(57)【要約】  本発明は、比濁分析によって２００ｇ／Ｌのマンノプロテイン濃度およびｐＨ４〜ｐＨ８の範囲のｐＨにおいて測定したときの濁度が、７０ＮＴＵ未満、好ましくは６０ＮＴＵ未満、より好ましくは５０ＮＴＵ未満、最も好ましくは４０ＮＴＵ未満であるマンノプロテイン溶液について記載している。この溶液は、それがきわめて透明であるために有利には酒石酸塩の沈殿に対するワインの安定化に使用することができ、混濁をまったく引き起こすことなくワインに直接に加えることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
比濁分析によって２００ｇ／Ｌのマンノプロテイン濃度およびｐＨ４からｐＨ８の範囲のｐＨにおいて測定したときの濁度が、７０ＮＴＵ未満であるマンノプロテイン溶液。
【請求項２】
プロテアーゼ活性のない、および場合によってはβ−グルカナーゼ活性のない、請求項１に記載のマンノプロテイン溶液。
【請求項３】
溶液１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）で測定される前記溶液中に存在する生存微生物の総量が１０未満である、請求項１または２に記載のマンノプロテイン溶液。
【請求項４】
水溶液である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマンノプロテイン溶液。
【請求項５】
少なくとも安定化添加剤をさらに含み、好ましくは前記安定化添加剤が二酸化硫黄である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のマンノプロテイン溶液。
【請求項６】
５０ｇ／Ｌから５００ｇ／Ｌの間のマンノプロテイン濃度を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のマンノプロテイン溶液。
【請求項７】
水に溶解して１ｇ／Ｌ（乾燥重量を基準にした）溶液を生成した場合にｐＨ３．５において測定される４ＮＴＵ以下の濁度を有し、かつ／または水に溶かした１２％ｖ／ｖエタノール溶液中に溶解して１ｇ／Ｌ（乾燥重量を基準にした）溶液を生成した場合にｐＨ３．５において測定される２０ＮＴＵ以下の濁度を有し、かつ／または０．２ｇ／Ｌ（乾燥重量を基準にした）の濃度で白ワイン中に溶解した場合に≦１０ＮＴＵの濁度を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のマンノプロテイン溶液。
【請求項８】
ａ）酵母細胞の懸濁液を、好ましくは外来性の酵素の作用下で、かつ生来の酵母酵素の不活性化後に酵素的加水分解にかけ、それによって前記酵母細胞を分解し、マンノプロテインおよび他の酵母成分を可溶化し、前記分解した酵母細胞から遊離させるステップと、ｂ）前記可溶化マンノプロテインを、好ましくは膜濾過を用いて溶液として回収するステップとを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のマンノプロテイン溶液の生成方法。
【請求項９】
ｃ）溶液として回収された前記可溶化マンノプロテインをホスホジエステラーゼで処理するステップと、任意選択で
ｄ）Ｆｄａｓｅで処理された前記マンノプロテイン溶液を、膜濾過を用いて精製するステップと
をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｅ）ステップｂ）、ｃ）、またはｄ）の後に得られる前記マンノプロテイン溶液を、好ましくは前記溶液を７０℃以上の温度で、好ましくは８０℃から１４０℃の間に含まれる温度で熱処理にかけることによる、プロテアーゼ、および場合によってはβ−グルカナーゼを不活性化するのに適した処理にかけるステップをさらに含み、前記熱処理が、好ましくは２秒から６０分の間に含まれる或る時間のあいだ行われる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｂ）、ｃ）、ｄ）、またはｅ）の後に得られる前記マンノプロテイン溶液が滅菌される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法によって得られる請求項１〜７のいずれか一項に記載のマンノプロテイン溶液。
【請求項１３】
ワインの安定化に請求項１〜７、１２のいずれか一項に記載のマンノプロテイン溶液の使用法。
【請求項１４】
酒石酸の塩の結晶化を防ぎまたは遅らせることによってワインを安定化する方法であって、請求項１〜７、および／または１２のいずれか一項に記載のマンノプロテイン溶液をワインまたはワインの生産に使用されるブドウマストに加える、方法。
【請求項１５】
ワインを濾過するステップ、および前記濾過したワインを瓶詰めまたは容器に詰めるステップを含む酒石酸の塩の結晶化に対して安定なワインを生産する方法であって、マンノプロテイン溶液を濾過の後、瓶詰めの前に前記ワインに加える、方法。
【請求項１６】
前記ワインに加えられるマンノプロテインの前記溶液が、請求項１〜７、１２のいずれか一項に記載の溶液である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
結晶化時間安定化ワイン（Ｔｃｒｙｓｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｗｉｎｅ）／結晶化時間不安定ワイン（Ｔｃｒｙｓｕｎｓｔａｂｌｅ  ｗｉｎｅ）比が少なくとも２であることを特徴とするワイン。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、マンノプロテインの溶液に関する。本発明はさらに、この溶液の生成方法およびワイン安定化におけるその使用法に関する。さらに本発明は、安定化されたワインの生産方法に関する。
【０００２】
［背景技術］
酒石酸塩、酒石酸水素カリウム（ＫＨＴ）、または酒石酸カルシウム（ＣａＴ）の存在は、ワインの不安定性の主要な原因の一つである。
【０００３】
酒石酸は、ブドウ果実によってその成長の間に生成される主要な有機酸である。それは、果実の加工の間にカリウムおよびカルシウム塩の形態でブドウマスト中へ溶解する。発酵の間に酒石酸の塩の可溶度は、エタノール濃度の増加とともに低下する（糖の発酵のため）。
【０００４】
若いワインでは酒石酸水素カリウム（ＫＨＴ）が、常に過飽和状態の濃度で存在し、自然に結晶化する。ワインの瓶詰めの後、ＫＨＴの不安定性は、結晶化の予測できない性質のために商業的な問題になる恐れがある。その上、瓶の中の結晶の存在を消費者は、しばしばワインの低品質の徴候と考える。瓶詰めの前に物理的処理を用いて酒石酸塩の結晶化を防ぐことができる。それらの処理は、ワインを−４℃に冷却することにより結晶化を促進させ、その後、濾過によって除去するかあるいは電気透析によるか、またはイオン交換樹脂の使用によりカリウムおよび酒石酸イオンを除去することにある。しかし、これらの時間およびエネルギーを要する方法は、ワインのコロイド平衡を変えると考えられる。
【０００５】
ワインの物理的処理の代替案は、ＫＨＴ結晶の核形成および／または成長を防ぐ添加剤を使用することである。
【０００６】
