(57)【要約】  本発明は、冠動脈心疾患、特に安定または不安定狭心症、急性心筋梗塞、心筋梗塞、心不全、高血圧およびアテローム性動脈硬化症に起因する症状、血管および腎臓の障害、特に腎不全、炎症性障害、勃起障害の処置および／または予防、および、心臓性突然死の防止のための医薬を製造するための、ＰＤＥ２Ａ阻害剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心不全およびその根底にある心筋症、および、冠動脈心疾患、特に安定および不安定狭心症、急性心筋梗塞、心臓性突然死、高血圧、アテローム性動脈硬化症の後遺症、および、血管の障害、腎臓の障害および／または勃起不全の処置および／または予防に適するＰＤＥ２Ａ阻害剤を見出すためのアッセイ系における、ＰＤＥ２ＡポリペプチドまたはＰＤＥ２Ａポリペプチドをコードする核酸の使用。
【請求項２】
アッセイ系が無細胞である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＰＤＥ２Ａをコードする核酸を含む全細胞がアッセイ系で使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ＰＤＥ２Ａ活性を測定する、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
ｃＧＭＰまたはＧＭＰレベルを測定する、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ＰＤＥ２Ａの発現を測定する、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
心不全が、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣＭ）、心筋炎および／または肥大型心筋症（ＨＣＭ）からなる心筋症の群から選択される心筋症により誘導される心不全である、請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
心不全および冠動脈心疾患、特に安定および不安定狭心症、急性心筋梗塞、心臓性突然死、高血圧、アテローム性動脈硬化症の後遺症、および、血管の障害、腎臓の障害および／または勃起不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための、請求項１ないし請求項７に記載の方法のいずれかにより同定されたＰＤＥ２Ａ阻害剤の使用。
【請求項９】
拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣＭ）、心筋炎および／または肥大型心筋症（ＨＣＭ）からなる心筋症の群から選択される心筋症により誘導される心不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための、請求項１ないし請求項７に記載の方法のいずれかを利用して同定されたＰＤＥ２Ａ阻害剤の使用。
【請求項１０】
心不全および冠動脈心疾患、特に安定および不安定狭心症、急性心筋梗塞、心臓性突然死、高血圧、アテローム性動脈硬化症の後遺症、および、血管の障害、腎臓の障害および／または勃起不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための、ＰＤＥ２Ａ−特異的抗体、ＰＤＥ２Ａ−特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＰＤＥ２Ａ−特異的ｓｉＲＮＡの使用。
【請求項１１】
拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣＭ）、心筋炎および／または肥大型心筋症（ＨＣＭ）からなる心筋症の群から選択される心筋症により誘導される心不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための、ＰＤＥ２Ａ−特異的抗体、ＰＤＥ２Ａ−特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＰＤＥ２Ａ−特異的ｓｉＲＮＡの使用。
【請求項１２】
心不全および冠動脈心疾患、特に安定および不安定狭心症、急性心筋梗塞、心臓性突然死、高血圧、アテローム性動脈硬化症の後遺症、および、血管の障害、腎臓の障害および／または勃起不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための、ＰＤＥ２Ａ阻害剤の使用。
【請求項１３】
心不全が、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣＭ）、心筋炎および／または肥大型心筋症（ＨＣＭ）からなる心筋症の群から選択される心筋症により誘導される心不全である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
心不全および冠動脈心疾患、特に安定および不安定狭心症、急性心筋梗塞、心臓性突然死、高血圧、アテローム性動脈硬化症の後遺症、および、血管の障害、腎臓の障害および／または勃起不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための、一般式（Ｉ）
【化１】
2010506561.tif 000008
［式中、
Ｒ１は、フェニル、ナフチル、キノリニルまたはイソキノリニルであり、これらの各々は、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ、ハロゲン、シアノ、−ＮＨＣＯＲ８、−ＮＨＳＯ２Ｒ９、−ＳＯ２ＮＲ１０Ｒ１１、−ＳＯ２Ｒ１２および−ＮＲ１３Ｒ１４からなる群から選択される３個までの同一かまたは異なるラジカルにより置換されていてもよく
｛ここで、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１３およびＲ１４は、相互に独立して、水素または（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルであり、そして、
Ｒ９およびＲ１２は、相互に独立して（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルであるか、
または、
Ｒ１０およびＲ１１は、隣接する窒素原子と一体となって、アゼチジン−１−イル、ピロール−１−イル、ピペリド−１−イル、アゼピン−１−イル、４−メチルピペラジン−１−イルまたはモルホリン−１−イルラジカルを形成するか、
または、
Ｒ１３およびＲ１４は、隣接する窒素原子と一体となって、アゼチジン−１−イル、ピロール−１−イル、ピペリド−１−イル、アゼピン−１−イル、４−メチルピペラジン−１−イルまたはモルホリン−１−イルラジカルを形成する｝、
Ｒ２およびＲ３は、相互に独立して水素またはフッ素であり、
Ｒ４は、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルであり、
Ｒ５は、（Ｃ１−Ｃ３）−アルキルであり、
Ｒ６は、水素またはメチルであり、
Ｒ７は、フェニル、チオフェニル、フラニル（これらの各々は、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ、ハロゲンおよびシアノからなる群から選択される３個までの同一かまたは異なるラジカルにより置換されていてもよい）であるか、または、（Ｃ５−Ｃ８）−シクロアルキルであり、
