわち、５０％以上）の該ケラチンバイオマーカーを検出する方法を使用して評価する。別の実施形態において、該上皮バイオマーカーは、ケラチン８および／またはケラチン１８を含む。
【００４５】
上記の方法のいずれかの望ましい一実施形態において、該ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、エルロチニブを含む。
【００４６】
特に、診断検査および治療の用途に関係がある、医術に精通する者は、生物系は、若干変化し、必ずしも完全に予測可能ではなく、ひいては多くの良好な診断検査または治療法は、時には効果のないことを評価するであろう。したがって、検査結果、患者の病状および病歴、および自身の経験に基づいて、個々の患者に対する治療の最も適切な治療コースを決定することは、最終的には、担当医の判断次第である。例えば、腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に特に敏感であることが予測されない時でさえ、診断検査または他の基準からのデータに基づいて、医師がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いて患者を治療することを選択する際、特に、全ての、またはほとんどの他の明白な治療の選択肢が機能しない場合、または別の治療を施す際一部の相乗効果が予想される場合、好機とさえなる場合がある。薬物の類としてＥＧＦＲキナーゼ阻害剤が、癌の治療に使用するさらに従来の化学療法または細胞毒性薬等の多くの他の抗癌剤と比較して、比較的良好な耐容性を示すという事実は、これをさらに実行可能な選択肢にする。
【００４７】
本発明の方法の文脈において、腫瘍細胞により発現したバイオマーカーは、腫瘍細胞の「ハイブリッド」遷移状態を示す、分子および細胞マーカーを含むことができる。望ましい一実施形態において、該バイオマーカーは、個々のマーカータンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡであり、腫瘍細胞、すなわち、上皮および間葉の特徴を示す、腫瘍細胞の特定の遷移状態の特徴を示す。代替的な実施形態において、ある環境では、バイオマーカーは、「ハイブリッド」細胞の特徴である、間葉状の状態を示す、細胞高分子によって腫瘍細胞に産生される特徴的な形態学的パターンであり得る。
【００４８】
【表１】
2010533836.tif 000003
2010533836.tif 000004
【００４９】
表１は、本明細書に記載する本発明の方法を実践する際に使用することができる分子バイオマーカーの例をコードする遺伝子を記載する。分子バイオマーカーは、その変異体、例えば、発現したｍＲＮＡまたはタンパク質、スプライス変異、共翻訳および翻訳後修飾タンパク質を含む、これらの遺伝子により発現した任意の産物を含み得る。追加の実施形態において、該バイオマーカーは、（例えば、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、サル、類人猿等からの）ヒト遺伝子産物の動物相同体であり得る。Ｎ．Ｂ．上皮ケラチンまたはサイトケラチンは、中間径フィラメントケラチンである。「ケラチン」および「サイトケラチン」という用語は、本明細書で同意語として使用する。本明細書の本文において、特異的ケラチンに関して、標準的なケラチン表示における「Ｋ」（表１参照）は、一般に省略する（例えば、ケラチンＫ８＝ケラチン８）。
【００５０】
同様のレベルの上皮および間葉バイオマーカーの共発現は、ＥＭＴ（例えば、ケラチン８および／または１８、およびビメンチン）後、間葉状の「ハイブリッド」腫瘍細胞の特徴を示すが、ハイブリッド腫瘍細胞において、ある他の上皮および間葉バイオマーカーは、上皮または間葉細胞型のさらに特徴を示すレベルで発現する。したがって、ある患者からの腫瘍細胞におけるこれらのバイオマーカーのレベルの評価は、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する高い感受性を有し得る間葉状の腫瘍細胞を同定するためにも利用することもできる。本発明はまた、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測するための方法も提供し、腫瘍細胞により発現した上皮バイオマーカーのレベルを評価すること、腫瘍細胞により発現した間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測すること、を含み、上皮バイオマーカーに対する間葉バイオマーカーの高い割合は、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する高い感受性と相関する（または、高い感受性を予測する）。本方法の一実施形態において、該上皮バイオマーカーは、Ｅカドヘリンまたはγカテニンであり、該間葉バイオマーカーは、フィブロネクチンまたはビメンチンである。しかしながら、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測するための上記の開示した方法とは異なり、同様のレベルの特異的上皮および間葉バイオマーカーの共発現は、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する高い感受性と相関し（または、高い感受性を予測し）、本方法は、間質細胞がバイオマーカー発現の類似のパターンを表示し得るため、このような感受性で腫瘍細胞を明確に同定しない場合がある。したがって、試験試料のさらなる評価が、新生細胞または腫瘍細胞として細胞を明確に同定するために必要な場合がある。
【００５１】
上記の方法を取り入れるＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた癌患者を治療するための改善された方法も提供する。したがって、本発明は、患者における腫瘍または腫瘍転移を治療するための方法をさらに提供し、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測することによって、患者のＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する考えられる反応性を診断するステップであって、腫瘍細胞により発現した上皮バイオマーカーのレベルを評価すること、腫瘍細胞により発現した間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測すること、を含み、上皮バイオマーカーに対する間葉バイオマーカーの高い割合は、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する高い感受性と相関し（または、高い感受性を予測し）、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲ阻害剤による阻害に対する高い感受性が予測される際、治療有効量のＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤を該患者に投与するステップと、を含む。本方法の一実施形態において、該上皮バイオマーカーは、Ｅカドヘリンまたはγカテニンであり、該間葉バイオマーカーは、フィブロネクチンまたはビメンチンである。本方法の一実施形態において、１つ以上の追加の抗癌剤または治療は、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤とともに、同時に、または続けて、併用投与し得る。該追加の抗癌剤または治療は、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、またはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤、あるいは他の細胞毒性薬、化学療法薬、抗ホルモン剤、抗血管形成剤、抗増殖剤、プロアポートシス、抗ＨＥＲ２、放射線または放射性医薬品、シグナル伝達阻害剤のいずれか、あるいは本明細書に記載の他の抗癌剤、または治療を含み得る。
【００５２】
上皮バイオマーカーに対する間葉バイオマーカーの高い割合は、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する高い感受性と相関する（または、高い感受性を予測する）、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測するための上記の方法に使用できる上皮マーカーの例としては、Ｅカドヘリン、Ｂｒｋ、γカテニン、α１カテニン、α２カテニン、α３カテニン、コネキシン３１、プラコフィリン３、ストラチフィン１、ラミニンアルファ−５、ＳＴ１４、リン酸１４−３−３イプシロン、１４−３−３ガンマ（ＫＣＩＰ−Ｉ）、１４−３−３シグマ（ストラティフィン）、１４−３−３ゼータ／デルタ、リン酸化セリン／トレオニンホスファターゼ２Ａ、４Ｆ２ｈｃ（ＣＤ９８抗原）、アデニンヌクレオチド輸送体２、アネキシンＡ３、ＡＴＰシンターゼベータ鎖、リン酸化インスリン受容体基質ｐ５３／ｐ５４、バシジン（ＣＤ１４７抗原）、リン酸化ＣＲＫ結合基質（ｐ１３０Ｃａｓ）、Ｂｃ１−Ｘ、リン酸化Ｐカドヘリン、リン酸化カルモジュリン（ＣａＭ）、カルパイン２触媒サブユニット、カテプシンＤ、コフィリン１、カルパイン小サブユニット１、カテニンベータ１、カテニンデルタ１（ｐ１２０カテニン）、シスタチンＢ、リン酸化ＤＡＺ結合タンパク質１、カルボニルレダクターゼ［ＮＡＤＰＨ］、Ｄｉａｐｈａｎｏｕｓ関連ホルミン１（ＤＲＦ１）、デスモグレイン２、伸長因子１デルタ、リン酸化ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、エズリン（ｐ８１）、リン酸化焦点接着キナーゼ１、リン酸化ｐ９４−ＦＥＲ（ｃ−ＦＥＲ）．、フィラミンＢ、リン酸化ＧＲＢ２関連結合タンパク質１、Ｒｈｏ−ＧＤＩアルファ、リン酸化ＧＲＢ２、ＧＲＰ７８、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＨＳＰ９０−アルファ、ＨＳＰ７０．１、ｅＩＦ３  ｐ１１０、ｅＩＦ−４Ｅ、白血球エラスターゼ阻害剤、インポーチン４、インテグリンアルファ６、インテグリンベータ４、リン酸化サイトケラチン１７、カゼインキナーゼＩ、アルファ、タンパク質キナーゼＣ、デルタ、ピルビン酸キナーゼ、アイソザイムＭ１／Ｍ２、リン酸化エルビン、ＬＩＭおよびＳＨ３ドメインタンパク質１（ＬＡＳＰ−１）、４Ｆ２１ｃ（ＣＤ９８軽鎖）、Ｌ乳酸脱水素酵素Ａ鎖、ガレクチン３、ガレクチン３結合タンパク質、リン酸化ＬＩＮ−７ホモログＣ、ＭＡＰ（ＡＰＣ結合タンパク質ＥＢ１）、マスピン前駆体（プロテアーゼ阻害剤５）、リン酸化Ｍｅｔチロシンキナーゼ（ＨＧＦ受容体）、混合系譜白血病タンパク質２、モノカルボン酸輸送体４、リン酸化Ｃ−Ｍｙｃ結合タンパク質（ＡＭＹ−１）、ミオシン９、ミオシンの軽いポリペプチド６、ニコチンアミドリン酸化リボシルトランスフェラーゼ、ニバン（Ｎｉｂａｎ）様たんぱく質（Ｍｅｇ−３）、オルニチンアミノトランスフェラーゼ、リン酸化オクルディン、ユビキチンチオエステラーゼ、ＰＡＦアセチルヒドロラーゼＩＢベータサブユニット、リン酸化分配欠損３（ＰＡＲ−３）、リン酸化プログラム細胞死６−結合タンパク質、リン酸化プログラム細胞死タンパク質６、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、リン酸化プラコフィリン２、リン酸化プラコフィリ��３、タンパク質ホスファターゼ１、ペルオキシレドキシン５、プロテアソーム活性化複合サブユニット１、プロチモシンアルファ、レチノイン酸誘導タンパク質３、リン酸化ＤＮＡ修復タンパク質ＲＥＶ１、リボヌクレアーゼ阻害剤、ＲｕｖＢ様１、Ｓ−１００Ｐ、Ｓ−１００Ｌ、カルサイクリン、Ｓ１００Ｃ、リン酸化Ｓｅｃ２３Ａ、リン酸化Ｓｅｃ２３Ｂ、リソソーム膜タンパク質ＩＩ（ＬＩＭＰ  ＩＩ）、ｐ６０−Ｓｒｃ、リン酸化Ａｍｐｌａｘｉｎ（ＥＭＳ１）、ＳＬＰ−２、ガンマシヌクレイン、腫瘍カルシウムシグナルトランスデューサー１、腫瘍カルシウムシグナルトランスデューサー２、トランスゲリン（Ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ）２、トランスアルドラーゼ、チューブリンベータ２鎖、翻訳制御された腫瘍タンパク質（ＴＣＴＰ）、組織トランスグルタミナーゼ、膜貫通タンパク質Ｔｍｐ２１、ユビキチン複合酵素Ｅ２  Ｎ、ＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ１、リン酸化ｐ６１−Ｙｅｓ、リン酸化タイトジャンクションタンパク質ＺＯ−１、ＡＨＮＡＫ（デスモヨキン）、リン酸化ＡＴＰシンターゼベータ鎖、リン酸化ＡＴＰシンターゼデルタ、低温ショックドメインタンパク質Ｅ１、デスモプラーキンＩＩＩ、プレクチン１、リン酸化ネクチン２（ＣＤ１１２抗原）、リン酸化ｐ１８５−Ｒｏｎ、およびリン酸化ＳＨＣ１が挙げられる。該上皮バイオマーカーが、リン酸化「タンパク質」である場合には、タンパク質自体のレベルではなく、タンパク質のリン酸化反応の範囲が、本質的に、ＥＭＴ後に変化させるパラメータである。これらのタンパク質のリン酸化反応のレベルの変化はまた、該タンパク質の１つ以上のチロシン残基のリン酸化反応のレベルの変化のためであることが理解される。
【００５３】
間葉バイオマーカーに対する上皮バイオマーカーの高い割合は、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する高い感受性と相関する（または、高い感受性を予測する）、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測するための上記の方法に使用することができる間葉マーカーの例としては、ビメンチン、フィブロネクチン、フィブリリン１、フィブリリン２、コラーゲンアルファ２（ＩＶ）、コラーゲンアルファ−２（Ｖ）、ＬＯＸＬ１、ナイドジェン、Ｃ１１ｏｒｆ９、テネイシン、Ｎカドヘリン、胎児性ＥＤＢ＋フィブロネクチン、チューブリンアルファ３、エピモルフィン、ＭＨＣクラスＩ抗原Ａ＊１、アシルＣｏＡデサチュラーゼ、ＬＡＮＰ様タンパク質（ＬＡＮＰ−Ｌ）、アネキシンＡ６、ＡＴＰシンターゼガンマ鎖、ＢＡＧファミリー分子シャペロンレギュレータ−２、リン酸化水疱性類天疱瘡抗原、リン酸化タンパク質Ｃｌｏｒｆ７７、ＣＤＫ１（ｃｄｃ２）、リン酸化クラスリン重鎖１、コンデンシン複合体サブユニット１、３，２−ｔｒａｎｓ−エノイル−ＣｏＡイソメラーゼ、ＤＥＡＨボックスタンパク質９、未発達ホモログのリン酸化エンハンサ、リン酸化フィブリラリン、ＧＡＰＤＨ筋肉、ＧＡＰＤＨ肝臓、シナプス糖タンパク質ＳＣ２、リン酸化ヒストンＨ１．０、リン酸化ヒストンＨ１．２、リン酸化ヒストンＨ１．３、リン酸化ヒストンＨ１．４、リン酸化ヒストンＨ１．５、リン酸化ヒストンＨ１ｘ、リン酸化ヒストンＨ２ＡＦＸ、リン酸化ヒストンＨ２Ａ．ｏ、リン酸化ヒストンＨ２Ａ．ｑ、リン酸化ヒストンＨ２Ａ．Ｚ、リン酸化ヒストンＨ２Ｂ．Ｊ、リン酸化ヒストンＨ２Ｂ．ｒ、リン酸化ヒストンＨ４、リン酸化ＨＭＧ−１７様３、リン酸化ＨＭＧ−１４、リン酸化ＨＭＧ−１７、リン酸化−ＨＭＧＩ−Ｃ、リン酸化−ＨＭＧ−Ｉ／ＨＭＧ−Ｙ、リン酸化甲状腺受容体結合タンパク質７（ＴＲＴＰ７）、リン酸化−ｈｎＲＮＰ  Ｈ３、ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰ  Ｆ、リン酸化−ｈｎＲＮＰ  Ｇ、ｅＩＦ−５Ａ、ＮＦＡＴ  ４５ｋＤａ、インポーチンベータ３、ｃＡＭＰ依存性ＰＫＩａ、ラミンＢ１、ラミンＡ／Ｃ、リン酸化ラミンアルファ３鎖、Ｌ乳酸デヒドロゲナーゼＢ鎖、ガレクチン１、リン酸化Ｆｅｚｌ、ヒアルロン酸結合タンパク質１、リン酸化微小管アクチン架橋因子１、メラノーマ関連抗原４、マトリン３、リン酸担体タンパク質、ミオシン１０、リン酸化−Ｎアセチルノイラミン酸シチジリルトランスフェラーゼ、リン酸化ＮＨＰ２様タンパク質１、Ｈ／ＡＣ  Ａ  リボ核タンパク質サブユニット１、核小体リン酸化タンパク質ｐ１３０、リン酸化−ＲＮＡ結合タンパク質Ｎｏｖａ２、ヌクレオホスミン（ＮＰＭ）、ＮＡＤＨユビキノン酸化レダクターゼ３９ｋＤａサブユニット、リン酸化ポリアデニル酸結合タンパク質２、プロヒビチン、プロヒビチン２、スプライシング因子Ｐｒｐ８、ポリピリミジントラクト結合タンパク質１、パラチモシン、Ｒａｂ−２Ａ、リン酸化ＲＮＡ結合タンパク質Ｒａｌｙ、推定ＲＮＡ結合タンパク質３、リン酸化６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２３、ｈｎＲＮＰ  Ａ０、ｈｎＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１、ｈｎＲＮＰ  Ａ／Ｂ、Ｕ２核内低分子リボ核タンパク質Ｂ、リン酸化リ���ノジン受容体３、リン酸化スプライシング因子３Ａサブユニット２、ｓｎＲＮＰコアタンパク質Ｄ３、ネスプリン１、チロシン−ｔＲＮＡリガーゼ、リン酸化タンキラーゼ１−ＢＰ、チューブリンベータ３、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、リン酸化ｂＺＩＰ増強因子ＢＥＦ（Ａｌｙ／ＲＥＦ；Ｔｈｏ４）、ユビキチン、ユビキチンカルボキシル−末端ヒドロラーゼ５、ユビキノールシトクロムｃレダクターゼ、液胞タンパク質の選別１６、リン酸化亜鉛フィンガータンパク質６４、リン酸化ＡＨＮＡＫ（デスモヨキン）、ＡＴＰシンターゼベータ鎖、ＡＴＰシンターゼデルタ鎖、リン酸化低温ショックドメインタンパク質Ｅ１、リン酸化プレクチン１、ネクチン２（ＣＤ１１２抗原）、ｐ１８５−Ｒｏｎ、およびＳＨＣ１が挙げられる。該間葉バイオマーカーが、リン酸化「タンパク質」である場合には、タンパク質自体のレベルではなく、タンパク質のリン酸化反応の範囲が、ＥＭＴ後に変化させるパラメータである。これらのタンパク質のリン酸化反応のレベルの変化はまた、該タンパク質の１つ以上のチロシン残基のリン酸化反応のレベルの変化のためであることが理解される。
【００５４】
上皮および間葉バイオマーカーの上記のリストは、ＥＭＴ後、発現レベル（または、リン酸化「タンパク質」のリン酸化レベル）の変化したものとして、同定されている（例えば、米国出願は、本出願として同日に出願された、米国出願第１１／３７７５３０号（２００６年３月１６日出願）の一部継続出願であり、それらの内容は、本明細書によって参照することにより組み込まれる、米国出願公開第２００６／０２１１０６０号（２００６年３月１６日出願）、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（２０）９４５５−９４６２、およびＹａｕｃｈ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．１１（２４）８６８６−８６９８を参照）。
【００５５】
本明細書に記載する方法において、該腫瘍細胞は、一般的に、癌、前癌状態、または異常細胞増殖の別の型であると診断される、および治療を必要とする患者からのものである。該癌は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、膵臓癌、頭部または頚部癌、胃癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、または本明細書の下記に記載する様々な他の癌のいずれかであり得る。癌は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いて潜在的に治療可能であると知られているものが望ましい。
【００５６】
本発明の方法において、バイオマーカー発現レベルは、発現レベルがＥＭＴを通して一定のままである対照分子と比較して、または分子バイオマーカー（例えば、ＧＡＰＤＨ、βアクチン、チューブリン等の「ハウスキーピング」遺伝子）によって示されるように、上皮遷移状態または間葉遷移状態を発現する腫瘍細胞を比較する際、評価することができる。バイオマーカー発現レベルはまた、腫瘍細胞バイオマーカー（すなわち、間葉と比較した上皮）の他の型、あるいは同一組織の非腫瘍細胞、または別の細胞または分析参照として使用する組織源のバイオマーカーレベルと比較して、評価することができる。
【００５７】
本発明の方法において、腫瘍細胞により発現した上皮または間葉バイオマーカーのレベルは、さらに下記に詳細を記載するように、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫沈降、免疫ブロット法、免疫蛍光顕微鏡検査法、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＲＴ−ＰＣＲ、原位置ハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡマイクロアレイ等を含む、遺伝子の発現レベルを決定するために当業者に公知の標準的なバイオアッセイ手順のうちのいずれかを使用することにより評価することができる。これらの方法のうちのいずれかの実施形態において、それらの使用は、例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）の特定の細胞集団を単離するための方法と併用する。
【００５８】
本発明の方法においては、腫瘍細胞の上皮または間葉バイオマーカーの発現レベルを、腫瘍生検を分析することにより評価するのが望ましい。一実施形態において、該生検は、腫瘍の複数エリアから得られた試料、または腫瘍の異なるエリアを試料する方法（例えば、針生検）を含み、したがって、腫瘍が、それが含有する細胞の型に対して、不均一な性質から成る際、典型的な生検が得られることを確実にする。望ましい一実施形態において、腫瘍が、それが含有する細胞の型に対して、不均一な性質から成る際、阻害剤による腫瘍感受性を予測するための本明細書に記載する本発明の診断方法は、異なる細胞型に別々に適用することが望ましい（例えば、ＩＨＣ、または特定の細胞集団を単離するためのステップで併用する分析方法を使用）。しかしながら、代替的な実施形態において、腫瘍細胞バイオマーカーの発現レベルは、腫瘍または腫瘍細胞に由来するバイオマーカーの検出可能なレベルを含む、体液または排出物において、評価することができる。本発明に有用な体液または排出物としては、血液、尿、唾液、大便、胸膜液、リンパ液、痰、腹水、前立腺液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、または任意の他の分泌液もしくはその誘導体が挙げられる。「血液」という用語は、全血、血漿、血清、または血液のいずれかの誘導体を含むことを意味する。このような体液または排出物において、腫瘍上皮または間葉バイオマーカーの評価は、侵襲的サンプリング法が、不適切または不便な状況において、望ましい場合がある。
【００５９】
本発明の方法において、該腫瘍細胞は、肺癌腫瘍細胞（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、膵臓癌腫瘍細胞、乳癌腫瘍細胞、頭部および頸部癌腫瘍細胞、胃癌腫瘍細胞、大腸癌腫瘍細胞、卵巣癌腫瘍細胞、または本明細書の下記に記載するような様々な他の癌のいずれかからの腫瘍細胞であり得る。該腫瘍細胞は、固体腫瘍からの全ての腫瘍細胞がそうであるように、ＥＧＦＲキナーゼを発現することで知られている、または期待される型であることが望ましい。該ＥＧＦＲキナーゼは、野生型または突然変異型であり得る。
【００６０】
本発明の方法において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、本明細書の下記に記載するような任意のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤であり得るが、薬理学的に許容される塩またはその多形体を含む、６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニルフェニル）アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４、またはＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エルロチニブＨＣｌ）としても知られている）であることが望ましい。
【００６１】
以下の方法は、本発明の方法のさらなる特定の実施形態を示す。
【００６２】
本発明は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測するための方法を提供し、腫瘍の細胞により発現した上皮バイオマーカーのレベルを評価すること、腫瘍の細胞により発現した間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測すること、を含み、同様のレベルの上皮および間葉バイオマーカーの共発現は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する低い感受性と相関し（または、低い感受性を予測し）、該上皮バイオマーカーは、該上皮ケラチン１−２８および７１−８０から選択される１つ以上のケラチンを含み、該間葉バイオマーカーは、ビメンチンである。一実施形態において、該上皮ケラチンは、（例えば、多または汎特異抗体を使用することにより）該腫瘍細胞により発現した全てまたは大部分（すなわち、５０％以上）の該ケラチンバイオマーカーを検出する方法を使用して評価する。別の実施形態において、該上皮バイオマーカーは、ケラチン８および／またはケラチン１８を含む。
