(57)【要約】  神経剤および殺虫剤の形態の有機リン酸エステルに対する暴露によって生じる生理学的機能の損傷をその必要性のある対象において処置または防止する方法が提供される。この方法は、治療有効量のアセチルコリンエステラーゼ変異体ＡＣｈＥ−Ｒ（「読み過ごし」ＡＣｈＥ）を対象に与え、それにより、有機リン酸エステル暴露関連損傷を対象において処置することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機リン酸エステル暴露関連損傷をその必要性のある対象において処置または防止する方法であって、治療有効量のＡＣｈＥ−Ｒを対象に与え、それにより、有機リン酸エステル暴露関連損傷を対象において処置することを含む方法。
【請求項２】
前記ＡＣｈＥ−ＲはＡＲＰを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは組換えＡＣｈＥ−Ｒを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組換えＡＣｈＥ−Ｒは植物産生ＡＣｈＥ−Ｒである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは、配列番号２および４に示される通りのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記与えることは、対象に前記ＡＣｈＥ−Ｒを投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記与えることは、有機リン酸エステル暴露の前に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記投与することは、吸入によって行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記投与することは、暴露の１０時間前から暴露の７日後まで行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記投与することは、吸入および注射によって行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
対象に、アトロピンと、場合によりオキシムとを投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記与えることは、局所適用によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
固体担体に固定化されたＡＣｈＥ−Ｒを含む、有機リン酸エステル暴露関連損傷を処置または防止するための製造物。
【請求項１４】
前記固体担体は局所投与のためのものである、請求項１３に記載の製造物。
【請求項１５】
局所投与のための前記固体担体は、スポンジ、拭き取り材および布地からなる群から選択される、請求項１４に記載の製造物。
【請求項１６】
前記固体担体は、フィルター、布地および裏当てからなる群から選択される、請求項１３に記載の製造物。
【請求項１７】
前記ＡＣｈＥ−ＲはＡＲＰを含む、請求項１３に記載の製造物。
【請求項１８】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは組換えＡＣｈＥ−Ｒを含む、請求項１３に記載の製造物。
【請求項１９】
前記組換えＡＣｈＥ−Ｒは植物産生ＡＣｈＥ−Ｒである、請求項１８に記載の製造物。
【請求項２０】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは、配列番号２および４に示される通りのものである、請求項１９に記載の製造物。
【請求項２１】
表面をＡＣｈＥ−Ｒと接触させ、それにより、表面を解毒することを含む、表面を解毒する方法。
【請求項２２】
表面を、腐食剤、除染用フォーム、焼き付け条件熱と二酸化炭素との組合せ、またはこれらの組合せと接触させることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＡＣｈＥ−Ｒが、被覆、塗料、膜非形成被覆、エラストマー、接着剤、シーラント、織物に適用される材料、またはワックスに含まれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＡＣｈＥ−ＲはＡＲＰを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは組換えＡＣｈＥ−Ｒを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記組換えＡＣｈＥ−Ｒは植物産生ＡＣｈＥ−Ｒである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは、配列番号２および４に示される通りのものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＡＣｈＥ−Ｒを含む被覆材。
【請求項２９】
前記ＡＣｈＥ−ＲはＡＲＰを含む、請求項２８に記載の被覆材。
【請求項３０】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは組換えＡＣｈＥ−Ｒを含む、請求項２８に記載の被覆材。
【請求項３１】
前記組換えＡＣｈＥ−Ｒは植物産生ＡＣｈＥ−Ｒである、請求項３０に記載の被覆材。
【請求項３２】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは、配列番号２および４に示される通りのものである、請求項３１に記載の被覆材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機リン酸エステル暴露関連損傷を処置または防止するための物質および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機リン酸エステル（ＯＰ）系殺虫剤に対する偶発的（環境的または職業的）暴露および自ら招いた暴露（自殺）は、特に発展途上国世界では救急処置室において頻繁に見受けられる。これらの絶えることのない公衆衛生問題は、ＯＰ系神経剤（例えば、サリンなど）をテロおよび今までにない形の戦争の手段として使用する潜在的可能性についての増大する懸念によって強まる。ＯＰは、シナプスのアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ−Ｓ）を阻害し、これにより、シナプスでのアセチルコリンの蓄積および神経の過刺激を引き起こすことによって神経伝達を乱す。その後のニコチン性症状およびムスカリン性症状の重篤度は用量依存的であり、心臓血管虚脱および呼吸虚脱に起因して死に至らしめ得る。そのような最初の傷害を生き延びた人々は多くの場合、ＯＰ誘導による遅発性神経障害、筋力低下、永続的な脳の異常形態および社会的／行動的欠損を含めて、長期間の様々な後遺症を患う。
【０００３】
ＯＰ遅延毒性および他のストレス性傷害（例えば、心理的ストレスまたは頭部外傷）の根底にある機構は、ｃ−ｆｏｓの急速な上昇と、それに続くＡＣＨＥ遺伝子のアップレギュレーションを伴う［Ｆｒｉｅｄｍａｎ、１９９６、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２、１３８２〜１３８５］。
【０００４】
ヒトおよびマウスのＡＣｈＥプレｍＲＮＡは選択的スプライシング部位を３’端および５’端の両方に有しており、後者は、対応するプロモーターを有する。３’端での選択的スプライシングにより、タンパク質生成物多量体化能およびその細胞局在化を決定する異なるカルボキシ末端配列を有する３つのＡＣｈＥ変異体が生じる。シナプスＡＣｈＥ−Ｓは、神経系および神経筋接合部（ＮＭＪ）において発現される主要な転写物であり、ジスルフィド結合による二量体化を可能にするＣ末端システインを含有する。この二量体は、さらなる単量体の結合によって四量体を形成することができ、また、ＣｏｌＱおよびＰＲｉＭＡの構造的サブユニットを介して膜に付着することができる。赤血球のＡＣｈＥ−Ｅ転写物は、タンパク質へのグリコホスファチジルイノシトール基の結合と、それに続く、赤血球膜への二量体としてのその固定を可能にするグリシル結合をそのＣ末端に含む。通常の場合には希な、ストレス誘導による「読み過ごし」のＡＣｈＥ−Ｒ変異体は、可溶性単量体のままである（例えば、米国特許第５９３２７８０号を参照のこと）。
【０００５】
ＡＣｈＥの調節は主に転写レベルにおいて行われるが、幾分かの転写後調節が報告されており、後者は一般には、神経変性疾患に対する試みられた代償に関連する。ＡＣｈＥ遺伝子座は、ＮＦ−κＢ、ＡＰ−１およびグルココルチコイド応答エレメントに属するエンハンサーを含めて、数個の推定される上流側エンハンサーを含有する。転写を増大させる条件には、細胞分化および抗コリンエステラーゼ剤暴露が含まれる。イソ型スイッチングの調節は、はるかにより複雑であり、あまりよく理解されていない。哺乳動物の生理学において、ＡＣｈＥ−Ｓは優勢な転写物であり、ＡＣｈＥ−Ｒは極めて希である。ＡＣｈＥの転写を全体的に増大させることに加えて、物理的、化学的および心理的なストレスは、ＡＣｈＥ−Ｓに対するＡＣｈＥ−Ｒの割合を増大させる。
【０００６】
ＯＰ遅延毒性の後には、ＡＣｈＥ−Ｓから、他の場合には希な「読み過ごし（ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ）」変異体（ＡＣｈＥ−Ｒ）への、迅速であるが長く続く変化した選択的スプライシングが存在することが示されている［Ｋａｕｆｅｒ，Ｄ．ら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、３９３、３７３〜３７７；Ｓｈｏｈａｍｉ，Ｅ．、２０００、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、７８、２２８〜２３６；Ｍｅｓｈｏｒｅｒ，Ｅ．、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５、５０８〜５１２］。Ｊｏｈｎｓｏｎら［Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ、１１５、１、２００７］は、様々なＯＰの非症状的用量に対する暴露の後でのＡＣｈＥ−ＳおよびＡＣｈＥ−Ｒの両方のアップレギュレーションを教示する。Ｐｅｒｒｉｅｒら［Ｊ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５、９４、６２９〜６３８］は、ＡＣｈＥ−Ｒが、ＯＰ暴露後、この酵素の活性における変化を認めることなく、穏やかに増大することを教示する。
【０００７】
しかしながら、現在まで、ＡＣｈＥ遺伝子発現における暴露後の変化（すなわち、全体的な増大、およびＡＣｈＥ−ＳからＡＣｈＥ−Ｒへの選択的スプライシングの変化）が暴露に誘導された損傷を反映するかどうか、または逆に、保護する価値を有する適応反応を反映するかどうかは不明であった。
【０００８】
既存の処置プロトコルでは、３つの相補的な取り組み、すなわち、ムスカリン性ＡＣｈ受容体をアトロピンにより中和すること、内因性ＡＣｈＥをオキシム治療により再活性化すること、および重篤な毒性を症候に基づいて管理することが強調される。これらの取り組みは、死亡率を低下させることにおいて価値があることが証明されている一方で、抗コリンエステラーゼ剤中毒に伴う身体を衰弱させる病的状態または長期間の結果を防止することができない。
【０００９】
代替として、ＯＰバイオスカベンジャーとしての様々なヒトコリンエステラーゼ（ＣｈＥ）の使用が提案されている［Ｍａｘｗｅｌｌ、１９９３、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２６４、１０８５〜１０８９］が、この取り組みの実用性は、触媒的な量ではなく、化学量論的な量で要求される多量のこれらの酵素が入手できるかに依存する。血漿から精製されたブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）をＯＰバイオスカベンジャーとすることによるかなりの成功［Ａｓｈａｎｉ，Ｙ．、２０００、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．、５０、２９８〜３０８；Ｄｏｃｔｏｒ，Ｂ．Ｐ．およびＳａｘｅｎａ，Ａ．、２００５、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ、印刷中］は、ＯＰの生理学的に関連した標的、すなわち、ヒトＡＣｈＥとの比較研究を必要とした。ＡＣｈＥは、ＢＣｈＥよりもかなり速いＯＰ結合速度論を示す［Ｍａｘｗｅｌｌ、１９９３、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２６４、１０８５〜１０８９］。このことから、より少ない用量が効果的であり得ることが予測される［Ｋａｐｌａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４０、７４３３〜７４４５］。
【発明の概要】
【００１０】
１つの局面によれば、有機リン酸エステル暴露関連損傷をその必要性のある対象において処置または防止する方法が提供され、この方法は、治療有効量のＡＣｈＥ−Ｒを対象に与え、それにより、有機リン酸エステル暴露関連損傷を対象において処置することを含む。
【００１１】
別の局面によれば、固体担体に固定化されたＡＣｈＥ−Ｒを含む、有機リン酸エステル暴露関連損傷を処置または防止するための製造物が提供される。
【００１２】
さらに別の局面によれば、表面をＡＣｈＥ−Ｒと接触させ、それにより、表面を解毒することを含む、表面を解毒する方法が提供される。
【００１３】
なおさらに別の局面によれば、ＡＣｈＥ−Ｒを含む被覆材が提供される。
【００１４】
１つの実施形態によれば、ＡＣｈＥ−ＲはＡＲＰを含む。
【００１５】
別の実施形態によれば、ＡＣｈＥ−Ｒは組換えＡＣｈＥ−Ｒを含む。
【００１６】
別の実施形態によれば、組換えＡＣｈＥ−Ｒは植物産生ＡＣｈＥ−Ｒである。
【００１７】
別の実施形態によれば、ＡＣｈＥ−Ｒは、配列番号２および４に示される通りである。
【００１８】
別の実施形態によれば、与えることは、対象にＡＣｈＥ−Ｒを投与することを含む。
【００１９】
別の実施形態によれば、与えることが有機リン酸エステル暴露の前に行われる。
【００２０】
別の実施形態によれば、投与することが吸入によって行われる。
【００２１】
別の実施形態によれば、投与することが暴露の１０時間前から暴露の７日後まで行われる。
【００２２】
別の実施形態によれば、投与することが吸入および注射によって行われる。
【００２３】
別の実施形態によれば、本発明の方法はさらに、対象に、アトロピンと、場合によりオキシムとを投与することを含む。
【００２４】
別の実施形態によれば、与えることが局所適用によって行われる。
【００２５】
別の実施形態によれば、固体担体は局所投与のためのものである。
【００２６】
別の実施形態によれば、局所投与のための固体担体が、スポンジ、拭き取り材および布地からなる群から選択される。
【００２７】
別の実施形態によれば、固体担体が、フィルター、布地および裏当てからなる群から選択される。
【００２８】
別の実施形態によれば、本発明の方法はさらに、表面を、腐食剤、除染用フォーム、焼き付け条件熱と二酸化炭素との組合せ、またはこれらの組合せと接触させることを含む。
【００２９】
別の実施形態によれば、ＡＣｈＥ−Ｒが、被覆、塗料、膜非形成被覆、エラストマー、接着剤、シーラント、織物に適用される材料、またはワックスに含まれる。
【００３０】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００３１】
