(57)【要約】  本発明は癌組織に対する透過及び保有性効果に優れて高い癌組織選択性を示す、下記の化学式１で表わされる新規な環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲート抗癌剤及びその製造方法に関する。2010524922.tif 000016  式中、ｎは７、１２または１６であり、ｍは０、１または２であり、ｘは１であり、ｙ及びｚはそれぞれ独立して０または１であり、Ｒ、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して（ＣＨ３）２ＣＨ−、（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−、（Ｃ２Ｈ５）（ＣＨ３）ＣＨ−及び（Ｃ６Ｈ５）ＣＨ２−よりなる群から選ばれるものであり、ＡとＡ’は互いに同一または異なる２つの単座アミンリガンド、またはＡとＡ’が互いに結合した１つの二座キレート型ジアミンリガンドである。
2010524922.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表わされる、環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲート：
【化１】
2010524922.tif 000011
式中、ｎは７、１２または１６であり、ｍは０、１または２であり、ｘは１であり、ｙ及びｚはそれぞれ独立して０または１であり、Ｒ、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して（ＣＨ３）２ＣＨ−、（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−、（Ｃ２Ｈ５）（ＣＨ３）ＣＨ−及び（Ｃ６Ｈ５）ＣＨ２−よりなる群から選ばれるものであり、ＡとＡ’は互いに同一または異なる２つの単座アミンリガンド、またはＡとＡ’が互いに結合した１つの二座キレート型ジアミンリガンドである。
【請求項２】
前記Ａ及びＡ’はそれぞれ独立してシクロヘキシルアミン、シクロペンチルアミン及びベンジルアミンよりなる群から選ばれる互いに同一または異なる２つの単座アミンリガンドである請求項１に記載の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲート。
【請求項３】
前記Ａ及びＡ’の少なくとも１つはシクロヘキシルアミンである請求項１に記載の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲート。
【請求項４】
前記Ａ及びＡ’は互いに結合され、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサンを形成する請求項１に記載の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲート。
【請求項５】
水溶液中１００〜２００ｎｍサイズのナノ粒子を形成する請求項１に記載の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲート。
【請求項６】
前記メトキシポリエチレングリコールの分子量が３５０、５５０又は７５０である請求項１に記載の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲート。
【請求項７】
請求項１のいずれか一項に記載の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートを有効成分として含有する癌治療用組成物。
【請求項８】
（１）基下記化学式３で表わされる環状ホスファゼン三量体を、アルカリを用いて加水分解させて下記の化学式４で表わされる環状ホスファゼン三量体のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を得るステップと、
（２）化学式４で表わされる環状ホスファゼン三量体のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を下記化学式５で表わされる（ジアミン）白金（II）錯体と結合させるステップと、
を含む請求項１に記載の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートの製造方法：
【化２】
2010524922.tif 000012
【化３】
2010524922.tif 000013
【化４】
2010524922.tif 000014
【化５】
2010524922.tif 000015
式中、ｎは７、１２または１６であり、ｍは０、１または２であり、ｘは１であり、ｙ及びｚはそれぞれ独立して０または１であり、Ｒ、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して（ＣＨ３）２ＣＨ−、（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−、（Ｃ２Ｈ５）（ＣＨ３）ＣＨ−及び（Ｃ６Ｈ５）ＣＨ２−よりなる群から選ばれるものであり、ＡとＡ’は互いに同一または異なる２つの単座アミンリガンド、またはＡとＡ’が互いに結合した１つの二座キレート型ジアミンリガンドであり、 Ｍはカリウムイオン及びナトリウムイオンの中から選択される二つのアルカリ金属イオンまたはＢａ２＋であり、Ｌは硫酸イオン及び硝酸イオンの中から選択される１つ又は２つの陰イオンリガンドである。
