(57)【要約】  破骨細胞によるｗｎｔもしくはｗｎｔシグナルエンハンサーの分泌の調節因子についてスクリーニングする方法であって、培養中の破骨細胞をスクリーニング対象の化合物に暴露させるステップと、ｗｎｔ感受性検出系を前記破骨細胞培養物由来の馴化培地に暴露させるステップと、骨芽細胞による骨形成のｗｎｔ媒介性活性化について、またはβ−カテニンの検出またはｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ、ａｘｉｎもしくはＦｒａｔ１による前記細胞の細胞膜への転位を検出することによる細胞中のＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６シグナル伝達のｗｎｔ媒介性活性化についてアッセイすることによって、ｗｎｔシグナルが前記培地中に存在するかどうかを決定するステップとを含む方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
破骨細胞によるｗｎｔもしくはｗｎｔシグナルエンハンサーの分泌の調節因子をスクリーニングする方法であって、培養中の破骨細胞をスクリーニング対象である化合物に暴露させるステップと、ｗｎｔ感受性検出系を前記破骨細胞培養物由来の馴化培地に暴露させるステップと、ｗｎｔシグナルが前記培地中に存在するかどうかを決定するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記ｗｎｔは、破骨細胞から骨芽細胞への同化シグナルである、または前記ｗｎｔシグナルエンハンサーは、破骨細胞から骨芽細胞への同化シグナルのエンハンサーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｗｎｔシグナルは、前記馴化培地中で、骨芽細胞による骨形成のｗｎｔ媒介性活性化についてアッセイすることによって検出される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｗｎｔシグナルは、前記馴化培地中で、細胞中のＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６シグナル伝達のｗｎｔ媒介性活性化についてアッセイすることによって検出される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６シグナル伝達は、β−カテニンの検出によって検出される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
β−カテニンによる前記細胞の核への転位を検出することによって、前記シグナル伝達が検出される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ、ａｘｉｎおよび／またはＦｒａｔ１による前記細胞の細胞膜への転位を検出することによって、前記シグナル伝達が検出される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
レポーター遺伝子のプロモーター領域内にＴＣＦ／ＬＥＦ応答エレメントを含有するレポーター系によってトランスフェクトされた細胞への暴露によって、前記ｗｎｔシグナルが検出される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
請求項３に記載の第１のスクリーニングと、請求項４〜８のいずれか一項に記載の第２のスクリーニングとを、化合物について実施するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
健常人では、骨形成は密接な平衡状態で骨吸収とカップリングしている。この繊細な平衡が阻害されると、最終的な結果は病理学的状況、例えば骨化石症または骨粗鬆症である。ヒト骨化石症は、吸収窩の酸性化に関係するタンパク質（ＣｌＣ−７またはａ３−Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）の突然変異によって惹起され、骨形成が正常または増加さえするにもかかわらず吸収減少が生じることを特徴とする。破骨細胞の剥離をもたらすマウス突然変異、例えばＭ−ＣＳＦもしくはｃ−ｆｏｓの消失は骨形成へ副次的な悪影響をもたらすが、これは破骨細胞数が維持されるのに骨吸収が無効にされる突然変異、例えばｃ−ｓｒｃマウスとは対照的である。これらのデータは、破骨細胞が骨形成の制御において中心的役割を果たすが、それは必ずしもそれらの吸収活性ではないことを示している。
【背景技術】
【０００２】
骨は、カルシウム恒常性を維持するためだけではなく微小損傷を修復するため、したがって骨質を維持するために、一生を通じて持続的にリモデリングされる動的組織である。この骨の持続的リモデリングは、カップリング(coupling)と呼ばれる局所的かつ協調した順次方法で、古い骨の協調した平衡の取れた吸収を達成することを目指す細胞（破骨細胞）および新しい骨の適正な形成の責任を担う細胞（骨芽細胞）の機能を含む。
