(57)【要約】  本発明は、概して、肥満及び脂肪異栄養症のマーカーに関する。特に、そのようなマーカーとして、ＳＬＵＧ遺伝子の発現レベル又はその発現産物を使用することができる。さらに、本発明は、追加的に、上記病理についての治療及び診断の標的としてのＳＬＵＧの使用に関する。さらに本発明は、哺乳動物におけるＳＬＵＧタンパク質又はＳＬＵＧ遺伝子の活性又はレベルを変調させることを含んでなる、哺乳動物中の増加又は減少した脂肪貯蔵に関連した障害を治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるＳＬＵＧタンパク質又はＳＬＵＧ遺伝子の活性又はレベルを変調させることを含んでなる、哺乳動物中の増加又は減少した脂肪貯蔵に関連した障害を治療する方法。
【請求項２】
ＳＬＵＧタンパク質の活性を増加させるか又はＳＬＵＧ遺伝子の転写又は翻訳を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＳＬＵＧタンパク質の活性を減少させるか又はＳＬＵＧ遺伝子の転写又は翻訳を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＳＬＵＧタンパク質、ＳＬＵＧタンパク質の修飾型、又はＳＬＵＧタンパク質の機能同等物を哺乳動物へ投与することを含んでなる、請求項１〜３のいずれにも記載の方法。
【請求項５】
ＳＬＵＧタンパク質の機能同等物が、正常なＳＬＵＧタンパク質により保有される活性の１以上において増加を示す、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＳＬＵＧタンパク質の機能同等物が、正常なＳＬＵＧタンパク質により保有される活性の１以上において減少を示す、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ＳＬＵＧタンパク質の活性を変調させるか又はＳＬＵＧ遺伝子の転写及び／又は翻訳を変調させる化合物を哺乳動物へ投与することを含んでなる、請求項１〜３のどの１項にも記載の方法。
【請求項８】
化合物が、ＳＬＵＧタンパク質の活性を上方調節するか又はＳＬＵＧ遺伝子の転写及び／又は翻訳を上方調節する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
化合物が、ＳＬＵＧタンパク質の活性を下方調節するか又はＳＬＵＧ遺伝子の転写及び／又は翻訳を下方調節する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
障害が肥満である、請求項１、３、４、６、７又は９に記載の方法。
【請求項１１】
障害が食欲不振である、請求項１〜２、４〜５又は７〜８に記載の方法。
【請求項１２】
障害が脂肪異栄養症である、請求項１〜８のどの１項にも記載の方法。
【請求項１３】
化合物が、アンチセンスＳＬＵＧ  ｍＲＮＡ、リボザイム、三重らせん分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗ＳＬＵＧ抗体、ＳＬＵＧタンパク質の活性を調節する酵素又はタンパク質、及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１０又は請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
化合物が、ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質、ｃ−Ｋｉｔタンパク質、ＦＧＦ１タンパク質、ＶＥＧＦ１６５、ＳＣＦ、ｎｇｎ３タンパク質、ＦＫＨＲタンパク質、ＰＡＸ３、及びβ−カテニンより選択される、請求項１１又は請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＳＬＵＧタンパク質、ＳＬＵＧタンパク質の修飾型、又はＳＬＵＧタンパク質の機能同等物の、哺乳動物中の増加又は減少した脂肪貯蔵に関連した障害を治療又は予防することへの使用。
【請求項１６】
ＳＬＵＧタンパク質の機能同等物が、正常なＳＬＵＧタンパク質により保有される活性の１以上において増加を示す、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
ＳＬＵＧタンパク質の機能同等物が、正常なＳＬＵＧタンパク質により保有される活性の１以上において減少を示す、請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
ＳＬＵＧタンパク質の活性を変調させるか又はＳＬＵＧ遺伝子の転写及び／又は翻訳を変調させる化合物の、哺乳動物中の増加又は減少した脂肪貯蔵に関連した障害を治療又は予防することへの使用。
【請求項１９】
化合物が、ＳＬＵＧタンパク質の活性を上方調節するか又はＳＬＵＧ遺伝子の転写及び／又は翻訳を上方調節する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
化合物が、ＳＬＵＧタンパク質の活性を下方調節するか又はＳＬＵＧ遺伝子の転写及び／又は翻訳を下方調節する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
障害が食欲不振である、請求項１５又は１６に記載のタンパク質又は請求項１８又は請求項１９のいずれにも記載の化合物の使用。
【請求項２２】
障害が肥満である、請求項１５又は請求項１７に記載のタンパク質又は請求項１８又は請求項２０に記載の化合物の使用。
【請求項２３】
障害が脂肪異栄養症である、請求項１５〜１９のどの１項にも記載のタンパク質の使用。
【請求項２４】
化合物が、アンチセンスＳＬＵＧ  ｍＲＮＡ、リボザイム、三重らせん分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、抗ＳＬＵＧ抗体、ＳＬＵＧタンパク質の活性を調節する酵素又はタンパク質、及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項２２又は請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
化合物が、ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質、ｃ−Ｋｉｔタンパク質、ＦＧＦ１タンパク質、ＶＥＧＦ１６５、ＳＣＦ、ｎｇｎ３タンパク質、ＦＫＨＲタンパク質、ＰＡＸ３、及びβ−カテニンより選択される、請求項２１又は請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
候補化合物を試験用非ヒト哺乳動物へ投与して、試験用非ヒト哺乳動物中の脂肪貯蔵に対する効果をモニタリングすることを含んでなる、ＳＬＵＧタンパク質又はＳＬＵＧタンパク質の機能同等物の活性を変調させるか又はＳＬＵＧ遺伝子の転写又は翻訳のレベルを変調させる化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２７】
試験用非ヒト哺乳動物中の脂肪貯蔵に対する効果をモニタリングすることが、試験用非ヒト哺乳動物中の脂肪組織の量を評価することと、任意選択的に：
（ｉ）第一の試験用非ヒト動物中の脂肪組織の量を同じ種の第二の試験用非ヒト動物と比較すること；又は
（ｉｉ）第一の試験用非ヒト動物中の脂肪組織の量を、プラセボを投与した同じ種の第二の試験用非ヒト動物と比較すること；又は
（ｉｉｉ）第一の試験用非ヒト動物中の脂肪組織の量を候補化合物の投与の前と後で比較することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
脂肪組織が白色脂肪組織である、請求項２７の方法。
【請求項２９】
第一及び／又は第二の試験用非ヒト哺乳動物が、より高い、より低い、又は存在しないレベルのＳＬＵＧポリペプチドを発現するように形質転換されたトランスジェニック又はノックアウト非ヒト哺乳動物である、請求項２６〜２８のいずれか１項の方法。
【請求項３０】
トランスジェニック又はノックアウト非ヒト哺乳動物が、そのゲノム中に、ＳＬＵＧタンパク質をコードする核酸配列を含むトランスジーンを含み、ここで前記トランスジーンの発現は、エフェクター物質により外因的に調節することができる、請求項２９の方法。
【請求項３１】
トランスジーンの発現がテトラサイクリン調節性である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記トランスジェニック又はノックアウト非ヒト哺乳動物が、増加又は減少した脂肪貯蔵に関連した障害に罹患している、請求項２９〜３１のいずれか１項の方法。
【請求項３３】
障害が、肥満、食欲不振、又は脂肪異栄養症である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第一及び／又は第二の試験用非ヒト動物が齧歯動物である、請求項２６〜３３のいずれもの方法。
【請求項３５】
齧歯動物がマウス又はラットである、請求項３４の方法。
【請求項３６】
候補化合物と細胞を接触させて、細胞中の脂質蓄積の量をモニタリングすることを含んでなる、ＳＬＵＧ遺伝子からの転写又は翻訳のレベルを変調させるか又はＳＬＵＧタンパク質又はＳＬＵＧタンパク質の誘導体の活性を変調させる化合物をスクリーニングする方法。
【請求項３７】
細胞が、請求項２９〜３５のいずれか１項において特性決定されるようなトランスジェニック又はノックアウト非ヒト哺乳動物に由来する、請求項３６の方法。
【請求項３８】
細胞が胚線維芽細胞である、請求項３７の方法。
【請求項３９】
細胞がマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）である、請求項３８の方法。
【請求項４０】
細胞がヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）である、請求項３６の方法。
【請求項４１】
細胞に対する効果をモニタリングすることが、所望により細胞中のＰＰＡＲγ２のレベルをモニタリングすることを含む、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
請求項２６〜４１のいずれか１項の方法により入手されるか又は入手可能である、ＳＬＵＧ遺伝子からの転写又は翻訳のレベルを変調させるか又はＳＬＵＧタンパク質又はＳＬＵＧタンパク質の誘導体の活性を変調させる化合物。
【請求項４３】
請求項４〜６のいずれか１項に定義されるようなタンパク質、請求項７〜９、１３、又は１４のどの１項にも定義されるような化合物、又は請求項４２に記載の化合物を含んでなる医薬組成物。
【請求項４４】
医薬品としての使用のための、請求項４２に記載の化合物。
【請求項４５】
請求項４２に記載の化合物の、増加又は減少した脂肪貯蔵に関連した障害を治療又は予防するための医薬品の製造における使用。
【請求項４６】
障害が、肥満、食欲不振、又は脂肪異栄養症である、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
請求項４２に記載の化合物又は請求項４３に記載の化合物を投与することを含んでなる、哺乳動物中の脂肪貯蔵を改変させるための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、肥満及び脂肪異栄養症のマーカーに関する。特に、そのようなマーカーとして、ＳＬＵＧ遺伝子の発現レベル又はその発現産物を使用することができる。さらに、本発明は、追加的に、上記病理についての治療及び診断の標的としてのＳＬＵＧの使用に関する。本発明はまた、ＳＬＵＧを調節されたやり方で発現するトランスジェニック非ヒト動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、その健康への意義のために重大な公衆衛生問題となっている。太りすぎ又は肥満であることは、多くの疾患と関連状態のリスクを増加させる。故に、脂肪組織の発生及び機能を制御する分子機序についてさらに知ることは、肥満の原因、予防、及び治療を理解するのに重要な目標である。
【０００３】
これまでの研究から、脂肪細胞分化に関与するいくつかの転写因子が同定されている。これらには、ＰＰＡＲγとＣ／ＥＢＰファミリーの転写因子のメンバーが含まれる（Morrison and Farmer, 2000; Rosen et al., 2000）。脂肪細胞の分化を制御する遺伝子調節ネットワークの成分の多くが培養３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞と一次マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の研究において解明されてきたが、最近の証拠は、in vivo では追加の因子が必要となる可能性があることを示唆する（Soukas et al., 2001; Chen et al., 2005）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
脂肪細胞の分化を制御する遺伝子調節ネットワークの成分の多くが培養３Ｔ３−Ｌ１の研究において解明されてきたが、脂肪細胞の発生を in vivo で制御する発生シグナルについてはほとんど知られていない。本研究では、in vivo 及び in vitro の脂肪生成においてＳＬＵＧが果たす重要な役割を初めて立証する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第一の側面により、哺乳動物におけるＳＬＵＧタンパク質又はＳＬＵＧ遺伝子の活性又はレベルを変調させることを含んでなる、哺乳動物中の増加又は減少した脂肪貯蔵に関連した障害を治療する方法を提供する。この活性又はレベルは、増加させても減少させてもよい。
【０００６】
本研究において、発明者は、ＳＬＵＧがヒト白色脂肪組織（ＷＡＴ）において発現されることを見出した。異なるボディマス指数（ＢＭＩ）のドナーより単離したヒトの皮下脂肪組織においてＳＬＵＧ発現を確認した。驚くべきことに、発明者は、より高いＢＭＩのドナーでＳＬＵＧ発現がより高いことを見出した。この観測結果は、定量リアルタイムＰＣＲによって確認されて、ＳＬＵＧの発現がヒトとマウスの両方のＷＡＴにおける共通の所見であることを示し、ＷＡＴ発生におけるＳＬＵＧの役割を示唆する。
【０００７】
次いで、発明者は、脂肪細胞分化の間のＳＬＵＧの発現を検証することによって、ＷＡＴ発生におけるＳＬＵＧの機能を特性決定した。３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞は、混合したホルモン刺激への曝露時に成熟脂肪細胞へ分化することができる、脂肪細胞分化の十分に特性決定された in vitro モデルである。ＳＬＵＧ発現は、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞のホルモン誘発性分化の前にきわめて高いことが示されて、ＳＬＵＧ  ｍＲＮＡ及びタンパク質の量はこのホルモン刺激の間に減少して、ＳＬＵＧが前脂肪細胞の分化の間に時間的及び空間的にしっかりと制御されていることを示唆し、ＳＬＵＧが脂肪生成に必要とされることをさらに示唆した。
