(57)【要約】本発明は、カリウムチャネルＫＣＮＨ２の新規な霊長類特異的脳アイソフォーム、および統合失調症のリスクとの遺伝学的関連に関する。
2010524434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含んでなる、単離核酸分子。
【請求項２】
前記ポリペプチドの第１番目のアミノ酸がＭ  Ｓ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ａ（配列番号１６）またはＭ  Ｆ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ｔ（配列番号１７）で置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
配列番号３を有するｃＤＮＡと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記核酸は配列番号５のアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
前記核酸は、配列番号５のポリペプチドであって第１番目のアミノ酸がＭ  Ｓ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ａ（配列番号１６）またはＭ  Ｆ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ｔ（配列番号１７）で置換されているポリペプチドをコードする、請求項４に記載の単離核酸分子。
【請求項６】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項１に記載の核酸分子にハイブリダイズする単離核酸分子であって、ハイブリダイズする前記核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ａ残基のみまたはＴ残基のみで構成されるヌクレオチド配列を有する核酸分子にはハイブリダイズしないことを特徴とする、単離核酸分子。
【請求項７】
配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、単離ポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドの第１番目のアミノ酸がＭ  Ｓ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ａ（配列番号１６）またはＭ  Ｆ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ｔ（配列番号１７）に置き換えられている、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドは配列番号５のアミノ酸配列を含んでなる、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドの第１番目のアミノ酸がＭ  Ｓ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ａ（配列番号１６）またはＭ  Ｆ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ｔ（配列番号１７）に置き換えられている、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離核酸分子をベクターに挿入することを含んでなる、組換えベクターの製造方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法によって生産された組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを宿主細胞に導入することを含んでなる、組換え宿主細胞の製造方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法によって生産された組換え宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の宿主細胞を、前記組換えポリペプチドが発現される条件下で培養することを含んでなる、組換えポリペプチドの製造方法。
【請求項１６】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドのうちのいずれか１つに特異的に結合することができる単離抗体。
【請求項１７】
ヒトの神経系疾患の治療に有用な治療薬のスクリーニング方法であって、
ａ）試験化合物を、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドのうちのいずれか１つと接触させること；および
ｂ）前記ポリペプチドへの前記試験化合物の結合を検出すること
からなる方法。
【請求項１８】
ヒトの神経系疾患の治療に有用な治療薬のスクリーニング方法であって、
ａ）請求項７〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドのうちのいずれか１つの活性を、第１の濃度の試験化合物のもとで、または前記試験化合物の不在下で測定すること、
ｂ）前記ポリペプチドの活性を、第２の濃度の試験化合物のもとで測定すること、ならびに
ｃ）条件（ａ）および（ｂ）の下での前記ポリペプチドの活性を、既知の調節因子の存在下における該ポリペプチドの活性と比較すること
からなる方法。
【請求項１９】
活性は電流である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ヒトの神経系疾患の治療に有用な治療薬のスクリーニング方法であって、
ａ）試験化合物を、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドのうちのいずれか１つをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子と接触させること、および
ｂ）前記ポリヌクレオチドへの前記試験化合物の結合を検出すること
からなる方法。
【請求項２１】
ヒトの神経系疾患の治療に有用な医薬組成物の調製方法であって、
ａ）請求項７〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドのうちのいずれか１つの調節因子を同定すること、
ｂ）前記調節因子が前記ヒトの神経系疾患の症状を改善するかどうか測定すること、および
ｃ）前記調節因子を許容可能な製薬担体と組み合わせること
からなる方法。
【請求項２２】
前記調節因子は小分子、ＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、またはリボザイムである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
個体が統合失調症に罹患するか、または統合失調症に関連した症状をより多く有するようになる可能性を予測する方法であって、
ａ）評価すべき個体からＤＮＡ試料を得ること、および
ｂ）マーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１９、Ｍ２０、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｍ２３、Ｍ２４、Ｍ２５、Ｍ２６、Ｍ２７、Ｍ２８、Ｍ２９、Ｍ３０、Ｍ３１、Ｍ３２、Ｍ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、Ｍ３６、Ｍ３７、Ｍ３８、Ｍ３９、Ｍ４０、Ｍ４１、Ｍ４２、またはＭ４３から選択された一塩基変異多型（ＳＮＰ）に存在するヌクレオチドを測定すること
からなり、ＳＮＰにリスク対立遺伝子由来のヌクレオチドが存在することは、該個体が、そのＳＮＰに保護的対立遺伝子由来のヌクレオチドを有する個体よりも統合失調症に罹患する可能性が高いか、または統合失調症に関連した症状をより多く有する可能性があることを示すことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カリウムチャネルＫＣＮＨ２の新規な霊長類特異的脳アイソフォームおよび統合失調症のリスクとの遺伝学的関連性に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願は、２００７年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／９２０，２２０号の利益を主張するものであり、前記仮特許出願は参照によってその全体が本願に明らかに組み込まれる。
【０００３】
近代医療における主な挑戦は、複雑な遺伝的決定因子および環境的決定因子が関与する、統合失調症のような一般的な精神病の根底にある細胞機構および分子機構を理解することである。最近の証拠から、各々は集団全体に対して比較的影響の小さい多数の遺伝子が統合失調症のリスクに寄与することが示されている（非特許文献１）。有力な病因仮説は、そのような遺伝的要因どうしの相互作用および遺伝的要因と環境との相互作用が、後年に病気を起こしやすい神経発達異常をもたらすとしている（非特許文献２）。この複雑さに、考えうる遺伝的および対立遺伝子上の不均一性、上位性効果、検出されない個体群層化、ならびに不正確かつ様々な表現型の定義を加えて前提とすれば、統合失調症の推定リスク遺伝子を同定するための統計的関連研究が合意の反響を得られていないことは驚くにはあたらない。原因遺伝子を立証する統計的証拠における上記の問題点を考慮して、統合失調症のような複雑な多遺伝子性疾患に関する遺伝子同定の終局には、種々のリスクが、その病気の重要な生物学的特徴に収束するかたちで遺伝子の生物学に影響を及ぼすことを実証する必要があるだろうという議論がなされてきた（非特許文献３）。このことから、統合失調症に関連する中間的な生物学的表現型に対する潜在的な統合失調症感受性遺伝子の影響を検討する努力が導かれた（非特許文献４，５）。
【０００４】
最も有望な中間的表現型は、前前頭皮質（ＰＦＣ）を仲介する実行機能、および海馬体（ＨＦ）を仲介する記憶機能であり、これらの機能はいずれも統合失調症の患者および該患者の健康な血縁者において低下している（非特許文献６）。海馬皮質および前前頭皮質における生物学的異常も、統合失調症の患者で頻繁に報告されており、また該患者の健康な血縁者においても高頻度で見られ、感受性遺伝子に関係した遺伝性の形質であることが示唆される。例えば、統合失調症患者および該患者の健康な血縁者は、ＨＦ容積の低下（非特許文献７，８）、ならびにニューロン活動およびシナプス存在度の尺度であるＮ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）のレベルの低下（非特許文献９）を示し、これは恐らく剖検で観察される神経網の縮小と関係する（非特許文献１０）。統合失調症の患者および該患者の健康な血縁者における皮質の活動の様々な生理学的調査から、ＨＦおよびＰＦＣにおける無秩序な活性化が明らかになっている（非特許文献１１〜１９）。ヒト以外の霊長類およびその他の動物モデルでの研究から、皮質ネットワークにおける異常な活性化および無秩序な高頻度の発火が記憶能力障害の根底にあるかもしれないことが示されている（非特許文献２０）。しかしながら、統合失調症に関連した異常なニューロン活動に寄与する分子レベルおよび遺伝子レベルの因子は、これまでのところ特定されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐ．Ｊ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ２００５  Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １０：４０
【非特許文献２】Ｄ．Ａ．Ｌｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｐ．Ｌｅｖｉｔｔ  ２００２  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５：４０９
【非特許文献３】Ｋ．Ｍ．Ｗｅｉｓｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ  ２０００  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２６：１５１
【非特許文献４】Ａ．Ｍｅｙｅｒ−Ｌｉｎｄｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ２００６  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ７：８１８
【非特許文献５】Ｍ．Ｆ．Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１２６０４
【非特許文献６】Ｄ．Ｒ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  １９９９  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ４５：３９５
【非特許文献７】Ｌ．Ｊ．Ｓｅｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ  Ｂｕｌｌ  ２９：８０３
【非特許文献８】Ｍ．Ｄ．Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ａｒｃｈ  Ｇｅｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５５：４３３
【非特許文献９】Ｒ．Ｇ．Ｓｔｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３０：１９４９
【非特許文献１０】Ｐ．Ｊ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ  １９９９  Ｂｒａｉｎ  １２２：５９３
【非特許文献１１】Ｊ．Ｈ．Ｃａｌｌｉｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ａｍ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １６０：７０９
【非特許文献１２】Ｃ．Ｓ．Ｃａｒｔｅｒ  ２００６  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ６０：１１６９
【非特許文献１３】Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ａｍ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １６１：４９０
【非特許文献１４】Ｅ．Ｂｒａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ  Ｒｅｓ  ７０：３１５
【非特許文献１５】Ｓ．Ｆｒａｎｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ  Ｒｅｓ  ２３：４５
【非特許文献１６】Ｒ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ  Ｒｅｓ  ４：２３３
【非特許文献１７】Ｓ．Ｈｅｃｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １：３１８
【非特許文献１８】Ａ．Ｍ．Ａｃｈｉｍ  ａｎｄ  Ｍ．Ｌｅｐａｇｅ  ２００５  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １８７：５００
【非特許文献１９】Ｄ．Ｏｎｇｕｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ａｒｃｈ  Ｇｅｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ６３：３５６
【非特許文献２０】Ｐ．Ｓ．Ｇｏｌｄｍａｎ−Ｒａｋｉｃ  １９９５  Ｎｅｕｒｏｎ  １４：４７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記した懸案を鑑みてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、電位依存性カリウムチャネルＫＣＮＨ２の新規な霊長類特異的脳アイソフォーム、および統合失調症のリスクとの遺伝的関連、ならびに関連する核酸分子、ポリペプチド、抗体、スクリーニングアッセイおよび診断法に関する。
【０００８】
いくつかの実施形態は、配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含んでなる、単離核酸分子に関する。別の実施形態は、上記の単離核酸分子であって、前記ポリペプチドの第１番目のアミノ酸がＭ  Ｓ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ａ（配列番号１６）またはＭ  Ｆ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ｔ（配列番号１７）で置換されていることを特徴とする核酸分子に関する。さらに別の実施形態は、配列番号３を有するｃＤＮＡと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含んでなる上記核酸分子に関する。
【０００９】
望ましい実施形態では、上記の単離核酸分子は、配列番号５のアミノ酸配列をコードする核酸である。いくつかの実施形態では、上記の単離核酸分子は、配列番号５のポリペプチドであって前記ポリペプチドの第１番目のアミノ酸がＭ  Ｓ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ａ（配列番号１６）またはＭ  Ｆ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ｔ（配列番号１７）で置換されているポリペプチドをコードする核酸である。さらに別の実施形態は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記の核酸分子にハイブリダイズする単離核酸分子であって、ハイブリダイズする前記核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ａ残基のみまたはＴ残基のみで構成されるヌクレオチド配列を有する核酸分子にはハイブリダイズしないことを特徴とする核酸分子に関する。
【００１０】
別の実施形態は、配列番号５のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、単離ポリペプチドに関する。いくつかの態様では、上記の単離ポリペプチドは、前記ポリペプチドの第１番目のアミノ酸がＭ  Ｓ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ａ（配列番号１６）またはＭ  Ｆ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ｔ（配列番号１７）に置き換えられているという点で修飾されている。別の実施形態では、前記ポリペプチドは配列番号５のアミノ酸配列を含んでなり、さらに別の実施形態では、上記の単離ポリペプチドは、前記ポリペプチドの第１番目のアミノ酸がＭ  Ｓ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ａ（配列番号１６）またはＭ  Ｆ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ｔ（配列番号１７）で置換されるように修飾される。
【００１１】
本発明のいくつかの態様はさらに、上述の単離核酸分子のうちのいずれかをベクターに挿入することを含んでなる組換えベクターの製造方法に関する。上記方法によって生産された組換えベクター、およびこのベクターを宿主細胞に導入することを含んでなる組換え宿主細胞の製造方法も、意図される実施形態である。これらの方法によって生産された組換え宿主細胞も実施形態である。さらに、本発明のいくつかの態様は、前記組換えポリペプチドが発現される条件下で上記の宿主細胞を培養することを含んでなる、組換えポリペプチドの製造方法に関する。上述のポリペプチドのうちのいずれか１つに特異的に結合することができる単離抗体も、意図される実施形態である。
【００１２】
別の実施形態は、ヒトの神経系疾患の治療に有用な治療薬のスクリーニング方法であって、試験化合物を上述のポリペプチドのうちのいずれか１つと接触させること；および前記ポリペプチドへの前記試験化合物の結合を検出すること、からなる方法に関する。
【００１３】
さらに別の実施形態は、ヒトの神経系疾患の治療に有用な治療薬のスクリーニング方法であって、（ａ）上述のポリペプチドのうちのいずれか１つの活性を、第１の濃度の試験化合物のもとで、または前記試験化合物の不在下で測定すること、（ｂ）前記ポリペプチドの活性を、第２の濃度の試験化合物のもとで測定すること、ならびに条件（ａ）および（ｂ）の下での前記ポリペプチドの活性を、既知の調節因子の存在下におけるポリペプチドの活性と比較すること、からなる方法に関する。いくつかの実施形態では、活性は電流である。別の実施形態は、ヒトの神経系疾患の治療に有用な治療薬のスクリーニング方法であって、試験化合物を、上述のポリペプチドのうちのいずれか１つをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子と接触させること、および前記ポリヌクレオチドへの前記試験化合物の結合を検出すること、からなる方法に関する。
【００１４】
さらに、本発明のいくつかの態様は、ヒトの神経系疾患の治療に有用な医薬組成物の調製方法であって、上述のポリペプチドのうちのいずれか１つの調節因子を同定すること、前記調節因子が前記ヒトの神経系疾患の症状を改善するかどうか測定すること、および前記調節因子を許容可能な製薬担体と組み合わせること、からなる方法に関する。いくつかの実施形態では、前記調節因子が小分子、ＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、またはリボザイムである上記方法が実行される。
【００１５】
さらなる実施形態は、個体が統合失調症に罹患するか、または統合失調症に関連した症状をより多く有するようになる可能性を予測する方法であって、評価すべき個体からＤＮＡ試料を得ること、およびマーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１９、Ｍ２０、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｍ２３、Ｍ２４、Ｍ２５、Ｍ２６、Ｍ２７、Ｍ２８、Ｍ２９、Ｍ３０、Ｍ３１、Ｍ３２、Ｍ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、Ｍ３６、Ｍ３７、Ｍ３８、Ｍ３９、Ｍ４０、Ｍ４１、Ｍ４２、またはＭ４３から選択された一塩基変異多型（ＳＮＰ）に存在するヌクレオチドを測定することからなり、ＳＮＰにリスク対立遺伝子由来のヌクレオチドが存在することは、該個体が、そのＳＮＰに保護的対立遺伝子由来のヌクレオチドを有する個体よりも統合失調症に罹患する可能性が高いか、または統合失調症に関連した症状をより多く有する可能性があることを示すことを特徴とする方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＨＥＲＧ  Ｋ＋チャネルの膜貫通トポロジーを示す図。
【図２】ＫＣＮＨ２（上、配列番号６）および光活性黄色タンパク質（下、配列番号７）のｅａｇドメインの配列アラインメントを示す図。
【図３Ａ】図３Ａ乃至図３Ｅは、ヒトのＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１のタンパク質およびｃＤＮＡの配列を示す図。ＫＣＮＨ２−１Ａタンパク質（配列番号２）、ＫＣＮＨ２−１Ａ  ｃＤＮＡ（配列番号１）；アイソフォーム３．１タンパク質（配列番号４）、アイソフォーム３．１  ｃＤＮＡ（配列番号３）。ＨＥＲＧΔ２−１０２は、ＨＥＲＧ（配列番号２）のアミノ酸２−１０２を欠き、その結果配列番号５となるタンパク質として定義される。
【図３Ｂ】図３Ａ乃至図３Ｅは、ヒトのＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１のタンパク質およびｃＤＮＡの配列を示す図。ＫＣＮＨ２−１Ａタンパク質（配列番号２）、ＫＣＮＨ２−１Ａ  ｃＤＮＡ（配列番号１）；アイソフォーム３．１タンパク質（配列番号４）、アイソフォーム３．１  ｃＤＮＡ（配列番号３）。ＨＥＲＧΔ２−１０２は、ＨＥＲＧ（配列番号２）のアミノ酸２−１０２を欠き、その結果配列番号５となるタンパク質として定義される。
【図３Ｃ】図３Ａ乃至図３Ｅは、ヒトのＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１のタンパク質およびｃＤＮＡの配列を示す図。ＫＣＮＨ２−１Ａタンパク質（配列番号２）、ＫＣＮＨ２−１Ａ  ｃＤＮＡ（配列番号１）；アイソフォーム３．１タンパク質（配列番号４）、アイソフォーム３．１  ｃＤＮＡ（配列番号３）。ＨＥＲＧΔ２−１０２は、ＨＥＲＧ（配列番号２）のアミノ酸２−１０２を欠き、その結果配列番号５となるタンパク質として定義される。
【図３Ｄ】図３Ａ乃至図３Ｅは、ヒトのＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１のタンパク質およびｃＤＮＡの配列を示す図。ＫＣＮＨ２−１Ａタンパク質（配列番号２）、ＫＣＮＨ２−１Ａ  ｃＤＮＡ（配列番号１）；アイソフォーム３．１タンパク質（配列番号４）、アイソフォーム３．１  ｃＤＮＡ（配列番号３）。ＨＥＲＧΔ２−１０２は、ＨＥＲＧ（配列番号２）のアミノ酸２−１０２を欠き、その結果配列番号５となるタンパク質として定義される。
【図３Ｅ】図３Ａ乃至図３Ｅは、ヒトのＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１のタンパク質およびｃＤＮＡの配列を示す図。ＫＣＮＨ２−１Ａタンパク質（配列番号２）、ＫＣＮＨ２−１Ａ  ｃＤＮＡ（配列番号１）；アイソフォーム３．１タンパク質（配列番号４）、アイソフォーム３．１  ｃＤＮＡ（配列番号３）。ＨＥＲＧΔ２−１０２は、ＨＥＲＧ（配列番号２）のアミノ酸２−１０２を欠き、その結果配列番号５となるタンパク質として定義される。
【図４】ＫＣＮＨ２および新規なアイソフォーム３．１のドメイン配置の概略を示す図。
【図５】７ｑ３６．１と統合失調症のリスクとの遺伝的関連を示す図。
【図６Ａ】リスクＳＮＰと、（Ａ）認知の尺度、（Ｂ）脳構造上の容積、および（Ｃ）記憶に基づいたタスクの際の領域別脳活動との関連を示す図。
【図６Ｂ】リスクＳＮＰと、（Ａ）認知の尺度、（Ｂ）脳構造上の容積、および（Ｃ）記憶に基づいたタスクの際の領域別脳活動との関連を示す図。
【図６Ｃ】リスクＳＮＰと、（Ａ）認知の尺度、（Ｂ）脳構造上の容積、および（Ｃ）記憶に基づいたタスクの際の領域別脳活動との関連を示す図。
【図７Ａ】（Ａ）領域別遺伝子発現および（Ｂ）リスク遺伝子型との関連を示す図。
【図７Ｂ】（Ａ）領域別遺伝子発現および（Ｂ）リスク遺伝子型との関連を示す図。
【図８Ａ】アイソフォーム３．１のｍＲＮＡおよびタンパク質の検出および定量について示す図。（Ａ）組織特異的なＰＣＲ；（Ｂ）組織特異的なＱＰＣＲ；（Ｃ）タンパク質発現；ならびに（Ｄ）トランスフェクションおよび細胞内局在化。
【図８Ｂ】アイソフォーム３．１のｍＲＮＡおよびタンパク質の検出および定量について示す図。（Ａ）組織特異的なＰＣＲ；（Ｂ）組織特異的なＱＰＣＲ；（Ｃ）タンパク質発現；ならびに（Ｄ）トランスフェクションおよび細胞内局在化。
【図８Ｃ】アイソフォーム３．１のｍＲＮＡおよびタンパク質の検出および定量について示す図。（Ａ）組織特異的なＰＣＲ；（Ｂ）組織特異的なＱＰＣＲ；（Ｃ）タンパク質発現；ならびに（Ｄ）トランスフェクションおよび細胞内局在化。
【図８Ｄ】アイソフォーム３．１のｍＲＮＡおよびタンパク質の検出および定量について示す図。（Ａ）組織特異的なＰＣＲ；（Ｂ）組織特異的なＱＰＣＲ；（Ｃ）タンパク質発現；ならびに（Ｄ）トランスフェクションおよび細胞内局在化。
【図９Ａ】ＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＫＣＮＨ２電流の特性解析について示す図。（Ａ）ドメイン構造の図解；（Ｂ）電圧ステップによって喚起された電流；（Ｃ）末尾電流に対する影響；（Ｄ）活性化曲線；（Ｅ）電圧ステップによって喚起された末尾電流；および（Ｆ）脱活性化時定数。
【図９Ｂ】ＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＫＣＮＨ２電流の特性解析について示す図。（Ａ）ドメイン構造の図解；（Ｂ）電圧ステップによって喚起された電流；（Ｃ）末尾電流に対する影響；（Ｄ）活性化曲線；（Ｅ）電圧ステップによって喚起された末尾電流；および（Ｆ）脱活性化時定数。
【図９Ｃ】ＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＫＣＮＨ２電流の特性解析について示す図。（Ａ）ドメイン構造の図解；（Ｂ）電圧ステップによって喚起された電流；（Ｃ）末尾電流に対する影響；（Ｄ）活性化曲線；（Ｅ）電圧ステップによって喚起された末尾電流；および（Ｆ）脱活性化時定数。
【図９Ｄ】ＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＫＣＮＨ２電流の特性解析について示す図。（Ａ）ドメイン構造の図解；（Ｂ）電圧ステップによって喚起された電流；（Ｃ）末尾電流に対する影響；（Ｄ）活性化曲線；（Ｅ）電圧ステップによって喚起された末尾電流；および（Ｆ）脱活性化時定数。
【図９Ｅ】ＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＫＣＮＨ２電流の特性解析について示す図。（Ａ）ドメイン構造の図解；（Ｂ）電圧ステップによって喚起された電流；（Ｃ）末尾電流に対する影響；（Ｄ）活性化曲線；（Ｅ）電圧ステップによって喚起された末尾電流；および（Ｆ）脱活性化時定数。
【図９Ｆ】ＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＫＣＮＨ２電流の特性解析について示す図。（Ａ）ドメイン構造の図解；（Ｂ）電圧ステップによって喚起された電流；（Ｃ）末尾電流に対する影響；（Ｄ）活性化曲線；（Ｅ）電圧ステップによって喚起された末尾電流；および（Ｆ）脱活性化時定数。
【図１０Ａ】皮質ニューロンにおけるＫＣＮＨ２電流および発火パターンに対するアイソフォーム３．１の影響を示す図。（Ａ）ＧＦＰでトランスフェクトされたニューロンにおける末尾電流；（Ｂ）アイソフォーム３．１でトランスフェクトされたニューロンにおける末尾電流；（Ｃ）脱活性化時定数；（Ｄ）活動電位発射；（Ｅ）スパイク頻度；および（Ｆ）スパイク頻度順応に対するアイソフォーム３．１の影響。
【図１０Ｂ】皮質ニューロンにおけるＫＣＮＨ２電流および発火パターンに対するアイソフォーム３．１の影響を示す図。（Ａ）ＧＦＰでトランスフェクトされたニューロンにおける末尾電流；（Ｂ）アイソフォーム３．１でトランスフェクトされたニューロンにおける末尾電流；（Ｃ）脱活性化時定数；（Ｄ）活動電位発射；（Ｅ）スパイク頻度；および（Ｆ）スパイク頻度順応に対するアイソフォーム３．１の影響。
【図１０Ｃ】皮質ニューロンにおけるＫＣＮＨ２電流および発火パターンに対するアイソフォーム３．１の影響を示す図。（Ａ）ＧＦＰでトランスフェクトされたニューロンにおける末尾電流；（Ｂ）アイソフォーム３．１でトランスフェクトされたニューロンにおける末尾電流；（Ｃ）脱活性化時定数；（Ｄ）活動電位発射；（Ｅ）スパイク頻度；および（Ｆ）スパイク頻度順応に対するアイソフォーム３．１の影響。
【図１０Ｄ】皮質ニューロンにおけるＫＣＮＨ２電流および発火パターンに対するアイソフォーム３．１の影響を示す図。（Ａ）ＧＦＰでトランスフェクトされたニューロンにおける末尾電流；（Ｂ）アイソフォーム３．１でトランスフェクトされたニューロンにおける末尾電流；（Ｃ）脱活性化時定数；（Ｄ）活動電位発射；（Ｅ）スパイク頻度；および（Ｆ）スパイク頻度順応に対するアイソフォーム３．１の影響。
【図１０Ｅ】皮質ニューロンにおけるＫＣＮＨ２電流および発火パターンに対するアイソフォーム３．１の影響を示す図。（Ａ）ＧＦＰでトランスフェクトされたニューロンにおける末尾電流；（Ｂ）アイソフォーム３．１でトランスフェクトされたニューロンにおける末尾電流；（Ｃ）脱活性化時定数；（Ｄ）活動電位発射；（Ｅ）スパイク頻度；および（Ｆ）スパイク頻度順応に対するアイソフォーム３．１の影響。
【図１０Ｆ】皮質ニューロンにおけるＫＣＮＨ２電流および発火パターンに対するアイソフォーム３．１の影響を示す図。（Ａ）ＧＦＰでトランスフェクトされたニューロンにおける末尾電流；（Ｂ）アイソフォーム３．１でトランスフェクトされたニューロンにおける末尾電流；（Ｃ）脱活性化時定数；（Ｄ）活動電位発射；（Ｅ）スパイク頻度；および（Ｆ）スパイク頻度順応に対するアイソフォーム３．１の影響。
【図１１】ＳＮＰ、転写物、ＱＰＣＲアッセイ、ＰＣＲプライマー、および再度配列決定を行った領域の物理的地図を示す図。
【図１２Ａ１】（Ａ１〜Ａ３）ＣＢＤＢ、（Ｂ１〜Ｂ３）ＮＩＭＨＧＩ−Ｃ、（Ｃ１〜Ｃ３）ＮＩＭＨＧＩ−ＡＡ、および（Ｄ）ドイツのＤＮＡコレクションに関する単一マーカーおよび３マーカーのスライディングウィンドウ解析の結果を示す図。
【図１２Ａ２】（Ａ１〜Ａ３）ＣＢＤＢ、（Ｂ１〜Ｂ３）ＮＩＭＨＧＩ−Ｃ、（Ｃ１〜Ｃ３）ＮＩＭＨＧＩ−ＡＡ、および（Ｄ）ドイツのＤＮＡコレクションに関する単一マーカーおよび３マーカーのスライディングウィンドウ解析の結果を示す図。
【図１２Ａ３】（Ａ１〜Ａ３）ＣＢＤＢ、（Ｂ１〜Ｂ３）ＮＩＭＨＧＩ−Ｃ、（Ｃ１〜Ｃ３）ＮＩＭＨＧＩ−ＡＡ、および（Ｄ）ドイツのＤＮＡコレクションに関する単一マーカーおよび３マーカーのスライディングウィンドウ解析の結果を示す図。
【図１２Ｂ１】（Ａ１〜Ａ３）ＣＢＤＢ、（Ｂ１〜Ｂ３）ＮＩＭＨＧＩ−Ｃ、（Ｃ１〜Ｃ３）ＮＩＭＨＧＩ−ＡＡ、および（Ｄ）ドイツのＤＮＡコレクションに関する単一マーカーおよび３マーカーのスライディングウィンドウ解析の結果を示す図。
【図１２Ｂ２】（Ａ１〜Ａ３）ＣＢＤＢ、（Ｂ１〜Ｂ３）ＮＩＭＨＧＩ−Ｃ、（Ｃ１〜Ｃ３）ＮＩＭＨＧＩ−ＡＡ、および（Ｄ）ドイツのＤＮＡコレクションに関する単一マーカーおよび３マーカーのスライディングウィンドウ解析の結果を示す図。
【図１２Ｂ３】（Ａ１〜Ａ３）ＣＢＤＢ、（Ｂ１〜Ｂ３）ＮＩＭＨＧＩ−Ｃ、（Ｃ１〜Ｃ３）ＮＩＭＨＧＩ−ＡＡ、および（Ｄ）ドイツのＤＮＡコレクションに関する単一マーカーおよび３マーカーのスライディングウィンドウ解析の結果を示す図。
【図１２Ｃ１】（Ａ１〜Ａ３）ＣＢＤＢ、（Ｂ１〜Ｂ３）ＮＩＭＨＧＩ−Ｃ、（Ｃ１〜Ｃ３）ＮＩＭＨＧＩ−ＡＡ、および（Ｄ）ドイツのＤＮＡコレクションに関する単一マーカーおよび３マーカーのスライディングウィンドウ解析の結果を示す図。
【図１２Ｃ２】（Ａ１〜Ａ３）ＣＢＤＢ、（Ｂ１〜Ｂ３）ＮＩＭＨＧＩ−Ｃ、（Ｃ１〜Ｃ３）ＮＩＭＨＧＩ−ＡＡ、および（Ｄ）ドイツのＤＮＡコレクションに関する単一マーカーおよび３マーカーのスライディングウィンドウ解析の結果を示す図。
【図１２Ｃ３】（Ａ１〜Ａ３）ＣＢＤＢ、（Ｂ１〜Ｂ３）ＮＩＭＨＧＩ−Ｃ、（Ｃ１〜Ｃ３）ＮＩＭＨＧＩ−ＡＡ、および（Ｄ）ドイツのＤＮＡコレクションに関する単一マーカーおよび３マーカーのスライディングウィンドウ解析の結果を示す図。