本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ及びｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」またはその文法的変形は、述べた特徴、整数、工程または構成要素を特定するものとして解釈されるが、一つ以上の追加の特徴、整数、工程、構成要素またはそれらの群の追加を除外しない。この用語は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を包含する。
【００３２】
本明細書で使用される表現「から本質的になる」またはその文法的変形は、述べた特徴、整数、工程または構成要素を特定するものとして解釈されるが、追加の特徴、整数、工程、構成要素またはそれらの群が、主張される組成物、装置または方法の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、一つ以上の追加の特徴、整数、工程、構成要素またはそれらの群の追加を除外しない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００３４】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、ヒトＡＣｈＥ変異体を過剰発現する安定的にトランスフェクトされた細胞株の樹立を説明する。図１Ａは、ＡＣｈＥ遺伝子の選択的スプライシング変異体を示すスキームである。矢印はそれぞれのｍＲＮＡのタンパク質産物を示す。図１Ｂは、ＡＣｈＥタンパク質の共通領域に対する抗体（Ｎ−１９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）によりプローブされる、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の全抽出物のウエスタンブロットである。ｒＡＣｈＥ−Ｓ（商業的に精製された組換えＡＣｈＥ−Ｓ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）がコントロールの役割を果たした。図１Ｃは、ＡＣｈＥ−Ｒ  ｃＤＮＡまたはＡＣｈＥ−Ｓ  ｃＤＮＡのどちらかを最小のＣＭＶエンハンサー−プロモーターの制御下に有する構築物により安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞における総ＡＣｈＥ活性を説明する棒グラフである。ＧＦＰベクターにより安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ＧＦＰ）がコントロールの役割を果たした。黒塗り棒は細胞内活性をμＭ加水分解ＡＣｈ／ｍｇタンパク質の単位で示す。白抜き棒は細胞外活性をμＭ加水分解ＡＣｈ／ｍｌ培地の単位で示す。誤差棒は標準偏差を示す。
【００３５】
【図２Ａ】図２Ａは、暴露後の血漿ＡＣｈＥ活性およびコルチコステロンレベルを説明する棒グラフである。図２Ａ：ＡＣｈＥ特異的活性を、５０μＭのＩＳＯ−ＯＭＰＡの存在下、Ｅｌｌｍａｎアッセイを使用して処置後７日目にすべての動物の血漿において測定した。血漿ＡＣｈＥ活性における最大の増強がパラオクソンおよびｍＡＲＰによる同時処置の後で観測された。挿入図：パラオクソンの構造およびｍＡＲＰの配列。
【図２Ｂ】図２Ｂは、暴露後の血漿ＡＣｈＥ活性およびコルチコステロンレベルを説明する棒グラフである。図２Ｂ：血漿コルチコステロンレベルを、ＯＣＴＥＩＡコルチコステロンキット（ＩＤＳ  Ｌｔｄ、Ｂｏｌｄｏｎ、英国）を製造者の説明書に従って実験の６日目に血漿において測定した。ｍＡＲＰは、生理食塩水およびパラオクソンによって誘導されたコルチコステロンレベルにおける増大を改善した。挿入図：コルチコステロンの構造。
【００３６】
【図３】図３Ａ〜Ｃは、ｍＡＲＰがＡＣｈＥ遺伝子発現に対する暴露の影響を改善することを説明する。ＡＣｈＥのｍＲＮＡレベルを、１週間の実験が終了したとき、処置動物の骨格筋において測定した。総ＲＮＡを、凍結された骨格筋から精製し、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）をリアルタイムＰＣＲ定量のために使用するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに供した。図３Ａは、ＡＣｈＥ  ｍＲＮＡの共通ドメイン（図３Ｂ）と、ＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡについて特有である３’領域（図３Ｃ）との両方を増幅するために使用された２組のプライマーの位置を説明する。数字はヌクレオチド位置を示す。柱は、サイクル数として測定される、ナイーブ動物に対するＲＴ−ＰＣＲ生成物量のｌｏｇ２差を示す。値が標準転写物（β−アクチンｍＲＮＡ）の値に対して較正された。したがって、棒グラフは、ナイーブマウスにおけるベースラインと比較したときの生成物蓄積における対数での差を示す。正の値は、試験された筋肉サンプルでのｍＲＮＡレベルにおける増大を反映する。それぞれの棒が、右側パネルにおけるパラオクソン＋生理食塩水の棒を除いて、３匹の動物の平均を示し、右側パネルでは、２匹の動物だけがこの実験のために利用可能であった。３番目のマウスは、低すぎて定量することができなかった筋肉のＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡレベルを示した。このことは、観測された低下を強調する。
【００３７】
【図４】図４Ａ〜Ｆは、ｍＡＲＰが体温（ＢＴ）に対する暴露の影響を変化させることを説明するグラフである。適応期間が終了したとき、試験群あたり３匹の動物をテレメトリー用送信機の埋め込みに供し、その後、２週間の回復期間を与えた。回復後、実験の全継続期間にわたる記録を開始した。テレメトリーでのベースライン値を確立した２日後、マウスに、生理食塩水、ｉ．ｐ．での０．４ｍｇ／ｋｇのパラオクソン（Ｓｉｇｍａ）、またはｉ．ｐ．での２．５ｍｇ／ｋｇの大腸菌リポ多糖（ＬＰＳ）を注射した。実験期間を通して毎日、マウスには、ｍｇ／ｋｇのｍＡＲＰ、またはコントロールのための生理食塩水をｉ．ｖ．注射した。テレメトリーにより測定されたＢＴを処置前日および処置後１日目について示す（図４Ａ〜図４Ｃ）。１日目における改善された、ＬＰＳ誘導による低下に留意すること。棒グラフは、全処置期間にわたる毎日の平均温度を示す（図４Ｄ〜図４Ｆ）。
【００３８】
【図５Ａ】図５Ａは、運動活性（ＭＡ）に対するｍＡＲＰの影響を説明するグラフである。図５Ａは、処置前日および処置後１日目の期間中におけるＭＡを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、運動活性（ＭＡ）に対するｍＡＲＰの影響を説明するグラフである。図５Ｂは、処置前日および処置後１日目の期間中におけるＭＡを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、運動活性（ＭＡ）に対するｍＡＲＰの影響を説明するグラフである。図５Ｃは、処置前日および処置後１日目の期間中におけるＭＡを示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、運動活性（ＭＡ）に対するｍＡＲＰの影響を説明するグラフである。図５Ｄは、完全な実験の過程を通した平均の明期ＭＡおよび暗期ＭＡを処置前および処置後の両方で示す棒グラフである。埋め込まれた送信機がマウスケージの下の検知台を横切って動くときにモニターされる事象の数が示される。
【図５Ｅ】図５Ｅは、運動活性（ＭＡ）に対するｍＡＲＰの影響を説明するグラフである。図５Ｅは、完全な実験の過程を通した平均の明期ＭＡおよび暗期ＭＡを処置前および処置後の両方で示す棒グラフである。埋め込まれた送信機がマウスケージの下の検知台を横切って動くときにモニターされる事象の数が示される。
【図５Ｆ】図５Ｆは、運動活性（ＭＡ）に対するｍＡＲＰの影響を説明するグラフである。図５Ｆは、完全な実験の過程を通した平均の明期ＭＡおよび暗期ＭＡを処置前および処置後の両方で示す棒グラフである。埋め込まれた送信機がマウスケージの下の検知台を横切って動くときにモニターされる事象の数が示される。
【００３９】
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａ〜Ｂは、植物におけるＡＣｈＥ−ＲＥＲの発現を説明する図および写真である。図６Ａは、ＡＣｈＥ−ＳおよびＡＣｈＥ−Ｒが、異なったＣ末端を有する選択的スプライシング変異体であることを説明するモデルである。図６Ｂは、ＡＣｈＥ−ＲＥＲ発現ベクターを説明する図である。Ｌ、左境界；Ｒ、右境界；Ａｇ７、ノパリンシンターゼポリアデニル化シグナル；ｎｐｔＩＩ、カナマイシン抵抗性マーカー；ＮＯＳ、ノパリンシンターゼプロモーター；３５Ｓ、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター；ＴＥＶ、タバコエッチウイルスの翻訳エンハンサー領域；ＡＣｈＥ−ＲＥＲ、Ｃ末端のＳＥＫＤＥＬ小胞体保持シグナルを含有する、ヒトＡＣｈＥ−Ｒのためのコドン最適化されたコード領域；ＶＳＰ、ダイズ栄養貯蔵タンパク質の３’ＵＴＲ；矢印、ＤＮＡブロット分析のためのプローブを作製するために使用されたプライマーの位置。
【図６Ｃ−Ｄ】図６Ｃ〜Ｄは、植物におけるＡＣｈＥ−ＲＥＲの発現を説明する図および写真である。図６Ｃは、ＤＮＡブロット分析である。ゲノムＤＮＡを最高発現Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ系統（２Ｄ）（レーン１〜３）およびｗｔ植物（レーン４〜５）から抽出し、ＥｃｏＲＩ（レーン１および４）、ＮｃｏＩ（レーン２および５）およびＨｉｎｄＩＩＩ（レーン３）により消化した。図６Ｄは、アリゾナ州立大学の管理された生育施設における２Ｄ  Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの大規模培養を説明する写真である。
【００４０】
【図７Ａ−Ｃ】図７Ａ〜Ｃは、植物産生ＡＣｈＥ−ＲＥＲの特徴づけを説明する写真およびグラフである。図７Ａ：連続する精製工程からの分画物を下記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クーマシー染色（レーン１〜５）または銀染色（レーン６）によって可視化した：粗ｗｔ抽出物（レーン１）、粗２Ｄ抽出物（レーン２）、プロカインアミド親和性クロマトグラフィーの素通り（レーン３）、徹底した透析の後での溶出物（レーン４）、アニオン交換クロマトグラフィーおよび濃縮の後での最終生成物（レーン５および６）。図７Ｂ：上記分画物をＡＣｈＥ特異的Ａｂによる免疫ブロット分析に供した（レーン１〜５）。図７Ｃ：ＣｈＥ活性について染色された非変性ＰＡＧＥ。
【図７Ｄ】図７Ｄは、植物産生ＡＣｈＥ−ＲＥＲの特徴づけを説明する写真およびグラフである。図７Ｄ：植物産生ＡＣｈＥ−ＲＥＲは、哺乳動物細胞培養または植物により産生されたＡＣｈＥ−Ｓと比較したとき、同等のＫｍおよび基質阻害を示す。挿入図：ラインウィーバー・バーク分析（挿入図）。
【図７Ｅ】図７Ｅは、植物産生ＡＣｈＥ−ＲＥＲの特徴づけを説明する写真およびグラフである。図７Ｅ：植物由来のＡＣｈＥ−ＲＥＲおよびＡＣｈＥ−Ｓならびに哺乳動物細胞培養物由来のＡＣｈＥ−Ｓの残存活性を、示された濃度のＯＰ（パラオクソン）の存在下でアッセイした。
【００４１】
【図８Ａ】図８Ａは、植物産生ＡＣｈＥ−ＲＥＲの薬物動態学を説明するグラフおよび写真である。図８Ａはクリアランスプロフィルである。５匹のマウスからなる群に、４００Ｕ、１０００Ｕの植物産生ＡＣｈＥ−ＲＥＲ、または等体積の生理食塩水のどれかを注射した。血漿サンプルを採取し、Ｉｓｏ−ＯＭＰＡ（選択的ＢＣｈＥ阻害剤）の存在下でのＡＣｈＥ活性についてアッセイした。
【図８Ｂ】図８Ｂは、植物産生ＡＣｈＥ−ＲＥＲの薬物動態学を説明するグラフおよび写真である。図８Ｂは無傷の循環ＡＣｈＥ−ＲＥＲの免疫ブロット検出である。４００ＵのＡＣｈＥ−ＲＥＲが注射された２匹のマウスから得られる血漿タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、免疫ブロッティングに供した。図８Ｂでは、精製された植物産生ＡＣｈＥ−ＲＥＲが比較のための血清サンプルと一緒に分離された。
【図８Ｃ】図８Ｃは、植物産生ＡＣｈＥ−ＲＥＲの薬物動態学を説明するグラフおよび写真である。図８Ｃ：循環しているＡＣｈＥ−ＲＥＲは、非変性ＰＡＧＥでは低下した移動を示す。４００ＵのＡＣｈＥ−ＲＥＲが注射された５匹のマウス、およびＰＢＳが注射された２匹のマウスから得られる血漿サンプルを調製し、非変性ＰＡＧＥに供し、その後、触媒活性なＡＣｈＥの染色を行った。速く移動するＡＣｈＥ−Ｒ単量体が組換え酵素の注射後にだけ現れた。図８Ｃでは、精製された植物産生ＡＣｈＥ−ＲＥＲが比較のための血清サンプルと一緒に分離された。
【００４２】
【図９Ａ】図９Ａは、インビボでの植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲの活性を説明するグラフである。図９Ａは、植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲがマウスをパラオクソンの致死的攻撃から保護し得ることを説明する。マウスに植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲをｉ．ｖ．注射し、続いて、１０分後に、もう１回のパラオクソン（７５０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｖ．注射を行って、示された酵素／ＯＰ比を得た。それぞれの円が個々のマウスを表す。症状を、本文に記載するようにスコア化した。
【図９Ｂ】図９Ｂは、インビボでの植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲの活性を説明するグラフである。図９Ｂは、植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲおよびパラオクソンがインビボでのマウスＡＣｈＥ−Ｒの蓄積を相互に調節し得ることを説明する。血漿サンプルを処置の１０日後に採取し、ＡＣｈＥ活性のそれらの含有量について分析した。星印は、統計学的に有意な変化（Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）を示す。
【００４３】
