(57)【要約】  以下のセグメント（ｉ）〜（ｉｉｉ）：ｉ）ポテクスウイルスＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能‐保存的変異体をコードする核酸配列；ｉｉ）ａ）ポテクスウイルストリプル遺伝子ブロックもしくはその機能‐保存的変異体およびｂ）ポテクスウイルス外被タンパク質もしくはその機能‐保存的変異体をコードする配列；またはトバゴウイルス移行タンパク質をコードする配列を含む核酸配列；ならびにｉｉｉ）植物体において、または植物組織においてＲＮＡレプリカから発現可能な非相同核酸配列をこの順序において含む該レプリカを含むか、またはコードする核酸。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のセグメント（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）ポテクスウイルスＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能‐保存的変異体をコードする核酸配列；
（ｉｉ）（ａ）ポテクスウイルストリプル遺伝子ブロックもしくはその機能‐保存的変異体および
（ｂ）ポテクスウイルス外被タンパク質もしくはその機能‐保存的変異体をコードする配列；またはトバモウイルス移行タンパク質をコードする配列を含む配列；ならびに
（ｉｉｉ）植物体において、または植物組織においてＲＮＡレプリコンから発現可能な非相同核酸配列をこの順序において含む、該レプリコンを含むか、またはコードする核酸。
【請求項２】
ポテクスウイルストリプル遺伝子ブロックの機能‐保存的変異体が以下の３種のタンパク質：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列セグメントに少なくとも４０％の配列同一性を有する、少なくとも２００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントを含む第１のタンパク質；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の配列セグメントに少なくとも４０％の配列同一性を有する、少なくとも１００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントを含む第２のタンパク質；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の配列セグメントに少なくとも４０％の配列同一性を有する、少なくとも５５アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントを含む第３のタンパク質をコードする、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ポテクスウイルストリプル遺伝子ブロックの機能‐保存的変異体が３種のタンパク質をコードし：その中の１種はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に少なくとも３３％の配列同一性を有し；１種はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に少なくとも３６％の配列同一性を有し；そして１種はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に少なくとも３０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
ポテクスウイルストリプル遺伝子ブロックの機能‐保存的変異体が３種のタンパク質をコードし：その中の１種はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に少なくとも５０％の配列同一性を有し；１種はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に少なくとも５０％の配列同一性を有し；そして１種はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に少なくとも５０％の配列同一性を有する、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
ポテクスウイルス外被タンパク質の機能‐保存的変異体が少なくとも２００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントを含み、該配列セグメントがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の配列セグメントに少なくとも３５％の配列同一性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６】
項目（ｉ）の配列が、少なくとも３００アミノ酸残基、好ましくは少なくとも５００アミノ酸残基、いっそう好ましくは少なくとも９００アミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも１４００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメント内に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によってコードされたタンパク質に少なくとも３６％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項７】
項目（ｉ）の配列が、少なくとも３００アミノ酸残基、好ましくは少なくとも５００アミノ酸残基、いっそう好ましくは少なくとも９００アミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも１４００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメント内に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によってコードされたタンパク質に少なくとも４５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８】
項目（ｉ）の配列が、少なくとも３００アミノ酸残基、好ましくは少なくとも５００アミノ酸残基、いっそう好ましくは少なくとも９００アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも１４００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメント内に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によってコードされたタンパク質に少なくとも５０％の配列相同性を有するタンパク質をコードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９】
項目（ｉ）の核酸配列が、少なくとも９００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５００ヌクレオチド、いっそう好ましくは少なくとも２７００ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも４２００ヌクレオチドの配列セグメント内に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対して少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％の配列同一性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０】
レプリコンがポテクスウイルスレプリコン、好ましくはジャガイモイルスＸに、竹モザイクポテクスウイルスに、またはパパイヤモザイクポテクスウイルスに由来するレプリコンである、請求項１〜９に記載の核酸。
【請求項１１】
レプリコンがウイルス粒子アセンブリーの起点を持たない、請求項１〜１０に記載の核酸。
【請求項１２】
以下の群：項目（ｉ）の上流の植物細胞において活性な転写プロモーター、ウイルスサブゲノムプロモーター、ポテクスウイルス５′または３′非翻訳領域から選択される配列を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸。
【請求項１３】
項目（ａ）および（ｂ）が項目（ｉｉ）の核酸配列においてどんな順番でもあり得る、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４】
項目（ｉｉ）においてポテクスウイルストリプル遺伝子ブロックまたはその機能‐保存的変異体がポテクスウイルス外被タンパク質遺伝子もしくはその機能‐保存的変異体の上流に位置するか、または逆である、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
トバモウイルス移行タンパク質がタバコモザイクウイルスもしくはターニップベインクリアリングウイルス（ｔｕｒｎｉｐ  ｖｅｉｎ  ｃｌｅａｒｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）の移行タンパク質または移行タンパク質の機能‐保存的変異体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸の相補的配列を含む、核酸。
【請求項１７】
以下のセグメント（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）ポテクスウイルスＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能‐保存的変異体をコードする核酸配列；
（ｉｉ）（ａ）ポテクスウイルストリプル遺伝子ブロックおよび
（ｂ）ポテクスウイルス外被タンパク質をコードする配列；またはトバモウイルス移行タンパク質をコードする配列を含む核酸配列；ならびに
（ｉｉｉ）植物体において、または植物組織においてＲＮＡレプリコンから発現可能な非相同核酸配列をこの順序において含む、該レプリコンを含むか、またはコードする核酸。
【請求項１８】
部位特異的組換えによって植物細胞に請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸をアセンブルすることが可能な、少なくとも２種のベクターを含む部品キット。
【請求項１９】
少なくとも２種のベクターを含む請求項１８に記載の部品キットであって、第１のベクターは請求項１〜１５のいずれか１項に記載の項目（ｉ）および（ｉｉ）のセグメントを含むか、またはコードし、そして第２のベクターは請求項１〜１５のいずれか１項に記載の項目（ｉｉｉ）のセグメントを含むか、またはコードし、ここで第１および第２ベクターはそれぞれ、部位特異的組換えによって請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸のアセンブリーを可能にする組換え部位を有する、キット。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸を植物体または植物組織に提供することを含む、植物体において、または植物組織において関心のある非相同核酸配列を発現するプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポテクスウイルスに由来するレプリコンを使用した、植物体、植物組織、または植物細胞における関心のある遺伝子の高収率発現のプロセス、および関心のある遺伝子を発現するために使用可能なポテクスウイルスＲＮＡレプリコンを含むか、またはコードする核酸に関する。本発明はさらに、本発明のＲＮＡレプリコンを一緒にコードする２種以上のベクターを含む部品キットに関する。
