(57)【要約】  本発明は、遺伝子増幅の必要なしに、組換えタンパク質の高い力価を産生するための方法、細胞株及びキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列へ作用可能に連結された、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができる１つ又はそれ以上のヌクレオチド配列を含む核酸分子を１つまたはそれ以上の細胞中に導入することを含み、前記核酸分子が高効率形質移入を用いた１つ又はそれ以上の細胞中へ導入される、遺伝子増幅なしに細胞培養中の組換えタンパク質の高い力価を生産する方法。
【請求項２】
高効率形質移入が、１）１つ又はそれ以上の細胞を受容するのに適した１つ又はそれ以上の開口部を有する障壁を含む電気穿孔装置中に１つ又はそれ以上の細胞を配置する工程；２）１つ又はそれ以上の開口部中に１つ又はそれ以上の細胞を固定する工程；３）１つ又はそれ以上の細胞を核酸分子と接触させる工程；４）電流が細胞を通過するように、１つ又はそれ以上の細胞を電流と接触させる工程；５）電気穿孔装置中の電流と電圧間の比をモニターする工程；及び６）局所的な場の強度の大きさを、１つ又はそれ以上の細胞の電気穿孔を達成するのに適した値に調整する工程、を含む調節された電気穿孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つ又はそれ以上の細胞が、電流と接触される前に、核酸分子と接触される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１つ又はそれ以上の細胞が、核酸と接触される前に、電流と接触される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
１つ又はそれ以上の細胞が、電流と同時に、核酸分子と接触される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
高効率形質移入が、１）第一の末端と第二の末端を含む管腔を有する少なくとも１つの細長い毛細管を含む電気穿孔装置中に１つ又はそれ以上の細胞を配置する工程（第一の末端及び第二の末端は何れも貯蔵槽中へ開口しており、並びに１つ又はそれ以上の細胞は少なくとも１つの毛細管の管腔を通過して流動し、及び貯蔵槽に流入することができる。）；２）組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列へ作用可能に連結された、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができる１つ又はそれ以上のＤＮＡ要素を含む核酸分子と１つ又はそれ以上の細胞を接触させる工程；３）電流が１つ又はそれ以上の細胞を通過するように、１つ又はそれ以上の細胞を電流と接触させる工程；４）電気穿孔装置中の電流と電圧間の比をモニターする工程；及び５）局所的な場の強度の大きさを、１つ又はそれ以上の細胞の電気穿孔を達成するのに適した場の強度になるように調整する工程、を含む調節された電気穿孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
１つ又はそれ以上の細胞が、電流と接触される前に、核酸分子と接触される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１つ又はそれ以上の細胞が、核酸分子と接触される前に、電流と接触される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
１つ又はそれ以上の細胞が、電流と同時に、核酸分子と接触される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
高効率形質移入が細胞の少なくとも８０％中へ核酸分子を導入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
高効率形質移入が細胞の少なくとも８５％中へ核酸分子を導入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
高効率形質移入が細胞の少なくとも９０％中へ核酸分子を導入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
高効率形質移入が細胞の少なくとも９５％中へ核酸分子を導入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
１つ又はそれ以上の細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
１つ又はそれ以上の細胞が、１つ若しくはそれ以上のＢＨＫ２１細胞、１つ若しくはそれ以上のＣＨＯ細胞、１つ若しくはそれ以上のＣＨＯ−Ｋ１細胞、１つ若しくはそれ以上のＣＨＯ−ＤＵＸＸ細胞、１つ若しくはそれ以上のＮＳＯ細胞又は１つ若しくはそれ以上のＳｐ２／０細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
１つ又はそれ以上の細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞細胞（ＣＨＯ細胞）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
組換えタンパク質が治療用タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
組換えタンパク質が抗体又はその抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
組換えタンパク質がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
クロマチンを開放し及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができる１つ又はそれ以上のＤＮＡ要素が、（ａ）１つ又はそれ以上の伸長された無メチル化ＣｐＧアイランド；（ｂ）１つ又はそれ以上のマトリックス付着領域；（ｃ）１つ又はそれ以上の安定化及び抗レプレッサー領域、及び（ｄ）（ａ）から（ｃ）のあらゆる組み合わせ、から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素が、天然に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素が、人工的に合成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素が、天然に存在するＤＮＡ要素と人工的に合成されたＤＮＡ要素の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
１つ又はそれ以上の伸長された無メチル化ＣｐＧアイランドが、１つ又はそれ以上の遍在的に発現される遺伝子のプロモーター領域に由来する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
１つ又はそれ以上の遍在的に発現されている遺伝子が、ヒトｈｎＲＮＰＡ２遺伝子、マウスｈｎＲＮＰＡ２遺伝子、ヒトＴＢＰ遺伝子、マウスＴＢＰ遺伝子、ヒトｒｐＳ３遺伝子及びマウスｒｐＳ３遺伝子から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
核酸分子が、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列へ作用可能に連結された、（ａ）翻訳を増強することができるヌクレオチド配列、（ｂ）分泌を増加させることができるヌクレオチド配列、及び（ｃ）ｍＲＮＡ安定性を増大させることができるヌクレオチド配列の１つ又はそれ以上をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
障壁が誘電性材料を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２８】
開口部の少なくとも７５％又は少なくとも８０％又は少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％が１つ又はそれ以上の細胞によって閉塞される、請求項２に記載の方法。
【請求項２９】
１つ又はそれ以上の開口部の直径が１つ又はそれ以上の細胞の直径より小さい、請求項２に記載の方法。
【請求項３０】
１つ又はそれ以上の開口部の直径が１つ又はそれ以上の細胞の直径と実質的に同一である、請求項２に記載の方法。
【請求項３１】
１つ又はそれ以上の細胞の直径が少なくとも１つの毛細管の管腔の直径の少なくとも８０％である、請求項６に記載の方法。
【請求項３２】
核酸分子がベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
ベクターがプラスミドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ベクターがウイルスベクターである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
圧力をかけることによって細胞が開口部へ固定される、請求項２に記載の方法。
【請求項３６】
圧力をかけることによって細胞が開口部へ固定される、請求項２に記載の方法。
【請求項３７】
電気穿孔装置が、各々が緩衝液を受容するのに適した２つのチャンバーを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３８】
２つのチャンバーの各々が同じ緩衝液を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３９】
２つのチャンバーの各々が異なる緩衝液を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
選択工程を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
ａ）組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列をクローニングするのに適した多重クローニング部位へ作用可能に連結されたクロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができる１つ又はそれ以上のＤＮＡ要素を含む核酸分子、並びにｂ）高効率形質移入を行うための装置又は試薬及び使用説明書を含む、組換えタンパク質の高い力価を生産するためのキット。
【請求項４２】
装置が調節された電気穿孔装置である、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
電流と電圧間の比をモニターするための手段をさらに含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４４】
核酸分子を導入するのに適した細胞株をさらに含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４５】
細胞株が細胞の複数を含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
局所的な場の強度が約２５０から４００Ｖ／ｃｍである、請求項２又は６に記載の方法。
【請求項４７】
高効率形質移入がナノ粒子の使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
高効率形質移入が磁気ナノ粒子の使用を含む、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００７年１月８日に出願された米国仮特許出願第６０／８７２，１６２号（その内容全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本願は、同じく２００７年１月８日に出願された米国仮特許出願第６０／８９７，２２１号及び２００８年１月８日に出願された、代理人整理番号ＭＣＡ−８４４ＵＳを有し、「Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｌｅｖｅｌｓ  Ｏｆ  Ｏｎｅ  Ｏｒ  Ｍｏｒｅ  Ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ」という名称の米国出願に関連し、これらの各々の内容全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０００３】
これらの特許出願の各々の内容全体が、その明細書、特許請求の範囲及び要約書並びに一切の図面、表又は図を含めて（これらに限定されない。）、参照により、明示的に本明細書中に組み込まれる。
【０００４】
発明の分野
本発明は、全般には、組換えタンパク質発現技術の分野に関する。より具体的には、本発明は、遺伝子増幅の必要なしに、細胞培養中の組換えタンパク質の高い力価を産生するための方法、細胞株及びキットを提供する。  
【背景技術】
【０００５】
治療薬、診断及び／又は研究試薬としての使用に適した組換えタンパク質の生産は、バイオテクノロジー分野において公知である。典型的には、この過程は、望ましい産物を産生する安定なクローンを同定することから、製造及び産物の精製を大規模化することにわたり、通例、作業が困難で、時間がかかり、時間、労働及び資源を著しく投入する必要がある。
【０００６】
安定な遺伝子発現は、宿主ゲノム中への組換え遺伝子の挿入を通じて達成される。しかしながら、組換え細胞株の同定及び性質決定は、費用と時間がかかる工程である。この工程における１つの著しい制限的工程は、４０から５０ｐｇ／細胞／日に近付く、高い産生速度で標的タンパク質を発現する安定に形質移入されたクローンを同定及び選択することである。通常、前記工程は、標的タンパク質の最適な量を発現するクローンを同定するための選択マーカーを使用する遺伝子増幅工程の数巡を含み、これにより、工程全体が時間と労力を要するものとなる。
【０００７】
従って、細胞培養中の標的産物を生産する、簡略化された、より効率的な方法に対する要求が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ある種の実施形態において、本発明は、遺伝子増幅の必要なしに、細胞培養中の組換えタンパク質の高い力価を産生するための改善された方法、細胞株及びキットに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
