(57)【要約】  本発明では、神経変性疾患を診断し、または神経変性疾患に対する被験者の素因を判定する方法が提供される。特に、本発明の方法は、地図位置９ｐ２１と連鎖するマーカー、例えば、オピオイド受容体シグマ１（ＯＰＲＳ１）遺伝子またはその発現産物内のマーカーを検出するステップを含む。本発明ではまた、神経変性疾患と関連する新規のマーカーを同定する方法も提供される。本発明ではまた、ＯＰＲＳ１遺伝子またはその発現産物の変異型、およびこれらの変異を検出する試薬も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における神経変性疾患を診断し、または被験者が神経変性疾患を発症する素因を判定し、または被験者が神経変性疾患を発症する危険性の増大を判定する方法であって、被験者に由来する試料中でヒトゲノムの染色体９ｐ２１と連鎖するマーカーを検出するステップを含み、前記マーカーの検出が、神経変性疾患または神経変性疾患に対する素因または被験者が神経変性疾患を発症する危険性の増大の指標となる方法。
【請求項２】
前記マーカーが、地図位置９ｐ２１．１〜９ｐ２１．２と連鎖する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
地図位置９ｐ２１と連鎖するマーカーが、Ｄ９Ｓ１６１（配列番号１）およびＤ９Ｓ１７５（配列番号２）と称するマイクロサテライトマーカーの間に位置するかまたはこれらのマイクロサテライトマーカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
被験者における神経変性疾患を診断し、または被験者が神経変性疾患を発症する素因を判定し、または被験者が神経変性疾患を発症する危険性の増大を判定する方法であって、被験者に由来する試料中の、神経変性疾患と関連するか、または該疾患と連鎖するか、または該疾患の原因となるオピオイド受容体シグマ１（ＯＰＲＳ１）遺伝子またはその発現産物内のマーカーを検出するステップを含み、前記マーカーの検出が、神経変性疾患または神経変性疾患に対する素因または神経変性疾患を発症する危険性の増大の指標となる方法。
【請求項５】
前記神経変性疾患が認知症または運動ニューロン疾患である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記認知症がアルツハイマー病である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記認知症が前頭側頭型認知症である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記運動ニューロン疾患が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記マーカーが、ＯＰＲＳ−１ゲノム遺伝子および／またはその発現産物中の変異を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記マーカーが、ＯＰＲＳ１  ｍＲＮＡの選択的スプライシングと関連するか、または選択的スプライシングの原因となる、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記マーカーが、配列番号１３のヌクレオチド位置２５８３に対応する位置のチミジン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２５７６に対応する位置のアデノシン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５４に対応する位置のアデノシン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５５に対応する位置のアデノシン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５７に対応する位置のアデノシン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２７９２に対応する位置のアデノシンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記マーカーが、ＯＰＲＳ１転写産物の発現の増大と関連するか、またはその原因となる、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記マーカーが、配列番号１３のヌクレオチド位置４１９１に対応する位置のチミジン、または配列番号３のヌクレオチド位置４１８７に対応する位置のチミジンを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記マーカーが、配列番号１３の位置２０８０に対応する位置のアデノシン、および／または配列番号１３の位置２０９２に対応する位置のチミジン、および／または配列番号１３の位置２５８３に対応する位置のチミジン、および／または配列番号１３の位置４０２０に対応する位置のチミジン、および／または配列番号１３の位置４１９１に対応する位置のチミジン、および／または配列番号１３の位置４１８７に対応する位置のアデノシン、および／または配列番号１３のヌクレオチド位置２０７０に対応する位置のアデノシン、および／または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５４に対応する位置のアデノシン、および／または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５５に対応する位置のアデノシン、および／または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５７に対応する位置のアデノシン、および／または配列番号１３のヌクレオチド位置２７９２に対応する位置のアデノシン、ならびに／配列番号５のヌクレオチド位置１４１におけるチミジン、ならびに／あるいは配列番号５のヌクレオチド位置１４１におけるチミジンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記マーカーが、ＯＰＲＳ１ポリペプチド内に存在する、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
前記マーカーが、配列番号６のアミノ酸位置４に対応する位置のバリン、および／または配列番号６の位置２３に対応する位置のセリンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記マーカーの配列を含む核酸プローブを、被験者に由来する試料中の核酸と連鎖するマーカーに、中等度から高度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせるステップと、検出手段を用いて前記ハイブリダイゼーションを検出するステップとにより前記マーカーを検出し、前記プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションが、前記被験者が神経変性疾患に罹患しているか、または神経変性疾患に対する素因を有するか、または神経変性疾患を発症する危険性が増大していることの指標となる、請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
ＯＰＲＳ１発現産物中のマーカーが、ＯＰＲＳ１ポリペプチド中に存在し、被験者に由来する生体試料を、前記マーカーに特異的に結合可能な抗体またはリガンドと、抗体／リガンド複合体が形成されるか、またはリガンド／リガンド複合体が形成されるのに十分な時間および条件で接触させるステップと、次いで、前記複合体を検出するステップとにより前記マーカーを検出し、前記複合体の検出が、検査される被験者が神経変性疾患に罹患しているか、または神経変性疾患に対する素因を有するか、または神経変性疾患を発症する危険性が増大していることの指標となる、請求項４に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験者に由来する試料中のＯＰＲＳ１転写産物レベルの上昇または低下を測定するステップにより前記マーカーを検出し、前記ＯＰＲＳ１転写産物レベルの上昇または低下が、神経変性疾患または神経変性疾患に対する素因または神経変性疾患を発症する危険性の増大の指標となる、請求項４に記載の方法。
【請求項２０】
ＯＰＲＳ１転写産物レベルの上昇または低下が、
（ｉ）被験者に由来する試料中のＯＰＲＳ１転写産物レベルを測定するステップと、
（ｉｉ）適切な対照試料中のＯＰＲＳ１転写産物レベルを測定するステップと
を含む工程を実施することにより検出され、（ｉ）における前記ＯＰＲＳ１転写産物レベルの（ｉｉ）と比較した上昇または低下が、神経変性疾患または神経変性疾患に対する素因もしくは神経変性疾患を発症する危険性の増大の指標となる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＯＰＲＳ１転写産物に選択的にハイブリダイズする核酸プローブを、前記被験者に由来する試料中の核酸に、中等度から高度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせるステップと、検出手段を用いて前記ハイブリダイゼーションのレベルを検出するステップとを含む方法を実施することによりＯＰＲＳ１転写産物レベルを決定する方法であって、前記プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションのレベルが試料中のＯＰＲＳ１転写産物レベルを示す、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
被験者に由来する試料中のＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルの上昇または低下を測定するステップにより前記マーカーを検出し、前記ＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルの上昇または低下が、神経変性疾患または神経変性疾患に対する素因または神経変性疾患を発症する危険性の増大の指標となる、請求項４に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＯＰＲＳ１ポリペプチドが、選択的スプライシングにより生じたＯＰＲＳ１転写産物にコードされ、かつ／または配列番号６のアミノ酸残基４に対応する位置のバリンを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルの上昇または低下を測定するステップが、
（ｉ）前記被験者に由来する試料中のＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルを測定するステップと、
（ｉｉ）適切な対照試料中のＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルを測定するステップと
を含む工程を実施するステップを含み、（ｉ）における前記ＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルの（ｉｉ）と比較した上昇または低下が、神経変性疾患または神経変性疾患に対する素因または神経変性疾患を発症する危険性の増大の指標となる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験者に由来する生体試料を、ＯＰＲＳ１ポリペプチドに選択的に結合可能な抗体またはリガンドと、抗体／リガンド複合体が形成されるか、またはリガンド／リガンド複合体が形成されるのに十分な時間および条件で接触させるステップと、次いで、複合体を検出するステップとを含む方法を実施することによってＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルを検出し、前記複合体のレベルが被験者中のＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルの指標となる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アルツハイマー病もしくはＦＴＬＤもしくは運動ニューロン疾患を診断し、または被験者がアルツハイマー病もしくはＦＴＬＤもしくは運動ニューロン疾患を発症する素因を判定し、または被験者がアルツハイマー病もしくはＦＴＬＤもしくは運動ニューロン疾患を発症する危険性を判定する方法であって、
（ｉ）配列番号１３の位置２０８０に対応する位置のアデノシン、
（ｉｉ）配列番号１３の位置２０９２に対応する位置のチミジン、
（ｉｉｉ）配列番号１３の位置２５８３に対応する位置のチミジン、
（ｉｖ）配列番号１３の位置４０２０に対応する位置のチミジン、
（ｖ）配列番号１３の位置４１９１に対応する位置のチミジン、
（ｖｉ）配列番号１３の位置４１８７に対応する位置のアデノシン、
（ｖｉｉ）配列番号３のアミノ酸位置４に対応する位置のバリン、
（ｖｉｉｉ）（ｉ）から（ｖｉｉ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択されるＯＰＲＳ１遺伝子内のマーカーを被験者に由来する試料から検出するステップを含む方法。
【請求項２７】
神経変性疾患の治療法または予防法であって、
（ｉ）請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法を実施するステップと、
（ｉｉ）神経変性疾患の治療のための治療用または予防用化合物を投与または推奨するステップと
を含む治療法または予防法。
【請求項２８】
神経変性疾患の治療法または予防法であって、
（ｉ）請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法の結果を得るステップと、
（ｉｉ）神経変性疾患の治療のための治療用または予防用化合物を投与または推奨するステップと
を含む治療法または予防法。
【請求項２９】
神経変性疾患の治療用または予防用の組成物による治療に対する被験者の応答を予測する方法であって、神経変性疾患の治療用または予防用の組成物による治療に対する被験者の応答と関連するＯＰＲＳ−１遺伝子またはその発現産物中のマーカーを検出するステップを含み、前記マーカーの検出が前記組成物による治療に対する被験者の応答の指標となる方法。
【請求項３０】
神経変性疾患と関連するＯＰＲＳ−１遺伝子または発現産物中のマーカーを同定する方法であって、
（ｉ）ＯＰＲＳ−１遺伝子またはその発現産物中の多型または対立遺伝子または変異を同定するステップと、
（ｉｉ）すべてのメンバーが多型または対立遺伝子または変異を含むわけではない被験者の一団を解析して、神経変性疾患に罹患している被験者を決定するステップと、
（ｉｉｉ）神経変性疾患の発症のばらつきを判定するステップであって、前記ばらつきにより、前記多型または対立遺伝子または変異が、神経変性疾患または被験者の神経変性疾患に対する素因と関連することが示されるステップと
を含む方法。
【請求項３１】
（ｉ）配列番号７に示される配列であって、配列番号７のヌクレオチド位置１００５に対応する位置にチミンを含む配列、
（ｉｉ）配列番号５に示される配列であって、配列番号５のヌクレオチド位置８０に対応する位置にアデノシン、および／または配列番号５の位置８５に対応する位置にチミン、および／または配列番号５のヌクレオチド位置６２６に対応する位置にアデノシンを含む配列、
（ｉｉｉ）配列番号８に示される配列であって、配列番号８のヌクレオチド位置６９９に対応する位置にチミンを含む配列、
（ｉｖ）配列番号１３に示される配列であって、配列番号１３の位置２０８０に対応する位置にアデノシン、および／または配列番号１３の位置２０９２に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３の位置２５８３に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３の位置４０２０に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３の位置４１９１に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３の位置４１８７に対応する位置にアデノシンを含む配列、
（ｖ）（ｉ）から（ｉｖ）のいずれかの組合せ
からなる群から選択される配列を含む単離された核酸。
【請求項３２】
請求項３０に記載の核酸に優先的または特異的にハイブリダイズまたはアニール可能な単離された核酸プローブまたはプライマー。
【請求項３３】
（ｉ）配列番号７の少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの配列であって、配列番号７のヌクレオチド位置１００５に対応する位置にチミンを含む配列、
（ｉｉ）配列番号５の少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの配列であって、配列番号５のヌクレオチド位置８０に対応する位置にアデノシン、および／または配列番号５の位置８５に対応する位置にチミン、および／または配列番号５のヌクレオチド位置６２６に対応する位置にアデノシンを含む配列、
（ｉｉｉ）配列番号８の少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの配列であって、配列番号８のヌクレオチド位置６９９に対応する位置にチミンを含む配列、
（ｉｖ）配列番号１３の少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの配列であって、配列番号１３の位置２０８０に対応する位置にアデノシン、および／または配列番号１３の位置２０９２に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３の位置２５８３に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３の位置４０２０に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３の位置４１９１に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３の位置４１８７に対応する位置にアデノシンを含む配列、
（ｖ）（ｉ）から（ｉｖ）のいずれかの組合せ、ならびに
（ｖｉ）（ｉ）から（ｉｖ）のいずれか１つの配列の相補体と
からなる群から選択される配列を含む単離された核酸プローブまたはプライマー。
【請求項３４】
配列番号６に示される配列を含み、前記配列が配列番号６の位置４に対応する位置にバリン、および／または配列番号６の位置２３に対応する位置にセリンを含む、単離されたタンパク質。
【請求項３５】
配列番号６に示される配列であって、配列番号６の位置４に対応する位置にバリンを含む配列、または配列番号６に示される配列であって、配列番号６の位置２３に対応する位置にセリンを含む配列を含むポリペプチドに優先的または特異的に結合可能な、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願データ
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２００７年２月８日に出願されたＵＳＳＮ６０／９００，５７７の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、被験者における神経変性疾患を診断し、かつ／または神経変性疾患に対する被験者の素因を判定する方法に関する。特に、本発明の方法は、地図位置９ｑ２１と連鎖する１つもしくは複数の多型、および／または１つもしくは複数の対立遺伝子多型、および／または１つもしくは複数の変異を含むマーカーを、例えば、オピオイド受容体シグマ（ＯＰＲＳ）１遺伝子またはその発現産物中で検出するステップを含む。
【背景技術】
【０００３】
総説
以下の刊行物は、分子生物学の従来の技法を提供する。こうした手順は、例えば、参照により組み込まれる以下の教科書中で説明されている：
（ｉ）Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ニューヨーク、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、第２版（１９８９）、第Ｉ、第ＩＩ、および第ＩＩＩ巻の全体；
（ｉｉ）「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、第Ｉおよび第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）、オックスフォード、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ社、教科書の全体；
（ｉｉｉ）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）オックスフォード、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ社、教科書の全体、ならびに、特に、同書中１〜２２頁のＧａｉｔ、３５〜８１頁のＡｔｋｉｎｓｏｎら、８３〜１１５頁のＳｐｒｏａｔら、および１３５〜１５１頁のＷｕらによる論考；
（ｉｖ）「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）オックスフォード、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ社、教科書の全体；
（ｖ）Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）；
（ｖｉ）「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）、教科書の全体；
（ｖｉｉ）Ｊ．Ｆ．Ｒａｍａｌｈｏ  Ｏｒｔｉｇａｏ、「Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、「Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ａｃｃｅｓｓ  ｔｏ  Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｗｅｂｓｉｔｅ」（ドイツ、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ社）；
（ｖｉｉｉ）Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｄ．、Ｔｅｉｃｈｍａｎ，Ｊ．、Ｌｉｅｎ，Ｅ．Ｌ．、およびＦｅｎｉｃｈｅｌ，Ｒ．Ｌ．（１９７６）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第７３巻、３３６〜３４２頁
（ｉｘ）Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９６３）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第８５巻、２１４９〜２１５４頁
（ｘ）「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第Ｉ〜ＩＶ巻、（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社）
【０００４】
関連技術の説明
神経変性疾患は、正常な神経機能の変化を特徴とする一群の疾患であり、大半の症例において、神経機能障害および細胞死さえも引き起こす。現在のところ、１００種類を超える神経変性疾患が存在すると推定される。しかし、これらの疾患の病因論的な原因は、いまだほとんど理解されていない。例えば、認知症、例えば、アルツハイマー病または前頭側頭型認知症などの神経変性疾患発症の最も恒常的な危険因子は、年齢である（Ｔａｎｎｅｒ、Ｎｅｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．、第１０巻、３１７〜３２９頁、１９９２年）。例えば、各疾患は、老齢者または老齢化途上者においてより高頻度であり、６５歳以後５年ごとに危険性が倍増する。
【０００５】
神経変性疾患の最も一般的な形態の１つは、認知症である。認知症は、被験者における正常な老化の結果として生じることが予測されるよりも急速な認知機能の進行性減退を特徴とする、神経変性疾患のクラスである。一般に、認知症は、神経損傷、神経疾患、および／または神経変性により引き起こされる。例えば、認知症は、例えば、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、レビー小体認知症、前頭側頭葉変性症、およびプリオン病などの疾患により引き起こされることが知られている。以下でさらに論じる通り、認知症は、一般に、老齢の被験者（すなわち、６５歳以上の被験者）において観察される。この点において、米国では、約４００万〜５００万人の人々が、ある形態の認知症に罹患している。
【０００６】
前世紀にわたり、先進国における６５歳以上の人口の増加率は、人口全体の増加率をはるかに超えた。したがって、次世代にわたり、老齢市民人口は倍増し、これと共に、認知症罹患者の比率も倍増するであろう。
【０００７】
認知症
認知症が通常６５歳を超える被験者において生じるにもかかわらず、早期発症型認知症または初老期認知症は６５歳未満の被験者において観察される。この点において、ミシガン大学社会調査研究所により米国で実施された「健康と退職に関する調査」により、米国内の約４８０，０００名の被験者が、初老期認知症の一部の形態に罹患していることが見出された。
【０００８】
初老期認知症は、一般に、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、レビー小体認知症、およびプリオン病などの疾患により引き起こされる。しかし、初老期認知症では、検出可能な認知症状が６５歳以前に生じる。
【０００９】
認知症の原因
認知症の最も一般的で最もよく研究された形態は、アルツハイマー病および前頭側頭型認知症／前頭側頭葉変性症である（Ｎｅａｒｙら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、第５１巻、１５４６〜１５５４頁、１９９８年）。現在のところ、米国だけで４５０万例のアルツハイマー病症例が存在し、変性性認知症を有する患者の約１２％〜１６％であると推定される。２００１〜２０１０年の期間において、さらに１５０万例のアルツハイマー病症例が、米国で診断されると推定される一方、現在のところ、年間１００万人当たり約４８０例のパーキンソン病症例が新規に診断されている。アルツハイマー病だけでも、米国内で３番目に費用がかかり、罹患者の治療および／または介護に毎年約１０００億米国ドルがかかる。
【００１０】
アルツハイマー病
アルツハイマー病は、最終的には死に至る、記憶、行動、言語、および視覚的空間的スキルの進行性障害を特徴とする、複雑な多遺伝子性神経障害である。アルツハイマー病の顕著な特徴をなす病態は、ニューロンの顆粒空胞変性、β−アミロイド沈着を伴う細胞外老人斑、細胞内神経原線維変化および神経原線維変性、シナプス喪失、ならびに広範な神経細胞死を含む。アルツハイマー病のこれらの組織病理学的病変が、多くの老齢者において観察される認知症と相関することが現在では知られている。
【００１１】
アルツハイマー病は、心身評価、脳波（ＥＥＧ）スキャン、ＣＴ（コンピュータ断層撮影）スキャン、および／または心電図を含む臨床評価を用いて一般に診断される。これらの形態の検査を実施して、例えば、脳卒中など、アルツハイマー病以外の認知症の可能な原因の一部を排除する。認知症の他の可能な原因を排除した後で、アルツハイマー病を診断する。したがって、アルツハイマー病に対する現在の診断法では、信頼できず主観的であるばかりでなく、疾患の発症が予測されない。むしろ、これらの方法では、発症後に未知の原因による認知症の発症が診断されるにすぎない。
【００１２】
さらに、アルツハイマー病の診断に現在用いられる方法により、すべての認知症の原因が容易に検出可能なわけでもない。したがって、脳に対する虚血性、代謝性、毒性、感染性、または外傷性の損傷を受けた被験者もまた認知症を示すことがあり、結果として、アルツハイマー病を有すると不正確に診断されることがある。実際、アルツハイマー病を有すると診断された被験者の最大４５％が、実際には認知症の別の形態に罹患するとＮＩＨでは推定している。
【００１３】
アルツハイマー病の家族歴を有する被験者に対する遺伝子研究により、例えば、アミロイド前駆体タンパク質、プレセニリン−１、またはプレセニリン−２などの遺伝子変異が、この疾患の早期発症形態を引き起こすことが示されている。しかし、アルツハイマー病のこれらの形態が占める割合は、該疾患全症例の５％未満である。
【００１４】
アルツハイマー病に対する感受性を賦与する多型および対立遺伝子を同定する研究により、多数の多型および変異が同定されている（Ｒｏｃｃｈｉら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．、第６１巻、１〜２４頁、２００３年で概観されている）。これらのうちで最も多岐にわたり研究されている遺伝子が、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子のε４アイソフォームである。多数の研究により、アポリポタンパク質Ｅε４（ＡｐｏＥ−ε４）と、アルツハイマー病の後期発症型家族性形態および後期発症型散発性形態との間の関連が示されている（例えば、Ｃｏｒｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６１巻、２６１〜２６３頁、１９９３年）。しかし、ＡｐｏＥ−ε４アイソフォームを保有する非家族性アルツハイマー病の罹患者は５０％未満である（Ｃｏｒｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６１巻、２６１〜２６３頁、１９９３年）。