発明の背景
植物における非相同タンパク質の高収率発現はウイルスベクターを使用することによって達成されうる。ウイルスベクター系は植物宿主の感染（Ｄｏｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８８：７２０４−７２０８；Ｃｈａｐｍａｎ，Ｋａｖａｎａｇｈ  ＆  Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２：５４９−５５７）またはトランスフェクション（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３：７１８−７２３；Ｓａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０３：８６１−８６６；ＷＯ２００５／０４９８３９）後の一過性発現のために主として開発された。最適に確立され、市販可能な系はプラスセンス１本鎖ＲＮＡウイルス、好ましくはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に由来するベクター（Ｋｕｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，４２７−４３０；Ｍａｌｌｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，６２２−６２５；ＵＳ５３１６９３１；ＵＳ５５８９３６７；ＵＳ５８６６７８５；ＵＳ５９７７４３８；ＷＯ０２０８８３６９；ＷＯ２０９７０８０；ＷＯ０２２９０６８；ＵＳ５４９１０７６）に基づく。
【０００２】
ポテクスウイルスＰＶＸ（ジャガイモウイルスＸ）に由来するＲＮＡウイルスを基礎にしたベクターの別の群も、ＴＭＶに由来するベクターより顕著に低い収率ではあるが、適度に高収率の組換えタンパク質を提供しうる（Ｃｈａｐｍａｎ，Ｋａｖａｎａｇｈ  ＆  Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２：５４９−５５７；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，７：１０４５−１０５３；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ａｐｒｉｌ  １３，電子版；Ｚｅｌａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，８６：２６３−２６７）。明らかに、そのようなシステムは関心のある組換えタンパク質の収率を増すためにいっそうの改善を必要とする。
【０００３】
全身ウイルスベクターの第１世代では、植物資源のかなりの部分がウイルスレプリコンの全身移行に必要なウイルス外被タンパク質の生産に浪費された。ＴＭＶに由来するベクターの場合、この問題はレプリコンの効率的な全身送達のために、外被タンパク質遺伝子を除去することによって、およびアグロ‐浸潤（ａｇｒｏ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を使用することによって解決され、そうして関心のある組換えタンパク質の収率を著しく高めた（ＷＯ２００５／０４９８３９；Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３：７１８−７２３）。しかし、ＴＭＶに由来するレプリコンとは異なり、ポテクスウイルスに由来するレプリコンは全身移行だけでなく、短距離（細胞間）移行のためにもウイルス外被タンパク質を必要とする。従って、ポテクスウイルスに由来するウイルスベクターの外被タンパク質遺伝子は、タンパク質発現効率の重大な損失なしに除去されるはずがない。さらに、ｉｎ  ｔｒａｎｓでウイルス外被タンパク質を提供する植物宿主の工学的操作は遺伝子サイレンシングのためにめったに良い解決法ではない。その上、外被タンパク質を発現するトランスジェニック植物が植物ウイルスによる挑戦に対して外被タンパク質‐媒介抵抗性を示す可能性がある（Ｂｅａｃｈｙ，ＲＮ．，１９９９，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，３５４：６５９−６６４；Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：５５９−５６７）。非相同性ＣＰ‐媒介抵抗性と呼ばれる別の類似の現象が、たとえばＰＶＸ  ＣＰを発現するトランスジェニック植物がＴＭＶ  ＲＮＡの細胞間拡散を減少させる場合、課題であり得る（Ｂａｚｚｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８７：１００５−１０１２）。その上、トランスジェニックタバコ植物体におけるＰＶＸ外被タンパク質の発現は移行‐欠陥ＰＶＸをレスキューするが、細胞間移行およびウイルス複製の効率を低下させる（Ｓｐｉｌｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２３６：７６−８４）。同じ植物細胞における２種のウイルスベクター（たとえば、ＴＭＶ‐およびＰＶＸ‐を基礎にしたベクター）の使用がヘテロオリゴマータンパク質の発現に（たとえば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の同時発現に）必要である場合、このことは問題点でありうる（ＷＯ２００６／０７９５４６；Ｇｉｒｉｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，印刷中）。
発明の一般的な説明
従って、植物体における、植物組織における、または植物細胞における関心のあるタンパク質の高収率発現のためにポテクスウイルスを基礎にしたウイルスベクターを提供することが本発明の目的である。ウイルスベクターは細胞間移行が可能であるべきであり、そしてウイルス外被タンパク質を生産するために植物宿主の資源をできるだけ浪費すべきではない。
【０００４】
この目的は以下のセグメント：
（ｉ）ＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能‐保存的誘導体をコードする核酸配列；
（ｉｉ）植物体において、または植物組織においてＲＮＡレプリコンの細胞間移行に必要な１種以上のタンパク質をコードする核酸配列；
（ｉｉｉ）植物体において、または植物組織において該レプリコンから発現可能な非相同核酸配列；
またはその相補的な配列をこの順序において含む該レプリコンを含むか、またはコードする核酸によって解決される。
【０００５】
この目的はさらに、以下のセグメント：
（ｉ）ＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能‐保存的誘導体をコードする核酸配列；
（ｉｉ）ポテクスウイルストリプル遺伝子ブロックまたはその機能‐保存的変異体および
ポテクスウイルス外被タンパク質またはその機能‐保存的変異体を含む核酸配列；
（ｉｉｉ）植物体において、または植物組織においてＲＮＡレプリコンから発現可能な非相同核酸配列；
またはその相補的な配列をこの順序において含む、該レプリコンを含むか、またはコードする核酸によって解決される。
【０００６】
この目的はさらに、以下のセグメント：
（ｉ）ＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能‐保存的誘導体をコードする核酸配列；
（ｉｉ）ポテクスウイルストリプル遺伝子ブロックまたはその機能‐保存的変異体および
トバモウイルス移行タンパク質を含む核酸配列；および
（ｉｉｉ）植物体において、または植物組織においてＲＮＡレプリコンから発現可能な非相同核酸配列；
またはその相補的な配列をこの順序において含む、該レプリコンを含むか、またはコードする核酸によって解決される。
【０００７】
ＲＮＡレプリコンは植物体において、または植物組織において非相同核酸配列を複製し、発現するためのレプリコンであってもよい。ＲＮＡレプリコンはポテクスウイルス上に構築されてもよく、非相同核酸配列を発現するためにポテクスウイルスの複製および発現系を使用する。
【０００８】
本発明の核酸は単離された、または単離され、そして精製された核酸であってもよい。本発明の核酸は典型的には、植物体または植物細胞にトランスフェクションするか、またはそれらを形質転換するためのベクターとして使用される。
【０００９】
本発明はさらに、部位特異的組換えによって植物細胞に本発明の核酸をアセンブルすることが可能な少なくとも２種のベクター（プロベクター）を含む部品キットを提供する。
本発明はまた、本発明の核酸を植物体または植物組織に提供することを含む、植物体において、または植物組織において関心のある非相同核酸配列を発現するプロセスを提供する。本発明はまた、部位特異的組換えによって植物細胞に本発明の核酸をアセンブルすることが可能な２種以上のベクターを植物体または植物組織に提供することを含む、植物体または植物組織において関心のある非相同核酸配列を発現するプロセスを提供する。
【００１０】
発明者らは驚くべきことに、ポテクスウイルスベクターから植物体において、または植物組織において発現される関心のあるタンパク質の発現収率をベクターデザインによって増すための方法を確認していて、ここでは項目（ｉｉ）で定義された配列は項目（ｉ）のＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼコーディング配列（ＲｄＲｐまたはＲｄＲＰ）の後（５から３′方向の下流）に配置される。ポテクスウイルスベクターの特殊な場合では、このベクターデザインがＲＮＡレプリコンの細胞間移行能力、および同時に慣用のポテクスウイルスベクターに比較して非相同核酸のより高い発現レベルを導き、ここでは非相同核酸はポテクスウイルス外被タンパク質遺伝子の上流に配置された。発明者らによって確認された効果は、項目（ｉｉ）の配列の位置がこれらのタンパク質のより低い発現レベル、およびこれらのタンパク質発現のための植物資源のより少ない消費を導き、関心のある３′タンパク質のより高い発現レベルを可能にするという事実に起因してもよい。重要なことに、本発明におけるポテクスウイルス外被タンパク質の限定された発現レベルは、関心のある非相同配列の高収率発現のための効率的な細胞間移行を支持するために十分である。
【００１１】
ポテクスウイルスはプラスセンス１本鎖ゲノムを持つ植物ＲＮＡウイルスである。従って、本発明の核酸はＲＮＡレプリコンであるか、もしくはそれを含むＲＮＡであってもよく、またはＲＮＡレプリコンをコードするＤＮＡであってもよい。本明細書では、「ポテクスウイルスベクター」または「ポテクスウイルスレプリコン」という用語は、該ベクターまたはレプリコンがポテクスウイルスの複製およびタンパク質発現系を利用することを意味する。該核酸は、たとえばポテクスウイルス由来の遺伝的要素を使用することによって、天然のポテクスウイルス上に構築されてもよい。本発明の核酸は、ポテクスウイルスをコードする核酸コンストラクトに非相同核酸配列を挿入することによって得ることが可能であってもよく、それによって関心のある非相同核酸配列がポテクスウイルス外被タンパク質をコードする配列の下流に挿入される。しかし、天然のポテクスウイルスの種々の遺伝的要素、たとえばポテクスウイルスＲｄＲｐ遺伝子、トリプル遺伝子ブロック、外被タンパク質遺伝子、またはポテクスウイルスの５′もしくは３′非翻訳領域に対して種々の改変が行われてもよく、それらの例は以下に記載される。
