(57)【要約】  本発明は、ニューレグリン（ＮＲＧ）ファミリー、特にＮＲＧ１、より特にＮＲＧ１β、最も特にＮＲＧ１β１の調節剤に関する。本発明はまた、杯細胞過形成を阻害するためのかかる調節剤の使用に関し、したがってまた、病的粘液生産を特徴とするヒトの疾患および障害、例えばＣＯＰＤ、ＣＦ、慢性気管支炎および喘息の処置または予防におけるかかる調節剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＲＧ１と同族受容体（例えばＥＲＢ２／ＥＲＢ３ヘテロダイマー）間の相互作用を調節して杯細胞過形成を阻害する、ＮＴＧ１の調節剤。
【請求項２】
ＮＲＧ１がＮＲＧ１αまたはＮＲＧ１βファミリーのメンバーである、請求項１の調節剤。
【請求項３】
ＮＲＧ１βがＮＲＧ１β１である、請求項２の調節剤。
【請求項４】
ＮＲＧ１がＮＲＧ１の膜結合および／または可溶形態である、請求項１〜３のいずれかの調節剤。
【請求項５】
調節剤が低分子量化合物である、請求項１〜４のいずれかの調節剤。
【請求項６】
調節剤が抗体である、請求項１〜４のいずれかの調節剤。
【請求項７】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項６の抗体。
【請求項８】
抗体がヒト、ヒト化またはキメラ抗体である、請求項７の調節剤。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかのＮＲＧ１と結合し、ＮＲＧ１と１種以上のその同族受容体（例えばＥＲＢ２／ＥＲＢ３）、特にＥＲＢ２／ＥＲＢ３ヘテロダイマー間の相互作用を調節（例えば阻害）する、請求項５〜８のいずれかの抗体。
【請求項１０】
抗体が（ＮＲＧ１αと比較して）主としてＮＲＧ１β１と結合する、請求項９の抗体。
【請求項１１】
（ＮＲＧ１αと比較して）ＮＲＧ１β１と特異的に結合する、請求項９または１０の抗体。
【請求項１２】
ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のヒト定常領域を含む、請求項５〜１１のいずれかの抗体。
【請求項１３】
（特にヒトの）異常な粘液生産を特徴とする疾患または障害の処置用医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれかの調節剤の使用。
【請求項１４】
疾患または障害が呼吸器のものである、請求項１３の使用。
【請求項１５】
疾患または障害がＣＯＰＤ、嚢胞性線維症（ＣＦ）、慢性気管支炎または喘息である、請求項１４の使用。
【請求項１６】
疾患または障害がヒトのものである、請求項１３〜１５のいずれかの使用。
【請求項１７】
ＣＯＰＤ、ＣＦ、慢性気管支炎、喘息のような異常な粘液生産を特徴とする疾患の予防（または進行の遅延および／または症状の改善）用医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれかの調節剤の使用。
【請求項１８】
ＣＯＰＤ、ＣＦ、慢性気管支炎、喘息のような異常な粘液生産を特徴とする疾患または障害を有するヒト患者を処置する方法であって、当該患者に治療上有効量の請求項１〜１２のいずれかの調節剤を投与することを含む方法。
【請求項１９】
請求項１〜４のいずれかの調節剤を同定する方法であって；
（ａ）候補調節剤を得て；
（ｂ）該調節剤と請求項１〜３の何れかのＮＲＧ１とを接触させて；
（ｃ）該候補調節剤が請求項１〜３の何れかのＮＲＧ１とその同族受容体（例えばＥＲＢ２および／またはＥＲＢ３）間の相と作用を調節（例えば阻害）するか、例えば該候補調節剤が、該候補調節剤の非存在下での杯細胞過形成と比較して杯細胞過形成を阻害するかを決定する
ことを含む方法。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれかの調節剤と薬学的に許容される単体を含む医薬組成物。
【請求項２１】
異常な粘液生産によって特徴付けられる呼吸器疾患または障害（例えばＣＯＰＤ、ＣＦ、慢性気管支炎）を有するヒト患者を処置する方法であって、ヒトＮＲＧ１、特にヒトＮＲＧ１β１と結合し、ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）とＥＲＢ２／ＥＲＢ３ヘテロダイマー間の相互作用を阻害する阻害剤（例えば治療タンパク質、例えばヒトまたはヒト化抗体）、ならびにヒトＩＬ−１３とその同族ヒト受容体間の相互作用を阻害する抗ヒトＩＬ−１３薬物（例えばＩＬ−１３抗体、特にヒトまたはヒト化ＩＬ−１３抗体）および／またはヒトＩＬ−４５とそのヒトＩＬ−４受容体間の相互作用を阻害する抗ヒトＩＬ−４薬物（例えばＩＬ−４抗体、特にヒトまたはヒト化ＩＬ−４抗体）および／またはヒトＩＬ−５とその同族受容体間の相互作用を阻害する抗ヒトＩＬ−５薬物（例えばＩＬ−５抗体、特にヒトまたはヒト化ＩＬ−５抗体）および／またはヒトＩｇＥとその同族受容体間の相互作用を阻害する抗ＩｇＥ薬物（例えばヒトまたはヒト化抗ＩｇＥ抗体）を共投与することを含む方法。
【請求項２２】
抗ヒトＮＲＧ１β１抗体が抗ヒトＩＬ−１３抗体と共投与される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
抗ヒトＮＲＧ１β１抗体が抗ヒトＩＬ−４抗体と共投与される、請求項２１または２２の方法。
【請求項２４】
抗ヒトＮＲＧ１β１抗体が抗ヒトＩＬ−５抗体と共投与される、請求項２１、２２または２３の方法。
【請求項２５】
抗ヒトＮＲＧ１β１抗体が抗ヒトＩｇＥ抗体と共投与される、請求項２１、２２、２３または２４の方法。
【請求項２６】
請求項１〜１２のいずれかの調節剤と薬学的に許容される単体を含む、ＣＯＰＤ、ＣＦ、喘息（特に中度および重度のもの）、慢性気管支炎、下気道の疾患、例えば呼吸器感染、肺気腫、肺炎の処置のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．  発明の分野
本発明は、疾患および障害の処置におけるニューレグリン（ＮＲＧ）ファミリーのメンバーの生物学的活性を中和する化合物、組成物および方法に関する。特に本発明は、ヒト疾患および障害の処置におけるニューレグリン−１（ＮＲＧ１）およびそのアイソフォームと結合し、その生物学的活性を中和するアンタゴニストに関する。本発明の他の局面、目的および利点は、以下の記載から明らかである。
【背景技術】
【０００２】
２．  発明の背景
気道粘膜過分泌は喘息［Aikawa et al, 1992］、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）［Vestbo, 2002］および嚢胞性線維症（ＣＦ）［Boucher, 2002］のような呼吸器疾患の多様な病的特徴と関連する。実際、粘液過分泌は感染の頻度および期間の増加、肺機能の低下ならびに呼吸器疾患の罹患率および死亡率の増加に関連している［Vestbo, 2002; Prescott et al, 1995; Vestbo et al, 1996］。太い気道において粘液は杯細胞および粘膜下腺によって生産されるが、細い気道では粘液の分泌源は杯細胞のみである［Rogers, 2003］。
【０００３】
ムチンＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂは喘息、ＣＯＰＤおよびＣＦのような呼吸器疾患における気道粘液分泌物の主要成分である［Williams et al, 2006; Rose and Voynow, 2006; Rogers, 2003］。粘液過分泌は喘息の特徴であり、重度の急性喘息発作で死亡した患者由来の肺の形態学的分析によって、杯細胞数および気道内腔の粘液の増加が示された［Aikawa et al, 1992］。気道内腔における粘液栓は、ほとんどの患者において致命的な喘息の主たる寄与原因として報告されている。［Kuyper et al, 2003; Hays and Fahay, 2003］。ＭＵＣ５ＡＣ発現は、正常個体と比較して、喘息重積状態において増加し、表層上皮、内腔および杯細胞に局在化する［Gronenberg et al, 2002a］。健常人と比較して軽度乃至中等度の喘息を有する対象における肺細胞数の増加も報告されており、分泌されるムチンの濃度が中等度の喘息を有する患者の気道においてより高いことが報告されている［Ordonez et al, 2001］。さらに、健常人と比較して喘息を有する対象の杯細胞のＭＵＣ５ＡＣムチン着色（staining）の増加が報告されている［Ordonez et al, 2001］。ムチンＭＵＣ５Ｂは喘息患者の気道表層杯細胞によって生産されることもある［Gronenberg et al, 2002a］。
【０００４】
ＣＯＰＤの進行は細い気道の内腔における粘液の蓄積と強力に関係していることが報告されている［Hogg et al, 2004］。ＣＯＰＤを有する個体において、細気管支上皮でのＭＵＣ５ＡＣ発現の増加および細気管支内腔でのＭＵＣ５Ｂ濃度の上昇が記載されている［Caramori et al, 2004］。ＭＵＣ５Ｂはまた、別の研究において、ＣＯＰＤを有する患者の痰における主たるムチンとして報告されている［Kirkham et al, 2002］。ＣＯＰＤ患者の細気管支内腔において観察される粘液の増加は、ＣＯＰＤにおける末梢気道の閉塞に関連すると示唆されている［Caramori et al, 2004］。ＣＯＰＤおよび慢性気管支炎を有する患者の細気管支上皮における杯細胞数の増加も報告されている［Saetta et al, 2000］。
【０００５】
ＣＦにおける粘液過分泌は気道閉塞、致命的な症例では細気道の閉塞と関連している［Williams et al, 2006］。過剰な粘液はまた、肺の感染の頻度および重症度を増加させ、ＣＦ罹患率に寄与すると考えられている［Williams et al, 2006］。正常対象と比較してＣＦ対象において分泌されるムチンＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂの濃度が低下することが報告されているが［Henke et al, 2004］、増悪期のＣＦ患者の痰中のＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂは増加する［Henke et al, 2007］。ＭＵＣ５ＡＣ陽性細胞数の増加によってもたらされる杯細胞過形成が嚢胞性線維症肺において増加することが報告されている［Gronenberg et al, 2002b］。
【０００６】
ＩＬ−１３はインビトロおよびインビボでＭＵＣ５ＡＣ遺伝子およびタンパク質発現に影響することが示されているが［Wills-Karp et al, 1998; Zhu et al, 1999; Kuperman et al, 2002; Atherton, Jones and Danahay, 2003］、ムチンＭＵＣ５Ｂには影響しない。ＭＵＣ５Ｂ産生メディエーターは十分に特徴付けられていない。
【０００７】
ニューレグリンは、ＥＲＢファミリーの受容体チロシンキナーゼを介した複数の細胞間相互作用を介在する、シグナル伝達タンパク質である。選択的スプライシングの結果として、少なくとも１５種のニューレグリン−１（ＮＲＧ１）の異なるアイソフォームが存在する［Falls, 2003］。これらのアイソフォームの２つであるＮＲＧ１αとＮＲＧ１β１は、ＥＧＦ様ドメインのＣ末端部分が異なる［Holmes et al, 1992］。ＮＲＧ１は、ＥｒｂＢ２とヘテロダイマーを形成するＥｒｂＢ３またはＥＲＲＢ４と結合すると考えられている［Falls, 2003］。ＮＲＧ１β１は、ＮＲＧ１αよりも１００倍高い親和性でＥｒｂＢ３と結合する。ＮＲＧ１β１はまた、ＥｒｂＢ３ホモダイマーよりもＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーに対して１００倍高い親和性を有する［Jones et al, 1999］。ＥｒｂＢ３はチロシンキナーゼ活性を欠くが、ＥｒｂＢ２との二量体化によって下流シグナルを仲介し得る活性なヘテロダイマーの形成が生じる［Citri, Skaria and Yarden, 2003］。ヒト肺形成におけるＮＲＧ１ならびにＥｒｂＢ２および３受容体の役割は、胎児肺組織の免疫組織化学的および機能的研究によって既に示唆されている［Patel et al, 2000］。ＮＲＧ１β１は胎児肺線維芽細胞から分泌され、タイプＩＩ細胞サーファクタント合成を刺激し、したがって間葉系−上皮相互作用を介して胎児肺成熟を制御すると提案されている［Dammann et al, 2003］。より最近では、ＮＲＧ１αアイソフォームが上皮創傷修復および気道のリモデリングに関与していると示唆されている［Vermeer et al, 2003］。この研究でＥｒｂＢ２受容体が分化上皮細胞の側底面において発現されており、ＮＲＧ１αリガンドが頂端膜側で発現されていることが示された。結果として、リガンド受容体相互作用は上皮損傷が生じるまで起こらないと考えられる。ＮＲＧ（ヒューレグリン、「ＨＲＧ」と称することもある）の発現は、ＣＯＰＤ患者由来の気管支組織において試験され、ＣＯＰＤを有さない対象と比較して、ＣＯＰＤを有する患者のインタクトな上皮においてより高い発現が観察された［de Boer et al, 2006］。しかし、de Boerらの研究において、試験したＮＲＧ１の具体的なアイソフォームが記載されなかった。
【０００８】
特許出願を含むあらゆる本明細書に記載の文献および本願が優先権を主張する何れかの明細書は、それらの全体において、参照により明示的に本明細書に包含される。
【発明の概要】
【０００９】
３．  発明の概要
本発明は、少なくとも一部において、ＮＲＧ−１、特にアイソフォームＮＲＧ１β１がＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂタンパク質発現を促進し、したがって杯細胞形成における関与を示唆しているという観察に基づく。
【００１０】
したがって、本発明の第１の局面において、杯細胞形成を阻害する方法であって、ＮＲＧ−１、例えばＮＲＧ１βアイソフォーム、特にＮＲＧ１β１（特にヒトＮＲＧ１β１）の生物学的活性を中和する結合化合物を与えることを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明の第２の局面において、ＮＲＧ−１、例えばＮＲＧ１β１生物学的活性を中和することができる結合化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００１２】
本発明の第３の局面において、ＮＲＧ−１、例えばＮＲＧ１β１（特にヒトＮＲＧ１β１）の生物学的活性を中和する結合化合物を含む（または本質的にそれからなる）医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明の第４の局面において、哺乳類患者における杯細胞形成を阻害する方法であって、当該患者に治療上有効量のＮＲＧ−１、例えばＮＲＧ１β１の生物学的活性を中和する結合化合物を投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
本発明の第５の局面において、それを臨床的に必要とする哺乳類患者における有害な粘液生産を阻害する方法であって、当該患者に治療上有効量のＮＲＧ−１、例えばＮＲＧ１β１の生物学的活性を中和する結合化合物を投与することを含む方法を提供する。
【００１５】
第６の局面において、ＣＯＰＤ、ＣＦ、慢性気管支炎および喘息（特に中等度乃至重度の喘息）からなる群から選択されるヒト患者の疾患または障害を処置する方法であって、当該患者に治療上有効量のＮＲＧ１β１の生物学的活性を（例えばＮＲＧ１β１と結合してＮＲＧ１β１とＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー間の相互作用を阻害することによって）中和する（例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４のようなＩｇＧアイソタイプの）ヒトまたはヒト化抗体を投与することを含む方法を提供する。
【００１６】
本発明のこれらおよび他の局面は以下により詳細に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＭＵＣ５ＡＣ発現に対するＮＲＧ１ベータ１およびＮＲＧ１アルファの効果。ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）を漸増濃度のＮＲＧ１β１（左上）またはＮＲＧ１α（右上）で７日間処理し、抗ＭＵＣ５ＡＣ（４５Ｍ１）モノクローナル抗体で染色した。ＭＵＣ５ＡＣ陽性細胞の割合をイメージ分析によって評価した。（下）ＭＵＣ５ＡＣ／アルシアンブルー染色したビークルおよびＮＲＧ１β１（５０ｎＭ）処理ＨＢＥＣの代表的組織イメージ。矢印は抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体で染色されていないアルシアンブルー染色された細胞を示す。示した結果は、３個の独立したドナーの実験から得た代表的な結果である。示した結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。非処理対照との有意な差が示される（＊Ｐ＜０．０５）。
【図２】ＭＵＣ５Ｂタンパク質に対するＮＲＧ１アルファおよびベータ１の効果。漸増濃度のＮＲＧ１β１（Ａ）およびＮＲＧ１α（Ｂ）のＭＵＣ５Ｂタンパク質に対する効果を免疫組織化学によって評価した。細胞をＮＲＧ１で７日間処理した。（Ｃ）ＭＵＣ５Ｂ／アルシアンブルー染色したビークルおよびＮＲＧ１β１（５０ｎＭ）処理ＨＢＥＣの代表的組織イメージ。示した結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。非処理対照との有意な差が示される（＊Ｐ＜０．０５）。
【図３】時間経過によるＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂ発現に対するＮＲＧ１ベータ１の効果。１〜１４日処理にわたるＭＵＣ５ＡＣタンパク質（Ａ）およびＭＵＣ５Ｂタンパク質（Ｂ）に対するＮＲＧ１β１（５０ｎＭ）の効果を組織学的に評価した。ＮＲＧ１β１処理サンプルは黒色で示し、非処理サンプルは白色で示す。結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）で示す。非処理対照との有意な差が示される（＊ｐ＜０．０５）。
【図４】初代細胞におけるＮＲＧ１ベータ１発現。Ｔ細胞、好中球、ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）、気管支平滑筋細胞（ＢＳＭＣ）および肺線維芽細胞を含む初代細胞群におけるＮＲＧ１β１発現をＲＴ−ＰＣＲで分析した。ハウスキーピング遺伝子トランスフェリンの発現も分析した。データは少なくとも２個の独立したドナー由来の細胞について得たデータを代表する。
【図５】オボアルブミン投与マウスの肺におけるＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂ発現。ＯＶＡ投与Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の肺組織におけるＭＵＣ５ＡＣ（Ａ）およびＭＵＣ５Ｂ（Ｂ）の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで分析した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝８／群）として示し、ハウスキーピング遺伝子βアクチンに正規化している。＊生理食塩水投与マウスと比較してｐ＜０．０５。
