(57)【要約】本明細書の開示は、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５番から得られるアルファ‐アミラーゼ酵素を含む組成物及び表面及び繊維を洗浄するための酵素の使用方法である。また、異なるシグナル配列を有する酵素の変異体を開示する。【選択図】図５
2010512787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図２（配列番号２）の８８から２０５２番目の残基を含む核酸配列。
【請求項２】
バシルス  リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼのシグナルペプチドをコードする核酸配列に作動的に連結する請求項１に記載の核酸配列。
【請求項３】
配列番号３（図３）の３０から６８３番目の残基を含むポリペプチドの欠損型をコードする核酸であって、前記欠損型が配列番号３の４９２、５０４、又は５０９番目の残基で終了していることを特徴とする核酸。
【請求項４】
請求項１又は３のいずれかの核酸配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項５】
前記欠損型が配列番号３（図４）の４９２、５０４、又は５０９番目の残基でのカルボキシ末端を有することを特徴とする、請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１から３のいずれかの核酸に作動的に連結するベクター。
【請求項７】
請求項１から３のいずれかの核酸を含む単離される宿主細胞。
【請求項８】
請求項６のベクターを含む単離される宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞がバシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス  レンツス（Ｂ．  ｌｅｎｔｕｓ）、  バシルス  ブレビス（Ｂ．  ｂｒｅｖｉｓ）、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  アルカロフィリス（Ｂ．  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス  コアグランス（Ｂ．  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシルス  シルクランス（Ｂ．  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシルス  ランツス（Ｂ．  ｌａｕｔｕｓ）、  バシルス  ツリンギエンシス（Ｂ．  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ストレプトミセス  リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はストレプトミセス  ムリナス（Ｓ．  ｍｕｒｉｎｕｓ）、  又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から選択される細菌であることを特徴とする、請求項８に記載の単離される宿主細胞。
【請求項１０】
非ダスティング粒状、マイクロ粒状、安定化液、ゲル、又は保護酵素のいずれかの形態を特徴とする、請求項４記載のポリペプチドを含む洗剤添加物。
【請求項１１】
前記欠損型が１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で約４９ｋＤａから約６９ｋＤａの分子量を有することを特徴とする、請求項１０記載の洗剤添加物。
【請求項１２】
前記洗剤添加物が洗剤添加物の１グラム対して約０．０２ｍｇから約２００ｍｇのポリペプチドを含有することを特徴とする、請求項１０記載の洗剤添加物。
【請求項１３】
プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、デンプン分解酵素、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される酵素をさらに含むことを特徴とする、請求項１０記載の洗剤添加物。
【請求項１４】
請求項１０から１３のいずれかの洗剤添加物を含有する洗剤組成物。
【請求項１５】
前記洗剤組成物が、一以上の界面活性剤、漂白システム又は漂白、洗剤ビルダー、ポリマー、安定剤、繊維コンディショナー、泡立ち剤、泥抑制剤、抗腐食剤、染料、香料、泥懸濁剤、曇り防止剤、蛍光増白剤、又は殺菌剤を任意的に含むことを特徴とする、請求項４又は５のいずれかのポリペプチドを含有する洗剤組成物。
【請求項１６】
プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、デンプン分解酵素、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される酵素をさらに含有することを特徴とする、請求項１５の洗剤組成物。
【請求項１７】
請求項４又は５のいずれかのポリペプチドを含有する手動又は自動食器洗浄洗剤組成物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の手動又は自動食器洗浄洗剤をそれらの必要性がある食器に適用することを含む洗浄方法。
【請求項１９】
請求項１０から１３のいずれかの洗剤添加物を含有する洗濯洗剤組成物。
【請求項２０】
請求項１２から１４のいずれかの洗剤組成物で溶液中の汚れた繊維を洗浄することを含む繊維洗浄方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書にてバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５から得られたアルファ‐アミラーゼ酵素の組成物及び使用方法を開示している。
【背景技術】
【０００２】
デンプンはアミロース（１５から３０％ｗ／ｗ）とアミロペクチン（７０から８５％ｗ／ｗ）の混合物からなる。アミロースは約６０、０００から約８００、０００からの分子量（ＭＷ）を有する直鎖アルファ‐１，４‐結合グルコースユニットからなる。アミロペクチンは２４から３０のグルコースのユニットごとにアルファ‐１、６分岐点を含む枝分かれポリマーであり、そのＭＷは１００万位である。
【０００３】
濃縮デキストロースシロップの形態のデンプン由来の糖は、現在、（１）約７から１０の平均重合度合いを有するデキストリンへアルファ‐アミラーゼで固体デンプンの液状化（又は粘度低下）（２）アミログルコシダーゼ（またグルコアミラーゼ又はＧＡと呼ばれる）で得られた液状デンプン（言い換えると、デンプン加水分解物）の糖化を含む酵素の触媒によるプロセスで生産される。得られたシロップは高いグルコース含有量を有する。商業的に生産されるグルコースシロップの多くは、後に、イソシロップで知られるデキストロース／フルクトース混合物へ酵素的に異性化される。
【０００４】
アルファ‐アミラーゼ類（ＥＣ  ３．２．１．１）は不規則に内部のアルファ‐１，４‐グルコシド結合を切断することによりデンプン、グリコーゲン、関連する多糖を加水分解する。この酵素は、例えば糖、醸造、アルコール及び繊維産業において数多くの重要な産業上の利用を有する。アルファ‐アミラーゼは、広範囲の細菌類、菌類、植物、及び動物の供給源から単離される。産業的に、多くの重要なアルファ‐アミラーゼは、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）から単離されたものである。長年、アルファ‐アミラーゼ酵素は、種々の異なる目的に用いられ、デンプンの液状化、繊維の湯通し、製紙及びパルプ産業におけるデンプンの改変、及び醸造を含む。またこれらの酵素は食器洗浄及び洗濯においてデンプン汚れを除くために用いられた。
【０００５】
配列が決定されたあるバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼは、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５番（ＢＡＡ）由来のアルファ‐アミラーゼである。それは二つの領域からなり、それは、動物アルファ‐アミラーゼに類似する触媒領域と二つのデンプン結合部位を含む領域である。Ｊ．  Ｓｕｍｉｔａｎｉ  他、  「Ｎｅｗ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ：  ｔｈｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ｎｏ．  １９５  α‐ａｍｙｌａｓｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｓｔａｒｃｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｒａｗ  ｓｔａｒｃｈ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ，」  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３５０：  ４７７−４８４  （２０００）を参照願いたい。Ｓｕｍｉｔａｎｉ  他、（２０００）において、遺伝子産物の三つの活性体が、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５番遺伝子産物が異種発現したストレプトミセス  リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）の培養上清に発見された。これらの産物は、６９ｋＤａ型、６０ｋＤａ型、５０ｋＤａ型であった。６９ｋＤａ型は完全長遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて計算した分子量と同等の分子量を有する完全サイズの成熟蛋白質のようだ。６０ｋＤａ型は、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５番の天然型酵素と同様であり、Ｃ末端に位置する二つのデンプン結合部位の間の蛋白質分解処理により発生するようだ。この型は６９ｋＤａ型と比較して、低い生デンプン結合及び分解活性を有する。５０ｋＤａ型は不溶性デンプンを結合及び分解できない。
【０００６】
アミラーゼ類は繊維処理、洗濯及び洗浄組成物、湯通し組成物、及び製パン、デンプン液化及び処理に用いられてきた。かくて、低コストで生産、コストマージンの改善、プラント容量の節約の提供、及びより高い活性産物の生産がより簡単にできるアルファ‐アミラーゼを同定する必要性が継続して存在する。
【発明の概要】
【０００７】
従って、本発明の一面は、産業界の必要性に十分取り組めるように、増量生産、低コスト生産のできるバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５由来のアルファ‐アミラーゼの開発に向けられる。これらアルファ‐アミラーゼの変異体はアルファ‐アミラーゼを用いる種々の組成物及び処理に用いることができる。
【０００８】
一つの目的は核酸の提供であって、代替的に、図２（配列番号２）に示す最適化される核酸を提供する。他の態様では、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ又はそれのポリペプチド欠損のシグナルペプチドをコードする核酸配列に作動的に連結するアルファ‐アミラーゼ遺伝子を提供する。
【０００９】
さらに他の態様は図４に記載のポリペプチドの欠損型をコードし、該欠損は４９１（例えば、任意のデンプン結合領域、及びその類似領域の後のアミノ酸４９２、４９４、５０４、５０９）番目のアミノ酸後の任意の残基に起こる、核酸を提供する。
【００１０】
さらなる態様は図４の完全長ポリペプチド又は４９１番目の残基後任意のカルボキシ末端欠損産物を提供する。
【００１１】
さらに他の実施態様は上述のポリペプチドをコードする核酸に作動的に結合するベクターを提供する。
【００１２】
さらに、他の態様はいずれかの上述の核酸を有する単離された宿主細胞又は該核酸を含むベクターを意図している。単離宿主細胞は原核細胞又は真核細胞である。単離される宿主細胞は細菌（例えば、バシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス  レンツス（Ｂ．  ｌｅｎｔｕｓ）、  バシルス  ブレビス（Ｂ．  ｂｒｅｖｉｓ）、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  アルカロフィリス（Ｂ．  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス  コアグランス（Ｂ．  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシルス  シルクランス（Ｂ．  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシルス  ランツス（Ｂ．  ｌａｕｔｕｓ）、  バシルス  ツリンギエンシス（Ｂ．  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ストレプトミセス  リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はストレプトミセス  ムリナス（Ｓ．  ｍｕｒｉｎｕｓ）、  又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【００１３】
他の態様では、本明細書に記載のポリペプチドを含有する洗剤添加物に関し、該洗剤添加物は、任意に非ダスティング粒状、マイクロ粒状、安定化液、ゲル、又は保護酵素の形態である。洗剤添加物中のポリペプチドは上述のように欠損ポリペプチドである。洗剤添加物は、洗剤添加物のグラム当たり０．０２ｍｇから２００ｍｇのポリペプチドを含む。さらに、洗剤添加物はプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、デンプン分解酵素、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される酵素を含む。
【００１４】
別の態様においては、いずれかの本明細書に記載の洗剤添加物を含有する洗剤組成物を含む。洗剤組成物は任意に一以上の界面活性剤、漂白システム又は漂白剤、洗剤ビルダー、ポリマー、安定剤、繊維コンディショナー、泡立ち剤、泥抑制剤、抗腐食剤、染料、香料、泥懸濁剤、曇り防止剤、蛍光増白剤、又は殺菌剤を含む。洗剤組成物は追加酵素を含み、又はさらに追加酵素を含むことができ、該酵素はプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、デンプン分解酵素、セルラーゼ、ポリエステラーゼ、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される酵素を含有する。
【００１５】
他の態様においては、本明細書記載のポリペプチドを含有する手動又は自動食器洗浄洗剤組成物を含む。
【００１６】
さらなる態様においては、本明細書記載の手動又は自動食器洗浄洗剤をそれらを必要とする食器又は食器類に適用することを含む食器洗浄方法を含む。食器を洗浄する方法は洗浄液が、約０．０１ｐｐｍから約４ｐｐｍの量で本明細書に記載のポリペプチドを含むような量で食器洗浄洗剤を添加することを意図する。
【００１７】
他の態様においては、本明細書記載の洗剤添加物を含有する洗濯洗剤組成物を含む。さらなる態様においては、本明細書に記載の洗剤組成物で溶液中の汚れた繊維を洗浄することを含む繊維洗浄方法を意図する。さらに、該方法は溶液中約０．０１ｐｐｍから約２ｐｐｍの溶液中の量で本明細書に記載のポリペプチドを有することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１ＡからＢは、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５アルファ‐アミラーゼ（登録第ＡＢ００６８２３号）のヌクレオチドコード配列である。Ａｍｙ１９５シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は下線部に示す。停止コドンは配列番号１の太字で示す。
【図２】図２は、コドン最適化後のバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５アルファ‐アミラーゼのヌクレオチドコード配列である。成熟Ａｍｙ１９５蛋白質をコードするヌクレオチド配列はバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ（ＬＡＴ）（配列番号２）のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列により前方に位置する。ＬＡＴシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は下線部に示す。停止コドンは太字で示す。アミノ酸コドン最適化はＧｅｎｅＡｒｔ（商標）(ＧｅｎｅＡｒｔ  ＧｍｂＨ，  Ｇｅｒｍａｎｙ)で行った。
【図３】図３はＡｍｙ１９５（配列番号３）のポリペプチド配列である。シグナル配列は１−４６（下線部）残基である。成熟Ａｍｙ１９５は４７残基で始まる。遺伝子操作による欠損型を作製するために太字かつ下線部の残基をコードするコドンは停止コドンに置き換えられた。すなわち、図３の番号を用いてＹ５１１、Ｋ５２１、及びＶ５２６が、遺伝子操作よる欠損型の最後のアミノ酸残基である。
【図４】図４はＡｍｙ１９５アミノ酸配列であってＬＡＴシグナル配列（配列番号４）を有する異種の融合蛋白質として示した。カルボキシ末端部の小文字は、ＣＢＤ‐２５ファミリーに属するデンプン結合部位を形成する。アミノ末端側の小文字（１から２９残基）はバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）から得られるアミラーゼシグナル配列を示す。大文字はサブドメインＡ、Ｂ、及びＣを含む酵素の触媒部位を示し、サブドメインＡについて約３０から１０５及び２０８から３００残基、サブドメインＢについて約１０６から２０７残基、及びサブドメインＣは３０１から４９２残基にわたると考えられる。Ｖａｌ４９２は蛋白質分解的な欠損型（図４の番号を用いる）の最終のアミノ酸残基である。サブドメインＡはポリペプチドの直線的配列上に不連続であることに注意されたい。
【図５】図５は、ｐＨＰＬＴベクターにおけるＬＡＴシグナル配列をコードする核酸及びＬＡＴターミネーター配列に連結するバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５のアルファ‐アミラーゼをコードする核酸の図である。ｐＨＰＬＴプラスミドは周知である（例えば米国特許第５，８７１，５５０号と６，５６２，６１２号及び米国特許出願広報２００６００１４２６５を参照）。ｐＨＰＬＴベクターを、９プロテアーゼ欠損  バシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株（ＵＳ２００５０２０２５３５Ａ１参照）に導入し、Ａｍｙ１９５を発現した。
