(57)【要約】  Ａｂのモノマー形態に対するよりも高い親和性でＡｂのダイマー形態に結合し、そしてＡβ（２１−３７）を含んでなるＡβポリペプチドに結合する場合、タンパク質分解消化からＡβ（２１−３７）を遮蔽する単離されたモノクローナルヒト抗／３アミロイド抗体を提供する。抗体は、線維形成を阻害し、そしてインビボでプラークサイズを減少し、そして脳血管壁には結合しないことを示した。従って、抗体は、ヒトおよび獣医学において、アルツハイマー病および他の神経性認知症疾患の処置および予防に有用である。神経性認知症疾患の進行を検出または測定する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群の少なくとも２つのコンセンサスアミノ酸配列から選択される１を超えるアミノ酸配列を含んでなる単離されたモノクローナルヒト抗βアミロイド抗体であって、ここで、前記１を超えるアミノ酸配列のそれぞれは異なる配列番号由来であり、ここで、前記抗体は、Ａβのモノマー形態に対するよりも高い親和性でＡβのダイマー形態に結合する、単離されたモノクローナルヒト抗βアミロイド抗体。
【請求項２】
前記抗体は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群の少なくとも３つのコンセンサスアミノ酸配列から選択される２を超えるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、前記２を超えるアミノ酸配列のそれぞれは異なる配列番号由来である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群の少なくとも４つのコンセンサスアミノ酸配列から選択される３を超えるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、前記３を超えるアミノ酸配列のそれぞれは異なる配列番号由来である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群の少なくとも５つのコンセンサスアミノ酸配列から選択される４を超えるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、前記４を超えるアミノ酸配列のそれぞれは異なる配列番号由来である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のコンセンサスアミノ酸配列のそれぞれに由来するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体は、特異的軽鎖ＣＤＲであるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３としてそれぞれ配列番号３３、配列番号４１；配列番号４５ならびに特異的重鎖ＣＤＲであるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として配列番号１５；配列番号２３および配列番号２９のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体は、配列番号５３および配列番号６０のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体は、配列番号１４５および配列番号６０、配列番号５１および配列番号６０、配列番号５２および配列番号６０、配列番号１４６および配列番号６０、配列番号５３および配列番号１４８、配列番号５５および配列番号６１、または配列番号１４５および配列番号６２のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体は、配列番号１４５および配列番号６０、配列番号５１および配列番号６０、配列番号５２および配列番号６０、配列番号１４６および配列番号６０、配列番号５３および配列番号１４８、配列番号５５および配列番号６１、または配列番号１４５および配列番号６２のアミノ酸配列由来のＣＤＲを含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体はＡβ（２１−３７）を含んでなるペプチドに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体は、Ａβ（２１−３７）を含んでなるＡβポリペプチドに結合する場合、タンパク質分解消化からＡβ（２１−３７）を遮蔽する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体がＮＨＳ−活性化６−アミノヘキサン酸−結合セファロースに結合する場合、前記抗体は、Ａβ部分ポリペプチドＡβ（１２−４０）またはＡβ（２０−３７）に特異的に結合するが、Ａβ（１７−２８）、Ａβ（２５−３５）またはＡβ（３１−４０）に特異的には結合しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体は、Ａβ（２１−３７）を含んでなるＡβポリペプチドに結合する場合、タンパク質分解消化からＡβ（２１−３７）を遮蔽する、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
請求項１に記載の抗体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１５】
患者における神経性認知症疾患（neurodementing disease）を予防または処置する方法であって、治療上許容可能な量の請求項１に記載の抗体を前記患者に投与する工程を含んでなる、方法。
【請求項１６】
前記神経性認知症疾患は、アルツハイマー病、ダウン症候群、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、脳アミロイド血管症およびアミロイドーシスからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記神経性認知症疾患はアルツハイマー病である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
神経性認知症疾患を処置するか、または神経性認知症疾患の進行を緩慢にするかもしくは防止するための医薬品の製造のための請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１９】
前記神経性認知症疾患は、アルツハイマー病、ダウン症候群、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、脳アミロイド血管症およびアミロイドーシスからなる群から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記神経性認知症疾患はアルツハイマー病である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
患者における神経性認知症疾患の進行を検出または測定する方法であって、
（Ａ）前記患者由来のサンプルにおいて、第１のＡβペプチドに対する抗体価を測定する工程であって、ここで、前記第１のＡβペプチドは、少なくともＡβ（３０−３７）に従う配列および多くともＡβ（１２−４０）に従う配列を含んでなる工程と；
（Ｂ）前記患者由来のサンプルにおいて、第２のＡβペプチドに対する抗体価を測定する工程であって、ここで、前記第２のＡβペプチドは、少なくともＡβ（４−１０）に従う配列および多くともＡβ（１−２０）に従う配列を含んでなる工程と；
（Ｃ）工程（Ａ）および（Ｂ）由来の力価を比較する工程と、
を含んでなる、方法。
【請求項２２】
前記神経性認知症疾患は、アルツハイマー病、ダウン症候群、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、脳アミロイド血管症およびアミロイドーシスからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記神経性認知症疾患はアルツハイマー病である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
第１のＡβペプチドは、少なくともＡβ（２１−３７）に従う配列を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者の力価と、正常およびＡＤ患者について決定された力価とを比較する工程をさらに含んでなり、ここで、前記第１のＡβペプチドに対してのより高い力価が、アルツハイマー病の発症および／または進行のより低いリスクに相関する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記患者の力価と、正常およびＡＤ患者について決定された力価とを比較する工程をさらに含んでなり、ここで、前記第２のＡβペプチドに対する力価と比べて、前記第１のＡβペプチドに対してのより高い力価が、アルツハイマー病の発症および／または進行のより低いリスクに相関する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記患者の力価と、正常およびＡＤ患者について決定された力価とを比較する工程をさらに含んでなり、ここで、前記第２のＡβペプチドに対してのより高い力価が、アルツハイマー病の発症および／または進行のより高いリスクに相関する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記患者の力価と、正常およびＡＤ患者について決定された力価とを比較する工程をさらに含んでなり、ここで、前記第１のＡβペプチドに対する力価と比べて、前記第２のＡβペプチドに対してのより高い力価が、アルツハイマー病の発症および／または進行のより高いリスクに相関する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
患者における神経性認知症疾患の進行を検出または測定する方法であって、
Ａ）所定の時点において前記患者から第１のサンプルを入手する工程と；
Ｂ）より後の時点において前記患者から第２のサンプルを入手する工程と；
Ｃ）前記第１および第２のサンプルにおいて、少なくともＡβ（３０−３７）および多くともＡβ（１２−４０）を含んでなるエピトープに対する抗体価を測定する工程と；
Ｄ）前記第１および第２のサンプルの力価を比較する工程と、
を含んでなる、方法。
【請求項３０】
患者における神経性認知症疾患の進行を検出または測定する方法であって、
Ａ）所定の時点において前記患者から第１のサンプルを入手する工程と；
Ｂ）より後の時点において前記患者から第２のサンプルを入手する工程と；
Ｃ）前記第１および第２のサンプルにおいて、少なくともＡβ（４−１０）および多くともＡβ（１−２０）を含んでなるエピトープに対する抗体価を測定する工程と；
Ｄ）前記第１および第２のサンプルの力価を比較する工程と、
を含んでなる、方法。
【請求項３１】
患者における神経性認知症疾患の進行を検出または測定する方法であって、
Ａ）所定の時点において前記患者から第１のサンプルを入手する工程と；
Ｂ）より後の時点において前記患者から第２のサンプルを入手する工程と；
Ｃ）前記第１および第２のサンプルにおいて、Ａβ（３０−３７）を含んでなるエピトープに対する抗体価を測定する工程と；
Ｄ）前記第１および第２のサンプルの力価を比較する工程と、
を含んでなる、方法。
【請求項３２】
（Ａ）少なくともＡβ（３０−３７）に従う配列および多くともＡβ（１２−４０）に従う配列を含んでなる第１のＡβペプチドと、
（Ｂ）少なくともＡβ（４−１０）に従う配列および多くともＡβ（１−２０）に従う配列を含んでなる第２のＡβペプチドと、
を含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に関する情報
本出願は、２００７年１月１１日に出願された特許文献１、および２００７年１月１１日に出願された特許文献２、および２００７年１０月２２日に出願された特許文献３、および２００７年１０月２２日に出願された特許文献４、および２００７年１月１１日に出願された特許文献５、および２００７年１月１１日に出願された特許文献６、および２００７年１０月２２日に出願された特許文献７、および２００７年１０月２２日に出願された特許文献８（これらのすべては、それらの全体が本明細書において参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、高齢者集団に最も多く見られる認知症の形態（罹患率：１０００／１００，０００；＞６５歳）であり、先進国における死亡原因の第４位である。皮質萎縮、神経細胞消失、領域特異的アミロイド沈着、神経炎性斑、および神経原線維変化は、ＡＤ脳において重要な神経病理学的特徴である。これらの変質は、臨床的にＡＤを定義する認知機能低下に関連すると考えられる。これらのマーカー内で、神経炎性斑は、アミロイド免疫反応性、チオフラビンポジティブであり、そして星膠症、小膠細胞症、細胞骨格変化、およびシナプス消失によって達成される。斑内の神経炎性退行（ｎｅｕｒｉｔｉｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の程度は、認知症の臨床パラメータに相関する。神経炎性斑は、ＡＤ脳の辺縁系の構造および関連する新皮質において通常中程度〜多数見出される球状の多細胞病巣である。これらの斑は、ペプチドの非線維性形態と混合した豊富なアミロイド線維を含むアミロイド−βペプチド（Ａβ）の細胞外沈着からなる。そのような斑はまた、線維性アミロイドコアの極めて近くにしばしば位置する様々な数の活動性ミクログリア、ならびにコア周辺の反応性星細胞を含有する。
【０００３】
神経炎性斑の主要構成分、β−アミロイドポリペプチド（Ａβ）は、前駆体タンパク質、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から生じる（Ｋａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｔａｎｚｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。Ａβは、正常細胞によって産生され、そして健常なヒトの血漿および脳脊髄液（ＣＳＦ）における循環ペプチドとして検出することができる。脳におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の生理学的役割はあまり理解されていないが、ＡＰＰにおけるミスセンス変異はＡＤの常染色体優性遺伝を付与し（ＦＡＤ）、そして潜在的に重要な発症メカニズムを解明する。Ａβ、神経炎性斑におけるＡＰＰの３９〜４２アミノ酸タンパク質分解産物の蓄積（解剖時の構造は、ＡＤの確定診断の神経病理学的基準を満たす）は、疾患進行の原因であると考えられる。ＡＰＰの主なＡβ切断産物はＡβ（１−４２）ポリペプチドであるが、Ｃ末端側のより短いＡβペプチド（３９〜４１）もまた、膜におけるタンパク質分解（γ−セクレターゼ）切断によって産生される。Ａβ（１−４２）のＮ末端部はＡＰＰの細胞外領域に局在し、そしてＡβペプチドの主なＣ末端部は、膜貫通ドメインに含有される。
【０００４】
ＦＡＤに関連するＡＰＰにおけるミスセンス変異は、Ａβドメイン付近で生じ、そして４ｋＤａのＡβペプチドの産生の増加をもたらす。ＡＤでは、Ａβの合成の増加および／またはクリアランスの減少は、アミロイド斑沈着、およびそれに続いて、疾患に関連する神経病理学的変化をもたらし得ると仮定されている。合成Ａβペプチドを使用するインビトロ研究は、神経毒性は、線維性であり、そしてβ−プリーツシートコンフォメーションにおいて優性であるＡβに依存することを示している。
【０００５】
主要産物としてβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の神経毒性アミロイドペプチドフラグメント（Ａβ）を含有する細胞外の斑の蓄積は、アルツハイマー病（ＡＤ）の特徴の１つである。ＡＰＰは、ＡＤに対する重要な分子として認識されているが、ＡＰＰの分子（病態）生理学的退行およびタンパク質分解経路、ならびにＡβペプチドの細胞相互作用および生化学的運命についてはなお不明である。Ａβ誘導性の斑の形成および沈着のための分解経路および細胞輸送に関する詳細は欠如しているにもかかわらず、Ａβ（１−４２）から産生される治療効果のある抗体に基づくＡＤの免疫方法の開発に対する最近の研究は、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて最初の成功を収めている。いくつかの報告は、Ａβ（１−４２）による免疫によって生じる抗体は、Ａβ線維を崩壊することによってＡβ斑の形成を阻害することが可能であり、そしてマウスの空間記憶の損傷を改善することを実証している。トランスジェニックＡＰＰＶ７１７Ｆマウス（ＴＧマウス）は、Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）の加齢および領域依存的沈着を伴うＡＤ−様斑の病理の良好に特徴付けられたモデルである（Ｇａｍｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。最近、Ｓｃｈｅｎｋらおよび他の者は、プレ凝集Ａβ（１−４２）による免疫またはＡβに対する抗体の投与後のＡＰＰＶ７１７Ｆ  ＴＧマウスにおけるＡβの沈着の変化について調べた（Ｂａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓｃｈｅｎｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。Ａβ抗体の免疫および投与は、両方とも、アミロイド斑沈着、神経炎性ジストロフィー、および星膠症を有意に減弱した。これらの研究では、マウス抗ヒトＡβ抗体の力価の増加は、斑負荷量の観察される減少に必要であった。これらの所見は、Ａβ抗原：抗体複合体の形成およびクリアランスが、中枢神経系内の抗体生成後または血液脳関門（ＢＢＢ）を通る末梢抗体輸送によるかのいずれかで脳Ａβ沈着を減少し得る可能性を引き起こす。さらに、受動免疫は、ＣＮＳと血漿との間のＡβ平衡を変更することによって、脳Ａβ負荷量を減少するようである（ＤｅＭａｔｔｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）。意外なことに、能動または受動免疫は、ＡＰＰＶ７１７Ｆマウスまたは他のＡＰＰトランスジェニックマウスにおける行動および記憶障害を有意に反転する（Ｄｏｄａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｊａｎｕｓ，ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｍｏｒｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０００）。これらの結果は、おそらく、Ａβの可溶性プールを変更することによって、記憶欠損を予防し得ることを示唆する。それ故、能動または受動免疫によるＡＤ患者の処置は、Ａβペプチドの産生、クリアランス、および凝集を標的化するいくつかの新興の臨床アプローチの１つである。
【０００６】
これらの結果に基づいて、能動免疫手順［Ａβ（１−４２）ペプチドおよび／またはそのプレ凝集体；アジュバント：ＱＳ２１］を使用する臨床治験を、確定されたＡＤ患者の処置のために開始した。都合の悪いことに、重度の副作用が生じ（「髄膜脳炎」）、そして臨床治験は停止された。この臨床治験において能動免疫で処置したＡＤ患者（ｎ＝３０）のサブグループについて解析が行われた（Ｈｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｈｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，２００３）。著者らは、（ｉ）免疫は、Ａβ（１−４２）に対する抗体の産生を誘導すること、および（ｉｉ）抗体の産生が観察可能である患者では、非処置コントロールグループと比較して、認知機能低下が有意に減少したことを実証した。著者らは、免疫がＡＤの治療選択肢であり得ると結論付けた。
【０００７】
最近の研究により、Ａβ（１−４２）による免疫時に産生される抗体の認識特性がより詳細に解明された。この研究は、トランスジェニックＡＤマウスにおいて生成される抗体によって認識される特異的なＡβエピトープの同定をもたらした（ＭｃＬａｕｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｐｒｚｙｂｙｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。これらの結果は、抗原エピトープの同定のための高感度かつ特異性のバイオ分析ツールとして高分解能質量分析（ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）と組み合わされた選択的なタンパク質分解摘出技術（エピトープ−摘出）を使用して、得られている（Ｍａｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ  １９９６；Ｓｕｃｋａｕ  ｅｔ  ａｌ  １９９２；Ｍａｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．２００４；図１、２を参照のこと））。固定化されたＡβ抗原−免疫複合体の質量分析エピトープ摘出を使用して、エピトープは、Ａβ（１−４２）の残基（４〜１０）（ＦＲＨＤＳＧＹ）からなることが同定された。この認識構造の選択性は、ＡＤ斑由来の同一のエピトープ、Ａβ−原線維からのＡβ（１−４２）抽出物、化学的に合成されたＡβ（１−４２）、およびＮ末端Ａβ配列を含んでなる他の（Ａβ−非依存的）ポリペプチドの解明によって確かめられた（Ｐｒｚｙｂｙｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。
【０００８】
天然に存在する抗Ａβ自己抗体（Ａβ自己抗体）は、免疫していないヒト由来の血液およびＣＳＦの両方において、Ｄｕらにより同定された（Ｄｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）。これらの抗体は、免疫沈降（Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）およびＥＬＩＳＡによって示されているように、ヒトＡβを特異的に認識する。さらに、抗体は、合成Ａβ（１−４０）、ならびにＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスの脳に沈着したヒトＡβを容易に認識する。加えて、Ａβペプチドの線維化／オリゴマー化および神経毒性は、Ａβ自己抗体の存在下で減少した（Ｄｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０００９】
さらに、アルツハイマー病患者におけるＡβ自己抗体濃度について、コントロールと比較して差異が認められるかどうかが調べられている。興味深いことに、２つのグループの間に有意な差異が見出され、アルツハイマー病患者におけるＡβに対する抗体の力価の実質的な減少（約１５〜２０倍）がもたらされた。これらの結果は、他のグループによって、最近確認されている（Ｗｅｋｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。Ａβに対する抗体はまた、市販の静脈内ＩｇＧ製剤（ＩＶＩｇＧ）においても検出することができる。これらの静脈内免疫グロブリン製剤による異なる神経疾患患者の処置は、ＣＳＦにおけるＡβ濃度の減少をもたらした（Ｄｏｄｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，２００２）。Ａβ斑沈着に対する予防および保護におけるＡβ自己抗体の実質的な効果もまた、若年（４箇月）ＡＰＰ−トランスジェニック（ＴｇＣＲＮＤ８）マウスにおいて確立された。さらに、ＩＶＩｇＧを利用した５例のＡＤ患者によるパイロット治験において、ＩＶＩｇＧの投与時に、全Ａβは、ＣＳＦでは有意に減少し、そして血清では増加した（Ｄｏｄｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）。調べられた５例の患者において、６箇月の観察期間中、認知低下は観察されなかった。これらの結果は、ＩＶＩｇＧで処置した８例のＡＤ患者に関与する最近のパイロット研究によって確認されている（Ｒｅｌｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００１０】
しかし、治療用Ａβ自己抗体の割合が低いため、ＡＤ患者にＩＶＩｇＧを投与することは簡便ではなく、そして高い費用を伴う。この製剤におけるＩｇＧの大部分は、Ａβ特異的ではなく、そして所望されない影響をもたらし得る。さらに、ＩＶＩｇＧの供給源は制限されており、これは、アルツハイマー病患者の罹患率を考慮すると許容できない欠点である。
【００１１】
ＡＤおよび他の神経性認知症疾患の進行を検出およびモニターする方法も同様に不十分である。現行のＡＤ診断は、次の３つのグループに当てはまる：（ｉ）遺伝的危険因子または変異の決定（主に、ＦＡＤ症例についてであり、孤発性ＡＤの診断についてではない）；（ｉｉ）神経画像処理方法；および（ｉｉｉ）生化学的／生物学的マーカーに基づく診断。バイオマーカーに基づく診断手順の開発に関する現在の研究は、主にＣＳＦに集中しているが、これは、そのような方法は、複雑な侵襲的材料を必要とするという重大な欠点を有する。脳由来のバイオマーカーに関連する主な問題は、臨床的に試験したコントロールもまた、しばしば、前臨床的なＡＤ病変を伴う被験体を含むことである。さらに、現行の利用可能なバイオマーカーは、特異性が低いという主要な欠点を有する。ＡＤにおける血液脳関門の推定された変化から生じる潜在的脳バイオマーカーとして脳プロテオミクスアプローチによって同定される前頭皮質において発現される一連のタンパク質についても、同様の欠点が認められている。
【００１２】
血漿および血清中のバイオマーカーに関する研究は、主に、ＳＰ（老人斑）ならびにＮＦＴ（神経原線維変化）成分、例えば、ＡβペプチドＡβ（１−４０）（配列番号１）およびＡβ（１−４２）（高レベルで見出される）ならびに過剰リン酸化タウタンパク質の測定によって実施されている。しかし、Ａβ測定の特異性、ならびに早期および鑑別診断のための適用については、不確定であるとみなされており、これは、既に進行している神経変性のマーカーとして説明されているタンパク質タウ測定の場合でも同じである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国仮特許出願第６０／８８４，５１３号明細書
【特許文献２】米国仮特許出願第６０／８８４，５２６号明細書
【特許文献３】米国仮特許出願第６０／９８１，６６７号明細書
【特許文献４】米国仮特許出願第６０／９８１，６７５号明細書
【特許文献５】欧州特許出願公開第０７０００５０７．９号明細書
【特許文献６】欧州特許出願公開第０７０００５２１．０号明細書
【特許文献７】欧州特許出願公開第０７１１９００２．９号明細書
【特許文献８】欧州特許出願公開第０７１１９０２６．８号明細書
【特許文献９】欧州特許第４０４，０９７号明細書
【特許文献１０】国際公開第９３／１１１６１号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第９６／３２４７８号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第９１／１７２７１号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第９２／０１０４７号パンフレット
【特許文献１４】米国特許第４，７６７，７０４号明細書
【特許文献１５】米国特許第４，６５７，８６６号明細書
【特許文献１６】米国特許第４，９２７，７６２号明細書
【特許文献１７】米国特許第４，５６０，６５５号明細書
【特許文献１８】米国特許第５，１２２，４６９号明細書
【特許文献１９】国際公開第９０１０３４３０号パンフレット
【特許文献２０】国際公開第８７／００１９５号パンフレット
【特許文献２１】米国再発行特許発明第３０，９８５号明細書
【特許文献２２】独国特許第１９９２６０６８号明細書
【特許文献２３】米国特許第２００３／０１１３３１６号明細書
【特許文献２４】米国特許第６，１７１，５８６号明細書
【特許文献２５】米国特許第３，７７３，９１９号明細書
【特許文献２６】米国特許出願公開第２００３／００８２１９１号明細書
【特許文献２７】国際公開第０３／０２０２１２号パンフレット
【特許文献２８】米国特許第７，１９５，７６１Ｂ２号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．＆  Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ９１−３４４２  ５ｔｈ  Ｅｄ．
【非特許文献２】Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｓ．Ｄｕｅｂｅｌ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ２００１
【非特許文献３】Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．３，Ｆｒａｎｋ  Ｃ．Ｈａｙ  ＆  Ｏｌｗｙｎ  Ｍ．Ｒ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  （２００２）
【非特許文献４】Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ：Ｂａｓｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，Ｃｈ．１６，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｔ．Ｌｏｔｚｅ  ＆  Ａｎｇｕｓ  Ｗ．Ｔｈｏｍｓｏｎ（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２００５）
【非特許文献５】Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）
【非特許文献６】Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）
【非特許文献７】Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）
【非特許文献８】Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）
【非特許文献９】Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）
【非特許文献１０】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献１１】Ｃａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）
【非特許文献１２】Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３−５４６７
【非特許文献１３】Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０）
【非特許文献１４】Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）
【非特許文献１５】Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）
【非特許文献１６】Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）
【非特許文献１７】Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）
【非特許文献１８】Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）
【非特許文献１９】Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３）
【非特許文献２０】Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６）
【非特許文献２１】Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００），２９７（５）ｐ．１１０５−１１２０
【非特許文献２２】Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００５，５（１１），ｐ．１４５３−６２
【非特許文献２３】Ｓｃｈｉｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００３  ６０（３）：ｐ．４３３−４４５
【非特許文献２４】Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）
【非特許文献２５】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ３８，Ｎｕｍｂｅｒ２，ｐａｇｅｓ４８−５９（１９８４）
【非特許文献２６】Ｃｈｅｎ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｖｏｌｕｍｅ１８，Ｎｕｍｂｅｒｓ１１  ａｎｄ  １２，ｐａｇｅｓ１３１１−１３５４（１９９２）
【非特許文献２７】Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ７４，ｐａｇｅｓ２２５−２３９（１９９１）
【非特許文献２８】Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，４６：３２−４３，２００４
【非特許文献２９】Ｍｉｓｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．，６：２５２−２７３，２００３
【非特許文献３０】Ｂｅｇｌｅｙ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００４  Ｏｃｔ；１０４（１）：２９−４５
【非特許文献３１】Ｐｏｄｕｓｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４３：６０６４−６０７５，２００４
【非特許文献３２】Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．２００４  Ｏｃｔ  １；１１７（Ｐｔ２１）：５０７１−８
【非特許文献３３】Ｓａｍｂｒｏｃｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３．ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献３４】Ｐｆｅｉｆｅｒ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ  ａｆｔｅｒ  ｐａｓｓｉｖｅ  ａｎｔｉ−Ａｂｅｔａ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１３７９
【非特許文献３５】Ｈｅｒｚｉｇ  ＭＣ，  ｅｔ  ａｌ  （２００４）：  Ａｂｅｔａ  ｉｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ  ｗｉｔｈ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ．  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ７：９５４−９６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、ＡＤのような神経性認知症疾患（neurodementing diseases）を処置および検出する改善された方法の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一態様では、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群の少なくとも２つのコンセンサスアミノ酸配列から選択される１を超えるアミノ酸配列を含んでなる単離されたモノクローナルヒト抗βアミロイド抗体が提供され、ここで、前記１を超えるアミノ酸配列のそれぞれは異なる配列番号由来であり、ここで、前記抗体は、Ａβのモノマー形態に対するよりも高い親和性でＡβのダイマー形態に結合する。
【００１７】
一実施形態では、抗体は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群の少なくとも３つのコンセンサスアミノ酸配列から選択される２を超えるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、前記２を超えるアミノ酸配列のそれぞれは異なる配列番号由来である。別において、抗体は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群の少なくとも４つのコンセンサスアミノ酸配列から選択される３を超えるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、前記３を超えるアミノ酸配列のそれぞれは異なる配列番号由来である。なお別の実施形態では、抗体は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群の少なくとも５つのコンセンサスアミノ酸配列から選択される４を超えるアミノ酸配列を含んでなり、ここで、前記４を超えるアミノ酸配列のそれぞれは異なる配列番号由来である。別の実施形態では、抗体は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のコンセンサスアミノ酸配列のそれぞれに由来するアミノ酸配列を含んでなる。
【００１８】
一実施形態では、抗体は、特異的軽鎖ＣＤＲであるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３としてそれぞれ配列番号３３、配列番号４１；配列番号４５ならびに特異的重鎖ＣＤＲであるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として配列番号１５；配列番号２３および配列番号２９のアミノ酸配列を含んでなる一方、別において、抗体は、配列番号５３および配列番号６０のアミノ酸配列を含んでなる。他の実施形態では、抗体は、配列番号１４５および配列番号６０、配列番号５１および配列番号６０、配列番号５２および配列番号６０、配列番号１４６および配列番号６０、配列番号５３および配列番号１４８、配列番号５５および配列番号６１、または配列番号１４５および配列番号６２のアミノ酸配列を含んでなる。抗体はまた、配列番号１４５および配列番号６０、配列番号５１および配列番号６０、配列番号５２および配列番号６０、配列番号１４６および配列番号６０、配列番号５３および配列番号１４８、配列番号５５および配列番号６１、または配列番号１４５および配列番号６２のアミノ酸配列由来のＣＤＲを含んでなることができる。
【００１９】
別の態様では、抗体はＡβ（２１−３７）を含んでなるペプチドに結合する一方、別では、Ａβ（２１−３７）を含んでなるＡβポリペプチドに結合する場合、抗体は、タンパク質分解消化からＡβ（２１−３７）の残基を遮蔽する。別において、抗体がＮＨＳ−活性化６−アミノヘキサン酸結合セファロースに結合する場合、そのような抗体は、Ａβ（１２−４０）またはＡβ（２０−３７）に特異的に結合するが、Ａβ（１７−２８）、Ａβ（２５−３５）またはＡβ（３１−４０）に特異的には結合しない。
【００２０】
本発明の抗βアミロイド抗体はまた、医薬組成物としても処方され得る。
【００２１】
別の態様では、患者における神経性認知症疾患を予防または処置する方法は、治療上許容可能な量の本発明の抗βアミロイド抗体を患者に投与することを含んでなる。そのような方法は、アルツハイマー病、ダウン症候群、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、脳アミロイド血管症およびアミロイドーシスからなる群から選択される神経性認知症疾患の予防または処置において使用することができる。好適な実施形態では、神経性認知症疾患はアルツハイマー病である。
【００２２】
別の実施形態では、本発明の抗βアミロイド抗体は、神経性認知症疾患を処置するか、または神経性認知症疾患の進行を緩慢にするかもしくは予防するための医薬品の製造のために使用することができる。
【００２３】
別の態様では、患者における神経性認知症疾患の進行を検出または測定する方法であって、（Ａ）前記患者由来のサンプルにおいて、第１のＡβペプチドに対する抗体価を測定する工程であって、ここで、第１のＡβペプチドは、少なくともＡβ（３０−３７）に従う配列および多くともＡβ（１２−４０）に従う配列を含んでなる工程と；（Ｂ）前記患者由来のサンプルにおいて、第２のＡβペプチドに対する抗体価を測定する工程であって、ここで、第２のＡβペプチドは、少なくともＡβ（４−１０）に従う配列および多くともＡβ（１−２０）に従う配列を含んでなる工程と；（Ｃ）工程（Ａ）および（Ｂ）の力価を比較する工程と、を含んでなる方法が提供される。いくつかの実施形態では、第１のＡβペプチドは、少なくともＡβ（２１−３７）に従う配列を含んでなる。別の実施形態では、本方法は、患者の力価と、健常なドナーおよびＡＤ患者について決定された力価とを比較することをさらに含んでなり、ここで、第１のＡβペプチドに対してのより高い力価は、アルツハイマー病の発症および／または進行のより低いリスクに相関する。本方法はまた、患者の力価と、健常なドナーおよびＡＤ患者について決定された力価とを比較することをさらに含んでなり得、ここで、第２のＡβペプチドに対する力価と比べて、第１のＡβペプチドに対してのより高い力価は、アルツハイマー病の発症および／または進行のより低いリスクに相関する。あるいは、本方法は、患者の力価と、健常なドナーおよびＡＤ患者について決定された力価とを比較する工程をさらに含んでなり得、ここで、第２のＡβペプチドに対してのより高い力価は、アルツハイマー病の発症および／または進行のより高いリスクに相関する。別の実施形態では、本方法は、患者の力価と、健常なドナーおよびＡＤ患者について決定された力価とを比較する工程をさらに含んでなり、ここで、第１のＡβペプチドに対する力価と比べて、第２のＡβペプチドに対してのより高い力価は、アルツハイマー病の発症および／または進行のより高いリスクに相関する。
【００２４】
患者における神経性認知症疾患の進行を検出または測定する方法であって、Ａ）所定の時点において前記患者から第１のサンプルを入手する工程と；Ｂ）より後の時点において前記患者から第２のサンプルを入手する工程と；Ｃ）前記第１および第２のサンプルにおいて、少なくともＡβ（３０−３７）および多くともＡβ（１２−４０）を含んでなるエピトープに対する抗体価を測定する工程と；Ｄ）前記第１および第２のサンプルの力価を比較する工程と、を含んでなる方法もまた、提供される。他のそのような方法は、Ａ）所定の時点において前記患者から第１のサンプルを入手する工程と；Ｂ）より後の時点において前記患者から第２のサンプルを入手する工程と；Ｃ）前記第１および第２のサンプルにおいて、少なくともＡβ（４−１０）および多くともＡβ（１−２０）を含んでなるエピトープに対する抗体価を測定する工程と；Ｄ）前記第１および第２のサンプルの力価を比較する工程とを含んでなる。他の実施形態では、そのような方法は、Ａ）所定の時点において前記患者から第１のサンプルを入手する工程と；Ｂ）より後の時点において前記患者から第２のサンプルを入手する工程と；Ｃ）前記第１および第２のサンプルにおいて、Ａβ（３０−３７）を含んでなるエピトープに対する抗体価を測定する工程と；Ｄ）前記第１および第２のサンプルの力価を比較する工程とを含んでなる。
【００２５】
別の態様では、（Ａ）少なくともＡβ（３０−３７）に従う配列および多くともＡβ（１２−４０）に従う配列を含んでなる第１のＡβペプチドと、（Ｂ）少なくともＡβ（４−１０）に従う配列および多くともＡβ（１−２０）に従う配列を含んでなる第２のＡβペプチドと、を含んでなるキットが提供される。
【００２６】
以下の図は、本明細書の一部を形成し、そして本発明の所定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書において提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参考にすることによって、より良好に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】質量分析エピトープ同定のためのエピトープ−摘出およびエピトープ抽出の原理。未変性のジスルフィド結合を伴う抗体免疫グロブリンは、一般的に、エンドペプチダーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、ＡｓｐＮ−プロテアーゼ）によるタンパク質分解消化に対して高度に耐性であり、そしてエピトープ−パラトープ相互作用構造を含んでなる抗原ポリペプチドのエピトープ領域は、一般的に、免疫複合体におけるタンパク質分解から保護される一方、遊離した非結合領域は消化されやすい。それ故、次いで、タンパク質分解による除去および非結合構造を洗浄排除した後も抗体に結合したままであるエピトープ配列を、抗体から解離させ、そして質量分析によって同定する。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）の両方とも、有用な質量分析方法であることが見いだされており、そしてエピトープ同定のために首尾よく応用されている。「ＴＦＡ」は、トリフルオロ酢酸を意味する、「ＭＡＬＤＩ−ＭＳ」は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析の略語である。
【図２】可溶性Ａβペプチドを含まないタンパク質分解ペプチドフラグメントの質量分析同定。抗体結合による複合体化を伴わなければ、トリプシンによるＡβ（１−４０）の消化は、タンパク質分解切断特異性に従って予想されるすべてのペプチドフラグメント（Ａβ（１−５）、Ａβ（６−１６）、Ａβ（１７−２８）、Ａβ（１７−４０）、Ａβ（１−１６））の形成をもたらす。質量分析は、イオンの完全な同位体分解能および典型的に１〜５ｐｐｍの質量決定精度を伴う約１００，０００質量分解能でスペクトルを提供する高分解能ＭＡＬＤＩ−フーリエ変換−イオンサイクロトン共鳴（ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）によって達成される。すべてのＦＴＩＣＲ−ＭＳスペクトルは、Ａｐｏｌｌｏ  ＩＩエレクトロスプレー／ナノエレクトロスプレーマルチポートイオン源およびパルス化衝突ガスを伴う外部のＳｃｏｕｔ１００完全自動化Ｘ−ＹターゲットステージＭＡＬＤＩ源を備えたＢｒｕｋｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）Ａｐｅｘ  ＩＩ  ７Ｔ  ＦＴ−ＩＣＲ質量分析計によって入手した。パルス窒素レーザーは、３３７ｎｍにおいて操作される。レーザーショットによって発生したイオンを０．５〜１秒間、１５Ｖで蓄積させ、そして−７Ｖで分析セルに抽出した。アセトニトリル：水中０．１％ＴＦＡ（２：１）における２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の１００ｍｇ／ｍｌ溶液を、マトリックスとして使用した。０．５μｌの同じ溶液を、スレンレス鋼製ＭＡＬＤＩサンプルターゲット上で混合し、そして乾燥させた。典型的なＥＳＩ条件は、約２ｋＶニードル電圧および１００ｎＡスプレー電流であった。イオンを２秒間、六極子に蓄積させ、次いで、円筒形のＩＣＲセルに移した。「ｐｐｍ」は百万分率の略語であり、「ｍ／ｚ」は質量対荷電比を示す。
【図３】ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳによるアミロイド斑特異的抗体のエピトープ同定：Ａβ（１−４２）またはＡβ（１−４２）−誘導性凝集体によるトランスジェニックマウスの能動免疫時に産生される斑特異的抗体によって認識されるＮ末端Ａβ−エピトープの質量分析同定。固定化された、精製された抗体をＡβ（１−４０）、Ａβ（１−４２）と共にインキュベートし、そして免疫複合体をプロテアーゼのトリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ−ＣプロテアーゼおよびＡｓｐ−Ｎ−プロテアーゼによるエピトープ摘出に供した。左側のスペクトルは、トリプシン消化後も結合したままであるフラグメント、Ａβ（１−１６）を示し、右側のスペクトルはＧｌｕ−Ｃ−プロテアーゼを使用するエピトープ摘出後のＡβ（１−１１）を示す。示したＡβ配列において示される小さな黒色の矢印は、エピトープ摘出によって同定された切断、太い灰色の矢印は、抗体結合時に遮蔽されたことが見出されたＡβ上の基質切断部位を示す。同一のＡβ（４−１０）エピトープ配列を、抗原として結合した可溶性Ａβ−斑および−原線維により、ならびにマウス抗Ａβ（１−１６）ペプチドモノクローナル抗体（Ｂａｃｈｅｍ−Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）から同定した。
【図４】実施例４に記載の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の不在下または存在下におけるヒト神経芽腫細胞（ＳＨ−Ｓｙ５ｙ）に対するＡβ−オリゴマーの毒性。ＯＤ：光学密度。
【図５】実施例１に記載のＡβ（４−１０）エピトープ特異的アフィニティークロマトグラフィーによって単離されるＡＤ患者（ＡＤ７７）由来のポリクローナル斑特異的抗体の１Ｄ−ゲル電気泳動分離。ＫＤａ：キロダルトンでの分子量。ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ。ＤＴＴ：ジチオスレイトール。
【図６】エピトープ摘出−質量分析によるヒト抗Ａβ（２１−３７）自己抗体によって認識されるエピトープとしてのＡβ（２１−３７）の同定。上のグラフは、黒色矢印によって示される、異なるプロテアーゼによる切断を伴う配列Ａβ（１−４０）を示す。Ａβ−配列より上方の中実黒色矢印によって示されるペプチドフラグメントは、プロナーゼを使用するエピトープ抽出後に同定した；Ａβ配列より下方の黒色破線矢印によって示されるペプチドフラグメントは、トリプシンおよびＧｌｕ−Ｃ−プロテアーゼを使用するエピトープ摘出によって見出された（Ｒ５、Ｅ１１、Ｋ１６）；Ａｒｇ−５は、斑特異的抗体との免疫複合体において完全に遮蔽される一方、抗Ａβ（２１−３７）自己抗体との免疫複合体では完全に切断を受けやすいことに留意すること。鎖線矢印によって示される遊離Ａβにおいて観察される切断位置は、抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の結合後に遮蔽されることが見出された（Ｇｌｕ−Ｃ：Ｅ２２、Ｄ２３、トリプシン：Ｋ２８）。ここで例示のために、プロナーゼによる部分消化（２時間）時のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を示す。
【図７】Ａβ（４−１０）−エピトープ特異的クロマトグラフィーによって単離されるアルツハイマー患者の血清Ａβ自己抗体由来のＮ末端Ａβ（４−１０）エピトープを認識する「斑特異的」抗体の単離。ＩｇＧは、免疫グロブリンＧの略語である。ＡＤはアルツハイマー病を意味する。アフィニティーカラム：Ｇ５Ａβ（４−１０）。ｋＤａ：キロダルトンでの分子量。
【図８】Ａβ（４−１０）エピトープを認識する斑特異的斑崩壊性（ｐｌａｑｕｅ−ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇ）Ａβ抗体、およびＡβ（２１−３７）カルボキシ末端エピトープを認識する抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の分子認識機構。
【図９】Ａβ（１２−４０）エピトープ特異的アフィニティーカラムの構造、および抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の単離のための実験手順。Ｃｙｓ−Ａβ（１２−４０）：システイン結合Ａβ（１２−４０）ペプチド。
【図１０】アフィニティー単離された抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の配列決定に用いられた分析スキームおよび実験手順：Ｎ末端タンパク質配列解析；２Ｄ−電気泳動分離、ゲル内タンパク質分解消化および定常領域配列の高分解能ＦＴＩＣＲ−ＭＳ同定；ペプチドフラグメントのタンパク質消化およびＨＰＬＣ分離、それに続く、ａ）エドマン配列決定；ｂ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ配列決定；ｃ）定常領域部分配列のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ同定；定常／可変部分配列のＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ同定。
【図１１】血清ＩＶＩｇＧ抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖および軽鎖配列対のアサインメントに用いられる実験手順の分析スキーム。
【図１２】ＩＶＩｇＧから単離されたポリクローナル抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の２次元ＳＤＳゲル電気泳動分離；Ａβ抗体アイソフォームの同定および配列決定のための図２２（ａ〜ｃ）を参照のこと。ＤＴＴ：ジチオスレイトール。ＣＨＡＰＳ：３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチル−アンモニオ］−１−プロパンスルホネート。
【図１３】血清ＩＶＩｇＧ抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖および軽鎖の１Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ単離、ａ）還元（１００００×ＤＴＴ）；ｂ）アルキル化（３×ヨードアセトアミド／ＤＴＴ）。ＬＭＷ：低分子量タンパク質標準。
【図１４】エドマン配列決定に使用される抗Ａβ（２１−３７）自己抗体（血清−ＩＶＩｇＧ）のＨＰＬＣ−単離された重鎖および軽鎖の１Ｄ−ゲル電気泳動分離。ＬＭＷ：低分子量タンパク質標準。
【図１５】１Ｄ−ゲル電気泳動、ならびにエドマン配列決定のためのＰＶＤＦ膜上の血清ＩＶＩｇＧ抗Ａβ（２１−３７）自己抗体重鎖および軽鎖のブロッティング。
【図１６】重鎖トリプシンペプチドのＨＰＬＣ分離。単離されたペプチド画分を、ａ）エドマン配列解析、ｂ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ配列決定、ｃ）直接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよびｄ）ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ分析に供した。
【図１７】軽鎖トリプシンペプチドのＨＰＬＣ分離。単離されたペプチド画分を、ａ）エドマン配列解析、ｂ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ配列決定、ｃ）直接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよびｄ）およびＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ分析に供した。
【図１８ａ】ＨＰＬＣ−単離された重鎖トリプシンペプチド、血清＿ＩＶＩＧ＿Ｇ１＿ＨＣ（１）＿１ｃ（３４８−３５９；ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ）のエドマン配列決定。１８ａ：標準。
【図１８ｂ】ＨＰＬＣ−単離された重鎖トリプシンペプチド、血清＿ＩＶＩＧ＿Ｇ１＿ＨＣ（１）＿１ｃ（３４８−３５９；ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ）のエドマン配列決定。１８ｂ：残基１。
【図１８ｃ】ＨＰＬＣ−単離された重鎖トリプシンペプチド、血清＿ＩＶＩＧ＿Ｇ１＿ＨＣ（１）＿１ｃ（３４８−３５９；ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ）のエドマン配列決定。１８ｃ：残基９。
【図１８ｄ】ＨＰＬＣ−単離された重鎖トリプシンペプチド、血清＿ＩＶＩＧ＿Ｇ１＿ＨＣ（１）＿１ｃ（３４８−３５９；ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ）のエドマン配列決定。１８ｄ：残基１１。
【図１９ａ】重鎖トリプシンＨＰＬＣペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ配列決定、画分２７（ａ）およびＨＰＬＣ画分３９、重鎖ＣＤＲ１ペプチドｖ（２０−３０）。図１９ａは、全体のイオンクロマトグラムを示し、１．３〜２．１分間の溶出時間において単離されたペプチド画分は赤色枠内にある。
【図１９ｂ】重鎖トリプシンＨＰＬＣペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ配列決定、画分２７（ａ）およびＨＰＬＣ画分３９、重鎖ＣＤＲ１ペプチドｖ（２０−３０）。（ｂ）１．３〜２．１分間において単離されたペプチド画分のＥＳＩ−質量スペクトル。
【図１９ｃ】重鎖トリプシンＨＰＬＣペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ配列決定、画分２７（ａ）およびＨＰＬＣ画分３９、重鎖ＣＤＲ１ペプチドｖ（２０−３０）。（ｃ）選択された二重荷電前駆体のＭＳ／ＭＳフラグメントイオン分析、ｍ／ｚ４８２．２。
【図２０ａ】トリプシンＨＰＬＣペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ同定、ａ）トリプシンペプチド、画分５０、重鎖（１３８−１５１）、分子量１４２３の同定。
【図２０ｂ】トリプシンＨＰＬＣペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ同定、ｂ）画分７５において単離されたペプチド、重鎖（３７５−３９６）、分子量２５４４Ｄａの同定。