【００１５】
前頭側頭葉変性症
前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）は、アルツハイマー病およびレビー小体認知症に次いで、３番目に認知症をもたらすことの多い神経変性疾患である。病理学的に、ＦＴＬＤは、前頭皮質表面および前側頭葉におけるニューロンの変性を特徴とする。ＦＴＬＤは、顕著な組織病態を欠く認知症として知られる細胞内または細胞間への検出可能な封入体を有さない症例、タウオパシーとしても知られるタウ陽性の病態を有する症例、および最も高頻度で認められるＴＤＰ−４３タンパク質症に分類される、病理学的に異質な障害である（Ｃａｉｒｎｓら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．、第１１４巻、５〜２２頁、２００７年）。ＴＤＰ−４３は、ＦＴＬＤの散発性の症例および家族性の症例の大半で見出される、ユビキチン免疫反応性封入体、タウ陰性封入体、およびα−シヌクレイン陰性封入体の主要なタンパク質成分である。ＦＴＬＤ患者の約２６％が、びまん性ベータ−アミロイド陽性プラークの細胞内沈着を有する（Ｍａｎｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔｅｒｓ、第３０４巻、１６１〜１６４頁、２００１年）。
【００１６】
ＦＴＬＤに罹患する患者は、一般に、前頭側頭葉変性症を代表するマナーおよび社会的スキルの減退を含む人格および行動の変化、ならびに表現（進行性失語症）および理解（意味性認知症）の言語障害を特徴とする複数の臨床症状を発症する（Ｎｅａｒｙら、前出）。しかし、一部の症例では、健忘症がＦＴＬＤの主特徴である（Ｇｒａｈａｍら、Ｂｒａｉｎ、第１２８巻、５９７〜６０５頁、２００５年）。
【００１７】
ＦＴＬＤの初期症状における顕著なばらつき、および他の神経疾患に共通する行動的症状の早期における卓越を踏まえると、患者およびその家族にとって、誤診が一般的な問題である（Ｇｒｅｉｃｉｕｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、第７２巻、６９１〜７００頁、２００２年）。
【００１８】
ＦＴＬＤ症例の約４０％が家族性であることは、この疾患に対する遺伝子の寄与が著明であることを示す（Ｒｏｓｓｏら、Ｂｒａｉｎ、第１２６巻、２０１６〜２０２２頁、２００３年）。原因となる変異は、パーキンソニズムを伴うＦＴＬＤで、第１７染色体上の微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）をコードする遺伝子において初めて同定された（Ｈｕｔｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９３巻、７０２〜７０５頁、１９９８年）。より近年では、第１７染色体上のプログラヌリン（ＰＧＮ）遺伝子中の変異もまた同定されている（Ｂａｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、第４４２巻、９１６〜９１９頁、２００６年）。第３染色体上の荷電小胞体タンパク質２（ＣＨＭＰ２Ｂ）の変異は、ＴＤＰ−４３陰性ＦＴＬＤ−Ｕのまれな形態と関連していた（Ｓｋｉｂｉｎｓｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第３７巻、８０６〜８０８頁、２００５年）。バロシン含有タンパク質（ＶＣＰ）遺伝子の変異もまた、封入体筋炎および骨ページェット病を含むＦＴＬＤのまれな形態で報告されている（Ｗａｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第３６巻、３７７〜３８１頁、２００４年）。しかし、これらの変異は、前頭側頭型認知症の大半の家族性症例を説明するものではなく、散発性前頭側頭型認知症ではまれにしか観察されない（Ｈｏｕｌｄｅｎら、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ、第４６巻、２４３〜８頁、１９９９年）。
【００１９】
運動ニューロン疾患
運動ニューロン疾患は、一般に、上部運動ニューロンおよび／または運動ニューロンの変性を特徴とする。運動ニューロン疾患は、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、ならびに脊髄延髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ、またはケネディー病）を含む疾患クラスである。運動ニューロン疾患の最も一般的な形態はＡＬＳであり、これは、進行性筋萎縮症ならびに消耗、衰弱、および痙縮を引き起こす、上部および下部の運動ニューロン変性を特徴とする。最終的に、ＡＬＳ患者は、重篤な全身麻痺に罹患し、呼吸器不全の結果として若年で死亡することが多い。
【００２０】
運動ニューロン症例の約１０％が、陽性の家族歴を有する（Ｓｔｒｏｎｇら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．ｓｃｉ．、第１８巻、４５〜５８頁、１９９１年）。運動ニューロン疾患と関連するかまたはその原因となる変異および多型が、複数の遺伝子、例えば、染色体２１ｑ２２上のスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子（Ｒｏｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第３６２巻、５９〜６２頁、１９９３年）、染色体２ｐ１３上のジナクチン（ＤＣＴＮ１）遺伝子（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第７５巻、８２２〜８３１頁、２００４年）、および染色体２０ｑ１３上の小胞輸送タンパク質（ＶＡＰＢ）遺伝子（Ｐｕｌｓら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、第３３巻、４５５〜４５６頁、２００３年）で同定されている。１５ｑ１５〜ｑ２２、１８ｑ、および１６ｑ染色体への連鎖もまた報告されている。しかし、現在同定されているすべての変異により説明されるのは、運動ニューロン疾患の遺伝性症例の半数未満である。したがって、家族性運動ニューロン疾患を発症する被験者の大部分は、臨床症状の発症以前には依然として診断未確定のままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本明細書での考察に基づくなら、被験者における神経変性疾患発症に対する素因を判定する改善された診断法、および神経変性疾患、例えば、初老期認知症の早期診断のための該診断法を開発する必要が存在する。当技術分野では、それにより被験者における神経変性疾患発症に対する素因を判定する迅速で信頼でき非侵襲的な診断／予後診断アッセイ、および神経変性疾患の早期診断のための該アッセイの作成を容易にする、神経変性疾患の分子マーカーに対する必要もまた存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明に至る作業において、本発明者らは、新規の診断法および／または予後診断法において用いる、神経変性疾患の発症と著明に関連する変異および／または多型を探索した。
【００２３】
本明細書で例示する通り、本発明者らは、２つの一般的な認知症、すなわち早期発症型アルツハイマー病および前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ）と関連する変異および／または多型を調べ、診断的および／または予測的アッセイにおいて用いる遺伝子マーカーおよび／または生化学的マーカーを同定した。当業者には前出の説明から明らかとなる通り、早期発症型アルツハイマー病およびＦＴＬＤは、認知症の顕著な形態である。したがって、アルツハイマー病もしくは前頭側頭型認知症、またはこれらの両方に罹患する被験者において同定される本明細書に記載の任意のマーカーは、一般に、認知症の診断または予測に適する。本発明者らはまた、認知症および運動ニューロン疾患に罹患する被験者における変異、ならびに運動ニューロン疾患に罹患する被験者における変異も同定した。これらの疾患は、広範にわたる神経変性疾患を代表する。したがって、認知症および／または運動ニューロン疾患に罹患する被験者において同定される本明細書に記載の任意のマーカーは、一般に、神経変性疾患の診断または予測に適する。本明細書で例示される通り、本発明者らは、これらの認知症に対する連鎖解析を実施することにより、地図位置９ｐ２１〜９ｑ２１と連鎖する神経変性疾患感受性遺伝子座、例えば、地図位置９ｐ２１．１〜９ｐ２１．２と連鎖する遺伝子座を同定した。
【００２４】
本発明者らによるさらなる解析により、神経変性疾患、例えば、早期発症型アルツハイマー病またはＦＴＬＤおよび／または運動ニューロン疾患に罹患する被験者におけるオピオイド受容体シグマ１（ＯＰＲＳ１）遺伝子中に、少なくとも１つの核酸変異を同定した。例えば、本発明者らは、認知症に罹患する被験者におけるＯＰＲＳ１遺伝子の３’側非翻訳領域中に、非多型性ヌクレオチド変異を同定したが、このような変異は対照被験者においては観察されなかった。本発明者らはまた、このヌクレオチド変異が、神経変性疾患に罹患する被験者におけるＯＰＲＳ１遺伝子の発現増強と関連することも見出した。
【００２５】
次いで、本発明者らは、２６６例の初老期認知症患者の一団、および運動ニューロン疾患に罹患している被験者の一団をスクリーニングして、ＯＰＲＳ１遺伝子内に位置するさらなるヌクレオチド変異を検出した。例えば、本発明者らは、運動ニューロン疾患と関連するかもしくはこの原因となる少なくとも５つの変異、および／または早期発症型認知症と関連するかもしくはこの原因となる少なくとも５つの変異、および／またはＦＴＬＤと関連するかもしくはこの原因となる少なくとも４つの変異、および／または早期発症型アルツハイマー病と関連するかもしくはこの原因となる少なくとも１つの変異を同定した。例えば、本発明者らは、ＯＰＲＳ１遺伝子のイントロンにおける２つのヌクレオチド変異を同定したが、この変異は、ＯＰＲＳ１遺伝子にコードされるｍＲＮＡのスプライシングを変化させ、正常なスプライシングにより生じるＯＰＲＳ１  ｍＲＮＡレベルを低下させるものである。これらのヌクレオチド変異の１つは、ＯＰＲＳ１遺伝子のイントロン２内に位置し、ＯＰＲＳ１転写産物中の２つのスプライシング因子であるｈｎＳＮＰＦ／ＨおよびＳＣ３５の結合部位内で生じる。本発明者らはまた、ＯＰＲＳ１の発現増大と関連するＯＰＲＳ１プロモーター領域におけるヌクレオチド置換およびヌクレオチド挿入も同定した。
【００２６】
本発明者らはまた、神経変性疾患に罹患する患者、例えば、早期発症型アルツハイマー病被験者におけるＯＰＲＳ１タンパク質のアミノ酸位置４におけるアラニンからバリンへの置換をもたらす変異も同定した。この変異は、β−アミロイドを切断して、アルツハイマー病に罹患する被験者におけるプラーク中で同定されるＡβペプチドを形成するタンパク質であるガンマ−セクレターゼレベルの上昇と関連する。こうした変異は、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、例えば、早期発症型アルツハイマー病を診断する方法、またはアルツハイマー病、例えば、早期発症型アルツハイマー病に対する被験者の素因を判定する方法の基礎をさらに提供する。
【００２７】
ＯＰＲＳ１遺伝子において本発明者らにより同定された各ヌクレオチド変異、およびＯＰＲＳ１タンパク質におけるアミノ酸変化により、被験者における神経変性疾患を診断し、または被験者が神経変性疾患を発症する素因を判定し、または被験者が神経変性疾患を発症する危険性を判定する方法の基礎が提供される。
【００２８】
具体的な実施形態
本発明の範囲は、実施例に続く、本出願と共に提出される特許請求の範囲から明らかであろう。本出願と共に提出される特許請求の範囲は、本明細書により説明中に組み込まれる。本発明の範囲はまた、具体的な実施形態についての以下の説明および／または好ましい実施形態についての詳細な説明からも明らかであろう。
【００２９】
本発明では、被験者における神経変性疾患を診断し、または被験者が神経変性疾患を発症する素因を判定し、または被験者が神経変性疾患を発症する危険性の増大を判定する方法であって、被験者に由来する試料中でヒトゲノムの染色体９ｐ２１〜９ｑ２１と連鎖するマーカーを検出するステップを含み、前記マーカーの検出が、神経変性疾患または神経変性疾患に対する素因または被験者が神経変性疾患を発症する危険性の増大の指標となる方法が提供される。
【００３０】
該マーカーは、地図位置９ｐ２１．１〜９ｐ２１．２と連鎖することが好ましい。
【００３１】
一例において、地図位置９ｐ２１〜９ｑ２１と連鎖するマーカーは、Ｄ９Ｓ１６１（配列番号１）およびＤ９Ｓ１７５（配列番号２）と称するマイクロサテライトマーカーの間に位置するかまたはこれらを含む。例えば、ヒトゲノムの地図位置９ｐ２１〜９ｑ２１と連鎖するマーカーは、Ｄ９Ｓ１６１（配列番号１）およびＤ９Ｓ２７３（配列番号３）と称するマイクロサテライトマーカーの間に位置するかまたはこれらを含む。例えば、ヒトゲノムの地図位置９ｐ２１〜９ｑ２１と連鎖するマーカーは、Ｄ９Ｓ１８１７（配列番号４）および／またはＤ９Ｓ１６３（配列番号１４）および／またはＤ９Ｓ１８４５（配列番号１５）および／またはＤ９Ｓ１１１８（配列番号１６）および／またはＤ９Ｓ３１９（配列番号１７）と称するマイクロサテライトマーカーの間に位置する、かつ／またはこれらを含む。ヒトゲノムの地図位置９ｐ２１〜９ｑ２１と連鎖するマーカーは、Ｄ９Ｓ３１９（配列番号１７）と称するマイクロサテライトマーカーと連鎖する、かつ／またはこれらを含む。
【００３２】
本明細書で用いられる「〜と連鎖する」および「〜にマップする」という用語は、該連鎖する核酸が、被験者における神経変性疾患または認知症に対する素因もしくは神経変性疾患を発症する危険性の増大を診断するのに有用であることを可能とするのに十分な、マーカーと、ヒトゲノムの地図位置９ｐ２１〜９ｑ２１の全部または一部を含む核酸またはその発現産物との間の近接性を指すものとする。当業者は、連鎖する核酸をこうした形で用いるには、それが連鎖するのに、または連鎖する核酸と地図位置９ｐ２１〜９ｑ２１との間の組み換え頻度を低下させるのに十分なだけ地図位置９ｐ２１に対して近接しなければならないことに気付くであろう。連鎖する核酸と遺伝子座との距離は約２５ｃＭ未満であることが好ましく、約１０ｃＭ未満であることがより好ましく、約５ｃＭ未満であることがさらにより好ましく、約３ｃＭ未満であることがさらにより好ましく、約１ｃＭ未満であることがさらにより好ましい。
【００３３】
本発明ではまた、被験者における神経変性疾患を診断し、または被験者が神経変性疾患を発症する素因を判定し、または被験者が神経変性疾患を発症する危険性の増大を判定する方法であって、被験者に由来する試料中で、神経変性疾患と関連するか、またはこれと連鎖するか、またはこの原因となるオピオイド受容体シグマ１（ＯＰＲＳ１）遺伝子またはその発現産物内のマーカーを検出するステップを含み、前記マーカーの検出が、神経変性疾患または神経変性疾患に対する素因または神経変性疾患を発症する危険性の増大の指標となる方法も提供される。
【００３４】
用語法のために述べると、ヒトＯＰＲＳ１遺伝子は、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列、および／または配列番号５に示される配列をコードする能力を有する核酸配列を含む。ヒトＯＰＲＳ１遺伝子は、配列番号１３に示される配列と少なくとも約８０％の同一性を示す配列、および／または配列番号５に示される配列と少なくとも約８０％の同一性を示す配列を含む核酸をコードする配列を含むことが好ましい。該核酸は、配列番号１３に示される配列と少なくとも約８５％の同一性を示す配列、または配列番号１３に示される配列と少なくとも約９０％の同一性を示す配列、または配列番号１３に示される配列と少なくとも約９５％の同一性を示す配列を含むことがより好ましい。その代わりに、またはそれに加えて、該核酸は、配列番号５に示される配列と少なくとも約８５％の同一性を示す配列、または少なくとも約９０％の同一性を示す配列、または少なくとも約９５％の同一性を示す配列を含む。
【００３５】
一例において、神経変性疾患と関連するかまたはこの原因となるマーカーは、ＯＰＲＳ１ゲノム遺伝子内に生じる。ＯＰＲＳ１ゲノム遺伝子は、該遺伝子の発現を制御する調節領域、例えば、プロモーターもしくはそのフラグメントおよび／または５’側の非翻訳領域および／または３’側の非翻訳領域に加えて介在するイントロン配列に加え、ＯＰＲＳ１タンパク質のコード領域（例えば、ＯＰＲＳ１の任意のアイソザイムをコードするのに必要とされるコドン）も含むと理解される。
【００３６】
本明細書で用いられる「神経変性疾患」という用語は、神経細胞死を特徴とする疾患を意味するものとする。神経変性疾患において観察される神経細胞死には、ときに数年間に及ぶ神経機能障害が先行することが多い。したがって、「神経変性疾患」という用語は、神経機能障害および最終的には神経細胞死を特徴とする疾患または障害を含む。神経変性疾患はまた、ニューロン死の１つまたは複数の領域における神経膠症（例えば、星状細胞増加症または小神経膠細胞症）の増加も特徴とすることが多い。神経変性疾患において観察される細胞事象は、行動の変化（例えば、思考および／または記憶の低下）および／または運動の変化（例えば、振戦、運動失調、姿勢変化、および／または硬直）として現れることが多い。神経変性疾患の例は、例えば、ＦＴＬＤ、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、運動失調（例えば、脊髄小脳失調症、フリードリッヒ失調症）、クロイツフェルト−ヤコブ病、ポリグルタミン病（例えば、ハンチントン病、または脊髄延髄性筋萎縮症）、ハラーフォルデン−シュパッツ病、特発性捻転症、レビー小体病、多系統萎縮症、神経有棘赤血球症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、ペリツェウス−メルツバッハー病、ピック病、進行性核上麻痺、脊髄空洞症、斜頸、脊髄性筋萎縮症、またはトリヌクレオチド反復病（例えば、脆弱Ｘ症候群）を含む。神経変性疾患は、ＯＰＲＳ１の発現および／または活性の異常と関連する神経変性疾患であることが好ましい。
【００３７】
神経変性疾患は認知症であることが好ましい。本明細書で用いられる「認知症」という用語は、心的能力の慢性的な喪失、特に、思考および／または記憶および／または行動および／または人格および／または運動機能の進行性低下を特徴とし、また、抑うつおよび無気力などの精神症状とも関連しうる神経変性疾患を意味するものとする。この点において、認知症は、例えば、脳卒中、感染症、または頭部外傷によっては引き起こされない。認知症の例は、例えば、とりわけ、アルツハイマー病、血管性認知症、レビー小体認知症、および前頭側頭型認知症を含む。
【００３８】
一例において、本発明の方法では、初老期認知症が診断され、かつ／または被験者の初老期認知症に対する素因が判定され、かつ／または被験者の初老期認知症に対する危険性が判定される。この点において、「初老期認知症」という用語は、被験者が６５歳以前に臨床的に検出可能な症状の発症を特徴とする認知症を意味すると、当該技術分野では理解される。
【００３９】
一例において、認知症は、アルツハイマー病またはＦＴＬＤである。「アルツハイマー病」とは、記憶、行動、言語、および／または視覚的−空間的スキルの進行性障害を特徴とする神経変性疾患を意味する。病理学的に、アルツハイマー病は、ニューロン喪失、神経膠症、神経原線維変化、老人斑、平野小体、ニューロンの顆粒空胞変性、アミロイド血管症、および／またはアセチルコリン欠損症を特徴とする。「アルツハイマー病」という用語は、早期発症型アルツハイマー病（例えば、被験者が６５歳以前で生じる検出可能な症状の発症を伴う）または後期発症型アルツハイマー病（例えば、６０歳代以降に発症する）を含むものとする。好ましくは、アルツハイマー病は、早期発症型アルツハイマー病である。
【００４０】
一例において、アルツハイマー病は、早期発症型アルツハイマー病である。例えば、本発明者らは、早期発症型アルツハイマー病に罹患する被験者において生じるＯＰＲＳ１遺伝子中の少なくとも１つのヌクレオチド変異（配列番号７のヌクレオチド位置１００５に対応する位置のチミジン）を同定した。
【００４１】
例えば、アルツハイマー病は、プラークの優勢なアルツハイマー病である。本明細書で用いられる「プラークの優勢なアルツハイマー病」という用語は、神経原線維変化が相対的に存在しない状態における多数の老人斑を特徴とするアルツハイマー病の異型を意味するものとする。
【００４２】
別の例において、疾患は運動ニューロン疾患である。本明細書で用いられる「運動ニューロン疾患」という用語は、運動ニューロン例えば、上部運動ニューロンおよび／または下部運動ニューロンの機能障害および／または死滅を特徴とする疾患を意味するものとする。
【００４３】
一般に、運動ニューロン疾患は、筋肉の衰弱および萎縮として示され、該衰弱は、四肢において、および／または嚥下困難として示されることが多い。運動ニューロン疾患が進行すると、これに罹患した被験者は、歩行および物体を持ち上げることの困難、ならびに、最終的には、呼吸困難を生じることが多い。例示的な運動ニューロン疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を含む。運動ニューロン疾患はＡＬＳであることが好ましい。
【００４４】
本明細書で用いられる「マーカー」という用語は、神経変性疾患と関連するかもしくはその原因となるヌクレオチド配列、および／または認知症に罹患する被験者においては生じるが、認知症に罹患しない被験者においては生じないヌクレオチド配列を含む核酸を意味するものとする。
【００４５】
その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、認知症と関連するゲノム中の多型またはヌクレオチド変異と連鎖する。例えば、マーカーは、エキソンまたはイントロンもしくはプロモーター領域もしくはエンハンサー領域もしくは３’側非翻訳領域を含むＯＰＲＳ１ゲノム遺伝子の任意の領域内で生じる。
【００４６】
転写されるか、または転写を制御するゲノム領域においてマーカーを検出するステップを含む任意の実施形態による本明細書に記載の方法において、「マーカー」という用語はまた、認知症と関連するＯＰＲＳ１遺伝子またはＯＰＲＳ１対立遺伝子の発現産物も意味するものとする。例えば、マーカーは、プレｍＲＮＡ分子、５’キャップが結合したｍＲＮＡ、ポリアデニル化したｍＲＮＡ、および／または成熟ｍＲＮＡもしくはプロセッシングされたｍＲＮＡを含むかまたはこれらの内部にある。
【００４７】
ポリペプチドをコードするゲノム領域においてマーカーを検出するステップを含む任意の実施形態による本明細書に記載の方法において、当業者は、「マーカー」という用語がまた、神経変性疾患と関連するか、またはこれと連鎖するか、またはこの原因となるＯＰＲＳ１遺伝子の対立遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質も意味することを理解するであろう。
【００４８】
本明細書で用いられる「神経変性疾患と関連する」という用語は、マーカーの検出が被験者における神経変性疾患の発症と著明に相関すること、またはマーカーの不在が神経変性疾患の発症と著明に相関することを意味するものとする。例えば、マーカーは、神経変性疾患に罹患する被験者において生じるかまたは検出可能であり、神経変性疾患に罹患しない被験者においては生じないかまたは検出可能でない。その代わりに、またはそれに加えて、神経変性疾患と関連するマーカーの検出は、被験者における神経変性疾患の発症と有意に相関するか、またはマーカーの不在は、神経変性疾患の発症と有意に相関する。例えば、疾患と正に関連するマーカーが多型である場合、そのマーカーの検出は神経変性疾患の発症と関連する。本明細書で用いられる「多型」という用語は、個体集団内で生じる被験者ゲノムの特定の部位または領域のヌクレオチド配列の違いを意味し、多型の一形態が神経変性疾患と関連するものとする。例示的な多型は、例えば、単純な配列反復、もしくはマイクロサテライトマーカーなどのマーカーの長さが集団内の個体間で変化する多型、及び一塩基多型を含む。当業者は、一塩基多型が、被験者集団のゲノム中において生じる小さな変化（例えば、挿入、欠失、転移、またはトランスバーション）であることを理解するであろう。例えば、一塩基多型は、被験者のゲノム中の１つ、または２つもしくは３つもしくは５つのヌクレオチド、または１０もしくは２０のヌクレオチドの挿入もしくは欠失もしくはトランスバーションを含むかまたは該挿入もしくは欠失もしくはトランスバーションからなる。多型は、一塩基多型（ＳＮＰ）であることが好ましい。一例において、多型は、複数の被験者において神経変性疾患の発症と有意に相関する。例えば、多型は、複数の血縁関係のない被験者において認知症の発症と有意に相関する。
【００４９】
本発明ではＯＰＲＳ−１核酸または該ポリペプチド内の任意のマーカーを意図するが、マーカーはＯＰＲＳ−１遺伝子もしくは該発現産物内の変異を含むか、または該変異からなることが好ましい。「変異」とは、天然ＯＰＲＳ１ポリペプチドの発現または活性のレベルを変化させ、これによって神経変性疾患を引き起こす、被験者ゲノムのヌクレオチド配列、および、場合によって、その発現産物中の恒常的で伝達性の変化を意味する。変異の例は、１つもしくは複数の新規のヌクレオチドの挿入、または１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失、または１つもしくは複数の既存のヌクレオチドの異なるヌクレオチドによる置換を含む。こうした変異はまた、ＯＰＲＳ１ポリペプチドのアミノ酸変化、例えば、ＯＰＲＳ１ポリペプチド活性の変化ももたらしうる。「変異」は、神経変性疾患に罹患している被験者中のＯＰＲＳ１遺伝子またはその発現産物の配列の違いであり、このような変異は、神経変性疾患に罹患しない被験者、例えば、神経変性疾患に罹患しない個体集団においては生じない。
【００５０】
本明細書で用いられる「神経変性疾患に対する素因」という用語は、任意の実施形態に従い本明細書で説明される方法により検出されるマーカーを含む被験者が、神経変性疾患の発症に対して感受性であるか、または正常な個体または正常な個体集団よりも神経変性疾患を発症する可能性が高いことを意味するものとする。この点において、神経変性疾患に対する素因の指標となるマーカーは、それ自体、疾患または障害の原因となるものであってもよく、あるいは、神経変性疾患の発症とも相関するものであってもよい。
【００５１】
例えば、マーカーは、配列番号７のヌクレオチド位置１００５に対応する位置のチミジンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号５のヌクレオチド位置８０に対応する位置のアデノシンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号５のヌクレオチド位置８５に対応する位置のチミジンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号５のヌクレオチド位置６２６に対応する位置のアデノシンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号８のヌクレオチド位置６９９に対応する位置、および配列番号９のヌクレオチド位置７００に対応する位置のグアニンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号１３の位置２０８０に対応する位置のグアニンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号１３の位置２０８０に対応する位置のアデノシンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号１３の位置２０９２に対応する位置のシトシンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号１３の位置２０９２に対応する位置のチミジンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号１３の位置２５８３に対応する位置のグアニンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号１３の位置２５８３に対応する位置のチミジンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号１３の位置４０２０に対応する位置のシトシンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号１３の位置４０２０に対応する位置のチミジンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号１３の位置４１９１に対応する位置のグアニンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号１３の位置４１９１に対応する位置のチミジンを含む。
【００５２】
