(57)【要約】  本発明は、容器（2）、その中でも特に細胞培養用容器を横倒しにするための装置（1）であって、伝動軸（13）によって減速装置（4）とダイナミック・ブレーキ（5）に接続された回転アクチュエータ（3）と、容器（2）を把持する支持体（17）およびロッド（7）とを備えており、支持体（17）が、回転アクチュエータ（3）の伝動軸（13）のシフター（16）によってその回転アクチュエータ（3）に接続されていて、その回転アクチュエータ（3）が踏子（18）によって作動するとともに、その回転アクチュエータ（3）が、容器（2）を横倒しにする時間の終了を示すタイマー（19）に接続されていることを特徴とする装置（1）に関する。
2010536325.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器（2）、その中でも特に細胞培養用容器を横倒しにするための装置（1）であって、伝動軸（13）によって減速装置（4）とダイナミック・ブレーキ（5）に接続された回転アクチュエータ（3）と、前記容器（2）を把持する支持体（17）およびロッド（7）とを備えており、前記支持体（17）が、前記回転アクチュエータ（3）の伝動軸（13）のシフター（16）によってその回転アクチュエータ（3）に接続されていることを特徴とする装置（1）。
【請求項２】
前記回転アクチュエータ（3）が空気圧式であることを特徴とする、容器（2）を横倒しにするための請求項1に記載の装置（1）。
【請求項３】
前記回転アクチュエータ（3）がラック-ピニオン・タイプのアクチュエータである、容器（2）を横倒しにするための請求項1または2に記載の装置（1）。
【請求項４】
前記回転アクチュエータ（3）が踏子（18）によって作動するとともに、その回転アクチュエータ（3）が、前記容器（2）を横倒しにする時間の終了を示すタイマー（19）に接続されている、容器（2）を横倒しにするための請求項1〜3のいずれか1項に記載の装置（1）。
【請求項５】
前記踏子が空気圧式である、請求項4に記載の装置（1）。
【請求項６】
前記踏子が電子式である、請求項4に記載の装置（1）。
【請求項７】
前記タイマーが空気圧式である、請求項4〜6のいずれか1項に記載の装置（1）。
【請求項８】
前記タイマーが電子式である、請求項4〜6のいずれか1項に記載の装置（1）。
【請求項９】
ワークステーション（1）に適合させるため、前記回転アクチュエータ（3）の伝動軸（13）のシフター（16）が一対の平坦なプレートを備えていて、そのプレートの一方の側でそのシフター（16）をその回転アクチュエータ（3）に固定し、他方の側でそのシフター（16）を前記支持体（17）のロッド（7）に固定することを特徴とする、容器（2）を横倒しにするための請求項1〜8のいずれか1項に記載の装置（1）。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか1項に記載の装置（1）を操作する方法であって、
a．横倒しにするための装置（1）の支持用ロッド（7）の中に容器（2）を配置し；
b．その横倒しにするための装置（1）の回転アクチュエータ（3）を踏子（18）によって作動させ；
c．前記容器（2）を横倒しにするプロセスを開始し；
d．前記容器（2）を横倒しにするプロセスの終了のタイミングを見積もり；
e．前記容器（2）を前記装置（1）とともに元の位置に戻し；
f．前記容器（2）を前記支持用ロッド（7）から取り出す操作を含む方法。
【請求項１１】
請求項1〜9のいずれか1項に記載の装置（1）を利用し、足場依存性細胞の細胞培地を収容したローラー・ボトル内の細胞培地を交換する方法。
【請求項１２】
前記細胞培地が無血清細胞培地である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記足場依存性細胞が組み換えタンパク質を発現する、請求項11または12に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、容器、その中でも特に細胞培養用容器を横倒しにするための改良された装置に関する、
【背景技術】
【０００２】
高等生物の細胞を大規模に培養するのに今日利用されている方法は、大きく2つのグループに分けられる。すなわち、撹拌している栄養培地の中に細胞を懸濁させる方法と、栄養培地を満たした固体支持体に細胞を付着させる方法である。固体支持体に付着する細胞は、一般に、“足場依存性”細胞と呼ばれる。栄養培地は、一般に、基本栄養素混合物を含む液体である。栄養培地には、生物抽出液として、それが存在していないと細胞はもはや生存できず、しかも増殖する能力を失うであろう生物抽出液（例えば哺乳動物の血液に由来する血清）も含まれていてよい。血清なしで細胞を増殖させて維持することのできる細胞培地がこれまでに開発されてきた。そのような培地は、一般に無血清培地と呼ばれる。
【０００３】
