(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）の化合物及びプロドラッグ、並びに当該化合物及びそれらのプロドラッグの薬学的に許容される塩及び溶媒和物に関する。当該化合物は、有用な医薬特性、特にプロテインキナーゼの阻害能を有する。    【化１】2010502767.tif 000010
2010502767.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2010502767.tif 000009
の化合物又は対応するＮ−オキシド若しくはプロドラッグ；又は該化合物の薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物；並びに該塩及び溶媒和物のＮ−オキシド及びプロドラッグ。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物を、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は賦形剤と共に含む、医薬組成物。
【請求項３】
患者における関節炎症を治療する方法であって、請求項１に記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項４】
患者における関節リウマチを治療する方法であって、請求項１に記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項５】
患者における関節炎症を治療する方法であって、メトトレキサートと併用して請求項１に記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項６】
患者における関節リウマチを治療する方法であって、メトトレキサートと併用して請求項１に記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項７】
患者における腫瘍を治療する方法であって、請求項１に記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項８】
患者におけるマントル細胞リンパ腫を治療する方法であって、請求項１に記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項９】
患者における血管新生を阻害する方法であって、請求項１に記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、置換アザインドール類、それらの製造、これらの化合物を含む医薬組成物、及びプロテインキナーゼの阻害によって調節することができる病態の治療におけるそれらの薬学的な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼは、細胞外メディエータ及び環境の変化に応じて細胞の活性化、増殖及び分化を制御するシグナル伝達事象に関与する。一般的に、これらのキナーゼは、幾つかの群に分類される；セリン及び／又はトレオニン残基を選択的にリン酸化するもの及びチロシン残基を選択的にリン酸化するもの［非特許文献１］。セリン／トレオニンキナーゼは、例えば、プロテインキナーゼＣアイソフォーム［非特許文献２] 、及びｃｄｃ２などのサイクリン依存性キナーゼの１群を含む［非特許文献３］。チロシンキナーゼは、上皮成長因子受容体などの膜貫通増殖因子受容体［非特許文献４］、及びｐ５６ｔｃｋ、ｐ５９ｆＹｎ、ＺＡＰ−７０及びｃｓｋキナーゼなどの細胞質非受容体キナーゼを含む［非特許文献５］。
【０００３】
不適切に高いプロテインキナーゼ活性は、異常な細胞機能に起因する多くの疾患に関与している。これは、例えば、酵素の変異、過剰発現又は不適切な活性化に関連する、例えば、キナーゼの適切な調節メカニズムの異常により；又はキナーゼのシグナル上流又は下流の伝達にも関与するサイトカイン又は増殖因子の過剰又は過少生産により、直接又は間接に生じる可能性がある。これらの例の全てにおいて、キナーゼの作用の選択的阻害は有益な効果を有することが期待される。
【０００４】
Ｓｙｋは種々の造血細胞に発現する７２−ｋＤａの細胞質タンパク質チロシンキナーゼであり、そして抗原受容体を細胞応答に連結させる幾つかのカスケードにおける重要な要素である。このように、Ｓｙｋはマスト細胞において高親和性ＩｇＥ受容体、ＦｃεＲ１のシグナル伝達に、またＴ及びＢリンパ球における受容体抗原シグナル伝達に極めて重要な役割を担っている。マスト細胞、Ｔ及びＢ細胞に存在するシグナル伝達経路は共通の特徴を有する。受容体のリガンド結合ドメインには、固有のチロシンキナーゼ活性が欠如している。しかしながら、それらは免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む伝達サブユニットと相互作用する［非特許文献６]。これらのモチーフは、ＦｃεＲ１のβ及びγサブユニットの両方に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のξサブユニットに、そしてＢ細胞受容体（ＢＣＲ）のＩｇＧα及びＩｇＧβサブユニットに存在する [非特許文献７] 。抗原の結合及び多量体化の際に、ＩＴＡＭ残基はＳｒｃファミリーのタンパク質チロシンキナーゼによってリン酸化される。Ｓｙｋは、２つのタンデムＳｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメイン及びＣ末端触媒ドメインを有する特異な種類のチロシンキナーゼに属する。これらのＳＨ２ドメインは高い親和性でＩＴＡＭに結合し、並びに活性化受容体を有するＳｙｋのこのＳＨ２介在結合はＳｙｋキナーゼ活性を促進し、そしてＳｙｋを細胞質膜に局在化させる。
【０００５】
Ｓｙｋ欠損マウスでは、マスト細胞脱顆粒が阻害されることから、これはマスト細胞安定剤の開発の重要なターゲットになることを示唆する［非特許文献８］。同様の研究は、ＢＣＲ及びＴＣＲシグナル伝達におけるＳｙｋの重要な役割を証明している［非特許文献９及び１０］。Ｓｙｋは、またＩＬ−５及びＧＭ−ＣＳＦに応じて好酸球の生存に関与するように見える［非特許文献１１］。マスト細胞、ＢＣＲ及びＴ細胞シグナル伝達におけるＳｙｋの重要な役割にもかかわらず、Ｓｙｋが下流エフェクターを伝達するメカニズムについてはほとんど知られていない。２つのアダプタータンパク質、ＢＬＮＫ（Ｂ細胞リンカータンパク質、ＳＬＰ−６５）及びＳＬＰ−７６はそれぞれＢ細胞及びマスト細胞においてＳｙｋの基質となることが示され、そしてＳｙｋを下流エフェクターと調和させることが仮定されている［非特許文献１２及び１３］。更に、Ｓｙｋは、Ｂ細胞増殖に重要な役割を果たすＣＤ４０シグナル伝達経路において、重要な役割を担うと思われる［非特許文献１４］。
【０００６】
Ｓｙｋは、更に低親和性ＩｇＧ受容体（Ｆｃγ−ＲＩＩＡ）を介して刺激され、又はコラーゲンによって刺激される血小板の活性化に関与する［非特許文献１５］。
【０００７】
焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）は、インテグリン介在シグナル伝達経路に関与する非受容体チロシンキナーゼである。ＦＡＫは焦点接着部位のインテグリンと共局在化し、そしてＦＡＫ活性化及びそのチロシンリン酸化は、多くの細胞型がそれらの細胞外リガンドに結合するインテグリンに依存性であることが示されている。幾つかの研究の結果は、ＦＡＫ阻害剤が癌治療において有用であり得るという仮説を支持する。例えば、ＦＡＫ欠乏細胞は走化性シグナルに応じて移動し難く、そしてＦＡＫのＣ末端ドメインの過剰発現は、細胞伸展並びに走化性移動をブロックする（非特許文献１６、１７) ；加えて、ＦＡＫアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した腫瘍細胞はその付着性を失い、アポトーシスを起こした（非特許文献１８)。ＦＡＫは、前立腺、乳腺、甲状腺、結腸及び肺癌に過剰発現することが報告されている。ＦＡＫの発現レベルは、最も悪性表現型を示す腫瘍と直接相関する。
【０００８】
既存血管系から出芽することによる血管新生又は新しい血管形成は、胚発生及び器官形成に最も重要である。関節リウマチ、糖尿病性腎症において及び腫瘍発生時に、新血管形成の異常増強が観察される（非特許文献１９）。血管新生は、内皮細胞の活性化、移動、増殖及び生存を含む複雑な多段階過程である。過去２０年の腫瘍血管新生の分野における広範囲な研究では、現在臨床評価中のＫＤＲ阻害剤を含む、多くの新しい抗血管新生剤の発見をもたらしたキナーゼ、プロテアーゼ及びインテグリンを含む数多くの治療標的が同定されている（非特許文献２０）。血管新生阻害剤は、悪性腫瘍の発生又は再増殖に対する最新の補助的及び予防的設定に対しても使用できる。