一例において、マーカーは、配列番号１３の位置２０８０に対応する位置のアデノシンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号１３の位置２０９２に対応する位置のチミジンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号１３の位置２５８３に対応する位置のチミジンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号１３の位置４０２０に対応する位置のチミジンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号１３の位置４１９１に対応する位置のチミジンを含む。
【００５３】
その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、ＯＰＲＳ１  ｍＲＮＡの選択的スプライシングと関連するかまたはこの原因となる。本明細書で用いられる「選択的スプライシング」という用語は、ＯＰＲＳ１  ｍＲＮＡへのエキソンの挿入またはＯＰＲＳ１  ｍＲＮＡからのエキソンの除去を意味するものとする。したがって、選択的スプライシングによって生じたＯＰＲＳ１  ｍＲＮＡは、配列番号２に示されるＯＰＲＳ１  ｃＤＮＡの配列と比較して、付加的なエキソンを含むか、またはエキソン（例えば、ヌクレオチド）を欠く。一実施形態において、ＯＰＲＳ１  ｍＲＮＡの選択的スプライシングと関連するマーカーの存在は、選択的スプライシングによって生じたＯＰＲＳ１  ｍＲＮＡレベルの調節と相関する。例えば、マーカーは、例えば、ｈｎＳＮＰＦ／Ｈおよび／またはＳＣ３５などのスプライシング因子の結合部位内において生じ、これにより、ＯＰＲＳ１転写産物のスプライシングレベルを調節する。したがって、マーカーが存在する場合、ＯＰＲＳ１の特異的なスプライシング形態のレベルが上昇または低下するため、該ＯＰＲＳ１の特異的なスプライシング形態のレベルは、疾患または障害と関連するマーカーを検出するのに有用である。ＯＰＲＳ１転写産物の選択的スプライシングと関連するかまたはこの原因となる例示的なマーカーは、配列番号１３のヌクレオチド位置２５８３もしくは配列番号１３のヌクレオチド位置２５７６に対応する位置のチミン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５４に対応する位置のアデノシン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５５に対応する位置のアデノシン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５７に対応する位置のアデノシン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２７９２に対応する位置のアデノシンを含む。これらのマーカーはまた、天然のＯＰＲＳ１発現産物レベルの低下、例えば、配列番号５に示される配列を含む転写産物レベルの低下とも関連する。
【００５４】
別の例において、マーカーは、ＯＰＲＳ１転写産物の発現の増大と関連する。例えば、マーカーは、配列番号１３のヌクレオチド位置４１９１に対応する位置のチミン、または配列番号３のヌクレオチド位置４１８７に対応する位置のアデノシンを含む。
【００５５】
その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号３のアミノ酸位置４に対応する位置のバリンを含む。その代わりに、またはそれに加えて、マーカーは、配列番号３のアミノ酸位置１８４に対応する位置のバリンを含む。
【００５６】
一例において、本明細書で説明される方法は、初老期認知症を診断する方法、または初老期認知症に対する素因を判定する方法、もしくは初老期認知症を発症する危険性の増大を判定する方法である。こうした方法により、配列番号１３の位置２０８０または配列番号５の位置８０に対応する位置のアデノシン、配列番号６のアミノ酸残基４に対応する位置のバリン、配列番号１３の位置２０９２または配列番号５の位置８５に対応する位置のチミジン、配列番号１３の位置２５７８３に対応する位置のチミジン、配列番号１３のヌクレオチド位置４０２０または配列番号５の位置６２６に対応する位置のチミジン、配列番号１３の位置４１９１または配列番号７の位置１００５に対応する位置のチミジン、配列番号５のヌクレオチド位置３０または配列番号１３のヌクレオチド位置２０３０に対応する位置のグアニン、配列番号５のヌクレオチド位置５４５または配列番号１３のヌクレオチド位置３９３９に対応する位置のシトシン、ならびに配列番号１３のヌクレオチド位置４１８７に対応する位置のアデノシンおよび配列番号１３のヌクレオチド位置７２９に対応する位置のアデノシンからなる群から選択される１つまたは複数の任意のマーカーが検出されることが好ましい。
【００５７】
別の例において、本明細書で説明される方法は、初老期認知症を診断する方法、または初老期認知症に対する素因を判定する方法、もしくは初老期認知症を発症する危険性の増大を判定する方法である。こうした方法により、配列番号１３のヌクレオチド位置２５７６に対応する位置のアデノシンが検出されることが好ましい。
【００５８】
一例において、本発明のマーカーは、運動ニューロン疾患と関連する。例えば、マーカーは、配列番号１３のヌクレオチド位置２０７０に対応する位置のアデノシン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５４に対応する位置のアデノシン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５５に対応する位置のアデノシン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５７に対応する位置のアデノシン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２７９２に対応する位置のアデノシン、配列番号５のヌクレオチド位置１４１におけるチミジンを含む。別の例において、マーカーは、配列番号６のアミノ酸残基２３に対応する位置のセリンを含む。
【００５９】
神経変性疾患と関連する核酸マーカーの場合、マーカー配列を含む核酸プローブを、被験者に由来する試料中の核酸と連鎖するマーカーに、中等度から高度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせるステップと、検出手段を用いてハイブリダイゼーションを検出するステップとにより前記マーカーを検出し、プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションが、被験者が神経変性疾患に罹患しているか、または神経変性疾患に対する素因を有するか、または神経変性疾患を発症する危険性が増大していることの指標となることが好ましい。例えば、検出手段は、核酸のハイブリダイゼーション、または、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法などの増幅反応である。
【００６０】
こうした方法は、例えば、被験者に由来する特異的な多型または変異を検出するのに有用であるだけでなく、ＯＰＲＳ１遺伝子の発現産物中のマーカー、例えば、ＯＰＲＳ１転写産物の選択的スプライシング形態を検出するのにも有用である。この点において、任意の実施形態に従い本明細書で説明される本発明の方法は、ＯＰＲＳ１遺伝子によりコードされる選択的スプライシング形態のレベル変化を検出するステップを含む。
【００６１】
本発明者らにより同定された少なくとも２つの変異はまた、ＯＰＲＳ１の発現変化とも関連する。したがって、認知症を発症する危険性を有するかまたは認知症に罹患する被験者は、被験者に由来する試料中のＯＰＲＳ１発現産物レベルの変化を検出するステップにより同様に判定されうる。一例において、こうした方法は、ＯＰＲＳ１発現産物レベルの低下を検出するステップを含む。別の例において、こうした方法は、ＯＰＲＳ１発現産物レベルの上昇を検出するステップを含む。ＯＰＲＳ１発現産物レベルを決定するのに適する方法は当業者に明らかであり、ＰＣＲ法もしくはその変種、または上記で列挙したイムノアッセイを含む。例えば、ＯＰＲＳ１転写産物レベルの上昇または低下は、
（ｉ）被験者に由来する試料中のＯＰＲＳ１転写産物レベルを決定するステップと、
（ｉｉ）適切な対照試料中のＯＰＲＳ１転写産物レベルを決定するステップと
を含む工程を実施することにより検出され、ここで、（ｉ）における前記ＯＰＲＳ１転写産物レベルの（ｉｉ）と比較した上昇または低下が、神経変性疾患または神経変性疾患に対する素因もしくは神経変性疾患を発症する危険性の増大の指標となる。
【００６２】
あるいは、マーカーは、ＯＰＲＳ１ポリペプチド内にある。例えば、こうしたマーカーは、被験者に由来する生体試料を、前記マーカーに特異的に結合可能な抗体またはリガンドと、抗体／リガンド複合体が形成されるか、またはリガンド／リガンド複合体が形成されるのに十分な時間および条件で接触させるステップと、次いで、複合体を検出するステップとにより検出され、複合体の検出が、検査される被験者が神経変性疾患に罹患しているか、または神経変性疾患に対する素因を有するか、または神経変性疾患を発症する危険性が増大していることの指標となる。該複合体を検出するのに適する方法は当業者に明らかであり、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）法、蛍光免疫測定（ＦＬＩＳＡ）法、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）法、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法を含む。
【００６３】
例えば、ＯＰＲＳ１ポリペプチドは、選択的スプライシングによって生じたＯＰＲＳ１転写産物によりコードされ、かつ／または配列番号６のアミノ酸残基４に対応する位置にバリンを含む。
【００６４】
本発明の一例において、ＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルの上昇または低下を検出するステップは、
（ｉ）被験者に由来する試料中のＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルを測定するステップと、
（ｉｉ）適切な対照試料中のＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルを測定するステップと
を含む工程を実施するステップを含み、（ｉ）における前記ＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルの（ｉｉ）と比較した上昇または低下が、神経変性疾患または神経変性疾患に対する素因もしくは神経変性疾患を発症する危険性の増大の指標となる。
【００６５】
適切な対照試料は当業者に明らかであり、
（ｉ）正常な被験者に由来する試料と、
（ｉｉ）健常な被験者に由来する試料と、
（ｉｉｉ）複数の正常な被験者に由来する試料中のハイブリダイゼーションレベルまたは複合体レベルの測定値を含むデータセットと、
（ｉｖ）複数の健常な被験者に由来する試料中のハイブリダイゼーションレベルまたは複合体レベルの測定値を含むデータセットと
を含む。
【００６６】
任意の実施形態に従い本明細書で説明される方法において用いられる生体試料は、有核細胞および／またはその抽出物を含む。試料は、全血、血清、血漿、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、軟膜画分、唾液、尿、口腔細胞、および皮膚細胞からなる群から選択されることが好ましい。
【００６７】
当業者には本明細書の説明に基づいて明らかとなる通り、試料サイズは、用いられる検出手段に依存する。例えば、ＰＣＲ法などのアッセイは、例えば、単一の細胞またはその抽出物を含む試料を用いて実施しうるが、より多数の細胞が好ましい。核酸検出の代替的な形態では、単一の細胞よりも著明に多数の細胞が必要となりうる。さらに、タンパク質ベースのアッセイでは、抗原ベースのアッセイに十分なタンパク質を供給するのに十分な数の細胞が必要となる。
【００６８】
一例において、試料は、被験者に由来するか、または被験者からあらかじめ単離されているか、または被験者からあらかじめ得られている。
【００６９】
一例において、任意の実施形態に従い本明細書で説明される本発明の方法は、被験者に由来する試料から得られたゲノムＤＮＡ、例えば、被験者に由来する血液試料から得られたゲノムＤＮＡを用いて実施される。その代わりに、またはそれに加えて、任意の実施形態に従い本明細書で説明される方法は、生体試料に由来するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを用いて実施される。その代わりに、またはそれに加えて、任意の実施形態に従い本明細書で説明される方法は、生体試料に由来するタンパク質を用いて実施される。
【００７０】
一例において、任意の実施形態に従い本明細書で説明される方法は、被験者の神経変性疾患に対する素因を判定するか、または神経変性疾患を診断する多重解析物検出法（multi-analyte detection method）の一部として実施される。例えば、こうした多重解析物法では、神経変性疾患と関連する２つ以上の核酸マーカー、例えば、任意の実施形態に従い本明細書で説明される２つ以上のマーカーが検出される。その代わりに、またはそれに加えて、多重解析物法では、任意の実施形態に従い本明細書で説明される神経変性疾患と関連する１つまたは複数の核酸マーカー、および神経変性疾患と関連する１つまたは複数の他のマーカーが検出される。核酸ベースの検出法とタンパク質ベースの検出法との組合せが、本発明では意図される。
【００７１】
本発明の一例において、任意の実施形態に従い本明細書で説明される方法は、マーカーと神経変性疾患との間の関連を判定するステップをさらに含む。マーカーと疾患または障害との間の関連を判定するのに適する方法は、当技術分野で知られている。
【００７２】
本発明の方法はまた、神経変性疾患と関連する、かつ／又は該疾患と連鎖するマーカーのキャリア−である被験者を決定するのにも有用である。こうしたアッセイは、例えば、検査される被験者の子供が神経変性疾患を発症する可能性または感受性を判定するのに有用である。
【００７３】
本発明者らはまた、アルツハイマー病に罹患する被験者において生じる少なくとも１つのマーカーも同定した。したがって、本発明ではまた、神経変性疾患の特定の形態を診断する方法、または被験者が神経変性疾患の特定の形態を発症する素因を判定する方法、もしくは被験者が神経変性疾患を発症する危険性を判定する方法も提供される。例えば、神経変性疾患の特定の形態はアルツハイマー病またはＦＴＬＤまたは運動ニューロン疾患である。例えば、任意の実施形態に従い本明細書で説明される方法は、変更すべき点は変更して、アルツハイマー病もしくはＦＴＬＤもしくは運動ニューロン疾患を診断するステップ、または被験者がアルツハイマー病もしくはＦＴＬＤもしくは運動ニューロン疾患を発症する素因を判定するステップ、または被験者がアルツハイマー病もしくはＦＴＬＤもしくは運動ニューロン疾患を発症する危険性を判定するステップに適用される。
【００７４】
一例において、任意の実施形態に従い本明細書で説明される方法は、被験者がそれに罹患しているか、または該疾患の素因があるか、または該疾患を発症する危険性を有する神経変性疾患を決定するステップをさらに含む。こうした決定は、例えば、家族歴、または生理学的アッセイ、または神経学的アッセイ、または分子的アッセイに基づく。
【００７５】
本発明の診断法はまた、治療法においても有用である。例えば、本発明では、神経変性疾患の治療法または予防法であって、
（ｉ）神経変性疾患または該疾患に対する素因を診断する本明細書に記載の方法を実施するステップと、
（ｉｉ）神経変性疾患の治療のための治療用または予防用化合物を投与または推奨するステップと
を含む治療法または予防法が提供される。
【００７６】
あるいは、本発明では、神経変性疾患の治療法または予防法であって、
（ｉ）被験者が神経変性疾患に罹患するか、または神経変性疾患に対する素因を有することを示す、任意の実施形態に従い本明細書で説明される方法の結果を得るステップと、
（ｉｉ）神経変性疾患の治療のための治療用または予防用化合物を投与または推奨するステップと
を含む治療法または予防法が提供される。
【００７７】
一実施形態において、神経変性疾患の治療用の治療物質の投与または推奨は、該疾患の診断または該疾患に対する素因の診断に基づく。
【００７８】
本発明ではまた、神経変性疾患の治療用または予防用の組成物による治療に対する被験者の応答を予測する方法であって、神経変性疾患の治療用または予防用の組成物による治療に対する被験者の応答と関連するＯＰＲＳ−１遺伝子またはその発現産物内のマーカーを検出するステップを含み、前記マーカーの検出が該組成物による治療に対する被験者の応答の指標となる方法も提供される。
【００７９】
一例において、該方法では、治療に対して応答する被験者と関連するマーカーが検出される。本明細著で用いられる「治療に応答する」という用語は、被験者における神経変性疾患の症状が、治療化合物による治療の結果として軽減または改善されることを意味するものとする。
【００８０】
あるいは、マーカーは、治療に応答しない被験者と関連する。前出の段落から当業者には明らかとなる通り、「治療に応答しない」という用語は、被験者における神経変性疾患または被験者における神経変性疾患の１つもしくは複数の症状が、治療化合物による治療の結果として軽減または改善される可能性が低いことを意味する。例えば、任意の実施形態に従い本明細書で説明されるマーカーを保有する集団の大部分において、治療化合物による治療は、神経変性疾患またはその１つもしくは複数の症状の治療において、被験者に対する治療的な有益性をもたらさない。この根拠に基づくなら、「治療に応答しない」という用語は、「治療に応答する可能性が低い」という用語と互換的に用いうる。
【００８１】
一例において、本発明では、配列番号７に示される配列を含み、該配列が配列番号７のヌクレオチド位置１００５に対応する位置にチミンを含む核酸が提供される。その代わりに、またはそれに加えて、本発明では、配列番号５に示される配列を含み、該配列が配列番号５のヌクレオチド位置８０に対応する位置にアデノシン、および／または配列番号５のヌクレオチド位置８５に対応する位置にチミン、および／または配列番号５のヌクレオチド位置６２６に対応する位置にアデノシンを含む核酸が提供される。その代わりに、またはそれに加えて、本発明では、配列番号８に示される配列を含み、該配列が配列番号８のヌクレオチド位置６９９に対応する位置にチミンを含む核酸が提供される。その代わりに、またはそれに加えて、本発明では、配列番号１３に示される配列を含み、該配列が配列番号１３の位置２０８０に対応する位置にアデノシン、および／または配列番号１３の位置２０９２に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３の位置２５８３に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３の位置４０２０に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３の位置４１９１に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３の位置４１８７に対応する位置にアデノシン、および／または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５４に対応する位置にアデノシン、および／または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５５に対応する位置にアデノシン、および／または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５７に対応する位置にアデノシン、および／または配列番号１３のヌクレオチド位置２７９２に対応する位置にアデノシンを含む核酸、ならびに／あるいは配列番号５のヌクレオチド位置１４１にチミジンを含む核酸が提供される。
【００８２】
本発明ではまた、前出の段落で説明された核酸に優先的または特異的にハイブリダイズまたはアニール可能な単離された核酸、例えば、プローブまたはプライマーも提供される。例えば、該プローブまたはプライマーは、
（ｉ）配列番号７の少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの配列であって、配列番号７のヌクレオチド位置１００５に対応する位置にチミンを含む配列、
（ｉｉ）配列番号５の少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの配列であって、配列番号５のヌクレオチド位置８０にに対応する位置にアデノシン、および／または配列番号５の位置８５に対応する位置にチミン、および／または配列番号５のヌクレオチド位置６２６に対応する位置にアデノシンを含む配列、
（ｉｉｉ）配列番号８の少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの配列であって、配列番号８のヌクレオチド位置６９９に対応する位置にチミンを含む配列、
（ｉｖ）配列番号１３の少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの配列であって、配列番号１３の位置２０８０に対応する位置にアデノシン、および／または配列番号１３の位置２０９２に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３の位置２５８３に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３の位置４０２０に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３の位置４１９１に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３の位置４１８７に対応する位置にアデノシン、および／または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５４に対応する位置にアデノシン、および／または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５５に対応する位置にアデノシン、および／または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５７に対応する位置にアデノシン、および／または配列番号１３のヌクレオチド位置２７９２に対応する位置にアデノシン、および／または配列番号５のヌクレオチド位置１４１にチミジンを含む配列、
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つの配列の相補体と
からなる群から選択される配列を含む。
【００８３】
「優先的に」とは、標的ポリヌクレオチドがプローブまたはプライマーにバックグラウンドを有意に上回るレベルでハイブリダイズする条件下で、プローブまたはプライマーが用いられることを意味する。例えば、スクリーニングされるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡライブラリー、またはスクリーニングされる試料中の他のｃＤＮＡもしくはｇＤＮＡ中に存在する他のポリヌクレオチドのためにバックグラウンドハイブリダイゼーションが生じうる。バックグラウンドは、プローブと標的でない核酸との間の相互作用によって生じる、標的核酸について観察される特異的な相互作用の１/１０倍未満、好ましくは１/１００倍未満の強さのシグナルレベルを示唆する。相互作用の強度は、プローブを、例えば、３２Ｐなどによって放射性標識することにより測定する。上述の配列に優先的にアニールまたはハイブリダイズするプローブまたはプライマーは、別の配列、例えば、配列番号５、７、８、または１３に示される配列の対立遺伝子多型とハイブリダイズまたはアニールするよりも高レベルで標的配列にハイブリダイズまたはアニールする。
【００８４】
「特異的に」とは、プローブまたはプライマーが標的配列にハイブリダイズまたはアニールし、別の標的配列、例えば、配列番号５、７、８、または１３に示される配列の対立遺伝子多型とは検出可能な程度でハイブリダイズまたはアニールしないことを意味する。
【００８５】
本発明ではまた、配列番号６に示される配列を含み、該配列が配列番号６の位置４に対応する位置にバリンを含む単離されたタンパク質も提供される。
【００８６】
本発明ではまた、配列番号６に示される配列を含み、該配列が配列番号６の位置４に対応する位置にバリン、または配列番号６の位置２３に対応する位置にセリンを含むポリペプチドに優先的または特異的に結合可能な、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントも提供される。例えば、該抗体またはそのフラグメントは、配列番号６の連続する少なくとも約５残基のアミノ酸を含む配列を含むＯＰＲＳ１ポリペプチドのエピトープであって、該配列が配列番号６の位置４に対応する位置にバリン、または配列番号６の位置２３に対応する位置にセリンを含むエピトープに結合する。「優先的に」および「特異的に」という用語には、プローブおよびプライマーに関する場合と同じ意味が、変更すべき点は変更して抗体に関する場合にも与えられる。
【００８７】
ヒトＯＰＲＳ−１遺伝子の神経変性疾患に対する緊密な関連、および神経変性疾患と関連するＯＰＲＳ−１中の複数のマーカーの提供を踏まえ、本発明では、神経変性疾患と関連するＯＰＲＳ−１遺伝子または発現産物中の新規なマーカーを同定する方法がさらに提供される。例えば、本発明では、神経変性疾患と関連するＯＰＲＳ−１遺伝子または発現産物中のマーカーを同定する方法であって、
（ｉ）ＯＰＲＳ−１遺伝子またはその発現産物内における多型または対立遺伝子または変異を同定するステップと、
（ｉｉ）すべてのメンバーが多型または対立遺伝子または変異を含むわけではない被験者の一団を解析して、神経変性疾患に罹患している被験者を決定するステップと、
（ｉｉｉ）神経変性疾患の発症のばらつきを判定するステップであって、前記ばらつきにより、前記多型または対立遺伝子または変異が神経変性疾患または被験者の神経変性疾患に対する素因と関連することが示されるステップと
を含む方法が提供される。
【００８８】
本発明ではまた、認知症と関連するマーカーを同定する方法であって、染色体の位置９ｐ２１、例えば、ヒトゲノムの９ｐ２ｌ．１〜９ｐ２ｌ．２と連鎖するマーカーを同定するステップを含み、前記マーカーが認知症に罹患する個体中に存在し、適切な対照被験者中には存在しない方法も提供される。例えば、ＯＰＲＳ１遺伝子内の多型または対立遺伝子または変異を同定するステップを含む上述の方法は、変更すべき点は変更して、ヒトゲノムの染色体位置９ｐ２１と連鎖する多型または対立遺伝子または変異を同定するステップに適用するものとする。
【００８９】
定義
本明細書は、特許請求の範囲に従い本明細書で提示されるＰａｔｅｎｔＩｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．３を用いて作成されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の情報を含む。各ヌクレオチド配列は、数値指示子＜２１０＞に続く配列同定子（＜２１０＞１、＜２１０＞２、＜２１０＞３など）により、配列表中で同定される。配列の長さおよび種類（ＤＮＡ、タンパク質（ＰＲＴ）など）、および各ヌクレオチド配列の供給源である生物は、それぞれ、数値指示子のフィールド＜２１１＞、＜２１２＞、および＜２１３＞に提供される情報により同定される。本明細書で参照されるヌクレオチド配列は、「配列番号」という用語に続く配列指示子により定義される（例えば、配列番号１は、配列表中では＜４００＞１と称する配列を指す）。
【００９０】
本明細書で参照されるヌクレオチド残基の記号表示法は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される記号表示法であり、Ａがアデノシンを表し、Ｃがシトシンを表し、Ｇがグアニンを表し、Ｔがチミンを表し、Ｙがピリミジン残基を表し、Ｒがプリン残基を表し、Ｍがアデノシンまたはシトシンを表し、Ｋがグアニンまたはチミンを表し、Ｓがグアニンまたはシトシンを表し、Ｗがアデノシンまたはチミンを表し、Ｈがグアニン以外のヌクレオチドを表し、Ｂがアデノシン以外のヌクレオチドを表し、Ｖがチミン以外のヌクレオチドを表し、Ｄがシトシン以外のヌクレオチドを表し、Ｎが任意のヌクレオチド残基を表す。
【００９１】
本明細書で用いられる「〜に由来する」という用語は、特定の供給源から指定された完全体を得ることができるが、該供給源から必ずしも直接に得ることができるわけではないことを示すものとする。
【００９２】
本明細書の全体で、文脈から別段に要請されない限り、「含む（comprise）」という語、または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などの変化形は、言及されたステップもしくはエレメントもしくは完全体、またはステップもしくはエレメントもしくは完全体の群の包含を示唆するが、他の任意のステップもしくはエレメントもしくは完全体、またはステップもしくはエレメントもしくは完全体の群の排除を示唆しないと理解される。
【００９３】
本明細書の全体で、別段に特記されるかまたは文脈から別段に要請されない限り、単一のステップ、組成物、ステップ群、または組成物群への言及は、１つおよび複数の（すなわち、１つまたは複数の）これらのステップ、組成物、ステップ群、または組成物群を包含するものとする。
