(57)【要約】  本発明は、ＴＬＲ９アンタゴニスト化合物およびそれらの治療的または予防的使用に関する。本発明は、新規な免疫調節オリゴヌクレオチドおよびＴＬＲのアンタゴニストとしてのイムノマーおよびその使用方法を提供する。これらの免疫調節オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲリガンドまたはＴＬＲシグナリングアゴニストに応答して、ＴＬＲ媒介シグナリングを完全に除去することなく抑制する独特の配列を有する。本方法は、自己免疫、炎症、炎症性大腸炎、狼瘡、アレルギー、喘息、感染症、敗血症、癌および免疫不全の予防または処置における用途を有し得る。
2010536787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドをベースとする化合物であって、構造５’−Ｎｍ−Ｎ１Ｎ２Ｃ１Ｇ１−ＮＰ−Ｎ３Ｎ４Ｃ２Ｇ２−Ｎｍ−３’
式中、Ｃ１およびＣ２は、独立して、シトシンまたはシトシン誘導体であり、かつ、Ｇ１およびＧ２は、独立して、グアノシンまたはグアノシン誘導体であり、
ここで、Ｃ１およびＧ１のうち少なくとも１個は、修飾ヌクレオシドであり、
Ｎ１およびＮ２は、それぞれにおいて独立して、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、ヌクレオチド、２’置換（例えば、２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または他のブロック部分であり、但し、Ｎ１またはＮ２の少なくとも１個は、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害するブロック部分であり、
Ｎ３およびＮ４は、それぞれにおいて独立して、Ｃ２Ｇ２のＴＬＲ刺激活性を阻害しない、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、
Ｎｍは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合であり、
Ｎｐは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、但し、前記化合物は３個より少ない連続的なグアノシンヌクレオチドを含み、
ここで、ｍは、０から約２０までの数であり、
ここで、ｐは、０から約２０までの数であり、かつ、
ここで、該オリゴヌクレオチドは、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、２’−Ｏ−置換ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他の修飾がなければ、免疫刺激性である、
を有するもの
を含むＴＬＲ９アンタゴニスト化合物。
【請求項２】
化合物が、２’、３’または５’結合または官能性核酸塩基結合またはその組み合わせを介して結合した少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＴＬＲ９アンタゴニスト化合物。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが、２’末端、３’末端または５’末端または官能性核酸塩基で互いに直接結合している、請求項２に記載のＴＬＲ９アンタゴニスト化合物。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドの２’末端、３’末端または５’末端または官能性核酸塩基が、非ヌクレオチドリンカーと結合している、請求項２に記載のＴＬＲ９アンタゴニスト化合物。
【請求項５】
非ヌクレオチドリンカーが、アルキルリンカーまたはアミノリンカーであり、該アルキルまたはアミノリンカーは、任意に、分岐または非分岐、環状または非環状、置換または無置換、飽和または不飽和、キラル、アキラルまたはラセミ混合物であってもよい、請求項４に記載のＴＬＲ９アンタゴニスト化合物。
【請求項６】
アルキルリンカーが、約２個〜約１８個の炭素原子を有する、請求項５に記載のＴＬＲ９アンタゴニスト化合物。
【請求項７】
アルキルリンカーが、約３個〜約９個の炭素原子を有する、請求項５に記載のＴＬＲ９アンタゴニスト化合物。
【請求項８】
アルキルリンカーが、１，２，３−プロパントリオール、１，２，４−ブタントリオール、２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、１，１，１，−トリス（ヒドロキシメチル）エタン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）１，３−プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）ニトロメタン、１，１，１−トリ(ヒドロキシメチル)プロパン、１，２，６−ヘキサントリオール、１，３，５−ヘキサントリオール、１，３，５−ペンタントリオール、３−メチル−１，３，５−ペンタントリオール、１，２，３−ヘプタントリオール、２−（ヒドロキシメチル）１，４−ブタンジオール、１，３−ジ(ヒドロキシメチル)フェノール、１，３，５−トリ(ヒドロキシメチル)ベンゼン、１，３−ジ（ヒドロキシエトキシ）−２−ヒドロキシプロパン、１，３−ジ（ヒドロキシプロポキシ）−２−ヒドロキシプロパン、Ｄ−ガラクタール、１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸、１，３，５−トリス（４−ヒドロキシフェニル）ベンゼン、１，３−プロパンジオール、１，２−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、２，４−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，２−ヘキサンジオール、１，５−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，７−ヘプタンジオール、１，８−オクタンジオール、１，２−オクタンジオール、１，９−ノナンジオール、１，１２−ドデカンジオールまたは２−（１−アミノプロピル）−１，３−プロパンジオールから選択される、請求項５に記載のＴＬＲ９アンタゴニスト化合物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のＴＬＲ９アンタゴニスト化合物および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
脊椎動物におけるＴＬＲ９媒介免疫応答を減少させる方法であって、ＴＬＲ９媒介免疫応答を減少させるが失わせない量で請求項９に記載の医薬組成物を脊椎動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
ＴＬＲ９媒介免疫応答を減少させることが有益である疾患または障害を有する脊椎動物を治療的に処置する方法であって、薬学的有効量で請求項９に記載の医薬組成物を、かかる障害または疾患を有する脊椎動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎、炎症性障害、感染症、マラリア、ライム病、眼感染症、皮膚障害、乾癬、強皮症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性疲労症候群、サルコイドーシス、アレルギー、喘息または病原体に起因する疾患から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
自己免疫障害が、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、１型糖尿病、過敏性腸症候群、クローン病、関節リウマチ、敗血症性ショック、全身脱毛症、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、汗腺膿瘍、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、限局性強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直症、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、血管炎、白斑、外陰部痛およびヴェーゲナー肉芽腫症から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
炎症性障害が、気道炎、喘息、自己免疫疾患、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、ベーチェット病、過敏症、炎症性大腸疾患、再潅流傷害、関節リウマチ、移植片拒絶、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、結膜炎および脈管炎から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＴＬＲ９媒介免疫応答を減少させることが有益である脊椎動物における疾患または障害を予防する方法であって、薬学的有効量で請求項９に記載の医薬組成物を、かかる障害または疾患にかかりやすい脊椎動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎、炎症性障害、感染症、マラリア、ライム病、眼感染症、結膜炎、皮膚障害、乾癬、強皮症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性疲労症候群、サルコイドーシス、移植片拒絶、アレルギー、喘息または病原体に起因する疾患から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
自己免疫障害が、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、１型糖尿病、過敏性腸症候群、クローン病、関節リウマチ、敗血症性ショック、全身脱毛症、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、汗腺膿瘍、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、限局性強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直症、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、血管炎、白斑、外陰部痛およびヴェーゲナー肉芽腫症から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
炎症性疾患が、気道炎、喘息、自己免疫疾患、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、ベーチェット病、過敏症、炎症性大腸疾患、再潅流傷害、関節リウマチ、移植片拒絶、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、結膜炎および脈管炎から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
投与のルートが、非経口的、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、経鼻、エアゾール、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃によるもの、経皮パッチまたは点眼または口腔洗浄形態である、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載方法。
【請求項２０】
１種または２種以上の、ワクチン、抗原、抗体、細胞毒性薬、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバントおよび共刺激分子またはその組み合わせを投与することをさらに含む、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００７年８月１５日出願の米国仮出願シリアルＮｏ．60/955,895の利益を主張し、その内容は、その全体を参照によりここに組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、概して、免疫モジュレート（modulatory）剤としてオリゴヌクレオチドをベースとする化合物を用いる、免疫学および免疫治療の適用の分野に関する。より詳しくは、本発明は、ＴＬＲを介して免疫調節をモジュレート（modulate）する化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドをベースとする化合物およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の要約
