(57)【要約】  本発明者らは、短いオリゴヌクレオチドから二本鎖ＤＮＡを合成するための一体型マイクロ流体デバイスの製造を報告する。本発明者らは、マイクロ流体デバイス上で、１段階及び２段階合成プロセスの両方を使用して、３９個のオリゴヌクレオチドのプールから７６０ｂｐ遺伝子セグメントの合成に成功したことを実証する。本発明者らはまた、全て同じデバイス上での二本鎖ＤＮＡ  ＰＣＲ産物の精製及び二本鎖ＤＮＡ産物中のシーケンスエラーのフィルター除去も記述する。【選択図】  図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）チャンバに制御可能に流体連通するＰＣＲアセンブリ（ＰＣＡ）チャンバを備えるマイクロ流体デバイスにおいて二本鎖ＤＮＡを合成するための方法であって、
（ａ）複数の異なるオリゴヌクレオチド及びポリメラーゼを含有するＰＣＡチャンバに時間変動する温度場を印加するステップであって、各オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドに部分的な塩基相補性を有し、それによって末端ＰＣＲプライマーの非存在下でオリゴヌクレオチドをＰＣＲ用の鋳型にアセンブリするステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において作製された鋳型を、末端ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ及びポリメラーゼを含むＰＣＲプレカーサーミックスの存在下でＰＣＲチャンバにロードするステップと、
（ｃ）ＰＣＲチャンバに時間変動する温度場を印加し、それによって二本鎖ＤＮＡを含むＰＣＲ産物混合物を得るステップと
を含む、方法。
【請求項２】
デバイスが、ＰＣＲチャンバに制御可能に流体連通する精製チャンバを更に備え、
（ｄ）ＰＣＲ産物混合物を精製チャンバ中にロードして、二本鎖ＤＮＡを固定し、それによって二本鎖ＤＮＡを遊離ｄＮＴＰ、プライマー及び重合していないオリゴヌクレオチドから分離するステップ
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
二本鎖ＤＮＡが磁気ビーズ上に固定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ビーズ固定化ＤＮＡを６０℃で３分間の熱ショック条件に供することによって、二本鎖ＤＮＡを磁気ビーズから抽出するステップを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
デバイスが、精製チャンバに制御可能に流体連通するエラーフィルター処理チャンバを更に備え、
（ｅ）ステップ（ｄ）において作製された二本鎖ＤＮＡをエラーフィルターチャンバ中にロードして、塩基対ミスマッチを含有する二本鎖ＤＮＡを除去するステップ
を更に含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
デバイスが、ＰＣＡチャンバに制御可能に流体連通する精製チャンバを更に備え、
（ｄ）ステップ（ａ）において作製された鋳型を精製チャンバ中にロードして、鋳型を固定し、それによって鋳型を遊離ｄＮＴＰ及び重合していないオリゴヌクレオチドから分離し、その後ステップ（ｂ）に進むステップ
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
鋳型が磁気ビーズ上に固定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ビーズ固定化鋳型を６０℃で３分間の熱ショック条件に供することによって、鋳型を磁気ビーズから抽出するステップを更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
デバイスが、精製チャンバに制御可能に流体連通するエラーフィルター処理チャンバを更に備え、
（ｅ）ステップ（ｄ）において作製された鋳型をエラーフィルターチャンバ中にロードして、塩基対ミスマッチを含有する鋳型を除去し、その後ステップ（ｂ）に進むステップ
を更に含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
デバイスがマイクロミキサを更に含み、
ステップ（ｂ）において、ＰＣＲプレカーサーミックスをステップ（ａ）において作製された鋳型と混合するステップ、及び／又は
ステップ（ｄ）において、ＰＣＲ産物混合物をＤＮＡ吸着固相媒体と混合するステップ
を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
精製チャンバに制御可能に流体連通する合成チャンバを備えるマイクロ流体デバイスにおいて二本鎖ＤＮＡを合成するための方法であって、
（ａ）末端ＰＣＲプライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及び複数の異なるオリゴヌクレオチドを含有する合成チャンバに時間変動する温度場を印加するステップであって、各オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドに部分的な塩基相補性を有し、それによって二本鎖ＤＮＡを含むＰＣＲ産物混合物を得るステップと、
（ｂ）ＰＣＲ産物混合物を精製チャンバ中にロードして、二本鎖ＤＮＡを固定し、それによって二本鎖ＤＮＡを遊離ｄＮＴＰ、プライマー及び重合していないオリゴヌクレオチドから分離するステップと
を含む、方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）において二本鎖ＤＮＡが磁気ビーズ上に固定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ビーズ固定化ＤＮＡを６０℃、３分間の熱ショック条件に供することによって、二本鎖ＤＮＡを磁気ビーズから抽出するステップを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
デバイスが、精製チャンバに制御可能に流体連通するエラーフィルター処理チャンバを更に備え、
（ｃ）ステップ（ｂ）において作製された二本鎖ＤＮＡをエラーフィルターチャンバ中にロードして、塩基対ミスマッチを含有する二本鎖ＤＮＡを除去するステップ
を更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
デバイスがマイクロミキサを更に含み、ステップ（ｂ）においてＰＣＲ産物混合物をＤＮＡ吸着固相媒体と混合するステップを更に含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
デバイスが流体フローアクチュエータに作動可能に連結されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
流体フローアクチュエータがポンプ又は遠心機である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
弁を備えるチャネルを介してチャンバが互いに制御可能に流体連通する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
弁が温度変化に反応性であり、ＰＣＲチャンバのシーリングを制御する弁が少なくとも６．８ｐｓｉの圧力に耐えることができる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
デバイスが加熱素子、冷却素子、温度センサ、及び温度調節器に作動可能に連結されている、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の参照］
本出願は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、２００７年８月７日に出願された米国特許仮出願第６０／９６３６７３号明細書の利益を主張する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、遺伝子合成、特に、マイクロ流体デバイス上で直接短いオリゴヌクレオチドから二本鎖ＤＮＡを合成するための方法及びシステムに関する。
【０００３】
［発明の背景］
一体型マイクロチップを用いたＰＣＲは、ラボオンチップ技術を使用して構築された。こうした技術及びマイクロＰＣＲの応用が概説されている（Ａｕｒｏｕｘら、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００４年、４巻、５３４頁；Ｚｈａｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｄｖ．、２００６年、２４巻２４３頁；Ｃｈｅｎら、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００７年、７巻、１４１３頁；Ｚｈａｎｇ及びＸｉｎｇ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００７年、３５巻、４２２３頁）。
【０００４】
Ｋｏｎｇら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００７年、３５（８）：ｅ６１、ｅ−ｐｕｂ  ２００７年４月２日、及び米国特許出願公開第２００７／０２８１３０９号明細書）は、同一のチャンバにおいて１回の反応でプレカーサーオリゴヌクレオチドをアセンブリすること及びアセンブリした鋳型を増幅することによるｄｅ  ｎｏｖｏ遺伝子合成のためのマルチチャンバマイクロ流体デバイスの製造を記述している。
【０００５】
［発明の概要］
本発明者らはここで、オリゴヌクレオチドのプールを所望のコード配列を有する遺伝子にアセンブリするための２段階遺伝子合成を実行することができる一体型マイクロ流体デバイスの本発明者らの例証に一部基づく（がこれに限定されるわけではない）発明を記述する。デバイスは、２つのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、温度制御されるハイドロゲル弁、電磁マイクロミキサ、シャトルマイクロミキサ、流量計、及び磁気ビーズを用いる固相ＰＣＲ精製から構成され、リソグラフィ工程なしで高速プロトタイプ法を使用して製造される。製造されたデバイスは、遺伝子合成を実行するために小型サーマルサイクラーと組み合わされる。まず、オリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖アセンブリ（ＰＣＡ）によって遺伝子にアセンブリし、完全長遺伝子を二次ＰＣＲによって増幅させた。合成された遺伝子は更に、固相ＰＣＲ精製によってＰＣＲ反応混合物から分離された。
【０００６】
したがって、本発明者らの発明の一態様は、マイクロ流体デバイスにおいて二本鎖ＤＮＡを合成するための２段階法に関する。本態様において、デバイスは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）チャンバに制御可能に流体連通するＰＣＲアセンブリ（ＰＣＡ）チャンバを備える。本方法は、（ａ）複数の異なるオリゴヌクレオチド及びポリメラーゼを含有するＰＣＡチャンバに時間変動する温度場を印加するステップであって、各オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドに部分的な塩基相補性を有し、それにより末端ＰＣＲプライマーの非存在下でオリゴヌクレオチドをＰＣＲ用の鋳型にアセンブリするステップと；（ｂ）ステップ（ａ）において作製された鋳型を、末端ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ及びポリメラーゼを含むＰＣＲプレカーサーミックスの存在下でＰＣＲチャンバにロードするステップと；（ｃ）ＰＣＲチャンバに時間変動する温度場を印加し、それにより二本鎖ＤＮＡを含むＰＣＲ産物混合物を得るステップとを含む。
【０００７】
ＰＣＲ増幅が終了すると、ＰＣＲ産物はデバイス上で精製することができる。したがって、２段階法においてデバイスは、ＰＣＲチャンバに制御可能に流体連通する精製チャンバを更に備えることができる。本方法において、さらなるステップ：すなわち（ｄ）ＰＣＲ産物混合物を精製チャンバ中にロードして二本鎖ＤＮＡを固定し、それにより二本鎖ＤＮＡを遊離ｄＮＴＰ、プライマー及び重合していないオリゴヌクレオチドから分離するステップが存在する。固定化は磁気ビーズを使用して達成することができる。二本鎖ＤＮＡは、ビーズ固定化ＤＮＡを６０℃で３分間の熱ショック条件に供することによって磁気ビーズから抽出することができる。
【０００８】
エラー訂正段階が本方法中に組み込まれてもよい。エラーフィルター処理を行うための緩衝液条件がＰＣＡ又はＰＣＲ条件と異なる場合は、緩衝液交換が望ましいはずであり、エラーフィルター処理段階は必然的に精製段階に続いて行うことになる。したがって、２段階法においてデバイスは、精製チャンバに制御可能に流体連通するエラーフィルター処理チャンバを更に備えることができる。本方法において、精製された二本鎖ＤＮＡをエラーフィルターチャンバ中にロードして、塩基対ミスマッチを含有する二本鎖ＤＮＡを除去するさらなるステップが存在する。
【０００９】
精製段階はまた、鋳型のＰＣＲ増幅前に行われてもよい。すなわち、鋳型がＰＣＲに使用される前に精製（及び場合によりエラー訂正）されてもよい。したがって、デバイスは、ＰＣＡチャンバに制御可能に流体連通する精製チャンバを更に備えることができる。本方法は、ＰＣＡによって作製された鋳型を精製チャンバ中にロードして、鋳型を固定し、それにより鋳型を遊離ｄＮＴＰ及び重合していないオリゴヌクレオチドから分離し、その後ＰＣＲに進むステップを含む。
【００１０】
固定化は磁気ビーズを使用して達成することができる。鋳型は、ビーズ固定化鋳型を６０℃で３分間の熱ショック条件に供することによって磁気ビーズから抽出することができる。
【００１１】
ＰＣＲ産物と同様に、ＰＣＡによって作製された鋳型もまた、エラーフィルター処理に供することができる。したがって、デバイスは、精製チャンバに制御可能に流体連通するエラーフィルター処理チャンバを更に備えることができる。本方法は、精製された鋳型をエラーフィルターチャンバ中にロードして、塩基対ミスマッチを含有する鋳型を除去し、その後ＰＣＲに進むステップを更に含む。
【００１２】
本発明者らの発明の別の態様は、精製段階と組み合わせたマイクロ流体デバイスにおいて二本鎖ＤＮＡを合成するための１段階法に関する。本態様において、デバイスは精製チャンバに制御可能に流体連通する合成チャンバを備え、本方法は、（ａ）末端ＰＣＲプライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及び複数の異なるオリゴヌクレオチドを含有する合成チャンバに時間変動する温度場を印加するステップであって、各オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドに部分的な塩基相補性を有し、それにより二本鎖ＤＮＡを含むＰＣＲ産物混合物を得るステップと、（ｂ）ＰＣＲ産物混合物を精製チャンバ中にロードして二本鎖ＤＮＡを固定し、それにより二本鎖ＤＮＡを遊離ｄＮＴＰ、プライマー及び重合していないオリゴヌクレオチドから分離するステップとを含む。
【００１３】
固定化は磁気ビーズを使用して達成することができる。二本鎖ＤＮＡは、ビーズ固定化ＤＮＡを６０℃で３分間の熱ショック条件に供することによって磁気ビーズから抽出することができる。
【００１４】
２段階法におけるＰＣＲ産物及び鋳型と同様に、１段階合成のためのデバイスは、精製チャンバに制御可能に流体連通するエラーフィルター処理チャンバを備えることができる。本方法において、精製された二本鎖ＤＮＡをエラーフィルターチャンバ中にロードして、塩基対ミスマッチを含有する二本鎖ＤＮＡを除去するさらなるステップが存在する。
【００１５】
本明細書に記載の方法及びデバイスは、反応成分の混合を容易にするためにマイクロミキサを更に備えることができる。特に、ＰＣＲプレカーサーミックス（ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ及び末端ＰＣＲプライマー）をＰＣＡによって作製された鋳型と混合するのに役立つことがある。また、精製用のＤＮＡ吸着固相媒体への結合を最適化するために混合段階を含むことが役立つこともある。
【００１６】
本明細書に記載のデバイスは、チャンバ内の流体のフローが制御されるように、流体フローアクチュエータに作動可能に連結されていてもよい。特定の実施形態において、流体フローアクチュエータはポンプ又は遠心機である。流体は、弁を備えるチャネルを介して１つのチャンバから次のチャンバに移動することができる。
【００１７】
特定の実施形態において、弁は温度変化に反応性である。特に、好ましくは、ＰＣＲチャンバのシーリングを制御する弁は、少なくとも６．８ｐｓｉの圧力に耐えることができる。
【００１８】
本明細書に記載の合成反応を行うために、デバイスは、加熱素子、冷却素子、温度センサ、及び温度調節器に作動可能に連結することができる。
【００１９】
別の態様において、本発明者らの発明は、１ｎＬ〜１００μＬの流体を含有するように構成されたＰＣＲアセンブリ（ＰＣＡ）チャンバ、１ｎＬ〜１００μＬの流体を含有するように構成されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）チャンバ、及びＰＣＲ産物の固相精製のために構成されたチャンバを含む、二本鎖ＤＮＡを合成するためのマイクロ流体デバイスに関し、これらのチャンバは互いに制御可能に流体連通する。
【００２０】
マイクロ流体デバイスは、ＰＣＲ反応ミックスとＰＣＡ反応産物とを混合するように構成された混合チャンバを更に備えることができる。
【００２１】
マイクロ流体デバイスは、ＰＣＡチャンバ中に複数の異なるオリゴヌクレオチドを更に含むことができ、各オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドに部分的な塩基相補性を有する。
【００２２】
マイクロ流体デバイスは、ＰＣＲ産物のエラーフィルター処理用に構成されたチャンバを更に備えることができる。
【００２３】
マイクロ流体デバイスの特定の実施形態において、チャンバは、弁を備えるチャネルを介して互いに制御可能に流体連通する。弁は温度変化に反応性であってもよく、ＰＣＲチャンバのシーリングを制御する弁は、いくつかの実施形態において、少なくとも６．８ｐｓｉの圧力に耐えることができる。
【００２４】
マイクロ流体デバイスは、流体フローアクチュエータに作動可能に連結されていてもよい。
【００２５】