幾つかの実施形態において、遺伝子増幅の必要なしに、組換えタンパク質の高い力価を生産する方法が提供される。この方法は、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列へ作用可能に連結された、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができる１つ又はそれ以上のＤＮＡ要素を含む核酸分子を１つまたはそれ以上の細胞中に導入することを含み、前記核酸分子は、高効率形質移入を用いて１つ又はそれ以上の細胞中へ導入される。
【００１０】
高効率形質移入は、本発明の方法を用いて形質移入されている細胞の少なくとも５０％若しくはそれ以上又は少なくとも６０％若しくはそれ以上又は少なくとも７０％若しくはそれ以上又は少なくとも７５％若しくはそれ以上又は少なくとも８０％若しくはそれ以上又は少なくとも８５％若しくはそれ以上又は少なくとも９０％若しくはそれ以上又は少なくとも９５％若しくはそれ以上又は少なくとも９６％若しくはそれ以上又は少なくとも９７％若しくはそれ以上又は少なくとも９８％若しくはそれ以上又は少なくとも９９％若しくはそれ以上又は１００％の中に核酸分子を導入することを含む。
【００１１】
一態様において、高効率形質移入は、１）細胞を受容するのに適した１つ又はそれ以上の開口部を有する障壁を含む電気穿孔装置中に１つ又はそれ以上の細胞を配置する工程；２）１つ又はそれ以上の開口部中に１つ又はそれ以上の細胞を固定する工程；３）１つ又はそれ以上の細胞を核酸分子と接触させる工程；４）電流が１つ又はそれ以上の細胞を通過するように、１つ又はそれ以上の細胞を電流と接触させる工程；５）電気穿孔装置中の電流と電圧間の比をモニターする工程；及び６）局所的な場の強度の大きさを、１つ又はそれ以上の細胞の電気穿孔を達成するのに適した場の強度になるように調整する工程、を含む調節された電気穿孔を含む。
【００１２】
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の細胞は、電流と接触される前に、核酸分子と接触される。別の実施形態において、１つ又はそれ以上の細胞は、核酸分子と接触される前に、電流と接触される。さらに別の実施形態において、１つ又はそれ以上の細胞は、電流と同時に核酸分子と接触される。
【００１３】
幾つかの実施形態において、障壁は誘電性材料を含む。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の開口部の直径は、１つ又はそれ以上の細胞の直径より小さい。他の実施形態において、１つ又はそれ以上の開口部の直径は、１つ又はそれ以上の細胞の直径と実質的に同じである。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の開口部の少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％又は１００％が、電気穿孔されている１つ又はそれ以上の細胞によって閉塞される。
【００１４】
幾つかの実施形態において、圧力をかけることによって、１つ又はそれ以上の細胞が１つ又はそれ以上の開口部へ固定される。他の実施形態において、真空を付与することによって、１つ又はそれ以上の細胞が開口部へ固定される。
【００１５】
幾つかの実施形態において、電気穿孔装置は、各々が緩衝液を受容するのに適した２つのチャンバーを含む。各チャンバーは、同じ緩衝液又は異なる緩衝液を含み得る。
【００１６】
別の態様において、高効率形質移入は、１）第一の末端と第二の末端を含む管腔を有する少なくとも１つの細長い毛細管を含む電気穿孔装置中に１つ又はそれ以上の細胞を配置する工程（第一の末端及び第二の末端は何れも貯蔵槽中へ開口しており、並びに１つ又はそれ以上の細胞は少なくとも１つの毛細管の管腔を通過して流動し、及び貯蔵槽に流入することができる。）；２）組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列へ作用可能に連結された、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができる１つ又はそれ以上のＤＮＡ要素を含む核酸分子と１つ又はそれ以上の細胞を接触させる工程；３）電流が１つ又はそれ以上の細胞を通過するように、１つ又はそれ以上の細胞を電流と接触させる工程；４）電気穿孔装置中の電流と電圧間の比をモニターする工程；並びに５）局所的な場の強度の大きさを、１つ又はそれ以上の細胞の電気穿孔を達成するのに適した場の強度になるように調整する工程、を含む調節された電気穿孔を含む。
【００１７】
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の細胞は、電流と接触される前に、核酸分子と接触される。別の実施形態において、１つ又はそれ以上の細胞は、核酸と接触される前に、電流と接触される。さらに別の実施形態において、１つ又はそれ以上の細胞は、電流と同時に核酸分子と接触される。
【００１８】
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の細胞の直径は、１つ又はそれ以上の毛細管の管腔の直径の少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％又は少なくとも９６％又は少なくとも９７％又は少なくとも９８％又は少なくとも９９％である。他の実施形態において、１つ又はそれ以上の細胞の直径は、１つ又はそれ以上の毛細管の管腔の直径より大きい。さらに別の実施形態において、複数の細胞が、１つ又はそれ以上の毛細管の管腔内部の総面積の少なくとも８０％又はそれ以上を占める。
【００１９】
逆に、幾つかの実施形態では、少なくとも１つ又はそれ以上の毛細管の管腔の直径は、１つ又はそれ以上の細胞の直径より少なくとも２０％大きい。別の実施形態では、１つ又はそれ以上の毛細管の管腔の直径は、１つ又はそれ以上の毛細管の管腔内部の複数の細胞の周囲長の周囲の直径より少なくとも２０％大きい。
【００２０】
本発明の様々な態様に従う幾つかの実施形態において、電場強度は約１５０から５００Ｖ／ｃｍである。他の実施形態において、電場強度は約２００から４００Ｖ／ｃｍである。さらに別の実施形態において、電場強度は約２５０から３５０Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態において、電場強度は約４００Ｖ／ｃｍである。
【００２１】
幾つかの実施形態において、高効率形質移入のためにナノ粒子又は磁気ナノ粒子が使用される。
【００２２】
幾つかの実施形態において、核酸分子は、ベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクターである。
【００２３】
幾つかの実施形態において、本発明の方法を用いて形質移入された１つ又はそれ以上の細胞は哺乳動物細胞である。典型的な哺乳動物細胞には、ＢＨＫ２１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＵＸＸ細胞、ＮＳＯ細胞又はＳｐ２／０細胞が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞である。
【００２４】
幾つかの実施形態において、組換えタンパク質は治療用タンパク質である。他の実施形態において、組換えタンパク質は抗体（例えば、モノクローナル抗体）又はその抗原結合断片である。
【００２５】
幾つかの実施形態において、クロマチンを開放することができ及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができる１つ又はそれ以上のＤＮＡ要素は、（ａ）１つ又はそれ以上の伸長された無メチル化ＣｐＧアイランド；（ｂ）１つ又はそれ以上のマトリックス付着領域；（ｃ）１つ又はそれ以上の安定化及び抗レプレッサー領域：並びに（ｄ）（ａ）から（ｃ）のあらゆる組み合わせ、から選択される。
【００２６】
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の伸長された無メチル化ＣｐＧアイランドは、１つ又はそれ以上の遍在的に発現される遺伝子のプロモーター領域に由来する。典型的な遍在的に発現される遺伝子には、ヒトｈｎＲＮＰＡ２、マウスｈｎＲＮＰＡ２、ヒトＴＢＰ、マウスＴＢＰ、ヒトｒｐＳ３及びマウスｒｐＳ３が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
幾つかの実施形態において、クロマチンを開放することができ及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素は、天然に存在するＤＮＡ要素である。他の実施形態において、クロマチンを開放することができ及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素は、人工的に合成される。さらに別の実施形態において、クロマチンを開放することができ及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素は、天然に存在するＤＮＡ要素と人工的に合成されたＤＮＡ要素の組み合わせである。
【００２８】
幾つかの実施形態において、核酸分子は、（ａ）翻訳を増強することができるヌクレオチド配列、（ｂ）分泌を増加させることができるヌクレオチド配列、及び（ｃ）組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列へ作用可能に連結された、ｍＲＮＡの安定性を増加させることができるヌクレオチド配列の１つ又はそれ以上をさらに含む。
【００２９】
さらなる実施形態において、本明細書に記載されている組換えタンパク質の高い力価を生産する方法は、選択工程を含まない。
【００３０】
組換えタンパク質の高い力価を生産するためのキットも、本発明に包含される。幾つかの実施形態において、本発明のキットは、使用説明書とともに、ａ）組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列をクローニングするのに適した多重クローニング部位へ作用可能に連結された、クロマチンを開放することができ及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素を含む核酸分子、並びにｂ）高効率形質移入（例えば、高効率の調節された電気穿孔）を実施するための試薬又は装置、を含む。
【００３１】
幾つかの実施形態において、キットは、約２５０から４００Ｖ／ｃｍの局所的な場の強度で、調節された電気穿孔を実施するのに適している。
【００３２】
幾つかの実施形態において、本発明のキットは、電流と電圧の間の比をモニターするための手段をさらに含む。
【００３３】
他の実施形態において、本発明のキットは、核酸分子の導入に適した複数の細胞を含む細胞株をさらに含む。幾つかの実施形態において、複数の細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
様々な実施形態において、本発明は、遺伝子増幅の必要なしに、組換えタンパク質の高い力価を生産する改善された方法を提供し、これにより、組換えタンパク質の生産に伴う時間及び資源をともに軽減する。
【００３５】
幾つかの実施形態において、本発明は、高効率形質移入を用いて、核酸分子（核酸分子は、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列へ作用可能に連結された、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができる１つ又はそれ以上のＤＮＡ要素を含む。）を適切な細胞中に導入することを使用する方法を提供する。
【００３６】
幾つかの実施形態において、本発明の方法は、選択工程を不要とする。
【００３７】
Ｉ．定義
本発明の開示をより容易に理解できるようにするために、まず、幾つかの用語を定義する。さらなる定義が、詳細な説明を通じて記載されている。
【００３８】
本明細書中で使用される「細胞」、「複数の細胞」、「宿主細胞」及び「複数の宿主細胞」という用語は動物細胞を包含し、無脊椎動物、非哺乳脊椎動物及び哺乳動物の細胞が含まれる。典型的な非哺乳脊椎動物細胞には、例えば、トリ細胞、爬虫類細胞及び両生類細胞が含まれる。典型的な無脊椎生物細胞には、例えば、毛虫（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））、蚊（アエデス・アエジプチ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ））細胞、ショウジョウバエ（ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））細胞、シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）細胞及びボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）細胞などの昆虫細胞が含まれるが、これらに限定されない。例えば、「Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７−５５（１９８８）」を参照されたい。細胞は、分化、部分的に分化又は未分化（例えば、胚性幹細胞及び造血性幹細胞を含む幹細胞）であり得る。さらに、臓器又は臓器系に由来する組織試料を本発明に従って使用し得る。
【００３９】
典型的な哺乳動物細胞には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ウサギ、げっ歯類（マウス、ハムスター、ラット及びモルモットを含む。）由来の細胞が含まれ、ＢＨＫ２１細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、Ｓｐ２／ｏ細胞並びにこれらのあらゆる派生物及び子孫が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