Ｌは、カルボニルまたはヒドロキシメタンジイルであり、そして、
Ｍは、（Ｃ２−Ｃ５）−アルカンジイル、（Ｃ２−Ｃ５）−アルケンジイルまたは（Ｃ２−Ｃ５）−アルキンジイルである］
の化合物およびその生理的に耐容される塩の使用。
【請求項１５】
Ｒ１が、そのメタおよび／またはパラ位が（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシおよび−ＳＯ２ＮＲ１０Ｒ１１からなる群から選択される３個までの同一かまたは異なるラジカルにより置換されているフェニルであり、Ｒ１０およびＲ１１が請求項１４に記載の意味を有する請求項１４に記載の化合物の、心不全および冠動脈心疾患、特に安定および不安定狭心症、急性心筋梗塞、心臓性突然死、高血圧、アテローム性動脈硬化症の後遺症、および、血管の障害、腎臓の障害および／または勃起不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための使用。
【請求項１６】
Ｒ７がフェニルである請求項１４または請求項１５に記載の化合物の、心不全および冠動脈心疾患、特に安定および不安定狭心症、急性心筋梗塞、心臓性突然死、高血圧、アテローム性動脈硬化症の後遺症、および、血管の障害、腎臓の障害および／または勃起不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための使用。
【請求項１７】
式中、
Ｒ１が、そのメタおよび／またはパラ位が（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシおよび−ＳＯ２ＮＲ１０Ｒ１１からなる群から選択される３個までの同一かまたは異なるラジカルにより置換されているフェニルであるか、または、ナフチルまたはキノリニルであり
｛式中、Ｒ１０およびＲ１１は、相互に独立して水素または（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルである｝、
Ｒ２およびＲ３が水素であり、
Ｒ４がメチルまたはエチルであり、
Ｒ５がメチルであり、
Ｒ６が水素またはメチルであり、
Ｌがカルボニルまたはヒドロキシメタンジイルであり、そして、
Ｍが、直鎖（Ｃ２−Ｃ５）−アルカン−１,ω−ジイル、直鎖（Ｃ２−Ｃ５）−アルケン−１,ω−ジイルまたは直鎖（Ｃ２−Ｃ５）−アルキン−１,ω−ジイルである、
請求項１４に記載の化合物の、心不全および冠動脈心疾患、特に安定および不安定狭心症、急性心筋梗塞、心臓性突然死、高血圧、アテローム性動脈硬化症の後遺症、および、血管の障害、腎臓の障害および／または勃起不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための使用。
【請求項１８】
一般式（ＩＩ）
【化２】
2010506561.tif 000009
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、ＬおよびＭは、請求項１４に記載の意味を有する）
の化合物の、心不全および冠動脈心疾患、特に安定および不安定狭心症、急性心筋梗塞、心臓性突然死、高血圧、アテローム性動脈硬化症の後遺症、および、血管の障害、腎臓の障害および／または勃起不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための使用。
【請求項１９】
構造式：
【化３】
2010506561.tif 000010
を有する物質２−（３,４−ジメトキシベンジル）−７−［１−（１−ヒドロキシエチル）−４−フェニルブチル］−５−メチルイミダゾ［５,１−ｆ］［１,２,４］トリアジン−４（３Ｈ）−オンの、心不全および冠動脈心疾患、特に安定および不安定狭心症、急性心筋梗塞、心臓性突然死、高血圧、アテローム性動脈硬化症の後遺症、および、血管の障害、腎臓の障害および／または勃起不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための使用。
【請求項２０】
心不全が、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣＭ）、心筋炎および／または肥大型心筋症（ＨＣＭ）からなる心筋症の群から選択される心筋症により誘導される心不全である、請求項１４ないし請求項１９のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心障害、特に心不全およびその根底にある心筋症、例えば、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣＭ）、心筋炎および特に肥大型心筋症（ＨＣＭ）の処置および／または予防用の医薬を製造するための、ＰＤＥ２Ａ阻害剤の使用に関する。本発明は、さらに、ＰＤＥ２Ａ阻害剤を使用する、勃起機能障害、高血圧の処置および動脈硬化の予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
本態性高血圧は、脳、腎臓および血管のみならず、特に心臓に損傷を与える。降圧治療の導入以前には、本態性高血圧は心不全および心筋梗塞の主原因であった。現在でも、心不全発症および心筋梗塞罹患のリスクは、たとえ降圧治療を受けていても、正常圧の人より高血圧の人で高い。左室肥大は、本態性高血圧において心筋を慢性的な圧力の負荷に適応させるための原理的な構造的メカニズムである。心筋の肥大の程度は、血圧のレベルに伴って高まる。
【０００３】
本態性高血圧の初期段階では、収縮期の壁張力（左心室の後負荷）は、心室壁にかかる収縮期圧負荷の結果として高まる。発症する左室肥大は、心筋壁の厚さの増大の結果として、壁張力が再度正常化されることをもたらす。この求心性左室肥大の初期段階では、左心室は、高血圧性収縮期血圧にも拘わらず、心筋の単位重量当たり正常な心臓のエネルギー消費で、正常な心拍出量を送達することができる。この段階でさえ、左心室の拡張機能の障害がある。
【０００４】
左心室に対する慢性的な圧力負荷は、胎児期の増殖因子の異常な活性化を導き、それは、タンパク質の生合成および胎児期の筋肉の遺伝子産物を変化させる。アンジオテンシンＩＩ、ノルアドレナリンおよび他の増殖ホルモンは、心筋に対して増殖促進効果を有する。この効果は、収縮期圧の負荷とは関係なく、さらなる心筋肥大の進行の刺激をもたらす。増殖ホルモンの程度に応じて、ある状況では、血圧の上昇に対して不相応に大きい、肥大型心筋症と似た心筋肥大の発生が起こり得る。成人の心筋組織は細胞周期の遮断のために細胞分裂の能力が殆どまたは全くないという事実の結果として、分子レベルの結果は、病的な心筋の肥大反応である。心肥大は、慢性的な連続的負荷に適合するための生理的メカニズムではない。それは、心筋梗塞、心不全および心臓性突然死などの心臓の事象の独立したリスク因子である［１］。
【０００５】
従って、心肥大を防止する治療方法および有効成分は、上述の障害の症状の処置に適する。
【０００６】
ヒトＰＤＥ２ＡをコードするＤＮＡ配列を、配列表の配列番号１に示す。ヒトＰＤＥ２Ａのアミノ酸配列を、配列表の配列番号２に示す。
【０００７】