【図１０Ａ】図１０Ａは、植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲおよびパラオクソンがインビボでのマウスＡＣｈＥ−Ｒの蓄積を相互に調節し得ることを説明するグラフおよび写真である。血漿サンプルを処置の１０日後に採取し、ＡＣｈＥタンパク質および酵素活性のそれらの含有量について分析した。図１０Ａ：血漿タンパク質を非変性ＰＡＧＥによって分離し、その後、活性なＡＣｈＥの染色を行った。植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲが比較の役割を果たした。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲおよびパラオクソンがインビボでのマウスＡＣｈＥ−Ｒの蓄積を相互に調節し得ることを説明するグラフおよび写真である。血漿サンプルを処置の１０日後に採取し、ＡＣｈＥタンパク質および酵素活性のそれらの含有量について分析した。図１０Ｂ：血漿タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後、免疫ブロッティングを行った。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲおよびパラオクソンがインビボでのマウスＡＣｈＥ−Ｒの蓄積を相互に調節し得ることを説明するグラフおよび写真である。大腿四頭筋サンプルを処置の１０日後に採取し、ＡＣｈＥタンパク質および酵素活性のそれらの含有量について分析した。図１０Ｃ：筋肉タンパク質を、以前の記載［Ｌｅｅら、Ｊａｍａ、２９０、６５９〜６６２］の通りに、低塩緩衝液（１４４ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する；ｐＨ７．４）、低塩＋界面活性剤（１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、および最後に、高塩（１ＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのリン酸ナトリウム）に対するそれらの溶解性に基づいて順次分画化した。低塩＋界面活性剤の分画物におけるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後、免疫ブロッティング、およびＡＣｈＥ−Ｒ特異的Ａｂによる検出を行った。合成ｍＡＲＰペプチドが陽性コントロールの役割を果たした。
【図１０Ｄ−Ｅ】図１０Ｄ〜Ｅは、植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲおよびパラオクソンがインビボでのマウスＡＣｈＥ−Ｒの蓄積を相互に調節し得ることを説明するグラフである。大腿四頭筋サンプルを処置の１０日後に採取し、ＡＣｈＥタンパク質および酵素活性のそれらの含有量について分析した。図１０Ｄ：ＡＣｈＥ活性を３つすべての分画物においてアッセイした（平均±ＳＥＭ）。図１０Ｅ：低塩分画物におけるＡＣｈＥ活性の（ＰＢＳコントロールに対する）パーセント変化。星印は、統計学的に有意であること（Ｐ＜０．０４、スチューデントｔ検定）を示す。
【００４４】
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＡＣｈＥ−ＲＥＲによる前処理が、ＯＰ中毒により誘導される形態的なＮＭＪ損傷を改善することを説明する。図１１Ａ：マウスを、ＰＢＳ（１）、４００ＵのＡＣｈＥ−ＲＥＲ（２）、０．８ｘＬＤ５０のパラオクソン（３）、または４００ＵのＡＣｈＥ−ＲＥＲおよび０．８ｘＬＤ５０のパラオクソン（４）のいずれかで処置した。処置後１０日で、横隔膜筋を解剖し、触媒活性なＡＣｈＥについて染色して、ＮＭＪの数およびサイズを可視化した。ＮＭＪ密度（ＮＭＪ数／ｍｍ２）を測定し、それぞれの切片（ａ１〜ａ４）における平均±ＳＥＭによって表した。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＡＣｈＥ−ＲＥＲによる前処理が、ＯＰ中毒により誘導される形態的なＮＭＪ損傷を改善することを説明する。図１１Ｂ：ＮＭＪ密度および形態学の分析。ＮＭＪ面積（μｍ２）を、ＭＡＴＬＡＢ７．０．１ソフトウェアを使用してボックスプロットした。ボックスは、下位四分位点、メジアンおよび上位四分位点の値における線分から組み立てられる。ひげは残りのデータを示し、＋によって示される外れ値は、ひげを超えるデータを示す。星印は、Ｐ＜０．０１を示す（メジアン検定）。両方の分析は、パラオクソン暴露がＮＭＪの密度および大きいシナプスの割合の両方を増大させたことを示唆する（図１１Ａ（１）と比較して、図１１Ａ（３）における挿入図もまた参照のこと）。植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲによる前処理はＮＭＪ面積に対する影響の少なくとも一部を防止し、一方、植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲ単独は非暴露の横隔膜においてＮＭＪ密度またはＮＭＪ面積を変化させなかった。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ＡＣｈＥ−ＲＥＲによる前処理が、ＯＰ中毒により誘導される形態的なＮＭＪ損傷を改善することを説明する。図１１Ｃは、ＯＰ中毒の急性的結果および慢性的結果からの保護の機構についてのモデルである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明は、有機リン酸エステル暴露関連損傷を処置または防止するための物質および方法に関し、特に本発明は、有機リン酸暴露関連損傷を処置または防止するためのＡＣｈＥ−Ｒの使用に関する。
【００４６】
本発明の原理および操作は、図面およびそれに伴なう説明を参照してより良く理解することができる。
【００４７】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるまたは実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行されることができる。また、本明細書中で用いられる表現および用語は説明のためであり、従って限定として見なされるべきではないことを理解しなければならない。
【００４８】
神経剤（例えば、サリン、ソマンおよびＶＸ）および殺虫剤（例えば、パラオクソン、パラチオンおよびマラチオン）の形態の有機リン酸エステル（ＯＰ）に対する暴露は、ニューロンの持続した神経インパルスを許し、それにより、毒性、行動的欠損および死亡を生じさせる、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の阻害による急性のコリン作動性影響を生じさせることがある。近年、そのような薬剤は、テロリスト活動の高まりのために、ますます増大する軍事的および非軍事的脅威となっている。
【００４９】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、ＡＣｈＥ−Ｒおよびその活性な部分ＡＲＰが、有機リン酸エステル暴露関連損傷から保護するために使用され得ることを発見した。
【００５０】
本明細書中下記において、また、下記の実施例の節において説明するように、外部から適用されたＡＣｈＥ−Ｒは動物をＯＰ攻撃から保護した。６週齢〜８週齢のオスのＦＶＢ／Ｎマウスが、増大する量の植物で産生させたヒトＡＣｈＥ−Ｒ（体重に対して調節された用量）で前処理され、その後、単回ボーラスの１．１４ｘＬＤ５０のパラオクソン（６６０μｇ／ｋｇ）により攻撃され、症状が観察され、記録された。パラオクソンのこの用量は、別途処置されていないマウスについては致死的であり、この場合、死の前に、重篤なコリン作動性症状（痙攣および不自然な呼吸能）が生じ、５分〜１０分のうちに死に至る。１７匹のマウスを植物由来ＡＣｈＥ−Ｒで前処理することにより、ＡＣｈＥ−Ｒ／ＯＰのモル比が、ＢＣｈＥによる同等な化学量論的保護よりもはるかに低い０．０４のときでさえ、死亡率が低下した［Ｒａｖｅｈ，Ｌ．、Ｇｒｕｎｗａｌｄ，Ｊ．、Ｍａｒｃｕｓ，Ｄ．、Ｐａｐｉｅｒ、Ｙ．、Ｃｏｈｅｎ，Ｅ．およびＡｓｈａｎｉ，Ｙ．（１９９３）、神経剤毒性のための一般的な予防解毒剤としてのヒトブチリルコリンエステラーゼ、インビトロおよびインビボでの定量的特徴づけ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４５、２４６５〜２４７４］。この低いモル比において、生存動物は最初、重篤な症状を示し、その後、より穏やかな症状（あまり激しくない痙攣および振せん）を示した。症状が徐々に小さくなり、そして、４時間以内に、マウスはほんの軽度の徴候（低下した運動活性および全身倦怠感）を示した。重要なことに、パラオクソン注射後の最初の１５分を生き延びたすべてのマウスが、明らかに完全な回復を２４時間以内に示した。
【００５１】
酵素／薬剤モル比が０．０９を超える場合、初期症状は中程度であり、０．２を超える場合、初期症状は軽度にすぎなかった。０．５を超える酵素／薬剤比により処置されたマウスは暴露後の症状の徴候を何ら示さなかった。すべての生存マウスの６ヶ月間のモニタリングでは、明白な神経障害または他の症状は何ら明らかにされなかった。投与されたヒト酵素に対して特異的なＩｇＧの極めて低い力価が観測された；しかしながら、ＡＣｈＥ特異的なＩｇＥ、またはマウスＡＣｈＥ２に対して向けられた自己Ａｂのどちらも、植物由来ＡＣｈＥ−Ｒの最大用量で処置されたマウスから得られた血清サンプルにおいてさえ検出することができなかった。
【００５２】
本発明者らはさらに、ＡＣｈＥ−ＲがＯＰ中毒の遅れた影響から保護することを示している。マウスがＰＢＳ＋／−ＡＣｈＥ−Ｒ（４００Ｕ）のｉ．ｖ．投与によって前処理され、その後、亜致死的（０．８ＬＤ５０）または致死的（１．１３ＬＤ５０）なパラオクソン攻撃が行われた。すべてが重篤なコリン作動性症状を示し、その後で回復した（生存率は、亜致死的な攻撃を受けたマウスおよび致死的な攻撃を受けたマウスについてそれぞれ、１００％および７０％であった）。処置後１０日で、マウスを安楽死させ、血漿サンプルおよび骨格筋サンプルを採取した。このとき、すべてのマウスが、予測され得たことだが、ＯＰ攻撃によって誘導されるそれらの血漿ＡＣｈＥレベルにおける小さい増大を経た。この遅れた時点での血漿ＡＣｈＥ活性は、保護されていない亜致死的な攻撃を受けたマウスと比較したとき、酵素により処置された動物では実質的により低かった。このことは、長く続くＡＣｈＥ−Ｒの過剰産生の、効果的ではあるが不完全な相殺が、植物由来ＡＣｈＥ−Ｒの投与によるものであることを示唆する。植物由来ＡＣｈＥ−Ｒの単独投与は、注射後１０日で、血漿ＡＣｈＥ−Ｒ活性のレベルを著しく制限した。このことは、この相殺が、循環系における高いレベルのＡＣｈＥ分子に対するフィードバック応答であったという見解を裏付ける。さらに、血漿ＡＣｈＥ−Ｒ活性におけるＯＰ誘導による増大の酵素前処理による調節が、攻撃後１０日で得られたサンプルの非変性ゲルによって観測されるＡＣｈＥ単量体（おそらくは、マウスＡＣｈＥ−Ｒ）における対応する変化によって反映される。したがって、内因性マウスＡＣｈＥ（具体的には、マウスＡＣｈＥ−Ｒ）の血漿レベルにおける中毒後の増大は、外部から適用された植物由来酵素によって少なくとも部分的に軽減され得る。
【００５３】
ＡＣｈＥ−Ｒにより前処理されたマウスにおける筋肉ＡＣｈＥ活性は、攻撃されていないコントロールの筋肉ＡＣｈＥ活性と類似していた。このことは、投与されたＡＣｈＥ−Ｒが、マウスの循環におけるＯＰ誘導によるＡＣｈＥ−Ｒの産生を低下させながら、筋肉ＡＣｈＥ−Ｒを阻害から保護する「おとり」として働いたことを明らかにする。
【００５４】
パラオクソン暴露は、ＰＢＳコントロールと比較したとき、処置後１０日で解剖され、触媒活性なＡＣｈＥについて染色された無傷の横隔膜筋における大きいＮＭＪの密度および割合の両方を増大させた。４００ＵのＡＣｈＥ−Ｒによる前処理は、ＮＭＪ面積の暴露に誘導された拡大の少なくとも一部を妨げ、これに対して、４００ＵのＡＣｈＥ−Ｒ単独による前処理は、暴露を受けない横隔膜におけるＮＭＪの密度または面積を変化させなかった。これらの発見により、これらの弱まったＮＭＪの異常形態の影響が宿主筋肉組織における改善されたフィードバック応答の結果であると考えられる。
【００５５】
加えて、本発明者らはまた、ＡＣｈＥ−Ｒの天然の切断可能なＣ末端ペプチド（ＡＲＰ）のパラオクソン暴露マウスへの投与が、ＡＣｈＥ活性、コルチコステロン、体温および認知機能を含むいくつかのパラメーターを分析することによって明らかにされるように、運動活性の回復および認知機能の回復を促進したことを示している。
【００５６】
これらの発見のすべてが、有機リン酸エステル暴露関連損傷を処置および防止するためのＡＣｈＥ−Ｒの使用を支持している。
【００５７】
したがって、本発明の１つの局面によれば、有機リン酸エステル（ＯＰ）暴露関連損傷をその必要性のある対象において処置または防止する方法が提供され、この方法は、治療有効量のＡＣｈＥ−Ｒを対象に与え、それにより、有機リン酸エステル暴露関連損傷を対象において処置することを含む。
【００５８】
本明細書中で使用される用語「処置する」は、有機リン酸エステル中毒の即時的な命にかかわる影響およびその長期間の身体を衰弱させる結果の有害な影響を防止すること、治すこと、逆転させること、弱めること、緩和すること、最小限に抑えること、抑制すること、または停止させることを示す。
【００５９】
本明細書中で使用される表現「有機リン酸エステル暴露関連損傷」は、生理学的機能（例えば、運動機能および認知機能）に対する短期間の損傷（例えば、暴露後数分から数時間まで）および長期間の損傷（例えば、暴露後１週間から数年にまで至る）を示す。有機リン酸エステル暴露関連損傷は、頭痛、広汎性筋痙攣、衰弱、過度な分泌、悪心、嘔吐および下痢（これらに限定されない）を含む臨床的症状によって表されることがある。状態は、発作、昏睡、麻痺、呼吸不全、遅発性神経障害、筋力低下、振せん、痙攣、永続的な脳の異常形態、社会的／行動的欠損、および全身的なコリン作動性クリーゼ（これは、例えば、悪化した炎症および低い血球数によって現れることがある）に進行する場合がある。極端な場合には、中毒者は死に至る場合がある。
【００６０】
本明細書中で使用される用語「有機リン酸エステル化合物」は、ホスホリル中心を含む化合物を示し、２つまたは３つのエステル連結をさらに含む。いくつかの局面において、ホスホリル中心におけるホスホエステル結合および／またはさらなる共有結合のタイプにより、有機リン化合物が分類される。リンが二重結合（ＰｄｂｄＯ）によって酸素に連結される実施形態において、そのようなＯＰ化合物は「オキソンＯＰ化合物」または「オキソン有機リン化合物」として知られている。リンが二重結合（ＰｄｂｄＳ）によってイオウに連結される実施形態において、そのようなＯＰ化合物は「チオンＯＰ化合物」または「チオン有機リン化合物」として知られている。
【００６１】
結合タイプにより分類されるＯＰ化合物のさらなる例には、Ｐ−−ＣＮ結合を含むホスホノシアナート；Ｐ−−Ｎ結合を含むホスホロアミダート；Ｐ−−Ｏ結合を含むホスホトリエステル；Ｐ−−Ｏ結合を含むホスホジエステル；Ｐ−−Ｆ結合を含むホスホノフルオリダート；Ｐ−−Ｓ結合を含むホスホノチオラートが含まれる。「ジメチルＯＰ化合物」は、リン原子に共有結合した２つのメチル成分を含む（例えば、マラチオンなど）。「ジエチルＯＰ化合物」は、リン原子に共有結合した２つのエトキシ成分を含む（例えば、ダイアジノンなど）。
【００６２】
一般的な実施形態において、ＯＰ化合物は有機リン系神経剤または有機リン系殺虫剤を含む。
【００６３】
本明細書中で使用される「神経剤」はコリンエステラーゼの阻害剤である。ＯＰ化合物の毒性は、標的酵素からのそのホスホリル中心（例えば、Ｐ−−Ｃ、Ｐ−−Ｏ、Ｐ−−Ｆ、Ｐ−−Ｓ、Ｐ−−ＣＮ）の遊離速度に依存する。好ましい神経剤は、その触媒活性が多くの場合には、ヒトを含む動物における健康および生存のために非常に重要であるコリンエステラーゼ（例えば、アセチルコリンエステラーゼ）の阻害剤である。
【００６４】
ある種のＯＰ化合物はヒトに対して非常に毒性が高いので、化学戦争薬剤（ＣＷＡ）としての使用のために改造されている（例えば、タブン、ソマン、サリン、シクロサリン、ＶＸおよびＲ−ＶＸなど）。ＣＷＡは空中浮遊形態である場合があり、そのような配合物は本明細書中では「ＯＰ系神経ガス」として理解される。空中浮遊形態の例には、ガス、蒸気、エアロゾル、ダストまたはそれらの組合せが含まれる。ＯＰ系神経ガスとして配合され得るＯＰ化合物の例には、タブン、サリン、ソマン、ＶＸ、ＧＸまたはそれらの組合せが含まれる。その性質において神経ガスの性質に類似していないにもかかわらず、神経ガスに近い有機リン酸エステルの一例は、揮発性がこの群の他のメンバーよりもかなり低いＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスホナート）の有機リン酸エステルである。
