(57)【要約】  本開示は、インスリン様成長因子融合ポリペプチド、上述のポリペプチドをコードする核酸分子、ならびに上述のポリペプチドを使用する治療の方法に関する。
2010535490.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン様成長因子受容体の少なくとも１つの結合ドメインに直接または間接的に連結されるインスリン様成長因子ポリペプチドを含む、インスリン様成長因子の活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項２】
インスリン様成長因子ポリペプチド受容体ポリペプチドの少なくとも１つのインスリン様成長因子ポリペプチド結合ドメインに直接または間接的に連結されるインスリン様成長因子ポリペプチドのアミノ酸配列またはその活性部分を含む融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチド結合ドメインは、ロイシンリッチアミノ酸モチーフを含む、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記ロイシンリッチアミノ酸モチーフは、配列番号１４のアミノ酸３１〜１７９を含む、請求項３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記ロイシンリッチアミノ酸モチーフは、配列番号１４のアミノ酸２２９〜４８７を含む、請求項２または３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ結合ドメインを含む、請求項３から５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
好ましくは、前記ドメインは、配列番号１４のアミノ酸残基４９４〜６０６を含む、請求項６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
インスリン様成長因子ポリペプチドは、ロイシンリッチ結合ドメインに連結され、前記インスリン様成長因子ポリペプチドは、前記融合ポリペプチドにおいて前記ロイシンリッチドメインのアミノ末端側に位置する、請求項２から７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
インスリン様成長因子ポリペプチドは、ロイシンリッチ結合ドメインに連結され、前記インスリン様成長因子ポリペプチドは、前記融合ポリペプチドにおいて前記ロイシンリッチドメインのカルボキシル末端側に位置する、請求項２から７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
インスリン様成長因子ポリペプチドは、フィブロネクチンＩＩＩ結合ドメインに連結され、前記インスリン様成長因子ポリペプチドは、前記融合ポリペプチドにおいて前記フィブロネクチンＩＩＩ結合ドメインのアミノ末端側に位置する、請求項２から９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
インスリン様成長因子ポリペプチドは、フィブロネクチンＩＩＩ結合ドメインに連結され、前記インスリン様成長因子ポリペプチドは、前記融合ポリペプチドにおいて前記フィブロネクチンＩＩＩ結合ドメインのカルボキシル末端側に位置する、請求項２から９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
インスリン様成長因子ポリペプチドは、ペプチドリンカーによって、インスリン様成長因子受容体ポリペプチドの前記結合ドメインに連結される、請求項２から１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの少なくとも１コピーを含む、請求項１２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの２、３、４、５、６、７、８、９または１０コピーを含む、請求項１３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
ペプチド連結分子を含まず、インスリン様成長因子ポリペプチドおよびインスリン様成長因子受容体ポリペプチドの前記結合ドメインの直接的な融合物である、請求項２から１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
ｉ）配列番号１で表される核酸配列、
ｉｉ）配列番号３で表される核酸配列、
ｉｉｉ）配列番号５で表される核酸配列、
ｉｖ）配列番号７で表される核酸配列、
ｖ）配列番号９で表される核酸配列、
ｖｉ）配列番号１１で表される核酸配列、
から選択される核酸配列を含む核酸分子、または
配列番号１、３、５、７、９または１１とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、インスリン様成長因子調節活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項１７】
アゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
アンタゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１９】
配列番号１で表される核酸配列を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２０】
配列番号３で表される核酸配列を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２１】
配列番号５で表される核酸配列を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２２】
配列番号７で表される核酸配列を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２３】
配列番号９で表される核酸配列を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２４】
配列番号１１で表される核酸配列を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２５】
請求項１または１６から２４のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１５、１６、１７、１８、１９または２０から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれから成るポリペプチド。
【請求項２７】
２つのポリペプチドから成るホモ二量体であって、前記ポリペプチドはそれぞれ、
ｉ）インスリン様成長因子またはその受容体結合ドメインを含む第１の部分と、ペプチド連結分子によってそれと任意選択で連結される
ｉｉ）インスリン様成長因子受容体の少なくとも１つのインスリン様成長因子結合ドメインまたはその部分を含む第２の部分と
を含むホモ二量体。
【請求項２８】
前記ホモ二量体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１５、１６、１７、１８、１９または２０を含む２つのポリペプチドを含む、請求項２７に記載のホモ二量体。
【請求項２９】
請求項１または１６から２４のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３０】
請求項１、１６から２４または２９のいずれか一項に記載の核酸分子またはベクターを用いて形質移入または形質転換される細胞。
【請求項３１】
真核細胞である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
原核細胞である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３３】
賦形剤または担体を含む、請求項２から１５、２５または２６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項３４】
さらなる治療薬と組み合わせられる、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
