(57)【要約】本発明は、クエン酸緩衝液中に約ｐＨ６．５で治療上有効量のＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質を、ポリソルベート−８０およびマンニトールとともに含む安定な溶液配合物を提供する。この配合物は、糖尿病および肥満症ならびに様々な他の病状または障害を治療する上で有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定な溶液配合物であって、クエン酸緩衝液中の治療上有効量のＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質を、約０．０１％−０．０５％（重量／体積）の範囲のポリソルベート−８０と、約４．３−５．０％（重量／体積）の範囲のマンニトールとともに含み、前記溶液は約ｐＨ６−７の範囲のｐＨを有する、安定な溶液配合物。
【請求項２】
前記治療上有効量のＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質が約０．２５−約１０ｍｇ／ｍｌの範囲にある、請求項１に記載の安定な溶液配合物。
【請求項３】
前記治療上有効量のＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質が約０．２５−約５ｍｇ／ｍｌの範囲にある、請求項２に記載の安定な溶液配合物。
【請求項４】
前記クエン酸緩衝液の濃度が約５−２０ｍＭの範囲にある、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の安定な溶液配合物。
【請求項５】
前記クエン酸緩衝液の濃度が約１０ｍＭである、請求項４に記載の安定な溶液配合物。
【請求項６】
前記ポリソルベート−８０の濃度が約０．０２％（重量／体積）である、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の安定な溶液配合物。
【請求項７】
前記マンニトールの濃度が約４．５−４．８％（重量／体積）の範囲にある、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の安定な溶液配合物。
【請求項８】
前記マンニトールの濃度が約４．６％（重量／体積）である、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の安定な溶液配合物。
【請求項９】
前記ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１によって与えられる配列である、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の安定な溶液配合物。
【請求項１０】
前記ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質の濃度が約０．２５−５ｍｇ／ｍＬの範囲にあり、前記クエン酸塩の濃度が約１０ｍＭであり、前記ポリソルベート−８０の濃度が約０．０２％（重量／体積）であり、前記マンニトールの濃度が約４．６％（重量／体積）であり、前記ｐＨが約６．３−６．７の範囲にある、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の安定な溶液配合物。
【請求項１１】
前記ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質の濃度が約１ｍｇ／ｍＬである、請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の安定な溶液配合物。
【請求項１２】
前記ｐＨが約６．５である、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の安定な溶液配合物。
【請求項１３】
前記配合物が滅菌された注射器中に保存されている、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の安定な溶液配合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合したグルカゴン様ペプチド類似体の市販の配合物に関する。この配合物は、糖尿病および肥満症ならびに様々な他の病状または障害を治療するために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）類似体および誘導体は、２型糖尿病の治療についての臨床試験で有望性を示している。ＧＬＰ−１は、インスリン分泌を刺激すること、グルカゴン分泌を阻害すること、胃排出を阻害すること、胃運動性または腸運動性を阻害すること、および体重減少を誘導することなどの多くの生物学的効果を誘導する。ＧＬＰ−１の重要な特徴は、ＧＬＰ−１が、インスリン療法、またはインスリン発現を増加させることによって作用するある種の経口療法を用いた場合に見られる低血糖のリスクを伴うことなく、インスリン分泌を刺激することができることである。
