(57)【要約】  本発明は、（ａ）胚性幹細胞由来の胚様体を含有する培養液を、培養液中の溶存酸素濃度が約１ないし約５ｐｐｍの範囲になるように処理する工程と、（ｂ）酸素分圧が約１５％以下である培養器中で、工程（ａ）で得られた培養液を培養し、前記胚様体を血管内皮前駆細胞に分化させる工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた培養液から、血管内皮前駆細胞を単離する工程と、を含む胚性幹細胞由来の胚様体から血管内皮前駆細胞への分化方法を提供する。
2010538639.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）胚性幹細胞由来の胚様体を含有する培養液を、培養液中の溶存酸素濃度が約１ないし約５ｐｐｍの範囲になるように処理する工程と、
（ｂ）酸素分圧が約１５％以下である培養器中で、工程（ａ）で得られた培養液を培養し、前記胚様体を血管内皮前駆細胞に分化させる工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた培養液から、血管内皮前駆細胞を単離する工程と、を含む胚性幹細胞由来の胚様体から血管内皮前駆細胞への分化方法。
【請求項２】
工程（ａ）で、前記培養液中の溶存酸素濃度が、約２ｐｐｍないし約３ｐｐｍの範囲であることを特徴とする請求項１に記載の分化方法。
【請求項３】
工程（ａ）で、前記処理が、不活性ガスをバブリング（bubbling）することによって行われることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の分化方法 。
【請求項４】
前記不活性ガスが、アルゴン（Ａｒ）、ヘリウム（Ｈｅ）、または窒素（Ｎ２）ガスであることを特徴とする請求項３に記載の分化方法。
【請求項５】
前記不活性ガスが、窒素（Ｎ２）ガスであることを特徴とする請求項４に記載の分化方法。
【請求項６】
工程（ｂ）で、前記酸素分圧が、約１％ないし約１０％であることを特徴とする請求項１に記載の分化方法。
【請求項７】
前記培養が、約１週間ないし約３週間行われることを特徴とする請求項１または請求項６に記載の分化方法。
【請求項８】
工程（ｃ）で、前記単離が、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用して行われることを特徴とする請求項１に記載の分化方法。
【請求項９】
ＦＡＣＳを使用した単離が、ＣＤ１３３及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１をマーカとして、両者がいずれも陽性である細胞を単離することによって行われることを特徴とする請求項８に記載の分化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞由来の胚様体を血管内皮前駆細胞に分化させる方法に係り、さらに詳細には、胚性幹細胞由来の胚様体を含有する培養液内に低酸素条件を直接誘導することによって、低酸素培養液条件を利用して、血管内皮前駆細胞を高収率及び高純度で分化及び単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胚性幹細胞は、無限の自己複製能（self-renewality）と、人体を構成する３つの胚葉（内胚葉、外胚葉、中胚葉）に分化しうる全能性とを有している (Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM, Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science (1998) 282:1145-1147)。ヒト胚性幹細胞の神経細胞、内皮細胞、筋肉細胞、膵臓細胞などへの分化に関する最近の研究の成果から、ヒト胚性幹細胞は、難病治療の研究において、重要な役割を果たすものと考えられている。
【０００３】
従って、ヒト胚性幹細胞の特定細胞への分化方法、及び分化した細胞の単離方法を介した高純度の細胞治療法の開発により、薬物や手術に基づく既存の治療法より優れた長所を有する新しい治療法として、難病治療の核心的技術とともに、画期的かつ根本的な治療法が提供されるであろう。
【０００４】
血管内皮前駆細胞を使用した細胞治療法は、心血管疾患、脳血管疾患、糖尿病性潰瘍のように、急増している血管疾患に直接的あるいは間接的に適用されるものと考えられる。
【０００５】
しかし、従来の分化及び単離の技術を使用して得られた血管内皮前駆細胞には、願わざる細胞や未分化細胞が共存する。従って、高収率及び高純度で、血管内皮前駆細胞に分化させる方法、及び分化した血管内皮前駆細胞を単離する方法を開発する必要がある。
【０００６】
