(57)【要約】細胞の個体数を増加させるための培養方法において、増殖効率の最も大きな変数となる細胞間の増殖及び抑制の信号の調節によって細胞増殖効率を構造させようとする３次元増殖培養を行う方法を提示することを目的とする。このため、本発明は、細胞培養過程において、a)適切な細胞間隔（足場と比べた相対濃度）を維持すべく、初期には少ない量の粉末状足場（micro-scaffolds）を用い、増殖速度に合わせて粉末状足場を徐々に増量させる、粉末状足場の段階的添加過程と、b)一定時間以上停滞させた後、付着している細胞の間を物理的な力で分離させるために振り動かす周期的動揺過程とを、同時に行うことで、細胞間の増殖及び抑制の信号を調節し、これを反復遂行して細胞を増殖・培養する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の付着及び増殖を行わせることのできる表面積を有した粉末状足場を用いる培養法であって、
a) 適切な細胞間隔（足場に比した相対的濃度）を維持すべく、初期には少量の足場を用い、増殖速度に合わせて徐々に足場を増量させる足場の段階的添加過程と、
b) 一定時間以上停滞させた後、くっ付いている細胞同士を分離するために振り動かす周期的動揺過程とのうちの、
いずれかの過程を行うことにより、細胞間の増殖及び抑制の信号を調節し、これを反復して行うことで細胞を増殖・培養することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２】
請求項１の細胞培養方法において、
a) 適切な細胞間隔（足場に比した相対的濃度）を維持すべく、初期には少量の粉末状足場を用い、増殖速度に合わせて徐々に粉末状足場を増量させる粉末状足場の段階的添加過程と、
b) 一定時間以上停滞させた後、くっ付いている細胞同士を分離するために振り動かす周期的動揺過程とを、
同時に行うことで、細胞間の増殖及び抑制の信号を調節し、これを反復して行うことで細胞を増殖・培養することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の細胞培養方法において、細胞の培養は、
増殖に適した状態にて遠心分離及び洗浄の過程を経る事前処理段階と、
培養容器に培養液及び粉末状足場を入れて培養液内にて浮遊状態で粉末状足場と細胞とを付着させ、これを沈殿させる粉末状足場付着段階と、
培養室にて細胞を培養する細胞培養段階と、
培養が進行する状態にて粉末状足場を段階的に添加する過程、及び、周期的に動揺させる過程のうちの一方を反復するか、または、段階的に添加する過程及び周期的に動揺させる過程を同時に行う方法からなり、
前記の細胞培養は、先端及び注入口を塞ぐことができピストンには開閉可能な通路が備えられた構造の脂肪採取及び培養用の注射器により行われ、前記の、事前処理段階、粉末状足場付着段階、及び、粉末状足場の段階的添加や周期的な動揺の全ての過程が、前記注射器内で行われることを特徴とする細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の付着及び増殖を可能にする表面を備えた粉末状足場（微細足場; micro-scaffolds）を用いる３次元の増殖培養法に関する。
【０００２】
本発明は、細胞の個体数を増やすための培養方法において、増殖効率にとり最も大きな変数である細胞間の増殖及び抑制の信号について適切に調節することで、脂肪組織から成体幹細胞（ストロマ(間質)幹細胞）を分離し、これを目的に合わせて増殖させ、必要に応じて分化させるといった、細胞増殖効率を向上させようとする３次元の増殖培養を行う方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
最近になって急激に進歩した幹細胞研究の成果として、脂肪組織から間質幹細胞を分離し、該間質幹細胞を目的に合った細胞に増殖・分化させることのできる段階に至った。しかし、実際の細胞の培養には、数多くの高価な装備と施設、研究人員、高価な消耗品などが必須であり、現実的な困難が多い。
【０００４】
特には、徹底した準備なしに培養を行うときには、空気中の細菌で汚染されて、培養過程の全体が失敗に至る場合もあり、また、研究人員のミスによる失敗など、種々の失敗の要因があるため、研究の成果を得るためには、莫大な施設投資と、研究人員の養成が必要である。
【０００５】
例えば、空気中の細菌汚染を減少させるべく、空気の流れを上方から下方へと形成したクリーンルームまたはクリーンベンチのような施設が必要であり、多様な容器を消毒するための消毒装備、空気浄化機、吸引機など、付随的な施設が必要である。また、研究人員については、これらの施設を正しく用い、複雑な過程中にて汚染が起きないようにするための、長期間の実習が必須である。
【０００６】
一方、細胞の増殖が誘発されるための条件には、化学的環境が無数に多く存在するが、いまだ正確には明らかにされていないものもある。増殖抑制もまた、当該環境の影響を大きく受ける点では同様であり、また、未だ明らかにされていない原理が多いと考えられる。例えば、病原菌もまた1cm3の人体組織に106以上であるときに、人体内における増殖が加速されて感染症を起こすという実験的な報告が存在するが、その正確な機構は把握されていない。一般細胞の培養もまた、一定数以上の細胞がどの程度密集しているときに細胞間の増殖信号を誘発し幾何級数的な増殖が誘導されると報告されているが、水溶性物質、または伝導性物質中にて可能であるということの他には、正確な物質及び原理は明らかにされていない。
