(57)【要約】  ヘミセルラーゼに対して高比率のセルラーゼを持つセルラーゼ混合物の生成のために、ヘミセルロース由来炭水化物を使用する発酵プロセスが提供される。本発明のプロセスによって生成されたセルラーゼは、高い比生産性によってさらに特徴づけられる。結果として生じるセルラーゼ混合物は、ヘミセルラーゼよりも少なくとも２倍多いセルラーゼを含み、セルロース系基質（特に、前処理したリグノセルロース系基質）の加水分解に有用である。
2010536390.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルラーゼ混合物の生成のための発酵プロセスであって、約３〜約３０日間、約２０℃〜約３５℃の温度、約３．０〜約６．５のｐＨで、セルラーゼを分泌するトリコデルマ属またはヒポクレア属の宿主細胞に、セルラーゼ酵素生成のための炭素源を提供する工程であり、前記炭素源が、該炭素源中に存在する全炭素の約４０質量パーセント〜約９７質量パーセントのヘミセルロース由来炭水化物、および該炭素源中に存在する全炭素の約３質量パーセント〜約２０質量パーセントのセルラーゼ誘導性炭水化物を含む工程、並びにセルロース混合物を得る工程を含む発酵プロセス。
【請求項２】
前記炭素源中に存在する全炭素の約８０質量パーセント〜約９７質量パーセントがヘミセルロース由来炭水化物であり、前記炭素源中に存在する全炭素の約８質量パーセント〜約１５質量パーセントがセルラーゼ誘導性炭水化物である、請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項３】
前記セルラーゼ混合物が、少なくとも２：１の比率でセルラーゼおよびヘミセルラーゼを含む、請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項４】
前記セルラーゼ混合物が、少なくとも３：１の比率でセルラーゼおよびヘミセルラーゼを含む、請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項５】
前記炭素源が、１種以上の追加の炭素源を含む、請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項６】
前記１種以上の追加の炭素源が、グリセロールまたは有機酸である、請求項５に記載の発酵プロセス。
【請求項７】
前記宿主細胞が、トリコデルマ・リーゼイの株である、請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項８】
炭素源がヘミセルロース由来炭水化物からなるプロセスにおいて生成された分泌セルロースの量と比較した場合、少なくとも２倍以上の分泌セルラーゼを生成する、請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項９】
炭素源がヘミセルロース由来炭水化物からなるプロセスの比生産性（ｑp）と比較した場合、ｑpの少なくとも３倍の増加を有することによって特徴づけられる、請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項１０】
炭素源がヘミセルロース由来炭水化物からなるプロセスの比生産性（ｑp）と比較した場合、ｑpの少なくとも５倍の増加を有することによって特徴づけられる、請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項１１】
流加式である、請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項１２】
連続的である、請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項１３】
好気的に行なわれる、請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項１４】
請求項１に記載の発酵プロセスによって生成されたセルラーゼ混合物の、セルロース系基質の加水分解のための使用。
【請求項１５】
請求項１に記載の発酵プロセスによって生成されたセルラーゼ混合物の、前処理したリグノセルロース系基質の加水分解のための使用。
【請求項１６】
セルロース系基質を加水分解する方法であって、
請求項１に記載の発酵プロセスによって生成されたセルラーゼ混合物を前記セルロース系基質に添加して反応混合物を生成する工程であり、該反応混合物中のセルロースの濃度が、約１ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌであり、前記セルラーゼ混合物が、約０．１ｍｇタンパク質／ｇセルロース〜約１００ｍｇタンパク質／ｇセルロースの濃度で添加される工程と；
約４〜約１２０時間の期間、約３０℃〜約６０℃の温度、および約３．５〜約７．０のｐＨで前記反応混合物をインキュベートして、前記セルロース系基質を加水分解し反応生成物を生成する工程とを含む方法。
【請求項１７】
前記反応生成物が、ヘミセルラーゼ由来炭水化物、グルコース、オリゴ糖、セルラーゼ誘導性炭水化物、およびその組合せを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記セルロース系基質が、前処理したリグノセルロース系基質である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００７年８月３０日に出願された、真菌セルラーゼ生成のための方法、と題される特許出願第６０／９６９，０２５号の仮出願の優先利益を主張し、それらの内容全体は参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は真菌宿主細胞からセルラーゼを生成するための発酵プロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
セルロースおよびヘミセルロースは、発酵性糖の生成のために重要な再生可能かつ低費用の炭素源を構成する。セルロースは、β−１，４グリコシド結合によって直鎖でともに結合されるＤグルコース単位からなる。ヘミセルロースは、主としてβ−１，４グリコシド結合によってともに結合されるＤ−キシロース単位、およびβ−１，２グリコシド結合もしくはβ−１，３グリコシド結合またはエステル結合によってキシロース単位へ結合される多数の側鎖（例えば、Ｌ−アラビノース酢酸、フェルラ酸など）を含む、直鎖キシラン骨格からなる。
【０００４】
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（ヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）の無性世代）は、多様なセルラーゼおよびヘミセルラーゼを含むセルラーゼ混合物を生成することができる糸状菌である。これらは、２つのセロビオヒドロラーゼ、８つのエンドグルカナーゼ、４つのキシラナーゼ、２つのα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、および１つのβ−マンナナーゼを含む。Ｔ．リーゼイは、アセチルキシランエステラーゼ、β−キシロシダーゼおよび複数のβ−グルコシダーゼを含む、セルロースおよびヘミセルロースからの単糖の生成を支援する多数の補助酵素もまた生成する。
【０００５】
