(57)【要約】マイクロＲＮＡ−１２５（ｍｉｒ−１２５）核酸分子を含む、低酸素状態で誘導される血管新生関連疾患、特に癌の治療のための抗癌組成物を提供する。また、本発明は、血管新生を阻害し、癌細胞の浸潤および転移を抑制し、癌を治療する方法を提供する。
2010533212.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を含む抗癌組成物。
【請求項２】
前記マイクロＲＮＡ−１２５がヒト由来のマイクロＲＮＡ−１２５ａ、マイクロＲＮＡ−１２５ｂ１またはマイクロＲＮＡ−１２５ｂであることを特徴とする、請求項１に記載の抗癌組成物。
【請求項３】
前記癌はマイクロＲＮＡ−１２５の発現程度が低い状態の癌であることを特徴とする、請求項１に記載の抗癌組成物。
【請求項４】
癌細胞の浸潤および転移に対する抑制活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の抗癌組成物。
【請求項５】
低酸素状態で誘導される血管新生に対する阻害活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の抗癌組成物。
【請求項６】
前記癌は脳癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、肝癌、前立腺癌および神経芽細胞腫よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の抗癌組成物。
【請求項７】
前記マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子は発現ベクター中に含まれることを特徴とする、請求項１に記載の抗癌組成物。
【請求項８】
前記ベクターは、レンチウイルス(lentivirus)、レトロウイルス(retrovirus)、アデノウイルス(adenovirus)、ヘルペスウイルス(herpes virus)、およびアビポックスウイルス(avipox virus)由来のベクターよりなる群から選ばれるウイルスベクターであることを特徴とする、請求項７に記載の抗癌組成物。
【請求項９】
前記マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子は細胞内に導入された形態であることを特徴とする、請求項１に記載の抗癌組成物。
【請求項１０】
薬学的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗癌組成物。
【請求項１１】
マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を含む、低酸素状態で誘導される血管新生関連疾患治療用組成物。
【請求項１２】
前記血管新生関連疾患は癌、血管腫、血管線維腫、動脈硬化、血管癒着、浮腫性硬化症、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、血管新生角膜疾患、関節炎、乾癬、毛細血管拡張症、化膿性肉芽腫およびアルツハイマー疾患よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
マイクロＲＮＡ−１２５の発現水準を測定する製剤を含む、脳癌および脳腫瘍診断用マーカー組成物。
【請求項１４】
マイクロＲＮＡ−１２５（ｍｉｒ−１２５）核酸分子を用いて癌細胞の浸潤および転移を抑制する方法。
【請求項１５】
マイクロＲＮＡ−１２５（ｍｉｒ−１２５）核酸分子を用いて、低酸素状態で誘導される血管新生を阻害する方法。
【請求項１６】
マイクロＲＮＡ−１２５を用いてＶＥＧＦ(Vascular endothelial growth factor)の分泌を抑制することにより血管新生を阻害することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＴＥＮ(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)の不活性に関与する経路を介して誘導される血管新生を抑制する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１の組成物を投与する段階を含む、マイクロＲＮＡ−１２５（ｍｉｒ−１２５）の発現程度が低い状態の癌を治療する方法。
【請求項１９】
前記癌は脳癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、肝癌、前立腺癌および神経芽細胞腫よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１の組成物を投与する段階を含む、低酸素状態で誘導される血管新生関連疾患治療方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、マイクロＲＮＡ−１２５（ｍｉｒ−１２５）の新規用途に関する。さらに詳しくは、本発明は、低酸素状態で誘導される血管新生関連疾患、特に癌の治療のための組成物に関する。また、本発明は、血管新生を阻害し、マイクロＲＮＡ−１２５の発現程度が低い癌細胞の浸潤および転移を抑制する方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
マイクロＲＮＡは、新しく発見された小さい調節分子であって、細胞内で多くの生物学的過程を調節するものと知られている。これらは、植物および動物のゲノム内でエンコードされてｍＲＮＡに結合することにより、対応遺伝子の発現を調節する(He and Harmon, 2004)。また、マイクロＲＮＡは、癌、ウイルス感染、心臓疾患、神経性疾患などの多様な疾病の発病および進行に関連していることが報告されている。よって、このマイクロＲＮＡを用いた臨床的適用のための多様な努力が行われている実情である。最も代表的な例として、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２２が肝炎ウイルスを増殖させるという事実が明らかになった(Science 309, 1577-1781; 2005)。この事実に基づき、Ｓａｎｔａｒｉｓ Ｐｈａｒｍａ社は、最近、前記肝臓特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２２に拮抗作用を示すＬＮＡ物質を開発して血中コレステロールレベルを低め、抗ＨＣＶ効果の治療物質を開発した(Nature 452, 896-900; 2008)。
【０００３】
一般に、癌細胞は、血管を形成する内皮細胞(endothelial cell)より速く増殖する。癌細胞の速い増殖により、新しく形成された腫瘍組織の血管が正常的に分布されていないので、腫瘍組織は十分な血液の供給を受けることができない。癌細胞への欠乏した血液供給は腫瘍組織内に栄養分の欠乏、酸性化および酸素欠乏を誘導する。実際に、正常組織の酸素分圧の中央値(median value)は４０〜６０ｍｍＨｇであるが、固形癌の場合、酸素分圧の中央値は大部分が１０ｍｍＨｇ以下である(Brown JM, Cancer Res 59, 5863-5870, 1999)。このような癌組織内部の低酸素状態下で、癌細胞は細胞の生存および増殖に必要な栄養と酸素の供給を受けるのに関与するタンパク質を作るものと解明されており、低酸素下で過量発現されるタンパク質としてはＶＥＧＦ(Vascular endothelial growth facto)）、ＥＰＯ(erythropoietin)、糖分解酵素などが知られている。
【０００４】
したがって、癌細胞の血管形成に関与するものとして知られている代表的なホルモンタンパク質ＶＥＧＦを調節することができれば、癌転移を最も効果的に阻害することができる。特に、固形癌の場合、低酸素状態下の腫瘍細胞内部は化学療法または放射線療法によってもよく治療されないと知られている。よって、特異的な調節因子を標的とする遺伝子治療が必要な実情である。
【０００５】
また、癌治療においては、癌の自体的な増殖を阻害することおよび他の組織への浸潤および転移を防ぐことが重要である。特に、脳癌は、外科的な手術が殆ど効果を発揮せず浸潤によって再発する場合が大部分であり、化学療法または放射線療法などにおいて多くの限界性を示している。よって、脳癌の治療のためには浸潤の阻害が必須的である。
【０００６】
