(57)【要約】本発明は、ＲＮＡの分離精製の方法を提供する。本発明の該方法は、固定相として多孔質の逆相を用いるＨＰＬＣによってＲＮＡが精製されることを特徴としている。本発明はまた、このＨＰＬＣ法における多孔質の逆相の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定相として多孔質の逆相を用いる、ＨＰＬＣ法または低圧もしくは常圧の液体クロマトグラフィー法によって、ＲＮＡを精製する、調製用の規模においてＲＮＡを精製する方法。
【請求項２】
上記ＲＮＡが、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは全細胞ＲＮＡ、特にまた例えばアプタマーもしくはリボザイムといったＲＮＡバリアントのなかから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ＲＮＡが、約１５０００ヌクレオチドまたは塩基対以下のサイズを有している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記ＲＮＡが、１００〜１００００ヌクレオチドまたは塩基対以下のサイズを有している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
多孔質の上記逆相が、８〜５０μｍ、特に８〜３０μｍ、より好ましくは８〜２５μｍの粒径を有している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記逆相が、１０００〜５０００Åの孔径を有している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記逆相が、１０００〜４０００Åの孔径を有している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
多孔質の上記逆相が、多孔質のポリスチレン、多孔質の非アルキル化ポリスチレン、ポリスチレンジビニルベンゼン、多孔質の非アルキル化ポリスチレンジビニルベンゼン、多孔質のシリカゲル、非極性残基を用いて修飾した多孔質のシリカゲル、ブチル−、オクチル−および／またはオクタデシル−含有残基から選択されるアルキル含有残基を用いて修飾した多孔性シリカゲル、フェニル残基を用いて修飾した多孔質シリカゲル、あるいは多孔質ポリメタクリレートである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
多孔質の上記逆相が、ビーズによって形成されているか、または重合体化ブロックとして存在している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＰＬＣカラムが、５ｃｍ以上、特に１００ｃｍ以下の長さ、および４ｍｍ以上、特に２５ｍｍ以下、好ましくは１ｍ、より好ましくは１００ｃｍの直径を有している、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＰＬＣ精製は、負電荷のＲＮＡに対する対イオンとして正電荷のイオンが移動相に加えられているイオン対法として実施されるか、またはサイズ排除クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーもしくはイオン対クロマトグラフィーによって実施される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
水性溶媒および有機溶媒の混合物が、ＨＰＬＣ精製の溶出のために使用される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
上記水性溶媒が緩衝液である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記緩衝液が、トリエチルアンモニウムアセテート、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、テトラブチルアンモニウムビサルフェート、テトラブチルアンモニウムブロマイドまたはテトラブチルアンモニウムクロライドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記トリエチルアンモニウムアセテートの緩衝液が、０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記有機溶媒が、アセトニトリル、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールおよびアセトン、またはこれらの混合物である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
上記有機溶媒がアセトニトリルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
移動相が、アセトニトリルと０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテートとの混合物である、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
移動相が、当該移動相に対して５．０〜２５．０容積％の上記有機溶媒を含有しており、かつ水性溶媒を用いて１００容積％にされている、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
上記移動相が、当該移動相に対して７．５〜１７．５容積％、特に９．５〜１４．４容積％の上記有機溶媒を含有しており、かつ水性溶媒を用いて１００容積％にされている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
分離が無勾配分離によって行われる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
分離が勾配分離によって行われる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
有機溶媒の比率が、勾配分離に際して、移動相における最初の容積％に対して、特に少なくとも１０％、より好ましくは５０％、最も好ましくは少なくとも１００％、任意に少なくとも２００％増加する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
移動相における有機溶媒の上記比率が、ＨＰＬＣ分離の間に３〜９容積％、好ましくは４〜７．５容積％、特に５．０容積％になる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
移動相における有機溶媒の上記比率が、ＨＰＬＣ分離の間に移動相に対してそれぞれ場合に、３〜９容積％、特に５．０〜２０．０容積％増加する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
移動相における有機溶媒の上記比率が、ＨＰＬＣ分離の間に移動相に対して、いずれの場合においても６．５〜８．５容積％、特に７．５〜１７．５容積％増加する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＨＰＬＣ法における、多孔質の逆相の使用。
【請求項２８】
多孔質の上記逆相が請求項５〜８のいずれか１項に記載の逆相である、請求項２７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、調製用の規模にてＨＰＬＣを用いてＲＮＡを精製する方法、および当該方法における固定相としての多孔質の逆相の使用に関する。
【０００２】
ＨＰＬＣ（“高速（高圧）液体クロマトグラフィー”の略語）は、物質の混合物を分離する確立された方法である。ＨＰＬＣは、生化学、分析化学および臨床化学において広く使用されている。
【０００３】
ＨＰＬＣ装置は、最も簡易な場合に、移動相を収納する溶出液貯留槽を有するポンプ、サンプル投入系、固定相を収納する分離カラム、および検出器からなる。さらに、フラクションコレクターがまた備えられ得る。フラクションコレクターによって、個々の画分が分離後に回収され得、その結果、個々の画分はさらなる用途に利用可能である。
【０００４】
イオン対逆相ＨＰＬＣを用いたＲＮＡ分析は、A. AzaraniおよびK.H. Hecker（Nucleic Acids Research, vol. 29, no. 2 e7）によって知られている。ここでは、固定相は、無孔性のアルキル化ポリスチレンビニルベンゼンマトリクスからなる。溶出は２つの溶出液の緩衝液系によって行われる。緩衝液Ａは、０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７．０の水性溶液からなる。緩衝液Ｂは、２５％のアセトニトリルを有する、０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．０の水性溶液からなる。溶出は以下の３つの勾配系を用いて実施された。３８〜４８％のＢに対して１分間、６０％のＢに対して１５分間、６６％のＢに対して６分間、７０％のＢに対して０．５分間、１００％のＢに対して０．５分間、１００％のＢに維持して１分間、３８％に対して１分間、３８％のＢに維持して２分間。代替可能に、以下の勾配プログラム：３８〜６０％のＢに３０分間、１００％のＢに対して２分間、３８％のＢに対して３分間が使用された。以下の第３の勾配プログラム：３８〜４０％のＢを１分、６０％のＢに対して３分間、１００％のＢに対して１分間、１００％のＢに維持して６分間、３８％のＢに対して１分間、３８％のＢに維持して１分間が使用された。
【０００５】
このように、このＨＰＬＣ法は、比較的に複雑であり費用のかかる勾配プログラムを用いることが必要であった。さらに、ほぼ１０００ｎｇ（１μｇまたは０．００１ｍｇ）以下の分析量のＲＮＡしか、この方法を用いて分離および分析され得ない。
【０００６】
ここで、本発明の目的は、従来技術の不都合をもはや示さない程度に、この種の方法を改善することである。