【００９４】
本明細書で説明される各実施形態は、特に別段の言及がない限り、変更すべき点は変更して、あらゆる他の実施形態に適用される。
【００９５】
認知症の診断、および／または被験者の認知症に対する素因を判定するステップに関して本明細書で説明される各実施形態は、変更すべき点は変更して、初老期認知症の診断、および／または被験者の初老期認知症に対する素因を判定するステップに適用するものとする。
【００９６】
本明細書で説明される発明が、具体的に説明された場合以外の変化および改変を受容するものであることを当業者は理解するであろう。本発明は、こうしたすべての変化および改変を含むことを理解されたい。本発明はまた、本明細書において個別にまたは集合的に言及または指示されたすべてのステップ、特徴、組成物、および化合物、ならびに２つ以上の前記ステップまたは特徴の任意かつすべての組合せも含む。
【００９７】
本発明は、本明細書で説明される、例示の目的のみを意図する具体的な実施形態により範囲を限定されるものではない。機能的に同等な生成物、組成物、および方法が、本明細書で説明される本発明の範囲内にあることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１Ａ】早期発症型認知症家族１４の罹患状況および疾患ハプロタイプを示す家系図である。四角は男性、丸は女性を示し、黒色矢印は発端者を示し、黒色記号はＡＤまたはＦＴＬＤいずれかの認知症を有すると臨床診断された個体を示し、斜めの縞模様はＭＮＤを有すると診断された個体、黒色と斜めの縞模様の組合せはＦＴＬＤ−ＭＮＤを有すると診断された個体を示す。斜線は死亡した被験者を示す。個体Ｉ：１は８０歳代まで生存したが、何らかの人格変化を有していたと考えられた。カッコ内の対立遺伝子は、推定である。×は、最小疾患ハプロタイプを定義する上流または下流の組み換え切断点を示す。
【図１Ｂ】図１Ａの説明を参照。
【図１Ｃ】図１Ａの説明を参照。
【図２】神経変性疾患に罹患する被験者において観察されるヌクレオチド変異配列を示す、ＤＮＡ配列の電気泳動図である。ヌクレオチド変異は、垂直の矢印で表す。一般的な多型は、星印（＊）で示す。
【図３】Ｇ７２３Ｔ変異（オーストラリア変異）またはＧ７１９Ａ変異（ポーランド変異）の制御下に置かれたＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞またはＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞中のルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルを示すグラフ表示である。
【図４Ａ】２％アガロースゲル上におけるエキソントラップ産物の電気泳動を示す写真表示の複製を示す図である。エキソントラッピングは、野生型のＯＰＲＳ１配列を含むｐＳＰＬ３ベクター（ｗｔ）、ＩＶＳ＋３１におけるＯＰＲＳ１変異を含むｐＳＰＬ３ベクター（ＩＶＳ＋３１）、またはＩＶＳ＋２４におけるＯＰＲＳ１変異を含むｐＳＰＬ３ベクター（ＩＶＳ＋２４）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（左側パネル）およびＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（右側パネル）中で実施された。
【図４Ｂ】ＨＥＫ−２９３細胞（左側パネル）およびＳＫＮＭＣ細胞（右側パネル）から単離されたエキソントラップ産物に対する半定量的解析の結果を示すグラフ表示である。平均値±ＳＤは、４回の個別のトランスフェクションから得た。Ｔ対立遺伝子エキソントラップ産物とＣ対立遺伝子エキソントラップ産物との間で、対応のあるスチューデントのｔ検定による比較を実施した。統計学的有意性を表示する（＊＝ｐ＜０．０５）。
【図５】野生型のＯＰＲＳ１（ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＯＰＲＳ１（ｗｔ））および変異ＯＰＲＳ１（Ａｌａ４Ｖａｌ；ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＯＰＲＳ１（Ａｌａ４Ｖａ１））を発現する細胞であるＳＫＮＭＣ細胞（薄いグレーのバー）およびＳＫＮＳＨ細胞（濃いグレーのバー）中におけるガンマセクレターゼ活性レベルを示すグラフ表示の複製である。
【図６】疾患状態のＯＰＲＳ１発現に対する年齢依存的影響を示すグラフ表示である。リンパ芽球様細胞株中のＯＰＲＳ１  ｃＤＮＡレベルを定量的リアルタイムＰＣＲ法により評価し、ハウスキーピング遺伝子ＳＤＨＡに対する相対値を計算した。５例の患者（グレーの四角）および１０例の対照（黒色の三角）について、試料供与時の年齢に対する発現レベルをプロットした。
【図７】ＯＰＲＳ１転写産物レベルと、核画分に対する細胞質画分中のＴＤＰ−４３比率として表される細胞質中におけるＴＤＰ−４３タンパク質の相対量との間における相関（ｒ２＝０．８５２、ｐ＝０．００６）を示すグラフ表示である。したがって、神経変性疾患に罹患する被験者において観察されるＯＰＲＳ１発現の増大は、神経変性疾患の別のマーカーである細胞質ＴＤＰ−４３レベルの上昇と相関する。
【図８】各種形態のＯＰＲＳ１が過剰発現するときに細胞核に局在化するＴＤＰ−４３レベルを示すグラフ表示である。白色バーはＳＫＮＭＣ細胞を表し、影を付けたバーはＳＫＮＳＨ細胞を表す。過剰発現（すなわち、神経変性疾患に罹患する一部の被験者で見られるＯＰＲＳ１レベルの上昇）により、神経変性疾患のマーカーである細胞質中のＴＤＰ−４３レベルの上昇がもたらされる。
【発明を実施するための形態】
【００９９】
１．疾患または障害と関連するマーカー
本発明の一例において、神経変性疾患と関連するかまたはこの原因となるマーカーは、核酸マーカーである。該マーカーは、
（ｉ）配列番号１〜５、７、８、および１３からなる群から選択される配列、
（ｉｉ）配列番号６に示される配列と少なくとも８０％の相同性を示すアミノ酸配列をコードする能力を有する配列、および
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に示されると相補的な配列
からなる群から選択される配列の少なくとも約２０個の隣接するヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約３０個の隣接するヌクレオチドと少なくとも約８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含むか、または該ヌクレオチド配列からなることが好ましい。
【０１００】
こうした核酸マーカーは、例えば、多型、ＯＰＲＳ１遺伝子への挿入もしくはその転写産物、ＯＰＲＳ１遺伝子からの欠失もしくはその転写産物、ＯＰＲＳ１遺伝子の転写産物もしくはそのフラグメント、またはＯＰＲＳ１の選択的スプライシングによって生じた転写産物もしくはそのフラグメントであることもあり、これらを含むこともある。
【０１０１】
本発明の一例において、マーカーは、ＯＰＲＳ１  ｍＲＮＡの選択的スプライシングと関連するかまたはこの原因となる多型、または、より好ましくは、変異を含む。
【０１０２】
一例において、ＯＰＲＳ１  ｍＲＮＡの選択的スプライシングと関連する多型または変異は、選択的スプライシングによって生じたＯＰＲＳ１  ｍＲＮＡレベルの調節、例えば、配列番号５と比較して核酸を欠くｍＲＮＡレベルの上昇、および／または配列番号５に示される配列を含むｍＲＮＡレベルの低下と相関する。マーカーは、配列番号１３のヌクレオチド位置２５８３に対応する位置にチミジン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２５７６に対応する位置にアデノシンを含む配列を含むことが好ましい。別の例において、ＯＰＲＳ１発現産物、例えば、転写産物中の選択的スプライシングと関連するかまたはこの原因となるマーカーは、配列番号１３のヌクレオチド位置２２５４に対応する位置にアデノシン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５５に対応する位置にアデノシン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２２５７に対応する位置にアデノシン、または配列番号１３のヌクレオチド位置２７９２に対応する位置にアデノシンを含む。多型が存在する場合、ＯＰＲＳ１  ｍＲＮＡに特異的なスプライシング形態のレベルが上昇または低下するので、ＯＰＲＳ１  ｍＲＮＡに特異的なスプライシング形態のレベルは、神経変性疾患と関連するマーカーを検出するのに有用である。
【０１０３】
本発明者らは、ＯＰＲＳ１発現を増加させるＯＰＲＳ１遺伝子中のヌクレオチド変異型と、神経変性疾患の発症との関連をさらに示した。したがって、本発明の別の実施形態において、マーカーは、多型または変異を含まない遺伝子から発現されるＯＰＲＳ１発現産物の発現レベルと比較して、ＯＰＲＳ１発現産物の発現を増加させる多型または変異を含む。マーカーは、配列番号１３のヌクレオチド位置４１９１に対応する位置にチミン、および／または配列番号１３のヌクレオチド位置４１８７に対応する位置にアデノシンを含む配列を含むことが好ましい。
【０１０４】
別の例において、マーカーは、ＯＰＲＳ１ポリペプチド中に存在する。マーカーは、配列番号６のアミノ酸残基４に対応する位置にバリンを含む配列を含むことが好ましい。
【０１０５】
一実施形態において、本発明の方法は、神経変性疾患と関連する複数のマーカーの存在を検出または判定するステップを含む。
【０１０６】
２．核酸検出法
当業者には明らかとなる通り、神経変性疾患と関連するかまたはこの原因となるマーカーを特異的に検出可能なプローブまたはプライマーは、該マーカーを含むゲノム領域、またはその発現産物に特異的にハイブリダイズ可能な任意のプローブまたはプライマーである。したがって、核酸マーカーは、少なくとも８ヌクレオチド長であることが好ましい（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）プローブを用いる検出の場合）。より特異的なハイブリダイゼーションを提供するために、マーカーは、少なくとも約１５ヌクレオチド長であることが好ましく、少なくとも、２０〜３０ヌクレオチド長であることがより好ましい。こうしたマーカーは、例えば、ＰＣＲ法またはリガーゼ連鎖反応の任意の既知のフォーマットなど、核酸ハイブリダイゼーションベースの検出手段アッセイによる検出に特に適する。
【０１０７】
一実施形態において、好ましいプローブまたはプライマーは、
（ｉ）配列番号１〜５、７、８、および１３からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％の相同性を示す配列、
（ｉｉ）配列番号６に示される配列と少なくとも８０％の相同性を示すアミノ酸配列をコードする能力を有する配列、および
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に示される配列と相補的な配列
からなる群から選択される配列の少なくとも２０個の隣接するヌクレオチドと少なくとも約８０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含む核酸を含むか、該核酸からなるか、または該核酸内に存在する。
【０１０８】
一般に、核酸マーカーを検出する方法は、オリゴヌクレオチドを、被験者に由来する試料中の核酸と連鎖するマーカーと、中等度から高度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせるステップと、例えば、増幅反応またはハイブリダイゼーション反応などの検出手段を用いてオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出するステップとを含む。
【０１０９】
これらの診断アッセイにおいて用いられるストリンジェンシーのレベルを定義する目的で、本明細書では、低度のストリンジェンシーを、２８℃の６ｘＳＳＣ緩衝液、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＣ中、または同等の条件下で実施されるハイブリダイゼーションおよび／または洗浄と定義する。本明細書では、中等度のストリンジェンシーを、４５℃〜６５℃の範囲の温度で２ｘＳＳＣ緩衝液、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＣ中、または同等の条件下で実施されるハイブリダイゼーションおよび／または洗浄と定義する。本明細書では、高度のストリンジェンシーを、少なくとも６５℃の温度で０．１ｘＳＳＣ緩衝液、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＣ、もしくはより低い塩濃度中、または同等の条件下で実施されるハイブリダイゼーションおよび／または洗浄と定義する。本明細書における特定レベルのストリンジェンシーへの言及は、当業者に知られるＳＳＣ以外の洗浄／ハイブリダイゼーション溶液を用いる同等の条件を包含する。
【０１１０】
一般に、ＳＳＣ緩衝液濃度を低下させること、ならびに／またはＳＤＳ濃度を上昇させること、ならびに／またはハイブリダイゼーションおよび／もしくは洗浄の温度を上昇させることによりストリンジェンシーが高くなる。当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件が、試料ＤＮＡを支持するのに用いられるハイブリダイゼーションマトリックスの性質、および／または用いられるハイブリダイゼーションプローブの種類に応じて変化しうることに気付くであろう。
【０１１１】
別の実施形態において、ストリンジェンシーは、プローブまたはプライマーが標的配列から解離する温度（すなわち、プローブまたはプライマーの融解温度またはＴｍ）に基づいて決定される。こうした温度は、例えば、方程式または経験的な手段を用いて決定しうる。当技術分野では、核酸のＴｍを決定する複数の方法が知られている。例えば、ウォーレスの法則では、オリゴヌクレオチド中のＧ＋Ｃ濃度およびＴ＋Ａ濃度を決定し、この情報を用いてＴｍの理論値を計算する（Ｗａｌｌａｃｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、第６巻、３５４３頁、１９７９年）。例えば、最近接法などの代替法が当技術分野では知られており、例えば、Ｈｏｗｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、第２５４巻、４８７６頁、Ｓａｎｔａ  Ｌｕｃｉａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９５巻、１４６０〜１４６５頁、１９９５年、またはＢｒｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８３巻、３７４６〜３７５０頁、１９８６年において説明されている。プローブまたはプライマーの仮定された変性温度と同等の温度（例えば、５℃以内または１０℃以内）または等しい温度は、高度なストリンジェンシーであると考えられる。中等度のストリンジェンシーは、プローブまたはプライマーＴｍの計算値から１０℃〜２０℃または１０℃〜１５℃の範囲内にあると考えられる。
【０１１２】
２．１  プローブ／プライマーの設計および作製
当業者には明らかとなる通り、本発明のアッセイで用いられる特異的なプローブまたはプライマーは、用いられるアッセイフォーマットに依存する。対象マーカーに優先的または特異的にハイブリダイズもしくはアニールする能力またはこれを検出可能なプローブまたはプライマーが好ましいことは明らかである。例えば、ＰＣＲ法またはハイブリダイゼーション法のプローブおよび／またはプライマーを設計する方法は当技術分野で知られており、例えば、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ（編）（「ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ニューヨーク州、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、１９９５年）で説明されている。さらに、各種のアッセイに最適なプローブおよび／またはプライマーを設計する複数のソフトウェアパッケージ、例えば、米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ、ゲノム研究センターから入手できるＰｒｉｍｅｒ  ３が、公開されている。神経変性疾患と関連するマーカーの検出に有用なプローブおよび／またはプライマーを評価して、ヘアピン、セルフプライムを形成しないか、またはプライマーの２量体（例えば、検出アッセイで用いられる別のプローブまたはプライマーとの）を形成しないプローブおよび／またはプライマーを決定する。
【０１１３】
さらに、プローブまたはプライマー（または、その配列）を評価して、それが標的核酸から変性する温度（すなわち、プローブもしくはプライマーの融解温度、またはＴｍ）を決定する。Ｔｍを決定する方法は当技術分野で知られており、例えば、Ｓａｎｔａ  Ｌｕｃｉａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９５巻、１４６０〜１４６５頁、１９９５年、またはＢｒｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８３巻、３７４６〜３７５０頁、１９８６年で説明されている。
【０１１４】
対立遺伝子特異的なＰＣＲアッセイまたはリガーゼ連鎖反応アッセイにおいてＳＮＰまたは変異を検出するのに有用なプライマーまたはプローブは、３’末端ヌクレオチドがＳＮＰ部位または変異部位にハイブリダイズするように設計される。３’末端ヌクレオチドは、ＳＮＰ部位または変異部位に存在することが知られる任意のヌクレオチドでありうる。プローブまたはプライマー中、および多型部位において相補的ヌクレオチドが生じる場合、プローブまたはプライマーの３’端は対象マーカーに完全にハイブリダイズし、例えば、ＰＣＲ法による増幅または別の核酸へのライゲーションを促進する。したがって、標的核酸に完全にハイブリダイズするプローブまたはプライマーは、アッセイにおいて肯定的な結果をもたらす。
【０１１５】
別の実施形態において、プライマー伸長反応に有用なプライマーは、それが特異的な対象ヌクレオチド、例えば、ＳＮＰまたは変異に隣接する領域に優先的または特異的にハイブリダイズするように設計される。
【０１１６】
プローブまたはプライマーに特異的なハイブリダイゼーションは、例えば、ＢＬＡＳＴなどのソフトウェアを用いて、プローブまたはプライマーの任意の核酸に対する相同性の程度を決定することにより評価しうるが、プローブまたはプライマーの特異性は、当技術分野で知られる方法を用いて経験的に決定することだけが可能である。
【０１１７】
例えば、ハイブリダイゼーションによるＳＮＰもしくは変異またはマイクロサテライトの検出に有用な、ロックド核酸（ＬＮＡ）もしくはタンパク質−核酸（ＰＮＡ）によるプローブまたは分子ビーコンは、少なくとも、約８〜１２ヌクレオチド長である。ＳＮＰ部位もしくは変異部位またはマイクロサテライト部位にハイブリダイズする核酸またはその派生物は、プローブのほぼ中央に配置し、これにより、選択的なハイブリダイゼーションおよび正確な検出を容易にする。
【０１１８】
本発明のプローブまたはプライマーを作製／合成する方法は、当技術分野で知られている。例えば、オリゴヌクレオチド合成は、Ｇａｉｔ（編）（「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、オックスフォード、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ社、１９８４年）で説明される。例えば、プローブまたはプライマーは、生物学的合成（例えば、制限エンドヌクレアーゼによる核酸の消化）または化学的合成により得ることができる。短い配列（約１００ヌクレオチドまでの）には、化学的合成が好ましい。
【０１１９】
より長い配列には、例えば、Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ（１９８３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、第１０１巻、２０〜７８頁で説明される、一本鎖ＤＮＡに対するＭ１３ベクターの使用など、分子生物学で用いられる標準的な複製法が有用である。
【０１２０】
オリゴヌクレオチド合成の他の方法は、例えば、ホスホトリエステル法およびホスホジエステル法（Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ、第６８巻、９０頁、１９７９年）、ならびに支持体上での合成（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２２巻、１８５９〜１８６２頁、１９８１年）の他、ホスホラミデート法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第１５４巻、２８７〜３１４頁（１９８８））、ならびに「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ」、Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ編、ニューヨーク、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社、１９８７年および同文献中に含まれる参考文献で説明される他の方法を含む。
【０１２１】
ＬＮＡ合成は、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．、第１巻、３４２３頁、１９９７年；ＳｉｎｇｈおよびＷｅｎｇｅｌ、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１２４７巻、１９９８年で説明される。一方、ＰＮＡ合成は、例えば、Ｅｇｈｏｌｍら、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１１４巻、１８９５頁、１９９２年；Ｅｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ、第３６５巻、５６６頁、１９９３年；およびＯｒｕｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２１巻、５３３２頁、１９９３年で説明される。
【０１２２】
一実施形態において、プローブまたはプライマーは、１つまたは複数の検出可能なマーカーを含む。例えば、プローブまたはプライマーは、例えば、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ならびにシアニン染料Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）などの蛍光標識を含む。これらの蛍光物質の吸光最大波長および発光最大波長は、それぞれ、ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ；６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）、およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）である。
【０１２３】
あるいは、プローブまたはプライマーは、例えば、蛍光半導体ナノ結晶（例えば、ＵＳ６，３０６，６１０で説明される）、放射性標識、または酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、またはβ−ガラクトシダーゼ）により標識される。
【０１２４】
こうした検出可能な標識により、プローブまたはプライマーの検出、例えば、プローブもしくはプライマーのハイブリダイゼーション、またはプローブもしくはプライマーを用いて作製された増幅産物の検出が容易となる。こうした標識されたプローブまたはプライマーを作製する方法は、当技術分野で知られている。さらに、標識されたプローブまたはプライマーの市販の供給源が当業者には知られており、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社（オーストラリア、シドニー）が知られている。
【０１２５】
本発明では、神経変性疾患に対する素因を診断または判定する診断用試薬の製造における、本明細書で説明したプローブまたはプライマーの使用もさらに意図する。
【０１２６】
２．２  検出法
核酸の検出法は当技術分野で知られており、例えば、ハイブリダイゼーションベースのアッセイ、増幅ベースのアッセイ、および制限エンドヌクレアーゼベースのアッセイを含む。例えば、遺伝子の挿入、欠失、トランスバーション、転移、選択的スプライシング、またはスプライシング形態の優先もしくは発生など、あるゲノム領域の配列変化またはその発現産物は、例えば、とりわけ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、鎖置換増幅法、リガーゼ連鎖反応法、サイクリングプローブ法、またはＤＮＡマイクロアレイチップ法などの方法を用いて検出される。
【０１２７】
ＰＣＲ法は当技術分野で知られており、例えば、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ（編）（「ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ニューヨーク州、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、１９９５年）で説明されている。一般に、ＰＣＲ法では、少なくとも約２０ヌクレオチド長、より好ましくは、少なくとも３０ヌクレオチド長を含む非相補的な２つの核酸プライマー分子が、鋳型核酸分子の異なる鎖にハイブリダイズされ、鋳型に特異的な核酸分子のコピーが酵素的に増幅される。ＰＣＲ産物は、電気泳動法および核酸に結合する検出可能なマーカーによる検出を用いて検出しうる。あるいは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを検出可能なマーカー（例えば、フルオロフォア）により標識して、増幅産物を、例えば、ライトサイクラー（米国、マサチューセッツ州、ウェレスリー、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて検出する。本発明もまた、例えば、ＴａｑｍａｎアッセイなどのＰＣＲ法の定量的形態を包含することは明らかである。
【０１２８】
ＳＤＡ（鎖置換増幅）法では、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、および制限エンドヌクレアーゼを用いて、標的配列を増幅する。オリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズし、ポリメラーゼを用いてこの領域のコピーを作製する。次いで、コピーされた核酸と標的核酸との二本鎖に、コピーされた核酸の始点において配列を特異的に認識するエンドヌクレアーゼにより切れ目を入れる。ＤＮＡポリメラーゼは切れ目を入れられたＤＮＡを認識し、標的領域の別のコピーを作製すると同時に、既に生成された核酸を移動させる。ＳＤＡ法の利点は、それが等温フォーマットで生じ、したがって、ハイスループットの自動的解析を容易にすることである。
【０１２９】
リガーゼ連鎖反応法（ＥＵ３２０，３０８およびＵＳ４，８８３，７５０で説明される）では、標的核酸に結合する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを、これらが隣接する形で用いる。次いで、リガーゼ酵素を用いて、該オリゴヌクレオチドを連結する。次いで、サーモサイクリングを用いると、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドがさらなるオリゴヌクレオチドの標的となる。次いで、ライゲーションされたフラグメントを、例えば、電気泳動法またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法を用いて検出する。その代わりに、またはそれに加えて、１つまたは複数のプローブを検出可能なマーカーにより標識し、これにより迅速な検出を容易にする。
【０１３０】
サイクリングプローブ法では、標的配列にハイブリダイズ可能なＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡを含むキメラの合成プローブを用いる。標的配列へのハイブリダイゼーションと同時に、形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖がＲＮアーゼＨの標的となり、これによりプローブを切断する。次いで、切断されたプローブを、例えば、電気泳動法またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法を用いて検出する。
【０１３１】