よって、癌細胞において低酸素状態の血管形成を調節することが可能な遺伝因子を開発し、これを遺伝子治療剤として用いれば、外科的手術、化学療法または放射線療法に限界性を示す多様な癌治療に適用できるのであろう。
【０００７】
そこで、本発明者は、正常細胞と多様な癌細胞との間で低酸素状態でマイクロＲＮＡの変化をマイクロアレイ技法によって分析し、特に、低酸素状態の癌細胞で特異的に減少した発現量を示すマイクロＲＮＡ−１２５を選別し、マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子が癌細胞の低酸素状態でＶＥＧＦ分泌を抑制することにより血管形成を阻害することが可能な重要因子であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
〔発明の開示〕
〔技術的課題〕
本発明の目的は、マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を含む抗癌組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を含む、低酸素状態で誘導される血管新生関連疾患治療用組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明の別の目的は、マイクロＲＮＡ−１２５の発現量を測定する製剤を含む、脳癌および脳腫瘍診断用マーカー組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を用いて、低酸素状態で誘導される血管新生を阻害する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を用いて癌細胞の浸潤および転移を抑制する方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を用いて、低酸素状態で誘導される血管新生関連疾患、特に癌を治療する方法を提供することにある。
【００１４】
〔技術的解決方法〕
一つの様態において、本発明は、マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を含む抗癌組成物に関する。
【００１５】
本発明において、用語「マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子」は、マイクロＲＮＡ−１２５を構成している一本鎖または二本鎖の核酸分子を意味する。本願において、「マイクロＲＮＡ−１２５」と「ｍｉｒ−１２５」は混用できる。
【００１６】
マイクロＲＮＡは、大部分、染色体上のイントロンなどによってエンコードされており、転写が起った後、Ｄｒｏｓｈａ等によってプロセスされて前駆体形態（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−ｍｉＲＮＡ）に変わり、しかる後に、核外輸送因(exportin)によって核を抜け出してＤｅｉｃｅｒによって長さ約２２ｂｐ程度の成熟した形態に変わるが、これはＲＩＳＣ(RNA interference silencing complex)と結合して遺伝子抑制機能を示す(Nat Rev Mol Cell Biol 6, 376-385;2005)。
【００１７】
マイクロＲＮＡ−１２５（ｍｉｒ１２５）はｍｉｒ１２５ａ、１２５ｂ１および１２５ｂ２などが知られているが、これらは同一のシード(seed)塩基配列を共有するファミリーを構成しているものと知られている。ｍｉｒ−１２５は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでｌｉｎ−４という名前として最初知られており、マウスでは２００２年にＬａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ等によって明らかになった。ヒトにおいては、２００５年にＬｅｅ等によって、ｍｉＲ１２５ｂ１は染色体１１番ｑ２４．１上の未だその機能が知られていない遺伝子のｅｘｏｎ部位に存在し、ｍｉＲ１２５ｂ２は染色体２１番ｑ２１．１のイントロン地域に位置するものと報告された。ｍｉＲ１２５ａは２００７年にＧｒｏｓｓ等によって染色体１９番ｑ１３．４に存在することが明らかになった（図６参照）。
【００１８】
本発明で用いることが可能なマイクロＲＮＡ−１２５は、ヒトを含む動物、例えば猿、豚、馬、牛、羊、犬、猫、マウス、ウサギなどに由来してもよく、好ましくはヒト由来のマイクロＲＮＡ−１２５ａ、マイクロＲＮＡ−１２５ｂ１またはマイクロＲＮＡ−１２５ｂ２であるが、これに限定されない。
【００１９】
また、本発明のマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子は、１８〜１００ｎｔ（ヌクレオチド）の長さを有することができ、好ましくは成熟マイクロＲＮＡ−１２５であって、１９〜２５ｎｔの長さ、さらに好ましくは２１〜２３ｎｔの長さを有する。また、本発明のマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子は５０〜１００ｎｔ、好ましくは６５〜９５ｎｔの長さを有する前駆体マイクロＲＮＡ−１２５分子として提供されることもできる。前記成熟マイクロＲＮＡ−１２５および前駆体マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子は、米国国立保健院遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から確保することが可能な遺伝情報、具体的にｍｉｒ１２５ａ（４０６９１０）、ｍｉｒ１２５ｂ１（４０６９１１）、ｍｉｒ１２５ｂ２（４０６９１２）、およびｍｉＲＢＡＳＥ(http://microrna. sanger.ac.uk/)の許可番号、ｍｉｒ１２５ａ（前駆体形態としてＭＩ００００４６９（ＩＤ：ｈｓａ−ｍｉｒ−１２５ａ）、成熟形態としてＭＩＭＡＴ００００４４３（ＩＤ：ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、配列番号１）およびＭＩＭＡＴ０００４６０２（ＩＤ：ｈｓａ−ｍｉＲ１２５ａ−３ｐ、配列番号２））、ｍｉｒ１２５ｂ１（前駆体形態としてＭＩ００００４４６（ＩＤ：ｈｓａ−ｍｉｒ−１２５ｂ−１）、成熟形態としてＭＩＭＡＴ００００４２３（ＩＤ：ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、配列番号３）およびＭＩＭＡＴ０００４５９２（ＩＤ：ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−１、配列番号４））およびｍｉｒ１２５ｂ２（前駆体形態としてＭＩ００００４７０（ＩＤ：ｈｓａ−ｍｉｒ−１２５ｂ−２）、成熟形態としてＭＩＭＡＴ００００４２３（ＩＤ：ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、配列番号３）およびＭＩＭＡＴ０００４６０３（ＩＤ：ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２、配列番号５））の塩基配列から構成できる（図６）。また、本発明で使用されるマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子は、これを構成する核酸分子の作用性等価物、例えばマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子の一部塩基配列が欠失(deletion)、置換(substitution)または挿入(insertion)によって変形されたが、マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子と機能的に同一の作用を行うことが可能な変異体(variants)を含む概念である。
【００２０】
また、本発明のマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子は、一本鎖または二本鎖として存在しうる。成熟マイクロＲＮＡ分子は主に一本鎖として存在するが、前駆体マイクロＲＮＡ分子は主に二本鎖部分を形成することが可能な少なくとも部分的に自己相補的な構造（例えば、ステム−およびループ−構造）である。また、本発明の核酸分子はＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ(peptide nucleic acids)またはＬＮＡ(locked nucleic acid)などの形態で構成できる。
