(57)【要約】  目的の病原体のためのワクチンを被験体がその後受領する前に被験体の免疫系をＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドペプチド構築物で最初に予備刺激する、ワクチンの効力の増大方法が開示される。該ワクチンは病原体のゲノムによりコードされるタンパク質若しくはその一部分から構成されうる。該ワクチンは病原体のタンパク質をコードするＤＮＡから構成されるＤＮＡワクチンでもまたありうる。Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッドペプチド構築物は、Ｉｉ−Ｋｅｙタンパク質のＬＲＭＫ残基、およびワクチンに使用されるタンパク質若しくはその一部分のＭＨＣクラスＩＩエピトープを包含する。Ｉｉ−Ｋｅｙ構築物はＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドペプチドをコードする核酸構築物の形態で投与しうる。Ｉｉ−ＫｅｙペプチドでのプライミングはｒＨＡタンパク質ならびにＨＡおよびＨＩＶ  ＤＮＡワクチンの免疫原性を高める。病原体がＨＩＶ若しくはＨ５Ｎ１を包含するＡ型インフルエンザである、ワクチンプロトコルでのＩｉ−Ｋｅｙハイブリッド構築物の使用に関する方法が記述される。Ｉｉ−ＫｅｙハイブリッドのＭＨＣクラスＩＩエピトープがＡ型インフルエンザによりコードされる赤血球凝集素若しくはＨＩＶによりコードされるＧａｇタンパク質である方法および組成物が記述される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における目的の病原体に向けられるワクチンの効力の増大方法であって、該方法は
ａ）ワクチンを提供することであって、該ワクチンは病原体のゲノムによりコードされるエピトープ含有タンパク質若しくはその一部分、またはそれをコードするＤＮＡを含んでなり；
ｂ）ｉ）Ｉｉ−ｋｅｙタンパク質のＬＲＭＫ残基；および
ｉｉ）段階ａ）のタンパク質若しくはその部分内に含有されるＭＨＣクラスＩＩエピトープ
または
ｉ）およびｉｉ）のエレメントをコードするＤＮＡ
を含んでなるＩｉ−Ｋｅｙハイブリッド構築物を提供すること。
ｃ）被験体における免疫応答の刺激に適切な条件下で段階ｂ）のＩｉ−ｋｅｙ構築物を投与することにより被験体の免疫系を予備刺激すること；
ｄ）段階ｃ）の免疫応答を追加免疫するのに適切な条件下で段階ａ）のワクチンを投与して、それにより予備刺激されない投与に関してワクチンの効力を増大させること
を含んでなる、上記方法。
【請求項２】
段階ａ）のタンパク質が組換えＤＮＡ技術により製造される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ワクチンがＤＮＡワクチンであり、かつ、コドン使用頻度が被験体のコドンの優先性に一致するように最適化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
病原体がウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
病原体が細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
被験体が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
被験体がトリである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
トリが家禽である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
病原体がＡ型インフルエンザである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
段階ａ）のタンパク質が赤血球凝集素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
段階ａ）のタンパク質がノイラミニダーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
Ａ型インフルエンザ病原体が株Ｈ５Ｎ１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
段階ａ）のタンパク質が赤血球凝集素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
段階ａ）のタンパク質がノイラミニダーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＭＨＣクラスＩＩエピトープが残基ＧＬＳＬＷＭＣＳＮを含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ＭＨＣクラスＩＩエピトープが残基ＦＲＮＶＩＷＬＩＫを含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ＭＨＣクラスＩＩエピトープが残基ＳＧＲＭＥＦＦＷＴを含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
病原体がＨＩＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
段階ａ）のタンパク質がｇａｇである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＭＨＣクラスＩＩエピトープが残基ＤＲＦＹＫＴＬＲＡを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
段階ｃ）とｄ）の間に、Ｉｉ−Ｋｅｙタンパク質のＬＲＭＫ残基およびＭＨＣクラスＩＩエピトープｇａｇ１９８を含んでなるＩｉ−ｋｅｙハイブリッドで被験体を再刺激することをさらに含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
段階ｃ）とｄ）の間に、ＭＨＣクラスＩＩエピトープが残基ＤＲＦＹＫＴＬＲＡを含んでなる段階ｂ）のＩｉ−ｋｅｙハイブリッドで被験体を再刺激することをさらに含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
目的の病原体に向けられるワクチンの予備刺激における使用のための組成物であって、該組成物は製薬学的に許容できる担体中にＩｉ−ｋｅｙハイブリッド構築物を含んでなり、該Ｉｉ−ｋｅｙハイブリッド構築物が
ａ）Ｉｉ  ｋｅｙタンパク質のＬＲＭＫ残基；および
ｂ）Ａ型インフルエンザのＨ５Ｎ１株によりコードされる赤血球凝集素ＭＨＣクラスＩＩエピトープ；
若しくはａ）およびｂ）のエレメントをコードするＤＮＡ
を含んでなる、上記組成物。
【請求項２５】
ＭＨＣクラスＩＩエピトープが残基ＧＬＳＬＷＭＣＳＮを含んでなる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
ＭＨＣクラスＩＩエピトープが残基ＦＲＮＶＩＷＬＩＫを含んでなる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
ＭＨＣクラスＩＩエピトープが残基ＳＧＲＭＥＦＦＷＴを含んでなる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
Ｉｉ−ｋｅｙハイブリッド構築物がａ）およびｂ）のエレメントをコードするＤＮＡを含んでなり、ならびに、コドン使用頻度が被験体の優先性に一致するように最適化されている、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
目的の病原体に向けられるＤＮＡワクチンの予備刺激における使用のための組成物であって、該組成物は製薬学的に許容できる担体中にＩｉ−ｋｅｙハイブリッド構築物を含んでなり、該Ｉｉ−ｋｅｙハイブリッド構築物が
ａ）Ｉｉ  ｋｅｙタンパク質のＬＲＭＫ残基；および
ｂ）ＨＩＶによりコードされるｇａｇ  ＭＨＣクラスＩＩエピトープ；
若しくはａ）およびｂ）のエレメントをコードするＤＮＡ
を含んでなる、上記組成物。
【請求項３０】
ＭＨＣクラスＩＩエピトープが残基ＤＲＦＹＫＴＬＲＡを含んでなる、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ＭＨＣクラスＩＩエピトープが残基ＭＱＭＬＫＥＴＩＮを含んでなる、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｉｉ−ｋｅｙハイブリッド構築物がａ）およびｂ）のエレメントをコードするＤＮＡを含んでなり、ならびに、コドン使用頻度が被験体の優先性に一致するように最適化されている、請求項２９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
免疫系は「外来」若しくは「異常」構造を抗原として認識することにより外来病原体、腫瘍細胞、アレルゲン、自己免疫疾患誘発過程および移植片に応答する。大部分の抗原は宿主細胞若しくは病原体のいずれかにより合成されるタンパク質である。こうした抗原はペプチドフラグメントにプロセシング（タンパク質分解性消化）される。該フラグメントはその後抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のペプチド提示構造中で提示される。これらのペプチド提示構造は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と呼ばれる（それらが最初ＭＨＣ遺伝子群に属する多形遺伝子の産物として認識されたためそのように命名された）。ＭＨＣ遺伝子は、移植片拒絶および特異的キラーＴリンパ球による病原体感染細胞の死滅のような免疫細胞の多くの活動を制御する。
【０００２】
特異的抗原に対する免疫応答は、抗原のフラグメントがＡＰＣの表面上に提示される場合に応答するＴリンパ球により媒介される。ＡＰＣ内で、タンパク質分解性にプロセシングされた抗原のペプチドフラグメントはＭＨＣ分子の抗原ペプチド結合部位に結合されたようになる。これらのペプチド−ＭＨＣ分子複合体がその後、応答性Ｔ細胞リンパ球上のＴ細胞受容体により（外来ペプチドおよび提示分子の隣接表面双方の）認識のため細胞表面に輸送される。この抗原特異的認識事象が免疫応答カスケードを開始し、防御免疫応答をもたらし、若しくは自己免疫過程の場合には有害な免疫応答に至る。
【０００３】
２クラスのＭＨＣ分子すなわちＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩが存在する。ＭＨＣクラスＩ分子は小胞体で合成される。それらはウイルスからのような内因性に合成されるタンパク質からペプチドを独占的に受領し、そしてそれらをＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に提示し、ＣＴＬはその後活性化されたようになりかつ抗原提示細胞を直接死滅させ得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子もまた小胞体で合成される。合成される場合、それらの抗原ペプチド結合部位はインバリアント鎖（Ｉｉ）タンパク質により阻害される。Ｉｉタンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ分子が、細胞質中で形成されかつ小胞体に輸送された内因性抗原性ペプチドを結合することを予防する。ＭＨＣクラスＩＩ分子およびＩｉタンパク質の複合体は小胞体からポストゴルジ（ｐｏｓｔ−Ｇｏｌｇｉ）区画に輸送され、そこでＩｉがタンパク質分解により遊離され、その後特異的抗原ペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。ＭＨＣクラスＩＩ分子はエンドサイトーシスを介して内部に取り入れられた外因性抗原のみ結合する。ＭＨＣクラスＩＩ分子はＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球（Ｔヘルパー細胞）に抗原を提示する。一旦活性化されればＴヘルパー細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球（キラーＴ細胞）およびＢリンパ球を活性化するのを助ける。（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６および非特許文献７）。
【０００４】
Ｒ．Ｈｕｍｐｈｒｅｙの特許文献１およびＨｕｍｐｈｒｅｙらの特許文献２はＩｉタンパク質が切断される機構を示し、そこでは切断の過程で遊離されるフラグメントがＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位内の抗原ペプチドの結合および固定を調節することを継続する（非特許文献８；非特許文献９；および非特許文献１０）。参照される特許はさらに、この初期の調節性の抗原ペプチド認識事象を制御するための新規治療的化合物および方法を開示した。これらの機構の同定は治療的介入の新たな途を拓いた。
【０００５】
特許文献３および特許文献４は免疫系の調節に関して有用なハイブリッドペプチドを開示する。該開示は、適切な介在化学構造により哺乳動物Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドに共有結合されてハイブリッドポリペプチドを形成するＭＨＣクラスＩＩ拘束性抗原エピトープが、前駆体抗原エピトープがそうであるより有意により高い効力を伴い抗原提示細胞によりＴ