カルボキシメチルセルロースおよびメタ酒石酸は、ＫＨＴ結晶化を妨げる添加剤のグループに属する。しかしカルボキシメチルセルロースは、現在の規制ではワイン添加剤として認可されていない。一方、メタ酒石酸はワインのｐＨにおいて、またワインが貯蔵される温度において不安定である。時間が経つにつれてメタ酒石酸は加水分解することになり、その保護効果が消滅することになる。したがってその使用は、短時間で消費されるワインに限定される。別の欠点は、添加剤は理想的にはワインの天然成分であるべきであるという点である。メタ酒石酸またはカルボキシメチルセルロースに関してはこれに全く当てはまらない。
【０００７】
ＫＨＴ結晶の核形成および成長速度の両方に対して働く天然の添加剤が、化学的添加剤よりも好ましい。
【０００８】
天然の添加剤の例は、マンノプロテインである。マンノプロテインは、グルカンと共に酵母における細胞壁の主要成分である（Ｌｉｐｋｅ  Ｐ．Ｎ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）１８０（１５）：３７３５〜３７４０）。マンノプロテインは、２種類の方法、すなわち物理的方法および酵素的方法によって主に酵母細胞から得られる。マンノプロテインを得るための最も一般的な物理的方法は、Ｐｅａｔ  Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ（１９６１）２８〜３５に記載されているものであり、これはマンノプロテインを、中性ｐＨにおいて酵母細胞を熱抽出することによって得る。酵母からマンノプロテインを得る酵素的方法は、例えば国際公開第９６／１３５７１号パンフレットに記載されている。この方法は、単離した酵母細胞壁のβ−グルカナーゼ調製剤による処理およびその生成物の限外濾過による単離を含む。
【０００９】
マンノプロテインは、いったんワインに加えられると、望ましくない混濁を引き起こし、また場合によっては副生物の沈殿を引き起こすという欠点を有する可能性がある。
【００１０】
欧州特許出願公開第１０９４１１７Ａ号明細書は、マンノプロテイン調製物中に存在する副生物によって引き起こされる混濁の問題を低減する、マンノプロテインの可溶性粉末の生成方法について述べている。この方法では自己消化後に酵母細胞壁を単離し、続いて９５〜１００℃で１５〜３０時間またはβ−グルカナーゼの作用下のいずれかにおいて選択的加水分解にかける。両方のケースにおいてマンノプロテインおよび他の不純物は可溶化される。可溶化されたマンノプロテインを精製するには幾つかのステップが必要である。
【００１１】
マンノプロテインは、粉末の形態または溶液の形態でワインまたはワインマストに加えることができる。粉末配合物中でのマンノプロテインの使用は、そのような配合物が時間内で微生物学的に安定であるという利点を有する。しかしワインにマンノプロテイン粉末配合物の量を正確に投入するには、好ましくはマンノプロテインは水またはワイン中に溶解される。ワインまたはマストにマンノプロテイン溶液を加える時にそれを希釈しすぎないようにするために前記溶液は、マンノプロテインが約２００〜３００ｇ／Ｌの濃度を有するべきである。しかしながらマンノプロテインの溶解が遅いために、粉末から出発するこのような濃厚溶液の調製は、溶液の１〜２時間の連続撹拌を必要とし、したがってワイン生産者にとって煩わしい。さらに溶液の生成の間ずっと微生物によるその汚染の危険が存在し、当然これは望ましくない。
【００１２】
上記の理由でワイン安定化用のすぐ使えるマンノプロテイン溶液の使用を、ワイン生産者は好むはずである。しかしすぐ使えるマンノプロテイン液状配合物は、幾つかの難題を提示する。すぐ使えるマンノプロテイン溶液は、使用濃度すなわち１００〜３００ｇ／Ｌでは半透明の液状配合物であるはずである。さらにこの液状配合物は安定であるべきである。具体的には、マンノプロテイン製造業者による溶液の生産と、ワイン生産者によるその使用との間の期間中、ワイン中の酒石酸塩の沈殿に対するワイン安定剤としてのマンノプロテイン溶液の活性は保たれるべきである。本発明の目的は、上記の問題に対する解決策を提供することである。
【００１３】
［発明の詳細な説明］
本発明は第一の態様において、比濁分析によって２００ｇ／Ｌのマンノプロテイン濃度およびｐＨ４〜ｐＨ８の範囲のｐＨにおいて測定したときの濁度が、７０ＮＴＵ未満、好ましくは６０ＮＴＵ未満、より好ましくは５０ＮＴＵ未満、最も好ましくは４０ＮＴＵ未満であるマンノプロテイン溶液を提供する。
【００１４】
本発明に関して「マンノプロテイン」は、物理化学的または酵素的方法によってワイン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞および／または酵母細胞壁から抽出することができる生成物として、ＯＩＶ（Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  ｌａ  Ｖｉｇｎｅ  ｅｔ  ｄｕ  Ｖｉｎ）のＲＥＳＯＬＵＴＩＯＮ  ＯＥＮＯ  ２６／２００４に従って定義される。マンノプロテインは、それらの分子量、それらのグリコシル化の度合と種類、および負荷の大きさ（ｌｏａｄ  ｓｉｚｅ）に応じて様々な構造である。
【００１５】
本出願人は、意外なことに従来技術中に記載されているいずれのマンノプロテイン溶液よりも透明な、きわめて透明なマンノプロテイン溶液が、２００〜３００ｇ／Ｌの濃度においてさえ生成することができることを見出した。このマンノプロテイン溶液は、ワインを希釈しすぎることなく高濃度でワインに加えることができるので、ワイン中の酒石酸塩の沈殿に対するその安定化のために用いるのに特に適している。さらにこの第一の態様によるマンノプロテイン溶液は、ワインに加えた場合に混濁を引き起こさない。マンノプロテイン溶液の濁度はその濃度に、またｐＨに左右されるので、濁度の値はその溶液の２００ｇ／Ｌの濃度において測定される。しかしこれは、本発明の溶液がマンノプロテインの２００ｇ／Ｌの固定濃度を有することを意味するものと解釈するべきではなく、その濁度が２００ｇ／Ｌの濃度で測定されることを意味するものと解釈するべきである。したがってその初期濃度に応じて、マンノプロテイン溶液を濁度の測定に先立って２００ｇ／Ｌまで希釈または濃縮することができる。ｐＨ５．５においては、マンノプロテイン２００ｇ／Ｌの濃度で比濁分析によって測定される第一の態様のマンノプロテイン溶液の濁度は、好ましくは１００ＮＴＵ以下、より好ましくは５０ＮＴＵ以下、さらに一層好ましくは４０ＮＴＵ以下、最も好ましくは３０ＮＴＵ以下である。
【００１６】
プロテアーゼおよびβ−グルカナーゼは、酵母または酵母細胞壁からのマンノプロテインの生成に使用することができる、既知の方法に従って生成されるマンノプロテイン中の不純物として（通常）存在する酵素である。これらの不純物の存在は、そのマンノプロテインを粉末として単離する場合の問題を意味しない。そうではなくほんの僅かでさえ溶液中にプロテアーゼ活性、および場合によってはβ−グルカナーゼ活性が存在すると、酒石酸塩の沈殿に対するワインの安定化に関するマンノプロテイン溶液の活性の急速な低下を引き起こす。
【００１７】
本出願人は、意外なことにマンノプロテイン溶液がプロテアーゼ活性、例えばアルカリ性プロテアーゼ活性のない場合、場合によってはβ−グルカナーゼ活性のない場合、溶液の貯蔵寿命および酒石酸塩の沈殿に対するそのワイン安定剤としての活性が延長されることを見出した。そうではなくほんの僅かでさえマンノプロテイン溶液中にプロテアーゼ活性、および場合によってはβ−グルカナーゼ活性が存在すると、酒石酸塩の沈殿に対するワインの安定化に関するマンノプロテイン溶液の活性の急速な低下を引き起こす。