【００２１】
本発明の前記核酸分子は、標準分子生物学技術、例えば化学的合成方法または組み換え方法を用いて分離または製造されたもの、或いは市販のものを使用することができる。
【００２２】
また、本発明の抗癌組成物は、マイクロＲＮＡ−１２５（ｍｉｒ−１２５）核酸分子自体だけでなく、細胞内でマイクロＲＮＡ−１２５の発現率を増加させることが可能な物質、例えば化合物、天然物、新規タンパク質などを含むことができる。
【００２３】
本発明において、用語「抗癌」とは、癌の予防および治療に関連して、癌細胞の増殖を抑制しまたは癌細胞を死滅する作用、および癌細胞の転移を抑制または遮断する作用を意味する。本願において、用語「癌の予防」とは、組成物の投与により癌の形成を抑制させ或いは癌の発病を遅延させる全ての行為を意味し、用語「癌の治療」とは、組成物の投与により前記癌の症状が好転され或いは有利に変更される全ての行為を意味する。
【００２４】
本発明のマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子は、低酸素状態で血管新生を阻害するため、抗癌活性を示すことができるが、このような血管新生阻害は血管内皮成長因子（Vascular endothelial growth factor、ＶＥＧＦ）の分泌抑制によって実現できる。
【００２５】
本発明において、用語「低酸素状態」または「低酸素症」とは、細胞および組織内の酸素が正常細胞または組織活性に必要な生理的水準以下、例えば最適水準未満に低くなった状態を意味する。
【００２６】
癌細胞は、一般に周囲の血管内皮細胞に比べて増殖速度が速くてこれらから血液の供給を受けないため、組織の酸性化、栄養分欠乏、酸素低下による低酸素症(Hypoxia)現象が現れる。このような癌組織は、細胞の増殖および生存に必要な栄養および酸素の供給を受けるためのタンパク質を分泌するが、この際、分泌される代表的なタンパク質がＶＥＧＦである。
【００２７】
本発明のマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子は、低酸素状態で誘導される血管内皮成長因子（Vascular endothelial growth factor、ＶＥＧＦ）の分泌を抑制することにより、ＶＥＧＦによる血管新生を阻害することができ、特に、ＰＴＥＮ(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)の不活性化によって誘導されるＶＥＧＦ発現を抑制して血管新生を阻害することができる。
【００２８】
また、本発明のマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子は、癌細胞の浸潤および転移を抑制する活性を有することにより、抗癌作用を示すことができる。「癌細胞の転移(metastasis)」とは、癌細胞が元々発生した組織または臓器から他の組織または臓器へ移動することをいう。癌細胞が移動するためには、周辺組織を貫いて近隣の血管にまで移動しなければならないが、これを浸潤という。血管に到達した癌細胞は血液に沿って他の臓器へ移動するので、浸潤と転移は癌細胞の移動において密接に連関した現象である。本発明のマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子は、特に癌細胞の浸潤を抑制することにより、癌の転移を防止し且つ癌の増殖も抑制することができる。
【００２９】
本発明の抗癌組成物は、マイクロＲＮＡ−１２５の発現異常に起因した全ての癌の治療に使用可能であり、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病を含む全ての癌組織に適用することができる。本発明の抗癌組成物は、好ましくは脳癌、子宮頸癌、乳癌、膀胱癌、肝癌、前立腺癌および神経芽細胞腫に使用することができ、特にマイクロＲＮＡ−１２５の発現程度が低い状態の癌組織、好ましくは下記の表１に記載されたマイクロＲＮＡ−１２５の発現程度が低い状態の癌組織に適用することができ、さらに好ましくは脳癌であるが、これに限定されない。本願において、脳癌は脳に生ずる癌組織を総称する意味であり、脳腫瘍を含む概念である。
【００３０】
【表１】
2010533212.tif 000003
【００３１】
別の様態において、本発明は、マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を含む、低酸素状態で誘導される血管新生関連疾患治療用組成物に関する。
【００３２】
本発明のマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子は、低酸素状態で誘導されるＶＥＧＦ分泌を抑制することにより血管新生を阻害する活性を有するので、低酸素状態で誘導される血管新生関連疾患治療用組成物として提供できる。本発明のマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を適用することが可能な血管新生関連疾患の例としては癌、血管腫、血管線維腫、動脈硬化、血管癒着、浮腫性硬化症、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、血管新生角膜疾患、関節炎、乾癬、毛細血管拡張症、化膿性肉芽腫およびアルツハイマー疾患などがあるが、これに限定されず、特にマイクロＲＮＡ−１２５の発現程度が低い状態の病変組織に適用することが好ましい。
【００３３】
本発明の具体的な実施例において、本発明者は、正常細胞と多様な癌細胞との間で低酸素状態におけるマイクロＲＮＡの変化をマイクロアレイ技法によって分析し、ここで発現量の減少を示すマイクロＲＮＡが、癌細胞の低酸素状態で誘導されるＶＥＧＦの発現にどんな影響を与えるかを考察した結果、マイクロＲＮＡ−１２５（ｍｉｒ−１２５ａおよびｍｉｒ−１２５ｂ）が低酸素状態でＶＥＧＦの分泌濃度を低めることを確認した（図１および図２）。これにより、選別されたマイクロＲＮＡ−１２５が細胞内でどんなメカニズムで調節されるかを確認した。
【００３４】
まず、低酸素状態で、ＶＥＧＦ分泌はＨＩＦ−１よりはマイクロＲＮＡ−１２５またはＰＴＥＮによって調節された。また、正常培養条件と低酸素症培養条件でＨＩＦ−１を抑制させ或いはＰＴＥＮを発現させたとき、マイクロＲＮＡ−１２５の発現は低酸素状態でＨＩＦ−１よりはＰＴＥＮ発現によって調節されるものと観察された（図３）。
【００３５】
また、低酸素状態でＰＴＥＮ変形によってＶＥＧＦ分泌水準が確然に増加することを確認したと共に、このようなＶＥＧＦ発現が増大した細胞にマイクロＲＮＡ−１２５を処理してＶＥＧＦ発現水準を低めることができることを確認した（図３）。これはマイクロＲＮＡ−１２５がＰＴＥＮの不活性化による血管新生を抑制させることができることを意味する結果である。
【００３６】
また、マイクロＲＮＡ−１２５は、脳癌細胞だけでなく、子宮頸癌細胞においても癌細胞の浸潤を抑制する効果を示した（図４および図８）。
【００３７】
また、マイクロＲＮＡ−１２５の抗癌活性に対して生体内分析を行った。マイクロＲＮＡ−１２５を発現する細胞株をマウスに移植した結果、対照群に比べて生存力が向上し、体重が減らないなどの抗癌効果を示した（図５）。
【００３８】
このような結果として、ＰＴＥＮが変形された脳癌細胞の低酸素状態でマイクロＲＮＡ−１２５の発現が減少してＶＥＧＦの発現を増加させて血管新生を促進させるが、マイクロＲＮＡ−１２５が脳癌の発生に作用する重要な因子であることが分かった。よって、マイクロＲＮＡ−１２５の発現を増加させることにより、低酸素状態で誘導される癌細胞の血管新生を抑制し、これにより癌の浸潤および転移を抑制することができることを確認することができた。
【００３９】
本発明の一実施様態において、抗癌組成物は、マイクロＲＮＡ−１２５（ｍｉｒ−１２５）を伝達する発現ベクターを含む。
【００４０】
