(57)【要約】  本発明者らは、個体において乳癌などの癌の治療、予防または緩和方法に用いるためのＶＨＺを提供する。本発明者らは、癌の治療、予防または緩和のための抗ＶＨＺ剤を提供する。本発明者らはさらに、個体またはその個体から採取したサンプルにおいてＶＨＺの発現を検出するための手段を含む個体における乳癌またはその個体の乳癌感受性を検出するためのキット、ならびに癌細胞を検出する方法（この方法は細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変調を検出することを含む）を提供する。【選択図】図１Ａ−１
2010535503.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において乳癌などの癌を治療、予防または緩和する方法に用いるためのＶＨＺ。
【請求項２】
乳癌、例えば、浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）のような浸潤性または転移性癌などの癌の治療、予防または緩和のための抗ＶＨＺ剤であって、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３またはＮＰ＿０６０２９３として示されるＶＨＺ配列またはその配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の発現、量または活性の任意の組合せをダウンレギュレーションすることができ、好ましくは、ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫに対して作製された抗ペプチド抗体などの抗ＶＨＺ抗体、例えば、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｃ３２２８１、アミノ酸３５〜９０、ＬＳ−Ｃ４２４５８、ＬＳ−Ａ６８０６およびＬＳ−Ａ６８０３、ＬＳ−Ｃ３２２８１、LifeSpan Inc、米国ワシントン州シアトル）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＤＳ−ＰＢ−００６７６、RayBiotech Inc、米国ジョージア州ノークロス）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＸＷ−７８５７、ProSci Incorporated、米国カリフォルニア州パウェイ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｆ４５６０およびＤ９８４０−６６Ａ、United States Biological、米国マサチューセッツ州スワンプスコット）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｄ９８４０−６６、United States Biological、米国マサチューセッツ州スワンプスコット）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＡＨＰ１１４２、AdB Serotec、英国オックスフォード）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−４０４５２、Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１００−７５３２８、Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン）を含むか、あるいはＳｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｓｈｏｒｔ  Ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはＤＵＳ  Ｐ２３プレデザインキメラＲＮＡｉ（カタログ番号Ｈ０００５４９３５−Ｒ０１、Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン）などのキメラＲＮＡｉを含むものなどのＲＮＡ干渉によりＶＨＺをダウンレギュレーションすることができる、抗ＶＨＺ剤。
【請求項３】
個体における乳癌または個体の乳癌に対する感受性を検出するためのキットであって、個体またその個体から採取したサンプルにおいてＶＨＺ発現を検出するための手段（好ましくは、この検出手段は、ＶＨＺポリヌクレオチドもしくはそのフラグメント；ＶＨＺ核酸に対して相補的なヌクレオチド配列もしくはそのフラグメント；ＶＨＺポリペプチドもしくはそのフラグメント、または請求項２に記載の抗ＶＨＺ抗体もしくは抗ＶＨＺ剤からなる群から選択される）および所望により使用説明書を含み、好ましくは、タモキシフェンまたはヘルセプチンを含むなど、乳癌の治療、予防または緩和のための治療薬をさらに含む、キット。
【請求項４】
浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）のような浸潤性または転移性癌細胞などの乳癌細胞などの癌細胞を検出する方法であって、細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変調（好ましくは、アップレギュレーション）を検出すること、好ましくは、このＶＨＺの発現を癌でないことが分かっている対照細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性と比較することを含む、方法。
【請求項５】
ＶＨＺ核酸を、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３もしくはＮＰ＿０６０２９３として示される配列またはこのような配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する核酸の少なくとも一部を含むプローブの手段などにより検出することを含むか、あるいはＶＨＺポリペプチドを、請求項２に示された抗ＶＨＺ抗体の手段などにより検出することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Elston-Ellis改変Scarff, Bloom, Richardson grading system (Nottingham Grading System (NGS))の使用などによる組織学的分類をさらに含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
細胞の増殖状態を決定する、または細胞が浸潤性もしくは侵襲性となる見込みを決定する方法であって、細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変調を検出することを含む、方法。
【請求項８】
癌を有する個体の生存率を推定する方法であって、その個体の細胞においてＶＨＺの発現の変調を検出することを含む、方法。
【請求項９】
癌を有する個体の療法を選択する方法であって、その個体の細胞においてＶＨＺの発現の変調を検出すること、癌の侵襲性に基づき抗ＶＨＺ剤などの適当な療法を選択することを含む、方法。
【請求項１０】
癌を有する個体において特定の療法の成功の見込みを決定する方法であって、その療法を請求項９に記載の方法により決定された療法と比較することを含む、方法。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれかに示される特徴をさらに含む、請求項４〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）のような浸潤性または転移性癌細胞などの乳癌細胞などの癌細胞を操作する方法であって、例えば細胞をＶＨＺと特異的に結合することができるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはキメラＲＮＡｉに曝すことによるか、または細胞を請求項２に示される抗ＶＨＺ抗体に曝すことにより、細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性を変調する（好ましくは、ダウンレギュレーションする）ことを含み、好ましくはこの操作の結果として、癌細胞が非癌性となるか、または浸潤性もしくは転移性癌細胞が非浸潤性もしくは非転移性となる、方法。
【請求項１３】
細胞を操作する方法であって、（ａ）細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の上昇を検出するステップ、および（ｂ）その細胞においてＶＨＺのレベルを低減するステップを含む、方法。
【請求項１４】
ＶＨＺポリペプチドと結合することができる分子を同定する方法であって、ＶＨＺポリペプチドまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を候補分子と接触させること、およびその候補分子がＶＨＺポリペプチドまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列と結合するかどうかを決定することを含む、方法。
【請求項１５】
ＶＨＺのモジュレーターを同定する方法であって、細胞を候補分子と接触させること、およびその細胞内のまたはその細胞のＶＨＺの発現、量または活性の上昇または低下を検出することを含む、方法。
【請求項１６】
癌の治療、予防または緩和に好適な分子を同定する方法であって、候補分子がＶＨＺまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを、好ましくは、候補分子をＶＨＺポリペプチドまたはＶＨＺポリペプチドを発現する細胞に曝してその候補分子がそのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定することによって決定することを含む、方法。
【請求項１７】
ＶＨＺまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であって、候補分子を動物に投与すること、およびその動物がＶＨＺの発現、量または活性の上昇または低下を示すかどうかを決定することを含む、方法。
【請求項１８】
個体において癌（例えば、浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）のような浸潤性または転移性癌などの乳癌）を治療、予防または緩和する方法であって、その個体の細胞においてＶＨＺの発現、量または活性を変調する、好ましくは、個体の乳房細胞においてＶＨＺの発現、量または活性を低下させることを含む、方法。
【請求項１９】
個体において癌（例えば、浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）のような浸潤性または転移性癌などの乳癌）または癌に対する感受性の診断、または癌を有する個体の予後の方法であって、その個体の細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変調を検出することを含む、方法。
【請求項２０】
個体における腫瘍が浸潤性または転移性腫瘍であるかどうか、または浸潤性または転移性腫瘍となる可能性があるかどうかを決定する方法であって、その個体の腫瘍細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変調を検出することを含む、方法。
【請求項２１】
個体において癌（例えば、浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）のような浸潤性または転移性癌などの乳癌）を治療、予防または緩和する方法であって、その個体の細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変調を検出すること、およびその腫瘍の侵襲性に基づき、抗ＶＨＺ剤などの適当な療法をその個体に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
診断、予後または療法の選択が、腫瘍の大きさもしくはリンパ節の悪性度またはその双方を、所望によりその他のリスク因子とともに、または組み合わせて評価することによりさらに評価される、好ましくは、診断、予後または療法の選択が、腫瘍のエストロゲン受容体（ＥＲ）の状態を評価することによりさらに評価される、請求項１８〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法または使用により同定されたＶＨＺポリペプチドの分子、アゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項２４】
ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫに対して作製された抗ペプチド抗体など、癌の治療、予防または緩和に用いるためのＶＨＺの発現を変調する、例えばダウンレギュレーションすることができる分子。
【請求項２５】
添付の図面の図１〜１１に関して以上に記載される、または図１〜１１に示される方法または物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、細胞生物学、分子生物学および遺伝学の分野に関する。本発明は医学の分野に関する。特に、本発明は、乳癌などの疾病の治療および診断ならびにそのような使用のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＶＨＺは、ヒトＰＲＬ−ＰＴＰと約２８％のアミノ酸配列同一性を有するホスファターゼである。ＶＨＺは多くの組織で発現され、サイトゾルおよび仁に局在することがこれまでに報告されている(Alonsoら, 2004a)。
【０００３】
しかしながら、進化を通じ、カエル、魚類、ハエおよび古細菌の相同分子種で保存されているにもかかわらず、ＶＨＺの役割は十分には知られていない。ＶＨＺならびにＶＨＲはＶＨ１様ＰＴＰの独立したサブグループに属す(Alonsoら, 2004b)。ＶＨＲは細胞周期の進行の調節に機能を持つことが報告されている(Rahmouniら, 2006)。
【０００４】
西洋世界およびアジアの先進国では、乳癌が女性における癌関連の第二の死因である(Polyak, 2001)。シンガポールでは、乳癌が女性の癌の筆頭であり、毎年７００〜８００の新たな症例が診断されている(Singapore Cancer Registry Report, 2000)。米国では、年間１８０，０００人の女性が乳癌の新たな症例として診断されている(Polyak, 2001)。診断が良くなり、スクリーニングが慣例化されているにもかかわらずに、奨励の４分の１前後がこの疾病から死に至る。
【０００５】
よって、乳癌の検出および療法の改良の必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Alonso A, Burkhalter S, Sasin, J, Tautz L, Bogetz J, Huynh H et al. (2004a). The minimal essential core of a cysteine-based protein-tyrosine phosphatase revealed by a novel 16-kDa VH1-like phosphatase, VHZ. J Biol Chem 279:35768-35774.
【非特許文献２】Alonso A, Sasin J, Bottini N, Friedberg I, Osterman A, Godzik A et al. (2004b). Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell 117:699-711.
【非特許文献３】Rahmouni, S., Cerignoli, F., Alonso, A., Tsutji, T., Henkens, R., Zhu, C., Louis-dit-Sully, C., Moutschen, M., Jiang, W. and Mustelin, T. (2006). Loss of the VHR dual-specific phosphatase causes cell-cycle arrest and senescence. Nat Cell Biol 8:524-531.
【非特許文献４】Polyak K. On the birth of breast cancer. Biochim Biophys Acta. 2001 1552(1):1-13. Review
【非特許文献５】Singapore Cancer Registry Report No. 5 "Cancer Incidence in Singapore, 1993-1997" published in the Yr 2000
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様に従い、本発明者らは、個体において乳癌などの癌を治療、予防または緩和する方法で用いるためのＶＨＺを提供する。
【０００８】
本発明の第２の態様によれば、癌の治療、予防または緩和のための抗ＶＨＺ剤が提供される。癌は乳癌を含み得る。癌は浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）のような浸潤性または転移性癌を含み得る。
【０００９】
抗ＶＨＺ剤は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３もしくはＮＰ＿０６０２９３として示されるＶＨＺ配列、またはその配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の発現、量または活性の任意の組合せをダウンレギュレーションすることができる可能性がある。この抗ＶＨＺ剤は抗ＶＨＺ抗体を含み得る。
【００１０】
抗ＶＨＺ抗体は、ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫに対して作製された抗ペプチド抗体を含み得る。
【００１１】
抗ＶＨＺ抗体は、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｃ３２２８１、アミノ酸３５〜９０、ＬＳ−Ｃ４２４５８、ＬＳ−Ａ６８０６およびＬＳ−Ａ６８０３、ＬＳ−Ｃ３２２８１、LifeSpan Inc、米国ワシントン州シアトル）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＤＳ−ＰＢ−００６７６、RayBiotech Inc、米国ジョージア州ノークロス）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＸＷ−７８５７、ProSci Incorporated、米国カリフォルニア州パウェイ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｆ４５６０およびＤ９８４０−６６Ａ、United States Biological、米国マサチューセッツ州スワンプスコット）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｄ９８４０−６６、United States Biological、米国マサチューセッツ州スワンプスコット）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＡＨＰ１１４２、AdB Serotec、英国オックスフォード）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−４０４５２、Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１００−７５３２８、Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン）を含み得る。
【００１２】
抗ＶＨＺ剤は、ＲＮＡ干渉によりＶＨＺをダウンレギュレーションすることができる可能性がある。抗ＶＨＺ剤は、Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｓｈｏｒｔ  Ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはＤＵＳ  Ｐ２３プレデザインキメラＲＮＡｉ（カタログ番号Ｈ０００５４９３５−Ｒ０１、Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン）などのキメラＲＮＡｉを含み得る。
【００１３】
本発明者らは、本発明の第３の態様に従い、個体における乳癌または個体の乳癌に対する感受性を検出するためのキットを提供する。このキットは、個体またその個体から採取したサンプルにおいてＶＨＺ発現を検出するための手段を含み得る。この検出手段は、ＶＨＺポリヌクレオチドもしくはそのフラグメント；ＶＨＺ核酸に対して相補的なヌクレオチド配列もしくはそのフラグメント；ＶＨＺポリペプチドもしくはそのフラグメント、または上記で示される抗ＶＨＺ抗体もしくは抗ＶＨＺ剤からなる群から選択することができ、所望により使用説明書を含む。このキットは、タモキシフェンまたはヘルセプチンを含むなど、乳癌の治療、予防または緩和のための治療薬をさらに含み得る。
【００１４】
本発明の第４の態様として、乳癌細胞などの癌細胞を検出する方法が提供される。癌細胞は浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）のような浸潤性または転移性癌細胞を含み得る。この方法は細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変調を検出することを含み得る。変調はアップレギュレーションを含み得る。このＶＨＺの発現を、癌でないことが分かっている対照細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性と比較することもできる。
【００１５】
この方法はＶＨＺ核酸を検出することを含み得る。これはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３もしくはＮＰ＿０６０２９３として示される配列またはこのような配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する核酸の少なくとも一部を含むプローブの手段によるものであってもよく、あるいはこの方法は請求項２に示される抗ＶＨＺ抗体の手段などによりＶＨＺポリペプチドを検出することを含む。
【００１６】
この方法は組織学的分類をさらに含み得る。組織学的分類はElston-Ellis改変Scarff, Bloom, Richardson grading system (Nottingham Grading System (NGS))の手段によるものであり得る。
【００１７】
本発明者らは、本発明の第５の態様に従い、細胞の増殖状態を決定する、または細胞が浸潤性もしくは侵襲性となる見込みを決定する方法を提供する。この方法は、細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変調を検出することを含む。
【００１８】
本発明は、第６の態様において、癌を有する個体の生存率を推定する方法を提供する。この方法は個体の細胞においてＶＨＺの発現の変調を検出することを含む。
【００１９】
本発明の第７の態様では、癌を有する個体の療法を選択する方法が提供され、その方法は、その個体の細胞においてＶＨＺの発現の変調を検出すること、癌の侵襲性に基づき適当な療法を選択することを含む。この療法は上記のような抗ＶＨＺ剤を含み得る。
【００２０】
本発明の第８の態様に従い、本発明者らは、癌を有する個体において特定の療法の成功の見込みを決定する方法を提供する。この方法は、その療法を上記に示される方法により決定された療法と比較することを含む。
【００２１】
これらの各方法は本発明の上記第１〜第３の態様のいずれかに示される特徴をさらに含み得る。
【００２２】
本発明者らは、本発明の第９の態様に従い、乳癌細胞などの癌細胞を操作する方法を提供する。癌細胞は浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）のような浸潤性または転移性癌細胞を含み得る。この方法は、細胞においてＶＨＺの発現、量または活性を変調することを含み得る。この変調はダウンレギュレーションを含み得る。この方法は、細胞をＶＨＺと特異的に結合することができるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡに曝すことを含み得る。この方法は、細胞を上記に示されるものなどの抗ＶＨＺ抗体に曝すことを含み得る。この操作の結果として、癌細胞が非癌性となり得るか、または浸潤性もしくは転移性癌細胞が非浸潤性もしくは非転移性となり得る。
【００２３】
本発明の第１０の態様によれば、細胞を操作する方法であって、（ａ）細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の上昇を検出するステップ、および（ｂ）その細胞においてＶＨＺのレベルを低減するステップを含む方法が提供される。
【００２４】
本発明の第１１の態様として、本発明者らは、ＶＨＺポリペプチドと結合することができる分子を同定する方法を提供し、この方法は、ＶＨＺポリペプチドまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を候補分子と接触させること、およびその候補分子がＶＨＺポリペプチドまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列と結合するかどうかを決定することを含む。
【００２５】
本発明者らは、本発明の第１２の態様に従い、ＶＨＺのモジュレーターを同定する方法を提供し、その方法は、細胞を候補分子と接触させること、およびその細胞内のまたはその細胞のＶＨＺの発現、量または活性の上昇または低下を検出することを含む。
【００２６】
本発明の第１３の態様に従い、本発明者らは、癌の治療、予防または緩和に好適な分子を同定する方法を提供し、その方法は、候補分子がＶＨＺまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定することを含む。この方法は、候補分子をＶＨＺポリペプチドまたはＶＨＺポリペプチドを発現する細胞に曝してその候補分子がそのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定することを含み得る。
【００２７】
本発明の第１４の態様によれば、ＶＨＺまたはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法が提供され、その方法は、候補分子を動物に投与すること、およびその動物がＶＨＺの発現、量または活性の上昇または低下を示すかどうかを決定することを含む。
【００２８】
本発明者らは、本発明の第１５の態様に従い、個体において癌を治療、予防または緩和する方法を提供し、その方法は、その個体の細胞においてＶＨＺの発現、量または活性を変調することを含む。癌細胞は浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）のような浸潤性または転移性癌などの乳癌を含み得る。この方法は、個体の乳房細胞においてＶＨＺの発現、量または活性を低下させるものであり得る。
【００２９】
本発明者らは、本発明の第１６の態様に従い、個体において癌または癌に対する感受性の診断、または癌を有する個体の予後の方法を提供し、その方法は、その個体の細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変調を検出することを含む。癌は浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）のような浸潤性または転移性癌などの乳癌を含み得る。
【００３０】
本発明者らは、本発明の第１７の態様に従い、個体における腫瘍が浸潤性または転移性腫瘍であるかどうか、または浸潤性または転移性腫瘍となる可能性があるかどうかを決定する方法を提供し、その方法は、その個体の腫瘍細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変調を検出することを含む。
【００３１】
本発明者らは、本発明の第１８の態様に従い、個体において癌を治療、予防または緩和する方法を提供し、その方法は、その個体の細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変調を検出すること、およびその腫瘍の侵襲性に基づき、適当な療法をその個体に投与することを含む。療法は上記のような抗ＶＨＺ剤を含み得る。癌は浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）のような浸潤性または転移性癌などの乳癌を含み得る。
【００３２】
診断、予後または療法の選択は、腫瘍の大きさもしくはリンパ節の悪性度またはその双方を、所望によりその他のリスク因子とともに、または組み合わせて評価することによりさらに評価することができる。診断、予後または療法の選択は、腫瘍のエストロゲン受容体（ＥＲ）の状態を評価することによりさらに評価することもできる。
【００３３】
本発明者らは、本発明の第１９の態様に従い、上記に示される方法または使用により同定されたＶＨＺポリペプチドの分子、アゴニストまたはアンタゴニストを提供する。
【００３４】
本発明者らは、本発明の第２０の態様に従い、癌の治療、予防または緩和に用いるためのＶＨＺの発現を変調する、例えばダウンレギュレーションすることができる分子を提供する。この分子は、ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫに対して作製された抗ペプチド抗体を含み得る。
【００３５】
本発明の実施では、特に断りのない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣例技術を用い、それらは当業者の能力の範囲内である。このような技術は文献で説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch,およびT. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M.ら(1995および定期増刊号; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13および16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree,およびA. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. PolakおよびJames O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (編), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. LilleyおよびJ. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I, Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual, Ed Harlow (編), David Lane (編) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855. Handbook of Drug Screening, Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes編(2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9);およびLab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Jane RoskamsおよびLinda Rodgers編, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3参照。これらの各一般教本は参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ−１】外因性ＶＨＺが中心体および細胞質に局在することを示す。間接的免疫蛍光は中心体内の外因性ＶＨＺを示した。ＶＨＺ−ＥＧＦＰ（緑）がＮＲＫ細胞にトランスフェクトされ、一定範囲の細胞下局在を示している（ａ）。ＶＨＺの主要局在は中心体であり、そこでそれは赤で中心体マーカー−ペリセントリンと同時局在する（ｂ）。Ｔｏ−ｐｒｏ−３ヨージドは青で核を可視化するために用いられる（ｂ）。合成画像は、ペリセントリンと同時局在するＶＨＺ−ＥＧＦＰ（緑）を示した（ｃ）。バーは２０μｍ。
【図１Ａ−２】（図１Ａ−１の続き）
【図１Ａ−３】（図１Ａ−２の続き）
【図１Ｂ−１】外因性ＶＨＺが中心体および細胞質に局在することを示す。間接的免疫蛍光は中心体内の外因性ＶＨＺを示した。ＶＨＺ−ＥＧＦＰがＮＲＫ細胞にトランスフェクトされ、種々の細胞周期段階の細胞で可視化されている：間期（ａ）、前期（ｂ）、中期（ｃ）および終期（ｄ）。ペリセントリンは赤で示され（ａ’〜ｄ’）、核はＴｏ−ｐｒｏ−３ヨージドを用いて青で示されている（ａ’〜ｄ’）。示されたように画像が合成されている（ａ”〜ｄ”）。バーは１０μｍ。
【図１Ｂ−２】（図１Ｂ−１の続き）
【図２Ａ】内因性ＶＨＺが中心体および細胞質に局在することを示す。内因性ＶＨＺが、ＮＲＫ（ａ〜ｃ、バーは１０ｍｍ）およびＭＣＦ−１０Ａ（ｄ〜ｆ、バーは２０ｍｍ）細胞において、アフィニティー精製ウサギ抗ＶＨＺおよびマウス抗γ−チューブリン抗体、次いで、抗ウサギ−ＦＩＴＣ（緑）とコンジュゲートされた抗ウサギＩｇＧおよび抗マウス−テキサスレッドとコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧで二重染色することにより可視化されている。内因性ＶＨＺはまた、Ａ４３１細胞（ｇ〜ｉ、バーは２０ｍｍ）でも、マウスモノクローナル抗体抗ＶＨＺ（クローン＃２５）およびウサギ抗ペリセントリン抗体、次いで、抗マウス−ＦＩＴＣ（緑）とコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧおよび抗ウサギ−テキサスレッドとコンジュゲートされた抗ウサギＩｇＧで二重染色することにより検出される。
【図２Ｂ−１】内因性ＶＨＺが中心体および細胞質に局在することを示す。内因性ＶＨＺが、血清飢餓ＮＲＫ（ａ〜ｃ、バーは２０ｍｍ）において、ウサギ抗ＶＨＺおよびマウス抗γ−チューブリン抗体、次いで、抗ウサギ−ＦＩＴＣ（緑）とコンジュゲートされた抗ウサギＩｇＧおよび抗マウス−テキサスレッドとコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧで二重染色することにより可視化されている。
【図２Ｂ−２】（図２Ｂ−１の続き）
