(57)【要約】  本発明は、光合成生物が生成物を生成するための組成物および方法を提供する。その光合成生物は、生成物の生成、分泌またはその両方をもたらすために遺伝的に改変される。それらの方法および組成物は、特に、石油化学産業において有用である。【選択図】図１
2010538616.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）２つのホスフェートを用いてイソプレノイドを生成する酵素をコードする核酸、および（ｂ）非維管束光合成生物の葉緑体内で前記核酸を発現させるために構成されたプロモーターを含み、ベクターが葉緑体のゲノム全体を含まない、単離されたベクター。
【請求項２】
２つのホスフェートを有する前記イソプレノイドが、ＧＰＰ、ＩＰＰ、ＦＰＰ、ＧＧＰＰまたはＤＭＡＰＰである、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
葉緑体ゲノムへの前記ベクターの挿入が、前記葉緑体の光合成能力を破壊しない、請求項１記載のベクター。
【請求項４】
葉緑体ゲノムによる相同組換えを促進する核酸配列をさらに含む、請求項１記載のベクター。
【請求項５】
２つのホスフェートを用いて前記イソプレノイドを改変する第２の酵素をコードする核酸をさらに含む、請求項１記載のベクター。
【請求項６】
前記第２の酵素が、ボトリオコッセンシンターゼ、リモネンシンターゼ、シネオールシンターゼ、ピネンシンターゼ、カンフェンシンターゼ、サビネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼ、タキサジエンシンターゼ、ビサボレンシンターゼ、ジアポフィトエンデサチュラーゼ、ジアポフィトエンシンターゼ、モノテルペンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、ジンギベレンシンターゼ、オシメンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、クルクメンシンターゼ、ファルネセンシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼ、β−カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンＡシンターゼ、８−エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、（＋）−δ−カジネンシンターゼ、ゲルマクレンＣシンターゼ、（Ｅ）−β−ファルネセンシンターゼ、カスベンシンターゼ、ベチスピラジエンシンターゼ、５−エピ−アリストロケンシンターゼ、アリストロケンシンターゼ、α−フムレン、（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセンシンターゼ、（−）−β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、（＋）−ボルニル二リン酸シンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、（Ｅ）−γ−ビサボレンシンターゼ、コパリルピロリン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、ロンギホレンシンターゼ、γ−フムレンシンターゼ、δ−セリネンシンターゼ、β−フェランドレンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、（＋）−３−カレンシンターゼ、ｓｙｎ−コパリル二リン酸シンターゼ、α−テルピネオールシンターゼ、ｓｙｎ−ピマラ−７，１５−ジエンシンターゼ、ｅｎｔ−サンダラコピマラジエンシンターゼ、ステルネル−１３−エンシンターゼ、Ｅ−β−オシメン、Ｓ−リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、ガンマ−テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、Ｅ−β−オシメンシンターゼ、ｅｐｉ−セドロールシンターゼ、α−ジンギベレンシンターゼ、グアイアジエンシンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、ｃｉｓ−ムウロラジエンシンターゼ、アフィジコラン−１６ｂ−オールシンターゼ、エリザベスアトリエンシンターゼ、サンダロールシンターゼ、パチョウロールシンターゼ、ジンザノールシンターゼ、セドロールシンターゼ、スカレオールシンターゼ、コパロールシンターゼまたはマノオールシンターゼである、請求項５記載のベクター。
【請求項７】
前記ベクターが、選択マーカーをさらに含む、請求項１記載のベクター。
【請求項８】
前記酵素をコードする前記核酸が、前記葉緑体に対してコドンバイアスがかけられている、請求項１記載のベクター。
【請求項９】
前記葉緑体が、微細藻類由来である、請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
前記微細藻類が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである、請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
表５中の配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列のいずれかを含む、請求項１記載のベクター。
【請求項１２】
（ａ）２つのホスフェートを用いてイソプレノイドを生成する酵素をコードする核酸、および（ｂ）前記酵素を葉緑体に標的化するための葉緑体標的分子をコードする核酸を含む、単離されたベクター。
【請求項１３】
選択マーカー、葉緑体ゲノムによる相同組換えを促進する核酸配列、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１２記載のベクター。
【請求項１４】
２つのホスフェートを有する前記イソプレノイドが、ＧＰＰ、ＩＰＰ、ＦＰＰ、ＧＧＰＰまたはＤＭＡＰＰである、請求項１２記載のベクター。
【請求項１５】
核ゲノムによる相同組換えを促進する核酸配列をさらに含む、請求項１２記載のベクター。
【請求項１６】
２つのホスフェートを用いて前記イソプレノイドを改変する第２の酵素をコードする核酸および前記第２の酵素を葉緑体に標的化するための葉緑体標的分子をコードする核酸をさらに含む、請求項１２記載のベクター。
【請求項１７】
前記第２の酵素は、ボトリオコッセンシンターゼ、リモネンシンターゼ、シネオールシンターゼ、ピネンシンターゼ、カンフェンシンターゼ、サビネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼ、タキサジエンシンターゼ、ビサボレンシンターゼ、ジアポフィトエンデサチュラーゼ、ジアポフィトエンシンターゼ、モノテルペンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、ジンギベレンシンターゼ、オシメンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、クルクメンシンターゼ、ファルネセンシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼ、β−カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンＡシンターゼ、８−エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、（＋）−δ−カジネンシンターゼ、ゲルマクレンＣシンターゼ、（Ｅ）−β−ファルネセンシンターゼ、カスベンシンターゼ、ベチスピラジエンシンターゼ、５−エピ−アリストロケンシンターゼ、アリストロケンシンターゼ、α−フムレン、（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセンシンターゼ、（−）−β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、（＋）−ボルニル二リン酸シンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、（Ｅ）−γ−ビサボレンシンターゼ、コパリルピロリン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、ロンギホレンシンターゼ、γ−フムレンシンターゼ、δ−セリネンシンターゼ、β−フェランドレンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、（＋）−３−カレンシンターゼ、ｓｙｎ−コパリル二リン酸シンターゼ、α−テルピネオールシンターゼ、ｓｙｎ−ピマラ−７，１５−ジエンシンターゼ、ｅｎｔ−サンダラコピマラジエンシンターゼ、ステルネル−１３−エンシンターゼ、Ｅ−β−オシメン、Ｓ−リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、ガンマ−テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、Ｅ−β−オシメンシンターゼ、ｅｐｉ−セドロールシンターゼ、α−ジンギベレンシンターゼ、グアイアジエンシンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、ｃｉｓ−ムウロラジエンシンターゼ、アフィジコラン−１６ｂ−オールシンターゼ、エリザベスアトリエンシンターゼ、サンダロールシンターゼ、パチョウロールシンターゼ、ジンザノールシンターゼ、セドロールシンターゼ、スカレオールシンターゼ、コパロールシンターゼまたはマノオールシンターゼである、請求項１６記載のベクター。
【請求項１８】
前記酵素をコードする前記核酸が、前記生物に対してコドンバイアスがかけられている、請求項１２記載のベクター。
【請求項１９】
前記生物が、微細藻類である、請求項１２記載のベクター。
【請求項２０】
前記微細藻類が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである、請求項１９記載のベクター。
【請求項２１】
表５中の配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列のいずれかを含む、請求項１２記載のベクター。
【請求項２２】
（ａ）ベクターであって、（ａ）２つのホスフェートを用いてイソプレノイドを生成する酵素をコードする核酸、および（ｂ）非維束光合成生物の葉緑体内で前記核酸を発現させるために構成されたプロモーターを含み、前記ベクターが葉緑体のゲノム全体を含まない、ベクター、または
（ｂ）ベクターであって、（ａ）２つのホスフェートを用いてイソプレノイドを生成する酵素をコードする核酸、および（ｂ）前記酵素を葉緑体に標的化するための葉緑体標的分子をコードする核酸を含む、ベクター、
を含む宿主細胞。
【請求項２３】
前記宿主細胞が、前記核酸について同質細胞質である、請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記細胞が、藍色植物門（ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、原核緑色植物門（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、黄金色植物門（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、渦鞭毛植物門（ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、プリムネシウム植物門（ｐｙｒｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ）、珪藻植物門（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、黄緑色植物門（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）、ユースティグマトフィータ（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）、ラフィド藻門（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）または植物プランクトンからなる群より選択される、請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記宿主細胞が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである、請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２６】
クロロフィルレベルが、形質転換後に前記宿主細胞が光独立栄養であるのに十分である、請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記宿主細胞が、少なくとも１つの天然に存在するイソプレノイドを同じ生物の野生型株よりも高いレベルで生成する、請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２８】
少なくとも２コピーの表５のヌクレオチド配列、またはそれらの配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、宿主細胞。
【請求項２９】
前記宿主細胞が、非維管束光合成生物である、請求項２８記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記宿主細胞が、前記ヌクレオチド配列について同質細胞質である、請求項２８記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記宿主細胞が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである、請求項２８記載の宿主細胞。
【請求項３２】
請求項１に記載のベクターを含む、遺伝的に改変された葉緑体。
【請求項３３】
請求項３２に記載の葉緑体を含む、非維管束光合成生物。
【請求項３４】
（ａ）２つのホスフェートを用いてイソプレノイドを生成する酵素をコードする核酸で非維管束光合成生物の葉緑体を形質転換する工程、および（ｂ）前記形質転換された生物によって生成される少なくとも１つのイソプレノイドを回収する工程を含む、イソプレノイドを生成する方法。
【請求項３５】
前記生物を水性環境中で生育する工程であって、ＣＯ2が前記生物に供給される工程をさらに含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記ＣＯ2が、燃焼された化石燃料から少なくとも部分的に得られる、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記ＣＯ2が、煙道ガスから少なくとも部分的に得られる、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
２つのホスフェートを有する前記イソプレノイドが、ＧＰＰ、ＩＰＰ、ＦＰＰ、ＧＧＰＰまたはＤＭＡＰＰである、請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
前記回収工程が、以下の工程：（ａ）前記形質転換された生物を収集する工程、（ｂ）前記イソプレノイドを細胞培養液から収集する工程、（ｃ）前記生物を機械的に破壊する工程、または（ｄ）前記生物を化学的に破壊する工程のうちの１つ以上を含む、請求項３４記載の方法。
【請求項４０】
前記生物が、微細藻類である、請求項３４記載の方法。
【請求項４１】
前記微細藻類が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）イソプレノイドを生成するように非維管束光合成生物の葉緑体を形質転換する工程であって、前記生物は、イソプレンシンターゼまたはメチル−ブテノールシンターゼで形質転換されない工程、および（ｂ）前記イソプレノイドを回収する工程を含む、イソプレノイドを生成するための方法。
【請求項４３】
前記生物を水性環境中で生育する工程であって、ＣＯ2が前記生物に供給される工程をさらに含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記ＣＯ2が、燃焼された化石燃料から少なくとも部分的に得られる、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記ＣＯ2が、煙道ガスから少なくとも部分的に得られる、請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
前記イソプレノイドが、ＧＰＰ、ＩＰＰ、ＦＰＰ、ＧＧＰＰまたはＤＭＡＰＰである、請求項４２記載の方法。
【請求項４７】
前記葉緑体が、ボトリオコッセンシンターゼ、リモネンシンターゼ、シネオールシンターゼ、ピネンシンターゼ、カンフェンシンターゼ、サビネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼ、タキサジエンシンターゼ、ビサボレンシンターゼ、ジアポフィトエンデサチュラーゼ、ジアポフィトエンシンターゼ、モノテルペンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、ジンギベレンシンターゼ、オシメンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、クルクメンシンターゼ、ファルネセンシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼ、β−カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンＡシンターゼ、８−エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、（＋）−δ−カジネンシンターゼ、ゲルマクレンＣシンターゼ、（Ｅ）−β−ファルネセンシンターゼ、カスベンシンターゼ、ベチスピラジエンシンターゼ、５−エピ−アリストロケンシンターゼ、アリストロケンシンターゼ、α−フムレン、（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセンシンターゼ、（−）−β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、（＋）−ボルニル二リン酸シンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、（Ｅ）−γ−ビサボレンシンターゼ、コパリルピロリン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、ロンギホレンシンターゼ、γ−フムレンシンターゼ、δ−セリネンシンターゼ、β−フェランドレンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、（＋）−３−カレンシンターゼ、ｓｙｎ−コパリル二リン酸シンターゼ、α−テルピネオールシンターゼ、ｓｙｎ−ピマラ−７，１５−ジエンシンターゼ、ｅｎｔ−サンダラコピマラジエンシンターゼ、ステルネル−１３−エンシンターゼ、Ｅ−β−オシメン、Ｓ−リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、ガンマ−テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、Ｅ−β−オシメンシンターゼ、ｅｐｉ−セドロールシンターゼ、α−ジンギベレンシンターゼ、グアイアジエンシンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、ｃｉｓ−ムウロラジエンシンターゼ、アフィジコラン−１６ｂ−オールシンターゼ、エリザベスアトリエンシンターゼ、サンダロールシンターゼ、パチョウロールシンターゼ、ジンザノールシンターゼ、セドロールシンターゼ、スカレオールシンターゼ、コパロールシンターゼまたはマノオールシンターゼをコードする核酸で形質転換される、請求項４２記載の方法。
【請求項４８】
前記回収工程が、以下の工程：（ａ）前記形質転換された生物を収集する工程、（ｂ）前記イソプレノイドを細胞培養液から収集する工程、（ｄ）前記生物を機械的に破壊する工程、または（ｅ）前記生物を化学的に破壊する工程のうちの１つ以上を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４９】
前記生物が、微細藻類である、請求項４２記載の方法。
【請求項５０】
前記微細藻類が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
遺伝的に改変された葉緑体を含む生物であって、ここで、前記葉緑体が、イソプレノイド生成酵素をコードする核酸を含み、前記生物が、高塩環境下で生長することができる、生物。
【請求項５２】
前記生物が、非維管束光合成生物である、請求項５１記載の生物。
【請求項５３】
前記生物が、Ｄ．ｓａｌｉｎａである、請求項５１記載の生物。
【請求項５４】
前記高塩環境が、０．５から４．０モル濃度の塩化ナトリウムを含む、請求項５１記載の生物。
【請求項５５】
イソプレノイドを調製するための方法であって、（ａ）前記イソプレノイドの生成を増加させるか、または開始する核酸で生物を形質転換する工程であって、前記生物が、高塩環境下で生長する工程、および（ｂ）前記イソプレノイドを回収する工程を含む、方法。
【請求項５６】
前記生物が、非維管束光合成生物である、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記生物が、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである、請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
前記形質転換工程が、葉緑体の形質転換である、請求項５５記載の方法。
【請求項５９】
前記回収工程が、以下の工程：（ａ）前記形質転換された生物を収集する工程；（ｂ）前記イソプレノイドを細胞培養液から収集する工程；（ｃ）前記生物を機械的に破壊する工程；または（ｄ）前記生物を化学的に破壊する工程のうちの１つ以上を含む、請求項５５記載の方法。
【請求項６０】
前記高塩環境が、０．５から４．０モル濃度の塩化ナトリウムを含む、請求項５５記載の方法。
【請求項６１】
１つ以上のイソプレノイド生成酵素をコードする異種核酸、および光合成細菌において前記核酸を発現させるために構成されたプロモーターを含むベクター。
【請求項６２】
前記光合成細菌が、ラン藻の種である、請求項６１記載のベクター。
【請求項６３】
前記ラン藻の種が、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、またはアルスロスピラ属（Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ）からなる群より選択される属のメンバーである、請求項６１記載のベクター。
【請求項６４】
請求項６１記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６５】
前記宿主細胞が、ラン藻の種である、請求項６４記載の宿主細胞。
【請求項６６】
前記宿主細胞が、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）およびアルスロスピラ属（Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ）からなる群より選択される属のメンバーである、請求項６６記載の宿主細胞。
【請求項６７】
ボトリオコッセンシンターゼをコードする第１の核酸、およびＦＰＰシンターゼをコードする第２の核酸を含む宿主細胞であって、前記宿主細胞が、非維管束光合成生物である、宿主細胞。
【請求項６８】
前記第１の核酸および前記第２の核酸が、葉緑体ゲノムに組み込まれる、請求項６７記載の宿主細胞。
【請求項６９】
前記宿主細胞が、微細藻類である、請求項６７記載の宿主細胞。
【請求項７０】
前記微細藻類が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである、請求項６９記載の宿主細胞。
【請求項７１】
（ａ）タンパク質をコードする第１の核酸、（ｂ）選択マーカーをコードする第２の核酸であって、前記第１の核酸および前記第２の核酸が、１つのオープンリーディングフレームを含み、ならびに（ｃ）非維管束光合成生物において前記第１の核酸および前記第２の核酸を発現させるために構成されたプロモーターを含む、ベクター。
【請求項７２】
前記タンパク質が、イソプレノイド生成酵素またはバイオマス分解酵素である、請求項７１記載のベクター。
【請求項７３】
前記イソプレノイド生成酵素が、ボトリオコッセンシンターゼ、リモネンシンターゼ、シネオールシンターゼ、ピネンシンターゼ、カンフェンシンターゼ、サビネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼ、タキサジエンシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、ビサボレンシンターゼ、ジアポフィトエンデサチュラーゼ、ジアポフィトエンシンターゼ、ＧＰＰシンターゼ、ＩＰＰイソメラーゼ、モノテルペンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、ジンギベレンシンターゼ、オシメンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、クルクメンシンターゼ、ファルネセンシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼ、β−カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンＡシンターゼ、８−エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、（＋）−δ−カジネンシンターゼ、ゲルマクレンＣシンターゼ、（Ｅ）−β−ファルネセンシンターゼ、カスベンシンターゼ、ベチスピラジエンシンターゼ、５−エピ−アリストロケンシンターゼ、アリストロケンシンターゼ、α−フムレン、（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセンシンターゼ、（−）−β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、（＋）−ボルニル二リン酸シンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、（Ｅ）−γ−ビサボレンシンターゼ、コパリルピロリン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、ロンギホレンシンターゼ、γ−フムレンシンターゼ、δ−セリネンシンターゼ、β−フェランドレンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、（＋）−３−カレンシンターゼ、ｓｙｎ−コパリル二リン酸シンターゼ、α−テルピネオールシンターゼ、ｓｙｎ−ピマラ−７，１５−ジエンシンターゼ、ｅｎｔ−サンダラコピマラジエンシンターゼ、ステルネル−１３−エンシンターゼ、Ｅ−β−オシメン、Ｓ−リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、ガンマ−テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、Ｅ−β−オシメンシンターゼ、ｅｐｉ−セドロールシンターゼ、α−ジンギベレンシンターゼ、グアイアジエンシンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、ｃｉｓ−ムウロラジエンシンターゼ、アフィジコラン−１６ｂ−オールシンターゼ、エリザベスアトリエンシンターゼ、サンダロールシンターゼ、パチョウロールシンターゼ、ジンザノールシンターゼ、セドロールシンターゼ、スカレオールシンターゼ、コパロールシンターゼまたはマノオールシンターゼである、請求項７２記載のベクター。
【請求項７４】
前記バイオマス分解酵素が、エキソ−β−グルカナーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、エンドキシラナーゼまたはリグニナーゼである、請求項７２記載のベクター。
【請求項７５】
前記第１の核酸または前記第２の核酸が、非維管束光合成生物の核における発現に対して最適化される少なくとも１つのコドンを含む、請求項７１記載のベクター。
【請求項７６】
切断部分をコードする第３の核酸を前記第１の核酸および前記第２の核酸とインフレームでさらに含む、請求項７１記載のベクター。
【請求項７７】
前記切断部分が、自己切断型プロテアーゼである、請求項７６記載のベクター。
【請求項７８】
前記プロテアーゼが、口蹄疫ウイルス由来のＡ２領域の機能部分である、請求項７７記載のベクター。
【請求項７９】
前記切断部分が、前記生物によって天然に生成されるプロテアーゼによって切断されることが可能である、請求項７６記載のベクター。
【請求項８０】
前記プロモーターが、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７０の機能部分、ｒｂｃＳ２  ５’上流翻訳領域（ＵＴＲ）、ｒｂｃＳ２  ５’ＵＴＲの機能部分またはそれらの組み合わせを含む、請求項７１記載のベクター。
【請求項８１】
前記プロモーターが、前記生物に由来する、請求項８０記載のベクター。
【請求項８２】
分泌シグナルをコードする第４の核酸をさらに含む、請求項７１または７６に記載のベクター。
【請求項８３】
前記第１の核酸、前記第２の核酸、および前記第４の核酸が、インフレームにある、請求項８２記載のベクター。
【請求項８４】
前記第１の核酸、前記第２の核酸、前記第３の核酸、および前記第４の核酸が、インフレームにある、請求項８２記載のベクター。
【請求項８５】
前記分泌シグナルが、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの炭酸脱水酵素分泌シグナルである、請求項８２記載のベクター。
【請求項８６】
前記生物が、光合成細菌、シアノバクテリア、藍色植物門（ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、原核緑色植物門（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、黄金色植物門（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、渦鞭毛植物門（ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、プリムネシウム植物門（ｐｙｒｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ）、珪藻植物門（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、黄緑色植物門（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）、ユースティグマトフィータ（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）、ラフィド藻門（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）および植物プランクトンからなる群より選択される、請求項７１記載のベクター。
【請求項８７】
前記ベクターが、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓ、またはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａおける安定な形質転換が可能である、請求項７１記載のベクター。
【請求項８８】
前記ベクターが、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）の細菌、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌またはアルスロスピラ属（Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ）の細菌における安定な形質転換が可能である、請求項７１記載のベクター。
【請求項８９】
表７中の配列、またはそれらに対して少なくとも７０％の同一性を有する配列のいずれかを含む、請求項７１記載のベクター。
【請求項９０】
さらに第５の核酸を前記第１の核酸、前記第２の核酸、前記第３の核酸とインフレームで含み、タグをコードする、請求項７１、７６、または８２記載のベクター。
【請求項９１】
前記タグが、エピトープタグまたは金属親和性タグである、請求項９０記載のベクター。
【請求項９２】
ベクターを含む宿主細胞であって、前記ベクターは、
タンパク質をコードする第１の核酸、
選択マーカーをコードする第２の核酸であって、前記第１の核酸および前記第２の核酸は、１つのオープンリーディングフレームを構成し、
非維管束光合成生物において前記第１の核酸および前記第２の核酸を発現させるために構成されたプロモーター、ならびに
必要に応じて、切断部分、分泌シグナル、タグまたはそれらの組み合わせをコードする１つ以上のさらなる核酸を含み、ここで、前記１つ以上のさらなる核酸は、前記第１の核酸および前記第２の核酸とインフレームにある、宿主細胞。
【請求項９３】
前記細胞が、光合成細菌、シアノバクテリア、藍色植物門（ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、原核緑色植物門（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、黄金色植物門（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、渦鞭毛植物門（ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、プリムネシウム植物門（ｐｙｒｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ）、珪藻植物門（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、黄緑色植物門（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）、ユースティグマトフィータ（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）、ラフィド藻門（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）および植物プランクトンからなる群より選択される、請求項９２記載の宿主細胞。
【請求項９４】
前記宿主細胞が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓ、またはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである、請求項９２記載の宿主細胞。
【請求項９５】
前記宿主細胞が、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）の細菌、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌またはアルスロスピラ属（Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ）の細菌である、請求項９２記載の宿主細胞。