Levenberg Sらによって行われた研究によれば、ヒト胚性幹細胞から得られた胚様体は、自発的に血管内皮細胞に分化し、該血管内皮細胞は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用して、分化した胚様体から単離される (Levenberg S, Golub JS, Amit M, Itskovitz-Eldor J, Langer R. PNAS (2002) 99, 4391-4396)。しかし、分化効率があまりにも低く、胚様体中でわずか２％しか血管内皮細胞に分化しなかった。
【０００７】
低酸素条件の誘導は、効率的な分化方法の一つとして報告されている。Diana L．Ramiez-Bergeronらは、低酸素条件が、胚様体の中胚葉細胞及び血管芽細胞への分化を促進することを報告している(Diana L. Ramiez-Bergeron, Anja Runge, Karen D. Cowden Dahl, Hans Joerg Fehling, Gordon Keller and M. Celeste Simon1, Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development. Development (2004) 131, 4623-4634)。
【０００８】
低酸素条件を誘導する方法は、低酸素培養器を利用する方法、市販のガスパック（gas pack）（Becton Dickinson／ＢＢＬ gas generator）を利用する方法、及びＣｏＣｌ２及びＤＦＸ（defferrioximine）などの試薬を利用する方法に分けられる。しかし、低酸素培養器を使用する場合、低酸素条件が、物理的にしか誘導されないので、低酸素条件が培養液内に直接誘導されない。また、初期段階で低酸素条件を持続的に維持し難く、また低酸素誘導の程度を直接測定し難い。ガスパックを利用する場合、低酸素培養器を使用するのと同様に、低酸素条件が物理的にしか誘導されず、また低酸素条件が１回しか誘導されない。さらに、ガスパックは、酸素分圧が１％以下である低酸素条件しか誘導できないために、酸素分圧が１％以下の低酸素条件で育つことができる細胞にしか用いることができない。ＣｏＣｌ２及びＤＦＸのような化学試薬は、細胞のシグナル伝達系に影響を及ぼし、分子レベルでの低酸素条件を誘導できるが、このような化学試薬は細胞毒性を有するため、その使用が制限される。上記のように、細胞の分化及び培養にこれまで使われてきた低酸素培養液の誘導方法には、低酸素条件の維持が不安定であること、細胞毒性があること、細胞での使用が限られていることといったさまざまな問題点が存在する。さらに、先行技術で提示されている方法は、血管内皮前駆細胞への分化効率が低く、その純度も低いといった短所を有している。
【０００９】
特に、Wang GLらは、低酸素条件を曝露した後の初めの４〜６時間が、ヒト体内での低酸素応答の媒介因子である低酸素誘導因子（ＨＩＦ）−１αの発現に重要であると報告している(Wang GL. Semenza GL. General involvement of hypoxia-inducible factor 1 in transcriptional response to hypoxia. PNAS .May 1;90(9):4304-8. 1993)。従って、単に低酸素培養器で培養液を培養するだけでは、血管内皮前駆細胞を高い収率で得ることができない。
【００１０】
従って、難治性血管疾患に対する細胞治療法の開発のためには、高収率及び高純度で血管内皮前駆細胞に分化させる方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、高収率及び高純度で、胚性幹細胞由来の胚様体を血管内皮前駆細胞に分化させる方法、及び分化した血管内皮前駆細胞を単離する方法を開発するために鋭意研究を行った。その結果、胚性幹細胞由来の胚様体を含有する培養液内に低酸素条件を直接誘導して、胚様体周囲の環境に低酸素条件を直接曝露すると、血管内皮前駆細胞への分化効率が大きく上昇するということを発見した。また、ＣＤ１３３及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のいずれも陽性である細胞（すなわち、二重陽性細胞群（double positive population））を、ＦＡＣＳにより単離することによって、純粋な血管内皮前駆細胞を単離することができる。
【００１２】