【図２Ｂ−３】（図２Ｂ−２の続き）
【図３Ａ】ＶＨＺがタンパク質チロシンホスファターゼ活性を有し、細胞周期の調節に関与することを示す。本発明者らは各タンパク質（０．６７５ピコモル）のＰＴＰアーゼ活性を試験する。ＶＨＺのＰＴＰアーゼ活性は、反応物に１０μＭオルトバナジウム酸ナトリウム（ＶＨＺ−ＧＳＴ＋バナジウム酸塩）を加えることにより、またはＣｙｓ９５からＳｅｒ［ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＧＳＴ）］への点突然変異により完全に無効にされる。
【図３Ｂ−１】ＶＨＺがタンパク質チロシンホスファターゼ活性を有し、細胞周期の調節に関与することを示す。ａ．３つの全細胞溶解液はＶＨＺ−ＥＧＦＰ、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰまたはＥＧＦＰベクターを発現するＭＣＦ−７細胞に由来する。タンパク質発現レベルは、抗ＥＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロットにより分析する。ＧＡＰＤＨをタンパク質ローディング対照として用いる。ｂ．ＤＮＡ含量は、ＢｒｄＵ取り込みおよびＦＡＣＳ分析により測定する。新たに合成されたＤＮＡへのＡＰＣ−ＢｒｄＵ取り込み（Ｒ１は赤色蛍光の量に相当する）。
【図３Ｂ−２】（図３Ｂ−１の続き）
【図３Ｂ−３】（図３Ｂ−２の続き）
【図３Ｂ−４】（図３Ｂ−３の続き）
【図３Ｃ−１】ＶＨＺがタンパク質チロシンホスファターゼ活性を有し、細胞周期の調節に関与することを示す。同じ３つの発現構築物を安定発現したＮＲＫ細胞は、ＶＨＺはＧ１集団を減少させるが、Ｓ集団を増加させることを示した。得られたヒストグラムは３種類の集団からなる（％）：Ｍ１：Ｇ１期、Ｍ２：Ｓ期およびＭ３：Ｇ２／Ｍ期。このグラフは、その個体細胞のＤＮＡ含量をＦＡＣＳ分析により測定する際、増殖中の細胞集団に関して得られる典型的な結果を示した。
【図３Ｃ−２】（図３Ｃ−１の続き）
【図３Ｃ−３】（図３Ｃ−２の続き）
【図４Ａ】ＭＣＦ−７細胞においてＶＨＺはＧ１／Ｓ移行を促進することを示す。ＥＧＦＰベクター、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰまたはＶＨＺ−ＥＧＦＰを発現するＭＣＦ−７細胞を、Ｇ１／Ｓ細胞周期制御に関与するいくつかの分子に関して分析する。それらはｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、Ｃｄｋ４、ならびにＳｅｒ７８０、Ｓｅｒ７９５およびＳｅｒ８０７／８１１でリン酸化されたＲｂである。
【図４Ｂ】ＭＣＦ−７細胞においてＶＨＺはＧ１／Ｓ移行を促進することを示す。ＶＨＺがＧ１／Ｓ期移行においていかにしてこれらの分子と配位結合するかを説明するために提案モデルを示す。
【図５Ａ−１】数種の乳癌サンプルにおいて過剰発現したＶＨＺタンパク質は上皮腫瘍細胞の中心体または細胞質に分布することを示す。ホルマリン固定し、パラフィン包埋した乳癌サンプルのＶＨＺタンパク質発現を評価する。ＶＨＺは、同じ組織切片に対する間接的二重免疫蛍光標識により、乳癌の細胞の中心体に局在することが分かる。白い矢印で示されているように、ＶＨＺ（ａ）とｇ−チューブリン（ｂ）は中心体（ｃ）に同時局在する。画像ｃは画像ａとｂを合成したものである。バーは１００μｍ。
【図５Ａ−２】（図５Ａ−１の続き）
【図５Ａ−３】（図５Ａ−２の続き）
【図５Ｂ−１】数種の乳癌サンプルにおいて過剰発現したＶＨＺタンパク質は上皮腫瘍細胞の中心体または細胞質に分布することを示す。ホルマリン固定し、パラフィン包埋した乳癌サンプルのＶＨＺタンパク質発現を評価する。乳癌サンプルの二連続切片を、それぞれＶＨＺおよびγ−チューブリンを検出するために免疫組織化学(immunohisochemical)標識向けに処理する。陽性シグナルが、３，３’−ジアミノベンジジン色素原（褐色）を用いた染色により検出される。ＶＨＺ（ａ）およびγ−チューブリン局在（ｂ）の類似の中心体標識パターンが黒い矢印で示される。全体像（ａ’、ｂ’）は２つの隣接する切片から得られたものである。パネルａ’〜ｃ’の四角で囲まれた３つの領域（６３０倍）をさらに拡大し（５倍）、それぞれパネルａ〜ｃに示し、中心体を黒い矢印で示す。パネルｃ’とｃは、対照としてのＶＨＺ陰性サンプルを示す。元の全体像を図８Ａに示す。
【図５Ｂ−２】（図５Ｂ−１の続き）
【図５Ｂ−３】（図５Ｂ−２の続き）
【図５Ｃ−１】数種の乳癌サンプルにおいて過剰発現したＶＨＺタンパク質は上皮腫瘍細胞の中心体または細胞質に分布することを示す。ホルマリン固定し、パラフィン包埋した乳癌サンプルのＶＨＺタンパク質発現を評価する。数種の乳癌サンプルにおいて、ＶＨＺタンパク質は分散した上皮の細胞質で過剰発現される。元の全体像を図８Ｂに示す。異なる乳房サンプルから選択した切片を全体像に示す（ａ’およびｂ’）。全体像中の四角で囲まれた３つの領域（ａ’、ｂ’およびｃ’、４００倍）をさらに拡大し（５倍）、それぞれパネルａ、ｂおよびｃに示す。パネルｃ’とｃは、対照としてのＶＨＺ陰性サンプルを示す。
【図５Ｃ−２】（図５Ｃ−１の続き）
【図５Ｃ−３】（図５Ｃ−２の続き）
【図６Ａ−１】Ｅ−カドヘリン陰性細胞におけるＶＨＺ発現およびＶＨＺの過剰発現はＭＣＦ−７細胞の運動を促進することを示す。２つの隣接する、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した乳癌サンプル組織切片は、ＶＨＺ陽性細胞がＥ−カドヘリン陰性であり（ａ，４００倍）、ＶＨＺ陰性上皮がＥ−カドヘリン陽性である（ｂ，４００倍）ことを示した。
【図６Ａ−２】（図６Ａ−１の続き）
【図６Ｂ−１】Ｅ−カドヘリン陰性細胞におけるＶＨＺ発現およびＶＨＺの過剰発現はＭＣＦ−７細胞の運動を促進することを示す。ＭＣＦ−７−ＶＨＺ−ＥＧＦＰおよびＭＣＦ−７−ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ細胞の運動を評価するために、カバーガラス上のコンフルエント単層に細胞をプレーティングする。細胞をコーティングしたカバーガラスを次に、新しい培養ディッシュに細胞側を下に転倒させた。ＭＣＦ−７−ＶＨＺ−ＥＧＦＰ細胞（ａ、ａ’）およびＭＣＦ−７−ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ（ｂ、ｂ’）細胞に関して０時間と４８時間目に画像を採取する。パネルａ’は、ＭＣＦ−７−ＶＨＺ−ＥＧＦＰ細胞はかぶせたカバーガラスの下から出て行く（矢印で示す）ことを示した。免疫蛍光画像（ａ、ｂ）。位相コントラスト画像（ａ’、ｂ’  ２００倍）。
【図６Ｂ−２】（図６Ｂ−１の続き）
【図７Ａ】ＶＨＺ  ｍＲＮＡは組織および細胞で広く発現することを示す。ヒトマルチプル組織アレイ（カタログ番号７７７６−１）はBD Bioscience (San Jose, CA)から入手する。これらのアレイは６５の異なるヒト組織および８つのヒト細胞系統から誘導された７３のｍＲＮＡを含む。ドットブロットを製造業者の説明書に従い（カタログ番号１５８５５８４，Roche, Mannheim, Germany）、３２Ｐ−ｄＣＴＰで放射性標識したヒトＶＨＺｃＤＮＡでプロービングする。ＶＨＺ  ｍＲＮＡ発現パターンを示す。ＶＨＺは主として心臓（スポット：４Ａ、４Ｃ〜４Ｈ）および他の多くの組織、ならびに肺癌細胞系統−Ａ５４９（スポット−１０Ｈ）で発現する。
【図７Ｂ】ＶＨＺ  ｍＲＮＡは組織および細胞で広く発現することを示す。ヒトマルチプル組織アレイ（カタログ番号７７７６−１）はBD Bioscience (San Jose, CA)から入手する。これらのアレイは６５の異なるヒト組織および８つのヒト細胞系統から誘導された７３のｍＲＮＡを含む。ヒトマルチプル組織アレイの完全マップ
【図８】図８は免疫組織化学により、ＶＨＺタンパク質が乳癌の中心体および細胞質で過剰発現することを示す。図８Ａ：乳癌の中心体でＶＨＺタンパク質の過剰発現が明らかである。中心体は黒い矢印で示されている（４００倍）。図８Ｂ：乳癌細胞の細胞質でＶＨＺタンパク質の過剰発現が見られる（２００倍）。
【図９】図９はウサギおよびマウス抗ＶＨＺ抗体の特徴を示す。図９Ａ：ウサギおよびマウス抗ＶＨＺ抗体を用いたウエスタンブロット分析。全細胞溶解液をＡ４３１、ＨａＬａ、ＮＲＫおよびＭＣＦ−７細胞から得る。ＭＣＦ−７全細胞溶解液を２μｇ  ＶＨＺ−ＧＳＴとともにプレインキュベートする（レーン１）。ＶＨＺバンドの検出はＶＨＺ−ＧＳＴにより特異的に遮断される（矢印で示されている）。図９Ｂ：ＶＨＺ  ｍＡｂはＥＣＬ（Ａ）、ＩＦ（Ｂ）およびＩＨＣ（図５）に使用可能である。
【図１０Ａ−１】創傷治癒アッセイにより、ＶＨＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞がＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞よりも高い遊走特性を示したことを示す。本発明者らは、ＭＣＦ１０Ａ細胞（５×１０５）において、ｐＢＡＢＥｐｕｒｏベクターを用いたレトロウイルスを媒介とする形質導入によりＶＨＺおよびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現させた。ＶＨＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞は、創傷治癒アッセイにより、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現するＭＣＦ１０Ａ細胞よりも高い遊走特性を示した。開始時（０時間、上のパネル）と終了時（８時間、下のパネル）で細胞遊走に明らかな違いが見て取れる。
【図１０Ａ−２】（図１０Ａ−１の続き）
【図１０Ｂ】
【図１１】
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、ＶＨＺホスファターゼが癌に役割を果たしていることの初めての証明に基づく。
【００３８】
ＶＨＺは、最も小さい既知の活性なタンパク質チロシンホスファターゼ（わずか１６ｋＤａ）であり、ｏｆ小ワクシニアウイルスＶＨ１関連二重特異性ホスファターゼ群に属す。ＶＨＺをコードする遺伝子はヒト染色体１ｑ２３．１に位置し、ただ２つのコードエキソンからなる(Wuら, 2004, Int J Biochem Cell Biol. 36(8):1542-53)。
【００３９】
ＶＨＺは、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ならびにホスホチロシンおよびホスホトレオニン残基を含むオリゴペプチドに対して明瞭なホスファターゼ活性を示す。さらに、ＶＨＺはin vitroにおいてｐ４４ＥＲＫ１を脱リン酸化できるが、ｐ３８およびｐ５４ＳＡＰＫβは脱リン酸化できない(Alonsoら (2004). J Biol Chem. 20;279(34):35768-74)。
【００４０】
本発明者らは、ＶＨＺが主として浸潤性ヒト上皮乳癌細胞に関連していることを示す。供試したヒト乳癌サンプルの中心体（６／６５症例）または細胞質（１１／６５症例）でＶＨＺタンパク質の過剰発現が見られる。
【００４１】
よって、ＶＨＺは乳癌の検出のためのマーカーとして使用可能である。ＶＨＺ発現のレベルは癌、特に、転移性、侵襲性または浸潤性乳癌などの乳癌の指標として使用可能である。ＶＨＺ発現のレベルはこのような癌の見込みの指標としても使用可能である。よって、本発明者らは、癌、特に、乳癌を診断または検出する方法を提供する。本発明者らはさらに、このような癌の侵襲性または浸潤性または転移性状態、またはこれらの任意の組合せを診断および検出する方法を提供する。これらの方法はタンパク質レベル（例えば、免疫組織化学）またはＲＮＡレベル（例えば、in situハイブリダイゼーション）の分析を含み得る。このような診断および検出方法を以下でさらに詳細に述べる。
【００４２】
間接的免疫蛍光を用い、本発明者らは、外因性および内因性双方のＶＨＺタンパク質が、その細胞質分布に加えて中心体に局在することを示す。よって、ＶＨＺはまた、中心体構造を検出するためのマーカーとしても使用可能である。
【００４３】
本発明者らは、ＶＨＺが細胞周期の進行を調節すること、およびＧ１−Ｓ期移行を促進する能力を有することを実証する。本発明者らは、ＶＨＺの過剰発現が乳癌発生に寄与することを実証する。ＶＨＺを発現するように操作されたＢｒｄＵ標識ＭＣＦ−７細胞のＦＡＣＳ分析は、ＶＨＺがＧ１からＳ期への移行を加速化できることを示す。同じ３つの発現構築物を安定発現するＮＲＫ細胞のＦＡＣＳ分析から得られた類似の結果は、ＶＨＺが、Ｇ１集団を減少させ、Ｓ集団を増加させることによりＧ１からＳ期への移行を加速化することを示す。
【００４４】
よって、本発明者らは、癌に罹患している個体を治療または予防する方法を提供する。ＶＨＺレベルの、正常組織におけるレベルへの回復も、乳房細胞の正常な機能を回復する手段として使用可能である。よって、本発明者らは、乳癌を含む癌の治療のためのＶＨＺ核酸およびポリペプチドの使用を提供する。本発明者らの方法は、乳癌、または浸潤性乳癌などの浸潤性癌の治療または予防のために使用可能である。
【００４５】
本発明者らはさらに、癌、例えば、乳癌に対する薬剤のスクリーニングにおけるＶＨＺの使用を提供する。癌は浸潤性乳癌を含み得る。ＶＨＺを過剰発現および過少発現する細胞、ならびにこれらを含む組織、器官および生物は癌のモデルとして、または抗癌剤のスクリーニングにおいて使用可能である。
【００４６】
ＭＣＦ−７細胞におけるＶＨＺの過剰発現はｐ２１Ｃｉｐ１のダウンレギュレーションおよびＣｄｋ４のアップレギュレーションを引き起こす。その結果、ホスホ特異的抗体を用いた免疫ブロット法によって評価すると、リン酸化された（不活性化された）網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）の蓄積が見られる。触媒的に不活性なＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を発現する細胞は、上記のＶＨＺ媒介事象が損なわれ、これらの特性がホスファターゼ活性を必要とすることを示す。
【００４７】
ＶＨＺにおける触媒システイン残基（Ｃ９５Ｓ）の突然変異は、そのタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）活性を無効にする。
【００４８】
「ＶＨＺ」という用語を用いる場合、ＶＨＺタンパク質またはＶＨＺ核酸およびそのいずれかのフラグメント、変異体、ホモログ、誘導体、変異体を含め、いずれのＶＨＺ配列も指すものと考えるべきである。
【００４９】
ＶＨＺの特性および活性は本明細書、例えば、参考文献に記載されている。
【００５０】
ＶＨＺポリペプチド
本明細書に記載の方法および組成物はＶＨＺポリペプチドを用いるが、以下、これを詳細に記載する。
【００５１】
ＶＨＺはＤＵＳＰ２３、ＭＯＳＰ、ＬＤＰ−３、ＤＵＳＰ２５、ＦＬＪ２０４４２およびＲＰ１１−１９０Ａ１２．１としても知られる。
【００５２】
本明細書で用いる場合、「ＶＨＺポリペプチド」とは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６０２９３．２、ＮＰ＿０８１００１．１、ＸＰ＿３４１１５７．１、ＸＰ＿００１１７０８１９．１、ＸＰ＿００１１７０８３５．１、ＸＰ＿５４５７４７．２、ＮＰ＿００１０７６０７８．１、ＮＰ＿００１０１１３７１．１、ＮＰ＿７８３８５９．１、ＮＰ＿００１０３４７０９．１、ＸＰ＿００１４８０７３０．１、ＸＰ＿００１１１７２５３．１またはＸＰ＿００１１１７２５６．１を有する配列を指すものとする。
【００５３】
「ＶＨＺポリペプチド」とは、受託番号ＮＰ＿０６０２９３を有する配列などのヒトＶＨＺポリペプチドを含み得るか、またはそれからなり得る。
【００５４】
これらのポリペプチドのいずれか、いくつかまたは全ての、そのホモログ、変異体および誘導体も含まれる。
【００５５】
ＶＨＺポリペプチドは、その治療のための種々の手段、例えば、乳癌に罹患している、または罹患している疑いのある個体への投与のために使用可能である。それらはまた、特異的ＶＨＺ結合剤、特に、抗ＶＨＺ抗体などの抗ＶＨＺ剤の製造またはスクリーニングのためにも使用可能である。これらを以下にさらに詳細に記載する。ＶＨＺポリペプチドの発現は癌、特に、乳癌の診断または検出のために検出することができる。
【００５６】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわち、ペプチドイソスターによって互いに連結された２以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を指す。「ポリペプチド」とは、一般にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短鎖と、一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の双方を指す。ポリペプチドは遺伝子にコードされている２０のアミノ酸以外のアミノ酸も含み得る。
【００５７】
「ポリペプチド」とは、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによるか、または当技術分野で周知の化学修飾技術によって修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は基本的教本およびより詳しく単行本ならびに多くの研究文献に十分記載されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのいずれの場所で起こってもよい。同じタイプの修飾が、あるポリペプチドの数カ所に同じまたは異なる程度で存在してもよいよと考えられる。また、あるポリペプチドが多くのタイプの修飾を含んでもよい。
【００５８】
ポリペプチドはユビキチン化の結果として分枝していてもよく、分枝を伴ってまたは伴わずに環状であってもよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは翻訳後の天然プロセスから生じる場合もあるし、あるいは合成法によって作製することもできる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール(phosphotidylinositol)の共有結合、架橋(cross-inking)、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合的架橋(covalent cross-inks)の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのトランスファーＲＮＡにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸の付加、およびユビキチン化が挙げられる。例えば、Proteins - Structure and Molecular Properties, 第2版, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993およびWold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson編, Academic Press, New York, 1983の1-12頁；Seifterら, "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182:626-646およびRattanら, "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62参照。
【００５９】
「ポリペプチド」とは、レトロインバーソＤペプチドなどの当技術分野で公知の種々の合成ペプチド変異体を含む。このペプチドは抗原決定基および／またはＴ細胞エピトープであってもよい。ペプチドはin vivoにおいて免疫原性であってもよい。このペプチドはin vivoにおいて抗体の中和を誘導し得る。
【００６０】
ＶＨＺに適用される場合、得られるアミノ酸配列は、ＶＨＺポリペプチド、例えば、ヒトＶＨＺポリペプチドに共通の１以上の活性、例えば、生物活性を有し得る。例えば、ＶＨＺホモログは、正常乳房細胞に比べて乳癌細胞で高い発現レベルを有し得る。特に、「ホモログ」とは、得られるアミノ酸配列がＶＨＺ活性を有する限り、構造および／または機能に関しての同一性を包含する。配列同一性（すなわち、類似性）に関して、少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性であり得る。また、少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性であり得る。これらの用語はまた、ＶＨＺ核酸配列の対立遺伝子変異体であるアミノ酸に由来するポリペプチドを包含する。
【００６１】
ＶＨＺなどのポリペプチドの「活性」または「生物活性」という場合、これらの用語は、類似の活性または向上した活性または望ましくない副作用が軽減されたこれらの活性を含む、ＶＨＺの代謝的または生理学的機能を指すものとする。また、ＶＨＺの抗原活性または免疫活性も含まれる。このような活性の例ならびにこれらの活性をアッセイおよび定量する方法は当技術分野で公知であり、本明細書の他所に詳細に記載されている。
【００６２】
例えば、このような活性には、ヒドロラーゼ活性、タンパク質チロシンホスファターゼ活性、タンパク質チロシン／セリン／トレオニンホスファターゼ活性およびタンパク質アミノ酸脱リン酸化のいずれか１以上を含み得る。これらの活性のアッセイは当技術分野で公知であり、例えば、Wuら (2004), Int J Biochem Cell Biol. 36(8):1542-53およびAlonsoら (2004). J Biol Chem. 20; 279(34): 35768-74に記載されている。
【００６３】
他のＶＨＺポリペプチド
ＶＨＺ変異体、ホモログ、誘導体およびフラグメントも本明細書に記載の方法および組成物で用いられる。
【００６４】
ＶＨＺに関して「変異体」、「ホモログ」、「誘導体」または「フラグメント」とは、ある配列に対する１個（またはそれを超える）アミノ酸の任意の置換、変更、修飾、置き換え、欠失または付加を含む。文脈がそれ以外のものを許容しない限り、「ＶＨＺ」という場合には、ＶＨＺのこのような変異体、ホモログ、誘導体およびフラグメントを含む。
【００６５】
本明細書において「欠失」とは、それぞれ１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在しない、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のいずれかにおける変化として定義される。本明細書において「挿入」または「付加」は、天然物と比べた際に、それぞれ１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加が起こっているヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化である。本明細書において「置換」は、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の、それぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による置き換えから起こる。
【００６６】
本明細書に記載のＶＨＺポリペプチドはまた、サイレント変異をもたらし、機能的に等価なアミノ酸配列を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有してもよい。計画的アミノ酸置換は、残基の極性、荷電、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負電荷を有するアミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正電荷を有するアミノ酸としてはリシンおよびアルギニンが挙げられ；類似の親水価を有する非荷電極性頭基を有するアミノ酸としてはロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。
【００６７】
保存的置換は、例えば下表に従って行うことができる。２番目の欄の同じブロックおよぶ３番目の欄の同じ列のアミノ酸は互いに置換可能である。
【表１】
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【００６８】
ＶＨＺポリペプチドはさらに、一般にＮ末端またはＣ末端、例えばＮ末端に異種アミノ酸配列を含んでもよい。異種配列は細胞内または細胞外タンパク質の標的化に影響を及ぼす配列（リーダー配列など）を含んでもよい。異種配列はまた、ＶＨＺポリペプチドの免疫原性を増強する、かつ／またはそれらのポリペプチドの同定、抽出および／または精製を助ける配列を含んでもよい。使用可能な別の異種配列としては、ポリヒスチジン（Ｎ末端であり得る）などのポリアミノ酸配列がある。少なくとも１０アミノ酸、例えば少なくとも１７アミノ酸、ただし５０アミノ酸未満のポリヒスチジン配列が使用可能である。
【００６９】
ＶＨＺポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形態であっても、あるいは融合タンパク質などのより大きなタンパク質の一部であってもよい。分泌またはリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基などの精製を助ける配列、または組換え生産中の安定性のための付加的配列を含む付加的アミノ酸配列を含むことが有利である場合が多い。
【００７０】
本明細書に記載のＶＨＺポリペプチドは、既知の技術を用い、組換え的手段によって有利に製造される。しかしながら、それはまた、固相合成などの当業者によく知られている技術を用い、合成的手段によって製造することもできる。このようなポリペプチドはまた、例えば抽出および精製を助けるために、融合タンパク質として生産することもできる。融合タンパク質相手の例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。また、融合タンパク質配列の除去が可能なように、融合タンパク質相手と目的のタンパク質配列の間に、トロンビン切断部位などのタンパク質分解切断部位を含めることが便宜であり得る。融合タンパク質は、目的配列のタンパク質の機能を隠さないものであればよい。
【００７１】
ＶＨＺポリペプチドは実質的に単離された形態であってよい。この用語は、ヒトの手による自然状態からの変更を指すものとする。「単離された」組成物または物質が自然界に存在する場合には、それはその元の環境から変化を受けているか、または環境から取り出されているか、またはその双方である。この用語を本明細書で用いる場合、例えば、生きている動物に自然に存在するポリヌクレオチド、核酸またはポリペプチドは「単離され」ていないが、その自然状態の共存材料から分離された同じポリヌクレオチド、核酸またはポリペプチドは「単離され」ている。
【００７２】
しかしながら、ＶＨＺタンパク質はそのタンパク質の意図される目的を妨げない担体または希釈剤と混合してもよく、なお実質的に単離されているとみなされると理解される。ＶＨＺポリペプチドはまた、その調製物中の９０％を超える、例えば、９５％、９８％または９９％のタンパク質がＶＨＺポリペプチドであるような調製物中のタンパク質を一般に含む場合に、実質的に精製された形態であると言える。
【００７３】
異なる種からのＶＨＺ配列をアラインすることにより、そのアミノ酸配列のどの領域が異なる種間で保存されているか（相同領域）、およびどの領域が異なる種間で違っているか（「異種領域」）を決定することができる。
【００７４】
よって、ＶＨＺポリペプチドは、相同領域の少なくとも一部に相当する配列を含み得る。相同領域は、少なくとも２つの種の間で高い程度の相同性を示す。例えば、相同領域は、上記の試験を用いてアミノ酸レベルで少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を示し得る。相同領域に相当する配列を含むペプチドは以下にさらに詳細に説明されるような治療戦略で使用可能である。あるいは、ＶＨＺペプチドは、異種領域の少なくとも一部に相当する配列を含み得る。異種領域は少なくとも２つの種の間で低い程度の相同性を示す。
【００７５】
ＶＨＺホモログ
使用のために開示されるＶＨＺポリペプチドとしては、任意の供給源から得られた相同配列、例えば、関連のウイルス／細菌タンパク質、細胞ホモログおよび合成ペプチド、ならびにそれらの変異体または誘導体が含まれる。よって、ポリペプチドはまた、哺乳類（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）、特に霊長類、より特にはヒトなどの動物を含む他種由来のＶＨＺのホモログをコードするものも含む。より具体的には、ホモログはヒトホモログを含む。
【００７６】
本明細書に関して、相同配列は、関連のＶＨＺ配列の配列とアミノ酸レベルで、例えば、少なくとも５０または１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８または１４９のアミノ酸にわたって、少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％同一、例えば、少なくとも９５または９８％同一であるアミノ酸配列を含むものとする。
【００７７】
特に、相同性は一般に、非必須隣接配列ではなく、タンパク質機能に必須であることが知られている配列の領域に関して考慮すべきである。このことは遠縁生物の相同配列を考える場合に特に重要である。一例として、ホスファターゼ機能に必須であることが示されているヒトＶＨＺタンパク質の９５番の残基における、またはそれに相当するシステイン残基、および前後の残基がある。
【００７８】
相同性は類似性（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）に関して考えることもできるが、本明細書では、配列同一性という点で相同性を表し得る。
【００７９】
相同性比較は目により、またはより通常には、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けで行うことができる。これらの公的および商業的に入手可能なコンピュータープログラムは、２以上の配列間の同一性％を算出することができる。
【００８０】
同一性％は連続する配列にわたって算出することができ、すなわち、一方の配列を他方の配列とともにアラインし、一方の配列の各アミノ酸を他方の配列の対応するアミノ酸と一残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップ無し（ungapped）」アライメントと呼ばれる。典型的には、このようなギャップ無しアライメントは、比較的短い個数の残基（例えば、５０個未満の連続アミノ酸）にわたって行われるにすぎない。
【００８１】
これは極めて単純かつ一貫性のある方法であるが、例えば、1つの挿入または欠失があると、それ以外は同一である配列対であっても、それ以降のアミノ酸残基がアライメントできなくなるという点が考慮されていないので、グローバルアライメントを行った場合、相同性％が大幅に減少する可能性がある。従って、ほとんどの配列比較法は、全相同性スコアに過度のペナルティーを課すことなく可能性のある挿入および欠失を考慮した最適アライメントを作製するようにデザインされる。これは、ローカルな相同性または類似性を最大化する試みのために配列アライメント中に「ギャップ」を挿入することにより達成される。
【００８２】
しかしながら、これらのより複雑な方法では、同一アミノ酸の数が同じ場合に、できるかぎり少ないギャップを有する配列アライメントが、２つの比較配列間のより高い関連性を反映して、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成するように、アライメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」が割り当てられる。一般には、ギャップの存在に比較的高いコストを課し、かつギャップ中の各後続残基により小さいペナルティーを課す「アフィンギャップコスト（Affine gap cost）」が使用される。これは、最もよく使用されるギャップスコアリングシステムである。当然ながら、ギャップペナルティーが高ければ、ギャップがより少ない最適化アライメントが作製される。ほとんどのアライメントプログラムでは、ギャップペナルティーを変更できるようになっている。しかしながら、配列比較用のこのようなソフトウエアを使用する場合には、デフォルト値を用いればよい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（下記参照）を使用する場合、アミノ酸配列に対するデフォルトギャップペナルティーは、ギャップ１つにつき−１２、各伸長につき−４である。
【００８３】
従って、最大相同性％の計算では、まず、ギャップペナルティーを考慮して最適アライメントを作製することが必要である。このようなアライメントを行うのに好適なコンピュータープログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（University of Wisconsin, U.S.A.; Devereuxら, 1984, Nucleic Acids Research 12:387）である。配列比較を行いうる他のソフトウエアの例としては、BLASTパッケージ（Ausubelら, 1999 同書 - Chapter 18）、FASTA（Atschulら, 1990, J. Mol. Biol., 403-410を参照されたい）、および一連のGENEWORKS比較ツールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。BLASTおよびFASTAはいずれも、オフライン検索およびオンライン検索で利用可能である(University of Wisconsin, U.S.A; Devereuxら, 1984, Nucleic Acids Research 12:387)。配列比較を実行できる他のソフトウエアの例としては、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubelら, 1999 同書-Chapter 18参照）、ＦＡＳＴＡ(Altschulら, 1990, J. Mol. Biol., 403-410)および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスーツが挙げられる。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは双方ともオフラインおよびオンライン検索で入手可能である（Ausubelら, 1999 同書, 7-58〜7-60頁参照）。ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用すればよい。
