(57)【要約】  本発明は、軸流クロマトグラフィーカラム、かかるカラムを用いて液体中の１種以上の被分析物を分離する方法、及びかかるカラムを使用するシステムに関する。このカラムは第１のポートと第２のポートを含んでおり、この第１のポートと第２のポートはクロマトグラフィーカラムにおいてベッドスペースのレベルの上方で本質的に同じレベル又は高さにある。【選択図】    図３
2010513848.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
側壁を含むハウジングと、
上記側壁で隔てられ、軸方向に間隔をおいて対向する第１及び第２のエンドユニット、
第１のエンドユニットに隣接する第１のフィルター及び第２のエンドユニットに隣接する第２のフィルターであって、上記側壁と共に粒状媒体のベッドを収容するための囲繞ベッドスペースを画成する第１及び第２のフィルターと
を備える軸流クロマトグラフィーカラムであって、
第１のエンドユニットが、上記ベッドスペースへの液体の添加又は上記ベッドスペースからの液体の除去のため、上記囲繞ベッドスペースと流体連通した第１のポートを含んでおり、
第２のエンドユニットが、上記ベッドスペースへの液体の添加又は上記ベッドスペースからの液体の除去のため、上記囲繞ベッドスペースと流体連通した第２のポートを含んでおり、
第１のポートと第２のポートとが、当該クロマトグラフィーカラムにおいて上記ベッドスペースのレベルの上方で本質的に同じレベル又は高さにあることを特徴とするクロマトグラフィーカラム。
【請求項２】
第２のポートが、第２のユニット内の通路に接続した中空部材によってベッドスペースと流体連通している、請求項１記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項３】
前記中空部材がカラムの一体部分である、請求項２記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項４】
前記通路が、ベッドスペースから第２のエンドユニットの側方壁を通して延在している、請求項２又は請求項３に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項５】
第１のエンドユニットがさらに、囲繞ベッドスペースと流体連通したバルブ手段を含んでおり、該バルブ手段が、第１のフィルターを通して延在していてその内部に通路を有する長手方向部材を含んでおり、該バルブが作動可能に開閉可能であって、上記通路を介して粒状媒体を前記ベッドスペースに充填することができる、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項６】
前記バルブ手段の前記長手方向部材がノズルを含んでいる、請求項５記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項７】
前記ノズルがベッドスペース内に固定されているか又はベッドスペース内の所定の位置に収納できる、請求項６記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項８】
前記バルブ手段がベッドスペースから粒状媒体を除いて空にすることができない、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項９】
前記カラムが粒状媒体で予め充填されている、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項１０】
前記カラムが使い捨て式カラムである、請求項８又は請求項９記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項１１】
液体中の１種以上の被分析物を互いに分離する方法であって、上記１種以上の被分析物を含有する液体を、粒状媒体のベッドを収容した請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の軸流クロマトグラフィーカラムに流し、１種以上の被分析物を移動相で溶出し、カラムから溶出する移動相の画分を回収することを含んでなる、方法。
【請求項１２】
液体中の１種以上の被分析物を互いに分離するためのシステムであって、
上記液体と流体連通した入口又は入口マニフォルド、
ポンプ、
請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載のクロマトグラフィーカラム、及び
出口又は出口マニフォルド
を備えるシステム。
【請求項１３】