図１に示す通り、驚くべきことに、細胞の肥大モデルにおいて、肥大の誘導の際に、ＰＤＥ２Ａ−ｍＲＮＡの発現が高まることが観察された。この目的で、ラットの心筋細胞株Ｈ９ｃ２（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１４４６）をアルギニン−バソプレッシンによる肥大性刺激に曝した。それは、ＡＮＰ（心房性ナトリウム利尿ペプチド）およびＭＹＨＣＢ（ミオシン重鎖ベータ−サブユニット）などの心肥大のマーカー遺伝子の発現増加のなかでも、とりわけ発現された［２］。ｃＧＭＰを加水分解するＰＤＥ２Ａの発現の増加は、心筋細胞の細胞内ｃＧＭＰレベルを下げ、従って、ｃＧＭＰの抗肥大効果を抑制し得る［３、４］。この観察から、肥大性Ｈ９ｃ２細胞におけるＰＤＥ２Ａの発現の増加も、インビボで心肥大の病理に寄与し、低分子量薬によるＰＤＥ２Ａ活性の阻害が、心肥大に対して正の効果を有することが推測できる。なぜなら、心筋細胞におけるｃＧＭＰレベルは高いままであり、従ってｃＧＭＰの抗肥大効果が維持されるからである［５］。この仮説を検証するために、Ｈ９ｃ２細胞をアルギニン−バソプレッシンで刺激し、ＰＤＥ２阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０とインキュベートした［６］。ＢＡＹ６０−７５５０は、構造式：
【化１】
2010506561.tif 000002
を有する物質、２−（３,４−ジメトキシベンジル）−７−［１−（１−ヒドロキシエチル）−４−フェニルブチル］−５−メチルイミダゾ［５,１−ｆ］［１,２,４］トリアジン−４（３Ｈ）−オンである。
【０００８】
図２に示す通り、ＰＤＥ２Ａ阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０は、肥大マーカー遺伝子ＭＹＨＣＢの増加の用量依存的抑制の能力がある。Ｈ９ｃ２細胞をＰＤＥ２Ａ阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０と共にインキュベートすることも細胞内ｃＧＭＰレベルの上昇を導き、かくして抗肥大効果を有することを確認するために、ＡＮＰによるｃＧＭＰ合成の刺激後、ＰＤＥ２Ａ阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０の存在下で、ＥＩＡにより細胞内ｃＧＭＰ量を測定した。図３から明らかな通り、ＢＡＹ６０−７５５０は、Ｈ９ｃ２細胞において細胞内ｃＧＭＰ量を用量依存的に高める。このインビトロの知見を確認するために、ＰＤＥ２阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０の抗肥大効果を、インビボで、マウス肥大モデルで調べた。この目的で、Ｃ５７ＢＬ６系統のマウスは、イソプレナリン２ｍｇ／ｋｇの１日１回の皮下投与、および、正の対照として、イソプレナリンに加えて、飲料水を介して投与されるエナラプリル１０ｍｇ／ｋｇを受容する。ＢＡＹ６０−７５５０は、イソプレナリン注射と並行して、１日２回、１０ｍｇ／ｋｇｉ.ｐ.の用量で投与された。図４から明らかな通り、イソプレナリン注入は、動物の心臓の重量を体重と比較して高める。正の対照のエナラプリルと全く同様に、ＰＤＥ２Ａ阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０の投与は、両方の用量群で、心臓重量の体重に対する比の顕著な減少を導いた。
これらのデータから、ＰＤＥ２Ａ阻害はヒトの心肥大も防止できることが明らかである。
【０００９】
従って、本発明は、以下の疾患の処置および／または予防用の医薬を製造するための、ＰＤＥ２Ａ阻害剤の使用に関する：冠動脈心疾患、特に安定および不安定狭心症、急性心筋梗塞、心筋梗塞予防、心臓性突然死、心不全および高血圧、および、アテローム性動脈硬化症の後遺症、および、血管の障害、腎障害および勃起不全。
【００１０】
本発明の意味におけるアンタゴニストは、ＰＤＥ２Ａの生物学的活性の阻害をもたらす全ての物質である。特に好ましいアンタゴニストは、ロックト核酸（locked nucleic acid）、ペプチド核酸および「スピーゲルマー（spiegelmer）」を含む核酸、抗体を含むタンパク質および低分子量の物質である；ことさら特に好ましいアンタゴニストは、低分子量の物質である。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、以下に関する：
１. 心不全およびその根底にある心筋症の処置および／または予防に適するＰＤＥ２Ａ阻害剤を見出すためのアッセイ系における、ＰＤＥ２ＡポリペプチドまたはＰＤＥ２Ａポリペプチドをコードする核酸の使用。
【００１２】
ＰＤＥ２Ａポリペプチドをコードする核酸は、
ａ）配列番号２により開示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、および、その機能的断片；
ｂ）配列番号１に示す配列を含む核酸分子、およびその機能的断片；
ｃ）その相補鎖が核酸分子ａ）またはｂ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＰＤＥ２Ａの生物学的機能を有する核酸分子、核酸分子のストリンジェントなハイブリダイゼーションは、０.２ｘＳＳＣ（１ｘ標準的生理食塩水−クエン酸塩＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）を含む水性溶液中、６８℃で実施する（Sambrook et al., 1989）；および、
ｄ）ｃ）で言及されるものと、遺伝子暗号の縮重の理由で異なる核酸分子
からなる群から選択される核酸である。
【００１３】
本発明の意味におけるＰＤＥ２Ａポリペプチドは、ａ）−ｄ）で言及される核酸の一つによりコードされるポリペプチドである。ポリペプチドは、特に、配列番号１で示される配列を含むか、または、ＰＤＥ２Ａ活性を有するそれらの断片を含むもの、ＰＤＥ２Ａポリペプチドである。
【００１４】
２. アッセイ系が無細胞である、第１項に記載の使用。
３. ＰＤＥ２Ａをコードする核酸を含む全細胞がアッセイ系で使用される、第１項に記載の使用。これに関して、核酸は内在的に存在すること、または、組換え的に導入されることが可能である。
４. ＰＤＥ２Ａ活性を測定する、第１項ないし第３項に記載の使用。
５. ｃＧＭＰまたはＧＭＰレベルを測定する、第４項に記載の使用。
６. ＰＤＥ２Ａの発現を測定する、第１項ないし第３項に記載の使用。
【００１５】
７. 心不全が、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣＭ）、心筋炎および／または肥大型心筋症（ＨＣＭ）からなる心筋症の群から選択される心筋症により誘導される心不全である、第１項ないし第６項に記載の使用。
８. 心不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための、第１項ないし第７項に記載の方法のいずれかを利用して同定されたＰＤＥ２Ａ阻害剤の使用。
９. 拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣＭ）、心筋炎および／または肥大型心筋症（ＨＣＭ）からなる心筋症の群から選択される心筋症により誘導される心不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための、第１項ないし第７項に記載の方法のいずれかを利用して同定されたＰＤＥ２Ａ阻害剤の使用。