【０００７】
増殖抑制についても、また、種々の環境が報告されており、そのうち、確実なのは、細胞が側部にくっ付いているときや、側部に存在するときに、その側へとそれ以上増殖しないという接触抑制現象は、ほぼ明確に明らかにされた事実である。
【０００８】
このような観点から見るとき、増殖のための既存の培養方法は、具体的に次のような長点及び短点を有する。
【０００９】
＜平面培養＞
既存の細胞培養法としての伝統的な方法は、平面上にて細胞分裂を誘導する平面培養法である。特定の細胞を培養液内にて平面上に蒔き、底面、すなわち平面に付着させた後、自身の周辺へと増殖させ、飽和状態になると、細胞が付着した構造物をトリプシンといった酵素で除去して分離する。この際の、細胞浮遊液（懸濁液）を遠心分離して、遠心分離容器の底に積層された細胞を得た後、酵素を洗い出すために、充分な量の中和液（リン酸緩衝液）に浮遊させ、再度遠心分離を行い、細胞を遠心分離容器の底側に積層させる。この過程を数回反復して、これら細胞を培養液に浮遊して新しい培養平面に分散接種する。これらが再び成育して飽和状態になれば、同じ過程を繰り替えすことで、幾何級数的な細胞数の増加を実現できる。
【００１０】
この方法における制限点は、細胞群落の外郭線に限って増殖が起こるという増殖速度の制限要因にある。したがって、平面増殖培養の原理は、可能な限り何個もの群落を形成して、増殖する細胞の数を最大化させることにある。
【００１１】
この際の付着面は、容器の底や壁であり、細胞の積層は起こらず、一つの層だけを形成するので、単一層培養とも言う。
【００１２】
＜足場を用いない3次元培養＞
細胞を液体またはゲル状に浮遊させた状態にて増殖条件を形成することにより、平面培養の制限を解決しようとした培養法であって、液体の流れを制御することもある。概念上、3次元培養であって、相互の接触抑制現象がなく細胞の増殖の方向性につき、平面培養よりもはるかに多くの機会を有するが、細胞間の増殖信号の認知及び各細胞単位での分裂速度が低下し、実質的な速度増加の効果を得るためには、細胞の種類及び条件に関して制限がある。
【００１３】
＜粉末状の足場でない足場を用いる3次元培養＞
足場は、細胞が付着して成育することのできる構造物であり、細胞が成育する空間を確保することを目的とするとともに、足場の形状にしたがって細胞の群落が形成されるので細胞群落の形態を調節することを目的として用いられる。足場を用いた培養は、平面培養に比べてはるかに多くの細胞付着面を有すると言う点、及び、細胞の成長の方向が同一の平面ではない上下への成長もい可能であって積層構造をなすこともできるという意味で、3次元培養という。
【００１４】
3次元培養に用いられる足場は、大部分が固体であるが、ゼラチンのような液体と固体の中間の性質の物質を用いることもある。
【００１５】
足場の形態は、大部分、培養液の移動が可能であって、細胞の付着面が最大化された多孔性構造のものであり、スポンジの形態の、ディスクやブロックの形態、または球形の形態を有する。
【００１６】
これらの足場は、実質的には、複雑な形状を有することで、付着平面の積層または屈曲により付着面積の最大化をなした構造であるが、細胞がこの足場を貫いて成育することができないので、内部では、ほとんど成育できない構造であり、足場の表面では結局飽和状態に達することとなる。したがって、飽和状態以降には、細胞を足場から分離して、再び、新しい足場に分散して接種する過程を通じてのみ、増殖をさらに拡大することができる。そのため、平面培養におけると同様に、細胞分離及び洗浄の過程を経る必要がある。
【００１７】
＜微細粒子の足場を用いる3次元培養＞
固体粉末を用いるのであるが、粒子が飽和すれば細胞による凝集が生じるものと思われ、細胞単位で考えて一般には従前と同様トリプシンなどを用いた細胞分離の過程を経る。そのため、既存の他の培養法に比べて増殖速度及び効率が増加するが、依然として細胞分離及び分散接種の段階における一定量の努力及び時間を必要とし、化学的な分離の際に細胞の生存度が低下するという問題を伴う。
【００１８】
＜足場浮遊培養＞
一定量の足場とともに、細胞を持続的に浮遊させて細胞の浮遊を誘導するが、細胞がくっ付いて粒子が飽和状態になれば、それ以上の増殖が起こらない。そのため、時間が経つにつれて、増殖が起こる粒子の数も増加するが飽和した粒子の比率も共に上昇するので、増殖抑制の総量も増加する。培養液のみの調節で一定の密度を維持することが容易であるが、常に動的であるので、細胞間相互の増殖誘発信号交換と、静的な表面に付着した状態での長点がなく、不利な面がある。
【００１９】
＜足場静止培養＞
意図した充分な量の足場に細胞を分散接種し、培養液に渦流を形成し、未付着の細胞を絶えず移動させることで、付着の機会を増やす方法がある。ところが、細胞が増殖している箇所では、実質上飽和状態になり、同じ細胞に取り囲まれた細胞の比率が高いため、相互接触による抑制量が増加する。また、初期には、過度に低い細胞密度のため、相互の増殖の信号量が少ない。
【００２０】
＜足場初期動揺、及び、静止培養＞
