(57)【要約】【課題】アナライトを処理し（例えばアナライトを分離し）そして検出する改善された方法を提供する。【解決手段】（ａ）結合区域で各異なるアナライトを異なる粒子に結合させ、２以上の結合アナライトを生成する工程と、（ｂ）前記結合アナライトを、分離導路を通って、２以上の別々の機能性導路へ移動させる工程とを含み、各異なる粒子が、流体中で、他の粒子と異なる浮揚性を有する又は有するように制御することができ；前記分離導路が、前記２以上の機能性導路と流体連通しており、各機能性導路は他の機能性導路とは異なる高さに位置し；アナライトに結合させたときの各異なる粒子が、少なくとも１の機能性導路において中立な浮揚性を有するように、各機能性導路が他の機能性導路中の流体と流体密度の異なる流体を含有することにより、前記結合アナライトを分離することが可能になる、流体中の２以上のアナライトを分離する方法。【選択図】図１
2010517052.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体中において２以上のアナライトを分離する方法であって、
（ａ）結合区域においてそれぞれの異なるアナライトを異なる粒子に結合させ、２以上の結合アナライトを生成する工程と、
（ｂ）前記結合アナライトを、分離導路を通って２以上の別々の機能性導路へと移動させる工程とを含み、
それぞれの異なる粒子が、前記流体中で、他の粒子と異なる浮揚性を有する又は有するように制御することができ；前記分離導路が、前記２以上の機能性導路と流体連通しており、各機能性導路は他の機能性導路と異なる高さに位置し；アナライトに結合させたときのそれぞれの異なる粒子が少なくとも１の前記機能性導路において中立な浮揚性を有するように、各機能性導路が、他の機能性導路中の流体と流体密度の異なる流体を含有することにより、異なる機能性導路において異なる粒子が中立な浮揚性を有することを利用した前記結合アナライトの分離が可能になることを特徴とする方法。
【請求項２】
それぞれの異なる粒子を、異なるアナライトに特異的な異なる認識剤に結合させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
粒子が、
（ａ）流体中で浮揚性のある粒子、
（ｂ）磁場の印加によって浮揚性を制御できる磁性粒子、
（ｃ）前記流体よりも密度の高い粒子、及び
（ｄ）前記流体中で中立な浮揚性を有する粒子から選択される請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
１以上の検出導路において、
（ａ）アナライトに結合させられる流体中で浮揚性がある粒子によって、結合アナライトを前記結合アナライト上方の１以上の機能性区域に向かって上昇させ、前記１以上の機能性区域の近傍に前記結合アナライトを濃縮すること、及び
（ｂ）アナライトに結合させられる前記流体よりも密度が高い粒子によって、結合アナライトを前記結合アナライト下方の１以上の機能性区域に向かって沈降させ、前記１以上の機能性区域の近傍に前記結合アナライトを濃縮することの少なくともいずれかによってアナライトを濃縮する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１以上の認識剤が抗体を含む請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
流体中で浮揚性を有する粒子が１以上の中空ガラスビーズを含む請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
流体がアナライトを含有するサンプルを含む請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
サンプルが、固形組織の粗溶解物、細胞の粗溶解物、体液、血液、及び血液製剤のいずれかを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
サンプルが、全血、及び血漿のいずれかを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルが哺乳類由来のものである請求項７から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