別の態様において、本発明者らの発明は、加熱素子、冷却素子、温度センサ、及び温度調節器に作動可能に連結された本明細書に記載のマイクロ流体デバイスを含む、二本鎖ＤＮＡを合成するためのシステムに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】（Ａ）遺伝子アセンブリ製造工程の一実施形態の概略を示す図である。（Ｂ）ＰＣＲを用いる遺伝子合成の一実施形態の概略図である。１段階合成は、ＰＣＡ及びＰＣＲ増幅を統合して１つの段階にする。２段階合成は、アセンブリ及び増幅のための別個の段階によって行われる。
【図２】（Ａ）ＰＣＡチップ；（Ｂ）サーマルサイクラーの概略；（Ｃ）ＰＣＡチップを有するサーマルサイクラーの写真、の実施形態を示す図である。
【図３】一体型２段階遺伝子合成チップの実施形態を示す図である。マイクロ流体デバイス（４０ｍｍ×３５ｍｍ）の（Ａ）概略；及び（Ｂ）写真。
【図４】計量チャンバ（Ｍ１及びＭ２）を有するＤＮＡ抽出／緩衝液交換チップ、洗浄及び溶出緩衝液をロードするための入口（Ａ１）及び出口（Ａ２）、ビーズチャンバ（Ｃ１）、並びに生成物回収チャンバ（Ｃ２）の（Ａ）概略；及び（Ｂ）写真。
【図５】（Ａ）単一チャンバチップのための感光性樹脂のプリントモールドの実施形態を示す図である。（Ｂ）製造されたハイドロゲル弁を有する単一チャンバチップを示す図である。ＰＣＲ反応及びハイドロゲル弁は、２つの別個の熱電ヒータ（ＴＥ１及びＴＥ２）によって制御された。（Ｃ）固相ＰＣＲ精製を用いる２段階遺伝子合成チップ（６５ｍｍ×５０ｍｍ）を示す写真である。
【図６】ＭｕｔＳエラーフィルター処理段階の実施形態の概略を示す図である。（Ａ）ＭｕｔＳ酵素によって捕捉されたミスマッチＤＮＡを、正確な配列を有するマッチＤＮＡから分離するためのゲル電気泳動を使用する従来の方法；（Ｂ）固相ＭｕｔＳエラーフィルター。ＭｕｔＳ酵素は、磁性粒子又はニッケルキレート粒子上に固定される。
【図７】ＭｕｔＳエラーフィルター処理（■）前及び（●）後のＤＮＡ量を示す図である。（Ａ）５０％の不正確な配列（２つの欠失及び２つの挿入）及び５０％の正確な配列の混合物を有する７６０ｂｐ  ＤＮＡ試料；（Ｂ）１００％の完全配列を有する７６０ｂｐ  ＤＮＡ試料。
【図８】（Ａ）ＰＣＡアセンブリ、ＰＣＲ増幅、緩衝液交換及びエラーフィルター処理を含むチップを用いる遺伝子合成システム；（Ｂ）遺伝子合成のための完全一体型デバイスの概略、の実施形態を示す図である。
【図９】遺伝子アセンブリ製造工程順序の概念的説明を示す図である。
【図１０】ＤＮＡ配列を最適なオリゴヌクレオチドに分解するためのバイオインフォマティクスソフトウェアの概略を示す図である。
【図１１】ＰＣＡに関する一実施形態を示す図である。オーバーラップ伸長、連続伸長、及び熱力学的平衡のとれたインサイドアウトポリメラーゼサイクリング遺伝子アセンブリ（ＰＣＡ）の方法、並びにライゲーションを用いる遺伝子合成を示す図である。
【図１２】（Ａ）遺伝子−ＣＤ装置；（Ｂ）遺伝子−ＣＤプラットフォームに利用されるマイクロ流体構造の概略図、の実施形態を示す図である。
【図１３】一実施形態におけるデバイス動作の概略図である。（ａ）オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ混合物をＰＣＡチャンバにロードした。次いでＰＣＡを実施した。（ｂ）ＰＣＡでアセンブリされた溶液を、外側プライマーを含有する新たなＰＣＲ混合物と混合した。（ｃ）混合した試薬をＰＣＲチャンバ内に置き、ＰＣＲ増幅を行った。（ｄ）ＰＣＲで合成された産物及びチャージスイッチ（ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ）試薬をビーズチャンバにポンプ輸送及びロードした。磁気ビーズを磁石によって捕捉した。（ｅ）磁気ビーズを洗浄した。（ｆ）溶出緩衝液をロードし、磁気ビーズと混合した。合成産物を溶出緩衝液中に溶出した。
【図１４】（ａ）マイクロミキサの一実施形態を示す写真である。有色色素（青色及び赤色）を、２つのチャンバ間を３回往復させた後によく混合した。（ｂ）シリンジポンプ、電磁ミキサ、熱電ヒータ及びデータ取得を有する実験装置の概略図である。
【図１５】ｉｎ  ｓｉｔｕ光重合ハイドロゲル弁の熱応答を示す図である。弁機能は高度に反復可能であった。挿入図は、弁機能の推移を示した。
【図１６】特注ＰＣＲサーマルサイクラーのサーマルサイクリングプロファイルを示す図である。ヒータ上に取り付けた熱電対を、サーマルサイクリングのための温度フィードバック制御（ヒータ温度）に使用した。ヒータ表面とＰＣＲチャンバ内（チャンバ温度）の温度差は、ＬａｂＶＩＥＷプログラムを使用して補正した。
【図１７】（Ａ）市販のサーマルサイクラー及び単一チャンバデバイスのＰＣＡ結果を示す写真である。ＰＣＡ方法を最適化するために異なるオリゴ濃度を使用する。（Ｂ）市販のサーマルサイクラー及び一体型２段階遺伝子合成デバイスの２段階遺伝子合成の結果を示す写真である。
【図１８】２段階プロセスのために５〜２５ｎＭのオリゴヌクレオチド濃度及び０．１〜０．４μＭの外側プライマー濃度を用いた合成収率を示すアガロースゲル（１．５％）電気泳動を示す写真である。合成は、市販のサーマルサイクラーを使用して実施した。（ａ）ＰＣＡ結果。（ｂ）ＰＣＲ増幅結果。
【図１９】市販のサーマルサイクラー（機械）及びマイクロ流体デバイス内で実施した合成結果を比較するアガロースゲル（１．５％）電気泳動の写真である。１０ｎＭのオリゴヌクレオチド濃度及び０．４μＭのプライマー濃度で実施した（ａ）１段階プロセス（デバイス：単一チャンバチップ）；及び（ｂ）２段階プロセス（デバイス：２段階チップ）。
【図２０】マイクロ流体デバイス（■：３分）及び標準ＰＣＲチューブ（□：３分；◇：２分）内で実施したＤＮＡ抽出に対する、溶出温度及びインキュベーション時間の影響。
【００２７】
［実施形態の詳細な説明］
本発明者らの目的は、短い合成オリゴヌクレオチドの自動遺伝子アセンブリを実行するための一体型ラボオンチップマイクロシステムを開発することである。オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含む既知のアセンブリ法に基づいて、コード遺伝子及びゲノムのＤＮＡ配列にアセンブリされる。遺伝子アセンブリを実行するために必要とされる構成要素が、開発され、小型化され、遺伝子アセンブリのためのマイクロ流体デバイス上に統合される。本発明者らは、その構成要素及び要素に関して本発明を記述し、その様々な実施形態に関して本発明を例示する。本発明は、例証される特定の実施形態又は本明細書に記載の要素の明示的な組合せに限定されるべきではない。
【００２８】
図１（Ａ）は、合成遺伝子を作出するための２段階オーバーラップ遺伝子アセンブリ法の一実施形態における概念を示す。本実施形態は、ポリメラーゼ連鎖アセンブリ（ＰＣＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、緩衝液交換（図１（Ａ）には示さず）、及びエラーフィルター処理の４つの工程段階を含む。ＰＣＡ段階は、短いオリゴヌクレオチド（２０〜６０塩基長の長さを有する）のプールを、所望の長さ及び配列情報を有する長い二本鎖ＤＮＡ（鋳型と呼ばれる）にアセンブリする。アセンブリされた鋳型ＤＮＡ量は、その後ＰＣＲ段階（図１Ｂ）によって増幅される。アセンブリ産物もまた不正確な配列を有するＤＮＡを含有するので、その産物は、ＭｕｔＳ酵素を含有する酵素エラーフィルターによってろ過される。この段階はアセンブリ産物を精製する。これらの段階をチップに統合するために、ＰＣＲ増幅及びエラーフィルター処理と併せて追加段階（緩衝液交換）を加える。この段階は、完全長鋳型を抽出し、エラーフィルター処理のために最適化された緩衝液に完全長鋳型を放出することになる。
【００２９】
マイクロ流体デバイス（「チップ」とも呼ばれる）上での遺伝子合成は、多くの構成要素から構成されていてもよい。図２（Ａ）は、ＰＣＡ又はＰＣＲを実行するための小型サーマルサイクラーを例示する。１つの設計は、光重合ハイドロゲル弁を備えるシリコン基板上のＰＤＭＳ流体構造から構成される。ハイドロゲル弁は、ＰＣＡ又はＰＣＲ試薬をシールするため、及び温度サイクリング中に試薬の蒸発を防止するために使用される。このチップの機能は、１つはサーマルサイクリング用及びもう１つはハイドロゲル弁制御用の２つの熱電モジュールによって制御される。サーマルサイクラーの概略及び実際の構成を図２（Ｂ）及び（Ｃ）にそれぞれ示す。全体のシステムは、ＬａｂＶｉｅｗソフトウェアによって制御することができる。
【００３０】
図３は、一体型２段階遺伝子合成チップの１つの設計を示す。このチップはＰＣＡ及びＰＣＲ段階を、試薬の体積計量及び混合のための他のマイクロ流体構成要素を有する同一のチップに統合する。このチップは、図２（Ｃ）に記載した同一のサーマルサイクラーを使用してＰＣＡアセンブリ、その後続いてＰＣＲ増幅を実行することができる。
【００３１】
本発明者らは、短いオリゴヌクレオチド（４０塩基）のプールを７６０ｂｐのＤＮＡ（ＧＦＰｕｖのセグメント）にアセンブリすることによって、製造されたデバイスの性能を実証した。遺伝子合成プロセスはまず、単一チャンバサーマルサイクリングチップ上で最適化された（図２（Ａ））。次いで最適化された方法を使用して、一体型２段階遺伝子合成チップ（図３）上で７６０ｂｐ  ＤＮＡを合成した。このチップを用いて得られた合成結果を、市販のサーマルサイクラーの結果と比較する（図１７）。単一チャンバデバイスは、１０ｎＭという低い濃度のオリゴヌクレオチドから完全長生成物を生成することに成功している（図１７（Ａ））。また、市販のサーマルサイクラーよりも多量の完全長ＤＮＡを作製する。図１７（Ｂ）は、２段階一体型チップの結果を示す。本発明者らのデバイスのゲル結果におけるはっきりとしたバンドは、合成された生成物の大部分が完全長ＤＮＡであることを明示している（図１７（Ｂ））。
【００３２】
ＰＣＲ増幅の後、試料はＤＮＡ抽出及び緩衝液交換に供することができる。前者の工程は、様々な長さのＤＮＡを含有するアセンブリ産物のプールから完全長ＤＮＡを抽出することを目的とする。これを行う１つの方法は、固相ＤＮＡ抽出工程をチップに組み合わせることである。基本概念は、シリカ被覆磁気ビーズを使用して、低ｐＨ値で長いＤＮＡを捕捉し、洗浄緩衝液でビーズを洗浄し、その後捕捉したＤＮＡをｐＨ値が８．５の別の緩衝液中に放出することである。図４（Ａ）は、このようなＤＮＡ抽出デバイスの概略を示す。磁気ビーズは、ビーズチャンバの下部にある極小の磁石を使用してビーズチャンバ（Ｃ１）中に閉じ込める。ＤＮＡ抽出チップは、ＰＣＲチップの出口を図４（Ａ）の試料ローティング入口に接続することによってＰＣＲチップと統合することができる。製造されたＤＮＡ抽出チップを図４（Ｂ）に示す。概念を示すために、本発明者らはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのシリカ被覆磁気ビーズを用いた。別の市販業者又はＩＢＮのシリカ被覆磁気ビーズもまた使用することができる。本発明者らは、１００ｂｐ  ＤＮＡラダーを試料として使用することによって、このＤＮＡ抽出チップのプロセスパラメータを最適化した。捕捉及び放出されたＤＮＡの割合として定義される収率は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供された標準プロトコールを使用した本発明者らのチップでは４２％である。本発明者ら独自の放出工程（加熱によって促進される）を組み込むことによって、本発明者らは収率を７０％まで増加させた。手短に述べると、本発明者らは、ＰＣＲチップと統合することができるＤＮＡ抽出チップを開発することに成功した。
【００３３】
遺伝子合成のための望ましいチップ構成要素の一つは、エラーフィルターである。アセンブリされたＤＮＡ産物は、正確な配列及び不正確な配列を有するＤＮＡを含有する。この産物から誤ったＤＮＡを除去するための１つの方法である、酵素エラーフィルターはＭｕｔＳ酵素を用いて使用される（図６参照）。ＭｕｔＳ酵素は、ミスマッチを有するＤＮＡを認識すること、及びミスマッチ部位に結合することができるが、正確なＤＮＡには影響を及ぼさない。従来の方法は、ゲル電気泳動を使用して正確なＤＮＡをＭｕｔＳ結合ＤＮＡから分離する（溶液中）（図６（Ａ））。本発明者らは、磁気ビーズ上に固定されたＭｕｔＳ酵素を有する固相エラーフィルターを使用した（図６（Ｂ））。ミスマッチＤＮＡは固定化ＭｕｔＳ酵素によって捕捉され、正確なＤＮＡは影響を受けずフィルターを通過するだけのはずである。
【００３４】
本発明者らは、ＭｕｔＳ酵素が固定されている磁気ビーズであるＭ２Ｂ２（Ｇｅｎｅｃｈｅｃｋ）を使用することによって、この固相エラーフィルターを例証した。実験は、５０％ミスマッチ配列（図７（Ａ））及び１００％完全配列（図７（Ｂ））を有する試料について５０μＬバイアルを使用して実行した。ＭｕｔＳエラーフィルターは生成物からエラーＤＮＡを除去することに成功した。固相エラーフィルターもまた磁気ビーズを使用するので、チップ設計は固相ＤＮＡ抽出チップに類似している。さらに、固相エラーフィルターは他の構成要素と容易に統合することができる。本発明者らは、市販のＭ２Ｂ２に取って代わる固定化方法として、ニッケルキレート粒子上でＨｉｓタグ化したＭｕｔＳを使用することを考慮している。これは固相エラーフィルターのプロセス及びチップ設計に影響を及ぼさないはずである。
【００３５】
本発明者らは、チップ上の自動遺伝子合成を可能にする構成要素を開発することに成功した。チップ設計に加えて、本発明者らはまた、試薬調節、温度サイクリング、固相精製及びエラーフィルター処理のためのハードウェア及びソフトウェアも開発した。図８（Ａ）は、このシステムの概略図を示す。一実施形態において、本発明者らの発明は以下のものを含む：
１．ＰＣＡ、ＰＣＲ、固相ＤＮＡ抽出、及び固相エラーフィルターのためのデバイス構成要素。本発明者らは、これらの構成要素の性能を別個のマイクロ流体チップ上で実証した。これらの構成要素は統合して１つのチップにすることができ、遺伝子合成を自動的に実行可能なマイクロシステムとすることができる。
２．チップ上で遺伝子合成を実行するための新規な方法。本発明者らは、ＤＮＡ抽出のための従来の電気泳動法及びエラーフィルター処理を、ハイドロゲル弁によって制御された流体調節を用いる固相法に置き換えた。加熱段階を組み込むことによって、ＤＮＡ抽出の収率もまた向上する。
３．結果は、本発明者らのデバイスが従来の方法をしのぐことができることを示す。本発明者らのデバイスは、遺伝子合成が手動ピペッティング、ＰＣＡ及びＰＣＲ用の市販のサーマルサイクラー、並びに緩衝液交換及びエラーフィルター処理のためのゲル電気泳動を使用して実施される従来の方法よりも高効率及び大量のアセンブリ産物を提供する。
【００３６】
本発明者らは、図８（Ｂ）に一体型チップの概略を示す。デバイスは、一体型薄膜ヒータ及び温度センサを有するプリント回路板（ＰＣＲ、最下層）からなる。ＰＣＡ及びＰＣＲチャンバのすぐ下にある薄膜ヒータ及び温度センサは、サーマルサイクリング用である。ＤＮＡ抽出チャンバのすぐ下の薄膜ヒータは、放出収率を増加させるためである。ハイドロゲル弁もまた、一体型ヒータによって制御することができる。チップは、チップ周囲の電気接続パッドを通じて電気モジュールを動力源にすることができる。一体型チップは、マイクロ流体構造を作り出すために、ポリメチル−メタクリレート（ＰＭＭＡ）（最上層）を利用してもよい。
【００３７】
図９は、オーバーラップしたオリゴを使用した遺伝子の設計、合成及びアセンブリを示す。これは、バイオインフォマティクス処理、オリゴヌクレオチド合成、及び遺伝子アセンブリを含み、ここでバイオインフォマティクスがＤＮＡ配列を最適な短いオリゴマーに分割する。その後、これらのオリゴマーは、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＤＮＡマイクロアレイ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３巻、５０１１〜８頁、２００４年）又は市販のオリゴヌクレオチド合成機を使用して合成される。これらのオリゴマーは次いで放出され、精製され、多段階ライゲーション及びポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）法を使用してより長いＤＮＡセグメントにアセンブリされる。不正確な配列を有するＤＮＡセグメントは、最終的なＰＣＲ増幅の前にエラーフィルター処理によって除去される（Ｃａｒｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２（２０）、ｅ１６２、２００４年）。
【００３８】
本発明者らの例証した実施形態において、ＰＤＭＳ／シリコンチップは、光重合樹脂のプリント３次元モールドを利用することによって製造された。ＰＤＭＳにおけるタンパク質吸着及びＰＣＲ混合物の蒸発は、デバイスをパリレンの薄層で被覆することによって排除された。流体制御は、精密シリンジポンプ及び熱活性化ハイドロゲル弁を用いて実現された。ＰＣＲ反応混合物は、サーマルサイクリング中、試験され、目視可能な漏れがなく、≧８ｐｓｉの圧力に耐えることができるｉｎ  ｓｉｔｕハイドロゲル弁によってシールされた。
【００３９】
本発明者らは、マイクロ流体合成が、１０ｎＭの低いオリゴヌクレオチド濃度及び０．４μＭのプライマー濃度で、１段階及び２段階ＰＣＲを用いる遺伝子合成プロセスを使用してうまく達成されることを示した。より完全な長さの生成物は２段階プロセスによって生成されるが、両プロセスで得られるエラー率はそれほど変わらない。合成された生成物は、市販のサーマルサイクラーを用いるＰＣＲチューブにおいて実施された対照実験と同程度の２５０塩基当たり約１のエラー率を有することをＤＮＡシーケンシングによって確認された。
【００４０】
本発明者らは、このデバイスを使用して緑色蛍光タンパク質断片（ＧＦＰｕｖ）（７６０ｂｐ）を合成することに成功し、市販のサーマルサイクラー内でＰＣＲチューブにおいて実施された実験と同程度の合成収率及びエラー率を得た。ＤＮＡシーケンシングによって測定した結果のエラー率は、２５０塩基当たり１であった。本発明者らの知る限り、これは一体型２段階遺伝子合成を実証した最初のマイクロ流体デバイスである。
【００４１】
一体型遺伝子合成チップとともに、本発明者らは、合成産物を精製するため、及び下流用途向けの緩衝溶液を調製するためのマイクロ流体設計を記述する。本発明者らは、合成産物をＰＣＲ反応混合物から分離するために、固相ＰＣＲ精製用のシリカ被覆磁気ビーズを使用することを例証する。試験時に、本発明者らは、短い熱ショックを使用してＤＮＡ抽出効率を向上させることができることを発見した。本発明者らは、ＤＮＡ溶出の前に短い熱ショック（例えば、６０℃で３分間）を印加することによって、７０％の抽出効率及びマイクログラムレベルのＤＮＡ負荷能力が得られることを示した。このことは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ無細胞タンパク質合成に適した緩衝溶液中で合成遺伝子を調製するのに、又は合成産物の精度を改善するためにチップ上にＤＮＡエラー訂正方法を統合するのに役立つはずである。本発明者らが例証した実施形態では、プロセスは２回のＰＣＲ（各３０サイクル）及びＰＣＲ精製（＜１０分）を含め約２時間かけて、約２μｇのＤＮＡ産物（７５２ｂｐ）を作製する。
