(57)【要約】  荷電分子を、その荷電固定相への異なる静電結合に基づいて分離するシステムおよび方法は、同時の独立または依存的なｐＨ勾配および添加剤勾配の生成を制御するステップを含む。【選択図】  図５Ａ【特許請求の範囲】
【請求項１】
荷電分子を、その荷電固定相への異なる静電結合に基づいて分離するためのシステムであって、
酸性および塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝溶液の送達を制御し、それによって緩衝液組成物中に勾配を生成するためのコンピューターと；
少なくとも１つは主に陰イオン性または陽イオン性である、１つまたは複数の固定相と；
酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液を含有する第１のリザーバーと；
塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液を含有する第２のリザーバーと；
ポンプＡと；
ポンプＡを前記第１のリザーバーおよび前記１つまたは複数の固定相に接続するための第１の流体接続手段であって、前記酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液を、前記第１のリザーバーから引き出し、前記１つまたは複数の固定相の入口上に送り込むことができる前記第１の流体接続手段と；
ポンプＢと；
ポンプＢを前記第１のリザーバーおよび前記固定相に接続するための第２の流体接続手段であって、前記塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液を、前記第２のリザーバーから引き出し、前記１つまたは複数の固定相の入口上に送り込むことができる前記第２の流体接続手段と；
前記１つまたは複数の固定相の出口に取り付けられた１つまたは複数の検出器と；
前記１つまたは複数の固定相からの溶出剤を、次の固定相に、もしくは次の固定相から離れて、または溶出剤試料を収集するための分画収集システムに、シャントすることを可能にするためのバルブシステムＶと；
前記溶出剤が第１の固定相を出た後で、第２の固定相に場合により入る前の位置から溶出する際に、所定サイズの溶出剤試料を収集するための分画収集器と；
第１の固定相を出る１つまたは複数の選択された試料を、第２の固定相上に選択的に注入するための注入システムと；
前記１つまたは複数の選択された試料の注入を制御するためのソフトウェアシステムと；
前記溶出剤が第２の固定相を出た後の位置から溶出する際に、所定サイズの溶出剤試料を収集するための分画収集システムと；
荷電分子を、その荷電固定相への異なる静電結合に基づいて分離するための本システムにおけるｐＨ勾配の生成を制御するためのソフトウェアシステムであって、
ａ）線形または非線形のｐＨ勾配構造の、メモリー中での特定化および記憶を可能にするためのＧＵＩであって、前記ｐＨ勾配構造により、送り込まれる溶出剤のカラム体積または時間の関数としてｐＨが特定される前記ＧＵＩと；
ｂ）前記溶出剤の流れにおける％酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液（Ａ％）と前記ｐＨとの関係を特定する、Ａ％＝ａ×ｐＨ９＋ｂ×ｐＨ８＋ｃ×ｐＨ７＋ｄ×ｐＨ６＋ｅ×ｐＨ５＋ｆ×ｐＨ４＋ｇ×ｐＨ３＋ｈ×ｐＨ２＋ｉ×ｐＨ＋ｊ（ａからｊはフィッティング定数である）などの式と；
ｃ）ポンプＡに、システムの作動中にわたって、そのポンプによって制御される全流体ポンプ流量の比率、（酸性緩衝液を送り込む速度／（酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液を送り込む速度＋塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液を送り込む速度））が（請求項１ｂの前記勾配構造および前記式によって必要とされるｐＨから計算される値によって決定されるＡ％）×．０１であるような速度で送り込むように指示し、ポンプＢに、１−（Ａ％×．０１）に等しい全流体ポンプ流量の比率である速度で送り込むように指示する伝達プロトコルと；
ｄ）Ｖに、最初の固定相を出る溶出剤を、ＵＶ吸収、蛍光、ｐＨ、屈折率、およびシグナルピークカウントからなる一連の判定基準からの、使用者による判定基準セットに基づいて、前記第２の固定相に、または前記第２の固定相から離れてシャントするように指示する第２の伝達プロトコルと；
を含む前記ソフトウェアシステムと
を含む前記システム。
【請求項２】
荷電分子を、その少なくとも１つの固定相への異なる結合に基づいて分離するためのシステムであって、
緩衝溶液の送達を制御するためのコンピューターと；
少なくとも１つの固定相と；
２ｎ個のリザーバー、Ｒ１、Ｒ２、．．．．．．．Ｒ２ｎ−１、Ｒ２ｎ（ｎ≧２）、ｐＨにおいてアイソクラチックな、最も酸性のｐｌＳｅｐ緩衝液を含有するリザーバーＲ１、Ｒ２、．．．．．．．Ｒ２ｎ−１−１、Ｒ２ｎ−１、すべてのリザーバーがｐＨにおいてアイソクラチックである、最も塩基性のｐｌＳｅｐ緩衝液を含有するリザーバーＲ２ｎ−１＋１、Ｒ２ｎ−１＋２、．．．．．．．Ｒ２ｎ−１、Ｒ２ｎと；
ｎ−１個の添加剤が、前記２ｎ個のリザーバーの中で分配されていることと；
リザーバーＲ１、Ｒ２は、Ｒ１が最小濃度の添加剤１を含有し、Ｒ２が最大濃度の添加剤１を含有するようになっており、リザーバーＲ３、Ｒ４は、Ｒ３が最小濃度の添加剤１を含有し、Ｒ４が最大濃度の添加剤１を含有するようになっているなど、このパターンが、Ｒ２ｎ−１が最小濃度の添加剤１を含有し、Ｒ２ｎが最大濃度の添加剤１を含有するようなリザーバーＲ２ｎ−１、Ｒ２ｎまでペアで続くことと；
ｎ＞２である場合、Ｒ１、Ｒ２が最小濃度の添加剤２を含有し、Ｒ３、Ｒ４が最大濃度の添加剤２を含有するようなリザーバーＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４であり、Ｒ５、Ｒ６が最小濃度の添加剤２を含有し、Ｒ７、Ｒ８が最大濃度の添加剤２を含有するようなリザーバーＲ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８であるなど、Ｒ２ｎ−３、Ｒ２ｎ−２が最小濃度の添加剤２を含有し、Ｒ２ｎ−１、Ｒ２ｎが最大濃度の添加剤２を含有するようなＲ２ｎ−３、Ｒ２ｎ−２、Ｒ２ｎ−１、Ｒ２ｎまで、ペアのペアでこのパターンを続けることと；
一般に、ｍ番目の添加剤について、リザーバーＲ１、Ｒ２、．．．．．Ｒ２ｍ−１−１、Ｒ２ｍ−１は、最小濃度の添加剤ｍを含有し、Ｒ２ｍ−１＋１、Ｒ２ｍ−１＋２、．．．．．Ｒ２ｍ−１、Ｒ２ｍは、最大濃度の添加剤ｍを含有し、Ｒ２ｍ＋１、Ｒ２ｍ＋２、．．．．．Ｒ３×２ｍ−１−１、Ｒ３×２ｍ−１は、最小濃度の添加剤ｍを含有し、これは、Ｒ２ｎ−２ｍ＋１、Ｒ２ｎ−２ｍ＋２、．．．．．Ｒ２ｎ−２ｍ−１−１、Ｒ２ｎ−２ｍ−１が、最小濃度の添加剤ｍを含有し、Ｒ２ｎ−２ｍ−１＋１、Ｒ２ｎ−２ｍ−１＋２、．．．．．Ｒ２ｎ−１、Ｒ２ｎが、最大濃度の添加剤ｍを含有するまで続くことと；
それぞれリザーバーＲ１〜Ｒｎから、それぞれｒ１〜ｒｎの速度で流体を引き出すためのポンプＡ１〜Ａｎと；
任意の少なくとも１つの固定相からの溶出剤を、次の固定相に、もしくは次の固定相から離れて、または分画収集システムに、もしくは分画収集システムから離れて、シャントすることを可能にするためのバルブシステムＶと；
Ａ１、Ａ２、．．Ａｎ−１、Ａｎによって送り込まれた流体を混合し、前記混合された流体を前記固定相中に伝導する、流体伝導システムＦと；
任意の１つまたは複数の組の固定相後の溶出剤の流れの中に位置した、ＵＶ吸収、可視吸収、赤外吸収、蛍光、ｐＨおよび屈折率を測定する検出器からなる群から選択される、１つまたは複数の検出器と；
前記溶出剤が第１の固定相を出た後で、第２の固定相に入る前の位置から溶出する際に、所定サイズの溶出剤試料を収集するための分画収集システムと；第１の固定相を出る１つまたは複数の選択された試料を、第２の固定相上に選択的に注入するための注入システムと；
前記１つまたは複数の選択された試料の注入を制御するためのソフトウェアシステムと；
前記溶出剤が第２の固定相を出た後の位置から溶出する際に、所定サイズの溶出剤試料を収集するための分画収集システムと；
分子を、その１つまたは複数の固定相への異なる結合に基づいて分離するための本システムにおける、同時の独立または依存的ｐＨおよび添加剤勾配の生成を制御するためのソフトウェアシステムであって、
ａ．線形または非線形のｐＨ勾配構造の、メモリー中での特定化および記憶を可能にするため、ならびに線形または非線形のｍ個の添加剤溶質勾配構造、ＥＧＳｍ（ｍ＝ｎ−１）のメモリー中での特定化および記憶を可能にするためのＧＵＩであって、前記ｐＨ勾配構造により、送り込まれる溶出剤のカラム体積または時間の関数としてｐＨが特定され、ＥＧＳｍにより、送り込まれる溶出剤のカラム体積または時間の関数としてｍ番目の添加剤溶質の濃度、Ｅｍが特定され、その結果、ｐＨにおける前記勾配が同時で、前記ｎ−１個の添加剤勾配から独立しており、互いに同時に独立でもある前記ＧＵＩと；
ｂ．ｎ−１個の添加剤の存在下での前記溶出剤の流れにおける％酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液（Ａ％）と前記ｐＨとの関係を特定する、（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、．．．．Ｅｎ−２、Ｅｎ−１、ｐＨ）の関数である式と；
ｃ．任意の所与の時間またはカラム体積でのｍ番目の添加剤（１≦ｍ≦ｎ−１）について、前記固定相に送達される溶出剤中の添加剤の濃度は、ＥＧＳｍによって決定され、すべてのリザーバーについて、それぞれのリザーバー中のｍ番目の添加剤の濃度は、前記システムにとって最大であるか、前記システムにとって最小であるかのいずれかであり、したがって、Ｘｍｉｎ（Ｅｍ）＝（Ｅｍａｘ−Ｅｍ）／（Ｅｍａｘ−Ｅｍｉｎ）は、Ｅｍｉｎを含有するリザーバーから送り込まれる割合であり、一方、Ｘｍａｘ（Ｅｍ）＝（Ｅｍ−Ｅｍｉｎ）／（Ｅｍａｘ−Ｅｍｉｎ）は、Ｅｍａｘを含有するリザーバーから送り込まれる割合であり、したがって、ｋ番目のリザーバー（１≦ｋ≦２ｎ）から送り込まれる全ポンプ流量の割合は、前記ｋ番目のリザーバーが、酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液を含有するリザーバーの群からのものである場合、［Ｘｍｉｎ  ｏｒ  ｍａｘ（Ｅｎ−１）×Ｘｍｉｎ  ｏｒ  ｍａｘ（Ｅｎ−２）×．．．．．．×Ｘｍｉｎ  ｏｒ  ｍａｘ（Ｅｌ）×Ｘｍｉｎ  ｏｒ  ｍａｘ（Ｅ０）］×．０１×Ａ％×ｒｔｏｔａｌであるか、または前記ｋ番目のリザーバーが、塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液を含有するリザーバーの群からのものである場合、［Ｘｍｉｎ  ｏｒ  ｍａｘ（Ｅｎ−１）×Ｘｍｉｎ  ｏｒ  ｍａｘ（Ｅｎ−２）×．．．．．．×Ｘｍｉｎ  ｏｒ  ｍａｘ（Ｅｌ）×Ｘｍｉｎ  ｏｒ  ｍａｘ（Ｅ０）］×．０１×（１００−Ａ％）×ｒｔｏｔａｌであることと；
ｄ．伝達プロトコルＰｋ（１≦ｋ≦２ｎ）であって、そのそれぞれは、そのそれぞれのポンプＡｋに、上記（ｃ）によって計算される速度ｒｋで送り込むことを指示する前記伝達プロトコルＰｋと；
ｅ．前記２ｎ個のリザーバーのすべてから送り込まれる溶出剤の流れを効率的に混合することによって、単一の溶出剤の流れを生成する伝達プロトコルＰｍｉｘと；
ｆ．Ｖに、最初の固定相を出る溶出剤を、第１の固定相からの流出時間、第１の固定相からの流出カラム体積、ＵＶ吸収、蛍光、ｐＨ、屈折率、およびシグナルピークカウントからなる一連の判定基準からの、使用者による１つまたは複数の判定基準セットに基づいて、分画収集器もしくは前記第２の固定相に、または分画収集器もしくは前記第２の固定相から離れてシャントするように指示する伝達プロトコルＰｖと
を含む前記ソフトウェアシステムと
を含む前記システム。
【請求項３】
荷電分子を、その少なくとも１つの固定相への異なる結合に基づいて分離するためのシステムであって、
緩衝溶液の送達を制御するためのコンピューターと；
少なくとも１つの固定相と；
２ｎ個のリザーバーＲ１、Ｒ２、．．．．．．．Ｒ２ｎ−１、Ｒ２ｎ（ｎ≧２）と；
前記２ｎ個のリザーバーに分配されたｎ個の添加剤と；
リザーバーＲ１、Ｒ２は、Ｒ１が最小濃度の添加剤１を含有し、Ｒ２が最大濃度の添加剤１を含有するようになっており、リザーバーＲ３、Ｒ４は、Ｒ３が最小濃度の添加剤１を含有し、Ｒ４が最大濃度の添加剤１を含有するようになっているなど、このパターンが、Ｒ２ｎ−１が最小濃度の添加剤１を含有し、Ｒ２ｎが最大濃度の添加剤１を含有するようなリザーバーＲ２ｎ−１、Ｒ２ｎまでペアで続くことと；
ｎ＞２である場合、Ｒ１、Ｒ２が最小濃度の添加剤２を含有し、Ｒ３、Ｒ４が最大濃度の添加剤２を含有するようなリザーバーＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４であり、Ｒ５、Ｒ６が最小濃度の添加剤２を含有し、Ｒ７、Ｒ８が最大濃度の添加剤２を含有するようなリザーバーＲ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８であるなど、Ｒ２ｎ−３、Ｒ２ｎ−２が最小濃度の添加剤２を含有し、Ｒ２ｎ−１、Ｒ２ｎが最大濃度の添加剤２を含有するようなＲ２ｎ−３、Ｒ２ｎ−２、Ｒ２ｎ−１、Ｒ２ｎまで、ペアのペアでこのパターンを続けることと；
一般に、ｍ番目の添加剤について、リザーバーＲ１、Ｒ２、．．．．．Ｒ２ｍ−１−１、Ｒ２ｍ−１は、最小濃度の添加剤ｍを含有し、Ｒ２ｍ−１＋１、Ｒ２ｍ−１＋２、．．．．．Ｒ２ｍ−１、Ｒ２ｍは、最大濃度の添加剤ｍを含有し、Ｒ２ｍ＋１、Ｒ２ｍ＋２、．．．．．Ｒ３×２ｍ−１−１、Ｒ３×２ｍ−１は、最小濃度の添加剤ｍを含有し、これは、Ｒ２ｎ−２ｍ＋１、Ｒ２ｎ−２ｍ＋２、．．．．．Ｒ２ｎ−２ｍ−１−１、Ｒ２ｎ−２ｍ−１が、最小濃度の添加剤ｍを含有し、Ｒ２ｎ−２ｍ−１＋１、Ｒ２ｎ−２ｍ−１＋２、．．．．．Ｒ２ｎ−１、Ｒ２ｎが、最大濃度の添加剤ｍを含有するまで続くことと；
それぞれリザーバーＲ１〜Ｒｎから、それぞれｒ１〜ｒｎの速度で流体を引き出すためのポンプＡ１〜Ａｎと；
任意の少なくとも１つの固定相からの溶出剤を、次の固定相に、もしくは次の固定相から離れて、または分画収集システムに、もしくは分画収集システムから離れて、シャントすることを可能にするためのバルブシステムＶと；
Ａ１、Ａ２、．．Ａｎ−１、Ａｎによって送り込まれた流体を混合し、前記混合された流体を前記固定相中に伝導する、流体伝導システムＦと；
任意の１つまたは複数の組の固定相後の溶出剤の流れの中に位置した、ＵＶ吸収、可視吸収、赤外吸収、蛍光、ｐＨおよび屈折率を測定する検出器からなる群から選択される、１つまたは複数の検出器と；
前記溶出剤が第１の固定相を出た後で、第２の固定相に入る前の位置から溶出する際に、所定サイズの溶出剤試料を収集するための分画収集システムと；第１の固定相を出る１つまたは複数の選択された試料を、第２の固定相上に選択的に注入するための注入システムと；
前記１つまたは複数の選択された試料の注入を制御するためのソフトウェアシステムと；
場合によって含まれていてもよい、前記溶出剤が第２の固定相を出た後の位置から溶出する際に、所定サイズの溶出剤試料を収集するための分画収集システムと；
分子を、その１つまたは複数の固定相への異なる結合に基づいて分離するための本システムにおける、同時の独立または依存的添加剤勾配の生成を制御するためのソフトウェアシステムであって、
ａ．線形または非線形のｐＨ勾配構造の、メモリー中での特定化および記憶を可能にするため、ならびに線形または非線形のｍ個の添加剤溶質勾配構造、ＥＧＳｍ（ｍ＝ｎ）のメモリー中での特定化および記憶を可能にするためのＧＵＩであって、各ＥＧＳｍにより、送り込まれる溶出剤のカラム体積または時間の関数としてｍ番目の添加剤溶質の濃度、Ｅｍが特定され、その結果、前記ｎ個の添加剤のそれぞれにおける前記勾配のそれぞれは、同時で、他のｎ−１個の添加剤勾配から独立しており、互いに同時に独立でもある前記ＧＵＩと；
ｂ．任意の所与の時間またはカラム体積でのｍ番目の添加剤（１≦ｍ≦ｎ）について、前記固定相に送達される溶出剤中の添加剤の濃度は、ＥＧＳｍによって決定され、すべてのリザーバーについて、それぞれのリザーバー中のｍ番目の添加剤の濃度は、前記システムにとって最大であるか、前記システムにとって最小であるかのいずれかであり、したがって、Ｘｍｉｎ（Ｅｍ）＝（Ｅｍａｘ−Ｅｍ）／（Ｅｍａｘ−Ｅｍｉｎ）は、Ｅｍｉｎを含有するリザーバーから送り込まれる割合であり、一方、Ｘｍａｘ（Ｅｍ）＝（Ｅｍ−Ｅｍｉｎ）／（Ｅｍａｘ−Ｅｍｉｎ）は、Ｅｍａｘを含有するリザーバーから送り込まれる割合であり、したがって、ｋ番目のリザーバー（１≦ｋ≦２ｎ）から送り込まれる全ポンプ流量の割合は、［Ｘｍｉｎ  ｏｒ  ｍａｘ（Ｅｎ−１）×Ｘｍｉｎ  ｏｒ  ｍａｘ（Ｅｎ−２）×．．．．．．×Ｘｍｉｎ  ｏｒ  ｍａｘ（Ｅｌ）×Ｘｍｉｎ  ｏｒ  ｍａｘ（Ｅ０）］×ｒｔｏｔａｌ（式中、ｒｔｏｔａｌはΣｒｎである）であることと；
ｃ．伝達プロトコルＰｋ（１≦ｋ≦２ｎ）であって、そのそれぞれは、そのそれぞれのポンプＡｋに、上記（ｂ）によって計算される速度ｒｋで送り込むことを指示する前記伝達プロトコルＰｋと；
ｄ．前記２ｎ個のリザーバーのすべてから送り込まれる溶出剤の流れを効率的に混合することによって、単一の溶出剤の流れを生成する伝達プロトコルＰｍｉｘと；
ｅ．Ｖに、最初の固定相を出る溶出剤を、第１の固定相からの流出時間、第１の固定相からの流出カラム体積、ＵＶ吸収、蛍光、ｐＨ、屈折率、およびシグナルピークカウントからなる一連の判定基準からの、使用者による１つまたは複数の判定基準セットに基づいて、分画収集器もしくは前記第２の固定相に、または分画収集器もしくは前記第２の固定相から離れてシャントするように指示する伝達プロトコルＰｖと
を含む前記ソフトウェアシステムと
を含む前記システム。
【請求項４】
前記添加剤溶質が、非イオン性洗浄剤、イオン性洗浄剤、極性有機分子、無極性有機分子、酸、塩基、中性塩、酸性塩および塩基性塩からなる化合物の群からの化合物である、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前記添加剤溶質が、非イオン性洗浄剤、イオン性洗浄剤、極性有機分子、無極性有機分子、酸、塩基、中性塩、酸性塩および塩基性塩からなる化合物の群からの化合物である、請求項３に記載のシステム。
【請求項６】
ｎ−１個の添加剤の存在下での前記溶出剤の流れにおける％酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液（Ａ％）と前記ｐＨとの関係を特定する、（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、．．．．Ｅｎ−２、Ｅｎ−１、ｐＨ）の前記関数が、Ａ％＝ａｐ×Ｅ１Ｐ＋ａｐ−１×Ｅ１ｐ−１＋．．．．＋×Ｅ１＋ａ０（ｐは０を超える整数であり、ａｐからａ０は、それぞれ（Ｅ２、Ｅ３、．．．．Ｅｎ−２、Ｅｎ−１、ｐＨ）の別個の関数である）の形式であり；
ａ．ａｐ、ａｐ−１、．．．．ａ１、ａ０のそれぞれは、ｂｑ（ｗ）×Ｅ２ｑ（ｗ）＋ｂｑ（ｗ）−１×Ｅ２ｑ（ｗ）−１＋．．．．＋ｂ１×Ｅ２＋ｂ０（式中、各ｑ（ｗ）は、０からｐまでのすべての整数ｗについて、０を超える別個の整数であり、ｂｑ（ｗ）からｂ０は、それぞれ（Ｅ３、Ｅ４、．．．．Ｅｎ−２、Ｅｎ−１、ｐＨ）の別個の関数である）の形式であり、
ｂ．このパターンを繰り返し、前記ｍ番目の添加剤の各べき乗の各係数は、（Ｅｍ＋１、Ｅｍ＋２、．．．．Ｅｎ−２、Ｅｎ−１、ｐＨ）の別個の関数であり、そのそれぞれは、（ｍ＋２）番目から（ｎ−１）番目の添加剤の濃度とｐＨの関数である係数を有する、（ｍ＋１）番目の添加剤の濃度における多項式の形式であり、
ｃ．（ｎ−１）番目の添加剤の濃度における多項式の係数は、純粋にｋｚ，ｊ×ｐＨｊ＋ｋｚ，ｊ−１×ｐＨｊ−１＋．．．．．＋ｋｚ，１×ｐＨ＋ｋｚ，０の形式のｐＨの関数であり、すべてのｋｚ，ｎはフィッティング定数であり、ここで各ｚは、前記（ｎ−１）番目の添加剤の濃度における多項式の係数の組のうちの１つを表し、そのような係数のそれぞれについて、１つおよび唯一のｚが存在する、
請求項２に記載のシステム。
【請求項７】
プロセッサーにプロセスを実施させるための指令を表しているコードを記憶している、プロセッサー可読媒体であって、前記コードは、
荷電分子の分離に関連するシステムにおける、緩衝溶液の送達を制御し、
前記荷電分子を、その１つまたは複数の固定相への異なる結合に基づいて分離するように構成された同時添加剤勾配の生成を制御し、
第１の固定相を出る溶出剤試料の第２の固定相上への注入を制御する
ためのコードを含む媒体。
【請求項８】
プロセッサーに異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離することに関連するプロセスを実施させるための指令を表しているコードを記憶している、プロセッサー可読媒体であって、前記コードは、
少なくとも１つの緩衝成分およびＩＣを有する溶媒でかん流された陰イオン性または陽イオン性イオン交換吸着剤に、前記イオン交換吸着剤が前記荷電分子の電荷と反対の電荷を有する所定初期ｐＨで、分離される前記荷電分子を適用し、結合させ、
（ｉ）リザーバーＲＡから送り出される、前記少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の酸性ｐＨの溶液を、（ｉｉ）リザーバーＲＢから送り出される、前記少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定のアルカリ性ｐＨの溶液と、連続的に混合することから形成される、初期ｐＨから開始する可変ｐＨを有する溶出剤を、前記イオン交換吸着剤に供給し（前記ＲＡおよびＲＢリザーバーからの前記溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配を維持する）、
所定最終ｐＨに到達するまで、それぞれが、その有効等電点で前記イオン交換吸着剤から連続的に溶出する、前記荷電分子を収集する
ためのコードを含む前記媒体。
【請求項９】
プロセッサーに異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離することに関連するプロセスを実施させるための指令を表しているコードを記憶している、プロセッサー可読媒体であって、前記コードは、
少なくとも１つの緩衝成分およびＩＣを含む溶出剤でかん流された、前記荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、陽イオン性または陰イオン性イオン交換吸着剤を含有する第１カラムに、所定初期ｐＨおよびＩＣの所定初期濃度で、分離される前記荷電分子を適用し、結合させ、
陽イオン性または陰イオン性イオン交換吸着剤を含有する前記第１カラムの後に、前記第１のものと反対の電荷の陽イオン性または陰イオン性イオン交換吸着剤を含有する第２カラムを連続して接続し、前記第１および第２カラム中に含有される前記吸着剤を、前記初期ｐＨで平衡化し、
前記第１カラム中に含有される前記イオン交換吸着剤に、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配およびＩＣの濃度における、独立で同時の未保持勾配を維持するように形成された、前記初期ｐＨおよび初期ＩＣ濃度から開始する可変ｐＨおよび独立可変ＩＣ濃度を有する溶出剤を供給し、
それぞれが、所定最終ｐＨおよびＩＣの所定濃度に到達するまで、その有効等電点で前記第１カラム中に含有される前記イオン交換吸着剤から連続的に溶出する前記荷電分子を溶出し、
二次分離のために、前記第１カラムから連続的に溶出した荷電分子を含有する、得られた流出物を、第２カラム中に含有される前記イオン交換吸着剤中に向け、
前記所定最終ｐＨおよびＩＣの前記所定濃度に到達するまで、前記第２カラム中に含有される前記イオン交換吸着剤に、反対に荷電した荷電分子を結合させる
ためのコードを含む前記媒体。
【請求項１０】
前記コードが、
前記第１カラムを前記第２カラムから外し、
前記第２カラム中に含有される前記イオン交換吸着剤をかん流している前記ｐＨ勾配を逆転させることによって、第２の所定初期ｐＨから第２の所定最終ｐＨを生じさせ、第２の所定初期ＩＣ濃度から所定最終ＩＣ濃度まで第２の独立勾配を同時に生じさせ、
それぞれが、第２の所定最終ｐＨおよび第２の所定最終ＩＣ濃度に到達するまで、その有効等電点で前記第２カラム中に含有される前記イオン交換吸着剤から連続的に溶出する、前記荷電分子を収集する
ためのコードをさらに含む、請求項９に記載のプロセッサー可読媒体。
【請求項１１】
前記コードが、前記第１カラムの後に、前記第１カラム中に含有される前記吸着剤と反対の電荷のイオン交換吸着剤を含有する第２カラムを連続に場合により再接続し、前記第１および第２カラム中に含有される前記イオン交換吸着剤を、前記初期ｐＨおよび前記初期ＩＣ濃度で平衡化するためのコードをさらに含む、請求項１０に記載のプロセッサー可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００６年８月２９日に出願された、米国仮出願第６０／８４０，６８８号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
約３０年前、Ｓｌｕｙｔｅｒｍａｎらは、新規の液体クロマトグラフィー法である、クロマトフォーカシング（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ、等電点クロマトグラフィー）を開拓した。これは、多成分移動相緩衝液（ポリ緩衝液（ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒｓ））と弱陰イオン固定相の間の複雑な相互作用によって生成される、保持ｐＨ勾配を下降するステップからなる。ｐＨを変更する結果として、巨大分子表面上の電荷を滴定することによる、荷電固定相への異なる結合によって荷電巨大分子を分離することにより、塩濃度を増加させることによって荷電固定相への結合を遮蔽することよりも、分子種がはるかに良好に分解される。したがって、クロマトフォーカシングは、伝統的な塩溶出に広く取って代わると期待されたが、それは起こらなかった。大部分、これは、クロマトフォーカシングがいくつかの重大な欠点を有することが発見されたためである。クロマトフォーカシングでは、勾配を生成したいと望むそれぞれのｐＨ範囲について、別々の緩衝溶液を生成しなければならない。勾配が形成される任意の所与のｐＨ範囲について、カラム中の勾配の傾きは、そのｐＨ範囲に比例し、したがって、同じ範囲を有する勾配を反復して形成する間の、傾きの変化の制御を妨げる。３ｐＨ単位を超える良好な緩衝能力を維持することができた、ポリ緩衝液の単一調合物はまったくなく、１１から８、９から６、および７から４のｐＨ範囲を網羅するために、製造者であるＰｈａｒｍａｃｉａによる、３つの異なる調合物の市販化を余儀なくさせている。ポリ緩衝液は、小さな多価電解質の複雑な混合物から構成されており、この電解質のいくつかは、単離の標的にされたタンパク質に頻繁に強く結合し、かつ、非常に高価である。したがって、これらは、予備タンパク質精製において、本質的にまったく使用されない。これらの欠点にもかかわらず、この方法に、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ（商標）ＰＦ  ２Ｄタンパク質分画システムの第１次元において新たな市況が見出された。これが起こったのは、上記に略述した困難にもかかわらず、制御されていない保持ｐＨ勾配が、アイソクラチックなｐＨ塩勾配よりも、複雑な混合物からタンパク質を分画することにおいて、依然として著しく良好であるためである。
【０００３】