【図６】ＯＶＡ投与マウス由来ＢＡＬ液中のＮＲＧ１ベータ１タンパク質のウェスタンブロット分析。ＯＶＡ投与マウスのＢＡＬ液をＮＲＧ１β１タンパク質についてウェスタンブロットによって分析した。ブロットはＮＲＧ１β１アイソフォームを優先的に認識する抗体（ｓｃ−３４７）で探索した。４匹のマウス由来のＢＡＬ液を各処置について分析した。示したデータは２つの独立したサンプルセットについて得たデータを代表する。
【図７】ＮＲＧ１ベータ１ＥＬＩＳＡ。  ＯＶＡ投与マウス由来ＢＡＬ液中のＮＲＧ１β１タンパク質を定量した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４／群）として示す。示したデータは２つの独立したサンプルセットを代表する。＊＊食塩水投与マウスと比較してｐ＜０．００１。
【図８】杯細胞形成に対するｐａｎ−ＥｒｂＢ受容体阻害剤の効果。ＮＲＧ１β１誘導性杯細胞形成に対するｐａｎ−ＥｒｂＢ受容体阻害剤の効果を示す。ＮＲＧ１β１誘導性ＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂタンパク質に対する阻害剤（１〜１０μＭ）の効果を組織学的に測定した。細胞は処理しないか、あるいはＮＲＧ１β１（５０ｎＭ）で示したとおりに処理した。＊未処理対照から有意な差（Ｐ＜０．０５）；＃ＮＲＧ１β１のみで処理した群から有意な差（Ｐ＜０．０５）；＃＃ＮＲＧ１β１のみで処理した群から有意な差（Ｐ＜０．００１）。結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示し、２つの独立した例を代表する。
【図９】ヒト気管支上皮細胞におけるＥｒＢ受容体発現の分析。初代ヒト気管支上皮細胞におけるＥｒｂＢ受容体発現をＲＴ−ＰＣＲ（左）およびウェスタンブロット（右）で分析した。３または２ドナーのＥｒｂＢ受容体発現をｍＲＮＡおよびタンパク質についてそれぞれ分析した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの発現も示す。
【図１０】ＮＲＧ１β１誘導性杯細胞形成に対するＥｒｂＢ受容体中和抗体の効果。ＨＢＥＣにおけるＮＲＧ１β１誘導性ＭＵＣ５ＡＣタンパク質（Ａ、Ｃ、Ｅ）およびＭＵＣ５Ｂタンパク質（Ｂ、Ｄ、Ｆ）に対する抗ＥｒｂＢ受容体抗体の効果を組織学的に定量した。抗ＥｒｂＢ２受容体抗体（Ａ、Ｂ）、抗ＥｒｂＢ３受容体抗体（Ｃ、Ｄ）および抗ＥｒｂＢ４受容体抗体（Ｅ、Ｆ）についてのデータを示し、使用する抗体の濃度をグラフ上に示す。＊非処理対照から有意な差（Ｐ＜０．０５）；＃ＮＲＧ１β１のみで処理した群と有意な差（Ｐ＜０．０５）。結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示し、２つの独立した例を代表する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
４．  発明の詳細な説明
下記セクション４の説明において、多様なタンパク質、そのアイソフォームおよび疾患／障害の処置に関する記載は、ヒトタンパク質、そのアイソフォームおよびヒト疾患および障害に関連する。したがって「ＮＲＧ−１」、「ＮＲＧ１α」および「ＮＲＧ１β１」は、ヒトＮＲＧ−１等について言及しているものと解釈される。下記の態様において、「ＮＲＧ１」および「ＮＲＧ１β１」についての記載は、それぞれのタンパク質のあらゆる形態ならびに付加的および個別に、可溶形態および膜結合形態を意味していると理解することができ、本明細書に触れた者はそれぞれの態様がそれ自体と解釈されることを意図していると推測することができる。したがって、特に定めのない限り、下記それぞれの態様において、３つの態様、第１にそれぞれのタンパク質のあらゆる形態、第２に何れかの膜結合形態そして第３にそれぞれのタンパク質の可溶形態に言及する。
【００１９】
４．１  結合化合物
本発明の一つの局面において、ＮＲＧ１タンパク質の生物学的活性を中和する結合化合物が提供される。
【００２０】
ある態様において、結合化合物はＮＲＧ１β１と結合して、上皮細胞（例えば杯細胞）でのＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂの発現を促進するその能力を中和する。かかる結合化合物は、同族受容体、例えばＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３と結合したＮＲＧ１β１、好ましくはＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーと結合して、阻害することができる。かかる態様において、本結合化合物はＮＲＧ−１タンパク質、例えばＮＲＧ−１β１と結合することができ、そうして例えばタンパク質とその同族受容体、例えばＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３間の相互作用を阻害することによって、その生物学的活性を中和する低分子量化学物質であり得る。他のかかる態様において、結合化合物は、ＮＲＧ−１タンパク質（例えばＮＲＧ−１β１）と結合して、それとその同族受容体（例えばＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３）間の相互作用を阻害することができる抗体のような治療用タンパク質であってもよい。これらの態様は以下により詳細に記載されている。他の態様において、本結合化合物は、ＡＤＡＭ−１７と結合してその活性を阻害し、次いで可溶ＮＲＧ１β１のその膜結合前駆体形態からの形成を阻害することができる。
【００２１】
他の態様において、本結合化合物はＮＲＧ−１、例えばＮＲＧ−１β１の発現を阻害し、それによって上皮細胞でのＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂタンパク質発現を促進するＮＲＧ１の能力を中和することができる。これらの態様において、結合化合物は、ＮＲＧ−１（例えばＮＲＧ−１β１）の発現を転写および／または翻訳レベルで阻害することができる。例えば、本結合化合物はＮＲＧ−１遺伝子の相補領域と結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。他のかかる態様において、本結合化合物は、ＮＲＧ−１（例えばＮＲＧ−１β１）タンパク質をコードすることができるＲＮＡ化合物の翻訳を阻害することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であってもよい。これらの態様は以下により詳細に記載される。
【００２２】
４．１  −  治療用タンパク質
本発明の治療用タンパク質は、抗体、アドネクチン、アンキリン、マキシボディー／アビマー、アフィボディー、アンチカリンまたはアフィリンであってよい。
【００２３】
４．１．１．  −  抗体
本発明の抗体は、当業者に周知の多数の形式の何れかであってよい。これらの形式は次に記載のとおり、インタクトな抗体、多様な抗体フラグメントおよび他の組換え形式を含む。好ましい形式において、本発明の抗体はモノクローナル集団として提供される。
【００２４】
４．１．１．１  −  インタクトな抗体
インタクトな抗体は、少なくとも２個の重鎖と２個の軽鎖を含む、ヘテロ多量体糖タンパク質を含む。ＩｇＭを除き、インタクトな抗体は通常、約１５０ＫＤａのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、２個の同一軽（Ｌ）鎖と２個の同一重（Ｈ）鎖から成る。典型的には、軽鎖はそれぞれ１つの共有ジスルフィド結合によって１個の重鎖と結合しているが、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合数は変化する。重鎖と軽鎖はそれぞれ、鎖内ジスルフィド架橋も有する。重鎖はそれぞれ、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、次いで多数の定常領域を有する。軽鎖はそれぞれ可変ドメイン（ＶＬ）およびその反対の末端に定常領域を有し；該軽鎖の定常領域は重鎖の最初の定常領域と一列に並び、該軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと一列に並ぶ。ほとんどの脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づきカッパまたはラムダと称される２つのタイプの一方に割り当てることができる。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいて、ヒト抗体は５個の異なるクラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに割り当てることができる。ＩｇＧおよびＩｇＡはさらにサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４；ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類することができる。種変異体はマウスおよびラットについて存在し、少なくともＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂを有する。抗体の可変ドメインは相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される特段の変動性を示す領域によって、抗体に結合特異性を付与する。可変領域のより保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と称される。インタクトな重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、３個のＣＤＲと結合した４個のＦＲを含む。それぞれの鎖のＣＤＲはＦＲ領域によってごく接近してまとめられており、他の鎖のＣＤＲは抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は抗体と抗原の結合に直接には関与しないが、抗体依存細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、Ｆｃγｒ受容体との結合を介した食作用、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介する半減／クリアランス速度および補体カスケードのＣ１ｑ成分を介した補体依存性細胞傷害への関与のような多様なエフェクター機能を示す。
【００２５】
したがって本発明の一つの態様において、ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）と結合してその生物学的活性を中和することができるインタクトな治療用抗体が提供される。特に、インタクトな治療用抗体はＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）と結合して、ＮＲＧ１（またはＮＲＧ１β１）とその同族受容体ＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３、特にＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー間の相互作用を阻害する。典型的な態様において、本抗体はＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４の霊長類、特にヒト定常領域を含み、次に記載のヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。
【００２６】
他の態様において、ＮＲＧ１β１と優先的に（ＮＲＧ１αと比較して）結合して、その生物学的活性を中和することができるインタクトな治療用抗体が提供される。特に、インタクトな治療用抗体はＮＲＧ１β１と優先的に結合して、ＮＲＧ１β１とその同族受容体ＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３、特にＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー間の相互作用を阻害する。好ましい形態において、インタクトな治療用抗体はＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４の霊長類、特にヒト定常領域を含み、次に記載のヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。本明細書を通じて使用される用語「優先的に結合」およびその文法的変形は、ＮＲＧ１αと結合するよりも高い親和性（少なくとも２倍）でＮＲＧ１β１と結合する治療用タンパク質（例えば抗体）の能力を意味する。しかし優先的に結合するタンパク質は、ＮＲＧ１β１およびＮＲＧ１αの両方の同じ共通する生物学的活性を顕著な程度中和することができる。
【００２７】
他の態様において、ＮＲＧ１β１と特異的に（ＮＲＧ１αと比較して）結合して、その生物学的活性を中和することができるインタクトな治療用抗体が提供される。特に、インタクトな治療用抗体はＮＲＧ１β１と特異的に結合して、ＮＲＧ１β１とその同族受容体ＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３、特にＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー間の相互作用を阻害する。好ましい形態において、インタクトな治療用抗体はＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４の霊長類、特にヒト定常領域を含み、次に記載のヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。本明細書を通じて使用される用語「特異的に結合」およびその文法的変形は、ＮＲＧ１αと結合するよりも高い親和性（少なくとも５倍）でＮＲＧ１β１と結合する治療用タンパク質（例えば抗体）の能力を意味する。特異的に結合する治療用タンパク質は、ＮＲＧ１β１の生物学的活性を中和することができるが、ＮＲＧ１αの同じ共通する生物学的活性を顕著な程度中和しない。
【００２８】
本発明の一つの態様において、膜結合ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）と結合してその生物学的活性を中和することができるインタクトな治療用抗体が提供される。特に、インタクトな治療用抗体は膜ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）と結合して、ＮＲＧ１（またはＮＲＧ１β１）とその同族受容体ＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３、特にＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー間の相互作用を阻害する。インタクトな治療用抗体は例えば、膜結合ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）と結合して、膜結合ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）の切断の阻害または膜ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）の再生の促進によって、それからの可溶ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）の形成を阻害することができる。典型的な態様において、本抗体はＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４の霊長類、特にヒト定常領域を含み、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。
【００２９】
本発明の他の態様において、可溶ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）と結合してその生物学的活性を中和することができるインタクトな治療用抗体が提供される。特に、インタクトな治療用抗体は可溶ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）と結合して、ＮＲＧ１（またはＮＲＧ１β１）とその同族受容体ＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３、特にＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー間の相互作用を阻害する。典型的な態様において、本抗体はＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４の霊長類、特にヒト定常領域を含み、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。
【００３０】
４．１．１．１．１  ヒト抗体
ヒト抗体は当業者に既知の多数の方法によって作製することができる。ヒト抗体はヒト骨髄腫またはマウスヒトヘテロ骨髄腫細胞系を用いたハイブリドーマ法によって作製することができる。Kozbor J. Immunol 133, 3001, (1984) and Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987)を参照されたい。別法はファージライブラリーまたはトランスジェニックマウスの使用を含み、それらはいずれもヒトＶ領域レパートリーを利用する（Winter G, (1994), Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455, Green LL (1999), J. Immunol. Methods 231, 11-23参照）。
【００３１】
マウス免疫グロブリン座がヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントで置換されている多様なトランスジェニックマウス株が現在では利用可能である（Tomizuka K, (2000) PNAS 97, 722-727; Fishwild DM (1996) Nature Biotechnol. 14, 845-851. Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15, 146-156参照）。抗原負荷によってかかるマウスは、興味のある抗体を選択することができるヒト抗体のレパートリーを作製することができる。特に注目すべきなのは、ヒトリンパ球が照射マウスに移植されているTrimera（商標）系（Eren R et al, (1988) Immunology 93:154-161参照）、ヒト（または他の種）リンパ球を大規模に蓄えられたインビトロ抗体生産方法に効果的に通し、次いで不要物を除去し（deconvulated）、希釈および選択方法を限定するSelected Lymphocyte Antibody System（ＳＬＡＭ、Babcook et al, PNAS (1996) 93: 7843-7848参照）ならびにXenomouse（商標）（Abgenix Inc）である。別のアプローチはMorphotek Incから入手可能なMorphodoma（商標）技術を用いる。