意図した充分な量の足場に細胞を分散接種し、初期にのみ適切な時期に動揺させることで、相互の接触による抑制量を最小化することができる。ところが、やはり、初期には過度に低い細胞密度のため、相互の増殖の誘発信号量が少ない。また、各細胞の分離を化学的に行っており、幾何級数的に足場を追加する方式を活用していない。そのため、細胞のない、新しい足場に分散接種するためには、化学的な細胞分離の過程を経ることとなる。また、足場を幾何級数的に追加するのでないなら、予め多量の足場を用いる。そのため、培養液の浸透が初期から困難になり、培養初期段階での効率に低下をもたらすので、幹細胞の維持に困難が生じ得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】米国特許US6946246B
【特許文献２】米国特許US6759245B
【特許文献３】米国特許US6143293B
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Internatinal Journal of Artificial Organs vol.30(5) 415-428 (2006), CIMETTA E et al.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、細胞培養において、細胞が成育することのできる環境のうち、細胞間の信号による増殖が加速化される環境を適切に利用する。同時に、分裂して増殖する細胞が互いにくっ付くことで増殖抑制信号が多く発生して増殖可能面積の相対的な比率が減少するのを最小化させる。さらに同時に、このための細胞間の分離は、適切なタイミングに、物理的な方法により行う。すなわち、遺伝子変異を起こす可能性があることが知られている化学的な方法でなく、物理的な方法により行う。本発明は、このようにして細胞増殖効率を高めることにより、既存の培養方法が有する諸問題を解消すべく案出された。
【００２４】
また、本発明は、培養における複雑な過程と、多様な装備及び道具を単純化し、実験に必要な経済的負担を減らし、小規模の施設でも先進的な研究を実現可能にし、かつ、研究の成果を確実に得ることができるようにする細胞培養方法を提示することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
上記の目的のため、本発明は、培養液中にて、粉末状足場（微細な足場(micro-scaffold)、微細な球状粉末(micro-beads)）を用いた3次元細胞培養にて、停滞状態ないし静止状態と、粉末状足場の動揺状態（動く状況；振り動かし、揺り動かし、攪拌、渦回転、ゆすり動かし、混ぜ合わせ、練り合わせ、等々）を周期的に反復する細胞培養方法と、粉末状足場を徐々に増量させる細胞培養方法とを、同時に、または、別個に行うことで、細胞培養の際の細胞が成育できる環境中の細胞間の信号による増殖が加速化される環境を適切に用いる。同時に、分裂して増殖した細胞が互いにくっ付くと増殖抑制信号が多く発生して増殖可能面積の相対比率が低下するという現象を最小化する。同時に、このための細胞間の分離においては、適切な時間に、遺伝子変異を起こす可能性があることが知られた化学的な方法ではなく、物理的な力による細胞間の分離を用いることで、細胞の増殖効果を高める。
【００２６】
上記の細胞培養方法は、ピストンの開閉が可能な注射器を備え、採取した後の増殖に適した状態にて遠心分離及び洗浄の過程を経る事前処理段階と、前記注射器のピストンを開いて培養液と粉末状足場とを加え入れ、培養液中にて浮遊状態で、粉末状足場と幹細胞などの細胞とを互いに付着させて、付着物を積層・沈殿させる粉末状足場付着段階と、ピストンが開いた状態にて細胞を培養する細胞培養段階と、培養が行われている状態にて、ピストン開閉口を通じて培養液及び粉末状足場を追加してから、動揺（動く状況；振り動かし、揺り動かし、攪拌、渦回転、ゆすり動かし、混合、練り込み、等々）させる増殖段階と、前記増殖段階を周期的に反復する増殖反復段階と、からなる注射器を用いる密閉式細胞培養方法に適用することができる。
【００２７】
上記のように、本発明は、幹細胞の3次元増殖培養方法であって、従来の種々の細胞培養方法に比べて、細胞数の高度増加と、速やかな培養速度と、安全性とを備える。
【００２８】
上記において、事前処理段階は、細胞を採取し、これをコラーゲン溶解剤（collagenage）にて処理して細胞を分離した後、遠心分離過程と、副産物除去過程と、洗浄液（リン酸緩衝液）などを用いる洗浄過程とを経て、培養の前段階として処理を行う段階である。
【００２９】
粉末状足場付着段階は、細胞が付着して成育することのできる固体粉末型の足場を、細胞と混合して培養液中に積層・沈殿させる段階である。各粒子の表面が全て培養面で、表面積の合算が、平面培養における培養面積に相当する効果を出すようにしている。
【００３０】
上記の段階において、培養液内における各細胞は浮遊しており、粉末状足場もまた浮遊して、細胞との付着が行われる。細胞付着の後、培養液よりも重量が重くなった粉末状足場は、沈殿して、注射器の底に段階的に積層する。
【００３１】
粉末状足場としては、キトサン粉末、同種の真皮組織の粉末、多孔性ポリエチレン粉末、4フッ化エチレン重合体（PTFE）粉末、乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）粉末、ポリグリコール酸（PGA）粉末、ポリ乳酸（PLA）粉末、ポリ-L-乳酸（PLLA）粉末、及び、ポリ-ε-カプロラクトン（PCL）を用いることができる。