Ｓｌｕｙｔｅｒｍａｎらの最初の研究以来の間の年月に、クロマトフォーカシングの欠点に対処するための多数の試みがなされた。事実上、これらのすべては、弱イオン交換固定相と相互作用することによって、固定相上に保持ｐＨ勾配を生成するように設計された、比較的単純な緩衝液の組合せからなっていた。少数例において、参照緩衝液が外部から混合されたが、純粋に外部操作によってｐＨを制御することに成功した方法は、見い出されていない。一般に、クロマトフォーカシングを改善するためのこれらの試みにより、溶出液のｐＨの変化を制御することを複雑で困難にする、緩衝液と固定相の間の相互作用は不可避であり、したがって、純粋に外部から決定されるｐＨ勾配は、実際上達成可能ではないということが想定された。その結果、広いｐＨ範囲にわたって、完全に制御可能なｐＨの液体クロマトグラフィー勾配を生成するための、特許された市場性のあるシステムは存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、いくつかの重要な課題が未解決のままである：１）最新液体クロマトグラフィーシステムの混合精度によってのみ制限される、正および負の傾きの両方の範囲を有する多段階ｐＨ勾配の、ソフトウェア主導型の生成；２）初期と最終のｐＨに独立で、それぞれの傾き変化に伴って緩衝液の化学的性質を変化させることなく、クロマトグラフィー分離の間にわたってｐＨ勾配の傾きを任意に変更するための、ソフトウェア主導型の能力；３）陰イオンおよび陽イオンの固定相の両方での、制御されたｐＨ勾配の生成；４）同じ固定相（複数も）上で２つ以上の独立、同時勾配を展開し、制御することのできるような、ｐＨ勾配の形成に著しく干渉しない、非イオン性洗浄剤、有機溶媒、塩などの溶出緩衝液に対する追加の成分（添加剤）の勾配の、ソフトウェア主導型の制御；５）課題＃１〜４も解決すると同時に、少数の緩衝液成分を有する比較的安価な、単純な移動相組成物；６）課題＃１〜５も解決すると同時に、タンパク質に結合しない移動相の緩衝液成分；および６）効率的で独立な、同時制御可能な勾配の形成により、同時にイオン性基と疎水基を含有し、例えば、２〜１２の広いｐＨ範囲にわたって安定な、混合モード固定相の選択性および分解能を十分に利用することが可能になる、疎水性、極性、および静電気的性質を有する移動相溶出液を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一実施形態では、本発明は、タンパク質などの荷電分子を、荷電固定相上のその見かけの等電点によって液体クロマトグラフィー分離するための新規の方法を提供する。第２の実施形態では、本発明は、荷電分子を、陰イオン固定相上のその見かけの等電点、陽イオン固定相上のその見かけの等電点、およびその疎水性によって分離するための多次元勾配システムを含む、低圧および高圧液体クロマトグラフィーを用いて使用するための新規のクロマトグラフィーシステムを提供する。以下において、各成分の濃度の勾配を形成するために混合される、液体クロマトグラフィーシステムの成分について参照する。
【０００６】
ここで記載される、多成分同時独立勾配システム（ｍｕｌｔｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ）（ＭＳＩＧＳ）は、静電気的相互作用クロマトグラフィー（塩勾配およびｐＨ勾配を伴うイオン交換クロマトグラフィー）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどによる、荷電、極性、非極性、小および大分子の分離の間に頻繁に遭遇する問題に系統的に対処し、解決する。ＭＳＩＧＳは、ｐＨ２以下からｐＨ１２以上の広いｐＨ範囲にわたって、部分的に一致するｐＫａを有する、少数の低分子量ポリイオン性有機緩衝液種の組合せの使用を含む。外部ｐＨ勾配を形成するために利用される、酸性およびアルカリ性の標準液は、全ｐＨ範囲が使用される場合、その初期ｐＨを調節するために使用される少量の強酸または強塩基を除いて、ほとんど同一の組成を有する。したがって、これらは、低い、ほぼ同一のイオン強度を有する。ｐＨ勾配は、ｐＨの関数として、各緩衝液の比率を決定する式に従って、固定相を含有するカラム外部の酸性およびアルカリ性緩衝液を混合することによって形成される。さらに、本システムの別の実施形態は、強い陰イオンおよび陽イオンイオン交換樹脂と強く相互作用せず、その結果、外部から決定される勾配が、固定相を通過することによってゆがまない、緩衝液の化学的性質である。これにより、本システムの一部として、オンデマンドｐＨ勾配形成のソフトウェアインプリメンテーションの構成が可能になった。したがって、ＭＳＩＧＳは、以下の課題、すなわち、１）最新液体クロマトグラフィーシステムの混合精度によってのみ制限される、正および負の傾きの両方の範囲を有するｐＨ勾配の生成；２）初期と最終のｐＨに独立で、それぞれの傾き変化に伴って緩衝液の化学的性質を変化させることなく、クロマトグラフィー分離の間にわたってｐＨ勾配の傾きを任意に変更するための能力；３）陰イオンおよび陽イオンの固定相の両方での、制御されたｐＨ勾配の生成；４）比較的安価な緩衝液成分；および５）タンパク質に結合しない緩衝液成分を独自に解決する。
【０００７】
ＭＳＩＧＳは、１つを超える勾配を同時に制御することを可能にし、同時に、１つのカラム、いくつかの並行カラム、または連続して接続され、タンデムシステムを形成する多段カラム上に独立に展開するように設計されている。これによって、現在市販されている勾配の方法体系に利用できない分離を達成することができる。例として、ｐＨ勾配をゼロでない傾きで維持しながら、塩勾配の傾きが変更される、同時の塩勾配およびｐＨ勾配を実行することによって、ある特定の問題となるモノクローナル抗体（ポリグリコシル化タンパク質）のアイソフォームを、容易に分離することができるが、アイソクラチックな塩でのｐＨ勾配およびアイソクラチックなｐＨでの塩勾配は、これらのアイソフォームを分解することができないことを示すことができる。展開される勾配は、互いに独立であるので、クロマトグラファーは、事実上無限数の実用的に固有のクロマトグラフィープロトコルを容易に作成することができる。この柔軟性は、いずれの他の文献ソースまたは液体クロマトグラフィーシステム製造者からも、現在利用できない。クロマトグラフィーシステムの民間の製造業者によって現在対処されていない、以下の一連の基本的な課題は、これによって解決される：１）分子の複雑な混合物中の標的分析物を、混合モード固定相上のその疎水性結合エネルギーとその静電結合エネルギーの合計に基づいて同時に分離すること；２）イオン交換および混合モード固定相上で、ｐＨの勾配および尿素などの可溶化カオトロピック剤を同時に制御することによって、膜タンパク質分離株などの低水溶性の複雑な混合物中の標的分析物を効率的に分離すること；３）例えば、２〜１２の広いｐＨ範囲にわたって、様々な疎水性およびイオン結合部位、ならびに安定性を有する、新規の混合モード定常状態組成物を生成するための、説得力のある理由を提供すること；および４）疎水性相互作用カラムおよび逆相カラム上の分析物の分離を改善するための、メタノール−アセトニトリルまたは塩−アセトニトリルなどの、ｐＨを緩衝することに直接関与しない溶出剤成分の同時、独立勾配の形成を可能にすること。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明のＭＳＩＧＳを実践するのに使用することができる、液体クロマトグラフィーシステムまたは装置の概略図である。
【図２】成分に加えられた２つを含む、同時一般化ｐｌＳｅｐ勾配の概略図である。
【図３】同時の一般化したｐｌＳｅｐと３つの添加剤の勾配の概略図である。
【図４】同時添加剤勾配の概略図である。
【図５Ａ】ＨＰＬＣ二元同時独立勾配の実験例の図である。図５Ａは、ｐＨのプロファイルを示す。
【図５Ｂ】ＨＰＬＣ二元同時独立勾配の実験例の図である。図５Ｂは、伝導性のプロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下の本発明の実施形態において、ｐｌＳｅｐ緩衝液と称する特定の組の緩衝液について参照する。ｐｌＳｅｐ緩衝液は、ｐＨの標的範囲全体にわたって部分的に一致するｐＫａを有する緩衝成分を特徴とし、各成分のモル比は、初期ｐＨと最終ｐＨの間の移行期全体にわたって一定のままであり、または変化し、各緩衝成分は、アミノ、アミド、イミノ、イミド、カルボン酸、スルホン酸、リン酸およびホスホン酸からなる群から選択される、少なくとも１つの官能性を含有する緩衝液組成物である。さらに、各緩衝成分は、０．００１ｍＭから１０００ｍＭの濃度で存在する。クロマトグラフィーカラムの外部で、ソフトウェアによって制御されるｐＨ勾配を発生させるために、強酸を使用してｐＨの下限までｐｌＳｅｐ緩衝液を滴定することによって、酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液が調製され、強塩基を使用してｐＨの上限までｐｌＳｅｐ緩衝液を滴定することによって、相補的な塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液が調製される。以下に説明されるアルゴリズムは、酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液と塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液との混合を制御することによって、標的範囲のｐＨ内のどこでも標的ｐＨを達成することに関係する。ｐｌＳｅｐ緩衝液の好ましい組成物は、ピペラジン、１−メチルピペラジン、トリエタノールアミン、ビス−トリスプロパンおよびギ酸を含む緩衝成分からなる。
【００１０】
本文書全体にわたって、成分１、２、．．．．ｎについて参照する。すべてのそのような場合において、成分０が暗示され、溶媒として作用する。すべての場合において、任意の１つまたは複数の成分の最小濃度は、ゼロまで小さくするように選択することができる。この例は、水を溶媒とした水−メタノール−アセトニトリル系であろう。したがって、この水−メタノール−アセトニトリル系では、許容可能な濃度の組は、０％ｗｔ．／ｗｔ．の最小メタノール濃度、４０％ｗｔ．／ｗｔ．の最大メタノール濃度；０％ｗｔ．／ｗｔ．の最小アセトニトリル濃度、６０％ｗｔ．／ｗｔ．の最大アセトニトリル濃度；および０％ｗｔ．／ｗｔ．の最小水（溶媒）濃度、１００％ｗｔ．／ｗｔ．の最大水濃度とすることができるであろう。
【００１１】
本明細書で使用される頭字語ＬＣは、液体クロマトグラフを指す。
【００１２】
本明細書で開示されるアルゴリズムおよびソフトウェアは、従来の液体クロマトグラフィー設備、例えば、４つ以上のチャネルを有するコンピューター制御ポンプ、および１つまたは複数のクロマトグラフィーカラムに接続された、関連するコンピューター制御バルブを含み、従来の検出器（例えば、ＵＶ、赤外、蛍光、屈折率、伝導性など）および／または分画収集デバイスを備えた、液体クロマトグラフに実装することができる。上記の種々の構成要素は、当技術分野の従来の手法によって、例えば、金属管を使用して相互接続することができる。一実施形態では、本発明の方法は、図１に示したようなクロマトグラフィーデバイスで実行される。
【００１３】
図２は、１および２と標識した（ｐＨ勾配を暗黙的に＃３と指定した）、２つの添加剤の同時独立勾配を含む、制御された外部ｐＨ勾配についてのダイアグラムである。概念的には、最後の混合ステップを伴う右側から開始し、図式を逆に分析するのが最も容易である。最終混合ステップでは、勾配により決定されるレベルの、成分１および２の両方は、両方の流出物流中に存在する（ｇｖ、すなわち勾配値）。酸性および塩基性溶液の流量規模は、勾配により指定されるｐＨを達成するのに必要な全流量値の、マニホルドにより指定される割合に等しい。前の混合ステップでは、成分１は、４つのすべての流出物流中で混合されるが、成分２は、酸性および塩基性流のそれぞれにおける、その最大において、または相補的なペアの流れにおける最小濃度においてのいずれかである。その結果、各流れのポンプ流量（ｐｕｍｐｉｎｇ  ｒａｔｅ）は、成分２のｇｖを達成するために、どの割合の最小成分２濃度の溶出剤が、最大成分２濃度の溶出剤と混合されなければならないかよって分配される、酸性、あるいは塩基性流量合計の割合となる。最初のレベルでは、成分２のｇｖを達成するのに必要な４つの溶出剤の流れのそれぞれは、４ペアのそれぞれについて、成分１のｇｖを達成するために、どの割合の最小成分１濃度の溶出剤が、最大成分１濃度の溶出剤と混合されなければならないかに由来する流量割合の分配に基づいて、２つの入来する流れにさらに分割される（合計８つの流れ）。これにより、８個のリザーバーのそれぞれからの流出についてのポンプ流量が求まる。
【００１４】
図３は、１〜３と標識した（ｐＨ勾配を暗黙的に＃４と指定した）、３つの添加剤の同時独立勾配を含む、制御された外部ｐＨ勾配についてのダイアグラムである。概念的には、最後の混合ステップを伴う右側から開始し、図式を逆に分析するのが最も容易である。最終混合ステップでは、勾配により決定されるレベルの、成分１および２の両方は、両方の流出物流中に存在する（ｇｖ、すなわち勾配値）。酸性溶液の合計および塩基性溶液の合計の流量規模は、勾配により指定されるｐＨを達成するのに必要な全流量値の、マニホルドにより指定される割合にそれぞれ別々に等しい。前の混合ステップでは、成分１および２は、４つのすべての流出物流中で混合されるが、成分３は、酸性および塩基性流のそれぞれにおける、その最大において、または相補的なペアの流れにおける最小濃度においてのいずれかである。その結果、各流れのポンプ流量は、成分３のｇｖを達成するために、どの割合の最小濃度の成分３の溶出剤が、（１−その割合）の最大濃度の成分３の溶出剤と混合されなければならないかよって分配される、酸性、あるいは塩基性流量合計の割合となる。次のレベルでは、成分３のｇｖを達成するのに必要な４つの溶出剤の流れのそれぞれは、４ペアのそれぞれについて、成分２のｇｖを達成するために、どの割合の最小濃度の成分２の溶出剤が、最大濃度の成分２の溶出剤と混合されなければならないかに由来する流量割合の分配に基づいて、２つの入来する流れにさらに分割される（合計８つの流れ）。このパターンは、成分１について繰り返され、これにより、１６個のリザーバーのそれぞれからの流出についてのポンプ流量が求まる。
【００１５】
図４は、１〜４と標識した、４つの添加剤の同時独立勾配の制御についてのダイアグラムである。概念的には、最後の混合ステップを伴う右側から開始し、図式を逆に分析するのが最も容易である。最終混合ステップでは、勾配により決定されるレベルの成分１〜３は、両方の流出物流中に存在する（ｇｖ、すなわち勾配値）。その結果、各流れのポンプ流量は、成分４のｇｖを達成するために、（１−その割合）の最大濃度の成分４の溶出剤と混合されなければならない、最小濃度の成分４の溶出剤の割合となる。前の混合ステップでは、成分１〜２は、４つのすべての流出物流中で混合されるが、成分３は、２つの流れのそれぞれにおける、その最大において、または相補的なペアの流れにおける最小濃度においてのいずれかである。次のレベルでは、成分３のｇｖを達成するのに必要な４つの溶出剤の流れのそれぞれは、４ペアのそれぞれについて、成分２のｇｖを達成するために、どの割合の最小濃度の成分２の溶出剤が、最大濃度の成分２の溶出剤と混合されなければならないかに由来する流量割合の分配に基づいて、２つの入来する流れにさらに分割される（合計８つの流れ）。このパターンは、成分１について繰り返され、これにより、１６個のリザーバーのそれぞれからの流出についてのポンプ流量が求まる。
【００１６】
１つまたは複数のカラムのｐＨ勾配
本発明の別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、およびスタティックメモリー、およびマルチポンプＬＣシステムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも２つの独立流体送達チャネルＡおよびＢと；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＡと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＢと；リザーバーＲＡからの酸性緩衝液の流出を制御するポンプＡ、およびリザーバーＲＢからの塩基性緩衝液の流出を制御するポンプＢと；強陰イオン交換固定相、強陽イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相、弱陽イオン交換固定相、疎水性固定相および疎水性固定相とイオン交換固定相の混合（混合モード）からなる固定相の群から選択される固定相を含有する少なくとも１つのカラムと；ソフトウェアであって、少なくとも１つの固定相が存在する場合、ＬＣを制御し、ＬＣに指示することによって、
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するためのシステムであって、
分離される荷電分子を、初期ｐＨで、ｐｌＳｅｐ溶媒でかん流された固定相に適用し、結合させるステップと、
（ｉ）リザーバーＲＡから送り出される所定の酸性ｐＨのｐｌＳｅｐ緩衝液を、（ｉｉ）リザーバーＲＢから送り出される所定のアルカリ性ｐＨのｐｌＳｅｐ緩衝液と、連続的に混合することから形成される、初期ｐＨから開始する可変ｐＨを有する溶出剤を固定相に供給するステップであって、ＲＡ（Ａ％）およびＲＢ（１００−Ａ％）のリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配が維持され、そして、混合比率は移動相中の酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液％（Ａ％）とｐＨとの間の関係を特定する式：Ａ％＝Ｆ（ｐＨ）によって決定される、前記供給するステップと、
所定の最終ｐＨに到達するまで荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子は、その荷電分子のｐＨ依存性保持時間に固定相から連続的に溶出する、前記収集するステップと、
を含む方法
を実施するように構成されたソフトウェアと；
を含む前記方法またはシステムが提供される。
【００１７】
１つのカラムのｐＨ勾配とアイソクラチックな濃度の１つの成分
本発明の別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、およびスタティックメモリー、およびマルチポンプクロマトグラフィー分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも２つの独立流体送達チャネルＡおよびＢと；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液、および、非イオン性洗浄剤、イオン性洗浄剤、極性有機分子、無極性有機分子、酸、塩基、中性塩、酸性塩および塩基性塩からなる成分の群から選択される、１つのアイソクラチックな成分（以降、ＩＣと呼ぶ）を含有するリザーバー、ＲＡと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバー、ＲＢと；リザーバーＲＡからの酸性緩衝液の流出を制御するポンプＡ、およびリザーバーＲＢからの塩基性緩衝液の流出を制御するポンプＢと；強陰イオン交換固定相、強陽イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相、および弱陽イオン交換固定相からなる群から選択される固定相を含有する少なくとも１つのカラムと；ソフトウェアであって、１つのカラムの固定相が存在する場合、ＬＣを制御し、ＬＣに指示することによって、
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するためのシステムであって、
所定初期ｐＨで、少なくとも１つの緩衝成分およびＩＣを含む溶媒でかん流された陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相に、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、イオン交換固定相は荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、前記適用し、結合させるステップと、
（ｉ）リザーバーＲＡから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の酸性ｐＨの溶液を、（ｉｉ）リザーバーＲＢから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定のアルカリ性ｐＨの溶液と、連続的に混合することから形成される、初期ｐＨから開始する可変ｐＨを有する溶出剤を、イオン交換固定相に供給するステップであって、ＲＡおよびＲＢのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配が維持される、前記供給するステップと、
所定の最終ｐＨに到達するまで荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子は、その有効等電点でイオン交換固定相から連続的に溶出する、前記収集するステップと、
を含む方法
を実施するように構成されたソフトウェアと；
を含む前記方法またはシステムが提供される。
【００１８】
１つのカラム、２つの成分の２つの同時独立勾配
本発明の実施形態では、固定相に対して異なる結合親和性を有する、荷電または非荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、およびスタティックメモリー、およびマルチポンプ（ｍｕｌｔｉ−ｐｕｍｐ）ＬＣ分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも４つの独立流体送達チャネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと；最小濃度の成分１、Ｅ１，ｍｉｎ、および最小濃度の成分２、Ｅ２，ｍｉｎ、を含む移動相を含有するリザーバー、ＲＡと、最大濃度の成分１、Ｅ１，ｍａｘ、および最小濃度の成分２、Ｅ２，ｍｉｎ、を含む移動相を含有するリザーバー、ＲＢと；最小濃度の成分１、Ｅ１，ｍｉｎ、および最大濃度の成分２、Ｅ２，ｍａｘを含む移動相を含有するリザーバー、ＲＣと；最大濃度の成分１、Ｅ１，ｍａｘ、および最大濃度の成分２、Ｅ２，ｍａｘを含む移動相を含有するリザーバー、ＲＤと；速度ｒＡでリザーバーＲＡからの移動相の流出を制御するポンプＡ、および速度ｒＢでリザーバーＲＢからの移動相の流出を制御するポンプＢ、および速度ｒＣでリザーバーＲＣからの移動相の流出を制御するポンプＣ、および速度ｒＤでリザーバーＲＤからの移動相の流出を制御するポンプＤであって、
【００１９】
【数１】
2010502960.tif 000002
であり、ｒｔｏｔａｌ＝ｒＡ＋ｒＢ＋ｒＣ＋ｒＤである場合、ソフトウェアは、ポンプＡ、Ｂ、ＣおよびＤからの流れを混合した後、固定相上に、ポンプＡに速度ｒＡ＝Ｘ１×Ｘ２×ｒｔｏｔａｌで送り込み、ポンプＢに速度ｒＢ＝（１−Ｘ１）×Ｘ２×ｒｔｏｔａｌで送り込み、ポンプＣに速度ｒＣ＝Ｘ１×（１−Ｘ２）×ｒｔｏｔａｌで送り込み、ポンプＤに速度ｒＤ＝（１−Ｘ１）×（１−Ｘ２）×ｒｔｏｔａｌで送り込むように指示することによって、随時または任意のカラム体積で、成分１の濃度、Ｅ１、および成分２の濃度、Ｅ２を決定し、
ａ）荷電または非荷電分子を溶出するステップであって、そのそれぞれが、
【００２０】
【数２】
2010502960.tif 000003
（式中、ＴＲは成分濃度依存性保持時間である）であるように、濃度Ｅ１およびＥ２で固定相から連続的に溶出する、前記溶出するステップと、
ｂ）荷電または非荷電分子を収集するステップであって、そのそれぞれが、
【００２１】
【数３】
2010502960.tif 000004
（式中、ＴＲは成分濃度依存性保持時間である）であるように、濃度Ｅ１およびＥ２で固定相から連続的に溶出する、前記収集するステップと、
ｃ）対象とするすべての分子種の分離に必要であるとみなされる場合、ステップａ）〜ｂ）を繰り返すステップと
を含む方法またはシステムが提供される。
【００２２】
２つの親水性カラムｐＨ勾配とアイソクラチックな濃度の１つの成分（構成Ａ）
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、およびスタティックメモリー、およびマルチポンプＬＣ分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも２つの独立流体送達チャネルＡおよびＢと；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバー、ＲＡと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバー、ＲＢと；リザーバーＲＡからの酸性緩衝液の流出を制御するポンプＡ、およびリザーバーＲＢからの塩基性緩衝液の流出を制御するポンプＢと；強陰イオン交換固定相、強陽イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相および弱陽イオン交換固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する少なくとも２つのカラムと；ソフトウェアであって、２つのカラムの固定相が存在する場合、ＬＣに指示し、ＬＣを制御することによって、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｐＨ勾配ＬＣ法であって、
所定初期ｐＨで、少なくとも１つの緩衝成分およびＩＣを含む溶媒でかん流された陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相に、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、イオン交換固定相が、荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、前記適用し、結合させるステップと、
第１カラムの後に、第１カラム中に含有される固定相と反対の電荷を有するイオン交換固定相を含有する第２カラムを連続して接続するステップならびに第１および第２カラム中に含有されるイオン交換固定相を初期ｐＨに平衡化するステップと、
ソフトウェアによって指示される場合、陰イオン（陽イオン固定相）交換固定相、その後に疎水性固定相を互いに連続して接続するステップと、
（ｉ）リザーバーＲＡから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の酸性ｐＨの溶液を、（ｉｉ）リザーバーＲＢから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定のアルカリ性ｐＨの溶液と、連続的に混合することから形成される、初期ｐＨから開始する可変ｐＨを有する溶出剤を、第１カラム中に含有されるイオン交換固定相に供給するステップであって、ＲＡおよびＲＢのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配が維持される、前記供給するステップと、
ａ）所定最終ｐＨに到達するまで、荷電分子が溶出するステップであって、それぞれの分子は、その有効等電点で第１カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出するステップと、
ｂ）第１カラムから連続的に溶出した荷電分子を含有する、得られた流出物を、二次分離のために、第２カラム中に含有されるイオン交換固定相中に向けるステップと、
ｃ）所定最終ｐＨに到達するまで、第２カラムに含有されるイオン交換固定相と反対に荷電された荷電分子を結合させるステップと、