【００８４】
同一性に基づいて最終相同性％を求めることができるが、アライメント法自体は、一般に、オールオアナッシング対比較に基づくものではない。その代わりに、化学的類似性または進化距離に基づいて各ペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケール化類似性スコアマトリックスが広く使用される。汎用されているこのようなマトリックスの一例として、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（ＢＬＡＳＴプログラムスーツ用のデフォルトマトリックス）がある。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムでは一般に、パブリックデフォルト値または提供されている場合にはカスタムシンボル比較表のいずれかを用いる（さらに詳しくはユーザーマニュアルを参照）。ＧＣＧパッケージ用のパブリックデフォルト値、またはＢＬＯＳＵＭ６２などの他のソフトウエアの場合にはデフォルトマトリックスを使用すればよい。
【００８５】
ソフトウエアが最適アライメントを作製すれば、相同性％、例えば、配列同一性％を計算することができる。一般には、ソフトウエアは配列比較の一部としてこれを行い、数値結果を作製する。
【００８６】
アミノ酸配列に関して「変異体」または「誘導体」とは、得られるアミノ酸配列が、少なくともＶＨＺポリペプチドと同じ活性を有するなど、非改変配列と実質的に同じ活性を保持する限り、その配列に対する１個（またはそれを超える）アミノ酸の任意の置換、変更、修飾、置き換え、欠失または付加を含む。
【００８７】
本明細書に開示されているＶＨＺアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそのフラグメントもしくはホモログは、本明細書に記載の方法および組成物で用いるために修飾可能である。一般に、その配列の生物活性を維持する改変が行われる。アミノ酸置換は、改変配列が非改変配列の生物活性を保持する限り、例えば、１、２または３から１０、２０または３０までの置換を行ってもよい。あるいは、修飾は本明細書に記載のポリペプチドの１以上の機能的ドメインを計画的に不活性化するよう改変を行うことができる。アミノ酸置換は、例えば治療的に投与されるポリペプチドの血漿半減期を高めるために非天然類似体の使用を含み得る。
【００８８】
ＶＨＺフラグメント
本明細書に記載の方法および組成物に用いるためのポリペプチドはまた、上記で定義されたＶＨＺポリペプチドのいずれかの全長配列のフラグメントも含む。フラグメントは少なくとも１つのエピトープを含み得る。エピトープを同定する方法は当業者によく知られている。フラグメントは一般に少なくとも６個のアミノ酸、例えば、少なくとも１０、２０、３０、５０または１００個のアミノ酸を含む。
【００８９】
関連のＶＨＺアミノ酸配列の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５またはそれを超える残基を含む、またはそれからなるフラグメントが含まれる。
【００９０】
本発明者らはさらに、本明細書に記載のＶＨＺポリペプチドの一部を含むペプチドを記載する。このように、ＶＨＺのフラグメントおよびそのホモログ、変異体または誘導体が含まれる。これらのペプチドは２〜２００アミノ酸長の間、例えば、４〜４０アミノ酸長の間であり得る。ペプチドは本明細書に開示されるＶＨＺポリペプチドから、例えば、トリプシンなどの好適な酵素を用いた消化により誘導することができる。あるいは、このペプチド、フラグメントなどは、組換え手段または合成により作製することもできる。
【００９１】
このようなＶＨＺフラグメントは、例えば、このようなフラグメントに対して作製された抗体によるなど、ＶＨＺ発現を優先的に検出するためのプローブの作製に使用することができる。これらの抗体はＶＨＺと特異的に結合すると予想され、本明細書に開示される診断および治療方法に有用である。
【００９２】
ＶＨＺおよびそのフラグメント、ホモログ、変異体および誘導体は組換え手段によって作製することができる。しかしながら、それらはまた、固相合成などの当業者によく知られている技術を用いた合成手段によっても作製することができる。これらのタンパク質はまた、例えば、抽出および精製を助けるために融合タンパク質として生産してもよい。融合タンパク質相手の例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。それはまた、融合タンパク質配列の除去が可能なように、融合タンパク質相手と目的のタンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位を含むのが便宜であり得る。
【００９３】
本明細書に開示されるＶＨＺポリペプチド、変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体は実質的に単離された形態であり得る。このようなリペプチドはそのタンパク質の意図される目的を妨げない担体または希釈剤と混合してもよく、なお実質的に単離されているとみなされると理解される。ＶＨＺ変異体、ホモログ、フラグメントまたは誘導体はまた、その調製物中の９０％を超える、例えば、９５％、９８％または９９％のタンパク質があるタンパク質であるような調製物中のタンパク質を一般に含む場合に、実質的に精製された形態であると言える。
【００９４】
本明細書に開示されるＶＨＺポリペプチド、変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体は指示標識で標識してもよい。指示標識は、ポリペプチドの検出を可能とするいずれの好適な標識であってもよい。好適な標識としては、放射性同位元素（例えば、１２５Ｉ）、酵素、抗体、ポリヌクレオチドおよびリンカー（ビオチンなど）が挙げられる。標識されたポリペプチドは、サンプル中のポリペプチドの量を決定するためにイムノアッセイなどの診断手順において使用可能である。ポリペプチドまたは標識ポリペプチドはまた、標準的プロトコールを用い、動物およびヒトでの該ポリペプチドの免疫反応性を検出するための血清学的または細胞媒介性イムノアッセイで使用可能である。
【００９５】
本明細書に開示されるＶＨＺポリペプチド、変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体は、所望により標識してもよく、また、固相、例えば、イムノアッセイウェルまたはディップスティックの表面に固定してもよい。このような標識され、かつ／または固定されたポリペプチドは好適な試薬、対照および説明書などともに好適な容器でキットにパッケージングすることができる。このようなポリペプチドおよびキットは、イムノアッセイによる、ポリペプチドまたはそれらの対立遺伝子変異体または種変異体に対する抗体の検出方法で使用することができる。
【００９６】
イムノアッセイ法は当技術分野で周知であり、一般に、（ａ）該タンパク質に対する抗体により得ることができるエピトープを含むポリペプチドを準備すること；（ｂ）生体サンプルを該ポリペプチドとともに、抗体−抗原複合体の形成を可能とする条件下でインキュベートすること；および（ｃ）該ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体が形成されるかどうかを決定することを含む。
【００９７】
本明細書に開示されるＶＨＺポリペプチド、変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体は、疾病におけるそれらの機能を含む細胞機能における、それらの対応する遺伝子およびそのホモログの役割を検討するためにin vitroまたはin vivo細胞培養系で使用可能である。例えば、細胞において生じる正常な機能を破壊するために細胞に末端切断型または改変ポリペプチドを導入することができる。ポリペプチドは組換え発現ベクターからのポリペプチドのin situ発現により細胞に導入することができる（以下参照）。発現ベクターは所望により、ポリペプチドの発現を制御する誘導プロモーターを運ぶ。
【００９８】
組換え発現産物に対して最適な生物活性を付与することが必要とされ得る場合には、昆虫細胞または哺乳類細胞などの適当な宿主細胞の使用がこのような翻訳後修飾（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、末端切断、ラピデーション(lapidation)およびチロシン、セリンまたはトレオニンリン酸化）を提供すると思われる。本明細書に開示されるＶＨＺポリペプチド、変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体が発現されるこのような細胞培養系は、細胞における該ポリペプチドの機能を妨害または促進する候補物質を同定するためのアッセイ系で使用可能である。
【００９９】
ＶＨＺ核酸
本明細書に記載の方法および組成物はＶＨＺ、ＶＨＺポリヌクレオチド、ＶＨＺヌクレオチドおよびＶＨＺ核酸、ならびにこれらのいずれかの変異体、ホモログ、誘導体およびフラグメントの発現レベルを検出するための手段として使用可能である。さらに、本発明者らは本明細書に記載の診断方法に有用な特定のＶＨＺフラグメントを開示する。ＶＨＺ核酸はまた、記載の治療または予防方法に使用することも可能である。
【０１００】
「ＶＨＺポリヌクレオチド」、「ＶＨＺヌクレオチド」および「ＶＨＺ核酸」は互換的に使用可能であり、具体的にはｃＤＮＡとゲノムＶＨＺ配列の双方を含むと理解すべきである。これらの用語はまた、ＶＨＺポリペプチドおよび／またはこのフラグメント、誘導体、ホモログまたは変異体をコードし得る核酸配列を含むものとする。
【０１０１】
ＶＨＺ核酸という場合には、これは核酸のＶＨＺファミリーの任意のメンバーを指すものと考えるべきである。特に注目されるものとしては、ＮＭ＿０１７８２３．３、ＮＭ＿０２６７２５．２、ＸＭ＿３４１１５６．３、ＸＭ＿００１１７０８１９．１、ＸＭ＿００１１７０８３５．１、ＸＭ＿５４５７４７．２、ＮＭ＿００１０８２６０９．１、ＮＭ＿００１０１１３７１．１、ＮＭ＿１７５７３２．１、ＮＭ＿００１０３９６２０．１、ＸＭ＿００１４８０６８０．１、ＸＭ＿００１１１７２５３．１またはＸＭ＿００１１１７２５６．１からなる群から選択されるＶＨＺ核酸がある。
【０１０２】
また、以下の「他のＶＨＺ核酸配列」として示される１以上の核酸配列のいずれもが含まれる。
【０１０３】
例えば、ＶＨＺ核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３．３を有するヒトＶＨＺ配列を含み得る。
【０１０４】
ＶＨＺ核酸は、例えば、乳癌に罹患している個体、または乳癌に罹患している疑いのある個体への、その治療のための投与などの種々の手段に使用可能である。ＶＨＺ核酸の発現は癌、特に乳癌の診断または検出のために検出が可能である。ＶＨＺ核酸はまた、ＶＨＺポリペプチドの発現または製造のためにも使用可能である。
【０１０５】
「ポリヌクレオチド」とは一般に、非改変ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、限定されるものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖または、より一般には、二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。加えて、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの双方を含む三本鎖領域も指す。ポリヌクレオチドにはまた、１以上の改変塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由で改変された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。「改変」塩基としては、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの非通常塩基が挙げられる。種々の改変がＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われている。従って、「ポリヌクレオチド」は、一般には自然に見られるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に改変された形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【０１０６】
当業者には、遺伝コードの縮重の結果として多くのヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードし得ることが理解されるであろう。
【０１０７】
本明細書において「ヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列、ならびにその変異体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体（その一部など）を指す。ヌクレオチド配列は、センス鎖に相当するものであれ、アンチセンス鎖に相当するものであれ、その組合せであれ、二本鎖または一本鎖であり得るゲノムまたは合成または組換え起源のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ヌクレオチド配列は組換えＤＮＡ技術の使用により製造され得る（例えば、組換えＤＮＡ）。
【０１０８】
「ヌクレオチド配列」とはＤＮＡを意味し得る。
【０１０９】
他の核酸
本発明者らはまた、ＶＨＺ核酸のフラグメント、ホモログ、変異体または誘導体である核酸も提供する。ＶＨＺ核酸に関して「変異体」、「ホモログ」、「誘導体」または「フラグメント」は、ＶＨＺヌクレオチド配列の配列に対する１個（またはそれを超える）アミノ酸の任意の置換、変更、修飾、置き換え、欠失または付加を含む。文脈がそれ以外のものを許容しない限り、「ＶＨＺ」および「ＶＨＺ」という場合には、ＶＨＺのこのような変異体、ホモログ、誘導体およびフラグメントを含む。
【０１１０】
得られたヌクレオチド配列は、任意の１以上のＶＨＺ活性を有するポリペプチドをコードし得る。「ホモログ」とは、構造および／または機能に関する同一性を包含するものとし、従って、得られるヌクレオチド配列はＶＨＺ活性を有するポリペプチドをコードする。例えば、ＶＨＺのホモログなどは、正常乳房細胞に比べて乳癌細胞で高い発現レベルを有し得る。配列同一性（すなわち、類似性）に関しては、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％または少なくとも９０％の配列同一性であり得る。関連の配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３．３を有するＶＨＺ配列）に対しては少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％の配列同一性であり得る。これらの用語はまた配列の対立遺伝子変異体を包含する。
【０１１１】
変異体、誘導体およびホモログ
ＶＨＺ核酸変異体、フラグメント、誘導体およびホモログはＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは一本鎖または二本鎖であり得る。それらはまた、その中に合成または改変ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対する種々のタイプの改変の多くは当技術分野で公知である。これらには、メチルホスフェートおよびホスホロチオエート主鎖、分子の３’末端および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書の目的では、これらのポリヌクレオチドは当技術分野で利用可能ないずれの方法によって改変してもよいと理解される。このような改変は目的ポリヌクレオチドのin vivo活性または寿命を増強するために行うことができる。
【０１１２】
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、その二重らせんの両鎖、いずれか一方、または組合せが本明細書に記載の方法および組成物に包含される。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、そのポリヌクレオチドの相補的配列も含まれると理解される。
【０１１３】
ヌクレオチド配列に関して「変異体」、「ホモログ」または「誘導体」とは、配列に対する１個（またはそれを超える）核酸の任意の置換、変更、修飾、置き換え、欠失または付加を含む。該変異体、ホモログまたは誘導体は生物活性を有するポリペプチドをコードすることができる。このようなＶＨＺのフラグメント、ホモログ、変異体および誘導体は、上記で示されるような変調された活性を含み得る。
【０１１４】
上記で示したように、配列同一性に関して「ホモログ」とは、関連の配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３．３を有するＶＨＺ配列）と少なくとも５％の同一性、少なくとも１０％の同一性、少なくとも１５％の同一性、少なくとも２０％の同一性、少なくとも２５％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも３５％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも４５％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。
【０１１５】
少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性であり得る。ヌクレオチド同一性比較は上記のように行うことができる。使用可能な配列比較プログラムは、上記のＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。デフォルトスコアリングマトリックスは同一のヌクレオチドにつきマッチ値１０およびミスマッチには−９を有する。ヌクレオチドごとに、デフォルトギャップクリエーションペナルティーは−５０であり、デフォルトギャップエクステンションペナルティーは−３である。
【０１１６】
ハイブリダイゼーション
本発明者らはさらに、本明細書に示されるいずれかの配列、またはそのいずれかの変異体、フラグメントもしくは誘導体、または上記のいずれかの相補物と選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を記載する。ヌクレオチド配列は少なくとも１５ヌクレオチド長、例えば、少なくとも２０、３０、４０または５０ヌクレオチド長であり得る。
【０１１７】
本明細書において「ハイブリダイゼーション」とは、「核酸鎖が相補鎖と塩基対合によって結びつくプロセス」ならびにポリメラーゼ連鎖反応技術において行われるような増幅のプロセスを含む。
【０１１８】
本明細書に示されるヌクレオチド配列と、またはそれらの相補物と選択的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、本明細書に示される対応するヌクレオチド配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３．３を有するＶＨＺ配列）と少なくとも４０％相同、少なくとも４５％相同、少なくとも５０％相同、少なくとも５５％相同、少なくとも６０％相同、少なくとも６５％相同、少なくとも７０％相同、少なくとも７５％相同、少なくとも８０％相同、少なくとも８５％相同、少なくとも９０％相同または少なくとも９５％相同であり得る。このようなポリヌクレオチドは一般に、対応するヌクレオチド配列と、少なくとも２０、例えば、少なくとも２５または３０、例えば、少なくとも４０、６０または１００またはそれを超える連続するヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも７０％、少なくとも８０または９０％または少なくとも９５％または９８％相同であり得る。
【０１１９】
「選択的にハイブリダイズすることができる」とは、プローブとして用いられるポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドがバックグラウンドを有意に超えるレベルでプローブとハイブリダイズすることが分かっている条件下で用いられることを意味する。このバックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、スクリーニングされるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーに存在する他のポリヌクレオチドによって生じ得る。この場合、バックグラウンドは、プローブとライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバーの間の相互作用により生じるシグナルのレベルを意味し、それは標的ＤＮＡで見られる特異的相互作用の１０分の１、例えば１００分の１の強度である。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば３２Ｐもしくは３３Ｐで放射性標識するか、または非放射性プローブ（例えば、蛍光色素、ビオチンまたはジゴキシゲニン）を用いて測定することができる。
【０１２０】
ハイブリダイゼーション条件は、BergerおよびKimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)に教示されているように、核酸結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づき、以下に説明するように所定の「ストリンジェンシー」を付与する。
【０１２１】
最大ストリンジェンシーは一般に約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い温度）；高ストリンジェンシーはＴｍより約５℃〜１０℃低い温度；中ストリンジェンシーはＴｍより約１０℃〜２０℃低い温度；および低ストリンジェンシーはＴｍより約２０℃〜２５℃低い温度で生じる。当業者に理解されるように、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用可能であり、中（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは類似または関連のポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用可能である。
【０１２２】
本発明者らは、ストリンジェント条件下（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａ３  ｐＨ７．０））でＶＨＺ核酸、フラグメント、変異体、ホモログまたは誘導体とハイブリダイズすることができる可能性があるヌクレオチド配列を提供する。
【０１２３】
ホモログ、変異体および誘導体の作製
関連の配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７８２３．３を有するヒトＶＨＺ配列）と１００％同一ではないが、それもまた含まれるポリヌクレオチド、ならびにＶＨＺのホモログ、変異体および誘導体はいくつかの方法で得ることができる。これらの配列の他の変異体は、例えば、一定範囲の個体、例えば、異なる集団からの個体から作製されたＤＮＡライブラリーをプロービングすることにより得ることができる。例えば、ＶＨＺホモログは、他の個体または他の種から同定することができる。さらなる組換えＶＨＺ核酸およびポリペプチドは、そのホモログにおいて対応する位置を確認すること、および本明細書の他所に記載されているようにその分子を合成または生産することにより作出することができる。
【０１２４】
加えて、ＶＨＺの他のウイルス／細菌、または細胞ホモログ、特に、哺乳類細胞（例えば、ラット、マウス、ウシおよび霊長類細胞）に見られる細胞ホモログを得ることができ、このようなホモログおよびそのフラグメントは一般にヒトＶＨＺと選択的にハイブリダイズすることができる。このようなホモログは、非ヒトＶＨＺ核酸、フラグメント、変異体およびホモログを設計するために使用可能である。さらなる変種を作り出すために、当技術分野で公知の手段により突然変異誘発を行うことができる。
【０１２５】
ＶＨＺホモログの配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリーまたは他の動物種に由来するゲノムＤＮＡライブラリーをプロービングすること、およびこのようなライブラリーをＶＨＺ核酸、フラグメント、変異体およびホモログ、またはＶＨＺの他のフラグメントのいずれかの全部または一部を含むプローブで、中〜高ストリンジェンシーの条件下でプロービングすることにより得ることができる。
【０１２６】
同様の考慮が、本明細書に開示されるポリペプチドまたはヌクレオチド配列の種ホモログおよび対立遺伝子変異体を得るために当てはまる。
【０１２７】
変異体および株／種ホモログはまた、ＶＨＺ核酸の配列内に保存されているアミノ酸配列をコードする、変異体およびホモログ内の配列を標的とするように設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲを用いて得ることもできる。保存されている配列は、例えば、いくつかの変異体／ホモログからのアミノ酸配列をアラインすることにより推定することができる。配列アラインメントは当技術分野で公知のコンピューターソフトウエアを用いて行うことができる。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く用いられている。
【０１２８】
縮重ＰＣＲに用いるプライマーは１以上の縮重場所を含み、既知の配列に対して単一の配列プライマーを用いて配列をクローニングするのに用いるものよりも低いストリンジェンシー条件で用いられる。当業者ならば、遠縁生物の配列間の全体的ヌクレオチド相同性は極めて低い可能性があることが分かるであろうが、これらの状況で、縮重ＰＣＲは、標識されたフラグメントを有するライブラリーをスクリーニングするというよりむしろＶＨＺ配列を選択する方法と言える。
【０１２９】
加えて、相同配列は、プログラムのＢＬＡＳＴスーツなどの検索アルゴリズムを用いてヌクレオチドおよび／またはタンパク質データベースを検索することにより同定することもできる。
【０１３０】
あるいは、このようなポリヌクレオチドは、特徴付けられた配列、例えば、ＶＨＺ核酸，またはその変異体、ホモログ、誘導体またはフラグメントの部位特異的突然変異誘発によっても得られる。これは、例えば、それらのポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞に関してコドン優先を至適化するためにサイレントコドン変化が必要な場合に有用であり得る。制限酵素認識部位を導入するため、またはそれらのポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドの特性または機能を変更するために他の配列変化が望ましい場合もある。
【０１３１】
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、選択的増幅反応用のプライマーなどのプライマー、例えば、放射性または非放射性標識を用いた慣例の手段により指示標識で標識されたものなどのプローブを作製するために使用することもできるし、あるいはこれらのポリヌクレオチドはベクターにクローニングすることもできる。このようなプライマー、プローブおよびその他のフラグメントは少なくとも８、９、１０または１５、例えば少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０または４０ヌクレオチド長であり、本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」という用語に包含される。
【０１３２】
ＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブなどのポリヌクレオチドは、組換え的に、合成的に、または当業者に利用可能ないずれかの手段により作製することができる。それらはまた標準的技術によりクローニングすることもできる。
【０１３３】
一般に、プライマーは、所望の核酸配列を１ヌクレオチドずつ段階的に製造することを含む合成手段によって作製される。自動技術を用いてこれを達成するための技術は当技術分野で容易に利用可能である。
【０１３４】
ＶＨＺのフラグメントを含むプライマーは、例えば乳癌に関連するようなＶＨＺ発現のアップレギュレーションなど、ＶＨＺ発現の検出方法において特に有用である。ＶＨＺの増幅に好適なプライマーはＶＨＺの好適なストレッチのいずれから作製してもよい。使用可能なプライマーとしては、特異的なＶＨＺの配列を増幅することができるものが挙げられる。
【０１３５】
ＶＨＺプライマーはそれ自体で提供可能であるが、最も有用には、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマー対として提供される。
【０１３６】
さらに長いポリヌクレオチドは一般に、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いるなど、組換え手段を用いて作製される。これには、プライマー（例えば、約１５〜３０ヌクレオチドのもの）を作製すること、これらのプライマーを動物またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させること、所望の領域の増幅を行う条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行うこと、増幅されたフラグメントを単離すること（例えば、アガロースゲル上で反応混合物を精製することによる）、および増幅されたＤＮＡを回収することを含む。これらのプライマーは、増幅されたＤＮＡが好適なクローニングベクターにクローニングできるよう好適な制限酵素認識部位を含むように設計することができる。
【０１３７】
ポリヌクレオチドまたはプライマーは、指示標識を運び得る。好適な標識としては、３２Ｐまたは３５Ｓなどの放射性同位元素、ジゴキシゲニン、蛍光色素、酵素標識、またはビオチンなどのその他のタンパク質標識が挙げられる。このような標識はポリヌクレオチドまたはプライマーに付加することができ、それ自体公知の技術を用いて検出することができる。標識されたまたは標識されていないポリヌクレオチドまたはプライマーまたはそのフラグメントは、当業者ならば、ヒトまたは動物身体のポリヌクレオチドを検出または配列決定するための核酸に基づく試験で使用することができる。
【０１３８】
検出のためのこのような試験は一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生体サンプルを、ポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブと、ハイブリダイズ条件下で接触させること、およびそのサンプルにおいてプローブと核酸の間で形成された二重らせんを検出することを含む。このような検出は、ＰＣＲなどの技術を用いて、またはプローブを固相支持体に固定し、そのプローブとハイブリダイズしないサンプル中の核酸を除去し、その後、そのプローブとハイブリダイズした核酸を検出することによって行うことができる。あるいは、このサンプル核酸を固相支持体に固定してもよく、このような支持体に結合したプローブの量を検出することができる。この形式、また他の形式の好適なアッセイ方法は例えば、ＷＯ８９／０３８９１およびＷＯ９０／１３６６７に見出せる。
【０１３９】
例えばＶＨＺ核酸などのヌクレオチドを配列決定するための試験は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生体サンプルを、ポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブと、ハイブリダイズ条件下で接触させること、および例えば、サンガーのジデオキシ鎖ターミネーション法(Sanger dideoxy chain termination method)（Sambrookら参照）により配列を決定することを含む。
【０１４０】
このような方法は一般に、好適な試薬の存在下、標的ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的な鎖の合成によりプライマーを伸張させ、１以上のＡ、Ｃ、ＧまたはＴ／Ｕ残基においてその伸張反応を選択的に終結させること；鎖の延長および終結反応を行わせること；延長産物を大きさに従って分離し、選択的終結が生じていたヌクレオチドの配列を決定することを含む。好適な試薬としては、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、バッファーおよびＡＴＰが含まれる。ジデオキシヌクレオチドが選択的終結に用いられる。
【０１４１】
ＶＨＺ制御領域
いくつかの目的では、ＶＨＺの制御領域を利用または検討する必要がある場合がある。このような制御領域としては、プロモーター、エンハンサーおよび遺伝子座制御領域が挙げられる。制御領域により、本発明者らは、それに作動可能なように連結されたコード配列の発現を調節することができる核酸配列または構造を意味する。
【０１４２】
例えば、制御領域は、ＶＨＺを発現するトランスジェニック動物を作出する際に有用である。さらに、制御領域は、ＶＨＺの発現構築物の作製に使用することもできる。これは以下にさらに詳細に記載する。
【０１４３】
ＶＨＺの制御領域の同定は簡単であり、いくつかの方法で行うことができる。例えば、ＶＨＺのコード配列は、ヒトまたはマウスＶＨＺ  ｃＤＮＡ配列をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより生物から得ることができる。５’配列は、適当なゲノムライブラリーのスクリーニング、または当技術分野で公知のプライマー伸張により得ることができる。ゲノムデータベースのデータベース検索も使用可能である。特に着目されるこのような５’配列は非コード領域を含む。５’領域は、プロモーター領域および／またはエンハンサー領域の存在を示す配列モチーフを確認するために目で、またはコンピュータープログラムの助けで調べることができる。
【０１４４】
さらに、２以上の生物からのＶＨＺ核酸配列の配列アラインメントを行うことができる。異なる種からのＶＨＺ配列をアラインすることにより、異なる種間でアミノ酸配列のどの領域が保存されているかを調べることができる。このような保存領域は対象とする遺伝子（すなわちＶＨＺ）の制御領域を含んでいる可能性がある。本明細書に開示されるマウスおよびヒトゲノム配列、例えば、マウスＶＨＺゲノム配列はこの目的で使用可能である。さらに、他の生物からのＶＨＺホモログも、マウスおよびヒトＶＨＺ配列から作製された適当なプローブを用いる標準的なスクリーニング方法を用いて得ることができる。フグ(Takifugu rubripes)またはゼブラフィッシュのゲノムもＶＨＺホモログを同定するためにスクリーニングすることができ、ＶＨＺのいくつかのゼブラフィッシュ配列が同定されている（上述）。フグまたはゼブラフィッシュＶＨＺ遺伝子の５’非コード領域とマウスまたはヒトゲノムＶＨＺ配列の比較を用い、制御領域を含有する保存領域を同定することができる。
