(57)【要約】  本発明は、細胞の分化を非骨原性細胞系譜から骨原性細胞系譜へと切り替える方法に関する。本発明はまた、骨増殖因子の細胞内シグナル伝達経路を評価するためのモデル系を作出する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の分化を非骨原性細胞系譜から骨原性細胞系譜へと切り替える方法であって、Ｓｍｕｒｆ１タンパク質とＳｍａｄ１／５タンパク質との間の結合を破壊可能な剤を前記細胞に導入することを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
剤を導入する工程が、前記細胞中のＬＭＰタンパク質またはそのフラグメントと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を過剰発現させることを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が筋芽細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞を培養する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＬＭＰタンパク質またはそのフラグメントと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を、細胞内に導入する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
核酸配列がベクター内に含まれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
核酸配列が、配列番号４７を含んでなるアミノ酸配列をコードする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
核酸配列が、配列番号４９を含んでなるアミノ酸配列をコードする、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
核酸配列が、配列番号５０または配列番号５１を含んでなるアミノ酸配列をコードする、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ＬＭＰ−１タンパク質のフラグメントが、Ｓｍｕｒｆ１タンパク質のＷＷ２ドメインと結合可能である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
骨空隙の治療方法であって、
（ａ）  非骨原性細胞系譜の少なくとも一細胞を得ること；
（ｂ）  少なくとも一細胞にＳｍｕｒｆ１タンパク質とＳｍａｄ１／５タンパク質との間の結合を破壊可能な剤を導入すること；
（ｃ）  少なくとも一細胞を、少なくとも一細胞を骨原性細胞系譜へと導くのに十分な時間、培養すること；
（ｄ）  骨原性細胞系譜の少なくとも一細胞を、骨空隙を有する患者に導入すること；
を含んでなる、前記方法。
【請求項１２】
非骨原性細胞系譜の前記少なくとも一細胞が、筋芽細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
非骨原性細胞系譜の前記少なくとも一細胞が、患者由来である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
非骨原性細胞系譜の前記少なくとも一細胞を、骨空隙の形に成形可能な基質上で培養する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記基質がメッシュまたはケージである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】
剤が、ＬＭＰタンパク質またはそのフラグメントと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
核酸配列がベクター内に含まれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
核酸配列が、配列番号４７を含んでなるアミノ酸配列をコードする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
核酸配列が、配列番号４９を含んでなるアミノ酸配列をコードする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
核酸配列が、配列番号５０または配列番号５１を含んでなるアミノ酸配列をコードする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
ＬＭＰ−１タンパク質のフラグメントが、Ｓｍｕｒｆ１タンパク質のＷＷ２ドメインと結合可能である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
骨増殖因子の細胞内シグナル伝達経路を評価するための細胞培養モデル系を作出する方法であって、
（ａ）  適切な培地中で筋細胞を培養し；
（ｂ）  前記筋細胞内に、切断型ヒトＬＭＰタンパク質と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ分子を形質導入またはトランスフェクトし；
（ｃ）  筋細胞において骨増殖因子を発現させ；
（ｄ）  前記筋細胞において筋管を阻害するのに十分な時間を取り；そして、
（ｅ）  前記筋細胞を、少なくとも一つの骨芽細胞フェノタイプを呈するよう誘導する；
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２３】
骨芽細胞のＬＭＰ誘導の機序を検証する工程をさらに含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
増殖因子が、ＴＧＦ−βおよびＢＭＰ増殖因子からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＢＭＰが、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
筋細胞がＣ２Ｃ１２細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
形質導入を、プラスミドおよびウイルスからなる群より選択されるベクターを用いて行う、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
切断型ヒトＬＭＰタンパク質が、ＬＭＰ−１、ｈＬＭＰ−１、切断型ｈＬＭＰ−１、ｈＬＭＰ−２およびｈＬＭＰ−３からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
筋細胞における骨増殖因子の細胞内シグナル伝達経路を評価するための方法であって、
（ａ）  適切な培地中で筋細胞を培養し；
（ｂ）  前記筋細胞内に、切断型ヒトＬＭＰタンパク質と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ分子を形質導入またはトランスフェクトし；
（ｃ）  筋細胞において骨増殖因子を発現させ；
（ｄ）  前記筋細胞において筋管を阻害するのに十分な時間を取り；そして、
（ｅ）  前記筋細胞を、少なくとも一つの骨芽細胞フェノタイプを呈するよう誘導する；
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項３０】
骨芽細胞のＬＭＰ誘導の機序を検証する工程をさらに含んでなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
増殖因子が、ＴＧＦ−βおよびＢＭＰ増殖因子からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
筋細胞が哺乳動物Ｃ２Ｃ１２細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
形質導入を、プラスミドおよびウイルスからなる群より選択されるベクターを用いて行う、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
切断型ヒトＬＭＰタンパク質が、ＬＭＰ−１、ｈＬＭＰ−１、切断型ｈＬＭＰ−１、ｈＬＭＰ−２およびｈＬＭＰ−３からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
骨増殖因子の細胞内シグナル伝達経路上で外因性因子の活性をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  適切な培地中で筋細胞を培養し；
（ｂ）  前記筋細胞内に、切断型ヒトＬＭＰタンパク質と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ分子を形質導入またはトランスフェクトし；
（ｃ）  筋細胞において骨増殖因子を発現させ；
（ｄ）  前記筋細胞において筋管を阻害するのに十分な時間を取り；
（ｅ）  前記筋細胞を、少なくとも一つの骨芽細胞フェノタイプを呈するよう誘導し；そして、
（ｆ）  工程（ｅ）の前記筋細胞のＬＭＰ誘導の機序に対する外部因子の効果を検証する；
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項３６】
増殖因子が、ＴＧＦ−βおよびＢＭＰ増殖因子からなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＢＭＰ増殖因子が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６からなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
筋細胞が哺乳動物Ｃ２Ｃ１２細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
形質導入を、プラスミドおよびウイルスからなる群より選択されるベクターを用いて行う、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、概して、骨原性細胞、ならびに哺乳動物種における骨および骨組織の形成に関する。具体的には、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで骨石灰化の有効性を増強する新規タンパク質ファミリー、ならびにこれらのタンパク質をコードする核酸に関する。本発明は、例えば脊椎融合、骨折修復および骨粗しょう症などの多様な病理学的状態に関連した骨および骨組織を治療するための方法を、提供する。
【背景技術】
【０００２】
骨芽細胞は、多能性間葉系幹細胞から分化すると考えられている。骨芽細胞の成熟は、骨を石灰化し、そして形成することが可能な細胞外マトリクスの分泌をもたらす。この複雑な過程の調節はあまり解明されていないが、しかし、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）として公知の一群のシグナル伝達糖タンパク質が関与すると考えられている。これらのタンパク質は、胚の背腹パターン形成、肢芽発生および成体動物における骨折修復に関与することが示されている。B. L. Hogan, Genes & Develop., 10:1580 (1996年)。このトランスフォーミング増殖因子−ベータスーパーファミリー分泌タンパク質の群は、多様な細胞型において異なる分化段階で活性の分布を有し；これらの密接に関連する分子間の生理活性の違いは、明らかにされていない。D. M. Kingsley, Trends Genet., 10:16 (1994年)。異なるＢＭＰシグナル伝達タンパク質のユニークな生理学的役割をより識別するために、我々は、ラット頭蓋冠の骨芽細胞分化の誘導に関して、ＢＭＰ−６の効力をＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４のものと比較した。Bodenら、Endocrinology, 137:3401 (1996年)。我々は、分化の開始にＢＭＰまたは糖質コルチコイドを必要とする胎性ラット頭蓋冠の最初の継代（二次）培養物において、この過程を試験した。膜性骨形成のこのモデルでは、糖質コルチコイド（ＧＣ）またはＢＭＰは、骨芽細胞特異的タンパク質であるオステオカルシンを分泌可能な石灰化骨小結節への分化を開始させるであろう。この二次培養系は、自発的な分化を起こす初代ラット骨芽細胞培養物とは異なっている。この二次的な系において、糖質コルチコイドは、骨芽細胞分化の増強に関与するＢＭＰ−６ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現の１０倍の誘導をもたらした。Bodenら、Endocrinology, 138:2920 (1997年)。
【０００３】
ＢＭＰなどの細胞外シグナルに加えて、細胞内シグナルまたは調節分子もまた、新たな骨の形成をもたらす事象のカスケードにおいて役割を果たしている可能性がある。細胞内調節分子の一つの広い分類は、ＬＩＭドメインとして公知の特徴的な構造モチーフを有することからそのように称されている、ＬＩＭタンパク質である。ＬＩＭドメインは、２アミノ酸のスペーサーにより連結している二つの特別なジンクフィンガーから構成される、システインに富む構造モチーフである。ＬＩＭドメインのみを有するタンパク質もあるが、多様なさらなる機能ドメインを含有するタンパク質もある。ＬＩＭタンパク質は、転写因子および細胞骨格タンパク質を含む、多様な群を形成する。ＬＩＭドメインの主な役割は、同一もしくは異なるＬＩＭドメインとの二量体形成によるか、または異なるタンパク質と結合することによって、タンパク質−タンパク質相互作用を媒介することにあるようである。
【０００４】
ＬＩＭホメオドメインタンパク質、すなわち、ＬＩＭドメインおよびホメオドメイン配列の双方を有するタンパク質において、ＬＩＭドメインは、負の調節エレメントとして機能する。ＬＩＭのみのタンパク質も同様の役割を有する可能性はあるが、ＬＩＭホメオドメインタンパク質は、細胞系譜決定の制御および分化の調節に関与する。ＬＩＭのみのタンパク質は、このようなタンパク質をコードするいくつかの遺伝子が発癌性の染色体転座に関連していることから、細胞増殖の制御にも関わっている。
【０００５】
ヒトおよび他の哺乳動物種は、骨修復および／または再生の過程を必要とする疾患または傷害を起こしやすい。例えば、骨折の治療は、自然の骨修復機序を刺激することによって、骨折した骨が治癒するのに必要な時間を低減することが可能な新たな治療レジメンによって、改善されるであろう。別の例において、骨粗しょう症などの全身性骨障害を患う個体は、新たな骨の全身性形成をもたらすことになる治療レジメンの利益を享受するであろう。このような治療レジメンは、この疾患の特徴である骨量減少により生じる骨折の発生率を低減させるであろう。
【０００６】
少なくともこれらの理由によって、ＢＭＰなどの細胞外因子は、新たな骨の形成をｉｎ  ｖｉｖｏで刺激するためにそれらを用いることを目的として、研究されている。ＢＭＰおよび他の細胞外シグナル伝達分子により達成された初期の成功にもかかわらず、その使用は、多くの不都合を伴う。例えば、比較的大用量の精製ＢＭＰが、新たな骨の生成を増強するために必要なことにより、このような治療方法の費用を増加させている。さらに、細胞外タンパク質は、宿主動物へのその導入後に分解を受けやすい。加えて、それらは典型的には免疫原性であるため、投与されたタンパク質に対する免疫応答を刺激する可能性がなお存在する。
【０００７】
譲受人により出願された係属中の米国出願番号11/385,612では、ＬＩＭ石灰化タンパク質の小分子およびペプチド模倣体を含む、組み合わせ治療戦略について記載されており、すべての仮および非仮出願の全開示は、参照によって本明細書に援用される。ＬＭＰ−１の正確な機序はなお研究中であるが、外因性ＢＭＰがＳｍａｄ１／５を活性化することによって骨形成を誘導すると、一般には考えられている。Ｓｍａｄ１／５は、Ｓｍｕｒｆ１によって、分解の標的とされる。ＬＭＰ−１タンパク質は、Ｓｍｕｒｆ１との結合に関してＳｍａｄ１／５と競合することにより、外因性ＢＭＰに対する細胞応答性を増加させる。
【０００８】
このようなことから、新たな骨形成を誘導するために細胞内シグナル伝達分子を用いる利用可能な治療レジメンを持つことが、望ましいであろう。遺伝子療法の分野における進歩により、現在、骨形成過程の一部を形成する細胞内シグナルをコードするヌクレオチドフラグメントを、骨原性前駆細胞、すなわち骨形成に関与する細胞内に導入することが可能となっている。骨形成のための遺伝子療法は、多くの潜在的な利点を供する：（１）生産費用の低減；（２）細胞内シグナルの発現をより長期間成し遂げる能力による、細胞外治療レジメンと比較してより大きな有効性；（３）それは、細胞外シグナルによる治療がこれらのシグナルについての限定された数の受容体の存在によって妨げられる可能性を回避するであろう；（４）それは、トランスフェクトされた潜在的な骨前駆細胞の、限局性の骨形成が必要とされる部位への直接的な送達を可能にする；ならびに、（５）それは、全身性骨形成を可能にすることによって、骨粗しょう症および他の代謝性骨疾患の治療レジメンを供するであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】係属中の米国出願番号11/385,612
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】B. L. Hogan, Genes & Develop., 10:1580 (1996年)
【非特許文献２】D. M. Kingsley, Trends Genet., 10:16 (1994年)