【０００３】
カップリングプロセスは、骨吸収の結果として生じる形成された骨形成反応であると理解され、形成される骨の量は吸収される骨の量と等しい。脱カップリング(uncoupling)は、形成と吸収の平衡が崩れた場合に発生し、これは骨化石症または骨粗鬆症のいずれかを引き起こす可能性がある。骨形成は、健常成人の骨代謝回転においては骨吸収と密接にカップリングしていると長年にわたり認識されてきたが、このカップリングは一部の状況では、例えば骨格成長中、閉経後骨粗鬆症、および全部ではないが一部の骨化石症性突然変異においては切り離される可能性がある。
【０００４】
閉経後女性における卵巣由来性ステロイドの消失は、骨形成に比して優勢な骨吸収を伴う骨代謝回転の加速を生じさせる。これに関連する負のカルシウム平衡は骨消失を促進し、骨の脆性、およびそれにより将来の骨折の危険性を増加させる。これらの望ましくないプロセスに対抗するための合理的アプローチは、骨吸収を阻害することであるが、これもまた現在まではこれらの細胞事象間のカップリングに起因して骨形成の阻害をもたらしてきた。
【０００５】
破骨細胞活性は、伝統的には骨吸収に限定されると見なされてきた。現在では、破骨細胞活性が骨吸収には限定されないこと（７、８）、および破骨細胞のまた別の活性、つまり骨形成の刺激があることが確定されている。本発明者らは、破骨細胞が骨芽細胞による骨形成を刺激する同化因子を分泌すること、およびこの因子はｗｎｔであることを明らかにする。これに基づいて以下では、本発明は、破骨細胞によるｗｎｔもしくはｗｎｔシグナルエンハンサーの分泌の調節因子についてスクリーニングする方法であって、培養中の破骨細胞をスクリーニング対象である化合物に暴露させるステップと、ｗｎｔ感受性検出系を上記破骨細胞培養物由来の馴化培地に暴露させるステップと、上記培地中にｗｎｔシグナルが存在するかどうかを決定するステップとを含む方法を提供する。
【０００６】
好ましくは、ｗｎｔシグナルのレベルは、定量的に検出される。馴化培地中のｗｎｔシグナルの増強を提供する化合物は、骨同化剤もしくはリード化合物としてさらに調査するための候補である。
【０００７】
ｗｎｔが検出される場合は、それは好ましくは破骨細胞から骨芽細胞への同化シグナルである可能性がある。
【０００８】
好ましいスクリーニングアッセイは、骨芽細胞への同化作用および分泌されたシグナルのｗｎｔに関連する性質の両方を検出する。各化合物を対象に、本明細書に記載した１つ以上のスクリーニングアッセイを実施することができる。
【０００９】
ｗｎｔシグナルエンハンサーには、順にｗｎｔシグナルを阻害する因子の破骨細胞分泌阻害剤またはｗｎｔシグナルのｗｎｔシグナル伝達経路への作用を増加させる任意の他の因子が含まれる。本明細書に記載したスクリーニングプロトコールにおけるそのようなエンハンサーの作用は、ｗｎｔ自体の分泌増加に似ていると予想される。
【００１０】
上記ｗｎｔシグナルは、上記馴化培地中で、骨芽細胞による骨形成のｗｎｔ媒介性活性化についてアッセイすることによって任意選択的に検出される。これは、おそらく実施例２および３に記載した通りであってもよい。
【００１１】
別法として、またはさらに加えて、上記ｗｎｔシグナルは、上記馴化培地中において、細胞中のＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６シグナル伝達のｗｎｔ媒介性活性化についてアッセイすることによって検出される。上記ＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６シグナル伝達は、β−カテニンの検出によって検出できる。これは、β−カテニンによる上記細胞の核への転位を検出することによって行ってもよい。その他のｗｎｔシグナル検出方法については、同様に以下で説明する。
【００１２】
ｗｎｔは、１２を超える別個のｗｎｔが同定されている公知のシグナル伝達タンパク質ファミリーである。それらは、Ｇタンパク質結合受容体ならびに様々な作用を生成するＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６として公知である受容体を含む共受容体への結合によって複雑なシグナル伝達カスケードにおいて作用する。これらには、幹細胞の再生、プレ骨芽細胞複製の刺激、骨芽細胞発生の誘導、ならびに骨芽細胞および骨細胞アポトーシスの阻害が含まれる。骨芽細胞がｗｎｔによって骨を形成するように刺激されることは公知であるが、骨芽細胞へのｗｎｔシグナルの天然起源の性質についてはこれまで確定されていない。
【００１３】