【００１８】
好ましい実施形態では第一の態様のマンノプロテイン溶液は、プロテアーゼ活性がない、および場合によってはβ−グルカナーゼ活性がない。
【００１９】
「プロテアーゼ活性」に関しては、これに加えてそれはエンドプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２１〜２４）による全酵素活性を意味する。「プロテアーゼ活性のない」は、そのマンノプロテイン溶液中のプロテアーゼ活性が、プロテアーゼ活性を測定するために用いられる方法で検出できる最低活性度よりも低いものを意味する。その溶液中に存在することが予想されるプロテアーゼの種類に応じてプロテアーゼを測定するために特定の方法を用いることができ、また特定のプロテアーゼ単位を明確にすることができる。これらの方法は当業者に既知である。材料および方法の中でプロテアーゼ活性を求めるために本発明で使用する方法が与えられ、プロテアーゼ活性の単位が定義される。
【００２０】
「β−グルカナーゼ活性」に関しては、これに加えてそれはβ−１，３、β−１，４、および／またはβ−１，６エンドグルカナーゼによる全酵素活性を意味する。β−グルカナーゼ活性は、材料および方法中で述べる方法に従って求めることができる。β−グルカナーゼ活性がないとは、その溶液中のβ−グルカナーゼ活性のレベルが、材料および方法中で述べる方法などのβ−グルカナーゼ活性を測定するのに適した方法で検出できる最低の活性よりも低いことを意味する。
【００２１】
第一の態様のマンノプロテイン溶液は、ワインまたはマストの安定化にその好ましい用途があることが分かる。このような理由で、この溶液はいかなる有害な微生物も存在しないことが重要である。さらに、どのような生存微生物の存在もその溶液の貯蔵安定性、およびそのワイン安定剤としての活性の維持に影響を及ぼす。これらの理由で本発明の一実施形態では第一の態様のマンノプロテイン溶液は、その溶液中に存在する生存微生物の総量がコロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬで測定される１０未満、好ましくは５未満であり、より好ましくはマンノプロテイン溶液は無菌である。
【００２２】
用語「生存微生物の総量」に関しては、その溶液中に存在する好気および嫌気好冷性微生物＋好気および嫌気中温性微生物＋好気および嫌気好熱性微生物の総量を意味する。コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬで測定される溶液中に存在する生存微生物の総量は、材料および方法の中で規定され、総生菌数（ＴＰＣ）を求めることによって確認される。その方法は当業者には周知であり、それについては材料および方法の中で簡単に述べる。最も好ましくはマンノプロテイン溶液は無菌であり、例えば溶液１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）で測定されるその溶液中に存在する生存微生物の総量が０である。マンノプロテイン溶液は、密閉した状態に閉鎖される滅菌容器に詰められることが好ましい。
【００２３】
第一の態様によるマンノプロテイン溶液は、好ましくは水溶液である。
【００２４】
本発明の第一の態様の溶液は、ワインまたはワインマストにその安定化のために加えるのに特に適している。マンノプロテイン溶液の添加時にワインまたはマストを希釈しすぎないようにするためには溶液中のマンノプロテインの濃度は、好ましくは５０ｇ／Ｌから５００ｇ／Ｌの間、より好ましくは１００ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌの間、最も好ましくは２００ｇ／Ｌである。
【００２５】
溶液のｐＨは、時間内でマンノプロテインの安定性が保たれるようなものであり、かつその溶液の混濁を避けるようなものであることが好ましい。したがってマンノプロテイン溶液のｐＨは、３から８の間、より好ましくは４から７の間、最も好ましくは５から６の間に含まれることが好ましい。
【００２６】
第一の態様の溶液は、好ましくは時間内で微生物学的に安定である。したがって好ましい実施形態では、少なくとも安定化添加剤がマンノプロテイン溶液に加えられる。より好ましくはこの安定化添加剤は二酸化硫黄である。より好ましくは二酸化硫黄は、重亜硫酸塩の形態で、より好ましくは重亜硫酸ナトリウムまたは重亜硫酸カリウム（Ｋ２Ｓ２Ｏ５）として溶液に加えることができる。二酸化硫黄の添加は、マンノプロテイン溶液を微生物学的に安定な状態に保つことに次いで別の利点を有する。マンノプロテイン溶液は、淡黄色から茶色がかった色まで変わる可能性のある色を有する。しかしワインの安定化のために茶色がかった溶液を使用することは、ワイン生産者にあまり受けないはずである。したがってワインまたはマストに使用されるマンノプロテイン溶液の着色は、好ましくはごくわずかであるべきである。マンノプロテイン溶液への二酸化硫黄の添加は、その色を茶色がかった色から黄白色に薄くすることができる。したがって溶液に加えられる二酸化硫黄の量は、好ましくは１から２０ｇ／Ｌ（加えられるＫ２Ｓ２Ｏ５の量として測定される）の範囲である。
【００２７】
ワイン中に溶解された本発明の第一の態様によるマンノプロテイン溶液は、半透明かつ安定であるべきである。具体的には酒石酸塩の沈殿に対するワイン安定剤としてのワイン中の溶存マンノプロテイン溶液の活性は、その溶液製造業者による生産と、そのワイン生産者による使用との間の期間中保たれるべきである。したがって好ましい実施形態では、
・水に１ｇ／Ｌ（乾燥重量を基準にした）の濃度で溶解した本発明の第一の態様によるマンノプロテイン溶液が、ｐＨ３．５において測定される４ＮＴＵ以下の、好ましくは２ＮＴＵ以下の、より好ましくは１ＮＴＵ以下の濁度を有し、かつ／または
・水に溶かした１２％ｖ／ｖエタノール中に１ｇ／Ｌ（乾燥重量を基準にした）の濃度で溶解した本発明の第一の態様によるマンノプロテイン溶液が、ｐＨ３．５において測定される２０ＮＴＵ以下の、好ましくは１０ＮＴＵ以下の、さらに一層好ましくは５ＮＴＵ以下の、最も好ましくは１ＮＴＵ以下の濁度を有し、かつ／または
・白ワインに０．２ｇ／Ｌ（乾燥重量を基準にした）の濃度で溶解した本発明の第一の態様によるマンノプロテイン溶液が、≦１０ＮＴＵの、好ましくは≦５ＮＴＵの、より一層好ましくは≦２ＮＴＵの、最も好ましくは≦１ＮＴＵの濁度を有する。
【００２８】
第一の態様によるマンノプロテイン溶液は、本発明の第二の態様の方法によって得られる。このマンノプロテイン溶液は、マンノプロテインの乾燥分量を基準にしてそのマンノプロテイン中の炭水化物含量が好ましくは少なくとも５０％ｗ／ｗであることを特徴とし、全炭水化物含量を基準にしてその少なくとも７０％ｗ／ｗがマンノースのオリゴマーまたはポリマーの形態のマンノース残分からなる。好ましくは本発明の方法によって得られるマンノプロテイン溶液は、乾燥分量を基準にして１％ｗ／ｗ未満、より好ましくは０．８％ｗ／ｗ以下、より一層好ましくは０．７％ｗ／ｗ以下のマンノプロテイン中のリン（Ｐ２Ｏ５として測定される）量を特徴とする。一般にはリンの量は、乾燥分量を基準にして０．４％ｗ／ｗ程度であることができる。マンノプロテイン中のリンの量は、周知のＡＥＳ−ＩＣＰ法（誘導結合プラズマを用いた原子発光分析）により測定することができる。
