(57)【要約】  本発明は、配列番号１のアミノ酸配列に９０％類似であるアミノ酸配列を有する単離ベータ−マンナナーゼタンパク質、ならびにベータ−マンナナーゼタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド、ならびに該ポリヌクレオチドを含有する単離発現系および宿主細胞に関する。本発明はまた、ベータ−マンナナーゼタンパク質を組換え的に産生する方法にも関する。やはり開示するのは、植物材料におけるマンナンおよび多糖を分解する方法であって、植物材料を提供し、そして植物材料におけるマンナンおよび多糖を分解するのに有効な条件下で、植物材料を本発明のベータ−マンナナーゼタンパク質と接触させる工程を含む、前記方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列に９０％類似であるアミノ酸配列を有する、単離β−マンナナーゼタンパク質。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列に９５％類似であるアミノ酸配列を有する、請求項１の単離β−マンナナーゼタンパク質。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列に９９％類似であるアミノ酸配列を有する、請求項１の単離β−マンナナーゼタンパク質。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１の単離β−マンナナーゼタンパク質。
【請求項５】
請求項１のβ−マンナナーゼタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項５の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号２のヌクレオチド配列を有する、請求項５の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項５のポリヌクレオチドを含有する単離発現系。
【請求項９】
請求項５のポリヌクレオチドを含有する単離宿主細胞。
【請求項１０】
植物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、および他の真核細胞からなる群より選択される、請求項９の宿主細胞。
【請求項１１】
請求項９の宿主細胞を提供し；
宿主細胞がβ−マンナナーゼタンパク質を発現するのに有効な条件下で宿主細胞を培養し；そして
β−マンナナーゼタンパク質を回収する
工程を含む、β−マンナナーゼタンパク質を組換え的に産生する方法。
【請求項１２】
植物材料を提供し、そして
植物材料におけるマンナンおよび多糖を分解するのに有効な条件下で、植物材料を請求項１のβ−マンナナーゼタンパク質と接触させる
工程を含む、植物材料におけるマンナンおよび多糖を分解する方法。
【請求項１３】
植物材料がコーヒー豆である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
植物物質とβ−マンナナーゼタンパク質との前記接触から生じた、分解された植物材料から可溶性糖を回収する
工程をさらに含む、請求項１２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［０００１］本出願は、本明細書にその全体が援用される、２００６年１１月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／８６６，７０５号の優先権の恩典を請求する。
［０００２］本発明は、単離β−マンナナーゼタンパク質およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
［０００３］マンナナーゼは、マンナン、ならびにガラクトマンナンおよびグルコガラクトマンナン（ガラクトグルコマンナンとも称される）などの関連ヘミセルロース性多糖を加水分解する酵素である。これらの多糖は植物細胞壁の特徴的な構成要素であり、そしてしたがって、マンナナーゼの重要な潜在的商業的使用は、植物バイオマスからのヘミセルロース性材料の分解にあり、こうしてこれらのバイオポリマーから可溶性の糖を回収する手段を提供する。マンナン多糖はまた、豆科の植物のものなどのいくつかの植物種の種子、および針葉樹における貯蔵ポリマーとしても見出されている。
【０００３】
［０００４］コーヒー豆において、ガラクトマンナンは非常に高濃度に集積し、そして豆の乾燥重量のおよそ２４％に相当する（Ｂｒａｄｂｕｒｙら，  “Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｇｒｅｅｎ  Ｃｏｆｆｅｅ  Ｂｅａｎ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，”  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ３８：３８９−３９２（１９９０））。これらの多糖は、ベータ１，４グリコシル連結によって互いに連結されており、これにアルファ−ガラクトシル残基モノマーが会合している、マンノシル残基の直鎖からなる。エンド−ベータ−マンナナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．７８）は、種子発芽中のマンナンポリマーを加水分解し、こうして発芽中の細根の出根を促進し、そして小分子オリゴ糖を放出させて、これを次いで、若い植物の生長のためのエネルギー源として用いる。実際、いくつかの植物において、エンド−β−マンナナーゼ活性は、主に、発芽を経ている種子の内胚乳中で検出されることが示されている（Ｂｅｗｌｅｙ，  “Ｂｒｅａｋｉｎｇ  Ｄｏｗｎ  ｔｈｅ  Ｗａｌｌｓ――Ａ  Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｅｎｄｏ−β−Ｍａｎｎａｎａｓｅ  Ｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｅｅｄ  Ｄｏｒｍａｎｃｙ？”  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ２：４６４−４６９（１９９７））。
【０００４】
［０００５］マンナナーゼは、カビ、酵母、および真菌、ならびに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの微生物によって産生される。いくつかのより高次の植物または動物もまた、マンナナーゼを産生可能である；が、文献には、昆虫由来のβ−マンナナーゼを記載する報告は存在しない。マンナナーゼの商業的産生に典型的に用いられる微生物には、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種が含まれる。
【０００５】
［０００６］産業プロセスにおいて、コーヒーの処理中、マンナンおよびその誘導体が、不溶性沈降物のかなりの部分を構成する。さらに、コーヒー産生における最初の抽出工程中、マンナンのおよそ５０％のみが可溶性であり、そしてこれらのポリマーはしたがって、続く工程中に起こる二次沈殿の大部分に関与する。欧州特許第０６７６１４５Ａ号は、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）から抽出された固定マンナナーゼを用いて、コーヒー・ガラクトマンナンを加水分解することが可能であることを立証した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】欧州特許第０６７６１４５Ａ号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｒａｄｂｕｒｙら，  “Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｇｒｅｅｎ  Ｃｏｆｆｅｅ  Ｂｅａｎ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，”  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ３８：３８９−３９２（１９９０）
【非特許文献２】Ｂｅｗｌｅｙ，  “Ｂｒｅａｋｉｎｇ  Ｄｏｗｎ  ｔｈｅ  Ｗａｌｌｓ――Ａ  Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｅｎｄｏ−β−Ｍａｎｎａｎａｓｅ  Ｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｅｅｄ  Ｄｏｒｍａｎｃｙ？”  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ２：４６４−４６９（１９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