【請求項９６】
前記ベクターが、前記宿主細胞の核ゲノム中に安定的に組み込まれる、請求項９２記載の宿主細胞。
【請求項９７】
非維管束光合成生物においてタンパク質を生成する方法であって、非維管束光合成生物を生育する工程を含み、ここで、前記生物は、単一のオープンリーディングフレームを含む外因性核酸を含み、前記オープンリーディングフレームは、タンパク質をコードする第１の核酸および選択マーカーをコードする第２の核酸を含み、前記生物は、当該生物において前記オープンリーディングフレームを発現させるために構成されたプロモーターをさらに含むことによって前記タンパク質を生成する、方法。
【請求項９８】
前記タンパク質が、イソプレノイド生成酵素またはバイオマス分解酵素である、請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
前記オープンリーディングフレームが、非維管束光合成生物の核における発現に対して最適化された少なくとも１つのコドンを含む、請求項９７記載の方法。
【請求項１００】
前記オープンリーディングフレームが、切断部分をコードする第３の核酸を前記第１の核酸および前記第２の核酸とインフレームでさらに含む、請求項９７記載の方法。
【請求項１０１】
前記切断部分が、自己切断型プロテアーゼである、請求項１００記載の方法。
【請求項１０２】
前記プロテアーゼが、口蹄疫ウイルス由来のＡ２領域の機能部分である、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０３】
前記切断部分が、前記生物によって天然に生成されるプロテアーゼによって切断されることが可能である、請求項１００記載の方法。
【請求項１０４】
分泌シグナルをコードする第４の核酸をさらに含む、請求項９７または１００記載の方法。
【請求項１０５】
前記第４の核酸が、前記オープンリーディングフレームを構成する他のすべての核酸とインフレームにある、請求項１０４記載の方法。
【請求項１０６】
前記分泌シグナルが、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの炭酸脱水酵素分泌シグナルである、請求項１０４記載の方法。
【請求項１０７】
前記生物が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｄ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）の細菌、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌またはアルスロスピラ属（Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ）の細菌である、請求項９７記載の方法。
【請求項１０８】
前記オープンリーディングフレームが、タグをコードする第５の核酸をさらに含み、前記第５の核酸は、前記オープンリーディングフレームを構成する他のすべての核酸とインフレームにある、請求項９７、１００、または１０４記載の方法。
【請求項１０９】
前記タグが、エピトープタグまたは金属親和性タグである、請求項１０８記載の方法。
【請求項１１０】
融合タンパク質を含む宿主細胞であって、前記融合タンパク質は、タンパク質をコードする第１の核酸および選択マーカーをコードする第２の核酸を含み、前記宿主細胞は、非維管束光合成生物である、宿主細胞。
【請求項１１１】
前記宿主細胞が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓ、またはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである、請求項１１０記載の宿主細胞。
【請求項１１２】
前記宿主細胞が、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）の細菌、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌またはアルスロスピラ属（Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ）の細菌である、請求項１１０記載の宿主細胞。
【請求項１１３】
前記ベクターが、前記宿主細胞の核ゲノム中に安定的に組み込まれる、請求項１１０記載の宿主細胞。
【請求項１１４】
前記融合タンパク質が、切断部分、分泌シグナル、タグまたはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１１０記載の宿主細胞。
【請求項１１５】
前記切断部分が、自己切断型プロテアーゼである、請求項１１０記載の宿主細胞。
【請求項１１６】
前記プロテアーゼが、口蹄疫ウイルス由来のＡ２領域の機能部分である、請求項１１５記載の宿主細胞。
【請求項１１７】
前記切断部分が、前記生物によって天然に生成されるプロテアーゼによって切断されることが可能である、請求項１１０記載の宿主細胞。
【請求項１１８】
前記分泌シグナルが、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの炭酸脱水酵素分泌シグナルである、請求項１１０記載の宿主細胞。
【請求項１１９】
前記タグが、エピトープタグまたは金属親和性タグである、請求項１１０記載の宿主細胞。
【請求項１２０】
選択的条件下で目的のタンパク質を発現するトランスジェニック非維管束光合成生物を作出する方法であって：
単一のオープンリーディングフレームを含む核酸で非維管束光合成生物を形質転換する工程であって、前記オープンリーディングフレームが、前記目的のタンパク質および選択マーカーを含む融合タンパク質をコードする、工程；
を含み、
ここで、前記生物は、当該生物が継続して生存するために前記選択マーカーの発現を必要とする環境条件下で前記選択マーカーを発現することができ、それによって、前記目的のタンパク質が発現する、
方法。
【請求項１２１】
前記タンパク質が、イソプレノイド生成酵素またはバイオマス分解酵素である、請求項１２０記載の方法。
【請求項１２２】
前記オープンリーディングフレームが、切断部分、分泌シグナル、タグ、またはそれらの組み合わせをコードする１つ以上の核酸をさらに含む、請求項１２０記載の方法。
【請求項１２３】
前記切断部分が、自己切断型プロテアーゼである、請求項１２２記載の方法。
【請求項１２４】
前記プロテアーゼが、口蹄疫ウイルス由来のＡ２領域の機能部分である、請求項１２３記載の方法。
【請求項１２５】
前記切断部分が、前記生物によって天然に生成されるプロテアーゼによって切断されることが可能である、請求項１２２記載の方法。
【請求項１２６】
前記分泌シグナルが、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの炭酸脱水酵素分泌シグナルである、請求項１２２記載の方法。
【請求項１２７】
前記タグが、エピトープタグまたは金属親和性タグである、請求項１２２記載の方法。
【請求項１２８】
非維管束光合成生物におけるフィトール生成を増加させる方法であって、
核酸で前記生物を形質転換する工程を含み、前記核酸は、前記生物によるフィトールの生成を、前記核酸を含んでいない前記宿主生物によって生成されるレベルよりも高いレベルに高めるものである、方法。
【請求項１２９】
前記核酸が、ＧＰＰシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼおよびピロホスファターゼからなる群より選択される酵素をコードする、請求項１２８記載の方法。
【請求項１３０】
前記形質転換が、葉緑体の形質転換である、請求項１２８記載の方法。
【請求項１３１】
前記酵素が、前記生物に対して内因性であるか、あるいは前記生物の内因性酵素と相同である、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３２】
前記酵素が、過剰発現される、請求項１３１記載の方法。
【請求項１３３】
前記酵素が、前記生物にとって外因性である、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３４】
前記酵素の発現が、誘導性プロモーターによって制御される、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３５】
ジメチルアリルアルコール、イソペンチルアルコール、ゲラニオール、ファルネソールまたはゲラニルゲラニオールの生成をもたらす核酸による前記生物の形質転換をさらに含む、請求項１２８記載の方法。
【請求項１３６】
前記生物が、光合成細菌、シアノバクテリア、藍色植物門（ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、原核緑色植物門（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、黄金色植物門（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、渦鞭毛植物門（ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、プリムネシウム植物門（ｐｙｒｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ）、珪藻植物門（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、黄緑色植物門（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）、ユースティグマトフィータ（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）、ラフィド藻門（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）および植物プランクトンからなる群より選択される、請求項１２８記載の方法。
【請求項１３７】
前記生物が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである、請求項１２８記載の方法。
【請求項１３８】
前記核酸が、表７からの配列またはそれらに対して７０％の相同性を有する配列を含む、請求項１２８記載の方法。
【請求項１３９】
導入される核酸を含む宿主細胞であって、前記核酸は、前記宿主細胞によるフィトールの生成を、前記核酸を含んでいない宿主細胞によって生成されるレベルよりも高いレベルに増加させ、前記宿主細胞は、非維管束光合成生物である、宿主細胞。
【請求項１４０】
前記宿主細胞が、高塩環境下において生長することができる、請求項１３９記載の宿主細胞。
【請求項１４１】
前記宿主細胞が、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである、請求項１４０記載の宿主細胞。
【請求項１４２】
前記高塩環境が、０．５から４．０モル濃度の塩化ナトリウムを含む、請求項１４０記載の宿主細胞。
【請求項１４３】
前記核酸が、葉緑体内に存在する、請求項１３９記載の宿主細胞。
【請求項１４４】
前記核酸が、ＧＰＰシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼおよびピロホスファターゼからなる群から選択される酵素をコードする、請求項１３９記載の宿主細胞。
【請求項１４５】
ジメチルアリルアルコール、イソペンチルアルコール、ゲラニオール、ファルネソールまたはゲラニルゲラニオールの生成をもたらす核酸をさらに含む、請求項１３９記載の宿主細胞。
【請求項１４６】
前記細胞が、光合成細菌、シアノバクテリア、藍色植物門（ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、原核緑色植物門（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、黄金色植物門（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、渦鞭毛植物門（ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、プリムネシウム植物門（ｐｙｒｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ）、珪藻植物門（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、黄緑色植物門（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）、ユースティグマトフィータ（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）、ラフィド藻門（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）および植物プランクトンからなる群より選択される、請求項１３９記載の宿主細胞。
【請求項１４７】
前記細胞が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである、請求項１３９記載の宿主細胞。
【請求項１４８】
非維管束光合成生物においてフィトールを生成する方法であって、
前記生物によるフィトールの生成を、前記核酸を含まない前記生物によって生成されるレベルよりも高いレベルに増加させる核酸で前記生物を形質転換する工程、および
前記生物由来の前記フィトールを回収する工程を含む、方法。
【請求項１４９】
前記核酸が、ＧＰＰシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼおよびピロホスファターゼからなる群より選択される酵素をコードする、請求項１４８記載の方法。
【請求項１５０】
前記形質転換が、葉緑体の形質転換である、請求項１４８記載の方法。
【請求項１５１】
前記核酸が、前記生物に対して内因性である酵素、または前記生物の内因性酵素と相同である酵素をコードする、請求項１４８記載の方法。
【請求項１５２】
前記酵素が、過剰発現される、請求項１５１記載の方法。
【請求項１５３】
前記核酸が、前記生物にとって外因性である酵素をコードする、請求項１４８記載の方法。
【請求項１５４】
前記核酸の発現が、誘導性プロモーターによって制御される、請求項１４８記載の方法。
【請求項１５５】
ジメチルアリルアルコール、イソペンチルアルコール、ゲラニオール、ファルネソールまたはゲラニルゲラニオールの生成をもたらす核酸による前記生物の形質転換をさらに含む、請求項１４８記載の方法。
【請求項１５６】
前記生物が、光合成細菌、シアノバクテリア、藍色植物門（ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、原核緑色植物門（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、黄金色植物門（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、渦鞭毛植物門（ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、プリムネシウム植物門（ｐｙｒｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ）、珪藻植物門（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、黄緑色植物門（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）、ユースティグマトフィータ（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）、ラフィド藻門（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）および植物プランクトンからなる群より選択される、請求項１４８記載の方法。
【請求項１５７】
前記生物が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、またはＨ．ｐｌｕｖａｌｉｓである、請求項１４８記載の方法。
【請求項１５８】
少なくとも３％のフィトール、および少なくとも微量の遺伝的に改変された非維管束光合成生物の細胞部分を含む、組成物。
【請求項１５９】
前記遺伝的に改変された生物が、内因性、異種性または外因性のＧＰＰシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼまたはピロホスファターゼによって改変される、請求項１５８記載の組成物。
【請求項１６０】
前記生物の葉緑体が、遺伝的に改変される、請求項１５８記載の組成物。
【請求項１６１】
ジメチルアリルアルコール、イソペンチルアルコール、ゲラニオール、ファルネソールまたはゲラニルゲラニオールをさらに含む、請求項１５８記載の組成物。
【請求項１６２】
前記生物が、光合成細菌、シアノバクテリア、藍色植物門（ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、原核緑色植物門（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、黄金色植物門（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、渦鞭毛植物門（ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、プリムネシウム植物門（ｐｙｒｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ）、珪藻植物門（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、黄緑色植物門（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）、ユースティグマトフィータ（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）、ラフィド藻門（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）および植物プランクトンからなる群より選択される、請求項１５８記載の組成物。
【請求項１６３】
前記生物が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである、請求項１５８記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国仮出願番号６０／９７１，４１８（２００７年９月１１日出願）、６０／９７１，４１２（２００７年９月１１日出願）および６１／１３０，８９２（２００８年６月２日出願）（これらの出願は、本明細書中で参照により援用される）に対して優先権を主張し、それらの利益を主張するものである。
【０００２】
（参照による援用）
本明細書中で言及される刊行物および特許出願のすべては、各個別の刊行物または特許出願が、参照により援用されると明確かつ個々に示されるかのように、同程度に本明細書中で参照により援用される。
【背景技術】
【０００３】
油などの燃料生成物、石油化学製品、および石油化学製品の製造に有用な他の物質の需要が、ますます高まっている。今日の燃料生成物の多くは、化石燃料から生成されているが、化石燃料は、何百万年にわたって堆積物の連続した層によって覆われた有機物の結果であるので、再生可能なエネルギー源ではないと考えられている。また、輸入原油への依存の低下させる要求も大きくなっている。汚染および環境ハザードに関する社会の意識も高まっている。結果として、燃料生成物を生成するための代替方法についての関心が高まり、その代替方法が求められている。したがって、再生可能かつ持続可能で、環境に対して害の少ない、燃料生成物を生成する代替方法が差し迫って必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、イソプレノイドなどの生成物を生成するための組成物および方法に関し、その生成物は、光合成生物を用いて複数の目的（例えば、燃料、燃料供給原料、芳香剤および殺虫剤）に使用することができる。その組成物は、非維管束光合成生物において生成物の生成を開始するか、増加させるか、またはもたらす１つ以上のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。
【０００５】
いくつかの場合において、そのようなヌクレオチド配列は、メバロン酸経路（ＭＶＡ経路）内の１つ以上のポリペプチドをコードする。ＭＶＡ経路内のポリペプチドの例としては、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸（ｐｈｏｓｐｈｅｍｅｖａｌｏｎａｔｅ）キナーゼまたはメバロン酸−５−ピロリン酸デカルボキシラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、そのヌクレオチド配列は、非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路）内のポリペプチドをコードする。そのポリペプチドは、ＤＯＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクターゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、４−ジホスホシチジル（ｄｉｐｈｏｐｈｏｃｙｔｉｄｙｌ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４，−シクロ二リン酸シンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰシンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰレダクターゼおよびＤＯＸＰレダクトイソメラーゼであり得る。
【０００６】
本発明の一態様は、２つのリン酸を用いてイソプレノイドを生成する酵素をコードする核酸、およびその核酸を非維管束光合成生物（ＮＶＰＯ）の葉緑体内で発現させるために構成されたプロモーターを含むベクターを提供し、葉緑体のゲノム全体を含まない。実際には、葉緑体ゲノムへの本ベクターの挿入は、葉緑体の光合成能力を破壊しないかもしれない。他の場合において、本発明のベクターは、葉緑体ゲノムによる相同組換えを促進する核酸配列をさらに含む。いくつかの場合において、本明細書中に開示されるようなベクター（ｖｅｃｏｒ）上でコードされる酵素によって生成されるイソプレノイドは、ＧＰＰ、ＩＰＰ、ＦＰＰ、ＧＧＰＰまたはＤＭＡＰＰである。本明細書中に開示されるいくつかのベクターでは、２つのホスフェートを用いてイソプレノイドを改変する第２の酵素をコードする第２の核酸もまた、そのベクター上に存在する。本発明のベクターによってコードされ得る第２の酵素の特定の例としては、ボトリオコッセン（ｂｏｔｙｒｏｃｏｃｃｅｎｅ）シンターゼ、リモネンシンターゼ、シネオールシンターゼ、ピネンシンターゼ、カンフェンシンターゼ、サビネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼ、タキサジエンシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、ビサボレンシンターゼ、ジアポフィトエンデサチュラーゼ、ジアポフィトエンシンターゼ、ＧＰＰシンターゼ、ＩＰＰイソメラーゼ、モノテルペンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、ジンギベレンシンターゼ、オシメンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、クルクメンシンターゼ、ファルネセンシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼ、β−カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンＡシンターゼ、８−エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、（＋）−δ−カジネンシンターゼ、ゲルマクレンＣシンターゼ、（Ｅ）−β−ファルネセンシンターゼ、カスベンシンターゼ、ベチスピラジエンシンターゼ、５−エピ−アリストロケンシンターゼ、アリストロケン（ａｒｉｓｔｏｌｃｈｅｎｅ）シンターゼ、α−フムレン、（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセンシンターゼ、（−）−β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、（＋）−ボルニル二リン酸シンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、（Ｅ）−γ−ビサボレンシンターゼ、コパリルピロリン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、ロンギホレンシンターゼ、γ−フムレンシンターゼ、δ−セリネンシンターゼ、β−フェランドレンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、（＋）−３−カレンシンターゼ、ｓｙｎ−コパリル二リン酸シンターゼ、α−テルピネオールシンターゼ、ｓｙｎ−ピマラ−７，１５−ジエンシンターゼ、ｅｎｔ−サンダラコピマラジエン（ｓａｎｄａａｒａｃｏｐｉｍａｒａｄｉｅｎｅ）シンターゼ、ステルネル（ｓｔｅｒｎｅｒ）−１３−エンシンターゼ、Ｅ−β−オシメン、Ｓ−リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、ガンマ−テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、Ｅ−β−オシメンシンターゼ、ｅｐｉ−セドロールシンターゼ、α−ジンギベレンシンターゼ、グアイアジエンシンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、ｃｉｓ−ムウロラジエンシンターゼ、アフィジコラン−１６ｂ−オールシンターゼ、エリザベスアトリエン（ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｔｒｉｅｎｅ）シンターゼ、サンダロールシンターゼ、パチョウロール（ｐａｔｃｈｏｕｌｏｌ）シンターゼ、ジンザノール（ｚｉｎｚａｎｏｌ）シンターゼ、セドロールシンターゼ、スカレオール（ｓｃａｒｅｏｌ）シンターゼ、コパロールシンターゼまたはマノオールシンターゼが挙げられるが、これらに限定されない。上記のベクターは、選択マーカーも含み得る。本発明の特定のベクターは、微細藻類内での安定な形質転換が可能である。いくつかの実施形態において、藻類の種は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである。酵素をコードする核の核酸は、非維管束光合成微生物の核および／または葉緑体における発現に対してバイアスがかけられていることがある。本発明において有用な酵素をコードする配列は、本明細書中に具体的に開示される配列（例えば、表５〜８中の配列）、またはそれらに対して６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくはそれ以上の同一性を有する配列のいずれかであり得る。本発明のいくつかのベクターは、本明細書中に具体的に開示される配列（例えば、表５〜８中の配列）、またはそれらに対して６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくはそれ以上の同一性を有する配列のいずれかを含む。
【０００７】
本明細書中で開示される別のベクターは、２つのホスフェートを用いてイソプレノイドを生成する酵素をコードする核酸；およびその酵素を葉緑体に標的化するための葉緑体標的分子をコードする核酸を含む。そのようなベクターは、選択マーカー、葉緑体もしくは核のゲノムゲノムによる相同組換えを促進する核酸配列、またはこれらの特徴の組み合わせをさらに含み得る。いくつかの場合において、上記核酸によってコードされる酵素は、ＧＰＰ、ＩＰＰ、ＦＰＰ、ＧＧＰＰまたはＤＭＡＰＰを生成する。本明細書中で開示されるそのようなベクターは、２つのホスフェートを用いてイソプレノイドを改変する第２の酵素をコードする核酸およびその第２の酵素を葉緑体に標的化するための葉緑体標的分子をコードする核酸をさらに含み得る。本発明のベクターによってコードされ得る第２の酵素の特定の例としては、ボトリオコッセンシンターゼ、リモネンシンターゼ、シネオールシンターゼ、ピネンシンターゼ、カンフェンシンターゼ、サビネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼ、タキサジエンシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、ビサボレンシンターゼ、ジアポフィトエンデサチュラーゼ、ジアポフィトエンシンターゼ、ＧＰＰシンターゼ、ＩＰＰイソメラーゼ、モノテルペンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、ジンギベレンシンターゼ、オシメンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、クルクメンシンターゼ、ファルネセンシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼ、β−カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンＡシンターゼ、８−エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、（＋）−δ−カジネンシンターゼ、ゲルマクレンＣシンターゼ、（Ｅ）−β−ファルネセンシンターゼ、カスベンシンターゼ、ベチスピラジエンシンターゼ、５−エピ−アリストロケンシンターゼ、アリストロケンシンターゼ、α−フムレン、（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセンシンターゼ、（−）−β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、（＋）−ボルニル二リン酸シンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、（Ｅ）−γ−ビサボレンシンターゼ、コパリルピロリン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、ロンギホレンシンターゼ、γ−フムレンシンターゼ、δ−セリネンシンターゼ、β−フェランドレンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、（＋）−３−カレンシンターゼ、ｓｙｎ−コパリル二リン酸シンターゼ、α−テルピネオールシンターゼ、ｓｙｎ−ピマラ−７，１５−ジエンシンターゼ、ｅｎｔ−サンダラコピマラジエンシンターゼ、ステルネル−１３−エンシンターゼ、Ｅ−β−オシメン、Ｓ−リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、ガンマ−テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、Ｅ−β−オシメンシンターゼ、ｅｐｉ−セドロールシンターゼ、α−ジンギベレンシンターゼ、グアイアジエンシンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、ｃｉｓ−ムウロラジエンシンターゼ、アフィジコラン−１６ｂ−オールシンターゼ、エリザベスアトリエンシンターゼ、サンダロールシンターゼ、パチョウロールシンターゼ、ジンザノールシンターゼ、セドロールシンターゼ、スカレオールシンターゼ、コパロールシンターゼまたはマノオールシンターゼが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において使用するための酵素をコードする核酸は、ＮＶＰＯに対してバイアスがかけられたコドンであり得る。本発明の特定のベクターは、微細藻類での安定な形質転換が可能である。いくつかの実施形態において、藻類の種は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである。本発明において有用な酵素をコードする配列は、本明細書中に具体的に開示される配列（例えば、表５〜８中の配列）、またはそれらに対して６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくはそれ以上の同一性を有する配列のいずれかであり得る。本発明のいくつかのベクターは、本明細書中に具体的に開示される配列（例えば、表５〜８中の配列）、またはそれらに対して６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくはそれ以上の同一性を有する配列のいずれかを含む。
【０００８】
本開示は、１）２つのホスフェートを用いてイソプレノイドを生成する酵素をコードする核酸、およびその核酸をＮＶＰＯの葉緑体内で発現させるために構成されたプロモーターを含み、葉緑体のゲノム全体を含まないベクター；または２）２つのホスフェートを用いてイソプレノイドを生成する酵素をコードする核酸、および酵素を葉緑体に標的化するための葉緑体標的分子をコードする核酸を含むベクターを含む宿主細胞も提供する。その宿主細胞は、ベクター上に存在する上記核酸のうちの１つ以上について同質細胞質であり得る。本明細書中で企図される宿主細胞のいくつかの例としては、藍色植物門（ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、原核緑色植物門（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、黄金色植物門（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、渦鞭毛植物門（ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、プリムネシウム植物門（ｐｙｒｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ）、珪藻植物門（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、黄緑色植物門（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）、ユースティグマトフィータ（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）、ラフィド藻門（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）および植物プランクトンが挙げられる。宿主細胞のいくつかの特定の例としては、藻類の種であるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａが挙げられる。いくつかの場合において、クロロフィルレベルは、形質転換後に宿主細胞が光独立栄養であるのに十分である。他の場合において、宿主細胞は、少なくとも１つの天然に存在するイソプレノイドを同じ生物の野生型よりも高いレベルで生成し得る。
【０００９】
本発明の別の実施形態において、少なくとも２コピーの本明細書中に記載されるヌクレオチド配列（例えば、表５〜８中）またはこれらの配列のいずれかに対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む宿主細胞が提供される。その宿主細胞は、非維管束光合成生物、特に、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａであり得る。いくつかの場合において、その宿主細胞は、そのヌクレオチド配列について同質細胞質である。本開示は、２つのホスフェートを用いてイソプレノイドを生成する酵素をコードする核酸およびその核酸を非維管束光合成生物（ＮＶＰＯ）の葉緑体内で発現させるために構成されたプロモーターを含むベクターを含む遺伝的に改変された葉緑体も提供する。