【図６】図６はｐＨ及び蛋白質濃度を関数とするＡｍｙ１９５に対する性能試験の結果を示す。試験された分画は図１０においてｅ‐ｐｏｏｌと表示するものである。試験を９６穴プレート試験で行った。着色米デンプン（Ｔｅｓｔｆａｂｒｉｃｓ  Ｉｎｃ．，  ＣＳ２８  ｃｏｌｏｒｅｄ  ｒｉｃｅ  ｓｔａｒｃｈ）で汚した４分の１インチの繊維見本を各ウェルへ移した。緩衝液：２５  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ８．０又は２５  ｍＭ  ＣＡＰＳ  ｐＨ  １０．３を各ウェルへ添加した。プレートを４０℃でインキュベーションした。反応を最終濃度が０ｐｐｍから２ｐｐｍであるＡｍｙ１９５酵素の添加により開始した。プレートをエッペンドルフサーモミックス（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘ）装置で７５０ｒｐｍにて振盪しながら４０℃で１０分間インキュベーションした。このインキュベーション後、上清を新しい９６穴プレートに移し、４８８ｎｍでの吸光度をモレキュラーデバイスプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  １９０モデルにて測定した。データをＥｒｉｔｈｉｃｕｓソフトウエアからのＧＲＡＦＩＴパッケージの助けをかりてグラフにした。データの点をミカエリスメンテン式（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ  ｆｉｔｔｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）のような同様の形をとるラングミュア吸着等温式（Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｉｓｏｔｈｅｒｍ  ｆｉｔｔｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）に適応した。発現した各Ａｍｙ１９５蛋白質はＬＡＴ由来のシグナルペプチドを含むが、これは、分泌過程の間に削り取られ、成熟Ａｍｙ１９５蛋白質に存在していない。
【図７】図７は図１０に示すすべての蛋白質分解断片の性能試験の結果を示す。この試験を実施例３及び図６のｐＨ８に関する凡例に記載のように行い、グラフに表した。データをすべての分画はＯｘＡｍ（ジェネンコ  インターナショナル社  (Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．)）と同等またはそれより良い結果を示した。
【図８】図８は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを行い、遺伝子操作による欠損Ａｍｙ１９５分子の発現を示す。欠損体を図４の番号を用いてＣ末端残基４９４、５０４、及び５０９と示す。発現培養は実施例２に記載のように行い、濃度の標準としてＯｘＡｍ用いて濃度を評価した。
【図９】図９は、遺伝子操作による欠損Ａｍｙ１９５アミラーゼ変異体の性能の適用を示す。性能試験をさらなる精製をせずに、培養上清を用いて行った。試験の手法及びデータのグラフ化を実施例３及び図６のｐＨ８に関する凡例に記載する。データはすべての欠損分子がＯｘＡｍよりよいことを示す。
【図１０】図１０は、Ａｍｙ１９５蛋白質分解断片を含み、ベータ‐シクロデキストリンカラムからの分画物の分析を示す。分画を「ｗｌ」（２５  ｍＭ  ｂｉｓ‐ｔｒｉｓ  ｐｒｏｐａｎｅ，  ｐＨ  ８．５、２  ｍＭ  ＣａＣｌ２でカラムから溶出される「洗浄１」）、「ｗ２」（さらに同様の緩衝液の一部で溶出される「洗浄２」）、及び「ｅ−ｐｏｏｌ」（同様の緩衝液中５０ｍＭベータ‐シクロデキストリンで溶出される分画及びゲル上で３点の異なる濃度で処理する）によって示す。ベータ‐シクロデキストリンカラムのマトリックスをベータ‐シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ｃ４７６７）とエポキシ‐活性化‐セファロース‐６Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ＮＪ．カタログ番号１７‐０４８０‐０１）から標準手順で工場内にて合成した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本出願はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５番アルファ‐アミラーゼを含む組成物及び使用方法を提供する。また、成熟アルファ‐アミラーゼのポリペプチド配列を修飾することにより、アルファ‐アミラーゼ及び異種型を生産する方法の多様性を開示する。
【００２０】
衣類及び食器の汚れは、非常に多様な組成物を有し、また、除去するための能力も非常に多様性に富む。市場におけるアミラーゼは比較的少数しか衣類及び食器両方の適用に用いられていない。バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５から得られるアルファ‐アミラーゼは商業的に用いる任意の細菌アミラーゼと高い相同性を示していない。すなわち、ある態様では、例えば、Ｃａ２＋依存性の減少、ＬＡＳ安定の改善、ｐＨ範囲の改善、温度範囲の改善、特異的活性の増強等のような、食器及び衣類適用の増強される特徴を有する変異体を同定するために基本骨格として野生型蛋白質を用いる。
【００２１】
１．    定義及び略語
この詳細な記載において、次の略語及び定義が適用される。本明細書と添付する請求の範囲に使用している単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他の事を指し示していない限り、複数の指示対象を含む。すなわち、例えば、「酵素」（ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ）はそんな酵素の複数を含み、「用量（ｔｈｅ  ｄｏｓａｇｅ）」の意味は一以上の用量及び当業者が知っているものと等価の意味を含む。
【００２２】
別段の指示がない限り、本明細書にて用いるすべての技術及び科学用語は当業者が通常理解する同様の意味を有する。次の用語を以下に示す。
【００２３】
１．１  略語
次の略語は、定義が本明細書の範囲内で述べている内容について他に示していない限り、以下の意味を有する。
【００２４】
ＡＥ  アルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）
ＡＥＯ  アルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）
ＡＥＯＳ  アルコール  エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）  
ＡＥＳ  アルコール  エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）
Ａｍｙ１９５  バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５番由来アルファ‐アミラーゼ（α‐ａｍｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ｎｏ．  １９５）
ＡＯＳ  アルファ‐オレフィンスルホン酸塩（α‐ｏｌｅｆｉｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ）
ＡＳ  アルキル硫酸塩（ａｌｋｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）
ＣＢＤ−２５  炭水化物結合領域蛋白質ファミリー２５（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ２５）  
ｃＤＮＡ  相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ）
ＣＭＣ  カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）
ＤＮＡ  デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
ＤＴＭＰＡ  ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）
ＥＣ  酵素委員会（ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）
ＥＤＴＡ  エチレンジアミンテトラ酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）
ＥＭＰＡ  スイス連邦材料試験研究所（Ｅｉｄｇｅｎｏｓｓｉｓｃｈｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｐｒｕｆｕｎｇｓ‐  ｕｎｄ  Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓ  Ａｎｓｔａｌｔ  （Ｓｗｉｓｓ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））
ＥＯ  エチレンオキシド（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）  （ポリマーフラグメント（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔ））
Ｆ＆ＨＣ    繊維及び家庭用ケア（ｆａｂｒｉｃ  ＆  ｈｏｕｓｅｈｏｌｄ  ｃａｒｅ）
ＧＡ  グルコアミラーゼ（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）
ＩＰＴＧ  イソプリピル  ベータ‐Ｄ‐チオガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β‐Ｄ‐ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）
ｋＤａ  キロダルトン（ｋｉｌｏ  Ｄａｌｔｏｎ）
ＬＡＳ  リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）
ＬＡＴ  バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼに関する（例、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼシグナル配列又はターミネーター）
ＭＷ  分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）
ＭＷＵ  修飾ウォルゲムス単位（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈ  ｕｎｉｔ）;  ｌ．６ｘｌ０−５  ｍｇ/ＭＷＵ  =  活性単位（ｕｎｉｔ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）
ＮＯＢＳ  ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩  （ｎｏｎａｎｏｙｌｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）
ＮＴＡ  ニトリロ酢酸（ｎｉｔｒｉｌｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）
ＯｘＡｍ  プラスター（Ｐｕｒａｓｔａｒ）ＨＰＡＭ  ５０００Ｌ（ジェネンコ  インターナショナル社  (Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．)）
ＰＥＧ  ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）
ｐＩ  等電点（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｏｉｎｔ）
ＰＶＡ  ポリ（ビニル  アルコール）（ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ））
ＰＶＰ  ポリ（ビニルピロリドン）（ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ））
ＲＮＡ  リボ核酸
ＳＡＳ  アルカンスルホン酸塩（ａｌｋａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）  
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ  ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）  
ｓｐ．  種（ｓｐｅｃｉｅｓ）
ＴＡＥＤ  テトラアセチルエチレンジアミン（ｔｅｔｒａａｃｅｔｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）  
ｗ／ｖ  質量／体積（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）
ｗ／ｗ  質量／質量（ｗｅｉｇｈｔ／ｗｅｉｇｈｔ）
１．２定義
「アミラーゼ」又は「デンプン分解酵素」はグルコアミラーゼ、アルファ‐アミラーゼ、ベータ‐アミラーゼ、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びバシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の野生型アルファ‐アミラーゼのような任意のアミラーゼを含むことを意味する。「アミラーゼ」は、とくに、デンプンの分解の触媒能力を有する酵素を意味する。アミラーゼ類はデンプン中のアルファ‐Ｄ‐（１→４）Ｏ‐グリコシド結合を切断する加水分解酵素である。一般的に、アルファ‐アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１；  α‐Ｄ‐（ｌ→４）‐グルカン  グルカノヒドロラーゼ（ｇｌｕｃａｎ  ｇｌｕｃａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ））は不規則的にデンプン分子内のアルファ‐Ｄ（１→４）Ｏ‐グリコシド結合を切断するエンド作用酵素として定義される。それに対して、ベータ‐アミラーゼ（（ＥＣ  ３．２.１．２．  α‐Ｄ‐（ｌ→４）−グルカン  マルトヒドロラーゼ（ｇｌｕｃａｎ  ｍａｌｔｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ））及び麦芽アルファ‐アミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  α‐ａｍｙｌａｓｅ）（ＥＣ  ３．２．１．１３３）のようにある産物特異的アミラーゼ類のような、エキソ作用デンプン分解酵素は、基質の非還元末端からデンプン分子を切断する。ベータ‐アミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ  (ＥＣ  ３．２．１．２０;  α‐Ｄ‐グルコシド  グルコヒドロラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ)）、グルコアミラーゼ  (ＥＣ  ３．２．１．３;  α‐Ｄ‐（ｌ→４）-グルカン  グルコヒドロラーゼ（ｇｌｕｃａｎ  ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ)）、及び産物特異的アミラーゼ類はデンプンから特徴的な長さの麦芽オリゴ糖を生産する。
【００２５】
「アミラーゼ変異体」、「アルファ‐アミラーゼ変異体」、「アルファ‐アミラーゼ変異ポリペプチド」、及び「変異酵素」は、例えば、他のアルファ‐アミラーゼのシグナル配列を用いて修飾され、配列の最適化が行われたバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５番のアルファ‐アミラーゼ蛋白質を意味する。本明細書にて用いる「親酵素」、「親配列」、「親ポリペプチド」、「野生型アルファ‐アミラーゼ蛋白質」、及び「親ポリペプチド」はアルファ‐アミラーゼ変異ポリペプチドの由来先である酵素及びポリペプチドを意味する。親酵素は野生型酵素又はすでに遺伝子組み換えされているアルファ‐アミラーゼでもよい。すなわち、アルファ‐アミラーゼポリペプチドは遺伝子組み換え酵素でもある。また、アルファ‐アミラーゼ変異体は異種のアルファ‐アミラーゼポリペプチドを含む融合蛋白でもよい。例えば、アルファ‐アミラーゼ蛋白質は、別のバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼの成熟蛋白質に結合したバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ（ＬＡＴ）のシグナルペプチドを含んでもよい。「変異体」という用語は、「ミュータント」という用語と互換可能に用いてよい。変異体はポリペプチド及び核酸を含む。変異体は挿入を含み、これらの変異体は、一以上の位置で、さらに追加的な置換、挿入、トランスバージョン、欠損、及び／又はインバージョンを含む。変異体は本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリッド可能な相補的配列である配列を含む。例えば変異配列はストリンジェント条件（例えば、５０℃及び０．２ＸＳＳＣ｛１ＸＳＳＣ＝０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１５  Ｍ  Ｎａ３  ｃｉｔｒａｔｅ，  ｐＨ  ７．０｝）下、本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる相補的配列を有する。さらに用語「変異体」は、高いストリンジェント条件（例えば、６５℃及び０．１ＸＳＳＣ｛１ＸＳＳＣ＝０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１５  Ｍ  Ｎａ３  ｃｉｔｒａｔｅ，  ｐＨ  ７．０｝）下、本明細書に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる相補的配列を有する配列を含む。
【００２６】
「バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５のアルファ‐アミラーゼ」、「Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ」、又は「Ａｍｙ１９５」は図３の蛋白質をコードする核酸（図１）又は、図４の蛋白質をもコードする図２の合成核酸配列を意味する。また、任意の欠損型（言い換えると、天然的に、組み換え的に、又は合成的に、４９２番目の残基後が欠損し、シグナル配列を含まない酵素の形態、又は異種のシグナル配列及びカルボキシ末端で欠損配列を有する形態）を含む。さらに、その用語は図３の任意の誘導体配列及びアミノ酸置換、欠損、挿入、又は自然では見られないＮ−又はＣ末でのアミノ酸延長を含む下線部ＤＮＡを含む。
【００２７】
用語「単離される」は、配列が自然に結合し及び配列とともに自然に見られる少なくとも一つの他の成分が少なくとも実質的にないことを意味する。
【００２８】
用語「精製される」は、材料が相対的に純粋状態、例えば少なくとも約９０％純粋、又は少なくとも約９５％純粋、又は少なくとも約９８％純粋であることを意味する。
【００２９】
用語「熱安定性」は、高い温度にさらされた後、活性を維持するような酵素能力を意味する。酵素の熱安定性、例えば、アルファ‐アミラーゼの熱安定性はその半減期によって測定される。半減期（ｔ１／２）は、所定の条件下、酵素活性が半分になるのにかかった分、時間、日の単位で表す時間である。半減期の値は残りのアルファ‐アミラーゼ活性を測定することにより計算される。
【００３０】
用語「ｐＨ範囲」は、５からそれ以上のｐＨ単位の範囲の酸性からアルカリ性条件での触媒活性を有する酵素の能力をいう。
【００３１】
本明細書にて用いる用語「ｐＨ安定性」は、ｐＨの広い範囲に対して活性を維持する酵素能力に関する。
【００３２】
本明細書にて用いる「アミノ酸配列」は「ポリペプチド」及び／又は「蛋白質」と同義語である。ある場合は、用語「アミノ酸配列」は「ペプチド」と同義語である。ある場合は、用語「アミノ酸配列」は「酵素」と同義語である。
【００３３】
本明細書にて用いる用語「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、及び変異体、相同体、断片及びそれらの誘導体（それらの一部のような）をいう。そのヌクレオチド配列はゲノム、合成又は組み換え体由来のものでよく、センス鎖又はアンチセンス鎖を表すかどうかで、二本鎖又は一本鎖でよい。本明細書にて用いるように、その用語ヌクレオチド配列はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡを含む。