サンプルがヒト由来のものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アナライトを検出するための検出要素が、バイオセンサーアレイ、電気化学バイオセンサー要素、及び光学バイオセンサー要素の１以上を含む請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
アナライトが、生体分子、ウイルス及びウイルス成分のいずれか、並びに細胞及び細胞成分のいずれかから選択される請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
アナライトが、タンパク質、ポリペプチド、プリオン、炭水化物、脂質、ＤＮＡ及びＲＮＡの少なくともいずれかである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１以上のアナライトを検出するための方法であって、
（ａ）請求項１から１４のいずれかにおいて規定される方法に従ってアナライトを分離する工程と、
（ｂ）前記１以上のアナライトを検出する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
被験体における病原体の有無を診断する方法、及び被験体における遺伝子型の有無を検出する方法のいずれかの方法であって、
（ａ）前記被験体からサンプルを採取する工程と、
（ｂ）請求項１５に規定される方法に従ってサンプルにおいて、病原体の有無及び量の少なくともいずれかを検出する、又は、遺伝子型に特徴的なタンパク質、ポリペプチド、及び核酸のいずれかの、有無及び量の少なくともいずれかを検出する工程と、
（ｃ）病原体の有無及び量の少なくともいずれかに基づいて、又は、遺伝子型に特徴的なポリペプチド及び核酸のいずれかの、有無及び量の少なくともいずれかに基づいて、被験体の診断を行う、又は、遺伝子型の有無を検出する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
病原体が細菌及びウイルスから選択され、ポリペプチドがタンパク質及びタンパク質断片から選択され、核酸がＤＮＡ及びＲＮＡから選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
病原体が、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、及びヘルペスウイルスのいずれかである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
被験体が哺乳類である請求項１６から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
被験体がヒトである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
流体中において２以上のアナライトを分離するための装置であって、
（ａ）結合区域と、
（ｂ）２以上の機能性導路と、
（ｃ）前記結合区域を前記２以上の機能性導路に連結させる分離導路と、
（ｄ）前記アナライトを、前記分離導路中を通って前記結合区域から前記２以上の機能性導路に運搬する運搬装置と、
（ｅ）任意に、少なくとも１の機能性導路に連結される１以上の濃縮区域とを含み、
使用に際しては、前記機能性導路がそれぞれ異なる高さに配され、流体が分離導路中を通って機能性導路へと流動するのに従って、浮揚性粒子をより低い導路からより高い導路へ移動させることを特徴とする装置。
【請求項２２】
少なくとも１の機能性導路に少なくとも１の検出要素を更に含む請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
１以上の検出要素を１以上の濃縮区域の上方に含む請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
運搬装置が、結合区域から流体を汲み上げるポンプを含む請求項２１から２３のいずれかに記載の装置。
【請求項２５】
検出要素がバイオセンサー及びマイクロアレイのいずれかである請求項２１から２４のいずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アナライト（ａｎａｌｙｔｅ）を操作し検出するための方法に関する。該方法は特に、同一サンプル中の異なるアナライトを分離するための方法に関する。本発明の分離態様により、単一のサンプル中の複数の異なるアナライトを検出する又は別々に操作することが可能となるので、本発明は特に有利である。
【背景技術】
【０００２】