【図１２Ｄ】（Ａ１〜Ａ３）ＣＢＤＢ、（Ｂ１〜Ｂ３）ＮＩＭＨＧＩ−Ｃ、（Ｃ１〜Ｃ３）ＮＩＭＨＧＩ−ＡＡ、および（Ｄ）ドイツのＤＮＡコレクションに関する単一マーカーおよび３マーカーのスライディングウィンドウ解析の結果を示す図。
【図１３】希少なＳＮＰであるＭ２５を有する８家族の系図およびこれらの家族を除いた関連表を示す図。
【図１４Ａ】最適化ＶＢＭを使用して得られた、ＳＮＰ  Ｍ３０の遺伝子型に基づいた右海馬の灰白質容積（ＭＮＩ座標：２６、−１２および−２２ｍｍ）の差を示す図。Ａ）灰白質容積のプロット図、Ｂ）閾値を設定した統計的ｔマップ。
【図１４Ｂ】最適化ＶＢＭを使用して得られた、ＳＮＰ  Ｍ３０の遺伝子型に基づいた右海馬の灰白質容積（ＭＮＩ座標：２６、−１２および−２２ｍｍ）の差を示す図。Ａ）灰白質容積のプロット図、Ｂ）閾値を設定した統計的ｔマップ。
【図１５Ａ】最適化ＶＢＭを使用して得られた、ＳＮＰ  Ｍ３１の遺伝子型に基づいた右海馬の灰白質容積（ＭＮＩ座標：２６、−９および−２４ｍｍ）の差を示す図。Ａ）灰白質容積のプロット図、Ｂ）閾値を設定した統計的ｔマップ。
【図１５Ｂ】最適化ＶＢＭを使用して得られた、ＳＮＰ  Ｍ３１の遺伝子型に基づいた右海馬の灰白質容積（ＭＮＩ座標：２６、−９および−２４ｍｍ）の差を示す図。Ａ）灰白質容積のプロット図、Ｂ）閾値を設定した統計的ｔマップ。
【図１６Ａ】最適化ＶＢＭを使用して得られた、ＳＮＰ  Ｍ３３の遺伝子型に基づいた右海馬の灰白質容積（ＭＮＩ座標：２６、−９および−２４ｍｍ）の差を示す図。Ａ）灰白質容積のプロット図、Ｂ）閾値を設定した統計的ｔマップ。
【図１６Ｂ】最適化ＶＢＭを使用して得られた、ＳＮＰ  Ｍ３３の遺伝子型に基づいた右海馬の灰白質容積（ＭＮＩ座標：２６、−９および−２４ｍｍ）の差を示す図。Ａ）灰白質容積のプロット図、Ｂ）閾値を設定した統計的ｔマップ。
【図１７Ａ】陳述記憶タスクの際の、ＳＮＰ  Ｍ３１の遺伝子型に基づいた海馬の関与の差を示す図。Ａ）左海馬後部におけるタスクの符号化状態の際の血中酸素レベル依存的（ＢＯＬＤ）なシグナルの変化（％）。Ｂ）閾値を設定した統計的ｔマップ。
【図１７Ｂ】陳述記憶タスクの際の、ＳＮＰ  Ｍ３１の遺伝子型に基づいた海馬の関与の差を示す図。Ａ）左海馬後部におけるタスクの符号化状態の際の血中酸素レベル依存的（ＢＯＬＤ）なシグナルの変化（％）。Ｂ）閾値を設定した統計的ｔマップ。
【図１８Ａ】陳述記憶タスクの際の、ＳＮＰ  Ｍ３３の遺伝子型に基づいた海馬の関与の差を示す図。Ａ）左海馬後部におけるタスクの符号化状態の際の血中酸素レベル依存的（ＢＯＬＤ）なシグナルの変化（％）。Ｂ）閾値を設定した統計的ｔマップ。
【図１８Ｂ】陳述記憶タスクの際の、ＳＮＰ  Ｍ３３の遺伝子型に基づいた海馬の関与の差を示す図。Ａ）左海馬後部におけるタスクの符号化状態の際の血中酸素レベル依存的（ＢＯＬＤ）なシグナルの変化（％）。Ｂ）閾値を設定した統計的ｔマップ。
【図１９】神経弛緩薬で処理されたラットの前頭皮質におけるＮＯＳ３およびＫＣＮＨ２−１Ａの発現を示す図。
【図２０】ＰＣＲおよびＱＰＣＲを用いたアイソフォーム３．１およびＫＣＮＨ２−１Ａの組織差を示す図。
【図２１Ａ】霊長類および霊長類以外の生物種のアイソフォーム３．１の５’−ＵＴＲ配列のアラインメントおよび該配列の保存について示す図。（Ａ）エキソン３の上流領域のＤＮＡ塩基配列のアラインメント。ヒト（Ｈｕｍａｎ）（配列番号８）；アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ）（配列番号９）；マウス（Ｍｏｕｓｅ）（配列番号１０）；ラット（Ｒａｔ）（配列番号１１）。（Ｂ）ｈＥＲＧ−１ａエキソン３の上流の予測される最長のＯＲＦ。ヒト（配列番号１２）；アカゲザル（配列番号１３）；マウス（配列番号１４）；ラット（配列番号１５）。
【図２１Ｂ】霊長類および霊長類以外の生物種のアイソフォーム３．１の５’−ＵＴＲ配列のアラインメントおよび該配列の保存について示す図。（Ａ）エキソン３の上流領域のＤＮＡ塩基配列のアラインメント。ヒト（Ｈｕｍａｎ）（配列番号８）；アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ）（配列番号９）；マウス（Ｍｏｕｓｅ）（配列番号１０）；ラット（Ｒａｔ）（配列番号１１）。（Ｂ）ｈＥＲＧ−１ａエキソン３の上流の予測される最長のＯＲＦ。ヒト（配列番号１２）；アカゲザル（配列番号１３）；マウス（配列番号１４）；ラット（配列番号１５）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
別途定義されないかぎり、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  Ｐ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ  Ｄ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１を参照されたい。
【００１８】
移行用語（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｔｅｒｍ）「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「備えている（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義であり、包含的すなわちオープンエンドであって、列挙されていない追加の要素または方法ステップを除外しない。
【００１９】
移行句（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｐｈｒａｓｅ）「〜のみで構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、クレームにおいて特定されていないあらゆる要素、ステップまたは成分を除外するが、その発明とは無関係な、その発明に通常伴う不純物のような追加の構成要素またはステップは除外しない。
【００２０】
移行句「〜のみで実質的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、クレームの範囲を、特定された材料またはステップ、およびクレームに記載された発明の基本的かつ新規な特性に物質的に影響を及ぼさないものに限定する。
【００２１】
概観
本明細書に記載されるように、本発明者らは、電位依存性カリウムチャネルＫＣＮＨ２の新規なアイソフォームの発見および特性解析に結びつく広範囲な一連の基礎実験および臨床実験について報告する。ヒト脳における該アイソフォームの発現は、統合失調症では統合失調症リスク一塩基変異多型（ＳＮＰ）と有意に相関して顕著に増加し、かつ細胞培養物における発現はニューロンの興奮性を劇的に変化させる。
【００２２】
近代医療の究極の目標は、糖尿病および精神病のような、一般的であるが複雑なヒト疾病の根底にある根本的な機構を理解することである。従来の遺伝学的な連鎖および相関の研究は、これらの疾病に複数の遺伝子が関与し、各遺伝子が集団全体にわたって及ぼす影響は比較的小さいため、決定的とは言い難かった。さらに、遺伝的要因の複雑さおよび該要因と環境との相互作用から、遺伝学的知見を病気の重要な生物学的または機構的態様に結び付けて考えるのは難しい場合が多い。これらの障害を克服するために、本発明者らは、統合失調症の複雑な現象を神経系および分子レベルの構成要素まで詳細に分析し、これらの多様なレベルの分析に遺伝的関連をマッピングする、強力かつトランスレーショナルな手法をとってきた。本研究に上記手法を使用して、本発明者らは、新しい種類の統合失調症感受性遺伝子であるＫＣＮＨ２カリウムチャネルを同定し、さらに重要なことには、霊長類および脳に特異的であり統合失調症においては２．５倍に増加する、この種の電位依存性カリウムチャネルの新規なアイソフォームを同定する。さらに、本発明者らは、ＫＣＮＨ２のこの新規アイソフォームの電気生理学的特性を解析し、ニューロンにおける高発現が、統合失調症の生理的相関現象である無秩序なニューロン活性化パターンをもたらすことを明らかにする。これらの集中的な知見は、統合失調症および関連障害の根底にある分子機構に対して、劇的な新しい洞察を提供する。
【００２３】
該研究の主な知見および潜在的な影響力は以下のとおりである。第１に、統合失調症の脳組織からの差次的遺伝子発現データに基づき、本発明者らはＫＣＮＨ２を含む７ｑ３６の領域を特定したが、該領域では３ｋｂのイントロン領域内のＳＮＰが統合失調症に有意に関連している。より重要なことに、上記の遺伝的関連は、アフリカ系アメリカ人を起原とするものを含む４つの独立した臨床試料において再現することができたが、このことは、程度が異なるとはいえ、この遺伝子が世界的に統合失調症のリスクに影響を与えることを示唆している。本発明者らの遺伝的関連研究の整合性は、ＫＣＮＨ２を統合失調症のリスク遺伝子として強力に関係付けている。
【００２４】
第２に、本発明者らは、独立した一組の健康な対照者群において、リスクＳＮＰと、最も一貫して報告される中間的な生物学的表現型のうちのいくつかにおける統合失調症様の変化、すなわち：記憶力およびＩＱ／認知処理速度の低下、ＭＲＩによって計測されるような海馬容積の縮小、ならびにｆＭＲＩによって計測されるような記憶タスクの際の海馬の生理的関与の低下、との有意な関連を示した。これらの、脳の構造および機能における変異との独立した関連性は、遺伝子機能および既知の認知機能と、統合失調症に関連する神経生物学的現象との間をさらに結び付ける。
【００２５】
第３に、本発明者らは、ＫＣＮＨ２との遺伝的関連の根底にあるかもしれない基本的な機構を解明するために臨床を越えて研究を拡張した。本発明者らは、死後のヒト脳におけるＫＣＮＨ２  ｍＲＮＡの発現を解析することから始めた。予想外にも、本発明者らは、霊長類に特異的で脳内に極めて豊富であるＫＣＮＨ２の新規アイソフォーム（３．１）を同定した。典型的なＫＣＮＨ２−１Ａ型とは異なり、この新規アイソフォーム３．１は心臓では微量しか発現を示さない。特に、このアイソフォームの発現は、統合失調症の患者の海馬内で著しく増加し（完全長型に対して２．５倍の増加）、またリスク対立遺伝子を有する正常な個体でも増加している。したがって、遺伝的関連は、特にこの新規アイソフォームに、主としてその発現の調節に関して、関係があるように見える。さらに構造分析から、新規アイソフォームが、ＫＣＮＨ２の特徴的な緩徐な脱活性化に重要であることが知られているＰＡＳドメインの、大部分を欠くことが明らかにされている。次に本発明者らはげっ歯動物の錐体ニューロンにおいてこの新規アイソフォームを過剰発現させ、該アイソフォームが急速に脱活性化するＫ＋電流および高頻度の順応しない発火パターンを生じることを見出した。これらの結果は、正常な高次認知について、さらに統合失調症で見られる認知障害についても重要な意味合いを持つ。持続的な順応しない発火パターンが、霊長類における高次の認識タスクおよび記憶タスクの根底にある皮質の情報処理にとって重要であると考えられてきたように、正常な生理的レベルの３．１アイソフォームは、このパターンのニューロンの活動を支えるための、霊長類における重要な進化論的発展であるのかもしれない。しかしながら、統合失調症において見られるように、このアイソフォームの発現上昇は、皮質回路における制御されていない非同期性の発火を引き起こし、その結果、統合失調症患者およびリスク対立遺伝子を有する正常な被験者にも見られる複雑な認知機能の遂行の異常、ならびに皮質の生理活性のパターン異常をもたらす可能性が考えられる。実際に、無秩序な生理活性は、統合失調症患者に関する最近の神経生理学的研究の特徴である。
【００２６】
総合すると、これらの集中的な知見は、新規なＫＣＮＨ２アイソフォームが統合失調症の病因および病態生理において役割を果たしているとみなす、説得力のある証拠を提供している。多くの利用可能な抗精神病薬がＫＣＮＨ２−１Ａにも結合し（Ｋｏｎｇｓａｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２  Ａｕｇ  １６；４５０（１）：３７−４１を参照）、その心臓への副作用の原因となっていること、およびアイソフォーム３．１は比較的脳特異的であり、ニューロンの発火を制御する際に主要な役割を果たすことを考えれば、本発明者らの結果はさらに、他の抗精神病薬に一般的に伴う心臓への副作用を回避する可能性のある、有望な新しい治療ターゲットをも提示している。
【００２７】
ＨＥＲＧおよびＰＡＳドメインの説明
ＨＥＲＧ（ヒトｅａｇ関連遺伝子）は、ｅａｇ（エーテルアゴーゴー）Ｋ＋チャネルファミリーのメンバーである（Ｗａｒｍｋｅ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１５６０−１５６２；Ｗａｒｍｋｅ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ  Ｇａｎｅｔｚｋｙ，Ｂ  １９９４  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：３４３８−３４４２）。ヒトの心臓および神経系で見つかったこれらのチャネルは、家族性の心不整脈および突然死を引き起こす遺伝的条件である、ＱＴ延長症候群の１形態のＬＱＴ２の基礎をなしている（Ｃｕｒｒａｎ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｃｅｌｌ  ８０：７９５−８０３）。他の電位依存性Ｋ＋チャネルと同様に、ＨＥＲＧは膜を貫通する６つのストレッチでできたサブユニット・トポロジーを有する（図１）。４つのこれらサブユニットが、中心にイオン伝達細孔を備えた四量体を形成する。細孔の電位依存的なゲート制御または開閉は、この電位依存性カチオンチャネルファミリーの全メンバーに存在するＳ４「電圧センサ」（アルギニンに富んだ４番目の膜貫通ストレッチ）によって与えられる（Ｓｉｇｗｏｒｔｈ，Ｆ．Ｊ．１９９４  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２７：１−４０）。
【００２８】
図１を参照すると、ＨＥＲＧチャネルのモノマーはＳ１〜Ｓ６と呼ばれる６つの膜貫通セグメントを有し；Ｓ４は電圧センサであって、＋記号で示すように６つの正に荷電したアミノ酸を含んでいる。該チャネルは、いずれも細胞質側にある大きなＣ末端および特徴的なＮ末端ｅａｇドメインを有し；細孔領域はＳ５とＳ６との間に位置している。機能的チャネルは中心にイオン伝達路を備えた四量体である。
【００２９】
ＨＥＲＧは、２つの異なる生理学上重要なゲート制御特性、すなわち迅速な不活性化および緩徐な脱活性化を示す（Ｔｒｕｄｅａｕ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：９２−９５；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：８３３−８３６；Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０７：６１１−６１９）。迅速な不活性化が存在するということは、チャネルが細胞膜の脱分極とともに開くと、外向きの電流をほとんど通過させずに非常に迅速に不伝導（不活性化）状態に入ることを意味している。膜が−８０ｍＶ近くの正常な静止膜電位に戻ると、チャネルはその立体配座上のステップを明らかに逆戻りして、閉止形態に戻る途中で開放状態を通過する。脱活性化プロセスと呼ばれる閉止状態への復帰は、ＨＥＲＧチャネルでは非常に遅く、従って大きな内向きの「末尾」Ｋ＋電流が電圧固定実験中に観察される。この緩徐型のＨＥＲＧチャネル脱活性化は、活動電位の長さを支配することにより、心臓の電気興奮性に重要な役割を果たす（Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ．Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｃｅｌｌ  ８１：２９９−３０７）。
【００３０】
ＨＥＲＧの細胞質側にあるアミノ末端の欠失は、脱活性化の速度に大きく影響することが示されている（Ｓｃｈｏｅｎｈｅｒｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．１９９６  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４９３：６３５−６４２；Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０７：６１１−６１９；Ｔｅｒｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５０２：５３７−５４３）。この知見は非常に興味深い、というのも、ＨＥＲＧのアミノ末端は、高度に保存されているだけでなくｅａｇＫ＋チャネルファミリーの特徴を規定していると考えるのに十分な独自性を有する、約１３５アミノ酸の配列を含んでいる（Ｗａｒｍｋｅ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ  Ｇａｎｅｔｚｋｙ，Ｂ．１９９４  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：３４３８−３４４２）からである。ｅａｇドメインは、Ｋ＋チャネルの主要部と、おそらくはその表面の疎水性パッチを介して緊密に結合することにより、脱活性化を制御する。該ドメインの三次元構造は、ＰＡＳドメインファミリーの最初の真核生物由来のメンバーを明らかにしている。ＰＡＳ（Ｐｅｒ、Ａｒｎｔ、およびＳｉｍの遺伝子産物の頭文字）（Ｒｅｐｐｅｒｔ，Ｓ．Ｍ．１９９８  Ｃｅｌｌ  ２１：１−４；Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ，Ｐ．１９９８  Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：８７１−８７４）ドメインは、哺乳動物における概日リズム、ホルモン分泌の周期的パターン、繁殖および自発運動、ならびに植物における光合成の周期的変動に関与するタンパク質に見出される。原核細胞では、ＰＡＳドメインは光センサおよび化学センサとして役立つことにより様々な生化学的プロセスを調節する。
【００３１】
図２を参照すると、ＫＣＮＨ２（上）および光活性黄色タンパク質（ＰＹＰ）（下）のｅａｇドメインが、重ね合わせ構造モデルに従ってアラインメントされている。ｅａｇドメインおよびＰＹＰが極めて類似した三次元構造を有することは明らかである。破線のボックスは、位置が一致した残基が両方の構造に共通の二次構造要素の同じ部位を占めている配列のストレッチを示している。二次構造要素は対応する配列の上方および下方に、αへリックスは矢印として、βストランドは塗りつぶした長方形として、３１０へリックスは白抜きの長方形として示されている。ｅａｇドメイン構造の構造要素には名前が付されている。実線のボックスは、ｅａｇドメイン構造中の不規則な残基を示している。残基番号はそれぞれの配列の上方および下方に示されている。
【００３２】
ｅａｇドメインは、コイルから成る長い規則的な「つる（ｖｉｎｅ）」および３１０ヘリックス（α’Ａ）の単一ターンを背景にして集まった５本鎖逆平行βシート（βＡ〜βＥ）を備えたα＋βタンパク質である。シートは両側にαヘリックス（αＡ〜αＣ）が施されている。該構造は、そのＮ末端およびＣ末端が並行して配置されて、βシートの中心の２本の鎖を形成する。
【００３３】
２つのタンパク質の間の主な違いは、αＣヘリックスおよび関連する「つる」がβシートをパックする方法にある。ｅａｇドメインおよびＰＹＰの構造に基づいた配列アラインメントは、際立った配列保存がないことを示している。これらのタンパク質の関連性は三次元構造の比較を通じてのみ明白である。
【００３４】
ＨＥＲＧおよびｅａｇ  Ｋ＋チャネルファミリーの他のメンバーは、その細胞質側Ｎ末端にＰＡＳドメインを含んでいる。カブラルら、１９９８年（Ｃａｂｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ｃｅｌｌ  ９５：６４９−６５５）は、ＨＥＲＧのアミノ酸２−１３５を欠くＮ末端短縮型タンパク質（ＨＥＲＧΔ２−１３５）を人為的に作出した。この研究者らは、ＰＡＳドメインの除去によりＨＥＲＧにおける生理学的に重要なゲート制御の推移が変化すること、また短縮型ＨＥＲＧを発現する細胞の細胞質に単離ドメインを添加すると野生型のゲート制御が再構成されることを究明した。要約すると、カブラルら、１９９８年は、ｅａｇドメインがＰＡＳドメインファミリーのメンバーであり、その役割はＫ＋チャネルのゲート制御を修正することである、と結論した。
【００３５】
核酸分子
ＫＣＮＨ２のｃＤＮＡ配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を図３に示し；概略的なドメイン配置を図４に示す。
【００３６】
アイソフォーム３．１のｃＤＮＡ配列（配列番号３）および推定アミノ酸配列（配列番号４）を図３に示し；概略的なドメイン配置を図４に示す。
本発明は、ここでＨＥＲＧΔ２−１０２として定義されるアイソフォーム３．１をコードすることが確認されたポリヌクレオチド配列を含んでなる、単離核酸分子を提供する。ＨＥＲＧΔ２−１０２は、ＨＥＲＧ（配列番号２）のアミノ酸２−１０２を欠き、従ってＰＡＳドメインの大半が欠けているが二次構造要素βＤおよびβＥシートを保持し、配列番号５となっているＮ末端短縮型ポリペプチドであって、いくつかの実施形態では、第１番目のアミノ酸が、ヒトのアイソフォームに特有の６アミノ酸（Ｍ  Ｓ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ａ；配列番号１６）、サルのアイソフォームに特有の６アミノ酸（Ｍ  Ｆ  Ｓ  Ｈ  Ｓ  Ｔ；配列番号１７）、またはその他の生物種のアイソフォームに特有の６アミノ酸で置換されているポリペプチドを意味する。本発明はさらに、アイソフォーム３．１をコードするｍＲＮＡ分子から決定されるヌクレオチド配列を提供し、該ヌクレオチド配列は、アイソフォーム３．１をコードするｃＤＮＡ、例えばアイソフォーム３．１に特有の１．１ｋｂの５’非翻訳領域（配列番号３）を含む。
【００３７】
【化１】
2010524434.tif 000003
用語「単離（される）」とは、物質がその本来の環境（例えば該物質が天然に存在する場合の自然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生命体中に存在する天然の状態の核酸分子またはポリヌクレオチドは単離されていないが、同じ核酸分子またはポリヌクレオチドであっても自然環境において共存する物質のうちの一部または全部から分離されたものは、単離されている。そのような核酸分子はベクターの一部であってもよく、かつ／またはそのようなポリヌクレオチドは組成物の一部であってもよいが、この場合も、そのようなベクターまたは組成物が核酸分子またはポリヌクレオチドの自然環境の一部ではないという点で、該核酸分子またはポリヌクレオチドは単離されている。
【００３８】
核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」とは、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチドの配列を意図し、またＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドについては、対応するリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ）の配列であって、所定のデオキシリボヌクレオチド配列中のチミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）がそれぞれリボヌクレオチドのウリジン（Ｕ）に置き換えられているものを意図している。
【００３９】
配列表に示すヌクレオチド配列のような、本明細書中に提供される情報を使用して、ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子を、標準的なクローニング法およびスクリーニング法、例えば出発物質としてｍＲＮＡを使用するｃＤＮＡクローニング用の手法などを使用して入手することができる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９４を参照されたい。
【００４０】
本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形であってもよいし、例えば、クローニングにより得られたかまたは合成的に生産されたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形であってもよい。ＤＮＡは二本鎖であってもよいし一本鎖であってもよい。一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としても知られるコード鎖であってもよいし、アンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であってもよい。
【００４１】
アイソフォーム３．１をコードする核酸分子に加えて、本発明の単離核酸分子は、上述の配列とは事実上異なる配列を含んでなるが、遺伝子コードの縮重により配列表に示したタンパク質をなおコードするＤＮＡ分子を含む。当然ながら、遺伝子コードおよび種特異的なコドン優先度は当分野においてよく知られている。したがって、当業者であれば、例えば特定の宿主に合わせてコドン発現を最適化する（例えばヒトのｍＲＮＡ中のコドンを大腸菌のような細菌宿主が好むコドンに変更する）ために上述の縮重バリアントを生成させるのは通常の作業である。
【００４２】
本発明は、上記配列のうちの１つに相補的な配列を有する核酸分子をさらに提供する。そのような単離分子（特にＤＮＡ分子）は、染色体を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる遺伝子地図作製、および例えばノーザンブロット解析によるヒト組織中の対応遺伝子の発現検出のための、プローブとして有用である。
【００４３】
本発明はさらに、本明細書中に記載のヌクレオチド配列の一部をコードする核酸分子、ならびに本明細書中に記載の単離核酸分子のフラグメントに関する。単離核酸分子の「フラグメント」とは、診断用プローブおよびプライマーとして有用な、長さが少なくとも約１５ｎｔ、より好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、さらにより一層好ましくは少なくとも約４０ｎｔのフラグメントを意味する。当然ながら、より大きな長さ５０〜５００ｎｔのフラグメントも、アイソフォーム３．１をコードしている全てではないにしてもほとんどの核酸分子に対応するフラグメントとして、本発明において有用である。「長さが少なくとも２０ｎｔ」のフラグメントとは、例えば、アイソフォーム３．１をコードする核酸分子由来の２０個以上連続した塩基を含むフラグメントを意味する。本発明の一部の核酸フラグメントは、アイソフォーム３．１に特有の１．１ｋｂの５’非翻訳領域を含む。
【００４４】
別の態様では、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上述の本発明の核酸分子の一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでなる、単離核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性させた断片化サケ精子ＤＮＡ、を含んでなる溶液中にて４２℃で一晩インキュベートした後に、フィルタを約６５℃の０．１×ＳＳＣで洗浄することを意味する。
【００４５】
ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参照ポリヌクレオチドのうち少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、より好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、さらにより一層好ましくは約３０〜７０（例えば５０）ｎｔ、もしくは５０〜５００ｎｔの長さに、または参照ポリヌクレオチドの全てではないにしてもほとんどに相当するフラグメントにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意味する。
【００４６】
例えば「長さが少なくとも２０ｎｔ」のポリヌクレオチドの一部とは、参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列由来の２０個以上連続したヌクレオチドを意味する。当然ながら、ポリＡ配列（任意のｃＤＮＡ３’末端ポリ（Ａ）域など）、または相補的な一続きのＴ（もしくはＵ）残基にのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイズさせるために用いられる本発明のポリヌクレオチドには含まれない、というのも、そのようなポリヌクレオチドは一続きのポリ（Ａ）またはその相補物を含む全ての核酸分子（例えば事実上全ての二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズしてしまうからである。
【００４７】
本発明の核酸によってさらにコードされるのは、本発明のアミノ酸配列に加えて、付加的な非コード配列、例えば、限定するものではないがイントロンならびに５’および３’非コード配列、例えば転写されるが翻訳されない配列であって、転写、ｍＲＮＡのプロセシング（スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、例えばリボソームへの結合およびｍＲＮＡの安定を含む）に役割を果たす配列；ならびに追加の官能性を提供するアミノ酸のような追加のアミノ酸をコードする付加的なコード配列である。
【００４８】
したがって、ポリペプチドをコードする配列は、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列のような、マーカー配列に融合されてもよい。本発明のこの態様の特定の好ましい実施形態では、マーカーのアミノ酸配列はヘキサヒスチジンペプチド、例えば多くが市販されているが中でもｐＱＥベクター（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州９１３５５、バレンシア、スタンフォードアベニュー２８１５９）に提供されるタグなどである。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４に記載されているように、例えば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の精製を好都合にする。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに相当する、精製に役立つ別のペプチドであり、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８４  Ｃｅｌｌ  ３７：７６７−７７８に記載されている。
【００４９】
バリアントおよび突然変異体のポリヌクレオチド
本発明はさらに、アイソフォームの一部、類縁体または誘導体をコードする、本発明の核酸分子のバリアントに関する。バリアントは、天然の対立遺伝子バリアントのように、自然に生じる場合もある。「対立遺伝子バリアント」とは、生物体の染色体上のある遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態のうちの１つを意味する（Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５））。天然に存在しないバリアントを、当分野で既知の突然変異誘発技術を使用して生産することもできる。
【００５０】
そのようなバリアントには、ヌクレオチドの置換、欠失または付加によって生じたものが含まれる。置換、欠失または付加は、１以上のヌクレオチドが関与するものであってよい。バリアントは、コード領域、非コード領域、または両方のいずれが変化してもよい。コード領域の変化は、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を生じる可能性がある。中でも特に好ましいのは、サイレントな置換、付加および欠失であって、チャネルタンパク質またはその一部の特性および活性を変化させないものである。同様にこの点で特に好ましいのは、保存的置換である。
【００５１】
最も好ましいのは、配列番号５のアミノ酸配列を有するアイソフォーム３．１をコードする核酸分子、および配列番号３を有するｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。さらなる実施形態には、本発明のポリヌクレオチドと少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含んでなる、またはそのようなポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでなる、単離核酸分子が挙げられる。このハイブリダイズするポリヌクレオチドは、Ａ残基のみ、またはＴ残基のみで構成されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドには、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない。本発明のさらなる核酸実施形態は、アイソフォーム３．１に特有の１．１ｋｂの５’非翻訳領域を含むポリヌクレオチドを含んでなる単離核酸分子に関する。
【００５２】
参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、該ポリヌクレオチド配列が参照ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり最大で５個の点突然変異を含む可能性があるという点を除いて、参照配列と同一であることを意味する。言いかえれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中の５％以内のヌクレオチドを欠失させるかまたは別のヌクレオチドで置換してもよいし、参照配列中の全ヌクレオチドの５％以内にあたる数のヌクレオチドを参照配列に挿入してもよい。このような参照配列の突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端の部位に生じてもよいし、これら末端部位の間の任意の場所に生じてもよく、参照配列のヌクレオチドの間に個々に、または参照配列内の１つ以上の連続した基として組み込まれてもよい。
【００５３】
実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば配列番号５のアミノ酸配列を有するアイソフォーム３．１をコードするヌクレオチド配列、および配列番号３のｃＤＮＡのヌクレオチド配列と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）のような既知のコンピュータプログラムを使用して従来どおりに判定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列の間の最も相同性の高いセグメントを見つけるために、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  １９８１  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９の局地的相同性アルゴリズムを使用する。ある特定の配列が本発明の参照配列と例えば９５％同一であるどうかを判断するためにＢｅｓｔｆｉｔまたは他の任意の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然ながら、同一性の割合（％）が参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、かつ参照配列中のヌクレオチド総数の５％以内の相同性ギャップが許容されるように、パラメータを設定する。