ｄ）ソフトウェアによって指示される場合、第１カラムを第２カラムから外すステップと、
ｅ）第２カラム中に含有されるイオン交換固定相をかん流しているｐＨ勾配を、所定最終ｐＨから第２の所定最終ｐＨになるよう逆転させるステップと、
ｆ）第２の所定最終ｐＨに到達するまで、荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子は、その有効等電点で第２カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出する、前記収集するステップと、
ｇ）場合によって含まれていてもよい、第１カラムの後に、第１カラム中に含有される固定相と反対の電荷を有するイオン交換固定相を含有する第２カラムを連続して再接続するステップならびに第１および第２カラム中に含有されるイオン交換固定相を初期ｐＨに平衡化するステップと、
ｈ）対象とするすべての分子種を分離するのに必要である場合、ステップａ）〜ｇ）を繰り返すステップと
を含む方法
を実施するように構成されたソフトウェアと；
を含む方法またはシステムが提供される。
【００２３】
２つの親水性カラムｐＨ勾配とアイソクラチックな濃度の１つの成分（構成Ｂ）
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、およびスタティックメモリー、およびマルチポンプＬＣ分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも２つの独立流体送達チャネルＡおよびＢと；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバー、ＲＡと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバー、ＲＢと；リザーバーＲＡからの酸性緩衝液の流出を制御するポンプＡ、およびリザーバーＲＢからの塩基性緩衝液の流出を制御するポンプＢと；強陰イオン交換固定相、強陽イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相および弱陽イオン交換固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する少なくとも２つのカラムと；ソフトウェアであって、２つのカラムの固定相が存在する場合、ＬＣに指示し、ＬＣを制御することによって、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｐＨ勾配ＬＣ法であって、
分離される荷電分子を、（ｉ）第１カラム中の陰イオン交換固定相、その後、第１カラムに連続して接続された第２カラム中の陽イオン交換固定相に適用するステップか、（ｉｉ）第１カラム中の陽イオン交換固定相、その後、第１カラムに連続して接続された第２カラム中の陰イオン交換固定相に適用するステップ、のいずれかであって、（ｉ）および（ｉｉ）の両方の構成において、固定相は、所定初期ｐＨで、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含む溶出剤でかん流され、ここで、分離される荷電分子のそれぞれが、３つの荷電クラス、すなわち：陰イオン交換固定相に接触すると、初期ｐＨ未満の見かけの等電点（ｐｌｓ）を有する荷電分子に関する、見かけ上負に荷電したクラス；初期ｐＨで陰イオン交換固定相または陽イオン交換固定相のいずれにも結合することができない荷電分子に関する、見かけ上中性のクラス；および陽イオン交換固定相に接触すると、初期ｐＨを超える見かけのｐｌｓを有する荷電分子に関する、見かけ上正に荷電したクラス、の１つに該当する、前記適用するステップと、
初期ｐＨで見かけ上負に荷電した荷電分子を陰イオン固定相に結合させるステップと、
初期ｐＨで見かけ上正に荷電した荷電分子を陽イオン固定相に結合させるステップと、
初期ｐＨで陽イオン交換固定相または陰イオン交換固定相のいずれにも結合することができない荷電分子を収集するステップと、
ソフトウェアによって指示される場合、（ｉ）または（ｉｉ）における陰イオン交換固定相と陽イオン交換固定相とを互いに外すステップと、
（ｉｉｉ）ＲＡから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の酸性ｐＨの溶液を、（ｉｖ）ＲＢから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定のアルカリ性ｐＨの溶液と、連続的に混合することから形成される、初期ｐＨから開始する時間依存性の漸減ｐＨを有する溶出剤を、陰イオン交換固定相に供給するステップであって、ＲＡおよびＲＢのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配が維持される、前記供給するステップと、
所定最終最小ｐＨに到達するまで、荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子は、その有効等電点で陰イオン交換固定相から連続的に溶出するステップと、
（ｖ）ＲＡから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の酸性ｐＨの溶液を、（ｖｉ）ＲＢから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定のアルカリ性ｐＨの溶液と、連続的に混合することから形成される、初期ｐＨから開始する時間依存性の漸増ｐＨを有する溶出剤を、陽イオン交換固定相に供給するステップであって、ＲＡおよびＲＢのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配が維持される、前記供給するステップと、
所定最終最大ｐＨに到達するまで、荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子は、その有効等電点で陽イオン交換固定相から連続的に溶出するステップと、
を含む方法
を実施するように構成されたソフトウェアと；
を含む方法またはシステムが提供される。
【００２４】
１つの親水性カラム、１つの疎水性カラム、連続勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、およびスタティックメモリー、およびマルチポンプＬＣ分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも４つの独立流体送達チャネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと；
酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバー、ＲＡと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバー、ＲＢと；リザーバーＲＡからの酸性緩衝液の流出を制御するポンプＡ、およびリザーバーＲＢからの塩基性緩衝液の流出を制御するポンプＢと；所定濃度で、水混和性有機分子種であるＩＣ（以降、ＷＭＯと呼ぶ）を含む溶液を含有するリザーバー、ＲＣと；Ｒｃにおける濃度と異なる濃度でＷＭＯを含む溶液を含有するリザーバーＲＤと；リザーバーＲＣからの溶液の流出を制御するポンプＣ、およびリザーバーＲＤからの溶液の流出を制御するポンプＤと；強陰イオン交換固定相、強陽イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相、弱陽イオン交換固定相および疎水性固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する少なくとも２つのカラムと；ソフトウェアであって、２つのカラムの固定相が存在し、そのうちの１つが疎水性である場合、ＬＣに指示し、ＬＣを制御することによって、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｐＨ勾配ＬＣ法であって、
所定初期ｐＨで、少なくとも１つの緩衝成分およびＩＣを含む溶媒でかん流された陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有する第１カラムに、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、イオン交換固定相が荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、前記適用し、結合させるステップと、
第１カラムの後に、第１カラム中に含有される固定相に対し疎水性固定相を含有する第２カラムを連続して接続するステップならびに第１および第２カラム中に含有される固定相を初期ｐＨに平衡化するステップと、
（ｉ）ＲＡから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の酸性ｐＨの溶液を、（ｉｉ）リザーバーＲＢから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定のアルカリ性ｐＨの溶液と、連続的に混合することから形成される、初期ｐＨから開始する可変ｐＨを有する溶出剤を、第１カラム中に含有されるイオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２のリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配が維持される、前記供給するステップと、
ａ）所定最終ｐＨに到達するまで、荷電分子が溶出するステップであって、それぞれの分子は、その有効等電点で第１カラム中に含有されるイオン交換固定相から、連続的に溶出するステップと、
ｂ）第１カラムから連続的に溶出した荷電分子を含有する、得られた流出物を、二次分離のために、第２カラム中に含有される疎水性交換固定相中に向けるステップと、
ｃ）所定の最終ｐＨに到達するまで、第２カラムに含有される疎水性交換固定相に、第１カラムから連続的に溶出した荷電分子を結合させるステップと、
ｄ）ソフトウェアによって指示される場合、第１カラムを第２カラムから外すステップと、
（ｉ）リザーバーＲＣから送り出される、特定濃度のＷＭＯを含む溶液を、（ｉｉ）リザーバーＲＤから送り出される、リザーバーＲＤと異なる特定濃度のＷＭＯを含有する溶液と、連続的に混合することから形成される、初期ＷＭＯ濃度から開始する、可変ＷＭＯ濃度を有する溶出剤を、第２カラム中に含有される疎水性固定相に供給するステップであって、ＲＣおよびＲＤリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、ＷＭＯ濃度において外部から定められる傾きを有する勾配が維持される、前記供給するステップと、
ｅ）第２の所定最終ＷＭＯ濃度に到達するまで、分子を収集するステップであって、それぞれの分子は、その疎水性結合自由エネルギーの変化によって、第２カラム中に含有される疎水性固定相から連続的に溶出する、前記収集するステップと、
ｆ）対象とするすべての分子種を分離するのに必要である場合、ステップａ）〜ｅ）を繰り返すステップと
を含む方法
を実施するように構成されたソフトウェアと；
を含む方法またはシステムが提供される。
【００２５】
２つの親水性カラム：陰イオン性（または陽イオン性）第１および１つの疎水性、連続勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、およびスタティックメモリー、およびマルチポンプＬＣ分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも４つの独立流体送達チャネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと；
酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバー、ＲＡと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバー、ＲＢと；リザーバーＲＡからの酸性緩衝液の流出を制御するポンプＡ、およびリザーバーＲＢからの塩基性緩衝液の流出を制御するポンプＢと；所定濃度で水混和性有機分子種であるＩＣを含む溶液を含有するリザーバー、ＲＣと；Ｒｃにおける濃度と異なる濃度でＷＭＯを含む溶液を含有するリザーバーＲＤと；リザーバーＲＣからの溶液の流出を制御するポンプＣ、およびリザーバーＲＤからの溶液の流出を制御するポンプＤと；強陰イオン交換固定相、強陽イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相、および弱陽イオン交換固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する少なくとも２つのカラムと；疎水性固定相を含有する第３のカラムと；ソフトウェアであって、２つのカラムの固定相が存在し、そのうちの１つが疎水性である場合、ＬＣに指示し、ＬＣを制御することによって、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｐＨ勾配ＬＣ法であって、
分離される荷電分子を、第１カラム中の陰イオン（陽イオン交換固定相）交換固定相に適用するステップであって、その後に、第１カラムに連続して接続された第２カラム中の陽イオン（陰イオン交換固定相）交換固定相に適用し、その後に、第２カラムに連続して接続された、疎水性固定相を含有する第３のカラムに適用し、その結果、固定相が、所定初期ｐＨで、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含む溶出剤でかん流され、分離される荷電分子のそれぞれが、３つの荷電クラス、すなわち、陰イオン交換固定相に接触すると、初期ｐＨ未満の見かけの等電点（ｐｌｓ）を有する荷電分子に関する、見かけ上負に荷電したクラス；初期ｐＨで陰イオン交換固定相または陽イオン交換固定相のいずれにも結合することができない荷電分子に関する、見かけ上中性のクラス；および陽イオン交換固定相に接触すると、初期ｐＨを超える見かけのｐｌｓを有する荷電分子に関する、見かけ上正に荷電したクラスの１つに該当する、前記適用するステップと、
ａ）初期ｐＨで見かけ上負に荷電した荷電分子を陰イオン固定相に結合させるステップと、
ｂ）初期ｐＨで見かけ上正に荷電した荷電分子を陽イオン固定相に結合させるステップと、
ｃ）初期ｐＨで陽イオン交換固定相または陰イオン交換固定相のいずれにも結合することができない、見かけ上中性の分子を、これらが結合する疎水性固定相を含有する第３カラム上に向けるステップと、
ｄ）ソフトウェアによって指示される場合、疎水性固定相から、陰イオン（陽イオン）交換カラム、その後に陽イオン（陰イオン）交換カラムを外すステップと、
（ｉｉｉ）Ｒｃから送り出される、所定濃度のＷＭＯを含有する溶液を、（ｉｖ）Ｒｄから送り出される、異なる所定濃度のＷＭＯを含有する溶液と連続的に混合することから形成される、時間依存性の漸増疎水性を有する溶出剤を疎水性固定相に供給するステップであって、ＲｃおよびＲｄリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、ＷＭＯ濃度において外部から定められる傾きを有する勾配が維持される、前記供給するステップと、
分離された分子分画が、その疎水性によって疎水性カラムから溶出する場合、これを収集するステップと、
ソフトウェアによって指示される場合、陰イオン（陽イオン交換固定相）交換固定相、その後に陽イオン（陰イオン固定相）交換固定相を互いに外すステップと、
ソフトウェアによって指示される場合、陰イオン（陽イオン固定相）交換固定相、その後に疎水性固定相を互いに連続して接続するステップと、
（ｉｉｉ）ＲＡから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の酸性ｐＨの溶液を、（ｉｖ）ＲＢから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定のアルカリ性ｐＨの溶液と連続的に混合することから形成される初期ｐＨから開始する、時間依存性の漸減（陽イオン固定相については漸増）ｐＨを有する溶出剤を陰イオン（陽イオン固定相）交換固定相に供給するステップであって、第１および第２の２つのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持（ｕｎｒｅｔａｉｎｅｄ）ｐＨ勾配が維持される、前記供給するステップと、
そのそれぞれが、その有効等電点で、陰イオン（陽イオン固定相）交換固定相から連続的に溶出する荷電分子を、所定の最終の最小（陽イオン固定相については最大）ｐＨに到達するまで、これらが結合する疎水性固定相を含有するカラム上に向けるステップと、
ソフトウェアによって指示される場合、陰イオン（陽イオン固定相）交換カラムと疎水性カラムを互いに外すステップと、
（ｉｉｉ）リザーバーＲｃから送り出される、所定濃度のＷＭＯを含む溶液を、（ｉｖ）リザーバーＲｄから送り出される、異なる所定濃度のＷＭＯを含有する溶液と連続的に混合することから形成される、時間依存性の漸増疎水性を有する溶出剤を疎水性固定相に供給するステップであって、ＲｃおよびＲｄリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、ＷＭＯ濃度において外部から定められる傾きを有する勾配が維持される、前記供給するステップと、
分離された分子分画が、その疎水性によって疎水性カラムから溶出する場合、これを収集するステップと、
ソフトウェアによって指示される場合、陰イオン（陽イオン固定相）交換固定相と疎水性固定相を互いに接続するステップと、
（ｖ）ＲＡから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の酸性ｐＨの溶液を、（ｉｖ）ＲＢから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定のアルカリ性ｐＨの溶液と連続的に混合することから形成される初期ｐＨから開始する、時間依存性の漸増（陰イオン固定相については漸減）ｐＨを有する溶出剤を陽イオン（陰イオン固定相）交換固定相に供給するステップであって、ＲＡおよびＲＢリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配が維持される、前記供給するステップと、
そのそれぞれが、その有効等電点で、陽イオン（陰イオン固定相）交換固定相から連続的に溶出する荷電分子を、所定の最終の最大（陽イオン固定相については最大）ｐＨに到達するまで、これらが結合する疎水性固定相を含有するカラム上に向けるステップと、
ソフトウェアによって指示される場合、陽イオン（陰イオン固定相）交換固定相と疎水性固定相を互いに外すステップと、
（ｉｉｉ）リザーバーＲｃから送り出される、所定濃度のＷＭＯを含む溶液を、（ｉｖ）リザーバーＲｄから送り出される、異なる所定濃度のＷＭＯを含有する溶液と連続的に混合することから形成される、時間依存性の漸増疎水性を有する溶出剤を疎水性固定相に供給するステップであって、ＲｃおよびＲｄリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、ＷＭＯ濃度において外部から定められる傾きを有する勾配が維持される、前記供給するステップと、
分離された分子分画が、その疎水性によって疎水性カラムから溶出する場合、これを収集するステップと
を含む方法
を実施するように構成されたソフトウェアと；
を含む方法またはシステムが提供される。
【００２６】
独立同時勾配を生成するためのマニホルド方程式
溶出剤の流れにおける％酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液（Ａ％）と添加剤Ｅの存在下のｐＨとの間の関係を特定する方程式系は、Ａ％＝ａｎ×Ｅｎ＋ａｎ−１×Ｅｎ−１＋・・・・・＋ａ１×Ｅ＋ａ０（式中、ａｎからａ０は、それぞれ、形式：
【００２７】
【数４】
2010502960.tif 000005
（ｋは、フィッティング定数である）の、ｐＨの別個の関数である）。これらのｋは、一定のＥでの各係数ａｎ．．．ａ０対ｐＨの曲線をフィッティングすることによって求められる。これにより、同じカラム（複数も）上のｐＨおよび添加剤における、独立同時勾配の形成が可能になる。多次元マニホルドを計算することによって、２つ以上の添加剤、Ｅ、Ｆ、Ｇなどに対してこれを一般化することが可能である。ＥおよびＦの濃度とｐＨを有する２つの添加剤についての例は、以下のようになる：Ａ％＝ａ×Ｅ５＋ｂ×Ｅ４＋ｃ×Ｅ３＋ｄ×Ｅ２＋ｅ×Ｅ＋ｆ（式中、ａからｆは、それぞれ、形式：ａ（Ｆ，ｐＨ）、ｂ（Ｆ，ｐＨ）などのＦとｐＨの別個の関数である）。それぞれがＦの異なる一定の濃度を有する一連のマニホルドを作成することによって、ａ（Ｆ，ｐＨ）、ｂ（Ｆ，ｐＨ）のそれぞれの、ＦとｐＨへの関数依存性を、各マニホルドについて計算することができる。それぞれが別個の値のＦで計算される一群のマニホルドが存在するので、それぞれのＥのべき乗の係数は定数ではないが、一定のｐＨで、ａ、ｂ．．．．．ｅ、ｆのそれぞれ対Ｆをプロットすることによって求められる場合、形式：ａ５，Ｆ×Ｆ５＋ａ４，Ｆ×Ｆ４＋ａ３，Ｆ×Ｆ３＋ａ２，Ｆ×Ｆ２＋ａ１，Ｆ×Ｆ＋ａ０，Ｆ，ｂ５，Ｆ×Ｆ５＋ｂ４，Ｆ×Ｆ４＋ｂ３，Ｆ×Ｆ３＋ｂ２，Ｆ×Ｆ２＋ｂ１，Ｆ×Ｆ＋ｂ０，Ｆ、．．．．．．．．．ｆ５，Ｆ×Ｆ５＋ｆ４，Ｆ×Ｆ４＋ｆ３，Ｆ×Ｆ３＋ｆ２，Ｆ×Ｆ２＋ｆ１，Ｆ×Ｆ＋ｆ０，ＦのＦの関数である。同様に、それぞれのＦのべき乗の係数は、ｐＨ単独の別個の多項式に合わせられるであろう。他の組の方程式は、任意の特定の組のｎ個の添加剤：Ａ％＝Ｆ（Ｅ１，Ｅ２，．．．．，Ｅｎ−１，Ｅｎ，ｐＨ）について適切となり得、方程式の数学的形式は、添加剤の濃度またはｐＨの多項式に限定されないことが理解されるべきである。その場合、そのような方程式の組を使用して２ｎ個のリザーバーのそれぞれからの流れを制御することによって、ｎ個の独立勾配の形成を制御することが可能となり得る。これの例は、おそらく、塩化テトラエチルアンモニウム（）のような塩基性溶質から予期することできるような、競合的緩衝能力を有する単一の添加剤であって、Ａ％＝ａ（ｐＨ）×ＥＴＥＡｂ（ｐＨ）であるような添加剤であるだろう。
【００２８】
１つの親水性カラム、同時独立勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、およびスタティックメモリー、およびマルチポンプＬＣ分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも４つの独立流体送達チャネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと；
酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＡと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＢと；リザーバーＲＡからの酸性緩衝液の流出を制御するポンプＡ、およびリザーバーＲＢからの塩基性緩衝液の流出を制御するポンプＢと；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液およびＩＣを最大濃度で含有するリザーバー、ＲＣと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液およびＩＣを最大濃度で含有するリザーバー、ＲＤと；リザーバーＲＣからの酸性緩衝液およびＩＣの流出を制御するポンプＣ、およびリザーバーＲＤからの塩基性緩衝液およびＩＣの流出を制御するポンプＤと；そして酸性溶出混合物を形成する、ＲＡから流出する溶出液の割合に対するＲＣから流出する溶出液の割合は、使用者によってソフトウェアにプログラムされたＩＣ勾配に要求されるＩＣの濃度によってソフトウェアにより決定され、同じＲＢから流出する溶出液の割合に対するＲＤから流出する溶出液の割合は、使用者によってソフトウェアにプログラムされたＩＣ勾配に要求される同一のＩＣの濃度を形成し、酸性混合物からなる全溶出液流の割合に対する塩基性混合物からなる全溶出液流の割合は、マニホルド方程式（任意のＩＣ濃度から選択された最大濃度まで、使用者によってソフトウェアにプログラムされた勾配で決定されたＩＣ濃度を含有する酸性緩衝液の割合と、使用者によってソフトウェアにプログラムされた勾配で決定されたＩＣ濃度を含有する塩基性緩衝液の割合とが、使用者によってソフトウェアにプログラムされたｐＨ勾配によって決定されるｐＨを生成する割合であるよう定義する）を使用することによりソフトウェアによって決定され；強陰イオン交換固定相、強陽イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相および弱陽イオン交換固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する少なくとも１つのカラムと；ソフトウェアであって、１つのカラムの固定相が存在する場合、ＬＣに指示し、ＬＣを制御することによって、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｐＨ勾配ＬＣ法であって、
所定初期ｐＨおよび所定初期ＩＣ濃度で、少なくとも１つの緩衝成分およびＩＣを含む溶媒でかん流された陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有するカラムに、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、イオン交換固定相が荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、前記適用し、結合させるステップと、
マニホルド方程式を使用することによりソフトウェアによって決定される、初期ｐＨおよび初期ＩＣ濃度から開始する可変ｐＨおよび独立可変ＩＣ濃度を有する溶出剤を、カラムに含有されるイオン交換固定相に供給するステップであって、前記マニホルド方程式は、任意のＩＣ濃度から選択された最大濃度まで、使用者によってソフトウェアにプログラムされた勾配で決定されたＩＣ濃度を含有する酸性緩衝液の割合と、使用者によってソフトウェアにプログラムされた勾配で決定されたＩＣ濃度を含有する塩基性緩衝液の割合を、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配および独立かつ同時の未保持勾配のＩＣ濃度が維持されるために、使用者によってソフトウェアにプログラムされたｐＨ勾配によって決定されるｐＨを生成するよう定義する、前記供給するステップと；
ａ）所定最終ｐＨおよび所定ＩＣ濃度に到達するまで、荷電分子が溶出するステップであって、それぞれの分子は、その有効等電点で、カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出するステップと、
ｂ）荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子は、その有効等電点で、カラム中に含有されるイオン交換固定相から、所定最終ｐＨおよび所定最終ＩＣ濃度に到達するまで、連続的に溶出するステップと、
ｃ）対象とするすべての分子種を分離するのに必要である場合、ステップａ）〜ｂ）を繰り返すステップと
を含む方法
を実施するように構成されたソフトウェアと；
を含む方法またはシステムが提供される。
【００２９】
２つの親水性カラム、同時独立勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、およびスタティックメモリー、およびマルチポンプＬＣ分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも４つの独立流体送達チャネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと；
酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＡと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＢと；リザーバーＲＡからの酸性緩衝液の流出を制御するポンプＡ、およびリザーバーＲＢからの塩基性緩衝液の流出を制御するポンプＢと；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液およびＩＣを最大濃度で含有するリザーバー、ＲＣと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液およびＩＣを最大濃度で含有するリザーバー、ＲＤと；リザーバーＲＣからの酸性緩衝液およびＩＣの流出を制御するポンプＣ、およびリザーバーＲＤからの塩基性緩衝液およびＩＣの流出を制御するポンプＤと；そして酸性溶出混合物を形成する、ＲＡから流出する溶出液の割合に対するＲＣから流出する溶出液の割合は、使用者によってソフトウェアにプログラムされたＩＣ勾配に要求されるＩＣの濃度によって、ソフトウェアにより決定され、同じＲＢから流出する溶出液の割合に対するＲＤから流出する溶出液の割合は、使用者によってソフトウェアにプログラムされたＩＣ勾配に要求される同一のＩＣの濃度を形成し、酸性混合物からなる全溶出液流の割合に対する塩基性混合物からなる全溶出液流の割合は、マニホルド方程式（任意のＩＣ濃度から選択された最大濃度まで、使用者によってソフトウェアにプログラムされた勾配で決定されたＩＣ濃度を含有する酸性緩衝液の割合と、使用者によってソフトウェアにプログラムされた勾配で決定されたＩＣ濃度を含有する塩基性緩衝液の割合とが、使用者によってソフトウェアにプログラムされたｐＨ勾配によって決定されるｐＨを生成する割合であるよう定義する）を使用することによりソフトウェアによって決定され；強陰イオン交換固定相、強陽イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相および弱陽イオン交換固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する少なくとも１つのカラムと；ソフトウェアであって、２つのカラムの固定相が存在する場合、ＬＣに指示し、ＬＣを制御することによって、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｐＨ勾配ＬＣ法であって、
所定初期ｐＨおよび所定初期ＩＣ濃度で、少なくとも１つの緩衝成分およびＩＣを含む溶媒でかん流された陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有する第１カラムに、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、イオン交換固定相が荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、前記適用し、結合させるステップと、
陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有する第１カラムの後に、第１と反対の電荷の陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有する第２カラムを連続して接続するステップならびに第１および第２カラム中に含有される固定相を初期ｐＨに平衡化するステップと、
マニホルド方程式を使用することによりソフトウェアによって決定される、初期ｐＨおよび初期ＩＣ濃度から開始する可変ｐＨおよび独立可変ＩＣ濃度を有する溶出剤を、第１カラムに含有されるイオン交換固定相に供給するステップであって、前記マニホルド方程式は、任意のＩＣ濃度から選択された最大濃度まで、使用者によってソフトウェアにプログラムされた勾配で決定されたＩＣ濃度を含有する酸性緩衝液の割合と、使用者によってソフトウェアにプログラムされた勾配で決定されたＩＣ濃度を含有する塩基性緩衝液の割合を、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配および独立かつ同時の未保持勾配のＩＣ濃度が維持されるために、使用者によってソフトウェアにプログラムされたｐＨ勾配によって決定されるｐＨを生成するよう定義する、前記供給するステップと；
ａ）所定最終ｐＨおよび所定ＩＣ濃度に到達するまで、荷電分子が溶出するステップであって、それぞれの分子は、その有効等電点で、第１カラム中に含有されるイオン交換固定相から、連続的に溶出するステップと、
ｂ）第１カラムから連続的に溶出した荷電分子を含有する、得られた流出物を、二次分離のために、第２カラム中に含有されるイオン交換固定相中に向けるステップと、
ｃ）所定最終ｐＨおよび所定ＩＣ濃度に到達するまで、第２カラムに含有されるイオン交換固定相と反対に荷電した荷電分子を結合させるステップと、
ｄ）ソフトウェアによって指示される場合、第１カラムを第２カラムから外すステップと、
ｅ）第２の所定初期ｐＨから第２の所定最終ｐＨを生じさせるよう、そして第２の所定初期ＩＣ濃度から所定最終ＩＣ濃度までの第２の独立勾配を同時に生じさせるよう、第２カラム中に含有されるイオン交換固定相をかん流しているｐＨ勾配を逆転させるステップと、
ｆ）第２の所定最終ｐＨおよび第２の所定最終ＩＣ濃度に到達するまで、荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子は、その有効等電点で、第２カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出する、前記収集するステップと、
ｇ）場合によって含まれていてもよい、第１カラムの後に、第１カラム中に含有される固定相と反対の電荷を有するイオン交換固定相を含有する第２カラムを連続して再接続するステップならびに第１および第２カラム中に含有されるイオン交換固定相を初期ｐＨおよび初期ＩＣ濃度に平衡化するステップと、
ｈ）対象とするすべての分子種を分離するのに必要である場合、ステップａ）〜ｇ）を繰り返すステップと
を含む方法
を実施するように構成されたソフトウェアと；
を含む方法またはシステムが提供される。
【００３０】
１つの親水性カラム、１つの疎水性カラム、同時勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、およびスタティックメモリー、およびマルチポンプＬＣ分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも４つの独立流体送達チャネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと；
酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＡと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＢと；リザーバーＲＡからの酸性緩衝液の流出を制御するポンプＡ、およびリザーバーＲＢからの塩基性緩衝液の流出を制御するポンプＢと；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバー、ＲＣと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバー、ＲＤと；リザーバーＲＣからの酸性緩衝液およびＩＣの流出を制御するポンプＣ、およびリザーバーＲＤからの塩基性緩衝液およびＩＣ溶液の流出を制御するポンプＤと；強陰イオン交換固定相、強陽イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相、弱陽イオン交換固定相および疎水性固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する少なくとも２つのカラムと；ソフトウェアであって、２つのカラムの固定相が存在し、そのうち１つが疎水性である場合、ソフトウェアが、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｐＨ勾配ＬＣ法であって、
所定初期ｐＨおよび所定初期ＩＣ濃度で、少なくとも１つの緩衝成分およびＩＣを含む溶媒でかん流された陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有する第１カラムに、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、イオン交換固定相が荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、前記適用し、結合させるステップと、
陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有する第１カラムの後に、疎水性固定相を含有する第２カラムを連続して接続するステップならびに第１および第２カラム中に含有される固定相を初期ｐＨに平衡化するステップと、
（ｉ）第１のリザーバーのペアから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する所定の酸性ｐＨの溶液を、少なくとも１つの緩衝成分を含有しＩＣを含有しない所定の酸性ｐＨの溶液と、所定ＩＣ濃度を生成するよう、連続的に混合することから形成されるか、（ｉｉ）第２のリザーバーのペアから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する所定の塩基性ｐＨの溶液を、少なくとも１つの緩衝成分を含有しＩＣを含有しない所定の塩基性ｐＨの溶液と、所定ＩＣ濃度を生成するよう、連続的に混合することから形成される、初期ｐＨおよび初期ＩＣ濃度から開始する可変ｐＨを有する溶出剤を、第１カラム中に含有されるイオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２のリザーバーのペアからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配および同時の未保持ＩＣ濃度勾配が維持される、前記供給するステップと、
ａ）所定最終ｐＨおよび最終ＩＣ濃度に到達するまで、荷電分子が溶出するステップであって、それぞれがその有効等電点で、第１カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出するステップと、
ｂ）第１カラムから連続的に溶出した荷電分子を含有する、得られた流出物を、二次分離のために、第２カラム中に含有される疎水性交換固定相中に向けるステップと、
ｃ）所定最終ｐＨに到達するまで、第２カラムに含有される疎水性交換固定相に対して十分に疎水性の、第１カラムからの荷電分子を結合させるステップと、
ｄ）第２カラムに結合しない分離された分子の分画を収集するステップと、
ｅ）ソフトウェアによって指示される場合、第１カラムを第２カラムから外すステップと、
ｆ）（ｉ）第１のリザーバーから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分と特定濃度のＷＭＯを含有する所定ｐＨの溶液を、（ｉｉ）第２のリザーバーから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分と第１のリザーバー中と異なる濃度のＷＭＯを含有する所定ｐＨの溶液と、連続的に混合することから形成される、初期ＷＭＯ濃度から開始する可変ＷＭＯ濃度を有する溶出剤を、第２カラム中に含有される疎水性固定相に供給するステップであって、第１および第２のリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有するＷＭＯ濃度勾配が維持される、前記供給するステップと、
ｇ）第２の所定最終ＷＭＯ濃度に到達するまで、荷電分子を収集するステップであって、それぞれの荷電分子は、その分子の疎水性結合自由エネルギーの変化によって、第２カラム中に含有される疎水性固定相から連続的に溶出する、前記収集するステップと、
ｈ）対象とするすべての分子種を分離するのに必要である場合、ステップａ）〜ｇ）を繰り返すステップと
を含む方法
を指示し、制御するように構成されたソフトウェアと；
を含む方法またはシステムが提供される。
【００３１】
陰イオン性および陽イオン性の２つの親水性カラムならびに１つの疎水性、同時二元勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、およびスタティックメモリー、およびマルチポンプＬＣ分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも４つの独立流体送達チャネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと；
酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＡと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＢと；リザーバーＲＡからの酸性緩衝液の流出を制御するポンプＡ、およびリザーバーＲＢからの塩基性緩衝液の流出を制御するポンプＢと；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバー、ＲＣと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバー、ＲＤと；リザーバーＲＣからの酸性緩衝液およびＩＣの流出を制御するポンプＣ、およびリザーバーＲＤからの塩基性緩衝液およびＩＣ溶液の流出を制御するポンプＤと；強陰イオン交換固定相、強陽イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相、弱陽イオン交換固定相および疎水性固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する少なくとも３つのカラムと；ソフトウェアであって、２つのカラムの親水性固定相および１つのカラムの疎水性固定相が存在する場合、ソフトウェアが、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｐＨ勾配ＬＣ法であって、
所定初期ｐＨおよび所定初期ＩＣ濃度で、少なくとも１つの緩衝成分およびＩＣを含む溶媒でかん流された陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有する第１カラムに、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、イオン交換固定相が荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、前記適用し、結合させるステップと、
陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有する第１カラムの後に、第１と反対の電荷の陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有する第２カラムを連続して接続するステップならびに第１および第２カラム中に含有される固定相を初期ｐＨに平衡化するステップと、
陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有する第２カラムの後に、疎水性固定相を含有する第３カラムを連続して接続するステップならびに第１、第２および第３カラム中に含有される固定相を初期ｐＨに平衡化するステップと、
（ｉ）第１のリザーバーのペアから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する所定の酸性ｐＨの溶液を、少なくとも１つの緩衝成分を含有しＩＣを含有しない所定の酸性ｐＨの溶液と、所定ＩＣ濃度を生成するよう、連続的に混合することから形成されるか、（ｉｉ）第２のリザーバーのペアから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する所定の塩基性ｐＨの溶液を、少なくとも１つの緩衝成分を含有しＩＣを含有しない所定の塩基性ｐＨの溶液と、所定ＩＣ濃度を生成するよう、連続的に混合することから形成される、初期ｐＨおよび初期ＩＣ濃度から開始する可変ｐＨを有する溶出剤を、第１カラム中に含有されるイオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２のリザーバーのペアからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配および独立かつ同時の未保持ＩＣ濃度勾配が維持される、前記供給するステップと、
ａ）初期ｐＨで見かけ上負に荷電した荷電分子を陰イオン固定相に結合させるステップと、
ｂ）初期ｐＨで見かけ上正に荷電した荷電分子を陽イオン固定相に結合させるステップと、
ｃ）初期ｐＨで陽イオン交換固定相または陰イオン交換固定相のいずれにも結合することができない、見かけ上中性の分子を、収集するステップと、
ｄ）見かけ上中性の分子を含有する分画を、これらが結合する疎水性固定相を含有する第３カラム上に向けるステップと、
ソフトウェアによって指示される場合、陰イオン交換固定相および陽イオン交換固定相を疎水性固定相から外すステップと、
（ｉｉｉ）ＲＣから送り出される、所定ｐＨおよび所定ＷＭＯ濃度の溶液と、（ｉｖ）Ｒｄから送り出される、所定ｐＨおよび異なる所定ＷＭＯ濃度の溶液を、連続的に混合することから形成される、時間依存性漸増疎水性を有する溶出剤を、疎水性固定相に供給するステップであって、第１および第２のリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有するＷＭＯ濃度の未保持勾配が維持される、前記供給するステップと、
疎水性カラムから溶出する分離された分子の分画を収集するステップと、
ソフトウェアによって指示される場合、陰イオン交換固定相と陽イオン交換固定相とを互いに外すステップと、
ソフトウェアによって指示される場合、陰イオン交換固定相と疎水性固定相とを互いに接続するステップと、
（ｉ）第１のリザーバーのペアから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する所定の酸性ｐＨの溶液を、少なくとも１つの緩衝成分を含有しＩＣを含有しない所定の酸性ｐＨの溶液と、所定ＩＣ濃度を生成するよう、連続的に混合することから形成されるか、（ｉｉ）第２のリザーバーのペアから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する所定の塩基性ｐＨの溶液を、少なくとも１つの緩衝成分を含有しＩＣを含有しない所定の塩基性ｐＨの溶液と、所定ＩＣ濃度を生成するよう、連続的に混合することから形成される、初期ｐＨおよび初期ＩＣ濃度から開始する可変ｐＨを有する溶出剤を、第１カラム中に含有される陰イオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２のリザーバーのペアからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配および独立かつ同時の未保持ＩＣ濃度勾配が維持される、前記供給するステップと、
所定最終最小ｐＨおよび所定最終ＷＭＯ濃度に到達するまで、それぞれの有効等電点で陰イオン交換固定相から連続的に溶出する荷電分子を、それらが結合する疎水性固定相を含有するカラムに向けるステップと、
ソフトウェアによって指示される場合、陰イオン交換固定相と疎水性固定相とを互いに外すステップと、
（ｉｉｉ）ＲＣから送り出される、所定ｐＨおよび所定ＷＭＯ濃度の溶液と、（ｉｖ）Ｒｄから送り出される、所定ｐＨおよび異なる所定ＷＭＯ濃度の溶液を、連続的に混合することから形成される、時間依存性漸増疎水性を有する溶出剤を、疎水性固定相に供給するステップであって、第１および第２の２つのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有するＷＭＯ濃度の未保持勾配が維持される、前記供給するステップと、
疎水性カラムから溶出する分離された分子の分画を収集するステップと、
ソフトウェアによって指示される場合、陽イオン交換固定相と疎水性固定相とを互いに接続するステップと、
（ｉ）第１のリザーバーのペアから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する所定の酸性ｐＨの溶液を、少なくとも１つの緩衝成分を含有しＩＣを含有しない所定の酸性ｐＨの溶液と、所定ＩＣ濃度を生成するよう、連続的に混合することから形成されるか、（ｉｉ）第２のリザーバーのペアから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する所定の塩基性ｐＨの溶液を、少なくとも１つの緩衝成分を含有しＩＣを含有しない所定の塩基性ｐＨの溶液と、所定ＩＣ濃度を生成するよう、連続的に混合することから形成される、初期ｐＨおよび初期ＩＣ濃度から開始する可変ｐＨを有する溶出剤を、第１カラム中に含有される陽イオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２のリザーバーのペアからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配および独立かつ同時の未保持ＩＣ濃度勾配が維持される、前記供給するステップと、
所定最終最大ｐＨに到達するまで、その有効等電点でそれぞれ陽イオン交換固定相から連続的に溶出する荷電分子を、それらが結合する疎水性固定相を含有するカラム上に向けるステップと、
ソフトウェアによって指示される場合、陽イオン交換固定相と疎水性固定相とを互いに外すステップと、
（ｉｉｉ）ＲＣから送り出される、所定ｐＨおよび所定ＷＭＯ濃度の溶液と、（ｉｖ）Ｒｄから送り出される、所定ｐＨおよび異なる所定ＷＭＯ濃度の溶液を、連続的に混合することから形成される、時間依存性漸増疎水性を有する溶出剤を、疎水性固定相に供給するステップであって、第１および第２の２つのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有するＷＭＯ濃度の未保持勾配が維持される、前記供給するステップと、
疎水性カラムから溶出する分離された分子の分画を収集するステップと、
を含む方法
を指示し、制御するように構成されたソフトウェアと；
を含む方法またはシステムが提供される。
【００３２】
１つの混合モードカラム、同時勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、およびスタティックメモリー、およびマルチポンプＬＣ分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも４つの独立流体送達チャネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと；
酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＡと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＢと；リザーバーＲＡからの酸性緩衝液の流出を制御するポンプＡ、およびリザーバーＲＢからの塩基性緩衝液の流出を制御するポンプＢと；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバー、ＲＣと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバー、ＲＤと；リザーバーＲＣからの酸性緩衝液およびＩＣの流出を制御するポンプＣ、およびリザーバーＲＤからの塩基性緩衝液およびＩＣの流出を制御するポンプＤと；疎水性固定相と陽イオンまたは陰イオン交換固定相のいずれかとの両方の混合物を含有するカラムと；ソフトウェアであって、１つのカラムの固定相が存在する場合、ソフトウェアが、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｐＨ勾配ＬＣ法であって、
所定初期ｐＨおよび所定初期ＩＣ濃度で、少なくとも１つの緩衝成分およびＩＣを含む溶媒でかん流された陽イオンまたは陰イオン混合モード固定相および疎水性固定相を含有するカラムに、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、荷電分子が吸着剤と反対の電荷を有するため、または荷電分子と固定相との間の疎水性力が荷電分子を固定相上に固定させるのに十分であるため、あるいはその両方であるため、荷電分子が固定相に結合する、前記適用し、結合させるステップと、
（ｉ）第１のリザーバーのペアから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する所定の酸性ｐＨの溶液を、少なくとも１つの緩衝成分を含有しＩＣを含有しない所定の酸性ｐＨの溶液と、所定ＩＣ濃度を生成するよう、連続的に混合することから形成されるか、（ｉｉ）第２のリザーバーのペアから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する所定の塩基性ｐＨの溶液を、少なくとも１つの緩衝成分を含有しＩＣを含有しない所定の塩基性ｐＨの溶液と、所定ＩＣ濃度を生成するよう、連続的に混合することから形成される、初期ｐＨおよび初期ＩＣ濃度から開始する、可変ｐＨを有する溶出剤を、カラムに含有される混合モード固定相に供給するステップであって、第１および第２のリザーバーのペアからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配および独立かつ同時の未保持ＩＣ濃度勾配が維持される、前記供給するステップと、
ａ）所定最終ｐＨおよび所定ＩＣ濃度に到達するまで、荷電分子が溶出するステップであって、それぞれの分子は、その有効等電点で、カラム中に含有される混合モード固定相から連続的に溶出するステップと、
ｂ）所定最終ｐＨおよび所定最終ＩＣ濃度に到達するまで、荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子は、その有効等電点で、カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出するステップと、
ｃ）対象とするすべての分子種を分離するのに必要であるとみなされる場合、ステップａ）〜ｂ）を繰り返すステップと
を含む方法
を指示し制御するように構成されたソフトウェアと；
を含む方法またはシステムが提供される。
【００３３】
１つの親水性カラム、同時一般化二元勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、およびスタティックメモリー、およびマルチポンプＬＣ分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも４つの独立流体送達チャネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと；
緩衝ｐＨの溶液を含有するリザーバー、ＲＡと；緩衝ｐＨの、第１のＩＣの溶液を含有するリザーバー、ＲＢと；リザーバーＲＡからの溶液の流出を制御するポンプＡ、およびリザーバーＲＢからの溶液の流出を制御するポンプＢと；緩衝ｐＨの、第２のＩＣの溶液を含有するリザーバー、ＲＣと；緩衝ｐＨの、第１のＩＣおよび第２のＩＣの溶液を含有するリザーバー、ＲＤと；リザーバーＲＣからの溶液の流出を制御するポンプＣ、およびリザーバーＲＤからの溶液の流出を制御するポンプＤと；強陰イオン交換固定相、強陽イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相および弱陽イオン交換固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する少なくとも１つのカラムと；ソフトウェアであって、１つのカラムの固定相が存在する場合、ソフトウェアが、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部二元勾配ＬＣ法であって、