【００３４】
「相同体」は、対象のアミノ酸配列及び対象のヌクレオチド配列とある度合いの相同性を有する物を意味する。相同配列は対象配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、又は９０％相同的なアミノ酸配列、又は少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相同的なアミノ酸配列を含むと考えられる。一般的に、相同性は対象アミノ酸配列の同様の活性部位を含む。
【００３５】
本明細書にて用いる「ハイブリダイゼーション」は、核酸の一本鎖が塩基対を通して相補鎖に結合する過程及びポリメレースチェーン反応（ＰＣＲ）において増幅する過程も含む。アルファ‐アミラーゼ変異核酸配列は一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡへテロ二本鎖又はＲＮＡ／ＤＮＡコポリマーを含んでよい。
【００３６】
本明細書にて用いる「コポリマー」はリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド両方を含む一本鎖の核酸をいう。アルファ‐アミラーゼ核酸はさらに増強した発現のためにコドン最適化をされてもよい。
【００３７】
本明細書にて用いる「合成の」はインビトロで化学的又は酵素的合成によって生産されるものいう。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、及びハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）のような宿主にとって最適化コドンを使用して創られたアルファ‐アミラーゼ変異核酸を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書に用いる「形質転換細胞」は組み換えＤＮＡ技術を用いて遺伝子操作された細胞を含む。一般的に形質転換は細胞に一以上のヌクレオチド配列の挿入により起こる。挿入されたヌクレオチド配列は異種のヌクレオチド配列（言い換えると、融合蛋白質をコードする配列のような、形質転換された細胞に本来有していない配列）でもよい。
【００３９】
本明細書に用いる「作動的に連結される」とは、記載される要素が、それらが意図する態様で機能するようにする関係である。コード配列に作動的に連結する調節配列は、制御配列に適合する条件下、コード配列の発現が達成されるようにライゲートされる。
【００４０】
本明細書にて用いる「生物学的活性な」とは、自然的に発生する配列と同様な構造機能（同じ程度とは必ずしも限らない）、及び／又は同様な調節機能（同じ程度とは必ずしも限らない）、及び／又は同様な生物学的機能（同じ程度とは必ずしも限らない）を有する配列をいう。
【００４１】
２．それによってコードされる核酸及びポリペプチド
バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５番の核酸配列は、種々の宿主細胞中に発現するベクター中の種々のプロモーター及びレギュレーター作動的に連結することができる。２，１０３残基の核酸配列は、ジェンバンク登録第ＡＢ００６８２３（図１ＡからＢを参照）に開示されている。２，１０３残基の核酸配列によりコードするポリペプチド配列はジェンバンク登録第ＢＡＡ２２０８２．１に開示され、７００アミノ酸の長さである（図３）。最初から４６番目までのアミノ酸はシグナルペプチドの形をとる。切断は４６番目の残基（Ａｌａ４６）後で起こる。
【００４２】
バシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での発現の場合、ゲルによって確認される３種の蛋白質分解プロセス型がある。これらの型すべて同様のアミノ末端を有するが、カルボキシ末端は異なる。４９．５ｋＤａ型はＶａｌ４９２（図４の配列）残基で終了する。言い換えると、蛋白質分解が４９２番目の残基後で起こる。二つのより長い型、６９ｋＤａ及び６０ｋＤａはそれぞれ、Ｓｕｍｉｔａｎｉ他（２０００）に説明するように１つ及び２つのデンプン結合領域を含む。一般的にＣ末端欠損型はＣ末端残基Ｔｙｒ４９４、  Ｌｙｓ５０４、及びＶａｌ５０９を有する産物とともに創製された。これらの組み換え的に生産される欠損産物はすべて図８に示すようにＬＡＴプロモーター及びシグナル配列制御下、９プロテアーゼ欠損バシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株（参照ＵＳ２００５０２０２５３５Ａ１）中で高いレベルで発現した。
【００４３】
２．１  融合蛋白質及び組み換え蛋白質
ある態様は融合蛋白質を意図し、酵母及び細菌のような他の微生物由来のアミラーゼのシグナル配列がバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５番の成熟蛋白質へ結合させて用いられた。すなわち、図３のシグナル配列を形成する最初の４６アミノ酸は除かれ、別の微生物由来のシグナル配列又は別の微生物由来シグナル配列の変異体で交換される。例えば、ＬＡＴ配列（下線部及び小文字）を、図４で示すように、最初の４６番目のアミノ酸に置換する。
【００４４】
他の実験ではバシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中に発現するバシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アミラーゼ（ａｍｙＥ）シグナル配列、バシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター、及びバシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中に発現するシグナル配列をも含むが、これらに限定されない。さらに、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プロモーター及びＣｅｌＡ由来シグナル配列を用いてストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）中での発現を試験することを意図している。
【００４５】
３．蛋白質の生産及び精製の方法
アルファ‐アミラーゼを生産するのに適した宿主細胞として、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から培養培地に分泌される蛋白質を生産及び精製する方法がよく知られている。典型的な、アルファ‐アミラーゼを生産する方法を下記に開示する。
【００４６】
３．１  アルファ‐アミラーゼを生産する材料及び方法
本明細書にて記載される方法によって、又は周知の改良された方法によって生産されるＡｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードするＤＮＡ配列は、適切なプロモーター、オペレーター、リボゾーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意に、抑制遺伝子又は種々の活性遺伝子をコードする制御配列を一般的に含む発現ベクターを用いて、酵素の形態で発現できる。
【００４７】
例えば、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）１９５番を、Ｔ.  Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  他、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｈａｉｍ‐ｓｅｎｓｉｔｉｖｅα‐ａｍｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｎｅｗｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．１９５番」、  Ｂｉｏｓｃ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：  １７９２−１７９６  （１９９２）に記載されるように３０℃で培養する。あるいは、ベクターに作動的に連結するアルファ‐アミラーゼをコードする遺伝子を、ストレプトミセス  リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ―２４のような、別の生物にトランスフェクションし、Ｊ．  Ｓｕｍｉｔａｎｉ  他、「Ｎｅｗ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ：  ｔｈｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ｎｏ．１９５  α‐ａｍｙｌａｓｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｓｔａｒｃｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｒａｗ  ｓｔａｒｃｈ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ」Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３５０：  ４７７−４８４  （２０００）に記載の適切な条件下、培養する。
【００４８】
Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードするＤＮＡ配列を保持する組み換え発現ベクターは、便宜的に組み換えＤＮＡ手法の施される任意のベクターでよく、ベクターの選択は、しばしば、それが導入される宿主細胞で決まる。つまり、ベクターは自律的に複製するベクターでもよく、言い換えると、染色体外に存在するベクターでもよく、その複製はプラスミド、バクテリオファージ、又は染色体外因子、小染色体、又は人工染色体のような染色体複製から独立した複製であるものでもよい。あるいは、ベクターは、単離される宿主細胞に導入される場合、宿主細胞染色体に組み込まれ、及び組み込まれてしまった染色体とともに複製されるベクターでもよい。また、組み込まれる遺伝子を、促進される増幅可能な構築体の使用により、抗体選別又は必須調節遺伝子のような他の選別圧によって、又は必須代謝経路遺伝子の効果を通じて相補性によって染色体内に遺伝子の複製コピーを創製するために増幅してもよい。
【００４９】
ベクターおいて、ＤＮＡ配列は適切なプロモーター配列に作動的に連結する。プロモーターは選択された宿主細胞での転写活性を示す任意のＤＮＡ配列でよく、宿主細胞に相同のまたは異種のいずれかである蛋白質をコードする遺伝子由来でもよい。Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を方向付ける典型的なプロモーターは、特に細菌の宿主において、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトミセス  セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ    ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡ、又はｃｅｌＡプロモーター、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）麦芽アミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ）遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アルファ‐アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、バシルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター等である。菌における転写のために、有用なプロモーターの例は、アスペルギルス  オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール  ミエヘイ(Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ)、アスパラ銀酸プロティナーゼ、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アルファ‐アミラーゼ、アスペルギルス  ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）酸安定アルファ‐アミラーゼ、アスペルギルス  ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、リゾムコール  ミエヘイ(Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ)リパーゼ、アスペルギルス  オリザエ（Ａ．  ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス  オリザエ（Ａ．  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ又はアスペルギルス  ニドゥラン（Ａ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセタミダーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターである。アルファ‐アミラーゼ変異ポリペプチドをコードする遺伝子が大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のような細菌類に発現する場合、適切なプロモーターは、例えば、Ｔ７プロモーターを含むバクテリオファージプロモーター及びファージラムダプロモーターから選択される。酵母菌で発現のために適したプロモーターの例は、サッカロミセス  セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧａｌ１及びＧａｌ１０プロモーター、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸｌ又はＡＯＸ２プロモーターを含むが、これらに限定されない。トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）における発現のために、ＣＢＨＩＩ（セロビオヒドロラーゼ  ＩＩ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ＩＩ））プロモーターを用いてよい。
【００５０】
発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター及び、真核生物において、Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体をコードするＤＮＡ配列に作動的に連結するポリアデニル化配列を含んでもよい。ターミネーション及びポリアデニル化配列はプロモーターとして同じ供給源から適切に由来してもよい。
【００５１】
さらに、ベクターは宿主細胞でベクターが複製可能なＤＮＡ配列でもよい。そのような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、及びｐＩＪ７０２の複製の原型である。
【００５２】
ベクターは、選択マーカーを含んでもよい。例えば、バシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来ｄａｌ遺伝子のような、単離される宿主細胞中の欠点を補完する遺伝子産物、又は例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、又はテトラサイクリン耐性のような抗生物質耐性を有する遺伝子である。さらに、ベクターは、ハイグロマイシン耐性を増加するマーカーで、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ、及びｘｘｓＣのようなアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）選択マーカーを含んでよく、選択は、周知の技術のような同時形質転換によって行われてよい。例えば、国際ＰＣＴ出願ＷＯ  ９１／１７２４３を参照願いたい。
【００５３】
細胞外発現又は固形発酵は、例えば、ある細菌又は菌類を宿主細胞として用いる場合、ある点では有利であるので、本発明のある態様においては、培地へのＡｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の発現を意図している。一般的にアルファ‐アミラーゼは培地への分泌を可能とするアミノ末端シグナルペプチドを含む。必要ならば、このシグナルペプチドを、個別のシグナルポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の置換によって便利に行われる異なる配列により置換してもよい。アルファ‐アミラーゼのシグナル配列は、３つの領域、Ｎ‐末端領域、Ｈ‐領域、及びＣ‐末端領域及び通常１８から３５残基の範囲の長さであって、しかし、Ａｍｙ１９５シグナル配列に示されるより長いものとして通常特徴づけられる。
【００５４】
発現ベクターは、例えば、選択宿主生物中ベクターの自律複製を可能とする要素、及び選択目的に対して表現的に検出可能な一以上のマーカーのようなクローニングベクターの組成物を一般的に含む。発現ベクターは通常プロモーター、オペレーター、リボゾーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意的に、抑制遺伝子又は一以上の活性化遺伝子のような、ヌクレオチド制御配列を通常含む。加えて、発現ベクターは、アルファ‐アミラーゼ変異体がペルオキシソームのような宿主細胞オルガネラ又は特定の宿主細胞の部分を標的できるアミノ酸配列をコードする配列を含んでもよい。そのような標的配列は、ＳＫＬ配列を含むが、これに限定されない。制御配列の支持の下、発現のために、アルファ‐アミラーゼ変異体の核酸配列は、発現に関して、適切な方法で制御配列に作動的に連結する。典型的なベクターの一部を図５に示す。
【００５５】
アルファ‐アミラーゼ変異体、プロモーター、ターミネーター、及び他の必要な要素をそれぞれコードするＤＮＡ構築体をライゲーションし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するために用いる方法は当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、  ２ｎｄ  ｅｄ．,  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８９、  ａｎｄ  ３ｒｄ  ｅｄ．，２００１を参照）。
【００５６】
ＤＮＡ構築体又は発現ベクターのいずれかを含む単離される細胞は、Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体組み換えの生産における宿主細胞として有効に用いられる。宿主染色体にＤＮＡ構築体（一以上のコピー）を都合よく組み込むことにより、細胞は酵素をコードするＤＮＡ構築体で形質転換される。ＤＮＡ配列が細胞で安定的に維持される可能性が高い場合、この組み込みは有効であると一般的に考えられる。宿主染色体へのＤＮＡ構築体の組み込みは、例えば、相同の又は異種の組み換えによる、従来の方法により行われる。あるいは、細胞は、宿主細胞の異なる型では上述のように発現ベクターで形質転換されてもよい。
【００５７】
