(57)【要約】  本発明は、ウイルス感染症に関連する新生物を、検出するため、処置方法を選択するため、モニタリングするため、および処置するための、組成物および方法を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスで自然感染した新生物の処置用に標識された医薬組成物であって、前記組成物はウイルス溶解誘発剤の有効量を含み、ここで前記剤は、プロテアソーム阻害剤、微小管破壊剤、グルココルチコイドまたはステロイドホルモン、ヌクレオシド類似体、および抗炎症剤からなる群から選択される、前記組成物。
【請求項２】
ウイルスに関連する新生物の処置のための医薬組成物であって、前記組成物は、ボルテゾミブ、トラニラスト、レフルノミド、メベンダゾール、シタラビンおよびインドプロフェンからなる群から選択される剤の有効量を含む、前記組成物。
【請求項３】
組成物が、２’−フルオロ−２’−デオキシ−β−Ｄ−５−ヨードウラシル−アラビノフラノシド（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
有効量が、対象においてウイルス遺伝子発現またはウイルス複製を誘発するのに十分である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
有効量が細胞障害性ではない、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
プロテアソーム阻害剤がボルテゾミブである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
新生物が、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）またはカポジ肉腫ヘルペスウイルスに自然感染している、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
新生物が、リンパ腫、胃癌、カポジ肉腫、または上咽頭癌である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
自然発生の感染症に関連する新生物の診断用の医薬組成物であって、前記組成物は、２’−フルオロ−２’−デオキシ−β−Ｄ−５−ヨードウラシル−アラビノフラノシド（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量を含む、前記組成物。
【請求項１０】
感染症が、ウイルス感染症または細菌感染症である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
組成物が、該組成物を請求項１〜６にいずれかに記載のウイルス溶解誘発剤と共に用いるための指示書を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
放射標識が、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴを用いて視覚化される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
類似体が、ヨウ素−１２３Ｉ、１２４Ｉ、または１２５Ｉである放射性核種を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
感染症に関連する新生物の処置のための医薬組成物であって、前記組成物は、２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量を含む、前記組成物。
【請求項１５】
放射性核種が、α、β、またはγ線放射体である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
放射性核種が、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１２３Ｉ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、および１３３Ｉからなる群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
放射性核種が、少なくとも約０．５〜２Ｇｙを放射する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＦＩＡＵの有効量が、約０．００１〜０．１ｍｇ／ｋｇである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ＦＩＡＵの有効量が、約０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
新生物が、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）またはカポジ肉腫ヘルペスウイルスに自然感染している、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
新生物が、リンパ腫、胃癌、カポジ肉腫、または上咽頭癌である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
組成物が、該組成物を請求項１〜６にいずれかに記載のウイルス溶解誘発剤と共に用いるための指示書を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ウイルス溶解誘発剤を同定するための方法であって、前記方法は、潜伏性ウイルス感染症を有する新生細胞を剤と接触させること、および前記細胞におけるウイルス溶解ポリペプチドの発現もしくは活性またはウイルス複製の増加を検出することを含む、前記方法。
【請求項２４】
方法が、ＺＴＡ発現、ＲＴＡ発現、ウイルスチミジンキナーゼ発現または活性、およびウイルス複製の１つまたは２つ以上における増加を同定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ウイルス溶解ポリペプチドの発現または活性を、レポーターポリペプチドの発現の増加を検出することにより分析する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
レポーターが、ＢＺＬＦＩＥプロモーター配列またはＺｔａプロモーター配列の制御下にある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
レポーターが、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
方法が、ウイルス複製の増加を検出することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
レポーターが、マイクロプレートリーダーにより検出される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
マイクロプレートリーダーが、相対蛍光単位（ＲＦＵ）の増加を検出し、これが剤を溶解誘発剤として同定する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
剤が、プロテアソーム阻害剤、微小管破壊剤、グルココルチコイドまたはステロイドホルモン、ヌクレオシド類似体、および抗炎症剤からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
対象における感染関連新生物を検出するための方法であって、前記方法は、該対象に対し、ウイルス溶解誘発剤および２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量を投与すること、および新生物を視覚化することを含む、前記方法。
【請求項３３】
放射標識類似体を、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴにより視覚化する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
類似体が、ヨウ素−１２３Ｉ、１２４Ｉ、または１２５Ｉである放射性核種で標識されている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
感染症が、ウイルス感染症または細菌感染症である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
新生物が、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）またはカポジ肉腫ヘルペスウイルスに自然感染している、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
新生物が、リンパ腫、胃癌、カポジ肉腫、または上咽頭癌である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
感染関連新生物を有する対象への治療を選択するための方法であって、前記方法は、該対象に対し、ウイルス溶解誘発剤および２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量を投与すること；および
該対象において、溶解誘発の有無を検出することを含み、ここで溶解誘発の増加により、対象が溶解誘発剤による処置および酵素標的化放射線療法を適用可能であるとして同定される、前記方法。
【請求項３９】
対象における感染関連新生物を処置または予防する方法であって、前記方法は、該対象に対し、ウイルス溶解誘発剤および２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４０】
感染症が、ウイルス感染症または細菌感染症である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ウイルスまたは細菌に感染した新生細胞を死滅させるための方法であって、前記方法は、該細胞を、ウイルス溶解誘発剤および２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４２】
溶解誘発剤が、プロテアソーム阻害剤、微小管破壊剤、グルココルチコイドまたはステロイドホルモン、ヌクレオシド類似体、および抗炎症剤からなる群から選択される、請求項３８〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
溶解誘発剤が、ボルテゾミブ、トラニラスト、レフルノミド、メベンダゾール、シタラビンおよびインドプロフェンからなる群から選択される、請求項３８〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
放射標識が、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１２３Ｉ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、および１３３Ｉからなる群から選択される、請求項３８〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
新生物が、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）またはカポジ肉腫ヘルペスウイルスに自然感染している、請求項３８〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
新生物が、リンパ腫、胃癌、カポジ肉腫、または上咽頭癌である、請求項３８〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
対象における感染関連新生物を診断またはモニタリングするためのキットであって、前記キットは、ウイルス溶解誘発剤および２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量、およびこのキットを新生物の診断に用いるための指示書を含む、前記キット。
【請求項４８】
感染症が、ウイルス感染症または細菌感染症である、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
新生物が、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）またはカポジ肉腫ヘルペスウイルスに自然感染している、請求項４７に記載のキット。
【請求項５０】
新生物が、リンパ腫、胃癌、カポジ肉腫、または上咽頭癌である、請求項４７に記載のキット。
【請求項５１】
放射標識類似体を、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴにより視覚化する、請求項４７に記載のキット。
【請求項５２】
類似体が、ヨウ素−１２３Ｉ、１２４Ｉ、または１２５Ｉである放射性核種で標識されている、請求項４７に記載のキット。
【請求項５３】
溶解誘発剤が、プロテアソーム阻害剤、微小管破壊剤、グルココルチコイドまたはステロイドホルモン、ヌクレオシド類似体、および抗炎症剤からなる群から選択される、請求項４７に記載のキット。
【請求項５４】
溶解誘発剤が、ボルテゾミブ、トラニラスト、レフルノミド、メベンダゾール、シタラビンおよびインドプロフェンからなる群から選択される、請求項４７に記載のキット。
【請求項５５】
対象におけるウイルス関連新生物を処置するためのキットであって、前記キットは、ウイルス溶解誘発剤および２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量、およびこのキットを新生物の診断に用いるための指示書を含む、前記キット。
【請求項５６】
溶解誘発剤が、プロテアソーム阻害剤、微小管破壊剤、グルココルチコイドまたはステロイドホルモン、ヌクレオシド類似体、および抗炎症剤からなる群から選択される、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
溶解誘発剤が、ボルテゾミブ、トラニラスト、レフルノミド、メベンダゾール、シタラビンおよびインドプロフェンからなる群から選択される、請求項５５に記載のキット。
【請求項５８】
新生物が、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）またはカポジ肉腫ヘルペスウイルスに自然感染している、請求項５５に記載のキット。
【請求項５９】
新生物が、リンパ腫、胃癌、カポジ肉腫、または上咽頭癌である、請求項５５に記載のキット。
【請求項６０】
細菌を死滅させるための方法であって、該細菌を２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体と接触させることを含む、前記方法。
【請求項６１】
放射標識が、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１２３Ｉ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、および１３３Ｉからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
対象における細菌感染症を処置するための方法であって、前記方法は、該対象に対して、２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項６３】
放射標識が、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１２３Ｉ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、および１３３Ｉからなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年４月１０日出願の米国仮出願第60/922,755号および２００７年５月２５日出願の米国仮出願第60/931,921号の利益を主張し、これらの内容の全体は本明細書に参照として組み込まれる。
【０００２】
連邦支援研究のもとでなされた発明に対する権利の申告
本研究は部分的にＮＩＨの助成金US24 CA92871およびP50 CA96888により支援された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明背景
多くの人々がエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を感染性単核球症と関連付けるが、ＥＢＶは、バーキットリンパ腫、ＡＩＤＳ患者、および全てのホジキン病症例の半数におけるリンパ腫を含む、ヒトの種々の癌に関連する腫瘍ウイルスである。ヒトパピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＥＢＶを含む腫瘍ウイルスは、ヒトにおける全ての癌の約１５％に関連する。ウイルス関連新生物を診断、モニタリングおよび処置するための現在存在する方法は不適切であり、改善された方法が緊急に求められている。
【発明の概要】
【０００４】
以下に記載するように、本発明は、ウイルス感染症または細菌感染症などの自然発生の感染症に関連する新生物を診断、モニタリングおよび処置するための組成物および方法を特徴とする。
１つの側面において、本発明は、ウイルスに自然感染した新生物の処置のために標識された医薬組成物を特徴とする。該組成物は、プロテアソーム阻害剤、微小管破壊剤、グルココルチコイドまたはステロイドホルモン、ヌクレオシド類似体、および抗炎症剤などのウイルス溶解誘発剤の有効量を、該組成物を投与する対象において、好ましくはウイルス遺伝子発現またはウイルス複製を誘発するのに十分な量で含む。さらに、ウイルス遺伝子発現またはウイルス複製を誘発するのに必要な量は、細胞障害性ではないのが好ましい。溶解誘発剤としては、ボルテゾミブ、トラニラスト、レフルノミド、メベンダゾール、シタラビンおよびインドプロフェンが挙げられるが、これに限定されない。１つの態様において、医薬組成物は、２’−フルオロ−２’−デオキシ−β−Ｄ−５−ヨードウラシル−アラビノフラノシド（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体をさらに含むことができる。組成物は、例えばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）またはカポジ肉腫ヘルペスウイルスによる感染に関連する新生物の処置のために、例えばリンパ腫、胃癌、カポジ肉腫、または上咽頭癌の処置のために、用いることができる。
【０００５】
他の側面において、本発明は、例えばウイルスまたは細菌による感染症などの、自然発生の感染症に関連する新生物の診断のための医薬組成物を特徴とする。組成物は、２’−フルオロ−２’−デオキシ−β−Ｄ−５−ヨードウラシル−アラビノフラノシド（ＦＩＡＵ）の有効量を含む。放射標識組成物は、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴによる視覚化に対して標識されることができ、例えば、ヨウ素−１２３Ｉ、１２４Ｉ、または１２５Ｉを用いる。放射標識組成物は、組成物をウイルス溶解誘発剤と共に用いるための指示書を含むことができる。
【０００６】
１つの側面において、本発明は、例えばウイルスまたは細菌による感染症などの、感染症に関連する新生物の処置のための医薬組成物を特徴とする。組成物は、２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量を含む。標識は、α、β、またはγ線放射体であることができ、例えば、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１２３Ｉ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、または１３３Ｉである。放射性核種は、好ましくは少なくとも約０．５〜２Ｇｙを放射し、対象に対して、約０．００１〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１〜約０．１ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。組成物は、例えばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）またはカポジ肉腫ヘルペスウイルスによる感染に関連する新生物の処置のために、例えばリンパ腫、胃癌、カポジ肉腫、または上咽頭癌の処置のために、用いることができる。放射標識組成物は、組成物をウイルス溶解誘発剤と共に用いるための指示書を含むことができる。
【０００７】
１つの側面において、本発明は、ウイルス溶解誘発剤を同定するための方法を特徴とする。方法は、潜伏性ウイルス感染症を有する新生細胞を剤と接触させること、および細胞におけるウイルス溶解ポリペプチドの発現もしくは活性またはウイルス複製の増加を検出することを含む。細胞におけるウイルス溶解ポリペプチドまたは遺伝子の発現または活性は、ＺＴＡ発現、ＲＴＡ発現、およびウイルスチミジンキナーゼ発現または活性の１つまたは２つ以上における増加により、検出することができる。ウイルス溶解ポリペプチドまたは遺伝子の活性もしくは発現は、レポーターポリペプチドまたは遺伝子の発現の増加を、例えば、ＢＺＬＦＩＥプロモーター配列またはＺｔａプロモーター配列の制御下において検出することにより、分析可能である。レポーターとしては、限定することなく、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質が挙げられ、これらは、例えばマイクロプレートリーダーを用いて、対照と比較した相対蛍光単位（ＲＦＵ）における増加を検出することにより、検出可能である。ウイルス溶解誘発剤は、プロテアソーム阻害剤、微小管破壊剤、グルココルチコイドまたはステロイドホルモン、ヌクレオシド類似体、および抗炎症剤を含むが、これに限定されない。
【０００８】
他の側面において、本発明は、対象における、例えば細菌またはウイルス感染症などの感染関連新生物を検出するための方法を特徴とする。方法は、対象に対して、ウイルス溶解誘発剤および２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量を投与すること、および新生物を視覚化することを含む。放射標識類似体は、例えばヨウ素−１２３Ｉ、１２４Ｉ、または１２５Ｉを用いて標識され、例えばＳＰＥＣＴまたはＰＥＴを用いて視覚化される。方法は、例えばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）またはカポジ肉腫ヘルペスウイルスによる感染に関連する新生物の処置のために、例えばリンパ腫、胃癌、カポジ肉腫、または上咽頭癌の処置のために、用いることができる。
【０００９】