【０００８】
ジンクフィンガー転写因子のＳＬＵＧ（ＳＮＡＩ２とも呼ばれる）は、正常な発生と腫瘍発生の重要なレギュレーターとして知られている（Sefton et al., 1998; Sanchez-Martin et al., 2004）。ＳＬＵＧは、幹細胞機能の重要な側面を制御して、類似の機序が正常な発生と癌の幹細胞の特性を制御し得ることを示唆する（Inoue et al., 2002; Perez-Losada et al., 2002; Perez-Losada et al., 2003; Perez-Mancera et al., 2005）。ＳＬＵＧ（ＳＮＡＩ２）の生後発現とＳＬＵＧの欠失及び過剰発現の効果は、マウスとヒトで類似していることが示された（Cohen et al., 1998; Perez-Losada et al., 2002; Sanchez-Martin et al., 2002; Oram et al., 2003; Sanchez-Martin et al., 2003; Perez-Mancera et al., 2005; Perez-Mancera et al., 2006）。最近の研究は、神経堤及び造血系が含まれる多くの部位においてＳＬＵＧが時間的及び空間的にしっかりと制御されていることを示した（Inoue et al, 2002; Perez-Losada et al., 2002）。主な成体組織では、マウスの白色脂肪組織（ＷＡＴ）にＳＬＵＧ遺伝子の転写産物が存在していることが示された（Perez-Mancera et al., 2005）が、この組織の分化における役割については今日まで解明されていない。
【０００９】
発明者はＳＬＵＧ欠損マウスについて分析して、ＷＡＴ発生におけるＳＬＵＧ発現の効果を決定した。ＳＬＵＧ欠損マウスは、野生型マウスよりずっと少ないＷＡＴ量を担うことが示され、ＳＬＵＧがＷＡＴ発生において in vivo でもある役割を果たすことを示した。さらに、ＳＬＵＧ欠損マウスは、高脂肪食により誘導される肥満に対して保護されることが見出された。ＳＬＵＧ欠損マウスにおけるＷＡＴ量の減少がＳＬＵＧの非存在により引き起こされることを確かめるために、トランスジェニックＳＬＵＧをＷＡＴ組織において発現する、テトラサイクリン抑止可能ＳＬＵＧトランスジーン（Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ）を担うマウスとＳＬＵＧ欠損マウスを交配した。ＷＡＴ表現型は、ＳＬＵＧ欠損マウスにおいて、ＳＬＵＧを発現することによってレスキューされることが見出された。
【００１０】
これらの結果と一致して、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウスは、著しく増加したＷＡＴ量を明示して、ＳＬＵＧ発現が脂肪組織サイズを変調させるという仮説を裏付けた。従って、ＳＬＵＧ発現を調節し得ないことは、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウスが肥満を発症する理由を説明するように思われる。発明者は、ＳＬＵＧ過剰発現の撤廃により、ＳＬＵＧにより誘導されるＷＡＴ改変が逆転することをさらに示した。
【００１１】
これらの in vivo データと一致して、ＳＬＵＧ欠損ＭＥＦは、野生型ＭＥＦと比較して、劇的に低下した in vitro 脂肪生成の能力を示した。対照的に、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ  ＭＥＦにおいては、甚だしい脂質蓄積があった。
【００１２】
ＳＬＵＧがＷＡＴ発生を制御する分子機序について分析すると、脂肪細胞の分化の経過の間に、ＳＬＵＧ欠損及びＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウスのＷＡＴの in vivo と、そしてＳＬＵＧ欠損ＭＥＦ及びＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ  ＭＥＦの in vitro の両方でＰＰＡＲγ２発現が改変されることを見出した。総括すると、上記の結果は、ＳＬＵＧが、ＰＰＡＲγ２発現に影響を及ぼすことによってＷＡＴ発生を変調させることを示唆する。ＳＬＵＧ欠損ＭＥＦにおける相補性試験によりこの調節を確認したが、Ｓｌｕｇは、ＰＰＡＲγ２プロモーターを含有するレポーターベクターからの転写を活性化することができなかった。Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ及びＳｌｕｇ欠損マウスのＷＡＴにおけるヒストンアセチル化状態を測定すると、脂肪組織におけるＳｌｕｇ遺伝子発現とヒストンアセチル化状態の間に相関性が確認された。この観測結果は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）をＳｌｕｇにより変調される遺伝子調節のメディエーターとして関連づけた最近の研究（Peinado et al., 2004; Bermejo-Rodriguez et al., 2006）と一致して、Ｓｌｕｇが実際にＰＰＡＲγ２遺伝子プロモーターで動員されるのかどうかを探究することを発明者に促した。本明細書に開示するクロマチン沈殿（ＣｈＩＰ）実験は、ＳｌｕｇとＨＤＡＣ１がＷＡＴ中のインタクトなクロマチンにおいて内因性ＰＰＡＲγ２プロモーターへ結合していることを示して、組織及びＳｌｕｇ依存的なやり方でのＰＰＡＲγ２プロモーターへの示差的なＨＤＡＣ動員を確認した。これらの観測結果と一致して、ＣｈＩＰ分析は、Ｓｌｕｇ依存的なやり方での、ＰＰＡＲγ２プロモーターでの示差的なＨ３アセチル化を裏付けた。
【００１３】
出願人はこの理論に束縛されることを望まないが、ＰＰＡＲγ２遺伝子発現へのＳｌｕｇ要求性に関する最も直截的なモデルは、ＰＰＡＲγ２遺伝子へのＳｌｕｇ結合の不足が、この遺伝子の発現をヒストン脱アセチル化により抑圧するサイレンシング複合体の形成をもたらすことであると仮定されている。このことに臨床上の意義があり得るのは、ＨＤＡＣ阻害剤が、臨床試験において患者に十分忍容される用量で活性を有する薬物だからである（Marks and Jiang, 2005）。このモデルに一致して、ヒストンデアセチラーゼの下方調節が脂肪細胞分化を刺激することが示された（Yoo et al., 2006）。故に、ＨＤＡＣ阻害剤は、減少した脂肪保存と関連した障害の治療に使用してよい。
【００１４】
故に、本発明のさらなる側面において、ＰＰＡＲγ２遺伝子からの転写のレベルを変調させることを含んでなる、減少した脂肪保存に関連した障害を哺乳動物において治療する方法を提供する。好ましくは、ＰＰＡＲγ２遺伝子からの変調は、ＨＤＡＣ阻害剤を使用して達成する。当業者が理解するように、当該技術分野で知られている数多くのＨＤＡＣ阻害剤がある。例には、酪酸塩及びフェニル酪酸塩、バルプロ酸塩のような短鎖脂肪酸；トリコスタチン、ＳＡＨＡとその誘導体、オキサムフラチン、ＡＢＨＡ、スクリプタイド、ピロキサミド、プロペンアミドのようなヒドロキサム酸；トラポキシン、ＨＣ毒素、クラミドシン、ジヘテロペプチン、ＷＦ−３１６１、Ｃｙｌ−１及びＣｙｌ−２のようなエポキシケトン含有環状テトラペプチド；ＦＲ９０１２２８、アピシジン、環状ヒドロキサム酸含有ペプチド（ＣＨＡＰ）のような非エポキシケトン含有環状テトラペプチド；ＭＳ−２７５（ＭＳ−２７−２７５）、ＣＩ−９９４と他のベンズアミド類似体、デプデシン及び有機イオウ化合物が含まれるベンズアミド類が含まれる。好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＡＰＨＡ化合物８、アピシジン、酪酸ナトリウム、（−）−デプデシン、スクリプタイド、シルチノール、及びトリコスタチンＡを含んでなる群より選択される。
【００１５】
上記の様々な結果は、ＳＬＵＧが in vitro と in vivo の両方での脂肪細胞分化の重要なレギュレーターであるという証拠を提供して、ＳＬＵＧ発現の厳格な制御の損失がマウスにおいて肥満及び／又は脂肪異栄養症を誘発する可能性があることを示す。故に、ＳＬＵＧ遺伝子発現又はＳＬＵＧ遺伝子活性の全体的又は部分的な抑圧は、脂肪保存に関連したあらゆる障害を治療又は予防するのに有用である可能性がある。特に、そのような状態には、肥満、食欲不振、及び脂肪異栄養症が含まれる。ＳＬＵＧがヒト白色脂肪においても発現されているという本明細書での実証に照らせば、このことは、これら病態のヒトにおける治療へ標的指向される医薬品の開発へのきわめて重要なリードを提供する。特に、脂肪保存の減少に関連した障害（例、食欲不振）では、この障害に罹患している患者を、該患者におけるＳＬＵＧ遺伝子からの発現を増加させること、ＳＬＵＧを該患者へ投与すること、又はＳＬＵＧ活性のアゴニストとして作用する化合物を該患者へ投与することによって治療することが望ましい。逆に、脂肪保存の増加に関連した障害（例、肥満）では、この障害に罹患している患者を、該患者におけるＳＬＵＧ遺伝子からの発現を減少させること、又はＳＬＵＧ活性へのアンタゴニストとして作用する化合物を該患者へ投与することによって治療することが望ましい。
【００１６】
本発明の第一の側面の１つの態様において、本方法は、ＳＬＵＧタンパク質、又はＳＬＵＧ突然変異体又はＳＬＵＧタンパク質の修飾型のようなＳＬＵＧタンパク質の機能同等物を哺乳動物へ投与することを含む。ＳＬＵＧタンパク質の機能同等物は、野生型ＳＬＵＧタンパク質が保有する活性の１以上において増加又は減少のいずれも示してよい。
【００１７】
用語「ＳＬＵＧポリペプチド」及び「ＳＬＵＧタンパク質」は、正常増殖と腫瘍増殖の重要なレギュレーターである、ジンクフィンガー転写因子のＳＬＵＧファミリーの一員を意味する。ＳＬＵＧは、幹細胞機能の重要な側面を制御する。ヒトＳＬＵＧタンパク質のアミノ酸配列は、知られている（例えば、ＮＣＢＩ、登録番号ＡＡＢ５８７０５を参照のこと）。
【００１８】
用語「ＳＬＵＧ遺伝子」は、ＳＬＵＧタンパク質をコードする遺伝子を意味する。ヒトＳＬＵＧ遺伝子のヌクレオチド配列は、知られていて（例えば、ＮＣＢＩ、登録番号Ｕ９７０６０を参照のこと）、これは、本明細書に言及する本発明の側面における使用に好ましい遺伝子である。
【００１９】
用語「活性」は、ＳＬＵＧタンパク質に関連して使用されるとき、野生型タンパク質が保有するあらゆる活性を意味する。そのような活性には、特別な配列規定コンセンサス部位でＤＮＡへ特異的に結合するタンパク質の能力、並びに、そのようなＤＮＡから転写を誘導するその能力が含まれる。そのようなＤＮＡ配列には、既知のＤＮＡプロモーター配列が含まれる。本発明のこの側面の好ましい態様において、ＳＬＵＧタンパク質は、Ｅ−カドヘリンプロモーターへ結合して、それからの転写を誘導する。故に、本発明では、分析的に検出可能なタンパク質をＥ−カドヘリンプロモーターの制御下に置いて使用して、ＳＬＵＧタンパク質のアゴニスト及びアンタゴニストを同定して試験することが想定される。好ましいタンパク質には、限定されないが、ルシフェラーゼと緑色蛍光タンパク質が含まれる。さらなる活性には、他のタンパク質へ結合するＳＬＵＧタンパク質の能力が含まれる。特に、本発明の文脈において、用語「活性」は、脂肪生成を誘導するタンパク質の能力と、故に、哺乳動物に存在する脂肪組織の量を増加させるその能力も意味する。用語「脂肪生成」は、脂肪又は脂肪組織の生成を意味する。それはまた、脂肪前駆細胞の成熟した白色又は褐色脂肪組織への発生を意味する。
【００２０】
正常なＳＬＵＧタンパク質が保有する活性の１以上において減少を示すタンパク質は、正常なＳＬＵＧの作用を阻害するのに有用であり得る。例えば、そのようなタンパク質は、ＤＮＡへ結合する能力を保持し得るが、前記ＤＮＡからの転写を活性化する能力を失うかもしれない。故に、そのようなタンパク質は、正常なＳＬＵＧへの競合阻害剤として作用する可能性がある。
【００２１】
用語「機能同等物」は、本明細書に使用するように、機能同等物のものである配列に類似した機能を有するタンパク質配列を意味する。「類似した機能」は、それらの配列が、例えば、脂肪生成の調節では、共通の機能を、そしていくつかの態様では、共通の進化の起源を共有することを意味する。用語「機能同等物」には、ある分子のすべての断片、突然変異体、雑種体、変異体、類似体、又は化学誘導体が含まれると企図される。
【００２２】
いくつかの態様において、機能的に同等な配列は、機能同等物のものである配列との配列同一性を示す場合がある。好ましくは、機能同等物と機能同等物のものである配列の間の配列同一性は、機能同等物の長さの全域で少なくとも５０％である。より好ましくは、同一性は、機能同等物の長さの全域で少なくとも６０％である。なおより好ましくは、同一性は、機能同等物の長さの全域で７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％より大きい。
【００２３】
機能同等物には、機能同等物のものである、即ち、前記配列からのアミノ酸置換、挿入、又は欠失を含有するが、機能は保持されている、配列の突然変異体が含まれる。機能同等物のものである配列に比較して改善された機能がある機能同等物は、前記配列中の特定残基の体系的又は指向性の突然変異を介して設計してよい。機能同等物には、配列の機能又は活性に不都合なやり方では影響しない保存的アミノ酸置換を含有する配列が含まれる。特に好ましい突然変異体は、少なくとも１、好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のアミノ酸が野生型ＳＬＵＧ配列より改変されたものである。
【００２４】
機能同等物には、ＳＬＵＧタンパク質の断片が含まれる。例えば、ＳＬＵＧタンパク質は、その活性に重要である機能性ドメインを保持するように、片端又は両端で切断してよい。そのような断片は、Ｎ末端及びＣ末端の一方又は両方のいずれでも、例えば、１０と３０の間のアミノ酸、１５と２５の間のアミノ酸、又はほぼ２０のアミノ酸だけ末端切断してよい。
【００２５】
ＳＬＵＧタンパク質又は機能同等物は、単離ペプチドとしても、他の実体との融合物としても作用することができる。本発明の文脈に使用されるどのペプチドも、典型的には、例えば、１０と５００の間のアミノ酸からなるポリペプチドである。ポリペプチドは、好ましくは、２００以下（例えば、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１以下、又１０以下）のアミノ酸からなる。本発明による使用に特に好ましいポリペプチドの詳細について、下記に示す。
【００２６】
上記に言及したような融合タンパク質のパートナー実体には、例えば、分子のＳＬＵＧ成分へ追加の機能を付与する機能性実体が含まれ、Ｆｃドメイン、薬物部分、分子へ追加の安定性を付与する成分、抗体又はその断片のような標的指向ドメイン、等が含まれる。他の例も、当業者に明らかであろう。
【００２７】
用語「ＳＬＵＧ遺伝子の転写産物」は、ＳＬＵＧ遺伝子のｍＲＮＡを意味する。