【００５４】
ベクター、宿主細胞およびタンパク質生産
本発明は、本発明の単離ＤＮＡ分子を含むベクター、該組換えベクターで遺伝子組換えされた宿主細胞、および組換え技術によるポリペプチドまたはそのフラグメントの生産に関する。ベクターは、例えばファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスのベクターであってよい。レトロウイルスベクターは複製能を有していてもよいし、複製不能であってもよい。後者の場合、一般にウイルスの増殖は補完性を有する宿主細胞においてのみ生じることになる。
【００５５】
ポリヌクレオチドは、宿主内での増殖のための選択可能なマーカーを含むベクターに連結されてもよい。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿のような沈殿物として、または荷電脂質との複合体として導入される。ベクターがウイルスである場合は、適切なパッケージング細胞株を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージングさせてから宿主細胞に形質導入することができる。
【００５６】
ＤＮＡ挿入断片は、適切なプロモータ、いくつか名前を挙げればλファージＰＬプロモータ、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡおよびｔａｃプロモータ、ＳＶ４０の初期および後期プロモータ、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモータなどに作動可能なように連結されなければならない。他の適切なプロモータは当業者には周知であろう。発現構築物は、転写の開始、終結のための部位、および転写される領域には翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含むことになる。構築物によって発現される転写物のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの最初に翻訳開始コドン、および翻訳されるポリペプチドの最後に適切に配置された終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含むことが好ましい。
【００５７】
既述のように、発現ベクターは少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むことが好ましい。そのようなマーカーには、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉還元酵素、Ｇ４１８またはネオマイシン耐性、大腸菌および他の細菌中で培養するためにはテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性の遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、限定するものではないが、細菌細胞、例えば大腸菌、ストレプトマイセス属細菌およびサルモネラ・ティフィムリウムの細胞；真菌細胞、例えば酵母の細胞；昆虫細胞、例えばショウジョウバエＳ２細胞およびスポドプテラＳｆ９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞および２９３細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。上記宿主細胞のための適切な培地および培養条件は、当分野において周知である。
【００５８】
細菌で使用するための入手可能なベクターには、キアゲン社（既述）から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；ストラタジーン・クローニング・システムズ社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）から入手可能なｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；ならびにファルマシアバイオテク社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が挙げられる。適切な真核生物のベクターには、ストラタジーンから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならびにファルマシアから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬが挙げられる。他の適切なベクターは、当業者にはすぐに明らかとなるであろう。
【００５９】
宿主細胞内への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＥＡＥデキストランを用いたトランスフェクション法、カチオン性脂質を用いたトランスフェクション法、エレクトロポレーション、形質導入、感染またはその他の方法によって行うことができる。そのような方法は、多くの標準的実験手引き書、例えばＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）に記載されている。
【００６０】
ポリペプチドは融合タンパク質のような修飾形態で発現されてもよいし、分泌シグナルだけでなく追加の異種由来の機能的領域を含むこともできる。例えば、追加のアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域をポリペプチドのＮ末端に付加して、宿主細胞中、精製中、またはその後の操作時および保管時における安定性および残存率を改善することができる。同様に、ペプチド部分をポリペプチドに付加して精製を容易にすることもできる。そのような領域はポリペプチドの最終的な調製の前に除去することができる。なかでも、安定性を改善し、かつ精製を容易にするために、分泌または排出を生じさせるペプチド部分をポリペプチドに付加することは、当分野でよく知られた日常的な技法である。代表的な融合タンパク質は、タンパク質を安定化および精製するのに有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含んでなる。
【００６１】
本発明のタンパク質は、良く知られた方法、例えば硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィおよびレクチンクロマトグラフィーにより、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィ（「ＨＰＬＣ」）を精製に使用する。本発明のポリペプチドとしては：直接単離されるにせよ培養されるにせよ、天然の供給源、例えば体液、組織および細胞から精製された生成物；化学的合成手法の生成物；ならびに、原核生物または真核生物の宿主、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物の細胞から組換え技術によって生産された生成物が挙げられる。組換え生産手法に使用される宿主によって、本発明のポリペプチドはグリコシル化される場合もあればグリコシル化されない場合もある。さらに、本発明のポリペプチドは、場合によっては宿主を介したプロセスの結果として、１番目に修飾メチオニン残基を含むこともある。このように、一般に翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンが、すべての真核細胞において翻訳後にいかなるタンパク質からも高効率で除去されることは当分野において良く知られている。ほとんどの原核生物においてもほとんどのタンパク質上のＮ末端メチオニンが効率的に除去されるが、一部のタンパク質については、Ｎ末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸の性質に依存して、この原核生物の除去プロセスが無効である。
【００６２】
ポリペプチドおよびフラグメント
本発明は、アイソフォーム３．１核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド、または上記ポリペプチドの一部を含んでなるペプチドもしくはポリペプチドをさらに提供する。最も簡便なレベルでは、アミノ酸配列は市販のペプチド合成機を使用して合成することができる。これは、小さなペプチドおよび大きなポリペプチドのフラグメントを生産するのに特に有用である。そのようなフラグメントは、例えば天然のポリペプチドに対する抗体を生成する際に有用である。
【００６３】
バリアントポリペプチドおよび突然変異ポリペプチド
本発明のポリペプチドの特性を改善または変更するために、タンパク質工学を使用することができる。当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して、単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加を含む新規な突然変異タンパク質すなわち「ミューテイン」または融合タンパク質を作出することができる。そのような修飾ポリペプチドは、例えば、増強された活性を示すこともあれば増大した安定性を示すこともある。さらに、該ポリペプチドが、少なくとも特定の精製条件および保存条件において、対応する天然ポリペプチドよりも高い収率で精製され、より良好な溶解度を示す場合もある。
【００６４】
さらに、当業者には当然のことであるが、タンパク質の構造または機能に対して重要な影響を及ぼさずにポリペプチドのアミノ酸配列をある程度変えることができる。そのような配列の違いについて考える場合、タンパク質上には活性を決定する重要な領域があることを覚えておかなければならない。
【００６５】
したがって、本発明は、実質的な生物学的活性を示すか、または以下に議論する部分のようなタンパク質の領域を含むポリペプチドのバリアントをさらに含む。そのような突然変異体は、活性に対する影響がほとんどないように当分野で既知の原則に従って選択された欠失、挿入、逆位、反復、およびタイプ置換を含む。例えば、表現型上サイレントなアミノ酸置換を行う方法に関する手引きは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０に提供されており、同文献において著者らは、アミノ酸配列の変更に対する寛容性を研究するためには２つの主な手法があることを示している。第１の手法は、突然変異が受容されるかまたは自然淘汰によって拒絶される、進化の過程に依存するものである。第２の手法は、クローニングした遺伝子の特定の部位にアミノ酸の変更を導入するための遺伝子工学と、機能性を維持している配列を同定するための選別または評価とを用いる。
【００６６】
先の文献の著者らが述べているように、これらの研究からタンパク質がアミノ酸置換に驚くほど寛容であることが明らかとなった。著者らはさらに、タンパク質のある特定の部位においてどのアミノ酸変更が許容されそうであるかを示している。例えば、最も内側に埋め込まれるアミノ酸残基には無極性の側鎖が必要であるが、表面にある側鎖の特徴は一般にほとんど保存的ではない。他のそのような表現型上サイレントな置換は、上述のＢｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．の文献および同文献で引用された参照文献に記載されている。保存的置換として一般的に知られているのは、脂肪族アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの中で、あるものを別のものに置換すること；ヒドロキシル残基であるＳｅｒおよびＴｈｒの相互交換、酸性残基であるＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基であるＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基であるＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基であるＰｈｅ、Ｔｙｒの中での置換である。
【００６７】
したがって、本発明のポリペプチドのフラグメント、誘導体または類縁体は、（ｉ）１以上のアミノ酸残基が、保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）で置換されたものであって、かつそのような置換アミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされていてもコードされていなくてもよく、あるいは（ｉｉ）１以上のアミノ酸残基が置換基を含むものであるか、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を延長する化合物（例えばポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合しているものであるか、あるいは（ｉｖ）付加アミノ酸、例えばＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチド、またはリーダー配列もしくは分泌配列、または上記形態のポリペプチドもしくは前駆タンパク質配列の精製のために使用される配列が、上記形態のポリペプチドに融合されたもの、であってよい。そのようなフラグメント、誘導体または類縁体は、本明細書中の教示から当業者の能力範囲内にあると考えられる。
【００６８】
したがって、本発明のポリペプチドは、自然突然変異または人為操作のいずれかに由来する１以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を含むことができる。既述のように、変更は、タンパク質のフォールディングや活性に著しい影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換のような、軽微な性質のものであることが好ましい（表１を参照）。
【００６９】
【表１】
2010524434.tif 000004
本発明のタンパク質中の、機能上不可欠なアミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発のような当分野で既知の方法によって同定することができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  １９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）。後者の手法は分子内の残基ごとに単一アラニン突然変異を導入する。次いで、得られた突然変異体分子を、結合特性またはｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏでのチャネル活性のような生物学的活性について試験する。
【００７０】
本発明のポリペプチドは単離形態で提供されることが好ましい。組換え生産型の本発明のポリペプチドは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８  Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０に記載されている一工程方法によって実質的に精製することができる。本発明のポリペプチドは、タンパク質精製の分野において良く知られている方法で、該タンパク質に対して生成された本発明の抗体を使用して、天然供給源または組換え体供給源から精製することもできる。
【００７１】
本発明のさらなるポリペプチドは、上述のポリペプチドに対して少なくとも９０％の類似性、より好ましくは少なくとも９５％の類似性、さらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の類似性を有するポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、アイソフォーム３．１核酸分子によってコードされるポリペプチドと少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％または９５％同一、さらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチドも含み、またそのようなポリペプチドの一部であって少なくとも３０アミノ酸、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有するものも含む。
【００７２】
２つのポリペプチドに関する「類似性（％）」とは、その２つのポリペプチドのアミノ酸配列を、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）および類似性測定用の初期設定を使用して比較することにより得られた類似性スコアを意味する。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列の間の最も類似性の高いセグメントを見つけるために、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  １９８１  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９の局地的相同性アルゴリズムを使用する。
【００７３】
本明細書中に記載のポリペプチドの参照アミノ酸配列と、少なくとも例えば９５％「同一の」アミノ酸配列を有しているポリペプチドとは、該ポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリペプチド配列が本発明のポリペプチドの参照アミノ酸の各１００アミノ酸当たり最大５個のアミノ酸変更を含みうるという点を除いて、参照配列と同一であることを意味する。言いかえれば、参照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列中の５％以内のアミノ酸残基を欠失させるかまたは別のアミノ酸で置換してもよいし、参照配列中の全アミノ酸残基の５％以内にあたる数のアミノ酸を参照配列に挿入してもよい。このような参照配列の変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端のまたはカルボキシ末端部位に生じてもよいし、これら末端部位の間の任意の場所に生じてもよく、参照配列の残基の間に個々に、または参照配列内の１つ以上の連続した基として散在してもよい。
【００７４】
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えばアイソフォーム３．１核酸分子によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）のような既知のコンピュータプログラムを使用して通常どおりに判定することができる。ある特定の配列が本発明の参照配列と例えば９５％同一であるどうかを判断するためにＢｅｓｔｆｉｔまたは他の任意の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然ながら、同一性の割合（％）が参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、かつ参照配列中のアミノ酸残基総数の５％以内の相同性ギャップが許容されるように、パラメータを設定する。
【００７５】
抗体
本明細書で使用されるような「抗体」は、完全な免疫グロブリン分子、ならびにそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖであって、アイソフォーム３．１のエピトープに結合することができるものを含む。典型的には、少なくとも６個、８個、１０個、または１２個の連続したアミノ酸が、エピトープの形成に必要である。しかしながら、連続していないアミノ酸を要するエピトープはそれ以上、例えば少なくとも１５個、２５個、または５０個のアミノ酸を必要とする場合がある。アイソフォーム３．１のエピトープに特異的に結合する抗体を治療に使用することもできるし、免疫化学的アッセイ、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学的アッセイ、免疫沈降、または当分野で既知の他の免疫化学的アッセイにおいて使用することもできる。様々なイムノアッセイを使用して所望の特異性を有する抗体を同定することができる。競合的結合アッセイまたは免疫放射定量アッセイのための多数のプロトコールが当分野において良く知られている。そのようなイムノアッセイは一般に、免疫原と、アイソフォーム３．１免疫原に特異的に結合する抗体との間の複合体形成の測定を伴う。
【００７６】
典型的には、アイソフォーム３．１に特異的に結合する抗体は、免疫化学的アッセイにおいて使用すると他のタンパク質の場合に提供される検出シグナルより少なくとも５倍、１０倍または２０倍高い検出シグナルを呈する。好ましくは、アイソフォーム３．１に特異的に結合する抗体は、免疫化学的アッセイ中の他のタンパク質、特にＫＣＮＨ２は検出せずに、溶液からアイソフォーム３．１を免疫沈殿させることができる。
【００７７】
アイソフォーム３．１を使用してマウス、ラットまたはウサギのような哺乳動物を免疫し、ポリクローナル抗体を生産することもできる。必要であれば、アイソフォーム３．１を、ウシ血清アルブミン、チログロブリン、およびキーホールリンペットヘモシニアンのような担体タンパク質にコンジュゲート化することができる。宿主生物種に応じて、免疫学的応答を増大させるために様々なアジュバントを使用することができる。そのようなアジュバントには、限定するものではないが、フロイントアジュバント、鉱物ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、および界面活性物質（例えばリソレシチン、ｐｌｕｒｏｎｉｃ（Ｒ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシニアンおよびジニトロフェノール）が挙げられる。ヒトで使用されるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）は特に有用である。
【００７８】
アイソフォーム３．１に特異的に結合するモノクローナル抗体は、連続継代性細胞系による培養下での抗体分子の産生をもたらす任意の技法を使用して調製することができる。これらの技法には、限定するものではないが、ハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法が挙げられる。
【００７９】
さらに、「キメラ抗体」を生産するために開発された技法、すなわちマウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に接合して適切な抗原特異性および生物学的活性を備えた分子を得る技法を使用することもできる。モノクローナル抗体およびその他の抗体を「ヒト化」して、該抗体が治療に使用された時に患者が該抗体に対する免疫応答を起こすのを防止することもできる。そのような抗体は、治療に直接使用できるように配列がヒト抗体に非常に類似している場合もあれば、少数の重要な残基の変更が必要な場合もある。げっ歯動物の抗体およびヒトの配列との間の配列の違いは、ヒト配列中の残基と異なる残基を、個々の残基の部位特異的変異誘発によって、または相補性決定領域全体を移植することによって置換することにより、最小限にすることができる。アイソフォーム３．１に特異的に結合する抗体は、部分的に、または完全にヒト化された抗原結合部位を含むことができる。
【００８０】
別例として、一本鎖抗体の生産のために説明された技法を、当分野で既知の方法を用いて、アイソフォーム３．１に特異的に結合する一本鎖抗体を生産するように適合させることもできる。関連する特異性を備えているが別個のイディオタイプ組成を有する抗体を、ランダムなコンビナトリアル免疫グロビン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）ライブラリからチェーン・シャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）によって生成させることもできる。一本鎖抗体は、ハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲのようなＤＮＡ増幅方法を使用して構築することもできる。一本鎖抗体は単一特異性でも二重特異性でもよいし、二価でも四価でもよい。四価で二重特異性の一本鎖抗体の構築について教示されている。一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を、手作業または自動のヌクレオチド合成を使用して構築し、標準的なＤＮＡ組換え方法を用いてクローニングして発現構築物とし、コード配列を発現させるために細胞に導入することができる。別例として、例えば繊維状ファージ技術を使用して一本鎖抗体を直接生産することもできる。
【００８１】
さらに、アイソフォーム３．１に特異的に結合する抗体を、リンパ球集団におけるｉｎ  ｖｉｖｏ産生を誘発することにより、または免疫グロブリンライブラリもしくは特異性の高い結合試薬のパネルをスクリーニングすることにより、生産することもできる。他のタイプの抗体を構築して本発明の方法で治療的に使用することもできる。免疫グロブリンに由来し、多価で多重特異性を有する結合タンパク質、例えば国際公開公報第９４／１３８０４号パンフレットに記載されている「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」を調製することもできる。
【００８２】
本発明の抗体は当分野において良く知られた方法によって精製することができる。例えば、抗体を、アイソフォーム３．１が結合しているカラムを通すことによりアフィニティ精製することができる。その後、結合した抗体を、高塩濃度のバッファーを使用してカラムから溶出させることが可能である。
【００８３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列である。細胞内に導入されると、この相補的ヌクレオチドは、細胞によって産生された天然の配列と結合して複合体を形成し、転写または翻訳のいずれかを阻止する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは長さが少なくとも１１ヌクレオチドであることが好ましいが、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０ヌクレオチド、またはそれ以上の長さであってもよい。さらに長い配列を使用することもできる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子をＤＮＡ構築物中に含めて提供し、上述のようにして細胞内に導入し、該細胞におけるアイソフォーム３．１遺伝子産物のレベルを減少させることができる。
【００８４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または両方の組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドは、手作業または自動合成機によって、１つのヌクレオチドの５’末端を別のヌクレオチドの３’末端にホスホジエステル結合ではないヌクレオチド間結合で共有結合させることにより合成可能であり、前記結合は例えばアルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロアミデート、リン酸エステル、カルバマート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カルボナート、およびリン酸トリエステルである。
【００８５】
アイソフォーム３．１遺伝子発現の修飾は、アイソフォーム３．１遺伝子の制御領域、５’領域、または調節領域と二重鎖を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することにより達成することができる。転写開始部位、例えば開始部位の−１０位〜＋１０位の間に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重らせん」の塩基対形成方法を使用して抑制を達成することもできる。三重らせん対形成は、ポリメラーゼ、転写因子またはシャペロンの結合のために二重らせんが十分な開放状態となる能力の抑制をもたらすので、有用である。三重らせんＤＮＡを使用する治療の進歩については、文献に記載されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、転写物がリボソームに結合するのを防止することによりｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計されてもよい。
【００８６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとアイソフォーム３．１ポリヌクレオチドの相補的配列との間の複合体形成の成功には、正確な相補性は必要ではない。例えば、アイソフォーム３．１ポリヌクレオチドに正確に相補的な、２、３、４、５個またはそれ以上の一続きの連続ヌクレオチドが、隣接するアイソフォーム３．１ヌクレオチドに相補的でない一続きの連続ヌクレオチドによってそれぞれ隔てられているものを含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アイソフォーム３．１ｍＲＮＡを標的とする十分な特異性を提供することができる。好ましくは、一続きの相補的な連続ヌクレオチドはそれぞれ、少なくとも４、５、６、７、８ヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。相補的でない介在配列は、好ましくは１、２、３、または４ヌクレオチドの長さである。当業者であれば、ある特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドとある特定のアイソフォーム３．１ポリヌクレオチド配列との間で許容されるミスマッチの程度を決定するために、アンチセンス−センス対について算出される融点を容易に使用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、アイソフォーム３．１ポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力に影響を与えることなく修飾することができる。これらの修飾はアンチセンス分子の内部にあってもよいし、一方の端部または両端部にあってもよい。例えば、ヌクレオシド間のリン酸結合を、アミノ基と末端のリボースとの間にコレステリル部分または様々な数の炭素系残基を備えたジアミン部分を付加することにより、修飾することができる。修飾塩基および／または修飾糖、例えばリボースの代わりにアラビノース、または３’水酸基もしくは５’リン酸基が置換されている３’、５’置換オリゴヌクレオチドを、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに使用することもできる。これらの修飾オリゴヌクレオチドは、当分野において良く知られた方法によって調製することができる。
【００８７】
リボザイム
リボザイムは触媒活性を備えたＲＮＡ分子である。リボザイムは、当分野で知られているように、ＲＮＡ配列を切断して遺伝子機能を阻害するために使用することができる。リボザイム作用の機構は、相補的な標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的なハイブリダイゼーションと、その後のエンドヌクレアーゼによる切断を要する。例としては、特定のヌクレオチド配列のエンドヌクレアーゼによる切断を特異的かつ効率的に触媒することができる、人工的に設計されたハンマーヘッドモチーフ型リボザイム分子が挙げられる。アイソフォーム３．１ポリヌクレオチドのコード配列を使用して、アイソフォーム３．１ポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡに特異的に結合するリボザイムを生成させることができる。他のＲＮＡ分子を配列特異性の高い方法でトランスに切断することができるリボザイムを設計および構築する方法が開発されており、当分野で報告されている。例えば、リボザイム内に個別の「ハイブリダイゼーション」領域を設計することにより、該リボザイムの切断活性の標的を特定のＲＮＡに定めることができる。該ハイブリダイゼーション領域は、標的ＲＮＡに相補的な配列を含み、従って標的ＲＮＡと特異的にハイブリダイズする。
【００８８】
アイソフォーム３．１ＲＮＡ標的の内部の特定のリボザイム切断部位は、次の配列すなわちＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム切断部位について標的分子を精査することにより同定することができる。同定されたら、該切断部位を含んでいる標的ＲＮＡの領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列について、標的を機能不可能としうる二次構造的特徴に関して評価することができる。アイソフォーム３．１ＲＮＡ標的候補の適合性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの参入可能性を試験することにより評価することもできる。配列番号３で示されるヌクレオチド配列およびその相補物は、適切なハイブリダイゼーション領域の配列の供給源を提供する。より長い相補配列を使用して、標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を高めることもできる。標的ＲＮＡに相補的な領域を介してハイブリダイズするとすぐにリボザイムの触媒領域が標的を切断することができるように、リボザイムのハイブリダイゼーション領域および切断領域を一体的に関連づけることもできる。
【００８９】
リボザイムをＤＮＡ構築物の一部として細胞内に導入することもできる。機械的方法、例えばマイクロインジェクション法、リポソームを介したトランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリン酸カルシウム沈澱を使用して、アイソフォーム３．１の発現を減少させたい細胞の中に、リボザイムを含んだＤＮＡ構築物を導入することができる。別例として、細胞がＤＮＡ構築物を安定して保持することが望ましい場合は、当分野で知られているように、構築物をプラスミド上に供給して別個の要素として維持してもよいし、細胞のゲノム中に組み込んでもよい。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、細胞内におけるリボザイムの転写を制御するために、転写調節要素、例えばプロモータ要素、エンハンサー要素またはＵＡＳ要素、および転写終結シグナルを含むことができる。リボザイムを、リボザイムおよび標的遺伝子の両方が細胞内で誘導された場合に限りｍＲＮＡの破壊が生じるような、追加の調節レベルを提供するように、人工的に設計することもできる。
【００９０】
スクリーニング／スクリーニングアッセイ
調節因子
