(57)【要約】  本発明は、新規の細胞性因子含有溶液組成物（本明細書において、「CFS」組成物と呼ぶ）であって、新規の持続放出型の細胞性因子含有溶液組成物（本明細書において、「SR-CFS」組成物と呼ぶ）を含む前記組成物、このような新規組成物を製造する方法およびそれらの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理的濃度の
a) VEGF、TGFβ2、アンギオゲニンおよびPDGFより選択される少なくとも1種の因子；ならびに
b) TIMP-1およびTIMP-2より選択される少なくとも1種のMMP阻害剤
を含む胚体外細胞由来の細胞性サイトカイン溶液組成物。
【請求項２】
MMP阻害剤がTIMP-1および／またはTIMP-2である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
生理的濃度の
a) VEGF、TGFβ2、アンギオゲニンおよびPDGFより選択される少なくとも2種の因子；ならびに
b)少なくとも1種のMMP阻害剤
を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
生理的濃度の
a) VEGF、TGFβ2、アンギオゲニンおよびPDGFより選択される少なくとも3種の因子；ならびに
b)少なくとも1種のMMP阻害剤
を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
生理的濃度のVEGF、TGFβ2、アンギオゲニン、PDGFおよびTIMP-1を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
生理的濃度のVEGF、TGFβ2、アンギオゲニン、PDGFおよびTIMP-2を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
生理的濃度のVEGF、TGFβ2、アンギオゲニン、PDGF、TIMP-1およびTIMP-2を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項８】
細胞性因子含有溶液組成物が、羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項９】
羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液が、生理的濃度のVEGF、TGFβ2、アンギオゲニン、PDGF、TIMP-1およびTIMP-2を含む、請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項1に記載の胚体外細胞由来の細胞性サイトカイン溶液を含む持続放出組成物。
【請求項１１】
胚体外細胞由来の細胞性サイトカイン溶液が、羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液である、請求項10に記載の持続放出組成物。
【請求項１２】
a) 胎盤の羊膜から羊膜上皮細胞を単離し、
b) 羊膜上皮細胞からAMP細胞を選択し、
c) AMP細胞をコンフルエントに達するまで培養し、
d) 培地を交換し、
e) 該細胞を該培地中で培養し、
f) 工程(e)の培地を収集して、羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液を得る
ことを含む、羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液を製造する方法。
【請求項１３】
工程(f)を複数回繰り返し、それぞれの工程(f)において得られる羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液を合わせて、プールされた羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液を製造する、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
請求項13の方法により製造される羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液。
【請求項１５】
溶液が、VEGF、TGFβ2、アンギオゲニン、PDGF、TIMP-1および／またはTIMP-2の因子を、生理的濃度で含む、請求項14に記載の羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液。
【請求項１６】
生理的濃度が、VEGFでは〜5.0〜16ng/mLであり、アンギオゲニンでは〜3.5〜4.5 ng/mLであり、PDGFでは〜100〜165pg/mLであり、TGFβ2では〜2.5〜2.7ng/mLであり、TIMP-1では〜0.68μg/mLであり、TIMP-2では〜1.04μg/mLである、請求項1〜10、14および15のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１７】
生理的濃度の
a) VEGF、TGFβ2、アンギオゲニンおよびPDGFより選択される1種以上の因子；
b) 少なくとも1種のMMP阻害剤；ならびに
c) 担体
から本質的になる治療成分を含み、生理的濃度が、VEGFでは〜5.0〜16ng/mLであり、アンギオゲニンでは〜3.5〜4.5 ng/mLであり、PDGFでは〜100〜165pg/mLであり、TGFβ2では〜2.5〜2.7ng/mLであり、担体が生理食塩水、PBS、乳酸加リンゲル液または細胞培養培地である、生理的サイトカイン溶液組成物。
【請求項１８】
MMP阻害剤がTIMP-1および／またはTIMP-2であり、生理的濃度が、TIMP-1では〜0.68μg/mLであり、TIMP-2では〜1.04μg/mLである、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
生理的濃度の
a) VEGF、TGFβ2、アンギオゲニンおよびPDGF;
b) TIMP-1および／またはTIMP-2； ならびに
c) 担体
から本質的になる治療成分を含み、生理的濃度が、VEGFでは〜5.0〜16ng/mLであり、アンギオゲニンでは〜3.5〜4.5 ng/mLであり、PDGFでは〜100〜165pg/mLであり、TGFβ2では〜2.5〜2.7ng/mLであり、TIMP-1では〜0.68μg/mLであり、TIMP-2では〜1.04μg/mLであり、担体が生理食塩水、PBS、乳酸加リンゲル液または細胞培養培地である、請求項17の組成物。
【請求項２０】
組成物A：VEGFおよびTIMP-1；組成物B：VEGF、アンギオゲニンおよびTIMP-1；組成物C：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BBおよびTIMP-1；組成物D：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-1；組成物E：VEGFおよびTIMP-2；組成物F：VEGF、アンギオゲニンおよびTIMP-2；組成物G：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BBおよびTIMP-2；組成物H：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-2；組成物I：VEGF、TIMP-1およびTIMP-2；組成物J：VEGF、アンギオゲニン、TIMP-1およびTIMP-2；組成物K：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BB、TIMP-1およびTIMP-2；組成物L：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1およびTIMP-2；組成物M：アンギオゲニンおよびTIMP-1；組成物N：アンギオゲニン、PDGF-BBおよびTIMP-1；組成物O：アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-1；組成物P：アンギオゲニンおよびTIMP-2；組成物Q：アンギオゲニン、PDGF-BBおよびTIMP-2；組成物R：アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-2；組成物S：アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1およびTIMP-2；組成物T：PDGF-BBおよびTIMP-1；組成物U：PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-1；組成物V：PDGF-BBおよびTIMP-2；組成物W：PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-2；組成物X：PDGF-BB、TIMP-1およびTIMP-2;ならびに組成物Y：PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1およびTIMP-2からなる群より選択される組成物；ならびに担体から本質的になる治療成分を含み、VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1およびTIMP-2が、VEGFでは〜5〜16ng/mL、アンギオゲニンでは〜3.5〜4.5 ng/mL、PDGFでは〜100〜165pg/mL、TGFβ2では〜2.5〜2.7ng/mL、TIMP-1では〜0.68μg/mL、およびTIMP-2では〜1.04μg/mLの濃度であり、担体が生理食塩水、PBS、乳酸加リンゲル液または細胞培養培地である、生理的サイトカイン溶液組成物。
【請求項２１】
請求項17〜20のいずれか1項に記載の組成物を含む持続放出組成物。
【請求項２２】
胚体外細胞由来の細胞性サイトカイン溶液の持続放出を達成させることができる薬剤をさらに含み、該薬剤が、ポリマー、混合ポリマー、ヒアルロン酸粒子、マイクロカプセル化材料またはナノ粒子より選択される、請求項21に記載の持続放出組成物。
【請求項２３】
細胞性因子含有溶液組成物を、細胞性因子含有溶液組成物の持続放出を達成させることができる薬剤と組み合わせる工程を含む、持続放出組成物を製造する方法。
【請求項２４】
請求項23の方法により製造される持続放出組成物。
【請求項２５】
請求項1〜10および14〜24のいずれか1項に記載の組成物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野は、新規の細胞性因子含有溶液組成物（本明細書において、「CFS」組成物と呼ぶ）であって、新規の持続放出型の細胞性因子含有溶液組成物（本明細書において、「SR-CFS」組成物と呼ぶ）を含む前記組成物、このような新規組成物を製造する方法およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの個々のサイトカインおよび成長因子について、多くの、さまざまな疾病、障害および損傷の治療におけるそれらの治療上の有用性について評価がおこなわれてきた。残念ながら、結果は一部が有望であるのみである。例えば、PDGF-BBは、糖尿病による足の潰瘍の治療に有用であることが証明されており；GM-CSFは、ヨーロッパにおいて静脈性潰瘍および糖尿病による足の潰瘍の両方の治療薬として市販されており；HGH（ヒト成長ホルモン）は、米国において小児熱傷の治療薬として市販されている。失敗例には、BDNF、CNTFおよびIGF-1があり、これらはすべてALSの治療におけるそれらの効果を試験するために設計された臨床試験において評価され、それぞれ期待はずれの結果に終わり；TGFβ2は、静脈性潰瘍の第II相試験で失敗に終わり；IGF-1とPDGFの併用療法は糖尿病による足の潰瘍において不成功であった。
【０００３】
これらの個々のサイトカインおよび成長因子のこれほど多くが臨床において失敗した理由は明らかではないが、一つの学説は、タンパク質が生理的でない用量、すなわち、in vivoで正常に見出される生理的レベルと比較して非常に高い用量で投与されたということである。また、与えられた生理学的適所（niche）においてサイトカインと成長因子の間には複雑な相互作用があるので、単に一つの因子、特に異常に高いレベルの一つの因子を適用しても生理学的適所を再現することができず、実際には、その繊細な均衡を甚だしく乱す可能性がある。