さらに、カラムベッドスペースへの液体の添加又はカラムベッドスペースからの液体の除去ができるように作動可能に開閉可能なバルブを備える、請求項１２記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軸流クロマトグラフィーカラム、及びかかるクロマトグラフィーカラムを用いて液体中に存在する１種以上の被分析物を互いに分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーは、化学的及び生物学的物質を分離するための確立された価値のある技術であって、研究及び産業において広く使用されており、化合物の調製、精製及び分析の面で多くの用途がある。多くの異なる形態のクロマトグラフィーがあり、液体クロマトグラフィーはタンパク質、ペプチド及び核酸の調製、精製及び分析に関して製薬及び生物産業で特に重要である。
【０００３】
典型的な液体クロマトグラフィー装置は直立のハウジングを有しており、この中では通常本質的に粒状であり多孔性の媒体からなる充填材料のベッド（床）が透過性の保持層により支持されている。液体移動相が入口、例えばカラムの頂部で、通常多孔性の有孔フィルター、メッシュ又はフリットを通って入り、充填材料のベッドを貫通して移動し、出口を介して、通例第２のフィルター、メッシュ又はフリットを通って排出される。
【０００４】
液体クロマトグラフィーに使用されるカラムは通例多孔性のクロマトグラフィー用媒体を内包する管状の本体を含んでおり、この媒体を通って担体の液体又は移動相が流れ、多孔性媒体の移動相と固体相との間で物質又は被分析物の分離が行われる。通例多孔性媒体は、通常カラムの一端に位置する中央ボア又はノズルからカラム中にポンプで送出、注入又は吸引されるスラリーといわれる離散した粒子の懸濁物を固めることによって一般に形成される充填ベッドとしてカラムに内包される。安定で一様なベッドの生成は最終的な分離プロセスに対して決定的な意味をもち、最適な結果はカラム端部を介して中央に位置付けられたボアを使用して得られる。かかる安定で一様なベッドを作成するためのシステムは当技術分野で公知であり、例えば、エンドユニットを用いることによってベッドを圧縮することが挙げられる。
【０００５】
カラムの充填後、かつ使用前に、通常ポンプ、検出器並びに入口及び出口マニフォルドを含むクロマトグラフィーシステムに接続することによってカラムを設置する必要がある。カラムを設置する際、カラムから液体が漏れるのを回避するのと同様にカラム及び充填ベッド中への空気の導入を回避することが不可欠である。また、このカラムを使用するシステムからカラムの上流の空気をパージして除去することが必要になることがある。通例、従来技術のカラム及びシステムは、カラムの一端に、通常はその基部にバルブ（「ベント」又は「パージ」バルブ）を用いてカラムの設置及び／又はパージ又は通気を達成する。
【０００６】
実施の際、このバルブはカラムと一緒に使用される。これは、バルブの上流でカラムをシステムに接続したり接続を外したりすることを意味する。使い捨て式カラムの場合、かかる追加のバルブの導入には費用がかかる。その位置のために、カラムから液体を吸い上げるリスクと、さらなる空気がカラム中に導入される可能性とが両方とも増大する。さらに、バルブの位置は、研究室内のカラムの設置位置に制約を課し、またカラムの頂部と底部の両方へのアクセスが必要になるのでユーザーのアクセス可能性の点で問題を起こす可能性がある。
【０００７】
特開昭６３−２９３４６５号公報（積水化学工業（株））には、固定相と共に製造されており、基部に排出口を、そして頂部に通気装置を備えているカラムを支持するカラムホルダーが記載されている。このカラムホルダーは、重力又は遠心力がかかると、固定相での物質のクロマトグラフ分離を促進するために、カラム内の固定相中に空気が流入することを許すことなく、固定相の上に残存する余剰の流体を除去することができるように設計されている。排出口は導管に接続されていて、この導管は、固定相溶液の上端と同じ又はそれより高いレベルにある位置で枝分かれして、３つの開放端を有している。その第１は排出口との接続点にあり、第２のものは溶液の表面レベルより上の位置にあり、そして第３のものは排出口のレベルより下に位置している。この導管は、余剰の流体が第３の開放端を介してカラムから除去され、そこで受容器に回収されることができるように構成されている。
【０００８】
クロマトグラフィーの分野における長年にわたる高いレベルの活躍にもかかわらず、ベントバルブ又は複雑なカラムホルダーの必要性を排除し、かつ空気がカラムに入ったり、及び／又はカラムから液体を吸い上げたりするリスクを低減する簡単な軸方向カラムに対するニーズが未だにある。今までのところ、このニーズを満たし、及び／又はユーザーのアクセス可能性を改良する軸流クロマトグラフィーカラムは得られていない。
【０００９】
定義