【００３２】
増殖段階では、周期的な動揺（振盪、攪拌、混ぜ合わせ）により、飽和した粒子を分離し、飽和した粒子が新たな粒子に接する可能性を高め、新たな粒子へと細胞が成育して行くように、新たな粒子が飽和する時点にて再び足場を追加しつつ、動揺させて、細胞増殖の機会を一定水準に維持する段階である。
【００３３】
このような過程は、連接した細胞をそれぞれ分離して、固定した足場に分散接種するという既存の過程に取って代わることにより、化学物質、例えばトリプシンを用いた細胞分離過程を省くことで、細胞の生存率の減少や細胞の流失を最小限とする。
【００３４】
また、飽和した粒子の比率を調節することで、細胞の密度が急激に高まって惹起される接触抑制状態の機会を最小化し、接触抑制の総量を最小限とする。また、細胞増殖に最も適切な細胞間相互信号を維持することのできる密度を維持することで、相互の増殖信号の総量を最大化する。
【００３５】
静的な沈殿状態では、粒子同士の相対位置に変化がないので、細胞の移動に安定的な環境である。そのため、一定時間以上維持される必要があり、動揺の始期には一部の細胞がそれぞれ離れ出して、新たな粒子に付着することとなる。
【００３６】
細胞が付着した粒子は、速やかな時間内に飽和がなされ、これ以上成育することのできない。しかし、連結された粒子がある場合、細胞は、接触抑制のない側である、連結された粒子の表面へと移動・転移して増殖する。この際、この粒子にまでも、表面に細胞が積もってしまうと、完全な接触抑制状態になり、これ以上増殖ができない。この際、新たな空いた粒子が、接触することとなると、再び増殖、及び移動・転移が行われる。
【００３７】
したがって、周期的に振り動かして、新たな空いた粒子との接触を誘発し、段階的に増量する足場の追加により、空いた粒子の密度を維持し、細胞増殖の機会を極大化する。この過程で、初期には少量の足場を追加し、以降、幾何級数的に増量して追加する。ここで、初期の少量の追加の意味は、飽和した粒子が相対的に他の飽和した粒子と、過度に遠くに離れると、細胞相互間の信号が困難となり、増殖の誘導が弱くなるので、適切な密度の維持が重要である。また、粒子の大きさと形態も適切に維持されなければならない。
【００３８】
このようなコンセプトは、既存の、細胞密度調節にあたり各細胞を単位とするコンセプトでもって細胞同士を分離して分散させる過程に取って代わるものである。すなわち、足場の単位で、これらが動く物理的な力でもって、移動・転移した細胞により連結された粒子間の連結を分離し、足場の粒子の単位のコンセプトで分散させて粒子の密度を調節する。このようにして、細胞の密度を維持する上で、細胞単位の密度の調節と同様の効果を得るようにする。したがって、あまり大きくない（20〜100μmの）粉末粒子を用いるのが適切である。
【００３９】
というのは、複数個の細胞でもって飽和した各粒子を最小単位と考えるため、全ての過程は、細胞が粒子に付着した状態で進行する。特別な化学物質なしには分離しない細胞間の連結に比べて、粒子同士の分離は、より容易になされるという点を利用したコンセプトである。より原理的な側面で見るならば、いくつかの細胞がくっ付いている粒子が、液体の動きにしたがって動くという慣性、すなわち、粒子の重さによる慣性と、培養液等の液体の抵抗が、粒子間を連結する細胞の分離に充分である物理的な力になり得るという、新たな事実を適用したものである。
【００４０】
したがって、各粒子の大きさは、一定水準以上でなければならず、動揺の周期は、粒子間に過剰な細胞連結が生じない水準でなされる必要がある。このような適正な値は、足場の素材により異なり、細胞により若干異なるが、簡単な実験により適正な範囲を得ることができる。
【００４１】
例えば、粉末状足場としては、20〜250μmの大きさのものが用いられ、動揺の周期は4〜8時間ごとに0.5〜2分間で行われる。粉末状足場の追加は、16〜48時間ごとに、直前の投入量の1.5〜4倍投入する方法で実施することができる。培養後に足場とともに体内に移植することを目的とする場合、注射針により体内注入が可能な大きさである20〜100μmの粉末状足場を用いるのが望ましい。その他の、粉末状足場に対する動揺の周期と時間、及び、粉末状足場の段階的追加量は、粉末状足場及び細胞の特性に合わせて、先行試験により、簡単に求めることができる。
【００４２】
本発明による培養方法は、上記に示した密閉型の脂肪採取及び培養用の注射器により、脂肪の採取、事前処理、及び培養の全過程が、注射器中で行われるように構成することができる。
【００４３】
上記の注射器は、胴体すなわちシリンダーの外形が一般の医療用注射器と同じである。しかし、通常、針が取り付けられる先端部が中央に位置し、ゴム栓を嵌めて密閉できるように、外径部にネジを設けている。ピストンは、遠心分離機に取り付け可能であるよう、プランジャーを分離可能である。また、ピストンには、ピストンを中心として、前方及び後方の空間を連通させる通路が形成されており、これを開閉可能とすることで、通路を通じて、細胞分離液、洗浄液、培養液、足場浮遊液などのような液体、並びに、酸素、二酸化炭素といった特定の気体などの、注入及び除去が可能である。
【００４４】
