(57)【要約】本発明は、哺乳動物における癌を予防または処置するための医薬組成物を調製するための、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤、ＧＡＤＤ３４の阻害剤およびＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤から選択されるプロテインホスファターゼ阻害剤の使用であって、医薬組成物が癌の処置において使用される産物との組み合わせでの投与に意図される、使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における癌を予防または処置するための医薬組成物を調製するための、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤、ＧＡＤＤ３４の阻害剤およびＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤から選択されるプロテインホスファターゼ阻害剤の使用であって、医薬組成物が癌の処置において使用される産物との組み合わせでの投与に意図される、使用。
【請求項２】
阻害剤が、トートマイシンおよびカリクリンＡから選択されるプロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
阻害剤が、サルブリナルおよび配列番号１の５〜３５アミノ酸に含まれる配列に存するＧＡＤＤ３４のフラグメントから選択されるＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤である、請求項１記載の使用。
【請求項４】
ＧＡＤＤ３４のフラグメントが、配列ＬＫＡＲＫＶＲＦＳＥＫＶ（配列番号２）を有する、請求項３記載の使用。
【請求項５】
ＧＡＤＤ３４のフラグメントが、腫瘍細胞の表面に結合できる形質膜移行モチーフをさらに含む、請求項３または４記載の使用。
【請求項６】
腫瘍細胞が、癌腫、肉腫、リンパ腫、黒色腫、小児腫瘍および白血病腫瘍に由来する、請求項５記載の使用。
【請求項７】
移行モチーフの配列が、ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ（配列番号３）である、請求項５または６記載の使用。
【請求項８】
ペプチドの配列が、ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ＬＫＡＲＫＶＲＦＳＥＫＶ（配列番号４）である、請求項３〜７のいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
癌の処置が、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、特異的キナーゼ阻害剤に基づく療法、抗血管新生剤に基づく療法、およびモノクローナル抗体に基づく療法から選択される、請求項１〜８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
癌の処置が化学療法である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
化学療法が、アントラサイクリン、免疫応答モジュレーター、ホルモンおよびチロシンキナーゼ阻害剤から選択される産物を使用する、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
産物が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシンおよびミトキサントロンから選択されるアントラサイクリンである、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
癌が、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓癌、肺癌、骨肉種、ＧＩＳＴ、黒色腫、白血病および神経芽細胞腫から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項記載の使用。
【請求項１４】
細胞におけるＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の形成または活性を阻害できるペプチドを選択するためのインビトロ方法であって、以下の工程：
ａ）配列番号１内のフラグメント配列またはその相同フラグメントを含む試験ペプチドを提供する工程、
ｂ）工程ａ）の試験ペプチドを細胞と接触させる工程、および
ｃ）細胞の表面上のカルレティキュリン（ＣＲＴ）、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の露出を検出するおよび／またはそのレベルを測定する工程であって、試験ペプチドと接触させられていないかまたは試験ペプチドの変異体と接触させられたコントロール細胞と比較して増強された露出が、細胞におけるＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の形成または活性の阻害の指標となる、工程
を含む方法。
【請求項１５】
工程ａ）の配列が５〜３５アミノ酸を含む、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、単離および精製されたタンパク質、例えばカルレティキュリン（ＣＲＴ）、ＫＤＥＬ受容体およびＥＲｐ５７、ならびに死滅している細胞の表面におけるＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の露出を可能にするかまたは増強し、従って免疫系からの反応を誘導する任意の化合物に関する。本発明者らは、特に、哺乳動物における癌または感染を予防または処置するための、特にそれを必要とする哺乳動物における療法、好ましくは癌の療法の効率を改善するための、医薬組成物を調製するために、細胞傷害性化合物またはアポトーシス誘導物質と組み合わせて前記タンパク質および化合物を使用できることを見出した。
本発明はさらに、キット、細胞の表面におけるＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体、および／またはＥＲｐ５７の露出を検出するための方法、目的の化合物を選択するための方法、ならびに医薬組成物を提供する。
【０００２】
発明の背景
癌は、大部分の工業国における主要な死因である。癌の処置の様々な方法が使用され得る：外科手術、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法および化学療法。多数の研究室が癌療法の改善を見出すための研究を主導している。化学療法は細胞死を導く。以下の２つの型の細胞死が知られている：アポトーシスおよび壊死。
【０００３】
アポトーシス細胞死は免疫原性が低い（または免疫寛容原性でさえある）が、壊死細胞死は真に免疫原性であると長らく仮定されていた（Bellamy, C.O., Malcomson, R.D., Harrison, D.J. & Wyllie, A.H. Semin Cancer Biol 6, 3-16 (1995) ; Thompson, C.B. Science 267, 1456-1462 (1995) ; Igney, F.H. & Krammer, P.H. Nat Rev Cancer. 2, 277-88 (2002)）。
【０００４】
この差異は、例えば局所的炎症反応（「危険シグナル」）を刺激することによって、そして／または樹状細胞（ＤＣ）の成熟を引き起こすことによって、免疫応答を刺激する、非アポトーシス細胞死で死滅している細胞の固有の能力から生じると考えられていた（Steinman, R.M., Turley, S., Mellman, I. & Inaba, K. J Exp Med. 191, 411-6 (2000) ; Liu, K. et al. J Exp Med 196, 1091-1097. (2002)）。
【０００５】
壊死（これは、活発な形質膜破裂によって規定される）とは対照的に、アポトーシスには、死滅している細胞を食細胞にとって食可能（palatable）にする形質膜における一連の微細な変化が付随する（Kroemer, G. et al. Cell Death Differ 12, 1463-1467 (2005)）。細胞の外側からの可溶性タンパク質の吸着（例えば、Ｃ１ｑおよびトロンボスポンジン）および細胞の内部から表面への分子の移行（例えば、ホスファチジルセリン、ＰＳ、およびカルレティキュリン、ＣＲＴ）、ならびに「食拒絶（don't eat me）」シグナルの抑制（例えば、ＣＤ４７）を含む、このような「食誘引（eat me）」シグナル（Savill, J. & Fadok, V. Nature 407, 784- (2000) ; Lauber, K., Blumenthal, S.G., Waibel, M. & Wesselborg, S. Mol Cell. 14, 277-87 (2004) ; Yoshida, H. et al. Nature 437, 754-8 (2005)  ; Gardai, S.J. et al. Cell 123, 321-34 (2005) ; Henson, P.M. & Hume, D.A. Trends Immunol 27, 244-50 (2006)）は、専門および非専門食細胞によるアポトーシス細胞の認識および除去を誘起する。アポトーシス細胞の最適以下のクリアランスは、所望されない免疫反応を引き起こし得、そして自己免疫疾患を導き得る（Hanayama, R. et al. Science 3004, 1147-50. (2004) ; Gaipl, U.S. et al. Curr Top Microbiol Immunol 305, 161-76 (2006)）。
【０００６】
それにもかかわらず、免疫原性壊死対免疫寛容原性アポトーシスの間の二分は簡略化のしすぎであるようである。従って、予定外の（壊死）腫瘍細胞死は局所的免疫抑制を誘導し得る（Vakkila, J. & Lotze, M.T Nat Rev Immunol 4, 641-8 (2004)）。さらに、免疫応答を引き起こすアポトーシス腫瘍細胞の能力はアポトーシス誘導物質に依存することが見出され、これは２つの形態的に区別可能でないアポトーシスのサブカテゴリー、すなわち免疫原性対非免疫原性アポトーシスの同定を導いた（Casares, N. et al. J. Exp. Med. 202, 1691-701 (2005) ; Blachere, N.E., Darnell, R.B. & Albert, M.L. PLoS Biol. 3, e185 (2005)）。
【０００７】
標準的な化学療法の大部分は非免疫原性アポトーシスを誘導する（Zitvogel, L., Casares, N., Pequignot, M., Albert, M.L. & Kroemer, G. Adv. Immunol. 84, 131-79 (2004) ; Steinman, R.M. & Mellman, I. Science 305, 197-200 (2004) ; Lake, R.A. & van der Most, R.G. N Engl J Med 354, 2503-4 (2006)）。従って、最初は効率的な化学療法の後でさえ、患者は効率的な自己腫瘍免疫応答を発達させず、次いで化学療法耐性腫瘍変異体によって克服される。抗癌化学療法を改善するために、有望な方法は免疫原性癌細胞死によってもたらされる。実際、免疫原性癌細胞死の誘導は、免疫系が「傍観者効果」を介して寄与して、化学療法耐性癌細胞および癌幹細胞を根絶し得るという点で非常に興味深いはずである（Steinman, R.M. & Mellman, I. Science 305, 197-200 (2004) ; Lake, R.A. & van der Most, R.G. N Engl J Med 354, 2503-4 (2006); Zitvogel, L., Tesniere, A. & Kroemer, G. Nat Rev Immunol in press (2006)）。
【０００８】
化学療法の効率および応答性は、使用される薬物および化学療法に関与する分子に関連する。抗腫瘍化学療法において使用される主要な薬物は以下の４つの群に分割され得る：細胞傷害性薬剤、ホルモン、免疫応答モジュレーター、およびチロシンキナーゼ活性の阻害剤。細胞傷害性薬剤の中に、アントラサイクリン（アポトーシス誘導物質であるドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン）のような細胞傷害性抗生物質を見出すことができる。本発明者らは、アントラサイクリンが免疫原性アポトーシスを誘起できることを最初に示した（Casares, N., Pequignot, M.O., Tesniere, A., Ghiringhelli, F., Roux, S., Chaput, N., Schmitt, E., Hamai, A., Hervas-Stubbs, S., Obeid, M., Coutant, F., Metivier, D., Pichard, E., Aucouturier, P.,  Pierron, G., Garrido, C., Zitvogel, L., and Kroemer, G. J Exp Med. 202, 1691-701 (2005)）。実際、小胞体（ＥＲ）（タプシガルジン、ツニカマイシン、ブレフェルジン）、ミトコンドリア（亜ヒ酸塩、ベツリン酸、Ｃ２セラミド）またはＤＮＡ（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４３、カンプトテシン、エトポシド、マイトマイシンＣ）を標的化する薬物を含む大部分のアポトーシス誘導物質は免疫原性アポトーシスを誘導できなかったが、アントラサイクリンは免疫原性細胞死を誘起した（図１Ｂ、Ｃに示すように）。研究の増大にもかかわらず、どの状況下で免疫応答が死滅している腫瘍細胞に対して引き起こされるのかは未解決の問題のままである（Zitvogel, L., Casares, N., Pequignot, M., Albert, M.L. & Kroemer, G. Adv. Immunol. 84, 131-79 (2004)）。
【０００９】
本発明は、カルレティキュリン（ＣＲＴ）、ＫＤＥＬ受容体（ＫＤＥＬ受容体はＣＲＴ受容体である）およびＥＲｐ５７と名付けられたタンパク質が免疫原性細胞死のために死滅する細胞上に露出されているが、非免疫原性細胞死を受ける細胞の表面上では欠如しているという観察に基づいている。
【００１０】
ＣＲＴは、癌を処置する別の方法であるホルモン応答の調節について既に記載されている。ホルモン受容体誘導遺伝子転写を調節するタンパク質は細胞の核中に存在し、そしてホルモンのその受容体への結合を阻害または促進する。特許ＵＳ２００３／００６０６１３Ａ１に記載される発明は、ホルモン応答性を調節すために使用される、抗癌療法において効率的な、精製タンパク質を提示する。ＵＳ２００３／００６０６１３Ａ１はＣＲＴを合成タンパク質、その模倣タンパク質、ＣＲＴをコードするＤＮＡ分子、癌のような疾患を処置する方法、および前記タンパク質の１つを含む医薬を含むキットとして記載している。ＣＲＴは小胞体または細胞の核のいずれかに存在すると記載されている。この特許出願は、遺伝子転写に対する核ＣＲＴの作用の機構を記載している。
【００１１】
ＥＲｐ５７は小胞体（ＥＲ）の管腔タンパク質であり、そしてタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）ファミリーのメンバーである。原型ＰＤＩとは対照的に、ＥＲｐ５７は新たに合成された糖タンパク質（ＣＲＴを含む）と特異的に相互作用することが知られている。Oliver et al.（MBC online, Vol. 10, Issue 8, 2573-2582, August 1999）は、ＥＲｐ５７がＥＲ管腔内のカルネキシンおよびＣＲＴと相互作用して、糖タンパク質の折り畳みを調節することを示している。
【００１２】
小胞体常在性タンパク質の大多数は残留モチーフを介して小胞体（ＥＲ）中に保持されている。このモチーフはタンパク質配列の末端の４つのアミノ酸から構成されている。最も一般的な残留配列はＫＤＥＬ（Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）である。哺乳動物細胞中には３つのＫＤＥＬ受容体が存在し、そしてそれらは非常に高度の配列同一性を有している。ＫＤＥＫ受容体（ＫＤＥＫ−Ｒ）は通常ＥＲ内に存在する。本発明者らは、ＫＤＥＬ受容体がＣＲＴのＫＤＥＬモチーフとも相互作用できることを示した。
【００１３】
本発明者らは、より特定すると、死滅している細胞の形質膜における特定の変化：カルレティキュリン（ＣＲＴ）、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の表面露出、を同定した。この事象は、免疫原性癌細胞死において、すなわち免疫系の反応が関連する癌細胞死においてのみ生じる。免疫原性癌細胞死において、免疫系は、他の生理学的細胞破壊機構に加えて、死滅している細胞の排除にこのように関与する。外因性ＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７、またはＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の露出を誘導するシグナルの外部提供は、そうでなければ非免疫原性の細胞死に免疫原性を付与して、すなわち免疫系を動員および活性化して、最適な抗癌化学療法を可能にする。
【００１４】
発明の詳細な説明
「免疫原性細胞死」
本発明は、死滅している細胞に対する免疫系からの応答を誘導するための必須事項としてのＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の露出の同定に基づいており、そして癌または感染のような疾患を予防または処置するための新たなストラテジーを描く。
免疫系からの応答を、それが腫瘍細胞に対する場合、本明細書において「抗癌免疫応答」と称する。
新たな処置ストラテジーを、それが癌に対する場合、本明細書においてさらに「癌の免疫原性処置」と称する。
【００１５】
ＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７は、それらの少なくとも１つがその表面上に露出される場合に、任意の死滅している細胞に対する免疫系からの応答を誘導することができる。免疫系からのこの応答は、死滅している細胞の破壊に有利に働く。この現象を「免疫原性細胞死」または「免疫原性アポトーシス」と称する。
【００１６】
従って、本発明者らは、本明細書において、ＣＲＴが死滅している細胞の表面上に露出される場合に、それが樹状細胞のような食細胞によるその破壊を促進することを実証する。次いで、食細胞は免疫系と相互作用し、これが今度は免疫応答を担う。
本発明者らはさらに、死滅している細胞の表面上にＣＲＴが増加した量で存在する場合に、この効果が増幅されることを実証する。本発明者らは、本明細書において、ＣＲＴが、細胞死誘導物質（アポトーシス誘導物質）と接触させられた大部分の腫瘍細胞の表面上に、増加した量で存在することを実証する。
【００１７】
本発明者らはさらに、ＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体（ＣＲＴ受容体）およびＥＲｐ５７の細胞表面露出のキネティクスが同一であること、および３つのタンパク質の全てが同じ刺激のパターンによって誘導されることを見出した。
【００１８】
二重免疫蛍光染色は、実際、ＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体およびＥＲｐ５７が、ＭＴＸ処理細胞の表面上で一緒に出現する場合に、大部分が共存することを明らかにする（図８および図１０）。本発明者らは、ＣＲＴを欠如しているマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）がＭＴＸ処理の後に表面上にＥＲｐ５７を露出できないことを見出した。逆に、ＥＲｐ５７を欠如しているＭＥＦはＭＴＸ処理の後に表面上にｅｃｔｏ−ＣＲＴを露出できない（示さず）。全体で、これらの結果は、ＥＲｐ５７およびＣＲＴは細胞表面に一緒に移行すること、および免疫学的技術によるＥＲｐ５７表面露出の決定はＣＲＴの表面露出（ｅｃｔｏ−ＣＲＴ）を正確に反映することを示す。従って、本発明者らは、例えば、トートマイシン（これもまたｅｃｔｏ−ＣＲＴ露出を誘導する（Obeid et al. Nat. Med. 2007））での処理もまた、免疫蛍光染色およびそれに続く細胞蛍光測定分析によって決定されるＥＲｐ５７の表面露出を刺激することを見出した（図９）。
【００１９】
細胞表面におけるＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の配置または露出は、細胞内ＣＲＴ、細胞内ＫＤＥＬ受容体および／または細胞内ＥＲｐ５７の細胞表面への移行の結果、および／または細胞外ＣＲＴ、細胞外ＫＤＥＬ受容体および／または細胞外ＥＲｐ５７の細胞表面への移行の結果であり得る。
【００２０】
本発明者らはまた、本明細書において、ＣＲＴおよびＥＲｐ５７の両方が免疫原特性をアポトーシス現象に付与できることを実証する。ＫＤＥＬ受容体も免疫原特性をアポトーシス現象に付与できる。
