(57)【要約】  本発明の開示により、配列番号５に記載されるアミノ酸配列ＨＷＲＲを含む単離されたペプチドであって、ペプチドが４個または５個のアミノ酸からなる単離されたペプチドが提供される。また、本発明の開示により、本発明のペプチド、または本発明のペプチドを含む医薬組成物を使用して、血管形成に関連する病状（例えば、異常に増大された血管形成に関連する病状および不十分な血管形成に関連する病状）を処置する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５に記載されるアミノ酸配列ＨＷＲＲを含む単離されたペプチドであって、ペプチドが４個または５個のアミノ酸からなる単離されたペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列は、ＨＷＲＲＰ（配列番号７）またはＨＷＲＲＡ（配列番号８）である、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
配列番号５に記載されるアミノ酸配列ＨＷＲＲを含む単離されたペプチドであって、ペプチドが配列番号１１（ＹＰＨＩＤＳＬＧＨＷＲＲ）ではない、単離されたペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列は配列番号２に記載される、請求項３に記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列は配列番号３に記載される、請求項３に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸配列は配列番号４に記載される、請求項３に記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
ペプチドは線状ペプチドである、請求項１〜６のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項８】
ペプチドは環状ペプチドである、請求項１〜６のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項９】
ペプチドは１２個以下のアミノ酸からなる、請求項３〜８のいずれかに記載の単離されたペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９に記載のペプチドの少なくとも１種を含む組成物。
【請求項１１】
有効成分として請求項１〜９に記載のペプチドを少なくとも１種を含み、かつ医薬的に許容されうるキャリアまたは希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
対象において血管形成を誘導する方法であって、対象に治療有効量の請求項１〜９に記載のペプチドの少なくとも１種を投与することを含み、それによって対象において血管形成を誘導する方法。
【請求項１３】
対象の組織において血管形成を誘導するために特定される医薬の製造のための、請求項１〜９に記載のペプチドの少なくとも１種の使用。
【請求項１４】
遅発性の創傷治癒、遅発性の潰瘍治癒、生殖関連障害、動脈硬化症、虚血性の血管疾患、虚血性の心臓疾患、心筋虚血、心筋梗塞、心不全、心筋機能不全、心筋再造形、心筋症、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、アテローム硬化性心臓血管疾患、左主冠状動脈疾患、閉塞性動脈疾患、末梢虚血、末梢血管疾患、腎臓の血管疾患、末梢動脈疾患、四肢虚血、重篤な脚の虚血、下肢の虚血、脳虚血、脳血管疾患、網膜症、網膜修復、再造形障害、フォン・ヒッペル−リンダウ症候群、糖尿病、遺伝性出血性毛細管拡張症、虚血性の血管疾患、バーガー病、ならびにパーキンソン病およびアルツハイマー病のような神経変性疾患と関連する虚血からなる群から選択される病状を処置するために特定される医薬の製造のための、請求項１〜９に記載のペプチドの少なくとも１種の使用。
【請求項１５】
対象の組織における不十分な血管形成によって特徴付けられる病状を処置する方法であって、対象に治療有効量の請求項１〜９に記載のペプチドを少なくとも１種投与することを含み、それによって対象の組織における不十分な血管形成によって特徴付けられる病状を処置する方法。
【請求項１６】
対象の組織における不十分な血管形成によって特徴付けられる病状を処置するために特定される医薬の製造のための請求項１〜９に記載のペプチドの少なくとも１種の使用。
【請求項１７】
対象の組織における不十分な血管形成によって特徴付けられる病状は、遅発性の創傷治癒、遅発性の潰瘍治癒、生殖関連障害、動脈硬化症、虚血性の血管疾患、虚血性の心臓疾患、心筋虚血、心筋梗塞、心不全、心筋機能不全、心筋再造形、心筋症、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、アテローム硬化性心臓血管疾患、左主冠状動脈疾患、閉塞性動脈疾患、末梢虚血、末梢血管疾患、腎臓の血管疾患、末梢動脈疾患、四肢虚血、重篤な脚の虚血、下肢の虚血、脳虚血、脳血管疾患、網膜症、網膜修復、再造形障害、フォン・ヒッペル−リンダウ症候群、糖尿病、遺伝性出血性毛細管拡張症、虚血性の血管疾患、バーガー病ならびにパーキンソン病およびアルツハイマー病のような神経変性疾患と関連する虚血からなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の方法または使用。
【請求項１８】
遅発性の創傷治癒、遅発性の潰瘍治癒、生殖関連障害、動脈硬化症、虚血性の血管疾患、虚血性の心臓疾患、心筋虚血、心筋梗塞、心不全、心筋機能不全、心筋再造形、心筋症、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、アテローム硬化性心臓血管疾患、左主冠状動脈疾患、閉塞性動脈疾患、末梢虚血、末梢血管疾患、腎臓の血管疾患、末梢動脈疾患、四肢虚血、重篤な脚の虚血、下肢の虚血、脳虚血、脳血管疾患、網膜症、網膜修復、再造形障害、フォン・ヒッペル−リンダウ症候群、糖尿病、遺伝性出血性毛細管拡張症、虚血性の血管疾患、バーガー病ならびにパーキンソン病およびアルツハイマー病のような神経変性疾患と関連する虚血からなる群から選択される病状を処置するための、請求項１２または１３に記載の方法または使用。
【請求項１９】
前記ペプチドは、組織の内皮細胞上で配列番号９に記載されるグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８）に結合することができる、請求項１〜１８のいずれかに記載の、単離されたペプチド、組成物、医薬組成物、方法、または使用。
【請求項２０】
前記配列番号９に記載されるグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８）への前記ペプチドの結合は、血管形成を誘導することができる、請求項１〜１９のいずれかに記載の、単離されたペプチド、組成物、医薬組成物、方法、または使用。
【請求項２１】
薬剤を内皮細胞に対して標的化するための組成物であって、請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドに結合された薬剤を含む組成物。
【請求項２２】
薬剤は、毒素、化学療法剤、および放射性同位体からなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
有効成分として請求項２１または２２に記載の組成物を含み、かつ医薬的に許容されうるキャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項２４】
異常に増大された血管形成によって特徴付けられる病状を処置するための方法であって、その処置を必要とする対象に治療有効量の請求項２１または２２に記載の組成物を投与することを含み、それによって異常に増大された血管形成によって特徴付けられる病状を処置する方法。
【請求項２５】
異常に増大された血管形成によって特徴付けられる病状の処置のために特定される医薬の製造のための請求項２１または２２に記載の組成物の使用。
【請求項２６】
前記病状は、癌、転移性癌、脊髄形成異常、全身性肥満細胞症（ＳＭ）、網膜の新生血管形成、アテローム動脈硬化性斑における新生血管形成、血管腫、関節炎、および乾癬からなる群から選択される、請求項２４または２５に記載の方法または使用。
【請求項２７】
推定血管形成分子を同定する方法であって、
（ａ）請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドが結合した内皮細胞を準備すること、および
（ｂ）前記ペプチドを前記内皮細胞から脱離させることができる分子を同定することを含み、それによって推定血管形成分子を同定する方法。
【請求項２８】
推定血管形成分子を同定する方法であって、
（ａ）請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドを、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８）またはＧＲＰ７８を発現する細胞と共に、ペプチドとＧＲＰ７８またはＧＲＰ７８を発現する細胞の間での複合体の形成に好適な条件下でインキュベートすること、および
（ｂ）ペプチドを前記複合体から脱離させることができる分子を同定し、それによって推定血管形成分子を同定する
ことを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
血管形成は、新しい毛細血管を生じさせるプロセスであり、細胞と可溶性因子との間の相互作用を含む。従って、活性化された内皮細胞が遊走し、増殖して新しい血管を形成し、その血管が内皮周囲細胞の層によって囲まれる；小さい血管は周皮細胞によって囲まれ、大きい血管は平滑筋細胞によって囲まれる。
【０００２】
多数の因子が、血管形成を調節することが知られている。これらの因子には、可溶性因子および組織の酸素が含まれる。血管形成を積極的に調節することが知られている因子には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性ＦＧＦ／ＦＧＦ−１および低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）が含まれる。低酸素症は、エリスロポイエチン、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、および解糖酵素のようないくつかの遺伝子産物の発現を誘導する。
【０００３】
血管形成依存性の病状は、血管形成の調節障害、すなわち、過剰な量の新しい血管または不十分な数の血管をもたらす。不十分な血管形成は、冠状動脈疾患、遅発性の創傷治癒、遅発性の潰瘍治癒、生殖関連障害、動脈硬化症、心筋虚血、末梢虚血、脳虚血、網膜症、再造形障害、フォン・ヒッペル−リンダウ症候群、糖尿病および遺伝性出血性毛細管拡張症のような多数の疾患および状態に関連づけられる。一方、過剰の血管形成は、癌細胞および癌転移に特有である。
【０００４】
虚血性疾患（例えば、重篤な四肢の虚血、冠状動脈疾患のような末梢動脈の疾患）の一般的な処置は、動脈導管および静脈導管を冠状動脈樹への移植片として使用する経皮技術またはバイパス手術による機械的な血管再生を含む。しかしながら、これらの処置様式は、散在性アテローム硬化性疾患または重症の小血管冠状動脈疾患を有する人において、糖尿病患者において、ならびに、手術的処置または経皮的処置を既に受けている人において、著しく制限される。これらの理由のために、新しい血管成長を刺激することを目指した治療的血管形成が非常に望ましい。
【０００５】
血管形成治療の治療的概念は、血管組織に固有の血管成長のために存在する潜在的可能性が、新しい血管の発達を適切な血管形成分子の影響下で誘導するために利用されることができるという前提に基づいている。
【０００６】
動物研究は、外因性の血管形成化合物によって、急性虚血および慢性虚血の実験モデルにおいて側副の潅流および機能を高めることの実現可能性を立証している（Ｓｕｎ  Ｑ，Ｃｈｅｎ  ＲＲ，Ｓｈｅｎ  Ｙ，Ｍｏｏｎｅｙ  ＤＪ，Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ  Ｓ，Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ＰＭ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｈｉｎｄ  ｌｉｍｂ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２００５；２２，１１１０−６）。加えて、ヒトのＦＧＦおよびＶＥＧＦタンパク質の一部を包含する合成ペプチドが、増殖因子ファミリーメンバーの生物学的機能を効率的にアゴナイズまたはアンタゴナイズすることが記載された。さらに、ランダムな１２量体ペプチドのコンビナトリアルファージディスプレーライブラリーのスクリーニングは、内皮細胞の細胞表面に結合し、かつ内皮細胞の増殖および血管新生を含む血管形成プロセスを誘発することができる特定のペプチドの単離を生じた（本発明者らのＰＣＴ公開公報ＷＯ２００５／０３９６１６）。
【０００７】
タンパク質分解酵素のＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ：Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）ファミリーのメンバーは、細胞表面受容体から増殖因子およびサイトカインに及ぶ多くの単一膜貫通型結合タンパク質の加工に関与している。ＡＤＡＭタンパク質におけるディスインテグリンドメインは、インテグリン結合上の細胞外タンパク質（ＥＣＭ）に匹敵する。従って、ＡＤＡＭタンパク質は、多くの生理学的および病理生理学的な状態において、細胞／ＥＣＭ相互作用および細胞／細胞相互作用の調節に関与すると考えられる。加えて、ＡＤＡＭタンパク質における保存されたメタロプロテアーゼドメインは、生物学的に重要な細胞表面タンパク質の脱落に関与すると考えられる。従って、ＡＤＡＭプロテアーゼが、外部ドメインを脱落させることおよびＥＣＭを再造形することによって細胞遊走を促進できることが示唆された（Ｔｒｏｃｈｏｎ  Ｖら、１９９８）。
【０００８】
ＡＤＡＭ１５（メタージディン（ｍｅｔａｒｇｉｄｉｎ）としても知られる）は、膜固定型の糖タンパク質であり、細胞−細胞相互作用または細胞−マトリクス相互作用、および細胞表面または細胞外マトリクス上の分子のタンパク質分解に関与している。ＡＤＡＭ１５の発現レベルは、血管細胞、心内膜、アテローム硬化性病変、リウマチ様組織、軟骨肉腫、ならびに心房細動および心房拡張のような広範囲な再造形によって特徴付けられる多くの組織および状態において高められることが見出された。加えて、ＡＤＡＭ１５は、ヒトの大動脈平滑筋および培養されたヒトの臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において発現され、ＡＤＡＭ１５遺伝子は、いくつかの型の癌において増幅されるヒト染色体バンド１ｑ２ｌ．３に局在した。
【０００９】
新生血管形成におけるＡＤＡＭ１５の考えられうる役割は、ＡＤＡＭ１５遺伝子を欠くマウス（すなわち、ＡＤＡＭ１５ノックアウトマウス）において研究された。ＡＤＡＭ１５ノックアウトマウスは、野生型コントロールに比べて新生血管形成の大きな減少を示し（Ｂｏｈｍ  ＢＢ，Ａｉｇｎｅｒ  Ｔ，Ｒｏｙ  Ｂ  Ｂｒｏｄｉｅ  ＴＡ，Ｂｌｏｂｅｌ  ＣＰ  Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ  Ｈ；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２００５  ５２，４  １１００−９）；低酸素誘導された増殖性網膜症のモデルにおける大きく減少された血管形成応答を示し；そして、黒色腫細胞の移植後に発達する有意に小さい腫瘍を示す。新生血管形成の関連におけるＡＤＡＭ１５に対する特定の候補基質には、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ４、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥ−カドヘリン、ＴＩＥ−２、膜型１  ＭＭＰ、あるいは、Ｋｉｔリガンドが含まれる。他方では、ＡＤＡＭ１５は、ＶＥＧＦ媒介血管形成のために必要とされることが知られている造血Ｓｒｃファミリーキナーゼとの強力かつ特異的な相互作用を示すが、ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦのいずれもＨＵＶＥＣにおけるＡＤＡＭ１５発現の変化を誘導しない。
【００１０】
特定の抗体またはメタロプロテアーゼ阻害剤ＢＢ３１０３によるＡＤＡＭ１５の阻害は、ヒト糸球体間質の細胞遊走の妨害を生じ、メタロプロテアーゼ活性がこのプロセスについて不可欠であることを示唆した。
【００１１】
グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８）（ＨＳＰＡ５またはＢｉＰとしても知られる）は、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）ファミリーのメンバーであり、分子シャペロンとして作用する高度に保存された分子であり、小胞体（ＥＲ）におけるタンパク質の折りたたみおよび組み立てに関与する。ＧＲＰ７８は、薬物耐性肺癌細胞株においてアップレギュレートされ、その発現レベルは微細血管密度（ＭＶＤ）に対して逆に相関することが見出された［Ｋｏｏｍａｑｉ  Ｒ．ら、１９９９；Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９（５Ｂ）：４３３３−６］。対照的に、小さな干渉性ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を用いるＧＲＰ７８の阻害は、ヒト乳癌細胞のエトポシド媒介細胞死に対する感作をもたらした［Ｄｏｎｇ  Ｄ．ら、２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（１３）：５７８５−９１］。他方、ＥＲストレス応答タンパク質ＧＲＰ７８の発現レベルと低酸素またはＥＲストレスに対する耐性の間には相関は見出されなかった［Ｋｏｓｈｉｋａｗａ  Ｎ．ら、２００６，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５（６）：９１７−２８］。最近、ＧＲＰ７８は、増殖性内皮細胞およびストレスが与えられた腫瘍細胞の細胞表面上にさらされ、Ｋｒｉｎｇｌｅ５（Ｋ５）の抗血管形成活性および抗腫瘍活性において重要な役割を果たすことが見出された［Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＤＪ．ら、２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（１１）：４６６３−７２］。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の１つの側面によれば、配列番号５に記載されるアミノ酸配列ＨＷＲＲを含む単離されたペプチドであって、ペプチドが４個または５個のアミノ酸からなる単離されたペプチドが提供される。
【００１３】
本発明の別の側面によれば、配列番号５に記載されるアミノ酸配列ＨＷＲＲを含む単離されたペプチドであって、ペプチドが配列番号１１（ＹＰＨＩＤＳＬＧＨＷＲＲ）ではない単離されたペプチドが提供される。
【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、少なくとも１種の本発明のペプチドを含む組成物が提供される。
【００１５】
本発明のさらに別の側面によれば、有効成分として少なくとも１種の本発明のペプチドを含み、かつ医薬的に許容されうるキャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物が提供される。
【００１６】
本発明の追加の側面によれば、対象において血管形成を誘導する方法であって、対象に治療有効量の少なくとも１種の本発明のペプチドを投与することを含み、それによって対象において血管形成を誘導する方法が提供される。
【００１７】
本発明のさらに追加の側面によれば、対象の組織において血管形成を誘導するために特定される医薬の製造のための少なくとも１種の本発明のペプチドの使用が提供される。
【００１８】
本発明のさらに追加の側面によれば、遅発性の創傷治癒、遅発性の潰瘍治癒、生殖関連障害、動脈硬化症、虚血性の血管疾患、虚血性の心臓疾患、心筋虚血、心筋梗塞、心不全、心筋機能不全、心筋再造形、心筋症、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、アテローム硬化性心臓血管疾患、左主冠状動脈疾患、閉塞性動脈疾患、末梢虚血、末梢血管疾患、腎臓の血管疾患、末梢動脈疾患、四肢虚血、重篤な脚の虚血、下肢の虚血、脳虚血、脳血管疾患、網膜症、網膜修復、再造形障害、フォン・ヒッペル−リンダウ症候群、糖尿病、遺伝性出血性毛細管拡張症、虚血性の血管疾患、バーガー病、ならびにパーキンソン病およびアルツハイマー病のような神経変性疾患と関連する虚血からなる群から選択される病状を処置するために特定される医薬の製造のための少なくとも１種の本発明のペプチドの使用が提供される。
【００１９】
本発明のさらなる側面によれば、対象の組織における不十分な血管形成によって特徴付けられる病状を処置する方法であって、対象に治療有効量の少なくとも１種の本発明のペプチドを投与することを含み、それによって対象の組織における不十分な血管形成によって特徴付けられる病状を処置する方法が提供される。
【００２０】
本発明のさらなる側面によれば、対象の組織における不十分な血管形成によって特徴付けられる病状を処置するために特定される医薬の製造のための少なくとも１種の本発明のペプチドの使用が提供される。