【０００９】
染色体分離及び紡錘体集合に関与する幾つかのタンパク質が、酵母及びショウジョウバエで同定されている。これらのタンパク質の破壊は、染色体誤分離及び単極又は破壊紡錘体をもたらす。これらのうち、キナーゼは、それぞれS. cerevisiae及びショウジョウバエ由来のＩＰｌ１及びオーロラキナーゼであり、中心体分離及び染色体分離に必要とされる。酵母のＩＰｌ１の１つのヒトホモログは最近クローニングされ、異なる研究室で特徴付けされた。このキナーゼはオーロラ２と命名され、ＳＴＫ１５又はＢＴＡＫはセリン／トレオニンキナーゼファミリーに属する。Bischoffらは、オーロラ２が発癌性で、ヒト結腸直腸癌で増幅することを示した（非特許文献２１)。これは、乳癌などの上皮腫瘍を含む癌においても実証されている。
【００１０】
本発明者らは、今回有用な医薬特性、特にプロテインキナーゼ阻害能、より具体的には、Ｓｙｋキナーゼを選択的に阻害する能力を有する、新しい置換アザインドールを見出した。このアザインドール化合物は、特許文献１に開示のものに関連するが、その特許に具体的には開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６７７０６４３号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】S. K. Hanks and T. Hunter, FASEB. J., 1995, 9, pages 576-596
【非特許文献２】A. C. Newton, J. Biol. Chem., 1995, 270, pages 28495-28498
【非特許文献３】J. Pines, Trends in Biochemical Sciences, 1995, 18, pages 195-l97
【非特許文献４】S. Iwashita and M. Kobayashi, Cellular Signalling, 1992, 4, pages 123-132
【非特許文献５】C. Chan et. al., Ann. Rev. Immunol., 1994, l2, pages 555-592
【非特許文献６】M. Reth, Nature, 1989, 338, pages 383-384
【非特許文献７】N. S. van Oers and A. Weiss, Seminars in Immunology, 1995, 7, pages 227-236
【非特許文献８】P. S. Costello, Oncogene, 1996, 13, pages 2595-2605
【非特許文献９】A. M. Cheng, Nature, 1995, 378, pages 303-306 (1995）
【非特許文献１０】D. H. Chu et. al., Immunological Reviews, 1998, 165, pages  167-180
【非特許文献１１】S. Yousefi et. al., J. Exp. Med., 1996, 183, pages 1407-1414
【非特許文献１２】M. Ishiai et. al., Immunity, 1999, 10, pages 117-125
【非特許文献１３】L. R. Hendricks−Taylor et. al., J. Biol. Chem, 1997, 272, pages 1363-1367
【非特許文献１４】M. Faris et al., J. Exp. Med., 1994,  179, pages 1923-1931
【非特許文献１５】F. Yanaga et. al., Biochem. J., 1995, 311, (Pt. 2), pages 471-478
【非特許文献１６】Sieg et. al., J. Cell Science, 1999, 112, pages 2677-2691
【非特許文献１７】Richardson A. and Parsons T., Cell, 1997, 97, pages 221-231
【非特許文献１８】Xu et. al., Cell Growth Differ. 1996, 4, pages 413-418
【非特許文献１９】Folkman, Nat. Med., 1995, 1, pages 27-31
【非特許文献２０】Jekunen et. al., Cancer Treatment Rev. 1997, 23, pages 263-286
【非特許文献２１】EMBO J, 1998, 17, pages 3052-3065
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、式Ｉ：
【化１】
2010502767.tif 000003
の化合物、薬学的に許容されるその塩又はプロドラッグ、又は当該化合物、その塩又はそのプロドラッグの溶媒和物に関する。
【００１４】
本発明は、また式Ｉの化合物を含む医薬組成物、及び患者におけるＳｙｋに関連する生理的状態に対して式Ｉの化合物を使用する方法、又はそれを治療し又は予防する方法を目的とする。
【００１５】
本発明は、また式Ｉの化合物の製造に有用な中間体となる化合物を製造する方法を目的とする。
【００１６】
別の態様において、本発明は、一般式（Ｉ）：
【化２】
2010502767.tif 000004
の化合物、対応するＮ−オキシド及びプロドラッグ；並びに当該化合物、Ｎ−オキシド及びプロドラッグの薬学的に許容される塩及び溶媒和物（例えば、水和物）を、１つ又はそれ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤と一緒に含む、医薬組成物を目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】式Ｉの化合物を製造するための反応スキーム。
【図２】不完全フロインドアジュバントにおけるウシ鼻由来のＩＩ型コラーゲンを注射し、Ａ００３３９７７６９、即ち、式Ｉの化合物（３．０、１０又は３０ｍｇ／ｋｇ、ｂ.ｉ.ｄ.（１日２回））で第６日目〜第２１日目にわたって処置したラットの平均足くるぶし直径。不完全フロインドアジュバント（４００μｇ／４００μｌ／ラット）において、コラーゲンの皮内注射によって第０日目と第７日目に感作した雌性ＬＥＷラットの平均足くるぶし直径。動物には第６日目〜第２１日目に投与。
【図３】Ａ００３３９７７６９（３．０、１０又は３０ｍｇ／ｋｇ）で処置したＣＩＡラットの踵骨における、骨びらん（骨量に対する骨表面の比率）の解析。
【図４】不完全フロインドアジュバントにおけるウシ鼻由来のＩＩ型コラーゲンを注射し、Ａ００３３９７７６９（３．０ｍｇ／ｋｇ）単独又はメトトレキサート（０．１又は０．２ｍｇ／ｋｇ）との併用で第６日目〜第２０日目もしくは第２１日目にわたって処置して、ビヒクル投与した動物と比較した、ラットの平均足くるぶし直径。ラットＣＩＡに対する単独療法又はメトトレキサートとの併用療法での、ＳＹＫ阻害剤、Ａ００３３９７７６９（３．０ｍｇ／ｋｇ、ｂ.ｉ.ｄ.）の効果。
【図５】不完全フロインドアジュバントにおけるウシ鼻由来のＩＩ型コラーゲンを注射し、Ａ００３３９７７６９（１０ｍｇ／ｋｇ）単独又はメトトレキサート（０．１又は０．２ｍｇ／ｋｇ）との併用で第６日目〜第２０日目もしくは第２１日目にわたって処置して、ビヒクル投与した動物と比較した、ラットの平均足くるぶし直径。ラットＣＩＡに対する単独療法又はメトトレキサートとの併用療法での、ＳＹＫ阻害剤、Ａ００３３９７７６９（１０ｍｇ／ｋｇ、ｂ.ｉ.ｄ.）の効果。
【図６】Ａ００３３９７７６９（３．０又は１０ｍｇ／ｋｇ）単独又はメトトレキサート（０．１又は０．２ｍｇ／ｋｇ）との併用で処置したＣＩＡラットの踵骨における、骨びらん（骨量に対する骨表面の比率）の解析。
【図７】不完全フロインドアジュバントにおけるウシ鼻由来のＩＩ型コラーゲンを注射し、Ａ００３３９７７６９Ａ（１０及び３０ｍｇ／ｋｇ、ｂ.ｉ.ｄ.）で第１２日目〜第２１日目にわたって治療的処置したラットの平均足くるぶし直径。不完全フロインドアジュバント（４００μｇ／４００μｌ／ラット）において、コラーゲンの皮内注射によって第０日目と第７日目に感作した雌性Lewisラットの平均足くるぶし直径。両足の平均。
【図８】Ａ００３３９７７６９Ａ（１０又は３０ｍｇ／ｋｇ、ｂ.ｉ.ｄ.）で治療的処置したＣＩＡラットの踵骨における、骨びらん（骨量に対する骨表面の比率）の解析。