【００２１】
本発明において、ＣＲＴは、組換えＣＲＴ、内因性ＣＲＴまたはその模倣物もしくは相同変異体であり得る。
本発明において、ＥＲｐ５７は、組換えＥＲｐ５７、内因性ＥＲｐ５７またはその模倣物もしくは相同変異体であり得る。
本発明において、ＫＤＥＬ受容体は、組換えＫＤＥＬ受容体、内因性ＫＤＥＬ受容体またはその模倣物もしくは相同変異体であり得る。
【００２２】
本発明において、用語「内因性」は、ＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体およびＥＲｐ５７がそれぞれ野生型のＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および野生型のＥＲｐ５７として細胞によって産生されることを意味する。野生型タンパク質は、その活性が、特に免疫系に関して、以前に記載される野生型タンパク質のものとそれぞれ実質的に同一であるが、細胞によって産生されるために人の介入を必要とする組換えのＣＲＴ（ｒＣＲＴ）、ＫＤＥＬ受容体（ｒＫＤＥＬ受容体）およびＥＲｐ５７（ｒＥＲｐ５７）とは区別されなければならない。
【００２３】
本発明において、用語「相同変異体」は、特に免疫系からの応答を誘導することができる（例えば、以前に定義されるような免疫原性細胞死またはアポトーシス）、対応する野生型タンパク質の特性を示す、欠失または置換されたアミノ酸を含む任意のＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体またはＥＲｐ５７タンパク質、例えば任意の野生型または組換えのＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体またはＥＲｐ５７タンパク質フラグメントを示すために使用される。
【００２４】
本発明の特定の実施態様において、ＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７を、好ましくはウイルス、細菌、真菌および寄生体感染から選択される感染を予防または処置するために使用し得る。
【００２５】
本発明の別の特定の実施態様において、ＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７を、任意の種類の癌または新形成を予防または処置するために使用することができる。
【００２６】
本発明において、標的化される癌は、好ましくは以下の療法の１つに感受性の癌である：（ｉ）化学療法、（ｉｉ）放射線療法、（ｉｉｉ）ホルモン療法、（ｉｖ）免疫療法、（ｖ）特異的キナーゼ阻害剤に基づく療法、（ｖｉ）抗血管新生剤に基づく療法、および（ｖｉｉ）抗体に基づく療法、好ましくはモノクローナル抗体に基づく療法。
【００２７】
化学療法に感受性の癌は、従来、任意の細胞傷害性薬剤または細胞死誘導物質、特に遺伝子毒性薬剤のような化合物を使用して処置されている。本発明の特定の実施態様において、細胞傷害性薬剤は、好ましくは例えばアントラサイクリン、有糸分裂阻害剤、ＤＮＡ挿入剤、タキサン、ゲムシタビン、エトポシド、マイトマイシンＣ、アルキル化剤、白金に基づく成分、例えばシスプラチン、好ましくはオキサリプラチンおよびＴＬＲ−３リガンドから選択される化学療法剤である。
【００２８】
好ましいアントラサイクリンは、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシンおよびミトキサントロンから選択され得る。
【００２９】
放射線療法に感受性の癌は、従来、例えばＸ線、γ線照射および／またはＵＶＣ照射から選択される照射を使用して処置されている。
【００３０】
ホルモン療法に、すなわちアポトーシスまたはＦａｓリガンドまたは可溶性／膜結合ＴＲＡＩＬまたは可溶性／膜結合ＴＮＦα（ＴＮＦａ）に導く療法に感受性の癌は、従来、例えばアロマターゼ阻害剤のような化合物を使用して処置されている。
【００３１】
免疫療法に感受性の癌は、従来、例えばＩＬ−２、ＩＦＮα（ＩＦＮａ）、およびワクチンから選択される化合物を使用して処置されている。
【００３２】
特異的キナーゼ阻害剤に基づく療法に感受性の癌は、従来、例えばチロシンキナーゼ阻害剤、セリンキナーゼ阻害剤およびトレオニンキナーゼ阻害剤から選択される化合物を使用して処置されている。
【００３３】
抗体に基づく療法、好ましくはモノクローナル抗体に基づく療法に感受性の癌は、従来、例えば抗ＣＤ２０または抗Ｈｅｒ２／Ｎｅｕのような特異的抗体を使用して処置されている。
【００３４】
用語「従来」は、療法が適用されているかまたは、慣習的に適用されていないとしても、適切であり、そして少なくとも衛生当局によって推奨されていることを意味する。「従来」の処置は、予防または処置しようとする特定の癌に依存して癌学者（cancerologist）によって選択される。
【００３５】
本発明において、標的化される癌は、従って、例えば、上記の治療産物の少なくとも１つに、特に以下の産物の少なくとも１つに感受性の癌であり得る：（ｉ）細胞傷害性薬剤、（ｉｉ）キナーゼ阻害剤、（ｉｉｉ）抗血管新生剤、（ｖｉ）モノクローナル抗体。
【００３６】
癌は、本発明において、好ましくは、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓癌、肺癌、骨肉種、ＧＩＳＴ、黒色腫、白血病および神経芽細胞腫から選択される。
【００３７】
好ましい乳癌は、従来、アントラサイクリン、タキサン、ハーセプチンおよび／またはＴＬＲ−３リガンドを用いて処置されている乳癌である。
好ましい前立腺癌は、従来、アントラサイクリンおよびＸ線を用いて処置されている前立腺癌である。
好ましい結腸癌は、従来、オキサリプラチンを用いて処置されている結腸癌である、
好ましい腎臓癌は、従来、サイトカインまたは抗血管新生薬物（ソラフェニブ）を用いて処置されている腎臓癌である。
好ましい肺癌は、従来、Ｘ線および白金を用いて処置されている肺癌である。
好ましい骨肉種および好ましいＧＩＳＴはそれぞれ、従来、アントラサイクリンおよび／またはグリベックを用いて処置されている骨肉種およびＧＩＳＴである。
好ましい黒色腫は、従来、電気化学療法または高用量のＴＮＦαの単離肢灌流（isolated limb perfusion）を用いて処置されている黒色腫である。
【００３８】
本発明において記載される腫瘍細胞は、好ましくは癌腫、肉腫、リンパ腫、黒色腫、小児腫瘍および白血病腫瘍から選択される。
【００３９】
本発明者らは、本発明において、患者腫瘍細胞が自発的にはＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７をその表面上に露出していない場合、前記腫瘍細胞に対する免疫系からの反応に有利に働くようにさらなる処置を前記患者に実施するべきであることを見出した。露出は、以前に記載されるような任意の従来の療法の実施の前または後に観察または決定され得る。腫瘍細胞の表面上のＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の自発的露出は、好ましくは、そのような適切な従来の療法の実施後に観察される。再び、前記従来の療法は、腫瘍の性質に直接的に依存する。
【００４０】
上記のさらなる処置は、本発明によれば、ＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の外因性供給、および／または腫瘍細胞の表面におけるＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の露出を可能にするかまたは増強する化合物（例えば、下記で説明するようなＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤）の、好ましくは上記のような処置において使用される従来の治療剤と一緒の（相乗効果を得るための）投与であり得、前記従来の処置は、予防または処置しようとする癌の性質に従って、以前に例証されるように、癌学者によって容易に選択される。
【００４１】
以前に示されるように、本発明の目的は、従って、哺乳動物、好ましくはヒトにおける上記で定義するような癌を予防または処置するための、癌の処置において、特に以前に記載されるような癌の従来の処置において使用される産物との組み合わせでの投与に好ましくは意図される、医薬組成物を調製するための、ＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の使用である。
【００４２】
医薬組成物は、好ましくは、上記の癌の処置の間およびまたは後に投与される。
【００４３】
本発明の別の目的は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける上記で定義するような感染を予防または処置するための医薬組成物を調製するための、ＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の使用である。
【００４４】
本発明はまた、細胞に対する免疫系の活性を改変できる化合物をスクリーニングまたは選択するための方法を提供し、この方法は、試験化合物の存在下での細胞の表面におけるＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の露出を検出するおよび／またはそのレベルを測定する工程であって、試験化合物に曝露されていないかまたは試験化合物と接触させられていないコントロール細胞と比較して改変された露出が、前記細胞に対する免疫系の活性を改変する前記化合物の能力の指標となる、工程を含む。
【００４５】
本発明の別の目的は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける癌または感染を予防または処置するための医薬組成物を調製するための、死滅している細胞、特に腫瘍細胞の表面におけるＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の露出を可能にするかまたは増強する任意の化合物または治療剤の使用である。この医薬組成物は、好ましくは、癌の処置との、そして以前に説明されるように、好ましくは天然には腫瘍細胞の表面上でのＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７の露出を誘導しない処置との組み合わせでの投与に意図される。
【００４６】
様々な化学療法剤が、見かけ上均一なアポトーシス経路を介して腫瘍細胞を死滅させ得るが、それらは免疫原性細胞死を刺激するその能力において異なる。従って、本発明者らは、アントラサイクリンおよびγ線照射が免疫原性細胞死を引き起こし、そして腫瘍細胞の表面上でのＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７（それぞれ本明細書においてｅｃｔｏ−ＣＲＴおよびｅｃｔｏ−ＥＲｐ５７と称する）の露出を誘導するが、非免疫原性細胞死を誘導する他のアポトーシス促進性薬剤（例えば、マイトマイシンＣおよびエトポシド）はｅｃｔｏ−ＣＲＴおよび／またはｅｃｔｏ−ＥＲｐ５７を誘導できないことを見出した。ＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７の枯渇は、アントラサイクリンによって誘起される細胞死の免疫原性を損なうが、ＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７の外因性供給または腫瘍細胞の表面へのＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７の移行に有利に働く薬理学的薬剤によるＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７の露出の強制は、腫瘍細胞に対する免疫系からの反応を誘導できる、すなわち細胞死の免疫原性を増強できる。
【００４７】
ＣＲＴ露出はＵＶＣ光によって誘導されることが知られている（Gardai, S.J. et al. Cell 123, 321-34 (2005)）。本発明者らは、ここで、ＣＲＴ露出がアントラサイクリン（図２に示すように）およびＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤（図５に示すように）によっても引き起こされ、そして特にＫＤＥＬが関与し、そして同様に、外因性ＣＲＴおよび内因性事前形成ＣＲＴに結合できる細胞表面上の他の飽和性ＣＲＴ受容体（Henson, P.M. & Hume, D.A. Trends Immunol 27, 244-50 (2006)）の存在が関与する分子機構を介する細胞内ＣＲＴの細胞表面への移行がＣＲＴ露出に関与することを実証する。
【００４８】
本発明者らは、本明細書において、このＣＲＴタンパク質が、一般にドキソルビシンおよびアントラサイクリンによって強く（６倍）誘導されることを実証する（図２Ｂおよび２Ｃに示すように）。２Ｄゲルのイムノブロット分析（示さず）および精製形質膜表面タンパク質の従来の電気泳動（図２Ｃに示すように）は、アントラサイクリンでの処理後のＣＲＴの表面露出を確認する。このＣＲＴ表面露出は、アントラサイクリン処理生細胞の免疫蛍光染色によっても検出可能である（図２Ｄに示すように）。アントラサイクリンによるＣＲＴ露出の誘導は迅速なプロセスであり、処理の１時間後ほど早くに検出可能であり（図１Ｓ  Ａ、Ｂに示すように）、従ってアポトーシス関連ホスファチジルセリン（ＰＳ）露出に先行する（図１Ｓ  Ｓ、Ｄに示すように）。注目すべきことに、細胞表面におけるＣＲＴの出現（４時間目で測定）と２０個の異なるアポトーシス誘導物質のパネルによって誘起される免疫原性との間に強い正の直線相関（ｐ＜０．００１）が存在した（図２Ｅ）。
【００４９】
免疫原性および免疫応答は、樹状細胞（ＤＣ）のような特定の細胞によって媒介され得る。本発明者らは、アントラサイクリン処理腫瘍細胞が、ドキソルビシンまたはミトキサントロンでの処理の数時間後にＤＣによって貪食される特性を獲得したことを示し（図３Ａ、補足図２Ａに示すように）、これはＣＲＴの迅速な誘導（図３Ｂ、図１Ｓ  Ａ、Ｂに示すように）および免疫原性の獲得（補足図２Ｂに示すように）と相関する。
【００５０】
ミトキサントロン（ＭＴＸ）アントラサイクリンに応答して、種々のヒト腫瘍細胞株がＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７をその細胞の表面上に露出する。ＣＲＴおよびＥＲｐ５７は通常、細胞内にのみ、大部分が小胞体と会合して見出される。しかし、アントラサイクリンとの短時間（５分間以上）の曝露の後に、ＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７を、非固定細胞に適用される免疫蛍光染色方法を使用して腫瘍細胞の表面上に検出することができる（図７Ａおよび７Ｂ）。非常に類似した結果が、γ線照射またはＵＶＣ照射、またはイダルビシン、ダウノルビシンもしくはドキソルビシンから選択される他のアントラサイクリンへの曝露に際して得られる。
【００５１】
従って、特異的抗体による、ミトキサントロン処理癌細胞の表面上に存在するＣＲＴの遮断は、ＤＣによるそのファゴサイトーシスを阻害する（図３Ｃに示すように）。逆に、細胞の表面に結合する組換えＣＲＴタンパク質（ｒＣＲＴ）の添加は、抗体によって誘導される欠損を逆転させる。従って、ｅｃｔｏ−ＣＲＴ（細胞の表面上に露出されたＣＲＴ）はＤＣによる前記細胞のファゴサイトーシスを誘起する。さらに、形質膜表面へのｒＣＲＴの吸収は、ｒＣＲＴでコートされたエトポシド処理細胞またはマイトマイシン処理細胞（図４Ｃに示すように）のような通常は免疫応答を誘導できない細胞の免疫原性を大いに増強し、そしてインビボにおいて活発な抗腫瘍免疫応答を誘起する（図４Ｄに示すように）。しかし、細胞死誘導物質での事前処理なしでの細胞表面へのｒＣＲＴの吸収は、抗癌免疫応答を誘起できなかった。
【００５２】
本発明者らは、アントラサイクリンおよびＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤によって誘導されるＣＲＴ露出が、アクチン細胞骨格の阻害剤であるラトランクリンＡによって損なわれることを観察した（補足図４に示すように）。本発明者らは、ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害がＣＲＴ露出を誘導すること、およびまた、この阻害が、ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４のこのような阻害の非存在下で使用された場合に有効でない従来の療法、特に化学療法によって媒介される抗腫瘍免疫応答および抗腫瘍効果を改善できることを示した。
【００５３】
本発明者らは、ＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７、ならびに腫瘍細胞の表面上でのＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の露出を可能にするかまたは増強する任意の化合物または治療剤が、腫瘍細胞の表面上でのＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の露出、好ましくは増加した露出であって、免疫原性アポトーシスの誘導を担う露出を誘導することによって、それを必要とする哺乳動物における、癌の療法の、特に上記のような従来の療法の効率を改善できることを見出した。
【００５４】
腫瘍細胞の表面においてＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の露出を可能にするかまたは増強する、本発明において使用可能な化合物または治療剤は、以前に記載されるような細胞傷害性薬剤または細胞死誘導物質であり得る。
【００５５】
腫瘍細胞の表面においてＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の露出を可能にするかまたは増強する、本発明において使用可能な好ましい化合物または治療剤は、以下から選択され得る：（ｉ）ＣＲＴ、（ｉｉ）ＫＤＥＬ受容体、（ｉｉｉ）ＥＲｐ５７、（ｉｖ）プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤、（ｖ）プロテインホスファターゼ１調節サブユニット１５Ａ（ＧＡＤＤ３４）の阻害剤、（ｖｉ）ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤、および（ｖｉｉ）アントラサイクリン。
【００５６】
ＰＰ１の触媒サブユニットの好ましい阻害剤は、例えばトートマイシン、カリクリンＡおよび適切なｓｉＲＮＡ（すなわち、ＰＰ１またはＧＡＤＤ３４の翻訳を阻害するｓｉＲＮＡ）から選択され得る。
【００５７】
ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の好ましい阻害剤は、例えばサルブリナルおよび以下でさらに説明されるような特定のペプチドから選択され得る。
【００５８】
好ましいアントラサイクリンは、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシンおよびミトキサントロンから選択され得る。
【００５９】
従って、本発明は、哺乳動物、特にヒトにおける、本出願において以前に定義されるような、癌または感染を予防または処置するための医薬組成物を調製するための、（ｉ）ＣＲＴ、（ｉｉ）ＫＤＥＬ受容体、（ｉｉｉ）ＥＲｐ５７、（ｉｖ）プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤、（ｖ）プロテインホスファターゼ１調節サブユニット１５Ａ（ＧＡＤＤ３４）の阻害剤、（ｖｉ）ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤、および（ｖｉｉ）アントラサイクリンから選択される少なくとも１つの化合物の使用を包含する。癌を予防または処置するために意図される医薬組成物は、好ましくは、以前に説明されるような癌の処置において使用される産物とともに投与されることが意図される。
【００６０】
さらなる実施態様において、本発明は、死滅している細胞、特に腫瘍細胞の表面におけるＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の露出を可能にするかまたは増強するさらなる化合物を以下で提供する。
【００６１】
プロテインホスファターゼ阻害剤
本出願は特に、哺乳動物における癌を予防または処置するための医薬組成物を調製するための、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤、ＧＡＤＤ３４の阻害剤およびＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤から選択されるプロテインホスファターゼ阻害剤の使用であって、医薬組成物が癌の処置において使用される産物との組み合わせでの投与に意図される、使用に関する。
【００６２】
プロテインホスファターゼ阻害剤は好ましくは、以下から選択される：
−  例えばトートマイシン、カリクリンＡおよび適切なｓｉＲＮＡ（すなわち、ＰＰ１の翻訳を阻害するｓｉＲＮＡ）から選択され得る、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤、