Ｔ．リーゼイによるセルラーゼおよびヘミセルラーゼの生成の調節は複雑であり、利用可能な炭素源に応答して主として転写レベルで制御される。グルコースは、ｃｒｅ１（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．ら、１９９５，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３７６：１０３−１０７）およびａｃｅ１（Ａｒｏ，Ｎ．ら、２００３，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：５６−６５）などの転写調節因子の作用を介してセルラーゼ遺伝子発現を抑制する。グルコース限定条件下では、セルラーゼ転写は脱抑制され、セルロースなどの誘導性の炭水化物またはセロビオース、ソフォロース、ケンチオビオースおよびラクトースなどのβ結合二糖類の存在を必要とする転写は完全活性化される（Ｉｌｍｅｎ，Ｍ．ら、１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８−１３０６）。セルラーゼ誘導性炭水化物（ＣＩＣ）は、ヘミセルラーゼ転写の活性化もまた導く。（Ｍａｃｈ，Ｒ．Ｌ．およびＺｅｉｌｉｎｇｅｒ，Ｓ．、２００３，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０：５１５−５２２；Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ−Ｃｌａｒｋら、１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５７：１６７−１７９）。ｘｙｒ１遺伝子産物は、キシロースによるヘミセルラーゼおよびセルラーゼ遺伝子の両方の転写活性化に参加することが示された（Ｓｔｒｉｃｋｅｒ，Ａ．Ｒ．ら、２００６，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ５：２１２８−２１３７）。
【０００６】
Ｔ．リーゼイはセルラーゼ誘導条件下で低レベルのキシラナーゼ活性を生成するが、キシロースまたは他のヘミセルロース由来炭水化物上で増殖するＴ．リーゼイの培養によって生成される酵素系は、セルラーゼ活性に対するヘミセルラーゼ活性を濃縮する。分泌キシラナーゼの生成は、キシラン（Ｂａｉｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．ら、１９９３，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：２２４−２２９）およびアラビノース（Ｘｉｏｎｇら、２００４，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ６４：３５３−３５８）によって促進される。ヘミセルラーゼ遺伝子の転写は、セルロースだけでなくヘミセルロースまたはその分解産物によってもさらに活性化される。トリコデルマ・リーゼイにおいて、キシラナーゼ１およびキシラナーゼ２（ｘｌｎ１およびｘｌｎ２）をコードする遺伝子の転写は、セルロース、ソフォロース、キシランおよびアラビニトールによって活性化され、アラビノフラノシダーゼ遺伝子ａｂｆ１の転写は、アラビノース、アラビニトールおよびキシランによって活性化される（Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ−Ｃｌａｒｋら、１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５７：１６７−１７９）。しかしながら、キシラナーゼ発現の増加の結果として、分泌酵素組成物中のセルラーゼの相対的比率は減少する。これはセルラーゼの比活性の減少をもたらし、結果としてより高い供与量の全タンパク質がセルロース系基質の効果的な加水分解のために必要とされる。
【０００７】
セロビオースおよびキシロビオースの等モル量の供与は、Ｔ．リーゼイ株ＱＭ９４１４の振盪フラスコバッチ培養において同様のレベルのキシラナーゼ活性をもたらす（Ｚｅｉｌｉｎｇｅｒ，Ｓ．ら、１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２５６２４−２５６２９）。２つの培養によって生成されるセルラーゼ活性は報告されなかった。流加培養においてＴ．リーゼイ株ＲｕｔＣ３０によって分泌キシラナーゼの相対的比率は、１００％ラクトースから７５％ラクトース／２５％キシロースまで炭素源を変化させることによって０．８％から３．５％に増加した（Ｍａｒｇｅｏｔ，Ａ．ら、２００７、酵母および糸状菌の生理学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  ａｎｄ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ）でポスター発表、エスポー、フィンランド）。同時に、４つの主要なセルラーゼ成分（セロビオヒドロラーゼ１およびセロビオヒドロラーゼ２、エンドグルカナーゼ１およびエンドグルカナーゼ２）の組み合わせ比率は、８２％から６２％まで減少した。他のヘミセルラーゼおよびセルラーゼの比率は報告されなかった。おがくず加水分解物を使用するＴ．リーゼイ株ＲｕｔＣ３０の振盪フラスコバッチ培養は、セルロース加水分解物と同様のレベルの分泌セルラーゼ活性（培養の１ｍｌあたり濾紙分解活性に換算した）を産生することが報告された（Ｌｏ，Ｃ−Ｈ．ら、２００５，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｓｐｒｉｎｇ（１２１−１２４）：５６１−５７３）。おがくず加水分解物は濃硫酸による処理によって生成され、おがくずの事例では、２５〜４０％のヘミセルロース由来炭水化物、５〜９％セルラーゼ誘導性炭水化物、１３〜４５％のグルコースおよび２〜４５％のオリゴ糖からなっていた。しかしながら、ヘミセルラーゼ活性または全分泌タンパク質に対するおがくず加水分解物の効果に関する情報が与えられないので、分泌タンパク質中のセルラーゼおよびヘミセルラーゼの相対的比率に対するおがくず加水分解物の影響を推定することができない。
【０００８】
ヘミセルラーゼの相対的比率は発酵培養培地のｐＨの調整によっても操作することができ（Ｂａｉｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．ら、１９９３，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：２２４−２２９）、セルラーゼ活性と比較してキシラナーゼ活性の比率はｐＨ６〜７で促進される。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）におけるキシラナーゼ遺伝子の転写は、ｐＨ依存性転写調節因子ｐａｃＣによる調節を受ける（Ｍａｃｃａｂｅ，Ａ．Ｐ．ら、１９９８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：１３３１−１３３３）。
【０００９】
リグノセルロース系バイオマスの化学処理によって生成されたものなどの、主としてキシロースおよびヘミセルロースに由来する他のペントース糖を含む炭水化物源を使用して、真菌培養から高比率のセルラーゼを持つセルラーゼ混合物を生成することが望ましい状況がある。ヘミセルロースを含むリグノセルロース系バイオマスの前処理のための方法は、米国特許第４，４６１，６４８号、第５，９１６，７８０号、第６，０９０，５９５号、第６，０４３，３９２号、第４，６００，５９０号中で記述されている；Ｗｅｉｌら、１９９７，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６８１：２１−４０；Ｏｈｇｒｅｎ，Ｋ．ら、２００５，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｓｐｒｉｎｇ（１２１−１２４）：１０５５−１０６７（それらは参照することにより本明細書に組み入れられる）。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は真菌宿主細胞からセルラーゼを生成するための発酵プロセスに関する。
【００１１】
本発明は、セルロース生成のための改良された方法を提供することを目的とする。
