(57)【要約】  前処理したリグノセルロース系原料の可溶性糖質への加水分解のための酵素混合物が提供される。酵素混合物は、酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、約０．０９〜約０．９１（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆＥＧ４）のＥＧ４、約０〜約０．９１（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆＳｗｏ１）のスウォレニン、および０〜約０．４２の画分濃度（ｆＣｉｐ１）のＣｉｐ１を含む。前処理したリグノセルロース系原料を、酵素混合物を使用して可溶性糖質に変換するプロセス、ならびにかかる酵素混合物の使用および生成の方法もまた提供される。
2010536391.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前処理したリグノセルロース系原料をセルラーゼ酵素混合物により酵素的に加水分解することを含む、前処理したリグノセルロース系原料を可溶性糖質に変換するためのプロセスであって、前記セルラーゼ酵素混合物が、ＥＧ４、スウォレニンおよびＣｉｐ１補助酵素を含み、
前記ＥＧ４補助酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、約０．０９〜０．９１（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆEG4）で存在し、
前記スウォレニン補助酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、約０．０９〜約０．９１（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆSwo1）で存在し、
前記Ｃｉｐ１補助酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、０〜約０．４２（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆCip1）で存在する、プロセス。
【請求項２】
前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、前記ＥＧ４補助酵素が、約０．２５〜０．８３（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆEG4）で存在し、前記スウォレニン補助酵素が、約０．０９〜約０．６６（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆSwo1）で存在し、前記Ｃｉｐ１補助酵素が、０〜約０．３３（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆCip1）で存在する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記セルラーゼ酵素混合物が、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２主要セルラーゼ酵素を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記セルラーゼ酵素混合物が、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２主要セルラーゼ酵素を含む、請求項２に記載のプロセス。
【請求項５】
前記主要セルラーゼ酵素が、セルラーゼ酵素混合物中に存在する主要セルラーゼ酵素および補助酵素に対して測定して、約７０〜約９５質量パーセントのセルラーゼ酵素混合物内の組合せ含有量を有し、前記補助酵素が、セルラーゼ酵素混合物中に存在する主要セルラーゼ酵素および補助酵素に対して測定して、約５〜約３０質量パーセントのセルラーゼ酵素混合物内の組合せ含有量を有する、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記セルラーゼ酵素混合物内の前記主要セルラーゼ酵素の組合せ含有量が、セルラーゼ酵素混合物中に存在する主要セルラーゼ酵素および補助酵素に対して測定して、約７０〜約９０質量パーセントであり、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する前記補助酵素のセルラーゼ酵素混合物内の組合せ含有量が、セルラーゼ酵素混合物中に存在する主要セルラーゼ酵素および補助酵素に対して測定して、約１０〜約３０質量パーセントである、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
前記主要セルラーゼ酵素および前記補助酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する全タンパク質に対して測定して、約７０〜約１００質量パーセントのセルラーゼ酵素混合物内の組合せ含有量を有する、請求項４に記載のプロセス。
【請求項８】
前記セルラーゼ酵素混合物中に存在するＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２酵素に対して測定して、前記ＣＢＨ１およびＣＢＨ２酵素が、約５５〜約８５質量パーセントの組合せ含有量を有し、前記ＥＧ１およびＥＧ２酵素が、約１５〜約４５質量パーセントの組合せ含有量を有する、請求項４に記載のプロセス。
【請求項９】
前記ＣＢＨ１およびＣＢＨ２酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在するＣＢＨ１およびＣＢＨ２酵素の組合せ含有量に対して測定して、約０．２５〜約０．７５（ｗ／ｗ）の画分濃度で各々存在する、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記ＥＧ１およびＥＧ２の酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在するＥＧ１およびＥＧ２の酵素の組合せ含有量に対して測定して、約０．３５〜約０．９５（ｗ／ｗ）および約０．０５〜約０．６５（ｗ／ｗ）の各々の画分濃度でそれぞれ存在する、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記ＥＧ４酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、約０．３３〜約０．５０（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆEG4）で存在する、請求項２に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記スウォレニン酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、約０．３３〜約０．５８（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆSwo1）で存在する、請求項２に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記Ｃｉｐ１が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、約０．０８〜約０．２５（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆCip1）で存在する、請求項２に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記主要セルラーゼ酵素および前記補助酵素が真菌のソースに由来する、請求項４に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記真菌ソースが、子嚢菌または担子菌の真菌である、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記真菌ソースが、トリコデルマ属の種、アスペルギルス属の種、ヒポクレア属の種、フミコーラ属の種、ニューロスポラ属の種、オルピノミセス属の種、ジベレラ属の種、エメリセラ属の種、ケトミウム属の種、フザリウム属の種、ペニシリウム属の種、マグナポルテ属の種、およびファネロカエテ属の種からなる群から選択される、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記真菌ソースが、トリコデルマ・リーゼイである、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記主要セルラーゼ酵素および前記補助酵素が、生物に内在性であるコード配列の発現によって生物から得られる、請求項４に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記主要セルラーゼ酵素および前記補助酵素が、生物に異種であるコード配列の発現によって生物から得られる、請求項４に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記主要セルラーゼ酵素および前記補助酵素が、トリコデルマ・リーゼイ内の発現によって生成される、請求項４に記載のプロセス。
【請求項２１】
酵素的に加水分解する前記工程において、前記前処理したリグノセルロース系原料中のセルロースの少なくとも８０質量％が、可溶性糖質に変換される、請求項２に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記酵素的加水分解工程の後に、エタノール、乳酸、ブタノール、またはその組合せを可溶性糖質から生成する発酵工程が後続する、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記セルラーゼ酵素混合物が、微生物ソースに由来する分泌酵素の完全なブレンドであり、前記主要セルラーゼ酵素および前記補助酵素が、前記ブレンド中の分泌酵素の約７０〜約１００質量％を構成し、前記分泌酵素が、ブレンド中の分泌酵素の０〜約３０質量％を構成する追加の非セルラーゼ酵素を含む、請求項４に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記セルラーゼ酵素混合物が、β−グルコシダーゼを含む、請求項２に記載のプロセス。
【請求項２５】
前処理したリグノセルロース系原料を可溶性糖質へ加水分解するためのセルラーゼ酵素混合物であって、ＥＧ４、スウォレニンおよびＣｉｐ１補助酵素を含み、
前記ＥＧ４補助酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、約０．０９〜約０．９１（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆEG4）で存在し、
前記スウォレニン補助酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、約０．０９〜約０．９１（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆSwo1）で存在し、
前記Ｃｉｐ１補助酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、０〜約０．４２の画分濃度（ｆCip1）で存在する、
セルラーゼ酵素混合物。
【請求項２６】
前記ＥＧ４補助酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、約０．２５〜約０．８３（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆEG4）で存在し、
前記スウォレニン補助酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、約０．０９〜約０．６６（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆSwo1）で存在し、
前記Ｃｉｐ１補助酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、０〜約０．３３の画分濃度（ｆCip1）で存在する、
請求項２５に記載のセルラーゼ酵素混合物。
【請求項２７】
前記セルラーゼ酵素混合物が、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２主要セルラーゼ酵素を含む、請求項２６に記載のセルラーゼ酵素混合物。
【請求項２８】
前記主要セルラーゼ酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する主要セルラーゼ酵素および補助酵素に対して測定して、約７０〜約９５質量パーセントのセルラーゼ酵素混合物内の組合せ含有量を有し、前記補助酵素が、セルラーゼ酵素混合物中に存在する主要セルラーゼ酵素および補助酵素に対して測定して、約５〜約３０質量パーセントのセルラーゼ酵素混合物内の組合せ含有量を有する、請求項２７に記載のセルラーゼ酵素混合物。
【請求項２９】
前記セルラーゼ酵素混合物内の前記主要セルラーゼ酵素の組合せ含有量が、セルラーゼ酵素混合物中に存在する主要セルラーゼ酵素および補助酵素に対して測定して、約７０〜約９０の質量パーセントであり、前記セルラーゼ酵素混合物内の前記補助酵素の組合せ含有量が、セルラーゼ酵素混合物中に存在する主要セルラーゼ酵素および補助酵素に対して測定して、約１０〜約３０質量パーセントである、請求項２８に記載のセルラーゼ酵素混合物。
【請求項３０】
前記主要セルラーゼ酵素および前記補助酵素が、セルラーゼ酵素混合物中に存在する全タンパク質に対して測定して、約７０〜約１００質量パーセントの組合せ含有量を有する、請求項２７に記載のセルラーゼ酵素混合物。
【請求項３１】
前記セルラーゼ酵素混合物中に存在するＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２酵素の組合せ含有量に対して測定して、前記ＣＢＨ１およびＣＢＨ２酵素が約５５〜約８５質量パーセントの組合せ含有量を有し、前記ＥＧ１およびＥＧ２酵素が約１５〜約４５質量パーセントの組合せ含有量を有する、請求項２７に記載のセルラーゼ酵素混合物。
【請求項３２】
前記ＣＢＨ１およびＣＢＨ２酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在するＣＢＨ１およびＣＢＨ２の酵素の組合せ含有量に対して測定して、約０．２５〜約０．７５（ｗ／ｗ）の画分濃度で各々存在する、請求項３１に記載のセルラーゼ酵素混合物。