免疫応答には、該応答に係わる細胞のサブセットに基づく先天的応答および適応応答の両方が含まれる。例えば、遅延型過敏性および細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」ｓ）の活性化などの古典的な細胞媒介機能に係わるＴヘルパー（Ｔｈ）細胞はＴｈ１細胞であり、一方、Ｂ細胞の活性化に対してヘルパー細胞として係わる細胞はＴｈ２細胞である。免疫応答のタイプは、抗原への暴露に対する応答において産生されるサイトカインおよびケモカインによって影響を受ける。サイトカインは、生じる免疫応答のタイプに直接的に影響するＴヘルパー１（Ｔｈ１）細胞とＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞とのバランスに影響することによって、免疫応答をコントロールする手段を提供する。バランスがＴｈ１の数がより高い方へ向くと、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬｓ）の活性化を含む細胞媒介免疫応答が生じる。バランスがＴｈ２の数がより高い方へ向くと、体液性または抗体免疫反応が生じる。これらの免疫応答のそれぞれは、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞から分泌されるサイトカインの異なる組み合わせをもたらす。Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞によって分泌されるサイトカインの差異は、これら２つのサブセットの異なる生体機能の結果であるかもしれない。
【０００４】
Ｔｈ１細胞は、抗原への身体の先天性応答に関与する（例えばウィルス感染、細胞内病原体、および腫瘍細胞）。抗原に対する最初の応答は、抗原提示細胞（例えば、活性化マクロファージおよび樹状細胞）からのＩＬ−１２の分泌およびＴｈ１細胞の同時活性化である可能性がある。Ｔｈ１細胞の活性化の結果は、あるサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマおよび他のサイトカイン）の分泌および抗原特異的ＣＴＬの同時活性化である。Ｔｈ２細胞は、細菌、寄生動物、抗原およびアレルゲンに応答して活性化されることが知られており、あるサイトカイン（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３および他のサイトカイン）およびケモカインの分泌を介して、身体の適応免疫応答（例えば、ＩｇＭおよびＩｇＧ産生および好酸球の活性化）を媒介し得る。これらのあるサイトカインの分泌によって、Ｂ細胞増殖および抗体産生の増加をもたらし得る。さらに、これらのあるサイトカインは、他のサイトカインの遊離を惹起するか、阻害し得る（例えば、ＩＬ−１０は、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ−γおよび樹状細胞からのＩＬ−１２の分泌を阻害する）。Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞の間のバランス並びに選択された刺激に応じて遊離したサイトカインおよびケモカインは、身体の免疫系が疾病にどのように応答するかにおける重要な役割を有する可能性がある。例えば、ＩＦＮ−αはＣ型肝炎を阻害し、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β（夫々、ＣＣＬ３およびＣＣＬ４としても知られる）は、ＨＩＶ−１の感染を阻害し得る。Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答の最適なバランスは、種々の疾病を処置および予防するために免疫系を用いる機会を提示する。
【０００５】
Ｔｈ１免疫応答は、例えば、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む細菌のまたは合成ＤＮＡの導入によって、哺乳動物において誘導され得、免疫応答は、パターン認識受容体（pattern recognition receptors；「ＰＲＲ」ｓ）として知られるある免疫細胞の受容体に対する特異的なオリゴヌクレオチド配列（例えば、非メチル化ＣｐＧ）の提示をもたらす。これらのうち、あるＰＲＲは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）である。
【０００６】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、微生物感染に対する応答における先天性免疫応答の誘導に密接に関与する。脊椎動物において、Ｔｏｌｌ様受容体と呼ばれる１０種のタンパク質のファミリー（ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０）が、病原体関連分子パターンを認識することが知られている。１０種のうち、ＴＬＲ３、７、８および９は、細胞内のエンドソーム内に限局化し、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）ならびにヌクレオシドおよび核酸代謝産物などの小分子を認識することが知られている。ＴＬＲ３およびＴＬＲ９は、それぞれウィルスおよび細菌ならびに合成ＤＮＡに存在するｄｓＲＮＡおよび非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドなどの核酸を認識することが知られている。細菌ＤＮＡは、免疫システムおよび抗腫瘍活性を活性化することが示されている(Tokunaga T et al., J. Natl. Cancer Inst. (1984) 72:955-962; Shimada S, et al., Jpn. H cancer Res, 1986, 77, 808-816; Yamamoto S, et al., Jpn. J. Cancer Res., 1986, 79, 866-73; Messina, J, et al., J. Immunolo. (1991) 147:1759-1764)。ＣｐＧジヌクレオチドを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する他の研究では、免疫応答の刺激が示された(Zhao Q, et al., Biochem.Pharmacol. 1996, 26, 173-82)。続く研究により、ＴＬＲ９が細菌および合成ＤＮＡに存在する非メチル化ＣｐＧモチーフを認識することが示された(Hemmi H, et al., Nature. (2000) 408:740-5)。ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの他の修飾はまた、ＴＬＲ９を介する免疫応答のモジュレータとして作用するその能力に影響を及ぼすことができる(例えば、Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182;  Zhao et al., Biochem Pharmacol. (1996) 52:1537-1544;  Zhao et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7:495-502;  Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9:3453-3458; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:1051-1054;  Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:2585-2588; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2001) 11:2263-2267; and Kandimalla et al., Bioorg. Med. Chem. (2001) 9:807-813参照)。加えて、構造活性相関研究により、合成モチーフおよび非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドから生じるものとは明白に異なる、特異的免疫応答プロフィールを誘発する新規のＤＮＡに基づく化合物の同定を可能にしてきた(Kandimalla ER, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (2005) 102:6925-30. Kandimalla ER, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (2003) 100:14303-8. Cong YP, et al., Biochem Biophys Res Commun. (2003) 310:1133-9. Kandimalla ER, et al., Biochem Biophys Res Commun. (2003) 306:948-53. Kandimalla ER, et al., Nucleic Acids Res. (2003) 31:2393-400. Yu D, et al., Bioorg Med Chem. (2003) 11:459-64. Bhagat L, et al., Biochem Biophys Res Commun. (2003) 300:853-61. Yu D, et al., Nucleic Acids Res. (2002) 30:4460-9. Yu D, et al., J Med Chem. (2002) 45:4540-8. Yu D, et al., Biochem Biophys Res Commun. (2002) 297:83-90. Kandimalla ER, et al., Bioconjug Chem. (2002) 13:966-74. Yu D, K et al., Nucleic Acids Res. (2002) 30:1613-9. Yu D, et al., Bioorg Med Chem. (2001) 9:2803-8. Yu D, et al., Bioorg Med Chem Lett. (2001) 11:2263-7. Kandimalla ER, et al., Bioorg Med Chem.( 2001) 9:807-13. Yu D, et al., Bioorg Med Chem Lett. (2000) 10:2585-8, Putta MR, et al., Nucleic Acids Res. (2006) 34:3231-8)。
【０００７】
リボースまたはデオキシリボースの糖を含むオリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチドは、様々な分野で使用されており、診断精査、ＰＣＲプライミング、遺伝子発現のアンチセンス阻害、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）をベースとした免疫療法剤が含まれるがこれらに限定されない。より最近では、多くの刊行物は、オリゴデオキシヌクレオチドの免疫調節剤としての使用や、アレルギー、喘息、炎症性疾患、自己免疫、癌、および感染症などの多くの疾病への免疫療法用途におけるそれらの単独でのまたはアジュバントとしての使用を実証している(Marshak-Rothstein A, Nat Rev Immunol (2006) 6:823-35)。
【０００８】