【０００４】
臨床において限定的にしか成功していないことのみならず、サイトカインおよび成長因子ならびに他のタンパク質ベースの治療薬は、典型的には他の医薬品と比べて患者への投与がより難しい。タンパク質の有効性はその形状に関連しているため、タンパク質ベースの治療薬は、そこに含まれるタンパク質（1種または複数種）がアンフォールディングまたは変性を引き起こす可能性のある条件下に置くことはできない。その結果、タンパク質ベースの治療薬の調製、保存、および投与には特別の注意が必要である。
【０００５】
タンパク質の変性を回避することに加えて、しばしば、患者に投与されるタンパク質の量を長時間制御することができることが望ましい。これは、患者におけるタンパク質濃度が望ましくない程度に高くもしくは低くなること、または望まれるレベルから過度に大きく変動することを防ぎ、患者における治療薬の安定したレベルを維持するのに役立つ。この目的で、タンパク質ベースの治療薬を含む多くの治療薬のための持続放出製剤が開発されているか、または現在開発中である。持続放出型のタンパク質ベースの治療薬は、錠剤またはカプセルの経口送達、粉末の吸入、埋め込み、マトリックスへの組み込み、またはそこから長期間にわたってタンパク質が徐々に放出されるカプセル化された治療薬の局所適用を含むがこれらに限定されない種々の方法により投与することができる。
【０００６】
このような持続放出製剤の調製法は多様である。ある方法は、タンパク質を有機溶媒と混合することを含む。例えば、粉末製剤は、タンパク質と有機溶媒の混合物を液体窒素の中に噴霧することにより製造することができる。別の方法は、タンパク質を生物浸食性／生物分解性ポリマーの有機溶媒溶液と混合し、混合物を凝固させることにより、タンパク質およびポリマーを含有する微粒子を形成することを含む。さらに別の方法においては、タンパク質、粉末化した製剤、または微粒子を有機溶媒と混合して液体またはゲルを製造し、これを患者に注入または局所適用する。残念なことに、有機溶媒を使用することの欠点は、それらがタンパク質の変性を起こしやすいことである。
【０００７】
変性を起こす有機溶媒の存在下でタンパク質を安定化するために添加剤が使用されてきた。これらの添加剤には、界面活性剤（米国特許第5,096,885号を参照されたい）、アミノ酸（米国特許第4,297,344号を参照されたい）、ポリオール（米国特許第5,589,167号を参照されたい）、天然高分子（国際公開第8903671号を参照されたい）、合成高分子（Pharm. Res. 8:285-291, 1991年を参照されたい）、および金属（米国特許第6,191,107号を参照されたい）が含まれる。これらの特許および刊行物をそれぞれ参照により本明細書に組み込む。
【０００８】
今日まで、健康な状態および病気または損傷の状態の体内において自然に見出される生理的に関連するサイトカインおよび成長因子の複雑な組合せおよび生理的レベルを、効果的に再現または模倣するタンパク質ベースの治療薬（すなわち、サイトカインおよび成長因子）は存在しない。現在利用可能なタンパク質ベースの治療薬はすべて、サイトカインまたは成長因子が体内で正常に見出されるレベルよりも、何倍も高い用量を投与する。また、これらの生理的に関連するサイトカインおよび成長因子を生理的レベルで投与することには誰も成功していない。さらに、これらの生理的に関連するサイトカインおよび成長因子を持続放出製剤として生理的レベルで投与することには誰も成功していない。したがって、出願人は、ここに、生理的に関連する成長因子およびサイトカインを生理的レベルで提供し（CFS組成物）、かつ、ある例においては、生理的に関連する成長因子およびサイトカインを、持続放出製剤を用いて生理的レベルで送達する（SR-CFS組成物）という達成されていない医学的必要性を満たすことを目的とする本発明を、初めて提示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第5,096,885号明細書
【特許文献２】米国特許第4,297,344号明細書
【特許文献３】米国特許第5,589,167号明細書
【特許文献４】国際公開第89/03671号パンフレット
【特許文献５】米国特許第6,191,107号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Pharm. Res. 第8巻:p. 285-291, 1991年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、生物学的適所において見出されるサイトカインおよび成長因子の複雑で独特な組合せおよび生理的レベルを再現する新規の細胞性因子含有溶液(CFS)組成物を提供することである。本発明の目的はさらに、生物学的適所において自然に見出される複雑で独特な組合せおよび生理的レベルのサイトカインおよび成長因子を含有する新規の持続放出型の細胞性因子含有溶液(SR-CFS)組成物を提供することである。細胞性因子が体内で見出される生理的レベルと同等のレベルで存在するので、それらは、疾病および／または損傷の治療および／または治癒に関与する生化学的および生物学的過程を支援、開始、置換または加速するための介入、あるいは前記過程に影響を与えるための介入が要求される治療的適用における使用に最適である。SR-CFS組成物の場合、細胞性因子が長時間にわたってゆっくりと放出され、前記因子の継続的で一定の生理的レベルを提供し、治癒および／または回復を最適化する。
【００１２】
本明細書に記載される新規のCFS組成物に加えて、細胞由来の組成物をプールすることを含む前記の新規CFS組成物（すなわち、プールされたECSおよびプールされたACCS組成物）およびSR-CFS組成物の製造方法、ならびに、それらの治療上の用途を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１３】
プールされた細胞由来の組成物は、プールされていない組成物と比較して、治療効果に必要な生理的に関連する細胞性因子のレベルにおけるばらつきの減少を含む、いくつかの重要な性質および特徴を有する。細胞性因子は、体内で見出される生理的レベルと同等のレベルで存在するので、疾病および／または損傷の治療および／または治癒に関与する生化学的および生物学的過程を支援、開始、置換または加速するための介入、あるいは前記過程に影響を与えるための介入が要求される治療的適用における使用に最適である。本明細書に記載される、ばらつきを減少させるために細胞由来の組成物をプールする新規の方法は、分泌される因子のレベルを、すべてのプールにおいてそれらの完全な治療能力が達成され得るように最適化する効果を有する。このようなプールされた組成物の治療的価値に加えて、プールされていない組成物間のばらつきを減少させるためにサンプルをプールする方法は、プールされていない組成物の製品規格を満たさないことを理由とした排除を最小限にすることによって生産収率を増大させ、その結果として、製造コストを減少させ、収入を増大させるという著しい商業的利点を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明の第一の態様は、生理的濃度の、a) VEGF、TGFβ2、アンギオゲニンおよびPDGFより選択される少なくとも1種の因子；ならびにb)少なくとも1種のMMP阻害剤を含む胚体外細胞由来の細胞性サイトカイン溶液組成物である。別の実施形態において、態様1の組成物は、生理的濃度の、a) VEGF、TGFβ2、アンギオゲニンおよびPDGFより選択される少なくとも2種の因子； ならびにb)少なくとも1種のMMP阻害剤を含む。特定の実施形態において、MMP阻害剤は、TIMP-1およびTIMP-2より選択される。さらに別の実施形態において、態様1の組成物は、生理的濃度のVEGF、TGFβ2、アンギオゲニン、PDGFおよびTIMP-1を含む。さらに別の実施形態において、態様1の組成物は、生理的濃度のVEGF、TGFβ2、アンギオゲニン、PDGFおよびTIMP-2を含む。特定の実施形態において、態様1の組成物は、生理的濃度のVEGF、TGFβ2、アンギオゲニン、PDGF、TIMP-1およびTIMP-2を含む。
【００１５】
本発明の態様2は、胚体外細胞由来の細胞性サイトカイン溶液が、羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液であるものである。態様2の特定の実施形態において、羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液は、生理的濃度のVEGF、TGFβ2、アンギオゲニン、PDGF、TIMP-1およびTIMP-2を含む。
【００１６】
本発明の態様3は、態様1の胚体外細胞由来の細胞性サイトカイン溶液または態様2の羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液を含む持続放出組成物である。
【００１７】
本発明の態様4は、a)胎盤の羊膜から羊膜上皮細胞を単離し、b)羊膜上皮細胞からAMP細胞を選択し、c) AMP細胞をコンフルエントに達するまで培養し、d)培地を交換し、e)該細胞を該培地中で培養し、f)工程e)の培地を収集して羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液を得ることを含む、羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液を製造する方法である。態様4の特定の実施形態において、工程f)を複数回繰り返して、それぞれの工程f)において得られる羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液を合わせて、プールされた羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液を製造する。
【００１８】
本発明の態様5は、態様4の方法により製造される羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液である。一実施形態において、態様5の羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液は、溶液が、VEGF、TGFβ2、アンギオゲニン、PDGF、TIMP-1および／またはTIMP-2の因子を生理的濃度で含むものである。本発明の組成物の特定の実施形態において、生理的濃度は、VEGFでは〜5.0〜16ng/mLであり、アンギオゲニンでは〜3.5〜4.5 ng/mLであり、PDGFでは〜100〜165pg/mLであり、TGFβ2では〜2.5〜2.7ng/mLであり、TIMP-1では〜0.68μg/mLであり、TIMP-2では〜1.04μg/mLである。
【００１９】
本発明の態様6は、生理的濃度のa) VEGF、TGFβ2、アンギオゲニンおよびPDGFより選択される1種以上の因子；b)少なくともMMP阻害剤； ならびにc)担体から本質的になる治療成分を含み、生理的濃度が、VEGFでは〜5.0〜16ng/mLであり、アンギオゲニンでは〜3.5〜4.5 ng/mLであり、PDGFでは〜100〜165pg/mLであり、TGFβ2では〜2.5〜2.7ng/mLであり、担体が生理食塩水、PBS、乳酸加リンゲル液または細胞培養培地である、生理的サイトカイン溶液組成物である。態様6の一実施形態において、MMP阻害剤はTIMP-1および／またはTIMP-2であり、生理的濃度は、TIMP-1では〜0.68μg/mLであり、TIMP-2では〜1.04μg/mLである。態様6の別の実施形態は、生理的濃度のa) VEGF、TGFβ2、アンギオゲニンおよびPDGF；b) TIMP-1および／またはTIMP-2; ならびにc)担体から本質的になる治療成分を含み、生理的濃度が、VEGFでは〜5.0〜16ng/mLであり、アンギオゲニンでは〜3.5〜4.5 ng/mLであり、PDGFでは〜100〜165pg/mLであり、TGFβ2では〜2.5〜2.7ng/mLであり、TIMP-1では〜0.68μg/mLであり、TIMP-2では〜1.04μg/mLであり、担体が生理食塩水、PBS、乳酸加リンゲル液または細胞培養培地である。
【００２０】
