(57)【要約】  本発明はアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに転換する酵素（ＴＨＬ）及びブチリル−ＣｏＡを中間体としてブタノールを生合成する能力を有する微生物を用いてブタノールを製造する方法に関し、上記の微生物にＣｏＡＴ（アセチル−ＣｏＡ：ブチリル−ＣｏＡＣｏＡ−トランスフェラーゼ）をコードする遺伝子を導入した微生物において、様々な方法によりブチリル−ＣｏＡを生成した後、ブタノールに転換してブタノールを製造する方法に関する。
2010517562.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸にＣｏＡ部分を転移して有機酸を有機酸−ＣｏＡに転換する機能を有するＣｏＡＴ（ＣｏＡトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子が導入されているブタノール生成能を有する組換え酵母。
【請求項２】
前記ＣｏＡＴはアセチル−ＣｏＡ：ブチリル−ＣｏＡ  ＣｏＡ−トランスフェラーゼであることを特徴とする請求項１に記載の組換え酵母。
【請求項３】
前記ＣｏＡＴをコードする遺伝子はクロストリジウム属由来ｃｔｆＡＢであることを特徴とする請求項１に記載の組換え酵母。
【請求項４】
前記酵母は、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに転換する酵素（ＴＨＬ）をコードする遺伝子を有していることを特徴とする請求項１に記載の組換え酵母。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え酵母をブチレート含有培地において培養することを含むブチリル−ＣｏＡの製造方法。
【請求項６】
前記培地は脂肪酸をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載のブチリル−ＣｏＡの製造方法。
【請求項７】
前記脂肪酸は炭素数が４−２４個であることを特徴とする請求項６に記載のブチリル−ＣｏＡの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え酵母をブチレート含有培地において培養してブタノールを生成するステップ；及び培養液よりブタノールを回収するステップを含むブタノールの製造方法。
【請求項９】
前記酵母は、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）活性を有するアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードする遺伝子を自発的に発現していることを特徴とする請求項８に記載のブタノールの製造方法。
【請求項１０】
前記酵母は、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項８に記載のブタノールの製造方法。
【請求項１１】
前記アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードする遺伝子はクロストリジウム属由来のａｄｈＥ１またはａｄｈＥ２であることを特徴とする請求項１０に記載のブタノールの製造方法。
【請求項１２】
前記培地は脂肪酸をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載のブタノールの製造方法。
【請求項１３】
前記脂肪酸は炭素数が４−２４個であることを特徴とする請求項１２に記載のブタノールの製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え酵母をブチレート産生能を有する微生物と共培養して、前記ブチレート産生能を有する微生物によりブチレートが生成されるようにし、前記組換え酵母が前記生成されたブチレートを用いてブタノールを生成するようにするステップと、培養液からブタノールを回収するステップと、を含むブタノールの製造方法。
【請求項１５】
前記酵母は、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）活性を有するアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードする遺伝子を自発的に発現していることを特徴とする請求項１４に記載のブタノールの製造方法。
【請求項１６】
前記酵母は、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項１４に記載のブタノールの製造方法。
【請求項１７】
前記アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードする遺伝子はクロストリジウム属由来のａｄｈＥ１またはａｄｈＥ２であることを特徴とする請求項１６に記載のブタノールの製造方法。
【請求項１８】
前記培地は脂肪酸をさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載のブタノールの製造方法。