【請求項９】
前記アルカリは水酸化カリウム、水酸化ナトリウム及び水酸化バリウムよりなる群から選ばれる請求項８に記載の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートの製造方法。
【請求項１０】
前記ステップ（２）の反応の溶媒としてアルコールを用いる請求項８に記載の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートの製造方法。
【請求項１１】
前記ステップ（２）の反応の溶媒として水を用いる請求項８に記載の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートの製造方法。
【請求項１２】
前記メトキシポリエチレングリコールの分子量は３５０、５５０又は７５０である請求項８に記載の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートの製造方法。
【請求項１３】
前記オリゴペプチドはグリシルフェニルアラニルロイシルグルタメート、グリシルフェニルアラニルロイシルアスパルテート、グリシルフェニルアラニルロイシルマロネートよりなる群から選ばれる請求項８に記載の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートの製造方法。
【請求項１４】
前記Ａ及びＡ’はそれぞれ独立してシクロヘキシルアミン、シクロペンチルアミン及びベンジルアミンよりなる群から選ばれる互いに同一または異なる２つの単座アミンリガンドである請求項８に記載の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートの製造方法。
【請求項１５】
前記Ａ及びＡ’の少なくとも１つはシクロヘキシルアミンである請求項８に記載の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートの製造方法。
【請求項１６】
前記Ａ及びＡ’は互いに結合され、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサンを形成する請求項８に記載の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌組織選択性を有する生分解性環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲート抗癌剤（cyclotriphosphazene-platinum(II) conjugate anticancer agent）及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在臨床において使用されているシスプラチンやカルボプラチンまたはオキサリプラチンなど白金（II）系抗癌剤は全世界的に最も広く使用されている抗癌剤の一つであり、特に、睾丸癌、卵巣癌、膀胱癌などの生殖器癌と大腸癌とに優れた抗癌効果を示すことが知られている。
【０００３】
しかしながら、これらの白金系抗癌剤は、パクリタキセル、ドキソルビシンなどの低分子量の他の単量体形態の抗癌剤と同様に、生体投与時に癌細胞／組織だけではなく、正常細胞と組織に対しても選択性なしに同一に作用し、特に、腎臓、骨髄及び神経系統に対する強い副作用、長期使用時の薬剤耐性及び水に対する低い溶解度などに起因して癌治療に対する限界が多い（D. Lebwohl, R. Canetta, Eur. J. Cancer., 34, 1522(1998)参照）。
【０００４】
この理由から、最近癌細胞又は組織にのみ選択的に細胞毒性を示すことにより毒性による副作用を画期的に低め、薬剤耐性をも克服可能な標的志向性抗癌剤の開発に全世界的に全力が尽くされている。すなわち、現在臨床において使用されているほとんどの低分子量の単量体形態の抗癌剤は癌細胞／組織選択性がないため、現在、癌細胞／組織選択性を有する抗癌剤を開発するための高分子薬物伝達システムの応用研究が全世界的に盛んになされている。その代表例として、抗体または癌細胞又は組織に大きく発現される受容体に親和力の強い標的化グループを既存の抗癌剤に直接的に結合させたり、抗癌剤と標的化グループを水溶性高分子に一緒に結合させることにより抗癌剤に標的志向性を与える方法（能動的標的化）と、標的化グループなしに癌組織に対する透過保有特性を有する高分子粒子に抗癌剤を結合させることにより抗癌剤に癌組織選択性を与える方法（受動的標的化）などを挙げることができる。
【０００５】
特に、高分子粒子が固形癌組織に対して高い透過及び保有性効果を示すという事実（H. Meada, and Y. Matsumura, CRC Crit, Rev. Ther. Drug Carrier Sys 6, 193(1989)）が発見されて以来、癌組織選択性の高い高分子物質に関する研究が全世界的に盛んになされている。高分子が固形癌組織に対して高い選択性を示す直接的な原因は、下記の２種類である。第一の原因は、高分子、ナノ粒子などの巨大分子は緻密な正常細胞組織の血管壁を通過することができないものの、癌組織内の血管壁を通過することができるという点である。これは、癌組織内の血管壁が稠密ではなく、癌組織には多量の血液が流入し、血圧が高いという点に起因して現れる現象である。第二の原因は、癌組織には生体高分子及び高分子体の放出通路であるリンパ管が存在しないという点である。このため、組織内に透過された高分子体の放出が正常細胞に比べて相対的に困難になる（R. Duncan, Parm. Sci. Technol. Today., 2, 441(1999)）。したがって、血管内に流入した高分子体は癌組織内に選択的に蓄積されるため（H. Maeda, J. Fang, T. Inutsuka, Inter Immun 3, 319(2003)）、癌組織に対して高い選択性を示すのである。