【０００３】
ＧＬＰ−１ペプチドが関与する療法の有用性は、ＧＬＰ−１（１−３７）の活性が非常に低く、２つの天然に存在する短縮されたペプチド、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨおよびＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、が生体内で急速に浄化され、極めて短い生体内半減期を有するという事実によって限定されたものとなっていた。内因的に産生したジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）は、Ｎ末端のヒスチジンおよびアラニン残基を取り除くことによって循環ＧＬＰ−１ペプチドを不活性化させ、これが短い生体内半減期の主な理由であることが知られている。
【０００４】
ＧＬＰ−１ペプチドの排出半減期を延ばすか、または生物活性を維持しつつ身体からのペプチドのクリアランスを減少させるために、種々のアプローチが試みられてきた。１つのアプローチには、ＧＬＰ−１ペプチドを免疫グロブリンのＦｃ部分に融合させることが含まれる。免疫グロブリンは、通常、生体内で長い循環半減期を有する。
【０００５】
例えば、ＩｇＧ分子は、ヒトにおいて２３日間までの半減期を有することができる。免疫グロブリンのＦｃ部分は、この生体内での安定性を一部担っている。ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質は、ＧＬＰ−１分子の生物活性を保存しつつ、免疫グロブリンのＦｃ部分によってもたらされる安定性を利用する。
【０００６】
このアプローチはＧＬＰ−１治療法としては実行可能であるが（特許文献１を参照）、長期間にわたって反復的に投与された場合、種々の融合タンパク質の抗原性に関しては全般的な懸念が存在する。これは、とりわけ、ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合治療法に対する懸念である。なぜなら、糖尿病を患う患者は、ひとたびその疾患と診断されると、その全生涯のあいだ治療を受けなければならないためである。加えて、Ｆｃ部分が望ましくないエフェクター機能を保持する場合は、Ｆｃ融合タンパク質治療法は、懸念となり得る。このアプローチは、ＰＣＴ／ＵＳ０４／１５５９５（特許文献２）の焦点であり、この特許文献では、ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質の投与に関連する潜在的な免疫原性およびエフェクター活性に関連する問題は、反復的かつ長期の投与後には免疫応答を誘導するリスクが低下しておりエフェクター機能をもはや有しない特異的ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質を同定することによって克服される。
【０００７】
この性質を有する融合タンパク質は、合成的にまたは細菌細胞中で組換え技術により産生するには、技術的に見てあまりに大きくかつ複雑である。これらの融合タンパク質は、通常、哺乳類の細胞（ＣＨＯ、２９３、またはＮＳ０など）中で産生される。哺乳類の細胞中で産生された融合タンパク質は、細菌細胞中で産生された非融合タンパク質よりも内因性プロテアーゼによる分解および化学的な変更を容易に受けやすいことが観察された。この問題は、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４５３７６（特許文献３）で克服しようとされた。この特許文献では、約ｐＨ６−約ｐＨ８．５の間に緩衝化されたＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質を含む配合物が高められた化学的安定性を提供することが見出された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０２／４６２２７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／０００８９２号パンフレット