【非特許文献３】Bodenら、Endocrinology, 137:3401 (1996年)
【非特許文献４】Bodenら、Endocrinology, 138:2920 (1997年)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、骨形成をもたらす事象のカスケード初期に関わる細胞内シグナル伝達分子を用いた、骨形成を誘導するための新規組成物および方法を提供することにより、先行技術における難点を克服することを目指している。出願人は、元は刺激されたラット頭蓋冠骨芽細胞培養物から単離された配列と相同の、新規ＬＩＭ遺伝子である１０−４／ＲＬＭＰ（配列番号１、配列番号２）を発見した。該遺伝子をクローニングし、配列決定し、そして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨石灰化の有効性を増強するその能力についてアッセイした。タンパク質ＲＬＭＰは、骨マトリクスの石灰化、ならびに骨芽細胞系譜への細胞分化に影響を及ぼす。例えばＢＭＰなどの他の公知のサイトカイン類とは違って、ＲＬＭＰは、分泌タンパク質ではなく、細胞内シグナル伝達分子である。この特徴には、細胞内シグナル伝達の増幅、ならびにトランスフェクトされた細胞のより容易な評価を提供する利点がある。それは、より効率的かつ特異的なｉｎ  ｖｉｖｏ適用にも適している。適切な臨床適用には、骨折、骨欠損、骨移植における骨修復、および骨粗しょう症を呈している患者の正常な恒常性の増強が含まれる。
【００１２】
出願人は、ヒトＬＭＰ−１と称される、対応するヒトタンパク質のアミノ酸配列を、クローニングし、配列決定し、そして推定した。該ヒトタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて骨石灰化の有効性の増強を示した。ＬＭＰ−１は、Ｎ末端ＰＤＺドメインおよび三つのＣ末端ＬＩＭドメインを含有する。出願人は、ＨＬＭＰ−１ｓと称される、完全長ｈＬＭＰ−１のＮ末端２２３アミノ酸を含有するが骨誘導活性を維持している、切断（短い）バージョンのＬＭＰ−１を性状解析した。
【００１３】
この短いバージョンは、ｃＤＮＡクローンのある源において、タンパク質を切断する終止コドンを提供する点変異により生じた。短いバージョン（ＬＭＰ−１ｓ）は、細胞培養物およびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて発現させる場合、完全に機能的である。本明細書に記載の発明において、発明者は、三つのＣ末端ＬＩＭドメインを欠損するヒトＬＭＰ−１の切断型［ｈＬＭＰ−１(ｔ)］が、多能性筋芽細胞の骨芽細胞系譜への分化を引き起こすかどうかを、評価した。本発明の目的の一つは、ＬＭＰ−１などの骨誘導タンパク質が骨芽細胞の分化を促す経路の少なくとも一つが、複数のＢＭＰの亢進を伴うことを示すことである。したがって、有用な培養系を、ＬＭＰ−１などの骨誘導タンパク質の作用機序を評価するために開発した。本発明のより好ましい側面は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｈＬＭＰ−１の作用機序を評価する、進展した方法である。
【００１４】
最も好ましくは、本発明は、ＬＭＰ−１の活性およびＢＭＰシグナル伝達経路を評価するための骨格筋細胞培養モデルを提供する。本発明はまた、筋細胞における遺伝子発現試験を行い、そしてさらに、増殖因子シグナル伝達経路を調節することが可能な適切な因子または剤をさらにスクリーニングする可能性も、当業者に供する。
【００１５】
本発明のさらなる特徴および利点を、以下の説明において記載することとし、そして、一部分は該説明から明白であろうし、あるいは、これを本発明の実施により学んでもよい。本発明の目的および他の利点は、本明細書に記述された説明および特許請求の範囲において具体的に指摘された事項の方法および組成物によって、認識され、かつ達成されるであろう。
【００１６】
一つの広い側面において、本発明は、任意のＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸分子であって、標準的な条件下で完全長の配列番号２５に相補的な核酸分子とハイブリダイズし、かつ、高ストリンジェントな条件下で完全長の配列番号２６に相補的な核酸分子とハイブリダイズする、前記核酸分子に関する。特定の側面において、単離された核酸分子は、ＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓまたはＲＬＭＰをコードする。加えて、本発明は、これらの核酸分子を含んでなるベクター、ならびに該ベクターを含んでなる宿主細胞に関する。別の特定の側面において、本発明は、該タンパク質自体に関する。
【００１７】
別の側面において、本発明は、細胞の分化を非骨原性細胞系譜から骨原性細胞系譜へと切り替える方法であって、Ｓｍｕｒｆ１タンパク質とＳｍａｄ１／５タンパク質との間の結合を破壊可能な剤を前記細胞に導入することを含んでなる方法を、提供する。一実施態様において、該剤を導入する工程は、前記細胞においてＬＭＰタンパク質またはそのフラグメントを過剰発現させることを含んでなる。
【００１８】
さらに別の側面において、本発明は、骨空隙欠損の治療方法であって：非骨原性細胞系譜の少なくとも一細胞を得ること；少なくとも一細胞にＳｍｕｒｆ１タンパク質とＳｍａｄ１／５タンパク質との間の結合を破壊可能な剤を導入すること；少なくとも一つの細胞を、該少なくとも一つの細胞を骨原性細胞系譜へと導くのに十分な時間、培養すること；骨原性細胞系譜の少なくとも一つの細胞を、骨空隙欠損を有する患者に導入すること；を含んでなる前記方法を提供する。一実施態様において、該剤は、ＬＭＰタンパク質またはそのフラグメントと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を、含んでなる。本発明の別の実施態様において、該アミノ酸配列は、ＬＭＰタンパク質またはそのフラグメントと、少なくとも７５％同一であるか、または少なくとも８０％同一であるか、または少なくとも８５％同一であるか、または少なくとも９０％同一であるか、または少なくとも９５％同一であるか、または少なくとも９９５％同一であるか、または１００％同一であってもよい。
【００１９】
別の広い側面において、本発明は、ＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓおよびＲＬＭＰを含むＬＩＭ石灰化タンパク質に特異的である抗体に関する。ある具体的な側面において、該抗体はポリクローナル抗体である。別の具体的な側面において、該抗体はモノクローナル抗体である。
【００２０】
さらに別の側面において、本発明は、骨原性前駆細胞にＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸分子をトランスフェクトする、骨形成の誘導方法に関する。ある具体的な側面において、単離された核酸分子はベクター内にあり、該ベクターは、プラスミドであっても、あるいはアデノウイルスまたはレトロウイルスなどのウイルスであってもよい。トランスフェクションは、単離された核酸分子の直接注入により、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行ってもよい。トランスフェクトされる単離された核酸分子は、ＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓまたはＲＬＭＰをコードしてもよい。
【００２１】
さらなる側面において、本発明は、骨原性前駆細胞にＬＩＭ石灰化タンパク質と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子をトランスフェクトし、トランスフェクトされた骨原性前駆細胞をマトリクスと混合し、そして該マトリクスを脊椎と接触させることによって脊椎を融合させる方法に関する。
【００２２】
さらに別の側面において、本発明は、宿主細胞への本発明のベクターの安定なトランスフェクションによって全身性の骨形成を誘導するための方法に関する。
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の双方は、典型的かつ説明的であり、そして、特許請求の範囲に記載の本発明のさらなる説明の提供を意図することが、理解されよう。
【００２３】
略語および定義
ＢＭＰ  骨形成タンパク質
ＨＬＭＰ−１、ヒトＬＭＰ−１、ヒトＬＩＭタンパク質またはＨＬＭＰまたはｈＬＭＰとも称される
ＨＬＭＰ−１ｓ、ｈＬＭＰ−１(ｔ)、ヒトＬＭＰ−１短い（切断型）タンパク質
ＨＬＭＰＵ、ヒトＬＩＭタンパク質ユニーク領域
ＬＭＰ、ＬＩＭ石灰化タンパク質
ＭＥＭ、最小必須培地
Ｔｒｍ、トリアムシノロン
β−ＧｌｙＰ、ベータ−グリセロールホスフェート
ＲＡＣＥ、ｃＤＮＡ端の迅速増幅
ＲＬＭＰ、ラットＬＩＭ石灰化タンパク質、ＲＬＭＰ−１とも称される
ＲＬＭＰＵ、ラットＬＩＭタンパク質ユニーク領域
ＲＮＡｓｉｎ、ＲＮａｓｅ阻害剤
ＲＯＢ、ラット骨芽細胞
１０−４、ＲＬＭＰのｃＤＮＡ配列（配列番号２）を含有するクローン
ＵＴＲ、非翻訳領域
Ａｄ５−ＧＦＰ−ＬＭＰ、マウスアルカリホスファターゼ、オステオカルシン、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７のためのプライマー配列
【００２４】
【表１】
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【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、本明細書においてＬＩＭ石灰化タンパク質またはＬＭＰと称される、新規の哺乳動物ＬＩＭタンパク質に関する。本発明は、より具体的には、ＨＬＭＰまたはＨＬＭＰ−１として公知のヒトＬＭＰに関する。
【００２６】
新規細胞内骨誘導タンパク質であるＬＩＭ石灰化タンパク質−１（ＬＭＰ−１）は、1998年にクローニングおよび配列決定された。Bodenら、Endocrinology 139(12):5125-34 (1998年)、該文献の教示は、その全体が参照によって本明細書に援用される。ＬＭＰ−１は、Ｎ末端ＰＤＺドメインおよび三つのＣ末端ＬＩＭドメイン／モチーフを含有する。Davidら、14:156-62 (1998年)。出願人は、これらのタンパク質が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育させた哺乳動物細胞において骨石灰化を増強することを、発見した。哺乳動物において産生される場合、ＬＭＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏでも骨形成を誘導する。
【００２７】
骨芽細胞培養物における試験は、完全長ｈＬＭＰ−１のＮ末端２２３アミノ酸を含有するが、ただしＬＩＭドメインは含有しない切断型ヒトＬＭＰ−１であるｈＬＭＰ−１(ｔ)（配列番号４７）が、上記の系においても骨誘導性であったように、ＬＭＰ−１が骨形成を誘導するのにＬＩＭドメインを必要としないことを示した。Liu YS ら、J Bone Min. Res. 17:406-14 (2002年)、該文献の教示は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【００２８】
本発明において、発明者は、より関わりの薄い多能性細胞および非骨原性細胞系譜において、ＬＩＭドメインがＬＭＰ−１骨誘導活性に必要とされるかどうかを、決定した。本出願全体にわたる「非骨原性細胞系譜」の語は、通常は骨細胞の少なくとも一つの特徴を呈する細胞へと発生しない細胞を特徴付けるために、用いられる。非骨原性細胞系譜の細胞には、例えば、例えば筋芽細胞などの、多能性が限定されている幹細胞（例えば、組織特異的幹細胞または衛星細胞）が含まれる。
【００２９】
外因性ＢＭＰは、Ｓｍａｄ１／５を活性化することによって骨形成を誘導すると、現在、考えられている。本開示において、「Ｓｍａｄ１／５」の語は、Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ５タンパク質の両方を指す。Ｓｍａｄ１／５は、Ｓｍｕｒｆ１による分解の標的とされる。ＬＭＰ−１タンパク質は、Ｓｍｕｒｆ１との結合についてＳｍａｄ１／５と競合し、それにより外因性ＢＭＰに対する細胞応答性を増加させる。Sandagalaら、Lim Mineralization Protein-1 Potentiates Bone Morphogenic Protein Responsiveness via a Novel Interaction with Smurf1 resultng in Decreased Ubiquination of Smads, J. Biol. Chem. 281(25): 17212-17219 (2006年)、該文献の全体は、参照によって本明細書に援用される。出願人は、Ｓｍｕｒｆ１タンパク質とＳｍａｄ１／５タンパク質との間の結合を破壊可能な剤を細胞に導入することによって、非骨原性細胞系譜から骨原性細胞系譜へと細胞の分化経路を切り替える方法を、任意の特定の理論に関わることなく、発見した。一実施態様において、該剤の導入は、ＬＭＰ−１タンパク質、あるいはＳｍｕｒｆ１タンパク質のＷＷ２ドメインとの結合に必要であり、かつ／またはＬＭＰ−１タンパク質の骨原性特性に十分なフラグメントなどの、そのフラグメントを、過剰発現させることを含んでなる。ある実施態様において、適切なフラグメントは、より大きなアミノ酸配列内に含まれ、それは所望により人工的であってもよい。このようなフラグメントおよび配列の適切な例には、非限定的に、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１が含まれる。
【００３０】
さらに別の実施態様において、核酸配列は、ＬＭＰタンパク質またはそのフラグメントと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列をコードする。当業者は、アミノ酸配列をコードする核酸配列が、ＬＭＰタンパク質またはそのフラグメントと、少なくとも７５％同一であるか、または少なくとも８０％同一であるか、または少なくとも８５％同一であるか、または少なくとも９０％同一であるか、または少なくとも９５％同一であるか、または少なくとも９９％同一であるか、または１００％同一であってもよいことを、正しく評価するであろう。
【００３１】
本発明の少なくとも一側面において、発明者は、ＢＭＰ−２またはＴＧＦ−βなどの細胞内増殖因子のシグナル伝達経路における調節因子の特異性および有効性を検証するための、有用なｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系を開発した。本発明の少なくとも一つの好ましい実施態様において、発明者は、骨芽細胞系譜のＬＭＰ−１誘導およびＢＭＰ−２細胞内経路に対するその潜在的な効果の研究におけるＣ２Ｃ１２細胞の新規使用を示した。
【００３２】
発明者は、関係する胎性ラット頭蓋冠骨芽細胞において、ＬＭＰ−１が骨小結節形成を増強することを、以前に示した。しかしながら、各実験を行うために、これらの初代細胞を動物から採取し、そして培養増殖させなければならない。これらの初代細胞の生物学的応答性は、異なるドナーおよび異なる継代によって様々である細胞の生理学的状態により変わる可能性がある。誘導された骨芽細胞系譜において骨誘導の機序を試験するためには、骨誘導タンパク質、好ましくはｈＬＭＰ−１が一貫性のある予測可能な効果を有している細胞株を用いることが、非常に重要である。
【００３３】
発明者は、Ｃ２Ｃ１２細胞を、それらが多能性であることから選択した。しかしながら、本発明において使用してもよい、筋芽細胞などの非骨原性細胞系譜の他の細胞は、自己、同種間または異種間の源に由来することが可能である。好ましくは、非骨原性細胞系譜の細胞は、自己源、すなわち患者自身に由来する。本発明の一実施態様において、筋組織の試料を生検によって得てもよく、そして、筋芽細胞を単離する。
【００３４】
筋芽細胞を、当該技術分野において公知であって、かつ例えばWebsterら、Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter, Exp Cell Res. 174(1):252-65 (1988年)に記載されている単離および精製スキームによって、単離し、そして実質的に精製することが可能である。該文献の全体は、参照によって本明細書に援用される。そのアプローチとは、モノクローナル抗体５．１Ｈ１１とヒト筋細胞表面抗原との特異的反応を利用したものである。該反応の結果に基づき、筋芽細胞を、蛍光励起細胞選別機を用いて単離してもよい。細胞集団の９９％を超える筋芽細胞画分を、達成することが可能である。０．１ｇの組織につき平均１０４個の生筋芽細胞を得ることが可能であり、それぞれは、およそ４０回の細胞分割を行う潜在性を持つ。
【００３５】
本発明の一実施態様において、Ｃ２Ｃ１２細胞は、損傷した成体マウス筋肉から元は単離され、かつ、筋原性分化の試験に優れたモデル系であることが証明された。Ｃ２Ｃ１２細胞は、培養培地中で増殖するが、しかし、コンフルエンスになるまで生育させ、かつ増殖因子を欠乏させると、最終分化を行う。この過程の間、Ｃ２Ｃ１２細胞は、細胞周期を出て、筋特異的遺伝子を亢進させ、そして融合して多核筋管となる。Yaffeら、Nature; 270:725-27(1997年)。Ｃ２Ｃ１２細胞は、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）などのサイトカインで処理されると、骨芽細胞フェノタイプへと分化することが可能である。Yingら、JBC; 278:39029-036 (2003年)。