重篤な原発性インスリン様成長因子欠乏症に関連する疾患または状態に罹患しているヒト対象を治療するための方法であって、請求項２から１５、２５、または２６のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドの有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項３６】
前記重篤な原発性欠乏症は、ラロン型小人症である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記疾患は、成長ホルモン療法に応答しない疾患である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記疾患は、Ｉ型糖尿病である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患は、ＩＩ型糖尿病である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患は、筋萎縮性側索硬化症である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患は、筋緊張性筋ジストロフィー症である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記状態は、重篤な熱傷である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
癌に罹患しているヒト対象を治療するための方法であって、請求項２から１５、２５、または２６のいずれか一項に記載のポリペプチドアンタゴニストの有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項４４】
前記ポリペプチドは、静脈内に投与される、請求項３５から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドは、皮下に投与される、請求項３５から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリペプチドは、２日間隔で投与される、請求項３５から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリペプチドは、１週間隔で投与される、請求項３５から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリペプチドは、２週間隔で投与される、請求項３５から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ポリペプチドは、１か月間隔で投与される、請求項３５から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
請求項２から１５、２５または２６または２７または２８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは二量体に結合するモノクローナル抗体。
【請求項５１】
ポリペプチドまたは二量体に結合するが、インスリン様成長因子またはインスリン様成長因子受容体にそれぞれ特異的に結合しない抗体である、請求項５０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５２】
本発明によるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製するための方法であって、
ｉ）請求項２から１５または２５または２６または２７または２８のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドまたは二量体を含む免疫原を用いて免疫応答性哺乳動物を免疫するステップ、
ｉｉ）免疫された免疫応答性哺乳動物のリンパ球を骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成するステップ、
ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体を、（ｉ）のポリペプチドに対する結合活性についてスクリーニングするステップ、
ｉｖ）ハイブリドーマ細胞を培養して、前記モノクローナル抗体を量産および／または分泌するステップ、ならびに
ｖ）培養上清からモノクローナル抗体を回収するステップを含む方法。
【請求項５３】
前記免疫応答性哺乳動物は、マウスまたはラットである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項５２または５３に記載の方法によって得られるまたは入手可能なハイブリドーマ細胞株。
【請求項５５】
生体試料において、本発明によるポリペプチドを検出するための診断試験であって、
ｉ）試験対象となる単離試料を提供するステップ、
ｉｉ）前記試料を、請求項２から１５、２５または２６または２７または２８のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは二量体に結合するリガンドと接触させるステップ、および
ｉｉｉ）前記試料において前記リガンドの結合を検出するステップを含む診断試験。
【請求項５６】
前記リガンドは、抗体である、請求項５５に記載の試験。
【請求項５７】
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項５６に記載の試験。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン様成長因子融合ポリペプチドおよび二量体、上述のポリペプチドをコードする核酸分子、ならびに上述のポリペプチド／二量体を使用する治療の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＧＦ−１は、７．６ｋＤの分子量を有する７０個のアミノ酸のポリペプチドである。ＩＧＦ−１は、細胞の中でも、骨成長をもたらす軟骨細胞の増殖を刺激する。ＩＧＦ−１はまた、筋肉発生にも関係する。ＩＧＦ−１は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）スーパーファミリーのメンバーと相互作用するタンパク質リガンドの例である。約９８％のＩＧＦ−１は、６つの結合タンパク質（ＩＧＦ−ＢＰ）の１つと結合する。ＩＧＦ−ＢＰ３は、最も多く、ＩＧＦ−１結合の８０％を占める。ＩＧＦ−１は２種の受容体；ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦＲ）およびインスリン受容体（ＩＲ）に結合する。このうちの前者は、より大きな親和性で結合する。ＩＧＦ１Ｒに加えて、ＲＴＫスーパーファミリーの他のメンバーは、インスリン受容体（ＩＲ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１としても知られている）および関連ＥｒｂＢ受容体、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦ）、ならびに神経成長因子（ＮＧＦＲ）を含む。細胞外ドメインは、それぞれ、免疫グロブリン様、システインリッチ、ＥＧＦ様を含む、多種多様の異なる構造のいくつかのサブドメインから成る。サイトカイン受容体ファミリーのように、活性化は、リガンド媒介性のオリゴマー化を通して、ほとんどの場合、おそらく二量体化によって起こると考えられる。
【０００３】
他のホルモン系は、ＩＧＦ−１シグナル伝達と相互作用し得る。たとえば、ソマトトロピンとしても知られているヒト成長ホルモンは、約１９０個のアミノ酸のタンパク質ホルモン／サイトカインであり、下垂体前葉の細胞によって合成され、分泌される。それは、成長および代謝を含む、いくつかの複雑な生物学的プロセスをコントロールするために機能する。成長ホルモンは、応答細胞によって発現される成長ホルモン受容体への結合を通しての直接的効果およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）によって主として媒介される間接的効果を有し得る。そのため、成長ホルモンの主な役割は、ＩＧＦ−１を産生するための肝臓の刺激となる。