リンパ球に提示されるという発見に基づく。特許文献３および特許文献４の開示は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０００６】
現在関心の高い２種の顕著な病原体はＨＩＶおよびインフルエンザウイルスとりわけＨ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスである。ＨＩＶは世界中で何百万もの人々を感染させ、そしてＨ５Ｎ１がそうするであろうことを多くが恐れている。Ｈ５Ｎ１はヒト、トリおよび数種の他の動物種に対する致命的ウイルスである。Ｈ５Ｎ１若しくは他の流行の場合、医療提供者はワクチン供給量の大きな不足に直面するであろう。米国で約２億の人々が感染したようになり、２００万までが死亡する（非特許文献１１）。パンデミックを終止させるのに１０億用量を超えるワクチンが必要とされうる。季節性インフルエンザの卵をベースとするワクチンはＨ５Ｎ１に対する交差防御を提供することがありそうにない。２００６年持点で、臨床試験されている３０以上のＨ５Ｎ１ワクチン候補が存在し（非特許文献１１）、多くは卵をベースとする製法を使用する。Ｈ５Ｎ１の高病原性により、有胚鶏卵を使用するＨ５Ｎ１ワクチンの製造は典型的に低ウイルス力価を生じる。現在評価されている他のＨ５Ｎ１ワクチンは、アデノウイルスに運搬される（ｖｅｃｔｏｒｅｄ）抗原（非特許文献１２）、ＤＮＡワクチン（非特許文献１３、非特許文献１４）、および細胞培養物に基づくアプローチを使用するワクチンを包含する。研究は、既知のＨ５Ｎ１ワクチンの免疫原性が乏しく、季節性インフルエンザワクチンより１２倍までより多い用量を必要とすることを示している（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。
【０００７】
研究は、免疫系の双方のアーム（ａｒｍ）を活性化することが、通常ＣＤ４＋  Ｔ細胞の作用に大きく頼る最も効果的な抗ウイルス応答を提供することを示した。活性化されたＣＤ４＋  Ｔ細胞から遊離されるサイトカインは、メモリーＢおよびＴ細胞の誘導のための不可欠の支援を提供しつつＢ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を間接的に補助する（非特許文献１９；非特許文献２０）。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、インフルエンザ特異的細胞溶解活性に影響を及ぼすこと（非特許文献２１；非特許文献２２）を包含するウイルス感染の制御で直接的役割を有する（非特許文献２３；非特許文献２４）。Ｈ５Ｎ１感染に対しヒトを防御することにおける各細胞型の寄与は不明であるため、免疫系の複数のアームを誘導しかつ広範な免疫を生成するよう設計されたワクチンが、ありそうにはＨ５Ｎ１パンデミックに対し最も効果的であることができる。
【０００８】
インフルエンザウイルスに対する広範囲にわたる免疫の誘導のためのペプチドワクチンの応用は以前に検討された。研究は、ペプチドワクチンとしてのＢ、ＴヘルパーおよびＣＴＬインフルエンザ由来エピトープの包含が強い免疫およびウイルス攻撃からの防御を刺激し得ることを示した（非特許文献２５：非特許文献２６：非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９：非特許文献３０；非特許文献３１）。他の研究は、高度に保存されたエピトープを包含することにより防御および系統間免疫（ｃｒｏｓｓ−ｓｔｒａｉｎ
ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を誘導し得ることを示した（非特許文献３２；非特許文献３３）。
【０００９】
抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞刺激を目的としたペプチドワクチンは血清学的に異なるウイルス株に対し防御する潜在能力を有する。インフルエンザワクチン開発の焦点は古典的に抗体中和の誘導にあった。この技術は、ワクチンを生成するのに使用されるものと異なる系統が出現する場合に有効であることがありそうにない。いくつかのマウス研究は、有効な抗ウイルス免疫応答の組織化においてＣＤ４＋細胞が役立つことを示した（非特許文献１９；非特許文献２０）。Ｓｗａｉｎらは、同系宿主へのＰＲ８インフルエンザ特異的Ｔｈ１極性化エフェクター細胞の養子移入が、致死的攻撃からマウスを防御し得る一方、予備刺激したＣＤ４＋細胞を受領しないマウスは全部が死に屈したことを示した（非特許文献２０）。これらの実験はウイルス感染の制御におけるＣＤ４＋  Ｔ細胞の重要性を強調する。
【００１０】
現在のＨ５Ｎ１ワクチンの不備のいくつかを取り扱い、本明細書に記述される新たな方法および組成物は、現在のワクチン供給量を限界まで引き伸ばしかつ集団にワクチン接種するのに必要とされる投薬量を低下させる見込みを提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】Ｒ．Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（１９９６）米国特許第５，５５９，０２８号
【特許文献２】Ｈｕｍｐｈｒｅｙら（１９９９）米国特許第５，９１９，６３９号
【特許文献３】米国特許出願第０９／３９６，８１３号（現在米国特許第６，４３２，４０９号）
【特許文献４】米国特許出願第１１／０３３，０３９号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｂｌｕｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３９７５（１９８８）
【非特許文献２】Ｒｉｂｅｒｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：４７４（１９９２）
【非特許文献３】Ｄａｉｂａｔａら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：２５５（１９９４）
【非特許文献４】Ｘｕら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：７２３（１９９４）
【非特許文献５】Ｘｕら、Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ  ｐ２２７（１９９４）
【非特許文献６】Ｋｒｏｐｓｈｏｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１３５７（１９９５）
【非特許文献７】Ｕｒｂａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：７５１（１９９４）
【非特許文献８】Ａｄａｍｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１６９３（１９９５）
【非特許文献９】Ａｄａｍｓら、Ａｒｚｎｅｉｍ．Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７：１０６９（１９９７）
【非特許文献１０】Ｘｕら、Ａｒｚｎｅｉｍ．Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、投稿中（１９９９）
【非特許文献１１】Ｐｏｌａｎｄ，Ｇ．Ａ．、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５４：１４１（２００６）
【非特許文献１２】Ｇａｏ，Ｗ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：１９５９（２００６）
【非特許文献１３】Ｂｒｉｇｈｔ，Ｒ．Ａ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３０８：２７０（２００３）
【非特許文献１４】Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ８：７９６（２００２）
【非特許文献１５】Ｂｒｅｓｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  ３６７：１６５７（２００６）
【非特許文献１６】Ｔｒｅａｎｏｒ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５４：１３４３（２００６）
【非特許文献１７】Ｔｒｅａｎｏｒ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１７３２（２００１）
【非特許文献１８】Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９１：１２１０（２００５）
【非特許文献１９】Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６：１７１（２００４）
【非特許文献２０】Ｓｗａｉｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２１１：８（２００６）
【非特許文献２１】Ｇｒａｈａｍ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８０：１２７３（１９９４）
【非特許文献２２】Ｇｒａｈａｍ，Ｍ．Ｂ．とＴ．Ｊ．Ｂｒａｃｉａｌｅ、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８６：２０６３（１９９７）
【非特許文献２３】Ｈｏｇａｎ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９３：９８１（２００１）
【非特許文献２４】Ｐａｌｕｄａｎ，Ｃ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：１５９３（２００２）
【非特許文献２５】Ｈｏｒｖａｔｈ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６０：１２７（１９９８）
【非特許文献２６】Ｗｅｓｔｅｒｆｅｌｄ，Ｎ．とＲ．Ｚｕｒｂｒｉｇｇｅｎ、Ｊ  ＰＰｅｐｔ  Ｓｃｉ  １１：７０７（２００５）
【非特許文献２７】Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｅ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：７３８０（２００５）
【非特許文献２８】Ｎｉｎｏｍｉｙａ，Ａ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：３１２３（２００２）
【非特許文献２９】Ｂｒｕｍｅａｎｕ，Ｔ．Ｄ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１：５４７３（１９９７）
【非特許文献３０】Ｊｅｏｎ，Ｓ．Ｈ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：２７７２（２００２）
【非特許文献３１】Ｓｉｍｅｃｋｏｖａ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：９２７（１９９５）
【非特許文献３２】Ｌｅｖｉ，Ｒ．とＲ．Ａｒｎｏｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：８５（１９９６）
【非特許文献３３】Ｂｅｎ−Ｙｅｄｉｄｉａ，Ｔ．ら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３９：３２３（２００２）
【発明の概要】
【００１３】
一局面において、本発明は、目的の抗原のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含有するＤＮＡおよびペプチドワクチンの効力の改良方法に関する。本発明は、その後投与されるＤＮＡ若しくはペプチドワクチンの効力が増強されるようなＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドペプチドで被験体の免疫系を予備刺激することを必要とする。Ｉｉ−Ｋｅｙ構築物はＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドペプチドをコードする核酸構築物の形態で投与してもよい。
【００１４】
２つの例は、ＨＩＶおよびＡ型インフルエンザとりわけＨ５Ｎ１に対して防御するためのワクチン接種プロトコルでのＩｉ−Ｋｅｙ抗原エピトープハイブリッドの使用である。Ｉｉ−Ｋｅｙ、およびＨＡタンパク質由来の高度に保存されたＭＨＣクラスＩＩエピトープから構成されるハイブリッドタンパク質でナイーブなＴヘルパー細胞を最初に予備刺激することにより、Ｈ５Ｎ１の予防および処置に使用される臨床で試験されたｒＨＡワクチンに対する免疫学的応答が改良される。ＤＮＡ若しくはタンパク質ワクチンで追加免疫する前にこれらのハイブリッドペプチドで被験体の免疫系を予備刺激することにより、ワクチンの制限された供給量を拡大し得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、被験体の免疫応答を予備刺激することによりＤＮＡおよびペプチドワクチンの効力を増大させるのに使用される組成物に関する。該組成物はＩｉ−Ｋｅｙタンパク質のＬＲＭＫアミノ酸残基およびＭＨＣクラスＩＩエピトープから構成されるハイブリッドペプチドであり、該エピトープはＡ型インフルエンザのＨ５Ｎ１株に