【００３６】
本発明の本実施態様において、発明者は、多能性細胞を細胞内増殖因子、好ましくは骨誘導タンパク質、およびより好ましくは切断型ヒトＬＭＰ−１などのＬＭＰ１のアイソフォームで処理するときの、前記細胞からの骨芽細胞系譜の誘導を、研究する。発明者は、ＢＭＰシグナル伝達経路における前記因子の潜在的効果を、さらに評価した。
【００３７】
本発明の本側面によると、発明者は、骨髄細胞およびラット頭蓋冠骨芽細胞などの初代細胞に優るこれらの多能性細胞（すなわち、哺乳動物Ｃ２Ｃ１２筋細胞）の利点を、初めて示した。本発明の本側面の最も特筆すべき発見は、形態変化および骨芽細胞特異的遺伝子の発現により測定された、多能性筋芽細胞が骨芽細胞となる誘導である。この観察は、ＬＭＰ−１アイソフォームが任意の多能性細胞を骨芽細胞フェノタイプへと駆動可能であることを示す、最初のものである。
【００３８】
本発明の特徴として、発明者は、切断型ｈＬＭＰ−１を用いて検証するためのビオチン移行アッセイにおける、ビオチン化した完全長および切断型ヒトＬＭＰ−１の核タンパク質への結合、ならびに、Ｃ２Ｃ１２培養物に対するその効果を、比較した。発明者はまた、完全長ＬＭＰ−１およびＬＭＰ−１(ｔ)の両方がＳｍｕｒｆ１と相互作用することから、それらが類似する機序によって骨芽細胞の分化を誘導することが示唆されることも、同定した。
【００３９】
別の実施態様において、例えばParkら、A Comparative Study of Magnetic-Activated Cell Sorting, Cytotoxicity and Preplating for the Purification of Human Myoblasts, Yonsei Med J., 47(2):179-183 (2006年)に記載のように、細胞を、磁気励起細胞選別機（ＭＡＣＳ）、補体を介した細胞毒性およびプレプレーティング技術の組み合わせによって、単離してもよい。著者は、この組み合わせを用いて、筋芽細胞を９２．８％含んでなる細胞培養物を得たことを、報告している。
【００４０】
所望の特徴を有する細胞を選択するためのさらなる基準は、当該技術分野において公知であり、そして、Jankowskiら、Establishing reliable criteria for isolating myogenic cell fractions with stem cell properties and enhanced regenerative capacity, Blood Cell Mol Dis, 3291:24-33 (2004年)において論じられるように、例えば、高度の増殖能を含む。この基準および他の基準は、有利には上述のプロトコール中に含まれてもよい。
【００４１】
本発明の別の実施態様において、発明者は、ＬＭＰのいずれかの型が相互作用するタンパク質に、ビオチンを移行させた。次いで、新たにビオチン化されたＬＭＰ−１と相互作用するタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびニュートラアビジン（neutravadin）−ＨＲＰを用いて検出されるビオチン標識によって、分離した。したがって、発明者は、検出されたバンドに差がないことから、完全長および切断型ｈＬＭＰ−１は同じ結合パートナーを有し、かつ類似する生理学的効果を及ぼす可能性が高いことが示唆されることを、見いだした。８５ｋＤａのバンドは、Ｓｍｕｒｆ１であることが決定され；５０ｋＤａおよび５５ｋＤａにある別の二つのバンドは、それぞれメオシンおよびカルデスモンであることが決定された。
【００４２】
本発明の別の側面において、発明者は、Ｃ２Ｃ１２培養物における骨増殖因子の形質導入効率を測定することが可能であった。少なくとも一つの好ましい実施態様において、発明者は、Ｃ２Ｃ１２培養物のＡｄ５−ｈＬＭＰ−１(ｔ)−ＧＦＰ形質導入効率を測定することにより、切断型ヒトＬＭＰ−１が多能性細胞を骨芽細胞系譜へと誘導するかどうかを同定した。
【００４３】
このような目標を達成するために、発明者は、ＬＭＰ−１のＮ末端２２３アミノ酸を含有するが、ただしＬＩＭドメインは含有しないタンパク質をコードする、ｈＬＭＰ−１(ｔ)  ｃＤＮＡを構築した。次いで、発明者は、形質導入効率を改善し、そしてｈＬＭＰ−１(ｔ)の過剰発現によるＣ２Ｃ１２培養物における遺伝子発現の誘導を評価するために、ｃＤＮＡをアデノウイルス送達によって送達した。フローサイトメトリーまたは当業者に公知の他の方法を、ベクターを取り込んだ細胞を同定するために使用した。したがって、ウイルス量の増加に伴って増加するＧＦＰ発現細胞数を、１０〜５００ｐｆｕ／細胞の用量範囲で培養物に加えた。
【００４４】
本発明の別の実施態様において、ｈＬＭＰ−１(ｔ)の最大限の発現を達成するためのウイルスの至適用量を決定した。したがって、発明者は、種々の用量のＡｄ５−ｈＬＭＰ−１(ｔ)−ＧＦＰを加え、そして４日後にＬＭＰ−１  ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定する実験を行った。
【００４５】
プライマーは、ヒト過剰発現ＬＭＰ−１  ｍＲＮＡを検出するが、しかし内因性マウスＬＭＰ−１は検出しないように、設計された。この戦略は、当業者が、試験された最低用量（１０ｐｆｕ／細胞）においてもヒトＬＭＰ−１の過剰発現を示すことを、可能にする。初めて、当業者は、このような過剰発現を実証できる能力を正しく評価することが可能である。
【００４６】
リアルタイムＰＣＲ解析は、切断型ヒトＬＭＰ−１  ｍＲＮＡが豊富に発現していることを示した。トランスフェクトされた細胞におけるｈＬＭＰ−１(ｔ)遺伝子発現の相対値は、本方法ではマウスＬＭＰ−１  ｍＲＮＡが対照Ｃ２Ｃ１２細胞において検出されなかったため、対照よりもはるかに高かった。発明者は、増加していく量のＡｄ５−ｈＬＭＰ−１(ｔ)−ＧＦＰを、Ｃ２Ｃ１２培養物に１０〜２５０ｐｆｕ／細胞の範囲で加えるとＬＭＰ−１発現が増加することを測定した。これに続く実験では、１００ｐｆｕ／細胞を、それがｈＬＭＰ−１(ｔ)の最大限の発現を与える最低用量であるため、適用した。
【００４７】
ウエスタンブロット解析により、切断型ＬＭＰ−１の顕著なシグナルが、約３０においてさらに確認された。本発明のこの側面によると、１００ｐｆｕ／細胞のＡｄ５−ｈＬＭＰ−１(ｔ)−ＧＦＰを形質導入したＣ２Ｃ１２培養物から抽出されたタンパク質に関して、ウエスタンブロット解析を、アフィニティ精製ｈＬＭＰ−１特異抗体を用いて行った。およそ５０ｋＤａのバンドは、内因性マウスＬＭＰ−１を表す可能性が最も高いことが決定された。
【００４８】
別の実施態様において、発明者は、細胞内増殖因子、好ましくは骨誘導タンパク質、およびより好ましくは切断型ヒトＬＭＰ−１などのＬＭＰ１のアイソフォームが、Ｃ２Ｃ１２細胞の筋管形成をブロックし、かつその骨芽細胞の特徴を増強することが可能なことを、初めて示した。より具体的には、当業者は、Ｃ２Ｃ１２細胞が、適切な培地中で培養されると筋芽細胞に分化する潜在性を有することを、現在、正しく評価することが可能である。
【００４９】
これらの対照条件下では、多くの筋管を、位相差顕微鏡下で見ることが可能である。しかしながら、Ａｄ５−ＧＦＰ−ＬＭＰ−１(ｔ)を形質導入されたＣ２Ｃ１２培養物では、形質導入後４日にほとんど筋管はなく、ｈＬＭＰ−１(ｔ)がＣ２Ｃ１２での筋管形成に対して阻害効果を有することが示唆される。
【００５０】
形質導入された培養物が骨芽細胞フェノタイプに分化したかどうかを決定するため、アルカリホスファターゼ活性を測定した。ｈＬＭＰ−１(ｔ)を４日間過剰発現させると、Ｃ２Ｃ１２培養物では、空のベクター対照で処理した培養物と比較して、アルカリホスファターゼ活性の５０％増加が誘導された。
【００５１】
アルカリホスファターゼおよびオステオカルシン遺伝子の発現増加は、骨芽細胞分化のマーカーである。ｈＬＭＰ−１(ｔ)を４日間過剰発現させたＣ２Ｃ１２培養物において、アルカリホスファターゼおよびオステオカルシン遺伝子発現は、ベクターのみで処理された対照Ｃ２Ｃ１２培養物と比較して、それぞれ９および１３倍有意に増加した。Ｃ２Ｃ１２培養物におけるｈＬＭＰ−１(ｔ)の骨芽細胞分化誘導の可能な機序に関してさらに学ぶため、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７遺伝子発現も、形質導入後４日に測定した。当業者には明らかなように、本発明の発明者は、両遺伝子の発現がｈＬＭＰ−１(ｔ)の過剰発現に続いて有意に増加したことを示す。Minamideら、J Bone & Joint Surg Am 85A:1030-39 (2003年)もまた参照されたく、該文献の教示は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【００５２】
ｈＬＭＰ−１(ｔ)過剰発現培養物において、ＢＭＰ−２の発現は、ベクター対照よりも８倍増加し、一方、ＢＭＰ−７の発現は、これらの培養物において１０倍増加した。総合すれば、該データは、ｈＬＭＰ−１(ｔ)の過剰発現が、分化しているＣ２Ｃ１２培養物において筋芽細胞フェノタイプを阻害し、一方で、骨芽細胞フェノタイプの複数のマーカーの発現を増強することを、当業者に証明している。
【００５３】
当業者は、形態変化および骨芽細胞特異的遺伝子の発現によって測定されるように、多能性筋芽細胞が骨芽細胞となるよう誘導されている、本発明の特筆すべき発見を、正しく評価するであろう。この観察は、骨誘導タンパク質、好ましくはＬＭＰ−１アイソフォームが、任意の多能性細胞を骨芽細胞フェノタイプへと駆動可能であることを実証した、最初のものである。
【００５４】
過剰発現させた完全長もしくは切断型のラットまたはヒトＬＭＰ−１は、関与する前骨芽細胞（ラット頭蓋冠から単離された初代培養物）の骨芽細胞マーカーを発現し、そして骨小結節を形成する能を増強可能であることが、示されている。Bodenら、139 (12):5125-34 (1998年)；および、Liuら、J Bone Min. Res.17:406-14 (2002年)を参照されたい。
【００５５】
本発明の少なくとも一つの側面において、当業者は、筋芽細胞フェノタイプを有する多能性細胞が、過剰発現させた切断型ｈＬＭＰ−１などの骨誘導タンパク質で処理すると、骨芽細胞フェノタイプへと誘導されるとの発見を、正しく評価するであろう。
【００５６】
本発明の最も好ましい実施態様において、Ａｄ５−ｈＬＭＰ−１(ｔ)−ＧＦＰを一時的に形質導入されたＣ２Ｃ１２培養物は、オステオカルシンおよびアルカリホスファターゼ遺伝子発現の亢進からも明らかなように、４日後に骨芽細胞フェノタイプへと分化した。対照群において、Ｃ２Ｃ１２細胞は、筋芽細胞フェノタイプへと分化し、そして、予想されたように、オステオカルシンおよびアルカリホスファターゼ遺伝子発現は増加しなかった。したがって、Ｃ２Ｃ１２細胞は、骨芽細胞フェノタイプのＬＭＰ誘導の機序を検証し、そしてさらに、前記経路を調節可能な適切な候補剤をさらにスクリーニングするための、適切なモデル系である。したがって、このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化過程は、ＴＧＦ−βまたはＢＭＰ−２シグナル伝達に対する調節因子の特異性および有効性を検証するための非常に有用なモデル系を提供する。
【００５７】
本発明はまた、遺伝子発現研究を行い、かつ、増殖因子シグナル伝達経路を調節することが可能な適切な剤をさらにスクリーニングする能力も、当業者に提供する。
本発明のさらに別の実施態様において、骨髄細胞、骨原性前駆細胞または間葉系幹細胞へのＬＭＰまたはＨＬＭＰをコードする核酸のｅｘ  ｖｉｖｏトランスフェクション、それに続くトランスフェクトされた細胞のドナーにおける再移植は、多様な骨関連障害もしくは損傷の治療に適することが予想される。例えば、長骨骨折の修復を増強し；部分欠損において骨を生成し；骨折に対して骨移植置換片を提供し；腫瘍再構築または脊椎融合を促進し；そして、腰部、椎骨または手関節の骨粗しょう症などにおける弱いかもしくは骨粗しょう症性の骨に対して局所治療（注入による）を提供するために、本方法を用いることが可能である。
【００５８】
ＬＭＰまたはＨＬＭＰをコードする核酸のトランスフェクションは、トランスフェクトされた骨髄細胞の経皮注入において、骨折した長骨の修復；遅延癒合性もしくは非癒合性の長骨骨折または脊椎融合の仮関節の治療；の加速、ならびに、腰部または膝部の無血管性壊死における新たな骨形成の誘導にも、有用である。本発明の少なくとも一つの実施態様において、ＬＭＰ−１タンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸を導入する前後に、単離された細胞を、骨空隙の形に成形可能な基質上で培養してもよい。適切な基質には、非限定的に、ケージまたはメッシュが含まれ、これらは細胞接着を誘導するための組成物でコーティングされていてもよい。多様なこれらの組成物は、当該技術分野において公知であり、かつ、市販されている。このような組成物の適切な例には、ＢＤバイオサイエンシズＩｎｃ．（サンノゼ、カリフォルニア州）より入手可能なマトリゲル（商標）が含まれる。
【００５９】
遺伝子療法のｅｘ  ｖｉｖｏ系方法に加え、ＬＭＰまたはＨＬＭＰをコードする核酸配列を含んでなる組換えＤＮＡベクターのトランスフェクションを、ｉｎ  ｖｉｖｏで成し遂げることが可能である。ＬＭＰまたはＨＬＭＰをコードするＤＮＡフラグメントを適切なウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターに挿入する場合、ウイルスコンストラクトを、軟骨内骨形成が望まれる身体部位に直接注入することが可能である。ＬＭＰまたはＨＬＭＰ配列を導入するために直接的な経皮注入を用いることによって、（ｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクトするための）骨髄細胞を得るか、または新たな骨が必要とされる患者の部位にそれらを再移植するための外科的インターベンションを必要とせずに、骨形成刺激を成し遂げることが可能である。Aldenら、Neurosurgical Focus (1998年)は、アデノウイルスベクター内にクローニングしたＢＭＰ−２をコードするｃＤＮＡを用いた遺伝子療法の直接注入方法の有用性を実証した。
【００６０】
適切な身体部位に、裸の、すなわち被包されていない、ＨＬＭＰをコードする核酸配列を含んでなる組換えプラスミドを直接注入することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法を実行することもまた可能である。本発明のこの実施態様において、トランスフェクションは、裸のプラスミドＤＮＡが記載されている適切な標的細胞に取り込まれるか、または内部移行するときに、起こる。ウイルスコンストラクトを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法の場合のように、裸のプラスミドＤＮＡの直接注入は、ほとんどもしくは全く外科的インターベンションを必要としないという利点を供する。内皮細胞マイトジェンＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）をコードする裸のプラスミドＤＮＡを用いた直接的な遺伝子療法は、ヒト患者における成功が実証されている。Baumgartnerら、Circulation, 97(12):1114-23 (1998年)。
【００６１】
ＬＭＰを骨原性細胞に送達するためにアデノウイルスベクターを用いることによって、ＬＭＰの一時的な発現が達成される。これは、アデノウイルスが、トランスフェクトされている標的細胞のゲノム内に組み入れられないために、起こる。ＬＭＰの一時的な発現、すなわち、トランスフェクトされた標的細胞の寿命の間に起こる発現は、本発明の目的を達成するのに十分である。しかしながら、標的細胞のゲノム内に組み入れるベクターを送達媒体として用いる場合、ＬＭＰの安定な発現が起こる。例えば、レトロウイルス系ベクターは、この目的に適している。
【００６２】
ＬＭＰの安定な発現は、骨粗しょう症および骨形成不全症などの種々の全身性骨関連障害の治療に、特に有用である。本発明のこの実施態様に関しては、ＬＭＰをコードするヌクレオチド配列を標的細胞内に送達するために標的細胞のゲノム内に組み込むベクターを用いることに加えて、ＬＭＰ発現が、調節可能なプロモーターの制御下に置かれている。例えば、テトラサイクリンなどの外因性誘導剤への曝露によって活性化されるプロモーターが、適している。このアプローチを用いると、有効量の外因性誘導剤を投与することによって、全身にて新たな骨の形成を刺激することが可能である。ひとたび十分な量の骨量が達成されたならば、外因性誘導剤の投与を中断する。例えば骨粗しょう症の結果としての骨量減少を補填するために、この過程を必要に応じて繰り返してもよい。
【００６３】
ＨＬＭＰに特異的な抗体は、骨誘導性の、すなわち骨形成を行う患者細胞の潜在性をアッセイするための方法における使用に適している。この方法で、骨修復の治癒が遅いかもしくは不十分なリスクのある患者を同定することが可能である。ＨＬＭＰ特異抗体はまた、例えば骨粗しょう症などの骨変性疾患におけるリスクファクターを同定するためのマーカーアッセイにおける使用にも、適している。
【００６４】
周知かつ慣用の用法にしたがって、本発明の遺伝子は、ＬＭＰをコードする核酸セグメントと、クローニングおよび／もしくは発現ベクターなどの他の核酸配列とのライゲーションによって、調製される。例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化、クローニングプロトコール、変異誘発、オリゴヌクレオチドの有機合成、およびＤＮＡ配列決定などの、これらの組換えベクターを構築および解析するために必要な方法については、記載されている。ＤＮＡ配列決定に関しては、ジデオキシターミネーター（dieoxyterminator）法が好ましい。