所定初期ｐＨおよび所定初期濃度の第１のＩＣおよび所定初期濃度の第２のＩＣで、少なくとも１つの緩衝成分、第１のＩＣおよび第２のＩＣを含む溶媒でかん流された陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有するカラムに、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、イオン交換固定相が荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、前記適用し、結合させるステップと、
（ｉ）所定濃度の第１のＩＣを生成するよう混合された、第１のリザーバーのペアである、ＲＡから送り出される少なくとも１つの緩衝成分を有する溶液と、ＲＢから送り出される、所定濃度の第１のＩＣの、少なくとも１つの緩衝成分を含有する溶液を、（ｉｉ）所定濃度の第１のＩＣおよび所定濃度の第２のＩＣを生成するよう混合された、第２のリザーバーのペアである、ＲＣから送り出される少なくとも１つの緩衝成分と第２のＩＣを含有する溶液と、ＲＤから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分および第１のＩＣと第２のＩＣの両方を含有する溶液と、連続的に混合することから形成される、初期濃度の第１のＩＣおよび初期濃度の第２のＩＣから開始する固定ｐＨを有する溶出剤を、カラム中に含有されるイオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２のリザーバーのペアからの溶液の混合比率が変化することによって、それぞれ外部から定められる傾きを有する勾配の、第１のＩＣおよび第２のＩＣの濃度の、独立かつ同時の未保持勾配が維持される、前記供給するステップと、
ａ）所定最終所定濃度の第１のＩＣおよび所定濃度の第２のＩＣに到達するまで、荷電分子を溶出するステップであって、そのそれぞれが有効等電点で、カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出するステップと、
ｂ）所定最終濃度の第１のＩＣに到達し、かつ所定最終濃度の第２のＩＣに到達するまで、その有効等電点で、カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出する荷電分子を収集するステップと、
ｃ）対象とするすべての分子種の分離に必要であるとみなされる場合、ステップａ）〜ｂ）を繰り返すステップと
を含む方法
を指示し、制御するように構成されたソフトウェアと；
を含む方法またはシステムが提供される。
【００３４】
１つの疎水性カラム、同時一般化二元勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる有効等疎水点（ｉｓｏｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ｐｏｉｎｔ）、ＥＩＨ、を有する分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、およびスタティックメモリー、およびマルチポンプＬＣ分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも４つの独立流体送達チャネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと；
緩衝ｐＨの溶液を含有するリザーバー、ＲＡと；緩衝ｐＨの、第１のＩＣの溶液を含有するリザーバー、ＲＢと；リザーバーＲＡからの溶液の流出を制御するポンプＡ、およびリザーバーＲＢからの溶液の流出を制御するポンプＢと；緩衝ｐＨの、第２のＩＣの溶液を含有するリザーバー、ＲＣと；緩衝ｐＨの、第１のＩＣおよび第２のＩＣの溶液を含有するリザーバー、ＲＤと；リザーバーＲＣからの溶液の流出を制御するポンプＣ、およびリザーバーＲＤからの溶液の流出を制御するポンプＤと；疎水性固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有するカラムと；ソフトウェアであって、
異なる有効ＥＩＨ点を有する分子を分離するための、複合外部二元勾配ＬＣ法であって、
所定初期ｐＨおよび所定初期濃度の第１のＩＣおよび所定初期濃度の第２のＩＣで、少なくとも１つの緩衝成分、第１のＩＣおよび第２のＩＣを含む溶媒でかん流された疎水性固定相を含有するカラムに、分離される分子を適用し、結合させるステップであって、疎水性固定相は分離される分子の全てを固定化することができる、前記適用し、結合させるステップと、
（ｉ）所定濃度の第１のＩＣを生成するよう混合された、第１のリザーバーのペアである、ＲＡから送り出される少なくとも１つの緩衝成分を有する溶液と、ＲＢから送り出される、所定濃度の第１のＩＣの、少なくとも１つの緩衝成分を含有する溶液を、（ｉｉ）所定濃度の第１のＩＣおよび所定濃度の第２のＩＣを生成するよう混合された、第２のリザーバーのペアである、ＲＣから送り出される少なくとも１つの緩衝成分および第２のＩＣを含有する溶液と、ＲＤから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分および第１のＩＣと第２のＩＣの両方を含有する溶液と、連続的に混合することから形成される、初期濃度の第１のＩＣおよび初期濃度の第２のＩＣから開始する固定ｐＨを有する溶出剤を、カラム中に含有される疎水性固定相に供給するステップであって、第１および第２のリザーバーのペアからの溶液の混合比率が変化することによって、それぞれ外部から定められる傾きを有する勾配の、第１のＩＣおよび第２のＩＣの濃度の、独立かつ同時の未保持勾配が維持される、前記供給するステップと、
ａ）所定最終所定濃度の第１のＩＣおよび所定濃度の第２のＩＣに到達するまで、分子を溶出するステップであって、そのそれぞれは、そのＥＩＨでカラム中に含有される疎水性固定相から連続的に溶出するステップと、
ｂ）所定最終濃度の第１のＩＣに到達し、かつ所定最終濃度の第２のＩＣに到達するまで、そのＥＩＨでカラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出する分子を収集するステップと、
ｃ）対象とするすべての分子種の分離に必要であるとみなされる場合、ステップａ）〜ｂ）を繰り返すステップと
を含む方法
を指示し、制御するように構成されたソフトウェアと；
を含む方法またはシステムが提供される。
【００３５】
１つの親水性カラム、算術的に見積もられる同時一般化多成分勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、スタティックメモリー、およびｎ≧３のｎ勾配ＬＣ分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも２ｎ個の独立流体チャネルＡ１、Ａ２、．．．Ａ２ｎと；緩衝ｐＨの溶液を含有するリザーバー、Ｒ１；緩衝ｐＨの、第１のＩＣの溶液を含有するリザーバー、Ｒ２；リザーバーＲ１からの溶液の流出を制御するポンプＡ１、およびリザーバーＲ２からの溶液の流出を制御するポンプＡ２；ならびに緩衝ｐＨの、第２のＩＣの溶液を含有するリザーバー、Ｒ３；ならびに緩衝ｐＨの、第１のＩＣおよび第２のＩＣの溶液を含有するリザーバー、Ｒ４；リザーバーＲ３からの溶液の流出を制御するポンプＡ３、およびリザーバーＲ４からの溶液の流出を制御するポンプＡ４など、合計Ｒ２ｎのリザーバーについて同様であるリザーバーならびにポンプであって、ｎ個のうちのｍ番目のＩＣ、ＩＣｍ（ｎ≧ｍ≧１）の勾配について、そのＩＣｍを含有する、２ｎ−１個の独立したリザーバーの固有のｍ番目のサブセット、およびそのＩＣｍを含有しない、２ｎ−１個のリザーバーの相補的なｍ番目のサブセットが存在するようになっており、ＩＣの分布は、以下の数学的規則、すなわち、
第１の成分、ＩＣ１について、すべてのｊ∋２ｎ≧ｊ≧１に対してｊ  ＭＯＤ  ２＝１である場合、Ｒｊ中の［ＩＣ１］＝０であり、さもなければ、Ｒｊ中の［ＩＣ１］＝試みられている特定の分離について到達できる、最大の［ＩＣ１］、［ＩＣ１＝ｍａｘ］であり、それぞれのｍ成分∋ｎ＞ｍ≧１であり、すべてのｋ∋２ｎ／２（ｍ−１）≧ｋ≧１であるとき、ｋ  ＭＯＤ  ２＝１である場合、そして（ｋ×２（ｍ−１））≧ｊ≧（ｋ×２（ｍ−１）−（２（ｍ−１）−１））である場合、Ｒｊ＝０であり、さもなければ、Ｒｊ＝最大の［ＩＣｍ］、［ＩＣｍ＝ｍａｘ］中の［ＩＣｍ］は、試みられている特定の分離についてクロマトグラファーによって設定される
リザーバーならびにポンプと；
強陰イオン交換固定相、強陽イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相および弱陽イオン交換固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する、少なくとも１つのカラムと；ソフトウェアであって、固定相の１つのカラムが存在する場合、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｎ勾配ＬＣ法であって、
少なくとも１つの緩衝成分、第１のＩＣ、第２のＩＣ、ｎ−１番目のＩＣを含めたｎ番目までのＩＣを含む溶出剤でかん流された、陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有するカラムに、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、第１のＩＣは所定初期ｐＨおよび所定初期濃度であり、第２のＩＣは所定初期濃度であり、ｎ番目のＩＣまで所定初期濃度であり、イオン交換固定相が、荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、前記適用し、結合させるステップと、
（ｉ）所定濃度の第１のＩＣを生成するように混合された、Ｒ１から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分を含む溶液、およびリザーバーの第１のペアであるＲ２から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分を含有する、最大所定濃度の第１のＩＣを含む溶液と、（ｉｉ）所定濃度の第１のＩＣおよび所定最大濃度の第２のＩＣを生成するように混合された、Ｒ３から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分、および所定最大濃度の第２のＩＣを含有する溶液、ならびにリザーバーの第２のペアであるＲ４から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分、および所定最大濃度の第１のＩＣと所定最大濃度の第２のＩＣの両方を含有する溶液とを連続的に混合することから形成される、初期濃度の第１のＩＣおよび初期濃度の第２のＩＣから開始する、固定ｐＨを有する溶出剤を、カラム中に含有されるイオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２のペアのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、第１のＩＣおよび第２のＩＣの濃度における、独立で同時の未保持勾配を維持し、各勾配は、２つのペアからの流出物が混合されるとき、それぞれの外部から定められる傾きを有するなど、ｎ個の独立同時勾配まで同様であり、ｎ個のＩＣの混合は、以下の数学的規則、すなわち、
ｎ番目の成分については、その勾配における任意の点で、標的濃度、［ＩＣｎ，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、
Ｆｖ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ＝（［ＩＣｎ，ｔａｒｇｅｔ］／［ＩＣｎ＝ｍａｘ］）×Ｆｖ（式中、Ｆｖは全流出剤流量であり、Ｆｖ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ＝ｍａｘ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ−Ｆｖ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ＝０］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量である）であるようになっており、（ｎ−１）番目の成分については、４つの流れが存在し、２つを合わせることによってＦｖ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔを生じ、他の２つを合わせることによってＦｖ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔを生じ、したがって、（ｎ−１）番目の成分についての４つの流れのうちの最初の２つの場合、その成分の勾配における任意の点、標的濃度、［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、その結果、Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ＝（［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］／［ＩＣｎ−１，ｍａｘ］）×Ｆｖ，ｎ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｍａｘ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ−１＝０，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ，ｎ，ｔａｒｇｅｔ−Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝０，ｎ＝ｍａｘ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、同様に、（ｎ−１）番目の成分についての４つの流れのうちの他の２つの場合、その成分の勾配における任意の点、標的濃度、［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、その結果、Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ＝（［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］／［ＩＣｎ−１，ｍａｘ］）×Ｆｖ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝０］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ−１＝０，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ−Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝０，ｎ＝０］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、したがって、（ｎ−２）番目の成分については、８つの分割された流れ、すなわち、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝０，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝０，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝０，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝０，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔが存在し、（ｎ−ｍ）番目の成分（ｎ−１≧ｍ≧０）のそれぞれついては、（ｎ−ｍ）番目の成分についての勾配の標的濃度値に由来する同じ比によって定められる、２（ｍ＋１）個の分割された流れが存在する
という規則に従うようになっている、前記供給するステップと、
ａ）荷電分子を溶出するステップであって、そのそれぞれは、その有効等電点で、カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出するステップと、
ｂ）ｎ個のＩＣのそれぞれの独立所定濃度に全て到達するまで、荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子がその有効等電点で、カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出する、前記収集するステップと、
ｃ）対象とするすべての分子種の分離に必要であるとみなされる場合、ステップａ）〜ｂ）を繰り返すステップと
を含む方法を指示し、制御するように構成されたソフトウェアと
を含む方法またはシステムが提供される。
【００３６】
１つの親水性または混合モードカラム、算術的方法およびマニホルド関数法の両方によって見積もられる、同時一般化多成分勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、スタティックメモリー、およびｎ≧３のｎ勾配ＬＣ分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも２ｎ個の独立流体チャネルＡ１、Ａ２、．．．Ａ２ｎと；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有するリザーバー、Ｒ１；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有する、第１のＩＣの溶液を含有するリザーバー、Ｒ２；リザーバーＲ１からの溶液の流出を制御するポンプＡ１、およびリザーバーＲ２からの溶液の流出を制御するポンプＡ２；ならびに塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液を含有するリザーバー、Ｒ３；ならびに塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液、および第１のＩＣを含有するリザーバー、Ｒ４；リザーバーＲ３からの溶液の流出を制御するポンプＡ３、およびリザーバーＲ４からの溶液の流出を制御するポンプＡ４など、合計Ｒ２ｎのリザーバーについて同様であるリザーバーならびにポンプであって、ｎ個のうちのｍ番目のＩＣ、ＩＣｍ（ｎ≧ｍ≧１）の勾配について、そのＩＣｍを含有する、２ｎ−１個の独立したリザーバーの固有のｍ番目のサブセット、およびそのＩＣｍを含有しない、２ｎ−１個のリザーバーの相補的なサブセットが存在するようになっており、ＩＣの分布は、以下の数学的規則、すなわち、
第１の成分、ＩＣ１について、すべてのｊ∋２ｎ≧ｊ≧１に対してｊ  ＭＯＤ  ２＝１である場合、Ｒｊ中の［ＩＣ１］＝０であり、さもなければ、Ｒｊ中の［ＩＣ１］＝試みられている特定の分離について到達できる、最大の［ＩＣ１］、［ＩＣ１＝ｍａｘ］であり、それぞれのｍ成分∋ｎ＞ｍ≧１であり、すべてのｋ∋２ｎ／２（ｍ−１）≧ｋ≧１であるとき、ｋ  ＭＯＤ  ２＝１である場合、そして（ｋ×２（ｍ−１））≧ｊ≧（ｋ×２（ｍ−１）−（２（ｍ−１）−１））である場合、Ｒｊ＝０であり、さもなければ、Ｒｊ＝最大の［ＩＣｍ］、［ＩＣｍ＝ｍａｘ］中の［ＩＣｍ］は、試みられている特定の分離についてクロマトグラファーによって設定され、ｍ＝ｎである場合、２ｎ−１≧ｊ≧１について、ｍ番目の成分は、塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液であり、さもなければ、ｍ＝ｎであり、２ｎ≧ｊ≧２ｎ−１である場合、ｍ番目の成分は、酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液と第１のＩＣであるという規則に従うようになっており；ポンプＡ３は、リザーバーＲ３からの溶液の流出を制御し、ポンプＡ４は、リザーバーＲ４からの溶液の流出を制御するなど、合計Ｒ２ｎのリザーバーについて同様であり、ｎ個のうちのｍ番目のＩＣ、ＩＣｍ（ｎ≧ｍ≧１）の勾配について、そのＩＣｍを含有する、２ｎ−１個の独立したリザーバーの固有のｍ番目のサブセット、およびそのＩＣｍを含有しない、２ｎ−１個のリザーバーの相補的なサブセットが存在するようになっている
リザーバーならびにポンプと；
強陰イオン交換固定相、強陽イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相、弱陽イオン交換固定相および疎水性固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する、少なくとも１つのカラムと；ソフトウェアであって、１つの固定相のカラムが存在する場合、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｎ勾配ＬＣ法であって、
少なくとも１つの緩衝成分、第１のＩＣ、第２のＩＣ、ｎ−１番目のＩＣを含めたｎ−１番目までのＩＣを含む溶出剤でかん流された、疎水結合固定相の混合物を含むか、または含まない、陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有するカラムに、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、第１のＩＣは所定初期ｐＨおよび所定初期濃度であり、第２のＩＣは所定初期濃度であり、ｎ番目のＩＣまで所定初期濃度であり、イオン交換固定相が、荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、前記適用し、結合させるステップと、
（ｉ）所定濃度の第１のＩＣを生成するように混合された、Ｒ１から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分を含む溶液、およびリザーバーの第１のペアであるＲ２から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分を含有する、最大所定濃度の第１のＩＣを含む溶液と、（ｉｉ）所定濃度の第１のＩＣおよび所定最大濃度の第２のＩＣを生成するように混合された、Ｒ３から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分、および所定最大濃度の第２のＩＣを含有する溶液、ならびにリザーバーの第２のペアであるＲ４から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分、および所定最大濃度の第１のＩＣと所定最大濃度の第２のＩＣの両方を含有する溶液とを連続的に混合することから形成される、初期濃度の第１のＩＣおよび初期濃度の第２のＩＣから開始する、固定ｐＨを有する溶出剤を、カラム中に含有されるイオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２のペアのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、第１のＩＣおよび第２のＩＣの濃度における、独立で同時の未保持勾配を維持し、各勾配は、２つのペアからの流出物が混合されるとき、それぞれの外部から定められる傾きを有するなど、ｎ個の独立同時勾配まで同様であり、ｎ個のＩＣの混合は、以下の数学的規則、すなわち、
ｎ番目の成分については、その成分の指定されたｐＨ勾配における任意のｐＨ値、標的濃度、［ＩＣｎ，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、
Ｆｖ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｕ（ｐＨ，［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］，［ＩＣｎ−２，ｔａｒｇｅｔ］．．．［ＩＣ１，ｔａｒｇｅｔ］）×Ｆｖ（式中、Ｆｖは全流出剤流量であり、Ｆｕは、ｐＨおよびすべての他のｎ−１個のＩＣの多次元関数であり、これは、酸性緩衝液を含有する流量からなるはずであるＦｖの部分に等しく、したがって、Ｆｖ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ＝ａｃｉｄｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ−Ｆｖ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ＝ｂａｓｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量である）であるようになっており、（ｎ−１）番目の成分については、４つの流れが存在し、２つを合わせることによってＦｖ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔを生じ、他の２つを合わせることによってＦｖ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔを生じ、したがって、（ｎ−１）番目の成分についての４つの流れのうちの最初の２つの場合、その成分の勾配における任意の点、標的濃度、［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、その結果、Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝（［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］／［ＩＣｎ−１，ｍａｘ］）×Ｆｖ，ｎ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ−１＝０，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ，ｎ，ｔａｒｇｅｔ−Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝０，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、同様に、（ｎ−１）番目の成分についての４つの流れのうちの他の２つの場合、その成分の勾配における任意の点、標的濃度、［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、その結果、Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝（［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］／［ＩＣｎ−１，ｍａｘ］）×Ｆｖ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｂａｓｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ−１＝０，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ−Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝０，ｎ＝ｂａｓｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、したがって、（ｎ−２）番目の成分については、８つの分割された流れ、すなわち、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ａｃｉｃｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝０，ｎ＝ａｃｉｃｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝０，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ａｃｉｃｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝０，ｎ＝ａｃｉｃｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝０，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔが存在し、（ｎ−ｍ）番目の成分（ｎ−１≧ｍ≧０）のそれぞれついては、（ｎ−ｍ）番目の成分についての勾配の標的濃度値に由来する同じ比によって定められる、２（ｍ＋１）個の分割された流れが存在する