従って、本発明は、高収率及び高純度で、胚性幹細胞由来の胚様体を血管内皮前駆細胞に分化させる方法、及び分化した血管内皮前駆細胞を単離する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一態様によって、（ａ）胚性幹細胞由来の胚様体を含有する培養液を、培養液中の溶存酸素濃度が約１ないし約５ｐｐｍの範囲になるように処理する工程と、（ｂ）酸素分圧が約１５％以下である培養器中で、工程（ａ）で得られた培養液を培養し、前記胚様体を血管内皮前駆細胞に分化させる工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた培養液から、血管内皮前駆細胞を単離する工程と、を含む胚性幹細胞由来の胚様体から血管内皮前駆細胞への分化方法が提供される。
【００１４】
工程（ａ）で、前記培養液中の溶存酸素濃度は、約２ｐｐｍないし約３ｐｐｍであればよく、前記処理は、アルゴン（Ａｒ）、ヘリウム（Ｈｅ）、または窒素（Ｎ２）ガスのような不活性ガス、さらに望ましくは、窒素（Ｎ２）ガスをバブリング（bubbling）することによって行われうる。
工程（ｂ）で、前記酸素分圧は、約１％ないし約１０％であればよく、前記培養は、約１週間ないし約３週間行われうる。
工程（ｃ）で、前記単離は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用して行われうる。ＦＡＣＳを使用した単離は、ＣＤ１３３及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１をマーカとして、両者がいずれも陽性である細胞を単離することによって行われうる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法は、胚性幹細胞由来の胚様体を含有する培養液を、低酸素条件になるように（例えば、溶存酸素濃度が１ないし５ｐｐｍの範囲になるように）、処理することを含むことによって、胚様体周囲の環境に低酸素条件を直接曝露し、血管内皮前駆細胞への分化効率を大きく上昇させることができる。
【００１６】
また、本発明によって、窒素（Ｎ２）ガスのような不活性ガスのバブリングを利用して、低酸素条件を直接的、安定的、効率的かつ簡単に誘導できる。特に、窒素（Ｎ２）ガスのような不活性ガスのバブリングは、培養液に存在する蛋白質を変性させず、かつ細胞に対する毒性がないので、ＣｏＣｌ２及びＤＦＸのような化学試薬によって引き起こされうる問題が発生しない。
【００１７】
また、本発明によって、単一マーカの代わりに、二重マーカ（すなわち、ＣＤ１３３及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１二重マーカ）を使用して、ＣＤ１３３及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のいずれも陽性である細胞（すなわち、二重陽性細胞群）をＦＡＣＳにより単離する場合、血管内皮前駆細胞を高純度で単離できる。従って、本発明の方法によって、血管内皮前駆細胞を高収率及び高純度で単離できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】窒素（Ｎ２）ガス調節器、培養液中の溶存酸素レベルを測定する溶存酸素測定器（ＤＯメータ）、及び低酸素培養器を示す写真である。
【図２】窒素（Ｎ２）ガスバブリングを模式的に説明する図面である。
【図３】様々な条件下での溶存酸素量の測定結果を示すグラフである。
【図４】正常酸素条件の培養液、または低酸素条件の培養液中で分化した胚様体中の血管内皮前駆細胞マーカの発現量をＦＡＣＳを使用して分析した結果を示すグラフである。
【図５】正常酸素条件の培養液、または低酸素条件の培養液中で培養した胚様体中で発現する血管内皮前駆細胞マーカＰＥＣＡＭを示す免疫染色像である。
【図６】正常酸素条件の培養液、または低酸素条件の培養液中で培養した胚様体中の、ＣＤ１３３及びＫＤＲのいずれも陽性である血管内皮前駆細胞の相対量をＦＡＣＳを使用して測定した結果を示す。
【図７】低酸素条件の培養液で培養した胚様体からＦＡＣＳを使用して単離した血管内皮前駆細胞と、臍帯血由来の血管内皮前駆細胞の光学顕微鏡写真である。
【図８】ＦＡＣＳを利用して単離した血管内皮前駆細胞の光学顕微鏡写真と、血管内皮細胞としての特性を検証するためのＲＴ−ＰＣＲ、マトリゲル分析、ａｃ−ＬＤＬ取り込み分析の結果を示す。
【図９】単離した血管内皮前駆細胞及び未分化ヒト胚性幹細胞それぞれの細胞周期と、未分化マーカであるＳＳＥＡ−４の発現量をＦＡＣＳを利用して測定した結果を示す。
【図１０】単離した血管内皮前駆細胞と、未分化ヒト胚性幹細胞のＤＮＡフィンガー・プリンティングを示す図面である。
【図１１】低酸素条件の培養液で分化した胚様体から、特異的マーカであるＣＤ１３３，ＫＤＲ及びＣＤ１３３／ＫＤＲを使用して単離した血管内皮前駆細胞と、臍帯血由来の血管内皮前駆細胞の形態学的特性を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書で、「胚様体」というのは、胚性幹細胞から自発的に分化した細胞塊（cell mass）であり、３つの胚葉（内胚葉、外胚葉、中胚葉）に分化できる細胞集合体（cell aggregate）を意味する。前記胚様体は、適切な培地中で維持することができる。