【００６５】
Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, コールドスプリングハーバー・プレス、第２版(1988年)；Davisら、Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986年)；および、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Wiley lnterscience (1988年)を含む、組換えＤＮＡ法に関する多くの論文が公表されている。これらの参照マニュアルは、参照によって本明細書に具体的に援用される。
【００６６】
ＤＮＡまたはｃＤＮＡのプライマー指向性増幅は、本発明の遺伝子の発現における一般的な工程である。それは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって典型的には行われる。ＰＣＲについては、Mullisらによる米国特許第4,800,159および他の公表された出所に記載されている。ＰＣＲの基本原理は、プライマー伸長の連続したサイクルによる、指数関数的なＤＮＡの複製である。あるプライマーの伸張産物は、別のプライマーとハイブリダイズさせたとき、別の核酸分子合成のための鋳型となる。プライマー−鋳型複合物は、その複製機能を行う際にプライマーを伸長するＤＮＡポリメラーゼの基質として作用する。ＰＣＲ適用のための慣用の酵素は、サーマス・アクアチス（Thermus aquaticus）から単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００６７】
基本的なＰＣＲ法の多数の変形形態が存在し、そして、本発明の組換えベクターを構築するために必要な任意の所与の工程における、選択された特定の手順は、当業者によって容易に行われる。例えば、１０−４／ＲＬＭＰの細胞発現を測定するために、ＲＮＡを、標準的かつ周知の手順の下で抽出および逆転写する。次いで、得られたｃＤＮＡを、適切なｍＲＮＡ配列に関して、ＰＣＲにより解析する。
【００６８】
ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする遺伝子を、組換え発現系において発現ベクターで発現させる。当然ながら、構築される配列は、元の配列またはその相補的な配列と同じである必要はなく、代わりに、それでもなお骨形成活性を有するＬＭＰを発現するＤＮＡコードの縮重によって決定される、任意の配列であってもよい。また、保存的アミノ酸置換、あるいはアミノ末端メチオニン残基の発生などの他の修飾が、使用されてもよい。
【００６９】
選択した宿主発現系において活性のリボソーム結合部位を、キメラＬＭＰコード配列の５'末端にライゲーションして、合成遺伝子を形成する。該合成遺伝子を、適切に線状化したプラスミドにライゲーションすることによって、非常に多様な発現用ベクターの任意の一つに挿入することが可能である。調節可能なプロモーター、例えば大腸菌（E. coli）ｌａｃプロモーターもまた、キメラコード配列の発現に適している。その他の適切な調節可能なプロモーターには、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｒｅｃＡ、Ｔ７およびラムダプロモーターが含まれる。
【００７０】
ＬＭＰをコードするＤＮＡを、例えば、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔またはプロトプラスト融合などの、いくつかの標準的な公表されている手順の一つによって、レシピエント細胞にトランスフェクトして、安定な形質転換体を形成する。以下のように実施する場合は特に、リン酸カルシウム沈降が好ましい。
【００７１】
ＤＮＡを、細胞内にトランスファーする前に、GrahamおよびVan Der, Virology, 52:456 (1973年)の方法にしたがって、リン酸カルシウムと共沈させた。担体としてサケ精子もしくは仔ウシ胸腺ＤＮＡを伴う、４０〜５０μｇのＤＮＡのアリコットを、１００ｍｍ皿上に蒔いた０．５ｘ１０６細胞に対して用いる。ＤＮＡを、０．５ｍｌの２ｘ  Ｈｅｐｅｓ溶液（２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓおよび１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０）と混合し、これに等量の２ｘＣａＣｌ２（２５０ｍＭ  ＣａＣｌ２および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０）を加える。３０〜４０分後に現れる白色顆粒状の沈殿物を、細胞上に滴下して均等に分配し、該細胞を３７℃にて４〜１６時間インキュベートする。培地を除去し、そして、ＰＢＳ中１５％グリセロールで３分間、細胞にショックを与える。グリセロールを除去した後、細胞に、１０％胎性ウシ血清含有ダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）を供給する。
【００７２】
ＤＮＡはまた、Kimuraら、Virology, 49:394 (1972年)；および、Sompayracら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7575 (1981年)のＤＥＡＥ−デキストラン法；Potter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:7161 (1984年)の電気穿孔法；ならびに、Sandri-Goddinら、Molec. Cell. Biol., 1:743 (1981年)のプロトプラスト融合法を用いても、トランスフェクトすることが可能である。
【００７３】
固相におけるホスホラミダイト化学は、オリゴデオキシヌクレオチドおよびポリデオキシヌクレオチドの有機合成に好ましい方法である。加えて、多くの他の有機合成法が利用可能である。これらの方法を、当業者は、本発明の特定の配列に対して容易に適応させることが可能である。
【００７４】
本発明には、本発明のＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする核酸配列のいずれかと標準的な条件下でハイブリダイズする核酸分子もまた含まれる。「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、プローブのサイズ、バックグラウンドおよび核酸試薬の濃度、ならびにハイブリダイゼーションのタイプ（例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕ、サザンブロット、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション（ノーザンブロット））に応じて、様々であろう。「標準的なハイブリダイゼーション条件」の決定は、当該技術分野における技能水準内である。例えば、Fremeauらによる米国特許第5,580,775を参照されたく、該出願は、本目的のために参照により本明細書に援用される。Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98:503 (1975年)；Alwineら、Meth. Enzymol., 68:220 (1979年)；および、Sambrookら、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 第２版、7.19-7.50ページ、コールドスプリングハーバー・プレス(1989年)もまた参照されたい。
【００７５】
ある好ましい標準的なハイブリダイゼーション条件のセットは、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ（１５０ｎＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４［ｐＨ７．４］、１ｍＭ  ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）、５ｘデンハルト溶液（水１００ｍｌにつき２０ｍｇフィコール、２０ｍｇポリビニルピロリドンおよび２０ｍｇ  ＢＳＡ）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中で、４２℃にて２時間プレハイブリダイズするブロットを、伴う。３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを加え、そして、ハイブリダイゼーションを１４時間続ける。その後、ブロットを、２ｘＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳで、２２℃にて２０分間、２回洗浄し、続いて、０．１ｘＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ中で、６５℃にて１時間洗浄する。次いで、ブロットを乾燥させ、そして増感スクリーンの存在下で５日間、Ｘ線フィルムに露出する。
【００７６】
「高度にストリンジェントな条件」下では、プローブは、その標的配列と、これらの二つの配列が実質的に同一であるならば、ハイブリダイズするであろう。標準的なハイブリダイゼーション条件の場合のように、当業者は、当該技術分野における技能水準および特定の実験の性質を考慮して、実質的に同一の配列のみがハイブリダイズするであろう条件を決定する。
【００７７】
本発明の別の側面には、核酸配列によってコードされるタンパク質が含まれる。さらに別の実施態様において、本発明は、抗ＬＭＰ抗体に基いたこのようなタンパク質の同定に関する。この実施態様では、細胞を溶解し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離することによって、タンパク質試料をウエスタンブロット解析のために調製する。タンパク質を、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, ジョンワイリー・アンド・サンズ(1987年)によって記載のように、エレクトロブロッティングによりニトロセルロースに移行させる。インスタント脱脂粉乳（１００ｍｌ  ＰＢＳ中５ｍｇ）でフィルターをブロッキングした後、抗ＬＭＰ抗体をフィルターに加え、そして室温にて１時間インキュベートする。フィルターをリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で徹底的に洗浄し、そして、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−抗ウサギ抗体複合体とともに室温にて１時間インキュベートする。フィルターを、ＰＢＳで再び徹底的に洗浄し、そして、抗原バンドを、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を加えることにより同定する。
【００７８】
単一特異性抗体は、本発明におけるえり抜きの試薬であり、そして、具体的には、ＬＭＰの発現に伴う特有の特徴について患者細胞を解析するために、用いられる。「単一特異性抗体」は、本明細書では、ＬＭＰアフィニティカラムを用いて精製されるような、ＬＭＰに対して均一な結合特徴を有する、単一の抗体種または複数の抗体種として定義される。「均一な結合」とは、本明細書では、上述のように、ＬＭＰに関連するものなどの、特定の抗原またはエピトープと結合する抗体種の能を指す。ＬＭＰに対する単一特異性抗体を、ＬＭＰに対して反応性の抗体を含有する哺乳動物血清から精製するか、あるいは、KohlerおよびMilstein, Nature, 256:495-97 (1975年)の技術を用いて、ＬＭＰと反応性のモノクローナル抗体として調製する。例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギまたはウマなどの動物を、免疫アジュバントを含むかもしくは含まない適切な濃度のＬＭＰで免疫することによって、ＬＭＰ特異抗体を産生させる。
【００７９】
この過程において、免疫前の血清を、最初の免疫に先立ち回収する。各動物は、望まれる場合に許容可能な免疫アジュバントを伴う、約０．１ｍｇ〜約１．０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのＬＭＰを投与される。このような許容可能なアジュバントには、これに限定されないが、フロイント完全、フロイント不完全、ミョウバン沈殿物、Corynebacterium parvumを含有する油中水型乳剤、およびｔＲＮＡアジュバントが含まれる。最初の免疫は、好ましくはフロイント完全アジュバント中のＬＭＰからなり、複数部位にて皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、またはその両方に注射される。抗体価を測定するために、各動物を一定間隔で、好ましくは１週間毎に採血する。動物は、最初の免疫後に、ブースター注射を受けても、または受けなくてもよい。ブースター注射を受けるこれらの動物には、同じ経路により、フロイント不完全アジュバント中の等量の抗原を与える。ブースター注射は、約３週間間隔で、最大限の力価が得られるまで行う。各ブースター免疫後約７日、または単回免疫後約１週間毎に動物を採血し、血清を回収し、そしてアリコットを約−２０℃にて保管する。
【００８０】
ＬＭＰと反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃマウスをＬＭＰで免疫することによって調製する。上記に論じるように、マウスを、等量の許容可能なアジュバントに取り込んだ、約０．５ｍｌのバッファーもしくは生理食塩液中約０．１ｍｇ〜約１ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのＬＭＰで、ＩＰもしくはＳＣ経路により免疫する。フロイント完全アジュバントが、好ましい。マウスは、第０日に初回免疫を受け、そして、約３〜３０週間おいておく。免疫したマウスに、リン酸緩衝生理食塩液などのバッファー溶液中約０．１〜約１ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのＬＭＰのブースター免疫を、１またはそれより多くの回数で静脈内（ＩＶ）経路により与える。抗体陽性マウスから得たリンパ細胞、好ましくは脾臓リンパ細胞を、当該技術分野において公知の標準的な手順によって免疫したマウスから脾臓を取り出すことによって得る。脾臓リンパ細胞を適切な融合パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と、安定なハイブリドーマの形成を可能にするであろう条件下で混合することにより、ハイブリドーマ細胞を作り出す。融合パートナーには、これに限定されないが、マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０が含まれ、Ｓｐ２／０が好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞を、約３０％〜約５０％の濃度の分子量約１０００のポリエチレングリコール中で融合させる。融合したハイブリドーマ細胞を、添加ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン中での生育によって、当該技術分野において公知の手順により選択する。上清液を、およそ第１４、１８および２１日に生育陽性ウェルから回収し、そして、ＬＭＰを抗原として用いる固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）などのイムノアッセイにより、抗体産生に関してスクリーニングする。培養液は、ｍＡｂのアイソタイプを決定するためのオクタロニー沈降アッセイでも試験する。抗体陽性ウェルから得たハイブリドーマ細胞を、MacPherson, "Soft Agar Techniques", Tissue Culture Methods and Applications, KruseおよびPaterson（編集）、アカデミックプレス(1973年)の軟寒天技術などの技術によって、クローニングする。Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual, コールドスプリング研究所(1988年)もまた参照されたい。
【００８１】
プリスタンで抗原刺激したＢａｌｂ／ｃマウスに、抗原刺激後約４日に、約２ｘ１０６〜約６ｘ１０６ハイブリドーマ細胞を各マウスにつきおよそ０．５ｍｌ注射することによって、モノクローナル抗体をｉｎ  ｖｉｖｏでも産生させてもよい。腹腔液を、細胞移行後およそ８〜１２日に回収し、そして、モノクローナル抗体を当該技術分野において公知の方法により精製する。
【００８２】
十分な量の特異的ｍＡｂを得るために、抗ＬＭＰ  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生を、ハイブリドーマ細胞株を約２％胎性仔ウシ血清含有ＤＭＥＭ中で生育させることによって実施する。該ｍＡｂは、当該技術分野で公知の技術により精製する。
【００８３】
腹腔液またはハイブリドーマ培養液の抗体価を、これに限定されないが、沈降、受身凝集反応、酵素結合免疫吸着抗体（ＥＬＩＳＡ）技術およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術を含む、種々の血清学的もしくは免疫学的アッセイによって測定する。同様なアッセイは、体液もしくは組織および細胞抽出物におけるＬＭＰの存在を検出するために用いられる。