【特許文献３】国際公開２００６／０６８９１０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それにもかかわらず、宿主細胞プロテアーゼによって引き起こされる不安定性が抑制されている場合でさえ、当該配合物は、それが物理的に不安定である場合は、適切ではない可能性がある。本発明者らが観察した別の問題は、溶液配合物の長期間の保存に伴う可溶性凝集体および不溶性粒子の形成である。この問題を、賦形剤の特定の組み合わせおよびＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質の特定の濃度によって克服しようとした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質の溶液配合物の長期間の保存に伴う可溶性凝集体および不溶性粒子の問題を克服するために、本発明者らは、約０．５−約１０ｍｇ／ｍＬのＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質と、５−２０ｍＭクエン酸緩衝液と、０．０１−０．０５％（重量／体積）のポリソルベート−８０と、４．０−５．３％（重量／体積）のマンニトールとを含み、かつ６−７のｐＨを有する物理的および化学的に安定な溶液配合物を開発した。この配合物は、予想外にそしてかなり少ない、長期間の保存に伴う可溶性凝集体および不溶性粒子をもたらした。加えて、長期の保管後は、この溶液配合物はバイアル中よりも注射器中でより安定であることを本発明者らは見出した。
【００１１】
本発明はまた、糖尿病および肥満症ならびに様々な他の病状または障害を患う患者の治療方法であって、ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質の配合物を投与することを含む方法を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｃ末端でペプチドリンカーを介して免疫グロブリンのＦｃ部分の類似体のＮ末端に融合されたＧＬＰ−１化合物を含む。この融合タンパク質は、単量体またはホモ二量体として生物活性があり、未変性のＧＬＰ−１と比べてより長期の半減期を有する。好ましいＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質は、（配列番号１）で与えられるアミノ酸配列を含む。より好ましいＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質は、本質的に（配列番号１）で与えられるアミノ酸配列からなる。最も好ましいＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質は、（配列番号１）で与えられるアミノ酸配列からなる。
【数１】
2010533197.tif 000002
【数２】
2010533197.tif 000003
【００１３】
ジスルフィド結合は、鎖内（鎖Ａもしくは鎖Ｂのいずれかの上）および／または鎖間（鎖Ａおよび鎖Ｂの両方の間）に存在することができる。鎖内ジスルフィド結合の例は、Ｃｙｓ９０Ａ−Ｃｙｓ１５０Ａ、Ｃｙｓ１９６Ａ−Ｃｙｓ２５４Ａ、Ｃｙｓ９０Ｂ−Ｃｙｓ１５０Ｂ、Ｃｙｓ１９６Ｂ−Ｃｙｓ２５４Ｂである。鎖間ジスルフィド結合の例は、Ｃｙｓ５５Ａ−Ｃｙｓ５５Ｂ、Ｃｙｓ５８Ａ−Ｃｙｓ５８Ｂである。
【００１４】
生物活性は、当該融合タンパク質が生体内でＧＬＰ−１受容体に結合してそれを活性化し、そして応答を誘発する能力を指す。応答としては、インスリンの分泌、グルカゴンの抑制、食欲の阻害、体重減少、満腹感の誘導、アポトーシスの阻害、膵臓β細胞増殖の誘導、および膵臓β細胞の分化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
当該ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質配合物は、約０．２５−約１０ｍｇ／ｍｌのＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質を含む。この融合タンパク質の好ましい濃度（ｍｇ／ｍＬ単位）は、約０．５−１０、０．５−５、０．５−２．５、０．５−２、０．５−１．６７、０．５−１．５、０．５−１．２５、０．５−１、０．５−０．９、０．５−０．８、０．５−０．７５、０．６−２、０．７−２、０．８−２、０．９−２、０．５−３、０．６−３、０．７−３、０．８−３、０．９−３、０．５−４、０．６−４、０．７−４、０．８−４、０．９−４、１−２、１．１−２、１．２−２、１．３−２、１．４−２、１．５−２、１．６−２、０．７−１．６７、０．９−１．１、１−４、１．０−４．０、０．５−５、０．２５−７、０．２５−５、０．２５−４、０．２５−３、０．２５−２、０．２５−１．５、０．２５−１、０．２５−０．５の範囲である。ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質の好ましい濃度（ｍｇ／ｍＬ単位）は、約０．２５、約０．４２、約０．５、約０．６、約０．６７、約０．７、約０．７５、約０．８、約０．８３、約０．９、約１、約１．１、約１．２、約１．２５、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．６７、約１．７、約１．８、約１．９、約２、約２．５、約３、約３．３３、約４、約５、約６．６７、または約１０である。