［０００７］本発明は、当該技術分野におけるこれらの限界および他の限界を克服することに向けられる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
［０００８］本発明の１つの側面は、配列番号１のアミノ酸配列に９０％類似のアミノ酸配列を有する単離β−マンナナーゼタンパク質に向けられる。本発明はまた、β−マンナナーゼタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド、ならびに該ポリヌクレオチドを含有する単離発現系および宿主細胞にも関する。
【００１０】
［０００９］本発明の別の側面は、β−マンナナーゼタンパク質を組換え的に産生する方法に向けられる。この方法は、本発明のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を提供し、そして宿主細胞がβ−マンナナーゼタンパク質を発現するのに有効な条件下で、宿主細胞を培養する工程を伴う。β−マンナナーゼタンパク質を回収する。
【００１１】
［００１０］本発明のさらなる側面は、植物材料におけるマンナンおよび多糖を分解する方法に向けられる。この方法は、植物材料を提供し、そして植物材料におけるマンナンおよび多糖を分解するのに有効な条件下で、植物材料を本発明のβ−マンナナーゼタンパク質と接触させる工程を伴う。
【００１２】
［００１１］本発明は、ベータ１，４グリコシル連結によって互いに連結されている非分枝または分枝マンナン分子を含むマンナン多糖の加水分解に関与するマンナナーゼ酵素をコードする、単離ポリヌクレオチド配列に関する。該ポリヌクレオチドは、昆虫（コーヒー豆穿孔虫、ヒポセネマス・ハンペイ（Ｈｙｐｏｔｈｅｎｅｍｕｓ  ｈａｍｐｅｉ））ゲノムから単離される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】［００１２］図１は、組換えバキュロウイルス中で発現された本発明の１つの態様にしたがった組換えβ−マンナナーゼタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す写真である。レーン１：分子量マーカー（ｋＤａ）；レーン２：Ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ濃縮タンパク質；レーン３：常磁性粒子を用いて精製された６ｘＨｉｓタグ化マンナナーゼ。
【図２】［００１３］図２は、Ｈ．ハンペイ由来の可溶性組換えβ−マンナナーゼを用いたＡＺＣ−ガラクトマンナン加水分解の時間経過を示すグラフである。時間に渡る吸光度の青色増加によって酵素活性を決定した。β−マンナナーゼ活性は、３回の反応の平均±ＳＥである。
【図３】［００１４］図３は、本発明にしたがったＨ．ハンペイ由来の組換えβ−マンナナーゼの活性に対するｐＨの影響を示すグラフである。緩衝液は、２００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、および１１．０であった。
【図４】［００１５］図４は、Ｈ．ハンペイ由来の組換えβ−マンナナーゼの活性に対する温度の影響を示すグラフである。２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０中の酵素溶液を多様な温度で１２０分間インキュベーションし、そして実施例に記載するように活性を測定した（以下）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［００１６］本発明の１つの側面は、以下のような配列番号１のアミノ酸配列を有する、コーヒー豆穿孔虫（ヒポセネマス・ハンペイ）由来の単離β−マンナナーゼタンパク質に関する：
【００１５】
【化１−１】
2010533476.tif 000002
【００１６】
【化１−２】
2010533476.tif 000003
［００１７］本発明はまた、配列番号１のアミノ酸配列に、少なくとも９０％類似、少なくとも９１％類似、少なくとも９２％類似、少なくとも９３％類似、少なくとも９４％類似、少なくとも９５％類似、少なくとも９６％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９８％類似、および／または少なくとも９９％類似であるアミノ酸配列を有する単離β−マンナナーゼタンパク質にも向けられる。
【００１７】
［００１８］配列番号１のβ−マンナナーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下のような配列番号２の配列を有する：
【００１８】
【化２−１】
2010533476.tif 000004
【００１９】
【化２−２】
2010533476.tif 000005
［００１９］配列番号２に、少なくとも９０％の類似性、少なくとも９１％の類似性、少なくとも９２％の類似性、少なくとも９３％の類似性、少なくとも９４％の類似性、少なくとも９５％の類似性、少なくとも９６％の類似性、少なくとも９７％の類似性、少なくとも９８％の類似性、および／または少なくとも９９％の類似性を有する単離ポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【００２０】
［００２０］配列番号２の単離ポリヌクレオチドが由来するゲノム配列は、以下のような配列番号３の配列を有する：
【００２１】
【化３−１】
2010533476.tif 000006
【００２２】
【化３−２】
2010533476.tif 000007
【００２３】
【化３−３】
2010533476.tif 000008
【００２４】
【化３−４】
2010533476.tif 000009
【００２５】
【化３−５】
2010533476.tif 000010
【００２６】
【化３−６】
2010533476.tif 000011
【００２７】
【化３−７】
2010533476.tif 000012
［００２１］２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセント、すなわち配列類似性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成可能である。２つの配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの好ましい限定されない例は、本明細書にその全体が援用される、Ｋａｒｌｉｎら，  “Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｈｉｇｈ−Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９０：５８７３−５８７７（１９９３）におけるように修飾された、本明細書にその全体が援用される、Ｋａｒｌｉｎら，  “Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｓｃｈｅｍｅｓ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８７：２２６４−２２６８（１９９０）のアルゴリズムである。配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの別の限定されない例は、Ｍｙｅｒｓら，  ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムを、ＣＧＣ配列並列ソフトウェアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込んでもよい。配列分析のさらなるアルゴリズムは当該技術分野に知られ、そしてこれには、本明細書にその全体が援用される、Ｔｏｒｅｌｌｉｓら  “ＡＤＶＡＮＣＥ  ａｎｄ  ＡＤＡＭ：  Ｔｗｏ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １０：３−５（１９９４）に記載されるようなＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ、ならびに本明細書にその全体が援用される、Ｐｅａｒｓｏｎら，  “Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８５：２４４４−８（１９８８）に記載されるようなＦＡＳＴＡが含まれる。
【００２８】
［００２２］本発明の単離β−マンナナーゼタンパク質は、好ましくは、慣用的技術によって、精製型で産生される。例えば、タンパク質を単離するため、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの宿主細胞を伴うプロトコルを用いてもよく、この場合、組換えプラスミドを所持する大腸菌宿主細胞を増殖させ、ホモジナイズし、そしてホモジネートを遠心分離して細菌破片を除去する。次いで、上清を連続硫酸アンモニウム沈殿に供する。β−マンナナーゼタンパク質を含有する分画を、適切なサイズのデキストランまたはポリアクリルアミドカラム中でゲルろ過に供して、タンパク質およびポリペプチドを分離してもよい。必要であれば、タンパク質分画をＨＰＬＣによってさらに精製してもよい。また、昆虫宿主細胞、好ましくはＳｆ９昆虫細胞株を伴うプロトコルにしたがって本発明の単離β−マンナナーゼタンパク質を産生してもよい。