足場依存性細胞に関して今日最もよく利用されている方法の1つでは、培養容器としていわゆるローラー・ボトルが利用される。このボトルは、通常は、対応する回転をボトルに与えるローラー・ラックの中に配置される。ローラー・ボトルの中では細胞がボトルの内壁に付着するため、ボトルを連続的に回転させると細胞層（細胞層の厚さは1つの層に等しいことがしばしばあり、その場合には“単層”と呼ばれる）が栄養培地に接触し続ける。細胞をこのような培地の中で培養するときには、細胞は、培地の1種類以上の栄養素が使用し尽くされるまでの有限期間生き続ける。この時期が過ぎると、上記の単層を道連れにすることなく、または傷めることなく、ローラー・ボトルの中にある栄養培地の内容を空にする必要、または新鮮なものにする必要、または交換する必要がある。これは、空にする操作を極めて穏やかに、そして注意深く行なうことを意味する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上の説明に基づくと、現在のところ、ボトルを空にするという操作、しかも大規模な培養では非常に頻繁に実施せねばならない操作を、手で、または非常に高価で複雑なロボットを利用して行なっている。ボトルを手で横倒しにすると、この操作を毎日多数回実施する責任のある作業者に、手と肩に不快感をもたらす腱炎と、いわゆる手根管症候群の問題が発生する。ロボットを利用してボトルを横倒しにするときには、動きに柔らかさが欠けていることと、振動が存在することに起因する問題がある。その結果、単層が多くの場合に剥がれたり、傷んだりする。
【０００５】
本発明は、上記の制約を解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、容器（特に細胞を培養するためのローラー・ボトル）を横倒しにするための装置を開発することによって上記の問題点を解決することを目的とする。その結果、極めて穏やかで注意深い動きの横倒しがなされるため、ローラー・ボトルの中にある細胞培地を新鮮なものにする操作が、細胞培養層または単層が道連れにされたり傷んだりすることなく実施される。さらに、本発明の装置により、作業者は、交換せねばならない培地の入ったローラー・ボトルを装置の中に単に置くだけで、作業者が再度関与することなく、横倒しにする操作を装置がすべて実施する。したがって本発明により、単純で、安価で、効果的な装置が提供され、作業者の不快感が防止される。
【０００７】
本発明のこれらの特徴と利点、ならびに他の特徴と利点は、説明を目的とした単なる例示としての実施態様に関して添付の図面を参照して行なう以下の詳細な説明から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】容器を横倒しにするための本発明による装置の概略図である。
【図２】容器を横倒しにするための本発明による装置の概略図である。
【図３】容器を横倒しにするための本発明による装置の主要な作動要素の分解組立図である。
【図４ａ】容器を横倒しにするための本発明による装置のケーシングの締め具の平面図である。
【図４ｂ】容器を横倒しにするための本発明による装置のケーシングの締め具の断面図である。
【図５ａ】容器を横倒しにするための本発明による装置の伝動軸の図である。
【図５ｂ】容器を横倒しにするための本発明による装置の伝動軸の図である。
【図５ｃ】容器を横倒しにするための本発明による装置の伝動軸の図である。
【図６】容器を横倒しにするための本発明による装置のバーを締め付けるための締め付け用ワッシャーの断面図である。
【図７ａ】容器を横倒しにするための本発明による装置の回転アクチュエータのカバーの平面図である。
【図７ｂ】容器を横倒しにするための本発明による装置の回転アクチュエータのカバーの断面図である。
【図８】容器を横倒しにするための本発明による装置の減速装置のダイナミック・ブレーキの概略図である。
【図９】容器を横倒しにするための本発明による装置のロッドの概略図である。
【図１０ａ】容器を横倒しにするための本発明による装置のロッドの支持体の平面図である。
【図１０ｂ】容器を横倒しにするための本発明による装置のロッドの支持体の平面図である。
【図１１ａ】容器を横倒しにするための本発明による装置の伝動軸のシフターの平面図である。
【図１１ｂ】容器を横倒しにするための本発明による装置の伝動軸のシフターの断面図である。
【図１２】容器を横倒しにするための本発明による装置に付随する空気圧回路の回路図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
図1〜図3に示してあるように、容器2を横倒しにするための本発明による装置1は、伝動軸13によって減速装置4とダイナミック・ブレーキ5に接続されるラック-ピニオン・タイプの回転アクチュエータ3（空気圧式であることが好ましい）を収容するケーシング6と；支持体17と、その支持体17に接続されていて容器2を把持するロッド7を備えている。支持体17は、回転アクチュエータ3のカバーの表面に配置された伝動軸のシフター16により、その回転アクチュエータ3に接続されている。
【００１０】