【請求項３３】
前記ＥＧ１およびＥＧ２酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在するＥＧ１およびＥＧ２酵素の組合せ含有量に対して測定して、約０．３５〜約０．９５（ｗ／ｗ）および約０．０５〜約０．６５（ｗ／ｗ）の各々の画分濃度でそれぞれ存在する、請求項３１に記載のセルラーゼ酵素混合物。
【請求項３４】
前記ＥＧ４酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、約０．３３〜約０．５０（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆEG4）で存在する、請求項２６に記載のセルラーゼ酵素混合物。
【請求項３５】
前記スウォレニン酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、約０．３３〜約０．５８（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆSwo1）で存在する、請求項２６に記載のセルラーゼ酵素混合物。
【請求項３６】
前記Ｃｉｐ１が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在するＥＧ４、スウォレニンおよびＣｉｐ１補助酵素に対して測定して、約０．０８〜約０．２５（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆCip1）で存在する、請求項２６に記載のセルラーゼ酵素組成物。
【請求項３７】
前記酵素混合物が微生物ソースに由来する分泌酵素の完全なブレンドであり、前記主要セルラーゼ酵素および前記補助酵素が、ブレンド中の分泌酵素の約７０〜約１００質量パーセントを構成し、前記分泌酵素が、ブレンド中の分泌酵素の０〜３０質量％を構成する追加の非セルラーゼ酵素を含む、請求項２６に記載のセルラーゼ酵素混合物。
【請求項３８】
前記酵素混合物が、β−グルコシダーゼを含む、請求項２６に記載のセルラーゼ酵素混合物。
【請求項３９】
前処理したリグノセルロース系原料をセルラーゼ酵素混合物により酵素的に加水分解することを含む、前処理したリグノセルロース系原料を可溶性糖質に変換するためのプロセスであって、前記セルラーゼ酵素混合物が、ＥＧ４、スウォレニンおよびＣｉｐ１補助酵素を含み、
前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、
前記ＥＧ４補助酵素が約０．２５〜０．８３（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆEG4）で存在し、
前記スウォレニン補助酵素が約０〜約０．６６（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆSwo1）で存在し、
前記Ｃｉｐ１補助酵素が０〜約０．３３（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆCip1）で存在する、プロセス。
【請求項４０】
前処理したリグノセルロース系原料を可溶性糖質へ加水分解するためのセルラーゼ酵素混合物であって、ＥＧ４、スウォレニンおよびＣｉｐ１補助酵素を含み、
前記ＥＧ４補助酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、約０．２５〜約０．８３（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆEG4）で存在し、
前記スウォレニン補助酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、約０〜約０．６６（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆSwo1）で存在し、
前記Ｃｉｐ１補助酵素が、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して、０〜約０．３３の画分濃度（ｆCip1）で存在する、セルラーゼ酵素混合物。
【請求項４１】
ＥＧ４、スウォレニンおよびＣｉｐ１補助酵素を含むセルラーゼ酵素混合物を生成する方法であって、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して約０．２５〜０．８３（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆEG4）のＥＧ４、前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して約０〜約０．６６（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆSwo1）のスウォレニン酵素、および前記セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定して０〜約０．３３（ｗ／ｗ）の画分濃度（ｆCip1）のＣｉｐ１酵素を生成するように、１種以上の微生物から前記セルラーゼ酵素混合物を発現することを含む方法。
【請求項４２】
前記１種以上の微生物を遺伝子組換えして、前記１種以上の微生物によって分泌されるＥＧ４、スウォレニン、Ｃｉｐ１またはその組合せのレベルを調整する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記１種以上の微生物を１種以上の主要セルラーゼ酵素の欠失によって遺伝子組換えして、主要セルラーゼに対するＥＧ４、スウォレニン、Ｃｉｐ１またはその組合せの発現レベルを調整する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記セルラーゼ酵素混合物を約２〜約５の間のｐＨで発酵を行うことにより生成して、お互いに対するＥＧ４、スウォレニン、Ｃｉｐ１もしくはその組合せの発現レベルまたは主要セルラーゼ酵素に対する補助成分の発現レベルを調整する、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００７年８月３０日に出願された、前処理されたリグノセルロース系原料の酵素的加水分解のためのプロセスにおける補助酵素の使用、と題される特許出願第６０／９６９，０４６号の仮出願の優先利益を主張し、それらの内容全体は参照することにより本明細書に組み入れられる。
本発明はセルラーゼ酵素混合物を提供する。本発明は、セルラーゼ酵素混合物を使用するリグノセルロース系原料の加水分解のためにプロセスもまた提供する。
【背景技術】
【０００２】
リグノセルロース系原料は、燃料エタノールの生産のためのトウモロコシデンプンに対する有望な代替物である。リグノセルロース系原料は低費用で広く入手可能であり、複数の研究は、セルロース系エタノールは温室効果ガス排出ゼロに近いと結論した。
【０００３】
しかしながら、リグノセルロース系原料は複合糖分子へと容易に分解されない。リグノセルロースの扱い難さは、物理的および／または化学的な前処理により部分的に克服することができる。化学的前処理の例は希硫酸の存在下における水蒸気爆砕である（米国特許第４，４６１，６４８号）。このプロセスは、大部分のヘミセルロースを除去するが、セルロースのグルコースへの転換はほとんど起こらない。次に前処理した物質は、セルラーゼ酵素により加水分解できる。
【０００４】
用語セルラーゼ（またはセルラーゼ酵素）は、セルロースポリマー中の個々のグルコース単位を結合するβ−１，４−グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素を広範囲に指す。触媒機構は、エンドグルカナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）、セロビオヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）およびβ−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）の相乗作用を含む。エンドグルカナーゼはセルロース鎖の中間の利用可能なグルコシド結合を加水分解するが、セロビオヒドロラーゼはこれらの鎖の末端からセロビオースを前進的に放出する。β−グルコシダーゼは、セロビオースをグルコースへ加水分解し、そうすることで、セロビオヒドロラーゼの生成物阻害を最小限にする。総体として、酵素は、セルロース基質を加水分解できるシステムとして作動する。
【０００５】
セルラーゼ酵素は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種、ヒポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）の種、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の種、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）の種、オルピノミセス属（Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ）の種、ジベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）の種、エメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）の種、ケトミウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）の種、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の種、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の種、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）の種、およびファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）の種を含む糸状菌から得ることができる。
【０００６】
トリコデルマ属の種（トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ  ）またはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ））は、結晶セルロースを分解することができるセルラーゼ酵素を生成する。トリコデルマ・リーゼイは、セルロース鎖の還元末端および非還元末端からセロビオースを放出する２つのセロビオヒドロラーゼ（それぞれＣＢＨ１（Ｃｅｌ７Ａ）およびＣＢＨ２（Ｃｅｌ６Ａ））、およびβ−グルコシダーゼ（Ｃｅｌ３Ａ）を分泌する。ＥＧ１（Ｃｅｌ７Ｂ）およびＥＧ２（Ｃｅｌ５Ａ）は結晶セルロースの加水分解に関与する２つの主要なエンドセルラーゼである。ＣＢＨ１（Ｃｅｌ７Ａ）、ＣＢＨ２（Ｃｅｌ６Ａ）、ＥＧ１（Ｃｅｌ７Ｂ）およびＥＧ２（Ｃｅｌ５Ａ）は、２つの機能ドメイン（触媒ドメインおよび炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ））を含む。
【０００７】
残りのエンドグルカナーゼのうちでＥＧ３（Ｃｅｌ１２Ａ）は、炭水化物結合モジュールを欠き、したがって結晶セルロースの結合は不十分である（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９９：６３−７８，（２００２））。ＥＧ５（Ｃｅｌ４５Ａ）およびＥＧ６（Ｃｅｌ７４Ａ）は、それぞれ、グルコマンナナーゼ（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、２００２ａ）およびキシログルカナーゼ（Ｄｅｓｍｅｔら、ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２７４：３５６−３６３、（２００６））であると報告されている。ＥＧ４（Ｃｅｌ６１Ａ）は、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースおよびβ−グルカンに対してある程度の活性を示すことが報告される（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８：６４９８−６５０７，（２００２ｂ））。しかしながらＥＧ１と比較した場合、これらの基質に対するＥＧ４の比活性は４桁低く、その天然の基質および／または作用様式が他に存在することを示唆する。それにもかかわらず、サーモアスカス・オーランティアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）からトリコデルマ属のセルラーゼまでのＣｅｌ６１Ａの追加は、前処理したトウモロコシ茎葉の加水分解を改良することが報告されている（ＷＯ２００５／０７４６５６）。このことはチエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）からのＣｅｌ６１Ｂ、Ｃｅｌ６１ＣおよびＣｅｌ６１Ｄについても示された（ＷＯ２００５／０７４６４７）。
【０００８】
前処理したリグノセルロース系原料の酵素的加水分解はセルロース系エタノールの生成における非能率的な工程であり、そのコストは、商業的実用化に対する主要な障害の１つである。セルラーゼの酵素活性の改良またはセルラーゼ生産効率の増加は、有意なコスト削減の好機として広く認められている。
【０００９】
多数のアプローチはエタノール製造のためのセルラーゼの活性を改良するために採用されてきた。トリコデルマ属によって分泌されたβ−グルコシダーゼ活性の量は、セロビオース蓄積および生成物阻害を最小限にするために増加された（米国特許第６，０１５，７０３号）。変異誘発戦略を使用して、ＣＢＨ１（ＷＯ２００５／０２７７１７２）およびＣＢＨ２（米国２００６／０２０５０４２）の熱安定性が改良された。アミノ酸コンセンサスおよび変異誘発の戦略を利用して、ＣＢＨ１（ＷＯ２００４／０１９７８９０）およびＣＢＨ２（ＷＯ２００６／００５３５１４）の活性が改良された。Ｔ．リーゼイからのＣｅｌ７Ａ触媒ドメインおよびアシドサーマス・セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）からのＥＧ１触媒ドメインからなる融合タンパク質が構築された（ＷＯ２００６／０００５７６７２）。さらに、ミセリオプトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｔｈｏｒａ）、フミコーラ属およびフザリウム属を起源とするセルラーゼおよびヘミセルラーゼからのＣＢＭおよび触媒ドメインの新規の組合せが、新規の酵素の特異性および活性を備えた酵素を生成しようとして、ドメインシャッフリングによって生成された（米国特許第５，７６３，２５４号）。