【００２９】
［００２３］本発明はまた、本発明のβ−マンナナーゼタンパク質の断片にも関する。キモトリプシンまたはスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテイナーゼＡ、あるいはトリプシンのようなタンパク質分解酵素で全長タンパク質を消化することによって、β−マンナナーゼタンパク質の断片を産生してもよい。異なるタンパク質分解酵素は、タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、異なる部位でβ−マンナナーゼタンパク質を切断する可能性が高い。
【００３０】
［００２４］別のアプローチにおいて、タンパク質の一次構造の知識に基づいて、関心対照のタンパク質の特定の部分に相当するように選択した特定のセットのプライマーと一緒に、ＰＣＲ技術を用いることによって、タンパク質をコードする遺伝子の断片を合成してもよい。次いで、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ペプチドまたはタンパク質の発現のため、これらを適切なベクター内にクローニングする。
【００３１】
［００２５］化学合成を用いて、適切な断片を作製してもよい。産生中のタンパク質に関して知られるアミノ酸配列を用いて、こうした合成を実行する。あるいは、本発明の全長β−マンナナーゼタンパク質を高温および高圧に供すると、断片が生じるであろう。次いで、これらの断片を慣用法（例えばクロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離してもよい。
【００３２】
［００２６］また（またはあるいは）、例えばタンパク質の特性、二次構造およびヒドロパシー性に対して最小限の影響しか持たないアミノ酸の欠失または付加によって、変異体を作製してもよい。例えば、タンパク質のＮ末端で、タンパク質を翻訳と同時にまたは翻訳後にトランスファーさせるシグナル（またはリーダー）配列にタンパク質をコンジュゲート化してもよい。また、リンカー、あるいはタンパク質の合成、精製、または同定を容易にするための他の配列に、タンパク質をコンジュゲート化してもよい。
【００３３】
［００２７］本発明のタンパク質は、好ましくは、慣用的技術によって、精製型で（好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは９０％純粋）産生される。典型的には、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質を分泌可能な、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）細胞または機能するＩＩＩ型分泌系を発現する宿主細胞の増殖培地内に分泌される。あるいは、本発明のタンパク質は、産生されるが、組換え宿主細胞（例えば大腸菌）の増殖培地内に分泌されない。こうした場合、タンパク質を単離するため、組換えプラスミドを所持する宿主細胞（例えば大腸菌）を増殖させ、超音波、熱、差圧、または化学薬品処理によって溶解してもよく、そしてホモジネートを遠心分離して細菌破片を除去する。次いで、上清を連続硫酸アンモニウム沈殿に供する。本発明のポリペプチドまたはタンパク質を含有する分画を、適切なサイズのデキストランまたはポリアクリルアミドカラム中でゲルろ過に供して、タンパク質を分離する。必要であれば、タンパク質分画をＨＰＬＣによってさらに精製してもよい。
【００３４】
［００２８］本発明はまた、β−マンナナーゼタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド、ならびに該ポリヌクレオチドを含有する単離発現系および宿主細胞にも関する。
［００２９］本発明の別の側面は、β−マンナナーゼタンパク質を組換え的に産生する方法に向けられる。この方法は、本発明のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を提供し、そして宿主細胞がβ−マンナナーゼタンパク質を発現するのに有効な条件下で、宿主細胞を培養する工程を伴う。β−マンナナーゼタンパク質を回収する。
【００３５】
［００３０］当該技術分野に周知の試薬を用いて、多くの利用可能な任意の発現ベクター内に、本発明のポリヌクレオチドを挿入してもよい。発現用のＤＮＡベクターを調製する際、通常、ＤＮＡ配列を細菌プラスミド内に挿入するかまたは置換してもよい。細菌複製系、細菌における選択を可能にするマーカー、および一般的に１以上のユニークな好適に位置する制限部位を有することによって特徴付けられるであろう、任意の慣用的プラスミドを使用してもよい。形質転換ベクターと称される多くのプラスミドが、植物形質転換のために利用可能である。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換のターゲット種に応じるであろう。クラウンゴールを引き起こす土壌伝播性細菌であるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いた安定形質転換のために多様なベクターが利用可能である。クラウンゴールは、感染した植物の茎下部および主根上に発展する腫瘍または瘤によって特徴付けられる。これらの腫瘍は、植物染色体ＤＮＡ内への細菌プラスミドＤＮＡの一部のトランスファーおよび取り込みによる。このトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）は、植物細胞の正常遺伝子と一緒に発現される。プラスミドＤＮＡ、ｐＴｉ、または「腫瘍誘導性プラスミド」であるＴｉ−ＤＮＡは、Ｔ−ＤＮＡを植物内に移動させるのに必要なｖｉｒ遺伝子を所持する。Ｔ−ＤＮＡは、植物制御因子の生合成に関与するタンパク質、および細菌栄養素（オパイン）をコードする遺伝子を所持する。Ｔ−ＤＮＡは、「境界配列」と称される２つの２５ｂｐ不完全直接反復配列によって囲まれている。癌遺伝子およびオパイン遺伝子を除去し、そして関心対象の遺伝子でこれらを置換することによって、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの腫瘍形成または増加を伴わずに、植物内に外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）ＤＮＡをトランスファーすることが可能になる（本明細書にその全体が援用される、Ｆｒａｌｅｙら，  “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８０：４８０３−４８０７（１９８３））。
【００３６】
［００３１］この技術のさらなる改善によって、二元ベクター系の開発が導かれた（本明細書にその全体が援用される、Ｂｅｖａｎ，  “Ｂｉｎａｒｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：８７１１−８７２１（１９８４））。この系では、すべてのＴ−ＤＮＡ配列（境界を含む）がｐＴｉから除去され、そしてＴ−ＤＮＡを含有する第二のベクターがアグロバクテリウム・ツメファシエンス内に導入される。この第二のベクターは、大腸菌ならびにＡ．ツメファシエンス中で複製可能であるという利点を有し、そして導入遺伝子のクローニングを容易にするマルチクローン部位を含有する。一般的に用いられるベクターの例は、ｐＢｉｎ１９である（本明細書にその全体が援用される、Ｆｒｉｓｃｈら，  “Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｎ  １９，”  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２７：４０５−４０９（１９９５））。遺伝子形質転換に関して現在知られるかまたは後に記載されるであろう任意の適切なベクターが、本発明での使用に適している。
【００３７】
［００３２］本発明を実施するのに適したベクターにはまた、限定されるわけではないが、ラムダベクター系ｇｔ１１、ｇｔＷＥＳ．ｔＢ、Ｃｈａｒｏｎ  ４、およびｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１、ＳＶ４０、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  ＋／−またはＫＳ  ＋／−（本明細書にその全体が援用される、“Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”  Ｃａｔａｌｏｇ（１９９３）を参照されたい）、ｐＱＥ、ｐＩＨ８２１、ｐＧＥＸ、ｐＥＴシリーズ（本明細書にその全体が援用される、Ｓｔｕｄｉｅｒら，  “Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｔｏ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ，”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：６０−８９（１９９０））などのプラスミドベクター、ならびに任意のその誘導体が含まれてもよい。