【００２０】
また、「血管内皮前駆細胞」というのは、血管の内皮を構成する血管内皮細胞に分化できる前駆細胞、すなわち前駆体的特性を有する細胞をいう。血管内皮前駆細胞は、ＰＥＣＡＭ、ＣＤ３４、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、ＣＤ１３３、Ｔｉｅ−２、ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びｖＷＦのような、血管内皮細胞の細胞表面マーカを発現する。
【００２１】
本発明による分化方法は、胚性幹細胞由来の胚様体を含有する培養液を、培養液中の溶存酸素濃度が、約１ｐｐｍないし約５ｐｐｍの範囲になるように処理する工程［工程（ａ）］を含む。
【００２２】
本明細書で、胚性幹細胞は、哺乳動物由来のあらゆる胚性幹細胞であって、望ましくは、ヒト胚性幹細胞である。前記ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）とは、ヒト桑実胚の内細胞塊由来の全能性（pluripotent）細胞を意味する。例えば、前記ｈＥＳＣｓとしては、ＣＨＡ−ｈＥＳ３などが挙げられるが（Ahn SE, Kim S, Park KH, Moon SH, Lee HJ, Kim GJ, Lee YJ, Park KH1 Cha KY, Chung HM. “Primary bone-derived cells induce osteogenic differentiation without exogenous factors in human embryonic stem cells”, Biochem Biophys Res Commun. (2006) 10; 340(2) 403-408）、これに限定されるものではない。また、前記ｈＥＳＣｓは、当業者によって容易に樹立することができる。
【００２３】
前記胚様体は、公知の方法によってｈＥＳＣｓから誘導されうる。例えば、 Kim J, Moon SH, Lee SH,  Lee DY, Koh GY and Chung HM, “Effective Isolation and Culture of Endothelial Cells in Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem Cells” Stem cell and Development (2007) 16:269.280に開示されている方法によって、ｈＥＳＣｓを、血清（または血清代替物）、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸及びβ−メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ：Dulbecco's modified Eagle's medium）中で培養することによって、ｈＥＳＣｓから胚様体を形成できる。
【００２４】
本発明による分化方法において、胚性幹細胞由来の胚様体を含有する培養液としては、胚様体が血管内皮前駆細胞に自発的に分化できればいかなる培養液でもよく、例えば、Kim J, Moon SH, Lee SH,  Lee DY, Koh GY and Chung HM, “Effective Isolation and Culture of Endothelial Cells in Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem Cells” Stem cell and Development (2007) 16:269.280で使われている培養液であってもよい。例えば、血清（または血清代替物）、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸及びβ−メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ）を使用できるが、前記培養液はこれらに限定されない。
【００２５】
胚性幹細胞由来の胚様体を含有する培養液中の溶存酸素濃度は、例えば約１ｐｐｍないし約５ｐｐｍの範囲、望ましくは約２ｐｐｍないし約３ｐｐｍの範囲、さらに望ましくは約２ｐｐｍである。
【００２６】