【００４２】
ＰＣＲチューブにおける実験と直接比較するためにマイクロリットルスケールで流体設計を用いてこの成果が示されたが、より費用効率の高い遺伝子合成を提供するために反応器容積及び構造の寸法は実質的に縮小することができる。ハイドロゲル弁、反応チャンバ、マイクロミキサ、及びＰＣＲ精製の設計は自由に変えられ、大幅な設計変更なく縮小することができる。
【００４３】
ＤＮＡアセンブリのためのオリゴ設計
遺伝子配列正確性及び作製効率は、基礎単位オリゴハイブリダイゼーションの特異性及び完全性に依存する。バイオインフォマティクスの主要目的は、各オリゴマーが唯一無二の１つの相補的な標的配列を有することを確認すること、及び各オリゴマーが遺伝子アセンブリを妨げる二次構造を有さないことを確認することである。したがって、各々の配列がただ１つしかなく、構造を有さないように、完全な遺伝子（２ｋｂ〜１０ｋｂ）をアセンブリ配列に分解することが最良である。
【００４４】
ＤＮＡ配列を最適なオリゴ（図１０）に分割するためのガイドラインは、様々な遺伝子のＤＮＡマイクロアレイのために最適なＤＮＡオリゴを選択するガイドラインと同様であり、オリゴは均一な融解温度（Ｔｍ）を有し、クロスハイブリダイゼーション及びヘアピン又はダイマーを形成する二次構造がないことが望ましい。したがって、オリゴマイクロアレイのために開発されたアルゴリズム及び方法（Ｌｉ及びＳｔｏｒｍｏ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１７（１１）巻、１０６７〜７６頁、２００１年；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０（１７）巻、２８９３〜２９０２頁、２００４年）を、遺伝子アセンブリのための高性能バイオインフォマティクスを開発するように適合させる。
【００４５】
ＤＮＡ配列は、キーワード（クロスハイブリダイゼーション）及び重複（反復又は高Ｇ＋Ｃ含量）等の文字列情報を含む４つの文字（Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣ）でできた文字列とみなすことができる。最初に問題のある配列領域を同定することによって、本発明者らは、このアプローチが現在の遺伝子アセンブリソフトウェアＤＮＡＷｏｒｋｓ（Ｈｏｏｖｅｒ及びＬｕｂｋｏｗｓｋｉ、３０（１０）巻、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｅ４３頁、２００２年）及びＧｅｎｅ２Ｏｌｉｇｏ（Ｒｏｕｉｌｌａｒｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２巻、Ｗｅｂサーバー版、ｗ１７６〜１８０頁、２００４年）に優るいくつかの利点をもたらすと考える。まず、厄介なＤＮＡセグメントを予測及び回避することができる。反復領域又は高Ｇ＋Ｃ含量を含有するＤＮＡは遺伝子アセンブリを妨げるはずであり、これは配列ランドスケープアルゴリズム（Ｌｉ及びＳｔｏｒｍｏ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１７（１１）巻、１０６７〜７６頁、２００１年）を使用して予測することができる。次に、配列はセグメントに分割され、オリゴヌクレオチドの組は各セグメントとして設計され、これらは並行してアセンブリされる。最後に、合成されたセグメントは全て統合されて最終配列になる。セグメントの統合の際に、これらはＰＣＲ用鋳型にアセンブリするための短いオリゴヌクレオチドの代わりに使用される。最終的な所望の配列を形成するために必要とされるオリゴヌクレオチド及び断片の数に応じて、複数回のアセンブリ及び合成反応が必要なことがある。第２に、クロスハイブリダイゼーション問題は、一般に使用されているＢＬＡＳＴプログラムと比較して効率を向上させるためにコンピュータ科学において十分に開発されたアルゴリズムの問題を探索するキーワードと考えることができる。第３に、二次構造の自由エネルギーを計算するためのＭｆｏｌｄプログラムを使用せずに不必要な計算を避けるために、文字列接尾辞配列アルゴリズム（Ｌｉ及びＳｔｏｒｍｏ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１７（１１）巻、１０６７〜７６頁、２００１年；  Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０（１７）巻、２８９３〜２９０２頁、２００４年）を使用して自己相補性の傾向を予測することができる。
【００４６】
最適なオリゴヌクレオチドは、記載したアプローチに基づくＬＣＲ又はＰＣＡによって遺伝子アセンブリ用に設計される。長いＤＮＡ配列はまず、５００ｂｐ〜１ｋｂｐの長さのセグメントに分割され、次に各セグメントは長さ優先法（ｌｅｎｇｔｈ  ｐｒｉｏｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ）又は融解温度優先法（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｐｒｉｏｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ）に基づいて最適なオリゴに分割される。長さ優先法では、オリゴは全て、ユーザーの定義した、又はユーザー定義の融解温度（Ｔｍ）及びオリゴ組の間で許容できる融解温度変化（ΔＴｍ）から計算した同じ長さを有する。融解温度優先法では、オリゴは、オリゴ組の間で均一なＴｍを得るために異なる長さを有することができる。この方法は、変異したオリゴのミスハイブリダイゼーションのための合成エラーを低減するのに利点をもたらす。オリゴ組全体で均一なＴｍを有することによって、平均Ｔｍにより近い温度でＬＣＲ又はＰＣＡを実行することができ、これにより、より低いＴｍを有する変異したオリゴの最終産物への混入の可能性は小さくなるはずである。
【００４７】
マイクロ流体デバイス
本発明のマイクロ流体デバイスはシリコンベースのチップであり、これらに限定されるものではないが、ホットエンボス加工、エラストマーの成形、射出成形、ＬＩＧＡ、ソフトリソグラフィ、シリコン製造及び関連する薄膜加工技術、フォトリソグラフィ、並びに反応性イオンエッチング技術を含む様々な技術を使用して製造される。一実施形態において、ガラスエッチング及び溶融石英基板の拡散接合を使用してマイクロ流体チップを調製することができる。積層及び成形されたマイクロ流体デバイスの微細構造は異なる可能性がある。
【００４８】
ペンシルベニア大学（米国特許第５４９８３９２号明細書；同第５５８７１２８号明細書；同第５９５５０２９号明細書；同第６９５３６７５号明細書）は、ＰＣＲを実行するための微細加工されたシリコンベースデバイスを開示した。この特許は、試料中の細胞又は微生物の核酸を迅速に増幅するための、小型で大量生産型の、典型的には１回使用の使い捨て「チップ」を開示した。デバイスは、試料入口ポート、「メソスケール」フローシステム、及び１つ又は複数の反応チャンバ中の温度制御のための手段を含んでいた。チップ外ポンプは、流体フローを制御するため及び試薬を送達するために使用された。開示された加熱及び冷却手段は、電気抵抗器、レーザー、及びコールドシンクを含んでいた。プリント回路、チップ上のセンサ、並びに分析対象物をトラップ及び濃縮するための分析前結合手段が開示された。一般的な流体チャネルを使用して、細胞溶解廃棄物は開口部又はチップ外の場所まで輸送された。チャンバ及び少なくとも１つの約０．１μｍ〜５００μｍの断面寸法を有する流路を有する分析デバイスが開示された。５μＬ以下の反応体積が予測された。
【００４９】
積層技術を使用したマイクロ流体システムの設計は、マルチチャネル分析及び様々な程度の複雑さの３次元マイクロ流体システムの形成を可能にする（Ｊａｎｄｉｋら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ、９５４巻：３３〜４０頁、２００２；Ｃａｂｒｅｒａ、「マイクロ流体電気化学フローセル：設計、製造、及び特性評価」、論文、２００２年  バイオエンジニアリング学部、シアトル、ワシントン大学；Ｃａｂｒｅｒａら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７３：６５８〜６６６頁、２００１年；ＭｃＤｏｎａｌｄ及びＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ．Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３５（７）巻、４９１〜４９９頁、２００２年；及びＭｃＤｏｎａｌｄら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２１巻、２７〜４０頁、２０００年；これらは全て、本明細書と矛盾しない程度にその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５０】
マイクロ流体デバイスを製造するために適した材料は、これらに限定されるわけではないが、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリカーボネート、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ガラスを含む。
【００５１】
タンパク質を吸着し特定の生物学的プロセスを阻害するＰＤＭＳ等のポリマーの疎水性のため、不動態化剤が必要なことがある（Ｓｈｏｆｆｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４巻：３７５〜３７９頁、１９９６年）。適した不動態化剤は当技術分野において知られており、パリレン及びＤＤＭを含む。ＰＣＲマイクロ流体工学のための材料、設計及び表面不動態化技術を含むマイクロ流体デバイス製造技術の説明のためのＺｈａｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ａｄｖ．、２００６年、２４巻、２４３頁を参照されたい。
【００５２】
「制御可能な流体連通」とは、反応流体がデバイス内で１つの場所から別の場所へ、ユーザーによって制御される形で移動させることができるようなデバイス設計のことを指す。
【００５３】
デバイスチャンバ間に連通を提供する１つの方法は、チャネルを介することである。マイクロ流体チャネルの１つの形態は、長さを調節できる流体チャネルである。いくつかの実施形態において、チャネルの横断面の１つの寸法は５００μｍ未満である。別の実施形態において、チャネルの横断面の１つの寸法は５００μｍより長い。マイクロ流体チャネル中のマイクロ流体の流体流動挙動は理想的ではなく、内壁の濡れ特性、粗さ、液体粘度、表面張力、粘着性及び凝集性に依存し得る。さらに、長方形又は円形の断面プロファイルに基づくチャネル中のフローは、対角幅又は直径によって制御される。チャネルの最狭幅寸法は、フローに対して最も大きな影響を有する。指向流、固体チェック弁のソートを促進するために、チャネル中にビアを設計することができる。
【００５４】
本発明のマイクロ流体デバイスは、ＰＣＡチャンバ及びＰＣＲチャンバ（２段階チップ）を含んでもよく、又は２つの反応を同一チャンバ（「合成チャンバ」；１段階チップ）内で行ってもよい。チャネルはチャンバを接続する１つの方法である。各チャンバにおける容積は、１ｎＬから１００μＬに及んでいてもよい。具体的には、各チャンバの容積は５ｎＬ〜１０ｎＬ、１０ｎＬ〜５０ｎＬ、５０ｎＬ〜１μＬ、１μＬ〜１０μＬ、７μＬ〜２０μＬ、１０μＬ〜２０μＬ、２０μＬ〜４０μＬ、４０μＬ〜７０μＬ、及び７０μＬ〜１００μＬに及んでいてもよい。
【００５５】
デバイス上で流体のチャンバへの通路を制御するための１つの方法は、弁を提供することによる。マイクロ流体デバイスは、例えば、少なくとも１つの５００μｍより小さい寸法を有する液圧、機械的、空気圧、磁気、及び静電アクチュエータ流量制御装置を含む。この種の代表的なフラップ弁は、米国特許第６４３１２１２号明細書に記載されている。ハイドロゲル弁、ピンチ弁、ワックス弁、膜弁、チェック弁及びエラストマー弁もまた含まれる。マイクロ流体弁の種類を記述している特許は、米国特許第５，９７１，３５５号明細書；同第６，４１８，９６８号明細書；同第６，６２０，２７３号明細書；同第６，７４８，９７５号明細書；同第６，７６７，１９４号明細書；同第６，９０１，９４９号明細書；同第６，８０２，３４２号明細書を含む。
【００５６】
チャネルを通る流体のフロー制御は、膨張可能な材料を含むフロー制御機構の使用によって行ってもよい。このようなフロー制御機構は、デバイスの一部として形成されてもよく、例えば、流体、例えば、水、溶媒等と接触すると膨張する材料、を含んでいてもよい。この使用に適した材料の例は、ハイドロゲル、ポリマー（例えば、膨潤性ポリマー）、例えば、ポリアクリルアミド等、一般に高吸水性ポリマー（ＳＡＰ）と呼ばれる膨張可能な材料、及び／又は他の利用可能な材料を含む。ハイドロゲルは、多くの因子、例えば、ｐＨ、温度、溶液のイオン強度、又はこれらの任意の組合せに反応して膨張又は崩壊する。膨張又は崩壊することによって、ハイドロゲルはチャネルを通る流体のフローを調節することができる。例えば、ハイドロゲルは３２℃より低い温度で膨張し、そのためチャネルを通るフローを遮断することができ、３２℃より高い温度では収縮し、そのためフローのチャネル通過を可能にすることができる。
【００５７】
マイクロ流体デバイス内で連続反応プロセスを実行するために、可逆的遮断を使用してもよい。連続反応プロセスでは、いったんマイクロ流体デバイス中に導入したら反応材料を環境にさらすことなく、マイクロ流体デバイス内の一連の化学反応及び／又はプロセスを順序付けることが望ましいことがある。
【００５８】
ハイドロゲルの一般的な材料は、例えば、ポリＮＩＰＡＡｍ、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー及び親水基の多いコポリマーを含む。天然のハイドロゲル材料は、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、及び他の天然由来ポリマーを含む。
【００５９】
マイクロ流体デバイスは、シャトルミキサ又は電磁ミキサ等の混合モジュールを含むことができる。シャトル混合において、溶液は狭チャネルによって接続された２つのチャンバ間を往復する。接続部でカオス的移流を作り出すチャネル−チャンバ接続部の急激な開閉は、フローを再循環させる。電磁混合において、マイクロ流体デバイス中で交流磁力を発生させて磁気ビーズを撹拌し、したがって磁気ビーズを含む溶液を撹拌した。別の態様において、チャネルにおける滞留時間の間に液体が混合されるように、２つの液体流を発生させてチャネルを通過させる。所与の速度の液体に関して、完全な混合を確実にするために、チャネルの長さを増加させることによって液体の対流時間を増加させる。別の態様において、より短い滞留時間において混合を確実にするために、ミキサチャネルを複数のより狭いチャネルに分岐させる。
【００６０】
入口は、マイクロ流体チャネルへの開口部を備える。入口は、マイクロ流体チャネルを主要マイクロ流体チャネルから外れる分岐チャネルである支流マイクロチャネルへ流体的に接続することができ、また流体をマイクロ流体デバイスに導入するために弁、チューブ、シリンジ、及び／又はポンプへ接続することもできる。出口は、マイクロ流体チャネルからの開口部を備え、また回収ポート、出口から流体を除去するための吸収性材料へ接続することもできる。
【００６１】
マイクロ流体デバイス内の流体体積の量を制御することが必要なこともある。流量計は、仕切られた部分への流体の導入が規定量の流体になるように仕切られた部分に規定量のチャンバ又はチャネルを含むことができる。
【００６２】
流体フローアクチュエータは、マイクロ流体デバイス内の流体の指向性運動を可能にする。例示的なアクチュエータは、流体の運動を強制することを目的とするシリンジポンプ、バルブ、ベローズ、ダイアフラム、又はバブルを含み、ここでポンプの基礎構造は、１ミリメートル未満の厚さ又は他の寸法を有する。このようなポンプは、米国特許第６７４３３９９号明細書及び米国特許出願公開第２００５／０１０６０６６号明細書に記載されている機械的に作動される再循環ポンプを含む。マイクロ流体ポンプは、手動で又はロボットによって操作することができる。電気浸透ポンプもまた、マイクロ流体デバイス中の流体のフローを制御するために使用することができる。
【００６３】
代替として、遠心力を使用してマイクロ流体デバイス中の流体を推進する。米国特許第５６１００７４号明細書は、試料溶液中に溶解、懸濁又は分散している物質の混合物から物質を、一連の段階において単離するための遠心ロータを記述した。多数の試料が複数の分画セルを用いて同時に処理され、これらはそれぞれ、分画及び単離手順の個々の段階が行われる一連の相互接続されたチャンバ型及びベント型区画を含む。この遠心ロータにおいて、プロセスの任意の段階で試料液体又はその画分の１つによって占められる特定の区画は、ロータの回転の速度及び方向並びに重力の両方の組合せによって制御される。相互接続、チャンバ及び各区画の流路は、所定量の試料及び試薬液体が区画をあふれさせないようにするための寸法及び角度にされる。
【００６４】
遺伝子アセンブリ及び合成
遺伝子又はゲノムをオリゴヌクレオチドからｄｅ  ｎｏｖｏ合成してウイルスゲノム（７．５ｋｂ；Ｃｅｌｌｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年、２９７巻、１０１６頁）、バクテリオファージゲノム（５．４ｋｂ；Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００３年、１００巻、１５４４０頁）、及び３２ｋｂの大きさの遺伝子クラスター（Ｋｏｄｕｍａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００４年、１０１巻、１５５７３頁）にアセンブリした。これまでに報告された最長の合成ＤＮＡは、Ｖｅｎｔｅｒ及び共同研究者（Ｇｉｂｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８年、３１９巻、１２１５頁）による細菌（マイコプラズマジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ））のゲノムの５８２ｋｂである。さらに、ＤＮＡ合成を、高密度ＤＮＡマイクロアレイ技術（Ｔｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２００４年、４３２巻、１０５０頁及びＲｉｃｈｍｏｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００４年、３２巻、５０１１頁）と組み合わせて、従来の合成オリゴヌクレオチド（１塩基当たり０．２米ドル）と比較して大幅に低いコスト（オリゴヌクレオチド当たり約１セント）で、何百万ものユニークなオリゴヌクレオチドを提供することに成功している。これまでに、１５ｋｂの大きさのＤＮＡ生体分子（Ｔｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２００４年、４３２巻、１０５０頁）を、ＤＮＡマイクロアレイ由来のオリゴヌクレオチドを用いて構築することに成功している。