【００６５】
そのような薬剤に共通する暴露の最初の吸入経路に加えて、ＣＷＡ、特に持続性薬剤、例えば、ＶＸおよび増粘化ソマンなどは、皮膚吸収によって脅威をもたらす［“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｗａｒｆａｒｅ  Ａｇｅｎｔｓ：Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｔ  Ｌｏｗ  Ｌｅｖｅｌｓ”（Ｓａｔｕ  Ｍ．ＳｏｍａｎｉおよびＪａｍｅｓ  Ａ．Ｒｏｍａｎｏ，Ｊｒ．編）、４１４頁、２００１年］。そのような持続性ＣＷＡ薬剤は固体または液体として留まり、同時に、３時間を超えて外気にさらされる。放出後、多くの場合、持続性薬剤は、空中浮遊の分散形態から、表面における固体または液体の残留物に変わることがあり、したがって、人の皮膚に接触する機会をもたらす。
【００６６】
ＯＰ系殺虫剤の例には、ブロモホス−エチル、クロルピリホス、クロルフェンビンホス、クロロチオホス、クロルピリホス−メチル、クマホス、クロトキシホス、クルホマート、シアノホス、ダイアジノン、ジクロフェンチオン、ジクロルボス、ダースバン、ＥＰＮ、エトプロプ、エチル−パラチオン、エトリムホス、ファンファー、フェンスルホチオン、フェンチオン、フェントロチオン、イソフェンホス、ヨードフェンホス、レプトホス−オキソン、マラチオン、メチル−パラチオン、メビンホス、パラオキソン、パラチオン、パラチオン−メチル、ピリミホス−エチル、ピリミホス−メチル、ピラゾホス、キナルホス、ロンネル、スルプロホス、スルホテップ、トリクロロナートまたはこれらの組合せが含まれる。
【００６７】
本明細書中で使用される表現「その必要性のある対象」は、ＯＰの毒性影響を受けやすいヒト対象または動物対象を示す。したがって、そのような対象はＯＰにさらされ得るか、またはＯＰに対する暴露の危険性があり得る。例には、公の行事におけるテロリスト攻撃によって汚染を受けた市民、殺虫剤／殺昆虫剤によるＯＰ中毒にさらされる屋外作業者、殺虫剤を輸送するトラック運転手、殺虫剤製造者、ノミ駆除液浸に過度にさらされるイヌ手入れ者、害虫駆除作業者、ならびにこれらの化合物を使用する様々な家庭内労働者および保管作業者、神経ガスにさらされる軍関係者が含まれる。
【００６８】
述べられたように、本発明のいくつかの実施形態において、本発明の方法は、治療有効量のＡＣｈＥ−Ｒを対象に与えることによって行われる。
【００６９】
本明細書中で使用される用語「ＡＣｈＥ−Ｒ」は、アセチルコリンエステラーゼの読み過ごし変異体（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＤＱ１４０３４７に示される変異体（例えば、配列番号２）など）またはその活性な部分（例えば、配列番号６および８に示されるＡＲＰ）を示す。
【００７０】
本発明のＡＣｈＥ−Ｒは自然界で発現され得る（すなわち、精製され得る）か、あるいは、合成または組換えにより製造され得る（例えば、細菌、酵母、細胞株、トランスジェニック動物（例えば、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる米国特許第５９３２７８０号を参照のこと）またはトランスジェニック植物（コケ、藻類、単子葉または双子葉植物、ならびに他の植物）などにおいて製造され得る）。例には、葉作物、オイル作物、アルファルファ、タバコ、トマト、バナナ、ニンジン、レタス、トウモロコシ、キュウリ、メロン、ジャガイモ、ブドウおよびシロクローバーが含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
植物細胞は場合により、任意のタイプの植物細胞：例えば、植物根細胞（すなわち、植物根に由来する細胞、植物根から得られる細胞、または元々は植物根に基づく細胞）、より好ましくは、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞からなる群から選択される植物根細胞などであり得る。例えば、実施例の節、タバコにおける発現を参照のこと。
【００７２】
組換えタンパク質を製造する様々な方法がこの技術分野では広く知られている。植物細胞における組換えタンパク質製造のための具体的な例が、ＰＣＴ  ＷＯ２００５／０８０５４４において提供される（これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態のＡＣｈＥ−Ｒは、生物学的利用能を増大させるために化学的に修飾することができる。タンパク質をＰＥＧ化する様々な方法がこの技術分野では広く知られている。
【００７４】
ＯＰは、肺、皮膚、胃腸（ＧＩ）管および粘膜から素早く吸収され得るので、ＡＣｈＥ−Ｒを様々な投与経路によって、または皮膚への直接的な適用によって与えることができる。
【００７５】
例えば、ＡＣｈＥ−Ｒを、ＡＣｈＥ−Ｒが固定化によって固定される固体担体（例えば、柔軟なスポンジ様物質または同様な材料であり得る多孔性担体）に固定化することができる。担体は、必要性および鋳型の形状に依存して、様々な形状、サイズおよび密度にすることができる。例えば、多孔性担体を、典型的な家事用スポンジ、拭き取り材またはペーパータオルにすることができる。
【００７６】
例えば、そのような物品を、創傷を清浄化および除染するために使用することができるが、固定化されたＡＣｈＥ−Ｒは傷の中に溶け出さない。したがって、そのようなスポンジを、公の行事におけるテロリスト攻撃によって汚染を受けた市民を除染するために使用することができる。
【００７７】
代替として、または加えて、ＡＣｈＥ−Ｒを、それ自体で、あるいは、ＡＣｈＥ−Ｒが好適なキャリアまたは賦形剤と混合された医薬組成物において対象に投与することができる。
【００７８】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適な担体および賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【００７９】
本明細書中において、用語「有効成分（活性成分）」は、生物学的効果を説明することができるＡＣｈＥ−Ｒを示す。
【００８０】
本明細書中以降、表現「生理学的に許容され得る担体」および表現「医薬的に許容され得る担体」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げない担体または希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。
【００８１】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００８２】
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【００８３】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれることができる。
【００８４】
あるいは、例えば、患者の組織領域（例えば皮膚）に直接的に医薬組成物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に医薬組成物を投与することができる。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
【００８６】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容され得る担体を使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【００８７】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【００８８】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容され得る担体と組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのような担体は、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
【００８９】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。
【００９０】
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【００９１】
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【００９２】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
【００９３】
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【００９４】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【００９５】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
【００９６】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
【００９７】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量」は、処置されている対象の疾患（例えば虚血）の症状を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（核酸構築物）の量を意味する。
【００９８】
治療有効量の決定は、特に本明細書で与えられた詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００９９】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外および細胞培養アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、所望の濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて決定されることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０１００】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照のこと）。
【０１０１】
投薬量および投薬間隔を、生物学的効果を誘導または抑制するために十分である活性な成分の血漿中レベルまたは脳中レベル（これは最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる）を提供するために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロデータおよび／またはインビボデータから推定することができ、例えば、特定の細胞の増殖の５０％〜９０％の阻害を達成するために必要な濃度を、本明細書中に記載されるアッセイを使用して求めることができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は個々の特性および投与経路に依存する。検出アッセイを使用して、血漿中濃度を求めることができる。
【０１０２】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０１０３】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
【０１０４】
ＡＣｈＥ−Ｒは様々なＯＰ分子を封鎖するので、化学量論的な量が投与され得る（本質的には、それぞれの毒分子について１個の酵素単量体）。
【０１０５】
ＡＣｈＥ−ＲをＯＰ暴露前に（予防的に、例えば、暴露の１０時間前または８時間前に）投与することができ、また、代替として、または加えて、単回服用または多回服用で、暴露後に、数日後（例えば、７日後）でさえ投与することができる。
【０１０６】
理論にとらわれることはないが、ＡＣｈＥ−Ｒを暴露直後に与えること（これは、不可逆的現象を避けるために、事象から２時間以内に行われることが推奨される）は、遅延期における内因性ＡＣｈＥ−Ｒの過剰産生を停止させるか、または最小限に抑え、これにより、神経筋接合部を保護することが示唆される。
【０１０７】
本発明の実施形態ではまた、ＯＰ損傷を処置または防止するための、ＡＣｈＥ−Ｒとの組合せでの他の薬剤の使用が意図される。
【０１０８】
したがって、１つの例示的な実施形態によれば、ＡＣｈＥ−Ｒを、暴露後２時間に至るまでに、肺を保護するために吸入によって、また、循環を保護するために注射（ｉ．ｖ．）によって投与することができる。アトロピンを暴露後２時間〜４時間において加えることができる。ＡＣｈＥ−Ｒの毎日の注射を中毒後７日に至るまで施すことができる。Ｈ１−６およびモノ−ビス四級オキシムのようなオキシム、例えば、塩化プラリドキシム（２−ＰＡＭ）などを、処置の有効性を改善するために加えることができる。
【０１０９】
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパック）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用担体に配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上で詳述されたように、示された状態を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０１１０】
ＡＣｈＥ−Ｒが様々なＯＰ分子を封鎖することができることにより、ＯＰ汚染表面の除染および空中浮遊ＯＰの解毒におけるＡＣｈＥ−Ｒの使用が提案される。
【０１１１】
したがって、本発明の１つの局面はさらに、ＯＰ分子により汚染された表面を解毒するか、またはＯＰによる表面の汚染を防止する方法を提供する。本方法は、表面をＡＣｈＥ−Ｒと接触させることによって行われる。
【０１１２】
したがって、本発明の実施形態に従って意図される合成表面および生体表面には、装置、実験器具、デバイス、織物（衣類）、皮膚（上記の通り）、および繊細な膜（生体膜）が含まれるが、これらに限定されない。適用様式は標的表面に非常に大きく依存する。したがって、例えば、表面が、亀裂、割れ目、多孔性表面または平らでない表面を含むときには特に、表面をフォームにより被覆することができる。少量の適用を、適切なノズルを備えるスプレー瓶により行うことができる。広い面積が汚染された場合、多量のフォームを施す装置を利用することができる。
【０１１３】
ＡＣｈＥ−Ｒを含むことができる被覆、内張り、塗料、接着剤、シーラント、ワックスを表面に適用することができる。そのようなものについての例示的な実施形態が米国特許出願公開第２００４０１０９８５３号において提供される。
【０１１４】
表面の除染はさらに、表面を、腐食剤、除染用フォーム、焼き付け条件熱と二酸化炭素との組合せ、またはこれらの組合せと接触させることによって補助され得る。
【０１１５】
上記の被覆用組成物に加えて、ＯＰ汚染を、スポンジ（上記の通り）、拭き取り材、織物およびフィルター（空中浮遊粒子の除染のためのフィルター）の形態の固体担体に固定化されているＡＣｈＥ−Ｒを含む製造物を使用して防止または解毒することができる。固定化のための化学反応は米国特許出願公開第２００４０００５６８１号において提供される。
