(57)【要約】  本発明は、ポリマー・マトリックスを有する生成物の生成方法、それによって生成できる生成物、およびその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）粉末形態の生分解性ポリマーと、成長因子、細胞増殖抑制剤、抗生物質、またはそれらの混合物の水溶液とを混合して、前記水溶液が粉末形態の前記ポリマーによってほぼ完全に吸収されるような量でスラリーを形成するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られた前記スラリーを乾燥させるステップと、
ｃ）ステップｂ）からの生成物を成形装置に導入するステップと、
ｄ）前記成形装置に導入された前記生成物を、細胞成長を促進する適用形態に成形するステップとを含む、ポリマー・マトリックスを有する生成物を生成する方法。
【請求項２】
最大５００μｍまでの粒子サイズの粉末形態の生分解性ポリマーが使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリ乳酸、ポリグリコール酸、またはそれらのコポリマーが前記生分解性ポリマーとして使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
粉末形態の前記生分解性ポリマーがｐＨ安定剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリマー１グラムについて、１〜３．５、好ましくは１．５〜２．５ミリリットルの水溶液が使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＢＭＰクラスの骨成長因子、特にＢＭＰ−２の水溶液が、前記生成物中の生分解性ポリマー１グラム当たり骨成長因子０．５ｍｇ〜１０ｍｇに相当する前記水溶液中の濃度で使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ｐＨ値４〜５、またはｐＨ値９．５〜１０．５のＢＭＰクラスの前記骨成長因子の水溶液が使用される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップａ）で生成された前記スラリーが凍結乾燥される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記乾燥されたスラリーが、前記成形装置としての押出機に導入され、前記生分解性ポリマーのガラス転移温度よりも高く前記骨成長因子の変性温度よりも低い温度で前記押出機を用いて押し出されて、成形体をもたらす、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記乾燥されたスラリーが、前記成形装置としてのオートクレーブに導入され、前記オートクレーブ内で、前記生分解性ポリマーのガラス転移温度よりも高く前記骨成長因子の変質温度よりも低い温度で超臨界二酸化炭素による加圧ガス処理にさらされ、次いで、前記オートクレーブが圧力解放され、得られる発泡体形態の生成物が前記オートクレーブから取り出される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法によって生成できる成形体。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法によって生成できる発泡体形態の生成物。
【請求項１３】
ａ．糸、ピン、くぎ、ねじ、リベットなどの外科的固定手段の製造のため、
ｂ．プレートもしくは膜の製造のため、または
ｃ．インプラントをコーティングするための、請求項１１または１２に記載の生成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー・マトリックスを有する生成物を生成する方法、その方法から得ることのできる生成物、およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織内での遊離（ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ）をその後に伴う、生物活性を維持しながらの、移植可能な合成ポリマーへの例えば成長因子などの生物学的に活性なタンパク質の導入は、生体材料およびインプラント研究の点でまだ解決されていない問題である。それらの問題の解決をもたらすきわめて有望なポリマーが、生分解性ポリラクチドである。