適切な細菌宿主生物の例は、バシルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス  レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バシルス  ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  アルカロフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス  コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）バシルス  ランツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バシルス  メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、及び  バシルス  ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を含むバシラス属（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）;  ストレプトミセス  ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）のようなストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）;ラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）のようなラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）ラクトバシルス  ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）を含むラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ.）;リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐｐ.）;  ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）を含む乳酸菌属;及びストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）のようなグラム陽性細菌種である。あるいは、グラム陰性菌種の菌は大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）を含むエンテロバクテリア科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）又はシュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）に属する。  
適切な酵母宿主生物は、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ.）ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐ.）、又はクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィニア（Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ）、シゾサッカロミセス種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）又はサッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含むサッカロミセスの種または、例えばシゾサッカロミセスポンベ（Ｓ．  ｐｏｍｂｅ）種のようなシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する種のようなバイオテクノロジー的に関係のある酵母の種から選択されてよいが、これらに限定されない。メタノール資化酵母である、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の菌株を宿主生物として用いてよい。あるいは、宿主生物は、ハンセヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）でもよい。糸状菌の間で適切な宿主生物は、例えば、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス  オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス  ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス  アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、又はアスペルギルス  ニドゥラン（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）のようなアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の宿主細胞を含む。あるいは、例えばフザリウム  オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のようなフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種  の菌株又はリゾムコール  ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）  のようなリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）種の菌株が宿主生物として用いられる。他の適切な菌株はテルモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）及びムコール（Ｍｕｃｏｒ）を含む。さらにトリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）も宿主として使用可能である。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞の形質転換にかかる適切な方法は、例えば、ＥＰ２３８０２３の記載を含む。
【００５８】
さらなる態様において、Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を生産する方法は、酵素の生産をもたらす条件下、上述のように、宿主細胞を培養する方法と細胞及び／又は培養培地から酵素を回収する方法を含んでいる。
【００５９】
細胞を培養のために用いる培地は、Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の発現が得られ、問題となる宿主細胞の成長に適した任意の従来の培地でよい。適切な培地及び培地成分は業者から入手可能であり、又は出版された手順（例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログに記載された手順）に従って調製してもよい。
【００６０】
ある態様においては、宿主細胞から分泌される酵素は全培養液調製において用いることができる。本発明の方法において、組み換え微生物の使用済み全発酵培地の調製は、アルファ‐アミラーゼの発現をもたらす周知のいずれかの培養方法を用いて行われる。それ故、アミラーゼを発現及び単離させる条件下で適切な培地で行う実験用又は産業用発酵槽において、発酵は、振盪フラスコでの培養、小さい又は大きいスケールでの発酵（連続的、バッチ、流加バッチ、又は固形発酵を含む）を含むものとして理解される。「使用済み全発酵培地」なる用語は、本明細書では、培養培地、細胞外蛋白質（例えば、酵素）、及び細胞バイオマスを含む発酵原料の未分画の内容物を指す。また、用語「使用済み全発酵培地」は、周知の方法を用いて溶解され、又は透過された細胞バイオマスを含む。
【００６１】
宿主細胞から分泌される酵素は周知の方法により、培養培地から便利に回収されてよく、遠心分離又はろ過によって培地から細胞を分離すること、及び硫酸アンモニウムのような塩を用いて培地の蛋白質成分を沈殿させ、引き続き、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、又はそれと類似のようなクロマトグラフィーの方法を用いて分離することを含む。
【００６２】
ある態様においては、ベクター中のポリヌクレオチドは、宿主細胞（言い換えると、ベクターが発現ベクターである）によってコード配列の発現をすることができる制御配列に作動的に連結することが意図される。制御配列は、例えば、さらに制御配列によって決定される転写レベルが転写調節物質に一層反応するように転写調節要素の追加によって修飾されてよい。制御配列は特にプロモーターを含んでよい。
【００６３】
宿主細胞を、Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を発現させる適切な条件下にて培養してよい。酵素の発現は、酵素が連続的に生産されるように、又は発現開始のため刺激を誘導するように構成してもよい。誘導発現の場合、例えば、蛋白質の生産は、デキサメタゾン又はＩＰＴＧ又はセファロースのような誘導物質が、培養培地へ添加されることによって要求されるとき、開始される。また、ポリペプチドを、ＴｎＴ（商標）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））ウサギ網赤血球システムのようなインビトロ、無細胞システムで組み換え的に生産できる。
【００６４】
また、Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を発現する宿主を好気状態の下、宿主に適切な培地で培養する。振盪及び攪拌と給気の組み合わせを、例えば、約２５℃から約７５℃（例、３０℃から４５℃）のような宿主の必要とする条件及び所望のアルファ‐アミラーゼ変異体の生産に応じた宿主の適切な温度で生産が得られるように、提供する。培養は、約１２から約１００時間またはそれ以上（及び例えば２４から７２時間の間の任意の時間）で行う。典型的に、培養培地は、アルファ‐アミラーゼ変異体の生産に関与する宿主の必要とする培養条件により、ｐＨ約５．５から約８．０とする。
【００６５】
３．２  蛋白質精製の材料及び方法
発酵、分離、及び濃縮方法は周知であり、従来方法を用いて溶液含有濃縮Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を調製する。
【００６６】
発酵後、発酵培地を得て、原発酵材料残渣を含む微生物細胞及び種々の懸濁した固体物は、従来の分離方法によって除かれ、アミラーゼ溶液を得る。ろ過、遠心分離、マイクロろ過、回転式ドラム真空ろ過、限外ろ過、遠心分離に引き続き限外ろ過、抽出、又はクロマトグラフィー、又は同類の方法が、一般的に用いられる。
【００６７】
回収の最適化を図るために溶液を含むＡｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を濃縮することが望ましい。非濃縮溶液を使用すると、精製酵素の沈殿を集めるためにインキュベーション時間の増加が必要となる。
【００６８】
所望の酵素レベルが得られるまで、酵素を含む溶液を従来の濃縮方法を用いて濃縮する。酵素含有溶液の濃縮は本明細書に記載される任意の方法により行うことができる。精製の典型的な方法は回転式真空ろ過及び／又は限外ろ過を含むがこれらに限定されない。
【００６９】
濃縮Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体含有溶液の酵素活性が少なくとも約４ｇ／Ｌ（例えば、少なくとも約４．８ｇ／Ｌ、又は少なくとも約５．６ｇ／Ｌ又はそれ以上）になるまで酵素溶液は濃縮酵素溶液に濃縮される。これらの濃度は、ある実施態様では、約２５ｇ／Ｌまで増加することができる。
【００７０】
精製の目的において、「沈殿剤」は、濃縮酵素溶液からＡｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を、自然の形は結晶、非結晶、これらの両者の混合のいずれでもよい固体形態で沈殿するために効果的な化合物を意味する。
【００７１】
沈殿は例えば、金属ハロゲン沈殿剤を用いて行われる。金属ハロゲン沈殿剤はアルカリ金属塩化物、アルカリ金属臭化物、及び二以上のこれらの金属ハロゲン化物の混合を含むがこれらに限定されない。典型的な金属ハロゲン化物は塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、及び二以上のこれらの金属ハロゲン化物の混合を含む。金属ハロゲン沈殿剤である、塩化ナトリウムは保存料としても用いられる。
【００７２】
金属ハロゲン沈殿剤はＡｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を沈殿するために効果的な量を用いる。少なくとも、効果的な量及び酵素の沈殿をさせるのに効果的な金属ハロゲン化物の最適量の選択も、インキュベーション時間、ｐＨ、温度、及び酵素の濃度を含む最大量の回収のための沈殿条件も、通常の試験後、当業者にとって容易に明らかである。
【００７３】
一般的に金属ハロゲン化物の少なくとも約５％ｗ／ｖ（重量／体積）から約２５％ｗ／ｖが濃縮酵素溶液に添加され、通常少なくとも８％ｗ／ｖである。一般的に、約２５％ｗ／ｖ以下の金属ハロゲン化物が濃縮酵素溶液に添加され、普通約２０％ｗ／ｖ以下である。金属ハロゲン沈殿剤の最適濃度は他の間では特定のＡｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ変異体の性質及び濃縮酵素溶液におけるその濃度によって決まる。
【００７４】
酵素の沈殿を行う別の代替方法は有機化合物を用いることである。典型的な有機化合物沈殿剤は４‐ヒドロキシ安息香酸、４‐ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、４‐ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、及び二以上のこれらの有機化合物の混合を含む。前記有機化合物沈殿剤の添加は、金属ハロゲン沈殿剤の添加、及び有機化合物及び金属ハロゲン化物の両者の沈殿剤の添加の前に、同時に、又は続いて行うことが可能であり、それは、連続、又は同時に行われてもよい。
【００７５】
さらなる記載は、例えば、米国特許第５、２８１、５２６を参照願いたい。一般的に、有機沈殿剤は、４‐ヒドロキシ安息香酸のナトリウム又はカリウム塩、及び４‐ヒドロキシ安息香酸の直鎖、分岐鎖のようなアルキルエステルであって、ここでアルキル基は１から１２の炭素原子を含み、二以上のこれらの有機化合物の混合のような４‐ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩からなる群から選択される。例えば、有機化合物沈殿剤は、４‐ヒドロキシ安息香酸の直鎖、分岐鎖アルキルエステルであり、ここで、典型的な有機化合物は４‐ヒドロキシ安息香酸の直鎖アルキルエスエルであって、ここでアルキル基は１から６炭素原子を含み、及び二以上のこれらの有機化合物の混合でもよい。４‐ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル、４‐ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル、４‐ヒドロキシ安息香酸のブチルエステル、４‐ヒドロキシ安息香酸のエチルエステル、及び二以上のこれらの有機化合物の混合もまた用いることができる。またさらなる有機化合物は４‐ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル（メチルパラベン（ｍｅｔｈｙｌＰＡＲＡＢＥＮ）と名づける）、４‐ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル（プロピルパラベン（ｐｒｏｐｙｌＰＡＲＡＢＥＮ）と名づける）を含むがこれらに限定されない。この両者はアミラーゼ保存剤でもある。
【００７６】
有機化合物沈殿剤の添加によって、ｐＨ、温度、Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の濃縮、沈殿剤の濃度、及びインキュベーション時間に関する沈殿条件に対して高い柔軟性という有益性をもたらす。
【００７７】
有機化合物沈殿剤は金属ハロゲン沈殿剤の手段により酵素の沈殿を改善するのに効果的な量を用いる。有機化合物沈殿剤の少なくとも効果的な量及び最適量の選択も、インキュベーション時間、ｐＨ、温度、及び酵素の量を含む最大回収のための沈殿条件の選択も、規定の試験後、本発明の開示の点から、当業者に容易に明らかとなる。
【００７８】
一般的に少なくとも約０．０１％ｗ／ｖの有機化合物沈殿剤が濃縮酵素の種々の溶液に加えられ、通常少なくとも約０．０２％ｗ／ｖである。一般的に、約０．３％ｗ／ｖ以下の有機化合物沈殿剤が濃縮酵素の種々の溶液に加えられ、通常約０．２％ｗ／ｖ以下である。
【００７９】
濃縮酵素溶液は、金属ハロゲン沈殿剤及び有機化合物沈殿剤を含有し、精製すべき酵素に応じて、必要があれば、ｐＨを調製してもよい。一般的にｐＨはアミラーゼの等電点に近いレベルに調整する。ｐＨは、等電点（ｐＩ）から約２．５ｐＨ下から等電点の上２．５ｐＨまでの範囲のｐＨに調整する。
【００８０】
精製酵素を得るために必要なインキュベーション時間は、特定の酵素の性質、酵素濃度、及び特定の沈殿剤とその濃度によって決まる。一般的に酵素を沈殿するのに効果的な時間は約１時間から３０時間の間である。通常、約２５時間を超えない。有機化合物沈殿剤存在下、インキュベーション時間は、約１０時間以下に減少し、多くの場合は約６時間である。
【００８１】
一般的に、インキュベーションの間の温度は約４℃から約５０℃の間である。通常、その方法は、約１０℃と４５℃（例えば、約２０℃と約４０℃の間）の間の室温で行う。沈殿を誘発する最適温度は溶液条件、酵素又は用いた沈殿剤に応じて変化する。精製酵素沈殿の全量回収、及び実施過程での効率は酵素、添加金属ハロゲン化物及び添加有機化合物含有溶液を攪拌によって改善される。攪拌工程は金属ハロゲン化物と有機化合物両方の添加の間及びその後のインキュベーションの間に行われる。適切な攪拌方法は機械的な攪拌、振盪、激しい給気、又は任意の同様な方法を含む。
【００８２】
インキュベーション期間を終えて、精製酵素を、解離色素と他の不純物から分離され、ろ過、遠心分離、マイクロろ過、回転式ドラム真空ろ過、限外ろ過、加圧ろ過、クロスメンブラン（ｃｒｏｓｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）マイクロろ過、クロスフロー（ｃｒｏｓｓ  ｆｌｏｗ）マイクロろ過、又は同様のもののような、従来の分離方法により集める。さらに、精製酵素沈殿物の精製は水で沈殿物を洗浄することで得られる。例えば、精製酵素沈殿物を金属ハロゲン沈殿剤含有水で、又は金属ハロゲン及び有機化合物沈殿剤含有水で洗浄する。
【００８３】
発酵の間Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は培養培地に蓄積する。所望のアルファ‐アミラーゼ変異体の単離及び精製のために培養培地は細胞を除くために、遠心分離又はろ過され、得られた細胞のない溶液は酵素精製のために用いる。ある実施態様おいては、細胞のない溶液で約７０％飽和硫酸アンモニウムを用いる塩析を行う。それから、７０％飽和沈殿分画を緩衝液に溶解し、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ)Ｇ−１００カラムのようなカラムにて処理し、酵素活性分画を回収するために溶出する。さらに、精製のために、イオン交換クロマトグラフィーのような都合のよい方法が採られてよい。
【００８４】
精製酵素は洗濯及び洗浄への適用に有用である。例えば、洗濯洗剤及び染み取り剤として用いられる。それらは、液体（液状、スラリー）又は固体（粒状、粉状）である最終製品に用いられてよい。
【００８５】