【図９】ラット重量に対する式Ｉの化合物の効果。
【図１０】ヘモグロビン濃度に対する式Ｉの化合物の効果。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
このように、１つの態様において、本発明は、一般式（Ｉ）：
【化３】
2010502767.tif 000005
の化合物、これは、２−［４−（７−エチル−５Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピラジン−６−イル）−フェニル］−プロパン−２−オ−ルとしても知ることができる、を含む医薬組成物を目的とする。
【００１９】
本明細書において、「本発明の化合物」の用語及びその等価表現は、上述の一般式（Ｉ）の化合物を包含することを意味するものであって、その表現は、文脈的に許容される場合は、そのプロドラッグ、その薬学的に許容される塩、及びその溶媒和物、例えば、水和物を含む。同様に、それ自体が特許請求されるか否かに関係なく、中間体への言及は、文脈的に許容される場合は、それらの塩及び溶媒和物を包含することを意味するものである。文脈的に許容される場合、具体的な説明の目的で特定の例が時に本文に示されるが、これらの例は純粋に説明のためであり、文脈的に許容される場合、他の例を除外することを意図するものではない。
【００２０】
本明細書で使用される略号：
ＡＴＰ：  アデノシン三リン酸
ＤＴＴ：  ジチオスレイトール
ＰＢＳ：  リン酸緩衝生理食塩水。
【００２１】
上記のように、また本発明の明細書全体を通して、以下の用語は、特別に指示がない限り、以下の意味を有するものと解釈される。
【００２２】
「患者」は、ヒトと他の哺乳動物の両者を含む。
【００２３】
「プロドラッグ」は、代謝的手段により（例えば、加水分解により）、インビボでそのＮ−オキシドを含む式（Ｉ）の化合物に変換可能である化合物を意味する。例えば、ヒドロキシ基を含む式（Ｉ）の化合物のエステルは、加水分解によりインビボで親分子に変換可能である。代わりに、カルボキシル基を含む式（Ｉ）の化合物のエステルは、加水分解によりインビボで親分子に変換可能である。
【００２４】
ヒドロキシ基を含む式（Ｉ）の化合物の好適なエステルは、酢酸エステル、クエン酸エステル、乳酸エステル、酒石酸エステル、マロン酸エステル、シュウ酸エステル、サリチル酸エステル、プロピオン酸エステル、コハク酸エステル、フマル酸エステル、マレイン酸エステル、メチレン−ビス−β−ヒドロキシナフトエ酸エステル、ゲンチシン酸エステル、イセチオン酸エステル、ジ−ｐ−トルオイル酒石酸エステル、メタンスルホン酸エステル、エタンスルホン酸エステル、ベンゼンスルホン酸エステル、ｐ−トルエンスルホン酸エステル、シクロヘキシルスルファミン酸エステル及びキナ酸エステルである。
【００２５】
ヒドロキシ基を含む式（Ｉ）の化合物のエステルの特に有用な種類は、Bundgaard et. al., J. Med. Chem., 1989, 32, pages 2503-2507によって記載されたものから選択された酸部分から形成することができ、そして置換（アミノメチル）−安息香酸エステル、例えば、２つのアルキル基が互に結合し、及び／又は酸素原子によって若しくは場合により置換窒素原子によって、例えば、アルキル化窒素原子によって遮断されたジアルキルアミノ−メチル安息香酸エステル、より具体的には（モルホリノ−メチル）安息香酸エステル、例えば、３−又は４−（モルホリノメチル）安息香酸エステル、及び（４−アルキルピペラジン−１−イル）安息香酸エステル、例えば、３−又は４−（４−アルキルピペラジン−１−イル）安息香酸エステルを含む。
【００２６】
本発明の化合物のあるものは塩基性であり、そして当該化合物は、遊離塩基の形態において又はその薬学的に許容される酸付加塩の形態において有用である。
【００２７】
酸付加塩は使用するのにより都合のよい形態であり；実際には、塩形態の使用は本質的に遊離塩基形態の使用になる。酸付加塩を製造するのに使用することができる酸としては、遊離塩基と組み合わせる場合、好ましくは薬学的に許容される塩を製造するもの、即ち、そのアニオンが塩の薬剤用量で患者に無毒であり、その結果、遊離塩基に固有の有益な阻害効果がアニオンに起因する副作用によって損なわれるものではない塩が挙げられる。該塩基性化合物の薬学的に許容される塩が好ましいが、特定の塩がそれ自体中間体生成物としてだけで所望される場合であっても、例えば、塩が精製及び同定だけの目的で形成される場合、又はそれをイオン交換の手段により薬学的に許容される塩を製造する際の中間体として用いる場合であっても、全ての酸付加塩は遊離塩基形態の原料として有用である。本発明の範囲内の薬学的に許容される塩としては、無機酸又は有機酸から得られるもの、及びハロゲン化水素酸塩、例えば、塩酸塩及び臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルファミン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マロン酸塩、シュウ酸塩、サリチル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、メチレン−ビス−ｂ−ヒドロキシナフトエ酸塩、ゲンチシン酸塩、イセチオン酸塩、ジ−ｐ−トルオイル酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩及びキナ酸塩が挙げられる。
【００２８】
それ自体が活性化合物として有用であるのと同様に、本発明の化合物の塩は、例えば、業界に周知の技術により、塩と親化合物、副生成物及び／又は出発物質との間の溶解度差の利用により、化合物を精製する目的に有用である。
【００２９】
本発明の化合物は有用な薬理活性を示し、従って医薬組成物に組み込まれ、そして特定の内科的疾患に罹患した患者の治療に使用される。従って、本発明は、更なる態様に従って、治療に使用するための、本発明の化合物及び本発明の化合物を含有する組成物を提供する。
【００３０】
本発明の範囲内の化合物は、文献に記載され、また後述するインビトロ手順に記載される試験により、キナーゼ触媒活性を阻害又はブロックし、そしてその試験結果は、ヒト及び他の哺乳動物における薬理活性と相関すると考えられる。このように、更なる実施態様において、本発明は、プロテインキナーゼ阻害剤（例えば、Ｓｙｋ、ＦＡＫ、ＫＤＲ又はオーロラ２）の投与により改善し得る状態に罹患している又は状態にある患者の治療に用いるために、本発明の化合物及び本発明の化合物を含有する組成物を提供する。例えば、本発明の化合物は、炎症性疾患、例えば、喘息：炎症性皮膚疾患（例えば、乾癬、疱疹状皮膚炎、湿疹、壊死性及び皮膚血管炎、水疱性疾患）；アレルギー性鼻炎及びアレルギー性結膜炎；関節炎、関節リウマチを含む関節炎症、並びにリウマチ様脊椎炎、痛風性関節炎、外傷性関節炎、風疹関節炎、乾癬性関節炎及び変形性関節炎など他の関節炎状態の治療に有用である。該化合物は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性滑膜炎、自己免疫性糖尿病、自己免疫性脳脊髄炎、大腸炎、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患、心血管疾患、多発性硬化症、再狭窄、心筋炎、Ｂ細胞リンパ腫、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病及び他の移植関連拒絶事象、癌及び腫瘍（結腸直腸、前立腺、乳腺、甲状腺、結腸及び肺の癌）、並びに炎症性腸疾患の治療にも有用である。加えて、該化合物は、腫瘍の抗血管新生剤としても有用である。そして更に、本発明の化合物は腫瘍細胞を抑制する薬剤としても有用である。
【００３１】
本発明の治療方法の特別な実施態様は、関節炎症の治療である。
【００３２】
本発明の治療方法の別の特別な実施態様は、関節リウマチの治療である。
【００３３】
本発明の治療方法の特別な実施態様は、癌、腫瘍及び他の増殖性疾患の治療である。
【００３４】
本発明の治療方法の別の特別な実施態様は、液状腫瘍を含む癌の治療である。
【００３５】
本発明の治療方法の別の特別な実施態様は、マントル細胞リンパ腫の治療である。
【００３６】
本発明の治療方法の更にもう１つの特別な実施態様は、血管新生の阻害による障害の治療である。
【００３７】