分析方法、特に生物学的検定法においては、浮揚性粒子及び他の種類の粒子（例えば磁性粒子及び高密度粒子）の使用が知られている。これに加えて、スイミングプールなど、大量の水の表面から浮揚性ビーズを使用して廃棄物を取り除く方法も周知であり、ＭＳＴ（ＭｉｃｒｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって開発されている。通常は、粒子表面に結合した抗体を介して水中の細菌性汚染物質に付着可能な浮揚性中空粒子を水と混合し、水面に浮上したときに、細菌と粒子の混合物を水面から「すくい取り」プールの汚染物質を検出している。これが、スイミングプールのクリプトスポリジウムの検出のために行われている。
【０００３】
磁性粒子、特に磁性ビーズを使用してアナライトを検出する方法が活躍するようになってしばらく経つ。例えば一般的な検定方法が、磁性ビーズを使用し、これを検定されるサンプルに添加する。このビーズは表面にリガンドを有し、これによってビーズが標的アナライトに特異的に結合することが可能となる。次いで磁場を印加することで、ビーズ及びそれと結合された物質のサンプルの残りからの分離が可能となる。多くの場合、アナライトは続いて、蛍光に基づく発光を検出することにより測定され、これと併せてフローサイトメトリー分析に使用することができる。このような方法は、細胞、核酸、タンパク質、及び他の種類の生体分子などの所望の標的に対するインビトロ診断に使用されている。
【０００４】
しかしながら、この種の従来法は幾つかのサンプル調製工程を必要とする。特に本発明は、１反応ボリューム内で、又はマイクロ流体システムの場合では１反応プラットホーム内で数個のアナライトを試験及び分離することを可能にする。更に、これまでの技術では、多重アナライト反応を達成するためには、幾つかの反応を並行して行う必要がある場合が多く、結果の一貫性を欠くと共に再現性に乏しかった。マイクロ流体ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐシステム又は一体化サンプル分析装置に関しても、本発明の方法によるこの能力は、全サンプルボリュームからアナライト全体を捕捉することを可能にする。捕捉されたアナライトは、次に、サンプル内で異なる処理モジュールへ向かって分離することができる。ここで有利である点としては、サンプルを分割する大抵の分析システムにおいてそうであるように捕捉工程がサンプルのアリコートに対して行われるのではなく、回収したサンプルの全ボリュームに対して捕捉工程が行われることである。これは、同等の感度を得るのに必要とされるサンプル量がより少なくて済み、患者に大きな利益を与えること、即ち患者は大量の試料を提供する必要がないことを意味する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上述した技術などの既知の技術に関連する問題を解決することである。本発明の更なる目的は、アナライトを処理する（例えばアナライトを分離する）改善された方法、及びアナライトを検出する改善された方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、流体中の２以上のアナライトを分離する方法であって、
（ａ）結合区域においてそれぞれの異なるアナライトを異なる粒子に結合させ、２以上の結合アナライトを生成する工程と、
（ｂ）前記結合アナライトを、分離導路（ｃｏｎｄｕｉｔ）中を、２以上の分離した機能性導路へ移動させる工程とを含み、
それぞれの異なる粒子が、流体において、その他の粒子とは異なる浮揚性を有し、及び有するように制御できるかのいずれかであり；そして前記分離導路が、前記２以上の機能性導路と流体連通させられ、それぞれの機能性導路はその他の機能性導路とは異なる高さに位置し；そして、アナライトに結合させた場合のそれぞれの異なる粒子が、少なくとも１の前記機能性導路において中立な浮揚性を有するように、それぞれの機能性導路の流体密度がその他の機能性導路の流体密度と相異させられ、その結果前記結合アナライトを、異なる機能性導路において異なる粒子が中立な浮揚性を有する仕組みによって、分離することが可能になることを特徴とする方法を提供する。
【０００７】