【０００４】
ＩＧＦ−１産生の欠如またはＩＧＦ−１非感受性に起因する病理は、当技術分野において知られている。重篤な原発性ＩＧＦ−１欠乏症の例は、ラロン型小人症である。罹患者は、成長ホルモン受容体を発現しないので、この疾患は、成長ホルモン療法に応答しない。重篤な原発性ＩＧＦ−１欠乏症の他の形態は、成長ホルモン受容体突然変異およびＩＧＦ−１またはＩＧＦＲにおける突然変異を持つ罹患者を含む。さらに、組換えＩＧＦ−１は、多くの状態、たとえばＩ型およびＩＩ型糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、重篤な熱傷、ならびに筋緊張性筋ジストロフィー症の治療において評価されてきた。ＩＧＦ−１は、腫瘍の維持において役割を有することもまた知られており、そのため、ＩＧＦ−１アンタゴニストは、癌の治療における治療価値を有するだろう。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、薬物動態（ＰＫ）および活性が改善されたＩＧＦ−１組換え形態の同定に関する。新しいＩＧＦ−１分子は、生物学的活性を有し、二量体を形成し、安定性が改善されている。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１ａ】ＬＲ５Ａ１の核酸配列を示す図である。
【図１ｂ】ＬＲ５Ａ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図２ａ】ＬＲ５Ｂ１の核酸配列を示す図である。
【図２ｂ】ＬＲ５Ｂ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図３ａ】ＬＲ５Ｃ１の核酸配列を示す図である。
【図３ｂ】ＬＲ５Ｃ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図４ａ】ＬＲ５Ｄ１の核酸配列を示す図である。
【図４ｂ】ＬＲ５Ｄ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図５ａ】ＬＲ５Ｅ１の核酸配列を示す図である。
【図５ｂ】ＬＲ５Ｅ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図６ａ】ＬＲ５Ｆ１の核酸配列を示す図である。
【図１ｂ】ＬＲ５Ｆ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図７】ヒトＩＧＦ−１  Ａのアミノ酸配列を示す図である。
【図８】ヒトＩＧＦ−１受容体のアミノ酸配列を示す図である。
【図９】ＰＣＲは、適した制限部位（プライマーＲ１〜４内に含有される）が側面に位置する、興味のある遺伝子から成るＤＮＡを生成するために使用した。ｂ）ＰＣＲ産物は、リンカー領域の両側に、適したベクターの中にライゲーションした。ｃ）構築物は、その後、適切なリンカーを導入するために修飾した。リンカーは、いかなる不要な配列（つまり非天然制限部位）も含有しなかった。
【図１０】オリゴヌクレオチドは、特有のオーバーラップを有する部分的に二本鎖の領域を形成するように設計し、アニールし、処理した場合、リガンドおよび受容体にアニールするであろう隣接領域を有するリンカーをコードするであろう。ｂ）ＰＣＲは、ＬＲ融合遺伝子を産生するために「メガプライマー」ならびに末端プライマー（Ｒ１およびＲ２）を使用して行った。Ｒ１およびＲ２プライマーは、標的ベクターの中へのライゲーションに有用な隣接制限部位を導入するように設計した。
【図１１Ａ】ＣＨＯ細胞発現５Ａ１のウェスタンブロットを示す図である。試料は、ＤＴＴの存在下において記載されるように調製した。レーン１：段階、レーン２：５Ａ１（安定細胞株からの１００×濃縮培地）、レーン３：５Ａ１一時的形質移入（３：２のＤＮＡ：ｆｕｇｅｎｅ６）、レーン４：５Ａ１一時的形質移入（３：１のＤＮＡ：ｆｕｇｅｎｅ６）、レーン５：５Ａ１一時的形質移入（ＤＮＡ＋ＴｒａｎｓＩＴ）、レーン６：−ｖｅコントロール（１Ｂ７ｓｔｏｐ安定細胞株からの１００×濃縮培地）、レーン７：ポジティブコントロール、１００ｎｇ  ｒｈ−ＩＧＦ−１。
【図１１Ｂ】より長い曝露時間の５Ａ１の再プローブしたウェスタンブロットを示す図である。レーン１：標準物、レーン２：５Ａ１（安定細胞株からの１００×濃縮培地）５Ａ１は、７５および４０ｋＤａの主な二重のバンドとして分離する。非グリコシル化ＭＷは、約２８．４ｋＤａである。ＩＧＦ−１コントロールタンパク質は、１７ｋＤａのＭＷを有する。
【図１１Ｃ】非還元条件下で実行した５Ａ１培地試料を示す図である。大多数の５Ａ１は、２５０ｋＤａマーカーを超えて流れ、分子が、ジスルフィド連結を介して結合している場合があることを示す。
【図１２Ａ】１％ウシ胎仔血清における成長３日後の、ＭＧ６３細胞の酸性ホスファターゼ活性を刺激する際の組換えＩＧＦ−１の生物活性を示す図である。
【図１２Ｂ】１％ウシ胎仔血清における成長４日後の、ＭＧ６３細胞の酸性ホスファターゼ活性を刺激する際の組換えＩＧＦ−１の生物活性を示す図である。
【図１２Ｃ】２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡにおける成長４日後の、ＭＧ６３細胞の酸性ホスファターゼ活性を刺激する際の組換えＩＧＦ−１の生物活性を示す図である。
【図１２Ｄ】１％ウシ胎仔血清における成長４日後の、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の酸性ホスファターゼ活性を刺激する際の組換えＩＧＦ−１の生物活性を示す図である。
【図１３Ａ】５Ａ１を発現する細胞に由来し、階段希釈した培地との、５Ａ１を発現しない細胞に由来するコントロール培地の比較および１％ウシ胎仔血清における成長３日後のＭＧ６３細胞の酸性ホスファターゼ活性に対するそれらの効果を示す図である。
【図１３Ｂ】５Ａ１を発現する細胞に由来し、階段希釈した培地との、５Ａ１を発現しない細胞に由来するコントロール培地の比較および１％ウシ胎仔血清における成長４日後のＭＧ６３細胞の酸性ホスファターゼ活性に対するそれらの効果を示す図である。
【図１３Ｃ】５Ａ１を発現する細胞に由来し、階段希釈した培地との、５Ａ１を発現しない細胞に由来するコントロール培地の比較および２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡにおける成長４日後のＭＧ６３細胞の酸性ホスファターゼ活性に対するそれらの効果を示す図である。
【図１３Ｄ】５Ａ１を発現する細胞に由来し、階段希釈した培地との、５Ａ１を発現しない細胞に由来するコントロール培地の比較および１％ウシ胎仔血清における成長４日後のＮＩＨ３Ｔ３細胞の酸性ホスファターゼ活性に対するそれらの効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の一態様によれば、インスリン様成長因子受容体の少なくとも１つの結合ドメインに直接または間接的に連結されるインスリン様成長因子ポリペプチドを含む、インスリン様成長因子の活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子が提供される。
本発明の一態様によれば、インスリン様成長因子ポリペプチド受容体ポリペプチドの少なくとも１つのインスリン様成長因子ポリペプチド結合ドメインに直接または間接的に連結されるインスリン様成長因子ポリペプチドのアミノ酸配列またはその活性部分を含む融合ポリペプチドが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述のポリペプチド結合ドメインは、ロイシンリッチアミノ酸モチーフを含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述のロイシンリッチアミノ酸モチーフは、配列番号１４のアミノ酸３１〜１７９を含むまたはそれから成る。
本発明の代替の好ましい実施形態において、上述のロイシンリッチアミノ酸モチーフは、配列番号１４のアミノ酸２２９〜４８７を含むまたはそれから成る。