【００８４】
単一特異性抗体を産生するための上述の方法を、ＬＭＰのポリペプチドフラグメント、完全長の新生ＬＭＰポリペプチド、またはそのバリアントもしくはアレルに特異的な抗体を産生するために利用してもよいことは、当業者に容易に明らかである。
【００８５】
1997年7月22日に、ｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰと称されるベクター内１０−４／ＲＬＭＰの試料（挿入断片１０−４クローン／ＲＬＭＰを伴うベクターｐＲｃ／ＣＭＶ２である）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852に寄託した。この寄託に対するカルチャー・アクセッション番号は、２０９１５３である。1998年3月19日に、挿入断片ＨＬＰＭ−１を伴うベクターｐＨｉｓ−Ａの試料を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託した。この寄託に対するカルチャー・アクセッション番号は、２０９６９８である。ブタペスト条約の要件下で行われたこの寄託は、少なくとも３０年間、ＡＴＣＣにおいて維持され、かつ、それらを開示する特許の許諾に基づいて公開されることになるであろう。寄託が利用可能であることは、政府の決定により許諾される特許権の侵害において、本件発明を実施する許可を構成しないことが、理解されるべきである。
【００８６】
本発明の核酸、タンパク質または抗体の評価において、酵素アッセイ、タンパク質精製および他の慣用の生化学的方法が使用される。ＤＮＡおよびＲＮＡは、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング技術によって、それぞれ解析される。典型的には、解析される試料は、ゲル電気泳動によってサイズ分画される。次いで、ゲル中のＤＮＡまたはＲＮＡを、ニトロセルロースもしくはナイロン膜に移行させる。次いで、ゲルにおける試料パターンのレプリカであるブロットに、プローブをハイブリダイズさせる。プローブを当業者に公知の他のシグナル作出分子で標識することは可能ではあるが、典型的には、プローブは、好ましくは３２Ｐで、放射標識される。次いで、目的とする特定のバンドを、オートラジオグラフィなどの検出システムによって視覚化することが可能である。本発明の好ましい実施態様を例示する目的で、以下の非限定的な実施例が含まれる。これらの結果は、本発明のＬＩＭ石灰化タンパク質、およびこれらのタンパク質をコードする単離された核酸分子を用いて、骨形成の誘導または増強を実行可能であることを、実証している。
【実施例】
【００８７】
（実施例１）
材料−Ｃ２Ｃ１２細胞およびダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、ＡＴＣＣ（マナサス、バージニア州）から購入した。胎性ウシ血清は、アトランタ・バイオロジカルズ社（アトランタ、ジョージア州）から得た。リポフェクタミン、オプティ−ＭＥＭ、ＮｕＰＡＧＥ（商標）４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ・ゲルおよび二フッ素化ポリビニルピロリデン膜は、インビトロジェン社（カールスバッド、カリフォルニア州）から購入した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイキットは、シグマ・アルドリッチ社（セントルイス、ミズーリ州）から得た。バイオ・ラッド・タンパク質アッセイキットは、バイオ・ラッド・ラボラトリー（ハーキュリーズ、カリフォルニア州）から得た。セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ならびにウエスタン発光試薬ＡおよびＢは、パーキンエルマー・ライフサイエンス社（ボストン、マサチューセッツ州）から購入した。ＲＮｅａｓｙミニキットおよびＤＮＡｓｅ  １は、キアゲンＩｎｃ．（バレンシア、カリフォルニア州）から得た。逆転写試薬およびＳＹＢＲグリーン・リアルタイムＰＣＲキットは、アプライド・バイオシステムズ社（フォスターシティ、カリフォルニア州）から購入した。
【００８８】
（実施例２）
細胞培養−第３もしくは第４代のＣ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア州）を、Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ（コーニングＩｎｃ．、コーニング、ニューヨーク州）内で、１０％ウシ胎仔血清（アトランタ・バイオロジカルズ社、アトランタ、ジョージア州）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア州）中で、加湿された５％ＣＯ２中で３７℃にて継代培養した。フラスコが８０％コンフルエントとなったときに、細胞をトリプシン処理し、そして２００,０００細胞／ウェル（２ｘ１０４細胞／ｃｍ２）にて６ウェルプレートに移した。
【００８９】
（実施例３）
Ａｄ５−ｈＬＭＰ１(ｔ)−ＧＦＰの構築−Ａｄ５−ｈＬＭＰ１(ｔ)の構築手順は、先に記載した。Ａｄ５−ｈＬＭＰ１(ｔ)−ＧＦＰを調製するために、我々は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の下流にＧＦＰ  ｃＤＮＡを含有するシャトルベクター（キュー・バイオジーン社、モントリオール、ケベック州、カナダ）を用いた。切断型ヒトＬＭＰ−１を、ＩＲＥＳの上流に位置するマルチプル・クローニング・サイト内にクローニングした。線状化したトランスファープラスミドとアデノウイルスゲノムとの相同領域間で、組換えが２９３細胞内で生じた結果、完全なアデノウイルス組換え体（Ａｄ５−ＬＭＰ−１(ｔ)−ＧＦＰ）が形成された。組換えアデノウイルスを選択し、さらに増幅し、そして塩化セシウム勾配遠心分離によって精製し、そしてプラークアッセイによって力価測定した。ウイルス力価は、９ｘ１０９ｐｆｕ／ｍｌであった。
【００９０】
（実施例４）
ＬＭＰ−１／ＬＭＰ−１(ｔ)と相互作用するタンパク質を検出するためのビオチン移行アッセイ−三官能性の架橋剤であるＳｕｌｆｏ−ＳＢＥＤ（ピアス社、ロックフォード、イリノイ州）は、三つの官能基（光で活性化可能なアリールアジド、切断可能なジスルフィド基を伴うスルホン化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル、およびビオチン部分）を含有し、かつ、相互作用するタンパク質を同定するために広く用いられている。ＬＭＰ−１またはＬＭＰ−１(ｔ)を、この試薬を用いて標識し、ベイトとして核タンパク質とインキュベートし、そして、ＵＶ（３６５ｎｍ）により相互作用するタンパク質と架橋した。ＬＭＰ−１またはＬＭＰ−１(ｔ)と物理学的に相互作用するタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元バッファー中に懸濁するとき、ビオチン基を保持する。ビオチンを含有する標的タンパク質を、ニュートラアビジン（neutravadin）ビーズを用いて分離し、ウエスタンブロットによってニュートラアビジン−ＨＲＰで検出し、そして、シグナルを化学発光基質で発色させた。対応するタンパク質のバンドはゲル内でトリプシンで消化した。トリプシンペプチドを回収し、濃縮し、そして、そのトリプシンペプチドのマスプロファイルを、エモリー大学微量化学施設（Microchemical Facility）でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって解析した。
【００９１】
（実施例５）
一時的なＡｄ５−ｈＬＭＰ１(ｔ)−ＧＦＰおよびＡｄ５−ＧＦＰの形質導入および形態学的観察−Ｃ２Ｃ１２細胞を６ウェルプレート（２００,０００細胞／ウェル）で継代培養した１日後に、細胞を、アデノウイルス形質導入効率を促進するために、各ウェルにつき５００μｌオプティ−ＭＥＭ中のリポフェクタミン（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）で４時間処理した。次いで、それらにＡｄ５−ｈＬＭＰ１(ｔ)−ＧＦＰまたはＡｄ５−ＧＦＰ（対照として）を、３００μｌのオプティ−ＭＥＭ（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）中で３０分間形質導入した。形質導入後に、オプティ−ＭＥＭを加えて２ｍｌ／ウェルとし、そして、細胞を３７℃にてインキュベートした。２日後に、培地を１０％ウシ胎仔血清添加ＤＭＥＭに替え、そして、細胞をさらに２日間分化させた。１０〜５００ｐｆｕ／細胞の範囲にわたる用量／反応実験を行い、そして、細胞または全ＲＮＡを回収して、形質導入効率をフローサイトメトリーにより測定するか、あるいは最大限のＬＭＰ−１発現をもたらすＡｄ５−ｈＬＭＰ１(ｔ)−ＧＦＰの用量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。これらの実験結果に基づき、それに続く試験において、１００ｐｆｕ／細胞を培地に適用した。このような各試験において、一つのウェルから、細胞を第４日にｍＲＮＡ解析のため回収し；別の二つの並列のウェルからは、細胞をアルカリホスファターゼ活性およびタンパク質解析のため回収した。細胞を回収する前に、細胞形態を位相差顕微鏡下で観察し、そして写真撮影した。
【００９２】
（実施例６）
アルカリホスファターゼ活性およびタンパク質アッセイ−氷冷リン酸緩衝生理食塩液で２回洗浄した後、細胞を、溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５％トリトンＸ−１００）中で超音波処理することによって溶解させた。細胞溶解物を遠心分離し、そして、上清をアルカリホスファターゼ活性およびタンパク質レベルの解析のために単離した。細胞溶解物中のアルカリホスファターゼ活性は、シグマＡＬＰアッセイキット（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）を用いて測定した。タンパク質含量は、バイオ・ラッド・タンパク質アッセイキット（バイオ・ラッド・ラボラトリー、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を用いて、ＢＳＡの標準曲線を用いて測定した。アルカリホスファターゼ活性およびタンパク質含量はトリプリケートで測定し、そして、アルカリホスファターゼ活性を、タンパク質含量を基準に正規化した。
【００９３】
（実施例７）
切断型ヒトＬＭＰ−１過剰発現のウエスタンブロット解析−形質導入されたＣ２Ｃ１２細胞における切断型ヒトＬＭＰ−１タンパク質の存在を実証するため、アルカリホスファターゼ測定用に調製した細胞溶解物（一試料につき２０μｇ）を、ＮｕＰＡＧＥ（商標）４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ・ゲル（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）上で分離し、そして、二フッ化ポリビニリデン膜（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）上に移行させた。膜を、まず５％ミルクで１時間ブロッキングし、そして次いで、アフィニティ精製ウサギ抗ＬＭＰ１抗体（１：２５００希釈）および二次抗体（セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ、１：５,０００希釈、パーキンエルマー・ライフサイエンス社、ボストン、マサチューセッツ州）でそれぞれ１時間、室温にてインキュベートした。次いで、シグナルを、化学発光基質（ウエスタン発光試薬ＡおよびＢ混合物；パーキンエルマー・ライフサイエンス社、ボストン、マサチューセッツ州）を用いて発色させた。
【００９４】
（実施例８）
遺伝子発現の定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ測定−ＲＮＡおよびｃＤＮＡ調製：各試料から得た全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキットを用いて、動物細胞から全ＲＮＡを単離するためのＲＮｅａｓｙミニのプロトコールにしたがい抽出した（キアゲンＩｎｃ．、バレンシア、カリフォルニア州）。単離されたＲＮＡを、ＤＮＡｓｅ１（キアゲンＩｎｃ．、バレンシア、カリフォルニア州）で処理して、試料からＤＮＡ混入を除去した。単離されたＲＮＡの濃度を、２６０ｎｍ波長にて分光光度法により測定し、そして、タンパク質混入を２８０ｎｍ波長にて測定した(ＤＵ−５００；ベックマン社、Fullerton、カリフォルニア州)。２６０／２８０の比率は、１．６〜１．８の間であった。逆転写を、全ＲＮＡ  １μｇ、１０ｘＲＴバッファー１０μＬ、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、０．２５μＭオリゴｄ(Ｔ)、０．２５μＭランダムプライマー、４０Ｕ  ＲＮａｓｅ阻害剤および１２５Ｕ  ＭｕＬＶ逆転写酵素（アプライド・バイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）を伴う１００μＬ量中で、２５℃にて１０分間、４８℃にて３０分間および９５℃にて５分間、行った。ＤＮＡ混入のないことを確認するため、逆転写酵素を行っていないＲＮＡ試料もＰＣＲにかけた。ＰＣＲ産物がないことで、ＲＮＡ試料中にＤＮＡが混入していないことが確認された。
【００９５】
定量的リアルタイムＰＣＲ：ＳＹＢＲグリーン・リアルタイムＰＣＲキット（アプライド・バイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）を、Ａｄ５−ｈＬＭＰ１(ｔ)−ＧＦＰ、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７および１８Ｓ（正規化用）のｃＤＮＡ発現を定量するために用いた。２５μｌの反応量には、ｃＤＮＡ  ５μｌ、各プライマー５ｐｍｏｌ、および２ｘＳＹＢＲグリーンマスターミックス（アプライド・バイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）１２．５μｌが含まれた。プライマー配列を、表１に列挙する。リアルタイムＰＣＲを、以下の三工程のプロトコールを用いて行った：Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ５７００配列検出システム（アプライド・バイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いて、工程１、５０℃にて２分間；工程２、９５℃にて１０分間；および、工程３（９５℃にて１５秒間、６２℃にて１分間）を４０サイクル。増幅特異性を確認するために、ＰＣＲ産物を解離曲線解析にかけた。各反応の閾値サイクル（Ｃｔ）を、すでに記載されたように、比較ΔΔＣｔ法を用いて、１８Ｓ  ＲＮＡについて得られたものを基準に正規化した。すべてのＰＣＲ反応を、トリプリケートで行った。
【００９６】
統計解析
両側スチューデントｔ検定を、処理群を対照と比較するために用いた。０．０５未満のｐ値を、統計学的有意差を定義するために用いた。
【００９７】
（実施例９）
頭蓋冠細胞培養−ラット骨芽細胞（「ＲＯＢ」）としても公知のラット頭蓋冠細胞を、すでに記載されたように、分娩前２０日のラットから得た。Bodenら、Endocrinology, 137(8):3401-07 (1996年)。初代培養物を、コンフルエンスとなるまで生育させ（７日間）、トリプシン処理し、そして、最初の継代培養細胞として６ウェルプレートに移した（１Ｘ１０５細胞／３５ｍｍウェル）。第０日にコンフルエントであった継代培養細胞を、さらに７日間生育させた。第０日より層流フード下で３もしくは４日毎に、培地を変え、そして処理（Ｔｒｍおよび／またはＢＭＰ）を適用した。標準的な培養プロトコールは、以下のとおりであった：第１〜７日、ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、±刺激；第８〜１４日、ＢＧＪｂ培地、１０％ＦＢＳ、５ｍＭ  β−ＧｌｙＰ（石灰化を可能にするための無機リン酸塩源として）。骨小結節形成およびオステオカルシン分泌のエンドポイント解析を、第１４日に行った。ＢＭＰの用量を、本系におけるパイロット実験に基づき、試験したすべてのＢＭＰに関する用量−反応曲線に対して中程度の効果を示した５０ｎｇ／ｍｌとして選択した。
【００９８】
（実施例１０）
アンチセンス処理および細胞培養−膜性骨形成時におけるＬＭＰ−１の潜在的な機能的役割を探求するため、我々は、ＬＭＰ−１  ｍＲＮＡの翻訳をブロックするアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成し、そして、糖質コルチコイドによって始動される分化を起こしている二次骨芽細胞培養物を処理した。ＲＬＭＰ発現の阻害を、推定翻訳開始部位（配列番号３５）にわたる２５ｂｐ配列に対応する高特異性のアンチセンスオリゴヌクレオチド（公知のラット配列と有意な相同性を持たない）を用いて、成し遂げた。対照培養物には、オリゴヌクレオチドを与えなかったか、あるいは、それらにセンスオリゴヌクレオチドを与えた。実験は、リポフェクタミンの存在下（プレインキュベーション）および非存在下で行った。簡潔には、２２μｇのセンスもしくはアンチセンスＲＬＭＰオリゴヌクレオチドを、ＭＥＭ中で４５分間、室温にてインキュベートした。このインキュベーション後に、さらなるＭＥＭまたはプレインキュベートしたリポフェクタミン／ＭＥＭ（７％  ｖ／ｖ；室温にて４５分間インキュベート）を、オリゴヌクレオチド濃度が０．２μＭに達するよう加えた。その結果生じた混合物を、室温にて１５分間インキュベートした。次いで、オリゴヌクレオチド混合物を、適切な培地、すなわちＭＥＭ／アスコルビン酸塩／±Ｔｒｍと、最終オリゴヌクレオチド濃度が０．１μＭに達するよう混合した。