１つの側面において、本発明は、感染関連新生物を有する対象に対する治療を選択するための方法を特徴とする。方法は、対象に対し、ウイルス溶解誘発剤および２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量を投与すること；および、該対象において、溶解誘発の有無を検出することを含む。溶解誘発の増加は、対象が、溶解誘発剤による処置および酵素標的化放射線療法を適用可能であると同定する。
【００１０】
他の側面において、本発明は、対象における、例えばウイルスまたは細菌感染症などの感染関連新生物を処置または予防する方法を特徴とする。方法は、対象に対し、ウイルス溶解誘発剤および２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量を投与することを含む。
１つの側面において、本発明は、ウイルスまたは細菌に感染した新生細胞を死滅させるための方法を特徴とする。方法は、該細胞をウイルス溶解誘発剤および２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量と接触させることを含む。
【００１１】
本発明の種々の態様において、溶解誘発剤は、例えば、プロテアソーム阻害剤、微小管破壊剤、グルココルチコイドまたはステロイドホルモン、ヌクレオシド類似体、および抗炎症剤である。本発明で用いる溶解誘発剤のさらなる例は、例えば、ボルテゾミブ、トラニラスト、レフルノミド、メベンダゾール、シタラビンおよびインドプロフェンが挙げられる。
本発明の種々の態様において、本発明の治療法および組成物のための放射性核種標識は、α、β、またはγ線放射体であることができ、例えば、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１２３Ｉ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、または１３３Ｉである。
【００１２】
本発明の種々の態様において、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴにおける画像化での使用についての放射性核種標識は、例えば、ヨウ素−１２３Ｉ、１２４Ｉ、または１２５Ｉである。
本発明の種々の態様において、例えばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）またはカポジ肉腫ヘルペスウイルスなどの感染に関連する新生物は、例えばリンパ腫、胃癌、カポジ肉腫、または上咽頭癌である。
【００１３】
１つの側面において、本発明は、対象における感染関連新生物を診断またはモニタリングするためのキットを特徴とする。キットは、ウイルス溶解誘発剤および２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量、およびこのキットを新生物の診断に用いるための指示書を含む。キットは、ウイルス感染または細菌感染を、例えばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）またはカポジ肉腫ヘルペスウイルスによる感染に関連する新生物、例えばリンパ腫、胃癌、カポジ肉腫、または上咽頭癌を、診断またはモニタリングするために用いることができる。感染関連新生物は、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴにより、ヨウ素−１２３Ｉ、１２４Ｉ、または１２５Ｉを放射性核種として、画像化することができる。溶解誘発剤は、プロテアソーム阻害剤、微小管破壊剤、グルココルチコイドまたはステロイドホルモン、ヌクレオシド類似体、および抗炎症剤であることができ、例えば、ボルテゾミブ、トラニラスト、レフルノミド、メベンダゾール、シタラビンおよびインドプロフェンである。
【００１４】
１つの側面において、本発明は、対象におけるウイルス関連新生物を処置するためのキットを特徴とする。キットは、ウイルス溶解誘発剤および２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量、およびこのキットを新生物の診断に用いるための指示書を含む。溶解誘発剤は、プロテアソーム阻害剤、微小管破壊剤、グルココルチコイドまたはステロイドホルモン、ヌクレオシド類似体、および抗炎症剤であることができ、例えば、ボルテゾミブ、トラニラスト、レフルノミド、メベンダゾール、シタラビンおよびインドプロフェンである。例えばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）またはカポジ肉腫ヘルペスウイルスなどの感染に関連する新生物は、例えばリンパ腫、胃癌、カポジ肉腫、または上咽頭癌である。
【００１５】
１つの側面において、本発明は細菌を死滅させるための方法を特徴とし、これは、該細菌を２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体と接触させることを含む。放射標識は、α、β、またはγ線放射体であることができ、例えば、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１２３Ｉ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、および１３３Ｉである。細菌は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方を含む。
他の側面において、本発明は、対象における細菌感染症を処置するための方法を特徴とする。方法は、対象に対して、２’−デオキシ−５−ヨード−Ｉ−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）の放射標識類似体の有効量を投与することを含む。放射標識は、α、β、またはγ線放射体であることができ、例えば、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１２３Ｉ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、および１３３Ｉである。細菌は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方を含む。
【００１６】
定義
「自然感染する」とは、人の介入の支援なしで起こる感染症を意味する。人の介入の例は、遺伝子療法、細胞形質転換、または細胞トランスフェクションが挙げられる。
「プロテアソーム阻害剤」とは、プロテアソーム活性を低下させる化合物、例えばユビキチン化タンパク質を分解する化合物を意味する。プロテアソーム阻害剤の例としては、ボルテゾミブ、ラクタシスチンおよびＭＧ１３２が挙げられるが、これに限定されない。
【００１７】
「微小管破壊剤」とは、生物学的機能、安定性、または微小管の成長に干渉する剤を意味する。剤の例としては、コルチシン、デメコルシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ポドフィロトキシンおよびノコダゾールが挙げられる。
「グルココルチコイド」とは、副腎により産生される内因性のグルココルチコイドの機能的または構造的類似体である、合成または天然のコルチコステロイド薬物またはホルモンを意味する。グルココルチコイドの例としては、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、βメタゾン、およびデキサメタゾンが挙げられる。
【００１８】
「ステロイドホルモン」とは、四環性シクロペンタフェナントレン骨格を有する、合成または天然の薬物またはホルモンを意味する。
「ヌクレオシド類似体」とは、糖およびプリンまたはピリミジン塩基を有する、合成または天然の化合物を意味する。ヌクレオシド類似体の例としては、２’−フルオロ−２’−デオキシ−β−Ｄ−５−ヨードウラシル−アラビノフラノシド、および種々のデオキシアデノシン類似体（例えばジダノシン、ビダラビン）、デオキシシチジン類似体（例えばシタラビン、エミトリシタビン、ラミブジン、ザルシタビン）、デオキシグアノシン類似体（例えばアバカビル）、デオキシチミジン類似体（例えばスタブジン、ジドブジン、アジドチミジン（ＡＺＴ））、およびデオキシウリジン類似体（例えばイドクスウリジン、トリフルリジン）、レフルノミド、インドプロフェン、メベンダゾールが挙げられる。
【００１９】
「抗炎症剤」とは、炎症またはその症状を抑制する剤を意味する。抗炎症剤の例としては、Ｎ−（３，４−ジメトキシシンナモイル）アントラニル酸（トラニラスト）、Ｎ−（４’−トリフルオロメチルフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボキサミド（レフルノミド）、および非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられるが、これに限定されない。
「改善する」とは、疾患の発症または進行を、減少する、抑制する、弱める、小さくする、止める、または安定化することを意味する。
【００２０】
「類似体」とは、同一ではないが、しかし同様の機能または構造特性を有する分子を意味する。
「改変」とは、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性における変化（増加または減少）であって、本明細書に記載のものなどの当分野に周知の標準の方法により検出されるものを意味する。本明細書において、改変は、発現レベルの１０％の変化、好ましくは２５％の変化、より好ましくは４０％の変化、および最も好ましくは５０％またはこれ以上の発現レベルにおける変化を含む。
【００２１】
用語「新生物」は、過剰な細胞増殖もしくは成長、または細胞死の減少を特徴とする、悪性疾患を含む。特定の態様において、用語「癌」は、癌腫、肉腫、白血病、およびリンパ腫を含むが、これに限定されない。用語「癌」はまた、原発性悪性腫瘍、例えば、対象の身体中の原発腫瘍の部位以外の部位にその細胞が移動していないもの、および、続発性悪性腫瘍、例えば、転移から生じたものであって、原発腫瘍の部位とは異なる二次部位への腫瘍細胞の移動なども含む。
【００２２】
化合物の「治療有効量」または「治療有効用量」の用語は、処置される状態、障害または疾患に関連する、またはこれにより引き起こされる少なくとも１つの症状の、検出可能な改善を提供するのに必要な、または十分な量である。治療有効量は、単一用量として、または時間をかけて複数用量として投与することができる。２種または３種以上の化合物を一緒に用いて、検出可能な改善を提供する「治療有効量」を提供することができ、これは、いずれの化合物１つのみの同量では、治療有効量を提供するのに不十分な場合である。
【００２３】
用語「イメージング化合物」とは、視覚化することができる化合物、または細胞、組織もしくは器官を視覚化するのに有用な化合物を含むことが意図される。例えば、平面ガンマ画像化により、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）またはポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）による。化合物は、放射標識されるか、または蛍光性であってよい。特定の態様において、化合物は、キナーゼ、例えばチミジンキナーゼに結合するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体である。
【００２４】
句「ウイルス溶解誘発剤」は、ウイルスにその遺伝子発現パターンを変化させて、ウイルス粒子の産生に関連するＲＮＡおよびタンパク質の発現を開始させる剤と理解される。ウイルス溶解が誘発されるとは、ウイルスポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えば溶解段階に関連するポリペプチド）の発現の増加、またはウイルス複製の増加を含むが、これに限定されない。ポリペプチド発現のレベルを検定するための方法は、ポリペプチドのレベルを測定するための免疫学的検定法（例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、またはラジオイムノアッセイ）を含むが、これに限定されない。ポリヌクレオチド発現を検定するための方法は当分野に知られており、および／または本明細書に記載されている。かかる方法は、マイクロアレイ解析、ノーザンブロット解析、およびＲＴ−ＰＣＲを含み、核酸分子から調製された任意の適切な断片をハイブリダイゼーションプローブとして用いる。候補化合物の存在下での遺伝子発現レベルを、候補分子不在の対照培養培地中で測定されたレベルと比較する。
【００２５】
句「薬学的に許容し得る担体」は当分野で認識されており、例えば哺乳類などの対象に対して、本明細書に記載の方法で用いる化合物を投与するのに適切な、薬学的に許容し得る材料、組成物またはビヒクルを含む。担体は、対象剤を器官または身体の１部分から、他の器官または身体の部分へと運搬または移送することに関与する、液体または固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料を含む。各担体は、製剤の他の成分と適合的であり、患者に有害ではないとの意味において、「許容し得」なければならない。薬学的に許容し得る担体として作用可能ないくつかの物質の例は、以下を含む：糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；デンプン類、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体類、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばココアバターおよび座剤用ワックス；油類、例えばピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油；グリコール類、例えばプロピレングリコール；ポリオール類、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；エステル類、例えばオレイン酸エチルおよびラウリル酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェン非含有水；等張食塩水；リンガー液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；および医薬製剤に用いられるその他の非毒性適合性物質。
【００２６】
本明細書において、用語「画像化（イメージング）」とは、細胞、組織、または器官に投与後に検出可能な化合物を視覚化する技術の使用を意味する。１つの態様において、画像化は、投与に続いて化合物が局在化した後に、化合物が放射したエネルギーを測定することにより行う。画像技術、例えばポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、ＳＰＥＣＴ−ＣＴなどを適用する。
本明細書において、「ポジトロン放出断層撮影」または「ＰＥＴ」は、全てのポジトロン放出断層撮影システムまたはその均等物およびポジトロン放出断層撮影が可能な全ての装置を含む。本発明の方法は、任意のかかる装置、またはＰＥＴ装置の変形物もしくは均等物を用いて、または任意の既知のＰＥＴ方法論と組み合わせて、実施することができる。例えば、米国特許第6,151,377号、第6,072,177号、第5,900,636号、第5,608,221号、第5,532,489号、第5,272,343号、第5,103,098号を参照のこと；これらの各々は、本明細書に参照として組み込まれる。動物の画像化の種類は、例えばｍｉｃｒｏ−ＰＥＴ（Corcorde Microsystems, Inc.）に含まれている。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１はＡＧＳ細胞でのルシフェラーゼ活性を定量化した４つのグラフである。
【図２】図２は組換えウイルスＥＢＶ誘発に続く、ＡＫＡＴＡ−ＢＸ１細胞におけるＧＦＰシグナルを示す図である。
【図３】図３は５アザデオキシシチジンがＡＫＡＴＡ−ＢＸ１細胞においてＧＦＰシグナルの溶解感染を誘発したことを示すグラフである。
【図４Ａ】図４ＡはＧＦＰ全ウイルスアッセイの代表的な読取りを示す表である。
【図４Ｂ】図４ＢはＧＦＰ全ウイルスアッセイの代表的な読取りを示す表である。
【図５】図５はＥＢＶにおいて溶解感染を誘発することが知られている薬物が、２つのアッセイで確認されたことを示すベン図である。
【図６Ａ】図６Ａは化合物トラニラストがＡＧＳにおいて１５倍までのＢＺＬＦ１プロモーターの誘発が可能であることを示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは化合物レフルノミドがＡＧＳにおいて１５倍までのＢＺＬＦ１プロモーターの誘発が可能であることを示す図である。
【図７Ａ】図７ＡはＡｒａ−ｃの構造式を示す図である。
【図７Ｂ】図７ＢはＡｒａ−ｃがルシフェラーゼアッセイにおいてＢＺＬＦ１プロモーターを誘発したことを示すグラフである。
【図７Ｃ】図７ＣはＡｒａ−ｃがＬＣＬ細胞においてＺＴＡ発現を誘発したことを示すウェスタンブロットである。
【図８】図８はＡｒａ−Ｃでの結果を示す図である。
【図９】図９はインドプロフェンでの結果を示す図である。
【００２８】
【図１０】図１０はボルテゾミブでの結果を示す図である。
【図１１Ａ−１１Ｃ】図１１Ａ−１１Ｃはメベンダゾールでの結果を示す図である。
【図１１Ｄ−１１Ｅ】図１１Ｄ−１１Ｅはメベンダゾールでの結果を示す図である。
【図１２Ａ−１２Ｃ】図１２Ａ−１２ＣはボルテゾミブがＥＢＶ−ＴＫおよびＺｔａ発現を誘発することを示す図である。
【図１２Ｄ】図１２ＤはボルテゾミブがＥＢＶ−ＴＫおよびＺｔａ発現を誘発することを示す図である。
【図１３Ａ】図１３ＡはボルテゾミブがＧＦＰ発現を上方調節したことを示す図である。
【図１３Ｂ−１３Ｄ】図１３Ｂ−１３ＤはボルテゾミブがＧＦＰ発現（１３Ｂ）およびＥＢＶウイルス負荷（１３Ｃ）を上方調節したことを示す図である。
【図１４】図１４はボルテゾミブによる処置後のバーキットリンパ腫異種移植片による［１２５Ｉ］ＦＩＡＵの経時的取り込みを、in vivoでの平面ガンマシンチグラフィーにより評価して示す画像である。
【図１５】図１５は別のＥＢＶ（＋）バーキット異種移植片（Ａｋａｔａ）による［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ取り込みの時間変化を、in vivoで単光子放出コンピュータ断層撮影／コンピュータ断層撮影、ＳＰＥＣＴ／ＣＴ（ＳＰＥＣＴ−ＣＴ）により示す画像である。
【図１６】図１６はin vivoでＳＰＥＣＴ／ＣＴ（ＳＰＥＣＴ−ＣＴ）による骨肉種における［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ取り込みを示す画像である。
【図１７】図１７はマウス異種移植モデルにおける［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ組織分布を示すグラフである。
【図１８Ａ−１８Ｂ】図１８Ａ−１８Ｂは腫瘍増殖曲線を示すグラフである。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは腫瘍増殖曲線を示すグラフである。
【００２９】
【図１９Ａ】図１９Ａはマウス異種移植片における腫瘍増殖曲線を示すグラフである。
【図１９Ｂ−１９Ｃ】図１９Ｂ−１９Ｃはマウス異種移植片における腫瘍増殖曲線を示すグラフである。
【図２０】図２０はボルテゾミブによる処置後の腫瘍の［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ ＳＰＥＣＴ−ＣＴ画像を示す図である。
【図２１】図２１はＫＳＨＶ腫瘍（ＢＣＢＬ１）に対する酵素分子放射線治療を示す図である。
【図２２】図２２は［１３１Ｉ］ＦＩＡＵおよびボルテゾミブによる治療後の、ＫＳＨＶ腫瘍サイズの減少を示すグラフである。
【図２３】図２３は「バイスタンダー効果」を示す模式図である。
【図２４】図２４はモンテカルロ細胞レベル線量計測計算に用いる幾何学モデルの図である。
【図２５】図２５はトランスフェクトされた細胞の１０％（上列）、５０％（中列）、および１００％（下列）に対する、２５０万１３１Ｉ崩壊から生じる、線量体積ヒストグラム（１番目の欄）および空間的吸収線量散布図（２番目の欄）を示すグラフである。
【図２６Ａ】図２６Ａは細菌およびそれらの対応するチミジンキナーゼの配列を示す図である。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは細菌およびそれらの対応するチミジンキナーゼの配列を示す図である。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは細菌およびそれらの対応するチミジンキナーゼの配列を示す図である。
【００３０】
図１は、ＡＧＳ細胞でのルシフェラーゼ活性を定量化した４つのグラフである。ルシフェラーゼはＺｔａプロモーター（−５７８７＋１３）の制御下で発現された。Ｚｔａプロモーターは、ＡＧＳ細胞中でＴＰＡ、酪酸塩、およびバルプロ酸塩により活性化された。これは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤である５’アザデオキシシチジンによっては活性化されなかった。
図２Ａ〜２Ｃは、組換えウイルスＥＢＶ誘発に続く、ＡＫＡＴＡ−ＢＸ１細胞におけるＧＦＰシグナルを示す。図２Ａは、組換えＥＢＶウイルスにおけるＧＦＰシグナルは、抗ＩｇＧによる処置によって誘発されることを示す、４つの顕微鏡写真である。位相差およびＧＦＰ発現を、倒立蛍光顕微鏡を用いて検討した。ＡＫＡＴＡ−ＢＸ１でのＧＦＰシグナルは、抗ＩｇＧにより誘発された場合に非常に明るかった。ＥＢＶ溶解誘発によるＧＦＰシグナルの強調は、マイクロプレートリーダーによって検出した。図２Ｂは、シグナル誘発が、溶解感染を阻害する薬物により抑制されることを示すグラフである。プルバラノールＡはＥＢＶの前初期遺伝子ＺＴＡ発現を阻害した。図２Ｃは、ＧＦＰにより駆動されるＣＭＶプロモーターを有するＨｅｌａ細胞でのＧＦＰシグナルは、ＴＰＡ、抗ＩｇＧ、または５’−アザデオキシシチジンによって活性化されなかったことを示すグラフである。
【００３１】
図３は、５アザデオキシシチジンがＡＫＡＴＡ−ＢＸ１細胞においてＧＦＰシグナルの溶解感染を誘発したことを示すグラフである。
図４は、ＧＦＰ全ウイルスアッセイの代表的な読取りを示す。真中の１０個の欄はライブラリからの８０種の薬物である。右の区画は、背景を低下させるための、細胞または薬物なしのプレーンな培地である。左の区画は、初めの４つのウェルは、陰性対照としての処置なしの細胞であり、下の４つのウェルは、陽性対照としての溶解誘発剤で処置された細胞である。ＧＦＰの読取りは、自動蛍光を有する薬物を消去するために０日目に行った。３日目にすでに、陽性対照ウェルはＧＦＰシグナルの明白な増加を示し、これに匹敵する任意の読取りを、ヒットとする。より長いインキュベーションでは、いくつかのウェルが平均より下の読取りを有することを示した。抑制のヒットは、１０日以後に見られた。
【００３２】