本発明のマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子は、ＤＮＡよびＤＥＡＥ−デキストランの複合体、ＤＮＡおよび核タンパク質の複合体、ＤＮＡおよび脂質の複合体などの形質転換技術を用いて細胞内に導入させることができるが、このために、前記マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子は細胞内への効率的な導入を可能にする伝達体内に含まれた形態であり得る。前記伝達体は、好ましくはベクターであり、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターも全て使用可能である。ウイルスベクターとして、例えばレンチウイルス(lentivirus)、レトロウイルス(retrovirus)、アデノウイルス(adenovirus)、ヘルペスウイルス(herpes virus)、およびアビポックスウイルス(avipox virus)由来のベクターなどを使用することができ、好ましくはレンチウイルスベクターであるが、これに限定されない。レンチウイルスは、レトロウイルスの一種であって、核孔(nucleopore)または完全な核膜への能動導入を可能にする事前統合複合体(pre-integration complex)（ウイルス「シェル(shell)」）の親核性により分裂細胞だけでなく未分裂細胞も感染させることができるという特徴がある。
【００４１】
好ましい実施の形態において、前記マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を含むベクターは、選別マーカーをさらに含む。本発明において、用語「選別マーカー(selection marker)」とは、マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子が導入された細胞の選別を容易にするためのものである。本発明のベクターで使用することが可能な選別マーカーとしては、ベクターの導入有無を容易に検出または測定することが可能な遺伝子であれば、特に限定されないが、例えば薬物耐性、自家栄養性、細胞毒性剤に対する耐性、または表面タンパク質の発現といった選択可能表現型を付与するマーカー、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ピューロマイシン(puromycin)、ネオマイシン(Ｎｅｏ)、ハイグロマイシン(hygromycin：Ｈｙｇ)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(ｈｉｓＤ)、およびグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(guanine phosphoribosyltransferase：Ｇｐｔ)などがあり、好ましくはＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）およびピューロマイシンマーカーを使用することができる。
【００４２】
本発明のまた一つの実施の形態によれば、抗癌組成物内のマイクロＲＮＡ−１２５（ｍｉｒ−１２５）核酸分子は、細胞に導入された形態で提供できる。
【００４３】
本発明において、用語「導入」とは、形質感染(transfection)または形質導入(transduction)によって外来ＤＮＡを細胞に流入させることを意味する。形質感染は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介形質感染法、ポリブレン媒介形質感染法、エレクトロポレーション法、微細注射法、リポソーム融合法、リポフェクタミントランスフェクション、および原形質体融合法など、当分野における公知の様々な方法によって行われ得る。また、形質導入は、感染(infection)を手段としてウイルスまたはウイルスベクター粒子を用いて他の細胞内に遺伝子を伝達させることを意味する。
【００４４】
このような方法によってマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子が導入された細胞は、マイクロＲＮＡ−１２５を高い水準に発現することができるため、このような細胞を癌組織に移植することにより、癌の浸潤および転移を抑制させることができる。よって、マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子が導入された細胞を含む本発明の組成物は、癌治療のための細胞治療剤として利用できる。
【００４５】
一方、本発明のマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を含む抗癌組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、担体と共に製剤化できる。本発明において、用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せず、投与化合物の薬剤活性および成分の特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。本発明の組成物の中、液状製剤を使用する場合、薬学的に許容される担体としては、滅菌および生体に適したものが好ましい。本発明の活性成分は食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの組み合わせの中から選ばれた一つを使用して剤形化することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、本発明の組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および/または潤滑剤を付加的に添加して注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
【００４６】
本発明のマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子および薬学的に許容可能な担体を含む抗癌組成物は、経口用剤形または非経口用剤形で剤形化することができる。本発明の薬学的剤形は口腔、直腸、鼻腔、局所（頬および舌の下方を含む）、皮下、膣または非経口（筋肉内、皮下および静脈内を含む）投与に適した形態、または吸入または注入による投与に適した形態を含む。
【００４７】
本発明の組成物として剤形化された経口投与用剤形としては、例えば錠剤、トローチ剤、ロセンジ(lozenges)、水溶性または油性懸濁液、粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップ、またはエリキシルを含む。錠剤およびカプセル剤形の場合、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどの結合剤、第二リン酸カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチまたはサツマイモ澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスなどの潤滑油を含む添加剤が有用する。カプセル剤形の場合、前述した添加剤の他にも脂肪油などの液体担体をさらに含有することができる。
【００４８】
本発明の組成物の非経口投与用剤形としては、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射などの注射用形態、坐剤注入方式または呼吸器を介して吸入可能にするエアロゾル剤などのスプレイ用に製剤化することができる。注射用剤形に製剤化するためには本発明の組成物を安定剤または緩衝剤と共に水で混合して溶液または懸濁液として製造し、これをアンプルまたはバイアルの単位投与用に製剤化することができる。坐剤としては、ココアバターまたはグリセリドなどの通常の坐薬ベースを含む坐薬または灌腸剤などの直腸投与用組成物に製剤化することができる。エアロゾル剤などのスプレイ用に剤形化する場合、水分散した濃縮物または湿潤粉末が分散するように推進剤と共に配合できる。
【００４９】
別の様態において、本発明は、マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を含む抗癌組成物を投与することを含む、マイクロＲＮＡ−１２５の発現程度が低い状態の癌を治療する方法に関する。
【００５０】