【０００７】
これは、本発明に係る調製用の規模においてＲＮＡを精製する方法によって実現される。当該方法は、固定相として多孔質の逆相を用いるＨＰＬＣによってＲＮＡが精製されることを特徴とする。したがって、本発明に係る方法において重要な要素は、多孔質の逆相が使用されることである。
【０００８】
本発明に鑑みて、用語“ＨＰＬＣによって”は、種々のＨＰＬＣ法だけでなく、本発明の方法の実施に使用され得る低圧または常圧の液体クロマトグラフィー法が含まれる。これらは、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはイオン対クロマトグラフィーを含み得る。ここで、逆相ＨＰＬＣが好ましい。詳述されていない限り、逆相ＨＰＬＣは、非極性の固定相および中程度の極性の移動相からなる。１つの通常の固定相は例えばシリカである。当該シリカは、例えばＲＭｅ２ＳｉＣｌを用いて処理されている。ここで、Ｒは直鎖アルキル基（Ｃ１８Ｈ３７またはＣ８Ｈ１７）である。したがって、保持時間は本質的により非極性の分子ほど長い。これによって極性分子が容易に溶出される。保持時間は、移動相に対する極性溶媒の添加によって増大し、かつより疎水性の溶媒の添加によって減少する。
【０００９】
しかし、上述した種々の手法は、疎水性相互作用の原理にしたがって作用する。疎水性相互作用は、相対的に極性の溶媒と、相対的に非極性の検体と、非極性の固定相とのそれぞれの間における反発力から生じる（逆相原理）。固定相に対する検体（ＲＮＡ分子）の結合の推進力は、溶媒にさらされる検体分子の非極性部分が有する面積の減少である。規則正しい分子−極性溶媒の界面の最小化と関連するエントロピーから自由エネルギーを減少させることによって、この疎水性の影響が優位になる。疎水性の影響は、より非極性の溶媒を移動相に添加することによって減少する。これは、検体が移動相においてカラムを伝い落ちる時間を一部余分に費させて、最終的にカラムから溶出されるように、分配係数を変える。
【００１０】
検体としての特定のＲＮＡの特性が、その保持特性に重要な役割を果たし得る。より無極性の官能基を有する検体は、分子の疎水性が増大するので、一般的により長い保持時間になる。しかし、非常に大きな分子は、巨大な検体とアルキル鎖との間に不完全な相互作用を生じ得る。保持時間は、溶質の大きさにおおよそ反比例して、疎水性表面の面積とともに増大する。分岐鎖化合物は、全体の表面積が小さいので、対応する異性体よりも速く溶出する。
【００１１】
移動相の疎水性のほかに、他の移動相の改変物は、本発明によれば、検体（ＲＮＡ分子）の保持に影響し得る。例えば、無機塩の添加は、水性溶液の表面張力を直線的に増加させると考えられ得る。さらに、検体−溶媒界面のエントロピーが表面張力によって制御されるので、無機塩の添加は保持時間の増大を示す傾向にある。本発明にしたがって利用され得る他の重要な要素はｐＨである。これは、検体の疎水性を変化し得るからである。この理由から、緩衝化物質（例えば、リン酸ナトリウムまたは他の通常の緩衝化物質）は、ｐＨの制御に使用され得る。有機酸（例えば、蟻酸または最も通常にトリフルオロ酢酸）は、移動相に加えられ得る。上述の改変は複数の目的を果たし得る。当該改変は、ｐＨを制御し、固定相上のあらゆる残基を露出した物質における電荷を無電荷にし、かつ検体を無電荷にするイオン対化物質として作用する。この影響は、利用法に依存して変化するが、一般的にクロマトグラフィーを改良する。
【００１２】
本発明にとって、用語“精製”は、サンプルにおける所望のＲＮＡが当該サンプルに存在する不純物から分離および／または単離されることを意味すると理解される。したがって、ＨＰＬＣ精製後におけるＲＮＡは、ＨＰＬＣ精製前における導入した当初のＲＮＡ含有サンプルよりも純粋な形態を示す。ＲＮＡ含有サンプルの所望されない成分（したがって分離される必要がある）は、特に分解断片もしくは転写が不十分に終了したことによって生じた断片、またはプラスミドが完全に直鎖化されない場合の過剰に長い転写物であり得る。さらに、酵素（例えば、ＲＮａｓｅおよびポリメラーゼ）、およびヌクレオチドといった不純物が分離され得る。
【００１３】
ＲＮＡは、本発明に係る方法を用いて精製されて、精製後に開始物質よりも高い純度になる。この観点から、可能な限り１００％であることが好ましい。７０％、特に８０％、とりわけ９０％、最も好ましくは９９％以上の純度が、この方法において達成され得る。
【００１４】
本発明に係る方法は、調製用のＲＮＡ精製をもたらす。これは、上述の従来技術（AzaraniおよびHecker）に説明されている分析ＨＰＬＣ法とは異なる。分析ＨＰＬＣ法において、調製用のＨＰＬＣ法よりも明らかに少量が導入され、かつ分離される。従来技術において論じられている方法において、８ｎｇ〜１０００ｎｇの量が導入される。これに対して、調製用のＨＰＬＣは、相対的に大量のＲＮＡが精製されるＨＰＬＣを意味することを理解されるべきである。当該相対的に大量とは、例えば、０．５ｍｇ以上、特に１．０ｍｇ〜１０００ｍｇ以上、とりわけ約１．５ｍｇ以上であり、ｋｇの範囲にさえ大規模化できる。したがって、上記説明は、これらの量が単回のＨＰＬＣの実行に関することを意味することを理解される。
【００１５】
本発明に係る方法、特に本明細書にその詳細について後述する好ましい実施形態は、以下の一連の利点を示す。従来技術から公知の方法を用いて可能な量と比較して、本発明に係る方法を用いた実質的に大量のＲＮＡが分離され得る。本発明に係る方法を用いて、これらの相対的に多い量が高い純度を有して得られる。分解断片、過剰に長い断片または転写の不十分な終了によって生じた断片の分離が可能である。さらに、ＲＮＡサンプルに存在するさらなる不純物（例えば、ＲＮａｓｅおよびポリメラーゼといった酵素、ならびにヌクレオチド）の良好な分離が可能である。これらの相対的に大量のＲＮＡは、非常に高レベルの不純物が混入しているサンプルからでさえ、数分以内に回収され得る。信頼性の高いＲＮＡの回収が実施される。すなわち、高純度のＲＮＡが、非常に高い信頼性を有して回収される。本発明に係る方法は、さらに容易に自動操作され得る。したがって、調製用の規模における通常のＲＮＡ精製に最も好適である。ＲＮＡは、本発明に係る方法の条件において安定である。すなわち、ＨＰＬＣ精製におけるＲＮＡ断片への分解、これによる新たな不純物の生成、およびＨＰＬＣ精製において所望されるＲＮＡの収量の低下が回避される。したがって、本発明に係る方法は、単純、迅速および安価な様式において、正確にかつ信頼性の高い結果を伴って実施され得る。ＨＰＬＣ精製後におけるＲＮＡの単離は、フラクションコレクターを用いて簡単に実施され得る。すなわち、ＲＮＡの回収は、非常に簡単に実現され得る。同様にＲＮＡのさらなる直接的な処理を行うことが可能である。検出は、最終的に非常に感度よく実施され得る。
【００１６】
本発明に係る方法を用いて精製される“ＲＮＡ”は、あらゆる種類のリボ核酸である。ＲＮＡは、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはホールセルＲＮＡから特に好ましく選択される。さらに、ＲＮＡはまた、アプタマーおよびリボザイムを包含し得る。単離されるＲＮＡは１本鎖または２本鎖であり得る。１本鎖ＲＮＡは、リフォールディングによって２次構造を任意に形成し得る。分離されるＲＮＡは典型的に１本鎖である。ＲＮＡは、非標識であり得るか、または標識され得る（蛍光標識、放射線標識または抗体エピトープを用いて）。標識ＲＮＡの一例は、ジゴキシゲニン標識したβ−アクチンＲＮＡである。
【００１７】
精製されるＲＮＡは、未処理のＲＮＡまたは処理後のＲＮＡであり得る。未処理のＲＮＡは、好ましく使用され、例えば、細胞系またはインビトロ発現系を用いて調製される。それから、ＲＮＡが単離され、かつ単離物が本発明に係る方法を用いて精製される。任意に、化学合成ＲＮＡもまた、本発明に係る方法を用いて精製され得る。あらゆる場合において、ＲＮＡは処理後のヌクレオチドを含み得る（ここで、ＲＮＡの骨格に化学修飾が存在し得る）。化学修飾は、例えばヌクレオチド塩基の構造、または糖残基におけるホスホロチオネートである。化学修飾を受けるヌクレオチドの構造は、例えば、ヒポキサンチン、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ＜２＞−ジメチルグアニン、２，４−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換された７−デアザプリン（好ましくは７−デアザ−７−置換および／または７−デアザ−８−置換のプリン）、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン（例えば、Ｎ４−エチルシトシン）、５−ヒドロキシデオキシシチジン、５−ヒドロキシメチルデオキシシチジン、Ｎ４−アルキルデオキシシチジン（例えば、Ｎ４−エチルデオキシシチジン）、６−チオデオキシグアノシン、およびニトロピロールのデオキシリボヌクレオチド、およびジアミノプリン（例えば、２，６−ジアミノプリン）、イノシン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリンである。修飾を受けたヌクレオチドのさらなる例は、２−アミノ−６−クロロプリン−リボシド−５’−トリホスフェート、２−アミノアデノシン−５’−トリホスフェート、２−チオシチジン−５’−トリホスフェート、２−チオウリジン−５’−トリホスフェート、４−チオウリジン−５’−トリホスフェート、５−アミノアリルシチジン−５’−トリホスフェート、５−アミノアリルウリジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモシチジン、−５’−トリホスフェート、５−ブロモウリジン−５’−トリホスフェート、５−ヨードシチジン−５’−トリホスフェート、５−ヨードウリジン−５’−トリホスフェート、５−メチルシチジン−５’−トリホスフェート、５−メチルウリジン−５’−トリホスフェート、６−アザシチジン−５’−トリホスフェート、６−アザウリジン−５’−トリホスフェート、６−クロロプリン−５’−トリホスフェート、７−デアザアデノシン−５’−トリホスフェート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスフェート、８−アザアデノシン−５’−トリホスフェート、８−アジドアデノシン−５’−トリホスフェート、ベンズイミダゾール−リボシド−５’−トリホスフェート、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−トリホスフェート、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−トリホスフェート、シュードウリジン−５’−トリホスフェート、ピューロマイシン−５’−トリホスフェート、キサントシン−５’−トリホスフェートである。