本発明の更なる特徴に従い、プロテインキナーゼ阻害剤（例えば、Ｓｙｋ、ＦＡＫ、ＫＤＲ又はオーロラ２）の投与により改善し得る状態、例えば、前述のような状態に罹患している又はその状態にある、ヒト又は動物の患者の治療方法が提供され、この方法は、本発明の化合物又は本発明の化合物を含有する組成物の有効量を患者へ投与することを含む。「有効量」とは、Ｓｙｋ、ＦＡＫ、ＫＤＲ又はオーロラ２などの、プロテインキナーゼの触媒活性を阻害し、そして所望の治療効果をもたらすのに有効な本発明化合物の量を記載することを意味する。
【００３８】
当然のことながら、本明細書における治療に対する言及としては、予防的治療並びに確立した状態の治療が含まれる。
【００３９】
本発明は、また、その範囲内に本発明の化合物を、薬学的に許容される担体又は賦形剤と一緒に含む医薬組成物を含む。
【００４０】
本発明の化合物は、あらゆる適切な方法で投与することができる。実際には、本発明の化合物は、一般的には非経口、局所、直腸、経口又は吸入で；特に経口経路又は吸入で投与され得る。
【００４１】
本発明の組成物は、１つ又はそれ以上の薬学的に許容される補助剤又は賦形剤を用いて常法に従って製造することができる。補助剤は、とりわけ、希釈剤、滅菌水媒体及び種々の非毒性有機溶媒を含む。組成物は、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、水溶液又は懸濁剤、注射剤、エリキシル剤又はシロップ剤の形態で提供してもよく、そして薬学的に許容される製剤を得るために、甘味料、着香料、着色剤、又は安定剤を含む群から選ばれる１つ又はそれ以上の薬剤を含有することができる。ビヒクルの選択及びビヒクル中の活性物質の含量は、一般的に活性化合物の溶解度及び化学的性質、特別な投与方式及び製剤実務で認められる規定に従って決定される。例えば、乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウムなどの賦形剤、及びステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリム及びタルクなどの滑沢剤と組み合わせた、澱粉、アルギン酸及び特定の複合珪酸塩などの崩壊剤が、錠剤の製造用に使用できる。カプセル製造には、乳糖及び高分子量グリコールを用いるのが有利である。水性懸濁液を使用する場合は、乳化剤又は懸濁化を促進する薬剤を含有することができる。蔗糖、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール及びクロロホルム又はそれらの混合物などの希釈剤も使用できる。
【００４２】
非経口投与には、植物油、例えば、ゴマ油、ラッカセイ油若しくはオリーブ油中の本発明の生成物の乳剤、懸濁剤若しくは溶液、又は水及びプロピレングリコールなどの水−有機溶液、オレイン酸エチルなどの注射用有機エステル、並びに薬学的に許容される塩の滅菌水溶液が使用される。本発明の生成物の塩の溶液は、筋肉内又は皮下注射による投与に特に有用である。また純蒸留水中の塩の溶液を含む水溶液は、そのｐＨを適切に調整し、十分な量のグルコース又は塩化ナトリウムと慎重に緩衝液化して等張化し、そして加熱、照射又は精密濾過によって滅菌するという条件で静脈内投与に使用可能である。
【００４３】
局所投与には、本発明の化合物を含有するゲル剤（水又はアルコール系の）、クリーム剤又は軟膏剤を使用することができる。本発明の化合物は、経皮バリアを介する化合物の制御放出を可能にする、パッチ剤に適用するためにゲル又はマトリックス基剤に組み込んでもよい。
【００４４】
吸入投与には、本発明の化合物をネブライザー又は懸濁液もしくは溶液エアロゾル用に適切な担体に溶解又は懸濁してもよく、又はドライパウダー吸入器用に適切な固形担体上で吸収又は吸着させてもよい。
【００４５】
直腸投与用の固形組成物としては、公知の方法によって製剤化され、そして少なくとも本発明の１つの化合物を含有する坐剤を含む。
【００４６】
本発明の組成物中の有効成分の割合は変動してもよく、適切な投薬量が得られるような比率を構成する必要がある。当然、幾つかのユニット製剤がほぼ同時に投与されてもよい。用いられる用量は医師によって決定されるもので、そして所望の治療効果、投与経路及び治療期間、並びに患者の状態に依存する。成人では、用量は、一般的に、吸入で約０.００１から約５０、好ましくは約０.００１から約５ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、経口投与で約０.０１から約１００、好ましくは０.１から７０、更に特別には０.５から１０ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、そして静脈内投与で約０.００１から約１０、好ましくは０.０１から１ｍｇ／ｋｇ体重／日である。個々のケースで、用量は治療される被験者に特有の要素、例えば、年齢、体重、全般的な健康状態及び医薬品の有効性に影響を及ぼし得る他の特性に従って決定される。
【００４７】
本発明の化合物は、所期の治療効果を得るために必要なだけの頻度で投与し得る。一部の患者は、高い又は低い用量に速やかに反応し、そしてはるかに弱い維持用量で十分となり得る。他の患者では、個々の患者の生理的条件に従って、１日当り１から４用量の割合で長期間治療が必要な場合があり得る。一般的に、活性生成物は１日当り１から４回経口投与される。勿論、一部の患者では、１日当り１回又は２回用量以下を処方する必要がある。
【００４８】
本発明の化合物は公知の方法、すなわちこれまで使用され又は文献に記載の方法、例えば、R. C. Larock in Comprehensive Organic Transformations, VCH publishers, 1989によって記述されている公知の方法の適用又は適応によって、製造することができる。
【００４９】
以下に記載の反応では、反応への好ましくない関与を避けるために、最終生成物中に必要とする反応性官能基、例えば、ヒドロキシ、アミノ、イミノ、チオ又はカルボキシル基を保護する必要があると思われる。従来の保護基は、標準技法に従って使用できるが、例えば、T. W. Greene and P. G. M. Wuts in “Protective Groups in Organic Chemistry” John Wiley and Sons, 1991を参照されたい。
【００５０】
当然のことながら、本発明の化合物は、不斉中心を含んでもよい。これらの不斉中心は、独立にＲ又はＳの立体配置であってもよい。本発明の特定の化合物が幾何異性を示してもよいことも当業者には明らかであると思われる。当然のことながら、本発明は、上記の式（Ｉ）の化合物の、個々の幾何異性体及び立体異性体、及びラセミ混合物を含むそれらの混合物を含む。当該異性体は、公知の方法、例えば、クロマトグラフィー法及び再結晶技術の適用又は適応により、それらの混合物から分離することができ、又はこれらはそれらの中間体の適切な異性体から別々に製造される。
【００５１】
本発明の更なる特徴によれば、本発明の化合物の酸付加塩は、公知の方法の適用又は適応により、遊離塩基と適切な酸との反応によって製造することができる。例えば、本発明の化合物の酸付加塩は、適切な酸を含有する水若しくは水性アルコール溶液又は他の適切な溶媒に遊離塩基を溶解し、そして溶液を蒸発することにより塩を分離するか、又は遊離塩基と酸を有機溶媒中で反応させることによって製造することができるが、その場合、塩は直接分離するか、又は溶液の濃縮によって得ることができる。
【００５２】
本発明の化合物の酸付加塩は、公知の方法の適用又は適応により、塩から再生することができる。例えば、本発明の親化合物は、アルカリ、例えば、重炭酸ナトリウム水溶液又はアンモニア水溶液による処理によって、それらの酸付加塩から再生することができる。
【００５３】
本発明の化合物は、公知の方法の適用又は適応により、それらの塩基付加塩から再生することができる。例えば、本発明の親化合物は、酸、例えば、塩酸による処理によって、それらの塩基付加塩から再生することができる。
【００５４】
本発明の化合物は、本発明の方法の間に、溶媒和物（例えば、水和物）として都合よく製造され、又は形成することができる。本発明の化合物の水和物は、ジオキサン、テトラヒドロフラン又はメタノールなどの有機溶媒を使用して、再結晶により水性／有機溶媒から都合よく製造することができる。
【００５５】
本発明の更なる特徴によれば、本発明の化合物の塩基付加塩は、遊離酸と適切な塩基との反応によって、公知の方法の適用又は適応により製造することができる。例えば、本発明の化合物の塩基付加塩は、適切な塩基を含有する水若しくは水性アルコール溶液又は他の適切な溶媒に遊離酸を溶解し、そして溶液を蒸発することにより塩を分離するか、又は遊離酸と塩基を有機溶媒中で反応させることによって製造することができるが、その場合、塩は直接分離するか、又は溶液の濃縮によって得ることができる。