【０１１６】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例を検討したとき、当業者には明らかになるだろう。加えて、本明細書中上記に描かれるような、また、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１１７】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１１８】
概して、本明細書中で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子、生化学、細胞および組み換えＤＮＡの技法が含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ他著「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ他、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎ他編；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（１９８４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；なお、これらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１１９】
実施例１〜４のための一般的な材料および方法
特定のＡＣｈＥ変異体を過剰発現する安定な細胞株の樹立：ＣＨＯ細胞を記載（Ｐｅｒｒｙら、２００４、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ、６、２７９〜８６）の通りに成長させた。トランスフェクションは、ＡＣｈＥ−Ｒ（配列番号１）をコードするｃＤＮＡ、およびＡＣｈＥ−Ｓ（配列番号１５）をコードするｃＤＮＡ（ＳｏｒｅｑおよびＳｅｉｄｍａｎ、２００１、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２、２９４〜３０２）、ならびに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｃＤＮＡ（Ｐｅｒｒｙら、２００２、Ｏｎｏｃｏｇｅｎｅ、印刷中）を伴い、標準的な選抜手順に従った。
【０１２０】
インビボ実験：７週齢〜８週齢のオスのＣＤ−１マウスを特定病原体除去（ＳＰＦ）環境に収容した（ケージあたり最大で６匹の動物）。動物には、市販の齧歯類用餌（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  ＴＲＭ  Ｒａｔ／Ｍｏｕｓｅ  Ｄｉｅｔ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）が自由に与えられ、また、飲料水を自由に摂取させた。自動制御された環境条件が、３０％〜７０％の相対湿度、１２時間照明／１２時間消灯のサイクル、および研究室における１０回／時間〜３０回／時間の空気交換とともに、温度を２０℃〜２４℃で維持するように設定された。試験の２週間前において、一晩の絶食の後、バイオテレメトリー用送信機が、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）による全身麻酔のもと、被試験マウスの腹膜腔に埋め込まれた（Ｃｏｈｅｎら、２００２、Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、７、８７４〜８５）。埋め込み後、マウスを個別ケージに収容し、食物および水を自由に摂取させた。手術手順から回復した２週間後、体温（ＢＴ）および運動活性（ＭＡ）を処置前および処置後において記録した（Ｃｏｈｅｎら、２００２、Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、７、８７４〜８５）。前処理およびベースライン値の確立を行った２日後、記録を継続しながらマウスを処置した。処置には、生理食塩水、０．４ｍｇ／ｋｇのパラオクソン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）または２．５ｍｇ／ｋｇの大腸菌ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）の第１の単回ｉ．ｐ．注射が含まれた。第１の注射の１時間後、そして、その後の５日間の実験を通して毎日１回、マウスに、０．２５ｍｇ／ｋｇのｍＡＲＰ（Ｎｉｊｈｏｌｔら、２００４）またはコントロールとしての生理食塩水を静脈内注射した（第２の注射（ｉ．ｖ．））。動物を、研究期間中、臨床的徴候、および体重における変化について定期的に観察した。研究が終了したとき、動物をＣＯ２窒息によって安楽死させ、血漿サンプルおよび組織サンプルを採取した。３匹の埋め込みされていない非処置のナイーブマウスから得られる血漿および組織がコントロールの役割を果たした。すべての安楽死させた被試験動物が詳細な解剖に供された。ヘブライ大学動物実験委員会がこの実験を承認した。
【０１２１】
ＡＣｈＥ活性およびコルチコステロンのアッセイ：ＡＣｈＥ活性を、５０μＭのＢＣｈＥ特異的阻害剤テトライソプロピルピロホスホルアミド（Ｉｓｏ−ＯＭＰＡ）の存在下、マルチウェルプレートに適合化されたＥｌｌｍａｎアッセイ（Ｓｉｅｄｍａｎら、１９９５、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１５、２９９３〜３００）を使用して動物血漿において測定した。血漿におけるコルチコステロンレベルを、ＯＣＴＥＩＡコルチコステロンキット（ＩＤＳ  Ｌｔｄ、Ｂｏｌｄｏｎ、英国）を製造者の説明書に従って使用して測定した。
【０１２２】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ：骨格筋におけるＡＣｈＥ遺伝子発現に対する試験された処置の結果について試験するために、総ＲＮＡを、安楽死させた処置マウスおよびコントロールマウスから摘出された凍結された骨格筋から、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を線維性組織のための説明書に従って使用して精製した。ＲＮＡを、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を使用してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量に供した。２組のプライマーを使用して、ＡＣｈＥ  ｍＲＮＡの共通ドメイン（２７３（＋）ＧＧＴＡＧＡＣＧＧＧＧＡＣＴＴＣ（配列番号９）／６３７（−）ＡＴＧＴＡＧＧＣＡＴＡＧＡＣＣＣＧ（配列番号１０））と、ＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡについて特有な３’領域（６３７（＋）ＣＧＧＧＴＣＴＡＴＧＣＣＴＡＣＡＴＣ（配列番号１１）／１２５０（−）ＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＡＴＣＣＣＡ（配列番号１２））との両方を増幅した。値が標準転写物（β−アクチンｍＲＮＡ）の値に対して較正された（Ｍｅｓｈｏｒｅｒら、２００５、Ｆａｓｅｂ  Ｊ、１９、９１０〜２２）。
【０１２３】
免疫ブロット：免疫ブロットを、ＡＣｈＥタンパク質の共通領域を標的とする抗体（Ｎ−１９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を使用して記載（Ｂｉｒｉｋｈら、２００３、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１００、２８３〜８）の通りに行った。
【０１２４】
（実施例１）
特定のＡＣｈＥ変異体を過剰発現する安定な細胞株の樹立
結果
ヒトのＡＣｈＥ−ＳまたはＡＣｈＥ−Ｒのどちらかと一緒にＧＦＰを安定的に同時発現するＣＨＯ細胞株（すべてが最小のＣＭＶプロモーター−エンハンサーの制御下にある）を樹立し、発現した酵素の対応する加水分解活性について試験した。両方の場合において、生存可能な細胞株が、容易に感知できるほどの活性レベルを伴って得られた。ＧＦＰのみを発現するＣＨＯ細胞がコントロールの役割を果たした。いくつかの細胞株がこれらのベクターのそれぞれについて樹立された。図１Ｂは、そのような細胞株におけるＡＣｈＥ変異体の発現レベルおよび分泌レベルの代表的な例を示す。
【０１２５】
ＡＣｈＥ−Ｒ活性およびＡＣｈＥ−Ｓ活性の両方が、樹立された細胞株の細胞内分画物および分泌分画物に現れた。アセチルコリン加水分解レベルが、ＧＦＰ発現細胞における無視できるレベルから、細胞タンパク質１ｍｇあたり、または培地１ｍｌあたり１マイクロモルの加水分解される基質のレベルに至るまで増大し（図１Ｃ）、これらのレベルは、一過性にトランスフェクトされた細胞よりも大きかった（Ｖｅｌａｎら、１９９１、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、１１、１４３〜５６）が、植物発現よりも低かった（Ｇｅｙｅｒら、２００５、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．）。予測され得たことだが、ＡＣｈＥ−Ｒは、ＡＣｈＥ−Ｓよりも効率的に分泌される傾向があり、２つの識別可能なバンドをウエスタンブロットにおいて示し、このことは、遊離ｈＡＲＰを生じさせるための切断を示唆した（Ｃｏｈｅｎら、２００３、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２１、１９９〜２１２）。ＡＣｈＥ−Ｓも同様に、そのような切断を受けることが見出された（図１Ｂおよび（Ｓｔｅｒｎｆｅｌｄら、１９９８、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１８、１２４０〜９））。安定的にトランスフェクトされた細胞株は、親の細胞株と比較したとき、変化していない倍加時間を示し、また、ＭＴＴ生存性試験では、アポトーシスがないことが明らかにされた（データは示さず）。
【０１２６】
（実施例２）
血漿中のＡＣｈＥ活性およびコルチコステロンレベルに対する全身的影響
ＯＰ系薬剤への暴露は、急性の哺乳動物ストレス応答の結果に類似する低下した体温および運動活性を生じさせる（Ｋａｒｃｚｍａｒ、２０００、Ｅ．Ｇｉａｃｏｂｉｎｉ編、１５７頁〜１８０頁、Ｍａｒｔｉｎ  Ｄｕｎｉｔｚ、Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍａｒｒｓ、１９９３、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ、５８、５１〜６６）。そのような影響の少なくとも一部が、ＡＣｈレベルおよびコルチゾールレベルにおける増大（Ｋａｕｆｅｒら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、３９３、３７３〜７；Ｋａｕｆｅｒら、１９９９、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ、１１９−１２０、３４９〜６０）、およびマウス（ｍ）ＡＲＰの固有的切断（Ｄｏｒｉら、２００５、Ｃｅｒｅｂ  Ｃｏｒｔｅｘ、１５、４１９〜３０；Ｇｒｉｓａｒｕら、２００１、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、７、９３〜１０５）をもたらす、ＡＣｈＥ触媒活性の阻止によって引き起こされる。有機リン酸エステル暴露後のＡＣｈＥの過剰産生を妨害するｍＡＲＰの潜在的能力について調べるために、ＣＤ−１マウスに、生理食塩水、パラオクソンまたは大腸菌リポ多糖（ＬＰＳ）を注射した。実験の５日間を通して毎日、マウスに、０．２５ｍｇ／ｋｇのｍＡＲＰ、またはコントロールとしての生理食塩水を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。
【０１２７】
結果
ＡＣｈＥ特異的活性を、１週間の実験が終了したとき、５０μＭのＩＳＯ−ＯＭＰＡ（ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）（主要な循環コリンエステラーゼ）の阻害剤）の存在下で、すべての動物の血漿において測定した。パラオクソン処置は、血漿ＡＣｈＥ活性の増大を生じさせた。この増大は、暴露後１週間を通して持続し、また、予測され得たことだが、ｍＡＲＰにより処置された動物ではより高く、ｍＡＲＰについての以前の発見（Ｇｒｉｓａｒｕら、２００１、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、７、９３〜１０５）およびｈＡＲＰについての以前の発見（Ｇｒｉｓａｒｕら、２００６、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７６、２７〜３５）と矛盾していなかった。図２Ａは、パラオクソン中毒に対するｍＡＲＰ処置のこの結果を示す。血漿ＡＣｈＥ活性における変化には、二重の生理食塩水処置のもとでは、ナイーブ動物と比較したとき、血漿コルチコステロンレベルにおける３倍の増大が伴い、パラオクソンと、それに続く生理食塩水のもとでは、生理食塩水＋生理食塩水と比較したとき、５倍の増大が伴った。ｍＡＲＰはこれらの影響を改善し、増大したコルチコステロンレベルを完全になくした（図２Ｂ）。したがって、投与されたｍＡＲＰはＡＣｈＥ遺伝子発現を高めたが、ＯＰ暴露後の過度なコルチコステロン産生を妨げた。
【０１２８】
（実施例３）
暴露後のＡＣｈＥ−Ｒ操作は宿主のＡＣｈＥ遺伝子発現に影響を及ぼす
結果
１週間の処置の後、種々のＡＣｈＥ転写物のｍＲＮＡレベルが、Ｌｉｇｈｔ  ＣｙｃｌｅｒシステムをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量のために使用して、３匹のナイーブ動物と比較されるように、処置された動物の３匹の骨格筋において測定された。２組のプライマーを用いて、ＡＣｈＥ  ｍＲＮＡの共通ドメイン（図３Ｂ）と、ＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡについて特有な３’領域（図３Ｃ）との両方を検出した。値が標準転写物（β−アクチンｍＲＮＡ）の値に対して較正された。パラオクソンは、処置されていないナイーブマウスと比較したとき、ＡＣｈＥ−ＳのｍＲＮＡレベルにおけるほぼ８倍の低下を伴う、ＡＣｈＥ  ｍＲＮＡにおける２倍の低下を引き起こした。このことは、組み合わさった筋肉反応が、以前から存在するＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡの破壊の促進、転写活性化、および発生期のＡＣｈＥ−Ｒ  ｍＲＮＡをもたらす選択的スプライシングにおける変化を伴うという見解と矛盾していない。ｍＡＲＰは、ＡＣｈＥ  ｍＲＮＡの両方の領域におけるパラオクソン誘導による低下をなくした。このことは、ｍＡＲＰが転写活性化およびＡＣｈＥプレｍＲＮＡの選択的スプライシング変化の両方を妨害したことを示唆する。生理食塩水により処置されたパラオクソン暴露動物と、ｍＡＲＰにより処置されたパラオクソン暴露動物との間における違いが、総ｍＲＮＡと、ＡＣｈＥ−Ｓ  ｍＲＮＡとの両方において観測された。このことは、それが真の変化を反映することを示している。したがって、暴露後７日までに、ｍＡＲＰは血液における暴露後のＡＣｈＥ産生を増大させ、筋肉のＡＣｈＥ産生における暴露後の低下を妨げた。
【０１２９】
（実施例４）
ｍＡＲＰ投与はパラオクソンまたは細菌ＬＰＳへの暴露の生理学的結果を変化させる