【００３８】
［００３３］本明細書にその全体が援用される、ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒに対して発行された米国特許第４，２３７，２２４号は、制限酵素切断およびＤＮＡリガーゼでの連結を用いた、組換えプラスミド型における発現系の産生を記載する。次いで、これらの組換えプラスミドを形質転換によって導入し、そして原核生物および組織培養中で増殖する真核細胞を含む単細胞培養物中で複製させる。
【００３９】
［００３４］多様な宿主−ベクター系を利用して、本発明のタンパク質コード配列（単数または複数）を発現させてもよい。主に、ベクター系は、用いる宿主細胞と適合しなければならない。宿主−ベクター系には、限定されるわけではないが、以下が含まれる：バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌；酵母ベクターを含有する酵母などの微生物；ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；および細菌に感染した植物細胞。これらのベクターの発現要素は、強度および特異性が多様である。利用する宿主−ベクター系に応じて、いくつかの適切な転写および翻訳要素の任意の１つが使用可能である。
【００４０】
［００３５］オープンリーディングフレームが、選択したプロモーターの調節下でのコードされるタンパク質の発現のために、適切に配向するように、本発明記載のタンパク質をセンス方向で適切なベクター内に取り込んでもよい。これには、ＤＮＡ−ベクター構築物内への適切な制御要素の包含が伴う。これらには、ベクターの非翻訳領域、有用なプロモーター、ならびに宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を実行する５’および３’非翻訳領域が含まれる。こうした要素は、強度および特異性が多様でありうる。利用するベクター系および宿主に応じて、恒常的および誘導性プロモーターを含む、任意の数の適切な転写および翻訳要素が使用可能である。
【００４１】
［００３６］恒常的プロモーターは、生物の発生および生涯全体に渡って遺伝子の発現を指示するプロモーターである。導入遺伝子の発現を誘導するのに広く用いられるいくつかの恒常的プロモーターの例には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子プロモーター（本明細書にその全体が援用される、Ｒｏｇｅｒｓらに対して発行された米国特許第５，０３４，３２２号）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓおよび１９Ｓプロモーター（本明細書にその全体が援用される、Ｆｒａｌｅｙらに対して発行された米国特許第５，３５２，６０５号）、大部分の細胞種において発現されることが知られる、任意のいくつかのアクチン遺伝子由来のもの（本明細書にその全体が援用される、Ｐｒｉｖａｌｌｅらに対して発行された米国特許第６，００２，０６８号）、ならびに多くの細胞種において集積することが知られる遺伝子産物であるユビキチンプロモーターが含まれる。
【００４２】
［００３７］誘導性プロモーターは、誘導因子に応答して、１以上のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接または間接的に活性化することが可能なプロモーターである。誘導因子の非存在下では、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されないであろう。誘導因子は、代謝産物、増殖制御因子、除草剤、またはフェノール性化合物などの化学剤、あるいは寒気、熱、塩、毒素などの、植物に直接課される生理学的ストレス、またはウイルスもしくは真菌などの病原体もしくは疾患因子の作用を通じたものであってもよい。スプレー、給水、加熱によるなどで細胞または植物に誘導因子を外部から適用することによって、あるいは作動性病原体への曝露によって、誘導性プロモーターを含有する植物細胞を誘導因子に曝露してもよい。本発明で使用するのに適した誘導性プロモーターの例は、グルココルチコイド誘導性プロモーターである（本明細書にその全体が援用される、Ｓｃｈｅｎａら，  “Ａ  Ｓｔｅｒｏｉｄ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８８：１０４２１−５（１９９１））。導入遺伝子にコードされるタンパク質の発現は、トランスジェニック植物が、ナノモル濃度のグルココルチコイドと接触した際に、またはグルココルチコイド類似体であるデキサメタゾンとの接触によって、形質転換植物において誘導される（本明細書にその全体が援用される、Ｓｃｈｅｎａら，  “Ａ  Ｓｔｅｒｏｉｄ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：１０４２１−５（１９９１）；  Ａｏｙａｍａら，  “Ａ  Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ，”  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １１：６０５−６１２（１９９７）、およびＭｃＮｅｌｌｉｓら，  “Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ，”  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １４（２）：２４７−５７（１９９８））。さらに、誘導性プロモーターには、植物の選択した組織内で関心対象の遺伝子を制御する組織特異的方式で機能するプロモーターが含まれる。こうした組織特異的または発生的に制御されたプロモーターの例には、当該分野に周知であるような、種子、花、果実、または根特異的プロモーターが含まれる（本明細書にその全体が援用される、Ｓｈｅｗｍａｋｅｒらに対して発行された米国特許第５，７５０，３８５号）。本発明の好ましい態様において、異種プロモーターが構築物の核酸に連結され、この場合、「異種プロモーター」は、天然には構築物の核酸に連結されていないプロモーターと定義される。
【００４３】
［００３８］本発明の発現系にはまた、選択したタンパク質をコードするＤＮＡ分子に機能可能であるように連結された、選択した宿主細胞において発現させるためのｍＲＮＡの正しい転写終結およびポリアデニル化を提供可能なものの中から選択される、機能可能な３’制御領域が含まれてもよい。
【００４４】
［００３９］本明細書にその全体が援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．ら  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ：  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  （１９８９）に記載されるような周知の分子クローニング技術を用いて、選択したベクター、プロモーター、および適切な３’制御領域を一緒に連結して、本発明のＤＮＡ構築物を産生してもよい。
【００４５】
［００４０］適切な転写または翻訳エンハンサー要素（例えば、本明細書にその全体が援用される、Ｂｉｔｔｎｅｒら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５３：５１６（１９８７）に開示される要素）の包含によって、発現効率を増進させてもよい。さらに、適切な発現系における最適コドン使用のため、遺伝子配列を修飾してもよいし、あるいは発現宿主が特定のｔＲＮＡ分子を発現するように修飾して、所望の遺伝子の発現を促進してもよい。
【００４６】
［００４１］さらに、組換え発現ベクターは、さらなるヌクレオチド配列を含有してもよい。例えば、組換え発現ベクターは、ベクターを取り込んだ宿主細胞を同定する選択可能マーカー遺伝子をコードしてもよい。さらに、宿主細胞からのタンパク質の分泌を促進するため、発現の際に、アミノ末端に融合したシグナル配列を含んでタンパク質が合成されるように、組換え発現ベクターは、タンパク質のアミノ末端に連結したシグナル配列をコードしてもよい。このシグナル配列は、細胞の分泌経路内にタンパク質を導き、そして次いで通常、切断されて、宿主細胞からの、シグナル配列を含まないタンパク質の放出を可能にする。哺乳動物宿主細胞からのタンパク質またはペプチドの分泌を促進するためのシグナル配列の使用は、当該技術分野に周知である。
【００４７】