炎症性の応答の調節における関連の結果として、ＴＬＲは、自己免疫、感染症および炎症を含む多くの疾患の病原性における役割を果たすことが示されてきた(Papadimitraki et al. (2007) J. Autoimmun 29: 310-318; Sun et al. (2007) Inflam Allergy Drug Targets 6:223-235; Diebold (2008) Adv Drug Deliv Rev 60:813-823; Cook, D.N. et al. (2004) Nature Immunol 5:975-979; Tse and Horner (2008) Semin Immunopathol 30:53-62; Tobias & Curtiss (2008) Semin Immunopathol 30:23-27; Ropert et al. (2008) Semin Immunopathol 30:41-51; Lee et al. (2008) Semin Immunopathol 30:3-9; Gao et al. (2008) Semin Immunopathol 30:29-40; Vijay-Kumar et al. (2008) Semin Immunopathol 30:11-21)。ＴＬＲの活性化は免疫応答を付与することに関連するのであるが、ＴＬＲを介した免疫システムのコントロールされていない刺激は、免疫機能が低下した対象における特定の病気を悪化させるかもしれない。近年、数グループが炎症性サイトカインの阻害剤として合成オリゴデオキシオリゴヌクレオチド（「ＯＤＮｓ」）の使用を示している(Lenert, P. et al. (2003) DNA Cell Biol. 22(10):621-631)。
【０００９】
加えて、数グループが、２個のトリプレット配列、近位「ＣＣＴ」トリプレットおよび遠位「ＧＧＧ」トリプレットを有する合成オリゴデオキシヌクレオチド、ポリ「Ｇ」（例えば、「ＧＧＧＧ」または「ＧＧＧ」）、または、ＴＬＲタンパク質と相互作用し、その活性化および共存物の産生および炎症性サイトカインの放出を阻害する「ＧＣ」配列を用いている。（例えば、Lenert, P. et al. (2003) DNA Cell Biol. 22(10):621-631; Patole, P. et al. (2005) J. Am. Soc. Nephrol. 16:3273-3280), Gursel, I., et al. (J. Immunol, 171: 1393-1400 (2003), Shirota, H., et al., J. Immunol, 173: 5002-5007 (2004), Chen, Y., et al., Gene Ther 8: 1024-1032 (2001); Stunz, L.L., Eur. J. Immunol 32: 1212-1222 (2002; Kandimalla et al. WO2007/7047396参照）。しかしながら、グアノシン鎖を含むオリゴヌクレオチドは、テトラプレックス構造を形成し、アプタマーとして作用し、トロンビン活性を阻害することが示されている(Bock LC et al., Nature, 355:564-6, 1992; Padmanabhan, K et al., J Biol Chem., 268(24):17651-4, 1993)。したがって、これらの阻害的なオリゴデオキシヌクレオチド分子の用途は、患者において達成できないかもしれない。
【００１０】
さらに、最近の研究によって、ＯＤＮｓを含むポリＧは、ＴＬＲのアンタゴニストとして作用しているという見解は疑問視されてきた。例えば、US 6,426,334, Agrawal et al.は、「ＧＧＧＧ」鎖を含むＣｐＧオリゴヌクレオチドを投与することによって、血清ＩＬ−１２濃度における増加を引き起こすであろうことを示し、ＴＬＲ阻害に抗したＴＬＲ活性化を示している。さらには、ポリＧ配列を含むＣｐＧオリゴは、ＴＬＲ９の活性化を介した免疫応答を誘導することが知られ(Verthelyi D et al, J Immunol 166, 2372, 2001; Gursel M et al, J Leukoc Biol, 71, 813, 2001, Krieg A et al, Eur J Immunol, 31, 2154, 2001)、抗腫瘍または抗ウィルス活性を示す(Ballas GK et al, J Immunol, 167, 4878, 2001; Verthelyi D et al, J Immunol, 170, 4717, 2003)。加えて、免疫刺激ＣｐＧモチーフおよび４連続Ｇヌクレオチド（クラスＡ  ＯＤＮ）を含むＯＤＮは、インターフェロン−γ産生および免疫応答におけるＴｈ１シフトを誘導する。
【００１１】
近年、Agrawal et al.(WO2007047396)は、従来同定されたＴＬＲアンタゴニストの限定を有しない、ＴＬＲアンタゴニストの新たなクラスを見出した。かかる新たなクラスの化合物は、ＴＬＲの活性を効果的に阻害し、様々なＴＬＲアゴニスト活性をブロックする。しかしながら、いくつかの疾患の状態において、ＴＬＲ活性と部分的にのみ拮抗することが望まれるかもしれない。したがって、用量に応じ、ＴＬＲ活性と完全までではない形で拮抗し得る化合物に対する要求が存在する。
【発明の概要】
【００１２】
第１の側面において、本発明は、ＴＬＲ９媒介免疫応答をコントロールされた様式で減少させるが失わせない、新規クラスの免疫調節オリゴヌクレオチド化合物を提供する。かかる化合物は、２個または３個以上のＴＬＲ９誘導部分、およびＴＬＲ９誘導部分に対しおよび／または最も５’側のＴＬＲ９誘導部分に配置する配列中に１種または２種以上の化学修飾を有し、かかる修飾は、最も５’側のＴＬＲ９誘導部分の活性を阻害し、ブロックされたＴＬＲ９誘導部分を生じる。
【００１３】
本発明のこの側面の１つの態様として、化合物は、構造５’−ＮｍＮ１Ｎ２Ｃ１Ｇ１−ＮＰ−Ｎ３Ｎ４Ｃ２Ｇ２−Ｎｍ−３’を有し、式中、Ｃ１はシトシンであり、Ｇ１はグアノシンであり、Ｃ２はシトシンまたはシトシン誘導体であり、および、Ｇ２はグアノシンまたはグアノシン誘導体であり、Ｎ１およびＮ２は、それぞれにおいて独立して、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、ヌクレオチド、２’置換（例えば、２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または他のブロック部分であり、但し、Ｎ１またはＮ２の少なくとも１個は、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害するブロック部分であり、Ｎ３およびＮ４は、それぞれにおいて独立して、Ｃ２Ｇ２のＴＬＲ刺激活性を阻害しない、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、Ｎｍは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合であり、Ｎｐは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、但し、前記化合物は３個より少ない連続的なグアノシンヌクレオチドを含み、ここで、ｍは０から約２０までの数であり、ここで、ｐは０から約２０までの数であり、ここで、オリゴヌクレオチドは、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、２’−Ｏ−置換ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他の修飾がなければ、免疫刺激性である。
【００１４】
本発明のこの側面の他の態様において、化合物は、構造５’−ＮｍＮ１Ｎ２Ｃ１Ｇ１−ＮＰ−Ｎ３Ｎ４Ｃ２Ｇ２−Ｎｍ−３’を有し、式中、Ｃ１およびＣ２は、独立して、シトシンまたはシトシン誘導体であり、Ｇ１およびＧ２は、独立して、グアノシンまたはグアノシン誘導体であり、ここで、Ｃ１およびＧ１は、修飾ヌクレオシドであり、Ｎ１およびＮ２は、それぞれにおいて独立して、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、ヌクレオチド、２’置換（例えば、２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または他のブロック部分であり、但し、Ｎ１またはＮ２の少なくとも１個は、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害するブロック部分であり、Ｎ３およびＮ４は、それぞれにおいて独立して、Ｃ２Ｇ２のＴＬＲ刺激活性を阻害しない、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、Ｎｍは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合であり、Ｎｐは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、但し、前記化合物は３個より少ない連続的なグアノシンヌクレオチドを含み、ここで、ｍは０から約２０までの数であり、ここで、ｐは０から約２０までの数であり、ここで、オリゴヌクレオチドは、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、２’−Ｏ−置換ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他の修飾がなければ、免疫刺激性である。
【００１５】
本発明のこの側面のさらなる態様において、化合物は、構造５’−Ｎｍ−Ｎ１Ｎ２Ｃ１Ｇ１−ＮＰ−Ｎ３Ｎ４Ｃ２Ｇ２−Ｎｒ−Ｘ−Ｎｒ−Ｇ２Ｃ２Ｎ４Ｎ３−Ｎｐ−Ｇ１Ｃ１Ｎ２Ｎ１−Ｎｍ−５’を有し、式中、Ｃ１はシトシンであり、Ｇ１はグアノシンであり、Ｃ２はシトシンまたはシトシン誘導体であり、Ｇ２はグアノシンまたはグアノシン誘導体であり、Ｎ１およびＮ２は、それぞれにおいて独立して、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、ヌクレオチド、２’置換（例えば、２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または他のブロック部分であり、但し、Ｎ１またはＮ２の少なくとも１個は、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害するブロック部分であり、Ｎ３およびＮ４は、それぞれ独立して、Ｃ２Ｇ２のＴＬＲ刺激活性を阻害しない、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、Ｎｍは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合であり、Ｎｐは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、Ｎｒは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、但し、前記化合物は、３個より少ない連続的なグアノシンヌクレオチドを含み、ここで、ｍは０から約２０までの数であり、ここで、ｒは０から約２０までの数であり、ここで、ｐは０から約２０までの数であり、ここで、Ｘは、非ヌクレオチドリンカーであり、および、ここで、オリゴヌクレオチドは、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、２’−Ｏ−置換ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他の修飾がなければ、免疫刺激性である。
【００１６】
本発明のこの側面のさらなる態様において、化合物は、構造５’−Ｎｍ−Ｎ１Ｎ２Ｃ１Ｇ１−ＮＰ−Ｎ３Ｎ４Ｃ２Ｇ２−Ｎｒ−Ｘ−Ｎｒ−Ｇ２Ｃ２Ｎ４Ｎ３−Ｎｐ−Ｇ１Ｃ１Ｎ２Ｎ１−Ｎｍ−５’を有し、式中、Ｃ１およびＣ２は、独立して、シトシンまたはシトシン誘導体であり、Ｇ１およびＧ２は、独立して、グアノシンまたはグアノシン誘導体であり、ここで、Ｃ１およびＧ１の少なくとも１個は修飾ヌクレオシドであり、Ｎ１およびＮ２は、それぞれにおいて独立して、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、ヌクレオチド、２’置換（例えば、２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または他のブロック部分であり、但し、Ｎ１またはＮ２の少なくとも１個は、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害するブロック部分であり、Ｎｍは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド結合であり、Ｎｐは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、Ｎｒは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体であり、但し、前記化合物が３個より少ない連続的なグアノシンヌクレオチドを含み、ここで、ｍは０から約２０までの数であり、ここで、ｒは０から約２０までの数であり、ここで、ｐは０から約２０までの数であり、ここで、Ｘは、非ヌクレオチドリンカーであり、および、ここで、オリゴヌクレオチドは、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、２’−Ｏ−置換ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他の修飾がなければ、免疫刺激性である。