【図２１ａ】ＨＰＬＣ画分４７、６６、および９６由来の重鎖定常領域トリプシンペプチドのＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−質量分析同定。（ａ）分子イオンピーク上に示される画分４７において同定される３つのペプチド、（３４９−３５９）；（３４９−３６４）、（１３７−１５１）の同定。
【図２１ｂ】ＨＰＬＣ画分４７、６６、および９６由来の重鎖定常領域トリプシンペプチドのＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−質量分析同定。（ｂ）画分６６における２つのペプチド、（２６０−２７８）および２７９−２９２）の同定。
【図２１ｃ】ＨＰＬＣ画分４７、６６、および９６由来の重鎖定常領域トリプシンペプチドのＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−質量分析同定。（ｃ）画分９６におけるペプチド（３０６−３２１）の同定。
【図２２ａ】ゲル内トリプシン消化に供される２Ｄ−ゲルバンドから  単離される血清ＩＶＩｇＧ１重鎖定常領域を含んでなる配列；図１２において例示したスポット４重鎖のＭＡＬＤＩ−ＦＴ−ＩＣＲ同定。配列決定は、ＮＣＢＩデータベースを使用して、５〜１０ｐｐｍの質量確度の閾値で実施した。
【図２２ｂ】ゲル内トリプシン消化に供される２Ｄ−ゲルバンドから単離される血清ＩＶＩｇＧ１重鎖定常領域を含んでなる配列；図１２において例示したスポット１２重鎖のＭＡＬＤＩ−ＦＴ−ＩＣＲ同定。配列決定は、ＮＣＢＩデータベースを使用して、５〜１０ｐｐｍの質量確度の閾値で実施した。
【図２２ｃ】ゲル内トリプシン消化に供される２Ｄ−ゲルバンドから単離される血清ＩＶＩｇＧ１重鎖定常領域を含んでなる配列；図１２において例示したスポット１３重鎖のＭＡＬＤＩ−ＦＴ−ＩＣＲ同定。配列決定は、ＮＣＢＩデータベースを使用して、５〜１０ｐｐｍの質量確度の閾値で実施した。
【図２３ａ】Ａβ−ペプチドのＣ末端部に特異的、特に、Ａβ（２１−３７）に特異的な同定および配列決定された抗体についての概観を示す表。表は、抗体鎖サンプルの名称、サンプルの供給源、配列決定した免疫グロブリン鎖のタイプ、軽鎖および重鎖の確かめられた相互作用（接続時のパートナー鎖の名称も示す）、ならびにそれぞれの免疫グロブリン鎖の確認されたアイソフォーム、およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３について同定されたＣＤＲ配列のタイプを提供する。図２３ａ：ＩＶＩＧ＿（１）＿Ａ’；ＩＶＩＧ＿（２）＿Ｂ’；ＩＶＩＧ＿（３）；ＩＶＩＧ＿（４）＿Ａ；ＩＶＩＧ＿（５）＿Ｂ；ＩＶＩＧ＿（６）；ＩＶＩＧ＿（７）；ＩＶＩＧ＿（８）；血清＿（９）；血清＿（１０）；血清＿（１１）。
【図２３ｂ】Ａβ−ペプチドのＣ末端部に特異的、特に、Ａβ（２１−３７）に特異的な同定および配列決定された抗体についての概観を示す表。表は、抗体鎖サンプルの名称、サンプルの供給源、配列決定した免疫グロブリン鎖のタイプ、軽鎖および重鎖の確かめられた相互作用（接続時のパートナー鎖の名称も示す）、ならびにそれぞれの免疫グロブリン鎖の確認されたアイソフォーム、およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３について同定されたＣＤＲ配列のタイプを提供する。図２３ｂ：ＩＶＩＧ＿（１２）；ＩＶＩＧ＿（１３）；ＩＶＩＧ＿（１４）；ＩＶＩＧ＿（１５）；ＩＶＩＧ＿（１６）；ＩＶＩＧ＿（１７）；ＩＶＩＧ＿（１８）；ＩＶＩＧ＿（１９）；ＩＶＩＧ＿（２０）；ＩＶＩＧ＿（２１）。
【図２３ｃ】Ａβ−ペプチドのＣ末端部に特異的、特に、Ａβ（２１−３７）に特異的な同定および配列決定された抗体についての概観を示す表。表は、抗体鎖サンプルの名称、サンプルの供給源、配列決定した免疫グロブリン鎖のタイプ、軽鎖および重鎖の確かめられた相互作用（接続時のパートナー鎖の名称も示す）、ならびにそれぞれの免疫グロブリン鎖の確認されたアイソフォーム、およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３について同定されたＣＤＲ配列のタイプを提供する。図２３ｃ：血清＿（２２）；血清＿（２３）；血清＿（２４）；血清＿（２５）。
【図２４ａ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ａ重鎖のＣＤＲ。
【図２４ｂ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ｂ：軽鎖（λ鎖ならびにκ鎖）のＣＤＲ。
【図２４ｃ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ｃ：重鎖のＣＤＲ１に対するＣＤＲコンセンサス配列。
【図２４ｄ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ｄ：重鎖のＣＤＲ２に対するＣＤＲコンセンサス配列。
【図２４ｅ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ｅ：重鎖のＣＤＲ３に対するＣＤＲコンセンサス配列。
【図２４ｆ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ｆ：κ軽鎖のＣＤＲ１に対するＣＤＲコンセンサス配列。
【図２４ｇ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ｇ：κ軽鎖のＣＤＲ２に対するＣＤＲコンセンサス配列。
【図２４ｈ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ｈ：κ軽鎖のＣＤＲ３に対するＣＤＲコンセンサス配列。
【図２４ｉ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ｉ：重鎖のＣＤＲ１に対する好適なコンセンサス配列。
【図２４ｊ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ｊ：重鎖のＣＤＲ１に対するより好適なコンセンサス配列。
【図２４ｋ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ｋ：重鎖のＣＤＲ１に対するより好適なコンセンサス配列。
【図２４ｌ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ｌ：重鎖のＣＤＲ２に対する好適なコンセンサス配列。
【図２４ｍ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ｍ：重鎖のＣＤＲ２に対するより好適なコンセンサス配列。
【図２４ｎ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ｎ：重鎖のＣＤＲ２に対するより好適なコンセンサス配列。
【図２４ｏ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ｏ：重鎖のＣＤＲ３に対する好適なコンセンサス配列。
【図２４ｐ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ｐ：重鎖のＣＤＲ３に対するより好適なコンセンサス配列。
【図２４ｑ】すべての配列決定された抗体鎖について同定されたＣＤＲタイプおよび対応するコンセンサス配列を示す表。ＣＤＲ番号は、ＣＤＲについて図２３において使用した番号付けに対応する。図２４ｑ：重鎖のＣＤＲ３に対するより好適なコンセンサス配列。
【図２５ａ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖可変領域配列のアミノ酸配列（配列概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２５ａ：サンプルＩＶＩＧ＿（１）＿Ａ’の軽鎖κ可変領域のアミノ酸配列（配列番号４７）。
【図２５ｂ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖可変領域配列のアミノ酸配列（配列概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２５ｂ：サンプルＩＶＩＧ＿（２）＿Ｂ’の軽鎖κ可変領域のアミノ酸配列（配列番号４８）。
【図２５ｃ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖可変領域配列のアミノ酸配列（配列概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２５ｃ：サンプルＩＶＩＧ＿（３）の軽鎖λ可変領域のアミノ酸配列（配列番号４９）。
【図２５ｄ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖可変領域配列のアミノ酸配列（配列概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２５ｄ：サンプルＩＶＩＧ＿（６）の軽鎖κ可変領域のアミノ酸配列（配列番号５０）。
【図２５ｅ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖可変領域配列のアミノ酸配列（配列概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２５ｅ：サンプルＩＶＩＧ＿（７）の軽鎖κ可変領域のアミノ酸配列（配列番号５１）。
【図２５ｆ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖可変領域配列のアミノ酸配列（配列概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２５ｆ：サンプルＩＶＩＧ＿（８）の軽鎖κ可変領域のアミノ酸配列（配列番号５２）。
【図２５ｇ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖可変領域配列のアミノ酸配列（配列概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２５ｇ：サンプル血清＿（９）の軽鎖κ可変領域のアミノ酸配列（配列番号５３）。
【図２５ｈ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖可変領域配列のアミノ酸配列（配列概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２５ｈ：サンプル血清＿（１０）の軽鎖κ可変領域のアミノ酸配列（配列番号５４）。
【図２５ｉ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖可変領域配列のアミノ酸配列（配列概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２５ｉ：サンプル血清＿（１１）の軽鎖κ可変領域のアミノ酸配列（配列番号５５）。
【図２５ｊ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖可変領域配列のアミノ酸配列（配列概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２５ｊ：サンプル血清＿（９）の軽鎖κ可変領域のアミノ酸配列（配列番号１４５）。
【図２５ｋ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖可変領域配列のアミノ酸配列（配列概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２５ｋ：サンプル血清＿（９）の軽鎖κ可変領域のアミノ酸配列（配列番号１４６）。
【図２５ｌ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖可変領域配列のアミノ酸配列（配列概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２５ｌ：サンプル血清＿（９）の軽鎖κ可変領域のアミノ酸配列（配列番号１４７）。
【図２６ａ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ａ：サンプルＩＶＩＧ＿（４）＿Ａの重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５６）。
【図２６ｂ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ｂ：サンプルＩＶＩＧ＿（５）＿Ｂの重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５７）。
【図２６ｃ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ｃ：サンプルＩＶＩＧ＿（１２）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５８）。
【図２６ｄ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ｄ：サンプルＩＶＩＧ（１３）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５９）。
【図２６ｅ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ｅ：サンプルＩＶＩＧ（１４）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６０）。
【図２６ｆ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ｆ：サンプルＩＶＩＧ＿（１５）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６１）。
【図２６ｇ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ｇ：サンプルＩＶＩＧ（１６）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６２）。
【図２６ｈ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ｈ：サンプルＩＶＩＧ（１７）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６３）。
【図２６ｉ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ｉ：サンプルＩＶＩＧ＿（１８）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６４）。
【図２６ｊ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ｊ：サンプルＩＶＩＧ＿（１９）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６５）。
【図２６ｋ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ｋ：サンプルＩＶＩＧ＿（２０）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６６）。
【図２６ｌ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ｌ：サンプルＩＶＩＧ＿（２１）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６７）。
【図２６ｍ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ｍ：サンプル血清＿（２２）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６８）。
【図２６ｎ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ｎ：サンプル血清＿（２３）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６９）。
【図２６ｏ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ｏ：サンプル血清＿（２４）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７０）。
【図２６ｐ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ｐ：サンプル血清＿（２５）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７１）。
【図２６ｑ】血清ＩＶＩｇＧ由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体および個々の血清抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖可変領域配列のアミノ酸配列（図２３、配列概観を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。図２６ｑ：サンプルＩＶＩＧ＿（１４）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１４８）。
【図２７ａ】抗Ａβ（２１−３７）自己抗体鎖のκおよびλ軽鎖の定常領域のアミノ酸配列。Ｖ１９２ＬにおけるＬＣ−κ−定常領域配列の変異を太字で示す。図２７ａ：定常領域軽鎖κアイソフォーム１の完全アミノ酸配列（配列番号７２）。
【図２７ｂ】抗Ａβ（２１−３７）自己抗体鎖のκおよびλ軽鎖の定常領域のアミノ酸配列。Ｖ１９２ＬにおけるＬＣ−κ−定常領域配列の変異を太字で示す。図２７ｂ：アイソフォーム２の定常領域軽鎖κの完全アミノ酸配列（配列番号７３）。
【図２７ｃ】抗Ａβ（２１−３７）自己抗体鎖のκおよびλ軽鎖の定常領域のアミノ酸配列。Ｖ１９２ＬにおけるＬＣ−κ−定常領域配列の変異を太字で示す。図２７ｃ：定常領域軽鎖λの完全アミノ酸配列（配列番号７４）。
【図２８ａ】ＩＶＩｇＧ抗Ａβ（２１−３７）自己抗体重鎖について同定された定常領域のアミノ酸配列および配列アイソフォーム。Ｆ３００Ｙ、Ｎ３０１Ａ（Ｎ−グリコシル化部位）、Ｆ３０４Ｙ、Ｇ３３１Ａ、Ｄ３６０Ｅ、Ｌ３６２Ｍ、Ｓ３６８Ｔ、およびＶ４０１Ｍにおいて同定されたアミノ酸変異を太字で示す。Ｎ−グリコシル化コンセンサス配列およびＮ−３０１ＳＴにおける部位を、ハッチングを施したボックスおよび灰色太字で示す。図２８ａ：アイソフォーム１の定常領域重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号７５）。
【図２８ｂ】ＩＶＩｇＧ抗Ａβ（２１−３７）自己抗体重鎖について同定された定常領域のアミノ酸配列および配列アイソフォーム。Ｆ３００Ｙ、Ｎ３０１Ａ（Ｎ−グリコシル化部位）、Ｆ３０４Ｙ、Ｇ３３１Ａ、Ｄ３６０Ｅ、Ｌ３６２Ｍ、Ｓ３６８Ｔ、およびＶ４０１Ｍにおいて同定されたアミノ酸変異を太字で示す。Ｎ−グリコシル化コンセンサス配列およびＮ−３０１ＳＴにおける部位を、ハッチングを施したボックスおよび灰色太字で示す。図２８ｂ：アイソフォーム２の定常領域重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号７６）。
【図２８ｃ】ＩＶＩｇＧ抗Ａβ（２１−３７）自己抗体重鎖について同定された定常領域のアミノ酸配列および配列アイソフォーム。Ｆ３００Ｙ、Ｎ３０１Ａ（Ｎ−グリコシル化部位）、Ｆ３０４Ｙ、Ｇ３３１Ａ、Ｄ３６０Ｅ、Ｌ３６２Ｍ、Ｓ３６８Ｔ、およびＶ４０１Ｍにおいて同定されたアミノ酸変異を太字で示す。Ｎ−グリコシル化コンセンサス配列およびＮ−３０１ＳＴにおける部位を、ハッチングを施したボックスおよび灰色太字で示す。図２８ｃ：定常領域重鎖アイソフォーム３の完全アミノ酸配列（配列番号７７）。
【図２９ａ】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。図２９ａ：サンプルＩＶＩＧ＿（１）＿Ａ’、定常領域アイソフォーム１の軽鎖κの完全アミノ酸配列（配列番号７８）。
【図２９ｂ】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。図２９ｂ：サンプルＩＶＩＧ＿（１）＿Ａ’、定常領域アイソフォーム２の軽鎖κの完全アミノ酸配列（配列番号７９）。
【図２９ｃ】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。図２９ｃ：サンプルＩＶＩＧ＿（２）＿Ｂ’、定常領域アイソフォーム１の軽鎖κの完全アミノ酸配列（配列番号８０）。
【図２９ｄ】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。図２９ｄ：サンプルＩＶＩＧ＿（２）＿Ｂ’、定常領域アイソフォーム２の軽鎖κの完全アミノ酸配列（配列番号８１）。
【図２９ｅ】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。図２９ｅ：サンプルＩＶＩＧ＿（３）の軽鎖λの完全アミノ酸配列（配列番号８２）。
【図２９ｆ】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。図２９ｆ：サンプルＩＶＩＧ＿（６）、定常領域アイソフォーム１の軽鎖κの完全アミノ酸配列（配列番号８３）。
【図２９ｇ】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。図２９ｇ：サンプルＩＶＩＧ＿（６）、定常領域アイソフォーム２の軽鎖κの完全アミノ酸配列（配列番号８４）。
【図２９ｈ】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。図２９ｈ：サンプルＩＶＩＧ＿（７）、定常領域アイソフォーム１の軽鎖κの完全アミノ酸配列（配列番号８５）。
【図２９ｉ】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。図２９ｉ：サンプルＩＶＩＧ＿（７）、定常領域アイソフォーム２の軽鎖κの完全アミノ酸配列（配列番号８６）。
【図２９ｊ】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。図２９ｊ：サンプルＩＶＩＧ＿（８）、定常領域アイソフォーム１の軽鎖κの完全アミノ酸配列（配列番号８７）。
【図２９ｋ】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。図２９ｋ：サンプルＩＶＩＧ＿（８）、定常領域アイソフォーム２の軽鎖κの完全アミノ酸配列（配列番号８８）。
【図２９ｌ】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。図２９ｌ：サンプル血清＿（９）、定常領域アイソフォーム１の軽鎖κの完全アミノ酸配列（配列番号８９）。
【図２９ｍ】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。図２９ｍ：サンプル血清＿（９）、定常領域アイソフォーム２の軽鎖κの完全アミノ酸配列（配列番号９０）。
【図２９ｎ】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。図２９ｎ：サンプル血清（１０）、定常領域アイソフォーム１の軽鎖κの完全アミノ酸配列（配列番号９１）。
【図２９ｏ】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。図２９ｏ：サンプル血清＿（１１）、定常領域アイソフォーム１の軽鎖κの完全アミノ酸配列（配列番号９２）。
【図２９ｐ】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の軽鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。図２９ｐ：サンプル血清＿（１１）、定常領域アイソフォーム２の軽鎖κの完全アミノ酸配列（配列番号９３）。
【図３０−１】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−１：サンプルＩＶＩＧ＿（４）＿Ａ、定常領域アイソフォーム１の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号９４）。
【図３０−２】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−２：サンプルＩＶＩＧ＿（４）＿Ａ、定常領域アイソフォーム２の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号９５）。
【図３０−３】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−３：サンプルＩＶＩＧ＿（４）＿Ａ、定常領域アイソフォーム３の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号９６）。
【図３０−４】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−４：サンプルＩＶＩＧ＿（５）＿Ｂ、定常領域アイソフォーム１の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号９７）。
【図３０−５】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−５：サンプルＩＶＩＧ＿（５）＿Ｂ、定常領域アイソフォーム２の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号９８）。
【図３０−６】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−６：サンプルＩＶＩＧ＿（５）＿Ｂ、定常領域アイソフォーム３の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号９９）。
【図３０−７】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−７：サンプルＩＶＩＧ＿（１２）＿Ｂ、定常領域アイソフォーム１の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１００）。
【図３０−８】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−８：サンプルＩＶＩＧ＿（１２）＿Ｂ、定常領域アイソフォーム２の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１０１）。
【図３０−９】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−９：サンプルＩＶＩＧ＿（１２）＿Ｂ、定常領域アイソフォーム３の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１０２）。
【図３０−１０】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−１０：サンプルＩＶＩＧ＿（１３）、定常領域アイソフォーム１の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１０３）。
【図３０−１１】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−１１：サンプルＩＶＩＧ＿（１３）、定常領域アイソフォーム２の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１０４）。
【図３０−１２】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−１２：サンプルＩＶＩＧ＿（１３）、定常領域アイソフォーム３の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１０５）。
【図３０−１３】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−１３：サンプルＩＶＩＧ＿（１４）、定常領域アイソフォーム１の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１０６）。
【図３０−１４】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−１４：サンプルＩＶＩＧ＿（１４）、定常領域アイソフォーム２の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１０７）。
【図３０−１５】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−１５：サンプルＩＶＩＧ＿（１４）、定常領域アイソフォーム３の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１０８）。
【図３０−１６】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−１６：サンプルＩＶＩＧ＿（１５）、定常領域アイソフォーム１の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１０９）。
【図３０−１７】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−１７：サンプルＩＶＩＧ＿（１５）、定常領域アイソフォーム２の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１１０）。
【図３０−１８】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−１８：サンプルＩＶＩＧ＿（１５）、定常領域アイソフォーム３の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１１１）。
【図３０−１９】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−１９：サンプルＩＶＩＧ＿（１６）、定常領域アイソフォーム１の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１１２）。
【図３０−２０】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−２０：サンプルＩＶＩＧ＿（１６）、定常領域アイソフォーム２の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１１３）。
【図３０−２１】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−２１：サンプルＩＶＩＧ（１６）、定常領域アイソフォーム３の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１１４）。
【図３０−２２】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−２２：サンプルＩＶＩＧ＿（１７）、定常領域アイソフォーム１の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１１５）。
【図３０−２３】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−２３：サンプルＩＶＩＧ＿（１７）、定常領域アイソフォーム２の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１１６）。
【図３０−２４】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−２４：サンプルＩＶＩＧ＿（１７）、定常領域アイソフォーム３の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１１７）。
【図３０−２５】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−２５：サンプルＩＶＩＧ＿（１８）、定常領域アイソフォーム１の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１１８）。
【図３０−２６】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−２６：サンプルＩＶＩＧ＿（１８）、定常領域アイソフォーム２の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１１９）。
【図３０−２７】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−２７：サンプルＩＶＩＧ＿（１８）、定常領域アイソフォーム３の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１２０）。
【図３０−２８】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−２８：サンプルＩＶＩＧ＿（１９）、定常領域アイソフォーム１の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１２１）。
【図３０−２９】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−２９：サンプルＩＶＩＧ＿（１９）、定常領域アイソフォーム２の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１２２）。
【図３０−３０】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−３０：サンプルＩＶＩＧ＿（１９）、定常領域アイソフォーム３の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１２３）。
【図３０−３１】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−３１：サンプルＩＶＩＧ＿（２０）、定常領域アイソフォーム１の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１２４）。
【図３０−３２】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−３２：サンプルＩＶＩＧ＿（２０）、定常領域アイソフォーム２の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１２５）。
【図３０−３３】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−３３：サンプルＩＶＩＧ＿（２０）、定常領域アイソフォーム３の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１２６）。
【図３０−３４】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−３４：サンプルＩＶＩＧ＿（２１）、定常領域アイソフォーム１の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１２７）。
【図３０−３５】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−３５：サンプルＩＶＩＧ＿（２１）、定常領域アイソフォーム２の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１２８）。
【図３０−３６】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−３６：サンプルＩＶＩＧ＿（２１）、定常領域アイソフォーム３の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１２９）。
【図３０−３７】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−３７：サンプル血清＿（２２）、定常領域アイソフォーム１の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１３０）。
【図３０−３８】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−３８：サンプル血清＿（２２）、定常領域アイソフォーム２の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１３１）。
【図３０−３９】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−３９：サンプル血清＿（２３）、定常領域アイソフォーム１の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１３２）。
【図３０−４０】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−４０：サンプル血清＿（２３）、定常領域アイソフォーム２の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１３３）。
【図３０−４１】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−４１  サンプル血清＿（２４）、定常領域アイソフォーム１の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１３４）。
【図３０−４２】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−４２：サンプル血清＿（２４）、定常領域アイソフォーム３の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１３５）。
【図３０−４３】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−４３  サンプル血清＿（２４）、定常領域アイソフォーム１の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１３６）。
【図３０−４４】血清ＩＶＩｇＧおよび個々の血清由来の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の重鎖の完全なアミノ酸配列（サンプル概観については図２３を参照のこと）。用いた配列決定方法（エドマン；エドマン−タンパク質Ｎ末端；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）のコード、およびＣＤＲ配列のアノテーションを各配列の下部に示す。ＣＤＲをボックスで示す。可変配列ドメイン、および単一部位変異を伴って見出される定常領域配列における単一のアミノ酸残基を太字で示す。Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ−３０１を灰色太字で示す。図３０−４４：サンプル血清＿（２４）、定常領域アイソフォーム３の重鎖の完全アミノ酸配列（配列番号１３７）。
【図３１】本発明のために配列決定した抗体のκ軽鎖のＮ末端の保存された性質を例示する表。本発明の抗体のκ軽鎖配列において同定された１８アミノ酸残基からなる６つのタイプのＮ末端配列を示す。
【図３２ａ】ＨＣ−ＬＣ−κおよびＨＣ−ＬＣ−λ接続のための抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の分子内−および分子間−ジスルフィド結合のスキーム。ＨＣ分子内ジスルフィド結合はＣ２１−Ｃ９６、Ｃ１４８−Ｃ２０４、Ｃ２６５−Ｃ３２５、３７１−Ｃ４２９であり；ＬＣ−κ−分子内ジスルフィド結合はＣ２３−Ｃ８９、Ｃ１３５−Ｃ１９５であり；ＬＣ−λ−分子内ジスルフィド結合はＣ２２−Ｃ９２、Ｃ１４２−Ｃ２０１であり；ＨＣ−ＨＣ分子間ジスルフィド結合はＣ２３０−Ｃ２３０、Ｃ２３３−Ｃ３３であり；ＨＣ−ＬＣ−κ−およびＨＣ−ＬＣ−λ−分子間ジスルフィド結合は、それぞれＣ２２４−Ｃ２１５およびＣ２２４−Ｃ２１９である。３２ａ：ＩＶＩｇＧ＿ＬＣ（１）＿ＨＣ（１）；３２ｂ：ＩＶＩＧ＿ＨＣ（１）＿ＬＣλ（３）。
【図３２ｂ】ＨＣ−ＬＣ−κおよびＨＣ−ＬＣ−λ接続のための抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の分子内−および分子間−ジスルフィド結合のスキーム。ＨＣ分子内ジスルフィド結合はＣ２１−Ｃ９６、Ｃ１４８−Ｃ２０４、Ｃ２６５−Ｃ３２５、３７１−Ｃ４２９であり；ＬＣ−κ−分子内ジスルフィド結合はＣ２３−Ｃ８９、Ｃ１３５−Ｃ１９５であり；ＬＣ−λ−分子内ジスルフィド結合はＣ２２−Ｃ９２、Ｃ１４２−Ｃ２０１であり；ＨＣ−ＨＣ分子間ジスルフィド結合はＣ２３０−Ｃ２３０、Ｃ２３３−Ｃ３３であり；ＨＣ−ＬＣ−κ−およびＨＣ−ＬＣ−λ−分子間ジスルフィド結合は、それぞれＣ２２４−Ｃ２１５およびＣ２２４−Ｃ２１９である。３２ａ：ＩＶＩｇＧ＿ＬＣ（１）＿ＨＣ（１）；３２ｂ：ＩＶＩＧ＿ＨＣ（１）＿ＬＣλ（３）。
【図３３】実施例６に記載のように組み換え抗Ａβ（２１−３７）自己抗体ＣＳＬ−クローン７が、Ａβ１−４０のオリゴマー形態で免疫沈降することを示すウエスタンブロット。抗体Ｂａｍ９０．１（Ａβ（１３−２８）に結合するＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ＃  Ａ８９７８）を使用して、免疫沈降したＡβを検出した。
【図３４ａ】Ａβ−自己抗体のエピトープ認識特異性の分子レベルの確認。ＭＡＬＤＩ−質量分析による健常者（非ＡＤコントロール個体）ドナー、ＡおよびＢの血清から単離した抗Ａβ自己抗体に対する３つの合成Ａβ−ポリペプチド、Ａβ（４−１０）、Ａβ（２０−３０）およびＡβ（２０−３７）の親和性を例示する。アフィニティー精製した抗体を、実施例２Ａに記載のように、ＮＨＳ−セファロース上に固定化した（Ａβ１２−４０）。質量分析（ペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＭＳ、上段のパネル）後、等モル混合物（水性ＰＢＳ緩衝溶液、ｐＨ７における合成Ａβ−ペプチドの５μｍｏｌ混合物）を抗体に結合させた。上清洗浄画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳは、優勢なイオンとしてＮ末端Ａβ（４−１０）エピトープシグナルを示し（Ｎ末端Ａβの結合の欠如が確認された；中段のパネル）、そしてＭＳシグナルが検出されなくなるまで洗浄を継続した。０．１％トリフルオロ酢酸による溶出後、Ａβ（２０−３７）ペプチドを、自己抗体に結合することが可能な唯一のポリペプチドとして同定した（下段のパネル）。すべてのＭＳ決定は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｌｆｌｅｘ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析計で行った。
【図３４ｂ】Ａβ自己抗体のエピトープ特異性を示す質量スペクトル。実施例２Ａに従ってＩＶＩｇＧから精製した固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体を、合成Ａβ（１２−４０）ポリペプチドと共にインキュベートした。上記のように、ＭＳを介して溶出プロファイルを分析した。データは、Ａβ（２１−３７）自己抗体がＡβ（１２−４０）ポリペプチドに特異的に結合したことを示す。
【図３４ｃ】Ａβ自己抗体のエピトープ特異性を示す質量スペクトル。ＩＶＩｇＧから精製した固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体を、合成Ａβポリペプチド、Ａβ（２５−３５）、Ａβ（１７−２８）およびＡβ（３１−４０）と共にインキュベートした。データは、Ａβ（２１−３７）自己抗体がＡβ部分ポリペプチドに結合しなかったことを示す。
【図３４ｄ】Ａβ自己抗体のエピトープ特異性を示す質量スペクトル。ＩＶＩｇＧから精製した固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体および固定化された抗体ＡＣＡ（実施例５を参照のこと）を、合成ポリペプチド、Ａβ（４−１０）、Ａβ（１７−２８）、Ａβ（１２−４０）およびＡβ（２０−３７）と共にインキュベートした。データは、固定化されたＡＣＡ抗体および固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体が、両方ともＡβ（１−４０）およびＡβ（１２−４０）に結合するが、固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体のみは、Ａβ（２０−３７）に特異的に結合することを示す。固定化された抗体は、両方ともＡβ（１７−２８）に結合しなかった。具体的には、図３４＿ｄは、ｍＡβ  ＡＣＡがＡβ（４−１０）に結合しないことを示す。
【図３４ｅ】Ａβ自己抗体のエピトープ特異性を示す質量スペクトル。ＩＶＩｇＧから精製した固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体および固定化された抗体ＡＣＡ（実施例５を参照のこと）を、合成ポリペプチド、Ａβ（４−１０）、Ａβ（１７−２８）、Ａβ（１２−４０）およびＡβ（２０−３７）と共にインキュベートした。データは、固定化されたＡＣＡ抗体および固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体が、両方ともＡβ（１−４０）およびＡβ（１２−４０）に結合するが、固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体のみは、Ａβ（２０−３７）に特異的に結合することを示す。固定化された抗体は、両方ともＡβ（１７−２８）に結合しなかった。具体的には、図３４＿ｅは、ｍＡβ  ＡＣＡがＡβ（１７−２８）に結合しないことを示す。
【図３４ｆ】Ａβ自己抗体のエピトープ特異性を示す質量スペクトル。ＩＶＩｇＧから精製した固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体および固定化された抗体ＡＣＡ（実施例５を参照のこと）を、合成ポリペプチド、Ａβ（４−１０）、Ａβ（１７−２８）、Ａβ（１２−４０）およびＡβ（２０−３７）と共にインキュベートした。データは、固定化されたＡＣＡ抗体および固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体が、両方ともＡβ（１−４０）およびＡβ（１２−４０）に結合するが、固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体のみは、Ａβ（２０−３７）に特異的に結合することを示す。固定化された抗体は、両方ともＡβ（１７−２８）に結合しなかった。具体的には、図３４＿ｆは、ｍＡβ  ＡＣＡがＡβ（１２−４０）に結合することを示す。
【図３４ｇ】Ａβ自己抗体のエピトープ特異性を示す質量スペクトル。ＩＶＩｇＧから精製した固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体および固定化された抗体ＡＣＡ（実施例５を参照のこと）を、合成ポリペプチド、Ａβ（４−１０）、Ａβ（１７−２８）、Ａβ（１２−４０）およびＡβ（２０−３７）と共にインキュベートした。データは、固定化されたＡＣＡ抗体および固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体が、両方ともＡβ（１−４０）およびＡβ（１２−４０）に結合するが、固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体のみは、Ａβ（２０−３７）に特異的に結合することを示す。固定化された抗体は、両方ともＡβ（１７−２８）に結合しなかった。具体的には、図３４＿ｇは、ｍＡβ  ＡＣＡがＡβ（２０−３７）に結合しないことを示す。
【図３４ｈ】Ａβ自己抗体のエピトープ特異性を示す質量スペクトル。ＩＶＩｇＧから精製した固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体および固定化された抗体ＡＣＡ（実施例５を参照のこと）を、合成ポリペプチド、Ａβ（４−１０）、Ａβ（１７−２８）、Ａβ（１２−４０）およびＡβ（２０−３７）と共にインキュベートした。データは、固定化されたＡＣＡ抗体および固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体が、両方ともＡβ（１−４０）およびＡβ（１２−４０）に結合するが、固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体のみは、Ａβ（２０−３７）に特異的に結合することを示す。固定化された抗体は、両方ともＡβ（１７−２８）に結合しなかった。具体的には、図３４＿ｈは、ｍＡβ  ＡＣＡがＡβ（１−４０）に結合することを示す。
【図３４ｉ】Ａβ自己抗体のエピトープ特異性を示す質量スペクトル。ＩＶＩｇＧから精製した固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体および固定化された抗体ＡＣＡ（実施例５を参照のこと）を、合成ポリペプチド、Ａβ（４−１０）、Ａβ（１７−２８）、Ａβ（１２−４０）およびＡβ（２０−３７）と共にインキュベートした。データは、固定化されたＡＣＡ抗体および固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体が、両方ともＡβ（１−４０）およびＡβ（１２−４０）に結合するが、固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体のみは、Ａβ（２０−３７）に特異的に結合することを示す。固定化された抗体は、両方ともＡβ（１７−２８）に結合しなかった。具体的には、図３４＿ｉは、Ａβ（２１−３７）自己抗体がＡβ（１−４０）に結合することを示す。
【図３４ｊ】Ａβ自己抗体のエピトープ特異性を示す質量スペクトル。ＩＶＩｇＧから精製した固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体および固定化された抗体ＡＣＡ（実施例５を参照のこと）を、合成ポリペプチド、Ａβ（４−１０）、Ａβ（１７−２８）、Ａβ（１２−４０）およびＡβ（２０−３７）と共にインキュベートした。データは、固定化されたＡＣＡ抗体および固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体が、両方ともＡβ（１−４０）およびＡβ（１２−４０）に結合するが、固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体のみは、Ａβ（２０−３７）に特異的に結合することを示す。固定化された抗体は、両方ともＡβ（１７−２８）に結合しなかった。具体的には、図３４＿ｊは、Ａβ（２１−３７）自己抗体がＡβ（１２−４０）に結合することを示す。
【図３４ｋ】Ａβ自己抗体のエピトープ特異性を示す質量スペクトル。ＩＶＩｇＧから精製した固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体および固定化された抗体ＡＣＡ（実施例５を参照のこと）を、合成ポリペプチド、Ａβ（４−１０）、Ａβ（１７−２８）、Ａβ（１２−４０）およびＡβ（２０−３７）と共にインキュベートした。データは、固定化されたＡＣＡ抗体および固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体が、両方ともＡβ（１−４０）およびＡβ（１２−４０）に結合するが、固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体のみは、Ａβ（２０−３７）に特異的に結合することを示す。固定化された抗体は、両方ともＡβ（１７−２８）に結合しなかった。具体的には、図３４＿ｋは、Ａβ（２１−３７）自己抗体がＡβ（１７−２８）に結合しないことを示す。
【図３４ｌ】Ａβ自己抗体のエピトープ特異性を示す質量スペクトル。ＩＶＩｇＧから精製した固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体および固定化された抗体ＡＣＡ（実施例５を参照のこと）を、合成ポリペプチド、Ａβ（４−１０）、Ａβ（１７−２８）、Ａβ（１２−４０）およびＡβ（２０−３７）と共にインキュベートした。データは、固定化されたＡＣＡ抗体および固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体が、両方ともＡβ（１−４０）およびＡβ（１２−４０）に結合するが、固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体のみは、Ａβ（２０−３７）に特異的に結合することを示す。固定化された抗体は、両方ともＡβ（１７−２８）に結合しなかった。具体的には、図３４＿ｌは、Ａβ（２１−３７）自己抗体がＡβ（２０−３７）に結合することを示す。
【図３５】抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の測定のための血清ＥＬＩＳＡ。ＢＳＡはウシ血清アルブミンである。ＨＲＰは西洋ワサビペルオキシダーゼである。ＯＰＤは、ｏ−フェニレンジアミンである。ＩｇＧは、免疫グロブリンＧの略語である。
【図３６】（ＩＶＩｇＧ由来の）Ａβ自己抗体のＥＬＩＳＡ測定。ＩＶＩｇＧは、静脈内ＩｇＧ製剤の略語である。ＥＬＩＳＡを、９６ウェルプレート上に被覆したＡβ（１−４０）で行い、そしてＡβ抗体の希釈物を添加し、そして抗ヒト西洋ワサビペルオキシダーゼ結合第二抗体で測定した。１μｇ／μｌストック溶液により、キャリブレーションのためのＢＳＡ基準曲線を使用して、Ａβ抗体の定量を実施した。示した百分率は、２つの個別のＥＬＩＳＡ測定からのＩＶＩｇＧにおけるＡβ抗体濃度を表す。
【図３７】実施例４に従うアフィニティー精製されたＩＶＩｇＧは、実施例６に記載のようにＡβ１−４０のオリゴマー形態で免疫沈降することを示すウエスタンブロット。抗体Ｂａｍ９０．１（Ａβ（１３−２８）に結合するＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ＃Ａ８９７８）を使用して、免疫沈降したＡβを検出した。
【図３８】実施例１３に記載のようなＡＤ動物モデルにおいて使用される抗体あたりの全斑面積の平均を表す棒グラフ。黒色カラムは皮質における斑の面積を表す一方、棒は海馬における斑の面積を表す。斑の面積は、処置した動物の免疫染色した脳スライスの写真に対してＮｉｋｏｎ  ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、測定した。ＣＳＬ３６０−またはＣＳＬクローン７−処置動物（Ｎ＝２）の測定した斑の面積を、アフィニティー精製したＩＶＩｇＧ−処置動物（Ｎ＝１）との比較のために、両方の動物について平均化した。
【図３９】実施例９Ｄにおいて考察するように、抗Ａβ（２１−３７）自己抗体ＣＳＬ−クローン７はＡβ（１−４０）およびＡβ（１２−４０）ペプチドに結合するが、Ａβ（４−１０）には結合しないことを示すＥＬＩＳＡデータ。
【図４０】３つの異なるＡβ特異的抗体の効果：（実施例４に記載の）Ａβアフィニティーカラム精製されたヒトＩＶＩｇＧ、（実施例５に記載の）ヒトモノクローナルＡβ自己抗体ＣＳＬクローン７、およびヒト化マウスモノクローナル抗体は、中間末端（ｍｉｄｔｅｒｍｉｎａｌ）Ａβペプチド配列（実施例５に記載のＡＫ  ＡＣＡ）に対して惹起して、実施例１０において記載のとおり、ＴＨＴ蛍光染色によって測定されるように、Ａβ線維形成を阻害した。ＴＨＴアッセイの蛍光は、線維性Ａｂに比例するが、これを使用して、線維形態を評価した。非特異的ヒトモノクローナル（ＣＳＬ３６０）の存在下でインキュベートしたＡβ（１−４０）の蛍光を、１００％に設定した。
【図４１】実施例１１Ａに記載のドットブロット分析。サンプルを、実施例１１Ａに記載のように、コントロール抗体（６Ｅ１０、Ｂａｍ９０．１、ＣＳＬクローン７、アフィニティー精製したＩＶＩＧ、ＡＣＡ）、ＡＤ患者（ＡＤ１）由来の血清、年齢が一致する健常なヒト個体（Ｋ４）由来の血清で処置した。
【図４２】プロテインＧ（Ｐｉｅｒｃｅ）上での精製後の血清サンプル（１つのＡＤポジティブサンプルおよび１つの年齢が一致するコントロールサンプル）由来のＩｇＧを、Ａβ（１−１６）カラム上に充填し、洗浄し、そして１００ｍＭグリシンｐＨ２．８で溶出した。溶出物を、実施例１１Ｂに記載のように、ビオチン−Ｇ５−Ａβ（４−１０）ＥＬＩＳＡにおいて分析した。
【図４３】組み換えＡβ（２１−３７）自己抗体５５／６１、１４６／６１およびコントロール抗体ＡＣＡについて、実施例１２Ｃに記載のような、Ａβ（１−４０）モノマーとは対照的なＡβ（１−４０Ｃｙｓ）ダイマーへの結合。
【図４４】組み換えＡβ（２１−３７）自己抗体５４／６１、４７／５６、５１／６０および５３／６０について、実施例１２Ｃに記載のような、Ａβ（１−４０）モノマーとは対照的なＡβ（１−４０Ｃｙｓ）ダイマーへの結合。
【図４５】組み換えＡβ（２１−３７）自己抗体１４６／６０、５２／６０、５３／１４８および１４５／６０について、実施例１２Ｃに記載のような、Ａβ（１−４０）モノマーとは対照的なＡβ（１−４０Ｃｙｓ）ダイマーへの結合。
【図４６】βアミロイドペプチドのトリシンゲルタンパク質ブロット分析。βアミロイドペプチドのタンパク質可視化を、Ｎｏｖｅｘゲルマニュアル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に記載の標準的なクマシー染色技術および高感度のためのｄｅｅｐ  ｐｕｒｐｌｅ試薬を使用して行った。製造者の指示に従い、Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナーを使用して、Ｄｅｅｐ  ｐｕｒｐｌｅ（ＧＥ，Ｓｗｅｄｅｎ）を可視化した。
【図４７】実施例１２Ｄに記載の抗体６Ｅ１０、ＡＣＡおよびＣＳＬクローン７のＡβ（１−４０）モノマー、Ａβ（１−４０）オリゴマーおよびＡβ（１−４０Ｃｙｓ）オリゴマーへの結合を比較したウエスタンブロット。
