(57)【要約】  本発明は、診断手段および診断方法に関する。より具体的には、本発明は、心筋梗塞に罹患した被験体の血管新生状態を診断する方法であって、心筋梗塞後に取得した被験体の第1のサンプル中、および該第1のサンプルの後に取得した該被験体の第2のサンプル中のPLGF、sFLT1およびエンドグリンの量を測定するステップ、ならびに第1のサンプル中の該量を第2のサンプル中の該量と比較することにより、血管新生状態が診断されるステップを含む方法に関する。本発明はまた、心筋梗塞に罹患した被験体が、血管新生促進療法に感受性であるか否かを決定する方法も包含する。最後に、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットまたはデバイスに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋梗塞に罹患した被験体の血管新生状態を診断する方法であって、以下のステップ：
(a)心筋梗塞後に取得した被験体の第1のサンプル中のPLGF、sFLT1およびエンドグリンの量を測定するステップ；
(b)該第1のサンプルの後に取得した該被験体の第2のサンプル中のPLGF、sFLT1およびエンドグリンの量を測定するステップ；ならびに
(b)ステップ(a)で測定した量をステップ(b)で測定した量と比較することにより、血管新生状態が診断されるステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記第1のサンプルと比較して、前記第2のサンプル中のPLGFおよびsFLT1の減少した量ならびにエンドグリンの増加した量が、血管新生促進状態を示すものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
心筋梗塞に罹患した被験体が血管新生促進療法に感受性であるか否かを決定する方法であって、以下のステップ：
(a)心筋梗塞後に取得した被験体の第1のサンプル中のPLGF、sFLT1およびエンドグリンの量を測定するステップ；
(b)該第1のサンプルの後に取得した該被験体の第2のサンプル中のPLGF、sFLT1およびエンドグリンの量を測定するステップ；ならびに
(b)ステップ(a)で測定した量をステップ(b)で測定した量と比較することにより、該被験体が血管新生促進療法に感受性であるか否かが決定されるステップ
を含む、上記方法。
【請求項４】
前記第1のサンプルと比較して、前記第2のサンプル中のPLGFおよびsFLT1の減少した量ならびにエンドグリンの増加した量が、血管新生促進療法に感受性であるとして被験体を排除する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記血管新生促進療法が血管新生促進薬の投与を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記第1のサンプルが心筋梗塞後3日以内に取得されたものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第2のサンプルが心筋梗塞の3日より後で心筋梗塞後3ヵ月以内に取得されたものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体がヒトである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
心筋梗塞に罹患した被験体の血管新生状態を診断するためのデバイスであって、以下の手段：
(a)被験体の第1および第2のサンプル中のPLGF、sFLT1およびエンドグリンの量を測定するための手段であって、該第1のサンプルは心筋梗塞後に取得されたものであり、該第2のサンプルは該第1のサンプルの後に取得されたものである、上記手段；ならびに
(b)(a)の手段により該第1のサンプル中で測定したPLGF、sFLT1およびエンドグリンの量を、該第2のサンプル中で測定した対応する量と比較するための手段であって、それにより血管新生状態の診断が可能になる手段
を含む、上記デバイス。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を実施するためにつくられたキットであって、以下の手段：
(a)被験体の第1および第2のサンプル中のPLGF、sFLT1およびエンドグリンの量を測定するための手段であって、該第1のサンプルは心筋梗塞後に取得されたものであり、該第2のサンプルは該第1のサンプルの後に取得されたものである、上記手段；ならびに
(b)(a)の手段により該第1のサンプル中で測定したPLGF、sFLT1およびエンドグリンの量を、該第2のサンプル中で測定した対応する量と比較するための手段であって、それにより血管新生状態の診断が可能になる手段
を含む、上記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断手段および診断方法に関する。より具体的には、本発明は、心筋梗塞に罹患した被験体の血管新生状態を診断する方法であって、心筋梗塞後に取得した被験体の第1のサンプル中、および該第1のサンプルの後に取得した該被験体の第2のサンプル中のPLGF、sFLT1およびエンドグリンの量を測定するステップ、ならびに第1のサンプル中の該量を第2のサンプル中の該量と比較することにより、血管新生状態が診断されるステップとを含む方法に関する。本発明は、心筋梗塞に罹患した被験体が血管新生促進療法に感受性であるか否かを決定する方法も包含する。最後に、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットまたはデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞(MI)は、生命を脅かす急性の心血管イベントである。MIは、冠血管の閉塞、狭窄によって生じる心筋の酸素サポートの障害、または他の場合では、冠血管系内の不十分な血流によって引き起こされる。冠血管の閉塞または狭窄は、例えば、血管のアテローム硬化性変化または他の血栓イベントの結果である場合もある。MIは、心臓の機能、特にその電気生理に影響を与え、心室細動または頻脈をもたらす。
【０００３】
MIは通常、心筋の複数の部分の虚血を伴い、それに続いて心臓壊死が起こるが、これは例えば、トロポニンIまたはトロポニンTなど心筋トロポニンの、血液への放出によってモニターすることができる。心臓壊死の結果、血管新生を含む血管のリモデリング過程が、患部で起こる。血管新生は、毛細血管の発芽過程による既存の血管からの新しい血管の形成として知られている。この過程は、生理的状態下で血管内皮増殖因子(VEGF)などの血管新生増殖因子によって促進される。このような血管新生増殖因子の発現は、低酸素により主に調節される。すなわち、組織が虚血になると、細胞が血管新生増殖因子を産生し始め、これにより血管新生によって新しい血管が患部組織に誘引される。