【００２１】
本発明のさらなる側面によれば、薬剤を内皮細胞に対して標的化するための組成物であって、本発明のペプチドに結合された薬剤を含む組成物が提供される。
【００２２】
本発明のさらなる側面によれば、有効成分として本発明の組成物を含み、かつ医薬的に許容されうるキャリアまたは希釈剤を含む医薬組成物が提供される。
【００２３】
本発明のさらなる側面によれば、異常に増大された血管形成によって特徴付けられる病状を処置するための方法であって、その処置を必要とする対象に治療有効量の本発明の組成物を投与することを含み、それによって異常に増大された血管形成によって特徴付けられる病状を処置する方法が提供される。
【００２４】
本発明のさらなる側面によれば、異常に増大された血管形成によって特徴付けられる病状の処置のために特定される医薬の製造のための本発明の組成物の使用が提供される。
【００２５】
本発明のさらなる側面によれば、推定血管形成分子を同定する方法であって、（ａ）本発明のペプチドが結合した内皮細胞を準備すること、および（ｂ）ペプチドを内皮細胞から脱離させることができる分子を同定することを含み、それによって推定血管形成分子を同定する方法が提供される。
【００２６】
本発明のさらなる側面によれば、推定血管形成分子を同定する方法であって、（ａ）本発明のペプチドを、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８）またはＧＲＰ７８を発現する細胞と共に、ペプチドとＧＲＰ７８またはＧＲＰ７８を発現する細胞の間での複合体の形成に好適な条件下でインキュベートすること、および（ｂ）ペプチドを複合体から脱離させることができる分子を同定することを含み、それによって推定血管形成分子を同定する方法が提供される。
【００２７】
以下に記載される本発明の実施形態におけるさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は、ＨＷＲＲＰ（配列番号７）またはＨＷＲＲＡ（配列番号８）である。
【００２８】
記載される実施形態におけるさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は配列番号２に記載される。
【００２９】
記載される実施形態におけるさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は配列番号３に記載される。
【００３０】
記載される実施形態におけるさらなる特徴によれば、アミノ酸配列は配列番号４に記載される。
【００３１】
記載される実施形態におけるさらなる特徴によれば、ペプチドは線状ペプチドである。
【００３２】
記載される実施形態におけるさらなる特徴によれば、ペプチドは環状ペプチドである。
【００３３】
記載される実施形態におけるさらなる特徴によれば、ペプチドは１２個以下のアミノ酸からなる。
【００３４】
記載される実施形態におけるさらなる特徴によれば、対象の組織における不十分な血管形成によって特徴付けられる病状は、遅発性の創傷治癒、遅発性の潰瘍治癒、生殖関連障害、動脈硬化症、虚血性の血管疾患、虚血性の心臓疾患、心筋虚血、心筋梗塞、心不全、心筋機能不全、心筋再造形、心筋症、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、アテローム硬化性心臓血管疾患、左主冠状動脈疾患、閉塞性動脈疾患、末梢虚血、末梢血管疾患、腎臓の血管疾患、末梢動脈疾患、四肢虚血、重篤な脚の虚血、下肢の虚血、脳虚血、脳血管疾患、網膜症、網膜修復、再造形障害、フォン・ヒッペル−リンダウ症候群、糖尿病、遺伝性出血性毛細管拡張症、虚血性の血管疾患、バーガー病ならびにパーキンソン病およびアルツハイマー病のような神経変性疾患と関連する虚血からなる群から選択される。
【００３５】
記載される実施形態におけるさらなる特徴によれば、本発明の方法または使用は、遅発性の創傷治癒、遅発性の潰瘍治癒、生殖関連障害、動脈硬化症、虚血性の血管疾患、虚血性の心臓疾患、心筋虚血、心筋梗塞、心不全、心筋機能不全、心筋再造形、心筋症、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、アテローム硬化性心臓血管疾患、左主冠状動脈疾患、閉塞性動脈疾患、末梢虚血、末梢血管疾患、腎臓の血管疾患、末梢動脈疾患、四肢虚血、重篤な脚の虚血、下肢の虚血、脳虚血、脳血管疾患、網膜症、網膜修復、再造形障害、フォン・ヒッペル−リンダウ症候群、糖尿病、遺伝性出血性毛細管拡張症、虚血性の血管疾患、バーガー病ならびにパーキンソン病およびアルツハイマー病のような神経変性疾患と関連する虚血からなる群から選択される病状を処置するための方法または使用である。
【００３６】
記載される実施形態におけるさらなる特徴によれば、ペプチドは、組織の内皮細胞上で配列番号９に記載されるグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８）に結合することができる。
【００３７】
記載される実施形態におけるさらなる特徴によれば、配列番号９に記載されるグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８）へのペプチドの結合は、血管形成を誘導することができる。
【００３８】
記載される実施形態におけるさらなる特徴によれば、薬剤は、毒素、化学療法剤、および放射性同位体からなる群から選択される。
【００３９】
記載される実施形態におけるさらなる特徴によれば、病状は、癌、転移性癌、脊髄形成異常、全身性肥満細胞症（ＳＭ）、網膜の新生血管形成、アテローム動脈硬化性斑における新生血管形成、血管腫、関節炎、および乾癬からなる群から選択される。
【００４０】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００４１】
本明細書において使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」またはその文法上の変化形は、記述されている特徴、数値、工程または成分を特定しているとみなすべきであるが、１つ以上の追加の特徴、数値、工程、成分またはそれらの群を追加することを妨げない。この用語は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を包含する。
【００４２】
語句「から本質的になる」またはその文法上の変化形は、本明細書中で使用する場合、記述された特徴、数値、工程または成分を特定しているとみなすべきであるが、１つ以上の追加の特徴、数値、工程、成分またはそれらの群を追加することを妨げない。しかし追加の特徴、数値、工程、成分またはそれらの群が、特許請求されている組成物、装置または方法の基本的な新規の特徴を著しく変えない場合だけである。
【００４３】
用語「方法」は、与えられたタスクを達成するための様式、手段、技術および手順を意味し、限定されないが、バイオテクノロジーの分野の当業者に知られているかまたはその当業者が既知の様式、手段、技術および手順から容易に開発する方式、手段、技術および手順を含んでいる。
【００４４】
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施形態を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ＡＤＡＭ１５分子によって代表されるＡＤＡＭファミリーメンバーのドメイン構造を示す概略図である。ＡＤＡＭタンパク質は、典型的には、ｐｒｏドメイン（ＰＲＯ）、メタロプロテアーゼドメイン（ＭＰ）、およびディスインテグリンドメイン（Ｄ）を含有し、これは細胞外マトリクス（ＥＣＭ）においても見出されるトリペプチドＲＧＤモチーフを含み、別個のインテグリンに対するＡＤＡＭの特異性および親和性を決定する。ＡＤＡＭタンパク質はまた、システインリッチ（Ｃ）領域、ＥＧＦ様ドメイン、および膜貫通セグメント（ＴＭ、黒色）を、細胞質テイル（ｔａｉｌ）と共に含む。ｐｒｏドメインが除去されると、メタロプロテアーゼドメインが活性化される。ｐｒｏドメインは、酵素を不活性な状態に保つ。ｐｒｏドメインの除去は、ｐｒｏ−ホルモン変換酵素の作用によってか、または自触反応によってかのいずれかで起こる。
【図２ａ】図２ａは、ＡＤＡＭ１５タンパク質ドメインを示す。ＡＤＡＭ１５タンパク質ドメインのアミノ酸位置は、配列番号１に記載のポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  Ｑ１３４４４）に言及する。
【図２ｂ】図２ｂは、ＡＤＡＭ１５タンパク質のアミノ酸配列を示す。太字の文字は、メタロプロテアーゼドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、およびＥＧＦ様ドメインを示す。下線の文字は、アミノ酸２８６−２９７に相当し、メタロプロテアーゼドメインにのみ存在し、ディスインテグリン様ドメイン、およびＥＧＦ様ドメインには存在しないＡＤＯＰｅｐ１ペプチドに言及する。
【図３】図３は、ＡＤＡＭ１５由来ペプチド（配列番号２）であるビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１（ＡＤＯＰｅｐ１Ｂｉｏｔ）の、通常酸素下での内皮細胞（ＥＣ）に対する結合（パーセント）を示すＦＡＣＳ分析である。０．０５、０．５および５マイクログラム／ｍｌ（μｇ／ｍｌ）のビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１が、内皮細胞に添加された。内皮細胞に対するＡＤＯＰｅｐ１の結合の増加は、用量依存的な様式で約６２％に到達し、５μｇ／ｍｌで最大であったことに注目されたい。
【図４】図４は、通常酸素条件および低酸素条件下での内皮細胞に対するビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１の結合（総数）を示すＦＡＣＳ分析である。１００，０００個の細胞あたり５マイクログラムで添加されたＡＤＯＰｅｐ１の内皮細胞に対する結合が、低酸素下で増大したことに注目されたい。Ｘ軸−結合の強度。
【図５】図５は、ＡＤＯＰｅｐの濃度の関数としての細胞増殖を示すグラフである。低酸素条件下での内皮細胞（ＥＣ）の増殖は、［Ｈ３］チミジン取り込みによって測定された。最小増殖培地中の内皮細胞（１２，０００個／ウェル）は、１、１０、および１００ｎｇ／ｍｌのＡＤＯＰｅｐ１ペプチド（配列番号２；赤色菱形）、ＡＤＯＰｅｐ２ペプチド（配列番号３；青色四角形）、およびＡＤＯＰｅｐ３ペプチド（配列番号４；緑色三角形）の存在下でインキュベートされた。ＡＤＯＰｅｐ１が、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で低酸素条件下で内皮細胞の増殖を誘導したことに注目されたい。
【図６】図６は、低酸素条件下での内皮細胞の遊走を示すグラフである。内皮細胞（２５，０００個）は、遊走チャンバにおいて補充物不含の内皮細胞増殖培地中でインキュベートされた。ＡＤＯＰｅｐ１（配列番号２）、ＡＤＯＰｅｐ２（配列番号３）、およびＡＤＯＰｅｐ３（配列番号４）は、５時間の低酸素の間、１，１０、および１００ｎｇ／ｍｌで、遊走キットの給餌トレイに添加された。結果は、蛍光ＥＬＩＳＡ読み取り機によって決定され、相対蛍光単位における遊走割合の増加として表示された。ＡＤＯＰｅｐ１が、１０ｎｇ／ｍｌで遊走の割合の増加を誘導したことに注目されたい。
【図７】図７は、Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ血流分析計によりマウス虚血性後肢モデルにおいて決定された血液潅流を示すグラフであり、虚血性マウス後肢における血液潅流の回復に対するＡＤＯＰｅｐの生体内活性を示す。マウス後肢モデルは、Ｃ５７Ｂｌマウス後肢の大腿動脈の切除によって作成され、非手術肢はコントロールとして役立てた。ＡＤＯＰｅｐ１（配列番号２；赤色記号）およびＡＤＯＰｅｐ３（配列番号４；緑色記号）は、０．１マイクログラム／マウス（四角形）および１マイクログラム／マウス（円形）で手術の１日後に筋肉内注射された。ＰＢＳ（黒色菱形）の注射は、コントロールとして役立てた。血流は、Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒを使用して、直後（Ｔ０）または術後７日目（Ｔ７）、１４日目（Ｔ１４）、および２１日目（Ｔ２１）に測定された。各肢の平均潅流が決定され、潅流率［相対潅流（虚血性の左脚／コントロールの右脚）として表現される］が時間に対してプロットされた。術後２１日目に、０．１マイクログラムのＡＤＯＰｅｐ１で処置したマウスの肢における血液潅流の有意な増加（ｐ＜０．０５）に注目されたい。
【図８】図８は、ＡＤＯＰｅｐ１で処置された虚血性後肢における血管形成の組織学的評価を示すグラフである。マウスは、後肢結紮および図７に記載されるようなＡＤＯＰｅｐ投与に供され、後肢結紮の後に記された日数（０日目、７日目、１４日目、および２１日目）で、マウスは犠牲にされ、脚はパラフィン中に包埋された。切片は、抗フォン・ヴィレブランド因子で染色され、第ＶＩＩＩ因子陽性血管の数がＩｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアを使用して決定された。示されているのは、ＡＤＯＰｅｐ１で処置されたマウス後肢虚血の組織学的切片における平方ミリメートルあたりの毛細血管の数として表される、（サンプルあたり１０個の独立した顕微鏡視野の）平均血管密度である。ＡＤＯＰｅｐ１の注射後の虚血性後肢の血管密度の有意な増加に注目されたい。
【図９】図９ａ−ｂは、ＡＤＯＰｅｐ１（図９ａ）またはＰＢＳ（図９ｂ）の注射後２１日目の、マウス後肢虚血のフォン・ヴィレブランド因子免疫染色に供された組織学的切片の顕微鏡画像である。コントロール（図９ｂ）と比べてＡＤＯＰｅｐ１処置群（図９ａ）における小血管の有意に高いフォン・ヴィレブランド因子染色に注目されたい。倍率  ×２００。
【図１０】図１０ａ−ｂは、低酸素下で細胞から得られ、かつビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１での細胞の免疫沈降（ＩＰ）の前（図１０ａ）および後（図１０ｂ）で分析された、内皮細胞溶解物のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）のクマシーブルー染色の画像である。図１０ａ−レーン１−ＩＰ前の内皮細胞溶解物；レーン２−分子量マーカー；図１０ｂ−レーン３−ＡＤＯＰｅｐ１でのＩＰ内皮細胞溶解物。ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１でのＩＰ後の７８ｋＤａの主要な単一タンパク質バンドに注目されたい。
【図１１】図１１は、通常酸素条件および低酸素条件下でのビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１での内皮細胞溶解物の免疫沈降のウェスタンブロット分析である。ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１でのニトロセルロース膜の染色後の化学発光基質の添加は、７８ｋＤａでバンドを示し、それは質量分析法によってＧＲＰ７８タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＣＡＢ７１３３５；配列番号９）としてさらに同定された。レーン１−ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１での通常酸素下での内皮細胞溶解物のＩＰ；レーン２−ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１での低酸素下での内皮細胞溶解物のＩＰ。
【図１２】図１２は、ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１での低酸素下および通常酸素下での内皮細胞溶解物の免疫沈降のウェスタンブロット分析である。抗ＧＲＰ７８抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，米国）でのニトロセルロース膜の染色後の化学発光基質の添加は、主要な７８ｋＤａタンパク質バンドにおけるＧＲＰ７８タンパク質の同一性を確認した。レーン１−ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１での低酸素下での内皮細胞溶解物のＩＰ；レーン２−ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１での通常酸素下での内皮細胞溶解物のＩＰ。
【図１３】図１３ａ−ｂは、ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１での低酸素下での内皮細胞溶解物の免疫沈降のウェスタンブロット分析である。ニトロセルロース膜の染色は、ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１（図１３ａ）または抗ＧＲＰ７８抗体（図１３ｂ）で行われ、その後、化学発光基質が添加され、ＧＰＲ７８タンパク質の存在が確認された。
【図１４】図１４は、抗ＧＰＲ７８抗体を用いた通常酸素条件および低酸素条件下での内皮細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す棒グラフである。抗ＧＲＰ７８抗体は、１０種の異なる臍帯に由来する内皮細胞に添加され、細胞に対する抗体の結合がＦＡＣＳ分析によって決定された。低酸素条件下での内皮細胞に対する抗ＧＲＰ７８抗体の結合割合の増加に注目されたい。
【図１５】図１５は、通常酸素条件および低酸素条件下での内皮細胞に対するビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１の結合を示すヒストグラムである。Ｘ軸−結合の強度。１００，０００個の細胞あたり５マイクログラムで添加されたＡＤＯＰｅｐＢｉｏｔの内皮細胞に対する結合は、低酸素下で増大した。
【図１６ａ−ｂ】図１６ａ−ｂは、抗ＧＲＰ７８抗体を用いた異なる腫瘍細胞株のＦＡＣＳ分析である。抗ＧＲＰ７８抗体は、ＭＣＦ７乳癌細胞（図１６ａ）およびＨＴ−２９結腸癌細胞（図１６ｂ）に添加され、細胞に対する結合がＦＡＣＳ分析を用いて検出された。ＭＣＦ７およびＨＴ２９細胞株に対する抗ＧＲＰ７８抗体の結合割合の増加に注目されたい。
【図１６ｃ−ｄ】図１６ｃ−ｄは、抗ＧＲＰ７８抗体を用いる異なる腫瘍細胞株のＦＡＣＳ分析である。抗ＧＲＰ７８抗体は、ＳＫ−２８黒色腫細胞（図１６ｃ）およびＫ５６２赤芽球腫細胞（図１６ｄ）に添加され、細胞に対する結合がＦＡＣＳ分析を用いて検出された。ＳＫ−２８細胞株に対する抗ＧＲＰ７８抗体の結合割合の増加に注目されたい。また、抗ＧＲＰ７８抗体がＫ５６２細胞の膜に結合しなかったことにも注目されたい。
【図１７】図１７は、内皮細胞の低酸素誘導アポトーシスに対するＡＤＯＰｅｐ１の効果を示すヒストグラムである。内皮細胞は、５％仔牛血清（ＦＣＳ）が補充された内皮細胞増殖培地の存在下で２４時間低酸素に曝露され、その後ＡＤＯＰｅｐ１（１０ｎｇ／ｍｌ）または抗ＧＲＰ７８抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）で低酸素条件下でインキュベートされた。細胞（１００，０００個／チューブ）は、内皮細胞アポトーシスの決定のためにＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ  ＦＩＴＣ／ＰＩと共にインキュベートされた。Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ／ＰＩで染色された内皮細胞のアポトーシス割合は、低酸素条件が６０％のアポトーシスを誘導する一方、ＡＤＯＰｅｐ１の添加は低酸素誘導アポトーシスを２５％まで低減させることを示す。同様に、抗ＧＲＰ７８抗体は、３２％までアポトーシスの低減を誘導した。
【図１８ａ−ｂ】図１８ａ−ｂは、ＡＤＯＰｅｐ１によるアポトーシスの阻害を示すドットプロットＦＡＣＳ分析である。低酸素下の内皮細胞は、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（Ｘ軸上に示される）およびヨウ化プロピジウム（Ｙ軸上に示される）アポトーシスマーカーで染色された。細胞は、通常酸素下の完全培地で（図１８ａ）および５％ＦＣＳの存在下かつ通常酸素下の完全培地で（図１８ｂ）でインキュベートされた。
【図１８ｃ】図１８ｃは、ＡＤＯＰｅｐ１によるアポトーシスの阻害を示すドットプロットＦＡＣＳ分析である。低酸素下の内皮細胞は、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（Ｘ軸上に示される）およびヨウ化プロピジウム（Ｙ軸上に示される）アポトーシスマーカーで染色された。細胞は、２４時間の低酸素下の飢餓培地でインキュベートされた。
【図１８ｄ−ｅ】図１８ｄ−ｅは、ＡＤＯＰｅｐ１によるアポトーシスの阻害を示すドットプロットＦＡＣＳ分析である。低酸素下の内皮細胞は、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（Ｘ軸上に示される）およびヨウ化プロピジウム（Ｙ軸上に示される）アポトーシスマーカーで染色された。細胞は、２４時間の低酸素下の飢餓培地かつＡＤＯＰｅｐ１の存在下（図１８ｄ）でおよび２４時間の低酸素下の飢餓培地かつ抗ＧＲＰ７８抗体の存在下（図１８ｅ）でインキュベートされた。ペプチドＡＤＯＰｅｐ１でのインキュベーションが、染色細胞の顕著な減少を誘導し（図１８ｄ）、ＡＤＯＰｅｐ１の低酸素誘導アポトーシスを低減する可能性を示すことに注目されたい。