【００３２】
ファージディスプレイ技術を用いて、ヒト抗体（およびそのフラグメント）を作製することができる（McCafferty; Nature, 348, 552-553 (1990) and Griffiths AD et al (1994) EMBO 13: 3245-3260参照）。この技術によると、抗体Ｖドメイン遺伝子はフレームにおいて、Ｍ１３またはｆｄのような糸状バクテリオファージのタンパク質遺伝子のメジャーまたはマイナーコートへとクローン化され、ファージ粒子表面の機能抗体フラグメントとして（通常、ヘルパーファージの補助によって）示される。抗体の機能特性に基づく選択によって、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択ができる。ファージディスプレイ技術を用いて、上記疾患または障害を有する個体または非免疫化ヒトドナーから採取したヒトＢ細胞によって作製したライブラリーから、抗原特異的抗体を選択することができる（Marks; J Mol Bio 222, 581-591, 1991参照）。インタクトなヒト抗体がＦｃドメインを含むことが望まれるとき、所望の定常領域を含み、哺乳類発現ベクターにファージディスプレイ由来フラグメントを再クローン化して安定発現細胞系を確立する必要がある。
【００３３】
親和性変化の技術（Marks; Bio/technol 10, 779-783 (1992)）を用いて、ＨおよびＬ鎖Ｖ領域を天然に生じる変異で順次置換し、改善された結合親和性に基づいて選択して１次ヒト抗体の親和性が改善されている結合親和性を得ることができる。この技術の変形、例えばエピトープインプリンティングも現在では利用可能である（WO 93/06213参照）。Waterhouse; Nucl Acids Res 21, 2265-2266 (1993)も参照されたい。
【００３４】
したがって、本発明の一つの態様において、ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）と結合してその生物学的活性を中和することができるインタクトな治療用ヒト抗体が提供される。特に、インタクトな治療用ヒト抗体はＮＲＧ１β１と結合して、ＮＲＧ１β１とその同族受容体ＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３、特にＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー間の相互作用を阻害する。典型的な態様において、本インタクトな治療用ヒト抗体はＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域を含む。
【００３５】
他の態様において、ＮＲＧ１β１と優先的に（ＮＲＧ１αと比較して）結合して、その生物学的活性を中和することができるインタクトな治療用ヒト抗体が提供される。特に、インタクトな治療用ヒト抗体はＮＲＧ１β１と優先的に結合して、ＮＲＧ１β１とその同族受容体ＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３、特にＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー間の相互作用を阻害する。好ましい形態において、インタクトな治療用ヒト抗体はＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域を含む。
【００３６】
他の態様において、ＮＲＧ１β１と特異的に（ＮＲＧ１αと比較して）結合して、その生物学的活性を中和することができるインタクトな治療用ヒト抗体が提供される。特に、インタクトな治療用ヒト抗体はＮＲＧ１β１と特異的に結合して、ＮＲＧ１β１とその同族受容体ＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３、特にＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー間の相互作用を阻害する。好ましい形態において、インタクトな治療用ヒト抗体はＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域を含む。
【００３７】
４．１．１．１．２  キメラおよびヒト化抗体
ヒト疾患または障害の処置におけるインタクトな非ヒト抗体の使用は、現在では十分に確立された免疫原性の問題（すなわち、患者の免疫系が非自己として非ヒトインタクトな抗体が認識して中和応答を開始することがある）の可能性がある。これは特にヒト患者に非ヒト抗体を多剤投与したときに顕著である。長年にわたってこれらの問題を克服する多様な技術が開発されており、一般に免疫化動物、例えばマウス、ラットまたはウサギから非ヒト抗体を得ることが容易なままに、インタクトな抗体の非ヒトアミノ酸配列の組成を減少させることを含む。これを得るため、広くは２つのアプローチが用いられている。第１のものは、一般にヒト定常領域と融合した非ヒト（例えばマウスのようなげっ歯類）可変ドメインを含む、キメラ抗体である。抗体の抗原結合部位が可変領域に局在しているため、キメラ抗体は抗原に対する結合親和性を保持するが、ヒト定常領域のエフェクター機能を獲得し、したがって上記のもののようなエフェクター機能を発揮することができる。キメラ抗体は典型的に、組換えＤＮＡ法を用いて作製する。抗体をコードするＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）を単離し、常套の方法を用いて（例えば本発明の抗体のＨおよびＬ鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブ、例えば上記配列番号１、２、３、４、５および６をコードするＤＮＡを用いて）配列決定する。ハイブリドーマ細胞はかかるＤＮＡの典型源として使用する。単離すると、該ＤＮＡは発現ベクターに入れて、次いでこれを大腸菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトする。これはそうしなければ免疫グロブリンタンパク質を生産して抗体を合成しない。ＤＮＡは、ヒトＬおよびＨ鎖のコーディング領域を対応する非ヒト（例えばマウス）ＨおよびＬ定常領域で置換して修飾してもよい（例えばMorrison; PNAS 81, 6851 (1984)参照）。
【００３８】
第２のアプローチは、可変領域をヒト化して抗体の非ヒト成分を減少させたヒト化抗体の作製を含む。ヒト化のための２つの技術が好評を博している。第１のものは、ＣＤＲ移植によるヒト化である。ＣＤＲはフレームワーク領域によって得られる足場にマウントされた表面を形成する抗体のＮ末端に近いループを構築する。抗体の抗原結合特異性は主として、局所分布およびＣＤＲ表面の化学的特徴によって定義される。これらの特徴は個々のＣＤＲのコンホメーション、ＣＤＲの相対的配置ならびにＣＤＲに含まれる残基の側鎖の性質および配置によって決定される。非ヒト（例えばマウス）抗体（ドナー抗体）のＣＤＲのみをヒトフレームワーク（アクセプターフレームワーク）および定常領域に移植して、免疫原性を大きく減少させることができる（Jones et al (1986) Nature 321, 522-525 および Verhoeyen M et al (1988) Science 239, 1534-1536参照）。しかし、ＣＤＲ移植のみによって抗原結合特性を完全に保持することはできず、顕著な抗原結合親和性が回復されるとき、ドナー抗体のいくつかのフレームワーク残基（復帰変異（backmutation）と称されることもある）がヒト化化合物に保存されている必要がしばしばある（Queen C et al (1989) PNAS 86, 10, 029-10,033, Co, M et al (1991) Nature 351, 501-502参照）。この場合、非ヒトドナー抗体に最も高い配列相同性を示すヒトＶ領域は、ヒトフレームワーク（ＦＲ）を得るためにデータベースから選択される。ヒトＦＲの選択は、ヒトコンセンサス抗体または個々のヒト抗体から行うことができる。必要があれば、ＣＤＲコンホメーションを保存するため、ヒトアクセプターフレームワークにドナー抗体由来の重要な残基が置換される。抗体のコンピューターモデリングは、かかる構造的に重要な残基の同定を補助するために使用することができる（WO99/48523参照）。
【００３９】
あるいは、ヒト化はベニアリング（veneering）の方法によって行ってもよい。ユニークなヒトおよびマウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域の統計的分析によって、露出している残基の正確なパターンがヒトおよびマウス抗体で異なっており、ほとんどの個々の表面位置が少数の異なる残基について強い優先性を有することが示された（Padlan EA, et al; (1991) Mol Immunol 28, 489-498 および Pedersen JT et al (1994) J Mol Biol 235; 959-973）。したがって、ヒト抗体において通常みられるものと異なるフレームワーク領域の露出している残基を置換して、非ヒトＦｖの免疫原性を低下させることができる。タンパク質抗原性は表面接触性に関係している可能性があるため、表面残基の置換はマウス可変領域をヒト免疫系に見えなくするために十分であり得る。（Mark GE et al (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol 113: The pharmacology of monoclonal Antibody, Springer-Verlag, pp 105-134も参照）。このヒト化方法は、抗体の表面のみを変化させて支持する残基が乱されていないままであるため、ベニアリング（veneering）と称される。
【００４０】
したがって、本発明の一つの態様において、ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）と結合してその生物学的活性を中和することができるインタクトな治療用ヒト化抗体が提供される。特に、インタクトな治療用ヒト化抗体はＮＲＧ１β１と結合して、ＮＲＧ１β１とその同族受容体ＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３間の相互作用を阻害する。典型的な態様において、本インタクトな治療用ヒト化抗体はＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域を含む。
【００４１】
他の態様において、ＮＲＧ１β１と優先的に（ＮＲＧ１αと比較して）結合して、その生物学的活性を中和することができるインタクトな治療用ヒト化抗体が提供される。特に、インタクトな治療用ヒト化抗体はＮＲＧ１β１と優先的に結合して、ＮＲＧ１β１とその同族受容体ＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３間の相互作用を阻害する。好ましい形態において、インタクトな治療用ヒト化抗体はＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域を含む。
【００４２】
他の態様において、ＮＲＧ１β１と特異的に（ＮＲＧ１αと比較して）結合して、その生物学的活性を中和することができるインタクトな治療用ヒト化抗体が提供される。特に、インタクトな治療用ヒト化抗体はＮＲＧ１β１と特異的に結合して、ＮＲＧ１β１とその同族受容体ＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３間の相互作用を阻害する。好ましい形態において、インタクトな治療用ヒト化抗体はＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域を含む。
【００４３】
４．１．１．１．３  二重特異性抗体
二重特異性抗体は少なくとも２種の異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。かかる抗体の作製方法は当該技術分野において知られている。伝統的に、二重特異性抗体の組換え作製は、２つのＨ鎖が異なる結合特異性を有する２つの免疫グロブリンＨ鎖−Ｌ鎖対の共発現に基づく（Millstein et al, Nature 305, 537-539 (1983), WO93/08829 および Traunecker et al, EMBO, 10, 1991, 3655-3659参照）。ＨおよびＬ鎖のランダム分類のため、１０種の異なる抗体構造の潜在的混合物が得られ、その１種のみが所望の結合特異性を有する。別のアプローチは、所望の結合特異性を有する可変ドメインとヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む重鎖定常領域とを融合することを含む。少なくとも１個の融合に存在する軽鎖結合に必要な部位を含むＣＨ１領域を有することが好ましい。これらの融合および所望によりＬ鎖をコードするＤＮＡは、別の発現ベクターに挿入され、好適な宿主生物にコトランスフェクトされる。しかし、２種または３種全ての鎖についてのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することも可能である。一つの好ましいアプローチにおいて、二重特異性抗体は１つのアームに第１の結合特異性を有するＨ鎖と、他のアームに第２の結合特異性を与えるＨ−Ｌ鎖対から成る（WO94/04690参照）。Suresh et al, Methods in Enzymology 121, 210, 1986も参照されたい。
【００４４】
本発明の１つの態様において、少なくとも１種の結合特異性がＮＲＧ１、特にＮＲＧ１β１に対するものであり、ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）と結合してその生物学的活性を中和する二重特異性治療用抗体が提供される。好ましい形態において、二重特異性抗体はＩｇＧ（例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４）アイソタイプの霊長類、例えばヒト抗体を含む。
【００４５】
４．１．１．１．４  抗体フラグメント
本発明のある態様において、ＮＲＧ１とその同族受容体、例えばＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３、例えばＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー間の相互作用を調節（例えば阻害）する治療用抗体フラグメントが提供される。かかるフラグメントは、上記抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖフラグメントのような、インタクトおよび／またはヒト化キメラ抗体の機能的抗原結合性フラグメントであってよい。
【００４６】
伝統的に、かかるフラグメントは例えばパパイン消化によるインタクトな抗体のタンパク分配によって作製されるが（例えばWO 94/29348参照）、形質転換した宿主細胞から組換え的に直接作製してもよい。ＳｃＦｖの作製については、Bird et al; (1988) Science, 242, 423-426を参照されたい。さらに、抗体フラグメントは、次に記載するように多様な遺伝子工学的技術を用いて作製してもよい。
【００４７】
ＦＶフラグメントはＦａｂフラグメントより２個の鎖の相互作用エネルギーを有すると考えられている。ＶＨドメインとＶＬドメインの会合を安定化するため、それらはペプチド（Bird et al, (1988) Science, 242, 423-426, Huston et al, PNAS, 85, 5879-5883）、ジスルフィド架橋（Glockshuber et al, (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367）および「ノブ・イン・ホール（knob in hole）」突然変異（Zhu et al (1997), Protein Sci., 6, 781-788）と関連している。ＳｃＦｖフラグメントは当業者に周知の方法で作製することができる（Whitlow et al (1991), Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105 および Huston et al (1993) Int Rev Immunol 10, 195-217参照）。ＳｃＦｖは大腸菌のような細菌細胞中で作製することができるが、より好ましくは真核細胞中で作製される。ＳｃＦｖの欠点の一つは、多価結合による増加した親和性を阻害する生成物の一価性、そしてそれらの短い半減期である。これらの問題を克服するための努力には、化学カップリングによるさらなるＣ末端システインを含むＳｃＦｖから（Adams et al (1993) Can Res 53, 4026-4034 and McCartney et al (1995) Protein Eng, 8, 301-314）または対でないＣ末端システイン残基を含むＳｃＦｖの自然発生的部位特異的二量体化によって（Kipriyanov et al (1995) Cell. Biophys 26, 187-204参照）作製した二価（ＳｃＦｖ’）２が含まれる。あるいは二重特異性抗体を形成するため、ＳｃＦｖはペプチドリンカーを３および１２残基に短縮してマルチマーを形成させることができる（Holliger et al PNAS (1993), 90, 6444-6448参照）。該リンカーをさらに減少させて、ＳｃＦＶトリマー（「三重特異性抗体」、Kortt et al (1997) Protein Eng, 10, 423-433参照）およびテトラマー（「四重特異性抗体」、Le Gall et al (1999) FEBS Lett, 453, 164-168参照）を得ることができる。二価ＳｃＦＶ化合物の構成はまた、タンパク質二量体化モチーフとの遺伝的融合によって得て、「ミニ抗体」（Pack et al (1992) Biochemistry 31, 1579-1584参照）および「ミニボディ」（Hu et al (1996), Cancer Res. 56, 3055-3061参照）を形成することもできる。ＳｃＦｖ−Ｓｃ−Ｆｖタンデム（（ＳｃＦＶ）２）はまた、第３のペプチドリンカーによって２個のＳｃＦＶユニットを結合して作製することもできる（Kurucz et al (1995) J Immunol, 154, 4576-4582参照）。二重特異性抗体は、ある抗体由来のＶＨドメインと、短いリンカーによってそれと結合した別の抗体のＶＬドメインから成る２つの一本鎖融合生成物の非共有結合によって作製することができる（Kipriyanov et al (1998), Int J Can 77, 763-772参照）。かかる二重特異性抗体の安定性は、上記のとおりジスルフィド架橋またはノブ・イン・ホール突然変異の導入によってまたは２個のハイブリッドＳｃＦｖフラグメントがペプチドリンカーを介して結合している一本鎖二重特異性抗体（ＳｃＤｂ）の形成によって、向上させることができる（Kontermann et al (1999) J Immunol Methods 226, 179-188参照）。四価二重特異性化合物は例えば、ＳｃＦｖフラグメントとＩｇＧ化合物のＣＨ３ドメインまたはＦａｂフラグメントとを、ヒンジ領域を介して融合させて得ることができる（Coloma et al (1997) Nature Biotechnol, 15, 159-163参照）。あるいは、四価二重特異性化合物は、二重特異性抗体一本鎖抗体の融合によって作製される（Alt et al (1999) FEBS Lett 454, 90-94参照）。より小さな四価二重特異性化合物はまた、ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフを含む��ンカーとＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデムの二量体化（ＤｉＢｉミニ抗体、Muller et al (1998) FEBS Lett 432, 45-49参照）または分子内対合を防止する方向での４つの抗体可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）を含む一本鎖化合物の二量体化によって形成してもよい（タンデム二重特異性抗体、Kipriyanov et al, (1999) J Mol Biol 293, 41-56参照）。二重特異性Ｆ９ａｂ’）２フラグメントはＦａｂ’フラグメントの化学的カップリングまたはロイシンジッパーを介したヘテロダイマー化によって作製することができる（Shalaby et al (1992) J Exp Med 175, 217-225 および Kostelny et al (1992), J Immunol 148 1547-1553参照）。単離したＶＨドメインおよびＶＬドメイン（Domantis plc、US 6, 248, 516; US 6, 291, 158; US 6, 172, 197参照）および単離したＶＨＨドメイン抗体（ナノボディー）も利用可能である。これらのドメインおよびナノボディーは二重特異性であってよく、一つの特異性はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような半減期延長タンパク質に関連していてもよい。本発明のＮＲＧ１タンパク質に一重特異性であり、ＨＳＡのような半減期延長タンパク質に二重特異性であるかかるドメインおよびナノボディーは、本発明によって特に意図される。