好ましい実施形態において、神経変性疾患と関連するかまたはこの原因となるマーカーは、ゲノム遺伝子（例えば、ＯＰＲＳ１遺伝子）のタンパク質コード領域内で生じ、この遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ中で検出される。例えば、こうしたマーカーは、ゲノム遺伝子によりコードされるｍＲＮＡの選択的スプライシング形態（例えば、正常および／または健常な被験者においては観察されないスプライシング形態、あるいは、該マーカーを有する被験者におけるスプライシング形態レベルの上昇または低下）でありうる。こうしたマーカーは、例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法、転写媒介増幅（ＴＭＡ）法、または核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）法を用いて検出しうるが、任意のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡベースのハイブリダイゼーションおよび／または増幅プロトコールが本発明に適することは明らかである。
【０１３２】
ＲＴ−ＰＣＲ法は当技術分野で知られており、例えば、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ（編）（「ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ニューヨーク州、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、１９９５年）で説明されている。
【０１３３】
ＴＭＡ法または自己維持配列複製（３ＳＲ）法では、標的配列に隣接する２つ以上のオリゴヌクレオチド、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮアーゼＨ、および逆転写酵素を用いる。第１のオリゴヌクレオチド（これはまた、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位も含む）が標的配列を含むＲＮＡ分子にハイブリダイズし、逆転写酵素により、この領域のｃＤＮＡコピーが作成される。ＲＮアーゼＨを用いてＲＮＡ−ＤＮＡ複合体中のＲＮＡを消化し、第２のオリゴヌクレオチドを用いてｃＤＮＡのコピーを作製する。次いで、ＲＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡのＲＮＡコピーを作製し、該工程を反復する。
【０１３４】
ＮＡＳＢＡシステムでは、３つの酵素（逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ、およびＲＮＡポリメラーゼ）の同時的な活性に依存して、標的ｍＲＮＡ配列を選択的に増幅する。標的配列にハイブリダイズし、５’端にＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含むオリゴヌクレオチドを用いる逆転写反応により、ｍＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに転写する。ＲＮアーゼＨにより鋳型ＲＮＡを消化し、二本鎖ＤＮＡを合成する。次いで、ＲＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡの多数のＲＮＡコピーを作製し、該工程を反復する。
【０１３５】
これらの方法のいずれかを用いる神経変性疾患と関連するマーカーへのハイブリダイゼーションおよび／または該マーカーの増幅が、例えば、電気泳動法および／または質量分析法を用いて検出されることは明らかである。この点において、増幅反応で用いられる１つもしくは複数のプローブ／プライマーおよび／または１つもしくは複数のヌクレオチドを、マーカーの迅速な検出を容易にする検出可能なマーカー、例えば、上述のマーカー、例えば、蛍光標識（例えば、Ｃｙ５またはＣｙ３）または放射性同位元素（例えば、３２Ｐ）により標識してもよい。
【０１３６】
あるいは、核酸の増幅は、例えば、ＵＳ６，１７４，６７０で説明されている方法などの融解曲線解析法を用いて、持続的にモニタリングしうる。
【０１３７】
本発明の例示的な一形態において、神経変性疾患と関連するマーカーは、単一ヌクレオチド変異を含む。単一ヌクレオチド変異を検出する方法は当技術分野で知られており、例えば、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第８巻、７６９〜７７６頁、１９９８年で概観されている。
【０１３８】
例えば、ＤＮＡをエンドヌクレアーゼにより消化し、例えば、サザンブロット法（Ａｕｓｕｂｅｌら（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社、ＩＳＢＮ０４７  １５０３３８、１９８７年）、およびＳａｍｂｒｏｏｋら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ニューヨーク、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、第３版、２００１年）で説明される）を用いて対象フラグメントを検出することにより、制限エンドヌクレアーゼの認識配列である配列を導入または変更する単一ヌクレオチド変異を検出する。あるいは、上述の核酸増幅法を用いて、単一ヌクレオチド変異の周囲領域を増幅する。次いで、増幅産物を該エンドヌクレアーゼと共にインキュベートし、結果として得られる任意のフラグメントを、例えば、電気泳動法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法、またはＰＣＲ法により検出する。
【０１３９】
本発明の多型配列に対する直接の解析は、ジデオキシ鎖終結法またはマクサム−ギルバート法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（第２版、ニューヨーク、ＣＳＨＰ社、１９８９年）；Ｚｙｓｋｉｎｄら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ社、１９８８年）を参照されたい）を用いて実施することができる。
【０１４０】
あるいは、単一ヌクレオチド変異は、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析法を用いて検出することができる。ＳＳＣＰ解析法は、核酸の二次構造の形成およびこれらの二次構造の配列依存的な性格に依拠する。この解析法の一形態では、例えば、上述の方法などの増幅法を用いて、単一ヌクレオチド変異を含む核酸を増幅する。次いで、増幅された核酸を、変性、冷却し、例えば、非変性型ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、質量分析法、または液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣまたはｄＨＰＬＣ）法を用いて解析する。異なる配列を含む領域は異なる二次構造を形成し、結果として、例えば、ゲルおよび／または荷電場中を異なる速度で泳動する。検出可能なマーカーをＳＳＣＰ解析法で有用なプローブ／プライマー中に組み込み、迅速なマーカー検出を容易にすることができることは明らかである。
【０１４１】
あるいは、例えば、質量分析法またはキャピラリー電気泳動法を用いて、任意のヌクレオチド変異を検出する。例えば、検査試料に由来する単一ヌクレオチド変異を含むＤＮＡ領域の増幅産物を、正常／健常な個体に由来する増幅産物と混合する。該産物を変性し、再アニールさせる。単一ヌクレオチド変異の位置において異なるヌクレオチドを含むこれらの試料は、正常／健常な個体に由来する核酸分子と完全にはアニールせず、これにより、完全にアニールした核酸と比較すると、核酸の電荷および／または高次構造を変化させることが明らかである。こうした不正確な塩基対形成は、例えば、質量分析法を用いて検出できる。
【０１４２】
質量分析法はまた、ヌクレオチド変異により核酸分子の分子量が変化する短い増幅産物の分子量を検出するのにも有用である（こうした方法は、例えば、ＵＳ６，５７４，７００で説明されている）。
【０１４３】
対立遺伝子特異的なＰＣＲ法（例えば、Ｌｉｕら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第７巻、３８９〜３９８頁、１９９７年で説明されている）もまた、単一ヌクレオチド変異の対立遺伝子の一方または他方の存在を判定するのに有用である。大半の３’側塩基が単一ヌクレオチド変異とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを設計する。ＰＣＲ反応時に、該オリゴヌクレオチドの３’端が標的配列にハイブリダイズしない場合、ＰＣＲ産物はほとんどまたはまったく作製されず、該オリゴヌクレオチド中に存在する塩基以外の塩基が試料中の単一ヌクレオチド変異部位に存在することが示される。次いで、例えば、ゲル電気泳動法もしくはキャピラリー電気泳動法または質量分析法を用いてＰＣＲ産物を検出する。
【０１４４】
プライマー伸長法（例えば、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ（編）（「ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ニューヨーク州、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、１９９５年）で説明されている）もまた、単一ヌクレオチド変異の検出に有用である。オリゴヌクレオチドを、単一ヌクレオチド変異に隣接する核酸領域にハイブリダイズさせる。次いで、このオリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼおよび単一ヌクレオチド変異において生じるいずれかまたは任意の可能な塩基に対応する遊離ヌクレオチド二リン酸と共にプライマー伸長プロトコールで用いる。ヌクレオチド二リン酸は、検出可能なマーカー（例えば、フルオロフォア）により標識することが好ましい。プライマーの伸長後、未結合の標識されたヌクレオチド二リン酸を、例えば、サイズ除外クロマトグラフィー法もしくは電気泳動法を用いて除去するか、または例えば、アルカリホスファターゼを用いて加水分解し、標識されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチド中への組み込みを検出し、単一ヌクレオチド変異部位に存在する塩基を表示する。その代わりに、またはそれに加えて、本明細書で例示する通り、プライマー伸長産物を、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）法を用いて検出する。
【０１４５】
本発明が、例えば、ミニ配列決定法（Ｓｙ  Ｖａｅｍｅｎら、Ｇｅｎｏｉｎｉｃｓ、第９巻、３４１〜３４２頁、１９９５年）などのハイスループット形態のプライマー伸長解析法に拡張されることは明らかである。こうした方法では、プローブまたはプライマー（または多数のプローブもしくはプライマー）を固体の支持体（例えば、スライドガラス）上に固相化する。次いで、核酸を含む生体試料を、１つもしくは複数のプローブまたは１つもしくは複数のプライマーと直接接触させ、異なる検出可能なマーカーで標識された各遊離ヌクレオチド塩基を用いてプライマー伸長プロトコールを実施する。次いで、各プローブおよび／またはプライマーに結合した検出可能なマーカーを決定することにより、単一ヌクレオチド変異または多数の単一ヌクレオチド変異において存在するヌクレオチドを決定する。
【０１４６】
蛍光標識されたロックド核酸（ＬＮＡ）分子または蛍光標識されたタンパク質−核酸（ＰＮＡ）分子は、ＳＮＰの検出に有用である（ＳｉｍｅｏｎｏｖおよびＮｉｋｉｆｏｒｏｖ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第３０巻、第１７号、１〜５頁、２００２年）。ＬＮＡ分子およびＰＮＡ分子は、高親和力で核酸、特に、ＤＮＡに結合する。ＬＮＡプローブまたはＰＮＡプローブに結合させたフルオロフォア（特に、ロドミンまたはヘキサクロロフルオレセイン）は、プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションすることにより有意により高レベルで蛍光発光する。しかし、蛍光発光増大のレベルは、単一のヌクレオチドのミスマッチが生じても、同じレベルまでは上昇しない。したがって、試料中で検出される蛍光発光の程度は、ＬＮＡプローブまたはＰＮＡプローブと、標的核酸との間におけるミスマッチの存在（例えば、ＳＮＰの存在など）を示す。蛍光標識ＬＮＡ法または蛍光標識ＰＮＡ法を用いて、例えば、上述の増幅法を用いて既に増幅された核酸中の単一の塩基変化を検出することが好ましい。
【０１４７】
当業者には明らかとなる通り、ＬＮＡまたはＰＮＡによる検出法は、Ｏｒｕｍら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、第４５巻、１８９８〜１９０５頁、１９９９年に説明されるような、ＬＮＡプローブまたはＰＮＡプローブを固体支持体に固相化する、１つまたは複数のマーカーのハイスループット検出に適する。
【０１４８】
同様に、分子ビーコンは、単一ヌクレオチド変異を試料または増幅産物中において直接に検出するのに有用である（例えば、ＭｈｌａｎｇおよびＭａｌｍｂｅｒｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２５巻、４６３〜４７１頁、２００１年を参照されたい）。分子ビーコンは、ステムループ構造を伴う一本鎖核酸である。ループ構造は、対象の単一ヌクレオチド変異の周囲領域に相補的である。ステム構造は、プローブ（ループ）の両側に存在する、互いに相補的である２本の「アーム」をアニールすることにより形成される。一方のアームには蛍光部分が結合し、もう一方のアームには、分子ビーコンが標的配列に結合しない場合に検出可能な蛍光発光を抑制する消光部分が結合する。ループ領域がその標的核酸に結合すると、アームが分離し、蛍光発光が検出される。しかし、単一の塩基ミスマッチでさえ、試料中で検出される蛍光発光レベルを著明に変化させる。したがって、検出される蛍光発光レベルにより、単一ヌクレオチド変異部位における特定の塩基の存在または不在が判定される。
【０１４９】
単一ヌクレオチド変異はまた、核酸アレイへのハイブリダイゼーションによっても同定することができ、その例が、ＷＯ９５／１１９９５に記載されている。ＷＯ９５／１１９９５ではまた、あらかじめ特徴づけされた多型の変異型の検出に最適化されるサブアレイについても説明される。こうしたサブアレイは、第１の基準配列の対立遺伝子多型である第２の基準配列に相補的であるように設計されるプローブを含有する。第２のプローブ群は、プローブが第２の基準配列に対する相補性を示すことを除き、同じ原理により設計される。第２群（またはさらなる群）の組み入れは、プローブ長に見合う短い距離内において複数の変異が生じる（例えば、９〜２１塩基内に２つ以上の変異）と予測される第１の基準配列の短い部分配列を解析するのに特に有用でありうる。
【０１５０】
本発明が、例えば、ＳＮＰマイクロアレイ法（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社から入手されるか、または、例えば、ＵＳ６，４６８，７４３もしくはＨａｃｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１４巻、４４１頁、１９９６年で説明される）、Ｔａｑｍａｎアッセイ（Ｌｉｖａｋら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第９巻、３４１〜３４２頁、１９９５年で説明される）、固相ミニ配列決定法（Ｓｙｖａｅｍｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第１３巻、１００８〜１０１７頁、１９９２年で説明される）、ＦＲＥＴ法によるミニ配列決定法（ＣｈｅｎおよびＫｗｏｋ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、第２５巻、３４７〜３５３頁、１９９７年で説明される）、またはピロミニ配列決定法（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、第８巻、第８号、７６９〜７７６頁、１９９８年で概説される）など、ＯＰＲＳ１遺伝子内に存在して神経変性疾患と関連する単一ヌクレオチド変異を検出する他の方法を包含することは明らかである。
【０１５１】
好ましい実施形態において、神経変性疾患と関連するＯＰＲＳ１遺伝子中の単一ヌクレオチド変異またはその発現産物は、基本的にＣｏｒｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６１巻、９２１〜９２３頁で説明されるＴａｑｍａｎアッセイを用いて検出される。
【０１５２】
３．タンパク質検出法
３．１  リガンドおよび抗体
本明細書の開示に基づく当業者には、本発明がまた、ポリペプチド中のマーカー、例えば、選択的スプライシングによって生じたＯＰＲＳ１  ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチド、または配列番号６のアミノ酸残基４に対応する位置にバリンを含む配列を含むＯＰＲＳ１ポリペプチドの検出にも拡張されることは明らかであろう。こうしたポリペプチドの検出法では、一般に、標的ポリペプチドに優先的または特異的に結合するリガンドまたは抗体を使用する。本明細書で用いられる「リガンド」という用語は、ＯＰＲＳ１ポリペプチド上の１つまたは複数の特異的部位に選択的に結合可能（共有結合的であろうとなかろうと）な任意の化合物、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、小分子、天然生成物、ポリマーなどを含むように、その最も広い文脈において理解すべきである。リガンドはとりわけ、疎水性相互作用、水素結合、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、πスタッキング、共有結合、または磁性的相互作用を含む任意の手段を介してその標的に結合しうる。リガンドが、ＯＰＲＳ１ポリペプチドの特異的形態、例えば、配列番号６のアミノ酸位置４に対応する位置にバリンを含むＯＰＲＳ１ポリペプチドに特異的に結合可能であることが特に好ましい。
【０１５３】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、完全なモノクローナル抗体もしくはポポリクローナル抗体、イムノグロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）画分、ヒト化抗体、または組み換え一本鎖抗体、ならびにこれらのフラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、およびＦｖフラグメントなどを指す。
【０１５４】
抗体は、当業者に知られる各種の任意の技法により調製され、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、１９８８年）で説明される。こうした技法の１つでは、まず、抗原ポリペプチドを含む免疫原を多種多様な動物のうちの任意の１種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヒト、イヌ、ブタ、ニワトリ、およびヤギ）に注射する。免疫原は、天然の供給源に由来するか、組み換え発現手段により作製するか、または化学合成（例えば、ＢＯＣ化学反応またはＦＭＯＣ化学反応）によるなど人工的に生成する。一例では、配列番号６のアミノ酸残基４に対応する位置にバリンを含むＯＰＲＳ−１のエピトープが、免疫原として用いられる。
【０１５５】
ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンなどの担体タンパク質に結合させる。好ましくは、あらかじめ定められた、１回または複数回のブースター免疫感作を組み込む日程に従って、免疫原および、場合によっては、該タンパク質用の担体を動物宿主に注射し、該動物から定期的に血液を採取する。場合によって、免疫原は、例えば、対象の免疫原への応答を増強するフロイント完全アジュバントまたは同不完全アジュバント、リゾレシチン、およびジニトロフェノールなどのアジュバントの存在下で注射する。次いで、例えば、適切な固体支持体に結合されたポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィー法により、動物から単離された血液からポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を精製する。
【０１５６】
対象の抗原ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、第６巻、５１１〜５１９頁、１９７６年に記載の技法およびこれへの変法を用いて調製する。略述すると、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、対象ポリペプチドとの反応性）を有する抗体を生成可能な不死化細胞株の調製を伴う。こうした細胞株は、例えば、前述の通りに免疫感作された動物から得られる脾臓細胞から作製する。脾臓細胞は、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは、免疫感作された動物と同系の融合パートナーとの融合により不死化させる。当技術分野では各種の融合法が知られており、例えば、脾臓細胞と骨髄腫細胞とを、非イオン性界面活性剤と組み合わせるかまたは電気融合し、次いで、ハイブリッド細胞の増殖は促進するが骨髄腫細胞の増殖は促進しない選択的培地中で増殖させる。好ましい選択法では、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）による選択を用いる。十分な時間、通常は約１〜２週間の後、ハイブリッド細胞のコロニーが観察される。単一のコロニーを選択し、細胞が増殖した増殖培地を、ポリペプチド（免疫原）に対する結合活性を有する抗体の存在について調べる。高度の反応性および特異性を有するバイブリドーマが好ましい。
【０１５７】
モノクローナル抗体は、例えば、前述のアフィニティーによる精製法などの方法を用いて、増殖するハイブリドーマコロニーの上清から単離する。
【０１５８】
抗体収量の増強には、マウスなど適切な宿主脊椎動物の腹腔内へのハイブリドーマ細胞株の注射など、各種の技法もまた知られている。次いで、こうした動物対象の腹水または血液から、モノクローナル抗体を回収する。クロマトグラフィー法、ゲル濾過法、沈殿法、および／または抽出法など従来の技法により、抗体から夾雑物を除去する。本発明の神経変性と関連するマーカーは、例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程などの精製工程でも用いうる。
【０１５９】
抗体の作製に用いられる免疫原は、免疫原に結合し、好ましくは、高力価抗体である抗体の生成を刺激するのに十分な程度に抗原性である免疫原であることが好ましい。一実施形態において、免疫原は、完全タンパク質である。
【０１６０】
別の実施形態において、免疫原は、ポリペプチドのフラグメント、例えば、選択的スプライシングによって生じたＯＰＲＳ１ポリペプチド領域、または配列番号６のアミノ酸残基４に対応する位置にバリンを含むＯＰＲＳ−１エピトープを表すペプチドからなる。こうした免疫原に対する抗体はまた、免疫原がそれに由来する、例えば、その天然状態における、または天然の高次構造を有する完全長タンパク質も認識することが好ましい。
【０１６１】
その代わりに、またはそれに加えて、ペプチド免疫原に対する抗体は、免疫原となるヌクレオチド変異タンパク質を、該タンパク質が変性した場合にも認識する。「変性した」とは、タンパク質の高次構造エピトープが、タンパク質の直鎖Ｂ細胞エピトープを保持する条件下において破壊されることを意味する。当業者に知られるであろうが、直鎖エピトープと高次構造エピトープとはオーバーラップしうる。
【０１６２】
あるいは、ＯＰＲＳ１ポリペプチドのある形態またはそのフラグメントに結合可能なモノクローナル抗体は、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂａｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、第４巻、７２頁、１９８３年）、ヒトモノクローナル抗体を作製するＥＢＶハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、１９８５年、Ａｌｌｅｎ  Ｒ．Ｂｌｉｓｓ社、７７〜９６頁）、またはコンビナトリアル抗体ライブラリースクリーニング法（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻、１２７５頁、１９８９年）などの方法を用いて作製される。
【０１６３】
ゆえに、こうした抗体は、神経変性疾患マーカーの存在を検出するのに特に有用である。
【０１６４】
前述の方法はまた、任意の実施形態に従い本明細書で説明される抗体または抗体結合フラグメントの作製にも適する。
【０１６５】
３．２  検出法
一実施形態では、本発明の方法により、神経変性疾患と関連するかまたはその原因となるポリペプチド中のマーカーの存在が検出される。
【０１６６】
ポリペプチドの量、レベル、または存在は、例えば、免疫組織化学法、免疫蛍光法、免疫ブロット法、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、酵素イムノアッセイ法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、質量分析法（タンデム質量分析法、例えば、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ法を含む）、バイオセンサー法、エバネセント波光ファイバー法、またはタンパク質チップ法からなる群から選択される技法など、当業者に知られた各種の任意の技法を用いて決定する。
【０１６７】
一例において、タンパク質の量またはレベルを決定するのに用いられるアッセイは、半定量的アッセイである。別の例において、タンパク質の量またはレベルを決定するのに用いられるアッセイは、定量的アッセイである。
【０１６８】
ＯＰＲＳ１ポリペプチド中の神経変性疾患マーカーと結合する抗体またはリガンドの量は、イムノアッセイ法を用いて決定することが好ましい。免疫組織化学法、免疫蛍光法、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定）法、蛍光免疫測定（ＦＬＩＳＡ）法、ウェスタンブロット法、ＲＩＡ法、バイオセンサーアッセイ、タンパク質チップアッセイ、質量分析アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ、および免疫染色アッセイ（例えば、免疫蛍光法）からなる群から選択されるアッセイを用いることが好ましい。
【０１６９】
標準的な固相ＥＬＩＳＡ法またはＦＬＩＳＡ法のフォーマットは、各種の試料に由来するタンパク質濃度を決定するのに特に有用である。
【０１７０】
一形態において、こうしたアッセイは、生体試料を、例えば、ポリスチレンまたはポリカーボネート製のマイクロウェルまたはディップスティック、膜、またはガラス製の支持体（例えば、スライドガラス）などの固体マトリックス上に固定化するステップを伴う。ＯＰＲＳ１ポリペプチド中の神経変性疾患マーカーと特異的に結合する抗体を固定化した生体試料と直接に接触させ、該試料中に存在するその任意の標的タンパク質との直接の結合を形成する。この抗体は、一般に、例えば、ＦＬＩＳＡ法の場合には蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣまたはテキサスレッド標識）もしくは蛍光半導体ナノ結晶（ＵＳ６，３０６，６１０で説明される）、またはＥＬＩＳＡ法の場合には酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、またはβ−ガラクトシダーゼ）で標識するか、あるいは該一次抗体に結合する適切に標識した二次抗体を用いる。洗浄により任意の未結合抗体を除去した後、蛍光標識の場合には直接に、あるいは酵素標識の場合には、例えば、過酸化水素、ＴＭＢ、もしくはトルイジン、または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｘ−ｇａｌ）などの基質の添加を介して標識を検出する。
【０１７１】
こうしたＥＬＩＳＡ法またはＦＬＩＳＡ法に基づくシステムは、例えば、単離した、および／または組み換えによるＯＰＲＳ１ポリペプチドもしくはその免疫原性フラグメント、またはこれらのエピトープなど、抗体が結合する既知量のタンパク質標準物質に対して検出システムを較正することにより、試料中のタンパク質量の定量に適したものとなる。
【０１７２】
別の形態において、ＥＬＩＳＡ法は、ＯＰＲＳ１ポリペプチド内の疾患または障害マーカーと特異的に結合する抗体またはリガンドを、例えば、膜、ポリスチレンもしくはポリカーボネート製のマイクロウェル、ポリスチレンもしくはポリカーボネート製のディップスティック、またはガラス製の支持体などの固体マトリックス上に固相化するステップを含む。次いで、試料を該抗体と物理的に関係させると、ＯＰＲＳ１ポリペプチド内の該マーカーに結合する、またはこれを「キャプチャー」する。次いで、標識された抗体を用いて、結合したタンパク質を検出する。例えば、マーカーがヒト試料からキャプチャーされる場合、第１の（キャプチャー）抗体とは異なるエピトープに結合する標識された抗ヒトＯＰＲＳ１抗体を用いて、キャプチャーされたタンパク質を検出する。あるいは、第２の（検出）抗体に結合する第３の抗体を用いることもできる。
【０１７３】