【００１７】
第２の側面において、本発明は医薬組成物を提供する。これらの組成物は本発明の第１の側面において開示された化合物のいずれか１種および薬学的に許容し得る担体を含む。
【００１８】
第３の側面において、本発明は、哺乳動物におけるＴＬＲ９媒介免疫応答を減少させる方法を提供し、該方法は、本発明による化合物または組成物を薬学的に有効な量で哺乳動物に投与することを含む。
【００１９】
第４の側面において、本発明は、ＴＬＲ９媒介免疫応答を減少させることが有益である疾患または障害を有する哺乳動物を治療的に処置する方法を提供する。
【００２０】
第５の側面において、本発明は、ＴＬＲ９媒介免疫応答を減少させることが有益である哺乳動物における疾患または障害を予防する、または、コントロールされたＴＬＲ拮抗作用が望まれる疾患または障害のための方法を提供する。この側面による方法は、本発明の化合物または組成物を哺乳動物に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明の化合物のリニア合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル；ＣＥ＝シアノエチル。
【００２２】
【図２】図２は、本発明の化合物のパラレル合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル；ＣＥ＝シアノエチル。
【００２３】
【図３】図３は、新規な免疫調節オリゴヌクレオチドにより媒介されたＴＬＲ９活性を図示する。図３は、より一般的には、新規な阻害性のオリゴヌクレオチドが、より低い濃度ではアンタゴニストとして、より高い濃度ではアゴニストとして、それらの阻害活性を有効にコントロールしながら機能することを実証する。
【００２４】
【図４】図４は、より低い用量での新規な免疫調節オリゴヌクレオチドにより媒介されたＴＬＲ９活性を図示する。図４は、より一般的には、新規な阻害性オリゴヌクレオチドがより低い濃度ではアンタゴニストとして、より高い濃度ではアゴニストとして、それらの阻害活性を有効にコントロールしながら機能するであろうことを実証する。
【００２５】
【図５】図５は、増加する用量での新規な免疫調節オリゴヌクレオチドのＴＬＲ９活性を図示する。図５は、より一般的には、新規な阻害性オリゴヌクレオチドがより低い濃度ではアンタゴニストとして、より高い濃度ではアゴニストとして、それらの阻害活性を有効にコントロールしながら機能することを実証する。
【００２６】
【図６】図６は、新規な免疫調節オリゴヌクレオチドのＴＬＲ９活性を図示する。図６は、より一般的には、新規な阻害性オリゴヌクレオチドが、より低い濃度ではアンタゴニストとして、より高い濃度ではアゴニストとして、それらの阻害活性を有効にコントロールしながら機能するであろうことを実証する。
【００２７】
【図７】図７は、増加する用量での新規な免疫調節オリゴヌクレオチドのＴＬＲ９活性を図示する。図７は、より一般的には、新規な阻害性オリゴヌクレオチドが、より低い濃度ではアンタゴニストとして、より高い濃度ではアゴニストとして、それらの阻害活性を有効にコントロールしながら機能するであろうことを実証する。
【００２８】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、免疫治療用途のための免疫モジュレート剤としてのオリゴヌクレオチドの治療的使用に関する。とくに、本発明は、ＴＬＲ９を介して免疫応答をモジュレートするオリゴヌクレオチドをベースとする化合物を提供する。本発明は、ＴＬＲ９媒介免疫応答を減少させるが、失わせることによるのではなく、ＴＬＲ９の用量コントロールされたアンタゴニストの投与が有益である自己免疫成分を有するものを含む、様々な疾患または障害を処置または予防するために有用であり得る化合物および方法を提供する。ここに引用された発行済み特許、特許出願および参照は、ここで、夫々、特別におよび個々に示し、」参照として組み込まれた場合と同程度で、参照することにより組み込まれる。ここで引用された任意の参照の任意の教示と本明細書との間に不整合が生じる場合、後者が本発明の目的のために優先すべきである。
【００２９】
前述のおよび他の本発明の目的、その種々の特徴、ならびに本発明自体は、付属の図表と共に読むと、次の記載からより完全に理解することができる：
【００３０】
用語「２’−置換ヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」は、一般に、ペントースまたはアラビノース部分の２’位の水酸基が置換して２’−置換または２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドであるヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドを含む。ある態様において、かかる置換は、１〜６個の飽和または不飽和の炭素原子を含む低級ヒドロカルビル基、ハロゲン原子、または、６〜１０個の炭素原子を有するアリール基によるものであり、ここでかかるヒドロカルビル基またはアリール基は、置換していなくても、あるいは、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシまたはアミノ基で置換していてもよい。２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−置換アラビノシドの例には、限定されないが、２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−アルキルおよび２’−プロパルギルリボヌクレオシドまたはアラビノシド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メチルアラビノシドおよび２’−Ｏ−メトキシエトキシリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メトキシエトキシアラビノシドがある。
【００３１】
用語「３’」は、方向性に用いる場合、一般に、同一のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの他の領域または位置からポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’（オリゴヌクレオチドの３’位の方へ）の領域または位置を意味する。
【００３２】
用語「５’」は、方向性に用いる場合、一般に、同一のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの他の領域または位置からポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’（オリゴヌクレオチドの５’位の方へ）の領域または位置を意味する。
【００３３】
用語「約」は、一般に、正確な数字が臨界的でないことを意味する。したがって、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド残基の数が臨界的であり、１つまたは２つのより少数のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチド、または１つから数個の付加的なヌクレオシド残基は、上記の各態様の相当物として考慮される。
【００３４】
用語「気道炎症」は、一般に、限定されず、喘息を含むアレルゲンによって引き起こされた呼吸管の炎症を含む。
【００３５】
用語「アレルゲン」は、一般に、対象にさらすとアレルギー反応を誘発する分子（通常、タンパク質）の抗原または抗原部分をいう。典型的な対象は、例えば、ホイール・アンド・フレイア試験（wheal and flare test）または当該分野で知られる任意の方法によって示されるように抗原に対しアレルギー性である。分子は、分子にさらすと対象の小さな小集団だけがアレルギーの（例えば、ＩｇＥ）免疫反応を示しても、アレルゲンであるといわれる。
【００３６】
用語「アレルギー」は、一般に、限定されないが、食品アレルギー、呼吸アレルギーおよび皮膚アレルギーを含む。
【００３７】
用語「抗原」は、一般に、抗体によって、または、Ｔ細胞抗原レセプターによって、認識され、選択的に結合する物質をいう。抗原は、限定されないが、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの組み合わせを含み得る。抗原は、天然または合成であってよく、一般に、当該抗原に特異的な免疫応答を誘導する。
【００３８】
用語「自己免疫疾患」は、一般に、「自己」の抗原が免疫系によって攻撃を受ける疾患をいう。
【００３９】
用語「担体」は、一般に、任意の賦形剤、希釈剤、増量剤、塩、バッファー、安定化剤、可溶化剤、オイル、脂質、脂質含有ベシクル、ミクロスフェア、リポソームカプセル剤または医薬の処方において用いるための当該分野でよく知られた他の材料を包含する。担体、賦形剤または希釈剤の特性が特定の適用に対する投与ルートに依存するであろうことは理解されるであろう。これらの材料を含む薬学的に許容し得る処方の製剤は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載されている。
【００４０】
用語「共投与（co-administration）」は、一般に、免疫応答をモジュレートするために十分に時間的に近接した少なくとも２つの異なる物質の投与をいう。好ましくは、共投与は、少なくとも２つの異なる物質の同時の投与をいう。
【００４１】
用語「薬学的に有効な量」は、一般に、病気または障害の兆候または症状の、限定されないが、予防（prevention）、阻害（inhibition）、減退（diminution）、良化（amelioration）または除去（elimination）を含む有益な結果などの、所望の生物学的効果に影響するのに十分な量をいう。したがって、「薬学的に有効な量」は、それが投与される状況に依存する。薬学的に有効な量は、１回または２回以上の予防的または治療的投与において投与され得る。
【００４２】
用語「予防的に有効な量」は、一般に、望ましくない生物学的影響の進行を予防、低減または阻害するために十分な量をいう。
【００４３】
用語「組み合わせて」は、一般に、本発明の化合物と、同じ患者における同じ疾患を処置する過程における該化合物のＴＬＲ９アンタゴニスト効果を減らさない疾患または症状を処置するのに有用なもう１つの剤とを投与することを意味する。かかる投与は、同時投与ならびに数秒から数日間隔の時間的に間隔の開いた手順を含む、任意の手順で投与すること含む。かかる組み合わせ処置は、さらに本発明の化合物および／または、独立して、他の剤の単独を超えた投与を含み得る。本発明の化合物および他の剤の投与は、同一または異なるルートによってもよい。
【００４４】
用語「個体」または「対象」は、一般に、ヒトなどの哺乳動物をいう。哺乳動物は、一般に、限定されないが、ヒト、ヒトでない霊長動物、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、雌ウシ、ブタ、ヒツジおよびウサギを含む。
【００４５】
用語「リニア合成」は、一般に、オリゴヌクレオチドの一端から始まり、他端まで直線的に進行する合成をいう。リニア合成は、同一または同一でない（長さ、塩基組成および／または組み込まれた化学修飾の点で）のモノマー単位をオリゴヌクレオチドへの組み込みを許容する。
【００４６】
用語「修飾」または「誘導体」は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの文脈において用いられる場合、一般に、修飾ヘテロ環塩基、修飾糖部分またはその任意の組み合わせを有するヌクレオシド、または、任意のかかる修飾または修飾ホスホネートを有するヌクレオチドをいう。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシドは、ここで記載されたとおり、非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。本発明の目的のために、修飾ヌクレオシド、ピリミジンまたはプリン類縁体または天然に発生しないピリミジンまたはプリンは、相互交換可能に用いられることができ、天然に発生しない塩基および／または天然に発生しない糖部分を含むヌクレオシドをいう本発明の目的のために、塩基は、グアニン、シトシン、アデニン、チミンまたはウラシルでない場合、非天然であると認められる。