図５は、ＥＢＶにおいて溶解感染を誘発することが知られている薬物が、２つのアッセイで確認されたことを示すベン図である。
図６は、化合物トラニラストおよびレフルノミドは、ＡＧＳにおいて１５倍までのＢＺＬＦ１プロモーターの誘発が可能であることを示す。
図７Ａ〜７Ｃは、シタラビン（Ａｒａ−ｃ）の結果を示す。Ａｒａ−ｃは、in vitroでＢ細胞および上皮細胞において溶解ＥＢＶ感染を誘発した。図７Ａは、Ａｒａ−ｃの構造式を示す。図７Ｂは、Ａｒａ−ｃがルシフェラーゼアッセイにおいてＢＺＬＦ１プロモーターを誘発したことを示すグラフである。図７Ｃは、Ａｒａ−ｃがＬＣＬ細胞においてＺＴＡ発現を誘発したことを示すウェスタンブロットである。
【００３３】
図８Ａ〜８Ｄは、Ａｒａ−Ｃでの結果を示す。Ａｒａ−ｃは、in vitroでＢ細胞および上皮細胞において、溶解ＥＢＶ感染を誘発した。図８Ａは、１μＭのＡｒａ−ｃで４８時間処置し、続いてウェスタンブロットによりＢＺＬＦ１タンパク質をアッセイすることによりＥＢＶＩＥ遺伝子発現についてアッセイした、ＥＢＶ陽性細胞株であるＡＫＡＴＡ、ＬＣＬおよびＳＮＵ７１９における結果を示す、ウェスタンブロットである。免疫ブロット法は、Ａｒａ−ｃがＥＢＶ陽性細胞株において、ＢＺＬＦ１タンパク質発現を誘発したことを示した。図８Ｂは、１μＭのＡｒａ−ｃで４８時間処置したＥＢＶ陽性リンパ芽球様細胞を示す、６枚の顕微鏡写真である。免疫蛍光アッセイを行って、ＢＺＬＦ１タンパク質を検出した。細胞をＢＺＬＦ１（赤）について染色し、核をＤＡＰＩ（青）で染色した。ＬＣＬ細胞の４０％は、１μＭのＡｒａ−ｃにより溶解感染を誘発された。図８Ｃは、Ａｒａ−ｃが、ＥＢＶの初期溶解遺伝子ＴＫ発現を誘発したことを示す、ウェスタンブロットである。図８Ｄは、Ａｒａ−ｃがＥＢＶのウイルス複製を活性化しなかったことを示す、２つのグラフである。ＬＣＬおよびＳＮＵ７１９細胞を、１μＭのＡｒａ−ｃで４８時間処置した。リアルタイムＰＣＲは、ＥＢＶウイルスＤＮＡコピー数は、Ａｒａ−ｃでの処置後に増幅されなかったことを示した。
【００３４】
図９Ａ〜９Ｄは、インドプロフェンでの結果を示す。図９Ａは、インドプロフェンの構造式を示す。図９Ｂは、ＡＧＳでのルシフェラーゼアッセイの結果を定量化するグラフであり、インドプロフェンがＢＺＬＦ１プロモーターを１０μＭにおいて誘発可能であることを示す。図９Ｃは、インドプロフェンがＳＮＵ７１９細胞においてＺＴＡ発現を誘発したことを示す、ウェスタンブロットである。図９Ｄは、インドプロフェンが、ＳＮＵ７１９細胞においてＥＢＶウイルス複製を誘発しなかったことを示すグラフである。
図１０Ａ〜１０Ｃは、ボルテゾミブでの結果を示す。図１０Ａは２つのグラフを示す。図１０Ａ（左の図）は、ＡＧＳ細胞でのルシフェラーゼアッセイ結果の定量化を示し、ボルテゾミブがＢＺＬＦ１プロモーターを１０ｎＭにおいて誘発したことを示す。図１０Ｂ（右の図）は、１０ｎＭにおいて、ボルテゾミブが、ＡＫＡＴＡ−ＢＸ１細胞でＧＦＰアッセイにおいてＧＦＰシグナルを誘発したことを示す。図１０Ｂは、Ｒａｅｌ細胞でのボルテゾミブ誘発性のＺＴＡ発現を示す。図１０Ｃは、Ｒａｅｌ細胞でのボルテゾミブ誘発性のＥＢＶウイルス複製を示す。Ｒａｅｌ細胞は、２０ｎＭのボルテゾミブで８時間処置し、ＤＮＡを４８時間後に収集した。リアルタイムＰＣＲは、ＥＢＶウイルスＤＮＡコピー数が２０倍に増加したことを示した。
【００３５】
図１１Ａ〜１１Ｅは、メベンダゾールでの結果を示す。図１１Ａはメベンダゾールの構造式を示す。図１１Ｂは、ＡＧＳ細胞でのルシフェラーゼアッセイ結果の定量化を示すグラフである。これらの結果は、メベンダゾールがＢＺＬＦ１プロモーターを１μＭにおいて誘発したことを示す。図１１Ｃは、１μＭにおいて、メベンダゾールが、ＡＧＳ−ＢＸ１細胞でＧＦＰアッセイにおいてＧＦＰシグナルを誘発したことを示す。図１１Ｄは、メベンダゾールがＬＣＬ細胞およびＡＫＡＴＡ細胞においてＺＴＡ発現を誘発したことを示す、ウェスタンブロットである。メベンダゾールはまた、ＬＣＬ細胞およびＲａｅｌ細胞においてＥＢＶウイルス複製も誘発した。図１１Ｅは、リアルタイムＰＣＲ結果の定量化を示す。細胞は、１μＭのメベンダゾールで４８時間処置し、ＤＮＡを収集した。リアルタイムＰＣＲは、ＥＢＶウイルスＤＮＡコピー数が２０倍に増幅されたことを示した。
【００３６】
図１２Ａ〜１２Ｄは、ボルテゾミブがＥＢＶ−ＴＫおよびＺｔａ発現を誘発することを示す。図１２Ａおよび１２Ｂは、ＥＢＶ（＋）バーキット細胞株（Ｒａｅｌ）をボルテゾミブで処置後の、ＥＢＶ−ＴＫ（Ａ）およびＺｔａ（Ｂ）発現を示す、免疫ブロットである。全細胞タンパク質を単離し、１レーン当たり１０ｐｇのタンパク質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。図１２Ｃは、Ｚｔａルシフェラーゼ活性が、ボルテゾミブの用量に依存的な様式で増加することを示すグラフである。Ｚｔａプロモーターを発現するＡＧＳ−ＨＣ１３細胞をボルテゾミブで処置し、ルシフェラーゼ活性を測定した（図１２Ｃ）。図１２Ｄは、［１４Ｃ］ＦＩＡＵの蓄積が、ボルテゾミブでの処置後に、ＥＢＶ（＋）バーキット［ＥＢＶ（＋）Ａｋａｔａ、ＥＢＶ（＋）Ｒａｅｌ］で増加したが、ＥＢＶ（−）バーキット［ＥＢＶ（−）Ａｋａｔａ］では増加しなかったことを示す。「ＢＬ」は、バーキットリンパ腫を示す。
【００３７】
図１３Ａ〜１３Ｄは、ボルテゾミブがＧＦＰ発現（１３Ａおよび１３Ｂ）およびＥＢＶウイルス負荷（１３Ｃ）を上方調節したことを示す。図１３Ａは、ＧＦＰを発現するＢＸ−１細胞に対する、ボルテゾミブによる処置の効果を４８時間時点において示すグラフである。図１３Ｂは、Ｒａｅｌ細胞での４８時間におけるＧＦＰ発現を示す顕微鏡写真である。図１３Ｃは、リアルタイムＰＣＲにより測定したウイルス負荷の定量化を示すグラフである。図１３Ｄは、ＩＫＢスーパーリプレッサーＩＫＢ（ｓｒ）を担持する発現ベクターおよび対照ベクターでトランスフェクトしたＥＢＶ（＋）Ｒａｅｌ細胞における、リアルタイムＰＣＲにより測定した、ウイルス負荷の定量化を示すグラフである。
図１４Ａおよび１４Ｂは、ボルテゾミブによる処置後のバーキットリンパ腫異種移植片による［１２５Ｉ］ＦＩＡＵの経時的取り込みを、in vivoでの平面ガンマシンチグラフィーにより評価して示した画像である。大きな矢印は腫瘍を示す。暗い領域（図１４Ａ、小さな矢印）は、画像の動的範囲を改善するための、膀胱の鉛シールドを示す。各動物は、後肢に１つの腫瘍を有する。図１４Ａにおいて、ＰＢＳのみで前処置された動物（対照）において、腫瘍での取り込みはなかった。図１４Ｂにおいて、腫瘍は前処置された動物（２μｇ／ｇボルテゾミブ）において遅い時点で視覚化された。画像は、ex vivo生体内分布のために犠牲にされた代表的な動物からのものであり、データは定量的に表１に示す。
【００３８】
図１５Ａおよび１５Ｂは、別のＥＢＶ（＋）バーキット異種移植片（Ａｋａｔａ）による［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ取り込みの時間変化を、in vivoで単光子放出コンピュータ断層撮影／コンピュータ断層撮影、ＳＰＥＣＴ／ＣＴ（ＳＰＥＣＴ−ＣＴ）により示す。矢印は、腫瘍（直径−１ｃｍ）を示す。各動物は、脇腹に１つの腫瘍を有する。図１５Ａは、放射性医薬品注射７２時間後の［１２５Ｉ］ＦＩＡＵの腫瘍での取り込みを示す。図１５Ｂは、９６時間での、腫瘍における［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ取り込みを示す。放射性医薬品投与の２４時間前に、動物はボルテゾミブ（２μｇ／ｇ、ｉｘ．）で処置した。腫瘍組織は青色で、骨（ＣＴから）は赤色で示す。
【００３９】
図１６Ａ〜１６Ｄは、in vivoでＳＰＥＣＴ／ＣＴ（ＳＰＥＣＴ−ＣＴ）による骨肉種における［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ取り込みを示す画像である。図１６Ａおよび１６Ｂは、ＥＢＶ−ＴＫ（ＴＫ１４３ｂ）を構造的に発現するよう操作された骨肉種１４３ｂを示す。図１６Ｃおよび１６Ｄは、空ベクター(empty vector)（Ｖ１４３ｂ）で偽(sham)操作された骨肉種１４３ｂ腫瘍を示す。大きな矢印で示すように、各動物に２つの腫瘍が存在する。暗い領域（図１６Ａ、小さな矢印）は、画像の動的範囲を改善するための、膀胱の鉛シールドを示す。図１６Ｃおよび１６Ｄに示す動物は、ボルテゾミブ（２μｇ／ｇ）で前処置し、剤が、ＦＩＡＵリン酸化を説明する可能性のある、細胞キナーゼの上方調節を導くかどうかを決定した。
【００４０】
図１７は、マウス異種移植モデルにおける［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ組織分布を示すグラフである。［１２５μＣｉ］ＦＩＡＵを、ＥＢＶ−ＴＫ（＋）腫瘍を移植したＳＣＩＤマウスに静脈内投与した。動物（各時点で３〜４匹）を犠牲にし、組織分布を測定した。１ｇの組織当たりの注射用量（ＩＤ）のパーセントを示す。
図１８Ａ〜１８Ｃは、腫瘍増殖曲線を示すグラフである。図１８Ａは、対照腫瘍（空ベクターのヒト骨肉種１４３Ｂ細胞）またはＴＫ発現腫瘍（ＥＢＶ ＴＫを発現するヒト骨肉種１４３Ｂ細胞）を有する、１．６ｍＣｉの［１３１Ｉ］ＦＩＡＵまたは緩衝食塩水でＩＶ処置した、腫瘍増殖マウスを示す。図１８Ｂは、腫瘍増殖の用量応答を示す。ＥＢＶ−ＴＫ発現腫瘍を有するマウスを、緩衝食塩水、１ｍＣｉの［１３１Ｉ］ＦＩＡＵまたは３ｍＣｉの［１３１Ｉ］ＦＩＡＵで処置した。図１８Ｃは、１．７ｍＣｉの［１３１Ｉ］ＦＩＡＵで処置した、ＥＢＶ−ＴＫ発現および対照の腫瘍細胞の混合を移植したものから生じる腫瘍における腫瘍増殖を示す。各時点は、３匹の動物に対応する。平均、ＳＥＭおよび最小２乗直線回帰をプロットした。腫瘍増殖曲線の最適直線回帰の傾きの信頼区間（ＣＩ、９５％）は、凡例の括弧内に示す。
【００４１】
図１９Ａ〜１９Ｃは、マウス異種移植片における腫瘍増殖曲線を示す。図１９Ａは、ＥＢＶ（＋）バーキットリンパ腫（Ｒａｅｌ）を示す。図１９Ｂは、ＥＢＶ（＋）胃腺癌（ＫＴ）を示す。図１９Ｃは、ＫＳＨＶ（＋）原発性浸出リンパ腫（ＢＣＢＬ１）に対して、静脈内に緩衝食塩水を注入し、その２４時間後に［１３１Ｉ］ＦＩＡＵ、ボルテゾミブ；またはボルテゾミブの２４時間後に、［１３１Ｉ］ＦＩＡＵを注入したものを示す。各時点は、３匹の動物に対応する。平均、ＳＥＭおよび最小２乗直線回帰をプロットした。腫瘍増殖曲線の最適直線回帰の傾きの信頼区間（ＣＩ、９５％）は、凡例の括弧内に示す。
【００４２】
図２０Ａおよび２０Ｂは、ボルテゾミブによる処置後の腫瘍の［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ ＳＰＥＣＴ−ＣＴ画像を示す。図２０Ａは、ｐ．ｉ．７２時間におけるＥＢＶ（＋）胃癌（ＫＴ）腫瘍を示す。図２０Ｂは、ｐ．ｉ．４８時間におけるＫＳＨＶ（＋）リンパ腫（ＢＣＢＬ１）を示す。黄色の矢印は腫瘍位置を示す。色付きバーは、［１２５Ｉ］ＦＩＡＵの取り込みの範囲を％ＩＤ／ｇとして示す（（ａ）において０．６８％および（ｂ）において１．５３％）。
図２１はＫＳＨＶ腫瘍（ＢＣＢＬ１）に対する酵素分子放射線治療を示す。
図２２は、［１３１Ｉ］ＦＩＡＵおよびボルテゾミブによる治療後の、ＫＳＨＶ腫瘍サイズの減少を示すグラフである。
【００４３】
図２３は、「バイスタンダー効果」を示す模式図である。
図２４は、モンテカルロ細胞レベル線量計測計算に用いる幾何学モデルの図である。細胞クラスターの中心を通る断面についての細胞レベル活性分布を、活性取り込み細胞の１０、５０、および１００％について示す。全取り込みに対する活性分布の効果を検討するために、腫瘍における全活性は一定に維持する。したがって、カラースケールに示すように、１０％のシナリオの細胞は、１細胞あたり、１００％モデル（赤の強度対灰色）における細胞より多くの活性を有する；活性は、各細胞内に均一に分布している。
【００４４】
図２５は、トランスフェクトされた細胞の１０％（上列）、５０％（中列）、および１００％（下列）に対する、２５０万１３１Ｉ崩壊から生じる、線量体積ヒストグラム（１番目の欄）および空間的吸収線量散布図（２番目の欄）を示す。線量体積ヒストグラム（１番目の欄）は、特定の吸収線量（ｘ軸）を受け取った細胞数（ｙ軸）を示す；縦の点線は分布の平均値に対応し、これは図の上にも記されている。散布図（２番目の欄）の各点は、その位置の個別の細胞が受け取った吸収線量に対応する；点線は、球状腫瘍表面の位置に対応する。
図２６は、細菌およびそれらの対応するチミジンキナーゼの配列を示し、これは本発明の方法に有用である。
【００４５】
発明の詳細な説明
本発明は、腫瘍の画像化、感染症に関連する新生物の処置または予防（例えば、ウイルスまたは細菌感染症）、新生物を有する対象への効果的な治療法の選択、および治療有効性のモニタリングに有用な、組成物および方法を特徴とする。他の態様において、本発明は、細菌感染症の処置に有用である（例えば、細菌チミジンキナーゼを含む細菌の処置）。特定の態様において、本発明は、放射線療法を腫瘍組織に標的化するために、ウイルス遺伝子発現を調節する剤を提供する。本発明は、少なくとも部分的に多くの発見に基づいており、これらは以下にさらに詳細に報告される。これらの発見は、溶解相誘発化合物の同定、およびそれらの、腫瘍の画像化のための使用、潜伏性ウイルス感染症に関連する疾患を患い、かつ溶解療法を用いる処置に影響を受けやすい対象の同定、およびかかる患者における治療有効性のモニタリング、およびウイルスポリペプチドを発現する腫瘍を放射医学で処置可能であるとの発見を含む。
【００４６】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、種々の悪性疾患に関連する。ＥＢＶチミジンキナーゼ（ＴＫ）は、ＥＢＶ関連腫瘍において全く発現されないか、または非常に低レベルで発現される。本明細書に報告されているように、ＥＢＶ−ＴＫ発現はin vitroで、ウイルス溶解誘発を促進する数種類の剤によって誘発することができる。［２〜１４Ｃ］２’−フルオロ−２’−デオキシ−β−Ｄ−５−ヨードウラシル−アラビノフラノシド（［１４Ｃ］ＦＩＡＵ）を用いたin vitroアッセイ、および［１２５Ｉ］ＦＩＡＵを用いたex vivoの生体内分布研究は、放射標識ＦＩＡＵの取り込みおよび維持が、ＥＢＶ−ＴＫを発現する細胞に特異的であることを示した。ＳＣＩＤマウスにおけるＥＢＶ（＋）バーキットリンパ腫異種移植片の平面ガンマ画像化により、１つのかかる誘発剤であるボルテゾミブによる処置後の、腫瘍内での［１２５Ｉ］ＦＩＡＵの局在化が実証された。これらの結果は、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）およびポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）などの放射性医薬品に基づく技術による、化学療法媒介性のウイルス溶解誘発の画像化の可能性を示唆する。
【００４７】
さらに、本明細書に報告されているように、マウス異種移植モデルを用いて、［１２５Ｉ］２’−フルオロ−２’−デオキシ−β−Ｄ−５−ヨードウラシル−アラビノフラノシド（［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ）は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）−チミジンキナーゼ（ＴＫ）を発現する腫瘍を標的化できることが見出された。このウイルスポリペプチドを発現する腫瘍は、治療放射性医薬品（例えば［１３１Ｉ］ＦＩＡＵ）に標的とされて、腫瘍増殖の緩和もしくは停止、または腫瘍の退縮が実現される。これらの結果は、ＥＢＶ−ＴＫを構成的に発現する腫瘍、および自然感染したＥＢＶ腫瘍細胞株での異種移植片において達成された。バーキットリンパ腫および胃癌は、ボルテゾミブによる前処置によるウイルス遺伝子発現の活性化が必要であった。腫瘍増殖における明白な変化はまた、自然感染カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）腫瘍においても、ボルテゾミブ活性化後に実現された。ボルテゾミブ誘発性の酵素標的化放射線（ＢＥＴＲ）療法は、腫瘍遺伝子発現を薬理学的に調節することにより、標的化された放射線療法の有効化が可能であることを示す。具体的な例では、トラニラスト、レフルノミド、インドプロフェン、シタラビン、メベンダゾール、およびボルテゾミブはＥＢＶ溶解誘発剤として作用し、ＥＢＶ関連腫瘍の処置に有用であることが示されたが、本発明はこれらに限定されない。本発明の方法は、任意のウイルス溶解誘発剤を用いて実践してよい。当業者は、ＥＢＶ関連腫瘍で得られた結果は一般に、ウイルス感染症に関連する実質的に全ての新生物に適用可能であることを理解する。さらに、例においてはＦＩＡＵおよびウイルス（ＥＢＶ／ＫＳＨＶ）チミジンキナーゼを用いて実現された結果を記載するが、かかる結果は他のウイルスおよびウイルスキナーゼにも外挿することができる。
【００４８】
ウイルス関連新生物
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、種々のリンパ腫および癌腫に関連する。カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ、ＨＨＶ−８）は、肉腫およびリンパ腫と関連する。これらの腫瘍を有する患者においては、ウイルスゲノムがほぼ腫瘍特異的標的として作用するが、ただしこれは、これらのウイルスがリンパ球の小さい部分のみに感染し、また患者においてほぼ全ての感染細胞が腫瘍細胞である限りにおいてである。したがって、ウイルス関連代謝経路が、ほぼ腫瘍特異的代謝経路となる。放射性同位体をヘルペスウイルス代謝経路に標的化させる能力は、研究者らにより、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を用いて操作したベクターを用いて、放射標識ヌクレオシド類似体を用いた遺伝子療法セッティングにおける遺伝子発現をモニタリングすることにより実証された。細胞およびウイルス代謝経路を標的とする新しい治療法を開発する能力は、腫瘍細胞において、ＴＫおよび、ＥＢＶゲノムによりコードされる他の多くの酵素の発現が実質的に存在しないことにより、制限されてきた。
【００４９】
放射性医薬品を特定組織に標的化することは、悪性疾患の治療に対して重要なツールを提供する。標的指向性組織特異的表面抗原、例えばＢ細胞上のＣＤ２０とモノクローナル抗体放射複合体によるものは、治療用放射線を、外部ビームまたは他の空間的に有向性のアプローチによって達成できるものを超えて、その応用を拡大した。これらのアプローチは、発現のレベルまたは標的分子に対する抗体の親和性、または抗体の薬物動態により制限され得る。Ｂ細胞系統のリンパ腫の間でさえも、ＣＤ２０発現は、抗体標的化療法には多くの場合不適切である。他の例において、抗体複合体の物理的特性が、大きな腫瘍内または中枢神経系などの保護された区画内の細胞への送達を妨害する。標的指向性の代謝経路、例えば甲状腺組織での同位体ヨウ素によるヨウ素の濃縮に関与するものなどは、よく確立された代替的アプローチであり、これのさらに一般的な適用は、適切な腫瘍特異的経路を同定する能力によって制限されてきた。
【００５０】
本明細書において報告されているように、ＥＢＶを含む自然発生の腫瘍細胞は、ウイルスＴＫの薬理学的誘導物質を利用すれば、放射標識ヌクレオシド類似体を用いて画像化することができた（Fu, D.X., et al. Virus-associated tumor imaging by induction of viral gene expression. Clin Cancer Res 13, 1453-1458 (2007)）。この所見は、in vivoでＥＢＶおよびＫＳＨＶ異種移植モデルにおけるウイルス含有腫瘍細胞を用いて実証されたように、ウイルスを含む新生物を処置するための新規な組成物および方法を提供することに拡張された。方法は、ウイルスを含む新生細胞を、放射線治療ヌクレオシド類似体を有する誘発剤で標的とすることを含む。
【００５１】
本発明の組成物および方法で用いるための放射性核種の物理的および化学的特性は、放射線治療の選択に重要であり、例えば微粒子放射の種類を考慮すべきである。α粒子は、細胞を死滅させるのに有効な高い線エネルギー付与（ＬＦＴ）および、数個の細胞の直径である４０〜８０μｍの範囲を有する。β粒子はより密度が低いイオン化状態であり、α粒子放射よりも長い範囲を有し、そのため腫瘍分布の要求の制限は小さい。γ線エネルギーおよび同位体存在比もまた重要な物理特性であり、その理由は、γ線の存在は外部画像化の可能性を提供するが、しかし全身の放射線量を追加するからである。
【００５２】
本発明の方法の新生物の処置への応用は、ＥＢＶおよびＨＳＶ関連新生物の処置に限定されず、しかし、新生物に関連する実質的に全てのウイルス感染での使用に適応可能である。例えば、ヒトパピローマウイルス感染症は子宮頸癌の発症に関連する；ＪＣウイルスは大腸癌の発症に関連する；ＢおよびＣ型肝炎ウイルスは、肝癌に関連する；およびヒトＴリンパ増殖性ウイルスは、Ｔ細胞白血病の発症に関連する。
【００５３】
処置方法の選択
対象がウイルス感染症に関連する新生物を有すると診断されると、処置の方法が選択される。ウイルス感染症に関連する新生物を有する患者であって、溶解相に入るよう誘発可能であるものは、本発明の方法による処置が適用可能であると同定される。かかる対象は、その身体を走査して、該対象内の新生物（例えば腫瘍）におけるウイルス溶解の有無を同定することにより、同定できる。視覚化できる腫瘍、すなわち、ウイルス溶解が誘発された腫瘍を有する対象は、本発明の方法による処置を適用可能であると同定される。視覚化できない腫瘍、すなわち、ウイルス溶解が誘発されていない腫瘍を有する対象は、本発明の方法による処置に抵抗性であると同定される。
【００５４】
患者のモニタリング
本発明の診断方法はまた、患者における新生物の経過をモニタリングするために、または、治療計画の有効性を評価するためにも有用である。１つの態様において、本発明の診断方法は、ウイルス関連腫瘍のサイズを定期的にモニタリングするために用いる。１つの例において、新生物は、本発明の診断アッセイを用いて、治療を行う前に特徴付けられる。このアッセイは、腫瘍のサイズを記載する、または腫瘍の、ウイルス溶解誘発剤による処置に対する感受性を記載するベースラインを提供する。治療の経過の間に追加の診断アッセイを行って、選択された治療計画の有効性をモニタリングする。治療は、本発明の診断アッセイが、腫瘍の細胞においてウイルス溶解誘発の増加を検出した場合に、または腫瘍サイズの減少を検出した場合に、有効であると同定される。
【００５５】
本発明の溶解誘発化合物