本発明の態様7は、組成物A：VEGFおよびTIMP-1；組成物B：VEGF、アンギオゲニンおよびTIMP-1；組成物C：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BBおよびTIMP-1；組成物D：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-1；組成物E：VEGFおよびTIMP-2；組成物F：VEGF、アンギオゲニンおよびTIMP-2；組成物G：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BBおよびTIMP-2；組成物H：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-2；組成物I：VEGF、TIMP-1およびTIMP-2；組成物J：VEGF、アンギオゲニン、TIMP-1およびTIMP-2；組成物K：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BB、TIMP-1およびTIMP-2；組成物L：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1およびTIMP-2；組成物M：アンギオゲニンおよびTIMP-1；組成物N：アンギオゲニン、PDGF-BBおよびTIMP-1；組成物O：アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-1；組成物P：アンギオゲニンおよびTIMP-2；組成物Q：アンギオゲニン、PDGF-BBおよびTIMP-2；組成物R：アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-2；組成物S：アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1およびTIMP-2；組成物T：PDGF-BBおよびTIMP-1；組成物U：PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-1；組成物V：PDGF-BBおよびTIMP-2；組成物W：PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-2；組成物X：PDGF-BB、TIMP-1およびTIMP-2；ならびに組成物Y：PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1およびTIMP-2からなる群より選択される組成物；ならびに担体から本質的になる治療成分を含み、VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1およびTIMP-2が、VEGFでは〜5〜16ng/mL、アンギオゲニンでは〜3.5〜4.5 ng/mL、PDGFでは〜100〜165pg/mL、TGFβ2では〜2.5〜2.7ng/mL、TIMP-1では〜0.68μg/mL、およびTIMP-2では〜1.04μg/mLの濃度であり、担体が生理食塩水、PBS、乳酸加リンゲル液または細胞培養培地である、生理的サイトカイン溶液組成物である。
【００２１】
本発明の態様8は、態様6および7の組成物を含む持続放出組成物である。
【００２２】
本発明の態様9は、胚体外細胞由来の細胞性サイトカイン溶液の持続放出を達成させることができる薬剤をさらに含み、前記薬剤がポリマー、混合ポリマー、ヒアルロン酸粒子、マイクロカプセル化材料またはナノ粒子より選択される、態様8の持続放出組成物である。
【００２３】
本発明の態様10は、細胞性因子含有溶液組成物を細胞性因子含有溶液組成物の持続放出を達成させることができる薬剤と組み合わせる工程を含む、持続放出組成物を製造する方法である。
【００２４】
本発明の態様11は、態様10の方法により製造される持続放出組成物である。本発明の態様12は、本発明の態様1〜9および11のいずれかの組成物を含む医薬組成物である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
本明細書において定義される「単離された」とは、その元の環境から取り出されて、「人の手により」その天然の状態から改変された材料を指す。
【００２６】
本明細書において使用される用語「タンパク質マーカー」は、細胞または場合により特定の細胞型の細胞膜に特徴的なタンパク質分子を意味する。
【００２７】
本明細書において使用される「強化された」は、混合物からの望まれない物質の除去または望まれる物質の選択および分離により、1種以上の物質の量を選択的に濃縮または増加させる（すなわち、集団のすべての細胞がマーカーを発現するわけではない異種細胞集団から特定の細胞マーカーを有する細胞を分離する）ことを意味する。
【００２８】
本明細書において使用される用語「実質的に精製された」は、特定のマーカーまたはマーカーの組合せに関して実質的に均質である細胞の集団を意味する。実質的に均質とは、特定のマーカーまたはマーカーの組合せに関して少なくとも90%、好ましくは95%均質であることを意味する。
【００２９】
本明細書において使用される用語「胎盤」は、早期胎盤および満期胎盤の両方を意味する。
【００３０】
本明細書において使用される用語「全能細胞」は以下の意味を有する。哺乳類において、全能細胞は、成体の体におけるいかなる細胞型、すなわち胚体外膜（例えば胎盤）のいかなる細胞型にもなる潜在能力を有する。全能細胞は、受精卵およびその卵割により作られる最初のおよそ4細胞である。
【００３１】
本明細書において使用される用語「多能性幹細胞」は以下の意味を有する。多能性幹細胞は、体におけるいかなる分化した細胞をも作る潜在能力を有する真の幹細胞であるが、栄養芽層に由来する胚体外膜の構成成分を作ることに寄与することはできない。羊膜は、栄養芽層からではなく、胚盤葉上層から発達する。今日までに3種類の多能性幹細胞が確認されている。すなわち、胚幹(ES)細胞（霊長類において全能でもあり得る）、胚生殖(EG)細胞、および胚性癌腫(EC)細胞である。EC細胞は、胎児の性腺において時々発生する腫瘍である奇形癌から単離することができる。他の二つとは異なり、それらは通常異数性である。
【００３２】
本明細書において使用される用語「多分化能性幹細胞」は、真の幹細胞であるが、限られた数の型にのみ分化することができるものである。例えば、骨髄は、血液のすべての細胞を生じさせるが、他の細胞型に分化することはできない多分化能性幹細胞を含む。
【００３３】
本明細書において使用される用語「胚体外組織」は、胚体の外側に位置し、胚の保護、栄養摂取、排出物除去等に関与する組織を意味する。胚体外組織は、誕生の時に廃棄される。胚体外組織には、羊膜、絨毛膜（栄養芽層および臍帯および血管を含む胚体外中胚葉）、卵黄嚢、尿膜および羊水（そこに含まれるすべての成分を含む）が含まれるが、これらに限定されない。胚体外組織およびそれに由来する細胞は、発達中の胚と同じ遺伝子型を有する。
【００３４】
本明細書において使用される用語「胚体外サイトカイン分泌細胞」または「ECS細胞」は、胚体外組織に由来し、特有の組合せの生理的に関連するサイトカインを生理的に関連する時間に細胞外空間または周囲の培地に分泌する特徴を有し、それらを作成する動物由来の産物およびヒトの臨床への使用に適したそれらに由来する細胞産物の存在下で培養されたものではない細胞の集団を意味する。一実施形態において、ECS細胞は、VEGF、アンギオゲニン、PDGFおよびTGFβ2より選択される少なくとも1種のサイトカインならびに少なくとも1種のMMP阻害剤を分泌する。特定の実施形態において、MMP阻害剤は、TIMP-1およびTIMP-2より選択される。別の実施形態において、ECS細胞は、VEGF、アンギオゲニン、PDGFおよびTGFβ2より選択される2種以上のサイトカインならびに2種以上のMMP阻害剤を分泌する。特定の実施形態において、MMP阻害剤は、TIMP-1およびTIMP-2より選択される。好ましい実施形態において、ECS細胞は、サイトカインであるVEGF、アンギオゲニン、PDGFおよびTGFβ2ならびにMMP阻害剤であるTIMP-1および／またはTIMP-2を分泌する。特有の組合せにおけるサイトカイン（1種または複数種）の生理的範囲は、以下の通りである。すなわち、VEGFでは〜5〜16ng/mLであり、アンギオゲニンでは〜3.5〜4.5 ng/mLであり、PDGFでは〜100〜165pg/mLであり、TGFβ2では〜2.5〜2.7ng/mLであり、TIMP-1では〜0.68μg/mLであり、TIMP-2では〜1.04μg/mLである。ECS細胞は、場合によりサイモシンβ4を発現し得る。ECS細胞は、本出願ならびに米国特許出願公開第2003/0235563号、米国特許出願公開第2004/0161419号、米国特許出願公開第2005/0124003号、米国仮出願番号第60/666,949号、第60/699,257号、第60/742,067号、第60/813,759号、米国出願番号第11/333,849号、米国出願番号第11/392,892号、PCTUS06/011392、米国特許出願公開第2006/0078993号、PCT/US00/40052、米国特許第7,045,148号、米国特許出願公開第2004/0048372号、および米国特許出願公開第2003/0032179号（これらの出願の内容全体を参照により本明細書に組み込む）に記載される細胞の集団および組成物より選択することができる。
【００３５】
本明細書において使用される用語「羊膜由来の多分化能性前駆細胞」または「AMP細胞」は、羊膜に由来する上皮細胞である特定のECS細胞の集団を意味する。ECS細胞についての上記の特徴に加えて、AMP細胞は以下の特徴を有する。AMP細胞は、それらを作成する動物由来の産物およびヒトの臨床への使用に適したそれらに由来する細胞産物の存在下で培養されたものではない。それらは支持細胞層なしで増殖し、タンパク質テロメラーゼを発現せず、腫瘍形成性でない。AMP細胞は、造血幹細胞マーカーCD34タンパク質を発現しない。この集団においてCD34陽性細胞が存在しないことは、単離物が臍帯血または胎児線維芽細胞などの造血幹細胞により汚染されていないことを示す。実質的に100%の細胞が低分子量サイトケラチンに対する抗体と反応し、それによりそれらの上皮としての性質を証明している。単離されたばかりのAMP細胞は、幹／前駆細胞マーカーのc-kit (CD117)およびThy-1 (CD90)に対する抗体と反応しない。満期または早期胎盤から細胞を得るために使用されるいくつかの方法が当業者に公知である（例えば、米国特許出願公開第2004/0110287号; Ankerら, 2005年, Stem Cells 22:1338-1345; Ramkumarら, 1995年, Am. J. Ob. Gyn. 172:493-500を参照されたい）。しかしながら、本明細書において使用する方法は改善された組成物および細胞の集団を提供する。AMP細胞は、以前は「羊膜由来細胞」と記載された（米国仮出願番号第60/666,949号、第60/699,257号、第60/742,067号、米国仮出願番号第60/813,759号、米国出願番号第11/333,849号、米国出願番号第11/392,892号、およびPCTUS06/011392を参照されたい。これらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み込む）。
【００３６】
本明細書において記載される特定の組成物、成長条件、培地等を指す場合の用語「動物を含まない」は、組み換えにより産生されるヒトタンパク質などの臨床グレードのヒト材料以外の、動物由来の血清などの動物由来の材料を、特定の組成物の調製、増殖、培養、拡張、保存もしくは製剤または方法に使用しないことを意味する。
【００３７】
本明細書において特定の組成物、成長条件、培地等を指す場合の用語「血清を含まない」は、動物由来の（すなわち、ヒト以外の）血清を、特定の組成物の調製、増殖、培養、拡張、保存もしくは製剤または方法に使用しないことを意味する。
【００３８】
細胞組成物に関して、用語「拡張した」は、細胞集団が、以前の方法を用いて得られるよりも有意に高い濃度であることを意味する。例えば、AMP細胞の拡張した組成物における羊膜組織1グラムあたりの細胞のレベルは、5代継代の後に、初代培養における細胞数よりも、少なくとも50〜150倍高い。それに対して、以前の方法を用いたこのような細胞においては約20倍の増加である。別の例において、AMP細胞の拡張した組成物における羊膜組織1グラムあたりの細胞レベルは、3代継代の後に、初代培養における細胞数よりも少なくとも30〜100倍高い。したがって、「拡張した」集団は、以前の方法よりも、羊膜組織1グラムあたりの細胞数において少なくとも2〜10倍改善されている。用語「拡張した」は、人が細胞の数の上昇に介入した状況のみを含むものとする。