−  適切なｓｉＲＮＡ（すなわち、ＧＡＤＤ３４の翻訳を阻害するｓｉＲＮＡ）のようなＧＡＤＤ３４の阻害剤、および
−  サルブリナルまたは以下で記載されるようなペプチド、特に以下で記載されるようなＧＡＤＤ３４のフラグメントの形態のペプチドのような、ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤。
【００６３】
この医薬組成物は、好ましくは、癌の従来の治療処置において使用可能な、上記のような、治療産物との、特に化学療法剤または産物、好ましくは腫瘍細胞の表面上でのＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７の露出を天然には誘導しない化学療法剤との組み合わせで使用されることが意図される。
【００６４】
哺乳動物における癌を予防または処置するための、癌の処置において使用される産物との組み合わせでの、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤、ＧＡＤＤ３４の阻害剤およびＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤から選択されるプロテインホスファターゼ阻害剤もまた本明細書において開示される。
【００６５】
本発明者らは、実際、本明細書において、プロテインホスファターゼが、キナーゼよりも広い触媒スペクトルを有することを実証する。ホスファターゼの特異性は、実際、基質認識を決定する非触媒コファクターとのその非共有結合相互作用によって増加される。本発明者らは、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）およびそのサブユニットＧＡＤＤ３４をより特定して研究した。驚くべきことに、本発明者らは、ＰＰ１の、ＧＡＤＤ３４のまたはそれらの複合体（ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４）の阻害が、細胞表面におけるＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７の増加した配置を誘導することを見出した（ＣＲＴについて図５に示すように）。
【００６６】
特定の実施態様において、本発明は、哺乳動物、特にヒトにおける癌（以前に定義されるような）を予防または処置するための、好ましくは癌の従来の処置において、特に化学療法において使用される治療産物との組み合わせで使用されることが意図される医薬組成物を調製するための、任意の上記のプロテインホスファターゼ阻害剤の使用に関する。
【００６７】
本発明の特定の医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤とともに、ＰＰ１の阻害剤、ＧＡＤＤ３４の阻害剤およびＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤から選択されるプロテインホスファターゼ阻害剤を含む。
この医薬組成物は、好ましくは、以前に説明される理由から、癌の処置において使用される産物との組み合わせでの投与に意図される。
【００６８】
特定の実施態様において、本発明は、哺乳動物、特にヒトにおける以前に記載されるような感染性疾患を予防または処置するための医薬組成物を調製するための、任意の上記のプロテインホスファターゼ阻害剤の使用に関する。医薬組成物は、好ましくは、以前に定義されるような癌の処置において、好ましくは以前に定義されるような化学療法において使用される産物をさらに含む。
【００６９】
本発明の特定のプロテインホスファターゼ阻害剤は、トートマイシン、カリクリンＡ、サルブリナル、適切なｓｉＲＮＡ（以前に定義されるような）および以下で記載されるＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体のペプチド阻害剤から選択され得る。
【００７０】
ペプチドＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤
本発明の別のプロテインホスファターゼ阻害剤は、ＧＡＤＤ３４のフラグメントに存するかまたはそれを含むペプチドであって、細胞におけるＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の形成または活性を阻害するペプチド、またはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の形成または活性を阻害するその能力に影響を及ぼさない置換されたアミノ酸を含むその相同変異体である。
【００７１】
本発明の意味で、ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の形成を阻害するペプチドは、ＧＡＤＤ３４と競合して、ＰＰ１との複合体を形成することができ、それによって前記複合体を非機能性にし、すなわち細胞の表面上に発現されることができなくし、次いで免疫系からの反応を誘導できるペプチドである。
【００７２】
本発明の意味で、ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の活性を阻害するペプチドは、細胞の表面上での前記複合体の非発現を、そして／または免疫系の反応の非誘導を、または前記ペプチドの非存在下でのその反応と比較して減少した免疫系の反応を、担うペプチドである。
【００７３】
ＧＡＤＤ３４の、以前に記載されるような、フラグメントは、好ましくは、配列番号１（ヒトＧＡＤＤ３４）、すなわち、ｍａｐｇｑａｐｈｑａ  ｔｐｗｒｄａｈｐｆｆ  ｌｌｓｐｖｍｇｌｌｓ  ｒａｗｓｒｌｒｇｌｇ  ｐｌｅｐｗｌｖｅａｖ  ｋｇａａｌｖｅａｇｌ  ｅｇｅａｒｔｐｌａｉ  ｐｈｔｐｗｇｒｒｐｇ  ｅｅａｅｄｓｇｇｐｇ  ｅｄｒｅｔｌｇｌｋｔ  ｓｓｓｌｐｅａｗｇｌ  ｌｄｄｄｄｇｍｙｇｅ  ｒｅａｔｓｖｐｒｇｑ  ｇｓｑｆａｄｇｑｒａ  ｐｌｓｐｓｌｌｉｒｔ  ｌｑｇｓｄｋｎｐｇｅ  ｅｋａｅｅｅｇｖａｅ  ｅｅｇｖｎｋｆｓｙｐ  ｐｓｈｒｅｃｃｐａｖ  ｅｅｅｄｄｅｅａｖｋ  ｋｅａｈｒｔｓｔｓａ  ｌｓｐｇｓｋｐｓｔｗ  ｖｓｃｐｇｅｅｅｎｑ  ａｔｅｄｋｒｔｅｒｓ  ｋｇａｒｋｔｓｖｓｐ  ｒｓｓｇｓｄｐｒｓｗ  ｅｙｒｓｇｅａｓｅｅ  ｋｅｅｋａｈｅｅｔｇ  ｋｇｅａａｐｇｐｑｓ  ｓａｐａｑｒｐｑｌｋ  ｓｗｗｃｑｐｓｄｅｅ  ｅｓｅｖｋｐｌｇａａ  ｅｋｄｇｅａｅｃｐｐ  ｃｉｐｐｐｓａｆｌｋ  ａｗｖｙｗｐｇｅｄｔ  ｅｅｅｅｄｅｅｅｄｅ  ｄｓｄｓｇｓｄｅｅｅ  ｇｅａｅａｓｓｓｔｐ  ａｔｇｖｆｌｋｓｗｖ  ｙｑｐｇｅｄｔｅｅｅ  ｅｄｅｄｓｄｔｇｓａ  ｅｄｅｒｅａｅｔｓａ  ｓｔｐｐａｓａｆｌｋ  ａｗｖｙｒｐｇｅｄｔ  ｅｅｅｅｄｅｄｖｄｓ  ｅｄｋｅｄｄｓｅａａ  ｌｇｅａｅｓｄｐｈｐ  ｓｈｐｄｑｓａｈｆｒ  ｇｗｇｙｒｐｇｋｅｔ  ｅｅｅｅａａｅｄｗｇ  ｅａｅｐｃｐｆｒｖａ  ｉｙｖｐｇｅｋｐｐｐ  ｐｗａｐｐｒｌｐｌｒ  ｌｑｒｒｌｋｒｐｅｔ  ｐｔｈｄｐｄｐｅｔｐ  ｌｋａｒｋｖｒｆｓｅ  ｋｖｔｖｈｆｌａｖｗ  ａｇｐａｑａａｒｑｇ  ｐｗｅｑｌａｒｄｒｓ  ｒｆａｒｒｉａｑａｑ  ｅｅｌｓｐｃｌｔｐａ  ａｒａｒａｗａｒｌｒ  ｎｐｐｌａｐｉｐａｌ  ｔｑｔｌｐｓｓｓｖｐ  ｓｓｐｖｑｔｔｐｌｓ  ｑａｖａｔｐｓｒｓｓ  ａａａａａａｌｄｌｓ  ｇｒｒｇのフラグメントである。
【００７４】
ＧＡＤＤ３４のフラグメントは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸位置５００〜６００、好ましくはアミノ酸位置５３０〜５８０、より好ましくは位置５４０〜５７０、特に位置５５０〜５６５、好ましくは位置５５１〜５６２に含まれる。
【００７５】
ＧＡＤＤ３４のフラグメントの配列は、好ましくは、配列番号１の５〜３５アミノ酸、好ましくは１０〜３５アミノ酸、より好ましくは５〜１５アミノ酸を含む。
【００７６】
好ましい実施態様において、ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤は、配列番号１の５〜３５アミノ酸に含まれる配列に存するＧＡＤＤ３４のフラグメントである。
【００７７】
本発明による特に好ましいペプチドは、以下の配列：ＬＫＡＲＫＶＲＦＳＥＫＶ（配列番号２）を含み、これはＧＡＤＤ３４のフラグメントである。
【００７８】
本発明による上記のペプチドは、細胞の表面上の形質膜に結合できる形質膜移行モチーフをさらに含み得る。このモチーフは、必要であれば、標的細胞、例えば腫瘍細胞または感染細胞へ本発明によるペプチドを向けるために使用され得る。
【００７９】
標的化される腫瘍細胞は、好ましくは、癌腫、肉腫、リンパ腫、黒色腫、小児腫瘍または白血病腫瘍に由来する。
【００８０】
腫瘍細胞を標的化するために本発明において使用可能な移行モチーフは、以下の配列：ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ（配列番号３）を含み、これはＮ末端ＤＰＴ−ｓｈ１配列である。
【００８１】
本発明による特定のペプチドは、以下の配列：ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ＬＫＡＲＫＶＲＦＳＥＫＶ（配列番号４）を含み、これはＧＡＤＤ３４のフラグメントおよび移行モチーフを含む。
【００８２】
このペプチドは、以前に説明されるように、ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害の迅速な生化学的帰結の１つである、細胞の表面上でのＣＲＴ（ｅｃｔｏ−ＣＲＴ）、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７（ｅｃｔｏ−ＥＲｐ５７）の露出を刺激するその能力について試験された。
図７Ａおよび７Ｂによって反映されるように、配列番号４を含む上記のペプチドは、２つの異なる細胞株、すなわちヒトＨＣＴ１１６結腸癌細胞およびマウスＣＴ２６結腸癌細胞において、カルレティキュリンの露出（細胞の免疫蛍光染色およびそれに続く細胞蛍光測定分析によって測定される）を誘導することができる。同様の結果が、ＨｅＬａ細胞およびマウス胚線維芽細胞を用いて得られた（示さず）。内部コントロールとして、本発明者らは、ＧＡＤＤ３４由来配列の２つのアミノ酸がアラニンによって置換された変異体ペプチド（完全配列：ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ｌｋａｒａｖａｆｓｅｋｖ）を生成した。この変異体コントロールペプチドはカルレティキュリン露出を誘導せず、反応の特異性が確認された。
【００８３】
本発明はさらに、細胞におけるＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の形成または活性を阻害できる、上記で定義するようなペプチドをスクリーニングまたは選択するための方法、有利にはインビトロ方法を提供する。この方法は、以下の工程：
ａ）配列番号１内のフラグメント配列またはその相同フラグメントを含む試験ペプチドを提供する工程、
ｂ）工程ａ）の試験ペプチドを細胞と接触させる工程、および
ｃ）前記細胞の表面上のカルレティキュリン（ＣＲＴ）、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の露出を検出するおよび／またはそのレベルを測定する工程であって、試験ペプチドと接触させられていないかもしくはそれに曝露されていないかまたは前記試験ペプチドの変異体と接触させられたかもしくはそれに曝露されたコントロール細胞と比較して増強された露出が、細胞におけるＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の形成または活性の阻害の指標となる、工程
を含む。
【００８４】
工程ａ）のフラグメント配列は配列番号１内で選択される。前記配列は、好ましくは、上記のように、配列番号１のアミノ酸位置５００〜６００、好ましくは位置５３０〜５８０、より好ましくは位置５４０〜５７０、特に位置５５０〜５６５、好ましくは位置５５１〜５６２に含まれる。
【００８５】
上記のように、配列番号１内で選択されるフラグメント配列は、好ましくは、配列番号１の５〜３５アミノ酸、好ましくは１０〜３５アミノ酸、より好ましくは５〜１５アミノ酸を含む。
【００８６】
本発明はさらに、上記のような方法を用いて選択されたペプチドの活性を改善するための方法であって、少なくとも１つのアミノ酸を、ＰＰ１／ＧＧＡＤ３４複合体の形成または活性を阻害する配列の能力を増強する異なるアミノ酸によって置換する工程を含む、方法を提供する。
【００８７】
ＰＰ１／ＧＧＡＤ３４複合体の形成または活性を阻害する配列の能力を増強する少なくとも１つの異なるアミノ酸は、（ｉ）ぺプチダーゼまたはプロテアーゼのような酵素に対する増加した耐性をペプチドに提供する、（ｉｉ）ペプチドの生物学的利用能を改善するそして／または（ｉｉｉ）ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の形成または活性に対するその阻害機能を増強する任意のアミノ酸であり得る。
【００８８】
細胞表面上のＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７を検出するために使用可能ないくつかの方法が当業者に周知である。
【００８９】
細胞表面上のＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７を検出するために、イムノブロッティング（特にウエスタンブロット）またはプロテオミクスならびに当業者に公知の任意の他の方法を、腫瘍検体（例えば、バイオプシー、腫瘍層から採集された細胞吸引物、サイトスピンまたは白血病の場合の循環腫瘍細胞のような）に適用し得る。
【００９０】
プロテオミクスに関して、ＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の露出は、抗ＣＲＴ抗体、抗ＫＤＥＬ受容体抗体および抗ＥＲｐ５７抗体から選択される抗体を用いて調製される、抗体に基づくバイオセンサーを使用して検出され得、前記抗体はＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の内因性形態、それらの組換え形態ならびにそれらの相同変異体または模倣物を検出することができる。抗体は有利には検出可能なコンジュゲートと結合される。
ＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７を検出するために、本発明は、細胞表面上の前記タンパク質の検出を可能にするキットを提供する。
【００９１】
このキットは少なくとも抗ＣＲＴ抗体、抗ＫＤＥＬ受容体抗体または抗ＥＲｐ５７抗体を含む。
【００９２】
免疫蛍光染色またはＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取器）分析（フローサイトメトリー分析）は、腫瘍細胞の、特に癌の治療処置を以前に受けた腫瘍細胞の、内部から表面へのＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の移行を検出するための適切な方法の例である。
【００９３】
上記のような方法を用いて入手可能な選択されたペプチドは、以前に定義されるような形質膜移行モチーフを組み入れるようにさらに改変され得る。
従って、本発明はまた、（ｉ）配列番号１の、またはその相同変異体の、フラグメントを含む選択されたペプチドの、そして（ｉｉ）細胞の表面に結合する形質膜移行モチーフの、融合体を含む、そのような改変されたペプチドを調製するための方法を提供する。
【００９４】
本発明による上記のペプチドならびに以前に記載されるようなスクリーニングの方法によって入手可能なペプチド、またはその相同変異体の各々は、本明細書において新たな医薬として提供される。
【００９５】
本発明はさらに、癌、特に乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓癌、肺癌、骨肉種、ＧＩＳＴ、黒色腫、白血病および神経芽細胞腫から選択される癌を予防または処置するための医薬組成物を調製するための、以前に記載されるようなプロテインホスファターゼ阻害剤、特にプロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤、例えばトートマイシンおよびカリクリンＡ、ＧＡＤＤ３４の阻害剤、および／またはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤、例えばサルブリナルおよび上記で定義されるようなペプチドの使用を含む。
【００９６】
哺乳動物における、好ましくは乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓癌、肺癌、骨肉種、ＧＩＳＴ、黒色腫、白血病および神経芽細胞腫から選択される癌を予防または処置するための、以前に定義されるような、癌の処置において使用される産物との組み合わせでの、上記で定義されるようなプロテインホスファターゼ阻害剤もまた本明細書において開示される。
【００９７】
本明細書に開示される医薬組成物は、好ましくは、以前に提供される理由から、以前に定義されるような癌の従来の処置において使用される産物との、特に化学療法剤のような癌の従来の処置との組み合わせでの投与に意図される。
前記プロテインホスファターゼ阻害剤および、好ましくは以前に定義されるような癌の処置において使用される産物を、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤とともに含む医薬組成物もまた本明細書において提供される。
【００９８】
全ての本発明において使用可能な適切な賦形剤、希釈剤または担体は、例えば生理食塩水、等張性、無菌または緩衝化溶液などから選択され得る。それらは、安定化剤、甘味剤および／または界面活性剤などをさらに含み得る。それらは、アンプル、フラスコ、錠剤、またはカプセルの形態に、それ自体公知のガレヌスの技術を使用することによって処方され得る。
【００９９】
癌の従来の処置は、以前に説明されるように、好ましくは（ｉ）化学療法、（ｉｉ）放射線療法、（ｉｉｉ）ホルモン療法、（ｉｖ）免疫療法、（ｖ）特異的キナーゼ阻害剤に基づく療法、（ｖｉ）抗血管新生剤に基づく療法、および（ｖｉｉ）モノクローナル抗体に基づく療法から選択される。特に好ましい癌の処置は化学療法である。化学療法は、好ましくは、アントラサイクリン、免疫応答モジュレーター、ホルモンおよびチロシンキナーゼ阻害剤から選択される産物を使用する。アントラサイクリンは好ましくはドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシンおよびミトキサントロンから選択される。
【０１００】
特定の実施態様において、本発明は、哺乳動物、特にヒトにおける、癌（以前に定義されるような）または感染（以前に定義されるような）を予防または処置するための医薬組成物を調製するための、任意の上記のプロテインホスファターゼ阻害剤の使用に関する。
【０１０１】
特定の実施態様において、プロテインホスファターゼ阻害剤、または前記プロテインホスファターゼ阻害剤もしくはいくつかのプロテインホスファターゼ阻害剤の混合物を含む医薬組成物は、上記で定義されるような癌の処置、好ましくは以前に定義されるような癌の従来の処置との組み合わせでの投与に意図される。
【０１０２】
キナーゼ活性化物質
他方、ｅＩＦ２αは、典型的にはストレスキナーゼの活性化に起因する小胞体ストレス下で過剰リン酸化されるタンパク質である（Zhang, K. & Kaufman, R.J. J Biol Chem 279, 25935-8 (2004)）。本発明のさらなる局面において、本発明者らは従って、ｅＩＦ２αをリン酸化することが知られているキナーゼが、細胞表面における増加したＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の移行および露出に関与し得ることを観察した。本発明者らは、そのようなキナーゼが、真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ、例えばヘム調節阻害剤（ＨＲＩ、ヘミン感受性開始因子２αキナーゼまたは真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ１とも称する）、ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ、真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ２とも称する）、ＰＫＲ様ＥＲ局在化ｅＩＦ２αキナーゼ（ＰＥＲＫ、真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ３とも称する）およびＧＣＮ２（真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ４とも称する）から選択され得ることを見出した。
【０１０３】
本発明はまた、医薬としての、（ｉ）真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ（ＨＲＩ）、（ｉｉ）ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、例えばＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ−３）リガンド、（ｉｉｉ）ＰＫＲ様ＥＲ局在化ｅＩＦ２αキナーゼおよび（ｉｖ）ＧＣＮ２を活性化する化合物から選択されるキナーゼ活性化物質に関する。