【００４７】
用語「モジュレートすること」または「モジュレートの」は、一般に、ＴＬＲ９媒介応答における応答の低減または質的な相違などの変化をいう。
【００４８】
用語「リンカー」は、一般に、糖、塩基または骨格（back bone）を介して共有結合または非共有結合によって、オリゴヌクレオチドに結合させることができる任意の部分をいう。リンカーは、２または３個以上のヌクレオシドに結合するように用いられるか、または、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端のヌクレオチドに結合され得る。かかるリンカーは、非ヌクレオチドリンカーまたはヌクレオチドリンカーであり得る。
【００４９】
用語「非ヌクレオチドリンカー」は、一般に、共有結合または非共有結合によってオリゴヌクレオチドに結合することができるヌクレオチド結合以外の化学部分をいう。好ましくは、かかる非ヌクレオチドリンカーは、約２オングストロームから約２００オングストロームの長さであり、シスまたはトランス配置であり得る。
【００５０】
用語「ヌクレオチド結合」は、一般に、隣接するヌクレオシドの間のリン原子および荷電したまたは中和した基（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネートまたはホスホロアミデートなど）からなるそれらの糖を介して（例えば、３’−３’、２’−３’、２’−５’、３’−５’）、２個のヌクレオシドを合わせる化学結合をいう。
【００５１】
用語「オリゴヌクレオチドをベースとする化合物」は、複数個の結合したヌクレオシド単位から形成されたポリヌクレオシドをいう。かかるオリゴヌクレオチドは、ゲノムまたはｃＤＮＡを含む既存の核酸源から得ることが可能であるが、好ましくは合成方法により産生される。好ましい態様において、それぞれのヌクレオシド単位は、ヘテロ環塩基およびペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’置換アラビノース、２’−Ｏ−置換アラビノースまたはヘキソース糖基を含む。ヌクレオシド残基は、任意の多数の知られたヌクレオシド間結合によって、互いに結合することができる。かかるヌクレオシド間結合は、限定されないが、ホスホロジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、シロキサン、カルボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラーノ、チオエーテル、架橋ホスホラミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエートおよびスルホンヌクレオシド間結合を含む。用語「オリゴヌクレオチドをベースとする化合物」はまた、１個または２個以上の立体特異的ヌクレオシド間結合（例えば、（Ｒｐ）−または（Ｓｐ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネートまたはホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドをも包含する。ここで用いられるように、用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、結合がリン酸基を含むか含まないかに拘らず、任意のかかるヌクレオシド間結合を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを明示的に意図する。ある好ましい態様においては、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合またはその組み合わせであってもよい。
【００５２】
用語「ペプチド」は、一般に、十分な長さのポリペプチドおよび、ペプチドがハプテンであってもなくても、例えば、抗体産生またはサイトカイン活性などの生体反応に影響を与える組成物をいう。用語「ぺプチド」は、修飾したアミノ酸（天然または非天然に生じたのであってもなくても）を含んでもよく、かかる修飾には、限定されないが、リン酸化、糖鎖化、ペグ化（pegylation）、脂質化およびメチル化が含まれる。
【００５３】
用語「生理学的に許容し得る」は、一般に、本発明の化合物の効果を干渉せず、細胞、細胞培養、組織または器官などの生物学的システムと適合性のある材料に関する。好ましくは、生物学的システムは脊椎動物などの生体である。
【００５４】
用語「ＴＬＲ９アンタゴニスト」は、一般に、ＴＬＲ９によって媒介される免疫刺激を予防または低減することが可能なオリゴヌクレオチドをベースとする化合物をいう。
【００５５】
用語「ＴＬＲ９誘導部分」は、オリゴヌクレオチドをベースとする化合物の文脈において、ＴＬＲ９媒介免疫応答を誘導するジヌクレオチド部分をいう。好ましい態様において、ジヌクレオチドは、構造Ｙ−Ｚを有し、式中、Ｙは、シチジン、２’デオキシシチジン、アラビノシチジン、２’−デオキシ−２’−置換アラビノシチジン、２’−Ｏ−置換アラビノシチジン、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン、２’−デオキシ−Ｎ４−アルキルシチジン、２’−デオキシ−４−チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、Ｚは、グアノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’置換アラビノグアノシン、２’−Ｏ−置換アラビノグアノシン、２’−デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドである。
【００５６】
用語「ブロックされたＴＬＲ９誘導部分」は、ＴＬＲ９誘導部分自体の修飾（単数または複数）を介して、および／または、オリゴヌクレオチドをベースとする化合物内での１個または２個以上の化学修飾によって、ＴＬＲ９媒介免疫応答を誘導することを機能的にブロックまたは阻害されるという事実がなければ、ＴＬＲ９拮抗作用を有するＴＬＲ９誘導部分をいう。ＴＬＲ９誘導部分の活性を阻害するブロック部分は、限定されないが、２’−ＯＭｅ−リボヌクレオシド、３’−ＯＭｅ−リボヌクレオシド、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ｄＵ、β−Ｌ−デオキシヌクレオシド、α−デオキシヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、プロパンジオールリンカー、アミノリンカー、イソプロポキシル、グリセロールリンカー、２’−５’−ＤＮＡ、２’−５’−ＲＮＡおよびＰ−ＭｅＤＮＡを含む。
【００５７】
用語「処置」は、一般に、症状の緩和または疾患の進行を遅らせることまたは良化することを含み得る、有益さまたは所望の結果を得ようとするアプローチをいう。
【００５８】
第１の側面において、本発明は、ＴＬＲ９媒介免疫応答をコントロールされた様式で減少させるが失わせない、新規クラスの免疫調節オリゴヌクレオチド化合物を提供する。かかる化合物は、２個または３個以上のＴＬＲ９誘導部分、およびＴＬＲ９誘導部分に対しおよび／または最も５’側のＴＬＲ９誘導部分に配置する配列中に１種または２種以上の化学修飾を有し、かかる修飾は、最も５’側のＴＬＲ９誘導部分の活性を阻害し、ブロックされたＴＬＲ９誘導部分を生じる。
【００５９】
本発明のこの側面の１つの態様として、化合物は、構造５’−ＮｍＮ１Ｎ２Ｃ１Ｇ１−ＮＰ−Ｎ３Ｎ４Ｃ２Ｇ２−Ｎｍ−３’を有し、式中、Ｃ１はシトシンであり、Ｇ１はグアノシンであり、Ｃ２はシトシンまたはシトシン誘導体であり、および、Ｇ２はグアノシンまたはグアノシン誘導体であり、Ｎ１およびＮ２は、それぞれにおいて独立して、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、ヌクレオチド、２’置換（例えば、２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または他のブロック部分であり、但し、Ｎ１またはＮ２の少なくとも１個は、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害するブロック部分であり、Ｎ３およびＮ４は、それぞれにおいて独立して、Ｃ２Ｇ２のＴＬＲ刺激活性を阻害しない、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、Ｎｍは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合であり、Ｎｐは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、但し、前記化合物は３個より少ない連続的なグアノシンヌクレオチドを含み、ここで、ｍは０から約２０までの数であり、ここで、ｐは０から約２０までの数であり、ここで、オリゴヌクレオチドは、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、２’−Ｏ−置換ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他の修飾がなければ、免疫刺激性である。この態様において、第１のＴＬＲ９誘導部分は、第２のＴＬＲ９誘導部分に対して５’であり、ここで、第１のＴＬＲ９誘導部分はブロックされたＴＬＲ９誘導部分であり、ＴＬＲ９アンタゴニストとして作用し、ここで、第２のＴＬＲ９誘導部分はブロックされない。
【００６０】
本発明のこの側面の他の態様において、化合物は、構造５’−ＮｍＮ１Ｎ２Ｃ１Ｇ１−ＮＰ−Ｎ３Ｎ４Ｃ２Ｇ２−Ｎｍ−３’を有し、式中、Ｃ１およびＣ２は、独立して、シトシンまたはシトシン誘導体であり、Ｇ１およびＧ２は、独立して、グアノシンまたはグアノシン誘導体であり、ここで、Ｃ１およびＧ１は、修飾ヌクレオシドであり、Ｎ１およびＮ２は、それぞれにおいて独立して、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、ヌクレオチド、２’置換（例えば、２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または他のブロック部分であり、但し、Ｎ１またはＮ２の少なくとも１個は、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害するブロック部分であり、Ｎ３およびＮ４は、それぞれにおいて独立して、Ｃ２Ｇ２のＴＬＲ刺激活性を阻害しない、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、Ｎｍは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合であり、Ｎｐは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、但し、前記化合物は３個より少ない連続的なグアノシンヌクレオチドを含み、ここで、ｍは０から約２０までの数であり、ここで、ｐは０から約２０までの数であり、ここで、オリゴヌクレオチドは、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、２’−Ｏ−置換ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他の修飾がなければ、免疫刺激性である。この態様において、第１のＴＬＲ９誘導部分は、第２のＴＬＲ９誘導部分に対して５’であり、ここで、第１のＴＬＲ９誘導部分はブロックされたＴＬＲ９誘導部分であり、ＴＬＲ９アンタゴニストとして作用し、ここで、第２のＴＬＲ９誘導部分はブロックされない。
【００６１】