【００１２】
本発明は、ヘミセルラーゼの生成を促す条件下でセルラーゼを生成できる宿主細胞を培養することを含む、ヘミセルラーゼに対して高比率のセルラーゼを持つセルラーゼ混合物の生成ための発酵プロセスを提供する。
【００１３】
セルロースを生成するプロセスは、高生産力での、液内発酵中の、高セルラーゼ：ヘミセルラーゼ比率を備えたトリコデルマ属またはヒポクレア属の種に由来する菌体酵素混合物の使用を組み入れ、そのプロセスにおいて前記プロセスのための炭素源の４０％以上はヘミセルロース由来炭水化物からであり、炭素源の３％以上２０％未満はセルラーゼ誘導性炭水化物からである。
【００１４】
本発明は、セルラーゼ混合物の生成のための発酵プロセスであって、約３〜約３０日間、約２０℃〜約３５℃の温度、約３．０〜約６．５のｐＨで、セルラーゼを分泌するトリコデルマ属またはヒポクレア属の宿主細胞に、セルラーゼ酵素生成のための炭素源を提供する工程であり、炭素源は、該炭素源中に存在する全炭素の約４０質量パーセント〜約９７質量パーセントがヘミセルロース由来炭水化物で、かつ該炭素源中に存在する全炭素の約３質量パーセント〜約２０質量パーセントがセルラーゼ誘導性炭水化物であることを含む工程、並びにセルロース混合物を得る工程を含む発酵プロセスを提供する。
【００１５】
本発明は、炭素源中に存在する全炭素の約８０質量パーセント〜約９７の質量パーセントがヘミセルロース由来炭水化物であり、炭素源中に存在する全炭素の約８質量パーセント〜約１５質量パーセントがセルラーゼ誘導性炭水化物である、上述の発酵プロセスを含む。さらに、セルラーゼ混合物は、少なくとも２：１、または少なくとも３：１の比率でセルラーゼおよびヘミセルラーゼを含む。上述されるような発酵プロセスにおいて使用される炭素源は、１種以上の追加の炭素源をさらに含むことができる。１種以上の追加の炭素源はグリセロールまたは有機酸でありえる。さらに、発酵プロセスは、バッチ、流加式、または連続的でありえる。
【００１６】
本発明は、宿主細胞がトリコデルマ・リーゼイの株である、上で定義されるような発酵プロセスを提供する。
【００１７】
本発明は、プロセスは、炭素源がヘミセルロース由来炭水化物からなるプロセスにおいて生成された分泌セルラーゼの量と比較した場合、少なくとも２倍以上の分泌セルラーゼを生成する、上述されるような発酵プロセスもまた提供する。プロセスは、炭素源がヘミセルロース由来炭水化物からなるプロセスの比生産性（ｑp）と比較した場合、ｑpの少なくとも３倍の増加を有することによってもまた特徴づけられることができる。さらに、プロセスは、炭素源がヘミセルロース由来炭水化物からなるプロセスの比生産性（ｑp）と比較した場合、ｑpを少なくとも５倍の増加を有することによって特徴づけられることができる。
【００１８】
本発明は、セルロース系基質の加水分解のための上述されるような発酵プロセスによって生成されたセルラーゼ混合物の使用にもまた関する。セルロース系基質は前処理したリグノセルロース系基質でありえる。
【００１９】
本発明は、セルロース系基質を加水分解する方法であって、
請求項１に記載の発酵プロセスによって生成されたセルラーゼ混合物をセルロース系基質に添加して反応混合物を生成する工程であり、セルロース系基質の濃度が、約１ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌであり、セルラーゼ混合物が、セルロース１ｇｍあたり約０．１〜約１００ｍｇのタンパク質の濃度で添加される工程と；
約４〜約１２０時間の期間、約３０℃〜約６０℃の温度、および約３．５〜約７．０のｐＨで反応混合物をインキュベートして、セルロース系基質を加水分解し反応生成物を生成する工程とを含む方法もまた提供する。
【００２０】
本発明は、発酵プロセスにおいてヘミセルロース由来炭水化物（ＨＤＣ）およびセルラーゼ誘導性炭水化物（ＣＩＣ）を含む炭水化物源を使用して、高比率のセルラーゼおよび付随して低比率のヘミセルラーゼを持つ真菌セルラーゼ混合物を生成できるという意外な発見に部分的に基づく。発酵プロセスの生産性は、ヘミセルラーゼ由来炭水化物のみを使用する同じプロセスよりも有意に高い。
【００２１】
本発明のこれらおよび他の特色は添付された図面が参照される以下の記述からより明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】発酵へ加えられた炭水化物が、０〜１５％のセルラーゼ誘導性炭水化物（ＲｕｔＣ３０についてはセロビオース）および８５〜１００％のキシロースからなる１４Ｌの流加発酵において、Ｔ．リーゼイ株ＲｕｔＣ３０によって生成および分泌されたセルラーゼ混合物のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）解析を示した図である。
【図１Ｂ】発酵へ加えられた炭水化物が、０〜１５％のセルラーゼ誘導性炭水化物（Ｐ５９ＧについてはＣＩＣカクテル）および８５〜１００％のキシロースからなる１４Ｌの流加発酵において、Ｔ．リーゼイ株Ｐ５９Ｇによって生成および分泌されたセルラーゼ混合物のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）解析を示した図である。
【図２】発酵へ加えられた炭水化物が、０％、２％または１０％のセルラーゼ誘導性炭水化物および１００％、９８％または９０％のアラビノースからなる１４Ｌの流加発酵において、Ｔ．リーゼイ株Ｐ５９Ｇによって生成および分泌されたセルラーゼ混合物のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）解析を示した図である。
【図３Ａ】発酵へ加えられた炭水化物が、示されるように、０〜１５％のＣＩＣカクテル＋８５〜１００％のキシロースからなる１４Ｌの流加発酵において、Ｔ．リーゼイ株Ｐ５９Ｇによって生成されたバイオマスの量を示した図である。各バーは、３つの独立した発酵の平均および標準偏差を示す。
【図３Ｂ】発酵へ加えられた炭水化物が、０〜１０％のセロビオース＋９０〜１００％のアラビノースからなる１４Ｌの流加発酵において、Ｔ．リーゼイ株Ｐ５９Ｇによって生成されたバイオマスの量を示した図である。各バーは、３つの独立した発酵の平均および標準偏差を示す。
【図４Ａ】発酵へ加えられた炭水化物が、示されるように０〜１５％のＣＩＣカクテル＋８５〜１００％のキシロースからなる１４Ｌの流加発酵において、Ｔ．リーゼイ株Ｐ５９Ｇによって生成された分泌タンパク質の量を示した図である。各バーは、３つの独立した発酵の平均および標準偏差を示す。
【図４Ｂ】発酵へ加えられた炭水化物が、０〜１０％のセロビオース＋９０〜１００％のアラビノースからなる１４Ｌの流加発酵において、Ｔ．リーゼイ株Ｐ５９Ｇによって生成された分泌タンパク質の量を示した図である。各バーは、３つの独立した発酵の平均および標準偏差を示す。
【図５Ａ】発酵へ加えられた炭水化物が、示されるように０〜１５％のＣＩＣカクテル＋８５〜１００％のキシロースからなる１４Ｌの流加発酵において、Ｔ．リーゼイ株Ｐ５９Ｇの、ｍｇ分泌タンパク質／ｇバイオマス／時間における平均比生産性（ｑp）を示した図である。各バーは、３つの独立した発酵の平均および標準偏差を示す。
【図５Ｂ】発酵へ加えられた炭水化物が、０〜１０％のセロビオース＋９０〜１００％のアラビノースからなる１４Ｌの流加発酵において、Ｔ．リーゼイ株Ｐ５９Ｇの、ｍｇ分泌タンパク質／ｇバイオマス／時間における平均比生産性（ｑp）を示した図である。各バーは、３つの独立した発酵の平均および標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は真菌宿主細胞からセルラーゼを生成するための発酵プロセスに関する。
【００２４】
以下の記述は単なる一例としての好ましい実施形態であり、限定されずに本発明を実行するために必要な特色の組合せである。
【００２５】