骨芽細胞が骨同化性ｗｎｔシグナルを分泌するように刺激する化合物、または分泌されたシグナルの作用を増強する化合物についてスクリーニングすることによって、骨同化薬を開発するため、および骨吸収を骨形成から脱カップリング(decoupling)するための道が開かれる。そのような薬物は、骨吸収が不均衡になっていて骨芽細胞による骨形成速度に比して過度である疾患を治療することに有用である。そのような疾患には、骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、性ホルモン欠損性骨粗鬆症、潰瘍性大腸炎もしくはクローン病の症状またはコルチコステロイド剤によるそれらの治療の副作用としての骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、薬物誘発性骨粗鬆症、廃用性骨粗鬆症を含む）、副甲状腺機能亢進症、ページェット病、悪性腫瘍の高カルシウム血症、骨への転移によって発生する溶骨性病変、不動化に起因する骨量減少、脊椎骨折に起因する骨量減少、ならびに骨軟化症が含まれる。
【００１４】
ｗｎｔの分泌の活性化またはシグナル伝達効率の増強について化合物をスクリーニングするためには、ＬＲＰ５媒介性シグナル伝達のｗｎｔ媒介性活性化に基づくアッセイを使用できる。ＬＲＰ５は、ｗｎｔによりＬＲＰ５が活性化されると細胞の核に移行するβ−カテニンを通してシグナルを媒介する（１）。適切には、例えばマウス細胞系ＭＣ３Ｔ３Ｅ１などの細胞系、またはＬＲＰ５／ｗｎｔシグナル伝達成分の全部を内在的に含有する別の細胞系もしくは初代トランスフェクト細胞を使用できる。ＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞は、ｗｎｔへ応答してβ−カテニンの転位を示すことが公知である。この転位は、ｗｎｔ産生を増強する様々な化合物を用いて処理された破骨細胞由来の馴化培地の存在下または非存在下でβ−カテニンの免疫蛍光法もしくは免疫ペルオキシダーゼ検出法を用いてスクリーニングすることができる。
【００１５】
または、破骨細胞馴化培地中に存在するｗｎｔシグナルは、レポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子または検出可能な酵素をコードする他の遺伝子のプロモーター領域内にＴＣＦ／ＬＥＦ応答エレメントを含有するレポーター系により（安定的または一過性的に）トランスフェクトされた細胞の暴露によるスクリーニング法で検出できる。そのようなレポーター系の１つの例は、ＴＯＰｆｌａｓｈルシフェラーゼレポーター系である。
【００１６】
ＬＲＰ５経路の活性化は、細胞質ゾルから細胞表面へのｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（ｄｓｈ）、Ｆｒａｔ１およびＡｘｉｎの転位を引き起こすので（５）、このため代替スクリーニング法は、β−カテニンについて記載した再局在決定アッセイを用いて破骨細胞由来の馴化培地へ応答して存在するこれらの成分についてアッセイする方法である。
【００１７】
さらに、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリーの転写因子の核への動員は、さらに転位アッセイを用いてアッセイすることもできる（６）。これは、例えば２４時間などの期間にわたり馴化培地または対応する対照の存在下で処理され、次に転写因子、例えばＴＣＦ１に対して特異的な抗体を用いて免疫学的局在決定のために固定された細胞を用いて実施することができる。この手順は、下記の実施例５に記載した方法に類似する手順である。簡潔には、この手順は、ＴＣＦ１特異的抗体とのインキュベーション、および核への転位の追跡を可能にする標識二次抗体を用いたＴＣＦ１特異的抗体の検出である。使用される細胞は、必要とされるシグナル伝達経路に対してコンピテント（反応能がある）でなければならず、骨芽細胞、または骨芽性細胞系であってよく、例えばＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞であってよい。
【００１８】
以下では、その内容が簡潔に記載されている添付の図面を参照しながら、実施例において本発明を詳細に例示かつ説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】パネルａ、ｂおよびｃは、実施例１で得られた結果を示す。
【図２】パネルａおよびｂは、実施例２で得られた結果を示す。
【図３】パネルａおよびｂは、実施例３で得られた結果を示す。
【図４】パネルＡ、ＢおよびＣは、実施例４で得られた結果を示す。
【実施例１】
【００２０】
＜ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は同化刺激の存在下で結節を形成する＞