【０００６】
従って、特定の生体親和性高分子物質を用いた医薬伝達体系に関する研究が全世界的に活発になされており（A. S. Lundberg and R. A. Weinberg, Eur, J, Cancer, 35, 531-539(1999)）、その実例として、日本においては、ＳＭＡＮＣＳ（neocarzinostatin bound to styren-maleinanhydride copolymer）が治療用に既に実用化されている（K. Tsuchia, H. Maeda, Urology, 55, 495(2000)）。特に、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタアクリルアミド（「ＨＰＭＡ」）とドキソルビシンとの複合体（P. A. Vasey, C. Twelves, Clin. Cancer Res., 5, 83 (1999)）をはじめとする多種多様な高分子−薬物複合体が、最近臨床試験（R. Haag, F. Kratz, Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45,1198-1215）中である。このため、この分野の研究が世界的に極めて活発になされていることが分かる。しかしながら、未だ本格的な商品化レベルには至っていないのが現状であるが、これは、これまで研究されているほとんどの有機系高分子が生分解性ではないという点と、癌組織に対する選択性が低いという点に起因するものと推察される。
【０００７】
本発明者らは、世界で初めて、環状ホスファゼン三量体にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とアミノ酸を導入して温度感応性新物質を合成（Youn Soo Sohn他、J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8315）し、これらの環状ホスファゼン三量体に白金錯体を導入して温度感応性白金錯体抗癌剤を合成することに成功（Youn Soo Sohn他、J. Control. Release, 90, 303 (2003); Youn Soo Sohn他、U.S. Pat. 6,333,422 (2001)）したものの、動物実験の結果、癌細胞／組織に対する選択性を全く示すことができなかった。これは、恐らく、白金錯体と環状ホスファゼン三量体との連結基として単純なアミノ酸を使用したため疎水性があまりにも弱くて水溶液においてミセルやナノ粒子を形成することができず、単量体として存在するためであると考えられる。
【発明の開示】
【０００８】
《技術的解決法》
そこで、本発明の目的は、水溶液においてミセルを形成する両親媒性環状ホスファゼン三量体に疎水性（ジアミン）白金（II）錯体が導入された、癌組織に対する透過及び保有性効果に優れていて癌組織選択性が高く、しかも、抗癌効果にも優れた高分子ナノ粒子型ホスファゼン三量体−白金錯体抗癌剤及びその製造方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な記載から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の実施例１において製造した環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲート抗癌剤の水溶液中における粒度分布測定結果を示すものである。
【図２】図２は、本発明の実施例３において製造した環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲート抗癌剤の水溶液中における粒度分布測定結果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは、最近、疎水性基としてアミノ酸に比べて疎水性が遥かに強いオリゴペプチドを導入し、親水性基として分子量が３５０以上のポリエチレングリコールを導入した環状ホスファゼン三量体は水溶液中において自己集合により従来の線形高分子ミセルに比べて遥かに強力で且つ安定したミセルを形成するということを見出した（Youn Soo Sohn他、Angew. Chem. Int. Edit. 2006, 45, 6173-6176）。
【００１２】