「被分析物」とは、天然若しくは合成起源の物質、化合物若しくは化学物質、又はこれらの反応生成物若しくは誘導体若しくは代謝物と定義される。疑念を避けるために、この用語には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸及び核酸のような生物学的分子、並びに薬剤及び／又はプロドラッグのような合成分子が含まれるものとする。
【００１０】
「分配チャンネル」とは、クロマトグラフィー媒体の充填ベッドのためのエンクロージャー又はベッドスペースに横断ゾーンから流体が導入するときに通過する構造体をいう。
【００１１】
使い捨て式カラムは、他の非使い捨て式カラムでは必要とされる設置及び適格化作業を低減するためのクロマトグラフィー媒体の前処理によって特徴付けられる。最低限、この前処理には多孔性媒体のベッドの形成が含まれる。追加の前処理は汚染微生物の低減、滅菌、発熱性物質の除去などであり得る。
【００１２】
使い捨て式カラムは単一回使用型カラムとして使用することができ、すなわち、繰返し使用の前に充填ベッドの適格化（例えば、試験、有効性の検査、など）を要求する洗浄管理規則をユーザーが実行しないことを意味する。
【００１３】
使い捨て式カラムの１つの実施形態は、クロマトグラフィー媒体が予め充填されて提供される完成したカラムである。
【００１４】
使い捨て式カラムのもう一つ別の実施形態は、充填ベッドの寸法安定性を提供するために作動中充填ベッドの１以上の外側面にかかる圧力及び荷重に耐えるように設計されたフレーム又は容器に相当する第１の装置と、多孔性媒体又はベッドを収容しており作動のために第１の装置に取り付けられた容器、殻、カートリッジ、袋などに相当する第２の装置とからなる。後者の実施形態の場合、多孔性媒体は第２の容器内に収容されていて取り替えることができ、一方フレームは再使用可能である。この場合、作動のために必要になる多孔性媒体の圧縮の程度は収容されている媒体をフレーム内に挿入した後に調節することができる（例えば、Ａｌｌｅｎ及びＤａｗｓｏｎの米国特許出願公開第２００２／０１６６８１６号、並びにＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社の国際公開第２００５／００９５８５号参照）。
【００１５】
「レベル」とは、水平面又は指定された高さと定義される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開昭６３−２９３４６５号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／０１６６８１６号明細書
【特許文献３】国際公開第２００５／００９５８５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、従来技術のシステムの欠点を克服するクロマトグラフィーカラムを提供することである。これは、請求項１に記載のクロマトグラフィーカラムによって達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
かかるクロマトグラフィーカラムで得られる１つの利点は、カラムからの吸い上げのリスクが低減されることである。
【００１９】
本発明のもう一つ別の利点は、隣接するパージバルブを必要とする現存のカラムと比較して製造が容易で安価なことである。これは殊に、このカラムを使い捨て式カラムとして使用するときに重要である。
【００２０】
このクロマトグラフィーカラムのさらなる利点は、移動相のような液体のための入口と出口を提供する第１のポートと第２のポートの両方がカラムの一端においてベッドスペースのレベルの上で本質的に同じレベル又は高さにあり、従って改良されたユーザーのアクセス可能性を提供するので、慣用のカラムより使用し易いことである。
【００２１】
相互に接続した要素が少ないことの設計の簡単さは、（使い捨て式）パージバルブに必要とされる動的シールの厳密さ及び可動又は回転部品の必要性が低減し、従って衛生上の問題に起因する漏洩又は汚染の可能性が低下するという意味で有利である。これらの特徴は、カラムの調製（生産）中の汚染微生物の低減、並びにこのような条件をカラムの貯蔵及び輸送中に維持するために、使い捨て式カラムにとって殊に重要である。
【００２２】
なおさらなる利点は、カラムのサイズを増大又は減少させたときに予測可能な性能が得られるという点でクロマトグラフィーカラムが拡大縮小可能であることである。
【００２３】
本発明の第１の態様によると、
側壁を含むハウジング、
前記側壁で隔てられ、軸方向に間隔をおいて対向する第１及び第２のエンドユニットと、
第１のエンドユニットに隣接する第１のフィルター及び第２のエンドユニットに隣接する第２のフィルターとを含んでなり、これらのフィルターは前記側壁と共に、粒状媒体のベッドを収容するための囲繞ベッドスペースを画成しており、