【請求項１９】
前記脂肪酸は炭素数が４−２４個であることを特徴とする請求項１８に記載のブタノールの製造方法。
【請求項２０】
脂肪酸からブチリル−ＣｏＡを生合成可能な酵母を脂肪酸含有培地において培養することを含むブチリル−ＣｏＡの製造方法。
【請求項２１】
前記脂肪酸は炭素数が４−２４個であることを特徴とする請求項２０に記載のブチリル−ＣｏＡの製造方法。
【請求項２２】
脂肪酸からブチリル−ＣｏＡを生合成可能な酵母を脂肪酸含有培地において培養してブタノールを生成するステップ；及び培養液よりブタノールを回収するステップを含むブタノールの製造方法。
【請求項２３】
前記脂肪酸は炭素数が４−２４個であることを特徴とする請求項２２に記載のブタノールの製造方法。
【請求項２４】
前記酵母は、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）活性を有するアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードする遺伝子を自発的に発現していることを特徴とする請求項２２に記載のブタノールの製造方法。
【請求項２５】
前記酵母は、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項２４に記載のブタノールの製造方法。
【請求項２６】
前記アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードする遺伝子はクロストリジウム属由来のａｄｈＥ１またはａｄｈＥ２であることを特徴とする請求項２５に記載のブタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はブチリル−ＣｏＡを中間体としてブタノールを生合成する能力を有する酵母を用いてブタノールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、高油価及び環境問題と相まって、微生物を用いたバイオ燃料産生が大きな関心を集めている。特に、バイオブタノールは、バイオエタノールに比べて酸素含有量が低くて化石燃料と高い混和性を有しているというメリットがある。近年、バイオブタノールがガソリンの代替燃料として浮上するに伴い、市場規模が急速度にて増加している。米国での年間バイオブタノール市場は３７億ガロンに達しており、３．７５ドル／ガロンの単価を形成している。特に、バイオブタノールは、高いエネルギー密度、低い蒸気圧、十分なオクタン価、低い不純物など燃料として好適な特性を有している。エタノールよりも揮発油の方にさらに適したブタノールを微生物を用いて量産するならば、原油代替効果及び温室効果ガス排出の低減による環境的効果などをもたらすことができる。
【０００３】
ブタノールは、クロストリジウム菌株の嫌気的アセトン・ブタノール・エタノール（ＡＢＥ）発酵により、生物学的方法を用いて産生可能であるが（Jones, D.T. and Woods, D.R., Microbiol. Rev., 50:484, 1986; Rogers, P., Adv. Appl. Microbiol., 31:1, 1986; Lesnik, E.A. et al., Necleic Acids Research, 29: 3583, 2001）、この方法が１９５０年代までには４０年以上に亘ってブタノールとアセトンの主たる供給源であった。クロストリジウム菌株は成長条件が厳しく、且つ、分子生物学的ツール及びオミクス技術などが完全に備えられていないため、さらなる菌株改良に難点がある。
【０００４】
このため、既にエタノール産生に卓越した能力を示し、且つ、様々なオミクス技術が備えられた酵母などでのブタノール産生が求められている。特に、代謝工学またはオミクス技術などを用いた菌株開発が全くない状態であるため、限りない開発潜在力があると言える。
【０００５】
クロストリジウム・アセトブチリクムでのブタノール生成経路は、図１に示す通りである（Jones, D.T. and Woods, D.R., Microbiol. Rev., 50:484, 1986; Desai, R.P. et al., J. Biotechnol., 71:191, 1999）。バイオブタノールの産生のために研究されている代表的な菌株のクロストリジウム属と大腸菌は、両方とも、最終産物であるブタノールに対する耐性が産業化までには距離がある。一方、ブタノール生合成経路を導入してブタノール生成能を有する組換え微生物を製作し、これを用いてブタノール産生を試みたことがあるが、その生成量が微量であった（ＵＳ２００７／０２５９４１０Ａ１、ＵＳ２００７／０２５９４１１Ａ１）。
【０００６】
現在、酵母は、エタノール発酵産業に多用されており、アルコールに対する耐性が相当高いという特徴を有する。一般的に、代謝活動が高く、成長速度も速く、しかも、低いｐＨや低い温度及び低い水分活性度の環境でもよく生長する生理的な特性はカビと同様であり、嫌気的な条件下でも成長する種類が多いという点が、酵母を用いたブタノール産生に当たって最大のメリットになると期待される。しかしながら、酵母は、通常の条件下では、図２に示すように、元来ブタノールを生成できず、組換え酵母を用いたブタノール産生を試みたことがあるが、その産生量が微量であった（ＷＯ２００７／０４１２６９Ａ２）。