本発明のさらなる好ましい実施形態において、上述のポリペプチドは、少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ結合ドメインを含み、好ましくは上述のドメインは、配列番号１４のアミノ酸残基４９４〜６０６を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、インスリン様成長因子ポリペプチドは、ロイシンリッチ結合ドメインに連結され、上述のインスリン様成長因子ポリペプチドは、上述の融合ポリペプチドにおいて上述のロイシンリッチドメインのアミノ末端側に位置する。
本発明の代替の好ましい実施形態において、インスリン様成長因子ポリペプチドは、ロイシンリッチ結合ドメインに連結され、上述のインスリン様成長因子ポリペプチドは、上述の融合ポリペプチドにおいて上述のロイシンリッチドメインのカルボキシル末端側に位置する。
本発明の好ましい実施形態において、インスリン様成長因子ポリペプチドは、フィブロネクチンＩＩＩ結合ドメインに連結され、上述のインスリン様成長因子ポリペプチドは、上述の融合ポリペプチドにおいて上述のフィブロネクチンＩＩＩ結合ドメインのアミノ末端側に位置する。
本発明の代替の好ましい実施形態において、インスリン様成長因子ポリペプチドは、フィブロネクチンＩＩＩ結合ドメインに連結され、上述のインスリン様成長因子ポリペプチドは、上述の融合ポリペプチドにおいて上述のフィブロネクチンＩＩＩ結合ドメインのカルボキシル末端側に位置する。
本発明の好ましい実施形態において、インスリン様成長因子ポリペプチドは、ペプチドリンカー、好ましくは柔軟なペプチドリンカーによって、インスリン様成長因子受容体ポリペプチドのロイシンリッチドメインに連結される。
本発明の好ましい実施形態において、上述のペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの少なくとも１コピーを含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述のペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの２、３、４、５、６、７、８、９または１０コピーを含む。
本発明の代替の実施形態において、上述のポリペプチドは、ペプチド連結分子を含まず、インスリン様成長因子ポリペプチドおよびインスリン様成長因子受容体ポリペプチドのロイシンリッチ結合ドメインの直接的な融合物である。
本発明の一態様によれば、
ｉ）配列番号１で表される核酸配列、
ｉｉ）配列番号３で表される核酸配列、
ｉｉｉ）配列番号５で表される核酸配列、
ｉｖ）配列番号７で表される核酸配列、
ｖ）配列番号９で表される核酸配列、
ｖｉ）配列番号１１で表される核酸配列、
から選択される核酸配列を含む核酸分子、または
配列番号１、３、５、７、９または１１とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、インスリン様成長因子調節活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子が提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、アゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、アンタゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする。
核酸分子のハイブリダイゼーションは、２つの相補的な核酸分子が、互いに、かなりの量の水素結合を起こす場合に起こる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、核酸を取り囲む環境条件、ハイブリダイゼーション方法の性質、ならびに使用される核酸分子の組成および長さによって変動し得る。特定の程度のストリンジェンシーを達成するのに必要とされるハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２００１）およびＴｉｊｓｓｅｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  第Ｉ部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３）において説明される。Ｔｍは、核酸分子の所与の鎖の５０％が、その相補鎖にハイブリダイズする温度である。以下は、ハイブリダイゼーション条件の例示的なセットであり、限定的なものではない。
非常に高度なストリンジェンシー（少なくとも９０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：１６時間、６５℃で５×ＳＳＣ
２度洗浄：それぞれ１５分間、室温（ＲＴ）で２×ＳＳＣ
２度洗浄：それぞれ２０分間、６５℃で０．５×ＳＳＣ
高度なストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：１６〜２０時間、６５℃〜７０℃で５×〜６×ＳＳＣ
２度洗浄：それぞれ５〜２０分間、ＲＴで２×ＳＳＣ
２度洗浄：それぞれ３０分間、５５℃〜７０℃で１×ＳＳＣ
低度なストリンジェンシー（少なくとも５０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：１６〜２０時間、ＲＴ〜５５℃で６×ＳＳＣ
少なくとも２度洗浄：それぞれ２０〜３０分間、ＲＴ〜５５℃で２×〜３×ＳＳＣ。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号１で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号３で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号５で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号７で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号９で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号１１で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の一態様によれば、本発明による核酸によってコードされるポリペプチドが提供される。
本発明のさらなる態様によれば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１５、１６、１７、１８、１９または２０から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれから成るポリペプチドが提供される。
本発明の一態様によれば、２つのポリペプチドから成るホモ二量体であって、上述のポリペプチドはそれぞれ、
ｉ）インスリン様成長因子またはその受容体結合ドメインを含む第１の部分と、ペプチド連結分子によってそれと任意選択で連結される
ｉｉ）インスリン様成長因子受容体の少なくとも１つのインスリン様成長因子結合ドメインまたはその部分を含む第２の部分と
を含むホモ二量体が提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述のホモ二量体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１５、１６、１７、１８、１９または２０を含むまたはそれから成る２つのポリペプチドを含む。
本発明のさらなる態様によれば、本発明による核酸分子を含むベクターが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述のベクターは、本発明による核酸分子を発現するように適合された発現ベクターである。
本発明による（１つまたは複数の）核酸を含むベクターは、特に、ベクターが、安定した形質移入のための、ゲノムの中への組換えのために細胞の中に核酸を導入するために使用されることになっている場合、プロモーターまたは他の調節配列を含む必要はない。好ましくは、ベクターにおける核酸は、適切なプロモーターまたは宿主細胞における転写のための他の調節エレメントに作動可能に連結される。ベクターは、複数の宿主において機能する二機能性発現ベクターであってもよい。「プロモーター」によって、転写開始部位から上流の、転写に必要とされる調節領域をすべて含有するヌクレオチド配列が意味される。適したプロモーターは、真核細胞または原核細胞における発現のための構成的、組織特異的、誘発性、発生的、または他のプロモーターを含む。「作動可能に連結される」は、転写がプロモーターから開始されるように適切に位置し、配向する同じ核酸分子の一部としてつながれていることを意味する。プロモーターに作動可能に連結されるＤＮＡは、プロモーターの「転写開始調節下に」ある。