【００１０】
イソプレノイドを含む組成物を生成するための方法もまた本明細書中で提供され、その方法は、２つのホスフェートを用いてイソプレノイドを生成する酵素をコードする核酸で非維管束光合成生物の葉緑体を形質転換する工程および形質転換されたＮＶＰＯによって生成される少なくとも１つのイソプレノイドを回収する工程を包含する。そのような方法は、水性環境中でその生物を生育する工程（ここで、ＣＯ2がその生物に供給される）をさらに包含し得る。提供されるＣＯ2は、燃焼された化石燃料から少なくとも部分的に得られ得、そして／または煙道ガスから少なくとも部分的に得られ得る。そのような方法は、ＧＰＰ、ＩＰＰ、ＦＰＰ、ＧＧＰＰまたはＤＭＡＰＰの生成を包含し得る。いくつかの場合において、回収プロセスは、以下の工程：形質転換されたＮＶＰＯを収集する工程、細胞培養液からイソプレノイドを収集する工程；形質転換された生物を機械的に破壊する工程および；生物を化学的に破壊する工程のうちの１つ以上を包含し得る。本発明のいくつかの態様において、微細藻類が利用され得、その微細藻類は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａであり得る。
【００１１】
イソプレノイドを生成するための別の方法もまた記載され、ここで、その方法は、前記イソプレノイドを生成するように非維管束光合成生物の葉緑体を形質転換する工程（ここで、前記生物は、イソプレンシンターゼまたはメチル−ブテノールシンターゼで形質転換されない）；および（ｂ）前記イソプレノイドを回収する工程を包含する。この方法は、その生物を水性環境下で生育する工程（ここで、ＣＯ2がその生物に供給される）をさらに包含し得る。そのＣＯ2は、燃焼された化石燃料および／または煙道ガスから少なくとも部分的に得られ得る。そのような方法は、ＧＰＰ、ＩＰＰ、ＦＰＰ、ＧＧＰＰまたはＤＭＡＰＰの生成を包含し得る。この方法の葉緑体は、ボトリオコッセンシンターゼ、リモネンシンターゼ、シネオールシンターゼ、ピネンシンターゼ、カンフェンシンターゼ、サビネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼ、タキサジエンシンターゼ、ビサボレンシンターゼ、ジアポフィトエンデサチュラーゼ、ジアポフィトエンシンターゼ、モノテルペンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、ジンギベレンシンターゼ、オシメンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、クルクメンシンターゼ、ファルネセンシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼ、β−カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンＡシンターゼ、８−エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、（＋）−δ−カジネンシンターゼ、ゲルマクレンＣシンターゼ、（Ｅ）−β−ファルネセンシンターゼ、カスベンシンターゼ、ベチスピラジエンシンターゼ、５−エピ−アリストロケンシンターゼ、アリストロケンシンターゼ、α−フムレン、（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセンシンターゼ、（−）−β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、（＋）−ボルニル二リン酸シンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、（Ｅ）−γ−ビサボレンシンターゼ、コパリルピロリン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、ロンギホレンシンターゼ、γ−フムレンシンターゼ、δ−セリネンシンターゼ、β−フェランドレンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、（＋）−３−カレンシンターゼ、ｓｙｎ−コパリル二リン酸シンターゼ、α−テルピネオールシンターゼ、ｓｙｎ−ピマラ−７，１５−ジエンシンターゼ、ｅｎｔ−サンダラコピマラジエンシンターゼ、ステルネル−１３−エンシンターゼ、Ｅ−β−オシメン、Ｓ−リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、ガンマ−テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、Ｅ−β−オシメンシンターゼ、ｅｐｉ−セドロールシンターゼ、α−ジンギベレンシンターゼ、グアイアジエンシンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、ｃｉｓ−ムウロラジエンシンターゼ、アフィジコラン−１６ｂ−オールシンターゼ、エリザベスアトリエンシンターゼ、サンダロールシンターゼ、パチョウロールシンターゼ、ジンザノールシンターゼ、セドロールシンターゼ、スカレオールシンターゼ、コパロールシンターゼまたはマノオールシンターゼをコードする核酸で形質転換され得る。いくつかの場合において、回収プロセスは、以下の工程：形質転換されたＮＶＰＯを収集���る工程、細胞培養液からイソプレノイドを収集する工程；形質転換された生物を機械的に破壊する工程、および；生物を化学的に破壊する工程のうちの１つ以上を包含し得る。本発明のいくつかの態様において、微細藻類が利用され得、その微細藻類は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａであり得る。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態は、遺伝的に改変された葉緑体を有する生物を提供し、ここで、その葉緑体は、イソプレノイド生成酵素をコードする核酸を含み、その生物は、高塩環境下で生長することができる。そのような生物は、ＮＶＰＯ、具体的には、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａであり得る。そのような実施形態において、高塩環境は、約０．５〜４．０モル濃度の塩化ナトリウムを含み得る。イソプレノイドを調製するための方法もまた提供され、その方法は、イソプレノイドの生成を増加させるかまたは開始する核酸で生物を形質転換する工程（ここで、その生物は、高塩環境下で生長する）；およびそのイソプレノイドを回収する工程を包含する。そのような生物は、ＮＶＰＯ、具体的には、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａであり得る。そのような実施形態において、高塩環境は、約０．５〜４．０モル濃度の塩化ナトリウムを含み得る。いくつかの場合において、上記形質転換工程は、葉緑体の形質転換である。他の場合において、上記回収工程は、以下の工程：（ａ）前記形質転換された生物を収集する工程；（ｂ）細胞培養液から前記イソプレノイドを収集する工程；（ｃ）前記生物を機械的に破壊する工程；または（ｄ）前記生物を化学的に破壊する工程のうちの１つ以上を包含する。
【００１３】
本明細書中の開示は、１つ以上のイソプレノイド生成酵素をコードする異種核酸を含むベクター；および光合成細菌において前記核酸を発現させるために構成されたプロモーターも提供する。いくつかの場合において、その光合成細菌は、ラン藻の種であり、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）および／またはアルスロスピラ属（Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ）のメンバーであり得る。そのようなベクターを含む宿主細胞が提供される。宿主細胞は、ラン藻の種であり得、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）および／またはアルスロスピラ属（Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ）のメンバーであり得る。
【００１４】
本開示は：タンパク質をコードする第１の核酸、選択マーカーをコードする第２の核酸（ここで、第１および第２の核酸は、１つのオープンリーディングフレームを構成する）、ならびに非維管束光合成生物において前記第１および第２の核酸を発現させるために構成されたプロモーターを含むベクターをさらに提供する。いくつかの場合において、上記タンパク質は、イソプレノイド生成酵素またはバイオマス分解酵素である。他の場合において、上記イソプレノイド生成酵素は、ボトリオコッセンシンターゼ、リモネンシンターゼ、シネオールシンターゼ、ピネンシンターゼ、カンフェンシンターゼ、サビネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼ、タキサジエンシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、ビサボレンシンターゼ、ジアポフィトエンデサチュラーゼ、ジアポフィトエンシンターゼ、ＧＰＰシンターゼ、ＩＰＰイソメラーゼ、モノテルペンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、ジンギベレンシンターゼ、オシメンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、クルクメンシンターゼ、ファルネセンシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼ、β−カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンＡシンターゼ、８−エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、（＋）−δ−カジネンシンターゼ、ゲルマクレンＣシンターゼ、（Ｅ）−β−ファルネセンシンターゼ、カスベンシンターゼ、ベチスピラジエンシンターゼ、５−エピ−アリストロケンシンターゼ、アリストロケンシンターゼ、α−フムレン、（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセンシンターゼ、（−）−β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、（＋）−ボルニル二リン酸シンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、（Ｅ）−γ−ビサボレンシンターゼ、コパリルピロリン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、ロンギホレンシンターゼ、γ−フムレンシンターゼ、δ−セリネンシンターゼ、β−フェランドレンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、（＋）−３−カレンシンターゼ、ｓｙｎ−コパリル二リン酸シンターゼ、α−テルピネオールシンターゼ、ｓｙｎ−ピマラ−７，１５−ジエンシンターゼ、ｅｎｔ−サンダラコピマラジエンシンターゼ、ステルネル−１３−エンシンターゼ、Ｅ−β−オシメン、Ｓ−リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、ガンマ−テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、Ｅ−β−オシメンシンターゼ、ｅｐｉ−セドロールシンターゼ、α−ジンギベレンシンターゼ、グアイアジエンシンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、ｃｉｓ−ムウロラジエンシンターゼ、アフィジコラン−１６ｂ−オールシンターゼ、エリザベスアトリエンシンターゼ、サンダロールシンターゼ、パチョウロールシンターゼ、ジンザノールシンターゼ、セドロールシンターゼ、スカレオールシンターゼ、コパロールシンターゼまたはマノオールシンターゼである。なおも他の場合において、バイオマス分解酵素は、エキソ−β−グルカナーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、エンドキシラナーゼまたはリグニナーゼである。本明細書中に記載されるベクターのうちのいくつかは、第１または第２の核酸を含み、その中の少なくとも１つのコドンが、存在する非維管束光合成生物の核における発現に対して最適化される。
【００１５】
いくつかの場合において、本明細書中に記載されるベクターは、切断部分をコードする第３の核酸を前記第１および第２の核酸とインフレームで含む。その切断部分は、自己切断型プロテアーゼであり得、具体的には、口蹄疫ウイルス由来のＡ２領域の機能部分であり得る。他の場合において、その切断部分は、前記生物によって天然に生成されるプロテアーゼによって切断されることが可能である。ＨＳＰ７０プロモーターをはじめとした調節エレメント、ＨＳＰ７０プロモーターの機能部分、ｒｂｃＳ２  ５’上流翻訳領域（ＵＴＲ）、ｒｂｃＳ２  ５’ＵＴＲの機能部分またはそれらの組み合わせを含むベクターもまた、本明細書中に記載される。いくつかの場合において、その調節エレメントは、形質転換される生物に由来する。なおも他のベクターは、分泌シグナルをコードする第４の核酸を第１、第２および／または第３の核酸とインフレームで含む。本ベクターにおいて有用な分泌シグナルは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの炭酸脱水酵素分泌シグナルである。本発明のベクターは、光合成細菌、シアノバクテリア、藍色植物門（ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、原核緑色植物門（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、黄金色植物門（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、渦鞭毛植物門（ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、プリムネシウム植物門（ｐｙｒｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ）、珪藻植物門（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、黄緑色植物門（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）、ユースティグマトフィータ（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）、ラフィド藻門（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）および植物プランクトンをはじめとした複数のＮＶＰＯにおいて有用であり得る。いくつかの場合において、本ベクターは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｄ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）の細菌、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌またはアルスロスピラ属（Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ）の細菌における安定な形質転換が可能である。本明細書中に記載されるベクターは、本明細書中（例えば、表５〜８中）に記載される任意のヌクレオチド配列、またはこれらの配列のうちのいずれかに対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。なおも他のベクターは、第５の核酸を前記第１、第２、第３および／または第４の核酸とインフレームで含み、ここで、第５の核酸は、タグをコードする。コードされるタグは、エピトープタグまたは金属親和性タグであり得��。
【００１６】
本開示は、ベクターを含む宿主細胞も提供し、そのベクターは、タンパク質をコードする第１の核酸、選択マーカーをコードする第２の核酸（ここで、第１および第２の核酸は、１つのオープンリーディングフレームを構成される）、非維管束光合成生物において第１および第２の核酸を発現させるために構成されたプロモーター、ならびに必要に応じて、切断部分、分泌シグナル、タグまたはそれらの組み合わせをコードする１つ以上のさらなる核酸を含み、ここで、その１つ以上のさらなる核酸は、前記第１および第２の核酸とインフレームである。その宿主細胞は、光合成細菌、シアノバクテリア、藍色植物門（ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、原核緑色植物門（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、黄金色植物門（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、渦鞭毛植物門（ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、プリムネシウム植物門（ｐｙｒｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ）、珪藻植物門（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、黄緑色植物門（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）、ユースティグマトフィータ（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）、ラフィド藻門（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）または植物プランクトンであり得る。いくつかの場合において、その宿主細胞は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｄ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）の細菌、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌またはアルスロスピラ属（Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ）の細菌である。他の場合において、上記ベクターは、前記宿主細胞の核ゲノム中に安定的に組み込まれる。
【００１７】
非維管束光合成生物においてタンパク質を生成する方法が、本明細書中でさらに提供され、その方法は：前記生物を生育する工程を包含し、ここで、その生物は、単一のオープンリーディングフレームを含む外因性核酸を含み、そのオープンリーディングフレームは、タンパク質をコードする第１の核酸および選択マーカーをコードする第２の核酸を含み、その生物は、前記生物において前記オープンリーディングフレームを発現させるために構成されたプロモーターをさらに含むことによって前記タンパク質を生成する。いくつかの場合において、上記タンパク質は、イソプレノイド生成酵素またはバイオマス分解酵素である。他の場合において、上記オープンリーディングフレームは、非維管束光合成生物の核における発現に対して最適化された少なくとも１つのコドンを含む。オープンリーディングフレームは、切断部分をコードする第３の核酸を第１および第２の核酸とインフレームでさらに含み得る。その切断部分は、自己切断型プロテアーゼであり得、特定の実施形態では、口蹄疫ウイルス由来のＡ２領域の機能部分であり得る。他の実施形態において、切断部分は、前記生物によって天然に生成されるプロテアーゼによって切断されることが可能である。オープンリーディングフレームは、分泌シグナルをコードする第４の核酸を、そのオープンリーディングフレームを構成する他のすべての核酸とインフレームでさらに含み得る。１つの実施形態において、その分泌シグナルは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの炭酸脱水酵素分泌シグナルである。本明細書中で開示されるように、そのような方法に対して有用な生物は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｄ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）またはアルスロスピラ属（Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ）の細菌であり得る。この方法において使用するためのオープンリーディングフレームは、タグをコードする第５の核酸を、そのオープンリーディングフレームを構成する他のすべての核酸とインフレームでさらに含み得る。そのタグは、エピトープタグまたは金属親和性タグであり得る。
【００１８】
融合タンパク質を含む宿主細胞が、本明細書中でさらに開示され、ここで、その融合タンパク質は、タンパク質をコードする第１の核酸および選択マーカーをコードする第２の核酸を含み、その宿主細胞は、非維管束光合成生物である。その宿主細胞は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）またはアルスロスピラ属（Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ）の細菌であり得る。いくつかの場合において、そのベクターは、その宿主細胞の核ゲノム中に安定的に組み込まれる。融合タンパク質は、切断部分、分泌シグナル、タグまたはそれらの組み合わせをさらに含み得る。切断部分は、自己切断型プロテアーゼ（例えば、口蹄疫ウイルス由来のＡ２領域の機能部分）であり得る。あるいは、切断部分は、前記生物によって天然に生成されるプロテアーゼによって切断されることが可能であり得る。利用され得る１つの分泌シグナルは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの炭酸脱水酵素分泌シグナルである。タグを含む融合タンパク質において、そのタグは、エピトープタグまたは金属親和性タグであり得る。
【００１９】
選択的条件下において目的のタンパク質を発現するトランスジェニック非維管束光合成生物を作出する方法が、本明細書中に提供され、ここで、その方法は、以下の工程：単一のオープンリーディングフレームを含む核酸でその生物を形質転換する工程を包含し、ここで、そのオープンリーディングフレームは、前記目的のタンパク質および選択マーカーを含む融合タンパク質をコードし；その生物は、その生物が継続して生存するためにその選択マーカーの発現が必要な環境条件下でその選択マーカーを発現することができることによって、前記目的のタンパク質を発現する。いくつかの場合において、上記タンパク質は、イソプレノイド生成酵素またはバイオマス分解酵素である。融合タンパク質は、切断部分、分泌シグナル、タグまたはそれらの組み合わせをさらに含み得る。切断部分は、自己切断型プロテアーゼ（例えば、口蹄疫ウイルス由来のＡ２領域の機能部分）であり得る。あるいは、切断部分は、前記生物によって天然に生成されるプロテアーゼによって切断されることが可能であり得る。利用され得る１つの分泌シグナルは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの炭酸脱水酵素分泌シグナルである。タグを含む融合タンパク質において、そのタグは、エピトープタグまたは金属親和性タグであり得る。
【００２０】
非維管束光合成生物におけるフィトール生成を増加させる方法が、本明細書中の開示によってさらに提供され、その方法は、ある核酸でその生物を形質転換する工程を包含し、そのある核酸は、その生物によるフィトールの生成を、前記核酸を含んでいない生物によって生成されるレベルよりも高いレベルに高めるものである。いくつかの場合において、その核酸は、ＧＰＰシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼまたはピロホスファターゼをコードする。いくつかの実施形態において、形質転換工程は、葉緑体の形質転換を含み得る。なおも他の実施形態において、上記酵素は、その生物に対して内因性であるか、またはその生物の内因性酵素と相同であるか、またはその生物にとって外因性である。いくつかの場合において、その酵素は、過剰発現される。その酵素の発現は、誘導性プロモーターによって制御され得る。開示される方法は、ジメチルアリルアルコール、イソペンチルアルコール、ゲラニオール、ファルネソールまたはゲラニルゲラニオールの生成をもたらす核酸による上記生物の形質転換をさらに包含し得る。いくつかの場合において、本方法を実施する際に使用される生物は、光合成細菌、シアノバクテリア、藍色植物門（ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、原核緑色植物門（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、黄金色植物門（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、渦鞭毛植物門（ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、プリムネシウム植物門（ｐｙｒｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ）、珪藻植物門（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、黄緑色植物門（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）、ユースティグマトフィータ（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）、ラフィド藻門（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）および植物プランクトンである。その生物は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａであり得る。
【００２１】
導入される核酸を含む宿主細胞もまた本明細書中で提供され、ここで、その核酸は、その宿主細胞によるフィトールの生成を、その核酸を含んでいない宿主細胞によって生成されるレベルよりも高いレベルに増加させ、ここで、その宿主細胞は、非維管束光合成生物である。いくつかの実施形態において、その宿主細胞は、高塩環境下において生長することができ、例えば、その宿主細胞は、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａであり得る。いくつかの場合において、高塩環境は、０．５〜４．０モル濃度の塩化ナトリウムを含む。いくつかの宿主細胞において、上記核酸は、葉緑体内に存在する。なおも他の宿主細胞において、上記核酸は、ＧＰＰシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼおよびピロホスファターゼからなる群から選択される酵素をコードする。その宿主細胞は、ジメチルアリルアルコール、イソペンチルアルコール、ゲラニオール、ファルネソールまたはゲラニルゲラニオールの生成をもたらす核酸をさらに含み得る。その宿主細胞は、光合成細菌、シアノバクテリア、藍色植物門（ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、原核緑色植物門（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、黄金色植物門（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、渦鞭毛植物門（ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、プリムネシウム植物門（ｐｙｒｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ）、珪藻植物門（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、黄緑色植物門（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）、ユースティグマトフィータ（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）、ラフィド藻門（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）および植物プランクトンであり得る。いくつかの場合において、その宿主細胞は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである。
【００２２】
本明細書中で開示される別の方法は、非維管束光合成生物においてフィトールを生成する方法を提供し、その方法は、その生物によるフィトールの生成を、所与の環境条件下において生成されるレベルよりも高いレベルに増加させる核酸でその生物を形質転換する工程；およびその生物由来のフィトールを回収する工程を包含する。この方法のいくつかの場合において、その核酸は、ＧＰＰシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼまたはピロホスファターゼをコードする。なおも他の場合において、形質転換は、葉緑体の形質転換である。なおも他の場合において、上記酵素は、上記生物に対して内因性であるか、またはその生物の内因性酵素と相同であるか、またはその生物にとって外因性である。いくつかの場合において、その酵素は、過剰発現される。その酵素の発現は、誘導性プロモーターによって制御され得る。開示される方法は、ジメチルアリルアルコール、イソペンチルアルコール、ゲラニオール、ファルネソールまたはゲラニルゲラニオールの生成をもたらす核酸によるその生物の形質転換をさらに含み得る。いくつかの場合において、本方法を実施する際に使用される生物は、光合成細菌、シアノバクテリア、藍色植物門（ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、原核緑色植物門（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、黄金色植物門（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、渦鞭毛植物門（ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、プリムネシウム植物門（ｐｙｒｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ）、珪藻植物門（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、黄緑色植物門（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）、ユースティグマトフィータ（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）、ラフィド藻門（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）および植物プランクトンである。その生物は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａであり得る。
【００２３】
少なくとも３％のフィトール、および少なくとも微量の遺伝的に改変された非維管束光合成生物の細胞部分を含む組成物が、本明細書中でさらに提供される。いくつかの場合において、その遺伝的に改変された生物は、内因性、異種性または外因性のＧＰＰシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼまたはピロホスファターゼによって改変される。他の場合において、その生物の葉緑体が、遺伝的に改変される。開示される組成物は、ジメチルアリルアルコール、イソペンチルアルコール、ゲラニオール、ファルネソールまたはゲラニルゲラニオールをさらに含み得る。いくつかの場合において、その組成物中に存在する細胞（ｃｅｌｌｌｕｌａｒ）部分は、光合成細菌、シアノバクテリア、藍色植物門（ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、原核緑色植物門（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、黄金色植物門（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、渦鞭毛植物門（ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、プリムネシウム植物門（ｐｙｒｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ）、珪藻植物門（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、黄緑色植物門（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）、ユースティグマトフィータ（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）、ラフィド藻門（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）および植物プランクトン由来のものである。他の場合において、その生物は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａであり得る。
【００２４】
いくつかの場合において、そのようなヌクレオチド配列は、イソプレノイド合成経路において機能する１つ以上のポリペプチドをコードする。イソプレノイド合成経路内のポリペプチドの例としては、シンターゼ（例えば、Ｃ５、Ｃ１０、Ｃ１５、Ｃ２０、Ｃ３０およびＣ４０シンターゼ）が挙げられる。イソプレノイド経路内のポリペプチドのより特定の例は、リモネンシンターゼ、１，８シネオールシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、カンフェンシンターゼ、（＋）−サビネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼ、タキサジエンシンターゼ、ファルネシルピロリン酸シンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、（Ｅ）−α−ビサボレンシンターゼ、ジアポフィトエンシンターゼまたはジアポフィトエンデサチュラーゼである。他の実施形態において、上記シンターゼは、β−カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンＡシンターゼ、８−エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、（＋）−δ−カジネンシンターゼ、ゲルマクレンＣシンターゼ、（Ｅ）−β−ファルネセンシンターゼ、カスベンシンターゼ、ベチスピラジエンシンターゼ、５−エピ−アリストロケンシンターゼ、アリストロケンシンターゼ、α−フムレン、（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセンシンターゼ、（−）−β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、（＋）−ボルニル二リン酸シンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、（Ｅ）−γ−ビサボレンシンターゼ、コパリルピロリン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、ロンギホレンシンターゼ、γ−フムレンシンターゼ、δ−セリネンシンターゼ、β−フェランドレンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、（＋）−３−カレンシンターゼ、ｓｙｎ−コパリル二リン酸シンターゼ、α−テルピネオールシンターゼ、ｓｙｎ−ピマラ−７，１５−ジエンシンターゼ、ｅｎｔ−サンダラコピマラジエンシンターゼ、ステルネル−１３−エンシンターゼ、Ｅ−β−オシメン、Ｓ−リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、Ｅ−β−オシメンシンターゼ、ｅｐｉ−セドロールシンターゼ、α−ジンギベレンシンターゼ、グアイアジエンシンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、ｃｉｓ−ムウロラジエンシンターゼ、アフィジコラン−１６ｂ−オールシンターゼ、エリザベスアトリエンシンターゼ、サンダロールシンターゼ、パチョウロールシンターゼ、ジンザノールシンターゼ、セドロールシンターゼ、スカレオールシンターゼ、コパロールシンターゼまたはマノオールシンターゼである。