本発明は、好ましくは液内培養発酵における真菌細胞の発酵からのセルラーゼの生成を提供する。
【００２６】
セルラーゼ混合物を生成するプロセス
セルラーゼ混合物は、細胞増殖に必要とされる他の栄養素とともに、グルコースおよびセルラーゼ誘導性炭水化物（ＣＩＣ）をほとんどまたはまったく含まない培地（固形または液体）に、活発に増殖する真菌培養を、宿主細胞に適切な温度およびｐＨでさらすことによって生成することができる。本明細書において記述されるように、好ましくは約４０％〜約９７％のＨＤＣ、またはその間の任意の量、および約３％〜約２０％のＣＩＣ、またはその間の任意の量の、ヘミセルロース由来炭水化物（ＨＤＣ）およびセルラーゼ誘導性炭水化物（ＣＩＣ）を含む炭水化物源により誘導因子（純粋なセルロースなどの）が置換される、セルロースを生成する任意の公知のプロセスを使用することができる。例えば、約４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９７％までのＨＤＣ、またはその間の任意の量、および約３、４、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０％までのＣＩＣ、またはその間の任意の量である。
【００２７】
トリコデルマ属および関連糸状菌の液内発酵は、バッチプロセス、流加プロセスまたは連続プロセスとして典型的には行われる。バッチプロセスにおいて、すべての必要な材料は、好気的プロセスのための酸素は例外として、実施の開始で反応装置中に配置され、完了（そのポイントで産物を採取する）まで発酵を進ませる。流加プロセスにおいて、培養は、培養液の除去をともない、１種以上の培地成分が連続的にまたは順番に加えられる。連続プロセスにおいて、新鮮培地が提供され、定常的増殖速度で培養を維持するように、培養液は容積測定的に等速度で連続的に除去される。
【００２８】
本発明のプロセスは、バッチプロセス、流加プロセス、反復流加プロセス、連続プロセスまたはその任意の組合せとして実行することができる。例えば、そのプロセスは流加プロセスでありえる。
【００２９】
本発明のプロセスは、約２０℃〜３５℃の温度、またはその間の任意の温度、例えば約２５℃〜約３０℃、またはその間の任意の温度、または２０、２２、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３５℃まで、またはその間の任意の温度で実行することができる。
【００３０】
本発明のプロセスは約３．０〜６．５のｐＨ、またはその間の任意のｐＨ、例えば約ｐＨ３．５〜ｐＨ５．５、またはその間の任意のｐＨ、例えば約ｐＨ  ３．０、３．２、３．４、３．５、３．７、３．８、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．２、５．４、５．５、５．７、５．８、６．０、６．２、６．５まで、またはその間の任意のｐＨで実行することができる。
【００３１】
本発明のプロセスは３〜３０日の期間、またはその間の任意の量、例えば３〜１０日の間、またはその間の任意の量、４〜８日の間、またはその間の任意の量、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０日まで、またはその間の任意の量にわたって実行することができる。
【００３２】
本発明のプロセスは、少なくとも１リットル、例えば約１〜約４００，０００リットル、またはその間の任意の量、例えば、１０〜約４００，０００リットル、またはその間の任意の量、１，０００〜約２００，０００リットル、またはその間の任意の量、または１０，０００〜約２００，０００リットル、またはその間の任意の量、または体積で約１、１０、５０、１００、２００、４００、６００、８００、１０００、２０００、４０００、６０００、８０００  １０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００リットルまで、またはその間の任意の量の培養において実行することができる。
【００３３】
本発明のプロセスは、酸素の存在下において好気的に、または酸素非存在下において嫌気的に実行することができる。例えば、プロセスは好気的に実行することはできる。
【００３４】
本発明の発酵プロセスは、炭素源がＨＤＣのみを含む対応するプロセスよりも少なくとも２．５倍、より好ましくは３倍多い分泌タンパク質を生成することができ、修飾されないか、またはＨＤＣによるセルラーゼ生成の促進された活性化に選択されない真菌株を使用して実行される。例えば、本明細書において記述されるプロセスは、炭素源がＨＤＣのみを含む対応するプロセスよりも２．５〜約１０倍以上、またはその間の任意の量、例えば約２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０倍以上の分泌タンパク質、またはその間の任意の量、または１０倍以上多い分泌タンパク質を生成することができ、修飾されないか、またはＨＤＣによるセルラーゼ生成の促進された活性化に選択されない真菌株を使用して実行される。したがって、発酵プロセスは、ｍｇ生成された分泌セルラーゼ／ｇｍバイオマス／時間に換算した比生産性（ｑp）において、炭素源がＨＤＣのみを含む対応するプロセスよりも少なくとも３倍、より好ましくは５倍、またはその間の任意の量で増加させることによって特徴づけることができ、修飾されないか、またはＨＤＣによるセルラーゼ生成の促進された活性化に選択されなかい真菌株を使用して実行される。本明細書において記述されるように、ＨＤＣ、ＣＩＣまたはＨＤＣおよびＣＩＣ両方の変化した量の存在下におけるタンパク質産生の比生産性の増加は、表１中に示される。
表１：１４Ｌの流加発酵においてＨＤＣ＋０〜２０％のＣＩＣで増殖させたＴ．リーゼイ株の液内培養からのタンパク質の生成および真菌細胞。
【表１】
2010536390.tif 000003
aこれらの発酵のためのＣＩＣは、全炭水化物の関数として、５６％ケンチオビオース、１４％ソフォロース、６％セロビオース、１０％トレハロース、６％マルトトリオース、４％グルコースおよび１４％他の炭水化物を含む誘導性カクテルであった。
bこれらの発酵のためのＣＩＣはセロビオースであった。
c株Ｐ５９Ｇについては、報告された値は、３つ（キシロース）または２つ（アラビノース）の重複した発酵の平均結果であり、株ＲｕｔＣ３０については、報告された値は単一発酵からの結果である。
【００３５】
発酵培地
本発明の実施形態において、発酵プロセスの間に少なくとも２つの炭素源（ヘミセルロース由来炭水化物（ＨＤＣ）およびセルラーゼ誘導性炭水化物（ＣＩＣ））が真菌細胞に提供される。
【００３６】
本明細書において使用される場合、用語、ヘミセルロース由来炭水化物またはＨＤＣは、ヘミセルロースに由来し、増殖または酵素生成または両方のために宿主微生物によって利用できる、１種以上のオリゴ糖、二糖または単糖を指す。ＨＤＣの非限定例は、キシロオリゴ糖、アラビノキシロオリゴ糖、Ｄ−キシロース、キシロビオース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンノースおよびＤ−ガラクトースを含む。好ましくは、ＨＤＣは、Ｄ−キシロースおよび／またはＬ−アラビノースを含む。ＨＤＣに由来する炭素は、発酵プロセスの間に真菌細胞へ加えられた全炭素の約４０％〜約９７％に相当する。例えば、ＨＤＣに由来する炭素は、発酵プロセスの間に真菌細胞へ加えられた全炭素の、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％または８５％または９０％、９５％、９７％、またはその間の任意の量に相当することができる。例えば、ＨＤＣに由来する炭素は、発酵プロセスの間に真菌細胞へ加えられた全炭素の約８０％〜約９７％に相当することができる。
【００３７】