【００１２】
本発明のＲＮＡレプリコンは、５′末端から３′末端の順序で、本発明のセグメント（ｉ）から（ｉｉｉ）までを含む。さらに、遺伝的要素は典型的には複製および発現のためにレプリコン上に存在することになる。ＲＮＡレプリコンであるために、すなわち植物細胞における自律複製のために、ＲＮＡレプリコンはＲｄＲｐまたはその機能‐保存的誘導体をコードする。該ＲＮＡレプリコンはさらに、ＲｄＲｐを結合するために、およびＲＮＡレプリコンを複製するために、ＲＮＡレプリコンの５′‐または３′‐非翻訳領域において、ポテクスウイルス５′‐または３′‐非翻訳領域およびプロモーター配列を含んでいてもよい。該ＲＮＡレプリコンはさらに、項目（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のセグメントによってコードされるタンパク質の発現のためのサブゲノムＲＮＡを生み出すために、項目（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のセグメントにおいてサブゲノムプロモーターを有していてもよい。核酸がＤＮＡの場合、それは典型的にはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｐｌａｎｔａにおいてＲＮＡレプリコンの転写による生産を可能にする転写プロモーターを有することになる。ｉｎ  ｐｌａｎｔａにおいてＤＮＡ核酸からのＲＮＡレプリコンの転写を可能にする転写プロモーターの例としては、植物バイオテクノロジーにおいて広範に使用される３５Ｓプロモーターが挙げられる。
【００１３】
上記セグメント（ｉ）はジャガイモウイルスＸのようなポテクスウイルスのＲｄＲｐ、またはポテクスウイルスＲｄＲｐの機能‐保存的変異体をコードしてもよい。ＲＮＡレプリコンにおいて使用されるＲｄＲｐは、項目（ｉ）の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によってコードされるタンパク質に少なくとも３６％の配列同一性を有するタンパク質をコードする場合、ポテクスウイルスＲｄＲｐの機能‐保存的変異体であると見なしてもよい。別の態様では、配列同一性はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によってコードされるタンパク質に対して少なくとも４５％、別の態様では少なくとも５５％、別の態様では少なくとも６５％、そしてさらに別の態様では少なくとも７５％である。これらの配列同一性はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列全体にわたり存在していてもよい。あるいは、これらの配列同一性は、少なくとも３００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメント内に、少なくとも５００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメント内に、少なくとも９００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメント内に、または少なくとも１４００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメント内に存在していてもよい。
【００１４】
本明細書では、アミノ酸配列同一性は、標準状態で使用するＢＬＡＳＴＸ２．２．１４を使用して測定されてもよい。
一例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によってコードされるタンパク質と、ポテクスウイルスＲｄＲｐの機能‐保存的変異体間の配列同一性は少なくとも９００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントにおいて４５％である。別の例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によってコードされるタンパク質と、ポテクスウイルスＲｄＲｐの機能‐保存的変異体間の配列同一性は少なくとも９００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントにおいて５５％である。
【００１５】
あるいは、ＲＮＡレプリコンにおいて使用されるＲｄＲｐは、項目（ｉ）の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によってコードされるタンパク質に少なくとも５０％の配列相同性を有するタンパク質をコードする場合、ポテクスウイルスＲｄＲｐの機能‐保存的変異体と見なされてもよい。別の態様では、配列相同性はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によってコードされるタンパク質に対して少なくとも６０％、別の態様では少なくとも７０％、そして別の態様では少なくとも８０％である。これらの配列相同性は少なくとも３００アミノ酸残基、少なくとも５００アミノ酸残基、少なくとも９００アミノ酸残基、または少なくとも１４００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメント内に存在していてもよい。アミノ酸配列相同性は、標準状態で使用するＢＬＡＳＴＸ２．２．１４を使用して測定されてもよい。標準状態は、たとえば、アラインメントにおける配列ギャップを考慮する。
【００１６】
一例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によってコードされるタンパク質と、ポテクスウイルスＲｄＲｐの機能‐保存的変異体間の配列相同性は少なくとも９００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントにおいて７０％である。別の例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によってコードされるタンパク質と、ポテクスウイルスＲｄＲｐの機能‐保存的変異体間の配列同一性は少なくとも９００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントにおいて８０％である。
【００１７】
あるいは、ＲＮＡレプリコンにおいて使用されるＲｄＲｐは、項目（ｉ）の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対して少なくとも５５％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％の配列同一性を有する場合、ポテクスウイルスＲｄＲｐの機能‐保存的変異体と見なされてもよい。配列同一性はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４内に、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の少なくとも９００ヌクレオチドの配列セグメント内に、少なくとも１５００ヌクレオチドの配列セグメント内に、少なくとも２０００ヌクレオチドの配列セグメント内に、もしくは少なくとも４２００ヌクレオチドの配列セグメント内に存在していてもよい。ヌクレオチド配列同一性は、標準状態で使用するＢＬＡＳＴＮ２．２．１４を使用して測定されてもよい。標準状態は、たとえばアラインメントにおける配列ギャップを考慮する。
【００１８】
ＲＮＡレプリコンは植物体において、または植物組織において、ＲＮＡレプリコンの細胞間移行を可能にするために項目（ｉｉ）の核酸配列を含む。ＲＮＡレプリコンの細胞間移行は、植物体または植物組織のできるだけ多くの細胞における項目（ｉｉｉ）の配列の発現を達成するために重要である。項目（ｉｉ）の核酸配列はポテクスウイルストリプル遺伝子ブロック（本明細書では「ＴＧＢ」と省略される）またはその機能‐保存的変異体を含んでいてもよい（ＴＧＢに関する総説はＪ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（２００３）８４，１３５１−１３６６に見いだされる）。ポテクスウイルストリプル遺伝子ブロックはポテクスウイルスに細胞間移行能力を提供するために必要な３種のタンパク質をコードする。従って、ＴＧＢの変異体が、付加的に別の必要な要素と一緒に植物体において、または植物組織において細胞間移行能力を持つ本発明のＲＮＡレプリコンを提供できる場合、ＴＧＢの該変異体はＴＧＢの機能‐保存的変異体であると見なされる。
【００１９】
ポテクスウイルスＴＧＢの例としては、ジャガイモウイルスＸのＴＧＢ（本明細書では「ＰＶＸ  ＴＧＢ」と表される）が挙げられる。ＰＶＸ  ＴＧＢは、それらのおおよその分子量に従って２５Ｋ、１２Ｋ、および８Ｋと表される３種のタンパク質をコードする３種の遺伝子から構成される。ＰＶＸ２５Ｋ、ＰＶＸ１２Ｋタンパク質、およびＰＶＸ８Ｋタンパク質をコードする遺伝子配列はそれぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で示される。ＰＶＸ２５Ｋタンパク質、ＰＶＸ１２Ｋタンパク質、およびＰＶＸ８Ｋタンパク質のタンパク質配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で示される。
【００２０】
一態様では、ポテクスウイルスＴＧＢの機能‐保存的変異体は３種の遺伝子のブロックであり、該ブロックは３種のタンパク質をコードし、そのうちの１種はＰＶＸ２５Ｋタンパク質に少なくとも３３％の配列同一性を有し、１種はＰＶＸ１２Ｋタンパク質に少なくとも３６％の配列同一性を有し、そして１種はＰＶＸ８Ｋタンパク質に少なくとも３０％の配列同一性を有する。別の態様では、ポテクスウイルスＴＧＢの機能‐保存的変異体は３種のタンパク質をコードし、そのうちの１種はＰＶＸ２５Ｋタンパク質に少なくとも４０％の配列同一性を有し、１種はＰＶＸ１２Ｋタンパク質に少なくとも４０％の配列同一性を有し、そして１種はＰＶＸ８Ｋタンパク質に少なくとも４０％の配列同一性を有する。別の態様では、ポテクスウイルスＴＧＢの機能‐保存的変異体は３種のタンパク質をコードし、そのうちの１種はＰＶＸ２５Ｋタンパク質に少なくとも５０％の配列同一性を有し、１種はＰＶＸ１２Ｋタンパク質に少なくとも５０％の配列同一性を有し、そして１種はＰＶＸ８Ｋタンパク質に少なくとも５０％の配列同一性を有する。別の態様では、対応する配列同一性値は、それぞれのタンパク質に対して６０％である。別の態様では、対応する配列同一性値は、それぞれのタンパク質に対して７０％である。
【００２１】
別の態様では、ポテクスウイルスＴＧＢの機能‐保存的変異体は以下の３種のタンパク質をコードし：第１のタンパク質は少なくとも２００アミノ酸残基の蛋白質配列セグメントを含み、該セグメントはＰＶＸ２５Ｋタンパク質の配列セグメントに少なくとも４０％の配列同一性を有し；第２のタンパク質は少なくとも１００アミノ酸残基の蛋白質配列セグメントを含み、該配列セグメントはＰＶＸ１２Ｋタンパク質の配列セグメントに少なくとも４０％の配列同一性を有し；そして第３のタンパク質は少なくとも５５アミノ酸残基の蛋白質配列セグメントを含み、該配列セグメントはＰＶＸ８Ｋタンパク質の配列セグメントに少なくとも４０％の配列同一性を有する。別の態様では、対応する配列同一性値は、それぞれのタンパク質に対して５０％である。別の態様では、対応する配列同一性値は、第１、第２および第３のタンパク質のそれぞれに対して６０％である。