本発明者らは、このように、水溶液中において強力で且つ安定したミセルを形成する能力を有する環状ホスファゼン三量体を加水分解して側鎖オリゴペプチドを機能化し、ここに疎水性（ジアミン）白金（II）錯体を結合させた１００〜２００ｎｍサイズの安定したナノ粒子型ホスファゼン−白金錯体コンジュゲート抗癌剤が、癌組織に対する選択性及び抗癌効果に優れているということを見出し、本発明を完成するに至った。（ジアミン）白金（II）錯体は細胞内のリソソームに存在するぺプチダーゼによって容易に分解されるオリゴペプチド（H. Soyez他、Adv. Drug Deliv. Rev. 21 (1996), 81-106）を介して連結されているため、本発明による環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートは生分解性を有する。これにより、本発明においては、両親媒性（親水性／疎水性）薬物伝達体である環状ホスファゼン三量体に置換されている親水性ポリエチレングリコールと疎水性オリゴペプチドの親水性／疎水性の割合と側鎖オリゴペプチドに結合させる（ジアミン）白金（II）錯体の疎水性の度合いを調節し、オリゴペプチドエチルエステルを加水分解して機能化し、ここに（ジアミン）白金（II）錯体抗癌剤を導入することにより、正常細胞または組織に比べて癌細胞または組織に対する透過及び保有性効果が高く、持続的であり、しかも、優れた抗癌活性を示す新規なナノ粒子型環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体及びその製造方法を提供する。
【００１３】
従って、本発明は、下記の化学式１で表わされる、癌組織選択性と優れた抗癌効果を有する環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲート抗癌剤に関するものである。
【００１４】
【化１】
2010524922.tif 000003
式中、ｎは７、１２または１６であり、ｍは０、１または２であり、ｘは１であり、ｙ及びｚはそれぞれ独立して０または１であり、Ｒ、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ独立して（ＣＨ３）２ＣＨ−、（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−、（Ｃ２Ｈ５）（ＣＨ３）ＣＨ−及び（Ｃ６Ｈ５）ＣＨ２−よりなる群から選ばれるものであり、ＡとＡ’は互いに同一または異なる２つの単座アミンリガンド、またはＡとＡ’が互いに結合した１つの二座キレート型ジアミンリガンドである。前記ＡとＡ’が２つの単座アミンリガンドである場合、これらのうち少なくとも１つはシクロヘキシルアミン、シクロペンチルアミンまたはベンジルアミンであり、前記１つの二座キレート型ジアミンリガンドはトランス−１，２−ジアミノシクロヘキサンなどのジアミンであってもよい。
【００１５】
また、本発明は、上記の化学式１で表わされる環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートを有効成分として含有する癌治療用組成物に関するものである。
【００１６】
さらに、本発明は、上記の化学式１で表わされる本発明の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲート抗癌剤の製造方法に関するものである。
【００１７】
本発明により、環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートを製造するに当たっては、反応器内に水分が浸透しないように真空及び窒素ラインを用いて全ての工程を行い、反応に供されるあらゆる溶媒は水分が十分に除去されるように乾燥することが好ましい。白金錯体とのカップリング反応は、常に光を遮断した状態で行うことが好ましい。
【００１８】
本発明による環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートは、後述する方法により製造可能である。
【００１９】
先ず、下記の化学式２で表わされる６塩化環状ホスファゼン三量体［（Ｎ＝ＰＣｌ２）３］に、文献に開示された方法（Youn Soo Sohn他、Angew. Chem. Int. Edit. 2006, 45, 6173-6176）に従い６塩化環状ホスファゼン三量体１モルに対して親水性基として分子量３５０以上のポリエチレングリコール３モルと疎水性基としてオリゴペプチド、例えば、トリ−、テトラ−またはペンタ−ペプチドエチルエステル３モルを順次に置換して化学式３で表わされる両親媒性環状ホスファゼン三量体を得る。
【００２０】
【化２】
2010524922.tif 000004
【００２１】
【化３】
2010524922.tif 000005
化学式３において、ｎ、ｍ、ｘ、ｙ、ｚ、Ｒ、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ化学式１における定義と同様である。
【００２２】
その後、上記の化学式３で表わされる両親媒性三量体をアルカリを用いて加水分解させて下記の化学式４で表わされるアルカリ金属塩を得る。
【００２３】
【化４】
2010524922.tif 000006
化学式４において、ｎ、ｍ、ｘ、ｙ、ｚ、Ｒ、Ｒ’及びＲ”はそれぞれ化学式１における定義と同様であり、Ｍは２つのアルカリ金属イオン、好ましくは、２Ｋ＋または２Ｎａ＋であるか、または、１つのアルカリ土金属イオン、好ましくは、Ｂａ２＋である。
【００２４】