ｍＡＲＰの潜在的な攻撃後の活性をさらに、送信機が埋め込まれたマウスを使用して処置前および処置後に体温（ＢＴ）および運動活性（ＭＡ）を記録することによって、上記の処置された動物を使用して詳しく調べた（Ｃｏｈｅｎら、２００２、Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、７、８７４〜８５）。
【０１３０】
結果
記録を、手術手順から回復した２週間後に開始した。ベースライン値を確立した２日後に、記録を継続しながらマウスを処置した。生理食塩水の単独投与では、ＢＴ値またはＭＡ値が、ナイーブ動物と比較したとき、送信機埋め込みマウスにおいて著しく変化しなかった（データは示さず）。
【０１３１】
本発明者らの作業仮説では、ストレス、ＬＰＳまたは抗コリンエステラーゼ剤暴露の後でのＡＣｈＥ−Ｒ蓄積が、そのような傷害に対する応答を調節するにちがいないことが予測された（Ｒｏｍａｎｏｖｓｋｙら、２００５、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ、１０、２１９３〜２１６）。パラオクソン（抗コリンエステラーゼ性有機リン酸エステル）の投与は、予測され得たことだが、明期および暗期のＢＴおよびＭＡにおける低下を処置後１日目に引き起こした。図４Ａ〜図４Ｆおよび図５Ａ〜図５Ｆはそれぞれ、この反応についての１匹の動物の様々な例を明らかにし、６時間後にＢＴにおける部分的回復が続く。図４Ａ〜図４Ｆは、ＭＡが暴露後６日間を通して依然として低いままであったことを説明する；合成ｍＡＲＰの注射によるＡＣｈＥ−Ｒレベルにおける上昇が処置後１日目の期間中にＢＴにおける低下を幾分か制限し、続く暗期の期間中にＢＴを上昇させた。生理食塩水暴露後早くも１日目で、ｍＡＲＰが自発運動活性をＭＡの明期および暗期の両方の期間中において増大させた。ＯＰ暴露後の４、５日目までに、ｍＡＲＰの注射はまた、ＭＡにおける劇的な増大を誘導した（図５Ｄ〜図５Ｆ）。したがって、長期間において、ｍＡＲＰ処置の用いられた療法は、明期および暗期のＭＡを、正常な値を超えて増大させた。炎症性ストレス要因、すなわち、ＬＰＳは、パラオクソンよりも少ないにもかかわらず、ＢＴおよびＭＡの両方を低下させた（それぞれ、図４Ａ〜図４Ｆおよび図５Ａ〜図５Ｆ）。ＬＰＳ暴露後１日目において、ｍＡＲＰはＢＴ値および／またはＭＡ値を変化さなかったが、長期間において、ｍＡＲＰは、明期および暗期のＭＡを、正常な値を超えて増大させた。このことは、概日変化に従う、ＡＣｈＥ−Ｒを過剰発現するトランスジェニックマウスについて記録された症状と矛盾しておらず（Ｃｏｈｅｎら、２００２、Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、７、８７４〜８５）、また、筋肉および血漿におけるＡＣｈＥのｍＲＮＡ産生およびタンパク質産生とそれぞれ一致している。
【０１３２】
実施例１〜４についての結論
実施例１〜４は、化学的傷害および生物学的傷害に対する入り組んだＡＣｈＥ−Ｒ応答に関連づけられる３つの重要な事柄を明確化することを目指した。すなわち、第１に、ＡＣｈＥの傷害後の蓄積が細胞死を誘導しないかを見出すことを目指した。ＡＣｈＥ−ＳまたはＡＣｈＥ−Ｒのどちらかを安定的に発現するＣＨＯ細胞が樹立され得たことは、これらの変異体のどちらも、測定された発現レベルでは細胞死を生じさせないという見解を裏付けている。
【０１３３】
第２には、過剰発現したＡＣｈＥが、試験された傷害によって引き起こされる損傷を悪化させるか、または逆に、影響を受けた生物を暴露後の結果から保護するように作用するかを見出すためである。今回の発見では、後者の選択肢を支持する議論が展開されたが、ＡＣｈＥ−Ｒに関連する損傷の可能性を排除することができない。第３には、これらの影響に関わるＡＣｈＥ−Ｒドメインを特定するため、また、そのドメインの合成型を、ＡＣＨＥ−Ｒ保護効果を模倣するその能力について試験するためである。さらにより具体的には、本発明者らは、抗コリンエステラーゼ剤または細菌感染への暴露の後における身体防御を増強させることにおけるマウスＡＣｈＥ−Ｒ過剰産生およびｍＡＲＰについての推定される機能を調べた。パラオクソン暴露およびＬＰＳ暴露の後における、血漿中のＡＣｈＥ活性レベルおよびコルチコステロンレベルに対する注射されたｍＡＲＰの影響、体温および運動活性に対する注射されたｍＡＲＰの影響、ならびに筋肉ＡＣｈＥ遺伝子発現に対する注射されたｍＡＲＰの影響はすべてが、これらの変化が暴露後の事象のメディエーターとして作用するという仮説を裏付けている。
【０１３４】
腹腔内注射されたｍＡＲＰが、ＢＴ、ＭＡ、血中ＡＣｈＥ活性および筋肉ＡＣｈＥ  ｍＲＮＡのレベルに影響を及ぼしたことは、この自然に切断可能なペプチドが、ＡＣｈＥ−Ｒに起因すると考えられる以前に認められた影響の大部分に関わるという見解を強く裏付けている。さらに、これらの発見は、回復を促進することに関して、また、暴露に誘導された損傷を最小限に抑えることに関して、暴露を受けた対象を処置するために合成ＡＲＰを使用することの可能性を高めている。
【０１３５】
有機リン酸エステル系ＡＣｈＥ阻害剤は、脳、筋肉および腸におけるＡＣｈＥ−Ｒの過剰発現を誘導する。短期間では、ＡＣｈＥ−Ｓ変異体からＡＣｈＥ−Ｒ変異体へのＡＣｈＥの選択的スプライシングにおける変化により、抗ＡＣｈＥ剤暴露のもとで蓄積する過剰なＡＣｈが除かれる。長期間では、過剰な可溶性単量体ＡＣｈＥ−Ｒがさらに、その非触媒的性質による造血性の細胞プロセス（例えば、顆粒球増加症および血小板新生）を誘導し得る。農業従事者において、有機リン酸エステル系殺昆虫剤に対する暴露は白血病についてのより高い危険性に相関づけられ、同様にまた、脳波計的障害および記憶障害と相関づけられた。ＡＣｈＥは造血系細胞系譜において発現し、末梢のコリン作動性状態を調節する。ＡＣｈＥがそのようなプロセスを制御する詳細な機構は、足場タンパク質ＲＡＣＫ１およびプロテインキナーゼ（ＰＫ）Ｃの動員を伴うと考えられる。
【０１３６】
ＡＣｈＥ−Ｒが、コルチゾール処置の後で、培養されているＣＤ３４＋造血始原体において誘導される。この上昇には、ＡＣｈＥ−ＲのＣ末端ペプチド、すなわち、ヒト（ｈ）ＡＲＰの切断が伴った。このペプチド切断は、短縮化されたＡＣｈＥを血液におけるプロテアーゼ活性にさらすことがあり、また、ＬＰＳに対する暴露の後、ヒト血清において生じる。したがって、ＬＰＳ投与およびＡＣｈＥ−Ｒのアップレギュレーションの後では、血液におけるＡＣｈレベルは低下するが、これは、その後のＡＣｈＥ分解のためにほんの一過性にすぎない。調節性ＡＣｈレベルがさらに、前炎症性サイトカインの産生、すなわち、急性ストレスに対する主要な応答を制御する。ｈＡＲＰの２６アミノ酸からなる合成ペプチドのエクスビボ投与は造血幹細胞の拡大および分化（有毒物質に対する生体反応の極めて重要な要素）を促進する。ＡＣｈＥ−Ｒ発現のアンチセンス抑制はＡＲＰのこの増殖活性を妨げた。このことは、ＡＲＰの投与がＡＣｈＥ遺伝子発現を促進し、これにより、そのプレタンパク質ＡＣｈＥ−Ｒの自己調節的な過剰産生をもたらすことを示唆する。造血細胞におけるｈＡＲＰの増殖的性質と一致して、ＡＣｈＥ−ＲのマウスＣ末端配列（ｍＡＲＰ）が、発達中の皮質において、分化プロセスに対して遊走プロセスおよび増殖プロセスを制御することが示された。そのうえ、脳の側脳室に注射されたとき、ｍＡＲＰは、隣接するニューロン細胞、および注射部位から離れた区域の両方に浸透した。このことは、エンドサイトーシスおよび逆行輸送を受けるその能力を証明する。ｍＡＲＰの投与は、処置されたマウスにおける恐怖記憶およびＬＴＰ（これらはアンチセンス処置によって抑制することができる）をさらに高め、また、ＡＣｈＥの過剰発現のもとでのＰＫＣβＩＩにおける海馬での増大が伴った。したがって、このペプチドの使用は、その二面的影響のために、注意して実験されなければならない。
【０１３７】
脳および血液の両方において、ＡＣｈＥ−Ｒは、広範囲の様々なシグナル伝達経路に関与する足場タンパク質ＲＡＣＫ１およびそのパートナーＰＫＣβＩＩと相互作用する（Ｂｉｒｉｋｈら、２００３；Ｓｋｌａｎら、２００６）。ｍＡＲＰペプチドは生組織において細胞に浸透することができる。脳起源および血液起源の両方の細胞の内部において、ｍＡＲＰは足場ＲＡＣＫ１タンパク質（プロテインキナーゼＣβＩＩの細胞内キャリア）と相互作用する。ＡＣｈＥ−Ｒ／ＲＡＣＫ１／ＰＫＣβＩＩ複合体の形成は遊離ＲＡＣＫ１の細胞質レベルを低下させ、これにより、翻訳を阻害するその能力を、リボソーム複合体と相互作用することによって妨害する。これは著しい影響を細胞の代謝に及ぼすにちがいない。ＡＣｈＥ−Ｒはまた、免疫ストレス因子ＬＰＳに対する暴露の後で蓄積し（Ｃｏｈｅｎら、２００３；Ｐｉｃｋら、２００６）、または自己免疫疾患の重症筋無力症（ＭＧ）の患者の血清において、ならびに実験的自己免疫ＭＧラット（ＥＡＭＧ）の血清および筋肉において蓄積する（Ｂｒｅｎｎｅｒら、２００３）。ＡＣｈＥ−Ｒのアンチセンス抑制はこの蓄積を防止し、ＥＡＭＧラットの筋肉機能および臨床的状態を改善した。霊長類の腰髄において、ストレス関連ＡＣｈＥ−Ｒのアンチセンス抑制は、運動ニューロン上にシナプスを形成する介在ニューロンにおけるその蓄積を減少させ、また、運動ニューロンにおけるコリン作動性負荷を低下させた。行われた霊長類および齧歯類での研究は、ヒトについても同様に関連する可能性が高い。しかしながら、遺伝子組換えアンチセンス配列による、ストレス後のＡＣｈＥ−Ｒ産生のテトラサイクリン制御された抑制は、ストレス関連カタレプシーの危険性を条件的トランスジェニックマウスにおいて増大させた。まとめると、このことは、適切な運動機能および認知機能と矛盾していないＡＣｈＥ−ＲレベルおよびＡＲＰレベルの「安全窓」を示唆する。
【０１３８】
実施例５〜１１のための一般的な材料および方法
ヒトＡＣｈＥ−Ｒを発現するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物の操作：Ｃ末端のＥＲ保持シグナルＳＥＫＤＥＬに融合されたヒトＡＣｈＥ−Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＤＱ１４０３４７）をコードする、植物発現のために最適化されたＤＮＡ構築物を新たに合成し、植物発現ベクターにクローン化し、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介による形質転換のために使用した（Ｍｏｒ，Ｔ．Ｓ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７５、２５９〜２６６）。最大のＡＣｈＥ活性を有する植物系統を、繁殖、種子作製およびさらなる分析のために選択した（Ｇｅｙｅｒら、２００５、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ、１５７−１５８、３３１〜３３４）。
【０１３９】
インビボ実験：植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲの循環ｔ１／２を、イソフルラン（Ｒｈｏｄｉａ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、英国）により軽く麻酔され、処置前に拘束具に入れられた６週齢〜８週齢のオスＦＶＢ／Ｎマウスにおいて求めた。マウスに、４００ユニット（Ｕ）または１０００Ｕの精製ＡＣｈＥ−ＲＥＲを含有する８０μｌの生理食塩水を（尾静脈）ｉ．ｖ．注射した。示された時点において、尾静脈からの血液サンプル（１０μｌ〜３０μｌ）を採取して、ＰＢＳにおける４μｌの０．２５Ｍ  ＥＤＴＡに入れ、遠心分離（５００ｒｐｍで３０分間、４℃）による血漿の分離まで氷上で保った。ＦＶＢ／ＮマウスについてのパラオクソンＬＤ５０値を種々の濃度でのパラオクソン（Ｓｉｇｍａ）の水溶液のボーラスｉ．ｖ．（尾静脈）注射によって求めた。
【０１４０】
保護アッセイ：マウスに１００μｌの０．９％生理食塩水中の０〜１００００ＵのＡＣｈＥ−ＲＥＲを注射した。ＣｈＥレベルを、ＡＣｈＥ注射の１０分前および５分後に採血された血液サンプルから求めた。マウスを注射後１０分でパラオクソン（７５０μｇ／ｋｇ）により攻撃し、症状を観察した。支持的措置は何ら与えられず、攻撃後１５分以内に改善を示さなかったマウスを安楽死させた。実験はアリゾナ州立大学およびヘブライ大学（エルサレム）の施設内動物管理使用委員会によって承認された。
【０１４１】
生化学的分析および分子分析：葉の総ゲノムＤＮＡブロット分析を、ＤＩＧ標識されたプローブ（このプローブは、以前の記載（Ｍｏｒら、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７５、２５９〜２６６）のように５’ＧＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＡＴＡＴＧＴＧＧＡＣＡＣＣＣ３’（配列番号１３）および５’ＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＣＣＡＣＡＡＧＧＴＧＧＧ３’（配列番号１４）のプライマーによりＰＣＲ増幅された）を用いて行った。葉組織からの植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲの精製は記載の通りであった（Ｇｅｙｅｒら、２００５、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ、１５７−１５８、３３１〜３３４）。純粋な酵素の典型的な調製物は約３０００Ｕ／ｍｇタンパク質の比活性を有したが、２０００Ｕ／ｍｇタンパク質よりも大きい比活性を有する調製物のみをインビボで使用した。
【０１４２】
タンパク質調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＧｅｌＣｏｄｅ  ＳｉｌｖｅｒＳＮＡＰ染色キットＩＩ（Ｐｉｅｒｃｅ）またはクーマシーブリリアントブルーにより染色したか、あるいは、ＰＶＤＦメンブランに転写し、ヒトＡＣｈＥもしくはマウスＡＣｈＥに対して特有の共通ドメインに対して惹起されたポリクローナルＡｂ（Ｎ−１９およびＥ−１９、それぞれ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、またはヒトＡＣｈＥ−ＲのＣ末端ドメインに対して惹起されたポリクローナルＡｂ（Ｓｔｅｒｎｆｅｌｄら、２０００、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９７、８６４７〜８６５２）のどちらかにより免疫装飾した。ＨＲＰコンジュゲート化二次Ａｂ（Ｓｉｇｍａ）およびＥＣＬ−ｐｌｕｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を検出のために使用した。総可溶性タンパク質（ＴＳＰ）を記載されるように求めた（Ｍｏｒら、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７５、２５９〜２６６）。
【０１４３】
ＡＣｈＥ活性アッセイ、酵素速度論、阻害曲線および非変性ＰＡＧＥのＡＣｈＥ活性染色は、以前に記載された通りであった（Ｍｏｒら、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７５、２５９〜２６６）。活性アッセイおよび染色が０．５ｘ１０−５Ｍの特異的ＢＣｈＥ阻害剤のテトライソプロピルピロホスホルアミド（ｉｓｏ−ＯＭＰＡ、Ｓｉｇｍａ）の存在下で行われた。
【０１４４】
横隔膜の組織化学的ＡＣｈＥ活性染色のために、屠殺されたマウスを解剖して、横隔膜筋を露出させ、これを５分間にわたって４％パラホルムアルデヒドによりインサイチュ固定し、解剖して取り出し、室温で固定液において一晩保った。ＰＢＳによる洗浄を２回行った後、褐色の沈殿物が現れるまで、筋肉をＫａｒｎｏｖｓｋｙ染色液において４℃でインキュベーションした。ＮＭＪ分析は、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｄｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を伴った。
