(57)【要約】  アナライトを検出する方法であって、前記アナライトは、前記アナライトに関係付け可能であると共に光学的検出のために適切な１以上の標識で標識化されており、（ａ）第１の周波数を有する振動電圧を、標識化アナライトを横切るように印加し、同時に前記標識化アナライトに対して光学的検出法を行い前記１以上の標識からデータを得る工程と、（ｂ）第２の周波数を有する振動電圧を、標識化アナライトを横切るように印加し、同時に前記標識化アナライトに対して光学的検出法を行い前記１以上の標識からデータを得る工程と、（ｃ）工程（ａ）及び工程（ｂ）において得られたデータに基づいてアナライトを同定及び定量の少なくともいずれかを行う工程とを含むことを特徴とする方法を提供する。【選択図】図２
2010515910.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アナライトを検出する方法であって、
前記アナライトは、前記アナライトに関係付け可能である（ｒｅｌａｔａｂｌｅ）と共に光学的検出に適切な１以上の標識で標識化されており、
（ａ）第１の周波数を有する振動電圧を、標識化アナライトを横切るように印加し、同時に前記標識化アナライトに対して光学的検出法を行い前記１以上の標識からデータを得る工程と、
（ｂ）第２の周波数を有する振動電圧を、標識化アナライトを横切るように印加し、同時に前記標識化アナライトに対して光学的検出法を行い前記１以上の標識からデータを得る工程と、
（ｃ）工程（ａ）及び工程（ｂ）において得られたデータに基づいてアナライトの同定及び定量の少なくともいずれかを行う工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
異なるアナライトのそれぞれが、前記アナライトに関係付け可能な１以上の異なる標識で標識化されている、複数のアナライトを検出する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
振動電圧の周波数を第１の周波数から第２の周波数までの周波数の範囲に亘って変化させ、前記電圧の変化と同時に光学的検出を行い前記周波数の範囲に亘って１以上の標識からデータを得る請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
振動電圧が１００μＶから２．５Ｖの範囲の電圧である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
第１の周波数が１ｍＨｚ以上であり、第２の周波数が１ＭＨｚ以下である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）の前に、アナライトを１以上の標識で標識化し標識化アナライトを形成する工程を更に含む請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
データが、１以上の標識によって放射される又は吸収される光の強度及び周波数の少なくともいずれかに対して振動電圧周波数が及ぼす作用に関する情報を含む請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
標識が蛍光標識である請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
蛍光標識が、フルオレセイン及びその誘導体と、ローダミン及びその誘導体と、ランタニド錯体と、Ｃｙ３、Ｃｙ５、及びＡｔｔｏ  Ｌａｂｅｌを含むシアニン染料と、量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ）とからなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
光学的検出法が発光検出法、吸光検出法、光散乱検出法、スペクトルシフト検出法、表面プラズモン共鳴イメージング法、及び吸着染料由来の表面増強ラマン散乱法からなる群から選択される請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
光学的検出法が発光検出法であり、標識化アナライトに標識の励起が可能な光を照射する工程と、前記標識からの光放射の周波数及び強度の少なくともいずれかを検出する工程とを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
光がレーザー光である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
光が赤外光、可視光、及び紫外光からなる群から選択される請求項１１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
アナライトが細胞、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド断片、アミノ酸、並びにＤＮＡ又はＲＮＡ及びそれらのオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はヌクレオチドからなる群から選択される１以上の化合物を含む請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
アナライトに関連付け可能な１以上の標識が内在性の標識である請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学的方法と電気化学的方法を同時に使用してアナライトに関するデータを得る、アナライトの検出方法に関する。前記方法は、光学的方法単独又は電気化学的方法単独の場合より感度を向上させることができるため有利である。
【背景技術】
【０００２】