【００５６】
出発物質及び中間体は、公知の方法、例えば、実施例に記載の方法又はそれらの明らかに化学的に同等の方法の適用又は適応により製造することができる。
【００５７】
本発明は、更に例示されるが、以下の説明のための実施例に限定されるものではない。
【００５８】
３００ＭＨｚ1Ｈ核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）は、Varian Mercury装置で記録された。核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）において、化学シフト（δ）はテトラメチルシランに対するｐｐｍで表わされる。略語は以下の意味を有する：ｓ＝一重線；ｄ＝二重線；ｔ＝三重線；ｍ＝多重線；ｑ＝四重線；ｄｄ＝二重線の二重線；ｄｄｄ＝重複二重線の二重線。
【００５９】
保持時間（ＲT）と関連質量イオンを測定する高速液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）実験は、以下の方法を用いて行なわれる。質量分析（ＭＳ）は飛行時間質量分析計のMicromassＬＣＴ時間を用いて測定される。この方法は正電荷エレクトロスプレーイオン化であり、質量ｍ／ｚを１００から１０００までスキャンする。液体クロマトグラフィーは、AgilentTM1100シリーズのBinary Pump & Degasser；固定相：Phenomenex SynergiTM  ２μ、Hydro-RP、２０×４.０ｍｍカラム、移動相：Ａ＝水中０．１％ギ酸（ＦＡ）、Ｂ＝アセトニトリル中０．１％ＦＡで実施される。注入量は、ＣＴＣ分析ＰＡＬシステムにより５μＬ。流量は１ｍＬ／分。傾斜溶離は、５％Ｂから９０％Ｂを３分で、また９０％Ｂから１００％Ｂを２分で行なう。補助検出器は、Agilent 1100シリーズＵＶ検出器、波長＝２２０ｎｍ及びSedere SEDEXTM 75蒸発光散乱（ＥＬＳ）検出器、温度＝４６℃、窒素圧＝４バールである。
【００６０】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）のＲF値は、MerckTMシリカプレートを用いて測定された。
【００６１】
〔実施例１〕
２−［４−（７−エチル−５Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピラジン−６−イル）−フェニル］−プロパン−２−オ−ル
合計で６.０ｇの２−［４−（７−エチル−５Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピラジン−６−イル）フェニル］プロパン−２−オ−ル（化合物１）を、２工程でｎ−プロピルピラジン（化合物２）及び４−アセチルベンゾニトリル（化合物３）から製造した。
化合物１の合成は以下のように実施された。ｎ−プロピルピラジン（化合物２）及び４−アセチルベンゾニトリル（化合物３）とナトリウムビス(トリメチルシリル)アミドとを、テトラヒドロフラン中４０℃でカップリングし、中間化合物４を３０％の収率で得た。化合物４と塩化メチルマグネシウムとを、テトラヒドロフラン中４０℃で反応させ、２−プロパノールで再結晶して、目的の化合物１を収率７４％で得た。その合成を図１に示す。
【００６２】
実験の部
２−［４−（７−エチル−５Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピラジン−６−イル）フェニル］エタノン（化合物４）
ｎ−プロピルピラジン（化合物２，９１２ｍｇ、７.４６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５ｍＬ）中の溶液を、ナトリウムビス(トリメチルシリル)アミド（２ＭのＴＨＦ溶液；１３ｍＬ、２６ｍｍｏｌ、３．５当量）の溶液へ２０℃で７分かけて滴下した。濃紫赤色溶液が得られ、温度は１６.４℃に降下した。４−アセチルベンゾニトリル（化合物３、１．０８ｇ、７.４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５ｍＬ）中の溶液を、１８分かけて１３.３℃で加えた。温度は１２.６℃まで降下して、褐色溶液が生じた。混合物を室温で１時間撹拌して、約３５℃で６時間加熱し、次いで室温で約６０時間撹拌を続けた。混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）に注ぎ、酢酸エチル（２×１５０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を水洗し、そして浴温４０℃、８０〜１０トールでBuchi上で濃縮して濃黄色固体を得た。固体をジエチルエーテル（２５ｍＬ）中で磨り潰し、濾過し、そしてエーテル（２５ｍＬ）で洗浄した。固体を風乾し、黄色固体として６００ｍｇ（３０.３％）の化合物４を得た。1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、図１）δ：８.５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ）、８．１５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ）、８．１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３Ｈｚ）、７．９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ）、３．１（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝９Ｈｚ）、２．７（３Ｈ、ｓ）、１．４（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝９Ｈｚ）。
【００６３】
１−［４−（７−エチル−５Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピラジン−６−イル）フェニル］プロパン−２−オ−ル（化合物１）
テトラヒドロフラン（１１６ｍＬ）中の塩化メチルマグネシウム（ＴＨＦ中に３Ｍ；８１.３ｍＬ、２４４ｍｍｏｌ、１０当量）の冷却溶液（〜５℃）へ、テトラヒドロフラン（３４８ｍＬ）中の化合物４（６．５ｇ、２４.４ｍｍｏｌ）の溶液を９０分かけて滴下し、温度を添加の速度により約０℃に維持するようにした。添加により鮮明な黄色の溶液が認められた。１時間後、ＴＬＣ（酢酸エチル／ｎ−ヘプタン１／１）の結果、出発物質は存在せずに、低Ｒfに移動した新しいスポットを認めた。そのバッチを、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（約６６０ｍＬ）を慎重に添加することによってクエンチした。高粘度の塊が生じ、酢酸エチル（２５０ｍＬ）及び水（２５０ｍＬ）をその混合物に加えた。水層を除去し、酢酸エチル（２×２５０ｍＬ）で再抽出した。酢酸エチル画分を合わせて水（２×２００ｍＬ）で洗浄し、そして浴温４０℃、８０〜１０トールで、Buchi上で濃縮して、淡いベージュ色の固体として７．５ｇ（１０９％）の化合物１を得た。1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、図２）δ：１２.０（１Ｈ、ｓ）、８．３５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．５Ｈｚ）、８．２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３.５Ｈｚ）、７．６（４Ｈ、ｓ）、５．１（１Ｈ、ｓ）、２．９（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝８Ｈｚ）、１．５（６Ｈ、ｓ）、１．３（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝８Ｈｚ）。
【００６４】