本明細書において使用される調節因子とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでアイソフォーム３．１の機能的活性に影響を及ぼす化合物を指す。調節因子はアイソフォーム３．１ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストであってよく、発現、翻訳後修飾、チャネルタンパク質との直接的相互作用、または他の手段によってアイソフォーム３．１活性に対して影響を及ぼす化合物であってよい。アイソフォーム３．１のアゴニストは、アイソフォーム３．１に結合した時、アイソフォーム３．１の機能的活性を増大または延長させる分子である。アイソフォーム３．１のアゴニストには、アイソフォーム３．１を活性化する、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子または他の任意の分子が挙げられる。アイソフォーム３．１のアンタゴニストは、アイソフォーム３．１に結合した時、アイソフォーム３．１の機能的活性の量または期間を減少させる分子である。アンタゴニストには、アイソフォーム３．１の活性を減少させる、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、小分子または他の任意の分子が挙げられる。
【００９１】
用語「調整する」とは、本明細書中にあるとおり、アイソフォーム３．１ポリペプチドの活性の変化を指す。例えば、調整により、アイソフォーム３．１の機能的活性、結合特性、またはその他の生物学的、機能的、もしくは免疫学的特性の増大または減少を引き起こすことができる。
【００９２】
本明細書中で使用されるように、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、タンパク質またはペプチドと、アゴニスト、抗体またはアンタゴニストとの間の相互作用を指す。この相互作用は、結合する分子によって認識されるタンパク質の特定の構造（すなわち抗原決定基またはエピトープ）の存在によって変わる。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、遊離の標識されたＡと抗体とを含む反応物中における、エピトープＡを含んでいるポリペプチドの存在、または遊離の標識されていないＡの存在は、抗体に結合する標識されたＡの量を減らすことになる。
【００９３】
本発明は、神経系疾患（例えば統合失調症）の治療に使用することができる化合物を同定する方法（本明細書中では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）を提供する。該方法は、アイソフォーム３．１に結合するか、アイソフォーム３．１の生物学的な機能的活性またはその発現に促進作用または阻害作用を有するかのうち少なくともいずれかである、候補対象または試験対象の化合物または作用薬（例えばペプチド、ペプチドミメティクス、小分子または他の分子）の同定、ならびに、次いでこれらの化合物のうちいずれがｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて神経系疾患（例えば統合失調症）に関する症状または疾病に効果を有するかの判定を伴う。
【００９４】
アイソフォーム３．１に結合するか、または、アイソフォーム３．１の機能的活性もしくは発現に促進作用または阻害作用を有するかのうち少なくともいずれかである、候補対象または試験対象の化合物または作用薬は、細胞表面にアイソフォーム３．１を発現する細胞を使用するアッセイ（細胞系アッセイ）、または単離されたアイソフォーム３．１を用いるアッセイ（無細胞アッセイ）のいずれかにおいて同定される。様々なアッセイにおいて、アイソフォーム３．１の多種多様なバリアント（例えば完全長アイソフォーム３．１、アイソフォーム３．１の生物学的活性を有するフラグメント、またはアイソフォーム３．１の全体もしくは一部を含む融合タンパク質）を使用することができる。さらに、アイソフォーム３．１は、任意の適切な哺乳類生物種に由来するものであってよい（例えばヒトまたはサルのアイソフォーム３．１）。アッセイは、試験化合物または既知のアイソフォーム３．１リガンドのアイソフォーム３．１への結合を直接または間接的に計測することを伴う結合アッセイであってよい。アッセイは、アイソフォーム３．１の活性を直接または間接的に計測することを伴う活性アッセイであってもよい。アッセイは、アイソフォーム３．１ｍＲＮＡまたはアイソフォーム３．１タンパク質の発現を直接または間接的に計測することを伴う発現アッセイであってもよい。様々なスクリーニングアッセイを、神経系疾患（例えば統合失調症）の症状に対する試験化合物の影響を計測することを伴うｉｎ  ｖｉｖｏアッセイと組み合わせてもよい。
【００９５】
一実施形態では、本発明は、膜結合型（細胞表面に発現される形態）のアイソフォーム３．１に結合するか、または該膜結合型アイソフォーム３．１の機能的活性を調整する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。そのようなアッセイは、完全長アイソフォーム３．１、アイソフォーム３．１の生物学的活性を有するフラグメント、またはアイソフォーム３．１の全体もしくは一部を含む融合タンパク質を使用することができる。より詳細に後述するように、試験化合物は任意の適切な手段によって、例えば従来の化合物ライブラリから得ることができる。試験化合物が膜結合型のアイソフォーム３．１に結合する能力の測定は、例えば、試験化合物を放射性同位元素または酵素標識と接続して、アイソフォーム３．１を発現する細胞への試験化合物の結合を、複合体中の標識化合物の検出によって計測可能なようにすることにより、行うことができる。例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで直接または間接的に試験化合物を標識して、放射性放出（ｒａｄｉｏｅｍｍｉｓｓｉｏｎ）の直接計数またはシンチレーション計数によって放射性同位体を検出することができる。あるいは、試験化合物を例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼで酵素標識して、適切な基質の生成物への変換を測定することによって酵素標識を検出することができる。
【００９６】
競合的結合方式では、アッセイは、アイソフォーム３．１を発現している細胞を、検出可能な標識を担持しかつアイソフォーム３．１と結合してアッセイ混合物を形成する既知の化合物と接触させることと、該アッセイ混合物を試験化合物と接触させることと、試験化合物がアイソフォーム３．１を発現している細胞と相互作用する能力を測定することとを含み、試験化合物がアイソフォーム３．１を発現している細胞と相互作用する能力の測定は、試験化合物が既知の化合物よりも優先的にアイソフォーム３．１を発現している細胞に結合する能力を測定することを含む。
【００９７】
別の実施形態では、アッセイは、膜結合型のアイソフォーム３．１（例えば完全長アイソフォーム３．１、アイソフォーム３．１の生物学的活性を有するフラグメント、またはアイソフォーム３．１の全体もしくは一部を含む融合タンパク質）を細胞表面に発現している細胞を試験化合物と接触させることと、試験化合物が膜結合型アイソフォーム３．１の機能的活性を調整（例えば、促進または抑制）する能力を測定することとを含む細胞系アッセイである。試験化合物が膜結合型アイソフォーム３．１の機能的活性を調整する能力の決定は、アイソフォーム３．１の機能的活性を計測するのに適した任意の方法、例えば任意のイオンチャネルまたはその他の起電性の標的タンパク質の活性を計測するのに適した任意の方法（より詳細に後述）によって行うことができる。起電性の標的物の活性は、すべてが所与の標的タンパク質に適しているとは限らないものの、多くの方法で計測することができる。活性の尺度には、イオン濃度の変化、微小生理機能測定条件における変化の計測、電圧の変化の計測または電流の変化の計測がある。
【００９８】
本発明はさらに無細胞アッセイを含んでいる。そのようなアッセイは、ある形態のアイソフォーム３．１（例えば完全長アイソフォーム３．１、アイソフォーム３．１の生物学的活性を有するフラグメント、またはアイソフォーム３．１の全体もしくは一部を含む融合タンパク質）を試験化合物と接触させることと、試験化合物がアイソフォーム３．１に結合する能力を決定することとを含む。上述のように、アイソフォーム３．１への試験化合物の結合は、直接または間接的に測定することができる。一実施形態では、アッセイは、アイソフォーム３．１を、検出可能な標識を担持しかつアイソフォーム３．１と結合してアッセイ混合物を形成する既知の化合物と接触させることと、該アッセイ混合物を試験化合物と接触させることと、試験化合物がアイソフォーム３．１と相互作用する能力を測定することとを含み、試験化合物がアイソフォーム３．１と相互作用する能力の測定は、試験化合物が既知の化合物よりも優先的にアイソフォーム３．１に結合する能力を測定することを含む。
【００９９】
本発明の無細胞アッセイは、膜結合型のアイソフォーム３．１またはその可溶性フラグメントのうちいずれかを使用するのに適している。膜結合型のポリペプチドを含んでなる無細胞アッセイの場合には、膜結合型のポリペプチドが溶液状態に維持されるように可溶化剤を利用することが望ましい場合がある。そのような可溶化剤の例としては、限定するものではないが、非イオン性界面活性剤、例えばｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、トリトン（Ｒ）Ｘ−１００、トリトンＸ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（Ｒ）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３アンモニオ−１−プロパンスルホナートが挙げられる。
【０１００】
本発明の上記アッセイ方法の様々な実施形態では、複合体化したタンパク質を、複合体化していないタンパク質のうち一方または両方から分離し易くするため、ならびにアッセイの自動化に対応するために、アイソフォーム３．１（またはアイソフォーム３．１標的分子）を固定化することが望ましい場合がある。アイソフォーム３．１への試験化合物の結合、または候補化合物の存在下および不在下でのアイソフォーム３．１と標的分子との相互作用は、該反応物を入れるのに適した任意の容器において行うことができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管および微小遠心チューブが含まれる。一実施形態では、タンパク質のうち一方または両方をマトリクスに結合させることを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ））に、またはグルタチオンで誘導体化したマイクロタイタープレートに吸着させることが可能であり、これを次に試験化合物と、または試験化合物および吸着していない標的タンパク質もしくはアイソフォーム３．１のいずれかと組み合わせ、混合物を複合体形成の助けになる条件（例えば塩およびｐＨに関して生理学的な条件）の下でインキュベートする。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄して結合していない構成成分を全て除去し、複合体形成を、例えば上述のようにして直接または間接的に計測する。別例として、複合体をマトリクスから解離させて、標準的技法を使用してアイソフォーム３．１の結合または活性のレベルを測定することもできる。
【０１０１】
マトリクス上にタンパク質を固定化するための他の技法も、本発明のスクリーニングアッセイに使用することができる。例えば、アイソフォーム３．１またはその標的分子のいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチン化された本発明のポリペプチドまたは標的分子を、当分野でよく知られた技法（例えばビオチン化キット、米国イリノイ州ロックフォード所在のピアス・ケミカルズ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジンでコーティングしたプレート（ピアス・ケミカル）のウェルに固定化することができる。別例として、アイソフォーム３．１または標的分子との反応性を有するが本発明のポリペプチドとその標的分子との結合を妨害しない抗体でプレートのウェルを誘導化し、結合していない標的分子または本発明のポリペプチドを、抗体結合によってウェルに捕捉することもできる。そのような複合体を検知する方法には、ＧＳＴで固定化される複合体について上述した方法のほかに、アイソフォーム３．１または標的分子との反応性を有する抗体を用いた複合体の免疫検出、ならびにアイソフォーム３．１または標的分子に結合した酵素活性の検出を利用する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０１０２】
スクリーニングアッセイはさらにアイソフォーム３．１の発現を観察することを伴う場合もある。例えば、アイソフォーム３．１の発現の調節因子は、細胞を候補化合物と接触させて、該細胞におけるアイソフォーム３．１タンパク質またはｍＲＮＡの発現を測定する方法で同定することができる。候補化合物の存在下でのアイソフォーム３．１タンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルを、候補化合物の不在下でのアイソフォーム３．１タンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルと比較する。次いで、この比較に基づいて、候補化合物をアイソフォーム３．１の発現の調節因子として同定することができる。例えば、アイソフォーム３．１タンパク質またはｍＲＮＡタンパク質の発現が、候補化合物の存在下において不在下よりも多い（統計的に有意に多い）場合、その候補化合物はアイソフォーム３．１タンパク質またはｍＲＮＡの発現の促進剤として同定される。あるいは、アイソフォーム３．１タンパク質またはｍＲＮＡの発現が、候補化合物の存在下において不在下よりも少ない（統計的に有意に少ない）場合、その候補化合物はアイソフォーム３．１タンパク質またはｍＲＮＡの発現の阻害剤として同定される。細胞におけるアイソフォーム３．１タンパク質またはｍＲＮＡの発現レベルは、下記に述べる方法によって測定することができる。
【０１０３】
結合アッセイ
結合アッセイについては、試験化合物は、アイソフォーム３．１の調節チャネル部位またはチャネル細孔の近くに結合する可能性を有し、そのため前記調節部位について生理的モジュレータと競合するか、チャネル細孔を閉鎖するか、またはチャネル細孔を解放状態もしくは閉止状態に保持して正常な生物学的活性を妨害、増強、もしくは変調する、小分子であることが好ましい。そのような小分子の例には、限定するものではないが、小ペプチド分子またはペプチド様小分子、ならびに低分子化合物が挙げられる。本発明のポリペプチドに結合する潜在的なリガンドには、限定するものではないが、既知のアイソフォーム３．１イオンチャネルの天然リガンド、およびその類縁体または誘導体が挙げられる。
【０１０４】
結合アッセイにおいて、試験化合物またはアイソフォーム３．１ポリペプチドのいずれかは、検出可能な標識、例えば蛍光標識、放射性同位体標識、化学発光標識、またはホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼもしくはルシフェラーゼのような酵素標識を含むことができる。その後、アイソフォーム３．１ポリペプチドに結合した試験化合物の検出を、例えば、放射性放出（ｒａｄｉｏｅｍｍｉｓｓｉｏｎ）の直接計数により、シンチレーション計数により、または適切な基質の検出可能な生成物への変換の測定により、行うことができる。別例として、アイソフォーム３．１ポリペプチドへの試験化合物の結合を、該反応物のいずれにも標識を施さずに測定することができる。例えば、試験化合物とアイソフォーム３．１ポリペプチドとの結合を検出するためにマイクロフィジオメータ（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）を使用することができる。マイクロフィジオメータ（例えばＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標））は、光アドレス型電位差測定センサ（ＬＡＰＳ）を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を計測する分析機器である。この酸性化速度の変化を、試験化合物とアイソフォームの３．１との間の相互作用の指標として使用することができる。
【０１０５】
試験化合物がアイソフォーム３．１に結合する能力の測定は、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）のような技術を使用して行うこともできる。ＢＩＡは、いずれの反応物も標識せずに、リアルタイムで生体特異的な相互作用を研究するための技術である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））。光学現象である表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化を、生体分子間のリアルタイム反応の指標として使用することができる。
【０１０６】
競合的結合方式では、アッセイは、アイソフォーム３．１と、検出可能な標識を担持し、検出可能な標識に接続され、かつアイソフォーム３．１と結合してアッセイ混合物を形成する既知化合物とを接触させること、該アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、ならびに試験化合物がアイソフォーム３．１と相互作用する能力を測定することを含み、試験化合物がアイソフォーム３．１と相互作用する能力の測定は、試験化合物が既知化合物と比較して優先的にアイソフォーム３．１に結合する能力を測定することからなる。
【０１０７】
本発明のさらに別の態様では、アイソフォーム３．１様のポリペプチドをツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおける「釣り餌（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用し、アイソフォーム３．１と結合または相互作用してアイソフォーム３．１の活性を調整する他のタンパク質を同定することができる。
【０１０８】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとで構成される、ほとんどの転写因子のモジュール式性質に基づいている。簡潔に述べれば、該アッセイは２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。例えば、一方の構築物では、アイソフォーム３．１をコードするポリヌクレオチドを、既知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合させることができる。他方の構築物では、未同定のタンパク質（「獲物（ｐｒｅｙ）」または「試料」）をコードするＤＮＡ塩基配列を、前記の既知の転写因子の活性化ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合させることができる。「釣り餌」タンパク質および「獲物」タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで相互作用してタンパク質依存性の複合体を形成することができる場合、転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは非常に接近することになる。この接近により、該転写因子に応答性を有する転写調節部位に作動可能なように連結されたレポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的な転写因子を含む細胞コロニーを単離して、アイソフォーム３．１と相互作用するタンパク質をコードするＤＮＡ塩基配列を得るために使用することができる。
【０１０９】
アイソフォーム３．１（もしくはポリヌクレオチド）または試験化合物のいずれかを固定化して、結合物を反応物のうち一方または両方の非結合物から分離するのを容易にするとともに、アッセイの自動化に対応することが望ましい場合もある。したがって、アイソフォーム３．１様ポリペプチド（もしくはポリヌクレオチド）または試験化合物のいずれかを固体担体に結合させることができる。適切な固体担体には、限定するものではないが、ガラスまたはプラスチックのスライド、組織培養プレート、マイクロタイターウェル、チューブ、シリコンチップ、またはビーズのような粒子（例えば、限定するものではないがラテックス、ポリスチレンまたはガラスのビーズ）が挙げられる。当分野で既知の任意の方法を用いて、アイソフォーム３．１様ポリペプチド（もしくはポリヌクレオチド）または試験化合物を固体担体に取り付けることができるが、該方法は例えば共有結合および非共有結合、受動的吸着、またはポリペプチド（もしくはポリヌクレオチド）もしくは試験化合物と固体担体とにそれぞれ取り付けられた結合部分の対を使用することを含む。試験化合物は、個々の試験化合物の位置を追跡可能なように、アレイ状の固体担体に結合させることが好ましい。アイソフォーム３．１（またはアイソフォーム３．１をコードするポリヌクレオチド）への試験化合物の結合は、該反応物を入れるのに適した任意の容器の中で行うことができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管および微小遠心チューブが挙げられる。
【０１１０】
一実施形態では、アイソフォーム３．１は、アイソフォーム３．１の固体担体との結合を可能にするドメインを含んでなる融合タンパク質である。例えば、グルタチオン−Ｓ−転移酵素融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（シグマ・ケミカル、米国ミズーリ州セントルイス所在）またはグルタチオンで誘導体化したマイクロタイタープレートに吸着させて、その後、試験化合物または試験化合物および吸着されていないアイソフォーム３．１と混合し；次いで該混合物を、複合体形成を促す条件の下で（例えば塩およびｐＨ値に関して生理学的条件で）インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄して、全ての結合していない構成要素を除去する。上述のようにして、反応物の結合を直接または間接的に測定することができる。別例として、複合体を固体担体から解離させてから結合を測定することもできる。
【０１１１】
タンパク質またはポリヌクレオチドを固体支持上に固定化するその他の技法を本発明のスクリーニングアッセイに使用することもできる。例えば、アイソフォーム３．１（もしくはアイソフォーム３．１をコードするポリヌクレオチド）または試験化合物のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して固定化することができる。ビオチン化されたアイソフォーム３．１（もしくはビオチン化アイソフォーム３．１をコードするポリヌクレオチド）または試験化合物を、当分野でよく知られた技法（例えばビオチン化キット、米国イリノイ州ロックフォード所在のピアス・ケミカルズ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジンでコーティングしたプレート（ピアス・ケミカル）のウェルに固定化することができる。別例として、アイソフォーム３．１、ポリヌクレオチド、または試験化合物に特異的に結合するが、アイソフォーム３．１の活性部位のような所望の結合部位を妨害しない抗体で、プレートのウェルを誘導化することもできる。結合していない標的またはタンパク質を、抗体結合によってウェルに捕捉することもできる。
【０１１２】
そのような複合体を検出する方法は、ＧＳＴで固定化される複合体について上述した方法の他に、アイソフォーム３．１ポリペプチドまたは試験化合物に特異的に結合する抗体を使用した複合体の免疫検出、アイソフォーム３．１ポリペプチドの活性の検出を利用する酵素結合アッセイ、および非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動法が挙げられる。
【０１１３】
アイソフォーム３．１のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する試験化合物のスクリーニングを、完全な細胞で実施することもできる。アイソフォーム３．１のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む任意の細胞を、細胞アッセイ系に使用することができる。アイソフォーム３．１ポリヌクレオチドは細胞内に生来存在していてもよいし、上述のような技法を使用して導入されてもよい。アイソフォーム３．１またはアイソフォーム３．１をコードするポリヌクレオチドへの試験化合物の結合は、上述のようにして測定される。
【０１１４】
機能アッセイ
試験化合物について、アイソフォーム３．１ポリペプチドのアイソフォーム３．１機能活性を増大または減少させる能力に関して試験することができる。例えば、下記の具体的実施例に記載の方法を用いてアイソフォーム３．１の活性を計測することができる。アイソフォーム３．１機能活性を、機能的なイオンチャネル活性を有する完全な細胞を試験化合物と接触させた後で、計測することができる。アイソフォーム３．１活性を少なくとも約１０％、好ましくは約５０％、より好ましくは約７５、９０、または１００％減少させる試験化合物は、アイソフォーム３．１活性を減少させる可能性を有する作用薬として同定される。アイソフォーム３．１活性を少なくとも約１０％、好ましくは約５０％、より好ましくは約７５、９０、または１００％増大させる試験化合物は、アイソフォーム３．１活性を増大させる可能性を有する作用薬として同定される。
【０１１５】
他のスクリーニング手法は、チャネルの活性化によって引き起こされた細胞外ｐＨの変化を計測する系において、アイソフォーム３．１を発現する細胞（例えばトランスフェクトされたＣＨＯ細胞）を使用することを含む。例えば、化合物を、本発明のチャネルポリペプチドを発現する細胞と接触させて、二次伝達物質の応答（例えばシグナル伝達またはｐＨの変化）を計測してその候補化合物がチャネルを活性化または抑制するかどうか判断することができる。その他のそのようなスクリーニング手法は、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞にアイソフォーム３．１をコードするＲＮＡまたはＤＮＡを導入してチャネルを一時的に発現させることを伴う。その後、この受容卵母細胞をチャネルのリガンドと接触させるか、または他の方法で活性化し、スクリーニングすべき化合物と接触させ、続いて観察される制御シグナルの変調を検出する。他のスクリーニング手法は、チャネルの活性化によって引き起こされた電圧変化を計測する系において、アイソフォーム３．１を発現する細胞（例えばトランスフェクトされたＣＨＯ細胞）を使用することを含む。例えば、化合物を、本発明のチャネルポリペプチドを発現する細胞と接触させて、電圧変化を計測してその候補化合物がチャネルを活性化または抑制するかどうか判断することができる。
【０１１６】
別のスクリーニング手法は、チャネルがホスホリパーゼＣまたはＤに関連している細胞においてアイソフォーム３．１を発現させることを伴う。そのような細胞には、内皮細胞、平滑筋細胞、胚性腎臓細胞などがある。ホスホリパーゼ活性の変化からチャネルの活性化の程度を定量化することにより、上述のようにスクリーニングを行うことが可能である。
【０１１７】
遺伝子発現
別の実施形態では、アイソフォーム３．１の遺伝子発現を増大または減少させる試験化合物が同定される。本明細書中で使用されるように、用語「ポリヌクレオチドの発現に関連する」とは、ノーザン分析またはリアルタイムＰＣＲによる、アイソフォーム３．１をコードする核酸配列と同一であるかまたは該核酸配列に関連を有する核酸の存在の検出が、試料中のアイソフォーム３．１をコードする核酸の存在を示し、かつその結果としてアイソフォーム３．１をコードするポリヌクレオチド由来の転写物の発現に関連していることを示す。用語「マイクロアレイ」とは、本明細書中で使用されるように、基材、例えば紙、ナイロンメンブレンもしくは他の任意の種類のメンブレン、フィルタ、チップ、スライドガラス、または他の適切な固体支持体の上にアレイ化された一連の別個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指す。アイソフォーム３．１ポリヌクレオチドを試験化合物と接触させて、アイソフォーム３．１ポリヌクレオチドのＲＮＡまたはポリペプチド生成物の発現を測定する。試験化合物の存在下における適切なｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現のレベルを、試験化合物の不在下におけるｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現のレベルと比較する。その後、この比較に基づいて試験化合物を発現の調節因子として同定することができる。例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、試験化合物の存在下において不在下よりも多い場合、その試験化合物はｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現の促進剤または強化剤として同定される。あるいは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、試験化合物の存在下において不在下よりも少ない場合、その試験化合物はｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現の阻害剤として同定される。
【０１１８】
細胞におけるアイソフォーム３．１のｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを検出するための、当分野において良く知られた方法によって測定することができる。定性的方法または定量的方法のいずれを使用することもできる。アイソフォーム３．１ポリヌクレオチドのポリペプチド生成物の存在は、例えば、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、および免疫組織化学的方法のような免疫化学的方法を含む当分野で既知の様々な技法を使用して測定することができる。別例として、標識アミノ酸のアイソフォーム３．１への取り込みを検出することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで、細胞培養物中で、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの翻訳系において、ポリペプチドの合成を測定することもできる。
【０１１９】
そのようなスクリーニングは、無細胞のアッセイ系または完全な細胞のいずれで行うこともできる。アイソフォーム３．１ポリヌクレオチドを発現する任意の細胞を、細胞系アッセイ系で使用することができる。アイソフォーム３．１ポリヌクレオチドは細胞中に生来存在していてもよいし、上述のような技法を使用して導入されてもよい。初代培養物または樹立細胞系のいずれを使用することも可能である。
【０１２０】
試験化合物
本発明のスクリーニングアッセイで使用するのに適した試験化合物は、任意の適切な供給源、例えば従来の化合物ライブラリから得ることができる。試験化合物は、当分野で既知のコンビナトリアルライブラリ法における多数の手法、すなわち：生物学的ライブラリ；空間的に位置指定可能な並列の固相または液相ライブラリ；デコンボリューションを要する合成ライブラリ法；「１ビーズ１化合物」ライブラリ法；および親和性クロマトグラフィ選別を使用する合成ライブラリ法のうち任意の手法を用いて得ることができる。生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の４つの手法はペプチド、非ペプチドのオリゴマーまたは小分子の化合物ライブラリに適用可能である。分子ライブラリの合成方法の例は当分野に見出すことができる。化合物ライブラリは、溶液として提供されてもよいし、ビーズ、細菌、胞子、プラスミドまたはファージ上に提示されてもよい。
【０１２１】
調節因子のモデリング
コンピュータモデリングおよび検索技術により、アイソフォーム３．１の発現または活性を調整することができる化合物の同定、または既に同定済みの化合物の改良が可能である。そのような化合物または組成物を同定済みであれば、活性部位または活性領域を同定する。そのような活性部位は、典型的には、リガンドのアイソフォーム３．１との相互作用ドメインのような、リガンド結合部位が考えられる。活性部位は、当分野で既知の方法を用いて、例えば、ペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、または適切な化合物もしくは組成物の天然リガンドとの複合体に関する研究から、同定することができる。後者の場合、化学的方法またはＸ線結晶学的方法を用いて、該因子上のどこに複合体化したリガンドが見られるかを知ることにより、活性部位を見出すことができる。
【０１２２】
次に、活性部位の三次元の幾何学的構造を決定する。これは、完全な分子構造を決定することが可能な、Ｘ線結晶解析を含む既知の方法によって行うことができる。他方、特定の分子内距離を測定するために固相または液相のＮＭＲを使用することができる。構造決定のための他の任意の実験法も、部分的または完全な幾何学的構造を得るために使用することができる。幾何学的構造は、天然または人工の複合体化したリガンドとともに計測することが可能であり、このことにより測定される活性部位の構造の正確さが増大する可能性がある。
【０１２３】
不完全な、または正確さが不十分な構造が測定された場合、コンピュータを用いる多数のモデリング方法を使用して、構造を完成させるかまたはその正確さを改善することができる。任意の広く認められたモデリング方法、例えばタンパク質または核酸のような特定の生体高分子に特化したパラメータ化モデル、分子運動の計算に基づいた分子動力学モデル、熱の集合に基づいた統計力学モデル、またはモデルの組み合わせを使用することもできる。
【０１２４】
ほとんどのタイプのモデルについては、構成する原子および基の間の力を表す標準的な分子力場が必要であり、物理化学における既知の力場から選択することができる。不完全な、またはあまり正確でない実験上の構造は、これらのモデリング方法によって計算される完全かつより正確な構造に対する制約としての役割を果たすことができる。
【０１２５】
最終的に、実験、モデリング、または組み合わせのいずれかによって活性部位の構造を決定したら、化合物をその分子構造についての情報と共に含んでいるデータベースを検索することにより、候補となる調整化合物を同定することができる。そのような検索により、測定した活性部位構造と合致し、かつ活性部位を規定する基と相互作用する構造を有する化合物を捜し出す。そのような検索は手作業でもよいが、コンピュータを利用することが好ましい。この検索から見出された化合物は、アイソフォーム３．１を調整する可能性を有する化合物である。
【０１２６】
別例として、これらの方法を使用して、調整作用を有する既知の化合物またはリガンドから改善された調整作用を有する化合物を同定することもできる。既知化合物の組成を修飾し、修飾の構造上の影響を、新しい組成に適用した上述の実験的方法およびコンピュータモデリング方法を使用して、測定することができる。その後、変更した構造を該化合物の活性部位の構造と比較して、適合度または相互作用の改善が得られるかどうかを判断する。このように、側鎖基を変えることなどによって組成を体系的に変化させたものを迅速に評価して、特異性または活性が改善された調整作用を有する化合物またはリガンドの修飾物を得ることができる。
【０１２７】
適用
本発明は、神経系疾患（例えば統合失調症）の予防方法および治療方法の両方を提供する。
【０１２８】