電気化学インピーダンス分光法の実施下において光放射が変調させられることが知られており、電気化学発光系を特徴づける研究において使用されている（例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００３】
変調した光電流を発生させ且つこれを分析するための光強度の変調、及び変調した光出力を発生させるための電場の変調が半導体及び太陽電池の分析において使用されている（例えば、非特許文献４；非特許文献５）。
【０００４】
近年、インピーダンスを変調させた光電流（Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｐｈｏｔｏｃｕｒｒｅｎｔｓ）は、ポリマーのイメージングにおいても使用されている（例えば、非特許文献６）。
【０００５】
現行の電気化学インピーダンス分析は、通常、広範囲の周波数に亘る電流‐電圧反応からインピーダンス反応を測定する。この電気化学反応は、特徴的周波数における特定の物理過程（例えば、拡散、吸着、電気化学反応など）を特徴としている。これらの過程は、インピーダンス分析によって同定することができる。
【０００６】
標識化せずに生体分子を検出するインピーダンス分光法を用いて、いくつかの研究が行われている（例えば、非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Itagaki,  Masayuki;  Kasugai,  Emi;  Kobari,  Nao;  Watanabe,  Kunihiro.  “Electrochemiluminescence  of  luminol  investigated  by  electrochemical  impedance  spectroscopy.”  Electrochemistry  (Tokyo,  Japan),  2001年,  69巻(２号）,  p.104-108.  CODEN:  EECTFA  ISSN:1344-3542.  CAN  134:154451  AN  2001:108323  CAPLUS.
【非特許文献２】Itagaki,  Masayuki;  Kobari,  Nao;  Watanabe,  Kunihiro.  “Electrochemiluminescence  impedance  of  perylene  in  acetonitrile.”  Journal  of  Electroanalytical  Chemistry,  2004年,  572巻(2号),  p.329-333.  CODEN:  JECHES  CAN  141:428860  AN  2004:809295  CAPLUS.
【非特許文献３】Itagaki,  Masayuki;  Kikuchi,  Takahiro;  Watanabe,  Kunihiro.  “Electrochemiluminescence  of  N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol  investigated  by  electrochemical impedance  spectroscopy.”  Analytical  Sciences  (1999),  15巻(8号),  p.755-760.  CODEN:  ANSCEN  ISSN:0910-6340.  CAN  131:206351  AN  1999:515415  CAPLUS
【非特許文献４】Oheda,  Hidetoshi(Electrotech.  Lab.,  Ibaraki,  Japan),  “Phase-shift  analysis  of  modulated  photocurrent:  Its  application  to  the  determination  of  the  energetic  distribution  of  gap  states.”.  Journal  of  Applied  Physics,  1981年,  52巻(11号),  p.6693-700.  CODEN:  JAPIAU  ISSN:  0021-8979.  英語で書かれた雑誌  CAN  95:230432  AN  1981:630432  CAPLUS.
【非特許文献５】Garuthara,  Rohana;  Tomkiewicz,  Micha;  Silberstein,  Robert  P.  “Electric  field  modulation  of  photoluminescence  in  cadmium  selenide  liquid-junction  solar  cells.”  Journal  of  Applied  Physics,  1983年,  54巻(11号),  p.6787-9.  CODEN:  JAPIAU  ISSN:0021-8979.  CAN  99:215717  AN  1983:615717  CAPLUS.
【非特許文献６】Krause,  Steffi;  Moritz,  Werner;  Talabani,  Habib;  Xu,  Ming;  Sabot,  Andrea;  Ensell,  Graham.  “Scanning  Photo-Induced  Impedance  Microscopy-Resolution  studies  and  polymer  characterization.”  Electrochimica  Acta  2006年,  51巻(8号-9号),  p.1423-1430.  CODEN:  ELCAAV  ISSN:0013-4686.  AN  2006:56265  CAPLUS.