ウイルス遺伝子は、種々の遺伝子療法モデルにおいてレポーターとして作用するように操作されてきた。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）は特に、広く用いられている。ＨＳＶ−ＴＫの相同体を、次のウイルスによりコードする：エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、および、流行性バーキットリンパ腫、移植後リンパ腫、ＡＩＤＳリンパ腫、ホジキンリンパ腫、上咽頭癌および胃癌を含む種々の腫瘍に関連するヘルペスウイルス。ＥＢＶ−ＴＫは、ヌクレオシド類似体、２’−フルオロ−２’−デオキシ−β−Ｄ−５−ヨードウラシル−アラビノフラノシド（ＦＩＡＵ）を選択的にリン酸化する。しかし、ＥＢＶ関連腫瘍のＦＩＡＵの放射標識類似体による直接的平面ガンマ画像化またはＰＥＴ画像化は、酵素が発現されないか、または潜伏性ウイルス感染のために非常に低レベルでのみ発現されるため、可能ではない。
【００５６】
溶解誘発は、細胞アポトーシスおよびウイルス産生をもたらす。意図的な溶解誘発は、ＥＢＶ関連腫瘍の可能性のある治療法として提唱された。理論的には、この戦略はいくつかのレベルで作用可能である：ＥＢＶの溶解感染は、宿主細胞を直接死滅させることができ、発現された溶解遺伝子は、ガンシクロビルをその細胞障害性形態に変え、宿主細胞を死滅させ、溶解抗原はＣＴＬにより認識可能であり、これは宿主細胞の身体からの除去を支援する。
【００５７】
ＥＢＶ溶解誘発療法を、ＥＢＶ関連腫瘍の特異的治療法とするとのアイディアは、これ以上実践されておらず、その理由は、これらのＥＢＶ溶解サイクルを誘発すると報告された薬物が細胞障害性であり、治療効果を有するのに十分な数の細胞中においてＥＢＶ溶解サイクルを誘発するのに十分な用量で投与できないからである。従来の細胞障害性療法を用いて内因性ＥＢＶゲノムを再活性化することは、特異的治療法の元の目的を失わせ、正常細胞を痛めることなく、ウイルス／宿主腫瘍細胞を死滅させるという利点を失わせる。
【００５８】
本発明は、ウイルス溶解誘発を引き起こす組成物および方法を提供する。上皮細胞のＥＢＶによる感染は、ウイルスの複製および感染細胞の溶解を伴う増殖性の感染を生じさせる。前初期遺伝子は、ＢＺＬＦ１およびＢＲＬＦ１タンパク質を含む、ウイルス遺伝子発現の制御因子をコードし、これらは溶解感染を開始させるスイッチとして作用する。ＢＺＬＦ１タンパク質は、インターフェロン−γ受容体の発現およびインターフェロン−γの活性を阻害する。初期遺伝子は、例えばウイルスＤＮＡポリメラーゼおよびチミジンキナーゼなどの、ウイルスＤＮＡ合成に関与するタンパク質をコードする。後期遺伝子は、ウイルスカプシド抗原および主要エンベロープ糖タンパク質ｇｐ３５０などを含む、ウイルスの構造タンパク質をコードする。初期の感染ステージの後に、ＥＢＶウイルスおよびヘルペスウイルス、および他のウイルスは、潜伏ステージに入り、ここで活性なウイルス増殖は終わるが、ウイルスは存在し続ける。一定の条件のもとでウイルスは潜伏相を出て、溶解相に再度入る。
【００５９】
本発明は、ウイルスの溶解ステージへの導入を誘発する剤を提供する。かかる剤を、「ウイルス溶解誘発剤」と呼ぶ。好ましくは、かかる剤は、宿主または正常組織に対して有害な細胞障害性効果を有することなく、ウイルス溶解を誘発するのに有効である。ウイルス溶解誘発剤は、プロテアソーム阻害剤、抗チューブリン薬物、グルココルチコイドおよびステロイドホルモン、ヌクレオシド類似体、および抗炎症剤を含む。かかる剤は、潜伏性ウイルス感染症に関連する新生物を有する対象に投与して、ウイルスを溶解相に導入することができる。
【００６０】
ウイルスイメージング剤
ウイルス溶解ステージの誘発は、ウイルスポリペプチド産生をもたらす。かかるポリペプチドは、ウイルス関連新生物の診断および／またはモニタリングのための特異的マーカーとして機能する。特定の態様において、本発明は、ウイルス酵素の基質を提供する。基質は画像化に対して感受性が高いため、またはその画像化を可能とする部分を含むため、例えばＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ−ＣＤなどの従来の画像化法によって視覚化することができる。ウイルス酵素は腫瘍細胞で基質を濃縮し、これによって腫瘍細胞の視覚化を可能とする。
【００６１】
in vivoで腫瘍の代謝を画像化する能力は広い用途を有し、例としては、［１８Ｆ］フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ−ＰＥＴ）を用いるポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）の臨床的使用の増加などがある。当然ながら、腫瘍組織に対するかかる走査の特異性は、多くの組織および悪性組織がグルコースを迅速に代謝する限りにおいて制限される。したがって、脳、心筋、および炎症病巣はすべて、ＦＤＧ−ＰＥＴ画像化によりシグナルを生成する。化合物の「画像化に対する有効量」の言葉は、新生物の有無を視覚化するのに十分なシグナルを提供するのに必要な、または十分な量である。新生物は、当分野に知られた、また本明細書に記載された、任意の方法を用いて画像化でき、例えば平面ガンマ画像化、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）およびポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）などである。有効量は、対象のサイズおよび重量、病気の種類、または特定の化合物などの要因によって変化し得る。例えば、化合物の選択は、何が「画像化に対する有効量」を構成するかに影響し得る。当業者は、本明細書に挙げられた要因を検討して、必要以上の実験なしに化合物の有効量を決定することができる。画像化は、例えばチミジンキナーゼに結合したイメージング剤の、存在および／または位置の検出を可能とする。存在は、検出限界より下、または不在を含み、位置は「なし」を含み得る。
【００６２】
特に、本発明は剤を提供し、該剤とは、生物においてウイルスポリペプチド（例えばウイルスチミジンキナーゼポリペプチドに結合する、チミジンキナーゼ結合化合物）に特異的に結合し、対象の画像を得るために用いることができる検出可能なシグナルを生成して、対象におけるチミジンキナーゼ、好ましくはウイルスチミジンキナーゼの存在および位置を決定する前記剤を含む。チミジンキナーゼは本発明の方法に特に好適である。ウイルスチミジンキナーゼは、哺乳類のチミジンキナーゼのキナーゼ触媒ドメインには存在しない共通塩基配列を、そのキナーゼ触媒ドメインに有する。したがって、ウイルスチミジンキナーゼに対して高い親和性を有する化合物は、哺乳類チミジンキナーゼに対して大幅に低下した親和性を示す。
【００６３】
本発明は、容易に合成され、かつＰＥＴまたはＳＰＥＣＴなどの画像化装置により検出可能な、チミジンキナーゼ結合化合物を利用する。１つの態様において、化合物はキナーゼに結合するヌクレオシド類似体である。特定の態様において、キナーゼはチミジンキナーゼである。本発明の方法において用いるためのチミジンキナーゼ結合化合物は、例えばWO2006/002142に提供されており、これは本明細書に参照として組み込まれる。
【００６４】
画像化
一般に、画像技術は、対象に対して、対象の外側で検出可能な化合物を投与することを含む。画像は、対象の種々の部位に蓄積するイメージング剤の空間的分布における差によって生成される。本発明の方法では、画像技術は、例えばウイルスチミジンキナーゼなどの、対象において選択的に結合される化合物に依存する。対象において蓄積したイメージング剤の空間的分布、例えば腫瘍容積を、任意の好適な手段によって、例えば平面ガンマ画像化、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）およびポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）によって測定することができる。代替的に、蛍光を検出する画像技術を本発明の方法で用いてもよい。
【００６５】
本発明の方法で用いることができる例示の化合物は、２’−フルオロ−２’デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨード−ウラシル（［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ）、２’−フルオロ−２’デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨード−ウラシル（［１２４Ｉ］ＦＩＡＵ）、９−（４−１８Ｆ−フルオロ−３−［ヒドロキシメチル］ブチル）グアニン（［１８Ｆ］−ＦＨＢＧ）、（１８）Ｆ−１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−ｄ−アラビノフラノシル）チミン（［１８Ｆ］−ＦＭＡＵ）、１８Ｆ−２’−フルオロ−２’デオキシ−１β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−エチル−ウラシル（［１２５Ｆ］ＦＥＡＵ）、および１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−［１８Ｆ］ヨードウラシル（［１８Ｆ］−ＦＩＡＵ）を含む。
【００６６】
本発明の方法において用いてよい例示の蛍光化合物は、Golankiewicz et al. ((2001) J. Med. Chem. 44:4284-7)およびGoslinski et al. ((2002) J. Med. Chem. 45:5052-7)に記載されている。Goslinski et al.に記載されている蛍光三環系アシクロビルおよびガンシクロビル類似体、特にＧＣＶ３は、クレームされている方法において、チミジンキナーゼ結合化合物として用いるために意図される。「チミジンキナーゼ結合化合物」の句は、チミジンキナーゼに対して、これらがイメージング剤、および／または治療剤としてとして用いることができる程度に十分な親和性を有する化合物として理解される。１つの態様において、チミジンキナーゼ結合化合物は、ウイルス性チミジンキナーゼ結合化合物である。ウイルス性チミジンキナーゼ結合化合物は、哺乳類のチミジンキナーゼに比べて、ウイルス性チミジンキナーゼに対して少なくとも１０倍、好ましくは１００倍、好ましくは１０００倍高い親和性を有する。ウイルス性チミジンキナーゼ結合化合物は、例えば、ＦＩＡＵ、ＦＨＢＧ、ＦＭＡＵ、ＦＥＡＵ、三環系アシクロビルおよびガンシクロビル類似体、例えばＧＣＶ３を含む。チミジンキナーゼ結合化合物は、官能基を含むように改変でき、これらのイメージング剤および／または治療剤としての使用を促進する。
【００６７】
特定の態様において、本発明は、例えば１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）などのヌクレオシド類似体を提供し、これらは、例えば米国特許第4,211,773号に、抗ウイルス剤および抗腫瘍剤として記載されている。基質が画像化のためであるか治療のためであるかは、用いる放射性核種に依存するのみであり、例えば、ヨウ素１２３、１２４、または１２５は画像化用であり、それに対して、ヨウ素１３１、またはアスタチン２１１は治療用である。ヌクレオシド類似体は放射性同位体で標識され、例えばヨウ素、フッ素、イットリウム、ビスマス、またはアスタチンの放射性同位体である。他の態様において、ヌクレオシド類似体は蛍光性であってもよい。本発明の好ましい放射標識化合物は、容易に合成され、in vivoでの異化に制限される、ヌクレオシド類似体である。米国特許第5,879,661号および第6,331,287号に記載された化合物などは、本発明の方法で用いることができる。
【００６８】
ＰＥＴにおいて最も一般に用いられるポジトロン放出核種には、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、および１８Ｆが挙げられる。電子捕捉および／またはガンマ放射により崩壊する同位体はＳＰＥＣＴで用いられ、例えば１２３Ｉおよび１２４Ｉを含む。
本発明の方法はＰＥＴを含む。特に、画像化は、検出システムを用いて、患者の全体または患者の特定領域をスキャンし、例えば放射性同位体シグナルなどのシグナルを検出する。検出したシグナルを次に、画像に変換する。得られた画像は、例えば内科医などの熟練した観察者により読み取られる。前述のプロセスを、本明細書において患者を「画像化する」と呼ぶ。一般に画像化は、本発明の方法で用いる化合物の投与後の約１分〜約４８時間の間に行われる。正確な画像化のタイミングは、投与された化合物のクリアランス速度などの要因に依存し、これは当業者には容易に明らかである。
【００６９】
画像が得られると、当業者は化合物の位置を決定することができる。この情報を用いて、当業者は例えば、腫瘍が存在するか、ウイルスが溶解相に入っているか、腫瘍の程度、または対象が受けている処置の有効性などを決定することができる。異なる時点で得た画像、例えば１２、２４、３６、４８時間またはそれ以上の間隔で得た画像は、処置の有効性、例えば溶解療法および／または化学療法の処置の有効性を決定するのに、特に有用である。
現在用いられている方法と違って、本明細書に記載の画像法は、臨床医に潜伏性ウイルスおよび溶解ウイルス感染時の腫瘍間の同定を可能とする。
【００７０】
スクリーニングアッセイ
本発明は、ウイルス溶解誘発のため、新生物の画像化のために有用な剤、または新生物の処置用の剤（例えば、放射性医薬品として）として有用な剤を同定するための方法を提供する。本明細書に記載の例は、特にＦＩＡＵをウイルスチミジンキナーゼの基質として用いることについて記載しているが、当業者は、本発明の方法はこれに限定されないことを理解する。ウイルスポリペプチドの基質として作用し、画像技術においてその視覚化を提供する部分を含むように改変でき、または細胞死の誘発を、例えば放射線の致死的線量を新生細胞に放出することにより提供する、実質的に任意の剤を、本発明の方法において用いることができる。
【００７１】
本発明の方法は、イメージング剤として有用な、ウイルス誘発剤として有用な、または放射性医薬品として有用な候補剤の、高スループット低コストスクリーニングに有用である。in vitroまたはin vivoアッセイにおいて単離され、活性について試験される剤は、本発明の方法に有用である。当業者は、候補剤の細胞に対する効果を、候補剤と接触していない対応する対照細胞と一般的に比較することを理解する。したがって、１つの態様において、スクリーニング法は、候補剤と接触した、潜伏性ウイルス感染症を有する細胞における溶解誘発を、未処置の対照細胞において観察される誘発と比較することを含む。
【００７２】
他の態様において、候補剤で処置した細胞中のウイルスポリペプチドの発現または活性を、未処置の対照試料と比較して、ウイルスポリペプチドの発現または活性を増加させるか、または接触細胞でのウイルス複製を増加させる候補化合物を同定する。ポリペプチド発現または活性は、当分野によく知られた方法により比較でき、例えば、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリ、免疫細胞化学法、磁気および／またはＣＤ１３７特異的抗体被覆ビーズへの結合、in situハイブリダイゼーション、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ解析、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット法、または比色アッセイ、例えばBradford AssayおよびLowry Assayなどである。
【００７３】
１つの実用例においては、１または２以上の候補剤を異なる濃度で潜伏性ウイルス誘発を有する細胞を含む培養培地に加える。ウイルスポリペプチドまたはレポーター遺伝子の発現を、細胞中で発現されるウイルスプロモーターの制御下で促進する剤は、本発明において有用であると考えられる；かかる剤は、例えば、ウイルス感染関連の新生物性疾患を、予防、遅延、改善、安定化または処置する治療薬として用いることができる。一旦同定されると、本発明の剤（例えばウイルスポリペプチドに特異的に結合する、および／またはウイルス溶解誘発を刺激する剤）は、対象における腫瘍の画像化または処置に用いることができる。
【００７４】
代替的に、または追加して、候補化合物は、ウイルスポリペプチドに特異的に結合して活性化させるものを最初にアッセイして、次に、それらのウイルス溶解誘発への効果を本明細書に記載のようにして試験することにより、同定してもよい。１つの態様において、候補剤の有効性は、チミジンキナーゼポリペプチドと相互作用する、またはその基質として作用する、その能力に依存する。かかる相互作用は、任意数の標準結合技術および機能性アッセイを用いて（例えば、上記Ausubel et al.に記載のもの）容易に分析することができる。例えば、候補化合物は、in vitroで本発明のポリペプチドとの相互作用および結合について、およびその潜伏性ウイルス感染を調節する能力について試験することができる。
【００７５】
１つの特定の例において、ウイルスポリペプチドに結合する候補化合物は、クロマトグラフィに基づく技術を用いて同定することができる。例えば、組換えウイルスポリペプチドは、ポリペプチドを発現するよう操作された細胞から標準技術により精製でき、または化学的に合成でき、一旦精製すると、ペプチドをカラム上に不動化する。次に候補剤の溶液をカラムに通し、ウイルスポリペプチドに特異的に結合する剤またはその断片を、ウイルスポリペプチドに結合してカラム上で不動化されるその能力に基づいて、同定する。剤の単離には、カラムを洗浄して非特異的に結合した分子を除去し、目的の剤を次にカラムから放出して収集する。この方法（または任意の他の適切な方法）で単離された剤は、必要に応じてさらに精製してもよい（例えば、高性能液体クロマトグラフィにより）。さらに、候補剤はウイルス誘発剤としてまたはウイルスポリペプチド用の基質として（例えば、本明細書に記載のように）作用するその能力について、試験することができる。このアプローチで単離された剤もまた、例えば、ウイルス関連新生物を処置またはその発症を予防する治療薬として用いることができる。親和性定数が１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１ｍＭまたは１０ｍＭ以下でウイルスポリペプチド結合するとして同定された化合物は、本発明に特に有用であると考えられる。
【００７６】
かかる剤は、例えば、新生物と戦う治療薬として用いることができる。任意に、上述の任意のアッセイにおいて同定された剤は、任意の標準動物モデル（例えばげっ歯類異種移植）において有効であると確認することができ、成功すれば、抗新生物治療薬として用いてよい。
【００７７】
試験化合物および抽出物
一般に、ウイルス溶解誘発剤として作用する剤、ウイルスポリペプチドに対する基質として作用する剤、またはウイルスポリペプチドに特異的に結合する剤は、天然産物または合成（もしくは半合成）抽出物の大きなライブラリ、または化学ライブラリから、またはポリペプチドもしくは核酸ライブラリから、当分野に知られた方法によって同定される。薬物の発見および開発分野の当業者は、試験抽出物または化合物の正確な給源は本発明のスクリーニング方法（単数または複数）に重要ではないことを理解する。スクリーンに用いる剤は、病原体感染の処置のための治療薬として知られているものを含んでよい。代替的に、実質的に任意の数の未知の化学抽出物または化合物を、本明細書に記載の方法を用いてスクリーニングすることができる。かかる抽出物または化合物の例としては、植物、真菌、原核生物または動物ベースの抽出物、発酵ブロス、および合成化合物、および存在するポリペプチドの改変物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態における、天然のポリペプチドのライブラリは、多くの供給元から市販されており、これらはBiotics (Sussex, UK)、Xenova (Slough, UK)、Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, Fla.)およびPharmaMar, U.S.A. (Cambridge, Mass.)を含む。かかるポリペプチドは、当分野に知られた本明細書に記載されている方法を用いて、タンパク質の形質導入ドメインを含むように改変することができる。さらに、必要に応じて、天然および合成的に産生したライブラリを、当分野に知られた方法により、例えば標準の抽出および分画法により、作製する。分子ライブラリの合成のための方法の例は、当分野に見出すことができ、例えば、以下に見出すことができる：DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909, 1993；Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422, 1994；Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678, 1994；Cho et al., Science 261:1303, 1993；Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994；Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061, 1994；およびGallop et al., J. Med. Chem. 37:1233, 1994。さらに、必要に応じて、任意のライブラリまたは化合物を、標準の化学的、物理的、または生化学的方法により、容易に改変する。
【００７９】
任意数のポリペプチドや化学化合物であって、限定することなく多糖類、脂質、ペプチド、および核酸ベースの化合物を含むものの、ランダムまたは指向性の合成（例えば半合成または全合成）をもたらす多数の方法が利用可能である。合成化合物のライブラリは、Brandon Associates (Merrimack, N.H.)およびAldrich Chemical (Milwaukee, Wis.)から市販されている。代替的に、候補化合物として用いる化学化合物は、容易に利用可能な開始材料から、当業者に知られた標準の合成技術および方法論を用いて合成することができる。本明細書に記載の方法により同定される化合物を合成するのに有用な、合成化学変換および保護基の方法論（保護および脱保護）は、当分野に知られており、例えば、以下に記載されたものを含む：R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989)；T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed., John Wiley and Sons (1991)；L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994)；およびL. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)、ならびにそれらの続版。
【００８０】
