(57)【要約】本開示は、天然に存在する野生型ケトレダクターゼ酵素と比較して改善された特性を有する操作されたケトレダクターゼ酵素を提供する。その操作されたケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、その操作されたケトレダクターゼ酵素を発現することができる宿主細胞、およびその操作されたケトレダクターゼ酵素を使用して種々のキラル化合物を合成する方法もまた提供される。１つの局面において、本開示は、２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステル（「基質」）を（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエート（「生成物」）に還元することができるか、または変換することができるケトレダクターゼポリペプチドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４のポリペプチドの速度の少なくとも１．５倍の速度で基質２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに変換することができるケトレダクターゼポリペプチド。
【請求項２】
少なくとも約９５％の立体異性体過剰率で前記基質を前記生成物に変換することができる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも約９９％の立体異性体過剰率で前記基質を前記生成物に変換することができる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
以下の特徴：Ｘ１９０に対応する残基がプロリンである、およびＸ２０２に対応する残基がトリプトファンである；を有するが、但し、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基が拘束残基であり、且つ、Ｘ２０２に対応する残基が芳香族残基である、アミノ酸配列を有することを条件とする、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
以下の特徴：Ｘ１９０に対応する残基がプロリンである；Ｘ１９５に対応する残基がアルギニンである；およびＸ２０２に対応する残基がトリプトファンである；を有するが、但し、前記ケトレダクターゼポリペプチドは、該Ｘ１９０に対応する残基が拘束残基であり、Ｘ１９５に対応する残基が塩基性、酸性、非極性または極性残基であり；且つ、Ｘ２０２に対応する残基が芳香族残基である、アミノ酸配列を有することを条件とする、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｘ１９０に対応する残基がプロリンであり、且つ、前記Ｘ２０２に対応する残基がトリプトファンである、アミノ酸配列を含む、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｘ１９０に対応する残基がプロリンであり、Ｘ１９５に対応する残基がアルギニンであり、且つ、Ｘ２０２に対応する残基がトリプトファンである、アミノ酸配列を含む、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基である；
Ｘ１７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２５に対応する残基が、極性または酸性残基である；
Ｘ２７に対応する残基が、芳香族残基である；
Ｘ４１に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ５３に対応する残基が、極性、非極性または酸性残基である；
Ｘ５７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ６４に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ６６に対応する残基が、酸性残基である；
Ｘ６８に対応する残基が、極性、酸性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ７２に対応する残基が、塩基性残基である；
Ｘ７６に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基である；
Ｘ８０に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基である；
Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９５に対応する残基が、脂肪族、非極性または酸性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９７に対応する残基が、塩基性、拘束または極性残基である；
Ｘ１００に対応する残基が、塩基性、酸性、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性または拘束残基である；
Ｘ１１１に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１３９に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１４５に対応する残基が、酸性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１４８に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１５１に対応する残基が、拘束、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１５２に対応する残基が、極性、芳香族、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１６３に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１６５に対応する残基が、極性、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１７９に対応する残基が、芳香族、塩基性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１９７に対応する残基が、酸性残基である；
Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基である；
Ｘ２１０に対応する残基が、極性または塩基性残基である；
Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基である；
Ｘ２１２に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性である；
Ｘ２１６に対応する残基が、拘束または塩基性残基である；
Ｘ２２３に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２２６に対応する残基が、非極性または極性残基である；
Ｘ２３３に対応する残基が、極性または酸性である；
Ｘ２３５に対応する残基が、極性または芳香族残基である；
Ｘ２４８に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；
Ｘ２４９に対応する残基が、芳香族残基である；
のうちの１つ以上をさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置に１つ以上の残基の相違を場合によっては有する、請求項４から７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、ヒスチジンである；
Ｘ１７に対応する残基が、メチオニンである；
Ｘ２５に対応する残基が、アスパラギン酸である；
Ｘ２７に対応する残基が、チロシンである；
Ｘ４１に対応する残基が、セリンまたはアラニンである；
Ｘ５３に対応する残基が、アスパラギン酸である；
Ｘ５７に対応する残基が、バリンである；
Ｘ６４に対応する残基が、バリンである；
Ｘ６６に対応する残基が、グルタミン酸である；
Ｘ６８に対応する残基が、バリンである；
Ｘ７２に対応する残基が、アルギニンである；
Ｘ７６に対応する残基が、アラニンである；
Ｘ８０に対応する残基が、トレオニンまたはバリンである；
Ｘ９３に対応する残基が、セリンである；
Ｘ９４に対応する残基が、システインまたはグリシンである；
Ｘ９５に対応する残基が、ロイシンまたはグルタミン酸である；
Ｘ９６に対応する残基が、システイン、アスパラギン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；
Ｘ９７に対応する残基が、ヒスチジンまたはセリンである；
Ｘ１００に対応する残基が、リシンである；
Ｘ１０８に対応する残基が、ヒスチジンである；
Ｘ１１１に対応する残基が、メチオニンである；
Ｘ１３９に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ１４５に対応する残基が、グルタミンまたはロイシンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ１４８に対応する残基が、バリンである；
Ｘ１５１に対応する残基が、アラニンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、セリンである；
Ｘ１６３に対応する残基が、イソロイシンである；
Ｘ１６５に対応する残基が、アスパラギンである；
Ｘ１７３に対応する残基が、バリンである；
Ｘ１７９に対応する残基が、フェニルアラニン、リシンまたはロイシンである；
Ｘ１９４に対応する残基が、グルタミン、セリンまたはロイシンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ１９７に対応する残基が、グルタミン酸である；
Ｘ１９８に対応する残基が、グルタミン酸またはグルタミンである；
Ｘ２１０に対応する残基が、アルギニンである；
Ｘ２１１に対応する残基が、バリン、ロイシン、トレオニンまたはイソロイシンである；
Ｘ２１２に対応する残基が、セリンまたはバリンである；
Ｘ２１６に対応する残基が、アルギニンである；
Ｘ２２３に対応する残基が、バリンである；
Ｘ２２６に対応する残基が、トレオニンである；
Ｘ２３３に対応する残基が、アスパラギンまたはアスパラギン酸である；
Ｘ２３５に対応する残基が、トリプトファンである；
Ｘ２４８に対応する残基が、グリシンまたはトリプトファンである；
Ｘ２４９に対応する残基が、トリプトファンである；
のうちの１つ以上をさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置に１つ以上の残基の相違を場合によっては有する、請求項４から７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基である、および
Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基である；
のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置に１つ以上の残基の相違を場合によっては有する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基である、
Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基である；
のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置に１つ以上の残基の相違を場合によっては有する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基である；
のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置に１つ以上の残基の相違を場合によっては有する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基である；
のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置に１つ以上の残基の相違を場合によっては有する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基である；；
のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置に１つ以上の残基の相違を場合によっては有する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基である；
のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置に１つ以上の残基の相違を場合によっては有する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１００に対応する残基が、塩基性、酸性、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１５２に対応する残基が、極性、芳香族、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基である；
のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置に１つ以上の残基の相違を場合によっては有する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基である；
Ｘ６６に対応する残基が、酸性残基である；
Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基である；
Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基である；
のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置に１つ以上の残基の相違を場合によっては有する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基である；
Ｘ１７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２７に対応する残基が、芳香族残基である；
Ｘ６４に対応する残基が、極性、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ６６に対応する残基が、酸性残基である；
Ｘ８０に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基である；
Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１００に対応する残基が、塩基性または拘束残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基である；
Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基である；
Ｘ２１６に対応する残基が、拘束または塩基性残基である；
のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置位置に１つ以上の残基の相違を場合によっては有する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基である；
Ｘ１７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ２７に対応する残基が、芳香族残基である；
Ｘ６４に対応する残基が、極性、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ８０に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基である；
Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１００に対応する残基が、塩基性または拘束残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基である；
Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基である；
Ｘ２１６に対応する残基が、拘束または塩基性残基である；
のすべてをさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置に１つ以上の残基の相違を場合によっては有する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：
Ｘ７に対応する残基が、ヒスチジンである；
Ｘ１７に対応する残基が、メチオニンである；
Ｘ２７に対応する残基が、芳香族残基である；
Ｘ６４に対応する残基が、チロシンである；
Ｘ８０に対応する残基が、トレオニンである；
Ｘ９３に対応する残基が、セリンである；
Ｘ９４に対応する残基が、システインである；
Ｘ９６に対応する残基が、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである；
Ｘ１００に対応する残基が、リシンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ１９４に対応する残基が、グルタミンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ１９８に対応する残基が、グルタミン酸である；
Ｘ２１１に対応する残基が、バリンである；
Ｘ２１６に対応する残基が、アルギニンである；
のすべてをさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置に１つ以上の残基の相違を場合によっては有する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：Ｘ７に対応する残基が、ヒスチジンである；Ｘ９６に対応する残基が、トレオニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、ロイシンである；およびＸ１９６に対応する残基が、ロイシンである、を有する、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：Ｘ９３に対応する残基が、セリンである；Ｘ９４に対応する残基が、システインである；Ｘ９６に対応する残基が、ロイシンである；およびＸ２１１に対応する残基が、バリンである、をさらに有する、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：Ｘ１７に対応する残基が、メチオニンである；Ｘ２７に対応する残基が、チロシンである；Ｘ６４に対応する残基が、バリンである；Ｘ８０に対応する残基が、トレオニンである；およびＸ１００に対応する残基が、リシンである、をさらに有する、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：Ｘ６６に対応する残基が、グルタミン酸である；Ｘ９６に対応する残基が、イソロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、グルタミンである；Ｘ１９８に対応する残基が、グルタミン酸である；およびＸ２１６に対応する残基が、アルギニンである、をさらに有する、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、さらなる以下の特徴：Ｘ６６に対応する残基が、グルタミン酸である；Ｘ９６に対応する残基が、イソロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、グルタミンである；およびＸ１９８に対応する残基が、グルタミン酸である、を有する、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：Ｘ１９４に対応する残基が、グルタミンである；Ｘ１９８に対応する残基が、グルタミン酸である；およびＸ２１６に対応する残基が、アルギニンである、をさらに有する、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ケトレダクターゼアミノ酸配列が、以下の特徴：Ｘ１７に対応する残基が、メチオニンである；Ｘ２７に対応する残基が、チロシンである；Ｘ６４に対応する残基が、バリンである；Ｘ６６に対応する残基が、アスパラギン酸である；Ｘ８０に対応する残基が、トレオニンである；Ｘ９６に対応する残基が、イソロイシンまたはロイシンである；およびＸ１００に対応する残基が、リシンである、をさらに有する、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記ケトレダクターゼポリペプチドが、以下の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、プロリンである、およびＸ２０２に対応する残基が、トリプトファンである；を有するが、但し、ケトレダクターゼドメインまたは領域が、Ｘ１９０に対応する残基が拘束残基であり、且つ、Ｘ２０２に対応する残基が芳香族残基である、アミノ酸配列を有することを条件とする、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の残基９０から２１１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する領域またはドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記ケトレダクターゼポリペプチドが、以下の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、プロリンである；Ｘ１９５に対応する残基が、アルギニンである；およびＸ２０２に対応する残基が、トリプトファンである；を有するが、但し、ケトレダクターゼドメインまたは領域が、Ｘ１９０に対応する残基が拘束残基であり、Ｘ１９５に対応する残基が塩基性、酸性、非極性または極性残基であり；且つ、Ｘ２０２に対応する残基が、芳香族残基である、アミノ酸配列を有することを条件とする、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の残基９０から２１１と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有する領域またはドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、Ｘ１９０に対応する残基がプロリンであり、且つ、Ｘ２０２に対応する残基がトリプトファンである、アミノ酸配列を含む、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、Ｘ１９０に対応する残基がプロリンであり、Ｘ１９５に対応する残基がアルギニンであり、且つ、Ｘ２０２に対応する残基がトリプトファンである、アミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、以下の特徴：
Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９５に対応する残基が、脂肪族、非極性または酸性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９７に対応する残基が、塩基性、拘束または極性残基である；
Ｘ１００に対応する残基が、塩基性、酸性、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性または拘束残基である；
Ｘ１１１に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１３９に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１４５に対応する残基が、酸性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１４８に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１５１に対応する残基が、拘束、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１５２に対応する残基が、極性、芳香族、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１６３に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１６５に対応する残基が、極性、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１７３に対応する残基が、酸性、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１７９に対応する残基が、芳香族、塩基性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１９７に対応する残基が、酸性残基である；
Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基である；
Ｘ２１０に対応する残基が、極性または塩基性残基である；
Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基である；
のうちの１つ以上をさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基の位置に１つ以上の相違を場合によっては有し得る、請求項２８から３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、以下の特徴：
Ｘ９３に対応する残基が、セリンである；
Ｘ９４に対応する残基が、システインまたはグリシンである；
Ｘ９５に対応する残基が、ロイシンまたはグルタミン酸である；
Ｘ９６に対応する残基が、システイン、アスパラギン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；
Ｘ９７に対応する残基が、ヒスチジンまたはセリンである；
Ｘ１００に対応する残基が、リシンである；
Ｘ１０８に対応する残基が、ヒスチジンである；
Ｘ１１１に対応する残基が、メチオニンである；
Ｘ１３９に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ１４５に対応する残基が、グルタミンまたはロイシンである；
Ｘ１４７に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ１５１に対応する残基が、アラニンである；
Ｘ１５２に対応する残基が、セリンである；
Ｘ１６３に対応する残基が、イソロイシンである；
Ｘ１６５に対応する残基が、アスパラギンである；
Ｘ１７３に対応する残基が、バリンである；
Ｘ１７９に対応する残基が、フェニルアラニン、リシンまたはロイシンである；
Ｘ１９４に対応する残基が、グルタミン、セリンまたはロイシンである；
Ｘ１９６に対応する残基が、ロイシンである；
Ｘ１９７に対応する残基が、グルタミン酸である；
Ｘ１９８に対応する残基が、グルタミン酸またはグルタミンである；
Ｘ２１０に対応する残基が、アルギニンである；
Ｘ２１１に対応する残基が、バリン、ロイシン、アルギニン、トレオニンまたはイソロイシンである；
のうちの１つ以上をさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基の位置に１つ以上の相違を場合によっては有し得る、請求項２８から３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ケトレダクターゼドメインまたは領域が、以下の特徴：
Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１００に対応する残基が、塩基性、酸性、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基である；
Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；
Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基である；
Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基である；
のすべてをさらに有し、ここで、該アミノ酸配列は、前記参照配列と比較して残基９０〜２１１に対応するドメイン内の他のアミノ酸残基の位置に１つ以上の相違を場合によっては有し得る、請求項２８から３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ケトレダクターゼが、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８および１１０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記ケトレダクターゼが、前記参照ポリペプチドよりも少なくとも１〜５０倍速い速度で前記基質を前記生成物に変換することができる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記ケトレダクターゼが、配列番号４２、４４、４６、４８、８６、８８、９２、９４、９６、１００または１０２に対応するアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記ケトレダクターゼが、前記参照ポリペプチドよりも少なくとも５０〜２５０倍速い速度で前記基質を前記生成物に変換することができる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
配列番号１０、３２、３４、３６、５０、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、９８、１０４、１０６および１０８に対応するアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
前記参照ポリペプチドよりも少なくとも２５０〜１０００倍速い速度で前記基質を前記生成物に変換することができる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
配列番号１２、１８、２２、２４、２６、２８、３０、３８、４０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および１１０に対応するアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記参照ポリペプチドよりも少なくとも１０００倍速い速度で前記基質を前記生成物に変換することができる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
配列番号６、８、１４、１６および２０に対応するアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
約１００ｇ／Ｌを超える基質および約５ｇ／Ｌ未満の前記ポリペプチドを用いて行われるとき、約２４時間未満で該基質の少なくとも約９５％を前記生成物に変換することができる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
配列番号６、８、１４、１６および２０に対応するアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記参照ポリペプチドと比較して、前記基質の前記生成物への変換に対する競合的インヒビターとしてのアセトンに対して改善された抵抗性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記ケトレダクターゼが、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９８、１０４、１０６、１０８および１１０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
請求項１〜４６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４９】
配列番号に対応する配列から選択される、請求項４８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５０】
宿主細胞における発現の指図に適する制御配列に作動可能に連結された請求項４８に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項５１】
前記制御配列が、プロモーターを含む、請求項５０に記載の発現ベクター。
【請求項５２】
前記プロモーターが、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターを含む、請求項５１に記載の発現ベクター。
【請求項５３】
請求項５０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５４】
Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項５３に記載の宿主細胞。
【請求項５５】
前記ポリペプチドをコードする発現ベクターのコドンが、前記宿主細胞における発現のために最適化されている、請求項５３に記載の宿主細胞。
【請求項５６】
請求項１〜４６のいずれか１項に記載のケトレダクターゼ、および構造式（Ｉ）の基質２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステル；構造式（ＩＩ）の生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエート；構造式（ＩＩＩ）の基質２−［２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］フェニル］−２−プロパノール；または構造式（ＩＶ）の生成物（Ｓ，Ｅ）−１−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−（２−（２−ヒドロキシプロパン−２−イル）フェニル）プロパン−１−オールを含む、組成物。
【請求項５７】
前記基質が、構造式（Ｉ）の基質であり、そして前記組成物が、構造式（ＩＩ）の生成物をさらに含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記基質が、構造式（ＩＩ）の基質であり、そして前記組成物が、構造式（ＩＶ）の生成物をさらに含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５９】
補因子再生系をさらに含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項６０】
前記補因子再生系が、グルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース；ギ酸デヒドロゲナーゼおよびホルマート；またはイソプロパノールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
式（Ｉ）の基質２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを式（ＩＩ）の生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに還元するための方法であって、式（Ｉ）の該基質を式（ＩＩ）の該生成物に還元するか、または変換するのに適する反応条件下で、該基質と請求項１〜４６のいずれか１項に記載のケトレダクターゼポリペプチドとを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項６２】
前記生成物が、約９９％より高い立体異性体過剰率で存在する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記基質の少なくとも約９５％が、約２４時間未満で前記生成物に還元され、ここで、該基質の濃度は、少なくとも１００ｇ／Ｌであり、且つ、前記ポリペプチドの濃度は、約５ｇ／Ｌ未満であり、そして該ポリペプチドは、配列番号６、８、１４、１６および２０に対応するアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６４】
前記ケトレダクターゼ酵素を発現する全細胞またはそのような細胞の抽出物もしくは溶解産物を用いて行われる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記ケトレダクターゼが、単離され、そして／または精製され、そして前記還元反応が、該ケトレダクターゼのための補因子および場合によっては該補因子のための再生系の存在下において行われる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記補因子再生系が、グルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース；ギ酸デヒドロゲナーゼおよびホルマート；またはイソプロパノールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記第二級アルコールデヒドロゲナーゼが、前記ケトレダクターゼである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
式（ＩＩＩ）の基質２−［２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］フェニル］−２−プロパノールを生成物（Ｓ，Ｅ）−１−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−（２−（２−ヒドロキシプロパン−２−イル）フェニル）プロパン−１−オールに還元するための方法であって、式（ＩＩＩ）の該基質を式（ＩＶ）の生成物に還元するのに適する反応条件下で、該基質と請求項１〜４６のいずれか１項に記載のケトレダクターゼポリペプチドとを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項６９】
前記生成物が、約９９％を超える立体異性体過剰率で存在する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記基質の少なくとも約９５％が、約２４時間未満で前記生成物に還元され、ここで、該基質の濃度は、少なくとも１００ｇ／Ｌであり、且つ、前記ポリペプチドの濃度は、約５ｇ／Ｌ未満であり、そして該ポリペプチドは、配列番号６、８、１４、１６および２０に対応するアミノ酸配列を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記ケトレダクターゼ酵素を発現する全細胞またはそのような細胞の抽出物もしくは溶解産物を用いて行われる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記ケトレダクターゼが、単離され、そして／または精製され、そして前記還元反応が、該ケトレダクターゼのための補因子および場合によっては該補因子のための再生系の存在下において行われる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記補因子再生系が、グルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース；ギ酸デヒドロゲナーゼおよびホルマート；またはイソプロパノールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記第二級アルコールデヒドロゲナーゼが、前記ケトレダクターゼである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
式（ＸＸ）：
【化２１】
2010539948.tif 000033
の化合物を合成するための方法であって、
ここで、Ｒ１は、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニルであり、該方法は：（ａ）式（Ｉ）の基質２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを式（ＩＩ）の生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに還元するか、または変換するのに適する反応条件下で、式（Ｉ）の該基質と請求項１〜４６のいずれか１項に記載のケトレダクターゼポリペプチドとを接触させることによって該基質を式（ＩＩ）の該生成物に還元する工程；および（ｂ）化合物（ＸＸ）の形成に適する条件下で、式（ＩＩ）の化合物とアルキルスルホニルハロゲン化物またはアリールスルホニルハロゲン化物とを反応させる工程を包含する、方法。
【請求項７６】
前記アルキルスルホニルハロゲン化物が、塩化メチルスルホニルである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
式（ＸＸＩ）：
【化２２】
2010539948.tif 000034
の化合物を合成するための方法であって、
ここで、Ｒ１は、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニルであり、該方法は：
（ａ）式（ＩＩＩ）の基質２−［２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］フェニル］−２−プロパノールを式（ＩＶ）の生成物（Ｓ，Ｅ）−１−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−（２−（２−ヒドロキシプロパン−２−イル）フェニル）プロパン−１−オールに還元するか、または変換するのに適する反応条件下で、式（ＩＩＩ）の該基質と請求項１〜４６のいずれか１項に記載のケトレダクターゼポリペプチドとを接触させることによって該基質を式（ＩＶ）の該生成物に還元する工程；および（ｂ）化合物（ＸＸＩ）の形成に適する条件下で、式（ＩＶ）の化合物とアルキルスルホニルハロゲン化物またはアリールスルホニルハロゲン化物とを反応させる工程を包含する、方法。
【請求項７８】
前記アルキルスルホニルハロゲン化物が、塩化メチルスルホニルである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
化合物（Ｖ）
【化２３】
2010539948.tif 000035
またはその塩、水和物もしくは溶媒和化合物を合成するための方法であって、ここで、
該方法における工程は、式（Ｉ）の基質２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを式（ＩＩ）の生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに還元するか、または変換するのに適する反応条件下で、式（Ｉ）の該基質と請求項１〜４６のいずれか１項に記載のケトレダクターゼポリペプチドとを接触させることによって該基質を式（ＩＩ）の該生成物に還元する工程を包含する、方法。
【請求項８０】
化合物（Ｖ）
【化２４】
2010539948.tif 000036
またはその塩、水和物もしくは溶媒和化合物を合成するための方法であって、ここで、該方法における工程は、式（ＩＩＩ）の基質２−［２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］フェニル］−２−プロパノールを式（ＩＶ）の生成物（Ｓ，Ｅ）−１−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−（２−（２−ヒドロキシプロパン−２−イル）フェニル）プロパン−１−オールに還元するのに適する反応条件下で、式（ＩＩＩ）の該基質と請求項１〜４６のいずれか１項に記載のケトレダクターゼポリペプチドとを接触させることによって該基質を式（ＩＶ）の該生成物に還元する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の引用
本願は、米国特許法第１１９条第（ｅ）項のもとで、２００７年９月２８日に出願された出願番号６０／９７６，３４５の利益を主張する。この出願の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
２．配列表、表またはコンピュータプログラムの援用
米国特許法施行規則第１．８２１条のもとでＥＦＳ−Ｗｅｂを介してコンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）で３７６２４７−０１８．ｔｘｔとのファイル名で、本願と同時に提出された配列表は、本明細書中に参考として援用される。この配列表の電子コピーは、２５４キロバイトのファイルサイズで、２００８年９月２８日に作成された。
【背景技術】
【０００３】
３．背景
ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）またはカルボニルレダクターゼクラス（ＥＣ１．１．１．１８４）に属する酵素は、対応するプロ立体異性体ケトン基質または対応するラセミ体アルデヒド基質からの光学活性アルコールの合成に有用である。ＫＲＥＤは、代表的に、ケトンまたはアルデヒドを対応するアルコール生成物に変換するが、逆反応、すなわちアルコール基質の対応するケトン／アルデヒド生成物への酸化も触媒し得る。ＫＲＥＤなどの酵素によるケトンおよびアルデヒドの還元、ならびにアルコールの酸化は、補因子、最も一般的には還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、および酸化反応にはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を必要とする。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、電子供与体としての役割を果たし、その一方でＮＡＤおよびＮＡＤＰは、電子受容体としての役割を果たす。ケトレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼが、リン酸化された補因子またはリン酸化されていない補因子のいずれか（その酸化および還元状態のもの）を受容することが、多くの場合、観察される。
【０００４】
ＫＲＥＤ酵素は、広範にわたる細菌および酵母において見つけることができる（概説について：ＫｒａｕｓおよびＷａｌｄｍａｎ，Ｅｎｚｙｍｅ  ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｖｏｌｓ．１＆２．ＶＣＨ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  １９９５；Ｆａｂｅｒ，Ｋ．，Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．２０００；非特許文献１）。幾つかのＫＲＥＤ遺伝子および酵素配列が報告されている。例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ  （Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＣ７３３８；ＧＩ：１１３６０５３８）Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ２４５２８．１；ＧＩ：２８１５４０９）、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ１６０７９９；ＧＩ：６５３９７３４）。