【００１０】
これらのアプローチは、個々のセルラーゼ成分（特に濾紙、ＣＭＣ、ＨＥＣおよびβ−グルカンなどの実験用基質に対して実質的な活性を示すもの）に注目した。個々のタンパク質の特性を変更しているが、これらのアプローチは、全体のセルラーゼ酵素システムの活性を実質的に増加せず、したがって、セルロース系エタノールの生成に必要とされる酵素のコストを低減しなかった。
【００１１】
いくつかの研究は、リグノセルロース系基質に対する活性を改良するためにセルラーゼ調製物と併用してヘミセルラーゼを検査した（Ｂｅｒｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９７（２）：２８７−２９６，（２００７））。しかしながら、水蒸気爆砕プロセスなどのリグノセルロース系原料の効果的な前処理は、実質的にはヘミセルロースのすべてを除去し、ヘミセルラーゼ活性の改良がセルラーゼのコストを低減するのに最良のアプローチではないことを強く示唆する。
【００１２】
いくつかのトリコデルマ属セルラーゼ成分は、実験用セルロース模倣基質に対して無視できる加水分解活性を有するが、セルロースによって誘導される。Ｃｉｐ１およびＣｉｐ２はセルロースおよびソフォロースによって誘導され、それらがセルロース系バイオマスの破壊における役割を有していることを示唆するが、それらの活性はなお不明である（Ｆｏｒｅｍａｎ  ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７８（３４）３１９８８−３１９９７，（２００３））。スウォレニン(Swollenin)（Ｓｗｏ１）（エクスパンシンドメインおよびＣＢＭを含む新規の真菌タンパク質）は、おそらくセルロース構造中の水素結合の破壊によって、綿繊維を崩壊させることが示されている（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６９：４２０２−４２１１，（２００２））。
【００１３】
多くの研究に対する取り組みにもかかわらず、前処理したリグノセルロース系原料中のセルロースの加水分解のための改良されたセルラーゼ酵素混合物の必要性がある。かかる酵素混合物の欠如は、エタノールおよび他の産物の生成のためのグルコースを含む可溶性糖質へのセルロース転換の商業化における大きなハードルを示す。
【発明の概要】
【００１４】
本発明はセルラーゼ酵素混合物を提供する。本発明は、セルラーゼ酵素混合物を使用するリグノセルロース系原料の加水分解のためのプロセスもまた提供する。
【００１５】
本発明は、リグノセルロース系原料の酵素的加水分解のための改良した酵素混合物の提供を目的とする。
【００１６】
本発明者は、セルラーゼ酵素混合物内の互いに対する補助酵素（すなわちＥＧ４、スウォレニン、Ｃｉｐ１）の比率を調整することが、前処理したリグノセルロース系原料の加水分解を改良できることを明らかにした。例えば、酵素混合物中に存在するＥＧ４、スウォレニンおよびＣｉｐ１酵素に対して測定して、約０．２５〜約０．８３の画分濃度（セルラーゼ酵素混合物中の全量のＥＧ４、スウォレニンおよびＣｉｐ１の関数としてのＥＧ４、スウォレニンおよびＣｉｐ１各々についてのｗ／ｗ）のＥＧ４、約０〜約０．６６の画分濃度のスウォレニンおよび０〜約０．３３の画分濃度のＣｉｐ１の、セルラーゼ酵素混合物中への組入れは、前処理した原料の加水分解を、対応する野生型酵素組成物に対して有意に改良できることが見出された。先行研究は、前処理したリグノセルロース系原料の加水分解における組合せのかかる補助成分の可変比率を検査していないが、むしろ個々のセルラーゼ成分のレベルを修飾することによる酵素活性の改良に注目してきた。
【００１７】
したがって本発明の第１の態様に従って、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２を含む主要セルラーゼ混合物、ならびに画分濃度がセルラーゼ酵素混合物中に存在するＥＧ４、スウォレニンおよびＣｉｐ１酵素の全質量に対して測定して、約０．０９〜約０．９１（ｗ／ｗ）の（例えば約０．２５〜約０．８３（ｗ／ｗ）の）画分濃度のＥＧ４（ｆEG4）；約０．０９〜約０．９１（ｗ／ｗ）の（例えば約０〜約０．６６の）画分濃度（ｆSwo1）のスウォレニン；および０〜約０．４２（ｗ／ｗ）の（例えば約０〜約０．３３の）画分濃度（ｆCip1）のＣｉｐ１を含む補助酵素混合物を含む、前処理したリグノセルロース系原料を可溶性糖質へ加水分解するための単離したセルラーゼ酵素混合物が提供される。
【００１８】
本発明の第２の態様に従って、上で定義されるようなセルラーゼ酵素混合物により前処理したリグノセルロース系原料を酵素的に加水分解することを含む、前処理したリグノセルロース系原料を可溶性糖質へ変換するプロセスが提供される。
【００１９】
本発明の第３の態様に従って、上で定義されるようなセルラーゼ混合物を使用して、前処理したリグノセルロース系原料を可溶性糖質へ加水分解するための方法が提供される。
【００２０】
本発明の各態様の実施形態に従って、酵素混合物はＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２主要セルラーゼ酵素を含む。酵素混合物中に存在する主要セルラーゼ酵素および補助酵素の全質量パーセントに対して測定して、主要セルラーゼ酵素は約７０〜約９５質量％の組合せ含有量を有し、補助酵素は約５〜約３０質量％の組合せ含有量を有することができる。セルラーゼ酵素混合物中に存在する主要セルラーゼ酵素および補助酵素の全質量パーセントに対して測定して、主要セルラーゼ酵素は約７０〜約９０質量％の組合せ含有量を有し、補助酵素は約１０〜約３０質量％の組合せ含有量を有することができる。
【００２１】
本発明の前述の態様のいずれかの実施形態において、酵素混合物中に存在する全タンパク質に対して測定して、主要酵素および補助酵素は約７０〜約１００質量％の組合せ含有量を有する。
【００２２】
セルラーゼ酵素混合物中に存在するＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２酵素の全組合せ質量に対して測定して、ＣＢＨ１およびＣＢＨ２酵素は約５５〜約８５質量％の組合せ含有量を有し、ＥＧ１およびＥＧ２酵素は約１５〜約４５質量％の組合せ含有量を有することができる。本発明の１つの実施形態において、ＣＢＨ１およびＣＢＨ２酵素は各々、セルラーゼ酵素混合物中に存在するＣＢＨ１およびＣＢＨ２酵素の組合せ全質量に対して測定して、約０．２５〜約０．７５（ｗ／ｗ）の画分濃度で存在することができる。本発明の他の実施形態において、ＥＧ１およびＥＧ２の酵素は各々、セルラーゼ酵素混合物中に存在するＥＧ１およびＥＧ２の酵素の組合せ全質量に対して測定して、それぞれ約０．３５〜約０．９５（ｗ／ｗ）および約０．０５〜約０．６５（ｗ／ｗ）の画分濃度で存在することができる。
【００２３】
セルラーゼ酵素混合物中に存在するＥＧ４、スウォレニンおよびＣｉｐ１酵素の全質量に対して、ＥＧ４酵素は約０．３３〜約０．５０の画分濃度で存在し、スウォレニン酵素は約０．３３〜約０．５８の画分濃度で存在し、Ｃｉｐ１は約０．０８〜約０．２５の画分濃度で存在する。
【００２４】
主要酵素および補助酵素は真菌ソースに由来するコーディング配列から発現することができる。真菌ソースは子嚢菌または担子菌でありえる。真菌ソースは、トリコデルマ属の種、アスペルギルス属の種、ヒポクレア属の種、フミコーラ属の種、ニューロスポラ属の種、オルピノミセス属の種、ジベレラ属の種、エメリセラ属の種、ケトミウム属の種、フザリウム属の種、ペニシリウム属の種、マグナポルテ属の種およびファネロカエテ属の種から選択される。真菌ソースはトリコデルマ属の種でありえる。
【００２５】
主要酵素および補助酵素は、主要酵素および補助酵素が由来する内在性生物における発現によって生成することができる。あるいは、主要酵素および補助酵素は、異種生物における発現によって生成することができる。例えば、主要酵素および補助酵素はトリコデルマ・リーゼイにおける発現によって生成される。
【００２６】
セルラーゼ酵素混合物は微生物ソースに由来する分泌酵素のブレンドでありえる。この実施形態に従って、主要酵素および補助酵素はブレンド中の分泌酵素の約７０〜約１００質量％を構成し、追加の非セルラーゼ酵素はブレンド中の全分泌酵素の０〜約３０の質量％を構成する。ブレンド中に分泌された追加の非セルラーゼ酵素はβ−グルコシダーゼを含むことができる。
【００２７】
本発明の他の態様に従って、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２を含む主要酵素混合物、およびＥＧ４、スウォレニンおよびＣｉｐ１補助酵素を含む補助酵素混合物を含む、前処理したリグノセルロース系原料を可溶性糖質へ加水分解するための、セルラーゼ酵素混合物が提供され、セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべてに対して測定された画分濃度（ｆEG4、ｆSwo1およびｆCip1）で存在する各々のＥＧ４、スウォレニンおよびＣｉｐ１補助酵素は、本明細書においてベンチマークブレンドとして定義されたトリコデルマ・リーゼイ（野生型）によって分泌された天然の酵素混合物と比較して、前処理したリグノセルロース系原料に対する活性の少なくとも約１０％の改良を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】クマシーブルー染色による可視化後の、精製された主要成分および補助成分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示した図である。市販のトリコデルマ属セルラーゼおよび分子量スタンダードを参照のために示す。このゲルのデンシトメトリー解析は、精製された成分が実質的に純粋であることを示した。ＣＢＨ１およびＣＢＨ２の調製物は、９５％以上の純度であった。ＥＧ１、ＥＧ２、ＥＧ４、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１は、９０％以上の純度であった。
【図２】精製された主要成分および補助成分のウエスタンブロット解析を示した図である。これらはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜へ電気的に転写し、成分特異的ポリクローナル抗血清を使用して可視化した。これは、精製された成分のクロスコンタミネーションの可能性を検出するより感受性のある技術である。これにより、これらの成分のすべてで、主要セルラーゼのクロスコンタミネーションが実質的にないことも実証された。
【図３】ＥＧ４、スウォレニンおよびＣｉｐ１の様々な混合物により補完された主要セルラーゼ混合物の酵素活性の三成分プロット表示を示した図である。主要セルラーゼ混合物は、３２質量％のＣＢＨ１、４７質量％のＣＢＨ２、１７質量％のＥＧ１および４質量％のＥＧ２からなる（すべての主要セルラーゼの全質量と比較して）。主要セルラーゼ混合物は補助成分混合物との組合せであり、最終組成物で８２ｗｔ％の主要セルラーゼ混合物および１８ｗｔ％補助成分混合物からなる。酵素活性は、補助成分の全濃度と比較して、ＥＧ４（ｆEG4）、スウォレニン（ｆSwo1）およびＣｉｐ１（ｆCip1）の様々な画分濃度でプロットされる。示された活性値は、等しいタンパク質質量ベースで補助成分を含まない主要セルラーゼ混合物の活性に対する値として表示される。市販のトリコデルマ属セルラーゼの補助成分組成物を比較のために示す（「ベンチマークブレンド」）。ＥＧ４、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１のモデル至適条件組成物は、等式１を使用する単一および二成分の補助成分ブレンドの活性をモデル化することによって決定された。これは「モデル至適条件ブレンド」として標識される。
【図４】ベンチマークブレンド（１．１６）よりも有意に高い活性のある補助成分ブレンドを示した図である。これらのブレンドの活性は１．２３以上である。三成分ブレンド空間のこの領域を本明細書においてゾーン１と呼ぶ。
【図５】最も高い活性のある補助成分ブレンドを示した図である。これらのブレンドの活性は１．３０以上である。三成分ブレンド空間のこの領域を本明細書においてゾーン２と呼ぶ。
【図６】本発明において定義された補助成分の最適化比率を使用する、全補助成分に対する全主要セルラーゼ成分の異なる比率からなるセルラーゼ混合物の活性を示した図である。主要セルラーゼ混合物は、３２質量％のＣＢＨ１、４７質量％のＣＢＨ２、１７質量％のＥＧ１および４質量％のＥＧ２からなるが（すべての主要セルラーゼの全質量と比較して）、補助酵素混合物は、４２質量％のＥＧ４、４１質量％のＳｗｏ１および１７質量％のＣｉｐ１からなる（すべての補助酵素の全質量と比較して）。市販のトリコデルマ属セルラーゼにおける、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２の組合せパーセンテージ（％ＰＣ）は、「ベンチマーク比率」としてこの図において標識される。
【図７Ａ】前処理したリグノセルロース系基質の異なるセルラーゼ成分混合物による経時的な転換を示した図である。主要成分のブレンドに追加した場合の補助成分のベンチマークブレンドを、補助成分の至適ブレンドと比較した。ＥＧ４、Ｓｗｏ１またはＣｉｐ１不含有の主要セルラーゼのブレンドのパフォーマンスを参照のために示す。この分析において使用する各ブレンドのタンパク質用量の合計は等しかった。
【図７Ｂ】前処理したリグノセルロース系基質の異なるセルラーゼ成分混合物による経時的な転換を示した図である。主要成分のブレンドに追加した場合の補助成分のベンチマークブレンドを、補助成分の至適ブレンドと比較した。ＥＧ４、Ｓｗｏ１またはＣｉｐ１不含有の主要セルラーゼのブレンドのパフォーマンスを参照のために示す。この分析において使用する各ブレンドのタンパク質用量の合計は等しかった。両方のグラフ（パネルＡおよびＢ）はパネルＢにおいて、軸を対数形態に変化させた以外は、同じ結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明はセルラーゼ酵素混合物を提供する。本発明は、またセルラーゼ酵素混合物を使用するリグノセルロース系原料の加水分解のためのプロセスを提供する。
【００３０】