本発明の調節方法は、細胞を、１以上のアイソフォーム３．１活性を調整する作用薬と接触させることを伴う。活性を調整する作用薬は、本明細書中に記載のような作用薬、例えば核酸もしくはタンパク質、該ポリペプチドの天然に存在する同種リガンド、ペプチド、ペプチドミメティック、または任意の小分子であってよい。一実施形態では、作用薬は、アイソフォーム３．１の１以上の生物学的活性を促進する。別の実施形態では、作用薬は、アイソフォーム３．１の１以上の生物学的活性を抑制する。そのため、本発明は、アイソフォーム３．１またはアイソフォーム３．１シグナル経路内のタンパク質の望ましくない発現または活性を特徴とする疾病または障害に罹患した個体を治療する方法を提供する。一実施形態では、該方法は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定されたかもしくは同定可能な任意の作用薬のような作用薬、または、アイソフォーム３．１もしくはアイソフォーム３．１シグナル経路内の任意のタンパク質の発現もしくは活性をアップレギュレートもしくはダウンレギュレートすることができる作用薬の組み合わせを、投与することを伴う。別の実施形態では、該方法は、アイソフォーム３．１もしくはアイソフォーム３．１シグナル経路内のタンパク質の、発現もしくは活性の上昇または望ましくない高発現もしくは高活性、あるいは発現もしくは活性の低下または望ましくない低発現もしくは低活性を補う療法として、アイソフォーム３．１の調節因子を投与することを伴う。
【０１２９】
アイソフォーム３．１の活性または発現の促進は、活性または発現が異常に低く、かつ活性の上昇が有益な効果を有すると思われる状況において望ましい。反対に、アイソフォーム３．１の活性または発現の抑制は、アイソフォーム３．１の活性または発現が異常に高く、かつアイソフォーム３．１の活性を低下させることが有益な効果を有すると思われる状況において望ましい。
【０１３０】
医薬組成物
本発明はさらに、上記スクリーニングアッセイによって同定される新規な作用薬および本明細書に記載の治療のための該作用薬の使用に関する。
【０１３１】
本発明の活性作用薬（本明細書中では「活性化合物」とも呼ばれる）は、投与に適した医薬組成物に組み入れることができる。そのような組成物は典型的には活性作用薬と薬学的に許容可能な担体とを含んでなる。本明細書中で使用されるように、用語「薬学的に許容可能な担体」は、医薬としての投与が可能である、任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図されている。薬学的活性を有する物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当分野において良く知られている。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と混合不可能でない限りは、組成物におけるその使用が企図される。補足的な活性化合物も組成物中に組み入れることができる。
【０１３２】
本発明は、アイソフォーム３．１の発現または活性の調節因子（またはアイソフォーム３．１シグナル経路内のタンパク質の活性もしくは発現の調節因子のうち少なくともいずれか）を含んでなる医薬組成物、ならびに、１以上のそのような調節因子および薬学的に許容可能な担体を組み合わせることによりそのような組成物を調製する方法を含む。本発明にはさらに、本発明のスクリーニングアッセイを使用して同定された調節因子を使用説明書とともにパッケージ化して含む医薬組成物も含まれる。該説明書は、アイソフォーム３．１活性のアンタゴニストである調節因子、またはアイソフォーム３．１発現を低下させる調節因子については、神経系疾患（例えば統合失調症）の治療のための該医薬組成物の使用を指示することになろう。アイソフォーム３．１活性のアゴニストであるかまたはアイソフォーム３．１発現を上昇させる調節因子については、説明書は、他の神経系疾患の治療のための該医薬組成物の使用を指示することになろう。
【０１３３】
アイソフォーム３．１のアンタゴニストは当分野で一般に知られた方法を用いて生成させることができる。特に、精製されたアイソフォーム３．１を使用して、抗体の生産、またはアイソフォーム３．１に特異的に結合する医薬品を同定するための医薬品ライブラリのスクリーニングを行うことができる。アイソフォーム３．１に対する抗体を、当分野において良く知られた方法を用いて生成させることもできる。そのような抗体には、限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリによって生産されるフラグメントが挙げられる。
【０１３４】
本発明の別の実施形態では、アイソフォーム３．１をコードするポリヌクレオチド、またはその任意のフラグメントもしくは相補体を、治療目的に使用することができる。１つの態様では、アイソフォーム３．１をコードするポリヌクレオチドの相補体を、ｍＲＮＡの転写を阻止することが望ましいと思われる状況において使用することができる。特に、アイソフォーム３．１をコードするポリヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形質転換することができる。したがって、相補的な分子またはフラグメントは、アイソフォーム３．１活性を調整するか、または遺伝子機能の調節を行うために使用することができる。そのような技術は現在では当分野において良く知られており、センスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはより大きなフラグメントを、アイソフォーム３．１をコードする配列のコード領域または制御領域に沿った様々な位置から設計することができる。
【０１３５】
レンチウイルス由来の発現ベクターを、対象とする器官、組織または細胞集団にヌクレオチド配列を送達するために使用することができる。当業者に良く知られた方法を使用して、アイソフォーム３．１をコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を発現するベクターを構築することができる。これらの技法については、例えば科学文献に記載されている。
【０１３６】
上述の治療方法のうち任意の方法を、そのような治療法を必要としている任意の対象者（好ましくはヒトを含む）に適用することができる。
本発明のさらなる実施形態は、上記に議論された任意の治療効果のための、アイソフォーム３．１を薬学的に許容可能な担体と併せて含有する医薬組成物の投与に関する。そのような医薬組成物は、アイソフォーム３．１、アイソフォーム３．１の抗体、およびアイソフォーム３．１のミメティック、アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤を構成することができる。該組成物は、単独で、または、安定化化合物のような少なくとも１つの他の作用薬であって、無菌の生物学的適合性を有する製薬担体、例えば、限定するものではないが生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水に含めて投与可能な作用薬と組み合わせて、投与することができる。該組成物は、単独で、または他の作用薬、医薬品もしくはホルモンと組み合わせて、患者に投与することができる。
【０１３７】
本発明の医薬組成物は、該組成物の意図された投与経路と両立可能なように製剤化される。投与経路の例には、腸管外投与、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮的（局所的）、経粘膜、および直腸内投与が挙げられる。腸管外、皮内、または皮下投与に使用される溶液または懸濁液は、下記成分すなわち：無菌の希釈剤、例えば注射用蒸留水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えばアセテート、シトラートまたはホスファート、および張度の調節のための物質、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース、を含むことができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調節することができる。腸管外投与用の調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブル注射筒または複数回投与用バイアルに入れることができる。
【０１３８】
注射可能な使用法に適した医薬組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液を即時調製するための無菌の散剤が挙げられる。静脈内投与については、適切な担体として生理食塩水、静菌水（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ  ｗａｔｅｒ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合にも、組成物は無菌でなければならず、容易にシリンジ操作が可能である（ｅａｓｙ  ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）程度の流動性がなければならない。組成物は製造条件および保存条件の下で安定でなければならず、細菌や真菌のような微生物の汚染を受けないように保存しなければならない。担体は、溶媒または分散媒であって、例えば水、エタノール、薬学的に許容可能な多価アルコールであってグリセロール、プロピレングリコール、液体のポリエチレングリコールのようなもの、およびこれらの適切な混合物を含有するものであってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用により、分散物の場合は必要な粒子径の維持により、また界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の活動の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖質、マンニトールのような多価アルコール、ソルビトールおよび塩化ナトリウムを組成物中に含めることが望ましいであろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用薬、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることにより実現することができる。無菌の注射可能な溶液は、上記に列挙した成分のうち１つまたは該成分の組み合わせを含んだ適切な溶媒中に、必要な量の活性化合物を組み入れ、その後必要に応じてろ過滅菌を行うことにより、調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒と、必要なその他の成分であって上記に列挙した成分由来ものとを含有する無菌のビヒクルに、活性化合物を組み入れることにより調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の散剤の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、該方法は、有効成分と任意の所望の追加成分との粉末を、予めろ過滅菌した前記成分の溶液から生産する。
【０１３９】
経口組成物は一般に不活性の希釈剤または食用の担体を含んでいる。該組成物をゼラチンカプセル剤に封入してもよいし、圧縮して錠剤としてもよい。治療的な経口投与の目的で、活性化合物を賦形剤と組み合わせて、錠剤、トローチ、またはカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物を、口内洗浄液として使用するために流動性担体を使用して調製することも可能であり、この場合は流動性担体中の化合物は経口的に施用され、口内をすすぎ、吐出または嚥下される。
【０１４０】
薬学的に混合可能な結合剤、かつ／または補助材料を、組成物の一部として含めることもできる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分すなわち：結合剤、例えば微結晶性セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ（Ｒ）、もしくはトウモロコシデンプン；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはステロート（ｓｔｅｒｏｔｅ）；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えばスクロースもしくはサッカリン；または着香料、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料、のうちのいずれか、または同様の性質の化合物を含むことができる。
【０１４１】
吸入による投与については、化合物を、エアゾルスプレーの形態で、適切な噴射剤（例えば二酸化炭素のような気体）の入った加圧容器もしくはディスペンサ、または噴霧器から送達する。
【０１４２】
経粘膜または経皮的な手段による全身投与も可能である。経粘膜投与または経皮投与については、浸透すべき障壁に適した浸透剤を製剤中に使用する。そのような浸透剤は当分野において一般に知られており、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻内噴霧または坐剤の使用を通じて実現することができる。経皮投与については、活性化合物を、当分野において一般に知られているような軟膏剤、軟膏、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤化する。
【０１４３】
化合物を、直腸送達のために、（例えばココアバターおよびその他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を用いた）坐剤または停留浣腸剤の形態に調製することもできる。
一実施形態では、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、身体からの急速な消失に対して化合物を保護する担体を用いて調製される。生物分解性の生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することもできる。
【０１４４】
投与のしやすさおよび用量の均一性のために投与単位形態の経口または非経口組成物を製剤化すると特に有利である。本明細書中で使用されるような投与単位形態とは、治療を受ける対象者についての単位となる用量として適した物理的に個別の単位を指し、それぞれの単位は、所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を、必要な製薬担体を伴って含有している。本発明の投与単位形態についての規格は、活性化合物の固有の特性および達成すべき特定の治療効果、ならびにそのような活性化合物を個体の治療のために配合する技術に内在する制限によって決まり、かつこれらに直接的に左右される。
【０１４５】
医薬組成物は、投与の説明書と一緒に包装容器、パックまたはディスペンサの中に入れることができる。アイソフォーム３．１活性のアンタゴニスト、アイソフォーム３．１の発現もしくは活性を低減する化合物、またはアイソフォーム３．１シグナル経路内のタンパク質の発現もしくは活性を低減する化合物、またはこれらの任意の組み合わせを含む医薬組成物については、投与の説明書は、神経系疾患（例えば統合失調症）のための組成物の使用を指示することになろう。アイソフォーム３．１活性のアゴニスト、アイソフォーム３．１の発現を増大させる化合物、またはアイソフォーム３．１シグナル経路内のタンパク質の発現もしくは活性を増大させる化合物、またはこれらの任意の組み合わせを含む医薬組成物については、投与の説明書は、他の神経系疾患のための組成物の使用を指示することになろう。
【０１４６】
治療上有効な用量の決定
治療上有効な用量の決定は十分に当業者の能力の範囲内にある。治療上有効な用量とは、治療上有効な用量が存在しない状態において生じるアイソフォーム３．１の活性に比べてアイソフォーム３．１の活性を増大または減少させる有効成分の量を指す。任意の化合物について、治療上有効な用量を、細胞培養アッセイまたは動物モデル（通常は、マウス、ラット、ウサギまたはサル）のいずれかにおいて最初に概算することができる。動物モデルは適切な濃度範囲および投与経路を決定するために使用することもできる。その後、そのような情報を用いてヒトにおける有用な用量および投与経路を決定することができる。
【０１４７】
治療上の有効性および毒性、例えばＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）は、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手法によって決定することができる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きい治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物での研究から得られたデータを使用して、ヒトでの使用のための用量範囲を策定する。そのような組成物に含まれる用量は、毒性をほとんど伴わないかまたは全く伴わない、ＥＤ５０を含む循環血中濃度範囲内にあることが好ましい。用量は、上記の範囲内で、使用される剤形、患者の感受性、および投与経路に依存して変わる。正確な用量は、治療を必要とする対象者に関係する要因に照らして、担当医によって決定されることになる。用量および用法は、十分なレベルの有効成分を提供するように、または所望の結果を維持するように調整される。考慮に入れることができる要因には、疾病状態の重症度、対象者の健康状態、対象者の年齢、体重および性別、食物、投与の時間および頻度、薬物の併用、過敏性反応、ならびに治療法に対する忍容性／応答性が含まれる。長時間作用性の医薬組成物は、その特定の製剤の半減期および消失率に応じて３〜４日ごと、毎週、または２週間に一度投与することができる。
【０１４８】
正常な投与量は、投与経路に応じて、０．１マイクログラム〜１００，０００マイクログラム、最大で約１グラムの総投与量まで様々であってよい。具体的な投与量および送達方法に関する手引きは文献に記載されており、当分野の医師には一般に利用可能である。
【０１４９】
当業者は、ヌクレオチドについてはタンパク質またはその阻害剤とは異なる製剤を使用することになろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は特定の細胞、条件、位置などに特異的なものとなる。その試薬が一本鎖抗体である場合、該抗体をコードするポリヌクレオチドを構築し、十分確立された技術、例えば、限定するものではないが、トランスフェリン−ポリカチオンを仲介したＤＮＡ移入、裸の核酸またはカプセル封入した核酸を用いたトランスフェクション、リポソームを仲介した細胞融合、ＤＮＡでコーティングしたラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」、およびＤＥＡＥまたはリン酸カルシウムを仲介したトランスフェクションを用いて、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで細胞内へ導入することができる。
【０１５０】
発現産物がｍＲＮＡである場合、試薬はアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムであることが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを発現するポリヌクレオチドを、上述のように、様々な方法によって細胞内に導入することができる。好ましくは、試薬は、アイソフォーム３．１遺伝子の発現またはアイソフォーム３．１の活性を、該試薬が存在しない場合に比べて少なくとも約１０％、好ましくは約５０％、より好ましくは約７５、９０または１００％低減する。アイソフォーム３．１遺伝子の発現またはアイソフォーム３．１の活性のレベルを減少させるために選択された機構の有効性は、当分野において良く知られた方法、例えばアイソフォーム３．１に特異的なｍＲＮＡへのヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、アイソフォーム３．１の免疫学的検出、またはアイソフォーム３．１活性の計測を用いて、評価することができる。
【０１５１】
上述の実施形態のいずれにおいても、本発明の医薬組成物のうち任意のものを他の適切な治療薬と組み合わせて投与することができる。併用療法で使用するのに適した作用薬の選択は、従来の薬学上の原則に従って当業者が行うことができる。治療薬の組み合わせは、相乗的に作用して上述の様々な障害の治療または予防を達成する可能性がある。この手法を使用して、それぞれの作用薬をより低用量とし、その結果として有害な副作用の可能性を低減しながら、治療効果を達成することができる場合がある。上述の治療方法のうち任意の方法を、そのような治療法を必要としている任意の対象者、例えばヒトに適用することができる。
【０１５２】
診断法
本発明の一実施形態は、個体が神経精神障害（例えば統合失調症）に罹患する可能性を予測する方法、または神経精神障害（例えば統合失調症）の診断、もしくは神経精神障害（例えば統合失調症）に関連して弱い症状を有する可能性が高いことの診断を支援する方法であって、評価される個体からＤＮＡ試料を得るステップと、存在するヌクレオチドについてＫＣＮＨ２遺伝子の一塩基変異多型（ＳＮＰ）を測定するステップとを含んでなる方法に関する。ＳＮＰに保護的対立遺伝子由来のヌクレオチドが存在することは、その個体が該ＳＮＰにリスク対立遺伝子由来のヌクレオチドを有していた場合よりも、該個体が神経精神障害に罹患する可能性は低いこと、または神経精神障害に関連して弱い症状を有する可能性が高いことを示す。反対に、ＳＮＰにリスク対立遺伝子由来のヌクレオチドが存在することは、その個体が該ＳＮＰに保護的対立遺伝子由来のヌクレオチドを有していた場合よりも、該個体が神経精神障害に罹患する可能性が高いこと、または神経精神障害に関連して強い症状を有する可能性があることを示す。好ましい実施形態では、神経精神障害は統合失調症である。特定の実施形態では、個体は統合失調症を発症するリスクのある個体である。別の実施形態では、個体は、統合失調症に関連した臨床症状を示す。一実施形態では、個体は統合失調症であることが臨床的に診断されている。
【０１５３】
ＳＮＰは、マーカーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１９、Ｍ２０、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｍ２３、Ｍ２４、Ｍ２５、Ｍ２６、Ｍ２７、Ｍ２８、Ｍ２９、Ｍ３０、Ｍ３１、Ｍ３２、Ｍ３３、Ｍ３４、Ｍ３５、Ｍ３６、Ｍ３７、Ｍ３８、Ｍ３９、Ｍ４０、Ｍ４１、Ｍ４２、またはＭ４３から選択される。
【０１５４】
【表２】
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評価すべき遺伝物質は、個体由来の任意の有核細胞から得ることができる。ゲノムＤＮＡのアッセイについては、事実上任意の生体試料（純粋な赤血球以外）が適切である。例えば、好都合な組織試料には全血、精液、唾液、涙液、尿、糞便、汗、皮膚および毛髪が挙げられる。ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのアッセイについては、組織試料は標的とする核酸が発現される器官から入手しなければならない。例えば、中枢神経系由来の細胞（海馬の細胞など）、神経冠由来の細胞、皮膚、心臓、肺および骨格筋が、ＫＣＮＨ２遺伝子のｃＤＮＡを得るのに適切な供給源である。神経冠由来の細胞には、例えば、メラノサイトおよびケラチノサイトが含まれる。
【０１５５】
本明細書中に記載された方法の多くは、標的試料からのＤＮＡの増幅を必要とする。これは、例えばＰＣＲによって遂行することができる。一般には、「ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」ｅｄ．Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２を参照されたい。
【０１５６】
他の適切な増幅方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅法、自家持続配列複製法（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）および核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。後者２つの増幅方法は、等温における転写に基づいた等温反応を伴い、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の両方を、それぞれ約３０または１００対の１の比率の増幅産物として生産する。
【０１５７】
対象とする多型部位を占めるヌクレオチドを、様々な方法で、例えばゲノムＤＮＡのサザン解析；制限酵素消化による直接的突然変異分析；ＲＮＡのノーザン解析；変性高速液体クロマトグラフィ（ＤＨＰＬＣ）；遺伝子の単離および配列決定；対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドと増幅した遺伝子産物とのハイブリダイゼーション；一塩基伸長法（ＳＢＥ）；またはＫＣＮＨ２タンパク質の分析、によって同定することができる。適切な手法の試料採取については以下に順次議論する。
【０１５８】
対立遺伝子特異的プローブ
多型性を分析する対立遺伝子特異的プローブの設計および使用については、例えば、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３−１６６に記載されている。２個体に由来するそれぞれのセグメントに多型的に異なる型が存在するため、一方の個体に由来する標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするが、別の個体に由来する対応するセグメントにはハイブリダイズしない、対立遺伝子特異的プローブを設計することができる。ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間でハイブリダイゼーション強度に有意な差があり、かつ好ましくは本質的に二元性の応答であるためプローブは対立遺伝子のうち一方のみにハイブリダイズするように、十分にストリンジェントでなければならない。ハイブリダイゼーションは通常、ストリンジェントな条件下で、例えば１Ｍ以下の塩濃度および少なくとも２５℃の温度で行なわれる。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）および温度２５〜３０℃の条件、または同等の条件が、対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションに適している。同等の条件は、当分野で知られているように、一例として挙げたパラメータのうち１つ以上を変更し、同時に標的ヌクレオチド配列と使用されるプライマーまたはプローブとの間の同一性または類似性を同程度に維持することにより、決定することができる。
【０１５９】
一部のプローブは、多型性の部位がプローブの中央の位置（例えば１５ｍｅｒでは第７位；１６ｍｅｒでは８位または９位のいずれか）と並ぶように標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするように設計される。このようなプローブの設計により、異なる対立遺伝子型の間のハイブリダイゼーションにおいて良好な識別力が達成される。
【０１６０】
対立遺伝子特異的プローブは、一方のプローブが標的配列の基準型に完全に一致し、他方のプローブがバリアント型に完全に一致するプローブ対として使用されることが多い。ひいては、同じ標的配列内の複数の多型性を同時に分析するために、数対のプローブを同一の支持体上に固定化することができる。
【０１６１】
タイリングアレイ
多型性を、核酸アレイへのハイブリダイゼーションによって同定することも可能であり、核酸アレイのいくつかの例は国際公開公報第９５／１１９９５号パンフレットに記載されている。国際公開公報第９５／１１９９５号パンフレットには、あらかじめ特徴解析された多型のバリアント型の検出用に最適化されたサブアレイについても記載されている。そのようなサブアレイは、第１の基準配列の対立遺伝子性のバリアントである第２の基準配列に相補的になるように設計されたプローブを含んでいる。第２のプローブ群は、該プローブが第２の基準配列に相補性を示すこと以外は同じ原則に従って設計される。第２の群（またはさらなる群）を含めると、プローブの長さと同程度の近距離内に複数の突然変異が生じる（例えば９〜２１塩基の中に２つ以上の突然変異）と予想される第１の基準配列の短いサブ配列を分析するのに特に有用である。
【０１６２】
対立遺伝子特異的プライマー
対立遺伝子特異的プライマーは、標的ＤＮＡ上の多型と重なる部位にハイブリダイズし、該プライマーが完全な相補性を示す対立遺伝子型の増幅のみを促す。Ｇｉｂｂｓ  １９８９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １７：２４２７−２４４８を参照のこと。このプライマーを、離れた部位にハイブリダイズする別のプライマーと共に使用する。増幅は上記２つのプライマーから始まり、特定の対立遺伝子型が存在することを示す検出可能な生成物が得られる。対照は通常、別のプライマー対を用いて実施され、該プライマー対のうちの一方は多型部位において１塩基のミスマッチを示し、他方は離れた部位に完全な相補性を示す。１塩基のミスマッチにより増幅が妨げられ、検出可能な生成物は形成されない。該方法は、多型と並んだオリゴヌクレオチドの最も３’側の部位にミスマッチが含まれている場合に最も良く機能するが、それはこの部位がプライマーからの伸長を最も不安定化するからである。
【０１６３】
直接シークエンス法
本発明の多型の配列の直接的な分析は、ジデオキシチェーンターミネーション法またはマクサム−ギルバート法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）のいずれかを使用して遂行することができる。
【０１６４】
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動
ポリメラーゼ連鎖反応を使用して生成された増幅産物を、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動の使用によって分析することができる。異なる対立遺伝子を、溶液中のＤＮＡの配列依存的な異なる融解特性および電気泳動上の移動度に基づいて同定することができる（Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．１９９２「ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ７）。
【０１６５】
一本鎖高次構造多型分析
標的配列の対立遺伝子は、一本鎖高次構造多型分析を使用して区別することが可能であり、該分析は、Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９８９  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：２７６６−２７７０に記載されているように、一本鎖ＰＣＲ生成物の電気泳動上の移動度の変化によって塩基の違いを識別する。増幅されたＰＣＲ生成物を上述のようにして生成させ、加熱またはその他の方法で変性させて、一本鎖の増幅産物を形成することができる。一本鎖の核酸は、リフォールディングする、すなわち塩基配列に部分的に依存する二次構造を形成する場合がある。一本鎖の増幅産物の異なる電気泳動度は、標的配列の対立遺伝子間の塩基配列の違いと関係する場合がある。
【０１６６】
ＫＣＮＨ２の新規かつ霊長類特異的な脳アイソフォーム：認知、海馬の生物学および統合失調症との関連における役割
組織化されたニューロンの活動は、皮質の情報処理にとって重要であり、統合失調症では混乱している。本発明者らは、ニューロンの発火を制御するカリウムチャネルＫＣＮＨ２の霊長類特異的なアイソフォーム（３．１）を同定した。３ｋｂの上流領域にあるいくつかのＳＮＰは、４つの独立のデータセットにおいて統合失調症に関連づけられる。リスクＳＮＰは、記憶、ＩＱおよび認知処理速度ならびに海馬の構造および生理学に影響を及ぼす。アイソフォーム３．１  ｍＲＮＡのレベルは、前前頭皮質および海馬ではＫＣＮＨ２−１Ａに匹敵するが、心臓では１０００倍以上低い。死後発現分析から、統合失調症の海馬ではＫＣＮＨ２−１Ａに比べてアイソフォーム３．１が２．５倍増大していること、およびリスクＳＮＰとの関連を示す。構造上、アイソフォーム３．１は、緩徐型のチャネル脱活性化に重要なＰＡＳドメインのほとんどを欠いている。げっ歯動物の皮質ニューロンにおける電気生理学的特徴解析から、アイソフォーム３．１の過剰発現の結果として、急速に脱活性化するＫ＋流および高頻度かつ非順応性の発火パターンが生じることを明らかにする。これらの結果は、皮質の生理学、認知、および精神病における新規なＫＣＮＨ２チャネルの予想外の役割を明らかにし、精神治療薬の潜在的な新しい標的を提供するものである。
【０１６７】
序論
本研究において遺伝学的解析、脳画像解析、および行動解析の組み合わせを使用して、本発明者らは４つの独立した臨床試料中に新規な統合失調症感受性遺伝子（ＫＣＮＨ２カリウムチャネル）を同定した。さらに本発明者らは、リスク対立遺伝子を有する正常な個体の試料中に、認知障害ならびにＨＦの構造および機能に関する画像解析上の尺度を含むいくつかの中間的表現型との関連も見出した。ＫＣＮＨ２（ｈＥＲＧ１とも呼ばれる）は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ０４２７０であり、電位依存性カリウムチャネルのエーテルアゴーゴー（ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ）関連ファミリーの一員であって（Ｊ．Ｗ．Ｗａｒｍｋｅ  ａｎｄ  Ｂ．Ｇａｎｅｔｚｋｙ  １９９４  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９１：３４３８）、心筋活動電位の際の膜電位の緩徐な再分極によりＱＴ間隔を調節することにおける役割に関して最もよく知られている（Ｍ．Ｃ．Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｔｒｉｓｔａｎｉ−Ｆｉｒｏｕｚｉ  ２００６  Ｎａｔｕｒｅ  ４４０：４６３）。心筋細胞におけるＫＣＮＨ２の大規模な特徴解析にもかかわらず、驚くべきことに、ニューロンで行なわれた研究はヒトではもちろんヒト以外の霊長類のニューロンにおいてもほとんどない。しかしながら、ＫＣＮＨ２は、海馬および前頭皮質を含む多くの脳領域で豊富に発現される（Ｌ．Ｇｕａｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４９１：１５７；Ｍ．Ｊ．Ｓａｇａｎｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１：４６０９）。その明瞭な生理学的特徴、すなわち緩徐型の活性化、急速型の不活性化、および緩徐型かつ電位依存性の脱活性化（Ｊ．Ｗ．Ｗａｒｍｋｅ  ａｎｄ  Ｂ．Ｇａｎｅｔｚｋｙ  １９９４  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９１：３４３８，Ｍ．Ｃ．Ｔｒｕｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：９２；Ｐ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：８３３；Ｊ．Ｈ．Ｍｏｒａｉｓ  Ｃａｂｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ｃｅｌｌ  ９５：６４９）は、ＫＣＮＨ２を、ＰＦＣおよびＨＦにおけるニューロンの発火パターンならびにネットワーク振動の制御における優れた候補としている。モデリング研究から、ＫＣＮＨ２が、スパイク頻度順応にとって、または脳の興奮性ニューロンで見られる通常の発火パターンである一連の誘発活動電位の段階的な終了にとって重要であることが予測されている（Ｎ．Ｃｈｉｅｓａ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５０１：３１３）。いくつかの研究から示されたのは、ＫＣＮＨ２の抑制により、低頻度で順応性のニューロン発火が、多数の複雑な認知機能を促進する持続的なニューロンの活動に必要な発火パターンである（Ｙ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ９：５３４）、高頻度で非順応性のニューロン発火に変換することである（Ｎ．  Ｃｈｉｅｓａ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５０１：３１３；Ｔ．Ｓａｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  ９０：１８１７）。