動作中の本発明の例を図１に示す。同図は分離導路を示し、本発明の好ましい実施形態では４個の機能性導路からなる。前記機能性導路は上下に配されており、密度が異なる４種の流体を含む。分離が最も効果的に行われるようにするためには、最も密度の低い流体を最も高い位置に配し、最も密度の高い流体を最も低い位置に配する。この例では分離されるべきアナライトが４種類あり、それぞれの異なるアナライトは、アナライト上の抗原に特異的な抗体によって、異なる粒子（この場合は中空ビーズ）に結合する。この分離法を開始する前に、抗体を異なるビーズに結合させる。それぞれの異なるビーズは、機能性導路の流体の内の１種において中立の浮揚性を有し、従ってアナライトは、機能性導路の間の連結領域中を、浮揚性が中立になるレベルに到達するまで上昇し、その地点でもはや上昇も下降もしなくなり機能性導路の別々の領域に運ばれる。これに代わる実施形態においては、ビーズは、より低い位置の機能性導路中へ、浮揚性が中立になるレベルに到達するまで沈降することができる。更に、両実施形態を組み合わせて、一部のビーズは沈降し一部のビーズは上昇するようにすることも可能である。これらの領域からの分離されたアナライトを、更に処理するか又は必要に応じて検出することができる。機能性導路は互いに流体連結しているが、本発明の文脈においては、これらは互いに分離しているものと見なす。これは、機能性導路が流体連結部より下流でアナライトの分離状態を維持することができる領域を有するためである。
【０００８】
本発明の文脈において、中立な浮揚性を有する状態とは、ある種類（密度、認識分子、及び結合アナライトの組み合わせで決まる種類）のビーズの９５％以上が、プラットホームの特定のチャンネル（機能性導路）中に残存する（流動するが離れない）状態のことである。
【０００９】
好ましくは、分離導路は、連結導路によって結合区域に連結させられており、結合アナライトは分離導路に到達するまで連結導路に沿って流動する。典型的には、連結導路は、最も低い位置の機能性導路（又は、「沈降」させる実施形態では最も高い位置の機能性導路）を形成し、結合アナライトを結合し分離導路へ運搬する媒体として使用される流体中で、少なくとも１の粒子が中立の浮揚性を有する（図１に示す）。しかし、本発明の他の実施形態においては、連結導路が、分離のための機能性導路として使用されない場合があり、このような実施形態においては、アナライトの全部が、分離のために連結導路から出て、その上方（又は下方）の機能性導路中へと上昇（又は沈降）する。この例から明らかであるように、分離導路は、機能性導路（互いに接合させた別々の要素又は単一の一体化要素として）からなることができる。
【００１０】
本発明の特に好ましい特徴は、機能性導路の位置が段階的に高くなるにつれて、含有される流体の密度が段階的に低くなる、即ち段階的に位置が高くなる各導路において流体の密度が漸次低くなることである（「沈降」させる実施形態ではその逆である）と理解される。しかしこの特徴は必須ではない。例えば、アナライトが２種類で導路が３本の場合（高密度導路が２本のより低密度の導路の間に位置する場合）、最低部の導路が最上部の導路よりも高密度の流体を有する場合においては、１のアナライトが最低部の導路において中立の浮揚性を有し、従って該導路内に留まり、第２のアナライトが最上部の導路において中立の浮揚性を有し、最低部の導路及び中央部の導路を通って最上部の導路へ上昇するならば、依然として分離は有効である。それでもなお、これは効率のより悪い配置であり、通常の状況においてより好ましいのは、最も効率的な分離が達成できるように、それぞれの導路の位置が段階的に高くなるにつれ流体密度が漸次低下する配置である。
【００１１】
機能性導路は、そのそれぞれが流体を含有することができ、連結位置で連結させる機能性導路からの流体とその流体とを混合させないならば、特に限定はされない。一般にこれらの導路は、マイクロ流体装置に典型的な寸法を有する。それは、これらの寸法は、流動する流体中における乱流を低減させるのに特に適しており、従って機能性導路間の流体連結されている位置において、流体同士が混合し易いという傾向を最小限とするからである。典型的な導路の寸法は約５０μｍ〜１，０００μｍである。事実、このスケールでは流体連結地点での混合は最小となり、分離過程に悪影響を及ぼす程のものとはならないことは確かである（Kamholz,  A.  E.,  Weigl,  B.  H.,  Finlayson,  B.  A.  &  Yager,  P.  “Quantitative  analysis  of  molecular  interaction  in  a  microfluidic  channel:  The  T-sensor.”  Analytical  Chemistry  1999年、71巻,  p.5340-5347）。