【０００４】
また、MI後の血管新生は、心筋の回復に決定的な役割を果たしている。しかし、被験体の血管新生に対する能力、すなわち、その血管新生状態は、複雑な生物学的パラメータに依存する。様々な血管新生促進因子ならびに血管新生阻害物質が報告されている(Nyberg 2005、Cancer Res 65:3967-3979)。
【０００５】
すでに上記した通り、VEGFに加えて様々な因子が、血管新生において役割を果たしていることが報告されている。胎盤成長因子(PlGF)は、その推定上の受容体Flt-1とともに動脈新生の関連する過程において役割を果たすことが示唆されている、密接に関連した成長因子である(Khurana 2005、Circulation 111:2828-2836)。動脈新生および血管新生におそらく関与する他の因子は、形質転換増殖因子-βスーパーファミリーのメンバーならびにALK受容体やエンドグリンなどのその受容体または結合パートナーである(van Laake 2006、Circulation、114:2288-2297;Bobik 2006、Arterioscler Thromb Vasc Biol 26:1712-1720;Bertolino 2005、Chest Supplement 128:585-590)。線維芽細胞増殖因子(FGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)ならびにサイトカインおよびマトリックスメタロプロテアーゼもまた、強力な血管新生因子として記載されている(Nyberg、上掲)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nyberg 2005、Cancer Res 65:3967-3979
【非特許文献２】Khurana 2005、Circulation 111:2828-2836
【非特許文献３】van Laake 2006、Circulation、114:2288-2297
【非特許文献４】Bobik 2006、Arterioscler Thromb Vasc Biol 26:1712-1720
【非特許文献５】Bertolino 2005、Chest Supplement 128:585-590
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
MIに罹患した被験体の血管新生状態を決定することが非常に望ましいことが上記から理解される。血管新生状態のこのような評価に基づいて、その長期の展望を改善するために、被験体が血管新生促進療法に感受性であるか否かを予測することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、MI後の被験体の血管新生状態を決定する手段および方法の提供と考えることができよう。それによって、被験体の長期の展望を改善するために、適切な治療を選択することができる。この技術的課題は、添付の特許請求の範囲および以下において特徴付けられる実施形態によって解決される。
【０００９】
したがって、本発明は、心筋梗塞に罹患した被験体の血管新生状態を診断する方法であって、以下のステップ:
(a)心筋梗塞後に取得した被験体の第1のサンプル中のPLGF、sFLTIおよびエンドグリンの量を測定するステップ;
(b)該第1のサンプルの後に取得した該被験体の第2のサンプル中のPLGF、sFLT1およびエンドグリンの量を測定するステップ;ならびに
(c)ステップ(a)で測定した量をステップ(b)で測定した量と比較することにより、血管新生状態が診断されるステップを含む、上記方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】時点=0、すなわちMI後3日目および時点=3ヵ月で測定されたPLGF、sFLT1およびエンドグリンの量についてのポックスプロット分析を示す。第5百分位数(perc.)、第25百分位数、第75百分位数および第95百分位数ならびに中央値が表に示される。さらに、それらの量の相対変化が算出されている(％変化)。
【図２】両方のバイオマーカーが時点=0で互いに統計的に独立していることを証明するsFLT1およびPLGFについての線形回帰分析を示す。
【図３】両方のバイオマーカーが時点=3ヵ月で互いに統計的に独立していることを証明するsFLT1およびPLGFについての線形回帰分析を示す。
【図４】両方のバイオマーカーが時点=0で互いに統計的に独立していることを証明するエンドグリンおよびPLGFについての線形回帰分析を示す。
【図５】両方のバイオマーカーが時点=3ヵ月で互いに統計的に独立していることを証明するエンドグリンおよびPLGFについての線形回帰分析を示す。
【図６】両方のバイオマーカーが時点=0で互いに統計的に独立していることを証明するsFLT1およびエンドグリンについての線形回帰分析を示す。
【図７】両方のバイオマーカーが時点=3ヵ月で互いに統計的に独立していることを証明するsFLT1およびエンドグリンについての線形回帰分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の方法は、好ましくはin vitro法である。さらに、それは、上記で明確に述べた方法に加えて複数のステップを含むことができる。例えば、さらなるステップは、サンプルの前処理またはその方法で取得した結果の評価に関するものであってもよい。本発明の方法は、血管新生状態のモニタリング、確認および細分類のために用いることもできる。その方法を、手動で実施しても自動化によって支援されて実施してもよい。好ましくは、ステップ(a)、(b)および/または(c)は、自動化によって、例えば、ステップ(a)および(b)での測定のための適切なロボット装置およびセンサー装置によって、またはステップ(c)でのコンピュータによって実施される比較によって、完全にまたは部分的に支援されてもよい。
【００１２】
