(57)【要約】  本発明は、フィターゼ、フィターゼをコードするヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用とともに前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造並びに単離に関する。特に、本発明は、高温条件下でフィターゼ活性を有するポリペプチド、および高温に暴露後に活性を保持するフィターゼを提供する。本発明のフィターゼは、高温に加えて、低温でも耐熱性および／または熱安定性でありえる。本発明のフィターゼは、食品類に用いて、フィテートに富む成分の飼養価を改善することができる。本発明のフィターゼは、食品もしくは飼料として、または例えばフィテートの消化を促進するために前記どちらかのためのサプリメントとして処方することができる。本発明の食品または飼料は、ペレット、液体、粉末などの形態で存在しえる。ある特徴では、本発明のフィターゼはペレット化の間の熱変性に対して安定であり、このことは、フィターゼ製品のコストを削減し、一方、in vivo有効性および飼料中の活性検出を維持する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）−（l）を含む、単離、合成または組換え核酸：
（a）（i）フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号:1に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%またはそれより高い配列同一性を有し、さらに、
139から141位のヌクレオチドがTTTまたはTTC；
289から291位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
289から291位のヌクレオチドがGAAまたはGAG；
406から408位のヌクレオチドがCATまたはCAC；
475から477位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
475から477位のヌクレオチドがGAAまたはGAG；
487から489位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
490から492位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
502から504位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
535から537位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
676から678位のヌクレオチドがGATまたはGAC；
697から699位のヌクレオチドがTGG；
823から825位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
865から867位のヌクレオチドがGCT、GCC、GCAまたはGCG；
1045から1047位のヌクレオチドがTATまたはTAC；および
1087から1089位のヌクレオチドがCCA、CCC、CCGまたはCCT
から成る群から選択される、配列番号:1に対するヌクレオチド塩基対配列改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含む核酸配列；
（ii）フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号:1に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、さらに、
139から141位に相当する位置のヌクレオチドがTTTまたはTTC；
289から291位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
289から291位に相当する位置のヌクレオチドがGAAまたはGAG；
406から408位に相当する位置のヌクレオチドがCATまたはCAC；
475から477位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
475から477位に相当する位置のヌクレオチドがGAAまたはGAG；
487から489位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
490から492位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
502から504位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
535から537位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
676から678位に相当する位置のヌクレオチドがGATまたはGAC；
697から699位に相当する位置のヌクレオチドがTGG；
823から825位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
865から867位に相当する位置のヌクレオチドがGCT、GCC、GCAまたはGCG；
1045から1047位に相当する位置のヌクレオチドがTATまたはTAC；および
1087から1089位に相当する位置のヌクレオチドがCCA、CCC、CCGまたはCCT
から成る群から選択される、配列番号:1に対するヌクレオチド塩基対配列改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含む核酸配列；
（iii）フィターゼ活性を有し、さらに
配列番号:2のアミノ酸47位のアミノ酸アラニンがフェニルアラニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸97位のアミノ酸システインがバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸97位のアミノ酸システインがグルタミン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸136位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに変化；
配列番号:2のアミノ酸159位のアミノ酸アスパラギンがバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸159位のアミノ酸アスパラギンがグルタミン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸163位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸164位のアミノ酸アスパラギン酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸168位のアミノ酸グルタミン酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸179位のアミノ酸グリシンがアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸226位のアミノ酸システインがアスパラギン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸233位のアミノ酸バリンがトリプトファンに変化；
配列番号:2のアミノ酸275位のアミノ酸グルタミンがバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸289位のアミノ酸アルギニンがアラニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸349位のアミノ酸スレオニンがチロシンに変化；および
配列番号:2のアミノ酸363位のアミノ酸ロイシンがプロリンに変化
から成る群から選択される、配列番号:2に対するアミノ酸残基改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含む配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（iv）フィターゼ活性を有し、
配列番号:2のアミノ酸47位のアラニンに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸97位のシステインに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸97位のシステインに相当する位置のアミノ酸がグルタミン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸136位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに変化；
配列番号:2のアミノ酸159位のアスパラギンに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；配列番号:2のアミノ酸159位のアスパラギンに相当する位置のアミノ酸がグルタミン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸163位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸164位のアスパラギン酸に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸168位のグルタミン酸に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸179位のグリシンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸226位のシステインに相当する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸233位のバリンに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに変化；
配列番号:2のアミノ酸275位のグルタミンに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸289位のアルギニンに相当する位置のアミノ酸がアラニンに変化；配列番号:2のアミノ酸349位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がチロシンに変化；および
配列番号:2のアミノ酸363位のロイシンに相当する位置のアミノ酸がプロリンに変化
から成る群から選択される、配列番号:2に対するアミノ酸残基改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含む配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；もしくは
（v）（i）または（ii）の核酸（ポリヌクレオチド）配列であって、前記配列同一性が配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、または目視精査によって決定され、さらに場合によって、前記配列比較アルゴリズムがBLASTバージョン2.2.2アルゴリズムであり、前記アルゴリズムにおいてフィルタリング設定がblastall -p blastp -d “nr pataa” -F Fに設定され、他の全てのオプションが規定値に設定される、前記（i）または（ii）の核酸（ポリヌクレオチド）配列；
（b）フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするが、シグナル配列もしくはプロタンパク質配列または同種プロモーター配列を欠く（a）の核酸（ポリヌクレオチド）配列；
（c）フィターゼ活性を有し、さらに異種アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする（a）または（b）の核酸（ポリヌクレオチド）、または異種ヌクレオチド配列を含む（a）または（b）の核酸（ポリヌクレオチド）；
（d）（c）の核酸（ポリヌクレオチド）であって、前記異種アミノ酸配列が、異種（リーダー）シグナル配列またはタグもしくはエピトープを含むかまたは前記から成るか、または前記異種ヌクレオチド配列が異種プロモーター配列を含む、前記（c）の核酸（ポリヌクレオチド）；
（e）（c）または（d）の核酸（ポリヌクレオチド）であって、前記異種ヌクレオチド配列が、小胞体（ER）もしくはエンドメンブレンへの、または植物の小胞体（ER）もしくはエンドメンブレン系への標的到達を目的とするN-末端および／またはC-末端伸張部を含むか、または前記から成る異種（リーダー）シグナル配列をコードするか、または前記異種配列が制限部位をコードする、前記（c）または（d）の核酸（ポリヌクレオチド）；
（f）（d）の核酸（ポリヌクレオチド）であって、前記異種プロモーター配列が、構成的もしくは誘導性プロモーターまたは植物特異的プロモーターまたはトウモロコシ特異的プロモーターを含むか、または前記から成る、前記（d）の核酸（ポリヌクレオチド）；
（g）（a）から（f）のいずれかの核酸（ポリヌクレオチド）であって、前記フィターゼ活性が、飼料、食物製品もしくは飲料、または穀物系動物用飼料、麦芽汁もしくはビール、生地、果実もしくは野菜を含む飼料、食物製品もしくは飲料中のフィテートの加水分解の触媒活性；または微生物細胞、菌類細胞、哺乳動物細胞または植物細胞内のフィテートの加水分解の触媒活性を含むか、または前記フィターゼ活性が、イノシトールおよび無機ホスフェートへのフィテート（ミオイノシトールヘキサホスフェート）の触媒活性；またはフィテート（ミオイノシトールヘキサホスフェート）の加水分解活性を含む、前記（a）から（f）のいずれかの核酸（ポリヌクレオチド）；
（h）（a）から（g）のいずれかの核酸（ポリヌクレオチド）であって、前記フィターゼ活性が熱安定性であるか、または前記ポリペプチドが、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約37℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃の範囲の温度、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃もしくはそれより高い温度を含む条件下でフィターゼ活性を保持する、前記（a）から（g）のいずれかの核酸（ポリヌクレオチド）；
（i）（a）から（g）のいずれかの核酸（ポリヌクレオチド）であって、前記フィターゼ活性が耐熱性であるか、または前記ポリペプチドが、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約37℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃の範囲の温度、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃もしくはそれより高い温度に暴露後にフィターゼ活性を保持する、前記（a）から（g）のいずれかの核酸（ポリヌクレオチド）；
（j）（h）または（i）のいずれかの核酸であって、前記フィターゼポリペプチドが、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5、pH4.0、pH3.5、pH3.0またはそれより強い酸性pHで耐熱性または熱安定活性を有するか、または前記フィターゼポリペプチドが、約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5、pH11.0、pH11.5、pH12.0、pH12.5またはそれより高いpHで耐熱性または熱安定活性を有する、前記（h）または（i）のいずれかの核酸；
（k）（h）または（i）のいずれかの核酸であって、前記ポリペプチドが、約40℃から約70℃、または約37℃から約90℃の範囲の温度、または37℃を超える温度から約50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃もしくは95℃またはそれより高い温度に暴露後にフィターゼ活性を保持するか、または前記ポリペプチドが、約40℃から約70℃、または約37℃から約90℃の範囲の温度、または37℃を超える温度から約50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃もしくは95℃またはそれより高い温度でフィターゼ活性を保持する、前記（h）または（i）のいずれかの核酸；
（l）（a）から（k）のいずれかの核酸（ポリヌクレオチド）配列に完全に相補的な核酸配列。
【請求項２】
発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクターであって、
（i）請求項1に記載の核酸を含むか、または請求項1に記載の核酸をその中に収納している、前記発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクター；または
（ii）前記クローニングビヒクルが、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージまたは人工染色体を含むか、または前記であり、さらに場合によって、前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクターを含み、さらに場合によって前記発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクターが、細菌人工染色体、プラスミド、バクテリオファージP1-由来ベクター（PAC)、酵母人工染色体（YAC）、哺乳動物人工染色体（MAC）を含むか、または前記に収納される、前記（i）の発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクター。
【請求項３】
形質転換細胞または宿主細胞であって、
（i）請求項1に記載の核酸または請求項2に記載の発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクターを含む、前記形質転換細胞または宿主細胞；または
（ii）細菌細胞、哺乳動物細胞、菌類細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞である、前記（i）の形質転換細胞または宿主細胞；
（iii）細菌細胞が、エシェリキア属、バチルス属、ストレプトミセス属、サルモネラ属、シュードモナス属もしくはスタフィロコッカス属、または大腸菌、ラクトコッカス・ラクチス、枯草菌、バチルス・セレウス、ネズミチフス菌、シュードモナス・フルオレセンス内のいずれかの種である、前記（ii）の形質転換細胞または宿主細胞。
【請求項４】
トランスジェニック非ヒト動物であって、
（i）請求項1に記載の核酸、または請求項2に記載の発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクター、または請求項3に記載の形質転換細胞または宿主細胞を含む、前記トランスジェニック非ヒト動物；または
（ii）マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ブタまたはウシである、前記（i）のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
トランスジェニック植物または種子であって、
（i）請求項1に記載の核酸、または請求項2に記載の発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクター、または請求項3に記載の形質転換細胞または宿主細胞核酸を含む、前記トランスジェニック植物または種子；または
（ii）場合によって、前記植物が、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、コムギ、オイルシード植物、アブラナ、ダイズもしくはタバコ、または動物用もしくは反芻動物用の飼葉および／または飼料植物であり、さらに場合によって、前記飼葉または飼料植物が、干草、トウモロコシ、アワ、ダイズ、コムギ、ソバ、オオムギ、アルファルファ、ライムギ、一年生牧草、ソルガム、モロコシ属牧草、ヴェルトグラス（veldt grass）またはブッフェルグラス（buffel grass）であるか；または前記種子が、トウモロコシ、コムギ、オイルシード植物、ナタネ、ダイズ、ヤシ、ヒマワリ、ゴマ、落花生、アルファルファ、綿実、ベニバナ、ソルガム、エンバク、ライムギ、アワ、オオムギ、コメ、エンドウまたはタバコの種子であり、さらに場合によって前記植物が、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、ブラシカ（Brassica）、ダイズ、サトウキビ、ワタ、ベニバナ、落花生、ソルガム、コムギ、エンバク、ライムギ、アワ、オオムギ、コメ、針葉樹、エンドウ、インゲン、ダイズ、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、タロイモ、カンナまたはテンサイである、前記（i）のトランスジェニック植物または種子。
【請求項６】
請求項1に記載の配列を有する核酸および配列番号:1に対するヌクレオチド塩基対改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、場合によって前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約10から50、約20から60、約30から70、約40から80、約60から100または約50から150塩基である、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
細胞でフィターゼメッセージの翻訳を阻害する方法であって、請求項6に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与するか、または細胞で発現させることを含む、前記翻訳を阻害する方法。
【請求項８】
二本鎖の阻害性RNA（RNAi）分子であって、
（a）請求項1に記載の配列の部分配列を含み、、場合によって、前記RNAiがsiRNAまたは阻害性ミクロRNA（miRNA）である、前記二本鎖阻害性RNA（RNAi）分子；または
（b）前記RNAiは、長さが約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25またはそれより大きい二本鎖ヌクレオチドである、前記（a）の分子。
【請求項９】
細胞でフィターゼメッセージの発現を阻害する方法であって、前記方法が、（a）請求項8に記載の二本鎖の阻害性RNA（RNAi）を細胞に投与するか、または細胞で発現させることを含む、前記発現を阻害する方法。
【請求項１０】
以下の（a）−（l）を含む、単離、合成または組換えフィターゼポリペプチド：
（a）（i）配列番号:2に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、さらに、
139から141位のヌクレオチドがTTTまたはTTC；
289から291位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
289から291位のヌクレオチドがGAAまたはGAG；
406から408位のヌクレオチドがCATまたはCAC；
475から477位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
475から477位のヌクレオチドがGAAまたはGAG；
487から489位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
490から492位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
502から504位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
535から537位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
676から678位のヌクレオチドがGATまたはGAC；
697から699位のヌクレオチドがTGG；
823から825位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
865から867位のヌクレオチドがGCT、GCC、GCAまたはGCG；
1045から1047位のヌクレオチドがTATまたはTAC；および
1087から1089位のヌクレオチドがCCA、CCC、CCGまたはCCT
から成る群から選択される、配列番号:1に対するヌクレオチド塩基対配列改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列；
（ii）配列番号:2に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、さらに、
139から141位に相当する位置のヌクレオチドがTTTまたはTTC；
289から291位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
289から291位に相当する位置のヌクレオチドがGAAまたはGAG；
406から408位に相当する位置のヌクレオチドがCATまたはCAC；
475から477位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
475から477位に相当する位置のヌクレオチドがGAAまたはGAG；
487から489位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
490から492位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
502から504位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
535から537位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
676から678位に相当する位置のヌクレオチドがGATまたはGAC；
697から699位に相当する位置のヌクレオチドがTGG；
823から825位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
865から867位に相当する位置のヌクレオチドがGCT、GCC、GCAまたはGCG；
1045から1047位に相当する位置のヌクレオチドがTATまたはTAC；および
1087から1089位に相当する位置のヌクレオチドがCCA、CCC、CCGまたはCCT
から成る群から選択される、配列番号:1に対するヌクレオチド塩基対配列改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列； 
（iii）配列番号:2のアミノ酸47位のアミノ酸アラニンがフェニルアラニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸97位のアミノ酸システインがバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸97位のアミノ酸システインがグルタミン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸136位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに変化；
配列番号:2のアミノ酸159位のアミノ酸アスパラギンがバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸159位のアミノ酸アスパラギンがグルタミン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸163位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸164位のアミノ酸アスパラギン酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸168位のアミノ酸グルタミン酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸179位のアミノ酸グリシンがアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸226位のアミノ酸システインがアスパラギン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸233位のアミノ酸バリンがトリプトファンに変化；
配列番号:2のアミノ酸275位のアミノ酸グルタミンがバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸289位のアミノ酸アルギニンがアラニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸349位のアミノ酸スレオニンがチロシンに変化；
および配列番号:2のアミノ酸363位のアミノ酸ロイシンがプロリンに変化
から成る群から選択される、配列番号:2に対するアミノ酸残基改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含むアミノ酸配列； 
（iv）配列番号:2のアミノ酸47位のアラニンに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸97位のシステインに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸97位のシステインに相当する位置のアミノ酸がグルタミン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸136位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに変化；
配列番号:2のアミノ酸159位のアスパラギンに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸159位のアスパラギンに相当する位置のアミノ酸がグルタミン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸163位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸164位のアスパラギン酸に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸168位のグルタミン酸に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸179位のグリシンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸226位のシステインに相当する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸233位のバリンに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに変化；
配列番号:2のアミノ酸275位のグルタミンに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸289位のアルギニンに相当する位置のアミノ酸がアラニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸349位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がチロシンに変化；
および
配列番号:2のアミノ酸363位のロイシンに相当する位置のアミノ酸がプロリンに変化
から成る群から選択される、配列番号:2に対するアミノ酸残基改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含むアミノ酸配列を含むアミノ酸配列；
（v）（i）から（iv）のいずれかのポリペプチドであって、前記配列同一性が配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、または目視精査によって決定される、前記（i）から（iv）のいずれかのポリペプチド；
（b）フィターゼ活性を有するが、シグナル配列またはプロタンパク質配列を欠く（a）のポリペプチド；
（c）フィターゼ活性を有し、さらに異種配列を含む（a）のポリペプチド；
（d）（c）のポリペプチドであって、前記異種アミノ酸配列が、異種（リーダー）シグナル配列またはタグもしくはエピトープを含むかまたは前記から成るか、または前記異種配列が識別ペプチドを含む前記（c）のポリペプチド；
（e）（c）または（d）のポリペプチドであって、前記異種（リーダー）シグナル配列が、小胞体（ER）もしくはエンドメンブレンへの、または植物の小胞体（ER）もしくはエンドメンブレン系への標的到達を目的とするN-末端および／またはC-末端伸張部を含むか、または前記から成るか、または前記異種アミノ酸配列が酵素標的部位を含むか、または前記から成る、前記（c）または（d）のポリペプチド；
（f）（a）から（e）のいずれかのポリペプチドであって、前記フィターゼ活性が、飼料、食物製品もしくは飲料、または穀物系動物飼料、麦芽汁もしくはビール、生地、果実もしくは野菜を含む飼料、食物製品または飲料中のフィテートの加水分解の触媒活性；または微生物細胞、菌類細胞、哺乳動物細胞または植物細胞内のフィテートの加水分解の触媒活性を含むか、または前記フィターゼ活性が、イノシトールおよび無機ホスフェートへのフィテート（ミオイノシトールヘキサホスフェート）の触媒活性；またはフィテート（ミオイノシトールヘキサホスフェート）の加水分解活性を含む、前記（a）から（e）のいずれかのポリペプチド；
（g）（a）から（f）のいずれかのポリペプチドであって、（i）前記ポリペプチドがグリコシル化されているか、または前記ポリペプチドが少なくとも1つのグリコシル化部位を含むか、（ii）（i）のポリペプチドでグリコシル化がN-結合グリコシル化またはO-結合グリコシル化であるか、または（iii）（i）または（ii）のポリペプチドが酵母細胞で発現された後でグリコシル化されるか、または（iv）（iii）のポリペプチドで酵母細胞が、P.パストリスまたはS.ポンベである、前記（a）から（f）のいずれかのポリペプチド；
（h）（a）から（g）のいずれかのポリペプチドであって、前記フィターゼ活性が熱安定性であるか、または前記ポリペプチドが、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約37℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃の範囲の温度、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃またはそれより高い温度を含む条件下でフィターゼ活性を保持するか、または
前記熱安定性フィターゼ活性が、約37℃の温度を含む条件下でタンパク質1ミリグラム当たり約100から約1000単位の範囲の比活性を含むか、または前記熱安定性フィターゼ活性がタンパク質1ミリグラム当たり約500から約750単位の比活性を含むか、または前記熱安定性フィターゼ活性が37℃でタンパク質1ミリグラム当たり約500から約1200単位の範囲の比活性を含むか、または前記熱安定性フィターゼ活性が37℃でタンパク質1ミリグラム当たり約750から約1000単位の範囲の比活性を含む、前記（a）から（g）のいずれかのポリペプチド；
（i）（a）から（g）のいずれかのポリペプチドであって、前記フィターゼ活性が耐熱性であるか、または前記ポリペプチドが、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約37℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃の範囲の温度、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃またはそれより高い温度に暴露後にフィターゼ活性を保持するか、または、
前記耐熱性が、上昇温度に加熱後にフィターゼの37℃の比活性の少なくとも半分の保持を含むか、または前記耐熱性が、上昇温度に加熱後にタンパク質1ミリグラム当たり約500から約1200単位の範囲の37℃の比活性の保持を含むか、または、
前記耐熱性フィターゼ活性が、約37℃の温度に暴露後にタンパク質1ミリグラム当たり約100から約1000単位の範囲の比活性を含むか、または、前記耐熱性フィターゼ活性が、約37℃の温度に暴露後にタンパク質1ミリグラム当たり約500から約750単位の比活性を含むか、または、前記耐熱性フィターゼ活性が、タンパク質1ミリグラム当たり約500から約1200単位の範囲の37℃の比活性を含むか、または、前記耐熱性フィターゼ活性が、タンパク質1ミリグラム当たり約750から約1000単位の範囲の37℃の比活性を含む、前記（a）から（g）のいずれかのポリペプチド；
（j）（a）から（h）のいずれかのポリペプチドであって、前記フィターゼ活性が、タンパク質1ミリグラム当たり約100から約1000単位、タンパク質1ミリグラム当たり約500から約750単位、タンパク質1ミリグラム当たり約500から約1200単位、タンパク質1ミリグラム当たり約750から約1000単位の範囲の約37℃の比活性を含む、前記（a）から（h）のいずれかのポリペプチド；
（k）（a）から（j）のいずれかのポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5、pH4.0、pH3.5、pH3.0またはそれより低いpH（より酸性）を含む条件下でフィターゼ活性を保持するか、または前記ポリペプチドが、約pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5、pH11.0、pH11.5、pH12.0またはpH12.5またはそれより高いpH（より塩基性）を含む条件下でフィターゼ活性を保持する、前記（a）から（j）のいずれかのポリペプチド；または、
（l）（a）から（k）のいずれかのポリペプチドであって、（i）前記ポリペプチドがさらにシグナル配列（リーダー配列またはリーダーペプチド）と前記酵素との間にまた別のアミノ酸残基を含む、前記（a）から（k）のいずれかのポリペプチド。
【請求項１１】
請求項10に記載のポリペプチドを含むタンパク質調製物であって、前記タンパク質調製物が、液体、スラリー、粉末、スプレー、懸濁物、凍結乾燥組成物／処方物、固体、ゲルタブ、ピル、インプラント、ゲル；または医薬処方物、食品もしくは飼料またはそのサプリメントを含む、前記タンパク質調製物。
【請求項１２】
（i）請求項10に記載のポリペプチドおよび第二のドメインを含む、ヘテロダイマー；または
（ii）前記第二のドメインがポリペプチドであり、かつ前記ヘテロダイマーが融合タンパク質であり、および／または前記第二のドメインがエピトープまたはタグである、前記（i）のヘテロダイマー。
【請求項１３】
固定化ポリペプチドであって、
（i）請求項10に記載のポリペプチドまたは請求項12に記載のヘテロダイマーを含む、前記固定化ポリペプチド；または
（ii）前記ポリペプチドが、細胞、小胞、リポソーム、フィルム、メンブレン、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、石墨粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイ、キャピラリー管、結晶、錠剤、ピル、カプセル、粉末、集塊、表面、または多孔性構造物の上または内部に固定される、前記固定化ポリペプチド。
【請求項１４】
固定化ポリペプチドを含むアレイであって、前記ポリペプチドが、請求項10に記載のポリペプチド、または請求項12に記載のヘテロダイマー、または請求項1に記載の核酸、またはその組合せを含む、前記固定化ポリペプチドを含むアレイ。
【請求項１５】
単離、合成または組換え抗体であって、
（i）請求項12に記載のポリペプチドまたは請求項1に記載の核酸によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する、前記単離、合成または組換え抗体；または
（ii）モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体である、前記（i）の抗体。
【請求項１６】
請求項15に記載の抗体を含むか、または前記を産生するハイブリドーマ。
【請求項１７】
以下の工程を含む、組換えポリペプチドを製造する方法：
（a）機能可能にプロモーターと連結された核酸を提供する工程であって、前記核酸が請求項1に記載の配列を含む、前記工程；（b）ポリペプチドの発現を許容する条件下で工程（a）の核酸を発現させ、それによって組換えポリペプチドを製造する工程、および、場合によって、工程（a）の核酸で宿主細胞を形質転換し、続いて工程（a）の核酸を発現させ、それによって形質転換宿主細胞で組換えポリペプチドを製造する更なる工程。
【請求項１８】
以下の工程を含む、フィターゼ活性を有するポリペプチドを同定する方法：
（a）請求項10に記載のポリペプチドを提供する工程；（b）フィターゼ基質を提供する工程；および（c）工程（a）のポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変種を工程（b）の基質と接触させ、基質量の増加または反応生成物量の低下を検出し、基質量の低下または反応生成物量の増加によってフィターゼ活性を有するポリペプチドを検出する工程。
【請求項１９】
以下の工程を含む、フィターゼ基質を同定する方法：
（a）請求項10に記載のポリペプチドを提供する工程；（b）試験基質を提供する工程；および（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の試験基質と接触させ、基質量の増加または反応生成物量の低下を検出し、基質量の低下または反応生成物量の増加によって前記試験基質をフィターゼ基質と同定する工程。
【請求項２０】
以下の工程を含む、化合物がポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する方法：
（a）請求項1に記載の配列を含む核酸または前記核酸を含むベクターを、前記核酸のポリペプチドへの翻訳を可能とする条件下で発現させる工程；（b）前記ポリペプチドを試験化合物と接触させる工程；および（c）前記試験化合物が前記ポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定し、それによって化合物がポリペプチドと特異的に結合することを決定する工程。
【請求項２１】
以下の工程を含む、フィターゼ活性の調節物質を同定する方法：
（a）請求項10に記載のフィターゼポリペプチドを提供する工程；（b）試験化合物を提供する工程；および（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の試験化合物と接触させてフィターゼの活性を測定し、試験化合物の非存在下での活性と比較して試験化合物の存在下で測定されるフィターゼ活性が変化すれば、前記試験化合物はフィターゼ活性を調節するという決定が提供される工程であって、場合によって前記フィターゼ活性は、フィターゼ基質を提供し、基質量の増加または反応生成物量の低下を検出することによって測定され、さらに場合によって、試験化合物の非存在下における基質または反応生成物の量と比較したとき、試験化合物の存在下で基質量の低下または反応生成物量の増加があれば、前記試験化合物をフィターゼ活性のアクチベーターと同定し、さらに場合によって、試験化合物の非存在下での基質または反応生成物の量と比較したとき、試験化合物の存在下での基質量の増加または反応生成物量の低下があれば、前記試験化合物をフィターゼ活性のインヒビターと同定する前記工程。
【請求項２２】
プロセッサーおよびデータ保存装置を含むコンピュータシステムであって、前記データ保存装置にはポリペプチド配列または核酸配列が保存されてあり、前記ポリペプチド配列は請求項10に記載の配列を含み、前記核酸は請求項1に記載の配列を含み、さらに場合によって、前記方法はさらに配列比較アルゴリズム、および少なくとも1つの参照配列が保存されたデータ保存装置を含み、さらに場合によって、前記配列比較アルゴリズムは多型性を表示するコンピュータプログラムを含み、さらに場合によって、前記方法はさらに、前記配列における1つ以上の特徴を識別するアイデンティファイアーを含む、前記コンピュータシステム。
【請求項２３】
ポリペプチド配列または核酸配列が保存されてあるコンピュータ読み出し可能媒体であって、前記ポリペプチド配列が請求項10に記載のアミノ酸配列を含み、さらに前記核酸が請求項1に記載の配列を含む、前記コンピュータ読み出し可能媒体。
【請求項２４】
以下の工程を含む、配列の特徴を識別する方法：
（a）配列内の1つ以上の特徴を識別するコンピュータプログラムを用いて配列を読み取る工程であって、前記配列がポリペプチド配列または核酸配列を含み、前記ポリペプチド配列が請求項10に記載のアミノ酸配列を含み、さらに前記核酸が請求項1に記載の配列を含む、前記工程；および（b）前記コンピュータプログラムにより前記配列の1つ以上の特徴を識別する工程。
【請求項２５】
以下の工程を含む、第一の配列と第二の配列を比較する方法：
（a）配列を比較するコンピュータプログラムを用いて第一の配列および第二の配列を読み取る工程であって、前記第一の配列がポリペプチド配列または核酸配列を含み、前記ポリペプチド配列が請求項10に記載のアミノ酸配列を含み、さらに前記核酸が請求項1に記載の配列を含む、前記工程；および（b）第一の配列と第二の配列との間の相違を前記コンピュータプログラムにより決定する工程であって、場合によって第一の配列と第二の配列との間の相違を決定する工程がさらに多型性を識別する工程を含み、場合によって前記方法がさらに、配列内の1つ以上の特徴を識別するアイデンティファイヤーを含み、さらに場合によって、コンピュータプログラムを用いて第一の配列を読み取り、前記配列内の1つ以上の特徴を識別する工程を含む、前記工程。
【請求項２６】
以下を含む、イノシトールヘキサホスフェートをイノシトールと無機ホスフェートに加水分解する方法：
（i）（a）フィターゼ活性を有するポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程であって、前記ポリペプチドは請求項10に記載のアミノ酸配列を含む、前記工程；（b）イノシトールヘキサホスフェートを含む組成物を提供する工程；および（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の組成物と、前記ポリペプチドがイノシトールヘキサホスフェートを加水分解してイノシトールおよび無機ホスフェートを生成する条件下で接触させる工程；
（ii）前記条件が、約37℃から約70℃、約50℃から約80℃、または約60℃から約90℃の間の温度を含む、前記（i）の方法；または
（iii）前記組成物がフィチン酸を含む、前記（i）または（ii）の方法。
【請求項２７】
以下の工程を含む、油を脱ガムする方法：
（a）フィターゼ活性を有するポリペプチドまたは請求項1に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程であって、前記ポリペプチドが請求項10に記載のアミノ酸配列を含む、前記工程；（b）植物油を含む組成物を提供する工程；および（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の植物油と、前記ポリペプチドがイノシトール-無機ホスフェート結合を切断する条件下で接触させ、それによって植物油を脱ガムする工程。
【請求項２８】
以下を含む、動物飼料または食品または飼料もしくは食品サプリメントを製造する方法：
（i）（a）植物、植物部分または植物細胞を、フィターゼ酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換する工程であって、前記フィターゼが請求項10に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは請求項1に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、前記工程；（b）前記植物、植物部分または植物細胞を、前記フィターゼ酵素が発現される条件下で培養する工程；および（c）前記植物、植物部分または植物細胞を、動物飼料または食品または飼料もしくは食品サプリメントに適した組成物に変換するか、または前記培養植物、植物部分または植物細胞を動物飼料または食品または飼料もしくは食品サプリメントに添加し、それによって動物飼料、または食品、または飼料もしくは食品サプリメントを製造する工程；
（ii）前記ポリヌクレオチドが発現ベクター内に収納され、さらに場合によって前記ベクターが、前記植物細胞内で核酸を発現させることができる発現制御配列を含む、前記（i）の方法；
（iii）前記動物が単胃動物であり、さらに場合によって前記動物が反芻動物である、前記（ii）の方法；または
（iv）前記動物飼料または食品または飼料もしくは食品サプリメントが、デリバリーマトリックス、ペレット、錠剤、ゲル、液体、スプレー、ひき割り穀物または粉末の形態として存在する、前記（i）から（iii）のいずれかの方法；
（v）前記デリバリーマトリックスが、穀物胚芽およびフィターゼ酵素を含む混合物をペレット化して粒子を生成することによって形成され、さらに場合によって前記ペレットが蒸気の適用を含む条件下で生成され、場合によって前記ペレットが80℃を超える温度を約5分間適用する工程を含む条件下で製造され、さらに場合によって、前記ペレットが、酵素1ミリグラム当たり少なくとも350から約900単位の比活性を含むフィターゼ酵素を含む、前記（iv）または（v）の方法。
【請求項２９】
以下を含む、動物または人間にフィターゼ酵素サプリメントをデリバーする方法：
（i）（a）食用担体および請求項10に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むフィターゼ酵素を含む食用デリバリーマトリックスを調製する工程であって、前記マトリックスが水性媒体に配置されたとき容易に分散してフィターゼを放出する、前記工程、および（b）前記食用酵素デリバリーマトリックスを動物または人間に投与する工程；
（ii）前記食用デリバリーマトリックスが顆粒状食用担体を含む、前記（i）の方法：
（iii）前記食用デリバリーマトリックスが、ペレット、錠剤、ゲル、液体、スラリー、懸濁液、スプレーまたは粉末の形態で存在する、前記（i）または（ii）の方法；
（iv）前記食用担体が、穀物胚芽、干草、アルファルファ、チモシー、ダイズ外皮、ひき割りヒマワリ種子、ひき割りトウモロコシ、ひき割りダイズおよびコムギ全粒粉から成る群から選択される担体を含む、前記（i）、（ii）または（iii）の方法；または
（v）前記食用担体が脱油した穀物胚芽を含む、前記（i）から（iv）のいずれかの方法。
【請求項３０】
動物または人間用の食品もしくは飼料または食品もしくは飼料サプリメントであって、（i）請求項10に記載のポリペプチドまたは請求項12に記載のヘテロダイマーを含む、前記食品もしくは飼料または食品もしくは飼料サプリメント；
（ii）前記ポリペプチドがグリコシル化されるか、または前記フィターゼ活性が耐熱性もしくは熱安定性である、前記（i）の食品もしくは飼料または食品もしくは飼料サプリメント；または
（iii）ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲルタブ、スプレー、粉末、スラリー、懸濁物または液状形として製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて生産されるか、または顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって生産される、前記（i）または（ii）の食品もしくは飼料または食品もしくは飼料サプリメント。
【請求項３１】
食用または吸収性酵素デリバリーマトリックスであって、
（i）請求項10に記載のポリペプチドまたは請求項12に記載のヘテロダイマーを含む、前記食用または吸収性酵素デリバリーマトリックス；
（ii）前記ポリペプチドがグリコシル化されるか、さらに場合によって前記フィターゼ活性が耐熱性もしくは熱安定性である、前記（i）の食用または吸収性酵素デリバリーマトリックス；または
（iii）ペレットを含むかまたはペレットの形状で製造されるか、またはペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲルタブ、スプレー、粉末、または液状形として製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて生産されるか、または顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって生産される、前記（i）または（ii）の食用または吸収性酵素デリバリーマトリックス。
【請求項３２】
食用または吸収性ペレットであって、
（i）顆粒状の食用または吸収性担体および請求項10に記載のポリペプチドまたは請求項12に記載のヘテロダイマーを含む、前記食用または吸収性ペレット
（ii）前記ポリペプチドがグリコシル化されるか、および／または前記ポリペプチドが耐熱性または熱安定性であるフィターゼ活性を有する、前記（i）の食用または吸収性ペレット；または
（iii）前記ペレットが、ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲルタブ、スプレー、粉末、または液体、スラリーもしくは懸濁物の形態で製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて生産されるか、または顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって生産される、前記（i）または（ii）の食用または吸収性ペレット。
【請求項３３】
ひき割りダイズであって、
（i）請求項10に記載のポリペプチドまたは請求項12に記載のヘテロダイマーを含む、前記ひき割りダイズ；または
（ii）ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲル、ゲルタブ、スプレー、粉末、スラリー、懸濁物または液状形として製造される、前記（i）のひき割りダイズ。
【請求項３４】
動物の消化系での酵素による不活化に対してフィターゼポリペプチドの耐性を高める方法であって、
（i）請求項10に記載のポリペプチドを含むフィターゼポリペプチドをグリコシル化し、それによって動物の消化系での酵素による不活化に対してフィターゼポリペプチドの耐性を高めることを含む、前記フィターゼポリペプチドの耐性を高める方法；
（ii）前記グリコシル化がN-結合グリコシル化である、前記（i）のフィターゼポリペプチドの耐性を高める方法；
（iii）前記フィターゼポリペプチドが、フィターゼをコードするポリヌクレオチドの細胞内でのin vivo発現の結果としてグリコシル化される、前記（i）または（ii）のフィターゼポリペプチドの耐性を高める方法；
（iv）前記細胞が真核細胞である、前記（i）から（iii）のいずれかのフィターゼポリペプチドの耐性を高める方法；または
（v）前記真核細胞が菌類細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である、前記（i）から（iv）のいずれかのフィターゼポリペプチドの耐性を高める方法。
【請求項３５】
以下の工程を含む、トウモロコシまたはソルガムの穀粒を加工する方法：
（a）フィターゼ活性を有するポリペプチドを提供する工程であって、前記ポリペプチドが請求項10に記載のポリペプチドを含む、前記工程；
（b）トウモロコシ浸漬液またはソルガム浸漬液を含む組成物を提供する工程；および
（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の組成物と、前記ポリペプチドがイノシトール-無機ホスフェート結合を切断することができる条件下で接触させる工程。
【請求項３６】
医薬または食餌用処方物であって、
（i）請求項10に記載のポリペプチドまたは請求項12に記載のヘテロダイマーを含む、前記医薬または食餌用処方物；
（ii）前記ポリペプチドがグリコシル化されるか、および／または前記フィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、前記（i）の医薬または食餌用処方物；
（iii）前記医薬または食餌用処方物が、ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲルタブ、スプレー、粉末、ローションまたは液状形として処方または製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて生産されるか、またはインプラントとして生産される、前記（i）または（ii）の医薬または食餌用処方物；または
（iv）顆粒形として製造されるか、または噴霧乾燥によって生産される、前記（i）から（iii）のいずれかの医薬または食餌用処方物。
【請求項３７】
（a）請求項10に記載のポリペプチド、または請求項12に記載のヘテロダイマー；および（b）表2に記載の生成物のいずれか、または表1に列挙される組成物のいずれかを含む組成物であって、場合によって前記ポリペプチドがグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、前記組成物。
【請求項３８】
請求項10に記載のポリペプチドまたは請求項12に記載のヘテロダイマーを含む、自己完結型形態食糧ユニット、飲料または水化剤であって、場合によって前記ポリペプチドがグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、前記完全食即席ユニット、飲料または水化剤。
【請求項３９】
骨粗しょう症を緩和する（その進行を遅らせるか、治療するかまたは予防する）方法であって、請求項10に記載のポリペプチドまたは請求項12に記載のヘテロダイマーを含む組成物の有効量（有効用量）をその必要がある個体に投与する工程を含み、さらに場合によって前記フィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、前記骨粗しょう症を緩和する方法。
【請求項４０】
請求項10に記載のポリペプチドまたは請求項12に記載のヘテロダイマーを含むチューイング錠であって、場合によって前記ポリペプチドがグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、前記チューイング錠。
【請求項４１】
請求項10に記載のポリペプチドまたは請求項12に記載のヘテロダイマーを含む焼成製品であって、場合によって前記ポリペプチドがグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、前記焼成製品。
【請求項４２】
請求項10に記載のポリペプチドまたは請求項12に記載のヘテロダイマーを含む朝食用シリアルであって、場合によって前記ポリペプチドがグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、前記朝食用シリアル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィターゼ、前記をコードするポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用とともに当該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造および単離に関する。具体的には、本発明は、高温条件下でフィターゼ活性を有するポリペプチド、および高温に暴露後に活性を保持するフィターゼを提供する。本発明のフィターゼは、高温に加えて低温でも耐熱性および／または熱安定性でありえる。本発明のフィターゼは食品で使用して、フィテートに富む成分の飼養価（feeding value）を改善することができる。本発明のフィターゼは、例えばフィテートの消化促進のために、食品もしくは飼料またはそのいずれかのためのサプリメントとして処方することができる。本発明の食品または飼料は、ペレット、液体、粉末などの形態として存在しえる。ある特徴では、本発明のフィターゼは、ペレット化の間の熱による変性に対して安定であり、このことは、フィターゼ製品のコストを削減し、一方、in vivo有効性および飼料中での活性の検出を保持する。
【背景技術】
【０００２】
ミネラルは全ての生物の成長に必須の成分である。食餌性ミネラルは、植物を含む多くの物質源から由来しえる。例えば、植物の種子はミネラルの豊富な供給源である。なぜならば、それらは、フィチン酸分子のリン酸基と複合体を形成するイオンを含むからである。これらのフィチン酸結合ミネラルは、いくつかの事例では、家畜動物（例えば複胃反芻動物）のいくつかの種の食餌の要件を満たす。したがって、いくつかの事例では、無機ホスフェートおよびミネラルによる食餌の補充要求は反芻動物では少ない。なぜならば、ルーメン内の微生物が、フィテート（ミオイノシトールヘキサホスフェート）のイノシトールおよび無機ホスフェートへの変換を触媒する酵素を産生するからである。このプロセスでは、フィチン酸と複合体を形成したミネラルが遊離される。家畜動物の大半の種は、しかしながら、フィチン酸結合ミネラルを効率的に利用することはできない。したがって、例えば単胃動物（例えばブタ、鳥類および魚類）の家畜群では、飼料には通常、消費動物の消化管フロラ環境を変化させて成長速度を加速するミネラルおよび／または抗生物質が補充される。
したがって、多くの適用においてフィテートの不十分な加水分解に関連する厄介な問題（栄養、ex vivo処理工程、保健および医薬、環境保全、並びに資源管理に関する問題）が存在する。以下はこれらの問題の非限定例である：
1）無機ミネラルによる食餌の補充は高額の出費である。
2）加水分解されていないフィテートの存在は、多くのex vivoでの適用で望ましくなく問題が多い（例えば望ましくないスラッジの出現をもたらす）。
3）抗生物質による食餌の補充は、多量の抗生物質耐性病原体を増加させることによって人間および動物に同様に医学的脅威となる。
4）糞便の未吸収ミネラルを環境中に廃棄することは周囲土壌の生態系、養殖場の水および表面水を広範囲に破壊しこれを損なう。
5）多くの潜在的な食品類の貴重な栄養物の提供がほとんど利用されずに浪費されたままである。
結果として、フィテート含有食品は、極めて多数の生物種による消費に際してそれら食品の不完全な栄養提供を修正するために、外因性の栄養物および／またはフィターゼ活性供給源による補充を必要とする。
結果として、多様な適用において効率的で費用効果に優れたフィテートの加水分解を達成するための手段が求められている。ある具体的な特徴では、人間および家畜による消費に対してフィテート含有食品類の栄養提供を改善する産業的処理方法の最適化が求められている。
【発明の概要】
【０００３】
発明の概要
本発明は、フィターゼ活性を有するポリペプチド、前記をコードするポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、並びにそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造および単離方法を提供する。ある特徴では、本発明は、高温条件下でフィターゼ活性を有するポリペプチド、および高温に暴露後に活性を保持するフィターゼを提供する。本発明のフィターゼは食品で使用して、フィテートに富む成分の飼養価を改善することができる。本発明のフィターゼは、例えばフィテートの消化促進のために、食品もしくは飼料またはそのいずれかのためのサプリメントとして処方することができる。本発明の食品または飼料は、ペレット、錠剤、ピル、液体、粉末、スプレーなどの形態として存在しえる。ある特徴では、本発明のフィターゼは、ペレット化の間の熱による変性に対して安定であり、これは、in vivo有効性および飼料中の活性の検出を保持しながらフィターゼ製品のコストを削減させる。
概要：
本発明は、
（a）（i）配列番号:1に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、さらに、139から141位のヌクレオチドがTTTまたはTTC；289から291位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；289から291位のヌクレオチドがGAAまたはGAG；406から408位のヌクレオチドがCATまたはCAC；475から477位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；475から477位のヌクレオチドがGAAまたはGAG；487から489位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；490から492位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；502から504位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；535から537位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；676から678位のヌクレオチドがGATまたはGAC；697から699位のヌクレオチドがTGG；823から825位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；865から867位のヌクレオチドがGCT、GCC、GCAまたはGCG；1045から1047位のヌクレオチドがTATまたはTAC；および1087から1089位のヌクレオチドがCCA、CCC、CCGまたはCCTから成る群から選択される、配列番号:1に対するヌクレオチド塩基対配列改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを有する核酸配列；または
（ii）配列番号:1に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、さらに、139から141位に相当する位置のヌクレオチドがTTTまたはTTC；289から291位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；289から291位に相当する位置のヌクレオチドがGAAまたはGAG；406から408位に相当する位置のヌクレオチドがCATまたはCAC；475から477位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；475から477位に相当する位置のヌクレオチドがGAAまたはGAG；487から489位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；490から492位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；502から504位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；535から537位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；676から678位に相当する位置のヌクレオチドがGATまたはGAC；697から699位に相当する位置のヌクレオチドがTGG；823から825位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；865から867位に相当する位置のヌクレオチドがGCT、GCC、GCAまたはGCG；1045から1047位に相当する位置のヌクレオチドがTATまたはTAC；および1087から1089位に相当する位置のヌクレオチドがCCA、CCC、CCGまたはCCTから成る群から選択される、配列番号:1に対するヌクレオチド塩基対配列改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを有する核酸配列；または
（iii）配列番号:2のアミノ酸47位のアミノ酸アラニンがフェニルアラニンに変化；配列番号:2のアミノ酸97位のアミノ酸システインがバリンに変化；配列番号:2のアミノ酸97位のアミノ酸システインがグルタミン酸に変化；配列番号:2のアミノ酸136位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに変化；配列番号:2のアミノ酸159位のアミノ酸アスパラギンがバリンに変化；配列番号:2のアミノ酸159位のアミノ酸アスパラギンがグルタミン酸に変化；配列番号:2のアミノ酸163位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸164位のアミノ酸アスパラギン酸がアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸168位のアミノ酸グルタミン酸がアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸179位のアミノ酸グリシンがアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸226位のアミノ酸システインがアスパラギン酸に変化；配列番号:2のアミノ酸233位のアミノ酸バリンがトリプトファンに変化；配列番号:2のアミノ酸275位のアミノ酸グルタミンがバリンに変化；配列番号:2のアミノ酸289位のアミノ酸アルギニンがアラニンに変化；配列番号:2のアミノ酸349位のアミノ酸スレオニンがチロシンに変化；および配列番号:2のアミノ酸363位のアミノ酸ロイシンがプロリンに変化から成る群から選択される、配列番号:2に対するアミノ酸残基改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含む配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（iv）配列番号:2のアミノ酸47位のアラニンに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに変化；配列番号:2のアミノ酸97位のシステインに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；配列番号:2のアミノ酸97位のシステインに相当する位置のアミノ酸がグルタミン酸に変化；配列番号:2のアミノ酸136位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに変化；配列番号:2のアミノ酸159位のアスパラギンに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；配列番号:2のアミノ酸159位のアスパラギンに相当する位置のアミノ酸がグルタミン酸に変化；配列番号:2のアミノ酸163位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸164位のアスパラギン酸に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸168位のグルタミン酸に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸179位のグリシンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸226位のシステインに相当する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に変化；配列番号:2のアミノ酸233位のバリンに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに変化；配列番号:2のアミノ酸275位のグルタミンに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；配列番号:2のアミノ酸289位のアルギニンに相当する位置のアミノ酸がアラニンに変化；配列番号:2のアミノ酸349位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がチロシンに変化；および配列番号:2のアミノ酸363位のロイシンに相当する位置のアミノ酸がプロリンに変化から成る群から選択される、配列番号:2に対するアミノ酸残基改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含む配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離、合成または組換え核酸であって、前記核酸がフィターゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードし、さらに場合によって前記配列同一性が配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、または目視精査によって決定される、前記単離、合成または組換え核酸；または（b）前記と完全に相補的な配列を提供する。これらの核酸のいずれも、“本発明のポリペプチド”をコードする“本発明の核酸”である。
【０００４】
ある特徴では、配列比較アルゴリズムは、BLASTバージョン2.2.2アルゴリズムであり、ここでフィルタリング設定はblastall -p blastp -d “nr pataa” -F Fに設定され、他の全てのオプションは規定値に設定される。
ある特徴では、フィターゼ活性は、フィテート（ミオイノシトールヘキサホスフェート）のイノシトールおよび無機ホスフェートへの触媒活性；またはフィテート（ミオイノシトールヘキサホスフェート）の加水分解を含む。ある特徴では、フィターゼ活性は耐熱性であり、さらに場合によって、前記ポリペプチドは、約40℃から約70℃、または約37℃から約100℃、または37℃を超える温度から約50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃またはそれより高い範囲の温度に暴露された後でフィターゼ活性を保持する。ある特徴では、フィターゼ活性は熱安定性であり、さらに場合によって、前記ポリペプチドは、約40℃から約70℃、または約37℃から約100℃、または37℃を超える温度から約50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃またはそれより高い範囲の温度でフィターゼ活性を保持する。
本発明は、本発明の核酸を含むか、または本発明の核酸（本発明のポリペプチドコードする核酸を含む）をその中に収納してある、発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクターを提供し、ここで前記クローニングビヒクルは場合によって、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージまたは人工染色体を含むか、または前記であり、さらに場合によって、前記ウイルスベクターはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクターを含み、さらに場合によって前記発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクターは、細菌人工染色体、プラスミド、バクテリオファージP1-由来ベクター（PAC)、酵母人工染色体（YAC）、哺乳動物人工染色体（MAC）を含むか、または前記に収納される。
【０００５】
本発明は、本発明の核酸を含むか、または、本発明の核酸（本発明のポリペプチドコードする核酸を含む）または本発明の発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクターをその中に収納してある、形質転換細胞、形質導入細胞、宿主細胞などを提供し、ここで前記細胞は場合によって、細菌細胞、哺乳動物細胞、菌類細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞である。
本発明は、本発明の核酸を含むか、または本発明の核酸（本発明のポリペプチドコードする核酸を含む）または本発明の発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクターをその中に収納してある、トランスジェニック非ヒト動物を提供し、ここで前記動物は場合によってマウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ブタまたはウシである。
本発明は、本発明の核酸を含むか、または本発明の核酸（本発明のポリペプチドコードする核酸を含む）または本発明の発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクターをその中に収納してある、トランスジェニック植物（植物の部分（例えば加工または収穫された、例えば葉、茎、根または果実を含む）または種子を提供し、ここで前記植物は場合によって、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、コムギ、オイルシード植物、アブラナ、ダイズ、またはタバコであり、前記種子は場合によって、トウモロコシ、コムギ、オイルシード植物、ナタネ、ダイズ、ヤシ、ヒマワリ、ゴマ、落花生、またはタバコの種子である。また別の実施態様では、本発明の種子または植物から得られた植物または種子、または本発明の植物または種子は、作物、例えばトウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、ブラシカ（Brassica）、ダイズ、ワタ、ベニバナ、落花生、ソルガム、コムギ、エンバク、ライムギ、アワ、オオムギ、イネ、針葉樹、豆類作物（例えばエンドウ、インゲンおよびダイズ）、デンプン質の塊茎／根（例えばジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、タロイモ、カンナおよびテンサイなど）を含むことができ、また前記植物は、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、コムギ、オイルシード植物、アブラナ、ダイズ、もしくはタバコ、または動物用もしくは反芻動物用の飼葉および／または飼料植物であってもよく、または前記植物は飼葉であるかまたは飼葉を含むことができ、または前記飼料植物は干草、トウモロコシ、アワ、ダイズ、コムギ、ソバ、オオムギ、アルファルファ、ライムギ、一年生牧草、ソルガム、モロコシ属牧草、ヴェルトグラス（veldt grass）またはブッフェルグラス（buffel grass）であり、または前記種子は、トウモロコシ、コムギ、オイルシード植物、ナタネ、ダイズ、ヤシ、ヒマワリ、ゴマ、落花生もしくは落花生の種子、アルファルファ、ワタ、ベニバナ、ソルガム、エンバク、ライムギ、アワ、オオムギ、コメ、エンドウ、タバコの種子であり、または前記植物は、ダイズ、アルファルファ、ヒマワリ、ブラシカ、ダイズ、サトウキビ、ワタ、ベニバナ、落花生、ソルガム、コムギ、エンバク、ライムギ、アワ、オオムギ、イネ、針葉樹、エンドウマメ、インゲン、ダイズ、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、タロイモ、カンナまたはテンサイである。
【０００６】
本発明は、本発明の核酸および配列番号:1に対するヌクレオチド塩基対改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここで、場合によって前記オリゴヌクレオチドは、長さが約10から50、約20から60、約30から70、約40から80、約60から100または約50から150塩基である。本発明はまた、本発明のアンチセンス配列を含むリボザイムおよび／またはiRNA（例えばsiRNAまたはmiRNA）を提供する。
本発明は、細胞でフィターゼメッセージの翻訳を阻害する方法を提供し、前記方法は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への投与、または細胞における前記の発現を含む。
本発明は、
（a）（i）配列番号:2に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、さらに、139から141位のヌクレオチドがTTTまたはTTC；289から291位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；289から291位のヌクレオチドがGAAまたはGAG；406から408位のヌクレオチドがCATまたはCAC；475から477位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；475から477位のヌクレオチドがGAAまたはGAG；487から489位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；490から492位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；502から504位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；535から537位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；676から678位のヌクレオチドがGATまたはGAC；697から699位のヌクレオチドがTGG；823から825位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；865から867位のヌクレオチドがGCT、GCC、GCAまたはGCG；1045から1047位のヌクレオチドがTATまたはTAC；および1087から1089位のヌクレオチドがCCA、CCC、CCGまたはCCTから成る群から選択される、配列番号:1に対するヌクレオチド塩基対配列改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列；または