【００１２】
上述したように、機能性導路は、分離を達成するために互いに流体連結されている。これらの流体連結は、そのサイズに関し、粒子とアナライトが１の機能性導路から次の機能性導路へ通過することができるのに十分ではあるが、密度の異なる流体同士の混合が生じる程大きなものではない限り、特に限定されない。好ましくは、連結は、チャンネルの幅よりも僅かに長く、ビーズが運動するチャンネル上面（流体を運搬するチャンネルの形によって垂直に投影される）の全体上に開放窓を形成する。
【００１３】
本発明の方法では、流体は、いずれの適切な流体でもよい。流体は水性流体であることが好ましい。
【００１４】
本発明の方法の好ましい実施形態においては、前記方法は、工程（ａ）の後に、分離が行われた１以上の別々の機能性導路から結合アナライトを流体中の１以上の検出要素の下方にある濃縮区域へと輸送する工程を更に含む。
【００１５】
本発明の方法において使用される各粒子は、認識剤に結合されている。異なる認識剤の数は、調査対象となっているサンプル中のアナライトの数によって決まる。通常、粒子の種類によって結合する認識剤が異なり、これにより、ある種のアナライトがある種の粒子に結合され、その他の種のアナライトがそれぞれ別の種の粒子に結合されることが保証される。別の実施形態においては、各粒子に１を超える認識剤を結合させて、アナライトを個々の種類毎ではなくグループ毎に分離する。単一の粒子に結合させる認識剤は、同一であっても（例えばアナライトの粒子に対する結合能力を増加させることが望ましい場合又は１の粒子に１を超えるアナライト種を結合させることが望ましい場合）異なっていてもよい（例えば調査対象となっている任意のアナライトを任意の粒子に結合させることが望ましい場合）。後者の実施形態の幾つかにおいては、システム内の異なる種類の認識剤の全てを単一の粒子に結合させて、可能なアナライトのいずれか又は全てを単一の粒子に結合させてもよい。
【００１６】
本発明においては、粒子の機能を過度に損なわないならば、粒子は特に限定されない。好ましくは、粒子は、
（ａ）流体において浮揚性のある粒子、
（ｂ）浮揚性を磁場の印加によって制御できる磁性粒子、
（ｃ）流体よりも密度の高い粒子から選択される粒子、及び
（ｄ）流体中で中立な浮揚性を有する粒子の少なくともいずれかから選択される。
【００１７】
後半の粒子は、特に最低レベルの導路が、粒子が上昇する必要なくこの導路中に保持されるように連結導路から形成される場合、最低レベルの機能性導路で使用できる。磁性粒子も使用することができ、浮揚性を変化させることが望ましい場合、例えば分離効率を微調整する場合に特に有用である。しかし、通常は異なる浮揚性を有するセットになった浮揚性粒子、例えば制御された範囲の浮揚性を有するガラスビーズなどが望ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法は、サンプルに対して行われる処理工程の数を減少させることによりサンプルにおけるアナライトのより迅速な分離（及び検出）を可能にするので、有利である。更に、この方法は、必要とされる実験装置の総量を減らし、この方法の実施をより簡便に、より安価にする。本発明は、その分離態様が、単一サンプル中で複数の異なるアナライトを検出し、別々に操作することを可能にするので、特に有利である。この方法は、従来の試験方法における場合のようにサンプルを異なるアリコートに分ける必要がなく、それぞれのビーズ種によってサンプルを全体として評価することも可能にする。ひとたび関心のあるアナライトがビーズ上の認識要素によって捕捉され、異なる導路中に存在する流体によって分離されると、これらは、場合によっては全く異なる方法を使用して別々に容易に処理できる。これらの特性は、多重アナライト試験を行う分析機器上で、又は一体化ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐシステム上で使用する場合に、特に興味深い。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明を、ほんの１例として、以下の図面を参照して説明する。
【００２０】
【図１】本発明の１の実施形態において、最低部機能性導路として血清（密度：１．０６）を含有する連結導路と、この上方に位置し、密度がそれぞれ０．８５、０．７５、０．６の流体を有する更なる３本の機能性導路とを使用することによって、４種のアナライトを検出する分離装置のレイアウトの例を示す略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明がここでより詳細に説明される。