この物質を前の実験で得た物質と合わせた。合わせた物質（８.５ｇ）を２−プロパノール（１５０ｍＬ）と還流することにより、透明な淡褐色溶液を得、それを減圧下に加熱ブフナー漏斗で加熱状態で濾過した。沈殿が濾過フラスコ中に生成したが、その混合物を沸騰するまで加熱して透明溶液を得た。この物質を撹拌しながら室温に冷却して、淡黄色固体を得た後、これを濾過して冷却２−プロパノールで洗浄して５０℃の真空オーブンで乾燥して、淡黄色固体として６.０ｇ（７１％）の化合物１を得た。ＬＣＭＳ：ＲT＝２.５５分、ＭＳ：２８２（Ｍ＋Ｈ）；1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6、図３）δ：１２.０（１Ｈ、ｓ）、８．３５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３Ｈｚ）、８．２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３Ｈｚ）、７．６（４Ｈ、ｓ）、５．１（１Ｈ、ｓ）、２．９（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝９Ｈｚ）、１．５（６Ｈ、ｓ）、１．３（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝９Ｈｚ）。
【００６５】
化合物１の元素分析を表１に示す。
表１
元素当りの理論％：Ｃ７２.５７％、Ｈ６．８１％、Ｎ１４.９３％、Ｏ５.６９％
実験値１：        Ｃ７２.４６％、Ｈ７．０５％、Ｎ１５.０７％
【００６６】
ＳＹＫに対するインビトロ試験手順
アッセイ名：          脾臓チロシナーゼ（Ｙ）キナーゼ
省略名：              Ｓｙｋ
アッセイ形式：        基質リン酸化
検出形式：            ストレプトアビジン・フラッシュプレート
モジュレーション：    阻害
【００６７】
PerkinElmer Life Sciencesのストレプトアビジン・フラッシュプレート・プラス・マイクロプレートTMを、インプレート放射分析のために計画される。各ウェルの内部は、ポリスチレンベースのシンチラントの薄層で永久コーティングし、次いでストレプトアビジンの共有結合を行う。これらのプレートは、ビオチン化捕捉分子を利用する広範囲の分析への応用に好適である。ポリ（Ｇｌｕ、Ｔｙｒ）４：１（ＰＧＴ）は、チロシン特異性プロテインキナーゼの基質として働き得るランダム共重合体である。このアッセイでは、ＰＧＴ−ビオチン基質のリン酸化をＳｙｋにより測定する。この酵素は、［γ33Ｐ］−リン酸塩を［γ33Ｐ］−ＡＴＰからポリマー基質に移動させる。このアッセイは非結合３８４−ウェルプレートにおいて溶液中で行なわれた。リン酸を用いて反応を停止した後、反応混合物を３８４−ウェルのストレプトアビジン・フラッシュプレートに移した。ビオチン化基質をプレート上で捕捉し、そしてホットＡＴＰを含む他の試薬を洗い流した。次いで、各ウェルの放射能をカウントした。
【００６８】
酵素反応は、３８４−ウェルの非結合プレ−トで行なわれた。最終試薬濃度／ウェルは、Ｓｙｋ：７．７７ｎＭ、ＰＧＴ−ビオチン基質：１５.５ｎＭ、33Ｐ−ＡＴＰ：０.１μＣｉ、Ｔｒｉｓ：５０ｍＭ、ｐＨ：７．５、ＭｇＣｌ2：１０ｍＭ、ＭｎＣｌ2：３ｍＭ、ＤＴＴ：１ｍＭ、γ−グロブリン類：０．１ｍｇ／ｍｌであった。反応容積：２２μｌ、反応時間：１２０分、温度：室温であった。反応を２０μｌの９％リン酸を添加して停止させ、そして３０μｌの反応混合物を３８４−ウェルのストレプトアビジン・フラッシュプレートに移した。室温で９０分のインキュベーションの後、プレートを５０ｍＭのＴｒｉｓ中０．０２％のTween-20でｐＨ７．５において洗浄した。放射能をTop CountTMシンチレーションカウンターでカウントした。
【００６９】
酵素希釈液を調製し、使用に先立って氷上に保持した。ＭｎＣｌ2及びＤＴＴを使用前にアッセイ緩衝液中に新たに添加した。
【００７０】
アッセイ用の物質を表２に示す。
【表１】
2010502767.tif 000006
【００７１】
酵素：
フラッグタグを付けたＳｙｋ（０.１８４ｍｇ／ｍｌ、ＭＷ＝３５，５３１．８１Ｄａ）を、業界公知の方法により調製して精製した。
基質：
ビオチン結合ポリ（Ｇｌｕ、Ｔｙｒ）４：１はCisbio internationalTM（カタログ番号６１ＧＴ０ＢＬＢ、ロット番号１６）から購入した。
【００７２】
使用したアッセイ溶液を表３に示す。
【表２】
2010502767.tif 000007
【００７３】
化合物希釈：
１.  化合物は、Ｈ空列を有する９６−ウェルのＵ底ポリプロピレンプレートに、１００％ＤＭＳＯ中１０ｍＭの１０μｌ／ウェルだけ取り込まれた。１ｍＭの化合物を含む１００μｌを得るために、９０μｌ／ウェルの１００％ＤＭＳＯが加えられ、再封され、更にこのプレ−トは暗所に室温で保存された。
２.  化合物目的プレートの作製：３８４−ウェルの丸底ポリプロピレンプレート（Corning保存プレート）において、カラム３及び１３に２３μｌ／ウェルのＨ2Ｏを加え、カラム４〜１２及びカラム１４〜２２に、２０μｌ／ウェルの３０％ＤＭＳＯを加えた（Ｏ列及びＰ空列を残して）。
３.  キナーゼ・プロファイリング・プログラムを用いたBiomek 2000TMによる化合物希釈（３００μＭ、１００μＭ、３０μＭ、・・・など１０の希釈）の調製：８番目を除去した２０μｌチップ（Ｈ列）を用いて、１０μｌ／ウェルの１ｍＭの化合物を元プレートのカラム１から目的プレートのカラム３に移して、最初の３００μＭ希釈を作製した。その後、目的プレートにおいて、１０μｌ／ウェルの３００μＭ希釈をカラム３からカラム４に混合して移して、１００μＭ希釈を作製した。１０μｌ／ウェルの１００μＭ希釈をカラム４から５に混合して移して、３０μＭ希釈を作製した・・・などを行った。各化合物に対する２倍希釈を、例えば、１０μｌ／ウェルの化合物を元プレートのＡ１から目的プレートのＡ３及びＢ３に移すことによって行った。混合と移動を繰り返した。次いで、１０μｌ／ウェルの１ｍＭ化合物を元プレートのカラム２から目的プレートのカラム１３に移して、３００μＭ希釈を作製した。その後、目的プレートにおいて、１０μｌ／ウェルの３００μＭ希釈をカラム１３からカラム１４に混合して移して、１００μＭ希釈を作製した・・・などを行った。Ｈ空列を含む１つの全面９６−ウェルの元プレートから、６つの化合物の目的プレートを完成することができる。
４.  基準化合物親プレートの作製：５μｌ／ウェルの１００％ＤＭＳＯ中１０ｍＭのロスコビチン溶液を、９６−ウェルのＵ底ポリプロピレンプレート内のＨ１及びＨ２に加え、次いで４５μｌ／ウェルの１００％ＤＭＳＯで１ｍＭ溶液に希釈した。
５.  基準化合物目的プレートの作製：３８４−ウェルの丸底ポリプロピレンプレート（CorningTM保存プレート）において、２３μｌ／ウェルのＨ2Ｏをカラム３及び１３に加え、２０μｌ／ウェルの３０％ＤＭＳＯをカラム４〜１２及びカラム１４〜２２に加えた（Ｏ列及びＰ列だけ）。
６.  プロファイリング標準プログラムを用いたBiomek 2000TMによる基準化合物希釈（３００μＭ、１００μＭ、３０μＭ、・・・などの１０の希釈）の調製：単一２０μｌチップを用いて、１０μｌ／ウェルの１ｍＭ基準化合物を親プレートのＨ１から目的プレートのＯ１に移して、最初の３００μＭ希釈を作製した。その後、目的プレートにおいて、１０μｌ／ウェルの３００μＭ希釈をＯ３からＯ４に混合して移して、１００μＭ希釈を作製した。１０μｌ／ウェルの１００μＭ希釈をＯ４からＯ５に混合して移して、３０μＭ希釈を作製した・・・などを行った。各基準化合物に対する２倍希釈を、例えば、１０μｌ／ウェルの化合物を親プレートのＨ１から目的プレートのＯ３及びＰ３に移すことによって行った。混合と移動を繰り返した。次いで、１０μｌ／ウェルの１ｍＭ化合物を親プレートのＨ２から目的プレートのＯ１３に移して、３００μＭ希釈を作製した。その後、目的プレートにおいて、１０μｌ／ウェルの３００μＭ希釈をＯ１３からＯ１４に混合して移して、１００μＭ希釈を作製した・・・などを行った。
７.  基準化合物目的プレートでは、カラム２３において、２０μｌ／ウェルの３０％ＤＭＳＯ（高い対照）をＡ〜Ｈに加え、そして２０μｌ／ウェルの４５％Ｈ3ＰＯ4（低い対照）をＩ〜Ｊに加えた。
【００７４】
アッセイ手順：
１.  アッセイプレート（CorningTM非結合３８４−ウェルプレート）に、１０μｌの酵素及び基質溶液、２μｌの試験化合物を加えて３０分間室温でインキュベートした（酵素／化合物プレインキュベーション工程）。
２.  １０μｌのＡＴＰ／33Ｐ−ＡＴＰ溶液を加えて反応を開始した。
３.  室温で１２０分間インキュベートした。
４.  ２０μｌの停止緩衝液を加えることによって反応を停止した。