第１のエンドユニットは、前記囲繞ベッドスペースに液体を添加し、又はそこから液体を除去するための、前記ベッドスペースと流体連通した第１のポートを含んでおり、
第２のエンドユニットは、前記囲繞ベッドスペースに液体を添加し、又はそこから液体を除去するための、前記ベッドスペースと流体連通した第２のポートを含んでおり、
第１のポートと第２のポートが、クロマトグラフィーカラムにおいて前記ベッドスペースのレベルの上方で本質的に同じレベル又は高さにある
ことを特徴とする軸流クロマトグラフィーカラムが提供される。
【００２４】
第２の態様においては、１種以上の被分析物を含有する液体を、粒状媒体のベッドを収容している上記軸流クロマトグラフィーカラムにかけ（適用し）、その１種以上の被分析物を移動相で溶出し、カラムから溶出する移動相の画分を回収することを含んでなる、液体中の１種以上の被分析物を互いに分離する方法が提供される。
【００２５】
本発明の第３の態様においては、液体中の１種以上の被分析物を互いに分離するためのシステムが提供され、このシステムは、
前記液体と流体連通した入口又は入口マニフォルドと、
ポンプと、
上記クロマトグラフィーカラムと、
出口又は出口マニフォルドと
を含んでなる。
【００２６】
本発明の様々な実施形態は従属請求項に定義されている。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、従来技術のクロマトグラフィーカラムの基本的な特徴を示す概略横断面図である。
【図２】図２ａ、ｂ及びｃは、従来技術のカラム（図２ａ及び２ｂ）及び本発明によるカラム（図２ｃ）を図解する簡略化した説明図である。
【図３】図３は、本発明によるカラムの横断面である。
【図４】図４は、本発明に従うクロマトグラフィーカラムの三次元概略図である。
【図５】図５ａは、従来技術で公知のカラムを使用するシステムの説明図であり、図５ｂは、本発明によるカラムを使用するシステムの説明図である。
【図６】図６は、上昇流（点線）及び下降流（実線）モードの本発明に従うクロマトグラフィーカラムにおけるアセトンのクロマトグラフ分離を示すクロマトグラムである。
【図７】図７は、溶出ピークから低減したプレート高さと非対称係数を計算する方法を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
図１は、従来技術（例えば、米国特許第６５２４４８４号参照）で公知のクロマトグラフィーカラム１の一般的な構成部品を概略的に示す。このカラムは、半透明であってもよい、例えばステンレス鋼又は高強度／強化ポリマー性材料の円筒状の流体不透過性側壁１１を有している。側壁１１の開放された頂部及び底部の端部は頂部及び底部のエンドアセンブリ又はユニット１２、１３によって閉鎖されている。各エンドユニットは、密封嵌合して円筒状の壁１１の開口を塞いでいる、好ましくはステンレス鋼又は高強度エンジニアリングプラスチック材料、例えばポリプロピレン製の流体不透過性のエンドプレート３を有している。これらのエンドプレートは、その外面に抗して位置し保持フランジ２２として側壁を越えて半径方向に突出する金属製保持プレート２によって支持されており、このフランジを通って調整可能なテンションロッド１４が固定されている。これらのロッドは、頂部及び底部のエンドアセンブリ１２、１３を連結しており、高い流体圧力に耐えるのを補助している。
【００２９】
各エンドプレート３は、カラムの外部と、側壁１１とエンドアセンブリ１２、１３により画成された充填ベッドスペース９との連通のための中央貫通開口３１を有している。この開口３１を介するアクセスは接続マニフォルド８を介して外部に接続された別々の導管に細分されている。
【００３０】
通例ろ過された又は製織プラスチック又は鋼からなるフィルター層４が、エンドプレート３の内面でベッドスペース９の領域を横切って延びている。エンドプレート３の内面３５は、フィルター層４の後ろで、例えば図示されているように、好ましくはフィルター層４を後ろから支持する支持リブ（図示してない）を使用することによって、円錐状に凹んでいて、それらの間に分配チャンネル３４を画成している。連通導管の１つ、すなわち移動相導管３３は、内側ではこの分配チャンネル３４に、外側ではマニフォルド８の移動相コネクター８１に開放している。
【００３１】
アクセスバルブ装置５が、マニフォルド８からエンドプレート開口３１を通って内側に、またフィルター層４の中央オリフィス４１を通って密封して突出している。アクセスバルブ５は、１以上の導管の、マニフォルド８からベッドスペース９への直接の、すなわちフィルター層４を迂回する連通を支配している。図には、バルブ５により支配され、マニフォルド８のコネクター８２を介して外部に接続された第１及び第２のバルブ付き導管５１、６１が示されている。
【００３２】