（ii）配列番号:2に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、さらに、139から141位に相当する位置のヌクレオチドがTTTまたはTTC；289から291位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；289から291位に相当する位置のヌクレオチドがGAAまたはGAG；406から408位に相当する位置のヌクレオチドがCATまたはCAC；475から477位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；475から477位に相当する位置のヌクレオチドがGAAまたはGAG；487から489位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；490から492位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；502から504位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；535から537位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；676から678位に相当する位置のヌクレオチドがGATまたはGAC；697から699位に相当する位置のヌクレオチドがTGG；823から825位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；865から867位に相当する位置のヌクレオチドがGCT、GCC、GCAまたはGCG；1045から1047位に相当する位置のヌクレオチドがTATまたはTAC；および1087から1089位に相当する位置のヌクレオチドがCCA、CCC、CCGまたはCCTから成る群から選択される、配列番号:1に対するヌクレオチド塩基対配列改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列；または
（iii）配列番号:2のアミノ酸47位のアミノ酸アラニンがフェニルアラニンに変化；配列番号:2のアミノ酸97位のアミノ酸システインがバリンに変化；配列番号:2のアミノ酸97位のアミノ酸システインがグルタミン酸に変化；配列番号:2のアミノ酸136位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに変化；配列番号:2のアミノ酸159位のアミノ酸アスパラギンがバリンに変化；配列番号:2のアミノ酸159位のアミノ酸アスパラギンがグルタミン酸に変化；配列番号:2のアミノ酸163位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸164位のアミノ酸アスパラギン酸がアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸168位のアミノ酸グルタミン酸がアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸179位のアミノ酸グリシンがアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸226位のアミノ酸システインがアスパラギン酸に変化；配列番号:2のアミノ酸233位のアミノ酸バリンがトリプトファンに変化；配列番号:2のアミノ酸275位のアミノ酸グルタミンがバリンに変化；配列番号:2のアミノ酸289位のアミノ酸アルギニンがアラニンに変化；配列番号:2のアミノ酸349位のアミノ酸スレオニンがチロシンに変化；および配列番号:2のアミノ酸363位のアミノ酸ロイシンがプロリンに変化から成る群から選択される、配列番号:2に対するアミノ酸残基改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含むアミノ酸配列；または
（iv）配列番号:2のアミノ酸47位のアラニンに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに変化；配列番号:2のアミノ酸97位のシステインに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；配列番号:2のアミノ酸97位のシステインに相当する位置のアミノ酸がグルタミン酸に変化；配列番号:2のアミノ酸136位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに変化；配列番号:2のアミノ酸159位のアスパラギンに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；配列番号:2のアミノ酸159位のアスパラギンに相当する位置のアミノ酸がグルタミン酸に変化；配列番号:2のアミノ酸163位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸164位のアスパラギン酸に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸168位のグルタミン酸に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸179位のグリシンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸226位のシステインに相当する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に変化；配列番号:2のアミノ酸233位のバリンに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに変化；配列番号:2のアミノ酸275位のグルタミンに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；配列番号:2のアミノ酸289位のアルギニンに相当する位置のアミノ酸がアラニンに変化；配列番号:2のアミノ酸349位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がチロシンに変化；および配列番号:2のアミノ酸363位のロイシンに相当する位置のアミノ酸がプロリンに変化から成る群から選択される、配列番号:2に対するアミノ酸残基改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含むアミノ酸配列を含む、単離、合成または組換えポリペプチドを提供し、
ここで、前記核酸はフィターゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードし、さらに場合によって前記配列同一性は配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、または目視精査によって決定され、
さらに前記ポリペプチドはフィターゼ活性を有し、場合によって前記フィターゼ活性は、フィテート（ミオイノシトールヘキサホスフェート）のイノシトールおよび無機ホスフェートへの触媒活性またはフィテート（ミオイノシトールヘキサホスフェート）の加水分解を含む。
【０００７】
本発明は、その活性が耐熱性であるフィターゼ活性を有する本発明のポリペプチドを提供し、場合によって前記ポリペプチドは、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃の範囲の温度、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃またはそれより高い温度に暴露後にフィターゼ活性を保持する。本発明の耐熱性ポリペプチドは、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃の範囲の温度、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃またはそれより高い温度に暴露後に活性（例えばフィターゼ活性）を保持することができる。いくつかの実施態様では、本発明の耐熱性ポリペプチドは、約pH3.0、約pH3.5、約pH4.0、約pH4.5、約pH5.0、約pH5.5、約pH6.0、約pH6.5、約pH7.0、約pH7.5、約pH8.0、約pH8.5、約pH9.0、約pH9.5、約pH10.0、約pH10.5、約pH11.0、約pH11.5、約pH12.0またはそれより高いpHで上記記載の範囲の温度に暴露後に活性（例えばフィターゼ活性）を保持する。
【０００８】
本発明は、その活性が熱安定性であるフィターゼ活性を有する本発明のポリペプチドを提供する。例えば、本発明のポリペプチドは熱安定性でありえる。本発明の熱安定性ポリペプチドは、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約37℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃の範囲の温度、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃またはそれより高い温度を含む条件下で、結合活性および／または酵素活性（例えばフィターゼ活性）を保持することができる。本発明の熱安定性ポリペプチドは、約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃の範囲の温度、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃またはそれより高い温度で活性（例えばフィターゼ活性）を保持することができる。いくつかの実施態様では、本発明の熱安定性ポリペプチドは、約pH3.0、約pH3.5、約pH4.0、約pH4.5、約pH5.0、約pH5.5、約pH6.0、約pH6.5、約pH7.0、約pH7.5、約pH8.0、約pH8.5、約pH9.0、約pH9.5、約pH10.0、約pH10.5、約pH11.0、約pH11.5、約pH12.0またはそれより高いpHで上記に記載の範囲の温度で活性（例えばフィターゼ活性）を保持する。
本発明は、本発明のアミノ酸配列を含み、さらに（a）シグナル配列（リーダーペプチド）を欠くか；（b）シグナル配列（リーダーペプチド）を欠き、さらに異種シグナル配列（リーダーペプチド）を含むか；（c）（a）または（b）のアミノ酸配列を含み、さらに異種配列を含む単離、合成または組換えポリペプチドを提供し、ここで前記異種配列は場合によって識別ペプチドを含む。
【０００９】
ある特徴では、本発明の任意のポリペプチドのフィターゼ活性は、約37℃でタンパク質1ミリグラム当たり約100から約1000単位の範囲、またはタンパク質1ミリグラム当たり約500から約750単位、または37℃でタンパク質1ミリグラム当たり約500から約1200単位の範囲、または37℃でタンパク質1ミリグラム当たり約750から約1000単位の範囲の比活性を含む（有する）。ある特徴では、前記耐熱性フィターゼ活性は、約37℃の温度に暴露した後でタンパク質1ミリグラム当たり約100から約1000単位の範囲の比活性を含むか、または前記熱安定性フィターゼ活性は、タンパク質1ミリグラム当たり約500から約750単位の比活性を含むか、または前記熱安定性フィターゼ活性は、37℃でタンパク質1ミリグラム当たり約500から約1200単位の範囲の比活性を含むか、または前記熱安定性フィターゼ活性は、37℃でタンパク質1ミリグラム当たり約750から約1000単位の範囲の比活性を含む。ある特徴では、前記熱安定性フィターゼ活性は、約37℃の温度を含む条件下でタンパク質1ミリグラム当たり約100から約1000単位の範囲の比活性を含むか、または前記熱安定性フィターゼ活性は、タンパク質1ミリグラム当たり約500から約750単位の比活性を含むか、または前記熱安定性フィターゼ活性は、37℃でタンパク質1ミリグラム当たり約500から約1200単位の範囲の比活性を含むか、または前記熱安定性フィターゼ活性は、37℃でタンパク質1ミリグラム当たり約750から約1000単位の範囲の比活性を含む。
【００１０】
ある特徴では、本発明は少なくとも1つのグリコシル化部位を含み、ここで前記グリコシル化は場合によって、N-結合グリコシル化またはO-結合グリコシル化であり、さらに前記ポリペプチドは場合によって、酵母（前記は場合によってP. パストリス（pastoris）またはS. ポンベ（pombe））で発現後にグリコシル化される。
ある特徴では、前記ポリペプチドは、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH4.0、pH3.5、pH3.0、またはそれより低い（酸性の）pHを含む条件下でフィターゼ活性を保持する。また別には、本発明のポリペプチドは、約pH7.5、pH8、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10.0、pH10.5、pH11.0、pH11.5、pH12、pH12.5またはそれより高い（塩基性の）pHを含む条件下でフィターゼ活性を保持することができる。
本発明は本発明のポリペプチドを含むタンパク質調製物を提供し、ここで前記タンパク質調製物は、液体、スラリー、粉末、スプレー、懸濁物、凍結乾燥組成物／処方物、固体、ゲルタブ、ピル、インプラント、ゲルの形態、または医薬処方物、食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養サプリメントまたはその食餌用サプリメントを含む。
本発明は本発明のポリペプチドを含むヘテロダイマーを提供し、ある特徴では、前記ヘテロダイマーは第二のドメインを含み、ここで、前記第二のドメインは場合によってポリペプチドでありかつ前記ヘテロダイマーは融合タンパク質であり、さらに前記第二のドメインは場合によってエピトープまたはタグである。
本発明は本発明のポリペプチドを含む固定化されたポリペプチドを提供し、ここで、前記固定化ポリペプチドは本発明のホモダイマーまたはヘテロダイマーを含むことができ、前記ポリペプチドは場合によって細胞、小胞、リポソーム、フィルム、メンブレン、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、石墨粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレー、キャピラリー管、結晶、錠剤、ピル、カプセル、粉末、集塊、表面、または多孔質構造の上部または内部に固定される。ある特徴では、本発明は固定化ポリペプチドを含むアレイ（例えばマイクロアレイ）を提供し、ここで、前記ポリペプチドは、本発明のポリペプチドまたは本発明のヘテロダイマーまたは本発明の核酸またはその組合せを含む。
本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する単離、合成または組換え抗体を提供し、ここで、前記抗体は場合によってモノクローナルまたはポリクローナル抗体である。本発明は、本発明の抗体を含むハイブリドーマを提供する。
【００１１】
本発明は、(a)プロモーターに機能可能に結合した本発明の配列を含む核酸を提供する工程；および(b)工程(a)の核酸をポリペプチドが発現できる条件下で発現させ、それによって組換えポリペプチドを製造する工程を含む、組換えポリペプチドを製造する方法を提供する。場合により、前記方法はさらに工程(a）の核酸で宿主細胞を形質転換し、続いて工程（a)の核酸を発現させ、それにより形質転換宿主細胞において組換えポリペプチドを製造する工程をさらに含む。
【００１２】
本発明は、（a）本発明のポリペプチドを提供する工程；（b）フィターゼ基質を提供する工程；および（c）工程（a）のポリペプチドもしくはそのフラグメントまたは変種を工程（b）の基質と接触させ、基質量の低下または反応生成物量の増加を検出する工程を含む、フィターゼ活性を有するポリペプチドを同定する方法を提供し、ここで、基質量の低下または反応生成物量の増加によってフィターゼ活性を有するポリペプチドが検出される。
本発明は、（a）本発明のポリペプチドを提供する工程；（b）試験基質を提供する工程；および（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の試験基質と接触させ、基質量の増加または反応生成物量の低下を検出する工程を含む、フィターゼ基質を同定する方法を提供し、ここで基質量が低下または反応生成物量が増加したら前記試験基質をフィターゼ基質と同定する。
本発明は、（a）核酸または前記核酸を含むベクターを、前記核酸のポリペプチドへの翻訳を可能とする条件下で発現させる工程（ここで前記核酸は本発明の配列を含む）；（b）前記ポリペプチドを試験化合物と接触させる工程；および（c）前記試験化合物が前記ポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定し、それによって化合物がポリペプチドと特異的に結合することを決定する工程を含む、ある化合物がポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する方法を提供する。
本発明は、（a）本発明のフィターゼポリペプチドを提供する工程；（b）試験化合物を提供する工程；および（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の試験化合物と接触させてフィターゼの活性を測定する工程を含む、フィターゼ活性の調節物質を同定する方法を提供し、ここで、試験化合物の非存在下の活性と比較して試験化合物の存在下で測定されるフィターゼ活性の変化が、前記試験化合物はフィターゼ活性を調節すると決定され、ここで、場合によって前記フィターゼ活性は、フィターゼ基質を提供し、基質量の増加または反応生成物量の低下を検出することによって測定され、さらに場合によって、試験化合物の非存在下における基質または反応生成物の量と比較して、試験化合物の存在下で基質量の低下または反応生成物量の増加があれば、前記試験化合物はフィターゼ活性のアクチベーターと同定され、さらに場合によって、試験化合物の非存在下における基質または反応生成物の量と比較して、試験化合物の存在下で基質量の増加または反応生成物量の低下があれば、前記試験化合物はフィターゼ活性のインヒビターと同定される。
【００１３】
本発明は、プロセッサーおよびデータ保存装置を含むコンピュータシステムを提供し、前記データ保存装置にはポリペプチド配列または核酸配列が保存されてあり、ここで前記ポリペプチド配列は本発明の配列を含み、前記核酸は本発明の配列を含み、さらに場合によって、前記方法はさらに配列比較アルゴリズム、及び少なくとも1つの参照配列が保存されたデータ保存装置を含み、さらに場合によって、前記配列比較アルゴリズムは多型性を表示するコンピュータプログラムを含み、さらに場合によって、前記方法はさらに、前記配列における1つ以上の特徴を識別するアイデンティファイアーを含む。本発明はコンピュータ読み出し可能媒体を提供し、前記媒体には、ポリペプチド配列または核酸配列が保存されてあり、ここで前記ポリペプチド配列は本発明のアミノ酸配列を含み、前記核酸は本発明の配列を含む。本発明は、以下の工程を含む配列の特徴を識別する方法を提供する：（a）配列内の1つ以上の特徴を識別するコンピュータプログラムを用いて配列を読み取る工程（前記配列はポリペプチド配列または核酸配列を含み、ここで前記ポリペプチド配列は本発明のアミノ酸配列を含み、前記核酸は本発明の配列を含む）；および（b）前記コンピュータプログラムにより前記配列の1つ以上の特徴を識別する工程。本発明は、以下の工程を含む第一の配列と第二の配列を比較する方法を提供する：（a）配列を比較するコンピュータプログラムを用いて第一の配列および第二の配列を読み取る工程（前記第一の配列はポリペプチド配列または核酸配列を含み、ここで前記ポリペプチド配列は本発明のアミノ酸配列を含み、前記核酸は本発明の配列を含む）；および（b）第一の配列と第二の配列との間の相違を前記コンピュータプログラムにより決定する工程。ここで、第一の配列と第二の配列との間の相違を決定する工程はさらに多型性を識別する工程を含み、場合によって前記方法はさらに、配列内の1つ以上の特徴を識別するアイデンティファイヤーを含み、さらに場合によって前記方法は、コンピュータプログラムを用いて第一の配列を読み取り、前記配列内の1つ以上の特徴を識別する工程を含む。
【００１４】
本発明は、以下の工程を含む、イノシトールヘキサホスフェートをイノシトールと無機ホスフェートに加水分解する方法を提供する：（a）フィターゼ活性を有するポリペプチド（前記ポリペプチドは本発明のアミノ酸配列を含む）または本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）イノシトールヘキサホスフェートを含む組成物を提供する工程；および（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の組成物と、前記ポリペプチドがイノシトールヘキサホスフェートを加水分解してイノシトールおよび無機ホスフェートを生成する条件下で接触させる工程、ここで場合によって前記条件は、約37℃から約70℃、約50℃から約80℃、または約60℃から約90℃の間の温度を含み、場合によって前記組成物はフィチン酸を含む。
本発明は、以下の工程を含む、油を脱ガムする方法を提供する：（a）フィターゼ活性を有するポリペプチド（前記ポリペプチドは本発明のアミノ酸配列を含む）または本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）植物油を含む組成物を提供する工程；および（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の植物油と、前記ポリペプチドがイノシトール-無機ホスフェート結合を切断する条件下で接触させ、それによって植物油を脱ガムする工程。
【００１５】
本発明は、以下の工程を含む、飼料もしくは食品、または飼料もしくは食品サプリメント、または飼料もしくは食品添加物、または栄養サプリメント、または食餌用サプリメントを製造する方法を提供する：（a）植物、植物の部分または植物細胞を、フィターゼ酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換する工程（ここで前記フィターゼは、本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む）；（b）前記植物、植物の部分または植物細胞を、前記フィターゼ酵素が発現される条件下で培養（栽培）する工程；および（c）前記植物、植物の部分または植物細胞を、食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養サプリメント、または食餌用サプリメントに適した組成物に変換するか、または前記培養した植物、植物の部分または植物細胞を食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養サプリメントまたは食餌用サプリメントに添加し、それによって食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養サプリメントまたは食餌用サプリメントを製造する工程、ここで、前記ポリヌクレオチドは場合によって発現ベクター内に収納され、さらに場合によって前記ベクターは前記植物細胞内で核酸を発現させることができる発現制御配列を含み、さらに場合によって、前記食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養サプリメントまたは食餌用サプリメントに添加し、それによって食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養サプリメントまたは食餌用サプリメントは動物用であり、さらに場合によって前記動物は単胃動物であり、さらに場合によって前記動物は反芻動物であり、さらに場合によって前記食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養サプリメントまたは食餌用サプリメントは、デリバリーマトリックス、ペレット、錠剤、ゲル、液体、スプレー、ひき割り穀物または粉末の形態として存在する。ある特徴では、フィターゼ酵素はグリコシル化されてペレット化条件での耐熱性または熱安定性を提供し、さらに場合によって、デリバリーマトリックスは、穀物胚芽およびフィターゼ酵素を含む混合物をペレット化して粒子を生成することによって形成され、さらに場合によって前記ペレットは蒸気の適用を含む条件下で生成され、場合によって前記ペレットは80℃を超える温度を約5分間適用する工程を含む条件下で生成され、さらに場合によって、前記ペレットは、酵素1ミリグラム当たり少なくとも350から約900単位の比活性を含むフィターゼ酵素を含む。
【００１６】
本発明は、動物または人間にフィターゼ酵素サプリメントをデリバーする方法を提供する。前記方法は、（a）食用担体および本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むフィターゼ酵素を含む食用デリバリーマトリックスを調製する工程（ここで前記マトリックスは、水性媒体に置いたとき容易に分散してフィターゼを放出する）、および（b）前記食用酵素デリバリーマトリックスを動物または人間に投与する工程を含み、ここで場合によって前記食用デリバリーマトリックスは顆粒状食用担体を含み、さらに場合によって前記食用デリバリーマトリックスは、ペレット、錠剤、ゲル、液体、スプレーまたは粉末の形態で存在し、さらに場合によって前記食用担体は、穀物胚芽、干草、アルファルファ、チモシー、ダイズ外皮、ひき割りヒマワリ種子、ひき割りトウモロコシ、ひき割りダイズおよびコムギ全粒粉から成る群から選択される担体を含み、さらに場合によって前記食用担体は脱油した（spent of oil）穀物胚芽を含む。
本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明のホモダイマーもしくはヘテロダイマーを含む、動物または人間用の食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養サプリメントまたは食餌用サプリメントを提供し、ここで場合によって、前記ポリペプチドはグリコシル化され、さらに場合によって、前記フィターゼ活性は耐熱性または熱安定性である。ある特徴では、食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食品添加物、飼料添加物、栄養サプリメントまたは食餌用サプリメントは、ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲル、ゲルタブ、スプレー、粉末、凍結乾燥処方物、医薬処方物、液状形で、懸濁物もしくはスラリーとして製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて生産されるか、または顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって生産される。
【００１７】
本発明は、本発明のポリペプチド、または本発明のホモダイマーもしくはヘテロダイマーを含む食用または吸収性酵素デリバリーマトリックスを提供し、ここで、場合によって前記ポリペプチドはグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性は耐熱性または熱安定性である。ある特徴では、前記食用デリバリーマトリックスはペレットを含むか、または前記食用もしくは吸収性酵素デリバリーマトリックスは、ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲル、ゲルタブ、スプレー、粉末、凍結乾燥処方物、医薬処方物、液状形で、懸濁物もしくはスラリーとして製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて生産されるか、または顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって生産される。
本発明は、顆粒状の食用または吸収性担体および本発明のポリペプチド、または本発明のホモダイマーもしくはヘテロダイマーを含む食用または吸収性ペレットを提供し、ここで、場合によって前記ポリペプチドはグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性は耐熱性または熱安定性であり、さらに場合によって前記ペレットは、ペレットの形状で、またはピル、錠剤、カプセル、ゲル、ゲルタブ、スプレー、粉末、凍結乾燥処方物、医薬処方物、液状形として、懸濁物もしくはスラリーとして製造されるか、またはポリマー被覆添加物を用いて生産されるか、または顆粒形で製造されるか、または噴霧乾燥によって生産される。
本発明は、本発明のポリペプチド、または本発明のホモダイマーもしくはヘテロダイマーを含むひき割り（例えばひき割りダイズ）を提供し、場合によって前記ひき割り（例えばひき割りダイズ）は、ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲル、ゲルタブ、スプレー、粉末、凍結乾燥処方物、医薬処方物として製造される。
本発明は、動物の消化管における酵素的不活化に対するフィターゼポリペプチドの耐性を高める方法を提供する。前記方法は、本発明のポリペプチドを含むフィターゼポリペプチドをグリコシル化する工程を含み、それによって動物の消化管における酵素的不活化に対するフィターゼポリペプチドの耐性を高める方法であり、場合によって前記グリコシル化はN-結合グリコシル化であり、さらに場合によって前記フィターゼポリペプチドは、フィターゼをコードするポリヌクレオチドの細胞内でのin vivo発現の結果としてグリコシル化され、さらに場合によって前記細胞は真核細胞であり、さらに場合によって前記真核細胞は菌類細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である。
【００１８】
本発明は、以下の工程を含むトウモロコシおよびソルガムの穀粒を加工する方法を提供する：（a）フィターゼ活性を有するポリペプチドを提供する工程（前記ポリペプチドは本発明のポリペプチドを含む）；（b）トウモロコシ浸漬液またはソルガム浸漬液を含む組成物を提供する工程；および（c）工程（a）のポリペプチドおよび工程（b）の組成物を、前記ポリペプチドがイノシトール-無機ホスフェート結合を切断することができる条件下で接触させる工程。
本発明は、本発明のポリペプチドまたはヘテロダイマーを含む医薬または食餌用処方物を提供し、ここで、場合によって前記ポリペプチドはグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性は耐熱性または熱安定性であり、さらに場合によって前記医薬または食餌用処方物は、ペレット、ピル、錠剤、カプセル、ゲルタブ、スプレー、粉末、ローション、または液状形として処方されるか、またはポリマー被覆添加物を用いてもしくはインプラントとして生産されるか、または顆粒状形として製造されるか、または噴霧乾燥によって生産される。
本発明は、本発明のポリペプチドまたはヘテロダイマー；および（b）表2に示される生成物のいずれかまたは表1に列挙される組成物のいずれか含む組成物を提供し、ここで、場合によって前記ポリペプチドはグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性は耐熱性または熱安定性である。
本発明は、本発明のポリペプチドまたはヘテロダイマーを含む、自己完結型携帯食糧ユニット（self-contained meal Ready-to-Eat unit, MRE）、飲料または水化剤を提供し、ここで、場合によって前記ポリペプチドはグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性は耐熱性または熱安定性である。
本発明は、本発明のポリペプチドまたはヘテロダイマーを含む組成物の有効量（用量）をその必要がある個体に投与する工程を含む、骨粗しょう症を緩和する（進行を遅らせるか、治療するかまたは予防する）方法を提供し、ここで、場合によって前記ポリペプチドはグリコシル化され、さらに場合によって前記フィターゼ活性は耐熱性または熱安定性である。
本発明の1つ以上の特徴の詳細は、添付の図面および以下の記述で説明される。本発明の他の特徴、目的および利点はこれらの記述および図面並びに特許請求の範囲から明白であろう。
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、GenBank配列およびATCC寄託物は、いずれの目的についても参照により明白に本明細書に含まれる。
以下の図面は本発明の特徴の例示であって、特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を限定しようとするものではない。
種々の図面中の同じ参照記号は同じ成分を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】下記に詳細に記載する、コンピュータシステムのブロック図である。
【図２】下記に詳細に記載するように、新規なヌクレオチド又はタンパク質配列とデータベースの配列を比較して、前記新規配列とデータベース配列との間の相同性レベルを決定するプロセス200の１つの特徴を示す流れ図である。
【図３】下記に詳細に記載するように、2つの配列が相同であるか否かを決定するためのコンピュータ処理の１つの実施態様を示す流れ図である。
【図４】下記に詳細に記載するように、配列中に特徴が存在するか否かを検出するためのアイデンティファイヤー処理の１つの特徴を示す流れ図である。
【図５】種々の温度で30分間熱処理した後の本発明の精製ポリペプチド（本発明の単一変異を含む例示的配列）の残存活性の要約を示す。ここでは、下記実施例1に詳細に記載するように、フィターゼ活性は蛍光基質を用いてアッセイし、その比率を各々対応する未処理サンプルの比率と比較した。
【図６】サーモサイクラーで熱処理した後の、“ブレンドした”単一残基変異を含む本発明の精製ポリペプチドの残存活性の要約を示す。ここでは、下記の実施例1に詳細に記載し、図6に要約するように、フィターゼ活性は蛍光基質を用いてアッセイし、その比率を各々対応する未処理サンプルの比率と比較した。
【図７】下記の実施例1の詳細な記載のとおり図6のグラフの作成に使用したデータをグラフにまとめたものである。
【図８】親フィターゼの配列（配列番号:2）および、下記で詳細に記載する、ジーンリアッセンブリ(商標)（GeneReassemblyTM）ライブラリー構築のために選択した、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）により作製した配列改変を示す。
【図９】本明細書に詳細に記載する、親の配列番号:2に対する多様な残基改変を有する例示的フィターゼを示す。
【図１０】本明細書に詳細に記載する、親の配列番号:2に対して単一残基改変を有する例示的フィターゼを示す。
【図１１】下記実施例1に詳細に記載する、蛍光基質4-メチルウンベリフェリルホスフェート（MeUMB-ホスフェート）を用いる本発明の例示的フィターゼアッセイの模式図である。
【図１２】下記実施例1に詳細に記載する、蛍光基質MeUMB-ホスフェートを用いる本発明の例示的フィターゼアッセイの模式図である。
【図１３】下記実施例1に詳細に記載する、図12に記載の例示的ライブラリースクリーニングのためのプロトコルの模式図である。
【図１４】本発明のフィターゼの使用を取り入れることができる例示的アルコール製法の図解である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、上記に記載したように、配列番号:2に対して特別な残基改変を含むフィターゼポリペプチド、および前記をコードするポリヌクレオチド（例えば、上記に記載したように配列番号:1に対する特別な塩基対改変を含む）とともに、前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを使用する方法に関する。図10は、親の配列番号:2に対して単一残基改変を有する例示的フィターゼを示し、図9は、親の配列番号:2に対して多重残基改変を有する例示的フィターゼを示す。
本発明のポリペプチドのフィターゼ活性は、任意のフィターゼ活性を有する酵素、例えばフィテートの分解を触媒する、例えばフィテート（ミオイノシトールヘキサホスフェート）をイノシトールおよび無機ホスフェートへ触媒することができる酵素を包含することができる。本発明のフィターゼには耐熱性および熱安定性酵素が含まれる。
本発明のフィターゼおよび本発明のフィターゼをコードするポリヌクレオチドは、多数のプロセス、方法および組成物で有用である。例えば、上記で考察したように、フィターゼは、動物の飼料および飼料サプリメントで用いることができるだけでなく、環境またはサンプルの過剰なフィテートを分解するか、または前記からそれらを除去するための処置でも用いることができる。上記で考察した利用を含む、本明細書で提供する教示を土台にした他の利用も当業者には明白であろう。
ある特徴では、本発明のフィターゼ分子は（単独であれ、他の試薬（酵素（例えばプロテアーゼ、アミラーゼなど）を含むがただし前記に限定されない）との併用であれ）、食品類の加工で（例えば望ましくないトウモロコシスラッジの防止のため）、およびフィテートの加水分解が所望される他の応用で用いられる。
【００２１】
ある特徴では、本発明のフィターゼ分子は、特に加水分解されていないフィテートがex vivo過程で厄介な結果をもたらす場合に（食品類の加工を含むがただし前記に限定されない）、未加水分解フィテートの存在を排除するかまたは減少させるために用いられる。ある特徴では、本発明のフィターゼ分子は、EP0321004-B1（Vaara et al.）に記載された方法（トウモロコシおよびソルガムの穀粒の加工の工程を含み、それによって堅い穀粒を水に浸漬して柔らかくする）で用いられる。このプロセスの間に濾しだされる水溶性物質はトウモロコシ浸漬液の部分となる（浸漬液は蒸発によって濃縮される）。トウモロコシ浸漬液の加水分解されないフィチン酸（大半がカルシウムおよびマグネシウム塩の形態として存在する）は、リンと結合し、タンパク質および金属イオンを含む望ましくないスラッジとして残っていく。このスラッジは、トウモロコシ浸漬液の蒸発、輸送および保存に問題をもたらす。本発明のフィターゼ分子を用いてこのスラッジを加水分解する。
ある特徴では、本発明のフィターゼは、以前に同定されたフィターゼ分子（例えば菌類起源のフィターゼ分子）よりも実質的に優れた工業的性能を提供することができる。ある特徴では、本発明のフィターゼは、ほぼ4400U/mgタンパク質、またはほぼ50から100、または50から1000、または100から4000U/mgタンパク質をこえることができる。
本発明はまた、下記で詳細に述べる変異導入および他の方法によって本発明のフィターゼの性状を変化させる方法を提供する。
【００２２】
核酸の生成および操作
本発明は、本発明のポリペプチドおよびフィターゼをコードする核酸を提供する。本発明はまた、発現カセット、ベクター（例えば発現またはクローニングベクター）、クローニングビヒクル（例えばウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージまたは人工染色体）を提供し、前記は本発明の核酸を含むか、またはその中に本発明の核酸を収納している。
本発明はまた、本発明の核酸を用いて新規なフィターゼ配列を発見する方法を含む。さらにまた、例えば合成連結再アッセンブリ、最適誘導進化系および／または飽和変異導入によって、本発明の核酸を改変する方法が提供される。
ある特徴では、本発明は、合成により生成される配列番号:1の変種である核酸類を提供し、本発明のこれら核酸は、“親の”配列番号:1に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、さらに上記に記載したように、配列番号:1に対するヌクレオチド塩基対配列改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含む。参照のために、親の配列番号:1は以下のとおりである：
【００２３】
atgaaagcga tcttaatccc atttttatct cttctgattc cgttaacccc gcaatctgca     60
ttcgctcaga gtgagccgga gctgaagctg gaaagtgtgg tgattgtcag tcgtcatggt    120
gtgcgtgctc caaccaaggc cacgcaactg atgcaggatg tcaccccaga cgcatggcca    180
acctggccgg taaaactggg tgagctgaca ccgcgcggtg gtgagctaat cgcctatctc    240
ggacattact ggcgtcagcg tctggtagcc gacggattgc tgcctaaatg tggctgcccg    300
cagtctggtc aggtcgcgat tattgctgat gtcgacgagc gtacccgtaa aacaggcgaa    360
gccttcgccg ccgggctggc acctgactgt gcaataaccg tacataccca ggcagatacg    420
tccagtcccg atccgttatt taatcctcta aaaactggcg tttgccaact ggataacgcg    480
aacgtgactg acgcgatcct cgagagggca ggagggtcaa ttgctgactt taccgggcat    540
tatcaaacgg cgtttcgcga actggaacgg gtgcttaatt ttccgcaatc aaacttgtgc    600
cttaaacgtg agaaacagga cgaaagctgt tcattaacgc aggcattacc atcggaactc    660
aaggtgagcg ccgactgtgt ctcattaacc ggtgcggtaa gcctcgcatc aatgctgacg    720
gagatatttc tcctgcaaca agcacaggga atgccggagc cggggtgggg aaggatcacc    780
gattcacacc agtggaacac cttgctaagt ttgcataacg cgcaatttga tttgctacaa    840
cgcacgccag aggttgcccg cagccgcgcc accccgttat tagatttgat caagacagcg    900
ttgacgcccc atccaccgca aaaacaggcg tatggtgtga cattacccac ttcagtgctg    960
tttatcgccg gacacgatac taatctggca aatctcggcg gcgcactgga gctcaactgg   1020
acgcttcccg gtcagccgga taacacgccg ccaggtggtg aactggtgtt tgaacgctgg   1080
cgtcggctaa gcgataacag ccagtggatt caggtttcgc tggtcttcca gactttacag   1140
cagatgcgtg ataaaacgcc gctgtcatta aatacgccgc ccggagaggt gaaactgacc   1200
ctggcaggat gtgaagagcg aaatgcgcag ggcatgtgtt cgttggcagg ttttacgcaa   1260
atcgtgaatg aagcacgcat accggcgtgc agtttgtaa                          1299
【００２４】
本発明の核酸は、例えばcDNAライブラリーのクローニングおよび発現、PCRによるメッセージまたはゲノムDNAの増幅などによって生成、単離および／または操作することができる。本発明の方法を実施するとき、本明細書に記載するように、相同な核酸を鋳型核酸の操作によって改変することができる。本発明は、当分野で公知の任意の方法またはプロトコルまたは装置（これらは学術文献および特許文献に詳しく記載されている）と一緒に実施することができる。
【００２５】
一般的技術：本発明の実施に用いられる核酸は、RNA、iRNA、アンチセンス核酸、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、ウイルス又は前記のハイブリッドのいずれであれ、種々の供給源から単離し、遺伝的に操作し、増幅し、及び／又は組換えにより発現／作製することができる。これらの核酸から作製された組換えポリペプチドは個々に単離またはクローニングし、所望の活性について試験することができる。任意の組換え発現系（細菌、哺乳動物、酵母、昆虫または植物細胞発現系を含む）を用いることができる。
あるいは、これら核酸は周知の化学的合成技術によってin vitroで合成することができる。前記技術は例えば以下に記載されている：Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (9179) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; US Patent No. 4,458,066。
核酸操作のための技術、例えばサブクローニング、プローブの標識（例えばクレノーポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅を用いるランダムプライマー標識）、配列決定、ハイブリダイゼーションなどは学術文献および特許文献に詳しく記載されている。例えば以下を参照されたい：Sambrook, ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acids Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)。
【００２６】
本発明の方法の実施に用いられる核酸を入手および操作するために有用なまた別の手段は、ゲノムサンプルからのクローニング、および所望の場合には、例えばゲノムクローンもしくはcDNAクローンから単離または増幅した挿入物のスクリーニングおよび再クローニングである。本発明の方法で用いられる核酸の供給源には、例えば哺乳動物人工染色体（MAC）（例えば米国特許5,721,118号、同6,025,155号を参照されたい）、ヒト人工染色体（例えば、Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、P1人工染色体（例えば、Woon (1998) Genomics 50:306-316）、P1誘導ベクター（PAC）（例えば、Kern (1997) Biotechniques 23:120-124）、コスミド、組換えイルス、ファージまたはプラスミドに収納されたゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーが含まれる。
また別の特徴では、“核酸”または“核酸配列”という語句は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドもしくは前記のいずれかのフラグメント、またはゲノムもしくは合成起源のDNAもしくはRNA（これらは一本鎖でも二本鎖でもよく、さらにセンス鎖でもアンチセンス鎖であってもよい）、ペプチド核酸（PNA）、または任意のDNA様もしくはRNA様物質（天然または合成起源）（例えばiRNA、リボヌクレオタンパク質（例えばiRNP）を含む）に適用される。前記用語は、天然のヌクレオチドの類似体を含む核酸（すなわちオリゴヌクレオチド）を包含する。前記用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造物を包含する（例えば以下を参照されたい：Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189-197；Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698；Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156）。
ある特徴では、本発明の組換えポリヌクレオチドは、天然の環境では隣接することがない“骨格”核酸と隣接する配列を含む。ある特徴では、核酸は、核酸の“骨格分子”集団内の核酸挿入物数の5%以上を表す。本発明の“骨格分子”には、核酸、例えば発現ベクター、自己複製核酸、ウイルス、組み込み核酸、および問題の核酸挿入物の維持または操作に用いられる他のベクターまたは核酸が含まれる。ある特徴では、濃縮された核酸は、組換え骨格分子集団内の核酸挿入物数の15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%またはそれ以上を表す。
【００２７】
ある特徴では、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、翻訳されたポリペプチドまたはそのフラグメントの分泌を誘導することができるリーダー配列とともに適切な局面で組み立てられる。
本発明は融合タンパク質およびそれらをコードする核酸を提供する。本発明のポリペプチドは、異種ペプチドまたはポリペプチド（例えば所望の性状（例えば安定性向上または精製の簡易化）を付与するN-末端識別ペプチド）と融合させることができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、例えば免疫原性がより強いペプチドを生成するため、組換えにより合成したペプチドをより容易に単離するため、抗体および抗体発現B細胞を同定および単離するためなどの目的のために、1つ以上のまた別のドメインが結合された融合タンパク質として合成および発現させることができる。検出および精製を容易にするドメインには、例えば金属キレートペプチド（例えばポリヒスチジン鎖およびヒスチジン-トリプトファンモジュール（固定化金属上での精製を可能にする）、プロテインAドメイン（固定化免疫グロブリン上での精製を可能にする）、およびFLAGS伸長/アフィニティー精製系（Immune Corp, Seatle WA）で利用されるドメインが含まれる。精製ドメインおよびモチーフ構成ペプチドまたはポリペプチド間への切断可能リンカー配列（例えばXa因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego CA））の挿入は精製を容易にする。例えば、発現ベクターは、6つのヒスチジン残基とそれに続くチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位に連結されたエピトープコード核酸配列を含むことができる（例えば以下を参照されたい：Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414）。前記ヒスチジン残基は検出および精製を容易にし、一方、エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質の残りの部分からエピトープを精製するための手段を提供する。融合タンパク質をコードするベクターおよび融合タンパク質の利用に関する技術は学術文献および特許文献に詳しく記載されている（例えば以下を参照されたい：Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53）。
【００２８】
ある特徴では、“単離された”という用語は、当該物質が、その本来の環境（例えば前記が天然に存在する場合は天然の環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、当該天然の系で一緒に存在する物質のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分であってもよく、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分であってもよく、当該ベクターまたは組成物がその天然の環境の部分ではないという点で、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドはやはり単離されてある。ある特徴では、“精製された”という用語は完全な純度を要求しないが、相対的な規定として意図される。ライブラリーから入手された個々の核酸は通常は電気泳動的均一性にまで精製されている。これらのクローンから得られる配列を、ライブラリーからまたはヒトの全DNAから直接得ることはできないであろう。本発明の精製核酸は、当該生物の残りのものから少なくとも104−106倍精製されている。また別の特徴では、“精製された”という用語はまた、ゲノムDNAの残りのものからまたはライブラリー内もしくは他の環境内の他の配列から、少なくとも1桁、あるいは2または3桁、あるいは4または5桁の程度まで精製されている。
【００２９】
転写および翻訳制御配列：本発明は、RNAの合成／発現を誘導または調節するために、発現（例えば転写または翻訳）制御配列、例えばプロモーターまたはエンハンサーに機能可能に連結された本発明の核酸（例えばDNA）配列を提供する。発現制御配列は発現ベクター内に存在することができる。例示的な細菌プロモーターにはlacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPR、PLおよびtrpが含まれる。例示的な真核細胞プロモーターにはCMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルスのLTRおよびマウスのメタロチオネインIが含まれる。
細菌でのポリペプチド発現または過剰発現に適したプロモーターには、大腸菌のlacまたはtrpプロモーター、lacIプロモーター、lacZプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター、gptプロモーター、ラムダPRプロモーター、ラムダPLプロモーター、糖分解酵素（例えば3-ホスホグリセレートキナーゼ（PGK））をコードするオペロン由来のプロモーターおよび酸性ホスファターゼプロモーターが含まれる。真核細胞プロモーターには、CMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、レトロウイルスのLTRおよびマウスのメタロチオネインIプロモーターが含まれる。原核細胞または真核細胞またはそれらのウイルスで遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターもまた用いることができる。
【００３０】
発現ベクターおよびクローニングビヒクル：本発明は、本発明の核酸、例えば本発明のフィターゼをコードする配列を含む発現系、例えば発現カセット、ベクター、クローニングビヒクルなどを、本発明のポリペプチド（および核酸、例えばアンチセンス）の発現および過剰発現のために提供する。本発明の発現ベクターおよびクローニングビヒクルは、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスDNA（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびSV40の誘導体）、P1系人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および関心のある特定宿主（例えばバチルス、アスペルギルスおよび酵母）に特異的な他の任意のベクターが含まれる。本発明のベクターには染色体配列、非染色体配列および合成DNA配列が含まれる。多くの適切なベクターが当業者に知られており、市場で入手できる。例示的なベクターには以下が含まれる：細菌系：pQEベクター（Qiagen）、pBluescriptプラスミド、pNHベクター、ラムダ-ZAPベクター（Stratagene）、ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T（Pharmacia）；真核細胞系：pXT1、pSG5（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40（Pharmacia）。しかしながら、他の任意のプラスミドまたは他のベクターもまた、それらが宿主内で複製可能でさらに生存可能である限り用いることができる。低コピー数または高コピー数ベクターを本発明に関して用いることができる。
用いることができる発現ベクターの代表的な例として、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスDNA（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびSV40の誘導体）、P1系人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および関心のある特定宿主（例えばバチルス、アスペルギルスおよび酵母）に特異的な他の任意のベクターをあげることができる。したがって、例えば、DNAは、ポリペプチドの発現を目的とする多様な発現ベクターのいずれかに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体配列、非染色体配列および合成DNA配列が含まれる。多くの適切なベクターが当業者に知られており、市場で入手できる。以下のベクターは例示として提供される：細菌系：pQEベクター（Qiagen）、pBluescriptプラスミド、pNHベクター、ラムダ-ZAPベクター（Stratagene）、ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T（Pharmacia）；真核細胞系：pXT1、pSG5（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40（Pharmacia）。しかしながら、他の任意のプラスミドまたは他のベクターもまた、それらが宿主内で複製可能でさらに生存可能である限り用いることができる。低コピー数または高コピー数ベクターを本発明に関して用いることができる。
【００３１】
本発明で使用される例示的ベクターは、f-因子複製起点を含む。大腸菌（E. coli）のf-因子（または稔性因子）は、接合時にそれ自体の高頻度伝達および細菌染色体自体の低頻度伝達を行うプラスミドである。ある特徴では、“フォスミド”または細菌人工染色体（BAC）ベクターと称されるクローニングベクターが使用される。これらは、大腸菌のf-因子（ゲノムDNAの大きなセグメントを安定的に組み込むことができる）に由来する。未培養の混在環境サンプルに由来するDNAとともに組み込まれるとき、前記は、安定な“環境DNAライブラリー”の形態にある大きなゲノムフラグメントを得ることを可能にする。
本発明で使用されるまた別のタイプのベクターはコスミドベクターである。コスミドベクターは、本来ゲノムDNAの大きなセグメントをクローニングし増やすために設計された。コスミドベクターへのクローニングは以下の成書に詳細に記載されている：“Molecular Cloning: A laboratory Manual”（Sambrook et al. 1989）。
発現ベクター中のDNA配列は、RNA合成を誘導するために適切な発現制御配列（プロモーター）に機能可能に連結される。具体的に名を挙げることができる細菌のプロモーターには、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPR、PL、およびtrpが含まれる。真核細胞プロモーターには、CMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルスのLTRおよびマウスのメタロチオネインIプロモーターが含まれる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は当業者の技術水準内にある。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含む。発現を増幅させるために、ベクターはまた適切な配列を含むことができる。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選別可能マーカーを含む他のベクターを用いて所望の任意の遺伝子から選択することができる。さらにまた、発現ベクターは1つ以上の選別可能マーカー遺伝子を含み、形質転換宿主細胞の選別のための表現型特色を提供することができる（例えば真核細胞培養に対してはジヒドロ葉酸レダクターゼもしくはネオマイシン耐性、または大腸菌ではテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性）。
【００３２】
ある特徴では、本発明の発現カセットは、本発明の配列および宿主の構造遺伝子（すなわちタンパク質コード配列（例えば本発明のフィターゼ））の発現に影響を与えることができ当該配列に適合性を有するヌクレオチドを含む。発現カセットは、ポリペプチドコード配列に機能可能に連結された、少なくとも1つのプロモーターおよび場合によって他の配列（例えば転写終了シグナル）を含む。発現の実行に必要なまたは有益な別の因子、たとえばエンハンサーもまた用いることができる。ある特徴では、本明細書で用いられる“機能可能に連結”とは、プロモーターがDNA配列の転写を仲介することができるようにDNA配列の上流にプロモーターが結合されることをいう。したがって、発現カセットはまた、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え“裸のDNA”ベクターなどを含む。ある特徴では、“ベクター”は、細胞に感染可能な、トランスフェクト可能な、一過性もしくは永久的に形質導入可能な核酸を含む。ベクターは裸の核酸でも、またはタンパク質もしくは脂質と複合体を形成した核酸でもよい。ベクターは、場合によってウイルスまたは細菌の核酸および／または膜（例えば細胞膜、ウイルスの脂質エンベロープなど）を含む。ある特徴では、ベクターは、DNAフラグメントが結合されて複製できるようになったレプリコン（例えばRNAレプリコン、バクテリオファージ）を含む（ただし前記に限定されない）。ある特徴では、ベクターは、RNA、自律的自己複製性環状または直鎖状DNAもしくはRNA（例えばプラスミド、ウイルスなど、例えば米国特許5,217,879号を参照されたい）（ただし前記に限定されない）を含み、発現および非発現性プラスミドを含む。組換え微生物または細胞培養が“発現ベクター”の宿主として記載されている事例では、前記は、染色体外環状DNAおよび宿主染色体に取り込まれたDNAを含む。ベクターが宿主細胞によって維持されている事例では、このベクターは、自律的構造物として有糸分裂中に細胞によって安定的に複製されえるか、または宿主ゲノム内に取り込まれている。
【００３３】
発現ベクターはプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含むことができる。ベクターはまた発現を増幅させる適切な配列を含むことができる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終了配列および5'フランキング非翻訳配列を含むことができる。いくつかの特徴では、SV40スプライシングおよびポリアデニル化部位に由来するDNA配列を用いて、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。
ある特徴では、発現ベクターは1つ以上の選別可能なマーカー遺伝子を含み、前記ベクターを含む宿主細胞の選別を可能にする。そのような選別可能マーカーには、真核細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子またはネオマイシン耐性を付与する遺伝子、大腸菌ではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を付与する遺伝子、及びS.セレビシアエ（S. cerevisiae）のTRP1遺伝子が含まれる。プロモーター領域は、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（CAT）ベクターまたは選別可能なマーカーを有する他のベクターを用いて、所望される任意の遺伝子から選りぬくことができる。
真核細胞中でポリペプチドまたはそのフラグメントを発現させるためのベクターはまた発現レベルを高めるためにエンハンサーを含むことができる。エンハンサーはDNAのcis-作動性エレメントであり、通常は長さが約10から約300bpであってプロモーターに作用してその転写を高める。その例には、複製起点の後期側100bpから270bpにあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
DNA配列は多様な方法によってベクターに挿入することができる。一般的には、DNA配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼによる挿入物およびベクターの消化に続いてベクター内の所望の位置に連結される。あるいは、挿入物とベクターの両方の平滑末端を連結することもできる。多様なクローニング技術が当分野で公知であり、例えばAusubel および Sambrookに記載されている。そのような方法および他の方法は当業者の技術範囲内であろう。
ベクターはプラスミド、ウイルス粒子またはファージの形態を有しえる。他のベクターには染色体配列、非染色体配列および合成DNA配列、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組合せに由来するベクター、ウイルスDNA、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルスが含まれる。原核細胞および真核細胞宿主で使用できる多様なクローニングベクターおよび発現ベクターは例えばSambrookによって記載されている。
使用できる具体的な細菌ベクターには、以下の周知のクローニングベクターの遺伝的要素を含む市販のプラスミドが含まれる：pBR322（ATCC37017）、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）、GEM1（Promega Biotec, Madison, WI, USA）、pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pD10、psiX174、pBluescript IIKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratagene）、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia）、pKK232-8およびpCM7。具体的な真核細胞ベクターには、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL（Pharmacia）が含まれる。しかしながら他のベクターのいずれも宿主細胞内で複製可能で生存可能である限り使用することができる。
【００３４】
宿主細胞および形質転換細胞：本発明はまた、本発明の核酸配列、例えば本発明のフィターゼをコードする配列を含むか、または本発明の発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクターを含む形質転換細胞を提供する。宿主細胞は、当業者に周知の任意の宿主細胞であって、原核細胞、真核細胞、例えば細菌細胞、菌類細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞または植物細胞が含まれえる。例示的な細菌細胞には、例えば、大腸菌、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バシルス・セレウス(B.cereus)、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）を含むエシェリキア（Eschericia）属、バチルス属、ストレプトミセス属、サルモネラ属、シュードモナス属およびスタフィロコッカス属の任意の種が含まれる。例示的な菌類細胞にはアスペルギルス（Aspergillus）の任意の種が含まれる。例示的な酵母細胞には、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）またはシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）を含む、ピキア、サッカロミセス、シゾサッカロミセスまたはシュワンニオミセス（Schwanniomyces）の任意の種が含まれる。例示的な昆虫細胞には、ドロソフィラ（Drosophila）S2およびスポドプテラSf9を含む、スポドプテラまたはドロソフィラの任意の種が含まれる。例示的な昆虫細胞にはドロソフィラ（Drosophila）S2およびスポドプテラSf9が含まれる。例示的な酵母細胞には、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシアエまたはシゾサッカロミセス・ポンベが含まれる。例示的な動物細胞にはCHO、COSまたはボウズ・メラノーマまたは任意のマウス若しくはヒト細胞株が含まれる。適切な宿主を選択することは当業者の技術範囲内である。
ベクターは、多様な任意の技術を用いて宿主細胞に導入することができる。前記技術には、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃またはTi仲介遺伝子伝達が含まれる。具体的な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる（L. Davis, M. Dibner, I. Battey, Basic Methods in Molecular Biology, (1986)）。
【００３５】
適切な場合には、操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化に適切なように改変した通常の栄養培地で培養し、形質転換体を選別するか、または本発明の遺伝子を増幅することができる。適切な宿主株を形質転換し、さらに適切な細胞密度に前記宿主株を増殖させた後、選択したプロモーターを適切な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）によって誘導し、さらに追加の期間培養して所望のポリペプチドまたはそのフラグメントを産生させることができる。
細胞を遠心分離によって採集し、物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物を更なる精製のために維持することができる。タンパク質の発現に用いた微生物細胞は任意の一般的な方法によって破壊することができる。そのような方法には、凍結融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用が含まれる。そのような方法は当業者には周知である。発現されたポリペプチドまたはそのフラグメントは、組換え細胞培養から以下を含む方法によって回収および精製することができる：硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー。タンパク質の再折りたたみ工程は、ポリペプチドの立体構造の完成に際して必要に応じて用いることができる。所望の場合には、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製工程に用いることができる。
宿主細胞内の構築物を通常の態様で用い、組換え配列によってコードされる遺伝子生成物を産生させることができる。組換え生産方法で用いる宿主細胞に応じて、ベクターを含む宿主細胞により産生されるポリペプチドはグリコシル化されることも、またグリコシル化されないこともある。本発明のポリペプチドはまた最初のメチオニン残基を含んでいることも含まないこともある。
無細胞翻訳系もまた本発明のポリペプチドの製造に利用することができる。無細胞翻訳系は、前記ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含むDNA構築物から転写されたmRNAを用いることができる。いくつかの特徴では、DNA構築物は、in vitro転写反応実施前に直鎖状化することができる。続いて適切な無細胞翻訳抽出物（例えばウサギ網状赤血球抽出物）とともに前記転写mRNAをインキュベートし、所望のポリペプチドまたはそのフラグメントを生成する。
発現ベクターは1つ以上の選別可能なマーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞の選別を目的とする表現型の特色（真核細胞の場合にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、大腸菌では例えばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供することができる。
【００３６】
本発明の核酸は、任意のin vitroまたはin vivo発現系で発現または過剰発現させることができる。任意の細胞培養系（細菌、酵母、菌類または哺乳動物細胞の培養を含む）を利用して、組換えタンパク質を発現または過剰発現させることができる。過剰発現は、プロモーター、エンハンサー、ベクター（例えばレプリコンベクター、二シストロン性ベクターの使用（例えば以下を参照されたい：Gurtu (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 229:295-8）、培養液、培養系などを適切に選択することによって実施できる。ある特徴では、細胞系で選別マーカー（例えばグルタミンシンターゼ（例えば以下を参照されたい：Saders (1987) Dev. Biol. Stand. 66:55-63））を使用する遺伝子増幅を用いて本発明のポリペプチドが過剰発現される。
種々の哺乳動物細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現させることができる。哺乳動物発現系の例には、サル腎線維芽細胞のCOS-7株（Gluzmanが“SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants”, (1981)で記載）および適合ベクターからタンパク質を発現することができる他の細胞株（例えばC127、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、さらにまた必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終了配列および5'フランキング非翻訳配列を含むであろう。SV40スプライシングおよびポリアデニル化部位に由来するDNA配列を用いて、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。
関心のあるポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選別または遺伝子の増幅に適切なように改変した通常の栄養培養液で培養することができる。培養条件（例えば温度、pHなど）は発現のために選択された宿主細胞に関して従来用いられてきた条件であり、当業者には明白であろう。続いて、特定の酵素活性を有すると認定されたクローンの配列を決定し、活性が強化された酵素をコードするポリヌクレオチド配列を特定する。
【００３７】
核酸の増幅：本発明を実施するとき、本発明のポリペプチドをコードする核酸または改変核酸は、例えば増幅によって複製することができる。本発明は、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸またはその部分配列をコードする核酸を増幅するための増幅プライマー配列対を提供し、この場合、前記プライマー対は、例示的配列番号:1および上記に示した特定の配列改変の少なくとも1つを含む核酸配列を増幅させることができる。当業者は、これら配列の任意の部分またはその完全長のための増幅プライマー配列対を設計することができる。
例えば“親”の配列番号:1は以下のとおりである：
ATGAAAGCGATCTTAATCCCATTTTTATCTCTTCTGATTCCGTTAACCCCGCAATCTGCATTCGCTCAGAGTGAGCCGGAGCTGAAGCTGGAAAGTGTGGTGATTGTCAGTCGTCATGGTGTGCGTGCTCCAACCAAGGCCACGCAACTGATGCAGGATGTCACCCCAGACGCATGGCCAACCTGGCCGGTAAAACTGGGTGAGCTGACACCGCGCGGTGGTGAGCTAATCGCCTATCTCGGACATTACTGGCGTCAGCGTCTGGTAGCCGACGGATTGCTGCCTAAATGTGGCTGCCCGCAGTCTGGTCAGGTCGCGATTATTGCTGATGTCGACGAGCGTACCCGTAAAACAGGCGAAGCCTTCGCCGCCGGGCTGGCACCTGACTGTGCAATAACCGTACATACCCAGGCAGATACGTCCAGTCCCGATCCGTTATTTAATCCTCTAAAAACTGGCGTTTGCCAACTGGATAACGCGAACGTGACTGACGCGATCCTCGAGAGGGCAGGAGGGTCAATTGCTGACTTTACCGGGCATTATCAAACGGCGTTTCGCGAACTGGAACGGGTGCTTAATTTTCCGCAATCAAACTTGTGCCTTAAACGTGAGAAACAGGACGAAAGCTGTTCATTAACGCAGGCATTACCATCGGAACTCAAGGTGAGCGCCGACTGTGTCTCATTAACCGGTGCGGTAAGCCTCGCATCAATGCTGACGGAGATATTTCTCCTGCAACAAGCACAGGGAATGCCGGAGCCGGGGTGGGGAAGGATCACCGATTCACACCAGTGGAACACCTTGCTAAGTTTGCATAACGCGCAATTTGATTTGCTACAACGCACGCCAGAGGTTGCCCGCAGCCGCGCCACCCCGTTATTAGATTTGATCAAGACAGCGTTGACGCCCCATCCACCGCAAAAACAGGCGTATGGTGTGACATTACCCACTTCAGTGCTGTTTATCGCCGGACACGATACTAATCTGGCAAATCTCGGCGGCGCACTGGAGCTCAACTGGACGCTTCCCGGTCAGCCGGATAACACGCCGCCAGGTGGTGAACTGGTGTTTGAACGCTGGCGTCGGCTAAGCGATAACAGCCAGTGGATTCAGGTTTCGCTGGTCTTCCAGACTTTACAGCAGATGCGTGATAAAACGCCGCTGTCATTAAATACGCCGCCCGGAGAGGTGAAACTGACCCTGGCAGGATGTGAAGAGCGAAATGCGCAGGGCATGTGTTCGTTGGCAGGTTTTACGCAAATCGTGAATGAAGCACGCATACCGGCGTGCAGTTTGAGATCTCATCTA
【００３８】
したがって、この親配列または本明細書に記載の特定の配列改変の少なくとも1つを有する本発明の例示的配列の1つを増幅することを目的とする増幅プライマー配列対は、配列番号:1の残基1から21（すなわちATGAAAGCGATCTTAATCCCA）、および配列番号:1の最後の21残基の相補鎖（すなわちTGCAGTTTGAGATCTCATCTAの相補鎖）でありえる。
増幅反応はまたサンプル中の核酸の量（例えば細胞サンプル中のメッセージの量）の定量、核酸の標識（例えば前記核酸をアレイまたはブロットに適用する）、核酸の検出、またはサンプル中の特定の核酸の量の定量に用いることができる。本発明のある特徴では、細胞またはcDNAライブラリーから単離したメッセージが増幅される。当業者は適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択および設計することができる。増幅方法はまた当分野で周知であり、例えば以下が含まれる：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば以下を参照されたい：PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, ed. Innis, Academic Press, NY (1990); PCR Strategies (1995) ed. Innis, Academic Press, Inc., NY）、リガーゼ連鎖反応（LCR）（例えば以下を参照されたい：Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117）、転写増幅（例えば以下を参照されたい：Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173）、およびセルフサステイン配列複製（例えば以下を参照されたい：Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874）、Qベータレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば以下を参照されたい：Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271）、自動化Q-ベータレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば以下を参照されたい：Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271）および他のRNAポリメラーゼ仲介技術（例えば以下を参照されたい：NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario）。さらにまた以下を参照されたい：Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; US Patent Nos. 4,683,195および4,683,202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564。
【００３９】
配列同一性の程度の決定
本発明は、配列番号:1に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、またはそれより高い配列同一性を有し、さらに上記で考察した配列番号:1に対する特定の列挙改変の少なくとも1つを含む核酸配列を含む単離、合成または組換え核酸を提供する。ある特徴では、配列同一性（相同性）の程度は、任意のコンピュータプログラムおよび付属のパラメーター（本明細書に記載されたもの、例えばBLAST2.2.2またはFASTA ver. 3.0t78を含む）を規定値パラメーターとともに用いて決定することができる。
相同な配列にはまたRNA配列が含まれる（RNA配列では核酸配列のチミンはウリジンに置換される）。相同な配列は本明細書に記載されている方法のいずれかを用いて入手できるが、またシークェンシングエラーの修正から得ることができる。
本明細書で特定される種々の配列比較プログラムは特に本発明のこの特徴で使用される。タンパク質及び／又は核酸の配列同一性（相同性）は、当分野で公知の多様な配列比較アルゴリズムおよびプログラムのいずれかを用いて評価することができる。そのようなアルゴリズムおよびプログラムには、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTAおよびCLUSTALWが含まれるが、ただしこれらに限定されない（Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266:383-402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics 3:266-272, 1993）。