【００２５】
本明細書中で企図される任意のヌクレオチド配列は、１つ以上の異種性配列および／または１つ以上の相同配列を含み得る。
【００２６】
いくつかの場合において、生成される生成物は、形質転換される生物によって天然に生成され得る。他の場合において、その生成物は、形質転換される生物によって天然ではなく生成される。
【００２７】
いくつかの場合において、生成物（例えば、燃料、燃料供給原料、芳香剤、殺虫剤）は、炭化水素に富んだ分子、例えば、イソプレノイドである。イソプレノイド（イソプレン単位の数によって分類される）は、ヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペンまたはテトラテルペンであり得る。特定の実施形態において、イソプレノイドは、天然に存在するイソプレノイド（例えば、ステロイドまたはカロテノイド）であり得る。カロテノイドのサブクラスには、カロテンおよびキサントフィルが含まれる。いくつかのイソプレノイドは、純粋な炭化水素（例えば、リモネン）であり、その他のものは、炭化水素誘導体（例えば、シネオール）である。
【００２８】
本明細書中の任意のヌクレオチド配列は、形質転換される生物におけるヌクレオチド配列の発現のためにバイアスがかけられたコドンをさらに含み得る。いくつかの場合において、そのヌクレオチド配列内のコドンは、それらのコドンの３つ目のヌクレオチドの位置がＡ／Ｔリッチである。例えば、それらのコドンの３つ目のヌクレオチドの位置の少なくとも５０％が、ＡまたはＴであり得る。他の場合において、それらのコドンは、Ｇ／Ｃリッチであり、例えば、それらのコドンの３つ目のヌクレオチドの位置の少なくとも５０％は、ＧまたはＣであり得る。
【００２９】
本明細書中のヌクレオチド配列は、葉緑体の発現に適合され得る。例えば、本明細書中のヌクレオチド配列は、葉緑体特異的プロモーターまたは葉緑体特異的制御調節領域を含み得る。本ヌクレオチド配列は、核の発現にも適合され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、核特異的プロモーターまたは核特異的制御調節領域を含み得る。その核配列は、葉緑体標的化タンパク質（例えば、葉緑体移行ペプチド）をコードする標的化配列、または内膜系（小胞体内への堆積のため）もしくは原形質膜にタンパク質を導くシグナルペプチドとともにタンパク質をコードし得る。
【００３０】
燃料生成物は、特定の燃料分子の生合成を増加させるように細胞の酵素含有量を変更することによって生成される。例えば、生合成酵素をコードするヌクレオチド配列が、光合成生物の葉緑体内に導入され得る。燃料生合成酵素をコードするヌクレオチド配列は、光合成生物の核ゲノム内にも導入され得る。核ゲノム内に導入されたヌクレオチド配列は、その細胞の細胞質内にその生合成酵素の蓄積を指示し得るか、または光合成生物の葉緑体内にその生合成酵素の蓄積を指示し得る。
【００３１】
本明細書中の任意のヌクレオチド配列が、制御調節配列をさらに含み得る。制御調節配列は、以下のもの：プロモーター、イントロン、エキソン、プロセシングエレメント、３’非翻訳領域、５’非翻訳領域、ＲＮＡ安定エレメントまたは翻訳エンハンサーのうちの１つ以上を含み得る。プロモーターは、以下のもの：上記生物における発現に適合されたプロモーター、藻類のプロモーター、葉緑体プロモーターおよび核プロモーターのうちの１つ以上であり得、これらのいずれもが、天然のプロモーターであってもよいし、合成のプロモーターであってもよい。制御調節配列は、誘導性または自己制御可能（ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ）であり得る。制御調節配列は、自家性および／または異種性の配列を包含し得る。いくつかの場合において、調節配列は、第１の相同配列および第２の相同配列によって隣接され得る。その第１および第２の相同配列は、それぞれ少なくとも５００ヌクレオチド長であり得る。その相同配列は、相同組換えを可能にさせ得るか、または異種性配列を孤立させるように作用することにより、遺伝子発現を促進し得る。
【００３２】
いくつかの場合において、ヌクレオチド配列は、細胞からの生成物（例えば、タンパク質）の分泌を可能にし得る。これらの場合において、本明細書中のヌクレオチド配列は、生物から外部環境への生成物の分泌の速度を高めるか、または分泌を開始するか、もしくは増加させるタンパク質をコードし得る。
【００３３】
本発明はまた、本明細書中の１つ以上のヌクレオチド配列または発現ベクターで形質転換された生物を企図する。そのような生物は、好ましくは、光合成生物であり、例えば、単細胞または多細胞（ｍｕｔｌｉｃｅｌｌｕｌａｒ）であり得る。例えば、そのような生物は、多細胞または単細胞の藻類またはシアノバクテリアであり得る。本明細書中で企図される藻類のいくつかの例としては、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）および植物プランクトンが挙げられる。
【００３４】
本明細書中で企図される生物のいずれもが、本明細書中に記載される発現ベクターのうちの１つ以上で一過性または安定的に形質転換され得る。好ましくは、その生物による生成物の生成は、その生物を生存不能にさせない。
【００３５】
本発明はまた、燃料生成物を生成するための方法も企図する。その方法は、発現ベクターで非維管束光合成生物を形質転換する工程、その生物を生育する工程；およびその生物によって生成された燃料生成物を回収する工程を包含し得る。その発現ベクターは、光合成生物の生合成経路を変更することにより、燃料分子の生成または蓄積の増加を可能にするタンパク質をコードし得る。その発現ベクターはまた、生合成経路内の天然の酵素を変更することにより燃料の生成または蓄積の増加を可能にする調節エレメントをコードし得る。そのベクターはまた、燃料分子の分泌または分泌の増加を可能にするタンパク質または調節エレメントをコードし得る。
【００３６】
本発明はまた、燃料生成物を生成するために適合され、遺伝的に改変された非維管束光合成生物を生育している団体に炭素クレジットを与える工程を包含するビジネス方法を提供する。その生物は、本明細書中に記載される生物のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、炭素クレジットは、以下のもの：実質的に流動性のある通貨代替物（ｍｏｎｅｔａｒｙ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、現在および将来のビジネスチャンスのうちの少なくとも１つの確約（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）、知的財産権に関する法的助成金、政府の税補助金（ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  ｔａｘ  ｓｕｂｓｉｄｙ）、所与の市場の購買者に接触する権利；または上記生物を生育する工程を包含しない炭素排出プロセスの使用権のうちの１つ以上と交換される。炭素クレジットは、実質的に、規制当局から直接与えられ得る。あるいは、炭素クレジットは、実質的に、行政体から直接与えられる。炭素クレジットは、市、郡、州、省（ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ）、国家、地域、多国家および国際的な独立した実体からなる群から選択される少なくとも１つの実体によって管理され得る。
【００３７】
本発明の新規特徴は、添付の請求項に詳細に説明されている。本発明の特徴および利点は、本発明の本質を利用している例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより、よりよく理解されるだろう：
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける、天然に存在する酵素経路の表示である。
【図２】図２は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける酵素経路の改変の一例の表示である。
【図３】図３のパネルＡ〜Ｄは、本発明の核酸構築物の略図を提供している。
【図４】図４のパネルＡ〜Ｄは、ＦＰＰシンターゼおよびビサボレンシンターゼで形質転換されたＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＰＣＲおよびウエスタン解析を示している。
【図５】図５は、ＦＰＰシンターゼおよびビサボレンシンターゼで形質転換されたＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのガスクロマトグラフィ−質量分析解析を示している。
【図６】図６のパネルＡ〜Ｅは、ＦＰＰシンターゼおよびスクワレンシンターゼで形質転換されたＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＰＣＲおよびウエスタン解析を示している。
【図７】図７は、ＦＰＰシンターゼおよびスクワレンシンターゼで形質転換されたＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのガスクロマトグラフィ−質量分析解析を示している。
【図８】図８は、リモネンシンターゼで形質転換されたＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのウエスタン解析を示している。
【図９】図９は、リモネンシンターゼで形質転換されたＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのガスクロマトグラフィ−質量分析解析を示している。
【図１０】図１０のパネルＡ〜Ｃは、ＧＰＰシンターゼで形質転換されたＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＰＣＲおよびウエスタン解析を示している。
【図１１】図１１は、ＦＰＰシンターゼおよびジンギベレンシンターゼで形質転換されたＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＰＣＲおよびウエスタン解析を示している。
【図１２】図１２は、ＦＰＰシンターゼおよびセスキテルペンシンターゼで形質転換されたＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのウエスタン解析を示している。
【図１３】図１３は、ＦＰＰシンターゼおよびセスキテルペンシンターゼで形質転換されたＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおけるフィトール生成のガスクロマトグラフィ−質量分析解析を示している。
【図１４】図１４は、ＦＰＰシンターゼおよびセスキテルペンシンターゼで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉのウエスタン解析を示している。
【図１５】図１５は、ＦＰＰシンターゼおよびセスキテルペンシンターゼで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉにおけるＦＰＰおよびセスキテルペンの生成のガスクロマトグラフィ−質量分析解析を示している。
【図１６】図１６は、本発明の核酸構築物の図示である。
【図１７】図１７は、核からキシラナーゼ２を発現しているＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのウエスタン解析を示している。
【図１８】図１８は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの核および葉緑体において発現された外因性酵素からのキシラナーゼ活性の比較を示している。
【図１９】図１９は、核からエンドグルカナーゼを発現しているＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのウエスタン解析を示している。
【図２０】図２０は、核からＣＢＨ１を発現しているＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのウエスタン解析を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、１つ以上の光合成生物を用いて生成物を生成するための組成物および方法に関する。いくつかの場合において、光合成生物は、非維管束生物（例えば、シアノバクテリア、藻類）である。本明細書中に詳述されるように、非維管束光合成生物（ＮＶＰＯ）は、本発明の生成物の生成をもたらす１つ以上の酵素をコードする、外因性、異種性または自家性の核酸で形質転換され得る。例えば、ＮＶＰＯ（例えば、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）は、所望の生成物（例えば、ビサボレン、スクアレン）の生成をもたらす酵素（例えば、ビサボレンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ）をコードする１つ以上の核酸で形質転換され得る。生成される生成物は、その光合成生物によって天然に生成されるものであってもよいし、天然に生成されないものであってもよい。天然に生成されるとき、生成は、本発明の核酸を導入することによって高められ得る。例えば、所望の生成物（例えば、ジンギベレン、ビサボレン）の生成をもたらす酵素をコードする１つ以上の核酸によるＮＶＰＯの形質転換は、別の生成物（例えば、フィトール）の生成を増加させ得る。なおも別の場合において、複数の生成物が、形質転換されたＮＶＰＯによって生成され得、その複数の生成物は、天然に存在するものであってもよいし、天然に存在しないものであってもよいし、それらの組み合わせであってもよい。本発明の組成物は、１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００またはそれ以上という比の、天然に存在する生成物と天然に存在しない生成物との混合物を含み得る。
【００４０】
本発明の方法によって生成される生成物としては、炭化水素および炭化水素誘導体が挙げられる。ある特定の態様において、炭化水素および／または誘導体は、イソプレノイド（またはテルペノイド）である。本発明によって企図されるイソプレノイドは、任意の数の炭素原子を含み得、５〜５０個の炭素原子を含むイソプレノイドが、典型的である。本発明のイソプレノイドは、形質転換の前にＮＶＰＯによって天然に生成されるもの（例えば、フィトール）であり得るか、または外因性核酸の挿入後にのみ生成され得るものである（例えば、ジンギベレン）。本発明の生成物は、１つ以上の天然に生成されるイソプレノイドに加えて、１つ以上の天然に生成されないイソプレノイドも含み得る。さらに、その生成物は、細胞内に生成され、その生物内に隔離され得る。したがって、生成物の回収は、本発明の生物の１つ以上の細胞の破壊および／またはその生物の周囲の環境からの生成物の回収を含み得る。本発明の生成物の回収は、その細胞を生育している液体環境の全部または一部の回収、その液体環境からの細胞の単離、および生育環境からの単離の前もしくは後におけるその細胞の破壊またはこれらの組み合わせを含み得る。
【００４１】
回収された生成物は、回収後に精製（例えば、精錬）され得る。その生成物は、それが回収された形態で利用され得るか、または回収の前もしくは後に改質され得る。例えば、生成物が、セスキテルペン（Ｃ１５）である場合、そのセスキテルペンは、水素化され得るか、熱分解され得るか、または別の方法で改変され得ることにより、異なる数の炭素原子を有する化合物がもたらされる。いくつかの場合において、生成物の改質は、燃料生成物（例えば、オクタン、ブタン）をもたらし得る。
【００４２】
（生物）
本明細書中の組成物および方法を用いて形質転換され得る生物の例としては、維管束生物および非維管束生物が挙げられる。その生物は、原核生物（ｐｒｏｋａｒｏｙｔｉｃ）または真核生物（ｅｕｋａｒｏｙｔｉｃ）であり得る。その生物は、単細胞または多細胞であり得る。
【００４３】
非維管束光合成生物の例としては、ゼニゴケ植物門（ｍａｒｃｈａｎｔｉｏｐｈｙｔｅｓ）またはツノゴケ植物門（ａｎｔｈｏｃｅｒｏｔｏｐｈｙｔｅｓ）などの蘚苔類（ｂｒｙｏｐｈｔｙｅ）が挙げられる。いくつかの場合において、その生物は、シアノバクテリアである。いくつかの場合において、その生物は、藻類（例えば、大型藻類（ｍａｃｒｏａｌｇａｅ）または微細藻類）である。その藻類は、単細胞または多細胞の藻類であり得る。いくつかの場合において、その生物は、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔｅ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔｅ）、トリボファイト（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔｅ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔｅ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄ）、ハプト藻類（ｈａｐｔｏｐｈｙｔｅ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄ）、ジノフラゲルム（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌｕｍ）または植物プランクトンである。例えば、微細藻類であるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉは、リモネンを生成するリモネンシンターゼをコードするベクターまたはその線状化された部分で形質転換され得る。
【００４４】
本発明の方法は、微細藻類であるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉを用いて例示される。本発明の方法に従ってポリペプチドまたはタンパク質複合体を発現する微細藻類を使用することにより、大きな集団の微細藻類を生育することができ（商業的に生育することを含む（Ｃｙａｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．；Ｋａｉｌｕａ−Ｋｏｎａ  ＨＩ））、ゆえに、大量の所望の生成物の生成、および所望であれば単離が可能になるという利点がもたらされる。一方、例えば、哺乳動物の機能的ポリペプチド（タンパク質複合体を含む）を任意の植物の葉緑体において発現させる能力は、そのような植物の作物の作出を可能にし、ゆえに大量のそのポリペプチドを便利に生成することができる。したがって、本発明の方法は、葉緑体を有する任意の植物（例えば、微細藻類および大型藻類、例えば、海藻および海草が挙げられる）ならびに土壌において生長する植物を用いて実施され得る。
【００４５】
用語「植物」は、プラスチド、特に葉緑体を含む真核生物または植物の一部（植物の切断物、植物細胞、植物細胞培養物、植物の器官、植物の種子または小植物を含む）のことを指すために本明細書中で広く使用され、これには、発生の任意のステージにおけるそのような任意の生物が包含される。植物細胞は、プロトプラストおよび細胞壁を含む、その植物の構造単位および生理学的単位である。植物細胞は、単離された単一の細胞もしくは培養された細胞の形態であり得るか、またはより高度に組織化された単位、例えば、植物組織、植物器官もしくは植物体の一部であり得る。したがって、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子産生細胞、または植物体全体に再生することができる細胞もしくは細胞の集合体であり得る。同様に、複数の植物細胞を含み、かつ植物体全体に再生することができる種子は、本開示の目的のために植物細胞とみなされる。植物の組織または植物の器官は、種子、プロトプラスト、カルス、または構造単位もしくは機能単位に組織化される植物細胞の他の任意の集団であり得る。植物の特に有用な部分としては、収集可能な部分および子孫植物の繁殖のために有用な部分が挙げられる。植物の収集可能な部分は、植物の任意の有用な部分、例えば、花、花粉、実生、塊茎、葉、茎、果実、種子、根などであり得る。繁殖に有用な植物の部分としては、例えば、種子、果実、切断物、実生、塊茎、台木などが挙げられる。
【００４６】
本発明の方法は、安定的に組み込まれたポリヌクレオチドを含むように遺伝的に改変された、葉緑体を含む植物を作出することができる（Ｈａｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｃｋ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５４：３０２−３１０，２０００）。したがって、本発明は、トランスジェニック（トランスプラストミック）植物、例えば、特異的に会合することにより機能性タンパク質複合体を形成し得るポリペプチドをはじめとした１つ以上の異種性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上の葉緑体を含むＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉをさらに提供する。本発明の光合成生物は、生成物を生成するように改変された少なくとも１つの宿主細胞を含む。
【００４７】
（ベクター、形質転換および方法）
本明細書中の生物／宿主細胞は、発現ベクターまたはその線状化された部分を用いて、生成物の生成および／または分泌を改変するように、例えば、生成物の生成および／または分泌を増加させるように、形質転換され得る。その生成物は、その生物によって天然に生成され得るものであるか、または天然ではなく生成され得る。
【００４８】
上記発現ベクターまたはその線状化された部分は、１つ以上の相同性ヌクレオチド配列もしくは異種性ヌクレオチド配列（宿主生物由来または異なる生物由来のヌクレオチド配列）および／または１つ以上の自家性ヌクレオチド配列（まったく同じ生物由来のヌクレオチド配列）および／または相同性ポリペプチドもしくは異種性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をコードし得る。藻類の宿主細胞に形質転換され得る異種性ヌクレオチド配列の例としては、細菌、真菌、植物、光合成細菌または他の藻類由来の遺伝子が挙げられる。藻類の宿主細胞に形質転換され得る自家性ヌクレオチド配列の例としては、２つのホスフェートを用いてイソプレノイドを生成するタンパク質（例えば、ＧＰＰシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ）をコードする遺伝子を含むイソプレノイド生成遺伝子、内在性プロモーターおよびｐｓｂＡ、ａｔｐＡまたはｒｂｃＬ遺伝子由来の５’ＵＴＲが挙げられる。いくつかの場合において、異種性（ｈｅｔｅｒｏｌｇｏｕｓ）配列は、２つの自家性配列または相同配列によって隣接される。相同配列は、その宿主細胞内の配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の相同性を有する配列を包含する。いくつかの場合において、相同配列は、２つの自家性配列によって隣接される。第１および第２の相同配列は、宿主生物のゲノムへの異種性配列の組換えを可能にする。その第１および第２の相同配列は、少なくとも１００、２００、３００、４００または５００ヌクレオチド長であり得る。
【００４９】
上記発現ベクターは、形質転換される生物内での発現に対してコドンバイアスがかけられたヌクレオチド配列を含み得る。当業者は、所与のアミノ酸を指定するヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス（ｃｏｄｏｎ−ｂｉａｓ）」を十分に承知している。理論に拘束されないが、宿主細胞の好ましいコドンを使用することによって、翻訳の割合が上がることがある。ゆえに、宿主細胞における発現を改善するために遺伝子を合成する際は、コドン使用頻度が、その宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくようにその遺伝子を設計することが望ましいことがある。いくつかの生物では、コドンバイアスは、核ゲノムと細胞小器官ゲノムとの間で異なるので、コドンを最適化することまたはコドンにバイアスをかけることは、標的ゲノムに対して行われ得る（例えば、核のコドンにバイアスがかけられる、葉緑体のコドンにバイアスがかけられる）。本発明のコドンは、一般に、Ａ／Ｔリッチ、例えば、コドンの３つ目のヌクレオチドの位置がＡ／Ｔリッチである。典型的には、Ａ／Ｔリッチのコドンバイアスが、藻類に対して用いられる。いくつかの実施形態において、コドンの３つ目のヌクレオチドの位置の少なくとも５０％が、ＡまたはＴである。他の実施形態において、コドンの３つ目のヌクレオチドの位置の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９９％が、ＡまたはＴである。
【００５０】
藻類の遺伝子操作された系統を構築するための１つのアプローチは、目的の遺伝子、典型的には、ある前駆体を燃料生成物または燃料生成物の前駆体に変換することができる酵素をコードする核酸での形質転換を包含する。いくつかの実施形態において、形質転換は、宿主藻類細胞の任意のプラスチド（例えば、葉緑体）中に核酸を導入し得る。形質転換された細胞は、典型的には、外因性核酸の導入後に選択培地上にプレーティングされる。この方法は、スクリーニングのためのいくつかの工程も包含し得る。まず、最初の形質転換体のスクリーニングは、典型的には、どのクローンがその外因性核酸の適切な挿入を有するかを判断するために行われる。適切な組み込みを示すクローンを増殖させ、遺伝的安定性を確実にするために再度スクリーニングする。そのような方法によって、形質転換体が、目的の遺伝子を含んでいることが確実になる。多くの場合において、そのようなスクリーニングは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる；しかしながら、当該分野で公知の他の任意の適切な手法を利用してもよい。ＰＣＲの多くの様々な方法が、当該分野で公知である（例えば、ネステッドＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ）。任意の所与のスクリーニングについて、当業者は、ＰＣＲの成分が、最適なスクリーニング結果を達成するように変更され得ることを認識するだろう。例えば、ＰＣＲが、有毒金属をキレートするためにＥＤＴＡ（マグネシウムをキレートする）が加えられた、破壊された藻類細胞において行われるとき、マグネシウム濃度は、上方調整される必要があり得る。そのような場合において、マグネシウム濃度は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０ｍＭ分、上方または下方調整される必要があり得る（市販のＰＣＲキットにおける標準的な濃度と比べて）。したがって、調整後の、ＰＣＲ反応物中の最終的なマグネシウム濃度は、例えば、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５ｍＭまたはそれ以上であり得る。特定の例が、本明細書中に記載される例において利用される；しかしながら、当業者は、記載される特定のプロトコルの代わりに他のＰＣＲ手法を用いてもよいことを認識するだろう。外因性核酸の適切な組み込みを有するクローンについてスクリーニングした後、クローンは、典型的には、コードされたタンパク質の存在についてスクリーニングされる。タンパク質発現スクリーニングは、典型的には、ウエスタンブロット解析および／または酵素活性アッセイによって行われる。
【００５１】
本発明の方法において有用な組換え核酸分子は、ベクター内に含められ得る。さらに、本方法が、第２（またはそれ以上）の組換え核酸分子を用いて実施される場合、その第２の組換え核酸分子もまた、ベクター内に含めることができ、そのベクターは、第１の組換え核酸分子を含んでいるベクターと同じベクターであり得るが、そうである必要はない。そのベクターは、葉緑体にポリヌクレオチドを導入するために有用な任意のベクターであり得、好ましくは、葉緑体ゲノムＤＮＡ、例えば、葉緑体ゲノムＤＮＡの約４００〜１５００またはそれ以上の実質的に連続的なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列との相同組換えを行うのに十分な葉緑体ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を含む。葉緑体ベクター、およびベクターとして使用するための葉緑体ゲノムの領域を選択するための方法は、周知である（例えば、Ｂｏｃｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１２：４２５−４３８，２００１を参照のこと；また、Ｓｔａｕｂ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：３９−４５，１９９２；Ｋａｖａｎａｇｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５２：１１１１−１１２２，１９９９（これらの各々が、本明細書中で参照により援用される）も参照のこと）。
【００５２】
いくつかの場合において、そのようなベクターは、プロモーターを含む。本発明に有用なプロモーターは、任意の起源（例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生生物、動物）に由来し得る。本明細書中で企図されるプロモーターは、光合成生物、非維管束光合成生物および維管束光合成生物（例えば、藻類、顕花植物）に特異的であり得る。本明細書中で使用されるとき、用語「非維管束光合成生物」とは、高等植物において見られるような維管束系を有しない、任意の巨視的生物または微視的生物のことを指し、それらとしては、藻類、シアノバクテリアおよび光合成細菌が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの場合において、上記の核酸は、光合成生物、例えば、藻類のプロモーターを含むベクターに挿入される。そのプロモーターは、葉緑体および／または他のプラスチドにおいて発現するためのプロモーターであり得る。いくつかの場合において、その核酸は、葉緑体に基づく核酸である。本明細書中の任意の核酸の葉緑体への挿入について企図されるプロモーターの例としては、米国出願番号２００４／００１４１７４に開示されているプロモーターが挙げられる。そのプロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。プロモーターは、典型的には、必要な核酸配列（例えば、ＴＡＴＡエレメント）を転写の開始部位付近に含む。
【００５３】
「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件下および発生条件下において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境制御下または発生制御下において活性であるプロモーターである。誘導性プロモーター／調節エレメントの例としては、例えば、硝酸誘導性プロモーター（Ｂｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７：９（１９９１））または光誘導性プロモーター（Ｆｅｉｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２６：４４９（１９９１）；Ｌａｍ  ａｎｄ  Ｃｈｕａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：４７１（１９９０））または熱応答性プロモーター（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １１１：１６５−７３（１９９２））が挙げられる。
【００５４】
Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの葉緑体ゲノム全体は、ＵＲＬ「ｂｉｏｌｏｇｙ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ／ｃｈｌａｍｙ ｇｅｎｏｍｅ／−ｃｈｌｏｒｏ．ｈｔｍｌ」（「ｖｉｅｗ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｓ  ｔｅｘｔ  ｆｉｌｅ」リンクおよび「ｍａｐｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ｇｅｎｏｍｅ」リンクを参照のこと）（それらの各々が、本明細書中で参照により援用される）においてワールドワイドウェブ上で一般に公開されている（Ｊ．Ｍａｕｌ，Ｊ．Ｗ．Ｌｉｌｌｙ，ａｎｄ  Ｄ．Ｂ．Ｓｔｅｒｎ，未発表の結果；２００２年１月２８日修正；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｅ．Ｎｏ．ＡＦ３９６９２９として公開予定）。一般に、葉緑体ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列は、それが、遺伝子の一部分（調節配列またはコード配列を含む）でないように、特に、相同組換えの事象に起因して破壊される場合に、葉緑体（例えば、葉緑体ゲノムの複製）または葉緑体を含む植物細胞に関して有害な作用をもたらし得る遺伝子の一部分でないように、選択される。この点において、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの葉緑体ゲノム配列を含むウェブサイトは、葉緑体ゲノムのコード領域および非コード領域を示すマップも提供しているので、本発明のベクターの構築に有用な配列の選択が容易になる。例えば、葉緑体ベクターであるｐ３２２は、約１４３．１ｋｂの位置のＥｃｏ（ＥｃｏＲＩ）部位から約１４８．５ｋｂの位置のＸｈｏ（ＸｈｏＩ）部位にわたるクローンである（ワールドワイドウェブのＵＲＬ「ｂｉｏｌｏｇｙ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ／ｃｈｌａｍｙ ｇｅｎｏｍｅ／ｃｈｌｏｒｏ．ｈｔｍｌ」を参照し、「ｍａｐｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ｇｅｎｏｍｅ」リンクおよび「１４０−１５０ｋｂ」リンクをクリックすること；ワールドワイドウェブのＵＲＬ「ｂｉｏｌｏｇｙ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ／ｃｈｌａｍ−ｙ／ｃｈｌｏｒｏ／ｃｈｌｏｒｏｌ４０．ｈｔｍｌ」上でも直接閲覧可能である）。