【００１８】
本発明に係る方法の好ましい実施形態において、分離されるＲＮＡは、約１５０００ヌクレオチド（１本鎖ＲＮＡ分子として）または塩基対以下のサイズを有する。特に、当該ＲＮＡは、１００〜１００００ヌクレオチドまたは塩基対、より好ましくは５００〜１００００ヌクレオチドまたは塩基対、さらに好ましくは８００〜２０００ヌクレオチドまたは塩基対のサイズを有する。このサイズのＲＮＡに対して、ＲＮＡの精製に関する非常に良好な結果が得られることが分かっている。これは、本発明に係る方法がこのサイズのＲＮＡに特によく適合しているからである。しかし、任意により小さい（例えば、３０〜１０００、５０〜１０００もしくは１００〜１０００、または２０〜２００、２０〜１００、２０〜５０もしくは２０〜３０ヌクレオチド）ＲＮＡ断片もまた、この方法において分離され得る。
【００１９】
分離されるＲＮＡがｍＲＮＡである場合に、ｍＲＮＡはタンパク質を好ましくコードする。特にタンパク質は抗原特性を有する。タンパク質は、組み換え的に生成されるか、または天然に生じる、従来技術から当業者に公知のすべてのタンパク質である。当該タンパク質は治療、診断または研究を目的として使用される。特に、抗原は、腫瘍抗原または病原体（例えば、ウイルス、細菌または原生動物）の抗原である。
【００２０】
これらに限定されないが、当該タンパク質としては、例えば（形質転換）生体における成長を促進する成長ホルモンまたは成長因子、代謝および／または造血に影響するタンパク質、または血液凝固系の因子ＶＩＩＩおよびＸＩといったタンパク質などが挙げられる。成長ホルモンまたは成長因子は、例えば、ＴＧＦおよびＩＧＦ（“インスリン様成長因子”）である。代謝および／または造血に影響するタンパク質は、例えば、（α−１）−抗トリプシン、ＬＤＬ受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、ＧＡＴＡ−１などである。さらなる当該タンパク質としては、例えば、酵素およびプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＨＩＶ感染の処置用）が挙げられる。酵素は、例えば、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ＤＮＡ制限酵素（例えば、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩなど）、リゾチームなど、またはプロテアーゼ（例えば、パパイン、ブロメライン、ケラチナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、レニン（キモシン）、スイザイム（ｓｕｉｚｙｍｅ）、ノルターゼ（ｎｏｒｔａｓｅ））などである。プロテアーゼ阻害剤は、例えば、アンペルナビル（１４１Ｗ９４またはＶＸ−４７８）、アタザナビル（ＢＭＳ−２３２６３２）、カテプシンＳプロテアーゼ阻害剤、Ｄ１９２７、Ｄ９１２０、フォサンプレナビル（ｆｏｓａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）（ＧＷ−４３３９０８またはＶＸ−１７５）、ＧＳ９００５、ＧＷ６４０３８５（ＶＸ−３８５）、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤、インジナビル（ＭＫ−６３９）、Ｌ−７５６  ４２３、レボプリン（Ｌｅｖｏｐｕｒｉｎ）−ＺＧ、ロピナビル／リトナビル（ＬＰＶ  ＡＢＴ−３７８／ｒ）、ＭＫ９４４Ａ、モゼナビル（ＤＭＰ４５０）、ネルフィナビル（ＡＧ−１３４３）、ＮＮＲＴＩ、Ｐ−１９４６、ＰＬ−１００、プリノマスタット（ｐｒｉｎｏｍａｓｔａｔ）、リトナビル（ＡＢＴ−５３８）、ＲＯ０３３−４６４９、ＴＭＣ１１４、サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）（Ｒｏ−３１−８９５９）、ＮＲＴＩ、ティプラナビル（ＰＮＵ−１４０６９０）、ＴＬＫ  １９７８１、ベルテックス  ３８５、ＶＸ−９５０からなる群から選択される。本発明に従って分離されるＲＮＡにコードされるタンパク質は、細胞シグナル伝達を刺激または阻害するタンパク質（例えば、サイトカインなど）をさらに包含し得る。したがって、当該タンパク質はまた、例えば、サイトカインファミリーのクラスＩのサイトカインを包含する。サイトカインファミリーのクラスＩのサイトカインは、位置的に保存された４つシステイン残基（ＣＣＣＣ）および１つの保存された配列モチーフＴｒｐ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳＸＷＳ）を備えている（ここで、Ｘは保存されていないアミノ酸を表す）。サイトカインファミリーのクラスＩのサイトカインは、ＧＭ−ＣＦＳサブファミリー、ＩＬ−６サブファミリー、またはＩＬ−２サブファミリー、またはサイトカインＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０などを包含する。ＧＭ−ＣＦＳサブファミリーは、例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−５ＧＭ−ＣＳＦである。ＩＬ−６サブファミリー、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２である。ＩＬ−２サブファミリーは、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１��などである。同様にまた、当該タンパク質は、サイトカインファミリーのクラスＩＩのサイトカイン（インターフェロン受容体ファミリー）を包含する。サイトカインファミリーのクラスＩＩのサイトカインは、位置的に保存された４つのシステイン残基（ＣＣＣＣ）を同様に備えるが、１つの保存された配列モチーフＴｒｐ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳＸＷＳ）を備えていない。サイトカインファミリーのクラスＩＩのサイトカインとしては、例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなどが挙げられる。また、分離されたＲＮＡによってコードされるタンパク質としては、腫瘍壊死ファミリー、ケモカインファミリーのサイトカイン、およびＧタンパク質と相互作用するサイトカインがさらに挙げられ得る。腫瘍壊死ファミリーは、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンドなどである。ケモカインファミリーのサイトカインは、特にインターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子および腫瘍壊死因子である。Ｇタンパク質と相互作用するサイトカインは、例えば、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＲ５、ＣＸＲ４などである。また、当該タンパク質は、アポトーシス因子、アポトーシス関連タンパク質（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、またはアポトーシス関連タンパク質（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）から選択され得る。アポトーシス因子、アポトーシス関連タンパク質としては、ＡＩＦ、Ａｐａｆ（例えば、Ａｐａｆ−１、Ａｐａｆ−２、Ａｐａｆ−３、Ａｐａｆ−４）、ＡＰＯ−２（Ｌ）、ＡＰＯ−３（Ｌ）、アポパイン（ａｐｏｐａｉｎ）、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ｂｉｋ、ＣＡＤ、カルパイン、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１）、ｃｅｄ−３、ｃｅｄ−９、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ、ｃｒｍ  Ａ、チトクローム  Ｃ、ＣｄＲ１、ＤＤ、ＤＥＤ、ＤＩＳＣ、ＤＮＡ−ＰＫＣＳ、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ−１、Ｆａｓ（Ｆａｓリガンド  ＣＤ９５／ｆａｓ（受容体））、ＦＬＩＣＥ／ＭＡＣＨ、ＦＬＩＰ、ホドリン、ｆｏｓ、Ｇ−アクチン、Ｇａｓ−２、ゲルソリン、グランザイム  Ａ／Ｂ、ＩＣＡＤ、ＩＣＥ、ＪＮＫ、ラミン  Ａ／Ｂ、ＭＡＰ、ＭＣＬ−１、Ｍｄｍ−２、ＭＥＫＫ−１ＭＯＲＴ−１、ＮＥＤＤ、ＮＦ−Ｂ、ＮｕＭａ、ｐ５３、ＰＡＫ−２、ペルフォリン、ＰＩＴＳＬＲＥ、ＰＫＣ、ｐＲｂ、プレセニリン、ｐｒＩＣＥ、ＲＡＩＤＤ、Ｒａｓ、ＲＩＰ、スフィンゴミエリナーゼ、単純ヘルペス由来のチミジンキナーゼ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、トランスグルタミナーゼなどが挙げられ得る。また、本発明に従って分離されるＲＮＡによってコードされるタンパク質は、抗原、または例えばＮＹ−Ｅｓｏ−１もしくはＮＹ−Ｅｓｏ−Ｂといった配列から選択され得る。