【０００５】
重要な化合物の生産のための多くの化学合成手順を回避するために、異なるケトおよびアルデヒド基質のキラルアルコール生成物への酵素的変換にケトレダクターゼが利用されることが増えている。これらの用途は、ケトレダクターゼを発現する全細胞を生体触媒的ケトン還元に利用することがあり、または全細胞中の多数のケトレダクターゼの存在が所望の生成物の立体化学的純度および収量に悪影響を及ぼす場合には精製された酵素を利用することもある。インビトロ用途には、補因子（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）再生酵素、例えばグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ギ酸デヒドロゲナーゼなどがケトレダクターゼと併用される。有用な化合物を生成するためにケトレダクターゼを使用する例としては、４−クロロアセト酢酸エステルの不斉還元（非特許文献２；非特許文献３；特許文献１；特許文献２および特許文献３）、ジオキソカルボン酸の還元（例えば、特許文献４）、（Ｓ）クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔ−ブチルの還元（例えば、特許文献５および特許文献６）、ピロロトリアジン系化合物の還元（例えば、特許文献７）；置換アセトフェノンの還元（例えば、特許文献８）；およびケトチオランの還元（特許文献９）が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，５５９，０３０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７００，６７０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８９１，６８５号明細書
【特許文献４】米国特許第６，３９９，３３９号明細書
【特許文献５】米国特許第６，６４５，７４６号明細書
【特許文献６】国際公開第０１／４０４５０号パンフレット
【特許文献７】米国特許出願公開第２００６／０２８６６４６号明細書
【特許文献８】米国特許第６，８００，４７７号明細書
【特許文献９】国際公開第２００５／０５４４９１号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＨｕｍｍｅｌおよびＫｕｌａ，１９８９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８４：１〜１３
【非特許文献２】Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８３，１０５：５９２５−５９２６
【非特許文献３】Ｓａｎｔａｎｉｅｌｌｏ，Ｊ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（Ｓ）１９８４：１３２−１３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
様々なケトおよびアルデヒド基質のその対応するキラルアルコール生成物への変換を行うために使用することができる他のケトレダクターゼ酵素を同定することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
４．要旨
１つの局面において、本開示は、２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステル（「基質」）を（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエート（「生成物」）に還元することができるか、または変換することができるケトレダクターゼポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびそのポリペプチドを使用するための方法を提供する。比較すると、天然に存在するケトレダクターゼは、特定のケトン基質を対応するアルコール生成物に還元するか、または変換する際に著しい活性を示さない。
【００１０】
本開示の操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種のケトレダクターゼ由来である。また、いくつかの実施形態において、本開示の操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、特定のケトン基質を対応するアルコール生成物に変換する際に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ（「Ｌ．ｋｅｆｉｒ」；配列番号４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（「Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ」；配列番号２）およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒ（「Ｌ．ｍｉｎｏｒ」，配列番号１１４）から得られる天然に存在する野生型ケトレダクターゼ酵素よりも高い活性を有する。いくつかの実施形態において、その操作されたケトレダクターゼは、配列番号２、４または１１４の配列と比較して、少なくとも以下の特徴：（１）１９０位（すなわち、Ｘ１９０）に対応する残基が、拘束残基である、および（２）２０２位（すなわちＸ２０２）に対応する残基が、芳香族残基である、を有する。いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼは、配列番号２、４または１１４の配列と比較して、少なくとも以下の特徴：（１）１９０位（すなわち、Ｘ１９０）に対応する残基が、拘束残基である；（２）１９５位（すなわち、Ｘ１９５）に対応する残基が、塩基性、酸性、非極性または極性残基である；および（３）２０２位（Ｘ２０２）に対応する残基が、芳香族残基である、を有する。
【００１１】
上に記載した特徴に加えて、本ケトレダクターゼは、配列番号２、４または１１４の配列と比較して、他の残基の位置に１つ以上の残基の相違を有し得る。いくつかの実施形態において、本明細書中のケトレダクターゼポリペプチドは、以下の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、拘束残基、特に、プロリンである；およびＸ２０２に対応する残基が、芳香族残基、特に、トリプトファンである；を有するが、但し、本ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴、すなわち、Ｘ１９０に対応する残基が、拘束残基である；およびＸ２０２に対応する残基が、芳香族残基である、を有することを条件とする、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも以下の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、プロリンである；およびＸ２０２に対応する残基が、トリプトファンである、を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本明細書中のケトレダクターゼポリペプチドは、以下の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、拘束残基、特に、プロリンである；Ｘ１９５に対応する残基が、塩基性、酸性、非極性または極性残基、特に、プロリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸またはアスパラギンである；およびＸ２０２に対応する残基が、芳香族残基、特に、トリプトファンである；を有するが、但し、本ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴、すなわち、Ｘ１９０に対応する残基が、拘束残基である；Ｘ１９５に対応する残基が、塩基性、酸性、非極性または極性残基である；およびＸ２０２に対応する残基が、芳香族残基である、を有することを条件とする、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも以下の特徴：Ｘ１９０に対応する残基が、プロリンである；Ｘ１９５に対応する残基が、プロリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸またはアスパラギンである；およびＸ２０２に対応する残基が、トリプトファンである、を有する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、例えば、改善された特性が、単一残基の相違または特定の組み合わせの残基の相違からのものである場合、操作されたケトレダクターゼは、参照配列と比較して、そのポリペプチド内の他の位置に１つ以上の保存的残基の相違を場合によっては含み得る。いくつかの実施形態において、他の残基の位置にさらなる残基の相違が組み込まれることにより、酵素特性のさらなる改善がもたらされ得る。これらの改善は、規定の基質に対する酵素活性をさらに高め得るが、立体選択性の増大、熱安定性、溶媒安定性および／または低い生成阻害も含み得る。１つ以上の改善された酵素特性をもたらし得る様々な残基の相違が、詳細な説明に提供される。いくつかの実施形態において、これらの操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１１１、１１２および１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１に対応する残基）において明らかにされている配列式に基づく。配列番号１１２は、Ｌ．ｋｅｆｉｒケトレダクターゼの野生型アミノ酸配列（配列番号４）に基づき；配列番号１１１は、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓケトレダクターゼの野生型アミノ酸配列（配列番号２）に基づき；そして配列番号１３９は、Ｌ．ｍｉｎｏｒケトレダクターゼの野生型アミノ酸配列（配列番号１１４）に基づく。上記配列式は、Ｘ１９０に対応する残基が拘束残基であり；Ｘ１９５に対応する残基が塩基性、酸性、非極性または極性残基であり；そしてＸ２０２に対応する残基が芳香族残基であることを明確に記している。上記配列式は、詳細な説明に提供されるように、他の残基の位置における特徴をさらに明確に記している。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、酵素活性の速度、すなわち、上記基質を上記生成物に変換する速度に関して、配列番号２、４または１１４よりも改善されている。その改善の量は、対応する野生型ケトレダクターゼ酵素または参照ケトレダクターゼ酵素の酵素活性の１．５倍（ｔｉｍｅｓ）（または倍（ｆｏｌｄ））から、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍またはそれ以上の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４または配列番号９０のポリペプチドが示す速度の少なくとも５倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、５００倍または１０００倍の速度で上記基質を上記生成物に変換することができる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、上記操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号９０のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドよりも改善された速度、且つ、少なくとも約９５％の立体異性体過剰率で基質２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに変換することができる速度で、その基質をその生成物に変換することができる。そのような特性を有する例示的なポリペプチドとしては、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８および１１０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドはまた、少なくとも約９９％の立体異性体過剰率で上記基質を上記生成物に変換することができる。そのような特性を有する例示的なポリペプチドとしては、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８および１１０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。配列番号９０のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドが、ある速度（例えば、１ｇ／Ｌの基質の１０〜２０％が約１０ｇ／ＬのＫＲＥＤを用いて２４時間で生成物に変換される速度）、且つ、野生型（配列番号４）よりも改善された立体選択性（９９％の立体異性体過剰率）で上記基質を上記生成物に変換することができるので、配列番号９０よりも改善された本明細書中のポリペプチドもまた、野生型よりも改善されている。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約９９％の立体異性体過剰率、且つ、配列番号９０のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドよりも少なくとも１〜５０倍改善された速度で、基質２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに変換することができる。そのような特性を有する例示的なポリペプチドとしては、配列番号４２、４４、４６、４８、８６、８８、９２、９４、９６、１００または１０２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約９９％の立体異性体過剰率、且つ、配列番号９０のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドよりも少なくとも５０〜２５０倍改善された速度で、基質２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに変換することができる。そのような特性を有する例示的なポリペプチドとしては、配列番号１０、３２、３４、３６、５０、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、９８、１０４、１０６および１０８に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約９９％の立体異性体過剰率、且つ、配列番号９０のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドよりも少なくとも２５０〜１０００倍改善された速度で、基質２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに変換することができる。そのような特性を有する例示的なポリペプチドとしては、配列番号１２、１８、２２、２４、２６、２８、３０、３８、４０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および１１０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも約９９％の立体異性体過剰率、且つ、配列番号９０のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドよりも少なくとも１０００倍改善された速度で、基質２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに変換することができるケトレダクターゼポリペプチドを提供する。そのような特性を有する例示的なポリペプチドとしては、配列番号６、８、１４、１６および２０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号９０のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドと比較して、上記基質の上記生成物への変換に対する競合的インヒビターとしてのアセトンに対して高い抵抗性も有する。この改善されたアセトン抵抗性を有する例示的なポリペプチドとしては、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９８、１０４、１０６、１０８および１１０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
いくつかの実施形態において、約１００ｇ／Ｌを超える基質および約５ｇ／Ｌ未満の本ケトレダクターゼポリペプチドを用いて行われるとき、そのポリペプチドは、約２４時間未満で上記基質の少なくとも約９５％を上記生成物に変換することができる。この能力を有する例示的なポリペプチドとしては、配列番号６、８、１４、１６および２０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼは、高度に立体選択的であり、ゆえに、約９９％，９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％を超える立体異性体過剰率で上記基質を上記生成物に還元することができる。そのような高い立体選択性を有する例示的なケトレダクターゼポリペプチドとしては、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８および１１０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
別の局面において、本開示は、本明細書中に記載される操作されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドまたは高度にストリンジェントな条件下でそのようなポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。そのポリヌクレオチドは、プロモーターおよびコードされる操作されたケトレダクターゼの発現に有用な他の調節エレメントを含み得、特定の所望の発現系のために最適化されたコドンを利用し得る。例示的なポリヌクレオチドとしては、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７または１０９が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なポリヌクレオチドはまた、配列番号１１１、１１２および１３９の配列式に対応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含む。
【００２５】
別の局面において、本開示は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。その宿主細胞は、Ｌ．ｋｅｆｉｒもしくはＬ．ｂｒｅｖｉｓもしくはＬ．ｍｉｎｏｒであり得るか、またはそれらは、異なる生物であり得る。その宿主細胞は、本明細書中に記載される操作されたケトレダクターゼ酵素の発現および単離のために使用され得るか、あるいは、それらは、立体異性の生成物への上記基質の変換に直接使用され得る。
【００２６】
全細胞、細胞抽出物または精製されたケトレダクターゼ酵素のいずれを用いる方法であるかに関係なく、単一のケトレダクターゼ酵素が使用され得るか、あるいは、２つ以上のケトレダクターゼ酵素の混合物が使用され得る。
【００２７】
本明細書中に記載されるケトレダクターゼ酵素は、構造式（Ｉ）の化合物、すなわち２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステル（「基質」）：
【００２８】
【化１】
2010539948.tif 000002
内のケト基を、構造式（ＩＩ）の対応する立体異性のアルコール生成物、すなわち（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエート（「生成物」）：
【００２９】
【化２】
2010539948.tif 000003
に還元する反応を触媒することができる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるケトレダクターゼ酵素は、構造式（ＩＩＩ）の化合物、すなわち、２−［２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］フェニル］−２−プロパノール（これもまた「基質」）
【００３１】
【化３】
2010539948.tif 000004
内のケト基を、構造式（ＩＶの対応する立体異性のアルコール生成物すなわち、（Ｓ，Ｅ）−１−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−（２−（２−ヒドロキシプロパン−２−イル）フェニル）プロパン−１−オール（これもまた、式（ＩＩＩ）の基質に関して「生成物」）：
【００３２】
【化４】
2010539948.tif 000005
に還元する反応を触媒することができる。
【００３３】
したがって、いくつかの実施形態において、構造式（Ｉ）または構造式（ＩＩＩ）の基質を対応するアルコール生成物に還元するための方法が本明細書中に提供され、その方法は、その基質をそれぞれ構造式（ＩＩ）または構造式（ＩＶ）の生成物に還元するか、または変換するのに適する反応条件下で、その基質と本開示のケトレダクターゼポリペプチドとを接触させるか、またはインキュベートする工程を包含する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるケトレダクターゼポリペプチドは、構造式（Ｖ）：
【００３５】
【化５】
2010539948.tif 000006
の化合物２−［１−［［（１Ｒ）−１−［３−［（Ｅ）−２−（７−クロロキノリン−２−イル）エテニル］フェニル］−３−［２−（２−ヒドロキシプロパン−２−イル）フェニル］プロピル］スルファニルメチル］シクロプロピル］酢酸（その溶媒和化合物、水和物および薬学的に許容可能な塩を含む）を合成するための中間体の生成において使用され得る。いくつかの実施形態において、式（Ｖ）の化合物を合成するための方法では、その方法における工程は、式（Ｉ）の基質を式（ＩＩ）の生成物に還元するか、または変換するのに適する反応条件下で本開示のケトレダクターゼポリペプチドを用いてその基質を式（ＩＩ）の生成物に還元するか、または変換する工程を包含し得る。
【００３６】
いくつかの実施形態において、式（ＩＶ）の中間体は、構造式（Ｖ）の化合物の合成においても使用され得る。したがって、いくつかの実施形態において、式（Ｖ）の化合物を合成するための方法では、その方法における工程は、式（ＩＩＩ）の基質を構造式（ＩＶ）の生成物に還元するか、または変換するのに適する反応条件下でその基質と本明細書中に開示されるケトレダクターゼとを接触させることによってその基質を式（ＩＶ）の生成物に還元するか、または変換する工程を包含し得る。
【００３７】
上記基質を上記生成物に還元するための方法のいくつかの実施形態において、その基質は、約９９％を超える立体異性体過剰率でその生成物に還元され、ここで、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１１または１１２に対応する配列を含む。
【００３８】
上記基質を上記生成物に還元するための方法のいくつかの実施形態において、約１００ｇ／Ｌを超える基質および約５ｇ／Ｌ未満の上記ポリペプチドを用いて行われるとき、その基質の少なくとも約９５％は、約２４時間未満でその生成物に変換され、ここで、そのポリペプチドは、配列番号６、８、１４、１６または２０に対応するアミノ酸配列を含む。
【００３９】
上記基質を上記生成物に還元するためのこの方法のいくつかの実施形態において、１ｇ／Ｌの基質の少なくとも約１０〜２０％は、約１０ｇ／Ｌの上記ポリペプチドを用いて、約２４時間未満で上記生成物に変換され、ここで、そのポリペプチドは、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１１または１１２に対応するアミノ酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、式（Ｉ）の基質化合物を式（ＩＩ）の対応する生成物に変換する際のケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）の役割を図示している。この還元は、本明細書中に記載されるＫＲＥＤおよびＮＡＤＰＨなどの補因子を使用する。グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を使用することにより、ＮＡＤ（Ｐ）＋がＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換／再利用される。グルコースは、グルコン酸に変換され、次いで水酸化ナトリウムを加えることによって、グルコン酸は、そのナトリウム塩（グルコン酸ナトリウム）に変換される。あるいは、第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、ＫＲＥＤ）を使用することにより、イソプロパノールがアセトンに変換され得、ＮＡＤ（Ｐ）＋がＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換／再利用され得る。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
６．詳細な説明
６．１  定義
本明細書において用いる場合、以下の用語は、以下の意味を有すると解釈する。
【００４２】
「ケトレダクターゼ」および「ＫＲＥＤ」は、カルボニル基をその対応するアルコールに還元する酵素能力を有するポリペプチドを指すために、本明細書では交換可能に用いている。より具体的には、本発明のケトレダクターゼポリペプチドは、上記の式（Ｉ）の化合物を上記の式（ＩＩ）の対応する生成物に立体選択的に還元することができる。前記ポリペプチドは、還元剤として補因子である還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を代表的に利用する。本明細書において用いる場合のケトレダクターゼは、天然由来（野生型）ケトレダクターゼ、ならびに人間の操作によって生成された非天然由来の操作されたポリペプチドを含む。
【００４３】
「コーディング配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸のその部分（例えば、遺伝子）を指す。
【００４４】
「天然由来の」または「野生型」は、自然界で見つけられる形態を指す。例えば、天然由来または野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然界の源から単離することができ、人間の操作によって故意に修飾されていない、生物体内に存在する配列である。
【００４５】
例えば細胞、核酸またはポリペプチドに関して用いるときの「組換え体」は、そうしなければ自然界に存在しないであろう方法で修飾された、またはそれと同一のものであるが合成材料からおよび／もしくは組換え技術を用いる操作によって生産もしくは誘導された、材料、またはその材料の自然なもしくは天然の形態に対応する材料を指す。非限定的な例としては、数ある中でも、天然（非組換え）形態のその細胞内では見つけられない遺伝子を発現する組換え細胞、またはそうでなければ異なるレベルで発現される天然遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。
【００４６】
「配列同一性百分率」および「相同性百分率」は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド間の比較を指すために本明細書では交換可能に用いており、これらは、ある比較ウインドウに関して２つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定され、この場合、その比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、それら２配列の最適なアラインメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある。前記百分率は、同一核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列内に出現する位置の数を決定して一致した位置の数を得、その一致した位置の数を比較ウインドウ内の全位置数で割り、その結果に１００をかけて配列同一性百分率を得ることによって計算することができる。あるいは、前記百分率は、同一核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列内に出現する位置または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップとアラインされる位置の数を決定して一致した位置の数を得、その一致した位置の数を比較ウインドウ内の全位置数で割り、その結果に１００をかけて配列同一性百分率を得ることによって計算することができる。２つの配列をアラインするために利用できる多くの確立されたアルゴリズムがあることは当業者に理解される。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性探索法によって、これらのアルゴリズム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅの中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータでの実施によって、または目視検査（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との合同ベンチャー（１９９５年補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）参照）によって行うことができる。配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントの決定に適するアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，１９７７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３８９−３４０２に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ウェブサイトを通して公的に入手することができる。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードとアラインしたときある正の値の閾値スコアＴと一致するまたはある���の値の閾値スコアＴを満たす、クエリ配列中の長さＷの短いワードを特定することによって、高いスコアになる配列の対（ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｉｒ）（ＨＳＰ）を先ず特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記文献）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つける検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。その後、累積アラインメントスコアを増加することができる限り、そのワードヒットをそれぞれの配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（１対の一致残基に対する報酬スコア；常に、＞０）およびＮ（不一致残基に対するペナルティスコア；常に、＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列については、スコアリング行列を用いて累積スコアを計算する。それぞれの方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ落ちると；累積スコアが１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積に起因してゼロ以下になると；またはいずれかの配列の末端に達すると、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸによって、アラインメントの感度および速度が決まる。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を用いる（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。配列アラインメントおよび配列同一％の例示的判定には、用意されたデフォルトパラメータを用いて、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（ウィスコンシン州、マディソンのＡｃｃｅｌｒｙｓ）の中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを利用することができる。
【００４７】
「参照配列」は、配列比較のための基準として用いられる規定された配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、完全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントである場合もある。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の長さ、少なくとも２５残基の長さ、少なくとも５０残基の長さ、または核酸もしくはポリペプチドの完全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ、（１）２つの配列間に類似した配列（すなわち、その完全配列の一部分）を含むことがあり、ならびに（２）２つの配列間に互いに異なる配列をさらに含むことがあるので、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、「比較ウインドウ」に関して２つのポリヌクレオチドの配列を比較して局所的な配列類似性領域を特定し、比較することによって、代表的に行われる。
【００４８】
一部の実施形態において、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づく場合があり、この場合の参照配列は、その一次配列内に１つ以上の変更を有し得る配列である。例えば、「Ｘ１９０に対応する残基にプロリンを有する配列番号４に基づく」参照配列は、配列番号４のＸ１９０における対応する残基がプロリンに変更された参照配列を指す。
【００４９】
「比較ウインドウ」は、配列を少なくとも２０の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、且つ、その比較ウインドウ内の配列の一部分が、２つの配列の最適なアラインメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して２０パーセント以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある、少なくとも約２０の連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念上のセグメントを指す。比較ウインドウは、２０連続残基より長いことがあり、場合によっては、３０、４０、５０、１００、またはそれより長いウインドウを含む。
【００５０】
「実質的同一性」は、少なくとも２０の残基位置の比較ウインドウに関して、多くの場合、少なくとも３０〜５０残基のウインドウに関して参照配列を比較すると、少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性および８９から９５パーセントの配列同一性、より普通には少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、この場合の配列同一性百分率は、その比較ウインドウに関して参照配列とその参照配列の総計２０パーセント以下になる欠失または付加を含む配列とを比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される特定の実施形態において、用語「実質的な同一性」は、デフォルトギャップ重みづけを用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインしたとき、２つのポリペプチド配列が、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれ以上（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。
【００５１】
所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けに関連して用いるときの「に対応する」、「への参照」または「基準として」は、その所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較するときのその指定参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えると、所与のポリマーの残基数または残基位置は、その所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値の位置によってではなく参照配列を基準にして指定される。例えば、所与のアミノ酸配列、例えば操作されたケトレダクターゼのもの、と参照配列とを、ギャップを導入してそれら２配列間の残基一致を最適化することによって、アラインすることができる。これらの場合では、ギャップは存在するが、アラインした参照配列を基準にしてその所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の番号付けを行う。
【００５２】
「立体選択性」は、化学反応または酵素的反応における１つの立体異性体の別のものに勝る優先的形成を指す。立体選択性は、部分的である場合があり、この場合は１つの立体異性体の形成が他のものより有利であり、または完全であることもあり、この場合は１つだけの立体異性体が形成される。立体異性体がエナンチオマーであるとき、その立体選択性はエナンチオ選択性と呼ばれ、これは、一方のエナンチオマーの両方の合計中の分率である（代表的に、百分率として報告される）。それは、当該技術分野では、一般に、代替的に、式［主エナンチオマー−副エナンチオマー］／［主エナンチオマー＋副エナンチオマー］に従ってそれから算出されるエナンチオマー過剰率（ｅ．ｅ．）として（代表的に、百分率として）報告される。立体異性体が、ジアステレオマーである場合、その立体選択性は、ジアステレオ選択性とも呼ばれ、これは、２つのジアステレオマーの混合物中の１つのジアステレオマーの分率であり（代表的に、百分率で報告される）、あるいはジアステレオ過剰率（ｄ．ｅ．）として一般的に報告されるエナンチオマー過剰率およびジアステレオ過剰率は、立体異性体過剰率の型である。
【００５３】
「高立体選択的」は、少なくとも約９９％の立体異性体過剰率で基質を対応する（Ｓ）−生成物に変換または還元することができるケトレダクターゼポリペプチドを指す。
【００５４】
「立体特異性」は、一つの立体異性体から別の立体異性体への化学的反応または酵素的反応における優先的な変換を指す。立体異性体特異性は部分的であり得る（一つの立体異性体の変換が、他の立体異性体の変換よりも好まれる）か、あるいは完全であり得る（一つの立体異性体のみが変換される）。
【００５５】
「化学選択性」は、一つの生成物から別の生成物への化学的反応または酵素的反応における優先的な形成を指す。
【００５６】
「改善された酵素特性」は、参照ケトレダクターゼと比較して何らかの酵素特性の改善を示すケトレダクターゼポリペプチドを指す。本明細書に記載する操作されたケトレダクターゼポリペプチドについて、その比較は、一般に、野生型ケトレダクターゼ酵素に対して行われるが、一部の実施形態では、その参照ケトレダクターゼが、別の改善された操作されたケトレダクターゼである場合もある。改善が望ましい酵素特性としては、酵素活性（基質の変換パーセントによって表すことができる）、熱安定性、溶媒溶解性、ｐＨ活性プロフィール、補因子要件、阻害因子（例えば、生成物阻害）に対する不応性、立体特異性、および立体選択性（エナンチオ選択性を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
「増大された酵素活性」は、操作されたケトレダクターゼポリペプチドの改善された特性を指し、参照ケトレダクターゼ酵素と比較して比活性（例えば生成される生成物／時間／タンパク質重量）の増加、または基質の生成物への変換パーセント（例えば、指定量のＫＲＥＤの使用による指定時間内の生成物への基質の出発量の変換パーセント）の増加がその代表であり得る。酵素活性を判定するための例示的方法は、実施例に提供する。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的酵素特性を含めて、その変化が増加された酵素活性につながり得る酵素活性に関するいずれの特性も対象となり得る。酵素活性の改善は、対応する野生型ケトレダクターゼ酵素の酵素活性の約１．５倍から、２倍ほどにもなる場合がある。天然由来のケトレダクターゼまたはそのケトレダクターゼポリペプチドが誘導された別の操作されたケトレダクターゼより５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、またはそれより大きい酵素活性。特定の実施形態において、前記操作されたケトレダクターゼ酵素は、親ケトレダクターゼ酵素のものより１．５から５０倍、１．５から１００倍大きい範囲の改善された酵素活性を示す。いずれの酵素の活性も、その触媒回転速度が基質（任意の必要補因子を含む）の拡散速度を超えることができないように、拡散制限されることは、当業者には理解される。その拡散限界、すなわちｋｃａｔ／Ｋｍ、の理論的最大値は、一般に、約１０８から１０９（Ｍ−１  ｓ−１）である。それ故、ケトレダクターゼの酵素活性のいずれの改善も、そのケトレダクターゼ酵素による作用を受ける基質の拡散速度に関連した上限を有する。ケトレダクターゼ活性は、ケトレダクターゼを測定するために用いられる標準的なアッセイのいずれか１つ、例えば、その酸化とケトンのアルコールへの付随的還元に起因する、ＮＡＤＰＨの吸光度もしくは蛍光の減少によって、または結合アッセイにおいて生成される生成物によって、測定することができる。酵素活性の比較は、本明細書中で詳細にさらに説明するような、酵素の規定された調製、設定条件下での規定されたアッセイ、および１つ以上の規定された基質を用いて行われる。一般に、溶解産物を比較するとき、宿主細胞によって生産されるおよび溶解産物中に存在する酵素の量の変化を最小にするために同一の発現系および同一の宿主細胞を使用するばかりでなく、アッセイする細胞の数およびタンパク質の量も決定する。
【００５８】
「変換」は、基質の対応する生成物への酵素的還元を指す。「変換パーセント」は、ある期間内に指定条件下で生成物に還元される基質のパーセントを指す。従って、ケトレダクターゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質の生成物への「変換パーセント」として表すことができる。
【００５９】
「熱安定性」は、ある期間（例えば、０．５〜２４時間）、高温（例えば、４０〜８０℃）への暴露後、未処理の酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％から８０％より多く）を維持するケトレダクターゼポリペプチドを指す。
【００６０】
「溶媒安定性」は、ある期間（例えば、０．５〜２４時間）、様々な濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（例えば、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）への暴露後、未処理の酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％から８０％より多く）を維持するケトレダクターゼポリペプチドを指す。
【００６１】
「ｐＨ安定性」は、ある期間（例えば、０．５〜２４時間）、高いまたは低いｐＨ（例えば、４．５〜６または８から１２）への暴露後、未処理の酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％から８０％より多く）を維持するケトレダクターゼポリペプチドを指す。
【００６２】
「熱および溶媒安定性」は、熱安定性でもあり、溶媒安定性でもある、ケトレダクターゼポリペプチドを指す。
【００６３】
操作されたケトレダクターゼ酵素に関連して本明細書において用いる場合の「から誘導される」は、その操作の基礎になった、元のケトレダクターゼ酵素、および／またはそのようなケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を特定する。例えば、配列番号９０の操作されたケトレダクターゼ酵素は、配列番号４のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を何世代にもわたって人工的に進化させることによって得られた。従って、この操作されたケトレダクターゼ酵素は、配列番号４の野生型ケトレダクターゼ「から誘導される」。
【００６４】
「親水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の正規化コンセンサス疎水性尺度に従ってゼロ未満の疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された親水性アミノ酸としては、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ−Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬ−Ａｒｇ（Ｒ）が挙げられる。
【００６５】
「酸性アミノ酸または残基」は、そのアミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれているときに約６未満のｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。酸性アミノ酸は、ヒドロニウムイオン喪失のため、生理学的ｐＨで負の電荷を有する側鎖を代表的に有する。遺伝子コード化された酸性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００６６】
「塩基性アミノ酸または残基」は、そのアミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれているときに約６より大きいｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。塩基性アミノ酸は、水素イオンとの会合のため、生理学的ｐＨで正の電荷を有する側鎖を代表的に有する。遺伝子コード化された塩基性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ−Ｌｙｓ（Ｋ）が挙げられる。