さらに、ハイブリドーマ細胞も、本発明の方法において使用することができる。「ハイブリドーマ」という用語は、免疫性起源の不死的細胞株と抗体産生細胞の融合によって産生されるハイブリッド細胞株を表す。この用語は、ヒト細胞及びマウス骨髄腫細胞株を融合させた後、形質細胞と融合させた結果として得られるヘテロハイブリッド骨髄腫融合物の子孫（一般に、トリオーマ細胞株として知られる。）を包含する。さらに、この用語は、例えば、クアドローマなどの、抗体を産生するあらゆる不死化されたハイブリッド細胞株を含むものとする。例えば、「Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５３７：３０５３（１９８３）」を参照されたい。ハイブリッド細胞株は、ヒト、ウサギ及びマウスを含むあらゆる種のものであり得る。
【００４１】
幾つかの実施形態において、本発明の方法において使用される細胞株は抗体産生細胞株である。抗体産生細胞株は、当業者に周知の技術を用いて選択及び培養され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）」（補遺を含めて、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
【００４２】
一般に、細胞培養中での組換えタンパク質発現に適したあらゆる細胞を、本発明の方法において使用することができる。
【００４３】
幾つかの実施形態において、本発明の方法において使用される細胞には、所望の組換えタンパク質（例えば、本発明の方法を用いて生産することが望まれる治療用タンパク質又は抗体）をコードする異種核酸分子が含まれ得る。特定の実施形態において、本発明の方法は、遺伝子増幅を必要とせずに、所望の組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質又は抗体）の高い力価を産生するのに有用である。
【００４４】
「細胞培養」という用語は、懸濁液、ローラー瓶、フラスコなどの中で増殖された細胞を表す。撹拌された発酵装置中の微小担体に付着されて増殖している付着性細胞を含む、バイオリアクターなどの大規模なアプローチも、この「細胞培養」という用語によって包含される。さらに、接触依存性細胞を培養することが可能であるのみならず、特許請求の範囲に記載されている本発明の方法では、懸濁培養技術も使用することが可能である。典型的な微小担体には、例えば、デキストラン、コラーゲン、プラスチック、ゼラチン及びセルロース並びにＢｕｔｌｅｒ，Ｓｐｉｅｒ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：２８３−３０３（１９８８）に記載されているようなその他のものが含まれる。例えば、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（Ｒ）又はＣｙｔｏｐｏｒｅ（Ｒ）などの多孔性担体及びＤＥＡＥ−デキストラン（Ｃｙｔｏｄｅｘ１（Ｒ））などのデキストランをベースとする担体、四級アミンによってコートされたデキストラン（Ｃｙｔｏｄｅｘ２（Ｒ））又はゼラチンによってコートされたデキストラン（Ｃｙｔｏｄｅｘ３（Ｒ））などのゼラチンをベースとする担体も使用され得る。タンパク質の大規模な及び小規模な生産のための細胞培養手法が、本発明によって包含される。微小担体とともに又は微小担体なしに、流動床バイオリアクター、中空繊維バイオリタクター、ローラー瓶培養又は撹拌タンクバイオリタクターシステムなどの（これらに限定されない。）手法を使用し、及び代わりに、バッチ、流加又は灌流様式で操作され得る。
【００４５】
「細胞培地」及び「培地」という用語は、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）を増殖させるために使用される栄養素溶液を表す。このような栄養素溶液は、細胞付着、増殖及び細胞環境の維持に必要な様々な因子を一般に含む。例えば、典型的な栄養素溶液には、基礎的培地製剤、細胞の種類に応じた様々な補充物、及び時には抗生物質が含まれ得る。幾つかの実施形態において、栄養素溶液は、以下のカテゴリーの１つ又はそれ以上から得られる少なくとも１つの成分を含み得る。１）一般にグルコースなどの炭水化物の形態のエネルギー源、２）全ての必須アミノ酸及び一般に、シスチンを加えた２０のアミノ酸の基本的な群、３）ビタミン及び／又は低濃度で必要とされる他の有機化合物、４）遊離の脂肪酸、並びに５）微量元素（微量元素は、通例極めて低濃度で（通常、μＭの範囲で）必要とされる無機化合物又は天然に存在する元素として定義される。）。栄養素溶液には、時折、以下のカテゴリーの何れかから得られる１つ又はそれ以上の成分が補充され得る。１）例えば、インシュリン、トランスフェリン及び上皮増殖因子などのホルモン及び他の増殖因子、２）例えば、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩などの塩及び緩衝液、３）例えば、アデノシン及びチミジン、ヒポキサンチンなどのヌクレオシド及び塩基、並びに４）タンパク質及び組織加水分解物。一般に、あらゆる適切な細胞培地を使用し得る。培地は、血清（例えば、ウシ胎児血清、ウシ血清など）から構成され得る。あるいは、培地は、無血清、無動物又は無タンパク質であり得る。
【００４６】
本明細書において互換的に使用される「作用可能に連結された」及び「操作可能に連結された」という用語は、２つ又はそれ以上のヌクレオチド配列又はＤＮＡ要素が、それらの所期の様式で機能できるように配置されていることを表す。幾つかの実施形態において、本発明の核酸分子は、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列へ作用可能に連結された、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができる１つ又はそれ以上のＤＮＡ要素を含む。さらに別の実施形態において、核酸分子は、（ａ）翻訳を増加することができるヌクレオチド配列、（ｂ）細胞外への組換えタンパク質の分泌を増加させることができるヌクレオチド配列、及び（ｃ）ｍＲＮＡの安定性を増加させることができるヌクレオチド配列（このようなヌクレオチド配列は、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列へ作用可能に連結されている。）から選択される１つ又はそれ以上のヌクレオチド配列をさらに含み得る。一般に、操作可能に連結されたヌクレオチド配列は（必要な場合には翻訳領域内において）連続しているが、常に連続しているわけではない。しかしながら、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができる作用可能に連結されたＤＮＡ要素は、一般に、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流に位置しているが、必ずしもこれらと連続しているわけではない。様々なヌクレオチド配列及び／又はＤＮＡ要素の作用可能な連結は、適切な制限部位での連結によって又は徐冷によって、例えばＰＣＲ法を用いて、本分野で周知の組換え法によって達成される。適切な制限部位が存在しなければ、旧来の手法に従って合成オリゴヌクレオチドリンカー又はアダプターを使用することができる。
【００４７】
本明細書において使用される「発現」という用語は、宿主細胞内でのヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を表す。宿主細胞中での所望の生成物の発現のレベルは、細胞中に存在する対応するｍＲＮＡの量又は選択された配列によってコードされる所望のポリペプチドの量に基づいて測定され得る。例えば、選択された配列から転写されたｍＲＮＡは、ノーザンブロットハイブリッド形成、リボヌクレアーゼＲＮＡ保護、細胞ＲＮＡへの原位置ハイブリッド形成によって、又はＰＣＲによって定量することができる。選択された配列によってコードされるタンパク質は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、タンパク質の生物活性のアッセイによって、又はタンパク質の免疫染色後のＦＡＣＳ分析を含む（但し、これらに限定されない。）様々な方法によって定量することができる。
【００４８】
幾つかの実施形態において、本発明の方法は、組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質又は抗体）の高い力価を達成することができる。
【００４９】
本明細書において使用される「力価」という用語は、本発明の方法を用いて生産された組換えタンパク質の量を表す。生産された組換えタンパク質の量は、本分野において周知の１つ又はそれ以上の技術及び本明細書に記載されている技術を用いて、ｍＲＮＡレベル又はポリペプチドレベルの何れかで測定され得る。「高い力価」という用語は、本発明の方法を用いて生産された組換えタンパク質の増加された量を表し、このような量は、本明細書に記載されているような、（ａ）クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素並びに（ｂ）高効率形質移入の一方又は両方を使用せずに得られた量より多い。幾つかの実施形態において、本発明の方法を用いて得られた組換えタンパク質の力価（すなわち、高い力価）は、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬ、約３００ｍｇ／ｍＬから約４００ｍｇ／ｍＬ、約４００ｍｇ／ｍＬから約５００ｍｇ／ｍＬ、約５００ｍｇ／ｍＬから約６００ｍｇ／ｍＬ、約６００ｍｇ／ｍＬから約７００ｍｇ／ｍＬ、約７００ｍｇ／ｍＬから約８００ｍｇ／ｍＬ及び約８００ｍｇ／ｍＬから約９００ｍｇ／ｍＬである。特定の実施形態において、組換えタンパク質は、約９００ｍｇ／ｍＬより高い力価で発現される。
【００５０】
「高効率形質移入」という用語は、細胞の少なくとも５０％若しくはそれ以上、少なくとも６０％若しくはそれ以上、少なくとも７０％若しくはそれ以上、少なくとも８０％若しくはそれ以上、少なくとも９０％若しくはそれ以上、少なくとも９５％若しくはそれ以上、又は少なくとも９９％若しくはそれ以上の中への、核酸分子の導入をもたらす、細胞（例えば、哺乳動物細胞）中へ核酸分子を伝達するあらゆる手段を表す。特定の実施形態において、形質移入されている細胞の少なくとも７０％中に核酸分子が伝達される。別の実施形態において、形質移入されている細胞の少なくとも８０％中に核酸分子が伝達される。典型的な形質移入法には、調節された電気穿孔及び磁気ナノ粒子を含むナノ粒子の使用が含まれる。
【００５１】
本明細書において使用される「電気穿孔」という用語は、生物細胞中へ化学種（例えば、核酸分子）を導入するために使用され、細胞膜を横切る電位へ細胞を曝露させることによって行われる技術を表す。電気穿孔は、細胞膜脂質二重層の破壊を伴い、拡散によって化学種が細胞内に入ることができるようにする一過性の又は永久的な孔の膜内への形成をもたらし得ると考えられる。調節された電気穿孔は、生物細胞中での電気穿孔の開始及び程度が生物細胞の又は生物細胞を含む伝導性媒体の電気的インピーダンス（本明細書において使用される場合、電圧に対する電流の比を意味する。）の変化と相関し得るという発見に基づいている。孔形成のために、細胞膜が透過性になると、生物細胞を横切る電流対電圧比の増加が起こる。同様に、流体が生物細胞をフロースルー電気セル中の電極間の領域中へ引き込むと、流動する伝導性流体を通じた電流／電圧比の減少が生じる。従って、生物細胞の又は細胞がその中に懸濁されている電解質溶液のインピーダンスをモニターすることによって、細胞膜中の孔形成が起こる時点及び孔形成による細胞膜透過性の相対的程度を検出することができる。次いで、ある細胞が実際に電気穿孔を経験したことを確立するために、又は電圧規模の選択を支配することによって電気穿孔プロセスを調節するために、この情報を使用することができる。調節された電気穿孔は、電気穿孔が実際に起こったことの直接的な指標及び細胞にわたって平均化された電気穿孔の程度の指標を与えるので、細胞の複数の同時電気穿孔において有用である。同様に、この方法は、同じ理由のために、生物組織（連続する膜を有する生物細胞の塊）の電気穿孔において有用である。「高効率の調節された電気穿孔」によって、調節された電気穿孔を用いて導入されている化学種（例えば、核酸分子）が、電気穿孔されている細胞の少なくとも７０％、又は細胞の少なくとも７５％又は細胞の少なくとも８０％又は細胞の少なくとも９０％又は細胞の少なくとも９５％又はそれ以上に入ることが意味される。高効率の調節された電気穿孔は、本分野で公知の方法及び本明細書に記載されている方法を用いて実施することができる。一態様において、高効率の調節された電気穿孔は、障壁を含む電気穿孔装置を用いて実施される。別の態様において、高効率の調節された電気穿孔は、１つ又はそれ以上の毛細管を含む電気穿孔装置を用いて実施される。電気穿孔の開始及び電気穿孔されている細胞のパーセントは、本分野で周知のアッセイを用いて、例えば、膜非透過性分子（例えば、ＳＹＴＯＸグリーンなど）の内部取り込みをアッセイすることによって測定することができる。
【００５２】
高効率形質移入を達成する他の典型的な方法には、ナノ粒子形質移入（Ｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ  （２００７），ｖｏｌ．１７７０，ｎｏ．５：７４７−７５２参照、及びＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨによって販売されている試薬）及び磁気ナノ粒子の使用が含まれる（例えば、ＯＺＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって販売されているＣｏｍｂｉＭａｇ）。このような方法は、単独で、又は本分野において公知の及び本明細書中に記載されているさらなる形質移入試薬又は装置と組み合わせ使用することができる。
【００５３】
本発明の方法によって作製される「組換えタンパク質」又は「組換えポリペプチド」という用語は、本発明の方法を用いて培養中の細胞によって生産される、典型的には約１０アミノ酸長を超えるペプチド又はタンパク質を一般に表す。本発明の方法によって生産されるポリペプチドは、典型的には、ポリペプチドを生産する細胞に対して外来性である、すなわち、異種又は異質である。本発明の方法を用いて培養中の細胞によって生産される典型的なポリペプチドには、治療用タンパク質並びに抗体及びその抗原結合断片が含まれる。融合タンパク質も、本発明によって包含される。
【００５４】