【００３９】
本明細書において使用される用語「継代」は、組織培養容器中のコンフルエントに達したまたはコンフルエントに近い培養において増殖する細胞を容器から取り出し、新しい培地により希釈し（すなわち、1:5に希釈し）、新しい組織培養容器に入れて、続けて増殖および生存させる細胞培養技術を意味する。例えば、羊膜から単離した細胞は初代細胞と呼ばれる。このような細胞を、本明細書に記載される増殖培地中で増殖させることにより培地中で拡張させる。このような初代細胞を継代培養した場合、それぞれの継代培養の回を継代と呼ぶ。本明細書において使用される「初代培養」は、新しく単離された細胞集団を意味する。
【００４０】
本明細書において使用される「馴化培地」は、特定の細胞または細胞の集団を培養した後に、それらを取り出した培地である。細胞を培地中で培養する場合、それらは他の細胞に対する支援を提供するかまたはそれらの挙動に影響を与えることができる細胞性因子を分泌し得る。このような因子には、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス(ECM)、タンパク質、小胞、抗体、ケモカイン、受容体、阻害剤および顆粒が含まれるが、それらに限定されない。細胞性因子を含有する培地は馴化培地である。馴化培地を調製する方法の例は、米国特許第6,372,494号（その全体を参照により本明細書に組み込む）に記載されている。本明細書において使用する場合、馴化培地は、馴化培地またはECS細胞（AMP細胞を含む）から回収および／または精製される、タンパク質などの成分をも指す。
【００４１】
本明細書において使用される用語「細胞性因子含有溶液」または「CFS」組成物は、生理的濃度のVEGF、アンギオゲニン、PDGFおよびTGFβ2より選択される1種以上の因子ならびに少なくとも1種のMMP阻害剤を有する組成物を意味する。好適なMMP阻害剤の例には、TIMP-1およびTIMP-2が含まれるが、これらに限定されない。CFS組成物には、ECS細胞に由来する馴化培地、羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液組成物（下記の定義を参照されたい）、生理的サイトカイン溶液組成物（下記の定義を参照されたい）、およびこのようなCFS組成物の持続放出製剤が含まれる。
【００４２】
本明細書において使用される用語「羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液」または「ACCS」は、AMP細胞または拡張したAMP細胞に由来する馴化培地を意味する。羊膜由来の細胞性サイトカイン溶液またはACCSは、以前は「羊膜由来のサイトカイン懸濁液」と呼ばれた。
【００４３】
本明細書において使用される用語「生理的サイトカイン溶液」または「PCS」組成物は、細胞由来ではなく、生理的濃度のVEGF、アンギオゲニン、PDGFおよびTGFβ2より選択される1種以上の因子ならびに少なくとも1種のMMP阻害剤を有する組成物を意味する。好適なMMP阻害剤の例には、TIMP-1およびTIMP-2が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書において使用される用語「懸濁液」は、分散した成分、すなわちサイトカインを含有する液体を意味する。分散した成分は、完全に可溶化されていても、部分的に可溶化されていても、懸濁していても、あるいは液体中に分散していてもよい。好適な液体には、水、塩および／または糖溶液などの浸透圧溶液、細胞培養培地、ならびに他の水性または非水性溶液が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書において使用される用語「ライセート」は、細胞、例えばAMP細胞を溶解し、場合により細胞残屑（例えば、細胞膜）を除去した時に得られる組成物を指す。これは、機械的手段により、凍結および解凍により、超音波処理により、EDTAなどの界面活性剤の使用により、または例えばヒアルロニダーゼ、ディスパーゼ、プロテアーゼ、およびヌクレアーゼを用いる酵素的消化により達成し得る。
【００４６】
本明細書において使用される用語「生理的」または「生理的レベル」は、生物系において物質が見出され、生化学的および／または生物学的プロセスの適正な機能に関連するレベルを意味する。
【００４７】
本明細書において使用される用語「プールされた」は、プールされていない組成物と比較してより一定なまたは一致した特性を有する新しい組成物を作り出すために混合された複数の組成物を意味する。例えば、プールされたACCSは、プールされていないACCSと比較してより一定なまたは一致した特性を有する。プールされた組成物の例には、「SPプール」（2つ以上のACCS収集物／1つの胎盤）、「MP1プール」（1つのACCS収集物／胎盤、複数の胎盤）、および「MP2プール」（2つ以上のACCS収集物／胎盤、複数の胎盤）が含まれる。
【００４８】
本明細書において使用される用語「基板」は、表面上の規定のコーティングであって、細胞がそこに接着するか、その上で増殖するか、および／またはその上を移動するものを意味する。本明細書において使用される用語「マトリックス」は、細胞がその中でまたはその上で増殖する、その成分が明らかであるかまたは明らかでない物質を意味する。マトリックスには、生物学的および非生物学的物質の両方が含まれる。本明細書において使用される用語「足場」は、細胞がその中でまたはその上で増殖する三次元(3D)構造（基板および／またはマトリックス）を意味する。これは生物成分、合成成分またはその両方の組合せにより構成されてよい。さらに、これは細胞により天然に構築されても、人工的に構築されてもよい。さらに、足場は、適切な条件下で生物活性を有する成分を含有してもよい。
【００４９】
本明細書において使用される用語「細胞産物」（単数または複数）は、細胞により作られ、かつ細胞から分泌されるすべての物質を指し、タンパク質因子（すなわち、成長因子、分化因子、移植因子、サイトカイン、モルフォゲン、プロテアーゼ（すなわち、内因性細胞剥離を促進させるため、プロテアーゼ阻害剤）、細胞外マトリックス成分（すなわち、フィブロネクチン等）を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
用語「治療上有効な量」は、所望の生理的効果を達成させる（すなわち、創傷治癒を促進させる）のに必要な治療薬の量を意味する。
【００５１】
本明細書において使用される用語「製薬上許容される」は、治療薬に加えて、製剤を構成する成分が、本発明により治療される患者への投与に適していることを意味する。
【００５２】
本明細書において使用される用語「治療成分」は、組成物を被験体に投与した場合に治療効果を発揮する組成物の成分を意味する。
【００５３】
本明細書において使用される用語「治療用タンパク質」は、成長因子、酵素、ホルモン、サイトカイン、サイトカインの阻害剤、血液凝固因子、ペプチド成長および分化因子を含むがこれらに限定されない、広い範囲の生物学的に活性なタンパク質を含む。
【００５４】
本明細書において使用される用語「組織」は、特定の機能の遂行において一体的にふるまう同じように特殊化した細胞の集合体を指す。
【００５５】
本明細書において使用される名詞は、1つ以上、少なくとも1つであることを意味する。
【００５６】
本明細書において使用される用語「補助の」は、合同で、一緒に、加えて、協力して等の意味である。
【００５７】
本明細書において使用される用語「共投与」は、2種以上の薬剤を同時にまたは順次投与することを含む。
【００５８】
本明細書において使用される用語「薬剤」は、活性薬剤または不活性薬剤を意味する。用語「活性薬剤」は、被験体に投与される場合に生理的効果を有することができる薬剤を意味する。活性薬剤の非限定的な例には、成長因子、サイトカイン、抗生物質、細胞、細胞からの馴化培地等が含まれる。用語「不活性薬剤」は投与される場合に生理的効果を有しない薬剤を意味する。このような薬剤は、「製薬上許容される賦形剤」とも呼ばれる。非限定的な例には、時間放出カプセル等が含まれる。
【００５９】
用語「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、当業者に公知であり、腸内および局所投与以外の、通常は注入による投与の方式を指し、静脈内、筋内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼腔内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内(intra-articulare)、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、大脳内および胸骨内注入または輸液を含むが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書において使用される用語「持続放出」、「長時間放出」、「時間放出」、「制御放出」、または「連続放出」は、ゆっくりと溶解し、長時間にわたって放出されるように製剤されている薬剤、典型的には治療薬または医薬品を意味する。
【００６１】
本明細書において使用される用語「生物浸食性」または「生物浸食」は、物質の破壊をもたらす物理的（すなわち、溶解）および化学的（すなわち、化学結合の開裂）プロセスの組合せを意味する。
【００６２】
本明細書において使用される用語「生物分解性」または「生物分解」は、生物学的薬剤（すなわち、酵素、微生物または細胞）が物質の破壊の原因であることを意味する。
【００６３】
本明細書において使用される用語「生体再吸収性(bioresporbable)」または「生体吸収性(bioabsorptable)」は、細胞の活性（すなわち、食作用）による破壊された産物の除去を意味する。
【００６４】
本明細書において使用される用語「ナノ粒子」は、同じ材料のより大きい粒子と比べて、新たなまたは向上した粒径依存特性を示す、直径100nm未満の粒子を意味する。
【００６５】
本明細書において使用される「治療」、「治療する」または「治療すること」は、哺乳類、特にヒトの疾病または状態のすべての治療を包含し、(a)疾病または状態にかかりやすい傾向があり得るが未だかかっているとは診断されていない被験体において、その疾病または状態が生じることを予防すること；(b)疾病または状態の阻害、すなわち、その進展を停止させること；(c)疾病または状態の緩和および／または改善、すなわち、疾病または状態の退行を起こすこと；または(d)疾病または状態の治癒、すなわち、その進展または進行を止めることを含む。本発明の方法により治療される被験体の集団には、望ましくない状態または疾病に冒された被験体、ならびにその状態または疾病の進展のリスクを有する被験体が含まれる。
【００６６】
本明細書において使用される「創傷」は、原因が何であれ、正常な生体構造（内部および／または外部生体構造）の何らかの崩壊であり、機械的（すなわち、挫傷、貫通）、熱的、化学的、電気的、放射線による、震とう性および切開性損傷などの外傷；外科手術および結果として起こる瘢痕ヘルニア、瘻孔等などの選択的損傷；急性創傷、慢性創傷、感染した創傷、および無菌の創傷、ならびに病状に伴う創傷（すなわち、糖尿病性神経障害により引き起こされる潰瘍または胃腸もしくは泌尿生殖器の潰瘍）を含むが、これらに限定されない。創傷は動的であり、治癒のプロセスは、創傷の時点に開始して、最初の傷縫合を経て安定な瘢痕への到達に至るまで進行する、統合され、相互に関係する一連の細胞プロセスが必要とされる連続した過程である。これらの細胞プロセスは、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、およびホルモンを含むがこれらに限定されない体液性物質により仲介または調節される。本発明によれば、「創傷治癒」とは、何らかの形の介入により、治癒がより速くなるように、かつ／または得られる治癒した領域の瘢痕がより小さくなるように、かつ／または傷ついた領域が無傷の組織のそれに近い組織強度を有するように、かつ／または傷ついた組織がある程度の機能的回復を得られるように、組織修復の天然の細胞プロセスおよび体液性物質を改善することを指す。