よりコードされる赤血球凝集素若しくはＨＩＶによりコードされるＧａｇタンパク質である。
【００１６】
［発明の詳細な記述］
本発明は、ＭＨＣクラスＩＩ  Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッドペプチドワクチンで免疫系を予備刺激すること、次いでＤＮＡ若しくはペプチドワクチン追加免疫が、被験体のＴ細胞応答を増大させるという発見に関する。最初にＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドで予備刺激すること、次いでＤＮＡワクチン追加免疫により、被験体の結果として生じるＴ細胞応答が２〜３回のＤＮＡワクチン接種のものに同等となる。より強いＴ細胞応答がウイルス感染からの増大された防御と相関し、そして長期の免疫学的記憶に寄与する。Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッドで予備刺激しかつｒＨＡタンパク質ワクチンで追加免疫したマウスは、１用量のタンパク質ワクチンを受領するマウスより２０倍以上より高いＩＦＮ−γ応答を表した。ＤＮＡ若しくはペプチドワクチンシリーズの用量のいくつかの代わりにＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドペプチドワクチンを使用することにより、ワクチン供給量不足を回避し得る。
【００１７】
定義：
以下の太字の用語は本文書を通じて以下の関連する意味で使用される。
【００１８】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）：ＭＨＣ分子と複合体形成した外来抗原をその表面上に表示する細胞。
【００１９】
ＢＡＬＢ／ｃ：多くの異なる研究分野でしかし最もしばしばモノクローナル抗体の製造で使用される一般的近交系マウス系統。Ｂａｌｂ／ｃマウスは白色種でありかつ大きさが小さい。ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスはＨ−２ｄアレル（ＭＨＣ複合体のアレル）だけＢＡＬＢ／ｃ系統と異なる。
【００２０】
傍観者（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）効果：それに対し寛容が既に確立されている第二の抗原の存在下で１抗原が提示される場合に起こる、１抗原に対する免疫応答の抑制若しくは増強。
【００２１】
ＣＦＡ：フロイントの完全アジュバント。
【００２２】
コドン最適化：その宿主の発現系のものと一致させるための外来タンパク質のコドン使用頻度の調節。数種の生物体種は他の同義コドンよりある種のコドンを好む。標的生物体により好まれるコドンを使用することにより翻訳がより効率的に行われ得る。
【００２３】
ＣＴＬ：細胞傷害性Ｔリンパ球。キラーＴリンパ球若しくは細胞。
【００２４】
サイトカイン：細胞間シグナル。別の細胞の挙動に影響を及ぼす１細胞から遊離されるペプチド。
【００２５】
エリスポット：サイトカイン特異的抗体で被覆したマイクロタイターウェル中にＴリンパ球を置くＥＬＩＳＡ様アッセイ。サンプル中の抗原特異的Ｔ細胞の数を測定するのに最もしばしば使用される。ＣＤ４応答はＩＬ−４捕捉およびＩＦＮ−γ捕捉により測定する。
【００２６】
ＩＦＡ：フロイントの不完全アジュバント。
【００２７】
Ｉｉ−Ｋｅｙ：Ｉｉタンパク質内の免疫調節モチーフ。
【００２８】
インターフェロン（ＩＦＮ）：外来作用物質による攻撃に応答して大部分の動物の免疫系の細胞により産生される糖タンパク質。サイトカイン。
【００２９】
インターロイキン（ＩＬ）：リンパ球の増殖／分化を誘導するマクロファージおよびＴリンパ球により分泌されるタンパク質。サイトカイン。
【００３０】
リンパ球：白血球の１タイプ。リンパ球はＢ細胞若しくはＴ細胞でありうる。
【００３１】
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）：免疫系で重要な役割を演じる、大部分の脊椎動物で見出される大きな遺伝子ファミリー。
【００３２】
ｐｃＤＮＡ：ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭにより製造されるプラスミドに基づくクローニングおよび発現ベクター。
【００３３】
乱交雑ペプチド：１種以上のヒト白血球抗原多様性（ａｎｔｉｇｅｎ−ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）領域アレルにより提示されるペプチド。
【００３４】
ＲＩＢＩ：モノホスホリルリピドＡおよびトレハロースジコリノミコール酸から構成される水中油型乳剤。ＲＩＢＩはフロイントのアジュバントに対する代替として使用し得る。
【００３５】
Ｓｙｎ−：合成（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）。
【００３６】
態様
背景の節で論考されたとおり、ワクチン供給量不足は米国および海外で多数の犠牲者をもたらしうる。集団を防御しかつ既存のワクチンの効力を増大するのに必要とされる投薬量の低減方法が必要とされる。数種の病原性生物体の有効な免疫化は組換え製造タンパク質若しくはなお合成ペプチドでの免疫化により達成し得るとは言え、他者については、ウイルスそれ自身を製造すること、ウイルスを単離すること、および熱死滅若しくは化学的不活化形態の該ウイルスを使用して免疫することが必要であった。これは例えばインフルエンザウイルスに関して真実である。以下の論考の多くはインフルエンザウイルスにとりわけ関するとは言え、論考される原理はウイルスに広範におよび一般に病原体に応用可能である。
【００３７】
季節性インフルエンザウイルスに向けられるワクチンは、典型的には有胚鶏卵に接種することおよびウイルスを増殖させることにより製造する。尿膜（ａｌａｎｔｏｉｃ）液をその後卵から収集し、そして免疫化前にウイルスを熱で死滅若しくは化学的に不活性化する。季節性インフルエンザワクチンと対照的に、Ｈ５Ｎ１パンデミックインフルエンザ株は、典型的には、主として該ウイルスの高病原性により有胚鶏卵を使用して低ウイルス力価を生じる。（はるかにより多い用量を必要とする）該ワクチンの通常低い免疫原性と相まって、パンデミックと闘うのに必要とされるとみられるよりもはるかにより少ないワクチン用量がこの手段を使用して生成され得ることが予期される。米国で２億の人々が感染されたようになる可能性があり、９千万人が臨床的疾患となり、そして２００万人までが死亡すると推定されている（Ｐｏｌａｎｄ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５４：１４１１（２００６））。
【００３８】
何百万ものワクチン用量を備蓄することはワクチンの半減期により制限された有用性を有し、かつ、抗原ドリフトによる突然変異株の潜在的出現のためほとんど意味を持たず、こうしたワクチンを無効にする。逆遺伝学ワクチンが鶏卵中のウイルス増殖の効率を向上させかつ攻撃後の防御を誘導し得るとは言え、それらの臨床評価は規制の問題により遅れ
ている。アデノウイルスに運搬される抗原、ＤＮＡワクチン、および細胞培養物に基づくアプローチを使用するワクチンを包含する開発中の他のＨ５Ｎ１ワクチンが評価中であるが、しかし診察室へのそれらの導入は遅れている。
【００３９】
数種の異なるワクチン候補が診察室で試験されている一方、該結果は変動的かつしばしば期待はずれであった。最近、組換えの不活化スプリットビリオン（ｓｐｌｉｔ−ｖｉｒｉｏｎ）ワクチンが試験され、参加者にアルムアジュバントを伴う若しくは伴わない１．５、１５若しくは３０ｍｇ／用量の赤血球凝集素を注入した。赤血球凝集阻害（ＨＩ）およびマイクロ中和試験分析に基づき、最高用量を受領するワクチン受領者は最高の応答を生じた一方、より低用量は最適以下の力価をもたらした。類似の一研究で、変動する用量の卵に基づくアジュバント添加しない組み換えＨ５ウイルス（ｒｇＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４×Ａ／ＰＲ／８／３４）でワクチン受領者を免疫した。その研究で、２用量の９０μｇで免疫した人々の５６％が免疫前力価を最低４倍超えたＨＩ力価を有し、該ワクチンが乏しく免疫原性であったことを意味した（Ｔｒｅａｎｏｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５４：１３４３（２００６））。類似の知見がバキュロウイルス由来Ｈ５Ｎ１赤血球凝集素をワクチン候補として使用した研究で観察された（Ｔｒｅａｎｏｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１７３２（２００１））。わずかな免疫原性を誘導するこうした高用量（季節性インフルエンザワクチンより１２倍までより多い）はパンデミックの場合に十分な防御を提供しないかもしれず、十分な集団の包括のための十分なワクチンを迅速に製造することを困難にする。加えて、他のＨ５Ｎ１株に対しこれらの組換えワクチンにより提供される交差防御（あれば）のレベルは確認されていない。にもかかわらずこれらの研究はこうしたワクチンの安全性および有効性についての重要な情報を提供する。
【００４０】
インフルエンザ感染およびワクチン開発はマウスモデル系で最も徹底的に検討されている。研究は、マウスでのＢ細胞の欠如がウイルス攻撃後の増大された死亡率につながり得ることを示しており（Ｍｏｚｄｚａｎｏｗｓｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３９：２１７（１９９７）；Ｍｏｚｄｚａｎｏｗｓｋａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５９４３（２００５））、強い抗ウイルス体液性免疫を有することの重要性を意味しているとは言え、ＣＤ８＋エフェクター応答の誘導もまたウイルスの消失および回収に寄与する（Ｔｏｐｈａｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：５１９７（１９９７））。免疫系の双方のアームの活性化が最も効果的な抗ウイルス応答を生じ、そして大部分の場合にＣＤ４＋  Ｔ細胞の補助に大きく頼ることが示されている。活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞から遊離されるサイトカイン環境はＢ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞に間接的「ヘルプ」を提供し、ならびにメモリーＢおよびＴ細胞の誘導に不可欠な支援を提供する（Ｂｒｏｗｎら、Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：１７１（２００４）；Ｓｗａｉｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２１１：８（２００６））。付加的なエフェクター機能が、インフルエンザ特異的細胞溶解活性を包含するウイルス感染の直接制御におけるＣＤ４＋  Ｔ細胞について記述されている。研究はまた、ＣＤ４枯渇マウスが高度に致死的なマウスインフルエンザＰＲ８ウイルスを消失し得ることも示したとは言え、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＢ細胞の組合せが増大されたウイルス消失およびマウスでの生存と関連することが示されており、三叉誘導が防御に最も効率的であることを示唆する。Ｈ５Ｎ１感染に対しヒトを防御することにおける各細胞型の寄与は現在不明であり、そして循環株の病原性および全体的毒性に主に依存しうる。一緒にすれば、免疫系の複数のアームを誘導しかつ広範な免疫を生成するよう設計されたＨ５Ｎ１ワクチンは、ありそうにはＨ５Ｎ１パンデミックに対し最も効果的であろう。
【００４１】
現在のＨ５Ｎ１ワクチンの欠点のいくつかを取り扱うため、免疫原性を向上し得かつ他のＨ５Ｎ１ワクチンとともに使用される場合に用量節約を見込み得る新規Ｈ５Ｎ１インフルエンザワクチンを開発した。高度に保存されたクラスＩＩエピトープを使用してナイーブなＴヘルパー細胞を予備刺激するこのアプローチは臨床で試験したｒＨＡワクチンに対する免疫学的応答を向上させることが示された。ＨＬＡ拘束性クラスＩＩエピトープの選