という規則に従うようになっている、前記供給するステップと、
ａ）荷電分子を溶出するステップであって、そのそれぞれは、その有効等電点で、カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出するステップと、
ｂ）ｎ個のＩＣのそれぞれの独立所定濃度に全て到達するまで、荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子がその有効等電点で、カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出する、前記収集するステップと、
ｃ）対象とするすべての分子種の分離に必要であるとみなされる場合、ステップａ）〜ｂ）を繰り返すステップと
を含む方法を指示し、制御するように構成されたソフトウェアと
を含む方法またはシステムが提供される。
【００３７】
１つの親水性または混合モードカラムおよび１つの疎水性カラム、算術的方法およびマニホルド関数法の両方によって見積もられる、同時一般化多成分勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、スタティックメモリー、およびｎ≧３のｎ勾配ＬＣ分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも２ｎ個の独立流体チャネルＡ１、Ａ２、．．．Ａ２ｎと；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有するリザーバー、Ｒ１；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有する、第１のＩＣの溶液を含有するリザーバー、Ｒ２；リザーバーＲ１からの溶液の流出を制御するポンプＡ１、およびリザーバーＲ２からの溶液の流出を制御するポンプＡ２；ならびに塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液を含有するリザーバー、Ｒ３；ならびに塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液、および第１のＩＣを含有するリザーバー、Ｒ４；リザーバーＲ３からの溶液の流出を制御するポンプＡ３、およびリザーバーＲ４からの溶液の流出を制御するポンプＡ４など、合計Ｒ２ｎのリザーバーについて同様であるリザーバーならびにポンプであって、ｎ個のうちのｍ番目のＩＣ、ＩＣｍ（ｎ≧ｍ≧１）の勾配について、そのＩＣｍを含有する、２ｎ−１個の独立したリザーバーの固有のｍ番目のサブセット、およびそのＩＣｍを含有しない、２ｎ−１個のリザーバーの相補的なサブセットが存在するようになっており、ＩＣの分布は、以下の数学的規則、すなわち、
第１の成分、ＩＣ１について、すべてのｊ∋２ｎ≧ｊ≧１に対してｊ  ＭＯＤ  ２＝１である場合、Ｒｊ中の［ＩＣ１］＝０であり、さもなければ、Ｒｊ中の［ＩＣ１］＝試みられている特定の分離について到達できる、最大の［ＩＣ１］、［ＩＣ１＝ｍａｘ］であり、それぞれのｍ成分∋ｎ＞ｍ≧１であり、すべてのｋ∋２ｎ／２（ｍ−１）≧ｋ≧１であるとき、ｋ  ＭＯＤ  ２＝１である場合、そして（ｋ×２（ｍ−１））≧ｊ≧（ｋ×２（ｍ−１）−（２（ｍ−１）−１））である場合、Ｒｊ＝０であり、さもなければ、Ｒｊ＝最大の［ＩＣｍ］、［ＩＣｍ＝ｍａｘ］中の［ＩＣｍ］は、試みられている特定の分離についてクロマトグラファーによって設定され、ｍ＝ｎである場合、２ｎ−１≧ｊ≧１について、ｍ番目の成分は、塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液であり、さもなければ、ｍ＝ｎであり、２ｎ≧ｊ≧２ｎ−１である場合、ｍ番目の成分は、酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液と第１のＩＣであるという規則に従うようになっており；ポンプＡ３は、リザーバーＲ３からの溶液の流出を制御し、ポンプＡ４は、リザーバーＲ４からの溶液の流出を制御するなど、合計Ｒ２ｎのリザーバーについて同様であり、ｎ個のうちのｍ番目のＩＣ、ＩＣｍ（ｎ≧ｍ≧１）の勾配について、そのＩＣｍを含有する、２ｎ−１個の独立したリザーバーの固有のｍ番目のサブセット、およびそのＩＣｍを含有しない、２ｎ−１個のリザーバーの相補的なサブセットが存在するようになっている
リザーバーならびにポンプと；
強陰イオン交換固定相、強陽イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相、弱陽イオン交換固定相および疎水性固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する、少なくとも２つのカラムと；ソフトウェアであって、２つの固定相のカラムが存在し、そのうち１つが疎水性である場合、ソフトウェアが、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｎ勾配ＬＣ法であって、
少なくとも１つの緩衝成分、第１のＩＣ、第２のＩＣ、ｎ−１番目のＩＣを含めたｎ−１番目までのＩＣを含む溶出剤でかん流された、疎水性結合固定相の混合物を含むか、または含まない、陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有する第１カラムに、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、第１のＩＣは所定初期ｐＨおよび所定初期濃度であり、第２のＩＣは所定初期濃度であり、ｎ番目のＩＣまで所定初期濃度であり、イオン交換固定相が、荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、前記適用し、結合させるステップと、
（ｉ）所定濃度の第１のＩＣを生成するように混合された、Ｒ１から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分を含む溶液、およびリザーバーの第１のペアであるＲ２から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分を含有する、最大所定濃度の第１のＩＣを含む溶液と、（ｉｉ）所定濃度の第１のＩＣおよび所定最大濃度の第２のＩＣを生成するように混合された、Ｒ３から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分、および所定最大濃度の第２のＩＣを含有する溶液、ならびにリザーバーの第２のペアであるＲ４から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分、および所定最大濃度の第１のＩＣと所定最大濃度の第２のＩＣの両方を含有する溶液とを連続的に混合することから形成される、初期濃度の第１のＩＣおよび初期濃度の第２のＩＣから開始する、固定ｐＨを有する溶出剤を、カラム中に含有されるイオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２のペアのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、第１のＩＣおよび第２のＩＣの濃度における、独立で同時の未保持勾配を維持し、各勾配は、２つのペアからの流出物が混合されるとき、それぞれの外部から定められる傾きを有するなど、ｎ個の独立同時勾配まで同様であり、ｎ個のＩＣの混合は、以下の数学的規則、すなわち、
ｎ番目の成分については、その成分の指定されたｐＨ勾配における任意のｐＨ値、標的濃度、［ＩＣｎ，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、
Ｆｖ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｕ（ｐＨ，［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］，［ＩＣｎ−２，ｔａｒｇｅｔ］．．．［ＩＣ１，ｔａｒｇｅｔ］）×Ｆｖ（式中、Ｆｖは全流出剤流量であり、Ｆｕは、ｐＨおよびすべての他のｎ−１個のＩＣの多次元関数であり、これは、酸性緩衝液を含有する流量からなるはずであるＦｖの部分に等しく、したがって、Ｆｖ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ＝ａｃｉｄｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ−Ｆｖ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ＝ｂａｓｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量である）であるようになっており、（ｎ−１）番目の成分については、４つの流れが存在し、２つを合わせることによってＦｖ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔを生じ、他の２つを合わせることによってＦｖ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔを生じ、したがって、（ｎ−１）番目の成分についての４つの流れのうちの最初の２つの場合、その成分の勾配における任意の点、標的濃度、［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、その結果、Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝（［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］／［ＩＣｎ−１，ｍａｘ］）×Ｆｖ，ｎ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ−１＝０，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ，ｎ，ｔａｒｇｅｔ−Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝０，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、同様に、（ｎ−１）番目の成分についての４つの流れのうちの他の２つの場合、その成分の勾配における任意の点、標的濃度、［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、その結果、Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝（［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］／［ＩＣｎ−１，ｍａｘ］）×Ｆｖ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｂａｓｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ−１＝０，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ−Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝０，ｎ＝ｂａｓｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、したがって、（ｎ−２）番目の成分については、８つの分割された流れ、すなわち、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ａｃｉｃｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝０，ｎ＝ａｃｉｃｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝０，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ａｃｉｃｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝０，ｎ＝ａｃｉｃｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝０，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔが存在し、（ｎ−ｍ）番目の成分（ｎ−１≧ｍ≧０）のそれぞれついては、（ｎ−ｍ）番目の成分についての勾配の標的濃度値に由来する同じ比によって定められる、２（ｍ＋１）個の分割された流れが存在する
という規則に従うようになっている、前記供給するステップと、
ａ）陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有する第１カラムの後に、疎水性固定相を含有する第２カラムを連続して接続するステップならびに初期ｐＨおよび他のｎ−１個のＩＣの初期濃度で、第１および第２カラム中に含有される固定相を平衡化するステップと、
ｂ）（ｉ）第１のペアのリザーバーから送り出され、ＩＣの所定濃度を生成するように混合された、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の酸性ｐＨを有する溶液、および少なくとも１つの緩衝成分を含有し、ＩＣを含有しない、所定の酸性ｐＨを有する溶液と、（ｉｉ）第２のペアのリザーバーから送り出され、ＩＣの所定濃度を生成するように混合された、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の塩基性ｐＨの溶液、および少なくとも１つの緩衝成分を含有し、ＩＣを含有しない、所定の塩基性ｐＨを有する溶液とを連続的に混合することから形成される、初期ｐＨおよび初期ＩＣ濃度から開始する可変ｐＨを有する溶出剤を、第１カラム中に含有されるイオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２のペアのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配およびＩＣの濃度における、独立で同時の未保持勾配が維持される、前記供給するステップと；第２のＩＣおよびｎ番目までのＩＣを用いて（ｂ）を繰り返すステップであって、直前に詳述した混合アルゴリズムに従って、第１および第２カラム内で、ｎ−１個のＩＣにおけるｎ−１個の独立勾配と独立ｐＨ勾配を生成する、前記繰り返すステップと、
ｃ）荷電分子を溶出するステップであって、そのそれぞれは、所定最終ｐＨおよび最終のｎ−１個のＩＣ濃度に到達するまでその有効等電点で、第１カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出するステップと、
ｄ）二次分離のために、第１カラムから連続的に溶出した荷電分子を含有する、得られた流出物を、第２カラム中に含有される疎水性固定相中に向けるステップと、
ｅ）所定最終ｐＨに到達するまで、十分に疎水性である、第１カラムから連続的に溶出した荷電分子を、第２カラム中に含有される疎水性固定相に結合させるステップと、
ｆ）第２カラムに結合していない、分離された分子の分画を収集するステップと、
ｇ）ソフトウェアによって指示される場合、第２カラムから第１カラムを外すステップと、
ｈ）（１ｉ）第１のペアのリザーバーから送り出され、ＩＣの所定濃度を生成するように混合された、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の酸性ｐＨを有する溶液、および少なくとも１つの緩衝成分を含有し、ＩＣを含有しない、所定の酸性ｐＨを有する溶液と、（１ｉｉ）第２のペアのリザーバーから送り出され、ＩＣの所定濃度を生成するように混合された、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の塩基性ｐＨの溶液、および少なくとも１つの緩衝成分を含有し、ＩＣを含有しない、所定の塩基性ｐＨを有する溶液とを連続的に混合することから形成される、初期ｐＨおよび初期ＩＣ濃度から開始する可変ｐＨを有する溶出剤を、第２カラム中に含有される疎水性固定相に供給するステップであって、第１および第２のペアのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配およびＩＣの濃度における、独立で同時の未保持勾配が維持される、前期供給するステップと；第２のＩＣおよびｎ番目までのＩＣを用いて（１ｉ〜１ｉｉ）を繰り返すステップであって、直前に詳述した混合アルゴリズムに従って、ｎ−１個のＩＣにおけるｎ−１個の独立勾配と独立ｐＨ勾配を生成して、合計ｎ個の独立勾配を作製する、前記繰り返すステップと、
ｉ）荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子が、ｎ−１個のＩＣのそれぞれの、ｎ−１個の所定最終濃度に到達し、所定最終ｐＨに到達するまで、その分子の疎水性結合自由エネルギーの変化によって、第２カラム中に含有される疎水性固定相から連続的に溶出する、前記収集するステップと、
ｊ）対象とするすべての分子種の分離に必要であるとみなされる場合、ステップａ）〜ｉ）を繰り返すステップと
を含む方法を指示し、制御するように構成されたソフトウェアと
を含む方法またはシステムが提供される。
【００３８】
２つの親水性カラム、同時化学的勾配、温度勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、およびスタティックメモリー、およびマルチポンプＬＣ分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも４つの独立流体送達チャネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと；
酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＡと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＢと；リザーバーＲＡからの酸性緩衝液の流出を制御するポンプＡ、およびリザーバーＲＢからの塩基性緩衝液の流出を制御するポンプＢと；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバー、ＲＣと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液およびＩＣを含有するリザーバーＲＤと；リザーバーＲＣからの酸性緩衝液とＩＣの流出を制御するポンプＣ、およびリザーバーＲＤからの塩基性緩衝液とＩＣの流出を制御するポンプＤと；強陰イオン交換固定相、強陽イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相、および弱陽イオン交換固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する少なくとも２つのカラムと；ソフトウェアであって、２つのカラムの固定相が存在し、そのうちの１つが疎水性である場合、ソフトウェアが、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｐＨ勾配ＬＣ法であって、
温度Ｔ０における測定での所定初期ｐＨおよび所定初期ＩＣ濃度で、少なくとも１つの緩衝成分およびＩＣを含む溶媒でかん流された陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相に、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、イオン交換固定相が荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、前記適用し、結合させるステップと、
陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有する第１カラムの後に、第１と反対の電荷の陽イオン性または陰イオン性イオン交換固定相を含有する第２カラムを連続して接続するステップならびに第１および第２カラム中に含有される固定相を温度Ｔ０における測定での初期ｐＨに平衡化するステップと、
（ｉ）第１のペアのリザーバーから送り出され、ＩＣの所定濃度を生成するように混合された、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有し、温度Ｔ０における測定で所定の酸性ｐＨを有する溶液と、少なくとも１つの緩衝成分を含有し、ＩＣを含有しない、温度Ｔ０における測定で所定の酸性ｐＨを有する溶液とを、（ｉｉ）第２のペアのリザーバーから送り出され、ＩＣの所定濃度を生成するように混合された、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、温度Ｔ０における測定で所定の塩基性ｐＨの溶液と、少なくとも１つの緩衝成分を含有し、ＩＣを含有しない、所定の塩基性ｐＨを有する溶液と、連続的に混合することから形成される溶出剤であって、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１５２１６（全ての目的において、参照することにより本明細書中に組み込まれる）中に教示される温度勾配法による温度Ｔ０における測定での初期ｐＨおよび初期ＩＣ濃度から開始する可変ｐＨを有する溶出剤を、第１カラムに含有されるイオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２のリザーバーのペアからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配および独立かつ同時未保持ＩＣ濃度勾配が維持され、そして両方の勾配は、温度Ｔ１から温度Ｔ２までの温度勾配に供され、ここで、温度Ｔ１は、溶出剤が固定相に入るときの固定相の温度であり、温度Ｔ２は、溶出剤が固定相から出るときの温度である（ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１５２１６中に教示される温度勾配法による）、前記供給するステップと、
ａ）温度Ｔ１から温度Ｔ２までの温度勾配（ここで、温度Ｔ１は、溶出剤が固定相に入るときの固定相の温度であり、温度Ｔ２は、溶出剤が固定相から出るときの温度である）に供された荷電分子を溶出するステップであって、そのそれぞれは、所定最終ｐＨおよび所定ＩＣ濃度に到達するまで、その有効等電点で、第１カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出するステップと、
ｂ）第１カラムから連続的に溶出した荷電分子を含有する、得られた流出物を、二次分離のために、温度Ｔ３から温度Ｔ４までの温度勾配に供された第２カラム中に含有されるイオン交換固定相中に向けるステップ（ここで、温度Ｔ３は、第１カラムの交換固定相からの流出物が第２カラムの吸着剤に入るときの第２カラム中の交換固定相の温度であり、温度Ｔ４は、第２カラムの交換体を流出物が出るときの温度であり、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１５２１６中に教示される温度勾配法による温度Ｔ０における測定での初期最大ｐＨに両方の交換体を平衡化する）と、
ｃ）所定最終ｐＨおよび所定ＩＣ濃度に到達するまで、第２カラム中に含有されるイオン交換固定相と反対に荷電された荷電粒子を結合させるステップと、
ｄ）ソフトウェアによって指示される場合、第２カラムから第１カラムを外すステップと、
ｅ）第２の所定初期ｐＨから第２の所定最終ｐＨを生じさせると同時に、第２の所定初期ＩＣ濃度から第２の所定最終ＩＣ濃度を生じさせるよう、第２カラム中に含有されるイオン交換固定相をかん流しているｐＨ勾配を逆転させるステップと、
ｆ）第２所定最終ｐＨおよび第２所定最終ＩＣ濃度に到達するまで、荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子が、その有効等電点で、温度Ｔ３から温度Ｔ４までの温度勾配に供された第２カラムに含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出する（ここで、温度Ｔ３は、第１カラムの交換固定相からの流出物が第２カラムの吸着剤に入るときの第２カラム中の交換固定相の温度であり、温度Ｔ４は、第２カラムの交換体を流出物が出るときの温度であり、温度Ｔ０における測定での初期最大ｐＨに両方の交換体を平衡化する）、前記収集するステップと、
ｇ）場合によって含まれていてもよい、第１カラムの後に、第１カラム中に含有される固定相と反対の電荷を有するイオン交換固定相を含有する第２カラムを連続して、ソフトウェアの指示により再接続するステップならびに第１および第２カラム中に含有されるイオン交換固定相を初期ｐＨに平衡化するステップと、
ｈ）対象とするすべての分子種を分離するのに必要であるとみなされる場合、ステップａ）〜ｇ）を繰り返すステップと
を含む方法
を実施するように構成されたソフトウェアと；
を含む方法またはシステムが提供される。
【００３９】
１つの陰イオン性エレクトロクロマトフォーカシング（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｓｉｎｇ）カラム
電位勾配を受ける充填イオン交換カラム中に生じる過剰温度ΔＴは、
ΔＴ＝Ｑｄ２ｃｏｌ／１６Ｋ    （式１）
（式中、Ｑは、電流がカラムを通過することによって発生するｃｍ当たりの熱であり、ｄｃｏｌは、カラムの内径であり、Ｋは、カラム中の溶液の熱伝導率である）によって与えられる。緩衝液系の熱伝導率は、ほぼ純水の熱伝導率、すなわち約．００６Ｗ×ｃｍ−１ｄｅｇ−１であり、したがって１６Ｋは、約０．１Ｗ×ｃｍ−１ｄｅｇ−１である。アルカリ性緩衝液中に添加されたＮａＯＨを含む、好ましい組のｐｌＳｅｐ緩衝液を利用する、本発明の実施形態では、充填強陰イオンおよび陽イオンカラムの抵抗は、５０Ω×ｃｍ−１で本質的に一定である。したがって、長さ２ｃｍのカラムに沿った２５ボルト×ｃｍ−１の電位勾配により、０．５アンペアの電流が生成するであろう。電力損失は、ｄ２ｃｏｌ＝０．２５ｃｍ−２、ΔＴ≒３０ｄｅｇで１２．５ワット×ｃｍ−１となるであろう。したがって、氷浴により、充填カラムの内部で、これらの電位およびおよそ周囲温度でのシステムの稼動が可能になる。
【００４０】