【００２９】
本発明の第一の態様によるマンノプロテイン溶液は、１種または複数種の他のワイン添加剤と組み合わせることができる。ワイン添加剤の例には、カルボキシメチルセルロース、メタ酒石酸、およびアラビアガムが挙げられる。好ましい実施形態ではマンノプロテイン溶液は、アラビアガムと組み合わせられる。
【００３０】
第二の態様において本発明は、ａ）酵母細胞の懸濁液を、好ましくは外来性の酵素の作用下で、かつ生来の酵母酵素の不活性化後に酵素的加水分解にかけ、それによって前記酵母細胞を分解し、マンノプロテインおよび他の酵母成分を可溶化し、分解した酵母細胞から遊離させるステップと、ｂ）可溶化されたマンノプロテインを、好ましくは膜濾過を用いて溶液として回収するステップとを含む、第一の態様によるマンノプロテイン溶液の生成方法を提供する。
【００３１】
ステップａ）においてマンノプロテインは、酵母細胞の水性懸濁液を酵素的加水分解にかけ、それによって前記酵母細胞を分解し、マンノプロテインおよび他の酵母成分を可溶化し、分解した酵母細胞から遊離させることによって酵母細胞の水性懸濁液から抽出される。
【００３２】
任意の種類の酵母を本発明の方法において使用することができる。具体的にはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、またはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母株を好適に用いることができる。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母株、例えばワイン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株が好ましい。
【００３３】
本発明の方法は、水性液体に溶かした酵母細胞の懸濁液、例えば当該酵母細胞の発酵液から始めることができる。酵母細胞の懸濁液をもたらす適切な発酵方法は当該技術分野で知られている。場合によってはこの発酵液を、本発明の方法での使用に先立って、例えば遠心分離または濾過によって濃縮することができる。例えばクリーム酵母（ｃｒｅａｍ  ｙｅａｓｔ）（乾燥分含量１５〜２７％ｗ／ｗまで濃縮したパン酵母）を使用することができる。
【００３４】
ステップａ）において酵母細胞の懸濁液の酵素的加水分解は、前記懸濁液に生来の酵母酵素および／または追加される外来性の酵素の作用を受けさせることによって行うことができる。
【００３５】
酵素的加水分解を行うために用いられる条件は、使用される酵素の種類に左右され、当業者が容易に決めることができる。一般には酵素的加水分解は、４から１０の間のｐＨおよび４０℃から７０℃の間の温度で行われるはずである。一般には酵素的加水分解は、１時間から２４時間の間に含まれる或る時間のあいだ行われるはずである。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、生来の酵母酵素をまず不活性化し、続いて外来性の酵素を懸濁液に加える。当業者は、生来の酵母酵素をどのように不活性化するかが分かっている。不活性化は、例えばｐＨ処理または熱ショックによって行うことができ、後者の方法が好ましい。熱ショックは、適切には酵母細胞の懸濁液を８０〜９７℃の温度で５から１０分間処理することによって行うことができる。いったん生来の酵母酵素が不活性化されたら外来性の酵素をその酵母細胞の懸濁液に加えて酵素的加水分解を行うことができる。好ましくはプロテアーゼ、より好ましくはエンドプロテアーゼがこの目的に使用される。好ましくは酵素的加水分解を行うために使用される外来性の酵素は、ＲＮＡをリボヌクレオチドに分解する酵素を含む。この点では任意のＲＮアーゼ、例えば５’−Ｆｄａｓｅ（５’−ホスホジエステラーゼ）を使用することができる。ＲＮＡをリボヌクレオチドに分解するために使用される酵素は、上記酵素と一緒に、または上記酵素による処理の後に加える、例えばプロテアーゼと一緒に、またはプロテアーゼによる処理の後に加えることができる。任意選択でデアミナーゼ、例えばアデニル酸デアミナーゼもまた上記酵素と一緒に、または上記酵素による処理の後に用いられる。
【００３７】
ステップｂ）に先立ってステップａ）において使用される酵素を、例えば上記の方法を用いることによって不活性化することができる。
【００３８】
この方法のステップｂ）ではマンノプロテインは溶液として、好ましくは膜濾過を用いて回収される。この溶液は、任意選択で所望の最終濃度まで濃縮される。
【００３９】
例えば酵母細胞壁から得られる不溶性物質は、マンノプロテインの回収に先立ってステップｂ）において一般には固−液分離法によって、好ましくは遠心分離または濾過によって除去されることが好ましい。マンノプロテインは、それに適した任意の方法によって回収することができる。
【００４０】
ステップｂ）の好ましい実施形態ではマンノプロテインは、膜濾過を用いて、好ましくは限外濾過（ＵＦ）またはダイアフィルトレーションを用いて溶液として回収される。膜濾過法、具体的には限外濾過またはダイアフィルトレーションは当業者に知られている。好ましくはマンノプロテインは、限外濾過（ＵＦ）またはダイアフィルトレーションによって回収される。ＵＦまたはダイアフィルトレーションを用いてマンノプロテインを回収する場合、分子量カットオフが１００ｋＤａ以下、好ましくは３から５０ｋＤａ、より好ましくは３から１０ｋＤａのフィルターを用いることができる。マンノプロテイン画分は、限外濾過またはダイアフィルトレーションのステップからもたらされる濃縮液中に残留する。不溶性物質を限外濾過またはダイアフィルトレーションの前に除去しない場合は、そのマンノプロテインと不溶性物質を含む濃縮液を再度懸濁（溶液状態に）し、例えば上記の一般的な固−液分離技術を用いて不溶性物質を除去することが好ましい。
【００４１】
マンノプロテインを溶液として回収した後に、好ましくはその回収マンノプロテインを第二の態様の方法のステップｃ）において、回収マンノプロテイン溶液中に存在するＲＮＡ残分をリボヌクレオチドに変換するのに十分な条件下でＲＮアーゼ、例えばＦｄａｓｅ（ホスホジエステラーゼ）で処理することができる。処理は、当業者に知られている方法を用いて行うことができる。この処理には、上記で示したものと同様に膜を用いて低分子量の不純物を除去するために、任意選択で１または複数の膜濾過のステップ、例えば限外濾過またはダイアフィルトレーション（本発明の第二の態様の方法のステップｄ））が続く。マンノプロテイン溶液は濃縮液中に回収される。
【００４２】
マンノプロテイン溶液は、生産過程の任意の適切なステップにおいて当業者に知られている方法を用いてｐＨ調整および／または濃縮を受けることができる。
【００４３】
一実施形態では第一の態様のマンノプロテイン溶液は、プロテアーゼ活性、および場合によってはβ−グルカナーゼ活性がない。後者の結果は、第二の態様の方法が、ステップｂ）、ｃ）、またはｄ）後に得られるマンノプロテイン溶液を、好ましくはその溶液を７０℃以上の温度で、好ましくは８０℃から１４０℃の間に含まれる温度で熱処理にかけることによる、プロテアーゼ、および場合によってはβ−グルカナーゼを不活性化するのに適した処理にかけるステップｅ）をさらに含む場合に得ることができる。この熱処理は、好ましくは２秒から６０分の間に含まれる或る時間のあいだ行われる。好ましくはステップｅ）は、ステップｄ）後または滅菌後、例えば本明細書中で後述する滅菌濾過後に行われることになる。