【０１０４】
特定の実施態様において、本発明は、哺乳動物、特にヒトにおける、本出願において以前に定義されるような癌または感染を予防または処置するための医薬組成物を調製するための、上記のようなキナーゼ活性化物質の使用を包含する。
【０１０５】
哺乳動物、特にヒトにおける癌または感染を予防または処置するための上記のようなキナーゼ活性化物質もまた本明細書において開示される。
【０１０６】
癌を予防または処置するための医薬組成物は、好ましくは、癌の処置、好ましくは以前に定義されるような癌の従来の処置において使用される産物との組み合わせでの投与に意図される組成物である。
【０１０７】
生細胞の表面に吸着されたＣＲＴはインビトロにおいて樹状細胞（ＤＣ）によるファゴサイトーシスを増強するが（図３Ｅに示すように）、局所性（図４Ｃに示すように）または全身性（図４Ｄ、図６に示すように）免疫応答をインビボで誘起するために、ＣＲＴは、実際、細胞死誘導物質と組み合わされなければならない。本発明者らは、細胞死誘導物質（エトポシドまたはマイトマイシンＣ）と、組換えカルレティキュリン（ｒＣＲＴ）、組換えＫＤＥＬ受容体または組換えＥＲｐ５７（ｒＥＲｐ５７）との組み合わせが、免疫適格性動物において（免疫不全動物においてではなく）腫瘍退縮を引き起こすことができることを実証した。同様に、エトポシドまたはマイトマイシンＣは、ＣＲＴ、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の露出を誘導する薬剤（サルブリナルまたはトートマイシン）と組み合わされ得、免疫適格性宿主において（無胸腺宿主においてではなく）安定な疾患または完全な腫瘍退縮を導く（図６Ａ、Ｂに示すように）。生ＣＴ２６細胞はＣＴ２６腫瘍から治癒された動物において増殖できず、このことは永久抗腫瘍免疫応答の確立を示す。本明細書において実証されるように、この知見を用いて、上記の化合物の１つ、例えばｒＣＲＴ、ｒＫＤＥＬ受容体、ｒＥＲｐ５７および／またはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤と組み合わされた場合に、非免疫原性化学療法剤（以前に例証されるような癌の従来の処置において使用される治療剤から選択される）が免疫原性になる、効率的な抗腫瘍免疫応答を刺激することができる。これらの結果は、以前に記載されるもののような確立された癌を治癒するための、またはウイルス、細菌、真菌または寄生体感染のような感染を治癒するための「免疫原性化学療法」のストラテジーを描く。
【０１０８】
抗ＣＲＴおよび抗ＥＲｐ５７抗体
自己免疫障害、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー、移植片対宿主病、移植片拒絶、または強制アポトーシスにおける強すぎる免疫原性、すなわち、死滅している細胞の表面におけるＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７の露出に有利に働く上記の化合物の１つによって誘導される過剰なそして所望されない免疫原性において、以前に記載される目的とは反対に、細胞死に対する免疫系の作用を制限することは興味深い。
本発明者らは、これが、阻止または中和抗カルレティキュリンおよび／または抗ＥＲｐ５７抗体を使用した細胞表面へのＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７の移行の減少によって得られ得ることを観察した。ＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７の移行を妨害する阻害または競合ペプチドもまた、細胞表面におけるＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７の量を減少させ、次いでそれらの状況で免疫応答を低下させ得る。
【０１０９】
従って、本発明はまた、医薬としての、ＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７の移行の増加を妨害する阻止または中和抗ＣＲＴおよび／または抗ＥＲｐ５７抗体ならびに阻害／競合ペプチド、および特に、哺乳動物、好ましくはヒトにおける、特に上記のような自己免疫障害、アレルギー、移植片対宿主病または移植片拒絶を予防または処置するための医薬組成物を調製するためのそれらそれぞれの使用を包含する。
【０１１０】
本発明はさらに、阻止または中和抗ＣＲＴ、抗ＫＤＥＬ受容体または抗ＥＲｐ５７抗体、または細胞表面上のＣＲＴおよび／またはＥＲｐ５７の移行の増加を妨害する阻害／競合ペプチドを、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤とともに含む特定の医薬組成物を記載する。
この医薬組成物は、好ましくは、以前に説明される理由から、癌の処置との組み合わせでの投与に意図される。
【０１１１】
疾患を予防または処置するための方法
本発明はまた、本明細書において定義されるような疾患、特に癌または感染を予防または処置するための方法であって、それを必要とする哺乳動物、特にヒトへの、（ｉ）ＣＲＴ、（ｉｉ）ＫＤＥＬ受容体、（ｉｉｉ）ＥＲｐ５７、（ｉｖ）プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤、（ｖ）プロテインホスファターゼ１調節サブユニット１５Ａ（ＧＡＤＤ３４）の阻害剤、（ｖｉ）ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤、（ｖｉｉ）アントラサイクリン、および（ｖｉｉｉ）上記のキナーゼから選択されるキナーゼ活性化物質から選択される少なくとも１つの化合物の投与を含む、方法に関する。
【０１１２】
この方法は、異なる癌の処置、例えば以前に記載されるものとの組み合わせで適用され得る。
【０１１３】
疾患を予防または処置するための上記の方法は、選択される化合物をそれを必要とする被験体の腫瘍中に直接的に注射する工程を含み得る。
【０１１４】
発明の開示
従って、本発明は、哺乳動物における疾患の処置のための薬物としてのその使用のためのカルレティキュリンに関し、前記薬物は細胞表面におけるカルレティキュリンの増加した配置を誘導する。
【０１１５】
本発明は、抗癌免疫応答の決定特徴としてのＣＲＴ露出の同定に基づいており、そして免疫原性化学療法のストラテジーを描く。
【０１１６】
細胞表面におけるＣＲＴの配置は、細胞表面への細胞内ＣＲＴの移行の結果、または細胞表面への細胞外ＣＲＴの移行の結果であり得る。それで、本発明は、カルレティキュリン（内因性形態または組換え形態または模倣形態）の移行が細胞質から細胞の膜へであるか、または細胞外媒質から細胞の膜へである、薬物としての適用に関する。模倣形態としては、カルレティキュリンのネイティブな形態と同じ特性（すなわち、細胞表面における配置）を示す、カルレティキュリンの切断形態またはカルレティキュリンの部分またはハイブリッドと理解すべきである。
【０１１７】
さらに、本発明者らは、細胞表面において増加した量で存在するカルレティキュリンが、死滅している細胞を、樹状細胞のような食細胞にとって食可能にすることを示した。これらの細胞は、免疫系と相互作用し、次いで免疫応答を誘導し、これはカルレティキュリンを免疫原性アポトーシスの誘導物質とする。本発明はまた、哺乳動物における疾患の処置のための薬物としてのその使用のためのカルレティキュリンに関し、前記薬物は免疫原性アポトーシスを誘導する。
【０１１８】
好ましくは、薬物としてのこの適用によって、処置される疾患は、乳癌、前立腺癌、黒色腫、結腸癌などのような癌、またはウイルスまたは細菌または真菌または寄生体感染のような感染である。
【０１１９】
本発明は、哺乳動物における疾患の処置のための薬物としてのその使用のためのカルレティキュリンを示し、前記薬物は、細胞表面におけるＣＲＴの配置の増加の誘導および／または免疫原性アポトーシスの誘導によって、そのような化学療法を必要とする哺乳動物における化学療法の効率を改善する。
【０１２０】
ＣＲＴ露出は、ＵＶＣ光によって誘導されることが知られている（Gardai, S.J. et al. Cell 123, 321-34 (2005)）。
【０１２１】
しかし、ＣＲＴ露出はアントラサイクリン（図２に示すように）およびＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤（図５に示すように）によっても引き起こされるようであり、これには、完全には理解されておらず、そして同様に外因性ＣＲＴおよび内因性事前形成ＣＲＴに結合できる細胞表面上の飽和性ＣＲＴ受容体（Henson, P.M. & Hume, D.A. Trends Immunol 27, 244-50 (2006)）の存在が関与する分子機構を介する細胞内ＣＲＴの細胞表面への移行が関与する。
【０１２２】
実際、本発明者らは、このＣＲＴタンパク質が、一般にドキソルビシンおよびアントラサイクリンによって強く（６倍）誘導されることを示した（図２Ｂおよび２Ｃに示すように）。２Ｄゲルのイムノブロット分析（示さず）および精製形質膜表面タンパク質の従来の電気泳動（図２Ｃに示すように）は、アントラサイクリンでの処理後のＣＲＴの表面露出を確認した。このＣＲＴ表面露出は、アントラサイクリン処理生細胞の免疫蛍光染色によっても検出可能であった（図２Ｄに示すように）。アントラサイクリンによるＣＲＴ露出の誘導は迅速なプロセスであり、処理の１時間後ほど早くに検出可能であり（図１Ｓ  Ａ、Ｂに示すように）、従ってアポトーシス関連ホスファチジルセリン（ＰＳ）露出に先行した（図１Ｓ  Ｃ、Ｄに示すように）。注目すべきことに、細胞表面におけるＣＲＴの出現（４時間目で測定）と２０個の異なるアポトーシス誘導物質のパネルによって誘起される免疫原性との間に強い正の直線相関（ｐ＜０．００１）が存在した（図２Ｅ）。
【０１２３】
免疫原性および免疫応答は、特定の細胞：樹状細胞（ＤＣ）によって媒介され得る。本発明者らは、アントラサイクリン処理腫瘍細胞が、ドキソルビシンまたはミトキサントロンでの処理の数時間後にＤＣによって貪食される特性を獲得したことを示し（図３Ａ、補足図２Ａに示すように）、これはＣＲＴの迅速な誘導（図３Ｂ、図１Ｓ  Ａ、Ｂに示すように）および免疫原性の獲得（補足図２Ｂに示すように）と相関する。
【０１２４】
従って、特異的抗体による、ミトキサントロン処理癌細胞の表面上に存在するＣＲＴの遮断は、ＤＣによるそのファゴサイトーシスを阻害した（図３Ｃに示すように）。逆に、細胞の表面に結合する組換えＣＲＴタンパク質（ｒＣＲＴ）の添加は、抗体によるＣＲＴの遮断によって誘導される欠損を逆転させ得た。従って、表面ＣＲＴはＤＣによるファゴサイトーシスを誘起する。さらに、形質膜表面へのｒＣＲＴの吸収は、ｒＣＲＴでコートされたエトポシド処理細胞またはマイトマイシン処理細胞（図４Ｃに示すように）のような通常は免疫応答を誘導できない細胞の免疫原性を大いに増強し、そしてインビボにおいて活発な抗腫瘍免疫応答を誘起した（図４Ｄに示すように）。しかし、細胞死誘導物質での事前処理なしでの細胞表面へのｒＣＲＴの吸収は、抗癌免疫応答を誘起できなかった。本発明は、哺乳動物における疾患の処置のための薬物としてのその使用のための組換えカルレティキュリンを取り扱い、前記薬物は、細胞死誘導物質（例えばエトポシドまたはマイトマイシンＣ）の投与後に、免疫原性アポトーシスを誘導する。
【０１２５】
従って、本発明はまた、哺乳動物における疾患の処置のための薬物としてのその使用のための、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤、ＧＡＤＤ３４阻害剤またはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤としてのプロテインホスファターゼ阻害剤に関し、前記阻害剤は、細胞表面における内因性カルレティキュリンの配置の増加を誘導する。
【０１２６】
さらに、本発明は、哺乳動物における疾患の処置のための薬物としてのその使用のための、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤、ＧＡＤＤ３４阻害剤またはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤としてのプロテインホスファターゼ阻害剤に関し、前記阻害剤は、細胞表面におけるカルレティキュリン移行の増加によって免疫原性アポトーシスを誘導する（図５に示すように）。
【０１２７】
本発明者らは、アントラサイクリンおよびＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤によって誘導されるＣＲＴ露出が、アクチン細胞骨格およびエキソサイトーシスの阻害剤であるラトランクリンＡによって損なわれることを観察した（補足図４に示すように）。本発明者らはまた、ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害がＣＲＴ露出を誘導することだけでなく、このプロセスが次いで抗腫瘍免疫応答を改善できることも示した。
【０１２８】
本発明はまた、哺乳動物における疾患の処置のための薬物としてのその使用のための、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤、ＧＡＤＤ３４阻害剤またはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤としてのプロテインホスファターゼ阻害剤に関し、前記阻害剤は、細胞表面におけるカルレティキュリンの配置の増加、および／または免疫原性アポトーシスアポトーシスを誘導することによって、そのような化学療法を必要とする哺乳動物における化学療法の効率を改善する。
【０１２９】
さらに、一定量の上記のＰＰ１またはＧＡＤＤ３４またはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体のそのような阻害剤を、細胞質から細胞膜へのカルレティキュリンタンパク質の移行の増加を促進する医薬組成物（これは従って哺乳動物におけるアポトーシスの間の免疫応答を誘導する）において使用することができる。
【０１３０】
細胞質から細胞表面へのカルレティキュリンの移行の増加を促進する前記阻害剤含有医薬組成物はまた、哺乳動物における化学療法応答を改善し得る。
【０１３１】
ＰＰ１またはＧＡＤＤ３４またはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４の阻害剤は、有利には、トートマイシン、カリクリンＡまたはサルブリナルの中から選択される。
【０１３２】
他方、ｅＩＦ２αは、典型的にはストレスキナーゼの活性化に起因する小胞体ストレスにおいて過剰リン酸化される（Zhang, K. & Kaufman, R.J. J Biol Chem 279, 25935-8 (2004)）。本発明者らは、ｅＩＦ２αをリン酸化することが知られているキナーゼが、細胞表面における増加したカルレティキュリンの移行および露出に関与し得ることを観察した。これらのキナーゼは、真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ、例えばヘム調節阻害剤（ＨＲＩ、ヘミン感受性開始因子２αキナーゼまたは真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ１とも称する）、ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ、真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ２とも称する）、ＰＫＲ様ＥＲ局在化ｅＩＦ２αキナーゼ（ＰＥＲＫ、真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ３とも称する）およびＧＣＮ２（真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ４とも称する）である。
【０１３３】
本発明はまた、哺乳動物における癌またはウイルス感染のような疾患の処置のための薬物としてのその使用のための、真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ、例えばヘム調節阻害剤（ＨＲＩ、ヘミン感受性開始因子２αキナーゼまたは真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ１とも称する）、ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ、真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ２とも称する）、ＰＫＲ様ＥＲ局在化ｅＩＦ２αキナーゼ（ＰＥＲＫ、真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ３とも称する）およびＧＣＮ２（真核生物翻訳開始因子２αキナーゼ４とも称する）の１つを活性化する化合物のような、キナーゼ活性化物質に関し、前記活性化物質は、細胞表面における内因性カルレティキュリンの配置の増加を誘導する。
【０１３４】
この活性化物質を含む薬物の前記使用によって処置される疾患は、癌（乳癌、前立腺癌、黒色腫、結腸癌など）または感染（ウイルス、細菌、真菌または寄生体感染）である。
【０１３５】
本発明はまた、少なくともカルレティキュリンまたはＰＰ１、ＧＡＤＤ３４もしくはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４の阻害剤またはアントラサイクリンまたは前記４つのキナーゼの活性化物質または抗カルレティキュリン抗体または阻害／競合ペプチドを含む、薬物としての適用を提供し、前記薬物は、Ｖ１６／エトポシド、放射線療法または免疫療法に感受性の腫瘍、すなわち黒色腫、腎臓癌、結腸癌、乳腫瘍または肺腫瘍、骨肉種のような癌の処置を改善する。
【０１３６】
自己免疫障害、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー、移植片対宿主病、移植片拒絶、または強制アポトーシスにおける強すぎる免疫原性の間に、細胞死の免疫原性を制限することは興味深い。本発明者らは、これが、阻止または中和抗カルレティキュリン抗体の使用による細胞表面へのカルレティキュリンの移行の減少によって得られ得ることを観察した。カルレティキュリンの移行を妨害する阻害または競合ペプチドもまた、細胞表面におけるカルレティキュリンの量を減少させ、次いでそれらの疾患における免疫原性および免疫応答を低下させ得る。
【０１３７】
従って、本発明はまた、自己免疫障害（ＳＬＥ、関節リウマチ、皮膚炎．．．）、アレルギー、移植片対宿主病、移植片拒絶の処置のための薬物としてのその使用のための、カルレティキュリンの移行の増加を、それゆえ細胞死の免疫原性を妨害する、阻止または中和抗カルレティキュリン抗体または阻害／競合ペプチドに関する。
【０１３８】
本発明の１つの実施態様において、細胞死薬剤としてのアントラサイクリンはまた、哺乳動物における疾患の処置のための薬物の調製において使用され得、前記薬物は細胞表面におけるカルレティキュリンの配置の増加を誘導する。
【０１３９】
アントラサイクリンはまた、哺乳動物における癌またはウイルス感染のような疾患の処置のための薬物の調製において使用され得、前記薬物は細胞表面におけるカルレティキュリン移行の増加によって免疫原性アポトーシスの誘導を促進する。
【０１４０】
本発明はまた、哺乳動物における癌またはウイルス感染のような疾患の処置のための薬物の調製におけるアントラサイクリンの使用を取り扱い、前記薬物は、細胞表面におけるカルレティキュリンの配置の増加および／または免疫原性アポトーシスを誘導することによって、そのような化学療法を必要とする哺乳動物における化学療法の効率を改善する。
【０１４１】
さらに、本発明はまた、細胞質から細胞膜へのカルレティキュリンタンパク質の移行の増加を促進する一定量のアントラサイクリンを含む医薬組成物（これは従って哺乳動物におけるアポトーシスの間の免疫応答を誘導する）に関する。
【０１４２】
細胞質から細胞表面へのカルレティキュリンの移行の増加を促進する前記アントラサイクリン含有医薬組成物はまた、哺乳動物における化学療法応答を改善することができる。
【０１４３】
本発明はまた、細胞表面におけるカルレティキュリンの配置の増加および／または免疫原性アポトーシスを誘導することによる、それを必要とする哺乳動物への一定量のアントラサイクリンを含む医薬組成物の投与を含む、哺乳動物における化学療法処置応答を促進する方法を提供する。
【０１４４】
アントラサイクリンはドキソルビシン、イダルビシンまたはミトキサントロンであり得る。
【０１４５】