Ｈ＋のイオン移動度は、約４．２５×１０−１０クーロン×秒×ｇｍ−１であり、１ボルト×ｃｍ−１＝１０７×ｇｍ×ｃｍ×秒−２×クーロン−１である。したがって、ボルト×ｃｍ−１の勾配により、約４０μｍ×秒−１のＨ＋の流れが生じることになり、２５ボルト×ｃｍ−１では、約１ｍｍ×秒−１の流れが生じることになる。これは、分析ＦＰＬＣおよびＨＰＬＣカラムにおける一般的な流れに匹敵する。陰イオン交換の場合では、この初期の流れは、バルク流および電気浸透流の合計によって妨害されることになる。このシステムにおけるＨ＋流束を記述する一般的な微分方程式は、単にＦｉｃｋの第１法則の改良型であり、定常状態では、この式は、随所で一定の流束、Ｊｘに等しい。これは、
【００４１】
【数５】
2010502960.tif 000006
（式中、Ｄは核酸定数であり、ＶＢは圧力誘発流量であり、Ｖｅｅは電気浸透流量であり、ｕＨは水素イオン移動度であり、Ｅは電位勾配である）である。一般解は、
【００４２】
【数６】
2010502960.tif 000007
【００４３】
である。
【００４４】
陰イオンカラム上の最も単純な場合では、（ＶＢ＋Ｖｅｅ＋ｕＨＥ）＝（ＶＢ＋Ｖｅｅ−ｕＨ｜Ｅ｜）であり、これは、２５ボルト×ｃｍ−１に近い電位勾配で、ポンプ流量も約１ｍｍ×秒−１である場合、ゼロに接近する。この場合、定常状態のＨ＋勾配は線形である。
【００４５】
【数７】
2010502960.tif 000008
【００４６】
これは、特殊な場合では、カラムを下降する水素イオンの流れは、厳密にＦｉｃｋｉａｎ拡散であることを意味する。その場合、質量平衡により、Ｊｘ＝ＶＢ×［Ｈ＋］Ｂ、すなわち、カラムを下降する流れは、リザーバーから送り込まれるＨ＋の流れに等しいことが要求される。したがって、長さｌのカラムの流出端での定常状態濃度は、［Ｈ＋］Ｂおよび
【００４７】
【数８】
2010502960.tif 000009
となる。一般的な５０ｍｍのＦＰＬＣカラムの長さにわたって、これにより、リザーバーから送り出されているｐＨ勾配の傾きと無関係に、３ｐＨ単位を超えるｐＨの降下が生じるであろう。したがって、０．０１ｐＨ単位ＣＶ−１で変化する、入来する勾配については、ピークのシャープ化は、一桁を超えると予期されるであろう。しかし、ピークのシャープ化は、カラム中のｐＨ勾配の傾きの平方根に比例するので、これは、分解能の非常に著しい増大を、はるかに小さい電位勾配によって達成することができることを暗示し、一般的な分析ＦＰＬＣまたはＨＰＬＣカラムのカラム冷却の必要性を除き、本発明の別の実施形態をもたらす。この実施形態は、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、スタティックメモリー、およびマルチポンプクロマトグラフィー分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも２つの独立流体送達チャネルＡおよびＢと；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＡと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＢと；リザーバーＲＡからの酸性緩衝液の流出を制御するポンプＡ、およびリザーバーＲＢからの塩基性緩衝液の流出を制御するポンプＢと；強陰イオン交換固定相および弱陰イオン交換固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する、少なくとも１つのカラムと；を含み、そして、前記固定相を含有する少なくとも１つのカラムは、開口部に電極を有するか、またはＡおよびＢからの緩衝液の混合物がカラムに入る、密封されたブリッジによって開口部に接続された電極を有し；そして開口部に第２の電極を有するか、または密封されたブリッジによってカラムの流出端に接続された第２の電極を有し、その結果、コンピューター上のソフトウェアが、
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離する方法であって、
所定初期ｐＨで、少なくとも１つの緩衝成分を含む溶媒でかん流された陰イオン交換固定相に、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、このイオン交換固定相が、荷電分子の電荷と反対の電荷と、ゼロから所定最大濃度までの濃度で、非イオン性洗浄剤、イオン性洗浄剤、極性有機分子、無極性有機分子、酸、塩基、中性塩、酸性塩および塩基性塩からなる成分の群から選択される、１つのアイソクラチックな成分（以降、ＩＣと呼ぶ）とを有する、前記適用し、結合させるステップと、
流入端に対して、および入来する流出物がカラムの長さを縦断するのに必要な有限の時間のために通常存在する勾配に加えて、カラムの流出端に向かって漸増アルカリ性のカラム内にｐＨの勾配を生成するように、カラムの長手方向軸に沿って電位を発生させるステップと、
（ｉ）第１のリザーバーから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の酸性ｐＨの溶液を、（ｉｉ）第２のリザーバーから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定のアルカリ性ｐＨの溶液と連続的に混合することから形成される初期ｐＨから開始する、可変ｐＨを有する溶出剤をイオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２の２つのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、カラムの流入端で、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配が維持される、前記供給するステップと、
カラム中の電流フロー、および結果として起こるカラムの長さを通じた上昇するｐＨ勾配、およびチャネルＡとＢを通る流体送達システムを駆動するポンプによる、外部から誘発される流れと同時に起こる、関連する電気浸透流を生成するように作用する、カラムの流出端での正電位の印加を指示するステップと、
所定最終ｐＨに到達するまで荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子は、その有効等電点でイオン交換固定相から連続的に溶出する、前記収集するステップと
を含む方法
を指示し、制御する方法またはシステムを提供する。
【００４８】
１つの陽イオン性通電クロマトフォーカシングカラム
陽イオン性交換の場合では、電気的なＨ＋の流れは、バルクと電気浸透流の合計となる。この場合、定常状態のｐＨ勾配についての一般解である
【００４９】
【数９】
2010502960.tif 000010
は、指数項が莫大で非物理的な大きさであるため、実際的な重要性はない。それにもかかわらず、陰イオンカラムにおいて使用されるものと同じ大きさの電場勾配の結果として、有意な正の傾きのｐＨ勾配を形成することを予期することができ、本発明の別の実施形態をもたらす。この実施形態は、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、スタティックメモリー、およびマルチポンプクロマトグラフィー分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも２つの独立流体送達チャネルＡおよびＢと；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＡと；塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液を含有するリザーバー、ＲＢと；リザーバーＲＡからの酸性緩衝液の流出を制御するポンプＡ、およびリザーバーＲＢからの塩基性緩衝液の流出を制御するポンプＢと；強陽イオン交換固定相および弱陽イオン交換固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する、少なくとも１つのカラムと；を含み、そして、前記固定相を含有する少なくとも１つのカラムは、開口部に電極を有するか、またはＡおよびＢからの緩衝液の混合物がカラムに入る、密封されたブリッジによって開口部に接続された電極を有し；開口部に第２の電極を有するか、または密封されたブリッジによってカラムの流出端に接続された第２の電極を有し、その結果、コンピューター上のソフトウェアが、
異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離する方法であって、
所定初期ｐＨで、少なくとも１つの緩衝成分を含む溶媒でかん流された陽イオン交換固定相に、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、このイオン交換固定相が、荷電分子の電荷と反対の電荷を有し、ゼロから所定最大濃度までの濃度で、非イオン性洗浄剤、イオン性洗浄剤、極性有機分子、無極性有機分子、酸、塩基、中性塩、酸性塩および塩基性塩からなる成分の群から選択される、１つのアイソクラチックな成分（以降、ＩＣと呼ぶ）を有する、前記適用し、結合させるステップと、
流入端に対して、および入来する流出物がカラムの長さを縦断するのに必要な有限の時間のために通常存在する勾配に加えて、カラムの流出端に向かって漸増酸性のカラム内にｐＨの勾配を生成するように、カラムの長手方向軸に沿って電位を発生させるステップと、
（ｉ）第１のリザーバーから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の酸性ｐＨの溶液を、（ｉｉ）第２のリザーバーから送り出される、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定のアルカリ性ｐＨの溶液と連続的に混合することから形成される、初期ｐＨから開始する、可変ｐＨを有する溶出剤をイオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２のリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、カラムの流入端で、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配が維持される、前記供給するステップと、
カラム中の電流フロー、および結果として起こるカラムの長さを通じた上昇するｐＨ勾配、およびチャネルＡとＢを通る流体送達システムを駆動するポンプによる、外部から誘発される流れと同時に起こる、関連する電気浸透流を生成するように作用する、カラムの流出端での正電位の印加を指示するステップと、
所定最終ｐＨに到達するまで荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子は、その有効等電点でイオン交換固定相から連続的に溶出する、前記収集するステップと
を含む方法
を指示し、制御する方法またはシステムを提供する。
【００５０】
１つの陰イオン性エレクトロクロマトフォーカシングカラム、算術的に見積もられる、同時一般化多成分勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、スタティックメモリー、およびｎ≧３のｎ勾配クロマトグラフィー分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも２ｎ個の独立流体チャネルＡ１、Ａ２、．．．Ａ２ｎと；緩衝ｐＨの溶液を含有するリザーバー、Ｒ１；緩衝ｐＨの、第１のＩＣの溶液を含有するリザーバー、Ｒ２；リザーバーＲ１からの溶液の流出を制御するポンプＡ１、およびリザーバーＲ２からの溶液の流出を制御するポンプＡ２；ならびに緩衝ｐＨの、第２のＩＣ溶液を含有するリザーバー、Ｒ３；ならびに緩衝ｐＨの、第１のＩＣおよび第２のＩＣ溶液を含有するリザーバー、Ｒ４；リザーバーＲ３からの溶液の流出を制御するポンプＡ３、およびリザーバーＲ４からの溶液の流出を制御するポンプＡ４など、合計Ｒ２ｎのリザーバーについて同様であるリザーバーならびにポンプであって、ｎ個のうちのｍ番目のＩＣ、ＩＣｍ（ｎ≧ｍ≧１）の勾配について、そのＩＣｍを含有する、２ｎ−１個の独立したリザーバーの固有のｍ番目のサブセット、およびそのＩＣｍを含有しない、２ｎ−１個のリザーバーの相補的なｍ番目のサブセットが存在するようになっており、ＩＣの分布は、以下の数学的規則、すなわち、
第１の成分、ＩＣ１について、すべてのｊ∋２ｎ≧ｊ≧１に対してｊ  ＭＯＤ  ２＝１である場合、Ｒｊ中の［ＩＣ１］＝０であり、さもなければ、Ｒｊ中の［ＩＣ１］＝試みられている特定の分離について到達できる、最大の［ＩＣ１］、［ＩＣ１＝ｍａｘ］であり、それぞれのｍ成分∋ｎ＞ｍ≧１であり、すべてのｋ∋２ｎ／２（ｍ−１）≧ｋ≧１であるとき、ｋ  ＭＯＤ  ２＝１である場合、そして（ｋ×２（ｍ−１））≧ｊ≧（ｋ×２（ｍ−１）−（２（ｍ−１）−１））である場合、Ｒｊ＝０であり、さもなければ、Ｒｊ＝最大の［ＩＣｍ］、［ＩＣｍ＝ｍａｘ］中の［ＩＣｍ］は、試みられている特定の分離についてクロマトグラファーによって設定される、
リザーバーならびにポンプと；
強陰イオン交換固定相および弱陰イオン交換固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する、少なくとも１つのカラムと；ソフトウェアであって、１つの固定相のカラムが存在し、固定相を含有する少なくとも１つのカラムが、開口部における電極を有するか、または少なくとも２ｎ個の独立流体送達チャネルＡ１、Ａ２、．．．Ａ２ｎからの緩衝液の混合物がカラムに入る、密封されたブリッジによって開口部に接続された電極を有し、そして開口部における第２の電極を有するか、またはカラムの流出端に密封されたブリッジによって接続された第２の電極を有する場合、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｎ勾配クロマトグラフィー法であって、
少なくとも１つの緩衝成分、第１のＩＣ、第２のＩＣ、ｎ番目のＩＣを含めたｎ番目までのＩＣを含む溶出剤でかん流された、陰イオン性イオン交換固定相を含有するカラムに、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、第１のＩＣは所定初期ｐＨおよび所定初期濃度であり、第２のＩＣは所定初期濃度であり、ｎ番目のＩＣまで所定初期濃度であり、イオン交換固定相が、荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、前記適用し、結合させるステップと、
流入端に対して、および入来する流入物がカラムの長さを縦断するのに必要な有限の時間のために通常存在する勾配に加えて、カラムの流出端に向かって漸増アルカリ性のカラム内にｐＨの勾配を生成するように、カラムの長手方向軸に沿って電位を発生させるステップと、
（ｉ）所定濃度の第１のＩＣを生成するように混合された、Ｒ１から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分を含む溶液、およびリザーバーの第１のペアであるＲ２から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分を含有する、最大所定濃度の第１のＩＣを含む溶液と、（ｉｉ）所定濃度の第１のＩＣおよび所定最大濃度の第２のＩＣを生成するように混合された、Ｒ３から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分、および所定最大濃度の第２のＩＣを含有する溶液、ならびにリザーバーの第２のペアであるＲ４から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分、および所定最大濃度の第１のＩＣと所定最大濃度の第２のＩＣの両方を含有する溶液とを連続的に混合することから形成される、初期濃度の第１のＩＣおよび初期濃度の第２のＩＣから開始する、固定ｐＨを有する溶出剤を、カラム中に含有されるイオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２のペアのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、第１のＩＣおよび第２のＩＣの濃度における、独立で同時の未保持勾配を維持し、各勾配は、２つのペアからの流出物が混合されるとき、それぞれの外部から定められる傾きを有するなど、ｎ個の独立同時勾配まで同様であり、ｎ個のＩＣの混合は、以下の数学的規則、すなわち、
ｎ番目の成分については、その勾配における任意の点で、標的濃度、［ＩＣｎ，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、
Ｆｖ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ＝（［ＩＣｎ，ｔａｒｇｅｔ］／［ＩＣｎ＝ｍａｘ］）×Ｆｖ（式中、Ｆｖは全流出剤流量であり、Ｆｖ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ＝ｍａｘ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ−Ｆｖ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ＝０］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量である）であるようになっており、（ｎ−１）番目の成分については、４つの流れが存在し、２つを合わせることによってＦｖ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔを生じ、他の２つを合わせることによってＦｖ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔを生じ、したがって、（ｎ−１）番目の成分についての４つの流れのうちの最初の２つの場合、その成分の勾配における任意の点、標的濃度、［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、その結果、Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ＝（［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］／［ＩＣｎ−１，ｍａｘ］）×Ｆｖ，ｎ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｍａｘ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ−１＝０，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ，ｎ，ｔａｒｇｅｔ−Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝０，ｎ＝ｍａｘ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、同様に、（ｎ−１）番目の成分についての４つの流れのうちの他の２つの場合、その成分の勾配における任意の点、標的濃度、［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、その結果、Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ＝（［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］／［ＩＣｎ−１，ｍａｘ］）×Ｆｖ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝０］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ−１＝０，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ−Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝０，ｎ＝０］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、したがって、（ｎ−２）番目の成分については、８つの分割された流れ、すなわち、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝０，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝０，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝０，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝０，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔが存在し、（ｎ−ｍ）番目の成分（ｎ−１≧ｍ≧０）のそれぞれついては、（ｎ−ｍ）番目の成分についての勾配の標的濃度値に由来する同じ比によって定められる、２（ｍ＋１）個の分割された流れが存在する
という規則に従うようになっている、前記供給するステップと、
ａ）荷電分子を溶出するステップであって、そのそれぞれは、その有効等電点で、カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出するステップと、
ｂ）ｎ個のＩＣのそれぞれの独立所定濃度に全て到達するまで、荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子が、その有効等電点で、カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出する、前記収集するステップと、
ｃ）対象とするすべての分子種の分離に必要であるとみなされる場合、ステップａ）〜ｂ）を繰り返すステップと
を含む方法を指示し、制御するソフトウェアと
を含む方法またはシステムが提供される。
【００５１】
１つの陽イオン性エレクトロクロマトフォーカシングカラム、算術的に見積もられる、同時一般化多成分勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、スタティックメモリー、およびｎ≧３のｎ勾配クロマトグラフィー分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも２ｎ個の独立流体チャネルＡ１、Ａ２、．．．Ａ２ｎと；緩衝ｐＨの溶液を含有するリザーバー、Ｒ１；緩衝ｐＨの、第１のＩＣの溶液を含有するリザーバー、Ｒ２；リザーバーＲ１からの溶液の流出を制御するポンプＡ１、およびリザーバーＲ２からの溶液の流出を制御するポンプＡ２；ならびに緩衝ｐＨの、第２のＩＣの溶液を含有するリザーバー、Ｒ３；ならびに緩衝ｐＨの、第１のＩＣおよび第２のＩＣの溶液を含有するリザーバー、Ｒ４；リザーバーＲ３からの溶液の流出を制御するポンプＡ３、およびリザーバーＲ４からの溶液の流出を制御するポンプＡ４など、合計Ｒ２ｎのリザーバーについて同様であるリザーバーならびにポンプであって、ｎ個のうちのｍ番目のＩＣ、ＩＣｍ（ｎ≧ｍ≧１）の勾配について、そのＩＣｍを含有する、２ｎ−１個の独立したリザーバーの固有のｍ番目のサブセット、およびそのＩＣｍを含有しない、２ｎ−１個のリザーバーの相補的なｍ番目のサブセットが存在するようになっており、ＩＣの分布は、以下の数学的規則、すなわち、
第１の成分、ＩＣ１について、すべてのｊ∋２ｎ≧ｊ≧１に対してｊ  ＭＯＤ  ２＝１である場合、Ｒｊ中の［ＩＣ１］＝０であり、さもなければ、Ｒｊ中の［ＩＣ１］＝試みられている特定の分離について到達できる、最大の［ＩＣ１］、［ＩＣ１＝ｍａｘ］であり、それぞれのｍ成分∋ｎ＞ｍ≧１であり、すべてのｋ∋２ｎ／２（ｍ−１）≧ｋ≧１であるとき、ｋ  ＭＯＤ  ２＝１である場合、そして（ｋ×２（ｍ−１））≧ｊ≧（ｋ×２（ｍ−１）−（２（ｍ−１）−１））である場合、Ｒｊ＝０であり、さもなければ、Ｒｊ＝最大の［ＩＣｍ］、［ＩＣｍ＝ｍａｘ］中の［ＩＣｍ］は、試みられている特定の分離についてクロマトグラファーによって設定される、
リザーバーならびにポンプと；
強陽イオン交換固定相および弱陽イオン交換固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する、少なくとも１つのカラムと；ソフトウェアであって、１つの固定相のカラムが存在し、固定相を含有する少なくとも１つのカラムが、開口部における電極を有するか、または少なくとも２ｎ個の独立流体送達チャネルＡ１、Ａ２、．．．Ａ２ｎからの緩衝液の混合物がカラムに入る、密封されたブリッジによって開口部に接続された電極を有し、そして開口部における第２の電極を有するか、またはカラムの流出端に密封されたブリッジによって接続された第２の電極を有する場合、ソフトウェアが、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｎ勾配クロマトグラフィー法であって、
少なくとも１つの緩衝成分、第１のＩＣ、第２のＩＣ、ｎ番目のＩＣを含めたｎ番目までのＩＣを含む溶出剤でかん流された、陽イオン性イオン交換固定相を含有するカラムに、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、第１のＩＣは所定初期ｐＨおよび所定初期濃度であり、第２のＩＣは所定初期濃度であり、ｎ番目のＩＣまで所定初期濃度であり、イオン交換固定相が、荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、前記適用し、結合させるステップと、
流入端に対して、および入来する流出物がカラムの長さを縦断するのに必要な有限の時間のために通常存在する勾配に加えて、カラムの流出端に向かって漸増酸性のカラム内にｐＨの勾配を生成するように、カラムの長手方向軸に沿って電位を発生させるステップと、
（ｉ）所定濃度の第１のＩＣを生成するように混合された、Ｒ１から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分を含む溶液、およびリザーバーの第１のペアであるＲ２から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分を含有する、最大所定濃度の第１のＩＣを含む溶液と、（ｉｉ）所定濃度の第１のＩＣおよび所定最大濃度の第２のＩＣを生成するように混合された、Ｒ３から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分、および所定最大濃度の第２のＩＣを含有する溶液、ならびにリザーバーの第２のペアであるＲ４から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分、および所定最大濃度の第１のＩＣと所定最大濃度の第２のＩＣの両方を含有する溶液とを連続的に混合することから形成される、初期濃度の第１のＩＣおよび初期濃度の第２のＩＣから開始する、固定ｐＨを有する溶出剤を、カラム中に含有されるイオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２のペアのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、第１のＩＣおよび第２のＩＣの濃度における、独立で同時の未保持勾配を維持し、各勾配は、２つのペアからの流出物が混合されるとき、それぞれの外部から定められる傾きを有するなど、ｎ個の独立同時勾配まで同様であり、ｎ個のＩＣの混合は、以下の数学的規則、すなわち、
ｎ番目の成分については、その勾配における任意の点、標的濃度、［ＩＣｎ，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、