【００４８】
一つの態様において、ＮＲＧ１、例えばＮＲＧ１β１と結合して（例えば優先的または特異的に結合して）、ＮＲＧ１とその同族受容体、例えばＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３、例えばＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー間の相互作用を阻害することによってその生物学的活性を中和する、上記治療用抗体フラグメント（例えばＳｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）または改変抗体フラグメントが提供される。
【００４９】
４．１．１．１．５  ヘテロ複合体抗体
ヘテロ複合体抗体も本発明の態様を形成する。ヘテロ複合体抗体は何れかの簡便な架橋方法を用いて形成した２つの共有結合した抗体から成る。例えばUS 4,676,980を参照されたい。
【００５０】
４．１．１．１．６  他の修飾
抗体のＦｃ領域と多様なＦｃ受容体（ＦｃγＲ）間の相互作用は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体の固定、食作用および抗体の半減期／クリアランスを含む、抗体のエフェクター機能を仲介すると考えられている。本発明の抗体のＦｃ領域の多様な修飾は、所望の特性に従って実施することができる。例えば、変異がなければ溶解性の抗体を非溶解性にするＦｃ領域における特異的変異は、EP 0629 240B1 および Ep 0307 434B2に証左いいに記載されているか、あるいはサルベージ受容体結合エピトープを抗体に導入して、血清半減期を延長することができる（US 5, 739, 277参照）。ヒトＦｃγ、ＦｃγＲ（Ｉ）、ＦＣγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよび新生児ＦｃＲｎの５種類が現在認識されている。Shields et al, (2001) J Biol Chem 276, 6591-6604は、ＩｇＧ１残基の共通セットが全てのＦｃγＲの結合に関与しているが、ＦＣγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩはこの共通セットの外側の別の部位を用いることを示した。ＩｇＧ１残基の一つのグループ（Ｐｒｏ−２３８、Ａｓｐ−２６５、Ａｓｐ−２７０、Ａｓｎ−２９７およびＰｒｏ−２３９）は、アラニンに変化したとき、全てのＦｃγＲへの結合が低下する。全てＩｇＧのＣＨ２ドメイン中に存在し、ＣＨ１とＣＨ２を結合するヒンジ付近に集積されている。ＦｃγＲＩは結合のためにＩｇＧ１残基の共通セットのみを利用するが、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩはそうではない（例えばＧｌｕ−２９３）。いくつかの変異体は改善されたＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩとの結合を示したが、他の受容体との結合には影響しなかった（例えばＳｅｒ−２６７ＡｌａはＦｃγＲＩＩとの結合を改善するが、ＦｃγＲＩＩＩとの結合は影響されなかった）。他の変異体はＤｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩとの改善された結合を示したが、他の受容体との結合を低下させた（例えばＳｅｒ２９８ＡｌａはＦｃγＲＩＩＩとの結合を改善し、ＦｃγＲＩＩとの結合を低下させた）。ＦｃγＲＩＩＩａについて、最善の結合性ＩｇＧ１変異体はＳｅｒ−２９８、Ｇｌｕ−３３３およびＬｓ−３３４での組合せアラニン置換を有した。新生児ＦｃＲｎ受容体は、抗体クリアランスと組織間のトランスサイトーシスの両方に関与すると考えられている（Junghans RP (1997) Immunol Res 16, 2957 および Ghetie et al (2000) Annu Rev Immunol 18, 739-766参照）。ヒトＩｇＧ１残基はＩｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５を含むヒトＦｃＲｎと直接相互作用することが決定された。本段落に記載のこれらの位置の何れかでの置換は、本発明の抗体の血清半減期および／または変化したエフェクター特性を可能として、したがって本発明の態様を形成する。
【００５１】
他の修飾は本発明の抗体のグリコシル化変異体を含む。定常領域の保存的位置での抗体のグリコシル化は、抗体機能、特に上記のもののようなエフェクター機能に対する、計り知れない影響を有することが知られている（例えばBoyd et al (1996), Mol Immunol 32, 1311-1318参照）。１個以上の炭化水素基が付加、置換、欠失または修飾されている本発明の治療用抗体またはその抗原結合性フラグメントのグリコシル化変異体が意図される。アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニンモチーフの導入は糖質基の酵素的付着のための潜在的側鎖を創出し、したがって抗体のグリコシル化を操作するために使用することができる。Raju et al (2001) Biochemistry 40, 8868-8876において、ＴＮＦＲ−ＩｇＧ免疫接着の末端シアリル化（sialyation）が、ベータ−１，４−ガラクトロシルトランスフェレース（transferace）を用いた再シアリル化および／または再ガラクトシル化および／またはアルファ−２，３シアリルトランスフェレースのプロセスを介して増加された。末端シアリル化の増加は免疫グロブリンの半減期を上昇させると考えられている。ほとんどの糖タンパク質と同様に、抗体は典型的には、糖型の混合物として作製される。抗体が真核細胞、特に哺乳類細胞中で作製されるとき、この混合物は特に明らかである。定義の糖型を作製するための多様な方法が開発されている（Zhang et al, Science (2004), 303, 371; Sears et al, Science (2001), 291, 2344; Wacker et al (2002), Science 298, 1790; Davis et al (2002), Chem Rev 102, 579; Hang et al (2001), Acc Chem Res 34, 727参照）。したがって、本発明は、所定の数の（例えば７またはそれ未満、例えば５またはそれ未満、例えば２または１個）糖型を含む、本明細書に記載の複数の治療用（モノクローナル）抗体（これはＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１のものであってもよい）または当該抗体もしくはその抗原結合性フラグメントを意図する。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンのような非タンパク質性（proteinaeous）ポリマーと結合した本発明の治療用抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。タンパク質とＰＥＧの複合体は、タンパク質の半減期を上昇し、タンパク質の抗原性および免疫原性を低下させるために確立された技術である。様々な分子量および形式（直鎖または分枝鎖）ＰＥＧ化の使用がインタクトな抗体およびＦａｂ’フラグメントについて研究されている（Koumenis IL et al (2000) Int J Pharmaceut 198;83-95参照）。
【００５３】
４．２  アドネクチン−  治療用化合物
アドネクチン骨格はフィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（例えばフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインの１０番目のモジュール（１０  Ｆｎ３ドメイン））を基礎とする。フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインは、２枚のベータシート間に分布する７または８個のベータ鎖を有し、これら自体が互いにパックして該タンパク質のコアを形成し、さらにベータ鎖と互いに結合し、溶媒に曝露されるループ（ＣＤＲと類似する）を含む。ベータシートサンドイッチの各端部に３個のかかるループが存在し、ここで該端部はベータ鎖の方向と直角なタンパク質の結合である（US 6,818,418）。
【００５４】
ラクダまたはラマＩｇＧの全抗原認識ユニットを含む重鎖の可変領域である最小機能的抗体フラグメントのものと密接に関連しているが、これらのフィブロネクチンベース骨格は全体の折り畳みが免疫グロブリンではない。この構造のため、非免疫グロブリン抗体は抗体のものと同様の性質および親和性である抗原結合特性を模倣する。これらの骨格はインビボでの抗体の親和性変異のプロセスと類似する、インビトロでのループランダム化およびシャッフル技術において使用することができる。これらのフィブロネクチンベース化合物は、標準的なクローニング技術を用いて化合物のループ領域を本発明のＣＤＲに置換することができる骨格として使用することができる。したがって、いくつかの態様において、ＮＲＧ１、特にＮＲＧ１β１と結合し、その生物学的活性を中和するアドネクチン化合物が提供される。
【００５５】
４．３  アンキリン  −  分子パートナー
この技術は、多様な標的と結合するために使用することができる可変領域を有する骨格としてのアンキリン由来反復モジュールを用いることに基づく。アンキリン反復モジュールは２個の逆平行α−ヘリックスおよびβ−ターンから成る３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソーム・ディスプレイを用いてほとんど最適化される。したがって、ある態様において、ＮＲＧ１、特にＮＲＧ１β１と結合してその生物学的活性を中和するアンキリン化合物が提供される。
【００５６】
４．４  マキシボディー／アビマー  −  アビジア
アビマーはＬＲＰ−１のようなタンパク質を含む天然Ａ−ドメインに由来する。これらのドメインは天然でタンパク質間相互作用のために使用され、ヒトにおいて２５０以上のタンパク質が構造的にＡ−ドメインに基づく。アビマーはアミノ酸リンカーを介して結合した多数の異なる「Ａ−ドメイン」モノマー（２〜１０個）から成る。アビマーは、例えばUS20040175756; US20050053973; US20050048512; および US20060008844に記載の方法論を用いて標的抗原と結合することができるように作製することができる。したがって、ある態様において、ＮＲＧ１、特にＮＲＧ１β１と結合してその生物学的活性を中和するマキシボディー化合物が提供される。
【００５７】
４．５  タンパク質Ａ  −  アフィボディー
アフィボディー（登録商標）親和性リガンドは、タンパク質ＡのＩｇＧ結合ドメインの一つの骨格に基づいた３−ヘリックスバンドルから成る小さく単純なタンパク質である。タンパク質Ａは黄色ブドウ球菌由来の表面タンパク質である。この足場ドメインは５８個のアミノ酸から成り、その１３個はランダム化されて多数のリガンド変異体を含むアフィボディー（登録商標）ライブラリーを創出している（例えばUS 5,831,012参照）。アフィボディー（登録商標）化合物は抗体を模倣し、それらは６ｋＤａの分子量を有し、抗体の分子量は１５０ｋＤａである。その小さなサイズに拘わらず、アフィボディー（登録商標）化合物の結合部位は抗体のものと同様である。したがって、ある態様において、ＮＲＧ１、特にＮＲＧ１β１と結合してその生物学的活性を中和するタンパク質Ａ−アフィボディー化合物が提供される。
【００５８】
４．６  アンチカリン  −  モンシロチョウ
アンチカリン（登録商標）はPieris ProteoLab AG社が開発した製品である。これは化学的に感受性な化合物または不溶性化合物の生理的輸送または貯蔵に通常関与する小さなロバストタンパク質の広範な群であるリポカリンに由来する。多様な天然リポカリンがヒト組織または体液中に生じる。
このタンパク質構造は、強固なフレームワークの頭頂部に超可変ループを有しており、免疫グロブリンと類似している。しかし、抗体またはその組換えフラグメントと対照的に、リポカリンは免疫グロブリンドメインよりもごくわずかに大きな１６０〜１８０アミノ酸残基を含む一本鎖ポリペプチドから成る。
結合ポケットを形成する４個のループのセットは、顕著な構造柔軟性を示し、多様な側鎖を受容する。したがって、異なる形態の上記標的化合物を高い親和性および特異性で認識するため、結合部位は独自の方法で再形成され得る。
リポカインファミリーの一つのタンパク質である、オオモンシロチョウのビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）は、４ループのセットに突然変異を起こさせてアンチカリンを開発するために使用されている。「アンチカリン」について記載している特許出願の一例は、PCT WO 199916873である。
したがって、ある態様において、ＮＲＧ１、特にＮＲＧ１β１と結合してその生物学的活性を中和するアンチカリン化合物が提供される。
【００５９】
４．７  アフィリン  −  Scil タンパク質
アフィリン（商標）化合物は、タンパク質と低分子化合物に対する特異的親和性について設計された低分子非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン（商標）化合物は、それぞれ異なるヒト由来足場タンパク質に基づく２種のライブラリーから極めて速やかに選択することができる。アフィリン（商標）化合物は免疫グロブリンタンパク質と全く構造的相同性を示さない。Scilタンパク質は２種のアフィリン（商標）骨格を用い、その一方はヒト構造的眼レンズ体タンパク質であるガンマ・クリスタリンであり、他方は「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。ヒト骨格はいずれも極めて小さく、高い温度安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤にほぼ耐性である。この高い安定性は、主に該タンパク質の広いベータシート構造に由来する。ガンマ・クリスタリン由来タンパク質の例はWO200104144に記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例はWO2004106368に記載されている。したがって、ある態様において、ＮＲＧ１、特にＮＲＧ１β１と結合してその生物学的活性を中和するアフィリン化合物が提供される。
【００６０】
４．７．１  −  他の治療手段
上記のとおり、本発明の他の治療手段は、タンパク質発現の前に標的に対する効果を発揮するＮＲＧ１、特にＮＲＧ１β１の調節剤（特に阻害剤）を含む。例えば（ａ）ＮＲＧ１（特にＮＲＧ１β１）遺伝子の一部と安定なトリプレックスを形成することができるか、または（ｂ）ＮＲＧ１（特にＮＲＧ１β１）遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の一部と生理的条件下で安定なデュープレックスを形成することができる配列を含む（または本質的にそれから成る）アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。他の例は、「ＲＮＡ干渉」減少に関与し得る分子を含む。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は特定のタンパク質の生産の特異的阻害に特に有用である。理論によって限定されることを望まないが、Waterhouse et al. (1998)はｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）を用いてタンパク質生産を減少させることができるメカニズムのモデルを提供している。この技術は、目的の遺伝子のｍＲＮＡまたはその一部と本質的に同一な配列を含むｄｓＲＮＡ分子の存在に依存している。簡便には、ｄｓＲＮＡはセンスおよびアンチセンス配列がハイブリダイズしてループ構造を形成する非関連配列とのｄｓＲＮＡを形成する非関連配列と隣接している組換えベクターまたは宿主細胞の一本鎖プロモーターから作製することができる。本発明に好適なｄｓＲＮＡ分子の設計および生産は、特にWaterhouse et al. (1998), Smith et al. (2000), WO 99/32619, WO 99/53050, WO 99/49029およびWO 01/34815を考慮して、当業者の能力の範囲内である。
【００６１】
一つの例において、不活性化される標的遺伝子と相同性を有する少なくとも部分的な二本鎖ＲＮＡ産物の合成に関与するＤＮＡが導入される。
【００６２】
したがってＤＮＡは、ＲＮＡに転写されるときハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができるセンスおよびアンチセンス配列の両方を含む。好ましい態様において、センスおよびアンチセンス配列は、ＲＮＡに翻訳されるときスプライシングにより除去されるイントロンを含むスペーサー領域によって分離されている。この配列は遺伝子サイレンシングのより高い効率をもたらすことが示されている。二本鎖領域は、１個のＤＮＡ領域または２個のものから転写された１または２個のＲＮＡ分子を含んでいてもよい。二本鎖分子の存在は、二本鎖ＲＮＡと標的哺乳類遺伝子と相同なＲＮＡ転写産物の両方を破壊する内因性哺乳類システムの応答を惹起して、標的遺伝子の活性を効果的に低減または排除すると考えられる。