【非特許文献７】E.  Katz  &  I.  Willner,  “Probing  biomolecular  interactions  at  conductive  and  semiconductive  surfaces  by  impedance  spectroscopy:  Routes  to  impedimetric  immunosensors,  DNA-sensors,  and  enzyme  biosensors”,  Electroanalysis  2003年,  15巻,  p.913.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、前記の技術を生体分子の検出に適用する場合には更なる改良が必要である。本発明の目的は、既知の方法に存する問題点を解決し、特に生体分子アナライト分析用の、感度及び／又は選択性が改善された検出方法を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明は、アナライトを検出する方法であって、前記アナライトは、前記アナライトに関係付け可能である（ｒｅｌａｔａｂｌｅ）と共に光学的検出に適切な１以上の標識で標識化されており、
（ａ）第１の周波数を有する振動電圧を、標識化アナライトを横切るように印加し、同時に前記標識化アナライトに対して光学的検出法を行い前記１以上の標識からデータを得る工程と、
（ｂ）第２の周波数を有する振動電圧を、標識化アナライトを横切るように印加し、同時に前記標識化アナライトに対して光学的検出法を行い前記１以上の標識からデータを得る工程と、
（ｃ）工程（ａ）及び工程（ｂ）において得られたデータに基づいてアナライトの同定及び定量の少なくともいずれかを行う工程とを含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１０】
本発明の文脈では、用語「振動（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ）」は、（これらに限定されるわけではないが）正弦波、鋸歯状波、方形波、及びパルス等を含むあらゆる電位波形を包含する。
【００１１】
上記のように、本発明の基礎となる知見は、電気化学的測定と光学的測定とを組み合わせた測定によって、感度若しくは特異性又はその両方を改善することにより、生体分子及び他の物質種などのアナライトの検出が、それぞれの技術を単独で使用した場合よりも有利になるというものである。蛍光（又は発光）検出系と電気化学的検出系とを組み合わせた場合には、電気化学的摂動における光放射の周波数の測定と、この光放射の同相成分及び異相成分の測定とを同時に行うことが有利である。これは、電気化学的摂動と蛍光出力とのカップリングの効果を周波数の関数として測定することを可能にし、これにより特定の組み合わせ系において、感度を向上させるために最適な周波数（カップリングした信号のみを分析することでバックグラウンドが低減される）及び特異性を向上させるために最適な周波数（特定の標的分子について最適な駆動周波数が存在し得る）を決定することができる。
【００１２】
本発明においては、典型的には、振動電圧の周波数を第１の周波数から第２の周波数までの周波数範囲を変化させ、この電圧変化と同時に光学的検出を行い前記周波数範囲に亘って１以上の標識からデータを得る。本発明のいくつかの実施形態では、系に振動電圧と同時に直流電圧も印加することができる。この方式は、アナライト（例えば生体分子）の置かれる酸化状態及び／又は場を制御して、その反応を最適化するのに使用することができる。
【００１３】
前記振動電圧は、光学的測定と組み合わせて有用なデータを提供すれば、特に限定されない。しかし、アナライトにかかる振動電圧の振幅は１００μＶと２．５Ｖの間であるのが好ましい。前記電圧範囲の上限は、分析が行われる場である水又はこれと同等の溶媒に使用溶媒が限定されることに基づき設定されるのに対して、下限は、電気化学検出回路の信号対雑音反応に基づき設定される。忘れてはならないのは、抵抗表面膜を横切って電圧を印加する場合には、前記上限を遥かに超える電圧を全体的に印加することが可能であり及び／又は望ましく、それによって電圧の大部分がこの膜を横切って印加され、結果としてアナライトに好ましい範囲内の電圧が印加される。アナライトに対する印加電圧は、より有用には１ｍＶから１Ｖの範囲であることが好ましい。前記上限とすることにより、不要な電気化学的酸化還元反応の発生を確実に防ぐのに役立つ可能性がある。更に好ましくは、前記電圧範囲は５ｍＶから０．１Ｖの範囲であり、特に電気化学反応の線形化により理論分析が単純化される（これは決定的要因ではないかもしれないが）前記振幅範囲の下端近傍が好ましい。