【図４８ａ】第一抗体として６Ｆ３Ｄ抗β−アミロイド抗体（Ｄａｋｏ）、および検出系としてＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｍ．Ｏ．Ｍ．−Ｋｉｔ（ＨＲＰ抗マウス）を使用する、アルツハイマー病を患う患者のヒト脳サンプルの免疫組織化学。特異的免疫染色は、血管壁（矢印）ならびにアルツハイマー斑（矢尻）において検出可能である。この免疫染色はポジティブコントロールとしての役割を果たす。
【図４８ｂ】第一抗体としてＡＣＡ抗体、および検出系としてＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ（ＨＲＰ抗ヒト）を使用する、アルツハイマー病を患う患者のヒト脳サンプルの免疫組織化学。特異的免疫染色は、血管壁（矢印）において検出可能である。
【図４８ｃ】第一抗体としてＡＣＡ抗体、および検出系としてＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ（ＨＲＰ抗ヒト）を使用する、アルツハイマー病を患う患者のヒト脳サンプルの免疫組織化学。特異的免疫染色は、血管壁（矢印）ならびにアルツハイマー斑（矢尻、挿入）において検出可能である。
【図４８ｄ】第一抗体としてアフィニティー精製されたＩＶＩｇＧ、および検出系としてＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ（ＨＲＰ抗ヒト）を使用する、アルツハイマー病およびＣＡＡを患う患者のヒト脳サンプルの免疫組織化学。非特異的免疫染色は、血管壁（矢印）において検出可能である。
【図４８ｅ】第一抗体としてクローン７抗体、および検出系としてＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ（ＨＲＰ抗ヒト）を使用する、アルツハイマー病を患う患者のヒト脳サンプルの免疫組織化学。非特異的免疫染色は、血管壁（矢印）において検出可能である。
【図４８ｆ】第一抗体としてＣＳＬ３６０抗体、および検出系としてＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ（ＨＲＰ抗ヒト）を使用する、アルツハイマー病を患う患者のヒト脳サンプルの免疫組織化学。非特異的免疫染色は血管壁（矢印）において検出可能であるが、血管内腔における血液は非特異的なバックグランド染色を示す。
【図４９】ヒト神経芽腫細胞（ＳＨ−Ｓｙ５ｙ）に対するＡβオリゴマーの毒性を、実施例４に記載のように試験した。（上記のように精製した）アフィニティー精製ＩＶＩｇＧ、ｍａｂ  ＣＳＬクローン７で実験を反復した（実施例５を参照のこと）。ネガティブコントロールとして、抗体ＣＳＬ３６０（実施例１０を参照のこと）を使用したか、または抗体を使用しなかった。使用したポジティブコントロール抗体はＡＣＡであった（実施例１０を参照のこと）。結果は、明らかに、アフィニティー精製ｍａｂ  ＣＳＬクローン７およびアフィニティー精製ＩＶＩｇＧの両方のＡβオリゴマーの神経毒性作用から細胞を保護する用量依存的有効性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
Ａβ自己抗体を、ＡＤ患者および健常者コントロールの血清またはプールされた市販の血清免疫グロブリン（ＩＶＩｇＧ）から単離した。重鎖ならびに軽鎖の可変領域のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を決定し、そして重鎖および軽鎖のすべての可能な対形成を、哺乳動物細胞において発現させた。これらの多くの対形成は、Ａβモノマーに対するよりも高い親和性でＡβダイマーに結合することを見出し、そしてこれらのうちの１つ、ＣＳＬクローン７が、ＡＤの処置に潜在的に有用な生物活性を有することを示した。本発明者らは、抗Ａβ（２１−３７）自己抗体のＣＤＲが高度に相同であることをさらに発見した。従って、コンセンサスＣＤＲを決定し、そしてＡＤのような神経性認知症疾患を予防または処置するのに有用なヒト抗βアミロイド抗体を調製するために使用した。本発明者らはまた、驚くべきことに、ＡＤ患者は、健常者コントロールと比較して、Ａβ（４−１０）に対する抗体価が増加し、そしてＡβ（２１−３７）に対する抗体価が減少していることを発見した。それ故、本発明者らは、ＡＤのような神経性認知症疾患の進行を検出および測定するための方法だけではなく、ＡＤの発症または進行を遅延させる方法も発見した。ＡＤのような神経性認知症疾患の進行を検出および測定するためのキットもまた提供する。
【００２９】
定義
本明細書において使用する「Ａβポリペプチド」は、配列番号０１のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有するポリペプチドを定義する。そのようなフラグメントは、特に、配列番号０２の配列を有するポリペプチドを含んでなる。
【００３０】
本明細書において使用する「抗体」はまた、抗体の誘導体および／またはフラグメントを含んでなる。抗体のそのような誘導体またはフラグメントは、無傷（ｉｎｔａｃｔ）な抗体の抗原結合特性を保持するが、但し、無傷な抗体のうちのいくつかの配列、例えばＦｃ−ドメインを欠く。そのような誘導体またはフラグメントの例として、それぞれパパインまたはペプシンプロテアーゼによる抗体の酵素消化を介して入手可能であるＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖の可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆｖフラグメント、ミニボディおよびダイアボディが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書において使用する用語「自己抗体」または「複数の自己抗体」は、一般に、ヒト身体のタンパク質におけるエピトープを対象とし、そしてそれぞれの抗原により予め免疫することなくヒト被験体の血液または脳脊髄液において見出すことができる抗体を指す。同時に、用語「抗Ａβ（２１−３７）自己抗体」は、Ａβ（２１−３７）（配列番号２）を含んでなるＡβペプチドに結合し、そして前記配列番号２をタンパク質分解消化から遮蔽する自己抗体を指す。そのような抗Ａβ（２１−３７）自己抗体はまた、Ａβの対応するモノマーに対するよりも高い親和性でＡβに結合する。
【００３２】
本明細書において使用する用語「ＣＤＲ」は、相補性決定領域を指す。通常、そのようなＣＤＲ−領域のうちの３つ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）は、抗体の軽鎖上ならびに重鎖上の可変領域において見出すことができる。これらの６つの超可変領域のそれぞれは、抗体の抗原特異性に寄与することができる。しかし、本明細書において使用するＣＤＲという用語は、分子が事実上抗体を指すことを意味しない。むしろ、この用語は、本発明に従うポリペプチドの完全長Ａβポリペプチド（Ａβ１−４０）のＣ末端部への特異的結合、特に、Ａβ（２１−３７）ポリペプチドへの結合に寄与する配列を明示すると考えられる。従って、前記エピトープへの結合のために操作された抗体の誘導体または他のポリペプチドもまた、ＣＤＲを示すことができる。
【００３３】
本明細書において使用する用語「コンセンサスＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ番号付け体系（非特許文献１、および非特許文献２（両方とも、本明細書において参考として援用される）を参照のこと）に従う所定のＣＤＲについて２つ以上の配列をアラインすることによって誘導される単一の配列を指す。従って、「コンセンサスＣＤＲ」のそれぞれのアミノ酸位置では、その位置で存在することができるアミノ酸の同一性が決定される。ＣＤＲの命名ならびにアミノ酸挿入は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って行う。
【００３４】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原−結合部位を伴う小さな抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ  ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなる。同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成することが可能でないほど短いリンカーを使用することによって、ドメインを、別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、そして２つの抗原−結合部位を作製する。ダイアボディについては、例えば、特許文献９；特許文献１０においてより詳細に記載されている。
【００３５】
本明細書において使用する用語「エピトープ」または「エピトープペプチド」は、一般的に、分子認識ペプチド配列、または特異的抗体に結合する抗原由来の構造を含んでなるポリペプチドを指す。抗体によって特異的に認識されるのが抗原の免疫学的決定基である。エピトープは、空間的または不連続コンフォメーションにおいて少なくとも５、好ましくは少なくとも８アミノ酸を含んでなり得る。エピトープはまた、最小の長さで約５アミノ酸を伴う連続線状アミノ酸配列を含んでなるポリペプチド鎖の単一のセグメントを含んでなり得る。
【００３６】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。この領域は、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの緊密な非共有結合でのダイマーからなる。それぞれの可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ  ＶＬダイマーの表面上の抗原結合部位を定義するのは、この配置においてである。総合的に、６つのＣＤＲが、抗原結合特異性を抗体に付与する。
【００３７】
本明細書において使用する用語「部分」は、異なる機能を伴うポリペプチドの一部分を指す。そのような部分は、ポリペプチドの残りの部分には普通存在しないか、またはこの部分によって特徴が増強される構造的または機能的特徴を提供することができる。そのような機能的または構造的部分は、例えば、ポリペプチドの結合、安定化または検出を提供することができる。部分は、ポリペプチド自体であり得るか、または所望される機能をポリペプチドに提供する他の任意の化合物であり得る。前記部分は、ポリペプチドと安定に会合し、特に、ポリペプチドに共有結合する。本明細書において使用する部分という用語は、ポリペプチド自体と比較して、この部分のサイズに関する情報を何ら付与しない。この部分は、それが結合するポリペプチドより小さいか、均等なサイズであるかまたはより大きくあり得る。
【００３８】
本明細書に記載の用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、集団を含んでなる個々の抗体は、少量存在し得る天然に存在する可能な変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、種々のエピトープに対する種々の抗体を典型的に含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、特定の抗原部位またはエピトープに対するものである。
【００３９】
本明細書において使用する用語「神経性認知症疾患（neurodementing diseases）」、「認知症疾患（dementing disorders）」または「ＡＤ型の神経認知症疾患」は、アルツハイマー病、ダウン症候群、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症から選択される疾患、ならびに脳アミロイド血管症およびアミロイドーシスのような障害を指す。
【００４０】
用語「オリゴマー形成した」、「オリゴマー」および「オリゴマーの」は、Ａβダイマー、トライマー、テトラマーおよびより高次のオリゴマーも含んでなるＡβのマルチマーを指すが、Ａβ線維を指すものではない。
【００４１】
本明細書において使用する用語「斑特異的」抗体は、ＡβポリペプチドのＡβ（４−１０）エピトープに対する抗体を指す。
【００４２】
本明細書において使用する用語「ポリペプチド」は、少なくとも５アミノ酸残基のポリペプチド鎖を指す。用語はまた、１本を超えるポリペプチド鎖の集成体、例えば、ＩｇＧ抗体のような４本のポリペプチド鎖の集成体を指す。
【００４３】
本明細書において使用する用語「パラトープ」または「パラトープペプチド」は、一般的に、特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体由来の分子認識ペプチド配列を定義する。この認識ペプチド配列は、抗原エピトープに特異的結合特性を及ぼし、そして抗体の可変および／または定常領域の部分配列を含んでなり得る。
【００４４】
本明細書において使用する「エピトープＸに特異的に結合する」は、特定のエピトープ、例えば、エピトープＸに、他のエピトープに対するよりも高い親和性で結合する抗体の特性を指す。
【００４５】
本明細書において使用する「Ａβのオリゴマー構造に特異的に結合する」は、それぞれの抗体が、Ａβのモノマー構造に対するよりも高い親和性でＡβのオリゴマー構造に結合することを意味する。
【００４６】
Ａβ抗体の「治療有効」量は、そのような処置を必要とする有意な数の被験体において、抗体が投与される場合の特異的薬理学的応答を提供する用量を指す。治療有効量は、処置している神経性認知症疾患の不都合な病態または症状の予防もしくは改善によって決定することができる。適切な用量は、例えば、疾患のタイプ、ステージ、および重症度、ならびに投与形態に依存して変動する。特定の場合に特定の被験体に投与される「治療有効量」は、たとえ、そのような用量が、当業者によって「治療有効量」であると考えられていても、特定の疾患について処置される患者の１００％には有効でないかもしれないことを強調しておく。
【００４７】
用語「力価」は、サンプル、典型的には、血液における特定の抗体の量または濃度の測定値を示す。
【００４８】
用語「処置」、「処置すること」、「処置する」などは、所望される薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患またはその症状を部分的もしくは部分的に防ぐ点では予防的であり得、ならびに／あるいは疾患および／または疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な安定化または治癒の点では治療的であり得る。「処置」は、哺乳動物、特に、ヒトにおける疾患のあらゆる処置におよび、そして次を含む：（ａ）疾患または症状の素因が認められ得るが、それを有すると未だ診断されていない被験体において、疾患または症状を予防すること；（ｂ）疾患の症状を抑制すること、即ち、その進行を止めること；または（ｃ）疾患の症状を緩和すること、即ち、疾患または症状を後退させること。
【００４９】
抗体
一態様では、本発明は、エピトープＡβ（２１−３７）（配列番号２）に特異的に結合するポリペプチドに関する。
【００５０】
本発明に従うポリペプチドは、例えば、全長Ａβポリペプチド（Ａβ１−４０）のＣ末端部、特に、Ａβ（２１−３７）（配列番号２）に示されるエピトープに結合する抗体、抗体フラグメント、または他の任意のポリペプチドであり得る。
【００５１】
一態様では、本発明のポリペプチドは、特に、生理学的条件下、例えば、ｐＨ約７．４、ＰＢＳにおける約５０〜約１５０ｍＭの塩濃度で、アミロイドβのエピトープＡβ（２１−３７）（配列番号２）を含んでなるポリペプチドに特異的に結合することが可能である。一実施形態では、ポリペプチドは、インビトロ条件下で少なくとも約１０−５Ｍ、約１０−６Ｍ、約１０−７Ｍ、約１０−８、約１０−９Ｍ、約１０−１０Ｍ、約１０−１１Ｍ、約１０−１２Ｍもしくはそれ以上の相対的解離定数（相対的ＫＤ；インビトロでの結果を反映するが、インビボ条件下では必ずしも同一の値ではない）を有する。例えば、Ａβ（２１−３７）（配列番号２）において示されるエピトープへのポリペプチドの結合の相対的解離定数は、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍの間、特に、約１〜５０×１０−９Ｍであり得る。そのような解離速度定数は、製造者によって概説された一般的手順または当該技術分野において公知の他の方法を使用する表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅもしくはＢｉｏｓｅｎｓｏｒ）のような動態解析技術を使用して、容易に決定することができる。
【００５２】
別の態様では、驚くべきことに、Ａβ（２１−３７）に特異的なポリペプチドが高度に相同であることを発見した。それ故、コンセンサスＣＤＲ配列から選択される配列を含んでなるポリペプチドを提供する。従って、一実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、配列番号６〜８のコンセンサス配列のいずれかに示される配列を有するＣＤＲ配列を含んでなり得る。
【００５３】
配列番号６〜８は、配列番号２に結合する能力を有する抗体の重鎖のＣＤＲ領域に対するコンセンサス配列を表す。コンセンサス配列は、配列番号２に特異的に結合することが本発明者らによって同定されている抗体から誘導される配列情報から誘導される。特に、重鎖（即ち、配列番号６〜８および配列番号１５３〜１６１）ならびに軽鎖（即ち、配列番号９〜１１）の両方のＣＤＲ領域について同定されたコンセンサス配列を、実施例２Ａに記載のように、天然に存在するヒト抗体から誘導した。
【００５４】
配列番号６は、重鎖に対するＣＤＲ１コンセンサス配列を表し、ここで、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ３１にある配列番号６の位置１のアミノ酸は、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＡｓｎであり得、
Ｋａｂａｔ位置８Ｈ３２におけるアミノ酸である配列番号６の位置２のアミノ酸は、Ｔｙｒであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ３３におけるアミノ酸である配列番号６の位置３のアミノ酸は、ＴｒｐまたはＡｓｐであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ３４におけるアミノ酸である配列番号６の位置４のアミノ酸は、Ｍｅｔであり、そして
Ｋａｂａｔ位置Ｈ３５におけるアミノ酸である配列番号６の位置５のアミノ酸は、ＳｅｒまたはＨｉｓであり得る。
【００５５】
配列番号１５３は、重鎖に対する好適なＣＤＲ１コンセンサス配列を表し、ここで、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ３１にある配列番号１５３の位置１のアミノ酸は、ＡｓｎまたはＳｅｒであり得、
Ｋａｂａｔ位置８Ｈ３２におけるアミノ酸である配列番号１５３の位置２のアミノ酸は、Ｔｙｒであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ３３におけるアミノ酸である配列番号１５３の位置３のアミノ酸は、ＡｓｐまたはＴｒｐであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ３４におけるアミノ酸である配列番号１５３の位置４のアミノ酸は、Ｍｅｔであり、そして
Ｋａｂａｔ位置Ｈ３５におけるアミノ酸である配列番号１５３の位置５のアミノ酸は、ＨｉｓまたはＳｅｒであり得る。
【００５６】
配列番号１５４は、重鎖に対するより好適なＣＤＲ１コンセンサス配列を表し、ここで、
配列番号６のＫａｂａｔ位置Ｈ３１にある配列番号１５４の位置１のアミノ酸は、Ａｓｎであり、
Ｋａｂａｔ位置８Ｈ３２におけるアミノ酸である配列番号１５４の位置２のアミノ酸は、Ｔｙｒであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ３３におけるアミノ酸である配列番号１５４の位置３のアミノ酸は、Ａｓｐであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ３４におけるアミノ酸である配列番号１５４の位置４のアミノ酸はＭｅｔであり、そして
Ｋａｂａｔ位置Ｈ３５におけるアミノ酸である配列番号１５４の位置５のアミノ酸は、Ｈｉｓである。
【００５７】
配列番号１５５は、重鎖に対するより好適なＣＤＲ１コンセンサス配列を表し、ここで、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ３１にある配列番号１５５の位置１のアミノ酸は、Ｓｅｒであり、
Ｋａｂａｔ位置８Ｈ３２におけるアミノ酸である配列番号１５５の位置２のアミノ酸は、Ｔｙｒであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ３３におけるアミノ酸である配列番号１５５の位置３のアミノ酸は、ＴｒｐまたはＡｓｐであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ３４におけるアミノ酸である配列番号１５５の位置４のアミノ酸はＭｅｔであり、そして
Ｋａｂａｔ位置Ｈ３５におけるアミノ酸である配列番号１５５の位置５のアミノ酸は、Ｓｅｒである。
【００５８】
配列番号７は、重鎖に対するＣＤＲ２コンセンサス配列を表し、ここで、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５０におけるアミノ酸である配列番号７の位置１のアミノ酸は、ＳｅｒまたはＡｒｇまたはＧｌｕであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５１におけるアミノ酸である配列番号７の位置２のアミノ酸は、ＶａｌまたはＩｌｅであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５２におけるアミノ酸である配列番号７の位置３のアミノ酸は、ＬｙｓまたはＧｌｙまたはＡｓｎであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５２ａにおけるアミノ酸である配列番号７の位置４のアミノ酸は、Ｇｌｎであるか、またはアミノ酸は存在し得ず、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５３におけるアミノ酸である配列番号７の位置５のアミノ酸は、ＡｓｐまたはＰｈｅまたはＴｈｒまたはＡｒｇであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５４におけるアミノ酸である配列番号７の位置６のアミノ酸は、ＧｌｙまたはＰｈｅまたはＡｌａまたはＳｅｒであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５５におけるアミノ酸である配列番号７の位置７のアミノ酸は、ＳｅｒまたはＧｌｙであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５６におけるアミノ酸である配列番号７の位置８のアミノ酸は、ＧｌｕまたはＧｌｙまたはＡｒｇまたはＡｓｐまたはＡｌａであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５７におけるアミノ酸である配列番号７の位置９のアミノ酸は、ＬｙｓまたはＰｒｏまたはＳｅｒまたはＴｈｒまたはＡｒｇであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５８におけるアミノ酸である配列番号７の位置１０のアミノ酸は、ＴｙｒまたはＬｅｕまたはＡｌａまたはＡｓｎであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５９におけるアミノ酸である配列番号７の位置１１のアミノ酸は、ＴｙｒまたはＡｌａであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６０におけるアミノ酸である配列番号７の位置１２のアミノ酸は、ＶａｌまたはＴｈｒまたはＡｌａまたはＡｓｎであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６１におけるアミノ酸である配列番号７の位置１３のアミノ酸は、ＡｓｐまたはＧｌｙまたはＰｒｏであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６２におけるアミノ酸である配列番号７の位置１４のアミノ酸は、Ｓｅｒであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６３におけるアミノ酸である配列番号７の位置１５のアミノ酸は、ＶａｌまたはＬｅｕであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６４におけるアミノ酸である配列番号７の位置１６のアミノ酸は、Ｌｙｓであり、そして
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６５におけるアミノ酸である配列番号１７の位置７のアミノ酸は、ＧｌｙまたはＳｅｒであり得る。
【００５９】
配列番号１５６は、重鎖に対する好適なＣＤＲ２コンセンサス配列を表し、ここで、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５０におけるアミノ酸である配列番号１５６の位置１のアミノ酸は、ＡｒｇまたはＳｅｒまたはＧｌｕであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５１におけるアミノ酸である配列番号１５６の位置２のアミノ酸は、ＩｌｅまたはＶａｌであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５２におけるアミノ酸である配列番号１５６の位置３のアミノ酸は、ＧｌｙまたはＬｙｓまたはＡｓｎであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５２ａにおけるアミノ酸である配列番号１５６の位置４のアミノ酸は、Ｇｌｎであるか、またはアミノ酸は存在し得ず、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５３におけるアミノ酸である配列番号１５６の位置５のアミノ酸は、ＴｈｒまたはＡｓｐまたはＡｒｇであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５４におけるアミノ酸である配列番号１５６の位置６のアミノ酸は、またはＡｌａまたはＧｌｙまたはＳｅｒであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５５におけるアミノ酸である配列番号７の位置１５６のアミノ酸は、ＧｌｙまたはＳｅｒであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５６におけるアミノ酸である配列番号１５６の位置８のアミノ酸は、ＡｒｇまたはＡｓｐまたはＧｌｕまたはＡｌａであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５７におけるアミノ酸である配列番号１５６の位置９のアミノ酸は、ＴｈｒまたはＡｒｇまたはＬｙｓであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５８におけるアミノ酸である配列番号１５６の位置１０のアミノ酸は、ＡｓｎまたはＴｙｒであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５９におけるアミノ酸である配列番号１５６の位置１１のアミノ酸は、Ｔｙｒであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６０におけるアミノ酸である配列番号１５６の位置１２のアミノ酸は、Ａｓｎ、ＡｌａまたはＶａｌであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６１におけるアミノ酸である配列番号１５６の位置１３のアミノ酸は、ＰｒｏまたはＧｌｙまたはＡｓｐであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６２におけるアミノ酸である配列番号１５６の位置１４のアミノ酸は、Ｓｅｒであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６３におけるアミノ酸である配列番号１５６の位置１５のアミノ酸は、ＬｅｕまたはＶａｌであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６４におけるアミノ酸である配列番号１５６の位置１６のアミノ酸は、Ｌｙｓであり、そして
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６５におけるアミノ酸である配列番号１５６の位置１７のアミノ酸は、ＧｌｙまたはＳｅｒであり得る。
【００６０】
配列番号１５７は、重鎖に対するより好適なＣＤＲ２コンセンサス配列を表し、ここで、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５０におけるアミノ酸である配列番号１５７の位置１のアミノ酸は、ＡｒｇまたはＧｌｕであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５１におけるアミノ酸である配列番号１５７の位置２のアミノ酸は、Ｉｌｅであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５２におけるアミノ酸である配列番号１５７の位置３のアミノ酸は、ＧｌｙまたはＡｓｎであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５３におけるアミノ酸である配列番号１５７の位置４のアミノ酸は、ＴｈｒまたはＡｒｇであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５４におけるアミノ酸である配列番号５の位置１５７のアミノ酸は、ＡｌａまたはＳｅｒであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５５におけるアミノ酸である配列番号１５７の位置６のアミノ酸は、Ｇｌｙであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５６におけるアミノ酸である配列番号１５７の位置７のアミノ酸は、ＡｒｇまたはＡｓｐまたはＡｌａであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５７におけるアミノ酸である配列番号１５７の位置８のアミノ酸は、ＴｈｒまたはＡｒｇであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５８におけるアミノ酸である配列番号１５７の位置９のアミノ酸は、ＡｓｎまたはＴｙｒであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５９におけるアミノ酸である配列番号１５７の位置１０のアミノ酸は、Ｔｙｒであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６０におけるアミノ酸である配列番号１５７の位置１１のアミノ酸は、ＡｓｎまたはＡｌａであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６１におけるアミノ酸である配列番号１５７の位置１２のアミノ酸は、ＰｒｏまたはＧｌｙであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６２におけるアミノ酸である配列番号１５７の位置１３のアミノ酸は、Ｓｅｒであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６３におけるアミノ酸である配列番号１５７の位置１４のアミノ酸は、ＬｅｕまたはＶａｌであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６４におけるアミノ酸である配列番号１５７の位置１５のアミノ酸は、Ｌｙｓであり、そして
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６５におけるアミノ酸である配列番号１５７の位置１６のアミノ酸は、ＧｌｙまたはＳｅｒであり得る。
【００６１】
配列番号１５８は、重鎖に対するより好適なＣＤＲ２コンセンサス配列を表し、ここで、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５０におけるアミノ酸である配列番号１５８の位置１のアミノ酸は、Ｓｅｒであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５１におけるアミノ酸である配列番号１５８の位置２のアミノ酸は、Ｖａｌであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５２におけるアミノ酸である配列番号１５８の位置３のアミノ酸は、Ｌｙｓであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５２ａにおけるアミノ酸である配列番号１５８の位置４のアミノ酸は、Ｇｌｎであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５３におけるアミノ酸である配列番号１５８の位置５のアミノ酸は、Ａｓｐであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５４におけるアミノ酸である配列番号１５８の位置６のアミノ酸は、Ｇｌｙであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５５におけるアミノ酸である配列番号１５８の位置７のアミノ酸は、Ｓｅｒであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５６におけるアミノ酸である配列番号１５８の位置８のアミノ酸は、Ｇｌｕであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５７におけるアミノ酸である配列番号１５８の位置９のアミノ酸は、Ｌｙｓであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５８におけるアミノ酸である配列番号１５８の位置１０のアミノ酸は、Ｔｙｒであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ５９におけるアミノ酸である配列番号１５８の位置１１のアミノ酸は、Ｔｙｒであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６０におけるアミノ酸である配列番号１５８の位置１２のアミノ酸は、Ｖａｌであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６１におけるアミノ酸である配列番号１５８の位置１３のアミノ酸は、Ａｓｐであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６２におけるアミノ酸である配列番号１５８の位置１４のアミノ酸は、Ｓｅｒであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６３におけるアミノ酸である配列番号１５８の位置１５のアミノ酸は、Ｖａｌであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６４におけるアミノ酸である配列番号１５８の位置１６のアミノ酸は、Ｌｙｓであり、そして
Ｋａｂａｔ位置Ｈ６５におけるアミノ酸である配列番号１５８の位置１７のアミノ酸は、Ｇｌｙである。
【００６２】
配列番号８は、重鎖に対するＣＤＲ３コンセンサス配列を表し、ここで、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９５におけるアミノ酸である配列番号８の位置１のアミノ酸は、ＡｓｐまたはＧｌｙであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９６におけるアミノ酸である配列番号８の位置２のアミノ酸は、ＡｌａまたはＧｌｙであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９７におけるアミノ酸である配列番号８の位置３のアミノ酸は、ＳｅｒまたはＧｌｙであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９８におけるアミノ酸である配列番号８の位置４のアミノ酸は、ＳｅｒまたはＡｒｇであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９９におけるアミノ酸である配列番号８の位置５のアミノ酸は、Ｔｒｐであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００におけるアミノ酸である配列番号８の位置６のアミノ酸は、ＴｙｒまたはＡｌａであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ａにおけるアミノ酸である配列番号８の位置７のアミノ酸は、ＡｒｇまたはＰｒｏまたはＡｓｐであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ｂにおけるアミノ酸である配列番号８の位置８のアミノ酸は、ＡｓｐまたはＬｅｕであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ｃにおけるアミノ酸である配列番号８の位置９のアミノ酸は、ＴｒｐまたはＧｌｙまたはＡｌａであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ｄにおけるアミノ酸である配列番号８の位置１０のアミノ酸は、ＰｈｅまたはＡｌａであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ｅにおけるアミノ酸である配列番号８の位置１１のアミノ酸は、Ｐｈｅであるか、またはアミノ酸は存在し得ず、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１０１におけるアミノ酸である配列番号８の位置１２のアミノ酸は、Ａｓｐであり、そして
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１０２におけるアミノ酸である配列番号８の位置１３のアミノ酸は、ＰｒｏまたはＩｌｅであり得る。
【００６３】
配列番号１５９は、重鎖に対する好適なＣＤＲ３コンセンサス配列を表し、ここで、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９５におけるアミノ酸である配列番号１５９の位置１のアミノ酸は、ＧｌｙまたはＡｓｐであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９６におけるアミノ酸である配列番号１５９の位置２のアミノ酸は、ＡｌａまたはＧｌｙであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９７におけるアミノ酸である配列番号１５９の位置３のアミノ酸は、ＧｌｙまたはＳｅｒであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９８におけるアミノ酸である配列番号１５９の位置４のアミノ酸は、ＡｒｇまたはＳｅｒであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９９におけるアミノ酸である配列番号１５９の位置５のアミノ酸は、Ｔｒｐであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００におけるアミノ酸である配列番号１５９の位置６のアミノ酸は、ＡｌａまたはＴｙｒであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ａにおけるアミノ酸である配列番号１５９の位置７のアミノ酸は、ＰｒｏまたはＡｒｇまたはＡｓｐであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ｂにおけるアミノ酸である配列番号１５９の位置８のアミノ酸は、ＬｅｕまたはＡｓｐであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ｃにおけるアミノ酸である配列番号１５９の位置９のアミノ酸は、ＧｌｙまたはＴｒｐまたはＡｌａであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ｄにおけるアミノ酸である配列番号１５９の位置１０のアミノ酸は、ＡｌａまたはＰｈｅであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ｅにおけるアミノ酸である配列番号１５９の位置１１のアミノ酸は、Ｐｈｅであるか、またはアミノ酸は存在し得ず、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１０１におけるアミノ酸である配列番号１５９の位置１２のアミノ酸は、Ａｓｐであり、そして
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１０２におけるアミノ酸である配列番号１５９の位置１３のアミノ酸は、ＩｌｅまたはＰｒｏであり得る。
【００６４】
配列番号１６０は、重鎖に対するより好適なＣＤＲ３コンセンサス配列を表し、ここで、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９５におけるアミノ酸である配列番号１６０の位置１のアミノ酸は、Ｇｌｙであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９６におけるアミノ酸である配列番号１６０の位置２のアミノ酸は、Ａｌａであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９７におけるアミノ酸である配列番号１６０の位置３のアミノ酸は、Ｇｌｙであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９８におけるアミノ酸である配列番号１６０の位置４のアミノ酸は、Ａｒｇであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９９におけるアミノ酸である配列番号１６０の位置５のアミノ酸は、Ｔｒｐであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００におけるアミノ酸である配列番号１６０の位置６のアミノ酸は、Ａｌａであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ａにおけるアミノ酸である配列番号１６０の位置７のアミノ酸は、Ｐｒｏであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ｂにおけるアミノ酸である配列番号１６０の位置８のアミノ酸は、Ｌｅｕであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ｃにおけるアミノ酸である配列番号１６０の位置９のアミノ酸は、Ｇｌｙであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ｄにおけるアミノ酸である配列番号１６０の位置１０のアミノ酸は、Ａｌａであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ｅにおけるアミノ酸である配列番号１６０の位置１１のアミノ酸は、Ｐｈｅであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１０１におけるアミノ酸である配列番号１６０の位置１２のアミノ酸は、Ａｓｐであり、そして
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１０２におけるアミノ酸である配列番号１６０の位置１３のアミノ酸は、Ｉｌｅである。
【００６５】
配列番号１６１は、重鎖に対するより好適なＣＤＲ３コンセンサス配列を表し、ここで、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９５におけるアミノ酸である配列番号１６１の位置１のアミノ酸は、Ａｓｐであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９６におけるアミノ酸である配列番号１６１の位置２のアミノ酸は、ＧｌｙまたはＡｌａであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９７におけるアミノ酸である配列番号１６１の位置３のアミノ酸は、ＳｅｒまたはＧｌｙであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９８におけるアミノ酸である配列番号１６１の位置４のアミノ酸は、ＳｅｒまたはＡｒｇであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ９９におけるアミノ酸である配列番号１６１の位置５のアミノ酸は、Ｔｒｐであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００におけるアミノ酸である配列番号１６１の位置６のアミノ酸は、ＴｙｒまたはＡｌａであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ａにおけるアミノ酸である配列番号１６１の位置７のアミノ酸は、ＡｒｇまたはＡｓｐであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ｂにおけるアミノ酸である配列番号８の位置１６１のアミノ酸は、ＡｓｐまたはＬｅｕであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ｃにおけるアミノ酸である配列番号１６１の位置９のアミノ酸は、ＴｒｐまたはＡｌａであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１００ｄにおけるアミノ酸である配列番号１６１の位置１０のアミノ酸は、Ｐｈｅであり、
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１０１におけるアミノ酸である配列番号１６１の位置１１のアミノ酸は、Ａｓｐであり、そして
Ｋａｂａｔ位置Ｈ１０２におけるアミノ酸である配列番号１６１の位置１２のアミノ酸は、ＰｒｏまたはＩｌｅであり得る。
【００６６】
別の実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、ＣＤＲとして、配列番号６〜８に示されるすべての３つのそれぞれのコンセンサスＣＤＲ配列を含んでなる。
【００６７】
別の実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、配列番号６〜８に示されるそれぞれのコンセンサスＣＤＲ配列のうち少なくとも２つを含んでなる。
【００６８】
別の実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、配列番号６〜１１のコンセンサス配列のいずれかに示されるそれぞれの配列のうち少なくとも２つを有するＣＤＲ配列を含んでなる。
【００６９】
配列番号９〜１１は、配列番号２に結合する能力を有する抗体の軽鎖のＣＤＲ領域に対するコンセンサス配列を表す。コンセンサス配列は、配列番号２に特異的に結合することが本発明者らによって同定されている抗体から誘導される配列情報から誘導される。特に、軽鎖のＣＤＲ領域について同定されたコンセンサス配列を、実施例２Ａに記載のように単離した天然に存在するヒト抗体から誘導した。
【００７０】
配列番号９は、κ軽鎖免疫グロブリンＣＤＲ１領域に対するＣＤＲ１コンセンサス配列を表し、ここで、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ２４におけるアミノ酸である配列番号９の位置１のアミノ酸は、Ａｒｇであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ２５におけるアミノ酸である配列番号９の位置２のアミノ酸は、ＡｌａまたはＧｌｕであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ２６におけるアミノ酸である配列番号９の位置３のアミノ酸は、Ｓｅｒであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ２７におけるアミノ酸である配列番号９の位置４のアミノ酸は、Ｇｌｎであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ２８におけるアミノ酸である配列番号９の位置５のアミノ酸は、ＳｅｒまたはＧｌｙであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ２９におけるアミノ酸である配列番号９の位置６のアミノ酸は、ＶａｌまたはＩｌｅであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ３０におけるアミノ酸である配列番号９の位置７のアミノ酸は、ＡｓｎまたはＡｒｇまたはＳｅｒであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ３１におけるアミノ酸である配列番号９の位置８のアミノ酸は、ＳｅｒまたはＡｓｎであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ３２におけるアミノ酸である配列番号９の位置９のアミノ酸は、Ｔｙｒであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ３３におけるアミノ酸である配列番号９の位置１０のアミノ酸は、Ｌｅｕであり得、そして
Ｋａｂａｔ位置Ｌ３４におけるアミノ酸である配列番号９の位置１１のアミノ酸は、Ａｌａであり得る。
【００７１】
配列番号１０は、κ軽鎖免疫グロブリンＣＤＲ２領域に対するＣＤＲ２コンセンサス配列を表し、ここで、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ５０におけるアミノ酸である配列番号１０の位置１のアミノ酸は、ＡｌａまたはＧｌｙまたはＬｙｓまたはＴｒｐであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ５１におけるアミノ酸である配列番号１０の位置２のアミノ酸は、ＶａｌまたはＡｌａであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ５２におけるアミノ酸である配列番号１０の位置３のアミノ酸は、ＳｅｒまたはＡｌａであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ５３におけるアミノ酸である配列番号１０の位置４のアミノ酸は、ＴｈｒまたはＳｅｒまたはＡｓｎまたはＩｌｅであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ５４におけるアミノ酸である配列番号１０の位置５のアミノ酸は、ＡｒｇまたはＬｅｕであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ５５におけるアミノ酸である配列番号１０の位置６のアミノ酸は、ＡｌａまたはＧｌｎまたはＰｈｅまたはＧｌｕであり得、そして
Ｋａｂａｔ位置Ｌ５６におけるアミノ酸である配列番号１０の位置７のアミノ酸は、ＴｈｒまたはＳｅｒであり得る。
【００７２】
配列番号１１は、κ軽鎖免疫グロブリンＣＤＲ３領域に対するＣＤＲ３コンセンサス配列を表し、ここで、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ８９におけるアミノ酸である配列番号１１の位置１のアミノ酸は、Ｇｌｎであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ９０におけるアミノ酸である配列番号１１の位置２のアミノ酸は、Ｇｌｎであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ９１におけるアミノ酸である配列番号１１の位置３のアミノ酸は、ＡｌａまたはＴｙｒであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ９２におけるアミノ酸である配列番号１１の位置４のアミノ酸は、ＧｌｙまたはＡｓｎであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ９３におけるアミノ酸である配列番号１１の位置５のアミノ酸は、Ｓｅｒであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ９４におけるアミノ酸である配列番号１１の位置６のアミノ酸は、ＳｅｒまたはＰｈｅであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ９５におけるアミノ酸である配列番号１１の位置７のアミノ酸は、ＧｌｎまたはＰｒｏであり得、
Ｋａｂａｔ位置Ｌ９６におけるアミノ酸である配列番号１１の位置８のアミノ酸は、ＧｌｙまたはＬｅｕであり得、そして
Ｋａｂａｔ位置Ｌ９７におけるアミノ酸である配列番号９の位置１１のアミノ酸は、Ｔｈｒであり得る。
【００７３】
一実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、軽鎖のＣＤＲとして、配列番号６〜１１に示されるすべての３つのそれぞれのコンセンサスＣＤＲ配列を含んでなる。
【００７４】
一実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、配列番号９〜１１に示されるすべての３つのそれぞれのコンセンサスＣＤＲ配列から選択される軽鎖の少なくとも２つのＣＤＲを含んでなる。
【００７５】
軽鎖について示されるコンセンサスＣＤＲ配列（配列番号９〜１１）から選択される少なくとも２つのＣＤＲ配列、または重鎖について示されるコンセンサスＣＤＲ配列（配列番号６〜８）のうちの少なくとも２つ、または軽鎖由来の少なくとも１つのＣＤＲ（配列番号９〜１１）および重鎖由来の少なくとも１つのＣＤＲ（配列番号６〜８）を含んでなるポリペプチドが、なおより好適である。
【００７６】
一実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、軽鎖のＣＤＲとして、配列番号９〜１１に示されるすべての３つのそれぞれのコンセンサスＣＤＲ配列を含んでなる。
【００７７】
軽鎖について示されるコンセンサスＣＤＲ配列（配列番号９〜１１）から選択される少なくとも２つのＣＤＲ配列、および／または重鎖について示されるコンセンサスＣＤＲ配列（配列番号６〜８）のうちの少なくとも２つを含んでなるポリペプチドが、なおより好適である。
【００７８】
一実施形態では、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群の少なくとも２つのコンセンサスアミノ酸配列から選択される１を超えるアミノ酸配列を含んでなる単離されたモノクローナル抗βアミロイド抗体が提供され、ここで、前記１を超えるアミノ酸配列のそれぞれは異なる配列番号由来であり、ここで、前記抗体は、Ａβのモノマー形態に対するよりも高い親和性でＡβのダイマー形態に結合する。
【００７９】
さらなる実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、重鎖上のＣＤＲ１として、配列番号１３〜２０に示される配列のうちの１つ、重鎖上のＣＤＲ２として、配列番号２１〜２７および１４９に示される配列のうちの１つ、および／または重鎖上のＣＤＲ３として、配列番号２８〜３２に示される配列のうちの１つを含んでなる。
【００８０】
別の実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対するコンセンサス配列から選択される少なくとも２つのコンセンサスＣＤＲ配列を含んでなり、ここで、コンセンサス配列は、Ｋａｂａｔ番号付けに従って、以下の抗体可変領域の配列をアラインすることによって誘導される：
ａ）重鎖のＣＤＲ１では、配列番号５６〜７１および１４８
ｂ）重鎖のＣＤＲ２では、配列番号５６〜７１および１４８
ｃ）重鎖のＣＤＲ３では、配列番号５６〜７１および１４８
ｄ）軽鎖のＣＤＲ１では、配列番号４７〜５５および１４５〜１４７
ｅ）軽鎖のＣＤＲ２では、配列番号４７〜５５および１４５〜１４７
ｆ）軽鎖のＣＤＲ３では、配列番号４７〜５５および１４５〜１４７。
【００８１】
配列番号１３〜２０はＣＤＲ１配列を表し、配列番号２１〜２７および１４９はＣＤＲ２配列を表し、そして配列番号２８〜３２はＣＤＲ３配列を表し、これらは、本発明者らにより、Ａβ（１−４０）のＣ末端部、特に、Ａβ（２１−３７）に結合する抗体の重鎖上に存在することが見出された。
【００８２】
さらなる実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、軽鎖上のＣＤＲ１として、配列番号３３〜３７に示される配列のうちの１つ、軽鎖上のＣＤＲ２として、配列番号３８〜４３および１５０〜１５２に示される配列のうちの１つ、および／または軽鎖上のＣＤＲ３として、配列番号４４〜４６に示される配列のうちの１つを含んでなる。
【００８３】
配列番号３３〜３７はＣＤＲ１配列を表し、配列番号３８〜４３および１５０〜１５２はＣＤＲ２配列を表し、そして配列番号４４〜４６はＣＤＲ３配列を表し、これらは、本発明者らにより、Ａβ（１−４０）のＣ末端部、特に、Ａβ（２１−３７）に結合する抗体の軽鎖上に存在することが見出された。
【００８４】
好適な実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、重鎖上において、配列番号１３〜２０から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２１〜２７および１４８から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号２８〜３２から選択されるＣＤＲ３配列、ならびに軽鎖上において、配列番号３３〜３７から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号３８〜４３および１５０〜１５２から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号４４〜４６から選択されるＣＤＲ３配列を含んでなる。