【０１４５】
ＶＨＺのプロモーター領域および／またはエンハンサー領域を同定するために欠失研究を行ってもよい。
【０１４６】
中枢的制御領域の同定は、候補配列をリポーター遺伝子に連結し、リポーターの発現を検出する分子生物学実験により行うことができる。
【０１４７】
検出および診断方法
ＶＨＺ発現の検出
本発明者らは、実施例において、乳癌組織におけるＶＨＺの発現が正常乳房組織と比較した場合にアップレギュレーションされていることを示す。よって、本発明者らは、転移性、侵襲性または浸潤性乳癌などの乳癌を含む癌の診断方法を提供し、その方法は、個体の細胞または組織におけるＶＨＺの発現の変調、例えば、ＶＨＺ発現のアップレギュレーションを検出することを含む。
【０１４８】
ＶＨＺの発現、活性または量の検出は、細胞の増殖状態を決定する方法を提供するために使用可能である。よって、増殖細胞は、正常細胞に比べて高レベルのＶＨＺ発現、活性または量を有するものである。同様に、非増殖細胞は、正常細胞に比べて低レベルのＶＨＺ発現、活性または量を有するものであり得る。
【０１４９】
このような検出はまた、細胞が浸潤性または侵襲性となるかどうかを決定するためにも使用可能である。よって、細胞において高レベルのＶＨＺ発現、ＶＨＺの量または活性が検出されれば、その細胞が侵襲性、転移性または浸潤性である、または侵襲性、転移性または浸潤性となる可能性があることを示し得る。同様に、細胞が低レベルのＶＨＺ発現、量または活性を持てば、その細胞は侵襲性、転移性または浸潤性ではない、または侵襲性、転移性または浸潤性ではない可能性がある。
【０１５０】
もしＶＨＺのレベルが腫瘍の侵襲性によって変動すれば、ＶＨＺ発現、量または活性の検出は、癌を有する個体の生存率の推定のためにも使用可能であり、すなわち、正常レベルのＶＨＺを有する個体または同族集団と比較して、高レベルのＶＨＺは低い生存率または生存確率を示し、低レベルのＶＨＺは高い生存率または生存確率を示す。従って、ＶＨＺの発現、量または活性の検出は、癌を有する個体の予後方法として使用可能である。
【０１５１】
ＶＨＺ発現、量またはレベルの検出は、癌を有する個体における特定の療法の成功の見込みを決定するために使用可能である。それは、個体における腫瘍が浸潤性または転移性腫瘍であるかどうか、または浸潤性または転移性腫瘍である可能性があるかどうかを決定する方法で使用可能である。
【０１５２】
本明細書に記載の診断方法は記載されている治療方法と組み合わせることができる。よって、本発明者らは、個体において癌を治療、予防または緩和する方法を提供し、その方法は、個体の細胞においてＶＨＺの発現、量または活性の変調を検出すること、およびその腫瘍の侵襲性に基づきその個体に対して適当な療法を投与することを含む。この療法は上記のような抗ＶＨＺ剤を含み得る。
【０１５３】
一般に、乳癌の検出には乳房の身体検査およびＸ線マンモグラフィーが使用される。一般に、乳癌診断のための組織病理学的検査には、腫瘍生検を採取する。ＶＨＺの発現、量または活性の検出は、標準的組織病理学手段とともに、乳癌の診断、またはその診断のさらなる確認のために使用可能である。これは特に組織病理学的分析で明確な結果が得られない場合に有用であり得る。
【０１５４】
以下でさらに詳細に記載するが、サンプルにおいてＶＨＺポリペプチドおよび核酸の存在および量を検出することができる。よって、乳癌を含むＶＨＺ関連疾病は、被験体由来のサンプルから、ＶＨＺポリペプチドまたはＶＨＺ  ｍＲＮＡＭの発現、量または活性の異常な低下または上昇、例えば、発現、量または活性の上昇を決定することを含む方法によって診断することができる。
【０１５５】
このサンプルは、ＶＨＺ発現、量または活性の増加、低下またはそうでなければ異常（発現、量または活性のレベルまたはパターンにおける空間的または時間的変化を含む）を伴う疾病に罹患しているまたは罹患している疑いのある生物または個体からの細胞または組織サンプルを含み得る。このような疾病に罹患しているまたは罹患している疑いのある生物におけるＶＨＺの発現、量または活性のレベルまたはパターンを、疾病の診断手段として、正常生物における発現、量または活性のレベルまたはパターンと比較することが有用であり得る。
【０１５６】
このサンプルは、乳癌に罹患しているまたは罹患している疑いのある個体からの細胞または組織サンプル、例えば、乳房組織または細胞サンプルを含み得る。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、サンプルにおいてＶＨＺの発現、量または活性のレベルの上昇が検出される。ＶＨＺのレベルは、正常細胞または癌でないことが分かっている細胞と比較した場合に有意な程度で上昇しているものであり得る。このような細胞は供試個体または供試個体と齢、体重、生活様式が一致する個体などの他の個体から得ることができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、ＶＨＺの発現、量または活性のレベルは１０％、２０％、３０％または４０％またはそれを超えて上昇している。いくつかの実施形態において、ＶＨＺの発現、量または活性のレベルは、ｃＤＮＡハイブリダイゼーションにより判断した場合、４５％以上、例えば５０％以上、上昇している。
【０１５９】
ＶＨＺの発現、量または活性は、当技術分野で公知であり、また、以下にさらに詳細に記載されるいくつかの方法で検出することができる。一般に、個体からの組織サンプルにおけるＶＨＺの量を測定し、非罹患個体からのサンプルと比較する。ＶＨＺ核酸レベルならびにＶＨＺポリペプチドレベルの双方が測定可能である。
【０１６０】
ＶＨＺの量、活性または発現の検出は、乳癌の悪性度判定に使用可能である。例えば、高レベルのＶＨＺ量、活性または発現は侵襲性、浸潤性または転移性癌を示し得る。同様に、低レベルのＶＨＺ量、活性または発現は非侵襲性、非浸潤性または非転移性癌を示し得る。このような悪性度判定系は、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ悪性度判定系（ＮＧＳ）としても知られるElston-Ellis改変Scarff, Bloom, Richardson悪性度判定系などの確立された悪性度判定系とともに使用可能である。(5, 6, Haybittleら, 1982)
この系は、最もよく研究され、広く用いられている乳癌悪性度判定法である。ＮＧＳは、細管形成の程度、核多型性および有糸分裂数を含む、腫瘍細胞の形態学的および組織学的特徴の顕微鏡評価を含む表現型スコアリング法に基づく。これらのスコアの合計は乳癌を、悪性度Ｉ（Ｇ１）（十分な分化、増殖が遅い）、悪性度ＩＩ（Ｇ２）（中程度の分化）および悪性度ＩＩＩ（Ｇ３）（分化が不十分、高い増殖）に分類する。
【０１６１】
ＶＨＺ遺伝子発現のレベルは、いくつかの異なる技術を用いて決定することができる。
【０１６２】
ＶＨＺ発現のＲＮＡレベルでの測定
ＶＨＺ遺伝子発現はＲＮＡレベルで検出することができる。
【０１６３】
よって、一実地形態において、本発明者らは、サンプルにおいてＶＨＺ核酸を含む核酸の存在を検出する方法を開示し、その方法は、サンプルを、ＶＨＺ核酸に特異的な少なくとも１つの核酸プローブと接触させること、およびそのサンプルのＶＨＺ核酸の存在をモニタリングすることによる。例えば、この核酸プローブはＶＨＺ核酸またはその一部と特異的に結合することができ、その２者間の結合を検出し、その複合体自体の存在も検出することができる。
【０１６４】
よって、一実地形態において、サンプルにおいてＶＨＺ核酸の量をＶＨＺ  ｍＲＮＡの形で測定することができる。ＶＨＺ  ｍＲＮＡはin situハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法および逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応によりアッセイすることができる。核酸配列は、特異的プライマーを用いた、in situハイブリダイゼーション、サザンブロット法、一本鎖コンフォメーション多型、ＰＣＲ増幅およびＤＮＡチップ分析により同定することができる(Kawasaki, 1990; Sambrook, 1992; Lichterら, 1990; Oritaら, 1989; Fodorら, 1993; Peaseら, 1994)。
【０１６５】
ＶＨＺ  ＲＮＡは、例えば、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出(RNAzol B; Biogenesis)またはＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ調製キット(Qiagen)の使用を含むＲＮＡ抽出技術を用いて細胞から抽出することができる。リボ核酸ハイブリダイゼーションを用いる典型的なアッセイ形式としては、核ｒｕｎ−ｏｎアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＮアーゼ保護アッセイが挙げられる(Meltonら, Nuc. Acids Res. 12:7035)。使用可能な検出方法としては、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識およびその他の好適な標識が挙げられる。
【０１６６】
これらの各方法は定量的測定が可能であり、当技術分野で周知である。よって、ＶＨＺ発現、量または活性の低下または上昇は、ポリヌクレオチドの定量に関して当技術分野で周知のいずれかの方法を用いてＲＮＡレベルで測定することができる。ＶＨＺ配列由来の好適なプローブ、例えば、好適なヒトＶＨＺ配列のいずれの一部もプローブとして使用可能である。ＶＨＺプローブを設計するための配列としては、受託番号ＮＭ＿０１５４７２を有する配列またはその一部を含み得る。
【０１６７】
一般に、ＲＮＡ標的を増幅するためにＲＴ−ＰＣＲを用いる。このプロセスにおいて、逆転写酵素を用いてＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へ変換し、その後、検出を助けるためのこれを増幅することができる。
【０１６８】
多くのＤＮＡ増幅方法が知られており、その大部分が酵素的連鎖反応（ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応または自律性配列複製）によるものか、またはそれがクローニングされるベクターの全てまたは一部の複製からのものである。
【０１６９】
多くの標的およびシグナル増幅法が文献、例えば、これらの方法の総説であるLandegren, U.ら, Science 242:229-237 (1988)およびLewis, R., Genetic Engineering News 10:1, 54-55 (1990)に記載されている。
【０１７０】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ＶＨＺ  ｍＲＮＡを検出することができる。
【０１７１】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に記載されている核酸増幅法である。ＰＣＲは、診断上、任意の既知の核酸を増幅するために使用可能である(Mokら, 1994, Gynaecologic Oncology 52:247-252)。自律性配列複製（３ＳＲ）はＴＡＳの変形であり、酵素カクテルおよび適当なオリゴヌクレオチドプライマーにより媒介される、逆転写酵素（ＲＴ）、ポリメラーゼおよびヌクレアーゼ活性の連続的周期による核酸鋳型の等温増幅を含む(Guatelliら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874)。連結増幅反応または連結増幅系では、ＤＮＡリガーゼと４つのオリゴヌクレオチド（標的鎖ごとに２つ）を用いる。Ｑβレプリカーゼ技術では、一本鎖ＲＮＡを複製する、バクテリオファージＱβＲＮＡレプリカーゼを用い、Lizardiら, 1988, Bio/Technology 6:1197に記載されているように標的ＤＮＡを複製する。
【０１７２】
ＰＣＲ手順は基本的に、（１）抽出されたＤＮＡを処理して一本鎖相補鎖を形成させること；（２）オリゴヌクレオチドプライマー対を加えること（この対の一方のプライマーはセンス鎖の配列の一部と実質的に相補的であり、各対の他方のプライマーは相補的アンチセンス鎖の同配列の別の一部と実質的に相補的である）；（３）このプライマー対を相補的配列とアニーリングすること；（４）同時に、各プライマーの３’末端からアニーリングしたプライマーを伸張させて、各プライマーとアニーリングした鎖と相補的な伸張産物を合成すること（この伸張産物は相補物から分離した後、各対の他方のプライマーの伸張産物を合成するための鋳型として役立つ）；（５）該鋳型から該伸張産物を分離して一本鎖分子を生成すること；および（６）該一本鎖分子を該アニーリング、伸張および分離工程を少なくとも一度繰り返すことにより増幅することを含む。
【０１７３】
逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が使用可能である。定量的ＲＴ−ＰＣＲもまた使用可能である。このようなＰＣＲ技術は当技術分野で周知であり、ＶＨＺ配列からのいずれの好適なプライマーを用いてもよい。
【０１７４】
別の増幅技術も利用可能である。例えば、ローリングサークル型増幅(Lizardiら, 1998, Nat Genet 19:225)は、ＤＮＡポリメラーゼにより駆動され、等温条件下で直線的または幾何学的速度論を用いて環状オリゴヌクレオチドプローブを増幅することができる市販の増幅技術（ＲＣＡＴ（商標））である。さらなる技術の鎖置換増幅(SDA; Walkerら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:392)は、特定の標的に対してユニークな具体的に定義された配列を用いて始める。
【０１７５】
ＶＨＺ発現のポリペプチドレベルでの測定
ＶＨＺ発現はポリペプチドレベルで検出することができる。
【０１７６】
よって、さらなる実施形態において、ＶＨＺの発現、量または活性は、サンプルにおけるＶＨＺポリペプチドの存在または量を検出することにより検出することができる。これはＶＨＺポリペプチドと結合する分子を用いることにより達成することができる。その存在を検出するために、ＶＨＺポリペプチドと直接的または間接的に結合する好適な分子／薬剤としては、ペプチドおよびタンパク質などの天然分子、例えば、抗体を含み、あるいは、それらは合成分子であってもよい。
【０１７７】
よって、本発明者らは、ＶＨＺポリペプチドの存在を検出する方法を開示し、その方法は、細胞サンプルを、そのポリペプチドと結合することができる抗体と接触させること、および該サンプルをそのポリペプチドの存在に関してモニタリングすることによる。
【０１７８】
例えば、ＶＨＺポリペプチドは抗ＶＨＺ抗体を用いて検出することができる。このような抗体は当技術分野で公知の（以下にさらに詳細に記載される）手段によって作製することができる。例えば、抗ＶＨＺ抗体は、限定されるものではないが、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｃ３２２８１、アミノ酸３５〜９０、ＬＳ−Ｃ４２４５８、ＬＳ−Ａ６８０６およびＬＳ−Ａ６８０３、ＬＳ−Ｃ３２２８１、LifeSpan Inc、米国ワシントン州シアトル）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＤＳ−ＰＢ−００６７６、RayBiotech Inc、米国ジョージア州ノークロス）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＸＷ−７８５７、ProSci Incorporated、米国カリフォルニア州パウェイ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｆ４５６０およびＤ９８４０−６６Ａ、United States Biological、米国マサチューセッツ州スワンプスコット）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｄ９８４０−６６、United States Biological、米国マサチューセッツ州スワンプスコット）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＡＨＰ１１４２、AdB Serotec、英国オックスフォード）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−４０４５２、Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１００−７５３２８、Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン）など、ＶＨＺに対するいずれの市販の抗体も含み得る。
【０１７９】
これは便宜には、抗体とポリペプチドの間で形成された複合体の存在をモニタリングするか、またはポリペプチドと抗体の間の結合をモニタリングすることにより達成することができる。２つの存在の間の結合を検出する方法は当技術分野で公知であり、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、表面プラズモン共鳴などが含まれる。
【０１８０】
上記のような免疫ブロット法などの標準的実験技術を用いて、同じ細胞集団の非処理細胞と比べた場合のＶＨＺタンパク質のレベルの変化を検出することができる。
【０１８１】
遺伝子発現はまた、ＶＨＺポリペプチドの翻訳後プロセシングまたはＶＨＺ核酸の転写後修飾における変化を検出することにより判定することもできる。例えば、ＶＨＺポリペプチドのリン酸化の違い、ＶＨＺポリペプチドの切断またはＶＨＺ  ＲＮＡの選択的スプライシングなどが測定可能である。ＶＨＺポリペプチドなどの遺伝子産物の発現ならびにそれらの翻訳後修飾のレベルは、特許タンパク質アッセイまたは二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの技術を用いて検出することができる。
【０１８２】
宿主由来のサンプルにおいてＶＨＺタンパク質のレベルを決定するために使用可能なアッセイ技術は当業者によく知られている。抗体は、当技術分野で公知のいずれかの方法により、免疫特異的結合に関してアッセイすることができる。
【０１８３】
使用可能なイムノアッセイとしては、限定されるものではないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散法沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイおよびＡタンパク質イムノアッセイなどの技術を用いる競合および非競合アッセイ系が挙げられる。このようなアッセイは当技術分野で慣例のものである（例えば、参照によりそのまま本明細書に組み入れられるAusubelら編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York参照）。
【０１８４】
検体をポリペプチド／タンパク質に関して、免疫組織化学および免疫組織化学染色（一般に、StitesおよびTerr, Basic and Clinical Immunology, Appleton and Lange, 1994参照）、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫ブロット法、ウエスタンブロット法、免疫沈降、機能アッセイおよびタンパク質末端切断試験によりアッセイすることができる。他のアッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。
【０１８５】
ＥＬＩＳＡアッセイは当業者によく知られている。これらのアッセイにはポリクローナルおよびモノクローナル双方の抗体を使用可能である。適当であれば、当業者に知られているように、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの他のイムノアッセイを用いてもよい。利用可能なイムノアッセイは特許および科学文献に詳細に記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号ならびにSambrookら, 1992参照。
【０１８６】
診断キット
本発明者らはまた、個体における乳癌、または個体の乳癌感受性を検出するための診断キットを提供する。
【０１８７】
診断キットは、本明細書に記載のいずれかの手段により、個体においてＶＨＺの発現、量または活性を検出するための手段を含み得る。従って、診断キットは下記のもののいずれか１以上を含み得る：ＶＨＺポリヌクレオチドまたはそのフラグメント；ＶＨＺ核酸に対する相補的ヌクレオチド配列またはそのフラグメント；ＶＨＺポリペプチドまたはそのフラグメント；またはＶＨＺに対する抗ＶＨＺ抗体を含むものなどのＶＨＺに対する抗体、例えば、抗ペプチド抗体ヒトＶＨＺ抗体。
【０１８８】
診断キットは使用説明書またはその他の指示書を含み得る。診断キットはさらに、本明細書に記載されているいずれかの組成物または乳癌の治療に関して当技術分野で知られているいずれかの手段など、乳癌の治療または予防のための手段を含み得る。特に、診断キットは、例えば、スクリーニングにより得られる、記載のような抗ＶＨＺ剤を含み得る。診断キットは、タモキシフェン（ノルバデックス(nolvadex)）もしくはその変種（タモキシフェン、クエン酸タモキシフェンなど）または他のいずれかの抗エストロゲン作用薬またはエストロゲン遮断薬といった治療薬を含み得る。この治療薬はまた抗ＶＨＺ抗体も含み得る。
【０１８９】
予防法および治療法
本発明者らは、乳癌など、ＶＨＺ発現または活性の不十分な量に関連する異常な症状を治療する方法を開示する。乳癌を回避する（（すなわち予防）する方法も適宜、同じまたは類似のアプローチを用いる。
【０１９０】
一般的には、本発明者らの方法は、細胞におけるＶＨＺの発現、量または活性を変調（例えば、ダウンレギュレーション）することによる癌細胞の操作を含む。細胞において変調されたＶＨＺ発現、量または活性を検出する工程は操作工程の前または後に行えばよい。検出工程はアップレギュレーションされた、またはダウンレギュレーションされたＶＨＺの発現、量または活性を検出することができる。本明細書の他所に詳細に記載されているように、ＶＨＺを変調するまたはダウンレギュレーションするいずれの方法を用いてもよい。
【０１９１】
その方法は、細胞を好適なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはキメラＲＮＡｉに曝すことを含み得る。例えば、ＤＵＳＰ２３  Ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎ  Ｃｈｉｍｅｒａ  ＲＮＡｉ（カタログ番号Ｈ０００５４９３５−Ｒ０１、Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン）を、ＶＨＺ  ｍＲＮＡの発現をダウンレギュレーションするために使用可能である。キメラＲＮＡ干渉（キメラＲＮＡｉ）は、小干渉ＲＮＡ／ＤＮＡキメラが元の遺伝子のｍＲＮＡの破壊を誘発するプロセスである。キメラＲＮＡｉ(Chimer RNAi)はUi-Tei Kら, 2008, Nucleic Acids Res., April 2008; 36: 2136 - 2151, Naito al. Nucleic Acids Res., Jul 2005; 33: W589 - W591, Ui-Tei Kら, 2004, Nucleic Acids Res. 2004 Feb 9;32(3):936-48およびNaitoらNucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32 (Web Server issue):W124-9に詳細に記載されている。
【０１９２】
この方法は、細胞をＶＨＺと特異的に結合することができる抗ＶＨＺ抗体に曝すことを含み得る。このような抗体は、上記に示されるような市販のいずれかの抗ＶＨＺ抗体を含み得る。
【０１９３】
本発明者らの方法によれば、この操作の結果として癌細胞が非癌となるか、または浸潤性または転移性癌細胞が非浸潤性または非転移性となる。癌は特に乳癌を含み得る。それは浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）のような浸潤性または転移性癌を含み得る。
【０１９４】
ＶＨＺは癌の侵襲性および浸潤性に関連し、癌を有する個体の細胞、癌細胞または非癌細胞においてＶＨＺのレベルが検出され、癌の侵襲性を評価することができる。正常細胞に比べて高レベルのＶＨＺ量、発現または活性は侵襲性または浸潤性癌を示すので、より強力な、またはより過酷な療法が必要となり、選択される。同様に、低いレベルは低侵襲性または低浸潤性の療法を示し得る。
【０１９５】
本明細書に記載のアプローチは、一般にいずれのＶＨＺ関連疾患の療法にも使用可能である。ＶＨＺ関連疾患としては、増殖性疾患、特に癌を含む。例えば、ＶＨＺ関連疾患としては、転移性、浸潤性または侵襲性乳癌などの乳癌を含み得る。
【０１９６】
ＶＨＺ関連疾患は、その疾患に伴う症状が対照に対して有意に阻害される（すなわち、５０％以上）ならば、「治療される」と定義される。この阻害は対照に対して少なくとも７５％、例えば、対照に対して９０％、９５％または１００％であり得る。症状は細胞増殖を含むか、またはそれは細胞周期時間、細胞数、細胞遊走、細胞浸潤性などを含み得る。本発明者らは「治療」により、癌の予防または緩和も含むことを意味する。
【０１９７】
ＶＨＺポリペプチドは、特に腫瘍細胞およびその他の増殖細胞における療法に関する、その機能の阻害のための標的に相当する。
【０１９８】
増殖性障害とは、本明細書では、細胞周期の制御を必要とするいずれの障害も含めて広義で用いられる。特に、増殖性障害としては、悪性および前新生物性障害が含まれる。本明細書に記載の方法および組成物は、小細胞肺癌、腎臓、子宮、前立腺(prostrate)、膀胱、卵巣、結腸および乳房の癌などの腺癌の治療または診断に関して特に有用である。例えば、治療可能な悪性疾患としては、急性および慢性白血病、リンパ腫、骨髄腫、肉腫、例えば、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、リンパ管内皮肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、骨膜腫、中皮腫、子宮肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、絨毛癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、精上皮腫、胚性癌腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、血管芽腫、頭蓋咽頭腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫および網膜芽腫が挙げられる。
【０１９９】
このような障害の療法のための１つの可能性あるアプローチは、本明細書に記載のようにＶＨＺポリヌクレオチドに対するアンチセンス構築物を発現させ、それらを腫瘍細胞に投与し、遺伝子機能を阻害し、腫瘍細胞の増殖または進行を妨げることである。
【０２００】
アンチセンス構築物は、遺伝子の機能を阻害して増殖細胞において増殖または進行を妨げるために使用可能である。アンチセンス構築物、すなわち、センス核酸またはｍＲＮＡと相補的なＲＮＡなどの核酸構築物は、米国特許第６，１００，０９０号(Moniaら)およびNeckersら, 1992, Crit Rev Oncog 3(1-2):175-231に記載されており、これらの文献の教示は参照により具体的に組み入れられる。
【０２０１】
特定の例において、乳癌は、例えば、ＶＨＺ  ｍＲＮＡと結合してこれを破壊することができるｓｉＲＮＡにより、全体的または部分的にＶＨＺの量、発現または活性を低下させることによって治療または予防され得る。本発明者らは具体的には、ＲＮＡ干渉によりＶＨＺをダウンレギュレーションする抗ＶＨＺ剤を提供する。抗ＶＨＺ剤はＳｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはＳｈｏｒｔ  Ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含み得る。それはＤＵＳ  Ｐ２３プレデザインキメラＲＮＡｉ（カタログ番号Ｈ０００５４９３５−Ｒ０１、Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン）などのキメラＲＮＡｉを含み得る。
【０２０２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の直接的導入によって誘発される転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）の方法であり、種々の生物において特定の遺伝子の発現をノックアウトするために有用なツールとして登場した。ＲＮＡｉはFireら, Nature 391:806-811 (1998)により記載されている。ＰＴＧＳの他の方法も知られており、例えば、導入遺伝子またはウイルスの導入を含む。一般に、ＰＴＧＳでは、サイレンシングを受けた遺伝子の転写物は合成されるが、すぐに分解されるために蓄積しない。ＲＮＡｉを含むＰＴＧＳの方法は、例えば、the Ambion.com world wide web siteのディレクトリ"/hottopics/"の"rnai"ファイルに記載されている。
【０２０３】
in vitroにおけるＲＮＡｉの好適な方法は本明細書に記載されている。このような方法の１つは、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）の導入を含む。現状のモデルは、これらの２１〜２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡがＰＴＧＳを誘導し得ることを示す。有効なｓｉＲＮＡを設計する方法は、例えば、上記のＡｍｂｉｏｎウェブサイトに記載されている。Ｓｈｏｒｔ  Ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などのＲＮＡ前駆体も、ＶＨＺ核酸配列の全てまたは一部にコードされ得る。
【０２０４】
あるいは、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、最近哺乳類で上手く行くことが示された(WiannyおよびZernicka-Goetz, 2000, Nat Cell Biol 2:70-75)、ある範囲の生物において遺伝子発現に干渉する有力な方法である。ＶＨＺポリヌクレオチドの配列に相当する二本鎖ＲＮＡは、ＶＨＺ活性と干渉させるために候補生物の卵母細胞および細胞に導入、またはそこで発現させることができる。
【０２０５】
ＶＨＺ遺伝子発現を変調するその他の方法も当業者に知られており、ドミナントネガティブアプローチを含む。よって、別のアプローチは、内因性遺伝子産物と競合して機能の阻害をもたらす本明細書のＶＨＺポリペプチドの非機能的変異体を使用することである。ＶＨＺの非機能的変異体の一例は、ヒト配列の９５番（またはそれに相当する）位置でのシステインへの突然変異である。これらの例は、ホスファターゼおよび関連の生物活性が欠損しているＶＨＺのＣ９５Ｓ変異体の生成および使用を示す。
【０２０６】
ＶＨＺ遺伝子発現は、遺伝子発現または機能活性を阻害するペプチドまたは小分子を導入することにより変調させることができる。よって、本明細書に記載のアッセイによって、ＶＨＺポリペプチドの量、活性または発現と結合する、またはそれを変調する、例えばダウンレギュレーションすると同定された化合物は、ＶＨＺポリペプチドの機能を妨げるために腫瘍または増殖細胞に投与することができる。このような化合物は薬学上許容される担体とともに、ＶＨＺの発現または活性をダウンレギュレーションするのに有効な量で、またはＶＨＺの発現、活性または量を制御する第二のシグナルを活性化またはダウンレギュレーションし、それにより異常な状態を緩和することにより投与することができる。
【０２０７】
本明細書に記載のＶＨＺポリペプチドに対する好適な抗体も治療薬として使用可能である。抗ＶＨＺ抗体はＶＨＺに対するウサギ抗ＶＨＺ抗体を含み得る。さらに、抗ＶＨＺ抗体は、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｃ３２２８１、アミノ酸３５〜９０、ＬＳ−Ｃ４２４５８、ＬＳ−Ａ６８０６およびＬＳ−Ａ６８０３、ＬＳ−Ｃ３２２８１、LifeSpan Inc、米国ワシントン州シアトル）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＤＳ−ＰＢ−００６７６、RayBiotech Inc、米国ジョージア州ノークロス）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＸＷ−７８５７、ProSci Incorporated、米国カリフォルニア州パウェイ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｆ４５６０およびＤ９８４０−６６Ａ、United States Biological、米国マサチューセッツ州スワンプスコット）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｄ９８４０−６６、United States Biological、米国マサチューセッツ州スワンプスコット）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＡＨＰ１１４２、AdB Serotec、英国オックスフォード）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−４０４５２、Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１００−７５３２８、Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン）のいずれか１以上を含み得る。
【０２０８】