生細胞の表面に吸着されたＣＲＴはインビトロにおいてＤＣによるそのファゴサイトーシスを増強したが（図３Ｅに示すように）、局所性（図４Ｃに示すように）または全身性（図４Ｄ、図６に示すように）免疫応答をインビボで誘起するために、ＣＲＴは細胞死誘導物質と組み合わされなければならなかった。治療薬において、本発明者らは、細胞死誘導物質（エトポシドまたはマイトマイシンＣ）＋カルレティキュリン（ｒＣＲＴ）の組み合わせが、免疫適格性動物において（免疫不全動物においてではなく）腫瘍退縮を引き起こすことができることを示した。同様に、エトポシドまたはマイトマイシンＣは、ＣＲＴ露出を誘導する薬物（サルブリナルまたはトートマイシン）と組み合わされ得、免疫適格性宿主において（無胸腺宿主においてではなく）安定な疾患または完全な腫瘍退縮を導く（図６Ａ、Ｂに示すように）。生ＣＴ２６細胞はＣＴ２６腫瘍から治癒された動物において増殖できず、このことは永久抗腫瘍免疫応答の確立を示す。本明細書において示されるように、この知見を用いて、ｒＣＲＴまたはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤と組み合わされた場合に、非免疫原性化学療法剤が免疫原性になる、効率的な抗腫瘍免疫応答を刺激することができる。これらの結果は、確立された癌（例えば、乳癌、前立腺癌、黒色腫、結腸癌など．．．）の治癒、または感染（ウイルス、細菌、真菌または寄生体感染）の治癒のための免疫原性化学療法のストラテジーを描く。
【０１４６】
本発明はまた、疾患の処置におけるその使用のための組み合わせ産物としての、化学療法剤および組換えカルレティキュリンを含む産物に関する。
【０１４７】
本発明はまた、疾患の処置におけるその使用のための組み合わせ産物としての、化学療法剤および阻害剤（例えば、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤、ＧＡＤＤ３４阻害剤またはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤）を含む産物を取り扱う。この組み合わせ産物は、癌（乳癌、前立腺癌、黒色腫、結腸癌など．．．）、または感染（ウイルス、細菌、真菌または寄生体感染）のような疾患の処置のために使用され得る。
【０１４８】
化学療法剤は、エトポシド、マイトマイシンＣ、アントラサイクリンおよびその他の周知の治療薬であり得る。本発明はまた、上記の組み合わせの産物（化学療法剤およびカルレティキュリンまたは細胞死薬剤および前記阻害剤）を提供し、ここで前記産物は、Ｖ１６／エトポシド、放射線療法または免疫療法に感受性の腫瘍、すなわち、黒色腫、腎臓癌、結腸癌、乳腫瘍または肺腫瘍、骨肉種のような癌の処置を改善する。
【０１４９】
本発明はまた、哺乳動物におけるアポトーシス現象における免疫応答を増強するために細胞質から細胞表面へのカルレティキュリンの移行の増加を誘導する方法に関し、前記方法は、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤、ＧＡＤＤ３４阻害剤またはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤としての阻害剤の薬学的有効量を投与することを含む。
【０１５０】
それとは異なって、本発明はまた、哺乳動物におけるアポトーシス現象における免疫応答を増強するために細胞質から細胞表面へのカルレティキュリンの移行の増加を誘導する方法を含み、前記方法は、アントラサイクリンの薬学的有効量を投与することを含む。
【０１５１】
増加したカルレティキュリンの移行は好ましくは細胞質から腫瘍細胞の膜へのものである。
【０１５２】
この方法は、好ましくは、Ｖ１６／エトポシド、放射線療法、または免疫療法に感受性の腫瘍、すなわち、黒色腫、腎臓癌、結腸癌、乳腫瘍または肺腫瘍、骨肉種など、癌の処置を改善する。
好ましくは、この方法は、免疫感受性癌と同等に化学感受性癌の処置に向けられる。
【０１５３】
この方法は、そのような化学療法を必要とする哺乳動物における化学療法の効率の増加を示す。
【０１５４】
好ましくは、処置される哺乳動物はヒトである。
【０１５５】
さらに、細胞表面におけるカルレティキュリンタンパク質の配置は、カルレティキュリンの内因性形態、組換え形態および模倣形態を検出する抗カルレティキュリン抗体によって実現され得る。細胞表面におけるカルレティキュリンタンパク質の全ての形態の検出の方法もまた本発明の目的である。これは、インビトロ、エキソビボまたはインビボで行われ得る。細胞表面におけるこのカルレティキュリンタンパク質を検出するために使用される方法は当業者に周知である。これらの方法は、組織切片（凍結またはパラフィン）に対する免疫化学、腫瘍溶解物に対するＥＬＩＳＡのようなＥＩＡアッセイ、サイトスピン、腫瘍層から採集された細胞吸引物または自己免疫病変の共焦点免疫蛍光またはフローサイトメトリー分析などを含む。本発明の１つの目的はまた、細胞表面におけるカルレティキュリン（全ての形態）の定量的検出の方法を開発することである。アポトーシスの免疫原性は、細胞表面に存在するカルレティキュリンの量と相関する。細胞表面におけるカルレティキュリンが多ければ多いほど、免疫原性アポトーシスは多くなる。この検出方法は、アポトーシスの免疫原性を予測するように作用し得る。さらに、化学療法の有効性は、免疫応答の効率と、それゆえアポトーシスの免疫原性と相関する。免疫原性アポトーシスが多ければ多いほど、化学療法の治療効率は多くなる。細胞表面におけるカルレティキュリンのこの検出方法を、免疫原性アポトーシスの予測のために、そしてまた、化学療法の治療効率の予測のために使用することができる。これらの方法においてカルレティキュリンは、免疫原性アポトーシスおよび化学療法の治療効率の両方の予測マーカーとして使用される。この定量的検出方法はまた、免疫原性になりすぎる強制アポトーシスの危険性を予測するために有利であり得る。細胞表面におけるカルレティキュリンの移行の阻害は、カルレティキュリンの免疫原性を減少させ得、従って免疫応答を低下または遮断（最良の場合）し得る。
【０１５６】
細胞表面にはカルレティキュリンの基底量が存在し、そしてカルレティキュリンの増加した量は、免疫原性アポトーシスおよび／または化学療法の治療効率の予測を可能にする。化学療法の前後の比較により、細胞表面におけるカルレティキュリンの量は一般に大いに増加し、そして増加は免疫原性アポトーシス、化学療法の治療効率、免疫原性ウイルス感染のための、また、自己免疫疾患または移植片拒絶／ＧＶＨ病のための良好な予測マーカーとなる。本発明はまた、細胞表面におけるカルレティキュリンの検出方法を提供し、ここで細胞表面におけるカルレティキュリンは、免疫原性ウイルス感染または自己免疫疾患または移植片拒絶／ＧＶＨ病の予測マーカーとして使用される。
【０１５７】
さらに、カルレティキュリンを検出するために、本発明はまた、上記の方法による、細胞表面におけるカルレティキュリンタンパク質の検出のキットを提供し、前記キットは少なくとも抗カルレティキュリン抗体を含む。本発明の実施態様において、この検出キットはまた細胞表面におけるカルレティキュリンの定量的検出のための定量的なものであり得、前記キットは少なくとも抗カルレティキュリン抗体を含む。
【０１５８】
本発明はまた、細胞表面におけるカルレティキュリンタンパク質の検出のための抗カルレティキュリン抗体を少なくとも含む、腫瘍細胞の免疫原性アポトーシスおよび／または化学療法の治療効率の予測のキットに関する。多量のカルレティキュリンが検出される場合、腫瘍細胞のアポトーシスは免疫原性となり、そして化学療法の効率は改善される。免疫原性ウイルス感染または自己免疫疾患または移植片拒絶／ＧＶＨ病の予測のキットであって、細胞表面におけるカルレティキュリンタンパク質の検出のための抗カルレティキュリン抗体を少なくとも含むキットもまた本発明によって提供される。
【０１５９】
本発明はまた、直接的または間接的免疫原性薬物のスクリーニングのための抗カルレティキュリン抗体を少なくとも含む、細胞表面におけるカルレティキュリンタンパク質の検出の工程を含む、直接的または間接的免疫原性薬物のスクリーニングのための細胞表面におけるカルレティキュリンタンパク質の検出の方法および免疫原性薬物のスクリーニングの方法に関する。
【０１６０】
直接的および間接的免疫原性薬物のスクリーニングは、より効率的な抗腫瘍薬剤を見出すことを導き得る。直接的な方法については、ヒト腫瘍細胞株が選択されなければならず、次いで薬物パネルとのそのインキュベーションは、フローサイトメトリーまたは共焦点による、細胞質から細胞表面への自発的ＣＲＴ移行が存在するかどうかの検出を可能にすべきである。間接的なスクリーニングの方法については、本発明者らは、アポトーシスがエトポシド処理後に得られるが、細胞表面におけるＣＲＴ移行が存在しないヒト腫瘍細胞株を選択した。次いで、薬物パネルを使用して、どれがこの現象を逆転させ得るかを検出する。これは、ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の新たな阻害剤またはキナーゼＧＣＮ２、ＨＲＩ、ＰＥＲＫ、ＰＫＲの新たな活性化物質を見出すために使用される。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１Ａ】図１はアントラサイクリンによって誘導される免疫原性細胞死を示す。異なる化学療法剤での処理後の死滅したおよび死滅している細胞の頻度。ＣＴ２６細胞を、材料および方法に記載するように、示す薬剤の存在下で２４時間培養し、次いでアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよび生体色素ＤＡＰＩで染色した。
【図１Ｂ】免疫原性細胞死誘導物質の同定。図１Ａにおけるように培養したＣＴ２６細胞を左側腹部中に注射し、続いて８日後に右側腹部において生腫瘍細胞を注射した。図１Ｃにおけるように無腫瘍マウスの百分率を１２０日後に決定した。
【図１Ｃ】死滅している細胞の接種後の腫瘍の発生率。データは、図１Ｂに要約される実験についての、無腫瘍マウスの実際の頻度を示す。１日目は、死滅している腫瘍細胞でのチャレンジの１週間前の、死滅している腫瘍細胞の接種の日とみなされた。
【図１ＳＡ】ＣＲＴ露出およびホスファチジルセリン露出の解離。ＣＲＴ露出のキネティクス。ＣＴ２６細胞を、示す期間ミトキサントロンで処理し、続いてＣＲＴ特異的抗体での免疫蛍光染色および細胞蛍光測定分析を行った。代表的な図を図１ＳＡに示し、そして定量的データを図１ＳＢに報告する。
【図１ＳＢ】ＣＲＴ露出およびホスファチジルセリン露出の解離。ＣＲＴ露出のキネティクス。ＣＴ２６細胞を、示す期間ミトキサントロンで処理し、続いてＣＲＴ特異的抗体での免疫蛍光染色および細胞蛍光測定分析を行った。代表的な図を図１ＳＡに示し、そして定量的データを図１ＳＢに報告する。
【図１ＳＣ】ＰＳ露出および細胞死のキネティクス。細胞を、示す期間図１ＳＡおよび図１ＳＢにおけるように培養し、続いてアネキシンＶ（死滅している細胞の表面上でのホスファチジルセリンを認識する）＋ＤＡＰＩ（死滅した細胞を染色する）での染色およびＦＡＣＳ分析を行った。
【図１ＳＤ】ＰＳ露出および細胞死のキネティクス。細胞を、示す期間図１ＳＡおよび図１ＳＢにおけるように培養し、続いてアネキシンＶ（死滅している細胞の表面上でのホスファチジルセリンを認識する）＋ＤＡＰＩ（死滅した細胞を染色する）での染色およびＦＡＣＳ分析を行った。
【図２Ａ】免疫原性細胞死におけるＣＲＴ表面露出。アントラサイクリンによって誘起される表面露出分子としてのＣＲＴの同定。細胞を４時間ドキソルビシン単独（ＤＸ）またはＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋとの組み合わせ（ＤＸＺ）で処理し、続いて細胞表面のビオチン化およびビオチン化タンパク質の精製、２Ｄゲル電気泳動（図２Ａおよびより高い拡大率でゲルの部分を示す図２Ａ中の挿入図）およびＣＲＴとしての１つのドキソルビシン誘導スポットの質量分析同定（図２Ａ中の矢印および図２Ｂ中のＣＲＴタンパク質配列における下線を付したペプチド）、形質膜タンパク質画分または全細胞溶解物におけるＣＲＴのイムノブロット検出（図２Ｃ）または細胞表面上（非透過処理生細胞における）または細胞内（透過処理および固定後）のＣＲＴの免疫蛍光検出（図２Ｄ）を行った。非処理細胞の核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて可視化されたが（青色）、ドキソルビシン処理細胞の核は赤色蛍光を発していることに留意のこと（図２Ｄ）。図２Ａ中の円はＥＲｐ５７の位置を示す。
【図２Ｂ】免疫原性細胞死におけるＣＲＴ表面露出。アントラサイクリンによって誘起される表面露出分子としてのＣＲＴの同定。細胞を４時間ドキソルビシン単独（ＤＸ）またはＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋとの組み合わせ（ＤＸＺ）で処理し、続いて細胞表面のビオチン化およびビオチン化タンパク質の精製、２Ｄゲル電気泳動（図２Ａおよびより高い拡大率でゲルの部分を示す図２Ａ中の挿入図）およびＣＲＴとしての１つのドキソルビシン誘導スポットの質量分析同定（図２Ａ中の矢印および図２Ｂ中のＣＲＴタンパク質配列における下線を付したペプチド）、形質膜タンパク質画分または全細胞溶解物におけるＣＲＴのイムノブロット検出（図２Ｃ）または細胞表面上（非透過処理生細胞における）または細胞内（透過処理および固定後）のＣＲＴの免疫蛍光検出（図２Ｄ）を行った。非処理細胞の核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて可視化されたが（青色）、ドキソルビシン処理細胞の核は赤色蛍光を発していることに留意のこと（図２Ｄ）。図２Ａ中の円はＥＲｐ５７の位置を示す。
【図２Ｃ】免疫原性細胞死におけるＣＲＴ表面露出。アントラサイクリンによって誘起される表面露出分子としてのＣＲＴの同定。細胞を４時間ドキソルビシン単独（ＤＸ）またはＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋとの組み合わせ（ＤＸＺ）で処理し、続いて細胞表面のビオチン化およびビオチン化タンパク質の精製、２Ｄゲル電気泳動（図２Ａおよびより高い拡大率でゲルの部分を示す図２Ａ中の挿入図）およびＣＲＴとしての１つのドキソルビシン誘導スポットの質量分析同定（図２Ａ中の矢印および図２Ｂ中のＣＲＴタンパク質配列における下線を付したペプチド）、形質膜タンパク質画分または全細胞溶解物におけるＣＲＴのイムノブロット検出（図２Ｃ）または細胞表面上（非透過処理生細胞における）または細胞内（透過処理および固定後）のＣＲＴの免疫蛍光検出（図２Ｄ）を行った。非処理細胞の核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて可視化されたが（青色）、ドキソルビシン処理細胞の核は赤色蛍光を発していることに留意のこと（図２Ｄ）。図２Ａ中の円はＥＲｐ５７の位置を示す。
【図２Ｄ】免疫原性細胞死におけるＣＲＴ表面露出。アントラサイクリンによって誘起される表面露出分子としてのＣＲＴの同定。細胞を４時間ドキソルビシン単独（ＤＸ）またはＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋとの組み合わせ（ＤＸＺ）で処理し、続いて細胞表面のビオチン化およびビオチン化タンパク質の精製、２Ｄゲル電気泳動（図２Ａおよびより高い拡大率でゲルの部分を示す図２Ａ中の挿入図）およびＣＲＴとしての１つのドキソルビシン誘導スポットの質量分析同定（図２Ａ中の矢印および図２Ｂ中のＣＲＴタンパク質配列における下線を付したペプチド）、形質膜タンパク質画分または全細胞溶解物におけるＣＲＴのイムノブロット検出（図２Ｃ）または細胞表面上（非透過処理生細胞における）または細胞内（透過処理および固定後）のＣＲＴの免疫蛍光検出（図２Ｄ）を行った。非処理細胞の核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて可視化されたが（青色）、ドキソルビシン処理細胞の核は赤色蛍光を発していることに留意のこと（図２Ｄ）。図２Ａ中の円はＥＲｐ５７の位置を示す。
【図２Ｅ】ＣＲＴ露出と免疫原性との間の相関。ＣＲＴの表面露出を、生存（ヨウ化プロピジウム陰性）細胞についてゲートしながら（挿入図）免疫蛍光サイトメトリーによって決定し、そして細胞死の免疫原性（図１において決定される）と相関させた。ＣＯ、コントロール；Ｔｇ、タプシガルジン；Ｔｕ、ツニカマイシン。
【図２ＳＡ】アントラサイクリンによって誘起されるファゴサイトーシスおよび免疫原性のキネティクス。ＣＴ２６細胞を、様々な期間ミトキサントロンまたはドキソルビシンとともに培養し、次いでＤＣに直面させて、そのファゴサイトーシスを、図３Ａにおけるように測定したか（図２ＳＡ）、または生細胞でのチャレンジの１週間前にマウスに注射した（図２ＳＢ）。図２ＳＢの各列上の数字は免疫化されたマウスの数を示す。
【図２ＳＢ】アントラサイクリンによって誘起されるファゴサイトーシスおよび免疫原性のキネティクス。ＣＴ２６細胞を、様々な期間ミトキサントロンまたはドキソルビシンとともに培養し、次いでＤＣに直面させて、そのファゴサイトーシスを、図３Ａにおけるように測定したか（図２ＳＡ）、または生細胞でのチャレンジの１週間前にマウスに注射した（図２ＳＢ）。図２ＳＢの各列上の数字は免疫化されたマウスの数を示す。
【図３Ａ】ＤＣによる腫瘍細胞のファゴサイトーシスのための表面ＣＲＴの必要性。腫瘍細胞ファゴサイトーシスとＣＲＴ露出との間の相関。Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで標識された腫瘍細胞をＣＤ１１ｃ発現ＤＣとともに培養し、そして腫瘍細胞を取り込むＤＣの百分率を決定し（Ａ）そして図２Ｅにおけるように測定したＣＲＴ表面露出と相関させた（Ｂ）。
【図３Ｂ】ＤＣによる腫瘍細胞のファゴサイトーシスのための表面ＣＲＴの必要性。腫瘍細胞ファゴサイトーシスとＣＲＴ露出との間の相関。Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで標識された腫瘍細胞をＣＤ１１ｃ発現ＤＣとともに培養し、そして腫瘍細胞を取り込むＤＣの百分率を決定し（Ａ）そして図２Ｅにおけるように測定したＣＲＴ表面露出と相関させた（Ｂ）。
【図３Ｃ】ＣＲＴの遮断はＤＣ媒介ファゴサイトーシスを阻害する。ミトキサントロン処理細胞またはコントロール細胞を阻止トリ抗ＣＲＴ抗体とともにインキュベートし、続いてＣＤによるファゴサイトーシスの検出を行った。
【図３Ｄ】ＣＲＴのノックダウンはＤＣ媒介ファゴサイトーシスを阻害し、そしてｒＣＲＴはファゴサイトーシスを回復させる。細胞を、示すｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、そして所望によりｒＣＲＴで処理し、続いて表面ＣＲＴ（図３Ｅ）およびＤＣによるファゴサイトーシス（図３Ｆ）のイムノブロット（図３Ｄ）検出を行った。結果は３連であり（Ｘ±ＳＤ）、そして３回の独立した実験の代表である。＊はスチューデントｔ検定を使用したｐ＜０．００１の統計的有意差を示す。
【図３Ｅ】ＣＲＴのノックダウンはＤＣ媒介ファゴサイトーシスを阻害し、そしてｒＣＲＴはファゴサイトーシスを回復させる。細胞を、示すｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、そして所望によりｒＣＲＴで処理し、続いて表面ＣＲＴ（図３Ｅ）およびＤＣによるファゴサイトーシス（図３Ｆ）のイムノブロット（図３Ｄ）検出を行った。結果は３連であり（Ｘ±ＳＤ）、そして３回の独立した実験の代表である。＊はスチューデントｔ検定を使用したｐ＜０．００１の統計的有意差を示す。
【図３Ｆ】ＣＲＴのノックダウンはＤＣ媒介ファゴサイトーシスを阻害し、そしてｒＣＲＴはファゴサイトーシスを回復させる。細胞を、示すｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、そして所望によりｒＣＲＴで処理し、続いて表面ＣＲＴ（図３Ｅ）およびＤＣによるファゴサイトーシス（図３Ｆ）のイムノブロット（図３Ｄ）検出を行った。結果は３連であり（Ｘ±ＳＤ）、そして３回の独立した実験の代表である。＊はスチューデントｔ検定を使用したｐ＜０．００１の統計的有意差を示す。
【図３Ｓ】ＣＲＴ露出の阻害プロファイル。タンパク質合成（シクロヘキシミド）、ＲＮＡ合成（アクチノマイシンＤ）、微小管（ノコダゾール）、またはアクチン細胞骨格（ラトランクリンＡ）の示す阻害剤との１時間のプレインキュベーションの後、細胞をミトキサントロンまたはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４の阻害剤で処理した。次いで、ＣＲＴ発現を免疫細胞蛍光測定によって決定した。結果は、３回のうち１回の代表的な実験についての３連の平均±ＳＤである。
【図４Ａ】ＣＲＴは死滅している腫瘍細胞に対する免疫応答に必要とされる。インビボ抗癌ワクチン接種はＣＲＴに依存する。ＣＴ２６結腸癌細胞を、示すｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、次いでｒＣＲＴおよび／またはミトキサントロンで処理し（図３Ｄにおけるように）、そして抗腫瘍応答を、一方の側腹部においてミトキサントロン処理腫瘍細胞で、そして反対の側腹部において非処理生腫瘍細胞でＢＡＬＢ／ｃマウスを同時にチャレンジすることによって測定した。
【図４Ｂ】ＣＲＴに依存するＴ細胞応答のプライミング。ＣＴ２６腫瘍細胞を非トランスフェクトのままにするか、または示すｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、次いで培地単独、マイトマイシンＣまたはミトキサントロンで処理し、そしてＢａｌｂ／ｃマウスの右足蹠中に注射した。５日後、流入領域膝窩リンパ節からの単核細胞を凍結融解したＣＴ２６細胞でチャレンジし、そしてＩＮＦ−γ分泌を７２時間目で評価した。