５.  ３０μｌの反応混合物を、３８４−ウェルのストレプトアビジン・フラッシュプレートに移した。
８.  室温で９０分間インキュベートした。
９.  ストレプトアビジン・フラッシュプレートを、Elx405自動洗浄機を用いて１００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で２回洗浄した。
１０.  密封して、Top CountTMシンチレーションカウンターでプレート（４０秒／ウェル）を読みとった。
*BiomekTM FXステーションを用いて、工程１から工程５までのアッセイを行った。
【００７５】
ＩＣ50測定に適合する曲線の方程式：
Ｙ＝ボトム＋(トップ−ボトム)／(１＋１０＾((ＬｏｇＩＣ50−Ｘ)*斜面勾配)）
式中、
Ｘは濃度の対数であり；
Ｙはレスポンスであり；
Ｙはボトムで開始し、Ｓ字型を経てトップに至る。
これは「４パラメーターロジスティック（four parameter logistic）」方程式に一致する。
式Ｉの化合物は、このアッセイで１．７ナノモルのＩＣ50の結果となった。
【００７６】
ＭＴＳ試薬を用いた悪性血液細胞系の生死判別試験
１．目的
本方法は、試験化合物による処理後に液状腫瘍細胞系の生存能を定量するものである。腫瘍細胞は長期増殖期には懸濁液で維持される。使用の当日に、細胞は０．０５から０.１ミリオン／ｍｌの密度に再懸濁され、そして試験化合物と９６−ウェルプレートで９６時間インキュベートされる。細胞の生存能は、PromegaのＭＴＳ試薬と細胞をインキュベートすることによって測定された。細胞の生存能は、４９０ｎｍでの吸光度の変化に比例する。対照と化合物処理細胞との吸光度を比較することによって、細胞生存能に対する試験化合物の影響が対照の細胞生存能の％として測定される。
【００７７】
２．手順
Ａ．材料
１．細胞：
液状腫瘍細胞系は、American Tissue Culture Collection（ＡＴＣＣ）か又はＤＳＭＺ（ドイツ微生物及び細胞培養コレクションＧｍｂＨ）から得られる。
２．培地：
完全ＲＰＭＩ：２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）及びＬ−グルタミン(Gibco／InvitrogenTM、カタログ番号２２４００−０８９）＋１０％加熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）(Gibco／InvitrogenTM、カタログ番号１６１４０−０７１）＋１×ペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco／Invitrogen、カタログ番号１５０７０−０６３）＋５０ｕｇ／ｍｌのPlasmocin(InvivogenTM、カタログ番号ａｎｔ−ｍｐｔ)を有するＲＰＭＩ−１６４０培地。
フェノールレッドフリーｃＲＰＭＩ：フェノールレッドフリーＲＰＭＩ−１６４０培地Ｌ−グルタミン(Gibco／InvitrogenTM、カタログ番号Gibco／Invitrogen, １１８３５−０３０）＋１０％加熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）(Gibco／Invitrogen、カタログ番号１６１４０−０７１）＋１×ペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco／InvitrogenTM、カタログ番号１５０７０−０６３）。
３．他の液体試薬：
PromegaTM  ＭＴＳ試薬(Cell Titer 96 Aqueous カタログ番号Ｇ３５８Ｂ）。
ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ) (SigmaTM、カタログ番号 Ｄ２６５０）。
４．消耗品：
滅菌９６−ウェルポリスチレン組織培養処理したへり付き透明プレート(FalconTM、カタログ番号 ３０７２）。
５．機器：
プレートリーダー、９６−ウェル(SpectraMAX GeminiEMTM、Molecular Devices, USA)。
【００７８】
Ｂ．方法
第１日目：試験化合物の調製
試験化合物を１０００×濃度でＤＭＳＯに溶解し、逐次希釈する。
滅菌９６−ウェルポリスチレン組織培養プレートにおいて、フェノールレッドフリーｃＲＰＭＩに試験化合物を１：１００に希釈する。
１２−チャンネルのピペッターを使用して、細胞インキュベーションに使用する空の９６−ウェルプレートに１０μｌの希釈化合物溶液を移す。
１００μｌの細胞培養物の添加後、試験化合物の最終濃度は１×となる。
第１日目：化合物処理用の液状腫瘍細胞の調製
ほぼ０.３〜０.７ミリオン／ｍｌの密度で、対数期培養物から完全ＲＰＭＩ中に細胞を回収する。細胞を計数して、フェノールレッドフリーｃＲＰＭＩ中０.１ミリオン／ｍｌに調整する（２４時間に等しいか以下の倍加時間を有する高速増殖細胞、例えば、Ｋ５６２用には、過剰増殖を避けるために代わりに０.０５ミリオン／ｍｌを使用する）。
トータルで１０,０００細胞／ウェルに対して、３組の１００μlの細胞を９６−ウェル透明プレートのウェルに移す。各ウェルは、先に調製した１０μｌの１０×濃縮試験化合物を既に含有していることに留意されたい。
細胞インキュベーション
細胞を、５％のＣＯ2を含む組織培養インキュベータにおいて３７℃で７２〜９６時間インキュベートする。
【００７９】
Ｃ．測定：細胞生存能の定量
１．PromegaのＭＴＳ試薬を解凍し、２０μｌを各ウェルに反復ピペッターで加える。
２．ウェル中の試薬をプレートを揺り動かしながら混合し、そのプレートを３７℃でＣＯ2組織培養インキュベータに入れる。
３．１００μｌのフェノールレッドフリーｃＲＰＭＩ単独を含有する１列のウェルにＭＴＳ試薬を加えることにより「無細胞」ブランク対照を調製する。
４．対照細胞の４９０ｎｍの吸光度が＞１.５になるまで３７℃でインキュベートする。
５．気泡がないことを確かめながら、ウェル中の色が確実に均一になるよう揺り動かしながら細胞培養を混合する。気泡がある場合は、気泡を除くために卓上遠心分離機により１０００×ｇでプレートを遠心分離する。
６．Molecular Devices９６−ウェルプレートリーダーで吸光度を読む。
【００８０】
Ｄ．結果の解析：
１．エクセルのスプレッドシートにテキストデータをコピーしペーストする。
２．「無細胞」ブランクデータを平均し、この値を細胞を含む各ウェルの吸光度から差し引く。
３．ブランク補正３組のウェルデータを平均し、反復変動に対する標準偏差を計算する。４．対照細胞データの平均：
５．平均化合物処理細胞データを、以下のように平均対照細胞データに対する％として計算する：
（化合物処理値／対照値）*１００ ＝ 対照値に対する％
結果：
式Ｉの化合物の抗増殖活性を測定した。表４に示すように、式Ｉの化合物は、Jeko-1及びGranta-519の２つのＭＣＬ細胞系で一貫して活性である。更に、式Ｉの化合物は、比較的広範囲の悪性血液細胞系(１５のうち６）に対して阻害活性があるように見える。
【００８１】
【表４】
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【００８２】
ラットコラーゲン誘発関節炎の抑制
序
ラットコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）は、アジュバントにＩＩ型コラーゲン（ｃＩＩ）を用いて免疫化後、遺伝的に感受性の強いげっ歯類に誘発される良く特徴付けされたヒト関節リウマチ（ＲＡ）のモデルである。ＣＩＡ及びＲＡの両者は、関節の重度の腫脹／炎症、滑膜過形成及び軟骨と骨のびらんを呈する。ｃＩＩによる免疫化で誘発したこの慢性炎症性関節炎は、Ｔ細胞欠損マウスにおけるＣＩＡ減弱で証明されたＴ細胞成分及びＢ細胞成分から成り立つ。Ｂ細胞欠損マウス、ｘｉｄマウス又はＣＸＣＲ５のヌル変異を有するマウスは、ＣＩＡを発症しない。
【００８３】
方法：
免疫化及び誘発：雌性Lewisラットを第０日目に感作し、第７日目に不完全フロインドアジュバントと混合したウシ鼻由来のｃＩＩにより、１．０ｍｇ／ｍｌの最終コラーゲン濃度で誘発した。この動物の尾底に４００μｇのｃＩＩを注射した。
【００８４】
予防的投与レジメン：式Ｉの化合物（３．０、１０、及び３０ｍｇ／ｋｇ）の１日２回（ｂ.ｉ.ｄ.）の経口投与（ｐ.ｏ.）を第６日目に開始し、第２１日目まで継続した。
【００８５】
併用投与レジメン：ラットに対して、式Ｉの化合物（３．０及び１０ｍｇ／ｋｇ、ｐ.ｏ.、ｂ.ｉ.ｄ.）又はメトトレキサート（ＭＴＸ、０．１及び０.２ｍｇ／ｋｇ、ｐ.ｏ.