カラムの典型的な作動において、頂部及び底部フィルター層４間のベッドスペース９に粒状固定相物質の充填ベッドを充填する。バルブ装置５を閉じ、移動相を移動相コネクター８１（矢印「Ａ」）を介して供給し、導管３３を介して分配チャンネル３４中に通してフィルター層４を通過させ、充填ベッドを通って流下させて、その成分又は被分析物の分離を行う。液体溶出液は底部エンドアセンブリ１３のフィルター層４を通って通過し、その移動相コネクター８１（矢印「Ｂ」）から流出して適宜回収される。これはカラムを通る移動相の下方移動によりクロマトグラフ分離を行うという「下降流」クロマトグラフィーの一例であるが、当業者には了解されるように、代案として、単に、移動相をカラムを通して上方へポンプで送り、すなわち流れの方向を逆転させることによって、「上昇流」クロマトグラフィーで分離を達成してもよい。このモードにおいて、移動相はコネクター８１（矢印「Ｂ」）でカラムに入り、固定相又は粒状媒体を通って上方へ移動し、カラムの頂部のコネクター８１（矢印「Ａ」）から回収される。
【００３３】
カラムを設置する際、カラムから液体が枯渇する(drain)のを回避すると共に、カラム及び充填ベッド中に空気が導入されるのを回避することが不可欠である。また、このカラムを使用するシステムからカラムの上流の空気をパージして除くことが必要であり得る。これは、カラムの底部に位置するベントバルブ５を用いて達成される。
【００３４】
図１及び以上の説明は、構成部品と典型的な作動モードとの一般的な関係を例証するためのものである。当業者には了解されるように、また以下の説明から明らかになるように、異なる種類のプロセスではその他の特定の構成及び作動モードが適当であることがあろう。
【００３５】
図２ａ及びｂは、従来技術のカラムの構成の簡略化した概略説明図である。カラム１０１は移動相の導入又は回収のための第１のポート１３３及び第２のポート１４０を有している。カラムの設置後、使用前に、通気／パージによってカラムから空気を除去する必要がある。これは、カラム１０１の一体部分である（図２ｂに示す）か又は第２のポート１４０の上方のある点でカラムに接続されている（図２ａには示してない）ベント出口を有するベントバルブ１０５によって達成することができる。
【００３６】
図２ｃは、本発明によるカラム１０１の構成の簡略化した概略説明図である。移動相の導入又は回収用の第１のポート１３３はカラム１０１の頂部に位置している（従来技術のカラムと同じ）。カラムの底部と流体連通した第２のポート１４０は、第１のポート１３３と本質的に同じレベル又は高さにある。これは、カラム１０１の底部と第２のポート１４０との間を空気又は移動相のような流体が流れるのを可能にする中空部材１６０によって達成される。この構成により、ベントバルブの必要がなくなり、またカラムからの吸い上げ及びカラム中への空気の導入の両方のリスクが低減する。
【００３７】
図３に、本発明によるカラムの横断面図を示す。このカラム２０１は管状のハウジング２１１、第１のエンドユニット２１２（部分的に示す）及び第２のエンドユニット２１３を含んでおり、これらが共にヘッド２１６を有するテンションロッド２１４によって固定されて流体漏れしないシールを形成している。第１のフィルター２０４と第２のフィルター２０６はそれぞれ第１のエンドユニット２１２と第２のエンドユニット２１３に隣接している。これらのフィルター２０４、２０６は側壁２１１と一緒になって、粒状媒体のベッドを収容するためのベッドスペース２０９を画成している。
【００３８】
ハウジング２１１とエンドユニット２１２、２１３は通例ステンレス鋼又はポリプロピレンのような高強度プラスチック材料からなっている。カラムを生物学的に活性な物質の分離に使用とする好ましい実施形態において、前記材料は米国薬局方（ＵＳＰ）＜８８＞クラスVIに合致してヒトにおける免疫応答を引き出すことがないように生物学的に不活性である。ヘッド２１６を有するテンションロッド２１４はエンドユニット２１２、２１３をハウジング２１１に固定して、高い作動圧力に耐えることができる流体漏れしないベッドスペース２０９を形成している。
【００３９】
バルブ手段２２０と第１のポート２３３が図に示されている。第２のポート２４０は、第２のエンドユニット２１３を通ってベッドスペース２０９まで延びており、これと（中空部材２６０を介して）流体連通している通路２４２を含んでおり、これを介して液体を添加したり回収したりすることができる。図から明らかなように、第２のポート２４０は第１のポート２３３と本質的に同じレベル又は高さであり、従ってカラムへの／カラムからの移動相の添加と回収が容易になる。この配置はさらに、カラムの設置を補助し、吸い上げのリスクを低減し、かつカラム中への空気の導入の可能性を低減するという利点を有する。
【００４０】