【００６７】
「極性アミノ酸または残基」は、生理学的ｐＨで電荷を有さない側鎖を有するが、２個の原子によって共同で共有される電子対がそれらの原子のうちの１つによってより近くに保持される少なくとも１つの結合を有する、親水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された極性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）およびＬ−Ｔｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
【００６８】
「疎水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の正規化コンセンサス疎水性尺度に従ってゼロより大きい疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された疎水性アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００６９】
「芳香族アミノ酸または残基」は、少なくとも１つの芳香族またはヘテロ芳香族環を含む側鎖を有する、親水性または疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された芳香族アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｔｙｒ（Ｙ）およびＬ−Ｔｒｐ（Ｗ）が挙げられる。そのヘテロ芳香族窒素原子のｐＫａのせいでＬ−Ｈｉｓ（Ｈ）は、時として、塩基性残基として分類され、またはその側鎖がヘテロ芳香族環を含むので芳香族残基として分類されるが、本明細書では、ヒスチジンを親水性残基として、または「拘束残基」（下記参照）として分類する。
【００７０】
「拘束アミノ酸または残基」は、拘束された幾何学的配置を有する、アミノ酸または残基を指す。本明細書において、拘束残基としては、Ｌ−ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ−ｈｉｓ（Ｈ）が挙げられる。ヒスチジンは、比較的小さいイミダゾール環を有するため、拘束された幾何学的配置を有する。プロリンは、これも５員環を有するため、拘束された幾何学的配置を有する。
【００７１】
「非極性アミノ酸または残基」は、生理学的ｐＨで電荷を有さない側鎖を有し、且つ、２個の原子によって共同で共有される電子対がそれら２個の原子それぞれによってほぼ同等に保持される結合を有する（すなわち、側鎖が非極性である）、疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された非極性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）およびＬ−Ａｌａ（Ａ）が挙げられる。
【００７２】
「脂肪族アミノ酸または残基」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する、疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子コード化された脂肪族アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）およびＬ−Ｉｌｅ（Ｉ）が挙げられる。
【００７３】
「システイン」またはＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、他のＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸または他のスルファニル含有もしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成することができる点で独特である。「システイン様残基」は、システイン、およびジスルフィド架橋の形成に利用できるスルフヒドリル部分を含有する他のアミノ酸を含む。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）（および−ＳＨ含有側鎖を有する他のアミノ酸）が、還元された遊離−ＳＨ形態または酸化されたジスルフィド架橋形態のいずれかでペプチド中に存在できることが、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）がペプチドに正味の疎水性をもたらすのか、親水性をもたらすのかに影響を及ぼす。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの正規化コンセンサス尺度（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９８４、上記文献）に従って０．２９の疎水性を示すが、本発明の開示のために、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）がそれ独自の独特な群に類別されることは理解されるべきである。
【００７４】
「小アミノ酸または残基」は、合計３個以下の炭素および／またはヘテロ原子（α−炭素および水素を除く）から構成される側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。小アミノ酸または残基は、上の定義に従って、脂肪族、非極性、極性または酸性小アミノ酸または残基としてさらに類別することができる。遺伝子コード化された小アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００７５】
「ヒドロキシル含有アミノ酸または残基」は、ヒドロキシル（−ＯＨ）部分を含有するアミノ酸を指す。遺伝子コード化されたヒドロキシル含有アミノ酸としては、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００７６】
「保存的」アミノ酸置換または突然変異は、類似した側鎖を有する残基の交換可能性を指し、従って、アミノ酸の同じまたは類似した規定されたクラスの中のアミノ酸でのポリペプチド内のアミノ酸の置換を代表的に含む。しかし、本明細書において用いる場合、一部の実施形態において、保存的突然変異は、その保存的突然変異が、代わりに、脂肪族残基から脂肪族残基、非極性残基から非極性残基、極性残基から極性残基、酸性残基から酸性残基、塩基性残基から塩基性残基、芳香族残基から芳香族残基、または拘束残基から拘束残基への置換であり得る場合、親水性残基から親水性残基、疎水性残基から疎水性残基、ヒドロキシル含有残基からヒドロキシル含有残基、または小残基から小残基への置換を含まない。さらに、本明細書において用いる場合、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＩは、別の脂肪族残基または別の非極性残基のいずれかに保存的に突然変異させることができる。下の表１は、例示的保存的置換を示すものである。
【００７７】
【表１】
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「非保存的置換」は、有意に異なる側鎖特性を有するアミノ酸でのポリペプチド内のアミノ酸の置換または突然変異を指す。非保存的置換は、上に列挙した規定された群内ではなく、群間でのアミノ酸を用いるものであり得る。１つの実施形態において、非保存的突然変異は、（ａ）置換領域内のペプチド骨格の構造（例えば、グリシンの代わりにプロリン）（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩に影響を及ぼす。
【００７８】
「欠失」は、参照ポリペプチドからの１つ以上のアミノ酸の除去によるポリペプチドへの修飾を指す。欠失は、操作されたケトレダクターゼ酵素の酵素活性を維持しながらおよび／または改善された特性を維持しながらの、そのポリペプチドを構成する１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、１５以上のアミノ酸、または２０以上のアミノ酸、総アミノ酸数の１０％以下、総アミノ酸数の２０％以下、または総アミノ酸数の３０％以下の除去を含むことができる。欠失は、ポリペプチドの内部に関する場合があり、および／または末端部分に関する場合がある。様々な実施形態において、欠失は、連続セグメントを含み得、または非連続的である場合がある。
【００７９】
「挿入」は、参照ポリペプチドからの１つ以上のアミノ酸の付加によるポリペプチドへの修飾を指す。一部の実施形態において、前記改善された操作されたケトレダクターゼ酵素は、天然由来のケトレダクターゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入、ならびに他の改善されたケトレダクターゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部でのものである場合があり、またはカルボキシもしくはアミノ末端へのものである場合がある。本明細書において用いる場合の挿入物は、当該技術分野において公知であるような融合タンパク質を含む。前記挿入物は、アミノ酸の連続セグメントである場合があり、または天然由来ポリペプチド内での１つ以上のアミノ酸によって隔てられている場合がある。
【００８０】
本明細書中で用いられる「フラグメント」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列はその配列の対応する位置と同じである、ポリペプチドを指す。フラグメントは、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長またはそれ以上で、配列番号２、配列番号４、または配列番号１４の天然に存在する完全長ケトレダクターゼポリペプチドの７０％、８０％、９０％、９５％、９８％および９９％までであり得る。
【００８１】
「単離されたポリペプチド」は、本来それに随伴する他の不純物、例えばタンパク質、脂質およびポリヌクレオチド、から実質的に分離されているポリペプチドを指す。この用語は、それらの自然発生環境または発現系（例えば、宿主細胞またはインビトロ合成）から除去または精製されたポリペプチドを包含する。前記改善されたケトレダクターゼ酵素は、細胞内に存在することもあり、細胞の培地に中に存在することもあり、または溶解産物もしくは単離された製剤などの様々な形態で調製することができる。従って、一部の実施形態において、前記改善されたケトレダクターゼ酵素は、単離されたポリペプチドであり得る。
【００８２】
「実質的に純粋なポリペプチド」は、そのポリペプチド種が、存在する優勢な種である（すなわち、ｍｏｌまたは重量ベースで、それがその組成物中のいずれの他の個々の高分子種よりも豊富である）組成物を指し、一般に、対象種がモルまたは重量％でその存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを構成する場合には実質的に精製されている組成物である。一般に、実質的に純粋なケトレダクターゼ組成物は、その組成物中に存在するすべての高分子種のモルまたは重量％で約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、および約９８％以上を構成する。一部の実施形態において、対象種は、その組成物が単一の高分子種から本質的に成る、本質的均質（すなわち、従来の検出方法によってその組成物中で汚染種を検出できない）へと精製される。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、高分子種とはみなされない。一部の実施形態において、単離された改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００８３】
「ストリンジェントハイブリダイゼーション」は、核酸ハイブリッドが安定している条件を指すために本明細書では用いる。当業者には公知であるように、ハイブリッドの安定性は、そのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含有率、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴｍ値は、融解温度の公知予測方法を用いて計算することができる（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏら，１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １６８：７６１−７７７；Ｂｏｌｔｏｎら，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：１３９０；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：８８９３−８８９７；Ｆｒｅｉｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；Ｋｉｅｒｚｅｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：７８４０−７８４６；Ｒｙｃｈｌｉｋら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：６４０９−６４１２（ｅｒｒａｔｕｍ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：６９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上記文献；Ｓｕｇｇｓら，１９８１，Ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ（Ｂｒｏｗｎら編），ｐｐ．６８３−６９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＷｅｔｍｕｒ，１９９１，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６：２２７−２５９参照；すべての出版物は、参照により本明細書に援用されている）。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示するポリペプチドをコードし、ならびに規定された条件下、例えば中ストリンジェントまたは高ストリンジェント条件下で、本開示の操作されたケトレダクターゼ酵素をコードする配列の補体にハイブリダイズする。
【００８４】
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおけるハイブリダイゼーション条件、例えば洗浄条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、その後、様々だがより高いストリンジェンシーの洗浄が行われる。用語「中ストリンジェントハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡが、その標的ＤＮＡとの約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、約８５％の同一性と、標的ポリヌクレオチドとの約９０％より高い同一性とを有する相補的核酸に結合できる条件を指す。例示的中ストリンジェント条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、その後、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、４２℃での洗浄に相当する条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、規定されたポリヌクレオチド配列についての溶解条件のもとで決定されるような熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれより低い条件を一般に指す。一部の実施形態において、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す。（すなわち、ハイブリッドが０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中、６５℃で不安定な場合、それは、ここで考えられる場合には高ストリンジェンシー条件下で不安定であある）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアルデヒド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、その後、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄に相当する条件によって規定され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、および０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中、６５℃での洗浄に相当する条件でのハイブリダイゼーションである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、ならびに中ストリンジェント条件は、上で引用した参考文献に記載されている。
【００８５】
「異種」ポリヌクレオチドは、実験技術によって宿主細胞に導入される任意のポリヌクレオチドを指し、および宿主細胞から除去され、実験操作に付され、その後、宿主細胞に再び導入されるポリヌクレオチドを含む。
【００８６】
「コドン最適化される」は、そのコードされたタンパク質がその対象生物において効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを特定の生物において優先的に用いられるものに変更することを指す。遺伝子コードは、大部分のアミノ酸が、「シノニム」または「同義」コドンと呼ばれる幾つかのコドンによって表される点で縮重しているが、特定の生物によるコドン使用頻度が無作為でなく、特定のコドントリプレット偏ることは周知である。このコドン使用頻度の偏りは、所定の遺伝子、共通の機能または先祖起源の遺伝子、低コピー数タンパク質に対して高度に発現されるタンパク質、および生物のゲノムの総タンパク質コーディング領域に関して、より高いことがある。一部の実施形態において、ケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを、発現のために選択される宿主生物からの最適な生産のためにコドン最適化することができる。
【００８７】
「好ましい、最適な、大いにコドン使用頻度に偏りのあるコドン」は、同義で、タンパク質コーディング領域内の同じアミノ酸をコードする他のコドンより高い頻度で使用されるコドン、を指す。単一の遺伝子のコドン使用頻度、共通の機能または起源の遺伝子のセット、高度に発現される遺伝子、生物全体の総タンパク質コーディング領域におけるコドン頻度、関連生物の総タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはそれらの組み合わせに関して、好ましいコドンを決定することができる。遺伝子発現レベルに伴って頻度が増加するコドンは、代表的に、発現に最適なコドンである。例えばクラスター分析または応答分析を用いる、多変量解析をはじめとする、特定の生物におけるコドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対同義コドン使用頻度）およびコドン選好性を判定するための様々な方法、ならびに遺伝子において使用されるコドンの有効数を決定するための様々な方法が公知である（ＧＣＧ  ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ，Ｊｏｈｎ  Ｐｅｄｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，Ｊ．Ｏ，１９９８，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４：３７２−７３；Ｓｔｅｎｉｃｏら，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２２４３７−４６；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｆ．，１９９０，Ｇｅｎｅ  ８７：２３−２９参照）。コドン使用頻度表は、増えつつある生物リストに利用できる（例えば、Ｗａｄａら，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８；Ｎａｋａｍｕｒａら，２０００、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２；Ｄｕｒｅｔら，上記文献；ＨｅｎａｕｔおよびＤａｎｃｈｉｎ，「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ」，１９９６，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら編，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ｐ．２０４７−２０６６参照）。コドン使用頻度を得るためのデータ源は、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依存し得る。これらのデータセットは、発現されるタンパク質をコードすることが実際に知られている核酸配列（例えば、完全タンパク質コーディング配列−ＣＤＳ）、発現される配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の予測コーディング領域を含む（例えば、Ｍｏｕｎｔ，Ｄ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，第８章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２５９−２８１；Ｔｉｗａｒｉら，１９９７，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：２６３−２７０参照）。
【００８８】
「制御配列」は、対象となるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有利である、すべての成分を含むと本明細書では定義する。それぞれの制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって固有のものである場合もあり、または外来のものである場合もある。そのような制御配列としては、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写終結因子が挙げられるが、これらに限定されない。最低でも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコーディング領域とその制御配列のライゲーションを助長する特定の制限部位を導入するためのリンカーを備えている場合がある。
【００８９】
「作動可能に連結された」は、制御配列が、目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指図するか、または制御するように、その制御配列が、目的のポリヌクレオチドに対する位置において適切に（すなわち、機能的な関係性で）配置されている配置として本明細書中で定義される。
【００９０】
「プロモーター配列」は、コード配列などの目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列である。その制御配列は、適切なプロモーター配列を含み得る。そのプロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。そのプロモーターは、最適な宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列（変異プロモーター、切断型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含む）であり得、その宿主細胞に対して同種または異種である、細胞外または細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【００９１】
６．２  ケトレダクターゼ酵素
本開示は、基質２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに立体選択的に還元することができるか、または変換することができ、且つ、Ｌ．ｋｅｆｉｒ（配列番号４）もしくはＬ．ｂｒｅｖｉｓ（配列番号２）もしくはＬ．ｍｉｎｏｒ（配列番号１１４）から得られる天然に存在する野生型ＫＲＥＤ酵素と比較されるか、または他の操作されたケトレダクターゼ酵素と比較されるときに改善された特性を有する、操作されたケトレダクターゼ（「ＫＲＥＤ」）酵素を提供する。その生成物化合物は、アレルギーの処置のためおよび喘息の管理における治療薬として使用されるロイコトリエンレセプターアンタゴニストである、Ｓｉｎｇｕｌａｉｒ（登録商標）という名称としても知られるモンテルカストの合成において有用である。本明細書中に示されるように、Ｌ．ｋｅｆｉｒ由来の野生型酵素は、２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに任意の著しい速度で還元しないか、または変換しない。対照的に、本開示のケトレダクターゼは、かなりのレベルで特定の基質を上記生成物に還元することができるか、または変換することができる。いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは：（１）配列番号２、４または１１４の１９０位（すなわち、Ｘ１９０）に対応する残基が、拘束残基である；および（２）配列番号２、４または１１４の２０２位（すなわち、Ｘ２０２）に対応する残基が、芳香族残基である、という必要条件を有する。いくつかの実施形態において、上記改善されたケトレダクターゼポリペプチドは：（１）配列番号２、４または１１４の１９０位（すなわち、Ｘ１９０）に対応する残基が、拘束残基である；（２）配列番号２、４または１１４の１９５位（すなわち、Ｘ１９５）に対応する残基が、塩基性、酸性、非極性または極性残基である；および（３）配列番号２、４または１１４の２０２位（すなわち、Ｘ２０２）に対応する残基が、芳香族残基である、という必要条件を有する。
【００９２】
上で述べたように、本開示のケトレダクターゼは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒの天然に存在するケトレダクターゼ（「ＡＤＨ」または「アルコールデヒドロゲナーゼ」とも呼ばれる）または別の操作されたケトレダクターゼのアミノ酸配列を参照して記載され得る。また、アミノ酸残基の位置は、開始メチオニン（Ｍ）残基（すなわち、Ｍは、１位の残基である）から開始するケトレダクターゼにおいて決定されるが、この開始メチオニン残基が、生物学的なプロセシング機構（例えば、宿主細胞またはインビトロの翻訳系における機構）によって除去されることにより、開始メチオニン残基を欠いた成熟タンパク質が生成され得ることは、当業者によって理解されるだろう。特定のアミノ酸またはアミノ酸の変更がアミノ酸配列中に存在するアミノ酸残基の位置は、時折、本明細書中で用語「Ｘｎ」すなわち「ｎ位」（ここで、ｎは、残基の位置のことを指す）として記載される。同じ残基の位置におけるアミノ酸残基が、ケトレダクターゼ間で異なる場合、その異なる残基は、「／」によって表され得、その配置は、「ｋｅｆｉｒ残基／ｂｒｅｖｉｓ残基／ｍｉｎｏｒ残基」である。参照配列中、例えば、配列番号２および配列番号４および配列番号１１４の野生型ケトレダクターゼ中のアミノ酸残基の、異なるアミノ酸残基による置換である置換変異は、記号「→」によって表され得る。本明細書中で、変異は、時折、あるタイプのアミノ酸「への」変異として記載される。例えば、配列番号４の残基９６は、脂肪族残基「に」変異され得る。しかし、句「への」の使用は、あるクラスの１つのアミノ酸から同じクラスの別のアミノ酸への変異を排除するものではない。例えば、配列番号４の残基９６が、極性残基のセリンであるが、それは、異なる極性残基に変異され得る；例えば、その変異は、「Ｓ９６Ｔ」（９６→Ｔ）変異であり得る。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒの天然に存在するケトレダクターゼ（「ＡＤＨ」または「アルコールデヒドロゲナーゼ」とも呼ばれる）のアミノ酸配列は、ケトレダクターゼ活性をコードすると知られているポリヌクレオチド（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＰ９４０２９ＧＩ：３３１１２０５６またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒに対する配列番号３；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＤ６６６４８ＧＩ：２８４００７８９またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓに対する配列番号１；およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒに対する配列番号１１３）から得られ得る。
【００９３】
いくつかの実施形態において、野生型または別の操作されたポリペプチドと比較するときの、上記ケトレダクターゼポリペプチドの改善された特性は、式（Ｉ）の基質である２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを式（ＩＩ）の対応する（Ｓ）−アルコール生成物である（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに還元するためか、または変換するための活性の増加に関するものである。いくつかの実施形態において、酵素活性の増加は、その基質をその生成物に変換する速度の上昇で明示され得るか、または同じ量の生成物を還元するか、または変換する野生型または別の参照配列（例えば、配列番号９０）と比較して、より少ない改善されたポリペプチドを使用する能力によって明示され得る。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼ特性の改善された特性は、その基質を生成物に還元する際の立体選択性の増大、すなわち、本明細書中において、その生成物の立体異性体過剰率の上昇に関するものである。いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドの改善された特性は、その安定性または熱安定性に関するものである。いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、高い酵素活性および高い立体選択性などの２つ以上の改善された特性を有する。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本明細書中のケトレダクターゼポリペプチドは、参照配列（例えば、天然に存在するポリペプチドまたは操作されたポリペプチド）に対していくつかの改変を有し得、それは、いくつかの実施形態において、改善されたケトレダクターゼ特性をもたらし得る。本明細書中で使用されるとき、「改変」には、アミノ酸の置換、欠失および挿入が包含される。任意の１つの改変または組み合わせの改変が、天然に存在するポリペプチドまたは操作されたポリペプチドに導入されることにより、操作された酵素が生成され得る。そのような実施形態において、アミノ酸配列に対する改変の数は、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、６つ以上のアミノ酸、８つ以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、１５個以上のアミノ酸または２０個以上のアミノ酸、参照ポリペプチド配列のアミノ酸の総数の最大１０％、アミノ酸の総数の最大１０％、アミノ酸の総数の最大１５％、アミノ酸の総数の最大２０％またはアミノ酸の総数の最大３０％を含み得る。いくつかの実施形態において、改善されたケトレダクターゼ特性をもたらす天然に存在するポリペプチドまたは操作されたポリペプチドに対する改変の数は、参照配列の約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個の改変を含み得る。いくつかの実施形態において、改変の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０アミノ酸残基であり得る。その改変は、挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００９５】
いくつかの実施形態において、上記改変は、参照配列に対するアミノ酸置換を含む。改善されたケトレダクターゼ特性をもたらし得る置換は、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、６つ以上のアミノ酸、８つ以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、１５個以上のアミノ酸または２０個以上のアミノ酸、参照酵素配列のアミノ酸の総数の最大１０％、アミノ酸の総数の最大１０％、アミノ酸の総数の最大２０％またはアミノ酸の総数の最大３０％におけるものであり得る。いくつかの実施形態において、改善されたケトレダクターゼ特性をもたらす天然に存在するポリペプチドまたは操作されたポリペプチドに対する置換の数は、参照配列の約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個のアミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態において、置換の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０アミノ酸残基であり得る。
【００９６】
いくつかの実施形態において、本明細書中のケトレダクターゼポリペプチドは、以下の特徴：Ｘ１９０位に対応する残基が、拘束残基、特に、プロリンである；およびＸ２０２に対応する残基が、芳香族残基、特に、トリプトファンである、を有するが但し、そのケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基が拘束残基であり、Ｘ２０２に対応する残基が芳香族残基である、アミノ配列を有することを条件とする、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｘ１９０に対応する残基は、プロリンである。いくつかの実施形態において、Ｘ２０２に対応する残基は、トリプトファンである。いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基がプロリンであり、且つ、Ｘ２０２に対応する残基がトリプトファンである、アミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、これらのケトレダクターゼポリペプチドは、参照アミノ酸配列と比較して、他の残基の位置に１つ以上の残基の相違を有し得る。その相違は、様々な改変（例えば、置換、欠失および挿入）を含み得る。その置換は、非保存的置換、保存的置換または非保存的置換と保存的置換との組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、これらのケトレダクターゼポリペプチドは、参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置に約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５または約１〜５０残基の相違を場合によっては有し得る。いくつかの実施形態において、その相違の数は、参照配列と比較して他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５、４０、４５または５０残基の相違であり得る。
【００９７】
いくつかの実施形態において、本明細書中のケトレダクターゼポリペプチドは、以下の特徴：Ｘ１９０位に対応する残基が、拘束残基、特に、プロリンである；Ｘ１９５に対応する残基が、塩基性、酸性、非極性または極性残基、特に、プロリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸またはアスパラギンである；およびＸ２０２に対応する残基が、芳香族残基、特に、トリプトファンである；を有するが但し、そのケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴、すなわち、Ｘ１９０位に対応する残基が、拘束残基である；Ｘ１９５に対応する残基が、塩基性、酸性、非極性または極性残基である；およびＸ２０２に対応する残基が、芳香族残基である、を有するアミノ酸配列を含むことを条件とする、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｘ１９０に対応する残基は、プロリンである。いくつかの実施形態において、Ｘ１９５に対応する残基は、アルギニンである。いくつかの実施形態において、Ｘ２０２に対応する残基は、トリプトファンである。いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基がプロリンであり；Ｘ１９５に対応する残基がプロリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸またはアスパラギン、特に、アルギニンであり；そしてＸ２０２に対応する残基がトリプトファンである、アミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、これらのケトレダクターゼポリペプチドは、参照アミノ酸配列と比較して、他の残基の位置に１つ以上の残基の相違を有し得る。その相違は、様々な改変（例えば、置換、欠失および挿入）を含み得る。その置換は、非保存的置換、保存的置換または非保存的置換と保存的置換との組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、これらのケトレダクターゼポリペプチドは、参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置に約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５または約１〜５０残基の相違を場合によっては有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５、４０、４５または５０残基の相違であり得る。
【００９８】
いくつかの実施形態において、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１１１もしくは配列番号１１２もしくは配列番号１３９またはその領域（例えば、９０〜２１１に対応する残基）において明らかにされている配列式に基づくアミノ酸配列を含む。配列番号１１２は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒケトレダクターゼの野生型アミノ酸配列（配列番号４）に基づき；配列番号１１１は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓケトレダクターゼの野生型アミノ酸配列（配列番号２）に基づき；そして配列番号１３９は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒケトレダクターゼの野生型アミノ酸配列（配列番号１１４）に基づく。配列番号１１１、１１２または１３９の配列式に基づくケトレダクターゼは、Ｘ１９０に対応する残基が拘束残基であり；Ｘ１９５に対応する残基が塩基性、酸性、非極性または極性残基であり；そしてＸ２０２が芳香族残基であることを明確に記している。配列番号１１１、１１２または１３９の配列式のいくつかの実施形態において、Ｘ１９０に対応する残基は、プロリンであり；そしてＸ２０２に対応する残基は、トリプトファンである。配列番号１１１、１１２または１３９の配列式のいくつかの実施形態において、Ｘ１９０に対応する残基は、プロリンであり；Ｘ１９５に対応する残基は、プロリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸またはアスパラギン、特に、アルギニンであり；そしてＸ２０２に対応する残基は、トリプトファンである。その配列式は、以下に記載されるように、様々な残基の位置に対する特徴をさらに明確に記している。
【００９９】
いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２もしくは１３９の配列式またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）に基づくアミノ酸配列を含み、且つ、本明細書中に記載されるように、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基に対して特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基に対して特定の特徴を有する、ケトレダクターゼポリペプチドは、上記配列式に提供されるような、以下：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基である；Ｘ１７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ２５に対応する残基が、極性または酸性残基である；Ｘ２７に対応する残基が、芳香族残基である；Ｘ４１に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ５３に対応する残基が、極性、非極性または酸性残基である；Ｘ５７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ６４に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ６６に対応する残基が、酸性残基である；Ｘ６８に対応する残基が、極性、酸性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ７２に対応する残基が、塩基性残基である；Ｘ７６に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基である；Ｘ８０に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基である；Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基である；Ｘ９５に対応する残基が、脂肪族、非極性または酸性残基である；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ９７に対応する残基が、塩基性、拘束または極性残基である；Ｘ１００に対応する残基が、塩基性、酸性、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性または拘束残基である；Ｘ１１１に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１３９に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１４５に対応する残基が、酸性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１４８に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１５１に対応する残基が、拘束、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１５２に対応する残基が、極性、芳香族、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１６３に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１６５に対応する残基が、極性、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１７９に対応する残基が、芳香族、塩基性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１９７に対応する残基が、酸性残基である；Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基である；Ｘ２１０に対応する残基が、極性または塩基性残基である；Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基である；Ｘ２１２に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ２１６に対応する残基が、拘束または塩基性残基である；Ｘ２２３に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ２２６に対応する残基が、非極性または極性残基である；Ｘ２３３に対応する残基が、極性または酸性残基である；Ｘ２３５に対応する残基が、極性または芳香族残基である；Ｘ２４８に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；およびＸ２４９に対応する残基が、芳香族残基である、から選択される特徴のうちの１つ以上をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、上記アミノ酸配列は、上記特徴の少なくとも２、３、４、５、６個またはそれ以上を有し得る。いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９（またはその領域）の配列式に基づくアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、上記のＸによって特定されない残基の位置に１つ以上の残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、その相違は、上記のＸによって特定されない他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基の位置における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号２、４または１１４のアミノ酸配列と比較して、１つ以上の保存的変異を有し得る。例示的な保存的変異は、アミノ酸置換を包含し、例えば：Ｘ２７フェニルアラニン（Ｆ）に対応する残基の、別の芳香族残基、例えば、チロシンによる置換；Ｘ５７イソロイシン（Ｉ）に対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、バリンによる置換；Ｘ６４アラニン（Ａ）に対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、バリンによる置換；Ｘ６６アスパラギン酸（Ｄ）に対応する残基の、別の酸性残基、例えば、グルタミン酸による置換；残基Ｘ７２リシン（Ｋ）の、別の塩基性残基、例えば、アルギニンによる置換；Ｘ８０アラニン（Ｖ）に対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、バリンによる置換；Ｘ９３イソロイシン（Ｉ）に対応する残基の、別の極性残基、例えば、セリンによる置換；Ｘ９４アラニン（Ａ）に対応する残基の、別の非極性残基、例えば、グリシンによる置換；Ｘ９５バリン（Ｖ）に対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、ロイシンによる置換；およびＸ９６セリン（Ｓ）に対応する残基の、別の極性残基、例えば、トレオニンによる置換；Ｘ１４８バリン（Ｖ）に対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、イソロイシンによる置換；Ｘ１５２トレオニンに対応する残基の、別の極性残基、例えば、セリンによる置換；Ｘ１６３バリン（Ｖ）に対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、イソロイシンによる置換；Ｘ１７９チロシン（Ｙ）の対応物の、別の芳香族残基、例えば、フェニルアラニンによる置換；残基Ｘ１９６バリン（Ｖ）残基の、別の脂肪族残基、例えば、ロイシンによる置換；残基Ｘ１９８アスパラギン酸（Ｄ）残基の、別の酸性残基、例えば、グルタミン酸による置換；残基Ｘ２２３イソロイシン（Ｉ）残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、バリンによる置換；およびＸ２４９チロシン（Ｙ）に対応する残基の、別の芳香族残基、例えば、トリプトファンによる置換であるがこれらに限定されない。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基に対する特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基に対する特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含むケトレダクターゼポリペプチドは、以下：Ｘ７に対応する残基が、ヒスチジン、プロリン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、グリシンまたはヒスチジンである；Ｘ１７に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、特に、メチオニンである；Ｘ２５に対応する残基が、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、グルタミンまたはアスパラギン、特に、トレオニンまたはアスパラギン酸である；Ｘ２７に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、特に、チロシンである；Ｘ４１に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、セリンまたはアラニンである；Ｘ５３に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸またはグルタミン酸、特に、トレオニン、グリシンまたはアスパラギン酸である；Ｘ５７に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、バリンである；Ｘ６４に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、セリン、アラニンまたはバリンである；Ｘ６６に対応する残基が、アスパラギン酸またはグルタミン酸である；Ｘ６８に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、トレオニン、アスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグルタミン酸である；Ｘ７２に対応する残基が、リシンまたはアルギニン、特に、アルギニンである；Ｘ７６に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、アラニンまたはトレオニンである；Ｘ８０に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、アラニン、トレオニンまたはバリンである；Ｘ９３に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、イソロイシン、セリン、アラニンまたはグリシンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、システイン、グリシンまたはアラニンである；Ｘ９５に対応する残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、バリン、ロイシンまたはグルタミン酸である；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、アスパラギン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；Ｘ９７に対応する残基が、リシン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、セリン、トレオニン、グルタミンまたはアスパラギン、特に、リシン、ヒスチジンまたはセリンである；Ｘ１００に対応する残基が、リシン、アルギニン、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、グルタミン酸、リシン、グルタミンまたはアラニンである；Ｘ１０８に対応する残基が、アルギニン、リシン、ヒスチジンまたはプロリン、特に、アルギニンまたはヒスチジンである；Ｘ１１１に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、メチオニンである；Ｘ１３９に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、ロイシンである；Ｘ１４５に対応する残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、グルタミン酸またはロイシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、フェニルアラニンまたはロイシンである；Ｘ１４８に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、イソロイシンである；Ｘ１５１に対応する残基が、プロリン、ヒスチジン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、アラニンである；Ｘ１５２に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、トレオニン、トリプトファン、アラニンまたはセリンである；Ｘ１６３に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、イソロイシンである；Ｘ１６５に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン  アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、アスパラギンである；Ｘ１７３に対応する残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、特に、バリンである；Ｘ１７９に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アルギニン、リシン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、チロシン、フェニルアラニン、リシンまたはロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、プロリン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、プロリン、グルタミン、セリンまたはロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、���リシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、ロイシンである；Ｘ１９７に対応する残基が、アスパラギン酸またはグルタミン酸、特に、グルタミン酸である；Ｘ１９８に対応する残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、グルタミンまたはアスパラギン、特に、アスパラギン酸、グルタミン酸またはグルタミンである；Ｘ２１０に対応する残基が、アルギニン、リシン、セリン、トレオニン、グルタミンまたはアスパラギン、特に、トレオニンまたはアルギニンである；Ｘ２１１に対応する残基が、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミンまたはアスパラギン、特に、リシン、バリン、ロイシン、アルギニン、トレオニン、アスパラギン酸またはイソロイシンである；Ｘ２１２に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、トレオニン、セリンまたはバリンである；Ｘ２１６に対応する残基が、プロリン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシン、特に、ヒスチジンまたはアルギニンである；Ｘ２２３に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、バリンである；Ｘ２２６に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミンまたはアスパラギン、特に、トレオニンである；Ｘ２３３に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、特に、アスパラギンまたはアスパラギン酸である；Ｘ２３５に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、特に、セリンまたはトリプトファンである；Ｘ２４８に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニンまたはトリプトファン、特に、グリシンまたはトリプトファンである；およびＸ２４９に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニンまたはトリプトファン、特に、トリプトファンである、から選択される特徴のうちの１つ以上をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、上記アミノ酸配列は、上記のＸによって定義されるさらなる特徴の少なくとも２、３、４、５、６個またはそれ以上を有し得る。いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９（またはその領域）の配列式に基づくアミノ酸配列を含むケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、上記のＸによって特定されない残基の位置に１つ以上の残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、その相違は、上記のＸによって特定されない他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違であり得る。いくつ���の実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基の位置における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、以下の特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、トレオニン、システイン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである；およびＸ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシンである、のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに有し得る。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴に加えて、以下の特徴：Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシン、セリンまたはグルタミンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである、のうちの１つ以上を有し得る。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴に加えて、以下の特徴：Ｘ１７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、メチオニンである；Ｘ２７に対応する残基が、芳香族残基、特に、チロシンである；Ｘ６４に対応する残基が、極性、非極性または脂肪族残基、特に、バリンである；Ｘ８０に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基、特に、トレオニンである；Ｘ１００に対応する残基が、塩基性、酸性、極性、脂肪族または非極性残基、特に、リシンである；Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基、特に、グルタミン酸である；およびＸ２１６に対応する残基が、拘束または塩基性残基、特に、アルギニンである、のうちの１つ以上を有し得る。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴に加えて、以下の特徴：Ｘ２５に対応する残基が、極性または酸性残基、特に、トレオニンである；Ｘ４１に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンまたはアラニンである；Ｘ５３に対応する残基が、極性、非極性または酸性残基、特に、アスパラギン酸である；Ｘ５７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、バリンである；Ｘ６６に対応する残基が、酸性残基、特に、グルタミン酸である；Ｘ６８に対応する残基が、極性、酸性、脂肪族または非極性残基、特に、バリンである；Ｘ７２に対応する残基が、塩基性残基、特に、アルギニンである；Ｘ７６に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基、特に、アラニンである；Ｘ９５に対応する残基が、脂肪族、非極性または酸性残基、特に、ロイシンまたはグルタミン酸である；Ｘ９７に対応する残基が、塩基性、拘束または極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性または拘束残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ１１１に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、メチオニンである；Ｘ１３９に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；Ｘ１４５に対応する残基が、酸性、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシンまたはグルタミンである；Ｘ１４８に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、イソロイシンである；Ｘ１５１に対応する残基が、拘束、非極性または脂肪族残基、特に、アラニンである；Ｘ１５２に対応する残基が、極性、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである；Ｘ１６３に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、イソロイシンである；Ｘ１６５に対応する残基が、極性、非極性または脂肪族残基、特に、アスパラギンである；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性、非極性または脂肪族残基、特に、バリンである；Ｘ１７９に対応する残基が、芳香族、塩基性、脂肪族または非極性残基、特に、フェニルアラニンである；Ｘ１９７に対応する残基が、酸性残基、特に、グルタミン酸である；Ｘ２１０に対応する残基が、極性または塩基性残基、特に、アルギニンである；Ｘ２１２に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、バリンまたはセリンである；Ｘ２２３に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、バリンである；Ｘ２２６に対応する残基が、非極性または極性残基、特に、トレオニンである；Ｘ２３３に対応する残基が、極性または酸性残基、特に、アスパラギンまたはアスパラギン酸である；Ｘ２３５に対応する残基が、極性または芳香族残基、特に、トリプトファンである；Ｘ２４８に対応する残基が、非極性または芳香族残基、特に、グリシンまたはトリプトファンである；およびＸ２４９に対応する残基が、芳香族残基である、特に、トリプトファンである、のうちの１つ以上を有し得る。当業者に明らかであるように、前述の群の中の特徴の様々な組み合わせが、本開示のケトレダクターゼを形成するために使用され得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、以下のさらなる特徴：Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、トレオニン、システイン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである、のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、以下のさらなる特徴：Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、トレオニン、システイン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである；およびＸ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシンである、のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、以下のさらなる特徴：Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、トレオニン、システイン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシンである；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである、のうちの１つ以上または少なくともすべてを含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含むことを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、以下のさらなる特徴：Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、トレオニン、システイン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシン、セリンまたはグルタミンである；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリンである、のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、以下のさらなる特徴：Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、トレオニン、システイン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシン、セリンまたはグルタミンである；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである、のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、以下のさらなる特徴：Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、トレオニンまたはロイシンである；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、トレオニン、イソロイシン、ロイシンまたはバリンである、のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、以下のさらなる特徴：Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、システイン、トレオニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである；Ｘ１００に対応する残基が、塩基性、酸性、極性、脂肪族または非極性残基、特に、リシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシンである；Ｘ１５２に対応する残基が、極性、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシン、セリンまたはグルタミンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；ならびに対応する残基およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである、のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、以下のさらなる特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ６６に対応する残基が、酸性残基、特に、グルタミン酸である；Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンまたはグリシンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特に、システインである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、イソロイシン、ロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシン、セリンまたはグルタミンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基、特に、グルタミン酸である；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、トレオニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである、のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、以下のさらなる特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ１７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、メチオニンである；Ｘ２７に対応する残基が、芳香族残基である、特に、チロシンである；Ｘ６４に対応する残基が、極性、非極性または脂肪族残基、特に、バリンである；Ｘ６６に対応する残基が、酸性残基、特に、グルタミン酸である；Ｘ８０に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基、特に、トレオニンである；Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンまたはグリシンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特に、システインである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、イソロイシン、ロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１００に対応する残基が、塩基性、酸性、極性、脂肪族、非極性残基または拘束残基、特に、リシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシン、セリンまたはグルタミンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基、特に、グルタミン酸である；Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、トレオニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである；およびＸ２１６に対応する残基が、拘束または塩基性残基、特に、アルギニンである、のうちの１つ以上または少なくともすべてをさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、グリシンまたはヒスチジンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ１７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、メチオニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ２５に対応する残基が、極性または酸性残基、特に、トレオニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ２７に対応する残基が、芳香族残基である、特に、チロシンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ５３に対応する残基が、極性、非極性または酸性残基、特に、アスパラギン酸である、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ６４に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、バリンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ８０に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基、特に、バリンまたはトレオニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基、特に、グリシンまたはシステインである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニンまたはシステインである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ１００に対応する残基が、塩基性、酸性、極性、脂肪族または非極性残基、特に、リシンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性または拘束残基、特に、ヒスチジンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ１５１に対応する残基が、拘束、非極性または脂肪族残基、特に、アラニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ１６５に対応する残基が、極性、非極性または脂肪族残基、特に、アスパラギンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ１７３に対応する残基が、酸性、非極性または脂肪族残基、特に、バリンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリン、グルタミンまたはロイシンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基、特に、グルタミン酸またはグルタミンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ２１０に対応する残基が、極性または塩基性残基、特に、アルギニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ２１２に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、バリンまたはセリンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ２１６に対応する残基が、拘束または塩基性残基、特に、アルギニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ２２３に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、バリンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ２２６に対応する残基が、非極性または極性残基、特に、トレオニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、フェニルアラニンまたはロイシンである；およびＸ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る（例えば、配列番号４８）。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、配列番号４８）。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、アスパラギン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、フェニルアラニンまたはロイシンである；およびＸ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る（例えば、配列番号４２、４４、４６または９０）。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、配列番号４２、４４、４６または９０）。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、アスパラギン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、フェニルアラニンまたはロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る（例えば、配列番号８８、９４または１０２）。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、配列番号８８、９４または１０２）。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、アスパラギン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、フェニルアラニンまたはロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシン、グルタミンまたはセリンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る（例えば、配列番号９８）。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、配列番号９８）。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、アスパラギン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、フェニルアラニンまたはロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して他のアミノ酸残基における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る（例えば、配列番号８４）。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、配列番号８４）。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ６６に対応する残基が、酸性残基、特に、グルタミン酸である；Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、アスパラギン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、フェニルアラニンまたはロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る（例えば、配列番号６４）。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、配列番号６４）。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ１７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、メチオニンである；Ｘ２７に対応する残基が、芳香族残基である、特に、チロシンである；Ｘ６４に対応する残基が、極性、非極性または脂肪族残基、特に、バリンである；Ｘ８０に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基、特に、トレオニンまたはバリンである；Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、アスパラギン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１００に対応する残基が、塩基性、酸性、極性または脂肪族、特に、リシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、フェニルアラニンまたはロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る（例えば、配列番号２２または２４）。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、配列番号２２または２４）。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ６６に対応する残基が、酸性残基、特に、グルタミン酸である；Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、アスパラギン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、フェニルアラニンまたはロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性または非極性残基、特に、アスパラギンまたはロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基、特に、グルタミン酸またはアスパラギンである；Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；およびＸ２１６に対応する残基が、拘束または塩基性残基、特に、アルギニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る（例えば、配列番号５８）。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、配列番号５８）。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ６６に対応する残基が、酸性残基、特に、グルタミン酸である；Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基、特に、システインである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、システイン、トレオニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族または脂肪族残基、特に、ロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基、特に、グルタミンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基、特に、グルタミン酸である；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族または非極性残基、特に、バリンバリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る（例えば、配列番号４０）。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、配列番号４０）。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ１７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、メチオニンである；Ｘ２７に対応する残基が、芳香族残基である、特に、チロシンである；Ｘ６４に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、バリンである；Ｘ８０に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基、特に、トレオニンまたはバリンである；Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、アスパラギン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１００に対応する残基が、塩基性、酸性、極性、非極性または脂肪族残基、特に、リシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、フェニルアラニンまたはロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性または非極性残基、特に、アスパラギンまたはロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基、特に、グルタミン酸またはアスパラギンである；Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；およびＸ２１６に対応する残基が、拘束または塩基性残基、特に、アルギニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る（例えば、配列番号１４または１６）。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、配列番号１４または１６）。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ１７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、メチオニンである；Ｘ２５に対応する残基が、極性または酸性残基、特に、トレオニンである；Ｘ２７に対応する残基が、芳香族残基である、特に、チロシンである；Ｘ５３に対応する残基が、極性、非極性または酸性残基、特に、アスパラギン酸である；Ｘ６４に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、バリンである；Ｘ８０に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基、特に、トレオニンまたはバリンである；Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、アスパラギン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１００に対応する残基が、塩基性、酸性、極性、非極性または脂肪族残基、特に、リシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、フェニルアラニンまたはロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性または非極性残基、特に、アスパラギンまたはロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基、特に、グルタミン酸またはアスパラギンである；Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；およびＸ２１６に対応する残基が、拘束または塩基性残基、特に、アルギニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る（例えば、配列番号６）。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、配列番号６）。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、配列番号１１１、１１２もしくは１３９またはその領域（例えば、残基９０〜２１１）の配列式に基づくアミノ酸配列を含む改善されたケトレダクターゼは、少なくとも以下のさらなる特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ１７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、メチオニンである；Ｘ２５に対応する残基が、極性または酸性残基、特に、トレオニンである；Ｘ２７に対応する残基が、芳香族残基である、特に、チロシンである；Ｘ５３に対応する残基が、極性、非極性または酸性残基、特に、アスパラギン酸である；Ｘ６４に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、バリンである；Ｘ７６に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基、特に、アラニンである；Ｘ８０に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基、特に、トレオニンまたはバリンである；Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、アスパラギン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１００に対応する残基が、塩基性、酸性、極性、非極性または脂肪族残基、特に、リシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、フェニルアラニンまたはロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性または非極性残基、特に、アスパラギンまたはロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基、特に、グルタミン酸またはアスパラギンである；Ｘ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；およびＸ２１６に対応する残基が、拘束または塩基性残基、特に、アルギニンである、をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２６、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る（例えば、配列番号８）。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼが、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を有することを条件として、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む（例えば、配列番号８）。