【００１４】
前記方法に悪影響を及ぼさない限り、振動電圧の周波数は特に限定されない。しかし、本発明の好ましい実施形態においては、第１の周波数から第２の周波数の範囲は１ｍＨｚから１ＭＨｚである。この範囲の周波数において、誘起効果、電解質イオン運動、分極、二重層帯電、アナライトの構造及びコンホメーションの変化、荷電アナライト運動、対イオン及び酸化還元イオンの運動、及び溶媒和の変化の全てが生じ、光学的標識の局所環境の変化を通して光学的信号出力の変化がもたらされる。更に好ましい実施形態においては、第１の周波数から第２の周波数の周波数範囲は１ｍＨｚから１００ｋＨｚであり、１ｍＨzから１０ｋＨｚがより好ましい。この周波数範囲の高周波数端では、電極２重層の帯電が通常生じ；中間の周波数では、電極の酸化還元反応、イオン及び溶媒の拡散、並びに比較的に小規模なアナライトの運動が生じ；低周波数範囲では、ポリマー及び大型アナライト種などの大型物質種の運動が生じる。
【００１５】
標識として働くことができるある種の部分（本発明の文脈においてはこのような部分を標識とみなす、即ち、これらは内在性標識である）をアナライトが含み、該アナライトの光学的分析が（望ましくは電気化学分析もが）可能となるならば、いくつかの態様において、本発明方法はアナライトを標識化することなしに実施することができる。この内在性標識は光学的標識であり、光学的測定に加えて電気化学測定を行う場合には電気化学標識である。また一方、好ましい実施形態においては、本発明の方法は、工程（ａ）の前に、アナライトを１以上の標識で標識化し標識化アナライトを形成する工程を更に含む。
【００１６】
本発明は、複数のアナライトを検出する方法であって、異なるアナライトそれぞれは、アナライトに関係付け可能であると共に光学的検出に適切な異なる１以上の標識で標識化されており、
（ａ）第１の周波数を有する振動電圧を、標識化アナライトを横切るように印加し、同時に前記標識化アナライトに対して光学的検出法を行い前記１以上の標識からデータを得る工程と、
（ｂ）第２の周波数を有する振動電圧を、標識化アナライトを横切るように印加し、同時に前記標識化アナライトに対して光学的検出法を行い前記１以上の標識からデータを得る工程と、
（ｃ）工程（ａ）及び工程（ｂ）において得られたデータに基づいて複数のアナライトを同定及び定量の少なくともいずれかを行う工程とを含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１７】
この方法においても、工程（ａ）の前に、複数のアナライトを１以上の標識で標識化し複数の標識化アナライトを形成する工程を更に含むことが好ましい。
【００１８】
前記標識は特に限定されない。しかし、前記標識は、それぞれ生体分子システムに共有結合可能な、フルオレセイン及びその誘導体と、ローダミン及びその誘導体と、ランタニド錯体と、Ｃｙ３、Ｃｙ５、及びＡｔｔｏ  Ｌａｂｅｌを含むシアニン染料と、量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ）とからなる群から選択される蛍光標識が好ましい。
【００１９】
本発明の方法の全てにおいて、得られたデータは、通常、振動電圧周波数の光学発光強度に対する作用と、１以上のアナライト（内在性標識）及び／又はアナライトに結合した標識（外来性標識）によって放射される又は吸収される光の発光寿命及び／又は周波数の変化に対する作用とに関する情報を含む。放射及び吸収の周波数の変化は、アナライト又は標識の化学的特性又は環境特性の変動、例えばプロトン化程度の変化（例えばｐＨの変化）、又は錯体形成の程度の変化（例えば錯形成剤の近接性及び／又は錯形成剤の濃度の変化）若しくは局所環境（例えば溶媒和）の変化によってもたらされ得る。発光寿命の変化は、アナライト又は標識を取り囲む環境の変化（例えば溶媒和の変化、局所組成の変化による局所誘電率の変化、及び分離状態の変化による隣接物質種へのエネルギー伝達の変化など）の結果として観測することができる。このような変化は、観測される発光強度も変化させる（観測される発光強度は発光寿命及び発光物質種の個数によって支配されるので）。従って本発明は、蛍光色素分子の環境の単純な変化が、前述したようなイオン運動及び溶媒和の変化などの非ファラデー過程によってもたらされるか、より複雑な作用によってもたらされるかに関わらず、電気化学的摂動によってもたらされる如何なる光学特性の変化にも拡大適用できる。