用語「ＳＬＵＧ遺伝子の翻訳産物」は、ＳＬＵＧタンパク質を意味する。しかも、ヒトＳＬＵＧタンパク質が好ましい。
【００２８】
第一の側面のさらに好ましい態様において、本方法は、ＳＬＵＧタンパク質の活性を変調させるか又はＳＬＵＧ遺伝子の転写及び／又は翻訳を変調させる化合物を哺乳動物へ投与することを含む。該化合物は、ＳＬＵＧタンパク質の活性を上方調節しても、ＳＬＵＧ遺伝子の転写及び／又は翻訳を上方調節してもよい；又は該化合物は、ＳＬＵＧタンパク質の活性を下方調節しても、ＳＬＵＧ遺伝子の転写及び／又は翻訳を下方調節してもよい。
【００２９】
本発明は、本発明の方法においてＳＬＵＧタンパク質の活性を変調させること、又はＳＬＵＧ遺伝子の転写及び／又は翻訳を変調させることのいずれかが可能であるあらゆる化合物の使用を考慮する。ＳＬＵＧ遺伝子の転写又は翻訳を変調させることが知られている化合物には、例えば、アンチセンスＳＬＵＧ  ｍＲＮＡ、リボザイム、三重らせん分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質、ｃ−Ｋｉｔタンパク質、ＦＧＦ１タンパク質、ＶＥＧＦ１６５、ＳＣＦ、ｎｇｎ３タンパク質、ＦＫＨＲタンパク質、ＰＡＸ３、及びβ−カテニンが含まれる。ＳＬＵＧタンパク質の活性を変調させる化合物には、例えば、抗ＳＬＵＧ抗体が含まれる。これら実体のすべてと、類似の機能のあるものは、本明細書に収載される病的状態の予防、治療、及び／又は診断に使用することができる。さらに、例えば、ペプチド、特定のタンパク質ドメイン、融合タンパク質、等が含まれる、これらの化合物の機能同等物も、本発明において同様に有用であろう。ＳＬＵＧタンパク質の機能同等物に関連する本明細書の数節は、上記に収載した化合物と同様に適用可能であると企図される。
【００３０】
用語「変調させる」は、ＳＬＵＧタンパク質の正常な活性の１以上の上方調節と下方調節をともに意味する。
本発明の第一の側面のさらに好ましい態様において、哺乳動物中の増加又は減少した脂肪保存に関連した障害は、限定されないが、肥満、食欲不振、又は脂肪異栄養症のどの１つでもよい。
【００３１】
用語「肥満」は、哺乳動物、特にヒトの脂肪組織に保存される自然エネルギーの予備量がある種の健康状態又は死亡率増加への危険因子となる点まで増加しているあらゆる状態を意味する。肥満は、典型的には、腹囲と組み合わせてＢＭＩ（ボディマス指数）を測定することによって評価される。過剰体重は、様々な疾患、特に心臓血管系疾患、２型糖尿病、睡眠時無呼吸、及び骨関節炎と相関することが示されてきた。故に、本発明により想定されるように、「肥満を治療すること」は、肥満に関連することが知られているあらゆる状態を治療することを意味する。本発明による肥満の治療のための化合物は、例えば、フェンテルミン及びジブトラミンのような１以上の食欲抑制薬；オルリスタトのようなリパーゼ阻害剤；ブプロピオンのような抗うつ薬；並びに、リモナバント及び毛様体神経栄養因子のような他の治験薬が含まれる、肥満の治療に使用されている他の部分（moieties）と同時投与してよい。
【００３２】
用語「脂肪異栄養症」は、身体における脂肪の一部又は全体の欠落と脂肪の異常な沈積及び分布に関与する、脂質（脂肪）代謝の乱れを特徴とするあらゆる状態を意味する。この用語には、ある領域（例、顔）からの脂肪の消失を記載するときに使用する、より具体的な用語「脂肪組織萎縮症」も含まれる。脂肪異栄養症は、ＨＩＶ療法（主に、プロテアーゼ阻害剤の使用）で起こり得る副作用であり得る。他の脂肪異栄養症は、身体の様々な部位における脂肪の過剰又は不足として発現される。これらには、限定されないが、くぼんだ頬、背中又は首の後部の「こぶ」、及び同じ点での反復注射（例、糖尿病患者におけるインスリン使用）により形成される皮膚の小さなしこり又はへこみを有することが含まれる。脂肪異栄養症は、遺伝障害による代謝異常によって引き起こされる可能性もある。これらは、インスリン抵抗性をしばしば特徴とする。脂肪異栄養症の治療用の本発明による化合物は、例えば、ポリ−Ｌ−乳酸（例、Ｓｃｕｌｐｔｒａ）が含まれる、そのような治療に使用される他の部分と同時投与してよい。
【００３３】
用語「食欲不振」は、顕著に低下した食欲又は食物への完全な忌避を特徴とするあらゆる摂食障害を意味する。この用語には、「神経性食欲不振」も含まれる。神経性食欲不振の治療用の本発明による化合物は、シプロヘプタジンが含まれる、これらの治療に使用される他の部分と同時投与してよい。
【００３４】
第二の側面において、本発明は、ＳＬＵＧタンパク質、又はＳＬＵＧタンパク質の機能同等物の、哺乳動物中の増加又は減少した脂肪保存に関連した障害を治療又は予防することへの使用に関する。上記に言及したように、ＳＬＵＧタンパク質の機能同等物は、正常なＳＬＵＧタンパク質が保有する活性の１以上において増加又は減少のいずれも示してよい。
【００３５】
第三の側面において、本発明は、ＳＬＵＧタンパク質の活性を変調させるか又はＳＬＵＧ遺伝子の転写及び／又は翻訳を変調させる化合物の、哺乳動物中の増加又は減少した脂肪保存に関連した障害を治療又は予防することへの使用に関する。そのような化合物は、ＳＬＵＧタンパク質の活性、又はＳＬＵＧ遺伝子の転写及び／又は翻訳を上方調節しても下方調節してもよい。
【００３６】
本発明の第二及び第三の側面の好ましい態様において、哺乳動物中の増加又は減少した脂肪保存に関連した障害は、限定されないが、肥満、食欲不振、又は脂肪異栄養症のどの１つでもよい。
【００３７】
第四の側面において、本発明は、候補化合物を試験用非ヒト哺乳動物へ投与して、その哺乳動物中の脂肪貯蔵に対する効果をモニタリングすることを含んでなる、ＳＬＵＧタンパク質の脂肪関連活性又はＳＬＵＧ遺伝子の転写又は翻訳のレベルを変調させる化合物をスクリーニングするための方法に関する。
【００３８】
本発明の第四の側面の好ましい態様において、哺乳動物中の脂肪貯蔵に対する効果をモニタリングすることは、脂肪組織の量を評価することを含む。好ましくは、この方法には、第一の試験用非ヒト動物中の脂肪組織の量を同じ種の第二の試験用非ヒト哺乳動物中の脂肪組織の量と比較することが含まれる。より好ましくは、この方法には、第一の試験用非ヒト動物中の脂肪組織の量の、同じ種の第二の試験用哺乳動物中の脂肪組織の量との比較が含まれ、ここで第二の試験用哺乳動物は、プラセボを投与されている。より好ましくは、この方法には、第一の試験用非ヒト動物中の脂肪組織の量の、候補化合物の投与の前と後での比較が含まれる。より好ましくは、脂肪組織は、白色脂肪組織である。哺乳動物中の脂肪組織の量の評価の方法は、当業者には明らかであり、具体的には、本明細書に言及するものが含まれる。例えば、脂肪細胞分化の文脈において、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の使用は、ホルモン刺激の混合物への曝露時に成熟脂肪細胞へ分化することができる、脂肪細胞分化の十分に特性決定された in vitro モデルとなる（Ntambi et al, 1988）。
【００３９】
本発明の第四の側面のさらに好ましい態様において、本方法の第一及び／又は第二の試験用非ヒト哺乳動物は、より高い、より低い、又は非存在のレベルのＳＬＵＧポリペプチドを発現するように形質転換されたトランスジェニック又はノックアウト非ヒト哺乳動物である。好ましくは、トランスジェニック又はノックアウト哺乳動物は、そのゲノムに、ＳＬＵＧタンパク質をコードする核酸配列を含むトランスジーンを含み、ここでトランスジーンの発現は、エフェクター物質によって外因的に調節することができる。トランスジーンの発現は、例えば、テトラサイクリン調節性であり得る。より好ましくは、トランスジェニック又はノックアウト哺乳動物は、増加又は減少した脂肪保存に関連した障害に罹患する。より好ましくは、トランスジェニック又はノックアウト非ヒト哺乳動物は、肥満、食欲不振、又は脂肪異栄養症に罹患する。
【００４０】
本明細書に使用するような表現「非ヒト哺乳動物」には、哺乳動物の綱に属するあらゆる非ヒト動物が含まれる。非ヒト哺乳動物は、好ましくは、マウスであるが、別の哺乳動物種、例えば、別の齧歯動物、例えば、ラット、ハムスター、又はモルモットであっても、サル、ブタ、ウサギのような別の種でも、イヌ科動物又はネコ科動物でも、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシのような有蹄動物種でも、非哺乳動物種でもよい。特別な態様において、本発明により提供されるトランスジェニック又はノックアウト非ヒト動物は、ネズミ動物である。用語「ネズミ」には、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、等が含まれる。好ましい態様において、ネズミ動物は、ラット又はマウスであり；最も好ましくは、本発明の非ヒト哺乳動物は、マウスである。
【００４１】
トランスジェニック動物の使用には、倫理性の問題が提起されるが、本明細書に記載のような研究からの人間への利益は、トランスジェニック動物の創出及び実験において課せられる可能性がある苦痛にはるかに優る価値があるとみなされる。当業者に明白であるように、薬物療法では、臨床試験をヒトにおいて現行の規制の下に現在利用可能なモデル系で開始する前に動物実験が求められて、動物実験は、しないで済ますわけにはいかない。どの新薬も、少なくとも２つの異なる種の生きた哺乳動物で検査しなければならず、その１つは、大型の非齧歯動物でなければならない。専門家は、身体においてきわめて特異的なやり方で作用する、現在開発中の新しいクラスの薬物のために将来さらに多くの動物と、より多くの霊長動物が使用される可能性があると考慮している。例えば、シルバー世代（greying population）が患っている神経系疾患に科学が取り組もうとするとき、我々には次世代医薬品の安全性及び有効性を検査するためのサルの一定供給が必要になると考えられる。従って、本明細書に記載するようなトランスジェニックモデルからの人類への利益は、マウスや齧歯動物全体に限定されるわけではなく、霊長動物を含めて他の哺乳動物も含まれる。これらの新規薬物が作用する特異的な方式は、霊長動物の脳の構造が我々自身ときわめて似ているので、それらが実験に適した唯一の動物であり得ることを意味する。
【００４２】
本発明のこの側面は、医薬品の探索及び開発における消耗の程度を抑えることを目的とする。薬物が試験の後期段階で頓挫するときはいつでも、動物実験のすべてがある意味で浪費されたことになろう。故に、医薬品の失敗を止めることは、試験動物の命を救うことになる。故に、本発明は、トランスジェニック動物に関するが、そのような動物の使用は、薬物試験プログラムに使用しなければならない動物の数を低下させて、ヒトの臨床アッセイにおける消耗率を減少させるはずである。
【００４３】
第五の側面において、本発明は、候補化合物と細胞を接触させて、細胞中の脂質蓄積の量に対する効果をモニタリングすることを含んでなる、ＳＬＵＧタンパク質又はＳＬＵＧタンパク質の機能同等物の活性を変調させるか又はＳＬＵＧ遺伝子の転写又は翻訳のレベルを変調させる化合物をスクリーニングする方法に関する。この細胞は、初めは（即ち、この細胞が候補化合物と接触する前は）、野生型細胞に比較して、改変したレベルのＳＬＵＧを発現する。
【００４４】
ＳＬＵＧ遺伝子の転写に化合物が標的指向される、代わりの方法論では、スクリーニング方法は、レポーター分子へ連結したＳＬＵＧプロモーターを含んでなる人工構築体を発現する細胞又は動物を利用してよい。この場合、レポーター分子を使用して、ＳＬＵＧ発現を低下させる化合物の効力をアッセイすることができる。好適なレポーター分子は、当業者に明らかであり、β−ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼのようなアッセイ可能な酵素、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のようなマーカータンパク質、及び放射性同位元素のような標識が含まれる。
【００４５】
本発明の第五の側面の好ましい態様において、細胞は、本発明の第一の側面に関連して上記に記載したようなトランスジェニック又はノックアウト非ヒト哺乳動物に由来する。細胞は、例えば、本発明の第一の側面に関連して上記に記載したようなトランスジェニック又はノックアウト非ヒト哺乳動物に由来する、胚線維芽細胞であってよい。より好ましくは、細胞は、マウス又はヒトの胚線維芽（ＭＥＦ又はＨＥＦ）細胞である。あるいは、細胞は、ＳＬＵＧをコードする遺伝子又はその機能同等物でトランスフェクトされてよい。
【００４６】
本発明の第五の側面の好ましい態様において、細胞に対する効果をモニタリングすることは、その細胞におけるＰＰＡＲγ２のレベル又は活性をモニタリングすることを含んでもよい。本明細書に開示する結果は、ＳＬＵＧがＰＰＡＲγ２発現に影響を及ぼすことによってＷＡＴの発生を変調させる可能性があることを示唆する。ＰＰＡＲγ２の発現は、ＳＬＵＧ欠損マウスのＷＡＴにおいて減少して、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウスのＷＡＴにおいて増加した。このように、上記に記載のアッセイの１つにおけるＰＰＡＲγ２発現又は活性のより低いレベルは、低下したＳＬＵＧ発現又は活性を反映する。
【００４７】
第六の側面において、本発明は、本発明の第四及び第五の側面の方法のいずれによっても入手されるか又は入手可能である、ＳＬＵＧタンパク質又はＳＬＵＧタンパク質の機能同等物の活性を変調させるか又はＳＬＵＧ遺伝子の転写又は翻訳のレベルを変調させる化合物に関する。
【００４８】
第七の側面において、本発明は、本発明の第二の側面で定義されるようなタンパク質、本発明の第三の側面で定義されるような化合物、又は本発明の第六の側面による化合物を含んでなる医薬組成物に関する。
【００４９】
第八の側面において、本発明は、医薬品としての使用のための、本発明の第六の側面による化合物に関する。
第九の側面において、本発明は、本発明の第六の側面による化合物の、増加又は減少した脂肪保存に関連した障害を治療又は予防するための医薬品の製造における使用に関する。好ましくは、障害は、肥満、食欲不振、又は脂肪異栄養症である。
【００５０】
第十の側面において、本発明は、本発明の第二の側面によるタンパク質、又は本発明の第三又は第六の側面による化合物、又は本発明の第七の側面による組成物を哺乳動物へ投与することを含んでなる、哺乳動物中の脂肪保存を改変させるための方法に関する。
【００５１】
諸定義
本明細書の理解を促進するために、本発明の文脈にあるいくつかの用語及び表現の意味を以下に説明する。
【００５２】
用語「遺伝子」は、タンパク質をコードするデオキシリボヌクレオチドの分子鎖を意味する。
用語「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸を意味する。ＤＮＡ配列は、デオキシリボヌクレオチド配列である。
【００５３】
用語「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を意味する。
用語「ＲＮＡ」は、リボ核酸を意味する。ＲＮＡ配列は、リボヌクレオチド配列である。