択を見込むＳＹＦＰＥＩＴＨＩプログラム（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５０：２１３（１９９９））を使用して、最も一般的なヒトＨＬＡ−ＤＲアレルの６種と相互作用することが累積的に予測されるＨＡタンパク質配列に由来する２４種のＭＨＣクラスＩＩエピトープを同定した。ペプチドの細胞外ＭＨＣクラスＩＩ負荷を可能にする免疫調節性Ｉｉタンパク質（Ｉｉ−Ｋｅｙと命名される）の１セグメントを包含してそれにより外因性のプロセシングおよび提示に対する必要性を迂回するようにこれらのエピトープを改変した。こうしたＩｉ−Ｋｅｙペプチドは、開発中の数種のワクチンに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴ細胞応答（Ａｄａｍｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１６９３（１９９５））ならびにｉｎ  ｖｉｖｏのＴおよびＢ細胞応答（Ｋａｌｌｉｎｔｅｒｉｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：４１２８（２００３）；Ｋａｌｌｉｎｔｅｒｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２８：３５２（２００５）；Ｋａｌｌｉｎｔｅｒｉｓら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：４６（２００６））を高める。細胞外ペプチド負荷はまた他者（Ｂｏｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７：３４３６（１９９６））により示されるとおりナイーブなＴ細胞もより迅速に活性化しうる。Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質からのＭＨＣクラスＩＩエピトープを使用して生成される１種のこうしたワクチンが現在臨床試験中であり、そして患者で確実なＴヘルパー細胞応答を生成する能力を示した（Ｍｉｔｔｅｎｄｏｒｆら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００６  ＡＳＣＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｐａｒｔ  Ｉ．２４：２５３２（２００６））。Ｉｉ−ＫｅｙペプチドワクチンはＨ５Ｎ１に対し「独立型（ｓｔａｎｄ−ａｌｏｎｅ）」として部分的防御を提供しうるとは言え、それらは、強い免疫を誘導するのに必要とされる用量を同時に低減しつつこの試験で使用されるｒＨＡのような他のワクチンに対する応答を増強することを主に意図している。従って、ペプチドでのプライミングは、ｒＨＡを包含する他のワクチン型の潜在的に制限される供給量を拡大することを合理的に期待し得る。ペプチドを使用するＣＤ４  Ｔ細胞のプライミングはタンパク質ワクチン接種に対する免疫応答を増大させることが以前に示されている（Ｈｏｓｍａｌｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４６：１６６７（１９９１））。それらの研究では、アカゲザルをＨＩＶ  ｇｐ１２０およびｇｐ４１由来の３種のＴ細胞エピトープで予備刺激し、次いで組換えｇｐ  １６０タンパク質で追加免疫した。ペプチドで予備刺激しなかった対照動物に比較して、ペプチド誘導性のＴヘルパー活性を暗示するＴ細胞増殖および抗体応答双方の有意の改善が存在した。他の研究もまたペプチドプライミング後の改良された免疫原性を観察した（Ｖａｓｌｉｎら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １０：１２４１（１９９４））。改変Ｈ５Ｎ１クラスＩＩエピトープでマウスを予備刺激すること、次いでｒＨＡで追加免疫することは、ｒＨＡ単独と比較してＴおよびＢ細胞応答を向上させるであろうと仮説を立てた。後に続く例示の節で示されるとおり、該結果は、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＡエピトープハイブリッドで予備刺激することがｒＨＡの免疫原性を向上させることを示し、また、開発中の他のＨ５Ｎ１ワクチンの用量節約戦略としてのこれらの型のペプチドの役割を示す。
【００４２】
従って、一局面において、本発明は被験体において目的の病原体に向けられるワクチンの効力を増大させるための用量節約方法に関する。ワクチンはこの方法とともに提供される。該ワクチンは例えば伝統的な熱死滅若しくは化学的不活化ウイルスを包含し得る。あるいは、ワクチンは目的の病原体からの単離されたタンパク質若しくはそのフラグメントを包含し得る。該ワクチンは組換えＤＮＡ技術により製造されたタンパク質若しくはペプチドまたは合成ペプチドもまた包含し得る。本発明は目的の病原体がウイルス若しくは細菌であるワクチン効力の増大方法を包含する。より具体的には、本発明は病原体がＨＩＶ若しくはインフルエンザのＨ５Ｎ１株を包含するインフルエンザウイルスである方法を包含する。上で論考されたとおりこのワクチン材料はしばしば供給量が限られるため、限られた供給量が可能な限り多くの個体の免疫化に有効であるようにワクチンの効力を増大させることが望ましい。
【００４３】
本明細書に開示される結果は、ワクチンの投与前に被験体の免疫系を予備刺激するためのＩｉ−ｋｅｙハイブリッド構築物の使用が予備刺激されない投与に関してのワクチンの効力の増大において驚くほど効果的であることを示す。Ｉｉ−ｋｅｙ配列は本明細書および従来技術に記述されている。本発明で利用されるＩｉ−ｋｅｙ構築物は、上で論考されたハイブリッド構築物内に見出されるＭＨＣクラスＩＩエピトープにリンカーにより結合されたＩｉ−ｋｅｙ配列のＬＲＭＫ残基を少なくとも包含する。該リンカーは、免疫応答の最大の増強をもたらすＩｉ−ｋｅｙエレメントとＭＨＣクラスＩＩエピトープの間のスペーシングを提供する大きさにされる。一般的に言って、このスペーサーは、１５〜２５アミノ酸残基のアミノ酸配列により提供されるとみられるスペーシングに近いこれらのエレメント間のスペーシングを提供する。該リンカーはアミノ酸から構成される必要はないとは言えこの組成はハイブリッド構築物の製造を単純化しない。アミノ酸リンカー部分に対する代替は従来技術に記述されている。
【００４４】
被験体の免疫系は上述された型のＩｉ−ｋｅｙ構築物を使用して予備刺激する。一般的に言ってＩｉ−ｋｅｙハイブリッド構築物は注入のため処方する。この製剤は生理学的に適合性の緩衝剤および場合によってはアジュバントを包含する。多くのアジュバントが当該技術分野で既知であり、そして別のものに優先する１アジュバントの選択は慣例の実験の問題である。典型的には、Ｉｉ−ｋｅｙ構築物製剤の投与は筋肉内若しくは皮下注入による。
【００４５】
生物体の免疫系がＩｉ−ｋｅｙハイブリッド投与に応答するのに十分な時間の後にワクチン組成物を投与する。Ｉｉ−ｋｅｙ製剤のように、ワクチン組成物は典型的にはアジュバントを含む若しくは含まない生理学的に適合性の緩衝液中で投与する。下に示される結果は、Ｉｉ−ｋｅｙハイブリッド構築物でのプライミング後のインフルエンザおよびＨＩＶワクチン組成物の効力の顕著な増強を示す。例示の節のインフルエンザＤＮＡワクチン実験に詳述される結果は、Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッドで予備刺激し次いでＤＮＡワクチンで追加免疫したマウスでＴ細胞活性が２ＤＮＡワクチン用量を与えられたマウスでより大きかったことを示す。同様に、例示に詳述されるＨＩＶ  ＤＮＡワクチン実験の結果は、Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッドで予備刺激しかつＤＮＡワクチンで追加免疫したマウスが、ＤＮＡワクチンで予備刺激および追加免疫したマウスの約２倍のＴ細胞活性を表したことを示す。該データはＩｉ−ＫｅｙハイブリッドがＤＮＡワクチンの１用量を置き換え得ることを示す。例示の下位節「Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドを予備刺激することはｒＨＡでのＴ細胞応答を増強する」にもまた記述されるとおり、Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドで予備刺激しかつｒＨＡで追加免疫したマウスは、１若しくは２用量のｒＨＡを与えられたマウスより有意により強い応答を表した（図５Ｂ）。事実、１ハイブリッド（Ｉｉ−Ｋｅｙ  １６０）でのプライミングは対照のものより２０倍高いＩＦＮ−γ応答を誘導した。該結果はＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドが１用量のタンパク質ワクチンもまた置き換え得ることを示す。
【００４６】
Ｉｉ−ｋｅｙハイブリッド構築物若しくはワクチン組成物いずれもアミノ酸に基づくワクチン若しくはＩｉ−ｋｅｙ構築物をコードする核酸構築物の形態で投与しうることが当業者により認識されるであろう。ＤＮＡワクチンは被験体のコドンの好みに一致するよう最適化したコドンでありうる。文献はコードされる産物で免疫応答を刺激する目的上のＤＮＡ構築物の投与のための構築物および方法の記述が豊富である。多くのこうした構築物はウイルスに基づくとは言え、機械的導入方法（例えば遺伝子銃技術）を使用し得る。
【００４７】
Ｈ５Ｎ１はＡ型インフルエンザウイルスの１サブタイプである。Ｈ５Ｎ１のＨ５は数種の既知の型のＨＡ（インフルエンザウイルスの表面上に見出される抗原性糖タンパク質）の第五を示す。ＨＡは感染されている細胞に該ウイルスを結合する。その名称は赤血球を一緒に凝集させるその能力に由来する。Ｎ１は数種の既知の型のノイラミニダーゼ（またインフルエンザウイルスの表面上に見出される抗原性のグリコシル化された酵素）の第一
を示す。赤血球凝集素およびノイラミニダーゼは抗ウイルス薬および抗体の最も医学上適切な標的であり、そして従ってＡ型インフルエンザの多様なサブタイプを命名するための根拠として使用される。本発明は、ＬＲＭＫ残基および赤血球凝集素若しくはノイラミニダーゼタンパク質内に含有される１エピトープから構成されるＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドペプチドで被験体を予備刺激すること、次いでＡ型インフルエンザワクチンで追加免疫することによるＡ型インフルエンザワクチン応答の増強方法を包含する。
【００４８】
例示の節に詳述される結果は、ＨＡ  ＤＮＡワクチンで追加免疫される前に３種のＨ５Ｎ１赤血球凝集素クラスＩＩ  Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドの１種で最初に予備刺激したマウスが、ＨＡ  ＤＮＡで予備刺激および追加免疫したマウスより大きいＴ細胞応答を表したことを示す。試験した３種のハイブリッドペプチドはペプチド５５１、１６０および２３９であった。これらのハイブリッドペプチドのいずれか１種でのプライミングはその後のＨＡ  ＤＮＡワクチンの効力を高める。同様に、ＩＦＮ−γ応答およびＴ細胞応答は、ｒＨＡペプチドワクチンの追加免疫を受領する前のペプチド５５１、１６０、２３９若しくは該３者の組合せで予備刺激したマウスでより強かった。例示に詳述されるとおり、Ｉｉ−Ｋｅｙ  １６０でマウスを予備刺激することおよびそれらをｒＨＡで追加免疫することは、２用量のｒＨＡを受領するマウスでよりも２０倍以上より大きいＩｉ−Ｋｅｙ  １６０に対するＩＦＮ−γ応答を誘導する。これらのハイブリッドのいずれか１種若しくは組合せでのプライミングはその後のｒＨＡワクチンの効力を高める。従って、本発明は、Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッドで使用されるＭＨＣクラスＩＩエピトープがＨＡ  ５５１、ＨＡ  １６０若しくはＨＡ  ２３９を含んでなるＨ５Ｎ１インフルエンザＤＮＡ若しくはペプチドワクチンの効力の増大方法を包含する。（配列については表１を参照されたい。）該データは１用量のＤＮＡ若しくはｒＨＡワクチンをＩｉ−Ｋｅｙペプチドにより置き換え得ることを示す。
【００４９】
背景の節で論考されたとおり、Ｈ５Ｎ１のような病原体は複数の動物種を苦しめる。本明細書で使用されるところの「哺乳動物」という用語は、ヒト種ならびに全部の他の哺乳動物種を包含することを意味している。本発明の化合物および方法は、全部の哺乳動物およびトリ（家禽および家禽以外）種の被験体で起こる疾患および状態の処置で適用しうる。本明細書で使用されるところの「被験体」という用語はヒト種を包含するいずれかの哺乳動物若しくはトリ種の１種を指す。ヒトで発生しかつ例として本明細書で挙げられる疾患および状態は、同一の生物体若しくは発症過程により引き起こされるにせよ、関連する生物体若しくは発症過程により引き起こされるにせよ、未知の若しくは他の既知の生物体および／若しくは発症過程により引き起こされるにせよ、別の種で発生する比較可能な疾患若しくは状態を包含する。
【００５０】
別の態様において、本発明はＨＩＶ  ＤＮＡワクチンの効力の増大方法に関する。例示の節に記述されるＨＩＶ  ＤＮＡワクチン実験の結果は、ＨＩＶエピトープを含んでなるＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドでの追加免疫が後に投与されるＨＩＶ  ＤＮＡワクチンのＴ細胞応答を増大させることを示す。該研究は、ｐｃＤＮＡ／ＳｙｎＧａｇ追加免疫を受領する前にＩｉ−ＫｅｙのＬＲＭＫ残基およびＨＩＶ病原体のＧａｇタンパク質エピトープから構成されるハイブリッド構築物で最初に予備刺激したマウスが、ＤＮＡワクチンで予備刺激および追加免疫したマウスのものの２倍のＴ細胞応答を表したことを示す。本発明は、プライミング段階で使用されるＭＨＣクラスＩＩエピトープがＧａｇエピトープであるＨＩＶ  ＤＮＡワクチンの効力の増強方法を包含する。より具体的には、本発明は、プライミング段階で使用されるＭＨＣクラスＩＩエピトープがＧａｇ２９８であるＨＩＶ  ＤＮＡワクチンの効力の増強方法を包含する。
【００５１】