本明細書では、「診断する」という用語は、被験体がある種の血管新生状態、すなわち、本明細書に言及する血管新生促進状態(pro-angiogenic status)または血管新生抑制状態(anti-angiogenic status)を有することによる確率を評価することを意味する。当業者によって理解されるように、このような評価は通常、診断対象の被験体の100％に対して正確であることは意図しない。しかし、この用語は、被験体の統計的に有意な部分が、前記血管新生状態を示すと正確に診断することができることを必要とする。ある部分が統計的に有意か否かは、様々な周知の統計的評価手段、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントのt検定、マンホイットニー検定などを用いて、当業者によって苦もなく決定することができる。詳細はDowdy and Wearden、Statistics for Research、John Wiley & Sons、New York 1983において見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％である。p値は、0.1、0.05、0.01、0.005または0.0001であることが好ましい。好ましくは、本発明によって想定された確率によって、診断が所与のコホートまたは母集団の少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％の被験体に対して正確であることが可能になる。
【００１３】
本明細書では、「血管新生状態」という用語は、既存の血管から、例えば、発芽によって血管を形成する被験体の能力を意味する。特に、MI後の被験体に存在する、本明細書で言及した分子の量の変化に応じて、血管新生が、苦もなく、すなわち生理的イニシエーターによって、好ましくは、低酸素によって起こり得るが、あるいは、本明細書において他で指定された血管新生薬などの外因的に供給されるイニシエーターをさらに必要とし得ることが見出されている。したがって、血管新生状態、すなわち、被験体における血管新生に対する能力は、前述の分子に関する被験体の生理的素因によって決定される。
【００１４】
本明細書では、「被験体」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを意味する。しかし、本明細書の他で指定された通り、被験体は、冠動脈心疾患に罹患していることが本発明で想定されている。
【００１５】
「心筋梗塞(MI)」という用語は、心筋への酸素供給が障害されることによって引き起こされる急性の心血管イベントを意味する。酸素供給が障害された結果、虚血、続いて壊死が、心筋の患部で発生する。前記心臓壊死により、心筋トロポニン、好ましくは、トロポニンIおよび/またはトロポニンTは、心筋の冒された細胞から血液に放出される。好ましくは、MIは、心臓の生理機能、具体的には、その電気生理に影響を与え、心室細動または頻脈をもたらす。さらなる症状は、(通常左腕に拡張する)胸痛、息切れ、悪心、嘔吐、動悸、発汗および不快感である。女性は、男性と異なる症状を経験することが多い。女性においてMIの最もよく知られる症状には、息切れ、脱力感、および疲労が含まれる。しかし、全心筋梗塞の約3分の1は、前述の症状のうちいずれの症状もなく無症候性である。好ましくは、MIは、冠血管の閉塞もしくは狭窄によって生じ、またはその他の場合では冠血管系内の不十分な血流によって生じる。冠血管の閉塞または狭窄は、例えば血管のアテローム硬化性変化、冠動脈心疾患に関連する他の血栓イベントの結果であり得る。
【００１６】
「サンプル」という用語は、体液のサンプル、分離した細胞のサンプル、または組織または臓器から得られたサンプルを意味する。体液サンプルは、周知の技法によって取得することができ、好ましくは、血液、血漿、血清、または尿のサンプル、より好ましくは、血液、血漿または血清のサンプルが含まれ得る。組織または臓器サンプルは、例えば、生検によって任意の組織または臓器から取得することができる。分離した細胞は、遠心または細胞選別などの分離技法によって体液または組織もしくは臓器から取得することができる。細胞サンプル、組織サンプルまたは臓器サンプルは、本明細書で言及したペプチドを発現するまたは産生する細胞、組織または臓器から取得されることが好ましい。本明細書では、「第1のサンプル」は、MIが発生した後または特徴的な症状によって明らかになった後、直ちに被験体から取得したサンプルを意味する。第1のサンプルは、好ましくはMI後の最初の5時間以内、より好ましくはMI後3時間までに、直ちに取得することができる。本発明による「第2のサンプル」は、第1のサンプルの後に取得されたものであろう。第2のサンプルは、リモデリング過程が開始された後に取得されることが好ましい。第2のサンプルは、第1のサンプルを取得した後またはMIが発生した後、より好ましくは1〜4ヵ月の間、最も好ましくは3ヵ月後に取得する。
【００１７】
本明細書では、「PlGF(胎盤成長因子)」という用語は、149アミノ酸長のポリペプチドであり、ヒトの血管内皮増殖因子(VEGF)の血小板由来増殖因子様領域との相同性が高い(53％同一)である胎盤由来成長因子を意味する。VEGFと同様に、PlGFは、in vitroおよびin vivoにおいて血管新生活性を有する。例えば、トランスフェクションされたCOS-1細胞に由来するPlGFの生化学的および機能的な特性決定によって、PlGFがin vitroにおいて内皮細胞増殖を刺激できるグリコシル化された二量体の分泌性タンパク質であることが明らかにされた(Maqlione 1993、Oncogene 8(4):925-31)。好ましくは、PlGFはヒトPlGFを意味し、より好ましくは、GenBank登録番号P49763、GI:17380553(GenBankは、www.ncbi.nlm.nih.gov/entrezにある米国NCBIから利用可能である)で示されるアミノ酸配列を有するヒトPlGFを意味する。さらに、本発明によって言及した変異体が少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失および/または付加によって異なるアミノ酸配列を有するものであり、その変異体のアミノ酸配列はさらに、好ましくは、特異的PlGFのアミノ配列と少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％または99％同一であることが理解されるべきである。2つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、原則的に、当技術分野で周知のアルゴリズムによって決定することができる。好ましくは、同一性の程度は、比較ウィンドウ上で最適にアライメントされた2つの配列を比較することによって決定されるべきであり、比較ウィンドウ中のアミノ酸配列の断片が、最適なアライメントの(付加または欠失を含まない)参照配列に比べて、付加または欠失(例えば、ギャップまたはオーバーハング)を含むことができる。