【０００７】
そこで、本発明者らは、酵母を用いてブタノールを産生する新規な方法を開発するために鋭意努力した結果、酵母において種々の方法により中間体であるブチリル−ＣｏＡを生成し、該生成されたブチリル−ＣｏＡがアルコール／アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）によりブタノールに転換されるということを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【０００８】
要するに、本発明の目的は、酵母において、ブタノールなどの生合成経路で重要な中間体であるブチリル−ＣｏＡを種々の経路を通じて生成した後、これを中間体としてブタノールを製造する方法及びブタノール生合成能を有する組換え酵母を提供するところにある。
【０００９】
上記の目的を達成するために、本発明は、有機酸にＣｏＡ部分を転移して有機酸を有機酸−ＣｏＡに転換する機能を有するＣｏＡＴ（ＣｏＡトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子が導入されているブタノール生成能を有する組換え酵母及び前記組換え酵母をブチレート含有培地において培養することを含むブチリル−ＣｏＡ及びブタノールの製造方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、前記組換え酵母をブチレート産生能を有する微生物と共培養して、前記ブチレート産生能を有する微生物によりブチレートが生成されるようにし、前記組換え酵母が前記生成されたブチレートを用いてブタノールを生成するようにするステップと、培養液からブタノールを回収するステップと、を含むブタノールの製造方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、脂肪酸からブチリル−ＣｏＡを生合成可能な酵母を脂肪酸含有培地において培養することを特徴とするブチリル−ＣｏＡ及びブタノールの製造方法を提供する。
【００１２】
本発明において、前記酵母は、アルコール／アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）活性を有するＡＡＤをコードする遺伝子を自発的に発現しているか、あるいは、ＡＡＤをコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする。
【００１３】
本発明の他の特徴及び具現例は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲から一層明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】クロストリジウム・アセトブチリクムでのブタノール生成経路を示す図である。
【図２】酵母のブタノエート代謝回路の一部を示すものであり、点線は酵母にない経路を示し、実線は酵母に存在する経路を示す。
【図３】脂肪酸から組換え酵母のブチリル−ＣｏＡプールを用いて推定されたブタノール生成経路を示す図である。
【図４】本発明による組換え酵母において培地にあるブチレートまたはアセテートを用いて細胞内のアセチル−ＣｏＡプールを高めてブタノールを生成する経路を示す図である。
【図５】ｐＹＵＣ１８ベクターの遺伝子地図を示す図である。
【図６】ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１の遺伝子地図を示す図である。
【図７】ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢの遺伝子地図を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明においては、酵母においてブチリル−ＣｏＡを生成するために２種類の方法を検討した：（１）ＴＨＬ（アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに転換する酵素）をコードする遺伝子を有する酵母にＣｏＡＴ（ＣｏＡトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子を導入して組換え酵母を製作し、これをブチレートを含有する培地において培養してブチリル−ＣｏＡを生成する方法、及び（２）脂肪酸から酵母自体のβ酸化経路を用いてブチリル−ＣｏＡを生成する方法。
【００１６】
酵母は、様々な脂肪酸を利用するβ酸化経路によりペルオキシソーム及びシトソルに短鎖長（ｓｃｌ）及び中鎖長（ｍｃｌ）のアシル−ＣｏＡを生成することができるが（Leaf, T.A. et al., Microbiology-Uk, 142:1169, 1996; Carlson, R. et al., J. Biotechnol., 124:561, 2006; Zhang, B. et al., Appl. Environ. Microbiol., 72:536, 2006）、これを用いたブタノール産生についての報告は未だない。