【００５５】
本発明の実施において利用されるベクターは、望ましい特徴をそのベクターに付与する１つ以上のさらなるヌクレオチド配列も含み得、その配列としては、例えば、そのベクターの操作を容易にするクローニング部位、そのベクターの複製またはその中に含まれるヌクレオチド配列の転写を指示する調節エレメント、選択マーカーをコードする配列などの配列が挙げられる。同様に、そのベクターは、例えばマルチクローニングサイトなどの１つ以上のクローニング部位を含み得、それは、異種性ポリヌクレオチドが、そのベクターに挿入されて、所望のエレメントに作動可能に連結され得るように位置するものであり得るが、そうである必要はない。そのベクターはまた、原核生物の複製起点（ｏｒｉ）、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｏｒｉまたはコスミドのｏｒｉを含み得るので、所望のとおり原核生物宿主細胞ならびに植物の葉緑体においてそのベクターの継代が可能である。
【００５６】
調節エレメントとは、この用語が本明細書中で使用されるとき、ポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳、またはそれが作動可能に連結されるポリペプチドの局在化を制御するヌクレオチド配列のことを広く指す。例としては、ＲＢＳ、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）（開始（ｓｔａｒｔ））コドン、イントロンの切除および正しい読み枠の維持のためのスプライシングシグナル、終止コドン、アンバーコドンまたはオーカーコドン、およびＩＲＥＳが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、細胞区画化シグナル（すなわち、サイトゾル、核、葉緑体膜または細胞膜にポリペプチドを標的化する配列）。本発明のいくつかの態様において、細胞区画化シグナル（例えば、葉緑体標的化配列）は、遺伝子の翻訳（ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ）が葉緑体内で生じるように、遺伝子および／または転写物に連結され得る。他の態様では、細胞区画化シグナルは、遺伝子の翻訳後に、そのタンパク質が葉緑体に輸送されるように、遺伝子に連結され得る。そのようなシグナルは、当該分野で周知であり、広く報告されている。例えば、米国特許第５，７７６，６８９号；Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４（２０）：１４４４４−５４；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９；１８０（３）：５３５−４５を参照のこと。
【００５７】
ベクターまたはその線状化された部分は、レポーターポリペプチドまたは他の選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含み得る。用語「レポーター」または「選択マーカー」とは、検出可能な表現型を付与するポリヌクレオチド（またはコードされたポリペプチド）のことを指す。レポーターは、一般に、検出可能なポリペプチド、例えば、緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼなどの酵素（これらは、適切な物質（それぞれ、特定の波長の光またはルシフェリン）と接触すると、目で検出できるか、または適切な器具を使用することによって検出できるシグナルを生成する）をコードする（Ｇｉａｃｏｍｉｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１１６：５９−７２，１９９６；Ｓｃｉｋａｎｔｈａ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１２１，１９９６；Ｇｅｒｄｅｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８９：４４−４７，１９９６；Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３９０１−３９０７，１９９７、ｆｌ−グルクロニダーゼも参照のこと）。選択マーカーは、一般に、それが細胞内に存在するかまたは発現されるときに、選択的優位性（または選択的非優位性）（例えば、別途その細胞を殺滅し得る物質の存在下において生長する能力）を、そのマーカーを含んでいる細胞に提供する分子である。
【００５８】
選択マーカーは、そのマーカーを発現する原核細胞もしくは植物細胞またはその両方を得るための手段を提供し得るので、本発明のベクターの構成要素として有用であり得る（例えば、Ｂｏｃｋ，前出，２００１を参照のこと）。１つのクラスの選択マーカーは、宿主細胞に生物学的または生理学的な機能を復帰させる（例えば、光合成能力を復帰させる、代謝経路を復帰させる）天然の遺伝子または改変された遺伝子である。選択マーカーの他の例としては、代謝拮抗物質抵抗性を付与するマーカー、例えば、メトトレキサートに対する抵抗性を付与するジヒドロ葉酸還元酵素（Ｒｅｉｓｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．Ａｄｖ．）１３：１４３−１４９，１９９４）；アミノグリコシドであるネオマイシン、カナマイシンおよびパロモマイシンに対する抵抗性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：９８７−９９５，１９８３）、ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｍａｒｓｈ，Ｇｅｎｅ  ３２：４８１−４８５，１９８４）、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：８０４７，１９８８）；細胞がマンノースを利用できるようにするマンノース−６−リン酸イソメラーゼ（ＷＯ９４／２０６２７）；オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチンに対する抵抗性を付与するオルニチンデカルボキシラーゼ（ＤＦＭＯ；ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，１９８７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｅｄ．）；およびブラストサイジンＳに対する抵抗性を付与するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ由来のデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ，ＢｉｏＳｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：２３３６−２３３８，１９９５）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる選択マーカーとしては、除草剤抵抗性を付与するマーカー、例えば、ホスフィノスリシンに対する抵抗性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：１０６２，１９９０；Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７９：６２５−６３１，１９９０）、グリホサート抵抗性を付与する変異ＥＰＳＰＶ−シンターゼ（Ｈｉｎｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９１：９１５−９２２，１９９８）、イミダゾリオン（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｏｎｅ）もしくはスルホニル尿素抵抗性を付与する変異アセト乳酸シンターゼ（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１２４１−１２４８，１９８８）、アトラジンに対する抵抗性を付与する変異ｐｓｂＡ（Ｓｍｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０３：９１１−９１７，１９９３）または変異プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（米国特許第５，７６７，３７３号を参照の���と）、あるいはグルホシネートなどの除草剤に対する抵抗性を付与する他のマーカーが挙げられる。選択マーカーとしては、真核細胞に対してジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはネオマイシン抵抗性およびテトラサイクリン；Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物に対するアンピシリン抵抗性；ならびに植物においてブレオマイシン、ゲンタマイシン、グリホサート、ハイグロマイシン、カナマイシン、メトトレキサート、フレオマイシン、ホスフィノトリシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、スルホンアミドおよびスルホニル尿素抵抗性を付与するポリヌクレオチドが挙げられる（例えば、Ｍａｌｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５，３９頁を参照のこと）。
【００５９】
レポーター遺伝子は、高等植物の葉緑体において首尾よく使用されており、高レベルの組換えタンパク質発現が報告されている。さらに、レポーター遺伝子は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの葉緑体において使用されているが、ほとんどの場合において、非常に少ない量のタンパク質が生成されていた。レポーター遺伝子は、いくつかの生物学的生物における遺伝子発現をモニターする能力を大いに高める。高等植物の葉緑体では、β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ，Ｓｔａｕｂ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：６０１−６０６，１９９３）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ，Ｃａｒｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４１：４９−５６，１９９３）、アデノシル−３−アデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ，Ｓｖａｂ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９０：９１３−９１７，１９９３）およびＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＧＦＰ（Ｓｉｄｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９：２０９−２１６，１９９９）が、レポーター遺伝子として使用されている（Ｈｅｉｆｅｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ８２：６５５−６６６，２０００）。それらを葉緑体遺伝子発現の有用なレポーターにするこれらの遺伝子の各々は、例えば、解析の容易さ、感度またはインサイチュにおいて発現を調べる能力に帰するものである。本研究に基づくと、他の異種性タンパク質（例えば、植食昆虫に対する抵抗性を付与するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのＣｒｙトキシン（Ｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９６：１８４０−１８４５，１９９９）または潜在的な生物製剤であるヒトソマトトロピン（Ｓｔａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３３３−３３８，２０００））は、高等植物の葉緑体において発現される。いくつかのレポーター遺伝子は、真核生物の緑藻類であるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの葉緑体において発現し、そのレポーター遺伝子としては、ａａｄＡ（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４０８３−４０８９  １９９１；Ｚｅｒｇｅｓ  ａｎｄ  Ｒｏｃｈａｉｘ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４：５２６８−５２７７，１９９４）、ｕｉｄＡ（Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９０：４７７−５０１，１９９３３，Ｉｓｈｉｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＢｉｏＳｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：３０７−３１４  １９９９）、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ（Ｍｉｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：４２１−４２５，１９９９）およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉ由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ａｐｈＡ６（Ｂａｔｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ  ２６３：４０４−４１０，２０００）が挙げられる。
【００６０】
本明細書中に記載されるベクターは、１つ以上の組換え的にもたらされる特徴を含む、改変された遺伝子および／またはオープンリーディングフレームを含み得る。例えば、目的のタンパク質をコードする遺伝子は、有用な分子マーカーでタグ化され得る。いくつかの場合において、タグは、エピトープタグまたはタグポリペプチドであり得る。一般に、エピトープタグは、抗体を作製することができるが融合されるポリペプチドの活性を妨害しない程度に十分に短いエピトープを提供する十分な数のアミノ酸残基を含む。好ましくは、タグは、そのタグに対して産生される抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように相当に独特のものである（例えば、ＦＬＡＧタグ）。他の（Ｏｔｈｅ）適切なタグ、例えば、親和性タグを使用してもよい。親和性タグは、親和性の手法を用いて、それが未精製の生物学的起源から精製され得るようにタンパク質に付け足される。そのようなタグの例としては、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）および金属親和性タグ（例えば、ｐｏｌ（Ｈｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃ末端および／またはＮ末端におけるタグの位置は、例えば、タンパク質の機能に基づいて決定され得る。当業者は、適切なタグの選択が、意図される用途、標的タンパク質、コストなどをはじめとした複数の因子に基づくことを認識するだろう。
【００６１】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子に対して行われ得る改変の別の例は、切断部分の付加である。典型的には、切断部分は、プロテアーゼによって標的化される適切な長さのポリペプチドである。そのプロテアーゼは、本発明のベクターに対する宿主であると意図される生物内に天然に存在し得る。例えば、標的宿主が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉである場合、タンパク質は、膜結合型プロテアーゼ（例えば、Ｈｏｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９２  Ｊｕｌｙ；９９（３）：９３２−９３７を参照のこと）またはＣｌｐＰプロテアーゼ（ＮＣＢＩ＃３０５３）によって認識されるアミノ酸領域を含むように操作され得る。他の場合において、口蹄疫ウイルスのＡ２領域（またはその機能部分）などの自己切断型プロテアーゼを利用してもよい。Ｈａｌｐｉｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１９９９；１７（４），４５３−４５９。典型的には、切断部分は、融合タンパク質を含む本発明のベクターに対して利用される。例えば、いくつかの場合において、ベクターは、融合タンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを含み得、切断部分は、融合タンパク質の部分をコードする配列間に挿入され得る（例えば、図１４Ａを参照のこと）。
【００６２】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子に対して行われ得るなおも別の改変は、分泌シグナルの付加である。タンパク質分泌は、典型的には、タンパク質を小胞体、および最終的には細胞膜に標的化する、通常ポリペプチドのＮ末端に位置する疎水性分泌シグナルによって付与される。分泌シグナルによって、ＮＶＰＯをはじめとした数多くの宿主において組換えタンパク質の生成および分泌が可能になる。本発明において利用され得る分泌シグナルの一例は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの炭酸脱水酵素タンパク質由来のシグナルである。Ｔｏｇｕｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８６；１５８，４４３−４５０。多くのそのようなシグナルは、当該分野で公知であり、適切なシグナルの選択は、例えば、宿主細胞およびタンパク質フォールディングに依存する。
【００６３】
いくつかの場合において、本発明のベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの複製起点などのエレメントを含む。適切な選択マーカーと組み合わされるそのような特徴によって、そのベクターが標的宿主細胞と細菌細胞および／または酵母細胞との間を「往復する」ことが可能になる。第２宿主において本発明のシャトルベクターが継代できることにより、そのベクターの特徴をより簡便に操作することが可能になり得る。例えば、ベクターおよび推定上の挿入された目的のポリヌクレオチドを含む反応混合物は、日常的な方法を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物宿主細胞に形質転換され、増幅され、回収され、そして調べられることにより、目的の挿入断片または構築物を含むベクターが同定され得る。所望であれば、そのベクターは、例えば、挿入されたポリヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発を行い、次いで、変異された目的のポリヌクレオチドを有するベクターを再度増幅し、選択することによって、さらに操作され得る。次いで、シャトルベクターを植物細胞葉緑体に導入することができ、ここで、目的のポリペプチドは、本発明の方法に従って発現され、所望であれば、単離され得る。
【００６４】
本発明のポリヌクレオチドまたは組換え核酸分子は、当該分野で公知の任意の方法を用いて、植物の葉緑体または核に導入され得る。ポリヌクレオチドは、当該分野で周知の種々の方法によって細胞に導入され、特定の宿主細胞に基づいて部分的に選択される。例えば、本ポリヌクレオチドは、直接遺伝子導入法、例えば、エレクトロポレーション、またはパーティクルガンを用いるマイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）媒介（遺伝子銃）形質転換を用いるか、または「ガラスビーズ法」を用いるか、または花粉媒介形質転換によるか、リポソーム媒介形質転換によるか、傷つけられたかもしくは酵素で分解された未熟胚、または傷つけられたかもしくは酵素で分解された胚形成カルスを用いる形質転換によって、植物細胞に導入され得る（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２０５−２２５，１９９１）。
【００６５】
用語「外因性」は、言及されているヌクレオチド配列（またはポリペプチド）が、参照起源以外の起源に由来しているか、または通常は結合していない第２のヌクレオチド配列（またはポリペプチド）に連結されているか、または通常は参照材料と会合しない形態であるように改変されていることを示すために比較の意味において本明細書中で使用される。例えば、ある酵素をコードするポリヌクレオチドは、植物の葉緑体のヌクレオチド配列に関して異種性であり、例えば、第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている第１のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子の構成要素も同様であり、葉緑体に導入された変異されたポリヌクレオチドも同様である（この変異ポリヌクレオチドは、通常、葉緑体内に見られない）。
【００６６】
プラスチドの形質転換は、植物細胞の葉緑体にポリヌクレオチドを導入するための方法である（米国特許第５，４５１，５１３号、同第５，５４５，８１７号および同第５，５４５，８１８号；ＷＯ９５／１６７８３；ＭｃＢｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９１：７３０１−７３０５，１９９４を参照のこと）。いくつかの実施形態において、葉緑体の形質転換は、外因性ＤＮＡの相同組換えを可能にする所望のヌクレオチド配列に隣接する葉緑体ＤＮＡの領域を、標的の葉緑体ゲノムに導入することを含む。本明細書中の説明は、宿主細胞がベクターで形質転換され得ることを提供する。当業者は、そのような形質転換には、環状のベクターもしくは線状化されたベクターまたはベクターの線状化された部分での形質転換が包含されることを認識するだろう。したがって、ベクターを含む宿主細胞は、細胞内にベクター全体（環状または線状のいずれかの形態）を含んでもよいし、本発明のベクターの線状化された部分（例えば、図３および１６に図解で示されている構築物）を含んでもよい。いくつかの場合において、葉緑体ゲノムＤＮＡの１〜１．５ｋｂの隣接ヌクレオチド配列が、使用され得る。この方法を用いると、葉緑体１６Ｓ  ｒＲＮＡおよびｒｐｓ１２遺伝子（スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する抵抗性を付与する）における点変異は、形質転換のための選択マーカーとして利用され得（Ｓｖａｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８７：８５２６−８５３０，１９９０）、標的の葉の１００回の衝撃（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）あたり約１回の頻度で安定な同質細胞質の形質転換体がもたらされ得る。
【００６７】
マイクロプロジェクタイル媒介形質転換もまた、ポリヌクレオチドを植物細胞の葉緑体に導入するために使用され得る（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３，１９８７）。この方法は、塩化カルシウム、スペルミジンまたはポリエチレングリコールとともに沈殿することによって所望のポリヌクレオチドでコーティングされた、金またはタングステンなどのマイクロプロジェクタイルを利用するものである。このマイクロプロジェクタイル粒子は、ＢＩＯＬＩＳＴＩＣ  ＰＤ−１０００パーティクルガン（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  Ｃａｌｉｆ）などのデバイスを用いて植物組織に高速度で打ち込まれる（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ）。遺伝子銃法を用いて形質転換するための方法は、当該分野で周知である（例えば；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １：４２３−４３１，１９９６を参照のこと）。マイクロプロジェクタイル媒介形質転換は、例えば、ワタ、タバコ、トウモロコシ、ハイブリッドポプラおよびパパイヤをはじめとした種々のトランスジェニック植物種を作出するために使用されている。重要な禾穀類（例えば、コムギ、カラスムギ、オオムギ、ソルガムおよびイネ）もまた、マイクロプロジェクタイル媒介送達を用いて形質転換されている（Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：４９４−４９８，１９９６；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：１５８−１６２，１９９４）。ほとんどの双子葉植物の形質転換が、上に記載した方法を用いて可能である。単子葉植物の形質転換もまた、例えば、上に記載したような遺伝子銃法、プロトプラスト形質転換、部分的に透過性になった細胞のエレクトロポレーション、ガラス繊維を用いるＤＮＡの導入、ガラスビーズ撹拌法などを用いて形質転換され得る。
【００６８】
形質転換の頻度は、劣性ｒＲＮＡまたはｒ−タンパク質抗生物質耐性遺伝子を優性の選択マーカー（例えば、細菌のａａｄＡ遺伝子（Ｓｖａｂ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９０：９１３−９１７，１９９３））が挙げられるがこれに限定されない）で置き換えることによって上昇し得る。ホモプラスチジック（ｈｏｍｏｐｌａｓｔｉｄｉｃ）状態に達するためには、通常、形質転換後に約１５〜２０の細胞分裂周期が必要である。葉緑体は、多コピーのゲノムを含み得るので、用語「同質細胞質」または「ホモプラスミー」とは、目的の特定の遺伝子座の全コピーが実質的に同一である状態のことを指すことは、当業者には明らかである。プラスチド発現（ここで、各植物細胞に存在する環状プラスチドゲノムの数千コピーのすべてに遺伝子が、相同組換えによって挿入される）は、核で発現される遺伝子に対して莫大なコピー数の利点を利用することにより、可溶性植物タンパク質全体の１０％を容易に超えることができる発現レベルを可能にする。
【００６９】
本発明の方法は、組換え核酸分子を葉緑体に導入することによって行うことができ、ここで、その組換え核酸分子は、少なくとも１つのポリペプチド（すなわち、１、２、３、４つまたはそれ以上）をコードする第１のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０および／またはその以降のポリペプチドに作動可能に連結される。例えば、炭化水素生成経路内のいくつかの酵素は、その経路内の１つの酵素によって生成される生成物が、いったん生成されると、その経路内の次の酵素と近接するように直接または間接的に連結され得る。
【００７０】
葉緑体の形質転換について、本発明の１つの主要な利点は、選択マーカーと目的の１つ以上の遺伝子の両方を含む組換え核酸構築物の利用である。典型的には、葉緑体の形質転換は、２つの構築物（１つは、選択マーカーを含み、第２のものは、目的の遺伝子を含む）を用いる葉緑体の同時形質転換によって行われる。そのような形質転換体のスクリーニングは、多数の理由から面倒であり、かつ時間のかかるものである。第１に、いくつかの形質転換された生物を生育するために必要な時間が長い。第２に、形質転換体は、選択マーカーの存在と目的の遺伝子の存在の両方についてスクリーニングされなければならない。典型的には、目的の遺伝子についての２次スクリーニングは、サザンブロットによって行われる（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７２４６５を参照のこと）。
【００７１】
葉緑体において、遺伝子発現の制御は、一般に、転写後に起き、翻訳開始中に生じることが多い。この制御は、葉緑体の翻訳装置ならびに核によってコードされる制御因子に依存する（Ｂａｒｋａｎ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ８２：５５９−５７２，２０００；Ｚｅｒｇｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ８２：５８３−６０１，２０００を参照のこと）。葉緑体の翻訳装置は、一般に、細菌における装置と似ている；葉緑体は、７０Ｓリボソームを含み；５’キャップを欠くｍＲＮＡを有し、そして一般に３’ポリアデニル化テイルを含まず（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：７００−７５４，１９９４）；そして翻訳は、葉緑体および細菌においてクロラムフェニコールなどの選択物質によって阻害される。
【００７２】
本発明のいくつかの方法は、コード配列に対してリボソーム結合配列（ＲＢＳ）の適切な位置を利用する。そのようなＲＢＳの配置が、植物の葉緑体における頑強な翻訳をもたらすこと（本明細書中で参照により援用される米国出願２００４／００１４１７４を参照のこと）、および葉緑体においてポリペプチドを発現する利点が、そのポリペプチドが典型的には核遺伝子から発現されるポリペプチドによって妨害される細胞内コンパートメントを通らないことであるので、そのポリペプチドは、グリコシル化などの特定の翻訳後修飾に供されないというポリペプチド     をもたらすことが、以前に注目されていた。同様に、本発明のいくつかの方法によって生成されるポリペプチドおよびタンパク質複合体は、そのような翻訳後修飾なしに生成されると予想され得る。
【００７３】
用語「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」または「核酸分子」は、ホスホジエステル結合によって共に連結されている２つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を意味するために、本明細書中で広く使用される。また、これらの用語は、遺伝子またはその一部、ｃＤＮＡ、合成ポリデオキシリボ核酸配列などであり得るＲＮＡおよびＤＮＡを包含し、一本鎖または二本鎖、ならびにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。さらに、これらの用語は、本明細書中で使用されるとき、細胞から単離され得る天然に存在する核酸分子、ならびに例えば化学的合成の方法またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの酵素的方法によって調製され得る合成ポリヌクレオチドを包含する。用語「合成ポリヌクレオチド」が、本明細書中で使用されるとき、葉緑体のコドン使用頻度を反映するように改変されているポリヌクレオチドのことを指すことを除いて、例えば、組成物の様々な構成要素を区別するために考察の都合のためだけに様々な用語が用いられることを認識するべきである。
【００７４】
一般に、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、２’−デオキシリボースに連結された天然に存在するデオキシリボヌクレオチド（例えば、アデニン、シトシン、グアニンまたはチミン）またはリボースに連結されたリボヌクレオチド（例えば、アデニン、シトシン、グアニンまたはウラシル）である。しかしながら、その用途に応じて、ポリヌクレオチドは、天然に存在しない合成ヌクレオチドまたは天然に存在する修飾ヌクレオチドをはじめとしたヌクレオチドアナログも含み得る。ヌクレオチドアナログは、当該分野で周知であり、市販されており、そのようなヌクレオチドアナログを含むポリヌクレオチドも同様である（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５２２０−５２３４，１９９４；Ｊｅｌｌｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１３６３−１１３７２，１９９５；Ｐａｇｒａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８−７３，１９９７）。一般に、ホスホジエステル結合が、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチドを連結する；しかしながら、チオジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ペプチド様結合および当該分野で公知の他の任意の結合をはじめとした他の結合が、合成ポリヌクレオチドを生成するために利用され得る（Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：９７７−９８６，１９９４；Ｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒｏｏｋｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３５１３６０，１９９５）。
【００７５】
本明細書中に記載される任意の生成物は、生物によって生成物の生成および／または分泌が引き起こされるように、そのような生物を形質転換することによって調製され得る。形質転換の事象が、形質転換された生物の光合成能力を破壊するかまたは減少させても（例えば、外因性核酸が、光合成に必要なタンパク質をコードする遺伝子に挿入されても）、その生物は、光合成生物であるとみなされる。
【００７６】
（融合タンパク質ベクター）
本発明のいくつかの実施形態において、宿主ＮＶＰＯの核ゲノムまたはプラスチドゲノムは、融合タンパク質を含む構築物での形質転換について標的化される。本明細書中に記載される任意のベクターまたはその線状化された一部は、適切なシグナル（例えば、宿主細胞の核複製起点またはプラスチド複製起点）または適切な隣接相同領域（標的ゲノムとの相同組換え用）を組み込むことによって、核またはプラスチドの形質転換のために改変され得る。本発明のいくつかの構築物は、図１４に図解によって示されている。図１４Ａに示されている構築物は、少なくとも１つの調節エレメント（「プロモーター／５’ＵＴＲ」および／または「３’ＵＴＲ」）、および少なくとも２つのエレメント（「選択マーカー」および「トランスジーン」）を含むオープンリーディングフレーム（すなわち、融合タンパク質）を含む。いくつかの場合において、調節エレメントのうちの１つ以上が、形質転換される生物にとって内在性であり得る（例えば、５’および３’調節エレメントは、標的ゲノムへの構築物の挿入を指示する隣接相同区分である）。この図において、プロモーターが、オープンリーディングフレームに作動可能に連結されているので、融合タンパク質の発現がもたらされる。そのようなアプローチを用いる１つの潜在的な利点は、組換え事象、発現の低下、またはトランスジーン（すなわち、イソプレノイドを生成する酵素）の欠失もしくは低発現をもたらし得る他の作用を防止することである。さらに、選択マーカーおよびトランスジーンを含む融合タンパク質を作製することによって、挿入部位を保存することにより、多数回形質転換された（ｍｕｌｔｉｐｌｙ−ｔｒａｎｆｏｒｍｅｄ）系統が作製され得る。しかしながら、いくつかの場合において、融合タンパク質は、２つ以上のトランスジーン（例えば、ＦＰＰシンターゼおよびジンギベレンシンターゼ）を含み得る。
【００７７】