そのパーセンテージは、同一のアミノ酸残基が両方の配列で起こる位置の数を測定して、一致した位置の数を得、比較のウィンドウ中で一致した位置の数を位置の総数で割り、その結果に100をかけて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。比較のための配列の最適なアライメントは、Smith and Waterman Add.APL.Math.2:482(1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch J.Mol.Biol.48:443(1970)の相同性アライメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman Proc.Natl.Acad Sci.(USA)85:2444(1988)の類似探索の方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行(Wisconsin GeneticsソフトウェアパッケージのGAP、BESTFIT、BLAST、PASTAおよびTFASTA、Genetics Computer Group(GCG)、575 Science Dr.、Madison、WI)によって、または目視検査によって実施することができる。2つの配列を比較のために同定した場合、GAPおよびBESTFITを、これらの最適なアライメント、すなわち、同一性の程度を決定するために使用することが好ましい。ギャップ重みづけのデフォルト値5.00およびギャップ重みづけ長のデフォルト値0.30を用いることが好ましい。変異体は対立遺伝子変異体、スプライシング変異体でも任意の他の生物種特異的なホモログ、パラログ、またはオルソログでもよい。さらに、これらの断片が上述した本質的な免疫学的特性および生物学的特性を有する限り、本明細書で言及する変異体には、特異的なPlGFの断片または前述のタイプの変異体の断片が含まれる。このような断片は、例えば、PlGFの分解生成物であってもよい。さらに含まれるのは、糖化、リン酸化またはミリスチル化などの翻訳後修飾に���って異なる変異体である。
【００１８】
本明細書では、「エンドグリン」という用語は、還元されていない形の分子量180kDa、還元後の分子量95kDa、およびその還元され脱Nグリコシル化した形の分子量66kDaを有するポリペプチドを意味する。このポリペプチドは、二量体を形成することができ、TGF-βおよびTGF-β受容体に結合する(下記参照)。エンドグリンはリン酸化されていてもよい。好ましくは、エンドグリンは、ヒトエンドグリンを意味する。より好ましくは、ヒトのエンドグリンは、GenBank登録番号AAC63386.1、GI:3201489に示されるアミノ酸配列を有する。さらに、本発明によって言及される変異体は、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失および/または付加によって異なるアミノ酸配列を有するものであり、その変異体のアミノ酸配列はさらに、好ましくは、特異的なエンドグリンのアミノ配列と少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％または99％同一であることが理解されるべきである。変異体は、対立遺伝子変異体、スプライシング変異体でも任意の他の生物種特異的なホモログ、パラログまたはオルソログでもよい。さらに、これらの断片が上述した本質的な免疫学的特性および生物学的特性を有する限り、本明細書で言及する変異体には、特異的なエンドグリンの断片または前述のタイプの変異体の断片が含まれる。このような断片は、例えば、エンドグリンの分解生成物であってもよい。さらに含まれるのは、糖化、リン酸化またはミリスチル化などの翻訳後修飾によって異なる変異体である。
【００１９】
本明細書では、「可溶性(s)Flt-1」という用語は、VEGF受容体FLT1の可溶性の形であるポリペプチドを意味する。可溶性Flt-1は、ヒトの臍静脈内皮細胞の馴化培地中で同定された。内因性可溶性FLT1(sFLT1)受容体は、クロマトグラフ上でおよび免疫学的に組換え型ヒトsFLT1に類似し、同様の高い親和性で[125I]VEGFに結合する。ヒトsFLT1は、in vitroでKDR/Flk-1の細胞外領域とVEGFによって安定した複合体を形成することが示されている。好ましくは、sFLT1は、ヒトsFLT1を意味する。より好ましくは、ヒトsFLT1は、GenBank登録番号P17948、GI:125361に示されるFlt-1のアミノ酸配列から推定することができる。マウスsFLT1のアミノ酸配列は、GenBank登録番号BAA24499.1、GI:2809071で示される。さらに、本発明によって言及される変異体が、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失および/または付加によって異なるアミノ酸配列を有するものであり、その変異体のアミノ酸配列がさらに、好ましくは、特異的なsFLT1のアミノ配列と少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％または99％同一であることが理解されるべきである。変異体は、対立遺伝子変異体、スプライシング変異体でも任意の他の生物種特異的なホモログ、パラログまたはオルソログでもよい。さらに、これらの断片が上述した本質的な免疫学的特性および生物学的特性を有する限り、本明細書で言及した変異体には、特異的なsFLT1の断片または前述のタイプの変異体の断片が含まれる。このような断片は、例えばsFLT1の分解生成物であってもよい。さらに含まれるのは、糖化、リン酸化またはミリスチル化などの翻訳後修飾によって異なる変異体である。
【００２０】
本明細書で言及されるポリペプチドの量を決定することとは、量または濃度を、好ましくは、半定量的にまたは定量的に測定することに関する。測定は、直接的または間接的に行うことができる。直接測定は、ポリペプチド自体から取得されるシグナルおよびサンプル中に存在するペプチドの分子の数に直接相関する強度に基づいてポリペプチドの量または濃度を測定することを意味する。強度シグナルとして本明細書で言及する場合もある、このようなシグナルは、例えば、ペプチドまたはポリペプチドの特異的な物理的特性または化学的特性の強度値を測定することによって取得することができる。間接測定には、二次的な成分(すなわち、ペプチドまたはポリペプチドそれ自体ではない成分)または例えば、測定可能な細胞応答、リガンド、標識または酵素反応生成物などの生物学的読み出しシステムから取得したシグナルを測定することが含まれる。