工程（ａ）の処理は、アルゴン（Ａｒ）、ヘリウム（Ｈｅ）、または窒素（Ｎ２）ガスのような不活性ガス、望ましくは窒素（Ｎ２）ガスをバブリング（bubbling）することによって行われうるが、培養液中の溶存酸素濃度が、上記範囲であるならば、これに限定されない。窒素（Ｎ２）ガスのような不活性ガスのバブリングは、培養液中に含まれる酸素ガスを除去することによって、培養液内に低酸素条件を、直接的かつ効率的に誘導できる。また、窒素（Ｎ２）ガスのような不活性ガスは、その安定した化学構造によって、室温で他の化合物とは容易に反応しないため、培養液中に含まれる栄養分（nutrient）を変性させることなく、培養液内の低酸素条件を安定的に維持することができる。
【００２７】
例えば、培養液中で窒素（Ｎ２）ガスをバブリングするだけで、胚性幹細胞由来の胚様体を含有する培養液に低酸素条件を誘導できる。低酸素条件の誘導は、ＤＯメータを使用し、溶存酸素濃度を測定することによって確認することができる。一般的に、低酸素条件は、５０ｍＬの培養液に５分間、窒素（Ｎ２）ガスをバブリングすることによって誘導することができる。
【００２８】
本発明による分化方法は、上述した通りに低酸素条件を誘導した培養液を、酸素分圧が約１５％以下、望ましくは１ないし１０％の範囲、さらに望ましくは約３％の培養器中で培養し、前記胚様体を血管内皮前駆細胞に分化させる工程［工程（ｂ）］を含む。
【００２９】
前記培養は、図１に示すように、低酸素培養器を使用して行われうる。しかし、低酸素条件を維持できる培養器、すなわち酸素分圧が１５％以下、望ましくは１ないし１０％の範囲、さらに望ましくは約３％である培養器であるならば、いずれも使用可能であり、培養器の形態及び種類は限定されない。
【００３０】
前記培養は、１週間ないし３週間、望ましくは約２週間行われうるが、これらの期間に限定されない。培養培地は、例えば２４時間ごとに交換されうる。
【００３１】
本発明による分化方法は、培養液から、具体的には、上述した通りに低酸素条件で培養した培養液中の胚様体から、血管内皮前駆細胞を単離する工程［工程（ｃ）］を含む。
【００３２】
前記単離は、通常の方法、例えば物理的単離方法もしくは酵素的単離方法を使用して行うか、または他の支持細胞との共培養後、物理的あるいは酵素的な単離方法を使用して行えばよいが、得られる血管内皮前駆細胞の純度を考慮して、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用して行ってもよい。特に、単一マーカの代わりに二重マーカ、すなわちＣＤ１３３及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のいずれも陽性である細胞（すなわち、二重陽性細胞群（double positive population））をＦＡＣＳを使用して単離する場合、血管内皮前駆細胞の純度を上昇させることができる。
【００３３】
例えば、ＣＤ１３３及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の二重マーカを使用した、二重陽性細胞群のＦＡＣＳによる単離は、次の通り行われうる。胚様体を、トリプシン−ＥＤＴＡなどの酵素で処理して単一細胞を調製し、約５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むリン酸緩衝食塩水などの緩衝液中で、ＣＤ１３３及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１を使用して染色する。この後、ＣＤ１３３及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のいずれも陽性である細胞をＦＡＣＳにより単離する。
【００３４】
上述のようにして得られた血管内皮前駆細胞は、通常の血管内皮細胞用培養液、例えばＥＧＭ−２／ＭＶ培養培地（Cambrex）、トリプシン−ＥＤＴＡなどを使用して継代培養することによって、増殖させることができる。
【００３５】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
【００３６】
＜実施例１＞
（１）胚様体の形成
マイトマイシンＣで２時間処理して増殖を抑制させたマウス線維芽細胞（ＳＴＯ cell、７．０×１０５cells／６０ｍｍ dish）を、支持細胞培養用培地（１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭメルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸（Gibco）を含む９０％ＤＭＥＭ高グルコース（high glucose）培地）を含む、ゼラチンコーティングされた培養皿で２４時間培養した。前記培養皿をＤＭＥＭ／Ｆ−１２で１回洗浄した後、培地を２０％血清代替物（ＳＲ）、０．１ｍＭメルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸（Gibco）、及び４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを含む８０％ＤＭＥＭ／Ｆ−１２に交換した。この培地中で、ヒト胚性幹細胞（ＣＨＡ−ｈＥＳ３）を、約７日間培養した。培養液中に形成されたｈＥＳＣｓのコロニーを、アルコールランプ加熱を介して所定の形態を有するガラスピペットを使用して支持細胞（feeder cell）から単離した後、ｂＦＧＦが除去された胚性幹細胞培養液で約２日間浮遊培養し、胚様体を形成させた。