本明細書で説明されるアッセイフォーマットが、例えば、スクリーニング工程の自動化などのハイスループットフォーマット、またはＭｅｎｄｏｚａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２７巻、第４号、７７８〜７８８頁、１９９９年で説明されるマイクロアレイフォーマットに適することは、当業者に明らかであろう。さらに、例えば、競合ＥＬＩＳＡ法など、上述のアッセイの変化形も、当業者には明らかであろう。
【０１７４】
あるいは、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法を用いて、ＯＰＲＳ１ポリペプチド内の疾患または障害マーカーの存在を検出する。該アッセイの基本原理は、抗体−抗原間の相互作用を検出する放射性標識された抗体または抗原の使用である。ＯＰＲＳ１ポリペプチド内のマーカーに特異的に結合する抗体またはリガンドを固体支持体に結合させ、試料を該抗体と直接に接触させる。結合した抗原レベルを検出するため、該抗原の単離された形態および／または組み換え形態に放射性標識し、同じ抗体に接触させる。洗浄後、結合放射活性を検出する。生体試料中の任意の抗原が放射性標識された抗原の結合を阻害するので、検出される放射活性レベルは、試料中の抗原レベルに反比例する。こうしたアッセイは、単離された抗原の既知濃度を高濃度で用いる検量線を用いて定量化しうる。
【０１７５】
当業者には明らかとなる通り、こうしたアッセイは、例えば、放射性標識の代わりに酵素または蛍光分子など、任意のレポーター分子を用いるように改変しうる。
【０１７６】
別の実施形態では、ウェスタンブロット法を用いて、試料中のＯＰＲＳ１ポリペプチド内におけるマーカーレベルを決定する。こうしたアッセイでは、当技術分野で知られ、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ社、１９９４年）で説明される技法を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）法を用いて、試料に由来するタンパク質を分離する。次いで、分離されたタンパク質を、例えば、エレクトロトランスファーなど、当技術分野で知られた方法を用いて、例えば、膜（例えば、ＰＶＤＦ膜）などの固体支持体に転写する。次いで、この膜をブロックして、ＯＰＲＳ１内の神経変性疾患マーカーと特異的に結合する標識された抗体またはリガンドによりプローブする。あるいは、標識された二次抗体もしくはリガンド、さらにまたは三次抗体もしくはリガンドを用いて、特異的な一次抗体の結合を検出する。次いで、用いられた標識に適切なアッセイを用いて、標識レベルを決定する。適切なアッセイは、当業者に明らかであろう。
【０１７７】
例えば、密度測定法など、当技術分野で知られた方法を用いて、例えば、ＯＰＲＳ１ポリペプチド内の疾患または障害マーカーのレベルまたは存在を決定する。一例において、タンパク質のバンドまたはスポットの強度は、当技術分野で知られた方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に添加されたタンパク質総量に対して標準化される。あるいは、検出されるマーカーレベルは、対照／基準タンパク質レベルに対して標準化される。こうした対照タンパク質は当技術分野で知られており、例えば、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、β２マイクログロブリン、ヒドロキシ−メチルビランシンターゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）、リボソームタンパク質Ｌ１３ｃ、コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体サブユニットＡ、およびＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）を含む。
【０１７８】
代替的な実施形態では、例えば、免疫組織化学法または免疫蛍光法などの当技術分野で知られた方法を用いてＯＰＲＳ１ポリペプチド内の神経変性疾患マーカーを細胞内で検出する。例えば、それを解析してＯＰＲＳ１ポリペプチド内の神経変性疾患マーカーの存在を判定する細胞または組織切片を固定し、細胞および細胞内に含有されるタンパク質の両方を安定化および保護する。固定法は、マーカーの抗原性を破壊または破損し、これによりマーカーを検出不能としないことが好ましい。細胞の固定法は当技術分野で知られており、例えば、パラホルムアルデヒド処理、アルコール処理、アセトン処理、メタノール処理、ブアン固定液処理、およびグルタルアルデヒド処理を含む。固定後、マーカーに結合可能なリガンドまたは抗体と共に、細胞をインキュベートする。例えば、リガンドまたは抗体は、例えば、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣまたはテキサスレッド標識）、蛍光半導体ナノ結晶（例えば、ＵＳ６，３０６，６１０で説明される）、または酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、またはβ−ガラクトシダーゼ）などの検出可能なマーカーで標識する。あるいは、一次抗体に結合する標識された二次抗体を用いて、一次抗体を検出する。洗浄により任意の未結合抗体を除去した後、関連する検出手段を用いて該標識された抗体への結合レベルを検出する。蛍光標識を検出する手段は、用いられる標識の種類に応じて異なり、これは当業者に明らかであろう。こうした方法はまた、ＴＤＰ−４３ポリペプチドの細胞内局在を検出するのにも有用である。
【０１７９】
場合によって、免疫蛍光法または免疫組織化学法を用いてＯＰＲＳ１ポリペプチド内の神経変性疾患マーカーを検出する方法は、例えば、細胞透過化法（例えば、ｎ−オクチル−βＤ−グルコピラノシド、デオキシコレート、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ＮＰ−４０などの非イオン性界面活性剤、例えば、ＳＤＳまたはサポニンなどの低濃度のイオン性界面活性剤の使用）、および／または抗原賦活（例えば、熱の使用）などのさらなるステップを含む。
【０１８０】
免疫蛍光法を用いる方法は、定量的、または、少なくとも、半定量的であるので好ましい。染色された細胞の蛍光度を定量化する方法は当技術分野で知られており、例えば、「Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（Ｃｕｅｌｌｏ、１９８４年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ社、ＡＳＩＮ  ０４７１９００５２４）で説明されている。
【０１８１】
バイオセンサー機器では、一般に、アッセイ基質と組み合わせて機器内に組み込まれる、電流またはインピーダンスを測定するエレメントと組み合わせた電極表面を用いる（米国特許第５，５６７，３０１号で説明されるバイオセンサーなど）。ＯＰＲＳ１ポリペプチド内の神経変性疾患マーカーに特異的に結合する抗体／リガンドは、バイオセンサー機器および該機器に接触させた生体試料上に組み込まれることが好ましい。バイオセンサー機器により検出される電流またはインピーダンスの変化は、該抗体へのタンパク質の結合を示す。当技術分野で知られるバイオセンサーの一部の形態ではまた、表面プラズモン共鳴の反射表面の変化がリガンドまたは抗体へのタンパク質の結合を示す表面プラズモン共鳴法にも依拠してタンパク質相互作用を検出する（米国特許第５，４８５，２７７号および同第５，４９２，８４０号）。
【０１８２】
バイオセンサーは、こうしたシステムをマイクロスケールまたはナノスケールに適合させる容易さのため、ハイスループット解析において特に有用である。さらに、こうしたシステムは、複数の検出用試薬を組み込み、単一のバイオセンサーユニット内における診断用試薬の多重化を可能とするように適合させるのにも好都合である。これにより、少量の体液中の複数のタンパク質またはペプチドの同時的な検出が可能になる。
【０１８３】
エバネセント波バイオセンサーもまた、対照タンパク質の検出以前に生体試料をあらかじめ処理する必要がないので好ましい。エバネセント波バイオセンサーは、一般に、例えば、プローブ表面付近に付着され、標的ポリペプチドの抗体またはリガンドへの結合時に異なる波長で蛍光発光する蛍光抗体などの蛍光分子と相互作用する、あらかじめ定められた波長の光に依拠する。
【０１８４】
マイクロカンチレバーまたはナノカンチレバーによるバイオセンサーもまた、検出可能な標識の使用を必要としないので好ましい。カンチレバーによるバイオセンサーでは、マイクロカンチレバーまたはナノカンチレバーの屈曲性アーム表面に結合する対象解析物を特異的に検出可能なリガンドおよび／または抗体を用いる。対象解析物（例えば、ＯＰＲＳ１ポリペプチド内のマーカー）が結合すると、カンチレバーの屈曲性アームが垂直方向に（すなわち、上方または下方に）屈曲する。次いで、屈曲性アームの屈曲変化を、例えば、原子間力顕微鏡法、屈曲性アーム振動変化法、またはピエゾ抵抗変化法など各種の任意の方法により検出する。例示的なマイクロカンチレバーによるセンサーは、ＵＳＳＮ２００３００１００９７で説明される。
【０１８５】
タンパク質チップを作製するには、対象の特異的な抗体またはタンパク質に結合可能なタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、またはリガンドを、例えば、ガラス、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、二酸化ケイ素、金属、または窒化ケイ素などの固体支持体に結合させる。この固相化は、直接的（例えば、シッフ塩基形成、ジスルフィド結合、またはアミド結合もしくは尿素結合の形成などの共有結合による）または間接的なものであってもよい。タンパク質チップの作製法は当技術分野で知られており、例えば、米国特許出願第２００２０１３６８２１号、同第２００２０１９２６５４号、同第２００２０１０２６１７号、および米国特許第６，３９１，６２５号で説明される。タンパク質を固体支持体に結合させるためには、例えば、アルデヒド含有シラン試薬などにより表面上に化学反応基を創出するように、固体支持体を処理する必要があることが多い。あるいは、Ａｒｅｎｋｏｖら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２７８巻、１２３〜１３１頁、２０００年で説明される通り、抗体またはリガンドを微細加工されたポリアクリルアミドゲルパッド上でキャプチャーし、マイクロ電気泳動法を用いてゲル内へと加速化させることもできる。
【０１８６】
タンパク質チップは、1種類のみのタンパク質、リガンド、または抗体を含んでいてもよく、１つの対象ポリペプチドの存在について１つまたは複数の患者試料をスクリーニングするのに用いることができる。こうしたチップはまた、対象ポリペプチドについて患者試料のアレイを同時にスクリーニングするのにも用いることができる。
【０１８７】
タンパク質チップを用いて解析されるタンパク質試料は、例えば、当技術分野で知られる方法を用いて検出可能な蛍光分子、放射性分子、酵素、または抗体などのレポーター分子に付着させることが好ましい。したがって、タンパク質チップを標識された試料と接触させるステップと、その後洗浄して任意の未結合タンパク質を除去するステップとにより、例えば、ＤＮＡマイクロアレイリーダーを用いるなど、当技術分野で知られた方法を用いて、結合タンパク質の存在を検出する。
【０１８８】
あるいは、生体分子相互作用解析−質量分析（ＢＩＡ−ＭＳ）法を用いて、低ｆｍｏｌレベル〜ｆｍｏｌ未満のレベルにおける複合生体試料中に存在するタンパク質を迅速に検出し特徴づける（Ｎｅｌｓｏｎら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、第２１巻、１１５５〜１１６３頁、２０００年）。タンパク質チップ解析で有用な１つの技法は、タンパク質チップに結合したタンパク質を特徴づける表面増強レーザー脱離イオン化質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）法である。あるいは、米国特許出願第２００２０１３９７５１号に説明されるＥＳＩ法を用いてタンパク質チップを解析する。
【０１８９】
前出の議論から明らかとなる通り、抗体またはリガンドベースの検出システムを用いることは、こうしたアッセイがＯＰＲＳ１ポリペプチド内の神経変性疾患マーカーの検出に適するので、特に好ましい。イムノアッセイフォーマットは、特に、さらにより好ましい。
【０１９０】
ＯＰＲＳ１転写産物レベルの上昇または低下の検出
本発明者らはまた、ヌクレオチド変異、例えば、ＯＰＲＳ１遺伝子変異が、神経変性疾患に罹患する被験者におけるＯＰＲＳ１遺伝子転写産物の発現上昇または発現低下と関連することも示した。したがって、一実施形態では、被験者に由来する試料中のＯＰＲＳ１転写産物レベルの上昇または低下を検出するステップにより疾患または障害と関連するマーカーが検出され、前記ＯＰＲＳ１転写産物レベルの上昇または低下が、神経変性疾患および／または神経変性疾患に対する素因および／または被験者が神経変性疾患を発症する危険性の増大の指標となる。
【０１９１】
一例において、該方法は、例えば、配列番号５に示される配列を含み、位置８０におけるヌクレオチドがグアニンであり、位置８５におけるヌクレオチドがシトシンであり、位置６２６におけるヌクレオチドがシトシンである、天然のＯＰＲＳ１転写産物レベルの上昇または低下を検出するステップを含む。あるいは、該方法は、選択的スプライシングによって生じたＯＰＲＳ１転写産物レベルの上昇を検出するステップも含む。
【０１９２】
ＯＰＲＳ１遺伝子転写産物を検出する方法は上述の通りであり、変更すべき点は変更して、本発明の本実施形態に適用されると理解すべきである。例えば、ＯＰＲＳ１転写産物に選択的にハイブリダイズする核酸プローブを、被験者に由来する試料中の核酸に、中等度から高度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせるステップと、検出手段を用いてハイブリダイゼーションレベルを検出するステップとを含む工程を実施することによりＯＰＲＳ１転写産物レベルを決定し、ここで、前記プローブと前記試料中の核酸とのハイブリダイゼーションレベルが試料中のＯＰＲＳ１転写産物レベルの指標となる。
【０１９３】
一実施形態において、
（ｉ）被験者に由来する試料中のＯＰＲＳ１転写産物レベルを測定するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）におけるレベルを、適切な対照試料中のレベルと比較するステップと
を含む工程を実施することによりＯＰＲＳ１転写産物レベルの上昇または低下を検出し、ここで、（ｉｉ）と比較された（ｉ）におけるＯＰＲＳ１転写産物レベルの上昇または低下が、神経変性疾患および／または神経変性疾患に対する素因および／または被験者が神経変性疾患を発症する危険性の増大の指標となる。適切な対照試料は、本明細書で説明する通りである。
【０１９４】
ＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルの上昇または低下の検出
本発明者らはまた、ＯＰＲＳ１ポリペプチドの発現レベルが、神経変性疾患の発症と関連することも示した。
【０１９５】
したがって、一例において、神経変性疾患と関連するマーカーは、被験者に由来する試料中のＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルの上昇または低下を検出するステップにより検出され、前記ＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルの上昇または低下が、神経変性疾患および／または神経変性疾患に対する素因および／または被験者が神経変性疾患を発症する危険性の増大の指標となる。
【０１９６】
一例において、該方法は、例えば、配列番号６に示される配列であって、位置４におけるアミノ酸がアラニンである配列を含む天然のＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルの上昇または低下を検出するステップを含む。あるいは、該方法は、選択的スプライシングによって生じたＯＰＲＳ１転写産物によりコードされるＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルの上昇を検出するステップも含む。
【０１９７】
ポリペプチドの発現レベルを検出する方法は上述され、変更すべき点は変更して、本発明の本態様に適用されると理解すべきである。例えば、被験者に由来する生体試料を、ＯＰＲＳ１ポリペプチドに優先的または特異的に結合可能な抗体またはリガンドと、抗体／リガンド複合体またはリガンド−リガンド複合体が形成されるのに十分な時間および条件で接触させるステップと、次いで、複合体を検出するステップとを含む工程を実施することによりＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルを検出し、ここで、前記複合体レベルが被験者におけるＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルの指標となる。
【０１９８】
試料中のＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルの上昇または低下を検出または決定する方法は、好ましくは、
（ｉ）試料中のＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルを決定するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）におけるＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルを、適切な対照試料中のＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルと比較するステップと
を含む工程を実施するステップを含み、ここで、（ｉｉ）と比較された（ｉ）におけるＯＰＲＳ１ポリペプチドレベルの上昇または低下が、神経変性疾患および／または神経変性疾患に対する素因および／または被験者が神経変性疾患を発症する危険性の増大の指標となる。適切な対照試料は、当業者には明らかであろうし、かつ／または本明細書で説明されている。
【０１９９】
治療有効性のモニタリング
本明細書で説明される方法はまた、変更すべき点は変更して、神経変性疾患の治療有効性をモニタリングする方法にも適用されると理解すべきである。
【０２００】
一実施形態において、本発明では、神経変性疾患に関する治療を受けている被験者に対する治療有効性をモニタリングする方法であって、
（ｉ）神経変性疾患に罹患しこれに関する治療を受けている被験者に由来する試料中のＯＰＲＳ１発現産物の発現レベルを測定するステップと、
（ｉｉ）適切な対照試料中のＯＰＲＳ１発現産物の発現レベルを測定するステップと
を含み、（ｉｉ）と比較された（ｉ）におけるＯＰＲＳ１発現産物の同様の発現レベルが、該疾患または障害の治療に対して該治療が有効であることの指標となる方法が提供される。
【０２０１】
この点において、適切な対照試料は、正常および／もしくは健常な被験者に由来する試料、ならびに／または複数の正常および／もしくは健常な被験者中のＯＰＲＳ１発現産物の発現レベルに関する情報を含むデータベースである。
【０２０２】
生体試料
本発明の実施形態はゲノムＤＮＡ中のマーカーの検出に基づくので、ゲノムＤＮＡを含む任意の細胞または試料が、疾患もしくは障害、および／または疾患もしくは障害に対する素因を決定するのに有用である。細胞または試料は、ヒトに由来することが好ましい。有核細胞を含むことが好ましい。
【０２０３】
好ましい生体試料は、例えば、全血、血清、血漿、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、軟膜画分、唾液、尿、口腔細胞、尿、糞便物質、汗、または皮膚細胞を含む。
【０２０４】
好ましい実施形態において、生体試料は、白血球、より好ましくは、リンパ球を含む。
【０２０５】
さらに、ＯＰＲＳ１は広範に発現するので、任意の細胞または細胞を含む試料を用いて被験者の神経変性疾患に対する素因を決定することもでき、又は、該細胞がＯＰＲＳ１を発現する場合にＯＰＲＳ１発現産物の検出に基づいて疾患を診断することもできる。
【０２０６】
あるいは、生体試料は、羊水穿刺、絨毛膜サンプリング、胎児血液サンプリング（例えば、臍帯穿刺または経皮臍帯血サンプリング）、および他の胎児組織サンプリング（例えば、胎児皮膚生検）からなる群から選択される方法を用いて単離される細胞である。こうした生体試料は、発達する胚の神経変性疾患に対する素因を判定するのに有用である。
【０２０７】
当業者には明らかとなる通り、生体試料のサイズは、用いられる検出手段に依存する。例えば、ＰＣＲ法または単一ヌクレオチドプライマー伸長法などのアッセイを、例えば、単一の細胞を含む試料に対して実施することもできるが、より多数の細胞が好ましい。核酸検出の代替的な形態では、単一の細胞よりも著明に多くの細胞が必要となりうる。さらに、タンパク質ベースのアッセイでは、抗原ベースのアッセイに十分なタンパク質を提供するのに十分な細胞が必要となる。
【０２０８】
生体試料は、被験者にあらかじめ由来するか、または被験者からあらかじめ単離されているか、もしくは被験者からあらかじめ得られていることが好ましい。したがって、本発明ではまた、ｅｘ  ｖｉｖｏでの方法も提供される。一実施形態において、本発明の方法は、生体試料を単離するステップ、生体試料を得るステップ、または生体試料を提供するステップもさらに含む。
【０２０９】
一実施形態において、該方法は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはタンパク質などの生体試料からの抽出物を用いて実施される。
【０２１０】
本発明はまた、疾患または障害と関連するＯＰＲＳ１遺伝子中のマーカーを細胞内に検出すること（例えば、免疫蛍光法を用いる）も含むので、「生体試料」という用語はまた、解析用に加工されていてもいなくても、１つまたは複数の細胞を含む試料も含む。
【０２１１】
前出の説明から明らかとなる通り、こうしたアッセイでは、例えば定量化に適切な対照、例えば、正常な個体または典型的な集団の使用が必要となりうる。
【０２１２】
本明細書で用いられる「正常な個体」という用語は、ＯＰＲＳ１遺伝子もしくはその発現産物を含む、該遺伝子もしくはその発現産物からなる、または該遺伝子もしくはその発現産物内にあり、神経変性疾患と関連するマーカーを含まないかまたは発現せず、また、神経変性疾患にも罹患しないことに基づき、該被験者が選択されることを意味するものとする。
【０２１３】
例えば、正常な被験者は、例えば、臨床的解析を用いて、神経変性疾患のいかなる形態も有さないと診断されている。例えば、被験者は、神経心理検査（例えば、ウェクスラー成人知能評価検査、ＭＤＲＳ検査、またはＧＤＳ検査）、ＥＥＧ、ＣＡＴスキャン、またはＭＲＩスキャンを用いて、神経変性疾患について検査することができる。
【０２１４】
その代わりに、またはそれに加えて、適切な対照試料は、神経変性疾患に罹患しないことが知られる典型的な被験者集団についてアッセイされているマーカーの測定値を含む対照データセットである。該被験者は、こうした疾患を発症する危険性を有さず、特に、該被験者は、該疾患の家族歴を有さないことが好ましい。
【０２１５】
本文脈において、疾患もしくは障害に罹患することがなく、かつ／または神経変性疾患マーカーを含むもしくは発現することがないと知られる被験者に関しての「典型的な集団」という用語は、例えば、神経変性疾患を診断する既知の方法を用いて検査され、該疾患に罹患しないと判定され、かつ／または該疾患マーカーの存在もしくは不在を判定するように検査された被験者の集団または試料を指すと理解すべきであり、このような被験者は、正常および／もしくは健常な被験者、または該疾患に罹患しないことが知られる被験者の集団の代表的なものである。
【０２１６】
多くの疾患が量的形質であることを踏まえれば、被験者が疾患に罹患しながら、本明細書に記載の疾患マーカーを含まないこともありこれを発現しないこともある。あるいは、被験者が疾患に罹患しないながらも、なお本明細書に記載のマーカーを含むこともありこれを発現することもある。しかし、本発明に適する対照試料は、疾患に罹患せず、疾患マーカー（例えば、本明細書に記載の）を含むまたは発現することのない被験者に由来する試料である。
【０２１７】
一実施形態において、基準試料はアッセイに含まれない。その代わりに、適切な基準試料は、典型的な集団からあらかじめ生成されて確立されたデータセットに由来する。次いで、検査試料を加工するステップ、解析するステップ、および／またはアッセイするステップに由来するデータを、試料集団について得られたデータと比較する。
【０２１８】
集団を代表するように、十分に多数の基準試料から得られたデータにより、特定のパラメータの平均レベルを決定するデータセットの生成が可能となる。したがって、任意の個体集団、および該個体に由来する任意の試料、アッセイされる試料について決定される発現産物レベルとのその後の比較について、神経変性疾患または神経変性疾患に対する素因を診断する発現産物量を決定することができる。こうした標準化されたデータセットが信頼性を有するため、実施される各アッセイにおいて、ばらつきを制御するために内部対照を含めることが好ましい。
【０２１９】
疾患または障害と関連するマーカーを決定する方法
一実施形態において、本発明の方法は、ＯＰＲＳ１遺伝子または該発現産物と神経変性疾患との間の関連を判定するステップをさらに含む。
【０２２０】
さらに、ヒトＯＰＲＳ１遺伝子の神経変性疾患への密接な関連、および神経変性疾患と関連する複数のマーカーの提供を踏まえ、本発明では、神経変性疾患の新規のマーカーを同定する方法もさらに提供される。
【０２２１】
したがって、本発明では、神経変性疾患と関連するマーカーを同定する方法であって、
（ｉ）ＯＰＲＳ１遺伝子またはその発現産物中の多型または対立遺伝子または変異を同定するステップと、
（ｉｉ）すべてのメンバーが多型または対立遺伝子または変異を含むわけではない被験者の一団を解析して、神経変性疾患に罹患している被験者を決定するステップと、
（ｉｉｉ）神経変性疾患の発症のばらつきを判定するステップであって、前記ばらつきにより、前記多型または対立遺伝子または変異が神経変性疾患または被験者の神経変性疾患に対する素因と関連することが示されるステップと
を含む方法がさらに提供される。
【０２２２】
マーカーと疾患、障害、および／または表現型との関連を判定する方法は当技術分野で知られており、例えば、Ｋｉｎｇ（編）、Ｒｏｔｔｅｒ（編）、およびＭｏｔｕｌｓｋｉ（編）、「Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ社、第２版、ＩＳＢＮ０１９５１２５８２７、ならびにＭｉｌｌｅｒおよびＣｒｏｎｉｎ（編）、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ社、第１版、ＩＳＢＮ０７４８４０８２２３で概説される。
【０２２３】
一般に、マーカー（例えば、多型および／または対立遺伝子および／またはスプライシング形態および／または変異）と疾患、障害、または表現型との間の関連を判定するステップは、特定の遺伝子座における多型、対立遺伝子、スプライシング形態、または変異の頻度を、血縁関係のない罹患個体（すなわち、対象表現型を含む、かつ／または対象疾患／障害に罹患する個体）の試料と、正常な集団における対立遺伝子分布を表す適切な対照との間で比較するステップを伴う。
【０２２４】
複数の方法が、マーカーと疾患、障害、および／または表現型との関連を判定するのに有用である。しかし、任意のこうした研究では、例えば、偽陽性の結果をもたらしうる集団の層別化などの困難を回避する複数のパラメータを考慮すべきである。
【０２２５】
集団の層別化は、対立遺伝子頻度の異なる複数のサブグループが集団内に存在する場合に生じる。サンプリングされたサブグループにおける潜在的な対立遺伝子頻度の違いは、各群内における疾患、障害、および／または表現型とは無関係であることもあり、結果として、連鎖不平衡または関連についての誤った結論をもたらすこともある。
【０２２６】
一般に、集団層別化の問題は、適切な対照試料を用いることにより回避される。例えば、疾患、障害、および／または表現型を有する血縁関係のない発端者群と、互いに対してまたは発端者に対して血縁関係はないが、遺伝子型（例えば、性別、人種、および／または年齢）に影響しうる重要な変数（罹患状況以外の）に関して発端者群とマッチしている対照（比較）個体群との間で比較がなされる、症例比較に基づくデザインを用いうる。
【０２２７】
あるいは、対照をスクリーニングして、対象の疾患、障害、および／または表現型に関する個人的な既往歴（および／または対象の疾患、障害、および／または表現型に関する家族歴）を有する被験者を除外する。こうした「超健常」対照群は、対象の疾患、障害、および／または表現型に罹患しない個体の対立遺伝子分布を表す。
【０２２８】
あるいは、単独で確認された発端者の両親の非伝達性対立遺伝子を、該発端者がそこからサンプリングされた対立遺伝子の無作為試料として用いる、家族ベース関連による方法を用いうる。こうした非伝達性対立遺伝子を用いて、マッチした対照試料を構築する。
【０２２９】