【００６７】
本明細書において使用される用語「創傷治癒のための標準的動物モデル」は、当技術分野で認められたすべての創傷治癒の動物モデルであって、そこにおいて、本発明の組成物が創傷治癒の促進により測定されるような有効性を示すものを指す。好適なモデルの非限定的な例は、Hayward PG, Robson MC: Animal models of wound contraction., Barbul Aら: Clinical and Experimental Approaches to Dermal and Epidermal Repair:  Normal and Chronic Wounds., John Wiley & Sons, New York, 1990年に記載; DelBecarroら: The use of specific thromboxane inhibitors to preserve the dermal microcirculation after burning., Surgery, 87: 137-141, 1980年; Robsonら: Increasing dermal perfusion after burning by decreasing thromboxane production., J Trauma, 20: 722-725, 1980年; Poloら: An in vivo model of human proliferative scar., J Surg Res, 74: 187-195, 1998年に記載されている。他の好適なモデルは当業者に公知である。
【００６８】
詳細な説明
本発明には、当業者に公知の従来の分子生物学、微生物学、および組み換えDNA技術を使用する。このような技術は文献に完全に説明されている。例えば、Sambrookら, 2001年, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"; Ausubel編, 1994年, "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III; Celis編, 1994年, "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III; Coligan編, 1994年, "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III; Gait編, 1984年, "Oligonucleotide Synthesis"; Hames & Higgins編, 1985年, "Nucleic Acid Hybridization"; Hames & Higgins編, 1984年, "Transcription And Translation"; Freshney編, 1986年, "Animal Cell Culture"; IRL Press, 1986年, "Immobilized Cells And Enzymes"; Perbal, 1984年, "A Practical Guide To Molecular Cloning"を参照されたい。
【００６９】
ある範囲の値が与えられる場合、その範囲の上限と下限の間に入る値（文脈により他に明らかに指示されない限り下限の単位の10分の1まで）、および記載された範囲の中の、記載されたかまたは間に入る他のすべての値が、本発明の範囲内に包含されると理解される。これらのより小さい範囲に独立して含まれ得る、そのより小さい範囲の上限および下限もまた、記載された範囲において特に除外された限界値に従うことを条件として、本発明の範囲内に包含される。記載された範囲が一方または両方の限界値を含む場合、その含まれる限界値の両方のうちの一方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００７０】
他に定義しない限り、本明細書において使用されるすべての技術および科学用語は本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同一または均等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することもできるが、ここでは好ましい方法および材料を記載する。
【００７１】
本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、単数形および「前記の」は、文脈により明確に他に指示されない限り、複数のものをも含むことに留意しなければならない。
【００７２】
細胞の入手および培養
ECS細胞- 細胞を胚体外組織から単離する種々の方法は、その後に本発明のECS細胞を製造するために使用することができるものであって、当技術分野の文献に記載されている（例えば、米国特許出願公開第2003/0235563号、米国特許出願公開第2004/0161419号、米国特許出願公開第2005/0124003号、米国仮出願番号第60/666,949号、第60/699,257号、第60/742,067号、第60/813,759号、米国出願番号第11/333,849号、米国出願番号第11/392,892号、PCTUS06/011392、米国特許出願公開第2006/0078993号、PCT/US00/40052、米国特許第7,045,148号、米国特許出願公開第2004/0048372号、および米国特許出願公開第2003/0032179号を参照されたい）。
【００７３】
ECS細胞の同定- 胚体外組織を単離した後、組織中のどの細胞がECS細胞（上記の定義を参照されたい）の特性を有するかを同定する必要がある。例えば、特有の組合せのサイトカインを細胞外空間または周囲の培地の中に分泌する細胞の能力について、該細胞をアッセイする。好適な細胞は、サイトカイン（1種または複数種）が、VEGFでは〜5.0〜16ng/mL、アンギオゲニンでは〜3.5〜4.5 ng/mL、PDGFでは〜100〜165pg/mL、TGFβ2では〜2.5〜2.7ng/mL、TIMP-1では〜0.68μg/mL、およびTIMP-2では〜1.04μg/mLの生理的範囲で存在するものである。好適な細胞は、場合によりサイモシンβ4を分泌し得る。
【００７４】
AMP細胞- 特定の実施形態において、AMP細胞組成物は、a)胎盤からの羊膜の回収、b)羊膜からの羊膜上皮細胞の解離、c)羊膜上皮細胞からのAMP細胞の単離、d)天然のまたは遺伝子組み換えにより作成されるヒトタンパク質を加えた基礎培地中でのAMP細胞の培養；および場合によりd)別の添加剤および／または成長因子を用いる細胞のさらなる増殖の工程を用いて調製される。詳細は、米国特許出願公開第2006-0222634号（これを参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【００７５】
AMP細胞は以下の通りに培養される。すなわち、AMP細胞を基礎培地中で培養する。このような培地には、Epilife (Cascade Biologicals製)、Opti-pro、VP-SFM、IMDM、Advanced DMEM、K/O DMEM、293 SFM II（すべてGibco；Invitrogen製）、HPGM、Pro 293S-CDM、Pro 293A-CDM、UltraMDCK、UltraCulture（すべてCambrex製）、Stemline IおよびStemline II（どちらもSigma-Aldrich製）、DMEM、DMEM/F-12、Ham’s F12、M199、および他の同等の基礎培地が含まれるが、これらに限定されない。このような培地は、場合により臨床グレードのヒトタンパク質を含有してもよく、ヒト臨床グレードタンパク質を追加してもよい。本明細書において使用される「ヒトタンパク質」は、天然に産生されるものまたは組み換え技術を用いて産生されるものである。ある特定の実施形態において、「ヒトタンパク質」はまた、ヒトタンパク質を含有する、ヒト血清または羊水などのヒトの体液またはその派生物もしくは調製物を含む意味である。
【００７６】
最も好ましい実施形態において、細胞は、異種汚染を防ぐために動物由来成分を含まない系を用いて培養される。この実施形態において、培地は、Stemline IまたはII、Opti-pro、IMDMまたはDMEMであり、場合により10%以下の濃度で加えられる臨床グレードのヒトアルブミンを追加する。好ましい実施形態において、培地は、動物成分を含まないのに加えて、血清を含まない。
【００７７】
場合により、他の因子を使用する。一実施形態において、0〜1μg/mLの濃度の上皮成長因子(EGF)を使用する。好ましい実施形態において、EGF濃度は約10ng/mLである。使用し得る別の成長因子には、TGFαまたはTGFβ(5ng/mL；0.1〜100ng/mLの範囲)、アクチビンA、コレラ毒素（好ましくは、約0.1μg/mLのレベル；0〜10μg/mLの範囲）、トランスフェリン（5μg/mL；0.1〜100μg/mLの範囲）、線維芽細胞成長因子（bFGF 40ng/mL（0〜200ng/mLの範囲）、aFGF、FGF-4、FGF-8（すべて0〜200ng/mLの範囲）、骨形態形成タンパク質（すなわち、BMP-4）または細胞増殖を増大させることが知られている他の成長因子が含まれるが、これらに限定されない。追加される因子はすべて臨床グレードである。
【００７８】
細胞因子含有溶液馴化培地の作成
ECS馴化培地の作成は、ECS細胞を用いることを除いて、ACCSについて以下に記載する通りに得られる。
【００７９】
ACCSの作成- 本発明のAMP細胞を、ACCSを作成するために使用することができる。一実施形態において、AMP細胞を本明細書に記載した通りに単離し、1×106細胞/mLを、5〜30mLの培地、好ましくは10〜25mLの培地、最も好ましくは約10mLの培地の入ったT75フラスコ中に接種する。細胞をコンフルエントに達するまで培養し、培地を交換して、一実施形態において、コンフルエンスの1日後にACCSを収集する。別の実施形態において、培地を交換して、コンフルエンスの2日後にACCSを収集する。別の実施形態において、培地を交換して、コンフルエンスの4日後にACCSを収集する。別の実施形態において、培地を交換して、コンフルエンスの5日後にACCSを収集する。好ましい実施形態において、培地を交換して、コンフルエンスの3日後にACCSを収集する。別の好ましい実施形態において、培地を交換して、コンフルエンスの3、4、5、6日後またはそれ以降の日後にACCSを収集する。細胞工場、フラスコ、中空糸、もしくは懸濁培養装置を含むがこれらに限定されない他の組織培養容器の使用、またはサブコンフルエントおよび／または活発に増殖している培養物からのACCSの収集などの、AMP細胞培養物からACCSを収集するための他の実施形態も、本発明の方法により意図されていることが当業者に理解されるであろう。ACCSを収集の後に凍結保存することも本発明により意図されている。ACCSを収集の後に凍結乾燥することも本発明により意図されている。ACCSを収集の後に持続放出用に製剤することも本発明により意図されている。臨床試験および商品化に十分な製品を製造するためにACCS生産を大規模化することも意図されている。凍結保存、凍結乾燥、および持続放出製剤の方法論は、当業者に公知である。
【００８０】
ACCSおよびプールされたACCSなどのCFS組成物を、使用の前に適切な希釈剤により希釈することも本発明により意図されている。適切な希釈剤には、生理食塩水、PBS、乳酸加リンゲル液、細胞培養培地、馴化細胞培養培地、水等が含まれるが、これらに限定されない。このような希釈は、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:100等であり得る。さらに、希釈の比率は、1:2よりも小さくてもよい（すなわち、1:1、1:0.5等）。要求される適切な希釈は目的とする用途に依存し、したがって当業者が経験的に決定する必要があるであろう。
【００８１】