【００６３】
それぞれハイブリダイズするべきセンスおよびアンチセンス配列の長さは、少なくとも１９連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０または５０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドである。全遺伝子転写産物に対応する全長配列を用いてもよい。長さは最も好ましくは１００〜２０００ヌクレオチドである。標的転写産物とのセンスおよびアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５〜１００％であるべきである。ＲＮＡ分子は当然、該分子を安定化するために機能し得る非関連配列を含んでいてもよい。ＲＮＡ分子はＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＨＩプロモーターの制御下で発現され得る。後者の例は、ｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡプロモーターを含む。
【００６４】
好ましい低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子は、標的ｍＲＮＡの約１９〜２１連続ヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡ配列はジヌクレオチドＡＡで開始し、約３０〜７０％（好ましくは、３０〜６０％、より好ましくは４０〜６０％、より好ましくは約４５％〜５５％）のＧＣ成分を含み、例えば標準的なＢＬＡＳＴサーチで決定するとそれが導入される哺乳類のゲノムの標的以外のヌクレオチド配列と高い同一性率を有さない。マイクロＲＮＡ制御は、常套のＲＮＡｉ／ＰＴＧＳから分かれて、遺伝子制御について進化したＲＮＡサイレンシング経路の明確に特化した分岐である。
【００６５】
マイクロＲＮＡは、特徴的な逆方向反復に組織された遺伝子様要素にコードされた低分子ＲＮＡの特定のクラスである。転写されると、マイクロＲＮＡ遺伝子はステム−ループ前駆ＲＮＡを生じさせ、次いでこれからマイクロＲＮＡが処理される。マイクロＲＮＡは典型的には約２１ヌクレオチド長である。放出されたｍｉＲＮＡは配列特異的遺伝子発現を示すアルゴノートタンパク質の特定のサブセットを含むＲＩＳＣ様複合体に導入される（例えばMillar and Waterhouse, 2005; Pasquinelli et al. 2005; Almeida and Allshire, 2005参照）。
【００６６】
４．８  製造方法
本発明の治療用タンパク質、特に抗体は、ポリクローナル群として作製することができるが、より好ましくはモノクローナル群として作製する（すなわち、特異的抗原結合部位に関して同一の抗体の実質的に均一な集団として）。群が１種以上の抗体分子を含むことは当業者には当然に理解されよう。本発明の抗体はトランスジェニック生物、例えばヤギ（Pollock et al (1999), J. Immunol. Methods 231 :147-157参照）、ニワトリ（Morrow KJJ (2000) Genet.Eng.News 20:1- 55参照）、マウス（Pollock et al参照）または植物（Doran PM, (2000) Curr.Opinion Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), Nat.Med. 4; 601-606, Baez J e. al, BioPharm (2000) 13: 50-54, Stoger E et al; (2000) Plant Mol.Biol. 42:583-590参照）において製作することができる。抗体は化学合成で製造してもよい。しかし、本発明の抗体および他の治療用タンパク質は、典型的には、当業者に周知の組換え細胞培養技術を用いて生産する。抗体をコードするポリヌクレオチドは単離され、さらなるクローニング（増幅）または発現のためのプラスミドのような複製可能なベクターに挿入される。有用な発現系の一つはグルタメート合成系（例えばLonza Biologiesによって販売されている）であり、特に宿主細胞はＣＨＯまたはＮＳＯである（下記参照）。抗体をコードするポリヌクレオチドは常套の方法（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）を用いて容易に単離し、配列決定される。使用することができるベクターは、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニクロモソームを含むが、プラスミドが典型的な態様である。一般に、かかるベクターはさらに、発現が促進されるように、シグナル配列、複製起点、１個以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーターおよび軽鎖および／または重鎖ポリヌクレオチドと作動可能に連結した転写終止配列を含む。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別のベクターに挿入して同じ宿主細胞にトランスフェクトするか、あるいは所望により重鎖と軽鎖の両方が宿主細胞にトランスフェクトするための同じベクターに挿入されてもよい。したがって、本発明の一つの局面に従って、本発明の治療用抗体またはその抗原結合性フラグメントの軽鎖および／または重鎖をコードしたベクターを構成する方法であって、本発明の治療用抗体の軽鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドをベクターに挿入することを含む方法が提供される。
【００６７】
４．８．１  シグナル配列
本発明の抗体は、成熟タンパク質のＮ末端に特異的切断部位を有する異種シグナル配列との融合タンパク質として作製してもよい。該シグナル配列は宿主細胞によって認識され、処理されるべきである。原核宿主細胞について、該シグナル配列はアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーであり得る。酵母の分泌のため、該シグナル配列は酵母インベルターゼリーダー、［アルファ］因子リーダーまたは酸ホスファターゼリーダーであってもよい（例えばWO90/13646参照）。哺乳類細胞系において、ウイルスの分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルおよび天然免疫グロブリンシグナル配列が利用可能である。典型的に、シグナル配列はリーダーフレームにおいて本発明の抗体をコードするＤＮＡとライゲートしている。
【００６８】
４．８．２  複製起点
ほとんどのグラム陰性菌に好適なｐＢＲ３２２、ほとんどの酵母についての２μプラスミドおよびほとんどの哺乳類細胞についての多様なウイルス性起点、例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶに関して、複製起点は当該技術分野において周知である。一般に、複製起点成分は哺乳類発現ベクターには必要ないが、初期プロモーターを含むためＳＶ４０は使用され得る。
【００６９】
４．８．３  選択マーカー
典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒物、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を与えるか、または（ｂ）補体要求性欠損または複合培地中で入手不可能な栄養を供給するタンパク質をコードする。選択スキームは宿主細胞の増殖停止を含んでいてもよい。本発明の治療用抗体をコードする遺伝子での形質転換が成功した細胞は、例えば選択マーカーによって与えられる薬剤耐性のために生存する。別の例は、所謂ＤＨＦＲ選択マーカーであり、形質転換物をメトトレキセートの存在下で培養する。典型的な態様において、細胞は目的の異種遺伝子のコピー数を増幅するため、増加量のメトトレキセートの存在下で培養される。ＣＨＯ細胞はＤＨＦＲ選択のために特に有用な細胞系である。さらなる例は、グルタメート合成酵素発現系である（Lonza Biologies）。酵母に使用するために好適な選択遺伝子はｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb et al Nature 282, 38, 1979参照）。
【００７０】
４．８．４  プロモーター
本発明の抗体を発現するために好適なプロモーターは、抗体をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドと作動可能に連結している。原核宿主のためのプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファンおよびハイブリッドプロモーター、例えばＴａｃを含む。酵母細胞での発現に好適なプロモーターは、３−ホスホグリセラートキナーゼまたは他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド３ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６ホスフェートアイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼおよびグリコキナーゼを含む。誘導可能な酵母プロモーターはアルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、メタロチオネイン、および窒素代謝またはマルトース／ガラクトース利用に関与する酵素を含む。
【００７１】
哺乳類細胞系における発現のためのプロモーターは、ウイルス性プロモーター、例えばポリオーマ、鶏痘ウイルスおよびアデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリサルコーマウイルス、サイトメガロウイルス（特に最初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アクチン、ラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーターおよび初期または後期サルウイルス４０を含む。プロモーターの選択は当然、発現に使用する宿主細胞との好適な適合性に基づく。
【００７２】
４．８．５  エンハンサー要素
適切であるとき、例えば高等真核細胞での発現のために、ベクター内でプロモーター要素に作動可能に連結したエンハンサー要素を用いてもよい。好適な哺乳類エンハンサー配列はグロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテインおよびインスリン由来のエンハンサー要素を含む。あるいは、ＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０で）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマ（polyma）エンハンサー、バキュロウイルスエンハンサーまたはマウスｌｇＧ２ａ遺伝子座（WO04/009823参照）のような真核細胞ウイルス由来のエンハンサー要素を用いてもよい。エンハンサーは好ましくは、プロモーターの上流位置でベクターに存在する。
【００７３】
４．８．６  宿主細胞
本発明の抗体をコードするベクターをクローニングまたは発現するのに好適な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞または高等真核細胞である。好適な原核細胞は真正細菌、例えば腸内細菌科、例えばエシェリキア属、例えば大腸菌（例えばＡＴＣＣ  ３１、４４６；３１、５３７；２７、３２５）、エンテロバクター属、エルウィニア属、クラブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチアマルセッセンスおよび赤痢菌、ならびに桿菌、例えば枯草菌およびリケニホルミス菌（DD 266 710参照）、シュードモナス属、例えば緑膿菌およびストレプトマイセス属を含む。酵母宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、クルイベロマイセス属（例えばＡＴＣＣ  １６，０４５；１２，４２４；２４１７８；５６，５００）、ヤロウイア属（ＥＰ４０２、２２６）、ピキア・パストリス（ＥＰ１８３，０７０、Peng et al J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192参照）、カンジダ属、トリコデルマ・リーゼイ（ＥＰ２４４，２３４）、ペニシリン、トリポクラジウム属、アスペルギルス属宿主、例えば偽巣性コウジ菌およびクロコウジカビも意図される。
【００７４】
真核および酵母宿主細胞が本発明によって特に意図されるが、好ましくは本発明の宿主細胞は高等真核細胞である。好適な高等真核宿主細胞は、哺乳類細胞、例えばＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胚腎臓系２９３、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ．１６３２）、ＢＨＫ５７０（ＡＴＣＣ  番号ＣＲＬ  １０３１４）、２９３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １５７３）、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（例えばＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ  ６１）、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞系、例えばＤＧ４４（Urlaub et al, (1986) Somatic Cell Mol.Genet.12, 555-556参照）、特に懸濁液培養に採用されるＣＨＯ細胞系、マウスセルトリ細胞、サル腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ＨＥＬＡ細胞、イヌ腎臓細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、Ｈｅｐ  Ｇ２および骨髄腫またはリンパ腫細胞、例えばＮＳＯ（US 5,807,715参照）、Ｓｐ２／０、ＹＯを含む。したがって、本発明の１つの態様において、本明細書に記載の治療用抗体またはその抗原結合性フラグメントの重鎖および／または軽鎖をコードするベクターを含む、安定的に形質転換した宿主細胞が提供される。好ましくは、かかる宿主細胞は軽鎖をコードする第１のベクターと重鎖をコードする第２のベクターを含む。
【００７５】
４．６．１  細菌性発酵
細菌系は、上記非免疫グロブリン治療用タンパク質の発現に使用することができる。細菌系はまた、抗体フラグメントの発現に特に好適である。かかるフラグメントは細胞内またはペリプラズム内に局在化する。不溶性ペリプラズムタンパク質を抽出して再フォールドし、当業者に既知の方法に従って活性タンパク質を形成することができる（Sanchez et al (1999) J.Biotechnol. 72, 13-20 および Cu pit PM et al (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277参照）。
【００７６】
４．８．７  細胞培養方法
本発明の治療用抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に既知の方法の何れかで培養することができる。宿主細胞はスピナーフラスコ、回転ボトルまたは中空繊維系で培養することができるが、大規模生産には特に懸濁培養のための撹拌タンク反応槽を用いるのが好ましい。好ましくは撹拌タンクは例えばスパージャー、バッフルまたは低剪断翼を用いた通気のために採用される。バブルカラムおよびエアリフトリアクターについて、空気または酸素バブルによる直接通気を用いてもよい。宿主細胞が無血清培地で培養されるとき、通気プロセスの結果としての細胞損傷を防止するのを補助するため、該培地は細胞保護剤、例えばプルロニックＦ−６８を補うのが好ましい。宿主細胞の特徴に依存して、足場依存性細胞系については増殖基質としてマイクロ単体を用いることができ、あるいは細胞は懸濁培養を採用してもよい（これが典型的である）。宿主細胞、特に無脊椎動物宿主細胞の培養は、流加培養法、反復回分法（Drapeau et al (1994) cytotechnology 15: 103-109参照）、拡張型回分法または灌流培養のような多様な運用モードを用いることができる。組換え形質転換された哺乳類宿主細胞は、胎児ウシ血清（ＦＣＳ）のような血清含有培地中で培養することができるが、かかる宿主細胞は合成無血清培地、例えばKeen et al (1995) Cytotechnology 17:153-163に記載のもの、または商業的に入手可能な培地、例えばProCHO-CDMまたはUltraCHO（商標）（Cambrex NJ, USA）中で培養することが好ましく、所望によりグルコースのようなエネルギー源および組換えインスリンのような合成増殖因子を補ってもよい。宿主細胞の無血清培養は、該細胞が無血清条件下での増殖に適合することが必要であり得る。一つの適合アプローチは、宿主細胞が無血清条件に適合するのを学習するように、かかる宿主細胞を血清含有培地中で培養して８０％の培養培地を無血清培地で反復して交換することである（例えばScharfenberg K et al (1995) in Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E. G. et al eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers参照）。
【００７７】
培地中に分泌された本発明の抗体または他の治療用タンパク質を多様な技術を用いて回収し、精製して、意図した使用に好適な純度を得ることができる。例えば、ヒト患者の処置のための本発明の治療用抗体の使用は、典型的に、少なくとも純度９５％、より典型的には９８％または９９％またはそれ以上の純度（粗培養培地と比較して）を必要とする。最初の例において、培養培地から細胞残屑が、典型的には遠心分離、次いで例えば精密濾過、限外濾過および／または深層濾過を用いた上清の精製工程を用いて除去される。透析およびゲル電気泳動およびクロマトグラフ技術、例えばヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、親和性クロマトグラフィー（所望によりポリヒスチジンのようなアフィニティータグ化システムを含む）および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、US 5, 429,746参照）のような多様な他の技術が利用可能である。一つの態様において、本発明の抗体は、多様な精製工程の次に、タンパク質ＡまたはＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて捕捉し、次いでさらにイオン交換および／またはＨＡクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーおよび硫安沈殿のようなさらなるクロマトグラフィー工程を実施する。典型的に、多様なウイルス除去工程も実施される（例えばＤＶ−２０フィルターを用いた例えばナノ濾過）。これらの多様な工程の後、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上、例えば１００ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む精製した（好ましくはモノクローナル）調製物が得られ、したがって本発明の態様を形成する。好適なかかる調製物は実質的に凝集形態の本発明の抗体を含まない。