カラムはバルブ手段２２０を介してスラリーの形態の粒状媒体を充填することができ、このバルブ手段２２０は中央ボア２２１とノズル２２４を含んでいる。充填された粒状媒体のベッドは、当技術分野で周知の慣用の手段によって、例えばエンドユニットの一方の移動によりベッドを圧縮することによって得られる。図３でノズル２２４はその引っ込んだ位置に示されているが、ベッドスペース２０９内の所定の位置に移動させてカラムの充填を促進することができることが理解される。ベッドスペース内のスラリーの分配と一様な充填を促進する広範囲のノズルを使用することができる。充填バルブ及びノズルでそれぞれ開放／閉鎖機能を達成するための別の１つの手段は、ノズルを、ベッドスペース内に固定し（従って引き込み可能ではない）、ノズルの内側又は外側にありその位置に応じてノズルを開放及び／又は閉鎖する可動の要素又はスリーブに隣接して配置することである。フィルター２０４、２０６は、各々がエンドユニット２１２、２１３の内面上に位置付けられており、（側壁２１１と一緒になって）ベッドスペースを画成すると共にベッドスペース２０９からの粒状媒体の漏洩を防止するように作用する。
【００４１】
カラムで分離される１種以上の被分析物又は物質を含有する移動相又は液体を、第１のポート２３３を介して添加する。次にこの液体を、フィルター２０４を通して、粒状媒体（図示してない）が充填されたベッドスペース２０９中に通過させる。このようにして粒状媒体上に導入された被分析物のクロマトグラフ分離は、移動相の導入及びその移動相による溶出によって行われる。この移動相は最終的に第２のフィルター２０６を通り通路２４２を介して第２のポート２４０に流れてカラムを出る。こうして得られた異なる被分析物を含有する移動相の画分はその後回収することができる。
【００４２】
当業者には理解されるように、このカラムは、上記のように「下降流」モードで作動させてもよいし、又は移動相がカラムを上昇するように移動相の流れの方向を逆転させた「上昇流」モードで作動させてもよい。上昇流モードにおいて、移動相は第２のポート２４０を介してカラムに入り、通路２４２に沿って、またベッドスペース２０９内の粒状媒体のベッドを通って上方へ移動し、カラムから出て第１のポート２３３で回収される。
【００４３】
図示の実施形態において、中空部材２６０はカラムの一体部分である。しかし、適切な材料（例えばポリプロピレン、ポリウレタン、など）で作成されたコネクター及び適当な配管を用いることによって中空部材２６０がカラムと一体になっている必要はないことが理解される。
【００４４】
単一のエンドユニットの同じ高さで移動相を導入し回収することによって、オペレーターのアクセスと取扱いの点で使用が簡単になり、空気がシステム内に侵入するリスクが低減し、かつカラムを設置するのに必要なスペースが低減する。
【００４５】
図３に示した実施形態は粒状媒体のカラムへの導入及び／又はカラムからの除去のためのバルブ手段（２２０）を含んでいる。カラムによっては（例えば、予め充填された、使い捨て式カラムのように）、エンドユーザーが粒状媒体の添加若しくは除去を行う必要がなかったり、又はかかるバルブ手段を使用する必要がない異なる技術で調製される（充填される）ので、かかるバルブは本発明の必須の特徴ではないことが理解される。
【００４６】
図４に、図３のカラムの三次元概略説明図を示す。この図から、カラムの外的特徴が明らかである。このカラムは第１のエンドユニット３１２、第２のエンドユニット３１３及びハウジング３１１を含んでおり、これらは共にテンションロッド３１４及びヘッド３１６によって固定されて流体漏れしないシールを形成している。スラリーの形態の粒状媒体はバルブ手段３２０を介してベッドスペース（図示してない）内に導入することができる。第１のポート３３３は粒状媒体上で分離される被分析物を含有する移動相又は液体のための導管として機能する。カラムの基部で出口（図示してない）を介してベッドスペースと流体連通した中空部材３６０は第２のポート３４０まで延びており、この第２のポートを介して、カラムから溶出した移動相の適当な画分を回収することができる。図から分かるように、第２のポート３４０は第１のポート３３３（これを介して移動相を導入する（又は回収する）ことができる）と本質的に同じレベル又は高さにある。この配置により、ユーザーの操作と試料の取扱いが容易になる。図４に示した実施形態において、カラムの容積はおよそ１０リットルであるが、通例０．１〜２０００リットルの範囲の広範囲のカラム容積が可能であることが理解される。カラムを使い捨て式カラムとして使用するときの好ましい容積は０．５〜５０リットルの範囲である。
【００４７】