Ｆｖ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ＝（［ＩＣｎ，ｔａｒｇｅｔ］／［ＩＣｎ＝ｍａｘ］）×Ｆｖ（式中、Ｆｖは全流出剤流量であり、Ｆｖ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ＝ｍａｘ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ−Ｆｖ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ＝０］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量である）であるようになっており、（ｎ−１）番目の成分については、４つの流れが存在し、２つを合わせることによってＦｖ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔを生じ、他の２つを合わせることによってＦｖ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔを生じ、したがって、（ｎ−１）番目の成分についての４つの流れのうちの最初の２つの場合、その成分の勾配における任意の点、標的濃度、［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、その結果、Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ＝（［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］／［ＩＣｎ−１，ｍａｘ］）×Ｆｖ，ｎ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｍａｘ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ−１＝０，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ，ｎ，ｔａｒｇｅｔ−Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝０，ｎ＝ｍａｘ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、同様に、（ｎ−１）番目の成分についての４つの流れのうちの他の２つの場合、その成分の勾配における任意の点、標的濃度、［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、その結果、Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ＝（［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］／［ＩＣｎ−１，ｍａｘ］）×Ｆｖ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝０］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ−１＝０，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ−Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝０，ｎ＝０］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、したがって、（ｎ−２）番目の成分については、８つの分割された流れ、すなわち、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝０，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝０，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝０，ｎ＝ｍａｘ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝０，ｎ＝０，ｔａｒｇｅｔが存在し、（ｎ−ｍ）番目の成分（ｎ−１≧ｍ≧０）のそれぞれついては、（ｎ−ｍ）番目の成分についての勾配の標的濃度値に由来する同じ比によって定められる、２（ｍ＋１）個の分割された流れが存在する
という規則に従うようになっている、前記供給するステップと、
ａ）荷電分子を溶出するステップであって、そのそれぞれは、その有効等電点で、カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出するステップと、
ｂ）ｎ個のＩＣのそれぞれの独立所定濃度に全て到達するまで、荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子が、その有効等電点で、カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出する、前記収集するステップと、
ｃ）対象とするすべての分子種の分離に必要である場合、ステップａ）〜ｂ）を繰り返すステップと
を含む方法を指示し、制御するソフトウェアと
を含む方法またはシステムが提供される。
【００５２】
１つのイオン交換エレクトロクロマトフォーカシングカラム、算術的方法およびマニホルド関数法の両方によって見積もられる、同時一般化多成分勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、スタティックメモリー、および可変電気勾配を有する、ｎ≧３のｎ勾配クロマトグラフィー分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも２ｎ個の独立流体チャネルＡ１、Ａ２、．．．Ａ２ｎと；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有するリザーバー、Ｒ１；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有する、第１のＩＣの溶液を含有するリザーバー、Ｒ２；リザーバーＲ１からの溶液の流出を制御するポンプＡ１、およびリザーバーＲ２からの溶液の流出を制御するポンプＡ２；ならびに塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液を含有するリザーバー、Ｒ３；ならびに塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液、および第１のＩＣを含有するリザーバー、Ｒ４；リザーバーＲ３からの溶液の流出を制御するポンプＡ３、およびリザーバーＲ４からの溶液の流出を制御するポンプＡ４など、合計Ｒ２ｎのリザーバーについて同様であるリザーバーならびにポンプであって、ｎ個のうちのｍ番目のＩＣ、ＩＣｍ（ｎ≧ｍ≧１）の勾配について、そのＩＣｍを含有する、２ｎ−１個の独立したリザーバーの固有のｍ番目のサブセット、およびそのＩＣｍを含有しない、２ｎ−１個のリザーバーの相補的なサブセットが存在するようになっており、ＩＣの分布は、以下の数学的規則、すなわち、
第１の成分、ＩＣ１について、すべてのｊ∋２ｎ≧ｊ≧１に対してｊ  ＭＯＤ  ２＝１である場合、Ｒｊ中の［ＩＣ１］＝０であり、さもなければ、Ｒｊ中の［ＩＣ１］＝試みられている特定の分離について到達できる、最大の［ＩＣ１］、［ＩＣ１＝ｍａｘ］であり、それぞれのｍ成分∋ｎ＞ｍ≧１であり、すべてのｋ∋２ｎ／２（ｍ−１）≧ｋ≧１であるとき、ｋ  ＭＯＤ  ２＝１である場合、そして（ｋ×２（ｍ−１））≧ｊ≧（ｋ×２（ｍ−１）−（２（ｍ−１）−１））である場合、Ｒｊ＝０であり、さもなければ、Ｒｊ＝最大の［ＩＣｍ］、［ＩＣｍ＝ｍａｘ］中の［ＩＣｍ］は、試みられている特定の分離についてクロマトグラファーによって設定され、ｍ＝ｎである場合、２ｎ−１≧ｊ≧１について、ｍ番目の成分は、塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからの塩基性緩衝液であり、さもなければ、ｍ＝ｎであり、２ｎ≧ｊ≧２ｎ−１である場合、ｍ番目の成分は、酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからの酸性緩衝液と第１のＩＣであるという規則に従うようになっており、
ポンプＡ３は、リザーバーＲ３からの溶液の流出を制御し、ポンプＡ４は、リザーバーＲ４からの溶液の流出を制御するなど、合計Ｒ２ｎのリザーバーについて同様であり、ｎ個のうちのｍ番目のＩＣ、ＩＣｍ（ｎ≧ｍ≧１）の勾配について、そのＩＣｍを含有する、２ｎ−１個の独立したリザーバーの固有のｍ番目のサブセット、およびそのＩＣｍを含有しない、２ｎ−１個のリザーバーの相補的なサブセットが存在するようになっている
リザーバーならびにポンプと；
強陰イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相、強陽イオン交換固定相および弱陽イオン交換固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有するカラムと；ソフトウェアであって、１つのイオン性固定相のカラムが存在し、イオン交換固定相を含有する少なくとも１つのカラムが、開口部における電極を有するか、または少なくとも２ｎ個の独立流体送達チャネルＡ１、Ａ２、．．．Ａ２ｎからの緩衝液の混合物がカラムに入る、密封されたブリッジによって開口部に接続された電極を有し、そして開口部における第２の電極を有するか、またはカラムの流出端に密封されたブリッジによって接続された第２の電極を有する場合、ソフトウェアが、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｎ勾配クロマトグラフィー法であって、
少なくとも１つの緩衝成分、第１のＩＣ、第２のＩＣ、ｎ−１番目のＩＣを含めたｎ−１番目までのＩＣを含む溶出剤でかん流されたイオン交換固定相を含有するカラムに、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、第１のＩＣは所定初期ｐＨおよび所定初期濃度であり、第２のＩＣは所定初期濃度であり、ｎ番目のＩＣまで所定初期濃度であり、イオン交換固定相が、荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、前記適用し、結合させるステップと、
流入端に対して、および入来する流出物がカラムの長さを縦断するのに必要な有限の時間のために通常存在する勾配に加えて、イオン交換固定相が陰イオン交換体である場合には、カラムの流出端に向かって漸増アルカリ性のカラム内のｐＨの勾配を生成するように、カラムの長手方向軸に沿って電位を発生させ、または、イオン交換固定相が陽イオン交換体である場合には、カラムの流出端に向かって漸減アルカリ性のカラム内のｐＨの勾配を生成するように、カラムの長手方向軸に沿って電位を発生させるステップと、
を含む方法を指示し、制御するソフトウェアと
を含む方法またはシステムが提供される。
【００５３】
１つの親水性または混合モード陰イオン性通電クロマトフォーカシングカラム、および１つの疎水性カラム、算術的方法およびマニホルド関数法の両方によって見積もられる、同時一般化多成分勾配
本発明のさらに別の実施形態では、異なる等電点を有する荷電分子をクロマトグラフィーで分離するための方法またはシステムであって、
ＣＰＵ、ダイナミックメモリー、スタティックメモリー、および可変電気勾配を有する、ｎ≧３のｎ勾配クロマトグラフィー分離システムの動作を制御するソフトウェアを含むコンピューターと；
コンピューター上で動作するソフトウェアによって独立に制御される流体送達速度を有する、少なくとも２ｎ個の独立流体チャネルＡ１、Ａ２、．．．Ａ２ｎと；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有するリザーバー、Ｒ１；酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される酸性緩衝液を含有する、第１のＩＣの溶液を含有するリザーバー、Ｒ２；リザーバーＲ１からの溶液の流出を制御するポンプＡ１、およびリザーバーＲ２からの溶液の流出を制御するポンプＡ２；ならびに塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液を含有するリザーバー、Ｒ３；ならびに塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからなる群から選択される塩基性緩衝液、および第１のＩＣを含有するリザーバー、Ｒ４；リザーバーＲ３からの溶液の流出を制御するポンプＡ３、およびリザーバーＲ４からの溶液の流出を制御するポンプＡ４など、合計Ｒ２ｎのリザーバーについて同様であるリザーバーならびにポンプであって、ｎ個のうちのｍ番目のＩＣ、ＩＣｍ（ｎ≧ｍ≧１）の勾配について、そのＩＣｍを含有する、２ｎ−１個の独立したリザーバーの固有のｍ番目のサブセット、およびそのＩＣｍを含有しない、２ｎ−１個のリザーバーの相補的なサブセットが存在するようになっており、ＩＣの分布は、以下の数学的規則、すなわち、
第１の成分、ＩＣ１について、すべてのｊ∋２ｎ≧ｊ≧１に対してｊ  ＭＯＤ  ２＝１である場合、Ｒｊ中の［ＩＣ１］＝０であり、さもなければ、Ｒｊ中の［ＩＣ１］＝試みられている特定の分離について到達できる、最大の［ＩＣ１］、［ＩＣ１＝ｍａｘ］であり、それぞれのｍ成分∋ｎ＞ｍ≧１であり、すべてのｋ∋２ｎ／２（ｍ−１）≧ｋ≧１であるとき、ｋ  ＭＯＤ  ２＝１である場合、そして（ｋ×２（ｍ−１））≧ｊ≧（ｋ×２（ｍ−１）−（２（ｍ−１）−１））である場合、Ｒｊ＝０であり、さもなければ、Ｒｊ＝最大の［ＩＣｍ］、［ＩＣｍ＝ｍａｘ］中の［ＩＣｍ］は、試みられている特定の分離についてクロマトグラファーによって設定され、ｍ＝ｎである場合、２ｎ−１≧ｊ≧１について、ｍ番目の成分は、塩基性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからの塩基性緩衝液であり、さもなければ、ｍ＝ｎであり、２ｎ≧ｊ≧２ｎ−１である場合、ｍ番目の成分は、酸性ｐｌＳｅｐ緩衝液のクラスからの酸性緩衝液と第１のＩＣであるという規則に従うようになっており、
ポンプＡ３は、リザーバーＲ３からの溶液の流出を制御し、ポンプＡ４は、リザーバーＲ４からの溶液の流出を制御するなど、合計Ｒ２ｎのリザーバーについて同様であり、ｎ個のうちのｍ番目のＩＣ、ＩＣｍ（ｎ≧ｍ≧１）の勾配について、そのＩＣｍを含有する、２ｎ−１個の独立したリザーバーの固有のｍ番目のサブセット、およびそのＩＣｍを含有しない、２ｎ−１個のリザーバーの相補的なサブセットが存在するようになっている
リザーバーならびにポンプと；
強陰イオン交換固定相、弱陰イオン交換固定相、および疎水性固定相からなる固定相の群から選択される固定相を含有する、少なくとも２つのカラムと；ソフトウェアであって、１つの陰イオン性固定相のカラムが存在し、陰イオン交換固定相を含有する少なくとも１つのカラムが、開口部における電極を有するか、または少なくとも２ｎ個の独立流体送達チャネルＡ１、Ａ２、．．．Ａ２ｎからの緩衝液の混合物がカラムに入る、密封されたブリッジによって開口部に接続された電極を有し、そして開口部における第２の電極を有するか、またはカラムの流出端に密封されたブリッジによって接続された第２の電極を有する場合、
異なる等電点を有する荷電分子を分離するための、複合外部ｎ勾配クロマトグラフィー法であって、
少なくとも１つの緩衝成分、第１のＩＣ、第２のＩＣ、ｎ−１番目のＩＣを含めたｎ−１番目までのＩＣを含む溶出剤でかん流された、疎水性固定相の混合物を含むか、または含まない、陰イオン性イオン交換固定相を含有する第１カラムに、分離される荷電分子を適用し、結合させるステップであって、第１のＩＣは所定初期ｐＨおよび所定初期濃度であり、第２のＩＣは所定初期濃度であり、ｎ番目のＩＣまで所定初期濃度であり、イオン交換固定相が、荷電分子の電荷と反対の電荷を有する、前記適用し、結合させるステップと、
流入端に対して、および入来する流出物がカラムの長さを縦断するのに必要な有限の時間のために通常存在する勾配に加えて、カラムの流出端に向かって漸増アルカリ性のカラム内にｐＨの勾配を生成するように、カラムの長手方向軸に沿って電位を発生させるステップと、
（ｉ）所定濃度の第１のＩＣを生成するように混合された、Ｒ１から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分を含む溶液、およびリザーバーの第１のペアであるＲ２から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分を含有する、最大所定濃度の第１のＩＣを含む溶液と、（ｉｉ）所定濃度の第１のＩＣおよび所定最大濃度の第２のＩＣを生成するように混合された、Ｒ３から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分、および所定最大濃度の第２のＩＣを含有する溶液、ならびにリザーバーの第２のペアであるＲ４から送り出される、少なくとも１つの緩衝成分、および所定最大濃度の第１のＩＣと所定最大濃度の第２のＩＣの両方を含有する溶液とを連続的に混合することから形成される、初期濃度の第１のＩＣおよび初期濃度の第２のＩＣから開始する、固定ｐＨを有する溶出剤を、カラム中に含有されるイオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２のペアのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、第１のＩＣおよび第２のＩＣの濃度における、独立で同時の未保持勾配を維持し、各勾配は、２つのペアからの流出物が混合されるとき、それぞれの外部から定められる傾きを有するなど、ｎ個の独立同時勾配まで同様であり、ｎ個のＩＣの混合は、以下の数学的規則、すなわち、
ｎ番目の成分については、その成分の指定されたｐＨ勾配における任意のｐＨ値、標的濃度、［ＩＣｎ，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、
Ｆｖ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｕ（ｐＨ，［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］，［ＩＣｎ−２，ｔａｒｇｅｔ］．．．［ＩＣ１，ｔａｒｇｅｔ］）×Ｆｖ（式中、Ｆｖは全流出剤流量であり、Ｆｕは、ｐＨおよびすべての他のｎ−１個のＩＣの多次元関数であり、これは、酸性緩衝液を含有する流量からなるはずであるＦｖの部分に等しく、したがって、Ｆｖ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ＝ａｃｉｄｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ−Ｆｖ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ＝ｂａｓｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量である）であるようになっており、（ｎ−１）番目の成分については、４つの流れが存在し、２つを合わせることによってＦｖ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔを生じ、他の２つを合わせることによってＦｖ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔを生じ、したがって、（ｎ−１）番目の成分についての４つの流れのうちの最初の２つの場合、その成分の勾配における任意の点、標的濃度、［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、その結果、Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝（［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］／［ＩＣｎ−１，ｍａｘ］）×Ｆｖ，ｎ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ−１＝０，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ，ｎ，ｔａｒｇｅｔ−Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝０，ｎ＝ａｃｉｄｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、同様に、（ｎ−１）番目の成分についての４つの流れのうちの他の２つの場合、その成分の勾配における任意の点、標的濃度、［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］と関連しており、その結果、Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝（［ＩＣｎ−１，ｔａｒｇｅｔ］／［ＩＣｎ−１，ｍａｘ］）×Ｆｖ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｂａｓｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、Ｆｖ，ｎ−１＝０，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ＝Ｆｖ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ−Ｆｖ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔは、［ＩＣｎ−１＝０，ｎ＝ｂａｓｉｃ］を含有するすべてのリザーバーの流量を合わせることによって寄与される全流量であり、したがって、（ｎ−２）番目の成分については、８つの分割された流れ、すなわち、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ａｃｉｃｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝０，ｎ＝ａｃｉｃｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝ｍａｘ，ｎ−１＝０，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ａｃｉｃｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝０，ｎ＝ａｃｉｃｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝ｍａｘ，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔ、Ｆｖ，ｎ−２＝０，ｎ−１＝０，ｎ＝ｂａｓｉｃ，ｔａｒｇｅｔが存在し、（ｎ−ｍ）番目の成分（ｎ−１≧ｍ≧０）のそれぞれついては、（ｎ−ｍ）番目の成分についての勾配の標的濃度値に由来する同じ比によって定められる、２（ｍ＋１）個の分割された流れが存在する
という規則に従うようになっている、前記供給するステップと、
ａ）陰イオン性イオン交換固定相を含有する第１カラムの後に、疎水性固定相を含有する第２カラムを連続して接続するステップならびに初期ｐＨおよび他のｎ−１個のＩＣの初期濃度で、第１および第２カラム中に含有される固定相を平衡化するステップと、
ｂ）（ｉ）第１のペアのリザーバーから送り出され、ＩＣの所定濃度を生成するように混合された、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の酸性ｐＨを有する溶液、および少なくとも１つの緩衝成分を含有し、ＩＣを含有しない、所定の酸性ｐＨを有する溶液と、（ｉｉ）第２のペアのリザーバーから送り出され、ＩＣの所定濃度を生成するように混合された、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の塩基性ｐＨの溶液、および少なくとも１つの緩衝成分を含有し、ＩＣを含有しない、所定の塩基性ｐＨを有する溶液とを連続的に混合することから形成される、初期ｐＨおよび初期ＩＣ濃度から開始する可変ｐＨを有する溶出剤を、第１カラム中に含有されるイオン交換固定相に供給するステップであって、第１および第２のペアのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配およびＩＣの濃度における、独立で同時の未保持勾配が維持される、前記供給するステップと；第２のＩＣおよびｎ番目までのＩＣを用いて（ｂ）を繰り返すステップであって、直前に詳述した混合アルゴリズムに従って、第１および第２カラム内で、ｎ−１個のＩＣにおけるｎ−１個の独立勾配と独立ｐＨ勾配を生成する、前記繰り返すステップと、
ｃ）荷電分子を溶出するステップであって、そのそれぞれは、所定最終ｐＨおよび最終のｎ−１個のＩＣ濃度に到達するまでその有効等電点で、第１カラム中に含有されるイオン交換固定相から連続的に溶出するステップと、
ｄ）二次分離のために、第１カラムから連続的に溶出した荷電分子を含有する、得られた流出物を、第２カラム中に含有される疎水性固定相中に向けるステップと、
ｅ）十分に疎水性である、第１カラムから連続的に溶出した荷電分子を、所定最終ｐＨに到達するまで、第２カラム中に含有される疎水性固定相に結合させるステップと、
ｆ）第２カラムに結合していない、分離された分子の分画を収集するステップと、
ｇ）ソフトウェアによって指示される場合、第２カラムから第１カラムを外すステップと、
ｈ）（１ｉ）第１のペアのリザーバーから送り出され、ＩＣの所定濃度を生成するように混合された、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の酸性ｐＨを有する溶液、および少なくとも１つの緩衝成分を含有し、ＩＣを含有しない、所定の酸性ｐＨを有する溶液と、（１ｉｉ）第２のペアのリザーバーから送り出され、ＩＣの所定濃度を生成するように混合された、少なくとも１つの緩衝成分とＩＣを含有する、所定の塩基性ｐＨの溶液、および少なくとも１つの緩衝成分を含有し、ＩＣを含有しない、所定の塩基性ｐＨを有する溶液とを連続的に混合することから形成される、初期ｐＨおよび初期ＩＣ濃度から開始する可変ｐＨを有する溶出剤を、第２カラム中に含有される疎水性固定相に供給するステップであって、第１および第２のペアのリザーバーからの溶液の混合比率が変化することによって、外部から定められる傾きを有する未保持ｐＨ勾配およびＩＣの濃度における、独立で同時の未保持勾配が維持される、前期供給するステップと；第２のＩＣおよびｎ番目までのＩＣを用いて（１ｉ〜１ｉｉ）を繰り返すステップであって、直前に詳述した混合アルゴリズムに従って、ｎ−１個のＩＣにおけるｎ−１個の独立勾配と独立ｐＨ勾配を生成して、合計ｎ個の独立勾配を作製する、前記繰り返すステップと、
ｉ）荷電分子を収集するステップであって、それぞれの分子が、ｎ−１個のＩＣのそれぞれの、ｎ−１個の所定最終濃度に到達し、所定最終ｐＨに到達するまで、その分子の疎水性結合自由エネルギーの変化によって、第２カラム中に含有される疎水性固定相から連続的に溶出する、前記収集するステップと、
ｊ）対象とするすべての分子種の分離に必要であるとみなされる場合、ステップａ）〜ｉ）を繰り返すステップと
を含む方法を指示し、制御するように構成されたソフトウェアと
を含む方法またはシステムが提供される。
【図１】
2010502960.tif 000011
【図２】
2010502960.tif 000012
【図３】
2010502960.tif 000013
【図４】
2010502960.tif 000014
【図５Ａ】
2010502960.tif 000015
【図５Ｂ】
2010502960.tif 000016
【国際調査報告】
2010502960.tif 000017