化学式４の塩を生成させる反応は、メタノールまたは水などの極性溶媒中において行うことができ、前記アルカリは、次の段階において行うべき白金（II）錯体との反応溶媒の種類によって決定される。すなわち、化学式４のアルカリ金属塩と白金（II）錯体との反応をメタノールなどのアルコール溶媒内において行う場合には、アルカリとして水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムを使用することが好ましく、化学式４のアルカリ金属塩と白金（II）錯体との反応を水溶液中において行う場合には、水酸化バリウムを使用することが好ましい。このとき、アルカリは、化学式３で表わされる環状ホスファゼン三量体に結合されているオリゴペプチド１モルに対して２．４−３．０当量を使用することが適当である。
【００２５】
その後、上記の化学式４で表わされる環状ホスファゼン三量体のアルカリ金属またはアルカリ土金属塩を下記の化学式５で表わされる（ジアミン）白金（II）錯体と反応させて化学式１で表わされる環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートを得る。
【００２６】
【化５】
2010524922.tif 000007
化学式５において、Ａ及びＡ’は化学式１における定義と同様であり、Ｌは１つまたは２つの陰イオンリガンドであり、好ましくは、硫酸イオン（ＳＯ４２−）または硝酸イオン（ＮＯ３−）である。
【００２７】
上記の化学式５の（ジアミン）白金（II）錯体は、抗癌効果はもちろん、水に対する溶解度とナノ粒子の形成有無など化学式１化合物の主な物性を左右するため極めて重要である。本発明においては、白金錯体の抗癌効果、疎水性、溶解度などを決定するアミンの分子構造を十分に考慮して、優れた抗癌効果と強い疎水性を同時に提供するために、ＡとＡ’のうち少なくとも一方はシクロヘキシルアミン、シクロペンチルアミンまたはベンジルアミンのように親脂性が強いアミンであるか、または、ＡとＡ’が互いに結合されているトランス−１，２−ジアミノシクロヘキサンなどのキレート型ジアミンを選択する。
【００２８】
前記陰イオンＬは、化学式４のアルカリの塩の種類及び反応溶媒によって、硝酸イオン及び硫酸イオンのうちから選択される。すなわち、疎水性が強い（ジシクロヘキシルアミン）白金（II）錯体の場合、硫酸塩は有機溶媒に溶解し難いものの、硝酸塩はメタノールに溶解し易い。このため、メタノール溶媒内において（ジシクロヘキシルアミン）白金（II）錯体の硝酸塩を同じ当量にて化学式４の環状ホスファゼン三量体のアルカリ金属塩と約６〜１２時間かけて反応させると、純粋な化学式１の化合物が得られる。しかしながら、（アンミン／シクロヘキシルアミン）白金（II）錯体の硫酸塩は有機溶媒に溶解し難いものの、水には溶解し易いため、化学式４のアルカリ土金属塩と同じ当量にて水において反応させると、不溶性硫酸バリウムが沈殿されるため、沈殿をろ過して除去すれば、純粋な化学式１の化合物が容易に得られる。
【００２９】
下記の反応式１は、上述した本発明の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートの製造方法を例示したものである。
【００３０】
【化６】
2010524922.tif 000008
式中、ｎ、ｍ、ｘ、ｙ、ｚ、Ｒ、Ｒ’、Ｒ”、Ａ及びＡ’はそれぞれ化学式１における定義と同様であり、ＭとＬはそれぞれ化学式４及び５における定義と同様である。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界において通常の知識を持った者にとって自明である。
【００３２】
実施例においては、パーキンエルマーＣ、Ｈ、Ｎ分析器により炭素、水素及び窒素の元素分析を行った。水素の核磁気共鳴スペクトルはブルカーＤＰＸ−２５０ＮＭＲスペクトロメータを、リン核磁気共鳴スペクトルはVarian Gemini−４００ＮＭＲスペクトロメータを用いて得た。水溶液中におけるナノ粒子の粒度分布は、Malvern Zetasizer（Ｎａｎｏ−ＺＳ）を用いて測定した。
【００３３】
実施例１：［トリス（メトキシポリエチレングリコール５５０）トリス（シス−ジシクロヘキシルアミン白金（II）グリシルフェニルアラニルロイシルアスパルテート）］環状ホスファゼン三量体、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ５５０）［ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｓｐ・Ｐｔ・ｃｉｓ−（Ｃ６Ｈ５ＮＨ２）２］｝３の製造
Youn Soo Sohn他らの方法（Angew. Chem. Int. Edit. 2006, 45, 6173-6176）により分子量５５０のメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ５５０）３モルとグリシルフェニルアラニルロイシルアスパチルエチルエステル３モルを置換させた環状ホスファゼン三量体［ＮＰ（ＭＰＥＧ５５０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｓｐＥｔ２）］３（０．５ｇ、０．１５ｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）溶媒内において水酸化カリウム（０．１１ｇ、２．０ｍｍｏｌ）により１２〜２４時間かけて加水分解させた。
【００３４】