【００４４】
この点ではプロテアーゼ活性、および場合によってはβ−グルカナーゼ活性を不活性化するのに適した任意の処理を用いることができる。より好ましくは加熱のステップが酵素の活性を不活性化するために用いられる。熱処理に使用される温度は、好ましくは７０℃以上であり、好ましくはその温度は８０℃から１４０℃の間に含まれる。熱処理の持続時間は、好ましくは酵素の活性がすべてマンノプロテイン溶液から除去されるようなものである。熱処理の持続時間は、使用される温度に左右されることになる。例えば、低い温度ほど長い熱処理の持続時間を必要とすることになり、一方、高い温度ほど短い時間しか必要としないことになる。したがって８０℃で３０分間の処理および１３０℃で７秒間の処理は、本発明の特許請求の範囲の範囲に属することになる。好ましくは熱処理は、食品または飲料業界で一般に使用される条件を用いたＵＨＴ処理の使用によって行われる。ＵＨＴ処理は、一般に１３０〜１４５℃の温度で２〜１０秒の持続時間のあいだ行うことができる。１３０℃以上で十分な時間行われる加熱処理、例えば１３０℃で７秒間の加熱処理の場合、プロテアーゼ活性およびβ−グルカナーゼ活性のない、また一般には酵素の活性の全くない溶液が得られるはずである。
【００４５】
加熱のステップを用いることによって、一般にはマンノプロテイン溶液中に存在する微生物の少なくとも一部が不活性になるか、または殺されることになる。好ましくは加熱処理は、上記に示したようなＵＨＴ処理であり、その理由は後者の場合には溶液中に存在する可能性のあるすべての微生物または微生物の胞子が不活性化されるか、または殺されることになるためである。
【００４６】
本発明の方法は、ステップｂ）、ｃ）、ｄ）、またはｅ）後に得られるマンノプロテインを滅菌、好ましくは滅菌濾過（ステップｆ））にかけて、溶液中に存在するすべての微生物を除去するステップを含むことができる。後者は、当業者に知られている特定のフィルターを使用することによって達成することができる。好ましくは滅菌濾過はステップｄ）、またはｅ）後に行われる。
【００４７】
酵素活性を不活性化する処理の前または後に、好ましくはこの処理の後だが滅菌濾過の前に、マンノプロテイン溶液に二酸化硫黄を所望の量で加えることができる。一般に添加は、第一の態様で示したように適切な塩を加えることによって行うことができる。当業者は、この添加をどのように行うかが分かっている。マンノプロテイン溶液に他の安定化添加剤を、生産過程の間の任意の適切なステップにおいて、一般にはステップｂ）の後、滅菌濾過前の任意のステップにおいて加えることができる。
【００４８】
生産工程の終りにマンノプロテイン溶液は、当業者に知られている方法に従って無菌で容器に詰めることができる。使用することができる無菌容器は、幾種類かの材料から生産することができる。好適な容器は、段ボール箱に収めた無菌の袋であることができる。これらの袋は、ねじ式の栓によって穴をあけることができるパッキン押さえを備えることができる。
【００４９】
本発明の方法が、固体の形態、例えば粉末または顆粒の形態のマンノプロテインを生成するために、マンノプロテイン溶液を当業者に知られている方法、例えば凍結乾燥または噴霧乾燥によって乾燥するステップを包含することができることを当業者は理解するはずである。本発明は、前記固体の形態のマンノプロテインもまた包含する。
【００５０】
第三の態様において本発明は、第一の態様によるマンノプロテイン溶液の使用法を提供する。好ましくは本発明は、ワインの安定化における第一の態様によるマンノプロテイン溶液の使用法を提供する。
【００５１】
具体的には第四の態様において本発明は、第一の態様によるマンノプロテイン溶液をワインまたはワインの生産に使用されるブドウマストに加える、酒石酸の塩の結晶化を防ぎ、かつ／または遅らせることによるワインの安定化方法を提供する。組成物は、好ましくは熟成の間に、すなわち発酵後、瓶詰め前にワインに加えられる。本発明は、白ワインおよびロゼワインに極めて適しているが、赤ワインまたは発泡性ワインにもまた適している。
【００５２】
マンノプロテイン溶液は、安定化効果を得るのに有効な量が加えられる。一般にはそれはワイン１リットル当たり１０〜２０００ｍｇの間の濃度でワインに加えることができる。良好な結果は、この溶液をワイン１リットル当たり１０から４００ｍｇのワイン中のマンノプロテイン最終濃度まで加えることによってすでに得られている。当業者は、その加えられる量が、例えば他のワイン安定剤、例えばカルボキシメチルセルロース、メタ酒石酸、またはアラビアガムの添加または存在に左右され、添加前のワイン中のＫＨＴの過飽和の度合に左右されることになることもまた理解するはずである。
【００５３】
ワイン中でのＫＨＴの核形成および結晶成長は、下記の方法により測定し、定量化することができる（Ｍｏｕｔｏｕｎｅｔら、Ａｃｔｕａｌｉｔｅｓ  ＯＥｎｏｌｏｇｉｑｕｅｓ  １９９９  Ｖｉｅｍｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄ’Ｏｅｎｏｌｏｇｉｅ  ｄｅ  Ｂｏｒｄｅａｕｘ（Ｌｏｎｖａｕｄ−Ｆｕｎｅｌ  ｅｄ．））。
【００５４】
結晶の核形成を表示する第一の方法は、−４℃で貯蔵した場合のワイン中の結晶の出現時間を測定する。目視検査を毎日行い、結晶の出現を検出するのに必要な時間（Ｔｃｒｙｓ）を日数で表す。
【００５５】
結晶の成長を表示する第二の方法は、ワインの酒石酸不安定度（Ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  Ｔａｒｔａｒｉｃ  Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）（ＤＴＩ）を測定する。この点に関してはワインを−４℃で撹拌し、初期導電率を測定する。続いてＫＨＴの検量済み結晶を加え、次いで安定値に達した後に導電率を測定する。ＤＴＩは初期導電率の減少比率として定義される。
【００５６】
第三の方法は、真の溶存酒石酸濃度を測定する。正確な体積のワインをガラス瓶に移し、正確に分かっている濃度のマレイン酸を含有する同じ正確な体積のＤ２Ｏと混合する。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを完全緩和条件で測定し、内標準（マレイン酸）の積分値を酒石酸の積分値と比較する。この方法で溶存酒石酸濃度をきわめて高い精度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）および確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）で求めることができる。
【００５７】
一般に酒石酸塩の結晶化に関して不安定なワインは、０．５から６日の間で変動する可能性のあるＴｃｒｙｓを有する。酒石酸塩の結晶化に対して安定化された本発明の第五の態様によるワインは、ワインまたはワイン生産のための発酵に使用されるブドウマストに、第一の態様のマンノプロテイン溶液を酒石酸の塩の結晶化を防ぎ、かつ／または遅らせるのに適した濃度で加えることによって得られる。前記安定化ワインは、方法１に従って測定される結晶化時間安定化ワイン（Ｔｃｒｙｓｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｗｉｎｅ）／結晶化時間不安定ワイン（Ｔｃｒｙｓｕｎｓｔａｂｌｅ  ｗｉｎｅ）比が少なくとも２、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、より一層好ましくは１０から６０の間であることを特徴とする。