より特定の精製例はＪ．  Ｓｕｍｉｔａｎｉ他、「Ｎｅｗ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ:  ｔｈｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  of  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.  ｎｏ．１９５  α‐  ａｍｙｌａｓｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｓｔａｒｃｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｒａｗ  ｓｔａｒｃｈ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ，」  Ｂｉｏｃｈｅｍ.  Ｊ.  ３５０：  ４７７‐４８４  （２０００）に記載され、ここに手短にまとめる。４リットルのストレプトミセス  リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４培養上清液からえられる酵素を８０％飽和硫酸アンモニウムで処理した。その沈殿物を１０，０００ｘｇ（２０分及び４℃）で遠心分離により回収し、５ｍＭＣａＣl2含有２０ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて再溶解した。それから、該溶解沈殿物を同じ緩衝液で透析した。それから、透析サンプルをすでに５ｍＭＣａＣl2含有２０ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化しているセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ‐２００カラムに投入し、同じ緩衝液で７ｃｍ／ｈｒの直線速度で溶出した。カラムからの分画物を集め、酵素試験及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判断されるように活性を評価した。さらに蛋白質を次のように精製した。トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）ＨＷ５５カラム(Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  ＰＡ；カタログ番号１９８１２)を５ｍＭＣａＣl2及び１．５Ｍ硫酸アンモニウム含有２０ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した。酵素を、５ｍＭＣａＣl2含有２０ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１．５Ｍから０Ｍ硫酸アンモニウムの直線勾配で溶出した。活性分画を集め、酵素を８０％飽和硫酸アンモニウムで沈殿した。沈殿物を回収し、再溶解し、上述のように透析した。透析サンプルをすでに５ｍＭＣａＣl2含有２０ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＭｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ；カタログ番号１７‐５１６７‐０１）で６０ｍＬ／ｈｒの流速で投入した。活性分画を集め、１．５Ｍ硫酸アンモニウム溶液に加えた。活性酵素分画をトヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）ＨＷ５５カラムにて再びクロマトグラフィーにかけ、従来通り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定するように均一酵素の収率を決定する。方法と多様な方法の一般的な検討のためにＪ．  Ｓｕｍｉｔａｎｉ他、「Ｎｅｗ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ:  ｔｈｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  of  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.  ｎｏ．１９５  α‐  ａｍｙｌａｓｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｓｔａｒｃｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｒａｗ  ｓｔａｒｃｈ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ，」  Ｂｉｏｃｈｅｍ.  Ｊ.  ３５０：  ４７７‐４８４  （２０００）を参照願いたい。
【００８６】
生産規模の回収のために、酵素をポリマーで凝集し、細胞を除去して、一般的に上述のように部分的に精製してもよい。あるいは、酵素を入手可能な膜及び装置を用いて限外ろ過によって濃縮させて、マイクロろ過により精製してもよい。しかしながら、ある実施態様において、酵素は精製の必要がなく、さらなる処理をせずに培養培地全体を溶解し、用いることができる。例えば、酵素は、それから粒子形態に処理されることも可能である。
【００８７】
４．洗浄組成物
Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は多様な産業上の利用に適する価値ある特徴を有している。これらの酵素は洗浄、食器洗浄、及び固い表面の洗浄組成物の成分として用いることができる。洗剤添加物の一部として、洗剤組成物の一部として、自動又は手動食器洗浄組成物の一部として、及びその類似物として、それらは製剤設計される。Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は、洗剤中、従来の使用濃度で含まれてよい。本発明においてアルファ‐アミラーゼは０．００００１から１ｍｇ（純粋酵素蛋白質として計算）に相当する量で添加されてよいと考えられる。典型的製剤処方を本明細書にて提供する。
【００８８】
４．１洗濯洗浄組成物
従って、Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は、酵素のみで又は他のでんぷん分解酵素を含有する他の酵素と共に一般的な洗剤組成物の成分としてよい。そのような場合、非ダスティング粒子、安定化液体、又は保護された酵素の形態での洗浄組成物を含んでもよい。非ダスティング粒子は例えば米国特許第４，１０６，９９１、及び４，６６１，４５２に記載されるように生産されてよく、任意的に周知の方法で表面を覆ってもよい。ワックスのコーティング原料の例は、平均分子量１、０００から２０、０００であるポリ（エチレンオキシド）産物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６から５０のエチレンオキシドの単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、１２から２０炭素原子及び１５から８０のエチレンオキシド単位を含有するアルコールであるエトキシ化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、モノ、ジ、トリグリセリドの脂肪酸である。流動層技術による適用に有用なフィルムコーティング材料の例は、例えばＧＢ  １４８３５９１に記載される。例えば、液体酵素の調製は、確立した方法に従って、プロピレングリコールのようなポリオール、糖、糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することにより安定化される。他の酵素の安定化剤は周知の技術である。保護酵素を例えばＥＰ２３８、２１６に記載される方法に従って調製してよい。ポリオールは蛋白質の安定化剤としても、蛋白質溶解性の改善としても長い間認められている。例えば、Ｊ．  Ｋ．  Ｋａｕｓｈｉｋ他、「Ｗｈｙ  ｉｓ  ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ａｎ  ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ?」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：  ２６４５８−６５  （２００３）及び  そこに引用されている文献Ｍｏｎｉｃａ  Ｃｏｎｔｉ他、「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ：  ｔｈｅ  ｐｒｏｂｌｅｍ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ」、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  ７５７：  ２３７−２４５  （１９９７）を参照願いたい。
【００８９】
洗剤組成物は例えば、粉体、粒体、ペースト、又は液体として、いずれかの有用な形態でよい。一般的に、液体洗剤は、最大約７０％の水及び０％から約３０％の有機溶剤を含有する液体でよい。また、約３０％の水のみを含むコンパクトゲルタイプの形態でもよい。
【００９０】
洗剤組成物は一以上のそれぞれ陰イオン、非イオン、陽イオン、両性イオンである界面活性剤を含む。洗剤は、通常、リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＬＡＳ）、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩（α‐ｏｌｅｆｉｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＡＯＳ）、アルキル硫酸塩（ａｌｋｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）(脂肪アルコール硫酸塩（ｆａｔｔｙ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）)（ＡＳ）、アルコール  エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（ＡＥＯＳ又はＡＥＳ）第二級アルカンスルホネート（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｌｋａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅｓ）（ＳＡＳ）、アルファ‐スルホ脂肪酸メチルエステル（α‐ｓｕｌｆｏ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ、アルキル‐又はアルケニルコハク酸（ａｌｋｙｌ‐  ｏｒ  ａｌｋｅｎｙｌｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）又は石鹸のような０％から５０％の陰イオン界面活性剤を含む。また、組成物は、アルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）  （ＡＥＯ又はＡＥ）、カルボキシル化アルコール  エトキシレート（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｓ）、ノニルフェノールエトキシレート（ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、アルキルポリグリコシド（ａｌｋｙｌｐｏｌｙｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）,  アルキルジメチルアミンオキシド（ａｌｋｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｏｘｉｄｅ）、  エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、脂肪酸モノエタノールアミド（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ  ａｌｋｙｌ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ａｍｉｄｅ）  (例えばＷＯ  ９２／０６１５４に記載されるように)のような０％から約４０％の非イオン界面活性剤を含んでもよい。
【００９１】
さらに、洗剤組成物は、リパーゼ、他のデンプン分解酵素、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、及び／又は任意の組み合わせのラッカーゼのような一以上の酵素を含んでもよい。
【００９２】
洗剤は約１％から約６５％の洗剤ビルダー又はゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＭＰＡ）、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（ｌａｙｅｒｅｄ  ｓｉｌｉｃａｔｅｓ）（例えば、ヘキストからＳＫＳ−６）のような錯化剤を含んでよい。また、洗剤は、アンビルト（ｕｎｂｕｉｌｔ）でもよい。言い換えると、本質的に洗剤ビルダーがなくてもよい。酵素は酵素の安定性に適合する任意の組成物を用いてよい。一般的に、酵素は、カプセル化という周知の形態によって有害な成分から保護される。例えば、ハイドロゲルでの粒状化及び封入である。酵素及びＡｍｙ１９５分子のような特定のアルファ‐アミラーゼは、デンプン結合領域を有する又は無い、いずれかの状態で洗濯及び食器洗浄利用としてもよく、表面洗浄剤を含む多様な組成物でも用いられるし、デンプン又はバイオマスからのエタノール産物のための組成物でも用いられる。
【００９３】
洗剤は一以上のポリマーを含んでよい。例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ），ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニル  アルコール）（ＰＶＡ）、ポリアクリレート、マレイン／アクリル酸コポリマー、及びラウリルメタアクリレート／アクリル酸コポリマーのようなポリカルボン酸塩を含む。
【００９４】
洗剤は漂白システムを含んでよく、それは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）のような過酸形成漂白活性化剤と結合する過ホウ酸塩、過炭酸塩のようなＨ２Ｏ２供給源を含む。あるいは、漂白システムはペルオキシ酸（例えば、アミド、イミド、又はスルホン型ペルオキシ酸）を含んでよい。また、漂白システムは、国際ＰＣＴ出願ＷＯ  ２００５／０５６７８３に記載されるような、例えば、ペルヒドロラーゼの酵素的漂白システムでもよい。
【００９５】
洗剤組成物の酵素は、例えば、プロピレングリコール又はグリセロールのようなポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸又は例えば、芳香族ホウ酸エステルのようなホウ酸誘導体のような従来の安定化剤を用いて安定化されてよく、組成物が例えばＷＯ  ９２／１９７０９及びＷＯ  ９２／１９７０８に記載のように製剤設計されてもよい。
【００９６】
また、洗剤は、泥、発泡剤、泥抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、抗汚染剤、染料、抗菌剤、曇り防止剤、蛍光増白剤、又は香料を含む例えば繊維コンディショナーのような他の従来の洗剤成分を含んでもよい。
【００９７】
ｐＨ（用いる濃度での水溶液で測定）は通常中性又はｐＨ約７．０から約１１．０のアルカリ性である。
【００９８】
Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体含有洗剤組成物の特定の形態は次を含むように製剤設計される。
【００９９】
１）    約７％から約１２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１％から約４％のアルコール  エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１８アルコール、１−２エチレンオキシド（ＥＯ））、又はアルキル硫酸塩（ａｌｋｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ１６−１８）、約５％から約９％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１４−１５アルコール、７ＥＯ）、約１４％から約２０％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約２から約６％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ,  ２ＳｉＯ２）、約１５％から約２２％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、０％から約６％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、０％から約１５％のクエン酸ナトリウム／クエン酸（例、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）、約１１％から約１８％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）、約２％から約６％のＴＡＥＤ、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０−３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の蛋白質の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、泥抑制剤、香料、蛍光増白剤、光退色）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。
【０１００】
２）    約６％から約１１％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１％から約３％のアルコール  エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１８アルコール、１−２ＥＯ）、又はアルキル硫酸塩（ａｌｋｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ１６−１８）、約５％から約９％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１４−１５アルコール、７ＥＯ）、約１５％から約２１％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約１％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ,  ２ＳｉＯ２）、約２４％から約３４％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約４％から約１０％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、０％から約１５％のクエン酸ナトリウム／クエン酸（例、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、１−６％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の蛋白質の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、泥抑制剤、香料、）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗浄組成物。
【０１０１】