それゆえ、成長因子、とりわけＢＭＰ−２をポリラクチドに導入しようとする試みは、すでに早い時期に行われてきた。こうして、例えば、Ｗｅｂｅｒら［（２００２）Ｓｌｏｗ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖｉａ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）ｆｏａｍｓｐｈｅｒｅｓ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ．Ｓｕｒｇ．、３１、６０〜６５］は、ドラスティックな条件（ジクロロメタン、６Ｍ尿素）下でポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）１ｇ当たり１７０μｇの量のｒｈＢＭＰ−２をＰＬＧＡ中にカプセル化することができたが、カプセル化されたｒｈＢＭＰ−２のほぼ完全な遊離は、早くも約１０日以内に起こった。
【０００３】
ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）は、ガラス転移温度が約５７℃のＤ−およびＬ−乳酸の非晶質ポリエステルである。結晶化度の不足により、ＰＤＬＬＡは、結晶性ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）よりも、強度が低く、低い弾性率を有する。組織代替材料であるポリラクチドの特定の利点は、何週間にもわたる強度、分解性、および最終分解産物としての生理学的モノマーである乳酸の発生である。
【０００４】
イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）およびイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのＰＬＬＡ分解は、５つの段階で起こる：
第１段階：水和
第２段階：質量損失のない解重合（１０〜２０週、新骨梁）
第３段階：質量損失
第４段階：吸収（２〜５年、食細胞による断片の吸収）
第５段階：消失（ラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）がピルベート（ｐｙｒｕｖａｔｅ）へと変換され、代謝される）
【０００５】
発泡性ポリラクチドについて、当該技術分野では、Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｍ．Ｈ．、Ｓｈｅａ，Ｌ．Ｄ．、Ｐｅｔｅｒｓ，Ｍ．Ｃ．、およびＭｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．（２０００）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、６４、９１〜１０２から、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリドの乾燥粉末と、凍結乾燥された血管内皮成長因子ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）とが混合され、発泡体の崩壊（ｆｏａｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｇ）を伴って発泡する（５９バール）ことが知られている。他の実験では、ＮａＣｌによる発泡によって開孔（ｏｐｅｎ−ｐｏｒｅ）構造が作り出された。遊離速度は、２〜７０日の間で変動した。
【発明の概要】
【０００６】
現在、本発明者らの側では、安定な生成物、特に、骨成長因子が結合した発泡体を、ポリラクチドと、ＢＭＰクラスの少なくとも１つの骨成長因子、特にＢＭＰ−２の溶液とを含む混合物から生成できることが判明している。
【０００７】
したがって、本発明は、
ａ）粉末形態の生分解性ポリマーと、成長因子、細胞増殖抑制剤、抗生物質、またはそれらの混合物の水溶液とを混合して、該水溶液が粉末形態のポリマーによってほぼ完全に吸収されるような量でスラリーを形成するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られたスラリーを乾燥させるステップと、
ｃ）ステップｂ）からの生成物を成形装置に導入するステップと、
ｄ）成形装置に導入された生成物を、細胞成長を促進する適用形態に成形するステップとを含む、ポリマー・マトリックスを有する生成物を生成する方法に関する。
【０００８】