【００８５】
特に、本発明に従うポリペプチドは、以下の軽鎖を含んでなり得る：
ａ）ＣＤＲ１として配列番号３４、ＣＤＲ２として配列番号３８およびＣＤＲ３として配列番号４４、または
ｂ）ＣＤＲ１として配列番号３３、ＣＤＲ２として配列番号４２およびＣＤＲ３として配列番号４４、または
ｃ）ＣＤＲ１として配列番号３７、ＣＤＲ２として配列番号４３およびＣＤＲ３として配列番号４６、または
ｄ）ＣＤＲ１として配列番号３４、ＣＤＲ２として配列番号４０およびＣＤＲ３として配列番号４４、または
ｅ）ＣＤＲ１として配列番号３５、ＣＤＲ２として配列番号３８およびＣＤＲ３として配列番号４４、または
ｆ）ＣＤＲ１として配列番号３３、ＣＤＲ２として配列番号４１およびＣＤＲ３として配列番号４４、または
ｇ）ＣＤＲ１として配列番号３３、ＣＤＲ２として配列番号４１およびＣＤＲ３として配列番号４５、または
ｈ）ＣＤＲ１として配列番号３４、ＣＤＲ２として配列番号３８およびＣＤＲ３として配列番号４４、または
ｉ）ＣＤＲ１として配列番号３６、ＣＤＲ２として配列番号３９およびＣＤＲ３として配列番号４４。
【００８６】
特に、本発明に従うポリペプチドはまた、重鎖を含んでなり得る：
ａ）ＣＤＲ１として配列番号１３、ＣＤＲ２として配列番号２１およびＣＤＲ３として配列番号２８、または
ｂ）ＣＤＲ１として配列番号１４、ＣＤＲ２として配列番号２７およびＣＤＲ３として配列番号３０、または
ｃ）ＣＤＲ１として配列番号１３、ＣＤＲ２として配列番号２６およびＣＤＲ３として配列番号２８、または
ｄ）ＣＤＲ１として配列番号１４、ＣＤＲ２として配列番号２１およびＣＤＲ３として配列番号３０、または
ｅ）ＣＤＲ１として配列番号１５、ＣＤＲ２として配列番号２３およびＣＤＲ３として配列番号２９、または
ｆ）ＣＤＲ１として配列番号１５、ＣＤＲ２として配列番号２２およびＣＤＲ３として配列番号２９、または
ｇ）ＣＤＲ１として配列番号２０、ＣＤＲ２として配列番号２７およびＣＤＲ３として配列番号３１、または
ｈ）ＣＤＲ１として配列番号１８、ＣＤＲ２として配列番号２５およびＣＤＲ３として配列番号３１、または
ｉ）ＣＤＲ１として配列番号１８、ＣＤＲ２として配列番号２７およびＣＤＲ３として配列番号３１、または
ｊ）ＣＤＲ１として配列番号１４、ＣＤＲ２として配列番号２７およびＣＤＲ３として配列番号３１、または
ｋ）ＣＤＲ１として配列番号１４、ＣＤＲ２として配列番号２１およびＣＤＲ３として配列番号３１、または
ｌ）ＣＤＲ１として配列番号１６、ＣＤＲ２として配列番号２１およびＣＤＲ３として配列番号３１、または
ｍ）ＣＤＲ１として配列番号１９、ＣＤＲ２として配列番号２１およびＣＤＲ３として配列番号３２、または
ｎ）ＣＤＲ１として配列番号１６、ＣＤＲ２として配列番号２１およびＣＤＲ３として配列番号２８、または
ｏ）ＣＤＲ１として配列番号１７、ＣＤＲ２として配列番号２６およびＣＤＲ３として配列番号３１、または
ｐ）ＣＤＲ１として配列番号１４、ＣＤＲ２として配列番号２４およびＣＤＲ３として配列番号２８。
【００８７】
以下を含んでなる本発明に従うポリペプチドがなおより好適である：
ａ）軽鎖上において、ＣＤＲ１として配列番号３４、ＣＤＲ２として配列番号３８およびＣＤＲ３として配列番号４４、ならびに重鎖上において、ＣＤＲ１として配列番号１３、ＣＤＲ２として配列番号２１およびＣＤＲ３として配列番号２８、または
ｂ）軽鎖上において、ＣＤＲ１として配列番号３３、ＣＤＲ２として配列番号４２およびＣＤＲ３として配列番号４４、ならびに重鎖上において、ＣＤＲ１として配列番号１４、ＣＤＲ２として配列番号２７およびＣＤＲ３として配列番号３０。
【００８８】
配列番号５３の配列を有する可変軽鎖、および配列番号６０の配列を有する可変重鎖を含んでなる本発明に従うポリペプチド、または配列番号３３、配列番号４１および配列番号４５のＣＤＲ配列を有する軽鎖、ならびに配列番号１５、配列番号２３および配列番号２９のＣＤＲ配列を有する重鎖を含んでなるポリペプチドが、なおより好適である。
【００８９】
配列番号４７〜５５および１４５〜１４７は、軽鎖の可変領域を示し、そして配列番号５６〜７１および１４８は、本発明者らによって決定されるように、Ａβ（１−４０）のＣ末端部、特に、Ａβ（２１−３７）に特異的に結合する能力を有する抗体の重鎖の可変領域を示す。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原特異性を担う。従って、さらなる実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、配列番号４７〜５５および１４５〜１４７から選択される配列、ならびに／あるいは配列番号５６〜７１および１４８から選択される配列を含んでなる。特に好適な実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、配列番号４７および配列番号５６または配列番号４８および配列番号５７を含んでなる。
【００９０】
配列番号４７〜５５および１４５〜１４７の軽鎖のそれぞれは、配列番号５６〜７１および１４８の重鎖のいずれかと組み合わせることができる。従って、配列番号４７および配列番号５６；配列番号４７および配列番号５７；配列番号４７および配列番号５８；配列番号４７および配列番号５９；配列番号４７および配列番号６０；配列番号４７および配列番号６１；配列番号４７および配列番号６２；配列番号４７および配列番号６３；配列番号４７および配列番号６４；配列番号４７および配列番号６５；配列番号４７および配列番号６６；配列番号４７および配列番号６７；配列番号４７および配列番号６８；配列番号４７および配列番号６９；配列番号４７および配列番号７０；配列番号４７および配列番号７１；配列番号４７および配列番号１４８；配列番号４８および配列番号５６；配列番号４８および配列番号５７；配列番号４８および配列番号５８；配列番号４８および配列番号５９；配列番号４８および配列番号６０；配列番号４８および配列番号６１；配列番号４８および配列番号６２；配列番号４８および配列番号６３；配列番号４８および配列番号６４；配列番号４８および配列番号６５；配列番号４８および配列番号６６；配列番号４８および配列番号６７；配列番号４８および配列番号６８；配列番号４８および配列番号６９；配列番号４８および配列番号７０；配列番号４８および配列番号７１；配列番号４８および配列番号１４８；配列番号４９および配列番号５６；配列番号４９および配列番号５７；配列番号４９および配列番号５８；配列番号４９および配列番号５９；配列番号４９および配列番号６０；配列番号４９および配列番号６１；配列番号４９および配列番号６２；配列番号４９および配列番号６３；配列番号４９および配列番号６４；配列番号４９および配列番号６５；配列番号４９および配列番号６６；配列番号４９および配列番号６７；配列番号４９および配列番号６８；配列番号４９および配列番号６９；配列番号４９および配列番号７０；配列番号４９および配列番号７１；配列番号４９および配列番号１４８；配列番号５０および配列番号５６；配列番号５０および配列番号５７；配列番号５０および配列番号５８；配列番号５０および配列番号５９；配列番号５０および配列番号６０；配列番号５０および配列番号６１；配列番号５０および配列番号６２；配列番号５０および配列番号６３；配列番号５０および配列番号６４；配列番号５０および配列番号６５；配列番号５０および配列番号６６；配列番号５０および配列番号６７；配列番号５０および配列番号６８；配列番号５０および配列番号６９；配列番号５０および配列番号７０；配列番号５０および配列番号７１；配列番号５０および配列番号１４８；配列番号５１および配列番号５６；配列番号５１および配列番号５７；配列番号５１および配列番号５８；配列番号５１および配列番号５９；配列番号５１および配列番号６０；配列番号５１および配列番号６１；配列番号５１および配列番号６２；配列番号５１および配列番号６３；配列番号５１および配列番号６４；配列番号５１および配列番号６５；配列番号５１および配列番号６６；配列番号５１および配列番号６７；配列番号５１および配列番号６８；配列番号５１および配列番号６９；配列番号５１および配列番号７０；配列番号５１および配列番号７１；配列番号５１および配列番号１４８；配列番号５２および配列番号５６；配列番号５２および配列番号５７；配列番号５２および配列番号５８；配列番号５２および配列番号５９；配列番号５２および配列番号６０；配列番号５２および配列番号６１；配列番号５２および配列番号６２；配列番号５２および配列番号６３；配列番号５２および配列番号６４；配列番号５２および配列番号６５；配列番号５２および配列番号６６；配列番号５２および配列番号６７；配列番号５２および配列番号６８；配列番号５２および配列番号６９；配列番号５２および配列番号７０；配列番号５２および配列番号７１；配列番号５２および配列番号１４８；配列番号５３および配列番号５６；配列番号５３および配列番号５７；配列番号５３および配列番号５８；配列番号５３および配列番号５９；配列番号５３および配列番号６０；配列番号５３および配列番号６１；配列番号５３および配列番号６２；配列番号５３および配列番号６３；配列番号５３および配列番号６４；配列番号５３および配列番号６５；配列番号５３および配列番号６６；配列番号５３および配列番号６７；配列番号５３および配列番号６８；配列番号５３および配列番号６９；配列番号５３および配列番号７０；配列番号５３および配列番号７１；配列番号５３および配列番号１４８；配列番号５４および配列番号５６；配列番号５４および配列番号５７；配列番号５４および配列番号５８；配列番号５４および配列番号５９；配列番号５４および配列番号６０；配列番号５４および配列番号６１；配列番号５４および配列番号６２；配列番号５４および配列番号６３；配列番号５４および配列番号６４；配列番号５４および配列番号６５；配列番号５４および配列番号６６；配列番号５４および配列番号６７；配列番号５４および配列番号６８；配列番号５４および配列番号６９；配列番号５４および配列番号７０；配列番号５４および配列番号７１；配列番号５４および配列番号１４８；配列番号５５および配列番号５６；配列番号５５および配列番号５７；配列番号５５および配列番号５８；配列番号５５および配列番号５９；配列番号５５および配列番号６０；配列番号５５および配列番号６１；配列番号５５および配列番号６２；配列番号５５および配列番号６３；配列番号５５および配列番号６４；配列番号５５および配列番号６５；配列番号５５および配列番号６６；配列番号５５および配列番号６７；配列番号５５および配列番号６８；配列番号５５および配列番号６９；配列番号５５および配列番号７０；配列番号５５および配列番号７１；配列番号５５および配列番号１４８；配列番号１４５および配列番号５６；配列番号１４５および配列番号５７；配列番号１４５および配列番号５８；配列番号１４５および配列番号５９；配列番号１４５および配列番号６０；配列番号１４５および配列番号６１；配列番号１４５および配列番号６２；配列番号１４５および配列番号６３；配列番号１４５および配列番号６４；配列番号１４５および配列番号６５；配列番号１４５および配列番号６６；配列番号１４５および配列番号６７；配列番号１４５および配列番号６８；配列番号１４５および配列番号６９；配列番号１４５および配列番号７０；配列番号１４５および配列番号７１；配列番号１４５および配列番号１４８；配列番号１４６および配列番号５６；配列番号１４６および配列番号５７；配列番号１４６および配列番号５８；配列番号１４６および配列番号５９；配列番号１４６および配列番号６０；配列番号１４６および配列番号６１；配列番号１４６および配列番号６２；配列番号１４６および配列番号６３；配列番号１４６および配列番号６４；配列番号１４６および配列番号６５；配列番号１４６および配列番号６６；配列番号１４６および配列番号６７；配列番号１４６および配列番号６８；配列番号１４６および配列番号６９；配列番号１４６および配列番号７０；配列番号１４６および配列番号７１；配列番号１４６および配列番号１４８；配列番号１４７および配列番号５６；配列番号１４７および配列番号５７；配列番号１４７および配列番号５８；配列番号１４７および配列番号５９；配列番号１４７および配列番号６０；配列番号１４７および配列番号６１；配列番号１４７および配列番号６２；配列番号１４７および配列番号６３；配列番号１４７および配列番号６４；配列番号１４７および配列番号６５；配列番号１４７および配列番号６６；配列番号１４７および配列番号６７；配列番号１４７および配列番号６８；配列番号１４７および配列番号６９；配列番号１４７および配列番号７０；配列番号１４７および配列番号７１；または配列番号１４７および配列番号１４８を含んでなる抗βアミロイド抗体が提供される。
【００９１】
好適な実施形態では、抗βアミロイド抗体は、配列番号１４５および配列番号６０；配列番号５３および配列番号６０；配列番号５１および配列番号６０；配列番号５２および配列番号６０；配列番号１４６および配列番号６０；配列番号５３および配列番号１４８；配列番号５５および配列番号６１；配列番号１４５および配列番号６２；配列番号５４および配列番号６０；配列番号５４および配列番号６１；配列番号５４および配列番号１４８；配列番号１４５および配列番号１４８；または配列番号１４６および配列番号６１を含んでなる。
【００９２】
加えて、配列番号７２〜７４は、軽鎖の定常領域を示し、そして配列番号７５〜７７は、Ａβ（１−４０）のＣ末端部、特に、Ａβ（２１−３７）に特異的に結合する能力を有する抗体の重鎖の定常領域を示す。従って、さらなる実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、配列番号７２〜７４から選択される配列、および／または配列番号７５〜７７から選択される配列を含んでなり得る。特に、本発明に従うポリペプチドは、配列番号７２〜７３から選択される配列、および配列番号７５〜７７から選択される配列を含んでなり得る。
【００９３】
Ａβ（１−４０）のＣ末端部、特に、Ａβ（２１−３７）に特異的に結合する能力を有する抗体の軽鎖について、可変領域および定常領域からなる完全な配列を、配列番号７８〜９３に示す。
【００９４】
従って、本発明の別の実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、配列番号７８〜９３から選択される配列を含んでなる。
【００９５】
Ａβ（１−４０）のＣ末端部、特に、Ａβ（２１−３７）に特異的に結合する能力を有する抗体の重鎖について、可変領域および定常領域からなる完全な配列を、配列番号９４〜１３７に示す。従って、本発明の別の実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、配列番号９４〜１３７から選択される配列を含んでなる。
【００９６】
なおより好適な実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、配列番号７８に示される配列および配列番号９４に示される配列または配列番号８０に示される配列および配列番号９７に示される配列を含んでなる。それぞれの鎖の類似のアイソフォームおよびそれらの組み合わせ（図２３ａから採取することができる）にも同じことが当てはまる。
【００９７】
フレームワーク領域に対するコンセンサス配列を同定することもできる。重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が、Ｋａｂａｔ則に従ってそれぞれアラインされる場合、いわゆるフレームワーク領域、Ｎ末端からＣＤＲ１、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ２の間、ＣＤＲ２〜ＣＤＲ３の間、ならびにＣ末端からＣＤＲ３を、ＣＤＲ領域について上記に類似の方法で比較することができ、そして本発明の抗体のフレームワークに対するコンセンサス配列を誘導することができる。
【００９８】
本発明者らが、Ｎ末端配列、Ａβ（１−４０）のＣ末端部、特に、Ａβ（２１−３７）に特異的に結合する能力を有する抗体のκ軽鎖の約１８アミノ酸残基が良好に保存されていることを見出したことに留意すべきである。このことは、ＩＶＩｇＧ製剤から誘導される抗体、ならびに患者血清から誘導される抗体についても当てはまる。図３１に、さらに配列番号１３８〜１４３としても示される前記配列を示す。Ａβペプチドに結合する場合、これらの抗体のκ軽鎖のＮ末端の保存的性質は、抗原特異性および／または斑形成の防止に寄与し得ることが考慮される。それ故、好適な実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、配列番号４４のコンセンサス配列において示される配列、特に、配列番号１３８〜１４３に示される配列を含んでなる。
【００９９】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、オリゴマー形態のβ−アミロイドポリペプチドに特異的に結合する。非限定的例によって、ポリペプチドは、オリゴマー形態のＡβ（１−４０）またはオリゴマー形態のＡβ（１２−２０）またはオリゴマー形態のＡβ（２１−３７）に結合することができる。一態様では、１晩、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４において、４℃でインキュベートする場合、本発明のポリペプチドは、オリゴマー形態のＡβ（１−４０）に特異的に結合することが可能である。
【０１００】
別の態様では、本発明の自己抗体は、Ａβの対応するモノマーに対するよりも高い親和性でＡβのダイマーに結合する。
【０１０１】
一般に、結合親和性は、抗体−抗原の組み合わせの測定であり、そして他の任意のエピトープへの結合と比較する場合、所定の抗体がエピトープに結合する選択性に関する。この優先的および選択的結合は、結合親和性または力価として定量することができる。抗体親和性を計算する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、非特許文献３；非特許文献４（両方とも、本明細書において参考として援用される）を参照のこと。
【０１０２】
好適な実施形態では、本発明に従うポリペプチドが抗体である場合、前記抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、それらがそれほど交差反応を示さないという利点を有する。
【０１０３】
別の好適な実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、Ａβ（２１−３７）（配列番号２）に結合する抗体の誘導体および／またはフラグメントを含んでなる。無傷な抗体（但し、Ｆｃ−ドメインを欠く）の抗原結合特性を保持する抗体のフラグメントを得るために、例えば、プロテアーゼによって酵素的に抗体を処置することができることは当該技術分野において周知である。そのようなフラグメントは、例えば、それぞれ、パパインまたはペプシンプロテアーゼによる抗体の酵素消化を介して入手可能であるＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。抗体の別のフラグメントは、抗体の一本鎖の可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、即ち、短い可撓性リンカー（通常、セリン、グリシン）を介する抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の融合である。通常、そのようなキメラ分子は、定常領域の取り出しおよびリンカーペプチドの導入にもかかわらず、本来の抗体の特異性を保持する。一本鎖の可変フラグメントは、そのような融合タンパク質をコードするそれぞれの核酸の遺伝子操作によって、入手することができる。そのようなフラグメントの利点は、それが、単一のポリペプチド鎖のみからなることであり、それは、適切に機能するために正確な集成を必要とする少なくとも４本のポリペプチド鎖を含んでなる抗体全体より、人工発現系において容易に発現され、そして適切にフォールディングされる。
【０１０４】
本発明に従うポリペプチドが抗体である場合、ヒトにおけるその低い免疫原性のため、ヒト抗体が好適である。しかし、抗体またはそのフラグメントは、抗体産生に適切な任意の種から誘導することができる。非ヒト抗体は、特に、マウス、ニワトリ、ウサギ、ラット、ロバ、ラクダ、ヒトコブラクダ、サメおよびラマから誘導することができる。ラクダ、ヒトコブラクダ、サメ、およびラマの抗体は、これらの動物が、ホモダイマーのみからなる抗体を有するという利点を有する。それ故、そのようなポリペプチドは、一本鎖の可変フラグメントについて上記のような発現および集成における類似の利点を有する。
【０１０５】
別の好適な実施形態では、抗体、その誘導体またはフラグメントは、ヒト化抗体、そのまたはフラグメントであり、即ち、抗原結合ドメインまたはその部分が非ヒト由来である一方、抗体の残りの部分、その誘導体またはフラグメントは、ヒト由来である。別の好適な実施形態では、抗体、その誘導体またはフラグメントはキメラであり、即ち、可変ドメインまたはその部分が非ヒト由来である一方、定常ドメインはヒト由来である。両方の実施形態は、非ヒト由来のタンパク質ドメインの免疫原性特性によるネガティブな副作用を減少する目的を満たす。なおより好適な実施形態では、アミロイドβペプチド（１−４０）（配列番号１）のエピトープＡβ（２１−３７）（配列番号２）に結合するポリペプチドは、前記エピトープに結合する抗体のパラトープのみを含んでなる抗体誘導体またはフラグメントである。そのようなパラトープの例には、例えば、介在配列または合成リンカーを介して接続した重鎖および軽鎖のそれぞれのＣＤＲドメインのためのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドがある。
【０１０６】
一態様では、本発明の抗体は、特異的抗Ａβ（２１−３７）自己抗体に対する対立遺伝子変異体、保存的に改変された変異体、および軽微な組み換え改変を包含する。抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化をコーディングＤＮＡに導入することによってか、またはペプチド合成によって調製することができる。そのような変異体として、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換が挙げられる。最終的構築物に到達するために、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせが行われるが、但し、最終的構築物は、所望される特徴を所有する。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数または位置を変更するように、抗体の翻訳後のプロセスを変更してもよい。
【０１０７】
アミノ酸配列挿入として、例えば、１残基〜１００残基もしくはそれ以上を含有するポリペプチドの範囲の長さのアミノ−および／またはカルボキシル−末端融合、ならびに単一もしくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入を挙げることができる。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基もしくは特異的結合因子を伴う抗体またはエピトープタグもしくはサルベージ受容体エピトープに融合された抗体（抗体フラグメントを含む）が挙げられる。他の挿入変異体として、例えば、Ｎ末端またはＣ末端における抗体の血清中半減期を増加するポリペプチドへの融合が挙げられる。
【０１０８】
別のタイプの変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子において少なくとも１アミノ酸残基が取り出され、そしてその場所に異なる残基が挿入される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づく基に分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族性：ｔｉｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１０９】
保存的置換は、アミノ酸を、そのクラスの別のメンバーで置き換えることに関与する。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、別のクラスのメンバーで置き換えることに関与する。保存的置換の例として、ａｌａをｖａｌ、ｌｅｕまたはｉｌｅで置き換えること；ａｒｇをｌｙｓ、ｇｌｎまたはａｓｎで置き換えること；ａｓｎをｇｌｎ、ｈｉｓ、ａｓｐ、ｌｙｓ、またはｇｌｎで置き換えること；ａｓｐをｇｌｕまたはａｓｎで置き換えること；ｃｙｓをｓｅｒまたはａｌａで置き換えること；ｇｌｎをａｓｎまたはｇｌｕで置き換えること；ｇｌｕをａｓｐまたはｇｌｎで置き換えること；ｇｌｙをａｌａで置き換えること；ｈｉｓをａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、またはａｒｇで置き換えること；ｉｌｅをｌｅｕ、ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａまたはｐｈｅで置き換えること；ｌｅｕをノルロイシン、ｉｌｅ、ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、またはｐｈｅで置き換えること；ｌｙｓをａｒｇ、ｇｌｙ、ａｓｎで置き換えること；ｍｅｔをｌｅｕ、ｐｈｅ、またはｉｌｅで置き換えること；ｐｈｅをｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａ、またはｔｙｒで置き換えること；ｐｒｏをａｌａで置き換えること；ｓｅｒをｔｈｒで置き換えること；ｔｈｒをｓｅｒで置き換えること；ｔｒｐをｔｙｒまたはｐｈｅで置き換えること；ｔｙｒをｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒまたはｓｅｒで置き換えること；およびｖａｌをｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａ、またはノルロイシンで置き換えることが挙げられる。
【０１１０】
特異的結合因子またはヒト化もしくは変異体抗体の適切なコンフォメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基もまた、一般的に、セリンで改変され得、分子の酸化安定性を改善し、そして異常な架橋を防止するために置換され得る。対照的に、システイン結合を、特異的結合因子または抗体に付加して、その安定性を改善してもよい（特に、抗体がＦｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）。
【０１１１】
また、例えば、抗体において見出される１つ以上の炭水化物部分を欠失すること、および／または抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することによって、親抗体に対して改変されたグリコシル化パターンを有する変更されたグリコシル化改変体を産生させることもできる。抗体を含むポリペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素学的付着のための認識配列である。ポリペプチドにおいてこれらのトリペプチド配列のうちいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作製される。それ故、抗体がこれらのトリペプチド配列の１つ以上を含有するようにアミノ酸配列変更することによって、Ｎ−結合型グリコシル化部位を抗体に付加してもよい。Ｏ−結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはスレオニン（但し、また、５−ヒドロキシプロリンもしくは５−ヒドロキシリジンを使用してもよい）への糖Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの付着を指す。１つ以上のセリンまたはスレオニン残基を抗体の配列に挿入あるいは置換することによって、Ｏ−結合型グリコシル化部位を、特異的結合因子または抗体に付加してもよい。
【０１１２】
例えば、（例えば、適切な領域の変異によってか、またはエピトープをペプチドタグに組み入れ、次いで、例えば、ＤＮＡもしくはペプチド合成によって末端もしくは中間において抗体に融合させることによって；例えば、特許文献１１を参照のこと）サルベージ受容体結合性エピトープの組み入れまたは付加によるか、あるいはＰＥＧまたは多糖ポリマーを含む他の水溶性ポリマーのような分子を付加することによる血清中半減期を増加するための改変もまた、所望され得る。
【０１１３】
抗体の調製
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注入によって、動物において惹起される。あるいは、抗原は、動物のリンパ節に直接注入してもよい（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１６：３８１−３８９，１９９７を参照のと）。改善された抗体応答は、二官能性もしくは誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸または当該技術分野において公知の他の薬剤を使用して、免疫しようとする種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターに関連抗原をコンジュゲートすることによって、得てもよい。
【０１１４】
動物は、例えば、（マウスについて）１００μｇのタンパク質もしくはコンジュゲートと３容積のフロイント完全アジュバントとを組み合わせ、そして溶液を複数の部位に皮内注入することによって、抗原、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫することができる。１箇月後、複数部位における皮下注入によって、フロイント完全アジュバント中の本来の量の１／５〜１／１０のペプチドまたはコンジュゲートで、動物をブーストする。ブースター注入の７〜１４日後、動物から採血し、そして抗体価について血清を分析する。動物は、力価プラトーまでブーストする。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲート（但し、異なる架橋剤を介してコンジュゲートされる）でブーストされる。コンジュゲートはまた、タンパク質融合物として組み換え細胞培養において作製することができる。また、アルム（ａｌｕｍ）のような凝集剤が、免疫応答を増強するために適切に使用される。
【０１１５】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、非特許文献５によって最初に記載されたハイブリドーマ方法、または組み換えＤＮＡ方法を使用して、作製することができる。ハイブリドーマ方法では、ラット、ハムスターまたはマカクザルのようなマウスあるいは他の適切な宿主動物は、免疫のために使用するタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかもしくは産生することが可能であるリンパ球を誘発するために、免疫される。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。次いで、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を使用して、リンパ球を、骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる（非特許文献６）。そのようにして調製したハイブリドーマ細胞を、播種し、そして好ましくは、融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する適切な培養培地において、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）（これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する）。
【０１１６】
好適な骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、そして培地に対して感受性である細胞である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫細胞系統もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（非特許文献７；非特許文献８）。例示的なマウス骨髄腫系統として、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから利用可能なＭＯＰ−２１およびＭ．Ｃ．−１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ＵＳＡから利用可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞から誘導される系統が挙げられる。ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対して指向されたモノクローナル抗体の産生について分析する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合アッセイによって決定する。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅまたはスキャッチャード解析（非特許文献９）によって決定することができる。
【０１１７】
所望される特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを、限界希釈手順によってサブクローニングし、そして標準的な方法（非特許文献６）によって増殖する。この目的のための適切な培養培地として、例えば、Ｄ−ＭＥＭＯまたはＲＰＭＩ１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体を、プロテインＡ−セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水、または血清から適切に分離する。
【０１１８】
抗体の組み換え産生
目的の免疫グロブリンのアミノ酸配列は、直接タンパク質配列決定によって決定することができ、そして適切なコーディングヌクレオチド配列は、ユニバーサルコドン表に従って、設計することができる。
【０１１９】
あるいは、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）従来の手順を使用して、容易に単離し、そして配列決定することができる。配列決定は、一般的に、目的の遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分の単離を必要とする。通常、これには、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡをクローニングすることが必要である。クローニングは、標準的な技術を使用して行われる（例えば、非特許文献１０（本明細書において参考として援用される）を参照のこと）。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、好ましくは、膜結合型（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ｍＲＮＡの逆転写によって構築することができ、そしてライブラリーは、ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特定なプローブを使用してスクリーニングされる。好適な実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、目的の免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、軽鎖可変セグメント）をコードするｃＤＮＡ（または全長ｃＤＮＡの部分）を増殖する。増幅された配列は、任意の適切なベクター、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、またはファージディスプレイベクターに容易にクローニングすることができる。目的の免疫グロブリンポリペプチドのいくつかの部分の配列を決定することが可能である限り、使用される特定のクローニング方法はそれほど厳密ではないことが理解されよう。
【０１２０】
クローニングおよび配列決定のために使用されるＲＮＡの１つの供給源は、トランスジェニックマウスからＢ細胞を入手し、そしてＢ細胞を不死細胞に融合することによって産生されるハイブリドーマである。ハイブリドーマを使用する利点は、それらを容易にスクリーニングすることができ、そして目的のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが選択されることである。あるいは、ＲＮＡは、免疫動物のＢ細胞（または脾臓全体）から単離することができる。ハイブリドーマ以外の供給源を使用する場合、免疫グロブリンまたは特異的結合特性を伴う免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列に対してスクリーニングすることが所望され得る。そのようなスクリーニングのための１つの方法は、ファージディスプレイ技術の使用である。ファージディスプレイについては、例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、特許文献１２、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、特許文献１３、および非特許文献１１（これらのそれぞれは本明細書において参考として援用される）に記載されている。一実施形態では、ファージディスプレイ技術を使用して、免疫したトランスジェニックマウス由来のｃＤＮＡ（例えば、全脾臓ｃＤＮＡ）を単離し、ＰＣＲを使用して、免疫グロブリンポリペプチド、例えば、ＣＤＲ領域の一部をコードするｃＤＮＡ配列を増幅し、そして増幅された配列を、ファージベクターに挿入する。目的のペプチド、例えば、所望される結合特徴を伴う可変領域ペプチドをコードするｃＤＮＡを、パンニングのような標準的な技術によって同定する。
【０１２１】
次いで、増幅またはクローニングした核酸の配列を決定する。典型的に、免疫グロブリンポリペプチドの全可変領域をコードする配列を決定するが、しかし、時々、可変領域の一部分のみ、例えば、ＣＤＲ−コーディング部分を配列決定する必要がある。典型的に、配列決定した部分は、少なくとも３０塩基長であり、そしてより多くの場合、可変領域の長さのうち少なくとも約３分の１または少なくとも約２分の１をコードする塩基が、配列決定される。
【０１２２】
配列決定は、ｃＤＮＡライブラリーから単離したクローン、もしくはＰＣＲを使用する場合、サブクローニング後、増幅された配列に対してか、または増幅されたセグメントの直接ＰＣＲ配列決定によって、行うことができる。配列決定は、標準的な技術を使用して行われる（例えば、非特許文献１０、および非特許文献１２（本明細書において参考として援用される）を参照のこと）。クローニングされた核酸の配列と、ヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの公開された配列とを比較することによって、当業者は、配列決定された領域に依存して、（ｉ）（重鎖のアイソタイプを含む）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチドの生殖細胞系列セグメント使用頻度、および（ｉｉ）Ｎ−領域付加および体細胞変異のプロセスから生じる配列を含む重鎖および軽鎖可変領域の配列を容易に決定することができる。免疫グロブリン遺伝子配列情報の１つの供給源は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤである。
【０１２３】
一旦単離されたら、ＤＮＡを、発現制御配列に作動可能に連結するか、または発現ベクターに配置することができ、次いで、それを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サル（ｓｉｍｉａｎ）ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を指令する。
【０１２４】
発現制御配列は、特に、宿主生物体において作動可能に連結されたコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列を示す。例えば、原核細胞に適切な制御配列は、プロモーター、場合により、オペレーター配列、およびリボゾーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが公知である。
【０１２５】
核酸は、それが別の核酸配列との機能的関係で配置される場合、作動可能に連結される。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのためのＤＮＡは、それが、ポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結されるか；プロモーターもしくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されるか；またはリボゾーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように位置する場合、コーディング配列に作動可能に連結される。一般的に、作動可能に連結されるとは、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、そして分泌リーダーの場合は、隣接かつリーディング相にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結は、便宜的な制限部位において連結によって達成することができる。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、常法に従って使用することができる。
【０１２６】
細胞、細胞系統、および細胞培養は、しばしば、交換可能に使用され、そしてそのようなすべての命名は、子孫を含む。形質転換体および形質転換された細胞は、初代の主題細胞および移入回数にかかわりなくそれから誘導される培養物を含む。また、すべての子孫では、意図的または偶発的な変異のため、ＤＮＡ含有量は正確に同一でなくてもよいことが理解される。本来形質転換される細胞についてスクリーニングされるような同じ機能または生物活性を有する変異子孫も含まれる。
【０１２７】
特異的抗体をコードする単離された核酸（場合により、宿主細胞、ベクター、および核酸を含んでなる宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結されている）、ならびに抗体の産生のための組み換え技術（核酸が発現されるように宿主細胞を培養すること、および場合により、宿主細胞培養または培養培地から抗体を回収することを含んでなり得る）もまた提供される。
【０１２８】
多様なベクターが、当該技術分野において公知である。ベクター成分は、次の１つ以上を含むことができる：シグナル配列（例えば、抗体の分泌を指令することができる）、複製開始点、１つ以上の選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質もしくは他の薬剤耐性を付与するか、栄養要求欠損を補足するか、または培地では入手できない栄養素を供給することができる）、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列（それらはすべて当該技術分野において周知である）。
【０１２９】
適切な宿主細胞として、原核細胞、酵母、または高等真核生物細胞が挙げられる。適切な原核細胞として、真正細菌（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）、例えば、グラム陰性またはグラム陽性生物体、例えば、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｈａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えば、セラチア・マルセッカンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ならびに桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。原核細胞に加えて、糸状菌または酵母のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのため適切なクローニングまたは発現宿主である。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または一般的なパン酵母は、下等真核宿主微生物のなかでも最も一般的に使用される。しかし、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、例えば、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；クリヴェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワンニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、シュワンニオマイセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；および糸状菌、例えば、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トイポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ならびにアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、Ａ．ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などの他の多くの属、種、および株が市販されている。
【０１３０】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物体から誘導される。無脊椎動物細胞の例として、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体、ならびにヨウトガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（幼虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）、およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のような宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。そのような細胞のトランスフェクションのための多様なウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォミカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｍｉｃａ）ＮＰＶのＬ−Ｉ変異体およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ−５株が好適に利用可能である。
【０１３１】
しかし、脊椎動物細胞は最も興味深く、そして培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、日常的になっている。有用な哺乳動物宿主細胞系統の例には、ＣＨＯＫｌ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４；非特許文献１３）を含むチャイニーズハムスター卵巣細胞；ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）によって形質転換されるサル腎臓ＣＶｌ系統；ヒト胎児腎系統（懸濁培養における増殖のためにサブクローニングされる２９３または２９３細胞、［非特許文献１４］；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、非特許文献１５）；サル腎細胞（ＣＶｌ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（ＷＩ３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝癌細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（非特許文献１６）；ＭＲＣ５細胞およびＦＳ４細胞がある。
【０１３２】
宿主細胞は、多様な培地において培養することができる。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適切である。加えて、非特許文献１７、非特許文献１８、特許文献１４；特許文献１５；特許文献１６；特許文献１７；または特許文献１８；特許文献１９；特許文献２０；または特許文献２１に記載の培地のいずれも、宿主細胞のための培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれも、必要であれば、ホルモンならびに／あるいは他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、もしくは上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧｅｎｔａｍｙｃｉｎＴＭ薬）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補充することができる。他の任意の必要な補充物もまた、当業者に公知である適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択される宿主細胞によって先に使用された条件であり、そして当業者には明らかであろう。
【０１３３】
抗体組成物は、例えば、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、カチオンもしくはアニオン交換クロマトグラフィー、あるいは好ましくは、アフィニティーリガンドとして目的の抗原またはプロテインＡもしくはプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィーを使用して、精製することができる。プロテインＡを使用して、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（非特許文献１９）。すべてのマウスアイソタイプおよびヒトγ３について、プロテインＧが推奨される（非特許文献２０）。アフィニティーリガンドが付着するマトリックスは、最も多くの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御された多孔性ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリックスは、アガロースによって達成され得る流速および処理時間より速い流速および遅い処理時間を可能にする。抗体はＣＨ３ドメインを含んでなる場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，２５ＮＪ．）が精製に有用である。エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿のようなタンパク質精製のための他の技術もまた、回収しようとする特異的結合因子または抗体に依存して可能である。
【０１３４】
当業者が本特許出願の情報を扱えば、本発明に従う方法を実施する仕方を容易に知るであろう。１つの実施例は、配列番号２の配列を有するポリペプチドでセファロースカラムを被覆し、続いて、サンプルから誘導される免疫グロブリン画分（抗体画分）と共にインキュベーションし、洗浄工程およびカラムに結合したＡβ（２１−３７）特異的抗体の以後の溶出を実施する。本発明に従う分離の方法について、Ａβポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド（ここで、Ａβポリペプチドの配列は、少なくとも配列番号２に従う配列および多くとも配列番号４に従う配列を有する）は、タグまたはマーカーのような部分、特に、ビオチン、ストレプトアビジン、ＧＳＴ、ＨＩＳ、ＳＴＲＥＰ−タグ、Ｍｙｃ、ＨＡ、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン−Ｌ−アラニンコポリマー、ポリ−Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、ポリ−β−アラニン、ポリ−Ｌ−アラニン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン−Ｄ−アラニンコポリマー、ポリ−Ｄ−アラニン、またはポリ−Ｌ−およびＤ−アミノ酸の組み合わせをさらに含んでなる。これらのマーカーは、このポリペプチドのキャリアへの結合を容易にすることができる。溶出、即ち、本発明に従うポリペプチドのキャリアからの分離は、例えば、ｐＨ２への短期間のｐＨ変化を適用することによってか、配列番号２に従う配列を含んでなるポリペプチドを過剰に添加することによってか、または溶出緩衝液の塩含有量を増加することによって、達成することができる。さらに、被験体の血清または市販のＩＶＩｇＧ製剤からのポリペプチドの単離のための非限定的例を、本出願の実施例セクションにおいてより詳細に示す。
【０１３５】
抗体は、ヒト被験体だけではなく、動物に由来することができる。上記の方法の類似体においてそのような動物の血液から既存の抗Ａβ（２１−３７）自己抗体を単離することの他に、そのような動物を、Ａβポリペプチド（ここで、Ａβポリペプチドの配列は、少なくとも配列番号２に従う配列、および多くとも配列番号４に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドでさらに免疫することができる。数回の免疫化後、日常的方法によって、動物の血液から、対応するＡβ特異的抗体を産生するＢ細胞を得ることができる。
【０１３６】
必要に応じて、（ヒトまたは動物由来の）そのようなＢ細胞クローンは、例えば、動物の脾臓から細胞を単離し、そしてエプスタイン・バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ）ウイルスでのトランスフェクションによるか、または細胞と骨髄腫細胞とを融合する（ハイブリドーマ技術）ことによりそれらを不死化することによって、細胞系統に変換することができる。後者は、大量の抗体を産生するのに特に有用である。
【０１３７】
あるいは、本発明のポリペプチドは、適切であれば、従来のポリペプチド合成か、インビトロ翻訳かまたはポリペプチドおよびタンパク質を合成する他の任意の手段のいずれかによって、直接合成することができる。当業者であれば、多数の適切な技術に精通しており、そして容易に、それらを本発明の主題に適用することが可能であろう。
【０１３８】
さらに、アミロイド−β（１−４０）（配列番号１）のエピトープＡβ（２１−３７）（配列番号２）に結合するポリペプチドは、抗体以外のタンパク質由来であり得る。例として、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）を操作して、所定のエピトープ、即ち、配列番号２に示されるようなエピトープに結合させることができる。アンチカリンは、リポカリン足場に基づく操作されたリガンド結合性タンパク質のクラスである。ループ領域の標的化された変異誘発および生化学的選択技術を使用して、低分子量物質および巨大分子タンパク質標的の両方について新規のリガンド特異性を伴う変異体を作製することができる（特許文献２２；非特許文献２１；非特許文献２２を参照のこと）。そのようなポリペプチドのＡβＣ末端部、特に、Ａβ（２１−３７）への結合はまた、Ａβペプチドの重合の阻害を提供することができ、それ故、アルツハイマー病および他の神経性認知症疾患の処置およびまたは予防のための効率的な手段を提供することができる。
【０１３９】
本発明に従うポリペプチドはまた、組み換え発現系を介して得ることができる。本発明に従うポリペプチドを発現させるために、それぞれの核酸発現構築物を作製しなければならない。従って、本発明はまた、本発明に従うポリペプチドをコードする、特に、上記の抗体、その誘導体またはフラグメントのうちの１つの軽鎖もしくは重鎖をコードするか、あるいはＡβ（２１−３７）に結合するアンチカリンのような本発明に従う別のタンパク質をコードする配列を有する核酸に関する。そのような核酸は、例えば、質量分析手段、エドマン配列決定または当業者に公知のタンパク質配列決定のための他の任意の方法を介して、例えば、上記のペプチドのうちの１つのアミノ酸配列を同定することによって、得ることができる。遺伝子暗号に従って、核酸配列を、アミノ酸配列から誘導することができる。好ましくは、作製された核酸配列を、目的のそれぞれの発現系のコドン使用頻度に関して最適化する。あるいは、そのような抗体を発現する細胞を単離することができ（上記を参照のこと）、そしてＡβのＣ末端に特異的な抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子座またはｍＲＮＡが配列決定される。所定の発現系では、最適なコドン使用頻度を提供するために、この核酸配列を適応する必要があり得る。当業者が上記の核酸配列を扱えば、容易に、適切な発現系に使用するための発現構築物を作製することが可能であろう。従って、本発明はまた、本発明のポリペプチドの発現を提供する発現構築物、および本発明に従うポリペプチドまたはそのフラグメントを発現する単離された細胞に関する。発現構築物、即ち、ベクターとして、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、エピソームならびに人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられる。当業者であれば、標準的な組み換え技術によって、ベクターを構築することが可能である。前記細胞は、例えば、本発明に従う発現ベクターで形質転換される骨髄腫細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、シリアンハムスター卵巣細胞、ヒト胎児腎細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス系）、もしくはトランスジェニック植物細胞（非特許文献２３を参照のこと）または本発明に従うポリペプチドを内因的に発現する細胞（ハイブリドーマ）であり得る。本発明の組み換えポリペプチドの発現は、真核細胞に限定されるが、原核細胞においても発現され得る。本発明に従う組み換えポリペプチドは、当該技術分野において周知である精製手段によって、そのような任意の細胞から得ることができる。