【００２０】
典型的には、光学的検出法は、発光検出法、吸光検出法、光散乱検出法、スペクトルシフト検出法、表面プラズモン共鳴イメージング法、及び吸着染料からの表面増強ラマン散乱法又は二重偏光干渉法からなる群から選択される。
【００２１】
光学的検出法は通常、発光検出法である。これは、例えば、標識を励起することができる光で標識化アナライトを照射する工程と前記標識からの光放射の周波数と強度を検出する工程を有する蛍光法を挙げることができる。使用する光は通常、レーザー光である。光の周波数は、典型的には赤外光、近赤外光、可視光、及び紫外光からなる群から選択される。しかし、蛍光法が唯一の方法ではなく、例えば電気化学発光法も用いることができる。
【００２２】
本発明の方法は、必要に応じて如何なるアナライトもアッセイすることができるが、生体分子であるアナライトを対象とすることが好ましい。好ましい実施形態では、アナライトは、細胞、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド断片、アミノ酸、炭水化物、脂質、合成化学物質、並びにＤＮＡ又はＲＮＡ及びそれらのオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はヌクレオチドからなる群から選択される１以上の化合物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
以下、図面を参照しながら本発明を更に詳細に説明するが、これはほんの１例に過ぎない：
【図１】荷電物質種を含む溶液を横切って正弦波振動電圧を印加している状況を示す。
【図２】第３の物質種によって、アナライトの発光部へエネルギーが伝達される化学発光システムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００２５】
本発明においては、電気化学摂動と光学的測定が同時に行われる。この技術の背景にある原理は以下の通りである。正弦波振動電圧が、荷電物質種を含有する溶液を横切って印加され（図１）電流を生じさせる。必要に応じて、この溶液を通る電流を測定してもよい。物質種は振動の周波数に応じて異なる挙動を示す。この挙動は、溶液の組成及び周囲状態（温度、圧力、及び物質種の局所環境）にも依存する。これは、これら要因が、溶液中の物質種の運動に影響するからである。高周波数及び／又は低運動性は物質種の単純振動をもたらし（図に示されるように）、これは事実、単純抵抗（コンダクタンス）のように見える。低周波数及び／又は高運動性は、物質種が元の平均的な位置から移動することを可能にし、電荷分極及びそれに伴う溶媒移動を引き起こし、通常ワールブルグ抵抗をもたらす。低周波数側の下限値ではバルク分極が生じることがあり、これにより電極で帯電２重層が形成される；これは単純キャパシタンスのように見える。更に、酸化還元活性物質種は電極に到達し、その表面で酸化還元反応に供され、電荷移動抵抗がもたらされる。
【００２６】
既知の電気化学法では、印加する周波数を変化させことと、電流の変化を測定することを含む。これらの変化は、溶液中の物質種のアイデンティティー（電荷、運動性、及び酸化還元活性）に依存するので、物質種及び物質種の局所環境において生じている各種過程に関する情報を提供する。明らかに、結合イベント（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｖｅｎｔ）、又は物質種の近傍の環境に摂動を起こさせるイベントは、全ての物質種の運動性、及び酸化還元活性物質種の電荷移動に大きな影響を与える。この方法は、生体分子における結合を検出するのに有効に使用できる。通常、周波数を漸減し特徴的抵抗（コンダクタンス）とキャパシタンスを測定する。
【００２７】