【００２１】
本発明によれば、ポリペプチドの量を決定することは、サンプル中のペプチドの量を決定するためのすべての既知の手段によって達成することができる。前記手段は、様々なサンドイッチ、競合、または他のアッセイ形式の形で、標識された分子を利用することができるイムノアッセイデバイスおよび方法を含む。前記アッセイは、ペプチドまたはポリペプチドの存在または非存在を示すシグナルを形成する。さらに、シグナルの強度は、好ましくは、サンプル中に存在するポリペプチドの量に直接的または間接的(例えば、反比例など)に相関し得る。さらに、適切な方法は、その正確な分子量またはNMRスペクトルなどペプチドまたはポリペプチドに特異的な物理的特性または化学的特性を測定することを含む。前記方法は、好ましくは、バイオセンサー、イムノアッセイと組み合わせた光学デバイス、バイオチップ、質量分析計、NMR分析器またはクロマトグラフィーデバイスなどの分析デバイスを含む。さらに、方法には、マイクロプレートのELISAに基づく方法、全自動またはロボット化イムノアッセイ(例えばElecsys(商標)分析器で利用可能)、CBA(酵素的コバルト結合アッセイ、例えばRoche-Hitachi(商標)分析器で利用可能)、およびラテックス凝集アッセイ(例えばRoche-Hitachi(商標)分析器で利用可能)が含まれる。
【００２２】
好ましくは、ポリペプチドの量を決定することは、(a)その強度がポリペプチドの量を示す細胞応答を誘導することのできる細胞を前記ポリペプチドと適切な時間接触させるステップ、および(b)その細胞応答を測定するステップを含む。細胞応答を測定するために、そのサンプルまたは処理済みのサンプルを、好ましくは細胞培養物に加えて、内部または外部の細胞応答を測定する。細胞応答には、レポーター遺伝子の測定可能な発現またはある物質、例えば、ペプチド、ポリペプチドもしくは小分子の分泌が含まれ得る。その発現または物質は、ペプチドまたはポリペプチドの量に相関する強度シグナルを生成するものとする。
【００２３】
また、ポリペプチドの量を決定することは、サンプル中のポリペプチドから取得できる特異的な強度シグナルを測定するステップを含むことが好ましい。前述した通り、このようなシグナルは、質量分析において観察されたポリペプチドに特異的な質量対電荷変数(m/z)またはポリペプチドに特異的なNMRスペクトルで観察されたシグナル強度であってもよい。
【００２４】
ポリペプチドの量を決定することは、好ましくは、(a)ペプチドを個々のリガンドと接触させるステップ、(b)(任意により)結合していないリガンドを除去するステップ、ならびに(c)結合したリガンドの量を測定するステップを含むことができる。結合したリガンドは、強度シグナルを生成することになる。本発明による結合には、共有結合および非共有結合の両方が含まれる。本発明によるリガンドは、例えば、本明細書に記載したペプチドまたはポリペプチドに結合する任意の化合物、例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸または小分子などであってよい。好ましいリガンドには、抗体、核酸、受容体などのペプチドもしくはポリペプチドペプチドまたはペプチドもしくはポリペプチドに対する結合パートナーおよびペプチドに対する結合ドメインを含むその断片、ならびにアプタマー、例えば、核酸アプタマーまたはペプチドアプタマーが含まれる。このようなリガンドを調製する方法は、当技術分野で周知である。例えば、適切な抗体またはアプタマーの同定および生成は、民間の供給業者によっても提供される。当業者は、より高い親和性または特異性を有するこのようなリガンドの誘導体を開発する方法について精通している。例えば、ランダム突然変異を、核酸、ペプチドまたはポリペプチドに導入することができる。その場合は、これらの誘導体は、例えば、ファージディスプレイなど当技術分野で知られているスクリーニング手順に従って、結合について試験することができる。本明細書で言及する抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方、ならびにそれらの断片、例えば、抗原またはハプテンに結合することのできる、Fv、FabおよびF(ab)2断片などが含まれる。本発明には、単鎖抗体、および所望の抗原特異性を示す非ヒトドナー抗体のアミノ酸配列をヒトのアクセプター抗体の配列と組み合わせたヒト化ハイブリッド抗体も含まれる。ドナー配列は、通常少なくともドナーの抗原結合性アミノ酸残基を含むが、ドナー抗体の他の構造的および/または機能的に関連するアミノ酸残基も含み得る。このようなハイブリッドは、当技術分野で周知のいくつかの方法によって調製することができる。リガンドまたは作用物質は、ポリペプチドに特異的に結合することが好ましい。本発明による特異的結合は、リガンドまたは作用物質が、分析対象のサンプル中に存在する他のペプチド、ポリペプチドまたは物質に実質的に結合(と「交差反応」)するべきでないことを意味する。好ましくは、特異的に結合したペプチドまたはポリペプチドは、任意の他の関連するペプチドまたはポリペプチドよりも、少なくとも3倍高い親和性で、より好ましくは少なくとも10倍高い親和性で、さらにより好ましくは少なくとも50倍高い親和性で結合するものとする。非特異的結合は、それが、例えば、ウェスタンブロットにおけるそのサイズに従ってまたはサンプル中の比較的高い存在量によって、明解に識別し測定することができる場合、許容され得る。リガンドの結合は、当技術分野で知られている任意の方法で測定することができる。前記方法は、半定量的または定量的であることが好ましい。適切な方法を以下に記載する。
【００２５】
第1に、リガンドの結合は、例えば、NMRまたは表面プラズモン共鳴によって直接測定することができる。第2に、リガンドが目的とするペプチドまたはポリペプチドの酵素活性の基質としても働く場合、酵素反応生成物を測定することができる(例えば、プロテアーゼの量は、例えば、ウェスタンブロット上の切断された基質の量を測定することによって測定することができる)。あるいは、リガンドは、それ自体酵素の特性を示すことができ、「リガンド/ポリペプチド」複合体またはポリペプチドによって結合されたリガンドはそれぞれ、強度シグナルの生成による検出を可能にする適切な基質と接触させることができる。酵素反応生成物の測定のため、基質の量は飽和していることが好ましい。基質は、反応の前に、検出可能な標識で標識することもできる。サンプルは、適切な時間、基質と接触させることが好ましい。適切な時間とは、検出可能な、好ましくは測定可能な量の生成物が生成されるのに必要な時間を意味する。生成物の量を測定する代わりに、所与の(例えば、検出可能な)量の生成物の出現に必要な時間を測定することができる。第3に、リガンドは、リガンドの検出および測定を可能にする標識に共有結合または非共有結合させることができる。