【００５８】
ワインの生産は、当業者によく知られている方法、すなわち、ａ）ブドウからワインマストを抽出するステップ、ｂ）ワインマストを酵母の作用下で発酵を受けさせてワインを生成し、続いて固形残渣から分離するステップ、ｃ）任意選択でそのワインを熟成にかけるステップ、およびｄ）そのワインを瓶詰めまたは容器に詰めるステップを特徴とする。発酵の後に存在する固形残渣からワインを分離した後、一般にその生産の後続のステップにおいてワイン中に他の不溶分が形成される（例えば、ワインが冷却固定（ｃｏｌｄ  ｓｔａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ）を受ける場合、例えば酒石酸塩の沈殿に起因する固形物）。したがってワイン生産は、特に大規模に行われる場合、形成された前述の不溶性化合物を除去するために、きわめてしばしばワインの瓶詰めまたは容器に詰める直前にワインを濾過するステップを含む。ワインの製造は、生産されるワインによっては前述のステップに追加のステップを含むことができる。これらのすべてのステップは当業者に知られている。
【００５９】
マンノプロテインなどのワイン安定剤の添加によってワインを安定化するためのステップを含む（工業的な）ワイン製造法では、前記マンノプロテインをワインマストまたはワインのどちらかに加えることができる。一般にはそれは、普通は熟成の間に、および濾過および瓶詰めの前にワインに加えられることになる。マンノプロテインの添加が熟成の間に、および濾過および瓶詰めの前に行われる場合、酒石酸塩の沈殿に対する安定剤としてのマンノプロテインの活性は、ワインの濾過後には低下することが分かっている。したがって瓶詰めされたワイン中での望ましい安定化を達成するには、より高用量のマンノプロテインが加えられることになる。したがってこの問題に対する解決策は、ワインが瓶詰めの前に受ける最後の濾過ステップの後に溶液としてマンノプロテインを加えることである。
【００６０】
したがって第六の態様において本発明は、ワインを濾過するステップと、濾過したワインを瓶詰めするステップとを含み、濾過後にワインにマンノプロテイン溶液を加える、酒石酸の塩の結晶化に対して安定なワインの生産方法を提供する。
【００６１】
濾過後にワインに加えられるマンノプロテイン溶液は、マンノプロテインを水またはワインと混合することによってワインへの添加の直前に形成されてもよく、またはそれはすぐ使えるマンノプロテイン溶液であってもよい。好ましくはマンノプロテイン溶液は、水にきわめて溶けやすく、かつワインに加えられたとき混濁をまったく引き起こさないマンノプロテインを用いて生成される。より好ましくはワインを安定化するためにこの方法において使用されるマンノプロテイン溶液は、本発明の第一の態様による（すぐ使える）溶液である。それはカルボキシメチルセルロース、メタ酒石酸、およびアラビアガムなどの１種または複数種の他のワイン添加剤または安定剤と組み合わせることができる。好ましい実施形態ではマンノプロテイン溶液は、アラビアガムと組み合わされる。
【００６２】
溶液は、酒石酸塩の沈殿に対してワインを安定化するのに適した適正な量で濾過後にワインに加えることができる。ワインへの添加は、瓶詰めする前に溶液をワインと混合することによって行うことができ、あるいは瓶（または容器）をワインで満たす前にそれに直接加えることができる。
【００６３】
本発明はまた、酒石酸の塩の結晶化に対して、かつ／またはタンパク質の曇りの形成に対して安定なワインを生成する方法を包含する。この方法は、ワインを濾過するステップおよび濾過したワインを瓶詰めまたは容器に詰めるステップを含み、ワイン安定剤溶液は濾過後にワインに加えられる。ワイン安定剤溶液は、カルボキシメチルセルロース、メタ酒石酸、およびアラビアガムなどの１種または複数種の安定剤を含むことができる。
【００６４】
本発明の一つの態様の好ましい特徴は、必要に応じて別の態様にも同様に適用可能である。
【００６５】
次に本発明を幾つかの実施例により例示することにするが、これらは限定されるものではない。
【００６６】
［実施例］
［材料および方法］
［分子量のＧＰＣ測定］
ペプチドの分子量は、流速０．５ｍＬ／分と２１４ｎｍにおける検出とを使用し、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０）を移動相として使用してＴＳＫＧｅｌ  Ｇ２０００ＳＷｘｌカラム７．８×３００ｍｍ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊａｐａｎ）によりＧＰＣによって測定した。試料注入量は２５μＬである。カラムは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＵＳＡから得た４種類の標準球状タンパク質、すなわち６７０ｋＤａのチログロブリン、１５８ｋＤａのｙ−グロブリン、４４ｋＤａのオボアルブミン、および１３５０ＤａのビタミンＢ１２で較正した。ｌｏｇ（ＭＷ）対保持時間の直線検量線を当てはめ、この検量線を各画分の平均分子量の測定に用いた。検出は、ＵＶ３０００  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ（ＵＳＡ）を用いて行った。
【００６７】
［濁度の測定］
濁度は、タングステン電球（４００〜６００ｎｍ）を備えたＨＡＣＨ  ２１００  Ｎ濁度計（ＨＡＣＨ−Ｌａｎｇｅ，Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により温度２０℃において測定した。
【００６８】
［総生菌数］
マンノプロテイン溶液の３試料を分析に先立って下記の特定の条件下で貯蔵し、総生菌数（ＴＰＣ）法を用いて、好気性および嫌気性雰囲気中で成長することができる好冷性、中温性、および好熱性微生物のあり得る出現度について分析した。ＴＰＣの測定は、ペトリ皿中に存在する１ｍＬのマンノプロテイン溶液上に約１５ｍＬのＰＣＡ寒天（Ｐｌａｔｅ  Ｃｏｕｎｔ  Ａｇａｒ，Ｏｘｏｉｄ，ＵＫ）を注ぐことによって行った。下記の６条件のうちの１条件の下でＴＰＣインキュベーションを行った。分析は各条件について２回行った。各マンノプロテイン試料について合計で１２枚のペトリ皿を準備し、６枚を好気的にインキュベートし、その他の６枚を嫌気的にインキュベートした。
【００６９】
［好気性および嫌気性好冷菌の測定条件］
試料の貯蔵：８℃で３０日間
分析：ＰＣＡシャーレ上のＴＰＣ
インキュベーション：８℃で７日間の好気性または嫌気性雰囲気
【００７０】
［好気性および嫌気性中温菌の測定条件］
試料の貯蔵：３０℃で１０日間
分析：ＰＣＡシャーレ上のＴＰＣ
インキュベーション：３０℃で３日間の好気性または嫌気性雰囲気
【００７１】
［好気性および嫌気性好熱菌の測定条件］
試料の貯蔵：５５℃で１０日間
分析：ＰＣＡシャーレ上のＴＰＣ
インキュベーション：５５℃で３日間の好気性または嫌気性雰囲気
【００７２】