【００６３】
本発明はまた、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測するための方法も提供し、腫瘍の細胞により発現した上皮バイオマーカーのレベルを評価すること、腫瘍の細胞により発現した間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する腫瘍細胞増殖の感受性を予測すること、を含み、同様のレベルの上皮および間葉バイオマーカーの共発現は、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対する高い感受性と相関し（または、高い感受性を予測し）、該上皮バイオマーカーは、該上皮ケラチン１−２８および７１−８０から選択される１つ以上のケラチンを含み、該間葉バイオマーカーは、ビメンチンである。一実施形態において、該上皮ケラチンは、（例えば、多または汎特異抗体を使用することにより）該腫瘍細胞により発現した全てまたは大部分（すなわち、５０％以上）の該ケラチンバイオマーカーを検出する方法を使用して評価する。別の実施形態において、該上皮バイオマーカーは、ケラチン８および／またはケラチン１８を含む。
【００６４】
本発明は、癌患者が、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた治療に対して有効に応答する腫瘍に苦しめられるかどうかを予測するための方法を提供し、腫瘍の細胞により発現した上皮バイオマーカーのレベルを評価すること、腫瘍の細胞により発現した間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、該腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた治療に対して有効に応答するかどうかを予測すること、を含み、同様のレベルの上皮および間葉バイオマーカーの共発現は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた治療に対して有効に応答しない場合がある腫瘍と相関し（または、腫瘍を予測し）、該上皮バイオマーカーは、該上皮ケラチン１−２８および７１−８０から選択される１つ以上のケラチンを含み、該間葉バイオマーカーは、ビメンチンである。一実施形態において、該上皮ケラチンは、（例えば、多または汎特異抗体を使用することにより）該腫瘍細胞により発現した全てまたは大部分（すなわち、５０％以上）の該ケラチンバイオマーカーを検出する方法を使用して評価する。別の実施形態において、該上皮バイオマーカーは、ケラチン８および／またはケラチン１８を含む。
【００６５】
本発明はまた、癌患者が、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた治療に対して有効に応答する腫瘍に苦しめられるかどうかを予測するための方法を提供し、腫瘍の細胞により発現した上皮バイオマーカーのレベルを評価すること、腫瘍の細胞により発現した間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、該腫瘍がＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた治療に対して有効に応答するかどうかを予測すること、を含み、同様のレベルの上皮および間葉バイオマーカーの共発現は、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた治療に対して有効に応答し得る腫瘍と相関し（または、腫瘍を予測し）、該上皮バイオマーカーは、該上皮ケラチン１−２８および７１−８０から選択される１つ以上のケラチンを含み、該間葉バイオマーカーは、ビメンチンである。一実施形態においては、該上皮ケラチンを、（例えば、多または汎特異抗体を使用することにより）該腫瘍細胞により発現した全てまたは大部分（すなわち、５０％以上）の該ケラチンバイオマーカーを検出する方法を使用して評価する。別の実施形態において、該上皮バイオマーカーは、ケラチン８および／またはケラチン１８を含む。
【００６６】
本発明の任意の方法において、該腫瘍は、肺癌腫瘍（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、膵臓癌腫瘍、乳癌腫瘍、頭部および頸部癌腫瘍、胃癌腫瘍、大腸癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、または本明細書の下記に記載するような様々な他の癌のいずれかからの腫瘍であり得る。該腫瘍は、全ての固体腫瘍がそうであるように、細胞が、ＥＧＦＲキナーゼを発現することで知られている、または期待される型であることが望ましい。該ＥＧＦＲキナーゼは、野生型または突然変異型であり得る。
【００６７】
本発明は、腫瘍を有する患者が、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた治療から延命効果を得る可能性を決定するための方法を提供し、腫瘍の細胞により発現した上皮バイオマーカーのレベルを評価すること、腫瘍の細胞により発現した間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、該腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた治療に対して有効に応答するかどうかを予測すること、を含み、同様のレベルの上皮および間葉バイオマーカーの共発現は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた治療に対して有効に応答しない場合がある腫瘍と相関し（または、腫瘍を予測し）、ひいては、患者がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いた治療から有意な延命効果を得ない場合があることを示し、該上皮バイオマーカーは、該上皮ケラチン１−２８および７１−８０から選択される１つ以上のケラチンを含み、該間葉バイオマーカーは、ビメンチンである。一実施形態において、該上皮ケラチンは、（例えば、多または汎特異抗体を使用することにより）該腫瘍細胞により発現した全てまたは大部分（すなわち、５０％以上）の該ケラチンバイオマーカーを検出する方法を使用して評価する。別の実施形態において、該上皮バイオマーカーは、ケラチン８および／またはケラチン１８を含む。
【００６８】
腫瘍細胞上皮または間葉バイオマーカー発現の評価に関しては、腫瘍細胞、これらの腫瘍細胞により産生されたタンパク質または核酸を含む、患者試料は、本発明の方法に使用できる。これらの実施形態において、バイオマーカーの発現レベルは、例えば、患者から得られる腫瘍生検、または腫瘍に由来する物質を含有する他の患者試料（例えば、血液、血清、尿、または本明細書の上記に記載するような他の体液または排出物）等の腫瘍細胞試料において、マーカーの量（例えば、絶対量または濃度）を評価することにより評価することができる。該細胞試料に、当然ながら、試料内のマーカーの量を評価する前に、様々な公知の回収後の調製および貯蔵技術（例えば、核酸および／またはタンパク質抽出、固化、貯蔵、冷凍、限外濾過、濃縮、蒸発、遠心分離等）を施すことができる。同様に、腫瘍生検はまた、例えば、固化等の回収後の調製および貯蔵技術が施される場合がある。
【００６９】
本発明の方法において、バイオマーカータンパク質を発現する腫瘍細胞の表面上に示される少なくとも１つの部分を有するバイオマーカータンパク質の発現を検出することができる。それは、マーカータンパク質またはその一部が、細胞表面上に露出するかどうかを決定するために、熟練した技術者に対して簡単な事柄である。例えば、免疫学的方法は、全細胞上のこのようなタンパク質を検出するために使用し得る、または公知のコンピュータに基づいた配列分析法は、少なくとも１つの細胞外ドメインの存在（すなわち、分泌タンパク質と少なくとも１つの細胞表面ドメインを有するタンパク質の両方を含む）を予測するために使用し得る。マーカータンパク質を発現する細胞の表面上に示される少なくとも１つの部分を有するマーカータンパク質は、腫瘍細胞を必ずしも溶解することなく（例えば、タンパク質の細胞表面ドメインで特異的に結合する標識抗体を使用して）、検出し得る。
【００７０】
本発明に記載するバイオマーカーの発現は、転写された核酸またはタンパク質の発現を検出するための多種多様の公知の方法のうちのいずれかにより評価し得る。このような方法の非限定の例としては、分泌タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞質タンパク質、または核タンパク質の検出のための免疫学的方法、タンパク質精製法、タンパク質機能または活性アッセイ、核酸ハイブリッド形成法、核酸逆転写法、および核酸増幅法が挙げられる。
【００７１】
一実施形態において、バイオマーカーの発現は、抗体（例えば、放射性標識抗体、発色団標識抗体、フルオロフォア団標識抗体、または酵素標識抗体）、抗体誘導体（例えば、基質、またはタンパク質リガンド対のタンパク質もしくはリガンド（例えば、ビオチンストレプトアビジン）と共役した抗体）、またはバイオマーカータンパク質またはその断片と特異的に結合する抗体断片（例えば、単鎖抗体、単離抗体超可変ドメイン等）を使用して評価し、それには、腫瘍細胞内で通常受ける翻訳終了後の修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、メチル化等）の全て、または一部で行われているバイオマーカータンパク質を含む。
【００７２】
別の実施形態において、バイオマーカーの発現は、患者試料中の細胞からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち、転写されたポリヌクレオチド）を調製することにより、およびバイオマーカー核酸またはその断片の相補体である参照ポリヌクレオチドで該ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡをハイブリダイズすることにより、評価する。任意に、ｃＤＮＡは、該参照ポリヌクレオチドでハイビリダイズする前に、様々なポリメラーゼ連鎖反応法のうちのいずれかを使用して増幅することができる。１つ以上のバイオマーカーの発現は、同様に、バイオマーカーの発現のレベルを評価するために、定量ＰＣＲを使用して検出することができる。あるいは、本発明のバイオマーカーの突然変異体または変異体（例えば、一塩基多型、欠失等）を検出するための多くの公知の方法のうちのいずれかを使用して、患者における、バイオマーカーの発生を検出し得る。
【００７３】
関連した実施形態において、試料から得られる転写ポリヌクレオチドの混合物は、バイオマーカー核酸の少なくとも一部（例えば、少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、５００、またはそれ以上のヌクレオチド残基）に相補的な、またはそれらと相同のポリヌクレオチドをそれに固定する基質と接触させる。ポリヌクレオチド相補体または相同体が基質上で特異的に検出可能（例えば、異なる発色団またはフルオロフォアを使用して、または異なる選択した位置に固定されて検出可能）である場合、複数のバイオマーカーの発現レベルは、単一基質（例えば、選択した位置で固定されたポリヌクレオチドの「遺伝子チップ」マイクロアレイ）を使用して、同時に、評価することができる。別の核酸を用いた１つの核酸のハイブリダイゼーションを含む、バイオマーカー発現を評価する方法を、使用する際、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下で、実施することが望ましい。
【００７４】
本発明の複数のバイオマーカーを、本発明の方法に使用する際、患者試料内のそれぞれのバイオマーカーの発現レベルは、単一反応混合物（すなわち、それぞれのバイオマーカーに対して、異なる蛍光プローブ等の試薬を使用）、または１つ以上のバイオマーカーに対応する個々の反応混合物のいずれかにおいて、同一型の非癌性試料内の複数のバイオマーカーのそれぞれの正常な発現レベルと比較することができる。
【００７５】
正常（すなわち、非癌性）ヒト組織における、バイオマーカーの発現レベルは、様々な方法で評価することができる。一実施形態において、この発現レベルは、非癌性であると思われる細胞の一部のバイオマーカーの発現レベルを評価した後、この正常な発現レベルを腫瘍細胞の一部の発現レベルと比較することにより評価する。あるいは、そして特に、さらなる情報が、本明細書に記載する方法の通常の動作の結果として利用可能になるため、本発明のバイオマーカーの正常な発現に対する集団平均値を使用してもよい。他の実施形態において、バイオマーカーの「正常な」発現レベルは、癌を有しない患者から得た患者試料、患者が疑いのある癌の発病の前に患者から得た患者試料、アーカイブした患者試料等から、バイオマーカーの発現を評価することにより決定し得る。
【００７６】
生体試料内のバイオマーカータンパク質または核酸の存在または不在を検出するための例示的な方法は、試験対象からの生体試料（例えば、腫瘍関連体液）を獲得するステップと、生体試料をポリペプチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｃＤＮＡ）を検出可能な化合物または薬剤と接触させるステップと、を含む。したがって、本発明の検出方法は、例えば、体外、ならびに生体内の生体試料内で、ｍＲＮＡ、タンパク質、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを検出するために使用することができる。例えば、ｍＲＮＡの検出のための生体外技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよび原位置ハイブリダイゼーションが挙げられる。バイオマーカータンパク質の検出のための生体外技術としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光が挙げられる。ゲノムＤＮＡの検出のための生体外技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。ｍＲＮＡの検出のための生体内技術としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ノーザンハイブリダイゼーションおよび原位置ハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、バイオマーカータンパク質の検出のための生体内技術としては、該タンパク質またはその断片に対する標識抗体を患者に導入することが挙げられる。例えば、該抗体は、患者における放射性マーカーの存在および位置を標準的な画像技術により検出し得る放射性マーカーで標識することができる。
【００７７】
このような診断および予後診断分析の一般原則は、適切な条件下で、バイオマーカーおよびプローブを相互作用および結合させるのに十分な時間、バイオマーカー、およびプローブを含有する可能性がある試料または反応混合物を調製することを含み、ひいては、反応混合物中で除去および／または検出できる複合体を形成する。これらの分析は、様々な方法で行うことができる。
【００７８】
例えば、このような分析を行う一方法は、基質とも称される固相支持体に、バイオマーカーまたはプローブをしっかりと固定するステップと、反応の終了時に、固相にしっかりと固定された標的バイオマーカー／プローブ複合体を検出するステップと、を含む。このような方法の一実施形態において、バイオマーカーの存在および／または濃度に対して分析される、患者からの試料は、担体または固相支持体にしっかりと固定することができる。別の実施形態において、該プローブを固相にしっかりと固定することができ、患者からの試料が分析の非固定成分として反応し得るという、逆の状況が可能である。
【００７９】
アッセイ成分を固相へ固定するための多くの確立された方法がある。これらには、ビオチンおよびストレプトアビジンを通して固定されるバイオマーカーまたはプローブ分子が挙げられるが、これらに限定されない。このようなビオチン化分析成分は、当業者に公知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ）を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジンをコーティングした９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中で固定することができる。ある実施形態において、固定化された分析成分を有する表面は、あらかじめ調製し、保存することができる。
【００８０】
このような分析のための他の適した担体または固相支持体としては、バイオマーカーまたはプローブが属する種類の分子に結合可能な任意の物質が挙げられる。公知の支持体または担体は、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、デキストラン、アミラーゼ、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、およびマグネタイトが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
上述のアプローチを用いた分析を行うために、非固定化成分を、第２の成分がしっかりと固定される固相に加える。反応が完了した後、非複合成分は、形成されたいずれの複合体が固相に固定化したままであるような条件下で、（例えば、洗浄によって）除去してもよい。固相に固定化されたバイオマーカー／プローブ複合体の検出は、本明細書に概説した多くの方法で、達成することができる。
【００８２】
一実施形態においては、該プローブが非固定化分析成分である際、該プローブを、本明細書で論じる、および当業者に公知の検出可能な標識を用いて、直接または間接的に、分析の検出および読み出しのために標識することができる。
【００８３】
また、例えば、蛍光エネルギー移動（すなわち、ＦＥＴ、例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６３１，１６９号、Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８６８，１０３号を参照）の技術を利用することにより、いずれかの成分（バイオマーカーまたはプローブ）のさらなる操作または標識化することなく、バイオマーカー／プローブ複合体形成を直接検出することも可能である。第１のフルオロフォア団標識、「ドナー」分子は、適切な波長の入射光で励起すると、その放出された蛍光エネルギーは、同様に、吸収エネルギーのため、蛍光を発することができる第２の「受容体」分子上に蛍光標識によって吸収されるように選択される。あるいは、該「ドナー」タンパク質分子は、トリプトファン残基の天然蛍光エネルギーを単に利用してもよい。標識は、「受容体」分子標識が「ドナー」の波長とは分別し得るように、異なる光の波長を発光する標識を選択する。標識間のエネルギー移動の効率が、分子を分離する距離に関連するため、分子間の空間的関係を評価することができる。結合が、分子間で起こる状況において、該分析における「受容体」分子の蛍光発光は、最大でなければならない。ＦＥＴ結合事象は、（例えば、蛍光光度計を使用して）当業者に公知の標準的な蛍光検出手段を通して、適宜に測定することができる。
【００８４】
別の実施形態において、バイオマーカーを評価するためのプローブの能力の測定は、実時間生物分子相互作用解析（ＢＩＡ）等の技術を利用することによって、いずれかの成分（プローブまたはバイオマーカー）を標識化することなく、達成することができる（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．，１９９１，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５およびＳｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５を参照）。本明細書で使用する「ＢＩＡ」または「表面プラズモン共鳴」は、反応体（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）のいずれかを標識化することなく、実時間において、生体特異的相互作用を研究するための技術である。結合表面で質量の変化（結合事象を示す）は、表面付近の光の屈折率の変化（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）をもたらし、生体分子間で、実時間反応の兆候として使用し得る検出可能なシグナルをもたらす。
【００８５】
あるいは、別の実施形態において、類似した診断および予後診断分析は、液相中の溶質としてバイオマーカーおよびプローブを用いて行うことができる。このような分析において、該複合バイオマーカーおよびプローブは、分画遠心法、クロマトグラフィー、電気泳動法、および免疫沈降（ただし、これらに限定されない）を含む、多くの標準的な技術のうちのいずれかによって、非複合成分から分離する。分画遠心法において、バイオマーカー／プローブ複合体は、それらの異なる大きさおよび濃度に基づいて、複合体の異なる沈降平衡のため、一連の遠心分離のステップを通して、非複合分析成分から分離し得る（例えば、Ｒｉｖａｓ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．１８（８）：２８４−７を参照）。標準的なクロマトグラフ法はまた、非複合分子から複合分子を分離するために利用してもよい。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーは、大きさに基づいて、および列形式の適切なゲル濾過樹脂の利用を通して、分子を分離し、例えば、比較的大きい複合体は、比較的小さい非複合成分から分離し得る。同様に、非複合成分と比較する際、バイオマーカー／プローブ複合体の比較的異なる電荷特性は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー樹脂の利用を通して、複合体と非複合成分を分別するために利用し得る。このような樹脂およびクロマトグラフ法は、当業者に公知である（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ，Ｎ．Ｈ．，１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．Ｗｉｎｔｅｒ  １１（１−６）：１４１−８、Ｈａｇｅ，Ｄ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｔｗｅｅｄ，Ｓ．Ａ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ  １９９７Ｏｃｔ  １０；６９９（ｌ−２）：４９９−５２５を参照）。ゲル電気泳動はまた、非結合成分から複合分析成分を分離するために利用し得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７−１９９９を参照）。この技術において、タンパク質または核酸複合体は、例えば、大きさまたは電荷に基づいて分離する。電気泳動工程中、結合相互作用を維持するために、非変性ゲルマトリックス材料および還元剤のない条件が、一般に望ましい。特定の分析の適切な条件およびその成分は、当業者に公知であろう。
【００８６】
特定の実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡのレベルは、当業者に公知の方法を使用して、生体試料において、原位置と体外形式の両方によって、測定することができる。「生体試料」という用語は、患者から単離した、組織、細胞、生体液、およびその単離体を含むことを意図し、ならびに患者内に存在する組織、細胞、液体を含むことを意図する。多くの発現検出方法は、単離されたＲＮＡを使用する。体外方法に関しては、ｍＲＮＡの単離に対して選択しないＲＮＡ単離技術が、腫瘍細胞からＲＮＡを精製するために利用することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７−１９９９を参照）。さらに、多数の組織試料は、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉの単一ステップＲＮＡ単離過程等の当業者に公知の技術を使用して、容易に処理することができる（１９８９、米国特許第４，８４３，１５５号）。
【００８７】