【図４Ｃ】ＣＲＴの外因性供給はＣＲＴ陰性の死滅している細胞の免疫原性を増強する。ｓｉＲＮＡおよびミトキサントロン処理でのＣＲＴの枯渇後、またはマイトマイシン処理後の、ＣＲＴ発現を欠如するＣＴ２６細胞を、ｒＣＲＴでコートし（挿入図）、次いで足蹠中に注射し、続いて図４Ｂにおけるように流入領域リンパ節からの細胞によるＩＦＮ−γ分泌の評価を行った。
【図４Ｄ】エトポシド処理腫瘍細胞に対する免疫応答のＣＲＴ媒介改善。ＣＴ２６細胞を２４時間エトポシド（またはＰＢＳ）で処理し、そして所望によりｒＣＲＴを細胞表面に吸収させ（挿入図）、続いてエトポシド±ＣＲＴ処理腫瘍細胞および生腫瘍細胞の反対側腹部における同時注射、および腫瘍成長のモニターリングを行った。
【図５Ａ】ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害によるカルレティキュリン露出および免疫原性細胞死の誘導。核の非存在下でのアントラサイクリン処理後のＣＲＴ露出。インタクトな細胞または除核細胞（細胞質体）を２時間ミトキサントロンで処理し、続いてＣＲＴ露出の免疫蛍光検出を行った。挿入図は、細胞質体からのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色可能核の有効な除去を示す。
【図５Ｂ】アントラサイクリンでの処理後のｅＩＦ２αのリン酸化。細胞を４時間ミトキサントロンまたはドキソルビシンで処理し、続いてＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして、そのリン酸化状態にかかわらずリン酸化されたｅＩＦ２αのイムノブロット検出を行った。
【図５Ｃ】ＰＰ１のノックダウンによるＣＲＴ露出の誘導。示す転写物に特異的なｓｉＲＮＡを用いて細胞をトランスフェクトし、そして３６時間後に２時間ミトキサントロンで処理し、その後イムノブロット（図５Ｃ）および細胞表面染色（図５Ｄ）を行った。
【図５Ｄ】ＰＰ１のノックダウンによるＣＲＴ露出の誘導。示す転写物に特異的なｓｉＲＮＡを用いて細胞をトランスフェクトし、そして３６時間後に２時間ミトキサントロンで処理し、その後イムノブロット（図５Ｃ）および細胞表面染色（図５Ｄ）を行った。
【図５Ｅ】示す薬物との細胞のインキュベーション後のＦＡＣＳ分析によって決定されるＣＲＴ露出のキネティクス。
【図５Ｆ】ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤はＣＲＴを介して細胞を免疫原性にする。腫瘍細胞をまずコントロールｓｉＲＮＡまたはＣＲＴ特異的ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、次いでインビトロでエトポシド単独またはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤との組み合わせで処理した。２時間後、表面ＣＲＴを検出して、エトポシド単独またはエトポシド＋ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤で処理したコントロールｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞上のＣＲＴの有効な発現を実証し（図５Ｆ）、その後、細胞を図１Ａにおけるように注射して、１週間後に接種した生腫瘍細胞の増殖を阻害するその能力を決定した（図５Ｇ）。結果は、無腫瘍マウスの％を表す（１群当たり合計１２〜１８匹のマウスを含む）。
【図５Ｇ】ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤はＣＲＴを介して細胞を免疫原性にする。腫瘍細胞をまずコントロールｓｉＲＮＡまたはＣＲＴ特異的ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、次いでインビトロでエトポシド単独またはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤との組み合わせで処理した。２時間後、表面ＣＲＴを検出して、エトポシド単独またはエトポシド＋ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤で処理したコントロールｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞上のＣＲＴの有効な発現を実証し（図５Ｆ）、その後、細胞を図１Ａにおけるように注射して、１週間後に接種した生腫瘍細胞の増殖を阻害するその能力を決定した（図５Ｇ）。結果は、無腫瘍マウスの％を表す（１群当たり合計１２〜１８匹のマウスを含む）。
【図６Ａ】腫瘍中に注射したＣＲＴまたはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤の治療効果。免疫適格性野生型（図６Ａ）または無胸腺ｎｕ／ｎｕ  Ｂａｌｂ／ｃマウス（図６Ｂ）において確立されたＣＴ２６腫瘍に、ミトキサントロン、エトポシド、マイトマイシンＣ、ｒＣＲＴ、サルブリナルまたはトートマイシンの示す組み合わせを局所注射し、続いて腫瘍成長をモニターした。各々の曲線は１匹のマウスを表す。各グラフの右下隅の数字は、４５日目に完全な腫瘍退行を現すマウスの数を示す。図６Ｃ。腫瘍内エトポシド＋ｒｅｃ．ＣＲＴの反対側皮下注射を使用する同一の実験設定。グラフは、マウス５匹／群を含む、２回のうち１回の代表的な実験を示す。
【図６Ｂ】腫瘍中に注射したＣＲＴまたはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤の治療効果。免疫適格性野生型（図６Ａ）または無胸腺ｎｕ／ｎｕ  Ｂａｌｂ／ｃマウス（図６Ｂ）において確立されたＣＴ２６腫瘍に、ミトキサントロン、エトポシド、マイトマイシンＣ、ｒＣＲＴ、サルブリナルまたはトートマイシンの示す組み合わせを局所注射し、続いて腫瘍成長をモニターした。各々の曲線は１匹のマウスを表す。各グラフの右下隅の数字は、４５日目に完全な腫瘍退行を現すマウスの数を示す。図６Ｃ。腫瘍内エトポシド＋ｒｅｃ．ＣＲＴの反対側皮下注射を使用する同一の実験設定。グラフは、マウス５匹／群を含む、２回のうち１回の代表的な実験を示す。
【図６Ｃ】腫瘍中に注射したＣＲＴまたはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤の治療効果。免疫適格性野生型（図６Ａ）または無胸腺ｎｕ／ｎｕ  Ｂａｌｂ／ｃマウス（図６Ｂ）において確立されたＣＴ２６腫瘍に、ミトキサントロン、エトポシド、マイトマイシンＣ、ｒＣＲＴ、サルブリナルまたはトートマイシンの示す組み合わせを局所注射し、続いて腫瘍成長をモニターした。各々の曲線は１匹のマウスを表す。各グラフの右下隅の数字は、４５日目に完全な腫瘍退行を現すマウスの数を示す。図６Ｃ。腫瘍内エトポシド＋ｒｅｃ．ＣＲＴの反対側皮下注射を使用する同一の実験設定。グラフは、マウス５匹／群を含む、２回のうち１回の代表的な実験を示す。
【図７Ａ】ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害ペプチドの存在下または非存在下でのＥＲｐ５７／ＣＲＴの発現。ＨＣＴ１１６細胞（図７Ａ）またはＣＴ２６細胞（図７Ｂ）を、１０％ウシ胎仔血清を補充した完全培地単独で、またはコントロールペプチド（ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ｌｋａｒａｖａｆｓｅｋｖ）またはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害ペプチド（ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ｌｋａｒｋｖｒｆｓｅｋｖ、ＰＰ１ペプチドと名付ける）の存在下で２時間培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そしてＰＦＡ（４％（w/v））中で５分間固定した。１：２００希釈のカルレティキュリンに対する抗体（AbcamからのｐＡｂ、ab2907）またはアイソタイプコントロールで、染色緩衝液（ＰＢＳ、１％ＦＣＳ）中で３０分間氷上で細胞を染色し、続いて洗浄した。１：５００希釈した抗ウサギＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ４８８免疫グロブリンコンジュゲート（Molecular Probe-Invitrogen）をさらに３０分間氷上で添加し、その後洗浄し、そしてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、Becton Dickinson）によって分析した。ヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ、Becton Dickinson）を試料に添加して、透過処理された（死滅した）細胞を標識しそして除外した。
【図７Ｂ】ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害ペプチドの存在下または非存在下でのＥＲｐ５７／ＣＲＴの発現。ＨＣＴ１１６細胞（図７Ａ）またはＣＴ２６細胞（図７Ｂ）を、１０％ウシ胎仔血清を補充した完全培地単独で、またはコントロールペプチド（ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ｌｋａｒａｖａｆｓｅｋｖ）またはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害ペプチド（ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ｌｋａｒｋｖｒｆｓｅｋｖ、ＰＰ１ペプチドと名付ける）の存在下で２時間培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そしてＰＦＡ（４％（w/v））中で５分間固定した。１：２００希釈のカルレティキュリンに対する抗体（AbcamからのｐＡｂ、ab2907）またはアイソタイプコントロールで、染色緩衝液（ＰＢＳ、１％ＦＣＳ）中で３０分間氷上で細胞を染色し、続いて洗浄した。１：５００希釈した抗ウサギＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ４８８免疫グロブリンコンジュゲート（Molecular Probe-Invitrogen）をさらに３０分間氷上で添加し、その後洗浄し、そしてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、Becton Dickinson）によって分析した。ヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ、Becton Dickinson）を試料に添加して、透過処理された（死滅した）細胞を標識しそして除外した。
【図８】カルレティキュリンおよびＥＲｐ５７はＭＴＸ処理細胞の表面上で共存する。ＨｅＬａ細胞をカバーグラス上で培養し、そして１μＭミトキサントロン（ＭＴＸ）有りまたは無しで２時間処理した。ＨｅＬａ細胞を、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ５６８および抗ウサギＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ４８８免疫グロブリンコンジュゲート（Molecular Probes-Invitrogen）によって明らかにされるカルレティキュリン（ＣＲＴ）（AbcamからのｍＡｂ、ab22683）およびＥＲｐ５７（AbcamからのｐＡｂ、ab10827）の検出ために染色した。核をＤＡＰＩマウント媒体（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）を用いて標識した。蛍光顕微鏡観察をＤＣ３００Ｆカメラを備えたＬｅｉｃａ  ＩＲＥ２を用いて６３×の拡大率で分析した。サイズバーは１０μｍを示す。
【図９】ＥＲｐ５７のフローサイトメトリー検出。ＨｅＬａ細胞をミトキサントロン（ＭＴＸ、１μＭ）またはトートマイシン（Ｔａｕ、１５０ｎＭ、Sigma）有りまたは無しで２時間処理した。細胞を２回ＰＢＳで洗浄し、そしてＰＦＡ（４％（w/v））中で５分間固定した。１：２００希釈のＥＲｐ５７に対する抗体（AbcamからのｐＡｂ、ab10827）またはアイソタイプコントロールで、染色緩衝液（ＰＢＳ、１％ＦＣＳ）中で３０分間氷上でＨｅＬａ細胞を染色し、続いて洗浄した。１：５００希釈した抗ウサギＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ４８８免疫グロブリンコンジュゲート（Molecular Probes-Invitrogen）をさらに３０分間氷上で添加し、その後洗浄し、そしてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、Becton Dickinson）によって分析した。ヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ、Becton Dickinson）を試料に添加して、透過処理された（死滅した）細胞を標識しそして除外した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを使用して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）およびＥＲｐ５７陽性細胞の百分率を分析した。
【図１０Ａ】アントラサイクリンで処理したＨｅＬａ細胞上のＫＤＥＬ受容体の免疫蛍光および共焦点顕微鏡観察分析。図１０（Ａ）コントロールおよび図１０（Ｂ）ＭＴＸ処理ＨｅＬａ細胞。ＨｅＬａ細胞をカバーグラス上で培養し、そして１μＭミトキサントロン（ＭＴＸ、Sigma）無し（Ａ）または有り（Ｂ）で２時間処理した。細胞をパラホルムアルデヒド（４％（w/v））で氷上で５分間固定した。細胞を、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ５６８および抗ウサギＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ４８８免疫グロブリンコンジュゲート（Molecular Probes-Invitrogen）によって、ＫＤＥＬ受容体（ＫＤＥＬ−Ｒ）（AbcamからのｍＡｂ、ab12224）およびＣＲＴ（AbcamからのｐＡｂ、ab2907）の検出のために染色した。核をＤＡＰＩマウント媒体（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）を用いて標識した。蛍光顕微鏡観察をＤＣ３００Ｆカメラを備えたＬｅｉｃａ  ＩＲＥ２を用いて分析した。サイズバー：１０μｍ。
【図１０Ｂ】アントラサイクリンで処理したＨｅＬａ細胞上のＫＤＥＬ受容体の免疫蛍光および共焦点顕微鏡観察分析。図１０（Ａ）コントロールおよび図１０（Ｂ）ＭＴＸ処理ＨｅＬａ細胞。ＨｅＬａ細胞をカバーグラス上で培養し、そして１μＭミトキサントロン（ＭＴＸ、Sigma）無し（Ａ）または有り（Ｂ）で２時間処理した。細胞をパラホルムアルデヒド（４％（w/v））で氷上で５分間固定した。細胞を、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ５６８および抗ウサギＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ４８８免疫グロブリンコンジュゲート（Molecular Probes-Invitrogen）によって、ＫＤＥＬ受容体（ＫＤＥＬ−Ｒ）（AbcamからのｍＡｂ、ab12224）およびＣＲＴ（AbcamからのｐＡｂ、ab2907）の検出のために染色した。核をＤＡＰＩマウント媒体（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）を用いて標識した。蛍光顕微鏡観察をＤＣ３００Ｆカメラを備えたＬｅｉｃａ  ＩＲＥ２を用いて分析した。サイズバー：１０μｍ。
【図１１】ＥＲｐ５７の露出のためのＢａｘおよびＢａｋの必要性。ＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレート中で培養し、そして８０％コンフルエンスでＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Invitrogen）を用いて、ヒトＢａｘ（センス５’−ＧＧＵＧＣＣＧＧＡＡＣＵＧＡＵＣＡＧＡＴＴ−３’  −  配列番号５、アンチセンス：５’ＵＣＵＧＡＵＣＡＧＵＵＣＣＧＧＣＡＣＣＴＴ−３’  −  配列番号６）および／またはＢａｋ（センス、５’−ＡＣＣＧＡＣＧＣＫＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＴＴＣ−３’  −  配列番号７、アンチセンス、５’−ＡＣＡＣＧＧＣＡＣＣＡＡＴＴＧＡＴＧ−３’  −  配列番号８）に特異的なｓｉＲＮＡおよびコントロールとしての無関係な配列（センス、５’−ＧＣＣＧＧＵＡＵＧＣＣＧＧＵＵＡＡＧＵ−３’  −  配列番号９、アンチセンス：５’−ＡＣＵＵＡＡＣＣＧＧＣＡＵＡＣＣＧＧＣ−３’  −  配列番号１０）２０ｎＭの存在下でトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡの効果をＢａｘおよびＢａｋに特異的な適切な抗体を用いるイムノブロットによって管理した。３６時間のトランスフェクションの後、細胞をＭＴＸ（１μＭ）で２時間処理した。表面ＥＲｐ５７陽性細胞のＭＦＩを図９において記載するように分析した。
【図１２】確立されたＣＴ２６結腸癌に対するマイトマイシンＣとのＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害ペプチドインの組み合わせのインビボ相乗治療効果。ＣＴ２６をＢＡＬＢ／ｃマウスにｓｃ注射した。２０ｍｍ２のサイズで、触知可能な腫瘍に、１０μｇの３つの以下のペプチド（下記参照）のいずれかを、単独でかまたはマイトマイシンＣでの全身的処置と一緒に（Obeid et al. Nat Med 2007に記載されるように）、またはＰＢＳを、インサイチュで直接的に接種した。  １．細胞透過可能ＰＰ１阻害ペプチドＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ＬＫＡＲＫＶＲＦＳＥＫＶ  ２．細胞透過性コントロールペプチドＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ＬＫＡＲＡＶＲＦＳＥＫＶ  ３．ＰＰ１阻害ペプチドＬＫＡＲＫＶＲＦＳＥＫＶ単独と一緒に混合された細胞透過配列ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ単独  腫瘍サイズを週に２回モニターし、そして生存曲線を代表的な実験（同様の結果を生じた２回のうち）について示す。動物５匹／群をこの実験において含めた。ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４の阻害（これはｅｃｔｏ−ＣＲＴを誘導する）は、それ自体は腫瘍細胞表面上のＣＲＴ露出を促進できない細胞死誘導物質マイトマイシンＣと協同する（ここには示さず）。細胞質ゾルへの侵入のために、関連するペプチドを細胞透過可能ペプチドと融合させなければならない。
【０１６２】
実験部
材料および方法
細胞株および細胞死誘導。
ＣＴ２６細胞を３７℃で５％ＣＯ２下、１０％ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で、ドキソルビシン（ＤＸ；２４時間、２５μＭ）、ミトキサントロン（Ｍｉｔｏｘ；２４時間、１μＭ、Sigma）、イダルビシン（２４時間、１μＭ、Aventis, France）、マイトマイシンＣ（３０μＭ、４８時間；Sanofi-Synthelabo, France）、および／またはｚＶＡＤ−ｆｍｋ（５０μＭ、２４時間；Bachem）、ツニカマイシン（２４時間、６５μＭ）、タプシガルジン（２４時間、３０μＭ）、ブレフェルジンＡ（２４時間、５０μＭ、Sigma）、エトポシド（４８時間、２５μＭ、Tava classics）、ＭＧ１３２（４８時間、１０μＭ）、ＡＬＬＮ（４８時間、μＭ）、ベツリン酸（２４時間、１０μＭ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４３（２４時間、０．２μＭ）、カンプトテシン（２４時間、１５μＭ）、ラクタシスチン（４８時間、６０μＭ）、ＢＡＹ１１−８０７２（２４時間、３０μＭ）、スタウロスポリン（２４時間、１．５μＭ）、バフィロマイシンＡ１（４８時間、３００ｎＭ）、三酸化ヒ素（２４時間、３０μＭ）、Ｃ２−セラミド（Ｃ２−Ｃ；２４時間、６０μＭ）、カリクリンＡ（４８時間、３０ｎＭ）、またはトートマイシン（４８時間、ｎＭ、Sigma）および／またはサルブリナル（４８時間、μＭ、Calbiochem）の存在下で培養した。
【０１６３】
細胞死アッセイ。
細胞をトリプシン処理し、そして細胞生存率の決定のために４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、２．５ｍＭ、１０分間、Molecular Probes）で、そしてホスファチジルセリン露出の評価のためにフルオレセインイソチオシアネートとコンジュゲートされたアネキシンＶ（Bender Medsystems）で染色した後、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅを用いる細胞蛍光測定分析に供した（Zamzami, N. & Kroemer, G. Methods Mol Biol. 282, 103-16 (2004)）。