家族ベース関連による方法の１つの拡張である伝達不平衡検定（ＴＤＴ）法では、マーカー対立遺伝子の罹患個体への、偶然に予測される伝達を上回る過度の伝達について検定するマクネマー統計を用いる（Ｓｐｉｅｌｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第５２巻、５０６〜５１６頁、１９９３年）。基本的に、ＴＤＴ法では、疾患、障害、または表現型と関連する対立遺伝子および／または多型および／またはスプライス変異型に関してヘテロ接合である両親を考察し、対立遺伝子および／または多型および／またはスプライス変異型もしくはその選択型が罹患する子供に伝達される頻度を評価する。ヘテロ接合の両親の遺伝子型のみを調べることにより、ＴＤＴ法では、連鎖した遺伝子座間における関連の検定が提供され、結果として、集団層別化の存在下における連鎖しない遺伝子座間の偽の関連が回避される。
【０２３０】
ＴＤＴ法はさらに洗練され、例えば、多重対立遺伝子マーカー（ＳｈａｍおよびＣｕｒｔｉｓ、Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第５９巻、３２３〜３２６頁、１９９５年）、家族内の複数同胞（ＳｐｉｅｌｍａｎおよびＥｗｅｎｓ、Ａｍ．Ｊ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第６２巻、４５０〜４５８頁、１９９８年）、両親の欠如データ（Ｃｕｒｔｉｓ、Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第６１巻、３１９〜３３３頁、１９９７年）、および量的形質（Ａｌｌｉｓｏｎ、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第６０巻、６７６〜６９０頁、１９９７年、およびＭａｒｔｉｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第６７巻、１４６〜１５４頁、２０００年）が説明されるようになった。
【０２３１】
一般に、関連の解析は、対象の疾患／障害、および／または表現型に罹患する被験者内における１つまたは複数の対立遺伝子および／または多型および／またはスプライス変異型の非無作為的分布を検出する検定である。検定集団と適切な対照集団との間の比較は、対立遺伝子および／または多型が連鎖する遺伝子座は表現型に対して影響を及ぼさないという帰無仮説下で行い、ここから公称のｐ値が得られる。症例対照研究を用いる２対立遺伝子の多型または変異（例えば、ＳＮＰ）の解析には、２×２の分割表（対立遺伝子の解析用）または３×２の分割表（遺伝子型の解析用）に関するカイ２乗解析法（または同等の検定法）を用いる。
【０２３２】
家族ベースの関連研究を用いる解析では、各発端者の家族メンバーに由来するマーカーデータを用いて、予測される帰無分布を推定し、観察されるデータを予測されるデータと帰無仮説下で比較する適切な統計学的検定を行う。
【０２３３】
マーカーと疾患／障害、および／または表現型との関連の解析に有用な別の方法は、ゲノム対照法（ＤｅｖｌｉｎおよびＲｏｅｄｅｒ、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ、第５５巻、９９７〜１００４頁、１９９９年）である。候補対立遺伝子／多型の症例対照解析では、遺伝子対照法により、帰無遺伝子座および候補遺伝子座の両方についてのカイ２乗検定統計量を計算する。集団の層別化および／または被験者間における未測定の遺伝子的関連が存在する場合、帰無遺伝子座について観察される検定統計量のばらつきおよび／または大きさが増大する。次いで、このデータを用いて、候補遺伝子座についての有意性検定の臨界値を調整するのに用いる乗数を導出する。この方式では、遺伝子対照により、偽陽性率の上昇なしに層別化された症例対照データの解析が可能となる。
【０２３４】
構造化関連法（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第６７巻、１７０〜１８１頁、２０００年）では、候補遺伝子座と連鎖しないマーカー遺伝子座を用いて、部分集団への帰属を推測する。潜在クラス解析を用いて、集団部分構造の影響を制御する。基本的には、帰無遺伝子座を用いて、部分集団数および被験者の各部分集団への帰属確率を推定する。したがって、この方法により、集団部分構造の結果としての対立遺伝子／多型頻度の変化を説明することができる。
【０２３５】
その代わりに、またはそれに加えて、特定の遺伝子または遺伝子産物が対象の疾患、障害、または表現型に関与する可能性が高い場合は、ベイズ統計法を用いて、該遺伝子の対立遺伝子および／または多型と対象の疾患、障害、または表現型との間の関連の有意性を判定しうる。こうした手法では、検討される遺伝子座が対象の疾患、障害、または表現型に関与する事前確率が考慮される（例えば、Ｍｏｒｒｉｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第６７巻、１５５〜１６９頁、２００１年）。
【０２３６】
市販されるソフトウェアを用いて、対立遺伝子および／または多型および／またはスプライシング形態と、疾患もしくは障害または疾患もしくは障害に対する素因との間の関連を決定する。こうしたソフトウェアは、例えば、以下：
（ｉ）複合形質の多変量解析法を含む、複合形質解析（ＡＣＴ）プログラム。ＡＣＴプログラムは、Ａｍｏｓら、Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第６０巻、１４３〜１６０頁、１９９６年、およびＡｍｏｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第５４巻、５３５〜５４３頁、１９９４年で報告された研究に基づく；
（ｉｉ）ＡＤＭＩＸＭＡＰプログラム：マーカー遺伝子型と混合集団に由来する個体の形質データとを用いて混合をモデル化する汎用プログラムで、個体および集団レベルでの混合を推定し、症例対照研究、断面研究、またはコホート研究における疾患の危険性と個体の混合との間の関係を検定し、疾患危険性の人種的違いの基礎をなす遺伝子の位置を混合マッピングにより同定し、遺伝子関連研究における集団構造（個体混合のばらつき）を制御して非連鎖遺伝子との関連を除去するのに有用である；
（ｉｉｉ）ＡＮＡＬＹＺＥプログラム：関連性のパラメトリック検定およびノンパラメトリック検定の両方を容易にする、ＬＩＮＫＡＧＥプログラムの付属プログラム；
（ｉｉｉ）ＢＡＭＡ（多重遺伝子座関連ベイズ解析）プログラム：多数の候補配列中からマーカーの形質関連サブセットを選択するのに有用；
（ｉｖ）ＣＬＵＭＰプログラム：多重対立遺伝子マーカーを伴う症例対照関連研究の有意性を評価するモンテカルロ法；
（ｖ）ＥＴ−ＴＤＴ（系統樹−伝達不平衡検定）プログラム、およびＴＤＴ検定の拡張であるＥＴＴＤＴ（拡張伝達不平衡検定）プログラム；
（ｖｉ）ＦＢＡＴ（家族ベース関連検定）プログラム：家族ベースの対照を用いることにより、疾患表現型とハプロタイプとの間の関連／連鎖を検定するのに有用
を含む。
【０２３７】
上述の任意の方法を用いて決定されるマーカーは、ＯＰＲＳ１遺伝子または発現産物内に存在し、神経変性疾患と関連することが好ましい。
【０２３８】
以下の非限定的な実施例において本発明をさらに説明する：
【実施例１】
【０２３９】
第９染色体上におけるＦＴＬＤ遺伝子座の同定
１．１  神経病態
同意を伴う剖検時に、患者ＩＩＩ：２、ＩＩＩ：３、およびＩＩＩ：１２の脳および患者ＩＩＩ：１２の脊髄を得た。ＩＩＩ：３の脳全体、ＩＩＩ：１２の左脳半球および脊髄、ならびにＩＩＩ：２の左脳半球を、１５％の緩衝ホルマリン液中で少なくとも２週間にわたり固定した。各症例については、剖検時に免疫組織化学スクリーニングを含む通常の神経病理学的評価を実施したが、本試験用に再検討し標準化した。固定された組織に対する通常の目視評価の後、前頭皮質、頭頂皮質、後頭皮質、および辺縁皮質、海馬、大脳基底核、視床、視床下部、中脳、橋、延髄、ならびに小脳からブロックを切り出した。患者ＩＩＩ：１２の場合、各脊髄セグメントからなるブロックもまた切り出した。すべての組織ブロックをパラフィン包埋し、ミクロトームで７ミクロンに切り、生理食塩液処理したスライド上に載せた。通常の染色法には、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色法、ミエリン染色法、および銀（ビールショウスキー）染色法が含まれた。すべての症例について、タウ（米国、ＰＩＥＲＣＥ社製、ＭＮ１０２０；１：１０，０００／クレシルバイオレットに希釈）、ユビキチン（デンマーク、ＤＡＫＯ社製、Ｚ０４５８；ｌ：２００／クレシルバイオレットに希釈）、Ａβおよびα−シヌクレイン（米国、Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ社製、６１０７８７；ｌ：２００／クレシルバイオレットに希釈）に対する抗体を用いて、標準化された免疫ペルオキシダーゼスライドの遡及的検討を、既に説明された（Ｈａｌｌｉｄａｙら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐｔｈｏｌ．、第９０巻、６８〜７５頁、１９９５年）通りに行った。最終的な診断を決定するために、ＡＤ（ＨｙｍａｎおよびＴｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ、第５６巻、１０９５〜１０９７頁、１９９７年）、レビー小体認知症（ＭｃＫｅｉｔｈら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、第６５巻、１８６３〜１８７２頁、２００５年）、ＦＴＬＤ（Ｃａｉｒｎｓら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ、第１１４巻、５〜２２頁、２００７年）、ＭＮＤ（Ｂｒｏｏｋｓ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．、第１２４巻、増刊号、９６〜１０７頁、１９９４年）、ならびに大脳前頭基底核変性（Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、第６１巻、９３５〜９４６頁、２００２年）、進行性核上麻痺（Ｈａｕｗら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、第４４巻、２０１５〜２０１９頁、１９９４年）、および血管性認知症（Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．、第２５７巻、４４〜４８頁、２００７年）を含む他の神経変性症候群に関する最新の診断基準を用いて、すべての症例をスクリーニングした。
【０２４０】
１．２  ＴＤＰ−４３免疫陽性封入体の評価
南オーストラリア脳バンクから、上前頭皮質および海馬のパラフィン包埋した７ミクロンの切片の他、個体ＩＩＩ：１２の脊髄切片を得た。市販される抗体（米国、ＰＴＧ社製、ＢＯ００１４８７；１：５００に希釈）を用いるマイクロ波による抗原賦活（ｐＨ６．０の０．２Ｍクエン酸緩衝液中で３分間にわたり切片を煮沸した）、ペルオキシダーゼによる可視化、および０．５％クレシルバイオレットによる対比染色の後、ＴＤＰ−４３タンパク質を可視化した。前頭皮質の第ＩＩ層ニューロンおよび海馬顆粒細胞内におけるＴＤＰ−４３免疫反応性タンパク質の沈着異常の場所は、細胞質、核内、または神経突起であった。これらの特徴を用いて、Ｓａｍｐａｔｈｕら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、第１６９巻、１３４３〜１３５２頁、２００６年に従い、症例を組織学的亜型に分類した。同様の免疫組織学的方法を用い、市販される抗体（米国、ＺＹＭＥＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、３２−３６００；１：５０に希釈）および０．５％クレシルバイオレットによる対比染色を用いて、α−インターネクシン陽性封入体を同定した。
【０２４１】
１．３  遺伝子試験
書面によるインフォームドコンセントを得た後で、１６例の家族メンバー（うち７例が罹患）から採血し、ＤＮＡを抽出した。コード領域および５０塩基対の隣接するイントロン配列に対する直接的なＤＮＡ配列決定を実施して、既知の認知症遺伝子およびＭＮＤ遺伝子（ＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、ＭＡＰＴ、ＶＣＰ、ＰＧＲＮ、ＩＦＴ７４、ＣＨＭＰ２Ｂ、およびＳＯＤ１）をスクリーニングした。
【０２４２】
ＳＩＭＬＩＮＫ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１２を用いるシミュレーション解析を実施して、家系の連鎖検出力（ＰｌｏｕｇｈｍａｎおよびＢｏｅｈｎｋｅ、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、第４４巻、５４３〜５５１頁、１９８９年）を評価した。対数オッズ（ＬＯＤ）スコアの推定最大値は、すべての臨床的変異型が罹患していると仮定した場合に、対立遺伝子頻度が同等な３つの対立遺伝子を有する単一のマーカーについての１０００回のシミュレーションに基づいた。
【０２４３】
１６例の個体に由来するＤＮＡに対する１０ｃＭにわたるゲノム規模のスキャンが、ＡＢＩ−４００セット（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ連鎖マッピングセット、ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．５、ＭＤ−１０）によるマイクロサテライトマーカーを用いて、オーストラリアゲノム研究所（ＡＧＲＦ）により実施された。ＬＩＮＫＡＧＥ  ５．２パッケージ中のコンピュータプログラムであるＭＬＩＮＫおよびＬＩＮＫＭＡＰを用いて、パラメトリックで対応のある多点ＬＯＤスコアを計算した。年齢依存的な浸透度、０．００５の表現型模写率、０．００１の疾患遺伝子頻度、および同等の対立遺伝子頻度により、常染色体優性の遺伝が仮定された。１％の浸透度―年齢＜２５歳、８％の浸透度―２６〜３４歳、２２％の浸透度―３５〜４４歳、４６％の浸透度―４５〜５４歳、７１％の浸透度―５５〜６４歳、９１％の浸透度―６５〜７４歳、および９５％の浸透度―年齢＞７５歳を有する家系データに基づき、７つの易罹患性クラスが確立された。罹患例では発症年齢、無症状例では最終通院年齢に基づき、個体を易罹患性クラスに割り当てた。平均ヘテロ接合度が０．７９で、間隔が２ｃＭを超えないマイクロサテライトマーカーを用いて、高解像度の精細マッピングを実施した。マーカーは、マーシュフィールド医学研究財団による遺伝子フレームワークマップから選択された。
【０２４４】
プライマーはＦＡＭにより蛍光標識し、標準的なプロトコールに従いＰＣＲ法を実施した。増幅された産物は、ニューサウスウェールズ大学ラマチョッティセンターのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製３７３０型ＤＮＡアナライザーにかけ、ＡＢＩソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ  ２．５およびＧｅｎｅＳｃａｎ  ３．１）を用いて解析した。不一致率の高いマーカーは解析から除去した。Ｍｅｒｌｉｎ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０１）を用いてハプロタイプを構築し、手作業で２回点検し、ＨａｐｌｏＰａｉｎｔｅｒ  Ｖ．０２９．５（ＴｈｉｅｌｅおよびＮｕｒｎｂｅｒｇ、２００５年）を用いて表示した。個体ＩＩＩ：５のハプロタイプは、その配偶者および子供から推測した。
【０２４５】
１．４  結果
罹患したメンバーの臨床的および神経病理学的検討
１１例の家族メンバーがＦＴＬＤ−ＭＮＤに罹患するアングロ−ケルト系のオーストラリア人家族を同定した（図１）。３世代にわたり、５例の家族メンバー（ＩＩ：２、ＩＩＩ：３、ＩＩＩ：５、ＩＩＩ：７、ＩＶ：１）が、ＦＴＬＤの行動変異型と符合する症状を示し、１例（ＩＩＩ：３）では組織病態が確認された。別の２例の家族メンバー（ＩＩＩ：８、ＩＩＩ：１２）は、ＭＮＤと符合する延髄および四肢の進行性衰弱を示し、１例（ＩＩＩ：１２）では組織病態が確認された。２例の家族メンバーが、ＦＴＬＤの特徴とＭＮＤの特徴との複合を示した（ＩＩ：５、ＩＩＩ：６）。１例の家族メンバーが、健忘性臨床像を示したが、また、剖検時のＴＤＰ−４３免疫染色が陽性であることも分かった（ＩＩＩ：２）。他の１例の家族メンバーが早期発症型認知症を示し（ＩＩ：７）、ＭＮＤに罹患している息子（ＩＩＩ：１２）を有していた。１１例の罹患した家族メンバーのうち、２例はまた、その疾患発症期であるその中年期に偏執性妄想も発症した（ＩＩＩ：６およびＩＩＩ：８）。発症年齢は４３〜６８歳の範囲であり、死亡年齢は４６〜７５歳であった。
【０２４６】
家系メンバーの変異スクリーニング
発端者（ＩＩＩ：３）、ＩＩＩ：６、ＩＩＩ：１２、およびＩＩＩ：１に由来するＤＮＡを、既知の認知症遺伝子およびＭＮＤ遺伝子のコード領域および隣接するイントロン配列に対するＤＮＡ配列解析に付した。既知の認知症遺伝子、すなわち、ＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、ＭＡＰＴ、ＰＧＲＮ、ＶＣＰ、ＣＨＭＰ２Ｂ、または１ＦＴ７４遺伝子中には変異が検出されなかった。ＳＯＤ１遺伝子もまた、個体ＩＩＩ：８およびＩＩＩ：１２では、変異は陰性であった。
【０２４７】
原因遺伝子座の染色体９ｐへの連鎖
ＳＩＭＬＩＮＫを用いる検定力の計算によれば、家族１４の家系（図１）から得ることのできる２点ＬＯＤスコアの理論的最大値は３．１７であり、ＬＯＤスコアの予測平均値は１．２３である。ＡＢＩ連鎖マッピングセットＩＩによる４００種類のマーカーを用いるゲノム規模の連鎖解析を、１６例の家系メンバー（そのうちの一部は、倫理的な理由により家系図に含まれていない）に対して行った。７例の個体が罹患者として分類され、１例が、ＦＴＬＤの前駆的特徴の可能性がある精神症に罹患していたため、未詳と分類された。
【０２４８】
２２の常染色体について入手可能なすべてのマイクロサテライトデータをＶｉｎｃｅｎｔデータベース（ガーバン医学研究所）にアップロードしてファイルを作成し、ＬＩＮＫＡＧＥパッケージ（ＭＬＩＮＫおよびＬＩＮＫＭＡＰ）を用いる統計学的解析を可能とした。単一の遺伝子座がすべての臨床的変異型の原因となると考える連鎖解析を実施した。
【０２４９】
ゲノム全体にわたり、連鎖を示唆する２．０の確立されたカットオフ値を超える２点ＬＯＤスコアを有する唯一の領域は、第９染色体に位置した。マーカーＤ９Ｓ１６１（９ｐ２ｌ．３）により、ＬＯＤスコアの最大値２．５７が与えられた。３つの隣接するマーカーもまた、正のＬＯＤスコアを有し、最も近接するマーカーＤ９Ｓ１８１７は、最大のＬＯＤスコア０．９９を有していた。第９染色体以外の染色体上で最大のＬＯＤスコアは、３ｐ１４．３上の１．４０であった。その他の染色体では、他のすべてのＬＯＤスコアはすべて一貫して負または無視できる値であり、これを用いて、ＭＮＤと連鎖する遺伝子座として報告される他の遺伝子座、すなわち、２ｐ１３、１５ｑ１５〜ｑ２２、１８ｑ、１６ｑ、および２０ｑ１３を除外した。これらの結果は、該家系が染色体９ｐのＦＴＬＤ−ＭＮＤ遺伝子座と連鎖しうることを示す。
【０２５０】
染色体９ｐの候補領域を、Ｄ９Ｓ１６１およびＤ９Ｓ１８１７の周囲にある８つのさらなるマーカー（Ｄ９Ｓ２５９、Ｄ９Ｓ１６９、Ｄ９Ｓ３１９、Ｄ９Ｓ１１１８、Ｄ９Ｓ３０４、Ｄ９Ｓ１８４５、Ｄ９Ｓ１８０５、Ｄ９Ｓ１６３）により高解像度精細マッピングにかけ、ＭＬＩＮＫを用いてデータを再解析した。これにより、マーカーＤ９Ｓ３１９において、著明な２点ＬＯＤスコア３．２５が得られた。この連鎖を確認し、９５％の信頼区間を同定するため、マーカーＤ９Ｓ２５９、Ｄ９Ｓ１６９、Ｄ９Ｓ１６１、Ｄ９Ｓ３１９、Ｄ９Ｓ１１１８、Ｄ９Ｓ１８４５、Ｄ９Ｓ１８１７、Ｄ９Ｓ１６３、Ｄ９Ｓ２７３、Ｄ９Ｓ１７５、およびＤ９Ｓ１６７により、多点パラメトリック連鎖解析を実施した。マーカーＤ９Ｓ３１９において、多点ＬＯＤスコアのピーク値３．７９が得られた。Ｚｍａｘ−１スコアにより定義される９５％の信頼区間により、マーカーＤ９Ｓ１６９およびＤ９Ｓ２７３を境界とする１２ｃＭの領域が同定された。
【０２５１】
検出された連鎖の信頼性をさらに評価し、組み換えの切断点を決定するため、Ｍｅｒｌｉｎを用いてハプロタイプを構築した（図１）。組み換え切断点は、２例の罹患個体により定義した。テロメア側の境界は、個体ＩＩ：２のマーカーＤ９Ｓ１６９とＤ９Ｓ１６１との間で見られる組み換え事象により明示された。セントロメア側の境界は、個体ＩＩＩ：８における単一の交差により定義された。しかし、マーカーＤ９Ｓ１１１８およびＤ９Ｓ３０４が共に対立遺伝子「２」に対してホモ接合性であり、疾患ハプロタイプから除外できなかったので、正確な組み換え切断点は決定できなかった。交差は、マーカーＤ９Ｓ３０４とＤ９Ｓ１８４５との間で検出された。すべての罹患する個体は、５．９Ｍｂの物理的距離に対応する９．６ｃＭの領域に広がる４つの隣接するマーカー（Ｄ９Ｓ１６１−Ｄ９Ｓ３１９−Ｄ９Ｓ１１１８−Ｄ９Ｓ３０４）からなる同一のハプロタイプを共有する。
【０２５２】
上述の最小疾患領域は、個体ＩＩ：２における組み換え事象（マーカーＤ９Ｓ１６９とＤ９Ｓ１６１との間における）および個体ＩＩＩ：８におけるセントロメア側の組み換え（マーカーＤ９Ｓ３０４とＤ９Ｓ１８４５との間における）により定義した。この領域は、ＵＣＳＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのページ［ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ］により列挙され、Ｃ９ｏｒｆ１１（ＡＣＲ形成関連因子）、ＭＯＢＫＬ２Ｂ、ＩＦＮＫ、ｃ９ｏｒｆ７２、ＬＩＮＧＯ２、ＡＣＯ１、ＤＤＸ５８、ＴＯＰＯＲＳ、ＮＤＵＦＢ６、ＴＡＦ１Ｌ、ＡＰＴＸ、ＤＮＡＪＡ１、ＳＭＵ１、およびＢ４ＧＡＬＴ１からなる１４の既知の遺伝子を含む。１１の候補遺伝子（ＴＡＦ１Ｌ、ＳＭＵ１、およびＢ４ＧＡＬＴ１を除く）のエキソンのコード配列および非コード配列、ならびに隣接するイントロン領域を、ゲノム鋳型から増幅されたＰＣＲ産物に対する直接的な配列決定によりスクリーニングした。ＭＯＢＫＬ２Ｂ、ＬＩＮＧＯ２、ＡＣＯ１、およびＤＤＸ５８をスクリーニングした後で、１１の既知の多型（ＭＯＢＫＬ２Ｂ：ｒｓ３４９５９３３８、ｒｓ１２３７９１５４；ＬＩＮＧＯ２：ｒｓ２３８３７６８、ｒｓ１３２９６４８９、ｒｓ１０９６８４６０；ＡＣＯ１：ｒｓ３４３１９８３９、ｒｓ３７８０４７３、ｒｓ３５３７０５０５、ｒｓ１２９８５；ＤＤＸ５８：ｒｓ３７３９６７４、ｒｓ１０８１３８３１）および１つの新規のヌクレオチド置換（ＣＧＴからＣＡＴへ；ＤＤＸ５８におけるＡｒｇ７ｌＨｉｓ）が検出された。これらを用いて有用なＳＮＰハプロタイプを作成し、セントロメア側の組み換え切断点をさらに精細にマップし、これをＤ９Ｓ１１１８とＤ９Ｓ３０４との間に移動させた。これにより、４つの既知の遺伝子（ＩＦＮＫ、ＬＩＮＧＯ２、ＭＯＢＫＬ２Ｂ、Ｃ９ｏｒｆ１１（ＡＣＲ形成関連因子））、および仮説的なタンパク質ｃ９ｏｒｆ７２が残った。これら５つの各候補遺伝子のエキソンのコード配列および非コード配列、ならびに隣接するイントロン領域を、ゲノム鋳型から増幅されたＰＣＲ産物に対する直接的な配列決定によりスクリーニングした。エキソンのコード配列および非コード配列に対する変異スクリーニングに加え、２つのさらなる方法を用いて、５つの遺伝子／転写産物の各々を解析した。本発明者らは、リンパ球および脳の転写産物に対するＲＴ−ＰＣＲ法およびアガロースゲル電気泳動法により、正常個体と罹患個体との間で、選択的スプライシングまたはスプライシング異常に違いが存在するかどうかを判定した。本発明者らはまた、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いる定量的ＰＣＲ法により、ゲノムＤＮＡ鋳型中の遺伝子コピー数に違いが存在する可能性があるかどうかも判定した。候補遺伝子中において、コード変異は検出されなかった。候補遺伝子の転写産物に対するＲＴ−ＰＣＲ法により、スプライシングの変化または小規模の欠失が検出されることはなかった。しかし、予備データにより、個体ＩＩＩ：８のみにおいてであるが、定量的ＰＣＲ法により定義されるＬＩＮＧＯ２遺伝子およびｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の遺伝子コピー数が変化したことが示唆される。これらの結果は、ＩＩＩ：８が表現型模写（すなわち、表現型が、家族性遺伝子変異の遺伝以外の手段により生じる）であり、個体ＩＩＩ：８により定義されるセントロメア側の組み換え切断点（Ｄ９Ｓ１１１８とＤ９Ｓ３０４との間）は不正確であることを示す。被験者ＩＩＩ：８の表現型模写状態に対する可能な説明は、ＬＩＮＧＯ２遺伝子およびｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の遺伝子コピー数の変化でありうる。
【０２５３】
次いで、ＩＩＩ：８を除外し、ＬＩＮＫＡＧＥプログラムと正常なオーストラリア人個体のコホートに由来する対立遺伝子頻度とを用いて、５つの易罹患性クラスを伴う常染色体優性モデル下において、データの再解析を行った。単一の領域のみが、マーカーＤ９Ｓ１８１７に対する著明な２点ＬＯＤスコア３．５４を達成した。したがって、改訂最小疾患領域は、マーカーＤ９Ｓ１６１〜Ｄ９Ｓ１７５を含み、既に報告された第９染色体のＦＴＤ／ＭＮＤ連鎖領域のすべてにオーバーラップする、染色体領域９ｐ２１〜９ｑ２１上の３０ｃＭに及ぶものである。
【実施例２】
【０２５４】
オピオイド受容体シグマ１（ＯＰＲＳ１）遺伝子中のマーカーの神経変性疾患マーカーとしての同定
実施例１で同定された改訂候補領域内の３０の遺伝子を解析して、これらの遺伝子が、認知症と関連する多型または変異を含むかどうかを判定した。これらの遺伝子は、ＵＢＥ２Ｒ２、ＤＮＡＪＡ１、ＰＡＸ５、ＣＮＴＮＡＰ３、ＧＤＡ、ＤＮＡＩ１、ＣＮＴＦＲ、ＤＣＮＴ３、ＩＬＩＩＲＡ、ＧＡＬＴ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２７、ＡＲＩＤ３Ｃ、ＴＬＮ１、ＭＯＢＫＬ２Ｂ、ＨＩＮＴ２、ＡＱＰ３、ＵＢＡＰ１、ＡＬＤＨ１Ｂ１、ＰＬＡＡ、ＩＦＮＫ、Ｐ２３、ＵＮＩＱ４７０、ＵＢＡＰ２、ＴＯＰＯＲＳ、ＮＤＵＦＢ６、ＡＰＴＸ、ＢＡＧ１、およびＯＰＲＳ１を含んだ。複数の候補遺伝子において多型が検出された。しかし、オピオイド受容体シグマ１（ＯＰＲＳ１）遺伝子は、家族１４における疾患表現型と共に共分離する非多型性のヌクレオチド変異を有していた（図２）。
【０２５５】
ＯＰＲＳ１の３’側非翻訳領域（ヌクレオチド７２３）中のＧからＴへのヌクレオチド変異が、家族１４家系において検出された（図２）。ＯＰＲＳ１のＧ７２３Ｔ変化は、ＥＯＡＤ１４における疾患ハプロタイプと共に分離する。Ｇ７２３Ｔの配列変化が２０９例の老齢正常対照コホート（シドニー老齢者研究（ＳＯＰＳ）コホートに由来）においては検出されなかったことにより、該配列変化が認知症と関連するまたはこの原因となる変異であることが示される。
【０２５６】
ＯＰＲＳ１の３’ＵＴＲに対するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析により、Ｇ７２３Ｔ置換がＯＰＲＳ１転写産物の保存領域内に位置し、該転写産物中の推定されるステムループ構造を破壊すると予測されることが示された。
【０２５７】
３’側非翻訳領域における多くのヌクレオチド置換が、認知に関する転写産物の安定性を変化させると報告されている（Ｃｈｅａｄｌｅら、Ａｎｎ  ＮＹＡｃａｄ  Ｓｃｉ、第１０５８巻、１９６〜２０４頁、２００５年）ので、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法（ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いてリンパ球中のＯＰＲＳ１転写産物の相対レベルを測定し、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子を用いてｃＤＮＡレベルに対して標準化した。ＯＰＲＳ１発現レベルは、ＥＯＡＤ１４（ｎ＝５）およびＥＯＡＤ１２（ｎ＝１）に由来する罹患個体において、対照個体（ｎ＝３）と比較して約２分の１に低下した。この解析により、ＯＰＲＳ１の３’側非翻訳領域中の変異が、転写産物レベルの低下と関連することが示される。
【０２５８】