【００１６】
１０. 心不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための、ＰＤＥ２Ａ−特異的抗体、ＰＤＥ２Ａ−特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＰＤＥ２Ａ−特異的ｓｉＲＮＡの使用。
１１. 拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣＭ）、心筋炎および／または肥大型心筋症（ＨＣＭ）からなる心筋症の群から選択される心筋症により誘導される心不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための、ＰＤＥ２Ａ−特異的抗体、ＰＤＥ２Ａ−特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＰＤＥ２Ａ−特異的ｓｉＲＮＡの使用。ｓｉＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡである。ＰＤＥ２Ａ−特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体またはｓｉＲＮＡを提供するための方法は、当業者に知られている。適するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたは抗体は、最終的に、ＰＤＥ２Ａ活性の阻害を導く。これは、ＰＤＥ２Ａタンパク質に直接関与するか、または、ＰＤＥ２Ａの転写または翻訳のレベルで作用するメカニズムにより起こり得る。
【００１７】
１２. 心不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための、ＰＤＥ２Ａ阻害剤の使用。
１３. 心不全が、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣＭ）、心筋炎および／または肥大型心筋症（ＨＣＭ）からなる心筋症の群から選択される心筋症により誘導される心不全である、第１２項に記載の使用。
１４. ＰＤＥ２Ａ阻害剤が１μＭより低いＩＣ５０を有する、第１２項または第１３項に記載の使用。
１５. ＰＤＥ２Ａ阻害剤が、１００ｎＭより低いＩＣ５０を有する、第１２項または第１３項に記載の使用。
【００１８】
ＰＤＥ２Ａ阻害は、例えば、下記のＰＤＥ２Ａ阻害アッセイで測定できる。
これに関して好ましいＰＤＥ２Ａアンタゴニストは、下記のＰＤＥ２Ａ阻害アッセイにおいて、１μＭのＩＣ５０、好ましくは０.１μＭより低いＩＣ５０で阻害を示す。
本発明のＰＤＥ２Ａ阻害剤は、好ましくは、血液脳関門を通過できず、全身的効果を有し、中枢への効果を有さない。
【００１９】
本発明はまた、一般式（Ｉ）
【化２】
2010506561.tif 000003
［式中、
Ｒ１は、フェニル、ナフチル、キノリニルまたはイソキノリニルであり、これらの各々は、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ、ハロゲン、シアノ、−ＮＨＣＯＲ８、−ＮＨＳＯ２Ｒ９、−ＳＯ２ＮＲ１０Ｒ１１、−ＳＯ２Ｒ１２および−ＮＲ１３Ｒ１４からなる群から選択される３個までの同一かまたは異なるラジカルにより置換されていてもよく
｛ここで、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１３およびＲ１４は、相互に独立して、水素または（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルであり、そして、
Ｒ９およびＲ１２は、相互に独立して（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルであるか、
または、
Ｒ１０およびＲ１１は、隣接する窒素原子と一体となって、アゼチジン−１−イル、ピロール−１−イル、ピペリド−１−イル、アゼピン−１−イル、４−メチルピペラジン−１−イルまたはモルホリン−１−イルラジカルを形成するか、
または、
Ｒ１３およびＲ１４は、隣接する窒素原子と一体となって、アゼチジン−１−イル、ピロール−１−イル、ピペリド−１−イル、アゼピン−１−イル、４−メチルピペラジン−１−イルまたはモルホリン−１−イルラジカルを形成する｝、
Ｒ２およびＲ３は、相互に独立して水素またはフッ素であり、
Ｒ４は、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルであり、
Ｒ５は、（Ｃ１−Ｃ３）−アルキルであり、
Ｒ６は、水素またはメチルであり、
Ｒ７は、フェニル、チオフェニル、フラニル（これらの各々は、（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシ、ハロゲンおよびシアノからなる群から選択される３個までの同一かまたは異なるラジカルにより置換されていてもよい）であるか、または、（Ｃ５−Ｃ８）−シクロアルキルであり、
Ｌは、カルボニルまたはヒドロキシメタンジイルであり、そして、
Ｍは、（Ｃ２−Ｃ５）−アルカンジイル、（Ｃ２−Ｃ５）−アルケンジイルまたは（Ｃ２−Ｃ５）−アルキンジイルである］
の化合物および生理的に耐容される塩の、心不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための使用に関する。
【００２０】
（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルおよび（Ｃ１−Ｃ３）−アルキルは、本発明に関して、各々１個ないし４個および１個ないし３個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルキルラジカルである。言及し得る例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｉ−、ｓ−、ｔ−ブチルである。メチルおよびエチルが好ましい。
【００２１】
（Ｃ２−Ｃ５）−アルカンジイルは、本発明に関して、２個ないし５個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルカンジイルラジカルである。言及し得る例は、エチレン、プロパン−１,３−ジイル、プロパン−１,２−ジイル、プロパン−２,２−ジイル、ブタン−１,３−ジイル、ブタン−２,４−ジイル、ペンタン−２,４−ジイルである。直鎖の（Ｃ２−Ｃ５）−アルカン−１,ω−ジイルラジカルが好ましい。言及し得る例は、エチレン、プロパン−１,３−ジイル、ブタン−１,４−ジイル、ペンタン−１,５−ジイルである。プロパン−１,３−ジイルおよびブタン−１,４−ジイルが特に好ましい。
【００２２】
（Ｃ２−Ｃ５）−アルケンジイルは、本発明に関して、２個ないし５個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルケンジイルラジカルである。言及し得る例は、エテン−１,２−ジイル、エテン−１,１−ジイル、プロペン−１,１−ジイル、プロペン−１,２−ジイル、プロプ−２−エン−１,３−ジイル、プロペン−３,３−ジイル、プロペン−２,３−ジイル、ブト−２−エン−１,４−ジイル、ペント−２−エン−１,４−ジイルである。直鎖の（Ｃ２−Ｃ５）−アルケン−１,ω−ジイルラジカルが好ましい。言及し得る例は、エテン−１,２−ジイル、プロプ−２−エン−１,３−ジイル、ブト−２−エン−１,４−ジイル、ブト−３−エン−１,４−ジイル、ペント−２−エン−１,５−ジイル、ペント−４−エン−１,５−ジイルである。プロプ−２−エン−１,３−ジイル、ブト−２−エン−１,４−ジイルおよびブト−３−エン−１,４−ジイルが特に好ましい。