３）    約５％から約９％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約７％から約１４％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ）、約１から約３％脂肪酸（例、Ｃ１６−２２脂肪酸）としての石鹸、約１０％から約１７％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約３％から約９％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ,  ２ＳｉＯ２）、約２３％から約３３％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、０％から約４％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約８％から約１６％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）、約２％から約８％のＴＡＥＤ、０％から約１％のホスホン酸塩（例、ＥＤＴＭＰＡ）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０−３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の蛋白質の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、泥抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。
【０１０２】
４）    約８％から約１２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１０％から約２５％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ）、約１４％から約２２％の炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）、約１％から約５％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ,  ２ＳｉＯ２）、約２５％から約３５％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、０％から約１０％の硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、１−３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、泥抑制剤、香料）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。
【０１０３】
５）    約１５％から約２１％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１２％から約１８％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）、約３％から約１３％脂肪酸（例、オレイン酸）としての石鹸、０％から約１３％のアルケニルコハク酸（ａｌｋｅｎｙｌｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｃ１２−１４）、約８％から約１８％のアミノエタノール、約２％から約８％のクエン酸、０％から約３％のホスホン酸塩、０から約３％のポリマー（例、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０から約２％のホウ酸塩（Ｂ４Ｏ７）、０から約３％のエタノール、約８％から約１４％のプロピレングリコール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、分散剤、泥抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。
【０１０４】
６）    約１５％から約２１％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、３−９％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）、約３％から約１０％脂肪酸（例、オレイン酸）としての石鹸、約１４％から約２２％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約９％から約１８％のクエン酸カリウム、０から約２％のホウ酸塩（Ｂ４Ｏ７）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０から約３％のポリマー（例、ＰＶＰ、ＰＥＧ）、０から約３％の例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー；モル比２５：１、分子量３８００のような固着用ポリマー、０％から約５％のグリセロール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、分散剤、泥抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む液体洗剤組成物を製剤設計する水溶液。
【０１０５】
７）    約５％から約１０％の脂肪アルコール硫酸塩、約３％から約９％のエトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、０−３％脂肪酸としての石鹸、約５％から約１０％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約１％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ,  ２ＳｉＯ２）、約２０％から約４０％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約２％から約８％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約１２％から約１８％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）、約２％から約７％のＴＡＥＤ、約１％から約５％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、蛍光増白剤、泥抑制剤、香料）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。
【０１０６】
８）    約８％から約１４％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約５％から約１１％のエトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ）、０％から約３％脂肪酸としての石鹸、約４％から約１０％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約１％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ,  ２ＳｉＯ２）、約３０％から約５０％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約３％から約１１％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約５％から約１２％のクエン酸ナトリウム（例、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）、約１％から約５％のポリマー（例、ＰＶＰ、マレイン／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、泥抑制剤、香料）を含む粒子として製剤設計される洗剤組成物。
【０１０７】
９）    約６％から約１２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約１％から約４％の非イオン界面活性剤、約２％から約６％脂肪酸としての石鹸、約１４％から約２２％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約１８％から約３２％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約５％から約２０％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約３％から約８％のクエン酸ナトリウム（例、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）、約４％から約９％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）、約１％から約５％の漂白活性剤（例、ＮＯＢＳ又はＴＡＥＤ）、０％から約２％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、約１％から約５％のポリマー（例、ポリカルボン酸塩、ＰＥＧ）、  ０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、蛍光増白剤、香料）を含む粒子として製剤設計される洗剤組成物。
【０１０８】
１０）  約１５％から約２３％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、約８％から約１５％のアルコール  エトキシ硫酸塩（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、２−３ＥＯ）、約３％から約９％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）、０％から約３％脂肪酸（例、ラウリン酸）としての石鹸、約１％から約５％のアミノエタノール、約５％から約１０％のクエン酸ナトリウム、約２％から約６％のハイドロトロープ（ｈｙｄｒｏｔｒｏｐｅ）（例トルエンスルホン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｔｏｌｕｅｎｓｕｌｆｏｎａｔｅ））、０から約２％のホウ酸塩（Ｂ４Ｏ７）、０％から約１％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、約１％から約３％のエタノール、約２％から約５％のプロピレングリコール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、ポリマー、分散剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。
【０１０９】
１１）  約２０％から約３２％のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（酸として計算）、６−１２％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）（例えば、Ｃ１２−１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２−１５アルコール、５ＥＯ）、約２％から約６％のアミノエタノール、約８％から約１４％のクエン酸、約１％から約３％のホウ酸塩（Ｂ４Ｏ７）、０％から約３％のポリマー（例、マレイン／アクリル酸コポリマー、例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーのような固着用ポリマー）、約３％から約８％のグリセロール、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、ヒドロトロープ（ｈｙｄｒｏｔｒｏｐｅ）、分散剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。
【０１１０】
１２）  約２５％から約４０％の陰イオン界面活性剤（リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩（ｌｉｎｅａｒ  ａｌｋｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、アルキル硫酸塩、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩、アルファ‐脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホン酸、石鹸）、約１％から約１０％の非イオン界面活性剤（例、アルコールエトキシレート）、約８％から約２５％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、約５％から約１５％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ,  ２ＳｉＯ２）、０％から約５％の硫酸ナトリウム（例、Ｎａ２ＳＯ４）、約１５％から約２８％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、０％から約２０％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）、０％から約５％の漂白活性剤（例、ＴＡＥＤ又はＮＯＢＳ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−３％の少量の成分（例、香料、蛍光増白剤）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。
【０１１１】
１３）  上記組成物１）−１２）に記載の洗剤組成物であって、すべて又は一部のリニアアルキルベンゼンスルホン酸塩が（Ｃ１２−Ｃ１８）アルキルスルホン酸塩により置換される洗剤組成物。
【０１１２】
１４）  約９％から約１５％の（Ｃ１２−Ｃ１８）アルキルスルホン酸塩、約３％から約６％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、約１％から約５％のポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙ  ａｌｋｙｌ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ａｍｉｄｅ）、約１０％から約２０％のゼオライト（例、ＮａＡｌＳｉＯ４）、約１０％から約２０％層状ジケイ酸塩（ｌａｙｅｒｅｄ  ｄｉｓｉｌｉｃａｔｅｓ）（ヘキストからＳＫ５６）、約３％から約１２％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、０％から約６％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ,  ２ＳｉＯ２）、約４％から約８％のクエン酸ナトリウム、約１３％から約２２％の過ホウ酸ナトリウム（例、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）、約３％から約８％のＴＡＥＤ、０％から約５％のポリマー（例、ポリカルボン酸塩、ＰＶＰ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−５％の少量の成分（例、蛍光増白剤、光退色、香料、泥抑制剤）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。
【０１１３】
１５）  約４％から約８％の（Ｃ１２−Ｃ１８）アルキル硫酸塩、約１１％から約１５％のアルコール  エトキシレート（ａｌｃｏｈｏｌ  ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、約１％から約４％の石鹸、約３５％から約４５％のゼオライトＭＡＰ又はゼオライトＡ、約２％から約８％の炭酸ナトリウム（例Ｎａ２ＣＯ３）、０％から約４％の可溶性ケイ酸塩（例、Ｎａ２Ｏ,  ２ＳｉＯ２）、約１３％から約２２％の過炭酸ナトリウム、１―８％のＴＡＥＤ、０％から約３％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（ＣＭＣ）、０％から約３％のポリマー（例、ポリカルボン酸塩、及びＰＶＰ）、０．０００１から０．１％の酵素（純粋酵素蛋白質として計算）、及び０−３％の少量の成分（例、蛍光増白剤、ホスホン酸塩、香料、）を含み、少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する粒子として製剤設計される洗剤組成物。
【０１１４】
１６）  追加的成分か又はすでに特定された漂白系に置換するかどちらか一方として、安定化又は封入された過酸を含むことを特徴とする、上述１）から１５）に記載の洗剤製剤。
【０１１５】
１７）  過ホウ酸塩が過炭酸塩に置き換えられることを特徴とする、１）、３）、７）、９）、及び１２）に上述するような洗剤製剤。
【０１１６】
１８）  マンガン触媒を追加的に含有することを特徴とする、１）、３）、７）、９）、１２）、１４）、及び１５）に上述するような洗剤製剤。例えば、該マンガン触媒は、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍａｎｇａｎｅｓｅ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ‐ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｂｌｅａｃｈｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６３７‐６３９  （１９９４）に記載の化合物の一つである。
【０１１７】
１９）  例えば、直鎖アルコキシル化第一級アルコール、ビルダーシステム（例、リン酸塩）、酵素、及びアルカリのような液体非イオン界面活性剤を含む非水性洗剤液として製剤設計される洗剤組成物。洗剤は陰イオン界面活性剤及び／又は漂白システムを含んでもよい。
【０１１８】
Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は、洗剤として通常用いる濃度を含んでもよい。洗剤組成物として、酵素は、洗浄液１リットル当たりＡｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体の０．００００１から１．０  ｍｇ（純粋酵素蛋白質として計算）に相当する量を添加してよいことが本発明にて意図される。
【０１１９】
他の実施態様おいては、２，６‐β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ（２，６‐β−Ｄ−ｆｒｕｃｔａｎ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）のような、他の酵素はＡｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体を含有する洗剤組成物に含まれてよく、家庭用及び／又は産業用繊維／洗濯に存在するバイオフィルムの除去／洗浄に用いてよい。
【０１２０】
例えば、洗剤組成物は、染みが付いた布地の前処理に適した洗濯用添加組成物及びすすぎに添加される布地用柔軟組成物を含む手作業（手動）、又は機械（自動）用の洗濯洗剤組成物として製剤設計されてよく、又は、一般的な家庭用の固い表面洗浄処理に用いるための洗剤組成物として製剤設計されてよく、又は手動又は自動食器洗浄処理のために製剤設計されてよい。
【０１２１】
特定の態様においては、洗剤組成物はＡｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体及びプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、他のデンプン分解酵素、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、及び／又はペルオキシダーゼ、及び／又はこれ等の組み合わせのような一以上の他の洗浄酵素に加えて２，６‐β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼ（２，６‐β−Ｄ−ｆｒｕｃｔａｎ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）を含んでもよい。