「イムノグロブリン」又は「抗体」（本明細書において互換的に使用される。）という用語は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる基本的な４ポリペプチド鎖構造（前記鎖は、例えば、鎖間ジスルフィド結合によって安定化されている。）を有し、抗原を特異的に結合する能力を有するタンパク質を表す。「一本鎖イムノグロブリン」又は「一本鎖抗体」（本明細書において互換的に使用される。）という用語は、１つの重鎖及び１つの軽鎖からなる２ポリペプチド鎖構造（前記鎖は、例えば、鎖間ジスルフィドペプチドリンカーによって安定化されている。）を有し、抗原を特異的に結合する能力を有するタンパク質を表す。「ドメイン」という用語は、例えば、β−プリーツシート及び／又は鎖内ジスルフィド結合によって安定化されたペプチドループを含む（例えば、３から４つのペプチドループを含む）重鎖又は軽鎖ポリペプチドの球状領域を表す。さらに、本明細書では、「定常」ドメインの場合における、様々なクラスの一員のドメイン内での配列変動性の相対的な欠如又は「可変」ドメインの場合における、様々なクラスの一員のドメイン内での著しい変動に基づいて、本明細書において、ドメインは、さらに、「定常」又は「可変」と称される。抗体又はポリペプチド「ドメイン」は、しばしば、本分野において互換的に抗体又はポリペプチド「領域」と称される。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域又は「ＣＬ」ドメインと互換的に称される。抗体重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域又は「ＣＨ」ドメインと互換的に称される。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域又は「ＶＬ」ドメインと互換的に称される。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＶＨ」領域又は「ＶＨ」ドメインと互換的に称される。免疫グロブリン又は抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであり得、単量体又は多量体形態で（例えば、五量体形態で存在するＩｇＭ抗体及び／又は単量体、二量体又は多量体形態で存在するＩｇＡ抗体）、存在し得る。「断片」という用語は、無傷の又は完全な抗体又は抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含む抗体又は抗体鎖の一部又は部分を表す。断片は、無傷の又は完全な抗体又は抗体鎖の化学的又は酵素的処理を介して得ることができる。断片は、組換え手段によって得ることもできる。典型的な断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ及び／又はＦｖ断片が含まれる。
【００５５】
「抗原結合断片」という用語は、抗原を結合する又は抗原結合（すなわち、特異的結合）に関して完全な状態の抗体と（すなわち、抗原結合断片が由来する完全な状態の抗体と）競合するイムノグロブリン又は抗体のポリペプチド部分を表す。結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、又は完全な状態のイムノグロブリンの酵素的若しくは化学的切断によって生産することができる。結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ、一本鎖及び一本鎖抗体が含まれる。
【００５６】
本明細書において互換的に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの何れかの、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態を表す。これらの用語には、一本鎖、二本鎖又は三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド又はプリン及びピリミジン塩基を含むポリマー又は他の天然の、化学的に、生化学的に修飾された、非天然の又は誘導化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。ポリヌクレオチドの骨格は、（ＲＮＡ又はＤＮＡ中に典型的に見出され得るように）糖及びホスファート基を含むことができ、又は修飾された若しくは置換された糖若しくはホスファート基を含むことができる。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成し、及び適切な条件下で鎖を徐冷することによって、又は適切なプライマーとともにＤＮＡポリメラーゼを用いて、相補鎖を新規に合成することによって、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から取得することができる。核酸分子は、多くの異なる形態、例えば、遺伝子又は遺伝子断片、１つ又はそれ以上のエキソン、１つ又はそれ以上のイントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐したポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離されたＤＮＡ、あらゆる配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーを採ることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチド類縁体などの修飾されたヌクレオチド、ウラシル、フルオロリボース及びチオアートなどの他の糖及び連結基並びにヌクレオチド分岐を含み得る。本明細書において使用される「ＤＮＡ」又は「ヌクレオチド配列」は、塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧを含むのみならず、これらの類縁体又はメチル化されたヌクレオチドなどのこれらの塩基の修飾された形態の全て、帯電していない連結及びチオアートなどのヌクレオチド間の修飾、糖類縁体の使用並びにポリアミドなどの修飾された及び／又は別の骨格構造も含む。特定の実施形態において、核酸分子は、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素へ作用可能に連結された組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質又は抗体など）をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５７】
「クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素」という用語は、クロマチンを転写因子へより接近できるようにし、操作可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を促進する能力を有する一切のＤＮＡ配列又は要素を表し、このようなＤＮＡ配列又は要素は、遺伝子座調節領域に由来しない。クロマチンを開放する又は開放状態のクロマチンとは、凝縮状態が解除されたクロマチンを表し、ユークロマチン（ｅｕｃｈｒｏｍａｔｉｎ）も表す。凝縮されたクロマチンは、ヘテロクロマチンとも称される。閉鎖された（凝縮された）状態のクロマチンは、転写的に不活性である。これに対して、開放された（凝縮状態が解除された）状態のクロマチンは、転写能力を有する。開放クロマチン構造の確立は、ＤＮアーゼＩ感受性、ＤＮＡメチル化の低下及びヒストンの過剰アセチル化によって特徴付けられる。開放したクロマチンを同定するための標準的な方法は、当業者に周知であり、「Ｗｕ，１９８９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７０，２６９−２８９；Ｃｒａｎｅ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｉ，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２，４８−５６；Ｒｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎ．Ａ．Ｒ，２６，２２５５−２２６４」に記載されている。
【００５８】
「遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）」は、真核宿主細胞の組織特異的な遺伝子座から得られる遺伝的要素であり、目的の遺伝子に連結されて、宿主細胞の染色体中に組み込まれたときに、組織特異的な、組み込み部位非依存性の、コピー数依存性の発現を目的の遺伝子に対して付与する遺伝的要素を表す。
【００５９】
再現可能な発現は、目的の遺伝子へ作用可能に連結された場合に、そのクロマチン環境に関わらず及び細胞の種類に関わらず、ＤＮＡ要素が、長期間にわたって、操作可能に連結された遺伝子の発現の実質的に同じレベルを与えることを意味する。幾つかの実施形態において、発現の実質的に同じレベルは、遺伝子コピー当りを基礎として、４８％未満又は４０％未満又は２５％未満の、平均値からの標準偏差を有する発現のレベルを意味する。あるいは、発現の実質的に同じレベルは、遺伝子コピー当りを基礎として、１０倍未満、５倍未満又は３倍未満、発現のレベルが変動することを意味する。幾つかの実施形態において、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素は、このような作用可能に連結されたＤＮＡ要素なしの発現と比べて、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも４倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍、又は少なくとも７０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも９０倍、又は少なくとも９５倍、又は少なくとも１００倍、又は少なくとも１５０倍、又は少なくとも２００倍又はそれ以上、作用可能に連結された遺伝子の発現を増加させる。幾つかの実施形態において、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素は、長期間にわたって、作用可能に連結された遺伝子の再現可能な発現を取得する。例えば、幾つかの実施形態において、作用可能に連結された遺伝子は、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素へ遺伝子が作用可能に連結されていない場合の発現レベルと比べて、少なくとも５日、１０日、又は少なくとも１５日、又は少なくとも２０日、又は少なくとも３０日、又は少なくとも４０日、又は少なくとも４５日、又は少なくとも６０日、又は少なくとも７０日、又は少なくとも８０日、少なくとも９０日又はそれ以上の期間にわたって、実質的に同じレベルで発現される。他の実施形態において、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素へ遺伝子が作用可能に連結されていない場合のレベルと比べて、作用可能に連結された遺伝子は、長期間にわたって、より高いレベルで発現される。クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができる典型的なＤＮＡ要素には、遍在的に発現された遺伝子のプロモーター領域に由来する伸長された無メチル化ＣｐＧアイランド（ＵＣＯＥ）、マトリックス及び／又は足場付着領域（ＭＡＲ）並びに安定化及びアンチレプレッサー領域（ＳＴＡＲ）が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、本分野において周知のアッセイ及び本明細書に記載されているアッセイを用いて、このようなＤＮＡ要素を容易に同定することができる。
【００６０】
幾つかの実施形態において、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素は、天然に存在するＤＮＡ要素である。天然に存在するＤＮＡ要素とは、このＤＮＡ要素が天然に存在すること、例えば、このＤＮＡ要素が遍在的に発現された遺伝子のプロモーター領域から単離され、その配列が天然に存在する配列から変化を受けていないことを意味する。
【００６１】
他の実施形態において、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素は、人工的に合成されたＤＮＡ要素である。人工的に合成されたとは、ＤＮＡ要素が天然に存在しないことを意味する（例えば、遍在的に発現された遺伝子のプロモーター領域から単離されたＤＮＡ要素が、遍在的に発現された別の遺伝子のプロモーター領域から単離された第二のＤＮＡ要素と組み合わされることにより、２つの要素は天然には本来一緒に存在しないので、人工の構築物がもたらされる。）。あるいは、ＤＮＡ要素の配列は、その天然に存在する配列から本分野において周知の様々な技術を用いて修飾され得、これにより、本来天然には存在しないＤＮＡ要素がもたらされる。
【００６２】
さらに別の実施形態において、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素は、天然に存在するＤＮＡ要素と人工的に合成されたＤＮＡ要素の組み合わせである。
【００６３】
「無メチル化ＣｐＧアイランド」という用語は、バルクＤＮＡ中の４０％という平均と比べて、約６０％の平均ＧＣ含量を有するＣｐＧアイランドを表す。当業者は、Ｃ及びＧ配列に対して特異的な制限酵素などの本分野において周知である標準的な技術を用いて、ＣｐＧアイランドを容易に同定することができる。ＣｐＧアイランドを同定するための典型的な方法は、例えば、参照により本明細書中に組み込まれる「Ｇａｒｄｉｎｅｒ−Ｇａｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，１９６：２６１−８２」中に見出すことが可能であり、ＣｐＧアイランドを分析及び同定するための当業者が容易に入手可能なＣｐＧｐｌｏｔ（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ｃｐｇｐｌｏｔ／）及びＧｒａｉｌｅｘｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｍｐｂｉｏ．ｏｒｎｌ．ｇｏｖ／ｇｒａｉｌｅｘｐ）などのコンピュータプログラムを使用することができる。
【００６４】