その点に関して、本発明者らは、本発明の必須要素の１つとして、スラリーが形成されること、すなわち、粉末のほかには上澄み液過剰がないことを確認した。スラリーの１次「乾燥」は、その場合、ＰＤＬＬＡ粉末のようなポリマー粉末の吸湿性によって自然乾燥状態になるものと、より強く解釈される。吸湿性は、例えばＢＭＰを含む水溶液がポリマー粒子中に吸い上げられ、おそらくはポリマー粒子に非常に細かく吸着関係で結合することと規定する。その点で、１グラムのポリマーに関して一般に１．０〜３．５ｍｌの水溶液が使用され、粉末形態のポリマーは、いくらか湿った粉末が残るようにほぼ完全に水溶液を吸収する。２次的な考慮事項として、乾燥手順、例えば空気乾燥またはフリーズドライと言われる冷凍乾燥（その後に凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ）を伴う）が使用される。
【０００９】
乾燥操作の際に、成長因子、細胞増殖抑制剤、抗生物質、またはそれらの混合物を生物活性の点で維持し、またそれらを保護するために、スクロースなどの多価の糖を水溶液中に存在させることができる。
【００１０】
スラリー中に上澄み液または液相が存在しないことは、乾燥手順においてＰＤＬＬＡ粉末に吸収されない非常に少量のＢＭＰしかＰＤＬＬＡ粒子間にとどまらないことと規定する。存在する液相、すなわち、粒子を含まない相の量が多いほど、それに対応して、凍結乾燥前の冷凍乾燥操作の際により多くの「氷塊（ｉｃｅ  ｌｕｍｐｓ）」が生じる。それらの氷塊が乾燥するときには、きわめて特別なＢＭＰ−２粉末が生じる。本発明者らは、このきわめて特別なＢＭＰこそが、タブレット外面上にとどまって本発明者らの目的ではない「バースト相（ｂｕｒｓｔ  ｐｈａｓｅ）」を引き起こすような形では後で発泡しないと考えている。
【００１１】
本発明による方法を用いて、今や、手術前に作り出された個々のインプラントの同時分解を伴う成長因子の遊離により、改善または加速された骨治癒および再生のための再吸収可能な骨誘導性ポリマー材料を生成することが可能である。それは、特に、可能な高いローディング度で、生物活性を維持しながら長期にわたって遊離する成長因子、特にＢＭＰ−２の均質な分布によって達成することができる。
【００１２】
本発明による方法は、好ましくは、最大５００μｍまでの粒子サイズの粉末形態の生分解性ポリマーを使用する。その生分解性ポリマーは、好ましくは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、またはそれらのコポリマーである。
【００１３】
体内でのポリマーの分解時に生理的媒質を安定化させるために、粉末形態の生分解性ポリマーは、さらに、ＣａＣＯ3やＮａＨＣＯ3などのｐＨ安定剤を含むことができる。ただし、ポリラクチドなどのポリ酸の欠点は、加水分解操作時の複数のｐＨ単位でのｐＨ低下であり、その理由から、緩衝物質（例えば、ＣａＣＯ3または８０％Ｎａ2ＨＰＯ4／２０％ＮａＨ2ＰＯ4）を、また、有利にはポリマーに加えることができる。
【００１４】
他の実施形態では、ポリマー１グラムにつき骨成長因子の水溶液１．５〜２．５ミリリットルが使用される。
【００１５】
ＢＭＰクラスの骨成長因子、特にＢＭＰ−２のその水溶液は、生成物中で生分解性ポリマー１グラム当たり０．５ｍｇ〜１０ｍｇの骨成長因子を可能にする成長因子濃度を含むべきである。骨成長因子によるポリマーの特に高いレベルのローディングは、ｐＨ値が４〜５、またはｐＨ値が９．５〜１０．５のＢＭＰクラス内の骨成長因子の水溶液によって達成することができる。
【００１６】
ポリマーと骨成長因子の水溶液との混合物が十分に細流（ｔｒｉｃｋｌｅ  ｆｌｏｗ）可能でない場合、得られる生成物、すなわちスラリーを、改善されたさらなるプロセス処理のために凍結乾燥することができる。
【００１７】
次の方法ステップでは、凍結乾燥物を、成形装置としての押出機に導入することができ、また、生分解性ポリマーのガラス転移温度よりも高く骨成長因子の変性温度よりも低い温度で押出機を用いて押し出して、粒状材料を形成することができる。それによって、すでに十分に均質な、ポリマー中の成長因子分布を有する粒状材料が得られる。
【００１８】
凍結乾燥物が、成形装置としてのオートクレーブに導入され、生分解性ポリマーのガラス転移温度よりも高く骨成長因子の変質温度よりも低いオートクレーブ内で超臨界二酸化炭素による加圧ガス処理にさらされ、次いで、オートクレーブが圧力解放され、得られる発泡体形態の生成物がオートクレーブから取り出される場合、さらに均質な分布を達成することができる。
【００１９】