［００４２］本発明記載のポリヌクレオチドを含有する発現系が調製された時点で、宿主細胞内に取り込む準備ができている。基本的に、この方法は、宿主細胞においてＤＮＡ分子の転写を生じるのに有効な条件下で、本発明の発現系を用いて宿主細胞を形質転換することによって実行可能である。形質転換、特に形質導入、コンジュゲート化、可動化、またはエレクトロポレーションによって、組換え分子を細胞内に導入してもよい。本明細書にその全体が援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）によって記載されるように、当該技術分野に知られる標準的クローニング法を用いて、ＤＮＡ配列を宿主細胞内にクローニングする。適切な宿主細胞には、限定されるわけではないが、細菌、ウイルス、酵母、哺乳動物細胞、昆虫、植物等が含まれる。形質転換の方法は、プロモーターの調節下での核酸の一過性または安定発現を生じうる。１つの態様において、本発明の核酸構築物は、形質転換の結果として組換え植物細胞ゲノム内に安定して挿入されるが、特に研究中の植物が緩慢に生長する場合、一過性発現が重要な目的を果たしうる。
【００４８】
［００４３］形質転換に適した植物組織には、葉の組織、根の組織、分裂組織、接合胚および体細胞胚、カルス、プロトプラスト、穂（ｔａｓｓｅｌ）、花粉、胚、葯などが含まれる。選択する形質転換手段は、形質転換しようとする組織に最も適したものである。
【００４９】
［００４４］植物組織における一過性発現はしばしば、微粒子銃によって達成される（本明細書にその全体が援用される、Ｋｌｅｉｎら，  “Ｈｉｇｈ−Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｉｎｔｏ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ，”  Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３（１９８７））。この方法において、タングステンまたは金微粒子（直径１〜２μｍ）を関心対象のＤＮＡでコーティングし、そして次いで、高圧ガスを用いて、組織に衝突させる。この方式で、核内に外来ＤＮＡを送達して、そして組織の現在の条件下で、遺伝子の一時的な発現を得ることが可能である。また生物学的活性粒子（例えばベクターおよび異種ＤＮＡを含有する乾燥細菌細胞）を植物細胞内に推進させてもよい。現在知られるかまたは今後開発される、粒子衝突の他の変形もまた使用可能である。
【００５０】
［００４５］植物細胞内に核酸構築物を安定して導入する適切な方法は、あらかじめ核酸構築物で形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）に植物細胞を感染させることである。上述のように、アグロバクテリウム属のＴｉ（またはＲＩ）プラスミドは、植物細胞内への外来核酸分子の非常に成功したトランスファーを可能にする。病原体に対する抵抗性を与える遺伝子で植物細胞を形質転換する別のアプローチは、本明細書にその全体が援用される、すべてＳａｎｆｏｒｄらに対する、米国特許第４，９４５，０５０号、第５，０３６，００６号、および第５，１００，７９２号、ならびにＥｍｅｒｓｃｈａｄら，  “Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｒｏｍ  Ｉｍｍａｔｕｒｅ  Ｚｙｇｏｔｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｓ  ｏｆ  Ｓｅｅｄｌｅｓｓ  Ｇｒａｐｅｓ  （Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ），”  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １４：６−１２（１９９５）に開示されるような、宿主細胞の微粒子銃（遺伝子銃形質転換としても知られる）である。導入のさらに別の方法は、ミニ細胞、細胞、リソソーム、または他の融合性脂質表面体いずれかである他の実体と、プロトプラストの融合である（本明細書にその全体が援用される、Ｆｒａｌｅｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７９：１８５９−６３（１９８２））。また、エレクトロポレーションによって、核酸分子を宿主細胞内に導入してもよい（本明細書にその全体が援用される、Ｆｒｏｍｍら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：５８２４（１９８５））。この技術において、発現カセットを含有するプラスミドの存在下で、植物プロトプラストをエレクトロポレーションする。高電場強度の電気インパルスは、生体膜を可逆的に透過性にし、プラスミドの導入を可能にする。エレクトロポレーションされた植物プロトプラストは、細胞壁を再形成し、分裂し、そして再生する。形質転換の正確な方法は、本発明の実施に重要ではない。選択した宿主細胞の効率的な形質転換を生じる任意の方法が、本発明を実施するのに適している。
【００５１】
［００４６］形質転換後、形質転換された植物細胞を再生しなければならない。培養プロトプラストからの植物再生は、本明細書にその全体が援用される、Ｅｖａｎｓら，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，  Ｖｏｌ．  １：  （ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８３）；  Ｖａｓｉｌ  Ｉ．Ｒ．（監修），  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，  Ａｃａｄ．  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｒｌａｎｄｏ，  Ｖｏｌ．  Ｉ，  １９８４、およびＶｏｌ．  ＩＩＩ（１９８６）、ならびにＦｉｔｃｈら，  “Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｉｍｍａｔｕｒｅ  Ｚｙｇｏｔｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｓ  ｏｆ  Ｐａｐａｙａ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ  Ｌ．），”  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  ９：３２０（１９９０）に記載される。
【００５２】
［００４７］再生のための手段は、植物の種から種で多様であるが、一般的に、形質転換プロトプラストの懸濁物または外植片を含有するペトリ皿をまず提供する。カルス組織を形成し、そしてカルスから苗条を誘導し、そして続いて根付かせてもよい。あるいは、カルス組織において胚形成を誘導してもよい。これらの胚は、天然胚のように発芽し、植物を形成する。培地は、一般的に、多様なアミノ酸およびホルモン、例えばオーキシンおよびサイトキニンを含有するであろう。効率的な再生は、培地、遺伝子型、および培養歴に応じるであろう。これらの３つの変数が調節されているならば、再生は通常再現可能であり、そして反復可能である。
【００５３】
［００４８］好ましくは、本発明の核酸構築物と一緒に、宿主細胞内に同時に導入した選択マーカーを用いて、形質転換細胞をまず同定する。適切な選択マーカーには、限定されるわけではないが、カナマイシン耐性を与えるｎｐｔＩＩ遺伝子（本明細書にその全体が援用される、Ｆｒａｌｅｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：４８０３−４８０７（１９８３））、およびゲンタマイシン、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール等に対する抵抗性を与える遺伝子などの、抗生物質抵抗性をコードするマーカーが含まれる。適切な抗生物質を含有する選択培地上で細胞または組織を増殖させ、それによって、一般的には抗生物質耐性マーカーを発現する形質転換体のみが増殖を続ける。他のタイプのマーカーもまた、本発明の発現カセット中に含むのに適している。例えば、除草剤耐性、例えばスルホニル尿素に対する耐性をコードする遺伝子、またはメトトレキセートに対する抵抗性を与えるｄｈｆｒ遺伝子が有用である（本明細書にその全体が援用される、Ｂｏｕｒｏｕｉｓら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２：１０９９−１１０４（１９８３））。同様に、同定可能化合物の産生を提供する酵素をコードする「レポーター遺伝子」が適している。遺伝子融合実験に最も広く用いられるレポーター遺伝子は、ＧＵＳとしても知られる、β−グルクロニダーゼタンパク質をコードする大腸菌由来の遺伝子、ｕｉｄＡであった（本明細書にその全体が援用される、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら，  “ＧＵＳ  Ｆｕｓｉｏｎｓ：  β  Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ａｓ  ａ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｐｌａｎｔｓ，”  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：３９０１−３９０７（１９８７））。同様に、発光によって同定可能な化合物の産生を提供する酵素、例えばルシフェラーゼが有用である。使用する選択マーカーは、ターゲット種に応じるであろうし；特定のターゲット種に関しては、異なる抗生物質、除草剤、または生合成選択マーカーが好ましい。