【００５４】
用語「ｍＲＮＡ」は、タンパク質へ翻訳される全ＲＮＡの一部である、メッセンジャーリボ核酸を意味する。
用語「タンパク質」は、生物学的活性のあるアミノ酸の分子鎖を意味する。
【００５５】
用語「抗体」は、「抗原」と呼ばれる特別なタンパク質への特異的な結合活性を明示する糖タンパク質を意味する。用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、インタクトであるか又はその断片、組換え抗体、等を含み、ヒト、ヒト化、及び非ヒト起源の抗体が含まれる。「モノクローナル抗体」は、単一の部位又は抗原「決定基」に対して指向されたきわめて特異的な抗体の均質集団である。「ポリクローナル抗体」には、異なる抗原決定基に対して指向された抗体の不均質集団が含まれる。
【００５６】
用語「エピトープ」は、本発明において使用されるように、特異抗体により認識されるタンパク質のアミノ酸配列である、タンパク質の抗原決定基を意味する。
以下の実施例は、本発明を例示するが、その範囲を制限するものとみなしてはならない。本発明の実施は、他に示さなければ、当業者の技量の範囲内にある、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、及び免疫学の慣用技術を利用する。ごく一般的な分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、及び免疫学的技術については、Sambrook et al.,「Molecular Cloning, A Laboratory Manual（分子クローニング−実験マニュアル）」（2001）コールドスプリングハーバー・ラボラトリー出版局、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、又は Ausubel et al.,「Current protocols in molecular biology（分子生物学の最新プロトコール）」（1990）ジョン・ワイリー・アンド・サンズに見出すことができる。
【００５７】
他に定義しなければ、本明細書に使用するすべての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書に引用する文献は、いずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ヒトとマウスの両方のＳｌｕｇの発現をＲＴ−ＰＣＲによって分析した。３６Ｂ４を使用して、ｃＤＮＡの完全性及びローディングをチェックした。Ａ）マウスＷＡＴ中でのＳｌｕｇ発現。Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ、内因性Ｓｌｕｇ、及び脂肪細胞の脂肪酸−結合タンパク質（ａＰ２）の発現をＣｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ、Ｓｌｕｇ欠損マウス、及び対照マウス由来のＷＡＴにおいてＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＰＣＲ産物をナイロン膜へ移して、特異プローブとのハイブリダイゼーションによって分析した。Ｂ）ヒト組織におけるＳＬＵＧ発現。内因性ＳＬＵＧの発現を肝臓（１）、心臓（２）、ｈＷＡＴ＃１（３）、腎臓（４）、脾臓（５）、及びｃＤＮＡなし（６）のような多様なヒト組織においてＲＴ−ＰＣＲによって分析した。Ｃ）ヒト脂肪組織におけるＳＬＵＧ発現。内因性ＳＬＵＧと脂肪細胞の脂肪酸−結合タンパク質（ａＰ２）の発現を、異なるＢＭＩであるドナーに対応する、ヒト皮下脂肪組織ＲＮＡ（Ｚｅｎ−ｂｉｏ社）においてＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ヒトＳＬＵＧが発現されない組織としてのヒト末梢血（レーン１）、ＢＭＩ＝２１．２３であるドナーに由来するヒト皮下脂肪組織（ｈＷＡＴ＃１，レーン２）、ＢＭＩ＝２７．３７であるドナーに由来するヒト皮下脂肪組織（ｈＷＡＴ＃２，レーン３）、ＢＭＩ＝３２．５５であるドナーに由来するヒト皮下脂肪組織（ｈＷＡＴ＃３，レーン４）、及びｃＤＮＡなし（レーン５）。Ｄ）ヒト脂肪組織におけるリアルタイムＰＣＲによるＳＬＵＧ（ＳＮＡＩ２）発現の定量化。β−アクチンを基準にしたＳＬＵＧ転写産物の百分率をｈＷＡＴ＃１、ｈＷＡＴ＃２、及びｈＷＡＴ＃３ヒト脂肪組織試料において示す。数値は、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭである。「ｈＷＡＴ＃１とｈＷＡＴ＃３」の差は、マン・ホイットニイ検定により決定されるように、統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）であった。しかしながら、それぞれのｈＷＡＴ試料は、ただ一人の個人に由来して、このＢＭＩとＳＬＵＧ発現の間の見かけの相関性は、母分散による可能性がある。Ｅ）褐色脂肪組織（ＢＡＴ）におけるＳｌｕｇ発現。マウスＳｌｕｇの発現を対照マウスに由来するＢＡＴにおいてＲＴ−ＰＣＲによって分析した。
【図２Ａ】前脂肪細胞の分化の間のＳＬＵＧの発現の経時変化。分化のインデューサーへの曝露の開始後、指定の時間インキュベートした３Ｔ３−Ｌ１細胞をノーザンブロット分析（Ａ）又はイムノブロット分析（Ｂ）へ処した。ホルモンカクテルへの曝露の後で、ＣＥＢＰβは、活発に発現されてから、ホルモン誘導の２日目頃には減衰しはじめて、この時点では、Ｃ／ＥＢＰαとＰＰＡＲγの発現が増加する（２３）。Ｃ／ＥＢＰαとＰＰＡＲγは、成熟脂肪細胞の分化をもたらす遺伝子発現のプログラムを誘導する（２，１７，２４）。ＰＰＡＲγ２の選択的な破壊が脂肪組織の発生を妨げて、分化に絶対的に必要とされる（１６）のに対し、Ｃ／ＥＢＰαは、厳密には脂肪生成に必要とされない（２５）と報告されてきた。これらのデータは、３回の独立した実験を代表している。これらのデータは、３回の実験を代表している。
【図２Ｂ】前脂肪細胞の分化の間のＳＬＵＧの発現の経時変化。分化のインデューサーへの曝露の開始後、指定の時間インキュベートした３Ｔ３−Ｌ１細胞をノーザンブロット分析（Ａ）又はイムノブロット分析（Ｂ）へ処した。ホルモンカクテルへの曝露の後で、ＣＥＢＰβは、活発に発現されてから、ホルモン誘導の２日目頃には減衰しはじめて、この時点では、Ｃ／ＥＢＰαとＰＰＡＲγの発現が増加する（２３）。Ｃ／ＥＢＰαとＰＰＡＲγは、成熟脂肪細胞の分化をもたらす遺伝子発現のプログラムを誘導する（２，１７，２４）。ＰＰＡＲγ２の選択的な破壊が脂肪組織の発生を妨げて、分化に絶対的に必要とされる（１６）のに対し、Ｃ／ＥＢＰαは、厳密には脂肪生成に必要とされない（２５）と報告されてきた。これらのデータは、３回の独立した実験を代表している。これらのデータは、３回の実験を代表している。
【図２Ｃ】Ｃ）対照及びＣｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ  ＭＥＦにおける脂肪細胞分化の間のＳｌｕｇ発現の経時変化。分化のインデューサーへの曝露の開始後、指定の時間インキュベートしたＭＥＦ細胞をイムノブロット分析へ処した。
【図３】Ｓｌｕｇ欠損、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ、及び対照マウスにおけるＷＡＴ試料の比較。Ａ）ＳＬＵＧ欠損、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ、及び対照マウスの腹面図（最上列）。Ｂ）ＳＬＵＧ欠損、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ、及び対照マウスの生殖系脂肪体の比較（第二列）。Ｃ）雄のＳＬＵＧ欠損、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ、及び対照マウス由来の生殖系脂肪体のヘマトキシリン／エオジン染色断面図（第三列、−２０Ｘ−、及び第四列−４０Ｘ−）。
【図４】Ｓｌｕｇ欠損、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ、及び対照マウスにおけるＢＡＴ試料の比較。ＳＬＵＧ欠損、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ、及び対照マウス由来の肩甲骨間褐色脂肪のヘマトキシリン／エオジン染色断面図（２０Ｘ）。
【図５】Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウスにおける脂肪細胞の蓄積。Ａ）野生型及びＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウスに由来する肝臓及び腎臓組織のヘマトキシリン−エオジン染色断面図。Ｂ）ＣｏｍｂｉＴＡ−ＳＬＵＧマウスにおいてヘマトキシリン−エオジン染色後に発症した脂肪腫の腫瘍と組織学的な外観。
【図６】テトラサイクリン処置によるＳＬＵＧ発現の抑圧後のＣｏｍｂｉＴＡ−ＳＬＵＧマウスにおけるＷＡＴサイズ。Ａ）ＣｏｍｂｉＴＡ−ＳＬＵＧの鼠径部脂肪体におけるテトラサイクリン依存性ＳＬＵＧ発現のＲＴ−ＰＣＲによる分析（−ｔｅｔ、＋ｔｅｔ水溶液）。３６Ｂ４を使用して、ｃＤＮＡの完全性及びローディングをチェックした。Ｂ）３週間のテトラサイクリン処置（４グラム／Ｌ）によるＳＬＵＧ発現の抑圧後のＣｏｍｂｉＴＡ−ＳＬＵＧマウス中のＷＡＴ重量。種々の差は、マン・ホイットニイ検定により決定されるように、統計学的に有意（Ｐ＜０．０１）であった。３週間のテトラサイクリン処置（４グラム／Ｌ）下の対照マウスにおいて、ＷＡＴ量は、影響を受けなかった。
【図７】ＳＬＵＧ欠損及びＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧのＷＡＴにおける脂肪生成遺伝子の発現。Ａ）Ｓｌｕｇ欠損マウス、対照マウス、及びＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウスのＷＡＴにおける遺伝子発現のウェスタンブロット分析。Ｂ）Ｓｌｕｇ欠損マウス、対照マウス、及びＣｏｍｂｉ−ＳｌｕｇマウスのＷＡＴにおけるリアルタイムＰＣＲによるＰＰＡＲγ２発現の定量化（ｎ＝３）。β−アクチンを基準にしたＳＬＵＧ転写産物の百分率を示す。種々の差は、マン・ホイットニイ検定により決定されるように、統計学的に有意（Ｐ＜０．０３）であった。Ｃ）Ｓｌｕｇ欠損マウス、対照マウス、及びＣｏｍｂｉ−ＳｌｕｇマウスのＷＡＴ中のｇｌｕｔ４、アジポネクチン、アジプシン、及びａｐ２のような脂肪細胞マーカーのウェスタンブロット分析。これらのデータは、３回の独立した実験を代表している。
【図８】ＳＬＵＧ欠損及びＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ  ＭＥＦにおいて改変した脂質蓄積。Ａ）対照、ＳＬＵＧ欠損、及びＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ  ＭＥＦにおける、分化のインデューサーへの曝露前のＳＬＵＧ発現のウェスタンブロット分析。アクチンを使用して、タンパク質ローディングをチェックした。Ｂ）各系統由来の一次胚線維芽細胞を標準分化誘導培地の存在下に培養した。脂肪細胞分化の誘導後８日目に細胞を固定して、オイルレッドＯで中性脂質を染色した。元の倍率はｘ２０である。すべての系統と異なる胚より調製した細胞を使用してこの実験を３回繰り返して、同様の結果を得た。
【図９−１】ＳＬＵＧ欠損及びＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ  ＭＥＦにおける分化の間の脂肪生成遺伝子発現。Ａ）ＳＬＵＧ欠損、対照、及びＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ  ＭＥＦにおける誘導後８日目の脂肪生成遺伝子のウェスタンブロット分析。誘導後２日目の３Ｔ３−Ｌ１細胞を対照として使用する。Ｂ）Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ  ＭＥＦにおける脂肪生成遺伝子発現のパターンは、誘導後８日目に最終的に分化した細胞に似ている。しかしながら、誘導後８日目のＳｌｕｇ欠損ＭＥＦにおける脂肪生成遺伝子発現のパターンは、誘導後２日目の３Ｔ３−Ｌ１細胞に似ている。誘導後０、２、４、及び８日目での対照、Ｓｌｕｇ欠損、及びＣｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ±ＤＯＸ  ＭＥＦにおけるリアルタイムＰＣＲによるＰＰＡＲγ２発現の定量化。代表的な臭化エチジウムアガロースゲルを、ｂ−アクチンを基準にしたＰＰＡＲγ２転写産物の百分率の近くに示す。種々の差は、マン・ホイットニイ検定により決定されるように、統計学的に有意（Ｐ＜０．０１）であった。Ｃ）ａｐ２の発現を対照及びＣｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ  ＭＥＦにおいて誘導後０、２、４、及び８日目にウェスタンブロットによって試験した。Ｄ）Ｓｌｕｇ−／−ＭＥＦを、１０μＭ  ＰＰＡＲγリガンド、トログリタゾンの存在又は非存在下に分化培地で誘導した。誘導後０、２、４、及び８日目に、ａｐ２タンパク質発現をウェスタンブロットによって試験した。アクチンをローディング対照として含めた。
【図９−２】ＳＬＵＧ欠損及びＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ  ＭＥＦにおける分化の間の脂肪生成遺伝子発現。Ｅ）誘導後８日目に、細胞をオイルレッドＯの飛沫で染色して、Ｓｌｕｇ欠損ＭＥＦ＋トログリタゾンの形態学的分化を示す。これらのデータは、３回の独立した実験を代表する。
【図１０】レトロウイルス媒介性のＳＬＵＧの過剰発現は、ＳＬＵＧ欠損ＭＥＦの妨害された in vitro 脂肪生成をレスキューする。Ａ）対照レトロウイルスベクター又はＳＬＵＧを発現するベクター（ｐＱＣＸＩＰ−ｍＳＬＵＧ）のいずれかで感染したＳＬＵＧ−／−ＭＥＦ中のＳＬＵＧ及びＰＰＡＲγ２タンパク質の、脂肪細胞分化のインデューサーへの曝露後０、２、４、及び８日目のウェスタンブロット分析。アクチンをローディング対照として含めた。Ｂ）対照レトロウイルスベクター又はＳＬＵＧを発現するベクター（ｐＱＣＸＩＰ−ｍＳｌｕｇ）のいずれかで感染したＳＬＵＧ−／−ＭＥＦにおける、誘導後０、２、４、及び８日目のリアルタイムＰＣＲによるＰＰＡＲγ２発現の定量化。代表的な臭化エチジウムアガロースゲルを、ｂ−アクチンを基準にしたＰＰＡＲγ２転写産物の百分率の近くに示す。種々の差は、マン・ホイットニイ検定により決定されるように、統計学的に有意（Ｐ＜０．０１）であった。Ｃ）対照レトロウイルスベクター又はＳＬＵＧを発現するベクター（ｐＱＣＸＩＰ−ｍＳｌｕｇ）のいずれかで感染したＳＬＵＧ−／−ＭＥＦにおける、脂肪細胞分化のインデューサーへの曝露後０、２、４、及び８日目のウェスタンブロットによるａｐ２タンパク質の分析。アクチンをローディング対照として含めた。Ｄ）脂肪細胞分化の誘導後８日目に、細胞を光学顕微鏡によりオイルレッドＯ染色で観察した（元の倍率はｘ２０である）。上記のデータは、３回の独立した実験を代表する。