【００９９】
細胞を、適切なオリゴヌクレオチドの存在下または非存在下で、適切な培地（±刺激）でインキュベートした。最初にリポフェクタミンとインキュベートした培養物に、４時間インキュベート（３７℃；５％ＣＯ２）した後、リポフェクタミンもオリゴヌクレオチドも含有しない培地を再供給した。すべての培養物、特にオリゴヌクレオチドを与えられた培養物に、オリゴヌクレオチドレベルを維持するために、２４時間ごとに再供給した。
【０１００】
ＬＭＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＭＰ−６オリゴヌクレオチドの効果と同様に、石灰化小結節形成およびオステオカルシン分泌を、用量依存的に阻害した。骨芽細胞分化におけるＬＭＰ−１アンチセンスのブロックは、外因性ＢＭＰ−６の添加によってレスキューできなかったが、ＢＭＰ−６アンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害は、ＢＭＰ−６の添加により元に戻った。この実験により、骨芽細胞の分化経路において、ＬＭＰ−１がＢＭＰ−６と比べて上流に位置することが、さらに確認された。ＬＭＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、初代ラット骨芽細胞培養物において、自発的な骨芽細胞分化を阻害した。
【０１０１】
（実施例１１）
石灰化骨小結節形成の定量
実施例９および１０にしたがって調製されたＲＯＢの培養物を、７０％エタノール中で一晩固定し、そして、フォン・コッサ銀染色により染色した。半自動コンピューター制御ビデオ画像解析システムを用いて、各ウェルにおける小結節数および小結節面積を定量した。Bodenら、Endocrinology, 137(8):3401-07 (1996年)。次いで、これらの値を除して、小結節あたりの面積値を計算した。この自動化された過程を、手動の計数技術に対して検証し、そして、０．９２の相関係数（ｐ＜０．０００００１）が示された。すべてのデータは、各条件における５もしくは６ウェルから計算された、平均±平均の標準誤差（Ｓ.Ｅ.Ｍ.）として表す。各実験は、異なる頭蓋冠調製物から得た細胞を用いて、少なくとも２回確認した。
【０１０２】
（実施例１２）
オステオカルシン分泌の定量−培養培地中のオステオカルシンレベルを、Nanesら、Endocrinology, 127:588 (1990年)に記載されるように、我々の研究所で産生させたラットオステオカルシンのＣ末端ノナペプチドに対する単特異性ポリクローナル抗体（Ｐａｂ）を用いて、競合ラジオイムノアッセイを用いて測定した。簡潔には、１μｇのノナペプチドを、ラクトペルオキシダーゼ法により、１ｍＭ  Ｃｉ  １２５Ｉ−Ｎａでヨウ素化した。２００μｌのアッセイバッファー（０．０２Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００１％チメロサール、０．０２５％ＢＳＡ）を含有するチューブに、細胞培養物から得た培地またはオステオカルシン標準品（０〜１２,０００ｆｍｏｌｅ）を、アッセイバッファー中１００μｌ／チューブで与えた。次いで、Ｐａｂ（１：４０,０００；１００μｌ）を加え、続いて、ヨウ素化したペプチド（１２,０００ｃｐｍ；１００μｌ）を加えた。非特異的結合について試験する試料を、同様に調製したが、ただし抗体は含有しなかった。結合もしくは遊離しているＰａｂを、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  ７００μｌを加え、続いて４℃にて１８時間インキュベートすることによって、分離した。試料を１２００ｒｐｍで４５分間遠心分離した後、上清をデカントし、そして、ガンマ計数器で沈殿物を計数した。オステオカルシン値を、ｆｍｏｌｅ／１００μｌで報告し、次いで、これらの値を１００で除することによりｐｍｏｌｅ／ｍｌ培地（３日産生）に変換した。値は、各条件について５もしくは６ウェルでのトリプリケートの測定の平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.として表した。各実験を、異なる頭蓋冠調製物から得た細胞を用いて、少なくとも２回確認した。
【０１０３】
（実施例１３）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ石灰化に対するＴｒｍおよびＲＬＭＰの効果−センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドはいずれも、非刺激細胞培養系における骨小結節の全体的な産生に対して、明白な効果がほとんどなかった。しかしながら、ＲＯＢをＴｒｍで刺激すると、ＲＬＭＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、小結節の石灰化を＞９５％阻害した。外因性ＢＭＰ−６のオリゴヌクレオチド処理培養物への添加は、ＲＬＭＰ−アンチセンス処理小結節の石灰化をレスキューしなかった。
【０１０４】
オステオカルシンは、長い間、骨石灰化と同義であり、かつ、オステオカルシンレベルは、小結節の生成および石灰化と相関している。ＲＬＭＰ−アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オステオカルシン産生を有意に減少させるが、しかし、アンチセンス処理培養物中の小結節数は、有意に変化しない。この場合、外因性ＢＭＰ−６の添加のみが、ＲＬＭＰ−アンチセンス処理培養物におけるオステオカルシン産生を、１０〜１５％レスキューした。このことは、ＲＬＭＰの作用が、より具体的には、ＢＭＰ−６の下流にあり、かつＢＭＰ−６よりも特異的であることを、示唆している。
【０１０５】
（実施例１４）
ＲＮＡの回収および精製−４Ｍグアニジン・イソチオシアネート（ＧＩＴ）溶液を用いてＲＯＢのデュプリケートウェルから得た細胞ＲＮＡ（６ウェル培養皿中で、実施例９および１０にしたがって調製）を回収して、統計上のトリプリケートを得た。簡潔には、培養上清をウェルから吸引し、次いで、デュプリケートウェル回収につき０．６ｍｌのＧＩＴ溶液を重ねた。ＧＩＴ溶液を加えた後、プレートを５〜１０秒間旋回させた。試料を、さらなる処理の前に−７０℃にて、７日間まで保存した。
【０１０６】
ＲＮＡを、Sambrookら、Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 第２版、第7.19章、コールドスプリングハーバー・プレス(1989年)に記載の標準的な方法のわずかな修飾により、精製した。簡潔には、解凍した試料に、２．０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）６０μｌ、フェノール（水で飽和）５５０μｌおよびクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）１５０μｌを与えた。ボルテックスした後、試料を遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分間；４℃）、水相を新しいチューブに移し、イソプロパノール６００μｌを加え、そして、ＲＮＡを−２０℃にて一晩沈殿させた。
【０１０７】
一晩インキュベートした後に、試料を遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分間）、そして、上清を穏やかに吸引した。ペレットを４００μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁し、フェノール：クロロホルム（１：１）で１回抽出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、そして、酢酸ナトリウム（３．０Ｍ；ｐＨ５．２）４０μｌおよび無水エタノール１．０ｍｌを加えた後に、−２０℃にて一晩沈殿させた。細胞ＲＮＡを回収するために、試料を遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分間）、７０％エタノールで１回洗浄し、５〜１０分間空気乾燥させ、そして、２０μｌのＤＥＰＣ処理水中に再懸濁した。ＲＮＡ濃度を、分光光度計を用いて測定された光学密度から計算した。
【０１０８】
（実施例１５）
逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応
加熱した全ＲＮＡ（総量１０．５μｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ中５μｇ、６５℃にて５分間）を、５ｘＭＭＬＶ−ＲＴバッファー４μｌ、ｄＮＴＰ  ２μｌ、ｄＴ１７プライマー（１０ｐｍｏｌ／ｍｌ）２μｌ、ＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／ｍｌ）０．５μｌおよびＭＭＬＶ−ＲＴ（２００単位／μｌ）１μｌを含有するチューブに加えた。試料を３７℃にて１時間、次いで９５℃にて５分間インキュベートして、ＭＭＬＶ−ＲＴを不活化した。試料を、８０μｌの水を加えることにより希釈した。
【０１０９】
逆転写した試料（５μｌ）を、標準的な方法論を用いてポリメラーゼ連鎖反応にかけた（総量５０μｌ）。簡潔には、水と適量のＰＣＲバッファー、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ、ハウスキーピング遺伝子）および／もしくはＢＭＰ−６用の順方向および逆方向プライマー、３２Ｐ−ｄＣＴＰならびにＴａｑポリメラーゼを含有するチューブに、試料を加えた。特に明記しない限り、プライマーは、２２サイクル（９４℃、３０秒；５８℃、３０秒；７２℃、２０秒）で一貫して行われるように標準化した。
【０１１０】
（実施例１６）
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびホスホイメージャー解析によるＲＴ−ＰＣＲ産物の定量−ＲＴ−ＰＣＲ産物に５μｌ／チューブのローディング色素を与え、混合し、６５℃にて１０分間加熱し、そして遠心分離した。１０μｌの各反応物を、標準的な条件下でＰＡＧＥ（１２％ポリアクリルアミド：ビス；１５Ｖ／ウェル；一定電流）にかけた。次いで、ゲルを、ゲル保存バッファー（１０％  ｖ／ｖグリセロール、７％  ｖ／ｖ酢酸、４０％  ｖ／ｖメタノール、４３％脱イオン水）中で３０分間インキュベートし、真空下で１〜２時間乾燥させ（８０℃）、そして、電子的増強リン光造影システムにより、６〜２４時間発色させた。可視化されたバンドを解析した。バンド当たりの計数を、グラフにプロットした。
【０１１１】
（実施例１７）
ディファレンシャルディスプレイＰＣＲ−ＲＮＡを、糖質コルチコイド（Ｔｒｍ、１ｎＭ）で刺激した細胞から抽出した。加熱した、ＤＮａｓｅ処理した全ＲＮＡ（総量１０．５μｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ中５μｇ、６５℃にて５分間）を、実施例７に記載のように逆転写したが、ただし、Ｈ−Ｔ１１Ｍ（配列番号４）をＭＭＬＶ−ＲＴプライマーとして用いた。得られたｃＤＮＡを、上述のようにＰＣＲ増幅したが、ただし、種々の市販のプライマーセット（例えば、Ｈ−Ｔ１１Ｇ（配列番号４）およびＨ−ＡＰ−１０（配列番号５）；ジェンハンター・コープ社、ナッシュビル、テネシー州）を用いた。放射標識されたＰＣＲ産物を、ＤＮＡ配列決定ゲル上で、ゲル電気泳動により分画した。電気泳動後に、得られたゲルを真空乾燥し、そして、オートラジオグラフを一晩露出した。差次的に発現されたｃＤＮＡを表すバンドをゲルから切り取り、そして、Connerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:278 (1983年)の方法を用いたＰＣＲにより再増幅した。ＰＣＲ再増幅の産物を、ベクターＰＣＲ−ＩＩ（ＴＡクローニングキット；インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）内にクローニングした。
【０１１２】
（実施例１８）
ＵＭＲ１０６ラット骨肉腫細胞ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング−ＵＭＲ１０６ライブラリ（２．５ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌ）を、寒天プレート（ＬＢ下層寒天）上に５Ｘ１０４ｐｆｕ／ｍｌで蒔き、そして、プレートを３７℃にて一晩インキュベートした。フィルター膜をプレートの上に２分間重ねた。取り出してすぐに、フィルターを変性させ、リンスし、乾燥し、そして紫外線架橋した。次いで、フィルターをプレハイブリダイゼーションバッファー（２Ｘ ＰＩＰＥＳ［ｐＨ６．５］、５％ホルムアミド、１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）中で、４２℃にて２時間インキュベートした。２６０塩基対の放射標識プローブ（配列番号３；ランダムプライミングによる３２Ｐ標識）を、ハイブリダイゼーションミックス／フィルター全体に加え、続いて、４２℃にて１８時間ハイブリダイズさせた。膜を、室温にて１回（１０分間、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、および５５℃にて３回（１５分間、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）洗浄した。
【０１１３】
それらを洗浄した後、膜を、上述のようにオートラジオグラフィーによって解析した。陽性クローンをプラーク精製した。偽陽性を最小限にするため、該手順を、第二のフィルターを用いて４分間繰り返した。プラーク精製したクローンを、ラムダＳＫ(−)ファージミドとしてレスキューした。クローニングしたｃＤＮＡを、以下に記載のように配列決定した。
【０１１４】
（実施例１９）
クローンの配列決定−クローニングしたｃＤＮＡインサートを、標準的な方法によって配列決定した。Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Wiley lnterscience (1988年)。簡潔には、適切な濃度の終止混合物、鋳型および反応混合物を、適切なサイクリングプロトコール（９５℃、３０秒；６８℃、３０秒；７２℃、６０秒；ｘ２５）にかけた。停止混合物を加えて、配列決定反応を終止させた。９２℃で３分間加熱した後、試料を、変性６％ポリアクリルアミド配列決定ゲル（29：1、アクリルアミド：ビス−アクリルアミド）に載せた。試料を、６０ボルトにて約４時間、定電流で電気泳動した。電気泳動後、ゲルを真空乾燥させ、そしてオートラジオグラフ処理した。
【０１１５】
オートラジオグラフは、手動で解析した。得られた配列について、デフォルトのパラメータに設定したＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＩＨ，ベセスダ、メリーランド州；http://www.ncbi.nim.nih.go- vl）によって維持されるデータベースをスクリーニングした。配列データに基づいて、新たな配列決定プライマーを調製し、そして、全遺伝子が配列決定されるまで、該過程を繰り返した。すべての配列を、双方の配向で最低３回は確認した。
【０１１６】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列もまた、ＰＣＧＥＮＥソフトウェアパッケージ（第１６．０版）を用いて解析した。ヌクレオチド配列に対する相同百分率値を、プログラムＮＡＬＩＧＮにより、以下のパラメータ：非一致ヌクレオチドの重み、１０；非一致ギャップの重み、１０；考えられるヌクレオチドの最大数、５０；および、考えられるヌクレオチドの最小数、５０を用いて計算した。アミノ酸配列に関しては、相同性パーセント値を、ＰＡＬＩＧＮを用いて計算した。オープンギャップコストとユニットギャップコストの双方について、１０の値を選択した。
【０１１７】
（実施例２０）
ＲＬＭＰ  ｃＤＮＡのクローニング−実施例１７に記載したディファレンシャルディスプレイＰＣＲ増幅産物は、およそ２６０塩基対の主要なバンドを含有した。この配列を用いて、ラット骨肉腫（ＵＭＲ  １０６）ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした。陽性クローンをネステッドプライマー解析にかけて、完全長ｃＤＮＡの増幅に必要なプライマー配列（配列番号１１、１２、２９、３０および３１）を得た。さらなる試験に向けて選択したそれらの陽性クローンの一つを、クローン１０−４と命名した。
【０１１８】