【００５４】
［００４９］次いで、形質転換に用いた所定のカセット中に含有されるウイルス遺伝子に特異的なプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーション分析によって、阻害剤または他の選択マーカーによって選択された植物細胞および組織を、ウイルス遺伝子の獲得に関して試験する（本明細書にその全体が援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。
【００５５】
［００５０］本発明の核酸構築物を含有する融合遺伝子がトランスジェニック植物中に安定に取り込まれた後、有性交雑によって導入遺伝子を他の植物にトランスファーしてもよい。交雑しようとする種に応じて、多くの標準的育種技術のいずれを用いてもよい。このタイプのトランスジェニック植物が産生された時点で、植物はそれ自体、慣用法にしたがって栽培可能であり、したがって生じる植物中に核酸構築物が存在する。あるいは、トランスジェニック植物からトランスジェニック種子を回収する。次いで、これらの種子を土中に植えて、そして慣用法を用いて、トランスジェニック植物を産生してもよい。
【００５６】
［００５１］非常に多様な植物またはその種子と組み合わせて、本発明を利用してもよい。適切な植物には双子葉類および単子葉類が含まれる。有用な作物植物には：アルファルファ（ａｌｆａｌｆａ）、イネ（ｒｉｃｅ）、コムギ（ｗｈｅａｔ）、オオムギ（ｂａｒｌｅｙ）、ライムギ（ｒｙｅ）、ワタ（ｃｏｔｔｏｎ）、ヒマワリ（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ）、ピーナツ（ｐｅａｎｕｔ）、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、ジャガイモ（ｐｏｔａｔｏ）、サツマイモ（ｓｗｅｅｔ  ｐｏｔａｔｏ）、マメ（ｂｅａｎ）、エンドウ（ｐｅａ）、チコリ（ｃｈｉｃｏｒｙ）、レタス（ｌｅｔｔｕｃｅ）、エンダイブ（ｅｎｄｉｖｅ）、キャベツ（ｃａｂｂａｇｅ）、芽キャベツ（ｂｒｕｓｓｅｌ  ｓｐｒｏｕｔ）、ビート（ｂｅｅｔ）、アメリカボウフウ（ｐａｒｓｎｉｐ）、カブ（ｔｕｒｎｉｐ）、カリフラワー（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ）、ブロッコリー（ｂｒｏｃｃｏｌｉ）、カブ（ｔｕｒｎｉｐ）、ダイコン（ｒａｄｉｓｈ）、ホウレンソウ（ｓｐｉｎａｃｈ）、タマネギ（ｏｎｉｏｎ）、ニンニク（ｇａｒｌｉｃ）、ナス（ｅｇｇｐｌａｎｔ）、コショウ（ｐｅｐｐｅｒ）、セロリ（ｃｅｌｅｒｙ）、ニンジン（ｃａｒｒｏｔ）、スカッシュ（ｓｑｕａｓｈ）、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、ズッキーニ（ｚｕｃｃｈｉｎｉ）、キュウリ（ｃｕｃｕｍｂｅｒ）、リンゴ（ａｐｐｌｅ）、西洋ナシ（ｐｅａｒ）、メロン（ｍｅｌｏｎ）、柑橘類（ｃｉｔｒｕｓ）、イチゴ（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ）、ブドウ（ｇｒａｐｅ）、ラズベリー（ｒａｓｐｂｅｒｒｙ）、パインアップル（ｐｉｎｅａｐｐｌｅ）、ダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）、タバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）、トマト（ｔｏｍａｔｏ）、モロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ）、パパイヤ（ｐａｐａｙａ）、サトウキビ（ｓｕｇａｒｃａｎｅ）、およびコーヒー（ｃｏｆｆｅｅ）が含まれうる。
【００５７】
［００５２］本発明のさらなる側面は、植物材料におけるマンナンおよび多糖を分解する方法に関する。この方法は、植物材料を提供し、そして植物材料におけるマンナンおよび多糖を分解するのに有効な条件下で、植物材料を本発明のβ−マンナナーゼタンパク質と接触させる工程を伴う。
【００５８】
［００５３］好ましい態様において、本発明のβ−マンナナーゼタンパク質と接触させる植物材料はコーヒー豆であるが、マンナンおよび多糖の分解が望ましい他の植物材料もまた接触させてもよい。
【００５９】
［００５４］本発明のこの方法にしたがって、分解した植物材料、特にβ−マンナナーゼタンパク質と植物物質を接触させる工程から生じたものから、可溶性糖を回収することもまた、望ましい可能性もある。
【００６０】
［００５５］これらの側面は、以下の実施例によってさらに例示される。
【実施例】
【００６１】
［００５６］以下の実施例は、本発明の態様を例示するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを決して意図されない。
実施例１  コーヒー豆穿孔虫（ヒポセネマス・ハンペイ）中腸からのβ−マンナナーゼ・クローニング
試料調製
［００５７］本明細書にその全体が援用される、Ｒｕｂｉｏら，  “Ｍｏｒｆｏｌｏｇｉａ  Ｄｅｌ  Ｓｉｓｔｅｍａ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｏ  ｄｅ  Ｈｙｐｏｔｈｅｎｅｍｕｓ  ｈａｍｐｅｉ（Ｆｅｒｒａｒｉ），”  Ｃｅｎｉｃａｆｅ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）５８：６６−７４（２００７）に記載されるように、ヒポセネマス・ハンペイ（鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）：キクイムシ科（Ｓｃｏｌｙｔｉｄａｅ））の成体昆虫にコーヒー種子を感染させた。簡潔には、立体顕微鏡を用いて、感染したコーヒー豆を切り裂き、そして幼虫をペトリ皿に収集した。各幼虫を４℃で少なくとも１０分間保存して身体活動を減少させ、そして次いで滅菌蒸留水滴を含むガラススライド中に入れ、そして小さいピンセットおよび０．１５ｍｍ裂き針（ｔｅａｓｉｎｇ  ｎｅｅｄｌｅ）を用いて、Ｚｅｉｓｓ  Ｅｓｔｅｍｉ  ２０００立体顕微鏡下で解剖した。中腸組織を単離するため、各幼虫を前胸および中胸レベルでの切開で解剖し、次いで幼虫全長に沿って大きく切開して、消化管全体を暴露した。最後に、脂肪組織を除去した後、中腸領域を解剖し、そして直ちに、０．１％ＲＮＡ  ＬａｔｅｒＴＭ試薬を含有する１００μｌの滅菌蒸留水を含む、あらかじめ冷却した微量遠心管内に入れた。タンパク質およびＲＮＡ抽出まで、すべての解剖中腸組織を−８０℃で保存した。
【００６２】
コーヒー豆穿孔虫ＹＳＳＴライブラリー構築
［００５８］中腸組織からＲＮＡを抽出し、そして−８０℃で保存した。製造者の使用説明書にしたがって、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡミディキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて、総ＲＮＡからポリアデニル化ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とともに、Ｎ６−ＮｏｔＩプライマー：
【００６３】
【化４】
2010533476.tif 000013