【００１６】
当該ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質配合物は、約５−２０ｍＭ  クエン酸塩の範囲に緩衝化されている。好ましいクエン酸塩濃度（ｍＭ単位）は、約５−１５、５−１２．５、５−１０、７．５−２０、７．５−１５、７．５−１２．５、７．５−１０、８−２０、８−１５、８−１２．５、８−１１、８−１０、９−２０、９−１５、９−１２．５、１０−２０、１０−１７．５、１０−１５、１０−１２．５、６−１４、７−１３、８−１２、９−１１、１２−２０、１４−２０、１６−２０、および１８−２０の範囲である。特に好ましいクエン酸塩濃度は、約９−約１１ｍＭ、および約８−約１２ｍＭの範囲である。特に好ましいクエン酸塩濃度は約１０または約１０．０である。
【００１７】
許容できる安定性を提供するため、当該ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質の溶解度およびインスリン分泌活性を維持するため、および非経口投与用に許容できるものとするために、ｐＨは、約６−７の範囲に調製される。このｐＨは、酸（ＨＣｌなど）、または塩基（ＮａＯＨなど）を所望のｐＨまで添加することによって調整することができるし、または所望の緩衝液濃度および所望のｐＨをともに実現するためにクエン酸緩衝液およびクエン酸の組み合わせを加えることもできる。好ましいｐＨ値は、約６．３−６．７、６．２５−６．７５、６．２−６．８、６．１５−６．８５、６．１−６．９の範囲である。好ましいｐＨ値は約６．５である。
【００１８】
当該ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質配合物は、さらに等張剤としてマンニトールを含む。マンニトール濃度は４．０−５．３％（重量／体積）の範囲である。単位「（重量／体積）」は、最終配合物の体積あたりの成分の質量を意味する。従って、４．６％（重量／体積）のマンニトール濃度を有する配合物は配合物１ｍＬあたり４６ｍｇのマンニトールを有するか、または別の形式で表現すれば、それは１００ｍＬの配合物の全体積の中に溶解した４．６グラムのマンニトールを有する。好ましいマンニトール濃度（％（重量／体積）単位）は、約４．０−約４．１、約４．１−約４．２、約４．２−約４．３、約４．３−約４．４、約４．４−約４．５、約４．５−約４．６、約４．６−約４．７、約４．５５−約４．７５、約４．５−約４．８、約４．４−約４．９、約４．３−約５．０、約４．２−約５．１、約４．１−約５．２、約４．７−約４．８、約４．８−約４．９、約４．９−約５．０、約５．０−約５．１、約５．１−約５．２、約５．２−約５．３の範囲である。好ましいマンニトール濃度（％（重量／体積）単位）は、約４．３、約４．５、約４．５５、約４．６、約４．６５、約４．６４、約４．７、約４．７５、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、または約５．３である。
【００１９】
当該ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質配合物は、さらにポリソルベート−８０を可溶化剤および／または安定剤として含む。ポリソルベート−８０の濃度は、約０．０１−０．０５％（重量／体積）（またはｍｇ／ｍｌの単位で表現すると、約０．１−０．５ｍｇ／ｍＬ）の範囲である。ポリソルベート−８０のこの濃度は、可溶性凝集体および不溶性粒子の形成を最少にするように、ＧＬＰ−Ｆｃ融合タンパク質およびマンニトールと組み合わせて決定される。ポリソルベート−８０の好ましい濃度（％（重量／体積）単位）は、約０．０１−０．０４、０．０１−０．０３、０．０１５−０．０２５の範囲である。ポリソルベート−８０の好ましい濃度は、約０．０１８−約０．０２２％（重量／体積）の範囲である。ポリソルベート−８０の別の好ましい濃度は約０．０１５−約０．０２５％（重量／体積）の範囲である。ポリソルベート−８０の特に好ましい濃度は約０．０２％（重量／体積）である。
【００２０】