本発明のこの側面のさらなる態様において、本発明は、非ヌクレオチドリンカーと３’末端で結合した少なくとも２つのオリゴヌクレオチドまたはヌクレオシド間結合または官能性核酸塩基または糖を含む免疫調節オリゴヌクレオチドを提供する。例えば、この態様の化合物は、構造５’−Ｎｍ−Ｎ１Ｎ２Ｃ１Ｇ１−ＮＰ−Ｎ３Ｎ４Ｃ２Ｇ２−Ｎｒ−Ｘ−Ｎｒ−Ｇ２Ｃ２Ｎ４Ｎ３−Ｎｐ−Ｇ１Ｃ１Ｎ２Ｎ１−Ｎｍ−５’を有し、式中、Ｃ１はシトシンであり、Ｇ１はグアノシンであり、Ｃ２はシトシンまたはシトシン誘導体であり、Ｇ２はグアノシンまたはグアノシン誘導体であり、Ｎ１およびＮ２は、それぞれにおいて独立して、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、ヌクレオチド、２’置換（例えば、２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または他のブロック部分であり、但し、Ｎ１またはＮ２の少なくとも１個は、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害するブロック部分であり、Ｎ３およびＮ４は、それぞれ独立して、Ｃ２Ｇ２のＴＬＲ刺激活性を阻害しない、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、Ｎｍは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または非ヌクレオチド結合であり、Ｎｐは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、Ｎｒは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、但し、前記化合物は、３個より少ない連続的なグアノシンヌクレオチドを含み、ここで、ｍは０から約２０までの数であり、ここで、ｒは０から約２０までの数であり、ここで、ｐは０から約２０までの数であり、ここで、Ｘは、非ヌクレオチドリンカーであり、および、ここで、オリゴヌクレオチドは、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、２’−Ｏ−置換ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他の修飾がなければ、免疫刺激性である。
【００６２】
他の態様において、本発明は、非ヌクレオチドリンカーと３’末端で結合した少なくとも２つのオリゴヌクレオチドまたはヌクレオシド間結合または官能性核酸塩基または糖を含む免疫調節オリゴヌクレオチドを提供する。例えば、この態様の化合物は、構造５’−Ｎｍ−Ｎ１Ｎ２Ｃ１Ｇ１−ＮＰ−Ｎ３Ｎ４Ｃ２Ｇ２−Ｎｒ−Ｘ−Ｎｒ−Ｇ２Ｃ２Ｎ４Ｎ３−Ｎｐ−Ｇ１Ｃ１Ｎ２Ｎ１−Ｎｍ−５’を有し、式中、Ｃ１およびＣ２は、独立して、シトシンまたはシトシン誘導体であり、Ｇ１およびＧ２は、独立して、グアノシンまたはグアノシン誘導体であり、ここで、Ｃ１およびＧ１の少なくとも１個は修飾ヌクレオシドであり、Ｎ１およびＮ２は、それぞれにおいて独立して、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、ヌクレオチド、２’置換（例えば、２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または他のブロック部分であり、但し、Ｎ１またはＮ２の少なくとも１個は、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害するブロック部分であり、Ｎｍは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド結合であり、Ｎｐは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体であり、Ｎｒは、それぞれにおいて独立して、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体であり、但し、前記化合物が３個より少ない連続的なグアノシンヌクレオチドを含み、ここで、ｍは０から約２０までの数であり、ここで、ｒは０から約２０までの数であり、ここで、ｐは０から約２０までの数であり、ここで、Ｘは、非ヌクレオチドリンカーであり、および、ここで、オリゴヌクレオチドは、Ｃ１Ｇ１のＴＬＲ刺激活性を阻害する、２’−Ｏ−置換ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他の修飾がなければ、免疫刺激性である。
【００６３】
本発明のかかる態様は、少なくとも１個の接近可能な５’末端を有してもよい。この構造が、免疫調節オリゴヌクレオチド化合物に対して、さらなる安定性（例えば、エクソヌクレアーゼ活性の阻害）を提供することが決定されている。免疫調節オリゴヌクレオチドの５’末端は、免疫調節オリゴヌクレオチド化合物をＴＬＲ９を介した免疫応答をモジュレートすることから妨げるように修飾されていない。
【００６４】
本発明のこの側面の他の態様は、少なくとも２個のオリゴリボヌクレオチドを含み、ここで、ドメインＡ、Ｂ、ＣおよびＤの少なくとも１個は、ＴＬＲ９アンタゴニストであって、少なくとも１つのＴＬＲ９誘導部分およびブロックされたＴＬＲ９誘導部分をＴＬＲ誘導部分に対して５’に含み、ここで免疫モジュレート化合物は、限定されないが、表１の式Ｉ〜Ｘで詳説されるものを含む構造を有する。
【表１】
2010536787.tif 000003
2010536787.tif 000004
【００６５】
ドメインＡ、Ｂ、ＣおよびＤは、独立して、約８個〜約３０個のヌクレオチドであってもよく、より好ましくは、約１０個〜約２１個のヌクレオチドである。ドメインＡ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤは、同一であっても同一でなくてもよい。ドメインＡ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤは、独立して、自己相補的ドメイン、ホモまたはヘテロリボヌクレオチド配列またはリンカーを有するかまたは有しない、５’−３’または２’−５’ＲＮＡであってよい。「ｎ」は１個から無制限の個数であってもよい。
【００６６】
「Ｘ」は、脂肪族、芳香族、アリール、環状、キラル、アキラル、ペプチド、炭化水素、脂質、脂肪酸、モノ、トリまたはヘキサポリエチレングリコールまたはヘテロ環部分またはその組み合わせであってもよい、３’または５’結合、リン酸基、非ＲＮＡヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを介し得るドメインＡ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤを継ぎ合わせる（joining）またはキャップするリンカーである。
【００６７】
さらなる態様において、本発明は、非ヌクレオチドリンカーにより結合された少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含む免疫調節オリゴヌクレオチド化合物を提供し、ここで免疫モジュレートオリゴヌクレオチドの配列が少なくとも部分的に自己相補的であってよい。当業者により認識されるであろうように、オリゴヌクレオチドの相補的配列は、分子間水素結合を可能にし、それによりオリゴヌクレオチドの２次構造が与えられる。追加的オリゴヌクレオチドが共に結合することができ、それにより本発明のオリゴヌクレオチドの鎖または多量体が作り出される。
【００６８】
この側面の化合物は、初回投与量ではＴＬＲ９アンタゴニストとして作用し、第２回のより多くの投与量では部分的なＴＬＲ９アゴニストとして作用する。理論に囚われることなく、出願人らは、より低い濃度で、この側面の化合物が、主として、第１の（最も５’側の）ＴＬＲ９誘導部分を介して、ＴＬＲ９を結びつけると考える。このことは、ＴＬＲ９が、オリゴヌクレオチドをベースとする化合物と、最初にそれらの５’末端（単数または複数）で相互作用すると考えられるからである。第１のＴＬＲ９誘導部分の活性がブロックされるため、化合物は、ＴＬＲ９が、主として、第１の（最も５’側の）ＴＬＲ９誘導部分で該化合物と相互作用する用量では、ＴＬＲ９アンタゴニストとして作用する。しかしながら、高濃度において、第１の（最も５側’の）ＴＬＲ９誘導部分が飽和すること、そして、ＴＬＲ９は第２の（より３’側の）ＴＬＲ９誘導部分で化合物と相互作用し始めることが考えられる。第２の（より３’側の）ＴＬＲ９誘導部分がブロックされていないため、したがって、化合物はＴＬＲ９アゴニストとして作用し始める。
【００６９】
この側面の化合物の利点は、ＴＬＲ９媒介免疫応答が、化合物のより低い用量で低減するのに対し、より高い用量においては、その時点で化合物がＴＬＲ９アゴニストとして作用し始めるため、失われないことである。したがって、この側面での化合物は、それらの、ＴＬＲ９の拮抗作用の程度において自己調節性である。
【００７０】
本発明のこの側面のいくつかの態様において、化合物は、米国特許番号7,276,489における記載のイムノマー構造を有する。
【００７１】
いくつかの態様において、リニアオリゴヌクレオチドまたは１個または２個以上の分岐オリゴヌクレオチドは、それぞれ独立して、約８個〜約３０個のヌクレオシド残基を有する。したがって、ある態様において、オリゴヌクレオチドは、独立して、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のヌクレオチド長を有し得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、約１１個〜約２５個のヌクレオシド残基であり、より好ましくは約１６個〜約２１個のヌクレオシド残基である。いくつかの態様において、免疫モジュレートオリゴヌクレオチドは、２１個のオリゴヌクレオチドを含む。ある好ましい態様は、４２個のヌクレオチドを含む。好ましくは、ＴＬＲ９アンタゴニスト化合物は、少なくとも１個のホスホジエステル、ホスホジチオエート、またはホスホロジチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【００７２】
好ましい態様において、各ヌクレオシド単位は、ヘテロ環塩基およびペントフラノシル、２’−Ｏ−置換ペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’−置換アラビノース、２’−Ｏ−置換リボースまたはアラビノースまたはヘキソース糖基を含む。ヌクレオシド残基は、任意の多数の知られたヌクレオシド間結合によって、互いに結合することができる。かかるヌクレオシド結合は、限定されないが、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、シロキサン、カルボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホラミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエートおよびスルホンヌクレオシド間結合を含む。ヌクレオチドの可能な抱合（conjugation）の部位は、下記式ＸＩにおいて示され、式中、Ｂは、ヘテロ環塩基を表す。
【化１】
2010536787.tif 000005
【００７３】
本発明のＴＬＲ９アンタゴニスト化合物は、天然に生じるリボヌクレオシド、修飾リボヌクレオシドまたはその混合物をさらに含み得る。
【００７４】
いくつかのヘテロ環塩基に対する化学修飾は、限定されないが、７−デアザ−Ｇ、アラ−Ｇ、６−チオ−Ｇ、イノシン、イソ−Ｇ、ロキソリビン、ＴＯＧ（７−チオ−８−オキソ）−Ｇ、８−ブロモ−Ｇ、８−ヒドロキシ−Ｇ、５−アミノホルミシンＢ、オキソホルミシン、７−メチル−Ｇ、９−ｐ−クロロフェニル−８−アザ−Ｇ、９−フェニル−Ｇ、９−ヘキシル−グアニン、７−デアザ−９−ベンジル−Ｇ、６−クロロ−７−デアザグアニン、６−メトキシ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザ−Ｇ（ＰＰＧ）、２−（ジメチルアミノ）グアノシン、７−メチル−６−チオグアノシン、８−ベンジルオキシグアノシン、９−デアザグアノシンおよび１−（Ｂ−Ｄ−フラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンなどのグアニン類縁体を含む。化学修飾はまた、限定されないが、９−ベンジル−８−ヒドロキシ−２−（２−メトキシエトキシ）アデニン、２−アミノ−Ｎ２−Ｏ−、メチルアデノシン、８−アザ−７−デアザ−Ａ、７−デアザ−Ａ、ビダラビン、２−アミノアデノシン、Ｎ１−メチルアデノシン、８−アザアデノシン、５−ヨードツベルシジンなどのアデニン類縁体をも含む。化学修飾はまた、限定されないが、２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジンおよび２’−デオキシ−Ｎ４−アルキルシチジンなどのシトシン類縁体をも含む。化学修飾はまた、限定されないが、４−チオ−Ｕなどのウラシル類縁体をも含む。
【００７５】
本発明のＴＬＲ９アンタゴニスト化合物は、非ヌクレオチドまたはヌクレオチドリンカーを介して、３’または２’末端または官能性リボースまたはデオキシリボース（置換形態を含む）または官能性核酸塩基で共有または非共有結合した少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含む化合物である。いくつかのリンカーの例は、表２に記載されている。非共有の結合は、これに限定されるものではないが、静電気的相互作用、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用および水素結合を含む。