【００２２】
項目（ｉｉ）の核酸配列はポテクスウイルス外被タンパク質またはその機能‐保存的変異体のような、ＲＮＡレプリコンの細胞間移行に必要なタンパク質をコードする別の配列を含んでいてもよい。ポテクスウイルス外被タンパク質の変異体が、植物体において、または植物組織において細胞間移行能力を有するＴＧＢのような他の必要な要素と一緒にＲＮＡレプリコンを提供することが可能である場合、それは外被タンパク質の機能‐保存的変異体と見なされる。一態様では、ＲＮＡレプリコンがポテクスウイルス外被タンパク質（またはその機能‐保存的変異体）を含む場合、アセンブルした植物ウイルスの形状での植物から植物へのＲＮＡレプリコンの拡散を避けるために、該ＲＮＡレプリコンはウイルス粒子アセンブリーの起点を持たない。ＲＮＡレプリコンがポテクスウイルス外被タンパク質遺伝子（またはその機能‐保存的変異体）およびＴＧＢ（またはその機能‐保存的変異体）を含む場合、該ＴＧＢは外被タンパク質遺伝子の上流に配置されるか、または逆であることが可能である。従って、ポテクスウイルス外被タンパク質遺伝子（またはその機能‐保存的変異体）およびＴＧＢ（またはその機能‐保存的変異体）は、項目（ｉｉ）の核酸配列においてどんな順番で存在してもよい。
【００２３】
ＰＶＸ外被タンパク質のコーディング配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７として示され、ＰＶＸ外被タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８として示される。あるタンパク質が少なくとも２００、あるいは少なくとも２２０、さらにあるいは２３７アミノ酸残基の蛋白質配列セグメントを含み、該配列セグメントがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の配列セグメントに少なくとも３５％の配列同一性を有する場合、それはポテクスウイルス外被タンパク質の機能‐保存的変異体と見なされうる。別の態様では、あるタンパク質が少なくとも２００、あるいは少なくとも２２０、さらにあるいは２３７アミノ酸残基の蛋白質配列セグメントを含み、該配列セグメントがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の配列セグメントに少なくとも４５％の配列同一性を有する場合、それはポテクスウイルス外被タンパク質の機能‐保存的変異体と見なされる。代わりの態様では、対応する配列同一性値は５５％または６５％である。
【００２４】
あるいは、項目（ｉｉ）の核酸配列は、付加的にポテクスウイルス外被タンパク質をコードする配列の代わりに、植物ウイルス移行タンパク質（ＭＰ）をコードする配列を含んでいてもよい。適切なＭＰの例としては、タバコモザイクウイルスのＭＰまたはターニップベインクリアリングウイルスＭＰのようなトバモウイルスＭＰが挙げられる。植物ウイルス移行タンパク質をコードする配列および上記ポテクスウイルスＴＧＢ（またはその機能‐保存的変異体）配列は項目（ｉｉ）の核酸配列においてどんな順番で存在してもよい。
【００２５】
項目（ｉｉｉ）の非相同核酸配列は典型的には植物体において、または植物組織において発現されることになる関心のあるタンパク質のコーディング配列を含む。そのような項目（ｉｉｉ）のコーディング配列はまた、関心のある遺伝子として本明細書において言及される。項目（ｉｉｉ）の配列は、ＲＮＡレプリコンの根拠となる植物ウイルスに非相同である。多くの場合、該配列はまた、それが発現されることになる植物体または植物組織に対して非相同である。植物体において、または植物組織においてＲＮＡレプリコンから発現可能である場合、項目（ｉｉｉ）の配列は典型的にはサブゲノムプロモーター、およびリボソーム結合部位および／または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）のような発現に必要な別の配列を含む。好ましい態様では、項目（ｉｉｉ）の非相同核酸配列は関心のある１種のタンパク質をコードする、関心のある１種の遺伝子を有する。
【００２６】
本発明の核酸はポテクスウイルス５′‐非翻訳領域（５′‐ＮＴＲ）およびポテクスウイルス３′‐非翻訳領域（３′‐ＮＴＲ）を含んでいてもよい。
本発明のプロセスは植物体において、または植物組織において関心のある１種のタンパク質、または１種より多い関心のあるタンパク質を生産するために使用されうる。該プロセスは植物体、植物組織または植物細胞に本発明の核酸を提供する。本発明のプロセスは好ましくは植物体において、または植物組織において実施される。一態様では、該プロセスは一過性発現プロセスであり、従って本発明の核酸の植物宿主クロモソームＤＮＡへの取込みは必要ではない。
【００２７】
本発明の核酸がＲＮＡである場合、それは、好ましくは感染した植物組織、たとえば葉部の機械的損傷と組み合わせて、植物体または植物組織を感染させるために使用されてもよい。別の態様では、本発明の核酸はＤＮＡであり、そして該ＤＮＡは、たとえば粒子衝突（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によって、またはアグロバクテリウム‐媒介形質転換によって、植物体または植物組織の細胞に導入されてもよい。アグロバクテリウム‐媒介形質転換は、いくつかの植物が本発明の核酸を提供されることになる場合、すなわち大規模タンパク質生産法の場合、一般に好まれる方法である。
【００２８】
本発明のプロセスは、プロベクター法（ＷＯ０２０８８３６９；Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１：６８５２−６８５７）を使用して、本発明の部品キットを植物体または植物組織に提供することによって実施されてもよい。本発明の核酸はその後、植物体の細胞においてプロベクター間の部位特異的組換えによって生産される。一態様では、項目（ｉ）および（ｉｉ）のセグメントを含むか、またはコードする第１ベクター（プロベクター）および項目（ｉｉｉ）のセグメントを含むか、またはコードする第２ベクター（プロベクター）が植物体または植物組織に提供され、ここで第１および第２プロベクターそれぞれは、第１および第２プロベクター間の部位特異的組換えによって本発明の核酸のアセンブリーを可能にする組換え部位を有する。ベクターの混合物またはそれぞれの系統がベクターの１種を含むアグロバクテリウム系統の混合物を植物体または植物組織に提供することによって、２種以上のベクターが植物体または植物組織に提供されてもよい。
【００２９】
関心のある１種以上のタンパク質は植物体または植物組織における生産後に精製されてもよい。植物体または植物細胞からタンパク質を精製する方法は当該技術分野で公知である。一方法では、ＷＯ０３／０２０９３８に記載のように、関心のあるタンパク質は植物アポプラストに誘導され、そこから精製されてもよい。
【００３０】
関心のある１種のタンパク質が生産されなければならない場合、関心のあるタンパク質をコードするヌクレオチド配列はＲＮＡレプリコンをコードするヌクレオチド配列中に含まれていてもよい。関心のある２種以上のタンパク質が同じ植物体において、または同じ植物組織において生産されることになる場合、該植物体または植物細胞は第２の、または別のＲＮＡレプリコンを含むか、またはコードする第２の核酸を提供されてもよい。その時、別のＲＮＡレプリコンは関心のある１種以上の別のタンパク質をコードしてもよい。一態様では、本発明の第１および第２の核酸はＷＯ２００６／０７９５４６に記載の非競合ＲＮＡレプリコンを含むか、またはコードしてもよい。
【００３１】
本発明は原則として感染性ポテクスウイルスが存在し、そしてウイルスベクター系が樹立されたいずれの植物体に適用されてもよい。一態様では、双子葉植物の植物体またはその組織もしくは細胞が使用される。別の態様では、ニコチアナベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）およびニコチアナタバクム（ｔａｂａｃｕｍ）のようなニコチアナ種が使用され；ニコチアナ種以外の好ましい植物種はペチュニアハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、ブラシカカンペストリス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、Ｂ．ジュンセア（ｊｕｎｃｅａ）、クレス（ｃｒｅｓｓ）、ルッコラ（ａｒｕｇｕｌａ）、マスタード（ｍｕｓｔａｒｄ）、ストロベリースピナッチ（Ｓｒａｗｂｅｒｒｙ  ｓｐｉｎａｃｈ）、チェノポジウムカピタツム（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｃａｐｉｔａｔｕｍ）、アルファルファ、レタス、ヒマワリ、ジャガイモおよびキュウリである。本発明のＲＮＡレプリコンが基礎を置いてもよい、最も好ましい植物ＲＮＡウイルスは、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）、パパイヤモザイクポテクスウイルスまたは竹モザイクポテクスウイルスのようなポテクスウイルスである。
【００３２】
本発明の主要な適用は植物体、植物体葉部または植物組織もしくは細胞培養物における関心のあるタンパク質の生産である。本発明のプロセスが植物体において実施される場合、ニコチアナ種のような、ヒトまたは動物食物連鎖に入らない植物が好ましい。ヒトまたは動物の食物連鎖に入らない植物はオープンフィールドで栽培され、ＲＮＡレプリコンによる感染後一定期間内に収穫されうる。好ましくは、全植物体または植物部分は、所望された発現レベルを提供するために必要なインキュベーション期間中、たとえば温室、または設計されたチャンバーのような隔離された環境に閉じ込められるべきである。
【００３３】
本発明の生産プロセスの効率は、植物発現系において新規な規模が獲得されるようなものである。本発明によって達成可能な発現レベルは、下流のプロセッシング（関心のあるタンパク質の分離および精製を含む）に対する消費が十分に低く、本発明のプロセスを他の大規模発現系に匹敵させるほどである。本発明は大規模スケールで使用されうる、最初の高収率ポテクスウイルス植物発現系を提供する。
発明の好都合な態様
従属する特許請求の範囲に記載されるか、または本明細書に記載される好ましい態様は組み合わせることができる。たとえば、本発明は以下のセグメント（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）ポテクスウイルスＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能‐保存的変異体をコードする核酸配列；
（ｉｉ）（ａ）ポテクスウイルストリプル遺伝子ブロックまたはその機能‐保存的変異体
および
（ｂ）ポテクスウイルス外被タンパク質またはその機能‐保存的変異体をコードする配列を含む核酸配列；ならびに
（ｉｉｉ）植物体において、または植物組織においてＲＮＡレプリコンから発現可能な非相同核酸配列をこの順序において含む、該レプリコンを含むか、またはコードする核酸を提供し；