本発明はさらに、Ｉｉ−ＫｅｙのＬＲＭＫ残基およびＧａｇ２９８エピトープのハイブリッド構築物で被験体を予備刺激すること、次いでＤＮＡワクチンで追加免疫すること、
およびその後ＭＨＣクラスＩＩエピトープがＧａｇ１９８若しくはＧａｇ２９８の残基を含んでなるＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドで被験体を再刺激することによる、ＨＩＶ  ＤＮＡワクチンの増強方法を含んでなる。（配列については表１を参照されたい。）例示の節に詳述されるＨＩＶ実験の結果は、Ｉｉ−Ｋｅｙ／Ｇａｇ２９８ハイブリッドで予備刺激し、ｐｃＤＮＡ／ＳｙｎＧａｇで追加免疫したマウスが、２若しくは３用量のＤＮＡを与えたマウスの２倍くらい強いＴ細胞活性を表したことを示す。
【００５２】
本発明は目的の病原体に向けられるＤＮＡ若しくはペプチドワクチンのプライミングでの使用のための組成物もまた提供する。該組成物は製薬学的に許容できる担体中にＩｉ−Ｋｅｙハイブリッド構築物を含んでなり、該構築物はＩｉ−Ｋｅｙタンパク質のＬＲＭＫ残基およびＡ型インフルエンザのＨ５Ｎ１株によりコードされる赤血球凝集素ＭＨＣクラスＩＩエピトープから構成される。より具体的には、本発明は、ハイブリッド構築物がエピトープＨＡ  ５５１、ＨＡ  １６０若しくはＨＡ  ２３９を包含する組成物を包含する。例示の節のインフルエンザＤＮＡおよびｒＨＡワクチン実験の結果は、Ｈ５Ｎ１によりコードされるエピトープ（具体的にはＨＡ  ５５１、ＨＡ  １６０若しくはＨＡ  ２３９）から構成されるＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドで予備刺激したマウスが、ＨＡ  ＤＮＡワクチンで予備刺激したマウスより高いＣＤ４  Ｔ細胞活性を表すことを示す。
【００５３】
別の態様において、本発明は、製薬学的に許容できる担体中にＩｉ−Ｋｅｙハイブリッド構築物を含んでなる組成物を提供し、該構築物は、Ｉｉ−Ｋｅｙタンパク質のＬＲＭＫ残基およびＨＩＶによりコードされるＧａｇ  ＭＨＣクラスＩＩエピトープから構成される。より具体的には、本発明は、ハイブリッド構築物がエピトープＧａｇ１９８若しくはＧａｇ２９８を包含する組成物を包含する。例示の節のＨＩＶ実験の結果は、ＨＩＶによりコードされるエピトープ（具体的にはＧａｇ２９８）から構成されるＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドで予備刺激したマウスが、Ｇａｇ  ＤＮＡワクチンで予備刺激したマウスより高いＣＤ４  Ｔ細胞活性を表すことを示す。さらに、Ｉｉ−Ｋｅｙ／Ｇａｇ２９８ハイブリッドで予備刺激し、Ｇａｇ  ＤＮＡで追加免疫し、そしてその後Ｉｉ−Ｋｅｙ／Ｇａｇ１９８ハイブリッドで再刺激したマウスは、３用量のＤＮＡを受領するマウスと同等のＴ細胞応答を表す。本発明は、Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッドペプチドを、免疫応答を再刺激するのにもまた使用しうる方法を包含する。
【００５４】
当業者は、慣例の実験法を使用して、ハイブリッドペプチド中のそれぞれの残基位置で多様な天然の若しくは非天然のアミノ酸を置換し得る。置換しうる分子のいくつかの例は、ペプチド模倣構造、Ｄ−異性体アミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、Ｌ−異性体アミノ酸、修飾Ｌ−異性体アミノ酸および環化誘導体である。
【００５５】
データは、Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッドが最低１用量のＤＮＡを置き換え得、それによりＨ５Ｎ１インフルエンザのような病原体の潜在的なＦＤＡに承認されるＤＮＡワクチンの利用可能性を増大させることを示す。より重要には、より強いＴ細胞応答はより迅速、より大きい、およびより長期間持続する防御に寄与しうる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ワクチン接種後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４エリスポット応答。ＢＡＬＢ／ｃマウス（５／群）を、ＲＩＢＩアジュバント中に乳化したＩｉ−Ｋｅｙペプチド（１００μｇ）で皮下若しくはＨＡ  ＤＮＡワクチン（５０μｇ）で筋肉内のいずれかで第０週に免疫化した。２週後にマウスをＨＡ  ＤＮＡで追加免疫した。追加免疫１２日後にマウスを屠殺しそして脾を無菌的に取り出した。プールした脾細胞はＸ軸に示されるＩｉ−Ｋｅｙペプチドを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏペプチド再刺激アッセイで使用した。対照マウスは無関係のＤＮＡワクチン（Ｂ５Ｒ）若しくはＲＩＢＩ／ＰＢＳを受領した。結果は３検体でアッセイしたサンプルの幾何平均を示す。
【図２】ワクチン接種後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＦＮ−γエリスポット応答。ＢＡＬＢ／ｃマウス（４／群）を、ＣＦＡアジュバント中で乳化した１００μｇのＩｉ−Ｋｅｙペプチド（Ｇａｇ２９８若しくはＧａｇ１９８）で皮下またはｐｃＤＮＡ／ＳｙｎＧａｇワクチン（５０μｇ）で筋肉内のいずれかで第０週に免疫化した。９日後に全マウスにｐｃＤＮＡ／ＳｙｎＧａｇで追加免疫した。マウスの１群は第１６日に２回目に追加免疫した。追加免疫１１日後にマウスを屠殺しそして脾細胞を無菌的に取り出した。プールした脾細胞を、Ｘ軸に示されるＩｉ−Ｋｅｙペプチドを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏペプチド再刺激アッセイで使用した。結果は３検体でアッセイしたサンプルの幾何平均を示す。
【図３】ｒＨＡ免疫化後のＩＦＮ−γ／ＩＬ−４応答。マウスをＣＦＡアジュバント中で乳化した１０μｇのｒＨＡで第０日に皮下で免疫した。第１４日にマウスに追加免疫し、次いで追加免疫２週後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで脾細胞を再刺激した（７２時間）。データは３検体でアッセイしたペプチドの平均±ＳＥＭを表す。
【図４】ＤＮＡ免疫化後のＩＦＮ−γ／ＩＬ−４応答。マウスを５０μｇのｐｃＤＮＡ／ＨＡで第０日に筋肉内で免疫化し、そして第１４日に追加免疫し、次いで追加免疫１０日後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで脾細胞を再刺激した（７２時間）。データは３検体でアッセイしたペプチドの平均±ＳＥＭを表す。
【図５Ａ】相同なＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドペプチドでの免疫化後のＩＦＮ−γエリスポット応答。マウスをＲＩＢＩアジュバント中で乳化した１００μｇのＩｉ−Ｋｅｙペプチドで第０日に皮下で免疫した。マウスを第１４日に追加免疫し、次いで追加免疫２週後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで脾細胞を再刺激した（７２時間）。再刺激で使用したＩｉ−ＫｅｙペプチドをＸ軸上に示す。データは３検体でアッセイしたペプチドの平均±ＳＥＭを表す。
【図５Ｂ】異種免疫化後のＩＦＮ−γエリスポット応答。マウスを、ＲＩＢＩアジュバント中で乳化した１００μｇのＩｉ−Ｋｅｙペプチド、３３μｇ／ペプチド（黒棒）のＩｉ−Ｋｅｙペプチド若しくは１０μｇのｒＨＡで第０日に皮下で免疫し、次いで第２１日に１０μｇのｒＨＡで追加免疫した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激（７２時間）を追加免疫２週後に実施した。再刺激で使用したＩｉ−ＫｅｙペプチドをＸ軸上に示す。データは３検体でアッセイしたペプチドの平均±ＳＥＭを表す。*ＲＩＢＩ／ｒＨＡおよびｒＨＡ／ｒＨＡに比較してＰ＜０．００１、**ＲＩＢＩ／ｒＨＡおよびｒＨＡ／ｒＨＡに比較してＰ＜０．０５。ＡＥＯ＝抗原エピトープ単独。
【図６】異種免疫化およびＣＤ４＋枯渇後のＩＦＮ−γエリスポット応答。マウスを、ＲＩＢＩアジュバント中で乳化した１００μｇのＩｉ−Ｋｅｙペプチド、３３μｇ／ペプチド（黒棒）のＩｉ−Ｋｅｙペプチド若しくは１０μｇのｒＨＡいずれかで第０日に皮下で免疫し、次いで第２１日に１０μｇのｒＨＡで追加免疫した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激（４８時間）を追加免疫２週後に実施した。再刺激で使用したＩｉ−ＫｅｙペプチドをＸ軸上に示す。データは３検体でアッセイしたペプチドの平均±ＳＥＭを表す。
【図７】マウスＩｇＧ抗ＨＡ応答。マウスを図５Ｂに記述したとおり免疫し、屠殺時点で血清を収集した。間接的ＥＬＩＳＡでｒＨＡに対し抗血清を試験することにより終点滴定を実施した。結果は２検体で試験したサンプルの平均±ＳＥＭを表す。*全部の他の群と比較してＰ＜０．００１。
【実施例】
【００５７】
例示
Ｉｉ−Ｋｅｙ技術は、インフルエンザＨ５Ｎ１およびＨＩＶワクチンを包含するＤＮＡワクチンの免疫原性を増強し得る。２件の本ＤＮＡワクチン研究は、Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッドペプチドで免疫系を予備刺激すること、次いでＤＮＡワクチンで追加免疫することが、ワクチン接種した生物体で全体的なＴ細胞応答を増強し得ることを示した。現在記述される組換えペプチドワクチン実験は、Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッドペプチドで免疫系を予備刺激することがペプチドワクチンの効力もまた増強し得ることを示す。ワクチン接種のためのこうした異種予備刺激／追加免疫方法を使用することは、病原性感染症からの長期の防御を提供するはずである。
【００５８】
Ｉｉ−Ｋｅｙペプチド／ＤＮＡ免疫化
全部のワクチン接種実験に使用したマウスは、マサチューセッツ大学メディカルセンター（ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）の動物施設にて特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下に収容した近交系ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）系統（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）の６〜８週齢の雌性であった。全処置はＩＡＣＵＣのプロトコルに従って実施した。ワクチンの投与および免疫化時間は各図の解説に定義する。一般に、マウスを最後の免疫化の約２週後に屠殺した。それらの脾を無菌的に収集しそして均質化まで無菌培地中に置いた。血清サンプルは後眼窩叢を介して収集しかつ分析まで−２０℃で凍結した。
【００５９】
エリスポット
ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４エリスポットサイトカインキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用してＤＮＡ若しくはタンパク質での免疫化後の免疫学的応答を評価した。エリスポットプレートは無菌ＰＢＳで希釈した５μｇ／ｍｌの抗ＩＦＮ−γ若しくは抗ＩＬ−４抗体（１００μｌ／ウェル）で被覆し、そして４℃で一夜インキュベートした。プレートを２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＲＰＭＩ  １６４０／１０％ＦＢＳ／１％ペニシリン−ストレプトマイシン−Ｌ−グルタミン）で１回洗浄し、次いでブロッキング緩衝液（２００μｌ／ウェル）を添加しかつ室温で２時間インキュベートした。
【００６０】
バルク脾細胞調製物は、Ｄｏｕｎｃｅホモジェナイザー（Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ニュージャージー州ミルビル）を使用する２％完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０／２％ＦＢＳ／１％ペニシリン−ストレプトマイシン−Ｌ−グルタミン）中での脾の均質化、次いで７０μｍ細胞濾過器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）での濾過により調製した。細胞の凝集を予防するため、脾細胞をＤｎアーゼＩ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）で短時間処理し、遠心分離し、そして赤血球溶解緩衝液（Ｒｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）の添加によりＲＢＣを溶解した。２％完全培地を添加してさらなる溶解を阻害し、次いで遠心分離した。生じる細胞ペレットを５×１０６／ｍｌ（インフルエンザ実験）若しくは１×１０７／ｍｌ（ＨＩＶ実験）の濃度で２％完全培地に再懸濁した。
【００６１】
ブロッキング後にプレートを２％完全培地で１回洗浄しかつデカントした。ペプチドを２％完全培地に再懸濁しそして５μｇ／ウェルの濃度で添加した（１００μｌ／ウェル）。バルク脾細胞を、２％完全培地中１００μｌ／ウェルで１×１０６細胞／ウェル（ＨＩＶ実験）若しくは５×１０５細胞／ウェル（インフルエンザ実験）の濃度で３検体でプレーティングした。陰性対照は培地のみおよび未刺激の脾細胞から構成した一方、植物性血球凝集素／イオノマイシンで刺激した細胞が陽性対照としてはたらいた。エリスポットプレートを５％ＣＯ２を含む３７℃で７２時間インキュベートした。