ピストンの通路の内面には、ネジが設けられ、プランジャー、連結管及び栓のうちのいずれかを取り付けられるようになっている。このピストンは、培養の前の過程にて容器を密閉するため、培養液の移動や洗浄などの過程では、外部の空気との接触の機会を最小化する。また、これらの過程を行う人員のミスによる汚染の可能性も最小化する。上方が開放された容器とは異なり、動揺のための別途のスターラーや動力を用いることなく、単に注射器を振り動かすか、または、ひっくり返す動作だけで、充分な動揺が可能である。そのため、操作が簡便になる。
【００４５】
先端のゴム栓は、随時にあり得るサンプリングを、注射針でもって可能にし、最小の操作、及び最小の露出により、サンプリング中の汚染の可能性を最小化する。
【００４６】
経済的な側面では、容易に購入することができ、価格の低い注射器を用いることから、手術室における採取段階から、培養場所までの移動が容易であり、別途の費用がかからず、複雑な過程、及び、多様な道具や高価な培養装備が不要である。そのため、幹細胞の研究といった、同時にいくつもの培養が必要な場合は、特に費用の節減効果が、大変大きい。
【００４７】
上記の注射器を用いる培養法は、上記の注射器を用意して細胞を採取した後、増殖に適した状態にて遠心分離及び洗浄の過程を経る事前処理段階と、上記の注射器のピストンを開いて培養液と粉末状足場とを入れ、培養液内にて浮遊状態で粉末状足場と細胞とを互いに付着させて、これを積層・沈殿させる粉末状足場付着段階と、ピストンが開いた状態にて、細胞を培養する細胞培養段階と、培養が進行する状態にてピストンの開閉口を通じて培養液及び粉末状足場を追加した後、動揺（動く状況；振り動かし、揺り動かし、攪拌、渦回転、ゆすり動かし、混ぜ合わせ、練り合わせ、等々）を行う増殖段階と、この増殖段階を周期的に反復する増殖反復段階とからなる。
【００４８】
細胞の採取は、注射器の先端のゴム栓を開いて、この箇所に、脂肪採取のための注射針を結合し、注射器の内部のピストンの通路を塞いで、注射器のプランジャーにサクションケーブルを取り付けて、吸入の部位に針を刺し、ピストンの裏面に陰圧を加えて注射器の容器の内部へと脂肪を吸引採取する方法で行われる。
【００４９】
遠心分離及び洗浄は、注射器の針を取り除き、先端のゴム栓を塞ぎ、ピストンの通路を通してコラゲナーゼを投入した後、ピストン通路を塞ぎ、注射器内部空間を密閉する段階と、上記の注射器容器を遠心分離機に入れて遠心分離する段階と、この後、ピストンの通路を通じて副産物を除去する段階と、ピストンの通路を通じて洗浄液を注入し、数十回振り動かした後、洗浄液を除去する段階とからなる。
【００５０】
粉末状足場の付着は、培養液と粉末状足場とをピストン通路を通じて注入し、３〜４回振り動かすことで混ぜ合わせる段階と、粉末状足場及び脂肪細胞が培養液に浮遊する状態にて安定した状態を維持することにより脂肪細胞が粉末状足場に付着し沈殿する段階とからなる。
【００５１】
培養は次のように行う。ピストンを開いた状態で、振盪機を用いて周期的に動揺を行い、1次細胞の培養が完了すれば、培養液と粉末状足場を追加で投入する。この後、最初の振り動かしと、この後の周期的な動揺とを反復する。このような過程により培養増殖を行う。
【００５２】
上記に説明した注射器を用いる培養方法は、既存の培養方法とは区分される、次のような特徴を備える。；
１）脂肪組織を採取した注射器から他の容器へ移すことなく、分離、洗浄及び遠心分離を行うことができる。；
２）足場と細胞とが沈殿した静的な状態においても、上層である培養液の交換を容易に行うことができる。；
３）特定の気体が充満したインキュベーターからピストンを通じて接触させるか、または、特定の気体をピストンを通じて注入し密閉することで、意図する気体との接触、すなわちエアレーションを容易に保つことができる。；
４）培養液の交換について、足場を動揺させずに、容易に行うことができる。；
５）足場の追加、培養液及び気体の交換などの過程が容易である。；
６）遠心分離が容易である。；
７）容器をひっくり返すことができるので、動揺（攪拌）が容易である。；
８）一つの容器を用いており、流失が最小限となる。；
９）密閉過程により感染が最小限となる。；
10）粉末状足場を用いることで、細胞分離の過程を省くことができる。；
11）希釈、分散接種などの過程において、足場を制御するとともに、細胞の密度を所望の水準に制御できる。；
12）足場とともに貯蔵された冷凍サンプルから、直接、増殖に用いることができ、分離過程なしに行うことで、細胞の生存率を極大化し、費用と時間を節約する。
【発明の効果】
【００５３】
既存の細胞増殖培養法のうち、足場を用いた3次元培養の際に、細胞が増殖してこれ以上増殖できる空間が不足すれば相互の抑制効果により増殖率が減少する。そのため、細胞を、新たな空間に分散させる過程を通じて、引き続き増殖率を保ち、引き続き増殖を行うことができるようにする。このようにして、細胞の数を大きく増加させることができる。このような細胞の分散のためには連接した細胞同士を互いに分離し、足場から分離する必要があるが、この際には、トリプシンのような化学物質または酵素を用いて細胞が足場にくっ付いているか細胞間を連結している結合部を分離することとなる。
【００５４】