【００１７】
本発明においては、クロストリジウム・アセトブチリクムＡＴＣＣ８２４由来のアルコール／アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードする遺伝子（ａｄｈＥ１）を導入した組換え酵母を製作し、前記２種類の方法により生成されると予測される中間体であるブチリル−ＣｏＡからブタノールを生成することを試みた。また、ＡＡＤ未導入酵母を脂肪酸含有培地において培養する場合にもブタノールが生成されるかどうかを確認した。
【００１８】
その結果、（１）ＴＨＬをコードする遺伝子を有する酵母にＣｏＡＴをコードする遺伝子とＡＡＤをコードする遺伝子を導入した組換え酵母をブチレートを含有する培地において培養する場合、ブタノールが生成されることを確認した。（２）ＡＡＤをコードする遺伝子を導入した組換え酵母を脂肪酸を含有する培地において培養する場合にもブタノールが生成されることを確認した。（３）さらに、ＡＡＤ未導入酵母を脂肪酸含有培地において培養する場合にブタノールが生成されることを確認した。これは、脂肪酸からβ酸化経路により生成されたブチリル−ＣｏＡが自発的に発現されるＡＡＤによりブタノールに転換されることを意味する。要するに、本発明において使用された酵母は活性を有するＡＡＤ遺伝子を自発的に発現しているということを間接的に確認することができた。
【００１９】
この結果から、種々の経路を通じて合成されたブチリル−ＣｏＡからブタノールを生成するためには、活性を有するＡＡＤ遺伝子を自発的に発現している酵母を利用したり、あるいは、自発的にＡＡＤ遺伝子を有していない酵母を利用する場合にはＡＡＤをコードする遺伝子（例：クロストリジウム・アセトブチリクムＡＴＣＣ８２４由来ａｄｈＥ１）を導入した組換え酵母を利用することが可能である。
【００２０】
従って、本発明は、一観点において、有機酸にＣｏＡ部分を転移して有機酸を有機酸−ＣｏＡに転換する機能を有するＣｏＡＴ（ＣｏＡトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子が導入されているブタノール生成能を有する組換え酵母及び前記組換え酵母をブチレート含有培地において培養することを含むブチリル−ＣｏＡ及びブタノールの製造方法に関する。
【００２１】
本発明において、前記酵母は、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに転換する酵素（ＴＨＬ）をコードする遺伝子を有していることを特徴とし、前記ＣｏＡＴはアセチル−ＣｏＡ：ブチリル−ＣｏＡＣｏＡ−トランスフェラーゼであることを特徴とし、前記ＣｏＡＴをコードする遺伝子はクロストリジウム属由来ｃｔｆＡＢであることを特徴とするが、これらに制限されるものではない。
【００２２】
他の観点において、本発明は、脂肪酸からブチリル−ＣｏＡを生合成可能な酵母を脂肪酸含有培地において培養することを含むブチリル−ＣｏＡ及びブタノールの製造方法に関する。
【００２３】
本発明の一実施形態においては、クロストリジウム・アセトブチリクムＡＴＣＣ８２４由来アルコール／アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードする遺伝子（ａｄｈＥ１）が導入されている組換え酵母［サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１）］がアセチル−ＣｏＡまたは短鎖、中鎖、長鎖の脂肪酸からそれ自体の酵素により中間体であるブチリル−ＣｏＡが生成されるかどうかをブタノール生成能により確認しようとした。前記組換え酵母は、酵母自体において生成されるブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドを経てブタノールを製造するために製作されたものである。すなわち、前記組換え酵母において様々なアシル−ＣｏＡ（ブチリル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡなど）を用いる場合、ブタノールが生成可能であると予測し、さらに、前記組換え酵母に導入されていたり、あるいは、既に有しているアルコール／アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）によりブチリル−ＣｏＡからブタノールが生成されると予測した（図３）。
【００２４】