【００６５】
６００個の異なるオリゴヌクレオチドを含むプールを使用した遺伝子合成が示された（Ｔｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４３２巻：１０５０頁、２００４年）。しかし、オリゴヌクレオチドのプールの複雑さの増加とともに、合成が実行不可能になる恐れがある。６００個の異なるオリゴヌクレオチドを含むプールがプールの限界であると、及び各オリゴヌクレオチドが２０ｂｐオーバーラップを有する平均４０ｂｐであると仮定すると、作製される可能性がある最大の二本鎖ＤＮＡ断片は長さ約１．２ｋｂである。結果として、約１．２ｋｂよりも大きい遺伝子及びＤＮＡ断片に関して、チップ上で２回以上の合成が必要となり得る。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドからのＰＣＲアセンブリ及び合成は、下記に記載の通り、連続使用のために適合させることができる。本発明者らは、マイクロ流体デバイスにおけるオリゴヌクレオチドからの単回のＰＣＲアセンブリ及び合成は、１．５ｋｂまでの；特に３００ｂｐ〜１．２ｋｂ及び５００ｂｐ〜８００ｂｐの範囲のＤＮＡの作製に関して、機械的繰り返しになると想定する。本発明者らは、チップを使用して少なくとも約１００ｂｐのＤＮＡを作製することが実用的であるはずであると想定する。
【００６６】
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｃｈａｌｍｅｒｓ及びＣｕｒｎｏｗ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３０（２）巻、２４９〜５２頁、２００１年；  Ｗｏｓｎｉｃｋら、Ｇｅｎｅ、６０（１）巻、１１５〜２７頁、１９８７）等の方法から一組のＰＣＲ手法（Ｓｔｅｍｍｅｒら、１６４巻、Ｇｅｎｅ、４９〜５３頁、１９９５年；Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ及びＬ．Ｈ．Ｐｅａｒｌ、５（８）巻、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８２７〜９頁、１９９２年；Ｓａｎｄｈｕら、１２（１）巻、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４〜６頁、１９９２年；Ｙｏｕｎｇ及びＤｏｎｇ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２（７）巻、ｅ５９頁、２００４年；Ｇａｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３１巻、ｅ１４３頁、２００３年；Ｘｉｏｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２（１２）巻、ｅ９８頁、２００４年）（図１１）まで、様々な遺伝子アセンブリ方法が存在する。大部分のアセンブリプロトコールはオーバーラップした合成オリゴのプールから開始してアセンブリした遺伝子のＰＣＲ増幅で終了するが、これら２点間の経路は全く異なり得る。ＬＣＲの場合、最初のオリゴ集団は５’末端をリン酸化してＰｆｕＤＮＡリガーゼがこれらの「基礎単位」に一緒に共有結合して最初の鋳型を形成できるようにする必要がある。しかしながらＰＣＲアセンブリは、非リン酸化オリゴを利用してＰＣＲサイクリングを繰り返し、伸長させて完全長鋳型を作り出す。さらに、一本鎖及び二本鎖ＰＣＲの選択肢が両方ともはるかに低い（ｎＭ、１０−９範囲）濃度の必要条件を有するのに対して、ＬＣＲ工程はμＭ（１０−６）範囲のオリゴ濃度を必要とする。
【００６７】
発表された合成の試みは、大きさが２０〜７０ｂｐの範囲のオリゴを使用し、オーバーラップ（６〜４０ｂｐ）のハイブリダイゼーションによってアセンブリした。多くの因子がオリゴの長さ及び組成（Ｔｍ、二次構造等）によって決定されるため、この集団の大きさ及び不均質性はアセンブリ効率及びアセンブリされた遺伝子の質に大きな影響を及ぼす恐れがあった。正確なＤＮＡ産物の割合は、「基礎単位」オリゴの質及び数に依存する。短いオリゴは長いオリゴと比較して低い変異率を有するが、ＤＮＡ産物を構築するためにはより多くのオリゴが必要である。その上、短いオリゴのオーバーラップの減少は、アニーリング反応のＴｍを低下させ、非特異的アニーリングを促進してアセンブリ工程の効率を低下させる。
【００６８】
時間変動する温度場とは、ＰＣＲ増幅又はＰＣＡ反応を発生させるためのマイクロ流体デバイスの時間制御された加熱のことを指す。時間変動する温度場は、外部から、例えば、マイクロ流体デバイスを加熱ブロックの上部に置くことによって印加することができ、又はマイクロ流体デバイス内に、例えば、ＰＣＡ及びＰＣＲチャンバのすぐ下に位置する薄膜ヒータとして統合することができる。温度調節器は、加熱素子に連結された温度センサと連動して加熱素子の温度を変化させ、また反応チャンバに統合される。タイマーは、反応チャンバに適用される加熱時間を変化させる。時間変動する温度場はまた、マイクロ流体デバイスの別の態様を制御するために、例えば、温度反応性ハイドロゲル弁を作動させるために適用されてもよい。
【００６９】
温度場の温度は、ＰＣＲ又はＰＣＡ反応の変性、アニーリング及び伸長段階に従って変化させることができる。典型的には、核酸は約９５℃で２分間変性させ、続いて９５℃で３０秒間の変性、４０〜６０℃で３０秒のアニーリング及び約７２℃で３０秒間の伸長を３０サイクル以上、最後に７２℃で１０分間の伸長とする。使用される時間及び温度は、オリゴヌクレオチドの組成、ＰＣＲプライマー、増幅される試料の大きさ、鋳型、及び使用される試薬、例えば、ポリメラーゼに応じて変化することがある。
【００７０】
ポリメラーゼは、ヌクレオシド三リン酸、又はデオキシヌクレオシド三リン酸を取り込み、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチド、又はＤＮＡ断片の３’ヒドロキシル末端を伸長する酵素である。ポリメラーゼに関する総論については、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９８７年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．、メンロパーク、カリフォルニア州、を参照されたい。適したポリメラーゼは、これらに限定されるわけではないが、ＫＯＤポリメラーゼ；ｐｆｕポリメラーゼ；Ｔａｑポリメラーゼ；Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、「クレノー」フラグメント、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ５ポリメラーゼ及び逆転写酵素を含み、これらは全て当技術分野において知られている。正確性の高いＤＮＡを複製するために、ｐｆｕ及びパイロベスト等の校正能を有するポリメラーゼを使用することができる。ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ校正活性を有し、したがってヌクレオチド誤取り込みエラー（ｍｉｓ−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｅｒｒｏｒ）を訂正することができる。
【００７１】
ＰＣＲアセンブリ（ＰＣＡ）
ＰＣＲアセンブリは、少なくともポリヌクレオチドの一方が、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ＫＯＤ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）等の耐熱性ポリメラーゼ）によるポリヌクレオチド鎖伸長が可能な遊離３’ヒドロキシルを有するようにアニールすることができる相補末端を有する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを組み合わせた、ポリメラーゼを介する鎖伸長を使用する。オーバーラップしたオリゴヌクレオチドは、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、及び緩衝液を含有する標準的なＰＣＲ反応物中に混合することができる。オリゴヌクレオチドのオーバーラップした末端は、アニーリングの際に、ＰＣＲ反応においてポリメラーゼによる伸長のためのプライマーとして機能する二本鎖核酸配列領域を生成する。伸長反応産物は、更に長い二本鎖核酸配列の形成のための基質として機能し、最終的に完全長標的配列の合成をもたらす。ＰＣＲ条件を最適化して、標的とする長さのＤＮＡ配列の収率を増加させることができる。
【００７２】
オリゴヌクレオチドから遺伝子を合成するために、様々なＰＣＲを用いる方法が記述されている。これらの方法は、熱力学的平衡のとれたインサイドアウト（ＴＢＩＯ）法（Ｇａｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３１巻：ｅｌ４３頁、２００３年）、連続ＰＣＲ（Ｘｉｏｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２巻：ｅ９８頁、２００４年）、二重非対称ＰＣＲ（ＤＡ−ＰＣＲ）（Ｓａｎｄｈｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１２巻：１４頁、１９９２年）、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＯＥ−ＰＣＲ）（Ｙｏｕｎｇ及びＤｏｎｇ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２巻：ｅ５９頁、２００４年；Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ及びＰｅａｒｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、５巻：８２７頁、１９９２年）、及びＰＣＲを用いる２段階ＤＮＡ合成（ＰＴＤＳ）（Ｘｉｏｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２巻：ｅ９８頁、２００４年）であり、これらは全て参照によって本明細書に組み込まれ、マイクロ流体デバイスにおいてＰＣＲ鋳型をアセンブリするために適合させることができる。
【００７３】
ＤＡ−ＰＣＲは、合成遺伝子を構築するための１段階プロセスである。１５〜１７塩基がオーバーラップする４つの隣接する長さが１７〜１００塩基のオリゴヌクレオチドが、ＰＣＲ反応においてプライマーとして使用される。２つの内側プライマーの量は高度に制限され、過剰な２つのフランキングプライマーのために、結果として生じる反応は全配列の半分の２つの非対称な一本鎖の増幅をもたらす。次のＰＣＲサイクルにおいて、互いにオーバーラップするこれらの二重非対称増幅断片は、二本鎖の完全長産物を生じる。
【００７４】
ＴＢＩＯ合成は、遺伝子配列のアミノ末端側半分に対するセンス鎖プライマーのみ及びカルボキシ末端半分に対するアンチセンス鎖プライマーのみを必要とする。加えて、ＴＢＩＯプライマーは、温度を最適化したプライマーオーバーラップの同一領域を含んでいた。ＴＢＩＯ法は、次の外側プライマーの、完全に合成された内側断片の末端との相補性を必要とする。ＴＢＩＯ両方向伸長は、次の回の両方向伸長が起こり得る前に、所与の外側プライマー対で完了されなければならない。
【００７５】
連続ＰＣＲは、センスプライマーの半分がアセンブリされる鋳型の半分の１つに対応し、アンチセンスプライマーがアセンブリされる鋳型の残り半分に対応する、単一段階ＰＣＲ手法である。この手法では、外側プライマー対による両方向増幅は、内側プライマー対を使用した増幅が完了するまで起こらないはずである。
【００７６】
ＰＤＴＳは、２つの２段階を含む。まず、対象とするＤＮＡの個々の断片が合成される。２０ｂｐオーバーラップを有する１０〜１２個の６０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを混合し、ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応を行い、長さ約５００ｂｐのＤＮＡ断片を作製する。次に、対象とするＤＮＡの配列全体を合成する：第１段階のＰＣＲ産物５〜１０個を混合し、プライマーとして２つの最も外側のオリゴヌクレオチドとともにパイロベストＤＮＡポリメラーゼを用いる二次ＰＣＲ反応の鋳型として使用する。
【００７７】
２０〜７０ｂｐのオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲアセンブリは、短いＤＮＡに関してはうまくいくが、単一反応内でアセンブリすることができるオリゴヌクレオチドの最大数に制限があることがある。これは、二本鎖ＤＮＡ産物の大きさに制限を課す可能性がある。この問題の解決法は、ＤＮＡを連続して作製することである。この計画では、別個のチャンバ中で並行して、多数のチップにおいて、又は連続して多数の小ＤＮＡセグメントを合成し、次いでアセンブリのためのＰＣＡ反応のプレカーサーとして、その後のＰＣＲ増幅のための「より大きい」ＤＮＡ断片中に一緒に導入する。換言すると、オリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲアセンブリは、ＰＣＲ増幅のための鋳型（初回鋳型）をもたらすはずである。このように作製された多数の初回鋳型は、初回鋳型よりも大きいＤＮＡ断片のＰＣＡアセンブリのためのプレカーサーとして機能することができ、したがって２回目の鋳型を生成する。今度は、２回目の鋳型が３回目の鋳型のアセンブリのためのプレカーサーとして機能することができ、以下同様である。この手法を、所望のＤＮＡが得られるまで繰り返すことができる。
【００７８】
合成反応において使用されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド自体よりも長い核酸をアセンブリするための一本鎖分子である。オリゴヌクレオチドは、長さが１０〜２００ｂｐであってよく、しかしより一般的には３０〜１００ｂｐ、４０〜８０ｂｐ、３０〜６０ｂｐ、及び最も一般的には２０〜７０ｂｐの長さであってもよい。複数のオリゴヌクレオチドを含むＰＣＡチャンバとは、遺伝子又はＤＮＡ断片に対応する鋳型を作製するために必要なオリゴヌクレオチドのプールを指す。合成反応及びデバイスが連続して使用される場合、その後の一連の反応におけるＰＣＡチャンバは、ＰＣＲ用鋳型にアセンブリするためのオリゴヌクレオチドの代わりにＤＮＡ断片のプールを含むはずであることに留意されたい。
【００７９】
オリゴヌクレオチドは、通常合成される。オリゴヌクレオチドは、固体支持体上でアレイフォーマット、例えば、各オリゴヌクレオチドが基板上で別個のフィーチャ又は位置において合成される一般的な基板上でｉｎ  ｓｉｔｕ合成された一本鎖ＤＮＡセグメントのマイクロアレイで、合成することができる。アレイは当技術分野においてよく知られているため、構築、特別注文、又は商業ベンダーから購入することができる。固体支持体上で、例えば、アレイフォーマットでオリゴヌクレオチド合成に適用できる方法及び技術は、例えば、国際公開第００／５８５１６号パンフレット及びＺｈｏｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２巻：５４０９〜５４１７頁（２００４年）に記載されている。
【００８０】
オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の固体支持体上で合成することができる。例示的な固体支持体は、例えば、スライド、ビーズ、チップ、粒子、ストランド、ゲル、シート、チューブ、球体、容器、キャピラリー、パッド、スライス、フィルム、プレート、ポリマー、又はマイクロ流体デバイスを含む。さらに、固体支持体は、生体、非生体、有機、無機、又はこれらの組合せであってもよい。実質的な平面である支持体上で、支持体は領域、例えば、トレンチ、グルーブ、ウェル、又は化学的バリア（例えば、疎水性コーティング等）に物理的に分離されていてもよい。
【００８１】
オリゴヌクレオチドは、切断可能な結合部分によって固体支持体上に接着されていてもよい。例えば、固体支持体は、オリゴヌクレオチドへの共有結合のために官能基付与して切断可能なリンカーを提供することができる。リンカー部分は、長さが６原子以上とすることができる。別法として、切断可能部分はオリゴヌクレオチド内であってもよく、ｉｎ  ｓｉｔｕ合成中に導入されてもよい。固相及びマイクロアレイオリゴヌクレオチド合成の分野において、様々な切断可能部分が利用可能である（例えば、Ｐｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０巻：４６５〜４９６頁、１９９３年；Ｖｅｒｍａら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７巻：９９〜１３４頁、１９９８年；米国特許第５７３９３８６号明細書；同第５７００６４２号明細書；及び同第５８３０６５５号明細書；及び米国特許出願公開第２００３／０１８６２２６号明細書及び同第２００４／０１０６７２８号明細書を参照されたい）。適切な切断可能部分は、例えば、ヌクレオシド塩基の保護基の性質、固体支持体の選択、及び／又は試薬送達方法に適合させるために選択してもよい。
【００８２】
一態様において、オリゴヌクレオチドは、マイクロ流体デバイスにおいて使用するために固体支持体上に、例えば、ＰＣＡ反応チャンバの一部として提供されてもよい。
【００８３】
別法として、オリゴヌクレオチドを合成して、その後マイクロ流体デバイス中に導入してもよい。ＤＮＡマイクロアレイによって提供されるオリゴヌクレオチドの量は通常、少量であるため、本発明者らは、マイクロ流体デバイスにおいて約１ｎＬ〜１０ｎＬのチャンバ中でのＤＮＡマイクロアレイの使用を想定している。
【００８４】