本発明は、前処理したリグノセルロース系原料の加水分解のために使用される主要セルラーゼおよび補助酵素を含むセルラーゼ酵素混合物に関する。「補助酵素」または「補助成分」は、エンドグルカナーゼ、ＥＧ４、スウォレニン（Ｓｗｏ１）およびＣｉｐ１として本明細書において定義される。「主要セルラーゼ酵素」、「主要セルラーゼ」、「主要成分」または「ＰＣ」は、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ１およびＣＢＨ２）およびエンドグルカナーゼ（ＥＧ１およびＥＧ２）として本明細書において定義される。セルラーゼ酵素混合物は、主要セルラーゼ（ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２）および補助酵素（ＥＧ４、スウォレニンおよびＣｉｐ１）に加えて、さらに詳細に本明細書において記述されるようなβ−グルコシダーゼ酵素成分と同様に、他のセロビオヒドロラーゼまたはエンドグルカナーゼおよびヘミセルラーゼを含む追加の酵素を含むことができる。
【００３１】
以下の定義は、国際生化学分子生物学連合の生化学命名法合同委員会によって定義されるようなセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４，２２３，１−５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５，２３２，１−６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６，２３７，１−５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７，２５０；１−６，ａｎｄ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，２６４，６１０−６５０中の別冊と共に；Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ、１９９２年、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ、カリフォルニア、ＩＳＢＮ、０−１２−２２７１６４−５中に発表され、各々は参照することにより本明細書に組み入れられる；ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／もまた参照）およびグリコヒドロラーゼ酵素のための正式名称として認められるＣＡＺｙシステムによって定義されるようなセルラーゼおよびβ−グルコシダーゼのグリコヒドロラーゼファミリー（Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．およびＨｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．、１９９９年、Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ中の「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ．」、Ｈ．Ｊ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｇ．Ｄａｖｉｅｓ、Ｂ．ＨｅｎｒｉｓｓａｔおよびＢ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ編、英国王立化学協会、ケンブリッジ、ｐｐ．３−１２、これらは参照することにより本明細書に組み入れられる；ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／ＣＡＺＹ／また参照）の分類、ならびに当業者によく知られているものを指す。
【００３２】
「ＥＧ４」は、ＥＣ３．２．１．４に分類されたグリコヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー６１触媒ドメインについての核酸配列コーディングから発現された炭水化物活性酵素、またはアミノ酸１４４〜アミノ酸１６３のトリコデルマ・リーゼイのＥＧ４酵素の高度に保存された配列に対して、４０％〜１００％、例えば５０％〜１００％のアミノ酸配列同一性を備えた任意のタンパク質、ポリペプチドもしくはその断片である（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＣＡＡ７１９９９、およびヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）エンドグルカナーゼＩＶとして注釈された）。例えば、ＥＧ４酵素は、表１においてリストされた生物のうちの任意の１つから得られるか、またはそれに由来することができ、トリコデルマ・リーゼイのＥＧ４に対して少なくとも４０％の同一性が実証される。ＥＧ４は、ファミリー１セルロース結合ドメインなどの結晶セルロースに対する高親和性を備えた炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）に機能的に結合することができる。
表１：トリコデルマ・リーゼイＥＧ４に対するＥＧ４酵素の配列同一性
【表１】
2010536391.tif 000003
*Ｔ．リーゼイＥＧ４について、最初の８つのアミノ酸がＨＧＨＩＮＤＩＶであるように、アミノ酸１は分泌された酵素の第１のアミノ酸である。
【００３３】
「スウォレニン」または「Ｓｗｏ１」は、トリコデルマ・リーゼイのスウォレニン酵素のアミノ酸９２〜４７５（エクスパンシン様ドメインおよびそれに結合するＣＢＭを含むが、ファミリー１ＣＢＭおよびリンカーペプチドを欠く）に対して、約７０％〜１００％のアミノ酸配列同一性、または例えば約７５％〜約１００％のアミノ酸配列同一性を備えた任意のタンパク質、ポリペプチドまたはその断片として本明細書において定義される（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＣＡＢ９２３２８、ヒポクレア・ジェコリナのスウォレニンとして注釈された）。例えば、スウォレニン酵素は表２においてリストされた生物のうちの任意の１つから得られるか、またはそれに由来することができ、トリコデルマ・リーゼイからのスウォレニン酵素に対して少なくとも約７０％の同一性が実証される。例えば、スウォレニンは、ファミリー１セルロース結合ドメインなどの結晶セルロースに対する高親和性を備えた炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）に機能的に連結することができる。
表２：トリコデルマ・リーゼイのスウォレニンに対するスウォレニン酵素の配列同一性
【表２】
2010536391.tif 000004
*Ｔ．リーゼイのスウォレニンについて、最初の８つのアミノ酸がＱＱＮＣＡＡＬＦであるように、アミノ酸１は分泌された酵素の第１のアミノ酸である。
【００３４】
「Ｃｉｐ１」は、トリコデルマ・リーゼイＣｉｐ１酵素の触媒ドメインを含むアミノ酸１〜２１２に対して、約４０％〜約１００％のアミノ酸配列同一性、例えば約５６％〜約１００％のアミノ酸配列同一性を備えた任意のタンパク質、ポリペプチドまたはその断片として本明細書において定義される（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＡＡＰ５７７５１、ヒポクレア・ジェコリナＣｉｐ１として注釈された）。例えば、Ｃｉｐ１酵素は表３においてリストされた生物のうちの任意の１つに由来することができ、トリコデルマ・リーゼイＣｉｐ１酵素に対して少なくとも約４０％の同一性が実証される。Ｃｉｐ１は、ファミリー１セルロース結合ドメインなどの結晶セルロースに対する高親和性を備えた炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）に機能的に連結することができる。
表３：トリコデルマ・リーゼイＣｉｐ１に対するＣｉｐ１酵素の配列同一性
【表３】
2010536391.tif 000005
*Ｔ．リーゼイＣｉｐ１について、最初の８つのアミノ酸がＱＩＳＤＤＦＥＳ．．であるように、アミノ酸１は分泌された酵素の第１のアミノ酸である。
【００３５】
「ＣＢＨ１」は、ＥＣ３．２．１．９１に分類されたグリコヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー７触媒ドメインについての核酸配列コーディングから発現された炭水化物活性酵素、またはトリコデルマ属ＣＢＨ１酵素の触媒ドメイン（アミノ酸１〜４３７）に対して、約６０％〜約１００％アミノ酸配列同一性、もしくは例えば約６５％〜約１００％のアミノ酸配列同一性を備えた任意のタンパク質、ポリペプチドもしくはその断片である（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＣＡＨ１０３２０、ヒポクレア・ジェコリナＣＢＨ１として注釈された）。例えば、ＣＢＨ１酵素は表４においてリストされた生物のうちの任意の１つに由来することができ、トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ１酵素に対して少なくとも６０％の同一性を実証する。ＣＢＨ１は、ファミリー１セルロース結合ドメインなどの結晶セルロースに対する高親和性を備えた炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）に機能的に連結することができる。
表４：トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ１に対するＣＢＨ１酵素の配列同一性
【表４】
2010536391.tif 000006
2010536391.tif 000007
*Ｔ．リーゼイＣＢＨ１について、最初の８つのアミノ酸がＱＳＡＣＴＬＱＳ．．であるように、アミノ酸１は分泌された酵素の第１のアミノ酸である。
【００３６】
「ＣＢＨ２」は、ＥＣ３．２．１．９１に分類されたグリコヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー６触媒ドメインについての核配列コーディングから発現された炭水化物活性酵素、またはトリコデルマ属ＣＢＨ２酵素の触媒ドメインを含むアミノ酸８３〜４４７に対して、約４５％〜約１００％のアミノ酸配列同一性、もしくは例えば約６０％〜約１００％のアミノ酸配列同一性を備えた任意のタンパク質、ポリペプチドもしくはその断片として定義される（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＡＡＡ３４２１０、ヒポクレア・ジェコリナのセロビオヒドロラーゼＩＩとして注釈された）。例えば、ＣＢＨ２酵素は表５においてリストされた生物のうちの任意の１つから得られるか、またはそれに由来することができ、トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ２酵素に対して少なくとも約４５％の同一性が実証される。ＣＢＨ２は、ファミリー１セルロース結合ドメインなどの結晶質のセルラーゼに対する高親和性を備えた炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）に機能的に連結することができる。
表５：トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ２に対するＣＢＨ２酵素の配列同一性
【表５】
2010536391.tif 000008
2010536391.tif 000009
2010536391.tif 000010
*Ｔ．リーゼイＣＢＨ１について、最初の８つのアミノ酸がＱＡＡＣＳＳＶＷＧであるように、アミノ酸１は分泌された酵素の第１のアミノ酸である。
【００３７】
「ＥＧ１」は、ＥＣ３．２．１．４に分類されたグリコヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー７触媒ドメインについての核酸配列コーディングから発現された炭水化物活性酵素、またはトリコデルマ・リーゼイＥＧ１酵素の触媒ドメインを含むアミノ酸１〜３７４に対して、約４０％〜約１００％のアミノ酸配列同一性、もしくは例えば約４８％〜約１００％のアミノ酸配列同一性を備えた任意のタンパク質、ポリペプチドもしくはその断片として定義される（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＡＡＡ３４２１２、ヒポクレア・ジェコリナのエンドグルカナーゼＩとして注釈された）。例えば、ＥＧ１酵素は表６においてリストされた生物のうちの任意の１つから得られるか、またはそれに由来することができ、トリコデルマ・リーゼイＥＧ１酵素に対して少なくとも約４０％の同一性が実証される。ＥＧ１は、ファミリー１セルロース結合ドメインなどの結晶質のセルラーゼに対する高親和性を備えた炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）に機能的に連結される。
表６：トリコデルマ・リーゼイＥＧ１に対するＥＧ１酵素の配列同一性
【表６】
2010536391.tif 000011
*Ｔ．リーゼイＥＧ１について、最初の８つのアミノ酸がＱＱＰＧＴＳＴＰであるように、アミノ酸１は分泌された酵素の第１のアミノ酸である。
【００３８】
「ＥＧ２」は、ＥＣ３．２．１．４に分類されたグリコヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー５触媒ドメインについての核酸配列コーディングから発現された炭水化物活性酵素またはトリコデルマ属ＥＧ２酵素のアミノ酸２０２〜２２２に対して、約４０％〜約１００％のアミノ酸配列同一性、もしくは例えば約４８％〜約１００％のアミノ酸配列同一性を備えた任意のタンパク質、ポリペプチドもしくはその断片として定義される（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＡＡＡ３４２１３、ヒポクレア・ジェコリナのエンドグルカナーゼＩＩＩとして注釈された）。トリコデルマ・リーゼイＥＧ２アミノ酸配列のアミノ酸２０２〜２２２によって表わされる高度に保存された領域は、ＧＨファミリー５を特徴づける２つの触媒のグルタミン酸残基のうちの１つを含む。例えば、ＥＧ２酵素は表７においてリストされた生物のうちの任意の１つから得られるか、または由来することができ、トリコデルマ・リーゼイＥＧ２酵素に対して少なくとも約４０％の同一性が実証される。ＥＧ２は、ファミリー１セルロース結合ドメインなどの結晶質のセルラーゼに対する高親和性を備えた炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）に機能的に連結することができる。
表７：トリコデルマ・リーゼイＥＧ２に対するＥＧ２酵素の配列同一性
【表７】
2010536391.tif 000012