化合物のライブラリは、溶液中に存在してよく（例えばHoughten, Biotechniques 13:412-421, 1992）、またはビーズ上（Lam, Nature 354:82-84, 1991）、チップ（Fodor, Nature 364:555-556, 1993）、細菌（Ladner, U.S. Patent No. 5,223,409）、胞子（Ladner U.S. Patent No. 5,223,409）、プラスミド（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869, 1992）、またはファージ上（Scott and Smith, Science 249:386-390, 1990；Devlin, Science 249:404-406, 1990；Cwirla et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382, 1990；Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310, 1991；Ladner、上記）に存在してもよい。
【００８１】
さらに、薬物発見および開発の分野の当業者は、脱複製（例えば、分類学上の脱複製、生物学的脱複製、および化学的脱複製、またはこれらの任意の組合せ）または複製の消去、またはその活性が既知である材料の繰返しのための方法を、可能な場合には用いるべきであることを、容易に理解する。
【００８２】
粗抽出物が、ウイルスポリペプチド結合および／またはウイルス溶解誘発活性を有すると見出された場合、陽性のリード抽出物（positive lead extract）のさらなる分画が、観察された効果の原因である分子成分を単離するために必要である。したがって、抽出、分画、および精製プロセスの目的は、イメージング剤として、ウイルス溶解誘発剤として、または新生物の治療薬として有用な、粗抽出物内の化学的実体の注意深い特徴づけおよび同定である。かかる異種抽出物の分画および精製の方法は、当分野に知られている。必要に応じて、治療薬として有用であることが示された化合物を、当分野に知られた方法により、化学的に修飾する。
【００８３】
治療法
ウイルス溶解誘発剤として作用する、ウイルスポリペプチドに対する基質として作用する、ウイルスポリペプチドを結合する、および／または放射性医薬品として作用するとして同定された剤は、ウイルス感染症（例えば潜伏性ウイルス感染症）に関連する新生物疾患を予防する、または改善するのに有用である。ウイルス感染に関連する癌は以下を含むが、これに限定されない：エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に関連する流行性バーキットリンパ腫、移植後リンパ腫、ＡＩＤＳリンパ腫、ホジキンリンパ腫、上咽頭癌および胃癌、およびヘルペスウイルスに関連するカポジ肉腫腫瘍。ウイルスに関連する新生物は、本発明の方法および組成物を用いて、処置、診断、画像化、またはモニタリングすることができる。
【００８４】
１つの治療アプローチにおいては、本明細書に記載のようして同定した剤を、潜在的または実際の疾患に影響された組織に投与するか、または全身的に投与する。投与剤の用量は、個々の患者のサイズおよび健康状態を含む多くの要因に依存する。任意の特定の対象に対して、具体的な投与計画は、個別の必要性および組成物を投与する、または投与を監督する人の専門的判断にしたがって、時間的に調節すべきである。
【００８５】
医薬治療法
本発明は、ウイルスポリペプチドに対する基質に結合するかまたは基質として作用することができる、ウイルス溶解相を誘発することができる、または新生物の処置または予防のための療法として作用する組成物（核酸、ペプチド、小分子阻害剤、および抗体）を同定するための、簡単な方法を提供する。したがって、本明細書に記載の方法を用いて医学的価値を有すると発見された化学的実体は、例えば合理的な薬物設計により、薬物として、または存在する化合物の構造的修飾のための情報として有用である。かかる方法は、ウイルス感染症に関連する種々の新生物に対する効果を有する剤をスクリーニングするために有用である。
【００８６】
治療的使用について、本明細書に開示された方法を用いて同定された組成物または剤は、全身的に投与してよく、例えば、生理食塩水などの薬学的に許容し得る緩衝液中に製剤化してよい。好ましい投与経路は、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、または皮内注射を含み、これらは患者において連続的に薬物の維持されたレベルを提供するものである。ヒト患者または他の動物の処置は、生理学的に許容し得る担体中での、本明細書で同定された治療薬の治療的有効量を用いて行われる。好適な担体およびそれらの製剤形態は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinに記載されている。投与される治療剤の量は、投与の様式、患者の年齢および体重、および病原体感染または新生物の臨床的症状に依存して変化する。一般に、量は、病原体感染または新生物に関連する他の疾患の処置において用いる他の剤に対して用いられる範囲であり、ただしある例においては、化合物の特異性の増加のために、より低い量が必要である。化合物は、ウイルス溶解を効果的に誘発する用量（例えば、溶解を、感染した腫瘍細胞の少なくとも約３〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、３０〜５０、５０〜７５、または７５〜１００％において誘発する）において投与され、これらの量は、当業者に知られた方法により決定されるか、またはウイルスプロモーター、ウイルスポリペプチドまたはウイルス複製の発現または生物学的活性を測定するアッセイを用いて決定される。
【００８７】
新生物の処置のための化合物の投与は、他の成分と混合されて、新生物を改善、低減または安定化するのに有効な治療薬の濃度をもたらす、任意の好適な手段により行うことができる。化合物は、任意の好適な担体物質において、任意の適切な量で含まれることができ、一般に組成物の全重量の１〜９５％の量で存在する。組成物は、非経口投与経路（例えば皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内）に好適な剤形において提供されてよい。医薬組成物は、従来の薬学的慣例にしたがって製剤化することができる（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000およびEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照）。
【００８８】
細菌感染
ウイルスは、チミジンキナーゼを発現する唯一つの病原体ではない。多くの細菌性病原体も、かかるキナーゼを発現する。したがって、細菌感染症もまた、放射標識ＦＩＡＵ類似体を含むＦＩＡＵによる処置に感受性である。グラム陽性細菌はパスツレラ（Pasteurella）種、ブドウ球菌種、および連鎖球菌種を含むが、これに限定されない。グラム陰性細菌は、大腸菌、シュードモナス（Pseudomonas）種およびサルモネラ種を含むが、これに限定されない。感染性細菌の具体的な例としては以下が挙げられるが、これに限定されない：ヘリコバクターピロリ、Borelia burgdorferi、レジオネラ・ニューモフィラ菌（Legionella pneumophilia）、マイコバクテリア種（例えば結核菌、鳥結核菌、M. intracellulare、M. kansaii、M. gordonae）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア菌、化膿連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）、Streptococcus agalactiae（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌（ビリダンス群）、糞便連鎖球菌、ウシ型連鎖球菌、連鎖球菌（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌、病原性カンピロバクター種、腸球菌種、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム種、豚丹毒菌、ウェルチ（ウェルシュ）菌、破傷風菌、Enterobacter aerogenes、肺炎桿菌、Pasturella multocida、バクテロイデス種、Fusobacterium nucleatum、Streptobacillus moniliformis、梅毒トレポネーマ、フランベジアトレポネーマ、レプトスピラ、リケッチア、およびイスラエル放線菌。
【００８９】
他の細菌性病原体は以下を含む：アエロバクター、アエロモナス、アシネトバクター、イスラエル放線菌、アグロバクテリウム、桿菌、炭疽菌、バクテロイデス、バルトネラ、ボルデテラ、Bortella、ボレリア、ブルセラ、Burkholderia、カリマトバクテリウム、カンピロバクター、シトロバクター、クロストリジウム、ウェルチ（ウェルシュ）菌、破傷風菌、Cornyebacterium、ジフテリア菌、コリネバクテリウム種、エンテロバクター、Enterobacter aerogenes、腸球菌、豚丹毒、大腸菌属、フランキセラ属、Fusobacterium nucleatum、Gardnerella、ヘモフィールス、ハフニア属、ヘリコバクター、クレブシエラ、肺炎桿菌、乳酸桿菌、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア、Morganella、モラクセラ、マイコバクテリウム、ナイセリア、パスツレラ、Pasturella multocida、プロテウス属、プロビデンシア属、シュードモナス、リケッチア、サルモネラ、セラチア、赤痢菌、ブドウ球菌、Stentorophomonas、連鎖球菌、Streptobacillus moniliformis、トレポネーマ属、梅毒トレポネーマ、フランベジアトレポネーマ、キサントモナス属、ビブリオ、およびエルシニア。
【００９０】
非経口組成物
医薬組成物は、注射、注入または移植（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内など）により、従来の非毒性の薬学的に許容し得る担体およびアジュバントを含有する剤形、製剤、または好適な送達装置または移植片により、投与することができる。かかる組成物の製剤および調製物は、医薬製剤の当業者によく知られている。製剤は、上記Remington: The Science and Practice of Pharmacyに見出すことができる。
【００９１】
非経口使用のための組成物は、単位剤形（例えば単回用量アンプル）、または好適な保存剤が添加されていてもよい、複数回の用量を含有するバイアル（下記参照）において、提供することができる。組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、注入装置、または移植用の送達装置の形態であってよく、または使用前に水または他の好適なビヒクルと再構成される、乾燥粉末として提供してもよい。病原体感染症または新生物を低減または改善する活性剤とは別に、組成物は、好適な非経口的に許容し得る担体および／または賦形剤を含んでもよい。活性治療剤（単数または複数）は、制御放出のために、微小球、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに組み込まれてもよい。さらに、組成物は懸濁剤、溶解剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、等張化剤、および／または分散剤を含んでもよい。
【００９２】
上述のように、本発明の医薬組成物は、無菌注射に適した形態でもよい。かかる組成物を調製するために、好適な活性な炎症性腸疾患治療薬（単数または複数）を、非経口的に許容し得る液体ビヒクル中に溶解または懸濁させる。用いてもよい、許容し得るビヒクルおよび溶媒は、水、適切量の塩酸の添加により好適なｐＨに調節された水、水酸化ナトリウムまたは好適な緩衝液、１，３−ブタンジオール、リンガー溶液、および等張塩化ナトリウム溶液、およびデキストロース溶液である。水性の製剤はまた、１または２以上の保存剤（例えばメチル、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸塩）を含んでもよい。化合物の１つが、水に少量またはわずかにのみ溶解する場合、溶解増強剤または溶解剤を加えることができ、または溶媒は、１０〜６０％ｗ／ｗのプロピレングリコールなどを含んでもよい。
【００９３】
制御放出非経口組成物
制御放出非経口組成物は、水性懸濁液、微小球、マイクロカプセル、磁気微小球、油性溶液、油性懸濁液、または乳濁液の形態であってもよい。代替的に、活性薬物は生体適合性担体、リポソーム、ナノ粒子、移植片、または注入装置に組み込まれていてもよい。
【００９４】
微小球および／またはマイクロカプセルの調製において用いる材料は、例えば、生分解性／生侵食性ポリマー、例えばポリガラクチン、ポリ−（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタム−ニン）および、ポリ（乳酸）である。制御放出非経口製剤を製剤化する場合に用いてよい、生体適合性担体は、炭水化物（例えばデキストラン）、タンパク質（例えばアルブミン）、リポタンパク質、または抗体である。移植片において用いるための材料は、非生分解性（例えばポリジメチルシロキサン）、または生分解性（例えばポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）またはポリ（オルトエステル）、またはこれらの組合せ）であることができる。
【００９５】
経口使用のための固体剤形
経口使用のための製剤は、活性成分（単数または複数）を、非毒性の薬学的に許容し得る賦形剤との混合物で含有する錠剤を含む。かかる製剤は、当業者に知られている。賦形剤は、例えば不活性の希釈剤または増量剤（例えばスクロース、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶セルロース、ジャガイモデンプンを含むデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム）；顆粒化剤および崩壊剤（例えば、セルロース誘導体類であって、微結晶セルロース、ジャガイモデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩、またはアルギン酸など）；結合剤（例えば、スクロース、グルコース、ソルビトール、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはポリエチレングリコール）；および潤滑剤、流動促進剤（glidant）、および抗接着剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油、またはタルク）である。他の薬学的に許容し得る賦形剤は、着色剤、香味剤、可塑剤、湿潤薬、緩衝剤などであることができる。
【００９６】
錠剤は、被覆なしでもよく、または、任意に胃腸管での分解および吸収を遅延させ、これにより長い期間持続性の作用を提供するために、既知の技術により被覆されてもよい。被覆は、活性薬物を、所定のパターンで放出するよう適合させてもよく（例えば、制御放出製剤を実現するため）、または、活性薬物を、胃を通過した後まで放出しないように適合させてもよい（腸溶コーティング）。被覆は、糖衣、薄膜コーティング（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレートコポリマー、ポリエチレングリコール、および／またはポリビニルピロリドンに基づくもの）、または、腸溶コーティング（例えばメタクリル酸コポリマー、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、セラック、および／またはエチルセルロースに基づくもの）であってよい。さらに、時間遅延材料、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを用いてもよい。
【００９７】
固体錠剤組成物は、組成物を望ましくない化学的変化（例えば、活性な抗病原体または抗新生物治療物質の放出前の化学的分解）から保護するよう適合されたコーティングを含んでよい。コーティングは、上記Encyclopedia of Pharmaceutical Technologyに記載されているものと同様の様式において、固体剤形に適用してもよい。
少なくとも２種の抗病原体または抗新生物治療薬を、錠剤中に一緒に混合してもよく、または分割してもよい。１つの例においては、第１の活性な抗病原体または抗新生物治療薬を、錠剤の内側に含有させ、第２の活性な抗病原体または抗新生物治療薬を外側に、第２の活性な抗病原体または抗新生物治療薬の大部分が、第１の活性な抗病原体または抗新生物治療薬の放出前に放出されるような様式で、含有させる。
【００９８】
経口使用のための製剤はまた、咀嚼錠として、または硬質ゼラチンカプセルとして活性成分を不活性の固体希釈剤（例えば、ジャガイモデンプン、ラクトース、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリン）と混合して、または軟質ゼラチンカプセルとして活性成分を水または油性の媒体、例えばピーナツ油、液体パラフィン、またはオリーブ油と混合して、提供してもよい。散剤および顆粒物も、上述の成分を用いて、錠剤およびカプセルとして、従来の様式で例えば撹拌機、流動床装置またはスプレー乾燥装置を用いて、調製することができる。
【００９９】
制御放出経口剤形
経口用の制御放出組成物は、例えば、抗新生物治療薬を、活性物質の溶解および／または拡散を制御して放出するよう、構成することができる。溶解または拡散による制御放出は、化合物の錠剤、カプセル、ペレットまたは顆粒製剤の適切なコーティングにより、または化合物を適切なマトリクス内に組み込むことにより、達成することができる。制御放出コーティングは、上述の１種または２種以上のコーティング物質、および／または、以下を含んでよい：例えばセラック、蜜ろう、糖ろう、ヒマシろう、カルナウバろう、ステアリルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセロール、エチルセルロース、アクリル樹脂、ｄｌ−ポリ乳酸、酢酸酪酸セルロース、塩化ポリビニル、酢酸ポリビニル、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メチルメタクリレート、２−ヒドロキシメタクリレート、メタクリレートヒドロゲル、１，３ブチレングリコール、エチレングリコールメタクリレート、および／またはポリエチレングリコール。制御放出マトリクス製剤において、マトリクス材料はまた、例えばメチルセルロース水和物、カルナウバろう、およびステアリルアルコール、カルボポール９３４、シリコーン、トリステアリル酸グリセリル、メチルアクリレート−メチルメタクリレート、塩化ポリビニル、ポリエチレン、および／またはハロゲン化フルオロカーボンを含んでよい。
【０１００】
１または２種以上の治療化合物を含有する制御放出組成物はまた、浮遊錠剤（buoyant tablet）またはカプセル（すなわち経口投与時に、一定時間胃内容物の上に浮遊する錠剤またはカプセル）の形態であってもよい。化合物（単数または複数）の浮遊錠剤製剤は、化合物（単数または複数）の混合物を、賦形剤および２０〜７５％ｗ／ｗのヒドロコロイド、例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースと、顆粒化することにより、調製することができる。得られた顆粒は次に、錠剤に押圧することができる。胃液と接触すると、錠剤は、その表面の回りに実質的に水不透過ゲルのバリアを形成する。このゲルバリアは、１より小さい密度を維持する役目を果たし、これによって錠剤が胃液中に浮遊することを可能とする。
【０１０１】
組合せ療法
任意に、抗新生物治療薬は、任意の他の標準の抗新生物治療と組み合わせて投与してよい；かかる方法は当業者に知られており、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinに記載されている。
【０１０２】
キット
本発明は、ウイルス関連新生物の、診断的画像化、処置、予防、またはモニタリングのためのキットを提供する。１つの態様において、キットは、新生物の処置のための剤の有効量（例えば単位剤形における）を含有する組成物を含む。他の態様において、キットは、ウイルス溶解誘発剤を含む組成物を含む。さらに他の態様において、キットは、新生物を画像化するための剤を含む。いくつかの態様において、キットは、治療または予防用の細胞組成物を含む、無菌の容器を含む；かかる容器は、箱、アンプル、ビン、バイアル、チューブ、袋、パウチ、ブリスター包装、または当分野に知られたその他の好適な容器であることができる。かかる容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属フォイル、または医薬を保持するのに好適な他の材料から作ることができる。
【０１０３】
必要に応じて、本発明の剤は、新生物を有するか、その発症のリスクを有する対象に剤を投与するための指示書と一緒に提供される。指示書は一般に、組成物を新生物の画像化のために、または新生物の処置もしくは予防のために用いることについての情報を含む。他の態様において、指示書は、以下の少なくとも１つを含む：治療剤またはイメージング剤の説明；新生物またはその症状の処置または予防のための投与計画および投与；用法注意；警告；効能・効果；過量投与の情報；副作用；動物薬理学；臨床試験；および／または参考文献。指示書は、容器（ある場合には）に直接印刷してもよく、または容器に貼付されたラベルとして、または容器中もしくは容器と共に提供される、別の紙、パンフレット、カード、もしくはフォルダーとして提供されてもよい。
【０１０４】
本発明の実践は、他に記載のない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を用い、これらは当業者の範囲内である。かかる技術は文献に完全に説明されており、その例としては以下である：“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition ；“Oligonucleotide Synthesis” ；“Animal Cell Culture” ；“Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” ；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” ；“Current Protocols in Molecular Biology” ；“PCR:  The Polymerase Chain Reaction”, ；“Current Protocols in Immunology” 。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に適用可能であり、したがって本発明の製造および実践おいて考慮することができる。特定の態様のために特に有用な技術は、以下の節で議論される。