好ましい実施形態において、プロモーターは、構成的、誘発性、または調節可能プロモーターである。
本発明のさらなる態様によれば、本発明による核酸分子またはベクターを用いて形質移入または形質転換される細胞が提供される。
好ましくは、上述の細胞は、真核細胞である。その代わりに、上述の細胞は、原核細胞である。
本発明の好ましい実施形態において、上述の細胞は、真菌細胞（たとえばピキア種、サッカロミセス種、アカパンカビ種）、昆虫細胞（たとえばスポドプテラ種）、哺乳動物細胞（たとえばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞）、植物細胞から成る群から選択される。
本発明のさらなる態様によれば、賦形剤または担体を含む、本発明によるポリペプチドを含む医薬組成物が提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述の医薬組成物は、さらなる治療薬と組み合わせられる。
投与される場合、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる調製物で投与される。そのような調製物は、薬学的に許容できる濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性の担体、および任意選択で他の治療薬を規定どおりに含有していてもよい。
本発明の医薬組成物は、注射を含む、任意の通常の経路によって投与することができる。投与および適用は、たとえば経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、関節内、皮下、局所（目）、皮膚（たとえば皮膚または粘膜へのクリーム状の脂質可溶性挿入物）、経皮、鼻腔内であってもよい。
本発明の医薬組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、単独でまたはさらなる薬もしくは共力性の薬剤と共に所望の応答をもたらす医薬品／組成物の量である。これは、一時的に疾患の進行を単に遅らせることを伴ってもよいが、より好ましくは、それは、持続的に疾患の進行を食い止めることを伴う。これは、ルーチン的な方法によってモニターすることができるまたは診断方法に従ってモニターすることができる。
対象に投与される医薬組成物の用量は、異なるパラメーターに従って、特に、使用される投与のモードおよび対象の状態（つまり年齢、性別）に従って選ぶことができる。投与される場合、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる量および薬学的に許容できる組成物で適用される。医薬で使用される場合、塩は、薬学的に許容できるはずであるが、薬学的に許容できない塩は、その薬学的に許容できる塩を調製するために好都合に使用されてもよく、本発明の範囲から除外されない。そのような薬理学的におよび薬学的に許容できる塩は、以下の酸から調製されるものを含むが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、およびその他同種のもの。さらに、薬学的に許容できる塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、またはカルシウム塩などのようなアルカリ金属塩またはアルカリ土類塩として調製することができる。
医薬組成物は、所望される場合、薬学的に許容できる担体と組み合わせられてもよい。本明細書において使用されるような用語「薬学的に許容できる担体」は、ヒトへの投与に適した１つまたは複数の適合性の固体または液体の増量剤、希釈剤、またはカプセル化する物質を意味する。用語「担体」は、適用を容易にするために有効成分が組み合わせられる天然または合成の有機または無機成分を示す。医薬組成物の構成成分はまた、所望の医薬品効力を実質的に損なうであろう相互作用がない方法で本発明の分子とおよび互いに混合することもできる。
医薬組成物は、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、および塩中のリン酸を含む適した緩衝剤を含有していてもよい。
医薬組成物はまた、任意選択で、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、およびチメロサールなどのような適した防腐剤を含有していてもよい。
医薬組成物は、単位剤形で好都合に与えられてもよく、薬学の技術分野においてよく知られている方法のいずれかによって調製されてもよい。方法はすべて、活性作用物質を、１つまたは複数の補助成分を構成する担体と結合させるステップを含む。一般に、組成物は、活性化合物を、液体の担体、微粉化した固体の担体、またはその両方と均一におよび完全に結合させることならびにその後、必要であれば、産物を成形することによって調製される。
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤、ロゼンジなどのように、別々の単位として与えられてもよく、それぞれが、所定の量の活性化合物を含有する。他の組成物は、シロップ剤、エリキシル剤、または乳剤などのような、水性の液体または非水系の液体中の懸濁剤を含む。
非経口投与に適した組成物は、好ましくは、レシピエントの血液と等張である滅菌した水性または非水系の調製物を好都合に含む。この調製物は、適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、知られている方法に従って製剤されてもよい。滅菌注射調製物はまた、たとえば１，３−ブタンジオール中の液剤のように、無毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶剤中の滅菌注射液剤または懸濁剤であってもよい。用いられてもよい許容できる溶剤の中には、水、リンガー溶液、および等張食塩水がある。さらに、滅菌した不揮発性油は、溶剤または懸濁化剤として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含む任意の無刺激の不揮発性油が用いられてもよい。さらに、オレイン酸などのような脂肪酸は、注射剤の調製物において使用されてもよい。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に適した担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて見つけることができる。
本発明のさらなる態様によれば、重篤な原発性インスリン様成長因子欠乏症に関連する疾患または状態に罹患しているヒト対象を治療するための方法であって、本発明による少なくとも１つのポリペプチドの有効量を投与するステップを含む方法が提供される。
本発明の好ましい方法において、上述の重篤な原発性欠乏症は、ラロン型小人症である。
本発明のさらなる好ましい方法において、上述の疾患は、成長ホルモン療法に応答しない疾患である。
本発明のさらなる好ましい方法において、上述の疾患は、Ｉ型糖尿病である。
本発明の代替の好ましい方法において、上述の疾患は、ＩＩ型糖尿病である。
本発明のさらなる好ましい方法において、上述の疾患は、筋萎縮性側索硬化症である。
本発明のさらなる好ましい方法において、上述の疾患は、筋緊張性筋ジストロフィー症である。
本発明のさらなる好ましい方法において、上述の状態は、重篤な熱傷である。
本発明のさらなる態様によれば、癌に罹患しているヒト対象を治療するための方法であって、本発明によるポリペプチドアンタゴニストの有効量を投与するステップを含む方法が提供される。