【００２２】
本発明の方法は、アナライトを粒子に結合させることができるならば、あらゆる種類のアナライトを検出するのに使用することができる。しかし、好ましくは本方法は、アナライトを含有するサンプルを含む流体を使用して行われる。通常、サンプルは、固形組織の粗可溶化液、単一若しくは複数の細胞の粗可溶化液、又は体液を含む。より好ましくは、サンプルは、血液又は血液製剤若しくは血液成分を含む。最も好ましくは、サンプルは全血又は血漿を含む。概して、サンプルはヒトなどの哺乳類由来のものである。用語「アナライト」は、特に限定されない。適切なアナライトは、サンプルにおいて検出されることが望ましいいずれの種類の生体分子であってよい。例えば、アナライトはタンパク質、プリオン、ペプチド、炭水化物、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は全細胞、ウイルス若しくは細菌であってよい。特に、アナライトは、抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、抗体、特異的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列、又は特定の細胞種であってよい。本発明の具体的実施形態では、アナライトはＣ型肝炎、ＨＩＶ、又は他のウイルス病原体の診断及び処置（テラノスティック情報の測定を含む）に関している。
【００２３】
用語「サンプル」は、特に限定は無く、アナライトが存在し得るあらゆる被検査物をいう。特に、既に述べたように、サンプルは、全血、尿若しくは他の体液、固形組織若しくは細胞の粗可溶化液、又は培養細胞の上清であってよい。サンプルは、本発明の方法において使用される前に、処理工程にかけられてもよい。
【００２４】
本発明の方法において言及される認識剤は特に限定されない。粒子は、認識剤で被覆することができる。認識剤の性質は、認識剤が粒子を標的アナライトに特異的に結合させるのであれば、特に限定されない。認識剤は、それ自身が標的アナライトであってもよい抗原に特異的な抗体、又は標的アナライトの表面上に存在する抗原に特異的な抗体であってもよい。また、標的アナライトがポリヌクレオチドである場合、認識剤は、このアナライトの配列の一部分に相補的なポリヌクレオチド配列であってもよい。更なる実施形態においては、アナライトが炭水化物である場合、認識剤はレクチンであってもよい。更なる実施形態においては、認識剤は、細胞表面受容体であってもよく、アナライトはリガンド、アゴニスト、又はアンタゴニストである。更なる実施形態では、認識剤は、抗体又はリガンドであってもよく、アナライトは、適切な抗原決定基又は受容体を有する細胞又は生物である。調査されるアナライトが２つ以上ある場合、それぞれのアナライトに特異的な抗体を使用して、１種類の粒子が１のアナライトに結合させられ、異なる種類の粒子は別のアナライトに結合させるようにすることができる。このようにして、複数のアナライトを同一のサンプルにおいて処理できる。
【００２５】
本発明の方法においては、流体中で浮揚性のある粒子は、特に限定されない。本発明における使用に適した浮揚性粒子としては、市販品も利用可能である。特に浮揚性粒子としては、中空のガラスビーズが挙げられる。
【００２６】
本発明における使用に適した磁性粒子は、当技術分野でよく知られている。特に、磁性ビーズの市販品が、磁気分離のために、様々なサイズで利用可能である。１の実施形態では、ビーズは超常磁性ビーズである。粒子の凝集を防止し、流体内での分散及び混合を容易にするために磁場が印加されないようにする場合には、粒子は残留磁化を全く保持しないことが好ましい。
【００２７】
粒子は、その検出を促進するために標識を含んでいてもよい。標識は、蛍光標識であるのが好ましい。
【００２８】
アナライトを検出する検出要素は、要素が調査されるアナライトを検出するのに適していれば、いかなる検出要素を含んでいてもよい。要素が、１以上のバイオセンサーアレイ、電気化学バイオセンサー要素、そして光バイオセンサー要素を含むのが好ましい。
【００２９】
本発明の方法の更に好ましい実施形態においては、１以上の検出導路において、アナライトは、上述した濃縮方法に従って濃縮されてもよい。
【００３０】