【図１１】Ｓｌｕｇは、ＰＰＡＲｇ２プロモーターをトランス活性化しない。ヒトＰＰＡＲγ２の１ｋｂ近傍プロモーター領域は、レポーターアッセイにおいてＰＰＡＲγ２の発現を推進するのに十分であることがかつて示されて（Fajas et al., 1997）、それは、Ｕ２ＯＳ細胞において、Ｃ／ＥＢＰα及びＣ／ＥＢＰα発現ベクターで同時トランスフェクトされるときに、活性である。ＰＰＡＲγ２プロモーターに存在するＤＮＡ配列からの転写を活性化するＳｌｕｇの能力を直接評価するために、Ｓｌｕｇ  ｃＤＮＡを含有する発現ベクターを、ＰＰＡＲγ２プロモーターを含有するレポーターベクター（ｐＧＬ３−ｈＰＰＡＲｇ２ｐ１０００ベクター）と一緒に、Ｕ２ＯＳ細胞中へ同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼレポーターアッセイにより、ヒトＰＰＡＲｇ２レポーターのＳｌｕｇへの応答性の不足が実証される。レポーター構築体の左に示す数字は、５’境界部分（開始部位の上流にある塩基対）を示す。上記のデータは、３回の独立した実験を代表する。
【図１２】ヒストンアセチル化状態。異なる野生型、Ｓｌｕｇ欠損、及びＣｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇマウスより取り出した異なる組織手術試料のタンパク質アセチル化パターン。データは、野生型マウスと比較した、Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ  ＷＡＴにおけるヒストンＨ３アセチル化の高い増加とＳｌｕｇ−／−ＷＡＴにおけるヒストンＨ３アセチル化の減少を示す。脳と肝臓を陰性の上方調節プロフィールとして使用した。試料を抗アセチルヒストンＨ３（Upstate Biotechnology，ニューヨーク州レークプラシッド）でブロッティングした。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）処置マウス由来の野生型組織を陽性の上方調節のアセチル化Ｈ３増加試料として使用した。コアＨ３クマッシー染色をローディング対照として使用した。上記のデータは、３回の独立した実験を代表する。
【図１３−１】ＨＤＡＣ、ＳＬＵＧ、及びｃ／ＥＢＰαのマウスＰＰＡＲγ２遺伝子プロモーターに対する動員分析。Ａ）−１２０５〜−４６のマウスＰＰＡＲγ２プロモーター配列の概略図（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ２４３５８４）。矢印は、ＣｈＩＰ産物を増幅するために使用するフォワード及びリバースのプライマーを示す。プライマー１及び２の対は、２つのＳｌｕｇ  ＤＮＡ−結合部位の付近にあり、プライマー３の対は、Ｓｌｕｇ  ＤＮＡ−結合部位の付近にない。Ｂ）Santa Cruz Biotechnology 社（カリフォルニア州サンタクルーズ、アメリカ）からのポリクローナル抗ＨＤＡＣ１（Ｈ−５１）、抗ＳＬＵＧ（Ｈ−１４０）、又は抗ｃ／ＥＢＰα（１４ＡＡ）を使用する、異なるマウス（野生型、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ、及びＳＬＵＧ−／−）からのＷＡＴ及び肝臓クロマチン免疫沈降法。データは、ＰＰＡＲγ２プロモーターに対する示差的なＨＤＡＣ動員を組織及び遺伝背景依存的なやり方で示す。免疫沈降法の前のプロモーターＤＮＡの存在は、ＰＣＲによって確認した（Input）。Ｃ／ＥＢＰαをＰＰＡＲγ２遺伝子プロモーターからの陽性の応答要素として使用した。ＰＣＲ産物は、臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲルにおいて分割した。Ｃ）Santa Cruz Biotechnology 社（カリフォルニア州サンタクルーズ、アメリカ）からのポリクローナル抗ＨＤＡＣ１（Ｈ−５１）又は抗ＳＬＵＧ（Ｈ−１４０）を使用する、異なるマウス（野生型、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ、及びＳＬＵＧ−／−）からのＷＡＴクロマチン免疫沈降法。データは、Ｓｌｕｇ  ＤＮＡ結合部位の付近にないプライマーの対を使用して、ＰＰＡＲγ２プロモーターに対するＳｌｕｇ動員がないことを示す。免疫沈降法の前のプロモーターＤＮＡの存在は、ＰＣＲによって確認した（Input）。ＰＣＲ産物は、臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲルにおいて分割した。
【図１３−２】ＨＤＡＣ、ＳＬＵＧ、及びｃ／ＥＢＰαのマウスＰＰＡＲγ２遺伝子プロモーターに対する動員分析。Ｄ）抗アセチルヒストンＨ３（Upstate Biotechnology，ニューヨーク州レークプラシッド）又は Santa Cruz Biotechnology 社（カリフォルニア州サンタクルーズ、アメリカ）からの抗ＳＬＵＧ（Ｈ−１４０）を使用する、異なるマウス（野生型、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ、及びＳＬＵＧ−／−）からのＷＡＴクロマチン免疫沈降法。データは、ＰＰＡＲγ２プロモーターでのＳｌｕｇ発現とＨ３アセチル化の間の相関性を示す。免疫沈降法の前のプロモーターＤＮＡの存在は、ＰＣＲによって確認した（Input）。ＰＣＲ産物は、臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲルにおいて分割した。Ｅ）Ｓｌｕｇ欠損細胞においてＰＰＡＲｇ２プロモーターをトランス活性化するＣ／ＥＢＰα及びＣ／ＥＢＰβの能力。Ｓｌｕｇ欠損細胞において ＰＰＡＲγ２プロモーターに存在するＤＮＡ配列からの転写を活性化するＣ／ＥＢＰα及びＣ／ＥＢＰβの能力を直接評価するために、Ｃ／ＥＢＰα及びＣ／ＥＢＰα 発現ベクターを、ＰＰＡＲγ２プロモーターを含有するレポーターベクター（ｐＧＬ３−ｈＰＰＡＲｇ２ｐ１０００ベクター）と一緒に、Ｓｌｕｇの存在（＋）下と非存在（−）下でＳｌｕｇ−／−ＭＥＦ中へ同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼレポーターアッセイは、Ｃ／ＥＢＰα及びＣ／ＥＢＰβに対するヒトＰＰＡＲｇ２レポーターの、Ｓｌｕｇの存在下での効率的な応答を実証する。上記のデータは、３回の独立した実験を代表する。
【図１４】チャウ（Ａ）及びＨＦＤ（Ｂ）の下での対照、Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ、及びＳｌｕｇ欠損マウスの代表的な成長曲線。２週ごとに１回、体重を定量した（ｎ＝８；雌４匹と雄４匹）。数値は、平均±ＳＥＭである。「対照及びＳｌｕｇ欠損マウス」と「対照及びＣｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇマウス」の間の差は、マン・ホイットニイ検定により決定されるように、統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）であった。
【実施例】
【００５９】
実施例１：材料と方法
マウス
動物は、慣用の動物施設において無菌条件下に収容した。ＳＬＵＧ欠損及びＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウスについては、既報（Jiang et al., 1998）の通りであった。Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇマウスは、他に示さなければ、野生型のバックグラウンドで分析する。Ｃｏｍｂｉ−ＳｌｕｇｘＳｌｕｇ−／−マウスは、以下のように作製した：異系接合ＳＬＵＧ＋／−マウスをＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧトランスジェニックマウスと交配して、複合ヘテロ接合体を作製した。Ｆ１動物を記載のように（Perez-Mancera et al., 2005）交配して、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧトランスジェニックマウスについて異系接合のヌルＳＬＵＧ−／−マウスを入手した。この動物を、他に示さなければ、通常のチャウ食餌で維持した。すべての実験は、関連する規制基準に従って行った。
【００６０】
組織学的分析
すべての組織試料を解剖顕微鏡下に詳しく検査して、パラフィンへ加工処理し、断面に切って、組織学的に検査した。すべての組織試料を、切除試料の均質で生きた部分より病理学者が採取して、切除の２〜５分以内に固定した。各組織のヘマトキシリン及びエオジン染色断面図を一人の病理学者が検討した（Ｔ．Ｆ．）。比較試験として、加齢適合マウスを使用した。
【００６１】
一次マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の調製
異系接合ＳＬＵＧ＋／−マウスを交配して、野生型及びヌルＳＬＵＧ−／−胚を入手した。一次胚線維芽細胞を１３．５ｄ．ｐ．ｃ．胚より採取した。１３．５日胚の頭部及び臓器を解剖し；胎児組織をＰＢＳに濯ぎ、細分化して、ＰＢＳに２回濯いだ。胎児組織をトリプシン／ＥＤＴＡで処理し、３７℃で３０分間インキュベートした後で、媒体中で解離させた。大きな組織塊の除去の後で、残存する細胞を１７５ｃｍ２フラスコにおいてプレート培養した。４８時間後、集密した培養物を凍結させた。これらの細胞を継代１のＭＥＦであるとみなした。連続培養のために、ＭＥＦ培養物を１：３に分けた。ＭＥＦとφＮＸ同種指向性パッケージング細胞系を、１０％熱不活性化ＦＢＳ（ベーリンガー・インゲルハイム）を補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ；ベーリンガー・インゲルハイム）において３７℃で増殖させた。この細胞は、マイコプラズマ（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔＴＭ  マイコプラズマ検出キット、Cambrex）についてすべて陰性であった。
【００６２】
脂肪細胞分化
３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を記載（Lin and Lane, 1994）のように培養した。野生型、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ、及びＳＬＵＧ−／−ＭＥＦを、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Hyclone）、１００ユニット／ｍｌペニシリン（Biowhittaker）、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Biowhittaker）を補充した標準Ｄ−ＭＥＭ：Ｆ１２培地（ギブコ）において３７℃で培養した。それぞれの遺伝子型の１０６個の細胞を１０ｃｍプラスチック皿へプレートして、集密まで増殖させた。集密から２日後、この細胞に、０．５ｍＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（シグマ）、１μＭデキサメタゾン（シグマ）、及び５μｇ／ｍｌインスリン（シグマ）を補充した標準培地を２日間、次いで５μｇ／ｍｌインスリンを補充した標準培地を６日間供与することによって、脂肪細胞分化プログラムを誘導した。この培地は、２日ごとに更新した。この分化の８日間、必要とされるときに、トログリタゾン（Calbiochem）又はビヒクルを１０μＭで使用した。８日後、オイルレッドＯ染色によって、細胞質の脂質蓄積の外観を観察した。脂質蓄積は、各実験につき少なくとも３回の独立した手順再現において約７００個の細胞を計数することによって、オイルレッドＯ陽性である細胞の百分率として定義した。簡潔に言えば、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄してから、３．７％ホルムアルデヒドで２分間固定した。水での洗浄後、細胞を６０％濾過済みオイルレッドＯストック溶液（１００ｍｌのイソプロパノール中０．５ｇのオイルレッドＯ（シグマ））で、室温で１時間染色した。最後に、細胞を水で２回洗浄して、写真撮影した。ノーザンブロッティング用のＲＮＡとウェスタンブロッティング用のタンパク質を調製するために、細胞を分化の０、２、４及び８日目に採取した。
【００６３】
ＲＮＡ抽出
任意選択のオンカラムＤＮアーゼ処置を伴う製造業者のＲＮＡ一掃プロトコールに従って、ＴＲＩｚｏｌ（Life Technologies 社、ニューヨーク州グランドアイランド）に続いてＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ−Ｋｉｔ（Qiagen 社、カリフォルニア州バレンシア）の精製を使用する２つの工程で全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡの完全性と品質は、電気泳動法とその濃度の測定によって裏付けた。
【００６４】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
Zen-bio よりヒトＷＡＴ試料を入手した（ｈＷＡＴ＃１は、ボディマス指数（ＢＭＩ）：２１．２３のカタログ番号ＲＮＡ−Ｔ１０−１であり；ｈＷＡＴ＃２は、ＢＭＩ：２７．２７のカタログ番号ＲＮＡＴ１０−２であり；ｈＷＡＴ＃３は、ＢＭＩ：３２．５５のカタログ番号ＲＮＡ−Ｔ１０−３である）。マウス細胞系とマウスにおけるＣｏｍｂｉｔＴＡ−ＳＬＵＧと内因性ＳＬＵＧの発現を分析するために、５０ｎｇのランダムヘキサマー、３μｇの全ＲＮＡ、及び２００ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮアーゼＨ−逆転写酵素（ギブコ／ＢＲＬ）を含有する２０μｌ反応液において、製造業者のプロトコールに従ってＲＴを実施した。特異的プライマーの配列は、以下の通りであった：ＣｏｍｂｉｐｏｌｙＡ−Ｂ１：５’−ＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧ−３’；ｍＳＬＵＧＦ：５’−ＧＴＴＴＣＡＧＴＧＣＡＡＴＴＴＡＴＧＣＡＡ−３’；ｍＳＬＵＧＢ：５’−ＴＴＡＴＡＣＡＴＡＣＴＡＴＴＴＧＧＴＴＧ−３’。ヒトＳＬＵＧの発現を分析するために、ＰＣＲ反応のサーモサイクリング変数と特異的プライマーの配列は、以下の通りとした：９４℃で１分間、５６℃で１分間、及び７２℃で２分間の３０サイクル；センスプライマー５'−ＧＣＣＴＣＣＡＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＣＴＡ−３’とアンチセンスプライマー５’−ＣＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＧＧＣＴＧＴＡＴＧ−３’。ＰＣＲ産物は、特異的プローブとのハイブリダイゼーションによって確認した。ａｐ２と３６Ｂ４の増幅は、脂肪組織と各ＲＮＡ試料の質をそれぞれ評価するための対照として役立てた。