本明細書において使用される場合、用語、セルラーゼ誘導性炭水化物またはＣＩＣは、宿主細胞によってセルラーゼ生成の誘導を導く、１種以上のオリゴ糖、二糖または単糖を指す。好ましくは、ＣＩＣは１種以上のセロビオース、ソフォロースまたはケンチオビオースである。１種以上のセルラーゼ酵素によるセルロースの酵素的加水分解によってＣＩＣを生成して、主としてβ結合グルコース二量体を生成することができる。あるいは、高濃度グルコースシロップを縮合して、グルコース二量体の混合物を形成することができる。グルコースを生成する縮合反応は、希釈酸によって触媒して１２０〜１５０℃より上の温度で行なうことができるか、またはより穏やかな温度の約４０〜７０℃でβ−グルコシダーゼ酵素またはセルラーゼ酵素によって行なうことができる（米国特許出願ＵＳ２００４／０１２１４４６Ａ１）。本発明の実施は、ＣＩＣの生成に使用される方法によって限定されない。
【００３８】
好ましくは、ＣＩＣに由来する炭素は、発酵プロセスの間に真菌細胞へ加えられた全炭素の約３％〜約２０％、またはその間の任意の量に相当する。例えば、ＣＩＣに由来する炭素は、発酵プロセスの間に真菌細胞へ加えられた全炭素の３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％もしくは２０％、またはその間の任意の量に相当することができる。例えば、ＣＩＣに由来する炭素は、発酵プロセスの間に真菌細胞へ加えられた全炭素の約８％〜約１５％、またはその間の任意の量に相当する。
【００３９】
ＨＤＣおよびＣＩＣに加えて、発酵プロセスの間に宿主細胞に提供された全炭素の約０．１〜約２０％、またはその間の任意の量は、宿主細胞によって利用できる１種以上のグルコース、グリセロール、有機酸または他の炭素源を含むことができる。例えば、発酵プロセスの間に宿主細胞に提供された全炭素の約０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１２．０、１４．０、１６．０、１８．０、２０％、またはその間の任意の量は、宿主細胞によって利用できる１種以上のグルコース、グリセロール、有機酸または他の炭素源を含むことができる。
【００４０】
バッチ発酵の事例において、炭素源は、接種前または接種と同時に発酵培地に追加することができる。流加操作または連続操作の事例において、炭素源は、発酵プロセスの間に連続的にまたは断続的に提供することもできる。好ましくは、流加速度は、０．２〜２．５ｇ炭素／培養Ｌ／時間、またはその間の任意の量である。より好ましくは、流加速度は、０．４〜１．６ｇ炭素／培養Ｌ／時間、またはその間の任意の量である。
【００４１】
当業者は、発酵培地に他の栄養素、ビタミンおよびミネラルを追加して宿主細胞の増殖および酵素生成を改良できることを承知している。これらの他の培地成分は、宿主細胞を培養に接種する前に、接種と同時にまたは接種後に追加することができる。アミノ酸およびペプチドなどの有機窒素源は、炭素源として時には使用されるが、これらの有機窒素源は、発酵プロセスの間に宿主細胞に提供される全炭素の計算に含まれない。
【００４２】
発酵に後続して、セルラーゼ酵素を含む培養液は直接使用することができるか、またはセルラーゼ酵素を、例えば濾過または遠心分離によって真菌細胞から分離することができる。発酵培地の消費されない成分などの低分子溶質は、限外濾過によって除去することができる。セルラーゼ酵素は、例えば蒸発、沈殿、沈降または濾過によって濃縮することができる。グリセロール、ショ糖、ソルビトールおよび同種のものなどの化学物質は、セルラーゼ酵素を安定化するために追加することができる。安息香酸ナトリウムまたはソルビン酸カリウムなどの他の化学物質をセルラーゼ酵素に追加して、微生物汚染の増殖を妨害することができる。
【００４３】
セルラーゼ生成のための真菌細胞
プロセスのための真菌細胞は、トリコデルマ属、ヒポクレア属、アスペルギルス属、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、オルピノミセス属（Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ジベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、エメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、ケトミウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ，）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、またはファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）の種などの子嚢菌類または担子菌類のファミリーに属する任意の糸状菌でありえる。好ましくは、宿主細胞は、トリコデルマ属またはヒポクレア属の種である。最も好ましくは、宿主細胞はトリコデルマ・リーゼイの株である。
【００４４】
真菌細胞は、１種以上の相同タンパク質または異種タンパク質の生成および分泌を促進するまたは低減するように修飾することができる。例えば、真菌細胞は、ＨＤＣおよび／またはＣＩＣによって誘導可能プロモーターに作動可能に結合されたセルラーゼ酵素をコードする遺伝子を含む１種以上の遺伝子コンストラクトにより修飾することができる。例えば、真菌細胞は、米国特許第６，０１５，７０３号に従ってβ−グルコシダーゼ酵素を過剰発現するように修飾することができる。宿主細胞は、同時係属米国特許出願ＵＳ２００８／００５７５４１Ａ１および６０／９６９，０４６に従ってセルラーゼ成分および補助成分の最適化されたブレンドを生成するように修飾することもできる。セルラーゼ遺伝子に作動可能に結合されたＣＩＣまたはＨＤＣの誘導可能プロモーターを含む遺伝子コンストラクトを調製する方法および真菌株を遺伝的に修飾する方法は、ＣａＣｌ2、エレクトロポレーション、微粒子銃照射、プロトプラストのＰＥＧ仲介性融合による細胞の処理を含むが、これらに限定されない当業者に公知のものを含む（米国特許第６，０１５，７０３号および米国特許第６，９３９，７０４号）。
【００４５】
セルラーゼ混合物
本明細書において使用される時、セルラーゼ混合物は、発酵プロセスの間に真菌細胞によって分泌されたセルラーゼ、ヘミセルラーゼおよび他のタンパク質のその混合物である。本発明の発酵プロセスを好ましくは使用して生成されたセルラーゼ混合物は、約２：１よりも高いセルラーゼ：ヘミセルラーゼ成分の比率を含む（表２）。より好ましくは、セルラーゼ：ヘミセルラーゼ比率は少なくとも約３：１である。より最も好ましくは、セルラーゼ：ヘミセルラーゼ比率は少なくとも約４：１である。例えば、ヘミセルラーゼ：セルラーゼ比率は、約２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、もしくは４：１、またはその間の任意の比率でありえる。
表２：１４Ｌの流加発酵においてＨＤＣおよびＣＩＣを用いた液内培養中で増殖させたＴ．リーゼイ培養からの分泌酵素の組成物。
【表２】
2010536390.tif 000004
*実施例４中に記述されているような各条件下で培養液の中へ分泌されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のスキャニングデンシトメトリーによって決定された。
**実施例４中に記述されているような前処理したリグノセルロース系基質に対する相対的加水分解活性。
aこれらの発酵のためのＣＩＣは、全炭水化物の関数として、５６％ケンチオビオース、１４％ソフォロース、６％セロビオース、１０％トレハロース、６％マルトトリオース、４％グルコースおよび１４％他の炭水化物を含む誘導性カクテルであった。
bこれらの発酵のためのＣＩＣはセロビオースであった。
【００４６】