あるいは、遺伝子療法は、被験体における乳房細胞などの関連細胞によるＶＨＺの内生を制御するために使用可能である。例えば、ＶＨＺ  ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドまたはこの一部は、後述するように複製欠陥型レトロウイルスベクターで発現させるために操作可能である。このレトロウイルス発現構築物を次に単離し、抗ＶＨＺ  ｓｉＲＮＡをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入されたパッケージング細胞に導入ればよく、その結果、このパッケージング細胞は目的の配列を含む感染性ウイルス粒子を産生するようになる。これらの生産細胞を、in vivoにおいて細胞を操作し、in vivoにおけるＶＨＺポリペプチドの発現を調節するために被験体に投与することができる。遺伝子療法の総説としては、Human Molecular Genetics, T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996)のChapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches(およびその中に挙げられている参照文献)を参照。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、乳房細胞においてＶＨＺのレベルが低下される。さらに、このような実施形態では、治療は乳房細胞を標的とし得るか、または乳房細胞に特異的であり得る。ＶＨＺの発現は罹患乳房細胞（すなわち、癌である細胞）でのみ特異的に低下され、他の非罹患乳房細胞では実質的に低下されないものであり得る。これらの方法において、他の細胞、すなわち、乳房細胞でない細胞においてＶＨＺの発現は実質的に低下されなくてよい。よって、このような実施形態では、ＶＨＺのレベルは非乳房細胞では、当該治療コースまたはその後の治療において、実質的に同じまたは類似のままである。
【０２１０】
ＶＨＺレベルの乳房細胞特異的低下は、標的化投与、すなわち、乳房細胞にのみ治療を施し、他の細胞には施さないことにより達成することができる。しかしながら、他の実施形態では、乳房細胞（実質的に他の細胞または組織種ではない）におけるＶＨＺ発現のダウンレギュレーションを用いる。このような方法は、以下にさらに詳細に記載されるように、例えば、ｓｉＲＮＡの乳房特異的発現のために、有利には乳房特異的発現ベクターを使用する。
【０２１１】
導入遺伝子（抗ＶＨＺ  ｓｉＲＮＡ）の乳房特異的発現
癌遺伝子療法は、正常組織における望ましくない副作用を軽減するために腫瘍組織を選択的に標的としなければならない。導入遺伝子の発現を悪性組織に標的化するには、腫瘍生物学に基づくプロモーター、組織特異的プロモーターおよび誘導調節エレメントを含む特異的調節エレメントの使用が必要である（Ａ１）。
【０２１２】
腫瘍生物学に基づくプロモーター
乳癌では、ある特定の遺伝子がアップレギュレーションされている。これらの遺伝子のプロモーターは、組換え複製欠陥レトロウイルスベクターを用いる導入遺伝子の腫瘍選択的発現を駆動するために使用可能である。このような遺伝子としては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮増殖因子受容体−１（ＶＥＧＦＲ−１）およびＶＥＧＦＲ−２が挙げられ、これらは乳癌において腫瘍病期依存的にアップレギュレーションされることが知られている（Ａ２）。ｃ−ｅｒｂＢ２癌遺伝子は乳癌において選択的にアップレギュレーションされている（Ａ３、Ａ６）。ヒトアクチン結合タンパク質であるＬ−プラスチンは悪性上皮細胞において構成的かつ豊富に発現されるが、成熟造血細胞で低レベルに発現する以外、正常組織においては発現されない（Ａ４）。抗アポトーシス遺伝子Ｂｃｌ−２は乳癌細胞でアップレギュレーションされていることが見出されている（Ａ５）。ヒト乳房腫瘍は正常乳房組織に比べて高レベルのＭＵＣ１を発現する（Ａ７）。
【０２１３】
組織特異的プロモーター
乳房組織では、ある特定の遺伝子が特異的に発現される。このような遺伝子の例として、ヒトα−ラクトアルブミン（ＡＬＡ）およびヒツジβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）がある。このような遺伝子のプロモーターは、アデノウイルスベクターにおける導入遺伝子の発現を乳癌細胞特異的に駆動するために使用可能である（Ａ８）。乳癌の遺伝子療法は、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）など、この組織に対して親和性を有するウイルスを調整することにより取り組むことができる。このレトロウイルスのグルココルチコイド応答性の長い末端反復配列（ＬＴＲ）が、グルココルチコイドにより誘導される導入遺伝子の発現のためのプロモーターとして使用可能である（Ａ９）。
【０２１４】
誘導プロモーター
誘導プロモーターは一時的導入遺伝子発現のメディエーターとして用いられる。乳房腫瘍における放射線照射または化学療法の際には、種々のストレス遺伝子がアップレギュレーションされる。このようなストレス遺伝子の例としては、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）（Ａ１０）および多剤耐性遺伝子−１（ＭＤＲ−１）（Ａ１１）が挙げられる。従って、これらの遺伝子のプロモーターは、放射線照射または化学療法を受けた乳癌において導入遺伝子の腫瘍特異的発現を駆動するために使用可能である。
【０２１５】
転写標的遺伝子療法は通常、目的の導入遺伝子を含む複製欠陥アデノウイルス発現ベクターの直接的腫瘍内注射によって達成される（Ａ６、Ａ１２、Ａ１３）。この導入遺伝子はまた、陽イオンリポソームとの脂質複合体として腫瘍内注射を行うことにより送達することもできる（Ａ１４、Ａ１５）。
【０２１６】
乳癌
本明細書に記載の方法および組成物によれば、ＶＨＺは乳癌の診断または治療に有用である。本明細書で「癌」という場合、これは転移性、侵襲性または浸潤性癌を含むものと考えるべきである。例えば、癌はＶＨＺの過剰発現に関連する癌であり得る。これにより本発明者らは、問題の癌の癌細胞が非癌細胞に比べて、高レベルのＶＨＺ発現または活性（またはその双方）を示すことを意味する。
【０２１７】
乳癌にはいくつかの種類がある。最も多いのが乳管癌であり、これは乳房の乳管の内面で起こる。別のタイプの小葉癌は、乳汁が産生される小葉で起こる。悪性腫瘍が近傍組織に浸潤すれば、それは浸潤性または侵襲性癌として知られる。乳癌が乳房の外部に拡散すると、癌細胞は腋下リンパ節で見られる場合が多くなる。乳癌細胞は他のリンパ節、骨、肝臓または肺など、乳房を超えて拡散し得る。
【０２１８】
認知されている乳癌の病期は次のものを含む。
【０２１９】
病期０：極めて初期の乳癌。この種の癌は乳房内または乳房外に拡散していない。ＤＣＩＳ、ＬＣＩＳまたは限局性乳癌または非浸潤性癌と呼ばれることがある。
【０２２０】
病期Ｉ：癌が約１インチ以下の大きさであり、乳房外には拡散していない（初期乳癌とも記載される）。
【０２２１】
病期ＩＩ：以下のいずれかが存在すること：癌は１インチ以下であるが、腋下リンパ節に拡散している；癌が１〜２インチの間であり、腋下リンパ節へ拡散している場合としていない場合がある；癌は２インチより大きいが、腋下リンパ節へ拡散していない。
【０２２２】
病期ＩＩＩおよび病期ＩＩＩＡ：以下のいずれかが存在すること：癌が２インチより小さく、腋下リンパ節へ拡散しており、さらに他のリンパ節へも拡散しているところである；癌が２インチより大きく、腋下リンパ節へ拡散している。
【０２２３】
病期ＩＩＩＢ：以下のいずれかが存在すること：癌が乳房近傍組織（皮膚、肋骨および胸部の筋肉を含む胸壁）に拡散していること；癌が胸骨に沿った胸壁内のリンパ節に拡散していること。
【０２２４】
病期ＩＶ：癌が他の身体部位、最も多くは骨、肺、肝臓または脳に拡散している。あるいは、腫瘍が頸部内、鎖骨近傍の皮膚およびリンパ節に局部的に拡散している。
【０２２５】
炎症性乳癌：炎症性乳癌は希であるが、極めて重篤、侵襲的タイプの乳癌。乳房は赤くなり、熱を持っている。乳房に隆起、みみず腫れまたは蕁麻疹が見られる場合があり；または皮膚にしわが見られる場合がある。単なる感染と誤診される場合がある。
【０２２６】
再発性乳癌：再発性疾病とは、処置された後に再び現れる（再発する）ことを意味する。それは乳房、胸部の軟組織（胸壁）または他の身体部分に再び現れる場合がある。
【０２２７】
限局性乳癌−ＤＣＩＳおよびＬＣＩＳ
発見されている多くの乳癌は、限局性乳癌または非浸潤性癌として知られる極めて初期の癌である。これらの癌のほとんどはマンモグラフィーによって発見される。これらの極めて初期の細胞変化が浸潤性乳癌となる場合がある。２種類の限局性乳癌として以下の物が含まれる。
【０２２８】
ＤＣＩＳ（非浸潤性乳管癌）  これは異常な細胞が乳房の乳管の内面にのみ見られることを意味する。異常な細胞は乳管の外部には拡散していない。それらは乳房内、乳房を超えて腋下リンパ節、または他の身体部分には拡散していない。いくつかのタイプのＤＣＩＳがある。摘出しなければ、いくつかのタイプは経時的に変化し、浸潤性癌となる場合がある。浸潤性癌にならないものもある。（ＤＣＩＳは乳管内癌腫と呼ばれる場合もある。）
ＬＣＩＳ（非浸潤性小葉癌）  これは異常な細胞が乳葉の内面に見られることを意味する。ＬＣＩＳはこの非浸潤性段階の実際の乳癌とはみなされないが、浸潤性癌を発症する高リスクの警告的徴候である。ＬＣＩＳは、マンモグラムで発見される別の塊状物または異常な変化に対して生検が行われる場合に発見されることがある。ＬＣＩＳ患者がその後２５年の間にいずれかの乳房に乳癌を発症する確率は２５％である。
【０２２９】
微小カルシウム沈着は、自覚できないがマンモグラムで見られるカルシウムの極めて小さな斑点である。それらは急速に分裂する細胞によって形成される。それらが乳房の一領域でクラスター化すると、これは限局性乳癌の初期徴候となり得る。マンモグラフィーによって発見される乳癌の約半数は微小カルシウム沈着のクラスターとして見られる。もう半分は塊状物として見られる。
【０２３０】
診断
本発明者らの診断方法は、既知の乳癌遺伝子ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の一方または双方の突然変異の検出を含む既知の乳癌診断法と併用することができる。その代わりに、またはそれに加えて、診断は、例えば抗Ｈｅｒ２抗体の使用によるＨｅｒ２発現の検出によって行うこともできる。
【０２３１】
治療
既知の乳癌治療は以下のいずれか１以上からなり得る：外科術、放射線療法、化学療法、高用量化学療法、ホルモン療法および免疫療法。よって、本明細書に記載のいずれの治療方法も、前記の既知療法のいずれか１以上と組み合わせることができる。加えて、癌の治療または緩和に有効であることが知られている以下の遺伝子療法のいずれか１以上も使用可能である。
【０２３２】
非特異的免疫調節剤
非特異的免疫調節剤は免疫系を刺激する、または間接的に増強する物質である。多くの場合、これらの薬剤は鍵となる免疫系細胞を標的とし、サイトカインおよび免疫グロブリンの産生の増加などの二次的応答を引き起こす。癌治療に用いられる２つの非特異的免疫調節剤がカルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）とレバミゾールである。本明細書に記載の抗ＶＨＺ剤はこのような非特異的免疫調節剤のいずれとも併用可能である。
【０２３３】
生物反応修飾物質
いくつかの抗体、サイトカインおよびその他の免疫系物質は癌治療に使用するために実験室で生産することができる。これらの物質はしばしば生物反応修飾物質（ＢＲＭ）と呼ばれる。それらは、疾病と闘う身体の能力を刺激、指令または回復させるために、身体の免疫防御と癌細胞の間の相互作用を変更する。ＢＲＭとしては、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、モノクローナル抗体およびワクチンが挙げられる。本明細書に記載の抗ＶＨＺ剤はこのような生物反応修飾物質のいずれとも併用可能である。
【０２３４】
インターフェロン（ＩＦＮ）
インターフェロンには、インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγの３つの主要なタイプがあり、インターフェロンαは癌治療に最も広く用いられているタイプである。
【０２３５】
インターフェロンは、癌患者の免疫系が癌細胞に作用する方法を改善することができる。加えて、インターフェロンは、それらの増殖を遅くするか、またはより正常な挙動を持つ細胞へとそれらの発達を促進することにより、癌細胞に直接作用し得る。いくつかのインターフェロンはまた、ＮＫ細胞、Ｔ細胞およびマクロファージを刺激して、免疫系の抗癌機能を刺激する。
【０２３６】
本明細書に記載の抗ＶＨＺ剤はこのようなインターフェロンのいずれとも併用可能である。
【０２３７】
インターロイキン（ＩＬ）
インターフェロンと同様、インターロイキンも身体に天然に存在するサイトカインである。多くのインターロイキンが同定されており、インターロイキン−２（ＩＬ−２またはアルデスロイキン）が癌治療において最も広く研究されている。ＩＬ−２は、リンパ球など、癌細胞を破壊することができる多くの免疫細胞の増殖および活性を刺激する。
【０２３８】
本明細書に記載の抗ＶＨＺ剤はこのようなインターロイキンのいずれとも併用可能である。
【０２３９】
コロニー刺激因子（ＣＳＦ）
コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（造血増殖因子と呼ばれることもある）は通常、腫瘍細胞に直接影響を及ぼさず、むしろ骨髄幹細胞を分裂して、白血球、血小板および赤血球へと発達するように促進する。骨髄はあらゆる血液細胞の供給源であるので、身体の免疫系に不可欠である。
【０２４０】
Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）およびＧＭ−ＣＳＦ（サルグラモスチム）は、白血球の数を増やし、それにより、化学療法を受けている患者の感染リスクを軽減することができる。Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦはまた、幹細胞または骨髄移植用調製物において幹細胞の生産を刺激することができ；エリスロポエチンは、化学療法を受けている患者において、赤血球の数を増やし、赤血球輸血の必要性を軽減することができ；また、オプレスベキンは、化学療法を受けている患者において血小板輸血の必要性を軽減することができる。
【０２４１】
本明細書に記載の抗ＶＨＺ剤はこのようなコロニー刺激因子のいずれとも併用可能である。
【０２４２】
モノクローナル抗体（ＭＯＡＢ）
ヘルセプチンは、ＨＥＲ−２と呼ばれる、過剰量のタンパク質を産生する腫瘍（乳癌腫瘍のおよそ２５％が過剰量のＨＥＲ−２を産生する）を有する患者の転移性乳癌を治療するために用いられる。特定の実施形態では、本明細書に記載の治療方法は、検討個体への抗Ｈｅｒ２抗体、例えばヘルセプチンの投与と併用することができる。
【０２４３】
本明細書に記載の抗ＶＨＺ剤はこのようなモノクローナル抗体のいずれとも併用可能である。
【０２４４】
Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｅｒｂＢ−２）遺伝子産物は、上皮細胞増殖因子の受容体ファミリーに属す１８５ｋＤＡの膜貫通型受容体チロシンキナーゼである。これは、参照により本明細書に組み入れられるReese, D. M.ら, Stem Cells, 15, 1-8 (1997)にいくらか詳細に記載されている。
【０２４５】
最近、乳癌におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕの重要性に大きな注目が集まっている。ＨＥＲ−２／ｎｅｕはヒト乳癌の２０〜３０％で過剰発現し、この発現の上昇は予後の悪さに関連付けられている。この発見から、試験で転移性乳癌における緩解時間を引き延ばすことが分かったＨＥＲ−２／ｎｅｕに対する抗体ヘルセプチンの開発に至った。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、細胞核に増殖シグナルを伝達する細胞表面受容体である。ヘルセプチンはこれらのシグナルを遮断し、それにより、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ陽性乳癌においてＨＥＲ−２／ｎｅｕにより媒介される細胞の増殖を明らかに阻害すると思われる。
【０２４６】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現はまた、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸直腸癌および非小細胞肺癌の一部でも見出されている。ＨＥＲ−２−ｎｅｕの過剰発現に関連する他の癌も潜在的にヘルセプチンで治療可能である。
【０２４７】
よって、本発明者らの診断方法は、個体におけるＨｅｒ２の過剰発現の検出と組み合わせることができる。同様に、本明細書に記載の治療方法は、ＶＨＺの活性、量または発現を低下させることに加え、個体へのヘルセプチン投与を含み得る。よって、本発明者らは、ＶＨＺ核酸またはＶＨＺポリペプチドと抗Ｈｅｒ２抗体の組合せを提供する。本発明者らはまた、抗ＶＨＺ抗体と抗Ｈｅｒ２抗体の組合せを提供する。いくつかの実施形態において、抗Ｈｅｒ２抗体はヘルセプチンを含む。
【０２４８】
抗ＶＨＺ剤のスクリーニング
ＶＨＺモジュレーター、アゴニストおよびアンタゴニストの同定
アンタゴニスト、特に、小分子を、抗ＶＨＺ剤として用いるため、ＶＨＺを特異的に阻害するために使用することができる。
【０２４９】
よって、本発明者らは、ＶＨＺアンタゴニストおよび小分子ＶＨＺ阻害剤、ならびにこれらをスクリーニングするためのアッセイを開示する。ＶＨＺのアンタゴニストは、結合または他のＶＨＺ活性の変調、例えばダウンレギュレーションを検出することによりスクリーニングすることができる。よって、本発明者らは、ＶＨＺポリペプチドの発現、量または活性をダウンレギュレーションすることができる化合物を提供する。このような化合物は、癌、特に乳癌を治療または予防するために本明細書に記載の方法および組成物で使用可能である。
【０２５０】
よって、ＶＨＺは、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然物混合物において小分子基質とリガンドの結合を評価するために使用可能である。これらの基質およびリガンドは天然の基質およびリガンドであってもよいし、あるいは構造的または機能的ミメティクスであってもよい。Coliganら, Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)参照。さらに、特に乳房細胞においてＶＨＺの発現に影響を及ぼす因子を同定するためにスクリーニングを行うこともできる。
【０２５１】
一般に、アゴニストおよびアンタゴニストに関するアッセイは、ＶＨＺの１以上の活性に対する候補分子の効果を決定することによる。アッセイは、候補分子の存在下および所望により候補分子の不在下で、またはＶＨＺ活性を阻害もしくは活性化することが知られている分子の存在下でＶＨＺ活性をアッセイすることを含み得る。
【０２５２】
本発明者らは、乳癌細胞においてＶＨＺの発現が上昇しており、従って、ＶＨＺ発現の制御は乳癌および他の癌の治療に使用可能であることを証明した。よって、ＶＨＺの発現および／または活性を刺激するか、またはこのタンパク質の機能を阻害することができる化合物および薬剤を発見することが望まれる。一般に、アゴニストおよびアンタゴニストは、既知の任意の癌、特に乳癌の治療および予防目的で用いられる。
【０２５３】
「ダウンレギュレーション」により本発明者らは、検討される挙動のいずれの負の効果も含め、これは全面的なものでも部分的なものでもよい。よって、結合が検出される場合には、候補アンタゴニストは、２つの物の間の結合を低下させる、軽減する、または不幸にすることができるものである。候補分子によって達成される結合（または他のいずれかの活性）のダウンレギュレーションは、候補分子の不在下での結合（または何であれ活性）と比較して少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれを超えるものであり得る。よって、アンタゴニストとしての使用に好適な候補分子は、結合または他の活性を１０％を超えて低下させ得るものである。
【０２５４】
「化合物」とは、化学化合物（天然または合成）、例えば、生体高分子（例えば、核酸、タンパク質、非ペプチドまたは有機分子）、または細菌、植物、真菌もしくは動物（特に哺乳類）細胞もしくは組織などの生体材料から作製された抽出物、またはさらには無機元素または分子を指す。化合物は抗体であり得る。
【０２５５】
ＶＨＺの可能性のあるアンタゴニストの例としては、抗体、小分子、ヌクレオチドおよびそれらの類似体（プリンおよびプリン類似体を含む）、ＶＨＺの結合相手に近縁のオリゴヌクレオチドまたはタンパク質、例えば結合相手のフラグメント、またはＶＨＺポリペプチドと結合するが反応を誘発せず、従って、そのポリペプチドの活性が妨げられる小分子などが挙げられる。
【０２５６】
スクリーニングキット
行われるこのようなスクリーニングに必要な材料はスクリーニングキットにパッケージングすることができる。
【０２５７】
このようなスクリーニングキットは、ＶＨＺの産生を低下または促進するＶＨＺポリペプチドまたは化合物に対するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素などを同定するために有用である。スクリーニングキットは、（ａ）ＶＨＺポリペプチド；（ｂ）ＶＨＺポリペプチドを発現する組換え細胞；または（ｃ）ＶＨＺポリペプチドに対する抗体を含み得る。スクリーニングキットはライブラリーを含み得る。スクリーニングキットは、以下に記載されるように、スクリーニングに必要な任意の１以上の成分を含み得る。スクリーニングキットは所望により使用説明書を含み得る。
【０２５８】
スクリーニングキットは、ＶＨＺ発現を核酸レベルで検出することができるものを提供することができる。このようなキットはＶＨＺの増幅のためのプライマーまたは増幅のためのプライマー対を含み得る。このプライマーは任意の好適な配列、例えば、ＶＨＺ配列の一部から選択することができる。プライマー配列を同定する方法は当技術分野で周知であり、当業者ならばこのようなプライマーを容易に設計することができる。これらのキットは、本明細書に記載されるようなＶＨＺ発現のための核酸プローブを含み得る。これらのキットはまた所望により使用説明書も含み得る。
【０２５９】
合理的設計
ＶＨＺと相互作用し得る可能性がある候補化合物の合理的設計は、ＶＨＺポリペプチドの分子形状の構造研究に基づき得る。どの部位が特定の他のタンパク質と相互作用するかを決定する１つの手段は、物理的構造決定、例えば、Ｘ線結晶学または二次元ＮＭＲ技術である。これらは、どのアミノ酸残基が分子接触領域を形成するかについての指針を与える。タンパク質構造決定の詳細な記載については、例えば、BlundellおよびJohnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New Yorkを参照。
【０２６０】
ポリペプチド結合アッセイ
ＶＨＺ活性または発現のモジュレーターおよびアンタゴニストは当技術分野で公知のいずれの手段によっても同定可能である。
【０２６１】
それらの最も単純な形態では、これらのアッセイは単に、候補化合物を、ＶＨＺポリペプチドを含有する溶液と混合して混合物を形成する工程、その混合物においてＶＨＺポリペプチドの活性を測定する工程、およびその混合物の活性を標品と比較する工程を含み得る。
【０２６２】
さらに、ＶＨＺと推定分子の間の結合を検出するアッセイにおいて、それらのＶＨＺへの結合によって分子を同定することができる。
【０２６３】
本明細書に記載のＶＨＺポリペプチドと結合する物質を同定するための一種のアッセイでは、固相支持体に固定されているＶＨＺポリペプチドを非固定候補物質と接触させ、目的のＶＨＺポリペプチドと候補物質が互いに結合かするかどうか、および／またはどの程度結合するかを決定することを含む。あるいは、候補物質を固定して、本明細書に示されるようなＶＨＺポリペプチドを非固定としてもよい。
【０２６４】
物質とＶＨＺポリペプチドの結合は、一時的、可逆的または恒久的なものであり得る。この物質は、対照ポリペプチド（例えば、癌の増殖または進行に関与しないことが知られるポリペプチド）との結合に関するＫｄ値よりも低いＫｄ値でそのポリペプチドと結合し得る。この物質のＫｄ値は、対照ポリペプチドとの結合に関するＫｄ値の２分の１、例えば、１００分の１のＫｄ値または１０００分の１のＫｄ値であり得る。
【０２６５】
一例としてのアッセイ法では、ＶＨＺポリペプチドはアガロースビーズなどのビーズに固定可能である。一般に、これは、ＶＨＺポリペプチドを細菌、酵母または高等真核細胞系統においてＧＳＴ−融合タンパク質を発現させ、粗細胞抽出物からグルタチオン−アガロースビーズを用いてＧＳＴ−ＶＨＺ融合タンパク質を精製することにより達成され得る(SmithおよびJohnson, 1988; Gene 67(10):31-40)。対照として、ＧＳＴ−融合タンパク質ではない候補物質の、固定ポリペプチドに対する結合を、ＶＨＺポリペプチドの不在下で測定することができる。そして、この候補物質の固定ＶＨＺポリペプチドに対する結合を測定すればよい。この種のアッセイは当技術分野でＧＳＴプルダウンアッセイとして知られている。この場合にも、候補物質を固定して、ＶＨＺポリペプチドを非固定としてもよい。
【０２６６】
また、例えば、Ｎｉ-ＮＴＡアガロース成分およびヒスチジンタグ成分など、成分の一方を固定するための種々のアフィニティー精製系を用いて、この種のアッセイを行うことも可能である。
【０２６７】
ポリペプチドと候補物質の結合は、当技術分野で周知の種々の方法によって測定することができる。例えば、非固定成分を標識してもよい（例えば、放射性標識、エピトープタグまたは酵素−抗体コンジュゲートで）。あるいは、結合を免疫学的検出技術によって測定してもよい。例えば、反応混合物にウエスタンブロットを行い、非固定成分を検出する抗体でプロービングすることができる。ＥＬＩＳＡ技術も使用可能である。
【０２６８】
候補物質は一般に、１〜１０００ｎｍｏｌ／ｍｌ、例えば１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌの終濃度で加える。抗体の場合、用いる終濃度は一般に１００〜５００μｇ／ｍｌ、例えば２００〜３００μｇ／ｍｌである。
【０２６９】
ＶＨＺのモジュレーターおよびアンタゴニストはまた、ＶＨＺとこのポリペプチドが結合する任意の分子との間の結合の変調、またはこのような結合または遊離の結果として生じる任意の活性の変調を検出することにより同定可能である。
【０２７０】
細胞系アッセイ
細胞系アッセイは単に候補化合物の結合を試験するものであってよく、そこではＶＨＺポリペプチドを担持する細胞への結合が、候補化合物と直接的もしくは間接的に会合された標識の手段によるか、または標識された競合物との競合を含むアッセイにおいて検出される。
【０２７１】
さらに、これらのアッセイは、表面にポリペプチドを担持する細胞に適当な検出系を用い、候補化合物が、ＶＨＺポリペプチドとの結合によって生成するシグナルをもたらすかどうかを試験すればよい。活性化の阻害剤は一般に既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、候補化合物の存在による、アゴニストによる活性化に対する効果を観察する。
【０２７２】
化合物をスクリーニングする別法としては、化合物のライブラリーを発現する組換えＤＮＡ分子で安定形質転換されている真核生物または原核生物宿主細胞を用いる。このような細胞は、生きた形または固定された形のいずれかで標準的結合相手アッセイに使用可能である。また、細胞応答を検出するための敏感な方法を記載しているParceら(1989) Science 246:243-247;およびOwickiら(1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87;4007-4011Ｍの参照。
【０２７３】
化合物のライブラリーを発現する細胞を１２５Ｉ−抗体などのＶＨＺポリペプチドと結合することが知られている標識抗体および候補化合物などの試験サンプル（結合組成物に対するその親和性が評価される）と接触させるかまたはインキュベートする競合アッセイが特に有用である。その後、ＶＨＺポリペプチドに対する結合型の標識結合相手と遊離型の標識結合相手を分離して結合の程度を評価する。結合した試験サンプルの量は、ＶＨＺポリペプチドと結合する標識抗体の量に反比例する。
【０２７４】
多くの技術のいずれか１つを用いて、遊離型の結合相手から結合型の結合相手を分離し、結合の程度を評価することができる。この分離工程は一般に、フィルターへ接着させた後に洗浄する、プラスチックへ接着させた後に洗浄する、または細胞膜の遠心分離などの手順を含み得る。
【０２７５】
これらのアッセイは、候補分子を乳房細胞などの細胞に曝すこと、およびいずれかの好適な手段によりＶＨＺの発現をアッセイすることを含み得る。このようなアッセイでＶＨＺの発現をダウンレギュレーションする分子を所望によりさらなる研究のために選択し、ＶＨＺ発現をダウンレギュレーションするための薬剤として使用することができる。このような薬剤は通常、乳癌を治療または予防するために有用に使用可能である。
【０２７６】
ＶＨＺタンパク質をコードするｃＤＮＡおよびそのタンパク質に対する抗体はまた、細胞においてＶＨＺ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の産生に対する添加した化合物の効果を検出するためのアッセイを構成するために使用可能である。例えば、ＥＬＩＳＡを、当技術分野で公知の標準的方法により、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いて分泌された、または細胞と会合したＶＨＺポリペプチドのレベルを測定するために構成することができ、これを用いて、適宜操作された細胞または組織からのＶＨＺタンパク質の産生を阻害または促進し得る薬剤（それぞれアンタゴニストまたはアゴニストとも呼ばれる）発見することができる。スクリーニングアッセイを行うための標準的方法は当技術分野で十分に理解されている。
【０２７７】
活性測定法
モジュレーターまたはアンタゴニストを検出するためのアッセイは一般に、候補分子の存在下でＶＨＺの任意の活性の変調を検出することを含み、所望により、候補分子の不在下で活性の変調の検出をともに行う。
【０２７８】
ホスファターゼ活性などのＶＨＺの特定の生物活性を検出するアッセイが使用可能である。これらのアッセイは一般に、候補分子（例えば、ライブラリーの形）を、候補モジュレーターとともに、ポリペプチド、そのポリペプチドをコードする核酸、またはこのようなものを含む細胞、オルガネラ、抽出物もしくは他の材料のいずれかの形態のＶＨＺと接触させることを含む。ＶＨＺの関連活性（下記のようなホスファターゼ活性など）を検出して候補モジュレーターの存在が何らかの効果を有するかどうかを確定することができる。
【０２７９】
ホスファターゼアッセイは当技術分野で公知であり、Wuら (2004), Int J Biochem Cell Biol. 36(8):1542-53およびAlonsoら(2004). J Biol Chem. 20;279(34):35768-74に記載されている。このようなアッセイは、ｐ−ニトロフェニルホスフェートまたはホスホチロシンおよびホスホトレオニン残基を含有するオリゴペプチドなどの好適な基質を脱リン酸化するＶＨＺの能力をアッセイすることを含む。これらのアッセイは候補モジュレーターの存在下または不在下で行い、ＶＨＺ活性の変調を検出するのに適当な活性を検出し、従って、ＶＨＺの候補モジュレーターおよび／またはアンタゴニストの同定を行うことができる。
【０２８０】
ＶＨＺと結合し、かつ／またはその転写または発現に影響を及ぼす候補モジュレーターを検出するためのプロモーター結合アッセイも使用可能である。その後、候補モジュレーターをさらなる試験のために選択するか、または使用のために単離することができる。このようなスクリーニング手順の詳細は当技術分野で周知であり、例えば、Handbook of Drug Screening, Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes編 (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9)に記載されている。
【０２８１】
本明細書に記載のスクリーニング方法はin vivoアッセイを使用可能であるが、それらはin vitro使用用に構成することもできる。in vivoアッセイは一般に、ＶＨＺを含む細胞を候補分子に曝すことを含む。in vitroアッセイでは、ＶＨＺを、所望により、未精製もしくは半精製細胞抽出物または精製タンパク質などの他の成分の存在下で候補分子に曝す。in vitroアッセイを行う場合、これらは候補分子のアレイ（例えば、アレイライブラリー）を用いてもよい。in vivoアッセイも使用可能である。よって、ＶＨＺポリペプチドは、ヘテロな状態などで細胞に含まれ得る。このような細胞は、上記のようにＶＨＺを発現するように操作されたトランスジェニック細胞であり得る。
【０２８２】
抽出物を用いる場合、それは細胞質抽出物または核抽出物を含むことができ、その調製方法は当技術分野で周知である。
【０２８３】
オルガネラなど、ＶＨＺを含む任意の細胞成分が使用可能であると考えられる。一実施形態では、細胞質調製物または核調製物、例えば、記載のようなＶＨＺを含む細胞核を含むものを用いる。核調製物は１以上の核を含み、それらは例えば洗剤処理よりにより、透過性または半透性であり得る。
【０２８４】
よって、特定の実施形態では、アッセイ形式には以下のものを含み得る：マルチウェルマイクロタイタープレートは、核ウェルにＶＨＺポリペプチドを発現する１以上の細胞を含むように設定し；例えばライブラリーからの各候補分子または候補分子プールを各ウェルに加え、ＶＨＺ活性の変調を測定することができる。プールを用いる場合、これらはさらなるプールに細分割し、同様に試験することができる。次に、本明細書の他所に記載されているように、ＶＨＺ活性、例えば、結合活性または転写同時活性化活性をアッセイすることができる。
【０２８５】
上記のアッセイ方法の代わりに、またはそれに加えて、ＶＨＺのモジュレーターまたはアンタゴニストを同定するために「差し引き」法も使用可能である。このような「差し引き」法では、モジュレーターとして機能し得る１以上の候補分子を含む複数の分子（例えば、細胞抽出物、核抽出物、分子ライブラリーなど）が提供され、その複数の分子から１以上の成分が除去されるか、枯渇されるか、または差し引かれる。その後、「差し引かれた」抽出物などの活性を、記載のようにＶＨＺを含む細胞（またはその成分）に曝すことによりアッセイする。
【０２８６】