【図１９】図１９は、ＡＤＯＰｅｐ１ペプチド、ＡＤＯＰｅｐ２ペプチド、およびＡＤＯＰｅｐ３ペプチドの増加する濃度による、内皮細胞に対する抗ＧＲＰ７８抗体の結合の阻害（％）を示すグラフである。内皮細胞は、増加する濃度のＡＤＯＰｅｐで２時間インキュベートされ、その後細胞は、２μｇ／ｍｌの抗ＧＲＰ７８抗体でさらに１時間インキュベートされ、ＥＣ上の結合抗体の量がＥＬＩＳＡ読み取り機を用いて検出された。ＡＤＯＰｅｐ１、ＡＤＯＰｅｐ２、またはＡＤＯＰｅｐ３の増大する濃度は、内皮細胞に対する抗ＧＲＰ７８抗体の結合の５０％までの阻害をもたらしたが、ｓＲｏＹスクランブルペプチド（配列番号１０；ＲＹＨＬＩＰＲＧＷＤＨＳ）は、内皮細胞に対する抗ＧＲＰ７８の結合に対して明確な阻害効果を示さなかったことに注目されたい。
【図２０ａ】図２０ａは、ＡＤＯＰｅｐ１での内皮細胞のインキュベーションの後の、内皮細胞に対する抗ＧＲＰ７８抗体の結合を示す。内皮細胞は、通常酸素下で４８時間インキュベートされたか、あるいは低酸素下で２４時間インキュベートされた後にＡＤＯＰｅｐ１（１０ｎｇ／ｍｌの濃度で）の存在下または非存在下でさらに２４時間通常酸素下でインキュベートされるかのいずれかであり、そして抗ＧＲＰ７８抗体に対する結合はＦＡＣＳ分析を用いて決定された。図２０ａは、通常酸素下（緑色プロット）、低酸素（２４時間）後のＡＤＯＰｅｐ１ペプチドの非存在下（赤色プロット）または存在下（青色プロット）での通常酸素下（さらに２４時間）の内皮細胞のフローサイトメトリー分析である。抗ＧＲＰ７８の結合は、通常酸素下の１８．１％から低酸素下の４０．１％まで増大したが、低酸素条件下でのＡＤＯＰｅｐ１の存在下で細胞がインキュベートされたときに、より有意な増加（８３．８％まで）が観察されたことに注目されたい。
【図２０ｂ】図２０ｂは、ＡＤＯＰｅｐ１での内皮細胞のインキュベーションの後の、内皮細胞に対する抗ＧＲＰ７８抗体の結合を示す。内皮細胞は、通常酸素下で４８時間インキュベートされたか、あるいは低酸素下で２４時間インキュベートされた後にＡＤＯＰｅｐ１（１０ｎｇ／ｍｌの濃度で）の存在下または非存在下でさらに２４時間通常酸素下でインキュベートされるかのいずれかであり、そして抗ＧＲＰ７８抗体に対する結合はＦＡＣＳ分析を用いて決定された。図２０ｂは、通常酸素、低酸素下（２４時間）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＡＤＯＰｅｐ１ありの通常酸素下、低酸素（２４時間）後の通常酸素下（２４時間）、または低酸素（２４時間）後の１０ｎｇ／ｍｌ  ＡＤＯＰｅｐ１ありの通常酸素（２４時間）下の、内皮細胞に対する抗ＧＲＰ７８結合の割合を示すヒストグラムである。結果は、３回の独立実験の平均±標準偏差を表す。
【図２１】図２１は、虚血誘導後の日数の関数としての、ＡＤＯＰｅｐ１で処置された後肢虚血における領域あたりのＧＲＰ７８陽性（ＧＲＰ７８＋）細胞の平均数を示す棒グラフである。マウスは、後肢結紮（虚血モデル）に供され、１日後に１μｇ／マウスのＡＤＯＰｅｐ１か、またはコントロールとしての５０μｌのＰＢＳのいずれかで注射された。ＧＲＰ７８陽性細胞の数は、虚血の誘導後７日目、１４日目、または２１日目に犠牲にされた（ＡＤＯＰｅｐ１またはＰＢＳで注射された）マウスの結紮された後肢から、または正常な非処置（非虚血）後肢から調製された組織学的切片において決定された。ＧＲＰ７８陽性細胞の数は、結紮後７日目〜１４日目にＰＢＳを注入された後肢において減少し、さらに結紮後２１日目に減少しているが、ＧＲＰ７８陽性細胞の数は、結紮後７日目〜１４日目にＡＤＯＰｅｐ１を注射された後肢において有意に増加し、さらに結紮後２１日目に減少したことに注目されたい。
【図２２】図２２は、虚血誘導後の日数の関数として、ＡＤＯＰｅｐ１で処置された虚血性後肢における視野あたりのアポトーシス細胞の数を示す棒グラフである。マウスは、本明細書の上記の図２１の説明において記載されるように、後肢結紮およびＰＢＳまたはＡＤＯＰｅｐ１注射に供され、顕微鏡視野あたりのアポトーシス細胞の数が、虚血の誘導後７日目、１４日目、または２１日目に犠牲にされたマウスの、結紮されかつＡＤＯＰｅｐ１またはＰＢＳ処置された後肢から、または正常の非虚血後肢から調製された組織学的切片において決定された。ＰＢＳを注射された虚血性後肢にくらべて、ＡＤＯＰｅｐ１を注射された結紮後肢における虚血誘導アポトーシス細胞の数の有意な減少（結紮後７日目）に注目されたい。
【図２３】図２３は、ＡＤＯＰｅｐからの保存されたモチーフに相当する特定のペプチドによる、内皮細胞に対するＡＤＯＰｅｐ１Ｂｉｏｔ（２μｇ／ｍｌ）の結合の阻害を示すグラフである。内皮細胞は、モチーフＡ（ＨＷＲＲＰ；配列番号７）、モチーフＢ（ＨＷＲＲＡ；配列番号８）、モチーフＣ（ＡＨＬＬＰ；配列番号６）、または非ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１（配列番号２）に相当するアミノ酸配列を有するペプチドの増大する濃度（０．０１、０．１、または１ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、通常酸素条件下で２時間インキュベートされ、次いで、ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１（２μｇ／ｍｌ）で１時間インキュベートされ、そして内皮細胞に対するビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１の結合はＨＲＰストレプトアビジンを使用して決定された。モチーフＡおよびモチーフＢに相当するアミノ酸を有するペプチドが、内皮細胞に対するＡＤＯＰｅｐ１Ｂｉｏｔの結合の有意な阻害を示したことに注目されたい。
【図２４ａ−ｂ】図２４ａ−ｂは、低酸素誘導アポトーシスを示すＦＡＣＳ分析である。内皮細胞は、１０ｎｇ／ｍｌのＡＤＯＰｅｐ１の非存在下（図２４ａ）または存在下（図２４ｂ）で低酸素条件下で２４時間インキュベートされ、アポトーシスのレベルは、ＦＡＣＳ分析およびＰＩ（Ｙ軸上に示される）／Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（Ｘ軸上に示される）マーカーを用いて決定された。
【図２４ｃ−ｄ】図２４ｃ−ｄは、低酸素誘導アポトーシスを示すＦＡＣＳ分析である。内皮細胞は、モチーフＡのペプチド（図２４ｃ）またはモチーフＣのペプチド（図２４ｂ）の存在下で低酸素条件下で２４時間インキュベートされ、アポトーシスのレベルは、ＦＡＣＳ分析およびＰＩ（Ｙ軸上に示される）／Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（Ｘ軸上に示される）マーカーを用いて決定された。ＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡのペプチドは低酸素誘導アポトーシスを低酸素下の７９．３％から２８．６（ＡＤＯＰｅｐ１）または３５．８％（モチーフＡ）まで阻害することができたが、モチーフＣペプチドは低酸素誘導アポトーシスに対し効果を示さなかった（８１．１％）ことに注目されたい。
【図２５】図２５は、ＡＤＯＰｅｐ１、モチーフＡ、およびモチーフＢによる低酸素誘導アポトーシスの阻害を示す棒グラフである。内皮細胞は、１０ｎｇ／ｍｌのＡＤＯＰｅｐ１、モチーフＡ、モチーフＢ、またはモチーフＣの非存在下または存在下で、低酸素条件下で２４時間インキュベートされ、アポトーシスのレベルは、ＦＡＣＳ分析を用いて決定され、そしてＡｎｎｅｘｉｎ  ＶおよびＰＩ陽性細胞の割合として定量化された。結果は、４回の独立実験の平均±標準偏差を表す。ＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡおよびＢペプチドは低酸素誘導アポトーシスの有意な阻害を示したが、モチーフＣペプチドはアポトーシスに対して効果を示さなかったことに注目されたい。
【図２６ａ】図２６ａは、ＡＤＯＰｅｐモチーフによる低酸素下での内皮細胞遊走の誘導を示すグラフである。内皮細胞は、増大する濃度のＡＤＯＰｅｐ１（赤色線）、ペプチドモチーフＡ（暗い青色線）、ペプチドモチーフＢ（緑色線）、またはペプチドモチーフＣ（明るい青色線）の存在下で、低酸素条件下で５時間インキュベートされ、内皮細胞の遊走が検出された。図２６ａ−実験１；図２６ｂ−実験２。ＡＤＯＰｅｐ１、モチーフＡおよびＢペプチドは、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で内皮細胞遊走を誘導したが、モチーフＣペプチドは内皮細胞遊走に対して有意な効果を示さなかったことに注目されたい。
【図２６ｂ】図２６ｂは、ＡＤＯＰｅｐモチーフによる低酸素下での内皮細胞遊走の誘導を示すグラフである。内皮細胞は、増大する濃度のＡＤＯＰｅｐ１（赤色線）、ペプチドモチーフＡ（暗い青色線）、ペプチドモチーフＢ（緑色線）、またはペプチドモチーフＣ（明るい青色線）の存在下で、低酸素条件下で５時間インキュベートされ、内皮細胞の遊走が検出された。図２６ａ−実験１；図２６ｂ−実験２。ＡＤＯＰｅｐ１、モチーフＡおよびＢペプチドは、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で内皮細胞遊走を誘導したが、モチーフＣペプチドは内皮細胞遊走に対して有意な効果を示さなかったことに注目されたい。
【図２７】図２７は、ＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡ（配列番号７）を用いる管形成の誘導を示すグラフである（スクランブルｓＲＯＹペプチドは管形成を誘導しなかった）。内皮細胞は、２４時間補充物不含培地においてインキュベートされ、５０，０００個の細胞が、次いで、５００μｌ培地から２５０μｌの（増殖因子が低減された）Ｃｕｌｔｒｅｘ基底膜抽出物で予め被覆された２４ウェルプレート（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，米国）に移された。ＡＤＯＰｅｐ１、モチーフＡ、およびスクランブルｓＲＯＹペプチドは、（予備的な知見に基づいて）１０ｎｇ／ｍｌの最適濃度で添加され、スライドは、１８時間のインキュベーション後に光学顕微鏡によって調べられた。結果は、３種の異なる臍帯を用いる３回の実験の平均±標準偏差を表す。結合された細胞のネットワーク（管形成）の長さは、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ，米国）を用いて、各ウェルの５つの異なる領域においてマイクロメーター単位で測定された。ＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡが、飢餓かつ通常酸素条件下で内皮細胞における結合された細胞のネットワークの長さを有意に増大したが、（コントロールペプチドとしての）スクランブルｓＲＯＹは管形成を誘導しなかったことに注目されたい。
【図２８ａ−ｂ】図２８ａ−ｄは、ＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡペプチドが内皮細胞上の同じ受容体に対する結合について競合することを示すＦＡＣＳヒストグラム（図２８ａ−ｃ）およびグラフ（図２８ｄ）である。内皮細胞は、内皮細胞増殖培地において低酸素条件下で２４時間インキュベートされた。細胞はトリプシンによって移され、そして増大する濃度のＡＤＯＰｅｐ１、モチーフＡおよびモチーフＣペプチドと共に氷上で１時間インキュベートされた。ＧＲＰ７８ポリクローナル抗体（２μｇ／１０００，０００）は、氷上で２時間細胞に添加された。抗ヤギＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）は、氷上で３０分間添加された。ＩｇＧ１−ＦＩＴＣは、イソタイプコントロールとして使用された。サンプルは、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析された。ＡＤＯＰｅｐ１ペプチド（図２８ａ）およびモチーフＡペプチド（図２８ｂ）は内皮細胞に対するＧＲＰ７８の結合を阻害し、モチーフＣペプチド（図２８ｃ）は阻害しなかったことに注目されたい。図２８ｄは、２回の独立実験によって決定されたペプチド量の関数としての、内皮細胞に対するＧＲＰ７８の結合の平均割合を示す。
【図２８ｃ−ｄ】図２８ａ−ｄは、ＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡペプチドが内皮細胞上の同じ受容体に対する結合について競合することを示すＦＡＣＳヒストグラム（図２８ａ−ｃ）およびグラフ（図２８ｄ）である。内皮細胞は、内皮細胞増殖培地において低酸素条件下で２４時間インキュベートされた。細胞はトリプシンによって移され、そして増大する濃度のＡＤＯＰｅｐ１、モチーフＡおよびモチーフＣペプチドと共に氷上で１時間インキュベートされた。ＧＲＰ７８ポリクローナル抗体（２μｇ／１０００，０００）は、氷上で２時間細胞に添加された。抗ヤギＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）は、氷上で３０分間添加された。ＩｇＧ１−ＦＩＴＣは、イソタイプコントロールとして使用された。サンプルは、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析された。ＡＤＯＰｅｐ１ペプチド（図２８ａ）およびモチーフＡペプチド（図２８ｂ）は内皮細胞に対するＧＲＰ７８の結合を阻害し、モチーフＣペプチド（図２８ｃ）は阻害しなかったことに注目されたい。図２８ｄは、２回の独立実験によって決定されたペプチド量の関数としての、内皮細胞に対するＧＲＰ７８の結合の平均割合を示す。
【図２９】図２９は、低酸素条件下でのＡＤＯＰｅｐ１結合に対するＧＲＰ７８受容体内在化反応を示すグラフである。内皮細胞は、飢餓条件かつ低酸素下で一晩インキュベートされた。細胞は、５分間、１５分間、３０分間、および６０分間１０ｎｇ／ｍｌのＡＤＯＰｅｐ１と共にインキュベートされた。膜染色のために、ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１を５マイクログラムでインタクトな細胞に１時間添加し、ストレプトアビジンＦＩＴＣによって置換した。細胞内染色のために、細胞は１％パラホルムアルデヒドで固定された後に、０．１％サポニンと共に１５分間インキュベートされた。細胞の洗浄後、ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１が細胞に添加された。サンプルは、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析された。膜染色は、青色棒によって示され（結果は、未処理細胞に対して正規化された割合で表される）；平均細胞内染色は、紫色棒によって示される（結果は蛍光の平均として表される）。
【図３０】図３０ａ−ｂは、ＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡによるＥＲＫのリン酸化の誘導を示すウェスタンブロット分析である。飢餓条件かつ５時間の低酸素下の内皮細胞は、１０ｎｇ／ｍｌのＡＤＯＰｅｐ１（レーン２〜５）またはモチーフＡ（レーン６〜９）ペプチドと共に、５分間（レーン２および６）、２０分間（レーン３および７）、３０分間（レーン４および８）、および６０分間（レーン５および９）インキュベートされるか、またはペプチドでのさらなるインキュベーション無しで低酸素のままであった（レーン１）。インキュベーション後、溶解物が調製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびニトロセルロース膜上でのブロッティングに供された。ウェスタンブロット分析は、抗ホスホＥＲＫ１／２抗体を使用して実施された。低酸素条件下でＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡと共に２０分間インキュベーションした後のＥＲＫ１／２リン酸化の誘導に注目されたい。デンシトメトリー測定は、ＡＤＯＰｅｐ１と共に２０分間インキュベーションした後およびモチーフＡと共に２０〜６０分間インキュベーションした後に最大ＥＲＫリン酸化を示した（データは示されていない）。図３０ａ−実験１；図３０ｂ−実験２。正味のバンド密度を比較するためにデンシトメトリー分析ソフトウェアによって決定された百分率に調節された量は以下の通りであった：図３０ａ、レーン１−４．５、レーン２−９．３、レーン３−１３．７、レーン４−１３．３、レーン５−１１．２、レーン６−１０．７、レーン７−１２．４、レーン８−１２．３、およびレーン９−１２．４；図３０ｂ、レーン１−４．２１、レーン２−１２．４、レーン３−１２．５、レーン４−１４．８、レーン５−１０．９、レーン６−１４．９、レーン７−９．８、レーン８−１２．７およびレーン９−７．８。
【図３１】図３１は、ＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡで２０分間活性化され、かつｐＥＲＫ阻害剤ペプチドによって阻害された内皮細胞におけるリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のレベルを示すウェスタンブロット分析である。飢餓条件かつ５時間の低酸素下の内皮細胞（臍帯１由来）は、ｐＥＲＫ阻害剤ペプチド（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）の存在下（レーン２および４）または非存在下（レーン１および３）で１０ｎｇ／ｍｌのＡＤＯＰｅｐ１（レーン３および４）またはモチーフＡ（レーン１および２）ペプチドと共にインキュベートされた。コントロールのために、飢餓条件かつ５時間の低酸素下の内皮細胞（レーン５）もまた、ｐＥＲＫ阻害剤ペプチドと共にインキュベートされた（レーン６）。ｐＥＲＫ阻害剤ペプチドの存在下でのＥＲＫリン酸化の阻害に注目されたい。正味のバンド密度を比較するためにデンシトメトリー分析ソフトウェアによって決定された百分率に調節された量は以下の通りであった：レーン１−１９、レーン２−１４、レーン３−１４、レーン４−８．８、レーン５−１１、レーン６−２．１。
【図３２】図３２ａ−ｂは、リン酸化ＥＲＫのレベルに対するＡＤＯＰｅｐの効果を示すウェスタンブロット分析である。低酸素（５時間）下の臍帯１由来（図３２ａ）または臍帯２由来（図３２ｂ）の内皮細胞（ＥＣ）は、１０ｎｇ／ｍｌのＡＤＯＰｅｐ１、ＡＤＯＰｅｐ２、およびＡＤＯＰｅｐ３で２０または３０分間インキュベートされるか、または未処理（すなわち、いかなるペプチドも無い低酸素下）のままであった。サンプル細胞溶解物のウェスタンブロット分析は、ニトロセルロース膜上で抗ホスホＥＲＫ抗体を用いて実施された。図３２ａ：レーン１および２−低酸素下のＥＣ（未処理）；レーン３および４−ＡＤＯＰｅｐ３と共に２０分間（レーン３）または３０分間（レーン４）インキュベートされた低酸素下のＥＣ；レーン５および６−ＡＤＯＰｅｐ２と共に２０分間（レーン５）または３０分間（レーン６）インキュベートされた低酸素下のＥＣ；レーン７および８−ＡＤＯＰｅｐ１と共に２０分間（レーン７）または３０分間（レーン８）インキュベートされた低酸素下のＥＣ；図３２ｂ：レーン１〜４−ＡＤＯＰｅｐ１（レーン２）、ＡＤＯＰｅｐ２（レーン３）、ＡＤＯＰｅｐ３（レーン４）と共に２０分間インキュベートされたか、または未処理のままである（レーン１）低酸素下のＥＣ；レーン５〜８−ＡＤＯＰｅｐ１（レーン６）、ＡＤＯＰｅｐ２（レーン７）、ＡＤＯＰｅｐ３（レーン８）と共に３０分間インキュベートされたか、または未処理のままである（レーン５）低酸素下のＥＣ。デンシトメトリー測定は、ＡＤＯＰｅｐ１およびＡＤＯＰｅｐ２での内皮細胞のインキュベーション後にＥＲＫ１／２リン酸化の増大を示したが、ＡＤＯＰｅｐ３では増大を示さなかった。正味のバンド密度を比較するためにデンシトメトリー分析ソフトウェアによって決定された百分率に調節された量は以下の通りであった：図３２ａ、レーン１−１１、レーン２−１３、レーン３−１１、レーン４−５、レーン５−１１、レーン６−１３、レーン７−１７、レーン８−１６．７；図３２ｂ、レーン１−１７、レーン２−２２、レーン３−１９、レーン４−７、レーン５−８、レーン６−１３、レーン７−１４、レーン８−１。
【図３３ａ−ｂ】図３３ａ−ｆは、ＡＤＯＰｅｐ１による内皮細胞の低酸素誘導アポトーシスの特異的な阻害を示す代表的ＦＡＳＣ分析である。ペトリ皿中の内皮細胞は、通常酸素下（図３３ａおよび３３ｄ）、２４時間の低酸素への曝露（図３３ｃおよび３３ｆ）または１００，０００個の細胞あたり１００μｍｏｌのＣｏＣｌ２での通常酸素下でのインキュベート（図３３ｂおよび３３ｅ）、１０ｎｇ／ｍｌのＡＤＯＰｅｐ１ペプチド（２４時間）の非存在下（図３３ａ−ｃ）または存在下（図３３ｄ−ｆ）で、補充物不含の内皮細胞増殖培地において５％ＦＣＳと共に２４時間インキュベートされた。細胞はトリプシン処理され、５％ＦＣＳおよび０．１％Ｎａアジドと共にＰＢＳ中にすぐに再懸濁された。１００，０００個の細胞を含有するサンプルは、Ａｎｎｅｘｉｎ−ＦＩＴＣ（Ｘ軸）およびヨウ化プロピジウム（Ｙ軸）キット（Ｂｅｎｄｅｒ  Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｉｅｎｎａ，オーストリア）を用いて、製造者の指示書に従ってアポトーシスについて試験された。結果は、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析された。細胞が、ＡＤＯＰｅｐ１ペプチドでインキュベートされたとき、ＣｏＣｌ２および低酸素条件はアポトーシス細胞の画分を増大し（図３３ａと比較して図３３ｂおよび３３ｃにおけるＰＩおよびＡｎｎｅｘｉｎＦＩＴＣ陽性細胞の増大によって示される）、低酸素誘導アポトーシスの有意な画分が阻害された（図３３ｆにおけるＰＩおよびＡｎｎｅｘｉｎ−ＦＩＴＣ陽性細胞を図３３ｃにおけるそれらと比較されたい）が、ＣｏＣｌ２によるアポトーシスに対する効果は観察されなかった（図３３ｅにおけるＰＩおよびＡｎｎｅｘｉｎ−ＦＩＴＣ陽性細胞を図３３ｂにおけるそれらと比較されたい）ことに注目されたい。