【０１０５】
以下の例は、当業者に対して、本発明のアッセイ、スクリーニングおよび治療法をいかにして作製して用いるかについての完全な開示および説明を提供するものであり、発明者がその発明と考えるものの範囲を限定することは意図していない。
本発明は、以下の例によりさらに説明され、これは限定とみなされるべきではない。
【０１０６】
例
例１：ルシフェラーゼアッセイは、Ｚｔａプロモーターを活性化する試薬を同定した
Ｚｔａは、ＥＢＶ溶解感染の誘発における主なトランス活性化因子である。報告されている全ての溶解誘発剤は、Ｚｔａの転写を活性化する。ＥＢＶの前初期遺伝子発現を誘発する薬物を同定するために、胃癌細胞株背景でのＺｔａプロモータールシフェラーゼレポーターを、ＥＢＶ溶解遺伝子発現の既知の誘導物質を検出するその能力について評価した。このプロモーター−上皮細胞アッセイにおいて、ホルボール１２−テトラデカノエート１３−アセテート（ＴＰＡ）およびブチレート（ＴＰＡ／ブチレート）およびバルプロ酸による処置は、図１に示すように、用量依存性の様式でルシフェラーゼの発現の増加をもたらし、一方で５’−アザデオキシシチジンはこのプロモーターを活性化しなかった（図１）。
【０１０７】
プロモーター−レポーター系は、ウイルスエピソームの文脈におけるＺｔａプロモーターの調節を反映しない可能性がある。ＺＴＡプロモーター−上皮アッセイは、単一ウェルで定義されたウイルスなしの系によるＥＢＶ複製の側面に焦点を当てる。ＥＢＶ溶解感染は、溶解プロモーターの後成的修飾および潜伏性タンパク質阻害を含む、多くのレベルにおいて調節されている。ＺＴＡルシフェラーゼアッセイは、５’−アザデオキシシチジンなどの薬物を同定しなかった。そこで、高スループットスクリーニングのための、相補的ウイルス−細胞ベースのアッセイが開発された。
【０１０８】
例２：ＥＢＶ溶解誘発試薬を同定するためのＧＦＰ−ウイルスベースのアッセイの開発
ＢＸ−１は、ＢＸＬＦ１ ＯＲＦが破壊されたＧＦＰをコードする組換えＥＢＶであり、ＡＫＡＴＡ−ＢＸ１細胞はこの組換えＥＢＶを有するＡｋａｔａ陰性細胞である。顕微鏡観察により、抗−ＩｇＧによりＡＫＡＴＡ−ＢＸ１細胞においてＥＢＶ溶解感染が誘発された場合に、ＧＦＰシグナルは溶解感染とともに増加することが示された（図２Ａ）。ＧＦＰはＥＢＶ組換えウイルスによりコードされたため、ウイルス複製はより多くのＧＦＰを産生し、より強い蛍光シグナルを生成する。このＧＦＰシグナルを、マイクロプレートリーダーにより検出した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）の増加を、溶解誘発後に検出した（図２Ａ）。ＧＦＰシグナルは、Ｓ相ＣＤＫ阻害剤プルバラノールＡによって特異的に阻害され、これは、ＥＢＶ溶解誘発を抑制すると報告されている［７］（図２Ｂ）。ＧＦＰシグナル誘発がＣＭＶプロモーター活性化のためであるか、または溶解複製を反映するのかを決定するために、ＣＭＶプロモーター駆動ＧＦＰプラスミドを有する安定なＨｅｌａ細胞株を、対照として用いた。試験した溶解誘発剤のいずれもが、この対照細胞株においてＧＦＰシグナルの増加を示さなかった（図２Ｃ）。
ルシフェラーゼアッセイとは対照的に、Ａｋａｔａ−ＢＸ１細胞では、ＧＦＰシグナルは５’−アザデオキシシチジンにより用量依存性の様式で誘発された（図３）。９６ウェルフォーマットにおいて、ＧＦＰアッセイは高スループットアッセイに容易に適合された。
【０１０９】
例３：臨床化合物ベースのライブラリの薬物スクリーン
ジョーンズホプキンス臨床化合物ライブラリ（ＪＨＣＣＬ）は、２７２０種の化合物から構成され、これらは最終濃度１０ｕＭにおいてスクリーニングされている。化合物はＤＭＳＯまたはＰＢＳに溶解され、９６ウェルプレートにフォーマットされていた。ＧＦＰ全ウイルスアッセイの典型的な読取りを図４に示す。２００以上の化合物が、可能性のある溶解誘発剤として１つまたは２つのアッセイにおいて同定された。活性を有すると同定されたほとんどの剤は、５つのファミリーに分類できた：プロテアソーム阻害剤、抗チューブリン薬物、グルココルチコイドまたはステロイドホルモン、ヌクレオシド類似体、および抗炎症剤。多くのヒットは共通であったが、グルココルチコイド活性は肉腫細胞株／全ウイルスアッセイにおいて最も頻繁に同定され、抗チューブリン薬物は、上皮プロモーターレポーターアッセイにおいて最も頻繁に見出された。興味深いことには、多くの抑制ヒットは、伝統的に細胞障害性薬物として知られていない薬物である。これらのヒットのうちにはシンバスタチンおよびロバスタチンがあり、これら２つの薬物は、近年、ＥＢＶ形質転換されたリンパ芽球腫細胞株のアポトーシスを誘発すると報告されたものである（Katano et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(14):4960-5）。これら試薬のさらなる研究は、ＥＢＶ関連腫瘍に対するいくつかの腫瘍特異的治療を明らかにするであろう。
【０１１０】
前にＥＢＶ溶解サイクルを誘発することが示された薬物の再同定は、２つのアッセイで用いられたアプローチの重要な確認を表わす。上皮プロモーターレポーターアッセイのみによって確認された薬物は、メトトレキセート、シスープラチナム、５−ＦＵ、およびタキソールであった。リンパ腫細胞株／全ウイルスアッセイのみから確認された薬物は、ほとんどのグルココルチコイド薬および抗ＩｇＧであった。両方で確認された薬物は、ドキソルビシン、ＰＭＡ、およびいくつかのグルココルチコイド薬であった。両方のアッセイで確認されなかった薬物は、酪酸ナトリウム、酪酸アルギニン、および塩化コバルトであった（図５）。
【０１１１】
ヒットは次に、５μＭ、１μＭ、１００ｎＭおよび１０ｎＭで実施した同じアッセイによってさらに試験し、溶解感染を誘発するＥＣ５０を決定した。期待できるヒットを次にＥＢＶ陽性細胞株において試験した。これらのさらなる検討について、化合物はライブラリから独立して得た。これらの選択は、一部には剤のさらなる分析に対する使用可能性に基づき、また、一部には最初のスクリーンにおいて同定された化合物の多様性を提示するためになされた。低いマイクロモル濃度で活性な化合物および、伝統的細胞障害性薬物ではない化合物については、より興味が低かった。
【０１１２】
例４：ボルテゾミブ、メベンダゾール、シタラビンは溶解誘発試薬として同定された
プロモーター−上皮アッセイにより、ＢＺＬＦプロモーターを誘発可能な多くの薬物が明らかにされた。トラニラストは、肥満細胞の脱顆粒化、ヒスタミン放出および線維増多プロセスを抑制する抗アレルギー薬である（図６）。抗炎症効果は、ＮＦ−ＫＢ機能の阻害を通してのものである。レフルノミドは、ピリミジン生合成経路の第４の酵素であるジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼを阻害し、in vitroでの成長因子媒介性の平滑筋細胞増殖に拮抗する。これは、関節リューマチの処置に用いられる。
【０１１３】
トラニラストおよびレフルノミドは、ＢＺＬＦプロモーターを治療的血清濃度において１５倍まで誘発した（図６）。前初期タンパク質ＢＺＬＦのみで、溶解カスケードの全体のトリガーとなるのに十分であることが報告されている。しかし、ルシフェラーゼアッセイにおいてＢＺＬＦプロモーターを誘発可能な薬物は、必ずしもＢＺＬＦタンパク質発現を誘発するわけではない。上記の試薬は、ＥＢＶ陽性細胞株、例えばＳＮＵ７１９、ＡＫＡＴＡ、Ｒａｊｉ、ＬＣＬおよびＲａｅｌ細胞などにおいて、ＢＺＬＦタンパク質発現を誘発しなかった。
ルシフェラーゼアッセイでの他のヒットは、ＢＺＬＦ１タンパク質を誘発したが、ウイルス複製は誘発しなかった。この部類の薬物は、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）（図７Ａ）およびインドプロフェン（図９Ａ）を含む。Ａｒａ−ｃは、ルシフェラーゼアッセイにおいてＢＺＬＦＩプロモーターを誘発し（図７Ｂ）、およびＬＣＬ細胞においてＺＴＡ発現を誘発した（図７Ｃ）。
【０１１４】
シタラビンおよびインドプロフェンは、ＥＢＶ前初期遺伝子発現のトリガーとなったが、しかし後のステージで溶解カスケードを停止させた。シタラビンは前初期タンパク質ＺＴＡを、ＳＮＵ７１９、ＬＣＬ、ＡＫＡＴＡ−ＢＸ１細胞において誘発し（図８Ａおよび８Ｂ）、また溶解遺伝子ＲＰＡおよびＴＫ発現を誘発したが（図８Ｃ）、しかしウイルス複製は誘発しなった（図８Ｄ）。インドプロフェンはＳＮＵ７１９においてＺＴＡを誘発したが、ウイルス複製は誘発しなった（図９Ａ〜９Ｄ）。
ボルテゾミブは両方のアッセイにおける最も顕著なヒットであった（図１０Ａ）。ボルテゾミブのＥＣ５０は、アッセイにおいてナノモルの桁であり、これは治療的血清濃度と整合する。ＥＢＶ（＋）Ｂ細胞において試験した場合に、ボルテゾミブはＺＴＡ（図１０Ｂ）、ＲＴＡおよびＥＢＶ−ＴＫなどの溶解遺伝子を誘発したのみでなく、ＥＢＶ複製も誘発した（図１０Ｃ）。メベンダゾールはまた、ＥＢＶ＋細胞株において、ＢＺＬＦ１タンパク質発現およびウイルス複製を誘発することができる（図１１）。
【０１１５】
まとめると、臨床化合物ライブラリに２つのアッセイを適用することにより、スクリーニングは、ＦＤＡ承認の多くの剤を、強力なＥＢＶ溶解誘発活性を有するとして同定した。
安定にトランスフェクトされたプラスミドにおける、ＺｔａプロモーターのｏｒｉＰによる調節は、ＥＢＶにおける内因性Ｚｔａプロモーター調節と同様であることが報告されている（Jenkins et al., J Virol, 2000. 74(2): p. 710-20）。ｏｒｉＰプラスミドにおいて、クロマチン構造はアセチル化に関して維持されているが、Ｚｐプロモーター領域はメチル化されていない。本報告では「通常の」ｐＧＬ２プラスミドを薬物スクリーニングに用いているが、同様のクロマチン構造が観察された。ＺｐプロモーターはＨＤＡＣ阻害剤である酪酸塩により誘発されたが、メチル化阻害剤である５−アザデオキシシチジンによっては誘発されなかった。
【０１１６】
観察されたＧＦＰシグナルは、ウイルス複製に対応し、ＥＢＶ溶解誘発の信頼できるレポーターである。複製の間でのその連続的産生および定量化の容易さは重要な力である。ＧＦＰは、結核菌（Collins et al., Antimicrob Agents Chemother, 1998. 42(2): p. 3447）、ＨＩＶ（Daelemans et al., Mol Pharmacol, 2005. 67(5): p. 1574-80）、ＣＭＶおよびＨＣＶ（Lee et al., J Virol Methods, 2004. 116(1): p. 27-33）などの多くの病原体に対する薬物スクリーニングアッセイにおいて、レポーターとして用いられてきた。本発明は、細胞内ＥＢＶ複製のリアルタイムモニタリングのための新規なアッセイを確立し、このアッセイを高スループットスクリーニングに適合させた。
【０１１７】
ＧＦＰおよびルシフェラーゼアッセイにおいて見出された異なるヒットは、２つのアッセイの異なる性質を反映する。また、任意の他の高スループットスクリーンにおけるのと同様に、アッセイの感受性および特異性は、スクリーンで用いる薬物の濃度により制限される。酪酸アルギニンおよび酪酸ナトリウムは、両方のスクリーンにおいてヒットとしては見過ごされ、その理由は、試験された濃度（１０μＭ）が、報告されている有効濃度（０．５〜２ｍＭ）よりはるかに低かったためである。
本明細書で実証されるように、本発明は、ＥＢＶの溶解感染を誘発する剤を提供する。ＥＢＶ溶解感染はまた、移植後リンパ球増殖性疾患（ＰＴＬＤ）においても役割を果たすと考えられる。ＥＢＶ複製を再活性化することができる種々の試薬の理解は、これらの疾患の処置に有用となり得る。
【０１１８】
トラニラストおよびレフルノミドは、溶解プロモーターを治療的血清濃度において活性化した。これらはＢ細胞または胃上皮細胞（ＳＮＵ７１９）において、溶解タンパク質発現またはウイルス複製を誘発しないが、インドプロフェンは、ＳＮＵ７１９細胞において高用量でＺｔａタンパク質を誘発することに有望性を示す。我々のヒットのほとんどは細胞障害性薬物であり、これはストレスへの応答としてウイルスが再活性化するとの注釈と整合しているようである。１つの特異的な薬物群は、微小管障害薬である。
シタラビンは、前初期および初期遺伝子発現を誘発可能な特別なクラスの薬物を表わすが、しかし完全な溶解複製は誘発しない。その作用は、ウイルスＤＮＡポリメラーゼの阻害による可能性がある。この薬物クラスは、ウイルス血症を引き起こすことなく、宿主細胞アポトーシスに必要な主なステップを達成できることから、興味深い。これらにより、前初期遺伝子ＢＺＬＦ１およびＢＲＬＦ１が誘発されるだけでなく、溶解カスケードをＴＫに対して実施でき、これは、ガンシクロビルおよびウイルス画像化の作用を可能とする。存在する薬物に対して新しい使用を見つけることは、有望なアプローチである。存在する化合物のスクリーニングは、いくつかの既知の薬物の新規な活性／効能を同定する可能性がある。このライブラリの１つの明白な利点は、スクリーンの追跡臨床試験では、毒性および薬物動態を確立するために必要な、時間およびコストのかかるプロセスを回避できることである。
【０１１９】
例５：ボルテゾミブはＥＢＶ−ＴＫを誘発した
ボルテゾミブ処置は、免疫ブロット法（図１２Ａおよび１２Ｂ）、ＺＴＡ／ルシフェラーゼ活性（図１２Ｃ）、および［１４Ｃ］ＦＩＡＵの蓄積に反映されたＴＫ機能活性（図１２Ｄ）の評価からわかるように、ＥＢＶ−ＴＫおよびＥＢＶ−ＺＴＡ発現を誘発した。ボルテゾミブの不在またはＥＢＶ（−）細胞株においては、抗原または機能活性は検出されなかった。ボルテゾミブの効果は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＢＸ−１細胞株において示されるように、用量依存性であった（図１３Ａおよび１３Ｂ）。リアルタイムＤＮＡ ＰＣＲにより測定したウイルスコピー数も、処置と共に増加した（図１３Ｃ）。よく認識されているボルテゾミブの作用の１つは、ＩκＢの安定化および、その結果としてのＮＦ−κＢの阻害である。溶解遺伝子発現の誘発においてこの経路も同様に重要であるかどうかを決定することを試みて、ボルテゾミブの効果を、バーキット細胞株でのトランスフェクション実験でＩκＢのスーパーリプレッサー（ＩκＢ（ｓｒ））において検討した。図１３Ｄに示すように、ＥＢＶウイルス負荷はトランスフェクション後に約１２倍に増加した。さらに、ＥＢＶ（＋）Ａｋａｔａ細胞を２０ｎＭのボルテゾミブの存在下で４８時間インキュベートすると、６７％の細胞が溶解サイクルに入り、誘発が用量依存性であることが証明された。
【０１２０】
ＥＢＶ（＋）バーキットリンパ腫異種移植片を有するマウスを、ボルテゾミブまたはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のどちらかで処置し、［１２５Ｉ］ＦＩＡＵの注射後の種々の時点で画像化した（図１４）。ボルテゾミブは常に［１２５Ｉ］ＦＩＡＵの２４時間前に、同じく静脈内に投与した。早い時点で得た画像は、心血液プール、肝臓、膀胱および甲状腺のみを示し、これは［１２５Ｉ］ＦＩＡＵの確立された生体内分布と整合した。放射性医薬品の注射後１日までに、ボルテゾミブで処置した動物の腫瘍は視覚化することができ、注射後４日までには、膀胱内での豊富な放射活性にも関わらず、処置した動物の腫瘍は明確に見ることができた。２μｇ／ｇのボルテゾミブは、この細胞株での処置後９６時間において、最大の標的対非標的シグナル比率を刺激した。図１４Ｂに矢印で示した９６時間時点での放射活性は、同時に行ったex vivoでのガンマカウントが示すように、腫瘍内にあった。同様の結果が、他のＥＢＶ（＋）バーキット細胞株（Ｒａｅｌ）異種移植片を有する動物においても得られた。ＰＢＳでなく、ボルテゾミブによる処置の後、放射性医薬品の注射後３０時間までに、腫瘍は明白に視覚化された。図１５は、放射性医薬品の投与の７２および９６時間後における、ＥＢＶ（＋）Ａｋａｔａ細胞株から得た異種移植片のＳＰＥＣＴ−ＣＴ画像を示す。画像から得た１ｇ当たりの注射線量の百分率（％ＩＤ／ｇ）は、７２および９６時間後においてそれぞれ１．１３±０．０１および０．７０±０．０１であった。１匹のマウスのみをＳＰＥＣＴ−ＣＴで画像化したため、標準偏差（ＳＤ）値は各画像の複数切片から導出した。
【０１２１】
例６：ex vivo生体内分布
図１４および１５の画像において一見腫瘍内に示された放射活性が、実際に腫瘍内であることを確認し、取込み量を定量するために、追加の実験でＥＢＶ（＋）異種移植片を有する動物においてex vivo生体内分布アッセイを行った。［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ取り込みの増加は初期には明白であったが、ボルテゾミブで前処置された動物の腫瘍において、注射後９６時間でこれはピークを示した。図１４Ａは、ＰＢＳで前処置されたマウスにおいて、９６時間での腫瘍での取込みの欠如（０．０３９％ＩＤ／ｇ）を示し、一方、図１４Ｂは、ボルテゾミブで前処置された動物の腫瘍での取込みの時間変化を示す。腫瘍での放射性医薬品の取り込みは、０．０３９％から０．８５％ＩＤ／ｇまで、ボルテゾミブでの前処置の後に、基底値のほぼ２２倍に増加した（表１）。
【０１２２】
【表１】
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他の組織内、すなわち、肝臓、脾臓、腎臓および筋肉内で検出された放射活性は、２４時間時点と９６時間時点の間で消滅した。
【０１２３】
ボルテゾミブ処置後の腫瘍を画像化する能力が、ＦＩＡＵ蓄積を導くヒト細胞キナーゼの誘発を反映していないことを確認するために、ＥＢＶ（−）骨肉種異種移植片も画像化した。ボルテゾミブの有無に関わりなく、腫瘍での取り込みは明らかでなかった。しかし、構成的にＥＢＶ−ＴＫを発現するよう操作された同じ細胞株は、容易に画像化された（図１６）。これらの結果は、画像化に関連する薬理学的誘発の効果は、細胞キナーゼの活性化によるよりも、ウイルスＴＫによって媒介されることを示した。
【０１２４】
レポータートランス遺伝子を用いて、目的の内因性遺伝子の発現を決定することは、細胞および分子生物学での中心となっている。以前にはin vitroで行われる作業用であったこれらの技術は、in vivoでの画像化に拡張されている。in vivo分子遺伝学的画像化の比較的新しい領域では、種々のモダリティが用いられ、これらの多くは診療室でも用いられるものと平行しており、磁気共鳴画像法およびＰＥＴを含む。細胞を適切な画像化用レポーター（主としてＨＳＶ１−ＴＫであるがこれに限定されない）でトランスフェクトすることにより、および、種々の放射標識基質およびリガンドを用いて、研究者は、Ｔ細胞輸送、免疫活性化、メカニズム特異的抗癌剤、およびタンパク質相互作用ネットワークのアセンブリを含む、種々の細胞プロセスを測定することができる。２つの報告においては、分子遺伝学的画像化を用いて、患者における抗腫瘍遺伝子療法への準備のために、ＨＳＶ１−ＴＫで生産的にトランスフェクトされた細胞が同定された。本発明者らは、内因性ＴＫ発現を画像化して、結腸癌および一般の細菌感染の実験モデルにおいて組合せ溶菌療法を検討した（Bettegowda et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:1145、これは本明細書に参照として組み込まれる）。本明細書においては、分子遺伝学的画像化を用いて、ウイルス溶解サイクルの代理マーカーとしての、遺伝子ＥＢＶ−ＴＫの発現を検討し、これは遺伝子トランスフェクションのステップの回避を可能とした。
【０１２５】
ＥＢＶバーキットおよびＡｋａｔａリンパ腫異種移植片を、［１２５Ｉ］ＦＩＡＵと専用ガンマカメラを用いて、ウイルスＴＫ発現の薬理学的誘発後に画像化した。病因学的ウイルス関連腫瘍そのものが、腫瘍を直接画像化するためのレポーター遺伝子を提供した。この方法は非常に高感度であり、腫瘍量でのたったの５％という少ない細胞のみが、あるＥＢＶ（＋）細胞株での画像化による検出のために、溶解サイクルに誘発される必要がある。用いた腫瘍モデルは皮下のものであったが、γ線の顕著な減衰の欠如は、この方法が、身体内部の深い位置の腫瘍に対して適用可能であることを示唆する。
【０１２６】
上述のように、ボルテゾミブは米国食品医薬品局が承認した２７００種の薬物のスクリーンにおいて、ＥＢＶ溶解サイクル誘発において最も活性であるとして同定され、本研究の論理的根拠を提供した。ＮＦ−κＢ経路の阻害は、ＥＢＶ溶解サイクルを誘発した。ボルテゾミブは、ＩκＢの分解の阻害による抗ＮＦκＢ活性を有することが知られている。本明細書に報告された結果は、抗ＮＦκＢ活性と溶解誘発の間のリンクを明らかにし、研究されたＥＢＶ関連リンパ腫において観察された結果についてのメカニズムを提供する。これらの所見に基づくと、画像化に対する腫瘍のウイルス性の関連を、癌療法のために利用できるようである。特に、腫瘍におけるウイルス遺伝子発現の調節が関与する、いくつかの治療戦略を調査した（Jacobs et al., Lancet 2001;358:727 -9; Yaghoubi et al., J Nucl Med 2006; 47:706-15）。かかる療法を、本報告に記載のように前臨床モデルにおいて、または患者において、すでに臨床使用されている放射標識ヌクレオシド類似体を用いて、非侵襲的にモニタリングすることができる（Jacobs et al., Lancet 2001;358:727 -9; Yaghoubi et al., J Nucl Med 2006; 47:706-15）。あるウイルス関連腫瘍の処置を最適化する方法はルーチンであり、当業者に知られている。ボルテゾミブは、溶解感染を誘発するのに有効な、新規のまた以前から知られている剤のアレイの１つであり、特定の剤を、特定の患者において、画像化を介する使用に適合させることができる。例えば、腫瘍が、治療を開始した直後に［１２４Ｉ］ＦＩＡＵ−ＰＥＴ走査上で陽性的に表わせない場合、その患者においては他の潜在的により有益なアプローチを支持して、溶解誘発療法は中止すべきである。画像化試験において、治療法の有益な効果を示す陽性シグナルの実証は、ウイルスゲノムに天然に関連する特異的遺伝子の誘発とメカニズム的に結合して、ウイルスまたは画像化レポーターの別のトランスフェクションを必要とすることなく、抗癌療法に対して容易に翻訳可能な利点を提供することができる。
【０１２７】
例７：操作された構成的ＥＢＶ ＴＫ発現