【０１２２】
一般的に選択される酵素の特徴は、選択される洗剤（例えば、最適ｐＨ、他の酵素及び非酵素成分等との適合性）と適合すべきであり、酵素は、効果的な量で存在すべきである。
【０１２３】
プロテアーゼ：適切なプロテアーゼは、動物、野菜、又は微生物のものを含む。自然的に処理された蛋白質同様、化学的に修飾され、又は蛋白質工学的に処理される変異体が含まれる。プロテアーゼはアルカリ微生物プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、キモトリプシン様プロテアーゼのような、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼでもよい。アルカリプロテアーゼの例はサブチリシン類であり、特に、例えばサブチリシンノボ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｎｏｖｏ）、サブチリシンカールスバーグ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８  (参照、例えば、ＷＯ  ８９／０６２７９)のようなバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のものである。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例、豚又は牛由来の）、及びフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼ（例えば、ＷＯ  ８９／０６２７０及びＷＯ  ９４／２５５８３を参照）である。また、有用なプロテアーゼの例はＷＯ  ９２／１９７２９、ＷＯ  ９８／２０１１５、ＷＯ  ９８／２０１１６、及びＷＯ  ９８／３４９４６に記載される変異体を含むが、これらに限定されない。商業的に入手可能なプロテアーゼ酵素はアルカラーゼ（商標）（Ａｌｃａｌａｓｅ）、サビナーゼ（商標）（Ｓａｖｉｎａｓｅ）、プリマーゼ（商標）（ＰｒｉｍａｓｅTM）、ドゥララーゼ（商標）（ＤｕｒａｌａｓｅTM）、エスペラーゼ（商標）（Ｅｓｐｅｒａｓｅ）、及びカンナーゼ（商標）（ＫａｎｎａｓｅTM）(ノボ  ノルディスク（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）)、マキサターゼ（商標）（Ｍａｘａｔａｓｅ）、マキサカール（商標）（ＭａｘａｃａｌTM）、マキサペム（商標）（ＭａｘａｐｅｍTM）、プロペラーゼ（商標）（Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ）、プラフェクト（商標）（Ｐｕｒａｆｅｃｔ）、プラフェクトＯＸＰ（商標）（Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ＯｘＰTM）、ＦＮ２TM（商標）、及びＦＮ３TM（商標）（ジェネンコ  インターナショナル社  (Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．)）を含むが、これらに限定されない。
【０１２４】
リパーゼ：適切なリパーゼは細菌又は菌類由来のものを含むが、これらに限定されない。化学的に修飾され、蛋白質分解的に修飾され又は蛋白質工学的に処理される変異体が含まれる。有用なリパーゼの例は、例えば、フミコーラ  ラヌギノサ（Ｈ．  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ  (Ｔ．  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ)）（例えば、ＥＰ  ２５８０６８及びＥＰ  ３０５２１６を参照）由来、フミコーラ  インソレンス（Ｈ．  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）（例えばＷＯ  ９６／１３５８０を参照）由来のようなフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（同義語  サーモミセス(Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ)）由来のリパーゼ、又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ（例えば、シュードモナス  アルカリゲネス（Ｐ．  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）又はシュードモナス  シュードアルカリゲネス（Ｐ．  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）由来（例えばＥＰ  ２１８  ２７２を参照）、  シュードモナス  セパシア（Ｐ．  ｃｅｐａｃｉａ）(例えばＥＰ  ３３１  ３７６を参照)、シュードモナス  スタッチェリ（Ｐ．  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（例えば、ＧＢ  １，３７２，０３４を参照）、シュードモナス  フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）株種ＳＤ  ７０５（例えば、ＷＯ  ９５／０６７２０及びＷＯ  ９６／２７００２を参照）、シュードモナス  ウィスコンシネンシス（Ｐ．  ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（例えば、ＷＯ  ９６／１２０１２を参照）由来）、又は  バシルス  （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ（例えば、バシルス  スブチリス由来（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）例えばＤａｒｔｏｉｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  １１３１  ：  ２５３−３６０  （１９９３）を参照）、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、（例えばＪＰ  ６４／７４４９９２を参照）、又はバシルス  プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ（例えばＷＯ  ９１／１６４２２を参照）由来）を含むが、これらに限定されない。製剤設計の使用が考えられる更なるリパーゼ変異体は、例えば  ＷＯ  ９２／０５２４９、ＷＯ  ９４／０１５４１、ＷＯ  ９５／３５３８１、ＷＯ  ９６／００２９２、ＷＯ  ９５／３０７４４、ＷＯ  ９４／２５５７８、ＷＯ  ９５／１４７８３、ＷＯ  ９５／２２６１５、ＷＯ  ９７／０４０７９、ＷＯ  ９７／０７２０２、ＥＰ  ４０７２２５、及びＥＰ  ２６０１０５に記載のものも含む。商業的に入手可能なリパーゼ酵素はリポラーゼ（商標）（Ｌｉｐｏｌａｓｅ）及びリポラーゼウルトラ（商標）（Ｌｉｐｏｌａｓｅ  ＵｌｔｒａTM）（ノボ  ノルディスク  (Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ)）である。  
ポリエステラーゼ：適切なポリエステラーゼは、例えば、ＷＯ  ０１／３４８９９及びＷＯ  ０１／１４６２９に記載のような組成物を含む。
【０１２５】
アミラーゼ：組成物は、非生産増強アルファ‐アミラーゼのような他のアミラーゼとの組み合わせでもよい。これらは、デュラミル（商標）（Ｄｕｒａｍｙｌ）、ターマミル（商標）（Ｔｅｒｍａｍｙｌ）、ファンガミル（商標）（Ｆｕｎｇａｍｙｌ）、及びバン（商標）（ＢＡＮTM）(ノボ  ノルディスク（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／S)）又はラピダーゼ（商標）（Ｒａｐｉｄａｓｅ）、及びプラスター（商標）（Ｐｕｒａｓｔａｒ）（ジェネンコ  インターナショナル社から(Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．)）のような商業的に入手可能なアミラーゼを含むがこれらに限定されない。
【０１２６】
セルラーゼ：セルラーゼを組成物に添加してよい。適切なセルラーゼは細菌又は菌類を含む。化学的に修飾され、又は蛋白質工学的に処理される変異体が含まれる。適切なセルラーゼは、バシルス  属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来のセルラーゼを含む。例えば、米国特許第４，４３５，３０７、５，６４８，２６３、５，６９１，１７８、５，７７６，７５７、及びＷＯ  ８９／０９２５９に開示されるフミコーラ  インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトラ  サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、フザリウム  オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から生産される菌類のセルラーゼである。一般的に使用を意図するセルラーゼは繊維に有益な色のケアを有している。そのようなセルラーゼの例は、例えば、ＥＰ  ０４９５２５７、ＥＰ  ０５３１３７２、ＷＯ  ９６／１１２６２、ＷＯ  ９６／２９３９７、及びＷＯ  ９８／０８９４０に記載のセルラーゼである。他の例では、ＷＯ  ９４／０７９９８、ＷＯ  ９８／１２３０７、ＷＯ  ９５／２４４７１、ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９、ＥＰ  ５３１３１５、米国特許第５，４５７，０４６、５，６８６，５９３、及び５，７６３，２５４に記載のようなセルラーゼ変異体である。商業的に入手可能なセルラーゼはセルザイム（商標）（ｅｌｌｕｚｙｍｅ）及びケアザイム（商標）（Ｃａｒｅｚｙｍｅ）（ノボ  ノルディスク  (Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ)）又はクラジネース（商標）（Ｃｌａｚｉｎａｓｅ）及びプラダックス  ＨＡ（商標）（Ｐｕｒａｄａｘ  ＨＡ）（ジェネンコ  インターナショナル社  (Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．)）及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王社）を含む。
【０１２７】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：組成物での使用が意図される適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類由来のものを含む。化学的に修飾され、又は蛋白質工学的に処理される変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼ例は、コプリナス  シネレウス（Ｃ．  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）由来のようなコプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）由来のペルオキシダーゼ及びＷＯ  ９３／２４６１８、ＷＯ  ９５／１０６０２、及びＷＯ  ９８／１５２５７に記載のようなそれらの変異体由来のペルオキシダーゼを含む。商業的に入手可能なペルオキシダーゼは、例えば、ガードザイム（商標）（ＧｕａｒｄｚｙｍｅTM）（ノボ  ノルディスク  (Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ)）を含む。
【０１２８】
洗剤酵素を一以上の酵素を含む分離添加物を加えることによって又はこれらの酵素すべてを含む組合せ添加物を加えることによって洗剤組成物中に含有してもよい。洗剤添加物、すなわち、分離添加物又は組合せ添加物は、例えば粒子、液体、スラリー等として製剤設計される。一般的に洗剤添加物製剤は、粒子、特に非ダスティング粒子、液体、特に安定化液体又はスラリーを含むが、これらに限定されない。
【０１２９】
非ダスティング粒子を、例えば、米国特許第４，１０６，９９１及び４，６６１，４５２に記載のように調製してよく、任意に周知の方法でコーティングしてよい。ワックスコーティング材の例は、平均分子量１、０００から２０、０００を有するポリ（エチレンオキシド）製品（例えば、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６から５０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、１２から２０炭素原子を含むアルコール及び１５から８０のエチレンオキシド単位であるエトキシ化脂肪アルコール、脂肪アルコール、脂肪酸、及び脂肪酸のモノ‐、ジ‐、トリグリセロールである。流動層技術による適用に有用なフィルム形状コーティングの例は、例えば、ＧＢ  １４８３５９１に記載される。例えば、液体酵素の調製は、プロピレングリコール、糖、糖アルコール、乳酸、ホウ酸のようなポリオールを確立した方法に従って加えることにより、安定化されてよい。保護酵素はＥＰ２３８，２１６に記載の方法に従って調製されてよい。
【０１３０】
洗剤組成物は例えば棒状、錠剤、粉、粒子、ペースト、又は液体のような任意の便利な形態でよい。液体洗剤は水性、典型的には、約７０％水分まで、及び０％から約３０％の有機溶剤まで含んでよい。約３０％以下の水分を含むコンパクト洗剤ゲルもまた含まれる。洗剤組成物は任意に一以上の界面活性剤を含み、それは、非イオン性でもよく、半極性及び／又は陰イオン性及び／又は陽イオン性及び／又は両性イオン性を含んでもよい。界面活性剤は広い範囲に存在し、約０．１％から約６０％重量を含んでよい。
【０１３１】
界面活性剤が含まれる場合、洗剤は通常約１％から約４０％の陰イオン性界面活性剤を含み、例えば、リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルファ‐オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（脂肪アルコール硫酸塩）、アルコール  エトキシ硫酸塩、第二級アルカンスルホン酸塩、アルファ‐スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル‐又はアルケニルコハク酸又は石鹸である。
【０１３２】
界面活性剤を含む場合、洗剤は通常、０．２％から約４０％の非イオン性界面活性剤を含み、例えば、アルコールエトキレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、  エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミン（「グルカミド」）のＮ‐アシル‐Ｎ‐アルキル誘導体である。
【０１３３】
洗剤は０％から約６５％のゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例、ヘキスト社製ＳＫＳ−６）のような洗剤ビルダー又は錯化剤を含んでよい。
【０１３４】
洗剤は一以上のポリマーを含んでよい。一般的にポリマーは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ），ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレン  グリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ビニル  アルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピリジン‐Ｎ‐オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリアクリレート、マレイン／アクリル酸コポリマー、及びラウリル  メタアクリレート／アクリル酸コポリマーのようなポリカルボン酸塩を含む。
【０１３５】
洗剤組成物の酵素は、従来の安定化剤を用いて安定化される。例えば、ポリオール（例、プロピレングリコール又はグリセロール）として、糖、糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体（例、芳香族ホウ酸エステル）、又はフェニルホウ酸誘導体（例、４−フォルミルフェニルホウ酸）である。組成物はＷＯ  ９２／１９７０９及びＷＯ  ９２／１９７０８に記載のように製剤設計されてよい。
【０１３６】
本発明において、洗剤組成物について、特定の酵素変異体を洗浄液（例えば、洗浄液１リットル当たり約０．０５から約５．０ｍｇの酵素蛋白質量又は洗浄液１リットル当たり約０．１から約１．０ｍｇの酵素蛋白質量）１リットル当たり約０．０１から約１００  ｍｇの酵素蛋白質量に相当する量を添加してよいことが意図される。
【０１３７】
４．２  洗浄組成物
洗剤適用において、Ａｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は通常プロピレングリコール含有液体組成物に用いられる。例えば、酵素は、１０％塩化カルシウム含有プロピレングリコール溶液を２５％体積／体積の割合で混合することによりプロピレングリコール中で安定化する。
【０１３８】
本明細書記載のＡｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ又はその変異体は食器洗浄又は他の洗浄組成物での使用のための洗剤組成物に製剤設計されてよい。これらは粉状、ゲル状、液体状でよい。組成物は酵素単独、又は他のデンプン分解酵素と共に及び／又は他の洗浄酵素と共に又は漂白活性化酵素、及び他の洗浄組成物として通常の成分を含んでよい。
【０１３９】
つまり、食器洗浄洗剤組成物は界面活性剤を含む。界面活性剤は陰イオン性、非イオン性、陽イオン性、両性の又はこれらのタイプの混合でもよい。洗浄剤は低い泡立ちから泡立ちがないようなエトキシ化プロポキシレート直鎖アルコールのような非イオン性界面活性剤の重量０％から約９０％を含んでよい。
【０１４０】
洗剤組成物は、無機及び／又は有機の洗剤ビルダー塩を含んでよい。洗剤ビルダーは、リン酸を含む及びリン酸を含まないタイプに細分化される。洗剤組成物は通常約１％から約９０％の洗剤ビルダーを含む。リン酸を含む無機アルカリ性洗剤ビルダーは、本発明の場合、水溶性塩、特に、アルカリ金属ピロリン酸塩、オルトリン酸塩、及びポリリン酸塩を含む。リン酸を含む有機アルカリ性洗剤ビルダーは、本発明の場合、ホスホン酸塩の水溶性塩である。リン酸を含まない無機ビルダーは、本発明の場合、水溶性アルカリ金属炭酸塩、ホウ酸、及びケイ酸塩も非水溶性結晶又はゼオライトがよく知られている典型例であるが、非結晶性のアルミノケイ酸塩をも含む。
【０１４１】
適切な有機ビルダーの例はアルカリ金属、アンモニウムや置換アンモニウム、クエン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、脂肪酸スルホン酸塩、カルボキシメトキシコハク酸塩、アンモニウムポリアセテート、カルボン酸塩、ポリカルボン酸塩、アミノポリカルボン酸塩、ポリアセチルカルボン酸塩、及びポリヒドロキシスルホン酸塩を含む。
【０１４２】
他の適切な有機ビルダーは、ビルダーの特徴を有している周知の高分子量ポリマーとコポリマー、例えば、適切なポリアクリル酸、ポリマレイン酸、及びポリアクリル／ポリマレイン酸コポリマー及びそれらの塩を含む。
【０１４３】