【００６２】
プレートをＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で２回洗浄し、次いでＰＢＳ／１０％ＦＢＳで希釈したビオチニル化抗マウスＩＦＮ−γ若しくは抗マウスＩＬ−４抗体（２μｇ／ｍｌ）を添加した。２時間インキュベーション後にプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いでＰＢＳ／１０％ＦＢＳで希釈したストレプトアビジン／ＨＲＰ（１：１００）を添加した。室温で１時間インキュベートした後にプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いでＰＢＳで２回洗浄した。十分なスポット形成が起こるまでのＡＥＣ基質（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）の添加によりアッセイの発色を実施し、次いでｄｄＨ２Ｏですすいだ。エリスポットプレートを走査のためＣＴＬ  Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（オハイオ州クリーブランド）に送り、次いでＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔソフトウェア（ＣＴＬ  Ａｎａｌｙｚｅｒｓ、オハイオ州クリーブランド）を使用してデータを解析した。データは３検体で試験した各Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドの幾何平均（図１〜２）若しくは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）（図３〜７）を表す。
【００６３】
バルク脾細胞調製物のＣＤ４＋枯渇は、製造元の指示（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州オーバーン）に従ってＭＡＣＳ(R)細胞分離カラムを使用する陰性選択により実施した。枯渇させた細胞集団をプレーティングしそして上述されたと同一に再刺激した。
【００６４】
インフルエンザＤＮＡワクチン実験
第０週に、マウス（５／群）を５５１、１６０若しくは２３９と呼称される３種のＨ５Ｎ１赤血球凝集素（ＨＡ）クラスＩＩ  Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドの１種で予備刺激し、次いで第２週にＨＡ  ＤＮＡワクチンで追加免疫した（図１）。対照マウスは無関係のＤＮＡワクチン（Ｂ５Ｒ）若しくはＲＩＢＩのいずれか、次いでＰＢＳで予備刺激および追加免疫した。マウスを１２日後に屠殺しそして各処置群の脾細胞をプールした。上の３種のＩｉ−Ｋｅｙペプチドを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏペプチド再刺激アッセイをその後脾細胞の各プールで実施した。該結果は、ＣＤ４  Ｔ細胞活性のマーカーである全体的ＩＦＮ−γ応答が、５５１、１６０若しくは２３９ペプチドのいずれかでマウスを予備刺激した場合に２用量のＤＮＡワクチンを受領したマウスに比較して最も顕著であったことを示した。ペプチド１６０で予備刺激しかつＨＡ  ＤＮＡで追加免疫したマウスでのインターロイキン（ＩＬ）−４（ＣＤ４  Ｔ細胞活性化の尺度）は脾細胞を１６０ハイブリッドペプチドで再刺激した場合に最も強かった。２用量のＤＮＡを受領したマウスは検出可能なＩＬ−４応答を誘導しなかった。該データはＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドが１用量のＤＮＡを置き換え得ることを示唆する。
【００６５】
ＨＩＶ  ＤＮＡワクチン実験
ＧａｇはＨＩＶ−１ウイルス粒子の集成に関与するタンパク質である。第０週にマウスをｐｃＤＮＡ／ＳｙｎＧａｇ、ＨＩＶ  Ｇａｇ２９８若しくはＧａｇ１９８  Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドいずれかで予備刺激し，次いで第９日にｐｃＤＮＡ／ＳｙｎＧａｇワクチンで追加免疫した（図２）。ｐｃＤＮＡ／ＳｙｎＧａｇで予備刺激および追加免疫したマウスの１群を第１６日にｐｃＤＮＡ／ＳｙｎＧａｇで２回目に追加免疫した。マウスを追加免疫１１日後に屠殺しそして各処置群の脾細胞をプールした。Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏペプチド再刺激アッセイを脾細胞の各プールで実施した。ＩＦＮ−γ応答はＴ細胞応答がＩｉ−Ｋｅｙペプチドで予備刺激することによりさらに向上され得ることを示す。Ｇａｇ１９８でのプライミングの利益がＤＮＡで免疫したマウスに関して存在しないようであるとは言え、Ｇａｇ２９８で予備刺激しかつＧａｇ１９８でｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激したマウスが合計３用量のＤＮＡを受領するマウスと同じくらい強かったＴ細胞応答を生じたという予期されない知見が存在した。これは、Ｇａｇ２９８が非常に有望なクラスＩＩエピトープであること、および／若しくはＧａｇ２９８が免疫学的「傍観者」活性を有することを示唆する。Ｇａｇ２９８で予備刺激しかつＤＮＡワクチンで追加免疫し次いで培養物中でＧａｇ２９８で再刺激したマウスは、ＤＮＡワクチンレジメ
ン（１追加免疫若しくは２追加免疫）のいずれよりもおよそ２倍強かったＩＦＮ−γ応答を示した。ＨＩＶ感染個体におけるＩＦＮ−γ応答は疾患の進行をモニターするのに使用される数種のパラメータの１種にすぎず、また、感染の初期段階で重要であることが示されている。加えて、ウイルス複製の制御におけるＣＤ４＋  Ｔ細胞の重要性は誇張され得ず、そして、であるからＩｉ−ＫｅｙハイブリッドをＨＩＶ  ＤＮＡワクチンとともに使用することはＴ細胞免疫の頻度、持続期間および強度を向上させるはずである。
【００６６】
組換えペプチドワクチン実験
Ｉｉ−Ｋｅｙペプチド／ｒＨＡ免疫化
マウス（４／群）を１００μｇのＩｉ−Ｋｅｙペプチド若しくは３３μｇ／ペプチド（組合せで）で個別に免疫し、次いで第２１日に１０μｇのｒＨＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、コネチカット州メリデン）で追加免疫した。双方のワクチン成分は、ｒＨＡをＣＦＡ／ＩＦＡ中で乳化した１実験を除きＲＩＢＩアジュバント（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）中で乳化しそして尾底部に皮下注入した（図３）。ＤＮＡで免疫したマウスは筋肉内送達される５０μｇのｐｃＤＮＡ／ＨＡを受領し、次いで第１４日に追加免疫した。
【００６７】
ペプチドの設計および合成
Ｈ５Ｎ１  ＨＡクラスＩＩエピトープの好ましい同定方法は、目的の抗原に以前に曝露した個体から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得、そして予測される若しくは重なるエピトープに対しそれらをスクリーニングすることである。Ｈ５Ｎ１ウイルス若しくは開発中のＨ５Ｎ１ワクチンに曝露した個体からのＰＢＭＣは得ることが非常に困難であるため、潜在的なヒトに認識されるＭＨＣクラスＩＩエピトープを同定する代替戦略を使用した。
【００６８】
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ）はＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子を結合することが既知の４５０超のペプチド配列のデータベースを管理し、ならびにエピトープを予測するのに有用なアルゴリズムを提供している。Ｈ５Ｎ１  Ａ／Ｄｕｃｋ／Ａｎｙａｎｇ／ＡＶＬ−１／２００１アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ；受託番号ＡＦ４６８８３７）から有望なＨＡエピトープを同定する見込みを最大にするためにＳＹＦＰＥＩＴＨＩアルゴリズムを使用した。エピトープをＨＬＡ−ＤＲＢ  １アレル（ＤＲＢ  １*０１０１、ＤＲＢ  Ｉ*０３０１、ＤＲＢ  １*０４０１、ＤＲＢ  Ｉ*０７０１、ＤＲＢ  Ｉ*１１０１およびＤＲＢ  Ｉ*１５０１）について予測した。４０種のトップスコアの予測されるエピトープを、示されるアレルについてＳＹＦＰＥＩＴＨＩプログラムから報告されたスコアに従い累積的に等級付けした。付加的な基準および制限を上位４０位の点数のペプチドに適用することは試験するための２４種のクラスＩＩエピトープのより小さい一団をもたらした。該選択基準はより詳細に以前に記述されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈａｒｍａｄｄ．ｃｏｍ／ａｒｃｈｉｖｅｓ／Ｍａｙ％２０１６％２０％２０２００６／ＢＮ％２０Ｔｅｃｈ％２０Ｂｒｉｅｆ．ａｓｐ）。
【００６９】
ペプチドを合成し（ＮｅｏＭＰＳ、カリフォルニア州サンディエゴ）そしてＩｉ−Ｋｅｙモチーフ（ＬＲＭＫ）を組み込むよう改変した。このモチーフはリンカー配列（５−アミノペンタン酸、ａｖａ）を介して各エピトープのＮ末端に共有結合した。以前の実験は１個のａｖａリンカーがＴ細胞誘導に最適であることを示している（Ｋａｌｌｉｎｔｅｒｉｓ，Ｎ．Ｌ．ら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：４６（２００６））。ペプチドを２０％ＤＭＳＯに溶解しかつ使用まで−８０℃で凍結した。
【００７０】
ヒトにおいて確実な抗原特異的ＣＤ４＋刺激を誘導する有望なＨＥＲ−２／ｎｅｕエピトープのＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドを使用する以前の研究もまたＢＡＬＢ／ｃマウスでの強いＣＤ４＋活性化を示し（未発表の観察結果）、この動物モデルが有望なＨ５Ｎ１  ＨＡエピトープのＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドを特徴付けするためにもまたはたらきうること
を示した。最も一般的なヒトアレルの６種と相互作用することが累積的に予測される２４種のＨＡエピトープのうち、免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスからのＣＤ４＋細胞により認識された３種を見出した。
【００７１】
ＥＬＩＳＡ分析
抗体応答を間接的ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、ニューヨーク州ロチェスター）をコーティング緩衝液中１μｇ／ｍｌのｒＨＡ精製タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、コネチカット州メリデン）若しくはＢＳＡいずれかで被覆した。プレートを４℃で一夜インキュベートし、その後Ｗｅｌｌｗａｓｈ  ４Ｍｋ２プレート洗浄機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用してＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで室温で１時間ブロッキングした（ＰＢＳ、３％ＢＳＡ、０．０１％チメロサール）。血清サンプル（６種のｌｏｇ２希釈）を希釈液（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．１％ＢＳＡ、０．０１％チメロサール）で希釈し、室温で２時間プレーティングしそして３回洗浄した。ヤギ抗マウス全ＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）を８，０００倍希釈したか、または２μｇ／ｍｌのラット抗マウスＩｇＧＩ若しくはＩｇＧ２ａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）をビオチニル化し、そして室温で１時間プレーティングし、次いで洗浄しかつ２，０００倍希釈したストレプトアビジン／ＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）を添加した。３０分インキュベートした後にプレートを４回洗浄し、次いでＴＭＢ基質溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を添加した。十分な発色が一旦起これば２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止した。ＬＤ４００  ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州フラートン）を使用してシグナル強度を測定した。ＯＤ４５０ｎｍが０．２以上のＯＤ４５０ｎｍを生じる希釈でナイーブな動物の血清のものの２倍以上である非線形回帰分析（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用することにより終点滴定を測定した。
【００７２】
ｒＨＡ免疫マウスを用いるヒトの予測されるＭＨＣクラスＩＩエピトープのスクリーニング