相同性または同一性は配列分析ソフト（例えばジネティクスコンピュータグループ（Universty of Wisconsin Bitechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705）の配列分析ソフトウェアパッケージ）を用いて測定できる。そのようなソフトは、種々の欠失、置換および他の改変に対して相同性の程度を決めることによって類似の配列を見つけ出す。2つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関して“相同性”および“同一性”という用語は、比較ウィンドウまたは指定の領域上で、多数の配列比較アルゴリズムを使用するかまたは手動アラインメントおよび目視精査による測定にしたがって最大一致を求めて比較およびアラインメントを実施したとき、特定のパーセンテージの同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する2つ以上の配列または部分配列を指す。配列比較の場合、一方の配列は、試験配列が比較される参照配列（本発明の例示的配列）として機能する。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験配列および参照配列はコンピュータに入力され、部分配列同等物が必要な場合に指定され、さらに配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。規定値プログラムパラメーターを用いることができるが、また別のパラメーターを指定することもできる。続いて配列比較アルゴリズムは、前記のプログラムパラメーターを基に参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００４０】
本明細書で用いられる“比較ウィンドウ”は、任意の数の連続残基セグメントに対する参照を含む。例えば、本発明のまた別の特徴では、本発明の例示的配列の20から完全長までの任意の範囲の連続残基が、2つの配列の最適アラインメントの後で、連続する同じ数だけ参照配列と比較される。参照配列が、本発明の例示的配列と必須の配列同一性（例えば配列番号:1、配列番号:2と98%の配列同一性）を有し、さらに上記に記載した特定の配列改変の1つを有するならば、当該配列は本発明の範囲内のものである。また別の実施態様では、約20から600、約50から200、および約100から150の範囲の部分配列が、2つの配列の最適アラインメントの後で、連続する同じ数だけ参照配列と比較される。比較のために配列をアラインメントする方法は当業者に周知である。比較を目的とする配列の最適アラインメントは、例えばSmith & Watermanの局所相同性アルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)）によって、Needleman & Wunschの相同性アラインメントアルゴリズム（J. Mol. Biol. 48:443 (1970)）によって、Pearson & Lipmanの類似性検索方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)）によって、前記アルゴリズムのコンピュータによる実施によって（GAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）、または手動アラインメントと目視精査によって実施できる。相同性または同一性決定のための他のアルゴリズムには、BLASTプログラム（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information）の他に、ALIGN、AMAS（Analysis of Multiply Aligned Sequences）、AMPS（Protein Multiple Sequence Alignment）、ASSET（Aligned Segment Statistical Evaluation Tool）、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN（Biological Sequence Comparative Analysis Node）、BLIMPS（BLocks IMProved Searcher）、FASTA、Intervals & Points、BMB、CLUSTALV、CLUSTALW、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Watermanアルゴリズム、DARWIN、ラスベガスアルゴリズム、FNAT（Forced Nucleotide Alignment Tool）、フレームアライン、フレームサーチ、DYNAMIC、FILTER、FSAP（Fristensky Sequence Analysis Package）、GAP（Global Alignment Program）、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC（Sensitive Sequence Comparison）、LALIGN（Local Sequence Alignment）、LCP（Local Content Program）、MACAW（Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench）、MAP（Multiple Alignment Program）、MBLKP、MBLKN、PIMA（Pattern-Induced Multi-Sequence Alignment）、SAGA（Sequence Alignment by Genetic Algorithm）およびWHAT-IFが含まれる。前記のようなアラインメントプログラムはまたゲノムデータベースのスクリーニングに用いられ、実質的に同一の配列をもつポリヌクレオチド配列を識別することができる。多数のゲノムデータベースが利用可能で、例えばヒトゲノムの実質的部分がヒトゲノム配列決定プロジェクトの一部分として利用可能である（J. Roach, http://weber.u.Washington.edu/~roach/human_genome_progress2.html）（Gibbs, 1995）。例えば以下のいくつかのゲノムが既に配列決定されている：M. ジェニタリウム（genitalium）（Fraser et al., 1995）、M. ジャナスキイー（jannaschii）（Bult et al., 1996）、H. インフルエンザ（Fleischmann et al. 1995）、大腸菌（Blattner et al. 1997）、酵母（S. cerevisiae）（Mewes et al. 1997）およびD.メラノガスター（melanogaster）（Adams et al., 2000）。顕著な進展がモデル生物（例えばマウス、C. エレガンスおよびアラビドプシス種（Arabidopsis sp））のゲノム配列決定で達成された。いくつかの機能的情報の注釈をもつゲノム情報を含むデータベースが種々の機関で維持されており、インターネットでアクセスすることができる。
【００４１】
BLAST、BLAST2.0およびBLAST2.2.2アルゴリズムもまた本発明の実施に用いられる。前記は例えば以下に記載されている：Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402；Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410。BLAST分析を実施するソフトは、National Center for Biotechnology Informationから公開されている。このアルゴリズムは、問い合わせ配列内の長さがWの短いワードを同定することによって高スコアをもつ配列対（HSP）をまず初めに同定することを必要とする。前記は、データベース配列中の同じ長さを持つワードとアラインメントを実施したとき、一致するかまたはいくらかの正の値をもつ閾値スコアTの条件を満たす。Tは近傍ワードスコア閾値と称される（Altschul (1990)上掲書）。これらの最初の近傍ワードヒットはそれらを含むより長いHSPを見つけるための検索開始のシードとして機能する。前記ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限り各配列の両方向に沿って伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターM（一致残基対のための褒賞スコア、常に＞0）を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアが計算される。各方向のワードヒットの伸長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Xだけ下降したとき；累積スコアが、1つ以上の負のスコアを与える残基アラインメントの累積のために0またはそれ以下になったとき；またはどちらかの配列の末端に達したとき。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは前記アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、規定値として11のワード長、10の期待値（E）、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、3のワード長および10の期待値（E）、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915）アラインメント（B）50、期待値（E）10、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。BLASTアルゴリズムはまた2つの配列間の類似性の統計的分析を実施する（例えば以下を参照されたい：Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性測定の1つは最小合計確率（P(N)）であり、前記は2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然によって生じる確率を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸の比較で最小合計確率が約0.2未満、ある特徴では、好ましくは約0.01未満、ある特徴ではもっとも好ましくは約0.001未満であるならば、前記核酸は参照配列と類似であると考えられる。ある特徴では、タンパク質および核酸配列相同性はベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Basic Local Alignment Search Tool, “BLAST”）を用いて評価される。特に、5つの特別なBLASTプログラムを用いて以下のタスクが実行される：（1）BLASTPおよびBLAST3はアミノ酸の問い合わせ配列をタンパク質配列データベースと比較する；（2）BLASTNはヌクレオチドの問い合わせ配列をヌクレオチド配列データベースと比較する；（3）BLASTXは問い合わせヌクレオチド配列（その両方の鎖）の仮想的な6フレームの翻訳生成物をタンパク質配列データベースと比較する；（4）TBLASTNは問い合わせタンパク質配列（両方の鎖）を6つのリーディングフレーム全てで翻訳されるヌクレオチド配列データベースと比較する；さらに（5）TBLASTXはヌクレオチド問い合わせ配列の6フレーム翻訳物をヌクレオチド配列データベースの6フレーム翻訳物と比較する。BLASTプログラムは類似のセグメントを同定することによって相同な配列を同定する。前記セグメントは本明細書では問い合わせアミノ酸または核酸配列とテスト配列間の“高スコアセグメントペア”と称され、ある特徴では、タンパク質または核酸配列データベースから得られる。高スコアセグメントペアは、ある特徴では、スコアリングマトリックス（その多くは当分野で公知である）によって同定される（すなわちアラインメントが実施される）。使用される例示的スコアリングマトリックスはBLOSUM62マトリックスである（Gonnet et al., Science 256:1443-1445 (1992); Henikoff and Henikoff, Proteins 17:49-61 (1993)）。あるいは、PAMまたはPAM250を用いてもよい（例えば以下を参照されたい：Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation）。
【００４２】
本発明のある特徴では、核酸が本発明の範囲内のものであるために必須の配列同一性を有するか否かを決定するために、NCBI BLAST2.2.2プログラムが用いられる。規定値はblastpについては選択することができる。BLAST2.2.2プログラムには約38の設定オプションがある。本発明のこの例示的特徴では、規定値のフィルタリング設定を除く全ての規定値が用いられ（すなわちフィルタリングを除き全てのパラメーターが規定値に設定され、フィルタリングはOFFに設定される）、適切であれば”-FF”設定が用いられ、前記はフィルタリングを無効にする。規定値フィルタリングの使用は、配列の長さが短いことによりしばしばKarlin-Altschul違反を生じる。
本発明のこの例示的特徴で用いられる規定値には以下が含まれる：
“低複合度に対するフィルター：ON
＞ワードサイズ：3
＞マトリックス：Blosum62
＞ギャップコスト：有り：11
＞伸張：1”
“低複合度に対するフィルター：ON
他の規定値設定は以下のとおりである：低複合度に対するフィルターはON、タンパク質の場合ワードサイズは3、BLOSUM62マトリックス、ギャップ存在ペナルティーは-11およびギャップ伸張ペナルティーは-1。
【００４３】
コンピュータシステムおよびコンピュータプログラム製品
配列同一性、構造的相同性、モチーフなどをコンピュータシステムで決定および同定するために、コンピュータによって読み取りさらにアクセスすることができる任意の媒体上に本発明の配列を保存、記録し、さらに操作することができる。上記のプログラムを用いて検出することができるモチーフには、ロイシンジッパーをコードする配列、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、アルファヘリックスおよびベータシート、コードされたタンパク質の分泌を誘導するシグナルペプチドをコードするシグナル配列、転写調節に関与する配列（例えばホメオボックス）、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位および酵素切断部位が含まれる。
したがって、本発明は、本発明の核酸およびポリペプチド配列、例えば本発明の例示的配列を記録または保存したコンピュータ、コンピュータシステム、コンピュータ読み出し可能媒体、コンピュータプログラム製品などを提供する。本明細書で用いられる“記録”および“保存”という用語はコンピュータ媒体に情報を保存するプロセスを指す。当業者は、コンピュータ読み出し可能媒体に情報を記録するための任意の公知の方法を容易に利用して、本発明の1つ以上の核酸および／またはポリペプチド配列を含む製品を製造することができる。
本発明のまた別の特徴は、本発明の少なくとも1つの核酸および／またはポリペプチド配列が記録されたコンピュータ読み出し可能媒体である。コンピュータ読み出し可能媒体には、磁気により読み出し可能な媒体、光学的に読み出し可能な媒体、電子的に読み出し可能な媒体および磁気/光学媒体が含まれる。例えばコンピュータ読み出し可能媒体は、ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、CD-ROM、多用途デジタルディスク（DVD）、ランダムアクセスメモリー（RAM）、または読み出し専用メモリー（ROM）の他、当業者に公知の他のタイプの媒体であろう。
本発明の特徴には、システム（例えばインターネット使用システム）、特に、本明細書に記載の配列および配列情報を保存し、操作するコンピュータシステムが含まれる。コンピュータシステム（100）の一例が図1のブロック図に示されている。本明細書で用いられる“コンピュータシステム”は、本発明のヌクレオチドまたはポリペプチド配列の分析に用いられるハードウェア構成部分、ソフトウェア構成部分およびデータ保存構成部分を指す。コンピュータシステム（100）は、配列データを処理し、これにアクセスし、さらにこれを操作するプロセッサーを含む。プロセッサ（105）は周知のタイプの中央演算ユニットのいずれか、例えばインテル社（Intel Corporation）のペンチアムIIIまたはサン（Sun）、モトローラ（Motorola）、コンパック（Compaq）、AMDもしくはインターナショナル・ビジネス・マシーンズ（IBM）の類似のプロセッサーであり得る。コンピュータシステム（100）は汎用システムであり、プロセッサー（105）および1つ以上のデータ保存のための内部データ保存構成部分（110）、および前記データ保存構成部分に保存されたデータを検索するための1つ以上のデータ検索装置を含む。従来の利用可能なコンピュータシステムのいずれも適切であることは当業者には理解されよう。
【００４４】
ある特徴では、コンピュータシステム（100）は、バス（メインメモリー（115）（RAMとして提供されている）に連結されている）に連結されたプロセッサー（105）、および1つ以上の内部データ保存装置（110）（例えばハードドライブおよび／またはそれにデータが記録される他のコンピュータ読み出し可能媒体）を含む。コンピュータシステム（100）はさらに、内部データ保存装置（110）に保存されたデータを読み取るための1つ以上のデータ検索装置（118）を含む。
データ検索装置（118）は、例えばフロッピー（登録商標）ディスクドライブ、コンパクトディスクドライブ、磁気テープドライブ、または遠隔データ保存システムに連結することができる（例えばインターネットを介して）モデムであろう。いくつかの特徴では、内部データ保存装置（110）は取り外し可能なコンピュータ読み出し可能媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク、磁気テープなどで、制御ロジックおよび／またはそれに記録されたデータを含んでいる。コンピュータシステム（100）は便利には、データ検索装置にいったん挿入されたデータ保存構成部分から前記制御ロジックおよび／またはデータを読み出すための適切なソフトを含むか、または前記ソフトによってプログラムされる。
コンピュータシステム（100）は、コンピュータのユーザーに出力結果を表示するために用いられるディスプレー（120）を含む。コンピュータシステム（100）は他のコンピュータシステム（125a−c）とネットワークまたは広域ネットワークで連結され、コンピュータシステム（100）への中央アクセスを提供することができることは留意されるべきであろう。本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列にアクセスし前記を処理するためのソフトは、実行時にはメインメモリー（115）に存在しえる。
いくつかの特徴では、コンピュータシステム（100）はさらに、本発明の核酸配列を比較するための配列比較アルゴリズムを含むことができる。前記アルゴリズムおよび配列はコンピュータ読み出し可能媒体に保存することができる。“配列比較アルゴリズム”は、データ保存手段内に保存されている他のヌクレオチド配列および／または化合物とヌクレオチド配列を比較するためにコンピュータシステム（100）に（端末または遠隔端末から）提供される1つ以上のプログラムを指す。例えば、配列比較アルゴリズムは、コンピュータ読み出し可能媒体に保存されている親の配列番号:1および／または配列番号:2を有する本発明のヌクレオチド配列をコンピュータ読み出し可能媒体に保存されている参照配列と比較し、相同性または構造モチーフを認定することができる。
【００４５】
上記のアルゴリズムと一緒に用いられるパラメーターは、配列の長さおよび調べる相同性の程度に応じて適用することができる。いくつかの特徴では、パラメーターは、ユーザーの指示のないときにアルゴリズムが用いる規定値パラメーターでありえる。図2は、新規なヌクレオチドまたはタンパク質配列を配列データベースと比較して、新規な配列とデータベースの配列との間の相同性レベルを決定するためのプロセス（200）の1つの特徴を示す流れ図である。前記データベースの配列は、コンピュータシステム（100）内に保存された個人的データベースでも、公的データベース（例えばインターネットを介して利用可能なGENBANK）でもよい。プロセス（200）は開始状態（201）で始まり、続いて、比較されるべき新規な配列がコンピュータシステム（100）内のメモリーに保存される状態（202）に移行する。上記で考察したように、メモリーは任意のタイプのメモリー（RAMまたは内部保存装置を含む）であり得る。
続いてプロセス（200）は状態（204）に移行し、ここで配列データベースが分析および比較のために開かれる。続いてプロセス（200）は、データベースに保存されている第一の配列がコンピュータのメモリーに読み出される状態（206）に移行する。続いて比較が状態（210）で実行され、第一の配列が第二の配列と同じであるか否かが決定される。この工程は、新規な配列とデータベースの第一の配列との間の正確な比較の実施に限定されないことに留意することが重要である。2つのヌクレオチド配列またはタンパク質配列を（たとえそれらが同一ではなくても）比較する周知の方法を当業者は心得ている。例えばギャップを1つの配列に導入してこれら2つの試験配列間の相同性レベルを高めることができる。比較時にギャップまたは他の特徴を配列に導入するか否かを制御するパラメーターは通常はコンピュータシステムのユーザーによって入力される。
いったん2つの配列の比較が状態（210）で実行されたら、決定の状態（210）で前記2つの配列が同じか否かの決定が下される。もちろんのこと、“同じ”という用語は完全に同一である配列に限定されない。ユーザーによって入力された相同性パラメーター内にある配列は、プロセス（200）で“同じ”と示される。2つの配列が同じであるという決定が下されたら、プロセス（200）は状態（214）に移行し、ここでデータベースの配列の名称がユーザーに表示される。前記状態は表示された名称の配列が入力した相同性の特徴を満たすことをユーザーに知らせる。保存配列の名称がいったんユーザーに表示されたら、プロセス（200）は、それ以上の配列がデータベースに存在するか否かの決定が下される決定状態（218）に移行する。それ以上データベースに配列が存在しない場合には、プロセス（200）は終了状態（220）で終了する。しかしながらデータベースにさらに配列が存在する場合は、プロセス（200）は状態（224）に移行し、前記状態でポインターは、データベースの次の配列に移動し新たな配列と比較することができる。このようにして、新たな配列はアラインメントを実施されデータベースの各配列と比較される。
配列が相同でないという決定が決定状態（212）で下された場合、プロセス（200）は直ちに決定状態（218）に移行し、データベース内に比較されるべき他の配列が存在するか否かが決定されることは留意されよう。したがって、本発明のある特徴は、プロセッサー、本発明の核酸配列が保存されているデータ保存装置、および比較を実施するための配列コンペアラーを含むコンピュータシステムである。前記配列コンペアラーは、比較される配列間の相同性レベルを示すか、もしくは構造モチーフを同定するか、またはこれら核酸コードおよびポリペプチドコードと比較される配列内の構造モチーフを同定することができる。
【００４６】
図3は、2つの配列が相同であるか否かを決定するコンピュータシステムのプロセス（250）のある実施態様を示す流れ図である。プロセス（250）は開始状態（252）で開始し、続いて比較されるべき第一の配列がメモリーに保存される状態（254）に移行する。続いて比較されるべき第二の配列が状態（256）でメモリーに保存される。続いてプロセス（250）は状態（260）に移行し、前記状態（260）で第一の配列中の第一の記号が読み取られ、続いて状態（262）に移行し、前記状態（262）で第二の配列の第一の記号が読み取られる。前記配列がヌクレオチド配列の場合、前記記号は通常はA、T、C、GまたはUのいずれかであることは理解されよう。前記配列がタンパク質配列の場合は、前記記号は一文字のアミノ酸コードであり、それによって第一および第二の配列は容易に比較することができる。続いて2つの記号が同じものであるか否かの決定が決定状態（264）で下される。それらが同じものである場合、プロセス（250）は状態（268）に移行し、前記状態（268）で第一および第二の配列の次の記号が読み取られる。続いて、前記次の記号が同じものであるか否かの決定が下される。それらが同じものである場合には、プロセス（250）は2つの記号が同じでなくなるまでこのループを繰り返す。次の2つの記号が同じでないという決定が下された場合、プロセス（250）は決定状態（274）に移行して、いずれかの配列に読み取られるべき記号がそれ以上存在するか否かが決定される。読み取られるべき記号がそれ以上存在しない場合は、プロセス（250）は状態（276）に移行し、第一および第二の配列間の相同性レベルがユーザーに表示される。相同性レベルは、第一の配列内の記号の総数のうち配列間で同じであった記号の割合を計算することによって決定される。したがって、第二の配列の各記号と最初の100ヌクレオチド配列内の各記号のアラインメントが達成された場合、相同性レベルは100％であろう。
あるいは、コンピュータプログラムは、参照配列を本発明の配列と比較して、前記配列が1つ以上の位置で異なるか否かを決定することができる。プログラムは、参照または本発明のどちらかの配列に対して挿入、欠失または置換されたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の長さおよび実体を記録することができる。コンピュータプログラムは、本発明の配列に対して参照配列が単一ヌクレオチド多形性（SNP）を含むか否か、または本発明の配列が、既知の配列のSNPを含むか否かを決定するプログラムであってもよい。したがっていくつかの特徴では、コンピュータプログラムはSNPを識別するプログラムである。この方法は、上記に記載のコンピュータシステムによって実行することができ、前記方法は図3に示されている。前記方法は、コンピュータプログラムを使用することにより本発明の配列および参照配列を読み取り、さらにコンピュータプログラムにより相違を識別することによって実施することができる。
【００４７】
他の特徴では、前記コンピュータ使用システムは、本発明の核酸またはポリペプチド内の特徴を識別するアイデンティファイヤーを含む。“アイデンティファイヤー”は、核酸配列内のある種の特徴を識別する1つ以上のプログラムを指す。例えば、アイデンティファイヤーは、核酸配列内のオープンリーディングフレーム（ORF）を識別するプログラムを含むことができる。図4は、配列内の特徴の存在を検出するためのアイデンティファイヤープロセス（300）のある特徴を示す流れ図である。プロセス（300）は開始状態（302）で開始し、続いて状態（304）に移行し、前記状態（304）で特徴についてチェックされるべき第一の配列がコンピュータシステム（100）のメモリー（115）に保存される。プロセス（300）は続いて状態（306）に移行し、前記状態（306）で配列の特徴のデータベースが開かれる。そのようなデータベースは各特徴の属性リストを前記特徴の名称とともに含むであろう。例えば、特徴の名称は“開始コドン”であり、その属性は“ATG”であろう。別の例では、特徴の名称は“TAATAAボックス”であり、特徴の属性は“TAATAA”であろう。そのようなデータベースの例は、ウィスコンシン大学のGenetics Computer Groupによって作製されている。あるいは、前記特徴は構造的なポリペプチドモチーフ例えばアルファへリックス、ベータシートまたは機能的ポリペプチドモチーフ、例えば酵素活性部位、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフまたは当業者に公知の他のモチーフであろう。特徴のデータベースが状態（306）で開かれると直ちにプロセス（300）は状態（308）に移行し、前記状態（308）で第一の特徴がデータベースから読み取られる。続いて第一の特徴の属性と第一の配列との比較が状態（310）で実施される。続いて、前記特徴の属性の比較が第一の配列内で見出されるか否かの決定が決定状態（316）で下される。前記属性が見出された場合、プロセス（300）は状態（318）に移行し、前記状態（318）で見出された特徴の名称がユーザーに表示される。続いてプロセス（300）は決定状態（320）に移行し、前記状態（320）でそれ以上の特徴がデータベースに存在するか否かの決定が下される。特徴がそれ以上存在しない場合は、プロセス（300）は終了状態（324）で終了する。しかしながら、それ以上の特徴がデータベースに存在する場合、プロセス（300）は状態（326）で次の配列特徴を読み取り、ループは状態（310）に戻り、前記状態（310）で次の特徴の属性が第一の配列に対して比較される。第一の配列で前記特徴の属性が決定状態（316）で見出されない場合、プロセス（300）は直接決定状態（320）に移行し、特徴がそれ以上データベースに存在するか否かを決定する。したがって、ある特徴では、本発明は、オープンリーディングフレーム（ORF）を識別するコンピュータプログラムを提供する。
【００４８】
本発明のポリペプチドまたは核酸配列は、種々のデータプロセッサプログラムにより多様な様式で保存し操作することができる。例えば、配列は、ワードプロセッシングファイル（例えばマイクロソフトワード（MicrosoftWORD）またはワードパーフェクト（WORDPERFECT））のテキストとして、または当業者に周知の多様なデータベースプログラム（例えばDB2、SYBASEまたはORACLE）でアスキー（ASCII）ファイルとして保存することができる。さらに、多くのコンピュータプログラムおよびデータベースを配列比較アルゴリズム、アイデンティファイヤー、または本発明の核酸配列と比較されるべき参照ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の供給源として用いることができる。本発明の実施に用いられるプログラムおよびデータベースには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない：MacPattern（EMBL）、DiscoveryBase（Molecular Applications Group）、GeneMine （Molecular Applications Group）、Look（Molecular Applications Group）、MacLook（Molecular Applications Group）、BLASTおよびBLAST2（NCBI）、BLASTNおよびBLASTX（Alyschul et al. J. Mol. Biol. 215:403, 1990）、FASTA（Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444,1988）、FASTDB (Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990)、Catalyst（Molecular Simulations Inc.）、Catalyst/SHAPE（Molecular Simulations Inc.）、Cerius2.DBAccess（Molecular Simulations Inc.）、HypoGen（Molecular Simulations Inc.）、Insight II（Molecular Simulations Inc.）、Discover（Molecular Simulations Inc.）、CHARMｍ（Molecular Simulations Inc.）、Felix（Molecular Simulations Inc.）、DelPhi（Molecular Simulations Inc.）、QuanteMN（Molecular Simulations Inc.）、Homology（Molecular Simulations Inc.）、Modeler（Molecular Simulations Inc.）、ISIS（Molecular Simulations Inc.）、Quanta/Protein Design（Molecular Simulations Inc.）、WebLab（Molecular Simulations Inc.）、WebLab Diversity Explorer（Molecular Simulations Inc.）、Gene Explorer（Molecular Simulations Inc.）、SeqFold（Molecular Simulations Inc.）、MDL Available Chemicals Directoryデータベース、MDL Drug Data Reportデータベース、Comprehensive Medical Chemistryデータベース、Derwent's World Drug Indexデータベース、BioByteMasterFileデータベース、GenbankデータベースおよびGenseqnデータベース。他の多くのプログラムおよびデータベースも本発明の開示が提供された当業者には明白であろう。
上記のプログラムを用いて検出することができるモチーフには、ロイシンジッパーをコードする配列、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、アルファヘリックスおよびベータシート、コードされたタンパク質の分泌を誘導するシグナルペプチドをコードするシグナル配列、転写調節に関与する配列（例えばホメオボックス）、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位および酵素切断部位が含まれる。
【００４９】
フィターゼの発現阻害
本発明は、本発明の核酸に相補的な核酸（例えばアンチセンス配列）を提供し、前記にはアンチセンスを含む核酸、iRNA、リボザイムが含まれる。アンチセンス配列は、フィターゼ-コード遺伝子の輸送、スプライシングまたは転写を阻害することができる。前記阻害は、ゲノムDNAまたはメッセンジャーRNAを標的とすることにより達成されえる。標的とされた核酸の転写または機能は、例えばハイブリダイゼーションおよび／または切断によって阻害されえる。本発明によって提供される特に有用な阻害物質セットには、フィターゼ遺伝子またはメッセージのどちらかと結合することができるオリゴヌクレオチドが含まれる（いずれの事例でもフィターゼ酵素の生成または機能を防止または阻害する）。前記の結合は配列特異的ハイブリダイゼーションによることができる。別の有用な阻害物質の種類にはフィターゼメッセージの不活化または切断をもたらすオリゴヌクレオチドが含まれる。前記オリゴヌクレオチドはそのような切断を惹起する酵素活性を有することができる（例えばリボザイム）。オリゴヌクレオチドは化学的に改変するか、または相補性核酸を切断することができる酵素もしくは組成物と結合させることができる。そのような多様な多くのオリゴヌクレオチドを含むプールを所望の活性を有するものについてスクリーニングすることができる。
【００５０】
アンチセンスオリゴヌクレオチド：本発明は、本発明の新規なフィターゼ配列改変を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドはフィターゼメッセージと結合することができ、mRNAを標的とすることによってフィターゼ活性を阻害することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する方法は学術文献および特許文献に詳しく記載されており、当業者は本発明の新規な試薬を用いてそのようなフィターゼオリゴヌクレオチドを設計することができる。例えば、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングするためのジーンウォーキング／RNAマッピングプロトコルは当業界で周知である。例えば以下を参照されたい：Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183。前記はRNAマッピングアッセイを記載し、前記アッセイは標準的な分子技術を基にし、強力なアンチセンス配列選別のための簡単で信頼できる方法を提供する。さらにまた以下を参照されたい：Smith (2000) Eur. J. Phar. Sci. 11:191-198。
天然に存在する核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いられる。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは任意の長さであり得る。例えば、また別の特徴では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは約5から100、約10から80、約15から60、約18から40である。最適な長さは日常的なスクリーニングによって決定できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは任意の濃度で存在しえる。最適濃度は日常的なスクリーニングによって決定できる。前記潜在的課題に利用しえる極めて多様な合成された天然に存在しないヌクレオチドおよび核酸類似体が知られている。例えば、非イオン性骨格（例えばN-（2-アミノエチル）グリシンユニット）を含むペプチド核酸（PNA）を用いることができる。ホスホロチオエート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた用いることができる（それらは以下に記載されている：WO97/03211; WO96/39154; Mata (1997) Toxicol. App. Pharmacol. 144:189-197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996)）。本発明によって提供される合成DNA骨格類似体をもつアンチセンスオリゴヌクレオチドにはまた、上記で述べたようにホスホロ-ジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、3'-N-カルバメートおよびモルホリノカルバメート核酸が含まれる。
コンビナトリアル化学による方法を用いて膨大な数のオリゴヌクレオチドを生成することができる。前記オリゴヌクレオチドは、任意の標的（例えば本発明のセンスおよびアンチセンスフィターゼ配列）に対し適切な結合親和性および特異性を有する特定のオリゴヌクレオチドについて迅速にスクリーニングされえる（例えば以下を参照されたい：Gold (1995) J. Biol. Chem. 270:13581-13584）。
【００５１】
阻害性リボザイム：
本発明は、新規なフィターゼ配列改変を含むリボザイムを提供する。本発明のリボザイムはフィターゼメッセージと結合することができ、mRNAを標的とすることによってフィターゼ酵素活性を阻害することができる。リボザイムを設計し、標的到達のためのフィターゼ特異的アンチセンス配列を選別する方法は学術文献および特許文献に詳しく記載されており、当業者は本発明の新規な試薬を用いてそのようなリボザイムを設計することができる。リボザイムは、標的RNAを切断するRNAの酵素部分の極めて近傍に保持されているリボザイムの標的RNA結合部分を介して標的RNAと結合することによって機能する。したがって、リボザイムは標的RNAを認識し、相補性塩基対形成によりこれと結合し、いったん正確な部位と結合したら、リボザイムは酵素として機能し標的RNAを切断してこれを不活化する。切断がコード配列内で発生すれば、そのような態様での標的RNAの切断は、コードされるタンパク質の合成を指令するその能力を破壊するであろう。リボザイムがそのRNA標的と結合し、これを切断した後、リボザイムは前記RNAから遊離し、したがってくり返し新たな標的と結合して、これを切断することができる。
いくつかの環境下では、リボザイムの酵素的性質は他の技術、例えばアンチセンス技術（アンチセンス技術では、核酸分子は核酸標的に単に結合してその転写、翻訳または別の分子との結合を妨げるだけである）に比べて有利であろう。なぜならば、治療達成に必要なリボザイムの有効濃度はアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれよりも低いからである。この潜在的な利点はリボザイムの酵素として機能する能力の結果である。したがって、ただ1つのリボザイム分子が多くの標的RNA分子を切断することができる。さらにまた、リボザイムは典型的には特異性が高い阻害因子であり、阻害の特異性は塩基対形成による結合メカニズムだけでなく、リボザイムが結合するRNAの発現を前記リボザイム分子が阻害するメカニズムにも依存している。すなわち、阻害はRNA標的の切断によって生じ、したがって特異性は非標的RNAの切断速度に対する標的RNAの切断速度の比と定義される。この切断メカニズムは塩基対形成に関与する要因に加えてさらに別の要因に左右される。したがって、リボザイム作用の特異性は、同じRNA部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド結合の特異性よりも高いであろう。酵素リボザイムRNA分子はハンマーヘッドモチーフとして形成されえるが、前記はまた、ヘアピンモチーフ、肝炎デルタウイルスモチーフ、グループIイントロンモチーフまたはRNaseP様RNAモチーフ（RNAガイド配列と結合している）としても形成されえる。そのようなハンマーヘッドモチーフの例はRossi（Aids Research and Human Retroviruses 8:183 (1992)）によって、ヘアピンモチーフの例はHampel（Biochmistry 28:4929 (1989)およびNuc. Acids Res. 18:299 (1992)）によって、肝炎デルタウイルスモチーフの例はPerrotta（Biochemistry 31:16 (1992)）によって、RNasePモチーフの例はGuerrier-Takada（Cell 35:849 (1983)）によって、さらにグループIイントロンの例はCech（US Pat. No. 4,987,071）によって記載されている。前記の特定のモチーフの記載はそれらに限定することを意図したものではない。当業者は、本発明の酵素RNA分子は、標的遺伝子のRNA領域の1つ以上と相補的な特異的基質結合部位を有し、さらに前記分子にRNA切断活性を付与するヌクレオチド配列を基質結合部位内またはその周辺に有することを理解していよう。
【００５２】
RNA干渉（RNAi）：ある特徴では、本発明は、本発明の酵素配列を含むRNA阻害分子、いわゆる“RNAi”分子を提供する。RNAi分子は二本鎖RNA（dsRNA）分子を含む。RNAi分子、例えばsiRNAおよび／またはmiRNAはフィターゼ酵素遺伝子の発現を阻害することができる。ある特徴では、RNAi分子、例えばsiRNAおよび／またはmiRNAは、長さが約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25またはそれより大きい二重鎖ヌクレオチドである。
本発明はいずれの特定の作用メカニズムにも限定されないが、RNAiは細胞内に入り、類似または同一の配列を有する一本鎖RNA（ssRNA）（内因性mRNAを含む）の分解を引き起こす。細胞が二本鎖RNA（dsRNA）に暴露されるとき、相同な遺伝子に由来するmRNAは、RNA干渉（RNAi）と称される過程によって選択的に分解される。RNAiの背後にある可能な基本的メカニズムは、特定の遺伝子配列と一致する二本鎖RNA（dsRNA）の短い破片（短小干渉性RNAと称される）への分解である。前記短小干渉性RNAは、その配列と一致するmRNAの分解の引き金となる。ある特徴では、本発明のRNAiは遺伝子サイレンシング療法で用いられる（例えば以下を参照されたい：Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046）。ある特徴では、本発明は、本発明のRNAi分子、例えばsiRNAおよび／またはmiRNAを用いて選択的にRNAを分解する方法を提供する。ある特徴では、極小阻害性RNA（miRNA）は翻訳を阻害し、さらにsiRNA転写を阻害する。前記方法はin vitro、ex vivoまたはin vivoで実施することができる。ある特徴では、本発明のRNAi分子を用いて細胞、器官または動物で機能喪失変異を作出することができる。選択的にRNAを分解するために、RNAi分子、例えばsiRNAおよび／またはmiRNAを製造および使用する方法は当業界では周知である。例えば以下を参照されたい：米国特許第6,506,559号、第6,511,824号、第6,515,109号および第6,489,127号。
【００５３】
核酸の改変
本発明は、本発明の核酸（例えばフィターゼをコードする核酸）の変種を作製する方法を提供する。これらの方法は、鋳型核酸によってコードされたフィターゼのそれとは変異した若しくは異なる活性または変異した若しくは異なる安定性を持つフィターゼ酵素を生成するために反復するかまたは多様な組合せで用いることができる。これらの方法はまた、例えば遺伝子／メッセージ発現、メッセージ翻訳またはメッセージ安定性における変種を生成するために反復するかまたは多様な組合せで用いることができる。別の特徴では、細胞の遺伝的構成は、例えば相同遺伝子のex vivo改変とそれに続く前記遺伝子の細胞への再挿入により改変される。
本発明はまた、変異導入および他の方法によって本発明のフィターゼの性状を変化させる方法を提供する。前記には定方向進化、例えば、Diversa社（San Diego, CA）の特許方法、例えばダイレクトエボルーション（DirectEvolution）（例えば米国特許第5,830,696号を参照されたい）、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）（例えば米国特許第6,171,820号および6,579,258号を参照されたい）、定方向進化におけるエキソヌクレアーゼ仲介遺伝子アッセンブリ（例えば米国特許第6,361,974号および6,352,842号を参照されたい）、定方向進化における末端選別（例えば米国特許第6,358,709号および6,238,884号を参照されたい）、組換え依存合成シャッフリング（例えば米国特許第5,965,408号および6,440,668号、並びにオーストラリア特許AU724521を参照されたい）および好熱性酵素の定方向進化（例えば米国特許第5,830,696号および6,335,179号を参照されたい）が含まれる。
ある特徴では、フィターゼの性状は以下の工程を含むダイレクトエボルーションプロトコルによって改変される：a）1つ以上の分子鋳型（例えば本発明のフィターゼ核酸）に変異を導入し、新規な分子を作製する工程、およびb）より望ましい性状を有するこれらの新規な子孫分子種での選別工程。定方向進化の威力は、最初の鋳型（例えば“親”の配列番号:1または本発明の任意の配列）の最初の選別とともに、選択される変異導入プロセスおよび用いられるスクリーニングプロセスに左右される。したがって、本発明は、新規な高度に能動的で、生理学的に効率的である経済的なフィターゼ活性の供給源を提供し、前記には以下の特性を有する新規なフィターゼが含まれる：a）1つ以上の特定の利用条件（例えば食品類の高温製造）下で優れた活性を有し、したがって当該特定の利用の最適化に有用である；b）定方向進化のための鋳型として有用で、さらに改善された新規な分子が入手される；さらに、c）例えばハイブリダイゼーション依存アプローチのような手段によってさらに別の関連分子を同定するためのツールとして有用である。
【００５４】
本発明の核酸は任意の手段、例えばランダム若しくは確率論的な方法、または非確率論的方法、または“定方向進化”方法によって改変できる。遺伝子のランダム変異導入の方法は当業界で周知である（例えば以下を参照されたい：US Pat. No. 5,830,696）。例えば変異原を用いて遺伝子をランダムに変異させることができる。変異原には、例えば紫外線またはガンマ線照射、または化学的変異原、例えばマイトマイシン、亜硝酸、光活性化ソラレンが含まれ、単独または併用して組換えによって修復されやすいDNA破壊を誘導する。他の化学的変異原には、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはギ酸が含まれる。その他の変異原は、ヌクレオチド前駆体の類似物質、例えばニトロソグアニジン、5-ブロモウラシル、2-アミノプリンまたはアクリジンである。これらの薬剤はPCR反応にヌクレオチド前駆体の代わりに添加され、それによって配列を変異させることができる。インターカレーション薬剤（例えばプロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなど）もまた用いることができる。
分子生物学の任意の技術、例えばランダムPCR変異導入（例えば以下を参照されたい：Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471）またはコンビナトリアルマルチカセット変異導入（combinatorial multiple cassette mutagenesis）（例えば以下を参照されたい：Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196）を用いることができる。あるいは、核酸（例えば遺伝子）をランダムにまたは“確率論的に”フラグメント化した後で再アッセンブリングすることもできる（例えば以下を参照されたい：米国特許第6,291,242号; 同6,287,862号; 同6,287,861号; 同5,955,358号; 同5,830,721号; 同5,824,514号; 同5,811,238号; 同5,605,793号）。また別の特徴では、改変、付加または欠失が、エラープローンPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）、合成連結再アッセンブリ（SLR）、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNAによる変異導入、ウラシル含有鋳型による変異導入、ギャップ含有二重鎖による変異導入、ポイントミスマッチ修復による変異導入、修復欠損宿主株による変異導入、化学的変異導入、放射源による変異導入、欠失による変異導入、制限-選別変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマーの生成および／またはこれらの組合せ並びに他の方法によって導入される。
【００５５】
以下の文献は、本発明の方法に取り入れることができる多様な反復組換え手順および／または方法を記載している：Stemmer (1999) “Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties”, Tiumor Tageting 4:1-4; Ness (1999) NatureBiotechnology 17:893-896; Chang (1999) “Evolution of a cytokine using DNA family shuffling”, Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull (1999) “Protein evolution by molecular breeding”, Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290; Christians (1999) “Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling”, Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri (1998) “DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution”, Nature 391:288-291; Crameri (1997) “Molecular evolution of an arsenate dtoxification pathway by DNA shuffling”, Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang (1997) “Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screenig”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten et al. (1997) “Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines”, Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri et al. (1996) “Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling”, Nature Medicine 2:100-103; Crameri et al. (1996) “Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling”, Nature Biotechnology 14:315-319; Gates et al. (1996) “Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor ‘headpiece dimer’” Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) “Sexual PCR and Assembly PCR” In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. pp.447-457; Crameri and Stemmer (1995) “Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes” BioTechniques 18:194-195; Stemmer et al. (1995) “Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides” Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) “The Evolution of Molecular Computation” Science 270: 1510; Stemmer (1995) “Searching Sequence Space” Bio/Technology 13:549-553; Stemmer (1994) “Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling” Nature 370:389-391; およびStemmer (1994) “DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751。
【００５６】
多様性を生成する変異導入方法には例えば以下が含まれる：部位特異的変異導入(Ling et al. (1997) “Approaches to DNA mutagenesis: an overview” Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al. (1996) “Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method” Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) “In vitro mutagenesis” Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle (1985) “Strategies and applications of in vitro mutagenesis” Science 229:1193-1201; Carter (1986) “Site-directed mutagenesis” Biochem. J. 237:1-7; および Kunkel (1987) “The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis” in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin))；ウラシル含有鋳型を用いる変異導入 (Kunkel (1985) “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection” Methods in Enzymol. 154, 367-382;およびBass et al. (1988) “Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities” Science 242:240-245)；オリゴヌクレオチド特異的変異導入（Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith (1982) “Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment” Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith (1983) “Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors” Methods in Enzymol. 100:468-500; および Zoller & Smith (1987) “Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template” Methods in Enzymol. 154:329-350)；ホスホロチオエート改変DNA変異導入(Taylor et al. (1985) “The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA” Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor et al. (1985) “The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA” Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye (1986) “Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis” Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers et al. (1988) “Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis” Nucl. Acids Res. 16:791-802;およびSayers et al. (1988) “Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide” Nucl. Acids Res. 16: 803-814)；ギャップをもつ二重鎖DNAを用いる変異導入(Kramer et al. (1984) “The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction” Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. “Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA” 154:350-367; Kramer et al. (1988) “Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations” Nucl. Acids Res. 16: 7207; およびFritz et al. (1988) “Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro” Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999)。
【００５７】
本発明の方法で用いられるさらに別の方法には以下が含まれる：点ミスマッチ修復(Kramer (1984) “Point Mismatch Repair” Cell 38:879-887)、修復欠損宿主株を用いる変異導入(Carter et al. (1985) “Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors” Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; and Carter (1987) “Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors” Methods in Enzymol. 154: 382-403)、欠失変異導入(Eghtedarzadeh (1986) “Use of oligonucleotides to generate large deletions” Nucl. Acids Res. 14: 5115), restriction-selection and restriction-selection and restriction-purification (Wells et al. (1986) “Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin” Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423)、全遺伝子合成による変異導入(Nambiar et al. (1984) “Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein” Science 223: 1299-1301; Sakamar and Khorana (1988) “Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)” Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) “Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites” Gene 34:315-323;およびGrundstrom et al. (1985) “Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale shot-gun' gene synthesis” Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316)、二本鎖開裂修復(Mandecki (1986); Arnold (1993) “Protein engineering for unusual environments” Current Opinion in Biotechnology 4:450-455. “Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181)。
【００５８】
上記方法の多くに関する更なる詳細または別のプロトコルは、Methods in Enzymology（Vol. 154）（前記はまた、種々の変異導入に関する問題を解決するために有用な制御についても記載している）で見出すことができる。さらにまた以下を参照されたい：U.S. Pat. No. 5,605,793（Stemmer, Feb. 25, 1997, “Methods for In Vitro Recombination）；U.S. Pat. No. 5,811,238 (Stemmer et al.,Sep. 22, 1998, “Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination”)；U.S. Pat. No. 5,830,721（Stemmer et al., Nov. 3, 1998, “DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”）；U.S. Pat. No. 5,834,252（Stemmer, et al., Nov. 10, 1998, “End-Complementary Polymerase Reaction”）；U.S. Pat. No. 5,837,458（Minshull, et al., Nov. 17, 1998, “Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”）；WO 95/22625（Stemmer and Crameri, “Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”）；WO 96/33207（Stemmer and Lipschutz, “End Complementary Polymerase Chain Reaction”）；WO 97/20078（Stemmer and Crameri, “Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination”）；WO 97/35966（Minshull and Stemmer, “Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”）；WO 99/41402（Punnonen et al. “Targeting of Genetic Vaccine Vectors”）；WO 99/41383（Punnonen et al. “Antigen Library Immunization”）；WO 99/41369（Punnonen et al. “Genetic Vaccine Vector Engineering”）； WO 99/41368（Punnonen et al. “Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines”）；EP 752008（Stemmer and Crameri, “DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”）；EP 0932670（Stemmer “Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination”）；WO 99/23107（Stemmer et al., “Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling”）；WO 99/21979（Apt et al., “Human Papillomavirus Vectors”）；WO 98/31837（del Cardayre et al. “Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination”）；WO 98/27230（Patten and Stemmer, “Methods and Compositions for Polypeptide Engineering”）；WO 98/27230（Stemmer et al., “Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection”）；WO 00/00632, “Methods for Generating Highly Diverse Libraries”；WO 00/09679, “Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences”；WO 98/42832（Arnold et al., “Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers”）；WO 99/29902（Arnold et al., “Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences”）；WO 98/41653（Vind, “An in Vitro Method for Construction of a DNA Library”）；WO 98/41622（Borchert et al., “Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling”）；およびWO 98/42727（Pati and Zarling, “Sequence Alterations using Homologous Recombination”）。
【００５９】
米国特許出願は種々の多様性を生じる方法に関する更なる詳細または別のプロトコルを提供する。前記出願には以下が含まれる：“SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES”（Patten et al.,1999年9月28日出願、U.S. Ser. No. 09/407,800）；“EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION” del Cardayre et al., 1998年7月15日出願（US Ser. No. 09/166,188）および1999年7月15日出願（US Ser.No. 09/354,922）；“OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION” Crameri et al., 1999年9月28日出願（US Ser No.09/408,392）および“OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION” Crameri et al., 2000年1月18日出願（PCT/US00/01203）；“USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING”（Welch et al., 1999年7月28日出願（US Ser. No. 09/408,393）；“METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS”（Selifonov et al., 2000年1月18日出願、PCT/US00/01202） および、例えば “METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS”（Selifonov et al., 2000年7月18日出願、U.S. Ser. No. 09/618,579）；“METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS”（Selifonov and Stemmer, 2000年1月18日出願PCT/US00/01138)；および “SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION”（Affholter, 2000年9月6日出願、U.S. Ser. No. 09/656,549)。
非確率論的、または“定方向進化”方法（例えば“飽和変異導入”（GSSM）、合成連結再アッセンブリ（SLR）または前記の組合せを含む）を用いて本発明の核酸を改変し、新規なまたは変異した特性（例えば強酸または強アルカリ条件下、高温または低温条件下などでの活性）を有するフィターゼが作製される。改変された核酸によってコードされるポリペプチドは、フィターゼまたは他の活性について試験する前に活性についてスクリーニングすることができる。任意の試験様式またはプロトコルを、例えばキャピラリーアレイ台を利用して用いることができる。例えば米国特許第6,361,974号、同6,280,926号、同5,939,250号を参照されたい。
【００６０】
飽和変異導入またはGSSM：本発明はまた、本明細書さらに米国特許第6,171,820号および6,579,258号の記載にしたがい、遺伝子部位飽和変異導入またはGSSMを用いて酵素を生成する方法を提供する。
ある特徴では、縮退N,N,G/T配列を含むコドンプライマーを使用してポリヌクレオチド（例えば本発明のフィターゼ酵素または抗体）に点変異を導入し、一組の子孫ポリペプチドが生成される。前記一組の子孫ポリペプチドでは、全範囲の単一アミノ酸置換の全てが、各アミノ酸（例えば改変の標的となる酵素活性部位またはリガンド結合部位中のアミノ酸残基）の位置に出現する。これらのオリゴヌクレオチドは、連続する第一の相同配列、縮退N,N,G/T配列および場合によって第二の相同な配列を含むことができる。そのようなオリゴヌクレオチドを使用することによって得られる後世代子孫の翻訳生成物には、前記ポリペプチドに沿って各アミノ酸の位置でありえる全てのアミノ酸変化が含まれる（N,N,G/T配列の縮退は20の全てのアミノ酸のためのコドンを含むからである）。ある特徴では、１つのそのような縮退オリゴヌクレオチド（例えば１つに縮退N,N,G/Tカセットを含む）が、親のポリヌクレオチド鋳型中の最初のコドンの各々を全範囲のコドン置換に付すために用いられる。また別の特徴では、親のポリヌクレオチド鋳型中の少なくとも2つの最初のコドンを全範囲のコドン置換に付すために少なくとも2つの縮退カセットが（同じヌクレオチド内に存在するものであれまたは別個のヌクレオチドに存在するものであれ）用いられる。例えば2つ以上のN,N,G/T配列を1つのオリゴヌクレオチド内に入れ、2つ以上の部位にアミノ酸置換を導入することができる。この複数のN,N,G/T配列は直接連続していてもよいし、または1つ以上のさらに別のヌクレオチド配列によって分離されてあってもよい。別の特徴では、付加および欠失の導入に役立つオリゴヌクレオチドを単独またはN,N,G/T配列を含むコドンとともに用いて、アミノ酸付加、欠失および／または置換の任意の順列組合せが導入される。
【００６１】
ある特徴では、2つ以上の連続するアミノ酸の位置の同時変異は、連続するN,N,G/Tトリプレット（すなわち縮退(N,N,G/T)ｎ配列）を含むオリゴヌクレオチドを用いて実施される。別の特徴では、N,N,G/T配列よりも縮退度の小さい縮退カセットが用いられる。例えば、いくつかの事例では、ただ1つのＮ（Ｎは前記トリプレットの第一、第二または第三番目の位置に存在できる）を含む縮退トリプレット配列を（オリゴヌクレオチドとして）用いることができる。任意の順列組合せを含む他のいずれの塩基もトリプレットの残りの2つの位置において用いることができる。あるいはいくつかの事例で縮退N,Ｎ,Ｎ,トリプレット配列を（例えばオリゴヌクレオチドとして）用いることができる。
ある特徴では、縮退トリプレット（例えばN,N,G/Tトリプレット）の使用によって、ポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸の位置について天然アミノ酸の全範囲全ての（合計20アミノ酸）系統的で容易な生成が可能になる（別の特徴では、前記方法はまた、各アミノ酸残基、コドン、位置の可能な全ての置換よりも少ない置換の生成も含む）。例えば、100アミノ酸のポリペプチドの場合、2000個の別個の種（すなわち各位置につき20個の可能なアミノ酸Ｘ100個のアミノ酸の位置）が生成される。縮退N,N,G/Tトリプレットを含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセットを使用することによって、32個の個々の配列が20個の可能な天然のアミノ酸を全てコードすることができる。したがって、少なくとも1つの前記のようなオリゴヌクレオチドを用いて親のポリヌクレオチド配列が飽和変異導入に付される反応容器では、20個の別個のポリペプチドをコードする32個のそれぞれ別個の子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、部位特異的変異導入では非縮退オリゴヌクレオチドを使用したとき、各反応容器につきただ1つの子孫ポリペプチド生成物が生じるだけである。場合によって非縮退オリゴヌクレオチドを開示の縮退プライマーとともに用いることができる。例えば、非縮退オリゴヌクレオチドを用いて対象のポリヌクレオチドで特定の点変異を生成することができる。これは、特定のサイレント点変異、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異、並びに終止コドンおよびポリペプチドフラグメントの対応する発現を生じさせる点変異を生成する1つの手段を提供する。
【００６２】
ある特徴では、各飽和変異導入反応容器は、親のポリヌクレオチドで変異を導入されるコドンの位置に一致する特定の１つのアミノ酸の位置において20個全ての天然アミノ酸が提示されるように、少なくとも20の子孫ポリペプチド（例えばフィターゼ酵素）分子をコードするポリヌクレオチドを含む（他の特徴では20個より少ない天然の組合せが用いられる）。各飽和変異導入反応容器から生成される32倍の縮退子孫ポリペプチドをクローン増幅に付し（例えば適切な宿主（例えば大腸菌宿主）で例えば発現ベクターを用いてクローニングする）、さらに発現スクリーニングに付すことができる。スクリーニングにより好ましい特性の変化を提示させることによって個々の子孫ポリペプチドが同定されたとき（例えば親のポリペプチドと比較したときアルカリ性または酸性条件下でグルカンの加水分解活性が増加する）、前記子孫ポリペプチドを配列決定し、その中に含まれる対応する好ましいアミノ酸置換を同定することができる。
ある特徴では、本明細書に開示したように、親のポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸の位置に飽和変異導入を用いて変異を導入するとき、好ましいアミノ酸変化が2つ以上のアミノ酸位置で同定できることがある。これら好ましいアミノ酸置換の全てまたは一部分の組合せを含む1つ以上の新規な子孫分子を生成することができる。例えば、2つの特定の好ましいアミノ酸変化がポリペプチドの3つのアミノ酸の位置の各々で同定されるならば、この置換は各位置でかつ3つの位置で3つの可能性（最初のアミノ酸から変化のないものおよび2つの好ましい変化のそれぞれ）を含む。したがって、3ｘ3ｘ3、または合計27の可能性が存在し、これらは以前に調べられた7つ（6つの単一点変異（すなわち3つの位置の各々で2つ）およびいずれの位置においても変化のないもの）を含む。
【００６３】
さらに別の特徴では、スクリーニングと併せて、位置飽和変異導入をシャッフリング、キメラ化、組換えおよび他の変異導入方法と一緒に用いることができる。本発明は任意の突然変異導入方法の使用を提供する。前記方法には反復態様で用いられる飽和変異導入が含まれる。ある実施態様では、任意の変異導入方法がスクリーニングと併用して反復使用される。
本発明はまた、点変異をポリヌクレオチドに導入して、全範囲の単一アミノ酸置換が各アミノ酸の位置で出現する一組の子孫ポリペプチドを作製するために専有コドンプライマー（縮退N,N,N配列を含む）の使用を提供する（遺伝子位置飽和変異導入（GSSM））。使用されるオリゴは、連続する第一の相同配列、縮退N,N,N配列および、ある特徴では（必ずというわけではない）第二の相同な配列で構成される。そのようなオリゴヌクレオチドを使用することによって得られる後世代子孫の翻訳生成物には、N,N,N配列の縮退は20の全てのアミノ酸に対するコドンを含むので、前記ポリペプチドに沿って各アミノ酸の位置でありえる全てのアミノ酸変化が含まれる。
ある特徴では、１つのそのような縮退オリゴ（１つの縮退N,N,Nカセットを含む）が、親のポリヌクレオチド鋳型中の最初のコドンの各々を全範囲のコドン置換に付すために用いられる。また別の特徴では、親のポリヌクレオチド鋳型中の少なくとも2つの最初のコドンを全範囲のコドン置換に付すために、少なくとも2つの縮退N,N,Nカセットが（同じオリゴに存在するものであれまたは別のオリゴに存在するものであれ）用いられる。したがって、2つ以上のN,N,N配列を1つのオリゴ内に含ませ、2つ以上の部位でアミノ酸置換を導入することができる。この複数のN,N,N配列は連続していてもよいし、または1つ以上のさらに別のヌクレオチド配列によって分離されてあってもよい。別の特徴では、付加および欠失の導入に役立つオリゴを単独またはN,N,N配列を含むコドンとともに用いて、アミノ酸付加、欠失および／または置換の任意の組合せまたは並べ換えを導入することができる。
【００６４】
特にある実施態様では、連続するN,N,Nトリプレット（すなわち縮退(N,N,N)ｎ配列）を含むオリゴを用いて、2つ以上の連続するアミノ酸の位置で同時に変異を導入することが可能である。
また別の特徴では、N,N,N配列よりも縮退度が低い縮退カセットの使用を提供する。例えばいくつかの事例では、ただ1つのNを含む縮退トリプレット（この場合Nは当該トリプレットの第一、第二または第三位に存在しえる）を（例えばオリゴとして）使用することが望ましいこともある。任意の順列組合せを含むいずれの他の塩基も、当該トリプレットの残りの2つの位置で用いることができる。あるいは、いくつかの事例では、縮退N,N,Nトリプレット配列、N,N,G/TまたはN,N,G/Cトリプレット配列を（例えばオリゴとして）使用することが望ましいこともある。
しかしながら、本発明で開示したような縮退配列（例えばN,N,G/TまたはN,N,G/Cトリプレット配列）を使用することはいくつかの理由で有利であることは理解されよう。ある特徴では、本発明は、ポリペプチド中の各々かつ全てのアミノ酸の位置でありえるアミノ酸の全範囲（合計20アミノ酸について）の置換が系統的且つ比較的容易に得られる手段を提供する。したがって、100アミノ酸のポリペプチドについて、本発明は系統的にかつ比較的容易に2000個の別個の種（すなわち各位置に付き20のありえるアミノ酸x 100個のアミノ酸の位置）を作製する方法を提供する。縮退N,N,G/TまたはN,N,G/Cトリプレット配列を含むオリゴの使用により、20のありえるアミノ酸をコードする32個の配列が提供されることは理解されよう。したがって、1つのそのようなオリゴを用いて親のポリヌクレオチド配列が飽和変異導入に付される反応容器では、20個の別個のポリペプチドをコードする32個の別個の子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、位置特異的変異導入において非縮退オリゴを使用した場合、反応容器に付きただ1個の子孫ポリペプチド生成物しか得られない。