オリゴヌクレオチド又はＤＮＡチップアレイは当技術分野においてよく知られている（例えば、アフィメトリックス、コンビマトリックス）。オリゴヌクレオチドアレイチップは、ＤＮＡアレイチップ上に固定されたオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドスポット）が反応チャンバの反応流体と接触するようにマイクロ流体デバイス中に配置される。ＤＮＡアレイは、デバイスの完全性が損なわれないように、及びオリゴヌクレオチドスポットがマイクロ流体デバイスの機能的特徴に沿って機能するように、マイクロ流体デバイスに圧着又は接着することができる。ＤＮＡアレイ及びマイクロ流体デバイスの構成要素は、一緒に圧着されてもよく、又はレーザーでパターン形成された両面接着剤等のパターン化接着剤を使用してマイクロ流体デバイスの表面をＤＮＡマイクロアレイ表面に接着させてもよい。
【００８５】
一般に、完全遺伝子配列は、必要に応じて、上記で論じた通り一定長（Ｎ）のオリゴヌクレオチドに分解される。オリゴヌクレオチドの長さは、典型的には２０〜７０塩基である。サブ配列間のオーバーラップの長さは一般に２／Ｎであるが、６〜４０ｂｐまで、特に１０〜２０ｂｐ及び２０〜３０ｂｐのオーバーラップまで変化し得る。部分的な塩基相補性の量は、使用されるアセンブリ方法に依存して変化する可能性がある。本明細書で例証したオーバーラップ遺伝子アセンブリ方法では、結果として生じるＰＣＲ鋳型の末端を形成しているものを除いて、ＰＣＡオリゴヌクレオチドは５’及び３’の両方でオーバーラップする。オリゴヌクレオチド間の塩基対ミスマッチは、ミスマッチの性質によってハイブリダイゼーションに影響を及ぼすことがある。オリゴヌクレオチドの３’末端又はその近くのミスマッチは、伸長を阻害する可能性がある。しかし、オーバーラップのＧ／Ｃリッチ領域はミスマッチを克服し、そのためエラーを含む鋳型をもたらすことがある。したがって、オリゴヌクレオチド設計において、オーバーラップ配列、融解温度、クロスハイブリダイゼーションの可能性及び二次構造を考慮する必要がある。
【００８６】
１０５以上の配列の同時増幅及びアセンブリでは、合成が均一に進行する可能性は低い（Ｋｏｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３５（８）巻：ｅ６１頁、２００７年）。約６００個の異なるオリゴヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドプールからの多重遺伝子合成が実証されている（Ｔｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４３２巻：１０５０〜１０５４頁、２００４年）。オリゴヌクレオチドは、長さが１０〜２００ｂｐであってよく、しかしより一般的には２０〜７０ｂｐの長さであってもよい。ＰＣＲアセンブリオリゴヌクレオチドの適切な濃度は、５〜２５ｎＭ、特に５〜２０ｎＭ、５〜１５ｎＭ、１０〜２０ｎＭ、及び好ましくは約１０ｎＭである。ＰＣＲアセンブリオリゴヌクレオチドは、融解温度、クロスハイブリダイゼーションの可能性及びヘアピン又はダイマーの形成に関する二次構造を考慮して設計される。
【００８７】
本明細書において使用する鋳型とは、ＰＣＲアセンブリによって生じる核酸配列のことを指し、ＰＣＲによる相補鎖複製のための標的核酸として機能する。典型的には、アセンブリ反応後、ＰＣＲアセンブリ産物はおそらく不完全なアセンブリ及び／又はコンカテマーのために、大きさが様々に異なる二本鎖ＤＮＡであり、ゲル電気泳動によって生成物はラダー状に見えることになる。いくつかの実施形態において、初回鋳型はオリゴヌクレオチドからアセンブリされる。別の実施形態において、２回目の鋳型は、少なくとも２つの初回鋳型を含むＤＮＡ断片からアセンブリされ、この２つの鋳型はＰＣＲ反応産物であり、場合によって精製及びエラーフィルター処理され、最初の２回の反応から得られる。３回目の鋳型は、少なくとも２つの２回目の鋳型を含むＤＮＡ断片からアセンブリされ、以下同様である。
【００８８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
当技術分野においてよく知られるように（例えば、米国特許第４６８３１９５号明細書；同第４６８３２０２号明細書；及び同第４９６５１８８号明細書；全て参照により本明細書に組み込まれる）、ＰＣＲは、クローニングを行わずに試料中の標的核酸配列の濃度を増加させるために使用され、典型的には長さが１０〜３０塩基対の適切なフォワード及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために標的配列情報を入手できる必要がある。モル過剰のプライマー対を、所望の標的又は鋳型を含有する試料に添加する。２つのプライマーは、鋳型の５’及び３’配列にそれぞれ相補的である。混合物をまず加熱して二本鎖鋳型を変性させ、次いで冷却してプライマーを鋳型にアニーリングさせる。アニーリング後、適切なポリメラーゼはプライマー／鋳型ハイブリッドに結合し、相補鎖を形成するようにプライマーの３’−ＯＨ末端に塩基を付加して一本鎖鋳型に沿ってプライマーを伸長させることができる。フォワード及びリバースプライマー両方の存在下で、もとの二本鎖標的の完全なコピーが作製される。変性、ハイブリダイゼーション、及びポリメラーゼ伸長のサイクル数は、鋳型を増幅する必要に応じて変動し得る。
【００８９】
ＰＣＲプライマーとは、ＰＣＲ増幅において使用するための鋳型配列の既知の部分に相補的な核酸の配列を指す。ＰＣＲプライマーは、適切なポリメラーゼ及び補因子の存在下で鋳型に対するＤＮＡ合成のための開始点として機能を果たすことができる、一本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートである。プライマーは、典型的には長さが１０〜３０、又はそれ以上のヌクレオチドである。「プライマー対」という用語は、増幅されるＤＮＡ鋳型の５’末端の相補体とハイブリダイズする５’「フォワード」又は「上流」プライマー及び増幅される配列の３’末端とハイブリダイズする３’「リバース」又は「下流」プライマーを含むプライマーの組を指す。
【００９０】
本発明において、ＰＣＲプライマーは、ＰＣＡによって得られる鋳型の５’及び３’末端の配列を標的とする。ＰＣＡオリゴヌクレオチドは、その後のＰＣＲ増幅のための二本鎖ＤＮＡ鋳型をアセンブリするために使用される一本鎖オリゴヌクレオチドである。ＰＣＲプライマーは、完全長二本鎖ＤＮＡ鋳型の全体を増幅するための一本鎖ポリヌクレオチドである。
【００９１】
ＰＣＲプレカーサーミックスは、当技術分野においてよく知られているＰＣＲ増幅に必要な濃度で試薬を含む。ＰＣＲプレカーサーミックスは、例えば、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、緩衝液及び０．４μＭのＰＣＲプライマーを含む。
【００９２】
時間変動する温度場は、ＰＣＲ増幅のために印加され、典型的には、以下を含む：約９５℃で２分間の最初の変性、続いて９５℃で３０秒間の変性、４０〜６０℃で３０秒のアニーリング及び約７２℃で３０秒間の伸長を３０サイクル以上、７２℃で１０分間の最終伸長。時間及び温度は、鋳型、プライマー、ポリメラーゼ又は使用される他の試薬の性質に応じて変動し得る。
【００９３】
精製
ＰＣＲ産物は、マイクロ流体デバイスに適合可能な方法で精製することができる。
【００９４】
固相抽出は、重要な広く使用されている試料調製技術であり、精製、試料の予備濃縮、及び／又は緩衝液交換を可能にする（Ｔａｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７５巻：５５０４〜５５１１頁、２００３年）。核酸の精製は、ポリエチレングリコール等のＤＮＡ結合ポリマーを用いて行うことができる。シリカ樹脂上での固相抽出（Ｗｏｌｆｅら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２３巻：７２７〜７３３頁、２００２年）は、一般的な技術である。抽出は、核酸が高濃度のカオトロピック塩の存在下でシリカに結合する傾向があるために達成される（Ｂｏｏｍら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２８巻：４９５〜５０３頁、１９９０年）。抽出された核酸はその後、水性低塩緩衝液中に溶出され、ごく少量に濃縮される。
【００９５】
固相抽出は、シリカ、ゾルゲルシリカ、シリカ粒子、又は微細加工シリコン構造で被覆された磁気ビーズを利用することができる。シリカ、ゾルゲルシリカ、シリカ粒子、又は微細加工シリコン構造を使用した方法は、流体フローに耐えるためにシリカ材料をチャンバ中に固定するためのさらなる工程を伴うことに留意されたい。したがって、外部の磁石を当ててビーズを捕捉及び撹拌できる磁気ビーズが好ましい。磁気ビーズはまた、より良好なＤＮＡ抽出効率及びＤＮＡ負荷能力も提供する。
【００９６】
本発明のいくつかの実施形態は、シリカで被覆された磁気ビーズの使用を含む。ビーズは、入口を経由してデバイス中に導入される。シリカ被覆磁気ビーズは、磁石を用いてデバイス中で操作され、可逆的にＰＣＲ産物を固定する。ＰＣＲ産物は、水性低塩緩衝液を使用してシリカ被覆磁気ビーズから溶出することができる。低塩溶出緩衝液は、ＰＣＲ反応において使用されるものと異なっていてもよい。
【００９７】
磁気ビーズとは、ナノ粒子、ビーズ、又はミクロスフェア、或いは当技術分野において知られる別の用語で、マイクロ又はナノメートル範囲の視直径又は外周等の少なくとも１つの寸法を有することを指す。このような寸法の上限は６００μｍであるが、典型的には視直径が２００μｍ未満であり、１〜５０μｍ又は５〜２０μｍであってもよいが、このように限定されるわけではない。このような粒子は、例えば、Ｆｅ２Ｃｂ及びＦｅ３Ｏ４（α−Ｆｅ結晶粒）、α’−ＦｅＣｏ、ε−コバルト、ＣｏＰｔ、ＣｒＰｔ３、ＳｍＣｏｓ、ニッケル及びニッケル合金、Ｃｕ２ＭｎＡＩ、α−ＦｅＺｒ、Ｎｄ２Ｆｅ）４Ｂ、ＮｏＴｉ等の常磁性又は超常磁性材料から構成されてもよく、これらのコアを含んでもよく、又はこれらの粒状ドメインを含んでいてもよい。これらの材料を、ポリマー等の結合剤、シリカ、又は他の既知の材料とともに粒子、ビーズ又はミクロスフェアに形成することができる。
【００９８】
ＤＮＡ抽出のための固相抽出法を、小型化してマイクロ流体チップ中に統合することに成功している。ゾルゲル／シリカビーズ混合物は特に、マイクロ流体システムにおいて極めて良好な抽出効率及び再現性を有する（Ｗｏｌｆｅら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２３巻、７２７〜７３３頁、２００２年）。
【００９９】
エラーフィルター処理
現在のオリゴヌクレオチド合成技術は、途中で終結した、又はより不利益なことに、最終ＤＮＡにエラーを導入する内部欠失を配列中に含有する、副産物を生成する（Ｃａｒｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２（２０）巻、ｅ１６２頁、２００４年；Ｈｏｏｖｅｒ及びＬｕｂｋｏｗｓｋｉ、３０（１０）巻、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｅ４３頁、２００２年）。合成オリゴヌクレオチドは、まずポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法を使用して精製することができるが、これらのプロセスは費用及び時間を劇的に増加させることになる。効率的にエラー率を減少させるために、酵素アフィニティキャプチャー及び選択的ミスマッチ切断に基づくもの等のエラーフィルター処理又はエラー訂正工程を使用することができる。
【０１００】
ＤＡＮエラー訂正のための知られている技術を、ＰＣＲ増幅の前又は後に使用するためにマイクロ流体デバイス中に組み込むことができる。ミスマッチ塩基を除去するための例示的な技術は、これらに限定されるわけではないが、酵素アフィニティキャプチャー、酵素的ミスマッチ切断、コンセンサスシャッフリング及びオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを含む。
【０１０１】
コンセンサスシャッフリングにおいて、ＤＮＡは断片化され、固定されたミスマッチ結合タンパク質（例えば、ＭｕｔＳ）に結合するとミスマッチ断片は除去される。残りの断片のＰＣＲアセンブリは、投入集団のコンセンサス配列を濃縮した完全長配列の新しい集団を生じる。
【０１０２】
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにおいて、オリゴヌクレオチドは、アニーリング条件下で、ＰＣＲアセンブリオリゴヌクレオチドに相補的な固定化オリゴヌクレオチドにアニールする。いったんハイブリダイズすると、ハイブリダイズしていない、つまり変異を含有すると考えられるオリゴヌクレオチドは洗い流される。
【０１０３】
酵素アフィニティキャプチャーにおいて、変異したＤＮＡは、ＭｕｔＳ及びＴ４Ｅ７等のＤＮＡミスマッチ結合タンパク質を使用して捕捉され、生成物溶液から除去される。Ｔ４Ｅ７、エンドヌクレアーゼＶ及びＴ７Ｅ１等の酵素は、ミスマッチ部位でＤＮＡを認識して切断することができる。Ｃａｒｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３２（２０）巻、ｅ１６２頁、２００４年は、ＭｕｔＳが、従来の遺伝子合成技術と比較して１５倍を超えてエラーを減少させ、１０ｋ塩基対当たり１個のエラーを有するＤＮＡを生じることができることを示した。ＭｕｔＳの結合した変異ＤＮＡセグメントは、ゲル電気泳動を使用して正確な生成物から分離される。このアフィニティキャプチャー法をマイクロ流体構造中に組み込むために、本発明者らは、固定化ヒスチジンタグ付ＭｕｔＳ（Ｂｉら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７５巻、４１１３〜９頁、２００３年）による、ビーズを用いる固相クロマトグラフィーを記述する。本発明者らは、エラーフィルター処理のために、ＭｕｔＳに相補的なミスマッチ結合優先性を有するＴ４Ｅ７（Ｔａｙｌｏｒ及びＤｅｅｂｌｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１４巻、１８１〜６頁、１９９９年）を使用することを想定している。本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載の任意のエラーフィルター処理方法又はその組合せを利用したオンチップエラーフィルター処理を含む。
【０１０４】
選択的ミスマッチ切断において、変異ＤＮＡは、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＳ及びＭｕｔＬの組合せ（Ｓｍｉｔｈ及びＭｏｄｒｉｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９４（１３）巻、６８４７〜５０頁、１９９７年）、及びＴ７Ｅ１（Ｙｏｕｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９２巻、８７〜９１頁、１９９５年）等のエンドヌクレアーゼタンパク質を使用して捕捉され、より小さいセグメントに切断される。切断されたセグメントは、次いで、マイクロマシン電気泳動によってセグメントの大きさに基づいて生成物からろ過される。このプロセスは、タンパク質を固体支持体上に固定することなく、マイクロ流体構造中に組み込むことができる。
【０１０５】
ＭｕｔＳとは、様々な誤対合塩基（ｍｉｓｐａｉｒｅｄ  ｂａｓｅ）及び小さい（１〜５塩基）一本鎖ループを認識して結合する、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質のことを指す。例示的なＭｕｔＳタンパク質は、これらに限定されるわけではないが、以下のＧｅｎＢａｎｋ受託番号を有する核酸によってコードされるポリペプチドを含む：ＡＦ１４６２２７（ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、ＡＦ１９３０１８（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））、ＡＦ１４４６０８（腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ））、ＡＦ０３４７５９（ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））、ＡＦ１０４２４３（ヒト）、ＡＦ００７５５３（サーマス・アクアティカス  カルドフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ））、ＡＦ１０９９０５（ハツカネズミ）、ＡＦ０７００７９（ヒト）、ＡＦ０７００７１（ヒト）、ＡＨ００６９０２（ヒト）、ＡＦ０４８９９１（ヒト）、ＡＦ０４８９８６（ヒト）、Ｕ３３１１７（サーマス・アクアティカス）、Ｕ１６１５２（エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ））、ＡＦ０００９４５（ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌａｒａｅ））、Ｕ６９８８７３（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））、ＡＦ００３２５２（ｂ型インフルエンザ菌（イーガン）株（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｓｔｒａｉｎ  ｂ（Ｅａｇａｎ））、ＡＦ００３００５（シロイヌナズナ）、ＡＦ００２７０６（シロイヌナズナ）、Ｌ１０３１９（マウス）、Ｄ６３８１０（サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、Ｕ２７３４３（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、Ｕ７１１５５（サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ））、Ｕ７１１５４（アクイフェクス・ピロフィラス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ））、Ｕ１６３０３（ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、Ｕ２１０１１（ハツカネズミ）、Ｍ８４１７０（Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、Ｍ８４１６９（Ｓ．セレビジエ）、Ｍ１  ８９６５（ネズミチフス菌）及びＭ６３００７（アゾトバクター・ビネランディ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ））。例示的なｍｕｔＳホモログは、例えば、真核生物ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ４、ＭＳＨ５及びＭＳＨ６タンパク質（米国特許第５８５８７５４号明細書及び同第６３３３１５３号明細書を参照）を含む。この用語は、原核生物ＭｕｔＳタンパク質に加えて、そのホモログ、オーソログ、パラログ、変異体、又は断片を包含することを意味する。この用語はまた、様々なＭｕｔＳタンパク質のホモ及びヘテロのダイマー及びマルチマーも包含する。