抗原は、例えば、腫瘍特異的表面抗原（ＴＳＳＡ）（例えば、５Ｔ４α５β１  インテグリン）、７０７��ＡＰ、ＡＦＰ、ＡＲＴ−４、Ｂ７Ｈ４、ＢＡＧＥ、βＢｃｒ−ａｂｌ、ＭＮ／Ｃ、  ＩＸ抗原、ＣＡ２１５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、β−カテニン／、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７／ｍ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤＫ４／、ＣＥＡ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥｐＣａ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｗ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＳＰ７０２Ｍ、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（ｈＴＲＴ）、ｉＣＥ、ＩＧＦ−１Ｒ。ＩＬ−２Ｒ、ＩＬＯ−５、ＫＩＡＡ０２０５、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＲＴ−／Ｓｋｉ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＮＡ８８−Ａ、ＰＡＰ、プロテイナーゼ−３、ｐ１９０  ｍｉｎｏｒ  ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ，ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＧＦ，ＴＰＩ／、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ−２、ＶＥＧＦおよびＷＴ１である。また、本発明に従って分離されるＲＮＡによってコードされるタンパク質は、上述のタンパク質の１つと少なくとも８０％または８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示すタンパク質またはタンパク質配列を任意に含む。
【００２１】
分離されるＲＮＡは、対応する野生型ｍＲＮＡに関する以下の改変（代替可能にか、または組み合わせとして表され得る）を示し得る。一方において、ペプチドまたはポリペプチドをコードする改変ｍＲＮＡの領域のＧ／Ｃ含有量は、ペプチドまたはポリペプチドをコードする野生型ｍＲＮＡの領域のＧ／Ｃ含有量よりも大きくなり得る。ここで、コードされるアミノ酸配列は、野生型に対して変化していない。この改変は、翻訳されるｍＲＮＡドメインの配列順序が、有効なｍＲＮＡの翻訳にとって必須であることに基づいている。この点において、種々のヌクレオチドの組成物および配列が、機能を果たす重要な部分を有している。特に、Ｇ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含有量が増加している配列は、Ａ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含有量が増加している配列よりも安定である。したがって、本発明によれば、コドンは、翻訳されるアミノ酸配列を維持すると同時に、Ｇ／Ｃヌクレオチドのより高い含有量を有するような様式において、野生型のｍＲＮＡに対して変更されている。種々のコドンが１つの同じアミノ酸をコードしている（遺伝暗号の縮重）ので、安定性に関して最も好ましいコドンを決定（代替可能なコドンを利用）することができる。また一方において、本発明に係る方法を用いて翻訳を最適化するＲＮＡを提供することができる。
【００２２】
本発明に係る方法において、逆相は、ＨＰＬＣ精製にとっての固定相として使用される。逆相を有するクロマトグラフィーに関して、非極性化合物が固定相としての役割を果たし、かつ極性溶媒が溶出にとっての移動相としての役割を果たす。極性溶媒は、緩衝液の形態において通常に使用される、例えば水の混合物（すなわち、アセトニトリルおよびまたはメタノールを有する）である。
【００２３】
固定相として使用されるカラムに充填される材料は、ビーズまたは重合体化した“ブロック”の形態において供給され得る。すなわち、ブロックは、クロマトグラフィーカラムの相当な部分を満たす。詳細な性質とは関係なく、重合体の固定相は本質的に多孔質である。つまり、ビーズおよびブロックが孔によって特徴付けられている。
【００２４】
本発明に係る方法の好ましい実施形態において、多孔質の逆相材料は、８．０〜５０μｍ、特に８．０〜３０μｍ、より好ましくは８．０〜２５μｍの粒径を有している。逆相材料は、小さな球状の形態において存在し得る。本発明に係る方法は、任意にビーズの形態の、上記粒径を有する多孔質の逆相を用いて特に好ましく実施され得る。これによって特に良好な分離結果が得られる。
【００２５】
本発明に係る方法に使用される逆相は、多孔質であり、かつ特定の粒径を有している。一方において、多孔質ではない、したがって例えばA. AzaraniおよびK.H. Heckerに記載のような、本発明の主題と粒径に関して完全に異なる固定の逆相を用いると、過剰な高圧が集中する。過剰な高圧が集中するので、仮に可能であったとしても、ＲＮＡの調製用の精製は非常な困難を伴ってのみ可能である。
【００２６】
本発明に係る方法の好ましい実施形態において、逆相は、１０００〜５０００Åの孔径、特に１０００〜４０００Å、より好ましくは１５００〜４０００Å、２０００〜４０００Å、２５００〜４０００Åの孔径を有している。逆相にとって特に好ましい孔径は、１０００〜２０００Å、より好ましくは１０００〜１５００Å、最も好ましくは１０００〜１２００Åまたは３５００〜４５００Åである。これらの孔径を有する逆相を用いると、本発明に係る方法を用いたＲＮＡの精製に関して、特に良好な結果が得られる。このようにして、A. AzaraniおよびK.H. Heckに係る方法（調製用の分離は、特定の好ましい様式において可能になる）において生じる増加した圧力が回避される。
【００２７】
１０００〜５０００Åの孔径、特に１０００〜４０００Å、より好ましくは１５００〜４０００Å、２０００〜４０００Å、２５００〜４０００Åの孔径は、混合物の他の成分からＲＮＡを分離するために好適であり得る。ここで、当該ＲＮＡは、上述のようなサイズを超えて、１５０００ヌクレオチド（１本鎖ＲＮＡ分子のとき）または塩基対（２本鎖ＲＮＡ分子のとき）、特に１００〜１００００ヌクレオチドまたは塩基対、より好ましくは５００〜１００００ヌクレオチドまたは塩基対、さらに好ましくは８００〜５０００ヌクレオチドまたは塩基対、その上さらに好ましくは８００〜２０００ヌクレオチドまたは塩基対を有している。しかし、逆相の孔径はまた、分離されるＲＮＡのサイズに依存して選択され得る。すなわち、より大きなＲＮＡ分子が分離される場合には、より大きな孔径が選択され得る。そして、より小さなＲＮＡ分子が分離される場合には、より小さな孔径が選択され得る。これは、ＲＮＡ分子の保持および分離が（逆）相の相互作用だけでなく、分子がマトリクスの孔に入り込む可能性（これによってさらなる保持効果が与えられる）に依存しているという、効果に起因している。これらに特に限定することなく、約２０００〜約５０００Å、より好ましくは約２５００〜約４０００Å、最も好ましくは約３５００〜約４５００Åの逆相の孔径は、より大きなＲＮＡ分子の分離に使用され得る。より大きなＲＮＡ分子は、例えば、１００〜１００００ヌクレオチドまたは塩基対、より好ましくは５００〜１００００ヌクレオチドまたは塩基対、さらに好ましくは８００〜５０００ヌクレオチドまたは塩基対、その上さらに好ましくは８００〜２０００ヌクレオチドまたは塩基対の分子である。代替可能に、これら特に限定することなく、約１０００〜約２５００Å、より好ましくは約１０００〜約２０００Å、最も好ましくは約１０００〜約１２００Åの逆相の孔径は、より小さなＲＮＡ分子の分離に使用され得る。このようにして分離され得る、より小さなＲＮＡ分子は、例えば、約３０〜１０００、５０〜１０００もしくは１００〜１０００、または２０〜２００、２０〜１００、２０〜５０もしくは２０〜３０ヌクレオチドのＲＮＡ分子である。
【００２８】
一般的に、逆相の固定相として使用されるあらゆる公知の材料、特にあらゆる重合体の材料は、当該材料が多孔性の形態において与えられ得る場合に、本発明の方法に使用され得る。固定相は、有機材料および／または無機材料から構成され得る。本発明に使用され得る重合体の例は、（非アルキル化）ポリスチレン、（非アルキル化）ポリスチレンジビニルベンゼン、シリカゲル、非極性残基（より好ましくはブチル−、オクチル−およびオクタデシル−含有残基）を用いて修飾されたシリカゲル、特にアルキル含有残基を用いて修飾されたシリカゲル、フェニル残基を用いて修飾されたシリカゲル、ポリメチルアクリレートなど、またはゲルクロマトグラフィーまたは他のクロマトグラフィー法にとって好適な他の材料である。他の好適な材料は、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）およびＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）材料といったデキストラン、アガロース、デキストラン／アガロースの混合物、ポリアクリルアミドなどである。
【００２９】
特に好ましい実施形態において、逆相に使用する材料は、多孔質のポリスチレン重合体、（多孔質の）（非アルキル化）ポリスチレンジビニルベンゼン重合体、多孔質のシリカゲル、非極性残基を用いて修飾した多孔質のシリカゲル、特にアルキル含有残基（より好ましくはブチル−、オクチル−および／またはオクタデシル−含有残基）を用いて修飾した多孔質のシリカゲル、多孔質のポリメタクリレートである。ここで、多孔質のポリスチレン重合体または（多孔質の）非アルキル化ポリスチレンジビニルベンゼンが特に使用され得る。
【００３０】