加水分解生成物に過量のエチルエーテルまたはｎ−ヘキサンを加えて環状ホスファゼン三量体のカリウム塩［ＮＰ（ＭＰＥＧ５５０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｓｐＫ２）］３を沈殿させた。沈殿をろ過して乾燥させた後、メタノール（２０ｍＬ）溶媒内において光を遮断した状態で（ジシクロヘキシルアミン）白金（II）錯体の硝酸塩であるシス−［（Ｃ６Ｈ５ＮＨ２）２Ｐｔ（ＮＯ３）２（０．３１ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）と１２〜２０時間かけて反応させた。最終反応液を体積が１０ｍＬになるまで真空濃縮させ、分子量５００以下のみ通過可能な透析膜を用いて純粋なメタノールにおいて２４時間、次いで、蒸留水において２４時間かけて透析し且つ冷凍乾燥させて、環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲート｛ＮＰ（ＭＰＥＧ５５０）［ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｓｐ・Ｐｔ・ｃｉｓ−（Ｃ６Ｈ５ＮＨ２）２］｝３を６３％の収率にて得た。
【００３５】
組成式：Ｃ１７４Ｈ３１２Ｎ２１Ｏ６０Ｐ３Ｐｔ３
分子量：４，３３６．６５
元素分析値（％）：Ｃ、４８．００；Ｈ、６．８５；Ｎ、７．０９理論値（％）：Ｃ、４８．１９；Ｈ、７．２５；Ｎ、６．７８
水素核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ３ＯＤ）（δ、ｐｐｍ）：０．８７（ｄ、６Ｈ、Ｌｅｕ−（ＣＨ３）２）、１．１２（ｔ、３Ｈ、Ｇｌｙ−ＯＣＨ２ＣＨ３）、１．４３−１．４６（ｍ、２Ｈ、シクロヘキシルアミンＣ−４プロトン）、１．５３−１．７８（ｍ、２Ｈ、シクロヘキシルアミンＣ−６プロトン）、１．３９−１．４９（ｍ、４Ｈ、シクロヘキシルアミンＣ−３、Ｃ−５プロトン）、２．５７（ｍ、１Ｈ、シクロヘキシルアミン、１−Ｃプロトン）、１．２−１．３（ｍ、３Ｈ、Ｌｅｕ−ＣＨＣＨ２）、２．９５（ｄｄ、２Ｈ、Ｐｈｅ−ＣＨ２）、３．２（ｓ、３Ｈ、ＰＥＧ３５０−ＯＣＨ３）、３．２５−３．６（ｂ、３０Ｈ、ＰＥＧ３５０、ＯＣＨ２ＣＨ２）、３．６５（ｄ、２Ｈ、Ｇｌｙ−ＣＨ２）、４．１（ｄｄ、１Ｈ、Ｌｅｕ−ＣＨ）、４．４２（ｔ、１Ｈ、Ｐｈｅ−ＣＨ）、７．１４（ｍ、Ｐｈｅ−芳香族）。
リン（３１Ｐ）核磁気共鳴スペクトル（Ｄ２Ｏ）（δ、ｐｐｍ）：２２．４
【００３６】
実施例２：［トリス（メトキシポリエチレングリコール５５０）トリス（シス−ジシクロヘキシルアミン白金（II）グリシルフェニルアラニルロイシルグルタメート）］環状ホスファゼン三量体、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ５５０）［ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｕ・Ｐｔ・ｃｉｓ−（Ｃ６Ｈ５ＮＨ２）２］｝３の製造
環状ホスファゼン三量体［ＮＰ（ＭＰＥＧ５５０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｕＥｔ２）］３（０．５ｇ、０．１５ｍｏｌ）とシス−［（Ｃ６Ｈ５ＮＨ２）２Ｐｔ（ＮＯ３）２（０．３１ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）を用い、実施例１における方法と同様にして｛ＮＰ（ＭＰＥＧ５５０）［ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｓｐ・Ｐｔ・ｃｉｓ−（Ｃ６Ｈ５ＮＨ２）２］｝３を６１％の収率にて得た。
【００３７】
組成式：Ｃ１７７Ｈ３１８Ｎ２１Ｏ６０Ｐ３Ｐｔ３
分子量：４，３７８．７３
元素分析値（％）：Ｃ、４８．１２；Ｈ、７．０１；Ｎ、７．０９
理論値（％）：Ｃ、４８．５５；Ｈ、７．３２；Ｎ、６．９２
水素核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ３ＯＤ）（δ、ｐｐｍ）：０．８７（ｄ、６Ｈ、Ｌｅｕ−（ＣＨ３）２）、１．１２（ｔ、３Ｈ、Ｇｌｙ−ＯＣＨ２ＣＨ３）、１．４３−１．４６（ｍ、２Ｈ、シクロヘキシルアミンＣ−４プロトン）、１．５３−１．７８（ｍ、２Ｈ、シクロヘキシルアミンＣ−６プロトン）、１．３９−１．４９（ｍ、４Ｈ、シクロヘキシルアミンＣ−３、Ｃ−５プロトン）、２．５７（ｍ、１Ｈ、シクロヘキシルアミン、１−Ｃプロトン）、１．２−１．３（ｍ、３Ｈ、Ｌｅｕ−ＣＨＣＨ２）、２．１７（ｄｄ、２Ｈ、Ｇｌｕ−ＣＨ２）、５．０６（ｄｄ、１Ｈ、Ｇｌｕ−ＣＨ）、２．９５（ｄｄ、２Ｈ、Ｐｈｅ−ＣＨ２）、３．２（ｓ、３Ｈ、ＰＥＧ３５０−ＯＣＨ３）、３．２５−３．６（ｂ、３０Ｈ、ＰＥＧ３５０、ＯＣＨ２ＣＨ２）、３．６５（ｄ、２Ｈ、Ｇｌｙ−ＣＨ２）、４．１（ｄｄ、１Ｈ、Ｌｅｕ−ＣＨ）、４．４２（ｔ、１Ｈ、Ｐｈｅ−ＣＨ）、７．１４（ｍ、Ｐｈｅ−芳香族）。
リン（３１Ｐ）核磁気共鳴スペクトル（Ｄ２Ｏ）（δ、ｐｐｍ）：２２．４
【００３８】
実施例３：［トリス（メトキシポリエチレングリコール３５０）トリス（シス−アンミンシクロヘキシルアミン白金（II）グリシルフェニルアラニルロイシルマロネート）］環状ホスファゼン三量体、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）［ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＭａｌ・Ｐｔ・ｃｉｓ−（ＮＨ３）（Ｃ６Ｈ５ＮＨ２）］｝３の製造