これを確認するために、前記組換え酵母をオレイン酸／ラウリン酸含有ＳＣ−ドロップアウト培地において培養した結果、β酸化経路から合成されたブチリル−ＣｏＡを含むアシル−ＣｏＡからブタノールが生成されることを確認することができた。また、ＡＡＤがさらに導入されていない菌株においてもブタノールが生成されることを確認した。これは、前記組換え酵母及び自体ＡＡＤ活性を有する酵母内に存在するアシル−ＣｏＡ合成に関与する酵素に起因すると推定される。すなわち、組換え酵母［サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１）］及び自体ＡＡＤ活性を有する酵母［サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８）］を脂肪酸含有培地において培養してブタノールが生成されることから、ブチリル−ＣｏＡなどのｓｃｌ−アシル−ＣｏＡまたはｍｃｌ−アシル−ＣｏＡに転換する酵素（アシル−ＣｏＡシンターゼ）によりブタノールに転換されたと推定することができる（図３）。前記酵母に存在するブチリル−ＣｏＡなどのｓｃｌ−アシル−ＣｏＡ及びｍｃｌ−アシル−ＣｏＡに転換する酵素（アシル−ＣｏＡシンターゼ）がブタノール産生に寄与することを本発明から確認することができた（Marchesini, S. et al., J. Biol. Chem. 278:32596, 2003; Zhang, B. et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:536, 2006）。
【００２５】
本発明の他の実施形態においては、クロストリジウム・アセトブチリクムＡＴＣＣ８２４由来アルコール／アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤ）をコードする遺伝子（ａｄｈＥ１）及びＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣｏＡＴ）をコードする遺伝子（ｃｔｆＡＢ）が導入されている組換え酵母が外部から添加されたブチレートを用いて細胞内のブチリル−ＣｏＡプールを高め、これを用いてブタノールを合成できるかどうかを確認しようとした。前記組換え酵母［サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）］は、外部のブチレートを用いてブチリル−ＣｏＡを製作し、ブチルアルデヒドを経てブタノールを製造するために製作されたものである。クロストリジウム・アセトブチリクムＡＴＣＣ８２４由来ＣｏＡＴ酵素は、酪酸または酢酸をアセトアセチル−ＣｏＡのＣｏＡ部分をブチリル−ＣｏＡまたはアセチル−ＣｏＡに転移する役割を果たすため、細胞内のブチリル−ＣｏＡのプールを高める上で極めて有利である（図４）（Bermejo, L. et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:1079, 1998）。すなわち、ＡＡＤをコードする遺伝子（ａｄｈＥ１）とＣｏＡＴをコードする遺伝子（ｃｔｆＡＢ）が導入されている組換え酵母をブチレート添加培地において培養する場合、細胞内のブチリル−ＣｏＡプールを高めることができ、その結果、ブタノールの生成が増大すると予測した。また、ブチレートと脂肪酸を併せ持つ培地において培養する場合に細胞内のブチリル−ＣｏＡプールを一層高めることができ、その結果、ブタノールの生成が一層増大すると予測した（図４）。
【００２６】
これを確認するために、前記組換え酵母［サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）］をブチレート含有培地において培養した結果、ブチレートからブチリル−ＣｏＡを経てブタノールが生成されたことを確認することができた。これは、前記組換え酵母内に存在するブチリル−ＣｏＡ生成に関与するＣｏＡＴ酵素に起因すると推定される。前記組換え酵母に存在するブチレートまたはアセテートをブチル−ＣｏＡまたはアセチル−ＣｏＡに転換する酵素（ＣｏＡＴ）がブタノール産生に寄与することを本発明から確認することができた。さらに、ブチレートと脂肪酸を併せ持つ培地において培養する場合、ブタノール生成がさらに増大することを確認した。これは、ブチレート及び脂肪酸からそれぞれＣｏＡＴ酵素及びβ酸化経路を通じてさらに多くのブチリル−ＣｏＡが生合成されたことを意味する。
【００２７】
本発明において、前記脂肪酸は炭素数が４−２４個であることを特徴とし、オレイン酸、ラウリン酸などを含む脂肪酸であることを特徴とする。
【００２８】
本発明において、前記ＡＡＤ及びＣｏＡＴをコードする遺伝子はそれぞれクロストリジウム属由来ａｄｈＥ１及びｃｔｆＡＢであることを特徴とするが、これに限定されるものではない。例えば、他の微生物由来の遺伝子であるとしても、宿主酵母に導入発現されて同じ酵素活性を示す限り、制限はない。
【００２９】
一方、外部から直接的にブチレートを添加する方法に加えて、ブチレートを提供するために共培養方法を利用することもできる。すなわち、ブチレートを産生可能な菌株と本発明の組換え酵母を共培養して、ブチレート産生菌株により前駆体であるブチレートを生成するようにし、本発明の組換え酵母により前記生成されたブチレートをブチリル−ＣｏＡを通じてブタノールに転換することができる。
【００３０】