本明細書において使用されるように、用語「癌」は、自律的増殖のための能力を有する細胞、つまり、異常な状態または急速に増殖する細胞の成長によって特徴づけられる状態を指す。用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲性のステージに関係なく、すべてのタイプの癌成長もしくは発癌プロセス、転移組織、または悪性形質転換細胞、組織、もしくは器官を含むように意味される。用語「癌」は、たとえば、肺、乳房、甲状腺、リンパ、胃腸、および生殖泌尿器系に影響を与えるものなどのような、様々な器官系の悪性腫瘍ならびにほとんどの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸癌、ならびに食道癌などのような悪性腫瘍を含む腺癌を含む。用語「癌腫」は、当技術分野において認識されており、呼吸器系癌腫、胃腸系癌腫、泌尿生殖器系癌腫、精巣癌腫、乳房癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫、および黒色腫を含む、上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。例示的な癌腫は、頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸、および卵巣の組織から形成されるものを含む。用語「癌腫」はまた、癌肉腫をも含み、たとえば、これは、癌性および肉腫性組織から構成される悪性腫瘍を含む。「腺癌」は、腺組織に由来するまたは腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫を指す。用語「肉腫」は、当技術分野において認識され、間葉由来の悪性腫瘍を指す。
本発明の好ましい方法において、上述のポリペプチドは、静脈内に投与される。
本発明の代替の好ましい方法において、上述のポリペプチドは、皮下に投与される。
本発明のさらなる好ましい方法において、上述のポリペプチドは、２日間隔で投与され、好ましくは、上述のポリペプチドは、１週、２週、または１か月間隔で投与される。
本発明のさらなる態様によれば、本発明によるポリペプチドまたは二量体に結合するモノクローナル抗体が提供される。
好ましくは、上述のモノクローナル抗体は、ポリペプチドまたは二量体に結合するが、インスリン様成長因子またはインスリン様成長因子受容体にそれぞれ特異的に結合しない抗体である。
モノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドを含む二量体のいずれかによって提示される立体構造抗原（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）に結合する。
本発明のさらなる態様において、本発明によるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製するための方法であって、
ｉ）本発明による少なくとも１つのポリペプチドまたはその断片を含む免疫原を用いて免疫応答性哺乳動物を免疫するステップ、ｉｉ）免疫された免疫応答性哺乳動物のリンパ球を骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成するステップ、
ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体を、（ｉ）のポリペプチドに対する結合活性についてスクリーニングするステップ、
ｉｖ）ハイブリドーマ細胞を培養して、上述のモノクローナル抗体を量産および／または分泌するステップ、ならびに
ｖ）培養上清からモノクローナル抗体を回収するステップを含む方法が提供される。
好ましくは、上述の免疫応答性哺乳動物は、マウスである。その代わりに、上述の免疫応答性哺乳動物は、ラットである。
ハイブリドーマ細胞を使用するモノクローナル抗体の産生は、当技術分野においてよく知られている。モノクローナル抗体を産生するために使用される方法は、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６、４９５〜４９７ページ（１９７５）におけるＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎならびにＤｏｎｉｌｌａｒｄおよびＨｏｆｆｍａｎ、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖ．ＩＩ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ編、１９８１における「Ｂａｓｉｃ  Ｆａｃｔｓ  ａｂｏｕｔ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」によって開示され、これらは、参照によって組み込まれる。
本発明のさらなる態様によれば、本発明による方法によって得られるまたは入手可能なハイブリドーマ細胞株が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、生体試料において、本発明によるポリペプチドを検出するための診断試験であって、
ｉ）試験対象となる単離試料を提供するステップ、
ｉｉ）上述の試料を、本発明によるポリペプチドまたは二量体に結合するリガンドと接触させるステップ、および
ｉｉｉ）上述の試料において上述のリガンドの結合を検出するステップを含む診断試験が提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述のリガンドは、抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
本明細書の説明および請求項の全体にわたって、その用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」および用語の変化形、たとえば「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「〜を含むが、これらに限定されない」を意味し、他の部分、添加剤、構成成分、整数、またはステップを除外することを意図しない（および除外しない）。
本明細書の説明および請求項の全体にわたって、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、明細書は、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、複数および単数を企図するものとして理解されたい。
本発明の特定の態様、実施形態、または実施例に関連して記載される特色、整数、特徴、化合物、化学的部分、または化学基は、矛盾しない限り、本明細書において記載される他の態様、実施形態、または実施例に適用可能であることが理解されたい。
本発明の実施形態は、ここで、単なる例示として、以下の図に関連して記載することとする。
表１は、タンパク質名称の概要を示す表である。
材料および方法
インビトロ試験
ＩＧＦ−１の活性を検出し、評価するためのインビトロ試験は、当技術分野において知られている。たとえば、Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９２）第１２巻、９号  ３８８３〜３８８９ページ）は、ＢＡＬＢ  ３Ｔ３細胞におけるＩＧＦ−１受容体の発現およびＩＧＦ−１への曝露が、細胞増殖の刺激およびＩＧＦ−１受容体の自己リン酸化をもたらすことを記載している。アンタゴニストモノクローナル抗体を使用する、ＩＧＦ−１によるＩＧＦ−１受容体活性化のブロッキングを記載するＦｌｉｅｒら（ＰＮＡＳ（１９８６）８３：６６４〜６６８ページ）もまた参照されたい。
インビボ試験
ＩＧＦ−１の様々な動物モデルは、ＩＧＦ−１の活性を試験するために入手可能である。たとえば、Ｌｅｍｂｏら（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（１９９９）９８、２６４８〜２６５５ページ）は、野生型ＩＧＦ−１レベルが３０％低下しているが、成年期まで生存することができた、突然変異対立遺伝子を持つ突然変異ＩＧＦ−１マウスを記載している。Ｌｉｕら（Ｃｅｌｌ（１９９３）７５：５９〜７２ページ）およびＰｏｗｅｌｌ−Ｂｒａｘｔｏｎら（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９３）７：２６０９〜２６１７ページ）は、重篤な胚および出生後の成長異常を示すホモ接合性マウスを記載している。