そのようにして得られる、また所望の適用形態にするためにさらに成形することもできる、発泡体形態の生成物は、生物活性を維持しながらの長期間にわたる遊離によって区別され、それは、当該技術分野では知られていない。
【００２０】
所望の適用形態には、前述のように、糸（ｔｈｒｅａｄ）、ピン、くぎ（ｎａｉｌ）、ねじもしくはリベット、プレートもしくは膜などの外科的固定手段、または、発泡体形態の生成物をそれに融着できる、金属もしくはセラミック・インプラント用のコーティング手段としての使用が含まれる。
【００２１】
したがって、本発明は、また、本発明による方法によって得られる、ポリマー・マトリックスを有する生成物、ならびに、糸、ピン、くぎ、ねじもしくはリベット、プレートもしくは膜などの外科的固定手段や、インプラント上にコーティングを作り出すための使用など、該生成物から作り出される適用形態、およびそのようにしてコーティングされるインプラントに関する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
生成例
本発明によれば、一実施形態例として、２ｇのポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（２００〜５００μｍのＰＤＬＬＡ、Ｒｅｓｏｍｅｒ  Ｒ２０７またはＲ２０８、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ））を含む、ポリラクチド−炭酸カルシウム複合材（ｐＨ安定化）を、１００ｍｌのクロロホルム中に溶解させ、規定の比（ｗ：ｗ＝８０：２０）でＣａＣＯ3（Ｍｅｒｃｋ，ｐ．ａ．）を分散させ、３００ｍｌのエタノール中に沈殿させ、乾燥させ、機械的にすりつぶして、粒度２００〜４００μｍの粉末（＝ＰＤＬＬＡ−ＣａＣＯ3粒状材料）を得る。
【００２３】
次いで、ＰＤＬＬＡ−ＣａＣＯ3−ＢＭＰ−２複合材の生成を、以下のように達成することができる：１ｇのＰＤＬＬＡ−ＣａＣＯ3粒状材料を、１．６ｍｌのＢＭＰ−２溶液（非緩衝１５ｍＭスクロース中で１２５μｇ／ｍｌ、ここで、該ＢＭＰ−２濃度は、非緩衝１５ｍＭスクロース中、またはｐＨ４．５もしくはｐＨ１０．０で緩衝された１５ｍＭスクロース中で最大２ｍｇ／ｍｌまでにすることができる）中に吸収させ、Ｐｏｔｔｅｒホモジナイザ内でテフロン乳棒によって手作業で回転運動により均質化する。均質化手順の間に、該均質化手順の終わりに再び粉末が存在するように、材料を再び乾燥させた。その粉末を、ガス処理方法で発泡タブレットが得られるように、すぐに、または凍結乾燥後に、さらなるプロセス処理にさらした。その点に関して、ＰＤＬＬＡ−ＣａＣＯ3−ＢＭＰ−２粉末混合物を、温度約３５〜５５℃のオートクレーブにおいて、テフロン中空モールド（１０×５×２ｍｍ開口部）内で超臨界ＣＯ2（１００バール）による加圧ガス処理にさらす。圧力１００バールでのＰＤＬＬＡのガラス転移温度は、＜−５０℃であり、すなわち、ガラス転移温度よりも１００℃高い温度では、ポリラクチドは、熱可塑性／流体であり、ＢＭＰ−２を溶解させる。ＰＤＬＬＡ−ＣａＣＯ3−ＢＭＰ−２粉末混合物を、それらの条件下で約２時間維持する（保持時間）。次いで、２０分以内に、温度を室温まで低下させ、圧力を周囲圧力まで低下させる（減圧）。それらの条件下では、特定の「孔隙率（ｐｏｒｏｓｉｔｙ）」が得られ、それは、より高速の減圧によって増大させることができる。したがって、それらの条件下では、ＢＭＰ−２は、生物学的に活性なままであるために、１００バールの圧力および５５℃の温度に耐えなければならない。
【００２４】
本発明者側では、初めて、生成にかかわる個々のステップおよびＢＭＰ−２ロードされた発泡ポリラクチド・タブレットの特性を正確に追跡できるように、125Ｉ標識したｒｈＢＭＰ−２を用いた。例えば骨成長因子ｒｈＢＭＰ−２をポリラクチド１ｇ当たり最高３．４ｍｇまでの量で組み込むことができること、ならびに、そのｒｈＢＭＰ−２が１．６×１０-3［ｄ］の速度定数で遊離されること、すなわち、半減時間が約４００日であることを示すことが可能であった。その点に関して、遊離したｒｈＢＭＰ−２は、イン・ビトロでもイン・ビボでも活性である。
【００２５】
<<活性測定>>
本発明者らは、これまでに記載した方法に従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で、組換えヒト「骨形態形成タンパク質」（ｒｈＢＭＰ−２）を＞９５％の純度で作り出した。そのようにして得られるｒｈＢＭＰ−２の生物活性は、細胞培養（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）を用いて判定することができる。