洗浄組成物は塩素／ホウ素タイプ又は酸素タイプの漂白剤を含んでもよい。無機塩素／ホウ素タイプ漂白剤の例は、リチウム、ナトリウム、又はカルシウム次亜塩素酸塩、及び次亜臭素酸塩も塩化リン酸三ナトリウムもある。有機塩素／ホウ素タイプ漂白剤の例は、トリクロロイソシアヌル酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸、及びジクロロイソシアヌル酸、及びカリウム及びナトリウムのような水溶性陽イオンを伴うそれらの塩のような複素環Ｎ‐ブロモ‐及びＮ‐クロロ‐イミド類である。ヒダントイン化合物もまた有用である。
【０１４４】
洗浄組成物は酸素漂白剤を含み、例えば、無機過酸基塩（ｐｅｒｓａｌｔ）の形態、任意に漂白前駆体又は過酸化合物としての形態である。一般的な、適切な過酸漂白化合物の例は、アルカリ金属過ホウ酸塩、四水和物及び一水和物の両方、アルカリ金属過炭酸塩、過ケイ酸塩、及び過リン酸塩である。典型的な活性剤はＴＡＥＤ及びグリセロールトリアセテートである。また、酵素漂白活性化システムは、例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、グリセロールトリアセテート、及びペルヒドロラーゼ（例えば、ＷＯ  ２００５／０５６７８３を参照）のような製剤設計である。
【０１４５】
洗浄組成物は、酵素に適した安定化剤を用いて安定化してよく、例えば、プロピレングリコールのようなポリオール、糖、糖アルコール、乳酸、ホウ酸又はホウ酸誘導体（例えば、芳香族ホウ酸エステル）である。
【０１４６】
また、洗浄組成物は他の適切な洗剤成分を含んでもよく、例えば、解膠剤、賦形剤、泡抑制剤、抗腐食剤、泥懸濁剤、金属イオン封鎖剤、抗泥再堆積剤、脱水剤、染料、抗菌剤、蛍光剤、増粘剤、及び香料を含んでよい。
【０１４７】
本発明は下記に詳細に引用にて説明されているが、種々の修飾がなされることは理解される。
【０１４８】
４．３  洗剤組成物評価方法
多数のアルファ‐アミラーゼ洗浄試験が存在する。典型的な洗浄試験の記載は、次を含む。
【０１４９】
「見本（ｓｗａｔｃｈ）」は、布地に着いた染みを有する布地のような材料の一片をいう。例えば、材料を綿、ポリエステル又は天然と合成繊維の混合から作製してよい。さらに、該見本は、フィルター紙又はニトロセルロースのような紙、又はセラミック、金属、又はグラスの一つでもよい。アミラーゼにとって、染みはデンプンベースであり、血液、牛乳、インク、紅茶、ワイン、ホウレンソウ、肉汁、チョコレート、卵、チーズ、泥、染料、油又はこれらの化合物の混合物を含むが、これらに限定されない。
【０１５０】
「小さな見本（ｓｍａｌｌｅｒ  ｓｗａｔｃｈ）」は、一穴式の穴開け器でカットされている見本の切断部であり、又は客のリクエストにより製造された９６穴用穴開け器であって、多数の穴が標準９６穴マイクロタイタープレートに対応するようになっている穴開け器でカットされる見本の切断部、又は見本から別な方法で取り出されている部分である。見本は繊維、紙、金属、又は他の適切な材料である。該小さな見本は、その見本が、２４‐、４８‐、又は９６‐穴マイクロタイタープレートに置かれる前又は後のいずれか一方にて染みが付着される。「小さな見本（ｓｍａｌｌｅｒ  ｓｗａｔｃｈ）」はまた少量の材料に染みを適用して作成してもよい。例えば、小さな見本は、染みが付いた直径５／８″又は０．２５″の布地のものでよい。客のリクエストにより製造された穴開け器は９６穴プレートのすべてに同時に９６個の見本が挿入されるように設計されている。装置は、単に同じ９６穴プレートに複数回挿入することにより、穴ごとに二以上の見本の搬送をさせる。複数穴用穴開け器は、任意の設定プレートに見本の同時挿入をすることができるものであり、２４‐、４８‐、又は９６‐穴プレートを含むがこれらに限定されない。他の考えられる方法は、汚れ試験プラットフォームが金属、プラスティック、グラス、セラミック又は汚れ物質でコートされる他の適切な材料から作られるビーズである。一以上のコートされるビーズは適切な緩衝液と酵素を含んだ２４‐、４８‐、又は９６‐穴プレート又はより大きい穴に挿入される。この場合、上清は直接吸光度の測定をすることにより、又は二次的な色の発色反応後のどちらかの方法で分離する汚れを測定する。分離する汚れの分析を質量スペクトル解析によって処理する。さらにマイクロスクリーニング試験は、例えばインディゴ染色デニムの見本をマルチウェルプレートの穴に供給し、固定し、砂又は例えば６，８、又は９ゲージの粒子を含むふるいで得たガーネットのようなより大きな粒子を加え、添加粒子によって見本を摩耗させるようにプレートを攪拌する。この試験はストーンウォッシング適用におけるセルラーゼの評価に有用である。酵素の有効性を、反応液への色の放出（例えば、放出インディゴをジメチルスルホキシドに溶解し、Ａ６００ｎｍの吸収で測定される。）によって又は摩耗する見本の反射率の測定により判断する。
【０１５１】
例えば、未処理のＢＭＩ（血液（ｂｌｏｏｄ）／牛乳（ｍｉｌｋ）／インク（ｉｎｋ））見本を漂白剤のない洗剤で洗浄する場合、インクの大部分はプロテアーゼの助けなしでも除去される。プロテアーゼの添加によりインクの除去が少し増大され、より大きなバックグラウンドにおいては定量化が困難である。本発明は、染みの固定度合いを制御させる処理手順を提供する。  結果として、例えば、試験されるべき酵素の不存在下で洗浄するとき、染みの量を変えて放出することのできる見本の作製が可能となる。固定化見本の使用によって、洗浄試験における信号対雑音の劇的な改善に至る。さらに、固定度合いの変化によって、種々の洗浄条件下、最適な結果が得られる染みの付着を与えることができる。
【０１５２】
種々のタイプの材料の既知「強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）」の染みを有する見本は商業的に入手可能である（ＥＭＰＡ，  Ｓｔ．  Ｇａｌｌｅｎ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；  ｗｆｋ-Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ  ＧｍｂＨ，  Ｋｒｅｆｅｌｄ  Ｇｅｒｍａｎｙ;  又はＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）及び／又は専門家（Ｍｏｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｔｏ，  Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５２（４）：  ２８０  ２８６  （１９８２））によって作成される。他の試験用見本は、繊維を含む綿上の血液／牛乳／インク（ＢＭI）染み、繊維を含む綿上のホウレンソウの染み、繊維を含む綿上の草の染みを含むがこれらに限定されない。
【０１５３】
ＢＭＩ染みは０．０００３％から０．３％の過酸化水素で綿に固定される。他の組み合わせは０．００１％から１％のグルタルアルデヒドで固定される草又はホウレンソウ、ゼラチン及び０．００１％から１％のグルタルアルデヒドで固定されるクーマシィー染色又は０．００１％から１％のグルタルアルデヒドで固定されるチョコレート、牛乳やすすを含む。
【０１５４】
また、見本を酵素及び／又は洗剤製剤でインキュベーションする間、攪拌する。洗浄能力データはウェル（水平対垂直）、特に９６穴プレートにおける見本の方向で決定する。これは、インキュベーション期間に混合が不十分であったことを示す。インキュベーション期間の十分な攪拌を確認する多くの方法があるけれども、アルミニウムの二つのプレートの間でマイクロタイタープレートを挟むプレートホルダーが設計された。これは単純な設置の仕方で、例えば、接着プレート用シールでウェルを覆う時、二つのアルミニウムプレートを適切なタイプの商業的に入手可能なクランプで９６穴プレートに固定する。それは商業的なインキュベーター振盪機に設置可能である。約４００ｒｐｍで振盪機に設置によって非常に効率のよい攪拌が得られ、一方、漏れ又は交互の汚染がホルダーによって効果的に防止される。
【０１５５】
トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）は洗浄液体中アミノ基の濃度を定量するために用いる。これは、見本（例えば、Ｃａｙｏｔ  ａｎｄ  Ｔａｉｎｔｕｒｉｅｒ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４９：  １８４−２００  （１９９７）参照。）からの除去された蛋白質の量の測定として役立つ。しかしながら、洗剤又は酵素のサンプルが非常に小さいペプチド断片（例えば、サンプル中のペプチダーゼの存在から）の形となる場合、より大きなＴＮＢＳシグナル、言い換えると「ノイズ」が生じる。
【０１５６】
血液／牛乳／インク又は他の染みに対する洗浄能力を測定する他の手段は、インク放出に基づく。見本上の蛋白質の蛋白質分解によって、洗浄液の吸光度を測定することにより定量されるインク粒子の放出が得られる。吸光度を４１０ｎｍ又は６２９ｎｍで測定する。また洗浄液体を用いて、草、ホウレンソウ、ゼラチン、クーマシィー染色を含む染みにおける洗浄能力を決定するために試験を行う。これらの染みに対する典型的な波長は、ホウレンソウ、又は草について６７０ｎｍ及びゼラチン又はクーマシィーについては６２０ｎｍを含む。例えば、洗浄液（例えば、一般的に９６穴プレートから１００‐１５０μＬ）の一部を除き、キュベット又はマルチウェルマイクロプレートに移す。その時これを分光光度計にセットし、吸光度を適切な波長にて測定する。
【０１５７】
またシステムを例えば衣服、プラスティック、又はセラミックのような適切な基質上の血液／牛乳／インク染みを用いて食器洗浄用の強化酵素及び／又は洗剤組成物を決定するために用いる。
【０１５８】
ある態様においては、０．３％過酸化水素をＢＭＩ／綿見本に３０分間２５℃で処理してＢＭＩ染みを綿に固定し、又は０．０３％過酸化水素をＢＭＩ／綿見本に３０分間６０℃で処理してＢＭＩ染みを綿に固定する。約０．２５″の小さな見本をＢＭＩ／綿見本から切り離し、９６穴マイクロタイタープレートのウェルに移す。各ウェルに洗剤組成物及び変異蛋白質のような酵素の周知の混合を添加する。粘着プレート用シールでマイクロタイタープレートの上に固定した後、マイクロタイタープレートをアルミニウムプレートに挟み、約１０から６０分間、約２５０ｒｐｍでオービタルシェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）で攪拌する。この時間の最終時点で、上清は新しいマイクロタイタープレートに移され、６２０ｎｍでインクの吸光度を測定する。これは０．０１％グルタルアルデヒドをホウレンソウ／綿見本又は草／綿見本に３０分間２５℃で処理によるホウレンソウ又は草染み固定綿で同様に試験される。同様にチョコレート、牛乳、及び／又はすすの染みで行われる。
【実施例】
【０１５９】
実施例１
バシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における発現
図５に示す構築体を９プロテアーゼ欠損バシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌種に形質転換した。（ｄｅｇＵＨｙ３２，ｏｐｐＡ,ΔｓｐｏＩＩ３５０１，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ‐  ｅｒｍＣ,  ΔａｐｒＥ,  ΔｎｐｒＥ，  Δｅｐｒ，  ΔｉｓｐＡ，  Δｂｐｒ，  Δｖｐｒ，  ΔｗｐｒＡ，  Δｍｐｒ‐ｙｂｆＪ，  ΔｎｐｒＢ)  (参照ＵＳ２００５０２０２５３５Ａ１)。この菌種の培養を次の培地で培養した（１リットル当たり）：１０ｇソイトン（Ｓｏｙｔｏｎｅ）、７５ｇグルコース、７．２ｇ尿素、４０ｍＭ  ＭＯＰＳ、４ｍＭ  トリシン、３ｍＭ  リン酸二水素カリウム、２１．４ｍＭ  ＫＯＨ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２７６μＭ  硫酸カリウム、５２８μＭ  塩化マグネシウム、５０μＭ  クエン酸三ナトリウム二水和物、１００μＭ  塩化カルシウム二水和物、１４μＭ  硫酸鉄七水和物、５．９μＭ  硫酸マグネシウム二水和物、５．７μＭ  硫酸亜鉛一水和物、２．９μＭ  塩化第二銅二水和物、４．２μＭコバルト六水和物、４．５μＭモリブデンナトリウム二水和物。１Ｌ体積に、ソイトンを５００ｍＬに混合する以外はすべての成分を滅菌ろ過し、等量の２Ｘソイトンに加え、オートクレーブにより滅菌する。微量金属及びクエン酸塩を１００Ｘ又は１０００Ｘ保存液として作製する。緩衝液、水酸化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸カリウム、及び塩化マグネシウム及び微量金属を１０Ｘ保存溶液として作製する。すべての成分を混合した後、ｐＨを７．３に調整した。使用する前に、この培地を２０ｍＭ塩化カルシウムで補完する。
【０１６０】
培養によって種々の過程の形態における酵素が発現した。明らかな成熟型（シグナル配列を有さない）を１０％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上に６９ｋＤａのマーカーの位置に観察した。また二つの短い形態が存在した。
【０１６１】
ベータ‐シクロデキストリンセファロースアフィニティ樹脂で培地を処理し、樹脂を集め、２ｍＭ  塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）含有２５ｍＭ  ビス‐トリスプロパン緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄し、５０ｍＭ  ベータシクロデキストリンを補完した同じ緩衝液で洗浄樹脂を溶出することによりＡｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼ活性部分を培養培地から分画した。ベータ‐シクロデキストリンで培養培地を処理する効果は培地から６０ｋＤａ種の部分的除去（約５０％まで）と６９ｋＤａ種の完全な除去であった。樹脂の緩衝液による洗浄により、６０ｋＤａサイズのほぼ純粋な蛋白質を得られ、緩衝液含有ベータ‐シクロデキストリンの溶出により、約２５％の６０ｋＤａ蛋白質を含んだ６９ｋＤａ蛋白質が得られた。これらの成分の評価をＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより決定した。結果は図１０に示す。分画酵素内容物を標準蛋白質として用いるＯｘＡｍ  アミラーゼ（ジェネンコ  インターナショナル社  (Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．)）でゲル濃度測定にて評価した。図１０の「ｗｌ」で記されたレーンの最も暗いバンドのＮ末端分析により、「ＡＡＰＧＰＫＤＡＴＡ」(配列番号５)の配列を得た。このＮ末端配列付近の質量スペクトル分析により図４の上方部分に示す配列（すなわち、シグナル配列及びデンプン結合部位を表すＣ末端を含まない配列）を有する蛋白質を同定した。これらの分析はこの分子断片がアルファ‐アミラーゼドメインＡ、Ｂ、及びＣからなることを示す。
【０１６２】
実施例２
遺伝子的に欠損したＡｍｙ１９５触媒領域の発現
Ａｍｙ１９５に対する遺伝子は、欠損型の発現試験をするため及び洗浄能力の試験のために三つの異なる部位を欠損させた。欠損を、図４でのポリペプチド配列番号を用いてアミノ酸残基番号４９４、５０４、及び５０９にて当業者に周知の標準的な方法で行った。欠損遺伝子を含むプラスミドを９プロテアーゼ欠損バシルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌種（ｄｅｇＵＨｙ３２，ｏｐｐＡ,ΔｓｐｏＩＩ３５０１，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ‐  ｅｒｍＣ,  ΔａｐｒＥ,  ΔｎｐｒＥ，  Δｅｐｒ，  ΔｉｓｐＡ，  Δｂｐｒ，  Δｖｐｒ，  ΔｗｐｒＡ，  Δｍｐｒ‐ｙｂｆＪ，  ΔｎｐｒＢ)  に形質転換した。細胞を６４時間、３７℃にて１０又は３０ｍＭＣａＣl２で補完される５０ｍＬの富栄養培地を含む２５０ｍＬのバッフルフラスコにて培養した。培養上清をＳＤＳＰＡＧＥにて分析し、アミラーゼ内容物はゲル濃度測定により評価した。
【０１６３】
欠損遺伝子からのアミラーゼの発現は、完全長の野生型遺伝子からの同じ領域の発現より約２倍高かった。これらの結果を図８に示し、欠損遺伝子は蛋白質発現に対して有意な効果があることを示す。
【０１６４】
実施例３
洗浄試験
ゲル上に示されるすべての分画をさらに９６穴ＣＳ２８オレンジ染色米デンプン汚れ見本適用試験により分析した。この分析を２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）及び２５ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１０．３）緩衝液で行った。
【０１６５】
実施例１で単離されるすべてのＡｍｙ１９５種の洗浄能力を、アミラーゼ濃度を関数としてシミュレートされる洗濯試験にて試験をした。図１０の「ｅ‐ｐｏｏｌ」分画に対する結果を図６に示す。性能が、上清液体に放出され４８８ｎｍで分光光度計を用いて測定される色素の量により判断した。さらなる試験の情報は米国特許第７，１２２，３３４を参照願いたい。酵素はｐＨ８．０で高い効果を示し、ｐＨ１０．３にて驚くべき染み除去を示した。蛋白質ゲル（図１０）の各レーンの重要な蛋白質のバンドのすべては、最も良い性能を示した「ｗｌ」レーンのバンドと共に洗浄活性を示した。ｐＨ８．０の条件下すべての洗浄活性を図７に示す。図４の４９２番目のアミノ酸残基で終了する欠損型は、ひとつのデンプン結合領域（図７で「□」参照）を維持する型より高い性能（図７で「●」参照）を示した。この試験の結果からＡｍｙ１９５アルファ‐アミラーゼは繊維見本から染みを除去する点に高い効果があることを示す。
【０１６６】
実施例４
遺伝子操作による欠損遺伝子産物の洗浄能力
上述の実施例２で得られる欠損遺伝子産物について、上述の実施例３での蛋白質加水分解断片の記載のように同じ方法で洗浄能力が試験された。ＣＳ２８米見本はＡｍｙ１９５触媒断片の濃度範囲でインキュベートした。洗浄能力が色素の上清への放出及び４８８ｎｍでの測定によって判断された。図９で示すように、すべて３つの遺伝操作による欠損遺伝子断片は、良い洗浄性能を示した。
【０１６７】
この見本試験を異なる目的に応じて幾つかの方法で改良してよい。９６穴プレートでの試験は見本と共に酵素のインキュベーション後に上清を測定することでハイスループット洗浄試験として非常に有用である一方、ウェルのサイズに合う見本を伴う２４穴プレートでは反射率が周知の技術にて測定できる大きな見本を洗浄するのに用いることができる。この二つの測定は、つまり、上清の吸光度及び見本の反射率が、ほぼ完全な相関関係を示した。
【０１６８】
上清の吸光度と洗浄見本の反射率の相関関係は高く、ｒ２の決定係数は０．９９の値であった。実施例３で記載のように測定の有効性を試験するために、おもに、試験は３８４穴プレートにスケールアップできる。試験は任意の汚れた見本で行われ、加えて、ＣＳ２８見本、ＣＳ２６、ＣＳ２７及びＣＳ２９見本も同様に（例えば、それぞれ、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン；Ｔｅｓｔｆａｂｒｉｃｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｔｔｉｓｔｏｎ，  ＰＡ）試験ができる。また、試験は洗剤組成物と共に用いてもよく、異なる温度及び異なるｐＨ値で導入されてよい。これらの試験は米国特許第７，１２２，３３４からに記載したものを用いている。
【０１６９】
上述のすべての文献の引用は、すべての目的に応じてそれらの全体を引用することにより本明細書に取り込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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