を用いて、ｍＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを合成した。第二鎖合成後、製造者の使用説明書にしたがって、ＥｃｏＲＩアダプターと連結することによって、単方向クローニング用にｃＤＮＡを調製し、その後、ＮｏｔＩ消化した。次いで、電気泳動によって１％アガロースゲル上でｃＤＮＡを分画し、そして概算サイズ範囲３００〜１，０００ｂｐ以内のものをゲルから切り出し、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製した。ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化した、３つのベクター、ＰＹＳＳＴ０、ｐＹＳＳＴ１、およびｐＹＳＳＴ２の等分割混合物に断片を連結させた。エレクトロポレーション（Ｍｉｃｒｏｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュルス）によって、生じたＹＳＳＴライブラリーおよそ１μｇでエレクトロコンピテントＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏ、カリフォルニア州カースバッド）を形質転換し、そして１０〜１５の大きいＬＢプレート上にスプレッドした。Ｐｅｒｆｅｃｔｐｒｅｐプラスミド・ミディキット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、生じた形質転換体のプールした試料から、プラスミドＤＮＡを単離した。ＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ酵母形質転換系２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンホセ）を用いて、５０マイクログラムのＹＳＳＴライブラリーを酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ））株ＤＢＹα２４４５（ＭＡＴα、ｓｕｃ２Δ−９、ｌｙｓ２−８０１、ｕｒａ３−５２、ａｄｅ２−１０１）内に形質転換した。ＹＰスクロースプレート（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％スクロース、２％寒天、ｐＨ６．５）上に形質転換体をスプレッドし、３０℃で４〜９日間インキュベーションし、そして可視コロニーをスクロースプレート上に再度ストリークし、その後、３０℃で２〜３日間インキュベーションした。本明細書にその全体が援用される、ＨｏｆｆｍａｎｎおよびＷｉｎｓｔｏｎ，  “Ａ  Ｔｅｎ−Ｍｉｎｕｔｅ  ＤＮＡ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  Ｒｅｌｅａｓｅｓ  Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，”  Ｇｅｎｅ  ５７：２６７−２７２（１９８７）に記載されるように、可視コロニーからプラスミドを単離し、ＸＬｌ−ｂｌｕｅエレクトロコンピテント大腸菌内に形質転換し、そしてＱｉａｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。Ｂｉｏ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  ニューヨーク州イタカ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ）にて、ｐＹＳＳＴ０、ｐＹＳＳＴ１、ｐＹＳＳＴ２（５’−ＴＣＣＴＣＧＴＣＡＴＴＧＴＴＣＴＣＧＴＴＣＣ−３’）（配列番号５）のＡＤＨ１プロモーターに対応するプライマーを用いて、プラスミド挿入物を配列決定した。
【００６４】
ＲＡＣＥ増幅
［００５９］単離マンナナーゼＹＳＳＴクローンの予測されるシグナル配列に対応するＤＮＡ配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを、アダプタープライマーとしてのプライマーとともに、３’ＲＡＣＥで用いた。全長ｃＤＮＡ配列を得るため、９４℃１分間、６３℃１分間、７２℃２．５分間で、１周期おきにアニーリング温度を１℃ずつ６０℃まで減少させつつ３５周期、その後、７２℃で１０分間最終伸長のプログラムを用いて、「タッチダウン」ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）内にサブクローニングした。上述のように、ＤＮＡ配列を決定した。Ｈ．ハンペイ由来のβ−マンナナーゼは、エンドグリカナーゼ（エンド−β−１，４−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ３．２．１．４）である。該酵素は、３２０アミノ酸の一本鎖ポリペプチドであり、予測される分子量は３５．６２ｋＤａで、そしてアミノ酸組成から計算される理論値ｐＩは４．７２である。
【００６５】
実施例２  スポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｔａ）（Ｓｆ９）細胞におけるβ−マンナナーゼの異種発現
融合タンパク質発現プラスミドの構築
［００６０］Ｃ末端マンナナーゼ−ＨＩＳタグ化発現プラスミドの構築のため、以下のプライマー：
【００６６】
【化５】
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とともに、テンプレートとしてｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）中のマンナナーゼｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲによってｃＤＮＡを再増幅した。配列番号６の下線部分を方向性ＴＯＰＯクローニングのために導入した。後者の逆プライマーは、天然β−マンナナーゼｃＤＮＡ中の停止コドンを欠く。生じたｃＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）内にクローニングし、そしてｐＥＮＴＲ／β−Ｍａｎｎと名付けた。
【００６７】
ＤＮＡバキュロウイルス組換えおよびトランスフェクション
［００６１］Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）のＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔバキュロウイルス発現系プロトコルにしたがって、バキュロウイルス構築およびＳｆ９細胞におけるタンパク質発現を行った。バキュロウイルス粒子を産生するため、スポドプテラ・フルギペルダＳｆ９細胞を組換えバクミドＤＮＡでトランスフェクションした。１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＳＦ９００−ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、２７℃で細胞を培養した。トランスフェクションのため、３５ｍｍ組織培養フラスコ中に９ｘ１０５細胞をプレーティングし、そして抗生物質を含まない２ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ  ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で１時間インキュベーションして、細胞がプレートに付着するのを可能にした。次いで、ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ（６μｌ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と室温で３０分間あらかじめインキュベーションしておいた組換えバクミドＤＮＡ（プラスミドＤＮＡの５μｌの標準的ミニ調製）を含有する、１ｍｌの血清不含Ｓｆ９００−ＩＩに、培地を交換した。細胞をリポソーム−ＤＮＡ複合体と２７℃で５時間インキュベーションした。トランスフェクション培地を除去し、そして抗生物質を含有する２ｍｌのＳＦ９００−ＩＩ培地を添加した。ｐＥＮＴＴＭ／ＭａｎプラスミドをＳｆ９細胞内にトランスフェクションし、そして非組換えバクミド（Ｂｄ）ＤＮＡおよびｐＥＮＴＴＭ／ＣＡＴを、それぞれ、陰性および陽性対照として用いた。トランスフェクション細胞を２７℃で７２時間インキュベーションして、バキュロウイルス産生および培地内への放出を可能にした。各トランスフェクションから培地を収集し、清澄化し（５００ｇで５分間）、そしてマスター・ウイルスストックとして４℃で保存した。位相差顕微鏡下で継代培養し、そしてＰＣＲ分析を通じてバキュロウイルスＤＮＡの存在をアッセイした後、４８時間以内に、トランスフェクション細胞によって示される細胞変性効果の可視化によって、トランスフェクション効率、組換えバキュロウイルス（Ｂｖ−Ｍａｎ）および非組み換えバキュロウイルス（Ｂｖ）産生を監視した。この目的のため、５０μｌの感染培養上清中に存在するバキュロウイルスを微量遠心管中で１２０００ｇで１０分間沈降させ、そして５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を含有するプロテイナーゼＫ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８；５ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．５％ＳＤＳ）のある量（２５μｌ）をペレットに添加して、ウイルスタンパク質を５６℃で１時間消化した。ＰＣＲ工程に進む前に、酵素を不活性化するため、９５℃で２０分間のさらなる加熱を含めた。上に記載するのと同じ条件およびプライマーで、テンプレートとして２μｌのこのＤＮＡ調製物を用いて、ウイルスＤＮＡ増幅を行った。ガンシクロビルを１２０時間用いて、細胞を選択し、そしてＳｆ９細胞に感染させることによって、生じたウイルスストックを２回増幅した。
【００６８】
バキュロウイルスストックの増幅