【００２３】
（Ｃ２−Ｃ５）アルキンジイルは、本発明に関して、２個ないし５個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルキンジイルラジカルである。言及し得る例は、エチン−１,２−ジイル、エチン−１,１−ジイル、プロプ−２−イン−１,３−ジイル、プロプ−２−イン−１,１−ジイル、ブト−２−イン−１,４−ジイル、ペント−２−イン−１,４−ジイルである。直鎖（Ｃ２−Ｃ５）−アルケン−１,ω−ジイルラジカルが好ましい。言及し得る例は、エチン−１,２−ジイル、プロプ−２−イン−１,３−ジイル、ブト−２−イン−１,４−ジイル、ブト−３−イン−１,４−ジイル、ペント−２−イン−１,５−ジイル、ペント−４−イン−１,５−ジイルである。プロプ−２−イン−１,３−ジイル、ブト−２−イン−１,４−ジイルおよびブト−３−イン−１,４−ジイルが特に好ましい。
【００２４】
（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシは、本発明に関して、１個ないし４個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルコキシラジカルである。言及し得る例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシおよびｎ−ヘキソキシである。メトキシおよびエトキシが特に好ましい。
【００２５】
（Ｃ５−Ｃ８）−シクロアルキルは、本発明に関して、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルまたはシクロオクチルである。好ましく言及し得るものは、シクロペンチル、シクロヘキシルまたはシクロヘプチルである。
【００２６】
ハロゲンは、本発明に関して、一般的に、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素である。フッ素、塩素および臭素が好ましい。フッ素および塩素が特に好ましい。
【００２７】
本発明に関して好ましい塩は、本発明の化合物の生理的に許容し得る塩である。
本発明の化合物の生理的に許容し得る塩は、本発明の物質の鉱酸、カルボン酸またはスルホン酸との酸付加塩であり得る。特に好ましい例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸または安息香酸の塩である。
【００２８】
しかしながら、また言及し得る塩は、常套の塩基との塩、例えば、アルカリ金属塩（例えばナトリウムまたはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウムまたはマグネシウム塩）、または、アンモニアまたは有機アミン（例えば、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ジヒドロアビエチルアミン、１−エフェンアミン（ephenamine）またはメチルピペリジン）から誘導されるアンモニウム塩である。
【００２９】
本発明の化合物は、像および鏡像をとる（エナンチオマー）か、または、像および鏡像をとらない（ジアステレオマー）、立体異性体で存在し得る。本発明は、エナンチオマーもしくはジアステレオマー、または、これらの各々の場合の混合物の両方に関する。ラセミ体は、ちょうどジアステレオマーのように、既知方法で立体異性的に純粋な構成分に分離できる。
【００３０】
Ｒ１が、そのメタおよび／またはパラ位が（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシおよび−ＳＯ２ＮＲ１０Ｒ１１からなる群から選択される３個までの同一かまたは異なるラジカルにより置換されているフェニルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１、ＬおよびＭが上記の意味を有する一般式（Ｉ）の化合物の、心不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための使用が好ましい。
【００３１】
フェニル環のメタおよびパラ位は、ＣＲ２Ｒ３基に対して各々メタおよびパラである位置を意味する。これらの位置は、以下の構造式（Ｉｃ）により例示説明できる：
【化３】
2010506561.tif 000004
【００３２】
フェニルラジカルのパラ位および１つのメタ位が置換されており、第２のメタ位が非置換である一般式（Ｉｃ）の化合物の、心不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための使用が特に好ましい。
【００３３】
Ｒ７がフェニルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、ＬおよびＭが上記の意味を有する一般式（Ｉ）の化合物の、心不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための使用が同様に好ましい。
【００３４】
ことさら特に好ましいのは、式中、
Ｒ１が、そのメタおよび／またはパラ位が（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）−アルコキシおよび−ＳＯ２ＮＲ１０Ｒ１１からなる群から選択される３個までの同一かまたは異なるラジカルにより置換されているフェニルであるか、または、ナフチルまたはキノリニルであり
｛式中、Ｒ１０およびＲ１１は、相互に独立して水素または（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルである｝、
Ｒ２およびＲ３が水素であり、
Ｒ４がメチルまたはエチルであり、
Ｒ５がメチルであり、
Ｒ６が水素またはメチルであり、
Ｌがカルボニルまたはヒドロキシメタンジイルであり、そして、
Ｍが、直鎖（Ｃ２−Ｃ５）−アルカン−１,ω−ジイル、直鎖（Ｃ２−Ｃ５）−アルケン−１,ω−ジイルまたは直鎖（Ｃ２−Ｃ５）−アルキン−１,ω−ジイルである、
一般式（Ｉ）の化合物の、心不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための使用である。
【００３５】
構造式：
【化４】
2010506561.tif 000005
を有する物質２−（３,４−ジメトキシベンジル）−７−［１−（１−ヒドロキシエチル）−４−フェニルブチル］−５−メチルイミダゾ［５,１−ｆ］［１,２,４］トリアジン−４（３Ｈ）−オンの、心不全の処置および／または予防用の医薬を製造するための使用が同様に好ましい。
【００３６】
心不全が、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、拘束型心筋症（ＲＣＭ）、不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣＭ）、心筋炎および／または肥大型心筋症（ＨＣＭ）からなる心筋症の群から選択される心筋症により誘導される心不全である、上記の構造式の上記の使用も好ましい。