ポリスチレンジビニルベンゼンを用いた固定相は、それ自体が公知である。それ自体が公知のポリスチレンジビニルベンゼンは、本発明に係る方法に使用され得る。当該ポリスチレンジビニルベンゼンは、ＨＰＬＣ法にすでに使用されており、市販されている。
【００３１】
本発明に係る方法にとりわけ好ましい、多孔質の非アルキル化ポリスチレンジビニルベンゼンは、これらに限定されないが、８．０±１．５μｍ、特に８．０±０．５μｍの粒径、および１０００〜１５００Å、特に１０００〜１２００Åまたは３５００〜４５００Åの孔径を特に有し得る。逆相としてこの材料を用いると、本発明に係る方法の上述のような利点が、特に好ましい様式において実現され得る。
【００３２】
上述したさらなる詳細の固定相は、通常にカラム内に配置される。Ｖ２Ａ鋼がカラムの材料として通常に使用されるが、ＨＰＬＣにおける通常の条件に適していれば、他の材料もまたカラムの材料として使用され得る。カラムは、通常、まっすぐ伸びている。長さ５〜１００ｃｍ、および直径４〜２５ｍｍを有することが、ＨＰＬＣカラムにとって好ましい。本発明に係る方法に使用されるカラムは、以下の寸法を有することが特に好ましい。長さ５０ｍｍおよび直径７．５ｍｍ、長さ５０ｍｍおよび直径４．６ｍｍ、長さ５０ｍｍおよび直径１０ｍｍ、またはＲＮＡの調製用の回収に好適な、長さおよび直径についてのあらゆる寸法。あらゆる寸法とは、例えば、大規模の場合に適した、数メートルにおよぶ長さ、およびより大きな直径でさえも当該カラムの寸法である。ここでは、寸法が液体クロマトグラフィーを用いて技術的に可能な寸法に適合される。
【００３３】
好ましい実施形態において、本発明に係る方法はイオン対法として実施される。ここで、親脂性残基および正の電荷を有するイオンが、負の電荷を有するＲＮＡにとっての対イオンとして移動相に加えられる。このようにして、逆相系の非極性の固定相によって減速される、親脂性特性を有するイオン対が得られる。特に、イオン対法にとっての正確な条件は、特定の分離のそれぞれにおける問題として経験的に解決されるべきである。対イオンのサイズ、濃度および溶液のｐＨ値は、分離の結果に大きく寄与する。これは、経験的に確立されたイオン対法の条件が、異なる分離における問題に対して直接に適用され得ないことを意味する。例えばあるイオン対法が公知である場合に、最終的に同一または類似の条件が好ましいと判明し得るとしても、これは、同一条件がまた本発明の基礎をなす分離の問題に適合され得ることを意味しない。トリエチルアンモニウムアセテートといったアルキルアンモニウム塩、および／またはテトラブチルアンモニウムといったテトラアルキルアンモニウムは、本発明に係る方法に好ましく加えられる。０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテートが加えられ、かつｐＨ値が約７に調整される。イオン対法用のこの緩衝液は、本発明の基礎をなす分離の問題を解決する。つまり、当該緩衝液は、調製用の規模におけるＲＮＡの精製にとって好ましい様式である。さらなる緩衝溶液としては、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、テトラブチルアンモニウムビサルフェート、テトラブチルアンモニウムブロマイドおよびテトラブチルアンモニウムクロライドが考えられ得る。
【００３４】
移動相の選択は、所望の分離の種類に依存する。これは、例えば従来技術から公知であり得るような特定の分離に関して確立された移動相が、十分に成功する見通しを伴って、異なる分離の問題に対して直接に適合されることがあり得ないことを意味する。分離のそれぞれの問題に関して、理想の溶出条件、特に使用される移動相は、経験的な試験によって決定されるべきである。
【００３５】
本発明に係るＨＰＬＣ法の好ましい実施形態において、水性溶媒および有機溶媒の混合物がＲＮＡを溶出する移動相として使用される。緩衝液にとって、６．０〜８．０、例えば約７（例えば、７．０）のｐＨを特に有する水性溶媒として使用されることが好ましい。当該緩衝液は、好ましくはトリエチルアンモニウムアセテート、特に好ましくは０．０２〜０．５Ｍ、特に０．０８〜０．１２Ｍ、とりわけ約０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液である。この緩衝液は、上述のようにイオン対法においてＲＮＡに対する対イオンとしての役割を果たす。
【００３６】
好ましい実施形態において、移動相に使用される有機溶媒は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールおよびアセトン、またはこれらの混合物、特に好ましくアセトニトリルである。これらの有機溶媒、特にアセトニトリルを用いると、ＲＮＡの精製は、本発明に係る方法を用いた特に好ましい様式において進行する。
【００３７】
本発明に係る方法の特に好ましい実施形態において、移動相は、アセトニトリル、および０．１Ｍ、ｐＨ７のトリエチルアンモニウムアセテートの混合物である。
【００３８】
移動相が当該移動相に対して５．０〜２５．０容積％の上記有機溶媒を含有しており、かつ水性溶媒を用いて１００容積％にされることは、本発明に係る方法にとって特に好ましいと分かっている。勾配分離に際して典型的に、有機溶媒の比率が、移動相における最初の容積％に対して、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも１００％、任意に少なくとも２００％増加する。本発明に係る方法の好ましい実施形態において、移動相における有機溶媒の比率が、ＨＰＬＣ分離の間に３〜９容積％、好ましくは４〜７．５容積％、特に５．０容積％になる。より好ましくは、移動相における有機溶媒の比率が、ＨＰＬＣ分離の間に移動相に対してそれぞれ場合に、３〜９容積％、特に５．０〜２０．０容積％増加する。さらに好ましくは、方法は、移動相における有機溶媒の上記比率が、ＨＰＬＣ分離の間に移動相に対してそれぞれ場合に、６．５〜８．５容積％、特に７．５〜１７．５容積％増加するように実施される。
【００３９】
移動相が当該移動相に対して４．５〜１７．５容積％の有機溶媒を含有し、かつ水性の緩衝化溶液を用いて１００容積％にされることは、本発明に係る方法にとってなかでも特に好ましいと分かっている。
【００４０】
本発明に係る方法の場合に、溶出は無勾配分離または勾配分離によって行われ得る。無勾配分離において、ＲＮＡの溶出は、１つの溶出液または複数の溶出液からなる一定の混合物を用いて実施される。ここで、詳細について上述した溶媒が溶出液として使用され得る。
【００４１】
本発明に係る方法の好ましい実施形態において、勾配分離が実施される。この点に関して、溶出液の組成は勾配プログラムによって変わる。勾配分離に必要な装置は当業者に公知である。ここでは、勾配溶出液は、容器の混合によって生じる低圧側にか、またはさらなるポンプによって高圧側に進み得る。
【００４２】
本発明に係る方法において好ましくは、上述のように有機溶媒の比率は、勾配分離の間に水性溶媒に対して増加する。ここでは、上述の物質が水性溶媒として使用され得、かつ同様に上述の物質が有機溶媒として使用され得る。
【００４３】
例えば、移動相における有機溶媒の比率は、ＨＰＬＣ分離の間に移動相に対してそれぞれ場合に、５．０〜２０．０容積％増加する。特に移動相における有機溶媒の比率は、ＨＰＬＣ分離の間に移動相に対してそれぞれ場合に、７．５〜１７．５容積％、特に９．５〜１４．５容積％増加する。
【００４４】
以下の勾配プログラムは、本発明に係る方法を用いたＲＮＡの精製にとって特に好ましいことが分かっている。
溶出液Ａ：０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ７
溶出液Ｂ：２５容量％のアセトニトリルを有する、０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ７
溶出液の組成：
開始時：６２％のＡおよび３８％のＢ（開始１〜３分間後）
Ｂを５８％に増加（１分間ごとにＢが１．６７％増加する）、（開始３〜１５分間後）
１００％のＢ（開始１５〜２０分間後）。
【００４５】
勾配プログラムの他の例は、以下に記載の通りである。同じ溶出液ＡおよびＢが使用される。
溶出液の組成：
開始レベル：６２％のＡおよび３８％のＢ（開始１〜３分間後）
分離範囲Ｉ：３８〜４９．５％のＢの勾配（１分間ごとにＢが５．７５％増加する）（開始３〜５分間後）
分離範囲ＩＩ：４９．５〜５７％のＢの勾配（１分間ごとにＢが０．８３％増加する）（開始５〜１４分間後）
リンス範囲：１００％のＢ（開始１５〜２０分間後）。
【００４６】
カラムが汚れないか、もしくは詰まらないように、かつ検出が中断されないように、ＨＰＬＣに純粋な溶媒を使用することが好ましい。そのような純粋な溶媒は市販されている。また、溶媒は、１〜５μｍのマイクロフィルターを用いてさらにろ過され得る。マイクロフィルターは、通常その系においてポンプの上流に配置される。溶媒のすべては使用の前に脱ガスされることがさらに好ましい。そうでなければ、ほとんどの場合にポンプに気泡が生じるためである。溶媒に気泡が生じた場合、分離だけでなく検出器における流出物の連続的な観察を妨げる。溶媒は、加熱、磁気攪拌器を用いた激しい攪拌、簡単な排気、超音波処理、または溶媒の貯留容器にヘリウムの気流をわずかに通すことによって、脱ガスされ得る。
【００４７】
溶出液の流量は、調査されるサンプルに含まれる他の成分からＲＮＡが良好に分離されるように選択される。本発明に係る方法のために選択される溶出液の流量は、種類および大規模化の範囲に依存して、１ｍｌ／分〜数リットル／分（大規模化の場合）、特に１〜１０００ｍｌ／分、より好ましくは５〜５００ｍｌ／分、さらに好ましくは１００ｍｌ／分以上の量である。この流量は、ポンプによって達成および制御され得る。
【００４８】
検出は、ＵＶ検出器を用いて２５４ｎｍにおいて好ましく実施される。ここで、基準測定は、６００ｎｍにおいてなされる。しかし、あらゆる他の検出法が、代替可能に使用され得る。他の検出法は、詳細について上述したＲＮＡが高い信頼性の様式において良好に検出され得るような検出法である。