該単離ｍＲＮＡは、サザンまたはノーザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応解析、およびプローブ分析が挙げられるが、これらに限定されない、ハイブリダイゼーションまたは増幅分析において使用することができる。ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの望ましい診断方法は、検出される遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と該単離ｍＲＮＡを接触させるステップを含む。該核酸プローブは、例えば、少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０、または５００のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド等の完全長ｃＤＮＡ、またはその一部であり、ストリンジェントな条件下で、本発明のバイオマーカーをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分であり得る。本発明の診断分析用に適した他のプローブは、本明細書に記載する。該プローブを用いたｍＲＮＡのハイブリダイゼーションは、問題になっているバイオマーカーが発現していることを示す。
【００８８】
一形式において、該ｍＲＮＡは、例えば、アガロースゲル上で単離したｍＲＮＡを電気泳動し、および該ゲルからニトロセルロース等の膜に、該ｍＲＮＡを移動させることにより、固体表面上に固定し、プローブと接触させる。代替的な形式において、該プローブは、例えば、アフィメトリクス遺伝子チップアレイにおいて、固体表面上に固定し、該ｍＲＮＡは、プローブと接触させる。熟練した技術者は、本発明のバイオマーカーによりコードされたｍＲＮＡのレベルを検出するための公知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適応することができる。
【００８９】
試料におけるｍＲＮＡバイオマーカーのレベルを測定するための代替的な方法は、核酸増幅過程、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号に記述している実験的な実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８９−１９３）、自立した配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号）、または任意の他の核酸増幅法、続いて、当業者に公知の技術を使用して、増幅分子の検出を含む。これらの検出スキームは、このような分子が非常に低い数で存在する場合、核酸分子の検出に対して特に有用である。本明細書で使用する増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域（それぞれ、プラスとマイナスのストランド、またはその逆）にアニールし、中間に短い領域を含むことができる、核酸分子の一対として定義される。一般に、増幅プライマーは、約１０から３０個の長さのヌクレオチドであり、約５０から２００個の長さのヌクレオチドの領域にフランクする。適切な条件下および適切な試薬を用いて、このようなプライマーは、プライマーにフランクしているヌクレオチド配列を含む核酸の増幅を可能にする。
【００９０】
原位置法に関しては、ｍＲＮＡは、検出前に腫瘍細胞から単離する必要なない。このような方法において、細胞または組織試料は、公知の組織学的方法を使用して、調製／処理する。試料は、その後、支持体、一般に、スライドガラス上に固定した後、該バイオマーカーをコードするｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるプローブに接触させる。
【００９１】
該バイオマーカーの絶対発現レベルに基づいて、測定を行う代替として、測定は、バイオマーカーの正規化発現レベルに基づいて行い得る。発現レベルは、例えば、構成的に発現するハウスキーピング遺伝子等のバイオマーカーでない遺伝子の発現とその発現を比較することにより、バイオマーカーの絶対発現レベルを修正することにより正規化する。正規化に適した遺伝子としては、アクチン遺伝子、または上皮細胞特異遺伝子等のハウスキーピング遺伝子が挙げられる。この正規化は、例えば、非腫瘍試料の別の試料に対する、例えば、患者試料の一試料、または異なる源からの試料間における発現レベルの比較を可能にする。
【００９２】
あるいは、該発現レベルは、相対的発現レベルとして提供することができる。バイオマーカー（例えば、間葉バイオマーカー）の相対的発現レベルを測定するために、バイオマーカーの発現レベルは、問題になっている試料に対する発現レベルの測定前に、正常対癌細胞単離株の１０以上の試料、望ましくは、５０以上の試料に対して測定する。多数の試料において分析するそれぞれの遺伝子の平均発現レベルを測定し、これを、バイオマーカーに対する基準の発現レベルとして使用する。試験試料に対して測定されたバイオマーカーの発現レベル（絶対発現レベル）は、その後、そのバイオマーカーに対して得られた平均発現値で割る。このことから、相対的発現レベルが得られる。
【００９３】
本発明の別の実施形態において、バイオマーカータンパク質を検出する。本発明のバイオマーカータンパク質を検出するための望ましい薬剤は、このようなタンパク質またはその断片に結合することが可能な抗体であり、望ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、多クローン、またはさらに望ましくは、単クローンであり得る。無傷抗体、またはその断片もしくは誘導体（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２）を使用することができる。プローブまたは抗体に関して「標識化」という用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体に結合する（すなわち、物理的に結合する）ことによって、プローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接標識化される別の試薬との反応性によって、プローブまたは抗体の間接標識を包含することを意図する。間接標識の例としては、それを蛍光標識したストレプトアビシンで検出することができるように、蛍光標識した第２抗体およびビオチンを用いたＤＮＡプローブの末端標識を使用する一次抗体の検出が挙げられる。
【００９４】
腫瘍細胞からのタンパク質は、当業者に公知の技術を使用して単離することができる。利用されるタンパク質単離法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅに記載するもの等であり得る（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。
【００９５】
様々な形式は、試料が所与の抗体に結合するタンパク質を含有するかどうかを測定するために利用することができる。このような形式の例としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット分析、および酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。熟練した技術者は、腫瘍細胞が、本発明のバイオマーカーを発現するかどうかを測定するための公知のタンパク質／抗体検出法を容易に適応することができる。
【００９６】
一つの形式において、抗体、または抗体断片、または誘導体は、発現したタンパク質を検出するためにウエスタンブロットまたは免疫蛍光測定法等の方法において、使用することができる。このような使用において、固体支持体上で、抗体またはタンパク質を固定化することが、一般的に望ましい。適した固相支持体または担体は、抗原または固体を結合可能な任意の支持体を含む。公知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、およびマグネタイトが挙げられる。
【００９７】
当業者は、抗体または抗原を結合するための多くの他の適した担体を知っており、本発明とともに使用するためにこのような支持体を適応できる。例えば、腫瘍細胞から単離されたタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で泳動し、ニトロセルロース等の固相支持体上に固定化することができる。支持体を、その後、適した緩衝液で洗浄し、続いて、検出可能な標識抗体で処理することができる。固相支持体を、その後、緩衝液で２回洗浄し、非結合抗体を除去することができる。固体支持体上の結合標識量は、その後、従来の手段によって検出することができる。
【００９８】
ＥＬＩＳＡ分析に関しては、特異的結合対は、免疫または非免疫型であり得る。免疫特異的結合対は、抗原抗体系、またはハプテン／抗ハプテン系によって例示する。それには、フルオレセイン／抗フルオレセイン、ジニトロフェニル／抗ジニトロフェニル、ビオチン／抗ビオチン、ペプチド／抗ペプチド等が挙げられる。特異的結合対の抗体メンバーは、当業者によく知られている通常の方法により製造することができる。このような方法は、特異的結合対の抗原メンバーを用いて動物を免疫化するステップを含む。特異的結合対の抗体メンバーが、例えば、ハプテン等、免疫原性でない場合、それを免疫原性の状態にするために担体タンパク質に共有結合することができる。非免疫結合対としては、抗体ではないが、２つの成分が互いに天然親和性を共有する系が挙げられる。例示的な非免疫結合対は、ビオチン−ストレプトアビジン、内因子−ビタミンＢ１２、葉酸−葉酸結合タンパク質等である。
【００９９】
様々な方法が、特異的結合対のメンバーを有する共有結合で標識された抗体に利用できる。諸方法は、特異的結合対のメンバーの特性、所望の結合型、および様々な共役化学への抗体の耐性に基づいて選択する。ビオチンは、市販の活性誘導体を利用することにより抗体に共有結合することができる。これらのいくつかは、タンパク質のアミン基に結合するビオチン−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、カルボジイミド結合を介して炭水化物部分、アルデヒド類、およびカルボキシル基に結合するビオチンヒドラジド、スルフヒドリル基に結合するビオチンマレイミドおよびヨードアセチルビオチンである。フルオレセインは、フルオレセインイソチオシアネートを使用して、タンパク質アミン基に結合することができる。ジニトロフェニル基は、２，４−ジニトロベンゼン硫酸塩、または２，４−ジニトロフルオロベンゼンを使用して、タンパク質のアミン基に結合することができる。共役の他の標準方法は、モノクローナル抗体を、ジアルデヒドを含む特異的結合対、カルボジイミド結合、ホモ官能性架橋結合、およびヘテロ二官能性架橋結合のメンバーに結合するために利用することができる。カルボジイミド結合は、ある物質上のカルボキシル基を別の物質上のアミン基に結合するための効果的な方法である。カルボジイミド結合は、市販の試薬の１−エチル−３−（ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を使用することにより促進させる。
【０１００】
二官能性イミドエステルおよび二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む、ホモ二官能性架橋剤は、市販されており、ある物質上のアミン基を別の物質上のアミン基に結合するために利用する。ヘテロ二官能性架橋剤は、異なる官能基を有する試薬である。最も一般的な市販のヘテロ二官能性架橋剤は、１つの官能基として、アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、および第２の官能基として、スルフヒドリル反応基を有する。最も一般的なスルフヒドリル反応基は、マレイミド、ピリジルジスルフィド、および活性ハロゲンである。照射により様々な基と反応する、官能基の１つは、光活性アリールニトレンであり得る。
【０１０１】
該特異的結合対の検出可能な標識抗体または検出可能なメンバーは、放射性同位体、酵素、蛍光性、化学発光、または電気化学的物質であり得る、レポーターに結合させることにより調製する。２つの一般に使用される放射性同位体は１２５Ｉおよび３Ｈである。標準的な放射性同位体標識法としては、クロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法、および１２５Ｉに対してボルトンハンター法、および３Ｈに対して還元的メチル化が挙げられる。「検出可能な標識」という用語は、標識の固有の酵素活性または別の成分の標識に結合することにより容易に検出することができるような方法において標識化された分子を指し、それ自体容易に検出することができる。
【０１０２】
本発明で用いるのに適した酵素は、ホタルおよびレニン、β−ラクタマーゼ、ウレアーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびリゾチームを含む、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ブドウ糖酸化酵素、発光酵素が挙げられるが、これらに限定されない。酵素標識は、特異的結合対のメンバーと抗体を結合するために、上記に記載するように、ジアルデヒド、カルボジイミド結合、ホモ二官能性架橋剤およびヘテロ二官能性架橋剤を使用することにより促進させる。
【０１０３】
選択する標識法は、酵素で利用できる官能基、および標識化する物質、共役条件への両方の耐性により異なる。本発明に使用する標識法は、Ｅｎｇｖａｌｌ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｌｍａｎｎ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８，８７１（１９７１），Ａｖｒａｍｅａｓ  ａｎｄ  Ｔｅｒｎｙｎｃｋ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８，１１７５（１９７５）、Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ４（３）：２０９−３２７（１９８３）、およびＪａｂｌｏｎｓｋｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４８：１９９（１９８５）に記載されるものを含む、現在利用される任意の従来の方法に限定されないが、それらのうちの１つであり得る。
【０１０４】
標識化は、スペーサーまたは特異的結合対の他のメンバーを使用する等の間接法により達成することができる。この一例は、ストレプトアビジンおよびビオチン化酵素を連続して、または同時に加えることによる、非標識化ストレプトアビジンおよびビオチン化酵素を用いた、ビオチン化抗体の検出である。したがって、本発明によると、検出するのに使用する該抗体は、レポーターとともに直接的に、または特異的結合対の第１のメンバーとともに間接的に、検出可能に標識化することができる。該抗体を、特異的結合対の第１のメンバーに結合させる際、検出は、上述のように、特異的結合複合体の抗体−第１のメンバーを、標識または非標識される結合対の第２のメンバーと反応させることにより達成する。
【０１０５】
さらに、該非標識検出抗体は、該非標識抗体を、該非標識抗体に対して特異的な標識抗体と反応させることにより検出することができる。本例において、上記に使用したような「検出可能に標識」とは、該非標識抗体に対して特異的な抗体が結合することができるエピトープを含むことを意味すると考えられる。このような抗抗体は、上記で論じた任意のアプローチを使用して、直接または間接的に標識化することができる。例えば、抗抗体は、上記で論じたようなストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ系と反応することにより検出されるビオチンに結合することができる。
【０１０６】
本発明の一実施形態において、ビオチンを利用する。該ビオチン化抗体は、同様に、ストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ複合体と反応させる。オルトフェニレンジアミン、４−クロロ−ナフトール、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＡＢＴＳ、ＢＴＳ、またはＡＳＡを使用し、発色検出をもたらすことができる。
【０１０７】
本発明を実践するための一免疫学的検定形式において、捕獲試薬が固定化されている、フォワードサンドウイッチ分析は、従来の技術を使用して、支持体の表面上で使用する。分析に使用する適した支持体としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、例えば、アミノ化またはカルボキシル化ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ガラスビーズ、アガロース、またはニトロセルロース等の置換ポリスチレン等の合成高分子支持体が挙げられる。
【０１０８】
本発明はまた、生体試料における、バイオマーカータンパク質、または核酸の存在を検出するためのキットを包含する。このようなキットは、患者が、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による阻害に対して感受性が低い腫瘍に苦しんでいる、またはその腫瘍に発達するリスクが増大するかどうかを決定するために使用することができる。例えば、該キットは、生体試料中のバイオマーカータンパク質または核酸を検出可能な標識化合物または薬剤、および試料中のタンパク質またはｍＲＮＡ（例えば、タンパク質もしくはその断片を結合する抗体、またはタンパク質をコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）の量を測定するための手段を含むことができる。キットはまた、キットを使用して得られた結果を解釈するための取扱説明書も含むことができる。
【０１０９】
抗体に基づいたキットに関しては、キットは、例えば、（１）バイオマーカータンパク質に結合する（例えば、固体支持体に結合される）第１の抗体、（２）タンパク質または第１の抗体に結合する、および検出可能な標識に共役される、第２の異なる抗体を含むことができる。
【０１１０】
オリゴヌクレオチドに基づいたキットに関しては、キットは、例えば、（１）例えば、バイオマーカータンパク質をコードする核酸配列にハイブリダイズする、検出可能な標識オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチド、または（２）バイオマーカー核酸分子を増幅するために有用な１対のプライマーを含むことができる。該キットはまた、例えば、緩衝剤、防腐剤、またはタンパク質安定剤を含むこともできる。該キットは、検出可能な標識（例えば、酵素または基質）を検出するために必要な成分をさらに含むことができる。該キットはまた、分析し、試験試料と比較することができる、対照試料または一連の対照試料を含むこともできる。該キットのそれぞれの成分は、個々の容器内に同封することができ、全ての様々な容器は、該キットを使用して実施する分析の結果を解釈するための取扱説明書とともに、個別の包装内であり得る。
【０１１１】
医術に精通する者は、患者のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する考えられる反応性を診断した後、治療有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を該患者に投与するための厳密な方法は、担当医の判断であることを当然理解する。用量、他の抗癌剤との併用、投与のタイミングおよび頻度等の投与形態は、患者のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する考えられる反応性の診断、ならびに患者の症状および病歴により影響され得る。したがって、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して比較的感受性の低いことが予測される腫瘍と診断された患者でさえ、このような阻害剤による治療、特に、他の抗癌剤、またはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して腫瘍の感受性が変化し得る試薬との併用から、まだ恩恵を受ける可能性がある。
【０１１２】
前述の諸方法による治療効果は、例えば、新生物成長状態を有する患者に存在する腫瘍の大きさの減少を測定することにより、または腫瘍細胞の増殖の程度の分子決定因子を分析することにより決定することができる。
【０１１３】
本発明は、治療有効量のＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤を患者に投与する、さらに、１つ以上の他の細胞毒性薬、化学療法薬、または抗癌剤、もしくはそのような薬剤の効果を向上する化合物を同時に、または続けて投与する、ステップを含む、患者における腫瘍または腫瘍転移を治療するための前述の諸方法をさらに提供する。
【０１１４】
本発明の文脈において、追加の他の細胞毒性薬、化学療法薬、または抗癌剤、あるいはこのような薬剤の効果を向上する化合物としては、例えば、アルキル化する薬剤、またはシクロホスファミド（ＣＴＸ、例えば、ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））、クロラムブシル（ＣＨＬ、例えば、ＬＥＵＫＥＲＡＮ（登録商標））、シスプラチン（ＣｉｓＰ、例えば、ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標））、ブルスファン（例えば、ＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、マイトマイシンＣ等のアルキル化活性する薬剤、メトトレキサート（ＭＴＸ）、エトポシド（ＶＰ１６、例えば、ＶＥＰＥＳＩＤ（登録商標））、６‐メルカプトプリン（６ＭＰ）、６‐チオクグアニン（６ＴＧ）、シタラビン（Ａｒａ‐Ｃ）、５‐フルオロウラシル（５‐ＦＵ）、カペシタビン（例えば、ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）等の抗代謝剤、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（ＤＸＲ、例えば、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン等の抗生物質、およびビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン（ＶＣＲ）、ビンブラスチン等）等のアルカロイド、およびパクリタキセル（例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標））ならびにパクリタキセル誘導体等の他の抗癌剤、細胞増殖抑制剤、デキサメタゾン（ＤＥＸ、例えば、ＤＥＣＡＤＲＯＮ（登録商標））等のグルココルチコイド、プレドニゾン等のコルチコステロイド、ヒドロキシウレア等のヌクレオシド酵素阻害剤、アスパラギナーゼ等のアミノ酸枯渇酵素、ロイコボリンおよび他の葉酸誘導体、および同様の様々な抗癌剤が挙げられる。以下の薬品、アルニホスチン（例えば、ＥＴＨＹＯＬ（登録商標））、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾトシン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシンリポ（例えば、ＤＯＸＩＬ（登録商標））、ゲムシタビン（例えば、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、ダウノルビシンリポ（例えば、ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標））、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル（例えば、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、アルデスロイキン、カルボプラチン、オキサリプラチン、クラドリビン、カンプトセシン、ＣＰＴ１１（イリノテカン）、１０‐ヒルドキシ７‐エチル‐カンプトセシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシルも、追加の薬剤として使用できる可能性がある。
【０１１５】
本発明は、治療有効量のＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤を患者に投与する、さらに、１つ以上の抗ホルモン剤を同時に、または続けて投与する、ステップを含む、患者における腫瘍または腫瘍転移を治療するための前述の諸方法をさらに提供する。本明細書で使用する「抗ホルモン剤」という用語は、腫瘍におけるホルモン活性を調節もしくは阻害する役割をする、天然、または合成有機、あるいはペプチド化合物を含む。
【０１１６】