【０１６４】
ｓｉＲＮＡおよび表面ＣＲＴの操作。
ＣＲＴ（センス鎖：５’−ｒＣｒＣｒＧｒＣＵｒＧｒＧｒＧＵｒＣｒＧｒＡｒＡＵｒＣｒＲｒＡｒＡＴＴ−３’  −  配列番号１１）、ＧＡＤＤ３４（５’−ｒＣｒＡｒＧｒＧｒＡｒＧｒＣｒＡｒＧｒＡＵｒＣｒＡｒＧｒＡＵｒＡｒＧｒＡＴＴ−３’  −  配列番号１２）、ＰＰＩＣα（５’−ｒＧｒＣＵｒＧｒＧｒＣｒＣＵｒＡＵｒＡｒＡｒＧｒＡＵｒＣｒＡｒＧｒＡＴＴ−３’  −  配列番号１３）または無関係なコントロール（５’−ｒＧｒＣｒＣｒＧｒＧＵｒＡＵｒＧｒＣｒＣｒＧｒＧＵＵｒＡｒＡｒＧＵＴＴ−３’  −  配列番号１４）に特異的なｓｉＲＮＡヘテロ二重鎖は、本発明者らの研究室において設計され、そしてSigma-Proligoによって合成された。ＣＴ２６細胞をＨｉＰｅｒＦｅｃｔ（Qiagen）を使用して１００ｎＭの最終濃度のｓｉＲＮＡによってトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後にＣＴ２６細胞を全ＣＲＴ含量についてイムノブロッティングによって評価した。ＣＲＴ発現を回復させるために、細胞を、３０分間氷上でＰＢＣ中３μｇ／１０６細胞で、記載されるように産生されたｒＣＲＴに曝露し（Culina, S., Lauvau, G., Gubler, B. & van Endert, P.M. Calreticulin promotes folding of functional human leukocyte antigen class I molecules in vitro. J Biol Chem 279, 54210-5 (2004)）、続いて３回洗浄した。
【０１６５】
細胞表面ＣＲＴの蛍光検出。
ＣＴ２６細胞（スライドガラス上または１２ウェルプレート中）をまずＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、５％ウシ胎児血清、および０．１％アジ化ナトリウム）で洗浄し、次いで３０分間４℃でＦＡＣＳ緩衝液中でウサギ抗マウスＣＲＴ抗体（１：１００、Stressgen）とともにインキュベートした。細胞を、抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲート（１：５００）とＦＡＣＳ緩衝液中４℃で３０分間反応させた。ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、表面ＣＲＴをＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ上での細胞蛍光測定分析によって検出した。いくつかの実験において、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ（２μＭ；Sigma）で対比染色し、続いてＤＣ３００Ｆカメラを備えたＬｅｉｃａ  ＩＲＥ２顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡観察評価を行った。
【０１６６】
イムノブロット分析。
細胞を４℃の冷ＰＢＳで洗浄し、そして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロールおよび２％ＳＤＳを含む緩衝液中で溶解した。ＣＲＴ（希釈１／２０００、Stressgen）、ＣＤ４７（希釈１／５００、BD Biosciences）、ＥＩＦ２α、ＥＩＦ２α−ＰおよびＰＰ１ｃα（希釈１／２０００、Cell Signaling Technology）、およびＧＡＤＤ３４（希釈１／２０００、Abcam）を検出する１次抗体を、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ標識２次抗体（Southern Biotechnologies Associates）を用いて明らかにし、そしてＥＣＬ（Pierce）によって検出した。抗アクチンまたは抗ＧＡＰＤＨ（Chemicon）を等価なローディングを管理するために使用した。
【０１６７】
抗腫瘍ワクチン接種および確立された腫瘍の処置。
全ての動物を特定の無病原体条件において維持し、そして全ての実験はＦＥＬＡＳＡガイドラインに従った。３×１０６個の処理ＣＴ２６細胞を２００ｍｌのＰＢＳ中ＢＡＬＢ／ｃ  ６週齢雌性マウス（Charles River, France）中、下側腹部中にｓ．ｃ．接種し、５×１０５個の非処理コントロール細胞を反対側側腹部中に接種した。腫瘍原性アッセイのために、３×１０６個の処理または非処理ＣＴ２６細胞をｎｕ／ｎｕマウス（IGR animal facility）中にｓ．ｃ．注射した。ＣＴ２６に対する免疫応答の特異性を評価するために、本発明者らは５×１０５個または５×１０６個（それぞれ標準プロトコルまたはワクチン接種プロトコルで免疫化したマウスについて）のいずれかのＣＴ２６を注射した。腫瘍を毎週ノギスを使用して評価した。一連の実験において、触知可能なＣＴ２６腫瘍（１０６個の腫瘍細胞の注射によって野生型については１４日前に、またはｎｕ／ｎｕマウスについては７日前に移植）を有するＢＡＬＢ／ｃ（野生型またはｎｕ／ｎｕ）に、インビトロで使用されたのと同じ濃度の抗癌剤およびＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤ならびにｒＣＲＴ（１５μｇ）を含む１００μＭ  ＰＢＳの単回腫瘍内注射を与えた。局所的免疫応答の評価のために、３×１０５個の細胞を５０μｌ中でマウスの足蹠中に注射した。５日後、マウスを屠殺し、そして流入領域リンパ節を採取した。１×１０５個のリンパ節細胞を４日間単独でまたは凍結融解サイクルによって死滅させた１×１０４個のＣＴ２６細胞とともに丸底９６ウェルプレート中２００μｌ中で培養した。ＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ（BD Pharmingen）によって決定した。
【０１６８】
ＢＭＤＣの生成。
ＢＭ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの脛骨および大腿から、１０％熱不活化ＦＢＳ（Invitrogen）、ピルビン酸ナトリウム、５０μＭ  ２−ＭＥ（Sigma）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen Life Technologies）から構成される培地を用いてフラッシュした。１回の遠心分離の後、ＢＭ細胞をＴｒｉｓ−塩化アンモニウム中に２分間再懸濁して、ＲＢＣを溶解した。さらに１回の遠心分離の後、ＢＭ細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を６ウェルプレート（Costar Corning）中、１００ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＦＬＴ３リガンド（R&D systems）を補充した培地中で培養した。７日後、非接着性および緩く接着性の細胞をＶｅｒｓｅｎｅを用いて採集し、洗浄し、そして腫瘍細胞との共培養のために１２ウェルプレート中に移した（１．５×１０６細胞／プレート）。
【０１６９】
ファゴサイトーシスアッセイ。
１２ウェルプレートにおいて、２５×１０６個の接着性ＣＴ２６細胞をＣｅｌｌｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（Calbiochem）を用いて標識し、次いで薬物とともにインキュベートした。いくつかの実験において、生存ＣＴ２６を２μｇ／１０６細胞のトリ抗ＣＲＴ抗体（ABR affinity bioreagents）またはアイソタイプコントロールで３０分間コートし、その後洗浄しそして樹状細胞に与えた。あるいは、ＣＴ２６細胞を２μｇ／１０６細胞のｒＣＲＴで氷上で３０分間コートし、そして２回洗浄し、その後樹状細胞に添加した。次いで細胞を採集し、ＦＢＳを補充した培地で３回洗浄し、そして未成熟ＤＣと２時間１：１および１：５の比率で共培養した。インキュベーションの最後に、細胞をｖｅｒｓｅｎｅを用いて採集し、上清中に存在する非接着性細胞とともにプールし、洗浄し、そしてＣＤ１１ｃ−ＦＩＴＣ抗体で染色した。ファゴサイトーシスを二重陽性細胞のＦＡＣＳ分析によって評価した。ファゴサイトーシス指数は、ＤＣと腫瘍細胞との間の共インキュベーションの、４℃で得られた値と３７℃で得られた値との間の比率を指す。
【０１７０】
統計分析。
データを算術平均±標準偏差（ＳＤ）または百分率として提示する。全ての統計分析をＪＭＰソフトウエア（SAS Institute Inc.）を使用して行った。スチューデントｔ検定を連続変数を比較するために使用し（腫瘍成長の比較）、カイ二乗検定を非母数変数を比較するために使用した（動物コホートの比較）。全ての試験について、統計的有意レベルを０．０５に設定した。
【０１７１】
生化学方法。
形質膜タンパク質の精製、質量分析および細胞質体の生成は以下で詳述する。
【０１７２】
ＣＴ２６細胞表面タンパク質のビオチン化。
細胞表面タンパク質のビオチン化および回収を、Gottardi et al.（Gottardi, C.J., Dunbar, L.A. & Caplan, M.J. Biotinylation and assessment of membrane polarity: caveats and methodological concerns. Am J Physiol 268, F285-95 (1995)）およびHanwell et al.（Hanwell, D., Ishikawa, T., Saleki, R. & Rotin, D. Trafficking and cell surface stability of the epithelial Na+ channel expressed in epithelial Madin-Darby canine kidney cells. J Biol Chem 277, 9772-9 (2002)）から適応させた方法を用いて行った。簡潔に記載すると、７５ｃｍ２フラスコ上で増殖させた２０×１０６個のＣＴ２６細胞を氷上に置き、そして氷冷ＰＢＳ−Ｃａ２＋−Ｍｇ２＋（０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで、膜タンパク質を、穏やかに攪拌しながらの、ビオチン化緩衝液（１０ｍＭトリエタノールアミン、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中に新たに希釈したＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン１．２５ｍｇ／ｍｌ（Pierce）との４℃での３０分間のインキュベーションによってビオチン化した。ＣＴ２６細胞をＰＢＳ−Ｃａ２＋−Ｍｇ２＋＋グリシン（１００ｍＭ）でリンスし、そしてこの緩衝液中で２０分間４℃で洗浄して、非反応ビオチンをクエンチした。次いで、細胞をＰＢＳ−Ｃａ２＋−Ｍｇ２＋で２回リンスし、冷ＰＢＳ中で掻き取り、そして２，０００ｒｐｍで４℃でペレット化した。ペレットを４５分間プロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）５００μｌ中で可溶化した。溶解物を１４，０００×ｇで１０分間４℃の遠心分離によって澄明化し、そして上清をパックしたストレプトアビジン−アガロースビーズとともに一晩インキュベートして、ビオチン化タンパク質を回収した。次いで、ビーズを遠心分離によってペレット化し、そして上清のアリコートを取って、タンパク質の非結合、細胞内プールとした。ビオチン化タンパク質を、１００℃で５分間ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で加熱することによってビーズから溶出し、その後上記のように１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。細胞中へのビオチンの漏れの非存在を確実にするために、本発明者らはビオチン化抽出物中の細胞内タンパク質アクチンおよびＧＡＰＤＨの非存在を体系的に確認した。
【０１７３】
２Ｄゲル電気泳動分析および質量分析によるタンパク質同定。
精製タンパク質をＥｔｔａｎ  ２−Ｄ  ｃｌｅａｎ  ｕｐ  ｋｉｔ（GE Healthcare）を使用して沈殿させ、次に尿素緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオウレア、２％Ｃｈａｐｓ、１％Ｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ  ＳＢ３−１０、１％Ａｍｉｄｏｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ  ＡＳＢ１４、５０ｍＭ  ＤＴＴ）中に再懸濁した。タンパク質分離の第１次元のために、等電点電気泳動（ＩＥＦ）を、１８ｃｍ固定化非直線ｐＨ勾配ストリップ（ｐＨ３〜１０；GE Healthcare）をＩＰＧｐｈｏｒ  ＩＩ電気泳動ユニット（GE Healthcare）上で使用して行った。タンパク質（１００μｇ）を低電圧（３０Ｖ）を使用する９時間のゲル中再水和によってロードし、次いで電圧を１００Ｖで１時間、２００Ｖで２時間、５００Ｖで１時間、１，０００Ｖで１時間、２時間、１，０００〜８，０００Ｖの２時間の電圧勾配、および８，０００Ｖで４時間に設定したプログラムを使用して泳動した。第２次元の電気泳動の前に、ＩＰＧゲルストリップを１０分間室温で１％ジチオトレイトール中で平衡化して、タンパク質を還元し、そして次にスルフヒドリル基を４％ヨードアセトアミドを使用して誘導体化した（両方の溶液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［ｐＨ８．８］−６Ｍ尿素−３０％グリセロール−２％ＳＤＳ−２％ブロモフェノールブルー中で調製した）。ストリップを１．０ｍｍ厚の１０％（wt/vol）ポリアクリルアミドゲル（２０×２０ｃｍ）に移し、そして第２次元ゲルを５０μＡで６時間泳動した。ゲルをＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ（BioRad）で染色し、そしてＴｙｐｈｏｏｎ９２００スキャナー（GE Healthcare）を使用して可視化した。Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ  ＨＴ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Genomic Solutions Inc）を、ディファレンシャルなゲルの間での可視化されたタンパク質スポットのマッチングおよび分析のために使用した。バックグラウンドサブトラクションを使用して、スポット当たりのタンパク質の量を表す強度値を規準化した。
【０１７４】
ディファレンシャルに発現されたスポットを自動スポットピッカー（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ  ＰｒｏＰｉｃ、Genomic Solutions Inc.）を用いてゲルから切り出し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に入れ、そして５分間５０μＬの０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３で洗浄することによって脱染した。次いで、５０μＬの１００％アセトニトリルを添加し、さらに５分間インキュベートした。液体を捨て、洗浄工程をさらに１回反復し、そしてゲルプラグを純粋アセトニトリルの添加によって収縮させた。乾燥したゲル小片を、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中の４．０ｎｇ／μＬトリプシン（Promega, Madison, WI）を用いて再膨潤させ、そして一晩３７℃で消化した。ペプチドをＺｉｐＴｉｐ（登録商標）μＣ１８ピペットチップを用いて濃縮した。１μＬのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸マトリックス（５０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ中５μｇ／ｍＬ）を用いてＭＡＬＤＩ標的上へ直接的に共溶出を行った。ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳを、ＴＯＦ／ＴＯＦイオンオプティクス（TOF/TOF ion optics）を用いてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７００  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ上で行った。スペクトルを、ポジティブＭＳ反射鏡モード（positive MS reflector mode）で獲得し、そして標準の５つのピークを使用して外部的に（ＡＢＩ４７００  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ）、またはブタトリプシン自己分解ペプチドピークを使用して内部的に（８４２．５１、１０４５．５６および２２１１．１０［Ｍ＋Ｈ］＋イオン）のいずれかで較正した。質量スペクトルを各試料スポットから、７５０〜４０００の質量範囲で３０サブスペクトル累積（各々が５０のレーザーショットからなる）によって得た。各スペクトルの５個のＳ／Ｎ最良ピークをＭＳ／ＭＳ分析のために選択した。ＭＳ／ＭＳスペクトルについて、衝突エネルギーは１ｋｅＶであり、そして衝突ガスは空気であった（Medzihradszky, K.F. et al. The characteristics of peptide collision-induced dissociation using a high-performance MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometer. Anal Chem 72, 552-8 (2000)）。
【０１７５】
ＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータを、ＧＰＳ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウエア（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１、Applied Biosystems）を使用して解釈し、これは生スペクトルを含むＯｒａｃｌｅデータベースとＭＡＳＣＯＴサーチエンジン（Ｖｅｒｓｉｏｎ１．８）のローカルコピーとの間のインターフェースとして作用する。ＭＳ分析から得られたペプチド質量フィンガープリントをＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ非重複データベースにおけるタンパク質同定のために使用した。全てのペプチド質量値を単一同位体であるとみなし、そして質量許容度を＜５０ｐｐｍに設定した。トリプシンを消化酵素として与え、１個の失われた切断部位は許容され、メチオニンは部分的に酸化されると仮定し、そしてセリン、トレオニンおよびチロシンは部分的にリン酸化されると仮定した。７１より大きなＭａｓｃｏｔ（Matrix Science）スコアを有意（ｐ＜０．００５）であるとみなした。ＭＳ／ＭＳ分析について、５より大きなＳ／Ｎ比を有する全てのピークを、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔデータベースに対して、ＭＳデータベースと同じ改変を使用して検索した。０．３Ｄａ未満のフラグメント許容度を考慮した。
【０１７６】
細胞質体の調製。
トリプシン処理したＣＴ２６細胞をAndreau, K. et al. Contagious apoptosis facilitated by the HIV-1 envelope. Fusion-induced cell-to-cell transmission of a lethal signal. J. Cell Sci. 117, 5643-53 (2004)の刊行物に記載のように除核した。簡潔に記載すると、細胞をサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ；Sigma）およびＤＮａｓｅＩ（８０Ｕ／ｍｌ；Sigma）を含む完全ＲＰＭＩ培地２ｍｌ中で処理した。細胞懸濁物を５×１０６／ｍｌの最終濃度に調整し、そして３７℃で４５分間インキュベートし、その後、事前調製した非連続Ｆｉｃｏｌｌ（Pharmacia）密度勾配（５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢおよび４０Ｕ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩを含む１ｍｌの９０％および３ｍｌの５５％Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ層中、３ｍｌの１００％；勾配を超遠心チューブ中で調製し、そして一晩ＣＯ２インキュベーター中３７℃で事前平衡化した）上に重層した。細胞懸濁物を含む勾配を、予熱したＳＷ４１  Ｂｅｃｋｍａｎローター中で２５０００ｒｐｍで２０分間３０℃で遠心分離した。細胞質体富化画分を９０および１００％Ｆｉｃｏｌｌ層の間の界面から採集し、完全ＲＰＭＩ培地中で洗浄し、そして３７℃でインキュベートした。細胞を、実験において示す期間、ＭＴＸ、ＣＡ、ＳａｌおよびＴＡとともにインキュベートした。次いで、細胞表面ＣＲＴを検出し（材料および方法参照）、そして５分間ヨウ化プロピジウム染色（２μｇ／ｍｌ、Sigma）およびそれに続く細胞蛍光測定分析によって生存率を決定した。あるいは、細胞質体を未成熟ＤＣとともに２時間１：１および１：５の比率で共培養した。インキュベーションの最後に、細胞をｖｅｒｓｅｎｅを用いて採集し、上清中に存在する非接着性細胞とともにプールし、洗浄し、そしてＣＤ１１ｃ−ＦＩＴＣ抗体で染色した。ファゴサイトーシスを二重陽性細胞のＦＡＣＳ分析によって評価した。