【００２６】
標識は直接的または間接的な方法で行うことができる。直接標識は、リガンドへの直接的な(共有結合でまたは非共有結合での)標識のカップリングを含む。間接標識化は、第1のリガンドへの第2のリガンドの(共有結合でまたは非共有結合での)結合を含む。第2のリガンドは、第1のリガンドに特異的に結合するものとする。前記第2のリガンドは、適切な標識とカップリングすることができ、かつ/または第2のリガンドに結合する第3のリガンドの標的(受容体)となり得る。第2、第3、さらにより高次のリガンドの使用はしばしば、シグナルを増加するために用いられる。適切な第2のおよびより高次のリガンドには、抗体、二次抗体および周知のストレプトアビジン-ビオチン系(ベクターラボラトリーズ社(Vector Laboratories,Inc.))が含まれる。リガンドまたは基質は、当技術分野で知られた1種または複数のタグで「タグをつける」ことができる。その場合は、このようなタグは、より高次のリガンドの標的となり得る。適切なタグには、ビオチン、ジゴキシゲニン、His-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、FLAG、GFP、myc-タグ、A型インフルエンザウイルス赤血球凝集素(HA)、マルトース結合タンパク質などが含まれる。ペプチドまたはポリペプチドの場合には、タグは、N末端および/またはC末端にあることが好ましい。適切な標識は、適切な検出方法で検出可能な任意の標識である。典型的な標識には、金粒子、ラテックスビーズ、アクリダンエステル、ルミノール、ルテニウム、酵素活性のある標識、放射活性標識、磁気標識(常磁性標識および超常磁性標識を含めた「例えば、磁気ビーズ」)および蛍光標識が含まれる。酵素活性のある標識には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびその誘導体などが含まれる。検出用の適切な基質には、ジアミノベンジジン(DAB)、3,3'-5,5'-テトラメチルベンジジン、NBT-BCIP(4-ニトロブルーテトラゾリウムクロリドおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスファート、ロシュ・ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社から既製の原液として入手可能)、CDP-Star(商標)(アマシャムバイオサイエンス(Amersham Biosciences)社)、ECF(商標)(アマシャムバイオサイエンス(Amersham Biosciences)社)が含まれる。適切な酵素-基質の組合せによって、当技術分野で知られている方法に従って(例えば、感光フィルムまたは適切なカメラシステムを用いて)測定することができる、着色された反応生成物、蛍光または化学発光になり得る。酵素反応を測定することに関して、上記の基準を同じように適用する。典型的な蛍光標識には、蛍光タンパク質(GFPおよびその誘導体など)、Cy3、Cy5、テキサスレッド、フルオレセインおよびAlexa色素(例えば、Alexa568)が含まれる。さらなる蛍光標識は、例えば、モレキュラー・プローブ(Molecular Probes)社(米国オレゴン州)から入手可能である。また、蛍光標識としての量子ドットの使用も考えられる。典型的な放射活性標識には、35S、125I、32P、33Pなどが含まれる。放射活性標識には、既知のおよび適切な任意の方法、例えば、感光フィルムまたはホスホルイメージャーによって検出することができる。本発明による適切な測定方法には、また、沈降(具体的には、免疫沈降)、電気化学発光(電気によって生成された化学発光)、RIA(ラジオイ��ノアッセイ)、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、サンドイッチ酵素免疫試験、電気化学発光サンドイッチイムノアッセイ(ECLIA)、解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ(DELFIA)、シンチレーション近接アッセイ(SPA)、比濁法、比ろう法、ラテックス増強比濁法もしくはラテックス増強比ろう法、または固相免疫試験が含まれる。当技術分野で知られているさらなる方法(ゲル電気泳動、2Dゲル電気泳動、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、ウェスタンブロット法および質量分析など)は、単独でまたは標識化もしくは前述した他の検出方法と組み合わせて用いることができる。
【００２７】
ポリペプチドの量は、また好ましくは、以下のように決定することができる。すなわち、(a)上記で指定されたポリペプチド用のリガンドを含む固体支持体をポリペプチドを含むサンプルと接触させ、(b)担体に結合しているポリペプチドの量を測定する。好ましくは核酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体およびアプタマーからなる群から選択されるリガンドは、固定化された形態で固体支持体上に存在することが好ましい。固体支持体を製造するための材料は、当技術分野でよく知られており、とりわけ、市販のカラム材料、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド状金属粒子、ガラスおよび/またはシリコンチップおよび表面、ニトロセルロースストリップ、メンブレン、シート、デュラサイト(duracyte)、反応トレーのウェルおよび壁、プラスチックチューブなどが含まれる。リガンドまたは作用物質は、多くの異なる担体に結合することができる。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然のおよび改変されたセルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトが含まれる。担体の性質は、本発明の目的では、可溶性または不溶性のどちらかであってよい。前記リガンドを固定化する/不動化する適切な方法は、よく知られており、それだけには限らないが、イオン相互作用、疎水的相互作用、共有結合性相互作用などが含まれる。本発明によるアレイとして「サスペンションアレイ」を用いることも考えられる(Nolan 2002、Trends Biotechnol.20(1):9-12)。このようなサスペンションアレイにおいて、担体、例えば、ミクロビーズまたはミクロスフェアは、懸濁液中に存在する。アレイは、異なるリガンドを担持する、場合によって標識された異なるミクロビーズまたはミクロスフェアからなる。例えば、固相化学および感光性保護基に基づく、このようなアレイを生成する方法は、一般に知られている(米国特許第5,744,305号)。