本明細書において使用される「伸長された無メチル化ＣｐＧアイランド」という用語は、少なくとも３００塩基対、又は少なくとも５００塩基対、又は少なくとも１０００塩基対、又は少なくとも１５００塩基対、又は少なくとも２０００塩基対、又は少なくとも２５００塩基対、又は少なくとも３０００塩基対の長さであり、及び遍在的に発現された遺伝子のプロモーター領域に由来する無メチル化ＣｐＧアイランドを表す。このようなアイランドは本分野において周知であり、米国特許第６，９６４，９５１号；米国特許第６，６８９，６０６号；米国特許第６，８８１，５５６号及び米国特許第６，９４９，３６１号；並びにＰＣＴ出願公開ＷＯ２００４／０６７７０１号（これらの各々の全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に詳しく記載されている。
【００６５】
幾つかの実施形態において、伸長された無メチル化ＣｐＧアイランドは、１つ又はそれ以上の転写因子結合部位を含む。他の実施形態において、伸長された無メチル化ＣｐＧアイランドは、プロモーター及び／又はエンハンサー配列を含む。さらに別の実施形態において、伸長された無メチル化ＣｐＧアイランドは、二重又は二方向性プロモーターを含む。本明細書において使用されているように、伸長された無メチル化ＣｐＧアイランドはプロモーターを含み得るが、このようなアイランドは、典型的にはアイランドに付随していない１つ又はそれ以上の異種プロモーター（例えば、ヒト又はモルモットＣＭＶプロモーター）と組み合わされて典型的に使用される。幾つかの実施形態において、異種プロモーターは、ＣｐＧアイランド内に見出される内在性プロモーターを置換する。
【００６６】
伸長された無メチル化ＣｐＧアイランドは、例えば、このようなアイランドの境界を特定することによって画定することができる。例えば、伸長された無メチル化ＣｐＧアイランドの境界は、認識配列においてＤＮＡを消化する（切断する）その能力が、存在する何れかのＣｐＧ残基のメチル化状態に対して感受性である制限エンドヌクレアーゼ酵素と組み合わせてＰＣＲを使用することを通じて確定することができる。１つのこのような酵素は、ＣｐＧアイランド内に一般に見出されるが、中央のＣＧ残基がメチル化されていない場合にのみ見出される部位ＣＣＧＧにおいて認識及び消化するＨｐａＩＩである。従って、ＨｐａＩＩによって消化されたＤＮＡを用いて、及びＨｐａＩＩ部位を有する領域にわたって実施されたＰＣＲは、ＤＮＡがメチル化されていなければ、ＨｐａＩＩ消化のために、増幅産物を与えない。ＰＣＲは、ＤＮＡがメチル化されていれば、増幅された産物を与えるのみである。従って、無メチル化領域を超えて、ＨｐａＩＩはＤＮＡを消化せず、ＰＣＲによって増幅された産物が観察され、これによって「伸長された無メチル化ＣｐＧアイランド」の境界を画定する。
【００６７】
典型的な伸長された無メチル化ＣｐＧアイランドには、ヒトＲＮＰＡ２遺伝子（配列番号２、３及び４）、ＲＰＳ３遺伝子（受付番号ＮＭ０１２０５２；配列番号１）、ＲＰＬ４遺伝子（受付番号ＮＴ ０３９４７４）、ＲＰＬ５遺伝子（ＮＴ ０３９３０８）、ＲＰＬ１０ａ遺伝子（受付番号ＮＴ ０３９６４９）、ＲＰＬ１３ａ遺伝子（受付番号ＮＴ ０３９４２０）、ＲＰＬ１９遺伝子（受付番号ＮＴ ０３９５２１）、ＲＰＬ２４遺伝子（受付番号ＮＴ ０９６９８７）、ＲＰＬ２７ａ遺伝子（受付番号ＮＴ ０３９４３３）、Ｔｅｒｆ２ｉｐ遺伝子（受付番号ＡＢ０４１５５７）、ヒトグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素遺伝子（受付番号Ｍ３２５９９）、チュブリンα１鎖遺伝子（受付番号Ｍ１３４４５）及びＲＰＳ１１遺伝子（受付番号ＡＫ０１１２０７）のプロモーター領域に由来するものが含まれるが、これらに限定されない。遍在的に発現された遺伝子又はハウスキーピング遺伝子のさらなる例は、例えば、「Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９，３６２−３６５（２００３）」（参照により本明細書に組み込まれる。）に見出すことができる。
【００６８】
本明細書において互換的に使用される「マトリックス付着領域」又は「足場付着領域」又は「足場／マトリックス付着領域」又は「ＭＡＲ」又は「Ｓ／ＭＡＲ」という用語は、単離された核足場又は核マトリックスに、インビトロにおいて高い親和性で結合することができるＤＮＡ要素を表す（例えば、Ｈａｒｔ  ａｎｄ  Ｌａｅｍｍｌｉ（１９８８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，８：５１９−５２５参照）。ＭＡＲＤＮＡ要素は、細胞培養中にて異種遺伝子の発現を増加させ得ることが報告されている（例えば、Ｋａｌｏｓ  ａｎｄ  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ（１９９５）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１５：１９８−２０７；Ｐｈｉ−Ｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０：２３０２−２３０７；Ｋｌｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１２６４−１２７０；ａｎｄ  Ｐｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄＲｅｓ．２２：４３８６−４３９４参照）。典型的なＭＡＲＤＮＡ要素は、例えば、米国特許第７，１２９，０６２号（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）中に見出すことができる。特定の実施形態において、本発明の方法において使用されるＭＡＲ要素は、米国特許第７，１２９，０６２号に記載されているようなニワトリのライソザイムＭＡＲ要素及びその機能的断片である。当業者は、本明細書に記載されているアッセイと組み合わされた本分野で周知のアッセイ（例えば、Ｍｅｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３２８１−３２８６及びＷｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ．（２００３）Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；２３（２４）：８９５３−８９５９に記載されているもの）に基づいてＭＡＲ要素を容易に同定することができる。別の実施形態において、本発明の方法において使用されるＭＡＲＤＮＡ要素は、ヒトβ−グロビンＭＡＲ要素である。本発明の方法において使用され得る典型的なＭＡＲＤＮＡ要素が、配列番号１１から１４に記載されている。
【００６９】
「安定化及びアンチレプレッサー領域」又は「ＳＴＡＲ」という用語は、ヘテロクロマチンによって媒介される導入遺伝子発現を遮断する能力を有するＤＮＡ要素を表す。ＳＴＡＲＤＮＡ要素は、ＤＮＡ要素の特性を調節する遺伝子転写をアッセイするための公知の技術、例えば、ＷＯ０３／００４７０４号、ＷＯ２００４／０５６９８６号及びＥＰ０１２０２５８１．３号（参照により、これらの全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されているものを用いて容易に同定することが可能である。本発明の方法において使用され得るＳＴＡＲ配列の非限定的な例には、米国特許公開２００６０１４１５７７号中の配列番号１から６６に記載されている配列が含まれる。
【００７０】
「翻訳を増加させることができるヌクレオチド配列」という用語は、ｍＲＮＡからのポリペプチドの合成を増加させることができるヌクレオチド配列を表す。ポリペプチドの合成の増加は、生産されるポリペプチドの総量の増加又はポリペプチドの合成の速度の増加の何れかであり得る。一実施形態において、翻訳を増加することができるヌクレオチド配列は、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列へ作用可能に連結される。翻訳を増加することができヌクレオチド配列の能力は、翻訳を増加させることができるヌクレオチド配列の存在下で産生される組換えタンパク質の量の増加をアッセイすることによって、又は組換えタンパク質の経時的な合成速度によって測定することができる。
【００７１】
「分泌を増加させることができるヌクレオチド配列」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列へ作用可能に連結された場合に、細胞外へのタンパク質の分泌を促進する能力を有するヌクレオチド配列を表す。典型的には、このようなヌクレオチド配列は、適切な固有の又は異種のシグナルペプチド（リーダー配列）を含む。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、その中で組換えタンパク質が産生されるべき宿主細胞の種類に依存し、異種のシグナルペプチドが固有のシグナル配列を置き換えることができる。本発明の方法において使用され得る典型的な配列には、例えば、ガウシア・ピリンセプス（Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ）から得られるルシフェラーゼ遺伝子に由来するシグナルペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＡＹ０１５９９３）が含まれる。分泌を増加させることができるヌクレオチド配列（シグナルペプチド配列とも称される。）は、例えば、ＳｉｇｎａｌＰＳｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ）などの、本分野において周知のソフトウェアプログラムを用いて同定することができる。
【００７２】
本明細書において使用される「ｍＲＮＡの安定性を増加させることができるヌクレオチド配列」という用語は、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列へ作用可能に連結された場合に、組換えタンパク質へ翻訳されるｍＲＮＡの半減期を増加させるヌクレオチド配列を表す。典型的には、このようなヌクレオチド配列は、遺伝子の３’又は５’非翻訳領域（又はＵＴＲ）に由来する。
【００７３】
ＩＩ．典型的な細胞
理論に拘泥することを望むものではないが、組換えタンパク質を産生することができるあらゆる細胞株が本発明の方法において使用され得ることが想定される。特定の実施形態において、本発明の方法において使用される細胞は、組換えポリペプチド（例えば、治療用タンパク質又は抗体）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子で形質移入されている。特定の実施形態において、本発明の方法において使用される細胞は、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞の例には、例えば、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養における成長に関してサブクローニングされた２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ＮＳＯマウス骨髄腫細胞（ＥＣＡＣＣ；ＳＩＧＭＡ）及びヒト肝細胞癌株（ＨｅｐＧ２）が含まれるが、これらに限定されない。有用な細胞株のさらなる例には、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１２１）、ＭＣＦ−７乳癌細胞（ＡＴＣＣＢＴＨ２２）、Ｋ−５６２白血病細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ２４３）、ＫＢ癌細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１７）、２７８０ＡＤ卵巣癌細胞（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｌｉｃｋ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：５９２７−５９３２（１９８８）参照）、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ８６）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ１５２）、Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１４３２）、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ２４０）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ２１３）、ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１５５）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５９３）、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ９６０７）、ＷＩ−３８ＶＡ１３サブライン２Ｒ４細胞（ＡＴＣＣＣＬＬ７５．１）及びＭＯＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８２）並びにヒト細胞と別の種の細胞の融合によって産生されたヘテロハイブリドーマが含まれるが、これらに限定されない。これらの及び他の細胞及び細胞株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）から市販されている。多��の他の細胞株が本分野において公知であり、当業者に周知である。従って、このような細胞株は、本発明の方法において等しく良好に使用され得る。特定の実施形態において、本発明の方法において使用される細胞は、ＣＨＯ細胞又はＮＳＯ細胞である。
【００７４】
ハイブリドーマ及び抗体産生細胞も、本発明の方法において使用され得る。
【００７５】
ＩＩＩ．典型的なヌクレオチド配列及びベクター