選択マーカーおよびトランスジーンとインフレームの任意の切断部分（「ＣＭ」）の包含もまた、図１４Ａに示される。上に記載したように、この切断部分は、存在するとき、選択マーカーからの目的の遺伝子の切断を可能にし得る。典型的には、この切断部分における切断は、２つの機能タンパク質（例えば、選択マーカーおよびトランスジーン）をもたらす。切断は、隣接するポリペプチドの一方もしくは両方に残存するか、または両方に存在しない、切断部分の一部をもたらし得る。切断は、翻訳後または翻訳中に起き得る。したがって、いくつかの実施形態において、選択マーカー、トランスジーンおよび介在切断部分からなる融合タンパク質が、宿主細胞内に存在し得る。他の実施形態において、その融合タンパク質は、完全長の融合タンパク質転写物の翻訳の前に切断される。
【００７８】
他の改変を、融合タンパク質（または本明細書中に記載されるタンパク質の他の任意のタンパク質およびクラス）をコードする配列に対して行ってもよい。１つの例は、リンカーポリペプチドである。そのようなポリペプチドは、目的のタンパク質の空間的隔離をもたらし得、融合タンパク質の一部の適切なフォールディングを可能にし得、そして／または融合タンパク質の組換え構築から生じ得る。別の例では、分泌シグナルは、融合タンパク質の１つ以上の部分（例えば、トランスジーン、選択マーカーまたはその両方）にインフレームで融合され得る。典型的には、分泌シグナルは、核ゲノムにおける発現のために標的化された融合タンパク質のために利用される。他の場合では、１つ以上のタグは、融合タンパク質の１つ以上の部分とインフレームで融合され得る。例えば、ポリ（Ｈｉｓ）タグをコードするヌクレオチド配列は、トランスジーンをコードする配列とインフレームで連結され得、ＦＬＡＧタグをコードするヌクレオチド配列は、選択マーカーをコードする配列とインフレームで連結される。なおも他の場合では、分泌シグナルをコードする核酸は、融合タンパク質の一部とインフレームで結合され得る。いくつかの場合において、分泌シグナルは、トランスジーンに結合される。明らかであるように、選択マーカー、トランスジーン、切断部分、シグナル配列および／またはタグの複数の組み合わせが、実行者の必要性に基づいて単一のオープンリーディングフレーム中で組み合わされ得る。したがって、図１４に示される構築物の単純化されたバージョンは、本発明の構築物の範囲について限定すると意味しない。当業者は、そのような構成要素の組み合わせが、葉緑体を形質転換するために使用される構築物においても利用され得ることも認識するだろう。
【００７９】
図１４Ｂは、形質転換構築物が、異なる調節エレメントの制御下で、選択マーカーおよびトランスジーンを含んでいる核の形質転換に対する別のアプローチを示している。示されていないが、そのような構築物は、上に記載したような切断部分、分泌シグナルおよび／またはタグを含み得る。
【００８０】
（核酸、タンパク質および酵素）
本明細書中で開示されるベクターおよび他の核酸は、本明細書中に記載される生成物の中間体、生成物、前駆体および誘導体の生成を促進するポリペプチドをコードし得る。例えば、それらのベクターは、イソプレノイド経路内の中間体、生成物、前駆体および誘導体の生成を促進するポリペプチドをコードし得る。
【００８１】
本発明を実施する際に利用される酵素は、細菌、植物、真菌および動物をはじめとした任意の生物に由来するヌクレオチド配列によってコードされ得る。いくつかの場合において、それらの酵素は、イソプレノイド生成酵素である。本明細書中で使用されるとき、「イソプレノイド生成酵素」は、イソプレノイドの生成をもたらすか、または増加させる、天然に存在する酵素または天然に存在しない酵素である。いくつかの場合において、イソプレノイド生成酵素は、２つのリン酸基を用いてイソプレノイドを生成する（例えば、  ＧＰＰシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、ＤＭＡＰＰシンターゼ）。他の場合において、イソプレノイド生成酵素は、０、１、３個もしくはそれ以上のホスフェートを用いてイソプレノイドを生成するか、または他の官能基を用いてイソプレノイドを生成し得る。そのような酵素の非限定的な例およびそれらの起源を表１に示す。本発明において有用な酵素および他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の手段（例えば、クローニング、サブクローニングおよびＰＣＲが挙げられるがこれらに限定されない）によって単離および／または合成され得る。
【００８２】
【表１】
2010538616.tif 000003
【００８３】
【表２】
2010538616.tif 000004
【００８４】
上記シンターゼは、ボトリオコッセンシンターゼ、β−カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンＡシンターゼ、８−エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、（＋）−δ−カジネンシンターゼ、ゲルマクレンＣシンターゼ、（Ｅ）−β−ファルネセンシンターゼ、カスベンシンターゼ、ベチスピラジエンシンターゼ、５−ｅｐｉ−アリストロケンシンターゼ、アリストロケンシンターゼ、α−フムレン、（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセンシンターゼ、（−）−β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、（＋）−ボルニル二リン酸シンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、（Ｅ）−γ−ビサボレンシンターゼ、コパリルピロリン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、ロンギホレンシンターゼ、γ−フムレンシンターゼ、δ−セリネンシンターゼ、β−フェランドレンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、（＋）−３−カレンシンターゼ、ｓｙｎ−コパリル二リン酸シンターゼ、α−テルピネオールシンターゼ、ｓｙｎ−ピマラ−７，１５−ジエンシンターゼ、ｅｎｔ−サンダラコピマラジエンシンターゼ、ステルネル−１３−エンシンターゼ、Ｅ−β−オシメン、Ｓ−リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、Ｅ−β−オシメンシンターゼ、ｅｐｉ−セドロールシンターゼ、α−ジンギベレンシンターゼ、グアイアジエンシンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、ｃｉｓ−ムウロラジエンシンターゼ、アフィジコラン−１６ｂ−オールシンターゼ、エリザベスアトリエンシンターゼ、サンダロールシンターゼ、パチョウロールシンターゼ、ジンザノールシンターゼ、セドロールシンターゼ、スカレオールシンターゼ、コパロールシンターゼまたはマノオールシンターゼでもあり得る。
【００８５】
本発明のベクターは、複数の光合成生物（例えば、光合成細菌（シアノバクテリアを含む）、藍色植物門（ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、原核緑色植物門（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、黄金色植物門（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、渦鞭毛植物門（ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、プリムネシウム植物門（ｐｙｒｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ）、珪藻植物門（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、黄緑色植物門（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）、ユースティグマトフィータ（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）、ラフィド藻門（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）および植物プランクトンが挙げられるがこれらに限定されない）の安定な形質転換が可能であり得る。本発明の他のベクターは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａの安定な形質転換が可能である。
【００８６】
本明細書中のベクターは、メバロン酸経路において役割を有するポリペプチド（例えば、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｅｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）およびメバロン酸−５−ピロリン酸デカルボキシラーゼ）をコードし得る。他の実施形態において、それらのポリペプチドは、非メバロン酸経路内の酵素（例えば、ＤＯＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクターゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４，−シクロ二リン酸シンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰシンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰレダクターゼまたはＤＯＸＰレダクトイソメラーゼ）である。
【００８７】
他の場合において、ベクターは、イソプレノイド経路内のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、シンターゼコード配列）を含み得る。そのシンターゼは、Ｃ１０、Ｃ１５、Ｃ２０、Ｃ３０またはＣ４０シンターゼであり得る。いくつかの実施形態において、そのシンターゼは、リモネンシンターゼ、１，８シネオールシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、カンフェンシンターゼ、（＋）−サビネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼ、タキサジエンシンターゼ、ファルネシルピロリン酸シンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、（Ｅ）−α−ビサボレンシンターゼ、ジアポフィトエンシンターゼまたはジアポフィトエンデサチュラーゼである。シンターゼおよびそれらのアミノ酸配列の非限定的な例を表２に示す。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
【表４】
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【００９０】
【表５】
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【００９１】
【表６】
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【００９２】
【表７】
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【００９３】
【表８】
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【００９４】
【表９】
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【００９５】
【表１０】
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【００９６】
【表１１】
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【００９７】
【表１２】
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【００９８】
【表１３】
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【００９９】
【表１４】
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【０１００】
コードしているポリヌクレオチドの１つ以上のコドンは、葉緑体および／または核のコドン使用頻度を反映するようにバイアスがかけられ得る。ほとんどのアミノ酸は、２つ以上の異なる（縮重）コドンによってコードされ、様々な生物が、ある特定のコドンを他のコドンに優先して利用することが十分に認識されている。葉緑体においても利用されるそのような優先的なコドン使用頻度は、「葉緑体コドン使用頻度」と本明細書中で呼ばれる。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのコドンバイアスは、報告されている。米国出願２００４／００１４１７４を参照のこと。Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける発現のためにバイアスがかけられたイソプレノイド生合成酵素をコードする核酸の例を表５〜８に提供する。天然配列（その配列が単離された生物内の配列）の同一性パーセントは、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ以上であり得る。本発明のいくつかのベクターは、表５に提供される核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）および／またはそれらに対して約７０％の同一性を有する核酸の１つ以上を含む。
【０１０１】
核酸配列間またはポリペプチド配列間のパーセント配列同一性または配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの１つの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータのＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列をデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、パーセント配列同一性の計算に加えて、２つの配列間の類似性の統計解析も行うことができる（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの基準は、最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチが偶然起き得る確率を示す。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは、約０．０１未満、最も好ましくは、約０．００１未満である場合に、核酸は、参照配列と類似であると考えられる。
【０１０２】
用語「バイアスがかけられた」は、コドンに関して使用されるとき、ポリヌクレオチド内のコドンが、バイアスをかける対象である標的、例えば、藻類細胞、葉緑体において優先的に使用されるものになるようにそのコドンの配列が変更されていることを意味する。葉緑体のコドン使用頻度についてバイアスがかけられたポリヌクレオチドは、新規に合成され得るか、または日常的な組換えＤＮＡ技術を用いて、例えば、部位特異的突然変異誘発法によって遺伝的に改変され得ることにより、１つ以上のコドンが変更され、葉緑体のコドン使用頻度についてバイアスがかけられる。葉緑体のコドンバイアスは、様々な植物において多様に歪められ得る（例えば、タバコと比べて藻類の葉緑体におけるものなど）。一般に、選択される葉緑体のコドンバイアスは、本発明の核酸で形質転換される植物の葉緑体のコドン使用頻度を反映する。例えば、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉが宿主である場合、葉緑体のコドン使用頻度は、藻類の葉緑体のコドン使用頻度を反映するようにバイアスがかけられる（コドンの３つ目の位置において約７４．６％のＡＴバイアス）。
【０１０３】
本発明の１つの方法は、第１のポリペプチドおよび少なくとも第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて行われ得る。同様に、そのポリヌクレオチドは、例えば、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド；第１のポリペプチド、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチド；などをコードし得る。さらに、コードされるポリペプチドのいずれかまたはすべてが、同じものであり得るか、または異なるものであり得る。微細藻類のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの葉緑体において発現されるポリペプチドは、組み立てられることにより、機能的なポリペプチドおよびタンパク質複合体を形成し得る。同様に、本発明の方法は、機能タンパク質複合体（例えば二量体、三量体および四量体を含む）を生成する手段を提供し、ここで、その複合体のサブユニットは、同じものであり得るか、または異なるものであり得る（例えば、それぞれ、ホモ二量体またはヘテロ二量体）。
【０１０４】
用語「組換え核酸分子」は、人間の介入によって操作されたポリヌクレオチドのことを指すために本明細書中で使用される。組換え核酸分子は、その生成物が天然には細胞内に見られないような様式で連結された２つ以上のヌクレオチド配列を含み得る。特に、その２つ以上のヌクレオチド配列は、作動可能に連結され得、例えば、融合ポリペプチドをコードし得るか、またはコードするヌクレオチド配列および調節エレメントを含み得る。組換え核酸分子は、天然に存在するポリヌクレオチドに基づき得るが、天然に存在するポリヌクレオチドと異ならせるために操作される（例えば、葉緑体のコドン使用頻度についてのバイアス、制限酵素部位の挿入、プロモーターの挿入、複製起点の挿入）。組換え核酸分子は、細胞内でのポリペプチドの発現の同定を容易にし得るペプチドタグ（例えば、Ｈｉｓ−６タグ）をさらに含み得る。さらなるタグとしては、例えば：ＦＬＡＧエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ；ビオチン；およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼが挙げられる。そのようなタグは、当該分野で公知の任意の方法（例えば、抗タグ抗体、ストレプトアビジン）によって検出され得る。そのようなタグは、作動可能に連結されたポリペプチドを、例えばアフィニティークロマトグラフィによって単離するためにも使用され得る。
【０１０５】
天然に存在するヌクレオチドおよびホスホジエステル結合を含むポリヌクレオチドは、化学的に合成され得るか、または適切なポリヌクレオチドを鋳型として用いる組換えＤＮＡ法を用いて生成され得る。比較として、ヌクレオチドアナログまたはホスホジエステル結合以外の共有結合を含むポリヌクレオチドは、通常、化学的に合成されるが、Ｔ７ポリメラーゼなどの酵素は、ある特定のタイプのヌクレオチドアナログをポリヌクレオチドに組み込むことができるので、それを使用することにより、そのようなポリヌクレオチドを適切な鋳型から組換え的に生成することができる（Ｊｅｌｌｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，前出，１９９５）。本発明の方法を実施するために有用なポリヌクレオチドは、任意の生物から単離され得る。
【０１０６】
本発明は、ＮＶＰＯにおける天然に存在する生成物の生成経路を利用し得る。そのような経路（フィトールおよびβ−カロテンの生成のための経路）の例を図１に示す。当業者は、このイソプレノイド生成経路が、単に１つの実施形態をさらに説明する例として提供されることを認識するだろう。
【０１０７】
本発明の一態様は、天然に存在しない生成物を生成するため、および／または天然に存在する生成物の生成を増加させるためにフィトール／β−カロテン経路を改変するものである。図２は、図１に図示される経路の改変に対する１つの可能性を図示している。外因性ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）および／またはファルネシル（ｆａｒｓｅｎｙｌ）二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）を挿入することによって、ＧＰＰおよびＦＰＰの生成が増加し得る。例えば、宿主生物（例えば、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎｄ）は、表５または７に列挙されるＧＰＰまたはＦＰＰシンターゼをコードする配列のいずれか（例えば、配列番号８２、８７〜９４、１１８および／または１８０〜１９１）で形質転換され得る。さらに、下記の実施例において例示されるように、ＧＰＰＳまたはＦＰＰＳの導入は、天然にはＮＶＰＯによって生成されない、目的のイソプレノイド（例えば、モノテルペン、セスキテルペンおよびトリテルペン）の生成をもたらす酵素（例えば、リモネンシンターゼ、ジンギベレンシンターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼ（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ））をコードする外因性遺伝子の挿入によって達成され得る。ＮＶＰＯを単独または組み合わせで形質転換するために使用され得る酵素の非限定的なリストは、表５〜８に提供されている。
【０１０８】
本発明の酵素をコードする遺伝子の挿入は、天然に存在するイソプレノイド（例えば、ＧＰＰ、ＦＰＰ、フィトール、フィトエン、β−カロテン）の生成を増加させ得る。例えば、天然に存在するイソプレノイド（例えば、ＧＰＰ、ＦＰＰ、フィトエン）の生成は：１）上記イソプレノイドを生成する合成酵素をコードする余分なコピー数の内因性または外因性の遺伝子を導入すること；２）天然に存在する合成酵素の発現を調節する調節エレメント（例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター）を導入すること；および／または３）天然に存在するイソプレノイドの生成を、間接的な経路を介して増加させる外因性核酸を導入することによって増加し得る（例えば、外因性ＧＰＰＳがＧＰＰの細胞内濃度を上昇させることにより、フィトール／クロロフィル合成経路に対してより多くの基質が提供され得る）。
【０１０９】
したがって、ある特定の天然に存在するイソプレノイドの生成が増加し得る。例示のみの目的で、イソプレノイドであるフィトールは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉをはじめとしたいくつかのＮＶＰＯによって天然に生成される。一般に、野生型のＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおけるフィトールの量は、１重量％未満である。本開示は、フィトールの生成を増加させ得るいくつかのメカニズムを提供する。１つの例では、内在性遺伝子（例えば、ＧＰＰシンターゼ）の構成的発現または誘導性発現をもたらす調節エレメントをその生物のゲノム内に導入することにより、天然に存在する調節エレメントによって達成されるレベルよりも高いレベルでその遺伝子が発現され得る。あるいは、１つ以上の外因性イソプレノイドシンターゼを、その生物のゲノム内に導入し得る。そのようなシンターゼは、標的のＮＶＰＯに対して相同性であってもよいし、相同性でなくてもよい（例えば、関連する生物由来のＧＰＰシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ）。あるいは、外因性酵素（例えば、ホスファターゼ、ピロホスファターゼ）を標的ＮＶＰＯに導入してもよい。そのような酵素は、天然に存在する基質（例えば、ＧＧＰＰ、フィチル二リン酸）に対して作用し得るか、または宿主ＮＶＰＯに導入された他の外因性遺伝子によって生成される基質に対して作用し得る。いくつかの場合において、外因性酵素は、目的のイソプレノイド（例えば、フィトール）を生成し得るか、またはその後で目的のイソプレノイドを生成するように作用する酵素に対する前駆体を生成し得る。なおも別のアプローチでは、宿主ＮＶＰＯによって生成される生成物の分解を引き起こす酵素を、導入するか、またはアップレギュレートする（天然に、または導入された遺伝子の結果として）ことによって、目的のイソプレノイドを生成し得る。例えば、クロロフィリドヒドロラーゼは、クロロフィルからフィトールへの分解を促進するために宿主細胞に導入され得る。
【０１１０】
そのようなアプローチを利用することにより、改変されたＮＶＰＯは、約１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４．０％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５．０％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、５．６％、５．７％、５．８％、５．９％、６．０％、６．１％、６．２％、６．３％、６．４％、６．５％またはそれ以上を含み得る。所望であれば、改変されたＮＶＰＯからフィトールを回収することができ、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７６％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上に濃縮することができる。いくつかの場合において、本発明のＮＶＰＯから回収されたフィトールを含む組成物は、ＮＶＰＯの細胞の一部（例えば、細胞壁の物質、細胞膜の物質、タンパク質、炭水化物、核酸など）も含み得る。
【０１１１】
本発明のために利用される経路は、サイトゾル内、プラスチド（例えば、葉緑体）内、またはその両方に存在する酵素が関与し得る。本発明の実施形態の酵素をコードする外因性核酸は、コードされる酵素がサイトゾル内もしくはプラスチド内またはその両方において活性であるように宿主細胞に導入され得る。いくつかの実施形態において、１つの細胞内コンパートメント（例えば、サイトゾル）内に存在する天然に存在する酵素は、宿主細胞の形質転換後に、異なる細胞内の場所（例えば、葉緑体）または天然に存在する場所と天然に存在しない場所の両方において発現され得る。
【０１１２】
この概念を説明するため、および単に例として、リモネン（特殊化学および石油化学産業において高い価値のある分子）などのイソプレノイドを生成するように、非維管束光合成微細藻類種を遺伝的に操作し得る。リモネンは、水素原子および炭素原子のみから構成される純粋な炭化水素であるモノテルペンである。リモネンは、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｅｉｎｈａｒｄｉｉ種では天然に生成されない。これらの微細藻類におけるリモネンの生成は、葉緑体において異種性のリモネンシンターゼ酵素を発現するように微細藻類を操作することによって達成され得る。リモネンシンターゼは、テルペン前駆体のゲラニルピロリン酸をリモネンに変換することができる。ゲラニルピロリン酸は、リモネンとは異なり、微細藻類の葉緑体内に天然に存在する。リモネンシンターゼの発現は、微細藻類の葉緑体ゲノム内にリモネンシンターゼをコードする異種性遺伝子を挿入することによって達成され得る。次いで、改変された系統の微細藻類を同質細胞質にすることにより、リモネン遺伝子がすべての子孫の葉緑体ゲノム内に安定的に維持されることを確実にする。挿入された遺伝子が葉緑体ゲノムの全コピーに存在するとき、微細藻類は、遺伝子について同質細胞質である。葉緑体は、複数のコピーのゲノムを含み得るので、用語「同質細胞質」または「ホモプラスミー」とは、目的の特定の遺伝子座の全コピーが実質的に同一である状態のことを指すことは、当業者には明らかである。プラスチド発現（ここで、相同組換えによって、各植物細胞に存在する数千コピーの環状プラスチドゲノムのすべてに遺伝子が挿入されている）は、全可溶性植物タンパク質の１０％を容易に超えることができる発現レベルを可能にする、核で発現された遺伝子より多いコピー数という利点を利用する。
【０１１３】
簡潔には、本発明の生物の細胞質の状態（ｐｌａｓｍｉｃ  ｓｔａｔｅ）を判定するプロセスは、目的の所与の遺伝子座における外因性核酸の存在および野生型核酸の非存在について形質転換体をスクリーニングすることを包含する。そのようなアプローチは、下記の実施例１および２において利用される（図４Ａ〜Ｃおよび６Ａ〜Ｃ）。
【０１１４】
本明細書中の任意のベクター（例えば、上に記載された発現ベクターのいずれかを含む）は、形質転換された生物によって生成される生成物の分泌を可能にするか、または改善するタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。そのタンパク質またはポリペプチド分子は、宿主細胞または生物から生成物の分泌をもたらすか、増加させるか、アップレギュレートするか、または調節する。
【０１１５】
発現ベクターは、生成物分子の分泌を可能にするか、または改善するタンパク質またはポリペプチドをコードする配列およびイソプレノイド経路からのシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０１１６】
（選択マーカー）
いくつかの場合において、発現ベクター内の異種性配列は、形質転換された生物を選択するための優性選択マーカーをコードする。したがって、形質転換に供された生物は、形質転換された宿主細胞の優性選択を可能にする化合物（例えば、優性選択マーカーが抵抗性を付与する化合物）の存在下において培養され得る。宿主生物において発現されるときに選択マーカーが抵抗性を付与する化合物の例としては、代謝阻害剤（すなわち、藻類の代謝を阻害する化合物）、例えば、抗生物質、殺真菌剤、殺藻剤、殺菌剤および除草剤が挙げられる。機能的には、そのような化合物は、細胞に対して有毒であり得るか、またはタンパク質結合物質もしくは核酸結合物質として機能することによって代謝を別途阻害し得る。例えば、そのような化合物は、翻訳、転写、酵素機能、細胞増殖、細胞分裂および／または微小管形成を阻害することができる。本発明において使用するのに適した優性選択マーカーは、任意の公知の選択マーカーまたは後に同定される選択マーカー（真菌および細菌の起源に由来するマーカーを含む（例えば、米国特許第５，６６１，０１７号を参照のこと））から選択され得る。他の実施形態において、栄養要求性変異株を補完する野生型の相同遺伝子も、選択マーカー系として例えばいくつかの緑藻類において使用され得る（例えば、硝酸レダクターゼをコードする遺伝子によるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの硝酸レダクターゼ欠損変異体の形質転換について考察しているＫｉｎｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１０９：２５８９−２６０１（１９８９）を参照のこと）。
【０１１７】
（制御調節配列）
本明細書中の任意の発現ベクターは、制御調節配列をさらに含み得る。制御調節配列には、例えば、プロモーター、オペレーター、リプレッサー、エンハンサー、転写終結配列、翻訳を制御する配列、または宿主細胞と適合し、本発明の核酸分子の発現を調節する他の制御調節配列が包含され得る。いくつかの場合において、制御調節配列は、転写の開始、伸長および／または終結を管理できるか、調節できるか、またはもたらすことができる転写調節配列を包含する。例えば、制御調節配列は、ある生物において遺伝子または遺伝子産物の転写および翻訳の速度および／または効率を増加させることができ、ここで、その遺伝子または遺伝子産物の発現がアップレギュレートされることにより、本明細書中に記載される生成物の生成、分泌またはその両方が増加する（直接または間接的に）。制御調節配列はまた、遺伝子または遺伝子産物の安定性を高めることによって、生成物の生成、分泌またはその両方を増加させ得る。
【０１１８】
制御調節配列は、自家性または異種性であり得、異種性である場合は、相同性であり得る。制御調節配列は、生成物の発現および生成を促進する酵素である１つ以上のポリペプチドをコードし得る。例えば、異種性の制御調節配列は、その生物と同じ属の別の種（例えば、別の藻類種）に由来してもよく、藻類においてシンターゼをコードし得るものである。別の例では、自家性の制御調節配列は、発現ベクターが発現される生物に由来し得る。
【０１１９】
誘導性の発現または構成的な発現をもたらす制御調節配列は、用途に応じて使用され得る。上記の藻類の制御調節配列が、使用され得、それらは、核、ウイルス、染色体外、ミトコンドリアまたは葉緑体起源であり得る。
【０１２０】
適当な制御調節配列としては、発現されるヌクレオチド配列と天然に会合している配列（例えば、天然において藻類由来のヌクレオチド配列と作動可能に連結されている藻類のプロモーター）が挙げられる。適当な制御調節配列としては、発現される核酸分子と天然には会合していない制御調節配列（例えば、別の生物または藻類種のヌクレオチド配列に作動可能に連結された藻類の１つの種のプロモーター）が挙げられる。後者の制御調節配列は、同じ種の中の別の遺伝子の発現を調節する配列（すなわち、自家性）であり得るか、または異なる生物もしくは種に由来し得る（すなわち、異種性）。
【０１２１】
推定上の制御調節配列が適当であるか否かを判定するために、その推定上の制御調節配列を、典型的には、容易に検出可能なシグナルを生成するタンパク質をコードする核酸分子に連結する。次いで、その構築物を、標準的な手法によって藻類または他の生物に導入し、その発現をモニターする。例えば、その核酸分子が優性選択マーカーをコードする場合、使用される藻類または生物は、そのマーカーが抵抗性を与える化合物の存在下において生長する能力について試験される。
【０１２２】
いくつかの場合において、制御調節配列は、プロモーター、例えば、非維管束光合成生物におけるヌクレオチド配列の発現に適合されたプロモーターである。例えば、そのプロモーターは、例えば、米国出願公開番号２００６／０２３４３６８および２００４／００１４１７４ならびにＨａｌｌｍａｎｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１：８１−９８（２００７）に記載されているような藻類のプロモーターであり得る。そのプロモーターは、葉緑体特異的プロモーターまたは核プロモーターであり得る。そのプロモーターは、ＥＦ１−α遺伝子プロモーターまたはＤプロモーターであり得る。いくつかの実施形態において、上記シンターゼは、ＥＦ１−α遺伝子プロモーターに作動可能に連結される。他の実施形態において、上記シンターゼは、Ｄプロモーターに作動可能に連結される。
【０１２３】
本明細書中の制御調節配列は、種々の位置（例えば、コード領域および非コード領域、５’非翻訳領域（例えば、コード領域から上流の領域）および３’非翻訳領域（例えば、コード領域から下流の領域）を含む）に見られる。したがって、いくつかの場合において、自家性または異種性のヌクレオチド配列は、１つ以上の３’もしくは５’非翻訳領域、１つ以上のイントロンまたは１つ以上のエキソンを含み得る。
【０１２４】
例えば、いくつかの実施形態において、制御調節配列は、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａのアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ５’非翻訳制御調節配列またはＣｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａのアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ３’非翻訳制御調節配列（米国特許第５，６６１，０１７号）を含み得る。