【０１６８】
本発明者らが見出したＫＣＮＨ２との臨床的関連性の分子機構を解明するために、本発明者らは死後のヒト脳中のＫＣＮＨ２  ｍＲＮＡの発現を特徴解析した。この特徴解析から、予想外なことに、リスク性配列バリアントの近くに転写開始部位を有する霊長類の脳に特異的な新規アイソフォーム（アイソフォーム３．１）が同定された。注目すべきことに、アイソフォーム３．１の発現は、統合失調症患者の海馬において、さらにＫＣＮＨ２のリスク対立遺伝子を有する正常な個体においても増大する。これらの結果に促されて、本発明者らは、内因性のアイソフォーム３．１を発現しないげっ歯動物の皮質ニューロンに遺伝子を導入した。アイソフォーム３．１の発現によりｈＥＲＧチャネルの脱活性化速度が著しく変化し、その結果として高頻度で非順応性の発火パターンが得られた。スパイク頻度のそのような変化は、統合失調症における皮質機能不全の重大な側面であると考えられる神経細胞群（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）の脱同期化をもたらすとも考えられる（Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒｅｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ２００４  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２７：６８３）。これらの集中的な結果を合わせると、新規なＫＣＮＨ２アイソフォームの役割が統合失調症の病因および病態生理に関係付けられ、該アイソフォームが抗精神病薬療法の有望な新しい標的となる。
【０１６９】
統合失調症に関連するＮＯＳ３／ＫＣＮＨ２領域の同定
統合失調症および他の多くの複雑な病気に関する遺伝的リスクが、大幅なアミノ酸変化および極めて有害なタンパク質突然変異（これらは珍しい型の病気ではやはり生じる場合もある）には関係しないであろうことが次第に明白になってきている（Ｒ．Ｅ．Ｓｔｒａｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ２００６  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ６０：８１）。代わりに、感受性遺伝子の分子レベルの影響のほうが、転写物またはタンパク質の調節およびスプライシングに関して鋭敏である可能性がありそうである。したがって、患者の組織の遺伝子発現プロファイルから、候補リスク遺伝子の同定の手掛かりが得られるかもしれない。上記の可能性の予備的根拠は、ＲＧＳ４（Ｍ．Ｅ．Ｔａｌｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ  Ｂｕｌｌ  ３２：２０３）およびＣＮＰ（Ｔ．Ｒ．Ｐｅｉｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ａｒｃｈ  Ｇｅｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ６３：１８）の統合失調症との関連から生じたものであり、ＲＧＳ４およびＣＮＰは、初めは統合失調症患者の死後の脳における発現プロファイルのマイクロアレイ分析から候補遺伝子として同定された（Ｋ．Ｍｉｒｎｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ６：２９３）。従って、本発明者らは、マイクロアレイで測定すると多くの統合失調症患者で示差的に発現されるとして最近報告された１０個の遺伝子（Ｓ．Ｐｒａｂａｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ９：６８４）を選択し、統合失調症の子孫を有する１７０組のコーカサス人家族のＨａｐＭａｐ（リリース１５）から得られたハプロタイプタギングＳＮＰ（ｈｔＳＮＰ）のジェノタイピングを行った。家族ベースの関連分析（Ｎ．Ｍ．Ｌａｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｇｅｎｅｔ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  １９（Ｓｕｐｐｌ  １）Ｓ３６）を実施すると、名目上は有意なシグナルが１０個の遺伝子のうち５個に観察された（表２）。特に、ＮＯＳ３のゲノム領域（７ｑ３６．１）にあるＳＮＰは、この病気との最も高い連鎖不平衡（ＬＤ）を示した。しかしながら、この領域の陽性のＳＮＰは、ＮＯＳ３の上流の、反対方向に転写される隣接遺伝子ＫＣＮＨ２の中に位置していた（図５；図１１）。比較ゲノムデータベースの調査は、ＮＯＳ３およびＫＣＮＨ２のゲノム上での近接性および方向性が哺乳類生物種において高度に保存されていることを示している。
【０１７０】
図５（上）を参照すると、単一ＳＮＰおよび３−ＳＮＰスライディングウィンドウハプロタイプに関する、ＣＢＤＢシブリングスタディ（Ｓｉｂｌｉｎｇ  Ｓｔｕｄｙ）（ＧＣ、ダイヤ形）、ＮＩＭＨＧＩ−Ｃ（ＧＩ−Ｃ、正方形）、ＮＩＭＨＧＩ−ＡＡ（ＧＩ−ＡＡ、三角形）およびドイツの症例対照研究（Ｇ、円形）についての家族ベースの関連分析結果からのｐ値の逆対数が示されている。ｐ値が０．１未満のマーカーおよびハプロタイプだけが示されている。該領域の物理的地図が提示され、領域内の既知遺伝子を示している。図５（下）を参照すると、３７０人の血縁関係のない健康なコーカサス人対照者についてジェノタイピングされたマーカーのＬＤ構造が示され、Ｄ’として表されている。グラフィックスはｎｉｃｏｄｅｍｕｓｋ＠ｍａｉｌ．ｎｉｈ．ｇｏｖから利用可能なＲパッケージｓｎｐ．ｐｌｏｔｔｅｒ（Ａ．Ｌｕｎａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋ．Ｎｉｃｏｄｅｍｕｓ  ２００７  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３：７７４−７７６）を使用して作出した。
【０１７１】
統合失調症のリスク遺伝子としてのＫＣＮＨ２
ＮＯＳ３およびＫＣＮＨ２の一部を含む、過去の組換えが最小限であることを示すハプロタイプブロック（Ｓ．Ｂ．Ｇａｂｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：２２２５）が、国際ＨａｐＭａｐプロジェクト（Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨａｐＭａｐ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  ２００３  Ｎａｔｕｒｅ  ４２６：７８９）によってジェノタイピングされた西欧人家族の人々に観察された。このハプロタイプブロックは、ＮＯＳ３転写開始部位の１．２Ｋｂ下流（５’ＵＴＲの中）を始点として、この遺伝子の上流２１．３Ｋｂに及ぶ（図１１）。この上流領域の最初の１３．１ｋｂは非コード領域かつ遺伝子間領域であるが、残りの部分はＫＣＮＨ２の６．９Ｋｂと重なり合う。この領域をタギングするのに必要な３個のｈｔＳＮＰ（Ｓ．Ｂ．Ｇａｂｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：２２２５）のうち、ｒｓ１０３６１４５（Ｍ３３）が、ハプロタイプブロック全体（全体的なｐ＝０．００５）と同じように、２９５組のコーカサス人家族のコホート（ＣＢＤＢコホート）において統合失調症患者に過度に伝達（ｏｖｅｒ−ｔｒａｎｓｍｉｔ）された（ｐ＝０．００３２）。
【０１７２】
これらのデータに基づいて、Ｍ３３が、原因ＳＮＰとの強力なＬＤ状態にあるか、または関連シグナルそのものに関与しているかのうち少なくともいずれかであることが期待された。従って、さらなるｄｂＳＮＰを、ＫＣＮＨ２の３’末端からＮＯＳ３の３’末端まで伸びる領域にわたって、Ｍ３３付近に集中した範囲に最も注目してジェノタイピングした。４８人の統合失調症患者についてＭ３３に隣接する７．２ｋｂの領域を再シークエンスし、まれなＳＮＰまたは未報告のＳＮＰを検出した。本発明者らはさらに、ＫＣＮＨ２のエキソン１〜３およびそのイントロンの境界部（合計１０．４ｋｂの配列）についても再シークエンスしたが、コード配列の多型は発見されなかった。１１個の新規なＳＮＰを含む合計４３個のＳＮＰがＣＢＤＢコホートにおいてジェノタイピングされた。６個のＳＮＰは、該ＳＮＰを含んでいる３マーカー・ハプロタイプの多くと同じように、統合失調症と有意に関連していた（５個についてはｐ＜０．０１）（図５；図１２、表３）。上記の有意な関連を有するＳＮＰの大多数は、ＫＣＮＨ２のイントロン２の小さな３ｋｂセグメントに位置する。
【０１７３】
図１２を参照すると、単一マーカーおよび３マーカーのスライディングウィンドウ解析の結果が、ＣＢＤＢ、ＮＩＭＨＧＩ−Ｃ、ＮＩＭＨＧＩ−ＡＡ、およびＲＵコホートについて示されている。新規と表示されたＳＮＰは、４８人の統合失調症患者由来のＤＮＡを再シークエンスすることによって同定された（実施例１を参照）。図１２Ａは、ＦＢＡＴによるＣＢＤＢ家族試料における３マーカーのスライディングウィンドウ解析を示す（ＣＢＤＢシブリングスタディ  ３−ＳＮＰスライディングウィンドウハプロタイプ結果（２９６組の家族）。図１２Ｂは、ＦＢＡＴによるＮＩＭＨ−Ｃ家族試料における３マーカーのスライディングウィンドウ解析を示す（ＮＩＭＨＧＩ−Ｃ  ３−ＳＮＰスライディングウィンドウハプロタイプ結果（７１組の家族）。図１２Ｃは、ＦＢＡＴによるＮＩＭＨ−ＡＡ家族試料における３マーカーのスライディングウィンドウ解析を示す（ＮＩＭＨＧＩ−ＡＡ  ＳＮＰスライディングウィンドウハプロタイプ結果（５１組の家族）。図１２Ｄは、Ｈａｐｌｏ．ｓｔａｔによるドイツの症例対照試料における３マーカーのスライディングウィンドウ解析を示す（ドイツ  症例対照３−ＳＮＰスライディングウィンドウハプロタイプ結果）。
【０１７４】
その後、これらのマーカーのうちの４０個について、ＮＩＭＨジェネティクス・イニチアシブ・プロジェクト（ＮＩＭＨ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  ｐｒｏｊｅｃｔ）（Ｃ．Ｒ．Ｃｌｏｎｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ８１：２７５）に由来する、７１組のコーカサス人家族（ＮＩＭＨＧＩ−Ｃ）および５１組のアフリカ系アメリカ人家族（ＮＩＭＨＧＩ−ＡＡ）から構成される２つの追加の家族ベースのコホートにおいてジェノタイピングした。家族の数が少ないため検出力は実質的に制限されるが、同じ小さな領域内のＳＮＰおよび／またはハプロタイプは、いずれのデータセットにおいても統合失調症に有意に関連していた（図５；図１２、表３）。特に、３つの集団すべてにおいて関連シグナルはＫＣＮＨ２のイントロン２に局在していたが、いくつかの他の推定上の統合失調症遺伝子で見られたように（Ｒ．Ｅ．Ｓｔｒａｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ２００６  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ６０：８１）、有意に関連したＳＮＰはすべてのコホートにおいて同一ではなかった。しかしながら、Ｍ９およびＭ１０にＡ−Ｇ、Ｍ２１およびＭ２２にＣ−Ｇを含んでいる２つの共通の重なり合うハプロタイプは、両方のコーカサス人家族のデータセットにおいてリスクに関係していた：ＮＩＭＨＧＩ−Ｃ（Ｍ９−Ｍ１０  全体的ｐ＝０．０７９、ハプロタイプｐ＝０．０７６；Ｍ２１−Ｍ２２  全体的ｐ＝０．０９２、ハプロタイプｐ＝０．０８２）およびＣＤＢＤ（Ｍ９−Ｍ１０  全体的ｐ＝０．０４８、ハプロタイプｐ＝０．０８３；Ｍ２１−Ｍ２２  全体的ｐ＝０．０９８、ハプロタイプｐ＝０．１０）。さらに、単一ＳＮＰ分析と一致して、Ｍ３０の主要対立遺伝子Ｇを含むハプロタイプは、ＣＢＤＢ試料（全体的ｐ＝０．０２３、ハプロタイプｐ＝０．０１）およびＮＩＭＨＧＩ−Ｃ（全体的ｐ＝０．１０、ハプロタイプｐ＝０．０２８）のいずれにおいても統合失調症と陰性の関連を有していたが、ＮＩＭＨＧＩ−Ｃの単一ＳＮＰ分析ではＭ３０と統合失調症との間には関連は観察されなかった。Ｍ３２−Ｍ３３−Ｍ３４のハプロタイプＣ−Ａ−Ｇは、ＣＢＤＢおよびＮＩＭＨ−ＧＩ  ＡＡ試料のいずれにおいても有意に陽性の関連を有していた（ＣＢＤＢハプロタイプｐ＝０．００８；ＮＩＭＨＧＩ−ＡＡハプロタイプｐ＝０．０４４）。興味深いことに、１つのまれなＳＮＰ（コーカサス人ＭＡＦ＝０．００７）がすべての研究コホート全体で８組の家族において見出され、これらの家族の中の９人の罹患した子供はすべて、ヘテロ接合の親から同一のまれな対立遺伝子を受け継いでいた（図１３を参照）。図１３を参照すると、このまれな対立遺伝子（Ｔ）を有する個体を少なくとも１人含むことが分かった全ての家族が示されている。表記は標準的な家系研究法に従う（黒＝罹患／統合失調症、など）。「−／−」遺伝子型の個体はいずれもＤＮＡ採取物が入手不可能であった。罹患した全ての子供がまれな対立遺伝子を受け継ぎ、個体が全員コーカサス人であったことに留意されたい。
【０１７５】
最後に、陽性の家族ベースの関連シグナルを前提として、本発明者らは、第４の試料、すなわち５０１人の患者および６２６人の対照者で構成されるドイツで収集されたコーカサス人の症例対照データセットにおいて関連性の試験を行い、ＣＢＤＢコホートで見出された６個の有意に関連していたＳＮＰ、さらに再シークエンスで見出された新規なＳＮＰについてもタイピングした。単一ＳＮＰについてロジスティク回帰を使用し、ＳＮＰ  Ｍ２０およびＭ３０において、オッズ比がそれぞれ２．９９（ＣＩ＝１．２６、７．１１）および１．５８（ＣＩ＝１．０５、２．３８）に相当する有意な関連性が観察された（図５；表３）。したがって、適切な検出力を備えた２つのコーカサス人試料において、本発明者らは、同じ２つのＳＮＰ、および同じ対立遺伝子について関連性を確認し、またＡＡ系の家族を含む２つの他の小規模な家族試料における各種ハプロタイプとの関連性について証拠を示す。総合すると、これらの結果はＫＣＮＨ２の該領域を統合失調症の感受性遺伝子座として同定し、かつＫＣＮＨ２がこの関連性に関与する遺伝子であることを示唆している。
【０１７６】
認知、海馬の構造および機能に対するＫＣＮＨ２  ＳＮＰの影響
この領域内のＳＮＰの変異を受け継ぐことが、脳機能を変化させることにより統合失調症のリスクを増大させるのであれば、そのような遺伝変異は、リスク対立遺伝子を有する個体において、該個体が診断上の症候群全体を現わしていないとしても、統合失調症の中間的な脳の表現型を伴っているはずである（Ａ．Ｍｅｙｅｒ−Ｌｉｎｄｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ２００６  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ７：８１８）。注意、記憶およびＩＱ／処理速度に関連した様々な認知障害が、統合失調症に関連した中間的な表現型として深く関係付けられており、また患者の罹患していない血縁者における相対リスクの増大と関連している（Ｔ．Ｄ．Ｃａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６７：３６９；Ｍ．Ｆ．Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ａｍ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １５７：１３０９；Ｍ．Ｆ．Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５０：９８；Ｔ．Ｅ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ａｒｃｈ  Ｇｅｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ６０：８８９）。これらの認知プロセスを助け、かつ統合失調症の神経病理学に一貫して関与する２つの領域（Ｐ．Ｊ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ  １９９９  Ｂｒａｉｎ  １２２：５９３，Ｄ．Ｒ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５０：８２５）、前前頭皮質（ＰＦＣ）およびＨＦの内部でのＫＣＮＨ２の高発現を考慮すると、リスクＳＮＰがこれらの脳領域の生物学的状態に影響を与えるのであれば、そのような認知障害も疾病の状態にかかわらずリスク遺伝子型に関係しているだろうと予想することは合理的である。従って、ＣＢＤＢ研究から最も有意に関連を示したＳＮＰ（Ｍ３０、Ｍ３１、Ｍ３３）について、精神障害の履歴のある個体を除外するためにスクリーンングした健康な非血縁対照者の独立した試料において、認知機能の７つの独立した集約尺度（ｓｕｍｍａｒｙ  ｍｅａｓｕｒｅ）に対する該ＳＮＰの影響を評価した（Ｇｅｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｍ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｈｉｚ  Ｒｅｓ（近刊））（表４）。処理速度を評価するモデルにおいては年齢について調整する線形回帰を使用して（処理速度の試験および年齢の相関係数ｐ値＝０．００６２；性別による平均の差についてのｔ検定のｐ値＝０．５７）、また視覚的記憶を評価するモデルにおいては共変量なしで（性別による平均の差についてのｔ検定のｐ値＝０．２６；年齢による視覚的記憶についての相関係数＝０．７５）、リスク遺伝子型とＩＱ／処理速度および視覚的記憶タスクの成績との間に有意な関連が観察された（図６Ａ；表４）。したがって、健康な対照者においても、統合失調症患者で高頻度に観察される同じ対立遺伝子を有する個体は、リスク対立遺伝子を持たない被験者よりも、ＩＱ、視覚的推論および視覚的記憶、ならびに時間制限付き順序付け（ｔｉｍｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を計測するタスクについて成績が有意に劣っていた。
【０１７７】
認知との遺伝的関連は、ＫＣＮＨ２の変異が上記の機能を助ける神経系の生物学的状態に影響を及ぼすことを示唆している。陳述記憶は、少なくともげっ歯動物ではＫＣＮＨ２が最も豊富に発現される海馬の機能に強く依存する（Ｍ．Ｊ．Ｓａｇａｎｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１：４６０９）。したがって、上記の関連性は、ＨＦ内での記憶処理の生理機能の遺伝的変調を反映するとも考えられ、また海馬の構造的発生のレベルでのより根本的な変化を表わす可能性も考えられる。したがって、本発明者らは、ＣＢＤＢ家族試料およびドイツの症例対照試料において統合失調症に有意に関連した同じＳＮＰが海馬の構造および生理機能の変化に関係し、またさらに、そのような変化が脳内の遺伝子作用の生物学的状態の現われであるならば、リスク対立遺伝子を有する健康な対照者はそのような変化の証拠を示すと予想されるものと仮定した。本発明者らは、慢性病および治療に関係する潜在的交絡因子を回避するために、脳の形態計測および情報処理のレベルでの遺伝的関連性について健康な対照者を使用することにした（Ａ．Ｒ．Ｈａｒｉｒｉ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ２００３  Ｂｒ  Ｍｅｄ  Ｂｕｌｌ  ６５：２５９）。ボクセル単位形態計測法（ＶＢＭ）を使用して、健康な対照被験者の試料を、ＨＦに注目して、局所的な脳容積について評価した。ＦＤＲ補正（α＝０．０５）した後、脳全体および関心領域（ＲＯＩ）の両方の分析を使用して、ＳＮＰ  Ｍ３０、Ｍ３１およびＭ３３の非主要対立遺伝子（リスク対立遺伝子）を有する個体において海馬構造での有意な容積減少が観察され、かつ相加的な対立遺伝子負荷効果が観察された（図６Ｂ；図１４〜１８；表５〜８）。非リスクＳＮＰに基づいた対照分析は、ＶＢＭの変化との関連について一貫して陰性であった（図１４〜１８、表５〜８）。
【０１７８】
異常な認知機能は生理的機能不全を反映するので、本発明者らは、リスク対立遺伝子を有する健康な対照者においても同じＳＮＰがＨＦの果たす記憶処理の生理機能に影響を及ぼすものと予測した。ｆＭＲＩ応答に対するタスク成績の影響に合わせて制御し、従って情報処理の生理機能に対する遺伝子型の影響を分離するために、遺伝子型の群を認知タスク（正確さおよび反応時間）の成績に一致させた。この一致戦略により、被験者がタスクをどれだけうまく行うかとは無関係に、認知情報が神経系レベルでどのように生理学的に扱われるかに対する遺伝子型の影響を試験することが可能となった。ｆＭＲＩを使用して、側頭葉記憶タスクの偶発的符号化の際の局所的活性化を評価し（Ａ．Ｒ．Ｈａｒｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２３：６６９０）、健康な対照被験者においても同様に行った。本発明者らは、正常なリスク保因者におけるＨＦの有意に高い活性化（ＦＷＥ補正α＝０．０５）を観察した（図６Ｃ；図１４〜１８、表５〜８）。このパターンの、記憶情報の非能率的な処理（すなわち一定レベルの成績に対する過度の活動）は、ＨＦにおける記憶処理を補助する皮質微小回路のチューニングがリスク遺伝子型の個体では比較的混乱していることを示唆している。ＨＦにおける同様のパターンの非能率的な記憶処理は、エピソード記憶に影響を及ぼす他の遺伝子について報告されている（例えば、Ｓ．Ｙ．Ｂｏｏｋｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４３：４５０およびＧ．Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：１５２４１）。
【０１７９】
図６Ａを参照すると、認知機能の尺度に対する、最も有意性の高い家族ベースのマーカーの遺伝子型の影響が示されている。回帰モデルのＰ値は２つの自由度をとるＦ検定に基づく。線形回帰を使用して、認知の尺度とヘテロ接合（Ｇ／Ａ）の保因者およびホモ接合（Ａ／Ａ）の保因者との間でＧ／Ｇの非リスク保有者に対する差を評価した。各遺伝子型の比較に関するＰ値が示され、続いて記載の遺伝子型のベータ係数が示されている。有意な主効果（ｐ＜０．０５）は太字で示されている。図６Ｂを参照すると、健康な対照保因者の異なるコホートについて、対象外の共変量として灰白質容積（ＧＭ）、年齢および性別を用いる共分散モデル分析を使用して、最適化されたボクセル単位形態計測分析（ＶＢＭ）を実施した。閾値設定した（ｐ＝０．０５  ＦＤＲ補正）統計的マップは、リスク対立遺伝子についてホモ接合の被験者（ｎ＝１７）からヘテロ接合の保因者（ｎ＝５９）、非保因者（ｎ＝６３）への、ＨＦのＧＭにおける相対的な直線的減少を示している。図６Ｃを参照すると、閾値設定した（ｐ＜０．０５、ＦＷＥ補正）統計的ｔマップ、および左後方海馬（ピーク・クラスターのＭＮＩ座標：−３４  −２５  −１５ｍｍ）における陳述記憶タスクの符号化状態の間の平均（±１  ＳＥＭ）血中酸素レベル依存性（ＢＯＬＤ）シグナルの変化（％）であり、Ｍ３０  ＳＮＰのリスク対立遺伝子のホモ接合の保因者（ｎ＝１４）において、ヘテロ接合の保因者（ｎ＝３７）および非保因者（ｎ＝２８）に対して活性化の有意な直線的増大が示されている。
【０１８０】
図１４を参照すると、ＳＮＰ  Ｍ３０に関する右海馬の灰白質容積（ＭＮＩ座標：２６、−１２、−２２ｍｍ）の遺伝子型による差が、最適化ＶＢＭを使用して導き出された。このプロット（図１４Ａ）および閾値設定した（ｐ＝０．０５  ＦＤＲ補正）統計的ｔマップ（図１４Ｂ）は、リスク対立遺伝子のホモ接合の保因者（ｎ＝１７）から、ヘテロ接合の保因者（ｎ＝５９）、非保因者（ｎ＝６３）への灰白質容積の直線的減少を示している。説明のために、海馬の灰白質容積の計測値を、平均値センタリングし（ｍｅａｎ  ｃｅｎｔｅｒｅｄ）、対象外の共変量として年齢、性別および灰白質総容積を使用したＳＰＭ２でのＡＮＣＯＶＡ分析において最も有意性の高い右前方海馬のクラスターから抽出した。
【０１８１】
図１５を参照すると、ＳＮＰ  Ｍ３１に関する右海馬の灰白質容積（ＭＮＩ座標：２６、−９、−２４ｍｍ）の遺伝子型による差が、最適化ＶＢＭを使用して導き出された。このプロット（図１５Ａ）および閾値設定した（ｐ＝０．０５  ＦＤＲ補正）の統計的ｔマップ（図１５Ｂ）は、リスク対立遺伝子のホモ接合の保因者（ｎ＝１６）から、ヘテロ接合の保因者（ｎ＝５９）、非保因者（ｎ＝６６）への灰白質容積の直線的減少を示している。説明のために、海馬の灰白質容積の計測値を、平均値センタリングし、対象外の共変量として年齢、性別および灰白質総容積を使用したＳＰＭ２でのＡＮＣＯＶＡ分析において最も有意性の高い右前方海馬のクラスターから抽出した。
【０１８２】
図１６を参照すると、ＳＮＰ  Ｍ３３に関する右海馬の灰白質容積（ＭＮＩ座標：２６、−９、−２４ｍｍ）の遺伝子型による差が、最適化ＶＢＭを使用して導き出された。このプロット（図１６Ａ）および（ｐ＝０．０７  ＦＤＲ補正）の統計的ｔマップ（図１６Ｂ）は、リスク対立遺伝子のホモ接合の保因者（ｎ＝１６）から、ヘテロ接合の保因者（ｎ＝６１）、非保因者（ｎ＝６４）への灰白質容積の直線的減少を示している。説明のために、海馬の灰白質容積の計測値を、平均値センタリングし、対象外の共変量として年齢、性別および灰白質総容積を使用したＳＰＭ２でのＡＮＣＯＶＡ分析において最も有意性の高い右前方海馬のクラスターから抽出した。
【０１８３】
図１７を参照すると、ＳＮＰ  Ｍ３１に関する、陳述記憶タスクの間の海馬の関与の遺伝子型による差が示されている。図１７Ａは、左後方海馬（ピーク・クラスターのＭＮＩ座標：−３４  −２２  −１５ｍｍ）における該タスクの符号化状態の間の平均（±１  ＳＥＭ）血中酸素レベル依存性（ＢＯＬＤ）シグナルの変化（％）を表し、リスク対立遺伝子のホモ接合の保因者（ｎ＝１２）においてヘテロ接合の保因者（ｎ＝３５）および非保因者（ｎ＝３０）に対して活性化の有意な直線的増大を示している。閾値設定した（ｐ＜０．０５、ＦＷＥ補正）統計的ｔマップは図１７Ｂに示されている。
【０１８４】
図１８を参照すると、ＳＮＰ  Ｍ３３に関する、陳述記憶タスクの間の海馬の関与の遺伝子型による差が示されている。図１８Ａは、左後方海馬（ピーク・クラスターのＭＮＩ座標：−３４  −２２  −１５ｍｍ）における該タスクの符号化状態の間の平均（±１  ＳＥＭ）ＢＯＬＤシグナルの変化（％）を表し、リスク対立遺伝子のホモ接合の保因者（ｎ＝１１）ではヘテロ接合の保因者（ｎ＝３７）および非保因者（ｎ＝２７）に対して活性化が有意に直線的に増大することを示している。閾値設定した（ｐ＜０．０５、ＦＷＥ補正）統計的ｔマップは図１８Ｂに示されている。
【０１８５】
ＫＣＮＨ２  ｍＲＮＡ発現に対する統合失調症およびリスク遺伝子型の影響
ヨーロッパおよび非ヨーロッパの家系の試料を含む５つの独立なデータセット、および精神障害についてスクリーニングした健康な対照者における、遺伝マーカーと統合失調症および関連する脳表現型との関連性は、この病気の神経系の生物学的状態を含む該病気の症状発現に、このゲノム領域が関与することを強く支持している。しかしながら、これらの知見は、リスクの根本的な分子機構を明らかにするものではない。この問題に取り組み始めるために、本発明者らは、ヒト脳における遺伝子発現、および該遺伝子発現と本発明者らによる遺伝的関連性の証拠との関係について調査した。実際に、３１例の統合失調症被験者および６９例の健康な対照被験者からの死後脳の試料における定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、本発明者らは、統合失調症患者のＤＬＰＦＣにおいてＫＣＮＨ２−１Ａ発現レベルが有意に低いことを見出した（ｐ＝０．００８；図７Ａ）。本発明者らは、別の統合失調症の死後脳で以前に報告された（Ｓ．Ｐｒａｂａｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ９：６８４）ＤＬＰＦＣにおけるＮＯＳ３発現の増大（ｐ＝０．０１９；図６Ａ）も再現した（表９）。更に、ＨＦ内では両方の遺伝子が高まると仮定して、さらに２９例の統合失調症被験者および５９例の健康な対照被験者の、大部分は重複しているコホートにおいて、この領域における該遺伝子の発現も計測した。ここでもＫＣＮＨ２−１Ａは統合失調症患者において有意に減少していた（ｐ＝０．００５；図７Ａ）。
【０１８６】
ほとんどの統合失調症患者は抗精神病薬を投与されるが、抗精神病薬はＫＣＮＨ２に結合してその発現に影響を及ぼす可能性がある（Ｓ．Ｋｏｎｇｓａｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４５０：３７）。いずれかの遺伝子において観察された変化が抗精神薬の影響である可能性について評価するために、６３匹のラット（治療群当たり８〜１０匹）に、３用量のクロザピンまたはハロペリドールのうちのいずれかを２８日間投与した。クロザピンもハロペリドールも、前頭皮質内で計測されたいずれの遺伝子の発現に対しても有意な影響を示さなかった（図１９）。しかしながら、有意には達しなかったが、０．０８および０．６ｍｇ／ｋｇ／日のハロペリドールで処理したラットにおいてＫＣＮＨ２−１Ａのわずかな減少が観察された（それぞれｐ＝０．０８２および０．１１９）。したがって、観察されたＫＣＮＨ２−１Ａの減少に対する薬物投与の影響を除外することはできない。
【０１８７】
図７Ａを参照すると、３０人の統合失調症患者／６２人の健康な対照被験者の海馬内、および大部分が重複している３１人の統合失調症患者／６９人の健康な対照被験者のＤＬＰＦＣ内における、ｍＲＮＡ発現の差が示されている。発現値はすべて、３つのハウスキーピング遺伝子（Ｂ２Ｍ、ＧＵＳＢおよびＰＢＧＤ）の幾何平均値に対して標準化され（Ｊ．Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ３：ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３４）、健康な対照者の平均値に対して何倍の差であるとして表されている。独立変数として年齢、ｐＨ、ＲＩＮおよび診断を用い、後進ステップワイズ線形回帰を使用して主効果に関してデータを検定した。ｐ値は最終的な回帰モデルにおける診断の主効果を表わす。図７Ｂは、マーカー３３（Ｍ３３）のリスク遺伝子型（Ａ保因者）と海馬内でのアイソフォーム３．１の発現（Ａ由来のデータ）との関連を、レイブ（ｒａｖｅ）と診断に関して示している。遺伝子型の主効果は、Ａと同じ線形回帰モデルリングに従って、ただしコーカサス人のサブセットおよびアフリカ系アメリカ人のサブセットについて別々に、Ｍ３３を変数としてモデルに含めて測定した。Ｍ３３  Ａ／Ａの個体が少数であるためＡ／Ｇの個体を合わせた。Ａ／Ｇ保有者とＧ／Ｇ保有者との間では多項式ロジスティク回帰によって測定されるような有意差は観察されなかった。エラーバーはすべて平均値の１ＳＥＭを表す。
【０１８８】
図１９を参照すると、治療群あたり８〜１０匹のラットを、３用量のハロペリドール（０．０８、０．６および１ｍｇ／ｋｇ）またはクロザピン（０．５、５および１０ｍｇ／ｋｇ）のうちいずれかで２８日間処理した（ビヒクルのみで処理したラットと比較）。ＮＯＳ３（ＡＢＩアッセイＲｎ０２１３２６３４＿ｓ１）およびＫＣＮＨ２−１Ａ（ＡＢＩアッセイＲｎ０１４４２５２３＿ｍ１）の前頭皮質での発現レベルを、２つのハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ、Ｂ２Ｍ）の幾何平均値に対して標準化した。遺伝子発現に対する抗精神病治療の影響を、従属変数として遺伝子発現を用いた線形回帰によって試験した。ビヒクルのみと２つの治療域等価用量（０．０８および０．６ｍｇ／ｋｇ／日のハロペリドール；０．５および５ｍｇ／ｋｇ／日のクロザピン）との間の差を、事後ＬＳＤ法を使用して検定した。いずれの神経弛緩剤治療群とビヒクルのみで処理したラットとの間でも有意差は観察されなかった。ビヒクルのみとの比較で最も大きな差のあった治療群のｐ値をハロペリドールについて示す。
【０１８９】
ＫＣＮＨ２−１Ａが臨床試料における遺伝的関連シグナルに物理的に近く、かつ統合失調症患者において示差的に発現することを考慮すると、関連性の分子機構が転写調節に関係することは妥当性があるように思われた。認知分析および画像分析に適用されたのと同じ論理によって、遺伝的リスクがＫＣＮＨ２−１Ａの転写に影響を及ぼすとすると、リスク対立遺伝子を有する個体は、健康であっても、これらの遺伝子について統合失調症患者の遺伝子と類似した発現プロファイル（すなわちレベル低下）を有するはずである。従って本発明者らは、リスク対立遺伝子の保因者である健康な対照者とそうでない健康な対照者との間のＫＣＮＨ２−１Ａの発現の差について試験した。リスク遺伝子型の有意な影響は観察されなかった（ＫＣＮＨ２−１Ａ：ｐ＝０．５２；表１０）。ＮＯＳ３発現も、リスクＳＮＰとの関連を示さなかった（表１０）。重要なのは、最初のマイクロアレイ研究において、ＮＯＳ３の増大は検出されたにも関わらずＫＣＮＨ２の示差的発現は検出されなかったこと（Ｐｒａｂａｋａｒａｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ９：６８４−６９７；Ｈｕｆｆａｋｅｒ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３：１００９８−１０１０３）に注目することである。このことはマイクロアレイ研究で使用された試料セットの全体として大きな平均ＰＭＩを反映している可能性もあるが、マイクロアレイによって調査されたＫＣＮＨ２の領域に関係する可能性が高いようである。ＨＧ−Ｕ１３３Ａマイクロアレイ（アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））上に含まれる２組のＫＣＮＨ２用プローブセットは、該遺伝子の３’−ＵＴＲに位置付けられる（図１１）。したがって、これらのプローブセットは、ＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１において高度に保存された３’−ＵＴＲ構造が特に付与された様々なアイソフォームを識別することはできないであろう。さらに、本明細書中で、アイソフォーム特異的なＲＴ−ＱＰＣＲを使用して、本発明者らは、アイソフォーム３．１の発現増大を伴うＫＣＮＨ２−１Ａの発現の著しい低減について報告している。したがって、両方のアイソフォームを合わせた検出では、ほとんど、または全く「正味の」差が得られないおそれがある。これは対立形質の不均一性（すなわち、異なる集団においては異なるＳＮＰが病気へのリスクを与える）の存在を示しているかもしれないが、一方で遺伝的リスクの分子の作用がＫＣＮＨ２−１Ａの発現に影響を与えないこと、または転写物のスプライシングもしくは他のアイソフォームの発現のような遺伝子プロセシングのより複雑な局面に関係するかもしれないことを示唆している可能性もある。