【０１０６】
コンパクトディスク（ＣＤ）を用いる遺伝子アセンブリ
遺伝子アセンブリは全体として、オリゴヌクレオチド合成、オリゴ精製、ライゲーション及び／又はポリメラーゼサイクリングによるオリゴセグメントのアセンブリ、不正確な配列の除去（エラーのフィルター除去）、及びポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子増幅等のいくつかの連続工程を含む。これらの遺伝子アセンブリプロセス及び必要な構成要素をコンパクトディスク形態（Ｇｅｎｅ−ＣＤと称する）等の単一のデバイスに統合して自動遺伝子合成機を提供することが望ましい。
【０１０７】
１つのデバイス形態はコンパクトディスク（ＣＤ）を用いるマイクロ流体である（図１２）。この手法は、流体送達及び流体制御にいくつかの利点をもたらす。流体パケットは、遠心力を使用することによって、事前計量してチャンバからチャンバへ移動させることができ、これによって外部ポンプが排除される（Ｚｏｖａｌ及びＭａｄｏｕ、Ｐｒｏｃ．ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＥＥＥ、９２（１）巻、１４０〜５３頁、２００４年）。流体流速は、プログラム可能な回転速度によって容易に制御することができる。また、チャネル直径における急膨張によってできたキャピラリー弁、及び疎水性材料をチャネル中の区域に適用することによって作られた疎水性弁も、正確な流体制御のために残りの構造と統合することができる。さらに、Ｙ構造中の流体は、回転方向及び速度によって選択されるコリオリ力を使用して、２つのチャネル出口間を往復させることができる（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ、５巻、１４６〜５０頁、２００５年）。リン酸化、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及びエラーフィルター処理の間の試薬交換は、Ｃ１８及びシリカビーズをそれぞれ充填した、流速を慎重に制御したカラムを用いて逆相又はイオン交換クロマトグラフィーを使用して解決することができる（Ｊｅｍｅｒｅら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２３巻、３５３７〜４４頁、２００２年）。不正確な配列を有するＤＮＡを除去するための酵素エラーフィルター処理は、ＭｕｔＳ及びＴ４Ｅ７固定化ビーズを充填したカラムを有する流体構造に統合することができる。これらのビーズをカラムに導入し、マイクロ流体デバイスが製造された後に単一制限領域を使用することによって配置することができる。最後に、リン酸化、ＬＣＲ、及びＰＣＲを実行するための温度制御は、加熱源として外部ヒータ又は赤外線を使用して達成されるはずである（Ｇｉｏｒｄａｎｏら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９１巻、１２４〜３２頁、２００１年）。
【０１０８】
大きい遺伝子（例えば、１０ｋｂ）のアセンブリを実行するために、多数のマイクロ流体カラムを１つのＧｅｎｅ−ＣＤに統合して、同時に作動させて最大効率を達成することができる。長いＤＮＡ配列は、各セグメントがそれぞれ別個の流体カラムでアセンブリされ、その後最終ＰＣＲ工程で一緒に連結されるようなセグメントに分割することになる。
【０１０９】
ラピッドプロトタイピングでは、流体構成要素は、ポリカーボネート材料上でソフトリソグラフィ又はＣＮＣミリングを使用して製造することができる（Ｌｅｅら、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ、３（４）巻、３３９〜３５１頁、２００１年）。
【０１１０】
［（ＶＩＩ）例示的実施形態］
マイクロ流体デバイス製造
ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）鋳型を作製するためのＳＵ−８を用いるリソグラフィ工程の代わりに、本発明者らは、感光性樹脂を使用して３Ｄ構造をプリントした３次元（３Ｄ）ラピッドプロトタイプ法を採用した。３Ｄ構造はＳｏｌｉｄＷｏｒｋｓで設計し、Ｅｄｅｎ３５０（Ｏｂｊｅｔ  Ｇｅｏｍｅｔｒｉｅｓ）に転写し、フォトポリマー材料（ＦｕｌｌＣｕｒｅ７２０）及び支持体材料（ＦｕｌｌＣｕｒｅ７０５）に層ごとにプリントした。フォトポリマー層は、プリント後直ちにＵＶ光によって硬化させた。完了したら、製造された構造体を２５％水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）溶液中に３時間浸漬させて、プリントされた形状を支持するために設計された支持体材料を除去した。マイクロ流体モールドを水に１時間浸漬させてＴＭＡＨを洗い流した。この方法は、リソグラフィ工程を行わずに、厚い多段構造を作製するのによく適した、ｘ軸及びｙ軸において４２μｍの分解能及びｚ軸において１６μｍの分解能をもたらした。逆に、液相光重合（Ｋｈｏｕｒｙら、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００２年、２巻、５０頁）及び接触液体フォトリソグラフィ重合（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎら、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００４年、４巻、６５８頁）等の他のラピッドプロトタイプ法は、フォトマスクを利用して優れた分解能を有する構造の構築を容易にした。２段モールドは、接続チャネル（高さ：０．２ｍｍ；幅：０．２ｍｍ）及びチャンバ（高さ：０．５ｍｍ）のために高さが異なるように設計して、接続チャネルのデッドボリュームを最小限に抑えた。
【０１１１】
ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）プレカーサーを、シルガード（Ｓｙｌｇａｒｄ）１８４主剤及びシルガード１８４硬化剤を１０：１の体積比で混合することによって調製した。プレカーサーをモールドに流し込み、真空チャンバ中で３０秒間脱気し、対流式オーブン中で、７５℃で３時間硬化させた。次いで、厚さ３ｍｍのＰＤＭＳ厚板をモールドから剥離して、接続孔を開けた。ＰＤＭＳ及びシリコン基板（厚さ５００μｍ）を接着させることによって、マイクロ流体デバイスを組み立てた。ＰＤＭＳ及びシリコン基板をともに放電処理で処理した（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．、２００１年、２４４巻、２００頁）。最後に、デバイスをオーブン中で、７５℃で２時間硬化させ、ＰＤＭＳ及びシリコン基板の不可逆的接着を確実にした。
【０１１２】
試料の蒸発を防止するために、接着されたデバイスは、ＰＤＳ２０１０パリレン被膜システム（ＳＣＳ、米国）を使用して厚さ２μｍのパリレン（Ｐａｒｙｌｅｎｅ）Ｃで被膜した。蒸着したパリレンＣは、バリアを形成して水蒸気拡散を抑制した。パリレンはまた、不要なタンパク質吸収を防止するためにデバイスの内側表面を不動態化した（Ｓｈｉｎら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．、２００３年、１３巻、７６８頁；Ｓｈｉｈら、Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ａ、２００６年、１２６巻、２７０頁）。
【０１１３】
ハイドロゲル弁の調製
感熱性ハイドロゲル弁を、流体制御及びＰＣＲ反応の密閉のために選択した。ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎら、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００４年、４巻、６１９頁、によって提案された方法に従ってハイドロゲルを合成した。感温性モノマーＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡＭ、２８６ｍｇ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ、７．８８ｍｇ）架橋剤及び２，２’−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡＰ、１８．８６ｍｇ）光開始剤を５００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で混合し、２％ＢＩＳ架橋剤を含有するプレカーサー溶液を作製した。プレカーサーを窒素でパージして酸素を除去し、アルミホイルで包み不要な光重合を回避した。全ての化学製品はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（シンガポール）から購入した。
【０１１４】
次いで混合物を、製造したチップに１ｍｌシリンジを使用して接続孔を通して注入し、暴露領域を決定するクロムマスクを用いて３２℃でｉｎ  ｓｉｔｕで光重合させた。次いで、オムニキュアシリーズ（ＯｍｎｉＣｕｒｅ  Ｓｅｒｉｅｓ）２０００ＵＶ照射システム（ＥＸＦＯ、カナダ）を使用して試料を３６５ｎｍの波長で放射線照射した（線量：２５２ｍＪ／ｃｍ２）。紫外線暴露後、デバイスを６０℃のホットプレート上に置き、ハイドロゲル弁を開いたままに保持し、重合していないプレカーサーを、シリンジポンプ（７４９００シリーズ、Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）を使用して流速５００μＬ／分で４０分間、脱イオン水で除去した。最後に、デバイスをオーブン中で、７５℃で３時間加熱して内側表面及びハイドロゲル弁を乾燥させた。
【０１１５】
ＮＩＰＡＡｍベースのハイドロゲルは、３２℃の下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を有する感熱性である（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎら、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００４年、４巻、６１９頁）。ハイドロゲルは、３２℃より低い温度で膨張して流体チャネルを遮断したはずである。３２℃より高い温度ではポリマー鎖が疎水性になり、ハイドロゲルの収縮を引き起こし、流体が流れるのを可能にした。弁の開閉は、４℃〜６０℃まで温度を変化させることによって制御した。プリント感光性樹脂モールドを用いて製造したマイクロ流体デバイス中に統合されたハイドロゲル弁の例を、図５に示す。
【０１１６】
ＰＣＲサーマルサイクリング
ファン、熱電（ＴＥ）ヒータ／冷却器（９５０１／１２７／０３０、ＦｅｒｒｏＴｅｃ）並びにＦＴＡ６００  Ｈブリッジ増幅器、ＦＴＣ１００温度調節器及びＦＴＣ制御ソフトウェアからなる熱電制御キット（ＦｅｒｒｏＴｅｃ、米国）を含む自作サーマルサイクラーを使用することによって、ＰＣＲを実行した。熱電ヒータは、ＦＴＡ６００増幅器を動力源にし、ＦＴＣ１００温度調節器によって制御した。Ｔ型熱電対（５ＴＣ−ＴＴ−Ｔ−４０−３６、ＯＭＥＧＡ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）をＴＥヒータ上に取り付けて温度を測定し、ＦＴＣ１００温度調節器へのフィードバックとして使用した。熱電ヒータと実際のＰＣＲチャンバ内部の温度差は、較正チップを使用して較正し、上記較正チップは、ＰＣＲ混合物が充填されたＰＣＲチャンバ内部に埋め込んだ熱電対を除いて、実際のデバイスと同じ大きさを有していた。ヒータ表面とチャンバ内部間の温度低下は、ＦＴＣ制御ソフトウェア中において記載されており、操作中に補正した。所望の温度プロファイルを、ＦＴＣ制御ソフトウェアによってコンピュータ中にプログラムし、ＰＩＤ（比例−積分−微分）アルゴリズムを使用してＦＴＣ１００温度調節器を制御して温度反応時間を最適化した。
【０１１７】
遺伝子アセンブリ及び増幅
全長７６０ｂｐ（Ｔ３５７Ｃ、Ｔ８１１Ａ及びＣ８１２Ｇの塩基置換を有する配列２６１〜１０２０）を有するＧＦＰｕｖの公開されている遺伝子セグメントを、合成のために選択した。２０ｂｐのオーバーラップを有する３７個の４０ｍｅｒ及び２個の２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを使用して、アセンブリした（表２；Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００５年、３３巻、ｅ５５頁）。ＰＣＲ合成反応を、マイクロ流体デバイス内、及び市販のサーマルサイクラー（ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて標準的な０．２ｍｌＰＣＲチューブ中の両方で実行して、合成性能を比較した。ＰＣＲを介する合成は、アセンブリＰＣＲ及び増幅ＰＣＲを１つの段階に組み合わせて１段階プロセスとして、又はアセンブリ及び増幅のために別個の段階を有する２段階プロセスとして、実行した。ＰＣＲチューブにおける１段階プロセスを、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ）、１ｍＭのＭｇＳＯ４、各０．２５μＭのｄＮＴＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、５〜２５ｎＭのオリゴヌクレオチド、０．１〜０．４μＭのフォワード及びリバースプライマー、並びに１ＵのＫＯＤホットスタート（Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含む５０μｌの反応混合物を用いて実施した。ＰＣＲは以下の条件下で実行した：９５℃で２分間の最初の変性；３０サイクルの９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間、及び７２℃で１０分間の最終伸長。２段階プロセスのＰＣＲプロトコールは、１段階プロセスのものと本質的に同じであった。ＰＣＲアセンブリでは、フォワード及びリバースプライマーを用いずに５〜２５ｎＭのオリゴヌクレオチドを使用した。遺伝子増幅では、アセンブリ産物を、濃度０．４μＭの最終プライマーを含有する新たな増幅反応混合物で２×希釈した。マイクロ流体合成は、調整したチャンバ容量で同じＰＣＲ条件を用いて実施した。全てのプロセスを、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｌａｂｓ（シンガポール）製の脱塩したオリゴヌクレオチドを用いて、さらなる精製を行わずに実行した。
【０１１８】
固相緩衝液交換
固相緩衝液交換を、磁気ビーズを用いるＰＣＲ精製方法（チャージスイッチ（ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ）ＰＣＲクリーンアップキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、マイクロ流体デバイス上で、及び標準的な０．２ｍＬのＰＣＲチューブにおいて（対照として）、合成したＰＣＲ産物及び対照として１００ｂｐ  ＤＮＡラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ、１７０ｎｇ／μＬ）を用いて実施した。
【０１１９】
ＰＣＲチューブにおいて行われた対照実験では、１００ｂｐ  ＤＮＡラダー又はＰＣＲ合成産物（７μＬ）を５μＬのビーズ及び１１μＬの精製緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、１分間インキュベートした。次いで、ビーズを磁石で捕捉して上清を除去した。本発明者らは、ビーズを１５０μＬの洗浄緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３回洗浄し、洗浄したビーズに７μＬの溶出緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）をロードした。溶出緩衝液及びビーズを異なる条件（２５〜８０℃で２〜３分間）でインキュベートして、結合ＤＮＡの溶出効率を最適化した。もとの及び溶出したＤＮＡ試料の濃度を測定し、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（ＮＤ−１００、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって比較した。
【０１２０】
２段階マイクロ流体デバイスで、同様のプロセスを実施した（図５Ｃ）。まず、精製緩衝液（１１μＬ）中の１００ｂｐラダー又はＰＣＲ産物（７μＬ）及び磁気ビーズ（５μＬ）を、計量チャンバによって決定される量でＭ３及びＭ４にそれぞれロードした。これらの２つの溶液を、外部シリンジポンプ（Ｃａｖｒｏ  ＸＬＰ６０００）を使用して混合し、ビーズチャンバ（Ｃ３）に押し出し、１分間インキュベートした。次いで、ビーズチャンバ中の夾雑物を、ビーズを永久磁石（Ｍ１２１９−５、Ａｓｓｅｍｔｅｃｈ）で捕捉して、Ａ５から２００μＬ／分の流速で導入される洗浄緩衝液で１５分間洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５μＬ）をビーズチャンバ中に導入し、ビーズとともに２５〜８０℃で２〜３分間インキュベートして結合ＤＮＡを放出させた。磁気ビーズを、図１４ｂに示す構成で外部電磁石を使用して溶出前に０．５Ｈｚの速度で激しく混合した。永久磁石を、２つの電磁石（ＧＭＨＸ、Ｍａｇｎｅｔ−Ｓｃｈｕｌｔｚ社）間に位置する自由に曲げられる吊り下げ式金属アームに取り付けた。１８０°位相ずれ電圧が電磁石に供給されたときに、交流磁力が金属アームに印加され、これが金属アーム及び取り付けた磁石を回転させる。電磁石は、固体リレー（ＯＤＣＭ−５、Ｔｙｃｏ）及びＤＣ電源（ＨＹ３００３、Ｄｉｇｉｍｅｓｓ）によって電力供給される。電磁力は、アナログ電圧出力ボード（ＰＣＩ−６７１３、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及びＬａｂＶＩＥＷプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を備えるコンピュータを使用したリレーによって制御した。
【０１２１】