【０１２５】
制御調節配列は、異種性のヌクレオチド配列およびタンパク質の発現を促進するキメラポリペプチドまたは融合ポリペプチド（例えば、プロテインＡＢすなわちＳＡＡ）もコードし得る。他の制御調節配列としては、異種性配列の翻訳を促進し得る自家性イントロン配列が挙げられる。
【０１２６】
本明細書中の任意の発現ベクターにおいて使用される制御調節配列は、誘導性であり得る。プロモーターなどの誘導性の制御調節配列は、例えば、光による誘導性であり得る。制御調節配列は、自己制御可能でもあり得る。自己制御可能な制御調節配列の例としては、例えば、内因性ＡＴＰレベルまたはその生物によって生成される生成物によって自己制御される配列が挙げられる。いくつかの場合において、その制御調節配列は、外因性物質によって誘導性であり得る。他の誘導性エレメントは、当該分野で周知であり、本発明において使用するために適合され得る。
【０１２７】
本明細書中に記載される制御調節配列の様々な組み合わせが、本発明によって包含され得、本発明の他の特徴と組み合わされ得る。いくつかの場合において、発現ベクターは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される１つ以上の制御調節配列を含む。そのような配列は、例えば、本明細書中に記載される生成物の分泌、生成またはその両方をアップレギュレートし得る。いくつかの場合において、発現ベクターは、生成物の分泌、生成またはその両方をもたらす、例えば、アップレギュレートするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される１つ以上の制御調節配列を含む。
【０１２８】
（発現）
葉緑体は、光合成生物の生産的な細胞小器官であり、多量のタンパク質の合成部位である。本明細書中の任意の発現ベクターは、葉緑体発現のために選択的に適合され得る。高等植物由来のいくつかの葉緑体プロモーターが、Ｋｕｎｇ  ａｎｄ  Ｌｉｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：７５４３−７５４９（１９８５）に記載されている。遺伝子産物は、葉緑体においてその発現ベクターから発現され得る。また、発現ベクターによってコードされる遺伝子産物は、葉緑体標的化配列によって葉緑体に標的化され得る。例えば、発現ベクターまたは発現ベクターによってコードされた遺伝子産物を葉緑体に標的化することは、制御調節配列、および燃料分子の分泌を可能にするかもしくは改善するタンパク質またはペプチドをコードする配列によって提供される作用をさらに増強し得る。
【０１２９】
本明細書中に記載される葉緑体標的化の様々な組み合わせが、本発明によって包含され得、本発明の他の特徴と組み合わされ得る。例えば、テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列は、葉緑体標的化配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。宿主細胞が、葉緑体に標的化されたリモネンシンターゼをコードする発現ベクターで形質転換され得るので、その宿主細胞は、リモネンシンターゼをコードするが葉緑体標的化配列をコードしない発現ベクターで形質転換された宿主細胞と比べて、より多くのリモネンシンターゼを生成し得る。リモネンシンターゼ発現の増加は、それより少なく生成する宿主細胞と比較して、より多くのリモネンを生成し得る。表５および７には、本発明において有用なイソプレノイド生成酵素をコードする核酸の例が提供されている。表６および８には、制限酵素部位が付加されたこれらの核酸配列が提供されている。表５〜８中の配列は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける発現のためにコドンバイアスがかけられている。すぐに明らかになるように、そのような部位は、核酸をベクター内に組み込むために使用され得る。
【０１３０】
さらに別の例では、その生物によって天然に生成される前駆体を基質として用いることによって、その生物によって天然に生成されない生成物（例えば、燃料生成物、芳香生成物、殺虫生成物）を生成する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターが、葉緑体に標的化される。その酵素を葉緑体に標的化することによって、その生成物の生成は、その酵素が発現されるが葉緑体に標的化されない宿主細胞と比較して増加し得る。理論によって拘束されないが、これは、葉緑体において生成される前駆体が増加することに起因し得るので、導入されたヌクレオチド配列によってコードされる酵素によって、より多くの生成物が生成され得る。
【０１３１】
（生成物）
本明細書中で企図される生成物の例としては、炭化水素生成物および炭化水素誘導体生成物が挙げられる。炭化水素生成物は、水素分子および炭素分子のみからなる生成物である。炭化水素誘導体生成物は、１つ以上のヘテロ原子を有する炭化水素生成物であり、ここで、そのヘテロ原子は、水素または炭素ではない任意の原子である。ヘテロ原子の例としては、窒素、酸素、硫黄およびリンが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの生成物は、炭化水素リッチであり、ここで、生成物の少なくとも５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％または９５重量％が、炭素および水素で構成されている。
【０１３２】
本明細書中の組成物および方法を用いて生成され得る炭化水素生成物および炭化水素誘導体生成物の例としては、テルペンおよびそれらの誘導体であるテルペノイドが挙げられる。テルペンは、イソプレン（Ｃ５）単位でできている分子であり、必ずしも純粋な炭化水素ではない。テルペンは、典型的には、イソプレン単位から得られる。イソプレン単位は、５炭素単位（Ｃ５）である。テルペンは、改変され得る（例えば、酸化されるか、メチル基が除去されるなど）か、またはその炭素骨格が転位されることにより、イソプレノイドなどのテルペンの誘導体を形成する炭化水素である。
【０１３３】
イソプレノイド（テルペノイドとしても知られる）は、イソプレンサブユニットから得られるが、酸素などのヘテロ原子の付加、炭素骨格の転位およびアルキル化などによって改変される。イソプレノイドは、一般に、５で割り切れるいくつかの炭素原子を有するが、「変則的な」テルペノイドが知れられているので、これは、必要条件ではない。カロテンおよびキサントフィルなどのカロテノイドは、有用な生成物としてのイソプレノイドの例である。ステロイドは、テルペノイドの別の例である。イソプレノイドの例としては、ヘミテルペン（Ｃ５）、モノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、トリテルペン（Ｃ３０）、テトラテルペン（Ｃ４０）およびポリテルペン（Ｃｎ，ここで、「ｎ」は、４５以上である）が挙げられるが、これらに限定されない。イソプレノイドの他の例としては、リモネン、１，８−シネオール、α−ピネン、カンフェン、（＋）−サビネン、ミルセン、アビエタジエン、タキサジエン、ファルネシルピロリン酸、アモルファジエン、（Ｅ）−α−ビサボレン、ジンギベレンまたはジアポフィトエンおよびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
イソプレノイド前駆体は、２つの経路によって生成されると考えられる。メバロン酸経路、すなわちＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ経路は、イソプレノイドに対する共通のＣ５前駆体である、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）およびイソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）を生成する。非メバロン酸経路は、ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰを形成する副経路である。ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰは、縮合することにより、より大きいイソプレンを形成するゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）または他の前駆体（例えば、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ））を形成し得る。
【０１３５】
本発明のイソプレノイドを包含し得る生成物の例としては、燃料生成物、芳香生成物および殺虫生成物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、生成物は、直接使用され得る。他の場合において、その生成物は、「供給原料」として使用されることにより、別の生成物を生成し得る。例えば、生成物が、イソプレノイドである場合、そのイソプレノイドは、水素化され、そして「熱分解」されることにより、より短い鎖の炭化水素が生成され得る（例えば、ファルネセンは、水素化されることにより、ファルネサンを生成し、次いでそれが熱分解されることにより、プロパン、ブタン、オクタンまたは他の燃料生成物が生成される）。
【０１３６】
本発明によって生成される生成物は、形質転換された宿主細胞および／または生物によって、天然にまたは非天然に（例えば、形質転換の結果として）生成され得る。その生成物は、天然には存在しない新規の分子でもあり得る。例えば、藻類において天然に生成される生成物は、カロテノイド（例えば、ベータ−カロテン）などのテルペンであり得る。藻類によって天然に生成されない生成物の例としては、リモネンなどの非天然のテルペンが挙げられ得る。その宿主細胞は、例えば、リモネンの分泌を助長する配列による形質転換によって、遺伝的に改変され得る。
【０１３７】
（燃料生成物）
燃料生成物の例としては、石油化学生成物およびそれらの前駆体ならびに石油化学産業において有用であり得る他のすべての物質が挙げられる。燃料生成物としては、例えば、石油生成物、石油の前駆体、ならびに石油化学製品およびその前駆体が挙げられる。燃料または燃料生成物は、燃焼器（例えば、ボイラー、窯炉、乾燥器または炉）において使用され得る。燃焼器の他の例は、内燃機関（例えば、自動車エンジンまたは発電機）（ガソリンエンジン、ディーゼルエンジン、ジェットエンジンなどを含む）である。燃料生成物は、プラスチック、樹脂、繊維、エラストマー、潤滑剤およびゲルを生成するためにも使用され得る。
【０１３８】
燃料生成物は、加熱（例えば、調理）するためまたはプラスチックを製造するために使用され得る低級アルカン（例えば、１〜約４個の炭素）（例えば、メタン、エタン、プロパンまたはブタン）を包含し得る。燃料生成物はまた、約５〜約９個の炭素原子の炭素骨格を有する分子（例えば、ナフサ（ｎａｐｔｈａ）またはリグロイン）またはそれらの前駆体を包含し得る。他の燃料生成物は、ガソリンまたはモーターの燃料として使用される、約５〜約１２個の炭素原子またはシクロアルカンであり得る。灯油などの約１０〜約１８個の炭素の分子および芳香族化合物またはその前駆体もまた、燃料生成物であり得る。燃料生成物は、１２個を超える炭素を有する分子またはそれらの前駆体（例えば、潤滑油に使用されるもの）も包含し得る。他の燃料生成物としては、典型的には約２０〜約７０個の炭素のアルカン、シクロアルカンおよび芳香族化合物を含む、重質軽油もしくは燃料油またはそれらの前駆体が挙げられる。燃料生成物は、通常、約７０個以上の炭素を有する複数の環を含む原油（例えば、コークス、アスファルト、タールおよびろう）およびそれらの前駆体から誘導され得るか、またはそれらの中に見られる、他の残留物も包含する。
【０１３９】
様々な燃料生成物が、エンドユーザーのためにいくつかのプロセスによって最終生成物にさらに精錬され得る。精錬は、分留によって生じ得る。例えば、燃料生成物の混合物（例えば、異なる様々な鎖長を有する様々な炭化水素の混合物）は、分留によって様々な成分に分離され得る）。
【０１４０】
精錬は、以下の工程；燃料生成物のクラッキング、一体化（ｕｎｉｆｙｉｎｇ）または改質のうちのいずれか１つ以上も包含し得る。高級炭化水素（例えば、≧Ｃ１０）などの大きな燃料生成物は、クラッキングによってより小さいフラグメントに分解され得る。クラッキングは、熱または高圧（例えば、水蒸気、ビスブレーキングまたはコークス化）によって行われ得る。燃料生成物は、ビスブレーキング、例えば、重油の粘度を低下させることによっても精錬され得る。精錬は、コークス化も包含し得、ここで、重いほぼ純粋な炭素残渣が生成される。クラッキングは、触媒（例えば、ゼオライト、ヒドロケイ酸アルミニウム、ボーキサイトまたはシリカ−アルミナが挙げられるがこれらに限定されない）を用いることによってクラッキング反応の速度を上昇させる触媒的手段によっても行われ得る。触媒作用は、流動接触分解によるものであり得、ゼオライトなどの熱触媒を使用することにより、クラッキング反応が触媒される。触媒作用は、水素化分解によっても行われ得るが、通常、流動接触分解よりも低い温度が使用される。水素化分解は、典型的には、高分圧の水素ガスの存在下において起きる。燃料生成物は、ディーゼル、ガソリンおよび／または灯油を生成する接触分解によって精錬され得る。
【０１４１】
上記燃料生成物は、一体化（ｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）工程において、例えば、白金または白金−レニウム混合物などの触媒を用いることによってそれらの燃料生成物を化合させることによっても精錬され得る。一体化プロセスは、典型的には、クラッキングにおいて使用され得る副産物である水素ガスを生成する。
【０１４２】
上記燃料生成物は、炭化水素をより小さな分子に改質するか、または転位するか、または再構築することによっても精錬され得る。当業者に公知の接触改質法において起きる化学反応がいくつか存在する。一般に、接触改質は、触媒の存在下および水素の高分圧下において行われる。１つの通常のプロセスは、アルキル化である。例えば、プロピレンおよびブチレンを、フッ化水素酸または硫酸などの触媒とともに混合する。
【０１４３】
上記燃料生成物を、混合物に混和するか、または混ぜ合わせることによっても、最終産物が得られ得る。例えば、それらの燃料生成物を混和することにより、様々な等級のガソリン、添加物を含むかまたは含まないガソリン、様々な重量および等級の潤滑油、様々な等級の灯油、ジェット燃料、ディーゼル燃料、暖房用オイル、ならびにプラスチックおよび他のポリマーを製造するための化学物質が形成され得る。本明細書中に記載される燃料生成物の組成物は、他の手段によって生成される燃料生成物と混ぜ合わされ得るか、または混和され得る。
【０１４４】
本発明の宿主細胞から生成されるいくつかの燃料生成物、特に、精錬後の燃料生成物は、既存の石油化学製品と同一、すなわち、同じ構造となる。それらの燃料生成物のうちのいくつかは、既存の石油化学製品と同じでないかもしれない。しかしながら、ある分子は、従来の石油化学製品中または精錬中に存在しないかもしれないが、それは、これらの産業においてなおも有用であり得る。例えば、天然にはガソリン中に出現しなかったとしても、ガソリンの沸点の範囲内であって、ガソリンまたは添加物として使用され得る炭化水素が生成され得る。
【０１４５】
（方法）
このように、生成物（例えば、イソプレノイド、燃料生成物、芳香生成物、殺虫生成物）は、以下：発現ベクターで宿主生物（例えば、非維管束光合成生物）を形質転換する工程；その生物を生育する工程；およびその生物によって生成された生成物を回収する工程を包含する方法によって生成され得る。関連するさらに異なる態様において、本発明は、生成物を生成するための方法を提供し、その方法は：発現ベクターで光合成生物を形質転換する工程、その生物を生育する工程；およびその生物（ｏｇａｎｉｓｍ）によって生成された生成物を回収する工程を包含する。上記発現ベクターは、典型的には、本明細書中に記載される発現ベクターのタイプであり、具体的には、生物にさらなる生合成能力を付加するためか、またはその生物内の既存の生合成経路を改変する（光合成生物による分子の生成を増加させるか、または分子の生成を可能にすることを包含する）ために使用される。
【０１４６】
本明細書中の方法は、生成物（例えば、イソプレノイド、燃料、芳香剤および殺虫剤）を生成するのに有用な遺伝子を選択する工程、そのような遺伝子で光合成生物の細胞を形質転換する工程および生成物の生成を可能にするのに適した条件下でそのような生物を生育する工程を包含する。本発明の生物は、従来の発酵バイオリアクター（バッチ、流加、細胞再利用および連続発酵槽が挙げられるが、これらに限定されない）内で培養され得る。さらに、それらの生物は、光バイオリアクター内で生育され得る（例えば、米国出願公開番号２００５０２６０５５３；米国特許第５，９５８，７６１号；米国特許第６，０８３，７４０号を参照のこと）。培養は、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ板においても行われ得る。培養は、組換え細胞にとって適切な温度、ｐＨおよび酸素含有量において行われる。そのような培養条件は、十分に当業者の専門知識の範囲内である。
【０１４７】
宿主生物は、宿主細胞を含む生物である。好ましい実施形態において、その宿主生物は、光合成的である。光合成生物は、天然に光合成する（プラスチドを有する）か、または光合成的となるように遺伝的に操作されているか、もしくは別途改変されている生物である。いくつかの場合において、光合成生物は、光合成装置の全部または一部を使用不可能にする本発明の構築物で形質転換され得る。いくつかの場合において、宿主生物は、非維管束性かつ光合成的である。その宿主細胞は、原核生物である。本発明のいくつかの原核生物の例としては、シアノバクテリア（例えば、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アルスロスピラ属（Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ））が挙げられるが、これらに限定されない。宿主生物は、単細胞または多細胞であり得る。ほとんどの実施形態において、その宿主生物は、真核生物（例えば、緑藻類、紅藻類、褐藻類）であり得る。好ましい実施形態において、その宿主細胞は、微細藻類（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ）である。本明細書中で企図される生物の例としては、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）および植物プランクトンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
本発明を実施するために使用され得る宿主生物のいくつかは、好塩性である（例えば、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ）。例えば、Ｄ．ｓａｌｉｎａは、海水および塩湖（１０００分の３０〜３００の塩分）ならびに高塩分培地（例えば、人工海水培地、海水栄養寒天、汽水培地、海水培地など）中で生長することができる。本発明のいくつかの実施形態において、本発明のベクターを含む宿主細胞は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２，１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３１．、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３モル濃度またはそれ以上の濃度の塩化ナトリウムである液体環境中で生長することができる。当業者は、他の塩（ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩など）もまたその液体環境中に存在し得ることを認識するだろう。
【０１４９】
好塩性生物が本発明に利用される場合、それを本明細書中に記載される任意のベクターで形質転換し得る。例えば、葉緑体ゲノム内に挿入することができ、かつイソプレノイド生成酵素（例えば、ＦＰＰシンターゼ、ジンギベレンシンターゼ、スクワレンシンターゼ）をコードする核酸を含むベクターで、Ｄ．ｓａｌｉｎａが形質転換され得る。次いで、形質転換された好塩性生物は、高塩環境（例えば、塩湖、塩池（ｓａｌｔ  ｐｏｎｄｓ）、高食塩水培地など）において生長することにより、目的の生成物（例えば、イソプレノイド）を生成し得る。その生成物の単離は、形質転換された生物から生成物を抽出する前にその生物を高塩環境から取り出す工程を包含し得る。生成物が周囲の環境に分泌される場合、その生成物の任意のさらなる処理の前に、その液体環境を脱塩する必要があり得る。
【０１５０】
宿主生物は、光合成を可能にする条件下で生育され得るが、しかしながら、これは、必要条件ではない（例えば、宿主生物は、光の非存在下において生長し得る）。いくつかの場合において、その宿主生物は、光合成能力を低下および／または破壊する方法で遺伝的に改変され得る（下記の実施例を参照のこと）。宿主生物が光合成することができない（例えば、光が存在しないことおよび／または遺伝的改変が原因で）生育条件では、その生物は、典型的には、光合成の非存在下における生長を支持する必要な栄養分を提供される。例えば、生物が生長している培養液には、必要な任意の栄養素（有機炭素源、窒素源、リン源、ビタミン、金属、脂質、核酸、微量栄養元素または生物特異的な要求を含む）が補充され得る。有機炭素源には、宿主生物が代謝することができる任意の炭素源が包含され、それらとしては、アセテート、単純な炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース）、複合糖質（例えば、デンプン、グリコーゲン）、タンパク質および脂質が挙げられるがこれらに限定されない。当業者は、すべての生物が特定の栄養素を十分に代謝することができるわけではなく、適切な栄養素の混合物を提供するために、栄養素の混合物を生物ごとに改変する必要があり得ることを認識するだろう。
【０１５１】
宿主生物は、陸地上、例えば、埋立地上でも生長し得る。いくつかの場合において、宿主生物は、エタノール生成植物またはＣＯ2を発生する他の施設もしくは領域（例えば、都市、幹線道路など）の付近で生長する。同様に、本明細書中の方法は、本明細書中に記載される改変された生物の１つ以上をエタノール生成植物付近で生育することによって燃料を製造しつつ、エタノール植物またはＣＯ2を発生する他の施設もしくは領域に対する炭素クレジットを売るためのビジネス方法を企図する。
【０１５２】
さらに、上記生物は、屋外の開水域（例えば、池、海、外洋、海、河川、水床、湿地水（ｍａｒｓｈ  ｗａｔｅｒ）、浅いプール、湖、貯水池など）の中で生育され得る。その生物は、水中で生育されるとき、レゴ（ｌｅｇｏ）様の小片から構成されるハロー状（ｈａｌｏ−ｌｉｋｅ）物体内に入れられ得る。そのハロー物体は、藻類を取り囲み、その物体を、おおわれていない太陽光中に維持しながら、その下の水から栄養分を保持することを可能にする。
【０１５３】
いくつかの場合において、生物は、容器内で生育され得、ここで、各容器は、１つもしくは２つまたは複数の生物を含む。それらの容器は、水に浮くように構成され得る。例えば、ある容器は、その容器およびその中の宿主生物を浮揚性にするために空気と水の組み合わせで満たされ得る。したがって、淡水中での生育に適応した宿主生物は、塩水（すなわち、外洋）において生育することができ、その逆もまた同じである。このメカニズムは、その容器に任意の損傷が生じた場合にその生物の自動的な死を可能にさせる。
【０１５４】
いくつかの場合において、複数の容器が、上に記載したようなハロー状の構造体内に含められ得る。例えば、最大１００、１，０００、１０，０００、１００，０００または１，０００，０００個の容器が、１平方メートルのハロー状の構造体内に配置され得る。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、上記生成物（例えば、燃料生成物、芳香生成物、殺虫生成物）は、上記生物を収集することによって回収される。次いで、その生成物は、その生物から抽出され得る。いくつかの場合において、その生成物は、その生物を殺滅することなく、生成され得る。その生成物の生成および／または発現は、その生物を生存不可能にさせないかもしれない。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、上記生成物（例えば、燃料生成物、芳香生成物、殺虫生成物）の生成は、誘導性である。その生成物は、例えば、光への曝露によって、発現および／または生成されるように誘導され得る。さらに他の実施形態において、上記生成物の生成は、自己制御可能である。その生成物は、フィードバックループを形成し得、ここで、その生成物（例えば、燃料生成物、芳香生成物、殺虫生成物）がある一定のレベルに達したときに、その生成物の発現または分泌が阻害され得る。他の実施形態では、上記生物の代謝産物のレベルが、その生成物の発現または分泌を阻害する。例えば、その生成物を発現または生成するエネルギー生成の増加の結果としてその生物によって生成される内因性ＡＴＰが、フィードバックループを形成することにより、その生成物の発現を阻害し得る。さらに別の実施形態では、その生成物の生成は、例えば、光または外因性物質による誘導性であり得る。例えば、宿主生物において生成物の生成をもたらすための発現ベクターは、外因性物質によって活性化または不活性化される誘導性の制御調節配列を含み得る。
【０１５７】
本発明は、本明細書中に記載される燃料生成物のいずれかを生成する新しい遺伝子／発現ベクターについてスクリーニングするための方法にも関する。そのような方法は、以下の工程：（１）核酸の候補発現ベクターを光合成生物に挿入する工程、（２）そこから生成された推定上の燃料生成物を回収する工程、（３）その推定燃料生成物を質量分析計に適用することにより、推定燃料生成物の特徴を測定し、それが燃料生成物として使用され得るか否かを判定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、工程（２）は、公知の燃料生成物の回収、および候補発現ベクターがその候補発現ベクターを有しない光合成生物と比べてその燃料生成物の生成または分泌を増加させるか否かを包含し得る。
【０１５８】
（他の方法）
本発明は、燃料生成物を生成するように適合され、遺伝的に改変された非維管束光合成生物を生育する団体に炭素クレジットを提供する工程を包含するビジネス方法も提供する。本発明によって提供される燃料生成物を生成する方法は、現在の方法と比べて、おそらくより環境に配慮した、燃料生成物を生成する方法を提供する。同様に、本明細書中に記載される方法および組成物は、炭素クレジットとの交換におけるビジネス方法において使用され得る。
【０１５９】
炭素クレジットは、割り当て、認可、信用などであり得、炭素クレジットは、いくつかの関連性のある独立した実体（例えば、市（所属の定まっている自治体と所属の定まっていない自治体の両方を含むすべての大きさおよびタイプの自治体を含む）、郡、州もしくは地方（ｐｒｏｖｉｎｃｅ）または国家ならびに関連する政治上の実体（例えば、地域、多国家または他の国際的組織（例えば、国際連合または欧州連合））が挙げられるがこれらに限定されない）によって割り当て、権限授与もしくは承認されるか、またはされている。
【０１６０】
炭素クレジットは、実質的に、規制当局または行政体から直接与えられ得る。他の場合において、炭素クレジットは、間接的に与えられ得、例えば、本明細書中の方法または組成物を用いる実体が、炭素クレジットを規制当局から直接与えられ、次いで、その炭素クレジットを別の実体に移譲してもよい。その炭素クレジットの移譲は、燃料生成物を生成するように適合され、遺伝的に改変された非維管束光合成生物を用いる、所与のプロセス、生成物と関連し得る。
【０１６１】
例えば、エンドユーザーのモバイルプラットフォーム（ｍｏｂｉｌｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）における消費に対して分配される消耗製品を提供する第１の実体が同定され得、ここで、その消耗製品の消費および／または製造は、結果として生じる対応する排出を含む。例えば、ディーゼル燃料の燃焼は、対応する窒素酸化物の環境放出をもたらすことが多く、ディーゼル燃料の燃焼は、対応する窒素酸化物の環境放出をもたらすことが多く、そしてガソリンの燃焼は、対応する硫黄酸化物の環境放出をもたらすことが多い。
【０１６２】
第一者は、上に記載された遺伝的に改変された生物を使用して、生成物を生成する方法を採用してもよいし、上に記載された遺伝的に改変された生物によって生成される生成物をその組成物として使用してもよく、それにより、従来の生成方法（例えば、ディーゼル燃料を生成する方法）よりも環境に対して有害でない作用がもたらされる。したがって、最終産物の環境的影響の相殺。次いで、第一者は、総排出量の減少の結果として、炭素クレジット、すなわち排出権が与えられ得る。炭素クレジットは、規制当局もしくは行政機関から与えられてもよいし、第二者から第一者に移譲されてもよく、ここで、第二者は、遺伝的に改変された生物または遺伝的に改変された生物の生成物を第一者に販売していてもよい。
【０１６３】
炭素クレジットは、実質的に流動性のある通貨代替物と交換され得る。例えば、炭素クレジットは、現金相当物（例えば、現金、小切手など）と交換され得る。炭素クレジットは、知的財産権（例えば、譲渡またはライセンスが挙げられるがこれらに限定されない）に関する法的助成金とも交換され得る。炭素クレジットは、政府の税補助金または所与の市場の購買者に接触する権利とも交換され得る。炭素クレジットは、別の炭素排出プロセス（例えば、本生物の生育を含まないプロセス）の使用とも交換され得る。例えば、ある団体は、ある期間、例えば、１ヶ月間または１年間放出してもよい、限られた数値の排出を有し得、限度を超過すると罰金およびペナルティを負うこともある。しかしながら、炭素クレジットを有していれば、限度を超過している団体は、炭素クレジットを交換することにより、罰金またはペナルティを相殺してもよいし、その団体が発生する排出量を決定する際に考慮に入れてもらってもよい。
【０１６４】
本発明のビジネス方法は、燃料生成物以外の生成物（例えば、芳香剤および殺虫剤）の生成も包含し得る。燃料生成物に関連するビジネス方法（炭素クレジットの使用を包含する方法を含む）は、他のタイプの有用な生成物および材料の生成にも関係する。
【０１６５】
本発明の好ましい実施形態を示し、本明細書中に記載してきたが、当業者には、そのような実施形態が例としてのみ提供されるものであることは明らかであろう。当業者には、本発明から逸脱せずに、数多くの変法、変更および置換が、思い浮かぶだろう。本明細書中に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。以下の請求項が、本発明の範囲を定義し、これらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物が、それらの請求項によって包含されると意図される。以下の実施例は、本明細書中で開示される本発明を単に例示するものであり、本発明を限定しない。
【実施例】
【０１６６】
（実施例１．Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおけるＦＰＰシンターゼおよびセスキテルペンシンターゼの生成）
この実施例では、Ｇ．ｇａｌｌｕｓ由来のＦＰＰシンターゼおよびＰ．ａｂｉｅｓ由来のビサボレンシンターゼをコードする核酸をＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに導入した。形質転換ＤＮＡを図３に図解で示す。これらの例の場合、形質転換ＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉエレメント（例えば、複製起点、抗生物質耐性マーカー）を有するベクター内に含められていた。この場合において、ＦＰＰシンターゼをコードする遺伝子（配列番号８２，表５；配列番号１３５，表６）は、図３において「トランスジーン」と表示されているセグメントであり、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＡ遺伝子に対する５’ＵＴＲおよびプロモーター配列ならびにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＡ遺伝子に対する３’ＵＴＲによって制御され、そして「選択マーカー」と表示されているセグメントは、細菌由来のカナマイシン耐性コード遺伝子であり、これは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のａｔｐＡ遺伝子に対する５’ＵＴＲおよびプロモーター配列ならびにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｒｂｃＬ遺伝子に対する３’ＵＴＲ配列によって制御される。ビサボレンシンターゼ遺伝子（配列番号１１５，表５；配列番号１６８，表６）は、図３において「トランスジーン」と表示されているセグメントであり、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＡ遺伝子に対する５’ＵＴＲおよびプロモーター配列ならびにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＡ遺伝子に対する３’ＵＴＲによって制御され、そして「選択マーカー」と表示されているセグメントは、細菌由来のストレプトマイシン耐性コード遺伝子であり、これは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のａｔｐＡ遺伝子に対する５’ＵＴＲおよびプロモーター配列ならびにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｒｂｃＬ遺伝子に対する３’ＵＴＲ配列によって制御される。ＦＰＰシンターゼトランスジーンカセットは、５’側および３’側でｐｓｂＡ遺伝子座と隣接するＤＮＡの配列とそれぞれ同一である「相同Ａ」および「相同Ｂ」と表示されているセグメントを介してＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのｐｓｂＡ遺伝子座に標的化されている。ビサボレンシンターゼトランスジーンカセットは、５’側および３’側で３ＨＢ遺伝子座と隣接するＤＮＡの配列とそれぞれ同一である「相同Ｃ」および「相同Ｄ」と表示されているセグメントを介してＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの３ＨＢ遺伝子座に標的化されている。この形質転換ＤＮＡの構築において行われたすべてのＤＮＡ操作は、本質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）およびＣｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９７，１９２−２０８，１９９８によって記載されているとおりであった。
【０１６７】
これらの実験において、すべての形質転換をＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  １３７ｃ（ｍｔ＋）株に対して行った。１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上、４５０Ｌｕｘの連続照明下、２３℃、ＴＡＰ培地（Ｇｏｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ５４：１６６５−１６６９，１９６５（本明細書中で参照により援用される））中、０．５ｍＭ  ５−フルオロデオキシウリジンの存在下において、対数後期まで（約７日間）細胞を生育した。５０ｍｌの細胞を、５分間にわたる２３℃、４，０００×ｇでの遠心分離によって収集した。上清をデカントし、粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出，１９９８）によるその後の葉緑体形質転換に向けて、細胞を４ｍｌのＴＡＰ培地に再懸濁した。すべての形質転換をカナマイシン選択下（１００μｇ／ｍｌ）において行い、ここで、耐性は、図３の「選択マーカー」と表示されているセグメントによってコードされる遺伝子によって付与されたものである（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。