よって、例えば、次のようにこのようなモジュレーターの同定のために「免疫枯渇」アッセイを行うことができる。細胞質抽出物または核抽出物は好適な細胞から調製することができる。この抽出物を、適当な抗体による免疫枯渇を用いるなどして、推定モジュレーターが除去されるように枯渇または分画することができる。抽出物のモジュレーターを枯渇させれば、それはＶＨＺの機能または活性または発現に影響を及ぼす能力を失う。モジュレーターまたはアンタゴニストを同定するために一連の差し引きおよび／または枯渇が必要となる場合もある。
【０２８７】
また、上記の「枯渇」または「差し引き」アッセイは、さらなるスクリーニングのための推定モジュレーター因子を同定するための予備工程としても使用可能であると考えられる。さらに、またはあるいは、「枯渇」または「差し引き」アッセイは、他の手段（例えば、本明細書の他所に記載されているような「陽性」スクリーニング）により推定モジュレーターとして同定された分子のモジュレーター活性を確認するためにも使用可能である。
【０２８８】
アッセイを受け、着目されることが分かった候補分子を単離し、さらに検討することができる。着目される分子の単離方法は、用いられる分子の種類、それがライブラリーの形態かどうか、いくつの候補分子を一度に試験するか、続いて回分法を行うかどうかによって異なる。
【０２８９】
候補分子はライブラリーの形で提供されてもよい。一実地形態では、１を超える候補分子を同時にスクリーニングすることができる。候補分子のライブラリー、例えば、小分子ライブラリー、ポリペプチドライブラリー、核酸ライブラリー、化合物のライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、アンチセンス分子のライブラリー（アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡなど）、抗体ライブラリーなどは、当技術分野で公知の手段により作製可能である。このようなライブラリーはハイスループットスクリーニングに好適である。ＶＨＺを含む種々の細胞をそのライブラリーの各メンバーに曝し、ＶＨＺ活性に対する効果を測定することができる。この目的でアレイ技術を用いてもよい。これらの細胞を、例えばマイクロタイタープレートのウェルにおいて、空間的に分離することもできる。
【０２９０】
一実施形態では、小分子ライブラリーを用いる。「小分子」により本発明者らは、分子量が約５０ｋＤａ未満であり得る分子を指す。特定の実施形態では、小分子は約３０ｋＤａ未満、例えば約１５ｋＤａ未満または１０ｋＤａ未満などの分子量を持ち得る。このような小分子のライブラリーを本明細書では「小分子ライブラリー」と予備、ポリペプチド、小ペプチド、例えば、２０アミノ酸以下、例えば、１５、１０または５アミノ酸のペプチド、単純化合物などを含み得る。
【０２９１】
その代わりに、それに加えて、以下にさらに詳細に記載されるようにコンビナトリアルライブラリーを、ＶＨＺのモジュレーターまたはアンタゴニストに関してスクリーニングすることもできる。ＶＨＺ活性のアッセイは上記されている。
【０２９２】
ライブラリー
ポリペプチドまたは核酸のライブラリーなどの候補分子ライブラリーは、本明細書に記載のＶＨＺアンタゴニストおよび阻害剤のスクリーニングにおいて使用可能である。このようなライブラリーをＶＨＺタンパク質に曝し、タンパク質の活性に対するそれらの効果があれば測定する。
【０２９３】
大きなライブラリーの目的のメンバーを単離する選択プロトコールは、ファージディスプレー技術に代表されるように当技術分野で公知である。繊維状バクテリオファージの表面に多様なペプチド配列がディスプレーされるこのような系(ScottおよびSmith (1990前掲)は、標的抗原と結合する特異的抗体フラグメントのin vitro選択および増幅のための抗体フラグメント（およびそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作出するのに有用であることが証明されている。ＶＨおよびＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列を、それらを大腸菌(E. coli)の原形質周辺空間に向けるリーダーシグナルをコードする遺伝子フラグメントに連結すると、その結果として、得られた抗体フラグメントはバクテリオファージの表面に、一般にバクテリオファージコートタンパク質（例えば、ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）との融合物としてディスプレーされる。あるいは、抗体フラグメントは、λファージキャプシッド（ファージボディー）の外部にディスプレーされる。ファージに基づくディスプレー系の利点は、それらが生物系であるので、選択されたライブラリーメンバーが、その選択されたライブラリーメンバーを含むファージを単に細菌細胞で増殖させることにより増幅することができるということである。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列がファージまたはファージミドベクターに含まれるので、配列決定、発現およびその後の遺伝子操作が比較的容易である。
【０２９４】
バクテリオファージ抗体ディスプレーライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの構築方法は当技術分野で周知である(参照により本明細書に組み入れられる、McCaffertyら(1990)前掲; Kangら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clacksonら(1991) Nature, 352: 624; Lowmanら(1991) Biochemical, 30: 10832; Burtonら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 88: 10134; Hoogenboomら(1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133; Changら(1991) J. Immunol., 147: 3610; Breitlingら(1991) Gene, 104: 147; Marksら(1991)前掲; Barbasら(1992)前掲; HawkinsおよびWinter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marksら, 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lernerら(1992) Science, 258: 1313)。このような技術は、一般にポリペプチドライブラリーの発現にとって必要で有れば改変することができる。
【０２９５】
特に有利なアプローチの１つは、ｓｃＦｖファージライブラリーを使用したものである(Bird, R.E.,ら(1988) Science 242: 423-6, Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883; Chaudharyら(1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070; McCaffertyら(1990)前掲; Clacksonら(1991)前掲; Marksら(1991)前掲; Chiswellら(1992) Trends Biotech., 10: 80; Marksら(1992)前掲)。バクテリオファージコートタンパク質上にディスプレーされるｓｃＦｖライブラリーの種々の実施形態が記載されている。また、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ９６／０６２１３およびＷＯ９２／０１０４７(Medical Research Councilら)およびＷＯ９７／０８３２０(Morphosys, 前掲)に記載されているように、ファージディスプレーアプローチの精密化も知られている。
【０２９６】
もう１つのライブラリー選択技術としては、バクテリオファージプラークまたは溶原菌コロニーとして（双方とも記載の通り(Huseら (1989) Science, 246: 1275; CatonおよびKoprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87; Mullinaxら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 8095; Perssonら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 2432)直接スクリーニングすることができるバクテリオファージλ発現系を含み、本明細書に記載の方法および組成物において用いられる。これらの発現系は、約約１０６またはさらにはそれを超える程度の多数の異なるライブラリーメンバーをスクリーニングする貯めに使用可能である。他のスクリーニング系は、例えば、ライブラリーメンバーの直接的化学合成によるものである。１つの初期の方法は、ＷＯ８４／０３５６４に記載されているものなど、一組のピンまたはロッド上でのペプチド合成を含む。各ビーズが１個のライブラリーメンバーであるペプチドライブラリーを形成する、ビーズ上でのペプチド合成を含む類似の方法が米国特許第４，６３１，２１１号に記載され、関連の方法がＷＯ９２／０００９１に記載されている。これらのビーズに基づく方法の有意義な改良としては、各ライブラリーメンバーのアミノ酸配列の同定を容易にするため、各ビーズにオリゴヌクレオチドなどのユニークな識別子タグを付けることを含む。これらの改良型のビーズに基づく方法はＷＯ９３／０６１２１に記載されている。
【０２９７】
別の化学合成方法は、アレイの離れた所定の場所に、異なる各ライブラリーメンバー（例えば、ユニークなペプチド配列）を配置する方法で表面にペプチド（またはペプチドミメティクス）のアレイを合成することを含む。各ライブラリーメンバーの存在の確認は、アレイにおけるその空間的な場所によって決定される。所定の分子（例えば、受容体）と反応性ライブラリーメンバーの間の結合相互作用が生じるアレイ内の場所を求め、それにより空間的な場所に基づいて反応性ライブラリーメンバーの配列を同定する。これらの方法は米国特許第５，１４３，８５４号；ＷＯ９０／１５０７０およびＷＯ９２／１００９２；Fodorら(1991) Science, 251: 767; DowerおよびFodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem., 26: 271に記載されている。
【０２９８】
ポリペプチドまたはヌクレオチドのライブラリーを作製するための他の系は、ライブラリーメンバーのin vitro合成のための無細胞酵素機構を含む。１つの方法では、ＲＮＡ分子を、標的リガンドに対する選択とＰＣＲ増幅を交互に行うことにより選択する(TuerkおよびGold (1990) Science, 249: 505; EllingtonおよびSzostak (1990) Nature, 346: 818)。同様の技術を、所定のヒト転写因子と結合するＤＮＡ配列を同定するために使用することもできる(ThiesenおよびBach (1990) Nucleic Acids Res., 18: 3203; BeaudryおよびJoyce (1992) Science, 257: 635; ＷＯ９２／０５２５８およびＷＯ９２／１４８４３)。同様にして、大きなライブラリーを作製する方法としてのポリペプチドの合成のためにin vitro翻訳を使用することもできる。一般に安定化されたポリゾーム複合体を含むこれらの方法は、ＷＯ８８／０８４５３、ＷＯ９０／０５７８５、ＷＯ９０／０７００３、ＷＯ９１／０２０７６、ＷＯ９１／０５０５８およびＷＯ９２／０２５３６にさらに記載されている。ＷＯ９５／２２６２５およびＷＯ９５／１１９２２(Affymax)に開示されているものなど、ファージに基づかない別のディスプレー系では、選択のためのポリペプチドのディスプレーにポリゾームを用いる。これら、また上記の文献全ては、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２９９】
コンビナトリアルライブラリー
ライブラリー、特に、候補分子のライブラリーは好適にはコンビナトリアルライブラリー（コンビナトリアル化学ライブラリーとしても知られる）の形であり得る。
【０３００】
「コンビナトリアルライブラリー」とは、本明細書で用いる場合、無作為に選択されたサブユニットからなる化学化合物の複数の種の集合体である。コンビナトリアルライブラリーを、ＶＨＺを阻害することができる分子に関してスクリーニングすることができる。
【０３０１】
とりわけ、タンパク質分解酵素および非タンパク質分解酵素に対して活性なライブラリー、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のアゴニストおよびアンタゴニストのライブラリー、非ＧＰＣＲ標的（例えば、インテグリン、イオンチャネル、ドメイン相互作用、核受容体および転写因子）に対して活性なライブラリーおよび全細胞腫瘍学および抗感染標的のライブラリーを含む、化学化合物の種々のコンビナトリアルライブラリーが現在利用可能である。コンビナトリアルライブラリー、特に、それらの構築および使用の包括的総説は、DolleおよびNelson (1999), Journal of Combinatorial Chemical, Vol 1 No 4, 235-282に提供されている。また、Combinatorial peptide library protocols (Shmuel Cabilly, Totowa, N.J.編: Humana Press, c1998. Methods in Molecular Biology v. 87)も参照。特異的コンビナトリアルライブラリーおよびそれらの構築方法は、米国特許第６，１６８，９１４号(Campbellら)ならびにBaldwinら (1995), "Synthesis of a Small Molecule Library Encoded with Molecular Tags," J. Am. Chem. Soc. 117:5588-5589およびそれらの文献に挙げられている参照文献に開示されている。
【０３０２】
一実地形態において、スクリーニングされるコンビナトリアルライブラリーは、細胞の成分と相互作用して遺伝子発現に影響を及ぼす分子を含み得るように設計されたものである。例えば、クロマチン構造タンパク質に対するコンビナトリアルライブラリーがスクリーニング可能である。この実施形態に有用な他のライブラリーとしては、ヒストン修飾酵素（例えば、ヒストンアセチル化またはヒストンメチル化酵素）、またはＤＮＡ修飾、例えば、ＤＮＡメチル化または脱メチル化に対するコンビナトリアルライブラリーが挙げられる。
【０３０３】
化学コンビナトリアルライブラリー、それらの製造および使用を記載しているさらなる参照は、The Chemical Generation of Molecular Diversity. Michael R. Pavia, Sphinx Pharmaceuticals, A Division of Eli Lilly (1995年7月刊行); Combinatorial Chemical: A Strategy for the Future - MDL Information Systems discusses the role its Project Library plays in managing diversity libraries (1995年7月刊行); Solid Support Combinatorial Chemical in Lead Discovery and SAR Optimization, Adnan M. M. MjalliおよびBarry E. Toyonaga, Ontogen Corporation (1995年7月刊行); Non-Peptidic Bradykinin Receptor Antagonists From a Structurally Directed Non-Peptide Library. Sarvajit Chakravarty, Babu J. Mavunkel, Robin Andy, Donald J. Kyle*, Scios Nova Inc. (1995年7月刊行); Combinatorial Chemical Library Design using Pharmacophore Diversity Keith DaviesおよびClive Briant, Chemical Design Ltd. (1995年7月刊行); A Database System for Combinatorial Synthesis Experiments - Craig JamesおよびDavid Weininger, Daylight Chemical Information Systems, Inc. (1995年7月刊行); An Information Management Architecture for Combinatorial Chemical, Keith DaviesおよびCatherine White, Chemical Design Ltd. (1995年7月刊行); Novel Software Tools for Addressing Chemical Diversity, R. S. Pearlman, Laboratory for Molecular Graphics and Theoretical Modeling, College of Pharmacy, University of Texas (1996年6/7月刊行); Opportunities for Computational Chemists Afforded by the New Strategies in Drug Discovery: An Opinion, Yvonne Connolly Martin, Computer Assisted Molecular Design Project, Abbott Laboratories (1996年6/7月刊行); Combinatorial Chemical and Molecular Diversity Course at the University of Louisville: A Description, Arno F. Spatola, Department of Chemical, University of Louisville (1996年6/7月刊行); Chemically Generated Screening Libraries: Present and Future. Michael R. Pavia, Sphinx Pharmaceuticals, A Division of Eli Lilly (1996年6/7月刊行); Chemical Strategies For Introducing Carbohydrate Molecular Diversity Into The Drug Discovery Process.. Michael J. Sofia, Transcell Technologies Inc. (1996年6/7月刊行); Data Management for Combinatorial Chemical. Maryjo Zaborowski, Chiron CorporationおよびSheila H. DeWitt, Parke-Davis Pharmaceutical Research, Division of Warner-Lambert Company (1995年11月刊行);およびThe Impact of High Throughput Organic Synthesis on R&D in Bio-Based Industries, John P. Devlin (1996年3月刊行)など、URL http://www.netsci.org/Science/Combichem/から入手可能なものが挙げられる。
【０３０４】
コンビナトリアル化学における技術は、新規な医薬リードの作出のための現在の方法の中で広く受け入れられている(Gallop, M. A.ら, 1994, J. Med. Chem. 37:1233-1251; Gordon, E. M.ら, 1994, J. Med. Chem. 37:1385-1401)。使用における１つのコンビナトリアルアプローチは、固相支持体の各粒子上での、異なる構造を含むライブラリーの合成、ライブラリーと可溶性受容体との相互作用、その高分子標的と相互作用する「ビーズ」の同定、および同定された「ビーズ」が持っている構造の決定を含む戦略に基づく(Lam, K. S.ら, 1991, Nature 354:82-84)。このアプローチの別法では、固相支持体から所定のアリコートの化合物を順次遊離させた後、溶液中で活性を測定し、その活性化合物が遊離された粒子を同定し、直接配列決定によりその構造を解明する(Kerr, J. M.ら, 1993, J.Am.Chem.Soc. 115:2529-2531; Nikolaiev, V.ら, 1993, Pept. Res. 6:161-170; Ohlmeyer, M. H. J.ら, 1993, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10922-10926)。
【０３０５】
可溶性ランダムコンビナトリアルライブラリーは、Furka (Furka, A.ら, 1988, Xth International Symposium on Medicinal Chemistry, Budapest 1988; Furka, A.ら, 1988, 14th International Congress of Biochemistry, Prague 1988; Furka, A.ら, 1991, Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493)によって最初に記載された、ペプチドの当モル混合物の作製のために簡単な原理を用いて合成することができる。相互作用性スクリーニングのための可溶性ライブラリーの構築も記載されている(Houghten, R. A.ら.1991, Nature 354:84-86)。K. S. Lamは、不溶性ランダムコンビナトリアルライブラリーを用いる新規かつ予期されないほど有力な技術を開示している。Lamは固相支持体上でランダムコンビナトリアルライブラリーを合成し（その結果、各支持体は均一な分子構造の試験化合物を有していた）、固相結合プロトコールにより、支持体から試験化合物を予め除去することなくライブラリーをスクリーニングした(Lam, K. S.ら, 1991, Nature 354:82-84)。
【０３０６】
よって、候補分子のライブラリーは、合成コンビナトリアルライブラリー（例えば、コンビナトリアル化学ライブラリー）、細胞抽出物、体液（例えば、尿、血液、涙、汗もしくは唾液）、または合成品または天然物のその他の混合物（例えば、小分子もしくは発酵混合物のライブラリー）であり得る。
【０３０７】
分子ライブラリーとしては、例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドもしくはタンパク質のフラグメント；核酸（例えば、アンチセンス；ＤＮＡ；ＲＮＡ；またはペプチド核酸、ＰＮＡ）；アプタマー；または炭水化物もしくは多糖類を含み得る。ライブラリーの各メンバーは単一のものであってもよいし、あるいは混合物の一部（例えば、圧縮ライブラリー）であってもよい。ライブラリーは精製された化合物を含んでもよいし、あるいは「不純」であってもよい（すなわち、有意な量の不純物を含有する）。
【０３０８】
市販のライブラリー（例えば、Affymetrix、ArQule、Neose Technology、Sarco、Ciddco、Oxford Asymmetry、Maybridge、Aldrich、Panlabs、Pharmacopoeia、SigmaまたはTriposeから）も本明細書に記載の方法とともに使用可能である。
【０３０９】
上記のようなライブラリーに加え、ディバーシティーファイルと呼ばれる特殊なライブラリーが、新規な方法の特異性、信頼性または再現性を評価するために使用可能である。ディバーシティーファイルは、アッセイにおいて非特異的検出をもたらし得る多くの化合物種を代表する多数の化合物（例えば、１０００以上の小分子）を含む。ディバーシティーファイルは市販されているか、または上記に挙げられている販売者から市販されている個々の化合物から構築することができる。
【０３１０】
抗ＶＨＺ抗体
このタンパク質の活性を調節するために使用可能な、ＶＨＺのアンタゴニストまたはモジュレーターを含む抗ＶＨＺ剤（例えば、本明細書に記載されているような癌などの疾病を治療または予防する方法のためのもの）はＶＨＺタンパク質に対する抗体を含み得る。
【０３１１】
よって、本発明者らは、ＶＨＺポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、変異体または誘導体と結合する抗体を提供する。このような抗体はＶＨＺ発現の検出および特に乳癌などのＶＨＺ関連疾病の診断に有用である。他の抗体としては、治療活性を有する、すなわち、乳癌を含むいずれのＶＨＺ関連疾病も治療、管理または予防する治療法に使用可能なものを含む。
【０３１２】
ＶＨＺに対する抗体は実施例に記載されるように、ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当するペプチドＲＲＬＲＰＧＳＩＥＴＹＥＱＥＫを感作させることにより作製することができる。
【０３１３】
ＶＨＺと結合することができる抗体の例としては、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｃ３２２８１、アミノ酸３５〜９０、ＬＳ−Ｃ４２４５８、ＬＳ−Ａ６８０６およびＬＳ−Ａ６８０３、ＬＳ−Ｃ３２２８１、LifeSpan Inc、米国ワシントン州シアトル）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＤＳ−ＰＢ−００６７６、RayBiotech Inc、米国ジョージア州ノークロス）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＸＷ−７８５７、ProSci Incorporated、米国カリフォルニア州パウェイ）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｆ４５６０およびＤ９８４０−６６Ａ、United States Biological、米国マサチューセッツ州スワンプスコット）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号Ｄ９８４０−６６、United States Biological、米国マサチューセッツ州スワンプスコット）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＡＨＰ１１４２、AdB Serotec、英国オックスフォード）、ウサギ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−４０４５２、Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン）、ニワトリ抗ヒトＶＨＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１００−７５３２８、Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン）が挙げられる。
【０３１４】
さらに、ＶＨＺに特異的な抗体は、任意の好適なエピトープ、例えば、ＶＨＺタンパク質に由来するエピトープに対して作製することができる。好適なＶＨＺフラグメントの配列はＶＨＺの残基Ｃ９５を含んでよく、この配列に由来するいずれのエピトープも、特異的ＶＨＺ抗体の作製に使用可能である。
【０３１５】
本明細書の目的で、「抗体」とは、選択された標的と結合することができる完全抗体または抗体フラグメントを指す。特に断りのない限り、この用語には、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、天然または操作抗体（キメラ、ＣＤＲグラフトおよびヒト化抗体を含む）、およびファージディスプレーまたは別の技術を用いて作製された人為的に選択された抗体を含む。この用語はまた、単鎖ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーにより作製されたフラグメントも含む。このようなフラグメントは、標的物質に対するそれらの結合活性を保持する完全抗体のフラグメント、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質およびその抗体の抗原結合部位を含む他の合成タンパク質を含む。ＦｖおよびＳｃＦｖなどの小フラグメントは、それらの小ささおよび結果としての優れた組織分布のために診断適用および治療適用に有利な特性を有する。
【０３１６】
これらの抗体およびそのフラグメントは、例えばＥＰ−Ａ−２３９４００に記載されているようにヒト化することができる。さらに、例えば米国特許第５，５４５，８０７号および同第６，０７５，１８１号に記載されているように完全ヒト可変領域（またはそれらのフラグメント）を有する抗体もまた使用可能である。中和抗体、すなわち、ＶＨＺの任意の生物活性を阻害するものも、診断薬および治療薬として使用可能である。
【０３１７】
本明細書に記載の抗体は、標識などのエフェクタータンパク質を含む変更された抗体であってもよい。in vivoまたはin vitroにおいて抗体分布の画像化を可能とする標識を使用することができる。このような標識は、放射性標識、または金属粒子などの、胚または細胞塊内で容易に可視化される陽性造影標識であり得る。さらに、それらは蛍光標識または組織サンプル上で可視化される他の標識であり得る。
【０３１８】
抗体は、免疫化またはファージディスプレーライブラリーの使用によるなどの標準的技術によって作製可能である。このような抗体はＶＨＺタンパク質またはホモログ、フラグメントなどと特異的に結合し得る。
【０３１９】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体が望まれる場合、選択された哺乳類（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）にＶＨＺポリペプチドまたはペプチドを含む免疫原組成物を感作させればよい。宿主種によって、免疫応答を増強するために種々のアジュバントが使用可能である。このようなアジュバントとしては、限定されるものではないが、フロイント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、ならびにリゾレシチン、プルロニック、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルション、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールなどの界面活性物質が挙げられる。ＢＣＧ(バチルス・カルメット−ゲラン(Bacilli Calmette-Guerin))およびコリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium Parvum)は、使用可能な潜在的に有用なアジュバントであり、この物質のアミノ酸配列は精製すれば、全身性防御を刺激する目的で免疫不全個体に投与される。
【０３２０】
免疫動物からの血清を既知の手順に従って回収および処理する。ＶＨＺポリペプチドから得られるエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含む場合には、ポリクローナル抗体をイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。ポリクローナル抗血清を作製し処理する技術は当技術分野で公知である。このような抗体が作製できるように、本発明者らはまた、動物またはヒトにおいて免疫原として用いるために、別のアミノ酸配列に対してハプテン化された(haptenised)ＶＨＺアミノ酸配列またはそのフラグメントを提供する。
【０３２１】
モノクローナル抗体
ＶＨＺポリペプチドまたはペプチドから得られるエピトープに対するモノクローナル抗体も当業者ならば容易に作製することができる。ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を作製する一般的な方法論が周知である。不死化抗体産生細胞系統を細胞融合により、また、発癌ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接的形質転換、もしくはエプスタイン−バーウイルスを用いたトランスフェクションなどの他の技術により作出することができる。軌道(orbit)エピトープに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルを、種々の特性、すなわちイソ型およびエピトープ親和性に関してスクリーニングすることができる。
【０３２２】
モノクローナル抗体は、連続的培養細胞系統による抗体分子の生産を提供する任意の技術を用いて作製することができる。これらには、限定されるものではないが、KoehlerおよびMilstein (1975 Nature 256:495-497)により最初に記載されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kosborら(1983) Immunol Today 4:72; Coteら (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030)およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96頁, Alan R. Liss, Inc., 1985)が含まれる。
【０３２３】
本明細書に記載されるように抗体を改良するために組換えＤＮＡ技術を用いてもよい。よって、診断または治療適用においてその免疫原性を低減するために、キメラ抗体を構築することができる。このような技術は、適当な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るためのヒト抗体遺伝子に対するマウス抗体遺伝子のスプライシングを含む(Morrisonら(1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; Neubergerら(1984) Nature 312:604-608; Takeda ら(1985) Nature 314:452-454)。さらに、ＣＤＲグラフト法により抗体をヒト化すること［欧州特許出願０２３９４００(Winter)］、および任意選択のフレームワーク修飾［ＥＰ０２３９４００］によって免疫原性を最小化することもできる。