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたケトレダクターゼは、Ｘ１９０に対応する残基が拘束残基であり、且つ、Ｘ２０２に対応する残基が芳香族残基である、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域は、Ｘ１９０に対応する残基がプロリンであり、且つ、Ｘ２０２に対応する残基がトリプトファンである、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の対応ドメインと比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８または１〜２０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基の位置における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８または約２０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼドメインまたは領域が、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含むという条件で、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基において前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の対応ドメインと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるドメインまたは領域を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、本開示の改善されたケトレダクターゼは、Ｘ１９０に対応する残基が、拘束残基であり；Ｘ１９５に対応する残基が、塩基性、酸性、非極性または極性残基であり；且つ、Ｘ２０２に対応する残基が、芳香族残基である、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応するドメインまたは領域は、Ｘ１９０に対応する残基が、プロリンであり；Ｘ１９５に対応する残基が、プロリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸またはアスパラギン、特に、アルギニンであり；且つ、Ｘ２０２に対応する残基が、トリプトファンである、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の対応ドメインと比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８または１〜２０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８または約２０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼドメインまたは領域が、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含むという条件で、Ｘ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基において前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の対応ドメインと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるドメインまたは領域を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基９０〜２１１に対応し、且つ、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、ドメインまたは領域を有するケトレダクターゼポリペプチドは、その領域またはドメインにおいて、以下：Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基である；Ｘ９５に対応する残基が、脂肪族、非極性または酸性残基である；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ９７に対応する残基が、塩基性、拘束または極性残基である；Ｘ１００に対応する残基が、塩基性、酸性、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１０８に対応する残基が、塩基性または拘束残基である；Ｘ１１１に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１３９に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１４５に対応する残基が、酸性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１４８に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１５１に対応する残基が、拘束、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１５２に対応する残基が、極性、芳香族、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１６３に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１６５に対応する残基が、極性、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１７３に対応する残基が、酸性、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１７９に対応する残基が、芳香族、塩基性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ１９７に対応する残基が、酸性残基である；Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基である；Ｘ２１０に対応する残基が、極性または塩基性残基である；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基である、から選択される特徴のうちの１つ以上をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の対応ドメインと比較して、上記のＸによって特定されない他のアミノ酸残基における約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８または１〜２０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８または約２０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、上に記載されたような、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列を有するドメインまたは領域を有するケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の対応ドメインのアミノ酸配列と比較して、そのドメインまたは領域内に１つ以上の保存的変異を有し得る。そのような保存的変異の例としては、アミノ酸置換、例えば：Ｘ９３イソロイシン（Ｉ）に対応する残基の、別の極性残基、例えば、セリンによる置換；Ｘ９４アラニン（Ａ）に対応する残基の、別の非極性残基、例えば、グリシンによる置換；Ｘ９５バリン（Ｖ）に対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、ロイシンによる置換；およびＸ９６セリン（Ｓ）に対応する残基の、別の極性残基、例えば、トレオニンによる置換；Ｘ１４８バリン（Ｖ）に対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、イソロイシンによる置換；Ｘ１５２トレオニンに対応する残基の、別の極性残基、例えば、セリンによる置換；Ｘ１６３バリン（Ｖ）に対応する残基の、別の非極性または脂肪族残基、例えば、イソロイシンによる置換；Ｘ１７９チロシン（Ｙ）の対応物の、別の芳香族残基、例えば、フェニルアラニンによる置換；および残基Ｘ１９６バリン（Ｖ）の、別の脂肪族残基、例えば、ロイシンによる置換；残基Ｘ１９８アスパラギン酸（Ｄ）の、別の酸性残基、例えば、グルタミン酸による置換が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基９０〜２１１に対応し、且つ、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、ドメインまたは領域を有するケトレダクターゼポリペプチドは、その領域またはドメインにおいて、以下：Ｘ９３に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、イソロイシン、セリン、アラニンまたはグリシンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、システイン、グリシンまたはアラニンである；Ｘ９５に対応する残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、バリン、ロイシンまたはグルタミン酸である；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、アスパラギン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである；Ｘ９７に対応する残基が、リシン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、セリン、トレオニン、グルタミンまたはアスパラギン、特に、リシン、ヒスチジンまたはセリンである；Ｘ１００に対応する残基が、リシン、アルギニン、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、グルタミン酸、リシン、グルタミンまたはアラニンである；Ｘ１０８に対応する残基が、アルギニン、リシン、ヒスチジンまたはプロリン、特に、アルギニンまたはヒスチジンである；Ｘ１１１に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、メチオニンである；Ｘ１３９に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、ロイシンである；Ｘ１４５に対応する残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、グルタミン酸またはロイシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、フェニルアラニンまたはロイシンである；Ｘ１５１に対応する残基が、プロリン、ヒスチジン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、アラニンである；Ｘ１５２に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、トレオニン、トリプトファン、アラニンまたはセリンである；Ｘ１６３に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、イソロイシンである；Ｘ１６５に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン  アスパラギン、グリシン、���チオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、アスパラギンである；Ｘ１７３に対応する残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、特に、バリンである；Ｘ１７９に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、アルギニン、リシン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、チロシン、フェニルアラニン、リシンまたはロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、プロリン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、プロリン、グルタミン、セリンまたはロイシンである；Ｘ１９６に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、ロイシンである；Ｘ１９７に対応する残基が、アスパラギン酸またはグルタミン酸、特に、グルタミン酸である；Ｘ１９８に対応する残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、グルタミンまたはアスパラギン、特に、アスパラギン酸、グルタミン酸またはグルタミンである；Ｘ２１０に対応する残基が、アルギニン、リシン、セリン、トレオニン、グルタミンまたはアスパラギン、特に、トレオニンまたはアルギニンである；およびＸ２１１に対応する残基が、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミンまたはアスパラギン、特に、バリン、ロイシン、トレオニンまたはイソロイシンである、から選択される特徴のうちの１つ以上をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の対応ドメインと比較して、上記のＸによって特定されない他のアミノ酸残基の位置における約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８または１〜２０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８または約２０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基９０〜２１１に対応し、且つ、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、ドメインまたは領域を有するケトレダクターゼポリペプチドは、その領域またはドメインにおいて、以下：Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、トレオニン、システイン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、トレオニンまたはイソロイシンである、から選択される特徴のうちの１つ以上またはすべてをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列のドメインと比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８または１〜２０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８または約２０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼ領域またはドメインは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列は、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基９０〜２１１に対応し、且つ、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、ドメインまたは領域を有するケトレダクターゼポリペプチドは、その領域またはドメインにおいて、以下：Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、トレオニン、システイン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシンである；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、トレオニンまたはイソロイシンである、から選択される特徴のうちの１つ以上またはすべてをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列のドメインと比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８または１〜２０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８または約２０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼ領域またはドメインは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列は、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基９０〜２１１に対応し、且つ、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、ドメインまたは領域を有するケトレダクターゼポリペプチドは、その領域またはドメインにおいて、以下：Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、トレオニン、システイン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンまたはグルタミンである；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、トレオニンまたはイソロイシンである、から選択される特徴のうちの１つ以上またはすべてをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列のドメインと比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８または１〜２０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８または約２０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼ領域またはドメインは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列は、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基９０〜２１１に対応し、且つ、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、ドメインまたは領域を有するケトレダクターゼポリペプチドは、その領域またはドメインにおいて、以下：Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、トレオニン、システイン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシン、セリンまたはグルタミンである；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはトレオニンである、から選択される特徴のうちの１つ以上またはすべてをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列のドメインと比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８または１〜２０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８または約２０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼ領域またはドメインは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列は、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基９０〜２１１に対応し、且つ、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、ドメインまたは領域を有するケトレダクターゼポリペプチドは、その領域またはドメインにおいて、以下：Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、トレオニンまたはロイシンである；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、トレオニン、イソロイシン、ロイシンまたはバリンである、から選択される特徴のうちの１つ以上またはすべてをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列のドメインと比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８または１〜２０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８または約２０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼ領域またはドメインは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列は、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基９０〜２１１に対応し、且つ、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、ドメインまたは領域を有するケトレダクターゼポリペプチドは、その領域またはドメインにおいて、以下：Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、脂肪族または非極性残基、特に、システインまたはグリシンである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、システイン、トレオニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである；Ｘ１００に対応する残基が、塩基性、酸性、極性、脂肪族または非極性残基、特に、リシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシンである；Ｘ１５２に対応する残基が、極性、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、セリンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンまたはグルタミンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；ならびに対応する残基およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、バリンである、から選択される特徴のうちの１つ以上またはすべてをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８または約２０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列のドメインと比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８または１〜２０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８または約２０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼ領域またはドメインは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列は、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基９０〜２１１に対応し、且つ、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、ドメインまたは領域を有するケトレダクターゼポリペプチドは、その領域またはドメインにおいて、以下：Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンまたはグリシンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特に、システインである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、イソロイシン、ロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基、特に、グルタミンまたはセリンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基、特に、グルタミン酸である；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、トレオニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである、から選択される特徴のうちの１つ以上またはすべてをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列のドメインと比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８または１〜２０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８または約２０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼ領域またはドメインは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列は、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基９０〜２１１に対応し、且つ、本明細書中に記載されるような、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基における特定の特徴を有する、ドメインまたは領域を有するケトレダクターゼポリペプチドは、その領域またはドメインにおいて、以下：Ｘ９３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、セリンまたはグリシンである；Ｘ９４に対応する残基が、システイン、非極性または脂肪族残基、特に、システインである；Ｘ９６に対応する残基が、システイン、極性、脂肪族または非極性残基、特に、イソロイシン、ロイシンまたはトレオニンである；Ｘ１００に対応する残基が、塩基性、酸性、極性、脂肪族、非極性残基または拘束残基、特に、リシンである；Ｘ１４７に対応する残基が、芳香族、脂肪族または非極性残基、特に、ロイシンである；Ｘ１９４に対応する残基が、拘束、極性、脂肪族または非極性残基、特に、グルタミンまたはセリンである；Ｘ１９６に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、ロイシンである；Ｘ１９８に対応する残基が、酸性または極性残基、特に、グルタミン酸である；およびＸ２１１に対応する残基が、塩基性、脂肪族、非極性、酸性または極性残基、特に、トレオニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンである、から選択される特徴のうちの１つ以上またはすべてをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、残基９０〜２１１に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列のドメインと比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８または１〜２０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８または約２０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼ領域またはドメインは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列は、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の残基９０〜２１１に対応するアミノ酸配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基１〜８９に対応するドメインまたは領域をさらに含み得、ここで、そのドメインまたは領域は、以下の特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基である；Ｘ１７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ２５に対応する残基が、極性または酸性残基である；Ｘ２７に対応する残基が、芳香族残基である；Ｘ４１に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ５３に対応する残基が、極性、非極性または酸性残基である；Ｘ５７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ６４に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ６６に対応する残基が、酸性残基である；Ｘ６８に対応する残基が、極性、酸性、脂肪族または非極性残基である；Ｘ７２に対応する残基が、塩基性残基である；Ｘ７６に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基である；Ｘ８０に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基である、のうちの１つ以上を有し得る。いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基１〜８９に対応する領域またはドメインを含むポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、上記のＸによって特定されない残基の位置に１つ以上の残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、その相違は、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、上記のＸによって特定されない他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５または１〜１６残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基の位置における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５または１６残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基１〜８９に対応するドメインまたは領域をさらに含み得、ここで、そのドメインまたは領域は、以下の特徴：Ｘ７に対応する残基が、ヒスチジン、プロリン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、グリシンまたはヒスチジンである；Ｘ１７に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、特に、メチオニンである；Ｘ２５に対応する残基が、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、グルタミンまたはアスパラギン、特に、トレオニンまたはアスパラギン酸である；Ｘ２７に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、特に、チロシンである；Ｘ４１に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、セリンまたはアラニンである；Ｘ５３に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸またはグルタミン酸、特に、トレオニン、グリシンまたはアスパラギン酸である；Ｘ５７に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、バリンである；Ｘ６４に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、セリン、アラニンまたはバリンである；Ｘ６６に対応する残基が、アスパラギン酸またはグルタミン酸である；Ｘ６８に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、トレオニン、アスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグルタミン酸である；Ｘ７２に対応する残基が、リシンまたはアルギニン、特に、アルギニンである；Ｘ７６に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、アラニンまたはトレオニンである；およびＸ８０に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、アラニン、トレオニンまたはバリンである、のうちの１つ以上を有し得る。いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基１〜８９に対応する領域またはドメインを含むポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、上記のＸによって特定されない残基の位置に１つ以上の残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、その相違は、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、上記のＸによって特定されない他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５または１〜１６残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基の位置における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５または１６残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基１〜８９に対応するドメインまたは領域をさらに含み得、ここで、そのドメインまたは領域は、少なくとも以下の特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである、を有し得る。いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基１〜８９に対応する領域またはドメインを含むポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他の残基の位置に１つ以上の残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、残基１〜８９に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の対応ドメインまたは領域と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５または１〜１６残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５または約１６残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼ領域またはドメインは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列は、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基１〜８９に対応するドメインまたは領域をさらに含み得、ここで、そのドメインまたは領域は、以下の特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；およびＸ６６に対応する残基が、酸性残基、特に、グルタミン酸である、のうちの１つ以上または少なくともすべてを有し得る。いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基１〜８９に対応する領域またはドメインを含むポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他の残基の位置に１つ以上の残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、残基１〜８９に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の対応ドメインと比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５または１〜１６残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基の位置における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５または約１６残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼ領域またはドメインは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列は、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基１〜８９に対応するドメインまたは領域をさらに含み得、ここで、そのドメインまたは領域は、以下の特徴：Ｘ７に対応する残基が、拘束または非極性残基、特に、ヒスチジンである；Ｘ１７に対応する残基が、非極性または脂肪族残基、特に、メチオニンである；Ｘ２７に対応する残基が、芳香族残基である、特に、チロシンである；Ｘ６４に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、バリンである；およびＸ８０に対応する残基が、脂肪族、非極性または極性残基、特に、トレオニンまたはバリンである、のうちの１つ以上または少なくともすべてを有し得る。いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基１〜８９に対応する領域またはドメインを含むポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他の残基の位置に１つ以上の残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、残基１〜８９に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の対応ドメインと比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５または１〜１６残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基の位置における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５または約１６残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼ領域またはドメインは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列は、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の残基１〜８９に対応するアミノ酸配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基２１２〜２５２に対応するドメインまたは領域をさらに含み得、ここで、そのドメインまたは領域は、以下の特徴：Ｘ２１２に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性である；Ｘ２１６に対応する残基が、拘束または塩基性残基である；Ｘ２２３に対応する残基が、非極性または脂肪族残基である；Ｘ２２６に対応する残基が、非極性または極性残基である；Ｘ２３３に対応する残基が、極性または酸性である；Ｘ２３５に対応する残基が、極性または芳香族残基である；Ｘ２４８に対応する残基が、非極性または芳香族残基である；およびＸ２４９に対応する残基が、芳香族残基である、のうちの１つ以上を有し得る。いくつかの実施形態において、そのアミノ酸配列は、上記のＸによって特定されるさらなる特徴の少なくとも２、３、４、５、６個またはそれ以上を有し得る。いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９（またはその領域）の配列式に基づくアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、上記のＸによって特定されない残基の位置に１つ以上の残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、その相違は、上記のＸによって特定されない他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９または１〜１０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基の位置における１、２、３、４、５、６、７、８、９または約１０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基２１２〜２５２に対応するドメインまたは領域をさらに含み得、ここで、そのドメインまたは領域は、以下の特徴：Ｘ２１２に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、トレオニン、セリンまたはバリンである；Ｘ２１６に対応する残基が、プロリン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシン、特に、ヒスチジンまたはアルギニンである；Ｘ２２３に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン、特に、バリンである；Ｘ２２６に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、グルタミンまたはアスパラギン、特に、トレオニンである；Ｘ２３３に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、特に、アスパラギンまたはアスパラギン酸である；Ｘ２３５に対応する残基が、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、特に、セリンまたはトリプトファンである；Ｘ２４８に対応する残基が、グリシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニンまたはトリプトファン、特に、グリシンまたはトリプトファンである；およびＸ２４９に対応する残基が、チロシン、フェニルアラニンまたはトリプトファン、特に、トリプトファンである、のうちの１つ以上を有し得る。いくつかの実施形態において、そのアミノ酸配列は、上記のＸによって特定されるさらなる特徴の少なくとも２、３、４、５、６個またはそれ以上を有し得る。いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９（またはその領域）の配列式に基づくアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、上記のＸによって特定されない残基の位置に１つ以上の残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、その相違は、上記のＸによって特定されない他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９または１〜１０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基の位置における１、２、３、４、５、６、７、８、９または約１０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基２１２〜２５２に対応するドメインまたは領域をさらに含み得、ここで、ドメインまたは領域は、少なくとも以下の特徴：Ｘ２１６に対応する残基が、拘束または塩基性残基、特に、アルギニンである、を有する。いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基２１２〜２５２に対応する領域またはドメインを含むポリペプチドは、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他の残基の位置に１つ以上の残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、残基２１２〜２５２に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の対応ドメインと比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９または１〜１０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９または約１０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼ領域またはドメインは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列は、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の残基２１２〜２５２に対応するアミノ酸配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基２１２〜２５２に対応するドメインまたは領域をさらに含み得、ここで、そのドメインまたは領域は、以下の特徴：Ｘ２１２に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性残基、特に、トレオニン、セリンまたはバリンである；Ｘ２１６に対応する残基が、拘束または塩基性残基、特に、ヒスチジンまたはアルギニンである；Ｘ２２３に対応する残基が、極性、脂肪族または非極性、特に、バリンである；Ｘ２３３に対応する残基が、極性または酸性残基、特に、アスパラギンまたはアスパラギン酸である；Ｘ２３５に対応する残基が、極性または芳香族残基、特に、セリンまたはトリプトファンである；Ｘ２４８に対応する残基が、非極性または芳香族残基、特に、グリシンまたはトリプトファンである；およびＸ２４９に対応する残基が、芳香族残基、特に、トリプトファンである、のうちの１つ以上または少なくともすべてを有し得る。いくつかの実施形態において、配列番号１１１、１１２または１３９の配列式の残基２１２〜２５２に対応する領域またはドメインを含むポリペプチドは、配列番号２、４または１１４の参照配列と比較して、他の残基の位置に１つ以上の残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、残基２１２〜２５２に対応する領域またはドメインは、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の対応ドメインと比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９または１〜１０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、そのドメイン内の他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９または約１０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼ領域またはドメインは、少なくとも前述の特徴を有するアミノ酸配列を含み、ここで、そのアミノ酸配列は、前述の特徴を有する、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列の残基２１２〜２５２に対応するアミノ酸配列と比較して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。
【０１７１】
下記の表２は、関連する活性を有する、本明細書中に開示される特定の配列番号のリストを提供している。下記の配列は、別段明記されない限り、野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒケトレダクターゼ配列（配列番号３および４）由来のものである。下記の表２では、各横列に、２つの配列番号を列挙し、ここで、奇数は、偶数によって提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。変異の数を列挙している縦列は、配列番号４のＬ．ｋｅｆｉｒ  ＫＲＥＤアミノ酸配列と比較したときのアミノ酸置換の数に関するものである。活性の縦列では、１つの「＋」は、約２４時間で、１０ｇ／Ｌの酵素が１ｇ／Ｌの基質の１０〜２０％を変換する能力に対応する。２つのプラス符号「＋＋」は、本ポリペプチドが、配列番号９０よりも約１〜５０倍高い活性であることを示す。３つのプラス符号「＋＋＋」は、本ポリペプチドが、配列番号９０よりも約５０〜２５０倍高い活性であることを示す。４つのプラス符号「＋＋＋＋」は、本ポリペプチドが、配列番号９０よりも約２５０〜１０００倍高い活性であることを示し、５つのプラス符号「＋＋＋＋＋」は、本ポリペプチドが、配列番号９０よりも１０００倍超活性であることを示す。
【０１７２】
【表２−１】
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【０１７３】