ACCS、プールされたACCS、PCS等を含む本発明のCFS組成物は、VEGFでは〜5〜16ng/mL、アンギオゲニンでは〜3.5〜4.5 ng/mL、PDGFでは〜100〜165pg/mL、TGFβ2では〜2.5〜2.7ng/mL、TIMP-1では〜0.68μg/mL、およびTIMP-2では〜1.04μg/mLの生理的に関連する範囲の生理的に関連するサイトカインについてアッセイすることにより特徴づけられる。ACCSおよびプールされたACCSは、場合によりサイモシンβ4の存在についてアッセイされる。
【００８２】
生理的サイトカイン溶液(PCS)組成物の作成
細胞に由来しない形態のACCS（本明細書において生理的サイトカイン溶液（「PCS」と呼ぶ）組成物を、担体中に、生理的レベルのVEGF、アンギオゲニン、PDGF、TGFβ2の1種以上、ならびに1種以上のMMP阻害剤（すなわち、TIMP-1および／またはTIMP-2）を混合することにより作成する。場合により、PCSはサイモシンβ4を含有する。これらのサイトカインの生理的レベルは、ACCSにおいて見出されるものと同じである。好適な担体には、生理食塩水、PBS、乳酸加リンゲル液、細胞培養培地、馴化細胞培養培地、水等が含まれる。このような組成物は凍結保存、凍結乾燥、持続放出製剤、大規模化等に適している。ACCSにおいて見出されるよりも濃縮されたレベルの因子をPCSが含有するように、該PCSを製造し、その後に、それを使用の前に適切な希釈剤により希釈してもよいことが、本発明により意図されている。適切な希釈剤には、生理食塩水、PBS、乳酸加リンゲル液、細胞培養培地、馴化細胞培養培地、水等が含まれるが、これらに限定されない。このような希釈は、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:100等である得る。また、そのような希釈の比率は、1:2よりも小さくてもよい（すなわち、1:1、1:0.5等）。要求される適切な希釈は目的とする用途に依存し、したがって当業者が経験的に決定する必要があろう。
【００８３】
本発明の組成物は、その目的とする用途に応じて種々の方法により調製することができる。例えば、組成物は、本発明の薬剤、すなわち、ACCS、プールされたACCS、およびPCSを含む液体であり得る。液体組成物はゲルも含む。液体組成物は、水性であってよく、または軟膏、膏薬、クリーム等の形態であってよい。液体組成物を、噴霧またはエアロゾル適用に適した方法で製剤してもよい。
【００８４】
有用な水性懸濁液は、懸濁剤として1種以上のポリマーを含有し得る。有用なポリマーには、セルロース系ポリマーなどの水溶性ポリマーおよび架橋されたカルボキシル含有ポリマーなどの水不溶性ポリマーが含まれる。本発明の水性懸濁液または溶液／懸濁液は、好ましくは粘性または粘膜接着性であり、またはより好ましくは、粘性かつ粘膜接着性の両方の性質を有する。
【００８５】
持続放出組成物
ACCS、プールされたACCSおよびPCSを含むがこれらに限定されないCFS組成物を、持続放出型のCFS組成物（本明細書において、「SR-CFS」と呼ぶ）として製剤してもよい。ACCS、プールされたACCSまたはPCSなどのタンパク質ベースの治療薬を含む治療薬の持続放出組成物を作る方法論は当業者に公知である。
【００８６】
SR-ACCSおよびSR-PCSを含むがこれらに限定されないSR-CFSは、本明細書に記載される方法のいずれを用いて製造してもよい。例えば、多小胞リポソーム製剤技術はタンパク質およびペプチド治療薬の持続放出に有用である。Qui, J.ら(ACTA Pharmacol Sin, 2005年, 26(11):1395-401)は、持続放出インターフェロンα-2bの製剤にこの方法を用いることについて記載している。Vyas, S.Pら(Drug Dev Ind Pharm, 2006年, 32(6):699-707)は、多小胞リポソーム中にペグ化インターフェロンαをカプセル化することを記載している。ACCS（プールされたACCSを含む）およびPCSは、多小胞リポソーム持続放出製剤への使用に好適である。
【００８７】
ナノ粒子技術もSR-CFSを作るのに有用である。例えば、Packhaeuser, C.B.ら(J Control Release, 2007年, 123(2):131-40)は、インスリンを封入したジアルキルアミノアルキル-アミン-ポリ(ビニルアルコール)-g-ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)ナノ粒子に基づく生物分解性非経口デポーシステムについて記載しており、ナノ粒子デポー製剤は生物活性巨大分子（すなわち、タンパク質）の制御放出装置の設計のための好適な候補であると結論づけている。Dailey, L.A.ら(Pharm Res 2003年, 20(12):2011-20)は、分枝鎖ポリマーDEAPA-PVAL-g-PLGAに基づくエアロゾル治療のための、界面活性剤を含まない生物分解性ナノ粒子について記載しており、DEAPA-PVAL-g-PLGAが多目的に使える薬物送達系であると結論づけている。ACCS（プールされたACCSを含む）およびPCSは、ナノ粒子ベースの持続放出製剤への使用に好適である。
【００８８】
ポリマーベースの持続放出製剤も非常に有用である。Chan, Y.P.ら(Expert Opin Drug Deliv, 2007年, 4(4):441-51)は、タンパク質およびペプチド治療薬の持続放出に使用されるMedusaシステム(Flamel Technologies)の総説を提供している。これまでに、Medusaシステムは、動物モデル（ラット、イヌ、サル）において、ならびに腎臓癌(IL-2)およびC型肝炎(IFN-α(2b))の患者における臨床試験において、IL-2およびIFN-アルファ(2b)の皮下注射に適用された。Chavanpatil, M.D.ら(Pharm Res, 2007年, 24(4):803-10)は、水溶性分子の持続性でかつ強化した細胞送達のための新規のプラットフォームとして界面活性剤-ポリマーナノ粒子を記載している。Takeuchi, H.ら(Adv Drug Deliv Res, 2001年, 47(1):39-54)は、リポソームおよびポリマー製ナノ粒子を含む、ペプチド薬送達のための粘膜接着性ナノ粒子系を記載している。Wong, H.L.ら(Pharm Res, 2006年, 23(7):1574-85)は、多薬剤耐性乳癌細胞に対するドキソルビシンの細胞毒性を増大させることが示された新規のポリマー-脂質混合系を記載している。ACCS（プールされたACCSを含む）およびPCSを含むがこれらに限定されないCFS組成物は、前記の持続放出製剤の方法論に使用するのに好適である。
【００８９】
さらに、当業者に公知の他の持続放出の方法論も、本明細書には具体的に記載しないものの、CFS組成物に使用するのに好適である。
【００９０】
ACCS、プールされたACCS、PCS、SR-ACCS（プールされたACCSを含む）およびSR-PCSを含むがこれらに限定されないCFS組成物の医薬組成物
本発明は、CFS組成物と製薬上許容される担体の医薬組成物を提供する。用語「製薬上許容される」は、連邦または州政府の監督官庁により認可されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に動物、より特定的にはヒトに使用できるものとして記載されていることを意味する。用語「担体」は、それと共に組成物が投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような医薬品担体は、水および油（ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等などの石油、動物、植物または合成に由来する油を含む）などの無菌の液体であり得る。好適な医薬品賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。組成物は、所望の場合には、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、持続放出製剤等の形態を取ることができる。好適な医薬品担体の例は、E. W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されており、さらにその他のものは当業者に公知である。
【００９１】
本発明の医薬組成物は、中性または塩の形態で製剤することができる。製薬上許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来する塩などの遊離のアミノ基と共に形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来する塩などの遊離のカルボキシル基と共に形成される塩が含まれる。
【００９２】
ACCS、プールされたACCS、PCS、SR-ACCS（プールされたACCSを含む）およびSR-PCSを含むがこれらに限定されないCFS組成物を含む治療キット
本発明はまた、包装材料およびその包装材料の中に入った本発明の医薬組成物を含む製品であって、そこにおいて、医薬組成物がCFS組成物を含む、前記製品を提供する。包装材料は、そこに含まれるCFS組成物を、例えば創傷治癒などの治療への適用に使用することができることを記載するラベルまたは挿入物を含む。
【００９３】
ACCS、プールされたACCS、PCS、SR-ACCS（プールされたACCSを含む）およびSR-PCSを含むがこれらに限定されないCFS組成物の製剤、用量および投与
CFS組成物を含む組成物は、被験体に種々の細胞または組織の機能を提供するために、例えば創傷治癒を促進させるために、投与し得る。本明細書において使用する「被験体」は、ヒトまたはヒト以外の動物のいずれかを意味する。
【００９４】
このような組成物は、場合により賦形剤および補助剤を含む1種以上の生理的に許容される担体を用いる通常の方法により、製剤し得る。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。組成物は、それらの治療用途について記載した説明書と共に包装してもよい。組成物は、1種以上の生理的に許容される担体に入れて受容者に投与してもよい。CFS組成物の担体には、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、生理的濃度の塩の混合物を含有する乳酸加リンゲル液、または細胞培養培地が含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
さらに、当業者は、特定の目的に適切なCFS組成物の用量を容易に決定することができる。好ましい用量は、適用する領域の平方センチメートルあたり約0.1〜1000μgの範囲である。他の好ましい用量の範囲は、1.0〜50.0μg/適用領域である。特に好ましい実施形態において、比較的少量のCFS組成物が治療上有用であることが見出された。このような治療上の有用性の一例は、ACCS（プールされたACCSを含む）による創傷治癒を促進させる能力である（詳細については、米国特許出願公開第2006/0222634号および米国特許出願公開第2007/1231297号を参照されたい。それぞれを参照により本明細書に組み込む）。投与されるべき用量数も、例えば治療される疾病、障害または傷害の重篤度および種類に基づいて経験的に決定する必要があることも当業者に認められるであろう。例えば、好ましい実施形態において、治療効果（すなわち、創傷治癒の促進）を得るのに1回の用量で十分である。別の好ましい実施形態では、治療効果を得るために、2、3、4、またはそれ以上の用量が意図される。
【００９６】
好ましい用量は、治療を必要とする患者において、創傷治癒の促進などの治療効果を引き起こす用量（治療上有効な量）であることが当業者に認められるであろう。当然、CFS組成物の適切な用量は、治療される傷害、障害または状態の重篤度および種類；患者の年齢、体重、性別、健康状態；患者に与えられている他の投薬および治療等を含むがこれらに限定されないいくつかの可変条件に基づいて、使用の時点で経験的に決定することが要求されるであろう。また、投与されるべき用量数（用法）も、例えば、治療される傷害、障害または状態の重篤度および種類に基づいて経験的に決定する必要があることも当業者に認められるであろう。さらに、投与の頻度も、治療される傷害、障害または状態の重篤度および種類に基づいて経験的に決定する必要があることが当業者に認められる。特定の実施形態において、1回の用量を、ある決められた日数の間、毎日投与する（すなわち、1日1回7日間等）。別の実施形態において、複数の用量を、1日の間に投与する（4時間おき等）。複数の日に渡る1日複数回の用量も本発明により意図されている。