【００３７】
（２）低酸素条件の誘導
胚様体を含有する培養液（すなわち、ｂＦＧＦが除去された胚性幹細胞培養液）５０ｍＬを、約５分間窒素（Ｎ２）ガスでバブリングし、低酸素条件を誘導した。ガス流入量を調節するために、調節器を前記培養液に連結し、培養液の汚染を防止するために、０．２２μｍのシリンジフィルタを、調節器と、培養液が接触するガラスピペットの中間部位とにそれぞれ設けた後、バブリングを行った。窒素（Ｎ２）ガスバブリングが終了した培養液中の溶存酸素量をＤＯメータを使用して測定した。低酸素条件が誘導された、胚様体を含有する培養液を、酸素分圧が約３％である低酸素条件の培養器で２１日間培養した。図１及び図２は、窒素（Ｎ２）ガスバブリング及びこれに使用した機器を示す。
【００３８】
（３）血管内皮前駆細胞の単離
上記培養期間（２１日）の間、７日間隔で、ＣＤ１３３、ＣＤ３４及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１などの血管内皮前駆細胞マーカの発現量をＦＡＣＳにより測定した。正常酸素条件と低酸素条件における、胚様体内の血管内皮前駆細胞マーカＰＥＣＡＭの発現を免疫染色を利用して確認した。ＣＤ１３３及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１二重陽性細胞群の発現量をＦＡＣＳを使用して測定した後、ＣＤ１３３及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１二重陽性細胞群を、ＦＡＣＳを利用して単離した。
【００３９】
（４）継代培養
単離した細胞を、ＥＧＭ−２／ＭＶ培地（Cambrex）中で培養した。培養皿に分布した細胞の濃度が約７０〜８０％になった時点で、トリプシン−ＥＤＴＡ（Gibco）を用いて培養皿から細胞を単離し、継代培養した。
【００４０】
＜試験例１＞
実施例１の（２）に記載の培養液において、培養液中の溶存酸素量を下記の様々な条件下で測定した。すなわち、実施例１の（１）で得られた胚様体を含有する培養液を、表１に示すような、正常酸素条件培養液（normoxia medium）、低酸素条件培養液（hypoxia medium）、正常酸素条件培養器（normoxia incubator）、及び低酸素条件培養器（hypoxia incubator）を組み合わせて調節した条件下で培養した後、経時的な溶存酸素量を測定した。その結果を、表１及び図３に示す。溶存酸素は、ｐｐｍ単位で測定した。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
表１及び図３に示すように、窒素（Ｎ２）ガスでバブリングした低酸素条件培養液を低酸素条件培養器中で培養すると、初めの４〜６時間以内に、酸素分圧が最も効果的に低下して低酸素条件に達した。初めの４〜６時間の低酸素条件への曝露が、ヒト体内での低酸素応答の媒介因子である低酸素誘導因子（ＨＩＦ）−１αの発現に重要であることから (Wang GL. Semenza GL. General involvement of hypoxia-inducible factor 1 in transcriptional response to hypoxia. PNAS. May 1; 90(9): 4304-8, 1993)、この結果は、血管内皮前駆細胞が、本発明による分化方法によって高収率で得られることを示す。
【００４３】
＜試験例２＞
実施例１の（２）で、窒素（Ｎ２）ガスバブリングを実施しないことを除いては、実施例１と同じ方法で培養液を培養し、血管内皮前駆細胞を単離した（比較例１）。実施例１及び比較例１で、ＣＤ１３３、ＣＤ３４及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１などの血管内皮前駆細胞マーカの発現量を、培養期間（２１日）の間、７日間隔でＦＡＣＳを利用してそれぞれ測定した。その結果を図４に示す。図４に示すように、本発明によって、低酸素条件で培養した胚様体で発現する血管内皮前駆細胞マーカの量が、正常酸素条件で培養した胚様体で発現する血管内皮前駆細胞マーカの量より多かった。また、ＣＤ１３３とＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の発現量は、１４日間分化させた胚様体で相対的に多かった。