本発明はまた、非縮退オリゴの使用を提供する。場合によって、前記オリゴは開示した縮退プライマーと一緒に用いることができる。いくつかの状況では、目下使用中のポリヌクレオチドで特定の点変異を作製するためには、非縮退オリゴを用いることが有利であることは理解されよう。これによって、特定のサイレント点変異、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異および終止コドンを生成させる点変異並びにポリペプチドフラグメントの対応する発現をもたらす手段が提供される。
【００６５】
したがって、本発明のある特徴では、飽和変異導入の各反応容器は、親のポリヌクレオチドで変異が導入されたコドンの位置に対応する特定の１つのアミノ酸の位置で20アミノ酸の全てが提示されるように、少なくとも20の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含んでいる。飽和変異導入の各反応容器から生成された32倍の縮退子孫ポリペプチドをクローン増幅に付し（例えば発現ベクターを用いて適切な大腸菌宿主でクローニングできる）、さらに発現スクリーニングに付すことができる。（親のポリペプチドと比較したとき）個々の子孫ポリペプチドが好ましい特性変化を示すことがスクリーニングによって同定されたら、前記の配列を決定して、前記配列に含まれる対応する好ましいアミノ酸置換を同定することができる。
本明細書に開示した飽和変異導入を用いて親のポリペプチド中の各々かつ全てのアミノ酸の位置に変異を導入するとき、好ましいアミノ酸変異が2つ以上のアミノ酸の位置で同定しえることは理解されよう。これら好ましいアミノ酸置換の全てまたは部分が組み合わされた1つ以上の新規な子孫分子を作製することができる。例えば、あるポリペプチド中の3つのアミノ酸の位置の各々で2つの特定の好ましいアミノ酸の変異が同定された場合、前記順列は各位置で3つの可能性（最初のアミノ酸から変化のないものおよび2つの好ましい変化のそれぞれ）を含む。したがって、合計3ｘ3ｘ3、または27の可能性が存在し、これらは以前に調べられた7つ（6つの単一点変異（すなわち3つの位置の各々で2つ）およびいずれの位置においても変化のないもの）を含む。
したがって、非限定的な具体例では、本発明は、また別の変異導入プロセスと組み合わされた飽和変異導入の使用を提供する。前記別の変異導入プロセスは例えば、ハイブリッドポリヌクレオチドを組換えおよび還元的再組合せによって生成することができるように2つ以上の関連ポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に導入するプロセスである。
遺伝子の配列全体に変異を導入すること以外にも、本発明は、ポリヌクレオチド中の多数の塩基の各々を置換することができる変異導入を提供する。この場合、変異を導入される塩基の数は、ある特徴では15から100,000のいずれかである。したがって、分子の全ての位置に変異を導入する代わりに、全ての塩基または所定の数の塩基（ある特徴では合計で15から100,000になるサブセット）に変異を導入することができる。ある特徴では、ポリヌクレオチド配列の各々の位置または位置群に変異を導入するために、別々のヌクレオチドが用いられる。変異を導入される3つの位置群はコドンであってもよい。変異は、変異原プライマー（異種カセットを含み、変異原カセットとも称される）を用いて導入することができる。例示的カセットは1つから500の塩基を有することができる。そのような異種カセットの各ヌクレオチドの位置はN、A、C、G、T、A/C、A/G、A/T、C/G、C/T、G/T、C/G/T、A/G/T、A/C/T、A/C/G、またはEで、ここでEはA、C、GまたはTではない任意の塩基である（Eはデザイナーオリゴと称することができる）。
【００６６】
一般的な意味では、飽和変異導入は、変異を導入される所定のポリヌクレオチド配列（この場合変異を導入される配列は、ある特徴では長さが約15から100,000塩基である）中の完全な一組の変異原カセット（この場合各カセットはある特徴では長さが約1−500塩基である）に変異を導入することを含む。したがって、変異群（1から100変異に及ぶ）が変異を導入される各カセットに導入される。1回の飽和変異導入の実施中に、1つのカセットに導入される変異群は、第二のカセットに導入される第二の変異群とは異なっていても同じであってもよい。そのような群の具体例は、欠失、付加、特定コドン群および特定ヌクレオチドカセット群である。
変異を導入される所定配列には完全な遺伝子、経路、cDNA、完全なオープンリーディングフレーム（ORF）および完全なプロモーター、エンハンサー、リプレッサー/トランスアクチベーター、複製起点、イントロン、オペレーターまたは任意のポリヌクレオチド機能群が含まれる。一般的には、この目的のための“所定配列”は、15塩基のポリヌクレオチド配列および15塩基から15,000塩基の長さのポリヌクレオチド配列のいずれかのポリヌクレオチドであり得る（本発明では特に15から15,000の間の全てのものが含まれる）。コドン群の選択で考慮しなければならないことには、縮退変異原カセットによってコードされるアミノ酸のタイプが含まれる。
変異原カセットに導入することができる変異群のある具体例では、本発明は特に縮退コドン置換およびそれによってコードされるポリペプチドライブラリーを提供する。前記は縮退オリゴを用いて提供され、前記オリゴは各位置で2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、、14、15、16、17、18、19および20アミノ酸をコードする。
【００６７】
合成連結再アッセンブリ（SLR）：本発明は、“合成連結再アッセンブリ”、または簡潔に“SLR”、“定方向進化プロセス”と称される、新規なまたは変異した特性を有するポリペプチド（例えば本発明のフィターゼまたは抗体）を生成する非確率論的遺伝子改変系を提供する。SLRは、オリゴヌクレオチドフラグメントを非確率論的に一緒に連結する方法である。この方法は、核酸構築ブロックがランダムにシャッフル、連結、またはキメラ化されるのではなく、非確率論的にアッセンブリングされるという点で確率論的オリゴヌクレオチドシャッフリングとは異なる。例えば、米国特許第6,773,900号、6,740,506号、6,713,282号、6,635,449号、6,605,449号、6,537,776号を参照されたい。
ある特徴では、SLRは以下の工程を含む：（a）鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程（前記鋳型ポリヌクレオチドは相同な遺伝子をコードする配列を含む）；（b）複数の構築ブロックポリヌクレオチドを提供する工程（前記構築ブロックポリヌクレオチドは鋳型ポリヌクレオチドとあらかじめ定められた配列で交差再アッセンブリングを生じるように設計され、構築ブロックポリヌクレオチドは前記相同な遺伝子の変種である配列および前記変種配列にフランキングする前記鋳型ポリヌクレオチドと相同な配列を含む）；（c）前記構築ブロックポリヌクレオチドが前記鋳型ポリヌクレオチドと交差再アッセンブリングして相同な遺伝子配列変種を含むポリヌクレオチドを生成できるように、構築ブロックポリヌクレオチドを鋳型ポリヌクレオチドと一緒にする工程。
SLRは、再編成を実施されるポリヌクレオチド間に高レベルの相同性が存在することを必要としない。したがって、本方法は、10100を超える種々のキメラを含む子孫分子のライブラリー（またはセット）を非確率論的に作製するために用いることができる。SLRを用いて101000を超える種々の子孫キメラを含むライブラリーの作製に用いることができる。したがって、本発明の特徴は、設計に従って選択される全体的なアッセンブリの順番にしたがって完成されたキメラ核酸分子セットを製造する非確率論的方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：互いに適合する連結可能な有用な末端を有する複数の特別な核酸構築ブロックを設計に従って作製する工程、および、設計した全体的なアッセンブリの順番が達成されるように前記核酸構築ブロックをアッセンブリングする工程。アッセンブリングされる互いに適合する核酸構築ブロックの末端は、これらが前記構築ブロックをあらかじめ定めた順序で結合させることができるならば、このタイプの指定されたアッセンブリに対して“利用可能”であると考えられる。したがって、前記核酸構築ブロックが結合される全体的なアッセンブリの順番は、連結させることができる末端の設計によって特定される。2つ以上のアッセンブリ工程が用いられる場合、核酸構築ブロックが結合される全体的アッセンブリの順番は、前記アッセンブリ工程の一連の順番によって特定される。ある特徴では、アニールした構築片は酵素（例えばリガーゼ（例えばT4DNAリガーゼ））で処理され、前記構築片の共有結合が達成される。ある特徴では、合成連結再アッセンブリ（SLR）と称される非確率論的方法（前記は、核酸構築ブロックがランダムにシャッフル、連結、またはキメラ化されるのではなく、非確率論的にアッセンブリングされるという点を除けばいくぶん確率論的シャッフリングと関連する）を用いて、変種を作製することができる。
【００６８】
SLRのための方法は、シャッフルされるポリヌクレオチド間に高レベルの相同性が存在することを必要としない。本発明は、10100を超える種々のキメラを含む子孫分子のライブラリー（またはセット）を非確率論的に作製するために用いることができる。SLRを用いて101000を超える種々の子孫キメラを含むライブラリーの作製にさえ用いることができる。
したがってある特徴では、本発明は、設計に従って選択される全体的なアッセンブリの順番にしたがって完成されたキメラ核酸分子セットを製造する非確率論的方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：互いに適合する連結可能な有用な末端を有する複数の特別な核酸構築ブロックを設計に従って作製する工程、および、設計した全体的なアッセンブリの順番が達成されるように前記核酸構築ブロックをアッセンブリングする工程。
アッセンブリングされる互いに適合する核酸構築ブロックの末端は、これらが前記構築ブロックをあらかじめ定めた順序で結合させることができるならば、このタイプの指定されたアッセンブリに対して“有用”であると考えられる。したがって、ある特徴では、前記核酸構築ブロックが結合される全体的なアッセンブリの順番は、連結させることができる末端の設計によって特定され、さらに2つ以上のアッセンブリ工程が用いられるならば、核酸構築ブロックが結合される全体的アッセンブリの順番は、前記アッセンブリ工程の一連の順番によって特定される。本発明のある特徴では、アニールした構築片は酵素（例えばリガーゼ（例えばT4DNAリガーゼ））で処理され、前記構築片の共有結合が達成される。
また別の特徴では、核酸構築ブロックの設計は、祖先核酸の鋳型セットの配列を分析することによって得られる（祖先核酸配列は完成したキメラポリヌクレオチドの子孫セットを製造する基礎として機能する）。したがって、これら祖先核酸鋳型は、変異（すなわちキメラ化またはシャッフリング）を導入しようとする核酸構築ブロックの設計を促進する配列情報供給源として機能する。
ある具体例では、本発明は、関連遺伝子ファミリーおよびそれらがコードする関連生成物ファミリーのキメラ化を提供する。特にある具体例では、コードされる生成物は酵素である。本発明で使用される酵素およびポリペプチドには本明細書に記載の方法にしたがって変異を導入することができる。
【００６９】
本発明のある特徴にしたがえば、複数の祖先核酸鋳型の配列でアラインメントを実施して1つ以上の境界点が選択される（前記境界点は相同領域に位置する）。この境界点を用いて作製されるオリゴヌクレオチド構築ブロックの境界線を引くことができる。祖先分子中で同定され選別される境界点は、子孫分子のアッセンブリにおける潜在的キメラ形成点として機能する。
典型的には、有用な境界点は、少なくとも2つの祖先鋳型によって共有される相同領域（少なくとも1つの相同なヌクレオチド塩基を含む）であるが、境界点は、祖先鋳型の少なくとも半分、祖先鋳型の少なくとも2/3、祖先鋳型の少なくとも3/4、または祖先鋳型のほぼ全てによって共有されえる。ある特徴では、有用な境界点は、祖先鋳型の全部によって共有される相同領域である。
ある特徴では、連結再アッセンブリ工程は網羅的に実施され、網羅的ライブラリーが作製される。換言すれば、全ての可能な順番で組み合わされた核酸構築ブロックが、完成キメラ核酸分子セットに出現する。同時に、各組合せにおけるアッセンブリの順番（すなわち完成したキメラ核酸の各々の配列の5'から3'方向における各構築ブロックのアッセンブリの順番）は意図的（または非確率論的）である。本方法の非確率論的な性質のために、望ましくない副生成物の可能性は極めて低くなる。
別の特徴では、連結再アッセンブリ方法を系統的に実施して、例えば系統的に区画化されたライブラリーを作製する。前記区画は系統的に（例えば1つずつ）スクリーニングすることができる。換言すれば、本発明は、連続的に進められるアッセンブリング反応の選択的および慎重な使用と併せて特定の核酸構築ブロックを選択的および慎重に使用することによって、特定の子孫生成物セットがいくつかの反応容器の各々で生成される実験的設計が達成されることを示した。前記によって系統的な調査およびスクリーニング方法の実施が可能になる。したがって、前記は、潜在的に膨大な数の子孫分子をより小さなグループで系統的に調査することを可能にする。
特に祖先分子間で低レベルの相同性しか存在しないときに、高度に柔軟性を有し、しかも網羅的で系統的な態様でキメラ化を実施できるるその能力のために、本発明は膨大な数の子孫分子を含むライブラリー（またはセット）の生成を提供する。本発明の連結再アッセンブリの非確率論的性質のために、生成される子孫分子は、設計により選択された全体的なアッセンブリの順番を有する完成されたキメラ核酸分子のライブラリーを含むことができる。特にある特徴では、そのように作製されたライブラリーは103を超える種々の子孫分子種から101000を超える種々の子孫分子種を含む。
ある特徴では、記載のように生成された完成キメラ核酸分子のセットはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特徴にしたがえば、このポリヌクレオチドは遺伝子であり、前記は人工遺伝子でもよい。別の特徴にしたがえば、このポリヌクレオチドは遺伝子経路であり、前記は人工遺伝子経路でもよい。本発明は、本発明により作製された1つ以上の人工遺伝子が人工遺伝子経路（例えば真核生物（植物を含む）で作働できる経路）に取り込まれたものを提供する。
【００７０】
また別の具体例では、構築ブロックが作製される工程の合成的な性質によって、in vitro過程（例えば変異導入による）またはin vivo過程（例えば宿主生物の遺伝子スプライシング能を利用することによる）で場合によって後で除去することが可能なヌクレオチド（例えば1つ以上のヌクレオチドで、例えばコドンまたはイントロンまたは調節配列でもよい）を設計または導入することが可能になる。多くの事例で、有用な境界点を創出できるという潜在的な利点以外にも他の多くの理由からこれらヌクレオチドの導入はまた望ましいものであり得ることは理解されよう。
したがって、別の特徴にしたがえば、本発明によって、核酸構築ブロックを用いてイントロンを導入することができる。したがって、本発明によって、機能的イントロンが本発明の人工遺伝子に導入されえる。また本発明によって、本発明の人工遺伝子経路に機能的イントロンが導入されえる。したがって、本発明は、1つ（または2つ以上）の人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子であるキメラポリヌクレオチドの作製を提供する。
したがって、本発明はまた、1つの（または2つ以上の）人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子経路であるキメラポリヌクレオチドの生成を提供する。ある特徴では、人工的に導入されたイントロンは、天然に存在するイントロンが遺伝子スプライシングで機能を発揮する態様で良好に遺伝子スプライシングのために1つ以上の宿主細胞で機能する。本発明は、組換え及び／又はスプライシングのために宿主生物に導入される人工イントロン含有ポリヌクレオチドの作製方法を提供する。
本発明を用いて作製された人工遺伝子はまた、また別の核酸との組換えのための基質として機能することができる。同様に、本発明を用いて作製された人工遺伝子経路はまた、また別の核酸との組換えのための基質として機能することができる。ある特徴では、前記組換えは、人工の、イントロン含有遺伝子と核酸（組換えのパートナーとして機能する）との間の相同領域によって促進されるか、または前記相同領域で生じる。ある特徴では、前記組換えパートナーはまた、本発明によって生成された核酸（人工遺伝子または人工遺伝子経路を含む）であり得る。組換えは、人工遺伝子内に人工的に導入された1つ（または2つ以上）のイントロンに存在する相同性領域によって促進されるか、または前記領域で生じる。
【００７１】
本発明の合成遺伝子再アッセンブリの方法は、複数の核酸構築ブロック（その各々は2つの連結可能末端を有する）を利用する。各核酸構築ブロックの2つの連結可能末端は2つの平滑端であるか（すなわち各々はオーバーハングヌクレオチドがゼロである）、または１つの平滑端および１つのオーバーハング、または2つのオーバーハングでありえる。
この目的のために有用なオーバーハングは3'側のオーバーハングでも5'側のオーバーハングでもよい。したがって、核酸構築ブロックは3'オーバーハングを有するか、また別には5'オーバーハングを有するか、また別には2つの3'オーバーハングまたは2つの5'オーバーハングを有することができる。核酸構築ブロックがアッセンブリングされて完成キメラ核酸分子が形成される全体的な順序は、意図的な実験設計によって決定され、ランダムではない。
ある特徴では、核酸構築ブロックは、2つの一本鎖核酸（一本鎖オリゴとも称される）を化学的に合成し、それらを接触させてアニールを可能にし二本鎖核酸構築物を形成することによって作製される。
二本鎖核酸構築ブロックのサイズは変動し得る。これら構築ブロックのサイズは小さくても大きくてもよい。構築ブロックの例示的サイズは1塩基対（オーバーハングを全く含まない）から100,000塩基対（オーバーハングを全く含まない）の範囲である。他のサイズ範囲もまた提供され、前記は１bp〜10,000bp（その間の全ての整数値を含む）の下限から、２bp〜100,000bp（その間の全ての整数値を含む）の上限を有する。
本発明に有用な二本鎖核酸構築ブロックを作製することができる多くの方法が有り、これらは当業者に公知であり、さらに当業者は容易にこれらを実施できる。
【００７２】
ある特徴にしたがえば、二本鎖核酸構築物は、先ず初めに2つの一本鎖核酸を作製し、さらにそれらをアニールさせて二本鎖核酸構築ブロック形成することによって作製される。二本鎖核酸構築ブロックの2つの鎖は、オーバーハングを形成するものは別として全てのヌクレオチドと相補的であり得る。したがって、オーバーハングを除いてミスマッチを含まない。別の特徴にしたがえば、二本鎖核酸構築ブロックの2つの鎖は、オーバーハングを形成するものを除いて、全ヌクレオチドより少ないヌクレオチドにおいて相補的である。したがって、この特徴にしたがえば、二本鎖核酸構築物を用いてコドンの縮退を導入することができる。ある特徴では、コドンの縮退は、1つ以上のN,N,G/Tカセット、また別には1つ以上のN,N,Nカセットを用い、本明細書に開示した部位飽和変異導入により導入される。
本発明のin vivo組換え方法は未知ハイブリッドプールまたは特定のポリヌクレオチドもしくは配列の対立遺伝子座プールで手当たり次第に実施することができる。しかしながら、前記特定のポリヌクレオチドのDNAまたはRNAの実際の配列を知ることは必要ではない。
遺伝子の混合集団内での組換えを用いるアプローチは、任意の有用なタンパク質、例えばインターロイキンI、抗体、tPAおよび成長ホルモンの作出に有用であり得る。このアプローチを用いて、変異した特異性または活性を有するタンパク質を作出することができる。前記アプローチはまた、ハイブリッド核酸配列、例えばプロモーター領域、イントロン、エキソン、エンハンサー配列、遺伝子の3'非翻訳領域または5'非翻訳領域の作出に有用であり得る。したがって、このアプローチを用いて発現率が増した遺伝子を作出することができる。このアプローチはまた、反復DNA配列の研究で有用である。最後に、このアプローチはリボザイムまたはアプタマーに変異を導入するために有用であり得る。
ある特徴では、本明細書に記載したポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変種は、還元的再組合せ、組換えおよび選別のサイクルを反復して用いることによって得られる（前記は高度に複雑な直鎖状配列（例えばDNA、RNAまたはタンパク質）の組換えによる定方向分子進化を可能にする）。
【００７３】
分子のin vivoシャッフリングは変種の提供で有用であり、マルチマーを組換える細胞の天然の特性を利用して実施することができる。in vivo組換えは分子の多様性をもたらす主要な天然の経路を提供してきたが、一方、遺伝子組み換えは以下を含む比較的複雑な過程のままである：1）相同性の認識；2）鎖の切断、鎖の侵襲、および組換えキアズマの生成をもたらす代謝工程；および最後に3）別個の組換え分子へのキアズマの解離。キアズマの形成は相同配列の認識を必要とする。
別の特徴では、本発明は、少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドからハイブリッドポリヌクレオチドを製造する方法を含む。本発明を用いて、少なくとも1つの部分的な配列相同性領域（例えば配列番号:1）を共有する少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に導入することによってハイブリッドヌクレオチドを生成することができる。部分的な配列相同性領域は、ハイブリッドポリヌクレオチドを生成する配列再編成を生じる過程を促進する。本明細書で用いられる“ハイブリッドポリヌクレオチド”という用語は、本発明の方法により得られる、少なくとも2つの原型ポリヌクレオチド配列由来の配列を含む任意のヌクレオチド配列である。そのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、DNA分子間の配列統合を促進する分子間組換え事象により生じる。さらにまた、そのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、DNA分子内のヌクレオチド配列を変異させるために反復配列を利用する分子内還元的再組合せ過程から生じえる。
【００７４】
本発明は、生物学的に活性なハイブリッドポリペプチド（例えばハイブリッドフィターゼ）をコードすることができるハイブリッドポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ある特徴では、原型ポリヌクレオチドは生物学的に活性なポリペプチドをコードする。本発明の方法は、生成されるハイブリッドポリヌクレオチドが生物学的に活性な原型ポリペプチドに由来する活性を示すポリペプチドをコードすることができるように、原型ポリヌクレオチドの配列を組み込む細胞性プロセスを利用することによって新規なハイブリッドポリペプチドを作製する。例えば、原型ポリヌクレオチドは、種々の微生物から特定の酵素をコードすることができる。ある生物または変種に由来する第一のポリヌクレオチドによってコードされる酵素は、例えば特定の環境条件（例えば高い塩分）下で効率的に機能することができる。異なる生物または変種に由来する第二のポリヌクレオチドによってコードされる酵素は、異なる環境条件（例えば超高温）下で効率的に機能することができる。第一および第二の原型ポリヌクレオチド由来の配列を含むハイブリッドポリヌクレオチドは、前記原型ポリヌクレオチドによってコードされる両酵素の性状を示す酵素をコードすることができる。したがって、ハイブリッドポリヌクレオチドによってコードされる酵素は、第一および第二のポリヌクレオチドによってコードされる酵素の各々が共有する環境条件（例えば高い塩分および極端な温度）下で効率的に機能することができる。
上記に記載した多様な方法の他に、酵素特性が強化されたハイブリッドポリヌクレオチドを得るために用いることができる多様な方法が当分野で公知である。以下の例は、対象の野生型酵素をコードするポリヌクレオチドに変異を導入することによって、熱安定性または耐熱性酵素を得ることを目的とする前記のような方法の使用を示す。
例えば、ある特徴では、M. Lehmannら（Biochimica et Biophysica Acta (2000), 1543:408-415）は“コンセンサスアプローチ”を記載し、このアプローチでは、同種の菌類フィターゼのアラインメントを用いて、コンセンサスフィターゼアミノ酸配列が決定された。対応するコンセンサス遺伝子の構築、組換え体の発現および精製に際して、得られた組換えフィターゼは、設計に用いられたいずれの親フィターゼよりも15−22℃高い非折畳み温度（Tm）を示した。組換えタンパク質をコードする遺伝子の位置特異的変異導入を用いて、Tm値を90.4℃にさらに高めた。熱安定性効果は、このタンパク質の全配列および主要な影響を受ける表面露出残基にわたって割り当てた多様なアミノ酸交換の組合せによるものであった。
【００７５】
ある特徴では、本発明は、L. Jermutusら（J Biotechnology (2001) 85:15-24）が記載した、熱特性が強化された酵素を得るための方法を用いる。このアプローチでは、先ず初めにアスペルギルス・テルレウス（Aspergillus terreus）フィターゼの表面のイオン相互作用および水素結合を、同種であるがより熱安定性のA.ニゲル（A. niger）由来酵素に存在するフィターゼに一致するように回復させた。続いて二次構造エレメント全体が、A.ニゲルのフィターゼの同じ領域で、かつ前記の結晶構造を基準に置き換えられた。A.テルレウスフィターゼの表面の1つのα-ヘリックスのA.ニゲルフィターゼの対応するストレッチによる置き換えは、熱安定性を改善し酵素活性には変化がない構造依存性キメラ酵素（融合タンパク質）をもたらした。
ある特徴では、本発明は、L. Giverら（Proc Natl Acad Sci USA (1998) 95:12809-12813）が記載した方法を用いる。Giverは、枯草菌のp-ニトロベンジルエステラーゼをコードするポリヌクレオチドの変異原性PCRとそれに続くStemmerの方法によるin vitro組換えの間に導入される6世代のランダム変異導入によって、低温での触媒活性を損なうことなく熱安定性が高められた（Tmで14℃を超える増加）組換えエステラーゼを作製する方法を記載している。
ある特徴では、本発明は、C. Vetrianiら（Proc Natl Acad Sci USA (1998) 95:12300-12305）が記載した方法を用いる。Vetrianiは、好熱菌ピロコッカス・フリオスス（Pyrococcus furiosus）およびテルモコックス・リトラリス（それぞれ100℃および88℃の至適増殖温度を有する）由来のヘキサマーグルタメートデヒドロゲナーゼの相同性依存モデリングおよび直接構造比較を用いて重要な熱安定性特性を決定する方法を記載している。不安定な酵素で実質的な減少が観察されるサブユニット間イオン対ネットワークが、その中の2つの残基の変異導入によって改変され、より安定な酵素で見出される相互作用を回復させた。どちらか一方の単一変異では熱安定性に関して逆効果が生じたが、両変異が適所で生じた場合、104℃で野生型酵素より4倍の安定性の改善が観察された。
ある特徴では、本発明は、Tomschyら（Protein Science (2000), 9:1304-1311）が記載した方法を用いる。Tomschyは、アスペルギルス・ニゲルのフィターゼの結晶構造を利用して（2.5オングストロームの解像で）、酵素の全活性部位を特定する方法を記載している。続いて多重アミノ酸配列アラインメントを用いて、対象のある好ましい特性に対応しえる非保存的活性部位残基を認定した。このアプローチを用いて、A.フミガツス（A. fumigatus）のフィターゼのGln27（A.ニゲルのLeu27と異なる）が、基質結合および／または遊離におそらく必要であり、A.フミガツスフィターゼのより低い比活性（pH5.0でタンパク質1mgにつき196.6Uに対して26.5U）の原因であることを確認した。A.フミガツスフィターゼのGln27からLeuへの位置特異的変異導入は、変異体酵素の比活性を92.1U/mgタンパク質に向上させた。
【００７６】
トランスジェニック植物および種子
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド、発現カセット、クローニングメカニズムもしくはベクター、またはトランスフェクトもしくは形質転換された細胞を含むトランスジェニック植物および種子を提供する。本発明はまた、本発明の核酸および／またはポリペプチドを含む植物生産物、例えば油、種子、葉、抽出物などを提供する。トランスジェニック植物は双子葉植物または単子葉植物であろう。本発明はまたトランスジェニック植物および種子の製造方法および使用方法を提供する。本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物または植物細胞は当分野で公知の任意の方法にしたがって構築できる。例えば米国特許第6,309,872号を参照されたい。
本発明のフィターゼ分子の組換え体の発現または過剰発現は、1つ以上のまた別の分子、例えば他の酵素と併用して実施することができる。このアプローチは合体生成物、例えば本発明のフィターゼとともに1つ以上のまた別の分子を含む植物または植物部分の生産に有用である。本発明のフィターゼ分子および前記また別の分子を合体処理で用いることができる。生じた組換え発現分子は均質化および／または精製形として、あるいは比較的未精製な形態として（例えば、フィターゼの分解を触媒するための食品類と混合したときに有用な消費可能な植物部分として）用いることができる。
具体的な特徴では、本発明は、トランスジェニック植物または植物器官でのフィターゼの発現および前記を生産する方法を提供する。DNA発現構築物が、調節配列（フィターゼの発現を誘導することができる）の制御下にあるフィターゼをコードする遺伝子により植物を形質転換するために提供される。これらの調節配列には、構成的にまたはステージ特異的および／または組織特異的態様で植物での転写を誘導することができる配列が含まれる。
【００７７】
発現の態様は、部分的には植物または植物部分の使用に左右される。本発明によって提供されるトランスジェニック植物および植物器官は、多様な工業的プロセスに利用することができる。前記利用は、直接的であるか（例えば動物飼料として）、または発現されたフィターゼは抽出され、所望の場合は利用前に精製されてもよい。あるいは、組換え宿主植物または植物部分を直接用いてもよい。具体的な特徴では、本発明は、増量されたフィターゼを含む種子を用いる、フィターゼ加水分解反応を触媒する方法を提供する。本方法は、トランスジェニックな非野生型種子（例えばひき割りまたはチューイング形である）をフィテート含有基質と接触させて種子中の酵素の反応速度を高める工程を含む。種子をフィテート含有基質に直接添加することによって、本発明は、酵素の抽出および精製という高価で問題の多いプロセスに対する解決を提供する。ある具体例では、本発明は、酵素の十分な供給を欠く生物に増量された酵素を含む種子の形で酵素を投与する処理方法を提供する。ある特徴では、生物への酵素投与のタイミングは、フィテート含有食品類の消費と一元化される。
植物中でのフィターゼの発現は多様な手段によって達成することができる。例えば、特に多数の植物種（双子葉植物種（例えばタバコ、ジャガイモ、トマト、ペチュニア、ブラシカ）および単子葉植物種を含む）を形質転換するための技術が利用可能である。さらにまた、例えば外来遺伝子を植物中で発現させる方法も利用可能である。さらにまた、植物および植物細胞で機能的に発現させることができるキメラ遺伝子の構築に有用な植物遺伝子由来の調節配列が既に同定されている（例えば、Klee Ann Rev Plant Phys (1987) 38:467-486；Clark et al. Virol (1990) 179(2):640-7；Smith et al Mol Genet (1990) 224(3):477-81）。
遺伝子構築物の植物への導入は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（A. rhizogenes）を用いる形質転換を含むいくつかの技術を用いて達成することができる。形質転換することができる植物組織の非限定的な例には、したがってプロトプラスト、小胞子または花粉、および外植片、例えば葉、茎、根、胚軸、子葉（cotyl）が含まれる。さらにまた、DNAはまた、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子ボンバードメントおよび直接的DNA取り込みによって、プロトプラストおよび植物細胞または組織に直接導入されえる。
タンパク質は多様な発現系によって植物で生産することができる。例えば、構成的プロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモータの使用（Guilley et al. 1982）は、トランスジェニック植物の実質的に全ての器官での発現タンパク質の蓄積のために有用である。あるいは、高度に組織特異的および／またはステージ特異的であるプロモータの使用は、所望の組織に向けておよび／または所望の発育ステージに向けて発現を偏らせるために本発明で有用である（Higgins, 1984；Shotwell, 1989）。本発明はまた、例えば米国特許第5,770,413号（Van Ooijen et al.）および米国特許第5,593,963号（Van Ooijen et al.）（菌類フィターゼの使用を教示する）で開示されている本発明のフィターゼ分子の植物での発現のためのプロトコルを使用する。
【００７８】
コード配列および隣接配列の改変
異種供給源に由来する遺伝子の植物でのトランスジェニックな発現は、それら遺伝子を改変して、植物におけるそれらの発現を達成し最適化することを必要とする。特に、別々の酵素をコードする細菌ORF（しかしこれらは天然の微生物では同じ転写物でコードされる）は、別々の転写物により植物中でもっとも良好に発現される。したがって、ある特徴では、前記を達成するために、各微生物のORFを個々に単離して、植物プロモーター配列を当該ORFの5'末端に、さらに植物転写ターミネーターをORFの3'末端に提供するカセット内で前記をクローニングする。前記単離ORF配列は、ATG開始コドンおよび終止STOPコドンを含むことができるが、開始ATGおよびSTOPコドンを超えて追加の配列を含むこともできる。さらにまた、ORFは短縮することができるが、なお必要な活性を保持し、特に長いORFについては、活性を保持する短縮型は、トランスジェニック生物での発現で好ましい。本発明の実施に用いることができる“植物プロモーター”および“植物転写ターミネーター”には、植物細胞内で作動する任意のプロモーターおよび／または転写ターミネーターが含まれる。前記には、非植物性供給源、例えばウイルス（その例はカリフラワーモザイクウイルスである）に由来しえるプロモーターおよび転写ターミネーターが含まれる。
いくつかの事例では、ORFコード配列および隣接配列に対する改変は要求されない。対象のORFを含むフラグメントを単離し、前記を植物プロモーターの下流に挿入するだけで十分である。例えば、Gaffneyら（Science (1993) 261:754-756）は、シュードモナスのnahG遺伝子をCaMV 35SプロモーターおよびCaMV tmlターミネーターの制御下においてトランスジェニック植物で成功裡に発現させたが、コード配列の改変は行われず、ATG上流のシュードモナス遺伝子のヌクレオチドは結合されたままであり、STOPコドンの下流のヌクレオチドもnahG ORFに結合したままであった。好ましくは、ごく小さいものとして、微生物の隣接配列はATGの上流およびSTOPコドンの下流に結合したまま残存することができる。実際には、そのような構築物は制限部位が利用できるか否かに左右される。
他の事例では、微生物に由来する遺伝子の発現は発現時に問題を提示することがある。これらの問題は当分野では詳しく性状が調べられており、ある種の微生物に由来する遺伝子に関しては特に一般的である。これらの問題は本発明のヌクレオチド配列に応用することができ、これらの遺伝子の改変は当分野で周知の技術を用いて実施することができる。以下の問題に遭遇することがあろう：
【００７９】
コドン使用頻度
本発明は、植物での使用のためにコドンを改変した核酸を提供する（いくつかの事例では、植物の好ましいコドン使用頻度はある種の微生物における好ましいコドン使用頻度と異なっている）。クローニングされた微生物ORF内のコドン使用頻度と植物遺伝子（特に標的植物由来遺伝子）のコドン使用頻度の比較は、望ましい変更を実施されるべきORF内のコドンの識別を容易にするであろう。典型的には、植物の進化は、単子葉植物の第三の塩基の位置にヌクレオチドCおよびGを強く嗜好してきたが、一方、双子葉植物はこの位置にヌクレオチドAまたはTをしばしば使用する。遺伝子を改変して特定のトランスジェニック標的種にとって好ましいコドン使用頻度を取り入れることによって、GC/AT含量および異常なスプライシングについて下記に記載する問題の多くが解決されるであろう。
GC/AT含量
本発明は、例えば植物での使用のためにそのGC含量が改変された核酸を提供する（植物遺伝子は典型的には35%を超えるGC含量を有する）。AおよびTヌクレオチドに富むORF配列は植物でいくつかの問題を引き起こす。第一に、ATTTAモチーフは、メッセージの脱安定化を引き起こすと考えられ、多くの短命なmRNAの3'末端に見出される。第二に、メッセージ内の不適切な位置にポリアデニル化シグナル（例えばAATAAA）が出現することは、転写物の成熟前短縮を引き起こすと考えられている。さらにまた、単子葉植物はAT富裕配列をスプライス部位と認識することがある（下記参照）。
開始メチオニンに隣接する配列
本発明は、ATGに隣接するヌクレオチドで改変および／または付加を実施された核酸を提供する（植物は、それらのメッセージが所定のリボソーム結合部位を保有しないという点で微生物と異なる）。むしろ、リボソームはメッセージの5'末端に結合し、翻訳開始のための最初の利用可能なATGを求めてスキャンを実施すると考えられている。それにもかかわらず、ATGに隣接するある種のヌクレオチドについて優先性が存在すること、および微生物遺伝子の発現はATGに真核細胞のコンセンサス翻訳開始因子が含まれることによって強化しえると考えられている。Clontech社（1993/1994カタログ、210ページ、前記は参照により本明細書に含まれる）は、大腸菌のuidA遺伝子を植物で発現させるためにコンセンサス翻訳開始因子として1つの配列を提唱した。さらに、Joshi（N.A.R. (1987) 15:6643-6653、前記文献は参照により本明細書に含まれる）は、ATGに隣接する多くの植物配列を比較して、また別のコンセンサス配列を提唱した。微生物ORFの植物での発現に際して困難に遭遇する場合、開始ATGにこれらの配列の1つを加えることによって翻訳を向上させることができる。そのような事例では、コンセンサスの最後の3つのヌクレオチドは、それらの第二のAA残基の改変のために、改変配列に加えるには適切ではないかもしてない。いくつかの特徴では、開始メチオニンに隣接する好ましい配列は、種々の植物種間で異なるかもしてない。GenBankデータベースに存在する14のトウモロコシ遺伝子の調査によって以下の結果が提供された：
【００８０】
14のトウモロコシ遺伝子の開始ATGから前の位置：
2010539888.tif 000002
この分析を、ヌクレオチド配列を取り込ませようとしている所望の植物種および改変されるATGに隣接する配列について実施して、好ましいヌクレオチドを取り込むことができる。
【００８１】
異常なスプライス部位の除去
本発明は、異常なスプライス部位が改変もしくは除去された、または機能的に“ノックアウト”された核酸を提供する。非植物性供給源からクローニングされ、かつ植物での発現のために最適化されていない遺伝子はまた、植物では5'または3'スプライス部位として認識されえるモチーフを含み、したがって切端または欠失メッセージを生じる可能性がある。これらの部位は当分野で周知の技術を用いて除去できる。
コード配列および隣接配列を改変する技術は当分野では周知である。微生物のORFの最初の発現が低く、上記記載の配列を変異させることが適切であるように思われる場合は、当分野で周知の方法にしたがって合成遺伝子の構築を実施することができる。これらは、例えば公開特許公報EP0385962（Monsanto）、EP0359472（Lubrizol）およびWO93/07278（Ciba-Geigy）（前記文献はいずれも参照により本明細書に含まれる）に記載されている。ほとんどの事例で、トランスジェニック植物へそれらを伝達させる前に、一過性アッセイプロトコル（当分野で公知である）を用いて遺伝子構築物の発現をアッセイすることが好ましい。
植物プロモーター
本発明の組成物は、例えば対象の植物の形質転換および発現のために、核酸配列（例えばプロモーター）を含むことができる。この核酸配列はDNA構築物または発現カセットに存在しえる。本発明の核酸は“発現カセット”であってもよく、または“発現カセット”含んでいてもよい。前記発現カセットは任意の核酸分子を含み、前記核酸分子は、適切な宿主細胞で特定のヌクレオチド配列の発現を誘導する能力を有し、終止シグナルに機能可能に連結された対象のヌクレオチド配列に機能可能に連結されたプロモーターを含む。
本発明の組成物（例えば核酸配列）はまた、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列を含むことができる。コード領域は通常は対象のタンパク質をコードするが、関心のある機能的RNA、例えばアンチセンスRNAまたは非翻訳RNA（センス方向またはアンチセンス方向）をコードすることもできる。対象のヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラでもよい（キメラとは、発現カセットの成分の少なくとも1つは、前記カセットの他の成分の少なくとも1つに対して異種であることを意味する）。発現カセットはまた、天然に存在するものであるが、異種発現に有用な組換え形態で得られたものであってもよい。しかしながら、典型的には、発現カセットは宿主に対して異種である。すなわち、発現カセットの特定のDNA配列は当該宿主細胞には天然には存在せず、宿主細胞または宿主細胞の祖先に形質転換事象によって導入されたものである。発現カセットのヌクレオチドの発現は、構成的プロモーターの制御下にあっても、または宿主細胞が何らかの特定の外部刺激に暴露されたときにのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。さらにまた、プロモーターは特定の組織もしくは器官または発育ステージに特異的であってもよい。
【００８２】
本発明は、ポリヌクレオチドを発現させることができる発現カセットによる植物の形質転換を含む。発現カセットは、転写の5'−3'方向に転写および翻訳開始領域（すなわちプロモーター）および対象のポリヌクレオチドを含むであろう。発現カセットは、場合によって、植物で機能する転写および翻訳終了領域（すなわち終止領域）を含むことができる。いくつかの実施態様では、発現カセットは選別可能なマーカー遺伝子を含み、安定な形質転換体の選別を可能にする。本発明の発現構築物はまた、リーダー配列および／または対象のポリヌクレオチドの誘導性発現を可能にする配列を含むことができる。誘導性発現を可能にする配列の例については以下を参照されたい：Guo et al. Plant J (2003) 34:383-92およびChen et al. Plant J (2003) 36:731-40。
発現構築物の調節配列は対象のポリヌクレオチドに機能可能に連結される。“機能可能に連結”とは、プロモーターと第二の配列との間の機能的結合を意味し、この場合プロモーター配列は第二の配列に対応するDNAの転写を開始および仲介する。一般的には、機能可能に連結とは、連結されるヌクレオチド配列が連続していることを意味する。
対象の植物で発現を駆動させることができる任意のプロモーターを本発明の実施に用いることができる。プロモーターは、当該植物宿主にとって天然物または類似体または外来性または異種でありえる。本明細書で核酸配列（例えばDNAまたはRNA配列）または遺伝子を指すために用いられるときは、“異種”および“外因性”という用語は、当該特定の宿主細胞にとって外来性供給源に由来する配列が該当し、同じ供給源に由来する場合は、当該配列はその本来の形態から改変されている。したがって、宿主細胞内で異種遺伝子は、当該特定の宿主細胞にとって内因性であるが既に改変されている遺伝子を含む。前記用語はまた、天然に存在するDNA配列の天然には存在しないマルチコピーを含む。したがって、前記用語は、当該細胞にとって外来性または異種であるDNAセグメントに適用されるか、または当該細胞にとって同種であるが、当該エレメントが通常見出される宿主細胞核酸内の位置においては異種であるDNAセグメントに適用される。外因性DNAセグメントは発現されて、外因性ポリペプチドを生じる。また別の実施態様では、“同種”核酸（例えばDNA）配列は、前記が導入される宿主細胞とひとりでに結合した核酸（例えばDNAまたはRNA）である。
【００８３】
含むことができるプロモーターの選択は、いくつかの要因に左右される（前記要因は、効率性、選択性、誘導性、所望される発現レベル、および細胞または組織優先性発現を含むがただしこれらに限定されない）。プロモーターおよび他のものを適切に選択および配置することによって配列の発現を調節することは、当業者にとって日常的な事柄である。
いくつかの適切なプロモーターは、一定の細胞タイプでのみまたは前記タイプで優先的に転写を開始させる。したがって、本明細書で用いられる細胞タイプまたは組織優先性プロモーターは、標的組織で優先的に発現を駆動させるものであるが、他の細胞タイプまたは組織でも同様にある程度の発現を先導することができる。植物ゲノムDNAのプロモーター領域を同定および性状を決定する方法には、例えば以下の文献に記載されたものが含まれる：Jordano et al. Plant Cell (1989) 1:855-866；Bustos et al. Plant Cell (1989) 1:839-854；Green et al. EMBO J (1988) 7:4035-4044；Meier et al. Plant Cell (1991) 3:309-316；およびZhang et al Plant Physiology (1996) 110:1069-1079。
いくつかの組織優先性調節遺伝子および／またはプロモーターが植物で報告された。報告されたいくつかの組織優先性遺伝子には、種子貯蔵タンパク質（例えばナピン、クルシフェリン、ベータ-コングリシニンおよびファセオリン、プロラミン、グルテリン、グロブリンおよびゼイン）ゼインまたは油体タンパク質（例えばオレオシン）をコードする遺伝子、または脂肪酸生合成に必要とされる遺伝子（アシル担体タンパク質、ステアロイル-ACPデサチュラーゼ、および脂肪酸デサチュラーゼ（fad2-1）を含む）、および胚発生時に発現される他の遺伝子（例えばBce4（例えば以下を参照されたい：EP255378；およびKridl et al. Seed Science Research (1991) 1:209））が含まれる。
【００８４】
既に報告されている組織特異的プロモーターの例には以下が含まれる：レクチン（Vodkin, Prog Clin Biol Res (1983) 138:87；Lindstrom et al. Der Genet (1990) 11:160）、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ（Dennis et al. Nucleic Acids Res (1984) 12:3938）、トウモロコシの集光性複合体（例えば以下を参照されたい：Simpson Science (1986) 233:34；Bansal Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89:3654）、トウモロコシの熱ショックタンパク質（例えば以下を参照されたい：Odell et al. Mol Gen Genet (1986) 205:193-200；Cashmore et al. Gen Eng of Plants （1983）Plenum Press, New York, 29-38）；Tiプラスミドマンノピンシンターゼ（例えば以下を参照されたい：Langridge et al. Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:3219-3223）、Tiプラスミドノパリンシンターゼ（Langridge et al. Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:3219-3223）、ペチュニアカルコンイソメラーゼ（例えば以下を参照されたい：vanTunen ENBO J (1988) 7:1257）；インゲンマメのグリシン富裕プロテイン1（例えば以下を参照されたい：Keller, Genes Dev (1989) 3:1639）；切端CaMV 35s（例えば以下を参照されたい：Odell, Nature (1985) 313:810）；ジャガイモのパパチン（例えば以下を参照されたい：Wenzler, Plant Mol Biol (1989) 13:347）；根の細胞（例えば以下を参照されたい：Yamamoto, Nucleic Acids Res (1990) 18:7449）；トウモロコシのゼイン（例えば以下を参照されたい：Reina, Nucleic Acids Res (1990) 18:6425；Lopes et al. Mol Gen Genet (1995) 247:603-613；Kriz, Mol Gen Genet (1987) 207:90；Wandelt, Nucleic Acids Res (1989) 17:2354；Langridge, Cell (1983) 34:1015；Reina, Nucleic Acids Res (1990) 18:7449）、ADP-gppプロモーター（例えば米国特許第7,102,057号を参照されたい）；グロブリン-1（例えば以下を参照されたい：Belanger, Genetics (1991) 129:863）；α-グロブリン（Sunikumar et al. Transgenic Res (2002) 11:347-359）；α-チュブリン；cab（例えば以下を参照されたい：Sullivan, Mol Gen Genet (1989) 215:431）；PEPCase（例えば以下を参照されたい：Hudspeth & Grula, Plant Molec Biol (1989) 12:579-589）；R遺伝子複合体関連プロモーター（Chandler et al. Plant Cell (1989) 1:1175）；エンドウのヴィシリンプロモーター（Czako et al. Mol Gen Genet (1992) 235:33；米国特許第5,625,136号）；GTL1プロモーター（Takaiwa et al. Plant Mol Biol (1991) 16(1):49-58）；カルコンシンターゼプロモーター（Franken et al. EMBO J (1991) 10:2605）；GY1プロモーター（Sims & Goldburg, Nuc Acids Res (1989) 17(11):4368）など（前記文献はいずれも参照により本明細書に含まれる）。
【００８５】
本発明は果実優先性プロモーターを用いることができ、前記プロモーターには、例えば、アンチテーシス期またはその間に果実の成長を通して少なくとも後熟の開始まで発現される任意の種類の果実優先性プロモーターが含まれる（前記は例えばU.S.4,943,674（参照により本明細書に含まれる）で考察されている）。ポリガラクツロナーゼ遺伝子のプロモーターは果実の後熟で活性を示す。本発明は、例えば米国特許第4,535,060号、米国特許第4,769,061号、米国特許第4,801,590号および米国特許第5,107,065号（前記文献は参照により本明細書に含まれる）に記載されている、ポリガラクツロナーゼ遺伝子を用いることができる。
本発明は任意の組織優先性プロモーターを用いることができる。前記には、葉の損傷後（例えばカミキリムシによる）に葉の細胞での発現を誘導するもの、塊茎（例えばパタチン遺伝子プロモーター）および線維細胞での発現を誘導するものが含まれる。生育により調節される線維細胞タンパク質の例はE6である（John & Crow (1992) PNAS 89:5769-5773）。E6遺伝子は線維でもっとも活動的であるが、低レベルの転写物が葉、胚珠および花にも見出される。
本発明は、光合成組織、例えば緑色組織（例えば葉および茎）での転写を駆動させるために活動的なプロモーターを用いることができる。それらは、そのような組織でのみまたはそのような組織で優先的に発現を駆動させるときに適切である。あるいは、本発明は、植物全体に構成的に発現をもたらすプロモーター、または緑色組織に対して弁別的に、または発現が生じる緑色組織の生育段階に関し弁別的に、または外部刺激に応答して発現をもたらすプロモーターを用いることができる。
本発明の実施に用いられる例示的なプロモーターには以下が含まれる：リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ（RbcS）プロモーター、例えばイースタンカラマツ（Larix laricina）由来RbcSプロモーター、マツのcab6プロモーター（Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol 35:773-778）、コムギ由来Cab-1遺伝子プロモーター（Fejes et al. (1990) Plant Mol Biol 15:921-932）、ホウレンソウ由来CAB-1プロモーター（Lubberstedt et al. (1994) Plant Physiol 104:997-1006）、イネのcab1Rプロモーター（Luan et al. (1992) Plant Cell 4:971-981）、トウモロコシのピルベートオルトホスフェートジキナーゼ（PPDK）プロモーター（Matsuoka et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:9586-9590）、タバコLhcb1*2プロモーター（Cerdan et al. (1997) Plant Mol Biol 33:245-255）、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）SUC2シュクロース-H+シンポータープロモーター（Truernit et al. (1995) Planta 196:564-570）、およびホウレンソウのチラコイド膜タンパク質プロモーター（psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS）。茎、葉および緑色組織で転写を駆動する他のプロモーターは、米国特許公開公報2007/0006346（前記文献は参照により本明細書に含まれる）に記載されている。
【００８６】
いくつかの実施態様では、いくつかの“組織優先性”プロモーターの組織特異性は絶対的ではなく、レポーター遺伝子（例えばGUSもしくは緑色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質）を試験することができる。組織優先性発現はまた、種々の組織優先性プロモーターの組み合わせによる“リーキー”な発現により達成できる。当業者は他の組織優先性プロモーターを単離することができる（例えばU.S.5,589,379を参照されたい）。
ある特徴では、植物ホルモン（例えばオーキシン）への暴露に対して誘導性である植物プロモーターを用いて、本発明の核酸が発現される。例えば、本発明は以下を用いることができる：ダイズ（Glycine max L.）でオーキシン応答エレメントE1プロモーターフラグメント（Liu (1997) Plant Physiol 115:397-407）；オーキシン応答性アラブドプシスGST6プロモーター（サリチル酸および過酸化水素にも応答性）（Chen (1996) Plant J 10:955-966）；タバコ由来オーキシン誘導性parCプロモーター（Sakai (1996) 37:906-913）；植物ビオチン応答エレメント（Streit (1997) Plant Microbe Interact 10:933-937）；およびストレスホルモンアブシジン酸に応答性のプロモーター（Sheen (1996) Science 274:1900-1902）。
本発明の核酸はまた、化学薬剤（植物に適用することができるもの、例えば除草剤または抗生物質）の暴露に対して誘導性である植物プロモーターに機能可能に連結することができる。例えば、前記は化学的リガンド（エタノールを含む）の存在下で活性化されるものであり、例えばWO96/2763、WO93/01294、WO94/03619、WO02/061102（前記文献はいずれも参照により本明細書に含まれる）で見出すことができる。トウモロコシのIn2-2プロモーター（ベンゼンスルホンアミド系除草剤の毒性緩和剤によって活性化される）を用いることができる（De Veylder (1997) Plant Cell Physiol 38:568-577）。種々の除草剤の毒性緩和剤の適用により、根、排水組織および茎頂の分裂組織での発現を含む、別個の遺伝子発現パターンが誘導される。コード配列は、例えばテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。前記は、例えば、アヴェナ・サティヴァ（Avena sativa）L.（エンバク）のアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子（Masgrau (1997) Plant J 11:465:473）；エストロゲン、例えばエクディソンレセプター（WO01/52620）またはサリチル酸応答性エレメント（Stange (1997) Plant J 11:1315-1324）を含むトランスジェニック植物のタバコに関して記載されている。化学的に（例えばホルモンによりまたは農薬により）誘導されるプロモーター、すなわち野外でトランスジェニック植物に適用することができる化学物質に応答性のプロモーターを用いて、本発明のポリペプチドの発現を、当該植物の特定の生育段階で誘導することができる。
【００８７】
本発明の実施に用いることができ、さらに既に記載されている例示的な構成的プロモーターには以下が含まれる：イネのアクチン1（Wang et al. (1992) Mol Cell Biol 12:3399；米国特許第5,641,876号）；他のアクチンアイソフォーム（McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171およびMcElroy et al. (1991) Mol Gen Genet 231:150-160）；CaMV 35S（Odell et al. (1985) Nature 313:810）；CaMV 19S（Lawton et al. (1987) Plant Mol Biol 9:315-324；米国特許第5,639,949号）；nos（Ebert et al. (1987) PNAS USA 84:5745-5749）；Adh（Walker et al. (1987) PNAS USA 84:6624-6628）；シュクロースシンターゼ（Yang & Russell (1990) PNAS USA 87:4144-4148）；およびユビキチンプロモーター（例えばヒマワリについてはBinet et al. (1991) Plant Science 79:87-94；トウモロコシについてはChristensen et al. (1989) Plant Molec Biol 12:619-632；およびアラビドプシスについてはCallis et al. J Biol Chem (1990) 265:12486-12493；およびNorris et al. Plant Mol Biol (1993) 21:895-906）。
任意の転写ターミネーターを用いて、本発明を実施することができる。前記は例えばベクター、発現カセットなどに用いることができる。これらは、トランスジーンおよび正確なmRNAポリアデニル化を超える転写の終了に必要である。終了領域は、転写開始領域に関して天然のものであるか、機能可能に連結された対象のDNA配列に関して天然のものであるか、植物宿主に関して天然のものであるか、または別の供給源に由来することもある（すなわち、プロモーター、対象のDNA配列、植物宿主または前記の任意の組合せに対して外来性または異種）。適切な転写ターミネーターは植物で機能することが知られているもので、CAMV 35Sターミネーター、tmlターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーターおよびマメのrbcs E9ターミネーターが含まれる。これらは単子葉および双子葉植物の両方で用いることができる。さらにまた、遺伝子の天然の転写ターミネーターを用いてもよい。
本発明は、転写ユニットの遺伝子発現を増強するために任意の配列を用いることができる。これらの配列を本発明の遺伝子と一緒に用いて、トランスジェニック植物でのそれらの発現を高めることができる。例えば、種々のイントロン配列は、特に単子葉植物で発現を強化することが示された。例えば、トウモロコシのAdhl遺伝子のイントロンは、トウモロコシ細胞に導入されたとき、その同族プロモーター下で野生型遺伝子の発現を顕著に強化することが見出された。ウイルスに由来する多数の非翻訳リーダー配列もまた発現を強化することが知られており、さらにこれらは特に双子葉植物細胞で有効である。特に、タバコモザイクウイルス（TMV、“W-配列”）、トウモロコシクロロチックモットルウイルス（Chlorotic Mottle Virus）（MCMV）およびアルファルファモザイクウイルス（AMV）由来のリーダー配列は、発現強化に有効であることが示された（例えば、Gallie et al. (1987) Nuc Acids Res 15:8693-8711；Skuzeski et al. (1990) Plant Molec Biol 15:65-79）。
【００８８】
遺伝子生成物の細胞内標的誘導
遺伝子生成物を、例えば植物内の標的に誘導する任意のメカニズムを用いて本発明を実施することができる。植物内に存在するそのようなメカニズムが知られており、これらメカニズムの機能を制御する配列の性状がいくらか詳細に調べられた。遺伝子生成物の他の細胞区画への誘導を引き起こす配列の性状が調べられた。対象のタンパク質を任意の細胞区画、例えば空胞、ミトコンドリア、ペロキシソーム、タンパク顆粒、小胞体、葉緑体、デンプン顆粒、アミロプラスト、アポプラストまたは植物の細胞壁へ誘導するにはアミノ末端配列が要求されえる（例えば、Unger et al. (1989) Plant Molec Biol 13:411-418；Rogers et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA, 82:6512-651；米国特許第7,102,057号；WO2005/096704、前記文献はいずれも参照により本明細書に含まれる）。場合によって、シグナル配列は、waxyのN-末端シグナル配列、γ-ゼインのN-末端シグナル配列、デンプン結合ドメイン、C-末端デンプン結合ドメイン、葉緑体誘導配列（前記は成熟タンパク質を葉緑体へ輸送する）（Comai et al. (1988) J Biol Chem 263:15104-15109；van den Broeck et al. (1985) Nature 313:358-363；米国特許第5,639,949号）、またはデンプン細胞由来の分泌シグナル配列であってもよい（Koehler & Ho, (1990) Plant Cell 2:769-783）。さらにまた、アミノ末端配列は、カルボキシ末端配列と連係して、遺伝子生成物の空胞への誘導に要求される（Shinshi et al. (1990) Plant Molec Biol 14:357-368）。
ある特徴では、選択されるシグナル配列は既知の切断部位を含まねばならず、さらに構築された融合物は切断部位の後ろの一切のアミノ酸（前記は切断に必要である）を考慮しなければならない。いくつかの事例では、この要求は、切断部位とトランスジーンのATGとの間に小数のアミノ酸を付加するか、また別にトランスジーン配列内のいくつかのアミノ酸の置換によって満たすことができる。これらの構築技術は当分野では周知であり、いずれの細胞区画にも等しく適用することができる。
ある特徴では、上記の細胞内標的への誘導メカニズムは、それらの同族プロモーターと連係する場合だけでなく、異種プロモーターと連係する場合にも利用することができ、したがって、誘導シグナルが由来したプロモーターの発現パターンと異なる発現パターンを有するプロモーターの転写調節の下で特異的な細胞内標的誘導の目標を達成することができる。
【００８９】
総合すれば、多様な手段を用いて本発明を実施することができ、この手段には、トランスジェニック植物、種子、器官または任意の植物部分でフィターゼの組換え発現を達成するための任意の手段が含まれる。そのようなトランスジェニック植物および植物部分は、組換え発現されたフィターゼの供給源として有用である（前記フィターゼ供給源はフィテート含有源に直接添加することができる）。あるいは、組換え植物によって発現されたフィターゼは前記植物源から抽出され、所望の場合にはフィターゼ基質と接触させる前に精製される。
本発明の関係では、選択することができる（本発明の実施に用いられる）植物には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：食用の花を産出する作物、例えばカリフラワー（Brassica oleracea）、アーティチョーク（Cynara scolymus）、果実、例えばリンゴ（Malus、例えばdomesticus）、バナナ（Musa、例えばacuminata）、ベリー（例えばアカスグリ、Ribes、例えばdomesticus）、サクランボ（例えばスィートチェリー、Prunus、例えばavium）、キウリ（Cucumis、例えばsativus）、レモン（Citrus limon）、メロン（Cucumis melo）、ナッツ（例えば胡桃、Juglans、例えばregia；落花生、Arachis hypogeae）、オレンジ（Citrus、例えばmaxima）、桃（Prunus、例えばpersica）、梨（Pyra、例えばcommunis）、プラム（Prunus、例えばdomestica）、イチゴ（Fragaria、例えばmoschata）、トマト（Lycopersicon、例えばesculentum）、葉、例えばアルファルファ（Medicago、例えばsativa）、キャベツ（例えばBrassica oleracea）、キクチシャ（Cichoreum、例えばendivia）、ニラネギ（Allium、例えばporrum）、レタス（Lactuca、例えばsativa）、ホウレンソウ（Spinacia、例えばoleraceae）、タバコ（Nicotiana、例えばtabacum）、根、例えばクズウコン、テンサイ（Beta、例えばvulgaris）、ニンジン（Daucus、例えばcarota）、キャッサバ（Manihot、例えばesculenta）、カブ（Brassica、例えばrapa）、ハツカダイコン（Raphanus、例えばsativus）、ヤムイモ（Dioscorea、例えばesculenta）、サツマイモ（Ipomoea batatas）および種子、例えばインゲンマメ（Phaseolus、例えばvulgaris）、エンドウマメ（Pisum、例えばsativum）、ダイズ（Glycin、例えばmax）、コムギ（Triticum、例えばaestivum）、オオムギ（Hordeum、例えばvulgare）、トウモロコシ（Zea、例えばmays）、コメ（Oryza、例えばsativa）、ナタネ（Brassica napus）、アワ（Panicum L.）、ヒマワリ（Helianthus annus）、エンバク（Avena sativa）、塊茎、例えばカブキャベツ（Brassica、例えばoleraceae）、ジャガイモ（Solanum、例えばtuberosum）など。
【００９０】
ある特徴では、本発明の核酸およびポリペプチドは任意の植物または種子で発現又は前記に挿入される。本発明のトランスジェニック植物は双子葉植物でも単子葉植物でもよい。本発明のトランスジェニック単子葉植物の例は、牧草、例えばメドーグラス（meadow grass（ブルーグラス、Poa））、飼葉用の草本、例えばウシノケグサ（festuca）、ロリウム（lolium）、温帯性草本、例えばアグロスチス（Agrostis）、および穀類、例えばコムギ、エンバク、ライムギ、オオムギ、コメ、ソルガムおよびトウモロコシ（コーン）である。本発明のトランスジェニック双子葉植物の例は、タバコ、豆類（例えばルピナス）、ジャガイモ、サトウダイコン、エンドウマメ、インゲンマメおよびダイズ、並びに十字架植物（ブラシッカ科（Brassicaceae））、例えばカリフラワー、アブラナ、および近縁のモデル植物のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）である。したがって、本発明のトランスジェニック植物および種子には以下の広範囲の植物が含まれる（ただしこれらに限定されない）：アナカルジウム（Anacardium）、アラキス（Arachis）、アスパラガス、アトロパ（Atropa）、アベナ（Avena）、ブラシカ（Brassica）、シトルス、シトルルス（Citrullus）、カプシクム（Capsicum）、カルサムス（Carthamus）、ココス（Cocos）、コフェア（Coffea）、ククミス（Cucumis）、ククルビタ（Cuurbita）、ダウクス（Daucus）、エレイス（Elaris）、フラガリア（Fragaria）、グリシン（Glycine）、ゴッシピウム（Gossypium）、ヘリアンサス（Helianthus）、ヘテロカリス（Heterocallis）、ホルデウム（Hordeum）、ヒオシアムス（Hyoscyamus）、ラクツカ（Lactuca）、リヌム（Linum）、ロリウム（Lolium）、ルピナス、リコペルシコン（Lycopersicon）、マルス（Malus）、マニホット（Manihot）、マジョラナ（Majorana）、メディカゴ（Medicago）、ニコチアナ、オレア（Olea）、オリザ（Oryza）、パニエウム（Panieum）、パニセツム（Panisetum）、ペルセア（Persea）、ファセオルス（Phaseolus）、ピスタキア（Pistachia）、ピスム（Pisum）、ピルス（Pyrus）、プルヌス（Prunus）、ラファヌス（Raphanus）、リシヌス（Ricinus）、セカレ（Secale）、セネシオ（Senecio）、シナピス（Sinapis）、ソラナム（Solanum）、ソルガム（Sorghum）、テオブロムス（Theobromus）、トリゴネラ（Trigonella）、トリチクム（Triticum）、ソラマメ（Vicia）、ブドウ（Vitis）、ササゲ（Vigna）、およびトウモロコシ（Zea）属由来の種。
また別の実施態様では、本発明の核酸は、繊維細胞を含む植物（例えば、綿、シルクコットンツリー（Kapok、Ceiba pentandra）、ヤナギ（desert willow）、クレオソートブッシュ、ウィンターファット、バルサ、カラムシ、ケナフ、アサ、ロゼレ（roselle）、ジュート、サイザル（sisal abaca）およびアマを含む）で発現される。また別の実施態様では、本発明のトランスジェニック植物はワタ（Gossypium）属のメンバー（一切のワタ属種のメンバー、例えばG.アルボレウム（arboreum）；G.ヘルバセウム（herbaceum）；G.バルバデンス（barbadense）；G.ヒルスタム（hirsutum）を含む）であり得る。
【００９１】
さらに別の植物および非植物発現系を用いて本発明を実施することができる。植物種の選択は、主として、植物またはその部分の意図される用途および植物種の形質転換の容易さによって決定される。
フィターゼをコードするDNA配列を含む発現構築物を標的植物に導入するためにいくつかの技術が利用可能である。広範囲の高等植物種を形質転換する技術がよく知られており、技術文献および学術文献に記載されている。例えば以下を参照されたい：Weising (1988) Ann Rev Genet 22:421-477；米国特許第5,750,870号。そのような技術にはまた、カルシウム／ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションまたは（被覆）粒子ボンバードメント（Potrykus, 1990）を用いるプロトプラストの形質転換が含まれる（ただしこれらに限定されない）。これらのいわゆる直接DNA形質転換法の他に、ベクターを必要とする形質転換系が広く利用可能である。前記ベクターは、例えば、ウイルスベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）に由来する）および細菌ベクター（例えばアグロバクテリウム属に由来する）である。選別および／またはスクリーニングの後、当分野で公知の方法を用いて、形質転換されたプロトプラスト、細胞または植物部分を完全な植物に再生することができる（Horsch et al. 1985）。形質転換および／または再生技術の選択は本発明にとって重大ではない。
本発明の核酸および発現構築物は任意の手段によって植物細胞に導入することができる。本発明を実施するまた別の特徴では、ポリヌクレオチド、例えば対象のヌクレオチド構築物に関して、“導入する”という用語は、当該ポリヌクレオチドが当該植物の細胞内部へアクセスしえる態様で、前記ポリヌクレオチドを前記植物に提示することを意味する。2つ以上のポリヌクレオチドが導入される場合は、これらのポリヌクレオチドは、ただ1つのヌクレオチド構築物の部分として、または別々のヌクレオチド構築物としてアッセンブリングすることができ、さらに同一または別個の形質転換ベクター上に配置することができる。したがって、これらのポリヌクレオチドは、ただ1つの形質転換事象で、別々の形質転換事象で、または植物の場合育種プロトコルの部分として問題の宿主細胞に導入することができる。本発明の方法は、1つ以上のポリヌクレオチドを植物に導入する具体的な方法には左右されず、ポリヌクレオチドが植物の少なくとも1つの細胞の内部にアクセスできるという一点にかかっている。ポリヌクレオチドを植物に導入する方法は当分野ではよく知られており、前記には一過性形質転換による方法、安定的形質転換方法およびウイルス仲介方法が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００９２】
本発明を実施するために“一過性形質転換”を用いることができる。ポリヌクレオチドに関するいくつかの特徴では、前記用語は、ポリヌクレオチドは植物に導入され、植物のゲノムには組み込まれないことを意味する。植物に導入されたポリヌクレオチドに関して“安定的な導入”または“安定的に導入される”とは、本発明の実施に用いることができ、いくつかの特徴では、導入されたポリヌクレオチドが植物ゲノムに安定的に組み込まれ、したがって植物は当該ポリヌクレオチドにより安定的に形質転換されることを意味する。
植物に導入されたポリヌクレオチドに関して、“安定的な導入”または“安定的に導入される”とは、本発明の実施に用いることができ、いくつかの特徴では、ポリヌクレオチド、例えば本明細書に記載のヌクレオチド構築物が植物に導入され、当該植物のゲノムに組み込まれ、その子孫によって、より具体的には多数の連続する世代の子孫によって受け継がれえることを意味する。所望の植物のゲノムへの導入とは、当該酵素が内因性の転写または翻訳制御エレメントによって調節される事柄でありえる。単子葉植物および双子葉植物の両植物のための形質転換技術が当分野で周知である。
本発明の核酸を用いて、本質的に任意の植物に所望の特徴を付与することができる。ある実施態様では、本発明の酵素は、当該酵素がその基質と所望されるまでは接触しないようにして発現させることができる。例えば、本発明の酵素を植物細胞の小胞体に誘導しそこで保持することができる。酵素を細胞の小胞体で保持することによって、酵素とその基質との接触が妨げられるであろう。続いて、この細胞内構造を破壊する任意の手段、例えば、ひき割り、製粉、加熱などにより、この酵素と基質を接触させることができる（WO98/11235、WO2003/18766およびWO2005/096704を参照されたい、前記文献はいずれも参照により本明細書に含まれる）。
選別可能マーカー遺伝子を当該遺伝子構築物に付加して、トランスジーンを成功裡に組み込んだ植物細胞または組織を識別することができる。このことは、植物細胞における遺伝子の取り込みおよび発現の達成は極めて稀な事象であり、標的とされた組織または細胞の数パーセントで生じるので必要なことであろう。選別可能なマーカー遺伝子は、植物にとって通常は有毒である物質、例えば抗生物質または除草剤に対する耐性を提供するタンパク質をコードする。適切な抗生物質または除草剤を含む培養液で増殖させたとき、選別可能なマーカー遺伝子を組み込んだ植物細胞のみが生存するであろう。形質転換に日常的に用いられる選別マーカーには、nptl1遺伝子（カナマイシンおよび関連抗生物質に対する耐性を付与する（Messing & Vierra (1982) Gene 19:259-268；Bevan et al. (1983) Nature 304:184-187）、bar遺伝子（除草剤ホスフィノスリシンに対する耐性を付与する（White et al. (1990) Nucl Acids Res 18:1062；Spender et al. (1990) Theor Appl Genet 79:625-631）、hph遺伝子（抗生物質ヒグロマイシンに対する耐性を付与する（Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4:2929-2931）、dhfr遺伝子（メトトレキセートに対する耐性を付与する（Bourouis et al. (1983) EMBO J 2(7):1099-1104）、EPSPS遺伝子（グリホセートに対する耐性を付与する（米国特許第4,940,935号および5,188,642号））が含まれる。
【００９３】
また別には、トランスジェニックな植物材料は陽性選別系により識別することができる。前記は、例えばマンノース-6-ホスフェートイソメラーゼ遺伝子を利用する系で、前記遺伝子はマンノースを代謝する能力を提供する（米国特許第5,767,378号および5,994,629号）。
ある特徴では、トランスジェニック植物または種子の作製は、本発明の配列および場合によってマーカー遺伝子を、プロモーターおよびターミネーター配列の適所への配置とともに標的発現構築物（例えばプラスミド）に取り込む工程を含む。前記は、改変した遺伝子を適切な方法により植物に伝達する工程を含むことができる。本発明の配列の1つ以上を、昆虫、病気、干ばつに対する耐性の付与、収量増加、穀粒の栄養価の改善、エタノール収量の改善などをもたらす配列と結合させることができる。
例えば植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションのような技術を用いて、植物細胞のゲノムDNAに構築物を直接導入するか、または弾道的方法、例えばDNA粒子ボンバードメントを用いて植物組織に構築物を間接的に導入してもよい。例えば以下を参照されたい：Christou (1997) Plant Mol Biol 35:197-203；Pawlowski (1996) Mol Biotechnol 6:17-30；Klein (1987) Nature 327:70-73；Takumi (1997) Genes Genet Syst 72:63-69（前記は、コムギにトランスジーンを導入するために粒子ボンバードメントの使用を考察する）；およびAdam (1997)上掲書（前記は、植物細胞にYACを導入するために粒子ボンバードメントの使用を考察する）。例えば、Rineharth（上掲書、1997）は粒子ボンバードメントを用いてトランスジェニックなワタの植物を作製した。粒子を加速する装置は米国特許第5,015,580号に記載され、さらにBioRad（Biolistcs）PDS-2000粒子加速装置は市場で入手できる（さらに以下の文献を参照されたい：米国特許第5,608,148号（John）および米国特許第5,681,730号（Ellis）（前記は裸子植物の粒子仲介形質転換を記載している））。
ある特徴では、プロトプラストは固定され、核酸（例えば発現構築物）が注入される。プロトプラストからの植物の再生は穀類に関しては容易ではないが、プロトプラスト由来カルスの体細胞性胚形成を用いれば豆類では植物の再生は可能である。組織化が進んだ組織は遺伝子銃技術を用いて裸のDNAにより形質転換することができ、この場合、DNAはタングステンの極小発射体上に被覆され、細胞の1/100のサイズに発射され、遺伝子銃技術は、細胞および細胞内小器官の奥深くにDNAを運ぶ。続いて形質転換された組織の再生を、通常は体細胞胚形成によって誘導する。前記技術は、トウモロコシおよびコメを含むいくつかの穀類の種で成功した。
【００９４】
核酸、例えば発現構築物はまた、組換えウイルスを用いて植物細胞に導入することができる。植物細胞は、ウイルスベクター、例えばタバコモザイクウイルス由来ベクター（Rouwendal (1997) Plant Mol Biol 33:989-999）を用いて形質転換することができる（以下を参照されたい：Porta (1996) “Use of Viral replicons for the expression of genes in plants”, Mol Biotechnol 5:209-221）。