セルロース系基質の加水分解
本発明の発酵プロセスを使用して生成された分泌されたセルラーゼ酵素は、セルロース系基質の加水分解に有用である。用語「セルロース系基質」によって、植物バイオマスに由来し、エタノールまたは他の高価値産物の生成のための前処理したリグノセルロース系原料、飼料、パルプおよび木材チップなどの林業廃棄物産物、ならびに織物を含むが、これらに限定されないセルロースを含む任意の基質が意味される。前処理したリグノセルロースおよび濾紙に対する分泌されたセルロース酵素の活性を、表３中に示す。
表３：１４Ｌの流加発酵においてＨＤＣおよびＣＩＣを用いた液内培養中で増殖させたＴ．リーゼイ培養からのセルラーゼ混合物の活性。
【表３】
2010536390.tif 000005
*実施例４中に記述されているような各条件下で培養液の中へ分泌されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のスキャニングデンシトメトリーによって決定された。
**実施例４中に記述されているような前処理したリグノセルロース系基質に対する相対的加水分解活性；ｎ．ｄ．＝決定されなかった。
aこれらの発酵のためのＣＩＣは、全炭水化物の関数として、５６％ケンチオビオース、１４％ソフォロース、６％セロビオース、１０％トレハロース、６％マルトトリオース、４％グルコースおよび１４％他の炭水化物を含む誘導性カクテルであった。
bこれらの発酵のためのＣＩＣはセロビオースであった。
【００４７】
本発明の発酵プロセスによって生成されたセルラーゼ酵素は、「前処理したリグノセルロース系原料」の酵素的加水分解に使用することができる。前処理したリグノセルロース系原料は、前処理の前に、少なくとも２０％のセルロース（乾燥質量）、より好ましくは約３０％以上のセルロース、さらにより好ましくは４０％以上のセルロース、および少なくとも１０％のリグニン（乾燥質量）、より典型的には少なくとも１２％（乾燥質量）を含む植物起原の材料であり、線維をセルロース分解性酵素の作用に対してより接近可能におよび／またはより感受性を強くするように、物理的および／または化学的プロセスにさらされる。前処理プロセスの非限定例は、硫酸もしくは亜硫酸、または他の酸；アンモニア、石灰、水酸化アンモニウムまたは他のアルカリ；エタノール、ブタノールまたは他の有機溶媒；または加圧水によるリグノセルロース系原料の化学処理を含む（米国特許第４，４６１，６４８号、５，９１６，７８０、６，０９０，５９５、６，０４３，３９２、４，６００，５９０Ｗｅｉｌら、１９９７，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６８１：２１−４０、およびＯｈｇｒｅｎ，Ｋ．ら２００５，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｓｐｒｉｎｇ（１２１−１２４）：１０５５−１０６７を参照；これらは参照することにより本明細書に組み入れられる）。
【００４８】
例えば、セルロース系基質は、反応混合物の１Ｌあたり約１〜約２００ｇ、またはその間の任意の量、例えば約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００まで、またはその間の任意の量のセルロースの濃度で、および１ｇセルロースあたり約０．１〜約１００ｍｇのタンパク質、またはその間の任意の量、例えば約０．１、０．５、１．０、２．０、５．０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍｇまでのタンパク質／ｇセルロース、またはその間の任意の量のセルラーゼ供与量で、本明細書において記述された方法を使用して生成されたセルラーゼ酵素によりインキュベートすることができる。反応混合物は、約４時間〜約１２０時間、またはその間の任意の量で、約３０℃〜約６０℃の温度、またはその間の任意の温度、例えば約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０℃まで、またはその間の任意の温度で、および約３．５〜約７．０のｐＨ、またはその間の任意のｐＨ、例えば約３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０のｐＨまで、またはその間の任意のｐＨでインキュベートすることができる。インキュベーションに後続して、ヘミセルロース由来炭水化物、セルラーゼ誘導性炭水化物、グルコース、オリゴ糖を含む反応生成物は、例えばエタノール、ブタノール、糖アルコール、乳酸、酢酸を産生するための基質として、さらなるプロセシングに使用することができるか、または最終産物は当技術分野において公知であるような標準的方法を使用して、濃縮および精製することができる。
【００４９】
要約すると、本発明は、セルロース系基質の加水分解に有用な低ヘミセルラーゼ含有量を備えたセルラーゼ酵素を生成する、高度に生産的な発酵プロセスを提供する。
【００５０】
上記の記述は、いかなる方式においても請求される発明を限定するようには意図されない。さらに、論じられた特色の組合せは、発明の説明に必要不可欠というわけではない。
【実施例】
【００５１】
本発明は以下の実施例においてさらに示されるだろう。しかしながら、これらの実施例が説明の目的のみのためであり、いかなる方式においても本発明の範囲を限定するように使用されるべきでないことは理解されるべきである。
【００５２】
実施例１は、以下の実施例において使用される株について記述する。実施例２はＨＤＣおよびＣＩＣを使用する流加発酵プロセスおよび連続発酵プロセスについて記述する。実施例３は、ＨＤＣおよびＣＩＣを使用する流加発酵プロセスについての比生産性およびプロセス収率の決定を記述する。実施例４は、ＨＤＣおよびＣＩＣを使用する流加発酵において生成されたセルラーゼ混合物の特性評価について記述する。
【００５３】
実施例１：トリコデルマ・リーゼイ株
Ｔ．リーゼイ株ＲｕｔＣ３０（ＡＴＣＣ＃５６７６５；Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ，Ｂ．およびＥｖｅｌｅｉｇｈ，Ｄ．１９７９．Ａｄｖ．Ｃｈｅｍ．Ｓｅｒ．１８１：２８９−３０１）またはＰ５９Ｇは、以下の実施例において使用された。株Ｐ５９Ｇは、ＵＳ６，０１５，７０３中に記述されるようなＴ．リーゼイのｂｇｌ１によってコードされる高レベルのβ−グルコシダーゼを生成し分泌する遺伝子組み換え株である。Ｐ５９Ｇの親株（株ＢＴＲ２１３）は、ランダム変異誘発によって生成され、最初に１％の酸で膨潤したセルロースおよび４ｇ／Ｌの２−デオキシグルコースを含む最少培地寒天上でより大きな透明ゾーンを生成する能力について選択され、次に０．２μｇ／ｍｌカルベンダジムを含むラクトース培地上で増殖する能力について選択されたＲｕｔＣ３０の誘導体である。
【００５４】
実施例２：ＨＤＣおよびＣＩＣの混合物を使用する発酵
凍結された（−８０℃）１５％グリセロールストックからのトリコデルマ属胞子を、ポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）を含むスタンダードの８５ｍｍペトリ皿上に接種した。これらのプレートを３〜５日間２８℃でインキュベートして、新鮮な緑色胞子の密集した増殖を達成した。発酵検査のための接種物を調製するために、単一ＰＤＡプレートからの胞子を、５．１ｇ／Ｌコーンスティープリカー粉末および１０ｇ／Ｌグルコースを追加した、７５０ｍＬの液体バークレー培地（ｐＨ５．５）を含む２Ｌのバッフル付きのエルレンマイヤーフラスコに移した。フラスコは、１００ｒｐｍで運転する旋回撹拌器（モデルＧ−５２ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック社（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．））を使用して、３日間２８℃でインキュベートした。