適正なインキュベーション時間の後、各ペトリ皿を分析して各皿中に形成されたコロニーの量を測定した。各皿中のコロニーの量は、特定の種類の微生物に対する溶液１ミリリットル当たりのコロニー形成単位（Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）（ＣＦＵ）を与える。本願中で規定したマンノプロテイン溶液１ミリリットル当たりのＣＦＵとして測定される生存微生物の総量は、ＣＦＵ／ｍＬ（嫌気性好冷菌）＋ＣＦＵ／ｍＬ（好気性好冷菌）＋ＣＦＵ／ｍＬ（嫌気性中温菌）＋ＣＦＵ／ｍＬ（好気性中温菌）＋ＣＦＵ／ｍＬ（嫌気性好熱菌）＋ＣＦＵ／ｍＬ（好気性好熱菌）によって与えられる。
【００７３】
［プロテアーゼ活性の測定］
Ｎ，Ｎ−ジメチルカゼインに対するプロテアーゼの作用後に放出される遊離アミノ基は、トリニトロベンゼンスルホン酸と反応して、４０５ｎｍで分光光度的に測定することができる黄色を生ずる。アルカリ性プロテアーゼを含有する酵素標準を、キャリブレーション用に使用する。１０〜６０Ｕ／ｍＬの活性度を有する５種類の標準溶液を作製する（１Ｕは、スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロピル−Ｌ−フェニルアラニン−パラ−ニトロアナリン（ｎｉｔｒｏａｎａｌｉｎｅ）（２．１８ｍｇ／ｍＬ）からｐＨ８．５（０．１Ｍ  ＴＲＩＳ）および３７℃において１分当たり７．５９μモルのｐ−ニトロアニリンを放出するために必要な酵素の量として定義される）。Ｎ，Ｎ−ジメチルカゼイン溶液（四ホウ酸二ナトリウム１０ｇ／Ｌを含有し、８．５％リン酸でｐＨ８．５に調整したホウ砂緩衝液中に１．６８ｇ／Ｌ溶解した）２ｍＬを、標準または試料溶液２００μＬと混合し、３７℃で１５分間インキュベートする。続いてトリニトロベンゼンスルホン酸溶液（１２ｍＭ  ＨＣｌに溶かした４ｍＭ）１．２ｍＬを加える。３７℃で５分間のインキュベーション後、４０５ｎｍにおいて吸光度を測定する。検量線を使用することにより未知試料の活性度を計算することができる。この試験のマンノプロテインマトリックス中での定量限界は６００Ｕ／ｍＬである。
【００７４】
［β−グルカナーゼ活性の測定］
β−グルカナーゼによって引き起こされるｐＨ４．７および４５℃のオオムギβ−グルカンＰ−ＢＧＢＭ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，ＵＫ）の溶液の粘度の低下を、Ｇｒａｂｎｅｒ落球式粘度計を用いて測定する。基質を満たした毛管中の鉄球の落下時間が、粘度の尺度である。粘度の低下（落下時間の減少）をその活性度の計算に使用する。β−グルカナーゼ活性を含有する酵素標準を較正に使用する。０．２〜１．２Ｕ／ｍＬ（１単位は、１分につき０．１４７の勾配を生み出す速度で基質の粘度の変化を引き起こす反応混合物１ｍＬ当たりの酵素の量であり、基質はｐＨ４．７および４５℃のオオムギβ−グルカンの溶液である）の活性度を有する５種類の標準液を作製する。連続的に撹拌しながらβ−グルカン１．１ｇを水４０ｍＬに加える。１Ｍ  ＮａＯＨを１ｍＬ加え、その溶液を１５分間撹拌する。続いて溶液を沸騰水浴中で１５分間インキュベートする。次に連続撹拌下でこの混合物を周囲温度において３０分間冷却する。１ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌおよび５０ｍＬの１００％酢酸をこの順に加える。容積を水で１００ｍＬまで満たす。この溶液のｐＨは、４．７０±０．０５であるべきである。４５℃において１ｍＬ試料（０．５ｇ／ＬのＢＳＡ画分Ｖもまた含有する１０ｇ／ＬのＮａＣｌ溶液中に希釈された）をβ−グルカン基質５ｍＬと混合し、３０分間インキュベートする。３０分間のインキュベーション後、Ｇｒａｂｎｅｒ粘度計を用いて粘度を測定する。検量線を使用することによって未知試料の活性度を計算することができる。マンノプロテインマトリクス中でのこの試験の定量限界は２Ｕ／ｍＬである。
【００７５】
［実施例１］
［酵母からのマンノプロテインの生成］
ワイン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のクリーム酵母２Ｌを９５℃で１０分間加熱して酵母自体の酵素を不活性化した。この懸濁液をＰｅｓｃａｌａｓｅ（ＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから市販されているセリンプロテアーゼ）で、ｐＨ６．０、６０℃において６時間処理した。次に酵母ＲＮＡをヌクレオチドに加水分解するために、この混合物をＦｄａｓｅ  ＲＰ−１Ｇ（Ａｍａｎｏ，Ｊａｐａｎから市販されているＦｄａｓｅ調製品）と共にｐＨ５．０、６０℃において１５時間インキュベートした。酵母抽出物を、遠心分離によって不溶性の細胞壁から分離した。遠心分離物を精密濾過により濾過してすべての残留不溶物を除去した。次にその透明な濾液を６２℃に加熱し、ポリエーテルスルホン膜（ＰＥＳＨ、４ｋＤａ、ＮＡＤＩＲ，Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で限外濾過により濃縮した。すべての残留ＲＮＡが加水分解されたことを確かめるためにＦｄａｓｅを加えた。次に濃縮液を、６２℃および洗浄係数（ｗａｓｈｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）６でダイアフィルトレーションによってさらに精製した。濃縮液を２００ｇ／Ｌのマンノプロテイン濃度まで濃縮し、不溶物をＳｅｉｔｚ  ＥＫＳフィルターパッド上で滅菌濾過によって除去した。その溶液を１３０℃で７秒間ＵＨＴ処理した。溶液のｐＨは５．３であった。このマンノプロテイン溶液はプロテアーゼ活性およびβ−グルカナーゼ活性がなかった。このマンノプロテイン溶液を無菌状態で容器に詰めた。溶液の濁度を比濁分析により測定したところ２７．３ＮＴＵであった。このマンノプロテイン溶液を、生存微生物の存在に関して材料および方法の中で示した総生菌数を用いて試験した。微生物のコロニーはこの試験条件下では全く検出されず、したがってこのマンノプロテイン溶液のＣＦＵ／ｍＬは０であった。
【００７６】
［実施例２］
この実施例は、マンノプロテイン試料中のプロテアーゼ活性を無効化するために使用されるＵＨＴ処理を省略した場合に何が起こるかを明らかにする。
【００７７】
［材料および方法］
１２．５％ｗ／ｖのマンノプロテイン無菌溶液を４０℃、すなわちプロテアーゼ活性にとって一般的な温度で１１ヵ月間保存した。この試料の凍結乾燥版を室温で同じ期間保存した。
【００７８】
この液状生成物をまず凍結乾燥し、次に両生成物の原液を１０ｍｇ／ｍＬに調製した。これらの少量を２種類のワイン、すなわち２００６年産ロゼおよび２００５年産シャルドネに加えて５０、１００、１５０、２００、および２５０ｍｇ／Ｌの最終濃度を得た。試料を−４℃で貯蔵し、結晶の形成を通常どおり視覚的に観察した。表１は、ＫＨＴ結晶の出現を検出するのに必要な時間（日）を示す。
【００７９】
【表１】
2010524446.tif 000002
【００８０】
これらの結果は、マンノプロテイン試料を４０℃で貯蔵した場合、結晶がより早期に現れる、換言すればマンノプロテインを４０℃、すなわちプロテアーゼ活性にとって一般的な温度で貯蔵した場合、マンノプロテインの活性は著しく低下することを示している。
【００８１】
［実施例３］
この試料は、マンノプロテインの性能に及ぼす酵素活性の影響を実証する。
【００８２】