Youn Soo Sohn他らの方法（Angew. Chem. Int. Edit. 2006, 45, 6173-6176）により分子量３５０のメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ３５０）３モルとグリシルフェニルアラニルロイシルマロニルエチルエステル３モルを置換させた環状ホスファゼン三量体［ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＭａｌＥｔ２）］３（０．５ｇ、０．１９ｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）溶媒内において水酸化バリウム（０．２２ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）により１２〜２４時間かけて加水分解させた。
【００３９】
反応溶液を濃縮させ、過量のエチルエーテルを加えて環状ホスファゼン三量体のバリウム塩［ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＭａｌ・Ｂａ）］３を沈殿させた。このバリウム塩を同じ溶媒システムを用いて再結晶し、蒸留水１０ｍＬに溶かした後、蒸留水（１０ｍＬ）に溶かしたシス−（アンミンシクロヘキシルアミン）白金錯体の硫酸塩、シス−（ＮＨ３）（Ｃ６Ｈ５ＮＨ２）ＰｔＳＯ４（０．２３ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。反応溶液を常温において約１２時間かけてさらに攪拌した後、硫酸バリウムをろ過して除去した。分子量５００以下のみ通過可能な透析膜を用いて蒸留水において２４時間かけて透析し且つ凍結乾燥させて、環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲート｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）［ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＭａｌ・Ｐｔ・ｃｉｓ−（ＮＨ３）（Ｃ６Ｈ５ＮＨ２）］｝３を６３％の収率にて得た。
【００４０】
組成式：Ｃ１２３Ｈ２１６Ｎ２１Ｏ４５Ｐ３Ｐｔ３・２４Ｈ２Ｏ
分子量：３，３８７．３４
元素分析値（％）：Ｃ、３７．７２；Ｈ、６．８５；Ｎ、８．０６
理論値（％）：Ｃ、３８．６８；Ｈ、６．９７；Ｎ、７．７０
水素核磁気共鳴スペクトル（ＣＤ３ＯＤ）（δ、ｐｐｍ）：０．８７（ｄ、６Ｈ、Ｌｅｕ−（ＣＨ３）２）、１．１２（ｔ、３Ｈ、Ｇｌｙ−ＯＣＨ２ＣＨ３）、１．４３−１．４６（ｍ、２Ｈ、シクロヘキシルアミンＣ−４プロトン）、１．５３−１．７８（ｍ、２Ｈ、シクロヘキシルアミンＣ−６プロトン）、１．３９−１．４９（ｍ、４Ｈ、シクロヘキシルアミンＣ−３、Ｃ−５プロトン）、２．５７（ｍ、１Ｈ、シクロヘキシルアミン、１−Ｃプロトン）、１．２−１．３（ｍ、３Ｈ、Ｌｅｕ−ＣＨＣＨ２）、２．９５（ｄｄ、２Ｈ、Ｐｈｅ−ＣＨ２）、３．２（ｓ、３Ｈ、ＰＥＧ３５０−ＯＣＨ３）３．２５−３．６（ｂ、３０Ｈ、ＰＥＧ３５０、ＯＣＨ２ＣＨ２）、３．６５（ｄ、２Ｈ、Ｇｌｙ−ＣＨ２）、４．１（ｄｄ、１Ｈ、Ｌｅｕ−ＣＨ）、４．４２（ｔ、１Ｈ、Ｐｈｅ−ＣＨ）、７．１４（ｍ、Ｐｈｅ−芳香族）。
リン（３１Ｐ）核磁気共鳴スペクトル（Ｄ２Ｏ）（δ、ｐｐｍ）：２２．３
【００４１】
実施例４：［トリス（メトキシポリエチレングリコール３５０）トリス（トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン白金（II）グリシルフェニルアラニルロイシルアスパテート）］環状ホスファゼン三量体、｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）［ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｓｐ・Ｐｔ（Ｈ２ＮＣ６Ｈ４ＮＨ２）］｝３の製造
環状ホスファゼン三量体［ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）（ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｓｐＥｔ２）］３（０．５ｇ、０．１５ｍｏｌ）と（Ｈ２ＮＣ６Ｈ５ＮＨ２）２ＰｔＳＯ４（０．３１ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）を用い、実施例３における方法と同様にして｛ＮＰ（ＭＰＥＧ３５０）［ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｓｐ・Ｐｔ（Ｈ２ＮＣ６Ｈ４ＮＨ２）］｝３を５８％の収率にて得た。
【００４２】
組成式：Ｃ１２６Ｈ２１０Ｎ２１Ｏ４５Ｐ３Ｐｔ３
分子量：３，４２３．３３
元素分析値（％）：Ｃ、４３．７５；Ｈ、６．６５；Ｎ、８．３４
理論値（％）：Ｃ、４４．２１；Ｈ、６．３６；Ｎ、８．５９