免疫試験
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体へのＩＧＦ−１の結合を測定するイムノアッセイは、当技術分野において知られている。市販で入手可能なＩＧＦ−１抗体は、試料におけるＩＧＦ−１を検出するためにおよびまた競合的阻害研究における使用のためにも入手可能である。たとえばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、Ａｂｃａｍ  ＰＬＣを参照されたい。
融合タンパク質の組換え産生
融合タンパク質の構成成分は、リガンドまたは受容体にアニールし、標的ベクターの中にクローニングするための適した制限部位を導入するように設計したプライマーを使用して、ＰＣＲによって生成した（図９ａ）。ＰＣＲのための鋳型は、標的遺伝子を含み、ＩＭＡＧＥクローン、ｃＤＮＡライブラリー、または特注合成遺伝子から得た。適切な隣接制限部位を有するリガンドおよび受容体の遺伝子を合成したら、これらは、その後、標的ベクターにおけるリンカー領域の両側にライゲーションした（図９ｂ）。構築物は、その後、リンカー領域の両側の２つの特有の制限部位の間への特注合成長のＤＮＡの挿入によって、ｓｓＤＮＡ修飾技術によるリンカー領域の変更によって、適した制限部位の間へのプライマーデュプレックス／マルチプレックスの挿入によって、またはＰＣＲ修飾によって、隣接制限部位を有していない適切なリンカーを含有するように修飾した（図９ｃ）。
その代わりに、最適なリガンドまたは受容体のドメインにアニールするように設計した隣接配列を有するリンカーを、オリゴヌクレオチドデュプレックスを作製することによって、最初に合成し、これを、二本鎖のＤＮＡを生成するように処理した（図１０ａ）。その後、「メガプライマー」としてのリンカー配列、「メガプライマー」がアニールするリガンドおよび受容体の反対側の末端に対して設計したプライマーを使用し、鋳型としてのリガンドおよび受容体を用いてＰＣＲを行った。末端プライマーは、最適な発現ベクターへのライゲーションに適した制限部位を用いて設計した（図１０ｂ）。
融合タンパク質の発現および精製
発現は、適した系（たとえば哺乳動物ＣＨＯ細胞および大腸菌）において実行し、これは、ＬＲ融合遺伝子を生成したベクターに依存した。発現は、その後、１つまたは複数のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、未変性ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡを含むことができる多種多様の方法を使用して分析した。
適したレベルの発現が達成されたら、ＬＲ融合物は、精製および後の分析のための十分なタンパク質を産生するためにより大規模で発現させた。精製は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、サイズ排除、および／またはアフィニティークロマトグラフィーなどのような１つまたは複数のクロマトグラフィー手順の適した組合せを使用して実行した（ニッケル／コバルト樹脂、抗体固定化樹脂、および／またはリガンド／受容体固定化樹脂を使用）。精製タンパク質は、１つまたは複数のブラッドフォードアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、未変性ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡを含むことができる、多種多様の方法を使用して分析した。
ＬＲ融合物の特徴づけ
変性ＰＡＧＥ、未変性ＰＡＧＥゲル、およびウェスタンブロッティングは、融合ポリペプチドを分析するために使用し、ウェスタンブロッティングは、ＬＲ融合物に対して非立体構造感受性の抗体を用いて行った。未変性溶液状態の分子量情報は、ＳｕｐｅｒｏｓｅＧ２００分析カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーおよび分析超遠心法などのような技術から得ることができる。
統計
２つのグループは、それらの分散が正常に分布した場合、スチューデント検定を用いてまたは正常に分布しなかった場合、スチューデント−サタースウェイト検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔｅ’ｓ  ｔｅｓｔ）によって比較した。分布は、Ｆ検定を用いて試験した。一元配置ＡＮＯＶＡは、３つ以上のグループの平均値を比較するために使用し、有意水準がｐ＜０．０５であった場合、個々の比較はダネット検定を用いて行った。統計的検定はすべて、５％の有意水準で両側とし、欠測値に対するインピュテーションは行わなかった。
キメラクローンの構築
クローンはすべて、哺乳動物発現プラスミドｐＳｅｃＴａｇ−ｌｉｎｋの中に、制限酵素Ｎｈｅ１／ＨｉｎｄＩＩＩを使用してライゲーションした。クローンは、細胞培地への効率的な分泌のためにヒトＩＧＦ−１の分泌シグナルに付着させた。５Ａ１の全遺伝子は、遺伝子合成を使用してクローニングし、哺乳動物発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ−ｌｉｎｋの中にクローニングして、ｐＩＧＦｓｅｃＴａｇ−５Ａ１を形成した。
哺乳動物安定発現
哺乳動物発現系は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎベクターｐＳｅｃＴａｇ−Ｖ５／ＦＲＴ−Ｈｉｓｔの改良を使用して確立した。
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＦｌｐ−Ｉｎ系
この系は、高度な発現のための、宿主ゲノム内の特異的な部位への安定したクローンの迅速な生成を可能にする。これは、分泌または細胞質発現タンパク質で使用することができる。Ｆｌｐ−Ｉｎ宿主細胞株（ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ）は、転写活性ゲノム座に位置する単一のＦｌｐリコンビナーゼ標的（ＦＲＴ）部位を有する。安定細胞株は、Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞株の中へのベクター（ＦＲＴ標的部位を含有）およびｐＯＧ４４（ｆｌｐリコンビナーゼを一時的に発現するプラスミド）の同時形質移入によって生成する。選択はハイグロマイシンＢを用いる。ＤＮＡの統合が指示されるので、クローン選択の必要はない。Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞株の培養：基本的な細胞培養技術を使用するメーカーの指示に従う。
Ｆｕｇｅｎｅ−６を使用するＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞の安定した形質移入
形質移入の前日、ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有する１０ｍｌのＨａｍｓＦ１２培地の全容量で１００ｍｍペトリ皿当たり６×１０Ｅ５で接種した。翌日、１．５ｍｌポリプロピレンチューブに５７０μｌの無血清培地（抗生物質を含有せず）を追加した。その後、３０μｌのｆｕｇｅｎｅ−６を追加し、緩やかな回転によって混合した。プラスミドの別個の混合物は、興味のある２μｇプラスミドを１８μｇ  ｐＯＧ４４（プラスミドは、宿主ゲノムの中へのプラスミドの適切な統合に必要なリコンビナーゼ酵素を含有する）と組み合わせるそれぞれの形質移入のために準備した。コントロールプレートにはプラスミドを加えなかった。これは、緩やかな回転によってｆｕｇｅｎｅ−６と混合し、１５分間、室温に置き、その後、Ｆ１２培地＋１０％ＦＣ中にＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を含有するそれぞれのペトリ皿の表面に液滴をかけた。プレートは、十分な混合を確実にするために穏やかに回転させ、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間置いた。翌日、培地は、６００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含有する選択培地と交換した。細胞は、６０％以下の培養密度にルーチン的に保った。コントロールプレート細胞（非形質移入細胞）が死滅する（つまり非ハイグロマイシン抵抗性）まで、細胞は、６００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンＢの存在下に置いておいて、成長させた。