特に好ましい配合物は、約０．２５−約１０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の配列番号１のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−Ｆｃ融合タンパク質と、約１０ｍＭの濃度のクエン酸緩衝液と、約０．０２％（重量／体積）の濃度のポリソルベート−８０と、約４．６％（重量／体積）の濃度のマンニトールと、約６．５のｐＨとを含む。別の特に好ましい配合物は、約０．２５−約５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の配列番号１のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−Ｆｃ融合タンパク質と、約１０ｍＭの濃度のクエン酸緩衝液と、約０．０２％（重量／体積）の濃度のポリソルベート−８０と、約４．６％（重量／体積）の濃度のマンニトールと、約６．５のｐＨとを含む。別の特定の配合物は、約０．２５−約１０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の配列番号１のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−Ｆｃ融合タンパク質と、約５−約２０ｍＭの範囲の濃度のクエン酸緩衝液と、約０．０２％（重量／体積）の濃度のポリソルベート−８０と、約４．５−約４．８％（重量／体積）の範囲の濃度のマンニトールと、約６．３−約６．７の範囲のｐＨとを含む。別の特定の配合物は、約０．２５−約５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度の配列番号１のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−Ｆｃ融合タンパク質と、約５−約２０ｍＭの範囲の濃度のクエン酸緩衝液と、約０．０２％（重量／体積）の濃度のポリソルベート−８０と、約４．５−約４．８％（重量／体積）の範囲の濃度のマンニトールと、約６．３−約６．７の範囲のｐＨを含む。
【００２１】
当該配合物の投与は、当業者によって有効であると知られている任意の経路によってよい。末梢での非経口は１つのかかる方法である。非経口投与は、医学文献では、滅菌した注射器または何らかの他の機械的装置（輸液ポンプなど）による身体への剤形の注入と一般に理解されている。末梢での非経口経路としては、静脈内投与経路、筋肉投与経路、皮下投与経路、および腹腔内投与経路を挙げることができる。皮下投与が好ましい経路である。
【００２２】
本発明の配合物は、インスリン非依存型糖尿病を患うか、またはインスリン非依存型糖尿病、インスリン依存型糖尿病、または肥満症にかかるリスクのある被験者を治療するために使用することができる。当該記載する配合物の文脈における当該ＧＬＰ−１−Ｆｃ融合タンパク質の有効量は、ＧＬＰ−１受容体の刺激を必要とする被験者に投与したときに、許容できない副作用を引き起こすことなく所望の治療効果および／または予防的効果をもたらす量である。
【００２３】
この融合タンパク質は２週間ごとに１回または週に１回のいずれかで投与することが好ましい。治療しようとする疾患に応じて、当該融合タンパク質をより頻繁に（１週間あたり２−３回など）投与することが必要となることがあり得る。
【００２４】
本発明は、以下に、実施例を参照して限定を意図しない具体例としてのみ記載される。
【実施例】
【００２５】
（生体外ＧＬＰ−１受容体活性化アッセイ）
ヒトＧＬＰ−１受容体を安定に発現するＨＥＫ−２９３細胞を、ＣＲＥ−ルシフェラーゼ系を用いて、３０，０００細胞／ウェル／８０μｌ低血清ＤＭＥＭ  Ｆ１２培地で９６穴プレートに播種した。播種の翌日に、０．５％  ＢＳＡに溶解した試験タンパク質の２０μｌのアリコートを混合し、上記細胞とともに５時間インキュベーションした。一般に、３ｐＭ−３ｎＭを含む１２希釈を各試験タンパク質について５×濃度で調製し、その後この細胞に加えて用量応答曲線を生成し、この曲線からＥＣ５０値を決定した。インキュベーション後、１００μｌのルシフェラーゼ試薬を、直接各プレートに加え、２分間ゆっくりと混合した。プレートをＴｒｉ−ｌｕｘルミノメーター中に置き、ルシフェラーゼ発現から生じる光の出力を算出した。
【００２６】
（ＧＬＰ−Ｆｃ融合配合物の分析試験）