【００７８】
４．９  −  スクリーニング方法
他の態様において、ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）とその同族受容体または受容体（例えばＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー）間の相度作用を調節することができる調節剤（例えばアンタゴニスト）を同定する方法を提供する。ある態様において、調節剤はＮＲＧ１の生物学的活性を中和する。
【００７９】
したがって、本発明において、ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）とその同族受容体例えばＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー間の相互作用を阻害することによってＮＲＧ１（特にＮＲＧ１β１）の生物学的活性を中和する能力について候補化合物をスクリーニングする方法であって、該ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）と前記候補化合物（例えば候補抗体）を接触させて、ＮＲＧ１とその同族受容体の一方または両方との間の相互作用の調節を検出することを含む方法が提供される。
【００８０】
したがって、本発明において、ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）と同族受容体（例えばＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー）間の相互作用を調節（例えば阻害）する能力について候補化合物をスクリーニングする方法であって、該ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）と前記候補化合物（例えば候補抗体）を接触させて、ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）と候補化合物を接触させて、ＮＲＧ１β１の生物学的活性の中和を検出することを含む方法が提供される。
【００８１】
一つの態様において、該方法は、ＭＵＣ５ＡＣおよび／またはＭＵＣ５Ｂを発現することができる細胞のＭＵＣ５ＡＣおよび／またはＭＵＣ５Ｂ発現の変化を検出することを含む。かかる細胞の例は、杯細胞のような上皮細胞である。かかる発現の変化を検出する方法は、当業者に明らかである。したがって本発明の一つの態様において、ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）と同族受容体（例えばＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３）間の相互作用の候補阻害剤をスクリーニングするための方法であって、ＭＵＣ５ＡＣおよび／またはＭＵＣ５Ｂを発現する細胞の存在下でＮＲＧ１と候補化合物を接触させて、ＮＲＧ１の存在下、候補化合物の非存在下での当該細胞のＭＵＣ５ＡＣおよび／またはＭＵＣ５Ｂの発現と比較して、ＭＵＣ５ＡＣおよび／またはＭＵＣ５Ｂの発現の変化（例えば減少）を検出することを含む方法が提供される。
【００８２】
他の態様において、該方法は、候補化合物の存在下での杯細胞過形成の変化を検出することを含む。したがって、本発明の一つの局面において、ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）と同族受容体（例えばＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３、例えばＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー）間の相互作用の候補阻害剤をスクリーニングする方法であって、杯細胞の存在下でＮＲＧ１と候補化合物を接触させて、候補化合物の非存在下での杯細胞分化と比較して、杯細胞分化の変化（例えば減少）を検出することを含む方法を提供する。
【００８３】
４．１０  医薬組成物
本発明は、治療用タンパク質または低分子量化合物を含み、薬学的に許容される単体と共に製剤されている医薬組成物を提供する。該組成物はさらに、下記ヒトの疾患または障害の処置または予防に好適な他の治療物質を含んでいてもよい。薬学的担体は該組成物を向上しまたは安定化し、あるいは組成物の製造を容易にする。薬学的に許容される単体は、生理的に適合性である溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等を含む。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野において既知の多様な方法で投与することができる。投与経路および／または形態は望まれる結果に従って変化する。静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下投与、あるいは標的部位の近くへの投与が好ましい。薬学的に許容される単体は担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与（例えば注射または輸液による）に好適であるべきである。投与経路に依存して、活性化合物（特に低分子量化合物）は、該化合物を不活性化し得る酸および他の自然条件の作用から該化合物を保護するための物質でコーティングされていてもよい。
【００８５】
本組成物は滅菌された液体であってもよい。例えばレシチンのようなコーティングを用いて、分散剤の場合には望ましい粒子サイズを維持して、そして界面活性剤を用いて、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、組成物に張性調節剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトールまたはソルビトールおよび塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射組成物の長期吸収は、組成物に吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを含めることによって達成することができる。
【００８６】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野において周知の、通常実施されている方法に従って製造することができる。例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; および Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。医薬組成物は好ましくはＧＭＰ条件下で製造される。典型的には、本明細書に記載のＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）の調節剤、例えばＮＲＧ１β１抗体の治療上有効量または有効用量が本発明の医薬組成物に使用される。それらは典型的には当業者に既知の常套の方法によって薬学的に許容される投与形態に製剤される。投与レジメンは、最適な望まれる奏効（例えば治療奏効）が得られるように調節される。例えば１回ボーラス投与が可能であり、時間を掛けて複数回分割用量を投与してもよく、あるいは治療状況の緊急性に比例して用量を増加または減少させてもよい。投与の簡便さおよび投与量の均一性のために、単位投与形態の非経腸組成物を製剤することが特に有利である。本明細書において使用するとき、単位投与形態は、処置する対象に単位投与量として好適な物理的に分離した単位を意味し；単位はそれぞれ、所望の薬学的担体と共に望まれる治療効果を発揮するように計算された所定量の活性化合物を含む。
【００８７】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量濃度は、患者に毒性がないように、特定の患者、組成物および投与形態について望まれる治療応答を得るために有効な有効成分の量が得られるように変化してよい。選択される投与量濃度は、使用する本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排出速度、処置の期間、使用する特定の組成物との組合せで使用される他の薬剤、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康および薬歴等の要因を含む多様な薬物動態学的因子に基づく。
【００８８】
医師または獣医は、医薬組成物において用いる本発明の抗体の用量を、望まれる治療効果を得るために必要なものよりも低い濃度で開始して、望まれる効果が得られるまで投与量を漸増することができる。一般に、本明細書に記載のアレルギー性炎症性障害の処置のための本発明の組成物の有効用量は、投与方法、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトまたは動物のいずれであるか、投与する他の医薬および処置が予防または治療のいずれであるかを含む、多様な要因に基づいて変化する。安全性および有効性を最適化するために、処置投与量は用量設定される必要がある。抗体の投与について、投与量は約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ宿主体重、より一般に０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、投与量は１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重、あるいは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。例示的な処置レジメンは、２週間に１回、１ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の投与を必要とする。
【００８９】
抗体および他のタンパク質治療薬は通常、複数回で投与される。１回の投与毎の間隔は、週間、月間または年間であり得る。間隔はまた、本発明の治療用タンパク質の血中濃度を測定して示されるとおり、不規則であってもよい。いくつかの方法において、血漿抗体濃度１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法において２５〜３００μｇ／ｍｌが得られるように投与量を調節する。あるいは、抗体および他のタンパク質治療薬は徐放製剤として投与することができ、その場合にはより少ない頻度での投与が必要とされる。投与量および頻度は、本発明の抗体の半減期に基づいて変化する。投与量および投与の頻度は、患者における抗体または他のタンパク質治療薬の半減期に従って変化する。一般に、ヒト化抗体はキメラ抗体および非ヒト抗体のものより長い半減期を示す。投与量および投与の頻度は、処置が予防的または治療的のいずれであるかに基づいて変化し得る。予防的適用において、相対的に低い投与量が相対的に低い頻度間隔で、長い期間にわたって投与される。残りの人生の間処置を受け続ける患者も存在する。治療的適用において、相対的に高い投与量が相対的に短い間隔で、疾患の進行が低下または停止するまで、好ましくは患者が疾患症状の部分的または完全な寛解を示すまで、必要であることがある。その後、患者は予防的レジメンで投与されてもよい。
【００９０】
４．１１  臨床的使用
本発明は、ニューレグリンファミリーのメンバー（特にＮＲＧ１ファミリー、例えばＮＲＧ１β、特にＮＲＧ１β１）が杯細胞形成を促進するという知見に少なくとも部分的には基づく。したがって本発明の調節剤（特にアンタゴニスト）は、異常な杯細胞形成が病理学的役割を有するヒトの疾患または障害の処置に有用であり得る。したがって本発明は、杯細胞サイクル制御の疾患または障害を処置する方法であって、それを臨床的に必要とするヒト患者に治療上有効量のＮＲＧ１生物学的活性の調節剤を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、該調節剤は、ＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）および／またはその同族受容体（例えばＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３、特にＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー）と結合してそれらの間の相互作用を阻害するアンタゴニスト（例えば抗体、特にＩｇＧアイソタイプのヒトもしくはヒト化抗体またはその抗体フラグメント）である。他の態様において、杯細胞サイクル制御（例えば杯細胞過形成）の疾患または障害を処置する方法であって、それを臨床的に必要とするヒト患者に治療上有効量のＮＲＧ１β１と結合する治療用タンパク質（例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプと結合する、ＮＲＧ１β１と優先的または特異的に結合する本明細書に記載のヒトまたはヒト化抗体）を投与することを含む方法が提供される。杯細胞過形成が寄与する臨床的疾患または障害の例は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、慢性気管支炎、喘息（特にその中等度乃至重度の形態）のような呼吸器疾患を含む。
【００９１】
したがっていくつかの態様において、ＣＯＰＤ、ＣＦ、慢性気管支炎または喘息（特に中等度乃至重度の形態）のような呼吸器疾患に罹患したヒト患者を処置する方法であって、当該患者に治療上有効量のＮＲＧ１（例えばＮＲＧ１β１）の生物学的活性の調節剤を投与することを含む方法が提供される。これらの態様の好ましい形態において、調節剤はＮＲＧ１（特にＮＲＧ１β１）と（例えば優先的または特異的に）結合してＮＲＧ１、特にＮＲＧ１β１の生物学的活性を中和するＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの抗体（特にヒトまたはヒト化抗体）または抗体フラグメントである。ここで、本明細書を通じてＮＲＧ１、特にＮＲＧ１β１に関して用いる「生物学的活性」は、ＭＵＣ５ＡＣおよび／またはＭＵＣ５Ｂの発現を促進するこれらのタンパク質の活性を意味する。したがって、本明細書を通じて使用する「生物学的活性を中和する」等は、本発明の調節剤によるＭＵＣ５Ｂおよび／またはＭＵＣ５ＡＣ発現の阻害を意味する。
【００９２】
ある態様において、ＣＯＰＤ、ＣＦ、慢性気管支炎もしくは喘息（特にその重度乃至中等度の形態）のような異常な粘液生産を含む疾患もしくは障害または下気道の疾患もしくは障害（例えば下気道の感染）に罹患したヒト患者を処置する方法であって、当該患者に治療上有効量のＮＲＧ１（特にＮＲＧ１β１）と１種以上のその同族受容体（例えばＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３、特にＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー）間の相互作用の阻害剤（例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのヒトまたはヒト化抗体）を投与することを含む方法が提供される。これらの態様の好ましい形態において、調節剤は、ＮＲＧ１β１と優先的またはより好ましくは特異的に結合して、異常な粘液分泌を阻害する本明細書に記載のヒトもしくはヒト化抗体または抗体フラグメントである。
【００９３】
ある態様において、ＣＯＰＤ、ＣＦ、気管支炎（特に慢性気管支炎）もしくは喘息（特にその重度乃至中等度の形態）のような呼吸器疾患もしくは障害または下気道の疾患もしくは障害（例えば下気道の感染）、肺炎、気腫に罹患したヒト患者を処置する方法であって、当該患者に治療上有効量のＮＲＧ１（特にＮＲＧ１β１）と１種以上のその同族受容体（例えばＥＲＢ２および／またはＥＲＢ３、特に“ＥｒｂＢ”２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマー）間の相互作用の阻害剤（例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのヒトまたはヒト化抗体）を投与することを含む方法が提供される。
【００９４】
ある態様において、ＣＯＰＤ、ＣＦ、慢性気管支炎または喘息（特にその重度乃至中等度の形態）のような呼吸器疾患の異常な粘液生産の局面を処置する方法であって、ヒト患者に治療上有効量のＮＲＧ１、特にＮＲＧ１βの生物学的活性を中和する調節剤（例えばヒトまたはヒト化抗体）を投与することを含む方法が提供される。
【００９５】
他の態様において、異常な粘液生産によって特徴付けられる呼吸器疾患または障害（例えばＣＯＰＤ、慢性気管支炎、嚢胞性線維症、喘息）に罹患する危険性があるヒト患者を処置する方法であって、当該患者に治療上有効量のＮＲＧ１（特にＮＲＧ１β、より特にＮＲＧ１β１）と１種以上のその同族受容体（例えばＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ３）間の相互作用を調節する調節剤（例えばＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４の本明細書に記載の治療用タンパク質、例えばヒトまたはヒト抗体）を投与することを含む方法が提供される。ある態様において、調節剤はＮＲＧ１の生物学的活性を中和する。
【００９６】
本発明の他の態様において、ＣＯＰＤ、ＣＦ、慢性気管支炎のような呼吸器疾患または障害に罹患したヒト患者を処置する方法であって、ＮＲＧ１（特にＮＲＧ１β、より特にＮＲＧ１β１）の生物学的活性の阻害剤（例えば本明細書に記載の治療用タンパク質、例えばヒトまたはヒト化抗体）と、抗ヒトＩＬ−１３薬物（例えばＩＬ−１３抗体、特にヒトまたはヒト化ＩＬ−１３抗体）および／または抗ヒトＩＬ−４薬物（例えばＩＬ−４抗体、特にヒトまたはヒト化ＩＬ−４抗体）および／または抗ヒトＩＬ−５薬物（例えばＩＬ−５抗体、特にヒトまたはヒト化ＩＬ−５抗体）および／または抗ＩｇＥ薬物（例えばヒトまたはヒト化抗ＩｇＥ抗体）および／または抗ＩＬ−１７（特にＩＬ−１７Ａ）抗体（例えばヒトまたはヒト化抗ＩＬ−１７、例えばＩＬ−１７Ａ抗体）との共投与を含む方法が提供される。これらの組合せはそれぞれ、具体的および個別に意図される。
【００９７】
本発明はヒト疾患または障害の処置について原理的に説明しているが、当業者は本明細書の教示が非ヒト哺乳類の同様の疾患または障害の処置にも適用され得ると容易に理解する。
【実施例】
【００９８】
５．  実施例
ここでは本発明が例示的に説明される。
【００９９】
５．１  図面の簡単な説明
図１．  ＭＵＣ５ＡＣ発現に対するＮＲＧ１ベータ１およびＮＲＧ１アルファの効果
ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）を漸増濃度のＮＲＧ１β１（左上）またはＮＲＧ１α（右上）で７日間処理し、抗ＭＵＣ５ＡＣ（４５Ｍ１）モノクローナル抗体で染色した。ＭＵＣ５ＡＣ陽性細胞の割合をイメージ分析によって評価した。（下）ＭＵＣ５ＡＣ／アルシアンブルー染色したビークルおよびＮＲＧ１β１（５０ｎＭ）処理ＨＢＥＣの代表的組織イメージ。矢印は抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体で染色されていないアルシアンブルー染色された細胞を示す。示した結果は、３個の独立したドナーの実験から得た代表的な結果である。示した結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。非処理対照との有意な差が示される（＊Ｐ＜０．０５）。
【０１００】
図２：  ＭＵＣ５Ｂタンパク質に対するＮＲＧ１アルファおよびベータ１の効果
漸増濃度のＮＲＧ１β１（Ａ）およびＮＲＧ１α（Ｂ）のＭＵＣ５Ｂタンパク質に対する効果を免疫組織化学によって評価した。細胞をＮＲＧ１で７日間処理した。（Ｃ）ＭＵＣ５Ｂ／アルシアンブルー染色したビークルおよびＮＲＧ１β１（５０ｎＭ）処理ＨＢＥＣの代表的組織イメージ。示した結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。非処理対照との有意な差が示される（＊Ｐ＜０．０５）。
【０１０１】
図３：  時間経過によるＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂ発現に対するＮＲＧ１ベータ１の効果
１〜１４日処理にわたるＭＵＣ５ＡＣタンパク質（Ａ）およびＭＵＣ５Ｂタンパク質（Ｂ）に対するＮＲＧ１β１（５０ｎＭ）の効果を組織学的に評価した。ＮＲＧ１β１処理サンプルは黒色で示し、非処理サンプルは白色で示す。結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）で示す。非処理対照との有意な差が示される（＊ｐ＜０．０５）。
【０１０２】
図４：  初代細胞におけるＮＲＧ１ベータ１発現
Ｔ細胞、好中球、ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）、気管支平滑筋細胞（ＢＳＭＣ）および肺線維芽細胞を含む初代細胞群におけるＮＲＧ１β１発現をＲＴ−ＰＣＲで分析した。ハウスキーピング遺伝子トランスフェリンの発現も分析した。データは少なくとも２個の独立したドナー由来の細胞について得たデータを代表する。
【０１０３】
図５：  オボアルブミン投与マウスの肺におけるＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂ発現
ＯＶＡ投与Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の肺組織におけるＭＵＣ５ＡＣ（Ａ）およびＭＵＣ５Ｂ（Ｂ）の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで分析した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝８／群）として示し、ハウスキーピング遺伝子βアクチンに正規化している。＊生理食塩水投与マウスと比較してｐ＜０．０５。
【０１０４】
図６  ：ＯＶＡ投与マウス由来ＢＡＬ液中のＮＲＧ１ベータ１タンパク質のウェスタンブロット分析
ＯＶＡ投与マウスのＢＡＬ液をＮＲＧ１β１タンパク質についてウェスタンブロットによって分析した。ブロットはＮＲＧ１β１アイソフォームを優先的に認識する抗体（ｓｃ−３４７）で探索した。４匹のマウス由来のＢＡＬ液を各処置について分析した。示したデータは２つの独立したサンプルセットについて得たデータを代表する。
【０１０５】
図７：  ＮＲＧ１ベータ１ＥＬＩＳＡ
ＯＶＡ投与マウス由来ＢＡＬ液中のＮＲＧ１β１タンパク質を定量した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４／群）として示す。示したデータは２つの独立したサンプルセットを代表する。＊＊食塩水投与マウスと比較してｐ＜０．００１。
【０１０６】
図８：  杯細胞形成に対するｐａｎ−ＥｒｂＢ受容体阻害剤の効果。
ＮＲＧ１β１誘導性杯細胞形成に対するｐａｎ−ＥｒｂＢ受容体阻害剤の効果を示す。ＮＲＧ１β１誘導性ＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂタンパク質に対する阻害剤（１〜１０μＭ）の効果を組織学的に測定した。細胞は処理しないか、あるいはＮＲＧ１β１（５０ｎＭ）で示したとおりに処理した。＊未処理対照から有意な差（Ｐ＜０．０５）；＃ＮＲＧ１β１のみで処理した群から有意な差（Ｐ＜０．０５）；＃＃ＮＲＧ１β１のみで処理した群から有意な差（Ｐ＜０．００１）。結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示し、２つの独立した例を代表する。
【０１０７】
図９：  ヒト気管支上皮細胞におけるＥｒＢ受容体発現の分析
初代ヒト気管支上皮細胞におけるＥｒｂＢ受容体発現をＲＴ−ＰＣＲ（左）およびウェスタンブロット（右）で分析した。３または２ドナーのＥｒｂＢ受容体発現をｍＲＮＡおよびタンパク質についてそれぞれ分析した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの発現も示す。
【０１０８】
図１０：  ＮＲＧ１β１誘導性杯細胞形成に対するＥｒｂＢ受容体中和抗体の効果
ＨＢＥＣにおけるＮＲＧ１β１誘導性ＭＵＣ５ＡＣタンパク質（Ａ、Ｃ、Ｅ）およびＭＵＣ５Ｂタンパク質（Ｂ、Ｄ、Ｆ）に対する抗ＥｒｂＢ受容体抗体の効果を組織学的に定量した。抗ＥｒｂＢ２受容体抗体（Ａ、Ｂ）、抗ＥｒｂＢ３受容体抗体（Ｃ、Ｄ）および抗ＥｒｂＢ４受容体抗体（Ｅ、Ｆ）についてのデータを示し、使用する抗体の濃度をグラフ上に示す。＊非処理対照から有意な差（Ｐ＜０．０５）；＃ＮＲＧ１β１のみで処理した群と有意な差（Ｐ＜０．０５）。結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示し、２つの独立した例を代表する。
【０１０９】
５．２  略語一覧
【表１】
2010536830.tif 000002
【０１１０】
５．３  方法
５．３．１  ＨＢＥＣの培養
［Atherton et al, 2003］に記載のとおり本質的に得られたシングルコート（singlequot）を補った気管支上皮細胞増殖培地（ＢＥＧＭ；Cambrex）でヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ； Cambrex）を培養した。分化のため、孔サイズ０．４μｍ、１２ｍｍのTranswellインサート（Costar）で細胞密度８．２５×１０４細胞／インサートで、分化培地中で細胞を増殖した。分化培地は５０％のＢＥＧＭおよび５０％のダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含み、５２μｇ／ｍｌのウシ下垂体抽出物、５μｇ／ｍｌのインスリン、０．５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０μｇ／ｍｌのトランスフェリン、０．５μｇ／ｍｌのエピネフリン、０．５ｎｇ／ｍｌのヒトＥＧＦ、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび５０ｎＭのレチノイン酸を補った。細胞を７日間液体中に維持し、次いで気液界面（ＡＬＩ）で７〜１４日間増殖し、培地を２〜３日ごとに補充した。ＡＬＩ培養期間の間、細胞をＮＲＧ１αまたはＮＲＧ１β１（R&D systems）で処理し、Transwellインサートの基底チャンバーに加えた。全段階で細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の存在下、気流インキュベーター中で維持した。
【０１１１】
５．３．２．  ＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂタンパク質の免疫組織化学的検出
ＡＬＩでの分化の７日後（特記しない限り）、ＨＢＥＣの頂端表面をＰＢＳで緩やかに洗浄し、中性緩衝化ホルマリンで固定し、ワックス包埋した。インサートを３μｍの厚みで切断し、ＤＡＢＭＡＰプロトコルを用いて抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体（４５Ｍｌ；Labvision）または抗ＭＵＣ５Ｂモノクローナル抗体で、Ventana XT免疫染色装置で染色して、３％の酢酸、ｐＨ２．５中の１％のアルシアンブルーで対比染色した。Imaging Associated KS400画像分析ソフト（Imaging Associates）を備えたZeiss Axioplan 2顕微鏡（×１０倍）を用いて染色面積を評価した。杯細胞密度としてデータを示し、これは染色面積（μｍ２）と評価した上皮の長さ（μｍ）の比として定義される。特注の抗ＭＵＣ５Ｂモノクローナル抗体をHybridoma Core Laboratory, University of Floridaから得て、ペプチドＳＷＹＮＧＨＲＰＥＰＧＬＧ（配列番号１１）と処理した。
【０１１２】
５．３．３  ＲＮＡの作製およびファーストストランドｃＤＮＡ合成
既報のとおり初代細胞から全ＲＮＡを単離した［Jones et al, 2003］。RNeasy mini RNA単離キット（Qiagen）を用い、製造業者の指示に従って細胞から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡはアレルゲン誘導性杯細胞形成のマウスオボアルブミン（ＯＶＡ）モデル由来肺組織からも単離した。Ｂａｌｂ／ｃマウスをＯＶＡで２週間にわたって感作し、［Trifilieff et al, 2000］に記載のとおり、オボアルブミン（５０ｍｇ／ｍｌ）の１日用量で２連続日投与する。Qiagen RNeasy miniprepキットの試薬およびプロトコルを用いてＲＮＡをマウス肺組織から作製した。ポリトロンホモジナイザー（Kinematica AG）を用いて、６００μＬのＲＬＴバッファーに凍結肺組織（２０ｍｇ）をホモジナイズした。Qiashredderカラム（Qiagen）を用い、製造業者の指示に従って溶解物をさらに処理した。
１μｇの全ＲＮＡならびにファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Roche Diagnostics Ltd.）の試薬およびプロトコルを用いて、ファーストストランドｃＤＮＡ合成を実施した。
【０１１３】
５．３．４  定量的ＲＴ−ＰＣＲ
マウスＯＶＡモデル（セクション２−３）由来肺組織のＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂ遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで分析した。ＰＣＲ反応混合物を最終体積２０μｌで調製し、これは１０μｌの２×SYBR Green PCR Master Mix（Sigma）、１０μＭの各フォワードおよびリバースプライマー（最終濃度４００ｎＭ）０．８μｌおよび４．４μｌのｄＨ２Ｏを含む。このマスター混合物１６μｌを９６ウェルOptical反応プレートに入れ、４μｌのｃＤＮＡテンプレート（セクション２−３）を各ウェルに加えた。ABI7900 Sequence Detection System（Applied Biosystems）を用いてサンプルを２連で分析した。ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂおよびβ−アクチンハウスキーピング遺伝子対照のプライマー配列を表１に示す。
【０１１４】
ｃＤＮＡ濃度６６，６６６〜２７４ｐｇを含む混合肺ｃＤＮＡプールを用いて各プレートに標準曲線を加えた。非テンプレート対照（ＮＴＣ）は希釈ｃＤＮＡに代えてヌクレアーゼを含まない水を含む。定量的ＰＣＲプログラムは次のとおりであった：ステージ１、５０℃で２分；ステージ２、９５℃で１０分；ステージ３、９５℃で１５秒、６０℃で１５秒および７２℃で３０秒を４０サイクル。データを相対的方法で解釈した（ABI PRISM 7700 Sequence Detection System. User Bulletin #2, PE Applied Biosystems, 1997）。発現値はハウスキーピング遺伝子βアクチンについて正規化して示す。
【０１１５】
表１  ＲＴ−ＰＣＲプライマー
【表２】
2010536830.tif 000003
【０１１６】
５．３．５  ＲＴ−ＰＣＲ
ｃＤＮＡのＮＲＧ１β１遺伝子発現の分析のために、初代ヒト細胞から調製した。ＰＣＲ反応物は１０μｌの２×HotStar Taq Master Mix（Qiagen）、各２０ｐｍｏｌのＮＲＧ１β１ＦｏｒおよびＮＲＧ１Ｒｅｖプライマー（Sigma-Genosys；表１）、１μｌのｃＤＮＡテンプレート（５０ｎｇ）を含み、０．２ｍｌ薄壁ＰＣＲチューブ中で最終体積２０μｌで調製した。プライマーＴｒａｎｓＦｏｒおよびＴｒａｎｓＲｅｖ（表１）を用いてハウスキーピング遺伝子トランスフェリンに特異的なプライマーについて対照ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲサイクリング条件は次のとおりである：９５℃で１５分間変性、９４℃で１５秒間変性、５５℃で１５秒間アニーリング、７２℃で４５秒間伸長を３０サイクル、次いで７２℃で５分間最終伸長。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で分析し、エチジウムブロマイドで染色した。
【０１１７】
５．３．６  ウェスタンブロッティング
マウスＯＶＡモデル由来の気管支肺胞（ＢＡＬ）サンプルについてウェスタンブロット分析を実施した。２５μｌのＢＡＬ液を含むサンプルを１×NuPAGE LDSサンプルバッファー、５０ｍＭのＤＴＴ中、７０℃で１０分間変性した後、４〜１２％のNuPAGE Bis-Trisアクリルアミドゲル上、２００Ｖで、NuPAGE MOPS泳動バッファーを用いて分析した。ゲルおよびバッファーはInvitrogenから購入した。ＮｕＰＡＧＥトランスファーバッファー（Invitrogen）を用いて１０Ｖで一夜、Immobilon-P PVDF膜（Millipore）にサンプルを移した。ＰＢＳ、０．１％（ｖ／ｖ）のTween-20、５％（ｗ／ｖ）のBlotto粉ミルク（Santa Cruz）中で１時間、室温で膜をブロックした。ブロックバッファーを除去し、膜を室温で３時間、ブロックバッファーで１：６００に希釈した抗ＮＲＧ１β１（ｓｃ−３４７；Santz Cruz）１次抗体と共に膜をインキュベートした。膜を、洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．１％（ｖ／ｖ）のTween-20）中、室温で１０分間、撹拌して４回洗浄した。ブロットを暗所で１時間、撹拌下で、０．５×ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）のTween-20、０．５×Odysseyブロックバッファー、０．０１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳで１：２０００に希釈したヤギ抗ウサギIRDye800２次抗体（Tebu-bio）と共にインキュベートした。上記のとおり膜を洗浄し、LI-COR Odyssey Infraredイメージングシステム（LI-COR Biosciences）を用いて分解能１６９μｍ、フォーカスオフセット３．０ｍｍ、強度設定５．０で分析した。ＮＲＧ１αまたはＮＲＧ１β１対照タンパク質（Labvision）をポジティブコントロールとして含ませた。
【０１１８】
５．３．７  ＮＲＧ１ベータ１ＥＬＩＳＡ
NRG1β1 DuoSet ELISAキット（R&D systems）を用い、キットに付属の薬剤を用いてＯＶＡ投与マウス（セクション２−３）のＢＡＬ液中のＮＲＧ１β１タンパク質濃度を分析した。イムノプレート（９６ウェル；Nunc）を１００μｌ／ウェルのマウス抗ヒトＮＲＧ１β１、４μｇ／ｍｌで室温で一夜コーティングした。４００μｌ／ウェルの洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）のTween-20）を用いてプレートを４回洗浄した。３００μｌ／ウェルのバッファーＡ（ＰＢＳ、１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ）を用いて室温で１時間プレートをブロックし、次いで上記のとおり洗浄した。ＢＡＬ液サンプル（１００μｌ／ウェル）またはバッファーＡで希釈した（０．０６２５〜４ｎｇ／ｍｌ）標準ＮＲＧ１β１タンパク質をウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。バッファーＡを含むブランクもプレートには含まれる。プレートを上記のとおり洗浄した後、１００μｌ／ウェルの検出抗体、ビオチニル化ヤギ抗ヒトＮＲＧ１β１を２００ｎｇ／ｍｌで２時間、室温で加えた。該プレートを再度洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（１００μｌ／ウェル）と結合した１００μｌ／ウェルのストレプトアビジンを、バッファーＡ中１：２００希釈で３０分間、室温で加えた。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Sigma；１００μｌ／ウェル）をプレートに加え、３０分間室温でインキュベートした。５０μｌ／ウェルの１Ｍの硫酸を加えて反応を停止させた。Spectramax 340プレートリーダー（Molecular Devices）を用いて５４０ｎｍで測定したバックグラウンドについて補正した４５０ｎｍでの吸収を測定した。サンプルを２連で分析した。
【０１１９】
５．３．８  データ分析および統計
データは平均±ＳＥＭとして示し、２つの独立した実験の２連のサンプルを代表する。２つのサンプルのｔ−検定を実施して、対照と処置群間に有意な差があるかを決定した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１）。
【０１２０】
５．４  結果
５．４．１  ムチン発現および杯細胞形成に対するＮＲＧ１アルファおよびベータ１の効果
ＡＬＩ  ＮＲＧ１β１処理で増殖した１次ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）の培養において、組織学的に評価したとき、気道杯細胞のマーカーであるＭＵＣ５ＡＣタンパク質の用量依存的増加が引き起こされた（図１Ａ）。５０ｎＭのＮＲＧ１β１で、ビークル濃度よりもＭＵＣ５ＡＣタンパク質の３倍の増加が得られた。密接に関連したＮＲＧ１アイソフォーム、ＮＲＧ１αは、２５０ｎＭまでの濃度でＭＵＣ５ＡＣタンパク質に対する有意な効果を有しなかった（図１Ｂ）。ＭＵＣ５ＡＣ抗体で染色したＨＢＥＣ挿入物はまた、アルシアンブルーで対比染色した。興味深いことに、ＭＵＣ５ＡＣ（４５Ｍ１）抗体で染色されなかったいくつかのアルシアンブルー染色細胞がＮＲＧ１β１処理サンプルにおいて見出され（図１Ｃ）、これはＭＵＣ５Ｂのような他のムチンの存在を反映している可能性がある。ＭＵＣ５Ｂタンパク質に対するＮＲＧ１β１およびＮＲＧ１αの何らかの効果を確認するため、細胞はまたＭＵＣ５Ｂに対するモノクローナル抗体で染色した。いずれのＮＲＧ１アイソフォームも５０ｎＭの濃度までで、ＭＵＣ５Ｂタンパク質の用量依存的増加を引き起こした（図２）。５０ｎＭで、ＮＲＧ１β１およびＮＲＧ１αはそれぞれ、ＭＵＣ５Ｂタンパク質の９．８倍および６．４倍の増加を引き起こした。ＮＲＧ１β１アイソフォームがＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂタンパク質に最も顕著な影響を有していたので、さらなる試験はＮＲＧ１β１に焦点を当てた。