この過程は、細胞の一部を溶かす過程であって細胞に衝撃を与える。細胞がこの衝撃から回復する過程が繰り返されると、遺伝子変異の可能性が高くなると考えることができ、一定回数以上は不可能である。本発明は、このような細胞分離過程を省略できるようにすることで、細胞分裂回数の制限なしに、理論的にも無限大に近い倍数の増殖が可能である。なお、既存の方法においては、分離分散・接種の過程のうち、必須である酵素作用時間及び遠心分離、適切な分割による再接種、細胞の衝撃からの回復などに消耗される時間及び努力が相当なものとなっており、増殖率に及ぼす影響が大きい。ところが、本発明は、このような時間及び努力を節減し、既存のものより格段に優れた増殖率を得ることができる。
【００５５】
細胞培養に用いる設備は、基本的に空気中の細菌との接触の機会を最小化させるための設備が必須であり、適正な量の素材を用いるための道具及び容器が必要である。また、随時に行う遠心分離に用いる容器及び移動手段を備える必要がある。しかし、このような装備を備えても、細胞培養を実行する研究人員の手や手袋、充分に消毒されていない容器、浄化されていない空気の流入などにより細菌に汚染される場合が多い。そのため、徹底した点検システムと反復学習を通じた保線可能性の最小化は、いずれの研究所でも必須の事案である。しかし、本発明は、一般実験用のコニカルチューブ（Falcon tube (B-D Co.)）に代えて、上記の実験道具（脂肪抽出用の注射器であって、先端が塞がれずに、ゴムまたはバルブが取り付けられた注入口を有する採取用及び培養用の注射器）として用いた注射器を、培養容器として活用する。これにより、方法的に最大限密閉された空間にて培養過程が行われるので、汚染の機会を少なくし、相対的に、設備及び研究人員の訓練に対する投資を減少させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】対照群1（静的培養）についての血球計算盤による測定の結果を示す写真である。
【図２】対照群1（静的培養）についてのヘマトキシリン及びエオシンによる染色（20倍）の結果を示す写真である。
【図３】対照群1（静的培養）についてのヘマトキシリン及びエオシンによる染色（40倍）の結果の結果を示す写真である。
【図４】対照群1（静的培養）についてのDAPI染色（20倍）の結果を示す写真である。
【図５】対照群1（静的培養）についてのDAPI染色（10倍）の結果を示す写真である。
【図６】対照群2（連続振盪）についての血球計算盤による測定の結果を示す写真である。
【図７】対照群2（連続振盪）についてのヘマトキシリン及びエオシンによる染色（40倍）の結果を示す写真（１）である。
【図８】対照群2（連続振盪）についてのヘマトキシリン及びエオシンによる染色（40倍）の結果を示す写真（２）である。
【図９】対照群2（連続振盪）についてのDAPI染色（20倍）の結果を示す写真（１）である。
【図１０】対照群2（連続振盪）についてのDAPI染色（20倍）の結果を示す写真（２）である。
【図１１】実験群1についての血球計算盤による測定の結果を示す写真である。
【図１２】実験群1についてのヘマトキシリン及びエオシンによる染色（40倍）の結果を示す写真（１）である。
【図１３】実験群1についてのヘマトキシリン及びエオシンによる染色（40倍）の結果の結果を示す写真（２）である。
【図１４】実験群1についてのDAPI染色（10倍）の結果を示す写真である。
【図１５】実験群1についてのDAPI染色（20倍）の結果を示す写真である。
【図１６】実験群2についての血球計算盤による測定の結果を示す写真である。
【図１７】実験群2についてのヘマトキシリン及びエオシンによる染色（40倍）の結果を示す写真（１）である。
【図１８】実験群2についてのヘマトキシリン及びエオシンによる染色（40倍）の結果の結果を示す写真（２）である。
【図１９】実験群2についてのDAPI染色（10倍）の結果を示す写真である。
【図２０】実験群2についてのDAPI染色（20倍）の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
以下、具体的な細胞培養の実施例を通じて、本発明をより詳細に説明する。
【００５８】
この実施例は、粉末状足場ないしは微細球状体を用いた３次元の細胞増殖培養において、同一の量の細胞と、同一の量の足場を用いて、同一時間だけ培養した際に、間歇的な振り動かし（動く状況；振り動かし、揺り動かし、攪拌、渦回転、ゆすり動かし、混ぜ合わせ、練り合わせ、等々）と、粉末状足場なしは微細球状体の段階的な追加方式が細胞培養効率に及ぼす影響を調査するために実施したものであり、以下の仮説が成立するかどうかを確認するためのものである。
【００５９】
仮説１: 細胞増殖に必要な２つの条件、すなわち、１）細胞相互間の増殖誘発信号、及び、２）細胞相互間の増殖抑制信号について、全て適切な状態に維持しようとする試みが細胞増殖量を増大させる方法として作用するであろう。
【００６０】
仮説1-1: 間歇的な振り動かしは、１）「停滞状態で、振り動かさないもの」に比べて、細胞間の一定間隔を一定時間維持し、増殖誘発信号を最大限活用する。また、接触抑制が強くなり始めた際に、再び、細胞同士を分離して接触抑制が小さくなる状況に転換することで、２）「引き続き振り動かし（動く状況；振り動かし、揺り動かし、攪拌、渦回転、ゆすり動かし、混ぜ合わせ、練り合わせ、等）を行うもの」と異なり、停滞状態が存在するので、部分的な密度上昇による増殖誘発効果をより増大させ、また、接触抑制を最小限とする。そのため、１）「停滞状態で、振り動かさないもの」及び２）「続けて振り動かしを行うもの」に比べて、細胞増殖量を増加させるであろう。
【００６１】