【００９７】
本発明の別の実施形態において、少なくとも1種の別の薬剤をCFS組成物と組み合わせ得る。このような薬剤は、本発明のCFS組成物と相乗的に作用して、治療効果を増大する。このような薬剤には、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体、阻害剤、抗生物質、免疫抑制剤、ステロイド、抗菌剤、抗ウイルス剤または他の細胞型（すなわち、幹細胞または幹様細胞、例えば、AMP細胞）が含まれるが、これらに限定されない。不活性薬剤には、担体、希釈剤、安定剤、ゲル化剤、送達ビヒクル、ECM（天然および合成）、足場等が含まれる。CFS組成物を他の医薬活性物質と組み合わせて投与する場合、治療効果を得るために必要なCFS組成物の量ははるかに少なくなる。
【００９８】
CFS組成物は、好ましくは管、例えばカテーテルなどの送達装置を用いて、注入により被験体の標的の部位の中に投与することができる。好ましい実施形態において、管はさらに針、例えばシリンジを含み、それを通してCFS組成物を被験体の所望の位置に導入することができる。被験体へのCFS組成物の投与の、特定の非限定的な例には、皮下注入、筋内注入、静脈内注入、動脈内注入、心臓内注入、皮内注入、くも膜下腔内注入、硬膜外注入、腹腔内注入、または脳内注入による投与も含まれ得る。輸液も本発明の方法により意図される（すなわち、硬膜下、くも膜下腔内または脳内輸液）。投与が静脈内である場合、注入用液体懸濁液を調製し、持続点滴によりまたは急速静注として投与することができる。ある例において、輸液ポンプを用いてCFS組成物を投与することが適切であり得る。
【００９９】
CFS組成物の投与のタイミングは、治療される疾病、障害または傷害の種類および重篤度に依存するであろう。一実施形態において、CFS組成物は診断または傷害の後、できる限り早く投与される。別の実施形態において、CFS組成物は診断または傷害の後、2回以上投与される。特定の実施形態において、手術が必要な場合、CFS組成物を手術の際に投与する。さらに別の実施形態において、CFS組成物を手術の際および手術の後に投与する。このような手術後投与は、1回投与または多数回投与の形態であってよい。
【０１００】
CFS組成物は、さまざまな形態で、送達装置、例えばシリンジに挿入し得る。例えば、CFS組成物は、そのような送達装置に入れられる溶液の一部であり得る。本明細書において使用される用語「溶液」は、製薬上許容される担体または希釈剤を含む。製薬上許容される担体および希釈剤には、生理食塩水、緩衝水溶液、溶媒および／または分散媒体が含まれる。このような担体および希釈剤の使用は当業者に公知である。溶液は、好ましくは、無菌であり、容易にシリンジに入れられる程度に流動性である。好ましくは、溶液は製造および保存の条件下で安定であり、場合により、細菌および真菌などの微生物の汚染作用を防ぐために、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等を使用して保存され得る。本発明の溶液は、製薬上許容される担体または希釈剤、および必要に応じて、上に列挙した他の成分中にCFS組成物を混合することにより、調製することができる。
【０１０１】
CFS組成物は、全身投与（例えば、静脈内）、局所(locally)投与（例えば、手術中に目で見ながらの直接適用）または局所(topically)投与され得る。このような投与のために、組成物は、注入用液体懸濁液調製物中に存在するか、または注入可能な液体の形態であって損傷を受けた組織の部位で半固体になる生体適合性媒体中に存在する。制御可能な内視鏡的送達装置も使用することができる。
【０１０２】
CFS組成物を組み込むかまたは埋め込むことができる支持マトリックスには、受容者に適合し、かつ分解して受容者に有害でない生成物になるマトリックスが含まれる。
【０１０３】
天然および／または合成の生物分解性マトリックスは、このようなマトリックスの例である。天然の生物分解性マトリックスには、凝固血漿、例えば哺乳類に由来するもの、コラーゲン、フィブロネクチン、およびラミニンマトリックスが含まれる。好適な合成マトリックス材料は免疫による合併症を防ぐために生体適合性でなければならない。それはまた吸収性でなければならない。マトリックスはさまざまな形状に構成することが可能であるべきで、また、移植の際の崩壊を防ぐのに十分な強度を有するべきである。最近の研究により、ポリグリコール酸から作成される生物分解性ポリエステルポリマーがこれらの基準のすべてを満たすことが示されている(Vacantiら, J. Ped. Surg. 23:3-9 (1988); Cimaら, Biotechnol. Bioeng. 38:145 (1991); Vacantiら, Plast. Reconstr. Surg. 88:753-9 (1991))。他の合成の生物分解性支持マトリックスには、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの合成ポリマーが含まれる。合成ポリマーおよびこれらのマトリックスに組成物を組み込むかまたは埋め込む方法の別の例も当業者に公知である。例えば、米国特許第4,298,002号および第5,308,701号を参照されたい。
【０１０４】
生物分解性ポリマーマトリックスの利点の一つは、CFS組成物を支持マトリックスの中に直接組み込むことができ、in vivoで支持マトリックスが分解されるに従ってCFS組成物がゆっくりと放出される点である。CFS組成物に加えて、栄養素、成長因子、分化または脱分化（すなわち、分化した細胞から分化の特徴を失わせ、増殖およびより一般的な機能などの特徴を獲得させること）の誘導物質、分泌の産物、免疫調節物質、炎症の阻害剤、退行因子、リンパ管ネットワークまたは神経線維の内部成長を増大または可能にさせる生物活性化合物、ヒアルロン酸、および当業者に公知でありCollaborative Research、Sigma Chemical Co.などの供給者から有効量に関する説明書を付けて販売されている薬物、上皮成長因子(EGF)およびヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子(HB-EGF)などの成長因子を含む他の因子をマトリックスに組み込むか、またはマトリックスと共に提供することができる。同様に、接着ペプチドRGD (Arg-Gly-Asp)などのペプチドを含有するポリマーを合成して、マトリックスを形成させるために使用することができる（例えば、米国特許第4,988,621号、第4,792,525号、第5,965,997号、第4,879,237号および第4,789,734号を参照されたい）。
【０１０５】
別の例において、CFS組成物はゲルマトリックス（例えば、Upjohn Company製のGelfoam）に組み込んでもよい。種々のカプセル化技術が開発されている（例えば、Lacyら, Science 254:1782-84 (1991); Sullivanら, Science 252:718-712 (1991); 国際公開第91/10470号; 国際公開第91/10425号; 米国特許第5,837,234号; 米国特許第5,011,472号; 米国特許第4,892,538号）。病気のまたは損傷を受けた組織への直接の物理的接触を伴う切開手術中に、CFS組成物送達調製物の上記のすべての形態を利用することができる。これらの組成物は、望まれる治療効果、すなわち、促進された創傷治癒が達成されるまで、間隔を置いて繰り返し投与することができる。
【０１０６】
使用される三次元マトリックスは、組織の治癒および形成の過程を誘導する足場を提供する構造マトリックスである。足場は、繊維から、ゲル、織物、スポンジ様シート、および複雑な固体自由造形(SFFF)法を用いて作られている孔およびチャネルを有する複雑な3-D構造までの幅広い形態を取ることができる。本明細書において使用される用語「足場」は、三次元(3D)構造（基質および／またはマトリックス）を意味する。足場は、生物成分、合成成分またはその両方の組合せから構成される。さらに、足場は、細胞により天然に構築されても人工的に構築されてもよい。それに加えて、足場は、適切な条件下で生物活性を有する成分を含有し得る。足場の構造は、網状、スポンジ状を含むことができるか、またはヒドロゲルから形成することができる。
【０１０７】
三次元マトリックスを形成する足場作りの設計および構築は最も重要である。マトリックスは、血管内部成長のために、柔軟で、毒性がなく、注入可能な多孔性鋳型とすべきである。細孔は、血管内部成長を可能にするべきである。これらは一般におよそ100〜300ミクロンの範囲の相互に連結した細孔であり、すなわち、100〜300ミクロンの間質空隙(interstitial spacing)を有するが、より大きい開口を使用することもできる。マトリックスは、栄養、気体および成長因子の十分な拡散を可能にするために、表面積を最大にするような形状とすべきである。現時点では、圧縮に比較的抵抗性を示す多孔性構造が好ましいが、マトリックスの典型的には6面のうちの1面または2面が圧縮された場合でも、マトリックスは依然として組織の成長をもたらすのに有効であることが実証された。
【０１０８】
ポリマーマトリックスは、望まれる最終的な形態、構造および機能に依存して、柔軟にも硬質にも作り得る。欠損の修復の場合、例えば、柔軟な繊維性マットを欠損全体とほぼ同じになるよう切断した後、移植の間に必要に応じて外科的にできた欠損に適合させる。繊維性マトリックスを使用することの利点は、移植の時点で構造を再形成および再編成することが容易な点である。
【０１０９】
本発明はまた、上記の支持マトリックスのいずれかおよび羊膜由来の膜を組み合わせたCFS組成物の送達を提供する。このような膜は、本明細書に記載されるAMP細胞の回収のための方法の副産物として得ることができ、または例えば、ヒト羊膜由来の外科用移植片の作成、保存および使用方法について記載している米国特許第6,326,019号、宿主内の部位への治療用分子、タンパク質または代謝産物の持続送達のための再構成羊膜および組み換え羊膜について記載している米国特許出願公開第2003/0235580号、接着の防止、細菌の除去もしくは細菌活性の阻害が可能な、または治癒もしくは組織の成長を促進させるための組織表面を被覆する羊膜について記載している米国特許出願公開第2004/0181240号、架橋された羊膜の調製および火傷および創傷の治療方法におけるそれらの使用に関する米国特許第4,361,552号に記載されるような他の方法により得ることができる。本発明によれば、CFS組成物をこのような膜に組み込むことができる。
【０１１０】
ACCS、プールされたACCS、PCS、SR-ACCS（プールされたACCSを含む）およびSR-PCSを含むがこれらに限定されないCFS組成物の治療への使用の例
創傷治癒- 本発明のCFS組成物は、切開損傷、圧迫損傷、熱傷、放射線による損傷、貫通傷、震とう性損傷、急性損傷、慢性損傷、感染による損傷、および無菌の損傷を含むがこれらに限定されない、多くの原因により引き起こされる創傷の創傷治癒を促進させるのに有効である。本発明は、CFS組成物が、特に局所投与、すなわち創傷部位の表面に投与される場合に、すべての創傷の種類に対して、創傷治癒過程を促進させることができるという発見に基づいている。CFS組成物を使用すると、機械的または熱的、急性または慢性、感染によるかまたは無菌の、すべての種類の創傷が、放置して自然に治癒させるかまたは現在利用可能な方法により治療した同様の創傷よりも迅速に治癒する。本発明の意味において治療薬の「治療上有効な量」は、患者を治療する医師または獣医により決定されるであろう。このような量は、当業者により容易に確定され、本発明に従って投与される場合に、創傷治癒を促進させることができるであろう。治療上有効な量に影響を与える要因には、使用される治療薬の特異的活性、創傷の種類（機械的または熱的、全層または部分層等）、創傷の大きさ、創傷の深さ（全層の場合）、感染の有無、損傷が与えられてから経過した時間、ならびに患者の年齢、身体状態、他の病状の存在、および栄養状態が含まれるであろう。さらに、患者が受けている可能性のある他の投薬は投与すべき治療薬の治療上有効な量の決定に影響を与えるであろう。
【実施例】
【０１１１】