ここで、ポテクスウイルストリプル遺伝子ブロックの機能‐保存的変異体は以下の３種のタンパク質をコードし：第１のタンパク質は少なくとも２００アミノ酸残基の蛋白質配列セグメントを含み、該タンパク質配列セグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列セグメントに少なくとも４０％の配列同一性を有し；第２のタンパク質は少なくとも１００アミノ酸残基の蛋白質配列セグメントを含み、該タンパク質配列セグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の配列セグメントに少なくとも４０％の配列同一性を有し；そして第３のタンパク質は少なくとも５５アミノ酸残基の蛋白質配列セグメントを含み、該タンパク質配列セグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の配列セグメントに少なくとも４０％の配列同一性を有し；
ここで該ポテクスウイルス外被タンパク質の機能‐保存的変異体は少なくとも２００アミノ酸残基の蛋白質配列セグメントを含み、該配列セグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の配列セグメントに少なくとも３５％の配列同一性を有し；そしてここで項目（ｉ）の配列は、少なくとも３００アミノ酸残基、好ましくは少なくとも５００アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも９００アミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも１４００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメント内にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によってコードされるタンパク質に少なくとも３６％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。
【００３４】
上記の態様において示される配列同一性値は、本発明の一般的な説明に開示される、いっそう特定の同一性値および／またはより大きな配列セグメントによって交換することができる。さらに、上記の態様は従属する特許請求の範囲に定義されるか、またはこの説明に記載される好ましい態様と組み合わせることができる。上記の核酸はニコチアナ植物体またはニコチアナ植物組織もしくは細胞のような、植物体において、または植物組織において関心のある非相同核酸配列を発現するプロセスにおいて使用されてもよい。
【００３５】
別の態様では、本発明は以下のセグメント（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）ポテクスウイルスＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能‐保存的変異体をコードする核酸配列；
（ｉｉ）（ａ）ポテクスウイルストリプル遺伝子ブロックの機能‐保存的変異体および
（ｂ）ポテクスウイルス外被タンパク質の機能‐保存的変異体をコードする配列；ならびに
（ｉｉｉ）植物体において、または植物組織においてＲＮＡレプリコンから発現可能な非相同核酸配列をこの順序において含む、該レプリコンを含むか、またはコードする核酸を提供し；
ここで機能‐保存的変異体は先に定義した通りである。
発明の詳細な説明
本発明はポテクスウイルスに由来するＲＮＡレプリコンの新規なデザインを記載し、該デザインは植物体において、または植物組織においてＲＮＡレプリコンから発現されることになる関心のあるタンパク質の収率を改善する。本発明のプロセスはウイルス外被タンパク質の生産を減らし、結果としてウイルス粒子を少なく形成しうるため、慣用のポテクスウイルスに由来するＲＮＡレプリコンより優れた生物学的に安全な特徴を有する。
【００３６】
我々は驚くべくことに、関心のあるタンパク質をコードする非相同核酸配列（ｉｉｉ）に先行する外被タンパク質または非相同移行タンパク質のコーディング配列の位置が、ウイルス外被タンパク質を犠牲にして組換えタンパク質の収率を増すことを見いだしている。ＰＶＸ外被タンパク質は全身移行だけでなく、トリプル遺伝子ブロックの他の３種のタンパク質と一緒に、細胞間（短距離）移行にとっても必要である（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，１３：５９９−６０５；Ｆｅｄｏｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８２：４４９−４５８）。本明細書では、ＰＶＸ外被タンパク質の欠如がＰＶＸに由来するＲＮＡレプリコンの長距離（図１Ａ、左側パネル）および細胞間（図１Ａ、右側パネル）移行の欠陥を起こすことが示される（実施例１および図１を参照されたい）。細胞間移行はｉｎ  ｔｒａｎｓでＰＶＸ外被タンパク質（ＣＰ）またはトバモウイルス移行タンパク質、たとえばタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）移行タンパク質（ＭＰ）を提供することによって回復されうる（実施例１Ａ、右側パネル）。また、ＴＶＣＶ移行タンパク質を持つＰＶＸに由来するＲＮＡレプリコンは短距離（細胞間）移行が可能であることが示される（実施例２、図２）。実験は、ｉｎ  ｐｌａｎｔａでたとえばプロベクターのＡｔｔＰおよびＡｔｔＢ部位間の部位特異的組換えを介して、ＲＮＡレプリコンのＤＮＡ前駆体のアセンブリーを可能にするプロベクター系（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１：６８５２−６８５７）を使用して実行された（図２Ｂ）。
【００３７】
ＴＶＣＶ  ＭＰ（ｐＩＣＨ２２９３９）またはＰＶＸ  ＣＰのいずれかを持つＰＶＸに由来するＲＮＡレプリコンの比較解析は実施例３に記載され、図３に示される。先に記載の場合のように、プロベクター系が使用された。関心のある遺伝子の前に位置するＰＶＸ  ＣＰがＲＮＡレプリコンの細胞間移行を提供することは図３から明らかである。細胞間移行の効率は、ＧＦＰスポット（図３Ａ）の明るさおよび密度からわかるようにＴＶＣＶ  ＭＰによるものより著しく高い。
【００３８】
本発明の別の態様では、関心のある遺伝子に先行するＰＶＸ  ＣＰの位置の効果が試験された。トリプル遺伝子ブロックの後のＣＰの位置は、ＰＶＸ  ＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼとトリプル遺伝子ブロック間のＣＰの位置よりいっそう効率的な細胞間移行を提供することは図４Ａから明らかである。この実験ではプロベクター系が同様に使用された。関心のあるタンパク質（ＧＦＰ）の発現レベルにおける差は、ＰＶＸに由来するＲＮＡレプリコンを提供するプロベクターまたはアセンブルしたベクターが使用された場合の間で全く見いだされなかった（実施例５、図５を参照されたい）。我々が比較研究に、関心のある遺伝子の後にＣＰを含むＲＮＡレプリコンを提供するベクターを含んだ場合、そのようなベクターに由来する関心のある遺伝子の発現レベル（ＧＦＰ発現部分の明るさ）は、驚くべくことにＣＰが関心のある遺伝子の前に配置されたベクターと比較して著しく弱かった（ｐＩＣＨ２０７９９対ｐＩＣＨ２５４８８またはｐＩＣＨ２５４９１、図６、実施例６）。
【００３９】
実施例では、我々はＰＶＸを基礎にしたＲＮＡレプリコンを使用する。しかし、ポテクスウイルスに分類される群に属する他のウイルスは本発明に記載のＲＮＡウイルスを基礎にしたベクターの構築のために使用されうる。本発明に使用可能なウイルス種には竹モザイクポテクスウイルス、パパイヤモザイクポテクスウイルス、アルテルナンテラ（ａｌｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ）モザイクポテクスウイルス、クローバーイエローモザイクウイルス、プランタン（ｐｌａｎｔａｉｎ）ウイルスＸ、ホワイトクローバーモザイクウイルスおよびジャガイモ黄斑モザイクウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。植物ウイルス移行タンパク質の詳細に関しては、ＷＪ  Ｌｕｃａｓの最近の総説（２００６，Ｖｉｌｏｇｙ，３４４：１６９−１８４）を参照されたい。
【００４０】
１種の植物ウイルス、たとえばジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）に由来する１種のＲＮＡレプリコンが本発明のプロセスに使用されてもよい。しかし、関心のある２種の異なるタンパク質を発現するために植物体において、または植物組織において２種以上の異なるＲＮＡレプリコンが使用されてもよく、それに従ってそのような異なるＲＮＡレプリコンは好ましくは異なる植物ウイルスに由来する。異なるＲＮＡレプリコンが由来してもよい異なる植物ウイルスは、好ましくは相乗的または非競合ウイルスである。「相乗的」または「非競合」は本明細書では同じ意味に使用される。相乗的ウイルスは同じ植物細胞において同時に存在し、そして効率的に増殖しうる。同様に、相乗的ウイルスに由来するＲＮＡレプリコンは同じ植物細胞に存在し、効率的に増殖しうる。そのようなＲＮＡレプリコンの相乗的ペアの例としては、１種のＲＮＡレプリコンはＴＭＶまたはＴＶＣＶに由来し、そして他のＲＮＡレプリコンはＰＶＸのようなポテクスウイルスに由来するＲＮＡレプリコンのペアが挙げられる。同じ植物細胞において、相乗的ＲＮＡレプリコンは、関心のある２種以上のタンパク質またはタンパク質サブユニット、たとえばモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の発現に使用されてもよい。同じ植物体において、または植物細胞において、異なる（非競合）ウイルスベクターを使用した関心のある２種以上のタンパク質を発現するプロセスはＥＰ１６８６１７６に記載される。
【００４１】
実施例では、我々は主として植物細胞におけるウイルスベクターのアグロバクテリウム‐媒介送達を使用した。植物体の安定な形質転換に通常使用される種々の他の方法、たとえばマイクロプロジェクタイルボンバードメント（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）またはプロトプラストのＰＥＧ‐媒介形質転換による植物細胞への非相同ヌクレオチド配列の直接導入が細胞へのベクターの送達に使用されてもよい。アグロバクテリウム‐媒介植物形質転換が好ましい。従って、非相同ヌクレオチド配列はアグロバクテリウムによって運ばれるＴｉ‐プラスミドベクター（ＵＳ５，５９１，６１６；ＵＳ４，９４０，８３８；ＵＳ５，４６４，７６３）、パーティクルまたはマイクロプロジェクタイルボンバードメント（ＵＳ０５１００７９２；ＥＰ００４４４８８２Ｂ１；ＥＰ００４３４６１６Ｂ１）によってのような種々の技術によって植物細胞に形質転換されてもよい。原則として、他の植物形質転換法、たとえばマイクロインジェクション（ＷＯ０９２０９６９６；ＷＯ０９４００５８３Ａ１；ＥＰ１７５９６６Ｂ１）、エレクトロポレーション（ＥＰ００５６４５９５Ｂ１；ＥＰ００２９０３９５Ｂ１；ＷＯ０８７０６６１４Ａ１）などが同様に使用されてもよい。形質転換法の選択は、とりわけ形質転換されることになる植物種に依存する。たとえば、マイクロプロジェクタイルボンバードメントは単子葉植物の形質転換に好ましくてもよいが、双子葉植物の場合はアグロバクテリウム‐媒介形質転換が一般により良い結果を与える。
【００４２】