【００６５】
リアルタイムＰＣＲ定量化
ＳＬＵＧ発現の検出及び定量のためにリアルタイム定量ＰＣＲを開発して、Zen-bio より入手したヒトＷＡＴ試料（ｈＷＡＴ＃１、ｈＷＡＴ＃２、及びｈＷＡＴ＃３）において行った。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲコア試薬キット（PE Biosystems）を使用して、５０μｌの反応量においてＰＣＲを開始した。ＰＣＲプライマーは、Isogen により合成された。各反応物は、５μｌの１０Ｘ緩衝液；３００ｎＭの各増幅プライマー；２００μＭの各ｄＮＴＰ；及び１．２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び１０ｎｇ  ｃＤＮＡを含有した。ｃＤＮＡ増幅は、PE Applied Biosystems ５７００配列検出器において９６ウェル反応プレートフォーマットで行った。９５℃で１０分の第一の変性工程で熱サイクリングを開始した。後続の加熱プロフィールは、９５℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の４０サイクルであった。多数の陰性の水ブランクを検査して、各分析と並行して、較正曲線を決定した。等量のｃＤＮＡを使用したが、β−アクチンの内因性対照を含めて、ＳＬＵＧ発現を各試料中の全ｃＤＮＡと関連付けた。
【００６６】
同様に、ＰＰＡＲγ２発現の検出及び定量のためにリアルタイム定量ＰＣＲを開発して、対照、Ｓｌｕｇ−／−、及びＣｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ  ＷＡＴ試料において行った。サーモサイクリングは、同一３検体で４０サイクルの間行った。各サイクルは、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、及び７２℃で３０秒からなった。ＰＰＡＲγ２プライマーは、ＨＭＰＰＡＲｇ２−Ｆ：５’−ａｔｇｇｇｔｇａａａｃｔｃｔｇｇｇａｇ−３’；及び、ＨＭＰＰＡＲｇ２−Ｂ：５’−ｃｃｔｔｇｃａｔｃｃｔｔｃａｃａａｇｃ−３’であった。
【００６７】
ノーザンブロット分析
分化の０、２、４及び８日目に採取した３Ｔ３−Ｌ１細胞の全細胞質ＲＮＡ（１０μｇ）をグリオキシル化して、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）中の１．４％アガロースゲル中で分画した。電気泳動の後で、このゲルをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ（アマーシャム）上へブロットし、ＵＶ架橋連結させて、３２Ｐ標識化マウスＳＬＵＧ及びａｐ２プローブへそれぞれハイブリダイズさせた。このフィルターをマウス３６Ｂ４プローブで再びプローブすることによって、ローディングをモニタリングした。
【００６８】
レトロウイルス感染
φＮＸ細胞の一過性トランスフェクションにより産生した高力価レトロウイルスストックでＳＬＵＧ欠損ＭＥＦを感染させた。感染の効率は、いつでも＞８０％であった。感染の前日、１０ｃｍ皿につき２ｘ１０６個の細胞で細胞をプレートした。感染されたＭＥＦを２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（シグマ）で３日間選択して、対応するアッセイのために再びプレートした。マウスＳＬＵＧ  ｃＤＮＡを、記載のように（Bermejo-Rodriguez et al., 2006）、ｐＱＣＸＩＰレトロウイルス（T. Jacks，マサチューセッツ工科大学より入手）へサブクローン化した。
【００６９】
ウェスタンブロット分析
異なる細胞及び組織のウェスタンブロット分析を本質的に（Castellanos et al., 1997）に記載のように行なった。ブラッドフォード分析（Bio-Rad Laboratories 社、ニューヨーク州メルビル、アメリカ）及びクマッシーブルーゲル染色によって、抽出物をタンパク含量について正規化した。溶解液を１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させて、ＰＶＤＦ膜へ移した。ブロッキングの後で、この膜を以下の一次抗体でプローブした：ＳＬＵＧ（Ｇ−１８，Santa Cruz Biotechnology）、ＰＰＡＲガンマ（Ｈ−１００及びＥ−８，Santa Cruz Biotechnology）、ＲＸＲアルファ（Ｄ−２０，Santa Cruz Biotechnology）、Ｃ／ＥＢＰベータ（Ｃ−１９，Santa Cruz Biotechnology）、Ｃ／ＥＢＰデルタ（Ｍ−１７，Santa Cruz Biotechnology）、Ｃ／ＥＢＰアルファ（１４ＡＡ，Santa Cruz Biotechnology）、及びアクチン（Ｉ−１９，Santa Cruz Biotechnology）。反応性のバンドをＥＣＬ系（アマーシャム）で検出した。
【００７０】
ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼ遺伝子の前でクローン化したＰＰＡＲγ２プロモーターの近位部分を含有するレポーター（ｐＧＬ３−ｈＰＰＡＲｇ２ｐ１０００ベクター）は、Johan Auwerx（Fajas et al., 1997）の厚意により提供された。ラットＣ／ＥＢＰαｗｔｐＳＧ５及びラットＣ／ＥＢＰαｗｔｐＳＧ５の発現ベクターは、Dr. Achim Leutz（Calkhoven et al., 2000）の厚意により提供された。発現ベクターのｐｃＤＮＡ３−ｍＳｌｕｇは、マウスＳｌｕｇ  ｃＤＮＡを発現プラスミドｐｃＤＮＡ３へクローン化することによって作製した。レポーターアッセイでは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼへ正規化したデュアルルシフェラーゼ（プロメガ）を使用してＵ２ＯＳ細胞をトランスフェクトして、少なくとも３つのデータ点より平均±標準誤差を決定した。１０％胎仔ウシ血清を補充したダルベッコ改良イーグル培地においてＵ２ＯＳ細胞を維持した。
【００７１】
ヒストンアセチル化状態
対照、Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ、及びＳｌｕｇ欠損マウスより外科的に取り出した組織を、ヒストンアセチル化のレベルを保持するために、５ｍＭ酪酸ナトリウムを補充した氷冷ＰＢＳにおいて２回洗浄して、冷ＴＥＢ（０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｖ／ｖ）、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、及び０．０２％（ｖ／ｖ）ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）中でホモジェナイズし、穏やかに撹拌しながら氷上に１０分置き、遠心分離させて、冷ＴＥＢ中で洗浄した。ペレットを０．２Ｎ  ＨＣｌに再懸濁して、ヒストンを４℃で一晩抽出した。酸性抽出により回収した上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動へ処し、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）２２μｍ孔径（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＳＱ；ミリポア）上へ移して、抗アセチル化ヒストンＨ３（Upstate Biotechnology，ニューヨーク州レークプラシッド）でイムノブロットした。コアヒストンローディング対照は、酸性タンパク抽出物の典型的なクマッシー染色で実施した。シグナルは、製造業者の推奨するプロトコールによる増強化学発光系（ＥＣＬ；アマーシャム・ファルマシア・バイオテク（ＵＫ）株式会社）で検出した。
【００７２】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ
マウス組織（ＷＡＴ及び肝臓）を異なるマウス（野生型、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ、及びＳＬＵＧ−／−）より外科的に取り出し、ホモジェナイズして、２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（シグマ、Ｉ型）ＯＮにおいて３７℃で非集合化した。架橋形成ミックス（１１％ホルムアルデヒド；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；０，５ｍＭ  ＥＧＴＡ；５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０）を１％の最終濃度で組織非集合化培地上へ直接添加することによって、室温で１５分間、細胞を in vivo で固定した。グリシンの０．１２５Ｍ最終濃度での添加により固定化を止めて、インキュベーションをさらに５分間続けた。この細胞を、氷冷リン酸緩衝化生理食塩水を使用して２回洗浄して、採取した。細胞ペレットを洗浄し、細胞溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）；１％  ＳＤＳ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（ロッシュ））で溶かして、氷上に１０分間放置した。この細胞溶解液を音波処理して、染色体ＤＮＡを５００〜１０００塩基対の間の平均長へ剪断した。遠心分離による不溶性材料の除去の後で、クロマチン溶液を９分量の希釈緩衝液（１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ）：１分量の溶解緩衝液の混合物に希釈して、この希釈した溶液を、プロテインＧセファロースビーズを回転ホイール上に４℃で１時間用いて、予め洗浄した。ビーズを遠心分離により除去して、上清を、Santa Cruz Biotechnology 社（カリフォルニア州サンタクルーズ、アメリカ）からのＨＤＡＣ（Ｈ−５１）、ＳＬＵＧ（Ｈ−１４０）又はｃ／ＥＢＰα（１４ＡＡ）に対する抗体、又は抗アセチル化ヒストンＨ３の２ｍｇとともに４℃で一晩インキュベートした。この複合体をプロテインＧセファロースビーズとともに４℃で２時間免疫沈降させた。このビーズを、ＩＰ希釈緩衝液で１回、洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％  ＳＤＳ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）で２回、最終洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％  ＳＤＳ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）で１回、そしてＴＥ緩衝液で２回洗浄した。免疫複合体を、溶出緩衝液（１％  ＳＤＳ；１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）においてビーズより１５分間溶出した。プロテイナーゼＫ及びＲＮアーゼＡ（それぞれ５００μｇ／ｍｌ）により３７℃で１時間消化することによって、タンパク質をＤＮＡより除去した。５Ｍ  ＮａＣｌを２００ｍＭの最終濃度へ加えることに続く６５℃で１時間のインキュベーションによって、架橋結合を逆転させた。次いで、試料ＤＮＡをフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、冷エタノールで沈殿させて、ＴＥ緩衝液に再懸濁させた。クロマチン抽出物（input）より同様に精製したＤＮＡ断片をＰＣＲ反応の対照として使用した。ＰＰＡＲγ２プロモーター由来の２０５、２１２、及び２１９塩基対をそれぞれカバーするプ��イマー：ｍ−ＰＰＡＲγ２−ＣｈＩＰ−１Ｆ  ５’−ｇｔａｃａｇｔｔｃａｃｇｃｃｃｃｔｃａｃ−３’及びｍ−ＰＰＡＲγ２−ＣｈＩＰ−１Ｒ  ５’−ｔｔｔｇｇｇａｇａｇｇｔｇｇｇａａｔａａ−３’；ｍ−ＰＰＡＲγ２−ＣｈＩＰ−２Ｆ  ５’−ｃａｇｇｇａａｔｔａｔｔｇｃｃａｔｃｔｇａ−３’及びｍ−ＰＰＡＲγ２−ＣｈＩＰ−２Ｒ  ５’−ｇｇｃａａｇｇａａｔｔｇｔｇｇｔｃａｇｔ−３’；ｍ−ＰＰＡＲγ２−ＣｈＩＰ−３Ｆ  ５’−ｃｔｔｇｔｔｇａａｔａａａｔｃａｃｃｔｔ−３’及びｍ−ＰＰＡＲγ２−ＣｈＩＰ−３Ｒ  ５’−ｃａｇｔｇｇｃｔｔｔｔａａａａｔａｇａａ−３’を使用する３０サイクルのＰＣＲによって、沈殿したＤＮＡを分析した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で分離させて、臭化エチジウムで染色した。
【００７３】
実施例２：結果
ＳＬＵＧは、ヒトの白色脂肪中で発現される
ＳＬＵＧ（ＳＮＡＩ２）発現とその欠失及び過剰発現の効果は、マウスとヒトで同様である（Cohen et al., 1998; Perez-Losada et al., 2002; Sanchez-Martin et al., 2002; Oram et al., 2003; Sanchez-Martin et al., 2003; Perez-Mancera et al., 2005; Perez-Mancera et al., 2006）。我々のこれまでの観測結果は、ＳＬＵＧがマウス脂肪組織に存在していることを示した（Perez-Mancera et al., 2005 と図１Ａ〜Ｅ）。我々は、今回、ヒト脂肪組織がＳＬＵＧを発現するかどうかを研究した。
【００７４】
ヒトＳＬＵＧの発現を逆転写酵素（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した。ＰＣＲ産物をナイロン膜へ移して、特異的プローブとのハイブリダイゼーションによって分析した。ＳＬＵＧ発現をヒト皮下脂肪組織において確認した（図１Ｂ及び１Ｃ）。ＳＬＵＧ発現は、より高いＢＭＩのドナーにおいてより高いように見える（図１Ｃ，レーン２，ＢＭＩは正常である；レーン３；ＢＭＩは、過剰体重とみなされる；及び、レーン４，ＢＭＩは、肥満とみなされる）ので、この観察結果を定量リアルタイムＰＣＲによって確かめた（図１Ｄ）。上記の観察結果は、ＳＬＵＧの発現がヒトとマウスの両方のＷＡＴに共通した所見であり、ＷＡＴ発生におけるＳＬＵＧの役割を示唆する。
【００７５】
ＳＬＵＧ発現は、脂肪細胞分化の間にしっかりと制御されている