図５ａ及び５ｂは、一体化されたベントバルブを有する従来技術のカラムを組み込んだシステム（図５ａ）を、本発明によるカラムを使用するシステム（図５ｂ）と比較して概略的に示す。図５ａに示したベントバルブは回転バルブ型であるが、他のバルブ原理（ピンチバルブ、膜バルブ、など）を使用してベントバルブ機能を達成してもよいことが理解される。
【００４８】
従来技術のシステム（図５ａ）の設置後、システムをプライミング処理することにより空気除去しなければならない。このシステムは入口マニフォルド４０８、ポンプ４７０、センサー４７２〜４７６、カラムバルブ４０７、出口マニフォルド４０９及びカラム４０１を含んでいる（図中のカラム４０１とベント／パージバルブ４０５を取り囲む点線の四角形は、カラムとベントバルブが一体ユニットとして使用されていて、カラムをクロマトグラフィーシステム内に設置するとき、充填されプライミング処理されたカラムにベントバルブが取り付けられていることを示している）。上記したように、ベントバルブの目的は、カラムをシステムに設置するとき、又はカラムをシステムから除去する／接続を外すときに、枯渇(drain)及び／又は空気の導入からカラムを保護することである。カラムバルブ４０７はカラム４０１と入口４０８及び／又は出口４０９マニフォルドとの接続を制御し、従ってカラム４０１が「オフライン」であるか「オンライン」であるかを支配する。図５ａ及び５ｂにおいて、カラムバルブは回転バルブ型であるが、他のバルブ原理（例えばピンチバルブ、膜バルブ、など）を使用してカラムバルブ機能を達成してもよいことが了解される。カラム４０１及び入口４０８／出口４０９マニフォルドとの流体接続性は、図中位置１〜４で示されるようにバルブ４０７内の幾つかのゲートウェイによって制御される。バルブ４０７が位置３と４及び位置１と２を接続するとき、カラムは迂回される。回転式バルブを９０度回転すると、位置３と１及び位置４と２が接続され、これはカラムがインライン又はオンラインであり上昇流モード／流れ方向で接続されていることを意味する。上で説明したように、他のバルブ原理（例えばピンチバルブ、膜バルブ、など）及び広範囲の他のバルブ構成（上昇流及び／又は下降流モード並びに複数のカラムの接続）を使用してカラムバルブ機能を達成してもよい。
【００４９】
システムのプライミング処理、特に導管４８０のプライミング処理、及びシステム内のあらゆる空気のパージを可能にするベント／パージバルブ４０５を用いてシステムから空気を除去する。
【００５０】
図５ａに示したシステムは上昇流モードで使用することを意図したものである。すなわち、液体は入口マニフォルド４０８から導管４８０を介して第２のポート４４０でカラム４０１に入り、充填ベッド（図示してない）を通って上方へ移動し、第１のポート４２０から出ていく。液体（例えば、カラムで分離される被分析物を含有する移動相試料）は入口マニフォルド４０８から入り、ポンプ４７０によって圧力下でカラムバルブ４０７を介してカラム４０１に移送される。センサー４７２〜４７６を使用してシステム内の環境、物理的及び化学的条件（例えば、圧力、流れ、伝導率、温度、ｐＨ、ＵＶ吸光度、空気など）を測定することができる。これらのセンサーを用いて、例えばカラムを通る移動相の流速を調節することによってカラムの作動を制御することができる。第１のポート４２０でカラムから出現する液体はカラムバルブ４０７を介して出口マニフォルド４０９に移送されて回収される。
【００５１】
図５ｂに、本発明によるカラムを使用するシステムを例示する。構成部品は、ベント／パージバルブ４０５がないことを除くと、図５ａについて上記したのと同じである。この構成において、カラム内のベッドスペース（図示してない）のレベルの上方にある第１のポート４２０と第２のポート４４０のレベル又は高さは本質的に同じであり、第２のポート４４０は中空部材４６０によってカラム４０１の基部に接続されている。この中空部材４６０は本発明によるカラムの一部であるが、従来技術の構成を示す図５ａの対応する液体導管４８０はクロマトグラフィーシステムの一部である。中空部材４６０を有する本発明に従うカラムは既に空気がパージされており、システムに設置したとき使用する準備ができている。殊に使い捨て式のすぐに使用できるカラムの場合、本発明では各個々のカラムと共に供給される使い捨て式パージバルブの必要性が回避され、このためコストが大幅に低減する。
【００５２】
設置後、カラム４０１が迂回されている（すなわち、カラムが「オフライン」である）ときにカラムバルブ４０７の上流でシステムをパージする。カラムを「インライン」に切り替えたとき、カラムバルブ４０７と導管４８０との間には無視し得る体積の空気しか残存しない。
【００５３】