本発明は好ましくは、より高等の多細胞植物により実行される。本発明における使用に好ましい植物は、栽培学的および園芸学的に重要な種として好ましい、いずれの植物種も含む。本発明における使用のための一般的な栽培植物には、アルファルファ、オオムギ、インゲンマメ、カノラ、ササゲ、ワタ、トウモロコシ、クローバー、ハス、レンズマメ、ウチワマメ、キビ、オートムギ、エンドウマメ、ラッカセイ、コメ、ライムギ、シナガワハギ、ヒマワリ、スイートピー、ダイズ、モロコシ、ライコムギ、クズイモ、ダーリングカズラ、カラスノエンドウ、コムギ、フジおよびナッツ植物が挙げられる。本発明を実行するために好ましい植物種は以下のものを含むがそれらに限定されない：
イネ科、キク科、ナス科およびバラ科の中の代表種。付加的に、先に特定したものに加えて、本発明における使用のための好ましい種、以下の属由来の植物：アラアビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アグロスティス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、アリウム（Ａｌｌｉｕｍ）、アンチリニューム（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）、アピウム（Ａｐｉｕｍ）、アラキス（Ａｒａｃｈｉｓ）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）、アトロパ（Ａｔｒｏｐａ）、アベナ（Ａｖｅｎａ）、バンブサ（Ｂａｍｂｕｓａ）、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ブロムス（Ｂｒｏｍｕｓ）、ブロワアリア（Ｂｒｏｗａａｌｉａ）、カメリア（Ｃａｍｅｌｌｉａ）、カンナビス（Ｃａｎｎａｂｉｓ）、カプシクム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、シサー（Ｃｉｃｅｒ）、ケノポジウム（Ｃｈｅｎｏｐｉｄｉｕｍ）、チコリウム（Ｃｈｉｃｈｏｒｉｕｍ），シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ），コフェア（Ｃｏｆｆｅａ）、コイクス（Ｃｏｉｘ）、ククムス（Ｃｕｃｕｍｕｓ）、クルクビタ（Ｃｕｒｃｕｂｉｔａ）、シノドン（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、ダクチリス（Ｄａｃｔｙｌｉｓ）、ダツラ（Ｄａｔｕｒａ）、ダウクス（Ｄａｕｃｕｓ）、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）、ディオスコレア（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）、エラエイス（Ｅｌａｅｉｓ）、エレウシン（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ）、フェスチュカ（Ｆｅｓｔｕｃａ）、フラガリア（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ゼラニウム（Ｇｅｒａｎｉｕｍ）、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ヘリアンスス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、ヘテロカリス（Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、ヘベア（Ｈｅｖｅａ）、ホルデューム（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、ヒオスシアムス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、イポモエア（Ｉｐｏｍｏｅａ）、ラクツカ（Ｌａｃｔｕｃａ）、レンズ（Ｌｅｎｓ）、リリウム（Ｌｉｌｉｕｍ）、リヌム（Ｌｉｎｕｍ）、ロリウム（Ｌｏｌｉｕｍ）、ロータス（Ｌｏｔｕｓ）、リコペルシコン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、マジョラナ（Ｍａｊｏｒａｎａ）、マルス（Ｍａｌｕｓ）、マンギフェラ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ）、マニホット（Ｍａｎｉｈｏｔ）、メディカゴ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、ネメシア（Ｎｅｍｅｓｉａ）、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、オノブリキス（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）、オリザ（Ｏｌｙｚａ）、パニクム（Ｐａｎｉｃｕｍ）、ペラルゴニウム（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ）、ペンニセツム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ピスム（Ｐｉｓｕｍ）、ファセオルス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、フレウム（Ｐｈｌｅｕｍ）、ポア（Ｐｏａ）、プルヌス（Ｐｒｕｎｕｓ）、ラヌンクルス（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ）、ラファヌス（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、リベス（Ｒｉｂｅｓ）、リシヌス（Ｒｉｃｉｎｕｓ）、ルブス（Ｒｕｂｕｓ）、サッカルム（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、サルピグロッシス（Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ）、セカレ（Ｓｅｃａｌｅ）、セネシオ（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、セタリア（Ｓｅｔａｒｉａ）、シナピス（Ｓｉｎａｐｉｓ）、ソラヌム（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、ステノタフルム（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ）、テオブロマ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、トリフォリウム（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、トリゴネラ（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、トリチクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ビシア（Ｖｉｃｉａ）、ビグラ（Ｖｉｇｒａ）、ビチス（Ｖｉｔｉｓ）、ゼア（Ｚｅａ）、およびオリレアエ（Ｏｌｙｒｅａｅ）、ファロイデアエ（Ｐｈａｒｏｉｄｅａｅ）および他の多くの植物種。
【００４３】
本発明のプロセスのある特定の態様では、ＰＶＸに由来するＲＮＡレプリコンはニコチアナ植物体と一緒に使用される。
本発明を使用して、センスまたはアンチセンスオリエンテーションにおいて発現されうる、関心のあるタンパク質またはそのフラグメントには以下のものが挙げられる：デンプン改変酵素（デンプンシンターゼ、デンプンリン酸化酵素、枝切り酵素、デンプン枝作り酵素、デンプン枝作り酵素ＩＩ、顆粒結合デンプンシンターゼ）、スクロースホスフェートシンターゼ、スクロースホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリフルクタンスクラーゼ、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、シクロデキストリン、グリコシルトランスフェラーゼ、フルクトシルトランスフェラーゼ、グリコーゲンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌レバンスクラーゼ、大腸菌ｇｌｇＡタンパク質、ＭＡＰＫ４およびオルソログ、窒素同化／代謝酵素、グルタミンシンターゼ、植物オスモチン、２Ｓアルブミン、ソーマチン（ｔｈａｕｍａｔｉｎ）、部位特異的レコンビナーゼ／インテグラーゼ（ＦＬＰ、Ｃｒｅ、Ｒレコンビナーゼ、Ｉｎｔ、ＳＳＶＩインテグラーゼＲ、インテグラーゼｐｈｉＣ３１、またはその活性フラグメントもしくは変異体）、イソペンテニルトランスフェラーゼ、ＳｃａＭ５（ダイズカルモジュリン）、鞘翅目型トキシンもしくは殺虫として活性なフラグメント、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）融合タンパク質、脂質、アミノ酸、糖、核酸および多糖を代謝する酵素、スーパーオキシドジスムターゼ、プロテアーゼの不活性なプロ酵素型、植物タンパク質トキシン、繊維生産植物において形質を変換する繊維（ｔｒａｉｔ  ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｆｉｂｅｒ）、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）由来の鞘翅目活性トキシン（Ｂｔ２トキシン、殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）、ＣｒｙｌＣトキシン、デルタエンドトキシン、ポリオペプチドトキシン、プロトキシンなど）昆虫特異的トキシンＡａｌＴ、セルロース分解酵素、アシドサームスセルロチクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃｕｓ）由来のＥ１セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シンナモイルアルコールデヒドロゲナーゼ、トレハロース−６−ホスフェートシンターゼ、サイトカイニン代謝経路の酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、大腸菌無機ピロホスファターゼ、種子貯蔵タンパク質、エルウィニアヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）リコペンシンターゼ、ＡＣＣオキシダーゼ、ｐＴＯＭ３６にコードされたタンパク質、フィターゼ、ケトヒドロラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブタノエート）シンターゼ、アシルキャリアタンパク質、ナピン、ＥＡ９、非高等植物フィトエンシンターゼ、ｐＴＯＭ５にコードされたタンパク質、ＥＴＲ（エチレン受容体）、プラスチジックピルベートホスフェートジキナーゼ、線虫‐誘導性膜貫通ポアタンパク質、植物細胞の光合成または色素体機能を高める形質、スチルベンシンターゼ、フェノールを水酸化することが可能な酵素、カテコールジオキシゲナーゼ、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ、クロロムコネートシクロイソメラーゼ、アンスラニレートシンターゼ、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）ＡＧＬ１５タンパク質、フルクトース１，６−ビホスファターゼ（Ｆ��Ｐアーゼ）、ＡＭＶ  