また別には、核酸、例えば発現構築物は適切なT-DNAフランキング領域と結合させ、通常のアグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主ベクターに導入することができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主のヴィルレンス機能は、細胞が当該細菌に感染したとき、構築物および隣接マーカーの植物細胞DNAへの挿入を誘導するであろう。アグロバクテリウム・ツメファシエンス仲介形質転換技術（バイナリーベクターの無毒化および使用を含む）は学術文献に詳しく記載されている。例えば以下を参照されたい：Horsch (1984) Science 233:496-498；Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803；Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlin 1995)。A.ツメファシエンス細胞内のDNAは、細菌の染色体および、Ti（腫瘍誘導）プラスミドとして知られている別の構造物中に含まれている。Tiプラスミドは、T-DNA（約20kbの長さ）と称される一続きのDNA（感染過程で植物細胞に移される）および一連のvir（virulence、ヴィルレンス）遺伝子（感染過程を誘導する）を含む。A.ツメファシエンスは創傷からのみ植物に感染する。植物の根または茎が傷を受けたとき、植物はある種の化学的シグナルを発し、それに応答してA.ツメファシエンスのvir遺伝子は活性化され、TiプラスミドのT-DNAの植物染色体への移転に必要な一連の事象を誘導する。続いてT-DNAは創傷から植物細胞に進入する。１つの推測は、T-DNAは、植物DNAが複製または転写されるまで待機し、続いて自身を裸の植物DNAに挿入するということである。A.ツメファシエンスをトランスジーンベクターとして使用するために、T-DNAの腫瘍誘導部分を除去し、一方T-DNAボーダー領域およびvir遺伝子は維持する必要がある。続いてトランスジーンをT-DNAボーダー領域間に挿入する（この場合、トランスジーンは植物細胞に移行し、植物染色体に組み込まれる）。
本発明は、本発明の核酸を用いる単子葉植物（重要な穀類を含む）の形質転換を提供する（Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218）。さらにまた、例えば以下を参照されたい：Horsch (1984) Science 233:496；Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803；Thykjaer (1997) 上掲書；Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:1135-1148（ゲノムDNAへのT-DNAの組み込みについて考察する）。さらにまた以下を参照されたい：米国特許第5,712,135号（D'Halluin）（穀類または他の単子葉植物の細胞内で機能を有する遺伝子を含むDNAの安定な組み込みのための方法を開示する）。
【００９５】
ある特徴では、第三の工程は、取り込まれた標的遺伝子を次の世代に伝達することができる植物体の選別および再生を含むことができる。そのような再生技術は、組織培養増殖培地のある種の植物ホルモンの操作に左右され、典型的には所望のヌクレオチド配列と一緒に導入された抗生物質および／または除草剤マーカーに左右される。培養プロトプラストから植物を再生することについては以下に記載されている：Evans et al., Protoplast Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp.124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983；およびBinding, Regenration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985。再生はまた植物カルス、外植片、器官またはその部分からも得ることができる。そのような再生技術は一般的には以下に記載されている：Klee (1987) Ann. Rev. of Phys. 38:467-486。トランスジェニック組織（例えば未熟胚）から植物体を得るために、前記胚を栄養およびホルモンを含む一連の培養液中で環境制御条件の下（組織培養として公知の方法）で増殖させることができる。いったん植物体が生成され種子が生じたら、子孫の評価が開始される。
ある特徴では、発現カセットがトランスジェニック植物に安定的に取り込まれた後、前記カセットは有性交配によって他の植物に導入することができる。交配される種に応じて、多くの標準的育種技術のいずれも用いることができる。例えば以下を参照されたい：Welsh J. R., Fundamentals of Plant Gentics and Breeding, John Wiley & Sons, NY (1981)；Crop Breeding, Wood D.R. (Ed.) American Society of Agronomy Madison, Wis. (1983)；Mayo O., The Theory of Plant Breeding, Second Edition, Clarendon Press, Oxford (1987)；D.P. Singh, Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests, Springer-Verlag, NY (1986)；およびWricke and Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter and Co., Berlin (1986)。
ある特徴では、本発明の核酸のトランスジェニックな発現は表現型の変化を生じるので、本発明の組換え核酸を含む植物を第二の植物と有性交配して最終生成物を得ることができる。したがって、本発明の種子は、本発明の2つのトランスジェニック植物間の交配、または本発明の植物と他の植物間の交配から誘導することができる。所望の作用（例えば本発明のポリペプチドの発現によって開花の態様が変化した植物が生産される）は、両方の親植物が本発明のポリペプチド（例えばフィターゼ）を発現するときに強化されえる。所望の作用は将来の植物世代に標準的な繁殖手段によって伝えることができる。
【００９６】
双子葉植物については、バイナリーベクター系を用いることができる（Hoekema et al (1983)；EP0120516, Schilperoort et al.）。例えば、ヴィルレンス遺伝子を含むvirプラスミドおよび移される遺伝子構築物を含む適合性プラスミドを含むアグロバクテリウム株を用いることができる。このベクターは、大腸菌とアグロバクテリウムの両方で複製することができ、バイナリーベクターBin19（Bevan, 1984）に由来する（前記は本発明とは無関係な細部が変更されている）。本実施例で用いるバイナリーベクターは、T-DNAの左の境界配列と右の境界配列との間に、全く同じカナマイシン耐性コードNPTII遺伝子（Bevan, 1984）および必要な遺伝子構築物中でのクローニングのためのマルチクローニング部位を含んでいる。
単子葉作物の形質転換および再生は、任意の方法または標準的な方法を用いて実施することができる。単子葉植物は形質転換が容易であり、生殖能力を有するトランスジェニック植物を形質転換細胞から再生することができる。また別の特徴では、単子葉植物はアグロバクテリウムによる形質転換によって形質転換される。
ある特徴では、トランスジェニックなイネは、選別マーカーとして細菌のhph遺伝子（ヒグロマイシン耐性をコードする）を用いて得ることができる（前記遺伝子はエレクトロポレーションによって導入することができる。ある特徴では、トランスジェニックなトウモロコシは、ストレプトミセス・ヒグロスコピクスのbar遺伝子を、マイクロ粒子ボンバードメントによってトウモロコシ懸濁培養の胚原性細胞に導入することによって得ることができる（bar遺伝子は、除草剤ホスフィノスリシンを不活化する酵素ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする）。ある特徴では、遺伝物質は、単子葉作物（例えばコムギおよびオオムギ）のデンプン粒プロトプラストに導入することができる。ある特徴では、コムギの植物体は胚原性懸濁培養から再生され、これは、胚原性懸濁培養を樹立させるために、齢を重ねた密な結節形成性胚原性カルス組織だけを選択することによって達成される。ある特徴では、これらの作物のための形質転換系と併用することによって、本発明の単子葉植物への応用を可能にする。これらの方法および他の方法はまた双子葉植物の形質転換および再生にも応用することができる。
【００９７】
本発明を実施する場合、フィターゼ構築物の発現には、植物ポリメラーゼによる当該遺伝子の転写、mRNAの翻訳など、組換えDNA技術の分野の業者にとって公知の細部が必要とされる。本発明のいくつかの実施態様の達成にために関連するいくつかの細部についてはここで考察する。フィターゼの発現を引き起こすことが知られているか、または判明した調節配列を本発明で用いることができる。用いられる調節配列の選択は、対象の標的作物および／または標的器官に左右されえる。そのような調節配列は植物または植物ウイルスから入手するか、または化学的に合成することができる。そのような調節配列は、植物またはその部分の使用にしたがって構成的にまたはステージおよび／または組織特異的に、植物での転写の誘導において活性を示すプロモーターである。これらのプロモーターには、構成的発現を示すプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）（Guilley et al. 1982）の35Sプロモーター、葉特異的発現のためのプロモーター、例えばリブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーター（Coruzzi et al. 1984）、根特異的発現のためのプロモーター、例えばグルタミンシンターゼ遺伝子のプロモーター（Tingey et al. 1987）、種子特異的発現のためのプロモーター、例えばブラッシカ・ナプス（Brassica napus）のクルシフェリンAプロモーター（Ryan et al. 1989）、塊茎特異的発現のためのプロモーター、例えばジャガイモのクラスIパパチンプロモーター（Koster-Topfer et al. 1989；Wenzler et al. 1989）、または果実特異的発現のためのプロモーター、例えばトマトのポリガラクチュロナーゼ（PG）プロモーター（Bird et al. 1988）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
他の調節配列、例えばターミネーター配列およびポリアデニル化シグナルも本発明の実施に用いることができ、それらには植物でそのような機能を果たす任意の配列が含まれえる。それらの選択は当業者の技術レベルの範囲内である。そのような配列の例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ（nos）遺伝子の3'フランキング領域（Bevan,上掲書）である。調節配列にはまた、エンハンサー配列、例えばCaMVの35Sプロモーター内に見出されるもの、およびmRNA安定化配列、例えばアルファルファモザイクウイルス（AlMV）のリーダー配列、RNA4（Brederode et al. 1980）または同様な態様で機能する任意の他の配列が含まれよう。
【００９８】
いくつかの実施態様では、本発明のフィターゼは、発現されたタンパク質の安定性を考慮する環境下で発現される。細胞内区画の選択、例えばサイトゾル、小胞体、空胞、タンパク顆粒または細胞周辺腔を本発明で用い、フィターゼの生物物理学的パラメーターに応じてそのような安定な環境を作ることができる。そのようなパラメーターには、至適pH、プロテアーゼ感受性、または好ましい区画のモル濃度に対する感受性が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
いくつかの実施態様では、本発明のフィターゼは細胞質で発現される。いくつかの特徴では、細胞質で発現させるために、発現酵素は、分泌シグナルペプチドまたは他のいずれの誘導配列も含んではならない。葉緑体およびミトコンドリアでの発現のために、発現される酵素は、これらの細胞内小器官への転移のために特異的ないわゆる輸送ペプチドを含まねばならない。前記を達成するために、対象の酵素に結合させることができる誘導配列は公知である（Smeekens et al. 1990；van den Broeck et al. 1985；Wolter et al. 1988）。酵素の活性が空胞中に所望される場合は、これらの空胞へ酵素を誘導する特異的な誘導配列と同様に、分泌シグナルペプチドが存在する必要がある（Tague et al. 1990）。同じことが種子のタンパク顆粒についても言える。対象の酵素をコードするDNA配列は、当該酵素が細胞内の所望の位置でその作用を発揮することができるように改変されなければならない。
いくつかの実施態様では、フィターゼの細胞外発現を達成するために、本発明の発現構築物は分泌シグナル配列を利用する。植物宿主の種と同種の（固有の）シグナル配列が好ましいが、異種シグナル配列（すなわち、他の植物種由来または微生物起源のものも同様に用いることができる。そのようなシグナル配列は当業者に公知である。本発明の状況内で用いることができる適切なシグナル配列は以下に開示されている：Blobel et al. 1979；Von Heijne 1986；Garcia et al. 1987；Sijmons et al. 1990；Ng et al. 1994；およびPowers et al. 1996。
【００９９】
いくつかの実施態様では、本発明の関連DNA構築物の全ての部分（プロモーター、調節配列、分泌配列、安定化配列、誘導配列、または終止配列）が、所望される場合は、それらの制御特性に影響を与えるために当業者に公知の方法を用いて改変される。本発明により得られたフィターゼ含有植物を用いて、さらに高いフィターゼレベルを有する植物または植物器官を得ることができる。例えば、体細胞クローン変種技術の使用によって、または交配技術によってそのような植物または植物器官を得ることが可能である。そのような技術は当業者には周知である。
ある特徴では、本発明は、フィターゼおよび他の分子の高度に効率的な過剰発現系を得る方法（およびその生成物）を提供する。ある特徴では、本発明は、フィターゼおよびトリコデルマ（Trichoderma）のpH2.5の酸性ホスファターゼの高度に効率的な過剰発現系を得る方法（およびその生成物）を提供する。この系は、動物飼料工業で特に有用である酵素組成物をもたらす。このアプローチに関する更なる詳細は刊行物に記載されてあり、および／または当業者に公知である。特に非限定的な具体例として、そのような公開文献にはEP0659215（WO9403612A1）（Nevalainen et al.）が含まれるが、ただし前記文献は本出願の分子を教示していない。
【０１００】
いくつかの実施態様では、本発明はin vivo再組合せを用い、前記は、包括的に“組換え”と称される“分子間”プロセス（細菌では “RecA-依存”現象であってもよい）に集約されえる。本発明は、配列を組換えて再組合せを生じる宿主細胞の組換えプロセス、または細胞内の擬似反復配列の複合度を欠失によって減少させる還元的プロセスを仲介する細胞の能力を必要とするであろう。“還元的再組合せ”のこのプロセスは“分子内”Rec-A非依存性プロセスによって生じる。
したがって、本発明の別の特徴では、変種ポリヌクレオチドは、還元的再組合せのプロセスによって生成することができる。本方法は、連続配列（原型コード配列）を含む構築物の作製、それらの適切なベクターへの挿入およびそれに続く適切な宿主へのそれらの導入を必要とする。個々の分子実体の再組合せは、相同性領域を有する構築物中の連続配列間または擬似反復ユニット間のコンビナトリアルプロセスによって生じる。再組合せプロセスは組換え及び／又は反復配列の複合度および程度の減少をもたらし、新規な分子種の生成をもたらす。多様な処理を適用して、再組合せ率を高めることができる。これらの処理には、紫外線またはDNA損傷化学物質による処理及び／又は“遺伝的不安定性”レベルの強化を示す宿主細胞株の使用が含まれよう。したがって、再組合せプロセスは相同な組換えまたはそれら自身の進化を誘導する擬似反復配列の天然の特性を必要とすることがあろう。
本発明は、反復配列または“擬似反復”配列を利用することができる。こらら配列は遺伝的不安定性において役割を果たすことができる。本発明では、“擬似リピート”はそれらの原型ユニット構造に制限されないリピートである。擬似反復ユニットは構築物中で配列のアレイ（すなわち類似配列の連続ユニット）として提示され得る。いったん連結されると、連続配列間の結合点は本質的に見えなくなり、生成された構築物の擬似反復特性は今や分子レベルで連続性である。細胞の欠失プロセスは、生成構築物が擬似反復配列間の複合度を低下させるために実施される。擬似反復ユニットは、スリップ事象を発生させることができる鋳型のレパートリーを実際的には無制限に提供する。したがって、擬似リピートを含む構築物は、擬似反復ユニット内の実質的にはいずれの場所でも欠失（および潜在的には挿入）事象が発生できるように十分な分子の弾性を効果的に提供する。
いくつかの特徴では、擬似反復配列が全て同じ向き（例えばヘッド-テール連結またはその逆）で連結されるとき、細胞は個々のユニットを区別することができない。結果的に、還元プロセスが配列全体で発生することが可能である。対照的に、例えばユニットが頭尾連結ではなく頭頭連結で提示されるとき、本発明は近傍のユニットの末端の輪郭を明らかにし、その結果欠失形成は分離されてある別個のユニットが失われるのを促進するであろう。したがって、本発明のある特徴では、配列は同じ向きで存在する。擬似反復配列のランダムな向きは再組合せの効率の低下をもたらすが、配列が同じ向きにあることによって最高の効率が提供されるであろう。しかしながら、同じ向きの連続配列の数が減少することによって効率は低下するが、それによって新規な分子の効率的な回収のために十分な弾性はなお提供され得る。構築物は、より高い効率を可能にするために同じ向きの擬似反復配列を用いて作製することができる。
【０１０１】
配列は、以下を含む多様な方法のいずれかを用いてヘッド-テールの向きでアッセンブリすることができる：
a）ポリ-Aヘッドおよびポリ-Tテールを含むプライマー（一本鎖として作製されたとき、前記は方向性を提供する）を利用することができる。これは、プライマーの最初の数塩基をRNAから作製（したがってRnaseHで容易に除去できる）することにより達成される。
b）固有の制限切断部位を含むプライマーを利用することができる。マルチ部位、固有配列一式、並びに反復合成および連結工程が要求されよう。
c）プライマーの内部数塩基をチオール化し、さらにエキソヌクレアーゼを用いて適切なテールを有する分子を生成することができる。
いくつかの特徴では、再組合せされた配列の回収はRIが低下したクローニングベクターの同定に左右される。続いて再組合せされたコード配列を増幅によって回収することができる。生成物を再クローニングして発現させる。RIが低下したクローニングベクターの回収は以下によって実施することができる：
1）複雑度が低下したときにのみ構築物が安定的に維持されるベクターの使用。
2）物理的方法による短縮ベクターの物理的回収。この場合には、クローニングベクターは、標準的なプラスミド単離方法およびアガロースゲルでの、または標準的な方法を使用する低分子量カットオフによるカラムサイズ分画を用いて回収されるであろう。
3）挿入物のサイズが低下したときに選別することができる分断遺伝子を含むベクターの回収。
4）発現ベクターおよび適切な選別を用いる直接選別技術の使用。
関連生物から得られたコード配列（例えば遺伝子）を用いて本発明を実施することができ、それらは高度な相同性を示し、極めて多様なタンパク質生成物をコードし得る。このような配列タイプは、擬似リピートとして本発明で特に有用である。しかしながら下記で考察する例示的プロトコルはほぼ同一の原型コード配列（擬似リピート）の再組合せを示すが、本方法はそのようなほぼ同一のリピートに限定されない。
いったん形成されたら、構築物は公表されているプロトコルにしたがってアガロースゲルでサイズ分画し（または分画せずに）、クローニングベクターに挿入し、適切な宿主細胞にトランスフェクトすることができる。続いて細胞を増殖させ、“還元的再組合せ” を実施する。所望する場合は、還元的再組合せ過程の速度はDNA損傷の導入によって速めることができる。RIの低下が“分子内メカニズム”により反復配列間の欠失形成によって仲介されるか、または“分子間メカニズム”により組換え様事象によって仲介されるかは重要ではない。最終的な結果は分子の再組合せによる全ての可能な組合せを得ることである。
ある特徴では、本方法は、シャッフルされたプールのライブラリーメンバーをスクリーニングし、結合あるいは相互作用するか、または特定の反応を触媒する（例えばフィテートの加水分解を触媒する）能力を有する個々のシャッフルされたライブラリーメンバーを同定するさらに別の工程を含む。
ある特徴では、そのようなライブラリーから同定されたポリペプチドを治療、診断、研究および関連する目的（例えば触媒、水溶液の浸透圧を高めるための溶質など）に用いることができ、および／または1つ以上の更なるシャッフリングおよび／または選別サイクルに付すことができる。
【０１０２】
別の特徴では、組換え若しくは再組合せ前またはそれらの間に、本発明のポリヌクレオチドまたは本明細書に記載の方法によって生成されたポリペプチドを、原型ポリヌクレオチドへの変異の導入を促進する薬剤またはプロセスに付すことができる。そのような変異の導入は生成されるハイブリッドポリヌクレオチドおよびそれらからコードされるポリペプチドの多様性を高めよう。変異導入を促進する薬剤またはプロセスには以下が含まれる得る（ただしこれらに限定されない）：(+)-CC-1065または合成類似体、例えば(+)-CC-1065-(N3-アデニン)（Sun and Hurley, 1992）；DNA合成を阻害することができるN-アセチル化または脱アセチル化-4'-フルオロ-4-アミノビフェニル付加物（例えば以下を参照されたい：van de Poll et al. (1992)）；またはDNA合成を阻害することができるN-アセチル化または脱アセチル化-アミノビフェニル付加物（さらにまた例えば以下を参照されたい：van de Poll et al. (1992), pp.751-758）；三価クロム、三価クロム塩、DNA複製を阻害することができる多環式芳香族炭化水素（PAH）DNA付加物、例えば7-ブロモメチル-ベンゾ[a]アントラセン（“BMA”）、トリス（2,3-ジブロモプロピル）ホスフェート（“トリス-BP”）、1,2-ジブロモ-3-クロロプロパン（“DBCP”）、2-ブロモアクロレイン（2BA）、ベンゾ[a]ピレン-7,8-ジヒドロジオール-9-10-エポキシド（“BPDE”）、白金(II)ハロゲン塩、N-ヒドロキシ-2-アミノ-3-メチルイミダゾ[4,5-f]-キノリン（“N-ヒドロキシ-IQ”）およびN-ヒドロキシ-2-アミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾ[4,5-f]-ピリジン（“N-ヒドロキシ-PhIP”）。PCR増幅を遅くするかまたは停止させるための例示的手段は、紫外線(+)-CC-1065および(+)-CC-1065-(N3-アデニン)から成る。特に包含される手段は（ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプール由来のDNA付加物を含む）DNA付加物またはポリヌクレオチドであり、前記は、更なる処理の前にポリヌクレオチドを含む溶液を加熱することを含む過程によって遊離または除去することができる。
また別の特徴では、本発明は、ハイブリッドまたは再組合せされたポリヌクレオチドの生成を提供する本発明の条件下で、野生型タンパク質をコードする二本鎖鋳型ポリヌクレオチドを含むサンプルを処理することによって、生物学的活性を有する組換えタンパク質を製造する方法を意図する。
【０１０３】
本発明はまた、点変異をポリヌクレオチドに導入して、全範囲の単一アミノ酸置換が各アミノ酸の位置で出現する一組の子孫ポリペプチドを作製するために専有コドンプライマー（縮退N,N,G/T配列を含む）の使用を提供する（遺伝子位置飽和変異導入（GSSM））。使用されるオリゴは、第一の相同配列、縮退N,N,G/T配列および、場合によって第二の相同な配列を連続的に含む。そのようなオリゴを使用することによって得られる後世代子孫の翻訳生成物は、N,N,G/T配列の縮退は20の全てのアミノ酸のためのコドンを含むので、前記ポリペプチドに沿って各アミノ酸の位置で可能な全てのアミノ酸変化を含む。
ある特徴では、１つのそのような縮退オリゴ（１つの縮退N,N,G/Tカセットを含む）が、親のポリヌクレオチド鋳型中の原型コドンの各々を全範囲のコドン置換に付すために用いられる。また別の特徴では、親のポリヌクレオチド鋳型中の少なくとも2つの原型コドンを全範囲のコドン置換に付すために、少なくとも2つの縮退N,N,G/Tカセットが（同じオリゴに存在するものであれまたは別のオリゴに存在するものであれ）用いられる。したがって、2つ以上のN,N,G/T配列を1つのオリゴ内に含ませ、2つ以上の部位でアミノ酸置換を導入することができる。この複数のN,N,G/T配列は連続していてもよいし、または1つ以上のさらに別のヌクレオチド配列によって分離されてあってもよい。別の特徴では、付加および欠失の導入に有用なオリゴを単独またはN,N,G/T配列を含むコドンとともに用いて、アミノ酸付加、欠失および／または置換の任意の順列または組合せを導入することができる。
【０１０４】
ある実施態様では、連続するN,N,G/Tトリプレット（すなわち縮退(N,N,G/T)ｎ配列）を含むオリゴを用いて、2つ以上の連続するアミノ酸の位置で同時に変異を導入することが可能である。
また別の特徴では、N,N,G/T配列よりも縮退性が低い縮退カセットの使用を提供する。例えばいくつかの事例では、ただ1つのNを含む縮退トリプレット（この場合Nは当該トリプレットの第一、第二または第三位に存在しえる）を（例えばオリゴとして）使用することを所望することができる。任意の組合せおよびその並べ換えを含むいずれの他の塩基も、当該トリプレットの残りの2つの位置で用いることができる。あるいは、いくつかの事例では、縮退N,N,Nトリプレット配列、またはN,N,G/Cトリプレット配列を（例えばオリゴとして）使用することを所望することができる。
しかしながら、本発明で開示したような縮退トリプレット（例えばN,N,G/TまたはN,N,G/Cトリプレット配列）を使用することはいくつかの理由で有利であることは理解されよう。ある特徴では、本発明は、ポリペプチド中の各々かつ全てのアミノ酸の位置で可能な全てのアミノ酸の全範囲（合計20アミノ酸について）の置換が系統的且つ比較的容易に得られる手段を提供する。したがって、100アミノ酸のポリペプチドについて、本発明は系統的にかつ比較的容易に2000個の別個の種（すなわち各位置に付き20の可能なアミノ酸X 100個のアミノ酸の位置）を作製する方法を提供する。縮退N,N,G/TまたはN,N,G/Cトリプレット配列を含むオリゴの使用により、20の可能なアミノ酸をコードする32個の配列が提供されることは理解されよう。したがって、1つのそのようなオリゴを用いて親のポリヌクレオチド配列が飽和変異導入に付される反応容器では、20個の別個のポリペプチドをコードする32個の別個の子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、位置特異的変異導入において非縮退オリゴを使用した場合、反応容器に付きただ1個の子孫ポリペプチド生成物しか得られない。
本発明はまた、非縮退オリゴの使用を提供する。場合によって、前記オリゴは開示した縮退プライマーと一緒に用いることができる。いくつかの状況では、目下使用中のポリヌクレオチドで特定の点変異を作製するために、非縮退オリゴを用いることが有利であることは理解されよう。これによって、特定のサイレント点変異、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異および終止コドンを生成させる点変異並びにポリペプチドフラグメントの対応する発現をもたらす手段が提供される。
【０１０５】
したがって、ある特徴では、飽和変異導入の各反応容器は、親のポリヌクレオチドで変異が導入されたコドンの位置に対応する特定の１つのアミノ酸の位置で20アミノ酸の全てが出現するように、少なくとも20の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含んでいる。飽和変異導入の各反応容器から生成された32倍の縮退子孫ポリペプチドをクローン増幅に付し（例えば発現ベクターを用いて適切な大腸菌宿主でクローニングできる）、さらに発現スクリーニングに付すことができる。（親のポリペプチドと比較したとき）個々の子孫ポリペプチドが好ましい特性変化を示すことがスクリーニングによって同定されたら、前記の配列を決定して、前記配列に含まれる対応する好ましいアミノ酸置換を同定することができる。
本明細書に開示した飽和変異導入（GSSM）を用いて親のポリペプチド中の各々かつ全てのアミノ酸の位置に変異を導入するとき、好ましいアミノ酸変異が2つ以上のアミノ酸の位置で同定しえることは理解されよう。これら好ましいアミノ酸置換の全てまたは部分の組み合わせを含む1つ以上の新規な子孫分子を作製することができる。例えば、あるポリペプチド中の3つのアミノ酸の位置の各々で2つの特定の好ましいアミノ酸の変異が同定された場合、前記並べ換えは各位置で3つの可能性（原型アミノ酸から変化のないものおよび2つの好ましい変化のそれぞれ）を含む。したがって、合計3ｘ3ｘ3、または27の可能性が存在し、これらは以前に調べられた7つ（6つの単一点変異（すなわち3つの位置の各々で2つ）およびいずれの位置においても変化のないもの）を含む。
さらにまた別の特徴では、部位飽和変異導入は、スクリーニングと併せて、シャッフリング、キメラ化、組換えおよび他の変異導入方法と一緒に用いることができる。本発明は、反復態様による飽和変異導入を含む、任意の突然変異導入方法の使用を提供する。ある具体例では、スクリーニングと併用して任意の変異導入方法が反復使用される。
したがって、非限定的な具体例では、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、また別の変異導入プロセスと組み合わされた遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）によって誘導される。前記また別の変異導入プロセスは例えば、ハイブリッドポリヌクレオチドが組換えおよび還元的再組合せによって生成されるように2つ以上の関連ポリヌクレオチドが適切な宿主細胞に導入されるプロセスである。
【０１０６】
遺伝子の配列全体に変異を導入すること以外にも、ポリヌクレオチド配列中の任意数の塩基の各々を置換することができる変異導入を用いることができる。この場合、変異を導入される塩基の数は、15から100,000の全ての整数である。したがって、分子全体の各位置に変異を導入する代わりに、全ての塩基または所定の数の塩基（合計で15から100,000になるサブセットであり得る）に変異を導入することができる。ポリヌクレオチド配列全体の各位置または位置群に変異を導入するために、別々のヌクレオチドが用いることができる。変異を導入される3つの位置群はコドンであってもよい。変異は、変異原プライマー（異種カセットを含み、変異原カセットとも称される）を用いて導入することができる。例示的カセットは1つから500の塩基を有することができる。そのような異種カセットの各ヌクレオチドの位置はN、A、C、G、T、A/C、A/G、A/T、C/G、C/T、G/T、C/G/T、A/G/T、A/C/T、A/C/G、またはEで、ここでEはA、C、GまたはTではない任意の塩基である（Eはデザイナーオリゴと称することができる）。
一般的な意味では、飽和変異導入は、変異を導入される所定のポリヌクレオチド配列（この場合変異を導入される配列は、長さが約15から100,000塩基でありえる）中の完全な一組の変異原カセット（この場合各カセットは長さが約1−500塩基でありえる）に変異を導入することを含む。したがって、変異群（1から100変異に及ぶ）が変異を導入される各カセットに導入される。1回の飽和変異導入の実施中に、1つのカセットに導入される変異群は、第二のカセットに導入される第二の変異群とは異なっていても同じであってもよい。そのような群の具体例は、欠失、付加、特定コドン群および特定ヌクレオチドカセット群である。
変異を導入される所定配列には完全な遺伝子、経路、cDNA、完全なオープンリーディングフレーム（ORF）および完全なプロモーター、エンハンサー、リプレッサー/トランスアクチベーター、複製起点、イントロン、オペレーターまたは任意のポリヌクレオチド機能群が含まれる。一般的には、この目的のための“所定配列”は、15塩基のポリヌクレオチド配列および15塩基から15,000塩基の長さのポリヌクレオチド配列のいずれかのポリヌクレオチドであり得る（本発明では特に15から15,000の間の全てのものが含まれる）。コドン群の選択で考慮しなければならないことには、縮退変異原カセットによってコードされるアミノ酸のタイプが含まれる。
変異原カセットに導入することができる変異群のある特徴では、本発明は特に縮退コドン置換およびそれによってコードされるポリペプチドライブラリーを提供する。前記は縮退オリゴを用いて提供され、前記オリゴは各位置で2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19および20アミノ酸をコードする。
【０１０７】
また別の特徴では、本発明の核酸はDNA（cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを含む）を含む。DNAは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖である場合は、コード鎖でも非コード（アンチセンス）鎖でもよい。
下記でさらに詳細に考察するように、本発明の単離核酸配列を用いて本発明のポリペプチドを調製することができる。
したがって、本発明の別の特徴は、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸配列である。本発明の核酸配列は、追加のコード配列、例えばリーダー配列またはプロタンパク質配列および非コード配列（例えばイントロン）またはコード配列の5'および／または3'非コード配列である。したがって、本明細書で用いられる“ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド”という用語は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドだけでなく追加のコード配列及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドも同様に包含する。
また別には、本発明の核酸配列を、通常の技術、例えば位置特異的変異導入または当業者に周知の他の技術を用いて変異させ、サイレント変化を本発明のポリヌクレオチドに導入してもよい。本明細書で用いられる、“サイレント変化”には、例えばポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を変更させない変化が含まれる。そのような変化は、ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞で頻繁に生じるコドンまたはコドン対を導入することによって前記宿主生物によって生成されるポリペプチドのレベルを増加させるために所望されることがある。
本発明はまた、本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および切端を生じるヌクレオチド変化を有するポリペプチドに関する。そのようなヌクレオチドの変化は、例えば位置特異的変異導入、化学物質によるランダム変異導入、エキソヌクレアーゼIIIによる欠失および他の組換えDNA技術のような技術を用いて導入することができる。
必要な場合には、プローブを相補的な配列と特異的にハイブリダイズさせる条件は、前記プローブを、相補的配列を含むことが判明しているサンプル由来の相補的配列とともに相補的配列を含まないコントロール配列と接触させることによって決定することができる。ハイブリダイゼーション条件、例えばハイブリダイゼーション緩衝液の塩濃度、ハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド濃度、またはハイブリダイゼーション温度は、プローブを相補的な核酸と特異的にハイブリダイズさせる条件の認定にしたがって変動しえる。
サンプルが、当該核酸が単離された生物を含む場合は、プローブの特異的なハイブリダイゼーションが検出される。ハイブリダイゼーションは、プローブを検出可能な薬剤、例えば放射性同位元素、蛍光色素、または検出可能な生成物の形成を触媒することができる酵素で標識することによって検出することができる。
【０１０８】
標識プローブを用いて、サンプル中の相補的な核酸の存在を検出する多くの方法が当業者によく知られている。これらには、サザンブロット、ノザンブロット、コロニーハイブリダイゼーション方法およびドットブロットが含まれる。これらの方法の各々についてのプロトコルは以下で提供される：Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997；およびSambrook et al. Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。
あるいは、2つ以上のプローブ（そのうちの少なくとも1つは核酸サンプルに存在する任意の相補性配列と特異的にハイブリダイズすることができる）を増幅反応で用いて、サンプルが本発明の核酸配列を含む生物（例えば前記核酸が単離された生物）を含むか否かを決定することができる。典型的には、プローブはオリゴヌクレオチドを含む。ある特徴では、増幅反応はPCR反応を含むことができる。PCRプロトコルは文献（AusubelおよびSambrook、上掲書）に記載されている。あるいは、増幅はリガーゼ連鎖反応、3SRまたは鎖置換反応を含むことができる（以下を参照されたい：F. Barany, “The Ligasa Chain Reaction in a PCR World”, PCR Methods and Applications 1:5-16, 1991; E. Fahy et al., “Self-sustained Sequence Replication (3SR): An Isothermal Transcription-based Amplification System Alternative to PCR”, PCR Methods and Applications 1:25-33, 1991;およびG.T. Walker et al., “Strand Displacement Amplification an Isothermal in vitro DNA Amplification Technique”, Nucleic Acid Research 20:1691-1696, 1992）。そのような方法では、サンプル中の核酸をプローブと接触させ、増幅反応を実施し、さらに生成された任意の増幅生成物を検出する。増幅生成物は、反応生成物のゲル電気泳動を実施し、前記ゲルをインターカレーション試薬（例えば臭化エチジウム）で染色することによって検出することができる。あるいは1つ以上のプローブを放射性同位元素で標識し、ゲル電気泳動の後で放射性増幅生成物の存在をオートラジオグラフィーによって検出してもよい。
本発明の配列の末端近くの配列に由来するプローブもまた染色体ウォーキング法で用いて、上記に示した核酸配列の近傍に位置するゲノム配列を含むクローンを同定することができる。そのような方法は、さらに別のタンパク質をコードする遺伝子を宿主生物から単離することを可能にする。
【０１０９】
本発明の核酸配列をプローブとして用いて、関連する核酸を同定および単離することができる。いくつかの特徴では、関連核酸は、前記核酸が単離された生物以外の生物に由来するcDNAまたはゲノムDNAでありえる。例えば、他の生物は関連する生物でありえる。そのような方法では、プローブが特異的に関連配列とハイブリダイズすることができる条件下で、核酸サンプルをプローブと接触させる。続いて、関連生物に由来する核酸とプローブのハイブリダイゼーションが、上記に記載した方法のいずれかを用いて検出される。
核酸のハイブリダイゼーション反応では、特定のストリンジェンシーレベルを達成するために用いられる条件は、ハイブリダイズされる核酸の性質に応じて変動するであろう。例えば、核酸のハイブリダイズする領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成（例えばGC対AT含量）および核酸のタイプ（例えばRNA対DNA）が、ハイブリダイゼーション条件の選択で考慮されえる。さらにまた、核酸の一方が、例えばフィルターに固定されているか否かが考慮される。
ハイブリダイゼーションは低ストリンジェンシー、中等度ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシー条件下で実施することができる。核酸のハイブリダイゼーションの例として、固定された変性核酸を含むポリマーメンブレンは、先ず初めに0.9MのNaCl、50mMのNaH2PO4（pH7.0）、5.0mMのNa2EDTA、0.5%SDS、10Xのデンハルト溶液および0.5mg/mLのポリリボアデニル酸から成る溶液中で45℃、30分プレハイブリダイズされる。続いて、約2X107cpm（比活性4−9X108cpm/μg）の32P末端標識オリゴヌクレオチドプローブを前記溶液に添加する。12から16時間インキュベートした後、前記メンブレンを0.5%のSDSを含む、1XのSET（150mMのNaCl、20mMのトリス-塩酸（pH7.8）、1mMのNa2EDTA）中で30分、室温で洗浄し、続いて前記オリゴヌクレオチドプローブのTm−10℃で新しい1XのSETで30分洗浄する。続いて前記メンブレンでオートラジオグラフィー用フィルムを感光させハイブリダイゼーションシグナルを検出する。
【０１１０】
検出可能なプローブとハイブリダイズする核酸（例えばcDNAまたはゲノムDNA）を同定するために用いられるハイブリダイゼーションのストリンジェンシーレベルを変動させることによって、プローブに対して種々のレベルの相同性を有する核酸を同定および単離することができる。ストリンジェンシーは、プローブの融解温度より低い種々の温度でハイブリダイゼーションを実施することによって変動させることができる。融解温度（Tm）は、（所定のイオン強度およびpHの下で）標的配列の50％が完全に相補性のプローブとハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、個々のプローブのTmに等しいかまたはそれより約5℃低くなるように選択される。プローブの融解温度は以下の等式を用いて計算できる。
長さが14から70ヌクレオチドのプローブの場合、融解温度（Tm）は下記式を用いて計算される：Tm＝81.5＋16.6（log[Na＋]）＋0.41（G+Cの割合）−（600/N）、式中Nはプローブの長さである。ハイブリダイゼーションがホルムアミド含有溶液中で実施される場合、融解温度は以下の等式を用いて計算できる：Tm＝81.5＋16.6（log[Na＋]）＋0.41（G+Cの割合）−（0.63％ホルムアミド）−（600/N）、式中Nはプローブの長さである。プレハイブリダイゼーションは、6XのSSC、5Xのデンハルト試薬、0.5％SDS、100μg/mLの変性フラグメント化サケ精子DNA、または6XのSSC、5Xのデンハルト試薬、0.5％SDS、100μg/mLの変性フラグメント化サケ精子DNA、50％ホルムアミド中で実施することができる。SSCおよびデンハルト溶液のための組成は例えば上掲書（Sambrook et al.）で見出すことができる。
ハイブリダイゼーションは、検出可能プローブを上記に挙げたプレハイブリダイゼーション溶液に添加することによって実施される。プローブが二本鎖DNAを含む場合、ハイブリダイゼーション溶液に添加する前に前記を変性させる。プローブが、それと相補的または相同な配列を含むcDNAまたはゲノムDNAとハイブリダイズできるように十分な時間前記ハイブリダイゼーション溶液とフィルターを接触させる。長さが200ヌクレオチドを超えるプローブの場合、ハイブリダイゼーションはTmより15−25℃下で実施できる。より短いプローブの場合（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）、ハイブリダイゼーションはTmより5−10℃下で実施できる。典型的には、6XのSSC中でのハイブリダイゼーションの場合、ハイブリダイゼーションは約68℃で実施される。通常では、50％ホルムアミド含有溶液中でのハイブリダイゼーションの場合、ハイブリダイゼーションは約42℃で実施される。前述のハイブリダイゼーションのいずれも高ストリンジェンシー条件下であると考えられる。
【０１１１】
ハイブリダイゼーションに続いて、フィルターを洗浄して非特異的に結合した検出可能プローブの一切を除去することができる。フィルターの洗浄に用いられるストリンジェンシーはまた、ハイブリダイズされる核酸の性質、ハイブリダイズされる核酸の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成（例えばGC対AT含有量）および核酸のタイプ（例えばRNA対DNA）に応じて変動し得る。ストリンジェンシーがだんだんと高くなる洗浄条件の例は以下のとおりである：2XのSSC、0.1%のSDS、室温で15分（低ストリンジェンシー）；0.1XのSSC、0.5%のSDS、室温で30分から1時間（中等度ストリンジェンシー）；0.1XのSSC、0.5%のSDS、ハイブリダイゼーション温度から68℃で15から30分（高ストリンジェンシー）；および0.15MのNaCl、72℃で15分（超高ストリンジェンシー）。最後の低ストリンジェンシー洗浄は、0.1XのSSCで室温にて実施することができる。前述の例は、フィルターの洗浄で用いることができる1組の条件の単なる例示である。種々のストリンジェンシーの洗浄レシピが多数存在することは当業者には知られていよう。他のいくつかの例が下記で提供される。
プローブとハイブリダイズした核酸はオートラジオグラフィーまたは他の通常的な技術によって同定される。
上記の方法を改変して、プローブ配列に対して相同性が低い核酸を同定することができる。例えば、検出可能なプローブに対して相同性が低い核酸を得るために、ストリンジェンシーが低い条件を用いることができる。例えば、約1MのNa+濃度を有するハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイゼーション温度を68℃から42℃まで5℃ずつ下げることができる。ハイブリダイゼーション後に、フィルターをハイブリダイゼーション温度で2XのSSC、0.5％SDSで洗浄することができる。前記の条件は、50℃より上で“中等度”の条件、50℃未満で“低度”の条件と考えられる。“中等度”のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが55℃で実施される場合である。“低ストリンジェンシー”のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが45℃で実施される場合である。
あるいは、ハイブリダイゼーションは、ホルムアミドを含む緩衝液（例えば6XのSSC）中で42℃の温度で実施することができる。この場合、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドの濃度を50%から0%まで5%ずつ減少させ、プローブに対して相同性レベルの低いクローンを同定することができる。ハイブリダイゼーションの後でフィルターを6XのSSC、0.5％SDSで50℃にて洗浄することができる。前記の条件は、25％を超えるホルムアミドで“中等度”の条件、25％より低いホルムアミドで“低度”の条件と考えられる。“中等度の”ハイブリダイゼーション条件の具体的な条件は、上記のハイブリダイゼーションが30％のホルムアミドで実施されるときである。“低ストリンジェンシー”のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが10％のホルムアミドで実施されるときである。
【０１１２】
前述の方法を用いて、配列番号:1に示す核酸配列と少なくとも約99%、少なくとも98%、少なくとも97%、少なくとも95%、少なくとも90%、または少なくとも80%の相同性を有する配列、配列番号:1に示す核酸配列と実質的に同一の配列、または連続する少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400または500の塩基を含む前記のフラグメント、および前述の配列のいずれかに相補的な配列を有する核酸を単離することができる。相同性はアラインメントアルゴリズムを用いて測定することができる。例えば、相同なポリヌクレオチドは、本明細書に記載したコード配列の1つの天然に存在する対立遺伝子座変種のコード配列を有することができる。そのような対立遺伝子座変種は、配列番号:１に示す核酸配列または前記と相補的な配列と比較したとき1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有することができる。
さらにまた、上記の方法を用いて、配列番号:2に示す配列を有するポリペプチドと少なくとも約99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、または少なくとも70%の相同性を有するポリペプチド、配列番号:2と実質的に同一の配列、または連続する少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100または150のアミノ酸を含む前記のフラグメントをコードする核酸を単離することができる。前記相同性は、配列アラインメントアルゴリズム（例えば規定値パラメーターを用いるFASTAバージョン3.0t78アルゴリズム）を用いて決定される。
本発明の別の特徴は、配列番号:1に示す配列、前記と実質的に同一の配列、または連続する少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100または150のアミノ酸を含む前記のフラグメントを含む単離および精製されたポリペプチドである。上記で考察したように、そのようなポリペプチドは、コード配列が、コードされるポリペプチドの発現を適切な宿主細胞で駆動することができる配列と機能可能に連結されるように、ベクターにポリペプチドをコードする核酸を挿入することによって入手することができる。例えば、発現ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターを含むことができる。ベクターはまた発現増幅のための適切な配列を含むことができる。
【０１１３】
細菌でポリペプチドまたはそのフラグメントを発現させるために適したプロモーターには、大腸菌のlacまたはtrpプロモーター、lacIプロモーター、lacZプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター、gptプロモーター、ラムダPRプロモーター、ラムダPLプロモーター、糖分解酵素（例えば3-ホスホグリセレートキナーゼ（PGK））をコードするオペロン由来のプロモーターおよび酸性ホスファターゼプロモーターが含まれる。菌類プロモーターには∀因子が含まれる。真核細胞プロモーターには、CMV極初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、レトロウイルスのLTRおよびマウスのメタロチオネインIプロモーターが含まれる。原核細胞または真核細胞またはそれらのウイルスで遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターもまた用いることができる。
哺乳動物発現ベクターはまた、複製起点、必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終了配列、および5'フランキング非転写配列を含むことができる。いくつかの特徴では、SV40スプライシングおよびポリアデニル化部位に由来するDNA配列を用いて、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。
真核細胞中でポリペプチドまたはそのフラグメントを発現させるためのベクターはまた発現レベルを高めるためにエンハンサーを含むことができる。エンハンサーはDNAのcis-作動性エレメントであり、通常は長さが約10から約300bpであってプロモーターに作用してその転写を高める。その例には、複製起点の後期側100bpから270bpにあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
さらにまた、発現ベクターは典型的には1つ以上の選別可能なマーカー遺伝子を含み、前記ベクターを含む宿主細胞の選別を可能にする。そのような選別可能マーカーには、真核細胞培養に対してはジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子またはネオマイシン耐性を付与する遺伝子、大腸菌にテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を付与する遺伝子、及びS.セレビシアエのTRP1遺伝子が含まれる。
【０１１４】
対象の標的DNAを少なくとも1つの微生物に由来するDNAから選択的に単離するために用いられるプローブDNAは、公知の活性をもつ酵素のためのDNAの完全長コード領域配列であっても、その部分的コード領域配列であってもよい。原型のDNAライブラリーを、指定の酵素活性を有する酵素をコードするDNA配列の少なくとも部分を含むプローブの混合物を用いて探査することができる。これらのプローブまたはプローブライブラリーは一本鎖であってもよく、さらに探査される微生物DNAは一本鎖型に変換されてもよい。適切なプローブは、スクリーニングしようとしている指定の酵素活性と類似または同一の活性を有する酵素をコードするDNAに由来するものである。
プローブDNAは少なくとも約10塩基または少なくとも15塩基である。ある特徴では、完全なコード領域をプローブとしても用いることができる。少なくとも1つのDNAプローブの使用によって標的DNAが選択的に単離されるハイブリダイゼーション条件が設計され、少なくとも約50%の配列同一性のハイブリダイゼーションストリンジェンシー、より具体的には少なくとも約70%の配列同一性を提供するストリンジェンシーを提供するであろう。
プローブDNAは特異的な結合対の一方のパートナー（すなわちリガンド）で“標識”することができ、前記結合対の他方のパートナーは固相マトリックスに結合させて、当該DNAの供給源から標的の分離を容易にする。リガンドおよび特異的な結合パートナーは、以下からどちらかの向きで選択することができる：（1）抗原またはハプテンおよび抗体またはその結合フラグメント；（2）ビオチンまたはイミノビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン；（3）糖およびそのレクチン特異物質；（4）酵素およびその阻害物質；（5）アポ酵素およびコファクター；（6）相補性ホモポリマーオリゴヌクレオチド；および（7）ホルモンおよびレセプター。固相は以下から選択することができる：（1）ガラスまたはポリマー表面；（2）ポリマービーズの充填カラム；および（3）磁性または常磁性粒子。
【０１１５】
適切なDNA配列は、多様な方法によってベクターに挿入することができる。一般的には、DNA配列は、挿入物およびベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで消化した後、ベクター内の所望の位置に連結される。あるいは、挿入物およびベクターの両方の平滑端を連結してもよい。多様なクローニング技術が以下に開示されている：Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997；およびSambrook et al. Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。そのような方法および他の方法は当業者の技術範囲内と考えられる。
ベクターは、例えばプラスミド、ウイルス粒子またはファージの形態でありえる。他のベクターには、染色体配列、非染色体配列および合成DNA配列、SV40の誘導体；細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージDNAの組合せに由来するベクター、ウイルスDNA（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病）が含まれる。原核細胞および真核細胞宿主とともに用いられる多様なクローニングおよび発現ベクターが以下に記載されている：Sambrook et al. Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。
用いることができる具体的な細菌ベクターには、以下の周知のクローニングベクターの遺伝的要素を含む市販のプラスミドが含まれる：pBR322（ATCC37017）、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）、GEM1（Promega Biotec, Madison, WI, USA）、pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pD10、psiX174、pBluescript IIKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratagene）、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia）、pKK232-8およびpCM7。具体的な真核細胞ベクターには、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL（Pharmacia）が含まれる。しかしながら他のベクターのいずれも宿主細胞内で複製可能で生存可能である限り使用することができる。
宿主細胞は当業者に周知の宿主細胞のいずれかであって、原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞または植物細胞が含まれる。適切な宿主の代表的な例として以下を挙げることができる：細菌細胞、例えば、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、バチルス・セレウス、ネズミチフス菌、並びにシュードモナス属、ストレプトミセス属およびスタフィロコッカス属の中の多様な種、菌類細胞、例えばアスペルギルス、酵母、例えばピキア、サッカロミセス、シゾサッカロミセスの任意の種（ピキア・パストリス、サッカロミセス・セレビシアエまたはシゾサッカロミセス・ポンベを含む）、昆虫細胞、例えばドロソフィラS2およびスポドプテラSf9、動物細胞、例えばCHO、COSまたはボウズ・メラノーマ、およびアデノウイルス。適切な宿主を選択することは当業者の技術範囲内である。
【０１１６】
ベクターは、多様な任意の技術を用いて宿主細胞に導入することができる。前記技術には、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃またはTi仲介遺伝子伝達が含まれる。具体的な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる（L. Davis, M. Dibner, I. Battey, Basic Methods in Molecular Biology, 1986）。
適切な場合には、操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選別または本発明の遺伝子の増幅に適切なように改変した通常の栄養培地で培養することができる。適切な宿主株を形質転換し、さらに適切な細胞密度に前記宿主株を増殖させた後、選択したプロモーターを適切な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）によって誘導し、さらに追加の期間培養して所望のポリペプチドまたはそのフラグメントを産生させることができる。
典型的には遠心分離によって細胞を採集し、物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物を更なる精製のために維持することができる。タンパク質の発現に用いた微生物細胞は任意の一般的な方法によって破壊することができる。そのような方法には、凍結融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用が含まれる。そのような方法は当業者には周知である。発現されたポリペプチドまたはそのフラグメントは、組換え細胞培養から以下を含む方法によって回収および精製することができる：硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー。タンパク質の再折りたたみ工程は、ポリペプチドの立体構造の完成に際して必要に応じて用いることができる。所望の場合には、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製工程に用いることができる。
多様な哺乳動物細胞培養系もまた組換えタンパク質の発現に利用することができる。哺乳動物細胞発現系の例には、サル腎線維芽細胞のCOS-7株（Gluzman, Cell 1981, 23:175）および適合するベクターからタンパク質を発現させることができる他の細胞株、例えばC127、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞株が含まれる。
【０１１７】
宿主細胞内の構築物を通常の態様で用い、組換え配列によってコードされる遺伝子生成物を産生させることができる。組換え体の製造方法で用いる宿主細胞に応じて、ベクターを含む宿主細胞により産生されるポリペプチドはグリコシル化されることも、またグリコシル化されないこともある。本発明のポリペプチドはまた最初のメチオニン残基を含んでいることも含まないこともある。組換えタンパク質の発現に関する更なる詳細は当業者には入手可能である。例えば、以下の成書は、広範囲の生物でのタンパク質発現について豊富な手引きを提供する：Protein Expression: A Practical Approach (Practical Approach Series by S.J. Higgins (Editor), B.D. Hames (Editor) (July 1999) Oxford University Press; ISBN:0199636249。
また別には、本発明のポリペプチドは、通常のペプチド合成装置により合成することができる。他の特徴では、ポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成によって対応する完全長ポリペプチドを生成するために利用することができ、したがってフラグメントは完全長ポリペプチドの生成のための中間物として利用することができる。
当業者には公知であるが、本発明の核酸配列は多様な生物での発現について最適化することができる。ある特徴では、対象の生物（例えばS.セレビシアエのような菌類、または大腸菌のような細菌）のコドン使用頻度について最適化される。コドン使用頻度についての核酸の最適化は、特定のアミノ酸をコードするためにある生物が好む特定のコドンの選択に関係することは当分野ではよく理解されている。最適化されたコドン使用頻度表は多くの生物について公知である。例えば以下を参照されたい：Transfer RNA in Protein Synthesis by Dolph L. Hatfield, Byeong J. Lee, Robert M. Pirtle (Editor)(July 1992) CRC Press; ISBN:0849356989。したがって、本発明はまたある生物のコドン使用頻度に順応させた本発明の核酸を含む。
本発明の核酸配列の最適化発現はまた、本コードタンパク質の発現増加を達成するための定方向またはランダム変異導入にも関係する。本発明の核酸の変異導入は、発現されるタンパク質の収量増加を直接的または間接的に提供することができる。非限定的に例示すれば、本明細書に記載する変異導入技術を利用して、5'非翻訳領域、3'非翻訳領域または核酸のコード領域の変異を達成することができる（その変異がRNAまたはタンパク質レベルの安定化を高め、それによってタンパク質収量の増加をもたらすことがある）。
【０１１８】
本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸と機能可能に連結されたプロモーターを含むDNA構築物から転写されたmRNAを用い、無細胞翻訳系を利用して、本発明のポリペプチドの1つを生成することもまた可能である。いくつかの特徴では、DNA構築物は、in vitro転写反応を実施する前に直鎖化することができる。転写されたmRNAを続いて適切な無細胞翻訳抽出物（例えばウサギの網状赤血球抽出物）とともにインキュベートして、所望のポリペプチドまたはそのフラグメントを生成する。
本発明はまた本発明のポリペプチドの変種に関する。“変種”という用語にはこれらポリペプチドの誘導体または類似体が含まれる。特に、前記変種は、1つ以上の置換、付加、欠失、融合および切端（前記は任意の組合せで出現しえる）によって本発明のポリペプチドとそのアミノ酸配列が異なることがあり、実質的には配列は本発明のポリペプチドと同一である。
変種は天然に存在するものでもin vitroで作製してもよい、特に、そのような変種は、遺伝子操作技術、例えば位置特異的変異導入、化学物質によるランダム変異導入、エキソヌクレアーゼIIIによる欠失導入方法および標準的クローニング技術を用いて作製することができる。あるいは、そのような変種、フラグメント、類似体または誘導体は化学的合成または改変手段によって作製することができる。
変種を作製する他の方法もまた当業者にはよく知られている。これらの方法には、天然の単離体から得られる核酸配列を改変して、工業的または実験的利用でそれらの価値を高める性状を有するポリペプチドをコードする核酸を生成する方法が含まれる。そのような方法では、天然の単離体から得られる配列に対して1つ以上のヌクレオチド相違を有する多数の変種配列が生成され、性状が明らかにされる。典型的には、これらのヌクレオチド相違は、天然の単離体の核酸によってコードされるポリペプチドに対してアミノ酸の変化を生じる。
【０１１９】
例えば、変種はエラープローンPCRを用いて作製することができる。エラープローンPCRでは、PCRは、DNAポリメラーゼの複写信頼性が低く、高率の点変異がPCR全長にわたって得られるような条件下で実施される。エラープローンPCRは例えば以下に記載されている：D.W. Leung et al., Technique, 1:11-15 (1989); R.C. Caldwell & G.F. Joyce, PCR Methods Applic. 2:28-33 (1992)。簡単に記せば、前記の方法では、変異を導入される核酸は、PCRプライマー、反応緩衝液、MgCl2、MnCl2、Taqポリメラーゼおよび適切な濃度のdNTPと混合され、PCR生成物の全長にわたって高率の点変異が達成される。例えば、前記反応は、20fmoleの突然変異を導入されるべき核酸、30pmoleの各PCRプライマー、反応緩衝液（50mMのKCL、10mMのトリス（pH8.3）および0.01％のゼラチンを含む）、7mMのMgCl2、0.5mMのMnCl2、5単位のTaqポリメラーゼ、0.2mMのdGTP、0.2mMのdATP、1mMのdCTPおよび1mMのdTTPを用いて実施される。PCRでは、94℃1分、45℃1分および72℃1分の30サイクルが実施される。しかしながら、これらのパラメーターは適宜変動させることができることは理解されよう。変異核酸は適切なベクターでクローニングされ、前記変異核酸によってコードされたポリペプチドの活性が評価される。
変種はまた、任意のクローニングされた対象DNAにおいて位置特異的変異を生じるオリゴヌクレオチド特異的変異導入を用いて生成することができる。オリゴヌクレオチド変異導入は例えば以下に記載されている：Reidhaar-Olson (1988) Science 241:53-57。簡単に記せば、前記の方法では、クローン化DNAに導入されるべき1つ以上の変異をもつ複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが合成され、変異を導入される前記クローン化DNAに挿入される。変異を導入されたDNAを含むクローンを回収し、それらがコードするポリペプチドの活性を評価する。
【０１２０】
変種を生成するまた別の方法はアッセンブリPCRである。アッセンブリPCRでは、小さなDNAフラグメント混合物からPCR生成物をアッセンブリングすることが必要である。多数の様々なPCR反応が同じバイアル中で平行して生じ、1つの反応の生成物が別の反応の生成物をプライミングする。アッセンブリPCRは、係属中の米国特許出願08/677,112号（1996年7月9日出願、発明の名称”Method of DNA Shuffling with Polynucleotides Produced by Blocking or Interrupting a Synthesis or Amplification Process.”）に記載されている。
変種を生成するまた別の方法はセクシュアルPCR変異導入である。セクシュアルPCR変異導入では、配列相同性によるDNA分子のランダムなフラグメント化とそれに続くPCR反応におけるプライマーの伸長による交差の固定の結果として、強制された相同組換えが、異なるが高度の相関性を有するDNA配列をもつDNA分子間においてin vitroで生じる。セクシュアルPCR変異導入は以下に記載されている：W.P. Stemmer (1994) PNAS, USA 91:10747-10751。簡単に記せば、前記の方法では、組換えられるべき複数の核酸をDNaseで消化して平均サイズが50−200ヌクレオチドのフラグメントを生成する。所望の平均サイズをもつフラグメントを精製し、PCR混合物に再懸濁する。PCRは、前記核酸フラグメント間の組換えが促進される条件下で実施される。PCRは、例えば以下によって実施できる:前記精製フラグメントを10−30ng/μＬの濃度で溶液（0.2Mの各dNTP、2.2mMのMgCl2、50mMのKCl、10mMのトリス塩酸（pH9.0）および0.1％トリトンX-100）に再懸濁する。100μLの反応混合物につき2.5単位のTaqポリメラーゼを添加し、PCRを以下の方式を用いて実施する：94℃60秒、94℃30秒、50−55℃30秒、72℃30秒（30−45回）および72℃で5分。しかしながら前記パラメーターは適宜変動させることができることは理解されよう。いくつかの特徴では、オリゴヌクレオチドをPCR反応に含ませることができる。他の特徴では、DNAポリメラーゼIのクレノーフラグメントをPCR反応の最初のセットで用い、Taqポリメラーゼをその後のPCR反応セットで用いることができる。組換え配列を単離し、それらがコードするポリペプチドの活性を評価する。
【０１２１】
変種はまたin vivo変異導入によって生成することができる。いくつかの特徴では、細菌株（例えば大腸菌株）で対象の配列を増殖させることによって、対象の配列中でランダム変異が生成される。前記大腸菌株はDNA修復経路の1つ以上に変異を含む。そのような“ミューテーター”株は野生型の親よりも高いランダム変異率を有する。これらの株の1つでDNAを増殖させることによって、最終的にDNA内部にランダム変異が生成されるであろう。in vivo変異導入に使用するために適したミューテーター株は例えばPCT公開広報WO91/16427（1991年10月31日公開、発明の名称”Methods for Phenotype Creation from Multiple Gene Populations”）に記載されている。
変種はまたカセット変異導入を用いて生成することができる。カセット変異導入では、二本鎖DNA分子の小さな領域が、天然の配列とは異なる合成オリゴヌクレオチド“カセット”で置き換えられる。前記オリゴヌクレオチドはしばしば完全におよび／または部分的に任意抽出された天然の配列を含む。
再帰的アンサンブル変異導入もまた変種の生成に用いることができる。再帰的アンサンブル変異導入は、表現型が関連性をもつ変異体の多様な集団（そのメンバーはアミノ酸配列が異なる）を生成するために開発されたタンパク質工学（タンパク質変異導入）のためのアルゴリズムである。前記方法はフィードバックメカニズムを用いて、コンビナトリアルカセット変異導入（combinatorial cassette mutagenesis）の連続繰り返し工程を制御する。再帰的アンサンブル変異導入は以下に記載されている：A.P. Arkin (1992) PNAS USA 89:7811-7815。
【０１２２】
いくつかの特徴では、変種はエクスポネンンシャルアンサンブル変異導入を用いて生成される。エクスポネンンシャルアンサンブル変異導入は、高い割合の固有で機能的な変異体を含む総当り組合せライブラリーを生成する方法である。前記変異導入では、残基の小グループが並行して任意抽出され、機能的タンパク質を生じるアミノ酸がそれぞれ変更された位置で同定される。エクスポネンンシャルアンサンブル変異導入は以下に記載されている：S. Delagrave and D.C. Youvan (1993) Biotechnol Res. 11:1548-1552。ランダムな変異導入および部位特異的変異導入は以下に記載されている：F.H. Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology 4:450-455。
いくつかの特徴では変種はシャッフリングの方法によって生成される。前記では、別個のポリペプチドをコードする複数の核酸の部分が融合され、係属中の米国特許出願08/677,112号（1996年7月9日出願、発明の名称 ”Methods of DNA Shuffling with Polynucleotides Produced by Blocking or Interrupting a Synthesis or Amplification Process”）、および継続中の米国特許出願08/651,568号（1996年5月22日出願、発明の名称 ”Combinatorial Enzyme Development”）に記載されたキメラポリペプチドをコードするキメラ核酸配列が生成される。
本発明のポリペプチドの変種は、本発明の配列のポリペプチドの1つ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（例えば保存アミノ酸残基）で置換された変種であり、さらにそのような置換アミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされるものでも、そうでないものでもよい。
保存的置換は、ポリペプチド内のあるアミノ酸が同様な特徴を有する別のアミノ酸によって置換されるものである。保存的置換として典型的に観察されるものは以下の置換である：脂肪族アミノ酸（例えばAla、Val、LeuおよびIle）の別の脂肪族アミノ酸による置換；SerのThrによる置換またはその逆；酸性残基（例えばAspおよびGlu）の別の酸性残基による置換；アミド基をもつ残基（例えばAsnおよびGln）の別のアミド基をもつ残基による置換；塩基性残基（例えばLysおよびArg）の別の塩基性残基による交換；および芳香族残基（例えばPhe、Tyr）の別の芳香族残基による置換。
他の変種は、本発明のポリペプチドの1つ以上のアミノ酸残基が置換基を含む変種である。
さらに他の変種は、前記ポリペプチドが別の化合物、例えば前記ポリペプチドの半減期を延長する化合物（例えばポリエチレングリコール）と結合しているものである。
さらに別の変種は、さらに別のアミノ酸が前記ポリペプチドに融合されているものである。前記のさらに別のアミノ酸は例えばリーダー配列、分泌配列、プロタンパク質配列または前記ポリペプチドの精製、濃縮または安定化を促進する配列である。いくつかの特徴では、誘導体および類似体は、本発明のポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を保持し、さらに前記誘導体および類似体はプロタンパク質を含み、したがって、プロタンパク質部分の切断によって前記フラグメント、誘導体または類似体は活性化されて活性なポリペプチド生成することができる。
【０１２３】
宿主細胞で高レベルのタンパク質発現を達成するためのコドンの最適化
本発明は、コドン使用頻度を改変するためにフィターゼコード核酸を改変する方法を提供する。ある特徴では、本発明は、フィターゼをコードする核酸のコドンを改変して宿主におけるその発現を増加または減少させる方法を提供する。本発明はまた、宿主細胞におけるその発現を高めるために改変されたフィターゼをコードする核酸、そのように改変されたフィターゼ酵素、および前記改変フィターゼ酵素を製造する方法を提供する。前記方法は、“非優先”または“低優先”コドンをフィターゼコード核酸中で同定し、さらにこれら非優先または低優先コドンの1つ以上を、前記コドンと同じアミノ酸をコードする“優先コドン”で置き換えることを含み、核酸内の少なくとも1つの非優先または低優先コドンが同じアミノ酸をコードする優先コドンによって置き換えられている。優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において高頻度に提示されるコドンであり、非優先または低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において低頻度で提示されるコドンである。
本発明の核酸、発現カセットおよびベクターの発現のための宿主細胞には細菌、酵母、菌類、植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が含まれる。したがって、本発明はこれら全ての細胞でコドン使用頻度を最適化する方法、コドン改変核酸、およびコドン改変核酸によって生成されるポリペプチドを提供する。例示的な宿主細胞には、グラム陰性細菌（例えば大腸菌およびシュードモナス・フルオレセンス）；グラム陽性細菌（例えばラクトバチルス・ガッセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、枯草菌（Bacillus subtilis）が含まれる。例示的な宿主細胞にはまた真核細胞生物、例えば種々の酵母、例えばサッカロミセス種（サッカロミセス・セレビシアエを含む）、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリス及びクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、アスペルギルス・ニゲル、並びに哺乳動物細胞および細胞株、並びに昆虫細胞および細胞株が含まれる。したがって、本発明はまた前記生物および種での発現のために最適化された核酸およびポリペプチドを含む。
例えば、細菌細胞から単離されたフィターゼをコードする核酸のコドンは、フィターゼが由来した細菌とは異なる細菌細胞、酵母、菌類、植物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞で前記核酸が最適に発現できるように改変される。コドンを最適化する方法は当分野では周知で、例えば以下を参照されたい：US Pat. No. 5,795,737；Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118；Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253。さらにまた以下を参照されたい：Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253（マウス系におけるコドンの最適化を記載）；Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24（酵母におけるコドンの最適化を記載）；Feng (2000) Biochemistry 39:15339-15409（大腸菌におけるコドンの最適化を記載）；Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252-264（大腸菌における分泌に影響するコドン使用頻度の最適化を記載）。
【０１２４】
非ヒトトランスジェニック動物
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド、発現カセットもしくはベクター、またはトランスフェクトされたもしくは形質転換された細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する。前記非ヒトトランスジェニック動物は、例えば本発明の核酸を含むヤギ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ラットおよびマウスであり得る。これらの動物は、例えばフィターゼ活性を調べるin vivoモデルとして、またはフィターゼ活性の調節物質をin vivoでスクリーニングするモデルとして用いることができる。非ヒトトランスジェニック動物で発現されるべきポリペプチドのコード配列は、構成的であるように、または組織特異的、生育特異的もしくは誘導性転写調節因子の制御下にあるように設計することができる。非ヒトトランスジェニック動物は当分野で公知の任意の方法を用いて設計および作製することができる。例えば以下を参照されたい：US Patent No. 6,211,428; 6,187,992; 6,156,952; 6,118,044; 6,111,166; 6,107,541; 5,959,171; 5,922,854; 5,892,070; 5,880,327; 5,891,698; 5,639,940; 5,573,933; 5,387,742; 5,087,571（形質転換細胞および卵並びにトランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタおよびウシの作製および使用について記載されている）。さらにまた例えば以下を参照されたい：Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157（トランスジェニック酪農動物のミルク中の組換えタンパク質の製造について記載）；Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17:456-461（トランスジェニックヤギの作製を示す）。米国特許第6,211,428号は、DNA配列を含む核酸構築物をその脳で発現する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の作製および使用について記載している。米国特許第5,387,742号は、クローン化組換えまたは合成DNA配列のマウス受精卵への注入、前記注入卵の偽妊娠雌への移植および、アルツハイマー病関連タンパク質をその細胞が発現するトランスジェニックマウスの周産期までの成長について記載している。米国特許第6,187,992号は、そのゲノムがアミロイド前駆体（APP）をコードする遺伝子の破壊を含むトランスジェニックマウスの作製および使用を記載している。