この解析に従い、神経変性疾患に罹患する被験者に由来する核酸をスクリーニングし、神経変性疾患と共に分離するＯＰＲＳ１遺伝子内の変異および／または多型を同定した。これらの被験者は、オーストラリア人の１０６例の早期発症型初老期認知症患者コホート、シドニー老齢者研究（ＳＯＰＳ）コホートに由来する神経変性疾患に罹患する１２３例の被験者、およびＡＰＰ遺伝子、ＰＳＥＮＩ遺伝子、ＰＳＥＮ２遺伝子、またはＭＡＰＴ遺伝子の変異について陰性であった１６０例の家族性認知症例を含むポーランドからの２つのコホートに由来した。図２および表１に示す通り、初老期認知症コホートでは、家族１４で見出されたヌクレオチド位置７２３における３’側非翻訳領域変異（配列番号１３の位置４１９１、または配列番号７の位置１００５に対応する位置におけるＧからＴへの変異）に加え、さらに４つの変異が検出された（コドン位置２における同義的ヌクレオチド置換（ＣＡＧからＣＡＡへ；配列番号１３の位置２０８０、または配列番号５の位置８０に対応する）、ＯＰＲＳ１タンパク質のアミノ酸４におけるアラニンからバリンへの変化をもたらすミスセンス変異（この変異は、配列番号１３の位置２０９２、または配列番号５の位置８５に対応する位置において生じるＣからＴへの変異において生じる）、位置３１におけるＧからＴへの変化（ＩＶＳ２＋３１）（配列番号１３の位置２５７８３に対応する位置における）、位置１８４における同義的ヌクレオチド置換（ＴＴＣからＴＴＴへ；この変異は、配列番号１３の位置４０２０、または配列番号５の位置６２６に対応する位置において生じる））。位置２４におけるＣからＡへの変化（ＩＶＳ＋２４；配列番号１３のヌクレオチド位置２５７６に対応する）を含むイントロン変異が、ＳＯＰコホートの後期発症型認知症に罹患する個体において検出された。４つのさらなるヌクレオチド変異、特に、位置−４５における５’ＵＴＲ中のヌクレオチド置換（ＣからＧ）（配列番号５のヌクレオチド位置３０、または配列番号１３のヌクレオチド位置２０３０に対応する）、ヌクレオチド位置＋１７におけるイントロン３中の変異（ＴからＡへ）（ＩＶＳ３＋１７ Ｔ to Ａ）（この変異は、配列番号１３のヌクレオチド位置２７９２に対応する位置において生じる）、コドン位置１５７における同義的ヌクレオチド置換（ＧＧＴからＧＧＣへ）（この変異は、配列番号５のヌクレオチド位置５４５、または配列番号１３のヌクレオチド位置３９３９に対応する位置において生じる）、および位置７１９における別の３’ＵＴＲ変異（ＧからＡへ；配列番号１３のヌクレオチド位置４１８７に対応する位置における）が、ポーランドのコホートで同定された。次いで、７６例の運動ニューロン疾患家族からなるコホートをスクリーニングしたところ、５つのヌクレオチド変異が検出され、すべてエキソン１付近に位置した。これらの変異は、イントロン１におけるヌクレオチド置換クラスターである、膜貫通ドメイン１中の残基２３（配列番号５のヌクレオチド位置１４１、または配列番号１３のヌクレオチド位置２１４１に対応する）におけるスレオニンからセリンへのアミノ酸置換を含む。これらは、ＩＶＳ１＋２９Ｃ to Ａ（この変異は、配列番号１３のヌクレオチド位置２２５４に対応する位置において生じる）、ＩＶＳ１＋３０Ｇ to Ａ（この変異は、配列番号１３のヌクレオチド位置２２５５に対応する位置において生じる）、ＩＶＳ１＋３２Ｃ to Ａ（この変異は、配列番号１３のヌクレオチド位置２２５７に対応する位置において生じる）を含む。また、別の５’ＵＴＲ変化（−６におけるＣからＡへの変化；配列番号１３のヌクレオチド位置２０７０に対応する）。
【０２５９】
【表１】
2010517540.tif 000002
【実施例３】
【０２６０】
ＯＰＲＳ１変異はＯＰＲＳ１  ｍＲＮＡレベルに影響する
３．１  方法と材料
オリゴヌクレオチドＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＧＧＡＣＣＡＴＴＧＴＴＴＣ（配列番号９）およびＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＣＧＣＧＡＡＧＡＧＡＴＡ（配列番号１０）を用いて、１２２３ｂｐのプロモーターフラグメントをＰＣＲ法により増幅し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するｐＧＬ３ベクターにサブクローニングした。その結果、オリゴヌクレオチドＡＣＴＧＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＴ（配列番号１１）およびＣＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＴＧＡＴＴＣＡＴＧＧＴ（配列番号１２）を用いて、ＯＰＲＳ１遺伝子の３’側非翻訳領域全体に対応する１１０４ｂｐのゲノムフラグメントが増幅された。認知症に罹患し、Ｇ７２３Ｔ変異対立遺伝子を含む被験者、または健常な被験者に由来するゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。野生型の対立遺伝子および変異対立遺伝子（Ｇ７２３Ｔ）を、野生型のＯＰＲＳ１プロモーターを含有する改変ｐＧＬ３ベクターにサブクローニングした。部位特異的変異誘発により、野生型のＯＰＲＳ１プロモーターおよび野生型の３’ＵＴＲを伴うルシフェラーゼレポーター構築物にＧ７１９Ａ変異の存在を導入した。
【０２６１】
製造元の指示書に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞またはＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞内に各組み換えベクターをトランスフェクトした。４８時間後に細胞を溶解させ、製造元の指示書に従い、Ｒｅａｄｉ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ルシフェラーゼ活性レベルを決定した。
【０２６２】
３．２  結果
図３に示す通り、いずれの変異も、ＳＫＮＭＣ細胞およびＳＫＮＳＨ細胞におけるルシフェラーゼ発現を増大させた。結果の比較を表２に示す。
【０２６３】
【表２】
2010517540.tif 000003
【実施例４】
【０２６４】
ＯＰＲＳ１のイントロン２における変異はスプライシングを変化させる
プライマーＯＰＲＳ１ＥｘｏｎＴｒａｐＦ（５’−ＧＧＡＧＣＣＴＡＧＧＧＴＴＣＣＧＡＡＧ−３’；配列番号２０）およびＯＰＲＳ１ＥｘｏｎＴｒａｐＲ（５’−ＣＡＡＣＣＡＡＴＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＴＴＡＴＧ−３’；配列番号２１）を用いて、ゲノムＤＮＡからＯＰＲＳ１遺伝子のエキソン２および３を含む６５８ｂｐのＰＣＲ産物を増幅した。認知症に罹患し、ＩＶＳ＋３１もしくはＩＶＳ＋２４における変異対立遺伝子を含む被験者に由来するゲノムＤＮＡ、または健常な被験者に由来するゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。野生型対立遺伝子および変異対立遺伝子（ＩＶＳ＋３１またはＩＶＳ＋２４）を、エキソントラップベクターｐＳＰＬ３（カリフォルニア州、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）にサブクローニングした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  １０）またはヒト胚性腎２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）に各組み換えベクターをトランスフェクトした。４８時間にわたり細胞を放置した後、全ＲＮＡを抽出し、基本的にＳｔａｎｆｏｒｄら、Ｂｒａｉｎ、第１２３巻、８８０〜８９３頁、２０００年で既に説明される通りに、ＲＴ−ＰＣＲ法によりエキソントラップ産物を検出した。
【０２６５】
図４Ａおよび４Ｂに示す通り、ＩＶＳ＋２４およびＩＶＳ＋３１のいずれにおける変異共に、ＯＰＲＳ１の選択的スプライシングレベルを上昇させ、正確なスプライシングによってＯＰＲＳ１  ｍＲＮＡレベルを著明に低下させる。したがって、これらの結果から、例えば、野生型ＯＰＲＳ１レベルの低下を検出すること、および／または選択的スプライシングによって生じたＯＰＲＳ１レベルの増大またはその存在を検出することにより、神経変性疾患を診断するか、または神経変性疾患に対する素因を判定するか、または神経変性疾患を発症する危険性の増大を予測するさらなるマーカーが提供される。
【実施例５】
【０２６６】
ＯＰＲＳ１変異はガンマ−セクレターゼ活性を上昇させる
プライマーＯＰＲＳ１−ＦＬＡＧＦ（５’−ＡＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＣ−３’；配列番号１８）およびＯＰＲＳ１−ＦＬＡＧＲ（５’−ＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＡＡ−３’；配列番号１９）を用いて、ＯＰＲＳ１タンパク質のアミノ末端におけるＦＬＡＧモチーフの存在を導入し、ｐＣＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＯＰＲＳ１（ｗｔ）プラスミドを作製した。部位特異的変異誘発を用いて、ｐＣＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＯＰＲＳ１（ｗｔ）プラスミドにｒｓ１８００８６６多型またはＡｌａ４Ｖａｌ変異を付加し、それぞれ、ｐＣＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＯＰＲＳ１（ｒｓ１８００８９９）プラスミドおよびｐＣＤＮＡＦＬＡＧ−ＯＰＲＳ１（Ａｌａ４Ｖａｌ）プラスミドを作製した。
【０２６７】
基本的にＫａｒｌｓｔｒｏｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７７巻、６７６３〜６７６６頁、２００２年で既に説明される通り、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、ガンマ−セクレターゼ活性を測定した。略述すると、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ＯＰＲＳ１発現構築物と共に、２つのレポーター構築物（ＭＨ１００プラスミドおよびＣ９９−ＧＶＰプラスミド）を、ヒト神経芽細胞腫細胞株であるＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  １０）またはＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  １１）にトランスフェクトする。４８時間後に細胞を溶解させ、製造元の指示書に従い、Ｒｅａｄｉ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ルシフェラーゼ活性レベルを決定した。
【０２６８】
図５に示す通り、ガンマ−セクレターゼ活性レベルは、Ａｌａ４Ｖａｌ変異を発現する細胞において、天然のＯＰＲＳ１を過剰発現する細胞と比較して著明に増大した。ガンマ−セクレターゼ活性レベルは、ＡＤに罹患する被験者においてガンマ−セクレターゼ活性を増大させることが知られる、プレセニリン１のΔエキソン９変異を発現する細胞で検出されるレベルと同等であった。
【実施例６】
【０２６９】
タウのリン酸化に対するＯＰＲＳ１変異の影響
６．１  発現コンストラクトの構築
ＯＰＲＳ１中で同定され、実施例３で同定された通りに転写および発現される各変異を含む核酸を、リンパ球ｃＤＮＡを用いるＰＣＲ法により増幅する。哺乳動物由来の発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、各ＰＣＲ産物をサブクローニングする。さらに、ＯＰＲＳ１プロモーターおよび変異ＯＰＲＳ１  ３’側非翻訳領域の制御下に置かれるＯＰＲＳ１  ｃＤＮＡを含むベクターを作製する。
【０２７０】
対照として、ＯＰＲＳ１プロモーターおよび野生型ＯＰＲＳ１  ３’側非翻訳領域の制御下に置かれるＯＰＲＳ１  ｃＤＮＡを含むベクターを作製する。
【０２７１】
次いで、ＣＯＳ−７細胞に遺伝子構築物をトランスフェクトする。
【０２７２】
６．２  タウ分子種の検出
トランスフェクトされた細胞を、１ｘ溶解緩衝液（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤の１倍濃度完全カクテル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）、および０．０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で溶解させる。全タウまたはセリン残基３９６においてリン酸化したタウについて、ヒトタウまたはヒトタウ［ｐＳ３９６］用のＥＬＩＳＡ法キット（米国、カリフォルニア州、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を用いてアッセイするのに、それぞれ、約２〜２５μｇずつの全タンパク質を用いる。
【０２７３】
６．３  結果
各形態のＯＰＲＳ１がセリン残基３９６においてタウをリン酸化（タウ［ｐＳｅｒ３９６］）させる能力を検討する。ＣＯＳ−７細胞に各ｃＤＮＡをトランスフェクトし、ＥＬＩＳＡ法により内因性のタウのリン酸化を測定する。例えば、本明細書で説明される各変異を含む細胞において、対照細胞と比べたタウのリン酸化レベルを決定する。次いで、アルツハイマー病の特徴である、タウのリン酸化の上昇と関連する変異を同定する。
【実施例７】
【０２７４】
ＯＰＲＳ１の変異型に対するＯＰＲＳ１アゴニストの効果
７．１  特異的なＯＰＲＳ１アイソフォームを発現する細胞の作製
ＣＯＳ−７細胞を、１×１０５個／ウェルの濃度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間にわたり放置して回収した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて、各ウェルに実施例５で説明した各ベクターをトランスフェクトする。４８時間後に増殖培地を除去し、硫酸プレグネノロンまたはＳＡ４５０３（１−（３，４−ジメトキシフェンエチル）−４−（３−フェニルプロピル）ピペラジンジヒドロクロリド）（Ｓｅｎｄａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第３１５巻、１〜１０頁、１９９６年）または２−（４−モルホリンエチル）１−フェニルシクロヘキサンカルボキシレート（Ｍａｒｒａｚｚｏら、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ、第１６巻、１２２３〜１２２６頁、２００５年）に曝露された細胞を増殖培地中で段階希釈する。培地を除去し、ｉｎ  ｓｉｔｕで細胞を溶解し、上述の通りに、内因性タウ［ｐＳ３９６］のリン酸化レベルを測定する。
【０２７５】
８．２  結果
認知症におけるＯＰＲＳ１アゴニストの作用に対して生物学的に重要な知見を得るため、各種のＯＰＲＳ１アゴニストが内因性タウタンパク質のリン酸化を阻害する能力を、ＯＰＲＳ１の変異型を発現するＣＯＳ−７生細胞中で検討する。
【実施例８】
【０２７６】
神経変性に罹患し、３’ＵＴＲのＧ７２３Ｔ変異を有する被験者におけるＯＰＲＳ１遺伝子の発現
不死化させたリンパ球から全ＲＮＡを抽出し、ポリ−ｄＴプライマーを用いて逆転写させた。プライマーＯＰＲＳ１−ＲＴＦ（５’−ＡＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＴ−３’；配列番号２２）およびＯＰＲＳ１−ＲＴＲ（５’−ＣＴＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＴＧＴＧＴＴＴＧ−３’；配列番号２３）を用いるＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙによる定量的ＰＣＲ法を介して、ＯＰＲＳ１転写産物レベルを決定した。基本的にＶａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３巻、２００２年で説明される通りに、ハウスキーピング遺伝子を増幅するプライマー、コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体サブユニットＡ（ＳＤＨＡ）を用いて、試料間の転写産物レベルを標準化した。図６に示す通り、標準化されたＯＰＲＳ１転写産物レベルと、そのリンパ球が不死化されたときの個体の年齢との間の強い相関が、罹患個体では存在する（ｒ２＝０．９４２２）が、対照リンパ球では存在しない（ｒ２＝０．０７６７）。線形回帰分析により、「年齢×疾患状態」相互作用が、ＯＰＲＳ１  ｃＤＮＡレベルの有意な予測因子である（β＝４．９９５、ｔ＝３．７１３、ｐ＝０．００４）ことが示された。罹患個体においては、非罹患対照と比較して、全般的にＯＰＲＳ１転写産物レベルが上昇（１．１３倍）する。
【実施例９】
【０２７７】
ＯＰＲＳ１転写産物レベルの上昇は、３’ＵＴＲのＧ７２３Ｔ変異キャリア−に由来するリンパ球細胞株細胞質中のＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）レベルの上昇と相関する
製造元の指示書に従い、Ｐｒｏｔｅｏｅｘｔｒａｃｔ  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（米国、カリフォルニア州、ラホラ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を用いて、リンパ球細胞株から、細胞内の細胞質画分および核画分を逐次単離した。約１０μｇのタンパク質溶解液を１０分間にわたり９５℃まで加熱した後、７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動を行い、ニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｄｉｕｍ；カリフォルニア州、Ｂｉｏｒａｄ社製）に転写した。ウサギポリクローナル抗体（米国、イリノイ州、シカゴ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ社製）を用いてＴＤＰ−４３タンパク質を検出した。Ｂｉｏｒａｄ社製のＣｈｅｍｉｄｏｃシステムを用いて、化学発光バンドの密度を定量した。結果は、ＯＰＲＳ１転写産物レベルと、核画分に対する細胞質画分中のＴＤＰ−４３比率として表される細胞質中のＴＤＰ−４３タンパク質の相対量との間における強い相関を示す。Ｂｉｏｒａｄ社製のＣｈｅｍｉｄｏｃシステムを用いて、化学発光バンドの密度を定量した。図７に示す通り、ＯＰＲＳ１転写産物レベルと、核画分に対する細胞質画分中のＴＤＰ−４３比率として表される細胞質中のＴＤＰ−４３タンパク質の相対量との間には、強い相関（ｒ２＝０．８５２、ｐ＝０．００６）が存在する。
【実施例１０】
【０２７８】
ＯＰＲＳ１  ｃＤＮＡの過剰発現は、トランスフェクトされた２つの神経細胞株の細胞質中のＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＤＰ−４３）レベルを上昇させる
プライマーＯＰＲＳ１−ＲＴＦ（５’−ＡＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＡＧＴＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＣ−３’；配列番号２４）およびＯＰＲＳ１−ＲＴＲ（５’−ＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＡＡ−３’；配列番号２５）を用いて、リンパ球ＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ法により、野生型のヌクレオチド変異ＯＰＲＳ１  ｃＤＮＡを構築し、発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローニングし、ｐＣＤＮＡ−ＯＰＲＳ１（ｗｔ）プラスミドを生成した。部位特異的変異誘発により、ＯＰＲＳ１発現構築物にＡｌａ４Ｖａｌ変異の存在を導入し、ｐＣＤＮＡ−ＯＰＲＳ  １（Ａｌａ４Ｖａｌ）プラスミドを生成した。ＯＰＲＳ１−ＦＬＡＧＦ（５’−ＡＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＣ−３’；配列番号２６）およびＯＰＲＳ１−ＦＬＡＧＲ（５’−ＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＡＡ−３’；配列番号２７）を用いて、ＯＰＲＳ１タンパク質のアミノ末端におけるＦＬＡＧモチーフの存在を導入し、ｐＣＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＯＰＲＳ１（ｗｔ）プラスミドを生成した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  １０）およびＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  １１）に各組み換えベクターをトランスフェクトした。４８時間にわたり細胞を放置した後、ＴＤＰ−４３タンパク質レベルに対するウェスタンブロット解析を行った。製造元の指示書に従い、Ｐｒｏｔｅｏｅｘｔｒａｃｔ  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（米国、カリフォルニア州、ラホラ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を用いて、トランスフェクトされた細胞から、細胞内の細胞質画分および核画分を逐次単離した。約１０μｇのタンパク質溶解液を１０分間にわたり９５℃まで加熱した後、７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動を行い、ニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｄｉｕｍ；カリフォルニア州、Ｂｉｏｒａｄ社製）に転写した。ウサギポリクローナル抗体（米国、イリノイ州、シカゴ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ社製）を用いてＴＤＰ−４３タンパク質を検出した。Ｂｉｏｒａｄ社製のＣｈｅｍｉｄｏｃシステムを用いて、化学発光バンドの密度を定量した。図８に示す通り、トランスフェクトされた細胞中の野生型ＯＰＲＳ１ｃＤＮＡの過剰発現は、対照のＬａｃＺベクターをトランスフェクトされた細胞と比較して、細胞質中のＴＤＰ−４３レベルを著明に上昇させる（１．３〜１．５倍、ｐ＝０．０１９、スチューデントのｔ検定）。
【実施例１１】
【０２７９】
ＯＰＲＳ  Ａｌａ４Ｖａｌ変異ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体の調製
当技術分野で知られる方法を用いて、Ａｌａ４Ｖａｌ変異を含むＯＰＲＳ１エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を作製する。略述すると、基本的に、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８４）「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、ハイデルベルク、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．＆  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．（１９８４）「Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、ハイデルベルク、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社で説明される方法を用いて、Ａｌａ４Ｖａｌ変異を含むＯＰＲＳ１領域に対応するペプチド抗原を合成する。
【０２８０】
ＨＰＬＣ法を用いてペプチドを精製し、アミノ酸解析により純度を評価する。
【０２８１】
該ペプチドの精製形態により、雌ＢａｌＢ／ｃマウスを免疫感作する。まず、ハンターのＴｉｔｅｒｍａｘアジュバント（ジョージア州、ノークロス、ＣｙｔＲｘ社製）の腹腔内注射によりマウスを感作する。初回感作の２、５．５、および６．５カ月後に３回の追加免疫ペプチドを投与する。これらの追加免疫の１回目は皮下注射であるが、残りの追加免疫は腹腔内注射により投与する。最終回の追加免疫は、融合の３日前に投与する。
【０２８２】
ＰＥＧ  １５００を用いて、免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウス１匹の脾臓細胞を、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞と融合させる。ＰＥＧ  １５００への曝露後、熱により不活化したウシ胎仔血清中、３７℃で１時間にわたり、細胞をインキュベートする。次いで、融合細胞をＲＰＭＩ  １６４０培地に移し、１０％ＣＯ２と共に、３７℃で一晩にわたりインキュベートする。翌日、マクロファージの培養上清を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて細胞をプレートに播種する。
【０２８３】
融合の２週間後、固相ＥＬＩＳＡアッセイにより、ハイブリドーマ細胞を抗体生成についてスクリーニングする。炭酸ベースの緩衝液中の組み換えＯＰＲＳ１  Ａｌａ４Ｖａｌで標準的なマイクロ滴定プレートをコートする。次いで、プレートをＢＳＡでブロックし、洗浄し、次いで、対照試料（すなわち、非融合細胞に由来する上清）に加えて、被験試料（すなわち、融合細胞に由来する上清）を添加する。ヤギ抗マウスＨＲＰ結合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）およびＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質システム（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａ  ９４０１０、ＵＳＡ）と共に該プレートをインキュベートすることにより、抗原−抗体間結合を検出する。４０５ｎｍの波長における自動プレートリーダー上で吸光度を読み取る。
【０２８４】
これらのスクリーニングにより陽性と同定された任意のコロニーを引き続き増殖させ、さらに何週間にもわたりスクリーニングする。次いで、安定したコロニーを単離し、８０℃で保存する。
【０２８５】
次いで、短期間にわたり培地中で増殖させ、細胞を９６ウェル組織培養プレートで０．１個／ウェルの最終濃度まで希釈して、安定した陽性ハイブリドーマをクローニングする。次いで、既に説明したアッセイを用いて、これらのクローン細胞をスクリーニングする。次いで、この手順を反復して、クローン細胞の純度を確認する。
【０２８６】
９６ウェルマイクロ滴定プレート中において、４種類の異なる希釈率である５個／ウェル、２個／ウェル、１個／ウェル、０．５個／ウェルの初代クローン細胞を調製し、２代目のクローニングを開始する。以下の添加物：２０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１％のＧＭＳ−Ｓ、０．０７５％のＮａＨＣＯ３を含有するＩＭＤＭ組織培養培地中で細胞を希釈する。抗ヒトＯＰＲＳ１抗体を分泌するクローン細胞を決定するため、増殖の２週間後に、マイクロ滴定プレートで０．２個／ウェルの上清を個々のウェルから採取し、上述のＥＬＩＳＡアッセイにより抗体の存在について調べる。
【０２８７】
次いで、以下の添加物：１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１％のＧＭＳ−Ｓ、０．０７５％のＮａＨＣＯ３、および０．０１３ｍｇ／ｍｌのオキサロ酢酸を含有するＲＰＭＩ培地中にすべての陽性クローン細胞を適応させ、拡大培養する。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー法により、細胞培養物の上清から特異的抗体を精製する。
【０２８８】
この方法を用いて作製された抗体の力価は、Ｐｉｅｒｃｅ社（米国、イリノイ州、ロックフォード）製のＥａｓｙ  Ｔｉｔｅｒキットを用いて決定する。このキットでは、マウス抗体に特異的に結合するビーズを用いるが、こうした抗体の結合後において、これらのビーズは凝集し、もはや未結合のビーズと同じ程度には光を吸収しない。したがって、この試料から得られるＯＤ測定値を、例えば、マウスＩｇＧなどの標準物質中で検出される量と比較することにより、ハイブリドーマ上清中の抗体量が評価される。
【０２８９】
次いで、ウェスタンブロット法を用いて、モノクローナル抗体の特異性を決定する。
【実施例１２】
【０２９０】
生体試料中のＯＰＲＳ１  Ａｌａ４Ｖａｌレベルの決定
実施例１１で説明したＯＰＲＳ１  Ａｌａ４Ｖａｌ変異体に結合するモノクローナル抗体をtwo-site ＥＬＩＳＡ法の実施において用いて、生体試料中の変異ＯＰＲＳ１レベルを決定する。
【０２９１】
ＯＰＲＳ１に結合するポリクローナル抗体を、２０℃で１６時間にわたり、マイクロ滴定プレートに吸着させる。次いで、プレートを洗浄し、１時間にわたりブロックする。組み換えＯＰＲＳ１  Ａｌａ４Ｖａｌを系列希釈し、マイクロ滴定プレートのウェルに添加し、１時間にわたりインキュベートする。あるいは、ＦＴＬＤに罹患する患者に由来する血清をＰＢＳ中で希釈し、該抗体を含むウェルに添加する。
【０２９２】
ＨＲＰ結合キット（米国、テキサス州、サンアントニオ、Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）を用いて、実施例１１で説明したモノクローナル抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＥＲＰ）に結合させる。
【０２９３】
マイクロ滴定プレートの洗浄後、ＨＲＰ結合モノクローナル抗体をプレートの各ウェルに添加し、インキュベートする。次いで、プレートを洗浄し、各ウェルにＡＢＴＳ（オーストラリア、シドニー、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加する。約２０分後に反応を停止させ、４１５ｎｍにおいて吸光度値を測定する。
【０２９４】
陰性対照ウェル（ＯＰＲＳ１  Ａｌａ４Ｖａｌまたは患者血清の添加なし）中で検出された吸光度量を他の各ウェルの吸光度から減じて、ＯＰＲＳ１に結合した抗体量を決定する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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