ＲＮＡ３、ＰＶＹレプリカーゼ、ＰＬＲＶレプリカーゼ、ポチウイルス外被タンパク質、ＣＭＶ外被タンパク質、ＴＭＶ外被タンパク質、ルテオウイルスレプリカーゼ、ＭＤＭＶメッセンジャーＲＮＡ、変異体ジェミニウイルスレプリカーゼ、ウンベルラリアカリホルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）Ｃ１２：０嗜好性アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ、植物Ｃ１０またはＣ１２：０嗜好性アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃ１４：０嗜好性アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ（ｌｕｘＤ）、植物シンターゼ因子Ａ、植物シンターゼ因子Ｂ、６−デサチュラーゼ、植物細胞における脂肪酸のペルオキシソーム‐酸化において酵素活性を有するタンパク質、アシル‐ＣｏＡオキシダーゼ、３−ケトアシル‐ＣｏＡチオラーゼ、リパーゼ、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）アセチル‐ＣｏＡカルボキシラーゼ、５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰ）、ホスフィノトリシンアシルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ、ＰＡＴ）、ＣＰ４タンパク質、ＡＣＣデアミナーゼ、リボザイム、翻訳後開裂部位を有するタンパク質、Ｇａｌ４転写アクチベーターのＤＮＡ‐結合ドメインおよび転写活性化ドメインからなるタンパク質融合物、脂質相に融合タンパク質を指向させることが可能な関心のあるタンパク質とオレオシンタンパク質の翻訳融合物、スルホンアミド抵抗性を与えるＤＨＰＳ遺伝子、細菌ニトリラーゼ、２，４−Ｄモノオキシゲナーゼ、アセトラクテートシンターゼまたはアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＬＳ、ＡＨＡＳ）、ポリガラクツロナーゼ、細菌ニトリラーゼ、色素体の内側エンベロープ膜に存在する成熟ホスフェートトランスロケ−タータンパク質のアミノ末端疎水性領域と該膜に指向することになる関心のあるタンパク質の融合物。
【００４４】
任意のヒトまたは動物タンパク質は本発明の系を使用して発現されうる。関心のあるそのようなタンパク質の例としては、とりわけ、以下のタンパク質（薬剤的タンパク質）が挙げられる：免疫反応タンパク質（モノクローナル抗体、１本鎖抗体、Ｔ細胞受容体など）、抗原、コロニー刺激因子、レラキシン、ポリペプチドホルモン、サイトカインおよびそれらの受容体、インターフェロン、成長因子および凝固因子、酵素的に活性なリソソーム酵素、線維素溶解ポリペプチド、血液凝固因子、トリプシノーゲン、１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、並びに上記タンパク質の融合物のような機能‐保存的タンパク質，変異体型および合成誘導体。
【００４５】
２００６年９月６日に出願された欧州特許出願第０６  ０１８  ７１３．５号の優先権は本特許出願によって主張され、その内容はそのまま参照として本明細書に援用される。
実施例
実施例１
ＣＰを欠くＰＶＸコンストラクトは細胞間移行をしない
ＧＦＰ遺伝子を含むＰＶＸコンストラクト（ｐＡ３１５１）はＹｕｒｉ  Ｄｏｒｏｋｈｏｖ教授（Ｍｏｓｃｏｗ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｒｕｓｓｉａ）から得た。このコンストラクトは、ＧＦＰコーディング配列を含むＮｈｅｌ−ＳａｌｌフラグメントをＮｈｅｌおよびＳａｌｌによって消化されたｐＰＶＸ２０１にクローニングし（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，Ｄ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｓ．  ＆  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｓ，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，７：１０４５−１０５３）、そして得られたコンストラクトからＨｉｎｄ３−Ｓａｃｌフラグメント（全ウイルスインサートおよびＧＦＰ遺伝子を含む）をｐＢＩＮ１９にサブクローニングすることによって作製された。ウイルスインサートは次にｐＡ３１５１からＳａｃｌ−ＳｐｈｌフラグメントとしてｐＩＣＢＶ５２（小さいｐＢＩＮ１９−を基礎にしたＫａｎＲバイナリーベクター）にサブクローニングされた。このコンストラクトは３５Ｓプロモーターの制御下でクローニングされたＰＶＸコンストラクトを含む（図１Ｂ）。ＧＦＰコーディング配列は複製されたＣＰサブゲノムプロモーター（ｓｇｃ）から発現され、トリプル遺伝子ブロック（ＴＧＢ）とＣＰコーディング配列間に配置される。ＧＦＰ上流の複製されたサブゲノムプロモーターフラグメントもＣＰ開始コドンを含んでいたため、開始コドンはＡＴＧからＡＧＧへの突然変異によって除去された。
【００４６】
ＣＰを欠如する対照コンストラクトはＣＰ遺伝子およびそのサブゲノムプロモーターを（欠失エンドポイントを重複するプライマーの１種を用いたＰＣＲを使用して）欠失させることによってｐＩＣＨ２０７９９（図１Ｂ）から作製された。得られたコンストラクト、ｐＩＣＨ２１３３３（図１Ｂ）はアグロバクテリウムに形質転換し、ニコチアナベンサミアナ葉部に浸潤させた。予想したように、ウイルスレプリコンは細胞間、または全身に移行することが不可能であった。レプリコンの移行は、それぞれＴＶＣＶ  ＭＰまたはＰＶＸ  ＣＰの一過性発現を提供するコンストラクトｐＩＣＨ１０７４５またはｐＩＣＨ２２０６６と一緒にｐＩＣＨ２１３３３を同時浸潤させた場合、レスキューされた（図１Ａ）。ｐＩＣＨ１０７４５またはｐＩＣＨ２２０６６コンストラクトは、３５Ｓプロモーターの制御下で、それぞれＴＶＣＶ  ＭＰまたはＰＶＸ  ＣＰコーディング配列を含む。
【００４７】
実施例２
ＴＧＢと関心のある遺伝子間にクローニングされたＴＶＣＶ遺伝子を持つＰＶＸレプリコンは細胞間移行が可能である
ＴＶＣＶ  ＭＰはＰＶＸ  ＣＰを欠くＰＶＸレプリコンに細胞間移行を提供することが可能であるため、ＴＶＣＶ  ＭＰ遺伝子は複製されたＣＰサブゲノムプロモーターの制御下でＰＶＸコンストラクトにおいてトリプル遺伝子ブロックと関心のある遺伝子（この場合ＧＦＰ）間にクローニングされた。実際上の理由のために、このコンストラクト（ｐＩＣＨ２２９３９、図２ＢおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、５′ウイルスベクター配列に融合した３５Ｓプロモーターを含むが、関心のある遺伝子のコーディング配列を含むコンストラクトの３′部分とＰＶＸ３′ＮＴＲを欠く５′プロベクターモジュールとして作製された。組換え部位（ストレプトミセスファージＣ３１  ＡｔｔＰ部位）およびイントロン配列がウイルスコンストラクト配列に続く。３′プロベクターモジュール、ｐＩＣＨ２１２８２  図２Ｂ）は、適合した組換え部位（ストレプトミセスファージＣ３１  ＡｔｔＢ組換え部位）を含み、イントロン配列、ＧＦＰ遺伝子およびＰＶＸ  ＮＴＲが続く。コンストラクトの５′および３′部分はｉｎ  ｖｉｖｏで、５′および３′モジュール、ならびにＰｈｉＣ３１レコンビナーゼを含むアグロバクテリアの同時浸潤による組換え部位での部位特異的組換えによってアセンブルされる（ｐＩＣＨ１０８８１、アラビドプシスＡＣＴ２プロモーターの制御下でＰｈｉＣ３１レコンビナーゼを含む、Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１：６８５２−６８５７を参照されたい）。植物細胞への５′および３′モジュールのＴ−ＤＮＡ送達およびＡｔｔＰおよびＡｔｔＢ部位における組換え後、組み換えられたＤＮＡは３５Ｓプロモーターから転写される。組換え部位は隣接するイントロン配列のスプライシングにより転写物から切り取られ、スプライシングされた転写物は核から細胞質に運ばれ、そこで通常のウイルスＲＮＡレプリコンとして増幅される。
【００４８】
対照プロベクターコンストラクト（ｐＩＣＨ２２９２２、ＴＶＣＶ  ＭＰ配列を持たない５′プロベクター）と３′プロベクターｐＩＣＨ２１２８２との浸潤は、細胞間移行が不可能なレプリコンの形成を導いた。対照的に、ｐＩＣＨ２２９３９の浸潤は細胞間移行が可能なレプリコンを導いた（図２Ａ）。
【００４９】
ＴＭＶは他のウイルスタンパク質を必要とせずにＴＭＶレプリコンに細胞間移行を提供することが可能であるため、１２Ｋおよび８Ｋタンパク質が欠失された第２のＰＶＸコンストラクトが作製され、コンストラクトｐＩＣＨ２２９５３を生み出した（図２ＢおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。この場合、ＴＭＶ  ＭＰは１２Ｋサブゲノムプロモーター（ｓｇ１２）から発現される。ｐＩＣＨ２１２８２とｐＩＣＨ２２９５３の浸潤は細胞間移行が可能なレプリコンを導いた。しかし、細胞間移行およびＧＦＰ蛍光はコンストラクトｐＩＣＨ２２９３９を使用した場合より多くも強くもなかった（図２）。
【００５０】
実施例３
ＴＧＢと関心のある遺伝子間にクローニングされたＰＶＸ  ＣＰを持つＰＶＸベクターは細胞間移行が可能である。
【００５１】
ｐＩＣＨ２２９３９に類似するが、ＴＶＣＶ  ＭＰと入れ換えてＰＶＸ  ＣＰを持つコンストラクトが作製された。このコンストラクトの配列は、ウイルスの５′末端からＣＰの末端に至るまで野生型ウイルスの配列と同じである。ＣＰの後に、複製されたＣＰサブゲノムプロモーターが続き、それが関心のある遺伝子の発現に使用される。このコンストラクト、ｐＩＣＨ２２９８８（図３Ｂ）とｐＩＣＨ２１２８２（図２Ｂ）との浸潤は、ｐＩＣＨ２２９３９から生産されたレプリコンよりずっと速く細胞間を移行し、そしてより明るいＧＦＰ蛍光を発するレプリコンの形成を導いた（図３Ａ）。
【００５２】
実施例４
ＲｄＲＰとＴＧＢ間にクローニングされたＰＶＸ  ＣＰ遺伝子を持つＰＶＸベクターは細胞間移行が可能である。
【００５３】
ＰＶＸ  ＣＰ遺伝子は複製された２５Ｋサブゲノムプロモーター（ｓｇ２５）の制御下で、ＲｄＲＰとトリプル遺伝子ブロック間にクローニングされ、コンストラクトｐＩＣＨ２４１８０（図４Ｂ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を生み出した。ｐＩＣＨ２１２８２およびインテグラーゼ供給源（ｐＩＣＨ１０８８１）と組み合わせたｐＩＣＨ２４１８０の浸潤は細胞間移行が可能なウイルスレプリコンの形成を導いた（図４Ａ）。対照実験では、コンストラクトｐＩＣＨ２２５７７（ｐＩＣＨ２２９２２に類似するが、いくつかの制限部位が異なる）がｐＩＣＨ２４１８０の代わりに浸潤し、予想されたように細胞間移行を全く示さなかった。ｐＩＣＨ２２９８８に関してのように、ｐＩＣＨ２４１８０からのＧＦＰ蛍光は、コンストラクトｐＩＣＨ２２９３９によるものより強かった。
【００５４】
実施例５
ＣＰを含む完全にアセンブルしたベクターＰＶＸウイルスベクターも細胞間移行を提供する。
【００５５】