“ノックアウト動物”もまた本発明の方法の実施に用いることができる。例えば、ある特徴では、本発明のトランスジェニックまたは改変動物は“ノックアウト動物”、例えばフィターゼを発現しないようにまたは発現できないように操作された“ノックアウトマウス”を含む。
【０１２５】
別の特徴では、本発明のフィターゼをコードする異種配列（特に列挙した配列番号:2の配列改変）を含む非ヒトトランスジェニック生物が提供される。本発明のトランスジェニック動物を作製するために多様な方法を用いることができる。概略すれば、3つのそのような方法を用いることができる。そのような方法の1つでは、前核細胞期の胚（“単細胞胚”）を雌から採取し、この胚にトランスジーンをマイクロインジェクトする。この事例では、トランスジーンは、得られる成熟動物の生殖細胞および体細胞の両方の染色体に組み込まれるであろう。また別のそのような方法では、胚性幹細胞を単離しエレクトロポレーション、プラスミドトランスフェクションまたはマイクロインジェクションによって前記細胞内にトランスジーンを取り込ませ、続いて前記幹細胞を胚に再導入する。この胚の中で、前記幹細胞はコロニーを形成し生殖系列に寄与する。哺乳動物種のマイクロインジェクションの方法は米国特許第4,873,191号に記載されている。
さらに別の例示的方法では、トランスジーンを含むレトロウイルスに胚の細胞を感染させ、それによって、胎児の生殖細胞はその染色体にトランスジーンを組み込ませる。トランスジェニックにされる動物が鳥類である場合は、鳥類の受精卵は一般的に最初の20時間は卵管内で細胞分裂を経ることから、前核へアクセスが不可能なために受精卵の前核へのマイクロインジェクションは困難である。したがって、上記に概略したトランスジェニック動物を作製する方法のうち、レトロウイルス感染が、例えば米国特許第5,162,215号に記載されたように、鳥類の種については好ましい。しかしながら、マイクロインジェクションを鳥類の種で用いようとする場合は、Loveら（Biotechnol, 1994, 12, Jan）が発表した方法を利用することができる。前記方法により、胚は、その前に生じた卵を産み落としてから約2.5時間後に屠殺した雌鶏から入手し、トランスジーンをジャーミナルディスクの細胞質にマイクロインジェクトし、前記胚を成熟するまで宿主の卵殻内で培養する。トランスジェニックにされる動物がウシまたはブタである場合、卵の不透明度のために伝統的な弁別的干渉対比顕微鏡検査法（differential interference-contrast microscopy）によって核を識別することが困難であり、マイクロインジェクションが妨げられる。この問題を克服するために、先ず初めに卵を遠心して前核を分離しより良好な可視化を達成することができる。
【０１２６】
ある特徴では、本発明の“非ヒト動物”にはウシ類、ブタ類、ヒツジ類および鳥類が含まれる（例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ）。本発明の“非ヒトトランスジェニック動物”は、“トランスジーン”を非ヒト動物の生殖細胞に導入することによって作製される。種々の発生段階にある胚性標的細胞を用いてトランスジーンを導入することができる。胚性標的細胞の発生段階に応じて、種々の方法を用いることができる。接合体はマイクロインジェクションのための最良の標的である。遺伝子移転のための標的としての接合体の使用は、ほとんどの事例で最初の卵割の前に注射されたDNAが宿主遺伝子に取り込まれるであろうという点で大きな利点を有する（Brinster et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82：4438-4442）。結果として、非ヒトトランスジェニック動物の全ての細胞が取り込まれたトランスジーンを保持するであろう。このことはまた、一般的に、始祖動物の子孫へのトランスジーンの効率的な伝達をもたらすであろう。なぜならば生殖細胞の50%がトランスジーンを保持するからである。
ある特徴では、“トランスジェニック”という用語は、外因性遺伝物質をその細胞の全てに含む動物を指すために用いられる。“トランスジェニック”動物は、生殖に用いられる細胞内に外因性遺伝物質を含む2つのキメラ動物を交配することによって生産することができる。得られる子孫の25%がトランスジェニックで（すなわち、その全細胞の両対立遺伝子に外因性遺伝物質を含む動物）、得られる動物の50%が1つの対立遺伝子内に外因性遺伝物質を含み、さらに25%が外因性遺伝物質を含まないであろう。
ある特徴では、マイクロインジェクション法を用いて本発明が実施される。トランスジーンを消化し、例えばゲル電気泳動によって一切のベクターDNAから前記を精製する。ある特徴では、トランスジーンは機能的に結合したプロモーターを含み、このプロモーターは転写に必要な細胞タンパク質と相互作用し、基本的に構成的発現をもたらす。これに関して有用なプロモーターには、サイトメガロウイルス（CMV）、モロニー白血病ウイルス（MLV）、およびヘルペスウイルス由来のプロモーターとともに、メタロチオニン、骨格筋アクチン、P-エノールピルベートカルボキシラーゼ（PEPCK）、ホスホグリセレート（PGK）、DHFR、およびチミジンキナーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターが含まれる。ウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）の末端反復配列（LTR）のプロモーターもまた用いることができる。トランスジェニックにしようとする動物が鳥類である場合は、好ましいプロモーターには、ニワトリβ-グロビン遺伝子、ニワトリリゾチーム遺伝子、およびニワトリ白血病ウイルスのプロモーターが含まれえる。胚性幹細胞のプラスミドトランスフェクションで有用な構築物は、さらに別の調節エレメントを利用するであろう。前記エレメントは当分野で周知であり、例えば転写を促進するエンハンサーエレメント、スプライスアクセプター、終止およびポリアデニル化シグナル、および翻訳を可能にするリボソーム結合部位である。
【０１２７】
レトロウイルス感染もまた、上記に記載したように、非ヒト動物へのトランスジーン導入に用いることができる。発生中の非ヒト胚をin vitroで培養して胚盤胞に至らせることができる。この時期に、卵割球はレトロウイルス感染の標的となりえる（R. Jaenich, Proc Natl Acad Sci, USA 1976, 73:1260-1264）。卵割球の効率的な感染は、酵素処理で透明体を除去することによって達成される（Hogan et al. (1986) Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）。トランスジーンの導入に用いられるウイルスベクター系は、典型的にはトランスジーンを保持する複製欠損レトロウイルスである（Jahner et al. Proc Natl Acad Sci, USA 1985, 82:6297-6931；Van der Putten et al. Proc Natl Acad Sci USA 1985, 82:6148-6152）。トランスフェクションは、単層ウイルス産生細胞上で胚盤胞を培養することによって容易にかつ効率的に達成される。（Van der Putten,上掲書；Stewart et al. EMBO J. 1987, 6:383-388）。あるいは、感染はより後期に実施してもよい。ウイルスまたはウイルス産生細胞を胞胚腔に注射することができる（D. Jahner et al. Nature 1982, 298:623-628）。始祖動物の大半がトランスジーンについてモザイクであろう。なぜならば、取り込みは、非ヒトトランスジェニック動物を形成した細胞の一部でのみ生じるからである。さらにまた、始祖動物は、一般的に子孫で分断されるトランスジーンを含む多様なレトロウイルス挿入物をゲノムの種々の位置に含みえる。さらにまた、低効率ではあるが、妊娠中期の胚の子宮内レトロウイルス感染によってトランスジーンを生殖細胞系列に導入することも可能である（D. Jahner et al.上掲書）。
トランスジーン導入のための第三のタイプの標的細胞は胚性幹（ES）細胞である。ES細胞はin vitroで培養した着床前の胚から得られ、これを胚と融合させる（M.J. Evans et al. Nature 1981, 292:154-156；M.O. Bradley et al. Nature 1984, 309:255-258；Grossler et al. Proc Natl Acad Sci, USA 1986, 83:9065-9069；およびRobertson et al. Nature, 1986, 322:445-448）。トランスジーンは、DNAトランスフェクションまたはレトロウイルス仲介形質導入によって効率的にES細胞に導入することができる。その後でそのような形質転換ES細胞を非ヒト動物由来の胚盤胞と合体させることができる。その後、ES細胞は胚でコロニーを形成し、生じたキメラ動物の生殖細胞系列に寄与する（概論のために以下を参照されたい：R. Jaenisch, Science, 1988, 240:1468-1474）。
【０１２８】
ある特徴では、“形質転換された”とは、組換え核酸技術によって異種核酸分子が細胞にまたは細胞の祖先に導入された当該細胞を意味する。“異種”とは、また別の種に由来する核酸、または当該細胞内の本来の形態もしくは当該細胞内で主として発現される形態から改変されている核酸配列に適用される。
ある特徴では、“トランスジーン”は、細胞内に巧妙な手段により挿入された任意のDNA片、または当該細胞から発生した生物のゲノムの一部分と成った（すなわち安定的にインテグレートされたか、または安定な染色体外エレメントとして存在する）任意のDNA片を意味する。そのようなトランスジーンには、トランスジェニック生物にとって部分的にまたは全体が異種である遺伝子、または当該生物の内因性遺伝子と同種である遺伝子が含まれえる。この定義に含まれるものは、DNAに転写され続いてゲノムに取り込まれるRNAの提供によって作製されたトランスジーンである。本発明のトランスジーンには、フィターゼまたはフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA配列が含まれ、さらに非ヒトトランスジェニック動物で発現されえるポリヌクレオチドが含まれる。本明細書で用いられる、“トランスジェニック”という用語はさらに、そのゲノムが、初期胚または受精卵のin vitro操作によって、または任意のトランスジェニック技術によって改変されて、特定の遺伝子がノックアウトされた任意の生物を含む。本明細書で用いられる“遺伝子ノックアウト”という用語は、当業者に周知の任意のトランスジェニック技術によって達成された、完全な機能の消失をもたらす遺伝子のin vivo誘導破壊に適用される。ある特徴では、遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物は、標的遺伝子が、当該遺伝子を標的とする挿入によって機能を消失させられた動物である（当該遺伝子は相同組換えにより機能を消失させられる）。
ある特徴では、“トランスジェニック”という用語は、導入されたトランスジーンを保持する生物、または内因性遺伝子が機能を失わされたかもしくは“ノックアウト”された生物を作出することができる、当業者に周知の任意のトランスジェニック技術を含む。
【０１２９】
本発明の実施に用いられるトランスジーンは、フィターゼまたはフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含むDNA配列である。ある特徴では、配列番号:1に示す配列または配列番号:2に示す配列を有するポリペプチドをコードする配列を有するポリヌクレオチドが、前記用語が本明細書で定義されるようにトランスジーンである。適切な場合には、フィターゼ活性を有するタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮退のために核酸配列が異なるDNA配列もまた、切端形、対立遺伝子変種および種間相同体として本明細書で用いることができる。
ある特徴では、胚にマイクロインジェクションを実施し、トランスフェクトされた胚性幹細胞がコロニーを形成し、またはトランスジーンを含むレトロウイルスを感染させた後で（本明細書の別の箇所で述べた本発明の鳥類種での実施を除く）、胚を擬似妊娠雌の卵管に移植する。その結果得られる子孫を、トランスジーン特異的プローブを用いて血液または組織サンプルのサザンブロット分析によってトランスジーンの取り込みについて試験する。これに関してはPCRが特に有用である。陽性子孫（G0）を交配して子孫（G1）を作出し、このG1を組織サンプルのノザンブロット分析によってトランスジーンの発現について分析する。
ある特徴では、本方法は、トランスジェニック動物の三価リンの取り込みの増加、および／またはトランスジェニック動物の排泄物中の汚染物質の量の約15%、約20%、約59%またはそれ以上の減少を含む。
ある特徴では、本発明の実施に用いることを意図される動物は、一般的に家畜化された動物とみなされるもの（例えばイヌ、ネコ、鳥類の種などを含む）、および食品類の加工に有用なもの、すなわち肉用および採卵用ニワトリ、シチメンチョウ、ヒツジ例えばラム、ウシ類例えば肉牛および乳牛、魚類およびブタである。ある特徴では、該当する動物が、異種DNA配列、または通常は当該動物にとって内因性であって当該動物の生殖細胞の染色体に組み込まれた1つ以上の付加DNA配列（包括的に本明細書では“トランスジーン”と称する）を有するとき、これらの動物を“トランスジェニック”と称する。トランスジェニック動物（その子孫を含む）ではまた、トランスジーンが体細胞の染色体に偶発的に組み込まれているであろう。
【０１３０】
スクリーニングの方法論および“オンライン”モニター装置
本発明の方法の実施に際して、多様な装置および方法論を本発明のポリペプチドおよび核酸と併せて用いて、例えばフィターゼ活性についてポリペプチドをスクリーニングし、活性の潜在的調節（例えば酵素活性の活性化または阻害）物質として化合物をスクリーニングし、本発明のポリペプチドと結合する抗体について、本発明の核酸とハイブリダイズする核酸についてスクリーニングすることなどが可能である。
【０１３１】
固定化酵素固相支持体：フィターゼ酵素、そのフラグメント並びの前記酵素をコードする核酸およびフラグメントを固相支持体に固定することができる。前記は、フィターゼを工業的プロセスで使用するときしばしば経済的で効率的である。例えば、フィターゼ酵素（またはその活性なフラグメント）のコンソーティウムまたはカクテル（前記は特定の化学反応で用いられる）を固相支持体に固定し、処理容器に浸すことができる。酵素反応を発生させ、続いて、繰り返し使用するために前記固相支持体を前記支持体に固定した酵素とともに容器から取り出すことができる。本発明のある実施態様では、本発明の単離核酸が固相支持体に固定される。本発明の別の実施態様では、固相支持体は、ゲル、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極および前記の任意の組合せの群から選択される。
例えば、本発明で有用な固相支持体にはゲルが含まれる。ゲルのいくつかの例には、セファロース、ゼラチン、グルタルアルデヒド、キトサン処理グルタルアルデヒド、アルブミン-グルタルアルデヒド、キトサン-キサンタン、トーヨーパールゲル（ポリマーゲル）、アルギネート、アルギネート-ポリリジン、カラジーナン、アガロース、グリオキシルアガロース、磁性アガロース、デキストラン-アガロース、ポリ(カルバモイル)スルホネートヒドロゲル、BSA-PEGヒドロゲル、リン酸化ポリビニルアルコール（PVA）、モノアミノエチル-N-アミノエチル（MANA）、アミノまたは前記の任意の組合せが含まれる。
本発明で有用なまた別の固相支持体は樹脂またはポリマーである。樹脂またはポリマーのいくつかの例には、セルロース、アクリルアミド、ナイロン、レーヨン、ポリエステル、陰イオン交換樹脂、AMBERLITETMXAD-7、AMBERLITETMXAD-8、AMBERLITETMIRA-94、AMBERLITETMIRC-50、ポリビニル、ポリアクリリック、ポリメタクリレートまたは前記の任意の組合せが含まれる。本発明で有用なまた別のタイプの固相支持体はセラミックである。いくつかの例には無孔性セラミック、有孔性セラミック、SiO2、Al2O3が含まれる。本発明で有用なまた別のタイプの固相支持体はガラスである。いくつかの例には、無孔性ガラス、有孔性ガラス、アミノプロピルガラスまたは前記の任意の組合せが含まれる。用いることができるまた別のタイプの固相支持体は微小電極である。一例はポリエチレンイミン被覆マグネタイトである。石墨粒子を固相支持体として用いてもよい。固相支持体の別の例は細胞、例えば赤血球である。
【０１３２】
固定化の方法：酵素もしくはそのフラグメントまたは核酸を固相支持体に固定するために当業者に公知の多くの方法が存在しよう。そのような方法のいくつかの例には、例えば静電的小滴発生、電気化学的手段、粘着、共有結合、架橋、化学反応または処理、エントラップメント、アルギン酸カルシウムによるもの、またはポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)によるものが含まれる。類似の方法が以下に記載されている：Methods in Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells, Part C. (1987) Academic Press, S.P. Colowick & N.O. Kaplan (Ed.), Vol 136；およびImmobilization of Enzymes and Cells. (1997) Humana Press, G.F. Bickerstaff (Ed.), Series:Methods in Biotechnology, J.M. Walker (Ed.)。
【０１３３】
キャピラリーアレイ：キャピラリーアレイ、例えばGIGAMATRIXTM（Diversa Corporation, San Diego, CA）を本発明の方法で用いることができる。本発明の核酸またはポリペプチドを、アレイ（キャピラリーアレイを含む）に固定または塗布することができる。アレイを用いて、組成物ライブラリー（例えば小分子、抗体、核酸など）を、本発明の核酸もしくはポリペプチドと結合する能力または前記の活性を調節する能力についてスクリーニングまたはモニターすることができる。キャピラリーアレイは、サンプルを保持およびスクリーニングするためのまた別の系を提供する。例えば、サンプルスクリーニング装置は、隣接するキャピラリーのアレイ中に形成された複数のキャピラリーを含むことができ、ここで各キャピラリーはサンプル保持のために管腔を仕切る少なくとも1つの壁を構成する。さらに装置は、アレイ中の隣接するキャピラリー間に沈積された間隙物質、および、前記間隙物質内に形成された1つ以上の参照印を含むことができる。サンプルをスクリーニングするためのキャピラリー（ここで前記キャピラリーはキャピラリーのアレイとして一緒に束ねることができるように適合させてある）は、サンプルを保持するための管腔を規定する第一の壁、およびろ材で形成された第二の壁を含むことができ、ろ過のために、励起エネルギーが管腔に提供されサンプルを励起する。
ポリペプチドまたは核酸（例えばリガンド）を、キャピラリーアレイの1つのキャピラリーの少なくとも一部分の第一の成分に導入することができる。キャピラリーアレイの各キャピラリーは、第一の成分を保持するために管腔を仕切る少なくとも1つの壁を含むことができる。第一の成分の後部のキャピラリーに気泡を導入することができる。第二の成分をキャピラリーに導入することができ、ここで前記第二の成分は前記気泡によって第一の成分と分離される。問題のサンプルを、検出可能な粒子で標識した第一の液体としてキャピラリーアレイの1つのキャピラリーに導入することができる。ここで、キャピラリーアレイの各キャピラリーは第一の液体および検出可能な粒子を保持するために管腔を規定する少なくとも1つの壁を含み、さらに、前記少なくとも1つの壁は、前記検出可能な粒子を前記少なくとも1つの壁に結合させるための結合物質で被覆されている。前記方法はさらに第一の液体をキャピラリー管から取り除く工程（ここで結合した検出可能粒子はキャピラリーの内部で維持される）、および第二の液体を前記キャピラリー管に導入する工程を含むことができる。
前記キャピラリーアレイは、管腔を規定する少なくとも1つの壁を含む、複数の個々のキャピラリーを含むことができる。キャピラリーの外側壁は一緒に融合させた1つ以上の壁であってもよい。同様に、壁は円筒形、四角形、六角形の管腔、または、壁が液体もしくはサンプル保持のために管腔を形成する限り他のいずれの幾何学的形状でもよい管腔を規定する。キャピラリーアレイのキャピラリーは、平坦な構造を形成するために極めて接近させて一緒に保持することができる。キャピラリーは、溶融するか（例えばキャピラリーがガラスでできている場合）、接着剤を用いるか、縛るか、または横に並べて留め金で固定することによって一緒に束ねることができる。キャピラリーアレイは、任意の数の個々のキャピラリーで形成することができる（例えば100から4,000,000の範囲のキャピラリー）。キャピラリーアレイは、約100,000以上の個々のキャピラリーを一緒に束ねたマイクロタイタープレートを形成することができる。
【０１３４】
アレイまたは“バイオチップ”：本発明の核酸またはポリペプチドはアレイに固定または塗布することができる。アレイを用いて、組成物（例えば小分子、抗体、核酸など）ライブラリーを、本発明の核酸またはポリペプチドと結合するその能力または前記の活性を調節するその能力についてスクリーニングまたはモニターすることができる。例えば本発明のある特徴では、モニターされるパラメーターはフィターゼ遺伝子の転写物の発現である。細胞の1つ以上または全ての転写物は、細胞の転写物を含むサンプルのハイブリダイゼーションによって、または細胞の転写物を代表するかもしくは前記と相補的な核酸はアレイまたは“バイオチップ”上に固定化された核酸とのハイブリダイゼーションによって測定することができる。マイクロチップ上の核酸“アレイ”を用いることによって、細胞の転写物のいくつかまたは全てを同時に定量することができる。あるいは、ゲノム核酸を含むアレイはまた、本発明の方法によって作出された新規に操作された株の遺伝子型の決定に用いることができる。“ポリペプチドアレイ”はまた、複数のタンパク質の同時定量に用いることができる。
また別の特徴では、本発明の“アレイ”または“マイクロアレイ”または“バイオチップ”または“チップ”は、本発明の核酸および／またはポリペプチドまたはペプチドの他に複数の標的エレメントを含み、各標的エレメントは所定の量の1つ以上のポリペプチド（抗体を含む）または核酸（前記は基材表面の所定の領域に固定化されている）を、以下にさらに詳細に考察されているように含むことができる。
本発明は、“マイクロアレイ”または“核酸アレイ”または“ポリペプチドアレイ”または“抗体アレイ”または“バイオチップ”またはその変種とも称される、公知の任意の“アレイ”を用いて実施することができる。アレイは一般的に複数の“スポット”または“標的エレメント”であり、各標的エレメントは所定量の1つ以上の生物学的分子（例えばオリゴヌクレオチド）を含み、前記はサンプル分子（例えばmRNA）との特異的な結合のために基材表面の所定の領域に固定化される。
本発明の方法の実施に際して、任意の公知のアレイおよび／またはアレイの製造および使用方法を全体的もしくは部分的にまたはその変型を取り入れることができる。それらは例えば以下に記載されているようなものである：米国特許第6,277,628号；第6,277,489号；第6,261,776号；第6,258,606号；第6,054,270号；第6.048,695号；第6,045,996号；第6,022,963号；第6,013,440号；第5,965,452号；第5,959,098号；第5,856,174号；第5,830,645号；第5,770,456号；第5,632,957号；第5,556,752号；第5,143,854号；第5,807,522号；第5,800,992号；第5,744,305号；第5,700,637号；第5,556,752号；第5,434,049号。さらにまた例えば以下を参照されたい：WO99/5173；WO99/09217；WO97/46313；WO96/17958。さらにまた例えば以下を参照されたい：Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174；Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092；Kern (1997) Biotechniques 23:120-124；Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes＆ Cancer 20:399-407；Bowtell (1999) Nature Genetis Supp. 21:25-32。さらにまた以下を参照されたい：米国特許出願公開広報第20010018642号；同第20010019827号；同第20010016322号；同第20010014449号；同第20010014448号；同第20010012537号；同第20010008765号。
【０１３５】
ポリペプチドおよびペプチド
本発明は、配列番号:2に対し少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有し、さらに上記に記載した、配列番号:1に対する特定のヌクレオチド塩基対配列改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するか、または上記に記載した、配列番号:2にする特定のアミノ酸残基改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含むアミノ酸配列を有する、単離、合成または組換えポリペプチドを提供する。参照として、合成により生成された“親”配列番号：2は以下のとおりである：
Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr 
1               5                   10                  15      
Pro Gln Ser Ala Phe Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser 
20                  25                  30          
Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr 
35                  40                  45              
Gln Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val 
50                  55                  60                  
Lys Leu Gly Glu Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu 
65                  70                  75                  80  
Gly His Tyr Trp Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys 
85                  90                  95      
Cys Gly Cys Pro Gln Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp 
100                 105                 110         
Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro 
115                 120                 125             
Asp Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp 
130                 135                 140                 
Pro Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala 
145                 150                 155                 160 
Asn Val Thr Asp Ala Ile Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp 
165                 170                 175     
Phe Thr Gly His Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu 
180                 185                 190         
Asn Phe Pro Gln Ser Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu 
195                 200                 205             
Ser Cys Ser Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala 
210                 215                 220                 
Asp Cys Val Ser Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr 
225                 230                 235                 240 
Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp 
245                 250                 255     
Gly Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His 
260                 265                 270         
Asn Ala Gln Phe Asp Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser 
275                 280                 285             
Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His 
290                 295                 300                 
Pro Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu 
305                 310                 315                 320 
Phe Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu 
325                 330                 335     
Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly 
340                 345                 350         
Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln 
355                 360                 365             
Trp Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp 
370                 375                 380                 
Lys Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr 
385                 390                 395                 400 
Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala 
405                 410                 415     
Gly Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu 
420                 425                 430         
【０１３６】
遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）により生じた配列改変を示す、遺伝子再アッセンブリ(商標)ライブラリー構築物のために選択された親フィターゼ配列番号:2の配列（例えば配列番号:１によってコードされる）は図8に示されている。
ある特徴では、本発明のポリペプチドおよびペプチドはフィターゼ活性を有する。また別の特徴では、それらはまた、例えば、標識プローブ、抗原、耐性誘発源、モチーフ、フィターゼ活性部位として有用でありえる。
また別の特徴では、本発明のポリペプチドおよびペプチドは合成または組換え生成ポリペプチドである。ペプチドおよびタンパク質は、in vitroまたはin vivoで組換えにより発現させることができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、当分野で公知の方法を用いて生成および単離することができる。本発明のポリペプチドおよびペプチドはまた、当分野で周知の化学的方法を用いて全体または部分として合成することができる。例えば以下を参照されたい：Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223；Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232；A.K. Banga, Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA。例えばペプチド合成は種々の固相技術を用いて実施でき（例えば以下を参照されたい：Roberge (1995) Science 269:202；Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13）、さらにABI431Aペプチド合成装置（Perkin Elmer）を製造業者によって提供される指示にしたがって用いて、自動合成を実施することができる。
本発明の酵素およびポリヌクレオチドは、単離形として提供するか、または均質になるまで精製することができる。本発明のフィターゼポリペプチドはいくつかの標準的な任意の方法を用いて入手することができる。例えば、フィターゼポリペプチドは、標準的な組換え発現系で生成するか（本明細書に記載のとおり）、化学的に合成するか（ただし小さなフィターゼペプチドフラグメントにある程度制限される）、またはそれらを天然に発現する生物から精製することができる。有用な組換え発現方法は哺乳動物宿主、微生物宿主および植物宿主を含む。
【０１３７】
また別の特徴では、本発明のポリペプチドおよびペプチドは、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列、あるいはそれらのいずれかのフラグメント、部分またはサブユニットであり、さらに天然に存在するかまたは合成の分子である“アミノ酸”または“アミノ酸配列”を含む。
また別の特徴では、本発明の“組換え”ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えDNA技術によって作製された、例えば所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外因性DNA構築物によって形質転換された細胞から生成されるポリペプチドまたはタンパク質を含む（意味する）。本発明の“合成”核酸（オリゴヌクレオチドを含む）、ポリペプチドまたはタンパク質には化学合成によって製造（本明細書で詳細に説明する）されたものが含まれる。また別の特徴では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、ペプチド結合または改変ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸を含み（すなわちペプチド同配体）、さらに20遺伝子によってコードされるアミノ酸以外の他の改変アミノ酸を含むことができる。前記ポリペプチドは、天然のプロセス（例えば翻訳後プロセッシング）によってまたは当分野で周知の化学的改変技術によって改変することができる。改変は前記ポリペプチドの任意の箇所（ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含む）で発生しえる。同じタイプの改変が、あるポリペプチドのいくつかの部位において同じ程度でまたは種々の程度で存在しえることは理解されよう。さらにまた、あるポリペプチドは、多くのタイプの改変、例えばアセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合による付加、ヘム成分の共有結合による付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合による付加、脂質または脂質誘導体の共有結合による付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合による付加、架橋環形成、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストリエーション、酸化、PEG化、タンパク分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、およびタンパク質へのトランスファーRNA仲介アミノ酸付加、例えばアルギニル化を有することができる。
【０１３８】
また別の特徴では、“合成”ポリペプチドまたはタンパク質は化学合成によって製造されたものである。固相ペプチド化学合成法もまた本発明のポリペプチドまたはフラグメントの合成に用いることができる。前記の方法は1960年代初頭より当分野で公知であり（R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963；さらにまた以下を参照されたい：J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Snthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp.11-12）、さらに最近は市販の実験室ペプチド設計および合成キット（Canbridge Research Biochemicals）として用いられている。そのような市販の実験室キットは一般的にはH.M. Geysenら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998 (1984)）の教示を利用し、多数の“ロッド”または“ピン”（これらは全て一枚のプレートにつながっている）の先端でペプチドを合成させる。前記のような系を利用するときは、ロッドまたはピンのプレートはさかさまにされ、対応するウェルまたはレザーバーの第二のプレートに挿入される。前記ウェルまたはレザーバーは適切なアミノ酸をピンまたはロッドの先端に結合または固着させるために溶液を含んでいる。そのような工程（すなわちロッドまたはピンの先端をさかさまにして適切な溶液に挿入する工程）を繰り返すことによって、アミノ酸は所望のペプチドに構築される。さらにまた、多数のFMOCペプチド合成系が利用可能である。例えば、ポリペプチドまたはフラグメントのアッセンブリはアプライドバイオシステムズ社のモデル431A自動ペプチド合成装置を用いて固相上で実施できる。前記のような装置は、直接合成または一連のフラグメント（前記フラグメントは他の公知の技術を用いて結合させることができる）の合成によって本発明のペプチドの容易な入手を提供する。
また別の特徴では、本発明のペプチドおよびポリペプチドはグリコシル化される。グリコシル化は翻訳後に化学的にまたは細胞の生合成メカニズムによって実施することができ、この場合、後者は既知のグリコシル化モチーフの使用を含み、当該モチーフは当該配列に本来備わっているか、または、ペプチドとして付加するかもしくは核酸コード配列に付加することができる。グリコシル化は、O-結合でもまたはN-結合でもまたは前記の組合せでもよい。
【０１３９】
また別の特徴では、上記に定義した本発明のペプチドおよびポリペプチドは、部分的にまたは完全に“模倣体”形および“ペプチド模倣体”形を含む。ある特徴では、“模倣体”および“ペプチド模倣体”という用語は、実質的に本発明のポリペプチドと同じ構造および／または機能的特徴を有する合成化学物質を指す。前記模倣体は完全に合成された非天然アミノ酸類似体で構成されているか、または部分的に天然のペプチドアミノ酸および部分的に非天然のアミノ酸類似体のキメラ分子である。前記模倣体はまた任意の量の天然アミノ酸の保存的置換を含むことができるが、ただしそのような置換が前記模倣体の構造および／または活性を実質的に変化させない場合に限られる。保存的変種である本発明のポリペプチドに関しては、日常的な実験によって模倣体が本発明の範囲内に包含されるものであるか否か、すなわちその構造および／または機能が実質的に改変されていないかどうかが決定されるであろう。したがって、ある特徴では、模倣体組成物がフィターゼ活性をもつならばそれらは本発明の範囲内に包含される。
また別の特徴では、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、上記で定義した配列番号:2に対する特定の改変、さらにまた活性（例えば酵素活性）を改変させることがあるかまたは改変させることがない保存的置換を含む配列を有する。また別の特徴では、保存的置換は、配列内のあるアミノ酸を類似の性状を有する別のアミノ酸によって置換するものである。また別の特徴では、保存的置換は以下の置換である：脂肪族アミノ酸（例えばAla、Val、LeuおよびIle）の別の脂肪族アミノ酸による置換；SerのThrによる置換またはその逆；酸性残基（例えばAspおよびGlu）の別の酸性残基による置換；アミド基をもつ残基（例えばAsnおよびGln）の別のアミド基をもつ残基による置換；塩基性残基（例えばLysおよびArg）の別の塩基性残基による交換；および芳香族残基（例えばPhe、Tyr）の別の芳香族残基による置換。
【０１４０】
本発明のポリペプチド模倣体組成物は任意の組合せの非天然構造成分を含むことができる。また別の特徴では、本発明の模倣体組成物は以下の3つの構造基の1つまたは全てを含む：a）天然のアミド結合（“ペプチド結合”）以外の残基結合基；b）天然に存在するアミノ酸残基の代わりに非天然残基；c）二次構造模倣を誘導する（すなわち二次構造、例えばベータターン、ガンマターン、ベータシート、アルファヘリックス構造などを誘導または安定化させる）残基。例えば本発明のポリペプチドは、その残基の全てまたはいくつかが天然のペプチド結合以外の化学的手段によって結合されるとき模倣体と特徴付けることができる。個々のペプチド模倣体残基は、ペプチド結合、他の化学的結合、またはカップリング手段、例えばグルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能基性マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）またはN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）によって結合される。通常のアミド結合（“ペプチド結合”）の代用となることができる結合基には例えば以下が含まれる：ケトメチレン（例えば-C(=O)-NH-の代わりに-C(O=)-CH2-）、アミノメチレン（CH2-NH）、エチレン、オレフィン（CH=CH）、エーテル（CH2-O）、チオエーテル（CH2-S）、テトラゾール（CN４-）、チアゾール、レトロアミド、チオアミドまたはエステル（例えば以下を参照されたい：Spatola (1983) Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol.7, pp267-357, “Peptide Backbone Modifications”, Marcell Dekker, NY）。
【０１４１】
本発明のポリペプチドはまた、天然に存在するアミノ酸残基の代わりに全てまたはいくつかの非天然の残基が含まれることによって模倣体と特徴付けられる。非天然残基は学術文献および特許文献に詳しく記載されている。天然のアミノ酸残基の模倣体として有用な例示的な非天然組成物のいくつかおよび基準は以下で述べる。芳香族アミノ酸の模倣体は、例えば以下によって置き換えることによって生成することができる：D-またはL-ナフチルアラニン；D-またはL-フェニルグリシン；D-またはL-2チエネイルアラニン；D-またはL-1、-2,3-、または4-ピレネイルアラニン；D-またはL-3チエネイルアラニン；D-またはL-(2-ピリジニル)-アラニン；D-またはL-(3-ピリジニル)-アラニン；D-またはL-(2-ピラジニル)-アラニン；D-またはL-(4-イソプロピル)-フェニルグリシン；D-(トリフルオロメチル)-フェニルグリシン；D-(トリフルオロメチル)-フェニルアラニン；D-p-フルオロ-フェニルアラニン；D-またはL-p-ビフェニルフェニルアラニン；D-またはL-p-メトキシ-ビフェニルフェニルアラニン；D-またはL-2-インドール(アルキル)アラニン；およびD-またはL-アルキルアラニン（前記アルキルはメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、iso-ブチル、sec-イソチル、iso-ペンチルまたは非酸性アミノ酸で置換されていても置換されてなくてもよい）。非天然アミノ酸の芳香環には、例えばチアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリルおよびピリジル芳香環が含まれる。
酸性アミノ酸の模倣体は、例えば陰性荷電を維持している非カルボキシレートアミノ酸、(ホスホノ)アラニン、硫酸スレオニンによって置換することにより生成できる。カルボキシル側鎖基（例えばアスパルチルまたはグルタミル）はまた、カルボジイミド（R'-N-C-N-R'）、例えば1-シクロヘキシル-3(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3(4-アゾニア-4,4-ジメソールペンチル)カルボジイミドとの反応によって選択的に改変することができる。アスパルチルまたはグルタミルもまた、アンモニウムイオンとの反応によってアスパルギニルおよびグルタミニル残基に変換することができる。塩基性アミノ酸の模倣体は、例えば（リジンおよびアルギニンの他に）アミノ酸オルニチン、シトルリン又は（グアニジノ）-酢酸または(グアニジノ)アルキル-酢酸（アルキルは上記で定義されたとおり）による置換によって生成することができる。ニトリル誘導体（例えばCOOHの代わりにCN-部分を含む）でアスパラギンまたはグルタミンを置換することができる。アスパラギニルおよびグルタミニル残基は、対応するアスパルチルまたはグルタミニル残基に脱アミノ化することができる。アルギニン残基模倣体は、アルギニルを例えば1つ以上の通常の試薬（例えばフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロ-ヘキサンジオンまたはニンヒドリンを含む）と反応させることによって生成することができる（これらの試薬についてはアルカリ性条件を用いることが好ましいかもしれない）。チロシン残基模倣体はチロシルを例えば芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させることによって生成することができる。N-アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用いてO-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体をそれぞれ形成することができる。システイン残基模倣体は、システイニル残基を例えばアルファ-ハロアセテート（例えば2-クロロ酢酸またはクロロアセトアミド）および対応するアミンと反応させてカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生成することによって達成できる。システイン残基模倣体もまた、システイニル残基を例えばブロモ-トリフルオロアセトン、アルファ-ブロモ-ベータ-(5-イミドゾイル)プロピオン酸；クロロアセチルホスフェート、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド；メチル2-ピリジルジスルフィド；p-クロロ水銀ベンゾエート；2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール；またはクロロ-7-ニトロベンゾ-オキサ-1,3-ジアゾールと反応させることによって生成することができる。リジン模倣体は、リジニルを例えばコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させることによって（さらにアミノ末端残基を変化させることによって）生成することができる。リジンおよび他のアルファ-アミノ含有残基模倣体もまた、イミドエステル、例えばメチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロハイドライド、トリニトロ-ベンゼンスルホン酸、O-メチルイソウレア、2,4-ペンタンジオンとの反応、およびグキオキシレートとのトランスアミダーゼ触媒反応によって生成することができる。メチオニンの模倣体は、例えばメチオニンスルホキシドとの反応によって生成することができる。プロリンの模倣体には、��えばピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、3-または4-ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、3-または4-メチルプロリンまたは3,3-ジメチルプロリンが含まれる。ヒスチジン残基模倣体はヒスチジルを例えばジエチルプロカーボネートまたはパラ-ブロモフェナシルブロミドと反応させることによって生成することができる。他の模倣体には、例えばプロリンおよびリジンのヒドロキシル化；セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リジン、アルギニンおよびヒスチジンのアルファ-アミノ基のメチル化；N-末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基のメチル化またはN-メチルアミノ酸による置換；またはC-末端カルボキシル基のアミド化によって生成することができるものが含まれる。
【０１４２】
本発明のポリペプチドの残基、例えばアミノ酸はまた反対のキラリティーをもつアミノ酸（またはペプチド模倣体残基）によって置換することができる。したがって、L型構造で天然に存在するいずれのアミノ酸（前記化学物質の構造に応じてRまたはSとも呼ぶことができる）も、同じ化学構造型であるが反対のキラリティーのアミノ酸またはペプチド模倣体（D-アミノ酸と称されるが、またR-またはS-型とも称される）で置換することができる。
本発明はまた本発明のポリペプチドを、天然の過程（例えば翻訳後プロセッシング、例えばリン酸化、アセチル化など）または化学的改変技術のどちらかによって改変する方法、および生成された改変ポリペプチドを提供する。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチド内のいずれの場所でも生じることができる。あるポリペプチドで同じタイプの改変が同じ程度または種々の程度でいくつかの部位で存在することができることは理解されよう。さらにまた与えられたポリペプチドが多くのタイプの改変を含むこともできる。改変には以下が含まれる：アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合による付加、ヘム成分の共有結合による付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合による付加、脂質または脂質誘導体の共有結合による付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合による付加、架橋環形成、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストリエーション、酸化、PEG化、タンパク分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、およびタンパク質へのトランスファーRNA仲介アミノ酸付加、例えばアルギニル化。例えば以下を参照されたい：T.E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C.  Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)。
【０１４３】
固相ペプチド化学合成法もまた本発明のポリペプチドまたはフラグメントの合成に用いることができる。前記の方法は1960年代初頭より当分野で公知であり（R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963；さらにまた以下を参照されたい：J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Snthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp.11-12）、さらに最近は市販の実験室ペプチド設計および合成キット（Canbridge Research Biochemicals）として用いられている。そのような市販の実験室キットは一般的にはH.M. Geysenら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998 (1984)）の教示を利用し、多数の“ロッド”または“ピン”（これらは全て一枚のプレートにつながっている）の先端でペプチドを合成させる。前記のような系を利用するときは、ロッドまたはピンのプレートはさかさまにされ、対応するウェルまたはレザーバーの第二のプレートに挿入される。前記ウェルまたはレザーバーは適切なアミノ酸をピンまたはロッドの先端に結合または固着させるために溶液を含んでいる。そのような工程（すなわちロッドまたはピンの先端をさかさまにして適切な溶液に挿入する工程）を繰り返すことによって、アミノ酸は所望のペプチドに構築される。さらにまた、多数のFMOCペプチド合成系が利用可能である。例えば、ポリペプチドまたはフラグメントのアッセンブリはアプライドバイオシステムズ社のモデル431ATM自動ペプチド合成装置を用いて固相上で実施できる。前記のような装置は、直接合成または一連のフラグメント（前記フラグメントは他の公知の技術を用いて結合させることができる）の合成によって本発明のペプチドの容易な入手を提供する。
【０１４４】
ある特徴では、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、上記に定義した、配列番号:2に対する特定の改変および“実質的に同一”のアミノ酸配列を含む配列を有する。すなわち、前記配列は、1つ以上の保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または挿入により相違し、特にそのような置換は分子の活性部位でない部位で生じるときに発生し、さらに当該ポリペプチドが本質的にその機能的特性を保持することを条件とする。ある特徴では、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、上記に定義した、配列番号:2に対する特定の改変および保存的アミノ酸置換を含む配列を有する（前記置換は、1つのアミノ酸を同じクラスの別のものと置換するもの、例えば1つの疎水性アミノ酸（例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）の別のものとの置換、または1つの極性アミノ酸の別のものとの置換、例えばアルギニンのリジンとの置換、グルタミン酸とアスパラギン酸との置換、またはグルタミンとアスパラギンとの置換である）。ある特徴では、1つ以上のアミノ酸を、例えば本発明のフィターゼポリペプチドから欠失させて、その生物学的活性を顕著に変更することなく当該ポリペプチドの構造を改変するか、あるいはその生物学的活性を意図的に顕著に変化させることができる。例えば、フィターゼの生物学的活性に必要な（あるいは必要でない）アミノまたはカルボキシル末端のアミノ酸を除去および／または付加することができる。本発明の改変ポリペプチド配列を任意の数の方法によってフィターゼの生物学的活性についてアッセイすることができる。前記方法は、改変ポリペプチド配列をフィターゼ基質と接触させ、改変ポリペプチドがアッセイ中の特定の基質の量を減少させるか、または機能的なフィターゼポリペプチドと当該基質との酵素反応の生成物を増加させるかを決定する工程を含む。
本発明の別の特徴は、配列番号:2に対して約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれより高い配列同一性を有し、さらに上記で考察（説明）した、列挙した特定の配列改変の1つを含むポリペプチド配列を含む。
【０１４５】
本発明のこれらのアミノ酸配列変種は予め定めた変化の性質を特徴とすることができる。前記変化の性質は、天然に存在する型からそれらを区別する特徴、例えばフィターゼ配列の対立遺伝子変化または種間変化である。ある特徴では、本発明の変種は、天然に存在する類似体と同質の生物学的活性を示す。あるいは、本発明の変種は、改変された特徴について選択することができる。ある特徴では、アミノ酸配列変化を導入するための部位または領域は予め決定されるが、変異それ自体を予め決定する必要はない。例えば、ある部位での変異の実行を最適化するために、標的コドンまたは領域でランダム変異導入を実施し、発現したフィターゼ変種を所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングすることができる。既知の配列を有するDNAの予め定めた部位で置換変異を生じる技術は、本明細書で考察するように、例えばM13プライマー変異導入およびPCR変異導入である。変異体のスクリーニングは、例えばフィテート（ミオイノシトールヘキサホスフェート）のイノシトールおよび無機リン酸塩への触媒、またはフィテート（ミオイノシトールヘキサホスフェート）の加水分解についてのアッセイを用いて実施することができる。また別の特徴では、アミノ酸置換は単一残基であり、挿入は約1から20アミノ酸の規模であろうが、ただし顕著に大きな挿入も為しえる。欠失の範囲は約1から約20、30、40、50、60、70残基またはそれより大きくてもよい。最適な特性を有する最終的な誘導体を得るために、置換、欠失、挿入またはその任意の組合せを用いることができる。一般的には、これらの変更は数アミノ酸で実施され、分子の変化を最少に留める。しかしながら、より多きな変更もある種の状況では耐性を示すことができる。
【０１４６】
本発明のポリペプチドは生化学的濃縮または生成工程により得ることができる。潜在的に均質なポリペプチドまたはフラグメントの配列は、タンパク分解消化、ゲル電気泳動および／またはマイクロシークェンシングによって決定することができる。
本発明のまた別の特徴は本発明のポリペプチドのフラグメントまたは変種を同定するアッセイである。本発明のポリペプチドを生化学的反応の触媒に用いて、前記フラグメントまたは変種が本発明のポリペプチドの酵素活性を保持していることを示すことができる。
変種のフラグメントが本発明のポリペプチドの酵素活性を保持しているか否かを決定することを目的とする例示的アッセイは以下の工程を含む：ポリペプチドフラグメントまたは変種を、当該ポリペプチドフラグメントまたは変種が機能することができる条件下で基質分子と接触させる工程および基質レベルの低下または当該ポリペプチドと基質間の反応の特異的な反応生成物のレベルの増加を検出する工程。
本発明のポリペプチドを生化学的反応の触媒に用いることができる。本発明のある特徴にしたがえば、本発明のポリペプチドをフィターゼとして利用する方法が提供される。
本発明は、シグナル配列（シグナルペプチド（SP）またはリーダー配列とも呼ばれる）をもたない、もしくは改変シグナル配列をもつフィターゼ、または異種シグナル配列をもつフィターゼを提供する。本発明のポリペプチドはまた、プレプロドメインをもたなくてもよいが、改変プロプロドメインまたは異種プレプロドメイン、および／または触媒ドメイン（CD）をもつことができる。本発明のポリペプチドに取り込まれた改変または異種SP、プレプロドメインおよび／またはCDは、例えばキメラタンパク質の異種ドメインとして融合タンパク質の部分であってもよく、または化学的結合剤によって付加されてもよい。例えば、本発明の酵素は、ベクター（例えばpPICシリーズベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA））中に異種SPおよび／またはプレプロを含むことができる。
さらにまた、本発明のポリペプチドは更なる異種配列（他のフィターゼ、非フィターゼ源、または完全な合成配列に由来する配列）を含むことができる。したがって、ある特徴では、本発明の核酸は、内因性の改変または異種シグナル配列（SP）、プレプロドメインおよび／または触媒ドメイン（CD）および異種配列（すなわち、本発明のシグナル配列（SP）、プレプロドメインおよび／または触媒ドメイン（CD）とは天然では結合していない配列）のためのコード配列を含む。
“プレプロ”ドメイン配列およびシグナル配列を同定する方法は当分野では周知である。例えば以下を参照されたい：Van de Ven (1993) Crit Rev Oncog 4(2):115-136。例えばプレプロ配列を同定するために、細胞外間隙からタンパク質を精製し、N-末端タンパク質配列を決定し、プロセッシングを受けていない型と比較する。シグナル配列を認定する多様な方法が当業者に知られている。例えば、ある特徴では、本発明のポリペプチドとともに用いられるシグナルペプチドは、SignalPと称される方法によって特定される。SignalPは、シグナルペプチドおよびそれらの切断部位の両方を認識する合同ニューラルネットワークを用いる（例えば以下を参照されたい：Nielsen (1997) “Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites” Protein Engineering 10:1-6）。
【０１４７】
本発明は、その骨格構造、二次または三次構造（例えばアルファ-ヘリックスまたはベータ-シート構造）が改変されているフィターゼ酵素を提供する。ある特徴では、電荷または疎水性が改変されている。ある特徴では、側鎖団が改変されている。機能または免疫学的実体における実質的な変化は、保存性がより低い置換を選択することによって生じる。例えば、変更領域のポリペプチド骨格構造（例えばアルファ-ヘリックスまたはベータ-シート構造）、分子の電荷または疎水性部位（前記は活性部位でありえる）または側鎖に対しより顕著に影響を及ぼす置換を実施することができる。本発明は、本発明のポリペプチドで以下のような置換を提供する：（a）親水性残基（例えばセリルまたはスレオニル）が疎水性残基（例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）によって置換される、または疎水性残基（例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）が親水性残基（例えばセリルまたはスレオニル）によって置換される；（b）システインまたはプロリンが任意の他の残基によって置換されるまたは、任意の他の残基がシステインまたはプロリンによって置換される；（c）陽性荷電側鎖をもつ残基（例えばリシル、アルギニルまたはヒスチジル）が陰性荷電をもつ残基（例えばグルタミルまたはアスパルチル）によって置換される、または、陰性荷電をもつ残基（例えばグルタミルまたはアスパルチル）が陽性荷電側鎖をもつ残基（例えばリシル、アルギニルまたはヒスチジル）によって置換される；（d）大きな側鎖をもつ残基（例えばフェニルアラニン）が側鎖をもたない残基（例えばグリシン）によって置換される、または、側鎖をもたない残基（例えばグリシン）が大きな側鎖をもつ残基（例えばフェニルアラニン）によって置換される。変種は同質の生物学的活性（すなわちフィターゼ酵素活性）を示すことができるが、むしろ必要とされるようにフィターゼの特徴を改変するために変種を選択することができる。
ある特徴では、本発明のフィターゼは、エピトープもしくは精製タグ、シグナル配列または他の融合配列などを含む。ある特徴では、本発明のフィターゼを任意のペプチドと融合させて、融合ポリペプチドを形成することができる。本明細書では“融合”または“機能可能に連結”とは、任意のペプチドおよびフィターゼが、当該フィターゼ活性の安定性の破壊を最小限に止めることができる態様で一緒に結合されることを意味する。融合ポリペプチド（または融合ポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチド）はさらに別の成分（複数のループに存在する複数のペプチドを含む）も同様に含むことができる。
【０１４８】
ある特徴では、本発明のフィターゼはキメラポリペプチドであり、前記は、例えば異種SP、炭水化物結合モジュール、フィターゼ酵素触媒ドメイン、リンカーおよび／または非フィターゼ触媒ドメインを含む。本発明は、生物学的に活性なハイブリッドポリペプチド（例えばハイブリッドフィターゼ酵素）をコードすることができるキメラポリペプチドを作製する手段を提供する。ある特徴では、原型ポリヌクレオチドは生物学的に活性なポリペプチドをコードする。本発明の方法は、生成されるハイブリッドポリヌクレオチドが生物学的に活性な原型ポリペプチドに由来する活性を表すポリペプチドをコードできるように原型ポリヌクレオチドの配列を組み込む細胞性過程を利用することによって新規なハイブリッドポリペプチドを作製する。例えば、原型ポリヌクレオチドは異なる細菌に由来する特定の酵素をコードすることができる。1つの生物または変種に由来する第一のポリヌクレオチドによってコードされる酵素は、例えば特定の環境条件下（例えば高塩濃度）で効率的に機能することが可能である。異なる生物または変種に由来する第二のポリヌクレオチドによってコードされる酵素は、異なる環境条件下（例えば超高温）で効率的に機能することができる。第一および第二の原型ポリヌクレオチドに由来する配列を含むハイブリッドポリヌクレオチドは、原型ポリヌクレオチドによってコードされる両方の酵素の特徴を示す酵素をコードすることができる。したがって、ハイブリッドポリヌクレオチドによってコードされる酵素は、第一および第二のポリヌクレオチドによってコードされる酵素の各々が共有する環境条件下（例えば高塩濃度および超高温）で効率的に機能することができる。
したがって、本発明の方法から得られるハイブリッドポリペプチドは、原型酵素では示されない特殊化された酵素活性を示すことができる。例えば、フィターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドの組換え及び／又は還元的再組合せに続いて、ハイブリッドポリヌクレオチドによってコードされる生成ハイブリッドポリペプチドを、特殊化された酵素活性、例えばヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、ホスホリラーゼなど、原型酵素の各々から得られる活性についてスクリーニングすることができる。したがって、例えばハイブリッドポリペプチドをスクリーニングして、原型の親ポリペプチドからハイブリッドポリペプチドを区別するそれら化学的機能性、例えばハイブリッドポリペプチドが機能する温度、pHまたは塩濃度を確認することができる。
本発明の方法から得られるハイブリッドポリペプチドは、原型酵素では示されない特殊化された酵素活性を示すことができる。例えば、ヒドロラーゼ活性をコードするポリヌクレオチドの組換え及び／又は還元的再組合せに続いて、ハイブリッドポリヌクレオチドによってコードされる生成ハイブリッドポリペプチドを、原型酵素の各々から得られる特殊化されたヒドロラーゼ活性（すなわちヒドロラーゼが作用する結合のタイプおよびヒドロラーゼが機能する温度）についてスクリーニングすることができる。したがって、例えばフィターゼをスクリーニングして、原型フィターゼからハイブリッドフィターゼを区別するそれら化学的機能性（例えば（a）アミド（ペプチド結合）、すなわちプロテアーゼ；（b）エステル結合、すなわちエステラーゼおよびリパーゼ；（c）アセタール、すなわちグリコシダーゼ）および例えば、ハイブリッドポリペプチドが機能する温度、pHまたは塩濃度を確認することができる。
【０１４９】
ある特徴では、本発明は、以下の工程によって生物学的に活性なハイブリッドポリペプチドを生成し、さらにそのようなポリペプチドを強化された活性についてスクリーニングする方法に関する：
（1）機能可能な結合下にある少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび機能可能な結合下にある第二のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に導入する工程であって、前記少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび前記第二のポリヌクレオチドは部分的な配列相同性を有する少なくとも1つの領域を共有する前記工程；
（2）機能可能な連結下にあるハイブリッドポリヌクレオチドを生じる配列認識を促進する条件下で前記宿主細胞を増殖させる工程；
（3）前記ハイブリッドポリヌクレオチドによってコードされるハイブリッドポリペプチドを発現させる工程；
（4）強化された生物学的活性の識別を容易にする条件下で前記ハイブリッドポリペプチドをスクリーニングする工程；および
（5）前記ハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する工程。
多様な酵素活性についてスクリーニングする方法は当業者に公知であり、本明細書を通して考察される。そのような方法は、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを単離するときに用いることができる。
ある特徴では、本発明は、フィターゼ活性を有する安定化させた水性液状処方物を製造する方法（およびその生成物）を提供する。前記処方物は、当該酵素活性の熱による不活化に対する耐性の強化を示し、さらに長期の保存期間中にそれらのフィターゼ活性を保持する。本液状処方物は、尿素および／またはポリオール（例えばソルビトールおよびグリセロール）を安定化剤として添加することによって安定化される。さらにまた、そのような安定化させた水性液状処方物の使用によって得られる単胃動物用飼料調製物およびその製造方法が提供される。このアプローチに関する更なる詳細は公表されている文献に記載されてあり、および／または当業者にも公知である。特に非限定的な具体例では、そのような公表されている文献には、EP0626010（WO9316175A1）（Barendse et al.）が含まれるが、ただし前記公表文献の教示には本出願の新規な分子についての言及はない。
【０１５０】
抗体および抗体使用スクリーニング方法
本発明は、本発明のフィターゼと特異的に結合する単離、合成、または組換え抗体を提供する。これらの抗体を用いて、本発明のフィターゼまたは関連するポリペプチドを単離、同定または定量することができる。これらの抗体を用いて、本発明の酵素の活性を阻害することができる。これらの抗体を用いて、本発明のポリペプチドと関連するポリペプチド、例えば関連するフィターゼ酵素を単離することができる。
本発明の抗体は、1つの免疫グロブリン遺伝子もしくは複数の免疫グロブリン遺伝子または前記のフラグメントに由来するか、それらに倣って生成されるか、または実質的にそれらによってコードされる、抗原またはエピトープと特異的に結合することができる、ペプチドまたはポリペプチドを含むことができる（例えば以下を参照されたい： Fundamental Immunology, 3rd Ed., W.E. Paul, ed. Raven Press, N.Y. 1983；Wilson (1994) J Immunol Methods 175:267-273；Yarmush (1992) J Biochem Biophys Methods 25:85-97）。抗体という用語は、抗原と結合する能力を保持する抗原結合部分、すなわち“抗原結合部位”（例えばフラグメント、部分配列、相補性決定領域（CDR））を含み、（i）Fabフラグメント（VL、VH、CLおよびCH1ドメインから成る一価のフラグメント）；（ii）F(ab')2フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント）；（iii）VHおよびCH1ドメインから成るFdフラグメント；（iv）抗体の単腕のVLおよびVHドメインから成るFvフラグメント；（v）dAbフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）（VHドメインから成る）；および（vi）単離された相補性決定領域（CDR）が含まれる。単鎖抗体もまた関連する場合には“抗体”という用語に含まれる。
抗体は、免疫沈降、染色（例えばFACS）、イムノアフィニティカラムなどに用いることができる。所望の場合には、特定の抗原をコードする核酸配列は、免疫とそれに続くポリペプチドまたは核酸の単離、増幅またはクローニングおよび本発明のアレイへのポリペプチドの固定によって生成できる。あるいは、本発明の方法を用いて、改変されるべき細胞によって生成される抗体の構造を改変することができる。例えば、抗体の親和性を高めまたは低下させることができる。さらにまた、抗体を生成または改変する能力は、本発明の方法によって細胞を操作して得られた表現型でありえる。
【０１５１】
免疫、抗体（ポリクローナルおよびモノクローナル）の生成および単離のための方法は当業者には公知であり、学術文献および特許文献に記載されている。例えば以下を参照されたい：Coligan, Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY (1991)；Stites (eds.) Basic and Clinical Immunology (7th ed.) Lang Medical Publications, Los Altos, CA (“Stites”)；Goding, Monoclonal Antibodies: Priciples and Practice (2nd ed.) Academic Press, New York, NY (1986)；Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York。抗体はまた、動物を用いる従来のin vivo方法以外でも、in vitroで例えば組換え抗体結合部位発現ファージディスプレーライブラリーを用いて作製することができる。例えば以下を参照されたい：Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70；Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45。
また本発明のポリペプチドを用いて、前記ポリペプチドと特異的に結合する抗体を作製することができる。得られた抗体をイムノアフィニティークロマトグラフィー方法で用いて、前記ポリペプチドを単離または精製するか、または前記ポリペプチドが生物学的サンプルに存在するか否かを決定することができる。そのような方法では、本発明のポリペプチドの1つと特異的に結合することができる抗体と、タンパク質調製物（例えば抽出物）または生物学的サンプルを接触させる。
イムノアフィニティーの方法では、前記抗体を固相（例えばビーズまたは他のカラムマトリックス）に付着させる。抗体が本発明のポリペプチドの1つと特異的に結合する条件下で、前記タンパク質調製物を前記抗体と接触させる。洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去した後、特異的に結合したポリペプチドを溶出させる。
【０１５２】
生物学的サンプル中のタンパク質の前記抗体との結合能力は、当業者に周知の多様な方法を用いて決定できる。例えば、結合は抗体を検出可能な標識（例えば蛍光物質、酵素標識または放射性同位元素）で標識することによって決定できる。あるいは、抗体とサンプルとの結合は、前記のような検出可能な標識をその上に保持する二次抗体を用いて検出してもよい。具体的なアッセイにはELISAアッセイ、サンドイッチアッセイ、放射能免疫アッセイおよびウェスタンブロットが含まれる。
本発明のポリペプチドに対して作製されるポリクローナル抗体は、動物に前記ポリペプチドを直接注射することによって、または動物（例えば非ヒト動物）に前記ポリペプチドを投与することによって得ることができる。そのようにして得られた抗体は前記ポリペプチド自体と結合するであろう。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも完全な天然のポリペプチドと結合することができる抗体の作製に用いることができる。続いて前記のような抗体を用いて、前記ポリペプチドを発現している細胞から前記ポリペプチドを単離することができる。
モノクローナル抗体の調製の場合、継続的な細胞株培養によって生成される抗体を提供するいずれの技術も用いることができる。その例にはハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術およびEBV-ハイブリドーマ技術（例えば以下を参照されたい：Cole (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）が含まれる。
単鎖抗体の生成のために記載された技術（例えば米国特許第4,946,778号を参照されたい）を利用して、本発明のポリペプチドに対する単鎖抗体を生成することができる。あるいは、トランスジェニックマウスを用いて、これらポリペプチドまたはそのフラグメントに対するヒト化抗体を発現させることができる。
本発明のポリペプチドに対して作製された抗体を他の生物およびサンプルに由来する類似のポリペプチドのスクリーニングに用いることができる。そのような技術では、前記生物由来のポリペプチドを抗体と接触させ、前記抗体と特異的に結合するポリペプチドが検出される。上記に記載したいずれの方法も抗体結合の検出に用いることができる。
【０１５３】
キット
本発明は、前記組成物、例えば本発明の核酸、発現カセット、ベクター、細胞、ポリペプチド（例えばフィターゼ）及び／又は抗体を含むキットを提供する。本キットはまた、本明細書に記載した本発明の方法論および工業的使用を教示する指示資料を含むことができる。
本発明のポリペプチドはまた、本発明の酵素ポリペプチドまたはフラグメントと特異的に結合する抗体の作製に用いることができる。得られた抗体をイムノアフィニティクロマトグラフィー方法で用いて、前記ポリペプチドを単離もしくは精製するか、または前記ポリペプチドが生物学的サンプルに存在するか否かを決定することができる。前記のような方法では、タンパク質調製物（例えば抽出物）または生物学的サンプルを、配列番号:2のポリペプチドの1つ、前記と実質的に同一の配列、または前述の配列のフラグメントと特異的に結合することができる抗体と接触させる。
イムノアフィニティクロマトグラフィー方法では、抗体を固相（例えばビーズまたは他のカラムマトリックス）に結合させる。抗体が配列番号:2のポリペプチドの1つ、前記と実質的に同一の配列、または前記のフラグメントと特異的に結合することができる条件下で、タンパク質調製物を前記抗体と接触させる。洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去した後、特異的に結合したポリペプチドを溶出させる。
単離したポリヌクレオチド配列、ポリペプチド配列、その変種および変異体を、本発明の酵素に特徴的な生物学的活性の保持に関して、例えばフィターゼ酵素活性を検出するアッセイで測定することができる（Food Chemicals Codex, 4th Ed.）。そのような酵素にはフィターゼの切端形および変種（例えば配列番号:2に示すポリペプチド配列の欠失および挿入変種）が含まれる。これらのフィターゼは耐熱性を有する。すなわち、このフィターゼは、70℃で30分処理後に約90%、および75℃で30分の処理後に約50%の残存比活性を有する。本発明のフィターゼの耐熱性は飼料添加物としてこの酵素を用いるときに有利である。なぜならば、前記飼料を高温で成形、顆粒化またはペレット化することができるからである。
【０１５４】