【図３３ｃ】図３３ａ−ｆは、ＡＤＯＰｅｐ１による内皮細胞の低酸素誘導アポトーシスの特異的な阻害を示す代表的ＦＡＳＣ分析である。ペトリ皿中の内皮細胞は、通常酸素下（図３３ａおよび３３ｄ）、２４時間の低酸素への曝露（図３３ｃおよび３３ｆ）または１００，０００個の細胞あたり１００μｍｏｌのＣｏＣｌ２での通常酸素下でのインキュベート（図３３ｂおよび３３ｅ）、１０ｎｇ／ｍｌのＡＤＯＰｅｐ１ペプチド（２４時間）の非存在下（図３３ａ−ｃ）または存在下（図３３ｄ−ｆ）で、補充物不含の内皮細胞増殖培地において５％ＦＣＳと共に２４時間インキュベートされた。細胞はトリプシン処理され、５％ＦＣＳおよび０．１％Ｎａアジドと共にＰＢＳ中にすぐに再懸濁された。１００，０００個の細胞を含有するサンプルは、Ａｎｎｅｘｉｎ−ＦＩＴＣ（Ｘ軸）およびヨウ化プロピジウム（Ｙ軸）キット（Ｂｅｎｄｅｒ  Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｉｅｎｎａ，オーストリア）を用いて、製造者の指示書に従ってアポトーシスについて試験された。結果は、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析された。細胞が、ＡＤＯＰｅｐ１ペプチドでインキュベートされたとき、ＣｏＣｌ２および低酸素条件はアポトーシス細胞の画分を増大し（図３３ａと比較して図３３ｂおよび３３ｃにおけるＰＩおよびＡｎｎｅｘｉｎＦＩＴＣ陽性細胞の増大によって示される）、低酸素誘導アポトーシスの有意な画分が阻害された（図３３ｆにおけるＰＩおよびＡｎｎｅｘｉｎ−ＦＩＴＣ陽性細胞を図３３ｃにおけるそれらと比較されたい）が、ＣｏＣｌ２によるアポトーシスに対する効果は観察されなかった（図３３ｅにおけるＰＩおよびＡｎｎｅｘｉｎ−ＦＩＴＣ陽性細胞を図３３ｂにおけるそれらと比較されたい）ことに注目されたい。
【図３３ｄ−ｅ】図３３ａ−ｆは、ＡＤＯＰｅｐ１による内皮細胞の低酸素誘導アポトーシスの特異的な阻害を示す代表的ＦＡＳＣ分析である。ペトリ皿中の内皮細胞は、通常酸素下（図３３ａおよび３３ｄ）、２４時間の低酸素への曝露（図３３ｃおよび３３ｆ）または１００，０００個の細胞あたり１００μｍｏｌのＣｏＣｌ２での通常酸素下でのインキュベート（図３３ｂおよび３３ｅ）、１０ｎｇ／ｍｌのＡＤＯＰｅｐ１ペプチド（２４時間）の非存在下（図３３ａ−ｃ）または存在下（図３３ｄ−ｆ）で、補充物不含の内皮細胞増殖培地において５％ＦＣＳと共に２４時間インキュベートされた。細胞はトリプシン処理され、５％ＦＣＳおよび０．１％Ｎａアジドと共にＰＢＳ中にすぐに再懸濁された。１００，０００個の細胞を含有するサンプルは、Ａｎｎｅｘｉｎ−ＦＩＴＣ（Ｘ軸）およびヨウ化プロピジウム（Ｙ軸）キット（Ｂｅｎｄｅｒ  Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｉｅｎｎａ，オーストリア）を用いて、製造者の指示書に従ってアポトーシスについて試験された。結果は、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析された。細胞が、ＡＤＯＰｅｐ１ペプチドでインキュベートされたとき、ＣｏＣｌ２および低酸素条件はアポトーシス細胞の画分を増大し（図３３ａと比較して図３３ｂおよび３３ｃにおけるＰＩおよびＡｎｎｅｘｉｎＦＩＴＣ陽性細胞の増大によって示される）、低酸素誘導アポトーシスの有意な画分が阻害された（図３３ｆにおけるＰＩおよびＡｎｎｅｘｉｎ−ＦＩＴＣ陽性細胞を図３３ｃにおけるそれらと比較されたい）が、ＣｏＣｌ２によるアポトーシスに対する効果は観察されなかった（図３３ｅにおけるＰＩおよびＡｎｎｅｘｉｎ−ＦＩＴＣ陽性細胞を図３３ｂにおけるそれらと比較されたい）ことに注目されたい。
【図３３ｆ】図３３ａ−ｆは、ＡＤＯＰｅｐ１による内皮細胞の低酸素誘導アポトーシスの特異的な阻害を示す代表的ＦＡＳＣ分析である。ペトリ皿中の内皮細胞は、通常酸素下（図３３ａおよび３３ｄ）、２４時間の低酸素への曝露（図３３ｃおよび３３ｆ）または１００，０００個の細胞あたり１００μｍｏｌのＣｏＣｌ２での通常酸素下でのインキュベート（図３３ｂおよび３３ｅ）、１０ｎｇ／ｍｌのＡＤＯＰｅｐ１ペプチド（２４時間）の非存在下（図３３ａ−ｃ）または存在下（図３３ｄ−ｆ）で、補充物不含の内皮細胞増殖培地において５％ＦＣＳと共に２４時間インキュベートされた。細胞はトリプシン処理され、５％ＦＣＳおよび０．１％Ｎａアジドと共にＰＢＳ中にすぐに再懸濁された。１００，０００個の細胞を含有するサンプルは、Ａｎｎｅｘｉｎ−ＦＩＴＣ（Ｘ軸）およびヨウ化プロピジウム（Ｙ軸）キット（Ｂｅｎｄｅｒ  Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｉｅｎｎａ，オーストリア）を用いて、製造者の指示書に従ってアポトーシスについて試験された。結果は、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析された。細胞が、ＡＤＯＰｅｐ１ペプチドでインキュベートされたとき、ＣｏＣｌ２および低酸素条件はアポトーシス細胞の画分を増大し（図３３ａと比較して図３３ｂおよび３３ｃにおけるＰＩおよびＡｎｎｅｘｉｎＦＩＴＣ陽性細胞の増大によって示される）、低酸素誘導アポトーシスの有意な画分が阻害された（図３３ｆにおけるＰＩおよびＡｎｎｅｘｉｎ−ＦＩＴＣ陽性細胞を図３３ｃにおけるそれらと比較されたい）が、ＣｏＣｌ２によるアポトーシスに対する効果は観察されなかった（図３３ｅにおけるＰＩおよびＡｎｎｅｘｉｎ−ＦＩＴＣ陽性細胞を図３３ｂにおけるそれらと比較されたい）ことに注目されたい。
【図３４】図３４は、図３３ａ−３３ｆに記載される実験のＦＡＣＳ結果を示すヒストグラムである。データは、２回の実験の平均±ＳＤを表す。２４時間の低酸素またはＣｏＣｌ２処置がアポトーシスのレベルを約２７％（通常酸素下）から約７０％または６７％までそれぞれ増大させたことに注目されたい。また、ＡＤＯＰｅｐ１処置が、低酸素誘導アポトーシスを約４０パーセント有意に阻害したが、ＣｏＣｌ２誘導アポトーシスを阻害しなかったことにも注目されたい。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態は、ＧＲＰ７８受容体を介して内皮細胞に結合することができ、かつ血管形成を誘導することができるペプチド、および虚血性疾患のような不十分な血管形成によって特徴付けられる病状を処置するためのその使用に関する。
【００４７】
本発明によるペプチド、組成物、および方法の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解されることができる。
【００４８】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。
【００４９】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、（ＡＤＡＭ１５タンパク質に由来する）ヒスチジン−トリプトファン−アルギニン−アルギニン（ＨＷＲＲ）アミノ酸モチーフを含む短いアミノ酸配列が、内皮細胞上のＧＲＰ７８受容体に結合することができ、内皮細胞の増殖および遊走を誘導することができ、かつ低酸素誘導アポトーシスを阻害することができ、従って、血管形成を誘導し、虚血性疾患を処置するために使用されることが可能であることを発見した。
【００５０】
以下の実施例の節において記載されるように、本発明のペプチド（例えば、配列番号２、３、および４にそれぞれ記載されるＡＤＯＰｅｐ−１、２、および３、または配列番号７および８に記載されるペプチド）は、生体外で内皮細胞に結合し（図３および４）、低酸素下での内皮細胞の増殖（図５）および遊走（図６および２６ａ−ｂ）を誘導する。加えて、マウス後肢虚血モデルを使用する生体内実験は、本発明のペプチド（例えば、ＡＤＯＰｅｐ１）での虚血性マウスの処置が、血液潅流（図７）および血管密度（図８、９ａ−ｂ）を有意に増大することを示している。さらに、免疫沈降（ＩＰ）およびウェスタンブロット分析は、内皮細胞上のＡＤＯＰｅｐの受容体が、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８；配列番号９）であり（図１０ａ−ｂ、１１、１２）、それが種々の腫瘍細胞上で発現されること（図１６ａ−ｄ）、および本発明のペプチド（例えば、ＡＤＯＰｅｐ１）が、低酸素下で内皮細胞上のＧＲＰ７８に結合すること（図１３ａ−ｂおよび１９）を明らかにした。加えて、低酸素条件は内皮細胞上のＧＲＰ７８受容体の呈示を約４０％まで増大する（図１５）が、ＡＤＯｐｅｐ１での内皮細胞の予備インキュベーションは、内皮細胞上のＧＲＰ７８呈示を約８４％までさらに増大する（図２０ａ−ｂ、２１）。さらに、本発明のペプチド（例えば、ＡＤＯＰｅｐ１、または配列番号７および８のような短いペプチド）は、生体外（図１７、１８、２４ａ−ｄ、および２５）および生体内（図２２）の両方において内皮細胞の低酸素誘導アポトーシスを防止したが、塩化コバルト誘導アポトーシスは防止しなかった（図３３ａ−ｆおよび３４）。加えて、本発明のペプチド（例えば、配列番号２または７）での内皮細胞のインキュベーションは、管形成（図２７）およびＥＲＫ１／２リン酸化の有意な増大（図３０ａ−ｂ、３１）をもたらす。要するに、これらの結果は、本発明のペプチドが低酸素下で組織における血管形成を誘導する能力を示し、かつ虚血性疾患を処置するためのそれらの使用を示唆する。
【００５１】
従って、本発明の１つの側面によれば、アミノ酸配列ＨＷＲＲ（配列番号５）を含む単離されたペプチドであって、４個または５個のアミノ酸からなるペプチドが提供される。
【００５２】
例えば、本発明のこの側面によるペプチドは、下記の表１に列挙されるペプチドのいずれかであることができる。
2010506905.tif 000002
【００５３】
本発明の実施形態によれば、本発明のペプチドは、ＨＷＲＲＰ（配列番号７）またはＨＷＲＲＡ（配列番号８）であることができる。
【００５４】
本発明がまた、ＨＷＲＲアミノ酸配列を含む長いペプチドも企図することは理解されるだろう。
【００５５】
従って、本発明の別の側面によれば、配列番号５に記載のアミノ酸配列ＨＷＲＲを含む単離されたペプチドが提供されるが、ただし、ペプチドは配列番号１１（ＹＰＨＩＤＳＬＧＨＷＲＲ）ではない。
【００５６】
本発明の実施形態によれば、本発明のこの側面のペプチドは、少なくとも４個（例えば、４個）のアミノ酸、少なくとも５個（例えば、５個）のアミノ酸、少なくとも６個（例えば、６個）のアミノ酸、少なくとも７個（例えば、７個）のアミノ酸、少なくとも８個（例えば、８個）のアミノ酸、少なくとも９個（例えば、９個）のアミノ酸、少なくとも１０個（例えば、１０個）のアミノ酸、少なくとも１１個（例えば、１１個）のアミノ酸、少なくとも１２個（例えば、１２個）のアミノ酸、少なくとも１３個（例えば、１３個）のアミノ酸、少なくとも１４個（例えば、１４個）のアミノ酸、少なくとも１５個（例えば、１５個）のアミノ酸、少なくとも１６個（例えば、１６個）のアミノ酸、少なくとも１７個（例えば、１７個）のアミノ酸、少なくとも１８個（例えば、１８個）のアミノ酸、少なくとも１９個（例えば、１９個）のアミノ酸、少なくとも２０個（例えば、２０個）のアミノ酸、少なくとも２１個（例えば、２１個）のアミノ酸、少なくとも２２個（例えば、２２個）のアミノ酸、少なくとも２３個（例えば、２３個）のアミノ酸、少なくとも２４個（例えば、２４個）のアミノ酸、少なくとも２５個（例えば、２５個）のアミノ酸、少なくとも２６個（例えば、２６個）のアミノ酸、少なくとも２７個（例えば、２７個）のアミノ酸、少なくとも２８個（例えば、２８個）のアミノ酸、少なくとも２９個（例えば、２９個）のアミノ酸、少なくとも３０個（例えば、３０個）のアミノ酸、少なくとも３１個（例えば、３１個）のアミノ酸、少なくとも３２個（例えば、３２個）のアミノ酸、少なくとも３３個（例えば、３３個）のアミノ酸、少なくとも３４個（例えば、３４個）のアミノ酸、少なくとも３５個（例えば、３５個）のアミノ酸、少なくとも３６個（例えば、３６個）のアミノ酸、少なくとも３７個（例えば、３７個）のアミノ酸、少なくとも３８個（例えば、３８個）のアミノ酸、少なくとも３９個（例えば、３９個）のアミノ酸、少なくとも４０個（例えば、４０個）のアミノ酸、少なくとも４１個（例えば、４１個）のアミノ酸、少なくとも４２個（例えば、４２個）のアミノ酸、少なくとも４３個（例えば、４３個）のアミノ酸、少なくとも４４個（例えば、４４個）のアミノ酸、少なくとも４５個（例えば、４５個）のアミノ酸、少なくとも４６個（例えば、４６個）のアミノ酸、少なくとも４７個（例えば、４７個）のアミノ酸、少なくとも４８個（例えば、４８個）のアミノ酸、少なくとも４９個（例えば、４９個）のアミノ酸、および５０個以下（例えば５０個）のアミノ酸を含む。
【００５７】
本発明の実施形態によれば、本発明のこの側面のペプチドは、５０個以下のアミノ酸、４９個以下のアミノ酸、４８個以下のアミノ酸、４７個以下のアミノ酸、４６個以下のアミノ酸、４５個以下のアミノ酸、４４個以下のアミノ酸、４３個以下のアミノ酸、４２個以下のアミノ酸、４１個以下のアミノ酸、４０個以下のアミノ酸、３９個以下のアミノ酸、３８個以下のアミノ酸、３７個以下のアミノ酸、３６個以下のアミノ酸、３５個以下のアミノ酸、３４個以下のアミノ酸、３３個以下のアミノ酸、３２個以下のアミノ酸、３１個以下のアミノ酸、３０個以下のアミノ酸、２９個以下のアミノ酸、２８個以下のアミノ酸、２７個以下のアミノ酸、２６個以下のアミノ酸、２５個以下のアミノ酸、２４個以下のアミノ酸、２３個以下のアミノ酸、２２個以下のアミノ酸、２１個以下のアミノ酸、２０個以下のアミノ酸、１９個以下のアミノ酸、１８個以下のアミノ酸、１７個以下のアミノ酸、１６個以下のアミノ酸、１５個以下のアミノ酸、１４個以下のアミノ酸、１３個以下のアミノ酸、１２個以下のアミノ酸、１１個以下のアミノ酸、１０個以下のアミノ酸、９個以下のアミノ酸、８個以下のアミノ酸、７個以下のアミノ酸、６個以下のアミノ酸、５個のアミノ酸、または４個のアミノ酸を含む。
【００５８】
本発明のペプチドの長さ（「ｘ」）が、少なくとも「ｎ」でありかつ「ｙ」以下である値を有する任意の整数であることができることは理解されるだろう。すなわち、ｎ＜ｘ＜ｙで、ｎ＜ｙであり、一方「ｎ」は４〜４９の値を有する整数であり、「ｙ」は５〜５０の値を有する整数である。
【００５９】
本発明の実施形態によれば、本発明のこの側面のペプチドは、少なくとも４個かつ５０個以下のアミノ酸、少なくとも４個かつ７個以下のアミノ酸、少なくとも５個かつ８個以下のアミノ酸、少なくとも６個かつ９個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１０個以下のアミノ酸、少なくとも８個かつ１１個以下のアミノ酸、少なくとも９個かつ１２個以下のアミノ酸、少なくとも７個かつ１３個以下のアミノ酸、少なくとも１２個かつ１７個以下のアミノ酸、少なくとも１２個かつ２０個以下のアミノ酸、少なくとも１２個かつ３０個以下のアミノ酸、少なくとも１０個かつ２０個以下のアミノ酸、少なくとも８個かつ３０個以下のアミノ酸、少なくとも１２個かつ４０個以下のアミノ酸を含む。
【００６０】
本発明の実施形態によれば、本発明のこの側面のペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。
【００６１】
本発明の実施形態によれば、本発明のこの側面のペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む。
【００６２】
本発明の実施形態によれば、本発明のこの側面のペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む。
【００６３】
本明細書中で使用される用語「ペプチド」は、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）、およびペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）、ならびにペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドを包含し、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有しうる。そのような修飾には、限定されないが、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれる。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。
【００６４】
これに関するさらなる詳細が本明細書の下記に示される。ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在することができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在することができる。
【００６５】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、フェニルグリシン、ＴＩＣ、ナフチレンアミン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換されることができる。
【００６６】
上述のことに加えて、本発明のペプチドはまた、１個以上の修飾されたアミノ酸または１個以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
【００６７】
本明細書中および請求項の節で使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；生体内で多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方が含まれる。
【００６８】
下記の表２および表３は、本発明で使用されることができる天然に存在するアミノ酸（表２）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（例えば合成アミノ酸、表３）を列挙する。
2010506905.tif 000003
2010506905.tif 000004
2010506905.tif 000005
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【００６９】
本発明のペプチドは、線状形態で利用されることができる。しかし、環化がペプチドの特性をひどく妨害しない場合、ペプチドの環状形態もまた利用できることが理解される。環状ペプチドは、環状形態に合成されるか、または所望の条件（例えば生理学的条件）の下で環状形態を備えるように構成されることも可能である。
【００７０】
治療において短いペプチドフラグメントを使用する際の大きな障害の１つは、立体特異的な細胞プロテアーゼによるそのタンパク質分解的な分解であるので、本発明のペプチドは、天然アミノ酸のＤ−異性体から合成されうることが理解される［すなわち、インベルソ（ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチドアナログ、Ｔｊｅｒｎｂｅｒｇ（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：１２６０１〜５；Ｇａｚｉｔ（２００２）、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、９：１６６７〜１６７５］。
【００７１】
加えて、本発明のペプチドには、そのレトロアナログ、インベルソアナログおよびレトロ−インベルソアナログが含まれる。ホルモンの完全なレトロ−インベルソアナログまたは延長された部分的レトロ−インベルソアナログは生物学的活性を保持または増強することが一般には見出されていることが理解される。レトロ反転化はまた、酵素阻害剤の合理的な設計の分野でも適用されている（米国特許第６２６１５６９号を参照のこと）。
【００７２】
本明細書中で使用される「レトロペプチド」は、生来的なペプチド配列とは反対方向で組み立てられる、Ｌ−アミノ酸残基から構成されるペプチドを示す。
【００７３】
天然に存在するポリペプチドのレトロインベルソ改変では、α−炭素の立体化学が対応するＬ−アミノ酸のα−炭素の立体化学とは反対であるアミノ酸（すなわち、Ｄ−アミノ酸またはＤ−ａｌｌｏ−アミノ酸）からの生来的なペプチド配列とは逆の順序での合成の組み立てを伴う。従って、レトロインベルソアナログは、逆になった末端および逆方向のペプチド結合を有しており、その一方で、生来的なペプチド配列におけるような側鎖のトポロジーを本質的には維持している。
【００７４】
本発明のペプチドのアミノ酸残基における保存された変化を含む上記アミノ酸修飾体のいずれかの取り込みは、本発明のペプチドの血管形成機能（例えば、内皮細胞の増殖、遊走、血管出芽、血管新生）が保持される限り行われうることが理解される。このことを調べるために、本明細書の下記および下記の実施例の節に記載される血管形成アッセイのいずれかが行われることができる。
【００７５】
本発明のペプチドは、ペプチド合成の分野における当業者に既知の任意の技術によって合成されることができる。固相ペプチド合成については、多くの技術の要約が、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．およびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．（１９６３）「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）に、また、Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．（１９７３）「Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」第２巻、４６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出されうる。古典的な溶液合成の概括については、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｇ．およびＬｕｐｋｅ，Ｋ．（１９６５）Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、第１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【００７６】