【００２８】
本明細書では「量」という用語は、ポリペプチドの絶対量、前記ポリペプチドの相対量または相対濃度ならびにそれに関連するまたはそれに由来し得る任意の値またはパラメータを包含する。このような値またはパラメータは、直接測定により前記ポリペプチドから取得されるすべての特異的な物理的特性または化学的特性についての強度シグナル値、例えば、質量スペクトルまたはNMRスペクトルにおける強度値を含む。さらに、包含されるのは、この説明の他で指定された間接測定によって取得されるすべての値またはパラメータ、例えば、特異的に結合したリガンドから取得したポリペプチドまたは強度シグナルに応じて、生物学的読み出しシステムから決定される反応レベルである。前述の量またはパラメータに関連する値はすべての標準の数学的操作によって取得することができるということが理解されるべきである。
【００２９】
本明細書では「比較する」という用語は、分析対象の第1のサンプルに含まれるそれぞれのポリペプチドの量を、第2のサンプル中のそれぞれのポリペプチドの対応する量と比較することを包含する。言い換えれば、第1と第2のサンプル中のPLGFの量を互いに比較して、同じ比較をsFLT1およびエンドグリンの量に対して準用して実施する。本明細書では「比較する」は、対応するパラメータまたは値の比較を意味し、例えば、ある絶対量をある絶対量と比較する、ある濃度をある濃度と比較する、あるいは第1のサンプルで取得した強度シグナルを第2のサンプルの同じタイプの強度シグナルと比較するということが理解されるべきである。本発明の方法のステップ(c)で言及する比較は、手動で実施してもコンピュータ支援で実施してもよい。コンピュータ支援の比較では、決定された量の値は、コンピュータプログラムによってデータベースに格納されている適切な参照に対応する値と比較することができる。コンピュータプログラムは、さらに比較の結果を評価することができる、すなわち、適切な出力フォーマットで所望の評価を自動的に提供することができる。
【００３０】
基本的には、MI後の被験体における血管新生促進状態は、バイオマーカーであるPLGFおよびsFLT1の減少を伴うが、バイオマーカーであるエンドグリンは増加することが見出されている。こうした組合せの変化は、MI後に血管新生抑制状態を示す被験体についてではなく、すなわち、被験体が血管新生促進状態を示すすべての場合である。
【００３１】
したがって、本発明の方法の好ましい実施形態において、第1のサンプルと比較して第2のサンプル中のPLGFおよびsFLT1の減少した量ならびにエンドグリンの増加した量が、血管新生促進状態を示すものであることが、前述のことから理解されよう。エンドグリンが増加していない、またはPLGFおよび/またはsFLT1が減少していない場合、血管新生抑制状態と診断されるべきである。
【００３２】
有利なことに、バイオマーカーとしてのPlGF、エンドグリンおよびsFLT1の組合せが、信頼できる効率的なやり方でMI後の被験体の血管新生状態を決定するために必要とされることが本発明の根底にある研究において判明している。さらに、それぞれの前記バイオマーカーは、それぞれ統計的に独立しているということが判明している。
【００３３】
したがって、本発明の方法は信頼性の高い診断を提供する。前述した通り、現在、この問題を解決するために用いられている技法は、時間がかかりコストがかかる。しかし、本発明の方法は、信頼できる高速でコストのかからない診断を可能にし、検査ストライプなどの移動可能なアッセイにおいても実施することができる。したがって、この方法は、特に救急患者を診断するのに適している。本発明の知見により、MIに罹患した被験体のための適切な血管新生療法およびそれらの結果は信頼して選択することができる。患者の誤った治療によって引き起こされる重篤な副作用は避けることができる。
【００３４】
さらに、本発明は、心筋梗塞に罹患した被験体が血管新生促進療法に感受性であるか否かを決定する方法であって、以下のステップ:
(a)心筋梗塞後に取得した被験体の第1のサンプル中のPLGF、sFLT1およびエンドグリンの量を測定するステップ;
(b)前記第1のサンプルの後に取得した前記被験体の第2のサンプル中のPLGF、sFLT1およびエンドグリンの量を測定するステップ;ならびに
(b)ステップ(a)で測定した量をステップ(b)で測定した量と比較することにより、被験体が、血管新生促進療法に感受性であるか否かを決定するステップを含む、上記方法に関する。
【００３５】
上記で述べた「血管新生促進療法」(pro-angiogenic therapy)という用語は、被験体における血管新生の過程を全身的にまたは局所的に誘発するまたは増進する治療に関する。前記血管新生促進療法は、好ましくは、VEGF、PlGF、エンドグリン、抗Flt-1抗体およびALK5修飾因子からなる群から選択される血管新生促進薬の投与を含むことが好ましい。
【００３６】
本明細書では「感受性」という用語は、その方法によって感受性であると同定された被験体の統計的に有意な部分が、心臓の患部で血管新生を示すことによって予想された療法に反応することを意味する。
【００３７】
前述の方法の好ましい実施形態において、第1のサンプルと比較して第2のサンプル中のPLGFおよびsFLT1の減少した量ならびにエンドグリンの増加した量は、血管新生促進療法に感受性である被験体を除外する。
【００３８】
本発明はまた、心筋梗塞に罹患した被験体の血管新生状態を診断するためのデバイスであって、以下の手段:
(a)被験体の第1および第2のサンプル中のPLGF、sFLT1およびエンドグリンの量を測定するための手段であって、前記第1のサンプルは、心筋梗塞後に取得されたものであり、前記第2のサンプルは、前記第1のサンプルの後に取得されたものである、上記手段;ならびに
(b)(a)の手段により第1のサンプル中で測定したPLGF、sFIT1およびエンドグリンの量を、第2のサンプル中で測定した対応する量と比較するための手段であって、それにより血管新生状態の診断が可能になる手段