前駆体を経て特定の産物を産生するために共培養する例として、ルミノコッカス・アルバスとウォリネラ・スシノゲネスの共培養などがある。ルミノコッカス・アルバスの単独培養を用いたグルコースの発酵は、主産物である酢酸と共にＣＯ２、Ｈ２、及びエタノールを最終産物として産生することになる。しかしながら、ウォリネラ・スシノゲネスと共培養する場合には水素が除去されてエタノールを産生しなくなる。これは、ウォリネラ・スシノゲネスがアセチル−ＣｏＡからアセテートを産生することによりＡＴＰを形成し、これにより、ルミノコッカス・アルバスの側面から、グルコースモル当たりのＡＴＰ産生収率を高める結果が得られる。すなわち、ルミノコッカス・アルバス単独培養の場合よりもウォリネラ・スシノゲネスとの共培養を通じて必要なＡＴＰを供給されて最終産物である酢酸を製造するのに利用可能である（Stams, A.J., Antonie Van Leeuwenhoek 66:271, 1994）。
【００３１】
ブチレートを産生可能な微生物としては、クロストリジウム属微生物（クロストリジウム・ブチリカム、クロストリジウム・ベイエリンキイ、クロストリジウム・アセトブチリクム）と腸内微生物（メガスファエラ・エルスデニ、ミツオケラ・マルチアシダス）などが知られている：（Alam, S. et al., J. Ind. Microbiol., 2:359, 1988; Andel, J.G. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 23:21-26, 1985; Barbeau, J.Y. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 29:447, 1988; Takamitsu, T. et al., J. Nutr., 132:2229, 2002）。このため、ブチレートを産生する前記菌株を本発明の組換え酵母と共培養する場合、前記菌株によりブチレートが生成され、本発明の組換え酵母が前記生成されたブチレートを用いてブタノールを生成することができると考えられる。
【００３２】
このため、さらに他の観点において、本発明は、前記組換え酵母をブチレート産生能を有する微生物と共培養して、前記ブチレート産生能を有する微生物によりブチレートが生成されるようにし、前記組換え酵母が前記生成されたブチレートを用いてブタノールを生成するようにするステップと、培養液からブタノールを回収するステップと、を含むブタノールの製造方法に関する。
【００３３】
共培養に利用可能なブチレート産生菌株として、前記クロストリジウム属と腸内微生物についてのみ言及したが、ブチレートを産生し、酵母と共培養可能な菌株であれば、その制限がないということは当業者にとって自明であると言える。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界において通常の知識を持った者にとって自明である。
【００３５】
特に、下記の実施例においては、酵母としてサッカロマイセス・セレビシエのみを例示したが、他の酵母を使用することも当業者にとって自明である。さらに、下記の実施例においては、導入対象遺伝子として特性の菌株由来のもののみを例示したが、導入される宿主細胞において発現されて同じ活性を示す限り、その制限がないということは当業者にとって自明であると言える。
【００３６】
さらに、下記の実施例においては、特定の培地と培養方法だけを例示したが、文献に報告されたように、乳清、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）などの糖化液と他の培地を用いた場合や、流加培養、連続培養など種々の方法を使用すること（Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26:63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25:111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54:23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72:41, 2001）も当業界において通常の知識を持った者にとって自明であると言える。
【００３７】
《実施例１：ブチリル−ＣｏＡからブタノールを生成する経路が導入された組換えＤＮＡの製造》
ブタノール生合成の最終経路にある遺伝子クロストリジウム・アセトブチリクムＡＴＣＣ８２４ａｄｈＥ１（ＡＡＤをコードする遺伝子）を増幅し、ｐＹＵＣ１８発現ベクターにクローニングしてｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１ベクターを得た。
【００３８】