【０３２４】
あるいは、単鎖抗体の作製に関して記載されている技術（米国特許第４，９４６，７７９号）をこの物質に特異的な単鎖抗体を産生するように適合させることもできる。
【０３２５】
ＶＨＺポリペプチドまたはペプチドから得られるエピトープに向けられた抗体（モノクローナルおよびポリクローナルの双方）は診断に特に有用である。モノクローナル抗体は、特に、抗イディオタイプ抗体を作製するために使用可能である。抗イディオタイプ抗体は、保護が望まれる物質および／または薬剤の「内部画像」を有する免疫グロブリンである。抗イディオタイプ抗体を作製するための技術は当技術分野で公知である。これらの抗イディオタイプ抗体も療法に有用であり得る。
【０３２６】
また、抗体を、Orlandiら(1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837)およびWinter GおよびMilstein C (1991; Nature 349:293-299)に開示されているように、リンパ球集団におけるin vivo生産を誘導することによるか、または組換え免疫グロブリンライブラリーもしくは高特異的結合試薬パネルをスクリーニングすることにより生産することもできる。
【０３２７】
ポリペプチドまたはペプチドの特異的結合部位を含む抗体フラグメントも作製可能である。例えば、このようなフラグメントとしては、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって作製することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびそのＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド橋を還元することによって作製することができるＦａｂフラグメントが挙げられる。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とするようにＦａｂ発現ライブラリーを構築することができる(Huse WDら(1989) Science 256:1275-128 1)。
【０３２８】
また、単鎖抗体の生産技術（米国特許第４，９４６，７７８号）をＶＨＺポリペプチドに対する単鎖抗体を生産するために適合させることもできる。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳類を含むその他の生物を用いてヒト化抗体を発現させることもできる。
【０３２９】
上記の抗体は、そのポリペプチドを発現するクローンを単離もしくは同定するため、またはそのポリペプチドをアフィニティークロマトグラフィーにより精製するために使用することもできる。
【０３３０】
抗体生産の組換え技術
抗体の生産のため、細菌または哺乳類細胞培養系で確立された手順に従って組換えＤＮＡ技術を用いることもできる。選択された細胞培養系は抗体産物を分泌することができる。
【０３３１】
よって、本発明者らは、シグナルペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列を抗体タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列と適切なリーディングフレームで連結したものと作動可能なように連結されたプロモーターを含む発現カセットを含むハイブリッドベクターで形質転換された宿主、例えば、大腸菌または哺乳類細胞を培養すること、および該タンパク質を単離することを含む抗体の生産方法を開示する。
【０３３２】
in vitroにおけるハイブリドーマ細胞または哺乳類宿主細胞の増殖は、慣例の標準培養培地、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ  １６４０培地に所望により、哺乳類血清、例えば、ウシ胎児血清、または微量元素および増殖持続添加物、例えば、正常マウス腹腔滲出細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質またはオレイン酸などのフィーダー細胞を添加したものである好適な培養培地で行う。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増幅も同様に、当技術分野で公知の好適な培養培地、例えば、細菌では、ＬＢ培地、ＮＺＣＹＭ培地、ＮＺＹＭ培地、ＮＺＭ培地、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ培養液、ＳＯＢ培地、ＳＯＣ培地、２ｘＹＴ培地またはＭ９最小培地、また酵母では、ＹＰＤ培地、ＹＥＰＤ培地、最小培地または完全最小Ｄｒｏｐｏｕｔ培地で行う。
【０３３３】
in vitro生産は比較的純粋な抗体調製物を提供し、大量の目的抗体を得るためのスケールアップが可能である。細菌細胞、酵母または哺乳類細胞培養に関する技術は当技術分野で公知であり、例えばエアリフトリアクターもしくは連続攪拌リアクターでの均質懸濁培養、または例えば中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジでの固定化または捕捉細胞培養が挙げられる。
【０３３４】
大量の目的抗体はまた、in vivoで哺乳類細胞を増殖させることにより得ることもできる。この目的で、目的抗体を産生するハイブリドーマ細胞を組織適合性哺乳類に注射して、抗体産生腫瘍の成長を生じさせる。所望により、これらの動物を、注射前に、炭化水素、特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）などの鉱油で刺激してもよい。１〜３週間後、これらの哺乳類の体液から抗体を単離する。例えば、好適な骨髄腫細胞とＢａｌｂ／ｃマウス由来の抗体産生脾臓細胞の融合により得られたハイブリドーマ細胞、または目的抗体を産生するハイブリドーマ細胞株Ｓｐ２／０に由来するトランスフェクト細胞を、所望によりプリスタンで前処理したＢａｌｂ／ｃマウスに腹膜内注射し、１〜２週間後にそれらの動物から腹水を採取する。
【０３３５】
以上およびその他の技術は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、KohlerおよびMilstein, (1975) Nature 256:495-497;米国特許第４，３７６，１１０号; HarlowおよびLane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harborに、また例えばＥＰ０６２３６７９、ＥＰ０３６８６８４およびＥＰ０４３６５９７記載されている。
【０３３６】
細胞培養上清を、好ましくは、ＰＧＣまたは他の多能性細胞（ＥＳまたはＥＧ細胞など）の免疫蛍光染色、免疫ブロット法、酵素イムノアッセイ、例えば、サンドイッチアッセイもしくはドットアッセイ、またはラジオイムノアッセイにより、目的抗体に関してスクリーニングする。
【０３３７】
抗体の単離に関しては、培養上清または腹水中の免疫グロブリンは、例えば、硫酸アンモニウムによる沈殿、ポリエチレングリコールなどの吸湿材に対する透析または選択膜での濾過などによって濃縮することができる。必要であれば、かつ／または所望であれば、抗体は、慣例のクロマトグラフィー方法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィーおよび／または（イムノ−）アフィニティークロマトグラフィー、例えば、抗原、もしくはそのフラグメント、またはＡタンパク質とのアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。
【０３３８】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞も提供される。ハイブリドーマ細胞は遺伝的に安定であり、所望の特異性のモノクローナル抗体を分泌し、解凍および再クローニングにより深冷凍培養から活性化させることができる。
【０３３９】
また、ＶＨＺポリペプチドに対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を生産するプロセスも含み、このプロセスは、好適な哺乳類、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスに１以上のＶＨＺポリペプチドまたはその抗原フラグメントを感作させ、その免疫哺乳類の抗体産生細胞を好適な骨髄腫細胞系統の細胞と融合させ、その融合において得られたハイブリッド細胞をクローニングし、所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択することを特徴とする。例えば、ＶＨＺで免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞を骨髄腫細胞系統ＰＡＩまたは骨髄腫細胞系統Ｓｐ２／０−Ａｇ１４の細胞と融合させ、得られたハイブリッド細胞を所望の抗体の分泌に関してスクリーニングし、陽性ハイブリドーマ細胞をクローニングする。
【０３４０】
本発明者らは、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＶＨＺを発現する１０〜１０７〜１０８の間の細胞と好適なアジュバントを数回、例えば数ヶ月にわたって、例えば２〜４か月にわたって４〜６回、皮下および／または腹膜内注射することにより免疫し、最後の注射から２〜４日後にその免疫マウスから脾臓細胞を採取し、ポリエチレングリコールなどの融合促進剤の存在下で骨髄腫細胞系統ＰＡＩの細胞と融合させることを特徴とする、ハイブリドーマ細胞系統の作製プロセスを記載する。骨髄腫細胞は、分子量４０００前後の約３０％〜約５０％ポリエチレングリコールを含有する溶液中で、３〜２０倍過剰の免疫マウス由来脾臓細胞と融合させればよい。融合後、細胞を、正常骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞を駆逐しないように、選択培地、例えば、ＨＡＴ培地を添加した、本明細書に前記した好適な培養培地で増殖させる。
【０３４１】
本明細書に前記されたＶＨＺに対する抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡもまた開示される。定義によれば、このようなＤＮＡは、コード一本鎖ＤＮＡ、該コードＤＮＡとそれと相補的なＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ、またはこれらの相補的（一本鎖）ＤＮＡ自体を含む。
【０３４２】
さらに、ＶＨＺに対する抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡは、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする真正(authentic)ＤＮＡ配列またはその突然変異体を有する酵素的または化学的に合成されたＤＮＡであり得る。真正ＤＮＡの突然変異体は、１以上のアミノ酸が欠失または他の１以上のアミノ酸と交換された、上記抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡである。該改変は、抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲ外にあることが好ましい。このような変異型ＤＮＡは、１以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換されて、その新しいコドンが同じアミノ酸をコードする、サイレント変異体であることも意図する。このような変異型配列も変性配列である。変性配列は、遺伝子コードの意味の範囲内で、元々コードされていたアミノ酸の変化を生じずに限定されない数のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されているという点で変性されている。このような変性配列は、重鎖マウス可変ドメインおよび／または軽鎖マウス可変ドメインの最適な発現を得るのに、特定の宿主、特に大腸菌が好む制限部位および／または特定のコドンの頻度が異なるために有用であり得る。
【０３４３】
突然変異体とは、当技術分野で公知の方法に従い、真正ＤＮＡのin vitro突然変異誘発により得られるＤＮＡ変異体を含むものとする。
【０３４４】
完全四量体免疫グロブリン分子のアセンブリおよびキメラ抗体の発現のために、重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする組換えＤＮＡインサートを、重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする対応ＤＮＡと融合させて、例えばハイブリッドベクターに組み込んだ後に適切な宿主細胞に導入する。
【０３４５】
また、ヒト定常ドメインγ、例えば、γ１、γ２、γ３またはγ４、例えばγ１またはγ４と融合したＶＨＺに対する抗体の重鎖ネズミ可変ドメインをコードする深サーとを含む組換えＤＮＡも開示される。同様に、ヒト定常ドメインκまたはλ、例えばκと融合したＶＨＺに対する抗体の軽鎖マウス可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡも開示される。
【０３４６】
別の実施形態では、本発明者らは、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインがスペーサー基により連結されており、所望により、宿主細胞中の抗体のプロセシングを容易にするシグナル配列、および／または抗体の精製を容易にするペプチドをコードするＤＮＡ、および／または切断部位および／またはペプチドスペーサーおよび／またはエフェクター分子を含む、組換えポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを開示する。
【０３４７】
エフェクター分子をコードするＤＮＡとは、診断または治療適用に有用なエフェクター分子をコードするＤＮＡであるものとする。よって、毒素または酵素、特にプロドラッグの活性化を触媒することができる酵素であるエフェクター分子が特に指示される。このようなエフェクター分子をコードするＤＮＡは天然の酵素または毒素をコードするＤＮＡ、その突然変異体の配列を有し、当技術分野で周知の方法によって作製することができる。
【０３４８】
使用
抗ＶＨＺ抗体は、（ａ）抗ＶＨＺ抗体を準備すること；（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を可能とする条件下で生体サンプルを該抗体とともにインキュベートすること；および（ｃ）該抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されるかどうか判定することを含む方法により、生体サンプル中に存在するＶＨＺポリペプチドを検出する方法において使用可能である。
【０３４９】
好適なサンプルとしては、脳、乳房、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉および骨組織などの組織の抽出物、またはこのような組織に由来する新生物増殖物からの抽出物が挙げられる。特に、サンプルは乳房組織、例えば、乳癌に罹患している疑いのある個体からの乳房組織を含み得る。
【０３５０】
抗体は固相支持体に結合させ、かつ／または好適な試薬、対照および説明書などとともにキットとして好適な容器内にパッケージングすることができる。
【０３５１】
抗体送達
ＶＨＺタンパク質に対する抗体は、当技術分野で公知の技術、例えば、リポソーム、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマー、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ＨＥＭＡ、直鎖ポリアミドアミンポリマーなど）などの使用により細胞へ送達することができる。免疫グロブリンおよび／または抗体はまた、原形質膜および／または核膜を通過可能なタンパク質とのタンパク質融合体またはコンジュゲートとして細胞に送達してもよい。例えば、免疫グロブリンおよび／または標的を、転移活性を担うこのようなタンパク質に由来するドメインまたは配列と融合またはコンジュゲートさせることができる。転移ドメインおよび配列としては、ＨＩＶ−１トランス活性化タンパク質（Ｔａｔ）、ショウジョウバエ・アンテナペディアホメオドメインタンパク質および単純ヘルペス−１ウイルスＶＰ２２タンパク質に由来するドメインおよび配列を含み得る。
【０３５２】
医薬組成物および投与
ＶＨＺ核酸、ポリペプチド、フラグメント、ホモログ、その異体または誘導体、モジュレーター、アゴニストまたはアンタゴニスト、構造的に関連のある化合物、またはいずれかの酸性塩を含む抗ＶＨＺ剤は単独で投与することができるが、この有効成分は医薬処方物として処方してもよい。
【０３５３】
よって、本発明者らはまた、抗ＶＨＺ剤を含む医薬組成物を開示する。このような医薬組成物は、例えば記載されているような組成物の形の抗ＶＨＺ剤を、記載されているような症状の治療または緩和のために個体へ送達するのに有用である。
【０３５４】
本明細書に関して医薬組成物とは、有効成分として少なくとも抗ＶＨＺ剤を含むものの組成物である。
【０３５５】
医薬処方物は有効量の抗ＶＨＺ剤を１以上の薬学上許容される担体とともに含む。「有効量」とは、記載されているような疾病の少なくとも１つの症状を緩和するのに十分な量である。
【０３５６】
この有効量は、治療または緩和される特定の疾病もしくは症候群、ならびに患者の年齢および体重、疾病などの状態がどの程度進行しているか、患者の健康状態、症状の重篤度、および抗ＶＨＺ剤が単独で投与されるか他の療法とともに投与されるかによって異なる。
【０３５７】
好適な薬学上許容される担体は当技術分野で周知であり、その医薬処方物の所望の形態および投与様式によって異なる。例えば、それらは希釈剤または賦形剤、例えば、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤および滑沢剤などを含み得る。一般に、担体は固体、液体または気化性担体、またはその組合せである。各担体は、その処方物中の他の成分と適合し、かつ、患者に害がないという意味で「許容される」ものでなければならない。担体は、宿主に投与した際に有害反応（例えば、免疫応答）を誘発せずに生物学的に許容されるものでなければならない。
【０３５８】
医薬組成物の有効成分は、例えば、癌、腫瘍、新生物および他の関連疾患の緩和において治療活性を示すことを意図する。投与計画は最適な治療応答を提供するために調節可能である。例えば、数回に分割した用量を毎日投与してもよいし、あるいは治療状況の緊急性が示すものに比例して減らしてもよい。
【０３５９】
有効化合物は、経口、静脈内（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内もしくは坐剤経路、またはインプラント（例えば、徐放性分子を使用）によるなどの通常の様式で投与可能である。投与経路に応じて、有効成分は酵素、酸および成分を不活性化する可能性のあるその他の天然条件の作用から保護するための材料でコーティングする必要がある場合がある。
【０３６０】
抗ＶＨＺ剤は単独で投与してもよいし、あるいは他の治療薬と組み合わせて投与してもよい。本明細書における使用に好適な他の治療薬は、意図される目的に有効な任意の適合薬剤、またはその薬剤処方物を補足する薬剤である。併用療法に用いられる処方物は、組合せ効果が達成されるように、他の治療と同時にまたは逐次に投与することができる。
【０３６１】
経口投与
いくつかの実施形態において、ＶＨＺ活性、発現または量の阻害剤は経口組成物として提供され、相応に投与される。ＶＨＺ活性、発現または量の阻害剤の用量は約１ｍｇ／日〜約１０ｍｇ／日の間であり得る。
【０３６２】
この医薬組成物は、錠剤、カプセル剤または溶液の形の経口処方物で投与することができる。有効量の経口処方物を患者に毎日１〜３回、疾病の症状が緩和されるまで投与する。
【０３６３】
薬剤の有効量は、患者の年齢、体重および状態によって異なる。一般に、薬剤の１日経口用量は１２００ｍｇ未満、１００ｍｇ超である。１日経口用量は約３００〜６００ｍｇであり得る。経口処方物は便宜には単位投与形で提供され、製薬分野で公知のいずれかの方法によって調製することができる。組成物は好適な薬学上許容される担体とともに任意の所望の投与形に処方することができる。典型的な単位投与形としては、錠剤、丸剤、散剤、溶液、懸濁液、エマルション、顆粒、カプセル剤、坐剤が挙げられる。一般に処方物は、薬剤組成物を液体担体または微粉固体担体またはその双方と均一かつ緊密に会合させ、必要に応じて、その生成物を成形することによって調製される。有効成分は、疾病の治療に有効な量の有効成分となるように、液体、散剤、錠剤またはカプセル剤の形の種々の基本材料に配合することができる。
【０３６４】
組成物は好適には、例えば、不活性希釈剤または同化性可食担体などとともに経口投与可能であり、またはゼラチン硬カプセルもしくは軟カプセルに封入可能であり、または錠剤中に圧縮可能であり、または食事の食品とともに直接配合可能である。経口治療薬の投与では、有効化合物は賦形剤とともに配合可能であり、摂取可能な錠剤、口内  錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップおよびウエハースなどの形で使用することができる。このような治療上有用な組成物中の有効化合物の量は、好適な用量が得られるものである。
【０３６５】
これらの錠剤、トローチ、丸剤およびカプセル剤などはまた次のものを含み得る：トラガカントガム、アラビアガム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンおよびアルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、冬緑油またはチェリーフレーバーなどの香味剤。単位投与形がカプセルである場合、上記の種の材料に加えて液体担体を含み得る。
【０３６６】
コーティング剤として、またはその他の点で投与単位の物理的形態を改良するために、種々の他の材料が存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤はセラック、糖またはその双方でコーティングすることができる。シロップまたはエリキシル剤は有効化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素およびチェリーまたはオレンジフレーバーなどの香味剤を含み得る。当然のことながら、いずれの単位投与形の調製に用いるいずれの材料も薬学上純粋で、その使用量において無毒でなければならない。さらに、有効化合物を徐放性製剤または処方物に配合してもよい。
【０３６７】
注射または静脈内投与
いくつかの実施形態において、抗ＶＨＺ剤は注射または静脈内組成物として提供され、相応に投与される。抗ＶＨＺ剤阻害剤の用量は約５ｍｇ／ｋｇ／２週間〜約１０ｍｇ／ｋｇ／２週間の間であり得る。抗ＶＨＺ剤阻害剤は１０〜３００ｍｇ／日の間、例えば、少なくとも３０ｍｇ／日、２００ｍｇ／日未満または３０ｍｇ／日〜２００ｍｇ／日の間の用量で提供することができる。
【０３６８】
注射用に好適な医薬形としては、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤、および無菌注射溶液もしくは分散液の即時調合用の無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、その形態は無菌でなければならず、容易なシリンジ性(syringability)が存在する程度の流動性があるべきである。組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、その好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性が、例えば、レチシンなどのコーティング剤の使用によって、分散物の場合では必要とされる粒径の維持によって、また、界面活性剤の使用によって、維持され得る。
【０３６９】
局所投与
本明細書に開示される医薬組成物は、局所投与および経口投与に好適なものを含み、罹患組織が主として皮膚または表皮である場合（例えば、乾癬、湿疹および他の上皮疾患）には局所処方物が好ましい。
【０３７０】
局所処方物には、組成物が処置される皮膚表面との直接的接触により外的に適用される医薬形を含む。局所適用の慣例の医薬形としては、浸漬剤、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スティック、スプレー、エアゾール、バスオイルおよび溶液などが挙げられる。局所療法は種々のビヒクルにより送達され、ビヒクルの選択は重要であり、一般に急性疾患を処置するか慢性疾患を処置するかに関連する。一例として、急性皮膚増殖性疾患は一般に水性乾燥製剤で処置するが、慢性皮膚増殖性疾患は水和製剤で処置する。浸漬剤は急性湿性発疹を乾燥させる最も簡単な方法である。ローション（水中の粉末懸濁液）および溶液（溶媒の薬剤を溶かしたもの）は有毛領域および間摩性に理想的である。軟膏または油中水エマルションは、乾性鱗状発疹に適当な最も効果的な水和剤であるが、べとつきがあり、病巣の部位によっては望ましくない場合がある。適当であれば、特に病巣への薬剤組成物の浸透を高めることが望まれる場合には、それらは包帯と組み合わせて適用することができる。クリーンまたは水中油エマルションおよびゲルは吸収性があり、患者にとって美容的に最も許容される(Guzzoら, Goodman & Gilman's Pharmacological Basis of Therapeutics, 第9版, 1593-15950 頁(1996))。クリーム処方物は一般に、石油、ラノリン、ポリエチレングリコール、鉱油、グリセリン、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸グリセリル、セテアリールアルコール、酢酸トコフェリル、ミリスチン酸イソプロピル、ラノリンアルコール、シメチコン、カルボメン、メチルクロリソチアゾリノン、メチルイソチアゾリノン、シクロメチコンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、ならびにこれらの混合物などの成分を含む。
【０３７１】
他の局所適用処方物としては、シャンプー、石鹸およびシェークローションなど、頭皮などの、特に下にある皮膚に残留させるように処方されたものが挙げられる(Arndtら, Dermatology In General Medicine 2:2838 (1993))。
【０３７２】
一般に、局所処方物中の組成物の濃度は、組成物の約０．５〜５０重量％、例えば約１〜３０％、約２〜２０％または約５〜１０％の量である。使用濃度は、最初はその範囲の上の部分とし、治療を続けるにつれて濃度を引き下げるか、またはその処方物の適用頻度を少なくすることができる。局所適用は多くの場合、１日に２回行う。しかしながら、より高用量を１日１回適用しても、またはより低用量をより高い頻度で適用しても効果的であり得る。角質層は貯蔵庫として働き、長時間かけて活性のある皮膚層に薬剤を徐々に浸透させることができる。
【０３７３】
局所適用では、所望の薬理作用を得るためには、十分な量の有効成分が患者の皮膚に浸透しなければならない。一般に、皮膚への薬剤の吸収は薬剤の性質、ビヒクルの挙動、および皮膚の関数であると理解される。３つの主要な変数が、異なる局所薬または異なるビヒクル中の同じ薬剤の吸収または流動速度；ビヒクル中の薬剤の濃度；角質層とのヒクルの間の分配係数および角質層における薬剤の拡散係数、における違いを説明する。治療に有効となるためには、薬剤は皮膚のバリア機能を担う角質層を通過しなければならない。一般に、高いin vitro皮膚浸透を発揮する局所用処方物はin vivoにおいて有効である。Ostrengaら(J. Pharm. Sci., 60:1175-1179 (1971)は、局所適用されたステロイドのin vivo有効性がin vitroにおける採取されたヒト皮膚へのステロイド浸透速度に比例することを実証した。
【０３７４】
皮膚科的に許容され、かつ、当該薬剤に適合する皮膚浸透エンハンサーは、皮膚表面から上皮ケラチノサイトへの有効化合物の浸透を増強するために処方物に配合することができる。有効化合物の皮膚への吸収を高める皮膚エンハンサーは、有効な治療に必要とされる薬剤の量を低減し、その処方物のより長く持続する効果を提供する。皮膚浸透エンハンサーは当技術分野で周知である。有効成分の皮膚浸透を向上させるためには、例えば、ジメチルスルホキシド（米国特許第３，７１１，６０２号）；オレイン酸、１，２−ブタンジオール界面活性剤(Cooper, J. Pharm. Sci., 73:1153-1156 (1984))；エタノールとオレイン酸またはオレイルアルコールの組合せ（ＥＰ２６７，６１７）、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（ＷＯ８７／０３４９０）；デシルメチルスルホキシドおよびアゾン．ＲＴＭ．(Hadgraft, Eur. J. Drug. Metab. Pharmacokinet, 21:165-173 (1996))；アルコール、スルホキシド、脂肪酸、エステル、アゾン．ＲＴＭ．、ピロリドン、尿素およびポリオール(Kalbitzら, Pharmazie, 51:619-637 (1996));１，８−シネオール、メントン、リモネンおよびネロリドールなどのテルペン(Yamane, J. Pharmacy & Pharmocology, 47:978-989 (1995))；アゾン．ＲＴＭ．およびトランスクトール(Transcutol)(Harrisonら, Pharmaceutical Res. 13:542-546 (1996))；およびオレイン酸、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール(Singhら, Pharmazie, 51:741-744 (1996))が知られている。
【０３７５】
薬剤または組成物の浸透のレベルは、当業者に知られている技術により決定することができる。当業者ならば、例えば、有効化合物を放射性標識した後、皮膚が吸収した放射性標識化合物の量を測定することで、試験化合物の皮膚浸透を測定するいくつかの方法のいずれかを用いて、吸収された組成物のレベルを求めることができる。皮膚浸透試験に関する刊行物としては、Reinfenrath, W GおよびG S Hawkins. The Weaning Yorkshire Pig as an Animal Model for Measuring Percutaneous Penetration. In:Swine in Biomedical Research (M. E. Tumbleson編) Plenum, New York, 1986、およびHawkins, G. S. Methodology for the Execution of In Vitro Skin Penetration Determinations. In: Methods for Skin Absorption, B W KemppainenおよびW G Reifenrath編, CRC Press, Boca Raton, 1990,67-80頁;およびW. G. Reifenrath, Cosmetics & Toiletries, 110:3-9 (1995)が含まれる。
【０３７６】
いくつかの適用では、持続作用型の薬剤または組成物は、ポリマーなどの当技術分野で公知の処方物を用いて投与することができる。この薬剤は、処置される領域への薬剤の送達効率を高めるために、当技術分野で公知の方法に従って、皮膚パッチ(Junginger, H. E., Acta Pharmaceutica Nordica 4:117 (1992); Thacharodiら, Biomaterials 16:145-148 (1995); Niedner R., Hautarzt 39:761-766 (1988))または包帯に配合することができる。
【０３７７】
所望により、本明細書に記載の局所用処方物は、付加的賦形剤、例えば、メチルパラベン、ベンジルアルコール、ソルビン酸または第四級アンモニウム化合物などの保存剤；ＥＤＴＡなどの安定剤；ブチル化ヒドロキシトルエンまたはブチル化ヒドロキシアニソールなどの抗酸化剤；ならびにクエン酸塩およびリン酸塩などの緩衝剤を含み得る。
【０３７８】
非経口投与
有効化合物はまた非経口または腹膜内投与が可能である。また分散剤も、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物ならびにオイル中で調製することができる。いくつかの実施形態において、分散剤は３０％カプシトール(CyDex, Inc., Lenexa, Kansas, USA)中で調製することができる。カプシトールは、ナトリウムスルホン酸塩がブチルエーテルスペーサー基またはスルホブチルエーテル（ＳＢＥ）により親油性キャビティーから隔てられたポリアニオン性β−シクロデキストリン誘導体である。シクロデキストリンはＳＢＥ７−β−ＣＤであり得る。
【０３７９】
アジュバント
組成物は、酵素阻害剤と同時投与されるアジュバント中、またはリポソーム中で投与することができる。アジュバントは広義で用いられ、インターフェロンなどの免疫刺激化合物も含む。本明細書で意図されるアジュバントとしては、レゾルシノール、非イオン界面活性剤（ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルなど）が含まれる。酵素阻害剤としては、膵臓トリプシンが含まれる。リポソームとしては、水中油中水ＣＧＦエマルションならびに慣例のリポソームが含まれる。
【０３８０】
微生物増殖の防止
通常の保存および使用条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含み得る。
【０３８１】
微生物作用の防止は、種々の抗菌薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸およびチメロサール(thirmerosal)などによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含むことができる。注射用組成物の長時間吸収は、組成物中での、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
【０３８２】
無菌注射溶液は、必要量の有効化合物を、上記に挙げた種々の他の成分とともに適当な溶媒中に配合し、必要であれば、その後、濾過除菌することにより調製される。一般に、分散剤は、滅菌した有効成分を、基本分散媒と上記に挙げたものからの必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに配合することにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合は、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術を含み、有効成分と、予め濾過除菌したその溶液からの付加的な所望の成分の粉末が得られる。