本発明による回転アクチュエータ3に発生する可能性のある振動は、減速装置4とダイナミック・ブレーキ5を用いることによって阻止されるため、回転アクチュエータ3が容器2を横倒しにするときのその容器の運動は穏やかで非常に正確である。その結果、容器2の中に収容されている培養細胞が剥離するという望ましくない事態が阻止される。図12からわかるように、空気圧式であることが好ましい回転アクチュエータ3は、容器2を横倒しにしている時間（あらかじめ計算してタイミングを決めてある）の終了を示すタイマー19に接続された踏子18によって作動する。したがって装置1と支持体17およびロッド7は元の位置に戻る。本発明によれば、踏子18は空気圧式または電子式にすることが可能である。タイマー19も空気圧式または電子式にすることが可能だが、後者が好ましい。
【００１１】
図4aと図4bからわかるように、容器2を横倒しにするための装置1のケーシング6は、円形であることが好ましいステンレス鋼製の締め付け部分21を通じて把持ロッド20を締め付ける。この締め付け部分21は、把持ロッド20を通すための偏心したボアホールと、部分21を把持ロッド20とともに装置1のケーシング6に固定するための中央ボアホール22を備えている。
【００１２】
ダイナミック・ブレーキ5と減速装置4は、ステンレス鋼製であることが好ましい伝動軸13によって回転アクチュエータ3に接続されている。この伝動軸13は、図5a、図5b、図5cからわかるように、断面が円形の中央部またはシャフト23と、断面がやはり円形で同心だがシャフト23より直径が小さくて減速装置4と噛み合うシャフト24と、断面が複雑な形状で回転アクチュエータ3と噛み合う円板25を備えている。
【００１３】
図9、図10a、図10bからわかるように、横倒しにする容器2（ステンレス鋼製であることが好ましい）の把持ロッド7は、下部35と上部34を有する支持体17（やはりステンレ鋼製であることが好ましい）に固定される。下部35には、ロッド7のうちの第1のロッドを中に把持するいくつかの前面ボアホール31と、ロッド7のうちの第2のロッドを中に把持するいくつかの側面ボアホール32とが存在している。上部34にはボアホール33が存在していて、支持体17がその中を通過し、伝動軸のシフター16とカバー15を通じて回転アクチュエータ3に接続される。
【００１４】
図3と、図5の詳細図からわかるように、容器2を把持または支持するための把持ロッド7は、青銅製であることが好ましいワッシャー37を用いて支持体17に固定される。
【００１５】
図11aと図11bは、伝動軸のシフター16を示している。このシフター16は平坦な一対のプレート（ステンレス鋼製であることが好ましい）を備えていて、それぞれのプレートは一対のボアホールを有する。一方のボアホールはその平坦なプレートを回転アクチュエータのカバー15に固定するのに用いられるのに対し、他方のボアホールは伝動軸のシフター16をロッドの支持体17に固定するのに用いられる。シフターは、ロッドの支持体17の回転中心をカバー15の回転中心に対して移動させ、本発明が目的とする横倒し装置1をワーク・ステーションに合った状態にするためのものである。回転アクチュエータ3のカバー15は、そのカバーを回転アクチュエータ3（ステンレス鋼製であることが好ましい）に固定するための一対のボアホールを有する。
【００１６】
図12からわかるように、本発明による横倒し装置1の回転アクチュエータ3に付随する空気圧回路は、回転アクチュエータ3を複動空気圧シリンダの回転アクチュエータと同様にして作動させる。回転アクチュエータ3は、前方に運動させるための通常は閉じられた3/2方向踏子18（空気圧式であることが好ましい）と、後方に運動させるためのタイマー19（空気圧式であることが好ましい）とによって制御される5/2方向バルブ40により作動する。
【００１７】
したがって容器2を支持するための支持体17と支持ロッド7の設計は単純であり、作業者が利用するのは容易である。本発明の横倒し装置1も殺菌領域に配置されることが好ましいため、この装置の動作中は、この殺菌領域を汚染させる可能性のあるいかなる粒子の剥離も起こってはならない。したがって本発明による装置1の外側の部品はステンレス鋼製であることが好ましい。そのためその外側の部品のクリーニングを、その部品を腐食させない化学薬品を用いて容易に行なうことができる。
【００１８】
本発明はさらに、横倒しにするための装置1を操作する方法であって、
1．横倒しにするための装置1の支持用ロッド7の中に容器2を配置し；
2．その横倒しにするための装置1の回転アクチュエータ3を踏子18によって作動させ；
3．容器2を横倒しにするプロセスを開始し；
4．容器2を横倒しにするプロセスの終了のタイミングを見積もり；
5．容器2を装置1とともに元の位置に戻し；
6．容器2を支持用ロッド7から取り出す操作を含む方法に関する。
【００１９】
本発明はさらに、本発明による横倒しにするための装置（1）を利用し、足場依存性細胞の細胞培地を収容したローラー・ボトル内の細胞培地を交換する方法に関する。
【００２０】
ローラー・ボトルの中で培養できる足場依存性細胞の例として、3T3細胞、COS細胞、ヒト骨肉腫細胞、MRC-5細胞、BHK細胞、VERO細胞、CHO細胞、rCHO-tPA細胞、rCHO-Hep B表面抗原細胞、NS0細胞、HEK 293細胞、rHEK 293細胞、C127細胞、正常なヒト線維芽細胞、ストローマ細胞、肝細胞、PER.C6細胞などの哺乳動物の細胞がある。
【００２１】