仮説1-2: 段階的な足場の追加は、同じ量の細胞で増殖を行おうとする際に、細胞数が増加するに連れて増加する細胞の相対的な濃度増加、すなわち、接触抑制を最小化させるためのものである。初期には、少量の足場に細胞を接種し、徐々に足場の量を増加させるというコンセプトである。初期から多量の足場に接種すると、細胞の相対的濃度が低く、増殖誘発信号が低く増殖誘発が弱くなるが、このような段階を避けるために、初期には細胞の相対濃度を高く保っておく。また、細胞が増殖して相対的濃度が高まるにつれて増加する増殖抑制信号を最小化するために、相対的濃度を一定に保とうという試みである。このようなことは、最終的に細胞の増殖量を増加させるのに寄与するであろう。
【００６２】
仮説２：微細足場を用いた３次元の細胞増殖にあっては、単純な振盪や攪拌だけでも、粒子間に連結された細胞同士を分割するであろう。したがって、細胞の再接種のためには、細胞分割のためのトリプシンなどの変種誘発可能物質を用いる必要がなくなるであろう。
【００６３】
仮説３：仮説１,２により、仮説1-1と仮説1-2を組み合わせた場合（実験群２）、これらの仮説を適用しない培養法、すなわち「停滞状態（対照群１；1-1-2）」、「続けて振り動かしを行うもの（対照群２；1-1-2）」、または、仮説1-1だけを適用した群（実験群１；間歇的に振り動かしを行うもの）に比べて、仮説２の上昇効果により、細胞増殖量が実験群１に比べて増加するであろう。
【００６４】
これらの仮説を確認するために、次のような方法で実験を行った。
【００６５】
＜使用材料及び方法＞
・粉末状足場：PLLA（直径10〜100μm, 球形, 非多孔性）；
・細胞：脂肪組織から抽出した継代培養を経ない（PO）間質（ストロマ）細胞；
・媒体：DMEM（構成；4.00mM L-グルタミン, 4500mg／Lグルコース, ピルビン酸添加, DW-0.2μm 滅菌濾過）+ 10%FBS + 1% PS；
・洗浄液：リン酸緩衝液（構成；KCL:200.00mg／L, KH2PO4:200.00mg／L, NaCL:8000.00mg／L, NaH2PO4・H2O:2160.00mg／L）；
・培養容器：50cc密閉型脂肪採取及び培養用注射器（メディカン(株)）、直立状態に配置→細胞と粉末状足場の沈殿を誘導；
・振盪機：機種; Vortex Genie-2（Scientific industries Co.）-60rpm；
・培養温度及び環境：37℃, 5% CO2-インキュベーター；
・総培養期間：７日。
【００６６】
＜培養方法＞
１）密閉型脂肪採取及び培養用の注射器に針を嵌めて、脂肪組織から脂肪を採取する。；
２）この後、注射器の針を取り外し、先端をゴム栓で塞ぐ。そして、ピストンの通路を通じてコラゲナーゼを投入し、ピストンの通路を塞ぎ、注射器の内部空間を密閉する。；
３）次に、上記注射器容器を医療用遠心分離機に入れて、遠心分離を行った。この後、上部の副産物と、下部の脂肪細胞とに分離する。そして、この後、上部の副産物を、ピストンを通じて外部に排出し、脂肪細胞を得る。；
次いで、洗浄液（リン酸緩衝液）をピストン通路を通じて投入する。そして、容器全体をまんべんなく振り動かし、脂肪細胞を洗浄する。この後、ピストン通路を通じて洗浄液を吸入除去する。このような過程を経て、事前処理された間質（ストロマ）細胞を得る。；
４）この後、上記の事前処理された細胞を、培養液及び粉末状足場に加える。このようにして、培養液内にて浮遊状態で、粉末状足場と細胞とを付着させる。付着物を、それぞれの条件に合わせて培養する。
【００６７】
対照群及び実験群を含む、全ての群について、７日間培養した後、１分振盪し、この後、サンプル中央部にて、25μLをサンプリングした。
【００６８】
a) 対照群１：静的培養にて、粉末状足場8mLを、媒体40ccに加え、１時間以上で沈殿させた後、細胞1×106／mLを上方からピペットで接種した。；
b) 対照群２：連続振盪培養であって、対照群１と同一の過程の後、連続振盪を行った。；
c) 実験群１：間歇的振盪培養であって、対照群１と同一の過程の後、６時間ごとに1分振盪を行った。；
d) 実験群２：間歇的振盪培養＋段階的な粉末状足場の追加。粉末状足場500μLを媒体40ccに入れて振盪した後、6時間ごとに1分振盪を行った。；
次いで、24時間（1日）後、粉末状足場500μLを加えて振盪した後、6時間ごとに1分振盪を行った。；
次いで、36時間（2日）後、粉末状足場1mLを加えて振盪した後、6時間ごとに1分振盪を行った。；
次いで、72時間（3日）後、粉末状足場2mLを加えて振盪した後、6時間ごとに1分振盪を行った。；
次いで、５日目、始めに、粉末状足場4mLを添加して振盪した後、6時間ごとに1分振盪を行った。
【００６９】
＜測定方法＞
１）サンプル採取：同一の条件で（振盪後に直ちに）、サンプルの中央部から25μLを採取し、ここから10μLを細胞計数のために再度採取する。次いで、静的培養及び振盪培養における1日、2日、3日、4日、7日に、微細足場25μLをサンプリングし、トリプシン−EDTAでインキュベーター（37℃, 5% CO2）中にて10分間インキュベーションを行う。この後、サンプリングした微細足場（micro-scaffold）を取り出してから、トリプシン−EDTAを不活性化させるべく、DMEM媒体（10%FBS+1%PS）を加える。1分振盪した後、トリパンブルーを用いて染色し、血球計算盤を用いて細胞数を計測する。