2010536391.tif 000013
*Ｔ．リーゼイＥＧ２について、最初の８つのアミノ酸がＱＱＴＶＷＧＱＣであるように、アミノ酸１は分泌された酵素の第１のアミノ酸である。
【００３９】
「β−グルコシダーゼ」は、ＥＣ  ３．２．１．２１または任意のタンパク質、ペプチドもしくはその断片にも分類されるＧＨファミリー３またはＧＨファミリー１からの任意の酵素として定義される。β−グルコシダーゼは真菌起原でありえる。例えば、β−グルコシダーゼは、トリコデルマ属、ヒポクレア属またはアスペルギルス属の種からでありえるか、またはβ−グルコシダーゼはトリコデルマ・リーゼイからでありえる。
【００４０】
配列同一性は、手動のアライメント、または当業者に公知の任意の配列アライメントアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴアルゴリズム（ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９７７；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２  （１９８１）によって開示されたアルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性のアライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４  （１９８８）の類似性方法の検索、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（ウィスコンシン遺伝学ソフトウェアパッケージ（遺伝学コンピューターグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、５７５サイエンス大通り、マディソン、ウィスコンシン）中の、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または手動のアライメントおよび目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌらおよび編集者１９９５年別冊）を参照）であるが、これらに限定されないものを使用する２つの配列のアミノ酸のアライメントによってたやすく決定することができる。セルラーゼ酵素のためのＢＬＡＳＴアライメントおよび配列同一性決定を行なう事例において、触媒ドメインを含むアミノ酸配列のみが判断される。
【００４１】
リグノセルロース系原料の加水分解の実行において特に利点を示す補助成分（すなわちＥＧ４、スウォレニンおよびＣｉｐ１）の比率を同定した。混合物のこれらのセットは、画分濃度（すなわち、セルラーゼ酵素混合物中に存在する補助酵素のすべての組合せ質量の合計の関数としての個々の補助酵素の質量）によって本明細書において定義される。ＥＧ４、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１に対するＥＧ４の画分は、本明細書においてｆEG4と呼ばれ、
ｆEG4＝ＥＧ４／（ＥＧ４＋Ｓｗｏ１＋Ｃｉｐ１）
である。ＥＧ４、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１に対するＳｗｏ１画分は、本明細書においてｆSwo1と呼ばれ、
ｆSwo1＝Ｓｗｏ１／（ＥＧ４＋Ｓｗｏ１＋Ｃｉｐ１）
である。ＥＧ４、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１に対するＣｉｐ１画分は、本明細書においてｆCip1と呼ばれ、
ｆCip1＝Ｃｉｐ１／（ＥＧ４＋Ｓｗｏ１＋Ｃｉｐ１）
である。
【００４２】
図４および５において示されるように、主要セルラーゼおよび補助酵素を含むセルラーゼ混合物中で、ＥＧ４の画分が約０．２５〜約０．８３の間であり（ｆEG4）、Ｓｗｏ１の画分が約０〜約０．６６の間であり（ｆSwo1）、Ｃｉｐ１の画分が０〜０．３３の間である（ｆCip1）場合、本明細書において「ベンチマークブレンド」として参照される市販のトリコデルマ属セルラーゼ混合物と比較して、有意に高いレベルの加水分解が観察された。図４において略述されるように、この補助酵素の混合物はゾーン１をカバーする。例えば、ｆEG4は約０．３３〜約０．５０の間であり、ｆSwo1は約０．３３〜約０．５８の間であり、ｆCip1は約０．０８〜約０．２５の間でありうる。図５において略述されるように、この補助酵素の混合物はゾーン２をカバーする。
【００４３】
したがって、本発明に従って、ＥＧ４酵素は、約０．２５〜約０．８３、またはその間の任意の値、例えば、０．２５、０、３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８３、またはその間の任意の値の画分濃度（ｆEG4）で存在する。例えば、ＥＧ４画分濃度（ｆEG4）は、約０．３３〜約０．５０、またはその間の任意の値、例えば、０．３３、０．３４、０．３６、０．３８、０．４０、０．４２、０．４４、０．４６、０．４８、０．５０またはその間の任意の値でありえる。スウォレニン酵素は、約０〜約０．６６、またはその間の任意の値、例えば０、０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．６６またはその間の任意の値の画分濃度（ｆSwo1）で存在する。例えば、スウォレニン画分濃度（ｆSwo1）は、約０．３３〜約０．５８、またはその間の任意の値、例えば０．３３、０．３４、０．３６、０．３８、０．４０、０．４２、０．４４、０．４６、０．４８、０．５０、０．５２、０．５４、０．５６、０．５８、またはその間の任意の値でありえる。Ｃｉｐ１は、０〜０．３３、またはその間の任意の値、例えば０、０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．３３またはその間の任意の値の画分濃度（ｆCip1）で存在する。例えば、Ｃｉｐ１は、０．０８〜０．２５、またはその間の任意の値、例えば０．０８、０．１０、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２０、０．２２、０．２４、０．２５またはその間の任意の値の画分濃度でありえる。
【００４４】
酵素混合物中の補助酵素および主要セルラーゼ酵素の両方と比較して測定して、補助成分（ＥＧ４、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１）の組合せ含有量は、約５質量％〜約３０質量％の間またはその間の任意の質量％、例えば約１０質量％〜約３０の質量％の間またはその間の任意の質量％でありえ、主要セルラーゼ酵素は、約７０質量％〜９５質量％の間またはその間の任意の質量％、例えば約１０質量％〜約７０質量％の間またはその間の任意の質量％でありえる。例えば、補助成分は、酵素混合物中に存在するすべての補助酵素およびすべての主要セルラーゼ酵素の組合せ質量と比較して、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３０．５質量％で存在することができる。主要セルラーゼ酵素は、酵素混合物中に存在するすべての補助酵素およびすべての主要セルラーゼ酵素の組合せ質量と比較して、約６９．５、７０、７１、７、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９４．５または９５質量％で存在することができる。
【００４５】
所望されるように、主要セルラーゼ成分（ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２）の互いに対する比率を調整して、加水分解のさらなる改良を達成することができる。本発明の実施において利用することができる酵素混合物中の主要セルラーゼの比率は、同時係属米国特許出願第２００８／００５７５４１Ａ１号において開示された通りである（参照することにより本明細書に組み入れられる）。限定して判断されるべきでない実施例を以下に提供する。しかしながら、本発明中に記述された主要セルラーゼの特異的比率によるいかなる方式でも本発明が限定されていないことは認識されるべきである。
【００４６】
例えば、本発明のセルラーゼ酵素混合物内のセロビオヒドロラーゼＣＢＨ１およびＣＢＨ２（すなわちＣＢＨ１およびＣＢＨ２の組合せ含有量）は、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２からなる主要セルラーゼ混合物の５５以上質量％〜８５未満の質量％、またはその間の任意の質量％で存在することができ、例えばＣＢＨ１およびＣＢＨ２は、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５質量％またはその間の任意の質量％で存在することができる。本発明のセルラーゼ酵素混合物内のエンドグルカナーゼ（ＥＧ１およびＥＧ２）は、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２からなる主要セルラーゼ混合物の１５％以上〜４５％未満の質量％、またはその間の任意の質量％で存在することができ、例えば、ＥＧ１およびＥＧ２は、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２５、３０、３５、４０、４５質量％またはその間の任意の質量％で存在することができる。
【００４７】
ＣＢＨ１およびＣＢＨ２の酵素は各々、酵素混合物中に存在するＣＢＨ１およびＣＢＨ２の酵素の組合せ含有量と比較して測定して、０．２５〜０．７５（ｗ／ｗ）またはその間の任意の値、および０．２５〜０．７５（ｗ／ｗ）またはその間の任意の値のそれぞれの画分濃度で存在することができる。例えば、ＣＢＨ１およびＣＢＨ２は各々、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５またはその間の任意の値の画分濃度で存在することができる。ＥＧ１およびＥＧ２の酵素は各々、酵素混合物中に存在するＥＧ１およびＥＧ２の酵素の組合せ含有量と比較して測定して、０．３５〜０．９５（ｗ／ｗ）またはその間の任意の値、および０．０５〜０．６５（ｗ／ｗ）またはその間の任意の値、のそれぞれの画分濃度で存在する。例えば、ＥＧ１は、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５またはその間の任意の値の画分濃度で存在することができ、ＥＧ２は、０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５またはその間の任意の値の画分濃度で存在することができる。
【００４８】
本発明のセルラーゼ酵素混合物は、「前処理したリグノセルロース系原料」の酵素的加水分解のために使用される。前処理したリグノセルロース系原料は、前処理前に、少なくとも２０％のセルロース（乾燥質量）、例えば約３０％以上のセルロース、または例えば４０％以上のセルロース、例えば２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０％もしくはその間の任意の％、および少なくとも１０％のリグニン（乾燥質量）、より典型的には少なくとも１２％（乾燥質量）を含む植物起原の材料であり、物理的プロセスおよび／または化学プロセスにさらして繊維をセルロース分解性酵素の作用に対してより接近可能におよび／またはより感受性があるようにする。
【００４９】
前処理後に、リグノセルロース系原料はより高いレベルのセルロースを含むことができる。例えば、酸前処理が利用されるならば、ヘミセルロース成分は加水分解され、それはセルロースの相対的レベルを増加させる。この事例において、前処理した原料は、約２０％以上のセルロース、および約１２％以上のリグニンを含むことができる。１つの実施形態において、前処理したリグノセルロース系原料は、約２０％以上のセルロース、および約１０％以上のリグニンを含むことができる。
【００５０】
本発明において使用できるリグノセルロース系原料は、トウモロコシ茎葉、麦わら、大麦わら、稲わら、エンバクわら、キャノーラわらおよび大豆茎葉などの農業用残渣；トウモロコシ繊維、甜菜パルプ、パルプミル微粉および不良品またはサトウキビバガスなどの繊維加工残渣；ハコヤナギ材、他の硬材、軟材およびおがくずなどの林業残渣；スイッチグラス、ススキ、コードグラスおよびクサヨシなどのイネ科草本；または使用済み廃紙産物を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
リグノセルロース系原料は、粉砕または摩砕または撹拌または破砕または圧縮／膨張または他のタイプの機械的作用を含むが、これらに限定されない方法によるサイズ減少を最初に行なうことができる。機械的作用によるサイズ減少は、目的のために適合した任意のタイプの装置（例えば、限定しないがハンマーミル）によって実行できる。
【００５２】
前処理プロセスの非限定例は、硫酸もしくは亜硫酸、または他の酸；アンモニア、石灰、水酸化アンモニウムまたは他のアルカリ；エタノール、ブタノールまたは他の有機溶媒；または加圧水によるリグノセルロース系原料の化学処理を含む（米国特許第４，４６１，６４８号、第５，９１６，７８０号、第６，０９０，５９５号、第６，０４３，３９２号、第４，６００，５９０号、Ｗｅｉｌら（１９９７）およびＯｈｇｒｅｎ，Ｋ．ら（２００５）を参照；これらは参照することにより本明細書に組み入れられる）。
【００５３】
前処理を実行して、リグノセルロース系原料中に存在するヘミセルロースまたはその部分を、単糖類（例えばキシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトースまたはその組合せ）へ加水分解することができる。ヘミセルロースのほぼ完全な加水分解、およびセルロースのグルコースへの少量の転換が起こるように、前処理を実行することができる。前処理の間に、典型的には、約０．０２％（ｗ／ｗ）〜約２％（ｗ／ｗ）、またはその間の任意の量の水性スラリー中の酸濃度が、リグノセルロース系原料の処理のために使用される。酸は、塩酸、硝酸または硫酸でありえるが、これらに限定されない。例えば、前処理の間に使用される酸は硫酸である。
【００５４】
原料の酸前処理を実行する１つの方法は、米国特許第４，４６１，６４８号において設定されたプロセス条件を使用する水蒸気爆砕である（Ｆｏｏｄｙ、参照することにより本明細書に組み入れられる）。原料スラリーを前処理する他の方法は連続的な前処理を含み、リグノセルロース系原料が反応装置を介して持続的にポンプで送り込まれることを意味する。連続的な酸前処理は当業者によく知られており；例えば、米国特許第５，５３６，３２５号（Ｂｒｉｎｋ）；ＷＯ２００６／１２８３０４（ＦｏｏｄｙおよびＴｏｌａｎ）；および米国特許第４，２３７，２２６号（Ｇｒｅｔｈｌｅｉｎ）を参照（それら各々は参照することにより本明細書に組み入れられる）。米国特許第４，５５６，４３０号において開示されたプロセスなどの当技術分野において公知の追加の技術を必要に応じて使用することができる（Ｃｏｎｖｅｒｓｅら；参照することにより本明細書に組み入れられる）。