一般に、ペプチド合成方法は、１つ以上のアミノ酸または好適に保護されたアミノ酸を成長中のペプチド鎖に逐次付加することを含む。通常、最初のアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかが、好適な保護基によって保護される。保護または誘導体化されたアミノ酸は、その後、好適に保護された相補的な（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列内の次のアミノ酸を、アミド連結を形成するために好適な条件のもとで加えることによって、不活性な固体担体に結合されることできるか、または、溶液中で利用されることができる。その後、保護基が、この新しく付加されたアミノ酸残基から除かれ、その後、次のアミノ酸（好適に保護されたアミノ酸）が加えられ、以降、同様に繰り返され；伝統的には、このプロセスはさらに洗浄工程を伴う。所望されるアミノ酸のすべてが適切な配列で連結された後、いずれかの残留する保護基（および何らかの固体担体）が、最終的なペプチド化合物を得るために、逐次的または同時に除かれる。この一般的な手順の簡便な変性によって、２つ以上のアミノ酸を一度に、例えば、保護されたトリペプチドを適切に保護されたジペプチドに（キラル中心をラセミ化させない条件のもとで）カップリングして、脱保護後にペンタペプチドを形成することなどによって、成長中の鎖に付加することが可能である。
【００７７】
ペプチド合成のさらなる記載が米国特許第６４７２５０５号に開示される。本発明のペプチド化合物を調製する１つの方法は、固相担体を利用する固相ペプチド合成を含む。大規模なペプチド合成がＡｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２０００、５５（３）：２２７〜５０によって記載される。
【００７８】
組換え技術は、大量のペプチドが要求されるときに使用されることができる（長いペプチドが要求されるときに使用されることができる）。そのような組換え技術は、Ｂｉｔｔｅｒら（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６〜５４４；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０〜８９；Ｂｒｉｓｓｏｎら（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ、３１０：５１１〜５１４；Ｔａｋａｍａｔｓｕら（１９８７）、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７〜３１１；Ｃｏｒｕｚｚｉら（１９８４）、ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１〜１６８０；およびＢｒｏｇｌｉら（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：８３８〜８４３；Ｇｕｒｌｅｙら（１９８６）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９〜５６５；ならびに、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、１９８８、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、第ＶＩＩＩ節、４２１頁〜４６３頁によって記載される。
【００７９】
簡単に記載すると、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、およびポリヌクレオチドの発現を宿主細胞（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉのような原核生物宿主細胞、または植物、酵母、または哺乳動物細胞のような真核生物宿主細胞）において導くためのプロモーターを含む核酸構築物は、組換ペプチドの生成のために好適な条件下で、好適な宿主細胞と共に使用されることができる。
【００８０】
本発明のペプチドは、「実質的に純粋な」形態で回収されることができる。本明細書中で使用される「実質的に純粋な」は、本明細書中に記載される様々な適用（例えば、治療目的、または診断目的）においてペプチドの効果的な使用を可能にする純度を示す。
【００８１】
従って、本発明は、本発明のペプチドの少なくとも１種を含む組成物を提供する。例えば、本発明の組成物は、本発明のペプチドの１種、２種、３種またはそれ以上を含むことができる。
【００８２】
本発明の実施形態によれば、本発明のペプチドは、組織の内皮細胞上の配列番号９に記載されるグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８）に結合することができる。
【００８３】
本発明の実施形態によれば、ＧＲＰ７８に対する本発明のペプチドの結合は、低酸素条件下でさえ対象の組織における血管形成の誘導（すなわち、血管新生を誘導すること）をもたらす。
【００８４】
本発明の血管形成促進ペプチドが、対象において血管形成を誘導するために使用されうることが理解されるだろう。
【００８５】
従って、本発明の追加の側面によれば、血管形成の誘導を必要とする対象において血管形成を誘導する方法が提供される。この方法は、治療有効量の本発明のペプチドのうち少なくとも１種のペプチドを対象に投与することによって行われ、それによって血管形成の誘導を必要とする対象において血管形成を誘導する。
【００８６】
本明細書中で使用される用語「対象」は、哺乳動物を示し、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、またはヒト対象を示す。
【００８７】
本発明の実施形態によれば、対象はヒトである。
【００８８】
本明細書中で使用される表現「必要とする対象」は、血管形成依存性の病状と診断されるか、血管形成依存性の病状の素因を有するか、または血管形成依存性の病状に罹患する対象を示す。
【００８９】
本明細書中で使用される表現「血管形成依存性の病状」は、調節されていない血管形成（すなわち、不十分な血管形成または過剰の血管形成）によって特徴付けられるいかなる病状（すなわち、状態、疾患、または障害）、および／または調節されていない血管形成（すなわち、不十分な血管形成または過剰の血管形成）から生じるいかなる病状（すなわち、状態、疾患、または障害）をも示す。
【００９０】
本発明の実施形態によれば、本発明のこの側面による血管形成依存性の病状は、不十分な血管形成によって特徴付けられる病状および／または不十分な血管形成により生じる病状を示す。その例には、限定されないが、遅発性の創傷治癒、遅発性の潰瘍治癒、生殖関連障害、動脈硬化症、虚血性の血管疾患、虚血性の心臓疾患、心筋虚血、心筋梗塞、心不全、心筋機能不全、心筋再造形、心筋症、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、アテローム硬化性心臓血管疾患、左主冠状動脈疾患、閉塞性動脈疾患、末梢虚血、末梢血管疾患、腎臓の血管疾患、末梢動脈疾患、四肢虚血、重篤な脚の虚血、下肢の虚血、脳虚血［例えば、小児期のモヤモヤ病における脳虚血（Ｔｏｕｈｏ  Ｈ．２００７，Ｓｕｒｇ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｊｕｎ  ２０；Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）］、脳血管疾患、網膜症、網膜修復、再造形障害、フォン・ヒッペル−リンダウ症候群、糖尿病、遺伝性出血性毛細管拡張症、虚血性の血管疾患、バーガー病、ならびにパーキンソン病およびアルツハイマー病のような神経変性疾患と関連する虚血が含まれる。
【００９１】
血管形成の誘導を必要とする対象の組織において血管形成を誘導することが、対象の組織における（本明細書の上記に記載されるような）不十分な血管形成によって特徴付けられる病状（例えば、疾患）を処置するために使用されうることは理解されるだろう。
【００９２】
対象において血管形成を誘導することおよび／または不十分な血管形成によって特徴付けられる病状を処置することは、本発明のこの側面によれば、対象に本発明のペプチドの少なくとも１種を投与することによって達成される。
【００９３】
用語「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、病状（疾患、障害、または状態）の進行を阻害すること、防止すること、または抑えること、および／または、病状を低減、軽減、または退縮させることを示す。当業者は、病状の進行を評価するために使用されることができる種々の方法論およびアッセイを理解し、同様に、病状の低減、軽減、または退縮を評価するために使用されることができる種々の方法論およびアッセイを理解するだろう。
【００９４】
本発明のペプチドが、それ自体で、または、本発明のペプチドが好適なキャリアまたは賦形剤と混合される医薬組成物において対象に投与されうることは理解されるだろう。
【００９５】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分（すなわち、本発明のペプチドのうちの少なくとも１種のペプチド）の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【００９６】
本明細書において、用語「有効成分」は、生物学的効果を担う本発明のペプチドを示す。
【００９７】
以降、交換可能に使用されることができる表現「生理学的に許容されうるキャリア」および表現「医薬的に許容されうるキャリア」は、生物に対する著しい刺激を生じさせず、しかも投与された化合物の生物学的な活性および性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に含まれる。
【００９８】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００９９】
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【０１００】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、心内注射（例えば、右心室腔または左心室腔内への注射、共通の冠状動脈内への注射）、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれることができる。
【０１０１】
ＣＮＳに対する薬物送達のための従来の取り組みには：神経外科的戦略（例えば、脳内注射または脳室内注入）；血液脳関門（ＢＢＢ）の内因性の輸送経路の１つを利用しようとするペプチドの分子操作［例えば、内皮細胞の表面に結合することができる本発明のペプチドを、それ自身では血液脳関門（ＢＢＢ）を横切ることができない薬剤と組み合わせて含むキメラ融合ペプチドの生成］；ペプチドの脂質溶解性を増大するように設計される薬理学的戦略（例えば、脂質またはコレステロールキャリアに対する水溶性ペプチドの結合）；および、高浸透圧性破壊によるＢＢＢの完全性の一時的な破壊（頸動脈へのマンニトール溶液の注入、またはアンギオテンシンペプチドのような生物学的に活性な薬剤の使用から生じる）が含まれる。
【０１０２】
あるいは、例えば、患者の組織領域に直接的に医薬組成物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に医薬組成物を投与することができる。
【０１０３】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
【０１０４】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容されうるキャリアを使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１０５】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１０６】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容されうるキャリアと組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのようなキャリアは、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容されうるポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
【０１０７】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。
【０１０８】
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０１０９】
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１１０】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
【０１１１】
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１１２】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１１３】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
【０１１４】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
【０１１５】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量」は、処置されている対象の障害の症状（例えば、不十分な血管形成に関連する病状）を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（本発明のペプチド）の量を意味する。
【０１１６】
治療有効量の決定は、特に、本明細書中に与えられる詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１１７】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外アッセイおよび細胞培養アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、望ましい濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて決定されることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０１１８】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照のこと）。
【０１１９】
投薬量および投薬間隔は、生物学的効果（血管形成）を誘導するのに十分な有効成分の組織（例えば、心臓組織、脳組織、肢組織、腎臓組織）レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供するために個々に調節されることができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、生体外でのデータから推定されることができる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、個体の特性および投与経路に依存する。検出アッセイは、血漿濃度を決定するために使用されることができる。
【０１２０】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０１２１】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
【０１２２】
本発明の組成物は、もし望むなら、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態を含有しうるパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供されることができる。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随しうる。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きでありうるか、または、承認された製品添付文書でありうる。医薬的に許容されうるキャリア中に配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上記にさらに詳述されるように、調製され、適切な容器に入れられ、示される状態の処置についてラベル書きされることができる。
【０１２３】
内皮細胞に対する選択的結合のために、本発明のペプチドは、試験管内で、生体外で（すなわち、対象から取り出された細胞において）、および／または生体内で（すなわち、生きている生物、対象内で）ペプチドに融合した薬剤を内皮細胞（ＥＣ）に対して標的化するために使用されることができる。このような薬剤は、薬剤を内皮細胞に対して標的化することが望ましく、かつ／または有益である（例えば、生体内投与が行なわれたときに対象にとって有益である）いかなる分子であることもできる。
【０１２４】
例えば、このような薬剤は、薬物、毒素部分（例えば、内皮細胞を殺すように設計されている毒素部分）、化学療法剤（例えば、内皮細胞内で、または内皮細胞の付近で癌性細胞を殺すように設計されている化学療法剤）、識別可能な薬剤（例えば、内皮細胞を検出するために使用されることができるビオチン、ジゴキシゲニン、酵素部分）、および放射性同位体（例えば、内皮細胞を標識および／または殺すことができる放射性同位体）であることができる。
【０１２５】
本発明のペプチドに融合させることができる毒素の例には、限定されないが、細菌起源、真菌起源、植物起源、または動物起源の酵素活性な毒素またはそのフラグメント［例えば、ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）のタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュウヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）のタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ［ニガウリ］（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）の阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセン］が含まれる。
【０１２６】
本発明のペプチドに融合させることができる放射性同位体の例には、限定されないが、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、２１２Ｂｉ、１９８Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、２１１Ａｔ、６７Ｃｕ、および２１２Ｐｂが含まれる。
【０１２７】
本発明のペプチドに融合させることができる化学療法剤の例には、限定されないが、ナイトロジェンマスタード［例えば、メクロレタミン（ＨＮ２）、シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、およびエストラムスチン］、アルキル化剤、葉酸アンタゴニストまたはそのアナログ（例えば、メトトレキサート、トリメトレキサート）、核酸代謝の代謝拮抗剤、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、４’−デオキシドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン）、ピリミジンアナログ（例えば、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン）、５−フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、それらのアナログおよび関連する阻害剤（例えば、アザシチジン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、フルダラビン）、アミン、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシド、コルチコステロイド、エチレンイミンおよびメチルメラミン（例えば、ヘキサメチルメラミン、チオテパ）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン）、トリアジン（例えば、ダカルバジン、プロカルバジン、アジリジン）ビンカ・アルカロイド［例えば、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、ビンデシン］、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド、テニポシド）、酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）、タキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル）、生物学的応答修飾因子（例えば、インターフェロンα、腫瘍壊死因子、腫瘍浸潤リンパ球）、白金配位錯体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）、アントラセンジオン（Ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｄｉｏｎｅ）（例えば、ミトザントロン）、置換尿素（ヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン誘導体（プロカルバジン）、副腎皮質抑止剤（ミトタン、アミノグルテチミド）、コステロイド、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシ−プロゲステロン、メドロキシプロゲステロン）が含まれる。具体的な例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（すなわち、Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキシン、タキソール、トクソテレ、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン（米国特許第４６７５１８７号を参照のこと）、メルファランおよび他の関連するナイトロジェンマスタードが含まれる。この定義にはまた、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール）、抗エストロゲン（タモキシフェン）、アンドロゲン（プロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン）、抗アンドロゲン（フルタミド）、ゴナドトロピン放出ホルモンアナログ（ロイプロリド、ゴセレリン）およびオナプリストンのような、腫瘍に対するホルモン作用を調節ま���は阻害するように作用するホルモン剤が含まれる。