抗ホルモン剤は、例えば、ステロイド受容体拮抗薬、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）‐イミダゾール、他のアロマターゼ阻害剤、４２‐ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（例えば、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））等の抗エストロゲン、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン等の抗アンドロゲン、ならびに上記いずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、およびＬＨＲＨ（黄体形成ホルモン放出ホルモン）等の糖タンパク質ホルモンの作用薬および／または拮抗薬、ＬＨＲＨ作用薬であり、ＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標）として販売されている酢酸ゴセレリン、ＬＨＲＨ拮抗薬であるＤ‐アラニンアミドＮ‐アセチル‐３‐（２‐ナフタレニル）‐Ｄ‐アラニル‐４‐クロロ‐Ｄ‐フェニルアラニル‐３‐（３‐ピリジニル）‐Ｄ‐アラニル‐Ｌ‐セリル‐Ｎ６‐（３‐ピリジニルカルボニル）‐Ｌ‐リシル‐Ｎ６‐（３‐ピリジニルカルボニル）‐Ｄ‐リシル‐Ｌ‐ロイシル‐Ｎ６‐（１‐メチルエチル）‐Ｌ‐リシル‐Ｌ‐プロリン（例えば、ＡＮＴＩＤＥ（登録商標）、Ａｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏ社製）、ＬＨＲＨ拮抗薬である酢酸ガニレリクス、ＭＥＧＡＣＥ（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ社製）として販売されているステロイド系抗アンドロゲンである酢酸シプロテロン（ＣＰＡ）と酢酸メゲストロール、ＥＵＬＥＸＩＮ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ社製）として販売されている非ステロイド系抗アンドロゲンフルタミド（２‐メチル‐Ｎ‐［４，２０‐ニトロ‐３‐（トリフルオロメチル）］フェニルプロパンアミド）、非ステロイド系抗アンドロゲンニルタミド（５，５‐ジメチル‐３‐［４‐ニトロ‐３‐（トリフルオロメチル‐４’‐ニトロフェニル）‐４，４‐ジメチル‐イミダゾリジン‐ジオン］、ならびにＲＡＲ、ＲＸＲ、ＴＲ、ＶＤＲ等に対する拮抗薬等の他の許容できない受容体の拮抗薬を含む。
【０１１７】
化学療法レジメンにおいて上記に記載の細胞毒性薬および他の抗癌剤の使用は、一般的に、癌治療技術において、明確に特徴付けられており、いくつかの調整を伴うが、本明細書におけるそれらの使用は、耐性および効果を監視するため、および投与経路と投薬量を制御するための同一の配慮を受ける。例えば、細胞毒性薬の実際の投薬量は、組織片培養法を用いて決定される患者の培養細胞の応答により変わる可能性がある。一般的に、該投薬量は、追加の他の薬剤がなしで使用する場合の量と比較し、当然少なくなる。
【０１１８】
有効な細胞毒性薬の一般的な投与量は、製造会社が推奨する範囲、および生体外反応または動物モデルにおける反応により示される範囲内となり、約１桁の濃度または量まで低減することが可能である。従って、実際の投薬量は、医師の判断、患者の病状、および一次培養された悪性細胞または組織片培養された組織サンプルの生体外での反応、あるいは適切な動物モデルにおいて認められる反応に基づく治療法の効果によって当然異なる。
【０１１９】
本発明は、治療有効量のＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤を患者に投与する、さらに、１つ以上の血管新生阻害剤を同時に、または続けて投与する、ステップを含む、患者における腫瘍または腫瘍転移を治療するための前述の諸方法をさらに提供する。
【０１２０】
抗血管形成剤としては、例えば、ＳＵ‐５４１６およびＳＵ‐６６６８（Ｓｕｇｅｎ  Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）等のＶＥＧＦＲ阻害剤、または本明細書に記載の、例えば国際出願第ＷＯ９９／２４４４０号、第ＷＯ９９／６２８９０号、第ＷＯ９５／２１６１３号、第ＷＯ９９／６１４２２号、第ＷＯ９８／５０３５６号、第ＷＯ９９／１０３４９号、第ＷＯ９７／３２８５６号、第ＷＯ９７／２２５９６号、第ＷＯ９８／５４０９３号、第ＷＯ９８／０２４３８号、第ＷＯ９９／１６７５５号、および第ＷＯ９８／０２４３７号、ならびに米国特許第５，８８３，１１３号、第５，８８６，０２０号、第５，７９２，７８３号、第５，８３４，５０４号、および第６，２３５，７６４号、ＩＭ８６２（Ｃｙｔｒａｎ  Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｗａｓｈ．，ＵＳＡ）等のＶＥＧＦ阻害剤、血管新生阻害剤、リボザイムからの合成リボザイム（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、およびカイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆ．）、ならびにベバシズマブ（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）等のＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦに対する組み換えヒト化抗体、αｖβ３、αｖβ５、およびαｖβ６インテグリン、ならびにその特殊型に対する、例えば、シレンギチド（ＥＭＤ１２１９７４）等のインテグリン受容体拮抗薬およびインテグリン拮抗薬、または、例えば、αｖβ３特定ヒト化抗体（例えば、ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標））等の抗インテグリン抗体、ＩＦＮ‐アルファ（米国特許第４１５３０，９０１号、４，５０３，０３５号、および５，２３１，１７６号）等の要素、血管新生阻害剤およびプラスミノーゲン断片（例えば、クリングル１‐４、クリングル５、クリングル１‐３（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７９：３１５−３２８、Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２９４６１−２９４６７、Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２９２４−２２９２８）、エンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ８８：２７７、および国際特許公開第ＷＯ９７／１５６６６号）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１；Ｆｒａｚｉｅｒ，（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：７９２）、血小板因子４（ＰＦ４）、プラスミノーゲン活性化因子／ウロキナーゼ阻害剤、ウロキナーゼ受容体拮抗薬、へパリナーゼ、ＴＮＰ−４７０１等のフマギリン類似物、スラミンおよびスラミン類似物、新脈管形成抑制ステロイド、ｂＦＧＦ拮抗薬、ｆｌｋ‐１およびｆｌｔ−１拮抗薬、ＭＭＰ‐２（マトリックスメタロプロテイナーゼ２）阻害剤等の抗血管形成剤およびＭＭＰ‐９（マトリックスメタロプロテイナーゼ９）阻害剤が挙げられる。マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の有用な例は、国際特許公開第ＷＯ９６／３３１７２号、第ＷＯ９６／２７５８３号、第ＷＯ９８／０７６９７号、第ＷＯ９８／０３５１６号、第ＷＯ９８／３４９１８号、第ＷＯ９８／３４９１５号、第ＷＯ９８／３３７６８号、第ＷＯ９８／３０５６６号、第ＷＯ９０／０５７１９号、第ＷＯ９９／５２９１０号、第ＷＯ９９／５２８８９号、第ＷＯ９９／２９６６７号、および第ＷＯ９９／０７６７５号、欧州特許公開第８１８，４４２号、第７８０，３８６号、第１，００４，５７８号、第６０６，０４６号、および第９３１，７８８号、英国特許公開第９９１２９６１号、および米国特許第５，８６３，９４９号および第５，８６１，５１０号に記載されている。望ましいＭＭＰ‐２およびＭＭＰ‐９阻害剤は、ＭＭＰ‐Ｉを阻害する活性をわずかに有する、または有さない。より望ましくは、ＭＭＰ‐２および／または他のマトリックスメタロプロテイナーゼ（すなわちＭＭＰ‐１、ＭＭＰ‐２、ＭＭＰ‐４、ＭＭＰ‐５、ＭＭＰ‐６、ＭＭＰ‐７、ＭＭＰ‐８、ＭＭＰ‐１０、ＭＭＰ‐１１、ＭＭＰ‐１２、およびＭＭＰ‐１３）に関係するＭＭＰ‐９を選択的に阻害する。
【０１２１】
本発明は、治療有効量のＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤を患者に投与する、さらに、１つ以上の腫瘍細胞に対するプロアポートシスまたはアポートシスの刺激剤を同時に、または続けて投与する、ステップを含む、患者における腫瘍または腫瘍転移を治療するための前述の諸方法をさらに提供する。
【０１２２】
本発明は、治療有効量のＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤を患者に投与する、さらに、１つ以上のシグナル伝達阻害剤を同時に、または続けて投与する、ステップを含む、患者における腫瘍または腫瘍転移を治療するための前述の諸方法をさらに提供する。
【０１２３】
シグナル伝達阻害剤としては、例えば、有機分子等のｅｒｂＢ２受容体阻害剤、または、例えば、トラスツズマブ（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））等のｅｒｂＢ２と結合する抗体、例えば、イマチニブ（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））等の他のタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、ｒａｓ阻害剤、ｒａｆ阻害剤（例えば、ＢＡＹ  ４３−９００６，Ｏｎｙｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｂａｙｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＭＥＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、サイクリン依存キナーゼ阻害剤、タンパク質キナーゼＣ阻害剤、およびＰＤＫ‐Ｉ阻害剤（それらの阻害剤のいくつかの例、および癌治療のための臨床試験におけるそれらの使用の詳細に関しては、Ｄａｎｃｅｙ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ，Ｅ．Ａ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２：９２−３１３を参照）が挙げられる。
【０１２４】
ＥｒｂＢ２受容体阻害剤としては、例えば、ＧＷ‐２８２９７４（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  ｐｉｃ）等のＥｒｂＢ２受容体阻害剤、ＡＲ‐２０９（Ａｒｏｎｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，Ｔｅｘ．，ＵＳＡ）および２Ｂ‐１（カイロン（Ｃｈｉｒｏｎ））等の単クローン抗体、および国際公開第ＷＯ９８／０２４３４号、第ＷＯ９９／３５１４６号、第ＷＯ９９／３５１３２号、第ＷＯ９８／０２４３７号、第ＷＯ９７／１３７６０号、および第ＷＯ９５／１９９７０号、ならびに米国特許第５，５８７，４５８号、第５，８７７，３０５号、第６，４６５，４４９号、および第６，５４１，４８１号に記載されているようなＥｒｂＢ２阻害剤が挙げられる。
【０１２５】
本発明は、治療有効量のＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤を患者に投与する、さらに、抗ＨＥＲ２抗体または免疫療法で活性なその断片を同時に、または続けて投与する、ステップを含む、患者における腫瘍または腫瘍転移を治療するための前述の諸方法をさらに提供する。
【０１２６】
本発明は、治療有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を患者に投与する、さらに、１つ以上の追加の抗増殖剤を同時に、または続けて投与する、ステップを含む、患者における腫瘍または腫瘍転移を治療するための前述の諸方法をさらに提供する。
【０１２７】
追加の抗増殖剤は、例えば、酵素ファルネシルタンパク質トランスファーゼ阻害剤、および受容体チロシンキナーゼＰＤＧＦＲ阻害剤を含み、それには、米国特許第６，０８０，７６９号、第６，１９４，４３８号、第６，２５８，８２４号、第６，５８６，４４７号、第６，０７１，９３５号、第６，４９５，５６４号、第６，１５０，３７７号、第６，５９６，７３５号、および第６，４７９，５１３号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ０１／４０２１７号に開示および主張される化合物を含む。
【０１２８】
本発明は、治療有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を患者に投与する、さらに、ＣＯＸ  ＩＩ（シクロオキシゲナーゼＩＩ）阻害剤を同時に、または続けて投与する、ステップを含む、患者における腫瘍または腫瘍転移を治療するための前述の諸方法をさらに提供する。有用なＣＯＸ−ＩＩ阻害剤の例としては、アレコキシブ（例えば、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標））、バルデコキシブ、ロフェコキシブが挙げられる。
【０１２９】
本発明は、治療有効量のＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤を患者に投与する、さらに、放射線または放射性医薬品を用いる治療を同時に、または続けて投与する、ステップを含む、患者における腫瘍または腫瘍転移を治療するための前述の諸方法をさらに提供する。
【０１３０】
放射線源は、治療を受けている患者の外部または内部にあり得る。放射線源が患者の外部にある場合には、治療法は、外照射療法（ＥＢＲＴ）として公知である。放射線源が患者の内部にある場合には、治療法は、近接照射療法（ＢＴ）と呼ばれる。本発明の文脈に使用するための放射性原子としては、ラジウム、セシウム‐１３７、イリジウム‐１９２、アメリシウム‐２４１、金‐１９８、コバルト‐５７、銅‐６７、テクネチウム‐９９、ヨウ素‐１２３、ヨウ素‐１３１、およびインジウム‐１１１が挙げられるが、これらに限定されない群から選択することができる。本発明のＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤が抗体である場合には、該抗体をこのような放射性同位体で標識することも可能である。
【０１３１】
放射線治療は、切除不能または手術不可能な腫瘍および／または腫瘍転移を制御するために、標準的に用いる治療である。放射線治療が化学療法と併用した際、結果の向上が見られる。放射線治療は、高線量の放射線を標的領域に送達する場合、腫瘍および正常組織内の両方で生殖細胞が死ぬという原理に基づいている。線量レジメンは、一般的に、放射線吸収線量（Ｇｙ）、時間、および分割に関して定義されるが、癌専門医により慎重に定義されなければいけない。患者が受ける放射線の量は、様々な考慮に依存するが、最も重要な２つは、体の他の重要な構造または器官に関する腫瘍の位置、および腫瘍が広がっている範囲である。放射線治療を行っている患者に対する一般的な一連の治療は、１から６週間に渡り、１日当たり約１．８から２．０Ｇｙで週５日間の合計１０から８０Ｇｙの放射線を患者に投与する治療計画となる。本発明の望ましい一実施形態において、ヒト患者における腫瘍を、本発明および放射線の併用治療により治療する際、相乗効果が生じる。つまり、本発明の組み合わせを含む薬剤による腫瘍増殖の阻害は、放射線、任意にさらなる化学療法または抗癌剤と併用する際、向上する。補助放射線療法のパラメータは、例えば、国際特許公開第ＷＯ９９／６００２３号に含まれている。
【０１３２】
本発明は、治療有効量のＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤を患者に投与する、さらに、１つ以上の抗腫瘍免疫反応を向上することができる薬剤を用いる治療を、同時に、または続けて投与する、ステップを含む、患者における腫瘍または腫瘍転移を治療するための前述の諸方法をさらに提供する。
【０１３３】
抗腫瘍免疫反応を向上することができる薬剤は、例えば、ＣＴＬＡ４（細胞傷害性リンパ球抗原４）抗体（例えば、ＭＤＸ‐ＣＴＬＡ４）、およびＣＴＬＡ４を遮断することができる他の薬剤を含む。本発明に使用できる特異的ＣＴＬＡ４抗体は、米国特許第６，６８２，７３６号に記載のものを含む。
【０１３４】
本発明の文脈において、薬剤または治療の「有効量」は上記に定義される通りである。薬剤または治療の「治療量以下の量」は、薬剤または治療の有効量より少ない量であるが、有効または治療量以下の量の他の薬剤または治療と併用する際、例えば、結果として生じる有効な効果における相乗効果、または副作用の減少により、医師の望む結果を生み出すことが可能な量である。
【０１３５】
本明細書で使用する「患者」という用語は、望ましくは、いずれの目的に対してＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いる治療を必要とするヒトを、さらに望ましくは、癌または前癌症状あるいは病変を治療するために、そのような治療を必要とするヒトを指す。しかしながら、「患者」という用語は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いる治療を必要とするヒトではない動物、望ましくは、特に、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ等の哺乳類、およびヒトではない霊長類も指す。
【０１３６】
望ましい一実施形態において、患者は、癌、前癌症状または病変、あるいは異常細胞増殖の他の形態のための治療を必要とするヒトである。癌は、望ましくは、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の投与により、部分的に、または完全に、治療可能ないずれかの癌である。癌は、例えば、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、細気管支肺胞型細胞肺癌、骨肉腫、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頚部癌、皮膚または眼球メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、腹部癌、胃癌、大腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、副腎癌、柔組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆嚢癌、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、中枢神経系腫瘍（ＣＮＳ）、脊髄軸癌、脳幹膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫であり得、難治性型のいずれの上記の癌、または１つ以上の上記癌の組み合わせを含む。前癌症状または病変としては、例えば、口腔白板症、光線性角化症（日光性角化症）、結腸または直腸の前癌状態のポリープ、胃上皮異形成症、腺腫性異形成症、遺伝性非腺腫性大腸癌症候群（ＨＮＰＣＣ）、バレット食道、膀胱異形成症、および子宮頚部の前癌症状が挙げられる。
【０１３７】
本発明の目的のために、追加の抗癌剤を用いた、ＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤「の併用投与」および「を併用投与する」（両方の成分は、以下、「２つの活性剤」という）は、独立または一緒のいずれかの２つの活性剤のいずれかの投与を指し、該２つの活性剤は、併用治療の利益を得るための適切な用法の一部として投与する。従って、該２つの活性剤は、同一医薬組成物の一部として、または独立した医薬組成物として、投与することが可能である。追加の薬剤は、ＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤の投与に先立って、同時に、または連続して、あるいはいくつかのその併用で投与することが可能である。ＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤が、例えば、標準的な一連の治療中等に、患者に繰り返し投与する際、該追加の薬剤は、ＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤の各投与の前に、同時に、または続けて、あるいはこれらの形態のそのいくつかの組み合わせにて、もしくはＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤による治療との関連で異なる間隔にて、ないしはＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤を用いる一連の治療の前、いずれの時点、または後に単回投与として投与することが可能である。
【０１３８】
ＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤は、一般的に、当業者に公知であり、例えば、国際特許公開第ＷＯ０１／３４５７４号（ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲのためのその他）に記載されるように、患者が治療を受けている癌にとって最も有効な癌治療（有効性および安全性の両方の観点から）を提供するための用法にて患者に投与する。本発明の治療法の実施において、ＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤は、治療する癌の種類、使用するキナーゼ阻害剤の種類（例えば、小分子、抗体、ＲＮＡｉ、リボザイム、またはアンチセンスコンストラクト）、および例えば、公開された臨床研究結果などに基づく処方医師の医療判断により、経口、局所、静脈注射、腹膜内、筋肉内、関節内注射、皮下、経鼻、眼球内部、膣内、直腸、皮内経路等の当業者に公知のいずれの有効な方法にて投与可能である。
【０１３９】
ＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤の投与量およびキナーゼ阻害剤の投与タイミングは、タイプ（生物種、性別、年齢、体重等）および治療を受けている該患者の病状、治療を受けている疾患または症状の重症度、および投与経路による。例えば、小分子キナーゼ阻害剤は、患者に対して、１日当たりまたは週当たり、体重の０．００１から１００ｍｇ／ｋｇを単回または分割、あるいは持続注入にて投与することが可能である（例に関しては、国際特許公開第ＷＯ０１／３４５７４号を参照）。特に、エラロチニブＨＣ１は、患者に対して、１日当たり５〜２００ｍｇ、または週当たり１００〜１６００ｍｇを単回または分割、あるいは持続注入にて投与可能である。望ましい投与量は、１５０ｍｇ／日である。抗体に基づいたキナーゼ阻害剤、またはアンチセンス、ＲＮＡｉ、あるいはリボザイムコンストラクトは、患者に対して、１日当たりまたは週当たり、体重の０．１から１００ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量を、単回または分割、あるいは持続注入にて投与可能である。場合によっては、上記の範囲の加減を下回る投薬量であっても、十分な場合もあり、一方、他の場合では、有害な副作用を引き起こすことなく、より大きな投与量を使用する場合もあり、そのような大投薬量は、１日を通した投与のために、最初にいくつかの小投薬量に分割する。
【０１４０】
ＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤、および他の追加の薬剤は、別々にまたは一緒に、同一または異なる経路で、多種多様な異なる投薬形態にて投与可能である。例えば、該キナーゼ阻害剤は、望ましくは、経口または非経口にて投与する。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤がエルロチニブＨＣｌ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））の際、経口投与が望ましい。ＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤、および他の追加の薬剤の両方は、単回または複数回にて投与することが可能である。
【０１４１】
ＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤は、様々な薬学的に許容される不活性の担体と共に、錠剤、カプセル、薬用キャンディー、トローチ剤、あめ玉、粉末、スプレー、クリーム、香油、坐薬、ゼリー状、ジェル、ペースト、水薬、軟膏、エリキシル剤、シロップ等の形態で投与することが可能である。それらの投薬形態による投与は、単回または複数回の投与により実施することができる。担体は、固形賦形剤または充填剤、無菌水性媒体、および様々な毒性のない有機溶媒等を含む。経口医薬組成物に、適切に甘味付けおよび／または風味付けを行うことが可能である。
【０１４２】
ＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤は、様々な薬学的に許容される不活性な担体と一緒に組み合わせ、スプレー、クリーム、香油、坐薬、ゼリー状、ジェル、ペースト、水薬、軟膏等の形態にすることが可能である。それらの投薬形態による投与は、単回または複数回の投与により実施することができる。担体は、固形賦形剤または充填剤、無菌水性媒体、および様々な毒性のない有機溶媒等を含む。
【０１４３】
タンパク性のＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤を含む全ての剤形は、変性および／または阻害剤の生物活性の低下ならび喪失を避けるよう選択しなければならない。
【０１４４】
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を含む医薬組成物を調製する諸方法は、当業者に公知であり、例えば、国際特許公開第ＷＯ０１／３４５７４号に記載されている。本発明を教えることを考慮し、ＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤を含む医薬組成物を調製する諸方法は、上記広報およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９０）等の他の公知の参考文献から明らかである。
【０１４５】
ＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤の経口投与のために、１つまたは複数の活性剤を含有する錠剤は、ポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチン、およびアカシアのような造粒結合剤と共に、スターチ（および望ましくは、コーン、ポテト、またはタピオカスターチ）、アルギン酸、および複合ケイ酸塩等の様々な錠剤分解物質に加え、様々な、例えば、微結晶性セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第２リン酸カルシウム、およびグリシン等のいずれの賦形剤と組み合わす。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、および滑石等の平滑剤は、多くの場合、錠剤を作る上で、非常に有用である。同じような種類の固体組成物はまた、ゼラチンカプセルの充填剤として使用する場合もあり、これに関する望ましい材料は、ラクトースまたは乳糖、および高分子量ポリエチレングリコールも含む。経口投与のために、水性懸濁液および／またはエリキシル剤を要望する際、キナーゼ阻害剤は、様々な甘味剤または風味剤、着色剤または染料、および、強く要望する場合は、乳化剤および／または懸濁化剤も、希釈剤としての水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、および様々なそれらのようなものの組み合わせと共に組み合わせることができる。
【０１４６】
活性剤の非経口投与のために、活性剤、またはその対応する水溶性塩を含む無菌水溶液はもちろん、ゴマまたはピーナッツ油、あるいは水性プロピレングリコール内の溶液を使用する場合がある。そのような無菌水溶液は、望ましくは、適切に中和し、また、望ましくは、例えば、十分な生理食塩水またはブドウ糖を用いて等張化させる。これらの特定の水溶液は、特に静脈注射、筋肉投与、皮下および腹腔内注射目的に適している。油性溶液は、関節内注射、筋肉および皮下注射目的に適している。無菌状態でのこれら全ての溶液の調製は、当業者に公知の標準医薬技術を用いて容易に達成できる。タンパク性のキナーゼ阻害剤の投与に選択する全ての非経口製剤は、変性および阻害剤の生物活性の喪失を避けるよう選択しなければならない。
【０１４７】
さらに、標準的な製薬法に従って、例えば、クリーム、水薬、ゼリー状、ジェル、ペースト、軟膏、香油等の方法により、片方または両方の活性剤を局所的に投与することが可能である。例えば、濃度が約０．１％（ｗ／ｖ）から約５％（ｗ／ｖ）のＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤を含む局所剤形を調製することができる。
【０１４８】
動物用目的としては、該活性剤は、動物に、上記に記載のいずれの形態を使用し、いずれの経路により、個別または一緒に投与することが可能である。望ましい一実施形態において、該キナーゼ阻害剤は、カプセル、ボーラス、錠剤、液体薬の形態で、注射またはインプラントにより投与する。別の方法としては、該ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、動物の飼料と共に投与し、この目的のために、濃厚飼料添加剤、または前もって混合したものを、通常の動物の飼料のために用意し得る。そのような剤形は、標準獣医業務に従う、従来の方法により調製する。
【０１４９】
本明細書で使用する「ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤」という用語は、現在当業者に公知である、または将来同定される、任意のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を指し、患者への投与によって、別様にその天然リガンドのＥＧＦＲへの結合に起因する任意の下流生物学的効果を含む、患者のＥＧＦ受容体の活性に関係する生物活性の阻害をもたらす、任意の化学物質を含む。そのようなＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲ活性を遮断可能ないずれの薬剤、または患者の癌の治療に関係するＥＧＦＲ活性のいずれの下流生物学的効果を含む。そのような阻害剤は、受容体の細胞内ドメインに直接結合し、そのキナーゼ活性を阻害することで、役割を果たす。あるいは、そのような阻害剤は、ＥＧＦ受容体のリガンド結合部位、またはその一部を占領し、通常の生物活性を抑制または減少するよう、受容体を、その天然リガンドに近づけないようにすることで、役割を果たす。あるいは、そのような阻害剤は、ＥＧＦＲポリペプチドの二量化、またはＥＧＦＲポリペプチドと他のタンパク質との相互作用を調節することで役割を果たす、あるいはＥＧＦＲのユビキチン化およびエンドサイトーシスの減少を増進することができる。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、低分子量阻害剤、抗体または抗体断片、アンチセンスコンストラクト、小さな抑制性ＲＮＡ（すなわち、ｄｓＲＮＡによるＲＮＡ干渉；ＲＮＡｉ）、およびリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤としては、抗ＥＧＦＲまたは抗ＥＧＦアプタマー、もしくは抗ＥＧＦＲまたは抗ＥＧＦ抗体、その同族の受容体にＥＧＦＲが結合するのを防ぐ可溶性ＥＧＦＲ受容体デコイ、もしくは他のＥＧＦＲリガンド（例えば、ＴＧＦ−α）を阻害するアプタマーまたは抗体が挙げられる。望ましい一実施形態において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ヒトＥＧＦＲと特異的に結合する、小有機分子または抗体である。
【０１５０】
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤としては、以下の特許公報、国際特許公開第ＷＯ９６／３３９８０号、第ＷＯ９６／３０３４７号、第ＷＯ９７／３００３４号、第ＷＯ９７／３００４４号、第ＷＯ９７／３８９９４号、第ＷＯ９７／４９６８８号、第ＷＯ９８／０２４３４号、第ＷＯ９７／３８９８３号、第ＷＯ９５／１９７７４号、第ＷＯ９５／１９９７０号、第ＷＯ９７／１３７７１号、第ＷＯ９８／０２４３７号、第ＷＯ９８／０２４３８号、第ＷＯ９７／３２８８１号、第ＷＯ９８／３３７９８号、第ＷＯ９７／３２８８０号、第ＷＯ９７／３２８８号、第ＷＯ９７／０２２６６号、第ＷＯ９７／２７１９９号、第ＷＯ９８／０７７２６号、第ＷＯ９７／３４８９５号、第ＷＯ９６／３１５１０号、第ＷＯ９８／１４４４９号、第ＷＯ９８／１４４５０号、第ＷＯ９８／１４４５１号、第ＷＯ９５／０９８４７号、第ＷＯ９７／１９０６５号、第ＷＯ９８／１７６６２号、第ＷＯ９９／３５１４６号、第ＷＯ９９／３５１３２号、第ＷＯ９９／０７７０１号、および第ＷＯ９２／２０６４２号、欧州特許出願第ＥＰ５２０７２２号、第ＥＰ５６６２２６号、第ＥＰ７８７７７２号、第ＥＰ８３７０６３号、および第ＥＰ６８２０２７号、米国特許第５，７４７，４９８号、第５，７８９，４２７号、第５，６５０，４１５号、および第５，６５６，６４３号、独国特許出願第ＤＥ１９６２９６５２号に記載の例えば、キナゾリンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピリドピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピリミドピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピロロピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピラゾロピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、フェニルアミノピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、オキシインドールＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、インドロカルバゾールＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、フタラジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、イソフラボンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、キナロン（ｑｕｉｎａｌｏｎｅ）ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、およびチロフォスチンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤等、ならびにＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の全ての薬学的に許容できる塩および溶媒和物が挙げられる。低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤のさらなる限定されない例は、Ｔｒａｘｌｅｒ，Ｐ．，１９９８，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ８（１２）：１５９９−１６２５に記載の全てのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤も含む。
【０１５１】
本発明に準じて使用可能な低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の具体的な望ましい例としては、［６，７‐ビス（２‐メトキシエトキシ）‐４‐キナゾリン‐４−イル］‐（３‐エチニルフェニル）アミン（ＯＳＩ‐７７４、エルロチニブ、またはＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エルロチニブＨＣｌ）としても知られている、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（米国特許第５，７４７，４９８号、国際特許公開第ＷＯ０１／３４５７４号、およびＭｏｙｅｒ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４８３８−４８４８）、ＣＩ‐１０３３（以前はＰＤ１８３８０５として知られていた、Ｐｆｉｚｅｒ）（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４０：７２３）、ＡＧ‐１４７８（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＣＧＰ‐５９３２６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＫＩ‐１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＥＫＢ‐５６９（Ｗｙｅｔｈ）、ＧＷ‐２０１６（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＷ‐５７２０１６またはラパチニブジトシレートとしても知られている、ＧＳＫ）、およびゲフィチニブ（ＺＤ１８３９またはＩＲＥＳＳＡ（登録商標）としても知られている、Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）（Ｗｏｏｄｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３８：６３３）が挙げられる。本発明に準じて使用可能な特に望ましい低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、［６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）‐４‐キナゾリン‐４‐イル］‐（３‐エチニルフェニル）アミン（すなわち、エルロチニブ）、その塩酸塩、（すなわち、エルロチニブＨＣｌ、ＴＡＲＣＥＡ（登録商標））、または他の塩形態（例えば、エルロチニブメシラート）である。
【０１５２】
抗体に基づいたＥＧＦＲキナーゼ阻害剤としては、その天然リガンドにより、局所的または完全にＥＧＦＲ活性を遮断できる、いずれの抗ＥＧＦＲ抗体あるいは抗体断片が挙げられる。抗体に基づいたＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の限定されない例としては、Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６７：２４７−２５３、Ｔｅｒａｍｏｔｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ７７：６３９−６４５、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：１３１１−１３１８、Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：５９（８）：１９３５−４０、およびＹａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：１２３６−１２４３に記載のものが挙げられる。従って、該ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、単クローン抗体Ｍａｂ  Ｅ７．６．３（Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：１２３６−４３）、またはＭａｂ  Ｃ２２５（ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＢ‐８５０８）、あるいはその結合特異性を有する抗体もしくは抗体断片になり得る。適合する単クローン抗体ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ＩＭＣ‐Ｃ２２５（セテュキマブまたはＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）としても知られる、Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標）；Ａｂｇｅｎｉｘ；ＡＢＸ−ＥＧＦとしても知られる）、ＥＭＤ７２０００（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、ＲＨ３（Ｙｏｒｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）、およびＭＤＸ‐４４７（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
さらなる抗体に基づいたＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、公知の方法に従い、適切な抗原またはエピトープを、例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびマウス等の選択された宿主動物に投与することによって、作ることができる。当業者に公知の様々な佐剤は、抗体産生を増進するために使用可能である。
【０１５４】
本発明の実施に有用な抗体は、多クローン性でも可能だが、単クローン抗体が望ましい。ＥＧＦＲに対する単クローン抗体は、培養液中の連続継代細胞系により、抗体分子の産生を提供するためのあらゆる技術を使用し、調製および分離することができる。産生および分離のための技術としては、最初にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより記載されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６：４９５−４９７）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ４：７２、Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ‐ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
あるいは、単鎖抗体の産生のために記載の技術（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照）は、抗ＥＧＦＲ単鎖抗体を産生するために適応可能である。本発明の実施に有用な抗体に基づいたＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、無傷抗体分子のペプシン消化により生成させることができるＦ（ａｂ’）２  断片、およびＦ（ａｂ’）２  断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成させることができるＦａｂ断片も含むが、これに限定されない、抗ＥＧＦＲ抗体断片も含む。あるいは、Ｆａｂおよび／またはｓｃＦｖ発現ライブラリーは、ＥＧＦＲに対する望ましい特異性を有する断片の迅速な特定を可能にするために、構成することができる（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１を参照）。
【０１５６】
単クローン抗体および抗体断片を産生および分離するための技術は、当業者に公知であり、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、およびＪ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ，１９８６，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体および抗体断片はまた、Ｖａｕｇｈｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：５３５−５３９、およびそこに引用されている参考文献に記載される技術等の公知の技術に従い、調製可能であり、またそのような抗体あるいはその断片は、本発明の実施にも有用である。
【０１５７】
本発明にて使用するＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンストラクトに基づくことが可能である。アンチセンスＲＮＡ分子、およびアンチセンスＤＮＡ分子を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンストラクトは、細胞内でＥＧＦＲ  ｍＲＮＡの翻訳を、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡに結合することによって直接阻止し、したがって、タンパク質の翻訳を阻止したり、ｍＲＮＡ分解を増進したりすることで、ＥＧＦＲキナーゼタンパク質のレベルを低下させ、活性を低下することで、直接阻止する役割を果たすだろう。例えば、少なくとも約１５個の基、およびＥＧＦＲをコードするｍＲＮＡ転写配列のユニーク領域に対する補体のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、従来のリン酸ジエステル技術により合成、および、例えば、静脈注射または注入により投与することが可能である。既知の配列を有する遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術を使用するための方法は、当業者に公知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号、第６，５６６，１３１号、第６，３６５，３５４号、第６，４１０，３２３号、第６，１０７，０９１号、第６，０４６，３２１号、および第５，９８１，７３２号を参照）。
【０１５８】
低分子の抑制性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）はまた、本発明にて使用するＥＧＦＲキナーゼ阻害剤として機能することも可能である。ＥＧＦＲ遺伝子発現は、腫瘍、低分子の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を有する対象または細胞、あるいは低分子の二本鎖ＲＮＡの産生をもたらすベクターもしくはコンストラクトへの接触によって、減少させることが可能であり、そのようなＥＧＦＲの発現は、特異的に阻害されている（すなわち、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）。既知の配列を有する遺伝子の適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードしているベクターを選択するための諸方法は、当業者に公知である（例えば、Ｔｕｓｃｈｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３（２４）：３１９１−３１９７、Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ４１１：４９４−４９８、Ｈａｒｍｏｎ，Ｇ．Ｊ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ４１８：２４４−２５１、ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ３：７３７−７４７、Ｂｒｅｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９６：５５０−５５３、米国特許第６，５７３，０９９号および６，５０６，５５９号、ならびに国際特許公開第ＷＯ０１／３６６４６号、第ＷＯ９９／３２６１９号、および第ＷＯ０１／６８８３６号を参照）。
【０１５９】
リボザイムはまた、本発明にて使用するＥＧＦＲキナーゼ阻害剤として機能することも可能である。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を促進できる酵素のＲＮＡ分子である。リボザイム作用の仕組みは、リボザイム分子の、相補的な標的ＲＮＡへの配列特異的なハイブリッドと、その後のエンドヌクレアーゼ的切断を含んでいる。ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ的切断を特異的かつ効果的に触媒する人工ヘアピンまたはハンマーヘッドをモチーフに設計されたリボザイム分子は、従って、本発明の範囲において有用である。最初に、いずれの潜在ＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位は、一般的に以下の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＧを含む、標的分子のリボザイム切断部位を走査することによって同定する。一旦同定すると、切断部位を含有する標的遺伝子の部位に対応する約１５から２０のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド配列を不適切にすることが可能な第２構造等の予想される構造的特徴について評価することが可能である。候補標的の適正はまた、例えば、リボヌクレアーゼ保護分析を使用し、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に対するアクセス性を試験することで、評価することもできる。
【０１６０】