【００２６】
ｒｈＢＭＰ−２の放射性標識は、当該技術分野でタンパク質ユビキチンについて記載されているように、クロラミンＴ方法（125Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２）に従って達成した。125Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２の生物活性は、その方法では完全に保持される。
【００２７】
生分解性ポリマーのローディングは、ＰＤＬＬＡに基づいて前述したように実証することができた。ＰＤＬＬＡ（ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）であるＲｅｓｏｍｅｒ２０７およびＲｅｓｏｍｅｒ２０８（重合度がわずかに異なる）を、商業的に入手し、クロロホルムに溶解させた。ＣａＣＯ3などのｐＨ安定剤を、加水分解中のｐＨ安定化のために有機物中に加えることができる。ＰＤＬＬＡ／ＣａＣＯ3混合物は、エタノールなどの有機溶媒で沈殿させ、次いで乾燥させ、すりつぶして細かい粉末を生じさせ、篩過し（粒度約２００μｍ）、水溶液中でｒｈＢＭＰ−２のような成長因子と混合することができる。次いで、得られる複合材料を、Ｔｓｃｈａｋａｌｏｆｆらの方法を使用してオートクレーブ内で超臨界ＣＯ2によって発泡させて、長方形タブレット（１０×５×２ｍｍ、約３５ｍｇ／タブレット）を生じさせる。
【００２８】
動物実験には、直径５ｍｍ、高さ２ｍｍの円形タブレットを使用した（約２０ｍｇ／タブレット）。それぞれのローディングおよびローディング収率（ｌｏａｄｉｎｇ  ｙｉｅｌｄ）を、125Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２を用いて決定した（上記参照）。発泡タブレットの密度は、約０．５ｇ／ｃｍ3であった。
【００２９】
<<ｒｈＢＭＰ−２の遊離>>
遊離動態を評価するために、125Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２を含有する発泡タブレットを、小さな試薬チューブ内の１．５ｍｌのＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水：１３７ｍＭのＮａＣｌ、８．１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、２．７ｍＭのＫＣｌ、および１．５ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）中に入れ、回転ホイール上で完全に混合するように室温で１０７日間にわたって１．５ｍｌのＰＢＳを何度か交換しながらインキュベートした。所与の時点（緩衝液交換）で、タブレットを試薬チューブから取り出し、新しいＰＢＳ（１．５ｍｌ）で２回洗浄し、新しいＰＢＳ緩衝液の入った新しいエッペンドルフ容器内に移し、次いで、ガンマ・メータ（Ｗｉｚａｒｄ  ＴＭ３、Ｗａｌｌａｃ、フィンランド）において測定した。計算された半減時間を、125Ｉの自然分解（ｔ1/2＝６０ｄ）に従って補正した。
【００３０】
<<生物活性測定>>
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を用いて用量作用曲線（アルカリ・ホスファターゼの誘導）を記録することによって、可溶性ｒｈＢＭＰ−２の生物活性を測定した。生物活性は、半活性化定数（ｈａｌｆ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）（Ｋr0.5）として規定され、その定数についての標準値は、本発明者によって生成されたｒｈＢＭＰ−２についても、市販のｒｈＢＭＰ−２（ＩｎｄｕｃｔＯｓ、Ｗｙｅｔｈ）についても、３〜２０ｎＭのところにある。
【００３１】
<<動物実験>>
動物保護規則を遵守しながら、ｒｈＢＭＰ−２（ＰＤＬＬＡ１ｇ当たり０．８〜３．４ｍｇ、Ｒｅｓｏｍｅｒ２０７）を含有するタブレット（直径５ｍｍ×高さ２ｍｍ）を、直径５ｍｍのボア内の臨界欠陥治療モデル（ヒツジの肋骨）で使用した。
【００３２】
<<標本作製>>