【００５５】
上述されるように、前処理はアルカリにより行うことができる。酸前処理とは対照的に、アルカリによる前処理は、原料のヘミセルロース成分を加水分解しないが、むしろアルカリはヘミセルロース上に存在する酸性基と反応して基質の表面を開く。アルカリの追加は、セルロースがさらに加水分解されやすいように、セルロースの結晶構造を変更することもできる。前処理において使用できるアルカリの例は、アンモニア、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムおよび水酸化ナトリウムを含む。前処理は、好ましくは、石灰および水酸化マグネシウムなどの水中で不溶性のアルカリにより行われない。
【００５６】
適切なアルカリ前処理の例は、アンモニア凍結爆砕、アンモニア繊維爆砕またはアンモニア繊維膨張（「ＡＦＥＸ」プロセス）である。このプロセスに従って、リグノセルロース系原料は、アンモニアまたは水酸化アンモニウムがセルロース繊維の結晶構造の変更を可能にするのに十分な時間の間、圧力容器中のアンモニアまたは水酸化アンモニウムと接触させられる。次に圧力を迅速に低下させ、アンモニアをフラッシュまたは煮沸し、セルロース繊維構造を爆砕することを可能にする（米国特許第５，１７１，５９２号、第５，０３７，６６３号、第４，６００，５９０号、第６，１０６，８８８号、第４，３５６，１９６号、第５，９３９，５４４号、第６，１７６，１７６号、第５，０３７，６６３号および第５，１７１，５９２号を参照（各々は参照することにより本明細書に組み入れられる））。次に、フラッシュされたアンモニアは、公知のプロセスに従って回収することができる。
【００５７】
当業者によく知られているように、前処理したリグノセルロース系原料は、前処理後であるが酵素的加水分解前に、水による希釈、水による洗浄、緩衝作用、濾過もしくは遠心分離、またはこれらのプロセスの組合せなどの複数の工程のいずれかによって、酵素的加水分解の前に加工することができる。
【００５８】
前処理したリグノセルロース系原料は次に酵素的加水分解を行なった。用語「酵素的加水分解」によって、セルラーゼ酵素がセルロースに働いて、そのすべてまたは部分が可溶性糖質に変換するプロセスが意味される。可溶性糖質は、前処理したリグノセルロース系原料のセルロース部分に由来する水溶性ヘキソースモノマーおよび最大６つのモノマー単位のオリゴマーを含むように意味される。可溶性糖質の例は、グルコース、セロビオース、セロデキシトリン、またはその混合物を含むが、これらに限定されない。可溶性糖質は大部分はセロビオースおよびグルコースでありえる。可溶性糖質は大部分はグルコースでありえる。
【００５９】
酵素的加水分解プロセスは、約８０％〜約１００％またはその間の任意の範囲のセルロースを可溶性糖質へ変換することができる。例えば、酵素的加水分解プロセスは、約９０％〜約１００％またはその間の任意の範囲のセルロースを可溶性糖質へ変換することができる。例えば、酵素的加水分解プロセスは、約９８％〜約１００％またはその間の任意の範囲のセルロースを可溶性糖質へ変換することができる。
【００６０】
セルラーゼ混合物を使用する酵素的加水分解は、バッチ加水分解、連続的加水分解またはその組合せでありえる。加水分解は、撹拌、非混合、またはその組合せでありえる。
【００６１】
例えば、酵素的加水分解は、約４５℃〜約７５℃の温度、またはその間の任意の温度、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５℃の温度、またはその間の任意の温度、および約３．５〜約７．５のｐＨ、またはその間の任意のｐＨ、例えば、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５のｐＨ、またはその間のｐＨで実行することができる。加水分解の開始の前の加水分解反応装置中のセルロースの初期濃度は、約４％（ｗ／ｗ）〜約１５％（ｗ／ｗ）、またはその間の任意の量、例えば、４、６、８、１０、１２、１４、１５％またはその間の任意の量でありえる。主要セルラーゼ酵素のすべての組合せ供与量は、セルロース１グラムあたり約１〜約１００ｍｇのタンパク質、またはその間の任意の量、例えばセルロース１グラムあたり１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍｇのタンパク質またはその間の任意の量でありえる。加水分解は、約１２時間〜約２００時間の期間、またはその間の任意の時間で実行することができ、例えば、加水分解は、１５時間〜１００時間の期間、またはその間の任意の時間で実行するか、またはそれは、１２、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００またはその間の任意の時間で実行することができる。反応条件はいかなる方式でも本発明を限定することを意味せず、当業者によって所望されるように調整できることが認識されるべきである。
【００６２】
酵素的加水分解は、典型的には、加水分解反応装置中で実行される。酵素混合物は、加水分解反応装置への基質の追加の前の、その間、またはその後に、前処理したリグノセルロース系原料（「基質」としても参照される）に追加される。
【００６３】
酵素混合物は、１種以上の液内培養発酵において生成され、濾過、遠心分離または当業者によく知られている他のプロセスによって発酵の終了時に細胞から分離することができる。次に、無細胞セルラーゼ含有画分は、使用前に、濃縮（例えば限外濾過を介して）維持および／または安定化させた。あるいは、主要セルラーゼは細胞から分離されないが、細胞と共に酵素的加水分解に追加される。
【００６４】
セルラーゼ混合物は、水中のタンパク質の水性溶液、水中のタンパク質のスラリー、固体粉末もしくは顆粒、またはゲルでありえる。セルラーゼ酵素を含むブレンドは、緩衝液、界面活性剤、安定剤、賦形剤、または当業者によく知られている他のかかる添加剤などの添加剤を含むことができる。
【００６５】
本発明の酵素混合物は、多数のソースの任意の１つに由来することができる。セルラーゼ酵素混合物の酵素のコード配列は、子嚢菌類または担子菌類からでありえる。例えば、コード配列は、トリコデルマ属の種、アスペルギルス属の種、ヒポクレア属の種、フミコーラ属の種、ニューロスポラ属の種、オルピノミセス属の種、ジベレラ属の種、エメリセラ属種およびケトミウム属の種、フザリウム属の種、ペニシリウム属の種、マグナポルテ属の種およびファネロカエテ属の種から選択された属からである。例えば、主要セルラーゼおよび補助酵素のためのコード配列はトリコデルマ・リーゼイからでありえる。
【００６６】
本発明の主要セルラーゼおよび補助酵素はクローン化されて、細菌または真菌などの発現宿主として当業者に公知の任意の適切な微生物において発現することができる。微生物は真菌でありえる。遺伝子コンストラクトは、ＣａＣｌ2、エレクトロポレーション、微粒子銃照射、プロトプラストのＰＥＧ仲介性融合による細胞の処理を含むが、これらに限定されない微生物形質転換の当業者に公知の任意の数の方法によって宿主微生物へと導入することができる（例えば米国特許第６，９３９，７０４号）。
【００６７】
セルラーゼ酵素混合物中のすべての酵素は、生物の１つの株から分泌されることができ、分泌された酵素の「完全なブレンド」として本明細書において参照される。用語「完全なブレンド」によって、特異的な微生物により増殖培地へと細胞外に分泌されるすべてのタンパク質が意味される。本発明の１つの実施形態において、主要酵素および補助酵素は、ブレンド中に分泌された酵素の約７０〜約１００の間の質量％、またはその間の任意の量、例えば７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００％、またはその間の任意の量である。酵素混合物は、β−グルコシダーゼを含む分泌セルラーゼシステムの一部でありえる。酵素混合物は、トリコデルマ・リーゼイによって分泌された酵素の完全なブレンドを含むことができる。
【００６８】
あるいは、酵素混合物は、個別にまたは異なる生物の異なる株からのサブグループにおいて発現され、酵素を組み合わせてセルラーゼ酵素混合物を製作できる。酵素混合物は、個別にまたはトリコデルマ・リーゼイの異なる株などの単一生物の異なる株からのサブグループにおいて発現され、酵素を組み合わせてセルラーゼ酵素混合物を製作できることもまた検討される。例えば、酵素はすべてトリコデルマ・リーゼイの単一株から発現させることができる。
【００６９】
セルラーゼ酵素混合物は真菌のコード配列から発現させることができる。この実施形態において、コード配列は任意の真菌ソースに由来するだろう。用語「真菌」、「真菌（複数）」、「真菌の」、「子嚢菌類」、「担子菌類」および関連語（例えば「子嚢菌」および「担子菌」）は、Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ：Ａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｒｅａｔｉｓｅ（ＧＣ  Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ、ＦＫ  Ｓｐａｒｒｏｗ、ＡＳ  Ｓｕｓｓｍａｎ、編；アカデミックプレス社１９７３年）中でそのようなものとして定義された生物を含むことを意味する。
【００７０】
酵素混合物内の主要セルラーゼ酵素に対する補助酵素の濃度は、公知の技術に従って主要セルラーゼ酵素または宿主細胞内の他の分泌された酵素についてコードする１つまたは複数の核酸配列を欠失させること、続いて発現される残りの酵素の量を決定することによって調整できる。核酸配列の欠失は、標的核酸配列それ自体からの配列を変更された形態でコンストラクトの中へ組入れるコンストラクトの操作によって達成することができる。発現宿主の中へのコンストラクトの形質転換後に、次に変更された標的核酸配列との組換えが起こり、天然の核酸配列を破壊する変更された配列の挿入を生じる。その配列の中断により、大部分の事例における変更された遺伝子は、機能を持たないタンパク質へと翻訳されるか、または全く翻訳されないだろう。宿主細胞からの標的核酸配列の欠失に使用できる方法の例は、米国特許第５，２９８，４０５号（参照することにより本明細書に組み入れられる）中で記述される方法を含むが、これらに限定されない。
【００７１】
酵素混合物内の主要セルラーゼ酵素に対する補助酵素の濃度は、上で略述されるような主要セルラーゼ酵素についてコードする１つまたは複数の核酸の破壊をもたらすように修飾した宿主細胞を含む宿主細胞によって生成されるセルラーゼ混合物への１つまたは複数の所望される酵素を追加すること、および最終セルラーゼ酵素混合物内の各酵素の濃度を決定することによっても調整することができる。
【００７２】
セルラーゼ酵素混合物中の互いに対する補助成分の比率は、発現宿主の遺伝子修飾によって酵素混合物中で調整することができる。例えば、発現宿主を遺伝的に修飾して、公知の組換え技術に従って補助酵素をコードする発現コンストラクトの導入によって、１つまたは複数の補助酵素および任意で主要セルラーゼ酵素の発現を必要に応じて調整することができる。例えば、これは、発現される補助酵素をコードする核酸配列を含むコンストラクトの複数のコピーの導入によって達成することができる。発現コンストラクトを含むプラスミドは、宿主ゲノムの中へ組込まれるように、発現宿主のゲノム中でのプラスミドの配列による組み換えを可能にする配列を含むことができる。発現される補助酵素をコードする核酸配列の複数のコピーを、宿主生物のゲノムの中へ組込み、遺伝子の発現のレベルを増加することができる。あるいは、プラスミドは、非組込み形態（この事例においては宿主ゲノムから独立して複製する）で宿主中で存続することができる。他の実施形態において、主要セルラーゼ、補助酵素またはその組合せは、内在性レベルを超えて天然の配列の発現のレベルを増加させる、標的天然の核酸配列の上流へのプロモーターの導入によっても過剰発現させることができる。
【００７３】
補助酵素および主要セルラーゼ酵素の発現レベルは、発酵のｐＨ調整によっても修飾することができる。本発明の１つの実施形態において、セルラーゼ酵素混合物は、約２〜約５のｐＨで発酵を行うことによって生成して主要セルラーゼ酵素および補助酵素の発現を調整する。例えば、発酵のｐＨは、約２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８もしくは５．０、またはその間の任意のｐＨでありえる。
【００７４】
酵素的加水分解によって生成された可溶性糖質は、微生物によって発酵することができる。発酵産物は、発酵プラントに対する価値を生み出す任意の所望される産物を含むことができる。発酵産物の例はエタノール、ブタノールおよび乳酸である。エタノール生成のために、発酵は、糖をエタノールへ発酵させることができる１種または１種以上の微生物によって実行することができる。例えば、発酵は、グルコース、マンノース、ガラクトースおよびキシロースをエタノールへ、またはグルコース、マンノース、ガラクトース、キシロースおよびアラビノースをエタノールへ発酵させるように操作した組換えサッカロミセス属酵母によって実行することができる。キシロースをエタノールへ発酵させることができる組換え酵母は、米国特許第５，７８９，２１０号（参照することにより本明細書に組み入れられる）中に記述される。酵母は、水性溶液中にエタノールを含む培養液を生成する。乳酸生産のために、発酵は、糖を乳酸へ発酵させる微生物によって実行することができる。
【００７５】
本発明の酵素混合物は、セルロース加水分解について天然に存在する酵素とは異なる組成物、および先行技術において記述されたものである。トリコデルマ・リーゼイによって分泌された天然の酵素混合物のｆEG4、ｆSwo1およびｆCip1は、それぞれ０．２６、０．２０および０．５４であり、したがって、それぞれ図４および５中のゾーン１およびゾーン２の外側に分類される。本発明の実施形態における酵素混合物は、トリコデルマ・リーゼイによって分泌された天然の酵素混合物よりも少なくとも１２％高い活性を有することができる。
【実施例】
【００７６】
本発明は以下の実施例においてさらに示されるだろう。
【００７７】