アガロースゲル電気泳動
合成産物を、１．５％アガロースゲル（ニューシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）（登録商標）ＧＴＧ）（登録商標）、Ｃａｍｂｒｅｘ社）によって分析し、エチジウムブロマイド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて染色し、タイフーン（Ｔｙｐｈｏｏｎ）９４１０変倍撮像装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して可視化した。ゲル電気泳動は、１００ｂｐラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ）並びに市販のサーマルサイクラー及びデバイスから回収した５μＬのＤＮＡ試料を用いて、１００Ｖで４５分間実行した。
【０１２２】
ＤＮＡシーケンシング
１段階及び２段階オーバーラップ合成産物をシーケンシングしてエラー率を調べた。ＧＦＰｕｖ遺伝子合成産物（さらなるＰＣＲ精製は行わず）をベクターｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ケミカルコンピテントＴＯＰ１０細胞に形質転換した。１×ルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）アガープレート（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有）上で一晩生育後、個々のコロニーを採取して１×ＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有）中で生育させた。キアプレップスピンミニプレップキット（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してプラスミドＤＮＡを抽出し、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｌａｂｓ（シンガポール）によってシーケンシングした。Ｍ１３フォワード及びリバースシーケンシングプライマーを使用して、全部で１５０個の個々の試料をシーケンシングした（１段階プロセスでは：マイクロ流体デバイスから９６個及び０．２ｍｌのＰＣＲチューブから４８個；２段階プロセスでは：マイクロ流体デバイスから５４個及び０．２ｍｌのＰＣＲチューブから４８個）。全てのシーケンス結果を、配列解析ツールＶｅｃｔｏｒ  ＮＩＴを使用して解析し、ＡＢＩプリズム（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ）（登録商標）３１００−Ａｖａｎｔジェネティックアナライザーの電気泳動図の目視確認によってエラーを確認した。
【０１２３】
デバイス操作
マルチポジション弁を有する精密シリンジポンプ（Ｃａｖｒｏ  ＸＬＰ６０００、Ｔｅｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、マイクロ流体デバイス内部の試薬を操作した。このシリンジポンプは、ＬａｂＶＩＥＷプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって制御される場合、１０ｎＬよりも良好な体積分解能で試薬を引き出す及び分配することができる。ハイドロゲル弁及びサーマルサイクリングを同時に及び別個に制御するために、それぞれ温度調節器を有する２つのＴＥモジュールを使用した（図５）。１つのＴＥモジュール（ＴＥ１）を、ＰＣＲチャンバの下に配置して温度サイクリングを行い、他方のＴＥモジュール（ＴＥ２）をハイドロゲル弁の下に配置してその動作を制御した。
【０１２４】
遺伝子合成デバイスの全てのデバイス操作を、各チャンバによって決定される体積とともに図１３に示した。まずオリゴヌクレオチド及びＰＣＲ混合物を、入口ポート（Ａ１）を介してＰＣＡチャンバ中にロードした。次いで、溶液をハイドロゲル弁（Ｖ１及びＶ２）によってシールし、熱電ヒータによって熱サイクルを行いオリゴヌクレオチドをアセンブリした。ＰＣＡの後、ハイドロゲル弁（Ｖ１及びＶ２）を開け、溶液を計量チャンバＭ１中にポンプ輸送し、同時に同量の計量チャンバＭ２由来の外側プライマーを含有する新たなＰＣＲ混合物と混合する。混合を強化するために、入口ポートＢ２で精密シリンジポンプを用いてこの混合物を２つの混合チャンバ（Ｃ１及びＣ２）間を５回往復させ（流速＝１２０μＬ／分）、次いで、ハイドロゲル弁（Ｖ３及びＶ４）を開けたままＰＣＲチャンバに移動させた。ＰＣＲ増幅後、ハイドロゲル弁（Ｖ３及びＶ４）を再度開け、溶液を計量チャンバＭ３へ移動させ（入口ポートＡ３を通って）、同時に、ビーズチャンバ（Ｃ３）中の計量チャンバＭ４によって決定される磁気ビーズ溶液と混合した。永久磁石によって捕捉されたＤＮＡ吸着磁気ビーズを用いて、夾雑物溶液を洗い流した。最後に、溶出緩衝液をロードし、磁気ビーズと混合した；その後ＤＮＡを溶出緩衝液中に放出した。流れ方向を制御するために、使用されていない入口及び出口を金属ピンでふさいだ。例えば、ＰＣＲ混合物をＰＣＲチャンバに向かわせるために、固相ＰＣＲ精製のための入口（Ａ４〜Ａ７）をふさいだ。
【０１２５】
ＰＣＡ産物をＰＣＲ増幅のための新しいＰＣＲ混合物と効率的に混合するため、並びに磁気ビーズを固相ＰＣＲ精製のためのＤＮＡ溶液及び溶出緩衝液と混合するために、２つのマイクロミキサを開発した。遺伝子合成チップは、自動遺伝子合成を行うための卓上機器として開発される予定であった。これらの使い捨てチップの費用を抑制し、製造プロセスを簡素化するために、単純な流体構造及び方法を利用した混合手法が望まれた。図１４は、シャトル混合及び電磁混合を使用した本発明者らの手法を示す。シャトル混合において、溶液は狭チャネルによって接続された２つのチャンバ間を往復させた。この狭いチャネルは２つの混合試薬の拡散距離を減少させ、チャネル−チャンバ接続部を急激に開放すると、接続部でカオス的移流を作り出し、フローを再循環させた（Ｇａｎら、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．、２００６年、８８巻、２２４１０３頁）。これらの特徴はともに、混合を強化することが報告されている（Ｎｇｕｙｅｎ及びＷｕ、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．、２００５年、１５巻、Ｒ１）。図１４ａはシャトルマイクロミキサの性能を示した。２色の食用色素（青色及び赤色）を、精密シリンジポンプによって送りだされる１５０μＬ／分の流速で、２つのチャンバ間を３回往復させた後によく混合した。この方法は、他の報告された方法と比較して小型で単純な流体構造で有効である（Ｎｇｕｙｅｎ及びＷｕ、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．、２００５年、１５巻、Ｒ１）。混合は、１９μＬの流体量を用いる本発明者らの適用において１分以内に完了した。溶液内部に閉じ込められた目視できる気泡はなかった。
【０１２６】
強力な磁力を与えるため、ネオジム希土類永久磁石を利用して、マイクロ流体デバイスにおいて磁気ビーズを捕捉した（Ｌｉｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００４年、７６巻、１８２４頁；Ｈｅｒｒｍａｎｎら、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００６年、６巻、５５５頁；Ｇｒｕｍａｎｎら、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００５年、５巻、５６０頁）。しかし、この強力な磁石は、ビーズの凝集もまた引き起こし（Ｒｉｄａ及びＧｉｊｓ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００４年、７６巻、６２３９頁）、ビーズが溶液中の所望の生体分子と十分接触するのを妨げる恐れがあった。確実にビーズが溶液と十分混合されるように、本発明者らは、チャンバ内部で溶液を撹拌する手法を開発した（図１４ｂ）。永久磁石を、２つの電磁石間に挟まれた自由に曲げられる金属アームに取り付けた。位相ずれ電圧が電磁石に印加されたときに、交流磁力が発生し、これが金属アーム及び永久磁石を同時に回転させた。回転する磁石は磁気ビーズを引きずり、溶液を撹拌した。この単純な手法を採用して、ＰＣＲ精製の最終段階において０．５Ｈｚの混合速度で、溶出緩衝液をＤＮＡ結合磁気ビーズと混合した。
【０１２７】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイドロゲル弁
ＰＣＲ工程中、４℃〜９４℃の空気溶解度変化は約３．１ｐｓｉの圧力を生じる可能性があった（Ｃｈｉｏｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、７３巻、２０１８頁）。閉じ込められた可能性のある気泡は、９４℃で３．７ｐｓｉのさらなる圧力を与えることになろう（Ｌｉｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００２年、７４巻、３０６３頁）。そのため、好ましいマイクロ弁は、少なくとも６．８ｐｓｉの圧力に耐えることができ、チャンバ内へのＰＣＲ混合物のシーリングの成功を確実にするはずである。
【０１２８】
ハイドロゲル弁は、一定加圧された貯水器（８ｐｓｉ）とデバイスの間に接続された液体流量計（ＳＬＧ１４３０、Ｓｅｎｓｉｒｉｏｎ）を用いて、単一チャンバデバイス上で使用される前に試験した（図５ｂ）。デバイス下部の熱電ヒータによって弁が冷却及び加熱の繰り返しを受けたときの、流速変化をモニターした。図１５は、時間の関数として弁温度及び流速を示す。弁寸法は１．５ｍｍ×１．５ｍｍ×０．５ｍｍであった。ハイドロゲルのＬＣＳＴ（３２℃）より低い温度では、熱反応性ハイドロゲルは膨張して弁を遮断したことが、流速の減少によって示された。温度がハイドロゲルのＬＣＳＴよりも高い場合、ハイドロゲルは体積が収縮して流体フローがチャネルを通過するのを可能にした。図１５に示すように、弁機能は、弁の開閉時間がそれぞれ約５秒及び約２０秒で高度に繰り返し可能であり（図１５の挿入図参照）、ヒータ下部の傾斜率、及びハイドロゲル膨張／脱膨張プロセスの水分拡散速度（Ｒｉｃｈｔｅｒら、Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ、２００４年、９９巻、４５１頁）によって制限される。閉じられた弁は、８ｐｓｉで漏れを示さず（流速ゼロ）、ＰＣＲチャンバをシールするのに十分強力であることを示した。Ｙｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、７５巻、１９５８頁は、ｉｎ  ｓｉｔｕ光重合ＮＩＰＡＡｍベースの弁が２００ｐｓｉまでの圧力に耐えることができることを報告した。Ｗａｎｇら、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００６年、６巻、４６頁及びＷａｎｇら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｄｅｖ．、２００５年、７巻、３１３頁もまた、化学重合したＮＩＰＡＡｍハイドロゲル弁を、事前合成したハイドロゲルを流路中に手動で挿入することによってＰＣＲと統合することに成功したことを記述した。
【０１２９】
ＰＣＲサーマルサイクリング
遺伝子合成プロセスを、シリコン基板上でＰＤＭＳ流体構造からなるチップに統合した。ＰＤＭＳは、高度に統合された生物学的マイクロシステムを構築するために優れたものになる多くの興味深い材料特性を有するが、その非特異的タンパク質吸着（Ｚｈａｎｇ及びＸｉｎｇ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００７年、３５巻、４２２３頁；Ｈｕａｎｇら、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００５年、５巻、１００５頁）及び水蒸気透過性（Ｐｒａｋａｓｈら、Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ、２００６年、１１３巻、３９８頁）が、少ない体積及び高い表面対体積比を有するマイクロ流体環境においてＰＣＲを実行するのに問題を引き起こす恐れがあった。これらの問題に対処するために、本発明者らは、製造したデバイスを２μｍ厚のパリレンで被覆し、水蒸気拡散に対するバリアを形成し、ＰＣＲ混合物との表面適合性を向上させた（Ｓｈｉｎら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．、２００３年、１３巻、７６８頁）。
【０１３０】
サーマルサイクリングのために、加熱シンク及びファンを有する熱電モジュールを利用した。図１６は、ＰＣＲチャンバ内に埋め込んだ熱電対以外は実際のデバイスと同一の大きさを有する、較正チップから得たサーマルサイクラーの温度プロファイルを示した。ヒータ表面及びＰＣＲチャンバ内の温度を測定した。これら２箇所の間の温度差は、５００μｍ厚のシリコン基板が５℃を超える温度低下を引き起こす可能性があり、サーマルサイクリングの操作中に補正されたことを示した。図１６から推定した加熱及び冷却速度は、それぞれ２．４℃／秒及び４．３℃／秒であり、これは市販のサーマルサイクラー（ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２００）よりも速かった。
【０１３１】
ＰＣＲチャンバは、７μＬの量を考慮して設計した。ＰＣＲ法によって合成された遺伝子は、完全長ＤＮＡ及び長さの短い中間段階の両方を含有していた。合成後、通常ゲル電気泳動を実施して合成の成功を確認し、完全長産物を分離し、次いでこれを、ゲル抽出キットを使用することによってゲルから抽出した。一部のＤＮＡは、これらの段階及びピペッティング工程のために失われた可能性があった。ＰＣＲ混合物を、６０℃で熱電ヒータによって開いたままにされたハイドロゲル弁を通してＰＣＲチャンバ中に導入した。ＰＣＲチャンバが溶液で満たされたら、ハイドロゲル弁を４℃まで冷却し、チャンバをシールした。高い熱伝導性を有するシリコンをデバイス基板として使用したため、ＰＣＲチャンバ及びハイドロゲル弁を離して配置し、ＰＣＲサーマルサイクリングと弁操作の間の熱的干渉を最小限に抑えた。９５℃の温度まで達する可能性があるサーマルサイクリング中に、ＰＣＲチャンバをシールするために、ハイドロゲル弁は転移温度より低く保たなければならない。ＰＣＲチャンバと弁間の熱的干渉を抑制し、デッドボリュームを減少させる１つの方法は、ポリマー基板（ポリカーボネート等）（Ｚｏｕら、Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ａ、２００２年、１０２巻、１１４頁）又はＷａｎｇら、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００６年、６巻、４６頁、及びＹａｎｇら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．、２００５年、１５巻、２２１頁によって報告された、基板の水平方向の熱流を抑制するための分離トレンチを使用することである。
【０１３２】
１段階及び２段階遺伝子合成の比較
ＰＣＲアセンブリのためのサーマルサイクラーの要件は、標準的なＰＣＲ増幅と同じであった。しかし、ＰＣＲアセンブリに関与するオリゴヌクレオチド数は、標準的なＰＣＲ増幅よりもはるかに多かった。様々な融解温度を有する１０個のオリゴヌクレオチドを含む溶液のプールから、完全長ＤＮＡを構築した。遺伝子合成の成功効率は、ポリメラーゼ、アセンブリオリゴヌクレオチド及び増幅プライマーの濃度、並びにオリゴヌクレオチドの構造及び特性を含むいくつかの重要な因子に依存していた（Ｃｏｘら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、２００７年、１６巻、３７９頁；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２００６年、１２４巻、４９６頁）。
【０１３３】
オリゴヌクレオチド及びプライマー濃度のベースラインを特定するため、ＧＦＰｕｖ（７６０ｂｐ）セグメントを、２段階ＰＣＲプロセスを使用してオリゴヌクレオチド濃度を５〜２５ｎＭ、及びプライマー濃度を０．１〜０．４μＭに変動させることによって、短いオリゴヌクレオチド（４０塩基）のプールから合成した；これは市販のサーマルサイクラーにおいて実施した。まず、所望の完全長産物を、外側プライマーを用いずにオリゴヌクレオチドからアセンブリし（ＰＣＡアセンブリ）、次いでこれらのプライマーを二次ＰＣＲで添加することによって増幅した（ＰＣＲ増幅）。マイクロ流体デバイス設計を適合させるために（図５ｃ）、等量の新たな増幅反応混合物で希釈したＰＣＡ産物を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。
【０１３４】
ＰＣＡアセンブリ（図１８ａ）及びＰＣＲ増幅（図１８ｂ）に関するゲル電気泳動結果を、表示したオリゴヌクレオチド及びプライマー濃度について示した。ＰＣＡはスメアーなゲル結果を有し、アセンブリ産物が、大部分が所望の標的（７６０ｂｐ）よりも低分子量を有するＤＮＡのスペクトルを含んでいたことを示した。１０ｎＭ未満の濃度のオリゴヌクレオチドからアセンブリされた産物では、完全長ＤＮＡ（７６０ｂｐ）の量はごく少量でＰＣＡゲル画像では視認できなかったが、ＰＣＲ増幅によって効率的に増加した。ＰＣＲゲル画像は、５ｎＭのオリゴヌクレオチド濃度並びにそれぞれ０．１μＭ、０．２μＭ及び０．４μＭのプライマー濃度で合成された試料１−１〜１−３を示した。他の試料は、使用したオリゴヌクレオチド濃度が１０ｎＭ、１５ｎＭ及び２５ｎＭであったことを除いて、試料１−１〜１−３と同じであった。１０ｎＭを超えるオリゴヌクレオチド濃度及び０．１μＭ及び０．２μＭのプライマー濃度を用いた合成は、所望の完全長（７６０ｂｐ）産物を提供することができなかった。対照的に、０．４μＭのプライマー濃度を用いて行った合成は全て、標的の７６０ｂｐ  ＤＮＡを生成することに成功した。４つの試料のうち、試料３−３（１５ｎＭ、０．４μＭ）及び４−３（２５ｎＭ、０．４μＭ）は、ＰＣＡ段階によって最初に生成されたより完全な長さのＤＮＡを有するが、１０ｎＭのオリゴヌクレオチド濃度及び０．４μＭのプライマー濃度を用いた試料２−３が最も完全な長さの生成物を生成した。これらの結果に基づいて、１０ｎＭのオリゴヌクレオチド濃度及び０．４μＭのプライマー濃度を、マイクロ流体デバイスにおける遺伝子合成のために選択した。
【０１３５】