組織サンプルを、取得直後に軟部鞘（ｓｏｆｔ  ｐａｒｔ  ｓｈｅａｔｈ）から慎重に取り除き、１次固定のためにリン酸緩衝ホルムアルデヒド溶液（４．５％）に導入した。Ｄｏｎａｔｈ教授による非脱灰微小切片標本の作製のための修正された組織学的手順に従って、１次固定後の組織サンプルを、低濃度から高濃度への一連のアルコール中で脱水した。次いで、ＰＤＬＬＡ成分を得るために、サンプルをＴｅｃｈｎｏｖｉｔ７２００ＶＬＣ内に埋め込んだ。包埋材料の光重合後、各サンプルから厚さ２０μｍの２つの微小切片を作製した。プロセス処理が終了したときのすりつぶされた標本の表面着色には、１％チオニン溶液を使用した。
【００３３】
<<組織形態計測>>
組織形態学的評価は、４倍の原倍率で、透視型顕微鏡（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｅｃｌｉｐｓｅ８００、ニコン株式会社（Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｒｐ．）、日本、東京）に結合された、半自動画像解析プログラム（Ｌｕｃｉａ、３２ｇ／４．５１、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｌｔｄ．、チェコ共和国、プラハ（Ｐｒａｇｕｅ））を用いて達成した。その目的で、標準化された測定フレームを、その中にＰＤＬＬＡタブレットを含む欠陥領域上の中央に位置決めし、新たに形成された骨組織（石灰化および非石灰化）とエンプティ・スペースとの表面比率を確認し、残っているＰＤＬＬＡの比率をそれらの値から計算した。
【００３４】
<<アイソトープによるローディング測定法の構造>>
ＰＤＬＬＡまたはさらにＰＬＧＡタブレットへのｒｈＢＭＰ−２の導入を、可能な限り明瞭に、かつ誤差なく、最高レベルの感度で定量化できるようにするために、ｒｈＢＭＰ−２から125Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２への放射ヨウ素標識のアイソトープ方法を採用した。
【００３５】
前述のように、ＰＤＬＬＡ粉末をｒｈＢＭＰ−２と混合し、次いで高圧ガス処理装置内で発泡させた。結果を以下の表に示す。
【００３６】
【表１】
2010512887.tif 000002
【００３７】
表１からわかるように、タブレット１ｇ当たり０．３４〜１．０ｍｇの125Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２のローディング・レベルを良好な収率で得ることができた。試験によって、タブレットの有効なローディング方法がここで開発されたことが示される。
【００３８】
<<遊離試験>>
表１のように生成されたタブレットは、ｒｈＢＭＰ−２の放射性標識により、同時に遊離試験に使用することができた。本発明者が述べたように、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中での125Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２／ＰＤＬＬＡタブレットのインキュベーションは、１０７日間にわたる125Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２のゆっくりとした遊離をもたらした。２相指数関数への非線形適応が良好な適応をもたらしたので、速度定数および半減時間を容易に確認することができた。時間の進展に関して、２つの相、すなわち、初めの１〜３日以内の、半減時間ｔ1/2が約０．３〜０．５ｄのいわゆる初期バースト相と、観察時間の残りにわたる、半減時間ｔ1/2が約４００〜４６９ｄの第２のゆっくりとした長期の単一指数関数的主要相とでの遊離が存在した。第２の、したがって主要相の長い半減時間は、発泡ＰＤＬＬＡ中に125Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２の遊離のための孔隙がなく、遊離がＰＤＬＬＡの加水分解または変質からしか始まらないという結論をもたらす。したがって、バースト相の場合を除き、タブレットの表面での125Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２の比較的多量の結合は、やはり、起こる可能性が低い。動態および統計データの概要が、以下の表に見られる。異なるようにローディングされた３つのＰＤＬＬＡタブレットの125Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２の遊離についての速度定数は、ｋb-1＝１．５〜１．７×１０-3［ｄ-1］または（ｋb-1約２．０×１０-8［ｓ-1］）である。