【０１９０】
ヒト脳中の新規ＫＣＮＨ２アイソフォームの同定
ＫＣＮＨ２イントロン２のサイズが大きいこと、および生物種をこえて高度に保存されているいくつかの領域が存在すること（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）から、リスクＳＮＰの作用は、まだ同定されていないエキソンのスプライシング、またはこのイントロン性の領域内の新規なアイソフォームの発現に関係する可能性もある。１０人の統合失調症患者のＤＬＰＦＣ由来のプールした全ＲＮＡに５’−ＲＡＣＥを使用し、完全長のＫＣＮＨ２転写物（ＫＣＮＨ２−１Ａ；ＮＭ＿０００２３）のエキソン４から始めることにより、本発明者らは、エキソン３の既知の開始部位の上流１．１Ｋｂを始点とするアイソフォームを生産する、エキソン３の新規な５’延長部を同定した（図５；図１１）。ヒトのｃＤＮＡライブラリ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））からさらにクローニングすると、該アイソフォームは内発的に発現され、完全長の遺伝子の下流のエキソンをすべて含んでいることが分かった（ＫＣＮＨ２−１Ａのエキソン１５まで；図２０、表１１）。この新規アイソフォーム（アイソフォーム３．１とも呼ばれる）の最も長いＯＲＦのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの（ワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおける）予測により、エキソン３の１．１Ｋｂの５’延長部は翻訳されないと思われること、最初のメチオニンは完全長タンパク質とフレームが一致していることが明らかとなった。そのため、アイソフォーム３．１は、完全長ＫＣＮＨ２−１Ａの最初の１０２アミノ酸が失われて、そのかわりに該アイソフォームに特有の６アミノ酸に置き換わっていると予想される。興味深いことに、ｈＥＲＧ１ａのエキソン１および２によってコードされる１０２アミノ酸は、チャネル脱活性化の速度を遅くするモチーフであるＰＡＳドメインの大部分を構成する（Ｊ．Ｈ．Ｍｏｒａｉｓ  Ｃａｂｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ｃｅｌｌ  ９５：６４９）。アイソフォーム３．１の翻訳および予測されるタンパク質サイズの差は、トランスフェクトされたＨＥＫ細胞でウェスタンブロットを使用して確認された（図８Ｃ）。免疫沈降法に続くヒトの海馬および前頭皮質でのウェスタンブロットから、トランスフェクトされたＨＥＫ細胞のものと同じような分子量のタンパク質のバンドが示された（図８Ｃ）。さらに、ＫＣＮＨ２−１Ａまたはアイソフォーム３．１のうちいずれかまたは両方をコードする構築物でトランスフェクトされた神経芽細胞腫細胞は、原形質膜上に該タンパク質アイソフォームの重複した発現を示す（図８Ｄ）。
【０１９１】
アイソフォーム３．１が主として脳で発現される可能性を検討するために、本発明者らは、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、心臓および３つの異なる脳領域を含むいくつかの組織にわたってＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１の量を計測した。さらに、ＫＣＮＨ２の既知のアイソフォームおよび相同体は、集合して独自の電気生理学的特性を備えたヘテロマーのカリウムチャネルを作り出すことが可能であり（Ｌ．Ｇｕａｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４９１：１５７）、前記特性はサブユニットの比率および配置によってさらに改変される（Ｓ．Ｗｉｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ  ４４５：４２３）ので、本発明者らは、アイソフォーム３．１のＫＣＮＨ２−１Ａに対する比率を計測し、この２つの形態がいくつかの脳領域内での発現に関して同程度であることを見出した（図８Ｂ；図２０、表１１）。しかしながら、アイソフォーム３．１は心臓内ではＫＣＮＨ２−１Ａよりも１０００倍以上量が少なく、アイソフォーム３．１の役割は主として脳内にあるかもしれないことが示唆された。
【０１９２】
図８Ａを参照すると、ＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１について、それぞれＫＣＮＨ２−１Ａのエキソン１の中の順方向プライマー（Ｅｘ１）およびアイソフォーム３．１の５’−ＵＴＲの中の順方向プライマー（Ｉｓｏ１）、ならびに同じ逆方向プライマーであってＫＣＮＨ２−１Ａのエキソン３（Ｅｘ３）および４（Ｅｘ４）の中のプライマーを使用して、ＰＣＲ産物を生成させた（実施例１を参照）。ＰＣＲは、ヒトの心臓、海馬および胎児の脳から単離された市販の全ＲＮＡ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））から調製したｃＤＮＡを使用して実施した。ＰＣＲ産物は、ＫＣＮＨ２−１Ａについてはそれぞれ３７３ｂｐおよび４６３ｂｐ、アイソフォーム３．１についてはそれぞれ３８８ｂｐおよび４７８ｂｐと予想された。Ｉｓｏ１−Ｅｘ４レーンの〜１．５ｋｂのバンドは、試料中に存在する少量のスプライシングされていないＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに相当する。図８Ｂを参照すると、ＴａｑＭａｎ（Ｒ）アッセイ（ＡＢＩ）を使用して定量的ＰＣＲを実施し、ＫＣＮＨ２−１Ａ（Ｈｓ００１６５１２０＿ｍ１）平均値±標準誤差に対するアイソフォーム３．１（アイソフォーム３．１の５’−ＵＴＲに対して設計されたカスタムＴａｑＭａｎアッセイ）の相対的なｍＲＮＡ発現を計測した。発現値は、ヒトの海馬、前前頭皮質、心臓および骨格筋由来の市販の全ＲＮＡ（アンビオン）をＤＮＡｓｅ処理（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））したものから作製したｃＤＮＡにおいて計測した。図８Ｃを参照すると、死後のヒトの海馬および前頭皮質から抽出したタンパク質を使用してウェスタンブロットの準備がなされた。陽性対照として、ＣＭＶプロモータの制御下でＫＣＮＨ２−１Ａまたはアイソフォーム３．１をコードするベクターでＨＥＫ細胞をトランスフェクトした。ウェスタンは、ＫＣＮＨ２の細孔部分に対して作製された抗体（サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｎ−２０）を用いて探査され、従ってアイソフォーム３．１およびＫＣＮＨ２−１Ａを検出するものと予想された。ヒト脳領域から抽出されたタンパク質は２本の別個のバンドを示し、１つはアイソフォーム３．１でトランスフェクトされたＨＥＫ細胞と同じ大きさであった。しかしながら、ヒト脳におけるより大きい主要なバンドは、ＫＣＮＨ２−１ＡでトランスフェクトされたＨＥＫタンパク質の大きさとしては観察されなかった。代わりに〜１６０ｋＤａのより大きなバンドが生じるが、これはｉｎ  ｖｉｖｏのタンパク質抽出物由来のＫＣＮＨ２−１Ａについて報告された大きさであり、翻訳後修飾を示唆している（Ｅ．Ｍ．Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：４４６９０）。図８Ｄを参照すると、ＫＣＮＨ２−１Ａまたはアイソフォーム３．１を含んでいるベクターでトランスフェクトしたラットの初代神経細胞である。
【０１９３】
図２０を参照すると、ＫＣＮＨ２−１Ａ（完全長）およびアイソフォーム３．１のＰＣＲを、１０種の異なる組織の全ＲＮＡ抽出物を使用して実施した。完全長のＰＣＲ産物は、Ｅｘ１−Ｆ順方向プライマーとＥｘ３−ＲおよびＥｘ４−Ｒ逆方向プライマーとを使用して生成された（実施例１を参照）。アイソフォーム３．１のＰＣＲ産物は、Ｅｘ３．１−Ｆ順方向プライマーならびに同じＥｘ３−ＲおよびＥｘ４−Ｒ逆方向プライマーを使用して生成された。予想される産物の大きさ：それぞれ３７３、４６３、３８８、４７８ｂｐ。一部の試料のＥｘ３．１−ＦおよびＥｘ４−ＲのＰＣＲにおける１５４７ｂｐのバンドをクローニングして配列決定すると、イントロン３がスプライシングで除かれた配列に相当し、これらの試料中へのＤＮＡの混入を表すことが示唆された。
【０１９４】
表１１では、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、８つの全ＲＮＡ単離物におけるＫＣＮＨ２−１Ａと比較したアイソフォーム３．１の相対的な発現量を計測した。試料はすべて、試料に対するＤＮＡ混入の影響を防ぐためにｃＤＮＡ合成に先立ってＤＮａｓｅで処理した。Ｃｔ値はすべて同じ閾値で測定し、試料の発現値はすべて３連で計測した。
【０１９５】
最後に、ＥＲＧファミリーの遺伝子はいくつかの生物種にわたって配列が適度に保存されているので（Ｊ．Ｗ．Ｗａｒｍｋｅ  ａｎｄ  Ｂ．Ｇａｎｅｔｚｋｙ  １９９４  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９１：３４３８）、本発明者らは、アイソフォーム３．１が他の哺乳動物に存在すると予想した。しかしながら、同じように５’−ＲＡＣＥを使用しても、マウス脳ではアイソフォーム３．１相同体を検出することができなかった。さらに、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析から、アイソフォーム３．１に特有の１．１Ｋｂ領域が霊長類以外では極めて退化していることが明らかとなった（図２１）。特に、マウス、ラット、イヌ、およびゼブラフィッシュでは、エキソン３の上流３ｋｂ以内にプロモータ様の配列は観察されず、エキソン３とフレームが一致する最も長いＯＲＦは開始メチオニンを欠いている（図２１）。
【０１９６】
図２１Ａを参照すると、ヒト、アカゲザル、マウスおよびラットのＫＣＮＨ２−１Ａ（ｈＥＲＧ−１Ａ）エキソン３スプライス部位上流の２５０ｂｐの領域および１８０ｂｐのエキソン３の、多重アラインメントが示されている。ゲノム配列はＵＣＳＣから入手し、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ワールドワイドウェブｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）を使用してアラインメントした。エキソン３スプライス部位（ＣＡＧ）は細い破線で囲まれており、その後にエキソン３（太い破線で囲む）が続いているが、いずれも生物種間で高度に保存されている。フレームに一致している開始コドン（ＡＴＧ）は、ヒトおよびアカゲザルの配列については実線で囲んで示されているが、マウスおよびラットの該当するＡＴＧはフレームシフトしている（フレームに一致したコドンは実線で囲んで示されている）。図２１Ｂは、エキソン３とフレームが一致するこの領域の予測ＯＲＦおよびＫＣＮＨ２コード配列の残りの部分の多重アラインメントを示す。ここでも、ヒトおよびアカゲザルの配列は開始メチオニンを示すが、マウスおよびラットの配列には、停止コドンの前に上流のフレームが一致するメチオニンがない。
【０１９７】
統合失調症およびリスク遺伝子型の被験者におけるアイソフォーム３．１の高発現
霊長類特異的であり、脳で豊富に発現すること、およびアイソフォーム３．１の第１エキソンの５’側上流にリスクＳＮＰが位置することから、本発明者らは、統合失調症の遺伝的リスクの機構がアイソフォーム３．１の示差的発現を伴うものと仮定した。定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、本発明者らは、アイソフォーム３．１の発現が患者のＨＦ内では健康な対照被験者と比べて有意に増大していることを見出した（ｐ＝０．０１２、図７Ａ）。ＫＣＮＨ２−１Ａに対するアイソフォーム３．１の比率は、患者における２．５倍の劇増を示した（ｐ＝０．００３）。さらに、アイソフォーム３．１の高発現レベルは、健康な対照被験者の間でもリスク対立遺伝子に有意に関連していた（図７Ｂ）。この傾向は人種または診断に関係なく観察され、薬物または遺伝的背景の層別化という潜在的交絡因子を排除している。これらの結果は、統合失調症との関連の遺伝学的機構がアイソフォーム３．１の転写調節に関与し、かつこのアイソフォームの過剰発現および潜在的生理作用が障害の病因と関係するという結論へと収束する。
【０１９８】
電気生理学により明らかとなったアイソフォーム３．１の機能的役割
アイソフォーム３．１の構造分析から、潜在的に特有の生理作用を示唆するいくつかの興味深い特性が明らかとなった。Ｎ末端のＰＡＳドメイン（ａａ２５〜１３６）は、ｈＥＲＧの固有の特徴である、ＫＣＮＨ２チャネルの緩徐な脱活性化を保証している（Ｍ．Ｃ．Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｔｒｉｓｔａｎｉ−Ｆｉｒｏｕｚｉ  ２００６  Ｎａｔｕｒｅ  ４４０：４６３）。対照的に、ｈＥＲＧチャネルのＮ末端の少数のアミノ酸（ａａ７〜１２）が、チャネルの脱活性化を促進している（Ｈ．Ｔｅｒｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５０２：５３７）。ＫＣＮＨ２−１Ａと比較すると、アイソフォーム３．１はＮ末端の最初の１０２アミノ酸が６つの新しいアミノ酸に置き換わっており（図９Ａ）、促進シグナルはすべて除去され、ＰＡＳドメインの大部分が削除されている。この新しいチャネルアイソフォームの生物物理学的特徴を決定するために、本発明者らは、ＫＣＮＨ２−１Ａまたはアイソフォーム３．１のいずれかを用いてトランスフェクトされたＨＥＫ細胞について全細胞記録（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）を実施した。−６０ｍＶに保持し、チャネルを様々な脱分極化ステップ（図９Ｂ、上）によって活性化した。以前に報告されているように、ＫＣＮＨ２−１Ａは典型的な緩徐な活性化を示した（図９Ｂ、中）。アイソフォーム３．１も緩徐に活性化された（図９Ｂ、下）。定量分析からは、ＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１の活性化動態の差は明らかとはならなかった（図９Ｄ）。膜電位が−１２０ｍＶまで過分極化すると、チャネルは不活性状態から急速に回復し、その結果、徐々に脱活性化する大きな「末尾電流」を伴う（図９Ｃ、上）。ｈＥＲＧチャネル阻害剤であるＥ−４０３１を用いて細胞を処理すると、この電流は完全に阻止され（図９Ｃ、上）、この電流がｈＥＲＧチャネルによって専ら仲介されることが示唆された。対照的に、アイソフォーム３．１でトランスフェクトされた細胞は劇的に低い末尾電流（図９Ｃ、下）を示した。Ｅ−４０３１を用いた処理は同様にこの電流を阻止し、該チャネルの性質が確認された。２つのアイソフォームの脱活性化動態をさらに比較するために、膜電位を最初に１秒間で＋６０ｍＶまで脱分極化し、その後様々な電位差の過分極化ステップとした（図９Ｅ、上）。アイソフォーム３．１によって仲介される大きな内向き電流は、ＫＣＮＨ２−１Ａによる電流よりもはるかに速くベースラインに向かって減衰した（図９Ｅ、中および下）。電流の脱活性化相を単一指数関数曲線にフィッティングして、電位依存的な脱活性化定数（τ）を得た（図９Ｆ）。試験したすべての電位ステップ（−７０ｍＶ−１２０ｍＶ）において、τは、ＫＣＮＨ２−１Ａと比較するとアイソフォーム３．１において大幅に低下している。総合すると、アイソフォーム３．１は、劇的に速い脱活性化動態を備えた内向き整流Ｋ＋電流を仲介する。
【０１９９】
図９Ａを参照すると、ＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１のドメイン構造の概略図により、最初の先導配列、ＰＡＳドメイン（またはアイソフォーム３．１の場合は部分的なＰＡＳドメイン）、およびＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１の間で同一のアミノ酸配列が示されている。バーの上の数字はアミノ酸の部位である。図９Ｂは、−６０ｍＶのＶＨから、１０ｍＶきざみで−１００〜＋８０ｍＶの電位までの電圧ステップ（２秒）と、その後の−１２０ｍＶへの電圧パルスによって引き起こされた電流を示している。上側パネル：電圧のプロトコール。中央および下側パネル：ＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１のｃＤＮＡでそれぞれトランスフェクトした細胞から得られたトレース。これらのトレースはリーク電流について補正されている。図９Ｃは、Ａと同じプロトコールを使用して、＋８０ｍＶの保持電位から−１２０までの試験パルスによって引き起こされた末尾電流に対するＥ−４０３１の影響を示している。１０μＭのＥ−４０３１を用いた処理の前後で同じ細胞から記録されたトレースが重ねられている。上側および下側パネルは、それぞれＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１のｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞から記録されたＫＣＮＨ２電流を示す。図９Ｄは、ＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１の活性化曲線を例証している。図９Ｅは、＋６０ｍＶから１０ｍＶきざみで−１２０ｍＶ〜−７０ｍＶの電位までの電圧ステップによって引き起こされた末尾電流を示している。上側および下側パネルのトレースは、それぞれＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１の末尾電流を表す。図９Ｆは、様々な再分極化電圧におけるＫＣＮＨ２電流の脱活性化時定数を示している。−１２０〜−７０ｍＶの間で、ＫＣＮＨ２電流の減衰相を単一指数関数によってフィッティングして脱活性化定数を計算した。データは平均±ＳＥとして示されている。記録された細胞の数は括弧内に示されている。
【０２００】
本発明者らは次に、皮質ニューロンにおけるアイソフォーム３．１の機能的な役割を調べた。げっ歯動物ＣＮＳのニューロンはＫＣＮＨ２−１Ａを発現するがアイソフォーム３．１は発現しないことを考慮すると、これらのニューロンに導入されたアイソフォーム３．１はおそらく内在性のＫＣＮＨ２−１Ａと複合体を形成し、その結果、Ｋ＋電流の脱活性化動態を著しく変化させると思われる。アイソフォーム３．１を、培養した皮質ニューロン内へ播種当日にＧＦＰを用いて、または用いずにトランスフェクトし、Ｎａ＋およびＣａ２＋電流を阻止するために阻害剤カクテルで灌流した後に１０日間培養したニューロンについて、全細胞電圧固定記録を実施した。ＧＦＰのみでトランスフェクトされたニューロンでは、図９Ｅと同様の電圧プロトコールを適用すると一連の末尾電流が引き起こされ、該電流はＥ−４０３１により阻止された（図１０Ａ）。対照の電流（上）からＥ−４０３１処理後の電流（中央）を差し引くと、典型的な緩徐な脱活性化動態を示す全くの「ＫＣＮＨ２−１Ａ仲介型」の電流（下）が生成された（図１０Ａ）。対照的に、アイソフォーム３．１でトランスフェクトされたニューロンに同じプロトコールを適用すると、脱活性化が非常に速い、劇的に低い末尾電流が引き起こされた（図１０Ｂ）。定量的分析から、−１００ｍＶの設定電位でτはそれぞれ５．８８倍（速い成分）および７．４３倍（遅い成分）低下した（図１０Ｃ）。これらの結果は、内在性のＫＣＮＨ２−１Ａと複合体を形成することによって、アイソフォーム３．１が膜の再分極化動態を変化させ、ニューロンの興奮性の増大をもたらしている可能性を示唆する。この可能性について試すために、本発明者らは、電流固定条件下でのステップ脱分極によって引き起こされる活動電位について調べた。対照ニューロン（トランスフェクトされていない）ならびにＧＦＰでトランスフェクトされたニューロンにおいて、１秒の脱分極により約１１回の活動電位が引き起こされた（図１０Ｄ、上および中央）。アイソフォーム３．１でトランスフェクトされたニューロンでは、同じ脱分極ステップにより、対照ニューロンおよびＧＦＰでトランスフェクトされたニューロンと比較して著しく多いスパイクが誘導された（図１０Ｄ、下）。平均では、４０ｐＡの脱分極化ステップによって引き起こされたスパイク頻度はそれぞれ、対照ニューロンでは８．９±１．３Ｈｚ、アイソフォーム３．１でトランスフェクトされたニューロンでは１６．６±０．５Ｈｚであった（図１０Ｅ）。スパイク間隔（ＩＳＩ）をさらに検討すると、アイソフォーム３．１の発現により順応性の発火パターン（図１０Ｄ、上）から非順応性の発火パターン（図１０Ｄ、下）に変換することも明らかとなった。確かに、最初のＩＳＩと最後のＩＳＩとの比は、対照ニューロンの０．５７±０．０５からアイソフォーム３．１でトランスフェクトされたニューロンの０．９６±０．０２へと増大した（図１０Ｆ）。この結果は興味深い、というのも、非順応性の発火パターンは作動記憶タスクの間のＰＦＣにおけるニューロンの持続的発火に関与するとされてきたからである（Ｙ．  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ９：５３４）。総合すると、これらの結果は、ヒトのＰＦＣにおけるアイソフォーム３．１の発現がニューロンの興奮性を著しく増大させることを示唆し、ニューロンの持続的活動の潜在的な機構を提示している。
【０２０１】
図１０に関しては、皮質ニューロンをＧＦＰ単独で、またはＧＦＰおよびアイソフォーム３．１でトランスフェクトし、１０日間培養した。図１０Ａおよび１０Ｂには、ＧＦＰでトランスフェクトされたニューロンおよびアイソフォーム３．１でトランスフェクトされたニューロンにおけるＫＣＮＨ２を仲介した末尾電流がそれぞれ示されている。末尾電流は、＋８０ｍＶのＶＨから１０ｍＶきざみで−７０〜−１２０ｍＶの電位への電圧パルス（１秒）によって引き起こされた。Ｅ−４０３１感受性の電流は、Ｅ−４０３１適用前に記録された電流からＥ−４０３１適用後に記録された電流を差し引くことにより得られた。図１０Ｃは、様々な再分極化電圧におけるＥ−４０３１感受性の電流の脱活性化時定数の片対数プロットを示している。−１２０〜−１００ｍＶの間ではＥ−４０３１感受性の電流の減衰を二重指数関数によってフィッティングしたが、−９０〜−７０ｍＶの経時変化は単一指数関数に従った。アイソフォーム３．１でトランスフェクトされたニューロンの脱活性化定数は、様々な再分極化電圧において対照ニューロンの脱活性化定数よりも一貫して小さい。図１０Ｄは、培養皮質ニューロンの活動電位発火に対するアイソフォーム３．１の過剰発現の影響を示している。長い脱分極化パルス（４０ｐＡ、１秒）によって反復的な発火が引き起こされた。対照ニューロンおよびＧＦＰでトランスフェクトされたニューロンでは強いスパイク頻度順応が見られるが、アイソフォーム３．１でトランスフェクトされたニューロンは非順応性の発火挙動を示す。図１０Ｅは、様々な脱分極化電流の注入により引き起こされたスパイク頻度を例証する。スパイク頻度は１秒あたりのスパイクの数として定義される。アイソフォーム３．１を発現するニューロンは、３０ｐＡの電流注入を最初として顕著に高いスパイク頻度を一貫して示す。図１０Ｆは、スパイク頻度順応に対するアイソフォーム３．１の影響を示している。４０ｐＡの脱分極化パルスによって引き起こされる最初のスパイク間隔と最後のスパイク間隔との比によって計測される非順応の程度は、対照ニューロンまたはＧＦＰ発現ニューロンよりもアイソフォーム３．１を発現するニューロンにおいて有意に高かった。データは平均±ＳＥとして示されている。記録された細胞の数は括弧内（Ｄ）またはカラム内（Ｅ）に示されており、星印は有意差を示している（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１）。
【０２０２】
【表３】
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【０２０３】
【表４】
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【０２０４】
【表５】
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【０２０５】
【表６】
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【０２０６】
【表７】
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【０２０７】
【表８】
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【０２０８】
【表９】
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【０２０９】
【表１０】
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【０２１０】
【表１１】
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【０２１１】
【表１２】
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【０２１２】
議論
本明細書に記載された知見は、３つの家族ベースのデータセットおよび１つの症例対照データセットを含む、ヨーロッパおよびアフリカ系アメリカ人の家系の４つの独立した遺伝学的コホートにおいて観察された、ＫＣＮＨ２領域内である７ｑ３６．１における統合失調症のリスクとの新規な遺伝学的関連を立証する説得力のある証拠を提供するものである。本発明者らの結果は、遺伝子が遺伝学的に複雑な病気のリスクを伝えるという予備的証拠に関して提唱される「３コホート再現規則（３−ｃｏｈｏｒｔ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｌｅ）」（Ｋ．Ｅ．Ｌｏｈｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３３：１７７）を満たしている。すべての試料がＫＣＮＨ２のイントロン２の小さなセグメント内のＳＮＰに関連性を示した。同様の状況は、統合失調症の有力な候補感受性遺伝子であると思われる他の遺伝子について報告されてきた（Ｐ．Ｊ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ２００５  Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １０：４０；Ｐ．Ｊ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｊ．Ｌａｗ  ２００６  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ６０：１３２；Ｄ．Ｊ．Ｐｏｒｔｅｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ６０：１２３；Ｎ．Ｍ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒ  Ｂｕｌｌ  ３１：８００）。興味深いことに、４８人の統合失調症患者における再シークエンスから、新規であるがまれな（〜１％ＭＡＦ）ＳＮＰであるＭ２５が見出された。これらの家系の調査から、すべての発端者がヘテロ接合の親からＭ２５の非主要対立遺伝子を継承したことが見出され、このことは、ＫＣＮＨ２における遺伝的関連性の、まれな対立遺伝子／まれなバリアント仮説の寄与を立証する証拠を示している可能性がある。リスク対立遺伝子は多様であり、様々な転写ドメインおよびその他の調節ドメインに影響を及ぼす可能性はあるが、同様の下流の分子の変化に収束するようである。
【０２１３】
すべての臨床試料が小さな領域（＜３ｋｂ）との関連性を示し、該領域の遺伝的リスクの大部分はＭ３０、Ｍ３１およびＭ３３によって十分にタギングされるようである。従って、これらのマーカーは、リスク対立遺伝子を担持するが精神病歴のない様々な遺伝的背景の健康な非血縁個体すべてにおいて、認知障害、脳容積の減少、脳活動の変化を含む演繹的に予測される統合失調症関連の中間的な表現型、およびアイソフォーム３．１発現の増大と、最も強い独立した関連性をも示した。すなわち、本発明者らは、この小さな〜３ｋｂ領域における遺伝変異と、統合失調症に強く結びついた臨床的事象との関連、および開始部位がこのリスク領域のわずか〜１１ｋｂ下流にある特定の新規な転写物の選択的発現との関連を示す。本発明者らは、これらの結果が新しい統合失調症感受性遺伝子を同定すること、ならびにこの関連性の機構が、皮質の発生および機能を変化させて統合失調症の臨床的現象に作用するＫＣＮＨ２の新規な脳選択的転写物の変則的なプロセシングを伴うことを提唱する。
【０２１４】
ＫＣＮＨ２アイソフォームによる、ニューロンにおける細胞膜再分極およびスパイク頻度の制御は、皮質の機能および統合失調症の病態生理にとって興味深い意味合いを有する。皮質の情報処理は、皮質回路内の組織化されたニューロン振動に非常に依存している（Ｒ．Ｔ．Ｃａｎｏｌｔｙ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：１６２６）。例えば、前前頭皮質（ＰＦＣ）のニューロンは、作業記憶にとって重要であると考えられている遅延期間中の高頻度の持続的発火活動を示す（Ｙ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ９：５３４）。本発明者らは、ラットの培養皮質ニューロンにおけるアイソフォーム３．１の発現の結果、ｈＥＲＧチャネルが非常に迅速に脱活性化し、発火頻度の著しい増加および順応性から非順応性への発火パターンの転換がもたらされることを見出した。この「持続的」発火パターンは、高次の認知タスクおよび記憶タスクの基礎となる皮質の情報処理にとって重要である可能性があり、正常なヒトの認知処理におけるアイソフォーム３．１の役割を示唆している。しかしながら、統合失調症の脳におけるＫＣＮＨ２−１Ａに対するアイソフォーム３．１の２．５倍の増加が、ニューロンの興奮性を異常に増大させ、かつ正常な振動リズムを混乱させる役目をする可能性もある。そのような持続性の発火の「律動異常」は、微小回路の変則的変調をもたらし、その結果シグナル対ノイズを十分に調節できなくなると推測される（Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒｅｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ２００４  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２７：６８３）。したがって、統合失調症の脳内でのアイソフォーム３．１の過剰発現およびニューロンの発火に対するその機能的影響は、統合失調症における皮質のシグナル対ノイズ処理の変化における疾患に関連した変化についての現在の仮説と一致している（Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒｅｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ２００４  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２７：６８３）。
【０２１５】
アイソフォーム３．１の発見は、説得力のある治療上の意味を有する。アイソフォーム３．１の独特の構造、非順応性の発火におけるその役割、心臓における低発現、ならびに統合失調症患者および遺伝的リスク保因者の脳における発現上昇からは、アイソフォーム３．１を選択的に阻害しＫＣＮＨ２は阻害しないことにより、心臓の副作用を誘発することなく統合失調症の脳内の無秩序な発火が修正されるという結論がもたらされる。したがって、アイソフォーム３．１は統合失調症の治療の有望な新規治療ターゲットである。
【０２１６】
結論として、本発明者らは、新規な霊長類特異的な脳カリウムチャネルを同定および特徴解析し、統合失調症のリスクとの新規な遺伝関連性をＫＣＮＨ２の小さな領域（７ｑ３６．１）内に特定し、かつこの知見を４つの独立な臨床ベースの試料において確認した。特に３つのＳＮＰ（Ｍ３０、Ｍ３１およびＭ３３）は、試験したすべての集団において関連性の証拠を示した。本発明者らは、ＫＣＮＨ２の特定の３ｋｂの領域内の多型が統合失調症患者では一貫してより高頻度で生じ、また対立遺伝子の不均一性にもかかわらず、この領域内のリスクＳＮＰの健康な対照保因者は、認知の形質（処理速度および視覚的記憶）ならびに海馬の容積および記憶処理時の生理学的関与において統合失調症様の変化を示す、という観察について報告する。これらの関連性の機構は、独特の電気生理学的特性、霊長類および脳特異性、ならびに発現のリスク遺伝子型依存性を有する、ＫＣＮＨ２の新規なアイソフォーム３．１の遺伝的調節と関係があるように思われる。本発明者らの結果は、統合失調症および関連症状のための新規な治療ターゲットの発見への第一歩に相当する。
【実施例１】
【０２１７】
遺伝的関連コホート
ＣＢＤＢシブリングスタディは、統合失調症の遺伝的リスクと関係する神経生物学的形質についての進行中の調査の一部として集められた被験者で構成されている（Ｍ．Ｆ．Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ａｍ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １５７：１３０９）。参加者は１８〜６０歳であり、遺伝的な不均一性を低減するために本研究ではヨーロッパ人の子孫と自認しているコーカサス人だけを分析した。ＤＮＡは、２５２人の発端者、その兄弟３１１人（ほとんど非罹患）、２６８人の親、および３８３人の健康な非血縁対照者から入手可能であった。採取、スクリーニング、および除外基準に関するさらに詳しい情報は以前に説明されたとおりである（Ｍ．Ｆ．Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ａｍ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １５７：１３０９）。家族ベースのさらに２つのコホートを、米国国立精神衛生研究所統合失調症に関する遺伝学的構想（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  ｏｎ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ）（ＮＩＭＨＧＩ）から加えた（Ｓ．Ｖ．Ｆａｒａｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８  Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ８１：２９０）。該コホートは、５１組のアフリカ系アメリカ人家族（ＧＩ−ＡＡ）および７１組のコーカサス人家族（ＧＩ−Ｃ）から構成されるものであった。統合失調症または分裂情動性障害の診断を受けた少なくとも１人の兄弟、および少なくとも１人の親からＤＮＡを入手可能な核家族だけを組み入れた。第４のコホートはドイツ連邦共和国のミュンヘン地域から収集され、５０１人の統合失調症患者および６２６人の健康な非血縁対照者で構成されている（Ｋ．Ｋ．Ｎｉｃｏｄｅｍｕｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １２０：８８９−９０６）。ドイツのコホートについての採取、評価、および除外基準に関するさらなる詳細については説明済みである（Ｋ．Ｋ．  Ｎｉｃｏｄｅｍｕｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １２０：８８９−９０６）。