本発明は、（ａ）上述の方法によってアナライトを分離する工程；及び（ｂ）１以上のアナライトを検出する工程を含む、１以上のアナライトを検出する方法も提供する。
【００３１】
更に、被検体における病原体の有無を診断する方法、及び被検体における遺伝子型の有無を検出する方法のいずれかの方法であって、（ａ）被検体からサンプルを採取する工程と、（ｂ）上述の方法によってサンプルにおいて、病原体の有無及び／又は量を検出する工程、又は、遺伝子型に特徴的なタンパク質、ポリペプチド、及び核酸のいずれかの有無及び／又は量を検出する工程と、（ｃ）病原体の有無及び／又は量に基づいて、又は、遺伝子型に特徴的なポリペプチド、及び核酸のいずれかの有無及び／又は量に基いて、被検体の診断を行う、又は、遺伝子型の有無を検出する工程とを含む方法が提供される。
【００３２】
本発明の方法においては、病原体は、通常、細菌及びウイルスから選択され、ポリペプチドはタンパク質又はタンパク質断片から選択され、又は核酸はＤＮＡ及びＲＮＡから選択される。より好ましくは、病原体はＨＣＶ、ＨＩＶ、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、又はヘルペスウイルスである。通常は、被検体は、ヒトなどの哺乳類である。通常は、上述のウイルスは、ヒトウイルスである。
【００３３】
なお更に本発明は、流体中の２以上のアナライトを分離するための装置であって、
（ａ）結合区域と、（ｂ）２以上の機能性導路と、（ｃ）前記結合区域を、前記２以上の機能性導路に連結させる分離導路と、（ｄ）アナライトを前記分離導路中を前記結合区域から前記２以上の機能性導路に運搬する運搬装置と、
（ｅ）任意に、少なくとも１の機能性導路に連結させる１以上の濃縮区域とを含み、使用に際しては、前記機能性導路がそれぞれ異なる高さに配置され、流体が分離導路中を機能性導路へと流動するのに従って、浮揚性粒子がより低い導路からより高い導路へ移動させられることを特徴とする装置を提供する。
【００３４】
本発明の装置は、典型的にはフローセル型装置である。本発明の装置においては、概して運搬装置が、結合区域から流体を送り込むためのポンプを含む。
【００３５】
装置は、少なくとも１の検出要素を、少なくとも１の機能性導路中に含むことが好ましい。前記１以上の検出要素を１以上の濃縮区域の上方に配置するのが更に好ましい。通常は、検出要素はバイオセンサー又はマイクロアレイである。
【実施例】
【００３６】
本発明を、ここでほんの１例として、以下の具体的実施形態を参照して説明する。
【００３７】
−ＨＣＶについて試験されるサンプルのためのプロトコル（このプロトコルはＨＢＶ、ＨＡＶ、ＨＩＶ、ヒトライノウイルス、インフルエンザウイルス、又は単純ヘルペスにも適用できる）−
（サンプルの性質）
通常は、サンプルは、全血、血清、血漿、細胞可溶化液若しくは細胞抽出物（例えばＢ細胞又は肝細胞）、鼻咽頭粘膜、又は尿である。サンプルは、サンプルの種類とその個別の性質によって、ある種の緩衝液組成を有するように調節することができる。
【００３８】
（ビーズの調製）
１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＨＣＶ  Ｅ１タンパク質結合性ビオチン化抗体１μｇ（他の認識剤、例えば、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲ断片、アプタマー、ＰＮＡ、レクチン、抗体断片、組み換えレセプター若しくは精製レセプター、及びタンパク質なども望ましいならば使用することができる）、又は１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のビオチン化組換えコアタンパク質抗原１μg、又はヒトアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）結合性ビオチン化抗体１μｇ、又はヒトアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）結合性ビオチン化抗体１μｇを、メーカーによってストレプトアビジンで被覆された、異なる密度の３００μＬの浮揚性ビーズ（ＭＳＴ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）のバッチに、２０×１０６ビーズ／ｍＬの割合で、連結させた。ビオチンはストレプトアビジンに対して高い親和性を有する（解離定数[ＫＤ]〜１０−１４Ｍ）ので、反応の成功は保証されており、そして抗体でビーズ表面は被覆された。ビーズを１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを捨て新たなＰＢＳと入れ替えることで、反応物から過剰の未連結抗体を洗浄し除去した。この洗浄工程は２回繰り返した。