実施例１：トリコデルマ・リーゼイのセルラーゼからの主要セルラーゼ（ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２）および補助成分（ＥＧ４、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１）の精製。
トリコデルマ・リーゼイの株は、当業者に公知であるようなセルラーゼ生産を誘導する条件下で液内発酵において増殖させた（例えば、Ｗｈｉｔｅら、米国特許第６，０１５，７０３号を参照  ）。トリコデルマ属タンパク質の粗製混合物は細胞によって培養液の中へ分泌された。真菌細胞はハーバーライト（Ｈａｒｂｏｒｌｉｔｅ）フィルターベッドを含むガラスマイクロファイバーフィルターを介した濾過によって培養液から除去された。主要セルラーゼ（ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１、ＥＧ２）は、Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉら（１９８４）により記述されるようなイオン交換クロマトグラフィーによって粗製濾過液から分離された。この工程はＥＧ１およびＥＧ２を単離する。次にＣＢＨ１およびＣＢＨ２は、Ｐｉｙａｃｈｏｍｋｗａｎら（１９９７、１９９８）によって報告されるようなｐ−アミノフェニル−１−チオ−β−Ｄ−セロビオシド親和性クロマトグラフィーによってさらに精製された。補助成分を精製するために、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２およびＥＧ１を欠損するセルラーゼは、陰イオンイオン交換クロマトグラフィーによって最初に分離された。７５ｍＬの充填ベッド体積のＤＥＡＥセファロースを１０ｍＭトリス、１０ｍＭビス‐トリス（ｐＨ８．５）中で平衡化した。出発材料はこれらの条件に調整され、５ｍＬ／分でカラムに適用した。次にカラムを、６００ｍＬの１０ｍＭトリス、１０ｍＭビス‐トリス（ｐＨ７．５）、および次に３００ｍＬの１０ｍＭトリス、１０ｍＭビス‐トリス（ｐＨ６．５）により洗浄した。次に結合タンパク質は９００ｍＬの０〜１５０ｍＭのＮａＣｌ勾配により溶出した。これは、ＵＶ吸光度プロファイルにおける２つの主要なピークの溶出をもたらした。第１のピークはもっぱらＥＧ４を含むが、第２のピークはＳｗｏ１およびＣｉｐ１を含んでいた。第２のピークに関連した画分をプールし、濃縮し、バイオゲル（ＢｉｏＧｅｌ）Ｐ−６０カラムを使用するゲル濾過クロマトグラフィーによって分離した。これは、Ｃｉｐ１の純粋な調製物および部分的に精製されたＳｗｏ１をもたらした。Ｓｗｏ１を含む画分を１．８Ｍ硫酸アンモニウムにより処理して、選択的にＳｗｏ１を沈降させた。この処理からのペレットは前述されるようなゲル濾過クロマトグラフィーによって分離された。これはＳｗｏ１の実質的に純粋な形態をもたらした。精製成分を濃縮し、緩衝液は、撹拌限外濾過セル（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）社）および１０ｋＤａ  ＮＭＷＬポリエーテルスルフォン膜を使用して、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）へと交換した。
【００７８】
実施例２：主要セルラーゼおよび補助成分の濃度および純度の測定。
タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７２：２４８−２５４，（１９７６））の方法を使用して化学的に決定された。各々の精製タンパク質（６μｇ）のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、電気泳動の後にクマシーブルー染色によって可視化した。各々のバンドの染色強度は、ケミジニアス（Ｃｈｅｍｉｇｅｎｉｕｓ）２（シンジーン（Ｓｙｎｇｅｎｅ）社）イメージングシステムを使用して、スキャニングデンシトメトリーによって定量した。トリコデルマ属セルラーゼ（１２μｇ全タンパク質）のサンプルは参照のために含まれていた。主要成分および補助成分の相対的純度は、ゲル上の同じレーン中のすべてのバンドについて測定された全染色強度により各々の成分のバンド強度を割ることによって計算された。炭水化物結合モジュールを欠くＥＧ２は、少量で存在したが、この調製物中の混入物とは考えられなかった。ＣＢＨ１およびＣＢＨ２の相対的純度は９５％以上であったが、ＥＧ１、ＥＧ２、ＥＧ４、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１の相対的純度は９０％以上であった。
【００７９】
各成分調製物がセルラーゼの混入が欠損していることをさらに実証するために、精製したＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１、ＥＧ２、ＥＧ４、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１を、ウサギからの成分特異的ポリクローナル抗血清を使用するウエスタンブロッティングによって解析した（図２）。タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）社からのミニトランスブロット（Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ）（登録商標）セルを使用して、ポリ塩化ビニリデンフッ化物（ＰＶＤＦ）膜に１００Ｖで１時間転写した。ウエスタンブロッティングは、Ｂｉｒｋｅｔｔら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１８７（２）：２１１−２１８，（１９８５））の方法を使用して行なった。成分特異的ポリクローナル抗血清は、当業者に公知であるように合成ペプチドを使用して生成され、その配列はトリコデルマ・リーゼイからのＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１、ＥＧ２、ＥＧ４、Ｓｗｏ１またはＣｉｐ１の一次アミノ酸配列に基づいた。
【００８０】
この実施例は、使用される精製方法が実質的に純粋な主要成分および補助成分を産出することを実証した。このことは、これらのセルラーゼ成分の各々についてのこれらの抗血清の特異性もまた実証した。
【００８１】
実施例３：市販のトリコデルマ・リーゼイのセルラーゼにおける主要セルラーゼおよび補助酵素の濃度の決定。
市販のトリコデルマ・リーゼイのセルラーゼにおける、主要成分および補助成分の相対的濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定した。
【００８２】
セルラーゼおよび精製された成分スタンダードはリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ）中で１〜１００μｇ／ｍＬで希釈し、マイクロタイタープレート（コースター（Ｃｏｓｔａｒ）社ＥＩＡ−高結合）中で４℃で一晩インキュベートした。これらのプレートは０．１％ツイーン２０（ＰＢＳ／ツイーン）を含むＰＢＳにより洗浄し、次に１％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ／ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中で室温で１時間インキュベートした。ブロッキングしたマイクロタイターウェルは、ＰＢＳ／ツイーンにより洗浄した。ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１、ＥＧ２、ＥＧ４、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１について特異的なウサギポリクローナル抗血清をＰＢＳ／ＢＳＡ中で希釈し、個別のマイクロタイタープレートに追加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングしたヤギ抗ウサギ抗体により室温で１時間インキュベートした。洗浄後に、テトラメチルベンジジンを各プレートに追加し、室温で１時間インキュベートした。
【００８３】
各ウェルにおいて３６０ｎｍで吸光度を測定し、実施例２において開発されたＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１、ＥＧ２、ＥＧ４、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１スタンダードを使用して、タンパク質濃度に変換した。各成分の相対的濃度は、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１、ＥＧ２、ＥＧ４、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１の全濃度によりこれらのタンパク質濃度を割ることによって計算された。
【００８４】
市販のトリコデルマ属セルラーゼの組成物を表８中に示す。
表８：市販のトリコデルマ属セルラーゼの組成物
【表８】
2010536391.tif 000014
【００８５】
全セルラーゼタンパク質のうちで主要セルラーゼの占めるパーセンテージ（％ＰＣ）は８２．７％であり、
2010536391.tif 000015
である。
【００８６】
ＥＧ４、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１は、全セルラーゼタンパク質のうちの５．６％、３．３％および８．４％を占めた。
【００８７】
すべての補助成分に対するＥＧ４の画分濃度（ｆEG4）は、５．６％／（５．６％＋３．３％＋８．４％）＝０．３２４である。
【００８８】
すべての補助成分に対するＳｗｏ１の画分濃度（ｆSwo1）は、３．３％／（５．６％＋３．３％＋８．４％）＝０．１９０である。
【００８９】
すべての補助成分に対するＣｉｐ１の画分濃度（ｆCip1）は、８．４％／（５．６％＋３．３％＋８．４％）＝０．４８６である。
【００９０】
この補助成分組成物は図３中に示される三成分プロット上にマッピングされ、「ベンチマークブレンド」として標識される。
【００９１】
主要セルラーゼの全体のセットに対するＣＢＨの濃度（％ＣＢＨ）は、５７％（４７．１％／８２．７％）ＣＢＨ１＋２９％（２４．０％／８２．７％）ＣＢＨ２＝８６％であり、
2010536391.tif 000016
である。
【００９２】
すべてのＣＢＨに対するＣＢＨ２の濃度（ｆC2）は、２９％／（５７％＋２９％）＝０．３３７である。
【００９３】
主要セルラーゼの全体のセットに対するＥＧの濃度は１４％である。すべての主要（ＥＧ１＋ＥＧ２）ＥＧに対するＥＧ２の濃度（ｆE2）は、７％／（７％＋７％）＝０．５００である。
【００９４】
実施例４：前処理したリグノセルロース系原料に対するセルラーゼブレンドのセルロース加水分解活性の測定。
ＥＧ４、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１のブレンドを、表９中に示される比率に従って調製した。これらの補助成分ブレンドを使用して、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２の混合物を補完した。主要セルラーゼブレンドの組成物は、３２％のＣＢＨ１、４７％のＣＢＨ２、１７％のＥＧ１および４％のＥＧ２であった。これは、米国公報の２００８／００５７５４１Ａ１記述される方法によって同定された主要セルラーゼの最適化されたブレンドである。補助成分ブレンドが全タンパク質のうちの１８％（％ＡＣ）を占め、％ＰＣ＝８２％であるように補完は行なわれた。主要セルラーゼおよび補助セルラーゼのこれらの混合物は、０．２５ｍＬの混合セルロース加水分解分析において検査された。セルラーゼ混合物を０．５％の安息香酸ナトリウムを含むクエン酸緩衝液中で希釈し、黒色麹菌からのβ−グルコシダーゼ調製物により補完し、酸により前処理した麦わらをインキュベートした。前処理は、Ｆｏｏｄｙ、米国特許第４，４６１，６４８号の通りに実行した。インキュベーションは５０℃で２４時間行い、標的セルロース転換レベルは７０％以上であった。酵素活性は、標的セルロース転換レベルを到達するのに必要な酵素の量の決定によって計算された。これらの活性は、補助セルラーゼの非存在下において検査された主要セルラーゼブレンドの活性に対して正規化された（％ＰＣ  １００％）。これらの分析のすべてにおいて、検査された全タンパク質質量は同じであった。セルラーゼ活性測定の標準誤差はモデル比較アプローチを使用して計算した（Ｍｏｔｕｌｓｋｙ，Ｈ．およびＡ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ（２００４）Ｆｉｔｔｉｎｇ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｔｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄａｔａ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｕｒｖｅ  Ｆｉｔｔｉｎｇ．オックスフォード大学出版局社（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク。３５１ｐｐ）。Ｔ−検定を使用して、各補助成分ブレンドの活性を主要セルラーゼ対照、ベンチマークブレンド、および至適ブレンドと比較した。０．０５以下のＰ値を統計的に有意であると判断した。
【００９５】
三成分ブレンド空間にわたる重み付き平均を適用して、活性データを平滑化した。与えられたポイントについて正規化された活性データは、その最も近接する６ポイントで平均化された。問題になっているポイントは重み付けｗ＝１．００を与えられ、隣接する６ポイントは各々、重み付き平均（ｘw）についての式、ｘw＝Σｗiｘi／Σｗi（式中、下付き添字ｉは、上述された７つのポイントすべてにわたり計上するカウント変数を示し、ｘiおよびｗiは、それぞれｉ番目のポイントの正規化された活性および重み付けを示す）においてｗ＝０．１５の重み付けを与えられた。
【００９６】
各補助成分ブレンドに関連する加水分解活性は表９中で示され、図３中でｆEG4、ｆSwo1およびｆCip1の関数としてプロットされる。
表９：異なるｆEG4、ｆSwo1およびｆCip1の補助セルラーゼ混合物により補完された主要セルラーゼ混合物の相対的活性。
【表９】
2010536391.tif 000017
2010536391.tif 000018
2010536391.tif 000019
2010536391.tif 000020
aｆEG4＝％ＥＧ４／（％ＥＧ４＋％Ｓｗｏ１＋％Ｃｉｐ１）
bｆSwo1＝％Ｓｗｏ１／（％ＥＧ４＋％Ｓｗｏ１＋％Ｃｉｐ１）