ＧＬＰ−Ｆｃ融合配合物の安定性を、以下の方法を用いて評価した：紫外−可視分光法（ＵＶ）、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、アニオン交換クロマトグラフィ、ＲＰクロマトグラフィを併用した限定消化、５５０ｎｍでの吸光度、動的光散乱、インストロン（ｉｎｓｔｒｏｎ）、ＨＩＡＣおよび示差走査熱量測定（ｍｉｃｒｏＤＳＣ）。逆相（ＲＰ）クロマトグラフィは、短縮形ＧＬＰ−Ｆｃの形成、Ｆｃ領域での酸化および対応する無変化の主ピークの減少をモニターするために使用した。サイズ排除（ＳＥ）ＨＰＬＣは、ポリマー（可溶性凝集体）形成および対応する単量体の減少をモニターするために使用した。アニオン交換（ＡＥＸ）ＨＰＬＣは、電荷の不均一性、特に酸性変異体（ＡＶ）の形成（これは、通常は脱アミドに対応する）、および対応する主ピークの減少をモニターするために使用した。限定消化は、当該ＧＬＰ−Ｆｃ分子のペプチド（ＧＬＰ−１）部分に特異的な分解生成物（Ｈ１（配列番号１の１位のＨｉｓ）および／またはＧ２（配列番号１の２位のＧｌｙ）Ｎ末端での短縮的欠失、Ｆ２２（配列番号１の２２位のＰｈｅ）および／またはＷ２５（配列番号１の２５位のＴｒｐ）でのプロテアーゼによる短縮、Ｎ末端でのピルビン酸化（ｐｙｒｕｖｌａｔｉｏｎ）、Ｗ２５（配列番号１の２５位のＴｒｐ）での酸化、およびＳ４６（配列番号１の４６位のＳｅｒ）でのリン酸化など）をモニターするために使用した。５５０ｎｍでの吸光度は、不溶性粒子の形成に起因する溶液の濁度をモニターするために使用した。動的光散乱は、巨大な可溶性凝集体を測定するために使用した。インストロンは、濾過抵抗を測定するために使用した。これは、最初はグルカゴン溶液のゲル様構造の形成を測定するために開発された半定量的方法である。この技法は、ＧＬＰ−１ペプチド溶液の物理的不安定性を評価するために広く使用されてきた。ＧＬＰ−Ｆｃ融合物はＧＬＰ−１類似体とＩｇＧ４Ｆｃ鎖との組み合わせであるため、濾過抵抗試験は、物理的不安定性の本質についてのさらなる考察材料（ｉｎｓｉｇｈｔ）を提供することができる。この試験は、０．２μｍ細孔径を有するＰＶＤＦ膜の１３ｍｍ直径のフィルターを通して、注射器の中の溶液を押し出すことから生じる背圧を測定するために実施した。抵抗または凝集がなければ、圧力フィードバックのグラフには、傾きは現れない。経時的に傾きが増加するということは、凝集および／またはゲル化の量が増加していることを示す。実施例（ｒｕｎ）の比較を単純にするために、最大抵抗値のみを本願明細書に報告する。ＨＩＡＣは、不溶性粒状物の形成をモニターするために非経口配合物開発で広く使用される光障害（ｌｉｇｈｔ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）手法である。示差走査熱量測定は、タンパク質が構造転移を受け始める時の熱転移温度によって示されるアンフォールディング特性をモニターするために使用した。
【００２７】
ＧＬＰ−Ｆｃ融合配合物を、以下の表に従って調製した。
【００２８】
【表１】
2010533197.tif 000004
【００２９】
このＧＬＰ−Ｆｃ融合配合物を０．２２μｍポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に通して滅菌濾過した。分析するまでまたは最高２０週間、この溶液を、５ｍＬのガラスバイアル中、５℃、１５℃、２５℃、３７℃および４５℃で保存した。
【００３０】
（ＧＬＰ−Ｆｃ安定性に対するｐＨの効果）
以下の表は、ＲＰクロマトグラフィで測定した、３７℃におけるＧＬＰ−Ｆｃ融合タンパク質の短縮形形成の速度定数を示す。
【００３１】
【表２】
2010533197.tif 000005
【００３２】
以下の表は、ＡＥＸ  ＨＰＬＣで測定した、３７℃におけるＧＬＰ−Ｆｃ融合タンパク質の酸性変異体の酸性変異体形成についての速度定数を示す。
【００３３】
【表３】
2010533197.tif 000006
【００３４】
以下の表は、ＳＥ  ＨＰＬＣで測定した、３７℃における２０週間の保存後のＧＬＰ−Ｆｃ融合タンパク質の可溶性凝集体の形成（ポリマー％）を示す。
【００３５】
【表４】
2010533197.tif 000007
【００３６】
以下の表は、限定消化による３７℃でのＮ末端短縮（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）（ｄｅｓ  Ｈ１／Ｈ１Ｇ２）の速度定数を示す。
【００３７】
【表５】
2010533197.tif 000008
【００３８】
（溶解度および粘度）
以下の表は、ＧＬＰ−Ｆｃ融合配合物の溶解度および粘度に対するｐＨの効果を示す。この溶液を適切な緩衝液中でまず調製し、ｐＨを調整し、次いでこの溶液を、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）濃縮器を用いて遠心分離によって濃縮した。この溶液を、溶液の溶解度の限界に到達する兆しについて目視で確認した。濃度は、ＵＶ吸光度によって測定した。粘度は、ポアズ（Ｐ）単位で測定した。１Ｐ＝１ｇ ｃｍ−１ｓ−１である。２０℃の水はおよそ０．０１ｇｃｍ−１ｓ−１の粘度を有する。この０．０１ｇ ｃｍ−１ｓ−１は１センチポアズ（ｃＰ）と同じである。
【００３９】
【表６】
2010533197.tif 000009
【００４０】
（溶液配合物の安定性比較）