腫瘍組織における、２’−フルオロ−２’−デオキシ−β−Ｄ−５−ヨードウラシル−アラビノフラノシド（ＦＩＡＵ）の濃度に関して、ウイルスＴＫ誘発により達成可能な特異性を評価するために、ＥＢＶ−ＴＫを発現するように前に操作されたヒト骨肉種細胞株を用いた（Moore, S.M., Cannon, J.S., Tanhehco, Y.C., Hamzeh, F.M. & Ambinder, R.F. Induction of Epstein-Barr virus kinases to sensitize tumor cells to nucleoside analogues. Antimicrob Agents Chemother 45, 2082-2091 (2001)）。腫瘍細胞を、ＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下移植した。腫瘍が触診可能になった後に、［１２５Ｉ］ＦＩＡＵを静脈内投与し、マウスを種々の時点で組織内分布試験のために犠牲にした（図１７）。ＴＫ（＋）腫瘍での放射活性の選択的濃縮は２時間後までに明らかとなり、腫瘍での放射活性レベルは９６時間の最終時点まで一定を保ち、一方非標的組織でのレベルは低下した。より遅い時点まで行われた平行実験において、腫瘍の放射活性は２時間から４日後の最終時点まで安定であった。腫瘍の筋肉に対する比率は、注入２時間後の４．６から、注入２４時間後の２０５でピークとなり、注入９６時間後に１１４まで低下した。
【０１２８】
腫瘍細胞における放射性同位体のＥＢＶ−ＴＫ媒介性の濃縮が、治療効果を達成するのに適当であるかどうかを決定するために、腫瘍を有するマウスを、［１３１Ｉ］ＦＩＡＵまたは緩衝食塩水で処置した（図１８Ａ〜１８Ｃ）。緩衝食塩水注入マウスの対照およびＴＫ腫瘍、および［１３１Ｉ］ＦＩＡＵ注入マウスの対照腫瘍は、類似の増殖曲線を示し、重要なことは、これらの増殖曲線の傾き（直線回帰により決定）の９５％信頼区間は重なっていた。［１３１Ｉ］ＦＩＡＵ注入マウスのＴＫ腫瘍の増殖の傾きは平らであり（すなわち、［１３１Ｉ］ＦＩＡＵを有するＴＫの傾きの信頼区間は特に、ゼロの傾きの推定を含み、他の増殖曲線の信頼区間と重ならない）、増殖速度がこの処置により、劇的に遅延されたことを示す。別の実験において、［１３１Ｉ］ＦＩＡＵの用量の増加は、腫瘍増殖に対する効果の増加と関連した（図１８Ｂ）。ＴＫおよび対照腫瘍細胞の混合物を移植して、キメラ腫瘍を発生させた場合、混合物でのＴＫ発現腫瘍細胞のパーセンエージの増加はまた、腫瘍増殖に対する効果の増加に関連した（図１８Ｃ）。
【０１２９】
例８：ＥＢＶ−バーキットリンパ腫に対するボルテゾミブ誘発性酵素標的化放射線療法
上述のように、プロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブは、in vitroにおけるバーキットリンパ腫細胞系、およびマウス異種移植モデルの細胞株において、溶解ＥＢＶ感染の強力な誘発因子として同定された。自然感染した腫瘍組織において薬理学的誘発により達成可能な特異性を評価するために、ＥＢＶ（＋）バーキットリンパ腫細胞を、ＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下移植した。腫瘍が触診可能になった後に、ボルテゾミブ投与の２４時間後に［１２５Ｉ］ＦＩＡＵを静脈内投与し、マウスを組織内分布試験のために犠牲にした。組織１グラム当たりで測定された、放射活性の選択的濃縮は、これらの腫瘍において明らかであった（表１）。
【０１３０】
【表２】
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【０１３１】
したがって、治療同位体の評価を行った。上述のように、ＥＢＶバーキットリンパ腫異種移植片を移植したＳＣＩＤマウスは、緩衝液またはボルテゾミブを、そしてこれに続いて次の日に［１３１Ｉ］ＦＩＡＵの処置または無処置を受けた。図１９Ａに見られるように、緩衝液に続いて［１３１Ｉ］ＦＩＡＵを注射したマウスの腫瘍増殖曲線は、緩衝液のみを注射したマウスの腫瘍増殖曲線と同様であった。ボルテゾミブに［１３１Ｉ］ＦＩＡＵなしの場合は、腫瘍増殖を遅延させた。ボルテゾミブに続いて［１３１Ｉ］ＦＩＡＵの場合は、腫瘍増殖を停止させた（９５％信頼区間は０に重なったが、緩衝液のみまたは緩衝液と［１３１Ｉ］ＦＩＡＵに関連する増殖曲線の傾きの９５％信頼区間とは重ならなかった）。第２ＥＢＶ（＋）バーキットリンパ腫細胞株（Ａｋａｔａ）での実験においては、平行した結果が得られた。したがって、ボルテゾミブは、治療効果を有して［１３１Ｉ］ＦＩＡＵの標的化を可能とした。他のプロテアソーム阻害剤も活性のようである。いくつかは臨床試験中である。
【０１３２】
例９：ＥＢＶ胃癌に対するボルテゾミブ誘発性酵素標的化放射線療法
ＥＢＶはアフリカ人のバーキットリンパ腫において発見され、多くのＡＩＤＳ関連リンパ腫およびホジキンリンパ腫に関連しているが、数値的に最も重要な関連は上皮癌とのものである。ＥＢＶは実質的に全ての上咽頭癌（〜８０，０００の新例／年）および胃癌の約１０％（〜９３，０００の新例／年）に関連する。ボルテゾミブ誘発戦略が、上皮悪性疾患にも適用可能であるかどうかを決定するために、ボルテゾミブ誘発性ＦＩＡＵ標的化を、移植可能なヒトＥＢＶ関連胃癌（ＫＴ）異種移植モデル（Chong, J.M., et al. Interleukin-1beta expression in human gastric carcinoma with Epstein-Barr virus infection. J Virol 76, 6825-6831 (2002)）において検討した。ＫＴ腫瘍の移植に続いて、ＳＣＩＤマウスを、ボルテゾミブ、次に［１２５Ｉ］ＦＩＡＵで誘発し、腫瘍を単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）で画像化した（図２０Ａ）。組織分布試験により、腫瘍組織において［１２５Ｉ］ＦＩＡＵの選択的濃縮が示されたが、腫瘍組織の他の組織に対する比率は、バーキット系でのように顕著ではなかった（表１）。誘発に続いて［１３１Ｉ］ＦＩＡＵを用いると、腫瘍増殖速度は低下した（図１９Ｂ）。
【０１３３】
例１０：ＫＳＨＶ悪性疾患におけるボルテゾミブ誘発性酵素標的化放射線療法
ＥＢＶ関連腫瘍において観察されたアプローチは、ＫＳＨＶを有する２種の原発性浸出リンパ腫（ＰＥＬ）細胞株において示されるように、他のＫＳＨＶ関連腫瘍にも適用可能である。ＳＣＩＤ異種移植モデルにおいて、ボルテゾミブは、ＢＣＢＬ１およびＢＣ３の［１２５Ｉ］ＦＩＡＵによる画像化を可能とした（図２０Ｂ）。ボルテゾミブ後の組織分布試験は、腫瘍組織での選択的濃縮を示した（表１）。最後に、ボルテゾミブによる誘発後に［１３１Ｉ］ＦＩＡＵの処置を行うと、腫瘍は退縮した（図１９Ｃ）。
ＨＳＶ１−ＴＫは、癌に対する遺伝子療法アプローチにおいてツールとして用いられてきた。レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、その他による腫瘍細胞への導入は全て、臨床試験および動物モデルにおいて研究されている。同様に、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と、続くＫＳＨＶによる処置によるＥＢＶ−ＴＫの誘発は、幾人かの患者において寛解をもたらしたことが報告された。本明細書に報告される結果は、新しいアプローチである、ボルテゾミブ誘発性の放射性核種の酵素標的化（ＢＥＴＲ）療法を提供する。ＢＥＴＲ療法は、ヒト腫瘍のマウス異種移植片における、リンパ性および上皮性悪性疾患の退縮を誘発するのにより効果的であることが示された。
【０１３４】
患者におけるリンパ種に対する１３１Ｉ標識抗体を用いた結果は、臨床反応が、腫瘍に対して０．５〜２Ｇｙで達成可能であることを実証する。図１７に示す生体内分布データは、腫瘍および生体器官に投与された活性当たりの吸収された線量の推定値を可能とし、腎臓および赤色骨髄が、［１３１Ｉ］ＦＩＡＵに対する線量制限器官であることを示唆する。オンラインの補足に詳述されているように、体重７０ｋｇの患者の腫瘍１ｇ当たり限界器官線量で０．５〜２Ｇｙの送達は、大幅に毒性より下である。
【０１３５】
ＢＥＴＲ療法の可能性のある臨床的使用について、ＦＩＡＵ関連毒性は議論を必要とする。ＦＩＡＵは以前に抗ウイルス剤として検討された。ＦＩＡＵの慢性の投与には肝障害が付随し、いくつかの例においては致死的であり、これは明らかにミトコンドリア障害による。これらの試験において、４週間より短く、累積用量が２００ｍｇ未満の処置は、臨床的または生化学的な毒性の証拠と関連しなかった。したがって、ＦＩＡＵの「無効用量（no-effect dose）」は、投与当たり０．１ｍｇ／ｋｇの桁であることが控えめに推定される。［１２４Ｉ］ＦＩＡＵは、肝機能への副作用なしに、患者に対して画像化のために投与されている（Diaz et al., PLoS ONE 2, e1007 (2007)）。異種移植実験から外挿すると、放射線療法効果も、ヒトにおける無効ＦＩＡＵ用量より何桁か低い程度におけるＦＩＡＵの用量において、達成されるであろう。
【０１３６】
上に報告した結果は、ボルテゾミブ処置がリンパ腫および癌腫異種移植モデルにおいてＦＩＡＵの濃縮をもたらし、試験した腫瘍それぞれの腫瘍増殖曲線に影響することを示す（図１９）。リンパ腫モデルにおいて増殖は停止し、胃癌モデルにおいて増殖は遅延した。ルーチンの方法を用いた、胃癌におけるボルテゾミブの投薬および［１３１Ｉ］ＦＩＡＵ投与の最適化は、リンパ腫で観察されたのと同様レベルの有効性を達成するであろう。
【０１３７】
ＦＩＡＵは安全に対する関心の傾向が薄く、これは他の放射性医薬品に影響し、その理由は、ＦＩＡＵの生体内変化が、アラビノシル（「アップ」）構造における２’−フルオロ置換基を含有するピリミジンヌクレオシドにおけるＮ−グリコシルリンケージの、高い化学的および代謝安定性によって制限されているためである（Jacobs et al., J Nucl Med 42, 467-475 (2001)）。２４時間にわたる血清および全血の検査により、その良好な安定性と脱イオン化への低い感度が示され、標識化合物の９７．８％±０．１％が変化なく維持された。ＦＩＡＵはまた、血漿からより迅速に排出される。脱イオン化の低いレベルおよび、より迅速なクリアランスを考えると、健康な組織への副作用は最小であることが期待される。さらに、放射の潜在的な副作用も、放射が、胃癌、上咽頭癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含む多くのＥＢＶ関連腫瘍の処置の中心であることを理解する文脈において、評価すべきである。腫瘍組織に特異的な放射の代謝性標的化では、正常組織の暴露に関連する副作用を最小化すべきである。
【０１３８】
ＢＥＴＲ療法は、他の溶解誘発性自己不活化（lytic induction-suicide）プロドラッグアプローチに対して利点を提供する。全ての溶解誘発性アプローチは、ガンマヘルペスウイルスの潜伏傾向のために制限される。ガンシクロビルまたは類似の剤が細胞死滅を媒介する場合、治療効果には、腫瘍細胞の大部分がウイルス酵素を発現することが必要となることが多い。細胞間でのギャップ結合を介してのリン酸化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体の交換による、バイスタンダー（第三者）死滅現象が認識されてはいるが、かかる死滅は限定されている。遺伝子療法の設定においては、遺伝子療法ベクターでのコネクシンタンパク質の発現の増加を操作して、かかる死滅を増加させる試みが行われている。しかし、バイスタンダー死滅を増加させるこのアプローチは、遺伝子療法が関与しないアプローチにおいては容易に適用できない。事実、腫瘍を処置するために用いるいくつかの治療剤は、かかるバイスタンダー死滅を妨害する。［１３１Ｉ］ＦＩＡＵバイスタンダー死滅は、コネクシン発現またはギャップ結合により制限されず、しかし、β放射の関数であって、最大エネルギーは０．６１ＭｅＶであり、これはエネルギーの９０％を、半径０．７ｍｍの球内に蓄積する。この「十字火」効果は、リンパ腫における放射免疫療法の有効性に重要な寄与をなす可能性がある。［１３１Ｉ］ＦＩＡＵでの「十字火」は図１９Ｃから見ることができ、ここで、腫瘍細胞の１０％がＥＢＶ−ＴＫ細胞を含む場合でも、腫瘍増殖速度は大幅に遅延した。細胞レベル線量計測モデルを図２４に示す。
【０１３９】
溶解誘発性自己不活性化プロドラッグアプローチの第２の制限は、ガンシクロビル媒介性の死滅が、細胞サイクルに依存性であることである。いくつかの研究者グループによる報告によれば、ＥＢＶおよびＫＳＨＶ感染細胞における溶解感染の活性化は、細胞サイクルの停止を導き、したがって、細胞サイクル依存性の腫瘍死滅を危うくする可能性がある。対照的に、放射の効果は、溶解誘発により同様に低減はされない。
【０１４０】
ＢＥＴＲ療法はまた、放射免疫療法アプローチに対しても利点を提供する。放射免疫複合体の内部化は、遊離の同位体の分解および放出と、その結果として特異性の損失とを導き得る。対照的にＦＩＡＵの注射後、同位体は安定してＥＢＶ−ＴＫ発現腫瘍と共にある（図１７ａ）。酵素性のリン酸化およびＤＮＡへの取り込みは（ＨＳＶ１−ＴＫ発現細胞において報告されたように）、濃度勾配に制限されることなく、腫瘍組織で高濃度を達成する可能性を提供する。最後に、ＦＩＡＵおよびボルテゾミブの両方は小分子であり、したがって抗体複合体と比べて、より良好な腫瘍への透過が予想される。ＦＩＡＵは血液脳関門を通過しないが、脳腫瘍へは到達し、血液脳関門の破壊を反映する。より広く、小分子を用いて組織または腫瘍特異的代謝経路を活性化することは、放射の代謝性標的化が、甲状腺癌を超えた用途を有する可能性を示唆する。
【０１４１】
例１１：ＫＳＨＶ腫瘍の処置
図２２〜２４は、ＫＳＨＶ腫瘍のボルテゾミブおよび［１３１Ｉ］ＦＩＡＵによる処置を示す。
例１２：マウスの生体内分布データのヒトへの拡大、およびＯＬＩＮＤＡソフトウェアを用いたＭＩＲＤ線量測定計算
マウスの生体内分布データを、マウスにおける器官または腫瘍の全身に対する濃度比率が、ヒトにおけるそれらと等しいとの仮定のもとに、線量測定のために対応するヒトデータへ変換した。重要な正常器官についての吸収線量の推定値を表３に示す。
【０１４２】
【表３】
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【０１４３】
１．９５％ＩＤ／ｇという、マウス腫瘍における初期（すなわち２時間）活性濃度は、ヒトにおいて１ｇｍの腫瘍を仮定すると、７×１０−４％ＩＤ／ｇとなる。この濃度で、また生体内分布データに見られるように１３１Ｉの無視できる生物学的クリアランスを仮定すると、７０ｋｇのヒトでの１ｇｍの腫瘍に投与された活性当たりの吸収線量は、０．１ｍＧｙ／ＭＢｑ（０．３８ｒａｄ／ｍＣｉ）である。患者におけるリンパ腫に対する１３１Ｉ標識抗体での経験から、反応は、腫瘍に対して０．５〜２Ｇｙで達成可能である。この線量範囲を送達するのに必要な５〜２０ＧＢｑ（１３５〜５４０ｍＣｉ）は、表に示した、正常器官が吸収する線量の推定値を仮定すると、正常な器官の許容範囲内である。２０ＧＢｑの全投与活性は、腎臓および骨髄へはそれぞれ０．２および０．０２Ｇｙをもたらす。外部のビームおよび放射性ペプチドの経験に基づき、腎臓は毒性発症の前に、２５〜２７Ｇｙを耐容できる；赤色骨髄の最大耐容線量は２Ｇｙである。５４０ｍＣｉの線量の投与は、運搬上の問題を生じる可能性があるが、しかしこれは、投与を３〜４回の注射に分割することにより対応可能である。
【０１４４】
例１３：細胞レベルの線量測定分析
モンテカルロシミュレーションパッケージＧＥＡＮＴ４を用いて、球状細胞の球状腫瘍モデルを、種々の大きさ（１辺当たり〜１０個の細胞、〜２０個の細胞、〜５０個の細胞、〜１５０個の細胞、）の六方格子（立方格子に対して７４％占有容積対５２％）に構築した（直径１５μｍ）。１３１Ｉを、３つの異なるパターンに従ってランダムに崩壊させた：
−全細胞が１３１Ｉを含有
−５０％の細胞が１３１Ｉを含有
−１０％の細胞が１３１Ｉを含有。
各細胞に蓄積されたエネルギーを収集し、各細胞への線量を（通常）１０００万回のモンテカルロ履歴後に計算した。細胞クラスター内の活性分布を図２４に示す。
【０１４５】
ＴＫを発現する細胞のパーセンテージに関わらず、腫瘍細胞クラスターへの平均の吸収線量は２５０万回の崩壊当たり約４．３〜４．４Ｇｙである。細胞当たりの線量はＴＫ発現細胞の低いパーセンテージにおいてわずかに増加し、これは、全活性が少数の（ランダムに選択された）細胞に配分されるからである。細胞当たりの平均線量は、断片取り込み活性からは独立しており、これは、腫瘍細胞サイズに対して１３１Ｉβ粒子放出の範囲が長いためである。
【０１４６】
ＴＫ発現細胞の異なるパーセンテージの、腫瘍内の吸収線量プロファイルへの影響を、下の図に示す。ＴＫ発現細胞のパーセンテージに関わらず、腫瘍細胞クラスターへの平均吸収線量は、２５０万回の崩壊当たり約４．３〜４．４Ｇｙである。細胞当たりの線量はＴＫ発現細胞の低いパーセンテージにおいて、わずかに増加し、これは、全活性が少数の（ランダムに選択された）細胞に配分されるからである。細胞当たりの平均線量は、断片取り込み活性からは独立しており、これは、腫瘍細胞サイズに対してＩ−１３１β粒子放出の範囲が長いためである。
例１〜６に記載の実験は、次の方法および材料を用いて行った。
【０１４７】
細胞株およびプラスミド
２種のＥＢＶ（＋）バーキットリンパ腫細胞株およびＥＢＶを欠いた１つのサブクローン（Ｒａｅｌ、ＡｋａｔａＥＢＶ（＋）、ＡｋａｔａＥＢＶ（−））を試験した（Ambinder et al., Hematol Oncol Clin North Am 2003;17:697-702, v - vi; and Feng et al., J Virol 2004;78:1893-902）。腫瘍細胞株は、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および１００ｍＭのＬ−グルタミンを有する１６４０ＲＰＭＩ（Life Technologies）に維持した。ヒト骨肉種細胞株（１４３Ｂ）を、前に記載のようにして（）、ＥＢＶ−ＴＫを発現するプラスミドおよび対照ベクター（ＰＣＤＮＡ３）で安定にトランスフェクトした。１４３Ｂ細胞株を、１５ｎｇ／ｍＬのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、Sigma, St. Louis, MO）に通して、細胞ＴＫ（−）表現型を維持した。ＴＫ−１４３ＢおよびＶ１４３Ｂ細胞を、３７℃および５％ＣＯ２において、１０％ウシ胎仔血清（Gemini BioProducts, Calabasas, CA）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン２ｍＭ、Ｌ−グルタミン４００μｇ／ｍＬ、選択用のＧ４１８を補足したダルベッコ修飾基本培地（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）中に維持した。ＢＸ−１は、ＢＸＬＦ１ ＯＲＦが破壊された、ＧＦＰをコードする組換えＥＢＶ細胞株である。ＧＦＰはＣＭＶプロモーターから転写された。Ａｋａｔａ−ＢＸ１およびＡＧＳ−ＢＸ１細胞は、それぞれこの組換えＥＢＶを含むＡｋａｔａ細胞およびＡＧＳ細胞である（Wang et al. J Virol 77, 9590-9612 (2003)）。ＩκＢαベースのＮＦ−κＢスーパーレプレッサー（ｓｒ）である、ＩκＢα（ｓｒ）を、ＩκＢキナーゼの標的であるセリン３２および３６を変異させるか、またはこれらの標的を含有するＩκＢのＮ末端部分を除去することにより、作製した。ＩκＢα（ｓｒ）は、刺激誘発性のＮＦ−κＢの活性化を、そのリン酸化および続く分解を妨害することにより阻害する。ＤＮＡ断片を発現ベクターｐＥＶＲＦにクローニングした（Wang et al., (1999) Nat Med 5, 412-7; Fu et al., (2004) J Biol Chem 279, 12819-26）。
【０１４８】
化学物質
ボルテゾミブは、Millennium Predictive Medicine Inc.（Cambridge, MA）から提供された。５−アザ−２’−デオキシシチジン、酪酸ナトリウムおよびガンシクロビル（ＧＣＶ）は、Sigma（St. Louis, MO）から購入した。［２−１４Ｃ］２’−フルオロ−２’−デオキシ−β−Ｄ−５−ヨードウラシル−アラビノフラノシド（［１４Ｃ］ＦＩＡＵ）、ＦＩＡＵおよび２’−フルオロ−２’−デオキシ−ウラシル−β−Ｄ−アラビノフラノシド（ＦＡＵ）は、Moravek Biochemicals (Brea, CA)から入手した。［１２５Ｉ］ＮａＩは、MP Biomedicals (Costa Mesa, CA)から購入した。［１２５Ｉ］ＦＩＡＵは、Jacobs et al., (2001) J Nucl Med 42の方法に従って合成した。簡潔に述べると、３０μｇのＦＡＵ（１．２２ｍｍｏｌ）を１７０μＬの２ＭのＨＮＯ３に溶解した。この溶液に、１〜５ｍＣｉの［１２５Ｉ］ＮａＩを加え、内容物を１３０℃で４５分間加熱した。反応物を次に、１５０μＬの高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の移動相（２０：７９．９：０．１比率のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ：トリメチルアミン）で急冷した。得られた［１２５Ｉ］ＦＩＡＵを次に、逆相ＨＰＬＣにてPhenomenex Luna C18 semi-prepカラム（Phenomenex, Torrance, CA）（１０μｍ、４．６×２５０ｍｍ）を用いて、上述の均一溶媒移動相を流速２ｍＬ／分で用いて精製した。産物は減圧下で濃縮し、０．９％生理食塩水中に製剤化し、０．２２μｍシリンジフィルターを通して滅菌ろ過した。製剤は〜１ｍＣｉ／ｍＬに維持して、マウス尾静脈への注射容積を最小化した。最終の放射性化学物質の収率は〜５０％であり、放射化学的純度は＞９９％であった。具体的な放射活性は常に≧２，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌであった。
【０１４９】
in vitro細胞内取り込み
in vitroでの［１４Ｃ］ＦＩＡＵ取り込み試験のために、細胞を５×１０５細胞／ｍＬで播種し、１０ｎＭのボルテゾミブと共に３７℃で６〜１２時間インキュベートした。これらを洗浄し、次に０．０４μＣｉ／ｍＬの［１４Ｃ］ＦＩＡＵと共に、３７℃で２、４、８、２４、４８、および７２時間インキュベートした。細胞を遠心分離によりペレット化し、非標識ＦＩＡＵで洗浄した。単離細胞およびプールされた培地および洗浄液の放射活性を、Beckman Coulter LS5000TAシンチレーションカウンター（Fullerton, CA）を用いたシンチレーション計数により、別々に計数した。全細胞タンパク質を、溶解緩衝液中（０．０５Ｍのトリス、ｐＨ７．６、０．１５ＭのＮａＣｌ、１％トリトン−Ｘ１００、２ｍＭのＥＤＴＡ）でインキュベートすることにより抽出し、細胞片は遠心分離により除去した。上清を収集し、タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce, Rockford, IL）により製造業者の指示に従って決定した。細胞取り込みは、蓄積比、すなわち細胞１ｇ当たり１分当たりのカウント数（ｃｐｍ／ｇ）を、培地のｃｐｍ／ｇ（ｍＬ）で割ったものにより表わした。