下記の実施例は、本発明の組成物の製造法および使用法ならびに本発明の方法についての完全な開示および説明を当業者に提供するために記載するものであり、発明者らが自らの発明と見なす範囲を限定するためのものではない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを保証するため努力したが、いくらかの実験誤差および偏差が存在するであろう。他に指示しない限り、割合は重量に基づく割合であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【０１１２】
実施例１
AMP細胞組成物の調製
AMP細胞の回収- 解離剤PXXIII、およびトリプシンを用いて、出発材料の羊膜からAMP細胞を解離した。羊膜の平均重量の範囲は18〜27 gであった。羊膜gあたりの回収された細胞の数は、PXXIIIによる解離では約10〜15×106であり、トリプシンによる解離では5〜8×106であった。
【０１１３】
選択されたAMP細胞を得る方法：細胞を羊膜から単離した直後にプレートに植えた。〜2日間培養した後に、接着していない細胞を除去して、接着した細胞を維持した。このプラスチック組織培養容器への接着は、望まれるAMP細胞の集団を得るために使用される選択法である。接着性および非接着性AMP細胞は、類似の細胞表面マーカー発現プロファイルを有するように見えるが、接着性細胞はより大きい生存能力を有し、望まれる細胞の集団である。接着性AMP細胞を、〜120,000〜150,000細胞/cm2に達するまで培養した。この時点で、培養はコンフルエントであった。好適な細胞培養は、〜5〜14日の間にこの細胞数に達するであろう。この基準に達することは、AMP細胞の増殖能力の指標であり、この基準を達成しない細胞はこれ以上の分析および使用には選択しない。AMP細胞が〜120,000〜150,000細胞/cm2に達した後、それらを収集し、凍結保存した。この収集の時点をp0と呼ぶ。
【０１１４】
実施例２
ACCSの作成
本発明のAMP細胞を、ACCS（プールされたACCSを含む）を作成するために使用することができる。AMP細胞を上記の通りに単離して、〜1×106細胞/mLを、〜10mLの培地の入ったT75フラスコ中に接種した。細胞をコンフルエントに達するまで培養し、培地を交換して、ACCSをコンフルエントの3日後に収集した。細胞工場、フラスコ、中空糸、または懸濁培養装置等を含むがこれらに限定されない他の組織培養容器を用いることなどの、コンフルエントに達した培養物からACCSを収集するための他の実施形態も本発明の方法により意図されることが、当業者に認識されるであろう（上記の詳細な説明を参照されたい）。ACCSを収集後に凍結保存すること、凍結乾燥することまたは持続放出のために製剤することも本発明により意図される。ACCSを異なる時点で収集することもまた、本発明により意図される（詳細については詳細な説明を参照されたい）。
【０１１５】
実施例３
プールされたACCSの作成
ACCSは本質的に上記の通りにして得た。特定の実施形態において、ACCSを一つの胎盤に由来するAMP細胞培養物から複数回収集して、これらの複数のACCS収集物を一緒にプールした。このようなプールは「SPプール」と呼ばれる（2回以上のACCS収集／1つの胎盤）。別の実施形態において、AMP細胞培養物は数個の胎盤、すなわち、5〜10の胎盤に由来するものであった。それぞれの胎盤に由来するAMP細胞を培養し、それぞれの培養物から1回のACCS収集をおこない、次いでそれらをすべてプールした。これらのプールは「MP1プール」と呼ばれる（1回のACCS収集／胎盤、複数の胎盤）。さらに別の実施形態において、AMP細胞培養は数個の胎盤、すなわち、5〜10の胎盤に由来するものであった。それぞれの胎盤に由来するAMP細胞を培養し、それぞれのAMP細胞培養物から2回以上のACCS収集を実施した後、プールした。これらのプールは「MP2プール」と呼ばれる（2回以上のACCS収集／胎盤、複数の胎盤）。
【０１１６】
実施例４
ELISAを用いるプールされていないおよびプールされたACCSにおけるサイトカインの検出
当業者に公知の標準的なELISAを、10の異なる胎盤から得られたAMP細胞から得たACCSに対して実施した。それぞれのACCSサンプルを個々にアッセイすることに加えて、プールされたACCSサンプルも試験して、ELISAの結果におけるサンプル間のばらつきが減少するかどうかを決定した。ACCSは上記の通りにして得た。プールは以下の通りに作成した。プール1は胎盤1〜5に由来するACCSを含み、プール2は胎盤6〜10に由来するACCSを含み、プール3は胎盤1〜10に由来するACCSを含む。さらに、SP、MP1、MP2プールのELISAを実施した。
【０１１７】
実施例５
PCS組成物の作成
下記のPCS組成物を、指示したサイトカインまたは因子を担体中に生理的レベルで混合することにより製造する。
【０１１８】
組成物A：VEGFおよびTIMP-1
組成物B：VEGF、アンギオゲニンおよびTIMP-1
組成物C：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BBおよびTIMP-1
組成物D：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-1
組成物E：VEGFおよびTIMP-2
組成物F：VEGF、アンギオゲニンおよびTIMP-2
組成物G：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BBおよびTIMP-2
組成物H：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-2
組成物I：VEGF、TIMP-1およびTIMP-2
組成物J：VEGF、アンギオゲニン、TIMP-1およびTIMP-2
組成物K：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BB、TIMP-1およびTIMP-2
組成物L：VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1およびTIMP-2
組成物M：アンギオゲニンおよびTIMP-1
組成物N：アンギオゲニン、PDGF-BBおよびTIMP-1
組成物O：アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-1
組成物P：アンギオゲニンおよびTIMP-2
組成物Q：アンギオゲニン、PDGF-BBおよびTIMP-2
組成物R：アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-2
組成物S：アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1およびTIMP-2
組成物T：PDGF-BBおよびTIMP-1
組成物U：PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-1
組成物V：PDGF-BBおよびTIMP-2
組成物W：PDGF-BB、TGFβ2およびTIMP-2
組成物X：PDGF-BB、TIMP-1およびTIMP-2
組成物Y：PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1およびTIMP-2
組成物A〜Yは、場合によりサイモシンβ4を含有する。特定の実施形態においては、他のMMP阻害剤（すなわち、TIMP-3、TIMP-4または合成MMP阻害剤）が好適であり得ることが当業者に認められるであろう(J. Frederick Woessner, Jr., J. Clin. Invest. 108(6): 799-800 (2001); Brew, K.ら, Biochim Biophys Acta. 2000年3月7日, ;1477(1-2):267-83)。
【０１１９】
VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1およびTIMP-2は、以下の生理的レベル：VEGFでは〜5〜16ng/mL、アンギオゲニンでは〜3.5〜4.5 ng/mL、PDGFでは〜100〜165pg/mL、TGFβ2では〜2.5〜2.7ng/mL、TIMP-1では〜0.68μg/mL、およびTIMP-2では〜1.04μg/mLで加える。VEGFは、Invitrogenより、カタログ#PHG0144、PHG0145、PHG0146、PHG0141またはPHG0143で入手でき；アンギオゲニンは、R&D Systemsより、カタログ#265-AN-050または265-AN-250で入手でき；PDGF-BBは、Invitrogenより、カタログ#PHG0044、#PHG0045、#PHG0046、#PHG0041、#PHG0043で入手でき；TGFβ2は、Invitrogenよりカタログ#PHG9114で入手でき；TIMP-1は、R&D Systemsより、カタログ#970-TM-010で入手でき；TIMP-2は、R&D Systemsより、カタログ#971-TM-010で入手できる。VEGF、アンギオゲニン、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1およびTIMP-2は、生理食塩水、PBS、乳酸加リンゲル液、細胞培養培地、水または当業者に公知の他の好適な水溶液などの担体に加える。
【０１２０】
PCS組成物を、標準的な動物モデルにおいて、創傷治癒について試験して、活性を評価する（創傷治癒の標準的な動物モデルに関しては上記の定義を参照されたい）。
【０１２１】
実施例６
持続放出型のCFS組成物の作成
例えばSR-ACCS（プールされたACCSを含む）またはSR-PCSなどのSR-CFS組成物は、CFS組成物を本明細書に記載される持続放出製剤技術（詳細な説明を参照されたい）または他の当業者に公知の持続放出製剤技術のいずれかと組み合わせることにより製造される。
【０１２２】
実施例７
慢性創傷治癒の動物モデルにおけるACCSの効果
慢性創傷治癒に対するACCSの効果を研究するために、当技術分野において認められた慢性肉芽創（chronic granulating wound）の動物モデルを使用した(Hayward PG, Robson MC: Animal models of wound contraction.  Barbul Aら: Clinical and Experimental Approaches to Dermal and Epidermal Repair:  Normal and Chronic Wounds.  John Wiley & Sons, New York, 1990年に記載)。
【０１２３】
結果：ACCSは、組織の細菌のバイオバーデンを増殖させない点で有効であった。ACCSは、治療していない感染した対照群と比較して有意に速い、肉芽創の促進された治癒を可能にした。
【０１２４】
実施例８
慢性創傷治癒の動物モデルにおけるCFS組成物PCS、SR-ACCSおよびSR-PCSの使用
当技術分野において認められた慢性肉芽創の動物モデル(Hayward PG, Robson MC: Animal models of wound contraction.  Barbul Aら: Clinical and Experimental Approaches to Dermal and Epidermal Repair:  Normal and Chronic Wounds.  John Wiley & Sons, New York, 1990年に記載)を、本発明のCFS組成物、PCS、SR-ACCSまたはSR-PCSの慢性創傷治癒に対する効果を研究するために使用する。
【０１２５】
本発明は、その精神または本質的な特性を逸脱することなく、他の特定の形態で実施することができる。すべての均等な実施形態は本発明の範囲に含まれることが意図される。実際、当業者には、本明細書に示し、説明したものに加えて、本発明の種々の変更が、上記の説明より明白になるであろう。このような変更も特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０１２６】
明細書全体において、種々の刊行物を参照した。それぞれの刊行物全体を、参照により本明細書に組み込むことが意図される。
【国際調査報告】
2010536851.tif 000002
2010536851.tif 000003