発現ベクターｐＹＵＣ１８は、大腸菌用クローニングベクターｐＵＣ１８（アマシャム社）を主鎖として酵母において活性を有する複製オリジン、プロモータ、転写終了配列を挿入して製作した。ｐＹＤ１（インビトロジェン社）を鋳型とし、配列番号１及び２のプライマーを用いたＰＣＲ（９５℃において２０秒間変性、５５℃において３０秒間徐冷復元、７２℃において３０秒間伸張を１周期として、合計で３０周期を繰り返す）を行うことでＰＣＲ断片（ＧＡＬプロモータ）を得た。この方法と同様にして配列番号３及び４のプライマーを用いたＰＣＲを行うことでＰＣＲ断片（転写終了配列、ＴＲＰ１ＯＲＦ、レプリコン）を得た。さらに最初のＰＣＲ断片と２番目のＰＣＲ断片を同時に鋳型とし、配列番号１及び４のプライマーを用いたＰＣＲを行うことでそれぞれのＰＣＲ断片が連結された最終ＰＣＲ断片を得た。前記増幅されたＰＣＲ断片をＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩにより切断し、同じ酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ）により切断したｐＵＣ１８ベクターに挿入して酵母発現ベクターｐＹＵＣ１８を製作した（図５）。
［配列番号１］Ｐ１：５’−ａａａａａａｇｃｔｔａａｃａａａａｇｃｔｇｇｃｔａｇｔａｃｇｇ−３’
［配列番号２］Ｐ２：５’−ｇｇｔａｃｃｃｇｇｇｇａｔｃｃｇｔｃｇａｃｃｔｇｃａｇｔｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇ
ｔｃｇｔａｔｔａｃａｇｃ−３’
［配列番号３］Ｐ３：５’−ｃｔｇｃａｇｇｔｃｇａｃｇｇａｔｃｃｃｃｇｇｇｔａｃｃｃａｇｔｇｔａｇａｔｇｔａａｃａａａａｔｃｇａｃｔ−３’
［配列番号４］Ｐ４：５’−ｃｔａｇｇａｇｃｔｃｃｔｇｇｇｔｃｃｔｔｔｔｃａｔｃａｃｇｔ−３’
【００３９】
クロストリジウム・アセトブチリクムＡＴＣＣ８２４の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び６のプライマーを用いたＰＣＲを行うことでＰＣＲ断片を得た。前記増幅されたＰＣＲ断片（ａｄｈＥ１遺伝子）をＰｓｔＩ−ＸｍａＩにより切断し、同じ酵素に制限されたｐＹＵＣ１８発現ベクターにクローニングしてｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１を製作した（図６）。
［配列番号５］Ｐ５：５’−ａａａａｃｔｇｃａｇａａｇｔｇｔａｔａｔｔｔａｔｇａａａｇｔｃａｃａａｃａｇ−３’
［配列番号６］Ｐ６：５’−ｔｃｃｃｃｃｃｇｇｇｇｔｔｇａａａｔａｔｇａａｇｇｔｔｔａａｇｇｔｔｇ−３’
【００４０】
《実施例２：ＡＡＤ及びＣｏＡＴが導入された組換えＤＮＡの製造》
クロストリジウム・アセトブチリクムＡＴＣＣ８２４ａｄｈＥ１（ＡＡＤをコードする遺伝子）及びｃｔｆＡＢ（ＣｏＡＴをコードする遺伝子）を増幅し、実施例１において製作されたｐＹＵＣ１８発現ベクターにクローニングしてｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢベクターを得た（図７）。
【００４１】
クロストリジウム・アセトブチリクムＡＴＣＣ８２４の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７及び８のプライマーを用いたＰＣＲを行うことでＰＣＲ断片を得た。前記増幅されたＰＣＲ断片（ａｄｈＥ１−ｃｔｆＡＢ遺伝子）をＳａｌＩ−ＸｍａＩにより切断し、同じ酵素に制限されたｐＹＵＣ１８発現ベクターにクローニングしてｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢを製作した（図７）。
［配列番号７］Ｐ７：５’−ｔａｃｇｃｇｔｃｇａｃａａｇｔｇｔａｔａｔｔｔａｔｇａａａｇｔｃａｃａａｃａｇ−３’
［配列番号８］Ｐ８：５’−ｔｃｃｃｃｃｃｇｇｇａｔａｃｃｇｇｃａｔｇｃａｇｔａｔｔｔｃｔｔｔｃｔａａａｃａｇｃｃａｔｇ−３’
【００４２】
《実施例３：ＡＡＤまたは／及びＣｏＡＴが導入された組換え酵母の製造》
実施例１及び実施例２において製造されたｐＹＵＣ１８、ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１及びｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢをそれぞれサッカロマイセス・セレビシエＡＴＣＣ２０８２８９菌株に導入した後、ＳＣ−Ｔｒｐ選択培地（Bacto-yeast nitrogen base without amino acids（０．６７％、Difco）、グルコース（２％、ＣＪ）、ドロップアウト混合物（０．２％、ＴＲＰＤＯ supplement、ＢＤ Bioscience）、Bacto-agar（２％、Ｄｉｆｃｏ））においてコロニーを選抜してサッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８）、サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１）、サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）菌株を製作した。
【００４３】
《実施例４：脂肪酸添加による酵母におけるブタノールの製造》