その後、図５ｂに示したシステムは、従来技術のシステムについて上記したのと本質的に同じように使用することができる。上昇流モードの場合、液体はポンプ４７０によりマニフォルド４０８から吸引され、バルブ４０７を介してカラム４０１の第２のポート４４０中に向けられる。次いで、液体は粒状媒体のベッド（図示してない）を通ってカラム内を上方に移動し、第１のポート４２０で出て、回収のためにカラムバルブ４０７により出口マニフォルド４０９に向けられる。センサー４７２〜４７６を使用してシステム内の環境、物理的及び化学的条件をモニターし、従ってその作動を調節することができる。
【００５４】
図６は、本発明による１０リットルのカラムを下降流（実線）及び上昇流（点線）モードで作動させて達成されたトレーサーパルス実験の例によってクロマトグラフ分離効率を示す。カラムには、アガロース粒径８５μｍのＣａｐｔｏＴＭ  Ｑアニオン交換樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）のベッドを充填した。このカラムは体積が１０．８リットル、直径が２６３ｍｍ、ベッド高さが２００ｍｍであった。アセトン（充填ベッド体積の１％）をトレーサー物質として使用し、移動相として水を用いてカラムから溶出し、２８０ｎｍで吸光度をモニターした。下記表１から分かるように、８５μｍのアガロース媒体を下降流（実線）又は上昇流（点線）モードで使用して優れたカラム効率が観察された。
【００５５】
表１と図６に示したデータは、本発明によるクロマトグラフィーカラムを用いて得られたものであるが、使用したカラムはさらに横分配チャンネルを含んでおり、第１のポートの出口と横分配チャンネルは非対称の構成を有している。かかる構成を有するクロマトグラフィーカラムは、本出願と同日に英国特許出願第０６１４３１６．８号として出願された「Axial Chromatography Columns and Methods」と題する本出願人（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）の同時係属中の特許出願の主題である。
【００５６】
【表１】
2010513848.tif 000003
カラム効率の尺度として、図７に示されているように、溶出ピークの高さの半値幅ｗｈを用いて低減したプレート高さを決定した。このやり方は、ガウス型分布に対して有効な近似値である。実際には、溶出ピークはこの理想的なガウス型から外れることが多く、ピークの歪みはいわゆる非対称係数Ａｆにより定性的に説明され、ＲＴＤにおいて「リーディング」はＡｆ＜１で示され、「テーリング」はＡｆ＞１で示される。非対称係数に対して一般に適用されている許容基準は、適用の型に応じて０．８＜Ａｆ＜１．５〜１．８である。
【００５７】
【数１】
2010513848.tif 000004
おおざっぱにいって、生物工学的下流プロセスにおいてタンパク質クロマトグラフィーに使用される高度に多孔性の媒体を考えると、媒体の特有の分散は通例、最適化された表面速度においてｈ＝１．５〜２．０の範囲の低減したプレート高さを与える。媒体の理想的な効率は、低減したプレート高さにおける増大が周辺機器、試料体積、ベッド不均一性及び分配システムの追加の分散の結果であるクロマトグラフシステムの実験的に決定された効率と比較するべきである。実際、タンパク質のイオン交換分離に使用されるクロマトグラフユニットの典型的な標準設置条件では、実験的に決定された低減したプレート高さｈユニット，見掛け＜３．０である。
Ａｆ         非対称係数
ｄｐ        粒径
ｈ          低減したプレート高さ
ＨＥＴＰ    理論的プレートと等価な高さ
Ｌ          ベッド高さ、充填ベッド
ｕｓ        充填ベッドにおける表面速度
ＶＲ        保持体積
ｗｈ         最大ピーク高さの５０％におけるピーク幅
【符号の説明】
【００５８】
２０１  カラム
２０４  第１のフィルター
２０６  第２のフィルター
２０９  ベッドスペース
２１１  ハウジング、側壁
２１２  第１のエンドユニット
２１３  第２のエンドユニット
２２０  バルブ手段
２２４  ノズル
２３３  第１のポート
２４０  第２のポート
２４２  通路
２６０  中空部材
４０１  カラム
４０５  バルブ
４０７  カラムバルブ
４０８  入口マニフォルド
４０９  出口マニフォルド
４２０  第１のポート
４４０  第２のポート
４７０  ポンプ
【図１】
2010513848.tif 000005
【図２】
2010513848.tif 000006
【図３】
2010513848.tif 000007
【図４】
2010513848.tif 000008
【図５】
2010513848.tif 000009
【図６】
2010513848.tif 000010
【図７】
2010513848.tif 000011
【国際調査報告】
2010513848.tif 000012
2010513848.tif 000013