好ましい一実施態様では、細胞培地は無血清培地である。
【００２２】
従来技術で知られていて市販されている無血清培地の例として、例えば、SFM 90（JRH社、67350）、SFM 90.1（JRH社、67350）、Supmed300または改変Supmed300（JRH社、67350）、DMEM（Gibco、7490571）、DMEM/F12（Gibco、99.5043）、SFM CHO 3a（BioWhi Haker）、CHO PFM（Sigma、C6970）、ProCHO 5、EX-CELL培地（例えばEX-CELL 302（例えばJRH社、カタログ番号14312-1000M）またはEX-CELL 325（JRH社、カタログ番号14335-1000M））、CHO-CD3（Sigma、カタログ番号C-1490）、CHO III PFM（Gibco、カタログ番号96-0334SA）、CHO-S-SFM II（Gibco、カタログ番号12052-098）、CHO-DHFR（シグマ社、カタログ番号C-8862）、ProCHO 5（Cambrex、カタログ番号BE12-766Q）、SFM4CHO（HyClone、カタログ番号SH30549.01）、Ultra CHO（Cambrex、カタログ番号12-724Q）、HyQ PF CHO（HyClone、カタログ番号SH30220.01）、HyQ SFX CHO（HyClone、カタログ番号SH30187.01）、HyQ CDM4CHO（HyClone、カタログ番号SH30558.01）、IS CHO-CD（Inrvine Scientific、カタログ番号#91119）、IS CHO-V（Inrvine Scientific、カタログ番号#9197）と、これらの派生物がある。
【００２３】
さらに別の好ましい一実施態様では、足場依存性細胞は組み換えタンパク質を発現する。
【００２４】
そのような組み換えタンパク質として、例えば、絨毛性性腺刺激ホルモン、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン-絨毛性性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン（特にヒト成長ホルモン）、インターフェロン（IFN）（IFN-α、IFN-β、IFN-γなど）、インターフェロン受容体（例えばインターフェロンγ受容体）、TNF受容体P55とp75、TACI-Fc融合タンパク質、インターロイキン（例えばインターロイキン-2、インターロイキン-11）、インターロイキン結合タンパク質（例えばインターロイキン-18結合タンパク質）、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球-マクロファージコロニー-刺激因子、下垂体ペプチド・ホルモン、更年期ゴナドトロピン、インスリン様増殖因子（例えばソマトメジン-C）、角質細胞増殖因子、グリア細胞由来神経栄養因子、トロンボモジュリン、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン、VIII因子、ソマトロピン、骨形成タンパク質-2、血小板由来増殖因子、ヒルジン、エポイエチン、組み換えLFA-3/IgG1融合タンパク質、グルコセレブロシダーゼ、ムテイン、ならびにこれらの断片、可溶形態、機能性誘導体、融合タンパク質などがある。さらに、足場依存性細胞によって発現させることのできる組み換えタンパク質として、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、イブリツモマブ、ベバシズマブ、オマリズマブなどの抗体が可能である。
【００２５】
本発明を好ましい実施態様に関して完全に説明したが、本発明がこれら実施態様に限定されると考えてはならず、以下の請求項に規定されている範囲に含まれるあらゆる変更を導入できる。
【図１】
2010536325.tif 000003
【図２】
2010536325.tif 000004
【図３】
2010536325.tif 000005
【図４ａ】
2010536325.tif 000006
【図４ｂ】
2010536325.tif 000007
【図５ａ】
2010536325.tif 000008
【図５ｂ】
2010536325.tif 000009
【図５ｃ】
2010536325.tif 000010
【図６】
2010536325.tif 000011
【図７ａ】
2010536325.tif 000012
【図７ｂ】
2010536325.tif 000013
【図８】
2010536325.tif 000014
【図９】
2010536325.tif 000015
【図１０ａ】
2010536325.tif 000016
【図１０ｂ】
2010536325.tif 000017
【図１１ａ】
2010536325.tif 000018
【図１１ｂ】
2010536325.tif 000019
【図１２】
2010536325.tif 000020
【国際調査報告】
2010536325.tif 000021
2010536325.tif 000022
2010536325.tif 000023