ｒＨＡで免疫することはクラスＩＩエピトープの天然のプロセシングおよび提示を可能にする。ＡＰＣ／ＭＨＣクラスＩＩ提示は、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩエピトープ予測プログラムにより同定される２４種の候補ペプチドのいくつかを認識しうるＴ細胞の誘導をもたらす。ＢＡＬＢ／ｃ  Ｈ−２ｄアレルによる認識のためのヒトの予測されるＭＨＣクラスＩＩエピトープをスクリーニングするため、ＢＡＬＢ／ｃ  Ｈ−２ｄマウスをＣＦＡ中で乳化した１０μｇのｒＨＡでまず免疫し、そしてその後ＩＦＡ中で乳化した１０μｇのｒＨＡで２週後に追加免疫した。免疫原性について若しくはｒＨＡの情況で各ペプチドを個別に試験するよりもむしろ、マウスを最初にｒＨＡで免疫し、２４種のペプチドのそれぞれでバルク脾細胞を再刺激し、そしてどのペプチドが認識されたかを決定することがより実際的であった。Ｉｉ−Ｋｅｙペプチド１６０、５５１および２３９での再刺激は、一団中の他のペプチドに関して観察されるより低いがしかし検出可能な応答を伴い、最も強いＩＦＮ−γおよびＩＬ−４応答を生じた（図３）。全部のペプチドが数種のヒト多様性領域（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｇｉｏｎ）（ＤＲ）アレルを結合することが予測されたため、２４種のうち３種のみが強い非経口アジュバントの存在下のｒＨＡでの免疫化後にＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞により認識されたことは驚くべきことでなかった。クラスＩＩグルーブ（ｇｒｏｏｖｅ）のペプチドのいくつかの低親和性が最適以下のＴ細胞活性化を誘導することが示唆されており（Ｇｒｅｇｅｒｓ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：１２９１（２００３））、そして低下された認識頻度を引き起こしていたとみられる。
【００７３】
ＤＮＡで免疫したマウスを用いるヒトの予測されるＭＨＣクラスＩＩエピトープのスクリ
ーニング
Ｉｉ−Ｋｅｙ／エピトープハイブリッド１６０、５５１および２３９の免疫原性活性をさらに実証するために、ｐｃＤＮＡ／ＨＡで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスでＴ細胞応答を測定した。このプラスミドワクチンは完全長ＨＡ（Ａ／Ｄｕｃｋ／Ａｎｙａｎｇ／ＡＶＬ−１／２００１由来の配列）を発現し、そしてマウスで認識されるエピトープのさらなる特徴付けを見込むとみられる。マウスを第０日および第１４日に５０μｇのＤＮＡで筋肉内で免疫し、次いでｉｎ  ｖｉｔｒｏでペプチドで再刺激した。Ｉｉ−Ｋｅｙペプチド１６０、５５１および２３９は再度最も頻繁に認識されかつ最も強い応答を誘導したとは言え、ＩＬ−４応答に適度に歪められた（ｓｋｅｗｅｄ）（図４）。同一ペプチドがＤＮＡおよびｒＨＡ双方でならびに免疫マウスで強く認識された（図３）ため、ペプチド１６０、５５１および２３９は、ありそうにはｒＨＡでの後の予備刺激／追加免疫研究を実施するために最も免疫原性であるとみられることが確認された。
【００７４】
Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドでの免疫化はＩＦＮ−γ応答を誘導する
ＣＦＡ乳化は高価でありかつより多いｒＨＡの使用を必要とするためＲＩＢＩアジュバント系をその後使用した。ＲＩＢＩはワクチン製造の間にはるかにより少ないｒＨＡを必要とし、そしてＣＦＡより少なく毒性である。同定されたエピトープの免疫原性を確認するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＲＩＢＩ中で個別に乳化した１００μｇのＩｉ−Ｋｅｙペプチド１６０、５５１若しくは２３９で第０日に皮下で免疫し、そして第１４日に追加免疫した。２用量のＩｉ−Ｋｅｙペプチド５５１若しくは１６０いずれかで免疫し次いで同一ペプチドで再刺激したマウスは中程度のＩＦＮ−γ応答を誘導し、１６０に対する応答が最も顕著であった（図５Ａ）。Ｉｉ−Ｋｅｙペプチド２３９での免疫化は、２３９ペプチドでの再刺激の間に弱いがしかし検出可能なレベルのＩＦＮ−γのみ誘導した。しかしながら、Ｉｉ−Ｋｅｙ  ２３９免疫動物のＴ細胞でのＩｉ−Ｋｅｙ  １６０ペプチドに対する交差認識が存在するようであった。この群のマウスはＩｉ−Ｋｅｙ  １６０ペプチドで再刺激した場合に適度の応答を表した（おそらくＩｉ−Ｋｅｙ  １６０ペプチドと交差反応する拡大されたＴ細胞サブセットから）。ＲＩＢＩ／ＲＩＢＩレジメンで免疫したマウスからの検出可能なＩＬ−４応答は存在しなかった。マウスを第０日に追加免疫で１回免疫したのみの研究もまた実施した。１用量のＩｉ−Ｋｅｙ  １６０ペプチドは２用量のＩｉ−Ｋｅｙ  １６０に関して低下されたレベルのＩＦＮ−γをもたらした。１用量の５５１若しくは２３９のいずれも検出不可能なレベルのＩＦＮ−γをもたらした（データは示されない）。該結果は少なくともＩｉ−Ｋｅｙ  １６０が１回のみの免疫化後に免疫原性であることを示す。
【００７５】
Ｉｉ−ＫｅｙペプチドでのプライミングはｒＨＡに対するＴ細胞応答を増強する
臨床研究は、これらの研究で使用した同一のｒＨＡが２回の９０μｇ用量のｒＨＡを受領する個体においてさえ乏しく免疫原性であったことを示した（Ｔｒｅａｎｏｒ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１７３２（２００１））。クラスＩＩエピトープでのプライミングがｒＨＡに対するＴ細胞免疫原性を高めるかどうかを評価するための検討を実施した。第一の研究で、第０日にマウスを１００μｇのＩｉ−Ｋｅｙペプチド２３９、５５１若しくは１６０で個別にまたは組合せの各ペプチド３３μｇで予備刺激し、次いで第２１日にＲＩＢＩアジュバント中で乳化した１０μｇのｒＨＡで追加免疫した。対照マウスはＲＩＢＩアジュバント次いでｒＨＡで予備刺激した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激は、免疫化に使用したＩｉ−Ｋｅｙペプチド若しくは抗原エピトープ単独（ＡＥＯ、Ｉｉ−Ｋｅｙ部分を含まないクラスＩＩエピトープ）いずれかを用いて追加免疫２週後に実施した。ハイブリッドおよびＡＥＯペプチドは再刺激４８時間後に強いＩＦＮ−γ応答を誘導した（図３Ｂ）。一般に、Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドで予備刺激した全群は少なくともＩｉ−Ｋｅｙ
１６０ペプチドに対するＴ細胞応答を誘導した。それらは１６０ＡＥＯに対する応答もまた誘導し、該応答が１６０エピトープに主に向けられかつ結合されたＩｉ−Ｋｅｙ領域若しくは潜在的接合部エピトープに向けられなかったことを示した。ＲＩＢＩ／ｒＨＡお
よびｒＨＡ／ｒＨＡレジメンで免疫したマウスに関して、最も強くかつ最も大きい応答は、Ｉｉ−Ｋｅｙ  １６０ペプチドで予備刺激しかつｒＨＡで追加免疫した動物（１６０／ｒＨＡ、Ｐ＜０．００１）で観察され、次いで組合せで使用したペプチド（２３９、５５１、１６０／ｒＨＡ、Ｐ＜０．００１）そしてその後２３９／ｒＨＡ（Ｐ＜０．０５）および５５１／ｒＨＡ（Ｐ＞０．０５）であった。再度、Ｉｉ−Ｋｅｙ  ２３９で予備刺激しかつＩｉ−Ｋｅｙ  １６０で再刺激したマウスは、配列の相同性が該２エピトープ間に存在しないとは言え以前に観察されたところの１６０エピトープと交差反応したＴ細胞を有するようであった（図３Ａ）。ＲＩＢＩ／ｒＨＡレジメンに関してＩＦＮ−γの有意の誘導は、Ｔ細胞応答を予備刺激するＩｉ−Ｋｅｙペプチドすなわち１６０および組合せで使用したものの能力を確認した。検出可能なレベルのＩＬ−４はいずれの群でも測定されず、Ｔｈ２細胞の最適以下のプライミング若しくはおそらく４８時間ペプチド再刺激後の検出可能なＩＬ−４の欠如が存在したことを示唆した。組合せの全３種のペプチドで予備刺激したマウスでの低下された応答は、ありそうには、全部の他の実験群の１００μｇ／ペプチドと対照的に３３μｇ／ペプチドのみを受領するマウスによる。２３９若しくは５５１いずれかでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激に対する応答は異種予備刺激／追加免疫レジメンに関係なく弱い若しくは検出不可能な応答のみ誘導した。
【００７６】
第二の研究の目的は、Ｉｉ−Ｋｅｙペプチド／ｒＨＡワクチン接種レジメンを受領するマウスのＴ細胞応答を２用量のｒＨＡ（ｒＨＡ／ｒＨＡ）を受領するものと比較することであった。ＲＩＢＩアジュバント中で乳化したｒＨＡの２回の１０μｇ用量で免疫したマウスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激条件下で試験した全部のペプチドに対し検出不可能ないし低いＩＦＮ−γ応答を生じた。該結果は１（ＲＩＢＩ／ｒＨＡ）若しくは２用量（ｒＨＡ／ｒＨＡ）のｒＨＡを受領したマウスで同一であった。これは、ＣＦＡ／ＩＦＡ中で乳化したｒＨＡでマウスを免疫した場合に観察されるはるかにより強い応答とよい対照をなし（図１）、より少なく強力なＲＩＢＩアジュバントが最適以下のＴ細胞応答を誘導していたかもしれないことを示唆する。Ｉｉ−Ｋｅｙ  １６０で予備刺激し、ｒＨＡで追加免疫しそしてＩｉ−Ｋｅｙ  １６０で再刺激したマウスは、２用量のｒＨＡを受領するマウスより２０倍以上より高いＩＦＮ−γ応答を表した。
【００７７】
ｒＨＡ追加免疫が重要であったかどうかを確認するため、および１６０／ｒＨＡレジメンにより誘導される驚くべき応答がＩｉ−Ｋｅｙ  １６０プライミング段階のみによったという可能性を排除するために、ｒＨＡ追加免疫を伴わずＩｉ−Ｋｅｙ  １６０ペプチドでマウスを予備刺激した研究を実施した。低下されたしかし検出可能なＩＦＮ−γ応答（データは示されない）が生じた。これは、異種免疫化の情況においてｒＨＡ追加免疫が全体的Ｔ細胞応答に寄与すること、しかしｒＨＡ免疫化単独は乏しいＴ細胞免疫原性をもたらすことを示唆する。１００μｇのＩｉ−Ｋｅｙ  １６０でのプライミングから生じるエピトープのより高いモル量は、ｒＨＡでの追加免疫により増強し得る抗原特異的Ｔ細胞応答を開始するのに十分なＭＨＣクラスＩＩ負荷を提供すること、およびｒＨＡ単独はより少なく効率的なプライミングをもたらすはるかにより少ないＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体を提供することが可能である。天然のプロセシングおよび提示により生成される１６０エピトープは、アルゴリズム予測される１６０  Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドに配列が完全に同一でないこともまたありそうである。これらの潜在的差違が、エピトープに対するＴ細胞の親和性およびＴ細胞応答のその後の誘導の双方に対する影響を有しうる。しかしながら、実験は、１６０／ｒＨＡレジメンで免疫しかつｒＨＡで再刺激したマウスからのバルク脾細胞が、２用量のｒＨＡを受領したマウスに比較してより高頻度のＩＦＮ−γ分泌性Ｔヘルパー細胞を有したことを示しており、天然にプロセシングかつ提示された１６０を天然のタンパク質から見分ける応答を誘導するＩｉ−Ｋｅｙ  １６０ペプチドの能力を確認する（データは示されない）。これらのデータは、１用量のｒＨＡをＩｉ−Ｋｅｙ／エピトープハイブリッドペプチドワクチンでのプライミングにより（２用量レジメンで）置き換え得ること、およびｒＨＡ若しくは他のワクチンの制限された供給量を従ってパン
デミックの間に増大させ得るという概念を裏付ける。
【００７８】
複数のＨＬＡアレルを高親和性で結合することが予測される高度に保存されたＭＨＣクラスＩＩ  Ｈ５Ｎ１  ＨＡエピトープがＩｉ−Ｋｅｙを包含するように改変されている。この改変は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞外負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）および装填（ｃｈａｒｇｉｎｇ）、次いでＣＤ４＋  Ｔ細胞の直接刺激を可能にする。「独立型」ワクチンとして、Ｉｉ−ＫｅｙペプチドはナイーブなＴ細胞を予備刺激するのに使用し得、それはウイルス感染の経過および重篤度を変えるのに十分な既存の免疫を感染後に提供しうる。その後の実験は、Ｉｉ−Ｋｅｙ／Ｈ５ハイブリッド単独でのマウスの免疫化が強いＴ細胞応答に至ることを示した。最大レベルの防御免疫の誘導は、もっともありそうには、他のサブユニット若しくは既に開発中の不活化ウイルスワクチンとともにのＩｉ−Ｋｅｙペプチドの利用から生じるであろう。Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッドでのプライミングは、高度に特異的であるのみならずしかしまたサイトカイン誘導による広範なＴ細胞ヘルプおよび他のＨ５バリアントに対するヘテロサブタイプ免疫を誘導する潜在能力もまた提供する強いＴ細胞応答を提供する。従って、Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッドにより刺激したＣＤ４＋  Ｔ細胞は、別の方法で存在しないとみられる新興Ｈ５Ｎ１株に対する何らかのレベルの免疫を提供するであろうと期待される。最後に、ペプチドワクチンの使用は、比較的長い貯蔵寿命、製造の容易さおよび臨床試験での良好な安全性プロファイルを包含する、伝統的なワクチンを上回るいくつかの利点を有する。