【００４４】
１４日間培養した胚様体内における、血管内皮前駆細胞のマーカの一つであるＰＥＣＡＭの発現を、免疫染色を利用して確認した。その結果、図５に示すように、低酸素条件で培養した胚様体内で発現するマーカの量が、正常酸素条件で培養した場合に比べて多く、また低酸素条件で培養したマーカの発現分布が、正常酸素条件で培養した場合に比べて広範囲である。また、図６に示すように、実施例１と比較例１で得られた胚様体をＦＡＣＳで分析した結果、低酸素培養液で分化した胚様体で発現するＣＤ１３３及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１二重陽性細胞群の数が大きく増加した。
【００４５】
＜試験例３＞
ＣＤ１３３単一陽性細胞群（single positive population）及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１単一陽性細胞群（single positive population）を、ＦＡＣＳを使用して、実施例１の（３）の培養液から単離した（比較例２）。
【００４６】
図７は、実施例１及び比較例２で単離した細胞の光学顕微鏡写真である。図７に示すように、ＣＤ１３３及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１二重陽性細胞群は、臍帯血由来の血管内皮前駆細胞（図７中の陽性対照群）と類似した形態学的特性を有する。また、比較例２で記述されたようなＣＤ１３３あるいはＫＤＲ／Ｆｌｋ−１単一陽性細胞群の単離に比べて、ＣＤ１３３／ＫＤＲ二重陽性細胞群の単離の方が、臍帯血由来の血管内皮前駆細胞と形態学的に類似した細胞が得られる（図１１）。
【００４７】
＜試験例４＞
実施例１で得られたＣＤ１３３及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１二重陽性細胞群の細胞の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、マトリゲル分析（matrigel assay）、及びアセチル化低密度リポタンパク質（ａｃ−ＬＤＬ）の取り込み試験を行い、血管内皮前駆細胞としての特性を検証した。
【００４８】
図８に示すように、ＣＤ１３３及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１二重陽性細胞群を培養すると、臍帯血由来の血管内皮前駆細胞と同様に増殖した。Kim J, et al. Effective Isolation and Culture of Endothelial Cells in Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem Cells Stem cell and Development (2007) 16:269.280 によるＲＴ−ＰＣＲによって、血管内皮前駆細胞マーカであるTie−２、ＰＥＣＡＭ及びＫＤＲが、継代培養で持続的に発現していることが確認された。また、血管内皮前駆細胞マーカであるTie−２、ＰＥＣＡＭ及びＫＤＲの発現は、対照群である臍帯血由来の血管内皮前駆細胞と類似していた。さらに、ヒト胚性幹細胞由来の血管内皮細胞の機能を評価するためのマトリゲル分析の三次元的培養環境で、単離した血管内皮前駆細胞は、血管と類似した構造を形成することが確認され、またａｃ−ＬＤＬが細胞内に取り込まれることが確認された。
【００４９】
＜試験例５＞
実施例１で得られたＣＤ１３３及びＫＤＲ／Ｆｌｋ−１二重陽性細胞群が分化しているか否かを確認するために、細胞周期及び未分化マーカの発現を、ＦＡＣＳを利用して調べた。血管内皮前駆細胞を単離し、単離した血管内皮前駆細胞が、ヒト胚性幹細胞由来であるか否かを確認するために、ＤＮＡフィンガー・プリンティングを行った。その結果を図９及び図１０に示す。
【００５０】
図９及び図１０に示すように、ほとんどの未分化ヒト胚性幹細胞がＳ期に留まっているのと異なり、単離したほとんどの血管内皮前駆細胞は、臍帯血由来の血管内皮前駆細胞と同じように、Ｇ１期に留まっている。また、単離した血管内皮前駆細胞における、未分化マーカであるＳＳＥＡ−４の発現は、０．９８％であることが確認され、これは、未分化ヒト胚性幹細胞（９０．１％）に比べ、かなり低い。また、ＤＮＡフィンガー・プリンティングの結果、単離した血管内皮前駆細胞は、ＣＨＡ−３ヒト胚性幹細胞由来であることが確認された。
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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