cｆCip1＝％Ｃｉｐ１／（％ＥＧ４＋％Ｓｗｏ１＋％Ｃｉｐ１）
dブレンド１８はカラム１の通りである
【００９７】
ＥＧ４単独（１．１４）の追加は、主要セルラーゼブレンド（１．００）と比較して、セルロース加水分解活性（Ｐ＜０．００１、表８）の有意な改良をもたらした。Ｓｗｏ１単独（１．０６）の追加は、主要セルラーゼブレンドと比較して、セルロース加水分解活性のわずかであるが有意な（Ｐ＝０．００５）改良をもたらした。しかしながら、ＥＧ４またはＳｗｏ１の単独のどちらの追加もベンチマークブレンド（１．１６）よりも高い活性をもたらさなかった。Ｃｉｐ１単独（１．０２）の追加は、主要セルラーゼ対照と比較して、酵素ブレンドのセルロース加水分解活性を有意に促進しなかった。
【００９８】
セルロース加水分解活性に対する、Ｃｉｐ１およびＳｗｏ１の組合せ追加の効果は最小だった。等量のＣｉｐ１およびＳｗｏ１を含むブレンド（１．０７）は、Ｓｗｏ１単独（１．０６）に類似する活性を有するが、Ｃｉｐ１単独（１．０２）よりも高かった。
【００９９】
等量のＳｗｏ１およびＥＧ４の組合せ（１．２６）は、ベンチマークブレンド（１．１６）と比較して、セルラーゼ混合物の活性を有意に（Ｐ＝０．００８）改良した。ＥＧ４およびＣｉｐ１の同等量の組合せ追加（１．２１）は、ベンチマークブレンドと比較して加水分解成績を改良したが、これは統計的有意性の境界であった。理論に束縛されるものではないが、ＥＧ４は、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１の両方と協調して働いて、主要セルラーゼ混合物のセルロース加水分解活性を促進しうる。
【０１００】
個々の補助成分およびすべての二成分混合物の追加からの結果を、等式１を使用してモデル化し、最初に相乗作用パラメーター（α、βおよびγ）のための値を決定し、次にモデル至適条件補助成分組成物を計算した。これらの結果を表１０中に示す。
等式１：
2010536391.tif 000021
（式中、
ＡTは、酵素ブレンドの全セルロース加水分解活性であり；
ｆPCは、酵素ブレンド中の、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ１およびＥＧ２の全パーセンテージであり；
ＡPCは、主要成分ブレンド単独の活性であり；
ｆEG4は、ＥＧ４の画分濃度であり；
ＡEG4は、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１の非存在下における主要セルラーゼのブレンドへのＥＧ４の追加に関連した活性であり；
ｆSwo1は、Ｓｗｏ１の画分濃度であり；
ＡSwo1は、ＥＧ４およびＣｉｐ１の非存在下における主要セルラーゼのブレンドへのＳｗｏ１の追加に関連した活性であり；
ｆCip1は、Ｃｉｐ１の画分濃度であり；
ＡCip1は、ＥＧ４およびＳｗｏ１の非存在下における主要セルラーゼのブレンドへのＣｉｐ１の追加に関連した活性であり；
αは、ＥＧ４とＳｗｏ１との間の相乗作用を表わし；
βは、ＥＧ４とＣｉｐ１との間の相乗作用を表わし；
γは、Ｓｗｏ１とＣｉｐ１との間の相乗作用を表わす。）
表１０：補助成分のモデル至適条件比率の決定
【表１０】
2010536391.tif 000022
モデル至適条件は、ｆEG4＝０．５６４、ｆSwo1＝０．３１４およびｆCip1＝０．１２２からなり、図３中で「モデル至適条件ブレンド」として標識される。この組成物は、実施例３において解析された市販のトリコデルマ属セルラーゼ（ベンチマークブレンド）の組成物とは実質的に異なっていた。
【０１０１】
補助成分の三成分ブレンド空間の検査において、至適セルロース加水分解活性は１．３６であり、ｆEG4＝０．４１７、ｆSwo1＝０．４１６およびｆCip1＝０．１６７に関連した。
【０１０２】
モデル至適補助酵素ブレンドおよび経験的至適補助酵素ブレンドの両方は、Ｃｉｐ１は低濃度であるが高濃度のＥＧ４およびＳｗｏ１のを含んでいた。これとは対照的に、市販のトリコデルマ属セルラーゼ中のｆCip1は０．４８６であり、モデル至適条件（０．１２２）および経験的至適条件（０．１６７）の両方よりも実質的に高かった。この三成分補助成分ブレンド（ｆEG4＝０．３２４、ｆSwo1＝０．１９０およびｆCip1＝０．４８６）に関連したセルロース加水分解活性は１．１６であり、経験的至適条件（１．３６）よりも有意に低い（Ｐ＜０．００１）。０．３３３以上のｆCip1による補助成分ブレンド空間において検査された他のブレンドもまた、経験的な至適条件混合物よりも有意に低い活性を有しており、ベンチマークブレンドよりも有意によくなかった。
【０１０３】
このことは、補助成分（ＥＧ４、Ｓｗｏ１およびＣｉｐ１）の比率の調整によって、前処理したリグノセルロース系基質に対する市販のトリコデルマ属セルラーゼの活性を改良できることを実証する。主要セルラーゼのブレンドに単独で追加された場合、補助成分はベンチマークブレンドよりも低い活性を有していた。このことは、主要セルラーゼ混合物とともに相乗的に働く複数の補助成分に注目する必要性を強調する。市販のトリコデルマ属セルラーゼ中に存在する比率から本明細書において決定された至適条件比率へ補助成分比率を変化させることにおいて、本発明者は、リグノセルロースの加水分解の速度を１７．２％改良した。
【０１０４】
図４は、図３から修飾した三成分プロットである。このグラフにおいて、１．２３〜１．３６の間の活性の範囲の補助成分混合物のみが示されるが、１．２３未満の活性を持つ補助成分ブレンドは除去されている。これらの酵素混合物はベンチマークブレンドよりも実質的に高い活性を有する。ベンチマークブレンドの位置は１．２３以下の活性を有しているにもかかわらず、参照のために示される。この図において示される補助成分混合物を表わすブレンド空間はゾーン１として参照され、ベンチマークブレンドよりも高い活性を持つ酵素混合物を表わす。
【０１０５】
図５は、図４から修飾した三成分プロットである。このグラフにおいて、１．３０〜１．３６の間の活性の範囲の補助成分混合物のみが示されるが、１．３０未満の活性を持つ補助成分ブレンドは除去されている。ベンチマークブレンドの位置は、参照のために再び示される。この図において示される補助成分混合物を表わすブレンド空間はゾーン２として参照され、ベンチマークブレンドと比較して、さらに促進された活性を持つ酵素混合物を表わす。
【０１０６】
補助成分の至適混合物は、ｆEG4＝０．４１７、ｆSwo1＝０．４１６およびｆCip1＝０．１６７からなる。
【０１０７】
実施例５：全主要セルラーゼのパーセンテージにおける成分混合物の変化の比較。
次に、全主要成分のパーセンテージ（％ＰＣ）において変化させた主要成分および補助成分を含む様々なセルラーゼ混合物の加水分解活性を検査した。主要セルラーゼ混合物の固有の組成物を固定し、３２％のＣＢＨ１、４７％のＣＢＨ２、１７％のＥＧ１および４％のＥＧ２である。補助成分ブレンドの固有の組成物も固定し、４２％のＥＧ４、４２％のＳｗｏ１および１６％のＣｉｐ１である。これらの２つの混合物は異なる％ＰＣで組み合わせられ、それ以外は実施例４中で記述されているように前処理した麦わらを検査した。これらの分析の結果を図６中に示す。
【０１０８】
市販のトリコデルマ属セルラーゼの％ＰＣは、「ベンチマーク比率」として本明細書において標識され、８２．７％だった。約９０％の％ＰＣは最も高いセルロース加水分解活性をもたらした。これはベンチマーク比率と比較して、わずかに改良された。％ＰＣが約９０％よりも高かったならば、セルロース加水分解活性は急速に減少した。これらの結果は、％ＰＣは、セルロース加水分解活性の著しい変化なしに、市販のトリコデルマ属セルラーゼ中に存在するものからおよそ７５％まで実質的に減少させることができることも実証する。市販のトリコデルマ属セルラーゼ中の組み合わせた補助成分組成物の増加は、他のリグノセルロース系原料、および異なる前処理条件に由来したものの加水分解のために有益であることが証明されうる。これは、理論によって限定されないが、本明細書において使用される前処理した基質と比較した重合度、結晶度および／または残留ヘミセルロースまたはリグニン含量の変化に起因するかもしれない。
【０１０９】
実施例６：長期間にわたって前処理したリグノセルロース系原料に対する主要セルラーゼブレンドの加水分解活性の測定。
実施例３からのｆEG4、ｆSwo1およびｆCip1値についてのベンチマーク値を持つ補助成分のブレンドを、約１７％活性が改良された補助成分の改良ブレンドに対して、実施例４中に記述されるように、より長いタイムコースのセルロース加水分解分析で比較した。改良ブレンドは、ｆEG4＝０．４１７、ｆSwo1＝０．４１６およびｆCip1＝０．１６７の組成物であった。両方の補助成分ブレンドは、３２％のＣＢＨ１、４７％のＣＢＨ２、１７％のＥＧ１および４％のＥＧ２からなる主要セルラーゼのブレンドに追加された。主要セルラーゼのブレンドは、比較のために、補助成分の追加なしに、単独で検査された。これらの３つのブレンドは、１グラムのセルロースあたり６ｍｇ酵素で与えられ、１００ＩＵ／ｇセルロースで黒色麹菌からのβ−グルコシダーゼ調製物がさらに追加された。
【０１１０】
ブレンドは、０．１％安息香酸ナトリウムを含む５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ５．０）中の２５ｇ／ｌのセルロースと共に連続的な旋回振盪により５０℃で１９４時間インキュベートした。０．７ｍＬのアリコートを様々なタイムポイントで採取し、溶解可能な部分のグルコース濃度を分析し、画分セルロース転換の測定へと転換した。次に転換データは、フィットの残差二乗和の最小化を使用して、追加の線形項を持つ直角双曲線にフィットさせる。等式は以下の形式であった。転換＝（最大値*時間）／（２分の１最大値＋時間）＋ｃ*時間。データの両方のセットは、特有の最大値および２分の１最大値ならびに変数ｃの共有の値により全体的にフィットさせた。記述されるようにこの実験を３回繰り返した。
【０１１１】
代表的な実験からの結果を図７中に示す。この図は、各タイムポイントでセルロース転換の程度がベンチマークブレンドと比較して、至適補助成分ブレンドについてより高いことを実証する。３つの重複した実験の結果は、０．７５の標的セルロース転換を到達するのに必要な時間の計算によってさらに解析された。これらの結果を表１１中に示す。補助成分の至適混合物を含む酵素ブレンドはわずか３８時間しか必要としなかったが、補助成分のベンチマークブレンドを含む酵素ブレンドは、この標的に到達するために５４時間を必要とした。これは３０％の時間の節約に対応し、統計的に有意だった（Ｐ＜０．００１、スチューデントのＴ−検定）。
表１１：０．７５の標的基質変換を達成するのに酵素ブレンドに必要な時間。
【表１１】
2010536391.tif 000023
【０１１２】
すべての引用は、参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０１１３】
本発明は１種以上の実施形態に関して記述されてきた。しかしながら、請求項において定義されるような本発明の範囲から逸脱することなしに、多数の変形および修飾を行なえることは当業者に明らかだろう。
【０１１４】
実施例７：ｐＨ５．０およびｐＨ３．５でのＴ．リーゼイ培養によるセルラーゼ混合物の生成。
胞子のコンフルエントなローンが得られるまで、Ｔ．リーゼイ株Ｐ５９Ｇを２８〜３０℃でポテトデキストロース寒天培地上で増殖させた。胞子を回収し、７５０ｍｌのバークレー培地（１０ｇ／Ｌ グルコース、１．４ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２．０ｇ／Ｌ ＫＨ2ＳＯ4、０．３１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５３ｇ／Ｌ ＣａＣｌ2；５．１ｇ／Ｌ 乾燥コーンスティープ、５ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；０．８ｍｇ／ｌＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．７ｍｇ／ｌＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）を、２Ｌのバッフル付きのフラスコ中での接種に使用した。２８℃および１５０ｒｐｍで３日間の増殖させた後に、この培養を使用して、初期組成物（１３ｇ／Ｌ グルコース、２．２ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4、１．３９ｇ／Ｌ ＫＨ2ＳＯ4、０．７ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１８５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ2、６ｇ／Ｌ 乾燥コーンスティープ、３．７５ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１．２ｍｇ／Ｌ のＭｎＳＯ４・Ｈ2Ｏ、１．０５ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）の１０Ｌの発酵培地に接種した。セルラーゼ誘導カクテル（全炭水化物の関数として、５６％ケンチオビオース、１４％ソフォロース、６％セロビオース、１０％トレハロース、６％マルトトリオース、４％グルコースおよび１４％他の炭水化物を含む）を使用する流加好気性発酵を、ｐＨ５．０またはｐＨ３．５のいずれかで、１４Ｌのニューブランズウィック（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）社ミクロファーム（Ｍｉｃｒｏｆｅｒｍ）発酵槽中で２８〜３０℃で６日間実行した。６日後に、培養をハーバーライトによって濾過し、培養濾液をｐＨ４．５に調整し、０．５％安息香酸塩と共に保存して微生物増殖を妨害した。
【０１１５】
排他的な特性または権利が主張される本発明の実施形態は、特許請求の範囲に定義される。
【図１】
2010536391.tif 000024
【図２】
2010536391.tif 000025
【図３】
2010536391.tif 000026
【図４】
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【図５】
2010536391.tif 000028
【図６】
2010536391.tif 000029
【図７Ａ】
2010536391.tif 000030
【図７Ｂ】
2010536391.tif 000031
【国際調査報告】
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