【００３９】
【表２】
2010512887.tif 000003
【００４０】
以下の表３に示されるように、遊離した125Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２の絶対量（初期ローディング、１．０±０．１４５ｍｇ／ｇ）を様々な期間について計算した。１０７日間で、ＰＤＬＬＡ１ｇ当たり合計２３０μｇの125Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２、すなわち（総量の２３％）が遊離した。バースト相では、１日に９３μｇ／ｇであった。したがって、以下の表３に示されるように、骨成長のきわめて有効な３カ月の一定刺激が可能である。
【００４１】
【表３】
2010512887.tif 000004
【００４２】
興味深いことに、９３日という長い期間にわたって０．８〜１．２μｇ／日・ｇの一定遊離速度が得られた。約４０μｌの体積の骨欠陥部（φ＝５ｍｍ×深さ２ｍｍ）において２０ｍｇタブレット（＝２０ｎｇ／日）から遊離したｒｈＢＭＰ−２の濃度が、１．０μｇ／日・ｇの平均遊離速度について計算される場合、約２０ｎＭという値が得られ、それは、イン・ビトロでのＭＣ３Ｔ３−Ｔ３細胞のほぼ最大の刺激を示す。
【００４３】
本発明によって得られるタブレット（１０×５×２ｍｍ）は、タブレット１個当たり４０〜６０ｍｇで、タブレット１個当たり２０〜８０μｇのＢＭＰ−２を含んでいた。発泡ＰＤＬＬＡの構造は、スポンジ・マトリックス状であり、骨成長因子の生物活性は、ほぼ無変化のまま維持される。
【００４４】
動物試験におけるｒｈＢＭＰ−２／ＰＤＬＬＡタブレットの生物活性の指標
前述のように、本発明者側ではヒツジの肋骨を使用して動物試験を実施した。肋骨に穴欠陥部（φ＝５ｍｍ×深さ２ｍｍ）を形成し、その中に、ＢＭＰ−２でローディングされた同じサイズ（２０ｍｇ）のＰＤＬＬＡタブレットを、精密に嵌合する関係で導入した。８週間の休息期間後、ヒツジを屠殺し、肋骨を取り出した。チオニン溶液で染色した、すりつぶされた切片標本の組織形態学的評価を、４倍の原倍率で、透視型顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ８００、ニコン（Ｎｉｋｏｎ））に結合された、半自動画像解析プログラム（Ｌｕｃｉａ、３２ｇ／４．５１、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｌｔｄ．）を用いて達成した。再生された骨組織（石灰化および非石灰化）について表面比率を決定し、エンプティ・スペースを決定した。顕著な相違として、エンプティ標本（ｒｈＢＭＰ−２なし）上では骨再生のある点領域をまばらにしか見ることができず、それらは、好ましくは、欠陥部の局所骨への移行部のところで、または骨膜のすぐ下の関係で、標本の周辺部にある。それとは対照的に、ｒｈＢＭＰ−２標本では、骨再生が著しく広範にある様子が見られる。骨再生を伴う多数の領域は、また、ＰＤＬＬＡタブレットの断面全体にわたって拡散的に分布しており、周辺部だけに集まっているわけではない。有意に強く目立つ骨再生は、また、顕著に多数の吸収位置をもつＰＤＬＬＡ材料の崩壊の増加を伴う。
【００４５】
動物試験の定量的評価が表４に要約される。２種類の対照試験を実施した：対照１では、肋骨でｒｈＢＭＰ−２なしのインプラントだけが使用され、対照２では、同一の肋骨中にＢＭＰ−２を含むインプラントが存在した。表４からわかるように、対照２は、常に対照１を上回っており、これは、対照２と隣接関係にあるｒｈＢＭＰ−２が常に標本において骨成長の顕著な増大をもたらすことを意味する。したがって、本発明者らは、対照２を真の対照としては認めなかった。ここで、ｒｈＢＭＰ−２を含むタブレット（０．８〜３．４ｍｇ／ｇ）が対照１と比較された場合、再生骨の百分率が有意に増大することがわかる（対応のない（ｎｏｎ−ｐａｉｒｅｄ）両側ｔ検定でｐ＜０．０５）。３．４ｍｇ／ｇの含有量では、再生骨の比率は、対照２よりもさらに有意に大きかった。したがって、発泡ＰＤＬＬＡタブレットへのｒｈＢＭＰ−２の組込みは、８週後のヒツジの肋骨モデルにおいて、骨成長の強い刺激と、骨によるＰＤＬＬＡの置換とをもたらす。
【００４６】
【表４】
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【００４７】