ＷＡＴ発生におけるＳＬＵＧの機能を決定するために、我々は、初めに、脂肪細胞分化の間のＳＬＵＧの発現を検証した。３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞は、混合ホルモン刺激への曝露時に成熟脂肪細胞へ分化することができる、脂肪細胞分化の十分に特性決定された in vitro モデルである（Ntambi et al, 1988）。ＳＬＵＧ発現は、分化処置の前にきわめて高くて、ＳＬＵＧ  ｍＲＮＡ及びタンパク質の量は、そのようなホルモン刺激の間に減少した（図２Ａ〜Ｂ）が、脂肪細胞分化に必須の転写因子である（Rosen et al., 1999）ペルオキシソーム増殖因子活性化因子γ（ＰＰＡＲγ）は、２日以内に明らかになって、その後で量が増加した（図２Ｂ）。この観測結果は、一次マウス胚線維芽細胞をモデルとして使用することによって、さらに確かめられた（図２Ｃ）。これらの結果は、前脂肪細胞の分化の間に、ＳＬＵＧが時間的及び空間的にしっかりと制御されていることを示す。
【００７６】
ＳＬＵＧ欠損マウスは、低下したＷＡＴ量を明示する
ＷＡＴ発生におけるＳＬＵＧ発現の効果を決定するために、我々は、ＳＬＵＧ欠損マウス中のＷＡＴ量を分析した。我々は、Ｓｌｕｇ欠損マウスにおいてわずかだが有意な体重の低下を観測した（図１４）。ＳＬＵＧ欠損マウスは、ＳＬＵＧ−／−マウスにおいてＷＡＴ重量の大きな低下を示した（表Ｉ及び図３）が、異系接合マウスは、野生型マウスから識別不能であった。減少した脂肪量の対照として、我々は、対照及びＳｌｕｇ−／−マウスの筋肉組織を比較して、差を見出さなかった。しかしながら，ＳＬＵＧ欠損動物は、高脂肪食により誘導される肥満から守られた（図１４）。さらに、食餌摂取は、野生型（２．９±０．４ｇ／マウス／日）とＳＬＵＧ欠損マウス（３．０±０．４ｇ／マウス／日）で同様であった。高脂肪食を給餌した動物では、ＳＬＵＧ欠損マウスの脂肪体は有意な変化を示さなかったが、これらのパッドは、野生型の同腹仔では劇的な増加を示していて、さらにより劇的な効果をもたらした。ＳＬＵＧ欠損マウスにおける脂肪組織の全体的な低下は、雄と雌で観測された（表１）。ＷＡＴとは対照的に、肩甲骨間褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、肝臓、及び腎臓が含まれる他の組織は、野生型とＳＬＵＧ欠損マウスで同様の重量を有した（表１）。
【００７７】
表１−ＳＬＵＧ欠損及びＳＬＵＧ過剰発現マウスの脂肪組織量
【００７８】
【表１】
2010506897.tif 000002
【００７９】
脂肪組織の表現型をさらに特性決定するために、我々は、ＷＡＴ及びＢＡＴの組織学的切片を検証した（図３及び４）。我々は、ＢＡＴ及びＷＡＴの組織において野生型とＫＯマウスの間に差異を観察しなかった。ＳＬＵＧ欠損マウスのＷＡＴの組織学的分析は、最終的に分化した脂肪細胞内にいかなる病理学的な変化も証明しなかった。それどころか、ＳＬＵＧ欠損マウスは、この組織の正常な構造を有して、我々は、ＳＬＵＧ欠損マウスにおいて、未熟なものへ向かうＷＡＴのシフトを観察しなかった。
【００８０】
ＳＬＵＧ欠損マウスにおけるＷＡＴ量の減少がＳＬＵＧの非存在により引き起こされることを確かめるために、ＳＬＵＧ欠損マウスを、ＷＡＴ組織においてトランスジェニックＳＬＵＧを発現するＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウス（Perez-Mancera et al., 2005）と交配した（図１Ａ）。予測されるように、ＳＬＵＧ欠損マウスでは、ＳＬＵＧを発現することによって、ＷＡＴ表現型がレスキューされた（表１）。
【００８１】
我々はまた、Ｓｌｕｇ欠損マウスにおいてコア体温と自発運動を試験することによって、これらのマウスにおけるＷＡＴ量の減少をエネルギー消費量の増加で説明し得るかどうかを検討した。我々は、欠損マウスの自発運動と体温を測定した（表２）が、有意差は示さなかった。
【００８２】
表２−Ｓｌｕｇ欠損及びＳｌｕｇ過剰発現マウスの自発運動及び体温
【００８３】
【表２】
2010506897.tif 000003
【００８４】
ＳＬＵＧ発現は、マウスにおいて白色脂肪組織サイズを変調させる
上記の結果は、ＳＬＵＧがＷＡＴ組織サイズを制御することを示唆する。従って、我々は、次に、ＳＬＵＧ発現の上方調節のＷＡＴ量に対する効果を in vivo で評価した。テトラサイクリン抑止可能ＳＬＵＧトランス遺伝子を担うマウス（Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウス）を初めに作製して、ＳＬＵＧ過剰発現の癌における潜在的な役割を検討した（Perez-Mancera et al., 2005）。ＳＬＵＧ発現のパターンから予期されるように、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウスは、脂肪組織において高い量のＳＬＵＧを発現した（図１Ａ）。今回我々は、ＳＬＵＧ過剰発現マウス中のＷＡＴを分析した。受胎期からドキシサイクリンを控えたトランスジェニックマウスは、発生を通してＳＬＵＧ発現をもたらし、体重のわずかだが有意な増加を有して（図１４）、著しく増加したＷＡＴ量を有することが見出された。一様に、雄と雌のＳＬＵＧ過剰発現マウスは、ＷＡＴ重量の有意な増加を示し（表１及び図３）、ＳＬＵＧの過剰発現が正常なＷＡＴ発生を混乱させることを示す。さらに、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウスの食餌摂取（２．９±０．６ｇ／マウス／日）は、野生型マウスと同様であった。
【００８５】
我々はまた、Ｓｌｕｇ−Ｃｏｍｂｉマウスにおいてコア体温と自発運動を試験することによって、これらのマウスにおけるＷＡＴ量の増加をエネルギー消費量の減少で説明し得るかどうかを検討した。我々は、Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇマウスの自発運動と体温を測定した（表２）が、有意差は示さなかった。
【００８６】
数匹のＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ動物（１２％）は、腎臓と肝臓に脂質蓄積を提示して（図５Ａ）、脂肪組織を伴う触知可能な塊を発症したが、これは、解剖と組織学的検査時に、脂肪腫形成を明らかにした（図５Ｂ）。ＳＬＵＧ欠損マウスと同様に、ＳＬＵＧ過剰発現動物中の白色脂肪貯留物の組織学的分析は、この組織の正常な構造を明らかにした（図３）。しかしながら、Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇマウスの脂肪細胞の量は、正常マウスのそれより大きかった（図３Ｃ）。トランスジェニックマウスの褐色脂肪組織（ＢＡＴ）には、病理学的な変化を観察しなかった（図４）。このように、ＳＬＵＧ過剰発現マウスは、増加したＷＡＴ量を示す。この結果は、ヒトではＳＬＵＧ発現がＢＭＩと並行して増加するように見えるという観測結果と一致している（図１Ｃ及び１Ｄ）。事実、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ細胞では、脂肪細胞分化の経過の間のＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ発現の生理学的な変調が失われている（図２Ｃ）。
【００８７】
上記の結果は、ＳＬＵＧ発現が脂肪組織サイズを変調させるという仮説を支持する。故に、ＳＬＵＧ過剰発現の撤廃は、ＷＡＴ増加を止めるか又は抑えると期待してよい。これを評価するために、体重が増加した１２匹のＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウスを野生型マウスと比較して、テトラサイクリン（４グラム／飲料水１Ｌ、３週間、外因性のＳＬＵＧ発現を抑圧するのに十分な用量−図６Ａ−）の投与に続いてＷＡＴサイズを評価した。１２匹のＣｏｍｂｉｔＴＡ−ＳＬＵＧマウスのうち１１匹は、体重の減少を明示して、ＷＡＴ重量は、野生型マウスと同様であった（図６Ｂ）。このように、上記の結果は、ＳＬＵＧにより誘導されるＷＡＴ改変が可逆的であることを示す。
【００８８】
ＳＬＵＧ欠損及びＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウスのＷＡＴにおける脂肪生成遺伝子の発現
脂肪組織の発生には、遺伝子発現の新たなプログラムを活性化する分化スイッチが関与して、ホルモン感受性のやり方で脂質の蓄積がこれに続く（Morrison and Farmer, 2000; Rosen et al., 2000）。ＳＬＵＧが脂肪組織の発生に有利であり、ＳＬＵＧの不足がそれを妨げるとする分子機序をさらに探究するために、我々は、ＷＡＴ発生に関与するタンパク質の発現レベル（図７Ａ〜Ｂ）と、いくつかの脂肪細胞マーカーの発現レベル（図７Ｃ）を検証した。図７に示すように、ＲＸＲα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、及びＣ／ＥＢＰα の発現は、影響を受けないように見える。しかしながら、ＰＰＡＲγ２の発現は、ＳＬＵＧ欠損マウスのＷＡＴにおいて減少して、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウスのＷＡＴにおいて増加した（図７Ｂ）。総合すれば、これらの結果は、ＳＬＵＧがＰＰＡＲγ２発現に影響を及ぼすことによってＷＡＴ発生を変調させる可能性があることを示唆する。
【００８９】
ＳＬＵＧ欠損及びＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ  ＭＥＦの in vitro 脂肪生成の障害：ＳＬＵＧは、ＰＰＡＲγ２を介して脂肪細胞分化を調節する
ＭＥＦのホルモン誘導による脂肪生成は、脂肪細胞分化の in vitro 研究にとって十分に確立されたモデル系である（Tontonoz P et al., 1994; Wu et al., 1999）。脂肪生成に対するＳＬＵＧの貢献をさらに検証するために、我々は、１３．５日目のＳＬＵＧ−／−、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ、及び対照胚よりＭＥＦを単離した（図８Ａ）。ホルモン誘導後８日目には、対照ＭＥＦ中のオイルレッドＯ陽性である細胞の百分率（１５〜２５％）として定義される、脂質蓄積がある。しかしながら、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ  ＭＥＦには、広い蓄積があり（３５〜４５％）、ＳＬＵＧ欠損ＭＥＦには、ほとんど脂質蓄積がなかった（０．１〜０．５％）（図８Ｂ）。上記の形態学的な変化と一致して、脂肪生成のマーカーであるＰＰＡＲγ２も、ＳＬＵＧ＋／＋ＭＥＦ中のそれと比較すると、ホルモン誘導したＳＬＵＧ−／−ＭＥＦでは有意に低下して（図９Ａ〜Ｂ）、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ  ＭＥＦでは増加した（図９Ａ〜Ｂ）。このＰＰＡＲγ２発現の増加は、Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ  ＭＥＦのドキシサイクリン処置時には元に戻った（図９Ｂ）。同様に、脂肪細胞マーカー、ａｐ２の発現は、その形態学的変化を裏付けた（図９Ｃ〜Ｄ）。ＰＰＡＲγの刺激がＳＬＵＧ欠損細胞における脂肪生成をレスキューし得るかどうかを明確にするために、ＳＬＵＧ−／−ＭＥＦにおいて、ＰＰＡＲγ リガンド、トログリタゾンの存在下に、脂肪細胞の分化を誘導した。興味深いことに、ＳＬＵＧ欠損ＭＥＦにおける脂肪細胞分化ブロックの障害は、ＰＰＡＲγ アゴニスト、トログリタゾンでの処置によって正常化した（図９Ｄ〜Ｅ）。
【００９０】
上記の結果は、ＳＬＵＧが in vitro 脂肪生成をＰＰＡＲγ２発現に影響を及ぼすことによって変調させることを示す。
ＳＬＵＧ−／−ＭＥＦの脂肪生成欠損は、ＳＬＵＧの異所性発現によってレスキューされ得る。
【００９１】
我々のデータは、ＰＰＡＲγ２発現がＳＬＵＧにより変調されることを明らかにして、これらのデータは、ＳＬＵＧ欠損細胞の脂肪細胞分化能力のトログリタゾンによる正常化によって確かめられて、この遺伝子とＳＬＵＧの間の興味深い関連を示唆した。この転写調節を確かめるために、我々は、野生型ＳＬＵＧをレトロウイルス形質導入によってＳＬＵＧ欠損ＭＥＦに再導入して、ＰＰＡＲγ２の発現レベルをウェスタン分析によって評価した。ＳＬＵＧ欠損ＭＥＦＳにおけるＳＬＵＧのレトロウイルス媒介性の発現は、図１０Ａ〜Ｂに示すように、ＰＰＡＲγ２の異常な発現と野生型レベルへの脂肪細胞分化能力を再確立させた。ＳＬＵＧがＳＬＵＧを不足している細胞におけるその異常な発現を完全に回復させるのに十分であったという実証は、ＰＰＡＲγ２がＳＬＵＧにより直接調節されたことをさらに示すものである。
【００９２】
Ｓｌｕｇは、ＰＰＡＲγ２プロモーターをトランス活性化しない。
これまでの結果により、ＳｌｕｇがＰＰＡＲγ２発現を直接調節することが示唆されるので、我々は、ＳｌｕｇがＰＰＡＲγ２転写の制御に直接関与している可能性があるのかどうかを検証した。ヒトＰＰＡＲγ２の１ｋｂ近位プロモーター領域は、レポーターアッセイにおいて、ＰＰＡＲγ２の発現を推進するのに十分であることがすでに示されていて（Fajas et al., 1997）、それは、Ｕ２ＯＳ細胞において、Ｃ／ＥＢＰα及びＣ／ＥＢＰβ発現ベクターと同時トランスフェクトされるときに活性である（図１１）。ＰＰＡＲγ２プロモーターに存在するＤＮＡ配列からの転写を活性化するＳｌｕｇの能力を直接評価するために、Ｓｌｕｇ  ｃＤＮＡを含有する発現ベクターを、ＰＰＡＲγ２プロモーターを含有するレポーターベクター（ｐＧＬ３−ｈＰＰＡＲｇ２ｐ１０００ベクター）とともにＵ２ＯＳ細胞へ同時トランスフェクトした。ＳＬＵＧの同時発現は、空ベクターでの活性に比較して、ルシフェラーゼ活性を増加させなかった（図１１）。
【００９３】
Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ及びＳｌｕｇ欠損マウスのＷＡＴにおけるヒストン修飾
上記の結果は、Ｓｌｕｇが、ＰＰＡＲγ２遺伝子プロモーター中の調節要素との会合を介してＰＰＡＲγ２の発現を誘導することに直接的な役割を有さないことを示唆する。しかしながら、プログラム化された遺伝子発現の調節は、転写機構とクロマチン再構築化因子、注目すべきはヒストンアセチル化及び脱アセチル化の協調的な変調の結果なのである。この課題に取り組むために、我々は、Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ及びＳｌｕｇ欠損マウスのＷＡＴにおけるヒストンアセチル化状態を測定した。我々は、タンパク質ブロッティングを使用して、ヒストンＨ３でのアセチル化レベルを分析した。我々は、対照マウスと比較した、Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ  ＷＡＴにおけるヒストンＨ３アセチル化の高い増加と、Ｓｌｕｇ−／−ＷＡＴにおけるヒストンＨ３アセチル化の減少を見出した（図１２）。従って、これらの結果は、脂肪組織におけるＳＬＵＧ発現とヒストンアセチル化状態の間の相関性を示す。
【００９４】