【０１５０】
腫瘍の発生
５×１０６の細胞を、２００μＬのMatrigel Matrix （ED Biosciences, Bedford, MA）に再懸濁させ、６〜７週齢の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの肩近くに皮下注射した。続く試験は、腫瘍が直径約１ｃｍになった時に実施した。
【０１５１】
免疫ブロット解析
ＥＢＶ−ＴＫまたはＥＢＶ−ＺＴＡの発現を検出するために、全細胞タンパク質を最初に、プロテーアーゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液（０．０５Ｍのトリス、ｐＨ７．６、０．１５ＭのＮａＣｌ、１％トリトン−Ｘ１００、２ｍＭのＥＤＴＡ）で細胞を１０分間４℃で処置することにより抽出した。次の試薬を、１ｍＬの溶解緩衝液に１０分間４℃にて加えた：２μＬのロイペプチン（５ｍｇ／ｍＬ）、１μＬの０．２ＭのＮａ３ＶＯ４、１μＬのＮａＦ、１μＬのアプロチニン（１０ｍｇ／ｍｌ）、１μＬのペプスタチン（２ｍＭ）、および１０μＬのＰＭＳＦ（１００ｍＭ）。遠心分離後、上清を収集し、−８０℃で保管した。タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce, Rockford, IL）により製造業者の指示に従って決定した。全細胞タンパク質の１０μｇのアリコートを、７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分画した。タンパク質をＰＲＯＴＲＡＮニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell, Keene, NH）に移した。膜は、ＰＢＳ中のブロットグレードの５％脱脂粉乳（Bio-rad, Hercules, CA）で０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）と共に４℃で一晩ブロックした。膜を次にＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、次いで、合成ＥＢＶ−ＴＫペプチド（GRHESGLDAGYLKSVNDAC）で免疫化したウサギからの１／１，０００希釈のウサギ抗ＴＫ血清、または、抗ＺＴＡモノクローナル抗体（Argene, North Massapequa, NY)）と共に、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、膜を、ＰＢＳ−Ｔ中に１／５，０００希釈した、ＨＲＰ複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、またはＨＲＰ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）と共に、室温で１時間インキュベートした。膜を２回洗浄し、タンパク質をＥＣＬウェスタンブロット検出試薬（Amersham Pharmacia Biotech）で検出した。膜はＸ−ＯＭＡＴフィルム（Kodak, Rochester, NY）に室温で暴露した。
【０１５２】
ＥＢＶコピー数のためのリアルタイムＰＣＲ
処置した細胞からのゲノムＤＮＡを、QIAamp DNA mini kit (Qiagen, CA)を用いて、製造業者の指示に従って抽出した。ＰＣＲを、TaqManＰＣＲコア試薬キット（Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ）を用いて５０μＬ容積にセットした。蛍光プローブは、Perkin-Elmer Applied Biosystemsで特注合成した。ＰＣＲプライマーはGibco BRL（Frederick, Md.）で合成した。各反応物は、５μＬの１０×緩衝液Ａ（４ｍＭＭｇＣｌ２）、増幅プライマー（３００ｎＭ）、蛍光プローブ（２５ｎＭ）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ（それぞれ２００μＭ）、ｄＵＴＰ（４００ｕＭ）、１．２５ＵのAmpliTaq Gold、および０．５ＵのAmpEraseウラシルＮ−グリコシラーゼを含有した。抽出したゲノムＤＮＡを増幅に用いた。ＤＮＡ増幅は、９６ウェル反応プレートでPerkin-Elmer Applied Biosystems 7700配列検出器にて行った。各試料はデュプリケートで分析し、多重陰性の水のブランクを、各分析に加えた。較正曲線は平行して、各分析についてデュプリケートで走らせ、ＥＢＶ陽性細胞株ナマルバ（Namalwa）から抽出したＤＮＡを標準とした。
【０１５３】
動物の準備
全ての作業は、Johns Hopkins Animal Care and Use Committeeの規則に従って実施した。雄の成体ＳＣＩＤマウス（５〜６週齢）は、National Cancer Institute (Frederick, MD)から購入した。画像化の３日前に、全てのマウスに、０．９％ＮａＩ溶液１ｍＬの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を３日間毎日与えて、遊離の放射性ヨウ素の甲状腺取り込みをブロックした。［１２５Ｉ］ＦＩＡＵ注射の２４時間前に、ボルテゾミブにより溶解誘発を開始させた。各マウスには、２μｇ／ｇのボルテゾミブの用量をｉ．ｐ．で注射した。ボルテゾミブは、ＰＢＳ中に新鮮に作製し、各注射の直前に、０．２μｍシリンジフィルター（Millipore, Billerica, MA）により滅菌ろ過した。対照マウスには、ＰＢＳのみをｉ．ｐ．で注射した。放射性トレーサーの注射の日に、動物を２５ｍｇ／ｍＬのケタミンと２ｍｇ／ｍＬのアセプロマジンの０．９％生理食塩水中の混合物２．３ｍＬ／ｋｇによりｉ．ｐ．注射で麻酔した。イソフルラン（０．５〜１Ｌ／分で０．５％〜１％）を投与して、麻酔を維持した。次に、線量キャリブレータ（CRC-15R, Capintec, Ramsey, NJ）を用いて測定した４．４４ＭＢｑ（１．２ｍＣｉ）の［１２５Ｉ］ＦＩＡＵを、各マウスの尾静脈に注射した。
【０１５４】
ex vivoでの生体内分布
ボルテゾミブによる処置の後、ＰＢＳ中の０．０７４ＭＢｑ（２μＣｉ）の［１２５Ｉ］ＦＩＡＵを尾静脈を介して注射した。４匹のマウスを各指示時点において頚椎脱臼により犠牲にした。腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓、脂肪、血液および筋肉を取り出して計量し、その後組織の放射活性を自動ガンマカウンターを用いて測定した。０．１ｍＬの血液試料も収集した。組織１グラム当たりの注射線量（％ＩＤ／ｇ）を、初期線量の標準希釈試料との比較により計算した。標準偏差（ＳＤ）も計算した。
【０１５５】
平面ガンマ画像化およびＳＰＥＣＴ−ＣＴ
画像化を、ex vivo生体内分布試験に付随して行った。定量的データは、ＳＰＥＣＴ−ＣＴを用いた場合を除いて、画像からは取得しなかった（次を参照）。Ｘ−ＳＰＥＣＴ（Gamma Medica Instruments, Northridge, CA）は、２０．５ｃｍ×１５ｃｍ×９ｃｍの寸法のガンマ線検出器ヘッド、および１２０ｍｍ×１２５ｍｍの視野（ＦＯＶ）を有する。本研究で用いた高解像度平行コリメータは、次の仕様である：穴の直径１．２２ｍｍ、隔壁厚さ０．２０ｍｍ、穴の長さ２５．４ｍｍ。検出器の材料またはシンチレーター結晶は、ＮａＩ［ＴＩ］からなり、これは２ｍｍ×２ｍｍ×６ｍｍのピクセルサイズを有する。マウスを平行コリメータ上に腹臥位で配置し、イソフルランによる麻酔下に維持し、イソフルランは精密噴霧器（VetEquip, Pleasanton, CA）を用いて送達した。Ｘ−ＳＰＥＣＴと共に提供されたLumaGEM（登録商標）ソフトウェアの静的取得プロトコルを用いた。各マウスについて、１０分間の高解像度走査を得た。ＳＰＥＣＴ−ＣＴは、上記のガンマ線検出器とＣＴ検出器を順番に用いて、マウスをガントリーから動かすことなく実施した。
【０１５６】
画像化データの解析
画像は、ImageJ 1.30v（(http://rsb.info.nih.gov/ij, National Institutes of Health, Bethesda, MD）またはAMIDE（A Medical Image Data Examiner）を用いて、ＳＰＥＣＴ−ＣＴに対してはSource Forge（http://amide.sourceforge.net）から提供されているフリーソフトウェアを用いて解析した。
【０１５７】
細胞株
Ａｋａｔａ−ＢＸ−１細胞は、組換えＧＦＰＥＢＶを有するＡｋａｔａＥＢＶ（−）細胞に由来する。ＡＧＳ−ＢＸ−１細胞は、組換えＧＦＰ−ＥＢＶを有するＡＧＳ細胞である（Haubner, R., Avril, N., Hantzopoulos, P.A., Gansbacher, B. & Schwaiger, M. In vivo imaging of herpes simplex virus type 1 thymidine kinase gene expression: early kinetics of radiolabelled FIAU. Eur J Nucl Med 27, 283-291 (2000)）。ＧＦＰはＣＭＶ前初期プロモーターから転写する。ＣＭＶプロモーターの非特異的活性化を制御するために、ＣＭＶプロモーター駆動ＧＦＰとＰｅｇｆｐ Ｎｉプラスミド（CLONTECH）を有する安定なＨｅｌａ細胞株を用いた。細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補足したＲＰＭＩ １６４０培地（Ａｋａｔａ）、ＤＭＥＭ（Ｈｅｌａ）またはハムのＦ−１２培地（ＡＧＳ−ＢＸ１）中で増殖させた。プラスミドＨＣ１３１は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に結合したＢＺＬＦ１ ＩＥプロモーター配列（ｍＲＮＡ開始部位に対して−５７８−＋１３）を含む。ＨＣ１３１プラスミドを含む安定な細胞株は、ＨＣ１３１およびｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏのＡＧＳ細胞への共トランスフェクションにより確立し、１μｇ／ｍｌプロマイシンにより選択した。ルシフェラーゼの適当な基底レベルを安定に発現するＡＧＳ細胞のクローンを、薬物スクリーンに用いた。ＡＧＳＨＣ１３１は、１０％ＦＢＳおよび１ｕｇ／ｍｌのプロマイシンを含むハムＦ−１２中で増殖させた。ＬＣＬ、ＲａｊｉおよびＳＮＵ−７１９は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。全ての細胞は、３７℃で５％ＣＯ２および１００％の湿度にて増殖させた。
【０１５８】
化学物質およびライブラリ
ジョーンズホプキンス臨床化合物ライブラリ（ＪＨＣＣＬ）は、２７２０種の化合物から構成される。全ての臨床化合物はＤＭＳＯまたはＰＢＳに溶解され、２００μＭにおいて９６ウェルプレートにフォーマットされていた。各プレートは、８０の薬物ウェルおよび１６のブランク対照ウェル（各側に１カラム）を含んでいた。抗ＩｇＧは、ＡＢＩから得た。トラニラスト、メベンダゾール、インドプロフェン、Ａｒａ−ｃ、酪酸塩、バルプロエート、レフルノミドおよびＴＰＡは、Sigma (St. Louis, MO)から得た。ボルテゾミブはMillennium Predictive Medicine Inc. (Cambridge, MA)から得た。プルバラノールＡはCalbiochemから得た。
溶解誘発試験のために、細胞は１０６／ｍｌで播種し、試験化合物で４８時間処置した。対照の処置なし細胞は平行してインキュベートした。
【０１５９】
ＧＦＰ−マイクロプレート読み取り
ＧＦＰ蛍光走査については、ＡＫＡＴＡ−ＢＸ−１細胞のアリコートを、通常の９６ウェルプレート（Costar3595）に１ウェル当たり２×１０５細胞／２００μｌで入れた。次に各セルに対して、試験する薬物（１０μｌ、２００μＭ）を薬物プレートから細胞プレートへと移して混合し、濃度１０μＭとした。試験薬物に加えて、プレートには細胞なしまたは薬物なしの培地のウェル、および細胞は有するが薬物なしのウェルも含めた。抗ＩｇＧを陽性対照として４つのウェルに加えた。プレートは３０日後まで維持した。読み取りは隔日で行った。プレートは蛍光マイクロプレート蛍光光度計（Packard Bioscience Company, Wellesley, MA）で走査した。ＧＦＰの励起は４８５ｎｍで行い、一方、発光は５３０ｎｍで測定した。読み取りはスプレッドシート解析用にExcelに変換した。最初の読み取りは、ライブラリ薬物添加の３０分後に行って、自己蛍光を有する薬物を消去した。３日目に、陽性対照はＧＦＰシグナルの増加を示し、陽性対照の読み取りの２／３を超える読み取りをヒットとした。
【０１６０】
フシフェラーゼレポーターアッセイ
ルシフェラーゼアッセイに対して、ＡＧＳ−ＨＣ１３１細胞を、４×１０４／２００μｌの濃度で９６ウェルプレートに一晩前に播種した。各ウェルに対して、１０μｌの２００μＭの薬物を、薬物プレートから細胞プレートへと移して混合した。酪酸塩を各プレートの１つのブランクカラムに陽性対照として加えた。次にプレートを、ルシフェラーゼアッセイ前の４８時間、インキュベートした。ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ試薬はPromegaから入手し、アッセイは製造業者の指示に従って行った。
【０１６１】
ウェスタンブロット解析
細胞はＰＢＳで２回洗浄した。全細胞タンパク質を溶解緩衝液で抽出した。タンパク質をポリアクリルアミド中で電気泳動にかけ、次にＰＲＯＴＲＡＮニトロセルロース膜（Schleicher&Schuell, Keene, NH）に移した。ブロットを一次抗体（Ａｂ）で一晩４℃にてプローブした。ＨＲＰ複合二次Ａｂを洗浄後に加え、強調化学発光システム（ＥＣＬ）（Amersham）で検出した。次の抗体を用いた：抗ＺＴＡ（Argene）、抗ｆ３アクチン（Sigma）、抗マウス（Sigma）。
【０１６２】
ＩＦＡ
ＬＣＬ細胞は、１μＭのＡｒａ−ｃで４８時間処置した。細胞を次にＰＢＳで洗浄し、再懸濁させ、ポリリジンガラススライド上にプレートした。間接免疫蛍光アッセイおよび蛍光顕微鏡法を実施した。スライドをメタノール中に−２０℃で固定し、ＰＢＳで洗浄し、次に一次抗体抗ＺＴＡ（１：２００）（Argen）でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次にロバローダミン複合ＩｇＧ（Jackson Pharmaceuticals, west Grove, Pa）の二次抗体インキュベーションを行った。４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Vector Shield）を有する封入溶液を用いて、細胞の核をマークした。次にスライドを観察して、４０×対物レンズでＣＣＤカメラ（Princeton Instruments）を備えたE800顕微鏡（NIKON）により、Metamorphソフトウェア（Universial Imaging-Molecular Devices）を用いて写真撮影した。
【０１６３】
定量的ＰＣＲ
ＥＢＶゲノムをICyclerシステム（Biorad, Hercules, CA）を有するリアルタイムＰＣＲにより定量化した。テンプレートＤＮＡをmini blood DNA Kit（Qiagen,Valencia, CA）で抽出した。ＢａｍＨＩ−Ｗプライマーは、BamH5'（5'- CCCAACACTCCACCACACC-3 '）およびBamH3'（5 '-TCTTAGGAGCTGTCCGAGGG3'）および蛍光プローブ（5'-(FAM)CACACA CTACACACACCCACCCGTCTC3'）であった。較正曲線は、各解析について、細胞当たり２つの組込みウイルスゲノムを含む２倍体ＥＢＶ陽性細胞株ナマルバから抽出したＤＮＡを標準として用いて、平行してデュプリケートで走らせた。増幅データはMyiQ単色リアルタイムＰＣＲ検出器（Biorad）により収集し、Bioradが開発したMyiQソフトウェアにより解析した。
例７〜１０に報告の結果は、次の方法および材料を用いて行った。
【０１６４】
細胞株およびプラスミド
リンパ腫細胞株を、１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および１００ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０（Life Technologies, Gaithersburg, MD）中の懸濁培養物中に維持した（上述の通り）。ＴＫ−１４３ＢおよびＶ１４３Ｂ細胞は、前に記載のように（Moore et al., Antimicrob Agents Chemother 45, 2082-2091 (2001)）、ＥＢＶ−ＴＫを発現するプラスミドまたは対照ベクター（ＰＣＤＮＡ３）のどちらかを担持する、ヒト骨肉種（１４３Ｂ）細胞株由来の安定にトランスフェクトされた株である。これらを、１０％ウシ胎仔血清（Gemini BioProducts, Calabasas, CA）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００Ａｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、および選択用の４００Ａｇ／ｍＬのＧ４１８を補足した、ＤＭＥＭ（Life Technologies）中に維持した。ＫＴ移植可能ＥＢＶ（＋）胃腺癌をＳＣＩＤマウスに継代した（Chong et al., J Virol 76, 6825-6831 (2002)）。
【０１６５】
化学物質
ボルテゾミブを静脈内に１．６７μｇ／グラムで投与した。ＦＩＡＵ、および２’−フルオロ−２’−デオキシ−ウラシル−β−Ｄ−アラビノフラノシドは、Moravek Biochemicals (Brea, CA)から入手した。［１２５Ｉ］および［１３１Ｉ］ＮａＩは、MP Biomedicals (Costa Mesa, CA)から購入した。［１２５Ｉ］ＦＩＡＵおよび［１３１Ｉ］ＦＩＡＵは、上に記載のようにして合成した。画像化または処置のために、ＦＩＡＵをボルテゾミブの２４時間後に投与した。記載の各実験において、ボルテゾミブは単一用量として投与した。
【０１６６】
腫瘍発生
培養細胞株をマイコプラズマについて試験し、陰性であることを見出した。細胞（５×１０６）を、２００μＬのMatrigel Matrix（BD Biosciences, Bedford, MA）中に再懸濁させ、６〜７週齢の雄の重症複合免疫不全マウスにＳＣ注射した。最長の垂直方向腫瘍直径のキャリパーによる測定を隔日で行った。腫瘍容積を３次元楕円に関する式に従って推定した：４π／３×（幅／２）２×（長さ／２）（LeBlanc et al., Cancer Res 62, 4996-5000 (2002)）。処置および画像化試験は、腫瘍が直径〜１ｃｍのサイズに達した時に行った。
【０１６７】
ex vivo生体内分布
上に記載したように、ＰＢＳ中の［１２５Ｉ］ＦＩＡＵを尾静脈に注射し、３〜４匹のマウスを各指示された時点で犠牲にし、器官を取り出して計量し、組織の放射活性を自動ガンマカウンターで測定した。組織１グラム当たりの注射線量のパーセント（％ＩＤ／ｇ）を、初期線量の標準希釈試料との比較により計算した。
【０１６８】
平面ガンマ画像化、ＳＰＥＣＴ−コンピュータ断層撮影および画像解析
本明細書に既に記載のように、画像化を、ex vivo生体内分布試験に付随して行った。Ｘ−ＳＰＥＣＴ（Gamma Medica Instruments, Northridge, CA）は、２０．５×１５×９ｃｍの寸法のガンマ線検出器ヘッド、および１２０ｍｍ×１２５ｍｍの視野を有する。本研究で用いた高解像度平行コリメータは、次の仕様である：穴の直径１．２２ｍｍ、隔壁厚さ０．２０ｍｍの、穴の長さ２５．４ｍｍ。検出器の材料はＮａＩ［ＴＩ］からなり、これはピクセルサイズ２×２×６ｍｍを有する。マウスを平行コリメータ上に腹臥位で配置し、イソフルランによる麻酔下に維持した。各マウスについて、１０分間の高解像度走査を得た。ＳＰＥＣＴ−ＣＴを、上記のガンマ線検出器とＣＴ検出器を順番に用いて、マウスをガントリーから動かすことなく実施した。画像データの解析は、ImageJ v1.30（NIH, Bethesda, MD）またはAMIDE（A Medical Image Data Examiner）により、ＳＰＥＣＴ−ＣＴについては（SourceForgeから提供されているフリーソフトウェア）を用いて行った。
生物統計。直線回帰および曲線適合は、ウィンドウズ（登録商標）のGraphPad Prism software version 5.00, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.comを用いて行った。
【０１６９】
その他の態様
前述の説明から、本明細書に記載の発明に対し変更および改変を行い、これを種々の用途および条件に適合させられることが明らかである。かかる態様もまた、以下のクレームの範囲内である。
本明細書の変数の任意の定義における要素のリストの記述は、その変数の、リストに挙げられた要素の任意の単一要素としての、またはその組合せ（または副組合せ（subcombination））としての定義も含む。本明細書の態様の記述は、その態様の、単一の態様としての、または任意の他の態様もしくはその一部との組合せとしての態様を含む。
本明細書で言及された全ての特許および刊行物は、各独立した特許および刊行物が具体的および個別に参照として組み込まれると指示されるのと同様に、同一の程度において、本明細書に参照として組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−１１Ｃ】
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【図１１Ｄ−１１Ｅ】
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【図１２Ａ−１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ−１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ−１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【国際調査報告】
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