【００７９】
ＩＦＮ−γ応答はＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞に依存する
Ｉｉ−ＫｅｙペプチドはＡＰＣの表面にＭＨＣクラスＩＩ分子を装填しかつナイーブなTヘルパー細胞を活性化すると考えられる。サイトカインＩＦＮ−γはＴｈ１、ＮＫおよびＣＤ８＋細胞を包含する多様な細胞型から分泌され得る。上述されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激アッセイでＩＦＮ−γの供給源を確かめるため実験を実施した。ＩＦＮ−γ分泌の大部分がＴヘルパー細胞に由来したことが期待された。従って、脾細胞をＣＤ４＋  Ｔ細胞を枯渇させ、次いで各ペプチドで再刺激した。４８時間再刺激後に全群のＩＦＮ−γのレベルはＣＤ４＋  Ｔ細胞の非存在下で大きく低下し（図６）、このサイトカインの主供給源がＴ細胞由来（Ｔｈ１）であったことを確認したが、とは言え低レベルのＮＫ若しくはＣＤ８＋  Ｔ細胞活性の可能性は排除し得ない。
【００８０】
赤血球凝集素阻害（ＨＩ）測定
ＶＮＨ５Ｎ１−ＰＲ８／ＣＤＣ−ｒｇウイルスを使用するＨＩ分析をＳｏｕｔｈｅｒｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（アラバマ州バーリンゲーム）により実施した。希釈した血清サンプルをＲＤＥ（デンカ生研、日本）で３７℃で一夜処理し、次いで５６℃で３０分間不活性化した。血清サンプルをその後連続希釈し、次いでＶＮＨ５Ｎ１−ＰＲ８／ＣＤＣ−ｒｇウイルス（４ＨＡＵ／ウェル）を添加した。室温で３０分インキュベーション後に１％ウマ赤血球（ＲＢＣ）を添加し、次いで追加の１時間インキュベートした。ＨＩ力価を目視分析により測定し、そしてペレットにしたＲＢＣを含有した反復希釈（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）として報告した。
【００８１】
Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドでの異種免疫化は体液性応答を増強し得かつＨＩ活性を誘導し得る
ウイルスを中和することが可能な高力価のウイルス特異的抗体の存在は、Ｈ５Ｎ１感染症（Ｋａｔｚ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８０：１７６３（１９９９））および他のＡ型インフルエンザ感染症（Ｍｏｚｄｚａｎｏｗｓｋａ，Ｋ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：５９４３（２００５））を生き残った個体で決定的に重要な役割を演じている。研究は、組換えタンパク質免疫化前の高度に保存されたＴヘルパーエピトープでのプライミングがタンパク質ワクチンに対する抗体応答を高め得ることを示した（Ｈｏｓｍａｌｉｎ，Ａ．，Ｐ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４６：１６６７（１９９１）；Ｖａｓｌｉｎ，Ｂ．ら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １０：１２４
１（１９９４））。本発明に関する研究は、Ｉｉ−Ｋｅｙ  ＭＨＣクラスＩＩペプチドでのプライミングがＢ細胞応答を増強し、また、Ｔ細胞ヘルプを介する高められた抗体応答を誘導することを示す。マウスをＩｉ−Ｋｅｙペプチド２３９、５５１若しくは１６０またはＲＩＢＩ（対照）いずれかで別個に予備刺激し、次いでｒＨＡで追加免疫した。Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッド／ｒＨＡレジメンは、対照マウスに関してｒＨＡに対する全ＩｇＧの適度のしかし有意でない増大（力価５×１０４）をもたらした（図７）。マウスはまた、３種のペプチドの組合せの相乗効果が存在したかどうかを決定するために組合せたペプチド乳化（３３μｇ／ペプチド）でも第０日に免疫しそして第２１日にｒＨＡで追加免疫した。興味深いことに、各Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドで個別に予備刺激することに関して全体的ＩｇＧ力価の増大が存在し、該３種のペプチドの組合せの可能な相乗効果を示唆した。２用量のアジュバント添加した（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ｒＨＡを受領するマウスは、他の類似の研究（Ｈｏｅｌｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ａ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉ））ＯＩ：１０．１０１６／Ｓ０１４０−６７３６（０６））：６８０７６（２００６））と矛盾しない非常に強いＩｇＧ応答を生じた。大用量のｒＨＡを与えることは、ＨＡタンパク質の表面露出されたＢ細胞エピトープを認識する低親和性Ｂ細胞のみの動員につながるとみられる。ペプチドで予備刺激することによりより強力なＴ細胞クローンを誘導することができ、それらは順により低濃度のｒＨＡを認識する表面免疫グロブリンでＢ細胞を刺激してより高親和性の抗体に潜在的に至る。
【００８２】
Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドでのプライミングが抗体応答をＴｈ１（ＩｇＧ２ａ）若しくはＴｈ２（ＩｇＧＩ）型応答に歪ませうるかどうかを確認するため、血清サンプルを抗ＨＡ  ＩｇＧＩおよびＩｇＧ２ａ抗体の存在について試験した。ＩＦＮ−γ応答のみがＲＩＢＩ−アジュバント添加した実験で検出された上述されたエリスポット分析での結果のため、Ｔｈ１極性化応答を暗示するより高力価のＩｇＧ２ａが期待された。期待に反して大部分のサンプルはＴｈ２様応答を導き出し、より高いＩｇＧＩ抗ＨＡ力価を生じた（表３）。興味深いことに、５５１若しくは１６０いずれのペプチドで予備刺激したマウスもＲＩＢＩ／ｒＨＡに関して抑制されたＩｇＧ２ａ応答を有するようであった。しかしながら２３９／ｒＨＡで予備刺激したマウスはより大きいＩｇＧ２ａ力価を有し、２３９が２３９／ｒＨＡ免疫化後に強いＴ細胞由来ＩＦＮ−γ応答を誘導することが観察されなかった場合であっても２３９がＢ細胞レベルで何らかの免疫調節活性を有しうることを意味した。プライミング戦略として全３種のペプチドを組合せることは、類似のレベルの双方のアイソタイプを誘導し、また、一般にペプチドで予備刺激した力価の最高のもの（全ＩｇＧ終点力価と一致した）を誘導した。血清アイソタイプ応答はＴ細胞応答と相関しなかったという事実はＲＩＢＩアジュバントの使用により影響されるとみられる。他の研究はＲＩＢＩの存在下でのＩｇＧ１の増大されたレベルを示し（Ｆｏｇｇ，Ｃ．ら、Ｖｉｒｏｌ  ７８：１０２３０（２００４））、そしてこれはここで観察された不一致を部分的に説明しうる。
【００８３】
抗体応答の機能性をより完全に検査するために血清サンプルをＨＩ活性について試験した（ＳＲＩで実施した）。受容体破壊酵素を含む抗血清でサンプルを処理し、そしてその後不活化ＶＮＨ５Ｎ１−ＰＲ８／ＣＤＣ−ｒｇ代理ウイルスとのインキュベーション後にウマ赤血球の凝集を予防する能力について試験した。このウイルスはＶｉｅｔｎａｍ株（Ａ／ＶＮ／１２０１／０３）に抗原性が同一であるがしかし非病原性である。最も高いＩｇＧ終点力価を有する群は、全ＩｇＧ分析でなされた観察結果と一致する最も強いＨＩ力価もまた有するであろうと期待された。組合せＩｉ−Ｋｅｙペプチドレジメン予備刺激したマウスは、わずかなＨＩ活性［５０］を生じた対照群より６倍以上より高かった［幾何平均３２０］ＨＩ力価を誘導した（表２）。Ｉｉ−Ｋｅｙ  ２３９、５５１若しくは１６０で個別に予備刺激することはそれぞれ２０２、１０１および２０２の力価を誘導した。２用量のｒＨＡを受領するマウスは最も高いＨＩ力価［２０３２］を生じたとは言え、ＲＩＢＩ／ｒＨＡ群に関して１ｒＨＡ用量がはるかにより低い力価［５０］を誘導し、１ｒ
ＨＡ用量がＢ細胞誘導に最適以下であることを示唆することに注目することは興味深かった。ヒトでの４０以上のＨＩ力価はＨ５Ｎ１に感染したおよび未感染のヒトで実施した血清学的調査に基づき防御的であると考えられる（Ｋａｔｚ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８０：１７６３（１９９９））とは言え、より高力価をもつ人々は症候性感染症を有し得るためこうした力価は防御を保証しない（Ｐｏｌａｎｄ，Ｇ．Ａ．、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５４：１４１（２００６））。
【００８４】
現在のワクチンを取り巻く不十分な免疫原性および供給量の問題を克服するため、われわれは、プライミング戦略として、改変ＭＨＣクラスＩＩエピトープワクチンの利用がｒＨＡおよびおそらく他の慣習的若しくは開発中の代替ワクチンに対するＴおよびＢ細胞応答を増大させ得ることを示した。ワクチン接種へのこうしたアプローチは伝統的なワクチンの製造（例えば卵に基づく）に対する制約を減少させることができ、それらの有効性を向上させかつ利用可能なワクチン用量の数を増大させうる。本研究は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープでのプライミングによりＴ細胞応答が１若しくは２用量のｒＨＡを上回って顕著に向上されることを示す。エリスポット分析は、Ｔｈ１極性化応答を示唆する検出可能なレベルのＩＬ−４を伴わずにＴｈ１由来ＩＦＮ−γの優越を示した。ＣＤ８＋細胞からのＩＦＮ−γ分泌は肺組織損傷に対し防御することが示された（Ｗｉｌｅｙ，Ｊ．Ａ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５８：１１９（２００１））一方、Ｔｈ２誘導は組織破壊を悪化させた。加えて、研究は、Ｔｈ２細胞が致死的攻撃に対しマウスを防御しないことを示している（Ｇｒａｈａｍ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８０：１２７３（１９９４））。従って、ＴｈＩに極性化された応答を誘導するｒＨＡとともにのＩｉ−Ｋｅｙペプチドは、肺組織損傷を最小限度にしつつ感染の処置に有利でありうる。
【００８５】
逆に、これらの研究からの抗体応答はＴ細胞応答と完全には相関しなかった。１６０／ｒＨＡおよび５５１／ｒＨＡワクチンレジメンを受領するマウスは、エリスポット分析の間に検出可能なＩＬ−４の非存在が存在した場合であってもＴｈ２応答を暗示するより高レベルのＩｇＧＩを誘導した一方、該研究の残存する群はより均一に分布されたＩｇＧＩ／ＩｇＧ２ａ力価をもたらした。２用量のｒＨＡははるかにより高いＩｇＧ終点およびＨＩ力価を生じたとは言え１用量はかなりより低い全体血清力価を生じ、高力価（ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒｅｄ）抗体応答の誘導が高用量の抗原を必要とすることを示唆した。全３種のＩｉ−Ｋｅｙペプチドの組合せでのプライミングは１ｒＨＡ用量に関してｒＨＡに対するＢ細胞活性を増強した。該結果は、１ｒＨＡ用量をＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドペプチドにより置き換えてそれによりワクチン供給量を増大させ得ることを示す。この知見は、Ｔヘルパーエピトープの組合せが、他者（Ｈｏｒｖａｔｈ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６０：１２７（１９９８）；Ｎｉｎｏｍｉｙａ，Ａ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：３１２３（２００２））により示唆されているとおり抗体の産生のためＢ細胞にヘルプを非特異的に提供する付加的なＣＤ４＋活性を誘導することもまた示唆する。
【００８６】
統計学
統計学的解析は適切な場合はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、ｖ．４．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて実施した。データはＡＮＯＶＡ解析およびＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較検定を使用して解析した。群間の差違はＰ＜０．０５の場合に有意とみなした。
【００８７】
ここで提示される研究は、免疫系を予備刺激しかつそれによりＨＩＶ若しくはインフルエンザワクチンおよび／またはウイルスそれ自体に対する免疫学的応答性を増大させるための手段としてのＩｉ−Ｋｅｙ／エピトープハイブリッドペプチドワクチンの潜在的利用性を示す。
【００８８】
【表１】
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【００８９】
【表２】
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【００９０】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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