【０１４０】
好適な実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、抗体またはそのフラグメントであり、そして場合により、２つの発現ベクター、即ち、軽鎖に対して１つの発現ベクターおよび重鎖に対して１つの発現ベクターによってコードされる。
【０１４１】
ポリペプチドフラグメントＡβ（２１−３７）内で結合するために、抗体またはそのフラグメントは、主に無傷な抗原結合ドメイン（可変ドメイン）を必要とする。そのような抗体の定常領域は、通常、抗原結合性にそれほど重要ではない。それ故、本発明に従うポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである場合、この抗体／フラグメントがこれらのアイソタイプのすべてのそれぞれのサブクラスを含むＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群から選択される任意の所定のアイソタイプを有し得ることは、当業者に明らかである。本発明に従うポリペプチドが、免疫細胞またはハイブリドーマ細胞において抗体として発現される場合、アイソタイプは、さらなる発現または活性化誘導シチジンデアミナーゼの投与および当業者に公知の刺激因子の投与によってクラス変換することができる。
【０１４２】
一実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、斑凝集を防止するおよび／または毒性Ａβオリゴマーの崩壊をもたらす物質と化学的に結合されるか、あるいは融合される。そのような物質は、例えば、本発明に従うエピトープの実験的特徴付けに使用されるアミロイドβポリペプチドを切断するプロテアーゼ、即ち、トリプシン、キモトリプシンのようなセリン−プロテアーゼ；またはＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ、Ａｒｇ−Ｃプロテアーゼ、Ａｓｐ−Ｎ−プロテアーゼ、また、プロテイナーゼ−Ｋ、サーモリシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎｅ）、スブチリシンのような非特異的プロテアーゼであり得る。
【０１４３】
本発明はまた、サンプルからの本発明に従うポリペプチドの単離および分離の方法に関し、本方法は、以下の工程を含んでなる：
ａ）Ａβポリペプチド（ここで、Ａβポリペプチドの配列は、少なくとも配列番号２に従う配列、即ち、Ａβ（２１−３７）および多くとも配列番号４に従う配列、即ち、Ａβ（１２−４０）を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド（ポリペプチドは、キャリア上に固定化されている）を、サンプルと共にインキュベートする工程、
ｂ）前記サンプルをキャリアから分離する工程。
ｃ）工程ａ）のポリペプチドに結合した本発明に従うポリペプチドをキャリアから分離する工程。
【０１４４】
代替的アプローチでは、本発明に従うポリペプチドは、サンプルを、Ａβポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドと共にインキュベートすることによって得ることができ、ここで、キャリアとのインキュベーションの前に、Ａβポリペプチドの配列は、少なくとも配列番号２に従う配列および多くとも配列番号４に従う配列を有する。それ故、本発明はまた、サンプルからの本発明に従うポリペプチドの分離の方法に関し、本方法は、以下の工程を含んでなる：
ａ）Ａβポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド（ここで、Ａβポリペプチドの配列は少なくとも配列番号２に従う配列および多くとも配列番号４に従う配列を有する）を、サンプルと共にインキュベートする工程、ならびにその後、
ｂ）サンプルを、工程ａ）のポリペプチドに対して結合親和性を有するキャリアと共にインキュベートする工程、ならびに
ｃ）前記サンプルをキャリアから分離する工程、ならびに
ｄ）工程ａ）のポリペプチドに結合した本発明に従うポリペプチドをキャリアから分離する工程。
【０１４５】
即ち、目的の細胞系統におけるそれぞれのポリペプチドの遺伝子操作および発現を介して上記のポリペプチドを得るためのストラテジーおよび技術は、当該技術分野において周知である。本発明に従う抗体フラグメントは、無傷な抗体から物理的に誘導する必要はないが、従来の手段によっても遺伝子操作することができる。
【０１４６】
上記のポリペプチドは、例えば、ヒト被験体の血液に由来する抗体を、配列番号１のアミノ酸２１〜３７（即ち、配列番号２）に結合する能力についてスクリーニングすることによって、得ることができる。
【０１４７】
処置の方法
別の態様では、本発明は、ヒトおよび獣医学に使用するための本発明に従う上記のポリペプチドの使用に関する。
【０１４８】
特に、本発明に従うポリペプチドは、アルツハイマー病、ダウン症候群、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、脳アミロイド血管症、および／またはアミロイドーシスの進行を処置および／または予防するための医薬品の製造に使用することができる。
【０１４９】
さらに加えて、本発明は、ヒトおよび獣医学、特に、アルツハイマー病、ダウン症候群、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、脳アミロイド血管症、およびアミロイドーシスの処置および／または予防のための医薬品の製造に使用するためのＡβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号２に従う配列および多くとも配列番号４に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの使用に関する。
【０１５０】
本発明では、本発明者らは、ＡＤ患者ならびに健常者コントロール個体の血清から単離されるＡβ自己抗体によって認識される２つのＡβエピトープ配列を同定した。健常者コントロール個体のＡβ自己抗体は、Ａβ配列のＣ末端部、即ち、Ａβ（２１−３７）（配列番号２）を特異的に認識することを見出した。さらに加えて、ＡＤ患者では、ＡβポリペプチドのＡβ（４−１０）部（配列番号３）を認識する抗体の画分が増加する一方、ＡβポリペプチドのＡβ（２１−３７）部を認識する抗体の画分は減少する。さらに、本発明者らは、ＡＤを患っていない健常な個体では、Ａβ（４−１０）に結合するＡβ自己抗体の量と比較したＡβの特異的Ｃ末端エピトープ、即ち、Ａβ（２１−３７）に対して指向されるＡβ自己抗体の量の割合が、ＡＤ患者よりかなり高いことを見出した。このエピトープへの結合は、斑の形成を阻害し、従って、ＡＤの発症および進行を遅延させるようである。これは、ヒト被験体または動物への薬剤の投与による新規の治療アプローチの基礎を提供し、この薬剤は、前記エピトープに結合し、それによってＡβペプチドの凝集を防止する。これは、アルツハイマー病の発症および／または進行を遅延させ、結果的に、価値の高い治療／予防医薬品を提供する。
【０１５１】
本発明者らは、ヒト身体が神経性認知症疾患を予防する天然の方法のように、Ａβの毒性オリゴマーを標的するための進化によって経時的に選択された天然のヒト抗体のクラスを同定したと考えている。そのような抗体は、Ａβまたは関連ペプチドへの結合によって、脳血管に病理学的影響を生じないことが予想される。最近、ＡβのＮ末端部に対して指向された抗体による受動免疫は、動物のトランスジェニックマウスモデルにおいて出血を生じることが示された。これらの実験では、受動免疫の５箇月後、免疫したマウスの新皮質において、シャム処置コントロールと比較して、有意なアミロイドの減少が見出された。しかし、免疫したマウスでは、コントロールを超える出血感受性の増加に加えて、ＣＡＡ−関連脳出血の頻度が２倍を超える増加を示した。これらの有害事象は、脳血管に沈着したＡβに結合するＡβ抗体によって生じると考えられる（Ｐｆｅｉｆｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．２００３、Ｈｅｒｚｉｇ  ＭＣ，ｅｔ  ａｌ  ２００４）。
【０１５２】
それ故、本発明はまた、神経性認知症疾患、アルツハイマー病、ダウン症候群、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、脳アミロイド血管症、およびアミロイドーシスの進行を処置および／または予防するための医薬品の製造のための上記のポリペプチドの使用に関する。上記の疾患の処置／予防は、Ａβ斑形成の防止によって提供される。それぞれの疾患のステージに依存して、これは、例えば、斑のさらなる形成を防止することによって、（まだ発症していない）疾患の予防または（疾患の発症後の）処置をもたらす。好適な実施形態では、医薬品は、患者の脳における斑の処置および／または予防のために処方される。
【０１５３】
あるいは、上記で既に示したように、本発明はまた、アルツハイマー病、ダウン症候群、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、脳アミロイド血管症、および／またはアミロイドーシスの処置のための医薬品の製造のためのＡβペプチド（ここで、Ａβポリペプチドは、少なくとも配列番号２に従う配列および多くとも配列番号４に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの使用に関する。そのような場合には、このエピトープは、Ａβ（２１−３７）に対する内因性抗体産生を増強するために、ヒトまたは動物被験体の能動免疫に役立つ。そのような免疫アプローチはまた、Ａβタンパク質フラグメントの投与を回避する有益性を有するＤＮＡワクチンを利用することもできる。従って、本発明はまた、Ａβポリペプチド（ここで、Ａβポリペプチドは、少なくとも配列番号２に従う配列および多くとも配列番号４に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする核酸分子に関する。結果的に、本発明はまた、アルツハイマー病、ダウン症候群、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、脳アミロイド血管症またはアミロイドーシスの処置および／または予防のための医薬品の製造のためのこの核酸配列の使用に関する。
【０１５４】
医薬製剤の投与および調製
抗Ａβ抗体は、所望される送達方法に適切なキャリアを含んでなる医薬組成物に処方することができる。適切なキャリアは、抗体と組み合わせた場合、Ａβの高い親和性の結合を保持し、そして被験体の免疫系に対して非反応性である任意の材料を含む。例として、滅菌リン酸緩衝食塩溶液、静菌水などのような多くの標準的な医薬品キャリアのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。多様な水性キャリア、例えば、水、緩衝水、０．４％塩水、０．３％グリシンなどを使用してもよく、そして若干の化学的改変などに供されたアルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどのような増強された安定性のための他のタンパク質を含むことができる。
【０１５５】
製剤における例示的な抗体濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１８０ｍｇ／ｍｌまたは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、あるいは約２ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。抗体の水性製剤は、例えば、約４．５〜約６．５、または約４．８〜約５．５、あるいは約５．０の範囲のｐＨのｐＨ緩衝液において調製することができる。この範囲内のｐＨに適切である緩衝液の例として、例えば、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸緩衝液が挙げられる。緩衝液濃度は、例えば、製剤の緩衝液および所望される等浸透圧に依存して、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約６０ｍＭであり得る。
【０１５６】
また、抗体を安定化することもできる張性剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）を、製剤に封入することができる。例示的な張性剤の例として、マンニトール、スクロースまたはトレハロースのような糖アルコールが挙げられる。高張液または低張液も適切であり得るが、好ましくは、水性製剤は等張性である。製剤における糖アルコールの例示的な濃度は、約１％〜約１５％ｗ／ｖの範囲であり得る。
【０１５７】
また、処方された抗体の凝集を減少するおよび／または製剤における粒子の形成を最小限にするおよび／または吸着を減少するために、界面活性剤を抗体製剤に添加してもよい。例示的な界面活性剤として、ポリソルベート類（例えば、ポリソルベート２０、もしくはポリソルベート８０）またはポロキサマー類（例えば、ポロキサマー１８８）のような非イオン性界面活性剤が挙げられる。界面活性剤の例示的な濃度は、約０．００１％〜約０．５％、または約０．００５％〜約０．２％、あるいは約０．００４％〜約０．０１％ｗ／ｖの範囲であり得る。
【０１５８】
一実施形態では、製剤は、上記の薬剤（即ち、抗体、緩衝液、ポリオールおよび界面活性剤）を含有し、そしてベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノールおよびベンゼトニウムＣｌのような１つ以上の保存剤を本質的に含まない。別の実施形態では、保存剤は、例えば、約０．１％〜約２％、あるいは約０．５％〜約１％の範囲の濃度で、製剤に含まれていてもよい。非特許文献２４に記載のもののような１つ以上の他の薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または安定剤は、製剤の所望される特徴に有害な影響を及ぼさない限り、製剤に含まれていてもよい。許容可能なキャリア、賦形剤または安定剤は、用いる用量および濃度においてレシピエントに非毒性であり、そして次のものを含む：さらなる緩衝剤；共溶媒；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；ＥＤＴＡのようなキレート剤；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ポリエステルのような生分解性ポリマー；および／またはナトリウムのような塩形成対イオン。
【０１５９】
抗体の治療用製剤は、凍結乾燥された製剤または水溶液の形態で、所望される程度の純度を有する抗体と任意の生理学的に許容可能なキャリア、賦形剤または安定剤（非特許文献２４）とを混合することによって、貯蔵のために調製される。許容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、用いる用量および濃度においてレシピエントに非毒性であり、そしてリン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；グルコース、マンノース、マルトース、もしくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／あるいは非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０１６０】
一実施形態では、適切な製剤は、張性を保持し（ｔｏｎｉｃｉｔｉｅｓ）、そして安定化する糖アルコール、ソルビトール、スクロースまたは塩化ナトリウムのような張性剤との組み合わせで、リン酸塩、酢酸塩またはＴＲＩＳ緩衝液のような等張性緩衝液を含有する。そのような張性剤の一例は、５％ソルビトールまたはスクロースである。加えて、製剤は、場合により、凝集を防止するような、および０．０１〜０．０２％ｗ／ｖにおける安定化のための界面活性剤を含むことができる。製剤のｐＨは、４．５〜６．５または４．５〜５．５の範囲であり得る。抗体に対する医薬製剤の他の例示的な説明は、特許文献２３および特許文献２４（それぞれ、本明細書においてその全体が参考として援用される）において見出すことができる。
【０１６１】
本明細書に記載の製剤はまた、治療する特定の適応症に必要な１を超える活性化合物、好ましくは、相互に悪影響を及ぼさない相補活性を伴うものを含有することができる。例えば、免疫抑制剤をさらに提供することが望ましいことがある。そのような分子は、意図される目的のために有効な量で組み合わされて適切に存在する。
【０１６２】
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ハイドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにおいてか、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）においてか、またはマクロエマルジョンもしくはミニセルにおいて、捕捉され得る。そのような技術は、非特許文献２４に開示されている。
【０１６３】
抗体の懸濁液および結晶形態もまた、考慮される。懸濁液および結晶形態を作製する方法は、当業者に公知である。
【０１６４】
インビボ投与に使用すべき製剤は、滅菌状態でなければならない。本発明の組成物は、従来の周知の滅菌技術によって、滅菌することができる。例えば、滅菌は、滅菌ろ過膜を介するろ過によって、容易に達成される。得られる溶液は、使用のために包装しても、または無菌条件下でろ過し、そして凍結乾燥してもよく、凍結乾燥した製剤は、投与の前に滅菌溶液と組み合わされる。凍結乾燥のプロセスは、特に、ポリペプチドが液体条件において比較的不安定である場合、長期間の貯蔵の間ポリペプチドを安定化するために、しばしば用いられる。凍結乾燥サイクルは、通常、次の３つの工程からなる：凍結、一次乾燥、および二次乾燥；非特許文献２５。凍結工程では、溶液が適切に凍結するまで、それを冷却する。この段階で、溶液中のバルク水は氷を形成する。減圧を使用して、氷の蒸気圧より下方にチャンバ圧を減少することによって行われる一次乾燥段階において、氷が昇華する。最終的に、二次乾燥段階、低いチャンバ圧下および高い棚温度下で、吸着水または結合水を取り出す。プロセスは、凍結乾燥ケーキとして公知の材料を生成する。以後、使用前にケーキを再構成することができる。
【０１６５】
非経口投与のための製剤の生成において、抗細菌剤の希釈溶液が時々使用されるが、凍結乾燥した材料の標準的な再構成の実施は、（典型的に、凍結乾燥中に取り出された容積に均等な）容積の純水を添加して戻す；非特許文献２６。
【０１６６】
賦形剤は、場合によっては、凍結乾燥製品の安定剤として作用することが認められている；非特許文献２７。例えば、既知の賦形剤として、糖アルコール（マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含む）；糖（グルコースおよびスクロースを含む）；ならびにアミノ酸（アラニン、グリシンおよびグルタミン酸を含む）が挙げられる。
【０１６７】
加えて、糖アルコールおよび糖は、凍結および乾燥により引き起こされる損傷からポリペプチドを保護するため、および乾燥状態における貯蔵中の安定性を増強するために、しばしば使用される。一般に、糖類、特に、二糖類は、凍結乾燥プロセスおよび貯蔵中の両方において効果的である。単糖類および二糖類ならびにＰＶＰのようなポリマーを含む他のクラスの分子もまた、凍結乾燥製品の安定剤として報告されている。
【０１６８】
注入では、医薬製剤および／または医薬品は、上記の適切な溶液による再構成に適切な粉末であり得る。これらの例として、凍結乾燥、ロータリー乾燥または噴霧乾燥された粉末、無定形粉末、顆粒、沈殿物、または粒子が挙げられるが、これらに限定されない。注入では、製剤は、場合により、安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ改善剤、およびこれらの組み合わせを含有してもよい。
【０１６９】
持続放出製剤を調製することもできる。持続放出製剤の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、成形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（特許文献２５）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、Ｌｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注入可能な微小球）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーが、１００日間を超える分子の放出を可能にする一方、所定のヒドロゲルは、より短期間の間、タンパク質を放出する。カプセル化された抗体が身体において長時間留まる場合、それらは、３ＴＣにおける水分への暴露の結果として変性または凝集し得、生物活性の消失および免疫原性または他の機能的特性における可能な変化をもたらす。関与する機構に依存する安定化のための合理的なストラテジーを考案することができる。例えば、凝集のメカニズムが、チオ−ジスルフィド相互交換（ｔｈｉｏ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ）を介する分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見される場合、スルフヒドリル残基を改変すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、水分含有量を制御すること、適切な添加剤を使用すること、および特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって、安定化を達成してもよい。
【０１７０】
本発明の製剤は、短期作用性、迅速放出性、長期作用性、または本明細書において記載のように持続放出性であるように設計することができる。それ故、医薬製剤はまた、制御型放出または緩徐放出のために処方することができる。
【０１７１】
具体的な用量は、疾患の病態、年齢、体重、全身の健康状態、性別、および被験体の食事、投薬間隔、投与経路、排泄速度、および薬物の組み合わせに依存して調整することができる。有効量を含有する上記の剤形のいずれも、十分に日常的実験の範囲内にあり、従って、十分に本発明の範囲内にある。
【０１７２】
特異的結合因子または抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内、ならびに局所処置を所望する場合、病巣内投与を含む任意の適切な手段によって、投与される。非経口的輸注として、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または皮下投与が挙げられる。加えて、特異的結合因子または抗体は、特に、特異的結合因子または抗体の漸減用量によるパルス注入によって適切に投与される。好ましくは、投薬は、注入、最も好ましくは、静脈内または皮下注入によって行われ、これは、部分的には、投与が短期であるかまたは長期であるかに依存する。例えば、所望される部位の付近に配置されたカテーテルを介する局部、特に、経皮、経粘膜、経直腸、経口または局所投与を含む他の投与方法も考慮される。最も好ましくは、抗体は、生理学的溶液中、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間の範囲の用量で、日単位から週単位、月単位までの範囲の頻度（例えば、連日、１日おき、２日おき、または１週間あたり２、３、４、５、もしくは６回）で、好ましくは、０．１〜４５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇまたは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量を、１週間あたり２もしくは３回の頻度で、または１箇月に１回、４５ｍｇ／ｋｇまで、静脈内に投与される。
【０１７３】
脳への投与
化合物の脳への投与を行うための多様なアプローチが、当該技術分野において公知である。例えば、化合物は、直接的脳室内または髄腔内注入によって、好ましくは、脳実質に対する影響を最小限にするための緩徐な輸注を介して、投与することができる。所望される薬物はまた、脳における徐放性インプラント、または（薬物がポリペプチドである場合）薬物を産生するインプラントされた組み換え細胞を使用して、送達することができる。血液脳関門（ＢＢＢ）を、薬物の投与に伴って透過性にして、薬物のＢＢＢを横切る移動を可能にすることができる。透過性化因子として、高張性マンニトールのような浸透剤、またはブラジキニン、アルキルグリセロール、超音波、電磁放射または副交感神経支配のような別の透過性化因子が挙げられる。
【０１７４】
あるいは、受容体仲介輸送を利用して、薬物を脳に投与することもできる。ＢＢＢを直接横切るペプチドおよびタンパク質は、血流への送達後、治療用薬剤がＢＢＢを横切ることを可能にする選択的治療用薬剤のためのキャリアとして役立ち得ることは、当該技術分野において公知である（非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０；特許文献２６；非特許文献３１）。例えば、特許文献２７は、後に低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１、ＢＢＢにおけるトランスポーターによって取り込まれるアミロイド−βタンパク質フラグメントへの抗体のコンジュゲーションについて記載している。ＢＢＢを横切るペプチドの他の例として、トランスフェリン受容体、ＢＢＢにおけるトランスポーターに結合するトランスフェリン；ＯＸ２６のようなトランスフェリン受容体に対するモノクローナル抗体；ＴＡＴトランスダクションドメイン、ペネトラチン、またはＳｙｎ  Ｂｌのような細胞透過性ペプチド；および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−２、ＢＢＢにおける別のトランスポーターに結合するＲＡＰが挙げられる（非特許文献３２を参照のこと）。
【０１７５】
脳への受容体仲介薬物送達は、キメラペプチド技術を用いることができ、ここで、非輸送性薬物が、ＢＢＢ輸送ベクターにコンジュゲートされる。後者は、インビボでＢＢＢを介して受容体仲介トランスサイトーシスを経験する改変されたタンパク質または受容体特異的モノクローナル抗体であり得る。薬物の輸送ベクターへのコンジュゲーションは、化学的リンカー、アビジン−ビオチン技術、ポリエチレングリコールリンカー、またはリポソームによって促進される。複数のクラスの治療剤が、ペプチドに基づく製剤、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むアンチセンス治療剤、およびリポソーム内に組み入れられる小分子を含むキメラペプチド技術によって、脳に送達されている。あるいは、薬物を、リポソームまたはナノ粒子にカプセル化することができ、次いで、これは、ＢＢＢ輸送ベクターに連結される。
【０１７６】
他の薬剤による投与
抗体は、他の抗アミロイド性治療用薬剤と併用して投与することができる。薬剤がそれらの治療効果を発揮している時間においていくつかの重複が存在する限り、併用投与は、異なる時間および異なる経路における異なる２つの治療用薬剤の投与を含む。
【０１７７】
当該技術分野において公知の例示的な抗アミロイド性薬剤として、他の抗アミロイド−β抗体、アミロイド蓄積の病原性効果を減少する当該技術分野において公知の抗炎症薬（例えば、ＮＳＡＩＤおよびＣｏｘ−２インヒビター）、コレステロール降下薬、β−セクレターゼインヒビター、またはＡβ抗体の投与により炎症反応を減少するかもしくは抗Ａβ抗体の副作用のモニタリングを可能にする抗炎症薬が挙げられる。
【０１７８】
本発明に従う医薬品の投与は、任意の一般的経路を介して達成することができる。静脈内経路は好適な実施形態であるが、他の投与経路も考慮される。これは、経口、経鼻、経頬、経直腸、経膣または局部を含む。あるいは、投与は、同所性、皮内、皮下、筋肉内または腹腔内によるものであってもよい。
【０１７９】
別の好適な実施形態では、本発明に従うポリペプチドを含んでなる本発明に従う医薬品は、それぞれの疾患について第２の医薬品と組み合わせられた投与のために処方される。そのような治療のための例には、アセチルコリンエステラーゼのインヒビターまたはＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）受容体アンタゴニストがある。本発明に従う医薬品の投与は、第２の医薬品の投与の前、同時または後であり得る。
【０１８０】
さらなる態様では、本発明は、上記の本発明のポリペプチドの１つ以上を、それを必要とする被験体に投与する工程を含んでなる、アルツハイマー病、ダウン症候群、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、脳アミロイド血管症もしくはアミロイドーシスの処置および／または予防の方法に関する。
【０１８１】
本発明はまた、Ａβポリペプチド（ここで、Ａβポリペプチドの配列は、本発明に従うポリペプチドのサンプルからの単離および分離のために、少なくとも配列番号２に従う配列、即ち、Ａβ（２１−３７）および多くとも配列番号４に従う配列、即ち、Ａβ（１２−４０）を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの使用に関する。
【０１８２】
疾患の進行の検出および測定
ペプチド
別の態様では、アルツハイマーおよび他の神経性認知症疾患の進行を検出するおよび／または測定するのに有用であるＡβペプチドが提供される。
【０１８３】
本発明者らは、ＡＤ患者ならびに健常者コントロール個体の血清から単離されるＡβ自己抗体によって認識される２つのＡβエピトープ配列を同定した。健常者コントロール個体のＡβ自己抗体は、Ａβ配列のＣ末端部、即ち、Ａβ（２１−３７）（配列番号２）またはＡβ（２１−３７）を含んでなる他の任意の配列を特異的に認識することを見出した。さらに加えて、ＡＤ患者では、Ｎ末端、特に、ＡβポリペプチドのＡβ（４−１０）エピトープ（配列番号３）を認識する抗体の画分が増加する一方、Ｃ末端、特に、Ａβ（２１−３７）エピトープまたはＡβポリペプチドのＡβ（２１−３７）を含んでなる他の任意の配列を認識する抗体の画分が減少する。これは、Ａβ抗体の決定による新規の早期ＡＤ診断方法の基礎を提供し、ここで、高いレベルのＡβ自己抗体（Ａβ２１−３７）は、ポジティブな指標、即ち、「健康」である一方、高いレベルの「斑特異的」Ａβ（４−１０）抗体は、被験体の疾患進行の予後に関して、ネガティブなインジケーター、即ち、「病気」である。
【０１８４】
従って、一態様では、本発明は、Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号２に従う配列および多くとも配列番号４に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに関する。
【０１８５】
上記のＡβの配列を有する本発明に従うポリペプチドは、例えば、アミロイドβ自体のＡβ（２１−３７）フラグメントであってもよい。他の可能な実施形態は、例えば、Ａβ（２０−３７）、Ａβ（１２−３７）、Ａβ（１２−４０）（配列番号４）、Ａβ（２０−４０）、Ａβ（２１−４０）などを含んでなり得る。このポリペプチドフラグメントは、他の部分に接合させることができる。これは、本発明に従うポリペプチドが、Ａβ（２１−３７）部分の他に、他のポリペプチド配列または非ポリペプチド構造もしくは部分を含んでなり得ることを意味する。Ａβポリペプチドフラグメントに付着した部分は、本発明に従う方法の実施を容易にし得る。他の態様では、Ａβポリペプチドは、オリゴマーを形成することができる。そのようなオリゴマーの例として、オリゴマー形態のＡβ（１−４０）またはオリゴマー形態のＡβ（１２−２０）またはオリゴマー形態のＡβ（２１−３７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８６】
それ故、好適な実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、特に、ポリペプチドのキャリアへの付着を容易にするタグまたはマーカーのような他の部分をさらに含んでなる。特に、そのようなタグは、それぞれのアンタゴニストで被覆されたキャリア上のポリペプチドの固定化を提供することができる。そのような部分の例には、ビオチン、ストレプトアビジン、ＧＳＴ、ＨＩＳ、ＳＴＲＥＰ−タグ、Ｍｙｃ、ＨＡ、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン−Ｌ−アラニンコポリマー、ポリ−Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、ポリ−β−アラニン、ポリ−Ｌ−アラニン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン−Ｄ−アラニンコポリマー、ポリ−Ｄ−アラニン、またはポリ−Ｌ−および−Ｄ−アミノ酸の組み合わせがある。本発明の方法において使用される配列番号３に従う配列、および多くとも配列番号５に従う配列を含んでなるポリペプチドはまた、そのようなさらなる部分を含んでなることができる。
【０１８７】
上記のペプチドマーカーは、例えば、それぞれ、配列番号２または３の配列を有するポリペプチドに直接融合させることができる。マーカー／タグと例えば、Ａβ（２１−３７）ペプチドとの間により高度の可撓性を所望する場合、リンカーを導入することができる。そのようなリンカーは、例えば、ポリグリシンまたは−アラニンリンカーであり得る。ビオチン、非ペプチド物質は、本発明のポリペプチドに共有結合することができる。本発明のポリペプチドの固定化のためのマーカーおよびキャリアの多数の可能な組み合わせは、先行技術から公知である。
【０１８８】
好適な実施形態では、例えば、配列番号２に従う配列を有する上記ポリペプチドの領域は、β−シートコンフォメーションではない。Ａβのβ−プリーツシートコンフォメーションは、神経毒性を担うことが明らかにされている。それ故、健常な個体におけるＡβ（２１−３７）抗体は、それがランダムコイルであるかまたはα−ヘリックスコンフォメーションである場合、特に、Ａβ（２１−３７）領域またはＡβ（２１−３７）を含んでなる他の任意の配列を認識する。従って、別の好適な実施形態では、配列番号２に従う配列またはＡβ（２１−３７）を含んでなる他の任意の配列を有する上記のポリペプチドの領域は、配列番号２に従う配列を有するポリペプチド領域のβ−シート形成を防止または減少するアミノ酸配列によってフランキングされる。好ましくは、前記フランキングアミノ酸配列は、例えば、配列番号２に従う配列を有するＡβ配列ストレッチのＮ−および／またはＣ末端の近接に局在し、および／またはこのフランキングアミノ酸配列は、例えば、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、β−アラニン、Ｄ−バリン、Ｌ−グリシン、Ｄ−グリシンおよび／または関連する疎水性アミノ酸を含んでなるオリゴマーペプチドからなる。−（Ｌ−アラニン）ｎ−、−（Ｄ−アラニン）ｎ−、−（Ａｉｂ）ｎ−、−（β−アラニン）ｎ−、−（Ｄ−バリン）ｎ−、−（Ｌ−グリシン）ｎ−、−（Ｄ−グリシン）ｎ−のようなオリゴマーペプチドは、フランキングアミノ酸配列として特に好適であり、ここで、ｎは、好ましくは、約２〜約６の範囲である。そのようなフランキング領域はまた、本発明のポリペプチドのエピトープＡβ（２１−３７）がβ−シートコンフォメーションで存在せず、それ故、サンプル中のＡβ（２１−３７）自己抗体にアクセス可能であることを確実にする。いくつかの実施形態では、β−アミロイドポリペプチドは、オリゴマー形態である。
【０１８９】
しかし、特定の実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、Ａβ（２０−３７）、Ａβ（１２−３７）、Ａβ（１２−４０）、Ａβ（２０−４０）またはＡβ（２１−４０）の配列以外のさらなる配列を有さない最小のポリペプチドである。特に、前記ポリペプチドのオリゴマー形態は、本発明の好適な実施形態である。
【０１９０】
しかし、上記のポリペプチド以外のポリペプチドであって、第１のモノクローナル抗体（この第１の抗体は、配列番号２に示される配列またはＡβ（２１−３７）を含んでなる他の任意の配列に特異的に結合することが可能である）に特異的に結合するが、第２のモノクローナル抗体（この第２のモノクローナル抗体は、配列番号３に示される配列に特異的に結合することが可能である）には特異的に結合しない上記のポリペプチド以外のポリペプチドもまた、本発明の方法を実践するために使用することができることが理解されるべきである。
【０１９１】
好適な実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、従来のポリペプチド合成方法によって直接合成される（また、実施例５も参照のこと）。類似のアプローチも、Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの作製に適切である。
【０１９２】
あるいは、本発明に従うポリペプチドはまた、インビトロ翻訳によってか、または組み換え発現系を介して得ることができる。本発明に従うポリペプチドを発現させるために、それぞれの核酸発現構築物を作製しなければならない。当業者は、本発明に従うポリペプチドをコードする核酸配列を所有する適切な発現系を構築するためのいくつかの方法を明確に理解するであろう。その後、構築物は、適切な宿主細胞において発現され、そしてポリペプチドが単離される。この精製工程では、上記のマーカーおよび／またはタグも使用することができる。
【０１９３】
本発明者らは、ＡＤ患者の血清において、健常な個体には存在しないか、または低い量でしか存在しないＡβペプチドのＮ末端エピトープに対して指向される抗体のさらなる画分を見出した。それ故、そのような抗体の検出は、ＡＤの診断、ステージおよび／または進行を表示する。そのような診断方法およびアッセイのために、一方のＡβ（２１−３７）と、Ａβ（４−１０）またはＡβのＮ末端部に対して指向される他の抗体との間を区別するために、Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３（Ａβ（４−１０））に従う配列および多くとも配列番号５（Ａβ（１−２０））に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを使用することができる。
【０１９４】
一実施形態では、本発明は、Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号２に従う配列および多くとも配列番号４に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに関する。
【０１９５】
それ故、本発明に従うポリペプチドは、少なくとも、配列番号１のアミノ酸２１〜アミノ酸３７の範囲のＡβペプチドアミノ酸配列に同一の配列ストレッチを含んでなる。このペプチド配列は、本明細書において、それぞれ、配列番号２またはＡβ（２１−３７）として示される。本発明に従うポリペプチドはまた、Ａβ（２１−３７）配列を超えるＡβペプチド配列のより長い配列ストレッチを示すことができる。しかし、本発明に従うポリペプチドに含まれるＡβペプチド配列ストレッチの長さは、配列番号４またはＡβ（１２−４０）として本明細書においても示されるＡβペプチドのアミノ酸１２〜アミノ酸４０をさらに超える範囲であるべきではない。これは、本発明のポリペプチドのＡβ配列ストレッチが、ＡＤを伴う患者において見出される斑特異的Ａβ抗体の結合に関連するアミノ酸を含まないことを確実にする。本発明に従うポリペプチドはまた、他のアミノ酸配列を含んでなり得る。例えば、タグ、マーカー、結合ドメイン、活性化ドメインまたは類似の機能的部分を、Ａβ配列ストレッチを融合して、例えば、本発明に従うポリペプチドの所定の表面へのより良好な結合を提供することができる。類似して、本発明に従うポリペプチドを、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ）または発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒ）、ビオチンなどへの共有結合のような所定の目的のために改変することができる。ある場合において、本発明に従うポリペプチドの非Ａβ配列ストレッチは、Ａβ（２１−３７）配列ストレッチの構造安定性を提供し、この領域におけるβ−シートコンフォメーションの形成を防止または減少する。
【０１９６】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、オリゴマー形態のβ−アミロイドポリペプチドに特異的に結合する。非限定的例によって、ポリペプチドは、オリゴマー形態のＡβ（１−４０）またはオリゴマー形態のＡβ（１２−２０）またはオリゴマー形態のＡβ（２１−３７）に結合することができる。一態様では、１晩、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４において、４℃で撹拌しながらインキュベートする場合、本発明のポリペプチドは、オリゴマー形態のＡβ（１−４０）に特異的に結合することが可能である。
【０１９７】
好適な実施形態では、上記のポリペプチドは、タグまたはマーカーのような１つ以上の部分、特に、ビオチン、ストレプトアビジン、ＧＳＴ、ＨＩＳ、ＳＴＲＥＰ−タグ、Ｍｙｃ、ＨＡ、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン−Ｌ−アラニンコポリマー、ポリ−Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、ポリ−β−アラニン、ポリ−Ｌ−アラニン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン−Ｄ−アラニンコポリマー、ポリ−Ｄ−アラニン、またはポリ−Ｌ−および−Ｄ−アミノ酸の組み合わせをさらに含んでなる。
【０１９８】
好適な実施形態では、配列番号２に従う配列またはＡβ（２１−３７）を含んでなる他の任意の配列を有する上記ポリペプチドの領域は、β−シートコンフォメーションではない。なおより好適な実施形態では、この領域は、ランダムコイルであるか、またはα−ヘリックスコンフォメーションを示す。
【０１９９】
別の好適な実施形態では、例えば、配列番号２に従う配列またはＡβ（２１−３７）を含んでなる他の任意の配列を有する上記のポリペプチドの領域は、例えば、配列番号２に従う配列またはＡβ（２１−３７）を含んでなる他の任意の配列を有するＡβポリペプチド領域のβ−シート形成を防止または減少するアミノ酸配列によってフランキングされ、特に、ここで、前記フランキングアミノ酸配列は、Ａβ配列のＮ−および／またはＣ末端の近接に局在し、およびこのフランキングアミノ酸配列は、例えば、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、β−アラニン、Ｄ−バリン、Ｌ−グリシン、Ｄ−グリシンおよび／または関連する疎水性アミノ酸を含んでなるオリゴマーペプチドからなる。−（Ｌ−アラニン）ｎ−、−（Ｄ−アラニン）ｎ−、−（Ａｉｂ）ｎ−、−（β−アラニン）ｎ−、−（Ｄ−バリン）ｎ−、−（Ｌ−グリシン）ｎ−、−（Ｄ−グリシン）ｎ−のようなオリゴマーペプチドは、フランキングアミノ酸配列として特に好適であり、ここで、ｎは、好ましくは、約２〜約６の範囲である。いくつかの実施形態では、β−アミロイドポリペプチドは、オリゴマー形態である。
【０２００】
さらに加えて、本発明は、本発明に従うポリペプチドおよび／またはＡβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの診断アッセイのための使用に関する。そのような診断アッセイのための方法を、以下に例示する。
【０２０１】
方法
別の態様では、本発明は、神経性認知症疾患を診断するための方法に関し、本方法は、以下の工程を含んでなる：
ａ）キャリア上に固定化された本発明に従うポリペプチドを、被験体に由来するサンプルと共にインキュベートする工程、その後
ｂ）前記サンプルをキャリアから分離する工程、および
ｃ）工程ａ）の固定化されたポリペプチドに結合したポリペプチドを検出する工程。
【０２０２】
本発明はまた、神経性認知症疾患を診断するための方法に関し、本方法は、以下の工程を含んでなる：
ａ）本発明に従うポリペプチドを、被験体に由来するサンプルと共にインキュベートする工程、およびその後
ｂ）サンプルを、本発明に従うポリペプチドに対して結合親和性を有するキャリアと共にインキュベートする工程、
ｃ）前記サンプルをキャリアから分離する工程、ならびに
ｄ）本発明に従うポリペプチドに結合したポリペプチドを検出する工程であって、前記ポリペプチドは、キャリアに結合されている工程。
【０２０３】
別の態様では、本発明は、神経性認知症疾患の診断の方法に関し、これは、少なくとも、配列番号１のアミノ酸４〜アミノ酸１０の範囲のＡβペプチドアミノ酸配列に同一な配列ストレッチを含んでなるポリペプチドまたはタンパク質を利用する。このペプチド配列は、本明細書において、それぞれ、配列番号３またはＡβ（４−１０）またはＮ末端ペプチドとして示される。そのようなポリペプチドはまた、Ａβ（４−１０）配列を超えるＡβペプチド配列のより長い配列ストレッチを示すことができる。しかし、そのようなポリペプチドに含まれるＡβペプチド配列ストレッチの長さは、好ましくは、配列番号５またはＡβ（１−２０）として本明細書においても示されるＡβペプチドのアミノ酸１〜アミノ酸２０をさらに超える範囲であるべきではない。これは、本発明のポリペプチドのＡβ配列ストレッチが、健常な個体において見出され、そしてＡβ（２１−３７）に対して指向されるＡβ自己抗体の結合に関連するアミノ酸を含まないことを確実にする。Ｎ末端ポリペプチドは、本発明に記載のポリペプチドについて既に記載のように、Ａβ配列ストレッチの他に、他のアミノ酸配列、部分および改変も含んでなり得る。
【０２０４】
それ故、本発明はまた、神経性認知症疾患を診断するための方法に関し、本方法は、以下の工程を含んでなる：
ａ）キャリア上に固定化されたポリペプチドを、被験体に由来するサンプルと共にインキュベートする工程であって、ここで、ポリペプチドは、Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなる工程、その後、
ｂ）前記サンプルをキャリアから分離する工程、ならびに
ｃ）工程ａ）の固定化されたポリペプチドに結合したポリペプチドを検出する工程。
【０２０５】
本発明はまた、神経性認知症疾患を診断するための方法に関し、本方法は、以下の工程を含んでなる：
ａ）ポリペプチドを、被験体に由来するサンプルと共にインキュベートする工程であって、ここで、ポリペプチドは、Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなる工程、その後、
ｂ）サンプルを、Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに対して結合親和性を有するキャリアと共にインキュベートする工程、
ｃ）前記サンプルをキャリアから分離する工程、ならびに
ｄ）Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに結合したポリペプチドを検出する工程であって、前記ポリペプチドは、キャリアに結合している工程。
【０２０６】
本発明はまた、神経性認知症疾患を診断するための方法に関し、本方法は、以下の工程を含んでなる：
ａ）キャリア上に固定化された本発明に従うポリペプチドを、被験体に由来する細胞含有サンプルと共にインキュベートする工程、
ｂ）前記サンプルをキャリアから分離する工程、ならびに
ｃ）工程ａ）の固定化されたポリペプチドに結合した細胞を検出する工程。
【０２０７】
本発明はまた、神経性認知症疾患を診断するための方法に関し、本方法は、以下の工程を含んでなる：
ａ）本発明に従うポリペプチドを、被験体に由来する細胞含有サンプルと共にインキュベートする工程、およびその後
ｂ）サンプルを、本発明のポリペプチドに対して結合親和性を有するキャリアと共にインキュベートする工程、
ｃ）前記サンプルをキャリアから分離する工程、ならびに
ｄ）本発明に従うポリペプチドに結合した細胞を検出する工程であって、前記ポリペプチドは、キャリアに結合されている工程。
【０２０８】
本発明はまた、神経性認知症疾患を診断するための方法に関し、本方法は、以下の工程を含んでなる：
ａ）キャリア上に固定化されたポリペプチドを、被験体に由来する細胞含有サンプルと共にインキュベートする工程であって、ここで、ポリペプチドは、Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなる工程、
ｂ）前記サンプルをキャリアから分離する工程、ならびに
ｃ）工程ａ）の固定化されたポリペプチドに結合した細胞を検出する工程。
【０２０９】
本発明はまた、神経性認知症疾患を診断するための方法に関し、本方法は、以下の工程を含んでなる：
ａ）ポリペプチドを、被験体に由来する細胞含有サンプルと共にインキュベートする工程であって、ここで、ポリペプチドは、Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなる工程、その後、
ｂ）サンプルを、Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに対して結合親和性を有するキャリアと共にインキュベートする工程、
ｃ）前記サンプルをキャリアから分離する工程、ならびに
ｄ）Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに結合した細胞を検出する工程であって、前記ポリペプチドは、キャリアに結合している工程。
【０２１０】
本発明のさらなる実施形態では、Ａβペプチドのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）は、上記のように、タグまたはマーカーのようなさらなる部分、特に、ビオチン、ストレプトアビジン、ＧＳＴ、ＨＩＳ、ＳＴＲＥＰ−タグ、Ｍｙｃ、ＨＡ、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン−Ｌ−アラニンコポリマー、ポリ−Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、ポリ−β−アラニン、ポリ−Ｌ−アラニン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン−Ｄ−アラニンコポリマー、ポリ−Ｄ−アラニン、またはポリ−Ｌ−およびＤ−アミノ酸の組み合わせを含んでなる。好適な実施形態では、本発明のポリペプチドは、Ａβ−配列を含む配列ストレッチを除いて、Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに同一である。
【０２１１】
本発明に従うポリペプチドを用いる本発明の方法の好適な実施形態では、溶媒は、例えば、配列番号２に従う配列を有するポリペプチド領域のβ−シート形成を防止または減少するインキュベーション工程において存在する。好適な溶媒は、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、ヘキサフルオロ−イソプロパノールまたはペプチドコンフォメーションを安定化し、そしてβ−シート形成を防止もしくは減少する類似の溶媒であり得る。好ましくは、溶媒は、例えば、５〜１０ｍＭリン酸緩衝液および１５０ｍＭのＮａＣｌを含んでなる水溶液において存在する。なおより好適な実施形態では、水溶液中のＴＦＥ、ヘキサフルオロ−イソプロパノールなどの濃度は、約１〜約５％、好ましくは、約１％〜約２％の範囲である。
【０２１２】
好適な実施形態では、本発明の方法は、さらなる工程を含んでなり、ここで、少なくとも１つの洗浄工程が、検出工程の前に実施される。
【０２１３】
細胞の検出に関連する本発明に従う方法の好適な実施形態では、本方法は、アフィニティークロマトグラフィー、特に、イムノアフィニティークロマトグラフィーの形態で行われる。
【０２１４】
ポリペプチド、例えば、本発明に従うポリペプチド、例えば、被験体のサンプルにおけるＡβ（２１−３７）またはＡβ（２１−３７）を含んでなる他の任意の配列に結合する抗体の量は、ＡＤの発症および／または進行に関する被験体の状態の指標である。Ａβ（２１−３７）配列ストレッチに対して指向されたポリペプチドの濃度が高いほど、保護能力が高く、そしてＡＤの発症および／または進行のリスクが低い。ポリペプチド、例えば、被験体のサンプルにおけるＡβ（４−１０）エピトープに対して指向された抗体の量は、ＡＤの発症および／または進行に関する被験体の状態の指標でもある。しかし、この場合、状況は逆もまた同様である。Ａβ（４−１０）配列ストレッチに対して指向されたポリペプチドの濃度が高いほど、ＡＤの発症および／または進行のリスクは高い。それ故、診断的理由のため、本発明に従う検出の方法は、個別に、但しまた、より特定の診断を提供するために組み合わせで、実施することができる。
【０２１５】
それ故、本発明のさらなる実施形態では、本発明に従うポリペプチドを用いる本発明に従う方法は、Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを用いる本発明の方法と組み合わせて行われる。本発明のポリペプチドを用いる方法は、第２の方法と同時、前、または後に実施することができる。
【０２１６】
また、間接的アプローチによって神経性認知症疾患を診断することも可能である。本発明に従うポリペプチドまたはＡβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのいずれかを利用する本発明に従う方法は、本発明の方法で利用するより短いＡβ配列ストレッチのかわりに、Ａβ（１−４０）またはＡβ（１−４２）、即ち、全長Ａβペプチドの長さを有するポリペプチドを含んでなるポリペプチドを利用することのみが本発明の方法と異なる類似の方法と組み合わされる。そのような場合には、２つの方法は、相互に独立して行われ、そして方法の結果が比較される。この概念を例示するために、以下の例を示す：
１）Ａβ全長ポリペプチド配列を利用する方法により、全長Ａβに対して指向されたサンプル中のすべてのポリペプチド（またはそれぞれ、そのようなポリペプチドを産生する細胞）の量が得られる（結果Ａ）。
２）他方で、本発明のポリペプチドを利用する本発明の方法により、Ａβ（２１−３７）またはＡβ（２１−３７）を含んでなる他の任意の配列のような本発明のポリペプチドに対して指向されたサンプル中のすべてのポリペプチド（またはそれぞれ、そのようなポリペプチドを産生する細胞）の量が得られる（結果Ｂ）。
３）当業者は、結果Ａから結果Ｂを差し引くことによって、ＡβのＮ末端におけるエピトープ、特に、エピトープＡβ（４−１０）に対して指向されたサンプル中のポリペプチドの量をもはや容易に推測することができる。
【０２１７】
類似して、Ａβ（２１−３７）またはＡβ（２１−３７）を含んでなる他の任意の配列のような本発明のポリペプチドに対して指向されたサンプル中のポリペプチド（またはそれぞれ、そのようなポリペプチドを産生する細胞）の量は、Ａβ全長で得られた結果から、Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列、例えば、Ａβ（４−１０）を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドで得られた結果を差し引くことによって得ることができる。
【０２１８】
それ故、本発明はまた、神経性認知症疾患を診断するための方法を指し、ここで、本発明に従う方法は、以下の工程を含んでなる：
ｉ）上記の本発明に従う第１の方法を実施する工程、
ｉｉ）本発明に従う第２の方法を実施する工程であって、但し、第２の方法の工程ａ）においてインキュベートすべきポリペプチドは、Ａβペプチドの全長アミノ酸配列を含んでなる工程、および
ｉｉｉ）工程ｉ）から得られた結果と、工程ｉｉ）の結果とを比較する工程。
【０２１９】
当業者は、上記の方法について、工程ｉ）が工程ｉｉ）の前、同時または後に行われるかどうかは問題ではないことを理解するであろう。
【０２２０】
一実施形態では、本発明の方法において検出しようとするポリペプチドは、抗体、特に、Ａβ（２１−３７）自己抗体またはＡβ（４−１０）自己抗体である。
【０２２１】
好適な実施形態では、本発明に従う方法は、アルツハイマー病、ダウン症候群、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、脳アミロイド血管症、および／またはアミロイドーシスを診断するために行われる。
【０２２２】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従うポリペプチドを含んでなるキャリアに関する。好適な実施形態では、キャリアは、Ａβペプチド（ここで、第２のポリペプチドのＡβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなる第２のポリペプチドをさらに含んでなる。
【０２２３】
本発明に従い、かつ本発明の方法において使用されるキャリアは、ビーズ、特に、磁気ビーズまたはセファロースビーズ、膜、特に、ポリフッ化ビリニデンまたはニトロセルロース膜、ガラス、セファロースマトリックス、金表面、合成表面、特に、マイクロタイタープレートのようなポリペプチドに結合することが可能な任意の適切な材料のものであり得る。所定の実施形態では、キャリアの表面は、例えば、上記のタグおよびマーカーに結合することが可能である薬剤で被覆することができる。
【０２２４】
検出
多様なアッセイを、目的のＡβペプチドに対する抗体価を検出または測定するための本発明の方法において、用いることができる。例示的なアッセイとして、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ウエスタンブロット、ドットブロット、タンパク質チップ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降もしくは共免疫沈降、またはアフィニティークロマトグラフィー、特に、イムノアフィニティークロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２５】