本発明者らは、ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１プレ骨芽細胞系（２）が同化刺激に応答するかどうか、およびこのため破骨細胞由来の馴化培地中に存在する可能性があるシグナルを調査するために適合するかどうかについて調査した。骨形成を誘導することが知られている、１０ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）の存在下または非存在下で、３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した。
【００２１】
プレ骨芽細胞であるマウスＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞を、１０％の熱不活化ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含有するαＭＥＭ中で２日毎もしくは３日毎に培地を取り替えながら培養し、細胞がコンフルエントに達したらトリプシン処理によって取り出し、適切な比率（１：３〜１：５）で細胞を再播種した。骨結節形成を誘導するために、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞をトリプシンによって取り出し、２４ウェルプレート内に７５，０００細胞／２４ウェルの密度で再播種し、次にアスコルビン酸５０μｇ／ｍＬおよび１０ｍＭのβ−グリセロールホスフェートの存在下で３週間にわたり、培地を２日毎または３日毎に取り替えながら培養した。
【００２２】
アリザリンレッド（Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ）を用いて、結節形成を測定した。３週間の培養後、ＰＢＳ中の３．７％ホルムアルデヒド中での２０分間にわたる固定によって骨芽細胞培養を停止させた。１０分間にわたり４０ｍＭのアリザリンレッド（ｐＨ４．２）中で細胞を染色し、完全に洗浄した。染色した結節の代表的領域のデジタルヒストグラフは、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃ５０５０  Ｚｏｏｍデジタルカメラを装備したＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７０光学顕微鏡を用いて撮影した。その後に、暗所で攪拌しながら１５分間にわたり、１０％塩化セチルピリジニウム中でのインキュベーションによって色素を細胞から抽出し、最後にＥＬＩＳＡリーダーを使用して５６１ｎｍでの吸光度を測定した。
【００２３】
骨結節のＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色によっても、結節形成を測定した。上記のように培養を停止させた後、強度の照明下で３０分間にわたり２．５％  ＡｇＮＯ３中で骨結節を染色した。ｍｉｌｌｉＱ中で細胞を完全に洗浄し、さらに３０秒間にわたり１％ピロガロール中でのインキュベーションによって染色を顕色させた。ｍｉｌｌｉＱ中での洗浄後、染色を５分間にわたり５％チオ硫酸ナトリウム中で固定させ、再びｍｉｌｌｉＱ中で洗浄した。最後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃ５０５０  Ｚｏｏｍデジタルカメラを装備したＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７０光学顕微鏡を用いて、染色した結節の代表的領域のデジタルヒストグラフを撮影した。
【００２４】
図１ａ〜ｃから明らかなように、ＢＭＰ−２は、アリザリンレッド（図１ａおよびｂ）ならびにＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色（図１ｃ）の両方によって測定されたように、ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞による骨結節形成を大きく誘導した。
【００２５】
これらの結果は、ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞が、同化刺激の存在下では実際に骨形成に向かって駆動され得ることを証明している。
【実施例２】
【００２６】
＜吸収性破骨細胞は同化シグナルを分泌する＞