ＧＦＰ部分を持つ３′プロベクター（ｐＩＣＨ２１２８２、図２Ｂ）を含むプロベクターｐＩＣＨ２２９８８またはｐＩＣＨ２４１０８に対応するアセンブルしたコンストラクトが作製され、それぞれプラスミドｐＩＣＨ２５４８８およびｐＩＣＨ２５４９１を生み出した（図５Ｂ）。ｐＩＣＨ２５４８８およびｐＩＣＨ２５４９１のＴ−ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６として示された。両方のコンストラクトは、予想されたように、プロベクターのように働くことが見いだされ、細胞間移行および強いＧＦＰ蛍光を提供した（図５Ａ）。ＧＦＰ蛍光は、ＣＰ遺伝子が関心のある遺伝子の後に配置される標準コンストラクト（ｐＩＣＨ２０７９９）によるものよりもいっそう強く、より多い組換えタンパク質の発現を示唆した〈図６Ａ〉。クーマシー−染色したタンパク質ゲルは、ｐＩＣＨ２０７９９からより、ｐＩＣＨ２５４９１とｐＩＣＨ２５４８８からはるかに多い量のＧＦＰタンパク質が発現されたこと、対照的に、他の２種のコンストラクトからより、ｐＩＣＨ２０７９９からはるかに多い量のＰＶＸ  ＣＰが生産されたことを示した。
【００５６】
実施例６
ＰＶＸクローニングベクター
ＲｄＲＰとＴＧＢの間、またはＴＧＢと関心のある遺伝子間にＣＰを持つ２種の型のＰＶＸクローニングベクターの概要が示される。ＣＳ：クローニング部位。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】Ａ−異なるＰＶＸベクターによるアグロ‐浸潤後ＵＶ光下でモニターされたＮ．ベンサミアナ植物体（左側写真）および植物体葉部（右側写真）。３５Ｓ−ＰＶＸ−ＣＰ：ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下でＰＶＸ外被タンパク質（ＣＰ）を提供するベクター；３５Ｓ−ＴＶＣＶ  ＭＰ：ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下でトバモウイルスのターニップベインクリアリングウイルス（ＴＶＣＶ）移行タンパク質（ＭＰ）を提供するベクター。Ｂ−コンストラクトｐＩＣＨ２０７９９およびｐＩＣＨ２１３３３のＴ−ＤＮＡ領域の概要。ＰＶＸ  Ｐｏｌ：ジャガイモウイルスＸ  ＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼ；３５Ｓ：ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター；２５Ｋ、１２Ｋ、８Ｋ：トリプル遺伝子ブロック；ＣＰ：ＰＶＸ外被タンパク質；ＰＶＸ  ｎｔｒ：ＰＶＸ非翻訳領域；ＧＦＰ：クラゲ緑色蛍光タンパク質；ｓｇｃ：外被タンパク質遺伝子のサブゲノムプロモーター；ＲＢ：Ｔ−ＤＮＡ右側境界；ＬＢ：Ｔ−ＤＮＡ左側境界。棒引きされたＡＴＧは、ＡＴＧコドンが翻訳開始を妨害するために示された位置で変異したことを意味する。
【図２】異なるＰＶＸプロベクターモジュールを使用したＧＦＰの発現。Ａ−３′プロベクターｐＩＣＨ２１２８２と組み合わせた異なる５′ＰＶＸプロベクターによるアグロ‐浸潤後、およびウイルスレプリコンをコードするＤＮＡの部位特異的組換えによって媒介されるアセンブリーを提供するファージＣ３１インテグラーゼの存在下で、ＵＶ光下でモニターされたＮ．ベンサミアナ葉部。５′プロベクター（たとえば、ｐＩＣＨ２２９２２；ｐＩＣＨ２２９４２など）だけが接種スポットをマークする。３５Ｓ−ＴＶＣＶ  ＭＰ：ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下でトバモウイルスのターニップベインクリアリングウイルス（ＴＶＣＶ）移行タンパク質（ＭＰ）を提供するベクター。写真は浸潤後７日目（７ｄｐｉ）に撮られた。浸潤に使用されるアグロバクテリウム懸濁液は発現レベルの差の肉眼的検出を可能にする発現レベルを達成するために１０５倍に希釈された。ＢはプラスミドｐＩＣ２２９２２、ｐＩＣＨ２２９３９、ｐＩＣＨ２２９４２、ｐＩＣＨ２２９５３およびｐＩＣＨ２１２８２のＴ−ＤＮＡ領域を示す。ＰＶＸ  Ｐｏｌ：ジャガイモウイルスＸ  ＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼ；３５Ｓ：ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター；２５Ｋ、１２Ｋ、８Ｋ：トリプル遺伝子ブロック；２５Ｋ（ｔｒｕｎｋ）：２５Ｋタンパク質をコードする切断された遺伝子；ＣＰ：ＰＶＸ外被タンパク質；ＰＶＸ  ｎｔｒ：ＰＶＸ非翻訳領域；ＧＦＰ：クラゲ緑色蛍光タンパク質；ｓｇｃ：外被タンパク質遺伝子のサブゲノムプロモーター；ｉｎｔ：植物体イントロンの５′末端；ＡｔｔＰおよびＡｔｔＢ：ファージＣ３１の部位特異的インテグラーゼによって認識される配列。
【図３】植物組織において細胞間移行を提供しない（ｐＩＣＨ２２９２２）または提供する（ｐＩＣＨ２２９３９またはｐＩＣＨ２２９８８）ＰＶＸプロベクターモジュールを使用したＧＦＰ発現の比較。Ａ−３′プロベクターｐＩＣＨ２１２８２と組み合わせた異なる５′ＰＶＸプロベクターによるアグロ‐浸潤後、およびウイルスレプリコンをコードするＤＮＡの部位特異的組換えによって媒介されるアセンブリーを提供するファージＣ３１インテグラーゼの存在下で、ＵＶ光下でモニターされたＮ．ベンサミアナ葉部。写真は浸潤後７日目（７ｄｐｉ）に撮られた。浸潤に使用されるアグロバクテリウム懸濁液は示したように１０３または１０５倍に希釈された。Ｂ−プラスミドｐＩＣ２２９２２、ｐＩＣＨ２２９３９およびｐＩＣＨ２２９８８、ｐＩＣＨ２２９５３およびｐＩＣＨ２１２８２のＴ−ＤＮＡ領域を示す。ＰＶＸ  Ｐｏｌ：ジャガイモウイルスＸ  ＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼ；３５Ｓ：ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター；２５Ｋ、１２Ｋ、８Ｋ：トリプル遺伝子ブロック；２５Ｋ（ｔｒｕｎｋ）：２５Ｋタンパク質をコードする切断された遺伝子；ＴＶＣＶ  ＭＰ：トバモウイルスターニップベインクリアリングウイルス移行タンパク質；ＣＰ：ＰＶＸ外被タンパク質；ＰＶＸ  ｎｔｒ：ＰＶＸ非翻訳領域；ＧＦＰ：クラゲ緑色蛍光タンパク質；ｓｇｃ：外被タンパク質遺伝子のサブゲノムプロモーター；ｉｎｔ：植物体イントロンの５′末端；ＡｔｔＰおよびＡｔｔＢ：ファージＣ３１の部位特異的インテグラーゼによって認識される配列。
【図４】細胞間移行を提供しない（ｐＩＣＨ２２５７７）または提供する（ｐＩＣＨ２２９８８またはｐＩＣＨ２４２１８０）ＰＶＸプロベクターモジュールを使用したＧＦＰ発現の比較。Ａ−３′プロベクターｐＩＣＨ２１２８２と組み合わせた異なる５′ＰＶＸプロベクターによるアグロ‐浸潤後、およびウイルスレプリコンをコードするＤＮＡの部位特異的組換えによって媒介されるアセンブリーを提供するファージＣ３１インテグラーゼの存在下で、ＵＶ光下でモニターされたＮ．ベンサミアナ葉部。写真は浸潤後７日目（７ｄｐｉ）に撮られた。浸潤に使用されるアグロバクテリウム懸濁液は示したように１０３または１０５倍に希釈された。Ｂ−プラスミドｐＩＣ２２５７７、ｐＩＣＨ２２９８８およびｐＩＣＨ２４１８０のＴ−ＤＮＡ領域を示す。ＰＶＸ  Ｐｏｌ：ジャガイモウイルスＸ  ＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼ；３５Ｓ：ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター；２５Ｋ、１２Ｋ、８Ｋ：トリプル遺伝子ブロック；ＣＰ：ＰＶＸ外被タンパク質；ＰＶＸ  ｎｔｒ：ＰＶＸ非翻訳領域；ｓｇｃ：外被タンパク質遺伝子のサブゲノムプロモーター；ｓｇ２５：２５Ｋ遺伝子のサブゲノムプロモーター；ｉｎｔ：植物体イントロンの５′末端；ＡｔｔＰ：ファージＣ３１の部位特異的インテグラーゼによって認識される配列。
【図５】ＧＦＰ遺伝子の前の異なる位置に配置されたＣＰを持つ異なるＰＶＸ発現カセット（プロベクターモジュールおよびアセンブルしたベクター）を使用したＧＦＰ発現。Ａ−３′プロベクターｐＩＣＨ２１２８２と組み合わせた、アセンブルしたウイルスベクターｐＩＣＨ２５４９１、ｐＩＣＨ２５４８８または異なる５′ＰＶＸプロベクター（ｐＩＣＨ２２９８０またはｐＩＣＨ２４１８０）によるアグロ‐浸潤後、およびウイルスレプリコンをコードするＤＮＡの部位特異的組換えによって媒介されるアセンブリーを提供するファージＣ３１インテグラーゼの存在下で、ＵＶ光下でモニターされたＮ．ベンサミアナ葉部。写真は浸潤後７日目に撮られた。浸潤に使用されるアグロバクテリウム懸濁液は１０５倍に希釈された。Ｂ−プラスミドｐＩＣ２２９８８、ｐＩＣＨ２５４９１、ｐＩＣＨ２５４８８およびｐＩＣＨ２４１８０のＴ−ＤＮＡ領域を示す。ＰＶＸ  Ｐｏｌ：ジャガイモウイルスＸ  ＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼ；３５Ｓ：ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター；２５Ｋ、１２Ｋ、８Ｋ：トリプル遺伝子ブロック；ＣＰ：ＰＶＸ外被タンパク質；ＰＶＸ  ｎｔｒ：ＰＶＸ非翻訳領域；ｓｇｃ：外被タンパク質遺伝子のサブゲノムプロモーター；ｓｇ２５：２５Ｋ遺伝子のサブゲノムプロモーター；ｉｎｔ：植物体イントロンの５′末端；ＡｔｔＰ：ファージＣ３１の部位特異的インテグラーゼによって認識される配列。
【図６】ＧＦＰ遺伝子の前の異なる位置に配置されたＣＰを持つアセンブルしたＰＶＸ発現カセットを使用したＧＦＰの発現。Ａ−アセンブルしたウイルスベクターｐＩＣＨ２５４９１、ｐＩＣＨ２５４８８およびｐＩＣＨ２０７９９によるアグロ‐浸潤後、１０日目（左側パネル）および１６日目（右側パネル）にＵＶ光下でモニターされたＮ．ベンサミアナ葉部。浸潤に使用されるアグロバクテリウム懸濁液は１０５倍に希釈された。Ｂ−プラスミドｐＩＣ２０７９９、ｐＩＣＨ２５４９１、およびｐＩＣＨ２５４８８のＴ−ＤＮＡ領域を示す。ＰＶＸ  Ｐｏｌ：ジャガイモウイルスＸ  ＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼ；３５Ｓ：ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター；２５Ｋ、１２Ｋ、８Ｋ：トリプル遺伝子ブロック；ＣＰ：ＰＶＸ外被タンパク質；ＰＶＸ  ｎｔｒ：ＰＶＸ非翻訳領域；ｓｇｃ：外被タンパク質遺伝子のサブゲノムプロモーター；ｓｇ２５：２５Ｋ遺伝子のサブゲノムプロモーター。
【図７】複数のクローニング部位（ＣＳ）を持つＰＶＸクローニングベクターを示す。ＰＶＸ  Ｐｏｌ：ジャガイモウイルスＸ  ＲＮＡ‐依存的ＲＮＡポリメラーゼ；３５Ｓ：ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター；２５Ｋ、１２Ｋ、８Ｋ：トリプル遺伝子ブロック；ＣＰ：ＰＶＸ外被タンパク質；ＰＶＸ  ｎｔｒ：ＰＶＸ非翻訳領域；ｓｇｃ：外被タンパク質遺伝子のサブゲノムプロモーター；ｓｇ２５：２５Ｋ遺伝子のサブゲノムプロモーター。
【図８】ｐＩＣＨ２５４９１のマップを示す。ｐＩＣＨ２５４９１のＴ−ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６において示される。
【図９】ｐＩＣＨ２５４８８のマップを示す。ｐＩＣＨ２５４８８のＴ−ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５において示される。
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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