ネステッドプライマー解析により決定されたクローン１０−４の完全長ｃＤＮＡの配列解析は、クローン１０−４が、ディファレンシャルディスプレイＰＣＲによって同定された元の２６０塩基対フラグメントを含有していることを示した。クローン１０−４（１６９６塩基対；配列番号２）は、４５７アミノ酸（配列番号１）を有するタンパク質をコードする１３７１塩基対のオープンリーディングフレームを含有した。終止コドンであるＴＧＡは、ヌクレオチド１４４４〜１４４６に生じた。ヌクレオチド１６７５〜１６８０のポリアデニル化シグナル、および隣接するポリ（Ａ）＋テイルは、３’非コード領域に存在した。二つの潜在的なＮ−グリコシル化部位Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ＴｈｒおよびＡｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒは、配列番号１のアミノ酸位置１１３〜１１６および２５７〜２５９にあった。二つの潜在的なｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位ＳｅｒおよびＴｈｒは、アミノ酸位置１９１および３４９にそれぞれ見いだされた。五つの潜在的なプロテインキナーゼＣリン酸化部位ＳｅｒまたはＴｈｒは、アミノ酸位置３、１１５、１６６、２１９、４４２にあった。一つの潜在的なＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位モチーフＡ（Ｐ−ループ）であるＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒが、アミノ酸位置２７２〜２７９に決定された。
【０１１９】
加えて、二つの高度に保存された推定されるＬＩＭドメインが、アミノ酸位置３４１〜３９１および４００〜４５１に見いだされた。この新規に同定されたラットｃＤＮＡクローンにおける推定されるＬＩＭドメインは、他の公知のＬＩＭタンパク質のＬＩＭドメインとかなりの相同性を示した。しかしながら、他のラットＬＩＭタンパク質との全体的な相同性は、２５％未満であった。ＲＬＭＰ（１０−４とも称される）は、ヒトエニグマタンパク質と７８．５％相同であったが（米国特許第5,504,192を参照されたい）、しかし、それと最も近いラットホモログＣＬＰ−３６およびＲＩＴ−１８とは、それぞれ２４．５％および２２．７％しか相同でなかった。
【０１２０】
（実施例２１）
ＲＬＭＰ発現のノーザンブロット解析−実施例１７および１８にしたがって調製した、ＲＯＢ由来全ＲＮＡ  ３０μｇを、１％アガロースフラットベッドゲル中でホルムアルデヒドゲル電気泳動によってサイズ分画し、そして、浸透圧によりナイロン膜にトランスブロットした。ブロットを、ランダムプライミングにより３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した完全長１０−４  ｃＤＮＡの６００塩基対のＥｃｏＲ１フラグメントでプローブした。
【０１２１】
ノーザンブロット解析は、ＲＬＭＰプローブとハイブリダイズする１．７ｋｂ  ｍＲＮＡ種を示した。ＲＬＭＰ  ｍＲＮＡは、ＢＭＰ−６に曝露後２４時間に、ＲＯＢにおいておよそ３．７倍亢進した。ＲＭＬＰの発現亢進は、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ４で刺激したＲＯＢにおいては、２４時間後に見られなかった。
【０１２２】
（実施例２２）
統計学的方法−報告された各小結節／オステオカルシンの結果に関して、代表的な実験から得た５〜６ウェルからのデータを用いて、平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.を計算した。グラフを、各パラメータについての最大値を基準に正規化したデータにより示して、小結節数、石灰化面積およびオステオカルシンを同時グラフ化させてもよい。
【０１２３】
それぞれ報告されたＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイまたはウエスタンブロット解析に関して、代表的な実験のトリプリケートの試料から得たデータを用いて、平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.を決定した。グラフを、第０日または陰性対照のいずれかを基準に正規化し、かつ対照値を超える倍増加として表して、示してもよい。統計学的有意性は、必要に応じてボンフェローニのポストホック多重比較補正を用いた、一元配置分散分析を用いて評価した。D. V. Huntsberger、「The Analysis of Variance」、Elements of Statistical Variance, P. Billingsley (編), 298-330ページ, Allyn & Bacon Inc., ボストン、マサチューセッツ州 (1977年)、およびシグマスタット、 ジャンデル・サイエンティフィック社、コルテマデラ、カリフォルニア州。有意性に関するアルファ水準は、ｐ＜０．０５と定義した。
【０１２４】
（実施例２３）
ウエスタンブロット解析によるラットＬＩＭ石灰化タンパク質の検出−ポリクローナル抗体を、Englandら、Biochim. Biophys. Acta, 623:171 (1980年)、およびTimmerら、J. Biol. Chem., 268:24863 (1993年)の方法にしたがって調製した。
【０１２５】
ＨｅＬａ細胞に、ｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰをトランスフェクトした。タンパク質を、Hairら、Leukemia Research, 20:1 (1996年)の方法にしたがって、トランスフェクトした細胞から回収した。天然ＲＬＭＰのウエスタンブロット解析を、Towbinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350 (1979年)に記載のように行った。
【０１２６】
（実施例２４）
ラットＬＭＰ−ユニーク（ＲＬＭＰＵ）由来ヒトＰＣＲ産物の合成−ラットＬＭＰ−１  ｃＤＮＡの配列に基づいて、順方向および逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号１５および１６）を合成し、そして、ユニークな２２３塩基対の配列を、ラットＬＭＰ−１  ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。類似するＰＣＲ産物を、ヒトＭＧ６３骨肉腫細胞のｃＤＮＡから、同じＰＣＲプライマーを用いて単離した。
【０１２７】
ＲＮＡを、Ｔ−７５フラスコ内で生育させたＭＧ６３骨肉腫細胞から回収した。培養上清を吸引によって取り除き、そして、フラスコにデュプリケートで３．０ｍｌのＧＩＴ溶液を重ね、５〜１０秒間旋回させ、そして、得られた溶液を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した（０．６ｍｌ／チューブで５チューブ）。ＲＮＡを、標準的な方法（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第7章、19ページ、コールドスプリングハーバー研究所プレス(1989年)、およびBodenら、Endocrinology, 138:2820-28 (1997年)を参照されたい）のわずかな修飾によって精製した。簡潔には、０．６ｍｌの試料に、２．０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）６０μｌ、水飽和フェノール５５０μｌおよびクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）１５０μｌを加えた。これらの試薬を加えた後、試料をボルテックスし、遠心分離し（１００００Ｘｇ；２０分間：４℃）、そして、水相を新しいチューブに移した。イソプロパノール（６００μｌ）を加え、そして、ＲＮＡを−２０℃にて一晩沈殿させた。試料を遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分間）、そして、上清を穏やかに吸引した。４００μｌのＤＥＰＣ処理水にペレットを再懸濁し、フェノール−クロロホルム（１：１）で１回抽出し、クロロホルム；イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、そして、酢酸ナトリウム（３．０Ｍ；ｐＨ５．２）４０μｌおよび無水エタノール１．０ｍｌ中で、−２０℃にて一晩沈殿させた。沈殿後に、試料を遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分間）、７０％エタノールで１回洗浄し、５〜１０分間空気乾燥させ、そして、２０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。ＲＮＡ濃度を、光学密度により得た。
【０１２８】
全ＲＮＡ（総量１０．５μｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ中５μｇ）を、６５℃で５分間加熱し、そして次いで、５ｘＭＭＬＶ−ＲＴバッファー４μｌ、ｄＮＴＰ  ２μｌ、ｄＴ１７プライマー（１０ｐｍｏｌ／ｍｌ）２μｌ、ＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／ｍｌ）０．５μｌおよびＭＭＬＶ−ＲＴ（２００単位／μｌ）１μｌを含有するチューブに加えた。反応物を、３７℃で１時間インキュベートした。その後、９５℃で５分間加熱することにより、ＭＭＬＶ−ＲＴを不活化した。試料を、８０μＬの水を加えることにより希釈した。
【０１２９】
転写された試料（５μｌ）を、標準的な方法論を用いてポリメラーゼ連鎖反応にかけた（総量５０μｌ）。Bodenら、Endocrinology, 138:2820-28 (1997年)；Ausubelら、「Quantitation of rare DNAs by the polymerase chain reaction」、Current Protocols in Molecular Biology, 第15.31-1章、ワイリー＆サンズ社、トレントン、ニュージャージー州(1990年)。簡潔には、試料を、水および適量のＰＣＲバッファー（２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、順方向および逆方向プライマー（ＲＬＭＰＵに関しては；配列番号１５および１６）、３２Ｐ−ｄＣＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼ）を含有するチューブに加えた。プライマーを、放射活性バンドの検出には２２サイクルで、そして、スクリーニングプローブとしての使用のためのＰＣＲ産物の増幅には３３サイクルで、一貫して実行するように設計した（９４℃、３０秒、５８℃、３０秒；７２℃、２０秒）。アガロースゲル精製したＭＧ６３骨肉腫由来ＰＣＲ産物の配列決定によって、配列がＲＬＭＰＵ  ＰＣＲ産物と９５％を超えて相同であることを得た。この配列を、ＨＬＭＰユニーク領域（ＨＬＭＰＵ；配列番号６）と命名する。
【０１３０】
（実施例２５）
逆転写酵素由来ＭＧ６３  ｃＤＮＡのスクリーニング−特定のプライマー（配列番号１６および１７）を用いたＰＣＲによって、実施例１５に記載のようにスクリーニングを行った。７１７塩基対のＭＧ６３  ＰＣＲ産物をアガロースゲル精製し、そして、所与のプライマー（配列番号１２、１５、１６、１７、１８、２７および２８）を用いて配列決定した。配列は、双方向において最低２回、確認した。ＭＧ６３配列を互いに、そして次いで、完全長ラットＬＭＰ  ｃＤＮＡ配列に対して並置して、部分的なヒトＬＭＰ  ｃＤＮＡ配列（配列番号７）を得た。
【０１３１】
（実施例２６）
ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング−ノーザンブロット実験に基づき、ＬＭＰ−１はヒト心筋を含む複数の異なる組織に異なるレベルで発現すると判断された。したがって、ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリを検証した。ライブラリを寒天プレート（ＬＢ下層寒天）上に５Ｘ１０４ｐｆｕ／ｍｌで蒔き、そして、プレートを３７℃にて一晩生育させた。フィルター膜をプレートの上に２分間重ねた。その後、フィルターを変性させ、リンスし、乾燥させ、紫外線架橋し、そして、プレハイブリダイゼーションバッファー（２Ｘ ＰＩＰＥＳ［ｐＨ６．５］；５％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）中で、４２℃にて２時間インキュベートした。放射標識したＬＭＰユニークの２２３塩基対プローブ（３２Ｐ、ランダムプライマー標識；配列番号６）を加え、そして、４２℃にて１８時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後に、膜を室温にて１回（１０分間、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、および５５℃にて３回（１５分間、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）洗浄した。オートラジオグラフィによって同定された、二重陽性のプラーク精製した心臓ライブラリクローンを、製造業者（ストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア州）のプロトコールにしたがい、ラムダファージミドとしてレスキューした。
【０１３２】
陽性クローンの制限消化により、様々なサイズのｃＤＮＡ挿入断片が得られた。６００塩基対長を超える挿入断片を、配列決定による初回スクリーニング用に選択した。これらの挿入断片を、実施例１９に記載の標準的な方法によって配列決定した。
【０１３３】
一つのクローンである７番もまた、配列番号１１〜１４、１６および２７に対応するプライマーを用いて、自動化された配列解析にかけた。これらの方法によって得られた配列は、定常的に９７〜１００％相同であった。クローン７（心臓ライブラリに由来する部分的ヒトＬＭＰ−１  ｃＤＮＡ；配列番号８）は、翻訳された領域においてラットＬＭＰ  ｃＤＮＡ配列と８７％を超えて相同である配列を含有した。
【０１３４】
（実施例２７）
完全長ヒトＬＭＰ−１  ｃＤＮＡの決定−
ＭＧ６３ヒト骨肉腫細胞ｃＤＮＡ配列とヒト心臓ｃＤＮＡクローン７配列との重複領域を用いて、これらの二つの配列を並置し、そして、１６４４塩基対の完全ヒトｃＤＮＡ配列を得た。ＰＣＧＥＮＥソフトウェアパッケージ中のプログラムＮＡＬＩＧＮを用いて、二つの配列を並置した。二つの配列の重複領域は、ＭＧ６３  ｃＤＮＡ（配列番号７）中のヌクレオチド６７２における、対応するヌクレオチド５１６においてＥＧＯの代わりに「Ａ」を有するクローン７（配列番号８）に対する、一つのヌクレオチド置換を除けば完全に相同である、およそ３６０塩基対を構成した。
【０１３５】
二つの並置した配列を、ＰＣＧＥＮＥの別の副プログラムであるＳＥＱＩＮを用い、ＭＧ６３骨肉腫ｃＤＮＡクローンの「Ｇ」置換を用いて、連結させた。得られた配列を、配列番号９に示す。新規ヒト由来配列とラットＬＭＰ−１  ｃＤＮＡとの並置を、ＮＡＬＩＧＮを用いて成し遂げた。完全長ヒトＬＭＰ−１  ｃＤＮＡ配列（配列番号９）は、ラットＬＭＰ−１  ｃＤＮＡ配列の翻訳部分と８７．３％相同である。 
【０１３６】
（実施例２８）
ヒトＬＭＰ−１のアミノ酸配列の決定−ヒトＬＭＰ−１の推定されるアミノ酸配列を、ＰＣＧＥＮＥの副プログラムＴＲＮＳＬを用いて決定した。配列番号９におけるオープンリーディングフレームは、４５７アミノ酸（配列番号１０）を含んでなるタンパク質をコードする。ＰＣＧＥＮＥの副プログラムＰａｌｉｇｎを用いて、ヒトＬＭＰ−１アミノ酸配列が、ラットＬＭＰ−１アミノ酸配列と９４．１％相同であることが見いだされた。
【０１３７】
（実施例２９）
ヒトＬＭＰ  ｃＤＮＡの５’非翻訳領域の決定−ＭＧ６３  ５’ｃＤＮＡを、ＭＧ６３全ＲＮＡのネステッドＲＴ−ＰＣＲにより、ｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（５’ＲＡＣＥ）プロトコールを用いて増幅した。この方法には、３’末端に二つの縮重ヌクレオチド位置を有するロックドッキングオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた、第一鎖ｃＤＮＡ合成が含まれた（Chenchikら、CLONTECHniques. x :5 (1995年)；Borsonら、PC Methods Applic., 2:144 (1993年)）。第二鎖の合成は、Gublerら、Gene. 25:263 (1983年)の方法にしたがって、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮａｓｅ  Ｈおよび大腸菌ＤＮＡリガーゼのカクテルで行った。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端を創出した後、二本鎖ｃＤＮＡをフラグメント（５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴ−−３’）（配列番号１９）にライゲーションした。ＲＡＣＥに先立ち、アダプターをライゲーションしたｃＤＮＡを、マラソンＲＡＣＥ反応に適した濃度に希釈した（１：５０）。次いで、アダプターをライゲーションした二本鎖ｃＤＮＡを、特異的にクローニングされるように準備した。
【０１３８】
第１巡のＰＣＲを、センスプライマーとしてのアダプター特異的オリゴヌクレオチド５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（ＡＰ−１）（配列番号２０）、および実施例１６に記載したユニーク領域（ＨＬＭＰＵ）由来の遺伝子特異プライマー（ＧＳＰ）を用いて行った。第２巡のＰＣＲを、ネステッドプライマーＧＳＰ１−ＨＬＭＰＵ（アンチセンス／逆方向プライマー）（配列番号２３）およびＧＳＰ２−ＨＬＭＰＵＦ（配列番号２４）（実施例１６を参照されたい；センス／順方向プライマー）を用いて行った。ＰＣＲは、抗体を介するが、ただし他の点では標準的なホットスタートプロトコールを利用する市販のキット（アドバンテージｃＤＮＡ  ＰＣＲコアキット；クロンテック・ラボラトリーズＩｎｃ．、パロアルト、カリフォルニア州）を用いて、行った。ＭＧ６３  ｃＤＮＡに対するＰＣＲ条件には、初回のホットスタート変性（９４℃；６０秒）に続く、９４℃、３０秒；６０℃、３０秒；６８℃、４分；３０サイクルが含まれた。第１巡ＰＣＲ産物はおよそ７５０塩基対長であったが、ネステッドＰＣＲ産物は、およそ２３０塩基対長であった。第１巡ＰＣＲ産物を、線状化したｐＣＲ２．１ベクター（３．９Ｋｂ）内にクローニングした。挿入断片を、Ｍ１３順方向および逆方向プライマー（配列番号１１；配列番号１２）を用いて、双方向において配列決定した。