、ｑ.ｄ.）を、単剤療法として又は各用量のＭＴＸと各用量の式Ｉの化合物から成る併用で、第６日目に投与を開始し第２１日目まで継続した。
【００８６】
治療的投与レジメン：式Ｉの化合物（１０及び３０ｍｇ／ｋｇ、ｐ.ｏ.、ｂ.ｉ.ｄ.）を、第１２日目に経口投与開始し、第２１日目まで継続した。
【００８７】
関節病態：足くるぶし腫脹を、電子デジタルキャリパーを用いることによって最近傍の０．０１ｍｍまで測定した。測定を第６日目に始めて第２１日目に終了するまで研究中に７回記録した。体重を同じ日に記録した。第２１日目に、後足をくるぶしの真上の毛の生え際で摘除して、１０％の中性緩衝化ホルマリン中で固定化した。
【００８８】
ＭｉｃｒｏＣＴ解析：足くるぶしを円錐ビームμＣＴスキャナーを用いて調べた。探査視野走査を、先ず標本の検査容積の選択のために施行し、次いで位置決め、測定及び計算機による再構成を行った。足くるぶしでは、骨量に対する骨表面の比を、一定容積中の骨表面の複雑さを記述しながら解析した。
統計解析：関節腫脹／炎症に対して、Everstat v.5ソフトウェア及びダネット事後検定による２−方向反復測定ＡＮＯＶＡを用いて、データを解析した。１−方向ＡＮＯＶＡ及びNewman-Keuls多重比較検定を用いるEverstatにより、ＭｉｃｒｏＣＴデータを解析した。データは、平均±ＳＥＭとして示し、そしてｐ値＜０.０５が有意と考えた。
【００８９】
結果：
予防的投与：関節腫脹／炎症のデジタルキャリパー測定（図２）
・式Ｉの化合物（３.０ｍｇ／ｋｇ）は、ビヒクル処置ラットに比べて、くるぶし腫脹／炎症を第１２日目のみ顕著に軽減した。
・式Ｉの化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）は、ビヒクル処置ラットに比べて、くるぶし腫脹／炎症を第１２日目〜第１９日目にわたって顕著に軽減した。
・式Ｉの化合物（３０ｍｇ／ｋｇ）は、ビヒクル処置ラットに比べて、くるぶし腫脹／炎症を第１２日目〜第２１日目にわたって顕著に軽減した。
【００９０】
ＭｉｃｒｏＣＴ解析（図３）
・式Ｉの化合物（３、１０又は３０ｍｇ／ｋｇ、ｂ.ｉ.ｄ.）は、ビヒクル処置ラットに比べた場合、骨びらんの顕著な軽減を示した（骨量に対する骨表面の比で測定）。
【００９１】
併用投与：関節腫脹／炎症のデジタルキャリパー測定（図４、５）
・式Ｉの化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）は、ビヒクル処置ラットに比べて、くるぶし腫脹／炎症を第１５日目〜第２１日目にわたって顕著に軽減した。
・式Ｉの化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）＋ＭＴＸ（０．２又は０.１ｍｇ／ｋｇ）の併用療法は、単独治療としての式Ｉの化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）か又はＭＴＸ（０．２又は０.１ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットに見られるものと比較して、第１５日目〜第２１日目にわたってくるぶし腫脹／炎症の顕著な軽減を示した。
・単独治療として又はＭＴＸ（０.１ｍｇ／ｋｇ）との併用療法として、式Ｉの化合物（３.０ｍｇ／ｋｇ）は、関節腫脹／炎症で測定した疾患重症度に対して著しい影響を及ぼさなかった。
・ＭＴＸ（０．２ｍｇ／ｋｇ）との併用療法による式Ｉの化合物（３.０ｍｇ／ｋｇ）は、第１８日目〜第２１日目にかけて行われた測定において、いずれかの薬剤を単独治療として投与した場合に認められた程度にまさって、関節腫脹／炎症の顕著な軽減を示した。
【００９２】
ＭｉｃｒｏＣＴ解析（図６）：
・３次元画像は、ビヒクル処置ラットの関節において顕著な骨びらん／破壊を示した。
・式Ｉの化合物（１０ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、ｂｉｄ）によるラットへの投与は、ビヒクル処置ラットに対して骨びらんの顕著な減少をもたらした。３ｍｇ／ｋｇの式Ｉの化合物を投与したラットでは著しい減少は認められなかった。
・ＭＴＸ（０．２ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、ｑｄ）による単独治療は、骨びらんの顕著な減少をもたらした。この効果は０．１ｍｇ／ｋｇのＭＴＸを投与したラットでは見られなかった。
・式Ｉの化合物とＭＴＸの併用で処置した場合、すべての群で、ビヒクル処置ラットに比べて、骨量に対する骨表面の比の著しい減少を示した。
・式Ｉの化合物（１０ｍｇ／ｋｇ、ｂｉｄ、ｐｏ）とＭＴＸ（０．２ｍｇ／ｋｇ、ｑｄ）の併用療法は、式Ｉの化合物か又はＭＴＸによる単独治療を受けたラットで見られた結果に対して、骨びらんの相加的保護作用をもたらした。
【００９３】
治療的投与
関節腫脹／炎症のデジタルキャリパー測定（図７）
・関節炎が視覚的に明白になるまで投薬が遅れて、治療的レジメンで投与した場合でも、式Ｉの化合物（１０および３０ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、ｂ.ｉ.ｄ.）は、第１５日目〜第２１日目にかけてくるぶし腫脹／炎症を顕著に軽減させた。
ＭｉｃｒｏＣＴ解析（図８）：
・ビヒクル処置に比べて、式Ｉの化合物（１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇ）を治療的に投与したＣＩＡラットは、骨びらんの著しい減少を示したことが、骨量に対する骨表面の比によって測定された。
【００９４】
要約：
これらの研究は、式Ｉの化合物によるｓｙｋキナーゼの阻害が、関節腫脹／炎症及び骨びらんの減少によって測定されるラットＣＩＡの発症及び進行の両者を著しく遅延させることを裏付けるものである。重要なこととして、疾患の進行及び重症度の顕著な抑制は、関節炎の目に見える徴候が明白になるまで投与が遅れたラットにおいて認められたことである。ＲＡに対する新しい臨床治療法は、通常ＭＴＸとの併用で与えられる。関節炎のげっ歯類モデルでの本発明者らのデータは、式Ｉの化合物がＭＴＸとの併用で投与される場合に相加効果を示すことから、式Ｉの化合物とＭＴＸの併用療法は、ＲＡの患者において相乗的な臨床効果をもたらす可能性を示唆する。
【００９５】
血管新生試験
雌性Lewisラット（５週齢、１５０〜１７５ｇ）を、キシラジン（４ｍｇ／ｋｇ）及びケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔した。次いで、５０μｌのＦＧＦ−２（線維芽細胞増殖因子２）溶液（４００ｎｇのＦＧＦ−２を含有する）か又はビヒクル（生理食塩水、ウシ血清アルブミン０.０８％）を含有するセルローススポンジ（直径１０ｍｍ、Vivoxid Ltd.TM、Turku、フィンランド）を、動物の背部に皮下移植した。２日後の時点で、更なる血管新生が、皮膚を介して、また５０μｌのＦＧＦ−２溶液又はビヒクル（基本条件）のスポンジ内への連日注入によって誘導された。スポンジ埋め込みの１週間後、動物を過量のペントバルビタールを用いて安楽死させ、そしてスポンジを解体した。次いでそのスポンジを細断し、リシス緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のTriton X100、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１０ｍＭのＮａＦ、３０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．８、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｐ８３４０、Sigma-AldrichTM、セントルイス、アメリカ）を含有する）において、Fastprepホモジナイザー(QbiogeneTM、Illkirch、フランス)中でLysing Mastrix Dチューブ(MP BiomedicalsTM、Illkirch、フランス)を用いてホモジナイズした。血管容積を示すヘモグロビン濃度を、Drabkinアッセイ(Pierce BiotechnologyTM、Rockford、イリノイ、アメリカ)を用いて定量した。化合物を、水性のメチルセルロース０.６％、０.５％のTween80溶液の懸濁液として強制経口投与した。
【００９６】
ラット重量に対する式Ｉの化合物の効果を図９に示す。ヘモグロビン濃度（ｍｇ／ｍｌ）に対する式Ｉの化合物の効果を図１０に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年6月11日(2008.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：【化１】
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の化合物又は対応するＮ−オキシド若しくはプロドラッグ；又は該化合物の薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物；並びに該塩溶媒和物のＮ−オキシド及びプロドラッグ。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物を、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は賦形剤と共に含む、医薬組成物。
【請求項３】
患者における関節炎症を治療する方法であって、請求項１に記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項４】
患者における関節リウマチを治療する方法であって、請求項１に記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項５】
患者における関節炎症を治療する方法であって、メトトレキサートと併用して請求項１に記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項６】
患者における関節リウマチを治療する方法であって、メトトレキサートと併用して請求項１に記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項７】
患者における腫瘍を治療する方法であって、請求項１に記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項８】
患者におけるマントル細胞リンパ腫を治療する方法であって、請求項１に記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項９】
患者における血管新生を阻害する方法であって、請求項１に記載の化合物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項１０】
塩が、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルファミン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マロン酸塩、シュウ酸塩、サリチル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、メチレン−ビス−ｂ−ヒドロキシナフトエ酸塩、ゲンチシン酸塩、イセチオン酸塩、ジ−ｐ−トルオイル酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩及びキナ酸塩から選ばれる、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
塩が塩酸塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
塩が酢酸塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
塩がクエン塩である、請求項１に記載の化合物。
【国際調査報告】
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