【０３８３】
薬学上許容される担体
本明細書において「薬学上許容される担体および／または希釈剤」としては、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などのいずれか、また全てが含まれる。薬学上有効な物質に関するこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知である。慣例の媒体または薬剤が有効成分に不適合である場合を除き、その治療組成物中での使用が意図される。補助的有効成分も組成物に配合可能である。
【０３８４】
単位投与形
投与の容易さと用量の均一性のため、医薬組成物は単位投与形で処方することが特に有利である。
【０３８５】
本明細書において単位投与形とは、処置される対象にとって単位用量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は所望の治療効果をもたらすよう計算された所定量の有効材料を、必要な医薬担体と会合して含有する。新規な谷投与形の仕様は、（ａ）有効材料と達成される特定の治療効果のユニークな特徴、および（ｂ）身体的健康が損なわれている病的状態を有する生きている対象における疾病の処置に関する、有効材料などの混成、についての当技術分野に固有の制限によって決まり、また、それらに直接的に依存する。
【０３８６】
主要有効成分は、単位投与形において便宜かつ有効な投与のために有効量で好適な薬学上許容される担体と混成される。補助的有効成分を含む組成物の場合、その用量はその成分の通常の用量および投与様式を参考にして決定される。
【実施例】
【０３８７】
実施例１．ＶＨＺ−ＥＧＦＰ、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ、ＶＨＺ−ＧＳＴおよびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＧＳＴ発現構築物の作製
ヒトＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｑｕｉｃｋ−ｃｌｏｎｅ  ＩＩ  ｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ、カタログ番号６３７２６０）をＶＨＺフラグメントの作製における鋳型として用いる。フォワードプライマーＡ；5’gcgaattcaccatgggcgtgcagccccccaacttctcc3’およびリバースプライマーＢ；5’gtggatcccgtttcgttcgctggtag 3’を用いてＰＣＲを行う（９４、５５、７２℃、４０サイクル）。次に、ＶＨＺ  ＰＣＲフラグメントをｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターのＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ１部位に挿入して、ＥＧＦＰをＣ末端タグとするＶＨＺ（ＶＨＺ−ＥＧＦＰ）を得る。ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を構築するため、上記フォワードプライマーＡおよびリバースプライマーＢをミッド−リバースプライマー5’gccaaagcccagagcagagtgcactcccacagc3’およびミッド−フォワードプライマー5’gcgaattcaccatgggcgtgcagccccccaacttctcc3’とともに、これまでに記載されているように(Zengら 2003)類似の戦略を用いて、触媒的に不活性なＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）を作製する。次に、このＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）ＰＣＲフラグメントをｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターのＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ１部位に挿入し、ＥＧＦＰをＣ末端タグとする変異体ＶＨＺを形成する；ＶＨＺ−（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ。このＶＨＺおよびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）ＰＣＲ産物をそれぞれｓｐＧＥＸ−ＫＧに挿入し、ＶＨＺ−ＧＳＴおよびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＧＳＴを得る。全てのクローンをコード領域のＤＮＡシーケンシングにより確認する。
【０３８８】
実施例２．ＶＨＺ−ＥＧＦＰ、ＶＨＺ−ＥＧＦＰ（Ｃ９５Ｓ）およびＥＧＦＰベクターを単独で安定発現するＭＣＦ−７およびＮＲＫ細胞プールの作製
これらの３つの発現構築物をそれぞれ、リポフェクタミン２０００(Invitrogen)を用い、ヒト乳癌細胞系統−ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）または正常ラット腎臓細胞−ＮＲＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６５０９）にトランスフェクトする。これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン(Invitrogen)を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地で培養する。細胞を１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８中で２０〜３０日選択し、安定な細胞プールを確立する。次に、安定なプール（１０６細胞／ｍｌ）に対してＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ、ＳＥモード(Becton Dickinson)によるＥＧＦＰソーティングを行い、ＥＧＦＰ陽性細胞を選択する。
【０３８９】
実施例３．ＶＨＺ−ＥＧＦＰ細胞下局在の共焦顕微鏡観察および分析
ＶＨＺ−ＥＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトされたＮＲＫ細胞をカバーガラス上で増殖させ、ＰＢＳＣＭ（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有するＰＢＳ）で１回洗浄する。次に、細胞を室温（ＲＴ、２４℃）で２０分間２．７％パラホルムアルデヒド中で固定する。ＰＢＳＣＭでさらに２回洗浄した後、この細胞にＰＢＳＣＭ中０．１２％サポニンで１５分間透過処理を施し、Covance’ Inc (Princeton, NJ)からのウサギ抗ペリセントリン抗体で室温にて１時間、次いで４℃で一晩インキュベートする。これらの細胞をＰＢＳＣＭで３回穏やかに洗浄し、室温で４時間、テキサスレッドとコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ(Sigma)でインキュベートする。このＶＨＺ−ＥＧＦＰを蛍光顕微鏡により直接可視化（緑）する。共焦画像法を行う(Zeiss LSM 510 Image Browser)。
【０３９０】
実施例４．マウスモノクローナルおよびウサギポリクローナル抗ＶＨＺ抗体の作製
この方法はこれまでに記載されている(Liら, 2005)。本発明者らはＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）−ＨＹハイブリドーマクローニングキット(Stemcell Technologies Inc.)を用い、ＶＨＺハイブリドーマを作製した。ＶＨＺ−ＧＳＴで免疫したマウスに由来する脾臓細胞とＳＰ２／０骨髄腫細胞を融合させた後、５０６の生存ハイブリドーマクローンを単離し、増殖させる。全てのクローンをまず、ＥＬＩＳＡによりＶＨＺ結合に関して試験する。８０のクローンがＶＨＺとの良好な反応を示し、最も強い反応性を有する２つの特定のＶＨＺクローンを選択し、これら２つのクローンはいくつかの適用に使用することができる（図１０）。ウサギポリクローナル抗ＶＨＺ血清を作製する(Genemed Synthesis, Inc.)。これらの抗体は、ヒトＶＨＺのアミノ酸残基（１２６〜１４０）に相当する合成ペプチドC-RRLRPGSIETYEQEKでウサギを免疫することにより作製する。抗体をプロテインＡ、次いでペプチドアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。数細胞系統に由来する細胞溶解液の免疫ブロット分析においてこの抗体により、予測された大きさ（１６ｋＤａ）の特異的バンドが検出され、このバンドの検出はＶＨＺ−ＧＳＴ融合タンパク質により特異的に遮断される（図１０Ａ）。
【０３９１】
実施例５．ＮＲＫ、ＭＣＦ−１０ＡおよびＡ４３１細胞における内因性ＶＨＺの共焦顕微鏡観察および分析
ＮＲＫ細胞、ヒト乳房上皮細胞−ＭＣＦ−１０Ａ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０３１７）およびヒト上皮癌細胞−Ａ４３１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５５）をカバーガラス上で増殖させ、ＰＢＳＣＭ（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有するＰＢＳ）で１回洗浄する。次に、細胞を−２０℃で１５分間、１００％メタノール中で固定する。ＰＢＳＣＭでさらに２回洗浄した後、これらの細胞にＰＢＳＣＭ中０．１２％サポニンで１５分間透過処理を施し、マウス抗γ−チューブリン(Sigma)およびウサギ抗ＶＨＺ抗体（１：１５０希釈）とともに室温で１時間、次いで４℃で一晩インキュベートする。これらの細胞をＰＢＳＣＭで３回穏やかに洗浄し、テキサスレッドとコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ(Sigma)およびＦＩＴＣとコンジュゲートされた抗ウサギＩｇＧ(Sigma)とともに室温で４時間インキュベートする。共焦画像法を行う(Zeiss LSM 510 Image Browser)。
【０３９２】
実施例６．チロシンホスファターゼアッセイ
ＥｎｚＣｈｅｋキット（Invitrogen、Ｒ２２０６５）を用いる。製造業者のプロトコール通りに、アッセイウェル中で蛍光性基質をバッファーで再構成し、これらのウェルに所望の潜在的ＰＴＰアーゼ（各タンパク質：ＶＨＺ−ＧＳＴ、ＶＨＺ−ＧＳＴ＋ホスファターゼ阻害剤、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＧＳＴおよび対照ＧＳＴにつき０．６７５ピコモル）を加え、それぞれ３０分または９０分インキュベートする。その後、Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＰＳマイクロプレート分光蛍光計(Molecular Devices)を用い、蛍光を定量する。蛍光は、励起および発光波長それぞれ３５８および４５２ｎｍで１０分ごとに測定する。ホスファターゼ阻害剤オルトバナジウム酸ナトリウム（１０μＭ）をこのアッセイで陰性対照として用いる。
【０３９３】
実施例７．ＢｒｄＵ標識による、新たに合成されたＤＮＡの測定
ＡＰＣ  ＢｒｄＵ  Ｆｌｏｗキット(BD Pharmingen)を製造業者のプロトコールに従って用い、新たに合成されたＤＮＡを測定することにより細胞増殖を評価する。ＦＡＣＳデータはＷｉｎＭＤＩ  ２．８ソフトウエアを用いて分析する。ＡＰＣ標識細胞（ＦＬ２）の
パーセンテージを求める。
【０３９４】
実施例８．ウエスタンブロット解析
詳細な工程はこれまでに記載されている通りとした(Liら, 2005)。ウサギ抗ＶＨＺ抗体を１：５００希釈で用いる。ホスホＲｂ（Ｓｅｒ  ７８０）、ホスホＲｂ（Ｓｅｒ７９５）、ホスホＲｂ（Ｓｅｒ８０７／８１１）およびｂ−アクチン抗体はCell Signaling Technology (Beverly, MA)から入手した。ＧＡＰＤＨ抗体はSanta Cruz Biotechnology (Santa Cruz)から入手した。
【０３９５】
実施例９．免疫組織化学（ＩＨＣ）
本発明者らは、ヒト乳癌検体に対するＶＨＺタンパク質発現を検討した。ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣキット(Orton Southgate, Peterborough, 英国)とともにウサギ抗ＶＨＺ抗体（１：３００希釈）を用いてＩＨＣ試験を行う。ヒト一次乳癌サンプルの全部で６５のホルマリン固定およびパラフィン包埋外科検体を河南医学院(Henan Medical Hospital)の病理学教室のアーカイブから収集する。さらに、それらの結果を再確認するために、ヒト乳房癌組織アレイＴＭＡ（ＣＣ０８−１１−００８）をCybrdi(Frederick)から購入する。ＩＨＣ法はこれまでに記載されている(Liら, 2005)。Ｅ−カドヘリン抗体も購入する(Cell Signaling Technology)。
【０３９６】
実施例１０．  ＭＣＦ−７−ＶＨＺ−ＥＧＦＰおよびＭＣＦ−７−ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ細胞の運動
本発明者らはこれまでに記載されている通りに評価した(Sherriら, 2006)。次に、カバーガラス（１２ｍｍ）上にコンフルエント単層として細胞をプレーティングすることにより、細胞でコーティングしたカバーガラスを、新しい培養ディッシュ（３５ｍｍ）に細胞側を下に転倒させた。このディッシュ新鮮培養培地（１０％ＦＢＳを含む２ｍｌ  ＲＰＭＩ）を穏やかに加える。０時点と４８時間目に画像を採取する。
【０３９７】
実施例１１．レトロウイルスの生成および感染による、ＶＨＺ−ＥＧＦＰおよびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰを発現するＭＣＦ−１０Ａ安定プールの確立
ＶＨＺおよびＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）ＰＣＲフラグメントをそれぞれレトロウイルスベクター(pBABEpuro)のＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ１酵素部位にクローニングする。リポフェクタミンを製造業者(Invitrogen)の説明書に従って用い、両指向性Ｐｈｏｅｎｉｘパッケージング細胞をそれぞれｐＢＡＢＥｐｕｒｏ−ＶＨＺまたはｐＢＡＢＥｐｕｒｏ−ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）レトロウイルスベクターでトランスフェクトする。４８時間後、レトロウイルス上清を採取し、濾過し（０．４５μｍ；Millipore）、５μｇ／ｍｌのポリブレン(Sigma-Aldrich)の存在下で６〜８時間標的ＭＣＦ１０Ａ細胞に加える。感染は２回行う。感染後、細胞を分析前の１週間、ピューロマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）で選択する。
【０３９８】
実施例１２．創傷治癒アッセイにおけるＭＣＦ−１０Ａ−ＶＨＺ−ＥＧＦＰおよびＭＣＦ−１０Ａ−ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ細胞の運動
アッセイは、細胞の単層に対してイエローピペットチップで傷を付けることにより行う。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を新鮮培養培地中で連続インキュベートする。アッセイの開始時（０時間、上のパネル）と終了時（８時間、下のパネル）に創傷領域の写真を撮る。
【０３９９】
実施例１３．外因性ＶＨＺは中心体および細胞質に局在する
タンパク質の細胞内局在を調べると、そのタンパク質の潜在的生物機能についての手掛かりが得られることがある。
【０４００】
ＶＨＺの細胞下局在を評価するため、本発明者らは、ＶＨＺ−ＥＧＦＰを安定発現するＮＲＫ細胞を作製する。これらの細胞の共焦顕微鏡観察は、ＶＨＺがある範囲の細胞下局在を有していることを示す。ＥＧＦＰシグナルは原形質膜および細胞質に見られる（図１Ａ）。重要なこととしては、ＥＧＦＰタグを有するＶＨＺは、中心体マーカーであるペリセントリンと同時局在することから、細胞周期の全ての段階で中心体に高密度で存在することが明らかである（図１Ｂ）。
【０４０１】
内因性ＶＨＺは中心体および細胞質に局在する。ＥＧＦＰタグを有するＶＨＺタンパク質は、その細胞下局在に関する有用な情報を提供する。このＶＨＺの因果性を理解するためには、内因性ＶＨＺタンパク質の細胞下分布を調べることが不可欠である。
【０４０２】
アフィニティー精製ウサギポリクローナル抗ＶＨＺ抗体とともにマウスモノクローナル（ｍＡｂ）抗γ−チューブリン（もう１つの中心体マーカー）抗体による二重免疫蛍光標識を用いると、ＮＲＫ細胞（図２Ａ、パネルＡ〜Ｃ）およびＭＣＦ−１０Ａ細胞（図２Ａ、パネルＤ〜Ｆ）において、内因性ＶＨＺは、γ−チューブリンと同時局在する中心体に明らかに見られる。さらに、抗ＶＨＺ  ｍＡｂはウサギポリクローナル抗ペリセントリン抗体とともに、この場合も、Ａ４３１細胞（図２Ａ、パネルＧ〜Ｉ）において、内因性ＶＨＺは中心体に局在する。
【０４０３】
内因性ＶＨＺは、血清飢餓の後に細胞質から核へ移行し、中心体に高密度で存在する。ＮＲＫ細胞を一晩、血清飢餓状態にする。ウサギ抗ＶＨＺ抗体と抗γ−チューブリンｍＡｂによる二重免疫蛍光標識によれば、内因性ＶＨＺタンパク質は中心体に高い濃度で見られる。さらに、ＮＲＫ細胞において驚くべきことに、細胞質分布の減少と同時に核において増加していることが見られた（図２Ｂ）。
【０４０４】
実施例１４．ＶＨＺはタンパク質チロシンホスファターゼである
ＶＨＺが実際に活性なチロシンホスファターゼであることを確認するため、本発明者らはＶＨＺ−ＧＳＴまたは触媒的に不活性なＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＧＳＴ融合タンパク質のＰＴＰ活性を、対照タンパク質としてＧＳＴ単独と比較してアッセイする。青色蛍光（励起／発光極大〜３５８／４５２ｎｍ）の増加により示されるＶＨＺ−ＧＳＴのＰＴＰアーゼ活性は、Ｃｙｓ  ９５からＳｅｒへの突然変異、またはアッセイにホスファターゼ阻害剤（オルトバナジウム酸ナトリウム）を加えることのいずれかによって無効となる（図３Ａ、パネルＡ）。
【０４０５】
実施例１５．ＶＨＺはＧ１／Ｓ移行を助長することにより細胞増殖を促進する
ＶＨＺの中心体との会合は、ＶＨＺが細胞周期調節の制御において潜在的機能を有していることを示唆する。これを試験するため、本発明者らは、１．ＶＨＺ−ＥＧＦＰ；２．ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰ；および３．ＥＧＦＰベクターの３つの異なる発現構築物を安定発現するＭＣＦ−７細胞を作製した。これら３つの安定なプールを細胞増殖に関してアッセイする。ＶＨＺは細胞増殖速度を増進し得ることが分かる（データは示されていない）。この所見を確認するため、これらの３つの細胞系統で、新たに合成されたＤＮＡへのＡＰＣ−ＢｒｄＵ取り込みを用い、ＤＮＡ合成速度を測定する。この実験は、ＢｒｄＵ取り込みは、ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰまたはＥＧＦＰベクター単独よりもＶＨＺ−ＥＧＦＰを発現する細胞で著しく高いことを示した（図３Ｂ）。また、同じ３つの発現構築物を安定発現するＮＲＫ細胞のＦＡＣＳ分析からも同様の結果が得られ、ＶＨＺが、Ｇ１集団を減らし、Ｓ集団を増やすことにより、Ｇ／Ｓ移行を促進することを示唆した（図３Ｃ）。これにより、野生型ＶＨＺがＧ１／Ｓ期進行に役割を持つ可能性が高まった。
【０４０６】
実施例１６．ＶＨＺは網膜芽腫タンパク質（Ｒｂ）の高リン酸化を直接引き起こし得る
ＶＨＺがどのようにしてＧ１／Ｓ期移行を助長するのか理解するため、また、その潜在的分子機構に取り組むため、本発明者らは、Ｇ１期からＳ期への細胞周期進行の調節に重要ないくつかの主要な分子に対して免疫ブロット研究を行った。本発明者らは、ＶＨＺが腫瘍抑制タンパク質ｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１をダウンレギュレーションし、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）４をアップレギュレーションし得ることを見出した。Ｃｄｋ４はＧ１期からＳ期への進行を統制する主要な担い手の１つであり、網膜芽腫タンパク質ｐＲＢをリン酸化することができる(SherrおよびRoberts, 1999)。これに一致して、本発明者らは、ホスホ特異的抗体により評価したところ、ＶＨＺホスファターゼの過剰発現が、残基Ｓｅｒ７８０、Ｓｅｒ７９５およびＳｅｒ８０７／８１１におけるＲｂのリン酸化の蓄積を間接的にもたらし得ることを示した（図４Ａ、レーン３）。
【０４０７】
実施例１７．過剰産生ＶＨＺタンパク質はヒト乳癌上皮の中心体（〜１０％）または細胞質（〜１７％）のいずれかに見られる
ＶＨＺはＰＲＬ−３ホスファターゼと２８％のアミノ酸配列類似性を有する。ＰＲＬ−３は結腸直腸癌の転移に関連するホスファターゼであるという事実(Sahaら, 2001)に基づき、本発明者らは、ＶＨＺホスファターゼもいくつかの癌の転移に関与する類似の機能を持っている可能性があるという仮説を立てた。ＶＨＺと複数のヒト癌検体との間の関係を検討するため、アフィニティー精製抗ＶＨＺウサギ抗体を免疫組織化学に用い、ＶＨＺタンパク質発現を評価する。本発明者らは、ＶＨＺの過剰発現が乳癌に優先的に関連していることを見出した。６５の乳癌サンプル（ＩＤＣ／ＩＬＣ病期Ｉが３０、ＩＤＣ病期ＩＩが３５）のうち、６サンプルが中心体で高レベルのＶＨＺタンパク質を発現しており、これは癌サンプルの同じ切片に対するウサギ抗ＶＨＺと中心体マーカーマウス抗γ−チューブリンによる二重免疫蛍光（図５Ａ）と、２つの隣接切片に対するウサギ抗ＶＨＺ抗体またはマウス抗γ−チューブリン抗体のいずれかによる一重免疫組織化学（図５Ｂ、パネルＡ〜Ｂ）の双方により証明される。免疫蛍光および免疫組織化学の双方により、ＶＨＺは、浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）または浸潤性小葉癌（ＩＬＣ）病期Ｉと診断されたいくつかの乳癌サンプルの中心体で過剰発現することが確認された（図８Ａ）。ＶＨＺの中心体染色の他、本発明者らは、ＩＤＣ病期ＩＩと診断された異なるサブセットの乳癌サンプルでＶＨＺの別の染色パターンを見出した。６５の乳癌サンプルのうち、１１は、繊維芽様形態を示す分散した上皮腫瘍細胞の細胞質に分布した高レベルのＶＨＺタンパク質を示した（図５Ｃ、パネルＡ〜Ｂ）（図８Ｂ）。
【０４０８】
実施例１８．ＶＨＺの過剰発現は乳癌におけるＥ−カドヘリン発現の欠如と相関している
本発明者らは、ＶＨＺタンパク質が乳癌サンプルの分散した繊維芽様細胞で特異的に過剰発現する場合のいくつかの微小環境での予期されない現象を捉えたことから、これらの細胞が上皮−間葉移行（ＥＭＴ）を受けているかどうかを調べた。ＥＭＴは胚発生および発癌の際に起こり、そこでは上皮細胞が繊維芽様特性を獲得し、上皮細胞の接着性および細胞骨格成分を失う(ThieryおよびSleeman, 2006)。Ｅ−カドヘリンの欠如の結果、細胞−細胞間接着結合が解離し、in vivoにおいて腫瘍細胞の浸潤性が高まり、これはＥＭＴの顕著な特徴である(Kangら, 2004)。本発明者らは、大多数のＶＨＺ過剰発現細胞（赤い矢印で示す）はＥ−カドヘリンの発現を欠いており（黒い矢印で示す）（図６Ａ）、このことはこれらの癌細胞がＥＭＴのプロセスを受けている可能性があることを示唆する。
【０４０９】
実施例１９．ＭＣＦ−７細胞におけるＶＨＺの過剰発現は細胞遊走を促進する
ＶＨＺは乳癌進行中のＥＭＴに関連しているものと思われたことから、本発明者らは、次に、ＶＨＺが癌細胞遊走の誘発に役割を果たすかどうかを試験した。ＶＨＺにより駆動される細胞の運動を研究するため、ＶＨＺ−ＥＧＦＰまたはＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）−ＥＧＦＰを発現するＭＣＦ−７細胞の細胞遊走特性を調べた。ＭＣＦ−７細胞の遊走は通常の創傷治癒またはトランスウェルチャンバーアッセイを用いた評価が困難であるため、本発明者らは、これまでに記載されている別の「転倒カバーガラス」アッセイを用いた(Sherriら, 2006)。示されているように、ＭＣＦ−ＶＨＺ細胞はカバーガラスから遊走した（図６Ｂ、パネルＡ’  白い矢印）が、ＭＣＦ−ＶＨＺ（Ｃ９５Ｓ）細胞はカバーガラス内に留まっていた（図６Ｂ、パネルＢ’  白い矢印）。これらの結果から、ＶＨＺは細胞運動を促進できることが示唆される。この細胞遊走の促進におけるＶＨＺの特性をさらに、不死化ヒト乳房上皮−ＭＣＦ１０Ａ細胞を用いて検討する（図１０）。
【０４１０】
実施例２０．考察
本発明者らは、ＶＨＺが新規な中心体ホスファターゼであることを示した。中心体は、細胞周期の進行および細胞分裂に重要な役割を果たすオルガネラである。中心体は細胞周期を通して微小管列を組織し、減数分裂細胞および有糸分裂細胞における細胞分裂の調節に中枢的役割を果たす。中心体オルガネラの脱調節はヒトの遺伝病および癌に関連している。実際に、多くのヒト腫瘍は中心体の異常を示す(Doxsey, 2001; Nigg, 2002)。
【０４１１】
本発明者らのＭＣＦ−７細胞およびＮＲＫ細胞におけるＶＨＺ過剰発現の結果は、ＶＨＺホスファターゼが細胞周期進行においてＧ１／Ｓ移行の促進に役割を果たしている可能性があるという結論を裏付けるものである。ＭＣＦ−７細胞の増殖の促進におけるＶＨＺの機構的役割に取り組む試みにおいて、Ｇ１／Ｓ細胞周期の制御に重要な役割を果たすいくつかの重要な分子を調べた。本発明者らは、ＶＨＺの過剰発現が細胞周期進行の阻害剤である腫瘍抑制タンパク質ｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１をダウンレギュレーションすることができることを見出した。ｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１はキナーゼ活性を阻害し、Ｇ１／Ｓ進行を遮断する(Pestellら, 1999)。ＶＨＺによるｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１のダウンレギュレーションは、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）４に対するｐ２１の阻害を解除する可能性がある(SherrおよびRoberts, 1999)。このことに一致して、本発明者らは、ＶＨＺがＣｄｋ４発現をアップレギュレーションすることを見出した。真核生物の細胞周期の進行は、一部には、厳格に調節されたＣＤＫの活性に依存している。Ｃｄｋ４の活性化はリン酸化に関して標的網膜芽腫タンパク質Ｒｂを標的とする可能性がある(Lukasら, 1996)。結論として、ＶＨＺはＲｂのリン酸化の増加を間接的に引き起こす。Ｒｂの高リン酸化は、細胞周期のＧ１期内の制限点を通過する進行を制御するＲｂの機能を不活性化することが知られている(Lukasら, 1996, Sherr, 1996)。よって、ＶＨＺの過剰発現は、Ｒｂの不活性化を介して間接的にＧ１／Ｓ期制限点を克服することができる。今後の研究が必要であるが、本発明者らの結果から、細胞周期進行におけるＶＨＺの役割の検討モデルを提案することができた（図４Ｂ）。
【０４１２】
いくつかの乳癌サンプルにおいて、本発明者らは、上皮腫瘍細胞の中心体（〜１０％）または細胞質（〜１７％）のいずれかにＶＨＺタンパク質の過剰発現を見出した。ＶＨＺは、遊走性繊維芽様形態を示した癌細胞でより高い頻度で発現する。本発明者らは、ＩＬＣまたはＩＤＣ病期Ｉ乳癌サンプルで、ＶＨＺ−中心体−陽性細胞が典型的な上皮形態を示したが、ＩＤＣ病期ＩＩサンプルでは、ＶＨＺ−サイトゾル−陽性細胞がより高い頻度で分散型上皮に関連していることを見出した。これらの結果は、ＶＨＺは最初に中心体で過剰発現し、その後、細胞の運動性を獲得した腫瘍細胞のサイトゾル全体で過剰発現することを示し得る。重要なこととしては、強く染色されたＶＨＺ−サイトゾル−陽性細胞はＥ−カドヘリン陰性である。このＥ−カドヘリンの欠如は、上皮細胞を遊走性間葉細胞へ変換するＥＭＴの複雑なプロセスの初期段階を果たす(Kangら, 2004)。Ｅ−カドヘリンの欠如の結果、細胞−細胞間接着結合が解離し、腫瘍細胞の浸潤性が高まる。ＶＨＺのアップレギュレーションは、ＥＭＴを誘発するため、または典型的な上皮現象を細胞遊走を促進するように変化させるための駆動力の１つとして働き得る。癌細胞は隣接する新生物性上皮の障壁を乗り越えて、新たな場所への悪性細胞の浸潤および成長に至るには、高い運動性を獲得する必要がある(ThieryおよびSleeman, 2006)。腫瘍細胞は、個細胞遊走戦略と集合細胞遊走戦略の双方を含む多様なパターンで周囲の組織基質に浸潤する(Friedl, 2003; VogelsteinおよびKinzler, 2004)。本発明者らの研究では、本発明者らは、ＶＨＺ−サイトゾル−陽性細胞に、個細胞遊走（図５Ｃ、パネルＡ）と集合細胞遊走（図５Ｃ、パネルＢ）の双方が同時に存在することを示した。これらの現象は、in vivoにおける微小環境内のＶＨＺにより駆動される比較的初期の局部浸潤発生を再現し、表している。ＶＨＺが腫瘍進行および癌細胞遊走に果たす正確な役割は分かっていないが、本発明者らのデータは、ＶＨＺの過剰発現またはその活性の上昇が局部浸潤にとって重要な初期事象であり得ることを示唆する。この仮説と一致して、本発明者らは、ＶＨＺがＭＣＦ−７細胞遊走を促進し得ることを示すことができる（図６Ｂ）。
【０４１３】
本発明者らの研究は本明細書において、ＶＨＺが細胞周期調節および乳癌進行に関与するホスファターゼであるという証拠を提供する。本発明者らの知見は、この小さな小ホスファターゼに対して、今後の診断および治療戦略における重要な標的としての洞察を明らかにする。本発明者らは、ＶＨＺの阻害が初期段階の乳癌転移の拡散を遮断するための治療アプローチの基礎となり得ることを提案する。
【０４１４】
（参照文献）
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本明細書に挙げられている各出願および特許、ならびに上記の各出願および特許に引用または参照されている各文献（各出願および特許の手続追行中のものを含む）「出願引用文献」、ならびに各出願および特許および出願引用文献のいずれかに引用または記載されている任意の製品に関するいずれの製造業者の説明書またはカタログも参照により本明細書に組み入れる。さらに、本明細書に引用されている全ての文献、ならびに本明細書に引用されている文献に引用または参照されている全ての文献、ならびに本明細書に引用または記載されている任意の製品に関するいずれの製造業者の説明書またはカタログも参照により本明細書に組み入れる。
【０４１５】
当業者には、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、記載されている本発明の方法および系の種々の改変および変更が自明である。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求された本発明はこのような特定の実施形態に不当に制限されるものではないと理解すべきである。実際に、分子生物学または関連分野の熟練者には自明の、本発明を実施するための記載の様式の種々の改変は本特許請求の範囲内にあるものとする。
【図１Ａ−１】
2010535503.tif 000004
【図１Ａ−２】
2010535503.tif 000005
【図１Ａ−３】
2010535503.tif 000006
【図１Ｂ−１】
2010535503.tif 000007
【図１Ｂ−２】
2010535503.tif 000008
【図２Ａ】
2010535503.tif 000009
【図２Ｂ−１】
2010535503.tif 000010
【図２Ｂ−２】
2010535503.tif 000011
【図２Ｂ−３】
2010535503.tif 000012
【図３Ａ】
2010535503.tif 000013
【図３Ｂ−１】
2010535503.tif 000014
【図３Ｂ−２】
2010535503.tif 000015
【図３Ｂ−３】
2010535503.tif 000016
【図３Ｂ−４】
2010535503.tif 000017
【図３Ｃ−１】
2010535503.tif 000018
【図３Ｃ−２】
2010535503.tif 000019
【図３Ｃ−３】
2010535503.tif 000020
【図４Ａ】
2010535503.tif 000021
【図４Ｂ】
2010535503.tif 000022
【図５Ａ−１】
2010535503.tif 000023
【図５Ａ−２】
2010535503.tif 000024
【図５Ａ−３】
2010535503.tif 000025
【図５Ｂ−１】
2010535503.tif 000026
【図５Ｂ−２】
2010535503.tif 000027
【図５Ｂ−３】
2010535503.tif 000028
【図５Ｃ−１】
2010535503.tif 000029
【図５Ｃ−２】
2010535503.tif 000030
【図５Ｃ−３】
2010535503.tif 000031
【図６Ａ−１】
2010535503.tif 000032
【図６Ａ−２】
2010535503.tif 000033
【図６Ｂ−１】
2010535503.tif 000034
【図６Ｂ−２】
2010535503.tif 000035
【図７Ａ】
2010535503.tif 000036
【図７Ｂ】
2010535503.tif 000037
【図８】
2010535503.tif 000038
【図９】
2010535503.tif 000039
【図１０Ａ−１】
2010535503.tif 000040
【図１０Ａ−２】
2010535503.tif 000041
【図１０Ｂ】
2010535503.tif 000042
【図１１】
2010535503.tif 000043
【配列表】
2010535503000001.app
【国際調査報告】
2010535503.tif 000044
2010535503.tif 000045
2010535503.tif 000046