【００７０】
対照群１については、最後のサンプリングの際にのみ適用し、血球計算盤を用いて細胞数を測定し、残りのサンプルは染色に用いる。
【００７１】
ｂ）顕微鏡評価、及び染色法による細胞計数：血球計算盤を用い、細胞顕微鏡下で、目で見て細胞個体数を測定する。
【００７２】
ｃ）H&E染色：ヘモトキシン（Haemotoxylin）及びエオシン（Eosin）で染色し、微細足場にくっ付いている細胞を確認する。
【００７３】
ｄ）DAPI染色：DAPI溶液で微細足場を染色し、蛍光顕微鏡を用いて、付着している細胞を確認する。
【００７４】
対照群１を除く全ての他の群においては、1,2,3,5,7日目に、いずれも1分振盪した後、サンプリングして測定したが、本報告からは除外した。
【００７５】
＜実験結果＞
１）対照群１（静的培養）；
細胞総数：220個のカウント；220 x 104 x 4 x 1/4 = 2.2 x 106；
２）対照群２（連続振盪培養）；
細胞総数：260個のカウント；260 x 104 x 4 x 1/4 = 2.6 x 106；
３）実験群１（間歇振盪培養）；
細胞総数：340個のカウント；340 x 104 x 4 x 1/4 = 3.4 x 106；
４）実験群２（間歇振盪＋段階的な粉末足場の追加による培養）；
細胞総数：680個のカウント；680 x 104 x 4 x 1/4 = 6.8 x 106。
【００７６】
＜倍増期間の計算＞
細胞が2倍に増殖する時間（倍増期間）を求めるために、サンプリングを6時間ごとに25μL採取で行い、そのうち10μLを採って細胞の個数を測定した。表１には、その結果を示す。
【表１】
2010524495.tif 000002
【００７７】
求める公式： ln(Nf/Ni)/ln2（Nf:時間あたりの、採取した細胞の個数。Ni:最初の細胞の個数）。
【００７８】
１）対照群１（静的培養）：倍増期間は約40時間（死んだ細胞も含む）。；
２）対照群２（連続振盪培養）：倍増期間は約40時間。；
３）実験群１（間歇振盪培養）：倍増期間は約28時間。；
４）実験群２（間歇振盪＋段階的な粉末足場の追加による培養）：倍増期間は約20時間。
【００７９】
各対照群及び各実験群について、写真撮影を行った。
【００８０】
１）対照群１（静的培養；2.2×106個の細胞）：図１〜５は、それぞれ、(1)血球計算盤による測定、（2）H&E・20倍、（3）H&E・40倍、（4）DAPI染色・20倍、及び（5）DAPI染色・40倍の結果を示す。
【００８１】
２）対照群２（連続振盪培養；2.6×106個の細胞）：図６〜１０は、それぞれ、(1)血球計算盤による測定、（2）H&E・40倍−１、（3）H&E・40倍−２、（4）DAPI染色・20倍−１、及び（5）DAPI染色・20倍−２の結果を示す。
【００８２】
３）実験群１（間歇振盪培養；3.4×106個の細胞）：図１１〜１５は、それぞれ、(1)血球計算盤による測定、（2）H&E・40倍−１、（3）H&E・40倍−２、（4）DAPI染色・20倍−１、及び（5）DAPI染色・20倍−２の結果を示す。
【００８３】
４）実験群２（間歇振盪＋段階的な粉末足場の追加による培養；6.8×106個の細胞）：図１６〜２０は、それぞれ、(1)血球計算盤による測定、（2）H&E・40倍−１、（3）H&E・40倍−２、（4）DAPI染色・10倍、及び（5）DAPI染色・20倍の結果を示す。
【００８４】
実験結果によると、上記仮説１（細胞増殖に必要な２つの条件、すなわち、１）細胞相互間の増殖誘発信号、及び、２）細胞相互間の増殖抑制信号について、全て適切な状態に維持しようとする試みが細胞増殖量を増大させる方法として作用するであろう）が成立することが知られる。
【００８５】
また、上記の仮説1-1、上記の仮説1-2が成立し、上記の仮説２も成立する。
【００８６】
また、間歇的に振り動かし、同時に段階的に足場を追加する方法であると、単に完結的に振り動かしたり、単に足場を追加する方法に比べて細胞増殖効果が上昇する結果を与える。
【産業上の利用性】
【００８７】
以上に説明したように、本発明は、増殖効率の最大の要因である細胞増殖誘起信号及び細胞増殖抑制信号の適切な制御により、細胞増殖効率を増大させることのできる3次元培養法を提供する。
【００８８】
本発明は、以下からなる方法を用いることにより細胞増殖効率を増大させることができる。(1)細胞間の信号または相互作用により細胞増殖が促進される環境を適切に用いる。(2)増殖した細胞同士がくっ付き合った際に、増殖抑制信号が増加して細胞が増殖できるスペースが小さくなるという現象を、最小化する。さらに、(3)適当な時点で、化学的方法に代えて物理的な力により、細胞同士を分離する。化学的方法は、遺伝子変異のおそれがあることが知られている。
【００８９】
また、本発明が提案する培養方法は、培養の工程、及び種々のシステムや道具をシンプルなものとすることで、実験に要する経済的負担を軽減することが可能である。そして、先進的な研究を、小規模のシステムでも実現可能とし、また、信頼性の高い研究結果を取得可能とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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