【表２−２】
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【０１７４】
【表２−３】
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【０１７５】
【表２−４】
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【０１７６】
【表２−５】
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いくつかの実施形態において、本ポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８または１１０に基づくポリペプチド参照配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するが、但し、そのケトレダクターゼポリペプチドアミノ酸配列は、配列番号４と比較して、表２に列挙された置換組み合わせのいずれか１セットを含むことを条件とする。いくつかの実施形態において、そのケトレダクターゼポリペプチドは、参照配列と比較して、他のアミノ酸残基の位置における１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０残基の相違をさらに有し得る。いくつかの実施形態において、相違の数は、他のアミノ酸残基における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０残基の相違であり得る。いくつかの実施形態において、その相違は、保存的変異を含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約９９％の立体異性体過剰率、且つ、配列番号９０のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドよりも改善された速度で、基質２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに変換することができる。そのような特性を有する例示的なポリペプチドとしては、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８および１１０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。配列番号９０のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドは、野生型（配列番号４）よりも改善された、速度（例えば、１ｇ／Ｌの基質の１０〜２０％が２４時間で約１０ｇ／ＬのＫＲＥＤによって生成物に変換される速度）および立体選択性（９９％の立体異性体過剰率）で上記基質を上記生成物に変換することができるので、配列番号９０よりも改善された本明細書中のポリペプチドもまた、野生型よりも改善されている。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約９９％の立体異性体過剰率、且つ、配列番号９０のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドに対して少なくとも１〜５０倍改善された速度で基質２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに変換することができる。そのような特性を有する例示的なポリペプチドとしては、配列番号４２、４４、４６、４８、８６、８８、９２、９４、９６、１００および１０２に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約９９％の立体異性体過剰率、且つ、配列番号９０のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドよりも少なくとも５０〜２５０倍改善された速度で、基質２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに変換することができる。そのような特性を有する例示的なポリペプチドとしては、配列番号１０、３２、３４、３６、５０、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、９８、１０４、１０６および１０８に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約９９％の立体異性体過剰率、且つ、配列番号９０のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドよりも少なくとも２５０〜１０００倍改善された速度で、基質２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに変換することができる。そのような特性を有する例示的なポリペプチドとしては、配列番号１２、１８、２２、２４、２６、２８、３０、３８、４０、５２、５４、５６、５８、６０、６２および１１０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも約９９％の立体異性体過剰率、且つ、配列番号９０のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドよりも少なくとも１０００倍改善された速度で、基質２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステルを生成物（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエートに変換することができる。そのような特性を有する例示的なポリペプチドとしては、配列番号６、８、１４、１６および２０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、上記改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号９０のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドと比較して、上記生成物への上記基質の変換に対する競合的インヒビターとしてのアセトンに対して改善された抵抗性を有し得る。この改善された抵抗性を有する例示的なポリペプチドとしては、配列番号配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９８、１０４、１０６、１０８および１１０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、約１００ｇ／Ｌを超える基質および約５ｇ／Ｌ未満の本ポリペプチドを用いて行われるとき、約２４時間未満で上記基質の少なくとも約９５％を上記生成物に変換することができる。この能力を有する例示的なポリペプチドとしては、配列番号６、８、１４、１６および２０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、高度に立体選択的であり、それは、約９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％を超える立体異性体過剰率で上記基質を上記生成物に還元し得る。そのような高い立体選択性を有する例示的なケトレダクターゼポリペプチドとしては、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８および１１０に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、上記改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４、配列番号１１４またはその領域もしくはドメイン（例えば、残基９０〜２１１）と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得るが、但し、配列番号２、４または１１４の残基１９０に対応する残基は、プロリンであり、配列番号２、４または１１４の残基１９５に対応する残基は、アルギニンであり、そして配列番号２、４または１１４の残基２０２に対応する残基は、トリプトファンであり、そのポリペプチドが、野生型ｋｅｆｉｒケトレダクターゼまたは別の操作されたケトレダクターゼ（例えば、配列番号９０）よりもさらに改善される（例えば、立体選択性、酵素活性および／または熱安定性に関して）ように、さらに以下の置換のうちの１つ以上をさらに有することを条件とする：７→Ｈ；１７→Ｍ；２５→Ｔ；２７→Ｙ；４１→Ｓ；５３→Ｄ；５７→Ｖ；６４→Ｖ；６６→Ｅ；６８→Ｖ、Ｅ；７２→Ｒ；７６→Ａ；８０→Ｔ、Ｖ；９３→Ｓ、Ａ、Ｇ；９４→Ｃ、Ｇ；９５→Ｌ、Ｅ；９６→Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｔ；９７→Ｈ、Ｓ；１００→Ｋ、Ｑ、Ａ；１０８→Ｈ；１１１→Ｍ；１３９→Ｌ；１４５→Ｌ；１４７→Ｌ；１５２→Ｗ、Ａ、Ｓ；１６３→Ｉ；１７９→Ｆ、Ｋ、Ｌ；１９４→Ｑ、Ｓ、Ｌ；１９６→Ｌ；１９７→Ｅ；１９８→Ｅ、Ｑ；２１０→Ｒ；２１１→Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｄ、Ｉ；２１２→Ｓ、Ｖ；２１６→Ｒ；２２３→Ｖ；２３３→Ｎ；２３５→Ｗ；２４８→Ｗ；および２４９→Ｗ。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、上記改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２、４または１１４（またはその領域もしくはドメイン（例えば、残基９０〜２１１））と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得るが、但し、配列番号２、４または１１４の残基１９０に対応する残基は、プロリンであり；配列番号２、４または１１４の残基１９５に対応する残基は、アルギニンであり；そして配列番号２、４または１１４の残基２０２に対応する残基は、トリプトファンであり、そのポリペプチドが、野生型ｋｅｆｉｒケトレダクターゼまたは別の操作されたケトレダクターゼ（例えば、配列番号９０）よりもさらに改善される（例えば、立体選択性、酵素活性および／または熱安定性に関して）ように、以下の置換のうちの少なくとも１つ以上をさらに有することを条件とする：１７→Ｍ；２７→Ｙ；６４→Ｖ；８０→Ｔ；９３→Ｓ；９４→Ｃ；９６→Ｌ；１００→Ｋ；１４７→Ｌ；１５２→Ｓ；１９４→Ｑ；および２１１→Ｖ。
【０１８７】
当業者によって認識されるように、上で定義されたアミノ酸のカテゴリーのいくつかは、別段明記されない限り、相互排他的ではない。したがって、２つ以上の物理化学的特性を示す側鎖を有するアミノ酸は、複数のカテゴリーに包含され得る。任意のアミノ酸または残基の適切な分類は、特に、本明細書中に提供される詳細な開示に鑑みて、当業者に明らかであろう。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、上記操作され改善されたケトレダクターゼ酵素は、天然に存在するケトレダクターゼポリペプチドの欠失または他の操作されたケトレダクターゼポリペプチドの欠失を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される操作され改善されたケトレダクターゼ酵素の各々は、本明細書中に記載されるポリペプチドの欠失を含み得る。したがって、本開示のケトレダクターゼポリペプチドの各々およびすべての実施形態について、そのケトレダクターゼ活性の機能活性が維持される限り、その欠失は、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、３つ以上のアミノ酸、４つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、６つ以上のアミノ酸、８つ以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、１５個以上のアミノ酸または２０個以上のアミノ酸、そのケトレダクターゼポリペプチドのアミノ酸の総数の最大１０％、アミノ酸の総数の最大１０％、アミノ酸の総数の最大２０％またはアミノ酸の総数の最大３０％を含み得る。いくつかの実施形態において、その欠失は、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０アミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態において、欠失の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、その欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８または２０アミノ酸残基の欠失を含み得る。
【０１８９】
本明細書中に記載されるとき、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、そのケトレダクターゼポリペプチドが他のポリペプチド（例としては、これらに限定されないが、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）、精製配列（例えば、Ｈｉｓタグ）および細胞局在化シグナル（例えば、分泌シグナル）など）に融合された、融合ポリペプチドの形態であり得る。したがって、そのケトレダクターゼポリペプチドは、他のポリペプチドとの融合有り、または無しで、使用され得る。
【０１９０】
本明細書に記載するポリペプチドは、遺伝子コード化されたアミノ酸に限定されない。遺伝子コード化されたアミノ酸に加えて、本明細書に記載するポリペプチドは、全部または一部、天然由来のおよび／または合成の非コード化アミノ酸から成り得る。本明細書に記載するポリペプチドを構成し得る一定の一般に見かける非コード化アミノ酸としては、次のものが挙げられるが、それらに限定されない：遺伝子コード化されたアミノ酸のＤ−立体異性体；２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２−クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３−フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２−ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３−ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２−メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４−メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２−ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３−ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２−シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４−アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４−アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド−２−イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド−３−イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド−４−イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト−１−イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト−２−イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルカラニン（ｓＡｌａ）；オーソリルアラニン（ａＡｌａ）；３，３−ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３−アミノ−５−フェニルペンタン酸（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン���Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）−ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリジン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈＧｌｕ）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）；アゼチジン−３−カルボン酸（ＡＣＡ）；１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸；アリルグリシン（ａＯｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）；ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）。本明細書に記載するポリペプチドを構成し得る追加の非コード化アミノ酸は、当業者に認識される（例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，ＣＲＣ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬの３−７０頁およびそこに引用されている参考文献に提供されている様々なアミノ酸を参照のこと。それらのすべてが参照として援用されている）。これらのアミノ酸は、Ｌ立体配置である場合もあり、またはＤ立体配置である場合もある。
【０１９１】
側鎖保護基を有するアミノ酸または残基も本明細書に記載するポリペプチドを構成する場合があることは、当業者に理解される。そのような保護アミノ酸（この場合、これらは芳香族カテゴリーに属する）の非限定的な例としては、次のもの（括弧内に保護基を列挙する）が挙げられるが、それらに限定されない：Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ−ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ−δ−キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ−ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ−ベンジル）およびＴｙｒ（Ｏ−ベンジル）。
【０１９２】
本明細書に記載するポリペプチドを構成し得る、配座的に拘束されている非コード化アミノ酸としては、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｌ立体配置）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン−３−カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９３】
上に記載されたように、操作されたケトレダクターゼ酵素を生成するために天然に存在するポリペプチドに導入された様々な改変は、本酵素の特定の特性を標的にし得る。
【０１９４】
６．３  操作されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチド
別の態様において、本開示は、操作されたケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを生じさせるために遺伝子発現を制御する１つ以上の異種調節配列に作動可能に連結させることができる。前記操作されたケトレダクターゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するケトレダクターゼポリペプチドを発現させることができる。
【０１９５】
様々なアミノ酸に対応するコドンが知られているため、タンパク質配列を利用できることで、本主題をコードできるすべてのポリヌクレオチドの説明が得られる。同じアミノ酸が代替または同義コドンによってコードされる遺伝子コードの縮重は、極めて多数の核酸（これらのすべてが、本明細書に開示する改善されたケトレダクターゼ酵素をコードする）の作製を可能にする。従って、特定のアミノ酸配列が同定されていれば、当業者は、そのタンパク質のアミノ酸配列を変えないような方法で１つ以上のコドンの配列を単に改変することによって、任意の数の異なる核酸を作ることができる。これに関して、本開示は、可能なコドン選択肢に基づいて組み合わせを選択することによって作ることができるポリヌクレオチドのそれぞれおよびすべての可能な異形を具体的に熟慮しており、すべてのそうした異形は、表２に提示するアミノ酸配列を含めて本明細書に開示するいずれのポリペプチドについても具体的に開示されていると考えられるべきである。様々な実施形態において、好ましくは、前記コドンは、そのタンパク質が生産されている宿主細胞に合うように選択される。例えば、細菌において用いられている好ましいコドンを用いて、細菌において遺伝子を発現させ；酵母において用いられている好ましいコドンを酵母での発現に用い；そして哺乳動物において用いられている好ましいコドンを哺乳動物細胞での発現に用いる。例として、配列番号３のポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のためにコドン最適化されているが、他の点ではＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒの天然由来のケトレダクターゼをコードする。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、天然配列が、好ましいコドンを含み、そして好ましいコドンの使用が、すべてのアミノ酸残基に対して必要でないかもしれないので、すべてのコドンが、本ケトレダクターゼのコドン使用頻度を最適化するために置換される必要はない。その結果として、本ケトレダクターゼ酵素をコードする、コドンが最適化されたポリヌクレオチドは、完全長コード領域の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を超えるコドンの位置において好ましいコドンを含み得る。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される操作された参照ケトレダクターゼポリペプチドのいずれかに対して少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するケトレダクターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。ゆえに、いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドは、以下の特徴：Ｘ１９０位に対応する残基が、拘束残基、特に、プロリンである；およびＸ２０２に対応する残基が、芳香族残基、特に、トリプトファンである、を有するが、但し、そのコードされたケトレダクターゼポリペプチドは、Ｘ１９０に対応する残基が拘束残基であり、且つ、Ｘ２０２に対応する残基が芳香族残基であるアミノ配列を有することを条件とする、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドは、Ｘ１９０に対応する残基がプロリンであり、且つ、Ｘ２０２に対応する残基がトリプトファンである、アミノ酸配列を有するケトレダクターゼをコードする。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、以下の特徴：Ｘ１９０位に対応する残基が、拘束残基、特に、プロリンである；Ｘ１９５に対応する残基が、塩基性、酸性、非極性または極性残基、特に、プロリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸またはアスパラギンである；およびＸ２０２に対応する残基が、芳香族残基、特に、トリプトファンである、を有するが、但し、そのコードされたケトレダクターゼポリペプチドは、少なくとも前述の特徴（すなわち、Ｘ１９０位に対応する残基が、拘束残基である；Ｘ１９５に対応する残基が、塩基性、酸性、非極性または極性残基である；およびＸ２０２に対応する残基が、芳香族残基である、を有するアミノ酸配列を含む、配列番号２、４または１１４に基づく参照配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むケトレダクターゼポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、そのコードされたケトレダクターゼは、Ｘ１９０に対応する残基が、プロリンであり；Ｘ１９５に対応する残基が、プロリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸またはアスパラギンであり；且つ、Ｘ２０２に対応する残基が、トリプトファンである、アミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８および１１０から選択されるアミノ酸配列を含む操作されたケトレダクターゼポリペプチドをコードする。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８および１１０から選択される参照配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むケトレダクターゼポリペプチドをコードし、ここで、そのコードされるポリペプチドは、Ｘ１９０およびＸ２０２に対応する残基に対して本明細書中で明記される特徴を有するか、または残基Ｘ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対して本明細書中で明記される特徴を有する。
【０２００】
いくつかの実施形態において、上記操作されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７および１０９から選択される。いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７または１０９を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、ここで、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするそのポリヌクレオチドは、式（Ｉ）の基質を式（ＩＩ）の生成物に還元することができるか、または変換することができるケトレダクターゼポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、そのストリンジェントにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、式（ＩＩＩ）の基質を式（ＩＶ）の生成物に還元することができるか、または変換することができる。いくつかの実施形態において、そのストリンジェントにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、特定の酵素活性、ならびにＸ１９０およびＸ２０２に対応する残基に対して明記される特徴またはＸ１９０、Ｘ１９５およびＸ２０２に対応する残基に対して明記される特徴を有する。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするが、操作されたケトレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドに対して、ヌクレオチドレベルにおいて約８０％またはそれ以上の配列同一性、約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、その参照ポリヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７および１０９から選択される。
【０２０２】
改善されたケトレダクターゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを、そのポリペプチドの発現に備えるために、様々な方法で操作することができる。発現ベクターによっては、ベクターに挿入する前にその単離されたポリヌクレオチドを操作することが、望ましいまたは必要である場合がある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾する技術は、当該技術分野において周知である。ガイダンスは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９８，２００６年までの最新版に提供されている。
【０２０３】
細菌宿主細胞のための、本開示の核酸構築物の転写の指図に適するプロモーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃオペロン、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｒｐオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成性アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核性β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７〜３７３１）から得られるプロモーター、ならびにｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）が挙げられる。
【０２０４】
糸状菌宿主細胞のための、本開示の核酸構築物の転写の指図に適するプロモーターとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ  ９６／００７８７）についての遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼについての遺伝子からのプロモーターとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、ならびにそれらの突然変異プロモーター、短縮型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターが挙げられる。
【０２０５】
酵母宿主において、有用なプロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセレートキナーゼについての遺伝子からのものであり得る。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら，１９９２，Ｙｅａｓｔ８：４２３〜４８８によって説明されている。
【０２０６】
制御配列は、適する転写終結因子配列（宿主細胞によって認識されて転写を終結させる配列）である場合もある。前記ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端にその終結因子配列を作動可能に連結させる。本発明では、選ばれた宿主細胞において機能できる任意の終結因子を用いることができる。
【０２０７】
例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的転写終結因子は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  α−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼについての遺伝子から得ることができる。
【０２０８】
酵母宿主細胞のための例示的終結因子は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼについての遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用な終結因子は、Ｒｏｍａｎｏｓら，１９９２，上記文献によって説明されている。
【０２０９】
制御配列は、適するリーダー配列（宿主細胞による翻訳のために重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域）である場合もある。前記ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端にそのリーダー配列を作動可能に連結させる。選ばれた宿主細胞において機能できる任意のリーダー配列を用いることができる。例示的なリーダーとしては、Ｍ１３ファージｐＩＩＩ配列、Ｅ．ｃｏｌｉマルトース結合タンパク質リーダー配列、およびＥ．ｃｏｌｉ  ｐｅｌＢリーダー配列が挙げられる。糸状菌宿主細胞のための例示的リーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子から得られ得る。酵母宿主細胞のための適するリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセレートキナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）についての遺伝子から得られる。
【０２１０】
制御配列は、ポリアデニル化配列（核酸配列の３’末端に作動可能に連結された配列であって、転写されると宿主細胞にシグナルとして認識されて、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加させる配列）である場合もある。本発明では、選ばれた宿主細胞において機能できる任意のポリアデニル化配列を用いることができる。糸状菌宿主細胞のための例示的ポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  α−グルコシダーゼについての遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、ＧｕｏおよびＳｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．１５：５９８３〜５９９０によって説明されている。
【０２１１】
制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、そのコードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に向ける、シグナルペプチドコーディング領域である場合もある。前記核酸配列のコーディング配列の５’末端は、翻訳リーディングフレーム内に元々連結されているシグナルペプチドコーディング領域を固有に含有することがあり、そのコーディング領域のセグメントが分泌されるポリペプチドをコードする。あるいは、前記コーディング配列の５’末端は、そのコーディング配列にとって異種であるシグナルペプチドコーディング領域を含有する場合がある。この異種シグナルペプチドコーディング領域は、そのコーディング配列がシグナルペプチドコーディング領域を元々含有しない場合に必要とされ得る。
【０２１２】
あるいは、前記異種シグナルペプチドコーディング領域で天然シグナルペプチドコーディング領域を単に置き換えて、そのポリペプチドの分泌を増進させることができる。しかし、本発明では、発現されたポリペプチドを選ばれた宿主細胞の分泌経路に向ける任意のシグナルペプチドコーディング領域を用いることができる。
【０２１３】
細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコーディング領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣｌＢ  １１８３７マルトース生成性アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  α−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  β−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡについての遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング領域である。さらなるシグナルペプチドは、ＳｉｍｏｎｅｎおよびＰａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ５７：１０９〜１３７によって説明されている。
【０２１４】
糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコーディング領域は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼについての遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング領域であり得る。
【０２１５】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ転化酵素についての遺伝子からのものであり得る。他の有用なシグナルペプチドコーディング領域は、Ｒｏｍａｎｏｓら，１９９２，上記文献によって説明されている。
【０２１６】
制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコーディング領域である場合もある。結果として得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（または一部の場合では酵素原）として知られている。プロポリペプチドは一般に不活性であり、そのプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的開裂によって成熟活性ポリペプチドへと変換され得る。前記プロペプチドコーディング領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼ（ＷＯ  ９５／３３８３６）についての遺伝子から得ることができる。
【０２１７】
シグナルペプチド領域とプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端のすぐ隣に位置し、シグナルペプチド領域は、そのプロペプチド領域のアミノ末端のすぐ隣に位置する。
【０２１８】
宿主細胞の増殖に関連してポリペプチドの発現を調節することを可能にする調節配列を付加させることが望ましい場合もある。調節系の例は、調節化合物の存在を含めて、化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにさせる。原核宿主細胞において、適する調節配列としては、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞において、適する調節系には、例として、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌において、適する調節配列としては、ＴＡＫＡ  α−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
【０２１９】
調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にする。真核系の場合、これらとしては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合では、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードする核酸配列をその調節配列に作動可能に連結させることとなる。
【０２２０】
従って、別の実施形態において、本開示は、組換え発現ベクターが導入されることとなる宿主のタイプに依存して、操作されたケトレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその変異体、ならびに１つ以上の発現調節領域、例えばプロモーターおよび終結因子、複製起点などを含む、組換え発現ベクターにも関する。上に記載した様々な核酸および制御配列を互いに連結させて、組換え発現ベクター（これは、１つ以上の適便な制限部位を含んで、ポリペプチドをコードする核酸配列のそのような部位での挿入または置換を可能にすることができる）を生じさせることができる。あるいは、本開示の核酸配列を、発現のための適切なベクターにその核酸配列または該配列を含む核酸構築物を挿入することによって、発現させることができる。前記発現ベクターを作る場合には、コーディング配列をそのベクター内に配置して、そのコーディング配列を発現のための適切な制御配列と作動可能に連結させる。
【０２２１】
組換え発現ベクターは、適便に組換えＤＮＡ手順に付すことができ、且つ、ポリヌクレオチド配列の発現を生じさせることができる、任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。前記ベクターの選択は、そのベクターを導入することとなる宿主細胞とそのベクターの適合性に代表的に依存する。前記ベクターは、線状プラスミドである場合もあり、または閉環状プラスミドである場合もある。
【０２２２】
前記発現ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、染色体外エンティティーとして存在するベクター（その複製は染色体の複製に依存しない）、例えばプラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であり得る。前記ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有する場合がある。あるいは、前記ベクターは、宿主細胞に導入されたときにそのゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（単数または複数）と一緒に複製されるものである場合もある。さらに、単一のベクターもしくはプラスミドまたは２つ以上のベクターもしくはプラスミド（これらは、一緒に、宿主細胞のゲノムに導入されるべき全ＤＮＡを含有する）、あるいはトランスポゾンを使用する場合がある。
【０２２３】
本発明の発現ベクターは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする１つ以上の選択マーカーを好ましくは含有する。選択マーカーは、その産物が殺生物剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養、などを規定する遺伝子である。細菌選択マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのｄａｌ遺伝子、または抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール（実施例１）もしくはテトラサイクリン耐性、を付与するマーカーである。酵母宿主細胞のための適するマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３である。
【０２２４】
糸状菌宿主細胞において使用するための選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの等価物が挙げられるが、それらに限定されない。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞において使用するための実施形態としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子が挙げられる。
【０２２５】
好ましくは、本発明の発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへのそのベクターの組み込みを可能にするまたはそのゲノムとは無関係にその細胞におけるそのベクターの自律複製を可能にするエレメント（単数または複数）を含有する。宿主細胞ゲノムへの組込みのために、前記ベクターは、前記ポリペプチドをコードする核酸配列に依存する場合もあり、または相同もしくは非相同組換えによるそのベクターのそのゲノムへの組み込みのためにそのベクターの任意の他のエレメントに依存する場合もある。
【０２２６】
あるいは、前記発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組込みを指図するための追加の核酸配列を含有する場合がある。それらの追加の核酸配列は、宿主細胞ゲノムのその（それらの）染色体（単数または複数）内の正確な位置（単数または複数）に前記ベクターを組み込むことができる。正確な位置での組込みの尤度を増すために、前記組込みエレメントは、対応する標的配列と高相同性である核酸の、相同組換えの確率を増すために十分な数、例えば、１００から１０，０００塩基対、好ましくは４００から１０，０００塩基対、および最も好ましくは８００から１０，０００塩基対を好ましくは含有すべきである。前記組込みエレメントは、宿主細胞のゲノム内の標的配列と相同性である任意の配列であり得る。さらに、前記組込みエレメントは、非コード化核酸配列である場合もあり、またはコード化核酸配列である場合もある。一方、前記ベクターを非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。
【０２２７】
自律複製のために、前記ベクターは、問題の宿主細胞におけるそのベクターの自律複製を可能にする複製起点をさらに含み得る。細菌の複製起点の例は、Ｐ１５Ａ  ｏｒｉ（図５のプラスミドにおいて示される）、またはＥ．ｃｏｌｉにおける複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７（このプラスミドはＰ１５Ａ  ｏｒｉを有する）もしくはｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、またはＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするプラスミドｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０もしくはｐＡＭβ１の複製起点である。酵母宿主細胞において使用するための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組み合わせ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組み合わせである。前記複製起点は、宿主細胞におけるその機能化を温度感受性にする突然変異を有するものである場合もある（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ，１９７８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１４３３参照）。
【０２２８】
本発明の核酸配列の１つより多くのコピーを宿主細胞に挿入して、遺伝子産物の生産を増加させることができる。前記核酸配列のコピー数の増加は、その配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞のゲノムに組み込むことによって達成することができ、または増幅可能な選択マーカー遺伝子をその核酸配列と共に含めることによって達成することがでる（この場合、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含有し、その結果、追加の核酸配列コピーを含有する細胞は、それらの細胞を適切な選択作用因子の存在下で培養することによって、選択することができる）。