【０１２８】
本発明のペプチドと上記薬剤との融合物は、様々な二機能性のタンパク質カップリング剤を使用して、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｃｕｍｂｅｒら、１９８５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１２：２０７−２２４に本質的に記載される）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣＬなど）、活性なエステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラートなど）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒドなど、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏに本質的に記載される）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンなど）、ジイソシアナート（例えば、トリエン−２，６−ジイソシアナートなど）、ビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）、またはカルボジイミド結合法（Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎ’ｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．３４９−５０  ＆  ３７２−７４（第３版），１９８５；Ｂ．Ｎｅｉｓｅｓら、１９７８，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１７：５２２；Ａ．Ｈａｓｓｎｅｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４４７５；Ｅ．Ｐ．Ｂｏｄｅｎら、１９８６，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：２３９４、およびＬ．Ｊ．Ｍａｔｈｉａｓ  １９７９，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ５６１に記載される）などを使用して作製されることができる。例えば、リシン融合物は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：１０９８（１９８７）に記載されるようにして調製されることができる。炭素−１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミノペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドをペプチドに結合するための例示的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６；米国特許番号第６４２６４００号；Ｌａｓｋｅ，Ｄ．Ｗ．、Ｙｏｕｌｅ，Ｒ．Ｊ．およびＯｌｄｆｉｅｌｄ，Ｅ．Ｈ．（１９９７）、悪性脳腫瘍患者における標的化された毒素ＴＦ−ＣＲＭ１０７の局所的分布による腫瘍退行、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３：１３６２〜１３６８を参照のこと。
【０１２９】
追加的にまたは代替的に、本発明の薬剤は、組換えＤＮＡ技術を介して、本発明のペプチドのコード配列（例えば、配列番号２）に翻訳上融合された本発明の薬剤（例えば、シュードモナス外毒素ＡのＰＥ３８ＫＤＥＬ切断形態）のコード配列を含む発現ベクターを構築し、本発明の薬剤およびペプチドのアミノ酸を含む組換え融合ペプチドの生産のためにその構築物を宿主細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）において発現することによって、本発明のペプチドに結合されることができる。あるいは、発現ベクターは、（例えば、バイアルビヒクルを使用する）公知の遺伝子治療技術を介して治療を必要とする対象に投与されることができる。
【０１３０】
本発明の実施形態によれば、本発明のペプチドおよびペプチドに融合（または結合）された薬剤（例えば、毒素、化学療法剤、識別可能な部分、または放射性同位体）を含む本発明の組成物は、医薬的に許容されうるキャリアを有する医薬組成物の一部を形成することができる。
【０１３１】
従って、このような組成物（本発明のペプチドに結合または融合された治療的薬剤を含む組成物）は、異常に増大した血管形成（過剰の血管新生）によって特徴付けられる病状を処置するために使用されることができる。例えば、このような組成物は、腫瘍脈管構造の破壊によって腫瘍の増殖を阻害するために使用されることができる。
【０１３２】
本発明の組成物によって処置されることができる、異常に増大した血管形成によって特徴付けられる病状の非限定的な例には、癌、転移性癌、ＨＩＶ患者の骨髄における骨髄異形成特徴（ＭＤＦ）、原発性骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、全身性肥満細胞症（ＳＭ）、網膜の新生血管形成、アテローム動脈硬化性斑における新生血管形成、血管腫、関節炎、乾癬、関節炎、および他の自己免疫疾患含まれる。
【０１３３】
本発明の組成物によって処置されうる癌または癌転移には、限定されないが、胃腸管の腫瘍（結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、小腸および／または大腸の癌、食道癌、胃癌、膵癌）、胆嚢癌、胆道腫瘍、前立腺癌、腎臓癌（例えば、ウイルム腫瘍）、肝臓癌（例えば、肝芽腫、肝細胞癌）、膀胱癌、胎児性横紋筋肉腫、胚細胞腫瘍、栄養膜の腫瘍、精巣の胚細胞腫瘍、卵巣、子宮、上皮性卵巣の未熟型奇形腫、仙尾部の腫瘍、絨毛癌、胎盤性絨毛腫瘍、成人上皮性腫瘍（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｄｕｌｔ  ｔｕｍｏｒ）、卵巣癌、子宮頸癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、鼻咽腔癌、乳癌、扁平上皮細胞癌（例えば、頭部および頸部）、神経原性腫瘍、星状細胞腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞、バーキット、皮膚Ｔ細胞性、組織球、リンパ芽球、Ｔ細胞、胸腺）、神経膠腫、腺癌、副腎腫瘍、脳の悪性（腫瘍）、種々の他の癌腫（例えば、気管支原性大細胞癌、腺管癌、腹水癌、類表皮癌、大細胞癌、ルイス肺癌、髄様癌、粘液性類表皮癌、燕麦細胞癌、小細胞癌、紡錘体細胞癌、脊髄小脳癌、移行細胞癌、未分化癌、癌肉腫、絨毛癌、嚢胞腺癌）、上衣芽細胞腫、上皮腫、赤白血病（例えば、フレンド白血病、リンパ芽球白血病）、繊維肉腫、巨細胞腫、神経謬腫瘍、神経謬芽細胞腫（例えば、多形（ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）細胞腫、星状細胞腫）、神経謬腫、肝臓癌、ヘテロハイブリドーマ、ヘテロ骨髄腫、組織球腫、ハイブリドーマ（例えば、Ｂ細胞ハイブリドーマ）、副腎腫、インスリノーマ、島細胞腫、角化腫、平滑筋芽細胞腫、平滑筋肉腫、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性前Ｂ細胞白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、急性巨核芽球性白血病、単球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄様白血病、Ｂ細胞白血病、好塩基性白血病、慢性骨髄様白血病、慢性Ｂ細胞白血病、好酸球性白血病、フレンド白血病、顆粒球性白血病または骨髄球性白血病、ヘアリー細胞白血病、リンパ性白血病、巨核芽球性白血病、単球性白血病、単球性−マクロファージ白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄様白血病、骨髄単球性白血病、形質細胞性白血病、前Ｂ細胞白血病、前骨髄球性白血病、亜急性白血病、Ｔ細胞白血病、リンパ球様新生物）、リンパ肉腫、黒色腫、乳腺癌、肥満細胞腫、髄芽細胞腫、中皮腫、転移性腫瘍、単球腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、腎性芽細胞腫、神経組織の神経謬腫瘍、神経組織のニューロン腫瘍、神経鞘腫、神経芽細胞腫、乏突起膠腫、骨軟骨腫、骨髄腫、骨肉腫（例えば、ユーニング肉腫）、乳頭腫、移行細胞、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍、形質細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、組織球細胞肉腫、ジェンセン肉腫、骨形成肉腫、細網細胞肉腫）、シュワン細胞腫、皮下腫瘍、奇形癌（例えば、多能性癌）、奇形腫、精巣腫瘍、胸腺腫、および毛包上皮腫が含まれる。
【０１３４】
増大しつつある一連の証拠は、血管形成が癌の進行にとって必須であることを示している。実際、新生血管分布の広がりは、原発性の乳癌、膀胱癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、皮膚メラノーマおよび子宮頸癌における転移と強く相関する［Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、３６：１２７〜１３７（１９９５）］。従って、腫瘍の血管形成表現型を評価することにより、疾患の結果が強く示される。過剰の血管新生または不十分な血管新生によって特徴づけられる他の疾患または状態には、本明細書の上記に記載される疾患だけでなく、網膜の新生血管形成、アテローム動脈硬化性斑における新生血管形成、血管腫、関節炎および乾癬が含まれるが、これらに限定されない。Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３３３：１７５７〜６３（１９９５）を参照のこと。
【０１３５】
従って、内皮細胞の細胞表面に特異的に結合する本発明のペプチドの能力は、血管新生を強力に検出するものとしてのその使用を示唆する。このことは、血管形成依存性の疾患の存在を検出するために、または、血管形成依存性の疾患に対する素因を評価するために、または、血管形成依存性の疾患の進行をモニターするために重要でありうる。
【０１３６】
従って、本発明ではまた、生物学的サンプルにおける内皮細胞の存在または非存在を検出する方法が考えられる。
【０１３７】
この方法は、生物学的サンプルを、（例えば、ＧＲＰ７８受容体を介して内皮細胞の細胞表面に結合することができる）本発明のペプチドでインキュベーションすること、および、そのペプチドを検出し、それにより生物学的サンプルにおける内皮細胞の存在または非存在を検出することによって行われる。
【０１３８】
検出のために利用される生物学的サンプルは、生検試料などの組織サンプルであることができる。組織生検物を哺乳動物から得る方法は、この分野で広く知られている（Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：／／ｗｗｗ．ｈｅａｌｔｈａｔｏｚ．ｃｏｍ／ｈｅａｌｔｈａｔｏｚ／Ａｔｏｚ／ｄｅｆａｕｌｔ．ｈｔｍｌを参照のこと）。
【０１３９】
本発明の少なくとも１種のペプチドが、以下の実施例の節において記載されるような複合体形成のために好適な条件（すなわち、緩衝液、温度、インキュベーション時間など）のもとで生物学的サンプルと接触させられる。
【０１４０】
生物学的サンプル内のペプチド−細胞複合体は、この分野で知られているいくつかの方法のいずれか１つによって検出されることができ、そのような方法は、生化学的および／または光学的な検出スキームを用いることができる。
【０１４１】
複合体の検出を容易にするために、本発明のペプチドは、タグまたは抗体によって目立たされる。目立たせることは、目立たせる方法に依存して、複合体形成の前に、または、複合体形成と同時に、または、複合体形成の後で行われうることが理解されるだろう。本明細書中で使用される用語「タグ」は、定量可能な活性または特徴を示す分子を示す。タグは、化学的蛍光体（例えば、フルオレセインなど）またはポリペプチド蛍光体（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または関連したタンパク質など）などを含む蛍光性分子である（ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）。そのような場合、タグは、好適な励起光を当てたときに生じるその蛍光によって定量することができる。あるいは、タグは、エピトープタグ（特異的な抗体が、他の細胞エピトープと実質的に交差反応することなく結合することができるかなり特有のポリペプチド配列）であることができる。そのようなエピトープタグには、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、ロイシンタグ、ＩｇＧタグおよびストレプトアビジンタグなどが含まれる。
【０１４２】
本発明のペプチドはまた、生体内で内皮細胞を強力に検出するものとして使用されうることが理解されるだろう。内皮細胞と結合することができる設計されたペプチドは、非放射能的に標識されている場合、または放射性同位体により標識されている場合であっても、この分野では広く知られているように、本明細書の上記で議論された血管形成依存性の疾患の発症または存在を診断するために個体に投与されることができる。内皮細胞に対する投与後におけるそのような標識ペプチドの結合は、この分野で知られている生体内画像化技術によって検出されることができる。
【０１４３】
本発明のペプチドが、推定血管形成分子（すなわち、血管形成を誘導することができる分子）または抗血管形成分子（すなわち、血管形成を阻害することができる分子）を同定するためにさらに使用されるうることが理解されるだろう。従って、本発明の別の側面によれば、推定血管形成分子を同定する方法が提供される。その方法は、（ａ）本発明のペプチドが結合した内皮細胞を準備すること、および（ｂ）ペプチドを内皮細胞から脱離させることができる分子を同定することによって行われ、それによって推定血管形成分子または推定抗血管形成分子を同定する。
【０１４４】
あるいは、推定血管形成分子または推定抗血管形成分子を同定する方法は、（ａ）本発明のペプチドを、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８）またはＧＲＰ７８を発現する細胞と共に、ペプチドとＧＲＰ７８またはＧＲＰ７８を発現する細胞の間での複合体の形成に好適な条件下でインキュベートすること、および（ｂ）ペプチドを複合体から脱離させることができる分子を同定することによって行われることができ、それによって推定血管形成分子または推定抗血管形成分子を同定する。
【０１４５】
そのような検出方法はまた、血管形成の阻害または促進（誘導）において有用な潜在的薬物を発見するためのアッセイにおいて利用されうることが理解されるだろう。例えば、本発明は、試験化合物（すなわち、推定血管形成分子または推定抗血管形成分子）のハイスループットスクリーニングのために使用されることができる。典型的に、本発明のペプチドは、アッセイ体積を減少させるために放射能標識される。本発明のペプチドは、試験化合物と結合させる前に、または、試験化合物と結合させるのと同時に、または、試験化合物と結合させた後で、内皮細胞と結合させられる。その場合、競合的アッセイが、試験化合物による標識の追い出しをモニターすることによって行われる［Ｈａｎ（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：４５０６〜７およびＥｓｌｅｒ（１９９６）Ｃｈｅｍ．２７１：８５４５〜８］。
【０１４６】
いったん、推定血管形成分子または抗血管形成分子が同定されると、その分子は、この分野では広く知られている血管形成アッセイを使用してさらに評価される。例には、ニワトリ漿尿膜、ウサギ角膜アッセイ、スポンジインプラントモデル、マトリゲルおよび腫瘍モデルが含まれるが、これらに限定されない（下記の実施例の節に記載されるアッセイもまた参照のこと）。
【０１４７】
本発明のペプチドは、診断キットまたは治療キットに含められることができる。例えば、本発明のペプチドは、適切な緩衝液および保存剤とともに１つまたは複数の容器に詰められることができ、そして、診断のために、または、治療的処置を導くために使用されることができる。従って、本発明のペプチドは、例えば、それぞれを１つの容器において混合されることができ、または、個々の容器に入れられることができる。本発明の実施形態によれば、容器は標識を含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されることができる。
【０１４８】
加えて、他の添加剤（例えば、安定化剤、緩衝剤およびブロッキング剤など）もまた加えられることができる。
【０１４９】
そのようなキットのペプチドはまた、固体支持体（例えば、ビーズおよびアレイ基板（例えば、チップ）など）に結合され、診断目的のために使用されることができる。
【０１５０】
キットに含まれるペプチド、または、基板に固定化されたペプチドは、検出可能な標識（例えば、本明細書の上記に記載される標識など）に結合されることができる。
【０１５１】
キットはまた、検査された対象が、調節されていない血管形成に関連する状態、障害、または疾患に罹患しているか、あるいは、そのような状態、障害、または疾患を発症する危険性にあるかどうかを明らかにするための説明書を含むことができる。
【０１５２】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１５３】
本発明の追加の目的、利点および新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１５４】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なお、これら実施例によって本発明は限定されない。
【０１５５】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組換えＤＮＡの技術が広く含まれている。これらの技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，バルチモア，メリーランド（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」、１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９８）；米国特許第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編、「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、ノーウォーク，ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ編、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている：米国特許第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲ��  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；なお、これらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用されるものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１５６】