【００７６】
さらに他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴヌクレオチドに結合可能な官能基を有する有機部分である。かかる結合は、好ましくは、安定な共有結合によるものである。非限定的な例として、リンカーは、ヌクレオチド上の任意の適した位置に結合され得る。いくつかの好ましい態様において、リンカーは、３’−ヒドロキシルに結合される。かかる態様において、リンカーは、好ましくは、ヒドロキシル官能基を含み、該官能基は、好ましくは、３’−ヒドロキシルに、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネートなどのホスフェートをベースとする結合または非ホスフェートをベースとする結合によって結合される。
【００７７】
いくつかの態様において、非ヌクレオチドリンカーは、限定されないが、ポリペプチド、抗体、脂質、抗原、アレルゲンおよびオリゴ糖を含む、小分子、マクロ分子または生体分子である。いくつかの他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは小分子である。本発明の目的のため、小分子は、１０００Ｄａよりも小さな分子量を有する有機部分である。いくつかの態様において、小分子は、７５０Ｄａよりも小さな分子量を有する。
【００７８】
いくつかの態様において、小分子は、脂肪族または芳香族の炭化水素であり、オリゴヌクレオチドに結合する直鎖か、それに追加される、限定されないが、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、ウレアまたはチオウレアを含む１つまたは２つ以上の官能基を任意に含み得る。小分子は、環状または非環状であり得る。小分子リンカーの例として、限定されないが、アミノ酸、炭化水素、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテンおよび抗生物質が挙げられる。しかしながら、非ヌクレオチドリンカーを記載する目的のため、用語「小分子」はヌクレオシドを含むことを意図しない。
【００７９】
いくつかの態様において、非ヌクレオチドリンカーは、アルキルリンカーまたはアミノリンカーである。アルキルリンカーは、分岐状または非分岐状、環状または非環状、置換または非置換、飽和または不飽和、キラル、アキラルまたはラセミ混合物であってもよい。アルキルリンカーは、約２個〜約１８個の炭素原子を有し得る。いくつかの態様において、かかるアルキルリンカーは、約３個〜約９個の炭素原子を有する。いくつかのアルキルリンカーは、限定されないが、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、ウレアおよびチオエーテルを含む１つまたは２つ以上の官能基を含む。かかるアルキルリンカーは、限定されないが、１−プロパノール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２，３−プロパントリオール、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ポリエチレングリコールリンカー（例えば、［−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−］ｎ（ｎ＝１〜９））、メチルリンカー、エチルリンカー、プロピルリンカー、ブチルリンカーまたはヘキシルリンカーを含み得る。いくつかの態様において、かかるアルキルリンカーは、ペプチドまたはアミノ酸を含み得る。
【００８０】
いくつかの態様において、非ヌクレオチドリンカーは、限定されないが、表２にリストされているものを含み得る。
【表２】
2010536787.tif 000006
2010536787.tif 000007
2010536787.tif 000008
2010536787.tif 000009
2010536787.tif 000010
2010536787.tif 000011
【００８１】
いくつかの態様において、小分子リンカーは、グリセロールまたは、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨ（式中、ｏおよびｐは、独立して、１〜約６、１〜約４、または１〜約３の整数である）のグリセロール類似体である。いくつかの態様において、小分子リンカーは、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。いくつかのかかる誘導体は、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨ（式中、ｍは、０〜約１０、０〜約６、２〜約６、または２〜約４の整数である）を有する。
【００８２】
本発明のいくつかの非ヌクレオチドリンカーは、表１に図示したように、２個より多いオリゴヌクレオチドの結合を許容する。例えば、小分子リンカーのグリセロールは、オリゴヌクレオチドが共有結合し得る３つの水酸基を有する。したがって、本発明のいくつかの免疫モジュレートオリゴヌクレオチドは、非ヌクレオチドリンカーを介して２個より多いオリゴヌクレオチドを含む。
【００８３】
本発明のこの側面のさらなる態様において、ＴＬＲ９アンタゴニスト化合物は、表１に図示されたとおり、２個または３個以上のリンカーに対して、それらの３’末端または５’末端で、またはヌクレオシド間結合またはの官能性核酸塩基または糖を介して結合した３個または４個以上のオリゴヌクレオチドを含み得る。本発明のこの側面のオリゴヌクレオチドは、同じまたは異なる配列を有してもよい。本発明のこの側面のリンカーは同じであってもまたは異なってもよい。
【００８４】
本発明に包含される化合物の特性を実証するために用いられた特定の免疫調節ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド化合物の配列は、表３に示されるものを含む。
【表３】
2010536787.tif 000012
【００８５】
本発明のＴＬＲ９アンタゴニスト化合物は、図１および２に概略的に図示したとおり、自動合成機またはホスホラミデート法を用いて簡便に合成され得る。いくつかの態様において、免疫モジュレートオリゴヌクレオチドはリニア合成法により合成される（図１）。
【００８６】
合成の代替的様式は「パラレル合成」であり、ここで、合成は、中央のリンカー部分から外方向に進行する（図２参照）。固体支持体結合リンカーは、米国特許No. 5,912,332において記載されるように、パラレル合成のために使用され得る。代替的に、汎用の固体支持体（ホスフェート結合コントロール多孔質ガラス支持体など）が使用され得る。
【００８７】
本発明の化合物のパラレル合成は、リニア合成に対し、いくつかの利点を有する：（１）パラレル合成は、同一のモノマー単位を取り込むことを許容する。（２）リニア合成における場合と異なり、両方（または全て）のモノマー単位は同時に合成され、それにより、合成ステップの数および合成のために必要な時間がモノマー単位のものと同程度である。（３）合成ステップにおける減少は、最終的な免疫モジュレートオリゴヌクレオチド生成物の純度と収率を改善する。
【００８８】
リニア合成またはパラレル合成プロトコールのどちらかによる合成の最後で、免疫モジュレートオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドが組み込まれていない場合、濃縮アンモニア溶液またはホスホラミデート供給者により推薦されるとおりに簡便に脱保護されてもよい。生成物の免疫モジュレートオリゴヌクレオチドは、好ましくは、逆相ＨＰＬＣにより精製され、脱トリチル化され、脱塩および透析される。
【００８９】
第２の側面において、本発明は、本発明のＴＬＲ９アンタゴニスト化合物を含む医薬処方および生理学的に許容し得る担体を提供する。
【００９０】
第３の側面において、本発明は、哺乳動物におけるＴＬＲ９媒介免疫応答を低減させるための方法を提供し、該方法は、本発明の化合物または医薬処方を、ＴＬＲ９媒介免疫応答を低減させる量で哺乳動物に投与することを含む。
【００９１】
第４の側面において、本発明は、ＴＬＲ９媒介免疫応答を低減することが有益である疾患または障害、例えば、自己免疫障害、気道炎、炎症性障害、アレルギー、喘息、関節炎、関節炎、マラリア、アレルギー、移植片拒絶、感染症および自己免疫成分を有する他の疾患または障害を有する哺乳動物を治療的に処置するための方法を提供する。本発明のこの面による方法は、かかる障害または疾患を有する哺乳動物に対し、薬学的に有効な量で、本発明の化合物または医薬処方を投与することを含む。
【００９２】
第５の側面において、本発明は、哺乳動物において、ＴＬＲ９媒介免疫応答を低減することが有益である疾患または障害、例えば、自己免疫障害、癌、気道炎、炎症性障害、感染症、マラリア、ライム病、眼感染症、皮膚障害、乾癬、強皮症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性疲労症候群、サルコイドーシス、アレルギー、喘息または病原体に起因する疾患を予防するための方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、かかる障害または疾患にかかり易い哺乳動物に、本発明の化合物または医薬処方を薬学的に有効な量で投与することを含む。
【００９３】
いくつかの態様において、自己免疫障害は、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、１型糖尿病、過敏性腸症候群、クローン病、関節リウマチ、敗血症性ショック、全身脱毛症、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、汗腺膿瘍、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、限局性強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直症、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎、（「巨細胞性動脈炎」）、血管炎、白斑、外陰部痛およびヴェーゲナー肉芽腫症から選択される。
【００９４】
いくつかの態様において、炎症性障害は、気道炎、喘息、自己免疫疾患、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、ベーチェット病、過敏症、炎症性大腸疾患、再潅流傷害、関節リウマチ、移植片拒絶、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、結膜炎、および脈管炎から選択される。
【００９５】
本発明の方法のいくつかにおいて、ＴＬＲ９アンタゴニスト化合物は、単に直接的なＴＬＲ９アンタゴニスト作用を産生することにより、および／または、前記化合物のＴＬＲ９アンタゴニスト作用を減じない、疾患または病状を処置または予防するために有用な任意の他の剤と組み合わせで、様々に作用することができる。本発明による方法のいずれかにおいて、疾患または病状の処置または予防のために有用な剤（単数または複数）は、限定されないが、ワクチン、抗原、抗体、好ましくは、モノクローナル抗体、細胞傷害性の剤、アレルゲン、抗生物質、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、他のＴＬＲアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ３のアゴニストまたはアンタゴニスト）、化学療法剤（伝統的な化学療法および現代の標的治療の両方）、標的治療剤、活性化細胞、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ペプチドワクチン、タンパク質ワクチン、ＤＮＡワクチン、アジュバントおよび共刺激分子（例えば、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、転写活性因子、ペプチドまたは修飾アミノ酸を含むペプチド）、またはそれらの組み合わせを含む。代替的に、剤は、抗原またはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含み得る。代替的に、化合物は、該化合物に対する免疫応答の特異性または大きさを増強するために他のアジュバントとの組み合わせで投与され得る。