を含む、上記デバイスに関する。
【００３９】
本明細書では「デバイス」という用語は、予測が可能となるように互いに機能的に連結された少なくとも前述の手段を含む手段のシステムに関する。前記ポリペプチドの量を決定する好ましい手段およびその比較を行う手段は、本発明の方法に関連して上記で開示される。機能的なやり方でその手段をどのように連結するかは、デバイス中に含まれる手段のタイプによって変わる。例えば、ポリペプチドの量を自動的に決定する手段が適用される場合、前記自動的に動作する手段によって取得したデータは、血管新生状態を診断するために、例えば、コンピュータプログラムによって処理することができる。このような場合には、手段は単一のデバイスによって構成されることが好ましい。したがって、前記デバイスは、サンプル中のポリペプチドの量を測定するための分析装置および鑑別診断の結果データを処理するためのコンピュータ装置を含めることができる。あるいは、検査ストライプなどの手段をポリペプチドの量を決定するために用いる場合、診断するための手段は、決定された量を血管新生促進状態または血管新生抑制状態を伴うことが知られている量に割り当てる対照ストライプまたは対照表を含むことができる。検査ストライプは、本明細書の他で定義された通りポリペプチドに特異的に結合するリガンドとカップリングしていることが好ましい。ストリップまたはデバイスは、前記リガンドへの前記ペプチドの結合を検出するための手段を含むことが好ましい。検出するための好ましい手段を、上記の本発明の方法に関する実施形態に関連して開示する。このような場合には、システムのユーザがマニュアルに示された指示および解釈によりその量の決定の結果およびその診断価値を統合するという点で、手段は機能的に連結されている。その手段は、このような実施形態において別々のデバイスのように見えてもよく、好ましくは、キットとして一緒に包装される。当業者は、苦もなくその手段を連結するやり方を理解するであろう。好ましいデバイスは、専門の臨床医の特定の知識なしに適用することができるものであり、例えば、サンプルをロードすることを必要とするだけの検査ストライプまたは電子デバイスである。これらの結果は、パラメトリックな診断生データの出力として、好ましくは絶対量または相対量として得られる。これらのデータは、臨床医による解釈を必要とすることが理解されるべきである。しかし、出力がその解釈に専門の臨床医を必要としない処理済みの診断生データである、エキスパートシステムデバイスも想定される。さらに好ましいデバイスは、本発明の方法に従って上記で言及した分析装置/デバイス(例えば、バイオセンサー、アレイ、ポリペプチドを特異的に認識するリガンドとカップリングした固体支持体、プラスモン表面共鳴デバイス、NMR分光計、質量分析計など)または評価装置/デバイスを含む。
【００４０】
最後に、本発明は、本発明の方法を実施するためにつくられたキットを含み、該キットは、以下の手段:
(a)被験体の第1および第2のサンプル中のPLGF、sFLT1およびエンドグリンの量を測定するための手段であって、前記第1のサンプルは心筋梗塞後に取得されたものであり、前記第2のサンプルは前記第1のサンプルの後に取得されたものである、上記手段;ならびに
(b)(a)の手段により第1のサンプル中で測定したPLGF、sF1T1およびエンドグリンの量を、第2のサンプル中で測定した対応する量と比較するための手段であって、それにより血管新生状態の診断が可能になる手段
を含む。
【００４１】
本明細書では「キット」という用語は、好ましくは、別々にまたは単一の容器中で提供される前述の手段の集まりを意味する。容器はまた、本発明の方法を実施するための説明書を含むことが好ましい。したがって、本発明は、本明細書で言及したポリペプチドを測定するための手段または試薬を含むキットに関する。このような手段または試薬の例ならびにその使用方法を本明細書中で挙げている。キットは、すぐ使用できるやり方で前述の手段または試薬を含むことが好ましい。好ましくは、キットは、さらに説明書、例えば、本発明の方法によって提供される診断に関して1つ(または複数)の任意の決定の結果を解釈するためのユーザ用マニュアルを含むことができる。具体的には、このようなマニュアルは、決定されたポリペプチドの量を診断の種類に割り当てるための情報を含めることができる。詳細は、本明細書の他で見いだせるであろう。さらに、このようなユーザ用マニュアルは、それぞれのバイオマーカーの1つ(または複数)の量を決定するためのキットの構成要素を正しく用いることについての説明書を提供することができる。ユーザ用マニュアルは、紙形式または例えば、CDもしくはCD ROMに格納された電子形式で提供することができる。本発明はまた、本発明による方法のいずれかにおける前記キットの使用に関する。
【００４２】
本明細書に引用したすべての参照文献を、その開示内容全体および本明細書で具体的に述べた開示内容に関して、参照によりこれに組み込む。
【００４３】
以下の実施例は、本発明を例示しているにすぎない。これがいかなるものであっても、本発明の範囲を限定するものと解釈するべきではない。
【実施例】
【００４４】
PlGF、sFLT1およびエンドグリンは、心筋梗塞に罹患した患者における血管新生状態の統計的に独立した共通の予測指標である
総数140名の心筋梗塞に罹患した患者を、sFLT1、エンドグリン、PlGFおよびTGF-β1の血中レベルについて調べた。すべての患者は、心筋梗塞約3ヵ月後に心エコー検査によって心臓生理機能について確認したとき血管新生促進状態を明らかに示した。
【００４５】
sFLT1、PlGFおよびエンドグリンの血中レベルを、第1の時点(心筋梗塞が起こってから3日後)および第2の時点(第1の時点から3ヵ月後)で米国アールアンドディー・システムス(R&D Systems)社から市販されているイムノアッセイ「Quantikine」(カタログ番号DVR100B、DPG00およびDNDG00)を用いて決定した。
【００４６】
試験の結果を図1にまとめて示す。特に、PLGFおよびsFLT1レベルの減少は、エンドグリンレベルの増加を伴う血管新生促進患者において観察された。
【００４７】
さらに、PlGF、エンドグリンおよびsFLT1は、線形回帰分析(図2〜7)によって示される通り時点=0ならびに時点=3ヵ月で互いに統計的に独立していた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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