【０１７７】
本出願の発明を完全にしそして例証するために様々な実施例を与える。
【０１７８】
実施例１：ＣＲＴ露出は免疫原性細胞死を規定する。
約２０個の異なるアポトーシス誘導物質のパネル（その全ては、生体色素ＤＡＰＩおよびＰＳ結合色素アネキシンＶでの二重染色によって決定される、約７０±１０％のアポトーシスを誘導した、図１Ａ）に曝露された死滅しているＣＴ２６腫瘍細胞を、免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスの一方の側腹部中に注射し、続いて８日後に反対の側腹部中に注射した生腫瘍細胞での動物の再チャレンジを行った。次いで、腫瘍成長に対する防御を抗腫瘍ワクチン接種の兆候として解釈した（図１Ｂ）。なぜなら、そのような防御は無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて観察されなかったからである（Casares, N. et al. J. Exp. Med. 202, 1691-701 (2005)、およびデータは示さず）。小胞体（ＥＲ）（タプシガルジン、ツニカマイシン、ブレフェルジン）、ミトコンドリア（亜ヒ酸塩、ベツリン酸、Ｃ２セラミド）またはＤＮＡ（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４３、カンプトテシン、エトポシド、マイトマイシンＣ）を標的化する薬剤を含む大部分のアポトーシス誘導物質は、免疫原性アポトーシスを誘導できなかったが、アントラサイクリン（ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン）は免疫原性細胞死を誘起した（図１Ｂ、Ｃ）。形質膜プロテオソームにおける変化を同定するために、本発明者らは、非処理のまたはドキソルビシンもしくはドキソルビシン＋Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（ドキソルビシン誘起細胞死の免疫原性を低下させる汎カスパーゼ阻害剤（Casares, N. et al. J. Exp. Med. 202, 1691-701 (2005)、および図１Ｂ））で短時間（４時間）処理した細胞から、ビオチン化表面タンパク質をアフィニティ精製した。２Ｄ電気泳動（図２Ａ）およびそれに続く質量分析の比較により、ドキソルビシンによって強く（６倍）誘導されるが、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋと組み合わせたドキソルビシンによってはより少なく（１．８倍）誘導されるタンパク質としてのＣＲＴの同定が導かれた（図２Ｂ）。その表面露出がドキソルビシンによって特異的に誘導された別のタンパク質はＥＲｐ５７として同定され（図２Ａ）、これはＣＲＴ相互作用シャペロンである（Bedard, K., Szabo, E., Michalak, M. & Opas, M. Int Rev Cytol 245, 91-121 (2005)）。２Ｄゲルのイムノブロット分析（示さず）および精製形質膜表面タンパク質の従来の電気泳動（図２Ｃ）によって、アントラサイクリンでの処理後のＣＲＴの表面露出が確認された。このＣＲＴ表面露出は、アントラサイクリン処理生細胞の免疫蛍光染色によっても検出可能であり（図２Ｄ）、そして細胞内ＣＲＴの存在量における一般的増加を伴わなかった（図２Ｃ、Ｄ）。アントラサイクリンによるＣＲＴ露出の誘導は迅速なプロセスであり、処理の１時間後ほど早くに検出可能であり（図１Ｓ  Ａ、Ｂ）、従ってアポトーシス関連ホスファチジルセリン（ＰＳ）露出に先行した（図１Ｓ  Ｃ、Ｄ）。ＣＲＴ露出はＣＤ４７発現における変化とは相関しなかった（図２Ｃ）。注目すべきことに、細胞表面におけるＣＲＴの出現（４時間目測定）と２０個の異なるアポトーシス誘導物質のパネルによって誘起される免疫原性との間に強い正の直線相関（ｐ＜０．００１）が存在した（図２Ｅ）。
【０１７９】
実施例２：死滅している腫瘍細胞のＤＣ媒介認識のためのＣＲＴの必要性。
「食誘引」シグナルとしてのＣＲＴの確立された役割の観点から（Gardai, S.J. et al. Cell 123, 321-34 (2005)  ; Ogden, C.A. et al. J Exp Med 194, 781-95 (2001)）、本発明者らは、アポトーシス腫瘍細胞に対する免疫応答を開始するために厳密に必要とされる細胞型である、ＤＣによるアントラサイクリン処理腫瘍細胞のファゴサイトーシスにおけるＣＲＴの可能な関連をさらに調べることを決意した（Steinman, R.M., Turley, S., Mellman, I. & Inaba, K. J Exp Med. 191, 411-6 (2000); Casares, N. et al. J. Exp. Med. 202, 1691-701 (2005)）。アントラサイクリン処理腫瘍細胞は、ＤＣによって貪食される特性を、迅速に、アポトーシス変化の顕在化の十分に前に、ドキソルビシンまたはミトキサントロンでの処理後数時間以内に獲得し（図３Ａ、図２Ｓ  Ａ）、これはＣＲＴの迅速な誘導（図３Ｂ、図１Ｓ  Ａ、Ｂ）および免疫原性の獲得（図２Ｓ  Ｂ）と相関した。異なる細胞死誘導物質のパネルで処理した腫瘍細胞の表面上のＣＲＴの存在は、そのＤＣ媒介ファゴサイトーシスと強く相関し、このことはＤＣによる腫瘍細胞の取り込みの媒介においてＣＲＴが重要であることを示唆する（図３Ｂ）。従って、トリ起源由来の特異的抗体（これはマウスＦｃ受容体と相互作用できない）によるミトキサントロン処理癌細胞の表面上に存在するＣＲＴの遮断は、ＤＣによるそのファゴサイトーシスを阻害した（図３Ｃ）。同様に、特異的ｓｉＲＮＡを用いるＣＲＴのノックダウンは（図３Ｄ、Ｅ）、アントラサイクリン処理腫瘍細胞のファゴサイトーシスを抑制した（図２Ｆ）。細胞の表面に結合する組換えＣＲＴタンパク質（ｒＣＲＴ）の添加は、ＣＲＴ特異的ｓｉＲＮＡによって誘導された欠損を、ＣＲＴ発現（図３Ｅ）およびＤＣによるファゴサイトーシス（図３Ｆ）の両方のレベルで逆転させることができた。注目すべきことに、ｒＣＲＴ単独は、広範囲の濃度にわたってエキソビボでＤＣ成熟を促進できなかった。従って、表面ＣＲＴはＤＣによるファゴサイトーシスを誘起する。
【０１８０】
実施例３：死滅している腫瘍細胞の免疫原性のためのＣＲＴの必要性。
ＣＲＴのノックダウンはミトキサントロン処理ＣＴ２６細胞の免疫原性を損ない、そしてこの欠損は、ｒＣＲＴを使用して、ＣＲＴ特異的ｓｉＲＮＡによって誘導されるＣＲＴ欠損を相補した場合に回復された。この結果は以下の２つの異なる実験系、すなわち（ｉ）ＣＴ２６腫瘍細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの側腹部中に注射（またはＭＣＡ２０５細胞をＣ５７Ｂｌ／６マウス中に注射（示さず））して、抗腫瘍ワクチン接種の効力を評価した場合（図４Ａ）、および（ｉｉ）腫瘍細胞を足蹠中に注射して、膝窩リンパ節由来のＴ細胞によるインターフェロンγ産生を測定した場合（図４Ｂ）、において得られた。この後者の系において、ｒＣＲＴの形質膜表面への吸収は、マイトマイシン処理細胞のような通常は免疫応答を誘導できない細胞の免疫原性を大いに増強した（図４Ｃ）。同様に、ｒＣＲＴでコートしたエトポシド処理細胞は、エトポシドで処理した偽コート細胞の免疫原性が乏しかった条件で、活発な抗腫瘍免疫応答をインビボで誘起した（図４Ｅ）。しかし、細胞死誘導物質での事前処理なしでの細胞表面へのｒＣＲＴの吸収は、抗癌免疫応答を誘起できず、そしてマウス中へ接種した生ｒＣＲＴ事前処理細胞は、免疫適格性（図４Ｅ）および免疫不全（示さず）両方のマウスにおいて腫瘍を形成した。従って、ＣＲＴはインビボで細胞死の免疫原性を決定的に決定するが、細胞死自体は決定しない。
【０１８１】
実施例４：ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４の阻害剤はＣＲＴ露出を誘導しそして免疫原性を誘導する。
アントラサイクリン誘導ＣＲＴ露出はいくぶん迅速なプロセスであるので（１時間以内、図１ＳＡ、１ＳＢ）、本発明者らは、アントラサイクリンが、遺伝子毒性ストレスによって媒介されない効果を発揮し得ると考えた。ミトキサントロンに応答して、除核細胞（細胞質体）はすぐに（１時間以内に）ＣＲＴを露出し（図５Ａ）、そしてインタクトな細胞ほど効率的に（図３Ａ）ＤＣの餌食になり（示さず）、このことは細胞質（非核）アントラサイクリン標的の存在を示す。アントラサイクリンは即時性ミトコンドリアストレスを誘導することができなかったが（示さず）、典型的にはストレスキナーゼの活性化に起因するＥＲストレスにおいて過剰リン酸化されるタンパク質であるｅＩＦ２α（Zhang, K. & Kaufman, R.J. J Biol Chem 279, 25935-8 (2004)）の迅速なリン酸化を引き起こした（図５Ｂ）。ｅＩＦ２αをリン酸化することが知られている４つのキナーゼ（ＧＣＮ２、ＨＲＩ、ＰＥＲＫ、ＰＫＲ）のノックダウンは、アントラサイクリン刺激ＣＲＴ露出を阻害できなかった（示さず）。対照的に、ＧＡＤＤ３４またはプロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニット（これらは一緒に、ｅＩＦ２αの脱リン酸化に関与するＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体を形成する）のいずれかのノックダウンは（図５Ｃ）、ＣＲＴ露出を誘導するために十分であった（図５Ｄ、および示さず）。ＰＰ１またはＧＡＤＤ３４の枯渇によって引き起こされるＣＲＴ露出はミトキサントロンによってさらには増強されず（図５Ｄ）、このことはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４およびアントラサイクリンが同じ経路に作用して、ＣＲＴの細胞表面への移行を誘起することを示唆する。ＣＲＴ露出は化学的ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤、すなわちトートマイシン、カリクリンＡ（これらの両方はＰＰ１の触媒サブユニットを阻害する）（Gupta, V., Ogawa, A.K., Du, X., Houk, K.N. & Armstrong, R.W. J Med Chem 40, 3199-206 (1997)）ならびにサルブリナル（これはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体を阻害する）（Boyce, M. et al. Science 307, 935-9 (2005)）によって効率的に誘導された（図５Ｅ）。全てのこれらのＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤は、アントラサイクリンと同様な迅速なキネティクスで、細胞中（図５Ｅ）および細胞質体中の両方でＣＲＴ露出を誘導した。ミトキサントロンおよびサルブリナルは、マウス（ＭＣＡ２０５、Ｂ１６Ｆ１０、Ｊ５５８）またはヒト（ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６）起源由来の腫瘍細胞株のパネル上でのＣＲＴ露出を誘導した。アントラサイクリンおよびＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤によって誘導されるＣＲＴ露出は、転写、翻訳または微小管の阻害剤によっては影響を及ぼされなかったが、アクチン細胞骨格およびエキソサイトーシスの阻害剤であるラトランクリンＡによって損なわれた（図３Ｓ）。サルブリナル、カリクリンＡまたはトートマイシンでのＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害は免疫原性細胞死を誘導するために十分ではなかった（図５Ｆ、Ｇ）（そして、死滅しなかった細胞は動物中に注射した場合に致死的な腫瘍を形成した）。しかし、これらの阻害剤は、ＣＲＴ露出（図５Ｆ）、およびエトポシド（図５Ｇ）またはマイトマイシンＣ（示さず）のために死滅する細胞の免疫原潜在性を大いに増強し、そしてこの免疫刺激効果はＣＲ��をノックダウンすることによって抑止された（図５Ｇ）。全体で、これらの結果はＰＰ１／ＧＡＤＤ３４の阻害がＣＲＴ露出を誘導し、これが次に抗腫瘍免疫応答を刺激できることを実証する。
【０１８２】
実施例５：ＣＲＴまたはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤のインビボ適用による免疫原性化学療法。
確立された１４日齢ＣＴ２６腫瘍中へのミトキサントロンの単回腫瘍内注射は、腫瘍が免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてた確立された場合、全てではないにしてもいくつかの場合にその永久退縮を引き起こすことができた（図６Ａ）。しかし、腫瘍が免疫不全ｎｕ／ｎｕマウスによって保有された場合、ミトキサントロンによる治癒は存在しなかった（図６Ｂ）。ｒＣＲＴ、サルブリナル、トートマイシン、エトポシドまたはマイトマイシンＣの腫瘍内注射は、免疫適格性マウスにおいてもｎｕ／ｎｕマウスにおいても大きな治療効果を有さなかった。しかし、細胞死誘導物質（エトポシドまたはマイトマイシンＣ）＋ｒＣＲＴの組み合わせは、免疫適格性動物において（免疫不全動物においてではなく）、腫瘍退縮を引き起こすことができた。治療効果を得るために、ｒＣＲＴを腫瘍中に注射しなければならなかった。遠位部位中に注射したｒＣＲＴは、腫瘍内に注射したエトポシドの抗腫瘍効果を改善しなかった（図６Ｃ）。同様に、エトポシドまたはマイトマイシンＣをＣＲＴ露出を誘導する薬物（サルブリナルまたはトートマイシン）と組み合わせることができ、免疫適格性宿主において（無胸腺宿主においてではなく）安定な疾患または完全な腫瘍退縮が導かれた（図６Ａ、Ｂ）。生ＣＴ２６細胞はＣＴ２６腫瘍から治癒された動物中で増殖できず、このことは永久抗腫瘍免疫応答の確立を示す。同様な結果が、確立されたＭＣＡ２０５肉種（Ｃ５７Ｂｌ／６マウス中）またはＰＲＯ結腸癌腫（ＢＤＩＸラット中）を、弱く免疫原性の細胞死誘導物質＋ｒＣＲＴまたはＰＰ１／ＧＡＤＤ３４阻害剤の局所注射によって処理した場合に得られた（示さず）。これらの結果は、確立された癌の治癒のための免疫原性化学療法のストラテジーを描く。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１ＳＡ】
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【図１ＳＢ】
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【図１ＳＣ】
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【図１ＳＤ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｅ】
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【図２ＳＡ】
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【図２ＳＢ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｓ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図８】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年5月11日(2009.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における癌を予防または処置するための医薬組成物を調製するための、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤、ＧＡＤＤ３４の阻害剤およびＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤から選択されるプロテインホスファターゼ阻害剤の使用であって、医薬組成物が癌の処置において使用される産物との組み合わせでの投与に意図される、使用。
【請求項２】
阻害剤が、トートマイシンおよびカリクリンＡから選択されるプロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）の触媒サブユニットの阻害剤である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
阻害剤が、サルブリナルおよび配列番号１の５〜３５アミノ酸に含まれる配列に存するＧＡＤＤ３４のフラグメントから選択されるＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の阻害剤である、請求項１記載の使用。
【請求項４】
ＧＡＤＤ３４のフラグメントが、配列ＬＫＡＲＫＶＲＦＳＥＫＶ（配列番号２）を有する、請求項３記載の使用。
【請求項５】
ＧＡＤＤ３４のフラグメントが、腫瘍細胞の表面に結合できる形質膜移行モチーフをさらに含む、請求項３または４記載の使用。
【請求項６】
腫瘍細胞が、癌腫、肉腫、リンパ腫、黒色腫、小児腫瘍または白血病腫瘍に由来する、請求項５記載の使用。
【請求項７】
移行モチーフの配列が、ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ（配列番号３）である、請求項５または６記載の使用。
【請求項８】
ペプチドの配列が、ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ−ＬＫＡＲＫＶＲＦＳＥＫＶ（配列番号４）である、請求項３〜７のいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
癌の処置が、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、特異的キナーゼ阻害剤に基づく療法、抗血管新生剤に基づく療法、およびモノクローナル抗体に基づく療法から選択される、請求項１〜８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
癌の処置が化学療法である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
化学療法が、アントラサイクリン、免疫応答モジュレーター、ホルモンおよびチロシンキナーゼ阻害剤から選択される産物を使用する、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
産物が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシンおよびミトキサントロンから選択されるアントラサイクリンである、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
癌が、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓癌、肺癌、骨肉種、ＧＩＳＴ、黒色腫、白血病および神経芽細胞腫から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項記載の使用。
【請求項１４】
細胞におけるＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の形成または活性を阻害できるペプチドを選択するためのインビトロ方法であって、以下の工程：
ａ）配列番号１内のフラグメント配列またはその相同フラグメントを含む試験ペプチドを提供する工程、
ｂ）工程ａ）の試験ペプチドを細胞と接触させる工程、および
ｃ）細胞の表面上のカルレティキュリン（ＣＲＴ）、ＫＤＥＬ受容体および／またはＥＲｐ５７の露出を検出するおよび／またはそのレベルを測定する工程であって、試験ペプチドと接触させられていないかまたは試験ペプチドの変異体と接触させられたコントロール細胞と比較して増強された露出が、細胞におけるＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体の形成または活性の阻害の指標となる、工程
を含む方法。
【請求項１５】
工程ａ）の配列が５〜３５アミノ酸を含む、請求項１４記載の方法。
【国際調査報告】
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