実施例３において製作された組換え酵母サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１）を培養してブタノールの製造を試みた。培養に使用された基本培地組成は、下記の通りである：Bacto-yeast nitrogen base without amino acids（０．６７％、Difco）、グルコース（２％、ＣＪ）、ウラシル（２０ｍｇ／ｌ、シグマ社）、Ｌ−ロイシン（１００ｍｇ／ｌ、シグマ社）、Ｌ−ヒスチジン（２０ｍｇ／ｌ、シグマ社）。なお、基本培地に最終濃度２．５ｇ／ｌオレイン酸と最終濃度２．５ｇ／ｌラウリン酸を添加し、ｐＨは５．７に補正した。
【００４４】
２５０ｍｌ培養フラスコに培地１００ｍｌを添加し、組換え酵母サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１）を接種し、３０℃の好気性及び嫌気性チャンバーにおいて培養した。培養後、１２時間おきにそれぞれ試料を採取してガスクロマトグラフィ（ＧＣ、アジレント社）によりブタノールを定量した。
【００４５】
その結果、下記表１に示すように、サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１）菌株だけではなく、サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８）菌株においてもブタノールが生成されたことを確認することができた。この結果から、培地に添加された脂肪酸がβ酸化を通じてブチリル−ＣｏＡを含む様々なアシル−ＣｏＡプールに転換された後、ブタノールに転換されることを確認することができた。
【００４６】
【表１】
2010517562.tif 000003
【００４７】
《実施例５：ブチレート添加による組換え酵母におけるブタノールの製造》
実施例３において製作された組換え酵母サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）を培養してブタノールの製造を試みた。培養に使用された基本培地組成は、実施例５と同様である。なお、基本培地に最終濃度４０ｍＭ酪酸を添加し、ｐＨは５．７に補正した。
【００４８】
２５０ｍｌ培養フラスコに培地１００ｍｌを添加し、組換え酵母サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）を接種し、３０℃の好気性及び嫌気性チャンバーにおいて培養した。培養後、１２時間おきにそれぞれ試料を採取してガスクロマトグラフィ（ＧＣ、アジレント社）によりブタノールを定量した。
【００４９】
その結果、下記表２に示すように、サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８）においてはブタノール産生が認められないのに対し、サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）菌株においてはブタノールが生成されたことを確認することができた。この結果から、ブチレートを培地に添加し、ＣｏＡＴが導入された菌株を培養すれば、細胞内にブチリル−ＣｏＡプールが増加し、これよりブタノールが生成されるということを確認することができた。
【００５０】
【表２】
2010517562.tif 000004
【００５１】
また、ブチレート添加培地にさらに脂肪酸を添加し、培養した後、ブタノールを定量した。その結果、下記表３に示すように、ブチレート添加培地にさらに脂肪酸を添加して培養した場合にもブタノールが生成され、組換え菌株サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）がサッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８）菌株よりも高濃度のブタノールを産生することを確認することができた。この結果から、（１）アシル−ＣｏＡシンターゼの作用により脂肪酸が分解されてブチリル−ＣｏＡが生成される代謝回路と、（２）ＣｏＡＴの作用によりブチレートがブチリル−ＣｏＡに生成される代謝回路とを併せ持つ組換え菌株サッカロマイセス・セレビシエ（ｐＹＵＣ１８．ａｄｈＥ１．ｃｔｆＡＢ）がブタノール合成にさらに有利であるということを確認することができた。なお、中間体としてのブチリル−ＣｏＡを生合成する代謝回路がブタノール産生に重要な役割を果たすということを確認することができた。
【００５２】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００５３】
以上、詳述したように、本発明は、酵母において様々な方法によりブチリル−ＣｏＡを製造した後、これを中間体としてブタノールを製造する方法を提供する効果がある。
【００５４】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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