【００３７】
上記の化合物、そのＰＤＥ２阻害剤としての効果およびそれらの製造方法は、ＷＯ０２／０５００７８Ａ１に開示されている。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１：アルギニン−バソプレッシン１マイクロモルとの７２時間のインキュベーション後のＨ９ｃ２細胞におけるＰＤＥ２Ａ−ＲＮＡの相対的発現の比較。Ｈ９ｃ２ラット心筋細胞におけるＬ３２リボソームタンパク質（ｒＥ）に対するＰＤＥ２Ａの発現を示す。結果を表に示す（トリプリケート測定からの平均の相対的発現ｒＥ。ＰＤＥ２ＡおよびＬ３２の平均Ｃｔ値）。
【表１】
2010506561.tif 000006
【図２】図２：バソプレッシン±ＰＤＥ２Ａ阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０による刺激後のＨ９Ｃ２ラット細胞における肥大マーカーＭＹＨＣＢの相対的発現。  バソプレッシン（０.１マイクロモル、１マイクロモル、１０マイクロモル）との７２時間のインキュベーション後のＨ９Ｃ２細胞におけるＬ３２リボソームタンパク質に対するＡＮＰおよびＭＹＨＣＢの発現を示す。ＰＤＥ２Ａ阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０の同時存在は、バソプレッシンによる肥大マーカーＭＹＨＣＢの誘導を、用量依存的に抑制することが明らかになる。結果を下表に列挙する。（デュプリケート測定からの平均の相対的発現ｒＥ）。
【表２】
2010506561.tif 000007
【図３】図３：様々な濃度のＰＤＥ２Ａ阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０の存在下でのＡＮＰによる刺激後のＨ９ｃ２ラット心筋細胞における細胞内ｃＧＭＰ濃度の変化。ＡＮＰおよび記載された用量のＰＤＥ２Ａ阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０との１５分間のインキュベーション後の細胞におけるｃＧＭＰ含有量を示す。ＰＤＥ２Ａ阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０は、用量依存的かつ相乗的に、Ｈ９ｃ２細胞における細胞内ｃＧＭＰレベルを高めることが明らかになる。
【図４】図４：イソプレナリン（２ｍｇ／ｋｇ／ｄ）の皮下投与による、体重と比較した心臓重量（ＨＷ：ＢＷ）の変化、および、正の対照としてのエナラプリル（８１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、飲料水中）およびＰＤＥ２Ａ阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０の影響。心臓重量：体重の比を処置に応じて示す。２つの独立した動物群において、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ（ｉ.ｐ.）で５日間与えられるＰＤＥ２Ａ阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０は、イソプレナリンに誘導される心臓重量の増加を正の対照のエナラプリルとほぼ同等に抑制できることが明らかになる。
【図５】図５：図５は、ヒトＰＤＥ２ＡのｃＤＮＡ配列を示す（受託番号ＮＭ＿００２５９９、配列番号１）。
【図６】図６：図６は、ヒトＰＤＥ２Ａのアミノ酸配列を示す（受託番号ＮＰ＿００２５９０、配列番号２）。
【００３９】
Ｈ９ｃ２ラット細胞におけるＰＤＥ２Ａ発現およびＭＹＨＣＢ発現の調査
Ｈ９ｃ２ラット細胞におけるＰＤＥ２Ａの相対的発現を、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を使用してｍＲＮＡを定量することにより測定する［７］。常套のＰＣＲと比較して、リアルタイムＰＣＲは、付加的な蛍光標識オリゴヌクレオチドの導入による、より正確な定量という利点を有する。このいわゆるプローブは、５'末端に蛍光染料ＦＡＭ（６−カルボニル−フルオレセイン）を、３'末端に蛍光クエンチャーＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチルローダミン）を含有する。ポリメラーゼ連鎖反応の間、蛍光染料ＦＡＭは、TaqMan PCR のＴａｑポリメラーゼの５'−エキソヌクレアーゼ活性によりプローブから切り離され、かくして、それまではクエンチされていた蛍光シグナルが得られる。蛍光強度がバックグラウンドの蛍光より約１０標準偏差高くなるサイクル数を、いわゆる閾値として記録する［閾値サイクル（Ｃｔ値）］。
【００４０】
６ウェル（細胞約４ｘ１０５個）のＨ９ｃ２ラット心筋細胞から、RNeasy Kit (Qiagen Hilden）を使用して全ＲＮＡを単離する。組織当たり１μｇ分の全ＲＮＡを、１ユニットのＤＮａｓｅＩ（Invitrogen より）と、室温で１５分間反応させ、ゲノムＤＮＡの混入を取り除く。ＥＤＴＡ（２５ｍＭ）１μｌの添加および続く６５℃（１０分間）の加熱によりＤｎａｓｅＩを非活性化する。
【００４１】
続いて、「SUPERSCRIPT-II RT cDNA synthesis kit」(Invitrogen より）の指示書に従って、同じ反応混合物中でｃＤＮＡ合成を実施し、反応体積を蒸留水で２００μｌとする。ＰＣＲのために、プライマーおよびプローブ混合物７.５μｌおよびＴａｑＭａｎ反応溶液（qPCR Mastermix, Eurogentecより）１２.５μｌを、希釈したｃＤＮＡ溶液５μｌ分に添加する。プライマーの最終濃度は各場合で３００ｎＭであり、プローブの最終濃度は１５０ｎＭである。ラットＰＤＥ２Ａ用のフォワードおよびリバースプライマーの配列は、５'−ＣＣＡＡＡＴＣＡＧＧＧＡＣＣＴＣＡＴＡＴＴＣＣ−３'（配列番号３）および５'−ＧＧＴＧＴＣＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＣＣＡＴ−３'（配列番号４）であり、蛍光プローブの配列は、５'−６ＦＡＭ−ＡＡＣＡＡＣＴＣＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＡ−ＴＡＭＲＡ−３'（配列番号５）である。ｒ−ＭＹＨＣＢ用のフォワードおよびリバースプライマーの配列は、５'−ＴＧＧＡＧＡＡＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧ−３'（配列番号６）および５'−ＣＣＴＧＧＣＧＴＴＧＡＧＴＧＣＡＴＴＴＡ−３'（配列番号７）であり、蛍光プローブの配列は、５'−６ＦＡＭ−ＴＧＧＡＴＧＡＧＣＧＡＣＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＣＴＴＴＧ−ＴＡＭＲＡ−３'（配列番号８）である。
【００４２】