【０１２１】
時間経過にわたるＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂタンパク質発現に対するＮＲＧ１β１の効果を図３に示す。ＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂタンパク質の発現は、ＮＲＧ１β１処理の７、１０または１４日後、ビークル処理対照と比較して顕著であった（図３）。
【０１２２】
ＮＲＧ１β１の遺伝子発現プロファイルを複数の初代細胞で分析した。ＮＲＧ１β１が分化した初代ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）、気管支平滑筋細胞（ＢＳＭＣ）および肺線維芽細胞において発現されていることを見出した（図４）。Ｔ細胞または好中球では発現は検出されなかった。
【０１２３】
ＯＶＡまたは生理食塩水投与マウス由来の肺組織をＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂ遺伝子発現について定量的ＲＴ−ＰＣＲで分析した。生理食塩水対照と比較してＯＶＡ投与後には、５７倍のＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現が観察された（図５）。ＭＵＣ５Ｂ遺伝子発現はまた、ＯＶＡ投与後３倍に増加した（図５）。
【０１２４】
ＯＶＡ投与マウス由来ＢＡＬ液中のＮＲＧ１β１タンパク質発現をウェスタンブロットで分析した。生理食塩水投与マウスと比較して、ＯＶＡ投与マウス由来のＢＡＬ液でＮＲＧ１β１タンパク質の増加が検出された（図６）。ＯＶＡ投与マウスのＢＡＬ液中ＮＲＧ１β１タンパク質をＥＬＩＳＡで定量した。生理食塩水投与対照マウスと比較して、ＯＶＡ投与マウスのＢＡＬ液中でＮＲＧ１β１の９倍の増加が検出され（図７）、これはウェスタンブロットのデータと一致している。ＮＲＧ１β１の濃度は約０．９ｎｇ／ｍｌであった。
【０１２５】
５．４．２  考察
ムチンＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂは喘息およびＣＯＰＤを有する患者の気道分泌物の主な成分である［Rose and Voynow, 2006; Rogers, 2003］。喘息、ＣＯＰＤおよびＣＦ患者の気道において、杯細胞数の増加が報告されている［Aikawa et al, 1992; Ordonez et al, 2001; Saetta et al, 2000; Gronenberg et al, 2002b］。気道における杯細胞数の増加は、抗原誘導性炎症のマウスＯＶＡモデルにおいてモデル化することができる。単回または反復ＯＶＡ投与は、気道におけるアルシアンブルー／ＰＡＳ染色杯細胞の増加をもたらす［Trifilieff, El-Hasim and Bertrand, 2000］。本発明者らは本願において、ＯＶＡ投与後のマウス肺におけるムチンＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂ遺伝子の発現の顕著な増加を示した。このデータはＯＶＡモデルにおけるＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現の増加がノーザンブロット分析で検出された公表されたデータと一致している［Zhudi Alimam et al, 2000］。
【０１２６】
本発明者らは、ＮＲＧ１β１が分化気道杯細胞におけるＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂタンパク質発現（いずれも気道杯細胞のマーカーである）を誘導することを示した。ＮＲＧ１β１は、密接に関連したアイソフォームであるＮＲＧ１αよりも、杯細胞形成のインビトロモデルにおいてＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂに対する最も顕著な効果を有していた。インビボでの杯細胞形成におけるＮＲＧ１β１の役割をさらに理解するため、ＯＶＡ投与マウス由来ＢＡＬ液中のＮＲＧ１β１タンパク質を分析した。ＯＶＡ投与マウスの肺におけるＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂ遺伝子発現の増加に伴って、ＮＲＧ１β１タンパク質の増加がウェスタンブロットによって検出され、ＥＬＩＳＡで定量された。ＮＲＧ１がヒト気道上皮の分化を刺激してヒト気道上皮培養物中の杯細胞数の増加を引き起こすことは、既に示されている［Vermeer et al, 2006］。しかし、ＮＲＧ１β１アイソフォームはVermeerらの研究では試験されておらず、ムチンＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂに対して影響がないと報告された。本試験において、ＮＲＧ１β１が気管支上皮細胞、気管支平滑筋細胞および肺線維芽細胞を含む肺由来細胞において発現されていることを見出した。
【０１２７】
したがって本発明者らは、ムチン遺伝子ＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５ＢがＯＶＡ投与マウスの肺において増加し、これは気道におけるＮＲＧ１β１タンパク質の増加を伴うことを見出した。本発明者らはまた、インビトロでＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂ陽性杯細胞の強力なメディエーターであり、したがってＮＲＧ１β１が粘液過分泌が関与する喘息、ＣＯＰＤおよびＣＦのような呼吸器疾患の潜在的な治療標的であり得ることを示した。
【０１２８】
５．５  −  ＮＲＧ１β１とＥｒｂＢ間の相互作用
５．５．１  方法
５．５．１．１  細胞の化合物および抗体処理
化合物または抗体をＨＢＥＣ分化培地で希釈し、トランスウェルインサート上で２時間培養したＨＢＥＣの基底チャンバーに加えた後、ＮＲＧ１β１を加えた。ＮＲＧ１β１と組み合わせて化合物または抗体でＨＢＥＣを７日間ＡＬＩで処理し、培地を補充する都度新鮮な抗体または化合物と共にＮＲＧ１β１を置換した（２〜３日毎）。それぞれの処理について、少なくとも３個の同一のウェルを調製した。ＥｒｂＢ２受容体（ＡＦ１１２９）およびＥｒｂＢ３受容体抗体（ＭＡＢ３８４１）はR&D systemsからであり、ＥｒｂＢ４受容体抗体（ＭＳ−３０４−Ｐ１ＡＢＸ）はLab Vision Corporationからであった。
【０１２９】
５．５．１．２  ＥｒｂＢ受容体発現のＲＴ−ＰＣＲ分析
分化ＨＢＥＣから作製したｃＤＮＡにおけるＥｒｂＢ受容体発現の分析のため、ＰＣＲ反応物を次のとおり調製した：ＰＣＲ反応混合物は１２．５μｌのHotStar Taq Master mix（Qiagen）、それぞれ５０ｐｍｏｌのフォワードおよびリバースプライマー（表２）、５０ｎｇのｃＤＮＡおよび水を含み、０．２ｍｌ薄壁ＰＣＲチューブ中最終体積２５μｌであった。プライマーＧＡＰＤＨＦおよびＧＡＰＤＨＲ（表２）を用いてハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに特異的なプライマーで対照ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲサイクリング条件は次のとおりであった：９５℃で１５分間変性、９４℃で１５秒間変性、５５℃で１５秒間アニーリング、７２℃で４５秒間伸長を３５サイクル、次いで７２℃で５分間最終伸長。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルでエチジウムブロマイドで染色して分析した。
【０１３０】
表２  ＥｒｂＢ受容体発現の分析のためのＲＴ−ＰＣＲプライマー
【表３】
2010536830.tif 000004
【０１３１】
５．５．１．３  ＥｒｂＢ受容体発現のウェスタンブロット分析
５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．６５％ｖ／ｖのＮＰ−４０を含み、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を補った氷冷溶解バッファーに細胞を溶解させて、溶解物を１６０００×ｇで５分間、４℃で遠心分離してクリアにした。Micro BCA Protein アッセイキット（Perbio）を用い、製造業者の指示に従ってタンパク質濃度を測定した。１×NuPAGEサンプルバッファー（Invitrogen）中、７０℃で１０分間クリアにした溶解物を変性させ、サンプル由来の等量のタンパク質をＭＯＰＳ泳動バッファー（Invitrogen）でBis-Tris NuPAGEポリアクリルアミドゲルを用いて分離した。タンパク質をNuPAGEトランスファーバッファー（Invitrogen）中でImmobilon-P PVDF膜（Millipore）に移した。１次抗体を１／１０００希釈で用い、適切な２次抗体を１／２０００または１／５０００希釈で用いた。全ての１次抗体はSanta Cruz Biotechnologyからであり、次のとおりに記載されているもの以外はウサギポリクローナル抗体であった：ＥＧＦＲ（１００５）；ＥｒｂＢ２（Ｃ−１８）、ＥｒｂＢ３（Ｃ−１７）、ＥｒｂＢ４（Ｃ−１８）およびＧＡＰＤＨ、マウスモノクローナル１次抗体（６Ｃ５）。２次抗体はAlexa Fluor 680複合抗ウサギ２次抗体（Invitrogen）またはIRDye 800複合抗マウス２次抗体（Tebu-bio）であった。膜をブロックバッファー（０．１％ｖ／ｖのTween-20および５％ｗ／ｖのBlotto（Santa Cruz）を含むＰＢＳ）中で４時間室温でインキュベートし、次いでブロックバッファーで希釈した１次抗体と共に４℃で一夜インキュベートした。膜を洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．１％ｖ／ｖのTween-20）で洗浄した後、０．１％ｖ／ｖのTween-20および０．０１％ｗ／ｖのＳＤＳを補ったOdysseyブロックバッファー（５０％ｖ／ｖのＰＢＳ：５０％ｖ／ｖのOdysseyバッファー（LI-COR Biosciences UK Ltd）で希釈した各赤外色素複合２次抗体と共に室温で１時間、暗所でインキュベートした。２次抗体と共にインキュベートした後、膜を暗所で再度洗浄して、LI-COR Odyssey赤外イメージングシステムを用いて分解能１６９μｍ、フォーカスオフセット３．０ｍｍおよび強度設定５．０でイメージングした。
【０１３２】
５．６  結果
５．６．１  杯細胞形成に対するｐａｎ−ＥｒｂＢ受容体阻害剤の効果
ＮＲＧ１β１誘導性杯細胞形成に対するｐａｎ−ＥｒｂＢ受容体阻害剤の効果を分析した。ＨＢＥＣを阻害剤で前処理した後、ＮＲＧ１β１を加えて、次いで細胞をＡＬＩで７日間増殖した。杯細胞マーカーＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂに対する効果を組織学的に分析した。ＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂタンパク質のＮＲＧ１β１誘導性増加がｐａｎ−ＥｒｂＢ受容体阻害剤によって１０μＭで顕著に阻害された（図８）。
【０１３３】
５．６．２  ＮＲＧ１β１誘導性杯細胞形成に対する抗ＥｒｂＢ受容体抗体の効果
ＥｒｂＢ受容体発現プロファイルを複数のヒトドナー由来のＨＢＥＣにおいて分析した。４種のＥｒｂＢ受容体ファミリーメンバーＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４全てのタンパク質およびｍＲＮＡを複数の初代ヒト気管支上皮細胞ドナー由来サンプルにおいて検出することができた（図９）。
【０１３４】
ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４受容体に対する中和抗体を用いて、杯細胞形成の初代ヒト気管支上皮細胞モデルにおけるＮＲＧ１β１誘導性杯細胞形成に関与するＥｒｂＢ受容体を評価した。ＨＢＥＣを抗体で前処理した後、ＡＬＩで７日間ＮＲＧ１β１で処理した。ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３受容体に対する抗体はＮＲＧ１β１誘導性ＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂ生産を阻害したが、ＥｒｂＢ４に対する抗体は効果を有さなかった（図１０）。
【０１３５】
５．６．３  考察
ＮＲＧ１β１はＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ４ヘテロダイマーを介してシグナル伝達することが報告されている［Falls, 2003; Citri et al, 2003］。発現分析は、ＥｒｂＢ受容体ファミリーメンバー、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ４の全てが初代ヒト気管支上皮細胞において発現されることを示した。どの受容体がＮＲＧ１β１誘導性杯細胞形成に関与するかをさらに詳細に明らかにするため、ｐａｎ−ＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ阻害剤［Traxler et al, 2004］をインビトロ杯細胞形成アッセイにおいて分析した。ｐａｎ−ＥｒｂＢ受容体チロシン阻害剤は杯細胞ムチンＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂの発現を顕著に減少させ、これはこのプロセスにおけるＥｒｂＢ受容体の関与を示している。どのＥｒｂＢ受容体がＮＲＧ１β１誘導性杯細胞形成に関与するかをさらに詳細に分析するため、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４受容体に対する中和抗体を試験した。ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３に対する中和抗体は、杯細胞マーカーＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂによって示されるように、ＮＲＧ１β１誘導性杯細胞形成を顕著に減少させた。逆に、抗ＥｒｂＢ４受容体中和抗体はＮＲＧ１β１誘導性杯細胞形成に対して効果がなかった。このデータは、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３受容体がヒト気道上皮細胞のＮＲＧ１β１誘導性杯細胞形成に関与していることを示唆している。
【０１３６】
６．  参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年4月30日(2010.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＲＧ１と同族受容体間の相互作用を調節して杯細胞過形成を阻害する、ＮＴＧ１の調節剤。
【請求項２】
ＮＲＧ１がＮＲＧ１αまたはＮＲＧ１βファミリーのメンバーである、請求項１の調節剤。
【請求項３】
ＮＲＧ１βがＮＲＧ１β１である、請求項２の調節剤。
【請求項４】
ＮＲＧ１がＮＲＧ１の膜結合および／または可溶形態である、請求項１〜３のいずれかの調節剤。
【請求項５】
調節剤が低分子量化合物である、請求項１〜４のいずれかの調節剤。
【請求項６】
調節剤が抗体である、請求項１〜４のいずれかの調節剤。
【請求項７】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項６の調節剤。
【請求項８】
抗体がヒト、ヒト化またはキメラ抗体である、請求項７の調節剤。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかのＮＲＧ１と結合し、ＮＲＧ１と１種以上のその同族受容体間の相互作用を調節する、請求項５〜８のいずれかの抗体。
【請求項１０】
抗体がＮＲＧ１αと比較して主としてＮＲＧ１β１と結合する、請求項９の抗体。
【請求項１１】
ＮＲＧ１αと比較してＮＲＧ１β１と特異的に結合する、請求項９または１０の抗体。
【請求項１２】
ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のヒト定常領域を含む、請求項５〜１１のいずれかの抗体。
【請求項１３】
異常な粘液生産を特徴とする疾患または障害の処置用医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれかの調節剤の使用。
【請求項１４】
疾患または障害が呼吸器のものである、請求項１３の使用。
【請求項１５】
疾患または障害がＣＯＰＤ、嚢胞性線維症（ＣＦ）、慢性気管支炎または喘息である、請求項１４の使用。
【請求項１６】
疾患または障害がヒトのものである、請求項１３〜１５のいずれかの使用。
【請求項１７】
異常な粘液生産を特徴とする疾患の予防または進行の遅延および／または症状の改善用医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれかの調節剤の使用。
【請求項１８】
請求項１〜４のいずれかの調節剤を同定する方法であって；
（ａ）候補調節剤を得て；
（ｂ）該調節剤と請求項１〜３の何れかのＮＲＧ１とを接触させて；
（ｃ）該候補調節剤が請求項１〜３の何れかのＮＲＧ１とその同族受容体間の相互作用を調節するかを決定する
ことを含む方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれかの調節剤と薬学的に許容される単体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
異常な粘液生産によって特徴付けられる呼吸器疾患または障害を有するヒト患者を処置する方法であって、ヒトＮＲＧ１、特にヒトＮＲＧ１β１と結合し、ＮＲＧ１とＥＲＢ２／ＥＲＢ３ヘテロダイマー間の相互作用を阻害する阻害剤、ならびにヒトＩＬ−１３とその同族ヒト受容体間の相互作用を阻害する抗ヒトＩＬ−１３薬物および／またはヒトＩＬ−４５とそのヒトＩＬ−４受容体間の相互作用を阻害する抗ヒトＩＬ−４薬物および／またはヒトＩＬ−５とその同族受容体間の相互作用を阻害する抗ヒトＩＬ−５薬物および／またはヒトＩｇＥとその同族受容体間の相互作用を阻害する抗ＩｇＥ薬物を共投与することを含む方法。
【請求項２１】
抗ヒトＮＲＧ１β１抗体が抗ヒトＩＬ−１３抗体と共投与される、請求項２０の方法。
【請求項２２】
抗ヒトＮＲＧ１β１抗体が抗ヒトＩＬ−４抗体と共投与される、請求項２０または２１の方法。
【請求項２３】
抗ヒトＮＲＧ１β１抗体が抗ヒトＩＬ−５抗体と共投与される、請求項２０、２１または２２の方法。
【請求項２４】
抗ヒトＮＲＧ１β１抗体が抗ヒトＩｇＥ抗体と共投与される、請求項２０、２１、２２または２３の方法。
【請求項２５】
請求項１〜１２のいずれかの調節剤と薬学的に許容される単体を含む、ＣＯＰＤ、ＣＦ、喘息、慢性気管支炎、下気道の疾患、肺気腫、肺炎の処置のための医薬組成物。
【国際調査報告】
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