最適化されたオリゴヌクレオチド及びプライマー濃度で、１段階（単一チャンバチップ）又は２段階マイクロ流体デバイスを使用することによって、短いオリゴヌクレオチド（４０塩基）のプールからＧＦＰｕｖ（７６０ｂｐ）を合成することに成功した。ゲル画像において、所望の生成物の強力な主要なバンドが得られた（図１９）。視覚的に推定したマイクロ流体デバイスの収率は、市販のサーマルサイクラーを用いてＰＣＲチューブにおいて行った対照の約５０％であった。これらは、ＰＣＲチャンバ（７μＬ）と弁間のチャネルにおけるデッドボリューム（２．８７μＬ）によって制限された。デッドボリューム内のオリゴヌクレオチド混合物はアセンブリされなかったが、溶出溶液の約３０％に寄与した。ゲル結果もまた、パリレンがＰＣＲ反応混合物と適合し、試薬の水蒸気透過性ＰＤＭＳからの蒸発を効果的に防止したことを示した。
【０１３６】
１段階プロセスと比較して、２段階プロセスは、同量の開始オリゴヌクレオチドからより多くの完全長産物を生成した。１段階プロセスにおいて、アセンブリ及び増幅を同時に実施し、一定量のオリゴヌクレオチド及びモノマー（ｄＮＴＰ）について競合し、より低分子量の中間段階産物を与えた（図１９ａ）。２段階プロセスにおいてプロセス競合は最小限に抑えられ、より多くの完全長産物をもたらした。２段階プロセスは、完全長ＤＮＡを生成できないこともある１段階プロセスよりも信頼できることが報告された（Ｇａｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００３年、３１巻、ｅ１４３頁；Ｘｉｏｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００４年、３２巻、ｅ９８頁）。２段階プロセスを用いる遺伝子合成はまた、アセンブリ及び増幅工程を別個に最適化するための異なるアニーリング温度を可能にした。
【０１３７】
アセンブリ配列は、ＤＮＡシーケンシングによって同定した。マイクロ流体デバイス及びＰＣＲチューブ由来の合成産物を、さらなる精製を行わずに、ＰＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して直接クローニングした。中間段階産物と同様に完全長標的を全てクローニングし、合成産物の実際の組成を反映させた。
【０１３８】
表１はシーケンシング結果を示す。完全長クローンから計算したキロベース（ｋｂ）当たりのエラー率は、１段階プロセスではデバイスにおいて３．４５、ＰＣＲチューブにおいて４．３６、２段階プロセスではデバイスにおいて４．０１、ＰＣＲチューブにおいて４．１０であった。これらの値は、報告されたエラー率の範囲（ｋｂ当たり１．８〜６）内であった（Ｔｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２００４年、４３２巻、１０５０頁；Ｘｉｏｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００４年、３２巻、ｅ９８頁；Ｈｏｏｖｅｒ及びＪ．Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００２年、３０巻、ｅ４３頁；Ｗｉｔｈｅｒｓ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｒ．、１９９９年、１２巻、１１１３頁）。
【０１３９】
大部分のエラー（＞８５％）が１塩基の挿入、欠失及び変異に関連していた。エラー率の差がないことは、これらのエラー率が合成方法（デバイス対ＰＣＲチューブ）及びプロセス（１段階対２段階）とは無関係であることを示唆した。Ｈｏｏｖｅｒ及びＪ．Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００２年、３０巻、ｅ４３頁及びＴｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２００４年、４３２巻、１０５０頁は、最も多いエラーは、ポリメラーゼ酵素の正確性ではなく、合成オリゴヌクレオチドの質に起因することを指摘した。
【０１４０】
オリゴヌクレオチドが、約９８．５％の工程効率で塩基ごとに化学合成された（Ｈｅｃｋｅｒ及びＲｉｌｌ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９８年、２４巻、２５６頁）。完全長オリゴヌクレオチドの全体収率は、オリゴヌクレオチドの長さが増加するにつれて減少した。例えば、標的として４０塩基長の合成産物において、わずか５４．６％のオリゴヌクレオチドのみが完全長であった。
【０１４１】
完全一致配列及びミスマッチ（１塩基及び複数塩基）を有する夾雑物の両方を含有する合成オリゴヌクレオチドの基礎単位は全て、ＰＣＲ工程に関与し、不正確な配列の生成物を生成する可能性があった。対照的に、ＤＮＡポリメラーゼは約１０〜６塩基／複製の複製正確性を有しており（Ｃｌｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９６年、２４巻、３５４６頁）、これは合成遺伝子産物のエラー率より３〜４桁低かった。マイクロ流体デバイスにおいて遺伝子合成を行うことは、マイクロＰＣＲ１段階遺伝子合成においてＫｏｎｇら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００７年、３５（８）巻：ｅ６１頁、ｅ−ｐｕｂ  ２００７年４月２日）により示されたように、合成産物の正確性を向上させない可能性があった。しかし、処理時間及び試薬コストを減少させ、人的プロセス因子を排除するはずであった。
【０１４２】
ＰＣＲ産物クローニング及びＤＮＡシーケンシングは、正確な合成産物が得られたことを確かめるために必要であった。これらのプロセスは、ラボの相当な労力を伴った。エラーを含まない遺伝子を得るために、望ましくない不完全なＤＮＡ又は所望の完全長ＤＮＡを含む可能性のある、多くの無作為選択したクローンをシーケンシングした（Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００５年、３３巻、ｅ５５頁；Ｃａｒｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００４年、３２巻、ｅ１６２頁）。２段階プロセスのより高い完全長収率によって有効な完全長クローンを得る確率が増加し、エラーを含まない遺伝子を獲得した。２段階プロセスによって作製された４個のうち約３個のクローン（ＰＣＲチューブにおいて３５／４７）が完全長産物を含んでおり、これは１段階プロセスで作製されたもの（３個のうち約１個のクローン（ＰＣＲチューブにおいて１６／４７））よりも多かった（表１）。したがって、エラーを含まない遺伝子を得るために必要なコロニーシーケンシング数並びにクローニング及びＤＮＡシーケンシングの労力を最低限に抑えるために、特に長いＤＮＡに関して、２段階プロセスが好ましいはずである。
【０１４３】
熱によって向上される固相ＰＣＲ精製
合成産物のエラー率を減少させるための、チップ上での、無細胞タンパク質合成（Ｍｅｉら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００６年、７８巻、７６５９頁；Ｎｏｉｒｅａｕｘ及びＬｉｂｃｈａｂｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００４年、１０１巻、１７６６９頁）（タンパク質伸長のために合成遺伝子を直接使用）及び酵素エラーフィルター処理方法の統合（Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００５年、３３巻、ｅ５５頁；Ｃａｒｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００４年、３２巻、ｅ１６２頁；Ｆｕｈｒｍａｎｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００５年、３３巻、ｅ５８頁；Ｂｒｏｗｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２００１年、３５４巻、６２７２５頁）等の適用に関して、磁気ビーズを用いるＰＣＲ精製方法（チャージスイッチＰＣＲクリーナップキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づいて、固相緩衝液交換工程を２段階マイクロ流体デバイスに統合した。このプロセスは、短いプライマー及びｄＮＴＰからアセンブリ産物を精製すること及び下流用途の緩衝溶液を調製することを目的とした。Ｊｅｍｅｒｅら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２００２年、２３巻、３５３７頁；Ｗｅｓｔら、Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ、２００７年、１２６巻、６６４頁；及びＢｒｅａｄｍｏｒｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、７５巻、１８８０頁により報告された別の核酸抽出方法と比較して、シリカ被覆磁気ビーズは、デバイス統合を簡略化するのに役立つ可能性があった（Ｌｉｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００４年、７６巻、１８２４頁；Ｃｈｏら、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ、２００７年、７巻、５６５頁）。
【０１４４】
チャージスイッチは、別の報告された方法（Ｗｅｓｔら、Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ、２００７年、１２６巻、６６４頁；Ｂｒｅａｄｍｏｒｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、７５巻、１８８０頁）と同じ手法を利用した。まず、高イオン強度条件下でＤＮＡをシリカ表面上に吸着させた。結合していない夾雑物を洗い流し、次いで吸着したＤＮＡを、ｐＨのより高い溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）中に放出した。チャージスイッチキットは、まず、対照として既知ＤＮＡ量（１．１９μｇ）とともに１００ｂｐ  ＤＮＡラダーを使用して、製造業者によって示される手法及びプロトコールに従って、標準的なＰＣＲチューブにおいて最適化した。
【０１４５】
試薬量を変更して、マイクロ流体デバイスの設計に適合させた。ＰＣＲチューブ及び１００ｂｐラダーを使用してベースラインプロトコールを確立した後、その手順を、１００ｂｐ  ＤＮＡラダー及びＰＣＲ合成産物に関してマイクロ流体デバイスに適用した。１００ｂｐ  ＤＮＡラダーの全量（１．１９μｇ）又はＰＣＲ産物（１．９８μｇ）は、ロードされたチャージスイッチビーズの結合能力未満であった。製造業者のプロトコールに基づくと、チャージスイッチビーズは９０ｂｐを超える長さを有する二本鎖ＤＮＡに結合するはずであり、したがって１００ｂｐ  ＤＮＡラダーを対照として選択した。ＤＮＡ抽出は、ＤＮＡ捕捉、夾雑物洗浄、及びＤＮＡ伸長の３つの段階を含んでいた。ＤＮＡ溶出条件（時間及び温度）を検討して、抽出効率を増加させた。
【０１４６】
捕捉及び放出されるＤＮＡの割合として定義される抽出効率を、図２０に示した。ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計によって、もとの及び溶出したＤＮＡ試料の量を測定した。全ての測定を３回繰り返した。１００ｂｐ  ＤＮＡラダーの平均抽出効率は、７μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）中で、２５℃で３分間溶出させて、ＰＣＲチューブにおいて６５．４％、マイクロ流体デバイスにおいて４２．２％であった。吸着されたＤＮＡの溶出温度が上昇した場合、結合ＤＮＡの放出は増加した。抽出効率は、６０℃で３分間インキュベートした場合、ＰＣＲチューブにおいて８６％まで、及びマイクロ流体デバイスにおいて７０％まで効果的に増加した。さらなる温度の上昇は、抽出効率を向上させなかった。抽出効率は、インキュベーション時間の増加（２分から３分）によってわずかに向上した（＜１０％）。熱によって向上するＤＮＡ溶出は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液におけるｐＨ変化の温度効果又は結合ＤＮＡの熱モーメンタムの増加（Ｃｌｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９６年、２４巻、３５４６頁）によるものである可能性があった。
【０１４７】
ＰＣＲ合成産物では、６０℃で３分間インキュベートした場合、抽出効率はＰＣＲチューブにおいて７６．６％（＋３．３８％、−５．６６％）、及びマイクロ流体デバイスにおいて６１．３％（＋３．５１％、−２．５６％）であった。これらの効率は、１００ｂｐ  ＤＮＡラダーで達成された、それぞれ８６％及び７０．１％よりも低いものであった。この差は、ｄｓＤＮＡのような２６０ｎｍの波長のＵＶ光も吸収する短いプライマー及びモノマー（ｄＮＴＰ）によるものであった可能性がある。抽出効率の低下は、ＰＣＲ産物中の夾雑物（短いプライマー及びモノマー（ｄＮＴＰ））が除去されたことを示唆した。熱によって向上するＤＮＡ抽出は単純であり、ゾルゲル誘導シリカ粒子（６５％）（Ｂｒｅａｄｍｏｒｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、７５巻、１８８０頁）及びモノリシックゾルゲルマイクロチップ（８５％）（Ｗｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２００６年、７８巻、５７０４）、及び高密度充填微細加工シリコン構造（７５％）（Ｗｅｓｔら、Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ、２００７年、１２６巻、６６４頁）によって達成されたものに近い抽出効率をもたらした。これは、特別な製造工程又は変更もなく、大部分のマイクロ流体デバイスと容易に統合することが可能であり、７μＬの溶出緩衝液において２０分以下で、マイクログラム量の抽出に成功することを可能にした。高い負荷能力（マイクログラム）は、ＰＣＲ合成産物を抽出するために特に望ましいものであった。大部分の固相ＤＮＡ抽出チップ（Ｗｅｓｔら、Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ、２００７年、１２６巻、６６４頁；Ｂｒｅａｄｍｏｒｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、７５巻、１８８０頁；Ｗｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００６年、７８巻、５７０４頁；Ｓａｍｐｅｒら、Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ａ、２００７年、１３９巻、１３９頁）は、生体試料からのＤＮＡ精製のために設計され、わずかナノグラムの結合能を有するのみであった。短い熱ショック（３分間）は、マイクロ流体デバイスにおいて４２．２％（２５℃）から７０％（６０℃）まで、効果的に抽出効率を増加させた。
【０１４８】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されるべきではない。本明細書に記載のものに加えて、本発明の様々な変更形態が前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるはずである。このような変更形態は特許請求の範囲内に入ることが意図されている。
【０１４９】
本発明は、本明細書に記載の個々の特徴、システム、材料、及び／又は方法を対象とする。加えて、上記の特徴、システム、材料、及び／又は方法が互いに矛盾しない限り、上記の特徴、システム、材料、及び／又は方法の２つ以上の任意の組合せが、本発明の範囲内に含まれる。
【０１５０】
明細書及び特許請求の範囲において、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「持っている（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」、「でできている（ｍａｄｅ  ｏｆ）」、「から形成される（ｆｏｒｍｅｄ  ｏｆ）」、「含んでいる（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」等の全ての暫定的な表現又は包含の表現は、非制限的である、すなわち、「限定されるわけではないが含んでいる」、したがって、その後列挙される項目及びその等価物並びに追加項目を包含していることを意味すると解釈されるものとする。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」の暫定的な表現又は包含の表現のみが、それぞれ制限的又は半制限的表現と解釈されるべきである。明細書及び特許請求の範囲において使用される不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、そうでない旨が明確に示されない限り、「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」を意味すると理解されるべきである。「Ａ又はＢ」という表現は、そうでない旨が明確に示されない限り、「Ａ又はＢ又は両方」を意味すると理解されるべきである。
【０１５１】
様々な出版物が本明細書において引用され、その開示は、引用されている出版物の文脈から理解されるように、参照によってその全体又は関連部分が組み込まれる。本明細書並びに参照によって組み込まれる文書及び／又は本明細書において言及される文書が、矛盾する開示及び／又は専門用語の整合性のない使用を含む場合、及び／又は組み込まれる／言及される文書が、本明細書において使用又は定義される用語と違う意味で用語を使用又は定義する場合、本明細書が効力を有するものとする。
【０１５２】
【表１】
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【０１５３】
【表２】
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【図１】
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【図７】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２０】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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