幾つかの実施形態において、目的の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は、本明細書に記載されているように、高効率形質移入を用いて宿主細胞中に導入され、ヌクレオチド配列は、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素へ作用可能に連結されている。例えば、目的の所望される組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸分子は、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に保つことができるＤＮＡ要素へ作用可能に連結された組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む適切な発現ベクター中にクローニングされる。
【００７６】
本発明に従って、あらゆる適切なベクターを使用し得る。ヌクレオチド配列は、例えば、レトロウイルス（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．ＭｉｃｒｏＢｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１）又はアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．ＭｉｃｒｏＢｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７；Ｆｌｏｔｔｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｅｒ，１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：３５７）を用いて、宿主細胞ゲノム中へ安定的に組み込むことができる。あるいは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＥＢＶ（Ｙａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１２）、ヒトパポバウイルスＢＫ（Ｄｅ  Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｒｈｏａｄｓ，１９９１，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９：１９２５；Ｃｏｏｐｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｒｏｎ，１９９３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：５５７；及びＢＰＶ−１（Ｐｉｉｒｓｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：１）から得られるものなどのウイルスの複製起点を含む自己複製エピソーム性ベクター内に取り込まれ得る。
【００７７】
目的のタンパク質を発現させるために細胞及び／又は細胞株を遺伝的に操作するためのベクター及び方法は当業者に周知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８，ａｎｄ  ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  ｕｐｄａｔｅｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）及びＫａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９９０，ｐｐ．１５−６９）中に、様々な技術が例示されている。
【００７８】
さらなる制御配列も、本明細書中に記載されている発現ベクターに含まれ得る。これらは、哺乳動物、微生物、ウイルス及び／又は昆虫の遺伝子に由来し得る。制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター及びエンハンサー、リボソーム結合部位（例えば、Ｋｏｚａｋ（１９９１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−７０参照）、転写及び翻訳の終結を調節することができる配列及びポリアデニル化シグナル（例えば、ＭｃＬａｕｃｈｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：５３２３−３３参照）が含まれる。
【００７９】
幾つかの一般的に使用されているプロモーター及びエンハンサー配列は、ウイルスゲノム、例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サルウイルス４０（ＳＶ４０）及びヒトサイトメガロウイルスに由来する。例えば、前初期遺伝子１のヒトＣＭＶプロモーター／エンハンサーが使用され得る（例えば、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ａｐｐｌｉｅｄ  ＭｉｃｒｏＢｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１−９８参照）。真核生物宿主細胞中でポリペプチドを発現するための他の遺伝要素を提供するために、ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス及びポリアデニル化部位を使用することができる。ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ウイルスゲノムから断片として容易に取得されるので、特に有用であり、これらはウイルスの複製起点も場合によって含有し得る（Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８），Ｎａｔｕｒｅ２７３：１１３；Ｋａｕｆｍａｎ（１９９０），Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４８７−５１１）。より小さな又はより大きなＳＶ４０断片も使用することができる。幾つかの実施形態において、本発明の方法において使用される発現ベクターには、ヒト又はモルモットＣＭＶプロモーターが含まれる。
【００８０】
幾つかの実施形態において、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、（ａ）翻訳を増加することができるヌクレオチド配列、（ｂ）分泌を増加することができるヌクレオチド配列、及び（ｃ）ｍＲＮＡの安定性を増加させることができるヌクレオチド配列から選択される１つ又はそれ以上のヌクレオチド配列へ作用可能に連結されている。
【００８１】
哺乳動物の発現ベクターから得られる異種遺伝子の発現を改善することが示されているさらなる調節配列には、ＣＨＯ細胞に由来する発現増強配列要素（ＥＡＳＥ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ．５２９−５３４（１９９７）；米国特許第６，３１２，９５１Ｂ１号；米国特許第６，０２７，９１５号；米国特許第６，３０９，８４１Ｂ１号）及びトリパータイトリーダー（ＴＰＬ；ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ）及びアデノウイルス２から得られるＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３４７５−１３４９１）及びｍＲＮＡを効率的に翻訳させることができる配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列などの要素が含まれる。
【００８２】
組換え細胞の同定を促進するために選択可能なマーカーをコードする遺伝子がしばしば使用される。例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＴＲ）選択スキーム又は細胞毒性薬に対する耐性などの方法を用いて、形質転換体の選択を実施することができる（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５：４８７−５１１参照）。ＤＨＦＲ選択のための適切な細胞株は、例えば、ＤＨＦＲを欠損するＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１（例えば、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ（１９８０），Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６−４２２０参照）であり得る。選択可能なマーカーの他の例には、Ｇ４１８及びハイグロマイシンＢなどの抗生物質に対する耐性を付与するものが含まれる。
【００８３】
本発明のある実施形態において、特定のクローンを選択することに代えて、組換えタンパク質を発現する細胞のプールを使用することができるので、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素と高効率形質移入の組み合わせを使用するために、選択可能なマーカーをコードする遺伝子は必要でない。
【００８４】
幾つかの実施形態において、本発明の方法によってタンパク質を生産するために使用される外来核酸は、ｃＤＮＡライブラリー又はゲノムライブラリーから単離される。例えば、目的のタンパク質をコードする核酸を単離するために、目的のタンパク質をコードする遺伝子又はｃＤＮＡクローンを同定するために設計されたプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし得る。ｃＤＮＡ発現ライブラリーに関して、適切なプローブには、目的のタンパク質を認識し、これに特異的に結合するモノクローナル若しくはポリクローナル抗体、同一若しくは別異の種から得られるタンパク質の公知の部分若しくは疑われる部分をコードする約２０から８０塩基長のオリゴヌクレオチド及び／又は同一若しくは類似の遺伝子に対する相補的な又は相同なｃＤＮＡ若しくはその断片が含まれる。ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための適切なプローブには、同一若しくは類似の遺伝子をコードするオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ若しくはその断片及び／又は相同なゲノムＤＮＡ若しくはその断片が含まれるが、これらに限定されない。選択されたプローブでのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）の１０から１２章に記載されている標準的な手順を用いて実施され得る。
【００８５】
本明細書に記載されている様々な実施形態において、本明細書に記載されている特定の配列並びにこのような配列の相同体及び断片は、所望の活性を有する限り、本発明の方法において使用することができる。例えば、幾つかの実施形態において、本発明によって包含される特定の配列と少なくとも７０％同一、又は少なくとも８０％同一、又は少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％又はそれ以上同一である配列が、本発明の方法において有用である。
【００８６】
ＩＶ．典型的な組換えタンパク質
本発明の方法は、あらゆる所望の組換えタンパク質又はその断片を生産するために使用することができる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている方法を用いて生産される組換えタンパク質は、治療用タンパク質である。他の実施形態において、組換えタンパク質は抗体又はその機能的断片である。本発明の方法を用いて生産され得る抗体には、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、一重特異的、多重特異的、完全ヒト、ヒト化、一本鎖、キメラ、ハイブリッド、変異された及びＣＤＲ移植された抗体並びに例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖなどのこれらの抗原結合断片が含まれる。抗体は、適切なエピトープを含むあらゆる望ましい抗原に対して特異的であり得る。望ましい抗原には、例えば、哺乳動物細胞中に見出される又は哺乳動物細胞と関連するマーカー、腫瘍と関連するマーカー又は疾病若しくは症状と関連するマーカーが含まれ得る。腫瘍マーカーの例には、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ｇｐ７２ＬＣＧ（肺癌と関連して発現されている遺伝子産物である。）、ＨＥＲ−２、腫瘍関連糖タンパク質及び腫瘍抗原ＭＵＣ１が含まれる。癌に対する他のマーカーには、ｈＴＥＲＴ（Ｆｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３８１３）、Ｋｉ−６７（Ｋｒｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．，２６：１５０１）、サイクリンＥ（Ｙａｓｍｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３，ＥｘｐｅｒｔＲｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．３（５）：６１７）及びヒストンＨ３（Ｒａｋｏｗｉｃｚ−Ｓｚｕｌｃｚｙｎｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．１９９６，ＣａｎｃｅｒＢｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１１：７７）が含まれる。
【００８７】
幾つかの実施形態において、本発明の方法は、抗体又はその抗原結合断片の高い力価を生成するために使用される。抗体は、増殖因子又はホルモン受容体などの細胞表面タンパク質に対して特異的であり得る。
【００８８】