【０２１８】
候補遺伝子のスクリーニング
統合失調症患者および健康な対照者の間で示差的に発現されるとして以前に報告されたものから１０個の候補遺伝子が選択された（Ｓ．Ｐｒａｂａｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４  ＭｏＩ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ９：６８４）。対象とする遺伝子の一部またはすべてと重なり合うハプロタイプブロックをタギングし、かつあらかじめ設計されたＴａｑＭａｎ  ＳＮＰアッセイ（アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ））があるｈｔＳＮＰについて、ＣＢＤＢシブリングスタディの１７５組の家族（６９８人のコーカサス人被験者）のスクリーニング試料に関してジェノタイピングした。すべてのＳＮＰを、以前に述べたように５’−エキソヌクレアーゼＴａｑＭａｎ  ＳＮＰアッセイを使用してジェノタイピングした（Ｋ．Ｊ．Ｌｉｖａｋ  １９９９  Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ  １４：１４３）。単一のマーカーおよび全体的なハプロタイプの関連性試験を、家族ベースの関連性試験（ＦＢＡＴ）（Ｓ．Ｈｏｒｖａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ９：３０１）を使用して実施し、α＝０．０５で評価した。
【０２１９】
ＫＣＮＨ２のジェノタイピングおよび再シークエンス
ＫＣＮＨ２およびＮＯＳ３の６５．２ｋｂの領域（第７染色体：１５０２８０４６４−１５０３４５６７９）の中の合計４３個のＳＮＰについて遺伝子型を得られた。ポリモルフィック社（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  Ｉｎｃ．）（米国カリフォルニア州アラミダ所在）により、またインハウスでも、４８人の統合失調症患者において、ＵＣＳＣゲノムデータベース（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）内において生物種間で高度に保存されている、ｒｓ１０３６１４５に隣接する１０．４Ｋｂ（第７染色体：１５０，２９９，５７５−１５０，３０９，９４８）およびエキソン３の上流３．１Ｋｂ（第７染色体：１５０，２８７，７５０−１５０，２９０）を含む合計１３．５Ｋｂを再シークエンスした。再シークエンスにより１１個の新規なＳＮＰが見出された。ＳＮＰは前述同様にＴａｑＭａｎ  ＳＮＰアッセイを使用して４つのコホートすべてにおいてジェノタイピングされた。最後に、ＣＢＤＢ／ＮＩＭＨ脳コレクション（以下を参照）の１１６人の個体（３４人の統合失調症患者および８２人の健康な対照者）においてＳＮＰ  Ｍ３３のジェノタイピングを行い、該個体についてはＱＰＣＲのためにＤＬＰＦＣおよび海馬から全ＲＮＡも抽出した（以下を参照）。
【０２２０】
認知能力の検査
認知能力検査によって、ＣＢＤＢの家族ベースのコホートに含まれる個体２３０〜３３０人についてデータを入手することができた。検査は、統合失調症の患者において著しく影響を受けることが示された様々な特徴、例えばＩＱ、視覚的記憶および学習記憶、注意持続時間などの評価を目指したタスクを含むものとした（Ｍ．Ｆ．Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５０：９８）。統合失調症の遺伝的リスクの増加に関連していることが示された（Ｍ．Ｆ．Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１２６０４；Ｔ．Ｅ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３１：２０２２；Ｊ．Ｈ．Ｃａｌｌｉｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０２：８６２７）９つの神経心理学的検査由来の２４個の成績スコアの要素分析から、これらの尺度の差異の６８％を説明した７つの要素が同定された（Ｇｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｈｉｚ  Ｒｅｓ（近刊））。これらの７つの要素を、認知タスクの成績（以下を参照）に対する遺伝子型の影響の評価に使用したが、該要素は：言語記憶（Ｖｅｒｂａｌ  Ｍｅｍｏｒｙ）、Ｎバック（Ｎｂａｃｋ）、視覚的記憶（Ｖｉｓｕａｌ  Ｍｅｍｏｒｙ）、処理速度（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｓｐｅｅｄ）／ＩＱ、カード分類（Ｃａｒｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）、注意力（Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ）、および数唱（Ｄｉｇｉｔ  Ｓｐａｎ）と呼ばれている。各要素に含まれる試験の尺度に関するさらに詳しい情報は表４に提供されている。
【０２２１】
統計遺伝学的分析
Ｆ−正確確率検定を使用してハーディ−ワインベルク平衡（ＨＷＥ）を検定した。単一ＳＮＰの分析は、核家族における家族ベースの関連性試験（ＦＢＡＴ）（Ｓ．Ｈｏｒｖａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ９：３０１）と、非血縁の症例対照の比較におけるＳＴＡＴＡバージョン８．２（米国テキサス州カレッジパーク）を使用したロジスティク回帰とを使用して実施した。ハプロタイプ分析は、家族についてはＦＢＡＴを使用し、非血縁の症例対照試験ではＲパッケージｈａｐｌｏ．ｓｔａｔｓ（Ｄ．Ｊ．Ｓｃｈａｉｄ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ７０：４２５）を使用して実施した。検定はすべてシミュレーションで実行され、１０００回の反復後のｐ値を表している。認知能力の中間的な表現型については単に線形回帰を使用して対照者において検定し、７つの標準化された誘導要素スコアに基づくものとした。
【０２２２】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）
ヒト脳組織をＣＢＤＢ／ＮＩＭＨ脳コレクションの一部として採取した。採取、スクリーニング、および解剖手順に関する詳細は説明済みである（Ｂ．Ｋ．Ｌｉｐｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １５：１２４５）。ＮＯＳ３（Ｈｓ００１６７１６６＿ｍ１）およびＫＣＮＨ２（ＫＣＮＨ２−１Ａ；Ｈｓ００１６５１２０＿ｍ１）に加えて３つのハウスキーピング遺伝子（ＧＵＳＢ、Ｂ２ＭおよびＰＢＧＤ）の主要な転写物のためのあらかじめ設計されたＴａｑＭａｎ  ＭＧＢアッセイ（アプライドバイオシステムズ社）を使用して、ＨＢＳ被験者のＤＬＰＦＣ（６９例が対照；３１例が統合失調症）または海馬（５９例が対照；２９例が統合失調症）から単離された１００ｎｇのｃＤＮＡ等価物における発現を計測した。カスタムＴａｑＭａｎ  ＭＧＢアッセイは、アイソフォーム３．１については該遺伝子の５’−ＵＴＲ領域を標的として設計された（Ｆ−プライマー：５’−ＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＴＴＡＴＡＴＡＣＡＴＴＡＴＧＴＧＴＡＴＣＡＣＡＡＣＡＴＣ、配列番号１８；Ｒ−プライマー：５’−ＧＣＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡ、配列番号１９；プローブ：５’−ＡＣＴＧＴＧＴＡＣＣＣＣＡＴＡＡＡＴＡＴＧＴＡ、配列番号２０）。１６人の個体（無作為に選択）由来のｃＤＮＡプールを使用して、８点の、１／２系列希釈による標準曲線を作出した。ＱＰＣＲ反応はすべて３連で実施した。
【０２２３】
ＮＯＳ３、ＫＣＮＨ２−１Ａ、およびアイソフォーム３．１アッセイの発現レベルを、ＧＵＳＢ（Ｈｓ９９９９９９０８＿ｍ１）、Ｂ２Ｍ（Ｈｓ９９９９９９０７＿ｍ１）、およびＰＢＧＤ（Ｈｓ００６０９２９７＿ｍ１）の相乗平均に対して標準化した（Ｊ．Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ３：ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３４）。データは、シャピロ−ウィルクＷ検定を使用して正規性を検定した。ＮＯＳ３のｑＰＣＲデータは非正規分布し、従ってｌｏｇ２変換されたが、ＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１のｑＰＣＲデータは正規分布した。標準化したすべての発現値を、後進ステップワイズ線形回帰を使用して様々な人口統計学的因子および試料の因子の主効果に関して検定した。検定した因子には：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）、死後脳のｐＨ、死後経過時間（ＰＭＩ）、死亡時の年齢、死戦状態、死の様態が含まれる。有意な回帰モデル係数を有する変数は、診断に関する最終的なＡＮＣＯＶＡモデルに含めた（α＝０．０５で評価）（表１０を参照）。遺伝子型および人種の影響については、人種およびＭ３３を含む別のＡＮＣＯＶＡモデルを使用して検定した。
【０２２４】
画像化の方法
被験者：本研究における画像化に参加した被験者はすべてコーカサス人であった（人口統計学的データについては表５および６を参照）。該被験者は神経学的問題、精神医学的問題、または物質濫用の問題がないことが明らかにされ、他の医学的問題の経歴または大脳の代謝および血流に関連する内科的治療歴もなかった。全ての遺伝子型群にわたって年齢、性別、ＩＱスコアおよび教育の分布に有意差はなかった。対象とする遺伝子型を備えた被験者について利用可能なすべてのスキャンがこれらの分析に使用された。
【０２２５】
構造画像処理：三次元構造的ＭＲＩのスキャンを、１．５ＴのＧＥスキャナで、１２４枚の矢状断（０．９４×０．９４×１．５ｍｍの分解能）を伴うＴ１強調ＳＰＧＲパルスシーケンス（ＴＲ／ＴＥ／ＮＥＸ２４／５／１、フリップ角４５度、マトリックスサイズ２５６×２５６、ＦＯＶ  ２４×２４ｃｍ）を使用して取得し、既述のようにして（Ｌ．Ｐｅｚａｗａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２４：１００９９）前処理し、続いてカスタマイズしたテンプレート（Ｊ．Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．Ｊ．Ｆｒｉｓｔｏｎ  ２０００  Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ  １１：８０５；Ｃ．Ｄ．Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ  １４：２１）を使用して、最適化されたＶＢＭ法を行った。得られた灰白質画像を、統計処理の前に１２ｍｍのガウスカーネルで平滑化した。解析は、ＳＰＭ２（Ｋ．Ｊ．Ｆｒｉｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｈｕｍ  Ｂｒａｉｎ  Ｍａｐｐ  ２：１８９−２１０）（ワールドワイドウェブｆｉｌ．ｉｏｎ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｓｐｍ）の一般的線形モデル（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｍｏｄｅｌ）の中のＭＡＴＬＡＢ７．０２（マスワークス（Ｍａｔｈ  Ｗｏｒｋｓ））を使用して、リナックス・ワークステーション（レッドハット（ＲｅｄＨａｔ））で実施した。本研究で使用されるものと同一のデザイン行列のスペックは、他所に詳細に記載されている（Ｌ．Ｐｅｚａｗａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２４：１００９９）。簡潔に述べると、灰白質容積に対するＫＣＮＨ２  ＳＮＰの影響を、以下の対象外の共変量すなわち：灰白質総容積、年齢の一次および二次直交多項式、および性別、を含んだ共分散分析モデルの使用により検討した。仮説に基づいて推進される関心領域（ＲＯＩ）研究方法を用いて、海馬体内の構造における遺伝子型に関連した変化を調査した。灰白質容積の変化を、海馬に対して小容積補正（ｓｍａｌｌ−ｖｏｌｕｍｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）した後に片側ｔコントラストを使用して統計的に評価した。誤検出率（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）の推定を使用して多重比較のための補正を行い、確率０．０５を有意とみなした。解剖学的な海馬のＲＯＩは、ＷＦＵ  Ｐｉｃｋ  ａｔｌａｓソフトウェア（ワールドワイドウェブｆｍｒｉ．ｗｆｕｂｍｃ．ｅｄｕ）を使用して作成した。本発明者らは、関心容積（ＶＯＩ）ＳＰＭ２ツールボックスを使用して、最も有意性の高い海馬のクラスターのピークから調整された灰白質容積測定のデータを抽出した。
【０２２６】
機能的タスク：ｆＭＲＩスキャン中に、被験者は、確実に海馬体に関与することが既に報告されている（Ａ．Ｒ．Ｈａｒｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２３：６６９０）陳述記憶タスクを実施した。パラダイムは、新規で複合的な場面の符号化およびその後の検索で構成されるものとした。４つの符号化ブロックに続いて４つの検索ブロックが、受動的なクロスヘアー固定静止状態と交互に配置されて、合計１７ブロックとなった。符号化ブロックの間、被験者は３秒間ずつ連続的に提示される６つのイメージを見て、各イメージが「屋内の」場面を表わすか「屋外」の場面を表わすかを判断した。すべての場面は中立的な感情価の場面であり、標準化されたセット（Ｐ．Ｌａｎｇ，Ｂ．Ｍ．，Ｂ．  Ｃｕｔｈｂｅｒｔ，「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｐｉｃｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＡＰＳ）：ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｍａｎｕａｌ  ａｎｄ  ａｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｒａｔｉｎｇｓ」（ＮＩＭＨ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｅｍｏｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ，Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ，ＦＬ，１９９７））に由来するものとした。その後の検索ブロックの間に、被験者は３秒間ずつ連続的に提示される６つのイメージを再び見て、各場面が「新しい」か「古い」かを判断した。各検索ブロックでは、場面の半分は「古い」（すなわち、符号化ブロックの間に提示された）もの、半分は「新しい」（すなわち、符号化ブロックの間に提示されなかった）ものとした。イメージの提示の順序は被験者全体でバランスがとれるようにした。スキャンの際には、すべての被験者は利き手でボタンを押すことにより応答し、正確さおよび反応時間の測定が可能となるようにした。
【０２２７】
機能画像の処理：
ＢＯＬＤ  ｆＭＲＩは、グラジエントエコーＥＰＩを使用して、ＧＥ  Ｓｉｇｎａ  ３Ｔスキャナで実施した（２４枚の軸位断、４ｍｍ厚、１ｍｍギャップ、ＴＲ／ＴＥ＝２０００／２８ｍｓ、ＦＯＶ＝２４ｃｍ、マトリックス＝６４×６４）。画像は、ＳＰＭ９９（ワールドワイドウェブｆｉｌ．ｉｏｎ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｓｐｍ）を使用して、これまでに報告されているようにして（Ａ．Ｒ．Ｈａｒｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２３：６６９０）処理した。簡潔に述べると、画像をスキャン実行の最初の画像に再編成し、アファイン変換および非線形変換（４×５×４基底関数）を使用して標準的定位空間（ＭＮＩテンプレート）へと空間的に標準化し、８ｍｍのＦＷＨＭガウスフィルタおよび脳全体の全体的平均に対して標準化した比を用いて平滑化した。第１レベル分析では、線形コントラストが計算されて、静止状態をベースラインと仮定して符号化および検索について各ボクセルのｔ統計パラメータマップを生成させた。これらの統計画像を第２レベルの変量効果モデル（ＡＮＯＶＡ）に入力し、遺伝子型群内および群間の有意な活性化を同定した。仮説に基づいた関心領域（ＲＯＩ）研究方法を使用して、海馬体内の機能的活動の変化に関連する遺伝子型を調査した（Ｐ＜０．０５、小容積および多重比較のために補正、海馬ＶＯＩ内でＦＷＥ）。平均ＢＯＬＤシグナル変化（％）を、有意なクラスターの中でＳＰＭ２のＭａｒｓＢａｒツールボックスを用いて抽出した（Ｍ．Ｂｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，第８回国際ヒト脳機能マッピング学会議（８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ）（Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ，１６，ａｂｓｔｒａｃｔ  ４９７，Ｓｅｎｄａｉ，Ｊａｐａｎ，  ２００２））。
【０２２８】
行動上の結果：タスクの符号化部分または検索部分のいずれの際にも、ＳＮＰそれぞれについて正確さおよび反応時間に３群間の行動上の違いはなかった。
アイソフォーム３．１のクローニングおよび発現
５’−ＲＡＣＥおよびアイソフォーム３．１のクローニング：５’−ＲＡＣＥシステム（ｖ２．０）を使用して推奨どおりに（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））５’−ＲＡＣＥを実施した。鋳型ｃＤＮＡは、１０種のヒト細胞株および組織（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））由来の市販の全ＲＮＡから作製した。エキソン５内の逆方向プライマー（５’−ＴＧＴＧＧＧＴＴＣＧＣＴＣＣＴＴＴＡＴＣ）（配列番号２１）を第１の遺伝子特異的プライマーとして、続いてエキソン４内のプライマーを最初のＰＣＲに使用した（５’−ＣＡＴＧＧＣＣＴＣＧＡＴＧＴＣＧＴＣ）（配列番号２２）。ネステッドＰＣＲは、エキソン３内のプライマー（５’−ＡＴＧＡＴＧＡＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＣＴ）（配列番号２３）を使用して実施した。ｈＥＲＧ−１Ａ（ＮＭ＿０００２３８）、ＢＣ００１９１４、およびアイソフォーム３．１に対応する３つの生成物を、ゲル精製、クローニング、および配列決定した。生成物を、１０人の統合失調症対照患者の前前頭皮質から単離およびプールされた全ＲＮＡを使用して、再び生成させた（Ｂ．Ｋ．Ｌｉｐｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １５：１２４５）。
【０２２９】
アイソフォーム３．１の３’末端を決定するために、アイソフォーム３．１の特有の領域内の順方向プライマー（５’−ＣＡＴＡＣＧＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡＡＧＴ）（配列番号２４）を使用してエキソン３〜１５に及ぶＰＣＲ生成物を生産した。生成物はすべてクローニングおよび塩基配列決定によって確認した。
【０２３０】
クローニングおよびトランスフェクション：新規なＫＣＮＨ２アイソフォーム３．１  ｃＤＮＡは、特異的プライマー（３．１Ｆ  ５’−ＣＡＴＡＣＧＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡＡＧＴ、配列番号２５；Ｅｘ１５−Ｒ  ＣＴＴＣＴＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧ、配列番号２６）および高正確性（ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＤＮＡポリメラーゼを用いたロングＰＣＲによってｐＺｅｒｏ−Ｂｌｕｎｔベクター（インビトロジェン）の中にクローニングし、次いでｐｃＤＮＡ３ベクター（インビトロジェン）にサブクローニングした。ｐＣＤＮＡ３に入ったヒトＫＣＮＨ２  ｃＤＮＡはゲイル  エイ．ロバートソン博士（Ｄｒ．Ｇａｉｌ  Ａ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）から寄贈されたものである。エキソン１および２の欠失とＫｏｚａｋ共通配列の付加とを備えたアイソフォーム３．１  ｃＤＮＡは、高正確性ＤＮＡポリメラーゼＰｆｘ（インビトロジェン）を用いたロングＰＣＲによって生成させて、ｐｃＤＮＡ３にクローニングした。ＫＣＮＨ２、アイソフォーム３．１およびｐＣＤＮＡ３ベクターでそれぞれＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、１％のプロティナーゼ阻害剤カクテル（シグマ（Ｓｉｇｍａ））およびホスファターゼ阻害剤（シグマ）を含んだＴ−ＰＥＲタンパク質抽出試薬（ピアス・ケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ））２５０μｌで溶解した。ホモジェネートのタンパク濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（米国イリノイ州ロックフォード所在のピアス・ケミカル）で測定した。すべての試料を、単離溶液で必要とされる特定濃度に希釈し、タンパク質試料ローディングバッファー（インビトロジェン）に含めて９５℃で５分間変性処理した。
【０２３１】
皮質タンパク質の抽出：ヒトの背外側前前頭皮質組織および海馬組織を組織溶解バッファー（ピアス・ケミカル）でホモジナイズした。ホモジェネートのタンパク濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（米国イリノイ州ロックフォード所在のピアス・ケミカル）で測定した。
【０２３２】
免疫沈降：２μｇの抗ＨＥＲＧ（Ｎ−２０）抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ））を、ヒトの皮質または海馬のタンパク質５００μｇと混合し、回転式振盪機で４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、２０μｌのγプロテインＧビーズ（インビトロジェン）を添加し、該混合物を回転式振盪機で４℃で１時間インキュベートした。抗原−抗体−プロテインＧビーズ複合体を、１０，０００×ｇにて４℃で３０秒間遠心することにより沈殿させた。ペレットを、洗浄バッファーで５回リンスした。５０μｌの１×試料バッファーをペレットに添加し、結合したｈＥＲＧタンパク質を解放するために９５℃で１０分間加熱した。遊離したｈＥＲＧタンパク質を、１０，０００×ｇで５分間遠心することによりビーズから分離した。ｈＥＲＧタンパク質を含んでいる上清を、同じ抗体を用いてウェスタンブロット解析するために４〜１２％の勾配ポリアクリルアミドゲルにロードした。
【０２３３】
ウェスタンブロット解析：タンパク質試料を４〜１２％の勾配プレキャストミニゲル（インビトロジェン）にロードして、トリスＮｕＰＡＧＥ（Ｒ）泳動バッファー中にて２００Ｖで３時間泳動した。ゲル中のタンパク質を、１０％メタノールを含んだＮｕＰＡＧＥトランスファーバッファー中で、１００Ｖで１．５時間かけてニトロセルロースメンブレンへトランスファーした。メンブレンを、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）−２０（ＴＢＳ−Ｔ）に含めた５％スキムミルクでブロッキングし、次にウサギ抗ｈｅｒｇ１ポリクローナル抗体（１：１，０００希釈、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））とともに４℃で一晩インキュベートした。該ブロットをＴＢＳ−Ｔでリンスし、５％の正常ヤギ血清を含むＴＢＳ−Ｔ中でペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ抗体（１：１，０００希釈、サンタクルーズ）とともに２時間インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔでリンスした。ブロットをＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（登録商標）（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））で発光検出し、コダックＢｉｏＭａｘ（Ｒ）フィルムに露光させた。スキャナを使用してフィルムをデジタル化し、得られたイメージを、ＮＩＨｉｍａｇｅＪを使用して分析した。
【０２３４】
免疫組織化学的分析：胎生期１８日目のラットから皮質を切開し、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない０．１２５％チロシン含有ＨＢＳＳの中で１５分間解離させ、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳの中で粉砕し、次にポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた１２ウェルプレート上にカバースリップ１つ当たり５，０００個として播種した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２および湿度９５％で、最初は１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭの中で、１日後に無血清培地Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）＋Ｂ２７に切り替えて、増殖させた。７日後、ｐｃＤＮＡ３．０ベクターに含めたＫＣＮＨ２、アイソフォーム３．１またはベクター単独で皮質ニューロンをトランスフェクトした。その後、トランスフェクトした細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した。切片を、１：２００の抗ＫＣＮＨ２（ｈＥＲＧ）ウサギ抗体（ケミコンインターナショナル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））で二重標識した。一次抗体を一晩適用し（４℃）、次いで組織をＨＳＰＢＳでリンスした。使用した二次抗体はＡｌｅｘａ−４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧであり、室温で１時間適用した。その後、組織を再びリンスし、次いで退色防止封入剤で封入した。ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  ５１０）を使用して共焦点画像を得た。
【０２３５】
電気生理学的解析
細胞培養および一過性トランスフェクション：ＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１のｃＤＮＡを上述のようにしてクローニングおよびサブクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で５０％コンフルエントにプレート培養した。プレート播種時に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（インビトロジェン）を使用して、製造業者のプロトコールを用いてＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１のｃＤＮＡ構築物でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を視覚化するために、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））ＤＮＡをコトランスフェクトした。２〜４日間トランスフェクトされた細胞を、電気生理学的解析に使用した。胎生期１８日目（Ｅ１８）のラットから分離した皮質ニューロンを、最初にアマクサ（Ａｍａｘａ）提供の説明書に従ってアイソフォーム３．１およびＥＧＦＰのｃＤＮＡでヌクレオフェクト（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔ）した。該細胞を、３５ｍｍディッシュ１枚当たり細胞１００万個となるように１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに含めて播種し、次いで翌日に、Ｂ２７（インビトロジェン）、ｇｌｕｔａｍａｘ（登録商標）Ｉ（インビトロジェン）が補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に移した。１１〜１５日間増殖させたニューロンを電気生理学的解析に使用した。
【０２３６】
細胞培養物タンパク質の抽出：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＫＣＮＨ２−１Ａおよびアイソフォーム３．１のＤＮＡ構築物を用いたトランスフェクションの４８時間後に、プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ）およびホスファターゼ阻害剤カクテル（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））が補充されたＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）で溶解させた。タンパク濃度をブラッドフォード・アッセイ（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））によって測定した。タンパク質を、上述のようなウェスタンブロット法によって解析した。
【０２３７】
電気生理学的記録：カバーグラス上のトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞および皮質ニューロンを、倒立顕微鏡（Ｄｉａｐｈｏｔ、ニコン）のステージ上に取り付けられた小型細胞浴槽に移し、蛍光顕微鏡下でＧＦＰ陽性として同定し、１３７ｍＭのイセチオン酸ナトリウム、４ｍＭのグルコン酸カリウム、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコースを含んでいる細胞外生理食塩水（ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４）で表面かん流した。標準的な全細胞記録（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）を室温で実施した。記録用ピペットは、１３０ｍＭのグルコン酸カリウム、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＭｇＡＴＰ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび０．４ｍＭのＮａ２ＧＴＰを含むピペット内液（ＫＯＨを用いてｐＨ７．２）で充填され、抵抗は２〜４ＭΩであった。データをパッチクランプ増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ）によって収集し、ｐＣｌａｍｐ  ９．０ソフトウェア（モレキュラー・ディバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、米国カリフォルニア州サニーヴェール）で分析した。全細胞法の配置が達成された後、直列抵抗を８０〜９０％補償し、周期的にモニターした。ほとんどの培養皮質ニューロンは、７〜８ＭΩ付近（範囲は４〜１３ＭΩ）の直列抵抗を有していた。−５０ｍＶ未満の静止膜電位を有するか、または膜電位、入力抵抗もしくは活動電位振幅が徐々に変化するごく一部の皮質ニューロンは不健康とみなして廃棄した。ｐＣｌａｍｐから得られた電圧プロトコールを、パッチ・ピペットを介して電圧固定条件下のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に提供した。チャネルの脱活性化に起因するＨＥＫ細胞の「末尾」電流の減衰は、単一指数方程式Ｉ（ｔ）＝Ｉ１［ｅｘｐ（−ｔ／τ）］＋Ｉ０（式中、Ｉ（ｔ）は時間ｔにおける電流の合計、Ｉ１は最初の振幅、τは脱活性化時定数、Ｉ０は不活性化しない残余電流である）によってフィッティングした。皮質ニューロンについては、二重指数方程式を用いてτ１およびτ２を得た。電流固定記録も実施した。脱分極化電流ステップを、複合活動電位を引き起こすために導入した。スパイク頻度（スパイク数／脱分極時間（秒））および順応の程度（最初のスパイク間隔と最後のスパイク間隔との比）の両方を計算した。
【０２３８】
本発明について、明瞭性および理解を目的としてかなり詳細に説明してきたが、当業者には当然のことながら、本発明の正確な範囲から逸脱することなく形態および細部に様々な変更を行なうことが可能である。上記に引用されたすべての図面、表および付録、ならびに特許、特許出願および出版物は、参照によって本願に組込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２Ａ１】
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【図１２Ａ２】
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【図１２Ａ３】
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【図１２Ｂ１】
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【図１２Ｂ２】
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【図１２Ｂ３】
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【図１２Ｃ１】
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【図１２Ｃ２】
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【図１２Ｃ３】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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