フラスコのためのバークレー培地
【表４】
2010536390.tif 000006
*微量元素溶液は５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１．６ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；１．４ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含む。
【００５５】
２ａ．流加発酵
接種物フラスコの内容物を、１０Ｌの初期パイロット培地（ｐＨ５．５）によりセットアップした１４Ｌのパイロット規模発酵容器（モデルＭＦ１１４ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック社）に移した。培地中のグルコースが枯渇するまで、容器はバッチモードで運転された。この時点で、炭素源を、典型的には３６ｗ％固形のストックから、連続ベースで追加した。ペリスタポンプを使用して、０．４グラムの炭素／リットル培養／時間の速度で、流加式で炭素源を送った。実行したバッチ部分および流加部分の両方の操作変数は、５００ｒｐｍでのインペラー撹拌による混合、毎分８スタンダードリットルでの空気散布、および２８℃の温度である。培養ｐＨは、オンラインｐＨプローブに接続した自動コントローラー、および１０％の水酸化アンモニウム溶液の追加を可能にするポンプを使用して、バッチ増殖の間に４．０〜４．５およびセルラーゼ生成の間にｐＨ３．５で維持した。定期的に、１００ｍＬのブロスサンプルをバイオマスおよびタンパク質分析のために採取した。全発酵時間は典型的には９６〜１４４時間の間である。
流加発酵のための初期培地
【表５】
2010536390.tif 000007
*微量元素溶液は５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１．６ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；１．４ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含む。
【００５６】
発酵槽ブロスのバイオマス含有量は、量り取った５〜１０ｍＬのアリコートを使用して決定し、ガラスマイクロファイバーを介して真空濾過し、４〜２４時間１００℃でオーブン乾燥した。バイオマスの濃度は以下の等式に従って決定された。
2010536390.tif 000008
【００５７】
培養液濾過液のタンパク質濃度はブラッドフォード分析を使用して決定した。クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０色素の色強度変化（この分析の基本原理を形成する）を、５９５ｎｍの吸光度測定を使用して分光測光的定量した。使用されるスタンダード分析対照は既知の組成物および濃度のセルラーゼ混合物であった。
【００５８】
ＨＤＣおよびＣＩＣの両方を使用する流加発酵プロセスは、ＨＤＣのみを使用する対応するプロセシングよりも、３〜５倍多いタンパク質および１０％〜４６％の範囲でより少ないバイオマスを生成した（表４、  図３）。
表４：ＣＩＣ有りまたはＣＩＣ無しのＨＤＣを使用したＴ．リーゼイ株の１４Ｌ流加培養中の分泌タンパク質の生成および真菌細胞量。
【表６】
2010536390.tif 000009
aＣＩＣ：誘導カクテルは、全炭水化物の関数として、５６％ケンチオビオース、１４％ソフォロース、６％セロビオース、１０％トレハロース、６％マルトトリオース、４％グルコースおよび１４％他の炭水化物を含む。
b株Ｐ５９Ｇについては、報告された値は、３つ（キシロース）または２つ（アラビノース）の重複した発酵の平均結果であり；株ＲｕｔＣ３０については、報告された値は単一発酵からの結果である。
【００５９】
２ｂ．連続発酵
上記の実施例２ａにおけるように、トリコデルマ属接種フラスコを調製した。
【００６０】
接種物フラスコの内容物を、上記の実施例２ａ中に記述されているような５Ｌの初期パイロット培地（ｐＨ５．５）によりセットアップした１４Ｌのパイロット規模発酵容器（モデルＭＦ１１４ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック社）に移した。培地中のグルコースが枯渇するまで、容器はバッチモードで運転された。この時点で、炭素源および新鮮な栄養素を連続ベースで追加した。
【００６１】
ペリスタポンプを使用して、０．０２５／時間の希釈速度で、０．８５〜１．１グラムの間の炭素／リットル培養／時間の速度で、流加式で炭素源を送った。炭素源は、全炭水化物の関数として９２％のＨＤＣおよび８％のＣＩＣからなった。ＨＤＣは、純粋なキシロース、グルコースおよびアラビノースの混合物または前処理加水分解物（麦わらの前処理によって生成された）のいずれかであり、８１．１％キシロース、１１．１％グルコースおよび７．８％アラビノースからなった。ＣＩＣは以下に示された組成物を持つ誘導性カクテルであった。培養体積はサイフォンの使用によって全体の発酵の間５Ｌで維持された。実行したバッチ部分および流加部分の両方の操作変数は、５００ｒｐｍでのインペラー撹拌による混合、毎分８スタンダードリットルでの空気散布、および２８℃の温度である。培養ｐＨは、オンラインｐＨプローブに接続した自動コントローラー、および１０％の水酸化アンモニウム溶液の追加を可能にするポンプを使用して、バッチ増殖の間に４．０〜４．５およびセルラーゼ生成の間にｐＨ３．５で維持した。定期的に、１００ｍＬのブロスサンプルをバイオマスおよびタンパク質分析のために採取した。全発酵時間は、典型的には、バッチ相について２４時間および連続相について１４４時間であった。
連続発酵培養液の組成物
【表７】
2010536390.tif 000010
*微量元素溶液は、５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１．６ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；１．４ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含む。
aＣＩＣ：誘導性カクテルは、全炭水化物の関数として、５６％ケンチオビオース、１４％ソフォロース、６％セロビオース、１０％トレハロース、６％マルトトリオース、４％グルコースおよび１４％他の炭水化物を含む。
【００６２】
実施例２ａにおけるように、発酵槽ブロスの内容物およびブロス濾過液のタンパク質濃度を決定した。表５中に示されるように、純粋な糖類または前処理加水分解物のＨＤＣ混合物を使用して増殖させた培養は、類似した量のタンパク質および細胞を生成する。
表５：前処理加水分解物または純粋な化学物質からのＣＩＣおよびＨＤＣの混合物を使用するＴ．リーゼイの１４Ｌの連続培養における分泌タンパク質および真菌細胞量の生成
【表８】
2010536390.tif 000011
aＣＩＣ：誘導カクテルは、全炭水化物の関数として、５６％ケンチオビオース、１４％ソフォロース、６％セロビオース、１０％トレハロース、６％マルトトリオース、４％グルコースおよび１４％他の炭水化物を含む。
b報告された値は２つの重複した発酵の平均結果である。
【００６３】
実施例３：比生産性
ＨＤＣおよびＣＩＣの両方を使用する流加発酵プロセスは、ＨＤＣのみを使用する対応するプロセシングよりも４〜１２倍高い比生産性を示す（表６、  図４）。
表６：ＣＩＣ有りまたはＣＩＣ無しのＨＤＣを使用したＴ．リーゼイ株の１４Ｌの流加培養の比生産性。
【表９】
2010536390.tif 000012
aＣＩＣ：誘導性カクテルは、全炭水化物の関数として、５６％ケンチオビオース、１４％ソフォロース、６％セロビオース、１０％トレハロース、６％マルトトリオース、４％グルコースおよび１４％他の炭水化物を含む。