【０１４５】
（実施例５）
植物におけるヒトＥＲ捕捉ＡＣｈＥ−Ｒの産生
ヒトおよび他の哺乳動物はＡＣｈＥのいくつかの分子変異体を発現する。すべてが共通コアドメインおよび酵素特性を有するが、異なったＣ末端ペプチド、発現パターン、細胞内局在化およびタンパク質パートナー相互作用を有する（図６Ａ）。他の異種発現システムのように、植物は、非ヒト型の複合グリカンにより装飾される様々な組換えヒトタンパク質を発現することができ、それらの速い循環クリアランスが予測される。加えて、植物グリカンは、場合によりアレルゲン性であり得る特有の糖エピトープを含有することがある。したがって、本発明者らは、ｃｉｓ−ゴルジからＥＲに戻るその逆行輸送を可能にするＣ末端ペプチドＳＥＫＤＥＬを含有させるようにＡＣｈＥ−Ｒを操作した（図６Ｂ）。これらの改変により、本発明者らは、ＡＣｈＥ−ＲＥＲを０．５％〜１．０％のＴＳＰ（約１９Ｕ／ｍｇタンパク質または約３０ｍｇ／ｋｇ新鮮重量）にまで蓄積させた、少なくとも４コピーの導入遺伝子を有する植物系統（図６Ｃ）を選択することができた。
【０１４６】
結果
選択された系統を、米国農務省により承認された封じ込め温室において種子作製およびバイオマス作製のために繁殖させた（図６Ｄ）。植物は、通常の生育条件のもとでは、ＷＴ植物と表現型が識別できないように見えた。
【０１４７】
ＡＣｈＥ−ＲＥＲタンパク質を、ＷＴの抽出物には存在しない６７ｋＤａのバンドを明らかにするＳＤＳ−ＰＡＧＥによって粗植物抽出物において検出することができた（図７Ａ）。ＡＣｈＥ−ＲＥＲが、プロカインアミド親和性クロマトグラフィーと、それに続くアニオン交換クロマトグラフィーを使用して植物抽出物から均一に精製され（Ｇｅｙｅｒら、２００５、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ、１５７−１５８、３３１〜３３４）、これは、３０００Ｕ／ｍｇを超える精製タンパク質の最終的な比活性を有した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、クーマシー染色または銀染色のどちらかにより可視化されたとき、精製されたタンパク質は、ＡＣｈＥ特異的Ａｂと強く反応する二重線として現れた（図７Ａ、図７Ｂ）。ＥＲにおけるその保持によって予測されるように、このタンパク質は高マンノースグリカンを含有し（データは示さず）、ゲルにおいて明らかなこれら２つのバンドは、おそらくは２つの異なってグリコシル化された種を表すことが考えられる。タンパク質の配列決定では、ヒト細胞株において発現するＡＣｈＥについて以前に明らかにされたように、蓄積している酵素が正しくプロセシングされ、成熟タンパク質のＮ末端残基がＲ３５であったことが明らかにされた。非変性ＰＡＧＥ（図７Ｃ）では、組換えＡＣｈＥ−Ｓとは異なり、ＡＣｈＥ−ＲＥＲが単量体であることが明らかにされた。このことは以前の観測結果と矛盾していない。植物産生ＡＣｈＥ−ＲＥＲの純粋な調製物は、４℃において少なくとも１２ヶ月間安定であることが見出された。
【０１４８】
（実施例６）
植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲの速度論的特徴づけ
植物由来のヒトＡＣｈＥ−ＲＥＲおよびヒトＡＣｈＥ−Ｓの活性を（Ｓｉｇｍａから得られる）細胞培養物由来のヒトＡＣｈＥ−Ｓと比較した（Ｓｏｒｅｑら、１９９０、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８７、９６８８〜９６９２）。３つすべての変異体についてのＫｍ値は互いに非常に類似しており、また、文献に報告される値と類似していた（約０．２ｍＭ、図７Ｄ、Ｋｒｏｎｍａｎら、１９９２、Ｇｅｎｅ、１２１、２９５〜３０４；Ｓｔｅｒｎｆｅｌｄら、１９９８、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１８、１２４０〜１２４９）。これらの酵素は、２ｍＭを超える基質濃度による特徴的な阻害を示したが、植物由来のＡＣｈＥ−Ｓと、細胞由来のＡＣｈＥ−Ｓとの間には有意な差はなかった。興味深いことに、基質阻害がＲ変異体の場合にはより顕著であり、Ｃ末端の活性部位の分子間シグナル伝達と匹敵した。ほんのわずかな違いが、ＡＣｈＥ−ＲＥＲがパラオクソン（殺虫剤パラチオンの活性なＯＰ代謝物）と結合し、これによって阻害され得ることにおいて観測された（図７Ｅ）。
【０１４９】
（実施例７）
植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲの循環クリアランス
マウスにおける植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲのクリアランスを、酵素（４００Ｕまたは１０００Ｕのどちらか）をｉ．ｖ．注射し、血漿サンプルにおけるその残存活性をｉｓｏ−ＯＭＰＡの存在下で測定することによって求めた（図８Ａ）。
【０１５０】
結果
植物由来のヒト酵素が迅速に排出され、循環ｔ１／２＝２４分であり、これは、他の供給源から得られるＡＣｈＥによる観測結果と類似していた（Ｋｒｏｎｍａｎ，Ｃ．ら（２００５）、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ、１５７−１５８、５１〜５５）。
【０１５１】
ヒトＡＣｈＥが、コントロール動物からではなく、４００ＵのＡＣｈＥ−ＲＥＲにより処置されたマウスから得られる血漿サンプルにおいて、ヒトＡＣｈＥの共通ドメインに対して特異的なＡｂによる免疫ブロッティングによって検出された。ＡＣｈＥタンパク質のレベルが１０分におけるその初期ピークの後で低下し、２時間後にはもはや検出できず、このことは酵素アッセイと矛盾していなかった（図８Ａ）。
【０１５２】
非変性ＰＡＧＥでは、コントロールを含めて、すべてのマウスの血漿において、ゆっくり移動するＣｈＥバンド（これは、ｉｓｏ−ＯＭＰＡによる阻害を受けないＢＣｈＥオリゴマーを表すと思われる）が明らかにされた。しかしながら、触媒活性な単量体酵素が、ＰＢＳが注射されたコントロールではなく、ＡＣｈＥ−ＲＥＲが注射された動物の血漿において観測された（図８Ｃ）。驚くべきことに、精製された植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲと比較した場合（図８Ｃ、左レーン）、マウスの血漿サンプルにおける注射された酵素は、いくつかの幅広いバンドとしてよりゆっくり移動した（図８Ｃ）。
【０１５３】
（実施例８）
植物産生ＡＣｈＥ−ＲＥＲによるＯＰ攻撃からの保護
外部から適用されたＡＣｈＥ−ＲＥＲが動物をＯＰ攻撃から保護し得るかを試験するために、本発明者らはパラオクソンの実験的単回ボーラスＬＤ５０の影響を明らかにした。
【０１５４】
結果
６週齢〜８週齢のオスのＦＶＢ／Ｎマウスにおいて、ＬＤ５０は６６０μｇ／ｋｇであった。植物産生によるヒトＡＣｈＥ−ＲＥＲの増大する量（体重に対して調節された用量）による前処理に続いて、１．１４ｘＬＤ５０のパラオクソンによる攻撃を行い、症状を観察し、記録した（図９Ａ〜図９Ｂ）。この用量のパラオクソンは、別途処置されていないマウスについては１００％致死的であり、死の前に、重篤なコリン作動性症状（痙攣および不自然な呼吸能）が生じ、５分〜１０分のうちに死に至る。１７匹のマウスを植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲにより前処理することにより、ＡＣｈＥ−ＲＥＲ／ＯＰのモル比が、ＢＣｈＥによる同等な化学量論的保護よりもはるかに低い０．０４のときでさえ、死亡率が低下した。この低いモル比において、生存動物は最初、重篤な症状を示し、その後、より穏やかな症状（あまり激しくない痙攣および振せん）を示した。症状は徐々に小さくなり、そして、４時間以内に、マウスはほんの軽度の徴候（低下した運動活性および全身倦怠感）を示した。重要なことに、パラオクソン注射後の最初の１５分を生き延びたすべてのマウスが、明らかに完全な回復を２４時間以内に示した。
【０１５５】
植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲのより大きい予防的用量は、なお一層より良好な保護をもたらした。酵素／薬剤モル比が０．０９を超える場合、初期症状は中程度であり、０．２を超える場合、初期症状は軽度にすぎなかった。０．５を超える酵素／薬剤比率により処置されたマウスは暴露後の症状の徴候を何ら示さなかった。すべての生存マウスの６ヶ月間のモニタリングでは、明白な神経障害または他の症状が明らかにされなかった。投与されたヒト酵素に対して特異的なＩｇＧの極めて低い力価が観測された；しかしながら、ＡＣｈＥ特異的なＩｇＥ、またはマウスＡＣｈＥに対して向けられた自己Ａｂのどちらも、植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲの最大用量（約１００００Ｕ）でさえ、それにより処置されたマウスから得られた血清サンプルにおいて検出することができなかった（データは示さず）。
【０１５６】
（実施例９）
ＡＣｈＥ−ＲＥＲによる処置は血漿における宿主ＡＣｈＥのＯＰ誘導によるアップレギュレーションを制限する
ＯＰ暴露は２つの一見して逆の影響を誘導する：第１に、ＯＰ暴露は遮断によってＣｈＥ活性を低下させ、第２に、ＯＰ暴露はＡＣｈＥ−Ｒの長く続くフィードバック過剰産生を誘導する。別の１組の実験において、本発明者らは、ＡＣｈＥ−ＲＥＲがＯＰ中毒のこれらの遅れた影響から保護する能力を調べた。この目的を達成するために、マウスをＰＢＳ＋／−ＡＣｈＥ−ＲＥＲ（４００Ｕ）のｉ．ｖ．投与によって前処理し、その後、亜致死的（０．８ＬＤ５０）または致死的（１．１３ＬＤ５０）なパラオクソン攻撃を行った。
【０１５７】
結果
保護されていない亜致死的な攻撃を受けたマウス、またはＡＣｈＥにより保護された致死的な攻撃を受けたマウスはすべて、重篤なコリン作動性症状を示し、その後で回復した（生存率は、亜致死的な攻撃を受けたマウスおよび致死的な攻撃を受けたマウスについてそれぞれ、１００％および７０％であった）。処置後１０日で、マウスを安楽死させ、血漿サンプルおよび骨格筋サンプルを採取した。このとき、すべてのマウスが、予測され得たことだが、ＯＰ攻撃によって誘導されるそれらの血漿ＡＣｈＥレベルにおける小さい増大を経た（図９Ｂ、図１０Ａ）。この遅れた時点での血漿ＡＣｈＥ活性は、保護されていない亜致死的な攻撃を受けたマウスと比較したとき、酵素により処置された動物では実質的により低かった。このことは、長く続くＡＣｈＥ−Ｒの過剰産生の、効果的ではあるが不完全な相殺が、植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲの投与によるものであることを示唆する。植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲの単独投与は、注射後１０日において、血漿ＡＣｈＥ−Ｒ活性のレベルを著しく制限した（図９Ｂ、図１０Ａ）。このことは、この相殺が、循環系における高いレベルのＡＣｈＥ分子に対するフィードバック応答であったという見解を裏付ける。さらに、血漿ＡＣｈＥ活性におけるＯＰ誘導による増大の酵素前処理による調節が、攻撃後１０日で得られたサンプルの非変性ゲルによって観測されるＡＣｈＥ単量体（おそらくは、マウスＡＣｈＥ−Ｒ）における対応する変化によって反映される（図１０Ａ）。したがって、内因性マウスＡＣｈＥ（具体的には、マウスＡＣｈＥ−Ｒ）の血漿レベルにおける中毒後の増大が、外部から適用された植物由来酵素によって少なくとも部分的に軽減され得ると結論することができる。
【０１５８】
（実施例１０）
ＡＣｈＥ−ＲＥＲによる処置はＯＰ中毒により誘導されるＮＭＪの異常形態を改善する
結果
酵素による前処理は、致死的ＯＰ傷害および亜致死的ＯＰ傷害の両方の後での骨格（脚）筋肉におけるマウスＡＣｈＥ−Ｒの暴露後の蓄積に対する相当の弱化作用を発揮し、その阻害を防止した（図１０Ｃ）。同時に、ＡＣｈＥ−ＲＥＲにより前処理されたマウスにおける筋肉ＡＣｈＥ活性は、攻撃されていないコントロールの筋肉ＡＣｈＥ活性と類似しており（図１０Ｄ〜図１０Ｅ）、投与されたＡＣｈＥ−ＲＥＲが、筋肉ＡＣｈＥ−Ｒを阻害から保護する「おとり」として働いたという仮説と矛盾していなかった。したがって、植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲの投与はＡＣｈＥ遺伝子発現におけるＯＰ誘導による変化を相互に調節し、これにより、マウスの循環におけるＯＰ誘導によるＡＣｈＥ−Ｒの産生を低下させながら、筋肉におけるその阻害を防止したようである。
【０１５９】
様々なＯＰによって誘導されるＮＭＪの長期間の異常形態に対するＡＣｈＥ−ＲＥＲの影響を調べるために、無傷の横隔膜筋を処置後１０日で解剖し、触媒活性なＡＣｈＥについて染色して、ＮＭＪの密度および平均個々面積に関して分析した（図１１Ａ〜図１１Ｂ）。パラオクソン暴露は、ＰＢＳコントロールと比較したとき、大きいＮＭＪの密度および割合の両方を増大させた（図１１Ａ〜図１１Ｂ、Ｐ＜０．０１（メジアン検定）を示す）。４００ＵのＡＣｈＥ−ＲＥＲによる前処理はＮＭＪ面積の暴露に誘導された拡大の少なくとも一部を妨げたが、４００ＵのＡＣｈＥ−ＲＥＲ単独による処理は非暴露の横隔膜においてＮＭＪの密度または面積を変化させなかった（Ｐ＞０．０５（メジアン検定）、図１１Ａ〜図１１Ｂ）。これらの発見により、これらの弱まったＮＭＪの異常形態の影響が宿主筋肉組織における改善されたフィードバック応答の結果であると考えられる。
【０１６０】
（実施例１１）
ＡＣｈＥ−ＲＥＲの、ＯＰ中毒のこれらの遅れた影響から保護する能力
ＯＰ暴露は２つの一見して逆の影響を誘導する：第１に、ＯＰ暴露は遮断によってＣｈＥ活性を低下させ、第２に、ＯＰ暴露はＡＣｈＥ−Ｒの長く続くフィードバック過剰産生を誘導する。本実施例において、本発明者らは、ＡＣｈＥ−ＲＥＲがＯＰ中毒のこれらの遅れた影響から保護する能力を調べた。この目的を達成するために、マウスをＰＢＳ＋／−ＡＣｈＥ−ＲＥＲ（４００Ｕ）のｉ．ｖ．投与によって前処理し、その後、亜致死的（０．８ＬＤ５０）または致死的（１．１３ＬＤ５０）なパラオクソン攻撃を行った。
【０１６１】
結果
保護されていない亜致死的な攻撃を受けたマウス、またはＡＣｈＥにより保護された致死的な攻撃を受けたマウスはすべて、重篤なコリン作動性症状を示し、その後で回復した（生存率は、亜致死的な攻撃を受けたマウスおよび致死的な攻撃を受けたマウスについてそれぞれ、１００％および７０％であった）。処置後１０日で、マウスを安楽死させ、血漿サンプルおよび骨格筋サンプルを採取した。このとき、すべてのマウスが、予測され得たことだが、ＯＰ攻撃によって誘導されるそれらの血漿ＡＣｈＥレベルにおける小さい増大を経た（図９Ｂ、図１０Ａ）。この遅れた時点での血漿ＡＣｈＥ活性は、保護されていない亜致死的な攻撃を受けたマウスと比較したとき、酵素により処置された動物では実質的により低かった。このことは、長く続くＡＣｈＥ−Ｒの過剰産生の、効果的ではあるが不完全な相殺が、植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲの投与によるものであることを示唆する。植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲの単独投与は、注射後１０日において、血漿ＡＣｈＥ−Ｒ活性のレベルを著しく制限した（図９Ｂ、図１０Ａ）。このことは、この相殺が、循環系における高いレベルのＡＣｈＥ分子に対するフィードバック応答であったという見解を裏付ける。さらに、血漿ＡＣｈＥ活性におけるＯＰ誘導による増大の酵素前処理による調節が、攻撃後１０日で得られたサンプルの非変性ゲルによって観測されるＡＣｈＥ単量体（おそらくは、マウスＡＣｈＥ−Ｒ）における対応する変化によって反映される（図１０Ａ）。