ＰＣＲを、ABI Prism SDS-7700 装置 (Applied Biosystems より）で、製造業者の指示に従い行う。この場合、４０サイクルを実施する。関連するｃＤＮＡの各遺伝子について得られるＣｔ（上記参照）は、遊離したプローブの蛍光強度がバックグラウンドのシグナルより約１０標準偏差高くなるサイクルに相当する。従って、より低いＣｔ値は、より早い増幅の開始を、即ち、元のサンプルがより多くのｍＲＮＡを含有することを意味する。ｃＤＮＡ合成のいかなる変動も補うために、細胞の処置と関係なく常に同程度に発現されるべき、いわゆる「ハウスキーピング遺伝子」の発現も、調査するサンプルの全てで分析する。Ｈ９ｃ２細胞におけるＰＤＥ２Ａ発現を標準化するために、Ｌ３２リボソームタンパク質を使用する。ラットＬ３２のフォワードおよびリバースプライマーの配列は、５'−ＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＴＧＧＣ−３'（配列番号９）、および、５'−ＴＣＡＴＴＣＴＣＴＴＣＧＣＴＧＣＧＴＡＧＣ−３'（配列番号１０）であり、プローブの配列は、５'−６ＦＡＭ−ＴＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＡＣＧＣＣＡ−ＴＡＭＲＡ−３'（配列番号１１）である。以下の方法でデータを分析する：各ＲＮＡについて、ｄＣｔ値を算出する。ｄＣｔ値は、候補遺伝子（即ち：ＭＹＨＣＢまたはＰＤＥ２Ａ）のＣｔ値と、各組織のハウスキーピング遺伝子のＣｔ値との差である。この値から、下式により相対的発現ｒＥを算出する：
ｒＥ＝２（１８−ｄＣｔ）。
【００４３】
ＰＤＥ２Ａ阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０とのプレインキュベーション後のＨ９ｃ２細胞におけるｃＧＭＰ含有量の測定
Ｈ９ｃ２細胞における細胞内ｃＧＭＰ含有量を、Amersham の Biotrak (EIA) Immunoassay（カタログ番号ＲＰＮ２２６）により、製造業者のプロトコールに従い測定した。この目的で、Ｈ９ｃ２細胞１０５個／ウェルを、１２ウェルプレートに終夜播き、１ｘＰＢＳ（１ｍｌ）で洗浄した後、ＦＣＳを含まない培地８００μｌ並びに上述の濃度のＰＤＥ２Ａ阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０およびＡＮＰと、室温で１５分間インキュベートする。上清を廃棄し、細胞を氷冷７０％強度エタノール５００ｍｌと混合した。室温（１５０ｒｐｍ）で２分間撹拌した後、プレートを−２０℃で終夜凍結し、融解後、溶解した細胞を Eppendorf 容器に移す。スピード−バック（speed-vac）中でエタノールを蒸発させた後（３時間、３５℃）、サンプルをアッセイバッファー２００μｌ中で再構成し、キットの説明書で指示される通りに後処理する。Tecan Spectrafluor 光度計で、４５０／５７０ｎｍで蛍光を測定する。得られるＯＤ値を、キットの指示書に従い、標準的較正プロットに基づき、ｆｍｏｌ／ウェルに変換する。
【００４４】
ＰＤＥ２Ａ阻害アッセイ
ＰＤＥ２Ａ阻害剤を同定するためのＰＤＥ２Ａアッセイ様式は、当業者に知られている。可能なＰＤＥ２Ａ活性アッセイ系の様式の一例を、以下に記載する。
ヒトＰＤＥ２Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ受託番号：ＮＭ＿００２５９９、Rosman et al. Gene 1997 191, 89-95) を、Bac-to-BacTM バキュロウイルス発現系を利用して、Ｓｆ９昆虫細胞で発現させる。感染の４８時間後、細胞を回収し、溶解バッファー（２０ｍＬ／培養液１Ｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１.５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、Protease Inhibitor Cocktail Set III [CalBiochem, La Jolla, CA USA] ２０μＬ）に懸濁する。４℃で超音波を利用して細胞を破壊し、次いで、１５,０００ｘｇ、４℃で３０分間、遠心分離する。上清（ＰＤＥ２Ａ調製物）を回収し、−８０℃で保存する。
【００４５】
試験物質を溶解し、１００％ＤＭＳＯ中で連続希釈し、それらのＰＤＥ２Ａに対するインビトロ効果を測定する。典型的には、２００μＭないし１.６μＭの連続希釈物を調製する（生じるアッセイ中の最終濃度：４μＭないし０.０３２μＭ）。希釈した物質溶液２μＬ分を、マイクロタイタープレートのウェル中に入れる（Isoplate; Wallac Inc., Atlanta, GA）。次いで、上記のＰＤＥ２Ａ調製物の希釈物５０μＬを添加する。ＰＤＥ２Ａ調製物の希釈物は、物質の７０％未満が後のインキュベーション中に変換されるように選択する（典型的な希釈：１：２０００００；希釈バッファー：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７.５；８.３ｍＭ ＭｇＣｌ２；１.７ｍＭ ＥＤＴＡ、０.２％ＢＳＡ）。基質の［５',８−３Ｈ］アデノシン３',５'−環状リン酸塩（１μＣｉ／μＬ；Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ）を、アッセイバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７.５；８.３ｍＭ ＭｇＣｌ２；１.７ｍＭ ＥＤＴＡ）で１：２０００に、０.０００５μＣｉ／μＬの濃度に希釈し、ＰＤＥ２の刺激に作用するｃＧＭＰ（アッセイにおける最終濃度１μＭ）を添加する。この基質溶液５０μＬ（０.０２５μＣｉ）を添加することにより、最終的に酵素反応を開始する。このアッセイ混合物を室温で６０分間インキュベートし、１８ｍｇ／ｍｌの Yttrium Scintillation Proximity Beads (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ.）懸濁液２５μＬの添加により、反応を停止する。マイクロタイタープレートをフィルムで密閉し、室温で６０分間静置する。次いで、Microbeta シンチレーションカウンター (Wallac Inc., Atlanta, GA）で、ウェル当たり３０秒間、プレートを測定する。物質濃度を阻害割合に対してプロットしたグラフを使用して、ＩＣ５０値を決定する。
【００４６】
ＰＤＥ１、３、４、５、７、８、９、１０および１１の阻害