本発明の範囲に属する抗体には、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（Ｒ））（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２８５−４２８９（１９９２）、米国特許第５，７２５，８５６号）を含む抗ＨＥＲ２抗体；米国特許第５，７３６，１３７（ＲＩＴＵＸＡＮ（Ｒ））中のキメラ抗ＣＤ２０「Ｃ２Ｂ８」、米国特許第５，７２１，１０８Ｂ１号中の２Ｈ７抗体のキメラ若しくはヒト化変形物、又はＴｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ（ＢＥＸＸＡＲ（Ｒ））などの抗ＣＤ２０抗体、抗ＩＬ−８（Ｓｔ  Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｓｔ，１０３：９３２（１９９３）及び国際公開ＷＯ９５／２３８６５号）；ヒト化された抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ＡＶＡＳＴＩＮ（Ｒ）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，７：５３−６４（１９９２），国際公開ＷＯ９６／３００４６号及びＷＯ９８／４５３３１号、１９９８年１０月１５日公開）などのヒト化された及び／又は親和性成熟された抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体；抗ＰＳＣＡ抗体（ＷＯ０１／４０３０９号）；Ｓ２Ｃ６及びそのヒト化された変形物（ＷＯ００／７５３４８号）を含む抗ＣＤ４０抗体；抗ＣＤ１１ａ（米国特許第５，６２２，７００号、ＷＯ９８／２３７６１号、Ｓｔｅｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｌ．４：３−７（１９９１）及びＨｏｕｒｍａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５８：３７７−３８０（１９９４））；抗ＩｇＥ（Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−２６３２（１９９３）及び国際公開ＷＯ９５／１９１８１号）；抗ＣＤ１８（１９９７年４月２２日に発行された米国特許第５，６２２，７００号又は１９９７年７月３１日に公開されたＷＯ９７／２６９１２）；抗ＩｇＥ（Ｅ２５、Ｅ２６及びＥ２７を含む；１９９８年２月３日に発行された米国特許第５，７１４，３３８号又は１９９２年２月２５日に発行された米国特許第５，０９１，３１３号、１９９３年３月４日に公開されたＷＯ９３／０４１７３号又は１９９８年６月３０日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１３４１０号、米国特許第５，７１４，３３８号）；抗Ａｐｏ−２受容体抗体（１９９８年１１月１９日に公開されたＷＯ９８／５１７９３号）；ｃＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（Ｒ））、ＣＤＰ５７１及びＭＡＫ−１９５を含む抗ＴＮＦ−α抗体（１９９７年９月３０日に発行された米国特許第５，６７２，３４７号、Ｌｏｒｅｎｚ  ｅｆ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６（４）：１６４６−１６５３（１９９６）及びＤｈａｉｎａｕｔ  ｅｆ  ａｌ．Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．２３（９）：１４６１−１４６９（１９９５））；抗組織因子（ＴＦ）（１９９４年１１月９日に付与された欧州特許第０４２０９３７Ｂ１号）；抗ヒトα４β７インテグリン（１９９８年２月１９日に公開されたＷＯ９８／０６２４８号）；抗ＥＧＦＲ（１９９６年１２月１９日に公開されたＷＯ９６／４０２１０号中のキメラ化又はヒト化された２２５抗体）；ＯＫＴ３（１９８５年５月７日に発行された米国特許第４，５１５，８９３号）などの抗ＣＤ３抗体；ＣＨＩ−６２１（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（Ｒ））及び（ＺＥＮＡＰＡＸ（Ｒ））などの抗ＣＤ２５又は抗ｔａｃ抗体（１９９７年１２月２日に発行された米国特許第５，６９３，７６２号参照）；ｃＭ−７４１２抗体などの抗ＣＤ４抗体（Ｃｈｏｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ３９（１）：５２−５６（１９９６））；ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈなどの抗ＣＤ５２抗体（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３３７（１９８８））；Ｇｒａｚｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６−５００２（１９９５）におけるようなＦｃγＲ１に対して誘導されたＭ２２抗体などの抗Ｆｃ受容体抗体；ｈＭＮ−１４などの抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）抗体（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３Ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ−５９４５ｓ（１９９５）；ｈｕＢｒＥ−３、ｈｕ−Ｍｃ３及びＣＨＬ６（Ｃｅｒｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３）：５８５２ｓ−５８５６ｓ（１９９５）；及びＲｉｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３Ｓｕｐｐ）：５９１６ｓ−５９２０ｓ（１９９５））などの乳房上皮細胞に対して誘導された抗体；Ｃ２４２（Ｌｉｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１）：１−９（１９９６））などの大腸癌細胞に結合する抗体；抗ＣＤ３８抗体、例えば、ＡＴ１３／５（Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（２）：９２５−９３７（１９９５））；ＨｕＭ１９５（Ｊｕｒｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ５５（２３Ｓｕｐｐｌ）：５９０８ｓ−５９１０ｓ（１９９５）及びＣＭＡ−６７６又はＣＤＰ７７１などの抗ＣＤ３３抗体；ＬＬ２又はＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（Ｊｕｗｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ５５（２３Ｓｕｐｐｌ）：５８９９ｓ−５９０７ｓ（１９９５））などの抗ＣＤ２２抗体；１７−１Ａ（ＰＡＮＯＲＥＸ（Ｒ））などの抗ＥｐＣＡＭ抗体；アブシキシマブ又はｃ７Ｅ３Ｆａｂ（ＲＥＯＰＲＯ（Ｒ））などの抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体；ＭＥＤＩ−４９３（ＳＹＮＡＧＩＳ（Ｒ））などの抗ＲＳＶ抗体；ＰＲＯＴＯＶＩＲ（Ｒ）などの抗ＣＭＶ抗体；ＰＲＯ５４２などの抗ＨＩＶ抗体；抗ＨｅｐＢ抗体ＯＳＴＡＶＩＲ（Ｒ）などの抗肝炎抗体：抗ＣＡ１２５抗体ＯｖａＲｅｘ；抗イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；抗αｖβ３抗体ＶＩＴＡＸＩＮ（Ｒ）；ｃｈ−Ｇ２５０などの抗ヒト腎細胞癌抗体；ＩＮＧ−１；抗ヒト１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体（Ａ３３）；ＧＤ３ガングリオシドに対して誘導された抗ヒト悪性黒色腫抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮細胞癌（ＳＦ−２５）；並びにＳｍａｒｔＩＤ１０及び抗ＨＬＡＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１）などの抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書における抗体に対する好ましい標的抗原は、ＨＥＲ２受容体、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ及びＣＤ４０である。
【００８９】
組換えタンパク質は、受容体（例えば、膜結合又は細胞質）又は構造タンパク質（例えば、細胞骨格タンパク質）などの細胞タンパク質であり得る。組換えタンパク質は、細胞によって分泌される細胞因子又は１つ若しくはそれ以上のシグナル伝達経路において内部で使用される細胞因子であり得る。非限定的な例には、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、肝細胞増殖因子、オステオプロテジェリンリガンド、インターフェロンγ、Ｂリンパ球刺激物質Ｃ５補体ＴＡＧ−７２、インテグリンα４β７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリンアドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２及びＣＴＬＡ４（細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原である。）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
組換えタンパク質は、ウイルス、細菌又は真菌などの感染性因子にも由来し得る。例えば、タンパク質は、ウイルス外被に由来し得、又はウイルスの酵素若しくは転写因子であり得る。タンパク質は、細菌の膜若しくは細胞壁に由来し得、又は細菌のサイトゾルに由来し得る。タンパク質は、酵母の酵素、転写因子又は構造タンパク質であり得る。酵母タンパク質は、膜結合、細胞質又は分泌型であり得る。感染性因子の例には、呼吸器多角体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）及びストレプトコッカス・オーレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
本発明の方法は、上記タンパク質の何れかの全部又は一部を含む組換え融合タンパク質を作製するためにも使用することができる。例えば、本発明の方法を用いて、上記タンパク質の１つに加えて、ロイシンジッパー、コイルドコイル、抗体のＦｃ部分又は実質的に類似のタンパク質などの多量体化ドメインを含む組換え融合タンパク質が生産され得る。例えば、国際出願ＷＯ９４／１０３０８号；Ｌｏｖｅｊｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１２８８−１２９３；Ｈａｒｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１４０１−０５；Ｈａｒｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ３７１：８０−８３；Ｈａｎｇ．ｋａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ７：２５５−６４を参照されたい。
【００９２】
本明細書に記載されている方法によって作製された１つ又はそれ以上の組換えタンパク質を含む医薬組成物も本発明によって包含される。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、医薬として許容される担体をさらに含む。本明細書において使用される「医薬として許容される担体」という用語は、対象中への投与に適した、１つ又はそれ以上の適合的な固体又は液体充填剤、希釈剤又は封入物質を意味する。
【００９３】
Ｖ．高効率形質移入法
本発明の方法は、高効率形質移入法を使用し、遺伝子増幅の必要なしに、組換えタンパク質（例えば、治療用タンパク質及び抗体）の高い力価を生産するのに有用である。
【００９４】
特定の態様において、電流が実質的に生物細胞を迂回しないようにしながら、生物細胞を通過する流路を通じて電流を誘導し、従って、イオン流を誘導する障壁を含む電気穿孔装置を用いて、宿主細胞中に様々な核酸分子を導入するために、高効率の調節された電気穿孔が使用される。調節された電気穿孔を実施するための典型的な装置及び方法は、例えば、米国特許第６，３００，１０８号；同第６，５６２，６０４号；同第６，３８７，６７１号；同第６，４０３，３４８号；同第６，４８２，６１９号；同第７，０５３，０６３号（これらの各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）中に見出すことができる。
【００９５】
本発明の一態様において、調節された電気穿孔は、実質的に電流に対して非透過性である障壁によって隔てられた２つの液体保持チャンバーを含有する装置の使用を含む。障壁は、開口部中に一旦格納された生物細胞が開口部を閉塞又は閉鎖するように、生物細胞より小さな開口部を含有する。電気穿孔を達成するために、例えば、生物細胞に対する損傷なしに、生物細胞をその後に除去できるような可逆的様式で、機械的又は化学的手段によって、開口部上に生物細胞が固定される。一旦、生物細胞が開口部上に固定されたら、２つのチャンバー間に及び開口部中に存在する生物細胞を横切って電圧がかけられる。このため、チャンバー間の電流の通過は、開口部を通過する経路に、従って、生物細胞を通過する経路に限定される。電気セル中の電流電圧の関係をモニターすることによって、何れも電気穿孔が確実に起こるようにするために及び過剰な孔形成及び細胞死を防ぐために、電気穿孔の開始が検出され、孔形成の程度が調節される。従って、生物細胞膜の状態及び生物細胞膜を横切る流束の極めて正確な知識及び調節が使用者に与えられる。従って、装置は、２つの電極を含み得る。それぞれの各電極の極性は、交互に入れ替わり得、従って、標的核酸が少なくとも２つの異なる点から細胞膜を通じて浸透することが可能となる。例えば、この点は、細胞の平面中において、約１８０°離れ得る。
【００９６】
電気穿孔装置は、単一の生物細胞又は複数の生物細胞を保持するための内部支持体及び装置中の電流を、生物細胞を通過する流路に制限する内部障壁を含み得る。電気穿孔装置は、緩衝液を保持するのに適した１つ又はそれ以上のチャンバーを含み得る。複数のチャンバーが存在する場合には、各チャンバーは、同じ緩衝液又は異なる緩衝液を保持し得る。電圧がかけられないときには、電圧によって誘導される孔形成を伴わない拡散輸送のためにのみ、構造が使用され得る。障壁及び２つのチャンバーを含む実施形態における２つのチャンバーの立体配置は、電気穿孔セルにとって重要ではなく、その目的をなお果たしながら幅広く変動し得る。しかしながら生物細胞のサイズは微視的なので、装置は、電子チップの製造において使用されるような微細加工技術によって加工された電子チップのサイズであり得る。連続流、断続流又は使用者の指示による流れで液体を通過させるために、並びに濃度、圧力及び生物細胞膜を横切る種の通過に対する綿密な調節を実現するのに必要とされる他の条件を変化させるために、チャンバーは、フロースルーチャンバーとして構築され得る。装置は、層又はプレートレットが互いに結合されたときに、流れの通過を形成する適切な開口部を有する層又はプレートレットを含み得る。