【００３９】
（結合工程）
ＨＣＶ表面タンパク質、ＨＣＶコアタンパク質、又はＡＳＴ及びＡＬＴなどの肝臓の健康度指標のバイオマーカーに対して産生された抗体と連結させたビーズと、１ｍＬ〜５ｍＬの容量を有するサンプルとを数分間インキュベートした。この過程は、サンプルを、該サンプルを保持できるが(フリット材料又はフィルター)、溶液の流動も可能であるチャンバー中のビーズ上を、０．１ｍＬ／分〜５ｍＬ／分の速度で流すことによって、オンラインでも達成できる（好ましい方法である）。同一のチャンネル中を、サンプルに続いて洗浄溶液を、サンプルの容量の３〜５倍の容量で流し、非特異的結合をしたものを除去した。この洗浄溶液は、抗体−抗原相互作用において観察することができる非特異的結合物を減少させる作用のある０．０１％〜１％の濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０又はＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０などの界面活性剤を含むことができる。
【００４０】
（選別機構又は検出部位への流動）
マイクロ流体システムのバルブが開かれ、粒子が選別部位へと流動させられる。低流速（０．０１ｍＬ／分〜１ｍＬ／分）で、ビーズはシステム中を、異なる密度の流体からなるシステムに向かって流動する。これらの異なる密度の流体は、血清にグリセリンなどの密度剤（ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）を添加することによって容易に得ることができた。このような場合、より低いパーセンテージのグリセリンを、１％ＢＳＡとＴｒｉｔｏｎＸ−１００又はＮｏｎｉｄｅｔＰ４０などの界面活性剤とを添加したＰＢＳなどの緩衝液で希釈し、より高い位置の導路へ入れる。流動工程の間、関連する構成要素に結合させられた粒子は、チャンネルの配置及びビーズの浮揚性によって、関連するチャンネルに選別され、検出及び／又は分離される。手短に言えば、特定の導路内でビーズが周囲の流体よりも低い密度を有している場合、ビーズは導路の上面へと移動する。導路が開口し直上の導路に連通している場合、ビーズはその密度がより低いことによってこの導路へと移動することができる。このシステム中でビーズの浮揚性が中立であれば、ビーズはこの導路中に残存する。この過程は、全ての導路で同様に生じ、全ての異なるバッチの密度が異なるビーズが、結合アナライトと共に仕分けられる。機構が純粋にビーズを分離するために使用される場合、ビーズは収容室に運ばれ、そこで必要ならば更なる処理がなされる。流体及びビーズの密度は、１ｇ／ｃｍ３から１．３ｇ／ｃｍ３の値をとることができる。
【００４１】
ビーズが検出地点又はバイオセンサーまで運ばれる場合、ビーズは再度低流速でそれらを通過する。このバイオセンサーは、捕捉されたアナライトの別の抗原性エピトープに対して産生された抗体を備える。一旦結合させられると、いずれのバイオセンサー認識地点にも結合しなかったビーズが、上述したのと同様にして、洗浄溶液によって洗浄される。
【００４２】
（検出）
ビーズが蛍光性を有する場合、ビーズは顕微鏡又はＣＣＤカメラを用いてすぐに検出及びカウントできる。ビーズが蛍光性を有さない場合、ビーズに用いられた１次抗体に対して産生される２次抗体であって、蛍光性分子又は化学発光シグナルを発生することのできる酵素(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）など)で標識された２次抗体が使用できる（インピーダンス法、又は酵素電気化学検出法も使用できる）。これは、ビーズ複合体の上を約０．５μｇ／ｍＬの濃度で流される。重要なことは、この２次抗体が、バイオセンサーの認識構成要素と交差反応しない又は認識構成要素を認識しないようにすることである。検出は、顕微鏡又はＣＣＤカメラを用いて、反応物によって発せられる蛍光を測定することによって達成される。
【図１】
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【国際調査報告】
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