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの両方は、公知の方法にて調製できる。これらは、例えば、固相ホスホラミダイト化学合成による化学合成のための技術を含む。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列の体外または生体内転写により生成可能である。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーター等の適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを導入する多種多様なベクターの中に導入することができる。本発明のオリゴヌクレオチドに対する様々な修飾を、細胞内安定性および半減期を延長する手段として導入することができる。可能な修飾としては、リボヌクレオチドあるいはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列を分子の５’および／または３’末端へ付加すること、またはオレゴヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合の代わりにホスホロチオエートあるいは２’‐Ｏ‐メチルを使用することが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
本明細書で使用する「ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤」という用語は、現在当業者に公知である、または将来同定される、任意のＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤を指し、患者への投与によって、別様にその天然リガンドのＰＤＧＦＲへの結合に起因する任意の下流生物学的効果を含む、患者のＰＤＧＦＲ受容体の活性に関係する生物活性の阻害をもたらす、任意の化学物質を含む。そのようなＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ＰＤＧＦＲ活性を遮断可能な薬剤全て、または患者の癌の治療に関係するＰＤＧＦＲ活性のあらゆる下流生物学的効果を含む。そのような阻害剤は、受容体の細胞内ドメインに直接結合し、そのキナーゼ活性を阻害することで、役割を果たす。あるいは、そのような阻害剤は、ＰＤＧＦ受容体のリガンド結合部位、またはその一部を占領し、通常の生物活性を抑制または減少するように、受容体を、その天然リガンドに近づけないようにすることで、役割を果たす。あるいは、そのような阻害剤は、ＰＤＧＦＲポリペプチドの二量化、またはＰＤＧＦＲポリペプチドと他のタンパク質との相互作用を調節することで役割を果たす、あるいはＰＤＧＦＲのユビキチン化およびエンドサイトーシスの減少を増進することができる。ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤は、低分子量阻害剤、抗体または抗体断片、アンチセンスコンストラクト、低分子の抑制性ＲＮＡ（すなわち、ｄｓＲＮＡによるＲＮＡ干渉；ＲＮＡｉ）、およびリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤としては、抗ＰＤＧＦＲまたは抗ＰＤＧＦＲアプタマー、もしくは抗ＰＤＧＦＲまたは抗ＰＤＧＦＲ抗体、その同族の受容体にＰＤＧＦＲが結合するのを防ぐ可溶性ＰＤＧＦＲ受容体デコイが挙げられる。望ましい一実施形態において、ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ヒトＰＤＧＦＲと特異的に結合する、小有機分子または抗体である。ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤として役割を果たすための化合物または薬剤の能力は、当業者に公知の方法に従い、さらに、例えば、Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ，（２００１）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１５：１９１３−２５、Ｚｉｐｐｅｌ，ｅｔ  ａｌ，（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５０（２）：４２８−３４、およびＺｗｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ，（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：２１９−２１に記述される方法に従い、決定し得る。
【０１６２】
本発明は、当業者に公知のＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤、ならびに下記に支持されるもの、および生成するために当業者の範囲内である任意かつ全ての同等物が挙げられる。例えば、ＰＤＧＦに対する阻害抗体は、当業者に公知であり、例えば、米国特許第５，９７６，５３４号、第５，８３３，９８６号、第５，８１７，３１０号、第５，８８２，６４４号、第５，６６２，９０４号、第５，６２０，６８７号、第５，４６８，４６８号、ＰＣＴＷＯ２００３／０２５０１９に記載されるものであり、それらの内容は、参照することによりその全体として組み込む。さらに、本発明は、米国特許第５，５２１，１８４号、ならびにＷＯ２００３／０１３５４１、ＷＯ２００３／０７８４０４、ＷＯ２００３／０９９７７１、ＷＯ２００３／０１５２８２、およびＷＯ２００４／０５２８２に記載されるもの等のＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤である、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体を含み、参照することによりその全体として本明細書に組み込む。
【０１６３】
ＰＤＧＦの作用を阻止する小分子体は、当業者に公知であり、例えば、米国特許または出願公開第６，５２８，５２６号（ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、第６，５２４，３４７号（ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、第６，４８２，８３４号（ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、第６，４７２，３９１号（ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）号、第６，９４９，５６３号、第６，６９６，４３４号、第６，３３１，５５５号、第６，２５１，９０５号、第６，２４５，７６０号、第６，２０７，６６７号、第５，９９０，１４１号、第５，７００，８２２号、第５，６１８，８３７号、第５，７３１，３２６号、および第２００５／０１５４０１４号、ならびに国際出願公開第ＷＯ２００５／０２１５３１号、第ＷＯ２００５／０２１５４４号、および第ＷＯ２００５／０２１５３７号に記載されるものであり、それらの内容は、参照することによりその全体として組み込む。
【０１６４】
ＰＤＧＦの作用を阻止するタンパク質およびポリペプチドは、当業者に公知であり、例えば、米国特許第６，３５０，７３１号（ＰＤＧＦペプチド類似体）、第５，９５２，３０４号に記載されるものであり、それらの内容は、参照することによりその全体として組み込む。
【０１６５】
ＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼを阻害するビス単環式およびニ環式アリールおよびヘテロアリール化合物は、当業者に公知であり、例えば、米国特許第５，４７６，８５１号、第５，４８０，８８３号、第５，６５６，６４３号、第５，７９５，８８９号、および第６，０５７，３２０号に記載されるものであり、それらの内容は、参照することによりその全体として組み込む。
【０１６６】
ＰＤＧＦの阻害に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に公知であり、例えば、米国特許第５，８６９，４６２号および第５，８２１，２３４号に記載されるものであり、それらのそれぞれの内容は、参照することによりその全体として組み込む。
【０１６７】
ＰＤＧＦの阻害に対するアプタマー（核酸リガンドとしても知られる）は、当業者に公知であり、例えば、米国特許第６，５８２，９１８号、第６，２２９，００２号、第６，２０７，８１６号、第５，６６８，２６４号、第５，６７４，６８５号、および第５，７２３，５９４号に記載されるものであり、それらのそれぞれの内容は、参照することによりその全体として組み込む。
【０１６８】
当業者に公知のＰＤＧＦを阻害する他の化合物は、米国特許第５，２３８，９５０号、第５，４１８，１３５号、第５，６７４，８９２号、第５，６９３，６１０号、第５，７００，８２２号、第５，７００，８２３号、第５，７２８，７２６号、第５，７９５，９１０号、第５，８１７，３１０号、第５，８７２，２１８号、第５，９３２，５８０号、第５，９３２，６０２号、第５，９５８，９５９号、第５，９９０，１４１号、第６，３５８，９５４号、および第６，５３７，９８８号に記載されるものを含み、それらのそれぞれの内容は、参照することによりその全体として組み込む。
【０１６９】
ＰＤＧＦＲ等のチロシンキナーゼ受容体酵素に対して選択的である数種類のチロシンキナーゼ阻害剤は、公知である（例えば、Ｓｐａｄａ  ａｎｄ  Ｍｙｅｒｓ（（１９９５）Ｅｘｐ．Ｑｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，５：８０５）およびＢｒｉｄｇｅｓ（（１９９５）Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，５：１２４５を参照）。さらに、ＬａｗおよびＬｙｄｏｎは、チロシンキナーゼ阻害剤の抗癌性の可能性を概説している（（１９９６）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｄｒｕｇｓ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔ  Ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，２４１−２６０）。例えば、米国特許第６，５２８，５２６号は、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）チロシンキナーゼ活性を選択的に阻害する置換キノキサリン化合物を記載する。ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ活性の公知の阻害剤としては、Ｍａｇｕｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ，（（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：２１２９）、およびＤｏｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ，（（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：２６２７）によって報告される、キノリンに基づいた阻害剤が挙げられる。フェニルアミノ−ピリミジンに基づいた阻害剤のクラスは、最近、欧州特許第ＥＰ  ５６４４０９号のＴｒａｘｌｅｒ，ｅｔ  ａｌにおいて、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，（（１９９６）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，６：１２２１−１２２６）、およびＢｕｃｈｄｕｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ，（（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９２：２５５８）によって報告された。ＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性を阻害するのに有用なキナゾリン誘導体としては、ビス単環式およびニ環指揮アリール化合物およびヘテロアリール化合物（例えば、国際出願第ＷＯ９２／２０６４２号を参照）、キノキサリン誘導体（（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４：６１０６−６１１４を参照）、ピリミジン誘導体（日本公開特許出願第８７８３４／９４号）、およびジメトキシキノリン誘導体（Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １１６ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（Ｋａｎａｚａｗａ），（１９９６），２，ｐ．２７５，２９（Ｃ２）１５−２を参照）が挙げられる。
【０１７０】
本発明に準じて使用可能な低分子量ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤の具体的な望ましい例はイマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＳＵ−１２２４８（リンゴ酸スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）；Ｐｆｉｚｅｒ）、ダサチニブ（ＳＰＲＹＣＥＬ（登録商標）；ＢＭＳ；ＢＭＳ−３５４８２５としても知られる）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶ  ＡＲ（登録商標）；Ｂａｙｅｒ；Ｂａｙ−４３−９００６としても知られる）、ＡＧ−１３７３６（アキシチニブ；Ｐｆｉｚｅｒ）、ＲＰＲ１２７９６３（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＣＰ−８６８５９６（Ｐｆｉｚｅｒ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＭＬＮ−５１８（タンデュチニブ（ｔａｎｄｕｔｉｎｉｂ）；Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＭＧ−７０６（モテサニブ；Ａｍｇｅｎ）、ＡＲＡＶＡ（登録商標）（レフルノミド；Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ；ＳＵ１０１としても知られる）、およびＯＳＩ−９３０（ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含む。本発明に準じて使用可能なＦＧＦＲキナーゼ阻害剤でもある低分子量ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤の望ましい追加の例は、ＸＬ−９９９（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＳＵ６６６８（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＨＩＲ−２５８／ＴＫＩ−２５８（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＲＯ４３８３５９６（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）およびＢＩＢＦ−１１２０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を含む。
【０１７１】
本明細書で使用する「ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤」という用語は、当業者に現在公知の、または将来特定される任意のＦＧＦＲキナーゼ阻害剤を指し、患者への投与において、投与されない場合は天然リガンドのＦＧＦＲへの結合に起因する下流の生物活性効果のすべてを含む、患者のＦＧＦ受容体の活性に関係する生物活性に阻害をもたらす、任意の化学物質を含む。そのようなＦＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ＦＧＦＲ活性、または患者の癌治療に関係するＦＧＦＲ活性の下流の生物学的効果のすべてを遮断可能なすべての薬剤を含む。そのような阻害剤は、受容体の細胞内ドメインに直接結合し、そのキナーゼ活性を阻害することで、役割を果たすことが可能である。あるいは、そのような阻害剤は、ＦＧＦ受容体のリガンド結合部位、またはその一部を占領し、通常の生物活性を抑制または減少するよう、受容体を、その天然リガンドに近づけないようにすることで、役割を果たすことが可能である。あるいは、そのような阻害剤は、ＦＧＦＲポリペプチドの二量化、またはＦＧＦＲポリペプチドと他のタンパク質との相互作用を調節することで役割を果たすこと、あるいはＦＧＦＲのユビキチン化およびエンドサイトーシスの減少を増進することができる。ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤は、低分子量阻害剤、抗体または抗体断片、アンチセンスコンストラクト、低分子の抑制性ＲＮＡ（いわゆる、ｄｓＲＮＡ、ＲＮＡｉによるＲＮＡ干渉）、およびリボザイムを含むが、それらに限定されない。ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤は、抗ＦＧＦまたは抗ＦＧＦＲアプタマー、もしくは抗ＦＧＦまたは抗ＦＧＦＲ抗体、または、その同族の受容体へのＦＧＦＲの結合を防ぐ可溶性ＦＧＦＲ受容体デコイを含む。望ましい一実施形態において、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤は、特にヒトＦＧＦＲと結合する、有機小分子または抗体である。抗ＦＧＦＲ抗体は、ＦＲｌ−Ｈ７（ＦＧＦＲ−１）およびＦＲ３−Ｄ１１（ＦＧＦＲ−３）（Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を含む。
【０１７２】
ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ＦＧＦＲ活性を調整するヘパラン硫酸プロテオグリカンの能力に影響を与えることによって、ＦＧＦＲシグナルの伝達を阻害する化合物も含む。細胞外基質中のへパラン硫酸プロテオグリカンは、例えば、タンパク質分解からの保護、貯蔵、局在、増殖因子の内在化など、ＦＧＦの作用を仲介することができ（Ｆａｈａｍ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，８：５７８−５８６）、また、同族のＦＧＦＲにＦＧＦを提示すように、および／または受容体のオリゴマー形成を促進するように作用する低親和ＦＧＦ受容体として機能することができる（Ｇａｌｚｉｅ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７５：６６９−６８５）。
【０１７３】
本発明は、当技術分野で公知のＦＧＦＲキナーゼ阻害剤（例えばＰＤ１７３０７４）、ならびに下記に担持されるもの、および生成するために当業者の範囲内である任意かつすべての同等物を含む。
【０１７４】
ＦＧＦ作用に拮抗することができ、従って本明細書で説明する方法においてＦＧＦＲキナーゼ阻害剤として使用することができる化学物質の例は、スラミン、スラミンの構造類似体、ペントサン多硫酸、スコポラミン、アンギオスタチン、ｓｐｒｏｕｔｙ、エストラジオール、カルボキシメチルベンジルアミンデキストラン（ＣＭＤＢ７）、スラジスタ、インスリン様増殖因子結合タンパク質３、エタノール、へパリン（例えば、６−Ｏ−脱硫酸へパリン）、低分子量へパリン、硫酸プロタミン、シクロスポリンＡ、またはｂＦＧＦのＲＮＡリガンドを含む。
【０１７５】
当技術分野において公知である、ＦＧＦＲキナーゼを阻害する他の薬剤または化合物は、米国特許第７，１５１，１７６号（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ピロロトリアジン化合物）、第７，１０２，００２号（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ピロロトリアジン化合物）、第５，１３２，４０８号（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ペプチドＦＧＦアンタゴニスト）および第５，９４５，４２２号（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ；２−アミド置換ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン）、米国出願公開第２００５／０２５６１５４号（４−アミノ−チエノ［３，２−ｃ］ピリジン−７−カルボン酸アミド化合物）、および第２００４／０２０４４２７号（ピリミジノ化合物）、および国際特許出願公開第ＷＯ−２００７０１９８８４号（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ、Ｎ−（３−ピラゾリル）−Ｎ’−４−（４−ピリジニルオキシ）フェニル）尿素化合物）、第ＷＯ−２００７００９７７３号（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧ、ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン誘導体）、第ＷＯ−２００７０１４１２３号（Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、ＦＧＦＲ融合タンパク質）、第ＷＯ−２００６１３４９８９号（協和発酵工業株式会社、窒素複素環化合物）、第ＷＯ−２００６１１２４７９号（協和発酵工業株式会社、アザへテロ環）、第ＷＯ−２００６１０８４８２号（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ、９−（４−ウレイドフェニル）プリン化合物）、第ＷＯ−２００６１０５８４４号（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ、Ｎ−（３−ピラゾリル）−Ｎ’−４−（４−ピリジニルオキシ）フェ二ル）尿素化合物）、第ＷＯ−２００６０９４６００号（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ、テトラヒドロピロロキノリン誘導体）、第ＷＯ−２００６０５０８００号（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ、Ｎ，Ｎ’−ジアリール尿素誘導体）、第ＷＯ−２００６０５０７７９号（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ、Ｎ，Ｎ’−ジアリール尿素誘導体）、第ＷＯ−２００６０４２５９９号（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ、フェニル尿素誘導体）、第ＷＯ−２００５０６６２１１号（Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、抗ＦＧＦＲ抗体）、第ＷＯ−２００５０５４２４６号（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ、複素環アミン）、第ＷＯ−２００５０２８４４８号（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ、２−アミノ−１−ベンジル−置換ベンズイミダゾール誘導体）、第ＷＯ−２００５０１１５９７号（Ｉｒｍ  Ｌｉｅ、置換複素環誘導体）、第ＷＯ−２００４０９３８１２（Ｉｒｍ  Ｌｌｃ／Ｓｃｒｉｐｐｓ、６−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン誘導体）、第ＷＯ−２００４０４６１５２号（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ、ピリミド［４，５−ｅ］オキサジアジン誘導体）、第ＷＯ−２００４０４１８２２号（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ、ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン誘導体）、第ＷＯ−２００４０１８４７２号（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ、ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン誘導体���、第ＷＯ−２００４０１３１４５号（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ピロロトリアジン誘導体）、第ＷＯ−２００４００９７８４号（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル化合物）、第ＷＯ−２００４００９６０１号（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ、アザインドール化合物）、第ＷＯ−２００４００１０５９号（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ、複素環誘導体）、第ＷＯ−０２１０２９７２号（Ｐｒｏｃｈｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．／Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ、抗ＦＧＦＲ抗体）、第ＷＯ−０２１０２９７３号（Ｐｒｏｃｈｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．、抗ＦＧＦＲ抗体）、第ＷＯ−００２１２２３８号（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、２−（ピリジン−４−イルアミノ）−６−ジアルコキシフェニル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−ｏｎｅ誘導体）、第ＷＯ−００１７０９７７号（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．、ＦＧＦＲ−Ｌおよび誘導体）、第ＷＯ−００１３２６５３号（Ｃｅｐｈａｌｏｎ，Ｉｎｃ．、ピラゾロン誘導体）、第ＷＯ−０００４６３８０号（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＦＧＦＲ−１ｇ融合タンパク質）、および第ＷＯ−０００１５７８１号（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ、ヒトＳＰＲＯＵＴＹ−１タンパク関連ポリペプチド）に記載の薬剤または化合物を含む。