上述したように、本発明においては、電気化学的方法を光学的測定と組み合わせる。前記のようなシステムにおいては、標識からの発光の周波数は、通常一定であるが、発光の強度は、印加された電気化学的摂動の周波数に応じて変化し得る。これは、電気化学的方法が物質種を取り巻く局所環境の摂動を引き起こすからである。これが標識（又はそれ自体が標識でもある物質種（即ち標識が内在している））の極く近傍で生じている場合には、局所標識環境が変化し発光寿命延いては発光強度が影響される。低周波数側では、環境変化は、物質種の元の位置からより遠い距離に亘って引き起こされ、より多くの標識又は各物質種から遠く離れた位置にある標識にまで影響することができる。発光の強度及び／又は周波数を測定することができると共に、発光の強度及び／又は周波数に対する電圧振動の周波数の作用についても測定することができる。前記したように、印加される電圧の周波数に応じて変化するのは発光の発光寿命（延いては強度）であることが通常予想され、測定されるのはこの強度の変化である。しかし調査対象とする系及び物質種の性質によっては、周波数に応じて変化するものは発光の周波数にも、発光の周波数及び強度の両方にもなり得る。この関係は、概して、物質種の性質、及び物質種が標識の局所環境に誘発する摂動の作用に依存する。光の位相敏感検波も使用できる。即ち、光強度の変調を印加電圧の周波数の関数として測定する。
【００２８】
繰り返すが、本発明の典型的な系においては、特定のアナライト又は物質種（通常は、選択される電圧範囲において酸化還元に不活性である）に振動電圧を印加し、物質種からの発光の強度及び／又は周波数を測定することにより調べる。いくつかの実施形態では、物質種を通る電流を測定してもよいが、これは必須工程ではない。
【００２９】
当業者に明らかなように、本発明は、調査対象とする物質種に応じ様々な方式で適用できる。以下に、想定されるいくつかの重要な態様及び具体的な実施形態について記載する。
【００３０】
態様１‐蛍光物質種を電気化学的発光によって励起する
発光させるためには、蛍光物質種にエネルギーを与える必要がある。電気化学的発光においてこのエネルギーは、自発的な酸化還元反応又は化学反応に（しばしば光学的標識と共に）関与してエネルギーを提供する１以上の酸化還元性物質種を電気化学的に発生させることによって提供される。
【００３１】
従って、蛍光を発生させるのに十分な量の酸化還元エネルギーを、蛍光部分（光学的標識）に移動させる必要がある。蛍光部分が酸化還元物質種の生成場所から離れ過ぎている場合には、エネルギーの消失が起こり蛍光を発生できなくなることがある。
【００３２】
例えば、図２に示すように、還元状態にある第３の物質種（例えばＲｅｄ）をまず電極で励起し酸化物質種を生成し（例えばＯｘ（過酸化水素など））、次いでこれを蛍光部分（例えばルミノール）へと拡散させる。従って、電気化学的発光の効率（蛍光強度）は、電極で生成される酸化還元物質種の量と、蛍光部分で電気化学発光を誘発するためにこの物質種が拡散可能な距離とに相関する。これは、電極に印加される電圧の周波数及び振幅によって制御できる；電圧の振幅及び直流電位を調節することで、電極で発生する（そして除去される）第３の物質種の量を制御することができ、周波数を調節することで、発生した第３の物質種が電極から拡散できる距離を制御することができる。従って前記強度は、印加電圧の特性を変化させることによって制御することができる。
【００３３】
態様２‐蛍光物質種は光によって励起され、電気化学（例えば、２個以上の酸化還元状態を有するなど）によって影響される
この例は、情報量という観点からより興味深い例となり得ることを除けば、前記の典型的な系と全く同様の方式で行われる。第１の酸化状態における光強度及び／又は光周波数は、振動電圧に対し、第２の酸化還元状態及び／又は更なる酸化還元状態における対応する強度及び／又は周波数とは異なる反応を示す。従って、単一の酸化還元状態の場合よりも多くの情報が得られる。
【００３４】
態様３‐ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ
前記の典型的な系、即ち態様１及び２において使用することができる更なる実施形態は、例えば挿入色素を使用したハイブリダイゼーション反応に特異的な系である。
【００３５】