【０２２９】
本発明において使用するための発現ベクターの多くは、市販されている。適する市販の発現ベクターとしては、ＣＭＶプロモーターと、哺乳動物宿主細胞における発現のためのｈＧＨポリアデニル化部位と、ｐＢＲ３２２複製起点と、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのアンピシリン耐性マーカーとを含む、ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓからのｐ３ｘＦＬＡＧＴＭＴＭ発現ベクターが挙げられる。他の適する発現ベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）およびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらは、カリフォルニア州、ラ・ホーヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅから市販されている）、ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙ（Ｌａｔｈｅら，１９８７、Ｇｅｎｅ  ５７：１９３〜２０１）から誘導されるプラスミドである。
【０２３０】
６．４  ケトレダクターゼポリペプチドの発現のための宿主細胞
別の態様において、本開示は、本開示の改善されたケトレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、このポリヌクレオチドは、その宿主細胞におけるケトレダクターゼ酵素の発現のために１つ以上の制御配列に作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされるＫＲＥＤポリペプチドを発現させる際に使用される宿主細胞は、当該技術分野において周知であり、それらとしては、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエＳ２およびヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞；ならびに動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記宿主細胞のための適切な培養培地および増殖条件は、当該技術分野において周知である。
【０２３１】
前記ケトレダクターゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当該技術分野において公知の様々な方法によって細胞に導入することができる。技術としては、数ある中でも、エレクトロポレーション、バイオリスティック・パーティクル・ボンバードメント、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。細胞にポリヌクレオチドを導入するための様々な方法は、当業者に明らかである。
【０２３２】
例示的宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０である。ｌａｃＩリプレッサーの制御下で、ｌａｃプロモーターに作動可能に連結されたプラスミドｐＣＫ１１０９００に、改善されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結させることによって、発現ベクターを作成した。この発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有する。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０の中の対象ポリヌクレオチドを含有する細胞を、それらの細胞をクロラムフェニコール選択に付すことによって、単離した。
【０２３３】
６．５  操作されたケトレダクターゼポリペプチドの生成方法
一部の実施形態では、本開示の改善されたＫＲＥＤポリヌクレオチドおよびポリペプチドを作るために、還元反応を触媒する天然由来のケトレダクターゼ酵素を、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒから得る（または誘導する）。一部の実施形態では、その親ポリヌクレオチド配列をコドン最適化して、指定宿主細胞におけるケトレダクターゼの発現を増進させる。実例として、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおいて入手できるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ  ＫＲＥＤ配列の公知ポリペプチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＰ９４０２９  ＧＩ：３３１１２０５６）に基づいて調製したオリゴヌクレオチドから、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒの野生型ＫＲＥＤポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列を構築した。その親ポリヌクレオチド配列（配列番号１として示される）をＥ．ｃｏｌｉでの発現のためにコドン最適化し、そのコドン最適化されたポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングし、ｌａｃプロモーターおよびｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下でそのケトレダクターゼ遺伝子を発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて活性ケトレダクターゼを発現するクローンを同定し、遺伝子の塩基配列を決定してそれらの素性を確認した。（配列番号１）と呼ぶその配列が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒケトレダクターゼから進化させる操作されたケトレダクターゼの大部分の実験およびライブラリ構築のための出発点として利用した親配列であった。
【０２３４】
前記操作されたケトレダクターゼは、上で論じたように、天然由来のケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｃｄｅ）を突然変異誘発および／または定方向進化法に付すことによって得ることができる。例示的定方向進化技術は、Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：１０７４７〜１０７５１；ＷＯ  ９５／２２６２５；ＷＯ  ９７／００７８；ＷＯ  ９７／３５９６６；ＷＯ  ９８／２７２３０；ＷＯ  ００／４２６５１；ＷＯ  ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号に記載されているような突然変異誘発および／またはＤＮＡシャッフリングである。用いることができる他の定方向進化手順としては、数ある中でも、スタッガード伸長プロセス（ＳｔＥＰ）、インビトロ組換え（Ｚｈａｏら，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２５８〜２６１）、突然変異誘発ＰＣＲ（Ｃａｌｄｗｅｌｌら，１９９４，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３：Ｓ１３６〜Ｓ１４０）、およびカセット突然変異誘発（Ｂｌａｃｋら，１９９６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：３５２５〜３５２９）が挙げられる。本明細書中の目的のために有用なさらなる突然変異誘発および指向進化の手法は、以下の参考文献：Ｌｉｎｇら、１９９７，“Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ，”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−７８；Ｄａｌｅら、１９９６，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−７４；Ｓｍｉｔｈ，１９８５，“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、１９８５，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０１；Ｃａｒｔｅｒ，１９８６，“Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７；Ｋｒａｍｅｒら、１９８４，“Ｐｏｉｎｔ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ，”Ｃｅｌｌ，３８：８７９−８８７；Ｗｅｌｌｓら、１９８５，“Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ，”Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、１９９９，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ，”Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ３：２８４−２９０；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、１９９９，“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ＡＺＴ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：２５９−２６４；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９８，“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９７，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｒｓｅｎａｔｅ  ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：４３６−４３８；Ｚｈａｎｇら、１９９７，“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｆｒｕｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：４５−４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９６，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，’Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３１５−３１９；およびＳｔｅｍｍｅｒ，１９９４，“Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１に見られる。すべての刊行物が、本明細書中で参考として援用される。
【０２３５】
突然変異誘発処理後に得られたクローンを、所望の改善された酵素特性を有する操作されたケトレダクターゼについてスクリーニングする。発現ライブラリからの酵素活性の測定は、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋に変換されるにつれてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ濃度が減少する率を（吸光度または蛍光の減少によって）モニターする標準的な生化学技術を用いて行うことができる。この反応では、ケトレダクターゼがケトン基質をその対応するヒドロキシル基に還元するにつれて、そのケトレダクターゼによってＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが消費（酸化）される。単位時間あたりの、吸光度または蛍光の減少によって測定されるような、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ濃度の減少率は、固定量の溶解産物（またはそれから作られた凍結乾燥粉末）中のＫＲＥＤポリペプチドの相対（酵素）活性を示す。所望される改善された酵素特性が、熱安定性である場合、酵素活性は、その酵素調製品を規定された温度に付し、熱処理後に残存する酵素活性の量を測定した後、測定することができる。その後、ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを単離し、塩基配列を決定して（もしあれば）そのヌクレオチド配列の変化を特定し、そしてそれらを用いて宿主細胞においてその酵素を発現させる。
【０２３６】
その操作されたポリペプチドの配列がわかっている場合、公知の合成方法に従って、標準的な固相法により、その酵素をコードするポリヌクレオチドを調製することができる。一部の実施形態では、約１００塩基までのフラグメントを個々に合成し、その後、（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション法、またはポリメラーゼ媒介法によって）連結させて、任意の所望される連続配列を形成することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら，１９８１，Ｔｅｔ  Ｌｅｔｔ  ２２：１８５９〜６９により説明された古典的ホスホルアミダイト法、または例えば、それを主として自動合成法で実施する場合には、Ｍａｔｔｈｅｓら，１９８４，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８０１〜０５により説明された方法を用いて、化学合成により調製することができる。前記ホスホルアミダイト法によると、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成装置で合成され、精製され、アニールされ、ライゲートされ、適切なベクターにクローニングされる。加えて、本質的に、様々な市場の供給業者、例えばテキサス州、ミッドランドのＴｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、カリフォルニア州、ラモーナのＴｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州、シカゴのＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、アラミダのＯｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．および多くの他の業者、のいずれからいずれの核酸を入手してもよい。
【０２３７】
宿主細胞において発現された操作されたケトレダクターゼ酵素は、数ある中でもリゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離法およびクロマトグラフィーをはじめとする周知のタンパク質精製技術のいずれか１つ以上を用いて、それらの細胞およびまたは培養培地から回収することができる。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌からのタンパク質の溶解および高効率抽出に適する溶液は、ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃ  ＢＴＭで市販されている。
【０２３８】
ケトレダクターゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフ技術としては、数ある中でも、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、実効電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの因子に一部依存し、当業者に明らかである。
【０２３９】
一部の実施形態では、アフィニティー技術を用いて、前記改善されたケトレダクターゼ酵素を単離することができる。アフィニティークロマトグラフィー精製には、前記ケトレダクターゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用することができる。抗体の生産のために、このケトレダクターゼポリペプチドを注射することによって、ウサギ、マウス、ラットなどが挙げられる（しかし、これらに限定されない）様々な宿主動物を免疫することができる。前記ポリペプチドは、側鎖官能基、または側鎖官能基に結合されたリンカーによって、ＢＳＡなどの適するキャリアに結合させることができる。宿主種に依存して、フロイント（完全または不完全）アジュバント、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（杆菌Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍが挙げられる（しかし、これらに限定されない）様々なアジュバントを使用してその免疫応答を増加させることができる。
【０２４０】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼは、上記酵素を発現する細胞の形態で、粗抽出物として、または単離されたか、もしくは精製された調製物として、調製され得、そして使用され得る。本ケトレダクターゼは、粉末の形態（例えば、アセトン粉末）での凍結乾燥物として調製され得るか、または酵素溶液として調製され得る。いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼは、実質的に純粋な調製物の形態であり得る。
【０２４１】
いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、固体の基材に付着され得る。その基材は、固相、表面および／または膜であり得る。固体支持体は、有機ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド）ならびにそのコポリマーおよびグラフトから構成され得る。固体支持体はまた、無機（例えば、ガラス、シリカ、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金もしくは白金などの金属）でもあり得る。その基材の外形は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜または表面の形態であり得る。表面は、平面、実質的に平面、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨張または非膨張の特性を有し得る。固体支持体は、ウェル、くぼみもしくは他の容器の形態、器、特徴または位置で作られ得る。複数の支持体が、試薬のロボット送達のためにアドレス指定できる様々な位置に、または検出方法および／もしくは検出装置によって様々な位置に、整列して配列され得る。
【０２４２】
６．６  操作されたケトレダクターゼ酵素およびそれを用いて調製された化合物を使用する方法
本明細書中に記載されるケトレダクターゼ酵素は、構造式（Ｉ）の基質である２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］安息香酸メチルエステル：
【０２４３】
【化６】
2010539948.tif 000013
の、構造式（ＩＩ）の対応する立体異性の（ｓｔｅｒｅｏｓｉｏｍｅｒｉｃ）生成物である（Ｓ，Ｅ）−メチル２−（３−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−ヒドロキシプロピル）ベンゾエート（「生成物」）：
【０２４４】
【化７】
2010539948.tif 000014
への還元を触媒し得る。
【０２４５】
別の実施形態では、本明細書中に記載されるケトレダクターゼ酵素は、構造式（ＩＩＩ）の化合物である２−［２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］フェニル］−２−プロパノール（これもまた「基質」である）
【０２４６】
【化８】
2010539948.tif 000015
の、構造式（ＩＶの対応する立体異性の生成物である（Ｓ，Ｅ）−１−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−（２−（２−ヒドロキシプロパン−２−イル）フェニル）プロパン−１−オール（これもまた式（ＩＩＩ）の基質に関して「生成物」と呼ばれ得る）：
【０２４７】
【化９】
2010539948.tif 000016
への還元反応を触媒することができる。
【０２４８】
いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼは、化学式（Ｉ）または（ＩＩＩ）を有する基質を、対応する生成物に還元するための方法において使用され得、ここで、その方法は、その基質をそれぞれ式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の生成物に還元するか、または変換するのに適する反応条件下で、その基質を本明細書中に記載されるケトレダクターゼポリペプチドのいずれか１つ（またはそれ以上）と接触させる工程またはインキュベートする工程を包含する。
【０２４９】
上記基質を上記生成物に還元するための方法のいくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４、２および１１４の野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒまたはＬ．ｂｒｅｖｉｓまたはＬ．ｍｉｎｏｒのＫＲＥＤ配列と比較して、少なくとも以下の特徴：（１）Ｘ１９０に対応する残基が、拘束残基である、および（２）Ｘ２０２に対応する残基が、芳香族残基である、を有する。いくつかの実施形態において、本ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号４、２および１１４の野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒまたはＬ．ｂｒｅｖｉｓまたはＬ．ｍｉｎｏｒのＫＲＥＤ配列と比較して、少なくとも以下の特徴：（１）Ｘ１９０に対応する残基が、拘束残基である；（２）１９５に対応する残基が、塩基性、酸性または極性残基である；および（３）Ｘ２０２に対応する残基が、芳香族残基である、を有する。
【０２５０】
上記基質を上記生成物に還元するための方法のいくつかの実施形態において、その基質は、約９９％を超える立体異性体過剰率でその生成物に還元され、ここで、そのケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１１または１１２に対応する配列を含む。
【０２５１】
上記基質を上記生成物に還元するための方法のいくつかの実施形態において、約１００ｇ／Ｌを超える基質および約５ｇ／Ｌ未満の本ポリペプチドを用いて行われるとき、その基質の少なくとも約９５％が、約２４時間未満でその生成物に変換され、ここで、そのポリペプチドは、配列番号６、８、１４、１６および２０に対応するアミノ酸配列を含む。
【０２５２】
上記基質を上記生成物に還元するための方法のいくつかの実施形態において、１ｇ／Ｌの基質の少なくとも約１０〜２０％が、約１０ｇ／Ｌのそのポリペプチドを用いて、約２４時間未満でその生成物に還元され、ここで、そのポリペプチドは、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１１または１１２に対応するアミノ酸配列を含む。
【０２５３】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるケトレダクターゼポリペプチドは、構造式（Ｖ）：
【０２５４】
【化１０】
2010539948.tif 000017
の化合物（その溶媒和化合物、水和物および薬学的に許容可能な塩を含む）を合成するための中間体の生成において使用され得る。モンテルカストとしても知られる、式（Ｖ）の化合物２−［１−［［（１Ｒ）−１−［３−［（Ｅ）−２−（７−クロロキノリン−２−イル）エテニル］フェニル］−３−［２−（２−ヒドロキシプロパン−２−イル）フェニル］プロピル］スルファニルメチル］シクロプロピル］酢酸は、式（Ｖａ）に示されるナトリウム塩（すなわち、（Ｒ，Ｅ）−２−（１−（（１−（３−（２（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−（２−（２−ヒドロキシプロパン−２−イル）フェニル）プロピルチオ）メチル）シクロプロピル）酢酸ナトリウム）：
【０２５５】
【化１１】
2010539948.tif 000018
の形態で市販されている。
【０２５６】
上に記載されたように、理論に拘束されないが、モンテルカストは、ロイコトリエンレセプターアンタゴニスト（ＬＴＲＡ）であり、システイニルロイコトリエンレセプターＣｙｓＬＴ１に対するロイコトリエンＤ４の作用を阻止するとみられる。モンテルカストは、アレルギーの処置のため、および喘息の維持療法において、処方される（例えば、米国特許第５，５６５，４７３号を参照のこと）。モンテルカストの合成のいくつかの実施形態において、重要な中間体は、式（ＩＩ）の化合物である。ゆえに、化合物（Ｖ）を合成するための方法において、その方法における工程は、式（Ｉ）の基質を式（ＩＩ）の生成物に還元するか、または変換するのに適する条件下で、その基質を本開示のケトレダクターゼポリペプチドと反応させる工程または接触させる工程を包含し得る。
【０２５７】
いくつかの実施形態において、式（Ｖ）の化合物は、スキームＩに図示されるように、ならびに米国出願公開２００７０１３５４８０および２００５０２４５５６８に記載されているように、式（ＩＩ）の化合物から合成され得る。
【０２５８】
【化１２】
2010539948.tif 000019
したがって、いくつかの実施形態において、化合物（Ｖ）を合成するための方法は：（ａ）本開示のケトレダクターゼを用いて、化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）に還元するか、または変換する工程；（ｂ）化合物（ＩＩ）を塩化メチルスルホニルと反応させることにより、式（ＶＩ）の化合物を形成する工程；（ｃ）化合物（ＶＩ）を式（ＶＩＩ）のチオ化合物に変換した後、式（ＶＩＩａ）の化合物に変換する工程；（ｄ）そのチオ化合物（ＶＩＩａ）を式（Ｘ）の化合物と反応させることにより、式（ＩＸ）の化合物（ここで、Ｒ’は、脱離基であり、Ｒは、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルである）を形成する工程；および（ｅ）化合物（ＩＸ）を式（Ｖｂ）の化合物またはその塩、例えば、式（Ｖａ）に変換する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、他のアルキルスルホニルハロゲン化物またはアリールスルホニルハロゲン化物が、塩化メチルスルホニルの代わりに使用され得る。式（ＩＸ）の化合物の式（Ｖｂ）の化合物への変換は、ＣＨ３Ｌｉを使用し得るが、その工程は、グリニャール試薬、例えば、ハロゲン化メチルマグネシウムを用いても行われ得る（米国出願公開２００７０１３５４８０を参照のこと）。いくつかの実施形態において、上記の工程（ｃ）の後の代替プロセスは：（ｄ）式（ＶＩＩ）の化合物を式（ＶＩＩＩ）の化合物に変換した後、式（ＶＩＩｂ）の化合物に変換する工程、および（ｅ）チオ化合物（Ｘ）を化合物（ＶＩＩｂ）と反応させることにより、式（Ｖｂ）の化合物またはその塩を形成する工程を包含し得る。それらの工程の各々についての詳細および条件は、米国出願公開２００７０１３５４８０および２００５０２４５５６８に記載されている。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、モンテルカストの合成は、式（ＩＶ）の中間体を使用し得る。したがって、いくつかの実施形態において、式（Ｖ）の化合物を合成するための方法において、その方法における工程は、式（ＩＩＩ）の基質を式（ＶＩ）の生成物に還元するか、または変換するのに適する反応条件下で、その基質を本明細書中に開示されるケトレダクターゼと接触させることによって、その基質を式（ＩＶ）の生成物に還元するか、または変換する工程を包含し得る。
【０２６０】
いくつかの実施形態において、そのモンテルカスト化合物は、スキームＩＩに図示されるように、ならびに米国出願公開番号２００５／０２３４２４１および米国特許第７，１８９，８５３号に記載されているように、式（ＩＶ）の生成物から合成され得る：
【０２６１】
【化１３】
2010539948.tif 000020
したがって、いくつかの実施形態において、化合物（Ｖ）を合成するための方法は：（ａ）本開示のケトレダクターゼを用いて、化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）に還元するか、または変換する工程；（ｂ）式（ＩＶ）の化合物を塩化メチルスルホニルと反応させることにより、式（ＶＩ）の化合物を形成する工程；（ｃ）式（ＸＩＩＩ）のチオール化合物を式（ＩＶ）の化合物と結合させることにより、式（ＶＩＩ）の化合物（ここで、Ｘは、−ＣＮまたはＣＯＮＨ２である）を形成する工程；および（ｄ）式（ＶＩＩ）の化合物を式（Ｖ）の化合物またはその塩に変換する工程を包含し得る。
【０２６２】
いくつかの実施形態において、上記モンテルカスト化合物は、下記のスキームＩＩＩに図示されるように、および米国特許第５，６１４６３２号（その開示が、本明細書中で参考として援用される）に記載されているように、式（ＩＩ）の生成物からも合成され得る（米国特許第５，６１４，６３２号の実施例５〜８を参照のこと）。スキームＩＩＩでは、式（Ｉ）の基質は、本開示のケトレダクターゼを用いて式（ＩＩ）の生成物に還元され；次いで、例えば、グリニャール試薬（塩化メチルマグネシウム）の使用によって、式（ＩＶ）の化合物に変換される。式（ＩＶ）の化合物が、塩化メチルスルホニルと反応することにより、メシレート化合物（ＸＩＩＩ）が形成されるが、他のアルキルスルホニルハロゲン化物またはアリールスルホニルハロゲン化物が使用され得る。化合物（ＸＩＩＩ）を式（ＸＩＩＩ）のチオール化合物と反応させることによって、化合物（Ｖ）が生じ、これは、ナトリウム塩の形態に変換され得る。
【０２６３】
【化１４】
2010539948.tif 000021
式（ＸＩＩＩ）のチオール化合物は、スキーム４に従って合成され得る（例えば、米国特許第５，６１４，６３２号を参照のこと）：
【０２６４】
【化１５】
2010539948.tif 000022
スキーム４におけるＲ基は、低級アルキル、好ましくは、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり得る。式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の化合物からのモンテルカストの合成の変法は、米国特許第５，５６５，４７３号；米国公開２００５０１０７６１２；米国公開２００５０２４５５６９；米国公開２００６０００４２０４；および米国公開２００６０１９４８３９；（すべての参考文献が、本明細書中で参考として援用される）にも記載されている。
【０２６５】
式（ＶＩ）および式（ＸＩＩ）のメシレート化合物の重要性を考慮すると、本開示のケトレダクターゼは、式（ＸＸ）：
【０２６６】
【化１６】
2010539948.tif 000023
の化合物または式（ＸＸＩ）：
【０２６７】
【化１７】
2010539948.tif 000024
の化合物の合成において使用され得、ここで、Ｒ１は、アルキルスルホニル、（ペル）フルオロアルキルスルホニルまたはアリールスルホニルである。いくつかの実施形態において、そのアルキルは、低級アルキル、例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキルであり、アリールは、ベンジルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、トルエンスルホニルまたはメチルスルホニルである。
【０２６８】
いくつかの実施形態において、化合物（ＸＸ）を合成するための方法は：（ａ）化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）に還元するのに適する反応条件下で、化合物（Ｉ）を本明細書中に記載されるケトレダクターゼと接触させる工程；および（ｂ）化合物（ＩＩ）をアルキルスルホニルハロゲン化物、（ペル）フルオロアルキルスルホニルハロゲン化物、アリールスルホニルハロゲン化物、アルキルスルホニル無水物、（ペル）フルオロアルキルスルホニル無水物またはアリールスルホニル無水物と反応させることにより、化合物（ＸＸ）を形成する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、（ｂ）において使用されるアルキルスルホニルハロゲン化物は、塩化メチルスルホニルであり、化合物（ＸＸ）におけるＲ１は、メチルスルホニルである。
【０２６９】
いくつかの実施形態において、式（ＸＸＩ）の化合物を合成するための方法は：（ａ）化合物（ＩＩＩ）を化合物（ＩＶ）に還元するのに適する反応条件下で、化合物（ＩＩＩ）を本明細書中に記載されるケトレダクターゼと接触させる工程；および（ｂ）化合物（ＶＩ）をアルキルスルホニルハロゲン化物、アリールスルホニルハロゲン化物、アルキルスルホニル無水物またはアリールスルホニル無水物と反応させることにより、化合物（ＸＸＩ）を形成する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、（ｂ）において使用されるアルキルスルホニルハロゲン化物は、塩化メチルスルホニルであり、化合物（ＸＸＩ）におけるＲ１は、メチルスルホニルである。
【０２７０】
あるいは、いくつかの実施形態において、化合物（ＸＸＩ）を合成するための方法は、スキーム３に図示されるプロセスを使用し得、ここで、その方法は：（ａ）化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）に還元するのに適する反応条件下で、化合物（Ｉ）を本明細書中に記載されるケトレダクターゼと接触させる工程；（ｂ）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＶ）に変換する工程；および（ｃ）化合物（ＩＶ）をアルキルスルホニルハロゲン化物、（ペル）フルオロアルキルスルホニルハロゲン化物、アリールスルホニルハロゲン化物と反応させることにより、化合物（ＸＸＩ）を形成する工程を包含する。上で述べたように、（ｂ）における化合物（ＩＩ）の化合物（ＩＶ）への変換は、グリニャール試薬またはＣＨ３Ｌｉを使用し得る。
【０２７１】
いくつかの実施形態において、本開示のケトレダクターゼは、そのケトレダクターゼによって作用される基質を含み、および／またはそのケトレダクターゼ反応によって生成される生成物を含む、組成物、例えば、反応組成物として存在し得る。したがって、いくつかの実施形態において、組成物は、本開示のケトレダクターゼおよび構造式（Ｉ）の基質または構造式（ＩＩＩ）の基質を含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、本開示のケトレダクターゼおよび構造式（ＩＩ）の生成物または構造式（ＩＶ）の生成物を含み得る。いくつかの実施形態において、その組成物は、本開示のケトレダクターゼ、式（Ｉ）の基質および式（ＩＩ）の生成物を含み得る。いくつかの実施形態において、その組成物は、本開示のケトレダクターゼ、式（ＩＩＩ）の基質および式（ＩＶ）の生成物を含み得る。
【０２７２】
上記ケトレダクターゼ反応が、補因子（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）再生系の存在下において行われ得るので、その反応条件は、以下でさらに詳細に記載される補因子再生系のエレメントをさらに含み得る。したがって、いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼの前述の組成物は、グルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース；ギ酸デヒドロゲナーゼおよびホルマート；またはイソプロパノールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む補因子再生系をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、その第二級アルコールデヒドロゲナーゼは、操作されたケトレダクターゼである。補因子再利用のために使用され得る他の酵素および基質は、当業者に周知であるだろう。
【０２７３】
当業者には公知であるように、ケトレダクターゼ触媒還元反応は、代表的に補因子を必要とする。本明細書に記載する操作されたケトレダクターゼ酵素によって触媒される還元反応も代表的に補因子を必要とするが、本操作されたケトレダクターゼの多くの実施形態は、野生型ケトレダクターゼ酵素で触媒される反応よりはるかに少ない補因子しか必要としない。本明細書において用いる場合、用語「補因子」は、ケトレダクターゼ酵素との組み合わせで動作する非タンパク質化合物を指す。本明細書に記載する操作されたケトレダクターゼ酵素と共に使用するために適する補因子としては、ＮＡＤＰ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰ＋の還元形）、ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）およびＮＡＤＨ（ＮＡＤ＋の還元形）が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、前記補因子の還元形を反応混合物に添加する。前記還元ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ形は、場合によっては、補因子再生系を使用してその酸化ＮＡＤ（Ｐ）＋形から再生させることができる。
【０２７４】
用語「補因子再生系」は、補因子の酸化形を還元する反応（例えば、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨ）に関与する１セットの反応物を指す。ケト基質のケトレダクターゼ触媒還元によって酸化された補因子は、補因子再生系によって還元形に再生される。補因子再生系は、還元性水素等価物の源であり、且つ、その補因子の酸化形を還元できる、化学量論的量の還元剤を含む。補因子再生系は、その還元剤によるその補因子の酸化形の還元を触媒する触媒、例えば酵素触媒、をさらに含み得る。ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋からそれぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生するための補因子再生系は、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載する方法においてそれらを使用することができる。
【０２７５】
利用することができる、適する例示的補因子再生系としては、グルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼ、ホルマートおよびギ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸塩およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、第二級（例えば、イソプロパノール）アルコールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼ、亜リン酸塩および亜リン酸デヒドロゲナーゼ、分子水素およびヒドロゲナーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの系を、補因子としてＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ＋／ＮＡＤＨいずれかと併用することができる。ヒドロゲナーゼを使用する電気化学的再生も、補因子再生系として用いることができる。例えば、米国特許第５，５３８，８６７号および同第６，４９５，０２３号参照（これらの両方が参照により本明細書に援用されている）。金属触媒および還元剤（例えば、分子水素またはホルマート）を含む化学的補因子再生系も適する。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２０００／０５３７３１参照（これは参照により本明細書に援用されている）。
【０２７６】
用語「グルコースデヒドロゲナーゼ」および「ＧＤＨ」は、グルコン酸およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへのＤ−グルコースおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の変換をそれぞれ触媒する、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性酵素を指すために本明細書では交換可能に用いている。下の反応式（１）は、グルコースによるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のグルコースデヒドロゲナーゼ触媒還元を説明する。
【０２７７】
【化１８】
2010539948.tif 000025
本明細書に記載する方法の実施の際の使用に適するグルコースデヒドロゲナーゼは、天然由来グルコースデヒドロゲナーゼと非天然由来グルコースデヒドロゲナーゼの両方を含む。天然由来グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、文献に報告されている。例えば、Ｂａｃｃｉｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ６１２９７  ＧＤＨ遺伝子が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてその天然宿主において生産された酵素と同じ物理化学的性質を示すと報告されている（Ｖａｓａｎｔｈａら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７８５）。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１２２７６に対応するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＧＤＨ遺伝子の遺伝子配列は、Ｌａｍｐｅｌら，１９８６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６：２３８〜２４３により報告されており、そして補正された形のものは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ５０４５３としてＹａｍａｎｅら，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２：３０４７〜３０５６により報告されている。天然由来のＧＤＨ遺伝子は、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９からのＧＤＨをコードするもの（Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２３：８７〜９１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ０１７０１３）およびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍからのＧＤＨをコードするもの（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８８，１７４：４８５〜４９０，ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１２３７０；Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９９０，７０：３６３〜３６９，ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ２１６２７０）も含む。Ｂａｃｉｌｌｕｓ種からのグルコースデヒドロゲナーゼは、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９に、（そのＰＣＴ公報の配列番号９および１１にそれぞれ対応するポリヌクレオチド配列によってコードされる）配列番号１０および１２として提供されており、その開示は参照により本明細書に援用される。
【０２７８】
非天然由来グルコースデヒドロゲナーゼは、例えば突然変異誘発、定方向進化などのような公知の方法を用いて生じさせることができる。天然由来であろうと、非天然由来であろうと、適する活性を有するＧＤＨ酵素は、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９の実施例４に記載されているアッセイを用いて容易に同定することができ、その開示は参照により本明細書に援用される。例示的非天然由来グルコースデヒドロゲナーゼは、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９に配列番号６２、６４、６６、６８、１２２、１２４、および１２６として提供されている。それらをコードするポリヌクレオチド配列は、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９に、それぞれ、配列番号６１、６３、６５、６７、１２１、１２３、および１２５として提供されている。これらの配列のすべてが参照により本明細書に援用される。本明細書に開示するケトレダクターゼ触媒還元反応において使用するために適する追加の非天然由来グルコースデヒドロゲナーゼは、米国特許出願公開第２００５／００９５６１９号および同第２００５／０１５３４１７号に提供されており、これらの開示は、参照により本明細書に援用される。
【０２７９】
本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応に利用されるグルコースデヒドロゲナーゼは、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９の実施例４に記載されているアッセイにおいて、少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇの、および時として少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇまたは約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇ、約１０４μｍｏｌ／分／ｍｇまで、またはそれより高い活性を示すことができる。
【０２８０】