骨上で培養された正常ヒト破骨細胞が骨同化シグナルを分泌するかどうかを試験するために、本発明者らは、３週間の期間中に吸収性破骨細胞由来のＣＭ（馴化培地）を収集した。破骨細胞を作成するために、以前に記載されたような磁性ビーズソーティング法を用いてヒトＣＤ１４＋単球を単離した［（３）］（４）。簡潔には、ＰＢＳ中で１：１に希釈したバッフィコートをフィコール勾配上で積層させ、遠心分離し、中間相でリンパ球画分を収集した。リンパ球を次に洗浄し、２０分間にわたり抗ＣＤ１４ビーズ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）とともにインキュベートし、最後に磁気装置を用いて単離した。これらの単球を計数し、１５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度で播種し、培地を２日毎または３日毎に取り替えながら、１０％の熱不活化ＦＢＳおよび２５ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦおよび２５ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を含有するαＭＥＭ中で培養し、成熟破骨細胞の形成を誘導した。
【００２７】
成熟ヒト破骨細胞をトリプシン消化およびその後のそう爬によって取り出し、次に１２ウェルプレート中で６００，０００細胞／ウェルの密度でいずれかの骨薄片上に再播種した。次に、ＲＡＮＫＬ、Ｍ−ＣＳＦおよび１０％熱不活化ＦＢＳを含有する培地中で、２日毎または３日毎に培地を取り替えながら３週間にわたり破骨細胞を培養した。各培地交換中には、上清を収集し、その後の使用時まで−２０℃で保管した。破骨細胞培養中で使用する前に、０．４５μｍの低タンパク質結合フィルターに通してＣＭを濾過し、溶液から凝集塊、細胞破片などを取り除いた。
【００２８】
個々の収集日からのＣＭの品質を、製造業者の取扱説明書にしたがって使用したＣｒｏｓｓＬａｐｓ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅキット（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて、吸収マーカーであるコラーゲンＩ型フラグメント（ＣＴＸ−Ｉ）の測定によって調査した。吸収データは、全培養期間を通して成熟吸収性破骨細胞の存在を確証した（データは示していない）。
【００２９】
本発明者らは次に、ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞を指示した濃度のＣＭに暴露させ、吸収性破骨細胞由来のＣＭが、上記のアリザリンレッドによって測定したように、用量依存性で結節形成を誘導することを見いだした（図２ａ）。誘導された骨結節形成の最大レベルは６０％で達成され、陰性対照と比較すると４００％のレベルに達した。結節形成の誘導は、陽性対照として１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−２を用いて観察された誘導と定量的に相違しなかった。本発明者らは、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色を用いた結節形成の定性的評価によってこれらの所見を確証した（図２ｂ）。
【実施例３】
【００３０】
＜破骨細胞は非骨由来同化シグナルを分泌する＞
シグナルが骨基質に由来したのか、または破骨細胞自体に由来したのかを解明するために、本発明者らは、プラスチック上で増殖させた破骨細胞由来のＣＭを骨芽細胞に加え、それが骨形成を刺激できるかどうかを調査した。最初に、本発明者らは、比色アッセイを用いて破骨細胞のマーカーである酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）活性を測定することによって、高品質の馴化培地を保証した。この馴化培地を６ｍＭの４−ニトロフェニルホスフェートおよび２５ｍＭの酒石酸ナトリウム（ｐＨ５．５）の添加によってＴＲＡＣＰ活性について試験した。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して参照として６５０ｎｍでの測定値を用いて、４０５ｎｍでの吸光度を測定することによって反応生成物を定量した。
【００３１】
収集されたＣＭ中のＴＲＡＣＰ活性のレベルは高く、これは成熟破骨細胞が存在することを確証していた（データは示していない）。
【００３２】
次に、本発明者らは、ＣＭがＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞中で結節形成を誘導できるかどうかを評価した。上述したアリザリンレッド法によって測定したように、ＣＭは用量依存的に骨形成を誘導し、２００％の最大作用が得られたが、これは６０％のＣＭで達成され、この作用は陽性対照であるＢＭＰ−２を用いて観察された作用に匹敵していた（図３ａ）。これを裏付けるために、本発明者らは、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色を用いて骨結節の形成について調査したところ、図３ｂから明らかなように、ＣＭがＢＭＰ−２と同程度まで結節の形成を誘導することを見いだした。そこで、本発明者らの所見は、破骨細胞が非骨由来シグナルを分泌して骨形成を誘導することを示している。