鍵となる配合物パラメータと上記分子の化学的／物理的安定性との間の関係を明らかにするために、実験計画法（ＤｏＥ）研究を設定した。そのデータに基づき、（ｉ）化学的安定性および物理的安定性に関して最適の標的配合物を画定するため、（ｉｉ）許容できる性能を備えた生成物のためのパラメータ範囲を画定するための配合物の設計空間を探索するため、および（ｉｉｉ）本研究で探索した設計空間の範囲内で配合物の性能の十分な安定性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）を確立するための定量的モデルを開発した。
【００４１】
ＤｏＥ研究で試験したすべての配合物を以下の表にまとめた。これらの種々の配合物を調製し、０．２２μｍポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に通して滅菌濾過した。分析するまでまたは最高３ヶ月間、これらの配合物を、３ｍＬガラスバイアル中、５℃、２５℃および４０℃で保存した。
【００４２】
【表７】
2010533197.tif 000010
【００４３】
配合物の安定性を、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィによって主ピーク％の減少をモニターすることによって評価した。すべての配合物についての速度定数を、以下の表に示す。
【００４４】
【表８】
2010533197.tif 000011
【００４５】
ＲＰクロマトグラフィによってモニターできる短縮形には２種類が存在した。第１のものは、残留するプロテアーゼによるＧＬＰ領域のＦ２２および／またはＷ２５での短縮形である。第２のタイプは、化学的機構を介してリンカー領域で短縮されている。ＲＰクロマトグラフィによって測定した、すべての配合物についての速度定数を、以下の表に示す。
【００４６】
【表９】
2010533197.tif 000012
【００４７】
可溶性凝集体形成をサイズ排除ＨＰＬＣによってモニターした。４０℃での単量体減少についての速度定数を以下の表に示す。
【００４８】
【表１０】
2010533197.tif 000013
【００４９】
ＧＬＰ領域内での限定消化によるＮ末端短縮を、限定消化分析によってモニターした。Ｄｅｓ  Ｈ１／Ｈ１Ｇ２についての速度定数を以下の表に示す。
【００５０】
【表１１】
2010533197.tif 000014
【００５１】
４００ＲＰＭで２４時間の旋回振盪による撹拌後の可溶性凝集形成をＳＥ  ＨＰＬＣでモニターした。単量体％の結果を以下の表に示す。
【００５２】
【表１２】
2010533197.tif 000015
【００５３】
撹拌安定性に関する主たる懸念は、不溶性の粒状物の形成であり、これはＨＩＡＣ測定によってモニターすることができる。４００ＲＰＭで２４時間の旋回振盪による撹拌後のＨＩＡＣの結果を以下の表に示す。
【００５４】
【表１３】
2010533197.tif 000016
【００５５】
注射器およびバイアル中でのＮａＣｌ対マンニトール配合物の比較
【００５６】
【表１４】
2010533197.tif 000017
【００５７】
マンニトールおよびＮａＣｌならびに注射器での保存およびバイアルでの保存を比較する上記の２種の配合物の５℃での安定性比較
【００５８】
【表１５】
2010533197.tif 000018
【００５９】
マンニトールおよびＮａＣｌならびに注射器での保存およびバイアルでの保存を比較する上記の２種の配合物の２５℃での安定性比較
【００６０】
【表１６】
2010533197.tif 000019
【００６１】
マンニトールおよびＮａＣｌならびに注射器での保存およびバイアルでの保存を比較する上記の２種の配合物の４０℃での安定性比較
【００６２】
【表１７】
2010533197.tif 000020
【００６３】
（マンニトール濃度の決定）
ＧＬＰ−Ｆｃ融合タンパク質溶液配合物について、２９０ミリ重量モル浸透圧濃度／Ｋｇの目標の浸透圧を達成するのに必要なマンニトール濃度を滴定実験により決定した。以下の表は、得られた浸透圧をマンニトール濃度の関数としてまとめたものである。０．０１未満の統計的ｐ値を有する、マンニトール濃度に対する浸透圧結果の線形回帰分析に基づき、マンニトール濃度は、４６．４ｍｇ／ｍＬまたは４．６４％であると決定した。
【００６４】
【表１８】
2010533197.tif 000021
【配列表】
2010533197000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月4日(2010.1.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2010533197.tif 000025