組換えヒトＰＤＥ３Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ受託番号：ＮＭ＿０００９２２、Miki et al. Genomics 1996 36, 476-485）、ＰＤＥ４Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ受託番号：ＮＭ＿００２６００、Obernolte et al. Gene. 1993 129, 239-247）、ＰＤＥ７Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ受託番号：ＮＭ＿０１８９４５、Hetman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000 97, 472-476）、ＰＤＥ８Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ受託番号：ＡＦ＿０５６４９０、Fisher et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998 246, 570-577）、ＰＤＥ９Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ受託番号：ＮＭ＿００２６０６、Fisher et al. J. Biol. Chem. 1998 273, 15559-15564）、ＰＤＥ１０Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ受託番号：ＮＭ＿０６６６１、Fujishige et al. J. Biol. Chem. 1999 274, 18438-45）、ＰＤＥ１１Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ受託番号：ＮＭ＿０１６９５３、Fawcett et al. Proc. Natl. Acad. Sci 2000 97, 3702-3707）を、ｐＦＡＳＴＢＡＣバキュロウイルス発現系（GibcoBRL）を利用して、Ｓｆ９細胞で発現させた。ウシＰＤＥ１を、Sigma-Aldrich (P 9529）から購入した。ＰＤＥ５を、ヒト血小板から、超音波処理および続く遠心分離および上清の Mono Q 10/10 でのカラムクロマトグラフィー（直線状ＮａＣｌグラジエント、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２中、０.２−０.３Ｍ ＮａＣｌによる溶出）により取り出した。
【００４７】
組換えＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ７Ｂ、ＰＤＥ８Ａ、ＰＤＥ１０ＡおよびＰＤＥ１１Ａに対する試験物質のインビトロ効果を、ＰＤＥ２Ａについて上記したアッセイプロトコール（ここでは、ＰＤＥ２Ａの刺激に使用されるｃＧＭＰのアッセイへの添加はない）により測定する。ＰＤＥ１、ＰＤＥ５およびＰＤＥ９Ａに対する対応する効果を測定するために、プロトコールをさらに次の通りに改変する：ＰＤＥ１には、さらにカルモジュリン１０−７ＭおよびＣａＣｌ２ ３ｍＭを反応混合物に添加する。ＰＤＥ５およびＰＤＥ９Ａには、使用する基質は、上記の希釈物中の［８−３Ｈ］ｃＧＭＰ（１μＣｉ／μＬ；Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ）である。ＰＤＥ９Ａ反応を停止するために、アッセイバッファーに溶解したＰＤＥ９Ａ阻害剤Ｃ、例えばＢＡＹ７３−６６９１（最終濃度５μＭ）２５μｌを、Yttrium Scintillation Proximity Bead 懸濁液の添加直後に添加する。
【００４８】
ＰＤＥ２Ａ阻害剤は、ＰＤＥ２Ａの転写または翻訳のレベルでも作用し得る。対応する阻害剤を見出すためのアッセイ系は、当業者に周知である。
【００４９】
インビボの抗肥大効果についてのＰＤＥ２Ａ阻害剤のアッセイ：
ＰＤＥ２Ａ阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０の抗肥大効果を、いわゆるマウスイソプレナリンモデル［］を使用してアッセイする。これには、用量群当たり８匹のマウス（Ｃ５７ｂｌ／６系統）が含まれ、これらは、イソプレナリンの皮下投与を２ｍｇ／ｋｇ／ｄの用量で５日間受け、一方、対照群は、媒体の対照として生理食塩水を受容する。正の対照として、イソプレナリンに加えて、ＡＣＥ阻害剤エナラプリルを１０ｍｇ／ｋｇ／ｄの用量で飲料水を介して１つの群に投与し、一方、２つのさらなる群は、イソプレナリンに加えて、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄの用量で腹腔内投与されるＰＤＥ２Ａ阻害剤ＢＡＹ６０−７５５０を受容する。心肥大の程度の尺度として、心臓重量／体重（ＨＷ：ＢＷ）の比を、５日後に測定し、イソプレナリンの効果に対する物質の効果の関係を見出す。
【００５０】
ＰＤＥ２Ａ阻害剤の製剤
ＰＤＥ２Ａ阻害剤は、既知方法で、不活性、非毒性の医薬的に適する担体または溶媒の使用により、錠剤、被覆錠剤、丸剤、顆粒剤、エアゾル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤および液剤などの通常の製剤に変換できる。この場合、治療的に有効な化合物は、各場合で完全な混合物の０.５ないし９０重量％の濃度で、即ち、上述の投与量範囲に達するのに十分な量で、存在すべきである。
【００５１】
製剤は、例えば、有効成分を溶媒および／または担体で薄めることにより、必要に応じて乳化剤および／または分散剤を使用して製造し、例えば水を希釈剤として使用する場合、必要に応じて有機溶媒を補助溶媒として使用することが可能である。
【００５２】
投与は、通常の方法で、好ましくは、経口で、経皮で、静脈内または非経腸で、特に経口で、または、静脈内で行う。しかしながら、例えばスプレーを利用して、口または鼻を介する吸入により、または、皮膚を介して局所的に行うこともできる。
【００５３】
０.００１ないし１０ｍｇ／体重ｋｇほどの、経口使用で好ましくは約０.００５ないし３ｍｇ／体重ｋｇの量を投与するのが、有効な結果を得るために有利であると一般的に明らかになった。
【００５４】
それにも拘わらず、必要に応じて、特に、体重または投与経路の性質、医薬に対する個々の応答、製剤のタイプおよび投与を行う時間または間隔に応じて、上述の量から逸脱することが必要であり得る。かくして、上述の最小量より少なくても十分な場合があり得、一方、上述の上限を超えなければならない場合もある。比較的大量に投与する場合、これらを１日にわたる複数の単回用量に分配するのが望ましいことがある。
【００５５】
参考文献
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7. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM., Real time quantitative PCR. Genome Res 6 (1996), 986-994.
8. Hassan MA, Ketat AF., Sildenafil citrate increases myocardial cGMP content in rat heart, decreases its hypertrophic response to isoproterenol and decreases myocardial leak of creatine kinase and troponin T, BMC Pharmacol. 2005 Apr 6;5(1):10.
【００５６】
参考
ＡＮＰ  心房性ナトリウム利尿ペプチド
ＡＶＰ：アルギニン−バソプレッシン
ＢＷ：体重
Ｃｔ：閾値サイクル
ＨＷ：心臓重量
ＭＹＨＣＢ：ミオシン重鎖ベータサブユニット
ＰＢＳ  リン酸緩衝塩水
ｒＥ：相対的発現
ＳＤ：標準偏差
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年6月4日(2009.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2010506561.tif 000027
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