【実施例４】
【００３３】
＜破骨細胞は骨芽細胞においてｗｎｔシグナル伝達を特異的に刺激するシグナルを分泌する＞
本発明者らの近年の研究データは、馴化培地による骨形成の活性化がｗｎｔによって誘発されることを示している。ｗｎｔは公知の骨芽細胞活性化因子であるが（１、５）、破骨細胞によるｗｎｔの産生についてはこれまで報告されていない。
【００３４】
本発明者らは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のプロモーター領域に配置された８つのＴＣＦ／ＬＥＦ応答エレメントを含有するルシフェラーゼレポーター系ＴＯＰｆｌａｓｈによりＵＭＲ−１０６細胞（ラット肉腫由来細胞系）を一過的に感染させた。ＴＣＦ／ＬＥＦ応答エレメントはｗｎｔによる活性化を特異的に媒介し、さらに図４Ａから明らかなように、陽性対照であるＷｎｔ３Ａは強力な活性化を誘導する。さらに、Ｗｎｔ阻害剤であるＤＫＫ１はこの活性化を予想とおりに阻害する。
【００３５】
破骨細胞から分泌されたシグナルの作用を調査するために、本発明者らは、骨もしくはプラスチックいずれかの上で培養した破骨細胞由来の馴化培地を収集し、さらにそれらがＴＣＦ／ＬＥＦレポーター系により一過的にトランスフェクトされた細胞の活性化を誘導する能力を非馴化破骨細胞培養培地の能力と比較した。次に細胞を２４時間にわたり対照化合物、ビヒクルまたは相違する馴化培地のいずれかを用いて処理し、その後に細胞を溶解させ、比色アッセイによってルシフェラーゼ活性を測定した。
【００３６】
骨上の破骨細胞由来の馴化培地はＴＣＦ／ＬＥＦ活性化を特異的に誘導するが、これはＤＫＫ１によって阻害されたので（図４Ｂを参照）、このシグナルがｗｎｔであることを確証した。さらに、プラスチック上の非吸収性破骨細胞もまたＴＣＦ／ＬＥＦ活性化をもたらすシグナルを分泌し、これもまたＤＫＫ１によって阻害された（図４Ｃを参照）。
【実施例５】
【００３７】
＜β−カテニン転位アッセイ＞
ｗｎｔシグナルから破骨細胞への破骨細胞産生の調節についてのスクリーニングアッセイを実施するために、ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞をガラス製カバースリップ上に播種し、付着させた。付着後、ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞は様々な対照化合物（ｗｎｔ３ＡもしくはＬｉＣｌ陽性対照）、ビヒクルまたは破骨細胞由来の馴化培地を用いて２４時間にわたり処理した。処理後、細胞を２０分間にわたりリリー（Ｌｉｌｌｙ）液中で固定し、ＰＢＳ中で完全に洗浄し、続いて、一次抗体としてのＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社からのウサギ抗β−カテニン抗体、および二次抗体としてのＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社からのＲａｂｂｉｔ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎを用いて、β−カテニンを免疫局在決定した。最後に、ペルオキシダーゼ反応を、基質としてＤＡＢ＋を用いて視認し、Ｅｈｒｌｉｃｈのヘマトキシリンを用いて細胞の核を対染色した。６０×の対物レンズを装備したＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ−２０光学顕微鏡を用いて、転位を調査した。
【００３８】
上記の方法における破骨細胞培養由来の馴化培地を使用する前のスクリーニング対象の化合物を用いた破骨細胞の処理は、必要なスクリーニングアッセイを提供する。
【００３９】
本明細書では、他に明示的に指示しない限り、用語「または」は、その状態の１つだけが満たされることを要求する「排他的または」という作用素とは対照的に、明記した条件のいずれかまたは両方が満たされる場合は実体価値が優先される作用素の意味で使用されている。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を意味するのではなくむしろ「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という意味で使用されている。上記で認識された全ての先行する教示は、明細書に参照することにより組み込まれる。
【００４０】
［参考文献］
【表１】
2010524444.tif 000003
【図１】
2010524444.tif 000004
【図２】
2010524444.tif 000005
【図３】
2010524444.tif 000006
【図４】
2010524444.tif 000007
【国際調査報告】
2010524444.tif 000008
2010524444.tif 000009