好適な実施形態では、それぞれ工程ｃ）またはｄ）におけるポリペプチドの検出を含んでなる本発明に従う方法は、ＥＬＩＳＡを表す。この場合、キャリアは、例えば、マイクロタイタープレートである。サンプルおよびキャリアの分離は、マイクロタイタープレートからサンプル液体を取り出すことによって、および／またはインキュベーション後にマイクロタイタープレートを洗浄することによって、達成される。好ましくは、この場合、結合したポリペプチドは抗体であり、そしてこの抗体は、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と結合した第二抗体、および例えば、光学デバイスによって検出可能な発色した化合物への基質のターンオーバーをもたらすＡＰの基質の添加を介して、検出することができる。ＥＬＩＳＡ技術に精通している当業者は、本発明の方法にも適用することができるＥＬＩＳＡ概念のいくつかの既知の変形を知っているであろう。
【０２２６】
あるいは、別の好適な実施形態では、それぞれ工程ｃ）またはｄ）におけるポリペプチドの検出を含んでなる本発明に従う方法は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを表す。この場合、キャリアは、例えば、ニトロセルロースプレートである。この場合、キャリアとサンプルとのインキュベーション工程は、サンプル中の細胞が十分量の抗体を産生するのに十分な時間を提供する。サンプルおよびキャリアの分離は、ニトロセルロースプレートからサンプル液体を取り出すことによって、および／またはインキュベーション後にニトロセルロースプレートを洗浄することによって、達成される。好ましくは、結合したポリペプチドは抗体であり、そしてこの抗体は、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と結合した第二抗体、および例えば、目視もしくは光学デバイスによって検出可能なディープパープル染色への基質のターンオーバーをもたらすＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ブロモ−クロロ−インドリルホスフェート／Ｎｉｔｒｏ  Ｂｌｕｅ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）のようなＡＰの基質の添加を介して、検出することができる。ＥＬＩＳＰＯＴ技術に精通している当業者は、本発明の方法にも適用することができるＥＬＩＳＰＯＴ概念のいくつかの既知の変形を知っているであろう。
【０２２７】
さらなる実施形態では、それぞれ工程ｃ）またはｄ）におけるポリペプチドの検出を含んでなる本発明に従う方法は、ウエスタンブロットまたはドットブロットアッセイを表す。この場合、キャリアは、例えば、ニトロセルロース膜である。ウエスタンブロットでは、本発明に従う方法の工程ａ）において使用されるようなポリペプチド、または本発明に従う方法の工程ａ）において使用されるようなポリペプチドに対する結合親和性を伴う基質のいずれか一方が、ニトロセルロース膜に固定化される。ニトロセルロースまたは類似の膜（ＰＶＤＦなど）自体も、本発明に従う方法の工程ａ）において使用されるようなポリペプチドに結合親和性を提供することができる。サンプルおよびキャリアの分離は、ニトロセルロース膜からサンプル液体を取り出すことによって、および／またはインキュベーション後にニトロセルロース膜を洗浄することによって、達成される。好ましくは、結合したポリペプチドは抗体であり、そしてこの抗体は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した標識第二抗体、ならびに以後の発光反応および検出を介して、検出される。ウエスタンブロット／ドットブロット技術に精通している当業者は、本発明の方法にも適用することができるウエスタンブロット／ドットブロット概念のいくつかの既知の変形を知っているであろう。
【０２２８】
さらなる実施形態では、それぞれ工程ｃ）またはｄ）におけるポリペプチドの検出を含んでなる本発明に従う方法は、タンパク質チップ、即ち、タンパク質マイクロアレイを表す。この場合、キャリアは、例えば、タンパク質に結合するために官能化されたガラス表面である。サンプルおよびキャリアの分離は、ガラスキャリアからサンプル液体を取り出すことによって、および／またはインキュベーション後にガラスキャリアを洗浄することによって、達成される。好ましくは、結合したポリペプチドは抗体であり、そしてこの抗体は、例えば、光学デバイスによって検出することができる蛍光染料と結合した標識第二抗体で検出される。タンパク質チップ技術に精通している当業者は、本発明の方法にも適用することができるタンパク質チップ概念のいくつかの既知の変形を知っているであろう。
【０２２９】
さらなる実施形態では、それぞれ工程ｃ）またはｄ）におけるポリペプチドの検出を含んでなる本発明に従う方法は、表面プラズモン共鳴分析を表す。この場合、キャリアは、例えば、金表面のような金属表面である。サンプルおよびキャリアの分離は、金属キャリアからサンプル液体を取り出すことによって、および／またはインキュベーション後に金属キャリアを洗浄することによって、達成される。好ましくは、結合したポリペプチドは抗体であり、そして抗体の結合は、光学デバイスにより、特定の入射角における反射光の強度を測定することを介して、検出される。プラズモン共鳴分析技術に精通している当業者は、本発明の方法にも適用することができる表面プラズモン共鳴概念のいくつかの既知の変形を知っているであろう。
【０２３０】
さらなる実施形態では、それぞれ工程ｃ）またはｄ）におけるポリペプチドの検出を含んでなる本発明に従う方法は、プルダウンまたは免疫沈降実験を表す。この場合、キャリアは、セファロースビーズからなり得る。これらのセファロースビーズは、例えば、グルタチオン（プルダウンアッセイのため）または抗体（免疫沈降アッセイ）で被覆される。サンプルおよびキャリアの分離は、セファロースビーズからサンプル液体を取り出すことによって、および／またはインキュベーション後にセファロースビーズを洗浄することによって、達成される。好ましくは、結合したポリペプチドは抗体であり、そしてこの抗体は、沈降したタンパク質複合体の以後のウエスタンブロット分析を介して検出される。プルダウン／免疫沈降技術に精通している当業者は、本発明の方法にも適用することができるこれらの概念のいくつかの既知の変形を知っているであろう。そのような１つの変形は、共免疫沈降アプローチの適用であって、ここで、キャリアは、本発明に従う方法の工程ａ）において使用されるようなポリペプチドに対して、間接的結合アッセイのみを有する。
【０２３１】
さらなる実施形態では、それぞれ工程ｃ）またはｄ）におけるポリペプチドの検出を含んでなる本発明に従う方法は、アフィニティークロマトグラフィーの形態で行われる。この場合、キャリアは、従来のクロマトグラフィーカラム内のマトリックス、例えば、セファロースであり、これに、本発明に従う方法の工程ａ）において使用されるようなポリペプチド、または本発明に従う方法の工程ａ）において使用されるようなポリペプチドに対する結合親和性を伴う基質のいずれか一方が、連結される。サンプルとキャリアとのインキュベーションは、サンプルがカラムを通過するのに必要な時間枠を含んでなる。サンプルおよびキャリアの分離は、カラムからサンプル液体を取り出すことによって、および／またはインキュベーション後にカラムを洗浄することによって、達成される。好ましくは、結合したポリペプチドは抗体であり、そしてこの抗体は、例えば、高塩含有量を有する緩衝液による結合抗体の溶出、および例えば、直接的な光学的決定による溶出したポリペプチドの以後の検出、または以後のウエスタンブロットもしくは類似の分析によって、検出される。アフィニティークロマトグラフィー技術に精通している当業者は、本発明の方法にも適用することができるアフィニティークロマトグラフィー概念のいくつかの既知の変形を知っているであろう。そのような１つの変形は、イムノアフィニティークロマトグラフィーアプローチの適用であって、ここで、キャリアは、本発明に従う方法の工程ａ）において使用されるようなポリペプチドに対して指向される抗体で被覆される。
【０２３２】
一実施形態では、それぞれ工程ｃ）またはｄ）における細胞の検出を含んでなる本発明に従う方法は、アフィニティークロマトグラフィーの形態で行われる。この場合、例えば、セファロースで被覆された磁気ビーズがキャリアを表し、これに、本発明に従う方法の工程ａ）において使用されるようなポリペプチド、または本発明に従う方法の工程ａ）において使用されるようなポリペプチドに対する結合親和性を伴う基質のいずれか一方が、連結される。サンプルおよびキャリアの分離は、カラムからサンプル液体を取り出すことによって、および／またはインキュベーション後にカラムを洗浄することによって、達成される。マトリックスに結合した細胞は、例えば、マトリックスからの細胞の溶出後、例えば、フローサイトメトリーによって検出することができるＢ−またはＴ細胞である。アフィニティークロマトグラフィーおよびフローサイトメトリー技術に精通している当業者は、本発明の方法にも適用することができるこれらの概念のいくつかの既知の変形を知っているであろう。
【０２３３】
それ故、本発明に従う方法は、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ウエスタンブロット、タンパク質チップ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降または共免疫沈降、またはアフィニティークロマトグラフィー、特に、イムノアフィニティークロマトグラフィーとして特に好適な実施形態において、行うことができる。これらは、診断アッセイのすべての例示である。ＥＬＩＳＡまたはアフィニティークロマトグラフィーの例は、実施例のセクションにおいて見出すことができる。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく診断手順では、Ａβエピトープ特異的抗体の検出、および定量化ならびに結合動態の解析は、（ｉ）ビオチン化Ａβ（２１−３７）−またはＡβ（４−１０）−ペプチドのアビジン／ストレプトアビジン−被覆ＳＰＲチップ表面への結合によってか、または（ｉｉ）カルボン酸スペーサーを含有するＮ末端チオール基を伴うＡβ（２１−３７）−もしくはＡβ（４−１０）−ペプチドの金−チップ表面への結合；それに続くＡβ自己抗体の結合および決定によって、実施することができる。当業者は、本発明に従う方法を、上記のこれらの標準的技術および手順の１つに組み入れる仕方を容易に知るであろう。
【０２３４】
本発明に従う方法は、上記の検出技術自体（ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ウエスタンブロット、ドットブロット、タンパク質チップ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィーなど）のうちの１つの形態で行うことができるが、これらの検出技術を組み合わせるか、またはそれらを、本発明に従う検出工程、即ち、それぞれ、工程ｃ）またはｄ）についてのみ適用することも可能である一方、他の工程は他の形式で行われることが理解されるべきである。本発明の方法における検出工程において得られる情報／シグナルは、この情報／シグナルの定量化のための基礎を提供し得ることもまた、当業者には明らかである。
【０２３５】
場合によっては、ポリペプチド、例えば、抗体の検出の代わりに、またはそれに加えて、前記ポリペプチドを産生する細胞が検出される場合、より高い診断価値が認められ得る。それは、例えば、ＡＤ患者において、Ａβ（２１−３７）自己抗体を産生する細胞の全体数が健常な個体においてより低い場合か、またはそれぞれの抗体産生細胞によって分泌される抗体の量が減少している場合、重要であり得る。結果に依存して、これは、異なる治療アプローチをもたらすことができる。それ故、本発明はまた、本発明に従うポリペプチドに結合するか、またはＡβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに結合するポリペプチドを産生する細胞の検出に関する。
【０２３６】
本発明において使用する固定化されたポリペプチドは、これに関して、キャリアに結合するポリペプチドを指す。結合は、共有結合または非共有結合であり得、それは、キャリアに対して直接的であり得るか、リンカー／連結物質を介し得る。固定化が非共有結合を生じる場合、キャリアまたは連結物質は、本発明に従うポリペプチドに対して特異的結合親和性を示し、その逆もまた同様である。結合親和性は、他の物質に会合する、および安定なダイマーまたはマルチマー複合体を形成するための物質、特に、ポリペプチドの特性を指す。そのような会合は、通常、ファンデルワールス−または水素−結合に依存する。
【０２３７】
インキュベート工程は、即ち、相互に対して結合親和性を有する結合対の２つのパートナーが会合し、そして安定な複合体を形成し得る目的を満たす。インキュベーション工程の温度は変動し得るが、通常、約０℃〜約４０℃、好ましくは、約４〜約３７℃、なおより好適には、約４℃、約１６℃、約２１℃または約３７℃である。温度が高いほど、インキュベーションの時間は短くあり得る。例えば、インキュベーション温度が４℃である場合、それは、少なくとも１２時間もしくは１晩、継続すべきである一方、３７℃でのインキュベーションでは、通常、１時間で十分である。適切である場合、キャリアは、方法の前に、適切なブロッキング剤でブロックすることができ、非特異的結合事象の可能性が減少する。ブロッキング剤は、例えば、粉乳、ＢＳＡ、ウシ胎児血血清、または他の任意のブロッキング試薬であり得る。
【０２３８】
本発明の固定化されたポリペプチドに結合したか、またはＡβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに結合したポリペプチドの検出は、いくつかの手段によって実施することができる。１つの可能性は、例えば、質量分析手段、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＳ−ＦＴＩＣＲを介する同定である。この目的のために、第１に、免疫グロブリンを、例えば、ＡＤ患者の血清サンプルから、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによって単離し、そして続いて、Ａβ自己抗体およびＡβ斑特異的抗体を、例えば、それぞれ、Ａβ−エピトープ−クロマトグラフィーによって単離する。次いで、抗体を、例えば、実施例において記載のようなセファロースキャリアに固定化する。次いで、特異的Ａβエピトープ、Ａβ（２１−３７）およびＡβ（４−１０）を、全長−Ａβ−ポリペプチド（例えば、Ａβ（１−４０）またはＡβ（１−４２））の結合、それに続く、プロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼ、Ａｓｐ−Ｎ−プロテアーゼのうちの１つもしくはいくつかを使用するタンパク質分解エピトープ−摘出質量分析後、同定する。上清においてシグナルが検出されなくなるまで、アフィニティー結合Ａβ−エピトープを洗浄した後、特異的Ａβエピトープを、典型的に、０．１％トリフルオロ酢酸による処置によってカラムから溶出させ、そしてそのプロトン化分子イオンの正確な決定によって同定する；後者の分子イオンの質量確度は、同定にはまったく十分であるが、フラグメントイオンの衝突誘起フラグメンテーションおよびタンデムＭＳ分析によって、さらに確かめることができる。
【０２３９】
所定の実施形態では、蛍光染料もしくは部分（例えば、ＧＦＰ）で標識したか、あるいは西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは無色の物質を適切な染料もしくは蛍光生成物に変換することが可能な他の関連酵素のような活性物質で標識した第二抗体を適用することができる。検出はまた、占有された結合部位の量を検出することによって、即ち、サンプルの取り出し後、キャリアと共にインキュベートされる標識Ａβ（２１−３７）抗体を利用して、達成することができる。結合したＡβ（２１−３７）の量は、この場合、先に結合したポリペプチドの指標である。その後の結合Ａβ（２１−３７）抗体の量が低いほど、サンプルに含有されるＡβ（２１−３７）結合性ポリペプチドは多い。検出について述べた例は、限定的であるとはみなされず、当業者であれば、本発明において使用することができる複数の検出方法を容易に知るであろう。
【０２４０】
通常、本発明の方法のそれぞれ、工程ｃ）またはｄ）において検出される固定化ポリペプチドに結合したポリペプチドは、抗体、特に、それぞれ、Ａβ（２１−３７）自己抗体またはＡβ（４−１０）自己抗体である。しかし、ヒト身体における他の物質はまた、例えば、Ａβ（２１−３７）またはＡβ（４−１０）ポリペプチドに結合させてもよい。
【０２４１】
同様に、本発明のポリペプチドに結合するか、またはＡβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに結合するポリペプチドを産生する細胞の検出は、当業者に公知の標準的技術によって、達成される。一例は、フローサイトメトリーを介する分析である。別のアプローチは、細胞の溶解、ＤＮＡ／ＲＮＡ単離および特異的ヌクレオチド配列のその後のＰＣＲ増幅である。この他に、先行技術において、本発明の方法において細胞を検出するために用いることができる公開された複数のさらなる可能性が認められる。
【０２４２】
好適な実施形態では、本発明の方法に使用されるサンプルまたは細胞含有サンプルは、それぞれ、被験体の血液、血漿、尿または脳脊髄液（ＣＳＦ）に由来する。なおより好適な実施形態では、細胞含有サンプルは血液に由来し、そして細胞は、Ｂ−細胞系統である。サンプル、即ち、被験体は、ヒト、げっ歯類、ウシ、ブタ、イヌまたはトリ由来であり得る。特に、サンプルまたは細胞含有サンプルは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ニワトリなどに由来することができる。
【０２４３】
被験体に由来するサンプルは、被験体の組織または体液に由来する。被験体は、健常な個体であり得、即ち、ＡＤを患っていないか、または神経性認知障害を患っている「患者」であり得る。好適な実施形態では、本発明の方法に使用されるサンプルまたは細胞含有サンプルは、それぞれ、被験体の血液、血漿、尿または脳脊髄液（ＣＳＦ）から得られる。なおより好適な実施形態では、細胞含有サンプルは血液から得られ、そして細胞は、Ｂ−細胞系統である。サンプル、即ち、被験体は、ヒト、げっ歯類、ウシ、ブタ、イヌまたはトリ由来であり得る。特に、サンプルまたは細胞含有サンプルは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ニワトリなどに由来することができる。そのようなサンプルの可能な調製手順は、先行技術から周知である。
【０２４４】
本発明のポリペプチドを用いる本発明の方法の好適な実施形態では、溶媒は、配列番号２に従う配列を有するポリペプチド領域のβ−シート形成を防止または減少するインキュベーション工程において存在する。上記のように、Ａβのβ−プリーツシートコンフォメーションは、神経毒性を担うことが明らかにされている。それ故、健常な個体におけるＡβ（２１−３７）抗体は、それがランダムコイルであるかまたはα−ヘリックスコンフォメーションである場合、特に、Ａβ（２１−３７）領域またはＡβ（２１−３７）を含んでなる他の任意の配列を認識する。フランキングアミノ酸配列に類似して、溶媒は、本発明のポリペプチドのコンフォメーション状態に影響を及ぼし得る。特に、ＴＦＥ、ヘキサフルオロ−イソプロパノールなどを、本発明の方法、例えば、インキュベーション工程において使用して、重要なエピトープＡβ（２１−３７）のβ−シートコンフォメーションを防止または減少することができ、それ故、それは、健常な個体において、Ａβ（２１−３７）自己抗体にアクセス可能に保たれる。好ましくは、ＴＦＥは、約１％〜約５％、好ましくは、約１〜約２％の範囲の濃度で存在する。
【０２４５】
好適な実施形態では、本発明の方法は、さらなる工程を含んでなり、ここで、洗浄溶液を伴う少なくとも１つの洗浄工程が、検出工程の前に実施される。洗浄工程は、後者の検出シグナルの特異性を増加し、そしてバックグランドのシグナルを減少することができる。好ましくは、洗浄溶液は水である。より好ましくは、一定のｐＨを確実にするために、ＰＢＳまたはＴＢＳのような緩衝液が使用される。洗浄溶液は、シグナルの特異性を増加するために、少量の界面活性剤を含有することができる。シグナルの特異性が低い場合、洗浄溶液中の塩濃度または界面活性剤の濃度を増加することができる。
【０２４６】
本発明のさらなる実施形態では、本発明のポリペプチド、即ち、Ａβ（２１−３７）ポリペプチドを用いる本発明に従う方法は、Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列、即ち、Ａβ（４−１０）を有する）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを用いる本発明の方法と組み合わせて行われる。本発明のポリペプチドを用いる方法は、第２の方法と同時、前、または後に実施することができる。Ａβ（２１−３７）特異的ポリペプチドの量と、Ａβ（４−１０）特異的ポリペプチドの量との比較は、ＡＤのステージおよび進行のより詳細な評価を提供する。
【０２４７】
本発明の方法における検出工程は、Ａβ（２１−３７）またはＡβ（４−１０）に結合したポリペプチドの量を定量する可能性を提供する。決定された値は、ＡＤのステージおよび進行の測定値である。例えば、ヒト被験体の血清が、約１〜１００ｎｇ／μｌのＡβ（２１−３７）特異的ポリペプチドおよび／または約０ｎｇ／μｌ（即ち、検出限界未満）のＡβ（４−１０）特異的ポリペプチドを含有する場合、ヒト被験体は、ＡＤに関して健常と考えることができる。健常な個体の対照として、２０〜３５歳の年齢のヒトの血清におけるそれぞれのポリペプチドの平均濃度が役立ち得る。対照的に、例えば、被験体の血清が、約０．０１〜５ｎｇ／μｌのＡβ（４−１０）特異的ポリペプチド、好ましくは、約０．０５〜１ｎｇ／μｌ、もしくはさらにより好ましくは、約０．０１ｎｇ／μｌを含有する場合、または血清における斑特異的ポリペプチドの濃度対Ａβ（２１−３７）特異的ポリペプチドの濃度の比が、０を超えて上昇する、好ましくは、それが、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．０１０、０．０１５、０．０２０、０．０３０より高いか、もしくは０．０５０よりなお高い場合、被験体は、神経性認知症疾患を患い得るか、または神経性認知症疾患を発症するリスクがあり得る。加齢に伴って、ヒト身体において産生される免疫グロブリンの量は、自然に減少する。従って、特定の場合、本発明に従う方法で得られた結果を評価する前に、被験体の年齢を考慮する必要があり得る。特に、例えば、その血清が約３０〜１００ｎｇ／μもしくはそれ以上のＡβ（２１−３７）特異的ポリペプチドを含有する場合、約２０〜約３５歳の年齢のヒトは健常であると考えられ得る一方、約７０〜約８０歳の年齢の被験体が、その血清中に「僅か」２〜５ｎｇ／μｌのＡβ（２１−３７）特異的ポリペプチドしか伴わなければ、ＡＤに関して等しく健常であるとなお考えられる。
【０２４８】
好適な実施形態では、本発明に従う方法は、神経性認知症疾患、アルツハイマー病、ダウン症候群、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、脳アミロイド血管症、および／またはアミロイドーシスを診断するために行われる。Ａβ自己抗体およびＡβ斑特異的抗体の濃度が、ＡＤについて上記で示したようにそれぞれの疾患の影響を受けることが、すべての疾患に共通している。
【０２４９】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従うポリペプチドを含んでなるキャリアに関する。好適な実施形態では、キャリアは、Ａβペプチド（ここで、第２のポリペプチドのＡβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなる第２のポリペプチドをさらに含んでなる。
【０２５０】
本発明に従い、かつ本発明の方法において使用されるキャリアは、ビーズ、特に、磁気ビーズまたはセファロースビーズ、膜、特に、ポリフッ化ビリニデンまたはニトロセルロース膜、ガラス、セファロースマトリックス、金表面、合成表面、特に、マイクロタイタープレートのようなポリペプチドに結合することが可能な任意の適切な材料のものであり得る。所定の実施形態では、キャリアの表面は、例えば、上記のタグおよびマーカーに結合することが可能である薬剤で被覆することができる。当業者は、本発明に従う方法に適用することができる広範な異なるキャリアおよび可能なコーティング剤を容易に知るであろう。
【０２５１】
キット
別の態様では、本発明は、神経性認知症疾患の診断のためのキットに関し、ここで、キットは、本発明に従うポリペプチドを含んでなる。一実施形態では、キットは、Ａβペプチド（ここで、Ａβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなる第２のポリペプチドを含んでなる。別の実施形態では、キットは、キャリア、特に、上記のキャリアを含んでなる。別の実施形態では、キットは、少なくともＡβ（３０−３７）に従う配列および多くともＡβ（１２−４０）に従う配列を含んでなる第１のＡβペプチド、および第２のＡβペプチド（ここで、第２のＡβペプチドは、少なくともＡβ（４−１０）に従う配列および多くともＡβ（１−２０）に従う配列を含んでなる）を含んでなる。そのようなキットは、例えば、病院および介護老人施設（ｎｕｒｓｉｎｇ  ｈｏｍｅ）における日常的診断のために使用して、例えば、ＡＤの進行をモニターするか、またはＡＤ治療の有効性をモニターすることができる。
【０２５２】
別の態様では、本発明は、神経性認知症疾患の診断のためのキットに関し、ここで、キットは、本発明に従うポリペプチドを含んでなる。
【０２５３】
好適な実施形態では、上記のキットは、Ａβペプチド（ここで、第２のポリペプチドのＡβペプチドは、少なくとも配列番号３に従う配列および多くとも配列番号５に従う配列を有する）のアミノ酸配列を含んでなる第２のポリペプチドをさらに含んでなる。なおより好適な実施形態では、キットは、キャリア、特に、上記のキャリアを含んでなる。
【０２５４】
キットは、Ａβペプチドのための１つ以上の容器を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、個別の容器、ディバイダーまたはＡβペプチドのためのコンパートメントおよび情報資材を含有する。例えば、各Ａβペプチドは、瓶、バイアル、またはシリンジに含有され得、そして情報資材は、プラスチックスリーブまたはパケットに含有され得る。他の実施形態では、キットの個別の要素は、単一の分割されていない容器内に含有される。例えば、各ペプチドは、ラベルの形態で情報資材が付着している瓶、バイアル、またはシリンジに含有される。
【０２５５】
以下の実施例は、本発明を説明するが、限定的であるとはみなされない。別段の記載がない限り、例えば、非特許文献３３に記載のような分子生物学的標準方法を使用した。
【実施例】
【０２５６】
実施例１．ＡＤ患者からのＡβ抗体の単離
エピトープ特異的アフィニティークロマトグラフィーによるＡＤ患者からの血清Ａβ抗体の免疫隔離を、セファロース−Ｇ５Ａβ（４−１０）アフィニティーマトリックスカラム上で実施した。セファロース−Ｇ５Ａβ（４−１０）アフィニティーマトリックスを、１０ｍｌのＰＢＳ（５ｍｍｏｌ  Ｌ−１Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍｍｏｌ  Ｌ−１ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄し、そして３００μｌのＰＢＳを使用して、１．７ｍｌバイアルに移した。８００μｌ（１μｇ／μｌ）の異なる２つのＡβ自己抗体（アルツハイマー患者の血清から単離した）を添加し、そしてサンプルを緩徐に、１晩、４℃で回転させた。懸濁液を、材料の有意な消失を伴わずに広範な洗浄の可能性を提供する０．８ｍｌマイクロ−カラム（Ｍｏｂｉｔｅｃ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。第１の２ｍｌを、フロースルー画分として回収した。カラムを、２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、そして最後の１ｍｌを、１次元電気泳動のために回収した。アフィニティー結合ＩｇＧを、６×０．５ｍｌの０．１％ＴＦＡで溶出させた；カラムを、１５分間穏やかに振盪し、そして遊離した抗体分子をマイクロ反応カップに回収した。サンプルを凍結乾燥し、そしてＩＤ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図５に示す）まで貯蔵した。
【０２５７】
調べたすべての年齢範囲の健常者コントロール由来の血清サンプルもまた、Ａβ（４−１０）エピトープカラムを使用して、斑抗体（Ｎ末端エピトープ）の存在について試験した。調べたすべてのサンプルにおいて、非−ＡＤコントロールサンプルは、検出可能な斑特異的抗体を含まなかった。
【０２５８】
実施例２．健常な個体からの抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の単離
Ａ．抗Ａβ（２１−３７）自己抗体のアフィニティー単離および精製
抗Ａβ（２１−３７）自己抗体を、（ｉ）市販の血清免疫グロブリンおよび（ｉｉ）健常な個体（ＨＩ）の血清から単離した。抗体の単離を、以下に記載のようなＵｌｔｒａｌｉｎｋ−ヨードアセチル−固相キャリア上に固定化されたＮ−システイニル−Ａβ（１２−４０）カラムを用いた手順によるＡβエピトープ特異的アフィニティークロマトグラフィーによって実施した。
【０２５９】
Ｎ−システイニル−Ａβ（１２−４０）（Ｈ−ＣＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ−ＣＯＯＨ）を、半自動化Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  ＥＰＳ−２２１（ＩＮＴＡＶＩＳ，Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上のＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＲ樹脂（０．２３ｍｍｏｌｅ／ｇ結合能）における９−フルオレニルメトキシカルボニル／ｔ−ブチル（Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ）化学を使用する固相ペプチド合成によって合成した。次の側鎖保護アミノ酸誘導体を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ。合成は、次のプロトコルに従って実施した：（ｉ）ＤＭＦ洗浄；（ｉｉ）ＤＭＦ中２％ＤＢＵ、２％ピペリジン（５＋１０分間）によるＦｍｏｃ脱保護、（ｉｉｉ）ＤＭＦ洗浄、（ｉｖ）ＤＭＦ中５当量のＦｍｏｃアミノ酸：ＰｙＢＯＰ：ＮＭＭの結合（４０分間）、（ｖ）ＤＭＦ中５ｍｏｌ−当量のＦｍｏｃアミノ酸：ＰｙＢＯＰ：ＮＭＭの結合（４０分間）（ｖｉ）ＤＭＦ洗浄（３×１分間）。ＡβのＣ末端配列の疎水性特徴のため、合成全体をとおして、各アミノ酸のダブルカップリングを用いた。合成サイクルの完了後、９５％ＴＦＡ、２．５％トリイソプロピルシランおよび２．５％脱イオン水を含有する混合物を使用して、３時間、樹脂からペプチドを切断した。粗生成物を、冷ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで沈殿させ、ジエチルエーテルで３回洗浄し、そして凍結乾燥の前に１０％酢酸（水溶液）に溶解した。ペプチドの精製を、準分取ＨＰＬＣによって実施した；ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による以後の特徴付けにより、ペプチドの分子均一度を確実にした。
【０２６０】
ｉ）Ｕｌｔｒａｌｉｎｋヨードアセチルゲル上のＣｙｓＡβ（１２−４０）の固定化
Ａβ（１２−４０）配列は、アミノ基を使用する固定化手順において副反応をもたらし得る２つの内部リジン残基を含有するため、Ａβ−Ｎ末端に付着したシステイン残基を使用して、特異的アフィニティーカラムを調製して、システイニル−Ｓ−チオエーテル結合を介する固定化により、カラム支持体上のペプチド分子の均一な配向を確実にした。アズラクトン活性化支持体は、ヘキサデシル−スペーサー基の末端においてヨードアセチル基（ＵｌｔｒａＬｉｎｋ；Ｐｅｒｂｉｏ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するが、立体障害を減少し、そして抗体の最大の結合能を提供するために、これを、システイニル−スルフヒドリル基と反応させて、安定なチオエーテル結合を得た。Ｃｙｓ−Ａβ（１２−４０）の共有結合のために、３．７ｍｇのペプチドを、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａカップリング緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解して、０．３７ｍｇ／ｍｌの最終濃度とした。溶液を、１ｍｌのドレインしたＵｌｔｒａｌｉｎｋ−ヨードアセチルゲルに添加し、そしてカップリング反応を、１時間、２５℃、穏やかな混合下で実施し、続く、３０分間の反応時間では、混合を伴わなかった。Ｃｙｓ−Ａβ（１２−４０）結合支持体の０．５ｍｌのアリコートを、カラム（２．５ｍｌ、ＭｏＢｉＴｅｃ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にパックし、溶液をドレインさせた。カラムを３ｍｌのカップリング緩衝液で洗浄し、そしてゲル上の非特異的結合部位を、２×４５分間、カップリング緩衝液中５０ｍＭのＬ−システイン・ＨＣｌの１ｍｌと反応させることによって、阻止した。続いて、カラムを、５ｍｌの１ＭのＮａＣｌおよび５ｍｌの０．１ＭのＮａ−リン酸、０．１５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）で洗浄し、そして４℃で貯蔵した。ゲル支持体（０．５ｍｌ）を、５ｍｌのＰＢＳを使用して、１５ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎバイアルに移し、そして５ｍｌのＩＶＩｇＧと混合した。１晩、４℃での穏やかな振盪後、流出液を使用して、懸濁液をカラムに移し、マトリックスを完全にリンスして、カラムに戻した。カラムを、１０ｍｌのＰＢＳで８回洗浄し、続いて、１０ｍｌ超純水で２回の洗浄サイクルを行った。アフィニティー結合抗体を、１０×０．５ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でカラムから溶出させた。構造的特徴付けおよびアフィニティー研究のためのＩｇＧの以後の単離ならびに調製を、以下の２つの異なるプロトコルを使用して、実施した。
【０２６１】
（ａ）第１の手順は、アフィニティー研究に使用するための抗体の強度を維持するために、０．５ＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８）を使用して回収した各画分に対し、中性ｐＨへの調整を要した。結合抗体を、１０×０．５ｍｌの０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ２．８でカラムから溶出させた。各画分を、３５μｌの１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９を含有するマイクロ反応チューブに回収した。抗体の強度を維持するために、適切な量のＴｒｉｓ−ＨＣｌまたはグリシン緩衝液を添加することによって、中性ｐＨを、溶出後直ちに調整した。さらなる使用のためにカラムを再生するために、カラムを、１０ｍｌの１０ｍＭナトリウム−リン酸緩衝液ｐＨ６．８で１回洗浄し、続いて、１Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄サイクルを行い、そして最終的に、１０ｍｌＰＢＳで２回洗浄サイクルを行った。ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｐｅｒｂｉｏ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、タンパク質濃度を決定した。この手順は、単一の規定された抗体の溶出を生じた。
【０２６２】
（ｂ）結合抗体を、１０×０．５ｍｌの０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ２．８でカラムから溶出させた。ゲル電気泳動による分離のため、等電点電気泳動に供するサンプルの塩含有量を減少するためにその後ｐＨ調整を行ったことにより、アフィニティー結合抗体の溶出は実施しなかった。ゲル電気泳動分離は、抗体の１組の定義されたバンドを提供した（図１２における番号付けを参照のこと）。
【０２６３】
ｉｉ）抗体の定量
溶出画分における抗体濃度を、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ方法（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｐｅｒｂｉｏ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって決定した。Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭＫｉｔ内に供給される２ｍｇ／ｍｌのウシアルブミンのストック溶液を使用して、４０〜０．５μｇ／ｍｌの範囲内の新鮮な標準希釈を調製した。抗体は、画分１〜６の間で溶出し、画分１および３において濃度が最も高かった。１０の溶出画分の各組の定量化のために、新鮮アルブミン標準希釈物を調製した。結果を、５６２ｎｍにおいてＥＬＩＳＡリーダーで読み取った。
【０２６４】
Ｂ．エピトープ摘出を介する抗Ａβ（２１−３７）自己抗体によって認識されるエピトープの決定
健常な個体の血清から実施例２Ａに記載のように単離した自己抗体を、５００μｌの０．２ＭのＮａＨＣＯ３／０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．３）中１００μｇのＡβ（２１−３７）自己抗体の溶液を使用して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）−活性化６−アミノヘキサン酸−結合セファロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）に添加し、そしてマイクロキャピラリー（ＭｏＢｉＴｅｃ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）へ移す前に、６０分間、２０℃で結合させたことにより、固定化した。カラムを、６ｍｌのブロッキング緩衝液（０．１Ｍエタノールアミン、０．５ＮａＣｌ−ｐＨ＝８．３）で５回洗浄し、そして各ブロッキング工程の間に、６ｍｌの洗浄緩衝液（０．２ＭのＮａＯＡｃ、０．５ＭのＮａＣｌ−ｐＨ＝４）で１秒間あたり１滴ずつの滴下で洗浄した。次いで、カラムを、１時間、ブロッキング緩衝液中でインキュベートし、続いて、別の洗浄工程を行った：６ｍｌの洗浄緩衝液（０．２ＭのＮａＯＡｃ、０．５ＭのＮａＣｌ−ｐＨ＝４）と、６ｍｌのブロッキング緩衝液（０．１Ｍエタノールアミン、０．５ＮａＣｌ−ｐＨ＝８．３）とで交互に７回洗浄した。最終的に、カラムを、２０ｍｌのＰＢＳ（５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５）で洗浄した。次いで、分析しようとするペプチドを、１つの結合抗体あたり約２ペプチドの分子比で適用した。次いで、カラムを、１０ｍｌのＰＢＳ洗浄、次いで、１０ｍｌの２回脱塩Ｈ２Ｏ（ＭｉｌｌｉＱ）で洗浄して、非特異的に結合したペプチドを取り出した。次いで、５００μｌの０．１％ＴＦＡを適用し、そしてそれを１５分間、穏やかな撹拌下でインキュベートすることによって、溶出を行った。次いで、特異的に結合したペプチドを含有するＴＦＡ溶液を溶出させ、そしてＴＦＡ溶液を、再度、２〜４回、適用する。これらの溶出液をプールし、そして凍結乾燥し、次いで、ＭＳによって測定する。
【０２６５】
１つの結合抗体あたり約２ペプチドの分子比のＰＢＳ中２〜５μｇのＡβ−抗原を、上記の段落に記載のように生成した抗体マイクロカラムに６０分間、室温（２０〜２５℃）で適用することにより、エピトープ摘出を実施した。洗浄後、カラム上で、２時間、３７℃、２００μｌのＰＢＳ中０．２μｇのプロテアーゼで、消化を実施した。結合していないペプチドを取り出し、そして５００μｌの０．１％トリフルオロ酢酸を使用して、エピトープを抗体から解離させた。１５分間、２０℃でのインキュベーション後、この工程を５回反復し、エピトープ溶出液を凍結乾燥し、そして質量分析のために、１０μｌの０．１％ＴＦＡまたはＭＡＬＤＩ溶媒（３：２ＡｃＣＮ：０．１％ＴＦＡ−緩衝液）において再構成した。
【０２６６】
類似の様式でエピトープ抽出を実施したが、しかし、第１に、結合していない抗原でタンパク質分解消化を実施し、そしてタンパク質分解消化物を、抗体カラムに直接適用した。図６に示すように、カルボキシ−末端Ａβ（２１−３７）配列は、特異的に認識される（タンパク質分解に対して遮蔽されていた）ことを見出した一方、ＡβのＮ末端残基は、切断のためのアクセスが可能であった。それ故、健常な個体から単離されたＡβ−自己抗体が結合した抽出されたエピトープは、Ａβ（２１−３７）のアミノ酸配列を示した。従って、本発明の抗体を、Ａβ（２１−３７）自己抗体と呼称した。
【０２６７】
図３は、Ａβ（４−１０）に対して指向された斑特異的抗体が、タンパク質分解消化からアミノ酸Ｆ４、Ｒ５、Ｄ７を遮蔽することが可能であることを示した類似の実験を示す。
【０２６８】
ＩＶＩｇＧから実施例２Ａに記載のように精製したＡβ（２１−３７）自己抗体を使用して、本発明の抗体の特異性についてさらに調べた。抗Ａβ抗体ＡＣＡ（米国特許第７，１９５，７６１号明細書に基づく、実施例５を参照のこと）についてもまた評価した。抗体を、下記のように、異なる部分Ａβペプチドと共にインキュベートし、そして実施例２Ｂにおいて上記のように洗浄した。上記のように、ＭＳを介して溶出プロファイルを分析した。
【０２６９】
図３４（ａ〜ｄ）は、本発明の抗体が、この実験設定において、Ａβ（１２−４０）およびＡβ（２０−３７）に特異的に結合するが、Ａβ（２５−３５）、Ａβ（１７−２８）またはＡβ（３１−４０）には結合しないことを示す。
【０２７０】
図３４（ｂ）は、Ａβ（２１−３７）自己抗体がＡβ（１２−４０）ポリペプチドに特異的に結合したことを示す。
【０２７１】
図３４（ｃ）は、Ａβ（２１−３７）抗体が、Ａβ−ポリペプチド、Ａβ（２５−３５）、Ａβ（１７−２８）またはＡβ（３１−４０）に結合しなかったことを示す。
【０２７２】
図３４（ｄ）〜３４（ｌ）は、固定化されたＡＣＡ抗体および固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体が、両方ともＡβ（１−４０）およびＡβ（１２−４０）に結合するが、固定化されたＡβ（２１−３７）自己抗体のみは、Ａβ（２０−３７）に特異的に結合し、そしてＡＣＡ抗体は結合しないことを示す。いずれの固定化された抗体も、Ａβ（１７−２８）には結合しなかった。さらに、固定化された抗体ＡＣＡは、Ａβ（４−１０）に結合しなかった。
【０２７３】
従って、本発明の抗体は、それらが、Ａβ（１２−４０）およびＡβ（２０−３７）に特異的に結合するによって特徴付けられる点で独特であるが、一方、それらは、上記の実験条件下では、Ａβ（２５−３５）、Ａβ（１７−２８）またはＡβ（３１−４０）に結合しない。
【０２７４】
Ａβ自己抗体エピトープの構造およびコンフォメーション特性、結合親和性、ならびに特異性を、Ａβ（２１−３７）エピトープ配列を含んでなる合成ペプチドの調査、ならびにアラニン配列変異を使用する細密な構造マッピング、Ｈ−Ｄ交換および高分解能質量分析、ＥＬＩＳＡ研究ならびに異なる溶媒におけるＣＤ分光コンフォメーション分析によって、さらに特徴付けた。ビオチン化Ａβ（２１−３７）ペプチドならびにオリゴ−グリシンおよび−（Ｄ−Ａｌａ）スペーサー基でフランキングされたペプチド誘導体を、Ａβペプチドについて先に記載した手順に従って固相ペプチド合成によって合成し、そして逆相ＨＰＬＣによって精製し、そして分子均一度についてＭＡＬＤＩ−およびＥＳＩ−質量分析によって特徴付けた（Ｍａｎｅａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｍｅｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＥＬＩＳＡシステムを使用して、異なるＣ末端配列長を含んでなるＡβ−エピトープペプチドにより、比較結合研究を実施した（以下を参照のこと、３）。これらの結果は、残基３０〜３７を含んでなるＡβのカルボキシ末端配列端部の抗体親和性に必須の機能を確立した；この部分配列は、Ａβのβ−シート形成および凝集に重大に関与する。それ故、十分な結合親和性がＡβ（１２−４０）において得られる。対照的に、短縮されたＡβ（２０−３０）ペプチドは、ほぼ完全に消失された親和性を示した。Ｈ−Ｄ平衡交換におけるペプチドの質量分析研究は、Ａβ配列（２０−３０）についてのみペプチド骨格水素の迅速な重水素組み入れを示したが、残基（３０−３７）についてはごく僅かな骨格重水素化しか示さず、コンフォメーションまたは凝集効果のため、この部分における遮蔽の増加が示唆された。Ｎ末端、Ａβ（１−１６）ペプチドを認識する抗体（斑特異的モノクローナル−およびポリクローナル抗体）によるエピトープペプチドＡβ（２０−３７）のコントロールの結合研究は、何ら結合親和性を示さなかった。
【０２７５】
Ｃ．精製された抗Ａβ（２１−３７）自己抗体のアフィニティー評価
アフィニティー精製された抗体の質を評価するために、コントロールとしてアフィニティー−精製カラム（固定化されたＡβ１２−４０）のフロースルーを使用して、ＥＬＩＳＡを実施した。９６ウェルプレートを、２００ｎｇ／ウェルのＡβ（１−４０）と共に、ＰＢＳ緩衝液中、２時間、２０℃でインキュベートした。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する２００μｌのＰＢＳで４回洗浄し、そしてＰＢＳ緩衝液中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する５％ＢＳＡで２時間、ブロッキングした。次いで、プレートを、コントロールとしてＩＶＩｇＧフロースルーを使用する５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中の実施例２Ａに記載のように得られたアフィニティー−精製された抗体を伴う穏やかな振盪下で、２時間、２０℃でインキュベートした。洗浄後、抗ヒト西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体を、ウェルに添加し、そして１時間、インキュベートした。基質ＯＰＤを添加した後、光学密度を、４５０ｎｍにおいて決定した。親和性を、約８〜約１５×１０−９Ｍの間の範囲のＫｄ−値を伴う競合ＥＬＩＳＡで決定した。
【０２７６】
Ｄ．抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の配列決定のための電気泳動分離
実施例２Ａに記載のように得られる抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の電気泳動分離および等電点電気泳動による単離を、１Ｄ−および２Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって行った。サンプルを、６Ｍ尿素、３０％グリセロール、２％ｗ／ｖＳＤＳ、０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１％ＤＴＴおよび微量のブロモフェノールブルー中において３０分間、次いで、ＤＴＴを４．５％（ｗ／ｖ）ヨードアセトアミドで置き換えたことを除いて同じ溶液中において３０分間、平衡化した。等電点電気泳動（ＩＥＦ）を、１７ｃｍ固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ（ｐＨ範囲３〜１０直線）を使用するＭｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ水平型電気泳動システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により、行った。２次元分離を、１．５ｍｍ厚の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用するＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ  ｘｉセル垂直型電気泳動システムにより、行った。ＩＰＧストリップを、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、０．３％ＤＴＴ、２％Ｓｅｒｖａｌｙｔ  ｐＨ３〜１０および微量のブロモフェノールブルー中に可溶化された凍結乾燥された抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の（クマシーでは）約１００μｇおよび（銀染色では）３０μｇを含有する溶液において、１晩、再水和させた。サンプルを、ゲル内再水和方法を使用して、適用した。サンプルを含有する再水和されたストリップを、１次元において、約３０ｋＶｈ、２０℃で稼動させた。
【０２７７】
垂直ゲル上に配置されたストリップを、ＳＤＳランニング緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１９２ｍＭグリシンおよび０．１％ｗ／ｖのＳＤＳ）中１％アガロースで覆い、そして２５ｍＡ／ゲルにおいて３０分間、そして追跡用色素（ｔａｃｋｉｎｇ  ｄｙｅ）がゲルの陽極端部に到達するまで４０ｍＡ／ゲルで電気泳動に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける分離後、タンパク質を、銀染色または高感度コロイドクマシー染色によって可視化し、そしてＧＳ−７１０Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、走査した（図１２および１３を参照のこと）。
【０２７８】
重鎖および軽鎖の単離
抗体の軽鎖および重鎖の単離を、１Ｄゲル電気泳動を使用して行った。サンプル（５０〜２００μｇ）を、サンプル緩衝液（４％ＳＤＳ、２５％グリセロール、５０ｍＭのＴｒｉｓ−緩衝液、０．０２％クマシー−ブルー、６Ｍ尿素、ｐＨ６．８）に、反復撹拌、音波処理をしながら溶解し、そして遠心分離して、抗体の最大限の可溶化を確実にした。ジスルフィド架橋の還元を、１０００×モル過剰ジチオスレイトール（ＤＴＴ）との９０分間、２０℃での反応によって、実施した。続いて、還元されたシステイニル−スルフヒドリル基のアルキル化を、３×モル過剰のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）／ＤＴＴ濃度との６０分間、２０℃での反応によって、実施した。重鎖および軽鎖バンドの１Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ単離を、１２％アクリルアミドゲル上、ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｐｒｏｔｅａｎ−（ＩＩ）電気泳動セルを使用して、１バンドあたり約２０μｇの抗体の適用によって、実施した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ製のＰＤＱｕｅｓｔソフトウェアを、１−Ｄおよび２−Ｄゲルを画像化および解析するのに用いた。ゲルを染色および走査した後、ＰＤＱｕｅｓｔソフトウェアの個別のアルゴリズムを使用して、バックグランドのノイズレベル、ゲルアーティファクト（ｇｅｌ  ａｒｔｉｆａｃｔ）、および画像の水平方向または垂直方向のストリーキングを減少させた。次いで、２−Ｄゲル上で分離したタンパク質スポットを自動的に検出するため、および異なるゲルの比較のために、ＰＤＱｕｅｓｔソフトウェアを使用した。識別されたスポットとして約２０のバンドが検出され、そのうち、１６個の重鎖および１５個の軽鎖のスポットを分析し、そして質量分析によって同定した。
【０２７９】
Ｅ．抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の配列決定のための分析ストラテジーおよび方法の概観
重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を包含する抗体の一次構造決定、ＣＤＲ配列、ジスルフィド結合、およびＮ末端配列の決定および多重度、ならびにそれらの変形を、以下の相補的および部分的重複方法の組み合わせによって実施した（図１０における概観）：
（ｉ）１Ｄ−電気泳動単離および抗体バンドのブロッティング後の無傷なタンパク質、重鎖および軽鎖の直接エドマンＮ末端配列決定（Ｎ末端およびＣＤＲ１可変ドメイン）；
（ｉｉ）重鎖および軽鎖の１Ｄ−電気泳動分離、それに続く、単離されたタンパク質バンドのトリプシン消化、トリプシンペプチドのＨＰＬＣ単離、およびペプチドフラグメントのエドマン配列決定（可変領域およびＣＤＲ領域）；
（ｉｉｉ）デノボ配列決定およびＮＣＢＩデータベース検索手順からの配列決定の組み合わせを使用するＨＰＬＣによって単離されたタンパク質分解ペプチドのＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ配列決定（可変配列およびＣＤＲ領域）；
（ｉｖ）２つ以上のデータベース検索手順（例えば、Ｍａｓｃｏｔ、Ｐｒｏｆｏｕｎｄ検索エンジン）を実施することによるデータベース検索と共に高分解能ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳを使用する抗体−アイソフォームの２Ｄ−ゲル電気泳動分離からのタンパク質分解消化物ペプチドの質量分析配列アサインメント；定常ドメインおよび部分的可変配列ドメイン；
（ｖ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（定常領域配列）を使用するＨＰＬＣ−単離されたタンパク質分解ペプチドの質量分析；加えて、ジスルフィド架橋の還元を伴わないおよび伴うタンパク質分解ペプチドフラグメントのＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）を、正確なジスルフィド結合のアサインメントおよび確認のために使用した；
（ｖｉ）抗体−アイソフォームの重鎖および軽鎖接続性のアサインメントを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）還元工程を最初に省略して、等電点電気泳動工程中に無傷なジスルフィド−連結抗体を提供する２Ｄ−ゲル電気泳動分離後のタンパク質分解ペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−およびＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）によって、実施した。次いで、ジスルフィド還元およびアルキル化を、第２の電気泳動工程において実施した。
【０２８０】
Ｆ．抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の配列の詳細な説明
ａ）血清−ＩＶＩｇＧ、およびｂ）２例の健常成人個体（ｍ、３０歳）から単離された血清−ＩｇＧからアフィニティー精製によって単離された抗Ａβ（２１−３７）自己抗体について、アミノ酸配列を決定した。（上記のようにジスルフィド−結合で同定された）完全な抗体、重鎖および軽鎖の配列決定を、図２９、３０および３２において、構造の詳細のアサインメントと共に示す。図２５〜３０に示される実験の詳細において、相補的および重複部分配列による配列決定を完了するために使用した異なる相補的方法を、（ｉ）エドマンＮ末端タンパク質配列決定；ならびに（ｉｉ〜ｖ）２Ｄ−電気泳動単離におけるタンパク質分解ペプチド混合物のエドマン配列決定、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよび高分解能ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、およびＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳを使用するＨＰＬＣによって単離されたタンパク質分解ペプチドの配列決定について異なる下線を付したコードによって示す。さらに加えて、シスチニル残基の分子内−ジスルフィド結合ならびにＣｙｓ−２２４（ＨＣ−ＬＣ）、Ｃｙｓ−２３０およびＣｙｓ−２３３（ＨＣ）において同定される重鎖−軽鎖−ジスルフィド結合を、重鎖配列において注釈を付している。システイン残基の配列位置の直接アサインメントに加えて、ジスルフィド結合が、トリプシン非還元ペプチド混合物（示さず）、およびその後のＤＴＴ−還元ペプチドからの質量分析分子量決定によって確認され、参照ＩｇＧ１構造の結晶学的データ（ＰＤＢ  １ＩＧ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎタンパク質構造データベース）から推定されたジスルフィド結合のアサインメントからの相同比較と共に完全な一致が示された。
【０２８１】
血清−ＩＶＩｇＧ抗体から、それぞれの可変領域の１２の重鎖アイソフォームおよび５つの軽鎖アイソフォームについて配列が同定された；軽鎖配列は、４つのκおよび１つのλ鎖配列を含んだ。アミノ酸配列の主要部分では、配列データは、少なくとも２つの相補的重複部分配列決定によって相互に対応および確認していた。すべての抗体配列は、ＩｇＧ１サブクラス分子として同定された。
【０２８２】