【００９６】
本発明の方法のいずれかにおいて、ＴＬＲ９アンタゴニスト化合物の投与は、単体または任意の他の剤との組合せで、限定されないが、非経口的、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、経鼻、エアゾール、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃によって、経皮パッチまたは点眼または口腔洗浄の形態を含む任意の好適なルートによって可能である。ＴＬＲ９アンタゴニスト化合物の治療的組成物の投与は、疾患の病徴または代理マーカーの低減に効果的な有効量および期間を用いた、既知の手法を用いて行うことができる。例えば、疾患および／または障害の処置のためのＴＬＲ９アンタゴニスト化合物の有効量は、病徴を緩和または低減するか、または、自己免疫応答を遅らせるか改善するために必要な量であることができる。任意の特定の適用のための有効量は、処置するの疾患または症状、投与する特定のオリゴヌクレオチド、対象のサイズ、または疾病または症状の重篤さなどの因子に依存して変化する可能性がある。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、特定のオリゴヌクレオチドの有効量を経験的に決定することができる。
【００９７】
全身に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、ＴＬＲ９アンタゴニスト化合物の血中レベルが、約０．０００１マイクロモル〜約１０マイクロモルになるために十分な用量で投与される。局所投与のためには、これよりもより低い濃度で効果がある可能性があり、より高い濃度で耐性となり得る。好ましくは、ＴＬＲアンタゴニスト化合物の総投与量は、患者１日あたり約０．００１ｍｇから、体重１ｋｇ１日あたり２００ｍｇである。単一の処置エピソードとして、個体へ本発明の１つまたは２つ以上の治療組成物の治療的に有効な量を同時または連続して投与することが望まれ得る。
【００９８】
ＴＬＲ９アンタゴニスト化合物は、任意に、１つまたは２つ以上のアレルゲンおよび／または抗原（自己または外来）、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、コレラ毒素Ｂサブユニットなどの免疫原性タンパク質、または任意の他の免疫原性担体タンパク質と結合し得る。ＴＬＲ９アンタゴニスト化合物はまた、限定されないが、フロイント不完全アジュバント、ＫＬＨ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ミョウバンおよび、ＱＳ−２１を含むサポニン、イミキモドまたはそれらの組み合わせを含む他の化合物との組み合わせで用いることができる。
【００９９】
本発明のこの面による方法は、免疫系のモデル研究に有用である。該方法はまた、ヒトまたは動物の疾病の予防または治療的処置に有用である。例えば、該方法は、小児および獣医のワクチンの適用に有用である。
【０１００】
以下の例は、本発明の好ましい実施例をさらに示すことを意図し、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【０１０１】
例
例１
ＴＬＲ９アンタゴニスト合成
免疫モジュレートオリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成でホスホルアミダイト化学を用いて化学的に合成される。ＴＡＣ保護された（Ｕ以外の）２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ  ＲＮＡモノマー、Ａ、Ｇ、ＣおよびＵは、Sigma-Aldrichから購入した。７−デアザ−Ｇ、イノシンおよびロキソリビンモノマーは、ChemGenes Corporationから購入した。０．２５Ｍの５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール、ＰＡＣ−無水物Ｃａｐ ＡおよびＣａｐ Ｂは、Glen Researchから購入した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）中３％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）および５％の３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Beaucage試薬）は自社製であった。
【０１０２】
ＴＬＲ９アンタゴニスト化合物は、標準のＲＮＡ合成プロトコールを用いて、１〜２μＭのスケールで合成した。
【０１０３】
開裂および塩基脱保護
ＴＬＲ９アンタゴニスト化合物を固体支持体から開裂し、溶液をさらに６５℃に加熱し、エキソ環状アミンの保護基を除去した。得られた溶液をSpeedVacで完全に乾燥した。
【０１０４】
イオン交換ＨＰＬＣ精製
ＴＬＲ９アンタゴニスト化合物は、イオン交換ＨＰＬＣで精製した。
カラム：Dionex DNAPac 100 カラム(22X250)
カラムヒーター：ChromTech TL-105 HPLC カラムヒーター、温度は８０℃に設定した。
バッファーＡ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、２０％アセトニトリル
バッファーＢ：３．０Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、２０％アセトニトリル
流速：１０ｍｌ／ｍｉｎ
勾配：
０−２ｍｉｎ：０％Ｂ
２−１１ｍｉｎ：０％Ｂから３５％Ｂ
１１−４１ｍｉｎ：３５％Ｂから９０％Ｂ
４１−４５ｍｉｎ：１００％Ｂ
【０１０５】
粗製ＴＬＲ９アンタゴニスト化合物溶液をＨＰＬＣに注入した。上記の勾配を行い、フラクションを集めた。９０％を超える所望の産物を含有する全てのフラクションを混合し、次いで、溶液をRotoVapによってほとんど乾燥し濃縮した。蒸留した脱イオン水を加え、終体積を１０ｍｌにした。
【０１０６】
Ｃ−１８逆相脱塩
Watersから購入したtC-18 Sep-Pakカートリッジを最初に１０ｍｌのアセトニトリル、続いて１０ｍｌの０．５Ｍ酢酸ナトリウムで調整した。１０ｍｌの免疫モジュレートオリゴヌクレオチド溶液を装填した。次いで、１５ｍｌの水を塩の洗浄に用いた。免疫モジュレートオリゴヌクレオチドは、最終的に、１ｍｌの水中５０％アセトニトリルによって溶出した。
【０１０７】
溶液は、３０分間SpeedVacに入れた。残りの溶液を０．２マイクロフィルターを介してろ過し、次いで凍結乾燥して乾燥した。次いで、溶液を水に再溶解し、所望の濃度にした。
【０１０８】
最終溶液を０℃以下で貯蔵した
【０１０９】
キャピラリー電気泳動
合成および精製に続き、ＴＬＲ９アンタゴニスト化合物をキャピラリー電気泳動法により分析した。
装置：Beckman 5010
キャピラリー：６２ｃｍ ｓｓＤＮＡキャピラリー
サンプル調製：０．２ＯＤのＴＬＲ９アンタゴニスト化合物を２００μｌの蒸留脱イオン水に溶解した。
注入：５ＫＶで５秒間の動電注入
実行条件：３０℃、１４ＫＶで５０分間
【０１１０】
イオン交換ＨＰＬＣ分析
合成および精製に続き、ＴＬＲ９アンタゴニスト化合物をイオン交換ＨＰＬＣにより分析した。
カラム：Dionex DNAPacガードカラム(22X250)
カラムヒーター：ChromTech TL-105 HPLCカラムヒーター、温度は８０℃に設定した。
バッファーＡ：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０％アセトニトリル
バッファーＢ：２．０Ｍ ＬｉＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０％アセトニトリル
流速：２ｍｌ／ｍｉｎ
勾配：
０−２ｍｉｎ：０％Ｂ
２−１０ｍｉｎ：０％Ｂから１００％Ｂ
１０−１５ｍｉｎ：１００％Ｂ
【０１１１】
ＰＡＧＥ分析
０．３ＯＤの免疫調節オリゴリボヌクレオチドを２０％ポリアクリルアミドゲルにロードし、４ワットの定電力でおよそ５時間で電気泳動した。ゲルを短波長のＵＶ光下で見た。
【０１１２】
例２
ヒト細胞培養プロトコール
ＨＥＫ２９３／ヒトＴＬＲ７またはＨＥＫ２９３／ヒトＴＬＲ８細胞(Invivogen, San Diego, CA)を５％ＣＯ２インキュベーター中、２５０μｌ／ウェルの１０％熱不活性化ＦＢＳ添加ＤＭＥＭで４８ウェルプレートでインキュベートした。
【０１１３】
レポーター遺伝子の形質転換
マウスＴＬＲ９を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞(Invivogen, San Diego, CA)を５％ＣＯ２インキュベーター中、２５０μｌ／ウェルの１０％熱不活性化ＦＢＳ添加ＤＭＥＭで４８ウェルプレートで培養した。８０％のコンフルエンスで、培養物は、培養培地中、４μｌ／ｍｌのlipofectamine(Invitrogen, Carlsbad, CA)の存在下、４００ｎｇ／ｍｌのＳＥＡＰ(ヒト胚性アルカリホスファターゼの分泌型)レポータープラスミド(pNifty2-Seap)(Invivogen)で一過性にトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡおよびlipofectamineを無血清培地で分けて希釈して、５分間室温でインキュベートした。インキュベーションの後、希釈したＤＮＡおよびlipofectamineを混合し、混合物を２０分間室温でインキュベートした。１００ｎｇのプラスミドＤＮＡおよび１μｌのlipofectamineを含むＤＮＡ／lipofectamine混合物の２５μｌのアリコートを細胞培養プレートの各ウェルに添加し、培養を４時間継続した。
【０１１４】
ＴＬＲ９アンタゴニスト処置
トランスフェクションの後、培地を新鮮な培養培地で置き換え、該培養物にＴＬＲ９アゴニスト化合物を加え、培養を１８時間続けた。処置の最後に、３０μｌの培養上清を各処置ごとに採取し、製造者のプロトコール（Invivogen）に従いＳＥＡＰアッセイに用いた。
【０１１５】
ＳＥＡＰアッセイ
簡単に、培養上清をｐ−ニトロフィニルホスフェート基質でインキュベートし、発生した黄色の色を４０５ｎｍでプレートリーダーで測定した。データをＰＢＳ対照に対するＮＦ−κＢ活性の倍数増加として示す(Putta MR et al, Nucleic Acids Res., 2006, 34:3231-8)。結果を図３に示す。
【０１１６】
例３
用量コントロールＴＬＲ９アンタゴニスト化合物で処置したマウスモデルにおけるin vivoでのＩＬ−１２分泌
Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウス、６〜８週齢を、Taconic Farms, Germantown, NYから得て、Idera Pharmaceutical’s IACUC 承認動物プロトコールに従い維持した。マウス（ｎ＝３）に、表３の個々の免疫調節オリゴヌクレオチドを、１、１０または２０ｍｇ／ｋｇ（単一投与）で皮下（ｓ．ｃ）注射した。血清を免疫モジュレートオリゴヌクレオチド投与の２時間後に採取し、サイトカインおよびケモカイン濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡまたはLuminexマルチプレックスアッセイにより決定した。結果は、ＩＬ−１２について、図４、５および７に示し、新規な化学組成物を含む免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与によって、独特のサイトカインプロフィールを発生することを実証する。サイトカインおよびケモカイン抗体および標品を含む全ての試薬は、PharMingen(San Diego, CA)から購入した。
【０１１７】
同等物
前述の発明が、明確化および理解を目的として詳細に記載されている一方、当然のことながら、当業者であれば、本発明の開示を読むことにより、形態および詳細のさまざまな変形を、本発明の真の範囲および特許請求の範囲から逸脱することなく想到することができる。
【図１】
2010536787.tif 000013
【図２】
2010536787.tif 000014
【図３】
2010536787.tif 000015
【図４】
2010536787.tif 000016
【図６】
2010536787.tif 000017
【図７】
2010536787.tif 000018
【図５】
2010536787.tif 000019
【国際調査報告】
2010536787.tif 000020
2010536787.tif 000021