本発明において、用語「投与」とは、いずれの適切な方法で患者に本発明の薬剤学的組成物を導入することを意味し、マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子のウイルス性または非ウイルス性技術による運搬、またはマイクロＲＮＡ−１２５を発現する細胞の移植を含む。本発明の組成物の投与経路は、目的組織に到達することができる限り、経口または非経口の多様な経路を介して投与できる。例えば、本発明の組成物は、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻腔内、吸入、眼球内または皮内経路によって投与できる。好ましくは本発明の抗癌組成物は癌組織に局所投与する。
【００５１】
本発明の治療方法は、本発明の抗癌組成物を薬学的有効量で投与することを含む。適正の総１日使用量を正しい医学的判断範囲内で処置医によって決定できるのは当業者に自明なことである。特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類および度合い、場合に応じて異なる製剤が使用されるか否かを含む具体的組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共にまたは同時に使用される薬物などの多様な因子と、医薬分野でよく知られている類似因子に応じて適用することが好ましい。よって、本発明の目的に適した抗癌組成物の有効量は、前述した事項を考慮して決定することが好ましい。また、場合に応じて、本発明の抗癌組成物と共に公知の抗癌剤を併用投与して抗癌効果を増大させることができる。
【００５２】
また、本発明の癌治療方法は、マイクロＲＮＡ−１２５の発現低下により癌が発生しうる任意の動物に適用可能であり、動物は、例えば、ヒトおよび霊長類だけでなく、牛、豚、羊、馬、犬および猫などの家畜を含む。
【００５３】
別の様態において、本発明は、マイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を用いて癌細胞の浸潤および転移を抑制する方法に関する。
【００５４】
その他の形態において、本発明は、低酸素状態で誘導される血管新生を阻害する方法に関する。本発明のマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を癌細胞に処理してマイクロＲＮＡ−１２５を発現させると、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の分泌を抑制することにより、血管新生を阻害し、これにより癌細胞の浸潤および転移を抑制する。本発明のマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子は、低酸素状態でＨＩＦ−１により誘導される血管新生よりは、特にＰＴＥＮ(phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten)の不活性化により誘導される血管新生を抑制するのに有効である。これは、細胞内でマイクロＲＮＡ−１２５の発現がＰＴＥＮ因子によって調節できることを意味する。したがって、低酸素状態でＰＴＥＮ遺伝子の発現率を高めることによりマイクロＲＮＡ−１２５の発現を増加させて血管新生を阻害し、癌細胞の浸潤および転移を抑制することもできる。
【００５５】
本発明のマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を癌細胞に処理する方法としては、ウイルス性または非ウイルス性運搬技術を用いることができる。ウイルス運搬メカニズムは、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびアビポックスウイルスなどを含むが、これに限定されない。非ウイルス性運搬メカニズムには、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽イオン性表面両親媒性物質、およびこれらの組み合わせが有用する。
【００５６】
別の様態において、本発明は、マイクロＲＮＡ−１２５の発現水準を測定する製剤を含む、脳癌および脳腫瘍診断用マーカー組成物、およびこれを含む診断キットに関する。
【００５７】
本発明において、用語「マイクロＲＮＡ−１２５の発現水準を測定する製剤」とは、マイクロＲＮＡ−１２５の発現水準を決定するためにマイクロＲＮＡ−１２４と反応する分子を意味する。本発明において、マイクロＲＮＡ−１２５の発現水準測定製剤として、マイクロＲＮＡ−１２５に特異的なプライマーまたはプローブを使用することができる。プライマーを用いてＰＣＲを行い、或いはプローブを用いた混成化反応によって行い、マイクロＲＮＡ−１２５の発現水準を測定することができる。また、前記マーカー組成物を含む診断キットには、検出を容易にする当業者における公知の各種道具、試薬、例えば適切な担体、検出可能な信号を生成することが可能な標識物質、溶解剤、洗浄剤、緩衝剤、安定化剤などが含まれ得る。
【００５８】
その他の形態において、本発明は、本発明のマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を使用して脳癌または脳腫瘍の治療化合物のスクリーニングの方法に関するものである。本方法は、マイクロＲＮＡ−１２５（ｍｉｒ−１２５）発現調節候補化合物で脳癌または腫瘍細胞を処理する段階と、低酸素状態でマイクロＲＮＡ−１２５の発現水準を測定する段階とを含む。治療候補化合物を脳癌または脳腫瘍細胞に処理した後、細胞内のマイクロＲＮＡ−１２５の発現水準を測定し、マイクロＲＮＡ−１２５の発現量を増大させる化合物を選別することにより、マイクロＲＮＡ−１２５媒介性癌を治療するのに有用する。
【００５９】
〔有利な効果〕
本発明に係るマイクロＲＮＡ−１２５核酸分子を含む抗癌組成物は、癌細胞の低酸素状態で誘導されるＶＥＧＦ分泌を抑制することにより血管形成を阻害することができ、癌細胞の浸潤および転移を効果的に抑制することができるため、多様な癌治療のための遺伝子治療剤としても用いることができる。
【００６０】
〔図面の簡単な説明〕
図１は低酸素状態および一般培養条件におけるマイクロＲＮＡ発現様相に対するマイクロアレイを示す。（Ａ）低酸素症特異的なマイクロＲＮＡ選別のための模式図である。脳癌細胞株としてのアストロサイトを用いて、正常条件で培養した細胞と低酸素状態における細胞からマイクロＲＮＡを分離してお互いに比較した。（Ｂ）マイクロアレイ分析は、各脳癌細胞株におけるマイクロＲＮＡの発現様相を示す。
【００６１】
図２は正常条件および低酸素症状態における多様なマイクロＲＮＡ添加によるＶＥＧＦ分泌量を示すグラフである。
【００６２】
図３は細胞内におけるｍｉＲＮＡ１２５の調節メカニズムを示す多様な結果である。（Ａ）ＨＩＦ−１に対するｓｉＲＮＡ添加によるＶＥＧＦの分泌濃度、（Ｂ）ＨＩＦ−１に対するｓｉＲＮＡ添加によるｍｉＲＮＡ１２５の発現量、（Ｃ）ｓｉＨＩＦおよびｍｉｒ−１２５ａによるＨＩＦ−１のタンパク質発現様相を確認するためにウエスタンブロットを行った結果、（Ｄ）低酸素状態におけるＰＴＥＮの不活性化によるＶＥＧＦの発現様相、（Ｅ）ＰＴＥＮで処理された細胞にＰＴＥＮ単独、ＰＴＥＮと共にマイクロＲＮＡ−１２５に対する拮抗剤を添加したときのＶＥＧＦ分泌濃度をそれぞれ示すグラフである。
【００６３】
図４はｍｉｒ１２５の脳癌細胞の浸潤阻害程度を示すグラフおよび細胞写真である。
【００６４】
図５はｍｉｒ１２５を発現する細胞をマウスに移植して抗癌効果を実験したデータである。（Ａ）マウスモデル、（Ｂ）脳癌細胞をマウスの脳に入れる過程模式図、（Ｃ）脳癌の誘導されたマウスに、ｍｉｒ１２５を発現する細胞株を処理したときにマウスの生存率、（Ｄ）脳癌の誘導されたマウスに、ｍｉｒ１２５を発現する細胞株を処理したときのマウスの体重変化。
【００６５】
図６は前駆体ｍｉｒ１２５と成熟ｍｉｒ１２５の核酸塩基配列および染色体上の位置を示す。ｍｉＲ−１２５群の核酸塩基配列およびヒト染色体上の位置。ＮＣＢＩのＧｅｎｅＩＤはｍｉｒ１２５ａ（４０６９１０）、ｍｉｒ１２５ｂ１（４０６９１１）、ｍｉｒ１２５ｂ２（４０６９１２）であり、ｍｉＲＢＡＳＥ(http://microrna. sanger.ac.uk/)の受託番号(accession number)はｍｉｒ１２５ａ（ＭＩ００００４６９）、ｍｉｒ１２５ｂ１（ＭＩ００００４４６）、ｍｉｒ１２５ｂ２（ＭＩ００００４７０）である。
【００６６】
図７はマイクロＲＮＡ−１２５を発現させるためのレンチウイルスの構造を示す模式図である。
【００６７】
図８はｍｉｒ１２５の子宮頸癌細胞であるＨｅＬａ細胞の浸潤阻害程度を示す細胞の写真およびヒストグラムである。