実施例１で得られた、プロテアーゼおよびβ−グルカナーゼ活性のないマンノプロテイン液（２０％ｄ．ｍ．）２０ｍＬにＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）（バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のプロテアーゼを含有する、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液１００μＬを加えた。この溶液をｐＨ５．３および４０℃で４８時間インキュベートした。同様にＧｌｕｃａｎｅｘ（登録商標）（β−グルカナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、およびトリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）由来のキチナーゼの活性を含有する、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１２．５ｍｇを各マンノプロテイン２０ｍＬに加え、同一条件下でインキュベーションを行った。実施例１で得られた、酵素活性のないマンノプロテイン溶液を４０℃でインキュベートし、その溶液を４℃で貯蔵した。これらマンノプロテイン溶液をＫＨＴが過飽和（飽和状態を２６％超えた酒石酸濃度）の白ワイン中で試験した。１０ｍｇ／ｍＬのそれら希釈液を調製し、アリコートをワインに加えて５０、７５、および１００ｍｇ／Ｌのマンノプロテインを得た。毎日、結晶の形成を視覚的に観察した。表２は、ＫＨＴ結晶の出現を検出するのに必要な時間（日）を示す。
【００８３】
【表２】
2010524446.tif 000003
【００８４】
表２は、プロテアーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標））の作用によって、およびβ−グルカナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、およびキチナーゼの活性によって、あるいはこれらの活性のいずれかの２種類以上の組合せによってマンノプロテインの活性が著しく低下することを示している。
【００８５】
試料Ａ〜Ｄのゲル透過クロマトグラフィーを、材料および方法の項で述べたように記録した。表３は、ペプチドピークのトップのＭＷを示す。
【００８６】
【表３】
2010524446.tif 000004
【００８７】
表３は、マンノプロテイン試料の分子量に及ぼす酵素活性の影響をはっきり示している。
【００８８】
［実施例４］
［亜硫酸塩による色の除去］
１００ｍｇ／ｍＬのメタ重亜硫酸カリウムＫ２Ｓ２Ｏ５原液を調製した。亜硫酸塩溶液の次第に増す量を実施例１で得られたマンノプロテイン溶液５ｍＬに加えてＫ２Ｓ２Ｏ５の０．５ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌまでの最終濃度を得た。最初の色の減少は１５分後に観察された。色は時間が経つとさらに減少した。室温で２４日後、試料を６０倍に希釈した後に、溶液の色をＵＶ／ＶＩＳを用いて測定した。４５０ｎｍにおける吸光度を監視した。４５０ｎｍにおける高い吸光度は、帯黄色／茶色を引き起こす。結果を表４に示す。
【００８９】
【表４】
2010524446.tif 000005
【００９０】
表４は、溶液の吸光度、したがって溶液の色が亜硫酸塩の添加によって著しく減少することを示している。
【００９１】
［実施例５］
［熱処理後の酵素活性の低下］
タンパク質分解活性の低下（Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を下記の実験で検討した。マンノプロテイン溶液１ｍＬに３００，０００単位のＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）を加えた。１０分間の煮沸の前および後に活性度を測定した。結果を表５に示す。
【００９２】
プロテアーゼおよびβ−グルカナーゼの活性度を求めるために使用した方法の詳細は、材料および方法の項に示す。
【００９３】
【表５】
2010524446.tif 000006
【００９４】
この熱処理は、タンパク質分解活性を検出限界以下、すなわち元の活性の＜０．２％まで低下させることが表５から分かる。
【００９５】
同じ実験をＧｌｕｃａｎｅｘ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に関して行った。表６を参照されたい。
【００９６】
【表６】
2010524446.tif 000007
【００９７】
この熱処理は、β−グルカナーゼの活性を検出限界以下、すなわち元の活性の＜０．２％まで低下させることが表６から分かる。
【００９８】
［実施例６］
本発明の方法に従って調製された液状マンノプロテイン試料（ＬＭＰ）の濁度を、下記の方法を用いてｐＨおよび濃度に応じて求めた。すなわち：
マンノプロテインの溶液を、実施例１で調製した粉末から５０、１００、２００、３００、および４００ｇ／Ｌの濃度に調製した。４００ｇ／Ｌの場合、完全可溶化を達成するために加熱を利用した。濁度は、タングステン電球（４００〜６００ｎｍ）を備えたＨＡＣＨ  ２１００  Ｎ濁度計（Ｈａｃｈ−Ｌａｎｇｅ）で温度２０℃において測定した。試料のｐＨは、ＨＣｌまたはＮａＯＨ溶液によりｐＨ４．０、５．０、５．５、６．０、７．０、および８．０に調整した。
【００９９】
市販のマンノプロテイン試料、すなわちＭａｎｎｏｓｔａｂ（Ｌａｆｆｏｒｔ）を溶解して２００ｇ／Ｌの濃度にし、この濁度もまたｐＨ４．０、５．０、５．５、６．０、７．０、および８．０で測定した。
【０１００】
【表７】
2010524446.tif 000008
【０１０１】
本発明による液状マンノプロテイン調製物の濁度は、試験されたすべての条件においてかなり低いことが表７から分かる。その濁度は、市販試料の濁度の８％以下である。これは、ｐＨ４などの低ｐＨならびに濃度４００ｇ／Ｌなどの濃縮試料における場合である。
【０１０２】
［実施例７］
この実施例は、本発明によるマンノプロテイン試料を原ワインの濾過後に加える効果を実証する。
【０１０３】
ソーヴィニョン・ブランおよびシャルドネをベントナイトによって澄ませ、濾過して原ワインを得た。原ワインを３種類の異なる方法で処理した。すなわち
１．原ワインを孔径０．４５μｍカートリッジ濾過により濾過した。マンノプロテインは何も加えなかった。
２．原ワインをまず孔径０．４５μｍカートリッジ濾過により濾過した。次にマンノプロテインを最終濃度２０ｇ／ｈＬで加えた。
３．マンノプロテインをまず原ワインに最終濃度２０ｇ／ｈＬで加えた。次にこのワインを孔径０．４５μｍカートリッジ濾過により濾過した。
【０１０４】
表８は、これらワインの濁度を示す。
【０１０５】
【表８】
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【０１０６】
これらの結果は、マンノプロテインの添加が結晶の形成を遅らせること、および好都合なことにその濁度に大きな影響を及ぼすことなく本発明によるマンノプロテイン溶液を原ワインの濾過前または後に加えることができることを示している。
【国際調査報告】
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