安定ＣＨＯ細胞株からの発現の試験
興味のあるタンパク質を発現するコンフルエントなＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞株を、無血清培地において約３〜４日間、７５ｃｍ２フラスコにおいて成長させ、この時点で、試料を採取し、アセトン沈殿を使用して濃縮した。試料を、２５ｍＭ  ＤＴＴの存在下または非存在下において等容量のｌａｅｍｍｌｉローディングバッファーと混合し、５分間、沸騰させた。試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＢＳ−０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０中の５％（ｗ／ｖ）牛乳タンパク質中でブロックした後に、試料検出は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合二次抗体と共に特異的抗ＩＧＦ−１抗体を使用して実行した。視覚化は、ＨＲＰ検出キットを使用する、写真用フィルム上での化学発光によるものとした。
一時的な形質移入からの発現の試験
ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞は、２ｍｌ培地（ＤＭＥＭ、Ｆ１２、１０％ＦＣＳ＋Ｐ／Ｓ＋Ｌ−グルタミン＋Ｚｅｏｃｉｎ）の全容量において６枚のウェルプレートのウェル当たり０．２５×１０Ｅ６細胞で接種した。細胞は、ｏ／ｎで成長させた。その後、細胞は、表１に示す、指定した試薬比率でＴｒａｎｓＩＴ−ＣＨＯ試薬（Ｍｉｒｕｓ）またはｆｕｇｅｎｅ−６のいずれかを使用して形質移入した。コントロール形質移入は、１Ｂ７ｓｔｏｐ（ＧＨ含有キメラ分子）を使用して準備した。手短に言えば、ＴｒａｎｓＩＴ試薬を使用する場合、２００ｕｌの無血清培地（ＯＰＴＩ  ＭＥＭ）を形質移入当たり１．５ｍｌエッペンドルフに追加し、その後、２ｕｇ  ＤＮＡを追加した。チューブは、室温で１５分間、置いた。その後、１ｕｌのＣＨＯ  Ｍｏｊｏ試薬を添加し、混合し、さらに１５分間、置いた。培地を無血清に交換し、形質移入混合物は、適切なウェルの表面上に液滴でピペットで移した。手短に言えば、Ｆｕｇｅｎｅ−６試薬を使用する場合、９４ｕｌの無血清培地（ＯＰＴＩ  ＭＥＭ）を形質移入当たり１．５ｍｌエッペンドルフに追加し、その後、２ｕｇ  ＤＮＡを追加した。チューブは、室温で１５分間、置いた。形質移入混合物は、その後、無血清培地を含有する適切なウェルの表面上に液滴でピペットで移した。プレートはすべて、２〜３日間、３７℃／５％ＣＯ２で置いた。
ＩＧＦ−１生物活性アッセイ
アッセイ培地
ＭＧ６３細胞：１０％ＦＣＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を補足したＥＭＥＭ＝完全ＥＭＥＭ  ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞：ＤＭＥＭ＋グルタマックス（４．５ｇ／Ｌ  グルコース］＋１０％ＦＣＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  Ｌ−グルタミン＝完全ＤＭＥＭ。
ＭＧ６３細胞：２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡまたは１％ＦＣＳ、５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、ＮＥＡＡを補足したＥＭＥＭ［Ｇｉｂｃｏ］。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞：ＤＭＥＭ＋グルタマックス［Ｇｉｂｃｏ；カタログ＃６１９５６、ロット＃３５７７００］＋１％ＦＣＳ（または２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）、５ｍＭ  Ｌ−グルタミン［Ｇｉｂｃｏ］、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ［Ｇｉｂｃｏ］、２ｍＭピルビン酸ナトリウム［Ｇｉｂｃｏ］。
アッセイ方法
１．アッセイについて；細胞をＴＥ処理し、数える。１％ＦＣＳ（または２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）を補足したＤＭＥＭにおいて５０ｕｌ中、約５×１０Ｅ３細胞（１ｍｌ当たり１×１０Ｅ５細胞）に密度を調節する。９６ウェルプレート上で平板培養する。
２．ＤＭＥＭ（１％ＦＣＳまたは２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを有する）において一連のＩＧＦ−１希釈溶液を調製し、５０ｕｌのそれぞれの希釈溶液（０〜１００ｎｇ／ウェル）を追加して、細胞を含有するウェルを分ける。培地試料について同じことを行う。
３．３７℃／５％ＣＯ２で３および４日間、ＩＧＦ−１または試験試料の存在下において細胞を成長させる。
４．アッセイするために、ウェルから培地を取り出し、２００ｕｌ  ＰＢＳバッファーを用いて一度、それぞれのウェルをすすぐ。
５．アッセイバッファー中でｐＮＰＰを使用する、アルカリホスファターゼのアッセイ：ウェル当たり１００ｕｌを追加する。
６．２時間、３７℃でインキュベートする。
７．それぞれのウェルに１０ｕｌの１Ｍ  ＮａＯＨを追加して、反応を停止させる。
８．５〜２０分間、室温でプレートをインキュベートして、発色させる。
９．マイクロプレートリーダーにおいてそれぞれのウェルのＡ４０５ｎｍを記録する。
コントロール
１．アッセイ培地および基質（生物活性因子なし）：基質の非酵素的加水分解の量を決定する。これらの値をそれぞれの実験値から引く。
２．細胞のみおよび基質（生物活性因子なし）：これは、細胞が、因子の非存在下においてどれくらい成長したかを表す。
実施例
細胞株ＭＧ６３およびＮＩＨ  ３Ｔ３がＩＧＦ−１またはキメラ（５Ａ１）の存在下において増殖する能力を試験した。試験は、基質ｐ−ニトロフェニルリン酸を使用する、内在性酸性ホスファターゼ活性のアッセイに基づく。ＭＧ６３細胞（ヒト骨肉腫細胞株：カタログ＃８６０５１６０１、ロット＃０５Ｆ００８、ＥＣＡＣＣ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞；マウス線維芽細胞株［Ｓｉｍｏｎ  Ｓｍｉｔｈ、ＡＲＣＢｉｏｓｅｒｖ、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから得た：バイアル上の日付、１９９３年６月２４日］。ＭＧ６３およびＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の両方は、組換えＩＧＦ−１の存在に十分に応答し、好適な用量応答曲線が得られる。図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、および１２Ｄを参照されたい。これらのデータは、５Ａ１培地の存在下において、細胞が増殖して、より低度な希釈溶液で軽度の用量応答をもたらすことを示す。５Ａ１培地試料は、一貫して、コントロール培地よりも高度な程度の増殖をもたらす。図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、または１３Ｄを参照されたい。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ）】
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【図１０Ｂ）】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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