【００６８】
〔発明を実施するための最善の様態〕
以下、本発明を下記の実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００６９】
（実施例１：細胞培養）
正常プライマリー(primary)細胞としてのアストロサイト(astrocyte)と各種脳腫瘍細胞（ＬＮ−１８（ＣＲＬ−２６１０）、Ｕ−８７ＭＧ（ＨＴＢ−１４）、ＬＮ−２２９（ＣＲＬ−２６１１）、Ｕ２５１、Ｕ３７３およびＬＮ４２８）細胞は、１０％ＦＢＳ(fetal bovine serum)を含有したＤＭＥＭ４５００ｍｇ／グルコース（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を培地として用いて、５％のＣＯ２と２１％のＯ２状態を維持するインキュベーターで培養した。低酸素条件での培養において、酸素濃度は１％に減少した。子宮頸癌細胞由来のＨｅＬａ細胞も前述と同一の方法によって培養した。
【００７０】
（実施例２：一過性のトランスフェクション(transient transfection)）
ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、およびそれぞれに必要な遺伝子を伝達するベクターを細胞にトランスフェクションするために、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｋｉｔ Ｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍａｘａ）を用いてエレクトロポレーション法(electroporation)を行った。これらのために、まず、血球計数器(hematocytometer)を用いて、エレクトロポレーションを行おうとする細胞の個数を数え、各反応当り１．５×１０６個の細胞を用いて行った。個数を数え、１．５ｍＬのＥ−Ｔｕｂｅに分注した後、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞を集めた。こうして集められた細胞は、ＤＰＢＳを用いて１回洗浄し、１００μＬのＴ溶液と２μｇのＤＮＡまたは１００ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡを添加し、よく混ぜた後、エレクトロポレーター(Amaxa electroporator)を用いてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの後、直ちに１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地１ｍＬに混ぜた後、１００ｍｍのディッシュ(dish)に細胞を移し、１０ｍＬの培地を添加した。ディッシュは、細胞培養器に移されて４８時間培養された後、次の実験に使用された。
【００７１】
（実施例３：マイクロアレイアッセイによるマイクロＲＮＡ発現様相の比較）
多様な細胞株において、低酸素症条件および一般培養条件におけるマイクロＲＮＡ発現様相の比較のためにマイクロアレイを行った（図１）。正常脳細胞としてのアストロサイトと脳腫瘍細胞それぞれを正常条件(normaxia)と低酸素症条件（１％Ｏ２）で２４時間培養した後、各細胞のＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ単離方法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって単離した。単離されたＲＮＡに対して、各条件の下でｍｉＲＮＡ発現量の変化を測定した。マイクロアレイ実験は、Ｅ−ｂｉｏｇｅｎ社に依頼し、Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＵＳＡ）から提供するマイクロアレイ方法によって行った。
【００７２】
（実施例４：低酸素状態における多様なマイクロＲＮＡのＶＥＧＦの分泌調節）
実施例３のマイクロアレイ上で発現変化を示したｍｉＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ社（ＵＳＡ）より注文し、このｍｉＲＮＡを脳癌細胞としてのＵ３７３細胞にエレクトロポレーション（electroporator、Ａｍａｘａ）を行った後、４８時間培養し、正常培養条件と低酸素症培養条件でさらに２４時間培養した。培地上澄み液を得、これを用いてＥＬＩＳＡアッセイを行うことにより、ＶＥＧＦ分泌量を測定した。
【００７３】
ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ ＱｕａｎｔｉＧｌｏ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。具体的に、ＶＥＧＦの量を測定しようとするサンプルの細胞培養液を準備し、Ａｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔをキットのそれぞれのウェルに１５０μＬずつ添加した。ここに、５０μＬの標準溶液とサンプルをそれぞれ５０μＬずつ添加し、２時間常温で攪拌しながら反応させた。その後、各ウェルの溶液を除去し、４回洗浄した。２００μＬのコンジュゲートを各ウェルに添加し、３時間常温で攪拌しながら反応させた。さらに１回溶液を除去した後、４回洗浄した。１００μＬのワーキンググロ反応液(Working Glo Reagent)をそれぞれのウェルに添加し、２０分間培養した。この際、光が入らないようにホイルに包んで暗室で反応させた。反応の後、ＶＥＧＦの測定値を照度計(luminometer)によって測定した。
【００７４】
正常条件および低酸素状態における、様々なｍｉｃｒｏＲＮＡがＶＥＧＦ分泌に及ぼす影響を調べた結果、特にｍｉｒ−１２５ａとｍｉｒ−１２５ｂが低酸素状態でＶＥＧＦの分泌濃度を低めることが分かった（図２）。
【００７５】
（実施例５：レンチウイルスの製造、およびマイクロＲＮＡを発現する細胞株の構築）
図７の構造を持つようにレンチウイルスを生産することが可能なベクターを構築し、ｍｉｃｒｏＲＮＡ１２５ａと１２５ｂを入れてベクターを製作した。こうして製造されたベクター（３μＬ）とウイルス構造タンパク質を形成するためのベクターとしてインビトロゲンのｐＬＰ／ＶＳＶＧ、ｐＬＰ１、ｐＬＰ２が混ざっているＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭＰａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（９μｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてウイルスを製造した。ウイルスを生産した細胞は２９３ＦＴ細胞を使用し、製造社の方法に応じて適切な培養培地を製造して培養させ、実験に使用した。トランスフェクション方法としてはＦｕｇｅｎ６（Ｒｏｃｈｅ）製品を用いて製造社の方法によって行った。トランスフェクションされた２９３ＦＴ細胞は４８時間さらに培養して培地の上澄み液を集めてウイルスを収去した。
【００７６】
本ウイルスは、ベクターに入っているＧＦＰを用いてＦＡＣＳ分析によってウイルス力価を測定した。これに関連して、収去したウイルスを１０−１〜１０−９まで連続的に希釈し、６ウェルプレート上の予め準備されたＵ３７３細胞に１ｍＬずつ添加した。添加４８時間の後、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで取り外し、ＤＰＢＳで洗浄した。ＦＡＣＳでＧＦＰ発現細胞の百分率を求めて力価を測定した。こうして力価が測定されたウイルスを用いてＵ３７３細胞に１０ＴＵ(transducing unit)／ｃｅｌｌのウイルスを処理することにより、ｍｉＲ−１２５ａとｍｉＲ−１２５ｂを生成するそれぞれのＵ３７３細胞株を構築した。
【００７７】
（実施例６：マイクロＲＮＡ−１２５の調節メカニズムの確認）