測定結果に基づいて、本発明によるポリラクチド複合材が、ポリラクチド・マトリックス（機械的に安定なインプラントもしくはプレース・ホルダ、骨代替材料）と、加水分解の際に生じる乳酸を緩衝するＣａＣＯ3と、骨誘導のためのＢＭＰ−２とを含有する、骨成長を目覚しく増進させるために使用できる材料であることが確認される。
【００４８】
骨成長因子を含む本発明によるマトリックスは、その点に関して、有利には以下の諸形態で使用することができ：
・  ピン、くぎ、ねじ
・  プレート、膜
・  金属インプラント上のコーティング
また、患者において、適用位置での局所的熱処理を用いて、それらの有効性を高めることができる。適用位置での局所的熱処理の有無にかかわらず、すべての場合に、一例として、ＢＭＰ−２は、変性することなく最高１００℃までの温度に耐える。
【００４９】
ゆえに、そのようにして作り出された成形体を、組織への移植時に音波溶着プロセスを用いて組織に融着させることができる。
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月14日(2008.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  ポリ乳酸、ポリグリコール酸、またはそれらのコポリマーから選択される粉末形態の生分解性ポリマーと、ｐＨ値４〜５またはｐＨ値９．５〜１０．５の、ＢＭＰクラスの骨成長因子の水溶液とを、生成物中の生分解性ポリマー１グラム当たり０．５ｍｇ〜１０ｍｇの骨成長因子に相当する前記水溶液中の濃度で混合して、前記水溶液が粉末形態の前記ポリマーによってほぼ完全に吸収されるような量でスラリーを形成するステップと、
ｂ）  ステップａ）で得られた前記スラリーを乾燥させるステップと、
ｃ）  ステップｂ）からの前記生成物を成形装置に導入するステップと、
ｄ）  前記成形装置に導入された前記生成物を、細胞成長を促進する適用形態に成形するステップとを含む、ポリマー・マトリックスを有する生成物を生成する方法。
【請求項２】
ステップａ）で、細胞増殖抑制剤、抗生物質、またはそれらの混合物が追加的に使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＢＭＰ−２が骨成長因子として使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
最大５００μｍまでの粒子サイズの粉末形態の生分解性ポリマーが使用される、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
粉末形態の前記生分解性ポリマーがｐＨ安定剤をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリマー１グラムについて、１〜３．５、好ましくは１．５〜２．５ミリリットルの水溶液が使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップａ）で生成された前記スラリーが凍結乾燥される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記乾燥されたスラリーが、前記成形装置としての押出機に導入され、前記生分解性ポリマーのガラス転移温度よりも高く前記骨成長因子の変性温度よりも低い温度で前記押出機を用いて押し出されて、成形体をもたらす、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記乾燥されたスラリーが、前記成形装置としてのオートクレーブに導入され、前記オートクレーブ内で、前記生分解性ポリマーのガラス転移温度よりも高く前記骨成長因子の変質温度よりも低い温度で超臨界二酸化炭素による加圧ガス処理にさらされ、次いで、前記オートクレーブが圧力解放され、得られる発泡体形態の生成物が前記オートクレーブから取り出される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法によって生成できる成形体。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法によって生成できる発泡体形態の生成物。
【請求項１２】
ａ．糸、ピン、くぎ、ねじ、リベットなどの外科的固定手段の製造のため、
ｂ．プレートもしくは膜の製造のため、または
ｃ．インプラントをコーティングするための、請求項１０又は１１に記載の生成物の使用。
【国際調査報告】
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