本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応は、一般に、溶媒中で行われる。適する溶媒としては、水、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエンなど）、イオン性液体（例えば、テトラフルオロホウ酸１−エチル−４−メチルイミダゾリウム、テトラフルオロホウ酸１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、ヘキサフルオロリン酸１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムなど）が挙げられる。一部の実施形態では、水および水性共溶媒系をはじめとする水性溶媒が、使用される。
【０２８１】
例示的水性共溶媒系は、水および１つ以上の有機溶媒を有する。一般に、水性共溶媒系の有機溶媒成分は、それがケトレダクターゼ酵素を完全には不活性化しないように選択される。適切な共溶媒系は、本明細書に記載するものなどの酵素活性アッセイを利用して、候補溶媒系中での対象となる規定された基質を用いて特定の操作されたケトレダクターゼ酵素の酵素活性を測定することによって、容易に特定することができる。
【０２８２】
水性共溶媒系の有機溶媒成分は、その水性成分と混和性であって、単一の液相を生じさせる場合もあり、またはその水性成分と部分混和性もしくは不混和性であって、２つの液相を生じさせる場合もある。一般に、水性共溶媒系を利用するときには、有機溶媒に分散された水、またはその逆で、二相性になるように選択する。一般に、水性共溶媒系を利用するときには、水相から容易に分離することができる有機溶媒を選択することが望ましい。一般に、前記共溶媒系中の水の有機溶媒に対する比率は、代表的に、有機溶媒対水  約９０：１０から約１０：９０（ｖ／ｖ）の範囲、および有機溶媒対水  ８０：２０と２０：８０（ｖ／ｖ）の間である。前記共溶媒系は、反応混合物に添加する前に前もって形成される場合もあり、または反応容器内でインサイチュで形成される場合もある。
【０２８３】
水性溶媒（水または水性共溶媒系）は、ｐＨ緩衝されていても、緩衝されていなくてもよい。一般に、前記還元は、約１０以下、通常は約５から約１０の範囲のｐＨで行うことができる。一部の実施形態において、前記還元は、約９以下、通常は約５から約９の範囲のｐＨで行われる。一部の実施形態において、前記還元は、約８以下、多くの場合、約５から約８の範囲、および通常は約６から約８の範囲のｐＨで行われる。前記還元は、約７．８以下、または約７．５以下のｐＨで行われる場合もある。あるいは、前記還元は、中性ｐＨ、すなわち約７、で行われる場合がある。
【０２８４】
前記還元反応の過程で、反応混合物のｐＨが変わることがある。反応の過程で酸または塩基を添加することにより、その反応混合物のｐＨを所望のｐＨでまたは所望のｐＨ範囲内で維持することができる。あるいは、緩衝剤を含む水性溶媒を使用することによって、ｐＨを制御することができる。所望のｐＨ範囲を維持するために適する緩衝剤は、当該技術分野において公知であり、それらとしては、例えば、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液などが挙げられる。緩衝と酸または塩基添加とを併用してもよい。
【０２８５】
グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ補因子再生系を用いる場合、反応式（１）で表されるようなグルコン酸の共生成（ｐＫａ＝３．６）は、結果として生ずる水性グルコン酸を別の方法で中和しなければ、その反応混合物のｐＨを低下させる。反応混合物のｐＨは、備わっている緩衝能まで緩衝剤がグルコン酸を中和する標準的な緩衝技術によって、またはその変換の過程で並行して塩基を添加することによって、所望のレベルで維持することができる。緩衝と塩基添加とを併用してもよい。所望のｐＨ範囲を維持するために適する緩衝剤は、上に記載されている。グルコン酸の中和に適する塩基は、有機塩基、例えばアミン、アルコキシドなど、および無機塩基、例えば水酸化物塩（例えば、ＮａＯＨ）、炭酸塩（例えば、ＮａＨＣＯ３）、重炭酸塩（例えば、Ｋ２ＣＯ３）、塩基性リン酸塩（例えば、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４）などである。前記変換の過程と並行した塩基の添加は、その反応混合物のｐＨをモニターしながら手作業で、またはより適便には、ｐＨスタットのような自動滴定装置を使用することによって、行うことができる。プロセス制御のために、部分緩衝能と塩基添加とを併用することもできる。
【０２８６】
ケトレダクターゼ触媒還元反応中に放出されるグルコン酸を中和するために塩基添加を用いる場合、ｐＨを維持するために添加する塩基の量によってその変換の進行をモニターすることができる。代表的に、還元の過程で緩衝されていない反応混合物または部分緩衝反応混合物に添加される塩基は、水溶液で添加される。
【０２８７】
一部の実施形態において、前記補因子再生系は、ギ酸デヒドロゲナーゼを含み得る。用語「ギ酸デヒドロゲナーゼ」および「ＦＤＨ」は、二酸化炭素およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへのホルマートおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の変換をそれぞれ触媒する、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性酵素を指すために、本明細書では交換可能に用いている。本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応における補因子再生系としての使用に適するギ酸デヒドロゲナーゼは、天然由来のギ酸デヒドロゲナーゼと、非天然由来ギ酸デヒドロゲナーゼの両方を含む。ギ酸デヒドロゲナーゼとしては、ＰＣＴ公報２００５／０１８５７９の配列番号６９および７１にそれぞれ対応するポリヌクレオチド配列によってコードされる、ＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９の配列番号７０（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種）および７２（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）に対応するものが挙げられ、これらの開示は参照により本明細書に援用される。本明細書に記載する方法において用いられるギ酸デヒドロゲナーゼは、天然由来であろうと、または非天然由来であろうと、少なくとも約１μｍｏｌ／分／ｍｇ、時として少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇ、または少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇ、約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇまで、またはそれより高い活性を示すことができ、およびＰＣＴ公報ＷＯ  ２００５／０１８５７９の実施例４に記載されているアッセイで活性について容易にスクリーニングすることができる。
【０２８８】
本明細書において用いる場合、用語「ホルマート」は、ギ酸アニオン（ＨＣＯ２−）、ギ酸（ＨＣＯ２Ｈ）、およびこれらの混合物を指す。ホルマートは、塩の形態、代表的にアルカリまたはアンモニウム塩（例えば、ＨＣＯ２Ｎａ、ＫＨＣＯ２ＮＨ４など）の形態で、ギ酸、代表的にギ酸水溶液、の形態で、またはそれらの混合物で供給することができる。ギ酸は、穏やかな酸である。そのｐＫａ（水中で、ｐＫａ＝３．７）の数ｐＨ単位以内の水溶液中では、ホルマートは、平衡濃度でＨＣＯ２−とＨＣＯ２Ｈの両方として存在する。約ｐＨ４より高いｐＨ値では、ホルマートは、主としてＨＣＯ２−として存在する。ホルマートをギ酸として供給する場合、代表的に、塩基の添加によってその反応混合物を緩衝してまたはより低酸性にして、代表的に約ｐＨ５以上の、所望のｐＨを生じさせる。ギ酸の中和に適する塩基としては、有機塩基、例えばアミン、アルコキシドなど、および無機塩基、例えば水酸化物塩（例えば、ＮａＯＨ）、炭酸塩（例えば、ＮａＨＣＯ３）、重炭酸塩（例えば、Ｋ２ＣＯ３）、塩基性リン酸塩（例えば、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８９】
ホルマートが主としてＨＣＯ２−として存在する約ｐＨ５より高いｐＨ値については、下の反応式（２）によって、ホルマートによるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のギ酸デヒドロゲナーゼ触媒還元が説明される。
【０２９０】
【化１９】
2010539948.tif 000026
ホルマートおよびギ酸デヒドロゲナーゼを補因子再生系として用いる場合、備わっている緩衝能まで緩衝剤がプロトンを放出する標準的な緩衝技術によって、またはその変換の過程と並行して酸を添加することによって、その反応混合物のｐＨを所望のレベルで維持することができる。ｐＨを維持するためにその反応の過程で添加される適する酸としては、有機酸、例えばカルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸など、および鉱酸、例えば、ハロゲン化水素酸（例えば、塩化水素酸）、硫酸、リン酸など、酸性塩、例えば二水素リン酸塩（例えば、ＫＨ２ＰＯ４）、重硫酸塩（例えば、ＮａＨＳＯ４）などが挙げられる。一部の実施形態は、ギ酸を利用し、それによって、その溶液のホルマート濃度とｐＨの両方を維持する。
【０２９１】
ホルマート／ギ酸デヒドロゲナーゼ補因子再生系を使用する還元反応中にｐＨを維持するために酸添加を用いる場合、そのｐＨを維持するために添加する酸の量によって、その変換の進行をモニターすることができる。代表的に、変換の過程で緩衝されていない反応混合物または部分緩衝反応混合物に添加される酸は、水溶液で添加される。
【０２９２】
用語「第二級アルコールデヒドロゲナーゼ」および「ｓＡＤＨ」は、ケトンおよびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨへの第二級アルコールおよびＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の変換をそれぞれ触媒する、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋依存性酵素を指すために、本明細書では交換可能に用いている。下の反応式（３）は、イソプロパノールによって例証される第二級アルコールによるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の還元を説明する。
【０２９３】
【化２０】
2010539948.tif 000027
本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応において補因子再生系としての使用に適する第二級アルコールデヒドロゲナーゼは、天然由来第二級アルコールデヒドロゲナーゼと、非天然由来第二級アルコールデヒドロゲナーゼの両方を含む。天然由来第二級アルコールデヒドロゲナーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏａｎｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｔｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓからの公知アルコールデヒドロゲナーゼが挙げられ、そして非天然由来第二級アルコールデヒドロゲナーゼとしては、それらから誘導された操作されたアルコールデヒドロゲナーゼが挙げられる。本明細書に記載する方法において用いられる第二級アルコールデヒドロゲナーゼは、天然由来であろうと、または非天然由来であろうと、少なくとも約１μｍｏｌ／分／ｍｇ、時として少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇ、または少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇ、約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇまで、またはそれより高い活性を示すことができる。
【０２９４】
適する第二級アルコールとしては、低級第二級アルコールおよびアリール−アルキルカルビノールが挙げられる。低級第二級アルコールの例としては、イソプロパノール、２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、３，３−ジメチル−２−ブタノールなどが挙げられる。１つの実施形態において、前記第二級アルコールは、イソプロパノールである。適するアリール−アルキルカルビノールとしては、非置換および置換１−アリールエタノールが挙げられる。
【０２９５】
第二級アルコールおよび第二級アルコールデヒドロゲナーゼを補因子再生系として用いる場合、結果として生ずるＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋は、その第二級アルコールデヒドロゲナーゼによるその第二級アルコールのケトンへの共役酸化によって還元される。一部の操作されたケトレダクターゼは、第二級アルコール還元体を脱水素する活性も有する。還元体として第二級アルコールを使用する一部の実施形態では、その操作されたケトレダクターゼとその第二アルコールケトレダクターゼが同じ酵素である。
【０２９６】
補因子再生系を用いる本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応の実施形態を行う場合、最初にその補因子の酸化形を供給してもよいし、還元形を供給してもよい。上で説明したように、補因子再生系は、酸化された補因子をその還元形に変換し、その後、それがケトレダクターゼ基質の還元に利用される。
【０２９７】
一部の実施形態では、補因子再生系を使用しない。補因子再生系を使用せずに行われる還元反応については、補因子を還元形で反応混合物に添加する。
【０２９８】
一部の実施形態において、宿主生物の全細胞を使用して前記プロセスを行う場合、その全細胞は、生得的に補因子を提供することができる。あるいは、または併せて、前記細胞は、生得的にまたは組換えにより、グルコースデヒドロゲナーゼを提供することができる。
【０２９９】
本明細書に記載する立体選択的還元反応を行う場合、前記操作されたケトレダクターゼ酵素、および任意の補因子再生系を構成する任意の酵素は、精製された酵素の形態、それらの酵素をコードする遺伝子（単数もしくは複数）で形質転換された全細胞の形態、ならびに／またはそのような細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解産物の形態で、その反応混合物に添加することができる。操作されたケトレダクターゼ酵素および任意の補因子再生酵素をコードする遺伝子（単数または複数）は、宿主細胞に別々に形質転換することができ、または一緒に同じ宿主細胞に形質転換することができる。例えば、一部の実施形態では、前記操作されたケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子（単数または複数）で１セットの宿主細胞を形質転換し、前記補因子再生酵素をコードする遺伝子（単数または複数）で別のセットを形質転換することができる。形質転換された細胞の両方のセットを、一緒に、全細胞の形態で、またはそれから誘導した溶解産物もしくは抽出物の形態で、反応混合物に用いることができる。他の実施形態では、前記操作されたケトレダクターゼ酵素と前記補因子再生酵素の両方をコードする遺伝子（単数または複数）で宿主細胞を形質転換することができる。
【０３００】
前記操作されたケトレダクターゼ酵素および／もしくは任意の補因子再生酵素をコードする遺伝子（単数もしくは複数）で形質転換された全細胞、またはそれらの細胞抽出物および／もしくは溶解産物は、固体（例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど）または半固体（例えば、粗製ペースト）をはじめとする様々な異なる形態で用いることができる。
【０３０１】
前記細胞抽出物または細胞溶解産物は、沈殿（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミンまたは熱処理など）、続いて脱塩手順、その後凍結乾燥（例えば、限外濾過、および透析など）によって部分的に精製することができる。いずれの細胞調製物も、例えばグルタルアルデヒドなどの公知架橋剤を使用する架橋または固相への固定化（例えば、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃなど）によって安定させることができる。
【０３０２】
固体反応物（例えば、酵素、塩など）は、粉末（例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど）、溶液、乳濁液、懸濁液などをはじめとする様々な異なる形態で反応に供給することができる。前記反応物は、当業者に公知である方法および装置を用いて容易に凍結乾燥または噴霧乾燥させることができる。例えば、前記タンパク質溶液を−８０℃で少量ずつ凍結させ、その後、予冷した凍結乾燥チャンバにそれを添加し、その後、真空を適用することができる。それらのサンプルから水を除去した後、代表的にその温度を２時間、４℃に上昇させ、その後、真空を解放し、凍結乾燥サンプルを回収する。
【０３０３】
一般に、還元反応に使用される反応物の量は、所望される生成物の量によって、および付随して、利用されるケトレダクターゼ基質の量によって変わる。以下のガイドラインを用いて、使用するケトレダクターゼ、補因子および任意の補因子再生系の量を決定することができる。一般に、ケト基質は、約５０ｍｇから約５ｇのケトレダクターゼおよび約１０ｍｇから約１５０ｍｇの補因子を使用して、約２０から３００グラム／リットルの濃度で利用することができる。所望の生産性レベルおよび生産規模に合わせるためにこれらの量を変える方法は、当業者には容易にわかるであろう。任意の補因子再生系の適切な量は、用いる補因子および／またはケトレダクターゼの量に基づき慣用的実験によって容易に決定することができる。一般に、還元体（例えば、グルコース、ホルマート、イソプロパノール）をケトレダクターゼ基質の等モルレベルより高いレベルで用いて、そのケトレダクターゼ基質の本質的に完全なまたはほぼ完全な変換を達成する。
【０３０４】
反応物の添加順序は、重要でない。反応物を一緒に溶媒（例えば、単相溶媒、二相水性共溶媒系など）に添加してもよいし、あるいは反応物の一部を別々に、および一部を異なる時点で一緒に添加してもよい。例えば、補因子再生系、補因子、ケトレダクターゼ、およびケトレダクターゼ基質を最初に溶媒に添加してもよい。
【０３０５】
水性共溶媒系を使用する際の混合効率改善のために、補因子再生系、ケトレダクターゼ、および補因子を最初に水相に添加して混合する。その後、有機相を添加して混合し、その後、ケトレダクターゼ基質を添加することができる。あるいは、水相に添加する前に、ケトレダクターゼ基質を有機相に予め混合することができる。
【０３０６】
本明細書に記載するケトレダクターゼ触媒還元反応を行うために適する条件は、操作されたケトレダクターゼ酵素と基質とを実験ｐＨおよび温度で接触させ、例えば本明細書に提供する実施例において説明する方法を用いて、生成物を検出することを含む（しかし、これらに限定されない）慣用的な実験によって、容易に最適化することができる、多種多様な条件を含む。
【０３０７】
前記ケトレダクターゼ触媒還元は、代表的に、約１５℃から約７５℃の範囲の温度で行われる。一部の実施形態について、前記反応は、約２０℃から約５５℃の範囲の温度で行われる。さらに他の実施形態では、約２０℃から約４５℃の範囲の温度で行われる。前記反応は、周囲条件下で行われる場合もある。
【０３０８】
一般に、前記還元反応を本質的に完了またはほぼ完了するまで進行させ、基質の還元を達成する。基質および／または生成物を検出することによる公知の方法を用いて、基質の生成物への還元をモニターすることができる。適する方法としては、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどが挙げられる。前記反応混合物において生成されるアルコール還元生成物の変換収率は、一般に約５０％より高く、約６０％より高い場合もあり、約７０％より高い場合もあり、約８０％より高い場合もあり、約９０％より高い場合もあり、および多くの場合、約９７％より高い。
【実施例】
【０３０９】
７．  実施例
本開示の様々な特徴および実施形態を以下の代表的実施例において例証する。これらの実施例は、例証のためのものであり、限定のためのものではない。
【０３１０】
以下の説明において、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が使用される場合は、あそれはＧＤＨ  ＣＤＸ９０１であり、これは、Ｊｕｒｉｃｈ  Ｃｈｉｒａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ユーリッヒ（ドイツ）より入手可能である。
【０３１１】
実施例１：野生型ケトレダクターゼ遺伝子獲得および発現ベクターの構築
ケトレダクターゼの報告されているアミノ酸配列と、参照により本明細書に援用されている米国特許仮出願第６０／８４８，９５０号の実施例１に記載されているようなコドン最適化アルゴリズムとに基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために、ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）をコードする遺伝子を設計した。４２ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドを使用して遺伝子を合成し、ｌａｃプロモーターの制御下で発現ベクターｐＣＫ１１０９００（米国特許出願公開第２００６０１９５９４７号に図３として図示されている）にクローニングした。この発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有した。得られたプラスミドを、標準的な方法を用いてＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０に形質転換させた。コドン最適化遺伝子およびコード化ポリペプチドも表３に列挙する。野生型ケトレダクターゼの活性を、米国特許仮出願第６０／８４８，９５０号に記載されているように確認した。
【０３１２】
【表３−１】
2010539948.tif 000028
【０３１３】
【表３−２】
2010539948.tif 000029
本発明の操作されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドもまた、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０での発現のためにベクターｐＣＫ１１０９００にクローニングした。
【０３１４】
実施例２：ケトレダクターゼ粉末の製造；振盪フラスコ手順
対象となるケトレダクターゼ遺伝子を有するプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉの単一微生物コロニーを、３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールと１％グルコースとを含有する５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロスに接種した。３０℃のインキュベーターの中で一晩（少なくとも１６時間）、２５０ｒｐｍで振盪しながら細胞を増殖させた。その培養物を１Ｌのフラスコの中の２５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（１２ｇ／Ｌのバクトトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌのグリセロール、６５ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１ｍＭのＭｇＳＯ４、３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）中で０．２の６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）に希釈し、３０℃で放置して増殖させた。その培養物のＯＤ６００が０．６から０．８になったらケトレダクターゼ遺伝子の発現を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、一晩（少なくとも１６時間）インキュベートした。細胞を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）によって回収し、上清を廃棄した。その細胞ペレットを同じ容量の冷（４℃）１００ｍＭのトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液（ｐＨ７．０）（ＡＤＨ−ＬＫおよびＡＤＨ−ＬＢならびにそれらから誘導される操作されたケトレダクターゼの場合は２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む）で再び懸濁させ、上のと同様に遠心分離によって回収した。洗浄した細胞を２容量の冷トリエタノールアミン（塩化物）緩衝液に再び懸濁させ、４℃で維持しながら１２０００ｐｓｉで２回、フレンチ・プレスに通した。細胞破壊片を遠心分離（９０００ｒｐｍ、４５分、４℃）によって除去した。透明な溶解産物上清を回収し、−２０℃で保管した。透明な冷凍溶解産物の凍結乾燥によって、粗製ケトレダクターゼ酵素の乾燥粉末を得た。
【０３１５】
実施例３：ケトレダクターゼの生成−発酵手順
曝気し攪拌した１５ｍＬ発酵槽において、０．８８ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムと、０．９８ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウムと、１２．５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム・三水和物と、６．２５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウムと、６．２ｇ／ＬのＴａｓｔｏｎｅ−１５４酵母抽出物と、０．０８３ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムと、（２ｇ／Ｌの塩化カルシウム・二水和物、２．２ｇ／Ｌの硫酸亜鉛・七水和物、０．５ｇ／Ｌの硫酸マンガン・一水和物、１ｇ／Ｌの硫酸第一銅・七水和物、０．１ｇ／Ｌのモリブデン酸アンモニウム・四水和物、および０．０２ｇ／Ｌの四ホウ酸ナトリウム・十水和物を含有する）８．３ｍＬ／Ｌの微量元素溶液とを含有する６．０Ｌの増殖培地を、３０℃の温度にした。実施例３において説明したような振盪フラスコで０．５から２．０の出発ＯＤ６００に増殖させた、対象となるケトレダクターゼ遺伝子を有するプラスミドを含有する、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０の後期指数増殖培養物を、その発酵槽に接種した。その発酵槽を５００〜１５００ｒｐｍで攪拌し、その発酵容器に空気を１．０〜１５．０Ｌ／分で供給して、３０％以上の飽和溶解酸素レベルを維持した。２０％  ｖ／ｖの水酸化アンモニウムの添加によって、培養物のｐＨを７．０に調節した。５００ｇ／Ｌのセルロースと、１２ｇ／Ｌの塩化アンモニウムと、１０．４ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム・七水和物とを含有する供給溶液の添加によって、培養物の増殖を維持した。その培養物が、５０のＯＤ６００に達した後、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度まで添加することによって、ケトレダクターゼの発現を誘導した。その培養物をさらに１４時間、増殖させた。その後、その培養物を４℃に冷却し、回収するまで４℃で維持した。４℃でのＳｏｒｖａｌ  ＲＣ１２ＢＰ遠心分離機における４０分間、５０００Ｇでの遠心分離によって細胞を回収した。回収した細胞は、後続の下流回収プロセスで直接使用するか、そのような使用まで４℃で保管した。
【０３１６】
その細胞ペレットを、それぞれの湿潤細胞ペースト容量に対して２容量の１００ｍＭのトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液（ｐＨ６．８）に、４℃で再び懸濁させた。１２０００ｐｓｉｇの圧力を用いて、二段均質化バルブ組立体を装着したホモジナイザーにその懸濁液を通すことによって、細胞内ケトレダクターゼを細胞から放出させた。破壊直後に、その細胞ホモジネートを４℃に冷却した。１０％  ｗ／ｖのポリエチレンイミンの溶液（ｐＨ７．２）を０．５％  ｗ／ｖの最終濃度までその溶解産物に添加し、３０分間攪拌した。得られた懸濁液を、３０分間の標準的な実験室用遠心分離機における５０００Ｇでの遠心分離によって透明にした。透明な上清をデカントし、３０Ｋｄの分子量カットオフでセルロース限界濾過膜を使用して１０倍濃縮した。その最終濃縮物を浅い容器に分配し、−２０℃で冷凍し、凍結乾燥させて粉末にした。そのケトレダクターゼ粉末を−８０℃で保管した。
【０３１７】
実施例４：２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ケトプロピル］安息香酸メチルエステルの（Ｓ）−２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ヒドロキシプロピル］安息香酸メチルエステルへの変換についての分析方法
２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ケトプロピル］安息香酸メチルエステルの還元およびアルコール生成物のキラル純度を、逆相ＨＰＬＣ（ガードカートリッジを備えた２．１×５０ｍｍ  Ｚｏｒｂａｘ  ＸＤＢカラム；９０：１０ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ中の０．２５％ＡｃＯＨ、０．６ｍＬ／分、３０℃；以下の保持時間：鏡像異性アルコール０．５５分；ケトン０．７２分で２８７ｎｍにて検出）または順相キラルＨＰＬＣ（ガードカートリッジを備えた２．１×１５０ｍｍ  ＣｈｉｒａｌＰａｋ  ＡＳ−Ｈカラム、１０：９０イソプロピルアルコール／ヘプタン、０．５ｍＬ／分、４０℃；以下の保持時間：（Ｓ）−アルコール７．１分；（Ｒ）−アルコール５．７分；ケトン４．５分で２８７ｎｍにて検出）によって測定した。
【０３１８】
実施例５：２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ケトプロピル］−フェニル］−１−メチル−１−エタノールの（Ｓ）−２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ヒドロキシプロピル］−フェニル］−１−メチル−１−エタノールへの変換についての分析方法
２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ケトプロピル］−フェニル］−１−メチル−１−エタノール（対応するアルコールの酸化によって調製されたもの）の還元およびアルコール生成物の純度を、ＨＰＬＣ（以下の溶出プロファイル：０．５ｍＬ／分の流速で、４分間の水／０．１％ＴＦＡの４０％〜８０％勾配、１．５分間保持、１分間で４０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡに戻す；外界温度；以下の保持時間：アルコール４．４分、ケトン５．７分で２５４ｎｍにて検出による、４．６×５０ｍｍ  Ｐｈｅｎｏｍｉｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８，１１０Ａカラム）によって測定した。
【０３１９】
キラル純度をＨＰＬＣ（２．１×１５０ｍｍ  ＣｈｉｒａｌＰａｋ  ＡＤ−Ｈカラム；溶媒：４０：６０イソプロピルアルコール：ヘプタン；流速＝４０℃にて０．５ｍＬ／分；以下の保持時間：（Ｓ）−アルコール１２．０分；（Ｒ）−アルコール１１．２分；ケトン１０．３分で２８０ｎｍにて検出）によって評価した。
【０３２０】
実施例６：２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ケトプロピル］安息香酸メチルエステルの還元についての野生型ケトレダクターゼの評価
補因子としてＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ、ならびに補因子再生系としてグルコースデヒドロゲナーゼ／グルコースまたはイソプロピルアルコールを用いて、実施例１の表３に記載されたＫＲＥＤをスクリーニングした。９６深ウェルプレート内のウェルに、ＴＨＦ中の、１．０ｇ／ＬのＮＡＤ（Ｐ）、３０〜５０ｇ／ＬのＫＲＥＤバリアント、２００μＬのＩＰＡおよび５０μＬの１０〜２０ｇ／Ｌのケトン基質を含む２５０μＬの１００ｍＭトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液ｐＨ７．０を加えた。あるいは、９６深ウェルプレート内の各ウェルに、１０〜２０ｍｇのＣａＣＯ３、１．０ｇ／ＬのＮＡＤ（Ｐ）、３０〜５０ｇ／ＬのＫＲＥＤ、１０〜２０ｇ／ＬのＧＤＨおよび１０％グルコース）を含む２５０μＬの１００ｍＭトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液ｐＨ７．０を予め充填した。そのプレートをアルミニウム／ポリプロピレンラミネートヒートシールテープ（Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  １１（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ），Ｃａｔ＃０６６４３−００１）で密閉し、そして室温で一晩振盪した。１０００μＬのＥｔＯＡｃを加えることによって、その反応をクエンチした。遠心（２２℃における１０分間の４０００ｒｐｍ）後、実施例４における順相ＨＰＬＣ法を用いて、変換について有機相をアッセイした。これらの酵素は、試験された条件のいずれにおいてもいかなる活性を示さなかった（検出限界  約０．５％変換）。
【０３２１】
この実施例から、野生型ケトレダクターゼは、２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ケトプロピル］安息香酸メチルエステルに対して、もしあったとしても非常に低い活性を有することが証明される。
【０３２２】
実施例７：実施例７：２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ケトプロピル］安息香酸メチルエステルの還元についてのＡＤＨ−ＬＫバリアントの評価
生成されたいくつかのＡＤＨ−ＬＫバリアントを評価したところ、実施例６に記載される条件下、且つ、表４に列挙されるように評価したとき、配列番号９０を有するＡＤＨ−ＬＫバリアントが、上記基質をキラル（Ｓ）−２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ヒドロキシプロピル］安息香酸メチルエステルに変換したことが見出された。
【０３２３】
【表４】
2010539948.tif 000030
この実施例は、Ｇ７Ｈ、Ｓ９６Ｔ、Ｆ１４７Ｌ、Ｙ１９０Ｐ、Ｖ１９６Ｌ、Ａ２０２Ｗ変異を含むＡＤＨ−ＬＫバリアントが、高い立体選択性（＞９９％の立体異性体過剰率）で２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ケトプロピル］安息香酸メチルエステルを（Ｓ）−２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ヒドロキシプロピル］安息香酸メチルエステルに変換することを示している。
【０３２４】
実施例８：補因子再利用のためにイソプロピルアルコールを用いる、２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ケトプロピル］安息香酸メチルエステルに対するケトレダクターゼ活性についてのハイスループットＨＰＬＣアッセイ
指向進化によって得られ、且つ、進化したケトレダクターゼ遺伝子を含む、プラスミドライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス上にプレーティングした。３０℃において少なくとも１６時間インキュベートした後、Ｑ−ｂｏｔ（登録商標）ロボットコロニーピッカー（Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，ＯＲ）を用いて、１８０μＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）、１％グルコース、３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ＣＡＭ）および２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む９６ウェルの浅ウェルマイクロタイタープレートにコロニーを拾った。２００ｒｐｍで振盪しながら細胞を３０℃において一晩生育した。次いで、２０μＬのこの培養物を、３５０μＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４および３０μｇ／ｍＬのＣＡＭを含む９６深ウェルプレートに移した。深ウェルプレートを２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２．５〜３時間インキュベートした後（ＯＤ６０００．６〜０．８）、その細胞培養物による組換え遺伝子発現を、最終濃度１ｍＭになるイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導した。次いで、そのプレートを２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃において１５〜２３時間インキュベートした。
【０３２５】
９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに、０．２ｍＭ  Ｎａ−ＮＡＤＰを含む１００μＬの１００ｍＭトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液ｐＨ７．０および２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、および任意の時点における既知の最良の酵素（例えば、進化の第１回目の配列番号９０）がケトンを（Ｓ）−アルコールに１０〜２０％変換し得るのに十分な体積の細胞培養物を加えた。ＩＰＡおよびＴＨＦ中に１．６７〜１６．７ｇ／Ｌの２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ケトプロピル］安息香酸メチルエステルを含む溶液を上記ウェルに加えることにより、４：１：５という体積比の１００ｍＭトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液ｐＨ７．０、ＴＨＦおよびＩＰＡという最終組成物（最終基質濃度１〜１０ｇ／Ｌ）が得られた。最終濃度０〜２％となるように所望のとおり（代表的には、ＩＰＡまたはＴＨＦ中の溶液として）アセトンを加えた。そのプレートを、実施例６に記載されるようにヒートシールし、振盪しながら室温または４０℃において４または２４時間インキュベートした。その反応の終わりに、１０００μＬの１：４  ＴＨＦ：アセトニトリルを用いて、基質および生成物をクエンチした。室温での遠心分離後、実施例４に記載した逆相ＨＰＬＣ法を用いて変換について上清を分析した。エナンチオ選択性についてアッセイする反応のために、その反応物を、１ｍＬのＥｔＯＡｃを用いてクエンチし、遠心し、有機相を、実施例４に記載した順相ＨＰＬＣ法によるキラル解析に供した。
【０３２６】
この実施例は、２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ケトプロピル］安息香酸メチルエステルの還元について改善されたＫＲＥＤバリアントを同定するために使用された方法を説明している。
【０３２７】
実施例９：ＡＤＨ−ＬＫから得られた、操作されたケトレダクターゼによる２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ケトプロピル］安息香酸メチルエステルの還元
スターバーが入った大気下の琥珀色バイアルに、順に、５０〜５００ｍｇの基質、１．５ｍＬの１００ｍＭトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液ｐＨ７．０または８．０（０．３３ｇ／ＬのＮＡＤＰ−Ｎａおよび１０．０〜３３．３ｇ／ＬのＫＲＥＤバリアントを含む）、２ｍＭのＭｇＳＯ４、２．５ｍＬのＩＰＡおよび０．５ｍＬの共溶媒（ＴＨＦまたはトルエン）を加えた。そのバイアルを閉じ、所望の温度に制御された油浴に浸漬した。２つの５０μＬのアリコートを１、２、４および８時間後に取り出し、４つの５０μＬのアリコートをｔ＝２４ｈにおいて取り出した。それらのアリコートを１０００μＬのＴＨＦで希釈し、遠心する（２２℃における１０分間の４０００ｒｐｍ）ことにより、残骸を除去した。上清をアセトニトリルで９×希釈し、実施例４に記載したように変換を測定した。２４時間後のサンプルについてキラル解析を行った：０．５体積のブラインおよび２体積のＴＨＦを加えることにより、きれいに相分離させ、有機相をＭｇＳＯ４で乾燥した。その有機相をＥｔＯＡｃで１０×希釈し、実施例４に記載したように分析した。表５には、ケトレダクターゼに対応する配列番号、野生型ＡＤＨ−ＬＫからのアミノ酸変異の数、および２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ケトプロピル］安息香酸メチルエステルの（Ｓ）−２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ヒドロキシプロピル］安息香酸メチルエステルへの変換が記載されている。試験されたすべてのバリアントが、＞９９．２％の立体異性体過剰率の（Ｓ）−２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ヒドロキシプロピル］安息香酸メチルエステルをもたらした（対照基準は、９９．２％ｅｅだった；望まれないステレオマー（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒ）は、検出不可能だった）。
【０３２８】
【表５−１】
2010539948.tif 000031
【０３２９】
【表５−２】
2010539948.tif 000032
＋：＜０．０３ｇ生成物／ｌ／ｇ酵素／日；＋＋：０．０３〜１ｇ生成物／ｌ／ｇ酵素／日；＋＋＋：１〜５ｇ生成物／ｌ／ｇ酵素／日；＋＋＋＋：５〜２０ｇ生成物／ｌ／ｇ酵素／日；＋＋＋＋＋＞２０ｇ生成物／ｌ／ｇ酵素／日．
実施例１０：ＡＤＨ−ＬＫから得られた、操作されたケトレダクターゼによる２−［２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］フェニル］−２−プロパノールの還元
スターバーが入った大気下の琥珀色バイアルに、順に、５００ｍｇの２−［２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−オキソプロピル］フェニル］−２−プロパノール、１．５ｍＬの１００ｍＭトリエタノールアミン（塩化物）緩衝液ｐＨ７．０（０．８９ｇ／ＬのＮＡＤＰ−Ｎａおよび１３．３ｇ／ＬのＫＲＥＤバリアント配列番号２０を含む）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２．５ｍＬのＩＰＡおよび０．５ｍＬの共溶媒（ＴＨＦまたはトルエン）を加えた。そのバイアルを閉じ、４０℃に制御された油浴に浸漬した。サンプルを６、２４および２９時間後に取り出し（３０μＬ）、１５００μＬのＴＨＦで希釈し；３０μＬの希釈サンプルを乾燥するまで濃縮し、１０００μＬのアセトニトリルに溶解した後、実施例５に記載したような化学変換についてのＨＰＬＣ解析に供した。
【０３３０】
２９時間後に反応混合物全体を以下のとおりワークアップした後、キラル解析を行った：サンプルを２ｍＬのブラインおよび６ｍＬのＴＨＦで希釈することにより、きれいに相分離させた。その水相を酢酸エチルで抽出し（３×１０ｍＬ）、併せた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した。その有機溶液をセライト床で濾過し、乾燥するまで濃縮した。１ｍｇの残渣を１ｍｌのアセトニトリルに溶解することによって分析用サンプルを調製し、実施例５に記載したように分析した。＞９９％の立体異性体過剰率で（Ｓ）−１−（３−（２−（７−クロロキノリン−２−イル）ビニル）フェニル）−３−（２−（２−ヒドロキシプロパン−２−イル）フェニル）プロパン−１−オールを得た。変換は、約６７％超だった。
【０３３１】
実施例１１：（Ｓ）−２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ヒドロキシプロピル］安息香酸メチルエステルの実験規模での生成
外部熱交換体を介して５１℃に設定されたジャケット温度、且つ、内部温度計および２５０ｒｐｍのメカニカルスターラーが装着された、窒素下のジャケット付き２Ｌ３首フラスコに、３００ｍＬの１００ｍＭ  ｐＨ８．０トリエタノールアミン＊ＨＣｌ、０．６ｍＬの１Ｍ  ＭｇＳＯ４、実施例３に記載したような３．０ｇの配列番号２０触媒、０．１ｇのＮＡＤＰ−Ｎａ２を加えることにより、淡黄色溶液が得られた。１０分間撹拌した後、１００ｇの２−［３−［３−［２−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ケトプロピル］安息香酸メチルエステルを、約５分間にわたって少しずつ加えた。そのスラリーに、５００ｍＬ（３９０ｇ）のＩＰＡおよび１００ｍＬ（８５ｇ）のトルエンを加えた。実施例４および６に記載したように、アキラルＨＰＬＣによって反応の進行をモニターした。サンプリングおよびサンプル調製には、実施例９に記載される手順を用いた。
【０３３２】
４５℃で２４時間撹拌した後、アキラルＨＰＬＣ解析に応じて反応が完了した。その反応混合物を、圧縮空気駆動式真空ポンプを介して、３層の直径１５０ｍｍのＷｈａｔｍａｎ＃２濾紙で濾過した。その濾過が完了するためには約１０分必要で、それにより黄褐色のペーストが得られた。その黄褐色のペーストを２×５００ｍＬの水で洗浄した。その黄褐色のペーストを一晩風乾することにより、１０４ｇの（Ｓ）−２−［３−２［−（７−クロロ−２−キノリニル）エテニル］フェニル］−３−ヒドロキシプロピル］安息香酸メチルエステル一水和物の黄褐色固体が９８．５ＨＰＬＣ面積パーセントの化学純度（主要な不純物は、出発物質の０．３〜０．４ＨＰＬＣ面積パーセントである）で得られた（１００％収率；生成物は一水和物である）。（Ｒ）−立体異性体は、検出不可能だった。
【０３３３】
本願において引用された刊行物、特許、特許出願および他の文書のすべては、その各個別の刊行物、特許、特許出願または他の文書がすべての目的のために参考として援用されると個別に示されたかのように、同程度に、すべての目的のために本明細書によってその全体が参考として援用される。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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