【０１６２】
血漿ＡＣｈＥ活性におけるＯＰ誘導による増大の酵素前処理による調節が、攻撃後１０日で得られたサンプルの非変性ゲルによって観測されるＡＣｈＥ単量体（おそらくは、マウスＡＣｈＥ−Ｒ）における対応する変化によって反映される（図１０Ａ）。これらの単量体は、マウスによってそれらの投与後２時間で完全に排出された植物由来の純粋なＡＣｈＥ−ＲＥＲよりも幾分か遅く移動する（図８Ａ〜図８Ｃ）。移動がより遅いこの種は、攻撃後のマウスＡＣｈＥ−Ｒのタンパク質・タンパク質の相互作用または異なったグリコシル化パターンのどちらかを反映し得る。
【０１６３】
ＡＣｈＥの総量（活性型および不活性型）における長期間の変化を検出するために、血漿タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後、ＡＣｈＥタンパク質を、ＡＣｈＥの共通ドメインに対して向けられた特異的なＡｂ、またはマウスＡＣｈＥ−Ｒの特有のカルボキシル末端ドメインに対して向けられた特異的なＡｂを使用して検出した（図１０Ｂ）。それぞれの処置群における個々のマウスが相当の生存性を示した。それにもかかわらず、血液におけるマウスＡＣｈＥのパラオクソン誘導による用量依存的な上昇が、酵素による前処理によって阻止されるようであった。したがって、マウスＡＣｈＥ−Ｒの血漿での蓄積は総ＡＣｈＥにおける変化の傾向に対応し（図１０Ｂ）、また、ＡＣｈＥ活性および活性なＡＣｈＥ単量体に関して認められる傾向と一致した（図９Ｂ、図１０Ａ）。したがって、内因性マウスＡＣｈＥ（具体的には、マウスＡＣｈＥ−Ｒ）の血漿レベルにおける中毒後の増大が、外部から適用された植物由来酵素によって少なくとも部分的に軽減され得ると結論することができる。
【０１６４】
酵素による前処理は、致死的ＯＰ傷害および亜致死的ＯＰ傷害の両方の後での骨格（脚）筋肉におけるマウスＡＣｈＥ−Ｒの暴露後の蓄積に対する相当の弱化作用を発揮し、その阻害を防止した（図１０Ｃ）。
【０１６５】
筋肉において、ＡＣｈＥ分子の大多数は、傷害後でさえ、シナプス型変異体（ＡＣｈＥ−Ｓ）の分子である。ＡＣｈＥ−Ｓはさらに、組織ホモジネートの逐次抽出によって分離され得るいくつかの分子形態（可溶性形態および膜結合型形態を含む）に組織化され得る。低塩緩衝液におけるホモジネート化は可溶性（単量体）のＡＣｈＥ−ＳおよびＡＣｈＥ−Ｒを遊離させる（これらはまとめて、総ＡＣｈＥ活性の約１５％を表す；図１０Ｅ）。その後の抽出は、最初に、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する緩衝液（低塩緩衝液−界面活性剤、約６５％）により、次いで、１ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液（高塩、約２０％）により行われ、ＡＣｈＥ−Ｓ種を、ほとんどが、膜と結合する四量体として遊離させる（データは示さず）。植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲの投与は、総筋肉ＡＣｈＥ活性に対する著しい影響を有しないが、致死的用量のパラオクソンは、おそらくは四量体ＡＣｈＥ−Ｓと考えられるが、ＡＣｈＥの膜結合した界面活性剤可溶性形態における約５０％の低下を引き起こした（図１０Ｅ）。保護されていないマウスにおいて、パラオクソンはまた、低塩可溶性ＡＣｈＥ活性（おそらくはＡＣｈＥ−Ｒ）における著しい低下を引き起こした（約１６．４％、図１０Ｅ）。このことは、宿主筋肉ＡＣｈＥ−ＲがＯＰによって不可逆的に阻害され、これにより、「老化した」酵素が生じることを示唆する。ＡＣｈＥ−ＲＥＲによる処置はこの傾向を逆転させ、その結果、ＡＣｈＥ活性がＰＢＳコントロールの活性に見かけ上は類似し（図１０Ｅ）、そのＡＣｈＥ活性は、投与されたＡＣｈＥ−ＲＥＲが、筋肉ＡＣｈＥ−Ｒを阻害から保護する「おとり」として働いたという仮説と矛盾していなかった。結論として、植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲの投与はＡＣｈＥ遺伝子発現におけるＯＰ誘導による変化を相互に調節し、これにより、マウスの循環におけるＯＰ誘導によるＡＣｈＥ−Ｒの産生を低下させながら、筋肉におけるその阻害を防止した。
【０１６６】
考察
ＯＰ中毒の影響を中和するための有用な予防剤および／または治療剤についての探索は、製造コスト、安全性、ならびに当然のことではあるが、短期間および長期間の両方の保護を確実にすることができることを含めて、多くの要素を考慮しなければならない。ここでは、本発明者らは、植物での製造が最初の２つの問題に対処し、一方、ＡＣｈＥの可溶性の、ストレスに関連づけられる「読み過ごし」スプライス変異体を選ぶことが、第３および第４の問題に対処することを明らかにしている。
【０１６７】
本発明者らは、依然としてその実験的初期段階にあるが、タンパク質医薬品の製造のための有望なシステムとして近年出現したトランスジェニック植物においてヒトＡＣｈＥ−ＲＥＲを発現させた。植物システムは、（同等の精製コストおよび規制コストによる）低い製造コスト、（低い資本投資による）製造の規模拡大性および柔軟性、ならびに改善された安全性（ヒト病原体およびプリオンの懸念がないこと）を提供する。他の異種発現システムと同様に、植物におけるＮ結合型グリコシル化プロセスは、ヒトにおけるグリコシル化プロセスとは細部で異なる。これに関連して、２つの大きな問題が提起される：植物がその糖タンパク質をシアル化することができないことによる加速された循環クリアランス、および特有の植物糖エピトープが複合グリカン上に存在することによる増大したアレルゲン性の危険性。これらの危険性を最小限に抑えるために、ＡＣｈＥ−Ｒの蓄積がＥＲに向けられ、したがって、これにより、ヒトにおけるアレルギー反応に時には関連するキシロース残基およびフコース残基が付加されるｔｒａｎｓ−ゴルジが回避された。実際、予備的データは、植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲが、ヒトの高マンノースグリカンとは異ならない、したがって、「アレルゲン性」の糖エピトープを有しない高マンノースグリカンによって装飾されることを示す。
【０１６８】
組換えＡＣｈＥ−ＲのＥＲ保持は、非常に高いレベルへのその蓄積を可能にした（約１％のＴＳＰ）。その天然の対応体と同様に、植物由来タンパク質が循環から迅速に排出された。哺乳動物ＣｈＥの循環ｔ１／２は、タンパク質表面におけるアミノ酸ドメイン、グリカン構造、およびタンパク質のオリゴマー化状態に依存する。排出速度は、排出速度が測定される種、試験されたタンパク質のゲノム起源、および産生宿主によって影響される。例えば、（ヒト細胞株で産生された）サルＡＣｈＥ−ＳおよびヒトＡＣｈＥ−Ｓの霊長類におけるクリアランスはタンパク質のオリゴマー化状態またはそのグリコシル化によってほんのわずかに影響されるだけである。同様に、ヒト血液から精製されたＢＣｈＥは齧歯類において特徴的に長い循環ｔ１／２を示し、一方、ハムスター細胞株、またはトランスジェニックヤギの乳腺で産生された組換えヒトＢＣｈＥは、はるかにより速く排出された。組換えＣｈＥの投与によって遭遇する劣った薬物動態学的パラメーターを、タンパク質を、迅速なクリアランスの原因となる表面特徴を遮蔽するポリ（エチレングリコール）により装飾することによって改善することができる。したがって、トランスジェニックヤギの乳汁に由来する「ＰＥＧ化」された組換えヒトＡＣｈＥ−Ｓまたは組換えＢＣｈＥは、齧歯類、ブタまたはサルのどれにおいても、非ＰＥＧ化タンパク質と比較したとき、著しく長い循環ｔ１／２を示した。
【０１６９】
本明細書中上記の実施例は、組換えヒトＡＣｈＥ−ＲＥＲが、商業的に実行可能なレベルにまでトランスジェニック植物組織に蓄積し得ること、組換えヒトＡＣｈＥ−ＲＥＲが容易に均一に精製され得ること、ならびに組換えヒトＡＣｈＥ−ＲＥＲが、基質加水分解およびＯＰ結合に関して、真性ヒト酵素の速度論的特徴を有することを明らかにする。ＥＲ捕捉型の可溶性ＡＣｈＥ−Ｒの植物での製造は、いくつかのレベルで好都合であることが見出された。組換えヒトＡＣｈＥ−ＲＥＲは、商業的に実行可能なレベルにまで植物組織に蓄積する（図６Ａ〜図６Ｄ）。均一に精製されたとき、組換えヒトＡＣｈＥ−ＲＥＲは、基質加水分解およびＯＰ結合に関して、真性ヒト酵素の速度論的特徴に達する（図７Ａ〜図７Ｅ）。動物に対するそのほぼ化学量論的投与は、循環している様々なＣｈＥのレベルを劇的に上昇させ（図８Ａ〜図８Ｃ）、これにより、動物をＯＰ中毒の急性症状および死亡から完全に保護した（図９Ａ〜図９Ｂ）。さらに、ＡＣｈＥ−Ｒによる予防は、ＡＣＨＥ遺伝子発現の長期間のアップレギュレーションを緩和することによってＯＰ毒性の慢性的影響を改善した（図９Ａ〜図９Ｂおよび図１０Ａ〜図１０Ｅ）。このことは、新しい側面をＣｈＥ治療の概念に加える。能動的なＯＰバイオスカベンジャーとしてのその機能のほかに、ＡＣｈＥのこの特定のイソ型は、ＯＰ暴露に対する長く続く分子的フィードバック応答に関連する悪循環を積極的に妨げることができる。
【０１７０】
ＯＰ系ＣｈＥ阻害剤に対する暴露はＮＭＪおよび末梢組織におけるシナプスＡＣｈのレベルを急速に増大させ、これにより、いわゆる「コリン作動性クリーゼ」を開始させる（図１１Ｃ）。ＡＣｈＥ−Ｒの過剰産生は、ＡＣｈ加水分解能を循環の至るところで増大させることによってコリン作動性バランスを迅速に元に戻す；しかしながら、ＡＣｈＥ−Ｒの持続した過剰産生は、前炎症性サイトカインの過剰産生、行動障害、陳述記憶喪失、筋肉の機能不全および過度な骨髄造血と結びつく。この酵素による前処理は炎症マーカーの一過性の上昇を引き起こすと考えられる；しかしながら、植物由来ＡＣｈＥ−ＲＥＲの組み込まれた一過性は、そのような影響の持続期間を制限する。そのうえ、循環における内因性ＡＣｈＥ−Ｒの軽減された過剰産生は、そのような症状の持続期間をさらに制限するにちがいない。このことは、この特定のＡＣｈＥイソ型による前処理がＯＰ中毒後の急性コリン作動性クリーゼを防止し得るだけでなく、その有害な慢性的後遺症もまた制限するかもしれないことを示唆する。
【０１７１】
明確にするため別個の実施形態で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０１７２】
本発明はその特定の実施形態によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本明細書中で言及した刊行物、特許および特許願はすべて、個々の刊行物、特許もしくは特許願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【配列表フリーテキスト】
【０１７３】
配列番号１は、アセチルコリンエステラーゼ読み過ごし同位型（ｏＡＣｈＥ−Ｒ）合成構築物の配列である。
配列番号２は、アセチルコリンエステラーゼ読み過ごし同位型（ｏＡＣｈＥ−Ｒ）ポリペプチドの配列である。
配列番号３は、Ｃ末端ＥＲ保持シグナルに融合されたアセチルコリンエステラーゼ（ｈＡＣｈＥ−Ｒ  ＥＲ）ポリヌクレオチドの配列である。
配列番号４は、Ｃ末端ＥＲ保持シグナルに融合されたアセチルコリンエステラーゼ（ｈＡＣｈＥ−Ｒ  ＥＲ）ポリペプチドの配列である。
配列番号５は、ｈＡＲＰを発現するポリヌクレオチド（ＡＣｈＥ−Ｒの活性部分）の配列である。
配列番号６は、ｈＡＲＰ（ＡＣｈＥ−Ｒの活性部分）の配列である。
配列番号７は、ｍＡＲＰを発現するポリヌクレオチド（ＡＣｈＥ−Ｒの活性部分）の配列である。
配列番号８は、ｍＡＲＰ（ＡＣｈＥ−Ｒの活性部分）の配列である。
配列番号９〜１４は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
【図１１Ｂ】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ−Ｄ】
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【図７Ａ−Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ−Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年8月10日(2010.8.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機リン酸エステル暴露関連損傷を対象において処置または防止するための医薬の製造のためのＡＣｈＥ−Ｒの使用。
【請求項２】
前記ＡＣｈＥ−ＲはＡＲＰを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは組換えＡＣｈＥ−Ｒを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記組換えＡＣｈＥ−Ｒは植物産生ＡＣｈＥ−Ｒである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは、配列番号２または４に示される通りのものである、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは、吸入、注射または局所適用のために配合される、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
固体担体に固定化されたＡＣｈＥ−Ｒを含む、有機リン酸エステル暴露関連損傷を処置または防止するための製造物。
【請求項８】
前記固体担体は局所投与のためのものである、請求項７に記載の製造物。
【請求項９】
前記固体担体は、フィルター、布地および裏当てからなる群から選択される、請求項７に記載の製造物。
【請求項１０】
前記ＡＣｈＥ−ＲはＡＲＰを含む、請求項７に記載の製造物。
【請求項１１】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは植物産生ＡＣｈＥ−Ｒである、請求項７に記載の製造物。
【請求項１２】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは、配列番号２または４に示される通りのものである、請求項１１に記載の製造物。
【請求項１３】
表面をＡＣｈＥ−Ｒと接触させ、それにより、表面を解毒することを含む、表面を解毒する方法。
【請求項１４】
前記ＡＣｈＥ−ＲはＡＲＰを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは植物産生ＡＣｈＥ−Ｒである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは、配列番号２または４に示される通りのものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＡＣｈＥ−Ｒを含む被覆材。
【請求項１８】
前記ＡＣｈＥ−ＲはＡＲＰを含む、請求項１７に記載の被覆材。
【請求項１９】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは植物産生ＡＣｈＥ−Ｒである、請求項１７に記載の被覆材。
【請求項２０】
前記ＡＣｈＥ−Ｒは、配列番号２または４に示される通りのものである、請求項１７に記載の被覆材。
【国際調査報告】
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