水素核磁気共鳴スペクトル（Ｄ２Ｏ）（δ、ｐｐｍ）：０．８７（ｄ、６Ｈ、Ｌｅｕ−（ＣＨ３）２）、１．１２（ｔ、３Ｈ、Ｇｌｙ−ＯＣＨ２ＣＨ３）、１．１−１．３（ｂ、４Ｈ、ｄａｃｈ Ｃ−４、Ｃ−５プロトン）、１．５（ｂ、２Ｈ、ｄａｃｈ Ｃ−３プロトン）、２．１（ｂ、２Ｈ、ｄａｃｈ Ｃ−６プロトン）、２．３（ｂ、２Ｈ、ｄａｃｈ Ｃ−１、Ｃ−２プロトン）、１．２−１．３（ｍ、３Ｈ、Ｌｅｕ−ＣＨＣＨ２）、２．９５（ｄｄ、２Ｈ、Ｐｈｅ−ＣＨ２）、３．２（ｓ、３Ｈ、ＰＥＧ３５０−ＯＣＨ３）３．２５−３．６（ｂ、３０Ｈ、ＰＥＧ３５０、ＯＣＨ２ＣＨ２）、３．６５（ｄ、２Ｈ、Ｇｌｙ−ＣＨ２）、４．１（ｄｄ、１Ｈ、Ｌｅｕ−ＣＨ）、４．４２（ｔ、１Ｈ、Ｐｈｅ−ＣＨ）、７．１４（ｍ、Ｐｈｅ−芳香族）
リン（３１Ｐ）核磁気共鳴スペクトル（Ｄ２Ｏ）（δ、ｐｐｍ）：２２．４
【００４３】
実施例５：実施例１及び３において得た生成物の粒度分布試験結果
動的光散乱（ＤＬＳ：Dynamic light scattering）法を用いて後述する手順に従い本発明の実施例において合成された環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートが水溶液中において親脂性基の相互作用により凝集されて安定したナノ粒子を形成するかどうかを確認し、その平均粒径を測定した。実施例１及び３のホスファゼン−白金錯体コンジュゲートをそれぞれ蒸留水に０．１−０．５％にて溶解させた水溶液をＤＬＳ法により測定した結果、水溶液においてミセルよりも遥かに大きくて安定したナノ粒子が形成されることを観察することができた。図１から明らかなように、実施例１の生成物は白金錯体（II）に配位されている疎水性の強い２つのシクロヘキシルリガンドに起因して約２００ｎｍの大きな平均直径を示し、実施例３の場合、白金（II）錯体に配位されているシクロヘキシルアミンリガンドが１つであって疎水性がやや低いため、平均１０５ｎｍのナノ粒子が形成されることが確認された。
【００４４】
実施例６：環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートの癌組織透過及び保有性効果に対する生体組織分布試験
本発明の環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートの透過及び保有性効果による癌組織選択性実験を下記のようにして実施した。
【００４５】
８〜９週齢の実験用ラット（Sprague-Dawley rat）（２５０−２８０ｇ）を４日間の順応期間を経た後、１匹につき１０６個のSarcoma−１８０細胞を背部位に移植した。２週が経過した後、癌組織が直径１０ｍｍまで大きくなったとき、ラットを２つの群に分け、実施例１において製造した環状ホスファゼン三量体−白金錯体コンジュゲートの生理食塩水溶液を２０ｍｇ／ｋｇずつ静脈注射した。それぞれ２時間及び２４時間が経過した後に実験用ラットから腫瘍組織、正常筋肉、肺、肝、腎臓及び血液などを取り、各組織の白金濃度を測定した。下記表１は、実施例１の薬物投与後２時間及び２４時間における組織分布試験結果（各組織の白金分布とＴＴＲ（腫瘍／正常組織）の値にて示す白金含量）を示すものである。表１から、本発明によるナノ粒子型環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートの癌組織選択性が極めて優れていることが分かる。
【００４６】
【表１】
2010524922.tif 000009
【００４７】
実施例７：環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートのヒト癌細胞株に対する生体外（in vitro）抗癌活性試験
本発明の実施例１及び３において製造したナノ粒子型白金（II）錯体を、Rita Song他らの文献に報告された方法（J. Control. Release 105 (2005) 142-150）に従い４種の主なヒト癌細胞株に対して生体外抗癌活性試験を実施した。下記表２は、実施例１及び３において製造したナノ粒子型白金（II）錯体の生体外抗癌活性試験結果を示すものである。
【００４８】
下記表２は、実施例１及び３においてそれぞれ製造したナノ粒子型白金（II）錯体の抗癌効果をまとめて示すものである。表２から明らかなように、白金周りの配位リガンドが類似のアスパルト酸またはマロン酸を含む環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体（実施例１及び３）の生体外細胞毒性は、標準物質として使用した低分子量のカルボプラチンとほとんど同様であった。本発明による高分子型前駆薬物の親脂性及びオリゴペプチドの酵素分解性などを考慮するとき、生体内（in vivo）試験において徐放性と優れた薬物代謝が予想されるため、抗癌効果にも優れていることが期待される。
【００４９】
【表２】
2010524922.tif 000010
【００５０】
本発明により、癌組織選択性に優れ、しかも、抗癌活性に優れたナノ粒子型環状ホスファゼン三量体−白金（II）錯体コンジュゲートが提供された。本発明のナノ粒子型ホスファゼン−白金（II）錯体は、癌組織に対する透過及び保有性効果に優れていて癌組織選択性が高いことから、副作用があまりなく、治療効果は高い新規な抗癌剤として汎用できるものと期待される。
【００５１】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
2010524922.tif 000017
【図２】
2010524922.tif 000018
【国際調査報告】
2010524922.tif 000019
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