例えばある特徴では、本発明は、ペレット化食用酵素デリバリーマトリックス、および例えば栄養性サプリメントとして動物にフィターゼをデリバーするために前記を使用する方法を提供する。前記酵素デリバリーマトリックスは、フィターゼ酵素（例えば配列番号:2のアミノ酸配列または前記の少なくとも30の連続するアミノ酸を有するもの）を、水性媒体（例えば動物の消化液）で容易に放出する。本発明の酵素デリバリーマトリックスは、脱油穀物胚芽、干草、アルファルファ、チモシー、ダイズ皮、ひき割りヒマワリ、コムギ全粒粉などの成分から選択される、顆粒状食用担体から調製される（前記担体はその中に含まれる組換え酵素を水性媒体中に容易に分散させる）。使用に際しては、ペレット化した食用酵素デリバリーマトリックスを動物に投与して動物へのフィターゼのデリバリーを可能にする。適切な穀物系基材は、任意の適切な食用穀物（例えばコムギ、トウモロコシ、ダイズ、ソルガム、アルファルファ、オオムギなどを含むかまたはそれらから誘導することができる。例示的な穀物系基材はトウモロコシ系素材である。前記基材は穀物の適切な任意の部分、例えば穀物胚芽（動物飼料としての使用が承認されている）、例えばトウモロコシ胚芽（湿式または乾式製粉過程で得られる）に由来しえる。穀物胚芽は脱油胚芽（spent germ）を含むことができる（前記は、例えば圧搾またはヘキサンもしくは他の溶媒抽出によって油が除去された穀物胚芽である）。あるいは、穀物胚芽はエキスペラーで抽出される（すなわち油は圧搾によって除去されている）。
本発明の酵素デリバリーマトリックスは、別々に分離した複数の粒子、ペレットまたは顆粒の形態である。“顆粒”とは、例えばペレット化、押出しまたは同様な圧縮によってマトリックスから水を除去することによって圧搾または圧縮された粒子を意味する。粒子のそのような圧搾または圧縮は当該粒子の粒子内凝集もまた促進する。例えば、顆粒は、穀物系基材をペレットミルでペレット化することによって製造することができる。そのようにして製造したペレットを、動物飼料のアジュバントとしての使用に適した顆粒サイズにすり潰すかまたは粉砕する。マトリックスそれ自体は動物飼料での使用が承認されているので、前記を動物飼料で酵素のデリバリーのための希釈剤として用いことができる。
【０１５５】
酵素デリバリーマトリックスは、約4から約400メッシュ（USS）、または約8から約80メッシュ、または約14から約20メッシュの範囲の顆粒サイズを有する顆粒形でありえる。穀物胚芽が溶媒抽出によって脱油される場合は、潤滑剤、例えばトウモロコシ油の使用がペレット化装置で必要となるかもしれないが、前記胚芽がエキスペラーで抽出される場合には潤滑剤は通常必要ではない。本発明の他の特徴では、マトリックスは、他の圧搾または圧縮プロセスによって、例えば穀物系基材をダイから押し出し、さらに押し出されたものを適切な顆粒サイズにすり潰すことによって製造される。
酵素デリバリーマトリックスはさらに凝集剤として多糖類成分を含んでよく、マトリックス顆粒の凝集性を高めることができる。凝集剤はさらに追加のヒドロキシル基を提供すると考えられる（このヒドロキシル基はマトリックス顆粒内の穀物タンパク質間の結合を強化する）。さらに、前記追加されるヒドロキシル基は、タンパク質とデンプンおよび他のタンパク質との水素結合を強化することによってもまた結合を強化すると考えられる。凝集剤は、酵素デリバリーマトリックスの顆粒の凝集性を強化するために適切な任意の量で存在することができる。適切な凝集剤は、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン、例えばトウモロコシデンプン、小麦粉、セルローシックス、ヘミセルローシックスなどの1つ以上を含む。 例えば、マトリックス中の穀物胚芽および凝集剤（酵素は含まない）のパーセンテージは、ひき割りトウモロコシ胚芽78%およびトウモロコシデンプン20重量％である。
本発明の酵素放出マトリックスは生分解性物質から製造されるので、マトリックスは分解を受けやすい（例えばカビの発生によって）。そのようなカビの発生を防止または抑制するために、マトリックスはカビ阻害剤（例えばプロピオン酸塩）を含むことができ（前記は、酵素放出マトリックスのカビ発生を抑制するために十分な任意量で存在しえる）、したがって冷蔵を必要としない安定な処方のデリバリーマトリックスが提供される。
ある特徴では、本発明の酵素デリバリーマトリックスおよび方法に含まれるフィターゼ酵素は、本明細書に記載したように耐熱性であり、したがって上昇温度および／または蒸気を利用してペレット化酵素デリバリーマトリックスを調製することがある製造時にフィターゼの不活化に耐性を示す。本発明の酵素デリバリーマトリックスを含む飼料の消化中に、水性消化液は活性酵素の放出を引き起こすであろう。他のタイプの耐熱性酵素および耐熱性の栄養性サプリメントもまたデリバリーマトリックスに混合して任意のタイプの水性条件下で放出させることができる。
【０１５６】
本発明の酵素マトリックス粒子にコーティングを、種々の多くの目的のために、例えば風味および栄養サプリメントを動物飼料に添加するために、胃の条件下で動物飼料サプリメントおよび酵素の放出を遅らせるなどの目的のために施すことができる。または、コーティングは、機能的な目的を達成するために、例えばマトリックス粒子から酵素をゆっくりと放出すること、または酵素が放出される条件を制御することを所望するときはいつでも施すことができる。コーティング材料の組成は、したがって前記材料が感受性を示す要因（例えば熱、酸もしくは塩基、酵素または他の化学物質）によって選択的に分解されえるものである。あるいは、そのような異なる崩壊要因に感受性を有する2つ以上のコーティングをマトリックス粒子に連続的に施してもよい。
本発明はまた酵素放出マトリックスの製造方法を目的とする。本発明にしたがえば、前記方法は、酵素放出マトリックスとして使用するために適した粒子サイズを有する、別々に分離した穀物系基材粒子を提供する工程を含み、ここで、前記粒子は本発明のフィターゼ酵素を含む。前記方法は、酵素放出マトリックス粒子を顆粒に圧縮または圧搾する工程を含み、前記方法はペレット化によって達成することができる。カビ阻害物質および凝集剤が使用される場合には、前記は適切な任意の時点で添加することができ、穀物系基材のペレット化の前に所望の割合で前記穀物系基材と混合してもよい。ペレットミル飼料中の水分含有量は、最終製品中の水分含有量に関して上記に示した範囲にあるか、または約14%から15%、または約10%から20%でありえる。水分を水性酵素調製物の形でフィードストックに添加し、フィードストックをこの水分含有量にすることができる。ペレットミルの温度は蒸気で約82℃にすることができる。ペレットミルは、フィードストックに十分な作業を施してペレットを提供する任意の条件下で操作することができる。ペレット化の方法それ自体は、酵素含有組成物から水を除去するための費用効率のよい方法である。
【０１５７】
ある特徴では、ペレットミルは1/8インチX 2インチ（0.32ｘ5.08cm）のダイを用い100ポンド/分（45.36kg/min)の圧力により82℃で操作されてペレットを提供する。続いてこのペレットをペレットミル粉砕装置で砕き、別々に分離した複数の粒子を提供する。前記粒子は8メッシュスクリーンを通過するが20メッシュスクリーン上で保持されえる粒子サイズを有する。
本明細書に記載する耐熱性フィターゼは高い至適温度を有することができ、さらに高い熱抵抗性または耐熱性を有することができる。したがって、本発明のフィターゼは、通常は至適を超えると思われる温度で酵素反応を遂行することができる。本発明のフィターゼはまた、高温に暴露した後酵素反応を遂行することができる（耐熱性は、予め高温に暴露した後、たとえ当該高温が酵素の活性を不活化または低下させえるとしても、野生型フィターゼが活性を有する温度で酵素活性を保持する能力である、さらにまた上記の耐熱性の定義を参照されたい）。本発明にしたがって、フィターゼをコードする遺伝子を配列番号:2のフィターゼの特徴とは異なる特徴（至適pH、至適温度、熱抵抗性、溶媒に対する安定性、比活性、基質親和性、分泌能力、翻訳速度、転写制御などに関して）を有するフィターゼの製造に（例えば本明細書に記載のGSSMにより）用いることができる。さらにまた、本明細書に記載した方法によって調製した変種フィターゼのスクリーニングに本発明のポリヌクレオチドを利用して、所望の活性（例えば改善または改変された熱安定性または熱耐性）を有するものを決定することができる。例えば、米国特許第5,830,732号は、フィターゼの耐熱性を決定するスクリーニングアッセイを記載している。
そのようなスクリーニングアッセイのin vitro例は以下のフィターゼ活性検出用アッセイである：フィターゼ活性は、150μLの酵素調製物を1mMのCaCl2を補充した100mMトリスHCl緩衝液（pH7.5）中の600μLのフィチン酸ナトリウム（2mM）と37℃にて30分インキュベートすることによって測定することができる。インキュベーション後、750μLの5%トリクロロ酢酸の添加によって反応を停止させる。放出されたホスフェートを、1500μLの着色試薬（5.5%硫酸中の1.5%モリブデン酸アンモニウムの4容積および2.7%硫酸第一鉄の1容積、Shimizu, 1992）を添加した後で、700nmにて分光光度計によりホスフェート標準物に対して測定した。酵素活性1単位は、アッセイ条件下で毎分1μmolのPiを放出するために必要な酵素の量と定義される。比活性は、タンパク質1mg当たりの酵素活性単位で表すことができる。本発明の酵素は、フィテートをイノシトールと遊離ホスフェートに加水分解する酵素活性を有する。
【０１５８】
ある特徴では、本発明は、フィテートを本明細書に開示する1つ以上の新規なフィターゼ分子（例えば配列番号:2の特定の改変を有するタンパク質）と接触させることを含む、フィテートを加水分解する方法を提供する。したがって、本発明は、フィテートのイノシトールと遊離ホスフェートへの加水分解を触媒してフィチン酸複合体からミネラルを遊離させる方法を提供する。前記方法は、フィテート基質を分解に有効な量の本発明の酵素と接触させることを含む。“分解に有効な”量という用語は、酵素と接触していないフィテートと比較して、少なくとも50%のフィテートを分解するために必要な酵素量を指す。フィテートの80%を分解することができる。
別の特徴では、本発明は、フィテートのホスホ-モノ-エステル結合を加水分解する方法を提供する。前記方法は、有効量の本発明のフィターゼ分子を加えて、イノシトールおよび遊離ホスフェートを得ることを含む。ある特徴では、“有効”量は、酵素と接触していないフィテートと比較して、少なくとも50%のホスホ-モノ-エステル結合を加水分解するために必要な酵素量を指す。ある特徴では、少なくとも80%の結合を加水分解することができる。
特にある特徴では、所望の場合は、フィターゼ分子を他の試薬（例えば他の触媒）と組み合わせて用いて、フィテート分子および／または基質源中の他の分子の化学的変化（例えば加水分解）を達成することができる。この特徴にしたがえば、フィターゼ分子および追加される試薬は互いを阻害しないであろう。フィターゼ分子および追加される試薬は全体的な付加効果を有するか、あるいはフィターゼ分子および追加される試薬は全体的な相乗効果を有することができる。
【０１５９】
基質フィテート分子の対応する供給源には、食品、潜在的食品、食品の副産物（in vitro副産物およびin vivo副産物の両方、例えばex vivo反応生成物および動物の排泄物産物）、食品の前駆物質および他の任意のフィテート供給源が含まれる。
非限定的な特徴では、生物は組換えフィターゼを消費しきることができ、消費時に活性を保持する。別の具体例では、トランスジェニックなアプローチを用いて、組換えフィターゼの発現を例えば管理された態様で達成することができる（トランスジェニック分子の発現の制御のために、複数の方法が時期特異的および組織特異的態様で利用可能である）。
ある特徴では、供給材料（例えばトランスジェニック植物源または組換え原核細胞宿主）中のフィターゼ活性は、消費時に高めることができる。この活性の増加は、例えば前駆形の前駆フィターゼ分子のより成熟形で顕著に活性の高い酵素への変換に際して生じえる。この場合、前記変換は、例えばフィターゼ供給源の摂取および消化により生じえる。フィテート基質の加水分解は、フィターゼとフィテートの接触時にいつでも生じえる。例えば前記変換は、基質もしくは酵素のどちらかまたはその両方の摂取前または摂取後、または摂取の前と後の両方の時期に生じえる。さらにまた、フィテート基質を、フィターゼの他に1つ以上の追加される試薬（例えば別の酵素）と接触させてもよいことは理解されよう（前記追加される試薬は直接的にまたはその供給源材料を精製した後に適用してもよい）。
フィターゼ供給源材料はフィテート供給源材料と、例えばフィターゼ供給源もしくはフィテート供給源のどちらかにまたはその両方のin vitroもしくはin vivoすり潰し時または咀嚼時に直接接触させてもよい。あるいは、フィターゼ酵素をフィテート基質と接触する前に、フィターゼ酵素を供給源材料から精製してもよく、またはフィテート基質を供給源材料から精製してもよく、またはフィターゼ酵素およびフィテート基質の両方を供給源材料から精製してもよい。精製または非精製試薬（酵素または基質またはその両方を含む）の組合せを用いてもよいことは理解されよう。
【０１６０】
2つ以上の供給源材料をフィターゼ活性の供給源として用いることができることは理解されよう。前記は、供給源材料から時間を定めて試薬を放出する1つの方法として有用である。前記の場合、異なる試薬のそれらの供給源材料からの放出が、弁別的に、例えば摂取された供給源材料がin vivoで消化されるときに、または供給源材料がin vitroの適用で処理されるときに生じる。フィターゼ活性の2つ以上の供給源材料の使用はまた、例えばある適用における種々の処理工程の間に遭遇しえる、ある範囲の条件およびその変動条件下（例えばある範囲のpH値、温度、塩濃度および時間間隔）でフィターゼ活性を得るために有用である。種々の供給源材料の使用はまた種々の試薬を得るために有用であり、前記は、フィターゼおよび／またはフィテートおよび／または他の物質の1つ以上の形態または異性体によって例示される。
単一の供給源材料、例えばトランスジェニック植物源（またはその植物部分）は、フィターゼおよびフィテートの供給源材料であってもよく、当該酵素および基質は、前記供給源内で別個の区画内に収納されるか（例えば分泌性区画対非分泌性区画）、別個に発現されるか、および／または種々の植物部分もしくは器官もしくは組織で、または同じ植物部分もしくは器官もしくは組織内の細胞内小区画で含有量が異なっていてもよいことは理解されよう。その中に含まれているフィターゼ分子の精製は、1つ以上の所望の植物部分または器官または組織または細胞内小区画の単離および／または更なる処理を含むことができる。
【０１６１】
ある特徴では、本発明は、増量した酵素を含む種子を用いてin vivoおよび／またはin vitro反応を触媒する方法を提供する。前記方法は、（例えばひき割り形態の）トランスジェニックな非野生型種子を反応混合物に添加する工程、および種子中の酵素に反応速度を速めさせる工程を含む。種子を反応混合物に直接添加することによって、前記方法は、酵素の抽出および精製のより高価で煩雑な過程に対し解決を提供する。酵素の十分な供給を欠く生物に、増量酵素を含む1つ以上の植物種（例えばトランスジェニック植物種）に由来する種子の形で酵素を投与する処理方法もまた提供される。このアプローチに関する更なる詳細は刊行物に記載されているか、および／または当業者には公知である。特に非限定的な例として、そのような刊行物には米国特許第5,543,576号（Van Ooijen et al.）および米国特許第5,714,474号（Van Ooijen et al.）が含まれるが、ただし前記は本出願の新規な分子については言及せずに菌類フィターゼの使用を教示している。
ある特徴では、本フィターゼ分子は、組換え体の消化系生活形（または微生物またはフロラ）の作製に、および前記組換え体消化系生活形の動物への投与に有用である。投与は、場合によって単独でまたは他の酵素および／または消化系で酵素活性を提供しえる他の生活形と一緒に実施してもよい。この場合、前記他の酵素および前記生活形は組換え体であってもそうでなくてもよい。例えば、投与はキシラン分解細菌と一緒に実施してもよい。
ある特徴では、本発明は、1つ以上のフィチン分解酵素を含む酵素調製物の存在下で（例えばトウモロコシまたはソルガムに存在するフィチンを実質的に分解する量の存在下で）、トウモロコシまたはソルガムの穀粒を二酸化硫黄含有温湯に浸漬する方法を提供する。前記酵素調製物は、フィターゼおよび／または酸性ホスファターゼおよび場合によって他の植物物質分解酵素を含むことができる。浸漬時間は12から18時間でありえる。浸漬は中間の製粉工程を間に挟み、浸漬時間を短縮することができる。ある特徴では、トウモロコシまたはソルガムの穀粒を、1つ以上のフィチン分解酵素（例えばフィターゼおよび酸性ホスファターゼ）を含む酵素調製物の存在下で二酸化硫黄含有温湯中で浸漬して、フィチン酸およびフィチン酸の塩を除去または大いに低下させる。このアプローチに関する更なる詳細は刊行物に記載されているか、および／または当業者には公知であり、例えば米国特許第4,914,029号（Caransa et al.）およびEP0321004（Vaara et al.）を参照されたい。
【０１６２】
ある特徴では、本発明は、所望の物理的特性（例えば非粘着性および弾力性）を有するパン生地および優れた品質（例えば比容）のパン製品を得る方法を提供する。前記方法は、フィターゼ分子をパン生地に添加する工程を含む。ある特徴では、本発明のフィターゼ分子を使用中のパン生地調製物に添加し、続いて前記パン生地を成形して焼く。このアプローチに関する更なる詳細は刊行物に記載されているか、および／または当業者には公知であり、例えばJP03076529（Hara et al.）を参照されたい。
ある特徴では、本発明は改善されたダイズ食品を製造する方法を提供する。ダイズを本発明のフィターゼ分子と一緒にしてフィチン酸をダイズから除去し、それによって、前記を消費する生物にとって必須の微量栄養物の供給量およびタンパク質の消化性が改善されたダイズ食品を製造する。ある特徴では、豆乳の製造で、フィチン酸の含有量を低下させるために、本発明のフィターゼ分子をダイズに添加してダイズと接触させる。非限定的な具体例では、前記適用過程は、加熱下で豆乳を酵素と一緒に攪拌することによって、または固定化酵素を用いて撹拌容器中で混合型反応を実施することによって加速することができる。このアプローチに関する更なる詳細は刊行物に記載されているか、および／または当業者には公知であり、例えばJP59166049（Kamikubo et al.）を参照されたい。
ある特徴では、本発明は、飲料水または液状形動物飼料のための混合製品を提供する。前記方法は、ミネラル混合物およびビタミン混合物、並びに本発明の新規なフィターゼを使用することを含む。ある特徴では、正確に用量が測定され構成された、消費する生物にとって必要な栄養物の混合物が、重要なミネラル／ビタミンの沈殿および破壊をもたらす恐れを全く生じることなく得られ、同時に飼料中のフィチン結合ホスフェートの最適な利用が達成される。このアプローチに関する更なる詳細は刊行物に記載されているか、および／または当業者には公知であり、例えばEP0772978（Bendixen et al.）を参照されたい。
【０１６３】
本発明のフィターゼ分子はまた、カビおよび／または穀物および／または他の植物を使用する他のアルコール性または非アルコール性飲用食品（または飲料）の製造に用いることができることは理解されよう。これらの飲用食品には、アルコール飲料、ワイン、混合アルコール飲料（例えばワイン混合飲料、他のアルコール性コーヒー（例えばアイリッシュコーヒー）など）、ビール、ニーアビール、ジュース、エキストラクト、ホモジネートおよびピューレが含まれる。ある特徴では、本明細書に開示するフィターゼ分子を用いて、そのような飲用食品の製造に有用なカビおよび／または穀物および／または他の植物のトランスジェニック型を作製することができる。別の特徴では、本明細書に開示するフィターゼ分子は、そのような飲用食品の製造過程のおよび／または最終内容物の追加の成分として用いられる。このアプローチに関する更なる詳細は刊行物に記載されているか、および／または当業者には公知である。
ある特徴では、本発明は、フィチンの量が低下しイノシトールの含有量が増加した清酒を得る手段を提供する。そのような酒は、直接的および／または心理的効果により肝疾患、アテローム性硬化症および他の疾患に対し予防的作用を有しえる。ある特徴では、酒は、原料として高いフィターゼ活性を有する米麹菌を増殖させることによって米麹から製造される。本発明のフィターゼ分子を用いて、活性が増強した有用な麹菌（例えばトランスジェニック麹菌）を製造するか、または前記を外因的に添加して麹菌の作用を増強することができることは理解されよう。この株を炊いた米に添加し、通常的な方法によって麹が製造される。ある具体例では、調製した麹が用いられる。全米を二段階で調製し、酒を15℃の一定の酒造温度で製造し、フィチンの量が低下しイノシトールの含有量が増加した目的の清酒を得る。このアプローチに関する更なる詳細は刊行物に記載されているか、および／または当業者には公知であり、例えばJP06153896（Soga et al.）およびJP06070749（Soga et al.）を参照されたい。
【０１６４】
ある特徴では、本発明は、摂取したカルシウムを含むミネラルの吸収を胃液または腸液による消化を受けることなく吸収を促進することができる吸収剤を低コストで得る方法を提供する。ある特徴では、ミネラル吸収剤は活性成分としてフィチン酸の部分的水解物を含む。フィチン酸の部分的水解物は、本発明の新規なフィターゼ分子を用いてフィチン酸またはその塩を加水分解することによって生成されえる。フィターゼ分子による処理は、単独でおよび／または併用処理として（最終効果の抑制または増強のため）実施することができ、その後続いてある範囲内で加水分解を阻害し全てのホスフェートラジカルが遊離されないようにする。このアプローチに関する更なる詳細は刊行物に記載されているか、および／または当業者には公知であり、例えばJP04270296（Hoshino et al.）を参照されたい。
ある特徴では、累積的または相乗的なフィターゼ加水分解活性を有する酵素組成物を製造する方法（および前記方法から得られる生成物）を提供する。前記組成物は、本発明の新規なフィターゼ分子および1つ以上の追加の試薬を含み、併用処理に有用な組成物を提供する。ある特徴では、本発明の併用処理は、異なる位置特異性を有する少なくとも2つのフィターゼ（すなわち1-、2-、3-、4-、5-および6-フィターゼ）の使用により達成される。異なる位置特異性を有するフィターゼを一緒にすることによって、累積的または相乗的効果が得られる。そのような混合フィターゼを含む組成物、例えば食物および飼料、または食物および飼料添加物もまた、それらの製造方法と同様に本発明に含まれる。このアプローチに関する更なる詳細は刊行物に記載されているか、および／または当業者には公知であり、例えばWO30681（Ohmann et al.）を参照されたい。
【０１６５】
別の特徴では、本発明の併用処理は、pH2.5でフィテートの加水分解活性を有する酸性ホスファターゼの使用により達成される。前記は、約0.1:1.0から10:1、または約0.5:1.0から5:1、または約0.8:1.0から3:1、または約0.8:1.0から2:1のpH2.5:5.0活性プロフィルに一致する低い比率にある。この酵素組成物は、熱処理によりさらに高い相乗的なフィテート加水分解効率を示すことができる。この酵素組成物は、フィテート加水分解を改善するための食品（飲用および固形食物、飼料および飼葉製品）の処理に有用である。このアプローチに関する更なる詳細およびまた別のプロトコルは刊行物に記載されているか、および／または当業者には公知であり、例えば米国特許第5,554399号（Vanderbeke et al.）および米国特許第5,443,979号（Vanderbeke et al.）を参照されたい（前記は菌類（特にアスペルギルス）のフィターゼを開示している）。
別の特徴では、本発明は、本発明の新規なフィテート作用性酵素を1つ以上の追加の酵素（多糖類に作用する）と一緒に含む組成物の製造方法（および前記方法から得られる組成物）を提供する。そのような多糖類は以下から成る群選択することができる：アラビナン、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン、レバン、フコイダン、カラギナン、ガラクトカロロース、ペクチン、ペクチン酸、アミロース、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、カルボキシルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デキストラン、プスツラン、キチン、ケラタン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギニン酸、並びに少なくとも１つのアルドース、ケトースを含む多糖類、以下から成る群から選択される酸またはアミン：エリスロース、スレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グルコース、イドース、ガラクトース、タロース、エリスルロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミンおよびノイラミン酸。
【０１６６】
ある特徴では、本発明は、1つ以上の本発明の新規なフィターゼ分子、セルラーゼ（キシラナーゼもまた含むことができる）、場合によってプロテアーゼ、および場合によって1つ以上の追加の試薬を含む、相乗的なフィテート加水分解活性を有する組成物を製造する方法（および前記方法から得られる生成物）を提供する。また別の特徴では、そのような併用処理は、食品、木材製品（例えば紙製品）の処理に、および洗浄溶液および固形洗浄剤として有用である。
ある特徴では、本発明のフィターゼはセルロース成分との組合せで有用である。多くのセルロース分解細菌のセルラーゼは別々のマルチ酵素複合体（セルロソームと称される）として編成されている。セルロソームの多様なサブユニットは多数の機能的ドメインを構成し、前記は当該ドメインと互いにおよびセルロース基質と相互作用する。これらサブユニットの１つは、新規なクラスの非触媒性骨格ポリペプチドを構成し、前記は多様なセルラーゼおよびキシラナーゼサブユニットをその凝集複合体に選択的に取り込む。セルロソームハイブリッドおよびセルロソームドメインのキメラ構築物の巧妙な適用は、セルロースバイオマスのより有利な利用を可能にし、研究、医薬および工業で広範囲の応用を提供することができる。
ある特徴では、本発明のフィターゼは、単独または併用処理により、バイオパルピングおよびバイオブリーチングの領域で有用である（前記領域では、パルプ工業および製紙工業で従来用いられている環境に有害な化学物質の使用を控えることが所望されている）。廃水処理はまた別の広大な応用領域であり、ここでは、生物学的酵素は、脱色だけではなく潜在的に有害な物質の有用なバイオ関連生成物への生物学的変換でも有効であることが示された。
【０１６７】
ある特徴では、本発明のフィターゼは、生物の消化系の処置（単独または併用処置による）において少なくとも1つの酵素活性を提供することができる生命体を作出するために有用である。特に関連する治療される生物には非反芻動物が含まれるが、ただし反芻動物もまたそのような処置により利益を得ることができる。特に、このアプローチは、単独でまたは生物学的分子（例えばキシラナーゼ）と一緒に実施して、複数の生物学的分子を発現する組換え宿主を作出することができることは理解されよう。さらに、本発明のフィターゼ分子および／または本発明のフィターゼ分子を発現する組換え宿主の投与を、単独でまたは他の生物学的分子および／または消化系において酵素活性を提供することができる生命体と一緒に実施することができることもまた理解されよう。この場合、前記他の酵素および前記生命体は組換え体であってもそうでなくてもよい。例えば、投与はキシラン分解性細菌と一緒に実施することができる。
【０１６８】
例えば、多くの生物がフィテートの他にヘミセルロースを適切に消化することができない。ヘミセルロースまたはキシランは植物材料の主要な成分（35％）である。反芻動物の場合、食餌性キシランの約50％が分解されるが、非反芻動物およびヒトの下部腸ではほんの少量のキシランしか消化されない。こぶ胃では、キシラン分解性菌の主要な種はブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Butyrivibrio fibrisolvens）およびバクテロイデス・ルミニコラ（Bacteroides ruminicola）である。ヒトの結腸では、バクテロイデス・オバツス（Bacteroides ovatus）およびバクテロイデス・フラギルス（Bacteroides fragilis）亜種“a”が主要なキシラン分解細菌である。キシランは化学的に複雑であり、それらの分解には多数の酵素が必要である。腸内細菌によるこれらの酵素の発現は種により大いに変動する。ブチリビブリオ・フィブリソルベンスは、細胞外キシラナーゼを産生するが、バクテロイデスの種は細胞結合性キシラナーゼ活性を有する。腸内細菌由来のキシラン分解性酵素の生化学的性状の決定は未だ完全には達成されていない。キシロシダーゼ遺伝子はB.フィブロソルベンスからクローニングされた。B.フィブロソルベンスからクローニングしたキシラナーゼ遺伝子を用いたDNAハイブリダイゼーションから得られたデータは、この遺伝子が他のB.フィブロソルベンス株にも存在する可能性があることを示している。バクテロイデス・ルミニコラからクローニングしたキシラナーゼを、バクテロイデス・フラギルスおよびバクテロイデス・ウニホルミス（B. uniformis）に移して強力に発現させた。バクテロイデス・オバツスのアラビノシダーゼおよびキシロシダーゼ遺伝子をクローニングした。両活性はただ1つの二機能性新規酵素によって触媒されるようである。
ある特徴では、本発明のフィターゼは、（1）適切な宿主（例えばバクテロイデス・フラギルスまたはバクテロイデス・ウニホルミス）に移し；（2）生じた組換え宿主において適切に発現させ；（3）さらに前記組換え宿主を生物に投与して、投与された生物のフィテート分解能力を改善するために有用である。遺伝学および生化学領域での継続的な研究によって、腸レベルにおける消化の操作のための情報および考察並びに結腸での線維の消化に関するより進んだ理解が提供されるであろう。
このアプローチに関する更なる詳細およびまた別のプロトコルは刊行物に記載されているか、および／または当業者には公知であり、例えば本発明は以下に記載された方法を取り入れることができる：米国特許第5,624,678号（Bedford et al.）、米国特許第5,683,911号（Bodie et al.）、米国特許第5,720,971号（Beauchemin et al.）、米国特許第5,759,840号（Sung et al.）、米国特許第5,770,012号（Cooper）、米国特許第5,786,316号（Baeck et al.）、米国特許第5,817,500号（Hansen et al.）。
【０１６９】
本発明は、フィターゼ活性が追加された調製物を得るために、開示の試薬に本発明のフィターゼ分子を添加することができることを教示する。ある特徴では、試薬および追加されるフィターゼ分子は互いに阻害しあわないであろう。ある特徴では、試薬および追加されるフィターゼ分子は全体的な累積作用を有することができる。ある特徴では、試薬および追加されるフィターゼ分子は全体的な相乗作用を有することができる。
ある特徴では、本発明は、フィチン酸リン利用の強化並びに動物（特に家禽）における脛骨の軟骨形成不全の治療および予防のための方法を提供し、前記は、動物に水酸化ビタミンD3誘導体を含む飼料組成物を投与することによって実施される。ビタミンD3誘導体は、カルシウムおよびリンの含有レベルが低い飼料で、フィチン酸リン利用の強化のために動物に投与することができる。したがって、ビタミンD3誘導体は、フィチン酸リン利用をさらに強化するために、本発明の新規なフィターゼ分子と一緒に投与することができる。このアプローチに関する更なる詳細およびまた別のプロトコルは刊行物に記載されているか、および／または当業者には公知であり、例えば以下を参照されたい：米国特許第5,516,525号（Edwards et al.）および米国特許第5,366,736号（Edwards et al.）、米国特許第5,316,770号（Edwards et al.）。
ある特徴では、本発明は、（1）動物の体内で容易に吸収されイノシトールの形で利用されるフィチンを含み；（2）し尿物質中のリンを減少させることができ；したがって（3）環境汚染の改善に有用である食品を得る方法（および前記方法から得られる生成物）を提供する。前記食品は、フィチン含有穀物、乳酸生成微生物および本発明の新規なフィターゼ分子の混合物を含む。 ある特徴では、前記食品は、フィチン含有穀物（例えば米のもみがら）を有効な微生物群（好酸性特性を有し、乳酸を産生し、酪酸を産生せず、病原性をもたない）およびフィターゼと混合することによって製造される。有効な微生物群の例には、例えばアクチノミセスグループに属するストレプトミセス（Streptomyces sp.）（アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC-3004）およびラクトバチルスグループに属するラクトバチルス（Lactobacillus sp.）（IFO3070）が含まれる。
【０１７０】
有効な微生物群の添加の例示量は、穀物材料を基準にして菌体重量で0.2重量％である。ある特徴では、フィターゼ添加量は、穀物材料中のフィチンを基準にして約1−2重量％である。このアプローチに関する更なる詳細または別のプロトコルは刊行物に記載されているか、および／または当業者には公知であり、例えばJP08205785（Akahori et al.）を参照されたい。
ある特徴では、本発明は野菜タンパク質の可溶性を改善する方法を提供する。より具体的には、本発明は、野菜のタンパク質源中のタンパク質の可溶化の方法に関し、前記方法は、野菜のタンパク質源を本発明の1つ以上のフィターゼの有効量で処理する工程および野菜のタンパク質源を1つ以上のタンパク分解酵素の有効量で処理する工程を含む。別の特徴では、本発明は、本発明のフィターゼおよび1つ以上のタンパク分解酵素を含む動物飼料添加物を提供する。このアプローチに関する更なる詳細または別のプロトコルは刊行物に記載されているか、および／または当業者には公知であり、例えばEP0756457（WO9528850A1）（Nielsen and Knap）を参照されたい。
ある特徴では、本発明は、野菜のタンパク質供給源材料を2から6の範囲のpHの水に分散させる工程およびその中に本発明のフィターゼ分子を混合する工程を含む、植物タンパク質調製物を製造する方法を提供する。可溶性タンパク質を含む酸性抽出物を分離し乾燥させて、所望の性状を有する固体のタンパク質が得られる。1つ以上のプロテアーゼを用いて、タンパク質の性状を改善することができる。このアプローチに関する更なる詳細または別のプロトコルは刊行物に記載されているか、および／または当業者には公知であり、例えば米国特許第3,966,971号を参照されたい。
ある特徴では、土壌および／またはコンポスト中の不活性なリンを活性化して窒素化合物の利用速度を改善し、さらに3試薬（フィターゼ、サポニンおよびキトサン）を当該コンポストに添加することによって病原性カビの増殖を抑制する方法（および前記方法から得られる生成物）が提供される。
ある特徴では、前記方法は以下によってコンポストを処理する工程を含む：（1）培地中のフィターゼ含有微生物（例えば本発明の新規なフィターゼ分子を過剰発現する組換え宿主）を、例えば100mL培地/100kg湿潤コンポストで添加する；（2）あるいはまたフィターゼ含有植物供給源（例えばコムギのもみがら）を例えば0.2から1kg/100kg湿潤コンポストで添加する；（3）サポニン含有供給源（例えばピート、マグワート、ユッカ）を例えば0.5から3.0g/kgで添加する；（4）キトサン含有材料（例えばエビ、カニなどの粉末化した殻）を例えば100から300kg/kg湿潤コンポストで添加する。
【０１７１】
ある特徴では、組換え体供給源、3試薬（フィターゼ、サポニンおよびキトサン）が用いられる。このアプローチに関する更なる詳細または別のプロトコルは刊行物に記載されているか、および／または当業者には公知であり、例えばJP07277865（Toya Taisuke）を参照されたい。
いくつかの例では、本発明のフィターゼ配列を局所的に（例えば特定の組織または細胞タイプ内に）デリバーして、発現させることが有利でありえる。例えば、動物の腸でフィターゼまたは消化酵素を局所的に発現させることによって、例えばフィテートおよびリンの消化および取り込みがそれぞれ促進されるであろう。例えば唾液腺、組織および細胞および／または腸の基底上皮細胞に核酸配列を直接デリバーしてもよい。そのようなデリバリー方法は当分野で公知であり、エレクトロポレーション、ウイルスベクターおよびDNAの直接取り込みが含まれる。フィターゼ活性を有するポリペプチドを本発明の方法で利用することができる（例えばこのセクションの6.3.18に記載したものおよび本発明の他のセクションに記載したもの）。
例えば、本発明の核酸構築物は、宿主組織内の標的細胞への取り込みに適した形態の核酸分子を含むであろう。前記核酸は裸のDNAまたはRNA分子でもよいが、この場合、前記分子は1つ以上の構造遺伝子、1つ以上の調節遺伝子、アンチセンス鎖（三重鎖を形成することができる鎖）などを含むことができる。一般的には、前記核酸構築物は、適切な調節領域の転写および翻訳制御下にある少なくとも1つの構造遺伝子を含むであろう。より通常的には、本発明の核酸構築物は、トランスフェクション効率を改善するためにデリバリービヒクルに取り込まれた核酸を含むであろう。この場合、前記デリバリービヒクルは、親水性の乾燥担体物質を含むより大きな粒子中に分散されるであろう。
【０１７２】
そのようなデリバリービヒクルの1つは、ウイルスベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）を含み、前記は、自己複製を防止するために不活化されているが、標的宿主細胞と結合する能力を維持し、遺伝物質を標的宿主細胞の細胞質にデリバーし、前記粒子内に取り込まれてある構造遺伝子および他の遺伝子の発現を促進する。仲介遺伝子伝達のために適したレトロウイルスベクターは以下に記載されている：Kahn et al. (1992) Circ. Res. 71:1508-1517。適切なアデノウイルス遺伝子デリバリーは以下に記載されている：Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434。レトロウイルスおよびアデノウイルスデリバリー系の両方の系は以下に記載されている：Friedman (1989) Science 244:1275-1281。
第二のタイプの核酸デリバリービヒクルは、リポソームトランスフェクションビヒクルを含み、前記には陰イオン性および陽イオン性リポソーム構築物が含まれる。陰イオンリポソームの使用は核酸のリポソーム内エントラップメントを必要とする。陽イオンリポソームは核酸のエントラップメントを必要としないで、核酸およびリポソームの単純な混合によって形成することができる。陽イオンリポソームは陰性に荷電した核酸分子（DNAおよびRNAの両方を含む）と強力に結合し、多くの細胞タイプで相応なトランスフェクション効率を提供する複合体を生じる（以下を参照されたい：Farhood et al. (1992) Biochem Biophys Acta 1111:239-246）。リポソーム小胞を形成する例示的物質はリポフェクチンであり、前記は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）およびジオレイルオキシプロピル-トリエチルアンモニウム（DOTMA）の等モル混合物で構成される（以下に記載されている：Felgner and Ringold (1989) Nature 337:387-388）。
これら2つのタイプのデリバリー系を一緒にすることもできる。例えば上掲書（Kahn et al.）は、レトロウイルスベクターを陽イオンDEAE-デキストラン小胞と一緒にしてさらに形質転換効率を高めることができることを開示している。さらにまた、核内タンパク質をウイルスおよび／またはリポソームデリバリー小胞に取り込んで、トランスフェクション効率をさらに改善することも可能である（以下を参照されたい：Kaneda et al. (1989) Science 243:375-378）。
【０１７３】
別の特徴では、唯一の活性成分としてまたは1つ以上の他の薬剤および／または酵素と併用して、酵素を含む消化促進剤が提供される。家畜または家畜化された動物の消化補助剤における酵素および他の薬剤の使用は動物の健康および平均余命を改善するだけでなく、家畜の健康増進および家畜から得られる食品の生産を促す。
本発明ではまた、多数のミネラル（例えば無機リン）、酵素、成長因子、医薬および家畜へのデリバリーのための他の薬剤が大量に補充された家畜用飼料（例えばある種の家禽用飼料）を用いることができる。これらのサプリメントは、例えば穀物に含まれるカロリーおよび天然の栄養物の多くの代用となる。無機リンサプリメントおよび他のサプリメント（例えば微量ミネラル塩、成長因子、酵素、抗生物質）を飼料そのものから削減または除去することによって、当該飼料はより多くの栄養物およびエネルギーを保持することができる。したがって、このような食餌はより多くの利用可能なエネルギーを含むことであろう。例えば、ひき割り穀物-オイルシード食餌は一般的に、1kgの食餌当たり約3,200kcalの代謝可能エネルギーを含み、ミネラル塩は代謝可能エネルギーを供給しない。不要なミネラルの除去および穀物による代替は、したがって食餌中の利用可能エネルギーを増加させる。したがって、本発明は、一般的に用いられるフィターゼ含有飼料とは区別される。例えば、ある特徴では、生物の胃腸管による消化に耐性を有する生体適合性物質が用いられる。
【０１７４】
多くの生物では（例えば家禽または鳥類、例えばニワトリ、シチメンチョウ、カモ、アヒル、オウム、クジャク、ダチョウ、キジ、ウズラ、ハト（pigeon）、エミュー、キーウィ、アビ、オカメインコ、オウム（cockatoo）、カナリア、ペンギン、フラミンゴおよびハト（dove）を含む）、消化管は、堅い生体適合性物体（例えば小石および甲殻類や貝の殻）を蓄え利用する砂嚢を含み、種子および鳥が消費する他の飼料の消化に役立てる。生物のこの一般的なファミリーの典型的な消化管は、小袋（そ嚢と呼ばれる）を有する食道を含み、そ嚢では食物が短期間保存される。そ嚢から、食物は本当の胃（または前胃）に移動し、そこで塩酸およびペプシンは消化プロセスを開始させる。次に、食物は砂嚢に移動する。砂嚢は卵形であり強力な筋肉を有する厚い壁をもつ。砂嚢の主要な機能は食物粒子をすり潰し粉砕することである（前記プロセスは鳥類が微細な砂利また砂を飲みこむことによって促進される）。砂嚢から、食物は十二指腸に移動する。鳥類の小腸は哺乳動物と同様である。小腸と大腸の結合部に、2つの出口のない小袋または盲腸があり、前記は長さが約4−6インチである。大腸は短く、主に長さが約3−4インチの直腸から成る。直腸は内容物を総排泄腔に出し、糞便が肛門から排出される。
砂嚢で消費され（あるいは導入され）提示される堅い生体適合性物体は、多様な酵素、化学物質、治療薬および抗生物質のデリバリーのための有用なベクターを提供する。これらの堅い物質は数時間から数日の寿命を有し、一定期間後は排泄される。したがって、本発明は、有用な消化剤または治療薬を生物にデリバーすることを目的とする、被覆、浸透（例えば浸透マトリックスおよびメンブレン）を実施した改変食餌補助物を提供する。そのような食餌補助物は、典型的には生物によって摂取されて砂嚢内の消化を促進する物体を含む（例えば小石または砂）。本発明は、生物のための消化補助物として有用な、または治療薬もしくは医薬もしくは化学物質のデリバリーのために有用な物質をその上に被覆した、またはその中に浸透させた生体適合性物体を提供する。
【０１７５】
ある特徴では、本発明は、消化を促進する物質の放出のために設計された生体適合性組成物を含む食餌補助物を提供し、この場合、前記生体適合性組成物は、生物の経口消費および消化管（例えば砂嚢）内での放出のために設計される。“生体適合性”という用語は、宿主生物（例えば鳥）との接触時に、当該物質が、それに対する拒絶をもたらすほどのまたは物質が操作不能になるほどの有害な応答を誘引しないことを意味する。そのような操作不能性は、例えば、浸透させた物質の宿主生物への拡散を制限する物質周辺の線維性構造物の形成によって、または毒性もしくは感染性のために当該生物の死亡率もしくは罹患率の増加をもたらす物質によって生じえる。生体適合性物質は非生分解性であっても、生分解性であってもよい。ある特徴では、生体適合性組成物は、胃腸管による分解または消化に耐性を有する。別の特徴では、生体適合性組成物は石または小石の堅牢性を有する。
本発明で有用な非生分解性物質は食餌性物質の付着または浸透を可能にするものである。非制限的なそのような非生分解性物質には、例えば熱可塑性物質、例えばアクリル、モダクリル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンおよびフッ化ポリビニリデンが含まれる。エラストマーもまた有用な物質であり、例えばポリアミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコールおよびシリコーン（例えばシリコーン系またはシリコーン含有シリカ）が含まれる。本発明は、複数のそのような物質を含むことができる生体適合性組成物を提供し、前記は例えば混合または重層されて、ブレンド、コポリマーまたはその組合せを形成することができる。
【０１７６】
ある特徴では、“生分解性”物質とは、当該物質がin vivoで崩壊または分解してより小さな化学物質種を形成することを意味するであろう。分解は、例えば酵素的、化学的または物理的プロセスによって生じえる。本発明での使用が意図される適切な生分解性物質には、ポリ(ラクチド)、ポリ(グリコリド)、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリエーテルエステル、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリカーボネート、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリアクリレートなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。そのような物質を混合または重層して、ブレンド、コポリマーまたはその組合せを形成することができる。
ある特徴では、本発明の多様な多数の生体適合性物質を動物に与え、連続的に摂取させるか、また別には、同じ生物に同時にまたは多様な組合せで（例えばある物質の前に別の物質を）与えることができる。さらにまた、本発明の生体適合性物質は、消化管をゆっくりと通過するように設計することができる。例えば大きな物質または脂肪性物質は消化管をゆっくりと移動する傾向があり、したがって消化管の急速な通過を防ぐためにサイズの大きな生体適合性物質を用いることができる。そのような大きな物質は、非生分解性物質と生分解性物質との組合せであってもよい。例えば、小さな非生分解性物質を本発明の生分解性物質で包みこみ、それにより一定期間にわたって生分解性部分が分解され、非生分解性部分の消化管の通過を許容するであろう。さらにまた、本発明の生体適合性物質に任意の数の香料を提供して、消費を促進することができることも理解されよう。
本発明の生体適合性物質を任意の数の物質（単独でまたは他の物質と併用される）で被覆してもよい。前記には例えば、ポリペプチド（例えば酵素、抗体、サイトカインまたは治療用小分子）および抗生物質が含まれる。特に有用な物質は下記の表1および2に列挙される。細胞を本発明の生体適合性物質中に被包化し、酵素または治療薬をデリバーするために用いることができる。例えば、多孔性物質を設計することができる。細胞が当該孔を通過して増殖することができるように十分に大きな孔を有し、さらに前記多孔性物質が消化管に取り込まれえる多孔性物質を設計することができる。例えば、本発明の生体適合性物質は、複数の細胞タイプの支援を提供する複数の細菌叢環境（例えば種々の多孔度、pHなど）を含むことができる。これらの細胞を遺伝学的に操作して、特定の薬剤、酵素または化学物質を生物にデリバーすることができる。前記細胞は真核細胞でも原核細胞でもよい。
【０１７７】
表1
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【０１７８】
表2：治療用処方物
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【０１７９】
ある種の作用因子は、一定の状態（例えば一定のpH、活性化薬剤の存在下など）で活性化されるか、または不活化されるように設計することができる。さらにまた、本発明の組成物でプロ酵素を使用することが有利である場合がある。例えば、プロ酵素はプロテアーゼ（例えば消化管に存在するか、またはある生物の消化管に人工的に導入される唾液プロテアーゼ）によって活性化することができる。本発明の生体適合性組成物によってデリバーされる物質は、当該生物が摂取することができるか、あるいはまた当該生物にデリバーできる活性化剤の添加によって活性化または不活化されることが意図されている。消化管内の作用因子の制御のためのまた別のメカニズムは、適切な消化性区画内で活性化される、環境感受性因子である。例えば、ある作用因子は低pHで不活性であるが中性pHでは活性でありえる。したがって、前記作用因子は胃では不活性であるが腸管内では活性を有するであろう。あるいは、前記作用因子は、微生物特異的因子（例えば腸内に存在する微生物）の存在に応答して活性になることができる。
ある特徴では、本発明の潜在的な利点には、例えば（1）1日の飼料又は穀物から動物（魚を含む）のためのミネラルサプリメント（例えば無機リンサプリメント）、酵素または治療薬を削減するかまたは可能ならば除去し、それにより飼料中に存在するカロリーおよび栄養物の量を増加させること、および（2）家畜および非家畜動物（例えば家禽、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む）の健康増進及び成長促進が含まる。
【０１８０】
本発明の方法及び組成物で多数の酵素を本発明のフィターゼの他に用いることができる。これらの酵素には、消費される食物の適切な消化のために、または化学物質、プロドラッグもしくは他の物質または消化管を介して動物にデリバーされる化合物の適切な代謝、活性化もしくは誘導のために必要な酵素が含まれる。本発明の組成物にデリバーされるか、又は取り込むことができる酵素の例には例えば飼料強化酵素が含まれ、前記は以下から成る群から選択される：α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、特にラクターゼ、フィターゼ、β-グルカナーゼ、特にエンド-β-1,4-グルカナーゼおよびエンド-β-1,3(4)-グルカナーゼ、セルラーゼ、キシロシダーゼ、ガラクタナーゼ、特にアラビノガラクタンエンド-1,4-β-ガラクトシダーゼおよびアラビノガラクタンエンド-1,3-β-ガラクトシダーゼ、エンドグルカナーゼ、特にエンド-1,2-β-グルカナーゼ、エンド-1,3-α-グルカナーゼ、およびエンド-1,3-β-グルカナーゼ、ペクチン分解酵素、特にペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、アラビナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナン-α-ラムノシダーゼ、ペクテートリアーゼおよびα-ガラクツロニシダーゼ、マンナナーゼ、β-マンノシダーゼ、マンナンアセチルエステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アラビノキシラナーゼおよび脂質分解酵素、例えばリパーゼ、フィターゼおよびクチナーゼ。配列番号:2に示されるアミノ酸配列を有するフィターゼ以外の他のフィターゼも本発明の方法および組成物で用いることができる。
ある特徴では、本発明の組成物（例えば食餌補助物）で用いられる酵素は、熱に対して安定であり、かつ耐熱性で、さらにフィテートの酵素的加水分解を触媒するフィターゼ酵素である。すなわち、前記酵素は、50℃を超える温度に短時間（すなわち5から30秒）または長時間（例えば数分又は数時間）暴露した後で活性を再生および再獲得することができる。
【０１８１】
“飼料”および“食物”はそれぞれ、任意の天然または人工の食餌、食事もしくは同様なもの、または動物および人間にそれぞれ食され、摂取され、消化されることが意図されるか、または前記に適した食事の成分を意味する。本明細書で用いられる“食餌補助物”は、例えば、動物または生物に治療薬または消化薬を提供する物質を含む組成物を意味する。“食餌補助物”は典型的には生物のカロリー摂取源ではない。換言すれば、食餌補助物は、典型的には生物にとってエネルギー源ではなく、むしろ典型的な“飼料”または“食物”の他に摂取される組成物である。
本発明の多様な特徴では、配列番号:2のアミノ酸配列を有するタンパク質の少なくとも30の連続するアミノ酸を含む組換えフィターゼタンパク質およびフィテート含有食品を含む飼料組成物が提供される。当業者には周知のことであるが、そのような組成物は、多様な方法で（ポリマー被覆添加物を含む（または含まない）ペレット形として、顆粒化形として、および噴霧乾燥によって（ただしこれらに限定されない））製造することができ。非限定的に例示すれば、飼料製造分野における教示は以下で見出される：国際公開WO0070034A1、WO0100042A1、WO0104279A1、WO0125411A1、WO0125412A1およびEP1073342A。
薬剤または酵素（フィターゼ）はin vitroまたはin vivoで（すなわち摂取前、または生物の胃もしくは砂嚢で）それぞれその作用を表すことができる。さらにまた作用の合体も可能である。
いずれの酵素も食餌補助物に取り込むことができるが、本明細書では本発明の方法および組成物の具体例としてフィターゼに言及する。本発明の食餌補助物には酵素（例えばフィターゼ）が含まれる。一般的には、フィターゼ組成物を含む食餌補助物は液状または乾燥状態である。
液状組成物は、酵素（例えばフィターゼ）以外のものを全く含む必要がない（酵素は好ましくは高度に精製された形態である）。しかしながら、通常は安定化剤、例えばグリセロール、ソルビトール、またはモノプロピレングリコールもまた添加される。液状組成物はまた他の添加物、例えば塩、糖、保存料、pH調整剤、タンパク質、フィテート（フィターゼ基質）を含むことができる。典型的な液状組成物は水性スラリーまたは油性スラリーである。液状組成物は、徐放用の生体適合性組成物に添加することができる。好ましくは、酵素は食餌補助組成物に添加される。前記食餌補助組成物は生体適合性物質（例えば生分解性または非生分解性）であり、例えば多孔性マイクロビーズへの組換え細胞の添加を含む。
【０１８２】
乾燥組成物は噴霧乾燥させた組成物であってもよく、この場合には、組成物は乾燥形の酵素以外のものを全く含む必要がない。しかしながら通常は、乾燥組成物はいわゆる顆粒化物であり、これは容易に食物または飼料と混合することができ、または、より好ましくはプレミックスの成分を形成することができる。酵素顆粒化物の粒子サイズは好ましくは、混合物の他の成分の粒子サイズと適合性を有する。これは、酵素を動物飼料に取り込む安全で便利な手段を提供する。本発明の顆粒化物は生体適合性でありえるが、それらはまた、非生分解性の生体適合性顆粒化物であってもよい。
酵素で被覆した本発明の凝結顆粒化物は、高せん断ミキサーで凝結技術を用いて製造することができる。吸収顆粒化物は、担体物質コアに酵素を吸収または被覆させることによって製造される。ある特徴では、担体物質は、動物の砂嚢中の小石または砂の役割を促進する生体適合性で非生分解性の物質である。凝結技術で用いられる典型的な充填材には塩、例えば硫酸二ナトリウムが含まれる。他の充填物質はカオリン、タルク、ケイ酸マグネシウムアルミニウムおよびセルロース線維である。場合によって、バインダー（例えばデキストリンもまた凝結顆粒化物に含まれる。担体物質は、生分解性および非生分解性物質（例えば石、小石、セラミックス、種々のポリマー）を含む、任意の生体適合性物質でありえる。ある特徴では、顆粒化物は、コーティング混合物で被覆される。そのような混合物は、コーティング剤、例えば疎水性コーティング剤（例えば水素添加ヤシ油および牛脂）を含み、さらに所望される場合は他の添加物、例えば炭酸カルシウムまたはカオリンを含む。
ある特徴では、食餌補助組成物（例えばフィターゼ食餌補助組成物）は、他の代用物、例えば着色剤、香料化合物、安定化剤、ビタミン、ミネラル、他の飼料もしくは食物強化酵素などを含むことができる。ある特徴では、本発明の組成物で用いられる添加物は、1つ以上の化合物、例えばビタミン、ミネラル、または飼料強化酵素および適切な担体および／または賦形剤を含む。
【０１８３】
ある特徴では、本発明の食餌補助組成物は、さらにまた有効量の1つ以上の飼料強化酵素を含む。特に、飼料強化酵素は以下から成る群から選択される：α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、特にラクターゼ、フィターゼ、β-グルカナーゼ、特にエンド-β-1,4-グルカナーゼおよびエンド-β-1,3(4)-グルカナーゼ、セルラーゼ、キシロシダーゼ、ガラクタナーゼ、特にアラビノガラクタンエンド-1,4-β-ガラクトシダーゼおよびアラビノガラクタンエンド-1,3-β-ガラクトシダーゼ、エンドグルカナーゼ、特にエンド-1,2-β-グルカナーゼ、エンド-1,3-α-グルカナーゼ、およびエンド-1,3-β-グルカナーゼ、ペクチン分解酵素、特にペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、アラビナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナン-α-ラムノシダーゼ、ペクテートリアーゼおよびα-ガラクツロニシダーゼ、マンナナーゼ、β-マンノシダーゼ、マンナンアセチルエステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アラビノキシラナーゼおよび脂質分解酵素、例えばリパーゼ、フィターゼおよびクチナーゼ。
本発明の動物用食餌補助物は単胃動物に食餌の前または食餌と同時に補充される。ある特徴では、本発明の食餌補助物は単胃動物に食餌と同時に補充される。別の特徴では、食餌補助物は、顆粒化物または安定化液状物の形態で食餌に添加される。
本発明の食餌補助物中の酵素の有効量は、約10−20,000、約10−15,000、約10−10,000、約100−5,000、または約100−約2,000FYT/kg食餌補助物である。
本発明のフィターゼの非限定的な他の特別な使用例は、ダイズ加工およびイノシトールまたはその誘導体の製造における使用である。
本発明はまた、動物排泄物肥料中のフィテートを低下させる方法に関し、この場合、前記動物は、有効量の本発明のフィターゼを含む食餌補助物を与えられる。本出願の初めに述べたように、その重要な作用はホスフェートによる環境汚染の削減である。
【０１８４】
別の特徴では、食餌補助物は磁性担体である。例えば、磁性担体（たとえば多孔性磁性ビーズ）中に、担体上またはその全体に酵素（例えばフィターゼ）を分布させた磁性担体をフィテータが多い領域に散布し、一定期間後磁石で収集することができる。そのような散布および再収集は更なる汚染を減少させ、ビーズの再使用を可能にする。さらにまた、そのような磁性ビーズのin vivoでの使用は、消化管内の一点に食餌補助物を局在させ、当該場所で例えばフィターゼ活性を発揮させることができる。例えば、消化酵素（例えばフィターゼ）を含む本発明の食餌補助物は、動物が磁性担体の食餌補助物を食べた後で、動物の砂嚢の直ぐ近くに磁石を併置することによって動物の砂嚢に局在させることができる。一定時間後に磁石を移動させて、食餌補助物の消化管の通過を可能にすることができる。さらにまた、磁性担体は屠殺後に生物から除去するために適切であり、また採集の促進にも適している。
食餌補助物が多孔性粒子であるときは、ゆっくりと放出させることが所望される物質を典型的にはそのような粒子に染み込ませて徐放性粒子を形成する。そのような徐放性粒子は、放出させたい物質を多孔性粒子に染み込ませるだけでなく、第一の分散相に所望の物質を先ず溶解させることによっても製造することができる。この事例では、放出されるべき物質が第一の分散相に先ず溶解される方法によって製造された徐放粒子もまた本発明の範囲内である。例えば医薬、農薬または酵素のような徐放性物質を多孔性中空粒子にしみ込ませることができる。特に、酵素をしみ込ませる多孔性中空粒子が生分解性ポリマーで製造されるときは、粒子自体を農薬または肥料として用いることが可能であり、それらは環境に対して副作用をもたない。ある特徴では、多孔性粒子は磁石の性質を有する。
【０１８５】
多孔性中空粒子をバイオリアクター支持体、特に酵素支持体として用いることができる。したがって、例えば微細小胞（例えばリポソーム）中に薬剤の酵素を被包化することによる徐放方法を用いて、食餌補助物を製造することは有利である（前記微細小胞から規定用量が数日間にわたって、好ましくは約3から20日間で放出される）。あるいは、前記薬剤（例えば酵素）を徐放のために処方することもできる（例えば、数日間にわたって、例えば2から30日間（さらに動物の寿命まで範囲を広げることができる）に薬剤の規定用量をゆっくりと放出する徐放ポリマーに薬剤（例えば酵素）を取り込ませることによって処方することができる）
ある特徴では、本発明のリポソームはリン脂質または他の脂質物質から誘導される。リポソームは、水性媒体に分散した単層または多層の水和液状結晶物によって形成される。リポソームを形成する能力を有し、毒性をもたない生理学的に許容可能な代謝性脂質はいずれも用いることができる。リポソームの形態を有する本発明の組成物は、前記薬剤の他に安定化剤、保存料、賦形剤などを含むことができる。いくつかの例示的な脂質はリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）であり、それらは天然および合成である。リポソームの生成方法は当分野で公知である。例えば以下を参照されたい：Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33et seq。
さらにまた、食物もしくは飼料調製物または添加物の製造時に本発明のフィターゼを使用することも本発明の範囲内である（すなわち、フィターゼは製造時にのみフィターゼ活性を表し、食物または飼料の最終製品では活性を示さない。この特徴は、例えば生地の製造および焼成に対応する。したがって、フィターゼまたは組換え酵母発現フィターゼを、磁性担体中に、前記担体上にまたはその全体にしみ込ませ、生地または食物媒体中に分散させ、さらに磁石によって回収することができる。
【０１８６】
動物に本発明の食餌補助物を、生体適合性（例えば生分解性または非生分解性）担体にて単独で、または他の消化添加物質と一緒に投与することができる。本発明の食餌補助物は、トップドレッシングとしてまたは動物飼料に直接混合することによって、または飼料と別々に提供することによって、別個の経口投与によって、注射によって、または経皮的手段によって、または他の成長関連食用化合物と一緒に容易に投与することができる（組み合わされる化合物の各々の割合は、個々の生物または考慮される問題および所望される応答の程度に左右される）。任意の事例において投与される個々の食餌用用量は、当業者に周知のように、投与される個々の化合物、処置されるべき問題、対象動物の状態、および有効成分の活性を変化させえる他の関連因子、または対象動物の応答にしたがって調節されることは理解されよう。一般的には、当分野で周知のように、一日一回投与または一日用量の分割投与のどちらかを用いることができる。
動物用飼料とは別に投与される場合は、当分野で周知のように、食餌補助物の形態は、それらを毒性のない生理学的に許容可能な担体と一緒にして即時放出または徐放処方物のどちらかを形成することができる。そのような食用担体は固体または液体、例えばトウモロコシデンプン、ラクトース、シュクロース、ダイズフレーク、落花生油、オリーブ油、ゴマ油およびプロピレングリコールでありえる。固体の担体が用いられる場合は、化合物の投与形は錠剤、カプセル、散剤、トローチもしくはロゼンジ、または微細分散が可能な形態としてトップドレッシングが可能である。液状担体が用いられる場合は、軟ゼラチンカプセルまたはシロップもしくは液状懸濁物、乳濁液または溶液が投与形でありえる。投与形はまた、アジュバント、例えば保存料、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶液促進剤などを含むことができる。それらはまた治療的に重要な他の物質を含むことができる。摂取されたときに酵素を放出させるために、高温で顆粒化食用担体を製造する方法は同時係属中の米国特許出願09/910,579号（2001年7月20日出願）に記載されている。
また別の実施態様では、本発明の顕著な利点には以下が含まれる：（1）活性成分が層化された生物適合組成物の製造の容易さ；（2）利用可能なポリマーおよび／または活性成分の種類に関連する融通性；（3）より高い収量およびローディング効率；および（4)活性を有する完全な活性物質をin vivoで放出する持続放出処方物の供給、したがって長期間にわたって活性物質の制御放出を提供する。ある実施態様では、利点は、生物の消化管（例えば砂嚢）内への当該物質の局所的デリバリーによるものでありえる。ある特徴では、“〜内に含まれる”という語句は、長期期間にわたってある物質を制御放出するために有用な組成物に前記物質を処方する方法を示す。
【０１８７】
本発明の持続放出組成物または徐放組成物のまた別の実施態様では、有効量の物質（例えば酵素または抗生物質）が用いられる。ある特徴では、持続放出または徐放とは、長期間にわたって生体適合性物質からある物質を徐々に放出することを指す。持続放出は、連続的もしくは非連続的、直線的もしくは非直線的であることができ、これは、1つ以上の生分解性もしくは非生分解性組成物、薬剤ローディング、賦形剤の選択または他の改変を用いて達成することができる。しかしながら、生物が一度に消費しつくす迅速放出を提供する“迅速”放出組成物の提供も所望されえることもまた理解されるべきであろう。さらにまた、“放出”はまた生体適合性担体から当該物質が放出されることをかならずしも意味しないことも理解されるべきである。そうではなくて、ある特徴では、徐放は生体適合性組成物に存在する物質のゆっくりとした活性化または持続的活性化を包含する。例えば、フィターゼは、有効であるためには生体適合性組成物から放出されることを必要としない。この特徴では、フィターゼは生体適合性組成物に固定される。
動物飼料は、動物の食餌要件に合致する通常用いられる、任意のタンパク質含有有機食物でありえる。そのようなタンパク質含有食物の多くは、典型的には主としてひき割りトウモロコシ、ひき割りダイズまたはトウモロコシ/ダイズひき割り混合物で構成される。例えば、ニワトリに与えられる典型的な市販製品には、エッグメーカーコンプリート（Land O'Lakes AG Servicesの家禽飼料製品）、とともにカントリーゲームアンドターキーグロウアー（Agwa Inc.の製品）が含まれる（以下もまた参照されたい：The Emu Farmer's Handbook by Phillip Minnaar and Maria Minnaar）。これらの市販製品の両方が、本発明の食餌補助物および／またはフィターゼ酵素を取り入れて、そのような組成物で要求されるリン、亜鉛、マンガンおよび鉄の投入量を削減するかまたは排除が可能な動物飼料の典型的な例である。
本発明は、新規な処方物、並びに食餌用サプリメントおよび添加物、並びにある種の食事（例えばアトキンス食、菜食主義者食、長寿食、絶対菜食主義者食、または地域食（例えば発展途上世界の食事））用の食餌サプリメントのための方法を提供する。ある種の選択的食事（例えばアトキン食、菜食主義者食、長寿食、絶対菜食主義者食、または地域食（例えば発展途上世界の食事））に関連する食物は、ある種の食物カテゴリー（例えばタンパク質および脂肪、ダイズなど）を強調するか、またはそれらは、個々の栄養素に対する実質的なまたは唯一の貢献物として土着の作物（例えば穀物、コメ、豆類など）に依存する。これらの穀物系作物は高いフィチン酸レベル（3から10倍）を有する。加工食物製品、例えばダイズタンパク質の加水分解物および他のものは高レベルのフィチン酸を維持しているように思われ、さらにタンパク質供給源として滋養スティック、粉末並びに他の食物または食物サプリメントおよび成分へのそれらの添加によって、これらの食事を摂取する個体が受けるフィチン酸負荷は増加する。
【０１８８】
骨低下の防止および回復：本発明はまた、サプリメントおよび添加物として用いることができる新規な医薬処方物および食餌用処方物を提供し、さらに、骨低下の素因のある個体、骨低下を示している個体、およびある種の症状（例えば骨粗しょう症、悪液質）を示す個体、および必須の栄養素の適切な取り込みまたは利用が損なわれることがある医学的処置（例えば化学療法）を受けている個体に対して、フィターゼ（例えば本発明のフィターゼを含む任意のフィターゼ）を含む食餌補填を実施する方法を提供する。本発明の方法および組成物は、単独でまたは他のサプリメントもしくは治療方式（医薬投与などを含む）と併用して用いることができる。例えば処方物、食餌用サプリメントおよび食餌補填の方法は、他の食餌サプリメントまたは骨粗しょう症の治療および予防のために医薬投与、例えばビタミンD3および／またはカルシウム（前記は骨低下を防ぐことが証明された））とともに行うことができる。ある特徴では、本発明は、フィターゼ（例えば任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼ）およびビタミンD3および／またはカルシウムを含む処方物を提供する。ある特徴では、本発明は、骨低下を防ぐために、フィターゼ（例えば任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼ）を含む処方物を提供する。ある特徴では、本発明は、骨低下を回復させるために、フィターゼ（例えば任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼ）を含む処方物を提供する。
前記処方物は、医薬組成物の形態であっても、または医薬への添加物であってもよく、前記はどちらも液体、固体、散剤、ローション、スプレーまたはエーロゾル形でありえる。本発明の経口投与用医薬組成物および処方物は、固有で適切な投薬で当業者に周知の医薬的に許容可能な担体を用いて処方することができる。そのような担体によって、前記医薬は、患者の摂取に適した錠剤、ピル、散剤、糖衣錠、カプセル、リキッド、ロゼンジ、ゲル、シロップ、スラリー懸濁液などとしてユニット投薬形で処方されえる。経口使用のための医薬調製物は固体賦形剤として処方することができ、前記は、場合によって生成された混合物をすり潰し、顆粒混合物を加工し、所望の場合は適切な追加の化合物を添加した後で錠剤または糖衣錠のコアが得られる。適切な固形賦形剤は炭水化物またはタンパク質充填剤であり、前記には例えば以下が含まれる：糖（ラクトース、シュクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む）；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプン；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシ-メチルセルロースナトリウム；およびゴム（アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含む）；並びにタンパク質、例えばゼラチンおよびコラーゲン。崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。前記は、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムである。
【０１８９】
本発明は、フィターゼ（例えば本発明のフィターゼ）を含む、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合された水性懸濁液を提供する。そのような賦形剤には以下が含まれる：懸濁剤（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴム、並びに分散剤または湿潤剤、例えば天然に存在するホスファチド（例えばレシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物（例えばポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪アルコールとの縮合生成物（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから誘導された部分的エステルとの縮合生成物（例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導された部分的エステルとの縮合生成物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）。前記水性懸濁液はまた、1つ以上の保存料、例えばエチルまたはn-プロピルp-ヒドロキシベンゾエート、1つ以上の着色剤、1つ以上の香料および1つ以上の甘味剤、例えばシュクロース、アスパルテームまたはサッカリンを含むことができる。
投薬計画はまた、当分野で周知の薬物動態パラメーター、すなわち活性物質の吸収速度、生体利用性、代謝、クリアランスなどを考慮する（例えば以下を参照されたい：Hidalgo-Aragones (1996) J Steroid BイオチェｍMol Biol 58:611-617；Groning (1996) Pharmazie 51:337-341；Fotherby (1996) Contraception 54:59-69；Johnson (1995) J Pharm Sci 84:1144-1146；Rohatagi (1995) Pharmazie 50:610-613；Brophy (1983) Eur J Clin Pharmacol 24:103-108；Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(最新版) Lippincott Williams & Wilkins）。従来技術により、臨床医は個々の患者、活性物質および治療される疾患または症状について投薬計画を決定することが可能である。医薬として用いられる類似の組成物について提供される指針を指標として用いて、本発明の方法の実施（例えば骨低下の回復または骨低下の予防）に適切であり正しい投薬計画、すなわち投与量スケジュールおよび投薬レベルを決定することができる。
【０１９０】
身体トレーニング用サプリメント：本発明はまた、フィターゼ（例えば任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼ）を含む、新規な食餌サプリメントおよび添加物、または運動選手のトレーニングもしくは他の激しい身体トレーニング（例えば兵士の訓練）を受ける個体のためにそれらを使用する方法を提供する。運動選手のトレーニングおよび極めて激しい運動は必須の栄養物を枯渇させ、食事補充を必要とする。これらの食事および状態では、一般的に、最適な栄養作用に必要な必須の微量栄養物、例えば金属（K、Ca、Fe、Zn、Mn、Se）およびイオン（PO4）が欠乏している。フィチン酸を多く含む食事はこの問題を悪化させ、さらに自発的または経済的理由による高フィチン酸食物を多く含む食事への依存から生じる慢性および急性症状をもたらしえる。
例えば、多様な低炭水化物（“低炭”）食を追求する人々はしばしば筋肉、例えば脚部筋肉、こむら返りに関する問題を抱えている。これについての典型的な助言は、彼らの食事に更なるカリウム、カルシウムおよび他の栄養物を加えることである。本発明は、食事補充用組成物、食餌補助物およびサプリメント、並びに食事補充のための方法を提供する。前記方法は、食事にフィターゼ（任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼを含む）を補充して多量栄養物および微量栄養物を動員することにより、そうでなければ損なわれる栄養作用を強化するために実施される。
本発明のある特徴では、食物および補充プロセスへの直接添加を適切にする熱不安定性またはpH安定性を示すように、および／または人間または動物の胃腸管で安定性および活性の強化を示すように、フィターゼの使用（例えば任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼの使用）が最適化される。
本発明はまた、フィターゼ（例えば任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼ）を含む新規な食餌サプリメントおよび添加物、並びにミネラル補充を受けている個体のためにそれらを使用する方法を提供する。フィチン酸含有量が高い食物に人間用にミネラルを補充することは実際には栄養物の利用性に関して問題を悪化させる可能性がある。文献によれば、フィチン酸、カルシウムおよび亜鉛の複合体は、フィチン酸とカルシウムの複合体よりもはるかに不溶性であると提唱されている。人間は多重ミネラルサプリメントをしばしば摂取する。高フィチン酸食物の存在下でミネラルサプリメントを一緒にするために考案した様式でフィターゼを添加すれば、これらサプリメントの効率がはるかに高められる可能性がある。
【０１９１】
また別の特徴では、本発明の組成物および方法（任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼを含む）は、サプリメントまたは添加物として以下に関して用いられる：
−特定の食物グループの摂取を制限する体重低下プログラム、獣肉、ナス属植物、パンなどの摂取を制限または排除する菜食主義食、長寿食または絶対菜食主義食、およびナッツ類の摂取に焦点を合わせた他の食事；
−高フィチン酸食物を多く含む低炭水化物食を摂取する人のミネラル摂取低下による生理学的症状の緩和のための特別サプリメント；
−食事の摂取を通して性能を高めることを希求する運動選手のトレーニング用養生食（軍隊の訓練用養生食を含む）；
−食物グループの摂取に問題があるかまたは制限される患者の特定の要求に合わせた病院食；
−微量栄養物が不足している、発展途上国の穀類および豆類の常食；
−学校給食プログラム。
本発明はまた、本発明の組成物（任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼを含む）および本発明の組成物または方法をこれら食事に取り入れることについての指示を含むキットを提供する。前記キットは任意のパッケージ、標識、製品挿入物などを含むことができる。
ある特徴では、本発明は、天然のフィターゼまたは本発明の最適化フィターゼを提供する。前記は、製造、加工または人間もしくは動物の系（例えば消化管）の通過のために処方または最適化（例えば配列の最適化）される。前記フィターゼ酵素はまた別の処方を用いて最適化することができる。
また別には、本発明のフィターゼ酵素または任意のフィターゼは、加工時、摂取時および人間の腸内で活性を保持するために、例えば定方向進化、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャル変異導入、部位特異的変異導入、再アッセンブリ、GSSMTMおよびそれらの任意の組合せをを用いてその配列を操作することによって最適化することができる。
【０１９２】
組成物（例えば任意のフィターゼ酵素または本発明のフィターゼ酵素を含む食事用処方物）は、多数の方法でデリバーされて食事の有効性を提供することができる。例えば、本発明は、以下の使用を含む組成物（例えば任意のフィターゼ酵素または本発明のフィターゼ酵素を含む食事用処方物または添加物）および方法を提供する：
−包装された食物サプリメント、例えば噛み砕くことができる錠剤または滋養スティック；
−摂取前に水和して利用できる凍結乾燥製品；
−食事用製品（例えば加工ダイズ製品）と一緒に包装されたもの、または、ダイズタンパク質の水解物および加工食品工業に成分として販売される全食品に由来する他の加工部分との処方物として販売されるもの；
−市販の焼成製品；
−朝食シリアルのふりかけ；
−噴霧投与処方物（例えば鼻用スプレー）；
−土着作物、すなわち穀類および豆類で発現されるトランスジェニック生成物（例えば微生物、例えば細菌のトランスジェニック生成物）；
−トランスジェニック生物（例えば微生物）（例えば、摂取または移植後、たとえばヒトまたは動物による摂取またはそれらの腸への移植後に発発明のフィターゼのような組換えフィターゼを産生（および他の態様では分泌）することの出来る、細菌または他の微生物がヒトや動物に与えられる）。
本発明のフィターゼ含有生成物および方法は、栄養強化能力、栄養物共存性能力が際立っているか、あるいは栄養物の性能を強化し栄養物の欠乏に付随する多様な症状を緩和するとしてブランド化することができる。
【０１９３】
本発明のフィターゼ含有生成物および方法は、フィテートの反栄養作用を緩和するために用いられる（フィテートは重要な食餌性ミネラル（例えば亜鉛、銅、鉄、マグネシウム、錫およびカルシウム）をキレートする）。したがって、本発明のフィターゼ含有生成物および方法は、摂取食物中の金属結合酵素およびタンパク質の沈殿防止のために食餌サプリメントとして用いられる。ある特徴では、本発明のフィターゼ含有生成物および方法は、人間の食事中のフィテート（特に豆類および穀類で豊富なもの）の反栄養作用を緩和するため、ミネラルの生体利用性を高めるために用いられる。ある特徴では、本発明の食餌サプリメント中のフィターゼは部分的または完全な加水分解を触媒して、フィテートからオルトホスフェートを除去する（この場合、フィテートの完全な加水分解は、1分子のイノシトールおよび6分子の無機リン酸塩の生成をもたらす）。
本発明のフィターゼ含有生成物および方法は、人間および多数の動物（家禽および魚類を含む）の食餌に適用することができる。例えば、本発明のフィターゼ含有食餌サプリメント製品および食餌サプリメントのための方法は、市場で重要な動物種、例えばブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、実験用げっ歯類（ラット、マウス、ハムスターおよびアレチネズミ）、毛皮用動物（例えばミンクおよびキツネ）および動物園動物（例えばサル、大型のサル）とともに家庭内哺乳動物（例えばネコおよびイヌ）に関して実施することができる。市場で重要な典型的な鳥類種には、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、カモ、キジ、エミュー、ダチョウ、アビ、ハト、オウム（parrot）、オカメインコ、オウム（cockatoo）、カナリア、ペンギン、フラミンゴおよびウズラが含まれる。商業的に飼育される魚類（例えばニジマス）もまた本明細書に記載の食餌補助物により利益を得よう。利益を得ることができる他の魚類には、例えば魚（特に水族館または養殖場にいるもの、例えば熱帯魚）、金魚および他の観賞用の鯉、ナマズ、マス、サケ、サメ、エイ、カレイ／ヒラメ、シタビラメ／シタガレイ、ティラピア、メダカ、グッピー、モーリー、プラティー、ソードテール、ゼブラフィッシュおよびドジョウが含まれる。