重鎖および軽鎖配列における注目すべき結果は、定常ドメインにおけるいくつかの単一アミノ酸変異の同定であり、それらのそれぞれは、いくつかの補足的な質量分析方法およびＨＬＣ−単離されたトリプシンペプチドのエドマン配列決定によって確認された。Ｎ−３０１におけるＮ−グリコシル化部位は、トリプシンペプチド（２９７−３０４）（ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ）のエドマン配列決定によって確かめられた；このペプチドは、配列決定サイクル−５においてブランクを提供した。ＰＮＧａｓｅＦによるＮ−脱グリコシル化後、このペプチドは、配列決定を生じた、Ｎ−３０１；さらに、脱グリコシル化ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ分析は、正確な分子量の同定を提供した。さらに、非グリコシル化Ｆｃ配列変異は、Ｎ３０１Ａの変異および部分的非グリコシル化Ｎの存在によって同定された。
【０２８３】
軽鎖および重鎖について決定した可変配列を、１２の配列改変体（重鎖）および５（軽鎖）を含んでなる図２５および２６にまとめている。重鎖における配列変異は、軽鎖についていくらかの配列変異を示したが、重鎖については完全な均一度を示したＮ末端配列を除いて、軽鎖よりかなり多く認められた。Ｎ末端配列を、タンパク質の直接エドマン配列解析、トリプシンＮ末端ペプチドのエドマン配列決定、およびＨＰＬＣ−単離されたＮ末端ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ配列決定の組み合わせによって、決定した。特徴は、軽鎖Ｎ末端変異とは対照的な単一の均一な重鎖Ｎ末端重鎖（１−２０）である。軽鎖のＮ末端変異を、ＮＣＢＩデータベースを使用するｂｌａｓｔ相同性検索によって、確認した。
【０２８４】
重鎖および軽鎖領域の両方について決定したＣＤＲ配列ドメインを、図２４ａ〜ｄにまとめる。可変ドメイン内において同定された変異と一致して、７つまでのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の同定により、重鎖配列について、より高い多様性が見出された；一方、４および５つの配列を、軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２ドメイン、ならびに２つのＣＤＲ３配列変異について決定した。重鎖および軽鎖ＣＤＲの段階的試験を使用して、すべてのＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ則（非特許文献１および非特許文献２；）に一致した。同定されたＣＤＲ配列は、コンセンサス配列の誘導を可能にした。
【０２８５】
Ｇ．配列決定のための実験手順の詳細な説明
ｉ）配列決定ためのタンパク質サンプル調製
実施例２Ａに記載のように得られる血清−ＩＶＩｇＧから単離された抗Ａβ（２１−３７）自己抗体を凍結乾燥し、そして１μｇ／μＬの濃度で変性緩衝液（６Ｍ尿素；５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ＝７．５）に溶解した。１０００×モル過剰のＤＴＴにより、２時間、３０℃で、ジスルフィド架橋の還元を実施した。遊離チオール基のその後のアルキル化を、３０００×モル過剰のヨードアセトアミドで、１時間、２０℃、薄明かり下における反応によって、行った。続いて、１Ｄ−ゲル電気泳動による重鎖および軽鎖の分離の前に、サンプルを凍結乾燥した。
【０２８６】
ｉｉ）Ｎ末端のエドマンタンパク質配列解析
自動化されたアミノ酸配列解析を、１４０Ｃ  Ｍｉｃｒｏｇｒａｄｉｅｎｔ  ＨＰＬＣシステム、７８５Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒおよび６１０Ａデータ解析システムを装着したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４９４ＨＴ  Ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒによって実施した。使用した溶媒および試薬は、分析用ウルトラグレード純度（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙより供給される）であった。
【０２８７】
以下の試薬および材料（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、すべての分析において用いた：ブロッティング緩衝液：２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ、２０％メタノール；ＰＶＤＦ膜：ＰｒｏＢｌｏｔｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；フィルターペーパー：ＧＢ００５（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）；ブロッター：ＰｅｑＬａｂ  ＰｅｒｆｅｃｔＢｌｕｅ  Ｔａｎｋ−Ｅｌｅｋｔｒｏｂｌｏｔｔｅｒ  Ｗｅｂ  Ｍ；染色溶液：５０％メタノール中０．１％Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０；脱染色溶液：５０％メタノール水溶液。
【０２８８】
４．）に記載のように、抗体を還元し、アルキル化し、そして１Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより重鎖および軽鎖成分に分離した。電気泳動分離後、直ちに、新鮮なゲルを、トランスファー緩衝液において１０分間、平衡化した。ＰＶＤＦ膜（１０×１０ｃｍ、ゲルのサイズ）を、メタノール（分析用、Ｎｏｒｍａｐｕｒ）に１分間、浸潤させ、次いで、２０分間、トランスファー緩衝液において平衡化した。２シートのフィルターペーパーを、ゲルの寸法（１０×１０ｃｍ）に切断し、そしてフィルターペーパーを、トランスファー緩衝液に浸した。
【０２８９】
ブロッティングサンドイッチを、次のとおりに集成した：湿潤フィルターペーパーを、ブロッティングカセットの陽極（＋）側に配置した。平衡化したＰＶＤＦ膜を、フィルターペーパーの頂部に配置した。平衡化したゲルを、トランスファー膜の頂部に配置した。他方のフィルターペーパーを、ゲルの頂部に配置した。サンドイッチ成分の間に気泡が含まれないように注意した。次いで、カセットを閉じ、そしてブロッティングタンクに浸漬した。
【０２９０】
１ｍＡ／ｃｍ２の定電流で４時間、ブロッティングを行った。タンパク質トランスファーを完了した後、ＰＶＤＦ膜を、ＭｉｌｌｉＱ水で、２回、１５分間洗浄して、ＳＤＳおよびグリシンを取り出した。次いで、ＰＶＤＦ膜をメタノールで１分間洗浄し、次いで、１分間、染色した。染色した膜を、タンパク質スポットがバックグランドから明確に目視可能になるまで、脱染色溶液で洗浄した。次いで、膜を空気乾燥させた。タンパク質スポットを切り出し、エッペンドルフチューブに配置して、そして４℃で貯蔵した。配列解析前に、完全な脱染色まで、スポットを１００％メタノールで洗浄した。タンパク質スポットを、シークエンサーカートリッジに配置し、そして標準的なＰＬ  ＰＶＤＦタンパク質方法（ＰＶＤＦドットしたタンパク質のためのパルスリキッドシークエンサー方法、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、配列決定した。
【０２９１】
ｉｉｉ）ゲル電気泳動分離後の抗体のタンパク質分解消化
重鎖および軽鎖は、１２％分離ゲルおよび５％スタッキングゲルを伴う１Ｄ−ゲル電気泳動によって分離し、そして４）に記載のようにコロイドクマシーブルーで染色した。
【０２９２】
ゲル内タンパク質分解消化ならびにトリプシンペプチドのその後のＨＰＬＣ単離および質量分析では、ゲルのバンドを切り出し、そしてＭｉｌｌｉＱ水中６０％アセトニトリルの２０分間、２５℃での添加によって、脱染色した。上清を取り出し、そしてゲルスポットを乾燥状態まで凍結乾燥した後、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３の溶液の１ｍｌを再水和のために添加し、そして２０分間、２５℃でインキュベートした。この手順を２回反復し、そして最終的水和を、プロテアーゼ溶液（５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中１２．５ｎｇ／μｌのトリプシン）により４℃で４５分間、実施した。次いで、ゲルスポットを、１２時間、３７℃、１ｍｌの５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３においてインキュベートし、そしてタンパク質フラグメントを、３回、水中６０％アセトニトリルの１ｍｌで１時間、溶出させた。溶出物を、乾燥状態まで凍結乾燥し、そしてＨＰＬＣおよびＭＳ分析の直前に溶解した。
【０２９３】
２Ｄ−電気泳動、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる配列決定およびタンパク質分解ペプチドのエドマンＮ末端配列決定後のタンパク質の同定／配列ならびにデータベース解析のために、ゲルスポットを切り出し、アセトニトリルにおける脱水、および真空遠心分離機の減圧乾燥におけるアセトニトリルのその後の取り出しに供した。タンパク質分解消化のためのサンプル調製を、ゲル片を覆うのに十分な容積の５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中１０ｍＭジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ）（ＤＴＴ）による還元によって上記のように実施し、そしてタンパク質を１時間、５６℃で実施した。室温まで冷却後、ＤＴＴ−含有溶液を、同じ容積の５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中５５ｍＭヨードアセトアミドの溶液に入れた。室温、暗所で、時折、振盪（ボルテックス撹拌）を伴う４５分間のインキュベーション後、ゲル片を、１０分間、５０〜１００μＬの５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３で洗浄し、そして同じ容積のアセトニトリルの添加によって、再度脱水した。次いで、液相を取り出し、そしてゲル片を、真空遠心分離機において完全に乾燥した。
【０２９４】
切り出したゲル片を、手動か、または文献の手順に従い、ＤｉｇｅｓｔＰｒｏ９６ロボット（Ｉｎｔａｖｉｓ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して自動のいずれかで、トリプシンにより消化した。手動のゲル内消化およびその後の質量分析では、スポットを切り出し、そしてＭｉｌｌｉＱ水中６０％アセトニトリルの２０分間、２５℃での添加によって脱染色した。上清の取り出し、およびゲルスポットの凍結乾燥後、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３の溶液を再水和のために添加し、そして２０分間、２５℃でインキュベートした。この手順を２回反復し、次いで、最終的水和を、プロテアーゼ溶液（５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中１２．５ｎｇ／μｌのトリプシン）により４℃で実施した。ゲルスポットを、１２時間、３７℃で、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３においてインキュベートし、そしてタンパク質分解ペプチドを、３〜４時間、水中６０％アセトニトリルで溶出させた。溶出液を、乾燥状態まで凍結乾燥し、そしてＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析の直前に、５μｌのアセトニトリル／水中０．１％トリフルオロ酢酸（２：１）に溶解した。
【０２９５】
後の質量分析のための自動化されたゲル内消化を、ＤｉｇｅｓｔＰｒｏ９６ロボット（Ｉｎｔａｖｉｓ  Ｂｉｏｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で実施した。ＤｉｇｅｓｔＰｒｏ９６は、温度調節されたアルミニウムリアクターブロックを含有するモジュールを備えたＧｉｌｓｏｎ２２１ＸＬロボットからなる市販の消化ロボットシステムである。ブロックは、９６までのタンパク質サンプルを保持することができ、そしてそれが、ロボットアームによって、洗浄またはサンプル回収位置まで移動され得るように、レール上に装架される。タンパク質ゲル片を、２Ｄ−ＰＡＧＥゲルから切り出し、そしてウェル底へ穿孔された小さな孔を含有する透明な９６ウェルＰＣＲプレートに充填した。プレートを、蓋および４本の取り付けねじによって固定されるシリコーン膜で覆った。シリコーン膜の孔は、特別に設計されたディスペンサニードルによる試薬送達を可能にする。このニードルは、窒素圧を反応ウェルに送達する第２の外側チャンネルを有する。ニードルの位置決めは、液体のバイアルへの送達または２．６バールの窒素圧によるリアクターからの射出のいずれかを可能にする。以下に記載のように、ゲル内消化プロセス全体を、ロボットプラットフォーム上で遂行し、そしてＤｉｇｅｓｔＰｒｏ９６ソフトウェア（バージョン４．０２．；ＩＮＴＡＶＩＳ）によって制御した。簡単に説明すると、ゲル片を４回、５０μｌの５０ｎＭのＮＨ４ＨＣＯ３で洗浄し、そして各工程後、１００μｌのアセトニトリルで脱水した。最後の収縮工程後、５０μｌの酵素緩衝液（５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ約８中１２．５ｎｇ／μｌトリプシン）をチューブに添加した。酵素を、ゲル片に３０分間引き抜いた。続いて、５０μｌ溶液５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ゲル片を覆い、そして６時間後、３７℃で、ペプチドを抽出した。第１の抽出は、５０μｌのＮＨ４ＨＣＯ３で実施し、続いて、３回の抽出を５０μｌの１０％ギ酸で行い；抽出と抽出との間に、上記のように、ゲル片をアセトニトリルで脱水した。次いで、回収した抽出物を、真空遠心分離機において乾燥し、そしてＭＳ分析の直前に、５μｌのＭＡＬＤＩ−ＭＳ溶液（アセトニトリル：水中０．１％トリフルオロ酢酸、２：１）または５μｌのＥＳＩ−ＭＳ溶液（メタノール：水：酢酸、５０：４８：２（ｖ／ｖ／ｖ））のいずれかに再溶解した。ゲル内脱グリコシル化のために、ゲル片を、１００μＬの市販のＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）製剤（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と１００μＬの０．１Ｍの重炭酸アンモニウム緩衝液とを混合して、１００単位ｍＬ−１の最終酵素濃度を提供することによって、調製した脱グリコシル化緩衝液において、膨潤させた。すべての液体がゲル片によって採取されたら、さらなる消化緩衝液（但し、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを伴わない）をサンプルに添加して、３７℃での１晩のインキュベーションの間、サンプルの湿潤を保持した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析におけるＰＮＧａｓｅ  Ｆ−関連ペプチドからの可能な干渉を回避するために、ゲル片を、０．１Ｍ重炭酸アンモニウム中０．１％ＳＤＳで洗浄（４回、１回につき２５０μＬで１時間）することによって、タンパク質分解��にグリコシダーゼを取り出した。すべての洗浄溶液を廃棄し、そして５０：４５：５（ｖ／ｖ／ｖ）メタノール：水：酢酸（３０分間）とのインキュベーション、および０．１Ｍ重炭酸アンモニウム中５０％アセトニトリルを使用する３回の洗浄（１回につき３０分間）によって、ＳＤＳを取り出した。すべての洗浄液を廃棄し、次いで、ゲルプラグを真空遠心分離機において乾燥した。同じ手順を、ＥｎｄｏＨグリコシダーゼによるゲル内脱グリコシル化に使用した。
【０２９６】
次いで、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製ＺｉｐＴｉｐ（登録商標）Ｃ１８ピペットチップを使用して、ＺｉｐＴｉｐ−清掃手順を実施した。ＺｉｐＴｉｐピペットチップは、１０μｌピペットチップの細長い端部にパックされた樹脂を伴うマイクロカラムである。ＺｉｐＴｉｐピペットチップは、ペプチドおよびタンパク質サンプルを濃縮ならびに精製するためのＣ１８またはＣ４逆相材料を含有する。ＺｉｐＴｉｐＣ１８ピペットチップは、ペプチドおよび低分子量タンパク質に対して適用した一方、ＺｉｐＴｉｐＣ４ピペットチップは、より高い分子量タンパク質に対して適用した。完全なＺｉｐＴｉｐ手順を、製造者の指示に従って行った。簡単に説明すると、それは、本質的に次の５つの工程からなる：湿潤；ＺｉｐＴｉｐピペットチップの平衡化；ペプチドおよびタンパク質のピペットチップへの結合；洗浄；および溶出。
【０２９７】
ｉｖ）タンパク質分解ペプチドのＨＰＬＣ分離および単離
すべての分析用ＨＰＬＣ分離を、５μｍシリカ（３００Åポアサイズ）を伴うＶｙｄａｃ  Ｃ４カラム（内径２５０×４．６ｍｍ）を使用するＢＩＯ−ＲＡＤ（Ｍｕｅｎｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）２７００ＨＰＬＣシステムによって行った。水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）からなる溶出液Ａ、およびアセトニトリル中０．１％ＴＦＡ：水（８０：２０、ｖ／ｖ）の溶出液Ｂによる１ｍＬ／分の流速での直線勾配溶出溶出（０分０％溶媒Ｂ；５分０％溶媒Ｂ；１３５分６５％溶媒Ｂ、１５０分１００％溶媒Ｂ、１６０分１００％Ｂ）。タンパク質分解ペプチドサンプル、典型的に、５０μｇ−アリコートを、２００μＬの溶出液Ａに溶解した。ペプチドの検出は、一般的に、ＢＩＯ−ＲＡＤ可変波長の吸光度検出器を使用して、２２０ｎｍで実施した。
【０２９８】
ｖ）タンパク質分解ペプチドのＮ末端エドマン配列決定
上記のように、ＨＰＬＣによりトリプシンペプチドを単離し、そして凍結乾燥し、そして配列解析前に−２０℃で貯蔵した。配列決定に使用したサンプル支持体は、３０μＬのＢｉｏＢｒｅｎｅＴＭ  Ｐｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）溶液（１００μｇ／μＬのＢｉｏｂｒｅｎｅおよび水中６．６６μｇ／μＬのＮａＣｌ）で処置したガラス線維フィルター（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からなり、そして標準的なフィルタープレサイクル方法を使用して、プレサイクル（３サイクル）を行った。配列解析のために、凍結乾燥したＨＰＬＣ画分を、水中２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含有する１５μＬの０．１％ＴＦＡにおいて再構成した。再構成したペプチド溶液を、５μｌのアリコート中のプレサイクルしたガラス線維フィルターに適用して、できるだけガラス線維フィルターの中心付近への分布を確実にし、各適用に続いて、Ａｒ流下で１分間、乾燥した。
【０２９９】
すべての配列解析は、上記のように７８５  Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒおよび６１０Ａ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを伴うＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４９４  ＨＴ  Ｐｒｏｃｉｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ／１４０Ｃ  Ｍｉｃｒｏｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ上で実施した。使用したすべての溶媒および試薬は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製であった。タンパク質分解ペプチドの解析に使用した一般的方法は、標準的なパルスリキッド方法であった。
【０３００】
ｖｉ）タンパク質分解ペプチドのＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる配列決定
ＨＰＬＣによって単離されたトリプシンペプチド（上記を参照のこと）のすべての配列決定は、ナノ−ＥＳＩ／ＬＣイオン源システムを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｅｓｑｕｉｒｅ−３０００＋イオン−トラップＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。タンパク質分解ペプチドのＨＰＬＣ画分を、１ｍｌエッペンドルフカップに回収し、そして乾燥状態まで凍結乾燥し、そしてＬＣ／ＭＳ分析まで−２０℃で貯蔵した。ＨＰＬＣ画分を、水中１％ギ酸：アセトニトリル（９：１、ｖ／ｖ）を含有する１６μｌの溶媒混合物に溶解した。サンプルを５分間、２０℃で音波処理し、そして１３０００ｒｐｍ／分で３分間、遠心分離した。サンプルの内容物を、内部マイクロバイアル（０．１ｍｌ）を備えた２ｍｌスクリューキャップバイアルに移し、そしてＬＣ／ＭＳトレイに配置した。サンプルの３μｌアリコートを、自動注入システムによるＣ−１８マイクロカラムに注入し、そして下記の表に列挙した溶出勾配（ＬＣ−ＭＳ勾配）を用いた。サンプルを注入ループからカラムに流動させ、次いで、エレクトロスプレーインターフェースに指向させ、そしてイオン光学系を介してイオントラップに指向させた。総イオン電流（ＴＩＣ）を時間の関数として記録し、そしてＤａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使用して、質量スペクトルに変換した。ＭＳ／ＭＳ分析に使用すべき最も強力なイオンを、第１のＬＣ／ＭＳ稼動から生じる質量スペクトルから選択した。同定した各プリカーサイオンについて、個別のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ稼動を、同一の勾配条件で実施した（表を参照のこと）。ポンプ輸送系の開始後、親イオンの単離と、フラグメンテーションとを、プリカーサ質量、アイソレーション幅およびフラグメンテーション振幅の規格を使用して、Ｅｓｑｕｉｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌウィンドウ上で切り換えた。イオンフラグメントに対応する総イオン流（ＴＩＣ）を、時間の関数として記録した；単一の親イオンを、稼働中にフラグメンテーションに供し、ＴＩＣは、単一のピークを含有する。プリカーサイオンの  ＭＳ／ＭＳスペクトルを、半ピーク幅におけるパルスを平均化することにより、Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアによって作製した。ＭＳ／ＭＳスペクトルに含有されるフラグメントのｍ／ｚ値およびそれらの強度を、データ解析ファイルタイプにエクスポートした（拡張子＊ｍｇｆを付す）。次の検索パラメータを使用して、ＮＣＢＩｎｒデータベース検索を実施するために、ファイルを、ＭＳ／ＭＳ  Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンにアップロードした：分類学、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）；許容される切断ミス、−１；ペプチド検索忍容性、２Ｄａ；ＭＳ／ＭＳ忍容性、０．８Ｄａ；固定修飾、カルバミドメチル（システイン）；可変修飾、Ｍｅｔ−酸化。表示された結果は、表の形態のＭｏｗｓｅ確率スコアを含有し、ペプチド配列および各ヒット結果について生じるタンパク質を提供する。所定のプリカーサのフラグメントイオンについての結果が、免疫グロブリン重鎖または軽鎖由来のペプチドの直接的同定スコアをもたらす場合、得られるペプチド配列を正確な配列とみ��した。所定のプリカーサおよびそのＭＳ／ＭＳスペクトルについて同定スコアが直接得られない場合、ペプチド配列を、Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアのアサインメント機能を使用して、デノボ配列決定によって確かめた。この機能は、２つのフラグメントの間の質量の差異を、特定のアミノ酸に対する質量にアサインする。デノボ手順によって得られたペプチド配列データは、ＮＣＢＩデータベース検索によって得られた配列と同一であった場合、配列結果は正確とみなした。所定のプリカーサイオンについて実施したデータベース検索がいずれの免疫グロブリンペプチドフラグメントを提供しなかった場合、対応するプリカーサは、未確認としてアサインされた。
【０３０１】
LC−MS/MS勾配溶出パラメータの表
【表１】
2010515717.tif 000002
【０３０２】
ｖｉｉ）タンパク質分解ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析は、窒素ＵＶレーザー（λ＝３３７ｎｍ）、２６−サンプルＳＣＯＵＴ源、ビデオシステムならびにスペクトル獲得および機器制御のためのＸＭＡＳＳデータシステムを備えたＢｒｕｋｅｒ  ＢｉｆｌｅｘリニアＴＯＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。アセトニトリル：水中０．１％ＴＦＡ（２：１ｖ／ｖ）におけるα−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイヒ酸（ＨＣＣＡ）の飽和溶液を、マトリックスとして使用した。すべてのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析について、０．８μＬのマトリックス溶液および０．８μＬのサンプル溶液（ＨＰＬＣによって分離したタンパク質分解ペプチド混合物またはトリプシンペプチド）を、ステンレス製ＭＡＬＤＩターゲット上で混合し、そして乾燥させた。スペクトルの獲得を、２０ｋＶの加速電圧（Ｖａｃｃ）および１．５ｋＶの検出電圧において行った。ウシインスリン（５７３４．５Ｄａ）、ウシインスリンβ鎖（酸化型）（３４９６．９）、ヒトニューロテンシン（１６７３．９Ｄａ）、ヒトアンジオテンシンＩ（１２９７．５Ｄａ）、ヒトブラジキニン（１０６１．２）およびヒトアンジオテンシンＩＩ（１０４７．２Ｄａ）の単一プロトン化イオンシグナルの平均質量を使用して、外部校正を行った。
【０３０３】
ｖｉｉｉ）タンパク質分解ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ
ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ質量分析を、アクティブシールド７Ｔ超伝導磁石（Ｍａｇｎｅｘ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）、円筒形インフィニティ（ｉｎｆｉｎｉｔｙ）ＩＣＲアナライザセル、およびパルス化衝突ガスを伴う外部Ｓｃｏｕｔ１００完全自動化Ｘ−ＹターゲットステージＭＡＬＤＩ源を備えたＢｒｕｋｅｒ  ＡＰＥＸ  ＩＩ  ＦＴＩＣＲ機器（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。パルス窒素レーザーは、３３７ｎｍにおいて操作した。
【０３０４】
ペプチドサンプルの分析は、マトリックスとして使用したアセトニトリル／水中０．１％ＴＦＡ（２：１ｖ／ｖ）中２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）の１００ｍｇ／ｍＬ溶液で実施した。０．５μＬのマトリックス溶液のアリコートおよび０．５μＬのサンプル溶液（トリプシンペプチドまたはペプチド混合物）を、ステンレス製ＭＡＬＤＩターゲット上で混合し、そして乾燥させた。ウシインスリン（５７３０．６０９Ｄａ）、ウシインスリンβ鎖（酸化型）（３４９４．６５１）、ヒトニューロテンシン（１６７２．９１７  Ｄａ）、ヒトアンジオテンシンＩ（１２９６．６８５Ｄａ）、ヒトブラジキニン（１０６０．５６９）およびヒトアンジオテンシンＩＩ（１０４６．５４２Ｄａ）の単一プロトン化イオンシグナルのモノアイソトピック質量を使用して、外部校正を行った。スペクトルの獲得およびプロセシングは、ＸＭＡＳＳソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。
【０３０５】
ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ／ＭＳ分析を、ペプチドおよびタンパク質イオンのフラグメンテーションのためのＳＯＲＩ−ＣＩＤ（連続オフレゾナンス−衝突誘起解離）解離、ＩＲＭＰＤ（Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ  Ｐｈｏｔｏｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）機器を備えたＢｒｕｋｅｒ  ＡｐｅｘＩＩ  ＦＴＩＣＲ−ＭＳ機器によって実施した（Ｄａｍｏｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＭＡＬＤＩイオン化によって形成されたイオンをアナライザセルにおいて捕らえ、そしてプリカーサイオンの単離を、適切な周波数および振幅を使用し、適切な励起パルスの適用を介して、ＩＣＲセルからより高いおよびより低い質量のすべてのイオンを射出させることによって、実施した。次の実験条件を用いた：相関した掃引減衰（ｓｗｅｅｐ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）：８〜１０ｄＢ、射出安全ベルト：５００〜１０００Ｈｚ。ＳＯＲＩ−ＣＩＤでは、低増幅ｒｆ−励起を、サイクロトロン周波数から僅かにオフレゾナンス（５００〜１０００Ｈｚ）である周波数で、２５０ミリ秒間の間、プリカーサイオンに適用した。励起の増幅は、イオンが、決してセルの中心からあまりに遠くまで行くことがないように、低度に保持された。この励起が適用される一方、２０〜８０ミリ秒の間、パルスバルブを介して、衝突ガス（アルゴン）を許容することによって、アナライザセルの圧力を上昇（１０−８ミリバール）させた。これらの条件下、プリカーサイオンは多くの低エネルギー衝突を経験し、イオンが解離のための閾値に到達するまで、緩徐に活性化された。
【０３０６】
ＩＲＭＰＤ（赤外多光子解離）実験では、質量選択イオンを、２５Ｗ連続波ＣＯ２レーザー（１０．６μｍ、Ｓｙｎａｒｄ，Ｍｕｋｉｌｔｅｏ，ＷＡ，ＵＳＡ）を使用して、光解離させた。レーザー出力を５０％閾値に設定し、そしてレーザー照射時間を５０〜２００ミリ秒に設定した。
【０３０７】
タンパク質同定および２Ｄ−ゲル電気泳動後のタンパク質分解ペプチド混合物の配列決定（定常領域配列）では、以下の（公的に利用可能な）データベース検索エンジンを用いた：
Ｍａｓｃｏｔ  −  Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎのペプチド質量フィンガープリントおよびＭＳ／ＭＳイオン検索
ＰｒｏＦｏｕｎｄ  −  ＲｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒおよびＮｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのペプチド質量フィンガープリント
ＭＳ−Ｆｉｔ  −  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（ＵＣＳＦ）のペプチド質量フィンガープリント
ＭＳ−Ｔａｇ  −  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（ＵＣＳＦ）のＭＳ／ＭＳイオン検索
【０３０８】
実施例３．ＥＬＩＳＡによる抗原−抗体−複合体の解離定数の決定
Ｋｉｍら（１９９０）の方法の変法により、Ｋｄ値を決定した。決定では、用いた抗体濃度は、実施例９Ｂに記載の間接ＥＬＩＳＡによって得られた初期の検量線から最初に誘導した。
【０３０９】
１）間接ＥＬＩＳＡでは、マイクロタイタープレートを、１５０μＬ／ウェルのストレプトアビジンで、２０℃で２時間、被覆した。ウェルを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｎａ２ＨＰＯ４  ５ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０界面活性剤で１回洗浄した。１×１０−６〜１０−８Ｍの間の濃度のビオチン化−（Ｇ）５−Ａβ（１２−４０）ペプチドを、ＰＢＳにおいて調製し、そして１００μＬ／ウェルの容積でウェルに沈着させた。ウェルを、２時間、２０℃の温度でインキュベートし、続いて、４回の洗浄工程およびブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中ＢＳＡ  ５％ｗ／ｖ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０ｖ／ｖ）による２時間のブロッキングを行った。抗Ａβ（１２−４０）抗体を、ブロッキング緩衝液で１．４×１０−７〜１０−９Ｍの間の濃度に希釈し、そして１００μＬ／ウェルで添加した。マイクロプレートを、２０℃で２時間、インキュベートし、次いで、Ｃｏｖａｂｕｆｆｅｒ（２ＭのＮａＣｌ、０．０８３ＭのＭｇＳＯ４および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する０．１５ＭのＰＢＳ、ｐＨ７．２）で洗浄した。ウェルを、ペルオキシダーゼ−コンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ（１：５．０００）と共に、４５分間、２０℃でインキュベートした。抗体結合を、０．１Ｍクエン酸−リン酸、０．１％ＯＰＤおよび０．００６％過酸化水素を含有する１，２−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）の新たに調製した溶液で検出した。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ２，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ／Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、４５０ｎｍにおいて時間の関数として、酵素反応をモニターした。各抗体および抗原濃度については、三重測定のウェルを調製し、そして測定した。吸光度と抗体濃度との間に、広範な濃度範囲にわたって、正比例が観察された。この濃度範囲を使用して、Ｋｄ決定のための初期濃度を選択した。初期濃度は、光学密度対抗体濃度のプロットの直線領域の範囲内にあるように選択した。
【０３１０】
２）Ｋｄ値の決定のために、次の条件を適用した。様々な濃度（１×１０−６Ｍ〜４．８×１０−１０Ｍ）の抗原、Ａβ（１２−４０）ペプチドを、予備のＥＬＩＳＡキャリブレーションから誘導した一定濃度の抗体と混合した。マイクロ反応チューブのウェル上の吸着によって抗体の消失を最小限にするために、ポリプロピレン試験チューブを使用して、ＰＢＳ中５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０において、インキュベーションを実施した。２時間後、各混合物の１００μｌを、そしてビオチン化−（Ｇ）５−Ａβ（１２−４０）（１μＭ）で予め被覆し、そしてブロッキングしたマイクロタイタープレートのウェルに移し、そして３０分間、インキュベートした。次いで、遊離の抗体の濃度を、上記のように間接ＥＬＩＳＡによって測定した。Ｋｄ値は、Ｓｉｐｓ座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）を使用して実験データをプロットすることによって得た。以下の平均Ｋｄ値を、Ａβ（１２−４０）ペプチドのＡβ−抗体複合体について決定した：
ａ）市販のＩＶＩｇＧ製剤からアフィニティー精製したＩＶＩｇＧ抗体：８×１０−９Ｍ
ｂ）血清−Ａ（健常なヒト個体；３０歳を超える）からアフィニティー精製したＩＶＩｇＧ抗体：１４×１０−９Ｍ
ｃ）血清−Ｂ（健常なヒト個体；３０歳を超える）からアフィニティー精製したＩＶＩｇＧ抗体：１８×１０−９Ｍ
【０３１１】
Ａβ−線維／凝集体の形成の結合／解離定数の範囲は、文献において（決定された）１０−６Ｍの範囲で見積もられているため、抗体の結合は、特異的であると決定される。ＩｇＧ抗体では、１０−８〜１０−９Ｍの範囲の典型的なＫｄ−値が、広範なオリゴ−およびポリペプチド抗原ならびにエピトープについて決定されている。
【０３１２】
実施例４．アフィニティー精製されたＩＶＩｇＧ抗体による斑形成の阻害
ヒト神経芽腫細胞（ＳＨ−Ｓｙ５ｙ）を、１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、４ｍＭグルタミンおよびペニシリン（２００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０−Ｍｅｄｉｕｍで増殖させた。細胞を、３０，０００個の細胞／ウェルの密度で、１晩、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいてインキュベートした。培地を取り出した後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そして毒性Ａβ−オリゴマー（２μＭ最終濃度）を、１００μｌの新鮮培地の容量で、７．５μＭまたは１５μＭの抗Ａβ（２１−３７）自己抗体に、または抗Ａβ（２１−３７）自己抗体を伴わずに添加した。実施例２Ａに記載のカップリング化学を使用してゲルに結合させたＡβ（１−４０）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーにより市販のＩＶＩｇＧから抗体を精製することによって、アフィニティー精製したＩＶＩｇＧ抗体を得た。４時間のインキュベーション後、ＭＴＴ試験を実施した。図４は、Ａβ−仲介毒性（灰色棒）が、アフィニティー精製されたＩＶＩｇＧ（黒色棒）によって、ほぼ完全に中和されることを示す。
【０３１３】
（上記のように精製した）アフィニティー精製したＩＶＩｇＧ、ｍａｂ  ＣＳＬクローン７で実験を反復した（実施例５を参照のこと）。ネガティブコントロールとして、抗体ＣＳＬ３６０（実施例１０を参照のこと）を使用したか、または抗体を使用しなかった。使用したポジティブコントロール抗体はＡＣＡであった（実施例１０を参照のこと）。図４９において示されるように、結果は、明らかに、アフィニティー精製したｍａｂ  ＣＳＬクローン７およびアフィニティー精製したＩＶＩｇＧの両方について、Ａβオリゴマーの神経毒性効果から細胞を保護する用量依存的有効性を示す。
【０３１４】
実施例４において使用したような可溶性の毒性Ａβオリゴマーは、１．０ｍｇのＡβを、４００μＬのＨＦＩＰに、１０〜２０分間、室温で溶解することによって、調製することができる。次いで、得られたシードレス（ｓｅｅｄｌｅｓｓ）のＡβ溶液の１００μｌを、シリコーン処理したエッペンドルフチューブ中９００μＬのＤＤ  Ｈ２Ｏに添加した。１０〜２０分間の室温でのインキュベーション後、サンプルを１５分間、１４，０００×Ｇで遠心分離し、そして上清画分（ｐＨ２．８〜３．５）を、新たなシリコーン処理したチューブに移し、そして穏やかな流速のＮ２に５〜１０分間供して、ＨＦＩＰをエバポレートした。次いで、Ｔｅｆｌｏｎ被覆したマイクロ撹拌子を使用して、サンプルを、５００ＲＰＭで、２４〜４８時間、２２℃で撹拌した。原子間力顕微鏡または電子顕微鏡による観察のため、アリコート（１０μｌ）を６〜１２時間間隔で採取した。
【０３１５】
実施例５．抗Ａβ（２１−３７）自己抗体の組み換え発現
Ａ．一過性発現のための哺乳動物発現ベクター構築
ＣＳＬクローン７（配列番号５３）の軽鎖可変領域およびＣＳＬクローン７（配列番号６０）の重鎖可変領域の両方のアミノ酸配列を使用して、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりこれらの配列をコードするｃＤＮＡ構築物を合成した。軽鎖および重鎖ｃＤＮＡ構築物はまた、独特なフランキング制限酵素部位を含有して、それぞれヒト軽鎖および重鎖定常領域の上流の哺乳動物発現ベクターへのクローニングを可能にするように設計した。構築物はまた、Ｋｏｚａｋ翻訳開始配列、ＡＴＧ開始コドンおよびシグナルペプチド（ＭＥＳＱＴＱＶＬＭＳＬＬＦＷＶＳＧＴＣＧ−軽鎖、およびＭＧＷＳＷＩＦＬＦＬＶＳＧＴＧＧＶＬＳ−重鎖）で操作した。
【０３１６】
標準的な分子生物学的技術を使用して、重鎖可変領域を、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈＩｇＧ１（ヒトＩｇＧ１定常領域および可変領域挿入部位の下流に末端の終止コドンを含むように改変されたｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づく）にクローニングした。軽鎖可変領域を、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈκ（ヒトκ定常領域および可変領域挿入部位の下流に終止コドンを含むように改変されたｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクターに基づく）にクローニングした。
【０３１７】
ＣＳＬクローン７もまた、マウス動物モデルにおける反復使用を容易にするための「マウス化」バージョンとして操作した。重鎖可変領域を、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｍＩｇＧ２ａ（マウスＩｇＧ２ａ定常領域および可変領域挿入部位の下流に末端の終止コドンを含むように改変されたｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づく）にクローニングした。軽鎖可変領域を、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｍκ（マウスκ定常領域および可変領域挿入部位の下流に終止コドンを含むように改変されたｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクターに基づく）にクローニングした。以下に記載のように、マウス化ＣＳＬクローン７を発現させ、そして精製した。
【０３１８】
Ｂ．細胞培養
無血清懸濁液適応２９３−Ｔ細胞を、Ｇｅｎｅｃｈｏｉｃｅ  Ｉｎｃ．から得た。細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン／ファンギゾン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。トランスフェクションの前に、細胞を、３７℃において、８％ＣＯ２の雰囲気を伴う加湿インキュベーター中で維持した。
【０３１９】
Ｃ．一過性トランスフェクション
製造者の指示に従い、２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２９３−Ｔ細胞を使用するクローン７発現プラスミドの一過性トランスフェクションを実施した。軽鎖および重鎖発現ベクターを組み合わせ、そして２９３−Ｔ細胞と共に同時トランスフェクトした。細胞（１０００ｍｌ）を、１×１０６個の生細胞／ｍｌの最終濃度でトランスフェクトし、そしてＣｅｌｌｂａｇ  ２Ｌ（Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中、５日間、３７℃、８％ＣＯ２の雰囲気、２／１０Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ２／１０または２０／５０（Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において、インキュベートした。培養条件は、８°の角度を伴う１分間あたり３５回（ｒｏｃｋ）振盪であった。トランスフェクションの４時間後、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、０．１％ｖ／ｖの最終濃度で添加した。トランスフェクションの２４時間後、細胞培養に、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を、０．５％ｖ／ｖの最終濃度で補充した。細胞培養上清を、２５００ｒｐｍの遠心分離によって回収し、次いで、精製前に、０．４５μＭフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）に通過させた。
【０３２０】
Ｄ．タンパク質発現の分析
５日間後、２０μｌの培養上清を、４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そしてクマシーブルー試薬による染色によって抗体を可視化した。
【０３２１】
Ｅ．抗体の精製
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂（５ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）が３０ｍｌのＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐ空カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ）にパックされたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを４℃で使用して、ＣＳＬクローン７モノクローナル抗体を精製した。まず、樹脂を、発熱物質を含まない１０カラム容積のＧＩＢＣＯ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で洗浄して、貯蔵エタノールを取り出し、次いで、発熱物質を含まない５カラム容積のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＧＩＢＣＯ  ＰＢＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で平衡化した。ろ過したならし細胞培養培地（１Ｌ）を、重力落下により樹脂上に充填した。次いで、樹脂を、発熱物資を含まない５カラム容積のＰＢＳで洗浄して、非特異的タンパク質を取り出した。結合抗体を、２カラム容積の０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．８（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）で、低いｐＨを中和するために０．２カラム容積の２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を含有する画分に溶出させた。溶出した抗体を、１８時間、４℃で、１２ｍｌのＳｌｉｄｅ−Ａ−ＬｙｚｅｒカセットＭＷカットオフ３．５ｋＤ（Ｐｉｅｒｃｅ，ＩＬ）中、５ＬのＰＢＳに対して透析した。Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）分光光度計を使用して、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、抗体濃度を決定した。抗体の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定し、ここで、製造者の指示に従い、クマシー染色を使用して、可視化する前に、還元Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）中２μｇタンパク質を、Ｎｏｖｅｘ  １０〜２０％Ｔｒｉｓ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）上に充填し、そして、１５０Ｖの一定電圧を、ＴｒｉｓグリシンＳＤＳランニング緩衝液を伴うＸＣｅＩｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に９０分間適用した。
【０３２２】
上記の技術を使用して、本発明の抗体のいずれをも発現および精製することができる。以後の実験では、軽鎖、配列番号４７、４８、５０〜５５、および１４５〜１４７を、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈκにクローニングし、そして発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈＩｇＧ１にクローニングした重鎖、配列番号５６〜７１および１４８と共に、同時トランスフェクトした。すべての可能な軽鎖および重鎖抗体の対を含む全部で１８７の一過性トランスフェクションを、実施した。次の４２の軽鎖および重鎖抗体の対（配列番号）が、精製および分析に十分な抗体を発現した：４７／５６、５０／６０、５０／６１、５０／６２、５０／６７、５０／６８、５０／６９、５０／１４８、５１／６０、５１／６１、５１／６２、５１／６８、５１／１４８、５２／６０、５２／１４８、５３／６０、５３／６８、５３／１４８、５４／６０、５４／６１、５４／６２、５４／６７、５４／６８、５４／６９、５４／１４８、５５／６０、５５／６１、５５／６２、５５／６７、５５／６８、５５／６９、５５／１４８、１４５／６０、１４５／６１、１４５／６２、１４５／６８、１４５／１４８、１４６／６０、１４６／６１、１４６／６２、１４６／６８および１４６／１４８。
【０３２３】
また、そのような方法を用いて、それぞれのＣＤＲのコンセンサス配列、例えば、配列番号６〜１１および配列番号１５３〜１６１、またはそれぞれのＣＤＲの単一の配列、例えば、（ａ）重鎖のＣＤＲＩについては、配列番号１３〜２０、ｂ）重鎖のＣＤＲ２については、配列番号２１〜２７、ｃ）重鎖のＣＤＲ３については、配列番号２８〜３２、ｄ）軽鎖のＣＤＲ１については、配列番号３３〜３７、ｅ）軽鎖のＣＤＲ２については、配列番号３８〜４３および配列番号５３、ｆ）軽鎖のＣＤＲ３については、配列番号４４〜４６、ｇ）可変重鎖については、配列番号５６〜７１、ならびにｈ）可変軽鎖については、配列番号４７〜５５に基づく選択されたこの配列を含んでなる十分なヒト抗βアミロイド抗体を産生させることができる。
【０３２４】
本発明に従う発明者らの研究におけるコントロール抗体（ＡＣＡ）としての使用のために、本発明に従う発明者らはまた、アミロイドβペプチドの位置１３〜２８内に含有されるエピトープに結合することが公知であるヒト化２６６抗体の軽鎖および重鎖可変領域配列をクローニングした。これらの配列は、特許文献２８から入手した。具体的には、上記の方法を使用して、２６６のヒト化軽鎖可変領域（特許文献２８、配列番号１１）および２６６のヒト化重鎖可変領域（特許文献２８、配列番号１２）に対する遺伝を合成し、発現ベクターにクローニングし、一過的に発現させ、そして精製した。
【０３２５】
実施例６．発現された組み換え体、抗Ａβ（２１−３７）自己抗体ＣＳＬクローン７およびアフィニティー精製されたＩＶＩｇＧのオリゴマー形態のＡβへの結合
実施例４に記載のように、アミノ末端においてさらなるシステインを含有する合成アミロイドβ１−４０ペプチド（Ａβ１−４０．Ｃｙｓ）（ＰＳＬ  ＧｍｂＨ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を、抗Ａβ（２１−３７）モノクローナル抗体（ｍａｂ）ＣＳＬクローン７およびアフィニティー精製したＩＶＩｇＧに対する免疫沈降アッセイにおいて分析した。ＰＢＳをネガティブコントロールとして用いた。
【０３２６】
具体的には、ｍａｂ  ＣＳＬクローン７が、合成ペプチドをモノマー形態で免疫沈降するのか、またはオリゴマー形態で免疫沈降するのかどうかを評価した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に再懸濁したペプチド（１ｍｇ／ｍｌ）を、直ちに（０時間）使用するか、または３７℃、９００ｒｐｍでのオリゴマー化（１５時間）に供し、そして使用するまで−８０℃で貯蔵した。免疫沈降では、３０μｌのプロテイン−Ｇビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のアリコートを、実施例２に従って精製した５μｇの抗体ｍａｂ  ＣＳＬクローン７または５μｇの抗Ａβ（２１−３７）自己抗体と共にインキュベートした（Ａβ１−４０カラム、２μｇのＡβ１−４０．Ｃｙｓおよび１．５ｍｌのＰＢＳ、４℃で１晩）。固定化された抗体／ペプチドを回収した。ＰＢＳによる洗浄（５回）後、１×非還元性ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１０分間、９５℃で添加することによって、ペプチドを溶出させた。ＮｕＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上での電気泳動および供給者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従うウェットブロットによるニトロセルロース膜上でのウエスタントランスファーによって、タンパク質の分離を行った。膜を、１×Ｒｏｔｉ−Ｂｌｏｃｋ（Ｒｏｔｈ）でブロッキングし、次いで、第一抗体、１：６０００Ｂａｍ９０．１（抗Ａβ）（Ｓｉｇｍａ）および第二抗体、ヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート（Ｐｉｅｒｃｅ）と共に連続的にインキュベートした。化学発光基質として、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｉｅｒｃｅ）を使用した。
【０３２７】
結果は、ｍａｂ  ＣＳＬクローン７（図３３を参照のこと）およびアフィニティー精製されたＩＶＩｇＧ（図３７を参照のこと）は、オリゴマー形態のＡβ１−４０に結合することを示す。特に、モノマー形態（０時間）またはオリゴマー形態（１５時間）のＡβ１−４０，Ｃｙｓのいずれか一方と共に同時インキュベートしたｍａｂ  ＣＳＬクローン７またはアフィニティー精製されたＩＶＩｇＧは、オリゴマー形態の方のペプチドを沈降させた。オリゴマー形態のＡβに対するさらなる結果を、実施例１２Ｄにおいて見出すことができる。
【０３２８】
実施例７．ペプチド合成
市販の材料および公開された文献の手順に従って、酸性条件下で切断可能なポリスチレン−ポリエチレングリコール樹脂およびＲｉｎｋ−アミド−リンカーを含有するＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＲ樹脂上での固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって、ペプチド、ビオチン−Ｇ５−ＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ−ＮＨ２（ビオチン−Ｇ５−Ａβ２０−３０）およびビオチン−Ｇ５−ＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧ−ＮＨ２（ビオチン−Ｇ５−Ａβ２０−３７）を合成した。半自動化Ｅｃｏｎｏｍｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  ＥＰＳ−２２１（ＡＢＩＭＥＤ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、合成  全体をとおして９−フルオレニルメトキシカルボニル／ｔ−ブチル（Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ）化学を使用した。次の側鎖保護アミノ酸誘導体を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ。合成は、次の一般的プロトコルに従って実施した：（ｉ）ＤＭＦ洗浄（３×１分間）、（ｉｉ）ＤＭＦ中２％ＤＢＵ、２％ピペリジンによるＦｍｏｃ脱保護（１５分間）、（ｉｉｉ）ＤＭＦ洗浄（６×１分間）、（ｉｖ）ＤＭＦ中５当量のＦｍｏｃアミノ酸：ＰｙＢＯＰ：ＮＭＭのカップリング（４０〜６０分間）、（ｖ）ＤＭＦ洗浄（３×１分間）。疎水性Ｃ末端部を有するＡβ（２０−３７）の合成では、各アミノ酸のダブルカップリングを用いた。Ｄ−（＋）−ビオチンを使用して、樹脂上でＮ末端のビオチン化を行った。合成の完了後、３時間、室温でＴＦＡ、トリエチルシランおよび脱イオン水混合物（９５：２．５：２．５、Ｖ／Ｖ／Ｖ）を使用して、樹脂からペプチドを切断した。合成ペプチドを、例えば、ＥＬＩＳＡにおいて使用した。
【０３２９】
実施例８．Ａβ（２１−３７）のアミノ酸配列決定
同定された（単離されたＡβエピトープ、Ａβ（４−１０）およびＡβ（２１−３７））か、または使用した（例えば、合成Ａβ（２１−３７））すべてのエピトープの配列決定を、以下の手段によって行った：
ａ）エドマン配列決定；
ＥＳＩ−タンデムＭＳ／ＭＳ−配列決定、および
ｃ）ＦＴＩＣＲ−ＭＳ分析、およびＩＲＭＰＤ−フラグメンテーションによるフラグメンテーション
【０３３０】
自動化されたアミノ酸配列解析を、１４０Ｃ  Ｍｉｃｒｏｇｒａｄｉｅｎｔシステム、７８５Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒおよび６１０Ａ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを装着した  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ４９４  Ｐｒｏｃｉｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒによって実施した。
【０３３１】
使用したすべての溶媒および試薬は、最高の分析用純度のもの（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であった。使用した配列決定方法は、パルスリキッドであった。凍結乾燥したサンプルを、１０μＬの０．１％ＴＦＡに溶解した。できるだけガラス線維フィルターの中心付近への分布を確実にするために、サンプルを２μＬのアリコートに適用し、各適用に続いて、アルゴン流下で乾燥した。
【０３３２】
実施例９．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを、以下の決定のために使用した：
（ａ）ＩＶＩｇＧから分離した抗Ａβ自己抗体混合物における斑特異的抗Ａβ（４−１０）抗体
（ｂ）ヒト血清由来抗Ａβ自己抗体のＡβ（２１−３７）ペプチド、Ａβ（１２−４０）ペプチド、およびＡβ（１−４０）ペプチドへの結合
（ｃ）ＩＶＩｇＧおよび個々のヒト血清（ＡＤ血清および健常な個体血清）から分離した抗Ａβ自己抗体のＡβ（１−４０）ペプチドおよびＡβ（２１−３７）エピトープペプチドへの結合
（ｄ）組み換え的に発現されるＡβ（２１−３７）自己抗体（ＣＳＬクローン７）のＡβ部分配列への結合
【０３３３】
Ａ．Ａβ（４−１０）抗体に対するＥＬＩＳＡ