態様２に言及されているように、生体システムにおいてタグとして使用することができる一部の蛍光標識には酸化還元活性もあり、蛍光状態とより蛍光の弱い又は蛍光のない状態との間を切り替わることができる。このような性質を有さないものも、消光物質種によって低減又は除去される蛍光出力を有し得る。標準的な固定化手順によって標識化物質種（例えばオリゴヌクレオチド）を固定化している下部電極表面（又はその近傍に標識化物質種が固定化されている隣接する電極表面）に印加される電圧を変調することによって、標識からの蛍光出力が変調される（直接の酸化還元反応によって又は可溶性酸化還元メディエータ若しくは消光剤による反応を介して）。光出力のこの変化は、通常、発光の光強度を測定できる光発電装置などの適切な検出器を使用して測定される。印加された電圧摂動に対する光出力の位相敏感反応を測定することもできる。１つの有用な分析方法は、光発電電圧の印加電圧に対する比（これを蛍光インピーダンスということもある）を周波数の関数として分析すること（蛍光インピーダンス分光法）、及び電流の印加電圧に対する比を周波数の関数として分析すること（インピーダンス分光法という）によって光反応及び電流反応の両方を測定する工程を含む。印加電圧の周波数の関数として表される（同相及び異相の両方の）光出力変調及び電流出力変調の程度は、固定化オリゴヌクレオチドを介するメディエータ又は消光剤の拡散及び／又は移動の速度、反応速度（反応に利用可能な標識の量によって影響され得る）、及び電極表面から標識までの距離などの要因によって決定される。これらの要因のいずれか又は全てが、オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションに際して著しく変化するが、実際には非特異的結合を伴っている場合もある。しかし、これらの測定値（光変調、電流変調、及び周波数）の全てを組み合わせることによって、単独で又は組み合わせることで特異的結合の指標となり且つ非特異的結合とは区別される、測定された光インピーダンス及びインピーダンス分光法データにおける特徴的且つ固有の変化となり得る。
【実施例】
【００３６】
実施例１‐印加交流電圧を用いたフルオレセインの蛍光出力の変調
指の幅及び間隔が５μｍである５本の指を有する、互いにかみ合う金電極対を用意し、電極間のアガロースゲル薄膜中に交流電圧を印加できるようにする。
【００３７】
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）蛍光色素分子を、そのエタノール原溶液（５０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、及び１μｇ／ｍｌ）から１％アガロースゲル（ＴＥＡ緩衝液‐４０ｍＭトリス（商標）緩衝液、２ｍＭ  ＥＤＴＡナトリウム、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ７．８中にアガロースを１％の濃度で溶解）中に異なる濃度で混合する。ＦＩＴＣ／アガロース薄膜（電子レンジによる加熱で液状化する）の厚さを、セロハンテープ（Ｓｃｏｔｃｈ（登録商標）テープ）又はＧｅｎｅＦｒａｍｅ（商標）で貼り付けることによって調節し、周辺部の厚さを適宜４μｍ、８μｍ、又は５００μｍとなるように規定する。
【００３８】
室温まで冷却しゲルを形成する。これをカバーガラスで覆う。蛍光スペクトルは、ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−３（Ｈｏｒｉｂａ，Ｌｔｄ．）蛍光分光計を用いて、ピーク励起波長の４９５ｎｍで励起し、５０５ｎｍと５５０ｎｍの間の発光スペクトルを測定することにより測定する。
【００３９】
反射角から離して蛍光を集め、信号‐雑音比を最適化する。互いにかみ合う電極間で交流電圧をＡｕｔｏｌａｂ  ＰＧＳＴＡＴ  １２ポテンシオスタットを用いて印加する：周波数応答解析（ＦＲＡ）モジュール、０Ｖの直流電圧及び１０ｋＨｚ、１ｋＨｚ、１００Ｈｚ、１０Ｈｚ、及び１Ｈｚの交流周波数、並びに１０ｍＶ、１００ｍＶ、及び３５０ｍＶのＲＭＳ振幅を用いる。
【００４０】
蛍光強度の変動の程度は、印加した交流電圧の印加周波数及び振幅に依存する。これからフルオレセインの環境に関する情報を推定することができる。
【図１】
2010515910.tif 000003
【図２】
2010515910.tif 000004
【国際調査報告】
2010515910.tif 000005
2010515910.tif 000006