【００４９】
本発明に係る方法を用いたＲＮＡの調製用の精製にとって、ＲＮＡを含有する溶出された溶媒の量を回収することが好ましい。この点から、溶出された溶媒が個々の分離された画分に回収されるようにこの回収を行うことが好ましい。これは、例えば、フラクションコレクターを用いて行われ得る。このようにして、高純度のＲＮＡ含有画分が、非常に少ない量にしても所望されない不純物をまだ含んでいる他のＲＮＡ含有画分から分離され得る。個々の画分は、例えば１分間に渡って回収され得る。
【００５０】
本発明に係る方法は、完全な変性条件下において好ましく実施される。これは、例えばサンプルの処理が４〜１２℃において行われることであり得る。そうでなければ、ＨＰＬＣ法が高温、好ましくは７０℃以上、特に好ましくは７５℃以上、特に８２℃以下、非常に好ましくは約７８℃において行われ得る。加熱はＲＮＡの変性にとって典型的に重要であり、より良好な分離が最終的に実現される。分解能はより低い温度において低下する。すなわち、不純物からのＲＮＡの分離が低下する。
【００５１】
サンプルの処理は、２つの方法、ストップフロー（ｓｔｏｐ−ｆｌｏｗ）インジェクションまたはループ（ｌｏｏｐ）インジェクションを用いて実施され得る。ストップフローインジェクションに関して、ＨＰＬＣに加えられる高圧に耐えられる微量注射器が使用される。サンプルは、カラムパッキンに対して直接にか、またはパッキンを直接に覆う不活性な材料の小さな受け容れ口に対して、入口弁における隔壁を通過して注入される。この場合、系が上昇した圧力条件にあり得るか、またはポンプが注入の前に止められ得る。したがって、圧力が通常の値に近い範囲にあるときに実施される。ループインジェクションの場合に、ループ注射器がサンプルの導入に使用される。これは、サンプルが挿入される管状のループからなる。それから、固定相は、好適な回転式の弁によってループを通ってポンプから運び出される。ループの排出口は直接カラムに通じている。このようにして、サンプルは、溶媒の流れがポンプの妨げにならずに、固定相によってカラムに送られる。
【００５２】
本発明は、本発明に係る上述のＨＰＬＣ法における多孔質の逆相の使用をさらに提供する。
【００５３】
本発明に係る方法の好ましい実施形態において、多孔質の逆相は、８．０〜５０μｍ、特に８．０〜６０μｍ、より好ましくは８．０〜２５μｍの粒径を有している。逆相は、ビーズの形態において存在し得る。本発明に係る方法は、この粒径および／またはビーズの形態を有する多孔質の逆相を用いて、特に好ましく実施され得る。これによって、特に良好な分離結果が得られる。
【００５４】
本発明に係る使用において用いられる逆相は、多孔質である。一方において、多孔質ではない、したがって例えばA. AzaraniおよびK.H. Heckerに記載のような、本発明の主題と粒径に関して完全に異なる固定の逆相を用いると、過剰な高圧が集中する。過剰な高圧が集中するので、仮に可能であったとしても、ＲＮＡの調製用の精製は非常な困難を伴ってのみ可能である。
【００５５】
本発明に係る使用の好ましい１つの実施形態において、逆相は、１０００〜５０００Åの孔径、特に１０００〜４０００Å、または上述の好ましい値の孔径を有する。逆相にとって特に好ましい孔径は、１０００〜１２００Åおよび３５００〜４５００Åである。これらの孔径を有する逆相を有しているので、本発明に係る方法を用いたＲＮＡの精製に関して、特に良好な結果が得られる。このようにして、特にA. AzaraniおよびK.H. Heckerに係る方法において生じる上昇した圧力が回避される。ここで、調製用の精製が特に好ましい様式において可能になる。１０００Å未満の孔径において、当該粒径があまり好ましくないので、ＲＮＡの分離がより悪くなる。しかし、孔径は上述のように分離されるＲＮＡのサイズに依存して選択され得る。
【００５６】
本発明に係る使用の特に好ましい実施形態において、逆相の材料は、ポリスチレンジビニルベンゼンである。ここで、特に非アルキル化ポリスチレンジビニルベンゼンが使用され得る。ポリスチレンジビニルベンゼンを用いた固定相は、それ自体が公知である。それ自体が公知のポリスチレンジビニルベンゼンは、本発明に係る方法に使用され得る。当該ポリスチレンジビニルベンゼンは、ＨＰＬＣ法にすでに使用されており、市販されている。
【００５７】
本発明に係る使用にとりわけ好ましい、多孔質の非アルキル化ポリスチレンジビニルベンゼンは、これらに限定されないが、８．０±１．５μｍ、特に８．０±０．５μｍの粒径、および１０００Å以上もしくは４０００Åの孔径を特に有し得る。逆相としてこの材料を用いると、本発明に係る方法の以下のような利点が、特に好ましい様式において実現され得る。
【００５８】
本発明に係る使用にとって、詳細について上述したこの固定相は、カラム内に配置される。Ｖ２Ａ鋼がカラムの材料として通常に使用されるが、ＨＰＬＣにおける通常の条件に適していれば、他の材料もまたカラムの材料として使用され得る。カラムは、通常、まっすぐ伸びている。長さ５〜１００ｃｍ、および直径４〜２５ｍｍを有することが、ＨＰＬＣカラムにとって好ましい。本発明に係る方法に使用されるカラムは、以下の寸法を特に有し得る。長さ５０ｍｍおよび直径７．５ｍｍ、長さ５０ｍｍおよび直径４．６ｍｍ、長さ５０ｍｍおよび直径１０ｍｍ、または長さおよび直径についてＲＮＡの調製用の回収に好適なあらゆる寸法。あらゆる寸法とは、例えば、大規模の場合に適した、数メートルにおよぶ長さ、およびより大きな直径でさえも当該カラムの寸法である。ここでは、寸法が液体クロマトグラフィーを用いて技術的に可能な寸法に適合される。
【００５９】
本発明に係る使用にとってのさらなる条件は、本発明に係る方法についての説明においてすでに述べられている。この言及は、不要な繰り返しを避けるためにさらなる条件に対してなされている。
【００６０】
本発明に係る使用である、本明細書の以下に記載の特に好ましい実施形態は、一連の利点を示す。本発明に係る使用に鑑みて、従来技術から公知の方法を用いて可能な量と比較して、本発明に係る方法を用いた実質的に大量のＲＮＡが分離され得る。本発明に係る使用は、これらのより多い量が高い純度を有して得られる。分解断片、過剰に長い断片または転写の不十分な終了によって生じた断片の分離が可能である。さらに、ＲＮＡサンプルに存在するさらなる不純物（例えば、ＲＮａｓｅおよびポリメラーゼといった酵素、ならびにヌクレオチド）の良好な分離が可能である。これらの相対的に大量のＲＮＡは、非常に高レベルの不純物が混入しているサンプルからでさえ、数分以内に回収され得る。信頼性の高いＲＮＡの回収が実施される。すなわち、高純度のＲＮＡが、非常に高い信頼性を有して回収される。本発明に係る使用は、高い分解能が実現可能である。本発明に係る使用は、さらに容易に自動操作され得る。したがって、調製用の規模における通常のＲＮＡ精製に最も好適である。ＲＮＡは、本発明に係る方法の条件において安定である。すなわち、ＨＰＬＣ精製におけるＲＮＡ断片への分解、これによる新たな不純物の生成、およびＨＰＬＣ精製において所望されるＲＮＡの収量の低下が回避される。したがって、本発明に係る使用は、単純、迅速および安価な様式において、正確にかつ信頼性の高い結果を伴って実施され得る。すなわち、ＲＮＡの回収は非常に簡単に実現され得る。同様にＲＮＡのさらなる直接的な処理を行うことが可能である。検出は、最終的に非常に感度よく実施され得る。
【００６１】
本発明は、さらなる詳細について、図面および例示的な実施形態を参照して以下に説明されているが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
（図面）
図１は１０μｇのルシフェラーゼ−ｍＲＮＡ（分析用）の分離のクロマトグラムを示す；
図２は１．５μｇのルシフェラーゼ−ｍＲＮＡ（調製用）の分離のクロマトグラムを示す；
図３は回収した画分がグレイで強調されている図２のクロマトグラムを示す；
図４はアガロースゲルにおける回収したｍＲＮＡの純度の検証を示す；
図５は、１０００Åの孔径を有する固定相を用いた、２００μｇの２ｋｂおよび４ｋｂのＲＮＡ断片の分離のクロマトグラムを示す；
図６は、４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、１００μｇの２ｋｂおよび４ｋｂのＲＮＡ断片の分離のクロマトグラムを示す；
図７は、４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、２５０μｇの２ｋｂおよび４ｋｂのＲＮＡ断片の分離のクロマトグラムを示す；
図８は、本発明に係る方法を用いて精製したＲＮＡからのルシフェラーゼの発現の増強を証明する棒グラフである；
図９は、例示的な実施形態に使用されたルシフェラーゼの野生型の配列、詳細にはｍＲＮＡ配列を示す；
図１０は、４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、３ｍｇのＦｌｉｃ（ＧＣ）ＲＮＡ調製（ＦＣ−９０５０）の分離のクロマトグラムを示す；
図１１は、４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、３ｍｇのＦＯＬＨ１（ＧＣ）ＲＮＡ調製（ＦＯ−９３３４）の分離のクロマトグラムを示す；
図１２は、４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、３ｍｇのＫＬＫ３（ＧＣ）ＲＮＡ調製（ＫＬ−８８４９）の分離のクロマトグラムを示す；
図１３は、４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、３ｍｇのＰＳＣＡ（ＧＣ）ＲＮＡ調製（ＰＳ−８８５４）の分離のクロマトグラムを示す；
図１４は、４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、３ｍｇのＳＴＥＡＰ（ＧＣ）ＲＮＡ調製（ＳＴ−８８４８）の分離のクロマトグラムを示す；