【００９７】
フロースルーチャンバーは、細胞の多数を連続して処理することができるように、各細胞の連続的な進入及び除去を可能とするという利点を与える。フロースルーチャンバーは、所望される場合に、濃度勾配が継続的に維持されることができるように、溶質が枯渇した溶液の補充も可能とする。フロースルーチャンバーによって果たされ得るさらなる機能は、以下に記載されているような様々な目的のために有用な機能である圧力の増加及び減少である。
【００９８】
この構造中での生物細胞に対する支持体は、生物細胞を固定された位置に固定し、電流の通過を可能とするあらゆる構造であり得る。最も便利な支持体は、障壁中の開口部である。開口部の上に生物細胞を固定することは、開口部を閉鎖し、密封し又は閉塞する役割を果たし、これにより、細胞を通じた電流の通過、拡散輸送又は両者を誘導し、細胞周囲の漏出を除去し又は最小限に抑える。これを達成する機械的手段は、開口部に対して細胞を押し付ける方向に、開口部を横切って圧力の差を課すことである。開口部の直径は細胞の直径より小さいものであり得、装置に入ると、細胞は、２つのチャンバーの１つの中を通過する。細胞がその中に存在するチャンバー中の圧力を増加させることによって又は他のチャンバー中の圧力を低下させることによって、開口部に対して細胞に力をかけ、開口部を閉鎖する。この手順が完了すると、２つのチャンバー中の圧力を等しくすることによって又は細胞がその中に導入されたチャンバー以外のチャンバー内の圧力がより高くなるように差を逆転させることによって、細胞は開口部から容易に放出される。細胞がその中に導入されたチャンバー中の液体の流れは、次いで、開口部から細胞を除去し、開口部を別の細胞に対して露出させる。
【００９９】
開口部を細胞で密封する別の方法は、細胞膜に結合する物質の、障壁表面上に又は開口部の縁上にコーティングを使用することによる。生物の細胞膜は負に帯電しているので、コーティングは、ポリリジン、ポリアルギニン又はポリヒスチジンなどの正電荷を有する物質であり得る。生物細胞は、開口部を横切る圧力差によって、開口部へ誘導され、コーティングによって所定の位置に固定され得る。この手順が完了したら、開口部の細胞側のチャンバー中における液体の流速を一瞬増加させることによって、又は細胞が開口部から離れるのを促進するために、開口部を横切る逆の圧力差をかけることによって、細胞をコーティングから放出させることができる。
【０１００】
別の態様において、調節された電気穿孔は、例えば、「Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ，（２００６）７８：５１５８−５１６４」に記載されているような電気穿孔装置を用いて実施される。
【０１０１】
一態様において、高効率の調節された電気穿孔は、１つ又はそれ以上の毛細管を含む装置を用いて実施される。調節された電気穿孔の方法は、１）第一の末端と第二の末端を含む管腔を有する少なくとも１つの細長い毛細管を含む電気穿孔装置中に１つ又はそれ以上の細胞を配置する工程（前記第一の末端と第二の末端は貯蔵槽中へ開放しており、１つ又はそれ以上の細胞が少なくとも１つの毛細管の管腔を通じて、貯蔵槽中へ流れ込むことができる。）、２）組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列へ作用可能に連結された、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができる１つ又はそれ以上のＤＮＡ要素を含む核酸分子と１つ又はそれ以上の細胞を接触させる工程、３）電流が１つ又はそれ以上の細胞を通過するように、１つ又はそれ以上の細胞を電流と接触させる工程、４）電気穿孔装置中の電流と電圧間の比をモニターする工程、及び５）１つ又はそれ以上の細胞の電気穿孔を達成するのに適した場の強度へ、局所的な場の強度の大きさを調整する工程を含む。
【０１０２】
幾つかの実施形態において、毛細管の管腔の直径は、管腔中の細胞の直径の約２０％以下である。幾つかの実施形態において、毛細管の管腔の直径は、複数の細胞の直径（例えば、管腔中の細胞群の周囲長）の約２０％以下である。
【０１０３】
本明細書に記載されている様々な調節された電気穿孔法において、特定の細胞種の電気穿孔を達成するのに適した最適な局所的な場の強度は、本分野において公知の方法を用いて、例えば、細胞が変動する場の強度に曝されたときに、細胞の直径の変化（例えば、増加）を経時的にアッセイすることによって、容易に測定することができる。幾つかの実施形態において、本発明の方法において使用される局所的な場の強度は、約１５０から５００Ｖ／ｃｍである。他の実施形態において、本発明の方法において使用される局所的な場の強度は、約２５０から４００Ｖ／ｃｍである。特定の実施形態において、本発明の方法において使用される局所的な場の強度は、（例えば、ＣＨＯ細胞の場合）約４００Ｖ／ｃｍである。
【０１０４】
本発明の他の実施形態において、形質移入は、沈殿剤としてのリン酸カルシウム又は陽イオン性脂質など（例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などの化学的試薬を用いて実施され得る。
【０１０５】
理論に拘泥することを望むものではないが、細胞の少なくとも５０％若しくはそれ以上又は少なくとも６０％若しくはそれ以上又は少なくとも７０％若しくはそれ以上又は少なくとも８０％若しくはそれ以上又は少なくとも９０％若しくはそれ以上又は少なくとも９５％若しくはそれ以上又は少なくとも９９％若しくはそれ以上が形質移入を達成できる限り、あらゆる適切な形質移入法を本発明において使用できることが想定される。本発明の方法において使用され得るさらなる典型的な方法には、例えば、磁気性ナノ粒子（例えば、ＯＺＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって販売されているキット参照）及びナノ粒子形質移入（例えば、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨによって販売されているキット参照の使用が含まれる。特定の実施形態において、細胞の少なくとも７０％の形質移入を達成することができるあらゆる方法が、本発明の方法において使用される。別の実施形態において、細胞の少なくとも８０％の形質移入を達成することができるあらゆる方法が、本発明の方法において使用される。
【０１０６】
ＶＩ．細胞培地
電気穿孔後、タンパク質発現及び培地中への分泌を促進するために、細胞は適切な培地中で増殖される。細胞増殖及びタンパク質産生に適したあらゆる適切な培地又は添加培地（ｆｅｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）が、本発明の方法において使用され得る。宿主細胞及び目的のポリペプチドとの適合性に関して、適切な培養又は添加培地が選択される。適切な培養又は添加培地は、本分野において周知であり、ＨａｍのＦ１０（ＳＩＧＭＡ）、基礎培地（ＳＩＧＭＡ）、ＲＰＭＩ−１６４０（ＳＩＧＭＡ）及びダルベッコ変法イーグル培地（ＳＩＧＭＡ）などの市販の培地が含まれ（ただし、これらに限定されない。）、動物細胞を培養するのに適している。
【０１０７】
さらに、Ｈａｍ及びＷａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓａｔｏ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；米国特許第４，６５７，８６６号；米国特許第４，９２７，７６２号；又は米国特許第４，５６０，６５５号；ＷＯ９０／０３４３０号；ＷＯ８７／００１９５号；米国特許再審査３０，９８５号又は米国特許第５，１２２，４６９号（これらの全ての開示内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている培地の全てが、宿主細胞に対する培養又は添加培地として使用され得る。これらの培地の何れもが、培養されている細胞の具体的な必要性を充足するために、さらなる成分が補充され得る。
【０１０８】
ＶＩＩ．細胞培養法
特定の細胞種及び所望される特定の生産計画に対して適切であり得るあらゆるスキーム又は定型操作を用いて、目的の組換えタンパク質を生産し得る。従って、本発明の方法では、単一工程又は複数工程の培養手法を使用し得ることが想定される。例えば、単一工程培養では、培養環境中に細胞が接種され、細胞培養の単一の産生相の間に、全ての栄養素又は補充物のその後の添加が使用される。あるいは、複数段階培養が使用され得る。複数段階培養では、多数の工程又は相において、細胞が培養され得る。例えば、保存から取り出された可能性がある細胞が、増殖及び高い生存性を促進するのに適した培地中に接種される第一の工程又は増殖相培養において細胞が増殖され得る。宿主細胞培養への新鮮な溶媒の添加によって、適切な期間にわたって、細胞は増殖相中に維持され得る。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の増殖段階及び産生段階を含む複数段階培養中で細胞が増殖される。本発明の方法の幾つかの実施形態において、増殖段階は、約５Ｌの培養容積から約２００Ｌの培養容積を含むのに対して、産生相は約１５０００Ｌの培養容積を含む。
【０１０９】
細胞培養プロセスの期間にわたって、最適なタンパク質産生（例えば、高い力価）を得るために、及びバッチの変動を低減するために、例えば、浸透圧、温度及びｐＨなどの様々な細胞培養条件が調節され得る。このような条件は、細胞培養プロセスの増殖相若しくは生産相又は両相において調節され得る。
【０１１０】
さらに、細胞を培養するあらゆる適切な様式（例えば、流加又は連続）が本発明の方法において使用され得ることが想定される。本発明の方法の幾つかの実施形態において、細胞培養の増殖相における哺乳動物細胞の増殖を増強させるために、流加又は連続的細胞培養条件が使用される。本発明の方法の他の実施形態において、バルク細胞培養方法が細胞増殖のために考案される。流加又は連続的細胞培養条件の間、最大増殖に適した条件下及び期間にわたって、増殖相細胞が増殖される。特定の細胞種に対して最適な培養条件（温度、ｐＨ、浸透圧、溶解された酸素（ＤＯ２）など）が当業者に自明であり、又は当業者によって容易に決定され得る。
【０１１１】
ＶＩＩＩ．キット
組換えタンパク質の高い力価を生産するためのキットも、本発明に包含される。幾つかの実施形態において、本発明のキットは、使用説明書とともに、ａ）組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列をクローニングするのに適した多重クローニング部位へ作用可能に連結された、クロマチンを開放することができる及び／又はクロマチンを開放状態に維持することができるＤＮＡ要素を含む核酸分子、並びにｂ）高効率形質移入を行うための装置又は試薬を含む。
【０１１２】
幾つかの実施形態において、本発明のキットは、調節された電気穿孔を実施するための装置を含む。幾つかの実施形態において、本発明のキットは、電流と電圧の間の比をモニターするための手段をさらに含む。幾つかの実施形態において、調節された電気穿孔は、約４００Ｖ／ｃｍの局所的な場の強度で実施される。
【０１１３】
幾つかの実施形態において、本発明のキットは、核酸分子の導入に適した細胞株を含む（例えば、複数の細胞を含む）。幾つかの実施形態において、細胞株は、複数の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を含む。
【０１１４】
さらなる実施形態において、本発明のキットは、核酸分子の形質移入に適した１つ又はそれ以上のナノ粒子を含む。
【０１１５】
幾つかの実施形態において、本明細書で取り上げられているキットは、形質移入装置又は試薬を使用することに関する詳細を含む指示書及び／又は販売促進資料を含む。
【０１１６】
本明細書は、参照により本明細書に組み込まれる本明細書中に引用されている参考文献の教示に照らして最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明における実施形態の例示を与えるものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。当業者は、他の多くの実施形態が本発明によって包含されることを容易に認識する。全ての公報及び発明の全体が、参照により組み込まれる。参照によって組み込まれた資料が本明細書と矛盾し、又は合致しない程度まで、本明細書は、このような全ての資料に優先する。本明細書中への全ての参考文献の引用は、このような参考文献が本発明に対する従来技術であることを認めるものではない。
【０１１７】
別段の記載がなければ、特許請求の範囲を含む本明細書中で使用されている成分の量、細胞培養、処理条件などを表す全ての数字は、全ての事例で、「約」という用語によって修飾されているものと理解しなければならない。従って、別段の記載がなければ、数的パラメータは近似であり、本発明によって得ることが求められる所望の特性に応じて変動し得る。別段の記載がなければ、要素の系列に先行する「少なくとも」という用語は、当該系列中の全ての要素を参照するものと理解しなければならない。当業者は、定型的な実験操作のみを用いて、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認知し、又は突き止めることができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【０１１８】
当業者に自明であるように、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の多くの改変及び変形を施すことができる。本明細書に記載されている具体的な実施形態は、例示のためのみに提供されており、いかなる意味においても限定を意図するものではない。明細書及び実施例は例示に過ぎないものと考えられ、本発明の真の範囲及び精神は以下の特許請求の範囲によって示されるものとする。
【配列表】
2010515435000001.app
【国際調査報告】
2010515435.tif 000002
2010515435.tif 000003
2010515435.tif 000004