【０１９４】
本発明のフィターゼ含有製品および方法はまた、組織培養および／または細胞培養で用いられる多様な寒天、ゲル、媒体および溶液で用いられる。ばらつきのあるダイズ水解物は、組織培養および／または細胞培養を用いるときに遭遇する問題であることがある。ある特徴では、本発明のフィターゼ含有製品および方法は、細胞培養媒体の添加物として、または、例えば細胞培養収量を高めるための処置としておよび性能の一定性のために用いられる。ある特徴では、本発明は、フィターゼ（例えば本発明のフィターゼ）を含む細胞培養のための加水分解物を提供する。
ある特徴では、一定した生成物を提供するために、本発明は、フィターゼバイオマーカーを用いて、フィターゼを含む細胞培養用加水分解物、サプリメントまたは他の添加物を作製する方法を提供する。例えば、前記方法は、加水分解物、サプリメントまたは他の添加物のバッチでいくつかのフィターゼ分子を“採点”または“マーキング”し、続いて加水分解物、サプリメントまたは他の添加物のバッチをブレンドして一定したバイオマーカーパターンを達成することを含む。ある特徴では、各バッチによる培養性能をミニバイオリアクターで測定し、各バイオマーカーおよびバッチによる性能を相関させる。ある特徴では、ブレンドを実施して、一定性を有し平均よりも良好なより高性能の製品が生成される。ある特徴では、チオレドキシン（TRX）を添加して、ジスルフィド結合により生じる二次構造を排除することにより多くのタンパク質の生物利用性を高める。ある特徴では、プロテアーゼがまた、本発明の加水分解物、サプリメントまたは添加物に添加される。前記プロテアーゼを他のバイオマーカーとともに（上記で考察したようにフィターゼとともに）“採点”または品質管理してブレンドプロセスの指標とする。
ある特徴では、本発明は、本発明の加水分解物、サプリメントまたは添加物について上記で述べたプロセスと同様なバイオマーカーの“採点”または品質管理プロセスを用いて、一定した製品を提供するために穀物にフィターゼを添加する方法を提供する。
【０１９５】
軍人の能率および士気を高めるための酵素強化食：ある特徴では、本発明は、軍人の効率および士気を高めることを意図する酵素強化食事のために、フィターゼ（例えば任意のフィターゼまたは本発明のフィターゼ）を含む、新規な食事用サプリメントおよび添加物並びに食事を補充する方法を提供する。ある特徴では、本発明のこれら食事用サプリメント組成物はin situで機能し、安定した容易に使用できる所望の様式でエネルギー、スタミナおよび士気を高め、一方で食料の浪費を制限する。
ある特徴では、本発明のこれら食事用サプリメント組成物および方法は、栄養物の効率的デリバリーおよび兵士の関連する健康、士気および作戦遂行効率を含む軍事作戦上の課題を意図する。本発明は、人間の消化管で効率的に機能するように最適化した酵素を提供する。これらの酵素は、栄養物の抽出およびエネルギーの生成を強化するとともに、栄養物の充足性および個体の満足感を長期にわたって維持することができる。
フィターゼの他に、他の酵素、例えばアミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、リパーゼを用いて、本発明の食事用サプリメント組成物および方法が実施される。ある特徴では、本発明は、フィターゼ（例えば本発明のフィターゼ）および別の酵素（例えばアミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、リパーゼまたは前記の組合せ）を含む、処方物、食物サプリメント、食物、自己完結型携帯食料ユニット（MRE）、飲料、水化剤などを提供する。食物とともに摂取されたとき、これらの酵素は、重要な栄養物（例えばリン、必須金属および鉄、アミノ酸ならびに糖）の放出を高めることが示された。さらにまた、これらの酵素の同時摂取は、植物由来のセルロース、ヘミセルロースおよびデンプンの脱ポリマー化によって胃腸管の機能および吸収を高める。政府報告書は、軍人に対し栄養物利用強化を提供するために、軍事用食事へのサプリメントとしてこれら酵素の開発を提唱している。
【０１９６】
ある特徴では、本発明の食物サプリメントは、通常は抗栄養性である植物由来フィテートから必須のホスフェートを放出させ、食物エネルギー収量および骨のCaPO4沈積を増進する。ある特徴では、フィターゼおよび他の栄養性サプリメント酵素は、腸内pHおよび内因性プロテアーゼ活性に耐性を示すことができる。
ある特徴では、本発明は、一日分糧食、飲料、食物、MRE、水化剤などのための酵素サプリメントを提供して、訓練、戦闘または任意の高ストレス状況下にある軍人に供される軍事用食事（または任意の食事（一般の消費者の食事および食事補充用製品を含む））の栄養価、消化性およびエネルギー含量を改善する。本サプリメントは、使用および各人による持ち運びが容易であるように（MRE、水化剤などとしてまたは前記とともに）処方することができる。ある特徴では、酵素サプリメントは食物の外観、味および／または一定性を損なわないであろう。ある特徴では、本製品は軍人の健康を改善しスタミナを増進する。
また別の特徴では、本酵素サプリメントは多数の方法でデリバーされ、食事有効性を提供する。例えば、本発明は、フィターゼ（本発明のフィターゼを含む）を提供し、いくつかの特徴では追加の酵素を提供し、それらは以下の状態である：
−包装された食物または飲料サプリメント、例えばMRE、一日分糧食、生存用キット、水化剤、噛み砕くことができる錠剤または滋養スティック；
−摂取前に水和して利用できる凍結乾燥製品（例えば散剤）；
−食事用製品、食物、飲料と一緒に包装されたもの、例えば、加工ダイズ製品またはダイズタンパク質水分解物との処方物、および加工食品工業に成分として販売される全食品に由来する他の加工部分；
−焼成製品；
−シリアルのふりかけ；
−処方物、例えば錠剤、ゲルタブ、カプセル、スプレーなど。
【０１９７】
ある特徴では、本発明の組成物および方法は、摂取した食事から迅速にカロリー並びに多量および微量栄養物を放出する栄養補充物を提供する。ある特徴では、本発明の組成物および方法は、高ストレス状況（極めて激しい活動および断続的期間のデプラヴェーション（depravation）を含む）下の個体にエネルギーおよび体力を提供する。ある特徴では、本発明の組成物および方法は、人間の消化管で効率的に機能し、一方で所望の環境（例えば軍事的設定）において安定性、保存期間および輸送安定性を維持する、最適化され処方化された酵素を提供する。
ある特徴では、本発明の組成物および方法は、当該製品の味、非溶解性、咀嚼性、個々人による持ち運び効率がそれぞれ向上した処方物を提供する。ある特徴では、本発明の組成物および方法はさらに、他の成分（例えばカリウム、グルコース、CaCl2）を含む。、処方物中のCaCl2は放出されたホスフェートと結合し、続いて骨への沈積および重量獲得を強化する。ある特徴では、本発明の組成物および方法は、さらに他の酵素、例えばプロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼをそれぞれタンパク質、セルロースおよびヘミセルロースのために含む。これらの酵素はタンパク質およびデンプンの利用可能性を改善し、さらに多くの鉄に富む食物から鉄の吸収を高めることができる。
ある特徴では、本発明の組成物および方法は、さらに植物材料に由来する食物を加水分解する酵素を含む。植物材料は、グルコースおよびキシロース系ポリマー、セルロース、ヘミセルロースおよびデンプンとともにアミノ酸ポリマー、タンパク質に富む。ある特徴では、本発明の組成物および方法は、食物中のポリマー物質の加水分解を促進、すなわちポリマーからモノマーへの完全な消化、例えば多糖類から単糖へ、またはタンパク質からアミノ酸成分への消化を促進する。したがって、この特徴では、本発明の組成物および方法は、食物、飲料または一日分糧食についてその完全なカロリー価および栄養価を知ることを可能にする。ある特徴では、酵素補充は、安定な酵素、例えば多様な種類のヒドロラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、プロテアーゼおよび他の酵素の使用を含む。ある特徴では、本発明の組成物および方法で用いられる酵素は、胃腸環境条件に耐性（すなわち低pHおよび胃内プロテアーゼ存在下における安定性）を有しえる。
【０１９８】
フィターゼの工業的使用
上記に記載の事柄の他に、本発明はフィターゼについての新規な工業的使用（本発明の新規なフィターゼの使用を含む）を提供する。
環境におけるホスフェート汚染の減少：ある特徴では、本発明は、排泄物または有機肥料堆積物に添加して、“環境性”フィチン酸を変換するフィターゼ（本発明のフィターゼを含む）を含む組成物を提供する。ある特徴では、前記は、汚染の削減および栄養物の利用可能性の増進の目的に供される。本発明はまた、土壌、天然または人工の水の集まる場所（例えば湖、池、井戸、動物の排泄物溜めなど）、都市下水、任意の下水流出液などにフィターゼを添加するための組成物および方法を提供する。上記に記載したように、本発明は、排泄物または下水（例えば動物の排泄物）中のフィテートレベルを低下させる組成物および方法を提供し、この場合、前記動物は、有効量のフィターゼ（例えば本発明のフィターゼ）を含む食餌補助物を与えられる。本発明の組成物および方法の例示的応用は、環境中のホスフェート汚染の削減である。したがって、フィチン酸の分解によって汚染を減少させる任意の応用で本発明の組成物および方法を用いることができる。
農業経営および植物育成への応用：ある特徴では、本発明は、農業経営への応用または他の植物育成への応用のためにフィターゼ（本発明のフィターゼを含む）を含む組成物および方法を提供する（例えば肥料または植物（例えば家庭用植物）のための植物栄養添加物（例えばMIRACLEGROWTM）へのフィターゼの添加）。農業経営への応用のために本発明を用いる場合、使用者には有機農業経営者が含まれる。本発明の組成物および方法は、亜リン酸が不足しているか、または特定の作物もしくは適用のために亜リン酸の補充を必要とする任意の土壌にフィターゼを添加するために用いることができる。亜リン酸の放出は植物の生育を促進するので、藻類または植物材料を含むいずれのものにもフィターゼ添加のために、本発明の組成物および方法を用いることができる。
【０１９９】
製造製品：本発明は、本発明の1つ以上のフィターゼを含む多様な工場生産製品を提供する。例えば、ある特徴では、本発明は、化粧品への応用（例えば植物生成物を含むシャンプー、ローションまたは石鹸）のためにフィターゼ（本発明のフィターゼを含む）を含む組成物および方法を提供する。
ある特徴では、本発明は、フィターゼを固定化するためにフィターゼ（本発明のフィターゼを含む）を含む組成物および方法を提供する。ある特徴では、固定化されたフィターゼは、制御放出機構として機能する。例えば、ある特徴では、本発明は、土壌（例えば粘土）、家庭用植物などに適用するために、フィターゼの制御放出（経時放出）処方物を提供する。ある特徴では、フィターゼは、ビーズ（例えばポリソーブビーズ）に固定化される。これらのビーズは、例えば農業用植物または室内用植物のために土壌にデリバーすることができる。別の特徴では、本発明のフィターゼの制御放出（経時放出）処方物は、食餌サプリメントおよび添加物で用いられる。
バイオ燃料およびバイオマス変換：本発明は、本発明の1つ以上のフィターゼの使用を含む、燃料（例えばバイオ燃料）の製造方法を提供する。前記は、本発明の1つ以上のフィターゼを含む、燃料（例えばバイオ燃料）を提供することを含む。本発明は、本発明の1つ以上のフィターゼの使用を含む、バイオマス変換のための方法を提供する。
ある特徴では、本発明は、発酵またはアルコール生成プロセス（例えばエタノール製造）でフィターゼを使用するために、フィターゼ（本発明のフィターゼを含む）を含む組成物および方法を提供する。例えば、本発明の組成物および方法を用いて、石油系生成物の使用に対し効率的で使用に耐える代替物または付加物を、例えばバイオエタノールとガソリンの混合物として提供することができる。
本発明は、天然のバイオマス変換を必要とする化学的サイクルに参画させるために本発明の酵素を発現する生物を提供する。さらにまた、フィターゼ（例えば本発明の酵素）と1つ以上のデンプン分解酵素（例えばアミラーゼまたはグルコアミラーゼ）との組合せは、デンプンからエタノールの生成を改善する。本発明は、これらの重要で新規な“バイオマス変換”および代替エネルギー工業プロセスを可能にする、もっとも有効な酵素の発見および提供のための方法を提供する。
【０２００】
バイオマス変換およびクリーンなバイオ燃料の製造：本発明は、バイオマスまたは任意のリグノセルロース性物質（例えばセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンを含む任意の組成物）を、飼料、食物および化学物質の他に燃料（例えばバイオエタノール、バイオプロパノール、バイオブタノール、バイオプロパノール、バイオメタノール、バイオジーゼル）に加工するためのポリペプチド（酵素（本発明のフィターゼ）および抗体を含む）および方法を提供する。例えば、ある特徴では、本発明の酵素は、バイオマス（例えばリグノセルロース性物質、穀物またはオイルシード）中の非消化性フィチン酸（フィテート）を分解して消化可能な亜リン酸を放出する。したがって、ある実施態様では、本発明のフィターゼを用いてバイオマスを処理または前処理する。
したがって、本発明の組成物および方法をバイオ燃料の製造および／または加工で用いて、例えば、石油系生成物の使用に対し効率的で使用に耐える代替物または付加物を提供することができる。例えば、本発明の組成物および方法を酵素の混合物とともに用いてバイオ燃料（例えばバイオメタノール、バイオエタノール、バイオプロパノール、バイオブタノール、バイオジーゼルなど）を製造することができる（前記バイオ燃料はジーゼル燃料、ガソリン、ケロシンなどに添加することができる）。本発明は、天然のバイオマス変換を必要とする化学的サイクルに参画させるために本発明の酵素を発現する生物を提供する。ある特徴では、変換のための酵素および方法は、多糖類、セルロース性および／またはヘミセルロース性ポリマーを代謝可能な（例えば発酵可能な）炭素成分へ脱重合するとともにバイオマスを効率的に加工するために酵素アンサンブル中で用いられる。本発明は、これらの重要で新規な“バイオマス変換”および代替エネルギー工業プロセスを可能にする、もっとも有効な酵素の発見および提供のための方法を提供する。
本発明の組成物および方法は、石油系生成物の使用に対し、例えばバイオエタノール、バイオプロパノール、バイオブタノール、バイオプロパノール、バイオメタノールおよび／またはバイオジーゼルおよびガソリンなどの混合物として効率的で使用に耐える代替物または付加物を提供することができる。本発明は、天然のバイオマス変換を必要とする化学的サイクルに参画させるために本発明の酵素を発現する生物を提供する。本発明は、これらの重要で新規な“バイオマス変換”および代替エネルギー工業プロセスを可能にする、もっとも有効な酵素の発見および提供のための方法を提供する。
【０２０１】
本発明は、材料、例えばバイオマス材料（例えばセロオリゴ糖、アラビノキシランオリゴマー、リグニン、リグノセルロース、キシラン、グルカン、セルロースおよび／または発酵性糖を含む組成物）を加工するための方法、本発明の酵素および酵素混合物または“カクテル”を提供する。前記方法は、例えば前記組成物を本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドと接触させる工程を含み、この場合、前記材料は場合によって農業作物（例えばコムギ、オオムギ、ジャガイモ、スイッチグラス、ポプラ材）に由来するか、食品または飼料製造の副産物であるか、リグノセルロース性廃棄産物であるか、または、植物残渣または紙廃棄物もしくは紙製品廃棄物であり、さらに場合によって前記植物残渣は、茎、葉、外皮、殻、トウモロコシもしくはトウモロコシの穂軸、トウモロコシの実以外の部分、トウモロコシの線維、干し草、わら（例えば稲わらまたは小麦わら）、サトウキビバガス、サトウダイコンパルプ、かんきつ類パルプ、かんきつ類の皮、木材、木材の薄片、ウッドチップ、ウッドパルプ、パルプ廃棄物、木材廃棄物、鉋屑およびおがくず、建築および／または取り壊しの廃棄物およびゴミ（例えば木材、鉋屑およびおがくず）を含み、さらに場合によって前記紙廃棄物は、廃棄または使用済みコピー用紙、コンピュータプリンタ用紙、ノート紙、便箋紙、タイプ用紙、新聞、雑誌、厚紙、紙製包装材およびリサイクル紙材料を含む。さらにまた、都市ゴミ、例えば都市の固形ゴミの紙部分、都市部の木材廃棄物および都市部の立ち木の廃棄物を、糖類、デンプンおよび／またはセルロースを含む他の材料とともに用いることができる。また別の実施態様では、前記材料（例えばバイオマス材料）の加工によって、バイオアルコール（例えばバイオジーゼル、バイオエタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール）が生成される。
【０２０２】
あるいは、本発明のポリペプチドは、バイオマス植物素材または供給原料自体において発現されえる。
本発明の方法はまた、（本発明の酵素によって加工された）変換リグノセルロース性材料を取り入れる工程、およびそれを発酵および／または化学合成によって燃料（例えばバイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオジーゼル）にする工程を含む。ある特徴では、前記生成された糖を発酵させるか、および／または非発酵性の生成物はガス化される。
本発明の方法はまた、藻類、植物性バージンオイル（virgin vegetable oil）、植物廃油、動物脂肪および獣脂（例えば牛脂、ブタ脂、黄色グリース）、または下水を、本発明の酵素を用いて変換する工程、およびそれを発酵および／または化学合成もしくは変換によって燃料（例えばバイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオジーゼル）にする工程を含む。
【０２０３】
本発明の酵素（本発明の組換え酵素を産生する、およびいくつかの特徴では分泌する、例えば生物、例えば微生物（例えば菌類、酵母または細菌）を含む）は、任意のバイオマス変換プロセスのいずれの段階（例えばいずれか1つの工程、複数の工程）の中で用いても、または存在しても／組み入れてもよく、または、複数の工程の全て、またはバイオマス変換プロセスの以下の方法の全て、またはこれらバイオ燃料代替物の全てに存在してもよい：
−直接燃焼：もっとも単純なバイオマス技術である直接加熱による材料の燃焼は、バイオマス供給源が手近に存在する場合は非常に経済的である。
−熱分解：酸素の非存在下でのバイオマスの熱による分解である。ある特徴では、バイオマスは華氏約800度から1400度の温度で加熱されるが、燃焼支援のための酸素は導入されず、気体、燃料油および木炭の生成がもたらされる。
−ガス化：バイオマスを用い、加熱または嫌気的消化によりメタンを生成することができる。合成ガス（一酸化炭素および水素の混合物）をバイオマスから誘導することができる。
−埋立地ガス：ゴミ投棄場の埋立てゴミの腐敗（嫌気的消化）によって生成する。有機廃棄物が分解するとき、ほぼ50％のメタン（天然ガスの主成分）から成る気体が生成される。
−嫌気的消化：有機物質をメタン（天然ガスの主成分）および二酸化炭素の混合物に変換する。ある特徴では、バイオマス、例えば廃水（下水）、排泄物、または食品処理廃水を水と混合して、空気の非存在下で消化タンクに投入する。
−発酵：
アルコール発酵：燃料アルコールは、セルロース集合体および／またはデンプンを糖に変換し、この糖をアルコールに変換し、続いてアルコール水混合物を蒸留によって分離することによって製造される。供給ストック、例えば専用作物（トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、スイッチグラス、ススキ属植物（Miscanthus）、ポプラ材）、農業残渣および廃棄物（例えば稲わら、トウモロコシの実以外の部分、小麦わら、サトウキビバガス、籾殻、トウモロコシの線維、サトウダイコンパルプ、かんきつ類パルプ、およびかんきつ類の皮）、森林廃棄物（例えば硬木および軟木薄片、材木操作に由来する硬木および軟木残渣、鉋屑およびおがくず）、都市ゴミ（例えば市部の固形ゴミの紙部分、市部の木材廃棄物および市部の立ち木の廃棄物）、木材廃棄物（製紙工場廃棄物、パルプ工場廃棄物、建築廃棄物、取り壊し廃棄物、木材鉋屑およびおがくず）、および紙廃棄物または糖、デンプンおよび／またはセルロースを含む他の材料を、酵母を用いる発酵により、糖に続いてアルコールに変換することができる。あるいは、糖を含む材料は発酵により直接アルコールに変換することができる。
−エステル交換：油をバイオジーゼルに変換する例示的反応は、エステル交換と称される。エステル交換プロセスは、アルコール（メタノールのようなアルコール）を植物油、動物脂肪またはリサイクル獣脂に含まれるトリグリセリド油と反応させ、脂肪酸アルキルエステル（バイオジーゼル）およびグリセリンを生成する。この反応は熱および強力な塩基触媒（例えば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム）を要求する。
−バイオジーゼル：バイオジーゼルは、植物油、動物脂肪またはリサイクル獣脂から生成される脂肪酸アルキルエステルの混合物である。バイオジーゼルはその純粋な形態で自動車の燃料として用いることができるが、通常は、石油ジーゼル添加物として用いられ、ジーゼル車の微粒子、一酸化炭素、炭化水素および大気汚染物質のレベルを削減する。
−加水分解：本発明の酵素により触媒される、化合物、例えばバイオマス（例えばリグノセルロース物質）の加水分解を含む。
−コジェネレーション：ただ1つの燃料および設備を用いた2以上のエネルギー形態の同時生成である。ある特徴では、バイオマスコジェネレーションはバイオマス単独発電よりも高い潜在的成長を示す。なぜならば、コジェネレーションは熱および電気の両方を生成するからである。
【０２０４】
ある特徴では、本発明のポリペプチドを、他の酵素、例えばヒドロラーゼまたはセルロース分解活性を有する酵素（例えばグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、マンナーゼおよび／または他の酵素）と一緒に用いて、燃料、例えばバイオアルコール（例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオジーゼル）を、任意の有機材料、例えばバイオマス、例えば植物および動物に由来する組成物（任意の農業作物または他の再生可能供給ストック、農業残渣または動物の廃棄物を含む）、都市および工業廃棄物の有機成分、または建築もしくは取り壊しの廃棄物もしくは残渣、または微生物（例えば藻類または酵母）から生成することができる。
ある特徴では、本発明のポリペプチドを、リグノセルロースバイオマスを燃料（例えばバイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオジーゼル）に変換するプロセスで用いるか、あるいは、燃料（例えばバイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオジーゼル）として用いることができるようにバイオ材料を加水分解または消化するプロセス、またはバイオマスの燃料への加工を容易にするプロセスで用いる。
また別の特徴では、本発明のポリペプチド（本発明の酵素の混合物または“カクテル”を含む）は、アルコール（エタノール、プロパノール、ブタノール、プロパノール、メタノールのようなアルコール）を、植物油、動物脂肪またはリサイクル獣脂に含まれるトリグリセリド油と反応させ、脂肪酸アルキルエステル（バイオジーゼル）およびグリセリンを生成するエステル交換プロセスで用いられる。ある特徴では、バイオジーゼルはダイズ油またはリサイクル調理油から生成される。動物脂肪、他の植物油およびリサイクル油もまた、コストおよび利用可能性に応じてバイオジーゼルの生成に用いることができる。別の特徴では、全種類の脂肪および油の混合物を用いて本発明のバイオジーゼル燃料が生成される。
【０２０５】
本発明の酵素（本発明の酵素の混合物または“カクテル”を含む）はまたグリセリン精製に用いることができる。グリセリン副産物は、未反応触媒および酸で中和される石鹸を含む。水およびアルコールを除去して50％から80％の粗グリセリンが生成される。残りの夾雑物質には未反応脂肪および油が含まれ、前記を本発明のポリペプチドを用いて処理することができる。本発明の大きなバイオジーゼルプラントで、グリセリンは、製薬および化粧品工業用に例えば99％以上の純度にさらに精製することができる。
本発明のポリペプチド（本発明の酵素の混合物または“カクテル”を含む）を用いて生成された燃料（例えばバイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオジーゼルを含む）は、燃料酸素酸付加剤とともに用いて燃焼特性を改善させることができる。酸素添加はより完全な燃焼をもたらし、それによって一酸化炭素放出が削減される。これは、石油燃料のバイオ燃料（例えば本発明の燃料）による代替のまた別の環境性利点である。本発明の組成物および／または方法を用いて生成されるバイオ燃料をガソリンとブレンドしてE10ブレンド（約5％から10％のエタノールおよび約90％から95％のガソリン）を生成することができるが、前記はより高濃度で、例えばE85またはその純粋な形態で用いてもよい。本発明の組成物および／または方法を用いて生成されるバイオ燃料を石油ジーゼルとブレンドしてB20ブレンド（20％ジーゼルおよび80％石油ジーゼル）を生成することができるが、B100（純粋バイオジーゼル）までの他のブレンドレベルを用いることができる。
【０２０６】
本発明はまた、本発明の酵素を用いて、バイオマス（例えば植物誘導供給源、例えばリグノセルロースバイオマス）を含む組成物からバイオ燃料（バイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオジーゼルを含む）を生成するプロセスを提供する。前記バイオマス材料は、農業作物から、食品または飼料製造の副産物として、または廃棄生成物としてリグノセルロース廃棄生成物（例えば植物残渣、廃棄紙または建築廃棄物および／または取り壊し廃棄物もしくはゴミを含む）から入手することができる。本発明のポリペプチドによる処理に適した植物供給源または植物残渣の例には、ケルプ、藻類、穀物、種子、茎、葉、外皮、殻、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの実以外の部分、わら、サトウキビ、サトウキビバガス、草類（例えばインディアングラス（例えばソルガストルム・ヌータンス（Sorghastrum nutans））、またはスイッチグラス（例えばパニクム（Panicum）種、例えばパニクム・ヴィルガツム（P. virgatum））などとともに木材、木材チップ、木材パルプおよびおがくずが含まれる。本発明のポリペプチドによる処理に適した紙廃棄物の例には、廃棄コピー用紙、コンピュータプリンタ用紙、ノート紙、便箋紙、タイプライター用紙などとともに新聞、雑誌、厚紙および紙製包装材が含まれる。建築廃棄物および取り壊し廃棄物もしくはゴミの例には、木材、木材スクラップ、木材削り屑およびおがくずが含まれる。
ある実施態様では、本発明の酵素（本発明の酵素の混合物または“カクテル”を含む）および方法は、バイオマスからエタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール、プロパノールおよび／またはジーゼルを生成する、より“伝統的な”手段（例えば乾燥リグノセルロース材料をリアクター内で強酸の希釈溶液および金属塩を含む触媒に付すことによってリグノセルロース材料を加水分解することを含む方法）と一緒に用いることができる。これによってセルロース加水分解の活性化エネルギーおよび温度を低下させ、より高い糖の収量を達成することができる（例えば米国特許6,660,506号および6,423,145号を参照されたい）。
【０２０７】
本発明の酵素（本発明の酵素の混合物または“カクテル”を含む）の使用を含むまた別の例示的方法は、バイオマス（任意のリグノセルロース材料（例えばヘミセルロース、セルロースおよびリグニンを含む）および加水分解されえる他の任意の多糖類を含む）を、水性媒体中で主としてヘミセルロースの脱重合を達成し、セルロースからグルコースへの大量の脱重合は起こさないように選択した温度および圧力で、第一段階の加水分解工程に前記物質を付すことによって加水分解することを含む。この工程は、流動性水性相が、ヘミセルロースの脱重合により生じた分解単糖類を含み、固相がセルロースおよびリグニンを含むスラリーを生じる。第二段階の加水分解工程は、セルロースの少なくとも主要部分が加水分解されるような条件を含むことができ、そのような工程は、セルロースの分解／可溶性脱ポリマー化生成物を含む流動性水性相を生じる（例えば米国特許5,536,325号を参照されたい）。本発明の酵素（本発明の酵素の混合物または“カクテル”を含む）はこの例示的プロセスの任意の段階で添加することができる。
本発明の酵素（本発明の酵素の混合物または“カクテル”を含む）の使用を含むまた別の例示的方法は、リグノセルロース含有バイオマス材料を約0.4％から2％の強酸の希釈酸による1以上の加水分解段階によって処理する工程、および酸加水分解バイオマス材料の未反応固体リグノセルロース成分をアルカリ脱リグニンによって処理して生分解性熱塑性物質および誘導体のための前駆物質を生成する工程を含む（例えば米国特許6,409,841号を参照されたい）。本発明の酵素はこの例示的プロセスの任意の段階で添加することができる。
本発明の酵素（本発明の酵素の混合物または“カクテル”を含む）の使用を含むまた別の例示的方法は、リグノセルロース材料を予備加水分解リアクターで予備加水分解する工程；酸性液を前記固体のリグノセルロース材料に添加して混合物を生成する工程；前記混合物を反応温度に加熱する工程；リグノセルロース材料由来のリグニンの少なくとも約20％を含む可溶化部分およびセルロースを含む固体画分に前記リグノセルロース材料を分画するために十分な時間反応温度を維持する工程；反応温度でまたは反応温度近くで前記固体画分から可溶化部分を取り出す工程（この場合、前記固体画分中のセルロースは酵素消化をいっそう受けやすい傾向にある）；および可溶化部分を回収する工程を含む（例えば米国特許5,705,369号を参照されたい）。本発明の酵素はこの例示的処理方法の任意の段階で添加することができる。
【０２０８】
本発明は、本発明の酵素または方法を用いることによって生成した燃料級アルコールとブレンドした液体炭化水素をベースにした、モーター用燃料組成物（例えば火花点火モーター用）を製造する方法を提供する。ある特徴では、本発明の酵素の使用によって生成した燃料は、石炭ガス-液体もしくは天然ガス-液体エタノールブレンドを含む。ある特徴では、補助溶媒はバイオマス由来2-メチルテトラヒドロフラン（MTHF）である。例えば米国特許6,712,866号を参照されたい。
ある特徴では、例えばリグノセルロース材料からバイオ燃料（バイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオジーゼルを含む）を製造するために、リグノセルロースを酵素的に分解する本発明の方法はまた、バイオマス材料の超音波処理の使用を含むことができる（例えば米国特許6,333,181号を参照されたい）。
別の特徴では、セルロース基質からバイオ燃料（バイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオジーゼルを含む）を製造する本発明の方法は、セルロース基質、本発明の酵素および発酵因子を含む、スラリーの形態にある反応混合物を（例えば反応容器、例えば半持続固体補給バイオリアクター内で）提供する工程を含み、前記反応混合物を、発酵反応を開始させこれを持続させるために十分な条件下で反応させる（例えば米国特許出願20060014260に記載されている）。ある特徴では、実験または理論的計算によって最適補給頻度を決定することができる。ある特徴では、追加量のセルロース基質および酵素は、最適化補給頻度に応じた間隔で反応容器に提供される。
本発明のバイオ燃料（バイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオジーゼルを含む）を製造する、ある例示的プロセスは、米国特許出願公開公報20050069998；20020164730に記載されてあり、さらにある特徴では、リグノセルロースバイオマスを（15−30mmのサイズに）すり潰す工程；得られた生成物をリアクター内で1から10分の蒸気爆発前処理（例えば190−230℃）に付す工程；サイクロン内の前処理材料または関連する製造生成物を採集する工程；およびフィルタープレスでろ過することによって液体および固体画分を分離し、固体分画を発酵堆積物に導入し、1つ以上の本発明の酵素（例えばセルラーゼおよび／またはベータ-グルコシダーゼ酵素（例えばクエン酸緩衝液（pH4.8）に溶解する）を添加する工程を含む。
【０２０９】
本発明の酵素を用いて、本発明のバイオ燃料（バイオアルコール、例えばバイオエタノール、バイオメタノール、バイオブタノールまたはバイオプロパノール、またはバイオジーゼルを含む）を製造するまた別の例示的プロセスは、少なくともヘミセルロースおよびセルロースを含むリグノセルロース供給ストックを含む出発材料を前処理する工程を含む。ある特徴では、前記出発材料は、ジャガイモ、ダイズ（ナタネ）、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、エンバク、コムギ、テンサイもしくはサトウキビ、または食料もしくは飼料製造副産物の成分または廃棄物を含む。出発材料（“供給原料”）は、植物の線維構造を破壊してヘミセルロースおよびセルロースの部分的加水分解を達成する条件下で反応させる。破壊条件は、例えば、出発材料を180℃から270℃の平均温度でpH0.5から2.5に約5秒から60分間；または220℃から270℃の温度でpH0.5から2.5に約5秒から１２０秒間または等価な条件に付すことを含む。前記によって、酵素（例えば本発明のセルラーゼ酵素）の消化のために接近性が高められた供給原料が生成される（米国特許6,090,595号）。
リグノセルロース材料の加水分解で本発明の酵素を使用するための例示的条件には、約30℃から48℃の温度、および／または約4.0から6.0のpHでの反応が含まれる。他の例示的条件には、約30℃から60℃の温度、および約4.0から8.0のpHが含まれる。
グルカナーゼ（またはセルラーゼ）、マンナナーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、キサンタナーゼおよび／またはグリコシダーゼ、例えばセロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼおよび／またはベータ-グルコシダーゼを、PCT出願WO0043496およびWO8100857に記載されているようにバイオマスの燃料への変換およびエタノールの製造で用いることができる。グルカナーゼ（またはセルラーゼ）、マンナナーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、キサンタナーゼおよび／またはグリコシダーゼ、例えばセロビオヒドロラーゼ、マンナナーゼおよび／またはベータ-グルコシダーゼは、フィターゼ（例えば本発明の酵素）と一緒に用いて、発酵可能な糖および燃料エタノールに変換可能なグルカン含有バイオマスを製造することができる。アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、グルコイソメラーゼアルファ-グルコシダーゼなどをフィターゼ（例えば本発明の酵素）と一緒に用いて、デンプンを発酵可能な糖またはエタノールに変換することができる。PCT出願WO2005/096804を参照されたい。
【０２１０】
蒸留乾燥穀粒の加工：また別の特徴では、本発明の酵素を用いて、“蒸留乾燥溶解物（DDS）”、“蒸留乾燥穀粒（DDS）”、“濃縮蒸留溶解物（CDS）”、“蒸留湿潤穀粒（DWG）”および“蒸留乾燥穀粒および溶解物（DDGS）”を処理／加工することができる。蒸留乾燥穀粒は蒸留プロセスのシリアル副産物であってもよく、溶解物を含むことができる。これらのプロセスは、例えば飼料に利用される（例えば家禽、ウシ、ブタおよび他の家畜用）乾燥製粉プラント副産物を含むことができる。したがって、本発明の酵素を用いて、穀物（例えば任意の蒸留プロセスの副産物であるシリアル）を処理／加工することができる。前記プロセスは、任意の穀物源（例えば従来の醸造者由来の供給源、あるいはエタノール製造プラント（工場、製粉所など）由来の供給源）を用いるプロセスを含む。本発明の酵素を用いて、蒸留業の乾燥マッシュを処理／加工することができる。続いて前記マッシュを多様な目的、例えば家畜（特に反芻動物）の飼葉として用いることができる。したがって、本発明は、家畜（例えば反芻動物）用飼葉を加工する方法、および本発明のフィターゼを含む酵素加工飼葉を提供する。
本発明のフィターゼを単独または他の酵素と一緒に用いて、“蒸留乾燥溶解物（DDS）”、“蒸留乾燥穀粒（DDS）”、“濃縮蒸留溶解物（CDS）”、“蒸留湿潤穀粒（DWG）”および“蒸留乾燥穀粒および溶解物（DDGS）”を加工することができる。例えば、図14のイラストで示したように、本発明のフィターゼをアルコール製造プロセスの任意の工程で用いることができる。本発明のフィターゼを用いて、任意のバイオ燃料または潜在的バイオ燃料中のリンの生物利用性を高めることができる（前記リンは、“蒸留乾燥溶解物（DDS）”、“蒸留乾燥穀粒（DDS）”、“濃縮蒸留溶解物（CDS）”、“蒸留湿潤穀粒（DWG）”および“蒸留乾燥穀粒および溶解物（DDGS）”で見出されるリンを含む）（例えば以下を参照されたい：C. Martinez Amezcua, 2004 Poultry Science 83:971-976）。
【０２１１】
スピリッツまたは飲用アルコール製造：本発明のフィターゼはまた、（バイオ燃料の製造を目的とするバイオマスの加工における使用の他に）、アルコール製造（“スピリッツ”のようなアルコール、例えばビールまたはウィスキーの製造）のための蒸留乾燥穀粒の加工で用いることができる。本発明のフィターゼをエタノールプラントで穀物（例えばトウモロコシ）の加工に用いることができる。蒸留乾燥穀粒は、最初に穀物（例えばトウモロコシ）を粗挽きしさらに熱水に加えることによって生成することができる。冷却した後、酵母を添加し、混合物を数日から数週間発酵させる、発酵後に残留する固体が蒸留穀粒である。本発明のフィターゼはこのプロセスの任意の工程で用いることができる。
【０２１２】
処方物：本発明は、フィターゼ（例えば本明細書に記載のもの）を含む新規な処方物、およびフィターゼのための処方物（本発明の新規なフィターゼを含む処方物を含む）を提供する。本発明のフィターゼは、単独でまたはフィターゼの混合物またはフィターゼと他の酵素（例えばキシラナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ）またはレドックス酵素（例えばラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、オキシダーゼまたはレダクターゼ）の混合物として用いられるか、または処方されえる。それらは、固体形（例えば散剤、凍結乾燥調製物、顆粒、錠剤、棒状物、結晶、カプセル、ピル、ペレット）、または液体形（例えば水溶液、エーロゾル、ゲル、ペースト、スラリー、水性/油性乳濁液、クリーム、カプセル、または小胞もしくはミセル懸濁物として）で処方して用いることができる。本発明の処方物は、任意の以下の成分またはその組合せを含むことができる：ポリオール（例えばポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセロール）、糖（例えばシュクロース、ソルビトール、トレハロース、グルコース、フラクトース、マルトース、マンノース）、ゲル形成剤（例えばグアーゴム、カラギーナン、アルギネート、デキストラン、セルロース誘導体、ペクチン、塩（例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、脂肪酸の塩および脂肪酸誘導体）、金属キレート剤（例えばEDTA、EGTA、クエン酸ナトリウム）、抗菌剤（例えば脂肪酸または脂肪酸誘導体、パラベン、ソルベート、ベンゾエート）、酵素の影響を阻止するためのまた別の調節化合物、例えばプロテアーゼ、粗タンパク質（例えばBSA、コムギ水解物）、ホウ酸化合物、アミノ酸またはペプチド）、適切なpHまたは温度調節化合物、乳化剤（例えば非イオン性および／またはイオン性界面活性剤、レドックス剤（例えばシスチン／システイン、グルタチオン、酸化グルタチオン、還元または抗酸化化合物（例えばアスコルビン酸）ロウもしくは油、または分散剤。架橋およびタンパク質改変（例えばPEG化）、脂肪酸修飾、グリコシル化もまた用いて酵素の安定性を改善することができる。
【０２１３】
代謝パラメーターの測定
本発明の方法は、細胞の遺伝的組成を改変することによって、新規な表現型を有する新規な細胞株を開発するために全細胞進化または全細胞操作を必要とする。この場合、遺伝的組成は、本発明の核酸を細胞に添加することによって改変される。新規な表現型を検出するために、改変細胞の少なくとも1つの代謝パラメーターを、細胞内で“リアルタイム”または“オンライン”タイムフレームによりモニターする。ある特徴では、複数の細胞（例えば細胞培養）を“リアルタイム”または“オンライン”でモニターされる。ある特徴では、複数の代謝パラメーターが“リアルタイム”または“オンライン”でモニターされる。
代謝フラックス分析（MFA）は公知の生化学フレームワークに拠る。線形独立代謝行列は、質量変換の法則および細胞内代謝における擬似定常状態仮説（PSSH）に基づいて構築される。本発明の方法の実施では、以下を含む代謝ネットワークが確立される：
−全経路の基質、生成物および中間代謝物の実体、
−当該経路の代謝物を相互に変換する全化学反応の実体、当該経路の反応の化学量論、
−反応を触媒する全酵素の実体、酵素反応の動態、
−経路の成分間の調節性相互作用、例えばアロステリック相互作用、酵素-酵素相互作用など、
−酵素の細胞内区画化または酵素の任意の他の超分子的組織化、および
−代謝物、酵素もしくはエフェクター分子の任意の濃度勾配、またはそれらの移動に対する拡散障壁の存在。
いったんある株についての代謝ネットワークを構築したら、行列概念による数学的提示を導入して、オンラインメタボロームデータが利用可能な場合には細胞内代謝フラックスを概算することができる。
代謝表現型は、細胞内の全代謝ネットワークの変化に左右される。代謝表現型は、環境条件、遺伝子調節、発育状態および遺伝子型などに関係する経路利用の変化に左右される。本発明の方法のある特徴では、オンラインMFAの計算後に、細胞の動的対応、それらの表現型および他の特性を経路の利用を精査することによって分析する。例えば、酵母の発酵中にグルコース供給が増加し、酸素が減少するならば、呼吸経路の利用は減少および／または停止し、発酵経路の利用が支配的となろう。細胞培養の生理学的状態の制御は、経路分析の後で可能となろう。本発明の方法は、基質供給、温度、誘発物質の使用などがどのように変化するかを決定することによって発酵の操作の仕方を決定し、細胞の生理学的状態を制御して所望の方向に移動させるために役立ちえる。本発明の方法の実施では、MFAの結果をまたトランスクリプトームおよびプロテオームデータと比較して、代謝操作または遺伝子シャッフリングのために実験およびプロトコルを操作することができる。
本発明の方法の実施では、任意の改変されたまたは新規な表現型（細胞内の新規なまたは改変された特性を含む）が付与され検出される。代謝および成長の任意の局面をモニターすることができる。
【０２１４】
mRNA転写物の発現のモニタリング：本発明のある特徴では、操作された表現型は、細胞内でのmRNA転写物の発現の増加もしくは低下または新規な転写物の生成を含む。mRNA転写物（またはメッセージ）は当分野で公知の任意の方法（例えばノザンブロット、定量的増幅反応、アレイへのハイブリダイゼーションなどを含む）によって検出および定量することができる。定量的増幅反応には、例えば定量的PCR（例えば定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応またはRT-PCR、定量的リアルタイムRT-PCRまたは“リアルタイムカイネティックRT-PCR”を含む）が含まれる（例えば以下を参照されたい：Kreuzer (2001) Br J Haematol 114:313-318；Xia (2001) Transplantation 72:907-914）。
本発明のある特徴では、操作された表現型は、相同遺伝子の発現をノックアウトすることによって生成される。前記遺伝子のコード配列または1つ以上の転写制御エレメント（例えばプロモーターまたはエンハンサー）をノックアウトすることができる。したがって、転写物の発現を完全に停止させるか、または単に低下させることができる。
本発明のある特徴では、操作された表現型は、相同遺伝子の発現の増加を含む。前記は、負の制御エレメント（cis-またはtrans-で作用する転写調節エレメントを含む）をノックアウトするか、または陽性制御エレメントに変異を導入することによって達成することができる。
下記で詳細に考察するように、細胞転写物の1つ以上または全てを、細胞転写物を含むサンプルのハイブリダイゼーションによって測定することができ、細胞転写物を表す核酸または前記と相補的な核酸はアレイに固定した核酸とのハイブリダイゼーションによって測定することができる。
【０２１５】
ポリペプチド、ペプチドおよびアミノ酸の発現のモニタリング：本発明のある特徴では、操作された表現型は、細胞内でのポリペプチドの発現の増加もしくは低下または新規なポリペプチドの生成を含む。ポリペプチド、ペプチドおよびアミノ酸は当分野で公知の任意の方法によって検出および定量することができる。前記方法には例えば以下が含まれる：核磁気共鳴（NMR）、分光分析法、ラジオグラフィー（タンパク質放射能標識）、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、高拡散クロマトグラフィー、種々の免疫学的方法（例えば免疫沈澱、免疫拡散、免疫電気泳動、放射能免疫アッセイ（RIA）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、免疫蛍光アッセイ、ゲル電気泳動（例えばSDS-PAGE）、抗体による染色、蛍光活性化細胞分類法（FACS）、熱分解質量分析、フーリエ変換赤外分光分析、ラマン分光分析、GC-MS、およびLC-エレクトロスプレーおよびcap-LC-タンデムエレクトロスプレー質量分析法など。新規な生物活性はまた、米国特許6,057,103号に記載された方法またはその変型を用いてスクリーニングすることができる。さらにまた、下記で詳細に考察されているように、細胞の1つ以上のポリペプチドまたは全てのポリペプチドを、タンパク質アレイを用いて測定することができる。
生合成により誘導される、タンパク質原性アミノ酸の分別13C標識は、13C均質標識および未標識炭素源化合物の混合物をバイオ反応ネットワークに供給することによってモニターすることができる。生じた標識パターンの分析によって、ネットワークトポロジーの包括的性状決定およびアミノ酸の代謝フラックス比の決定の両方が可能になる（例えば以下を参照されたい：Szyperski (1999) Metab Eng 1:189:197）。
以下の実施例は説明を目的としているが、本発明を制限しようとするものではない。実施例に記載する方法は、本発明のある種の特徴を実施するために用いることができる典型的な方法であるが、当業者に公知の他の方法もまた用いることができる。
【実施例１】
【０２１６】
実施例１．本発明の例示的フィターゼの活性特徴付け
この実施例では、親フィターゼ配列番号２の配列改変体（いわゆる「進化」フィターゼ）である本発明のポリペプチドのフィターゼ活性の特徴付けおよび例示的フィターゼ活性アッセイについて記載する。
本発明のGSSM-改変核酸配列を発現させることによって本発明のポリペプチドを生成したのち、この“進化”フィターゼポリペプチド−この実験では単一残基変異の例示的ポリペプチド種のみ−を精製し、30分間種々の温度にて熱処理した(pH7.0、0.01％Tween）。この熱処理工程後、サンプル（20μL)を蛍光基質(180μL)4mM DiFMUPでpH5.5にてアッセイした。割合を対応する各非熱処理サンプルの割合と比較した。結果を図5に図示した。
別の実験では、“混合”単一変異を含む本発明の“進化”フィターゼ（すなわち、複数の変異を含むフィターゼ）をLBCARB100TM(LBcarb100)中30℃にて一晩増殖させた。各培養物（混合変異体）の100μLをサーマルサイクラー上で72℃から100℃まで熱処理した。熱処理物の20μLを180μLの4mM DiFMUPとpH5.5にて混合した。割合を各対応する非処理サンプルと比較し、図６にまとめた。図７に示した表は図６のグラフを作成するてために用いたデータを図にまとめたのもである（四捨五入した）。
サンプル１から21は、図９のチャートに図示した、親配列番号２の“混合”単一変異に対応する；“進化”フィターゼ10番はGSSMによって導入されたものでない（配列番号２からの）配列残基改変を有することに注意されたし；この変異は偶然に導入されたものであって、本発明の例示的フィターゼの熱安定性に関係するかもしれないが関係しないかもしれない。また、**の印を付けた例示的フィターゼ19、20および21はC-末端ヒスチジン(6xHis)タグ(-RSHHHHHH)を有することにも注意されたし。図９は、本明細書で詳細に記載した、親配列番号２に対して複数の残基改変を有する例示的フィターゼを図解したものである。図１０は本明細書で詳細に記載した、親配列番号２に対して単一残基改変を有する例示的フィターゼを図解したものである。
図１１は蛍光基質4-メチルウンベリフェリルホスフェート(MeUMB-ホスフェート、その構造も図示した）を用いた、本発明の例示的フィターゼアッセイの模式図である：(i)フィターゼを20分間72℃、pH4.5にて熱負荷をかける；さらに生理的pH(pH7.4)にて80℃で熱負荷をかける；および(ii)残存活性を37℃、pH4.5にてテストする。
・高pHおよび低pHの両方で残存活性を測定する、
・熱処理した野生型に対する残存活性を計算する。
図１２は、蛍光基質MeUMB-ホスフェートを用いる別の本発明の例示的フィターゼアッセイの模式図である：(i)フィターゼを30分間86℃、pH5.5にて熱負荷をかける；および(ii)残存活性を37℃、pH4.5にてテストする。
・6X変種コントロールに対する残存活性を測定する、
・ヒットを選別し、トップ変種を選別するためにより高いストリンジェンシーにて再アッセイする。
このアッセイを用いて、コードされるポリペプチドのフィターゼ活性についてアッセイすることにより、（配列番号１）のGSSM変種のライブラリーをスクリーニングした。図１３はこのライブラリースクリーニングのプロトコル（図１２に記載）の模式図である。ここではスクリーニングされたライブラリーサイズは24,576個の変種である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年9月8日(2010.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）−（ｅ）を含む、単離、合成または組換え核酸：
（a）（i）フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号:1に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%またはそれより高い配列同一性を有し、さらに、
139から141位のヌクレオチドがTTTまたはTTC；
289から291位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
289から291位のヌクレオチドがGAAまたはGAG；
406から408位のヌクレオチドがCATまたはCAC；
475から477位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
475から477位のヌクレオチドがGAAまたはGAG；
487から489位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
490から492位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
502から504位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
535から537位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
676から678位のヌクレオチドがGATまたはGAC；
697から699位のヌクレオチドがTGG；
823から825位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
865から867位のヌクレオチドがGCT、GCC、GCAまたはGCG；
1045から1047位のヌクレオチドがTATまたはTAC；および
1087から1089位のヌクレオチドがCCA、CCC、CCGまたはCCT
から成る群から選択される、配列番号:1に対するヌクレオチド塩基対配列改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含む核酸配列；
（ii）フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号:1に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、さらに、
139から141位に相当する位置のヌクレオチドがTTTまたはTTC；
289から291位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
289から291位に相当する位置のヌクレオチドがGAAまたはGAG；
406から408位に相当する位置のヌクレオチドがCATまたはCAC；
475から477位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
475から477位に相当する位置のヌクレオチドがGAAまたはGAG；
487から489位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
490から492位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
502から504位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
535から537位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
676から678位に相当する位置のヌクレオチドがGATまたはGAC；
697から699位に相当する位置のヌクレオチドがTGG；
823から825位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
865から867位に相当する位置のヌクレオチドがGCT、GCC、GCAまたはGCG；
1045から1047位に相当する位置のヌクレオチドがTATまたはTAC；および
1087から1089位に相当する位置のヌクレオチドがCCA、CCC、CCGまたはCCT
から成る群から選択される、配列番号:1に対するヌクレオチド塩基対配列改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含む核酸配列；
（iii）フィターゼ活性を有し、さらに
配列番号:2のアミノ酸47位のアミノ酸アラニンがフェニルアラニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸97位のアミノ酸システインがバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸97位のアミノ酸システインがグルタミン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸136位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに変化；
配列番号:2のアミノ酸159位のアミノ酸アスパラギンがバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸159位のアミノ酸アスパラギンがグルタミン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸163位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸164位のアミノ酸アスパラギン酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸168位のアミノ酸グルタミン酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸179位のアミノ酸グリシンがアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸226位のアミノ酸システインがアスパラギン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸233位のアミノ酸バリンがトリプトファンに変化；
配列番号:2のアミノ酸275位のアミノ酸グルタミンがバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸289位のアミノ酸アルギニンがアラニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸349位のアミノ酸スレオニンがチロシンに変化；および
配列番号:2のアミノ酸363位のアミノ酸ロイシンがプロリンに変化
から成る群から選択される、配列番号:2に対するアミノ酸残基改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含む配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；若しくは、
（iv）フィターゼ活性を有し、
配列番号:2のアミノ酸47位のアラニンに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸97位のシステインに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸97位のシステインに相当する位置のアミノ酸がグルタミン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸136位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに変化；
配列番号:2のアミノ酸159位のアスパラギンに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；配列番号:2のアミノ酸159位のアスパラギンに相当する位置のアミノ酸がグルタミン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸163位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸164位のアスパラギン酸に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸168位のグルタミン酸に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸179位のグリシンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；配列番号:2のアミノ酸226位のシステインに相当する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸233位のバリンに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに変化；
配列番号:2のアミノ酸275位のグルタミンに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸289位のアルギニンに相当する位置のアミノ酸がアラニンに変化；配列番号:2のアミノ酸349位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がチロシンに変化；および
配列番号:2のアミノ酸363位のロイシンに相当する位置のアミノ酸がプロリンに変化
から成る群から選択される、配列番号:2に対するアミノ酸残基改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含む配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b）フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするが、シグナル配列もしくはプロタンパク質配列または同種プロモーター配列を欠く（a）の核酸（ポリヌクレオチド）配列；
（c）フィターゼ活性を有し、さらに異種アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする（a）または（b）の核酸（ポリヌクレオチド）、または異種ヌクレオチド配列を含む（a）または（b）の核酸（ポリヌクレオチド）；
（d）（c）の核酸（ポリヌクレオチド）であって、前記異種アミノ酸配列が、異種（リーダー）シグナル配列またはタグもしくはエピトープを含むかまたは前記から成るか、または前記異種ヌクレオチド配列が異種プロモーター配列を含む、前記（c）の核酸（ポリヌクレオチド）；または、
（e）（a）から（ｄ）のいずれかの核酸（ポリヌクレオチド）配列に完全に相補的な核酸配列。
【請求項２】
発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクターであって、
（i）請求項1に記載の核酸を含むか、または請求項1に記載の核酸をその中に収納している、前記発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクター；または
（ii）前記クローニングビヒクルが、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージまたは人工染色体を含むか、または前記であり、さらに場合によって、前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ関連ウイルスベクターを含み、さらに場合によって前記発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクターが、細菌人工染色体、プラスミド、バクテリオファージP1-由来ベクター（PAC)、酵母人工染色体（YAC）、哺乳動物人工染色体（MAC）を含むか、または前記に収納される、前記（i）の発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクター。
【請求項３】
形質転換細胞または宿主細胞であって、
（i）請求項1に記載の核酸または請求項2に記載の発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクターを含む、前記形質転換細胞または宿主細胞；または
（ii）細菌細胞、哺乳動物細胞、菌類細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞である、前記（i）の形質転換細胞または宿主細胞；
（iii）細菌細胞が、エシェリキア属、バチルス属、ストレプトミセス属、サルモネラ属、シュードモナス属もしくはスタフィロコッカス属、または大腸菌、ラクトコッカス・ラクチス、枯草菌、バチルス・セレウス、ネズミチフス菌、シュードモナス・フルオレセンス内のいずれかの種である、前記（ii）の形質転換細胞または宿主細胞。
【請求項４】
トランスジェニック非ヒト動物であって、
（i）請求項1に記載の核酸、または請求項2に記載の発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクター、を含む、前記トランスジェニック非ヒト動物；または
（ii）マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ブタまたはウシである、前記（i）のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
トランスジェニック植物または種子であって、
（i）請求項1に記載の核酸、または請求項2に記載の発現カセット、ベクター、クローニングビヒクル、発現ベクター、クローニングベクター、を含む、前記トランスジェニック植物または種子；または
（ii）場合によって、前記植物が、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、コムギ、オイルシード植物、アブラナ、ダイズもしくはタバコ、または動物用もしくは反芻動物用の飼葉および／または飼料植物であり、さらに場合によって、前記飼葉または飼料植物が、干草、トウモロコシ、アワ、ダイズ、コムギ、ソバ、オオムギ、アルファルファ、ライムギ、一年生牧草、ソルガム、モロコシ属牧草、ヴェルトグラス（veldt grass）またはブッフェルグラス（buffel grass）であるか；または前記種子が、トウモロコシ、コムギ、オイルシード植物、ナタネ、ダイズ、ヤシ、ヒマワリ、ゴマ、落花生、アルファルファ、綿実、ベニバナ、ソルガム、エンバク、ライムギ、アワ、オオムギ、コメ、エンドウまたはタバコの種子であり、さらに場合によって前記植物が、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、ブラシカ（Brassica）、ダイズ、サトウキビ、ワタ、ベニバナ、落花生、ソルガム、コムギ、エンバク、ライムギ、アワ、オオムギ、コメ、針葉樹、エンドウ、インゲン、ダイズ、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、タロイモ、カンナまたはテンサイである、前記（i）のトランスジェニック植物または種子。
【請求項６】
以下の（a）−（ｆ）を含む、単離、合成または組換えフィターゼポリペプチド：
（a）（i）配列番号:2に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、さらに、
139から141位のヌクレオチドがTTTまたはTTC；
289から291位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
289から291位のヌクレオチドがGAAまたはGAG；
406から408位のヌクレオチドがCATまたはCAC；
475から477位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
475から477位のヌクレオチドがGAAまたはGAG；
487から489位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
490から492位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
502から504位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
535から537位のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
676から678位のヌクレオチドがGATまたはGAC；
697から699位のヌクレオチドがTGG；
823から825位のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
865から867位のヌクレオチドがGCT、GCC、GCAまたはGCG；
1045から1047位のヌクレオチドがTATまたはTAC；および
1087から1089位のヌクレオチドがCCA、CCC、CCGまたはCCT
から成る群から選択される、配列番号:1に対するヌクレオチド塩基対配列改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列；
（ii）配列番号:2に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、さらに、
139から141位に相当する位置のヌクレオチドがTTTまたはTTC；
289から291位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
289から291位に相当する位置のヌクレオチドがGAAまたはGAG；
406から408位に相当する位置のヌクレオチドがCATまたはCAC；
475から477位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
475から477位に相当する位置のヌクレオチドがGAAまたはGAG；
487から489位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
490から492位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
502から504位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
535から537位に相当する位置のヌクレオチドがCGT、CGC、CGA、CGG、AGAまたはAGG；
676から678位に相当する位置のヌクレオチドがGATまたはGAC；
697から699位に相当する位置のヌクレオチドがTGG；
823から825位に相当する位置のヌクレオチドがGTT、GTC、GTAまたはGTG；
865から867位に相当する位置のヌクレオチドがGCT、GCC、GCAまたはGCG；
1045から1047位に相当する位置のヌクレオチドがTATまたはTAC；および
1087から1089位に相当する位置のヌクレオチドがCCA、CCC、CCGまたはCCT
から成る群から選択される、配列番号:1に対するヌクレオチド塩基対配列改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列； 
（iii）配列番号:2のアミノ酸47位のアミノ酸アラニンがフェニルアラニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸97位のアミノ酸システインがバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸97位のアミノ酸システインがグルタミン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸136位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに変化；
配列番号:2のアミノ酸159位のアミノ酸アスパラギンがバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸159位のアミノ酸アスパラギンがグルタミン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸163位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸164位のアミノ酸アスパラギン酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸168位のアミノ酸グルタミン酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸179位のアミノ酸グリシンがアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸226位のアミノ酸システインがアスパラギン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸233位のアミノ酸バリンがトリプトファンに変化；
配列番号:2のアミノ酸275位のアミノ酸グルタミンがバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸289位のアミノ酸アルギニンがアラニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸349位のアミノ酸スレオニンがチロシンに変化；
および配列番号:2のアミノ酸363位のアミノ酸ロイシンがプロリンに変化
から成る群から選択される、配列番号:2に対するアミノ酸残基改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含むアミノ酸配列； 若しくは、
（iv）配列番号:2のアミノ酸47位のアラニンに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸97位のシステインに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸97位のシステインに相当する位置のアミノ酸がグルタミン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸136位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに変化；
配列番号:2のアミノ酸159位のアスパラギンに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸159位のアスパラギンに相当する位置のアミノ酸がグルタミン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸163位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸164位のアスパラギン酸に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸168位のグルタミン酸に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸179位のグリシンに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸226位のシステインに相当する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に変化；
配列番号:2のアミノ酸233位のバリンに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに変化；
配列番号:2のアミノ酸275位のグルタミンに相当する位置のアミノ酸がバリンに変化；
配列番号:2のアミノ酸289位のアルギニンに相当する位置のアミノ酸がアラニンに変化；
配列番号:2のアミノ酸349位のスレオニンに相当する位置のアミノ酸がチロシンに変化；
および
配列番号:2のアミノ酸363位のロイシンに相当する位置のアミノ酸がプロリンに変化
から成る群から選択される、配列番号:2に対するアミノ酸残基改変の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13または14全てを含むアミノ酸配列を含むアミノ酸配列；
（b）フィターゼ活性を有するが、シグナル配列またはプロタンパク質配列を欠く（a）のポリペプチド；
（c）フィターゼ活性を有し、さらに異種配列を含む（a）のポリペプチド；
（d）（c）のポリペプチドであって、前記異種アミノ酸配列が、異種（リーダー）シグナル配列またはタグもしくはエピトープを含むかまたは前記から成るか、または前記異種配列が識別ペプチドを含む前記（c）のポリペプチド；
（e）（a）から（d）のいずれかのポリペプチドであって、（i）前記ポリペプチドがグリコシル化されているか、または前記ポリペプチドが少なくとも1つのグリコシル化部位を含むか、（ii）（i）のポリペプチドでグリコシル化がN-結合グリコシル化またはO-結合グリコシル化であるか、または（iii）（i）または（ii）のポリペプチドが酵母細胞で発現された後でグリコシル化されるか、または（iv）（iii）のポリペプチドで酵母細胞が、P.パストリスまたはS.ポンベである、前記（a）から（d）のいずれかのポリペプチド；または、
（ｆ）（a）から（ｅ）のいずれかのポリペプチドであって、前記ポリペプチドがさらにシグナル配列（リーダー配列またはリーダーペプチド）と前記酵素との間にまた別のアミノ酸残基を含む、前記（a）から（e）のいずれかのポリペプチド。
【請求項７】
以下の工程を含む、組換えポリペプチドを製造する方法：
（a）核酸を提供する工程であって、前記核酸が請求項1に記載の配列を含む、前記工程；（b）ポリペプチドの発現を許容する条件下で工程（a）の核酸を発現させ、それによって組換えポリペプチドを製造する工程、および、場合によって、工程（a）の核酸で宿主細胞を形質転換し、続いて工程（a）の核酸を発現させ、それによって形質転換宿主細胞で組換えポリペプチドを製造する更なる工程。
【請求項８】
以下を含む、イノシトールヘキサホスフェートをイノシトールと無機ホスフェートに加水分解する方法：
（i）（a）フィターゼ活性を有するポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程であって、前記ポリペプチドは請求項６に示したアミノ酸配列を含む、前記工程；（b）イノシトールヘキサホスフェートを含む組成物を提供する工程；および（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の組成物と、前記ポリペプチドがイノシトールヘキサホスフェートを加水分解してイノシトールおよび無機ホスフェートを生成する条件下で接触させる工程；
（ii）前記条件が、約37℃から約70℃、約50℃から約80℃、または約60℃から約90℃の間の温度を含む、前記（i）の方法；または
（iii）前記組成物がフィチン酸を含む、前記（i）または（ii）の方法。
【請求項９】
以下の工程を含む、油を脱ガムする方法：
（a）フィターゼ活性を有するポリペプチドまたは請求項1に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程であって、前記ポリペプチドが請求項６に示したアミノ酸配列を含む、前記工程；（b）植物油を含む組成物を提供する工程；および（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の植物油と、前記ポリペプチドがイノシトール-無機ホスフェート結合を切断する条件下で接触させ、それによって植物油を脱ガムする工程。
【請求項１０】
以下を含む、動物飼料または食品または飼料もしくは食品サプリメントを製造する方法：
（i）（a）植物、植物部分または植物細胞を、フィターゼ酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換する工程であって、前記フィターゼが請求項６に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは請求項1に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、前記工程；（b）前記植物、植物部分または植物細胞を、前記フィターゼ酵素が発現される条件下で培養する工程；および（c）前記植物、植物部分または植物細胞を、動物飼料または食品または飼料もしくは食品サプリメントに適した組成物に変換するか、または前記培養植物、植物部分または植物細胞を動物飼料または食品または飼料もしくは食品サプリメントに添加し、それによって動物飼料、または食品、または飼料もしくは食品サプリメントを製造する工程；
（ii）前記ポリヌクレオチドが発現ベクター内に収納され、さらに場合によって前記ベクターが、前記植物細胞内で核酸を発現させることができる発現制御配列を含む、前記（i）の方法；
（iii）前記動物が単胃動物であり、さらに場合によって前記動物が反芻動物である、前記（ii）の方法；または
（iv）前記動物飼料または食品または飼料もしくは食品サプリメントが、デリバリーマトリックス、ペレット、錠剤、ゲル、液体、スプレー、ひき割り穀物または粉末の形態として存在する、前記（i）から（iii）のいずれかの方法；
（v）フィターゼ酵素がグリコシル化されているか、またはフィターゼ酵素がペレット化条件で耐熱性または熱安定性であるようにグリコシル化されている、（i）〜（iv）のいずれかの方法；
（vi）前記デリバリーマトリックスが、穀物胚芽およびフィターゼ酵素を含む混合物をペレット化して粒子を生成することによって形成され、さらに場合によって前記ペレットが蒸気の適用を含む条件下で生成され、場合によって前記ペレットが80℃を超える温度を約5分間適用する工程を含む条件下で製造され、さらに場合によって、前記ペレットが、酵素1ミリグラム当たり少なくとも350から約900単位の比活性を含むフィターゼ酵素を含む、前記（iv）または（v）の方法。
【請求項１１】
（a）請求項６に記載のポリペプチド；および（b）表2に記載の生成物のいずれか、または表1に列挙される組成物のいずれかを含む組成物であって、場合によって、タンパク質調製物、医薬、食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食用または吸収性酵素デリバリーマトリックス、食餌用処方物、自己完結型携帯食糧ユニット(MRE)、飲料、水化剤、噛み砕くことができる錠剤、ダイズ食品、焼成品または朝食用シリアルである、または、タンパク質調製物、医薬、食品、飼料、食品サプリメント、飼料サプリメント、食用または吸収性酵素デリバリーマトリックス、食餌用処方物、自己完結型携帯食糧ユニット(MRE)、飲料、水化剤、噛み砕くことができる錠剤、ダイズ食品、焼成製品または朝食用シリアルを含む、前記組成物。
【請求項１２】
骨粗しょう症を緩和する（その進行を遅らせるか、治療するかまたは予防する）方法であって、請求項６に記載のポリペプチドを含む組成物の有効量（有効用量）をその必要がある個体に投与する工程を含み、さらに場合によって前記フィターゼ活性が耐熱性または熱安定性である、前記骨粗しょう症を緩和する方法。
【国際調査報告】
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2010539888.tif 000023
2010539888.tif 000024
2010539888.tif 000025
2010539888.tif 000026