図１５は、無孔性の固定相を用いた２ｋｂのＲＮＡ（２００μｇ）および４ｋｂのＲＮＡ（２００μｇ）の混合物の分離のクロマトグラムを示す；
図１６は、図１５（無孔性の固定相を用いた２ｋｂのＲＮＡ（２００μｇ）および４ｋｂのＲＮＡ（２００μｇ）の混合物の分離のクロマトグラムを示す）に係るクロマトグラムに対応する、アガロースゲル分析を示す。
【００６３】
（実施例１：本発明に係るＨＰＬＣ法による１．５ｍｇのルシフェラーゼｍＲＮＡの精製）
１８２５塩基対のサイズを有するルシフェラーゼのｍＲＮＡが分離に使用された。多孔質の非アルキル化ポリスチレン／ジビニルベンゼン（ポリスチレンジビニルベンゼン）マトリクス（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した従来の市販品）が、固定相として使用された。それは、８μｍの直径および４０００Åの孔径を有する。使用されたカラムは、長さ５．０ｃｍおよび直径７．５ｍｍであった。試料採取器の温度は１２℃であり、ＨＰＬＣ分離用（詳細には分離カラム）の温度は７８℃であった。すなわち、動作は変性条件下において実施された。
【００６４】
勾配プログラムによって実施された分離
溶出液Ａ：０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ７
溶出液Ｂ：２５容量％のアセトニトリルを有する、０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ７
溶出液の組成：
開始時：６２％のＡおよび３８％のＢ（開始１〜３分間後）
Ｂを５８％に増加（１分間ごとにＢが１．６７％増加する）、（開始３〜１５分間後）
１００％のＢ（開始１５〜２０分間後）。
【００６５】
検出は、２５４ｎｍにおいてＵＶ検出器を用いて行った。基準測定は６００ｎｍにおいて行った。流量は３ｍｌ／分であった。
【００６６】
ルシフェラーゼｍＲＮＡにおける不純物を示すために、まず、１０μｇのルシフェラーゼｍＲＮＡのみがカラムに導入されて、分析分離が実施された。この分析ＨＰＬＣ分離の結果は、図１に示されている（勾配はクロマトグラムにおいて破線で示されている）。図面から明らかなように、所望されるルシフェラーゼのｍＲＮＡ（保持時間１２．７６分間）の他に、ルシフェラーゼｍＲＮＡのピークを挟んで、不純物がまだ存在する（１２．３９８分間および１３．２２７分間の保持時間）。
【００６７】
調製用の規模においてルシフェラーゼｍＲＮＡを精製する目的は、これらの所望されない不純物を除去することである。
【００６８】
図２および３は、調製用の規模（１．５ｍｇ）におけるルシフェラーゼｍＲＮＡの分離に対応するクロマトグラムを示す。ここで、勾配プログラムは図２において破線で示されている。
【００６９】
回収された画分１〜１０は、図２および３においてグレイで強調されている。画分は１分間に渡って回収された。
【００７０】
この場合に、回収された画分２〜１０からの１μｇのルシフェラーゼｍＲＮＡが、ｍＲＮＡ画分の純度を確認するために、アガロースゲル分離にかけられ、かつエチジウムブロマイドを用いて可視化された。
【００７１】
アガロースゲル分離の結果は、図４に示される（Ｍはサイズの基準を表す）。画分５〜８は、所望されない不純物なしで、所望のルシフェラーゼｍＲＮＡを含む。結果として、調製用の規模におけるＲＮＡの高純度の画分を生じて、ＲＮＡの分離は成功であった。
【００７２】
この例示的な実施形態は、本発明に係る方法を用いて、ＨＰＬＣによって調製用の規模におけるｍＲＮＡの精製が可能であることを示している。
【００７３】
（実施例２：１０００Åの孔径を有する固定相を用いた、２００μｇの２ｋｂおよび４ｋｂのＲＮＡ断片の分離）
２００μｇの２ｋｂおよび４ｋｂのＲＮＡ断片が分離に使用された。多孔質の非アルキル化ポリスチレン／ジビニルベンゼン（ポリスチレンジビニルベンゼン）マトリクス（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した従来の市販品）が、固定相として使用された。それは、８μｍの直径および１０００Åの孔径を有する。使用されたカラムは、長さ２．５ｃｍおよび直径４．６ｍｍであった。試料採取器の温度は１２℃であり、ＨＰＬＣ分離用（詳細には分離カラム）の温度は７８℃であった。すなわち、動作は変性条件下において実施された。
【００７４】
勾配プログラムによって実施された分離
溶出液Ａ：０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート
溶出液Ｂ：０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート／２５％のアセトニトリル
溶出液の組成：
開始レベル：６２％のＡおよび３８％のＢ（開始１〜３分間後）
分離範囲Ｉ：３８〜４９．５％のＢの勾配（１分間ごとにＢが５．７５％増加する）（開始３〜５分間後）
分離範囲ＩＩ：４９．５〜５７％のＢの勾配（１分間ごとにＢが０．８３％増加する）（開始５〜１４分間後）
リンス範囲：１００％のＢ（開始１５〜２０分間後）。
【００７５】
検出は、２５４ｎｍにおいてＵＶ検出器を用いて行った。基準測定は６００ｎｍにおいて行った。流量は３ｍｌ／分であった。
【００７６】
図５は、調製用の規模（２００μｇ）におけるこの分離に対応するクロマトグラムを示す。ここで、勾配プログラムは図５において破線で示されている。回収された画分は図５においてグレイで強調されている。画分は１分間にわたって回収された。結果として、調製用の規模におけるＲＮＡの高純度の画分を生じて、ＲＮＡの分離は成功であった。
【００７７】
（実施例３：４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、１００μｇの２ｋｂおよび４ｋｂのＲＮＡ断片の分離）
１００μｇの２ｋｂおよび４ｋｂのＲＮＡ断片が分離に使用された。多孔質の非アルキル化ポリスチレン／ジビニルベンゼン（ポリスチレンジビニルベンゼン）マトリクス（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した従来の市販品）が、固定相として使用された。それは、８μｍの直径および４０００Åの孔径を有する。使用されたカラムは、長さ２．５ｃｍおよび直径４．６ｍｍであった。試料採取器の温度は１２℃であり、ＨＰＬＣ分離用（詳細には分離カラム）の温度は７８℃であった。すなわち、動作は変性条件下において実施された。
【００７８】
勾配プログラムによって実施された分離
溶出液Ａ：０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート
溶出液Ｂ：０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート／２５％のアセトニトリル
溶出液の組成：
開始レベル：６２％のＡおよび３８％のＢ（開始１〜３分間後）
分離範囲Ｉ：３８〜４９．５％のＢの勾配（１分間ごとにＢが５．７５％増加する）（開始３〜５分間後）
分離範囲ＩＩ：４９．５〜５７％のＢの勾配（１分間ごとにＢが０．８３％増加する）（開始５〜１４分間後）
リンス範囲：１００％のＢ（開始１５〜２０分間後）。
【００７９】
検出は、２５４ｎｍにおいてＵＶ検出器を用いて行った。基準測定は６００ｎｍにおいて行った。流量は３ｍｌ／分であった。
【００８０】
図６は、調製用の規模（１００μｇ）におけるこの分離に対応するクロマトグラムを示す。ここで、勾配プログラムは図６において破線で示されている。回収された画分は図６においてグレイで強調されている。画分は１分間に渡って回収された。結果として、調製用の規模におけるＲＮＡの高純度の画分を生じて、ＲＮＡの分離は成功であった。
【００８１】
（実施例４：４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、２５０μｇの２ｋｂおよび４ｋｂのＲＮＡ断片の分離）
２５０μｇの２ｋｂおよび４ｋｂのＲＮＡ断片が分離に使用された。多孔質の非アルキル化ポリスチレン／ジビニルベンゼン（ポリスチレンジビニルベンゼン）マトリクス（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した従来の市販品）が、固定相として使用された。それは、８μｍの直径および４０００Åの孔径を有する。使用されたカラムは、長さ２．５ｃｍおよび直径４．６ｍｍであった。試料採取器の温度は１２℃であり、ＨＰＬＣ分離用（詳細には分離カラム）の温度は７８℃であった。すなわち、動作は変性条件下において実施された。
【００８２】
勾配プログラムによって実施された分離
溶出液Ａ：０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート
溶出液Ｂ：０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート／２５％のアセトニトリル
溶出液の組成：
開始レベル：６２％のＡおよび３８％のＢ（開始１〜３分間後）
分離範囲Ｉ：３８〜４９．５％のＢの勾配（１分間ごとにＢが５．７５％増加する）（開始３〜５分間後）
分離範囲ＩＩ：４９．５〜５７％のＢの勾配（１分間ごとにＢが０．８３％増加する）（開始５〜１４分間後）
リンス範囲：１００％のＢ（開始１５〜２０分間後）。
【００８３】
検出は、２５４ｎｍにおいてＵＶ検出器を用いて行った。基準測定は６００ｎｍにおいて行った。流量は３ｍｌ／分であった。
【００８４】
図７は、調製用の規模（２５０μｇ）におけるこの分離に対応するクロマトグラムを示す。ここで、勾配プログラムは図７において破線で示されている。回収された画分は図７においてグレイで強調されている。画分は１分間に渡って回収された。結果として、調製用の規模におけるＲＮＡの高純度の画分を生じて、ＲＮＡの分離は成功であった。
【００８５】
本発明に係る方法を用いた精製から生じたルシフェラーゼの発現の向上が、図８に示されている。
【００８６】
（実施例５：４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、３ｍｇの１．７ｋｂのＲＮＡ（ＦｌｉＣ（ＣＧ）−調製物、ＦＣ９０５０）の分離）