一般的な材料および方法
ペプチド合成  −  ＡＤＯＰｅｐ１（配列番号２）、ＡＤＯＰｅｐ２（配列番号３）、およびＡＤＯＰｅｐ３（配列番号４）は、ＡＤＡＭ１５アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  Ｑ１３４４４）に従って、ＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ，米国）によって合成された。ＨＰＬＣ純度は、９７％より高かった。ペプチドは、１ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解された。
【０１５７】
内皮細胞に対するＡＤＯＰｅｐの結合  −  ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、トリプシンによって採取され、サンプルあたり１００，０００個の細胞がＰＢＳ＋５％ＦＣＳ＋０．１％Ｎａアジド中に懸濁された。内皮細胞は、低酸素に５時間曝露されるか、または通常酸素条件下のままのいずれかであった。細胞は、１００，０００個の細胞あたり０．０５μｇ、０．５μｇ、５μｇのビオチニル化ＡＤＯＰｅｐで、暗所において氷上で２時間染色された。細胞は次いで、ＰＢＳで２回洗浄され、その後、細胞はＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＡ，米国）で３０分間染色された。洗浄後、サンプルは、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳｃａｎ  Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＣＡ，米国）を用いて分析された。
【０１５８】
ＡＤＯＰｅｐでインキュベートされた内皮細胞の増殖  −  継代数３由来のＨＵＶＥＣが、増殖実験のために使用された。内皮細胞（１５，０００細胞／ウェル）は、補充物を有する内皮細胞増殖培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ）の存在下で２４ウェルに播種され、２４時間インキュベートされた。その後、細胞は補充物不含培地において２４時間飢餓に曝露された。ＡＤＯＰｅｐは、低酸素条件下で２４時間、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、および１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加された。２μＣｉ／ウェルのチミジン（ＳＩＧＭＡ，Ｒｅｈｏｖｏｔ  イスラエル）が添加され、一晩インキュベートされ、その後３００μｌ／ウェルの０．５Ｍ  ＮａＯＨで３７℃で採取する前にＰＢＳで３回洗浄された。細胞溶解物は、２ｍｌのシンチレーション液Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，米国）を含むシンチレーションバイアルに移され、βカウンターにおいて数えられた。結果は、１分あたりのカウント数（ｃｐｍ）として得られた。
【０１５９】
ＡＤＯＰｅｐによって誘導される内皮細胞の遊走  −  内皮細胞遊走は、製造者の説明書に従って、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＱＣＭ  ９６ウェル遊走アッセイ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＣＡ、米国）によって評価された。このキットは、８μｍの細孔サイズを有する膜を利用する。インサート膜の底にいる遊走細胞は、キットによって提供される細胞脱離緩衝液でインキュベートされたときに膜から解離される。これらの細胞は、続いて溶解され、分子プローブＣｙＱｕａｎｔ  ＧＲ色素（細胞の核酸に結合したときに増強された蛍光を示す緑色蛍光色素）によって検出される。遊走アッセイのために、継代数３由来のＨＵＶＥＣが、補充物不含の内皮細胞（ＥＣ）増殖培地中でインキュベートされた。トリプシン処理後、２５，０００個のＥＣは、遊走チャンバにおいてインキュベートされた。ＡＤＯＰｅｐは、化学誘因物質遊走アッセイのために給餌トレイ中に１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、および１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加された。インキュベーションの時間は、低酸素条件下の内皮細胞に対して５時間であった。結果は、４８０／５２０ｎｍで蛍光ＥＬＩＳＡ読み取り機において決定された。
【０１６０】
ＡＤＯＰｅｐの生体内血管形成活性の評価のためのマウス後肢虚血モデル  −  マウス後肢虚血モデルが使用された。虚血は、Ｃ５７Ｂｌ系統のマウスにおいて、左後肢での大腿動脈の結紮および切除によって作られた。右後肢はコントロールとして役立てた。手術の１日後に、ＡＤＯＰｅｐ１およびＡＤＯＰｅｐ３が、手術に近い部位で筋肉内注射された。各マウスは手術の１日後に、マウスあたり０．１μｇまたは１μｇの総量のペプチドのいずれかで処置されるか、あるいはコントロールとして注入されたＰＢＳ（５０μｌ）で処置された。血液潅流は、Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ血流分析計（Ｐｅｒｉｍｅｄ，スウェーデン）を用いて術後１日目、および７日目、１４日目、２１日目に測定された。各肢の平均潅流が計算され、潅流の百分率割合が虚血（左）／コントロール（右）の潅流の百分率として示された。
【０１６１】
組織学的検査  −  ＡＤＯＰｅｐ１またはＡＤＯＰｅｐ３で処置されたマウス、あるいはＰＢＳを注射されたコントロールマウスからの肢は、術後７日目、１４日目、および２１日目に犠牲にされた。虚血性の脚および非虚血性の脚の全体が、即時に４％パラホルムアルデヒド中で４８時間固定され、次いでパラフィン中に包埋された。３マイクロメーター厚の切片が調製され、筋腺維を横方向にして切断された。内皮細胞の同定は、１／２００希釈でのポリクローナル抗第ＶＩＩＩ因子の一次抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，デンマーク）、および二次抗体Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，デンマーク）を使用して、フォン・ヴィレブランド第ＶＩＩＩ因子関連抗原についての免疫染色によって実施された。血管密度は、ミリメートル平方あたりの毛細血管として表された。断面積あたりの平均血管数を得るために、最小１０個の視野がサンプリングされ、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ−Ｐｌｕｓ（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ，米国）を使用してカウントされる領域を測定した。第ＶＩＩＩ因子陽性血管の数がカウントされた。
【０１６２】
ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐでの内皮細胞の免疫沈降（ＩＰ）実験
ＨＵＶＥＣ溶解物の調製  −  ＨＵＶＥＣは、完全内皮細胞増殖培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ．Ｈｅｉｌｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ）と共に９０ｍｍペトリ皿プレートに２４時間播種された。細胞はＰＢＳで２回洗浄され、緩衝液溶解物（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  Ｃｌ（ｐＨ８，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０２％  Ｎａアジド，０．１％  ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌ  プロテアーゼ阻害剤，１％  ＮＰ−４０）は氷上で２０分間添加された。インキュベーション後、細胞は、ゴム製ポリスマンで削り取られ、冷却されたマイクロチューブに移された。４℃、２分間の１２，０００ｇでの溶解物の遠心分離の後、上清は新しいマイクロチューブに移され、−７０℃で保存された。
【０１６３】
免疫沈降（ＩＰ）  −  溶解物のアリコートサンプル（５００μｌ）は、緩やかに混合させながら、４℃で１時間、１０μｇのビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１と共にインキュベートされた。ストレプトアビジンセファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓｌａ，スウェーデン）（５０μｌ）は、緩やかに混合させながら、４℃で１時間、第２のインキュベーションのためにサンプルに添加された。その後、サンプルは１２，０００ｇで２０秒間遠心分離され、ペレットが残され、さらに３回洗浄された。最終的に、ペレットは、ウェスタンブロット分析のために１００μｌのサンプル緩衝液に懸濁された。ＥＬＩＳＡのために、タンパク質は、１ｍｌのトリス−グリシン０．２Ｍ（ｐＨ２．２）における室温でのサンプルの５分間のインキュベーション、その後の１Ｍトリス（ｐＨ９．１）での滴定によって溶出された。
【０１６４】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析  −  ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１（ＧＲＰ７８免疫沈降タンパク質）（３０μｌ）で免疫沈降されたＧＲＰ７８を含有するタンパク質バンドが、ミニゲルのレーンにアプライされ、１０％トリスアクリルアミドゲルにおいて標準条件（２枚のミニゲルに対して６０ｍＡ、１．４時間）で電気泳動された。ゲルはクマシーブルーで染色された。バンドは、タンパク質同定のために、切り取られて質量分析にまわされた。
【０１６５】
ウェスタンブロット分析  −  ＰＡＧＥ分析の後、タンパク質転写が、ニトロセルロース膜において４０Ｖで湿潤条件で２時間実施され、その後ゲルがクマシーブルーで染色された。ニトロセルロース膜は、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０および５％の脱脂乳を含有するＰＢＳでインキュベーションすることによって、室温で２時間ブロッキングされた。ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにおいて５μｇ／ｍｌ）での膜のインキュベーションは、緩やかに振盪させながら４℃で一晩行われた。その後、膜は、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で３回（それぞれ１５分）洗浄された。二次抗体ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（１μｇ／ｍｌ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＰＡ，ＣＡ  米国）でのインキュベーションは、室温で４５分間実施され、その後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で３回（それぞれ１５分）洗浄された。ＧＲＰ７８免疫染色のために、膜は、上記に記載されるようにブロッキングされ、さらに２μｇ／ｍｌの濃度で抗ＧＲＰ７８抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，米国）で４℃で２４時間インキュベートされ、その後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄された。１：５０００の希釈での二次抗ヤギＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＡ，米国）でのインキュベーションは、室温で４５分間実施され、その後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄された。ＥＣＬは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ，ＩＬ，米国）を用いて実施された。
【０１６６】
内皮細胞に対する抗ＧＲＰ７８結合のＦＡＣＳ分析  −  ＨＵＶＥＣがトリプシンによって採取され、サンプルあたり１００，０００個の細胞がＰＢＳ＋５％ＦＣＳ＋０．１％  Ｎａアジド中に懸濁された。１μｇ／１００，０００個の細胞の濃度のヤギポリクローナル抗ＧＲＰ７８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，米国）が、氷上で４０分間添加された。細胞は洗浄され、抗ヤギＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＡ，米国）で染色された。サンプルは、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳｃａｎ  Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＣＡ，米国）を用いて分析された。
【０１６７】
異なる腫瘍細胞に対する抗ＧＲＰ７８結合のＦＡＣＳ分析  −  ＭＣＦ７乳癌細胞、ＳＫ２８黒色腫細胞、ＨＴ２９結腸癌細胞、およびＫ５６２赤白血病細胞がトリプシンによって採取され、サンプルあたり３００，０００個の細胞がＰＢＳ＋５％ＦＣＳ＋０．１％  Ｎａアジド中に懸濁された。１μｇ／１００，０００個の細胞の濃度のヤギポリクローナル抗ＧＲＰ７８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，米国）が、氷上で４０分間添加された。細胞は洗浄され、抗ヤギＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＡ，米国）で染色された。サンプルは、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳｃａｎ  Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＣＡ，米国）を用いて分析された。
【０１６８】
アポトーシス  −  ＥＣは、ペトリ皿プレートにおいてＥＣ増殖培地中で５％ＦＣＳで２４時間インキュベートされ、その後、ＡＤＯＰｅｐ１（１０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＧＲＰ７８抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，米国）（１μｇ／ｍｌ）または組換えＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で、低酸素条件下で２４時間インキュベートされた。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ＦＩＴＣ／ＰＩは、フローサイトメトリーを使用してアポトーシス細胞上のホスファチジルセリンを検出する。ヒトＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣキット（Ｂｅｎｄｅｒ  Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｉｅｎｎａ，オーストリア）は、製造者の指示書に従ってＥＣアポトーシス百分率割合の測定のために使用された。サンプルは、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳｃａｎ  Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＣＡ，米国）を用いて分析された。
【０１６９】
ＧＲＰ７８に対する、ＡＤＯＰｅｐ１、ＡＤＯＰｅｐ２、およびＡＤＯＰｅｐ３ペプチドの競合的結合  −  内皮細胞（ウェルあたり２０，０００個）は、完全培地の存在下で２４時間９６ウェルプレートに播種された。プレートは、ＰＢＳで一晩洗浄され、ＰＢＳ、０．１％  Ｎａアジド、および５％  ＦＣＳで再水和された。ＡＤＯＰｅｐ１、ＡＤＯＰｅｐ２、およびＡＤＯＰｅｐ３は、１ｍｌあたり０．０１μｇ、０．１μｇ、および１μｇの濃度で室温で２時間、洗浄されたプレートに添加された。抗ＧＲＰ７８抗体（ヤギポリクロ−ナルＩｇＧ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，米国）は、ウェルあたり２μｇ／ｍｌの濃度で室温で１時間プレートに添加された。洗浄後、結合した抗ＧＲＰ７８抗体は、ペルオキシダーゼ結合抗ヤギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｅｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＡ，米国）でのインキュベーションによって検出された。ＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０での５回の洗浄後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ＋基質−色原体（ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，ＣＡ，米国）が最大３０分間添加された。反応は、１Ｎ  ＨＣｌで停止された。発現された色は４５０ｎｍでＥＬＩＳＡ読み取り機によって決定された。
【０１７０】
実施例１
ＡＤＡＭ１５のメタロプロテアーゼドメインに由来する特定のペプチドは、内皮細胞に結合し、かつ内皮細胞の増殖および遊走を誘導する
実験結果
ＡＤＯＰｅｐ１配列  −  いくつかのペプチドが、メタロプロテアーゼドメインから合成され、内皮細胞に対する最も良好な結合能力を有するペプチドを選択するために予備実験が行なわれた。これらのうちの１つ、ＡＤＯＰｅｐ１と呼ばれるペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列ＨＷＲＲＡＨＬＬＰＲＬＰを有する。ＡＤＡＭ１５分子（配列番号１）のメタロプロテアーゼドメインにおけるＡＤＯＰｅｐ１の位置が、図２ｂに示される（配列番号１のアミノ酸２８６〜２９７に相当する、下線が引かれた文字）。
【０１７１】
ＦＡＣＳ分析による内皮細胞（ＥＣ）に対するＡＤＯＰｅｐ１の結合  −  増大する濃度のビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１が通常酸素条件下でＥＣに添加され、ＥＣに対するＡＤＯＰｅｐ１の結合がＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンおよびＦＡＣＳ分析を用いて検出された。図３に見られるように、ＥＣに対するＡＤＯＰｅｐ１の結合百分率の増大は、用量依存的な様式で約６２％に到達し、１ｍｌあたり５μｇで最大であった。低酸素条件（５時間）下のＥＣがビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１と共にインキュベートされたとき、５μｇ／ｍｌでのＡＤＯＰｅｐ１の結合は約８５％に達した（図４）。これらの結果は、低酸素下での内皮細胞に対するＡＤＯＰｅｐ１の結合の増大を示す。
【０１７２】
ＡＤＯＰｅｐは、低酸素下でＥＣの増殖を誘導する  −  ＡＤＯＰｅｐのＥＣ増殖を誘導する能力をさらに試験するために、増大する濃度のＡＤＯＰｅｐ１、ＡＤＯＰｅｐ２、およびＡＤＯＰｅｐ３がＥＣと共にインキュベートされ、低酸素下かつ２４時間飢餓での細胞の増殖が決定された。図５に示されるように、ＡＤＯＰｅｐ１およびＡＤＯＰｅｐ２は、１０ｎｇ／ｍｌの濃度でＥＣの増殖を誘導することができた。
【０１７３】
新規なペプチドＡＤＯＰｅｐ１は、低酸素下でＥＣの遊走を誘導する  −  ＡＤＯＰｅｐの低酸素下で内皮細胞の遊走を誘導する能力が試験された。ＥＣは遊走チャンバにおいてインキュベートされ、ＡＤＯＰｅｐが低酸素条件下で５時間、給餌トレイ中に１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、および１００ｎｇ／ｍｌで添加された。ＥＣの遊走は、蛍光ＥＬＩＳＡ読み取り機において決定され、相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表された。図６に示されるように、ＥＣ遊走の最も有意な増大は、１０ｎｇ／ｍｌの濃度でのＡＤＯＰｅｐ１の存在下で観察された。
【０１７４】
要するに、これらの知見は、本発明のＡＤＯＰｅｐが、主に低酸素条件下で内皮細胞に結合することが可能であり、かつ低酸素下で内皮細胞の増殖および遊走を誘導することが可能であることを示す。
【０１７５】
実施例２
ＡＤＯＰｅｐ１は、生体内で虚血組織の血管形成および潅流の増大を誘導する
実験結果
ＡＤＯＰｅｐ１は、後肢虚血を有するマウスにおいて潅流の有意な増大を誘導する  −  マウス虚血後肢モデルが、ＡＤＯＰｅｐによって誘導される血管形成の生体内での可能性を評価するために使用された。虚血は、大腿動脈の結紮および切除によってマウスの左後肢において作られた。右後肢はコントロールとして役立てた。手術の１日後に、各々のペプチドは、結紮に近い１つの部位に注射された。各マウスは、マウスあたり０．１μｇまたは１μｇの総量の各々のペプチドで処置された。血液潅流は、Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｉｍａｇｅｒ（ＰｅｒｉＭｅｄ，スウェーデン）を用いて術後７日目、１４日目、および２１日目に測定された。図７において見られるように、各肢の平均潅流が計算され、虚血（左）／コントロール（右）の血液潅流率として示された。統計学的な分析は、ＰＢＳを注射されたマウスに比べて、術後２１日目に０．１μｇのＡＤＯＰｅｐ１を注射されたマウスにおける血液潅流の有意な増加を示し、後肢における血液潅流の完全な回復を示す。