最近の研究は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を、Ｓｌｕｇにより変調される遺伝子調節のメディエーターとして関連付けている（Peinado et al., 2004; Bermejo-Rodriguez et al., 2006）。ＨＤＡＣの主要な機能は、アセチル基をヒストンより除去することであり、これはクロマチン構造の凝縮をもたらす（Ayer, 1999）。これは、次いで、転写因子の標的ＤＮＡへの接近を減少させて、最終的には、転写の抑制をもたらす。Ｓｌｕｇが実際に細胞核内のＰＰＡＲγ２遺伝子プロモーターで動員されるかどうかを探究するために、我々は、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイを実施した（図１３Ａ）。対照、Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ、及びＳｌｕｇ欠損マウスのＷＡＴよりクロマチン試料を調製してから、Ｃ／ＥＢＰα、Ｓｌｕｇ、及びＨＤＡＣ１に対する特異抗体で免疫沈降させた。Ｃ／ＥＢＰαの結合は検出可能であったが、これは、Ｃ／ＥＢＰによるＰＰＡＲγ２制御の現行モデルと一致している（図１３Ｂ）。このＣｈＩＰ分析は、ＳｌｕｇだけでなくＨＤＡＣ１も、対照脂肪組織中のＰＰＡＲγ２プロモーターで動員されることを明らかにした（図１３Ｂ）。重要なことに、ＨＤＡＣ１は、Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇマウス由来のＷＡＴ細胞中の核においては動員されず、Ｃｏｍｂｉ−ＳｌｕｇマウスのＷＡＴにはアセチル化ヒストンが豊富にあることと一致する（図１２）。一方、ＨＤＡＣ１は、Ｓｌｕｇ欠損ＷＡＴ中のＰＰＡＲγ２プロモーターでは動員される（図１３Ｂ）。このように、これらのデータは、組織及びＳｌｕｇ依存的なやり方での、ＰＰＡＲγ２プロモーターへの示差的なＨＤＡＣ動員を示すものである。上記の知見は、Ｓｌｕｇ発現の増加がＰＰＡＲγ２プロモーターでのアセチル化の増加をもたらし、そして逆もまた真であることを予測させる。これを検証するために、我々は、対照、Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ、及びＳｌｕｇ欠損マウスのＷＡＴ中のＰＰＡＲγ２プロモーターでのヒストンＨ３アセチル化を定量した（図１３Ｄ）。ＣｈＩＰ分析は、ＰＰＡＲγ２プロモーターでの示差的なＨ３アセチル化をＳｌｕｇ依存的なやり方で示して、ＰＰＡＲγ２クロマチンにおける変化が、Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ  ＷＡＴではより活性な「オープン」状態へ向かうこと、そしてＳｌｕｇ欠損ＷＡＴでは不活性状態へ向かうことを示唆した。このことが正しいのであれば、Ｃ／ＥＢＰは、Ｓｌｕｇの非存在時には、ＰＰＡＲγ２レポーターをトランス活性化することがさほど可能でないと予測されよう。このことを直接評価するために、Ｃ／ＥＢＰα又はＣ／ＥＢＰβのいずれか一方のｃＤＮＡを含有する発現ベクターを、ＰＰＡＲγ２プロモーターを含有するレポーターベクター（ｐＧＬ３−ｈＰＰＡＲｇ２ｐ１０００ベクター）とともにＳｌｕｇ欠損細胞へ同時トランスフェクトした。Ｃ／ＥＢＰα又はＣ／ＥＢＰβの同時発現は、空ベクターでの活性に比較してルシフェラーゼ活性を増加させたが、それらはあまり効率的ではなかった（図１３Ｅ）。しかしながら、ＳＬＵＧの同時発現は、Ｃ／ＥＢＰα又はＣ／ＥＢＰβにより誘導されるルシフェラーゼ活性を増加させることができた（図１３Ｅ）。これらの観測結果は、Ｓｌｕｇ欠損及びＣｏｍｂｉ−ＳｌｕｇマウスにおけるＰＰＡＲγ２発現の差異とＷＡＴ発生における���ｌｕｇの役割を説明する可能性がある。
【００９５】
実施例３：考察
哺乳動物において、細胞特異化は、細胞が初めに発生運命へ決定された後で分化して、特定の細胞種の特性を獲得するプロセスである。脂肪細胞発生は、線維芽細胞を前脂肪細胞になるように導く遺伝子プログラムによって制御されている。さらに誘導されると、前脂肪細胞は分化して、それらが脂質を貯えて成熟脂肪細胞になることを可能にする遺伝子を発現する。脂肪細胞の分化を制御するこの遺伝子調節ネットワークの成分の多くは、３Ｔ３−Ｌ１培養物の研究において解明されてきたが、脂肪細胞の発生を in vivo で制御する発生シグナルについてはほとんど知られていない。本研究は、in vivo 及び in vitro の脂肪生成においてＳＬＵＧが果たす重要な役割を初めて確定するものである。
【００９６】
ＳＬＵＧ発現は、脂肪細胞分化の間にしっかりと制御されている。ＳＬＵＧは、in vivo で発現されるが、培養細胞では一過性にのみ発現されて、脂肪生成を in vivo で始動させること、及び／又は維持することにある役割を担う可能性があることを示唆する。ＳＬＵＧの発現は、３Ｔ３−Ｌ１細胞（系統決定された前脂肪細胞である）及びＭＥＦ（未決定の前駆細胞である）における分化の誘導の前に観測されて、両方の細胞種において、ホルモン刺激の適用後２日以内に下方調節されることが見出された。未決定の前駆細胞が成熟細胞へ分化する時にＳＬＵＧの発現が下方調節される造血系では、同様の発現パターンが観測される（Inoue et al., 2002; Perez-Losada et al, 2002）。
【００９７】
これらの知見は、脂肪生成を始動させるにはＳＬＵＧ下方調節が必要とされ、これらの細胞の前駆細胞からの発生又は維持において、そのことがある役割を果たす可能性があることを示唆する。ＳＬＵＧ欠損マウスにおいて観察されるＷＡＴ量の低下とＳＬＵＧ欠損ＭＥＦにおいて見られる脂肪細胞分化の低下も、初期の脂肪細胞分化におけるＳＬＵＧの役割と一致しているが、本実験では、前脂肪細胞におけるＳＬＵＧの機能を分化決定（lineage commitment）に対する効果から区別することはできない。その発現を制御している機序が解明されれば、次いで脂肪生成を in vivo で制御するシグナルの同定がもたらされる可能性がある。注目すべきことに、Ｋｉｔは、ＳＬＵＧ発現のアクチベータであるだけでなく、予定間葉系幹細胞のマーカーの１つである（Perez-Losada et al, 2002）。さらに、いくつかのＳＬＵＧ標的は、幹細胞機能を調節することへの関与が示唆されてきた（Bermejo-Rodriguez, 2006）。
【００９８】
これらの遺伝子のＳＬＵＧによる調節は、未決定の前駆細胞を維持するのに重要であり得る。ＳＬＵＧは、in vivo と in vivo の両方で正常なＷＡＴ発生を達成するには、ある閾値レベルより上に保たれなければならないらしい。この解釈と一致して、テトラサイクリン抑止可能ＳＬＵＧトランスジーン（Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ）を担うマウスは、ＷＡＴサイズの増加を示して、これは、ＳＬＵＧトランスジーンの抑圧によって特異的に再確立された。in vivo データと一致して、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ  ＭＥＦは、脂肪細胞分化を増加させて、この因子が脂肪細胞分化をポジティブに調節することを示唆した。このように、ＳＬＵＧ発現を調節し得ないことがＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウスで肥満が発症する理由を説明する可能性がある。
【００９９】
今回提示したデータは、ＳＬＵＧが哺乳動物における脂肪組織発生の新規メディエーターであることを示す。故に、我々は、ＳＬＵＧがＷＡＴ発生を制御する分子機序を解析した。Ｃ／ＥＢＰβ が培養細胞の脂肪分化を促進し得ることは十分に確かめられている。ホルモンカクテルへの曝露後、ＣＥＢＰβは、活発に発現されてから、ホルモン誘導の２日目頃に減衰しはじめて、この時点では、Ｃ／ＥＢＰα 及びＰＰＡＲγの発現が 増加する（Cao et al, 1991）。Ｃ／ＥＢＰαとＰＰＡＲγ は、成熟脂肪細胞の分化をもたらす遺伝子発現のプログラムを誘導する（Lin and Lane, 1994; Tontonoz et al., 1994; Rosen et al., 2002）。ＰＰＡＲγ２の選択的な破壊が脂肪組織の発生を妨げて、分化には絶対的に必要とされる（Zhang et al., 2004）のに対し、Ｃ／ＥＢＰαは、厳密には脂肪生成に必要とされない（Rosen et al., 2002）と報告されてきた。in vivo と in vitro で、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ及びＳＬＵＧ欠損の組織及びＭＥＦは、Ｃ／ＥＢＰ因子の正常な発現を示す。しかしながら、我々は、in vivo のＳＬＵＧ欠損及びＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウスのＷＡＴと in vitro のＳＬＵＧ欠損ＭＥＦ及びＣｏｍｂｉ−ＳＬＵＧ  ＭＥＦの両方で、脂肪細胞の分化の経過の間に、ＰＰＡＲγ２発現が改変されることを見出した。ＳＬＵＧ欠損ＭＥＦにおける相補性試験はこの調節を裏付けたが、Ｓｌｕｇは、ＰＰＡＲγ２プロモーターを含有するレポーターベクターからの転写を活性化することができなかった。しかしながら、Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇ及びＳｌｕｇ欠損マウスのＷＡＴにおけるヒストンアセチル化状態を測定したとき、我々は、脂肪組織中のＳＬＵＧ遺伝子発現とヒストンアセチル化状態の間に相関性を確認した。Ｓｌｕｇによって変調される遺伝子調節のメディエーターとしてＨＤＡＣを意義付ける最近の研究（Peinado et al., 2004; Bermejo-Rodriguez et al., 2006）に近いこの観測結果により、我々は、Ｓｌｕｇが実際にＰＰＡＲγ２遺伝子プロモーターで動員されるのかどうかを探究することに促された。我々のＣｈＩＰ実験は、ＳｌｕｇとＨＤＡＣ１がＷＡＴ中のインタクトクロマチンにおいて内因性ＰＰＡＲγ２プロモーターへ結合していることを示して、組織及びＳｌｕｇ依存的なやり方でのＰＰＡＲγ２プロモーターへの示差的なＨＤＡＣ動員を確認した。これらの観測結果と一致して、ＣｈＩＰ分析は、Ｓｌｕｇ依存的なやり方での、ＰＰＡＲγ２プロモーターでの示差的なＨ３アセチル化を裏付けた。従って、ＰＰＡＲγ２遺伝子発現へのＳｌｕｇ要求性の最も直接的なモデルは、ＰＰＡＲγ２遺伝子へのＳｌｕｇ結合の不足が、この遺伝子の発現をヒストン脱アセチル化によって抑圧するサイレンシング複合体の形成をもたらすことであろう。反対に、ＨＤＡＣ１は、Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇマウス由来のＷＡＴ細胞において、ＰＰＡＲγ２プロモーターで動員されず、Ｃｏｍｂｉ−ＳｌｕｇマウスのＷＡＴにアセチル化Ｈ３ヒストンが豊富にあることと一致する（図１２及び１３Ｄ）。このことは、さらに、転写因子の標的ＤＮＡへの接近を増加させて、最終的には、ＰＰＡＲγ２転写活性化をもたらす（図１３Ｅ）。このことは、ＨＤＡＣ阻害剤が臨床試験において患者により十分忍容される用量で活性を有する薬物であるので、潜在的に重要な臨床課題になり得���（Marks and Jiang, 2005）。このモデルと一致して、ヒストンデアセチラーゼの下方調節が脂肪細胞分化を刺激することが示された（Yoo et al., 2006）。
【０１００】
ヒトのＷＡＴ組織におけるＳＬＵＧの発現（これは、Ｃｏｍｂｉ−ＳＬＵＧマウスを模倣する、より高いＢＭＩの個人においてより高いように見える）は、Ｃｏｍｂｉ−Ｓｌｕｇマウスにおいて観察される肥満が脂肪細胞肥大と関連しているときは特に、ヒトの肥満において重要である。Ｃｏｍｂｉ−ＳｌｕｇマウスのＷＡＴサイズは、Ｓｌｕｇ発現を抑圧することによって元に戻すことができて、ＷＡＴサイズは、Ｓｌｕｇ欠損マウスにおいて低下している。ＳＬＵＧは、癌のような他のヒト疾患において過剰に発現されている（Inukai et al., 1999; Khan et al., 1999; Perez-Mancera et al., 2005）。白色脂肪は非悪性組織であるが、それは、速やかに増殖して拡大する能力を有する（Wasserman, 1965； Cinti, 2000）。
【０１０１】
従って、それ故に、ＳＬＵＧ発現は、癌と肥満に共通の経路を明確にするかもしれない。しかしながら、ＳＬＵＧにより付与される役割は、肥満においては可逆的である。ＳＬＵＧは、いくつかの系においてＳｎａｉｌに似た役割を果たすことが示されているので、転写因子のＳｎａｉｌファミリーの他のメンバーも、ＳＬＵＧについて本明細書において記載した機能に類似した生物学的機能に関与している可能性がある。しかしながら、この機能同等性が脂肪生成の間にも生じるかどうかは明らかでない。これまでに確認されたＳＬＵＧ調節される種の間では、関連の転写因子、ＳｎａｉｌがアフリカツメガエルではＳＬＵＧ誘導性であると報告された（Aybar et al., 2003）。しかしながら、ＳＬＵＧは、ＭＤＣＫ細胞（Bolos et al., 2003）やＭＥＦ（Bermejo-Rodriguez et al, 2006）では、Ｓｎａｉｌの発現に影響しない。同様に、我々は、マウスのＳＬＵＧの過剰発現又は欠損に関連したＳｎａｉｌ発現の変化を検出しなかった。
【０１０２】
要約すると、我々は、脂肪組織の発生及び分化に必須の役割を果たすものとしてのＳＬＵＧの確定を報告する。その in vivo 調節の分析は、脂肪生成の調節のより完全な理解をもたらす可能性がある。我々の結果は、ＥＭＴレギュレータの哺乳動物における臨界値の要求性と脂肪生成を結び付ける。ＳＬＵＧは、マウスにおいて脂肪組織サイズを変調させて、ヒト白色脂肪においても発現されているので、上記の結果は、改善された抗肥満療法及び抗脂肪異栄養症療法の基礎を形成し得る戦略を開発するのに役立つだろう。
【０１０３】
参考文献
【０１０４】
【表３−１】
2010506897.tif 000004
【０１０５】
【表３−２】
2010506897.tif 000005
【０１０６】
【表３−３】
2010506897.tif 000006
【０１０７】
【表３−４】
2010506897.tif 000007
【０１０８】
【表３−５】
2010506897.tif 000008
【０１０９】
【表３−６】
2010506897.tif 000009
【０１１０】
【表３−７】
2010506897.tif 000010
【図１】
2010506897.tif 000011
【図２Ａ】
2010506897.tif 000012
【図２Ｂ】
2010506897.tif 000013
【図２Ｃ】
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【図３】
2010506897.tif 000015
【図４】
2010506897.tif 000016
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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