３ｍｇの１．７ｋｂのＲＮＡ（ＦｌｉＣ（ＧＣ）ＲＮＡ−調製物、ＦＣ９０５０）が分離に使用された。多孔質の非アルキル化ポリスチレン／ジビニルベンゼン（ポリスチレンジビニルベンゼン）マトリクス（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した従来の市販品）が、固定相として使用された。それは、８μｍの直径および４０００Åの孔径を有する。使用されたカラムは、長さ２．５ｃｍおよび直径４．６ｍｍであった。試料採取器の温度は１２℃であり、ＨＰＬＣ分離用（詳細には分離カラム）の温度は７８℃であった。すなわち、動作は変性条件下において実施された。
【００８７】
勾配プログラムによって実施された分離
溶出液Ａ：０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート
溶出液Ｂ：０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート／２５％のアセトニトリル
溶出液の組成：
開始レベル：６２％のＡおよび３８％のＢ（開始１〜３分間後）
分離範囲Ｉ：３８〜４９．５％のＢの勾配（１分間ごとにＢが５．７５％増加する）（開始３〜５分間後）
分離範囲ＩＩ：４９．５〜５７％のＢの勾配（１分間ごとにＢが０．８３％増加する）（開始５〜１４分間後）
リンス範囲：１００％のＢ（開始１５〜２０分間後）。
【００８８】
検出は、２５４ｎｍにおいてＵＶ検出器を用いて行った。基準測定は６００ｎｍにおいて行った。流量は３ｍｌ／分であった。
【００８９】
図１０は、調製用の規模（３ｍｇ）におけるこの分離に対応するクロマトグラムを示す。ここで、勾配プログラムは図１０において破線で示されている。回収された画分は図１０においてグレイで強調されている。画分は１分間に渡って回収された。結果として、調製用の規模におけるＲＮＡの高純度の画分を生じて、ＲＮＡの分離は成功であった。
【００９０】
（実施例６：４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、１．５ｍｇのＦＯＬＨ１（ＣＧ）ＲＮＡ調製物（ＦＯ−９３３４）の分離、１．５ｍｇのＫＬＫ３（ＣＧ）ＲＮＡ調製物（ＫＬ−８８４９）の分離、１．５ｍｇのＰＳＣＡ（ＣＧ）ＲＮＡ調製物（ＰＳ−８８５４）の分離、または１．５ｍｇのＳＴＥＡＰ（ＣＧ）ＲＮＡ調製物（ＳＴ−８８４８）の分離）
１．５ｍｇのＦＯＬＨ１（ＧＣ）ＲＮＡ調製物（ＦＯ−９３３４）、１．５ｍｇのＫＬＫ３（ＣＧ）ＲＮＡ調製物（ＫＬ−８８４９）、１．５ｍｇのＰＳＣＡ（ＣＧ）ＲＮＡ調製物（ＰＳ−８８５４）、または１．５ｍｇのＳＴＥＡＰ（ＣＧ）ＲＮＡ調製物（ＳＴ−８８４８）が分離に使用された。多孔質の非アルキル化ポリスチレン／ジビニルベンゼン（ポリスチレンジビニルベンゼン）マトリクス（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した従来の市販品）が、固定相として使用された。それは、８μｍの直径および４０００Åの孔径を有する。使用されたカラムは、長さ２．５ｃｍおよび直径４．６ｍｍであった。試料採取器の温度は１２℃であり、ＨＰＬＣ分離用（詳細には分離カラム）の温度は７８℃であった。すなわち、動作は変性条件下において実施された。
【００９１】
勾配プログラムによって実施された分離
溶出液Ａ：０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート
溶出液Ｂ：０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート／２５％のアセトニトリル
溶出液の組成：
開始レベル：６２％のＡおよび３８％のＢ（開始１〜３分間後）
分離範囲Ｉ：３８〜４９．５％のＢの勾配（１分間ごとにＢが５．７５％増加する）（開始３〜５分間後）
分離範囲ＩＩ：４９．５〜５７％のＢの勾配（１分間ごとにＢが０．８３％増加する）（開始５〜１４分間後）
リンス範囲：１００％のＢ（開始１５〜２０分間後）。
【００９２】
検出は、２５４ｎｍにおいてＵＶ検出器を用いて行った。基準測定は６００ｎｍにおいて行った。流量は３ｍｌ／分であった。
【００９３】
図１１、１２、１３および１４は、調製用の規模（１．５ｍｇ）における、１．５ｍｇのＦＯＬＨ１（ＧＣ）ＲＮＡ調製物（ＦＯ−９３３４）、１．５ｍｇのＫＬＫ３（ＣＧ）ＲＮＡ調製物（ＫＬ−８８４９）、１．５ｍｇのＰＳＣＡ（ＣＧ）ＲＮＡ調製物（ＰＳ−８８５４）、または１．５ｍｇのＳＴＥＡＰ（ＣＧ）ＲＮＡ調製物（ＳＴ−８８４８）の分離にそれぞれ対応するクロマトグラムを示す。ここで、勾配プログラムはこれらの図面において破線で示されている。回収された画分は図１１、１２、１３および１４においてグレイで強調されている。図面から明らかなように、それぞれの場合に調製用の規模におけるＲＮＡの高純度の画分を生じて、それぞれの場合にＲＮＡの分離が可能である。
【００９４】
（実施例７：無孔性の固定ポリスチレンジビニルベンゼンマトリクスにおける、２００μｇの２ｋｂのＲＮＡおよび２００μｇの４ｋｂのＲＮＡの混合物の分離（比較例））
２００μｇの２ｋｂのＲＮＡおよび２００μｇの４ｋｂのＲＮＡの混合物が分離に使用された。カラムは、１０００Åの多孔質の非アルキル化ポリスチレンジビニルベンゼン、または無孔質の固定ポリスチレンジビニルベンゼンマトリクスのいずれかを用いて充填された。１０００Åの多孔質の非アルキル化ポリスチレンジビニルベンゼン用に使用されたカラムは、長さ２．５ｃｍおよび直径４．０ｍｍであった。試料採取器の温度は１２℃であり、ＨＰＬＣ分離用（詳細には分離カラム）の温度は７８℃であった。すなわち、動作は変性条件下において実施された。
【００９５】
勾配プログラムによって実施された分離
溶出液Ａ：０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート
溶出液Ｂ：０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート／２５％のアセトニトリル
溶出液の組成：
開始レベル：６２％のＡおよび３８％のＢ（開始１〜３分間後）
分離範囲Ｉ：３８〜４９．５％のＢの勾配（１分間ごとにＢが５．７５％増加する）（開始３〜５分間後）
分離範囲ＩＩ：４９．５〜５７％のＢの勾配（１分間ごとにＢが０．８３％増加する）（開始５〜１４分間後）
リンス範囲：１００％のＢ（開始１５〜２０分間後）。
【００９６】
検出は、２５４ｎｍにおいてＵＶ検出器を用いて行った。基準測定は６００ｎｍにおいて行った。流量は３ｍｌ／分であった。
【００９７】
図１５は、調製用の規模（２００μｇ）におけるこの分離に対応するクロマトグラムを示す。ここで、勾配プログラムは図１５において破線で示されている。回収された画分は図７においてグレイで強調されている。図面から明らかなように、マトリクスとして通常の多孔質の非アルキル化ポリスチレンジビニルベンゼンを用いて、両方のＲＮＡの分離が不可能である。図１６は図１５に係るクロマトグラムに対応するアガロースゲルを示す。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】１０μｇのルシフェラーゼ−ｍＲＮＡ（分析用）の分離のクロマトグラムを示す。
【図２】１．５μｇのルシフェラーゼ−ｍＲＮＡ（調製用）の分離のクロマトグラムを示す。
【図３】回収した画分がグレイで強調されている図２のクロマトグラムを示す。
【図４】アガロースゲルにおける回収したｍＲＮＡの純度の検証を示す。
【図５】１０００Åの孔径を有する固定相を用いた、２００μｇの２ｋｂおよび４ｋｂのＲＮＡ断片の分離のクロマトグラムを示す。
【図６】４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、１００μｇの２ｋｂおよび４ｋｂのＲＮＡ断片の分離のクロマトグラムを示す。
【図７】４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、２５０μｇの２ｋｂおよび４ｋｂのＲＮＡ断片の分離のクロマトグラムを示す。
【図８】本発明に係る方法を用いて精製したＲＮＡからのルシフェラーゼの発現の増強を証明する棒グラフである。
【図９】例示的な実施形態に使用されたルシフェラーゼの野生型の配列、詳細にはｍＲＮＡ配列を示す。
【図１０】４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、３ｍｇのＦｌｉｃ（ＧＣ）ＲＮＡ調製（ＦＣ−９０５０）の分離のクロマトグラムを示す。
【図１１】４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、３ｍｇのＦＯＬＨ１（ＧＣ）ＲＮＡ調製（ＦＯ−９３３４）の分離のクロマトグラムを示す。
【図１２】４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、３ｍｇのＫＬＫ３（ＧＣ）ＲＮＡ調製（ＫＬ−８８４９）の分離のクロマトグラムを示す。
【図１３】４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、３ｍｇのＰＳＣＡ（ＧＣ）ＲＮＡ調製（ＰＳ−８８５４）の分離のクロマトグラムを示す。
【図１４】４０００Åの孔径を有する固定相を用いた、３ｍｇのＳＴＥＡＰ（ＧＣ）ＲＮＡ調製（ＳＴ−８８４８）の分離のクロマトグラムを示す。
【図１５】無孔性の固定相を用いた２ｋｂのＲＮＡ（２００μｇ）および４ｋｂのＲＮＡ（２００μｇ）の混合物の分離のクロマトグラムを示す。
【図１６】図１５（無孔性の固定相を用いた２ｋｂのＲＮＡ（２００μｇ）および４ｋｂのＲＮＡ（２００μｇ）の混合物の分離のクロマトグラムを示す）に係るクロマトグラムに対応する、アガロースゲル分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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