【０１７６】
ＡＤＯＰｅｐ１で処置された虚血後肢における血管形成の組織学的評価  −  後肢の結紮およびマウスあたり０．１μｇのＡＤＯＰｅｐ１の投与の後、マウスは７日目、１４日目、および２１日目に犠牲にされ、脚全体がパラフィン中に包埋された。図８は、ＰＢＳ注射マウスと比べて、ＡＤＯＰｅｐ１で処置されたマウスの脚における平均＋ＳＥとして表された、サンプルあたり１０個の個別の視野の断面積あたりの血管数の平均を示す。ＡＤＯＰｅｐ１処置は、ＰＢＳ処置マウスと比べて血管数の有意な増大（ｐ＜０．０５）をもたらした。代表的な実例（図９ａ−ｂ）は、ＡＤＯＰｅｐ１処置群においてコントロールよりも高くフォン・ヴィレブランド因子陽性染色された小血管を示す。
【０１７７】
要するに、これらの知見は、本発明のＡＤＯＰｅｐが虚血後の血管形成を誘導することが可能であり、従って、虚血性疾患を処置するために使用されうることを示す。
【０１７８】
実施例３
内皮細胞上のＡＤＯＰｅｐ受容体の同定
実験結果
内皮細胞上のＡＤＯＰｅｐ受容体の同定  −  ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１での内皮細胞溶解物の免疫沈降（ＩＰ）が、ＰＡＧＥによって分析された。図１０ａ−ｂに見られるように、ＡＤＯＰｅｐ１での免疫沈降の後に、主要な単一タンパク質バンドが７８ｋＤａに存在する。このバンドがＡＤＯＰｅｐ１ぺプチド結合受容体であることを確認するために、分離されたタンパク質はニトロセルロース膜に移され、それはビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１で染色された後、化学発光基質でさらに染色された。図１１に見られるように、実際に２つの異なる実験において標識されたペプチドによって同じバンドが染色された（図１１に示されるＰＡＧＥにおける両方のレーン）。タンパク質受容体バンドは、ゲルから切り取られ、質量分析法によって分析された。
【０１７９】
質量分析法の結果は、本明細書の下記の表４に示される。受容体は、単離されたバンドから消化された２２個のペプチドを用いてグルコース調節タンパク質［ホモ・サピエンス］ＧＲＰ７８タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＣＡＢ７１３３５；Ｇｉ：６９００１０４）として同定された。
2010506905.tif 000007
【０１８０】
実際に、内皮細胞上のＡＤＯＰｅｐ１受容体がＧＲＰ７８タンパク質であることをさらに確認するために、ＩＰ実験が繰り返され、抗ＧＲＰ７８抗体を用いてウェスタンブロット分析が実施された。図１２に示された結果は、抗ＧＲＰ７８での陽性染色を示す。
【０１８１】
低酸素下でのＥＣ上のＧＲＰ７８受容体タンパク質の同定  −  低酸素条件下でＡＤＯＰｅｐペプチドに結合するＥＣ上の受容体を分析するために、ＥＣは、低酸素条件下で５時間予備インキュベートされ、免疫沈降はビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１を用いて実施された後、ビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１（図１３ａ）または抗ＧＲＰ７８抗体（図１３ｂ）を使用するウェスタンブロット分析が行われた。低酸素下でのＥＣ上の同一の受容体（グルコース調節タンパク質、ホモ・サピエンス、Ｇｉ  ６９００１０４）の確認は、以下の表５に示されるように質量分析法によって行われた（１９個の一致）。
【表５】
2010506905.tif 000008
【０１８２】
低酸素下でのＥＣ上のＧＲＰタンパク質の増大された呈示  −  図１４および１５は、ＦＡＣＳ分析によって通常酸素条件および低酸素条件下で膜上でＧＲＰ７８を発現するＥＣの割合を示す。図１４に見られるように、１０個の異なる臍帯に由来するＥＣに対するＧＲＰ７８の結合は、通常酸素条件下で３０±１３％、５時間の低酸素後に５２．８±８．４％であった。ＦＡＣＳヒストグラム（図１５）は、通常酸素条件または低酸素条件下でのＥＣ上のＧＲＰ７８受容体の存在を、低酸素下での抗ＧＲＰ７８抗体の増大された結合によって示した。
【０１８３】
腫瘍細胞上の受容体の存在  −  ＥＣ上のＧＲＰ７８の存在および低酸素とのその関係をさらに確認するために、抗ＧＲＰ７８抗体を使用するＦＡＣＳ分析が、ＭＣＦ７乳癌細胞、ＳＫ黒色腫細胞、ＨＴ結腸癌細胞、およびＫ５６２赤白血病細胞を含む種々の系統の腫瘍細胞上で実施され、ＧＲＰ７８が、ＭＣＦ７乳癌細胞、ＨＴ２９結腸癌細胞、およびＳＫ２８黒色腫細胞上で発現されるが、Ｋ５６２赤白血病細胞上では発現されないことを明らかにした（図１６ａ−ｄ）。
【０１８４】
これらの結果は、ＥＣ上のＡＤＯＰｅｐ受容体がＧＲＰ７８であること、およびＥＣ膜上のその呈示が低酸素下および種々の腫瘍細胞において増大されることを示す。
【０１８５】
実施例４
ＡＤＯＰｅｐは、低酸素誘導アポトーシスを阻害する
実験結果
抗ＧＲＰ７８抗体でのＧＲＰ７８受容体の阻害、またはＡＤＯＰｅｐ１の添加によるＧＲＰ７８受容体の阻害は、ＥＣの低酸素誘導アポトーシスの阻害をもたらす  −  アポトーシスにおけるＧＲＰ７８の役割は、低酸素下でＥＣを用いて研究された。図１７に見られるように、低酸素に２４時間曝露されたＥＣのアポトーシスの割合は、２５％から６２％に増大された。ＡＤＯＰｅｐ１でのＥＣのインキュベーションは、アポトーシスを通常酸素条件下でみられるのと同様のレベルまで防止した。抗ＧＲＰ７８抗体でのＥＣのインキュベーションはまた、アポトーシスのレベルを減少させたが、ＡＤＯＰｅｐは抗ＧＲＰ７８抗体と比べてアポトーシスの減少においてより効果的（２９％）であった（図１７）。図１８ａ−ｅは、ＡＤＯＰｅｐ１ペプチドによるアポトーシスの阻害のドットプロットＦＡＣＳ分析によって実例を示す。見られるように、低酸素下のＥＣは、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）アポトーシス性マーカーの両方で染色された。対照的に、ＡＤＯＰｅｐ１ペプチドでのＥＣのインキュベーションは、染色された細胞の割合の顕著な減少を誘導した。
【０１８６】
ＡＤＯＰｅｐ１は低酸素誘導アポトーシスを阻害したが、ＣｏＣｌ２誘導アポトーシスを阻害しなかった  −  アポトーシスに対するＡＤＯＰｅｐ１の効果をさらに示すために、アポトーシスが低酸素またはＣｏＣｌ２（塩化コバルト）処置によって誘導された。図３３ａ−ｆおよび３４において示されるように、２４時間の低酸素は、約７０％までのアポトーシスの増大をもたらした。加えて、ＡＤＯＰｅｐ１は内皮細胞の低酸素誘導アポトーシスを約４０％阻害したが、ＡＤＯＰｅｐ１は、アポトーシス誘導物質である塩化コバルトに曝露された内皮細胞のアポトーシスを阻害しなかった。従って、ＡＤＯＰｅｐ１によるアポトーシスの阻害は、低酸素ストレス条件に特異的である。
【０１８７】
ＡＤＯＰｅｐ１は、生体内で低酸素誘導アポトーシスの阻害を誘導する  −  図２２において見られるように、アポトーシス細胞の平均数は、ＡＤＯＰｅｐ１を注射された７日目の虚血後肢において劇的に減少された。従って、虚血後肢マウスモデルを使用して、本発明者らは初めて、虚血後肢へのＡＤＯＰｅｐ１の投与が虚血誘導アポトーシスの有意な低減をもたらすことを示すことができた。
【０１８８】
要するに、これらの結果は、ストレス応答性タンパク質であるＧＲＰ７８と同様に、本発明のＡＤＯＰｅｐが低酸素誘導アポトーシス内皮細胞の数を減少させることが可能であり、従って、細胞においてアポトーシスを阻害するために使用されうることを示す。
【０１８９】
実施例５
ＡＤＯｐｅｐは、内皮細胞上のＧＲＰ７８受容体に結合する
実験結果
ＧＲＰ７８受容体に対するペプチドＡＤＯＰｅｐ１、ＡＤＯＰｅｐ２、およびＡＤＯＰｅｐ３由来のＡＤＡＭ１５の競合的結合  −  ＡＤＯＰｅｐがＥＣ上のＧＲＰ７８受容体に結合するかどうかをさらに試験するために、競合的結合アッセイが、抗ＧＲＰ７８抗体との結合の前にＡＤＯＰｅｐでインキュベートされたＥＣに対して行われた。図１９（４つの実験の要約を示す）において示されるように、３種のＡＤＯＰｅｐの全て（すなわち、ＡＤＯＰｅｐ１、ＡＤＯＰｅｐ２、およびＡＤＯＰｅｐ３）は、ＥＣに対する抗ＧＲＰ７８抗体の結合のある程度の阻害を示したが、スクランブルペプチド（ｓＲｏＹ）は、ＥＣ上の受容体に対する競合的結合において効果的でなかった。
【０１９０】
ＡＤＯＰｅｐ１は、生体内（低酸素下）においてＧＲＰ７８受容体発現のアップレギュレーションを誘導する  −  図２０ａ−ｂは、通常酸素条件または低酸素条件下でのＡＤＯＰｅｐ１での細胞のインキュベーション後に、内皮細胞に対する抗ＧＲＰ７８抗体の結合をさらに示し、内皮細胞上のＧＲＰ７８受容体の存在（ＥＣに対する抗ＧＲＰ７８の結合によって明らかにされる）は低酸素下で約１８．１％から約４０．１％まで増大するが（本発明者ではないＬｉ  Ｊ，Ｌｅｅ  ＡＳ．Ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＲＰ／ＢＩＰ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００６；６：４５−５４；Ａｒａｐ  ＭＡ，Ｌａｈｄｅｎｒａｎｔａ  Ｊ，Ｍｉｎｔｚ  ＰＪ，Ｈａｊｉｔｏｕ  Ａ，Ｓａｒｋｉｓ  ＡＳ，Ａｒａｐ  Ｗ，Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  Ｒ．Ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ＧＲＰ７８  ｅｎａｂｌｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｙ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２００４；６：２７５−８４によって既に報告されている）、ＥＣ上のＧＲＰ７８呈示のより有意な増加（約８３．８％までの増加）が、細胞が低酸素条件下でＡＤＯｐｅｐ１でインキュベートされたときに観察された。これらの結果は、低酸素下でのＧＲＰ７８のアップレギュレーションにおけるＡＤＯＰｅｐ１の関与を示す。
【０１９１】
ＡＤＯＰｅｐ１は、生体内（虚血下）でＧＲＰ７８受容体発現のアップレギュレーションを誘導する  −  内皮細胞上のＧＲＰ７８呈示におけるＡＤＯＰｅｐの関与をさらに確認するために、ＧＲＰ７８陽性細胞の平均数が、虚血後肢切片において決定された。図２１において示されるように、虚血の誘導後７日目に、ＧＲＰ陽性細胞の平均数は、未処置の後肢に比べて増大された。しかしながら、ＡＤＯＰｅｐ１の注射は、虚血の誘導後１４日目に検出されるように、ＧＲＰ７８陽性細胞の平均数のより有意な増大をもたらした。虚血後２１日目での比較的低いレベルのＧＲＰ７８陽性細胞は、おそらく、処置された動物における虚血の回復を示す。
【０１９２】
これらの結果は、ＡＤＯＰｅｐ１が、低酸素下（生体外）または虚血下（生体内）でＧＲＰ７８発現を増大することを示す。
【０１９３】
実施例６
ＡＤＯＰｅｐ１結合は、低酸素条件下でＧＲＰ７８受容体の内在化反応を起こす
実験結果
ＡＤＯｐｅｐ１結合は、低酸素条件下でＧＲＰ７８受容体の内在化反応を起こす  −  図２９に示されるように、５分間のインキュベーション後に、ＡＤＯｐｅｐ１は低酸素条件下で内皮細胞におけるＧＲＰ７８受容体の内在化を誘導した。内在化反応は、膜に対するＡＤＯＰｅｐの結合割合の阻害（より少ない膜ＧＲＰ７８受容体）、およびＡＤＯＰｅｐ１で５分間インキュベートされた内皮細胞における細胞内ＧＲＰ７８平均蛍光の増加によって示された。
【０１９４】
実施例７
ＡＤＯＰｅｐペプチドからの生物学的活性を示す最小モチーフ配列の同定
実験結果
新規の血管形成関連モチーフまたは腫瘍関連モチーフの同定  −  本発明者らは、４個のアミノ酸配列ＨＷＲＲを、血管形成を誘導しかつＥＣ上のＧＲＰ７８受容体に結合するＡＤＡＭ１５由来ペプチドであるＡＤＯＰｅｐ１、ＡＤＯＰｅｐ２、およびＡＤＯＰｅｐ３に存在する共通モチーフとして同定した（表６、下記）。
2010506905.tif 000009
【０１９５】
全てのＡＤＯＰｅｐの共通モチーフＨＷＲＲ（配列番号５）は、その血管形成活性について試験された。
【０１９６】
５個のアミノ酸モチーフＨＷＲＲＰ（モチーフＡ；配列番号７）、ＨＷＲＲＡ（モチーフＢ；配列番号８）、またはＡＨＬＬＰ（モチーフＣ；配列番号６）がＥＣ上のＧＲＰ７８に結合できるかどうかをさらに試験するために、配列番号７、８、および９に相当するアミノ酸配列を有する合成ペプチドが内皮細胞に対するビオチニル化ＡＤＯＰｅｐ１の結合についての競合的アッセイにおいて使用された。図２３において示されるように、モチーフＡおよびＢに相当するアミノ酸配列を有するペプチドは、内皮細胞に対するＡＤＯＰｅｐ１Ｂｉｏｔの結合の有意な阻害を示し、モチーフＣに相当するペプチドは、結合の穏やかな阻害を示した。
【０１９７】
加えて、内皮細胞は、ＡＤＯＰｅｐ１、モチーフＡ、またはモチーフＣの存在下または非存在下で低酸素条件下でインキュベートされ、アポトーシスのＱ１レベルは、ＦＡＣＳ分析を使用して決定された。図２４ａ−ｄおよび図２５に示されるように、ＡＤＯＰｅｐ１ならびにモチーフＡおよびモチーフＢペプチドは、低酸素誘導アポトーシスを阻害することが可能であったが、モチーフＣペプチドは低酸素誘導アポトーシスに対して効果を示さなかった。
【０１９８】
内皮細胞に対するモチーフＡ、Ｂ、Ｃの生物学的活性をさらに試験するために、遊走アッセイが低酸素下でＥＣに対して実施された。図２６ａ−ｂに示されるように、ＡＤＯＰｅｐ１、モチーフＡ、およびモチーフＢペプチドは、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で内皮細胞遊走を誘導したが、モチーフＣペプチドは内皮細胞の遊走に対して有意な効果を示さなかった。
【０１９９】
要するに、これらの結果は、低酸素誘導アポトーシスを減少させ、かつ内皮細胞遊走を誘導することが可能なＡＤＯＰｅｐ由来の最小アミノ酸配列の同定を示す。これらのペプチド（例えば、配列番号７および８）は、低酸素誘導アポトーシスを阻害するため、血管形成を誘導するため、および虚血性疾患を処置するために使用されることができる。
【０２００】
実施例８
ＡＤＯＰｅｐモチーフは、管の形成およびＥＲＫ１／２リン酸化の誘導が可能である
実験結果
ＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡペプチドは、内皮細胞から管を形成することが可能である  −  ＡＤＯＰｅｐ１またはモチーフＡペプチドの管を形成する能力が、生体外で決定された。図２７に示されるように、ＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡは、飢餓条件および通常酸素条件下で内皮細胞において連結された細胞のネットワークの長さを有意に増大したが、スクランブルｓＲＯＹペプチドの添加は管の形成に対して効果を有さなかった。
【０２０１】
ＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡペプチドは、内皮細胞上の同じ受容体に対する結合について競合する  −  図２８ａ−ｄに示されるように、ＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡペプチドは、低酸素条件下で内皮細胞に対する抗ＧＲＰ６７結合を阻害した。１０μｇのＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡは、それぞれ約８０％および約６０％の抗ＧＲＰ７８結合を阻害したが、モチーフＣは内皮細胞に対する抗ＧＲＰ７８結合を阻害しなかった。
【０２０２】
低酸素条件下でのＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡでの内皮細胞のインキュベーションは、ＥＲＫ１／２リン酸化を増大する  −  図３０ａ−ｂに示されるように、低酸素条件下でのＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡでの内皮細胞のインキュベーションは、２０分後に測定されたように、ＥＲＫ１／２リン酸化の有意な増大をもたらした。
【０２０３】
ＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡペプチドによるＥＲＫ１／２リン酸化の誘導は特異的である  −  ＥＲＫリン酸化がＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡの活性化に特異的であることを評価するために、特異的ｐＥＲＫペプチド阻害剤が、ＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡペプチドでインキュベートされた内皮細胞に添加された。図３１は、低酸素条件下で２０分間、ＡＤＯＰｅｐ１およびモチーフＡでインキュベートされた内皮細胞における阻害剤ペプチドによるＥＲＫリン酸化阻害のウェスタンブロット分析を示す。
【０２０４】
ＡＤＯＰｅｐ１およびＡＤＯＰｅｐ２は、低酸素下で内皮細胞におけるＥＲＫ１／２リン酸化を誘導することが可能であるが、ＡＤＯＰｅｐ３はＥＲＫ１／２リン酸化を誘導できない  −  図３２ａ−ｂに示されるように、抗リン酸ＥＲＫ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｐ−ＥＲＫ（Ｅ−４），ｓｃ７３８３）を用いて実施されたウェスタンブロット分析は、ＡＤＯＰｅｐ１およびＡＤＯＰｅｐ２がＥＲＫ１／２リン酸化を誘導したが、ＡＤＯＰｅｐ３がＥＲＫ１／２リン酸化に対して効果を有さなかったことを明らかにした。
【０２０５】
明確にするため別個の実施形態で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２０６】
本発明はその特定の実施形態によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本明細書中で言及した刊行物、特許および特許願はすべて、個々の刊行物、特許または特許願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【０２０７】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図１５】
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【図１６ａ−ｂ】
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【図１６ｃ−ｄ】
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【図２０ａ】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１７】
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【図１８ａ−ｂ】
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【図１８ｃ】
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【図１８ｄ−ｅ】
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【図１９】
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【図２０ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４ａ−ｂ】
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【図２４ｃ−ｄ】
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【図２５】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２７】
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【図２８ａ−ｂ】
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【図２８ｃ−ｄ】
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【図２９】
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【図３０】
2010506905.tif 000048
【図３１】
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【図３２】
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【図３３ａ−ｂ】
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【図３３ｃ】
2010506905.tif 000052
【図３３ｄ−ｅ】
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【図３３ｆ】
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【図３４】
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【国際調査報告】
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