【０１３９】
（実施例３０）
５’ＵＴＲを伴う完全長ヒトＬＭＰ−１  ｃＤＮＡの決定−重複しているＭＧ６３ヒト骨肉腫細胞ｃＤＮＡ  ５’−ＵＴＲ配列（配列番号２１）、ＭＧ６３  ７１７塩基対配列（実施例１７；配列番号８）およびヒト心臓ｃＤＮＡクローン７配列（実施例２６）を並置して、１７０４塩基対の新規ヒトｃＤＮＡ配列（配列番号２２）を得た。この並置は、ＮＡＬＩＧＮ（ＰＣＧＥＮＥとＯｍｉｇａ  １．０の両方；インテリジェネティクス社）を用いて成し遂げた。重複配列は、全７１７塩基対領域（実施例１７）のほとんどを１００％相同で構成した。並置した配列の連結は、ＳＥＱＩＮを用いて成し遂げた。
【０１４０】
（実施例３１）
ＬＩＭタンパク質発現ベクターの構築−実施例２５および２６に記載した配列を用いて、ｐＨＩＳ−５ＡＴＧ  ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターの構築を実施した。７１７塩基対のクローン（実施例２５；配列番号７）を、ＣｌａＩおよびＥｃｏＲＶで消化した。小フラグメント（約２５０塩基対）を、ゲル精製した。クローン７（実施例２６；配列番号８）を、ＣｌａＩおよびｘｂａＩで消化し、そして、１４００塩基対のフラグメントをゲル精製した。単離された２５０塩基対および１４００塩基対の制限フラグメントをライゲーションして、約１６５０塩基対のフラグメントを形成した。
【０１４１】
クローン７における単一ヌクレオチド置換（７１７塩基対のＰＣＲ配列および元のラット配列と比較して）により、翻訳される塩基対６７２において終止コドンが生じた。この終止コドンのために、ＬＭＰ−１ｓと称される切断型（短い）タンパク質がコードされた。これは、発現ベクター（配列番号３２）において用いられるコンストラクトであった。５’ＵＴＲを伴う完全長ｃＤＮＡ配列（配列番号３３）を、配列番号３２を５’ＲＡＣＥ配列（配列番号２１）と並置することによって創出した。次いで、ＬＭＰ−１ｓのアミノ酸配列（配列番号３４）を２２３アミノ酸のタンパク質として推定し、そして、ウエスタンブロットにより（実施例２３におけるように）約２３．７ｋＤの予測分子量で泳動することを確認した。ｐＨｉｓ−ＡＴＧベクター（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）を、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで消化した。ベクターを回収し、そして次いで、１６５０塩基対の制限フラグメントを、線状化したｐＨｉｓ−ＡＴＧ内にライゲーションした。ライゲーションした産物をクローニングし、そして増幅した。挿入断片ＨＬＭＰ−１ｓを伴うｐＨＩＳ−Ａとも称される、ｐＨｉｓ−ＡＴＧ−ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターを、標準的な方法により精製した。
【０１４２】
（実施例３２）
ＬＭＰ発現ベクターを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの骨小結節形成および石灰化の誘導−実施例９にしたがい、ラット頭蓋冠細胞を単離し、そして二次培養において生育させた。培養物を、実施例９に記載のように、刺激しないか、あるいは糖質コルチコイド（ＧＣ）で刺激した。実施例２５にしたがい、スーパーフェクト試薬（キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州）トランスフェクション・プロトコールの修飾を用いて、３μｇ／ウェルの各ベクターを二次ラット頭蓋冠骨芽細胞培養物へトランスフェクトした。石灰化小結節を、実施例１１に記載のように、フォン・コッサ染色によって視覚化した。
【０１４３】
ヒトＬＭＰ−１ｓ遺伝子産物の過剰発現のみは、骨小結節形成（約２０３小結節／ウェル）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導した。小結節のレベルは、ＧＣ陽性対照によって誘導されたもの（約４１２小結節／ウェル）のおよそ５０％であった。他の陽性対照には、ｐＨｉｓＡ−ＬＭＰ−Ｒａｔ発現ベクター（約１５２小結節／ウェル）およびｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｆｗｄ発現ベクター（約２０６小結節／ウェル）が含まれ、一方、陰性対照には、ｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｒｅｖ発現ベクター（約２小結節／ウェル）および非処理（ＮＴ）プレート（約４小結節／ウェル）が含まれた。これらのデータは、ヒトｃＤＮＡがラットｃＤＮＡと少なくとも同じ程度に骨誘導性であったことを実証している。その効果は、ＧＣ刺激により観察されるものより少なかったが、おそらく、発現ベクターの最適用量を下回っていたためであろう。
【０１４４】
（実施例３３）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＭＰにより誘導される細胞分化−クローン１０−４におけるラットＬＭＰ  ｃＤＮＡ（実施例２０を参照されたい）を、クローンをＮｏｔＩおよびＡｐａＩで３７℃にて一晩二重消化することにより、ベクターから切り出した。ベクターｐＣＭＶ２  ＭＣＳ（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）を、同じ制限酵素で消化した。クローン１０−４およびｐＣＭＶ２に由来する双方の線状ｃＤＮＡフラグメントをゲル精製し、抽出し、そしてＴＡリガーゼを用いてライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡをゲル精製し、抽出し、そして、増幅用の大腸菌ＪＭ１０９細胞を形質転換するために用いた。陽性の寒天コロニーを拾い、ＮｏｔＩおよびＡｐａＩで消化し、そして、制限消化物をゲル電気泳動により検証した。ストック培養物を、陽性クローンから調製した。
【０１４５】
リバースベクターを、用いた制限酵素がＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩであったことを除いては類似の様式で、調製した。これらの制限酵素を用いたため、クローン１０−４由来のＬＭＰ  ｃＤＮＡフラグメントは、ｐＲｃ／ＣＭＶ２内に逆の（すなわち、翻訳不可能な）配向で挿入された。作り出された組換えベクターを、ｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰと命名した。
【０１４６】
適量のｐＣＭＶ１０−４（６０ｎＭの最終濃度が最適である［３μｇ］；本実験に関しては、０〜６００ｎＭ／ウェル［０〜３０μｇ／ウェル］の範囲の最終濃度が好ましい）を最小イーグル培地（ＭＥＭ）に再懸濁して最終量４５０μｌとし、そして、１０秒間ボルテックスした。スーパーフェクトを加え（７．５μｌ／ｍｌ最終溶液）、該溶液を１０秒間ボルテックスし、そして次いで、室温にて１０分間インキュベートした。このインキュベート後に、１０％ＦＢＳ添加ＭＥＭ（１ｍｌ／ウェル；６ｍｌ／プレート）を加え、そして、ピペット操作により混合した。
【０１４７】
次いで、得られた溶液を、洗浄したＲＯＢ培養物上へ速やかにピペット操作した（１ｍｌ／ウェル）。培養物を、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下で、３７℃にて２時間インキュベートした。その後、細胞を無菌ＰＢＳで穏やかに１回洗浄し、そして、適切な通常のインキュベーション培地を加えた。
【０１４８】
結果は、ｐＣＭＶ１０−４で誘導したすべてのラット培養物における有意な骨小結節形成を実証した。例えば、ｐＣＭＶ１０−４をトランスフェクトされた細胞は、４２９小結節／ウェルを産生した。Ｔｒｍへ曝露された陽性対照培養物は、４６０小結節／ウェルを産生した。対照的に、処理を受けなかった陰性対照は、１小結節／ウェルを産生した。同様に、培養物にｐＣＭＶ１０−４（リバース）をトランスフェクトしたとき、小結節は観察されなかった。
【０１４９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｄｅ  ｎｏｖｏ骨形成を実証するために、４〜５週齢の正常ラット（ｍｕ／＋；劣勢無胸腺状態についてヘテロ接合）の後肢より、骨髄を吸引した。吸引した骨髄細胞をアルファＭＥＭ中で洗浄し、遠心分離し、そして、ペレットを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中０．８３％ＮＨ４Ｃｌに再懸濁させることによって、ＲＢＣを溶解した。残った骨髄細胞をＭＥＭで３回洗浄し、そして、３ｘ１０６細胞につき９μｇのｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓ（順もしくは逆の配向）で、２時間トランスフェクトした。次いで、トランスフェクトされた細胞をＭＥＭで２回洗浄し、そして、３ｘ１０７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。
【０１５０】
細胞懸濁液（１００μｌ）を、無菌ピペットにより無菌の２ｘ５ｍｍ  Ｉ型ウシコラーゲンディスク（Ｓｕｌｚｅｒオルソペディックス社、フィートリッジ、コロラド州）に適用した。ディスクを、４〜５週齢無胸腺ラット（ｍｕ／ｍｕ）の頭蓋、胸部または腹部脊椎に、外科的に皮下移植した。動物を３〜４週目に屠殺し、その時点で、ディスクまたは外科的区域を切り出し、そして７０％エタノール中に固定した。固定した標本をＸ線撮影によって解析し、そして、非脱灰の組織学的検査をゴールドナー・トリクロームにより染色した厚さ５μｍの切片について行った。コラーゲンディスクに代わって、失活させ（グアニジン抽出）、鉱質除去した骨マトリックス（オステオテック社、Shrewsbury、ニュージャージー州）を用いた実験も行った。
【０１５１】
Ｘ線撮影により、高レベルの石灰化骨形成が明らかとなり、このことは、ＬＭＰ−ｉｓをトランスフェクトされた骨髄細胞を含有する元のコラーゲンディスクの形態と適合した。陰性対照（翻訳されるタンパク質をコードしない、ＬＭＰ−１ｓ  ｃＤＮＡの逆配向バージョンをトランスフェクトされた細胞）では、石灰化骨形成は観察されず、かつ、担体の吸収は十分に進行しているように見えた。
【０１５２】
組織像によって、ＬＭＰ−１ｓをトランスフェクトされたインプラント中の骨芽細胞に沿って並ぶ新たな骨梁が明らかとなった。陰性対照における担体が部分的に再吸収されている所に、骨は見られなかった。
【０１５３】
１８セット（９の陰性対照ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−ＲＥＶおよび９の実験ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓ）のインプラントを無胸腺ラットの腰椎と胸椎の部位へ交互に加えた、さらなる実験のＸ線撮影により、０／９の陰性対象インプラントが椎骨間に骨形成（脊椎融合）を呈することが実証された。ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓ処理インプラントの９つすべては、椎骨間に強固な骨融合を呈した。
【０１５４】
（実施例３４）
実施例１０および１１において実証された配列からの、ｐＨＩＳ−５’ＡＴＧ  ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターの合成−７１７塩基対クローン（実施例２５）を、ＣｌａＩおよびＥｃｏＲＶ（ニューイングランド・バイオロジカルズ社、シティ、マサチューセッツ州）で消化した。小フラグメント（約２５０塩基対）を、ゲル精製した。クローン７番（実施例１８）を、ＣｌａＩおよびＸｂａＩで消化した。その消化物から、１４００塩基対のフラグメントをゲル精製した。単離された２５０塩基対および１４００塩基対のｃＤＮＡフラグメントを、標準的な方法によりライゲーションして、約１６５０ｂｐのフラグメントを形成した。ｐＨｉｓ−Ａベクター（インビトロジェン社）を、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで消化した。線状化されたベクターを回収し、そして、キメラの１６５０塩基対ｃＤＮＡフラグメントにライゲーションした。ライゲーションされた産物を、標準的な方法によってクローニングおよび増幅し、そして、ｐＨｉｓ−Ａ−５’ＡＴＧ  ＬＭＰ−１ｓ発現ベクター（挿入断片ＨＬＭＰ−１ｓを伴うベクターｐＨｉｓ−Ａとも称される）を、すでに記載されたように、ＡＴＣＣに寄託した。
【０１５５】
（実施例３５）
ｐＨｉｓ−５’ＡＴＧ  ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの骨小結節形成および石灰化の誘導−実施例９にしたがって、ラット頭蓋冠細胞を単離し、そして二次培養において生育させた。培養物を、実施例９にしたがって、刺激しないか、あるいは糖質コルチコイド（ＧＣ）で刺激した。培養物に、組換えｐＨｉｓ−ＡベクターＤＮＡ  ３μｇ／ウェルを、実施例３３に記載のようにトランスフェクトした。石灰化小結節を、実施例１２にしたがって、フォン・コッサ染色により視覚化した。
【０１５６】
ヒトＬＭＰ−１ｓ遺伝子産物の過剰発現のみ（すなわち、ＧＣ刺激なし）は、有意な骨小結節形成（約２０３小結節／ウェル）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導した。これは、ＧＣ陽性対照に曝露された細胞によって産生された小結節量（約４１２小結節／ウェル）のおよそ５０％である。同様な結果は、ｐＨｉｓＡ−ＬＭＰ−Ｒａｔ発現ベクター（約１５２小結節／ウェル）およびｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｆｗｄ（約２０６小結節／ウェル）をトランスフェクトされた培養物で得られた。対照的に、陰性対照ｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｒｅｖは、（約２小結節／ウェル）を生じ、一方、非処理プレートでは、およそ４小結節／ウェルが認められた。これらのデータは、ヒトＬＭＰ−１  ｃＤＮＡが、このモデル系においてラットＬＭＰ−１  ｃＤＮＡと少なくとも同じ程度に骨誘導性であったことを、実証している。この実験における効果は、ＧＣ刺激により観察されたものよりは少なかったが；しかし、効果が同程度である場合もあった。
【０１５７】
（実施例３６）
ＬＭＰは可溶性骨誘導因子の分泌を誘導する−実施例２４に記載のようなラット頭蓋冠骨芽細胞培養物におけるＲＬＭＰ−１またはＨＬＭＰ−１ｓの過剰発現は、陰性対照において観察されたものよりも有意に大きな小結節形成をもたらした。ＬＩＭ石灰化タンパク質の作用機序を検討するため、条件培地を異なる時点で回収し、１０倍に濃縮し、無菌ろ過し、新鮮血清含有培地においてその元の濃度へと希釈し、そして、トランスフェクトしていない細胞へ４日間適用した。
【０１５８】
ＲＬＭＰ−１またはＨＬＭＰ−１ｓをトランスフェクトされた細胞から第４日に回収した条件培地は、トランスフェクトされた細胞におけるＲＬＭＰ−１の直接的な過剰発現とほぼ同程度に、小結節形成を誘導するのに有効であった。逆配向のＲＬＭＰ−１またはＨＬＭＰ−１をトランスフェクトされた細胞から得た条件培地は、小結節形成に対して明らかな効果を及ぼさなかった。ＬＭＰ−１をトランスフェクトされた培養物から第４日よりも前に回収した条件培地も、小結節形成を誘導しなかった。これらのデータは、ＬＭＰ−１の発現が、可溶性因子の合成および／または分泌を引き起こし、それが、トランスフェクション後４日まで有効量にて培養培地に出現しなかったことを、示唆している。
【０１５９】
ｒＬＭＰ−１の過剰発現が骨誘導性因子の培地中への分泌をもたらしたことから、ウエスタンブロット解析を用いて、ＬＭＰ−１タンパク質が培地中に存在するかどうかを測定した。ｒＬＭＰ−１タンパク質の存在を、ＬＭＰ−１（ＱＤＰＤＥＥ）に特異的な抗体を用いて評価し、そして、慣用の手段により検出した。ＬＭＰ−１タンパク質は、培養物の細胞層にのみ見いだされ、かつ、培地中には検出されなかった。
【０１６０】
骨誘導性可溶性因子の部分精製を、標準的な２５％および１００％硫酸アンモニウムでのカットに続く、ＤＥ−５２陰イオン交換バッチクロマトグラフィ（１００ｍＭまたは５００ｍＭ  ＮａＣｌ）によって、成し遂げた。全活性は、高硫酸アンモニウム、高ＮａＣｌ画分中に観察された。このような局在性は、単一の因子が培地の条件付けに関与している可能性と一致する。
【０１６１】
すべての引用された出版物は、その全体が、参照によって本明細書に援用される。
上述の詳細は、本発明の原理を教示し、実施例を例示の目的で提供するが、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲を逸脱することなく、形態および細部における種々の変更を行うことが可能であることが、当業者によって理解されるであろう。
【国際調査報告】
2010506567.tif 000003
2010506567.tif 000004
2010506567.tif 000005
2010506567.tif 000006
2010506567.tif 000007