この実験では、抗体（Ｃｙｓ−Ａβ（１−４０）抗原カラムを使用してＩＶＩｇＧから単離した抗Ａβ抗体）の標準的な希釈を、被覆抗原として使用したビオチン−Ｇ５Ａβ（４−１０）ペプチドの１２系列希釈と組み合わせて、使用した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１５０μＬ／ウェルのストレプトアビジン溶液（ｃ＝ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬ）で、２時間、室温で被覆した。ウェルを、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．５中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０ｖ／ｖ）で４回洗浄した後、１００μＬ／ウェルのビオチン化エピトープペプチド（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．５における５０μＭ〜０．０２４μＭの１２系列希釈）を添加し、そして２時間、室温でインキュベートした。その後、プレートを２００μＬ／ウェルＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、そして非特異的吸着部位を、ＰＢＳ中５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０でブロッキングした（２００μＬ／ウェル、室温で２時間のインキュベーション）。次いで、ＩＶＩｇＧから単離した１００μＬ／ウェルの抗Ａβ自己抗体（ＰＢＳ中５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０において調製した１：１５０希釈）を各ウェルに添加した。以後、プレートを、室温で２時間、インキュベートし、その後、ＰＢＳ−Ｔで６回洗浄した。５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０において５０００倍希釈した１００μＬのペルオキシダーゼヤギ抗ヒトＩｇＧを、各ウェルに添加し、そしてプレートを室温で１時間、インキュベートし、次いで、それらを、ＰＢＳ−Ｔで３回、および０．０５Ｍリン酸ナトリウム−クエン酸緩衝液、ｐＨ＝５で１回、洗浄した。基質緩衝液（リン酸−クエン酸）中ｃ＝１ｍｇ／ｍＬにおけるｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）の１００μＬを、１０ｍＬの基質緩衝液あたり３０％過酸化水素の２μＬを添加した。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｗａｌｌａｃ  １４２０  Ｖｉｃｔｏｒ２ＥＬＩＳＡ  Ｐｌａｔｅ上で測定した。
【０３３４】
Ｂ．間接ＥＬＩＳＡによるヒト血清における抗体決定
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１００μＬ／ウェルのＡβ（１−４０）ペプチド（ｃ＝ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．５中２．５μｇ／ｍＬ）で、２時間、室温で被覆した。以後、プレートを、２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を伴うＰＢＳ）で４回、洗浄し、そしてブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）により２時間、室温でブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄したあと、血清を１：３３．３の初期希釈で添加し、次いで、ブロッキング緩衝液に３倍系列希釈し、そして２時間、室温でインキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで８回洗浄し、そしてブロッキング緩衝液で１：５０００希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧを、プレートに添加し、そして１時間、室温でインキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔで４回、そして０．０５Ｍリン酸ナトリウム−クエン酸緩衝液、ｐＨ＝５で２回、洗浄した。基質緩衝液（リン酸−クエン酸）中ｃ＝１ｍｇ／ｍＬにおけるｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）の１００μＬを、１０ｍＬの基質緩衝液あたり３０％過酸化水素の２μＬを添加した。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｗａｌｌａｃ１４２０Ｖｉｃｔｏｒ２ＥＬＩＳＡ  Ｐｌａｔｅ上で測定した。１μｇ／μｌストック溶液により、キャリブレーションのためのＢＳＡ基準曲線を使用し、市販のタンパク質定量化キットＰｉｅｒｃｅマイクロ−ＢＣＡを使用して、Ａβ抗体の定量を実施した。得られた結果を図８に例示する。示した百分率は、２つの個別のＥＬＩＳＡ決定由来のＩＶＩｇＧにおけるＡβ抗体濃度を例示する。類似の結果が、Ａβ（２１−３７）アフィニティークロマトグラフィーにより得られた。対照的に、Ａβ（４−１０）ペプチドによるアフィニティークロマトグラフィーでは、検出可能な量のＮ末端エピトープ結合するポリペプチドが得られなかった。結果的に、Ａβ（１−４０）で得られた結果は、健常な個体についてＡβ（２１−３７）で得られた結果に均等である。
【０３３５】
Ｃ．ＩＶＩｇＧおよび個々のヒト血清から単離された抗Ａβ自己抗体のＡβ１−４０ペプチドの結合
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１００μＬ／ウェルのＡβ１−４０ペプチド（ｃ＝ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．５中２．５μｇ／ｍＬ）で、２時間、室温で被覆した。以後、プレートを、２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を伴うＰＢＳ）で４回、洗浄し、そしてブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％ＢＳＡ）により２時間、室温でブロッキングした。２００μＬ／ウェルのＰＢＳ−Ｔでプレートを２回洗浄したあと、１００μＬ／ウェルの第一抗体（ＩＶＩｇＧまたは個々のヒト血清から単離されたポリクローナル抗Ａβ自己抗体）（ブロッキング緩衝液において調製した８希釈系列；１：２５０〜１：３２０００の希釈）を添加し、そして２時間、室温でインキュベートした。次いで、プレートを、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、そしてブロッキング緩衝液において２０００倍希釈した第二抗体（ＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ；ｃ＝１μｇ／μＬ）を、添加した（１００μＬ／ウェル；室温で２時間のインキュベーション）。２００μＬ／ウェルのＰＢＳ−Ｔで３回および２００μＬ／ウェルのクエン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ＝５で１回プレートを洗浄した後、基質緩衝液（リン酸−クエン酸）中ｃ＝１ｍｇ／ｍＬにおけるｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）の１００μＬを、１０ｍＬの基質緩衝液あたり３０％過酸化水素の２μＬと共に添加した。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｗａｌｌａｃ  １４２０Ｖｉｃｔｏｒ２ＥＬＩＳＡ  Ｐｌａｔｅ上で測定した。
【０３３６】
Ｄ．組み換え的に発現されるＡβ（２１−３７）自己抗体（ＣＳＬクローン７）のＡβ部分配列への結合
ペプチドビオチン−Ｇ５−Ａβ（１−４０）、ビオチン−Ｇ５−Ａβ（１２−４０）およびビオチン−Ｇ５−Ａβ（４−１０）を、次の間接ＥＬＩＳＡによって、組み換え的に発現されるＡβ（２１−３７）自己抗体（ＣＳＬクローン７）への結合について比較した：９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１５０μＬ／ウェルストレプトアビジン溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中ｃ＝２．５μｇ／ｍＬ）で、２時間、室温で被覆した。２００μＬ／ウェルＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０ｖ／ｖ）をウェルを４回洗浄した後、１００μＬ／ウェルのビオチン化エピトープペプチド  ＰＢＳ、ｐＨ＝７．５中１μＭ）を添加し、そして２時間、室温でインキュベートした。その後、プレートを２００μＬ／ウェルＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、そして非特異的吸着部位を、ＰＢＳ中５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０でブロッキングした（２００μＬ／ウェル、室温で１晩）。次いで、プレートを、ＰＢＳ−Ｔを伴う２００μＬ／ウェルにより１回洗浄した。次いで、ＰＢＳ中５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、１％ＤＭＳＯ）において調製したＣＳＬクローン７の８系列希釈をウェルに添加した。以後、プレートを、室温で２時間、インキュベートし、その後、ＰＢＳ−Ｔで６回洗浄した。５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０において５０００倍希釈した１００μＬのペルオキシダーゼヤギ抗ヒトＩｇＧを各ウェルに添加し、そしてプレートを室温で１時間、インキュベートし、次いで、それらを、２００μＬ／ウェルＰＢＳ−Ｔで３回および０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム−クエン酸緩衝液、ｐＨ＝５で１回洗浄した。基質緩衝液（リン酸−クエン酸）中ｃ＝１ｍｇ／ｍＬにおけるｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）の１００μＬを、１０ｍＬの基質緩衝液あたり３０％過酸化水素の２μＬと共に添加した。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｗａｌｌａｃ１４２０Ｖｉｃｔｏｒ２ＥＬＩＳＡ  Ｐｌａｔｅ上で測定した。アッセイのバックグランドシグナルを、ビオチン化ペプチドを欠くウェルにおいてインキュベートして抗体希釈液で測定した。
【０３３７】
組み換え的に発現される抗Ａβ（２１−３７）自己抗体ＣＳＬクローン７（実施例５を参照のこと）を、ビオチン−Ｇ５−Ａβ（１−４０）、ビオチン−Ｇ５−Ａβ（１２−４０）およびビオチン−Ｇ５−Ａβ（４−１０）を使用して、上記のように評価した。図３９は、ＣＳＬクローン７がＡβ（１−４０）およびＡβ（１２−４０）に結合するが、Ａβ（４−１０）には結合しないことを示す。
【０３３８】
実施例１０．本発明の抗体による線維形成の防止
１ｍｇのＡβ１−４０（ＰＳＬ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を、１００μｌトリフルオロ酢酸（０．１％（ＴＦＡ））を伴うＬｏＢｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に溶解し、そして１時間、室温でインキュベートした。溶液をＰＢＳで１ｍＭ  ＡＢ１−４０に希釈した。１００μｌのＡβ線維形成サンプルに、抗体を１．３μＭの最終濃度で添加した。
【０３３９】
以下の抗体に付いて調べた：
・実施例４に記載のアフィニティー精製されたＩＶＩｇＧ
・組み換え抗体ＣＳＬクローン７（実施例５に記載されている）
・抗体ＡＣＡ（特許文献２８）
・ネガティブコントロールＣＳＬ３６０（バイオセンサまたはＥＬＩＳＡ分析を使用して試験する場合、ＣＳＬ３６０はキメラ抗体であり、そしてＡβ（１−４０）への結合性を示さない）
【０３４０】
インキュベーションを、加熱ブロック上１晩、３７℃で行った。グリシン緩衝液ｐＨ９．２中２．５ｍＭのＴｈｉｏｆｌａｖｉｎ  Ｔ（ＴＨＴ）溶液を調製した。１００μｌのＡβ線維形成サンプルを、ブラック−９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移し、そして５０μＭのＴＨＴを添加した。サンプルの蛍光（励起４５０ｎｍ、蛍光４９０ｎｍ）を、２４時間後、Ｔｅｃａｎ  ＩｎｆｉｎｉＴＥ  Ｍ２００プレートリーダーにより測定した。１つの測定値は、２５フラッシュの平均を表す。
【０３４１】
図４０において示されるように、すべての試験したＡβ抗体は、ネガティブコントロールと比較して、約２０％の線維形成の阻害を示した。
【０３４２】
実施例１１．ＡＤ患者および年齢が一致する健常者コントロール由来の血清のアッセイ結合
Ａ：ドットブロット
ＰＢＳ緩衝液において新たに再懸濁した（サンプル−０時間）か、またはオリゴマー化に供した（サンプル−１５時間）Ａβ１−１５Ｃｙｓ−およびＡβ１−４０Ｃｙｓ−のドットブロット（両方のペプチドともＮ−末端においてシステインを有する）を、ニトロセルロース膜（０．５μｇ／３μｌスポット）上に適用した。
【０３４３】
膜を、Ｒｏｔｉ−Ｂｌｏｃｋ（Ｒｏｔｈ）で１時間、室温でブロッキングし、次いで、健常なヒト個体）由来の１０μｇの第一抗体（６Ｅ１０、Ｂａｍ９０．１、ＩＶＩＧ、ＣＳＬ−７、ＡＣＡ）、ＡＤ−血清（ＡＤ１）および血清（Ｋ４）と共に、２０ｍｌブロッキング試薬（ＲｏｔｉＢｌｏｃｋ）中、１晩、４℃でインキュベートした。第二抗体（抗ヒトＨＲＰ：１：１００，０００；抗マウスＨＲＰ：１：６，０００）とのインキュベーションを、１時間、室温で行った。製造者の指示に従い、化学発光基質として、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｉｅｒｃｅ）を使用した。Ｘ線フィルム上のシグナルを、１０秒間〜５分間、記録した。
【０３４４】
図４１に示されるように、すべてのコントロール抗体は、予想されるエピトープ（６Ｅ１０＝Ａβ（１−１７）、Ｂａｍ９０．１＝Ａβ（１３−２８））に対する特異性を示した。精製された抗体ＣＳＬクローン７、抗Ａβ（２１−３７）自己抗体（実施例４に従って精製された）、ＡＣＡ（実施例５を参照のこと）、但し、ＡＤ血清および健常な個体由来の抗体もまた、Ａβ１−４０オリゴマーに結合する（実施例１５ｈ）。６Ｅ１０およびＡＤ−血清のみが、Ａβ１−１５に結合したが、健常な患者のコントロール血清には結合しなかった。
【０３４５】
また、ＣＳＬクローン７および実施例４に記載のようにＩＶＩｇＧから精製したＡβ（２１−３７）自己抗体は、Ａβ１−４０、０時間）とは対照的に、Ａβ（Ａβ（１−４０）１５時間の凝集した／オリゴマー形態に対する好ましい結合を示した。比較すると、抗体６Ｅ１０、Ｂａｍ９０．１およびＡＣＡは、Ａβの両方の種に対してむしろ均等であるような好ましい結合を示さなかった。
【０３４６】
【表２】
2010515717.tif 000003
【０３４７】
Ｂ：ＥＬＩＳＡ
製造者の指示に従うプロテインＧ（Ｐｉｅｒｃｅ）上での精製後、血清サンプル（ＡＤ１および年齢が一致する健常なヒト個体、上記の実施例１１Ａを参照のこと）由来のＩｇＧを、（実施例１に従って調製した）Ａβ（１−１６）アフィニティーカラム上に充填し、ＰＢＳおよび１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８で洗浄し、そして１００ｍＭグリシンｐＨ２．８で溶出した。
【０３４８】
溶出物を、実施例９Ｄに記載のように、プレート上に被覆されたビオチン−Ｇ５−Ａβ（４−１０）に対し、ＥＬＩＳＡにおいて分析した。
【０３４９】
結果は、年齢が一致する健常なヒト個体由来のコントロールサンプルについて検出されたシグナルと比較して、ＡＤ患者の血清ではより高い力価のＡβ（４−１０）抗体を示した（図４２を参照のこと）。
【０３５０】
結果は、少なくとも、試験した単一のＡＤ１血清について、Ａβ（４−１０）自己抗体は存在するものの、但し、低量であるか、低い親和性であるか、またはこれらの両方の可能性があることを示唆する早期の実験を表す。これらの結果が確認される場合、それら結果は、超高感度のアッセイ手順を日常的に扱うことを可能にすることが、この手順に求められることを示す。
【０３５１】
実施例１２．ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、およびウエスタンブロットにおける組み換え体により発現されるＡβ（２１−３７）自己抗体の結合特徴
【０３５２】
【表３】
2010515717.tif 000004
＋／− ELISAおよびバイオセンサ結合の定性的評価であって、ここで、増加(+)は、ELISAにおいて結合力価の増加を示し、そしてバイオセンサにおいてオフ率またはオン率における改善を示し、これは、抗体が比較的高い親和性を伴うことを示唆する
(−)は、抗体による固定化抗体への結合のいずれも示さない。
Nt  試験しなかったことを示す
【０３５３】
免疫グロブリンを効率的に発現したすべてのトランスフェクタントを、アミロイドβペプチドへの結合に基づくＥＬＩＳＡにおいて試験した。バイオセンサデータを、以下に記載のように、ｃｙｓ−ダイマーペプチドに対する抗体の提要的親和性結合評価に対して格付けする。
【０３５４】
多様に発現され、かつＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅまたはウエスタンブロットにおいて結合性を示す抗体が、本発明の好適な実施形態である。多量に発現しないかまたは以下に記載のアッセイのいずれにおいても非結合性であることは、発現が改善されるか、またはより高感度の検出方法が用いられるかのいずれかである場合、これらの抗体が、必ずしも非機能的であることを意味するものではない。
【０３５５】
Ａ：Ａβペプチドの調製
凍結乾燥した１ｍｇのＡβ（１−４０）ペプチド（Ｓｉｇｍａ）を、２００μｌの１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにアリコートを採取し、そして１晩、凍結乾燥した。アリコート採取したＡβ（１−４０）ペプチドを、１ｍｇ／ｍｌでジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、ＩＣＮ）に再懸濁し、そして４℃で貯蔵した。この材料を、Ａβ１−４０モノマーと称する。
【０３５６】
Ａβ（１−４０）ペプチドをオリゴマー化するために、Ａβ（１−４０）モノマーを、１×ＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸、２．７ｍＭのＫＣｌ）で０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして３〜６日間、３７℃でインキュベートし、次いで、４℃で貯蔵したが、この材料をＡβ（１−４０）オリゴマーと称する。
【０３５７】
Ｎ末端システイン残基を伴うＡβ（１−４０）ペプチド（Ａβ（１−４０Ｃｙｓ））を、凍結乾燥状態からｄｄＨ２Ｏに、５．９ｍｇ／ｍｌで再懸濁し、そして−８０℃で貯蔵した。次いで、Ａβ（１−４０Ｃｙｓ）ペプチドを、１×ＰＢＳにおいて０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして４℃で貯蔵したが、この材料をＡβ（１−４０Ｃｙｓ）オリゴマーと称する。
【０３５８】
Ｂ：抗βアミロイド抗体ＥＬＩＳＡプロトコル
Ａβ（１−４０）モノマー、Ａβ（１−４０）オリゴマー、Ａβ（１−４０Ｃｙｓ）オリゴマー、およびウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）またはアプロチニン（Ｓｉｇｍａ）を使用するコントロールプレートを、ＰＢＳ（１ウェルあたり５０μｌ）中１μｇ／ｍｌで、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６−ウェルプレート上に、１晩、４℃で固定化した。ウェルを、３５０μｌ洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ））で１回洗浄した。次いで、ウェルをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）Ｄｉｆｃｏ  Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ（ＢＤ）、１ウェルあたり５０〜１５０μｌ）で、２時間、室温でブロッキングし、そして３５０μｌ洗浄緩衝液で１回洗浄した。
【０３５９】
第一抗体を、Ｖ−底ウェル９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）において、抗体緩衝液（ＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ））中１００μｇ／ｍｌの濃度から開始して、１：２系列希釈を行った。
【０３６０】
コントロール抗体（例えば、６Ｅ１０  ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ）およびＡＣＡ）を、１μｇ／ｍｌの開始濃度で分析した。１００μｌの第一抗体を、系列希釈でＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂプレートに移し、そして２〜３時間、室温でインキュベートした。ウェルを、３５０μｌ洗浄緩衝液で迅速に３回洗浄した。
【０３６１】
第二抗体、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰおよびヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を、抗体緩衝液（１ウェルあたり５０μｌ）において１：１０００で添加し、そして３０分間、室温でインキュベートした。
【０３６２】
次いで、ウェルを３５０μｌ洗浄緩衝液で３回洗浄し、そしてプレートを、ＴＭＢ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）（１ウェルあたり５０μｌ）で５分間、展開した。反応を、２Ｍリン酸（１ウェルあたり２５μｌ）で停止し、そしてプレートを、４５０ｎｍで、０．１秒間、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２プレートリーダーにおいて読み取った。
【０３６３】
Ｃ：組み換え的に発現されるＡβ（２１−３７）自己抗体とのＡβ（１−４０）相互作用のバイオセンサ分析
ペプチドサンプルの調製：
捕捉されたモノクローナル抗体に対する分析のためのペプチドの調製は、上記の「ペプチドのＡβ製剤」に記載のとおりである。
【０３６４】
バイオセンサ免疫グロブリン捕捉表面の調製：
抗ヒト免疫グロブリンバイオセンサチップを、製造者の指示に従い、５μｌ／分の流速、ＮＨＳ／ＥＣＤ固定化中６分間の接触時間でヒト抗体捕捉キット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、調製した。約１００００レゾナンスユニットをすべてのチャンネルに対して達成した。
【０３６５】
捕捉条件：
すべての抗体を、２０μｌ／分の流速で、２分間、補足した（０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水中２５μｇ／ｍｌ）。すべての実験において、フローセル１は、ヒトＩｇＧ１コントロール抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用する基底の差し引かれるコントロールチャンネルとしての役割を果たした。
【０３６６】
残りの３つのチャンネルを使用して、コントロール抗体（ＡＣＡ）またはヒトモノクローナル抗体のいずれかを捕捉して、ペプチド結合について試験した。次いで、捕捉された抗体に対するペプチド結合（６０μｌ）を、３０μｌ／分の流速で、同時にすべてのチャンネルにわたって分析し、そして指示に従い、５μｌ注入の３ＭのＭｇＣｌ２を使用する、センサ表面からの脱着の前に、３００〜６００秒間、解離させた。バイオセンサ２０００（ＧＥ，Ｓｗｅｄｅｎ）を装着したＭｕｌｔｉｔｅｍｐ（ＧＥ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、１２’Ｃでの分析の前に、すべてのサンプルを冷却した。第２のコントロール実験をすべてのモノクローナル抗体について実施し、ここで、固定化された捕捉抗体からのヒトモノクローナル抗体の解離を考慮して、抗体捕捉後、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水の６０μｌ注入を直接注入した。この結果を、ＢＩＡ評価ソフトウェ（ＧＥ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するペプチドを使用して作成したデータから手動で差し引いた。
【０３６７】
すべての実験において、Ａβ（１−４０Ｃｙｓ）オリゴマーを、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水中２０〜５０μｇ／ｍｌで分析した。Ａβ（１−４０）モノマーを、分析の前に、１００％ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌストックから０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水中１０μｇ／ｍｌまで希釈した。
【０３６８】
図４３〜４５は、この分析において得られる結果を示す。ＡＣＡコントロール抗体は、Ａβ（１−４０）モノマーおよびＡβ（１−４０Ｃｙｓ）オリゴマーの両方に均等な結合を示す一方、本発明のほとんどの抗体は、Ａβ（１−４０Ｃｙｓ）オリゴマーへの好ましい結合を示す。
【０３６９】
Ｄ：抗βアミロイド抗体トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットプロトコル
Ｎｏｖｅｘ  Ｐｒｅ−ｃａｓｔ１０−２０％トリシンゲル１０−ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、２０μｌ中１ウェルあたり０．５μｇペプチド（０．５μｇ／２０μｌ＝２５μｇ／ｍｌ）で充填した。
【０３７０】
分子量マーカーの調製：２０μｌの２×トリシンサンプル緩衝液−非還元性（ＴＳＢ−ＮＲ）（３００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４５、２４％グリセロール、８％ＳＤＳ、０．００５％クマシーブルーＧ、０．００５％フェノールレッド）を、２０μｌのＰｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄマーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に添加し、そして１ウェルあたり２０μｌを使用した。
【０３７１】
サンプルの調製：
１００μｌ  １×ＴＳＢ−ＮＲ充填サンプルを、以下のように調製した。
【０３７２】
【表４】
2010515717.tif 000005
【０３７３】
各ゲルを、各試験抗体（ａｎｔｉｖｏｄｙ）が、分子量マーカーレーンとブランクの緩衝液レーンとの間に挟まれるように、下記のとおりに１０−レーンのフォーマットを設定した。分子量の位置を、簡便な形でマークで示している。
【０３７４】
１）Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄマーカー
２）Ａβ１−４０モノマー
３）Ａβ１−４０オリゴマー
４）Ａβ１−４０Ｃｙｓオリゴマー
５）１×ＴＳＢ−ＮＲ
６）Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄマーカー
７）Ａβ１−４０モノマー
８）Ａβ１−４０オリゴマー
９）Ａβ１−４０Ｃｙｓオリゴマー
１０）１×ＴＳＢ−ＮＲ
【０３７５】
さらなるゲルを、上記のように稼動させ、そしてクマシーおよびディープパープルでタンパク質を染色した。より低感度のクマシーは、ペプチドは、レーン２および３において本質的にモノマーであり、そしてレーン４（または図４７および４８において１、２および３で標識されているそれぞれレーン７、８および９）ではダイマーであることを示している。より高感度のデープパープルは、ｍａｂｓ  ６Ｅ１０およびＡＣＡに対する染色パターンと一致する各レーンにおけるオリゴマーのラダーを表す。
【０３７６】
トリシンゲルを、トリシンＳＤＳランニング緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ  Ｂａｓｅ、０．１Ｍトリシン、０．１％ＳＤＳ）を含有する内部および外部緩衝液チャンバを伴うＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において稼動させた。電気泳動分離を、９０分間、１２５Ｖを提供することによって、完了させた。
【０３７７】
次いで、ゲルを、ＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＸＣｅｌｌ  ＩＩ  Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐａｐｅｒ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、ニトロセルロースに移した。内部ＸＣｅｌｌ  ＩＩ  Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅチャンバに、冷却した１×Ｔｒｉｓ−グリシントランスファー緩衝液（１２ｍＭのＴｒｉｓ  Ｂａｓｅ、９６ｍＭグリシン、２０％メタノール））を満たし、そして外部チャンバに冷却した蒸留水を満たした。
【０３７８】
１．５時間、２５Ｖを適用することによってトランスファーを達成し、そしてその後、ニトロセルロース膜を、１晩、５０ｍｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）Ｄｉｆｃｏ  Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ（ＢＤ））において、４℃でブロッキングした。
【０３７９】
第一抗体、コントロール抗体６Ｅ１０およびＡＣＡを、０．５μｇ／ｍｌで膜に添加し、そして組み換えＡβ（２１−３７）抗体を、ＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ））の１０ｍｌにおいて、１０〜２０μｇ／ｍｌで、添加し、そして２〜３時間、振盪しながらインキュベートした。膜を、５０ｍｌ洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ））で１０分間、３回、洗浄した。第二抗体、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰおよびヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を、（上記の）１０ｍｌ緩衝液において０．５μｇ／ｍｌで添加し、そして膜と共に振盪しながら３０分間、インキュベートした。
【０３８０】
膜を、５０ｍｌ洗浄緩衝液で３回、１０分間洗浄し、その後、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で展開させた（図４７を参照のこと）。
【０３８１】
シグナルが上記のプロトコルを使用する検出閾値より低かった場合、膜を洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ  Ｃｌｏｎｅ８ｃ／６−３９，１：２０００）で３０〜６分間、室温でさらにプロービングした。次いで、膜を上記のように洗浄した。次いで、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（１：４０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を３０分間添加し、そして膜を再度洗浄した。このさらなる工程は、シグナルを増幅し、そして上記のようにＥＣＬ基質を使用する検出をもたらした。
【０３８２】
ウエスタンブロット分析においてプロービングしたような均等なゲルは、ニトロセルロースには移さなかった。２分の１を、製造者（Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従って、クマシーブルーで染色し、そして残りの半分を、製造者（ＧＥ，Ｓｗｅｄｅｎ）の指示に従ってディープパープル高感度タンパク質染色に供した。
【０３８３】
実施例１３  斑の沈着（Ｔａｃｏｎｉｃ製マウス）
トランスフェニックＡＰＰマウスの抗体処置
１０箇月齢のＡＰＰトランスジェニックマウス（Ｔｇ２５７６）に、１週間に１回、２００μｇ（８ｇ／ｋｇ）抗体を含有する２００μｌの腹腔内注入を、８週間、投与した。１匹の動物に、ＩＶＩｇＧ由来のアフィニティー精製されたＡβ自己抗体を投与し、２匹の動物に、Ａβ（ＣＳＬクローン７）に対するマウス化モノクローナル抗体を投与し、そして２匹のマウスに、ネガティブなキメラモノクローナルコントロール抗体（ＣＳＬ３６０）を投与した。実験期間の終了時に、断頭により動物を屠殺した。脳を解剖し、そして正中線に沿って半球を分離した。１つの半球を、４％緩衝化ホルムアルデヒドで２４時間、固定し、続いて、脱水およびパラフィン包埋を行った。他の半球を、液体窒素で直ちにスナップ凍結し、そして−８０℃で保持した。
【０３８４】
斑の評価
材料：
Ｍｅｎｔｚｅｌ  Ｇｌａｓ製顕微鏡スライド上に装架され、そして６Ｆ３Ｄ−抗体で免疫染色された３μｍ厚スライスのマウス脳組織（プロトコル：免疫組織化学を参照のこと）。
【０３８５】
透過光顕微鏡：Ｐｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物２倍〜４０倍の倍率を含有するＥｃｌｉｐｓｅ８０ｉ；Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｎｉｋｏｎ  ＧｍｂＨ，Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ
【０３８６】
画像化ソフトウェア：ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＢＲソフトウェアバージョン２．３、Ｎｉｋｏｎ；Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｎｉｋｏｎ  ＧｍｂＨ，Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ
【０３８７】
デジタルカメラ（Ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｉｇｈｔ）：２Ｍｅｇａｐｉｘｅｌデジタルカメラ、Ｎｉｋｏｎ（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｎｉｋｏｎ  ＧｍｂＨ，Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０３８８】
エクセルソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ２００３，Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．Ｒｅｄｍｏｎｔ，ＵＳＡ．）
【０３８９】
方法：
上記のカメラを４０倍の倍率で使用して、デジタルＲＧＢ−画像を撮影した。強度、例えば、管（「中央に孔を伴う対象」）を含まない最小および最大直径の閾値を定義するすべての工程を記録して、すべての分析に対して等しいパラメータを確実にすることによって、マクロを作成した。測定フレームを適用することによって、目的の面積を定義した。この面積内で、上記の基準を使用して、マクロによって提供されるスキームに適合する「対象」（ピクセルのクラスター）を同定した。バックグランド減算のためのソフトウェアによって、バイナリー画像（ｂｉｎａｒｙ  ｐｉｃｔｕｒｅ）を作成した。１箇所あたり５つの独立したフィールドを分析した（皮質および海馬での形成を個別に評価した）。５つの解析のデータをソフトウェアによってまとめ、そして１つの測定された面積あたりの斑の数、百分率での斑面積と測定された面積との比率のような小規模の統計解析を提供した。すべての対象の詳細なデータをさらなる解析のために伝達した。
【０３９０】
【表５】
2010515717.tif 000006
【０３９１】
「面積画分」は、それが、測定された面積（全面積）からの斑面積（マークした面積）の百分率に等しい場合、特に重要である。
【０３９２】
測定された特徴：
面積
面積は、主要なサイズ基準である。非校正系では、それは、ピクセルの数を表現する；校正系では、それは、真の面積（μｍ２で示される）。
【０３９３】
面積画分
面積画分は、セグメント化画像の面積と測定された面積（選択されたフィールドを覆う平方単位：として定義される）との比。
面積画分＝面積／測定された面積
【０３９４】
真円度
真円度は、円の場合にのみ「１」に等しい；他のすべての形状は、「１」より小さな真円度値によって特徴付けられる。それは、面積および周長から計算される誘導された形状の測定値である。この特徴は、形状の特質を調べるのに有用である。
真円度＝４＊π＊面積／周長２
【０３９５】
Ｅｑ直径
均等な直径（Ｅｑ直径）は、面積から誘導されるサイズの特徴である。それは、測定された対象と同じ面積を伴う円の直径を決定する：
Ｅｑ直径＝√（４＊面積／π）
【０３９６】
面積あたりの対象
選択されたフィールドを覆う１平方単位あたりの対象の数（測定された面積）、
【０３９７】
周長
周長は、全境界線の測定値である。それは、外部および内部の境界の両方を含む（対象の内部に孔が存在する場合）。パラメータは、Ｃｒｏｆｔｏｎの式を使用して、０、４５、９０および１３５度の方向における４つの投影から計算される。
周長＝π＊（Ｐｒ０＋Ｐｒ４５＋Ｐｒ９０＋Ｐｒ１３５）／４
【０３９８】
幅
幅は、長形または薄い構造に適切な誘導される特徴である。それは、棒モデルに基づき、そして以下から計算される：
幅＝面積／長さ
【０３９９】
実施例１４：本発明の抗体が血管染色を示さない証拠。
方法：
Ｍｉｃｒｏｍ（ＭＩＣＲＯＭ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＧｍｂＨ，Ｗａｌｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＨＭ３５５Ｓ回転式ミクロトームを使用して、アルツハイマー病および脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）を患う患者の検死脳材料から３μｍのパラフィンスライスを切り出し、そしてＭｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｅｓｅｒ（Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｅｓｅｒ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド上に装架した。他で述べない限り、すべてのプロトコル固定は、室温で実施した。
【０４００】
次のプロトコルに従って、脱パラフィンを実施した：キシレン（４回交換）、９６％エタノール（３回交換）、７０％エタノール（３回交換）、続いて、脱イオン水の２回交換。各工程を３分間、実施した。
【０４０１】
抗原賦活化の前処置として、スライドをＰＢＳ中７０％（ｖ／ｖ）ギ酸において、２０分間、インキュベートし、脱イオン水で置き換え、そして洗浄工程としてＰＢＳの２回交換を行った。メタノール中１％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を使用して、３０分間、内因性ペルオキシダーゼを阻止した。非特異的染色を防止するために、スライドを、それぞれ、希釈したヤギ血清（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ  の指示に従う）と共に３０分間、または希釈したマウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｍ．Ｏ．Ｍ．−Ｋｉｔの指示に従う）とともに１時間、インキュベートした。ブロッキング溶液を取り出し、洗浄工程を使用した。
【０４０２】
ブロッキング工程後、一次抗体を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ希釈液における１：１００またはＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｍ．Ｏ．Ｍ．−Ｋｉｔ希釈液における１：５０（６Ｆ３Ｄ、製造者の指示に従う）の希釈でスライドに適用した。何ら抗体または検出系を伴わない１つのスライド、第一抗体を伴わないが、それぞれ、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ＫｉｔまたはＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｍ．Ｏ．Ｍ．−Ｋｉｔ第二系を伴う２つのスライド、およびそれぞれ、クローン５３／６０組み換え体ヒト抗β−アミロイド免疫グロブリンまたは６Ｆ３Ｄ抗体を伴い、そして何ら検出系を伴わない２つのスライドからなるネガティブコントロールも共に用いた。
【０４０３】
スライドを、第一抗体と共に、１晩（１８時間）、４℃で、湿潤チャンバにおいて、インキュベートした。翌日、スライドをＰＢＳで２分間、２回洗浄した。その後、スライドを、３０分間、ビオチン化抗マウス抗体（６Ｆ３Ｄ抗体）またはビオチン化抗ヒト抗体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ＫｉｔもしくはＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｍ．Ｏ．Ｍ．−Ｋｉｔの指示に従って希釈した）と共にインキュベートした。スライドをＰＢＳで２分間、２回洗浄した。続いて、スライドを、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ＫｉｔおよびＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｍ．Ｏ．Ｍ．−Ｋｉｔの指示に従って、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ試薬と共に３０分間、インキュベートした。この工程に続いて、２分間のＰＢＳによる２回の洗浄工程を行った。その後、（製造者の指示に従って）ＤＡＢ試薬を、色原体として５分間適用した。脱イオン水における５分間の洗浄工程によって、この反応を停止した。Ｍａｙｅｒ’ｓ  ａｃｉｄヘマローン溶液に１０秒間漬けた後、続いて、対比染色として役立つ流水（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｔａｐ−ｗａｔｅｒ）における５分間の青み付けを行った。スライドを、７０％（ｖ／ｖ）エタノール（３回）、９６％エタノール（３回）、イソプロパノール（１回）、キシレン（４回）の順にそれぞれ３０秒間供することによって、脱水を実施した。スライドを空気乾燥し、そしてＭｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｓ製のＲｏｔｉＨｉｓｔｏｋｉｔ（登録商標）およびカバーガラスを装架した。Ｎｉｋｏｎ  ｄｉｇｉｔａｌｓｉｇｈｔ２  ＭｅｇａｐｉｘｅｌカメラおよびＮｉｋｏｎ  ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＢＲバージョン２．３ソフトウェアを伴うＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ８０ｉ顕微鏡を使用して、画像を撮影した。
【０４０４】
図４８ａ〜４８ｆに示す結果は、アフィニティー精製された自己抗体（実施例４におけるように精製した）またはｍａｂ  ＣＳＬクローン７（実施例５を参照のこと）のいずれも、血管壁の染色を示さないが、一方、抗Ａβ抗体ＡＣＡ（実施例５を参照のこと）は、ポジティブコントロールとして使用した抗体６Ｆ３Ｄと比較して、血管壁の染色を示すことを実証する。そのような結果は、本発明の抗体が、Ａβが沈着した脳血管に結合するＡβ抗体によって引き起こされると考えられる有害事象を誘発しないことを示唆する（非特許文献３４、非特許文献３５）。
【図１】
2010515717.tif 000007
【図２】
2010515717.tif 000008
【図３】
2010515717.tif 000009
【図４】
2010515717.tif 000010
【図５】
2010515717.tif 000011
【図６】
2010515717.tif 000012
【図７】
2010515717.tif 000013
【図８】
2010515717.tif 000014
【図９】
2010515717.tif 000015
【図１０】
2010515717.tif 000016
【図１１】
2010515717.tif 000017
【図１２】
2010515717.tif 000018
【図１３】
2010515717.tif 000019
【図１４】
2010515717.tif 000020
【図１５】
2010515717.tif 000021
【図１６】
2010515717.tif 000022
【図１７】
2010515717.tif 000023
【図１８ａ】
2010515717.tif 000024
【図１８ｂ】
2010515717.tif 000025
【図１８ｃ】
2010515717.tif 000026
【図１８ｄ】
2010515717.tif 000027
【図１９ａ】
2010515717.tif 000028
【図１９ｂ】
2010515717.tif 000029
【図１９ｃ】
2010515717.tif 000030
【図２０ａ】
2010515717.tif 000031
【図２０ｂ】
2010515717.tif 000032
【図２１ａ】
2010515717.tif 000033
【図２１ｂ】
2010515717.tif 000034
【図２１ｃ】
2010515717.tif 000035
【図２２ａ】
2010515717.tif 000036
【図２２ｂ】
2010515717.tif 000037
【図２２ｃ】
2010515717.tif 000038
【図２３ａ】
2010515717.tif 000039
【図２３ｂ】
2010515717.tif 000040
【図２３ｃ】
2010515717.tif 000041
【図２４ａ】
2010515717.tif 000042
【図２４ｂ】
2010515717.tif 000043
【図２４ｃ】
2010515717.tif 000044
【図２４ｄ】
2010515717.tif 000045
【図２４ｅ】
2010515717.tif 000046
【図２４ｆ】
2010515717.tif 000047
【図２４ｇ】
2010515717.tif 000048
【図２４ｈ】
2010515717.tif 000049
【図２４ｉ】
2010515717.tif 000050
【図２４ｊ】
2010515717.tif 000051
【図２４ｋ】
2010515717.tif 000052
【図２４ｌ】
2010515717.tif 000053
【図２４ｍ】
2010515717.tif 000054
【図２４ｎ】
2010515717.tif 000055
【図２４ｏ】
2010515717.tif 000056
【図２４ｐ】
2010515717.tif 000057
【図２４ｑ】
2010515717.tif 000058
【図２５ａ】
2010515717.tif 000059
【図２５ｂ】
2010515717.tif 000060
【図２５ｃ】
2010515717.tif 000061
【図２５ｄ】
2010515717.tif 000062
【図２５ｅ】
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【図２５ｆ】
2010515717.tif 000064
【図２５ｇ】
2010515717.tif 000065
【図２５ｈ】
2010515717.tif 000066
【図２５ｉ】
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【図２５ｊ】
2010515717.tif 000068
【図２５ｋ】
2010515717.tif 000069
【図２５ｌ】
2010515717.tif 000070
【図２６ａ】
2010515717.tif 000071
【図２６ｂ】
2010515717.tif 000072
【図２６ｃ】
2010515717.tif 000073
【図２６ｄ】
2010515717.tif 000074
【図２６ｅ】
2010515717.tif 000075
【図２６ｆ】
2010515717.tif 000076
【図２６ｇ】
2010515717.tif 000077
【図２６ｈ】
2010515717.tif 000078
【図２６ｉ】
2010515717.tif 000079
【図２６ｊ】
2010515717.tif 000080
【図２６ｋ】
2010515717.tif 000081
【図２６ｌ】
2010515717.tif 000082
【図２６ｍ】
2010515717.tif 000083
【図２６ｎ】
2010515717.tif 000084
【図２６ｏ】
2010515717.tif 000085
【図２６ｐ】
2010515717.tif 000086
【図２６ｑ】
2010515717.tif 000087
【図２７ａ】
2010515717.tif 000088
【図２７ｂ】
2010515717.tif 000089
【図２７ｃ】
2010515717.tif 000090
【図２８ａ】
2010515717.tif 000091
【図２８ｂ】
2010515717.tif 000092
【図２８ｃ】
2010515717.tif 000093
【図２９ａ】
2010515717.tif 000094
【図２９ｂ】
2010515717.tif 000095
【図２９ｃ】
2010515717.tif 000096
【図２９ｄ】
2010515717.tif 000097
【図２９ｅ】
2010515717.tif 000098
【図２９ｆ】
2010515717.tif 000099
【図２９ｇ】
2010515717.tif 000100
【図２９ｈ】
2010515717.tif 000101
【図２９ｉ】
2010515717.tif 000102
【図２９ｊ】
2010515717.tif 000103
【図２９ｋ】
2010515717.tif 000104
【図２９ｌ】
2010515717.tif 000105
【図２９ｍ】
2010515717.tif 000106
【図２９ｎ】
2010515717.tif 000107
【図２９ｏ】
2010515717.tif 000108
【図２９ｐ】
2010515717.tif 000109
【図３０−１】
2010515717.tif 000110
【図３０−２】
2010515717.tif 000111
【図３０−３】
2010515717.tif 000112
【図３０−４】
2010515717.tif 000113
【図３０−５】
2010515717.tif 000114
【図３０−６】
2010515717.tif 000115
【図３０−７】
2010515717.tif 000116
【図３０−８】
2010515717.tif 000117
【図３０−９】
2010515717.tif 000118
【図３０−１０】
2010515717.tif 000119
【図３０−１１】
2010515717.tif 000120
【図３０−１２】
2010515717.tif 000121
【図３０−１３】
2010515717.tif 000122
【図３０−１４】
2010515717.tif 000123
【図３０−１５】
2010515717.tif 000124
【図３０−１６】
2010515717.tif 000125
【図３０−１７】
2010515717.tif 000126
【図３０−１８】
2010515717.tif 000127
【図３０−１９】
2010515717.tif 000128
【図３０−２０】
2010515717.tif 000129
【図３０−２１】
2010515717.tif 000130
【図３０−２２】
2010515717.tif 000131
【図３０−２３】
2010515717.tif 000132
【図３０−２４】
2010515717.tif 000133
【図３０−２５】
2010515717.tif 000134
【図３０−２６】
2010515717.tif 000135
【図３０−２７】
2010515717.tif 000136
【図３０−２８】
2010515717.tif 000137
【図３０−２９】
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【図３０−３０】
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【図３０−３１】
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【図３０−３２】
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【図３０−３３】
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【図３０−３４】
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【図３０−３５】
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【図３０−３６】
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【図３０−３７】
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【図３０−３８】
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【図３０−３９】
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【図３０−４０】
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【図３０−４１】
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【図３０−４２】
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【図３０−４３】
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【図３０−４４】
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【図３１】
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【図３２ａ】
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【図３２ｂ】
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【図３３】
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【図３４ａ】
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【図３４ｂ】
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【図３４ｃ】
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【図３４ｄ】
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【図３４ｅ】
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【図３４ｆ】
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【図３４ｇ】
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【図３４ｈ】
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【図３４ｉ】
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【図３４ｊ】
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【図３４ｋ】
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【図３４ｌ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８ａ】
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【図４８ｂ】
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【図４８ｃ】
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【図４８ｄ】
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【図４８ｅ】
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【図４８ｆ】
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【図４９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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