b株Ｐ５９Ｇについては、報告された値は、３つ（キシロース）または２つ（アラビノース）の重複した発酵の平均結果であり、株ＲｕｔＣ３０については、報告された値は単一発酵からの結果である。
【００６４】
麦わらの希釈酸気流前処理（米国特許４，４６１，６４８および５，９１６，７８０におけるように）によって生成されたＨＤＣ混合物と組み合わせて、または純粋な糖類を使用して作製された同等のＨＤＣ混合物と組み合わせて、ＣＩＣを使用する連続発酵プロセス。これらのＨＤＣ混合物は、全炭水化物の関数として、８１．１％キシロース、１１．１％グルコースおよび７．８％アラビノースを含んでいた。表７中で示されるように、前処理加水分解物または純粋な糖の形態でＨＤＣ混合物を使用する連続培養の比生産性は類似していた。
表７：前処理加水分解物または純粋な化学物質からのＣＩＣおよびＨＤＣの混合物を使用するＴ．リーゼイ株のＣＳＴＲ培養の比生産性。
【表１０】
2010536390.tif 000013
aＣＩＣ：誘導性カクテルは、全炭水化物の関数として、５６％ケンチオビオース、１４％ソフォロース、６％セロビオース、１０％トレハロース、６％マルトトリオース、４％グルコースおよび１４％他の炭水化物を含む。
b報告された値は、各ＨＤＣ／ＣＩＣ混合物を使用して実行された２つの連続発酵の平均を表わす。
【００６５】
実施例４：流加発酵において生成されたセルラーゼ混合物の特性評価
実施例２中で記述された発酵プロセスによって生成されたセルラーゼ混合物の個々の成分は、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して、サイズに基づいて分離された。この目的のために、濃縮ゲルは４％アクリルアミド、０．１２５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）であり、分離ゲルは１２％アクリルアミド、０．３７５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）であった。ゲル調製に使用されるストックゲルのモノマー溶液の比率は、３７．５：１のアクリルアミド：ビス−アクリルアミドであった。ローディングの前に、タンパク質サンプルをβ−メルカプトエタノールを含む緩衝液中で５分間煮沸することによって変性させた。１０×８×０．０７５ｃｍのゲルにおよそ１０μｇタンパク質／レーンをロードした。電気泳動の分離はおよそ４５分間２００Ｖで行った。分画されたタンパク質は、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０色素溶液による染色によって可視化した。
【００６６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画されたセルラーゼおよびヘミセルラーゼの比率は、スキャニングゲルデンシトメトリーを使用して特性を評価した。このプロセスには、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０色素により染色したゲルのデジタル画像を最初に取り込むことが必要であった。これは、ＣＨＥＭＩＧＥＮＩＵＳ２バイオイメージングシステム（シノプティック（Ｓｙｎｏｐｔｉｃｓ）社）およびソフトウェアパッケージＧｅｎｅＳｎａｐバージョン６．０３（シノプティック社）を使用して行われた。次に、別個のバンドとして可視化された分画したセルラーゼタンパク質およびヘミセルラーゼタンパク質は、与えられたサンプル中のすべてのバンドについてのシグナルの合計に対するそれらの画像シグナル強度に基づいて特性を評価した。シグナル強度は、可能なデフォルト設定によりＧｅｎｅＴｏｏｌｓバージョン３．０５ソフトウェアパッケージ（シノプティック社）を使用して決定した。データは、さらなる解析のためにエクセルスプレッドシート（マイクロソフト社）にエクスポートした。
【００６７】
ＨＤＣおよびＣＩＣの混合物を使用してＴ．リーゼイ発酵によって生成されたセルラーゼ混合物の比活性は、前処理した麦わら基質または濾紙からの還元糖の放出の測定によって決定された。
【００６８】
濾紙の加水分解は、セルラーゼ活性の測定のためのスタンダードＩＵＰＡＣ法に従って行われた（Ｇｈｏｓｅ，Ｔ．Ｋ．、１９８７，Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７−２６８）。報告された値はＩＵ／ｍｇタンパク質中のセルラーゼの比活性である。
【００６９】
麦わらの加水分解は以下のように行なった。０．５％安息香酸ナトリウムを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中での発酵濾過液の希釈は、黒色麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ  ｎｉｇｅｒ）からのβ−グルコシダーゼ調製物により補完され、米国特許第４，４６１，６４８号の通りに調製した酸前処理した麦わらと共にインキュベートし、反応混合物を５０℃で２４時間振盪し、標的セルロース転換レベルは７０％以上であった。酵素活性は、標的セルロース転換レベルを達成するのに必要な酵素の量の決定によって計算された。これらの活性は、グルコースの酸縮合によって生成された炭素源を使用して増殖させた同じ株の１４Ｌの流加培養において生成された対照発酵濾過液の活性に対して正規化された。すべての発酵濾過液についての分析において検査された全タンパク質質量は同じであった。
【００７０】
表８中で示されるように、ＨＤＣと組み合わせて少なくとも３％のＣＩＣにより増殖させたＴ．リーゼイ培養によって生成された発酵濾過液は、ＨＤＣ単独により増殖させた培養よりもより高い品質のセルラーゼを生成した。発酵に対して加えられた炭素源中の少なくとも３％のＣＩＣの含有は、セルラーゼ：ヘミセルラーゼの比率、およびセルロース系基質の加水分解についてのセルラーゼの比活性を改良した。
表８：１４Ｌの流加発酵においてＨＤＣおよびＣＩＣを用いた液内培養中で増殖させたＴ．リーゼイ培養からの分泌酵素の組成物。
【表１１】
2010536390.tif 000014
aこれらの発酵についてのＣＩＣは、全炭水化物全の関数として、５６％ケンチオビオース、１４％ソフォロース、６％セロビオース、１０％トレハロース、６％マルトトリオース、４％グルコースおよび１４％他の炭水化物を含む誘導性カクテルであった。
bこれらの発酵についてのＣＩＣはセロビオースであった。
c前処理したリグノセルロース系基質または濾紙に対する相対的加水分解活性。値は、３つ（ＨＤＣ＝キシロース）または２つ（ＨＤＣ＝アラビノース）の独立した１４Ｌの発酵の濾過液からの分泌酵素を用いて実行された三重分析の平均を表わす（ｎ．ｄ．＝決定されなかった）。
d純粋な糖類の混合物（８１．１％キシロース、１１．１％グルコースおよび７．８％アラビノース）。
e前処理加水分解物中の糖の混合物（８１．１％キシロース、１１．１％グルコース、７．８％アラビノース）。
【００７１】
排他的な特性または権利が主張される本発明の実施形態は、特許請求の範囲に定義される。
【図１Ａ】
2010536390.tif 000015
【図１Ｂ】
2010536390.tif 000016
【図２】
2010536390.tif 000017
【図３Ａ】
2010536390.tif 000018
【図３Ｂ】
2010536390.tif 000019
【図４Ａ】
2010536390.tif 000020
【図４Ｂ】
2010536390.tif 000021
【図５Ａ】
2010536390.tif 000022
【図５Ｂ】
2010536390.tif 000023
【国際調査報告】
2010536390.tif 000024
2010536390.tif 000025