マイクロＲＮＡ−１２５が細胞内でどんなメカニズムで調節されるかを確認するために、ＶＥＧＦの発現に重要な役割を担当している転写調節因子ＨＩＦ−１(Hypoxia inducible factor 1)と癌抑制遺伝子(tumor suppressor gene)としてよく知られているＰＴＥＮとの調節関係を調べた。ｍｉｃｒｏＲＮＡ拮抗剤は、細胞内に存在するｍｉＲＮＡに特異的に結合して機能を阻害するようにデザインされたヌクレオチドである。今回の実験に使用された拮抗剤は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。本実験に使用されたｍｉＲＮＡ１２５発現ベクターは、実施例５によるレンチウイルスベクターを使用した。処理されたｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡは１００ｎＭの濃度で細胞にそれぞれ処理した。
【００７８】
まず、ＨＩＦ−１抑制、ＰＴＥＮ発現およびマイクロＲＮＡ−１２５発現によって血管新生がどのように調節されるかを調べるために、Ｕ３７３細胞にｓｉＨＩＦ−１、ｓｉＨＩＦ−２、ＰＴＥＮ、ｍｉｒ−１２５ａをそれぞれエレクトロポレーションして４８時間培養した後、正常培養条件と低酸素症培養条件でさらに２４時間培養して得た培地の上澄み液を抽出し、ＥＬＩＳＡキットを用いてＶＥＧＦ分泌量を測定した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）（図３Ａ）。
【００７９】
図３Ａのデータから明らかなように、低酸素状態でｓｉＨＩＦ−１によってＨＩＦ−１が抑制されるとき、或いはＰＴＥＮ、マイクロＲＮＡ−１２５が発現されるときに、ＶＥＧＦ分泌が抑制された。特に、ＨＩＦ−１活性の抑制よりはマイクロＲＮＡ−１２５またはＰＴＥＮの発現によってＶＥＧＦ分泌がさらに抑制されることが確認された。
【００８０】
また、正常培養条件と低酸素培養条件でＨＩＦ−１を抑制させ或いはＰＴＥＮを発現させたとき、マイクロＲＮＡ−１２５の発現程度がどのように調節されるかを調べた。これのために、Ｕ３７３細胞をｓｉＨＩＦ、ＰＴＥＮ、ｍｉｒ−１２５ａでそれぞれエレクトロポレーションによってトランスフェクションして４８時間培養した後、正常培養条件と低酸素症培養条件でさらに２４時間培養した細胞からトリゾール(Trizol)（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いてＲＮＡを単離した。得られたＲＮＡは実時間ＰＣＲ方法を用いて増幅し、各条件でｍｉｒ−１２５ａの発現量を測定した（図３Ｂ）。
【００８１】
図３Ｂのグラフから分かるように、低酸素状態でＨＩＦ−１抑制よりはＰＴＥＮ発現によってマイクロＲＮＡ−１２５の発現水準が増加した。これは、低酸素状態の細胞内でＰＴＥＮ発現によってマイクロＲＮＡ−１２５の発現が調節できることを意味する結果である。
【００８２】
また、ｓｉＨＩＦおよびｍｉｒ−１２５ａによるＨＩＦ−１のタンパク質発現様相を確認するために、ウェスタンブロットを行った。Ｕ３７３細胞をｓｉＨＩＦ、ｍｉｒ−１２５ａでそれぞれエレクトロポレーションして４８時間培養した後、正常培養条件と低酸素症培養条件でさらに２４時間培養した細胞からタンパク質を単離し、ウェスタンブロットを行ってそれぞれのＨＩＦ−１の量を測定した。図３Ｃの発現様相において示すように、ｓｉＨｉＦ−１ａによってＨＩＦ−１ａの発現水準が確然に減少したことを確認することができた。
【００８３】
また、低酸素状態でＰＴＥＮ変形によるＶＥＧＦ発現様相、およびＰＴＥＮ変形によるマイクロＲＮＡ−１２５の過発現を調べた。具体的に、ｓｉＰＴＥＮを発現するレンチウイルスをＬＮ２２９細胞に感染させることによりＰＴＥＮを変形させて作用不可能にした後、この細胞にさらにそれぞれｍｉｒ−１２５ａとｍｉｒ−１２５ｂレンチウイルスを感染させてｍｉｒ−１２５ａおよびｍｉｒ−１２５ｂをそれぞれ発現する細胞株を確保した。ＶＥＧＦ発現量は、ＰＴＥＮが変形して不活性化されたとき、およびＰＴＥＮの不活性化によりｍｉｒ−１２５ａとｍｉｒ−１２５ｂが過発現されたときに細胞からＥＬＩＳＡキットを用いて測定した（図３Ｄ）。
【００８４】
図３Ｄに示すように、低酸素状態でＰＴＥＮの変形によりＶＥＧＦ発現が増大してＶＥＧＦ分泌水準が確然に増加することを確認したと共に、このようなＰＴＥＮが変形してＶＥＧＦ発現が増大した細胞にマイクロＲＮＡ−１２５を処理してマイクロＲＮＡ−１２５を過発現させることにより、増大したＶＥＧＦ発現水準を低めることができることを確認した。これは、マイクロＲＮＡ−１２５がＰＴＥＮ変形による血管新生を抑制させることができることを意味する結果である。
【００８５】
また、低酸素状態で細胞のＰＴＥＮによるＶＥＧＦ分泌阻害がマイクロＲＮＡ−１２５発現を媒介として行われるか否かを確認するために、ＰＴＥＮの変形した細胞にＰＴＥＮを添加してＶＥＧＦ分泌程度を確認し、他方にはＰＴＥＮと共に同時にマイクロＲＮＡ−１２５に対する拮抗剤としてａｎｔｉ１２５ａまたはａｎｔｉ１２５ｂを処理してＶＥＧＦ分泌濃度を比較した（図３Ｅ）。例えば、ＰＴＥＮが突然変異によって変形して作動できない細胞株としてのＵ３７３細胞にＰＴＥＮを添加したときの影響を調べるために、ＰＴＥＮをエレクトロポレーションし、他方にはＰＴＥＮと共にｍｉｒ−１２５ａとｍｉｒ−１２５ｂの拮抗剤を一緒に入れた後、ＶＥＧＦの濃度変化をＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
【００８６】
図３Ｅに示すように、低酸素状態でＰＴＥＮの変形した細胞にＰＴＥＮを添加したとき、ＰＴＥＮによってＶＥＧＦの発現が抑制されたことを確認することができた。また、ＰＴＥＮと共にマイクロＲＮＡ−１２５に対する拮抗剤を処理したときは、ＰＴＥＮを単独で処理したときに比べてＶＥＧＦ発現の抑制程度が弱いことを確認することができた。これは細胞内において低酸素状態でＰＴＥＮによる血管新生抑制作用がマイクロＲＮＡ−１２５の発現によって調節されていることを示す結果である。
【００８７】
前記結果をまとめると、ＰＴＥＮの変形した脳癌細胞の低酸素状態でマイクロＲＮＡ−１２５の発現量が減少することにより、ＶＥＧＦの発現を増加させて血管新生を促進させるので、マイクロＲＮＡ−１２５が脳癌の形成に作用する重要な因子であることを確認することができた。
【００８８】
（実施例７．マイクロＲＮＡ−１２５が癌細胞の浸潤に及ぼす影響）
マイクロＲＮＡ−１２５が脳癌細胞の浸潤に及ぼす影響を調べるために、ｍｉｒ−１２５ａ、ｍｉｒ１２５ｂ、陰性対照群ｍｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）をそれぞれＵ３７３細胞に導入させて癌細胞の浸潤程度を調べた（図４）。具体的に、実験１日前に、必要な細胞数を計算して準備した後、ｍｉｒ−１２５ａ、ｍｉｒ１２５ｂ、陰性対照群ｍｉＲＮＡをそれぞれ１．５×１０６個の細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションされた細胞株は４８時間培養し、浸潤測定用トランスウェルのある２４−ｗｅｌｌプレート上にマトリゲル(Growth Factor Reduced BD Matrigel Matrix)を予め準備した。予め準備されたトランスウェル当り１．５×１０６個の細胞を血清のないＤＭＥＭ培地に入れて載置し、トランスウェルの下方のウェルには１％ＢＳＡ入りのＤＭＥＭを添加した後、２４時間３７℃の二酸化炭素細胞培養器で培養した。２４時間培養の後、Ｄｉｆｆ Ｑｕｉｃｋ（Ｓｙｓｍｅｘ）キットを用いて細胞を固定させ、細胞質と細胞核を染色した。染色の後、トランスウェルの上面を棉棒でよく拭き出し、トランスウェルを抜け出した細胞数を計算した。
【００８９】
図４に示すように、陰性対照群ｍｉＲＮＡに比べて、ｍｉｒ１２５ａは約６０％の浸潤阻害効果を示し、ｍｉｒ１２５ｂは４０％の浸潤阻害効果を示した。
【００９０】
（実施例８：マイクロＲＮＡ−１２５による抗癌活性）
ｍｉＲ−１２５ｂおよびＨＩＦ１ａが生産される細胞株を作り、これをマウスに移植し、マウスの生存力および体重を測定してｍｉＲ−１２５ｂおよびＨＩＦ１ａの発現によって癌が調節できるかを確認した（図５）。
【００９１】
具体的に、ｍｉＲ−１２５ｂ、ＨＩＦ１ａまたは空ベクターで製造されたレンチウイルスを用いてＵ３７３−ＭＧ細胞に感染させ、ｍｉＲ−１２５ｂとＨＩＦ１ａが生産される細胞株を作った。１５匹の６週齢雌ヌードマウス（Ｂａｌｂ−Ｃ／ｎｕ−ｎｕ、Ｈａｌａｎ）の頭蓋骨ブレグマ(bregma)位置で左１ｍｍ下２ｍｍの部位にガイドスクリュー(Guide-screw, Plastics one)を植えた後、ダミー(dummy, Plastics one)を挿し、約１０日後に構築されたそれぞれの細胞株５×１０５ｃｅｌｌを、それぞれ５匹の脳に、ガイドスクリューのダミーを除去した後でその部分の４ｍｍ深さに尾状核被殻(caudate putamen)位置に注射器で注入した。注入の後、ダミーをさらに挿し、１０日から約１２０日まで体重を測定し、行動変化および健康状態を観察した。