【０１７６】
本発明に準じて使用可能な低分子量ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤の具体的な望ましい例は、ＲＯ−４３９６６８６（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）、ＣＨＩＲ−２５８（Ｃｈｉｒｏｎ；ＴＫＩ−２５８としても知られる）、ＰＤ  １７３０７４（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＤ  １６６８６６（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＥＮＫ−８３４およびＥＮＫ−８３５（ｂｏｔｈ  Ｅｎｋａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ａ／Ｓ）、およびＳＵ５４０２（Ｐｆｉｚｅｒ）を含む。本発明に従って使用可能なＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤でもある低分子量ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤の追加の好ましい例としては、ＸＬ−９９９（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＳＵ６６６８（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＨＩＲ−２５８／ＴＫＩ−２５８（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＲＯ４３８３５９６（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）およびＢＩＢＦ−１１２０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）が挙げられる。
【０１７７】
本発明の治療方法の説明においては、ＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼの阻害剤は、薬剤的に容認可能な担体、および非毒性の治療上有効量のキナーゼ阻害剤化合物（薬剤的に容認可能なその塩を含む）を含む化合物として使用する。
【０１７８】
「薬剤的に容認可能な塩」という用語は、薬剤的に容認可能な非毒性塩基または酸から調整された塩を指す。本発明の化合物が酸性である場合、その対応する塩は、無機塩基および有機塩基を含む、薬剤的に容認可能な非毒性塩基から簡便に調製することができる。このような無機塩基に由来する塩は、アルミニウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、銅（酸化第２銅および酸化第１銅）塩、第２鉄塩、第１鉄塩、リチウム塩、マグネシウム塩、マンガン（第１マンガンおよび第２マンガン）塩、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩などの塩を含む。特に望ましいのは、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウムおよびナトリウムの塩である。薬剤的に容認可能な非毒性の有機塩基に由来する塩は、第１級、第２級および第３級アミン、ならびに自然発生的および合成的に置換されたアミンなどの環状アミンおよび置換アミンの塩を含む。塩を形成可能な他の薬剤的に容認可能な非毒性の有機塩基は、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラアミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどのイオン交換樹脂を含む。
【０１７９】
本発明において使用する化合物が塩基性である場合、その対応する塩は、無機および有機酸を含む、薬剤的に容認可能な非毒性酸から簡便に調製することができる。このような酸は、例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐトルエンスルホン酸などを含む。特に望ましいのは、クエン酸、臭化水素、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸および酒石酸である。
【０１８０】
有効成分としてキナーゼ阻害剤化合物を含む本発明で使用する医薬組成物は（薬剤的に容認可能なその塩を含む）、薬剤的に容認可能な担体、および随意で他の治療用組成物またはアジュバントを含むことができる。他の治療薬剤は、それらの細胞毒性、化学療法薬または抗癌剤、または上記に挙げたような薬剤の効果を強化する薬剤を含んでもよい。任意の指定の事例における最適経路は、特定の受給者および有効成分が投与されている病状の性質および重篤度に依存することになるが、該組成物は、経口、直腸、局所および非経口（皮下、筋肉、および静脈を含む）投与に適した組成物を含む。該医薬組成物類は、１回の服用量で都合よく示し、製薬技術分野において公知の任意の方法によって調整してもよい。
【０１８１】
実際には、本発明のキナーゼ阻害剤化合物（薬剤的に容認可能なその塩を含む）は、従来の薬剤的配合技術に準じて、薬剤担体との密接混合における有効成分として配合することが可能である。該担体は、例えば、経口投与形態または皮下（静脈を含む）投与形態など、投与に望ましい調整の形に応じて、広範な形を取ってもよい。このように、本発明の薬剤化合物は、それぞれ有効成分の既定量を含むカプセル剤、カプセル、または錠剤等、経口投与に適した個別の単位として調製できる。さらに、化合物は、粉末、顆粒、液剤、水生液体中の懸濁液剤、非水生液剤、水中油型乳剤、または、油中水型乳剤として調製できる。上記の一般的な服用形式に加えて、ＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤化合物（薬剤的に容認可能なそのそれぞれの化合物の塩を含む）は、管理型放出手段および／または搬送器具によって投与することもできる。複合組成物は、任意の製薬方法によって調整することができる。一般的に、このような方法は、有効成分を１つ以上の必要な成分を構成する担体との会合部に結合するステップを含む。一般的に、該組成物は、有効成分を液状の担体または微粉化した固体状の担体または両方を均一状かつ密接に混合することによって調製する。その後、生成物は、望ましい形状に都合よく形成することが可能である。
【０１８２】
本発明で使用するＥＧＦＲキナーゼ、ＦＧＦＲキナーゼ、またはＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤化合物（薬剤的に容認可能なその塩を含む）は、１つ以上の他の治療上有効な化合物との併用で薬剤組成物にも含めることができる。他の治療上有効な化合物は、上記に挙げたような、このような薬剤の効能を強化する細胞毒性薬、化学療法薬または抗癌剤を含むことができる。
【０１８３】
このように、本発明の一実施形態において、薬剤化合物は、抗癌剤との組み合わせでキナーゼ阻害剤化合物を含むことができ、前記抗癌剤は、アルキル化薬、代謝拮抗物質、微小管阻害剤、ポドフィロトキシン、抗生物質、ニトロソ尿素、ホルモン治療薬、キナーゼ阻害剤、腫瘍細胞アポトーシスの活性剤、および血管新生阻害剤から成るグループから選択される１メンバーである。
【０１８４】
採用する医薬担体は、例えば、固体、液体、または気体が可能である。固体担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸を含む。液体担体の例は、液糖、ピーナッツ油、オリーブ油および水である。気体担体の例は、二酸化炭素、窒素を含む。
【０１８５】
経口投与形状の化合物の調整においては、任意の都合のよい薬剤媒体を採用することができる。例えば、水、グリコール、油、アルコール、香料添加剤、保存剤、着色料などは、懸濁液、エリキシル剤および溶剤のような経口液剤製剤を形成するために使用できるが、澱粉、糖、微晶質セルロース、希釈液、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などのような担体は、粉末、カプセル剤および錠剤のような経口固体製剤を形成するために使用することができる。錠剤やカプセル剤の投与は容易なので、錠剤やカプセル剤は、固体状の医薬担体を採用するのに望ましい経口服用単位である。随意で、錠剤は、標準の水性または非水性技法によってコーティングしてもよい。
【０１８６】
本発明のために使用する組成物を含む錠剤は、随意で１つ以上の補助成分またはアジュバントを使用して圧縮または成形することによって調整してもよい。圧縮錠剤は、適切な機械で、随意で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、表面活性または分散剤と混合して、粉または顆粒の自由に流れる形状に有効な成分を圧縮することによって調製できる。成形された錠剤は、適切な機械で、不活性希釈液で湿らせた粉状の組成物の混合物を成形することによって作成することができる。各錠剤は有効成分を約０．０５ｍｇから５ｇ含有することが望ましく、それぞれのカプセル剤は有効成分を０．０５ｍｇから５ｇ含有することが望ましい。
【０１８７】
例えば、ヒトの経口投与を目的とする製剤は、有効成分を約０．５ｍｇから５ｇ含有することができ、組成全体の約５パーセントから９５パーセントで変化することができる、適切で便利な量の担体材料で形成できる。１回の服用形式は、一般的に、有効成分を約１ｍｇから約２ｇ含有し、典型的には、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、または１０００ｍｇである。
【０１８８】
非経口投与に適した本発明で使用する薬剤組成物は、水中で有効な化合物の液剤または懸濁液剤として調整することができる。適切な界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどを含めることができる。散剤も、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびこれらの油性混合物に調整することができる。さらに、微小有機物の有害な増殖を防止する保存料を含めることができる。
【０１８９】
本発明において使用する注射の使用に適切な薬剤組成物は、無菌水溶液または散剤を含む。さらに、該組成物は、このような無菌水溶液または散剤を即時に調整するために、無菌粉末の形にすることが可能である。全ての場合において、最終的な注射可能な形態は無菌であることが必要で、容易に注射できるために有効な液状であることが必要である。該薬剤組成物は、製造および保存の状態で安定していることが必要なため、ばい菌や真菌のような微小有機物の汚染から守られていることが望ましい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコール）、植物油およびこれらの適切な混合物を含む溶液または散剤溶剤にすることが可能である。
【０１９０】
本発明の薬剤組成物は、例えば、エアロゾール、クリーム、軟膏、ローション、パウダーなど、局所使用に適切な形状にすることが可能である。さらに、該組成物は、経皮器具での使用に最適な形状にすることが可能である。これらの製剤は、キナーゼ阻害剤化合物（薬学的に容認可能なその塩を含む）を利用して、従来の工程方法を使用して調整することができる。例としては、望ましい均一性を有するクリーム剤または軟膏を生成するには、クリーム剤または軟膏は、約５重量％から約１０重量％の化合物と合わせて、親水性物質と水を混合することによって調製する。
【０１９１】
本発明の薬剤的組成は、担体が固体である直腸投与に適切な形式にすることが可能である。混合形状単位の服用は座剤であることが望ましい。適切な担体は、ココアバターおよび当分野で一般的に使用される他の材料である。該座剤は、まず化合物を柔らかくまたは溶かした単体と混合してから、冷却して型で成形することによって容易に形成することができる。
【０１９２】
前述の担体材料に加えて、上記の薬剤製剤は、必要に応じて、希釈液、緩衝液、香料、結合剤、表面活性剤、増粘剤、潤滑剤、保存料（抗酸化剤を含む）など、１つ以上の追加の担体材料を含むことができる。さらに、他のアジュバントを含めて、対象患者の血液との製剤等張を実現することができる。キナーゼ阻害剤化合物（薬剤的に容認可能なその塩を含む）も、粉末または濃縮液状に調製することができる。
【０１９３】
本発明を実践するために使用する化合物の服用レベルは、およそ本明細書に記載する通り、またはこれらの化合物の分野に記載されている通りである。しかしながら、任意の特定の患者の具体的な服用レベルは、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、投与の時間、投与の経路、排出速度、薬の組み合わせおよび治療を受けている特定の疾病の重篤度など、多様な因子に依存する。
【０１９４】
当技術で公知の多数の代わりの実験方法は、例えば、本発明に関連する技術の分野において利用可能な多数の優れたマニュアルおよびテキスト（例えば、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，１９９９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（例えば、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５４４−７）；Ｒｏｅ  Ｂ．Ａ．ｅｔ．ａｌ．１９９６，ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．（例えばＩＳＢＮ０−４７１−９７３２４−０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，２０００，ｅｄ．Ｊ．Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ｓｉｍｏｎ，Ｓ．Ｅｍｒ，Ｊ．Ｔｈｏｒａｅｒ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２００１，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  ＭａｃＣａｌｌｕｍ，（ｔｈｅ  ｆｏｒｍｅｒ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｍａｎｕａｌ）（例えば、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５７７−３）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｆｒｅｄ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ．ａｌ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（例えば、ＩＳＢＮ  ０−  ４７１−５０３３８−Ｘ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（例えば、ＩＳＢＮ  ０−４７１−１１１８４−８）；およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１９９０，Ｖｏｌ．１８２，Ｅｄ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ａｃｅｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（例えば、ＩＳＢＮ  ０−１２−２１３５８５−７））または、分子生物学における実験方法を記載している大学および企業のウェブサイトに記載されているなど、本発明の実施において具体的に記載される方法に代えることができる。
【０１９５】
本発明は、以下の実験詳細によってさらに理解される。しかしながら、当業者は、検討される特定の方法および結果は、後述の請求項により詳細に記述される本発明の説明に過ぎず、本発明に対する制限として解釈されるものではないことを容易に理解する。
【０１９６】
実験の詳細
材料および方法
細胞培養および細胞抽出物の調製
ヒトＮＳＣＬＣ株のＨ１２９９、Ｈ２６６、Ｈ５２２、Ｈ６５０、Ｈ１４３７、Ｈ１１５５、Ｃａｌｕ１、Ｈｏｐ９２、Ｈ２３、Ｈ２９２、Ｈ３５８、Ｈ３２２、Ｈ４４１、Ａ５４９、Ｃａｌｕ６、Ｈ４６０、Ｈ１７０３およびＳＷ１５７３は、適切なＡＴＣＣ推奨の補助培地において培養した。細胞抽出物は、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む洗浄溶菌法（５ＯｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、０．５％  ＮａＤｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％  ＳＤＳ）によって調整した。溶解タンパク質濃度は、マイクロＢＳＡ測定（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）によって決定した。血清刺激を監視する実験においては、細胞は０．５％ＦＢＳを含む培地で２４時間培養後に、ＦＢＳを加えて、溶菌前には、最終濃度１０％で１０分間培養した。阻害剤の処理が必要な実験においては、阻害剤は、示された濃度で加えて、細胞は、示されたリガンドで刺激した。細胞増殖測定の目的では、細胞を、固定し、阻害剤を加え、７２時間後にＣＥＬＬＴＩＴＥＲＧＬＯ（登録商標）細胞の生存能力測定（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を使用して、増殖を測定した。
【０１９７】
生体内薬理学
雌ＣＤ−１  ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）の腋窩部位の脇腹皮下部位１箇所に、培養したＮＳＣＬＣ癌細胞をインプラントした。腫瘍は、２００±５０ｍｍ３まで増殖させ、この時点で、マウスは体重（±１ｇ  体重）別にグループあたり８匹の治療グループに分け、個体認識のために尾に入れ墨をした。腫瘍体積と体重は１週間に２回決定した。腫瘍体積は、ノギスを使用して２方向で測定して、次の式を使用して計算した。腫瘍体積＝（長さｘ幅２）／２。データは、各グループの腫瘍体積および体重の平均値の％変化としてグラフに表した。腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）は、％ＴＧＩ＝１００（１−Ｗｒ  Ｗｃ）として決定した。この式において、Ｗｔは、ｘ時点での治療グループの平均腫瘍体積で、Ｗｃは、ｘ時点での対照グループの平均腫瘍体積である。ＴＡＲＣＥＶ  Ａ（登録商標）は、ＷＦＩ（注射液）溶液中６％  Ｃａｐｔｉｓｏｌ（ＣｙＤｅｘ、ｍｅ）として服用して、対照動物は全て賦形剤の等量を服用した。腫瘍増殖阻害実験では、１４日間、１日１回経口服用した。薬力学実験では、強制経口投与によって、１〜３日間服用し、１、２、３日目の服用４時間後に４つの対照動物および４つのＴＡＲＣＥＶ  Ａ（登録商標）治療動物から腫瘍を摘出して、液体窒素で急速冷凍した。
【０１９８】
タンパク質免疫検出
タンパク質免疫検出は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質を電場にかけてニトロセルロース膜へ転写し、抗体とインキュベートし化学発光検出によって実施した（Ｐｉｃｏ  Ｗｅｓｔ；  Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。使用された抗体は以下の通りである。Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡｋｔＳ４７３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；  ＃９２７１）、Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；  ＃９２７２）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２  Ｍａｐ  キナーゼＴ２０２／Ｙ２０４（Ｅｒｋｌ／２；  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；  ＃９１０１）、ｐ４４／４２  ＭＡＰキナーゼ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；  ＃９１０２）、β−アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；  ＃Ａ５４４１）、ＰＤＧＦＲα（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；  ＃３１６４）、ＰＤＧＦＲβ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；  ＃３９６１）、ＦＧＦＲ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ；  ＃ｓｃｌ２２  ）、ＦＧＦＲ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ；  ＃ｓｃｌ２３）、ＦＧＦＲ４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ；  ＃ｓｃｌ２４）、Ｅ−カドヘリン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，＃ｓｃ２１７９１）、サイトケラチン  ８／１８（ＡｂＣａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；  ８４７７）、ビメンチン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ；  ＃５５０５１３）、ＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ；  ＃ｓｃ２５７７８）。
【０１９９】
ＲＮＡ分離および遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析
総ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４１０４）を使用して、細胞株から分離した。第１のストランドｃＤＮＡを合成し、対象遺伝子のＰＣＲは、市販のＲＴ−ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｎ８０８−０２３６）および適切なタックマンプローブ（表１を参照）をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００リアルタイムＰＣＲ機器上で使用して、実行した。
【０２００】
【表２】
2010533836.tif 000005
【０２０１】
異種移植片およびヒト組織サンプルの免疫組織化学的染色