［００６２］バキュロウイルス・マスターストックの増幅のため、１ｘ１０６  Ｓｆ９細胞を２５ｃｍ２フラスコ中にプレーティングし、そして抗生物質を含有する１ｍｌのＳＦ９００−ＩＩ培地中、１０μｌのバキュロウイルス・マスターストックと１時間インキュベーションした（０．０１〜０．１のＭＯＩに対応する）。この期間後、培地を４．５ｍｌにして、そして感染細胞を２７℃で４８時間インキュベーションした。培地を収集し、清澄化し（５００ｇで５分間）、そして組換えタンパク質産生のため、ウイルスストックとして４℃で保存した。
【００６９】
組換えβ−マンナナーゼのスケールアップ産生
［００６３］Ｓ．フルギペルタの細胞を５０ｍｌの培地を含む２２５ｃｍ２中にプレーティングし、そして上述のようにインキュベーションした。５００μｌのウイルスストックＰ３（力価３．４４ｘ１０６ｐｆｕ／ｍｌ）を用いて、対数期に細胞をトランスフェクションした。９６時間後、培地を収集し、清澄化し（５００ｇで５分間）、そしてＭａｇｎｅＨｉｓ系（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、組換えβ−マンナナーゼを精製した。これは、１００ｍｌ培養あたり、２．４ｍｇの精製β−マンナナーゼの産生を生じた。
【００７０】
実施例３  組換えβ−マンナナーゼの精製
［００６４］製造者のプロトコルにしたがって、ＭａｇｎｅＨｉｓ  Ｎｉ−Ｐａｒｔｉｃｌｅ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）プルダウンアッセイを行った。簡潔には、細胞を取り除いた後の１０ｍｌの培地を、３００μｌのＭａｇｎｅＨｉｓ  Ｎｉ−Ｐａｒｔｉｃｌｅ（登録商標）と混合し、そして穏やかに振盪しながら室温で２分間インキュベーションした。インキュベーション後、試験管を磁気スタンドに３０秒間置き、磁石によってＭａｇｎｅＨｉｓ  Ｎｉ−Ｐａｒｔｉｃｌｅ（登録商標）が捕捉されるのを可能にし、そして上清を取り除いた。結合／洗浄緩衝液でＭａｇｎｅＨｉｓ  Ｎｉ−Ｐａｒｔｉｃｌｅ（登録商標）を３回洗浄した。純粋なβ−マンナナーゼ−６ｘＨｉｓタグ化タンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥ（図１）および機能アッセイ（図２）に供した。
【００７１】
実施例４  イナゴマメ（ｃａｒｏｂ）樹木種子由来のβ−ガラクトマンナンを用いた、酵素活性の決定
［００６５］イナゴマメ種子粉より抽出したガラクトマンナン多糖を染色し、そして架橋することによって、アズリン架橋ガラクトマンナンを調製した（ＡＺＣＬ−ガラクトマンナン（登録商標）；Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ．）。イナゴマメ樹木、セラトニア・シリクア（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ）は、常緑低木または樹木であり、地中海地方原産で、食用種子鞘のために栽培されている。この基質は緩衝溶液中で不溶性であるが、本明細書にその全体が援用される、Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉら，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＮＤＯ−β−ＭＡＮＮＡＮＡＳＥｓ  ｆｒｏｍ  Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  Ｃｏｆｆｅｅ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）  Ｇｒａｉｎｓ，”  Ｐｌａｎｔａ  ２１３：２９６−３０８（２００１）にしたがって、特異的エンド−ヒドロラーゼによって容易にそして迅速に加水分解されて、可溶性の色素標識された断片を放出する。基質溶液［０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中の１％（ｗ／ｖ）ＡＺＣＬ−ガラクトマンナン（登録商標）］中で混合された組換えβ−マンナナーゼ−６ｘＨｉｓタグ化タンパク質の２０μｌアリコットを穏やかに振盪しながら３７℃でインキュベーションした。２００μｌのアリコットを３０分おきに除去し、そして１００℃で５分間加熱して、反応を停止した。各アリコットを１３ｋ  ｒｐｍで５分間遠心分離し、そしてλ５９５ｎｍで吸光度を測定した（図２）。
【００７２】
実施例５  コーヒー豆由来のβ−ガラクトマンナンを用いた、酵素活性の測定
コーヒーβ−ガラクトマンナン精製
［００６６］脱リグニン処理、酸洗浄、およびそれに続くアルカリ抽出に基づく連続分画法（本明細書にその全体が援用される、Ｂｒａｄｂｕｒｙら，  “Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｇｒｅｅｎ  Ｃｏｆｆｅｅ  Ｂｅａｎ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，”  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ３８：３８９−３９２  （１９９０）におけるようなもの）を用いて、純粋なβ−マンナンを未焙煎コーヒー豆から単離した。挽いた未焙煎コーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）コーヒー豆をクロロホルム／メタノール（２：１）および石油エーテル（５ｈ）でソックレー抽出して脂質を除去し、そして水性エタノール（９５％、一晩）で抽出して低分子量炭水化物を除去した。本明細書にその全体が援用される、ＷｏｌｆｒｏｍおよびＰａｔｉｎ，  “Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｆｆｅｅ  Ｂｅａｎ．  ＩＶ．  Ａｎ  Ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎ，”  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ３０：４０６０−４０６３（１９６５）の方法にしたがって、脱脂豆を熱湯抽出し、そして次いで弱酸性塩化ナトリウム溶液で脱リグニン処理して、白色ホロセルロース産物を得た。希塩酸（１％、８０℃）で洗浄することによって、アラビノガラクタンポリマーの大部分は部分的に加水分解された型で可溶化された。次いで、２．５および１０％水酸化ナトリウム溶液での抽出（一晩、４℃）によって別個の分画中でマンナンを単離した。２．５％ＮａＯＨ抽出物にエタノールを添加すると、アラビノガラクタンおよびマンナンを含有する沈殿物が生じた。１０％ＮａＯＨ抽出物を中和すると、白色沈殿物の迅速な形成が生じ、混合物を４℃で一晩置いた後、ろ過によってこれを除去した。ろ液にエタノールを添加することによって、さらなる分画を得た。乾燥前に、沈殿物をすべてエタノールおよびジエチルエーテルで洗浄した。この作業に用いたマンナン基質を１０％ＮａＯＨ抽出物の中和によって分画沈降し、これは重量９４％のマンナンを含有した。
【００７３】
Ｈ．ハンペイ由来の組換えβ−マンナナーゼの活性に対するｐＨおよび温度の影響
［００６７］コーヒー・ガラクトマンナンに対する酵素活性を試験するため、本明細書にその全体が援用される、Ｂｅｒｎｆｅｌｄ，  Ｐ．  ：  Ｃｏｌｌｏｗｉｃｋ  Ｓ．Ｐ．およびＫａｐｌａｎ  Ｎ．Ｏ．（監修）中，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  Ｉ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  １４９−１５８（１９５５）のジニトロサリチル酸アッセイによって、β−マンナナーゼ活性を決定した。４．０〜１１．０の範囲の異なるｐＨ値で、コーヒー・ガラクトマンナンに対する酵素活性の最適ｐＨを決定した。緩衝液は、２００ｍＭ酢酸ナトリウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムで３７℃であった。最高酵素活性はｐＨ６．０で観察された（図３）。ｐＨ６．０の同じ緩衝液を用いて、１５℃〜７０℃の温度範囲で、コーヒー・ガラクトマンナンに対する組換えβ−マンナナーゼの活性に対する温度の影響を調べた（図４）。酵素は５０℃前後で最大活性を示した。温度をさらに増加させると、酵素活性は急激に減少した。
【００７４】
［００６８］本発明は例示の目的のために詳細に記載されているが、こうした詳細は単にその目的のためであり、そして以下の請求項によって定義される、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は変形を作製可能である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【国際調査報告】
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