【００９２】
図５に示すように、対照群のマウスは体重減少を起こしながら４０余日後に死んだが、ｍｉｒ−１２５ｂを発現する細胞株を移植させたマウスは体重変化も大きくなく、何よりも１２０余日以上生存した。これは、ｍｉｒ−１２５ｂが動物組織内で実質的な抗癌効果を示して癌増殖を抑制することができるということを示す結果である。
【００９３】
（実施例９：マイクロＲＮＡ−１２５が子宮頸癌細胞の浸潤に及ぼす影響）
脳腫瘍細胞を除いた他の細胞におけるｍｉｒ−１２５の効果を調べるために、子宮頸癌細胞としてのＨｅＬａ細胞を用いて、実施例７で行った浸潤実験を同一に行った後、細胞の浸潤程度を確認した（図８）。具体的に、実験１日前に、必要な細胞の数を計算して準備した後、ｍｉｒ−１２５ａ、陰性対照群ｍｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍｍａｃｏｎ）をそれぞれ１．５×１０６個のＨｅＬａ細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションされた細胞株は４８時間培養し、浸潤測定用トランスウェルのある２４−ウェルプレート上にマトリゲル(Growth Factor Reduced BD Matrigel Matrix)を予め準備した。予め準備されたトランスウェル当り１．５×１０５個の細胞を血清のないＤＭＥＭ培地に入れて載置し、トランスウェルの下方のウェルには１％ＢＳＡ入りのＤＭＥＭを添加した後、２４時間３７℃の二酸化炭素細胞培養器で培養した。２４時間培養の後、Ｄｉｆｆ Ｑｕｉｃｋ（Ｓｙｓｍｅｘ）キットを細胞に固定させ、細胞質と細胞核を染色した。染色の後、トランスウェルの上面を棉棒でよく拭き出し、トランスウェルを抜け出した細胞数を計算した。
【００９４】
図８に示すように、陰性対照群ｍｉＲＮＡに比べて、ｍｉｒ１２５ａはＨｅＬａ細胞の浸潤を阻害した。これは、マイクロＲＮＡ−１２５が脳癌細胞だけでなく子宮癌細胞においても癌細胞の浸潤を阻害することにより抗癌効果を示すことを示唆する結果である。
【００９５】
〔産業上の利用可能性〕
本発明では、マイクロＲＮＡ−１２５が、癌細胞の低酸素状態で誘導される血管形成を阻害し、癌細胞の成長、浸潤および転移を抑制することを解明したので、本発明に係るマイクロＲＮＡ−１２５を含む抗癌組成物は、多様な癌、特に外科的手術、化学療法または放射線療法に限界性を示す癌治療のための効果的な遺伝子治療剤として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】（ａ）は、低酸素症特異的なマイクロＲＮＡ選別のための模式図であり、（ｂ）は、各脳癌細胞株におけるマイクロＲＮＡの発現様相を示す図である。
【図２】正常条件および低酸素症状態における多様なマイクロＲＮＡ添加によるＶＥＧＦ分泌量を示すグラフである。
【図３】（ａ）は、ＨＩＦ−１に対するｓｉＲＮＡ添加によるＶＥＧＦの分泌濃度を示す図であり、（ｂ）は、ＨＩＦ−１に対するｓｉＲＮＡ添加によるｍｉＲＮＡ１２５の発現量を示す図であり、（ｃ）は、ｓｉＨＩＦおよびｍｉｒ−１２５ａによるＨＩＦ−１のタンパク質発現様相を確認するためにウエスタンブロットを行った結果を示す図であり、（ｄ）は、低酸素状態におけるＰＴＥＮの不活性化によるＶＥＧＦの発現様相を示す図であり、（ｅ）は、ＰＴＥＮで処理された細胞にＰＴＥＮ単独、ＰＴＥＮと共にマイクロＲＮＡ−１２５に対する拮抗剤を添加したときのＶＥＧＦ分泌濃度をそれぞれ示すグラフである。
【図４】ｍｉｒ１２５の脳癌細胞の浸潤阻害程度を示すグラフおよび細胞写真を示す図である。
【図５】（ａ）は、マウスモデルを示す模式図であり、（ｂ）は、脳癌細胞をマウスの脳に入れる過程模式図であり、（ｃ）は、脳癌の誘導されたマウスに、ｍｉｒ１２５を発現する細胞株を処理したときにマウスの生存率を示す図であり、（ｄ）は、脳癌の誘導されたマウスに、ｍｉｒ１２５を発現する細胞株を処理したときのマウスの体重変化を示す図である。
【図６】前駆体ｍｉｒ１２５と成熟ｍｉｒ１２５の核酸塩基配列および染色体上の位置を示す図である。
【図７】マイクロＲＮＡ−１２５を発現させるためのレンチウイルスの構造を示す模式図である。
【図８】ｍｉｒ１２５の子宮頸癌細胞であるＨｅＬａ細胞の浸潤阻害程度を示す細胞の写真およびヒストグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年1月13日(2010.1.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロＲＮＡ−１２５ａ核酸分子を含む、脳癌および子宮頸癌治療用組成物。
【請求項２】
前記マイクロＲＮＡ−１２５ｂ１またはマイクロＲＮＡ−１２５ｂ２核酸分子を含む、脳癌、子宮頸癌、血管腫、血管線維腫、動脈硬化、血管癒着、浮腫性硬化症、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、血管新生角膜疾患、関節炎、乾癬、毛細血管拡張症、化膿性肉芽腫およびアルツハイマー治療用組成物。
【請求項３】
前記癌は、マイクロＲＮＡ−１２５の発現程度が低い状態の癌であることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
癌細胞の浸潤および転移抑制活性を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
低酸素状態で誘導される血管新生に対する阻害活性を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
前記マイクロＲＮＡ−１２５ａ、マイクロＲＮＡ−１２５ｂ１またはマイクロＲＮＡ−１２５ｂ２核酸分子は発現ベクターに含まれることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
前記ベクターは、レンチウイルス(lentivirus)、レトロウイルス(retrovirus)、アデノウイルス(adenovirus)、ヘルペスウイルス(herpes virus)、およびアビポックスウイルス(avipox virus)よりなる群に由来するウイルスベクターであることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記マイクロＲＮＡ−１２５ａ、マイクロＲＮＡ−１２５ｂ１またはマイクロＲＮＡ−１２５ｂ２核酸分子は細胞内に導入された形態であることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項９】
薬学的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記マイクロＲＮＡ−１２５ａ、マイクロＲＮＡ−１２５ｂ１またはマイクロＲＮＡ−１２５ｂ２の発現水準を測定する製剤を含む、脳癌および脳腫瘍診断用マーカー組成物。
【請求項１１】
請求項１の組成物を投与する段階を含む、マイクロＲＮＡ−１２５ａの発現程度が低い状態の脳癌および子宮頸癌を治療する方法。
【請求項１２】
請求項２の組成物を投与する段階を含む、マイクロＲＮＡ−１２５ｂ１またはマイクロＲＮＡ−１２５ｂ２の発現程度が低い状態の脳癌および子宮頸癌を治療する方法。
【請求項１３】
請求項２の組成物を投与する段階を含む、低酸素状態で誘導される血管新生関連疾患治療方法。
【請求項１４】
血管内皮成長因子（Vascular endothelial growth factor、ＶＥＧＦ）の分泌抑制によって治療することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＴＥＮ(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)の不活性によって誘導される血管新生を抑制することにより治療することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【国際調査報告】
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