ヌードマウスにおいて増殖した異種移植片腫瘍を、培養し、連続切片に埋め込まれた切片を、腫瘍ブロックから切断して、組織のマイクロアレイを準備した。ヒトＮＳＣＬＣ組織のマイクロアレイを同様に準備した（ＨｉｓｔｏＲｘ、Ｙａｌｅ  ＣＴ）。該組織切片は、まず、６０度Ｃで加熱することによって、パラフィンを溶かしてから、キシレンで２回洗浄した後１００％エタノールで２回洗浄してから水で１回洗浄した。抗原の回収は、ＰＴ  Ｍｏｄｕｌｅ機器（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）内でｐＨ６．０のクエン酸ナトリウム緩衝液を使用して実施した。ＩＸ  Ｔｒｉｓ−緩衝食塩水（ＴＢＳ）で短時間洗浄後、内因性ペルオキシダーゼを阻害するように２．５％の過酸化水素／メタノールで３０分間培養した。非特定の背景染色を削減するために、スライドは室温で１時間、０．３％ウシ生理食塩水アルブミン（ＢＳＡ）／ｌｘＴＢＳで培養した後、ＩｘＴＢＳおよびｌｘＴＢＳ／０．０１％トリトン（ＴＢＳ洗浄液）で順次洗浄した。スライドは、ウサギ一次標的抗体を使用している場合は単クローンマウス抗サイトケラチン抗体（クローンＡＥ１／ＡＥ３、ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、１：２００；特に、ケラチンｓ１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１５、１６および１９（Ｍｏｌｌの表示））、または単クローンマウス一次標的抗体を使用している場合はウサギ抗サイトケラチン抗体（Ｗｉｄｅ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、１：２００、ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ；広範囲の上皮ケラチンに結合）を使用して、４度Ｃで一晩培養した。スライドは、一次抗体を一晩インキュベーションした後、次のように室温で１時間二次抗体でインキュベーションしてから、ＩＸＴＢＳで洗浄した。サイトケラチンを検出するためにＡｌｅｘａ  ５５５ヤギ抗マウス抗体またはＡｌｅｘａ５５５ヤギ抗ウサギ抗体（１：２００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を加え、および標的一次抗体を検出するために、種特定のデキストランポリマー主鎖（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を有する西洋ワサビベルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を添加した後、ＨＰＲに結合するＣｙ−５チラミド（１：５０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を添加した。Ｃｙ５は、その放射ピークが組織自動蛍光のスペクトル外であるため、標的抗体のために使用した。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール／ＤＡＰＩ（ＤＡＰＩ封入ゲル入りＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）は核マーカーとして利用した。
【０２０２】
サイトケラチン発現の評価
ここでケラチンレベルの評価を参照する場合、１つ以上の上皮ケラチンの発現レベルを同時に評価する場合（例えば、複数のケラチンに結合する抗体調製物を使用することによって）、評価されるケラチンは、一般的に、評価されるタンパク質の特定の名前（例えば、「サイトケラチン８／１８」または「サイトケラチン８および／またはサイトケラチン１８」、例えば、サイトケラチン８および１８に対する抗体を含む抗体調製物によって決定される）によって、または、「サイトケラチン」という用語だけ（例えば、１つ以上のケラチンがパン特定抗体によって評価される場合）、によって呼ばれる。
【０２０３】
結果
ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）は、肺（ＮＳＣＬＣ）、ＣＮＳ、頭頸部、膀胱、膵臓および胸部を含むヒトの癌において過剰発現することが示されており、低い生存率との相関関係が示されている（Ｙａｒｄｅｎ  Ｙ．ａｎｄ  Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ＭＸ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００１）２：１２７−１３７．）。ＥＧＦＲ機能の阻害剤は、臨床的効能を示しており、治療の恩恵を受けることが最も大きい患者のサブセットを説明する主要なＥＧＦＲシグナル伝達経路の明確化が、調査の重要な分野となっている。ＥＧＦＲのパラクリンおよびオートクリン活性は上皮組織の保持に重要な役割を果たすが、ＮＳＣＬＳ株は、ＥＧＦＲ阻害に対する細胞反応においてかなりばらつきを見せ、ＥＧＦＲシグナルの薬剤的離脱に対して比較的感受性が低い可能性がある。ＥＧＦＲ変異の役割は（Ｌｙｎｃｈ  ＴＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００４）３５０：２１２９−  ２１３９；  Ｓｏｒｄｅｌｌａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）３０５：１１６３−１１６７）ＥＧＦＲ阻害剤への効能感受性における主なメカニズムとしては、異議があった（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ＦＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００５）３５３：１２３−１３２．）。野生型ＥＧＦＲを含有する細胞株と腫瘍両方のＥＧＦＲ阻害への感受性のばらつきは、ホスファチジルイノシトール−３’キナーゼ経路のＥＧＦＲ独立活性から部分的に派生することが示されており、抗アポトーシスのセリン−トレオニンキナーゼＡｋｔのリン酸化の継続につながる（Ｖｉｖａｎｃｏ  Ｉ，ａｎｄ  Ｓａｗｙｅｒｓ  ＣＬ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ（２００２）２：４８９−５０１．）。ＰＩ−３’キナーゼの経路を強力に活性化する、インスリン様増殖因子−１受容体は、ＥＧＦ阻害剤に対する細胞抵抗において関与しているが、ＰＩ−３’キナーゼ活性の代替ルートおよび結果として生じるＥＧＦＲ阻害の感受性の低さに対する分子の決定因子は、十分に説明されていない。（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００２）６２：２００−２０７）。最近の臨床データはまた、ＦＩＳＨによって測定されるＥＧＦＲ遺伝子増幅および免疫組織化学的方法によって測定されるＥＧＦＲたんぱく質は、ＥＧＦＲ阻害剤に対するＮＳＣＬＣ患者の恩恵と相関があることを示唆している（Ｃａｐｐｕｚｚｏ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ（２００５）９７（９）：６４３−６５５；  Ｈｉｒｓｃｈ  ＦＲ．ａｎｄ  Ｗｉｔｔａ  Ｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（２００５）１７（２）：１１８−１２２）。
【０２０４】
ここでは、野生型ＥＧＦＲを含むヒトＮＳＣＬＣ細胞は、体外および生体内のエルロチニブ治療に対して、可変の感受性を示すことが実証された。ＥＧＦＲ阻害に対する感受性は、総ＥＧＦＲレベルとは相関しなかったが、リン酸−ＥＧＦＲ、リン酸−ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ３と相関した。細胞および異種移植片のエルロチニブ治療に対する感受性は、細胞が上皮間葉転換（ＥＭＴ）と呼ばれるプロセスを受けたかどうかにより予測できる。この転換は、Ｅカドヘリンなどの上皮細胞接合タンパク質、およびビメンチンまたはフィブロネクチンなどの間葉マーカーの取得によって特徴付けられる（Ｔｈｉｅｒｙ  ＪＰ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００３）１５（６）：７４０−７４６．）。  重要な発生プロセスとして既に確立されたＥＭＴは、癌の進行に重要な役割を果たすことが近年ますます明確になっている（Ｇｒｕｎｅｒｔ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００３）４（８）：６５７−６６５；  Ｔｈｉｅｒｙ  ＪＰ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ（２００２）２（６）：４４２−４５４）。
【０２０５】
本明細書に記載したデータは、新しい間葉様腫瘍細胞タイプが特定され、それが上皮細胞マーカーサイトケラチン８および／またはサイトケラチン１８および間葉細胞マーカービメンチンを共発現することを示す。これらの異常な間葉様「ハイブリッド」腫瘍細胞は予想外の特性を有し、新しい抗癌治療に対して感受性が高い。
【０２０６】
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤エルロチニブの有る場合とない場合のＨ２９２及びＣａｌｕβ  ＮＳＣＬＣ株の異種移植片の増殖は、Ｈ２９２はＥＧＦＲ阻害に感受性が高く、服用期間中腫瘍体積の減少を示すがＣａｌｕ６はＥＧＦＲ阻害に対して感受性が無いことを示す（図９）。Ｃａｌｕ６はＥＭＴ様転換を受けて、ＥＧＦＲ阻害に対して比較的感受性が無くなっている。
【０２０７】
Ｅ−カドヘリン、サイトケラチンおよびビメンチンタンパク質の発現は、ＮＳＣＬＣ移植片の蛍光免疫組織化学法によって、ＥＧＦＲ阻害に対する感受性の高低として、測定した（図１０）。ＮＳＣＬＣ移植片Ｈ２９２（高い感受性）とＣａｌｕ６（低い感受性）を比較した。左の２つのパネルはＥカドヘリン染色を検査したが、Ｅカドヘリンは赤い蛍光性抗体で染色され、サイトケラチンは緑で染色され、細胞核はＤＡＰＩで青で染色されている。右の２つのパネルはビメンチン染色を検査したが、ビメンチンは赤い蛍光および抗体で染色され、サイトケラチンは緑で染色され、細胞核はＤＡＰＩで青で染色されている。以下の観察がなされた。ＥＭＴ様転換を受けたＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性が無い細胞において、サイトケラチンは削減されたが消失しない。ビメンチンは間葉細胞系統のマーカーで、一方サイトケラチンは上皮細胞のマーカーである。間葉様「ハイブリッド」腫瘍細胞は、単一の腫瘍細胞内のビメンチンおよびケラチン（８および／または１８）両方の安定発現によって区別される。これは、単一の腫瘍細胞をＥＨＣ形状のパン−サイトケラチンおよびビメンチン抗体で二重標識することによって、小細胞肺癌以外でも観察することができる（図１１）。上皮マーカーは、ケラチン（赤）である。間葉マーカーはビメンチン（緑）である。共染色ハイブリッド腫瘍細胞は、ビメンチンとサイトケラチン（黄）の両方を含み、例としての領域は矢印で示されている（図１１）。
【０２０８】
これらの間葉様ハイブリッド腫瘍細胞は、通常の上皮細胞では見られず、また腫瘍細胞で前述されていない増殖因子受容体経路に対する異常な依存を獲得した。例えば、これらの腫瘍細胞は、ＦＧＦおよびＰＤＧＦ受容体の発現を獲得した。さらに、これらは、オートクリンまたはパラクリン方式でＰＤＧＦおよびＦＧＦに応答して、ＰＩ−３キナーゼ、ｒａｓ／ｒａｆ／ｍｅｋ／ｅｒｋおよびＳＴＡＴ３／５伝達経路を活性化することができる（図３Ｂおよび７）。ハイブリッド細胞は、増殖および／または転移によって測定されるように、ＰＤＧＦ受容体および／またはＦＧＦ受容体キナーゼ阻害剤に対して頻繁に非常に感受性が高い。
【０２０９】
一部のハイブリッド様腫瘍細胞はＰＤＧＦＲおよび／またはＦＧＦＲを発現するが、オートクリン方式でそれぞれのリガンドを作成できない。しかし、生体内では、新しく取得された受容体などは、近辺の間質細胞によって提示されるＰＤＧＦおよびＦＧＦに反応することができ（例えば繊維芽細胞、グリア、内皮細胞及び炎症細胞）、腫瘍の進行および転移を促進することが可能である。ＰＤＧＦおよびＦＧＦ受容体の阻害剤は、ハイブリッド腫瘍細胞のこれらのプロセスを阻害することを示したので、ビメンチンおよび１つ以上のサイトケラチンを共発現するこのようなハイブリッド腫瘍細胞を含む腫瘍における癌患者の生存率を改善すると予測される。
【０２１０】
生存シグナルおよび上皮間葉細胞表現型に関連するタンパク質を分離して、複数の実験的手法によって測定した。これらは、ＮＳＣＬＣ腫瘍株の間の個別のタンパク質量を比較する、質量分析法、免疫ブロット法、および顕微鏡測定を含む。
【０２１１】
ハイブリッド上皮間葉腫瘍細胞
腫瘍細胞によって利用されるタンパク質および伝達経路の実験によって、上皮および間葉特徴を有する新しいハイブリッド細胞型が明らかになった。ハイブリッド腫瘍細胞は、上皮ケラチン（例えば、サイトケラチン８および／または１８）と間葉マーカービメンチンを同時に発現する。間葉様ハイブリッド腫瘍細胞を阻害するＰＤＧＦＲおよびＦＧＦＲ阻害剤の使用を提案する。
【０２１２】
間葉様ＮＳＣＬＣ細胞株の生物学を詳細に理解するために、いくつかの異なる受容体チロシンキナーゼおよびそれらのリガンドの発現パターンを分析して分類した。使用した細胞株を表２に詳細に示す。
【０２１３】
【表３】
2010533836.tif 000006
【０２１４】
ＮＳＣＬＣにおけるＰＤＧＦＲシグナル
間葉様ＮＳＣＬＣ細胞株の生物学を詳細に理解するために、ＰＤＧＦ受容体ファミリー（αおよびβ）ならびにこれらの受容体のリガンド（ＰＤＧＦａおよびＰＤＧＦｂ）の発現レベルを分析して分類した。図１は、示された遺伝子専用のタックマンプローブを使用して定量的ＰＣＲ測定からの結果を示す。該結果は、二重試験の平均として示す。
【０２１５】
一団のＮＳＣＬＣ細胞株の分析は、表現型が間葉様または上皮に関わらず、細胞すべてがＰＤＧＦリガンドを生成したことを示した。該間葉様細胞株Ｈ  １７０３は大量のＰＤＧＦｂを生成した。興味深いことに、４つの該上皮細胞株は全くＰＤＧＦＲαもＰＤＧＦＲβも発現しなかったが、間葉様株の１３のうち８つは、１つまたは他の受容体を発現した。最も特筆すべきことは、Ｈ  １７０３は大量のＰＤＧＦＲａを発現したことである。これらの結果は、該間葉様細胞株が、ＰＤＧＦ受容体の発現を獲得して、オートクリン方式でシグナルを出す可能性が高いことを示唆している。
【０２１６】
ｍＲＮＡレベルでの分析の確認として、ウェスタンブロットを、ＰＤＧＦＲαまたはＰＤＧＦＲβに対する抗体としてプローブした（図２）。これにより、該上皮細胞株はＰＤＧＦＲαもＰＤＧＦＲβも発現しないことが確認された。ＰＤＧＦＲαの発現はＨ１７０３細胞に限定されたが、ＰＤＧＦＲβは、分析された間葉様株のすべてにある程度発現したことが分かった。
【０２１７】
全体的に、これらの結果は、該間葉様細胞は、間葉転換に対する皮下の一部として、ＰＤＧＦ受容体の発現を増やし、増殖および／または生存シグナルを調整するように、この受容体のシグナル軸を利用する可能性が高いことを示す。従って、これらの細胞株の増殖を阻害するＰＤＧＦＲ阻害剤の能力を試験した。阻害剤ＯＳＩ−９３０（ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を利用した。これは、デュアルＫｉｔ／ＫＤＲ阻害剤で、ＰＤＧＦ受容体に対して比較的良好な効能も示す。
【０２１８】
３つの間葉様細胞株（Ｈ１７０３、Ｃａｌｕ１及びＨ２２６）および１つの上皮細胞株（Ｈ３５８）は、１０％  ＦＣＳでＯＳＩ−９３０の濃度を徐々に高くして処理し（図３）、ＣｅｌｌＴｉｔｒｅＧｌｏを使用して細胞の増殖を測定した。ＯＳＩ９３０による細胞増殖の阻害は、Ｈ１７０３細胞だけで観察した。Ｈ１７０３細胞は、大量のリガンドを生成し、阻害剤がオートクリンＰＤＧＦＲシグナルを阻害することによって機能していることを示唆する。他の細胞株（Ｈ２２６及びＣａＩｕ１）は高レベルのＰＤＧＦＲβを含有するが、ＰＤＧＦＲ阻害剤によって増殖が阻害されていない。これは、この細胞培養システムにある活性リガンドが不十分なためである可能性がある（注：ＰＤＧＦＲβ受容体の二量体は、ＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＡＡではなく、ＰＤＧＦ−ＢＢによってのみ活性化される）。しかし、リガンドは、ヒト腫瘍組織のパラクリンシグナルから十分に利用可能の可能性もある。この問題に対応するために、細胞は、培地に０．５％  ＦＣＳおよびＰＤＧＦ（ＡＡ、ＡＢ及びＢＢの混合形）を追加して増殖させ、パラクリンＰＤＧＦシグナルをより密接にモデル化した。しかし、Ｈ１７０３  細胞は、ＯＳＩ−９３０によってこれらの条件下でより強く阻害されたが、他の細胞株は、単層の組織培養では増殖阻害の向上をまったく見せることはなかった（図３Ａ）。細胞間シグナル伝達経路（ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼおよびＡＫＴ）は、どちらも、ＰＤＧＦＲ阻害剤ＯＳＩ−９３０で処理されたＨ１７０３細胞で阻害された（図３Ｂ）。該阻害剤は、基礎（１０％  ＦＣＳ）とリガンド刺激条件下で、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼとＡＫＴ（セリン４７３上）のリン酸化反応を削減した。該Ｈ２２６細胞株は、ＰＤＧＦＲβ受容体ではあるが不正なリガンドを発現し（つまりＰＤＧＦ−ＢＢ以外の、主にＰＤＧＦＲ−ββのリガンドを活性化）、ＥＲＫおよびＡＫＴ伝達経路のリガンド誘発阻害しか示さなかった。Ｈ１７０３とＣａＩｕ１はどちらも、ＰＤＧＦＲ阻害剤ＯＳＩ−９３０に反応して、細胞運動性の阻害を示した（図３Ｃ）。
【０２１９】
全体的に、これらのデータは、ＰＤＧＦ受容体発現の増加は、ＥＭＴを受けた細胞に対するマーカーであり、ＥＧＦＲ伝達経路阻害の感受性が無くなっていることを示す。Ｈ１７０３は、増殖のＰＤＧＦＲ伝達経路および生存伝達経路に依存し、ＰＤＧＦＲα受容体の阻害によって、強い増殖阻害反応を提供していることが明らかなようである。ＰＤＧＦＲβ受容体を発現する他の間葉様細胞株は、完全生理食塩水でも、外因性ＰＤＧＦを追加しても、阻害剤治療時に増殖の阻害を示さず、生体外で試験した条件下では、増殖または生存にＰＤＧＦＲ伝達経路を利用しない可能性があることを示唆する。しかし、生体内環境で直面する多様な細胞外刺激を受ける場合、これらのような多数の腫瘍細胞は、このような設定でＰＤＧＦＲ伝達経路の阻害に反応する。
【０２２０】
ＮＳＣＬＣにおけるＦＧＦＲシグナル伝達
定量的ＰＣＲ測定を実行し、腫瘍細胞のＦＧＦＲファミリー（ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２）の２つのメンバーの発現レベルを分析した（図４）。
【０２２１】
該結果は、ＦＧＦＲ１受容体の発現が、間葉様ＮＳＣＬＣ細胞株に限定され、上皮細胞株では発現しなかったことを示す。Ｈ１７０３とＨ５２２は、他の間葉様細胞株に比べると高レベルのＦＧＦＲ１受容体を発現している。ＦＧＦＲ２の発現レベルは、表現型に関わらず、試験した細胞株全てで低かった。これらのデータは、ＦＧＦＲ１は、間葉ＮＳＣＬＣ細胞株で上方調整されており、細胞増殖／生存において役割を果たしている可能性を示唆する。
【０２２２】
ＦＧＦ受容体ファミリーの４つのメンバーのそれぞれのタンパク質レベルを、免疫ブロット分析法により分析した（図５）。該結果は、該ＲＴ−ＰＣＲ分析結果を裏づけて、ＦＧＦＲ１は間葉様細胞株において主に発現したが、ＦＧＦＲ２は、ＳＷ１５７３およびＨ２６６細胞においてのみ、少なからず発現したことを示した。興味深いことに、Ｈ２２６は、低レベルのＦＧＦＲ２ｍＲＮＡを発現するが、比較的高いタンパク質発現を示す。
【０２２３】
さらに、ＦＧＦＲ３は、高レベルを示すＨ３２２を除いて、間葉様細胞において主に発現することも観察された。ＦＧＦＲ４は、分析した細胞株全てで、ある程度発現する。
【０２２４】
ＦＧＦＲがこれらの細胞において細胞増殖／生存シグナルの刺激に関与したかどうかを判断するために、ＦＧＦＲファミリー（特にＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ３）専用の小分子量阻害剤ＰＤ１７３０７４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を利用した。ＦＧＦＲ１、３および４の検出可能なレベルを示す２つの間葉様ＮＳＣＬＣ細胞株は、ＰＤ１７３０７４の濃度を徐々に増加して処理し、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲＧＬＯ（登録商標）細胞生存能力測定（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を使用して、細胞増殖を測定した（図６）。Ｈ１７０３およびＨ２２６細胞の増殖は、ＰＤ１７３０７４の処理によって阻害されたが、該阻害剤は、Ｃａｌｕｌ細胞にはほとんど影響を与えなかった。
【０２２５】
２つの敏感な細胞株における細胞間シグナル伝達経路に対する該阻害剤の影響内容を理解するために、該細胞を、外から加えられたリガンドのある場合またはない場合にＰＤ１７３０７４で処理した。ＥＲＫ  ＭＡＰ  キナーゼ伝達経路の活性は、基礎（図７、「Ｃｏｎ」）およびリガンド（図７、「ＦＧＦ」）の両方の刺激条件下においてＰＤ１７３０７４によって阻害した。ＡＫＴ伝達経路は、Ｈ１７０３細胞のリガンド刺激後にのみ阻害された。Ｃａｌｕｌ細胞のシグナルはＰＤ１７３０７４によって影響を受けなかった。
【０２２６】
まとめると、これらの結果は、間葉様細胞ではＦＧＦ受容体のレベルが高く、Ｈ１７０３およびＨ２２６の少なくとも２つの細胞タイプは、該受容体からのシグナルを利用して、細胞の生存および増殖シグナルを送信することを示している。
【０２２７】
腫瘍細胞が刺激されてＥＭＴが誘導されるとき、ＰＤＧＦＲおよびＦＧＦＲの上方調節は、ＴＧＦ−β３で処理されたＨ３５８細胞（図８）の例のように、観察することができる。
【０２２８】
結論
要約すると、本明細書に記載した結果は、間葉様腫瘍細胞はエルロチニブのようなＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して比較的感受性が無く、上皮と間葉細胞療法の特徴を示す「ハイブリッド」腫瘍細胞であり、類似レベルでの特定の上皮（例えば、サイトケラチン、例えばケラチン８および／またはケラチン１８）および間葉（例えば、ビメンチン）バイオマーカーの共発現を決定することによって特定することができることを示す。従って、このような間葉様ハイブリッド腫瘍細胞を特定することは、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して比較的感受性が無いタイプの腫瘍細胞を診断することになる。
【０２２９】
本明細書に記載した結果は、間葉様「ハイブリッド」腫瘍細胞が、該腫瘍細胞の増殖および転移を強化することができる他の受容体キナーゼ（例えば、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ）のレベル上昇を獲得していたことも示す。従って、このような間葉様ハイブリッド腫瘍細胞を特定することは、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する感受性が比較的無いが、他の受容体キナーゼ阻害剤（例えば、ＦＧＦＲまたはＰＤＧＦＲの阻害剤）による阻害に対して感受性が高いことが可能な腫瘍細胞のタイプを診断することになる。本明細書に示したデータは、検査した間葉様ハイブリッド腫瘍細胞のうち、１７％は、ＰＤＧＦＲまたはＦＧＦＲどちらかのキナーゼ阻害剤によって阻害され、８％は両方によって阻害されたことを示す。阻害されたハイブリッド腫瘍細胞のパーセントは、おそらく、他の受容体キナーゼを考慮する場合、および／または、細胞の増殖が、リガンドの可用性および感受性がはるかに改善される生体内環境で監視される場合にははるかに高くなると思われる。
【０２３０】
このように、癌患者の腫瘍細胞を間葉様ハイブリッド細胞として特定することは、患者の潜在的な治療形態を決定することに役立つ有用な診断ツールを医師に提供することになり、従って生存率を強化することになるであろう。
【０２３１】
略称
ＥＧＦ、上皮増殖因子；ＥＭＴ、上皮から間葉への転換；ＮＳＣＬＣ、非小細胞肺癌；ＨＮＳＣＣ、頭頸部扁平上皮悪性腫瘍；ＣＲＣ、結腸直腸癌；ＭＢＣ、転移性乳癌；ＥＧＦＲ、上皮増殖因子受容体；ＰＤＧＦＲ、血小板由来増殖因子受容体；ＦＧＦＲ、繊維芽細胞増殖因子受容体；Ｂｒｋ，胸部腫瘍キナーゼ（タンパク質チロシンキナーゼ６（ＰＴＫ６）としても知られる）；ＩＨＣ、免疫組織化学法；ＬＣ、液体クロマトグラフィー；ＭＳ、質量分析法；ＩＧＦ−１、インスリン様増殖因子１；ＴＧＦα、転換増殖因子アルファ；ＨＢ−ＥＧＦ、へパリン結合表皮増殖因子；ＬＰＡ、リゾホスファチジン酸；ＴＧＦα、転換増殖因子アルファ；ＩＣ５０、半数阻害濃度；ｐＹ、リン酸チロシン；ｗｔ、野生型；ＰＩ３Ｋ、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ；ＧＡＰＤＨ、グリセアルデヒド３リン酸脱水素酵素；ＴＢＳ、トリス緩衝生理食塩水。
【０２３２】
参照による組み込み
本明細書において開示される全ての特許、公開特許出願、および他の参考文献は、参照することにより本明細書に明示的に組み込む。
【０２３３】
同等物
当業者は、通常の実験を使用して、本明細書に具体的に説明された本発明の特定の実施形態に対する多数の相当物を認識、または、確定することができる。こうような同等物は、以下の請求項の範囲内に含まれることを目的とする。
【図１】
2010533836.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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2010533836.tif 000022
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