【０１６８】
ＰＣＲを使用することにより、形質転換された株を同定した。ＰＣＲ解析のために、１０6個の藻類細胞（寒天プレートまたは液体培養物からの細胞）を１０ｍＭ  ＥＤＴＡに懸濁し、１０分間９５℃に加熱し、次いで、２３℃付近まで冷却した。反応緩衝液、ＭｇＣ１２、ｄＮＴＰ、ＰＣＲプライマー対（表４）、ＤＮＡポリメラーゼおよび水からなるＰＣＲカクテルを調製した。ＥＤＴＡ中の藻類溶解物を加えることにより、反応物に鋳型を提供した。マグネシウム濃度を変化させることにより、加えられたＥＤＴＡ中の藻類溶解物の量および濃度を補った。アニーリング温度の勾配を用いることにより、特異的プライマー対にとって最適なアニーリング温度を決定した。
【０１６９】
ＦＰＰシンターゼ遺伝子を含む株を同定するために、一方のプライマーが、ｐｓｂＡ  ５’ＵＴＲ内の部位にアニールし（配列番号５５）、他方のプライマー（配列番号６６）が、ＦＰＰシンターゼをコードするセグメント内にアニールする、プライマー対を使用した。所望のクローンは、予想されるサイズのＰＣＲ産物をもたらすクローンである。ビサボレンシンターゼ遺伝子を含む株を同定するために、一方のプライマーが、ｐｓｂＡ  ５’ＵＴＲ内の部位にアニールし（配列番号５５）、他方のプライマーが、ビサボレンシンターゼをコードするセグメント内にアニールする（配列番号７３）、プライマー対を使用した。所望のクローンは、両方の反応において予想されるサイズのＰＣＲ産物をもたらすクローンである。
【０１７０】
内在性ｐｓｂＡ遺伝子座が置換されている程度（同質細胞質に対する異質細胞質）を判定するために、２セットのプライマー対からなるＰＣＲ反応物を使用した（同じ反応物中で）。第１の対のプライマーは、発現ベクターによって標的化される内在性遺伝子座を増幅し、ｐｓｂＡ  ５’ＵＴＲ内にアニールするプライマー（配列番号５７）およびｐｓｂＡコード領域内にアニールするプライマー（配列番号５８）からなる。第２の対のプライマー（配列番号５９および６０）は、発現ベクターによって標的化されない定常領域すなわち調節領域を増幅するので、すべての場合において予想されるサイズの生成物を生成するはずである。この反応によって、内在性遺伝子座からのＰＣＲ産物が存在しないことがＰＣＲ反応を阻害する細胞夾雑物および／または他の夾雑物に起因しなかったことが確かめられる。それらのプライマー対の濃度は、両方の反応が同じチューブ内で起こるように変更される；しかしながら、内在性遺伝子座のための対は、定常対の５×濃度である。用いられたサイクル数は、感度を上げるために＞３０であった。最も望まれるクローンは、定常領域に対して生成物をもたらすが内在性遺伝子座に対して生成物をもたらさないクローンである。所望のクローンは、コントロール反応物と比べて強度の低い内在性遺伝子座生成物を生じるクローンでもある。このＰＣＲの結果を図４のパネルＡ、ＢおよびＣに示す。
【０１７１】
９６個のクローンに対するこのＰＣＲの結果が決定され、それらの結果を図４に示す。図４Ａおよび４Ｂは、それぞれＦＰＰシンターゼ遺伝子およびスクワレンシンターゼ遺伝子に特異的な対を用いたＰＣＲの結果を示している。示されるように、複数の形質転換されたクローンが、ＦＰＰシンターゼ遺伝子とスクワレンシンターゼ遺伝子の両方の挿入について陽性である（例えば、番号１〜３）。図４Ｃは、同質細胞質クローンと異質細胞質クローンとを識別するプライマー対を用いたＰＣＲの結果を示している。示されるように、複数の形質転換されたクローンが、トランスジーンの組み込みを支持する程度に、同質細胞質または異質細胞質のいずれかである（例えば、番号１〜３）。番号のついていないクローンは、野生型遺伝子座の存在を証明しているので、さらなる解析のために選択されなかった。
【０１７２】
形質転換された藻類細胞において、ＦＰＰシンターゼ遺伝子がＦＰＰシンターゼの発現をもたらしたか否か、およびビサボレンシンターゼ遺伝子がビサボレンシンターゼの発現をもたらしたか否かを判定するために、両方の可溶性タンパク質を免疫沈降し、ウエスタンブロットにより可視化した。簡潔には、５００ｍｌの藻類細胞培養物を、１５分間にわたる４℃、４０００×ｇでの遠心分離によって回収した。上清をデカントし、細胞を１０ｍｌの溶解緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２％Ｔｗｅｅｎ−２０）に再懸濁した。超音波処理（３５％の力で１０×３０秒）によって細胞を溶解した。１時間にわたる４℃、１４，０００×ｇでの遠心分離によって溶解物を清浄化した。上清を取り出し、抗ＦＬＡＧ抗体結合体化アガロース樹脂とともに４℃において１０時間インキュベートした。その溶解物から樹脂を重力濾過によって分離し、洗浄緩衝液（（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。樹脂をローディング緩衝液（ＸＴサンプル緩衝液；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と４：１混合し、サンプルを１分間９５℃に加熱し、２３℃まで冷却し、不溶性タンパク質を遠心分離によって除去した。可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。その膜を２３℃において３０分間、ＴＢＳＴ＋０．５％乾燥脱脂乳でブロッキングし、抗ＦＬＡＧアルカリホスファターゼ結合体化抗体（ＴＢＳＴ＋０．５％乾燥脱脂乳中で１：２，５００希釈したもの）と４℃において１０時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。化学蛍光（ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｎｓｃｅｎｔ）検出を用いてタンパク質を可視化した。複数のクローンの結果（図４Ｄ）は、ＦＰＰシンターゼ遺伝子の発現が、ＦＰＰシンターゼの発現をもたらし、ビサボレンシンターゼ遺伝子の発現が、ビサボレンシンターゼの発現をもたらしたことを示している。
【０１７３】
ＦＰＰシンターゼおよびビサボレンシンターゼの発現のためのＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ形質転換体の培養は、別段述べられない限り、１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上、５，０００Ｌｕｘの連続照明下、２３℃、液体ＴＡＰ培地中で行った。収集の前に少なくとも４８時間にわたって、１×１０7細胞／ｍｌの密度で培養物を維持した。
【０１７４】
藻類葉緑体内で生成されたビサボレンシンターゼが機能的な酵素であるか否かを判定するために、ＦＰＰからのセスキテルペンの生成を調べた。簡潔には、５０ｍＬの藻類細胞培養物を、１５分間にわたる４℃、４０００×ｇでの遠心分離によって収集した。上清をデカントし、０．５ｍＬの反応緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ＝７．２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｎＣ１２、１０％グリセロールおよび５ｍＭ  ＤＴＴ）に細胞を再懸濁した。超音波処理（３５％の力で１０×３０秒）によって細胞を溶解した。その溶解物に０．３３ｍｇ／ｍＬのＦＰＰを加え、その混合物をガラスバイアルに移した。その反応物をヘプタンで覆い、２３℃で１２時間インキュベートした。その反応物をクエンチし、その混合物をボルテックスすることによって抽出した。０．１ｍＬのヘプタンを除去し、そのサンプルをガスクロマトグラフィ−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）によって解析した。結果を図５に示す。この結果は、野生型株に対するセスキテルペンの大きな増加を示している（ピークによって示される）。
【０１７５】
（実施例２．Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおけるトリテルペン分子の生成）
この実施例では、Ｇ．ｇａｌｌｕｓ由来のＦＰＰシンターゼおよびスクワレンシンターゼＳ．ａｕｒｅｕｓをコードする核酸をＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに導入した。形質転換ＤＮＡを図３に図解で示す。この例において、「トランスジーン１」と表示されているセグメントは、ＦＰＰシンターゼをコードする遺伝子であり（配列番号８２，表５；配列番号１３５，表６）、「トランスジーン２」と表示されているセグメントは、スクワレンシンターゼをコードする遺伝子であり（配列番号８５，表５；配列番号１３８，表６）、「５’ＵＴＲ」と表示されているセグメントは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｒｂｃＬ遺伝子に対する５’ＵＴＲおよびプロモーター配列であり、「３’ＵＴＲ」と表示されているセグメントは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＡ遺伝子に対する３’ＵＴＲを含み、そして「選択マーカー」と表示されているセグメントは、細菌由来のカナマイシン耐性コード遺伝子であり、これは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のａｔｐＡ遺伝子に対する５’ＵＴＲおよびプロモーター配列ならびにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｒｂｃＬ遺伝子に対する３’ＵＴＲ配列によって制御される。このトランスジーンカセットは、５’側および３’側で３ＨＢ遺伝子座と隣接するＤＮＡの配列とそれぞれ同一である「５’相同」および「３’相同」と表示されているセグメントを介してＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの３ＨＢ遺伝子座に標的化されている。この形質転換ＤＮＡの構築において行われたすべてのＤＮＡ操作は、本質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）およびＣｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９７，１９２−２０８，１９９８によって記載されているとおりであった。
【０１７６】
これらの実験において、すべての形質転換をＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  １３７ｃ（ｍｔ＋）株に対して行った。１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上、４５０Ｌｕｘの連続照明下、２３℃、ＴＡＰ培地（Ｇｏｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ５４：１６６５−１６６９，１９６５（本明細書中で参照により援用される））中、０．５ｍＭ  ５−フルオロデオキシウリジンの存在下において、対数後期まで（約７日間）細胞を生育した。５０ｍｌの細胞を、５分間にわたる２３℃、４，０００×ｇでの遠心分離によって収集した。上清をデカントし、粒子銃（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出，１９９８）によるその後の葉緑体形質転換に向けて、細胞を４ｍｌのＴＡＰ培地に再懸濁した。すべての形質転換をカナマイシン選択下（１５０μｇ／ｍｌ）において行い、ここで、耐性は、図３の「選択マーカー」と表示されているセグメントによってコードされる遺伝子によって付与されたものである（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。
【０１７７】
ＰＣＲを使用することにより、形質転換された株を同定した。ＰＣＲ解析のために、１０6個の藻類細胞（寒天プレートまたは液体培養物からの細胞）を１０ｍＭ  ＥＤＴＡに懸濁し、１０分間９５℃に加熱し、次いで、２３℃付近まで冷却した。反応緩衝液、ＭｇＣ１２、ｄＮＴＰ、ＰＣＲプライマー対（表４）、ＤＮＡポリメラーゼおよび水からなるＰＣＲカクテルを調製した。ＥＤＴＡ中の藻類溶解物を加えることにより、反応物に鋳型を提供した。マグネシウム濃度を変化させることにより、加えられたＥＤＴＡ中の藻類溶解物の量および濃度を補った。アニーリング温度の勾配を用いることにより、特異的プライマー対にとって最適なアニーリング温度を決定した。
【０１７８】
ＦＰＰシンターゼ遺伝子を含む株を同定するために、一方のプライマーが、ｐｓｂＣ  ５’ＵＴＲ内の部位にアニールし（配列番号６４）、他方のプライマーが、ＦＰＰシンターゼをコードするセグメント内にアニールする（配列番号６６）、プライマー対を使用した。スクワレンシンターゼ遺伝子を含む株を同定するために、一方のプライマーが、ｐｓｂＣ  ５’ＵＴＲ内の部位にアニールし（配列番号６４）、他方のプライマーが、スクワレンシンターゼをコードするセグメント内にアニールする（配列番号７２）、プライマー対を使用した。所望のクローンは、両方の反応において予想されるサイズのＰＣＲ産物をもたらすクローンである。その内在性遺伝子座が置換されている程度（同質細胞質に対する異質細胞質）を判定するために、２セットのプライマー対からなるＰＣＲ反応物を使用した（同じ反応物中で）。第１の対のプライマーは、発現ベクターによって標的化される内在性遺伝子座を増幅する（配列番号６８および６９）。第２の対のプライマー（配列番号５９および６０）は、発現ベクターによって標的化されない定常領域すなわち調節領域を増幅するので、すべての場合において予想されるサイズの生成物を生成するはずである。この反応によって、内在性遺伝子座からのＰＣＲ産物が存在しないことがＰＣＲ反応を阻害する細胞夾雑物および／または他の夾雑物に起因しなかったことが確かめられる。それらのプライマー対の濃度は、両方の反応が同じチューブ内で起こるように変更される；しかしながら、内在性遺伝子座のための対は、定常対の５×濃度である。用いられたサイクル数は、感度を上げるために＞３０であった。最も望まれるクローンは、定常領域に対して生成物をもたらすが内在性遺伝子座に対して生成物をもたらさないクローンである。所望のクローンは、コントロール反応物と比べて強度の低い内在性遺伝子座生成物を生じるクローンでもある。
【０１７９】
９６個のクローンに対するこのＰＣＲの結果が決定され、それらの結果を図６に示す。図６Ａおよび６Ｂは、それぞれＦＰＰシンターゼ遺伝子およびスクワレンシンターゼ遺伝子に特異的な対を用いたＰＣＲの結果を示している。示されるように、複数の形質転換されたクローンが、ＦＰＰシンターゼ遺伝子とスクワレンシンターゼ遺伝子の両方の挿入について陽性である（例えば、番号１〜１０）。図６Ｃは、同質細胞質クローンと異質細胞質クローンとを識別するプライマー対を用いたＰＣＲの結果を示している。示されるように、複数の形質転換されたクローンが、トランスジーンの組み込みを支持する程度に、同質細胞質または異質細胞質のいずれかである（例えば、番号１〜１０）。番号のついていないクローンは、野生型遺伝子座の存在を証明しているので、さらなる解析のために選択されなかった。
【０１８０】
ＦＰＰシンターゼ遺伝子およびスクワレンシンターゼ遺伝子が存在することにより、ＦＰＰシンターゼ酵素およびスクワレンシンターゼ酵素の発現がもたらされたことを確認するために、ウエスタンブロットを行った。約１×１０8個の藻類細胞をＴＡＰ寒天培地から回収し、０．５ｍｌの溶解緩衝液（７５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ＝８．０、１５％スクロース、１００ｍＭベータ−メルカプトエタノール）に懸濁した。超音波処理（１５％の力で５×３０秒）によって細胞を溶解した。溶解物をローディング緩衝液（５％ＳＤＳ、５％ベータ−メルカプトエタノール、３０％スクロース、ブロモフェノールブルー）と１：１混合し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。その膜を２３℃において３０分間、ＴＢＳＴ＋５％乾燥脱脂乳でブロッキングし、抗ＦＬＡＧ抗体（ＴＢＳＴ＋５％乾燥脱脂乳中で１：１，０００希釈したもの）と４℃において１０時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄し、西洋ワサビ結合抗マウス抗体（ＴＢＳＴ＋５％乾燥脱脂乳で１：１０，０００希釈したもの）と２３℃において１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。化学発光検出を用いてタンパク質を可視化した。複数のクローンの結果（図６Ｄ）は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ細胞におけるＦＰＰシンターゼ遺伝子の発現が、そのタンパク質の発現をもたらしたことを示している。スクワレンシンターゼ遺伝子の生成物の可視化は、すべてのサンプル中に存在する同定されなかったタンパク質からのシグナルによって妨げられた。
【０１８１】
エンド−β−グルカナーゼの発現のためのＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ形質転換体の培養は、別段述べられない限り、１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上、５，０００Ｌｕｘの連続照明下、２３℃、液体ＴＡＰ培地中で行った。収集の前に少なくとも４８時間にわたって、１×１０7細胞／ｍｌの密度で培養物を維持した。
【０１８２】
ＦＰＰシンターゼ酵素およびスクワレンシンターゼ酵素が形質転換された藻類細胞内で生成されたか否かを判定するために、両方の酵素を免疫沈降し、ウエスタンブロットによって可視化した。簡潔には、５００ｍｌの藻類細胞培養物を、１５分間にわたる４℃、４０００×ｇでの遠心分離によって回収した。上清をデカントし、細胞を１０ｍｌの溶解緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２％Ｔｗｅｅｎ−２０）に再懸濁した。超音波処理（３５％の力で１０×３０秒）によって細胞を溶解した。１時間にわたる４℃、１４，０００×ｇでの遠心分離によって溶解物を清浄化した。上清を取り出し、抗ＦＬＡＧ抗体結合体化アガロース樹脂とともに４℃において１０時間インキュベートした。その溶解物から樹脂を重力濾過によって分離し、洗浄緩衝液（（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。複数のサンプルのウエスタンブロット解析の結果（図６Ｄおよび６Ｅ）は、両方の酵素が実際に生成されていることを示している。
【０１８３】
ＦＰＰシンターゼおよびスクワレンシンターゼが、インビボにおいて、機能的なスクアレン生合成経路を構成しているか否かを判定するために、スクアレンの蓄積を測定した。簡潔には、１．２Ｌの藻類細胞培養物を、５分間にわたる４℃、４０００×ｇでの遠心分離によって収集した。その上清を流し出し、残存した細胞ペレットを１０ｍｌのＴＡＰ培地に再懸濁し、５０ｍＬの遠心管に移した。再度、５分間、３，０００ＲＰＭでの遠心分離によって細胞をペレットにした。その上清のすべてを除去し、細胞の質量を測定した。サンプルを氷上で維持し、細胞ペレットを０．７５ｍｇのバイオマス：５ｍＬのＭｅＯＨという比で氷冷メタノール（ＭｅＯＨ）に再懸濁した。３０ｍＬのＭｅＯＨからなる溶媒ブランクを、浸出のためのコントロールとして５０ｍＬのコニカルバイアル中、氷上で保存した。ピペッティングを繰り返すことによって細胞ペレットを可溶化し（ｓｏｌｕｂｌｉｚｅｄ）、溶解物を氷上で保存することにより、タンパク質を沈殿させた。次いで、溶解物を５分間、１，０００ＲＰＭでの遠心分離によって清浄化した。４ｍＬの可溶性画分を琥珀色のガラスバイアルに移し、８ｍＬのヘプタンで覆った。溶解物を回転ホイール上で２３℃において一晩抽出した。各サンプルからの１．５ｍＬのヘプタンを完全に乾燥するまで凍結乾燥し、次いで１００μＬのヘプタンに再懸濁した。ＧＣ−ＭＳにおいて解析を行った。結果を図７に示す。１株あたり５反復でこれらの解析を行った。
【０１８４】
（実施例３．Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおけるモノテルペンシンターゼの生成）
この実施例では、Ｍ．ｓｐｉｃａｔａ由来のリモネンシンターゼをコードする核酸をＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに導入した。形質転換ＤＮＡを図３に図解で示す。この例において、「トランスジーン」と表示されているセグメントは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＡ遺伝子に対する５’ＵＴＲおよびプロモーター配列ならびにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＡ遺伝子に対する３’ＵＴＲによって制御されるリモネンシンターゼをコードする遺伝子であり（配列番号７４，表５；配列番号１２７，表６）、「選択マーカー」と表示されているセグメントは、細菌由来のカナマイシン耐性コード遺伝子であり、これは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のａｔｐＡ遺伝子に対する５’ＵＴＲおよびプロモーター配列ならびにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｒｂｃＬ遺伝子に対する３’ＵＴＲ配列によって制御される。このトランスジーンカセットは、５’側および３’側でｐｓｂＡ遺伝子座と隣接するＤＮＡの配列とそれぞれ同一である「相同Ａ」および「相同Ｂ」と表示されているセグメントを介してＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのｐｓｂＡ遺伝子座に標的化されている。この形質転換ＤＮＡの構築において行われたすべてのＤＮＡ操作は、本質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）およびＣｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９７，１９２−２０８，１９９８によって記載されているとおりであった。
【０１８５】
これらの実験において、すべての形質転換をＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  １３７ｃ（ｍｔ＋）株に対して行った。１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上、４５０Ｌｕｘの連続照明下、２３℃、ＴＡＰ培地（Ｇｏｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ５４：１６６５−１６６９，１９６５（本明細書中で参照により援用される））中、０．５ｍＭ  ５−フルオロデオキシウリジンの存在下において、対数後期まで（約７日間）細胞を生育した。５０ｍｌの細胞を、５分間にわたる２３℃、４，０００×ｇでの遠心分離によって収集した。上清をデカントし、粒子銃（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出，１９９８）によるその後の葉緑体形質転換に向けて、細胞を４ｍｌのＴＡＰ培地に再懸濁した。すべての形質転換をカナマイシン選択下（１００μｇ／ｍｌ）において行い、ここで、耐性は、図３の「選択マーカー」と表示されているセグメントによってコードされる遺伝子によって付与されたものである（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。
【０１８６】
ＰＣＲを使用することにより、形質転換された株を同定した。ＰＣＲ解析のために、１０6個の藻類細胞（寒天プレートまたは液体培養物からの細胞）を１０ｍＭ  ＥＤＴＡに懸濁し、１０分間９５℃に加熱し、次いで、２３℃付近まで冷却した。反応緩衝液、ＭｇＣ１２、ｄＮＴＰ、ＰＣＲプライマー対（表４）、ＤＮＡポリメラーゼおよび水からなるＰＣＲカクテルを調製した。ＥＤＴＡ中の藻類溶解物を加えることにより、反応物に鋳型を提供した。マグネシウム濃度を変化させることにより、加えられたＥＤＴＡ中の藻類溶解物の量および濃度を補った。アニーリング温度の勾配を用いることにより、特異的プライマー対にとって最適なアニーリング温度を決定した。
【０１８７】
リモネンシンターゼ遺伝子を含む株を同定するために、一方のプライマーが、ｐｓｂＡ  ５’ＵＴＲ内の部位にアニールし（配列番号５５）、他方のプライマーが、リモネンシンターゼをコードするセグメント内にアニールする（配列番号５６）、プライマー対を使用した。所望のクローンは、予想されるサイズのＰＣＲ産物をもたらすクローンである。その内在性遺伝子座が置換されている程度（同質細胞質に対する異質細胞質）を判定するために、２セットのプライマー対からなるＰＣＲ反応物を使用した（同じ反応物中で）。第１の対のプライマーは、発現ベクターによって標的化される内在性遺伝子座を増幅し、ｐｓｂＡ  ５’ＵＴＲ内にアニールするプライマー（配列番号５７）およびｐｓｂＡコード領域内にアニールするプライマー（配列番号５８）からなる。第２の対のプライマー（配列番号５９および６０）は、発現ベクターによって標的化されない定常領域すなわち調節領域を増幅するので、すべての場合において予想されるサイズの生成物を生成するはずである。この反応によって、内在性遺伝子座からのＰＣＲ産物が存在しないことがＰＣＲ反応を阻害する細胞夾雑物および／または他の夾雑物に起因しなかったことが確かめられる。それらのプライマー対の濃度は、両方の反応が同じチューブ内で起こるように変更される；しかしながら、内在性遺伝子座のための対は、定常対の５×濃度である。用いられたサイクル数は、感度を上げるために＞３０であった。最も望まれるクローンは、定常領域に対して生成物をもたらすが内在性遺伝子座に対して生成物をもたらさないクローンである。所望のクローンは、コントロール反応物と比べて強度の低い内在性遺伝子座生成物を生じるクローンでもある。
【０１８８】
リモネンシンターゼの発現のためのＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ形質転換体の培養は、別段述べられない限り、１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上、暗黒下、２３℃、液体ＴＡＰ培地中で行った。収集の前に少なくとも４８時間にわたって、１×１０7細胞／ｍｌの密度で培養物を維持した。
【０１８９】
リモネンシンターゼ遺伝子が、形質転換された藻類細胞内でリモネンシンターゼの発現をもたらしたか否かを判定するために、両方の可溶性タンパク質を免疫沈降し、ウエスタンブロットによって可視化した。簡潔には、５００ｍｌの藻類細胞培養物を、１５分間にわたる４℃、４０００×ｇでの遠心分離によって回収した。上清をデカントし、細胞を１０ｍｌの溶解緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２％Ｔｗｅｅｎ−２０）に再懸濁した。超音波処理（３５％の力で１０×３０秒）によって細胞を溶解した。１時間にわたる４℃、１４，０００×ｇでの遠心分離によって溶解物を清浄化した。上清を取り出し、抗ＦＬＡＧ抗体結合体化アガロース樹脂とともに４℃において１０時間インキュベートした。その溶解物から樹脂を重力濾過によって分離し、洗浄緩衝液（（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。複数のサンプルのウエスタンブロット解析の結果（図８）は、リモネンシンターゼが実際に生成されていることを示している。
【０１９０】
藻類葉緑体内で生成されたリモネンシンターゼが機能的な酵素であるか否かを判定するために、ＧＰＰからのリモネンの生成を調べた。簡潔には、５０μＬのリモネンシンターゼ結合アガロース（上で調製された同じサンプル）を、０．３３ｍｇ／ｍＬのＧＰＰとともに３００μＬの反応緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ＝７．２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｎＣ１２、１０％グリセロールおよび５ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し、ガラスバイアルに移した。その反応物をヘプタンで覆い、２３℃で１２時間インキュベートした。その反応物をクエンチし、その混合物をボルテックスすることによって抽出した。０．１ｍＬのヘプタンを除去し、そのサンプルをＧＣ−ＭＳによって解析した。結果を図９に示す。これらの結果は、単離された酵素が、インビトロにおいてＧＰＰをリモネンに変換することができたことを示している。
【０１９１】
粗細胞溶解物由来のリモネンシンターゼの活性も調べた。簡潔には、５０ｍｌの藻類細胞培養物を、１５分間にわたる４℃、４０００×ｇでの遠心分離によって収集した。上清をデカントし、細胞を０．５ｍＬの反応緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ＝７．２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｎＣ１２、１０％グリセロールおよび５ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁した。超音波処理（３５％の力で１０×３０秒）によって細胞を溶解した。その溶解物に０．３３ｍｇ／ｍＬのＧＰＰを加え、その混合物をガラスバイアルに移した。その反応物をヘプタンで覆い、２３℃において１２時間インキュベートした。その反応物をクエンチし、その混合物をボルテックスすることによって抽出した。０．１ｍＬのヘプタンを除去し、そのサンプルをＧＣ−ＭＳによって解析した。結果を図９に示す。これらの結果は、リモネンシンターゼを生成する株が、インビボにおいてリモネンを生成することができることを示している。
【０１９２】
（実施例４．Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおけるＧＰＰシンターゼの生成）
この実施例では、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＧＰＰシンターゼをコードする核酸をＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに導入した。質転換ＤＮＡを図３に図解で示す。この例において、「トランスジーン」と表示されているセグメントは、は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＡ遺伝子に対する５’ＵＴＲおよびプロモーター配列ならびにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＡ遺伝子に対する３’ＵＴＲによって制御されるＧＰＰシンターゼをコードする遺伝子であり（配列番号８９，表５；配列番号１４２，表６）、そして「選択マーカー」と表示されているセグメントは、細菌由来のカナマイシン耐性コード遺伝子であり、これは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のａｔｐＡ遺伝子に対する５’ＵＴＲおよびプロモーター配列ならびにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｒｂｃＬ遺伝子に対する３’ＵＴＲ配列によって制御される。このトランスジーンカセットは、５’側および３’側でｐｓｂＡ遺伝子座と隣接するＤＮＡの配列とそれぞれ同一である「相同Ａ」および「相同Ｂ」と表示されているセグメントを介してＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのｐｓｂＡ遺伝子座に標的化されている。この形質転換ＤＮＡの構築において行われたすべてのＤＮＡ操作は、本質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）およびＣｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９７，１９２−２０８，１９９８によって記載されているとおりであった。
【０１９３】
これらの実験において、すべての形質転換をＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  １３７ｃ（ｍｔ＋）株に対して行った。１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上、４５０Ｌｕｘの連続照明下、２３℃、ＴＡＰ培地（Ｇｏｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ５４：１６６５−１６６９，１９６５（本明細書中で参照により援用される））中、０．５ｍＭ  ５−フルオロデオキシウリジンの存在下において、対数後期まで（約７日間）細胞を生育した。５０ｍｌの細胞を、５分間にわたる２３℃、４，０００×ｇでの遠心分離によって収集した。上清をデカントし、粒子銃（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出，１９９８）によるその後の葉緑体形質転換に向けて、細胞を４ｍｌのＴＡＰ培地に再懸濁した。すべての形質転換をカナマイシン選択下（１００μｇ／ｍｌ）において行い、ここで、耐性は、図３の「選択マーカー」と表示されているセグメントによってコードされる遺伝子によって付与されたものである（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。
【０１９４】
ＰＣＲを使用することにより、形質転換された株を同定した。ＰＣＲ解析のために、１０6個の藻類細胞（寒天プレートまたは液体培養物からの細胞）を１０ｍＭ  ＥＤＴＡに懸濁し、１０分間９５℃に加熱し、次いで、２３℃付近まで冷却した。反応緩衝液、ＭｇＣ１２、ｄＮＴＰ、ＰＣＲプライマー対（表４）、ＤＮＡポリメラーゼおよび水からなるＰＣＲカクテルを調製した。ＥＤＴＡ中の藻類溶解物を加えることにより、反応物に鋳型を提供した。マグネシウム濃度を変化させることにより、加えられたＥＤＴＡ中の藻類溶解物の量および濃度を補った。アニーリング温度の勾配を用いることにより、特異的プライマー対にとって最適なアニーリング温度を決定した。
【０１９５】
ＧＰＰシンターゼ遺伝子を含む株を同定するために、一方のプライマーが、ｐｓｂＡ  ５’ＵＴＲ内の部位にアニールし（配列番号５５）、他方のプライマーが、ＧＰＰシンターゼをコードするセグメント内にアニールする（配列番号６１）、プライマー対を使用した。所望のクローンは、予想されるサイズのＰＣＲ産物をもたらすクローンである。その内在性遺伝子座が置換されている程度（同質細胞質に対する異質細胞質）を判定するために、２セットのプライマー対からなるＰＣＲ反応物を使用した（同じ反応物中で）。第１の対のプライマーは、発現ベクターによって標的化される内在性遺伝子座を増幅し、ｐｓｂＡ  ５’ＵＴＲ内にアニールするプライマー（配列番号５７）およびｐｓｂＡコード領域内にアニールするプライマー（配列番号５８）からなる。第２の対のプライマー（配列番号５９および６０）は、発現ベクターによって標的化されない定常領域すなわち調節領域を増幅するので、すべての場合において予想されるサイズの生成物を生成するはずである。この反応によって、内在性遺伝子座からのＰＣＲ産物が存在しないことがＰＣＲ反応を阻害する細胞夾雑物および／または他の夾雑物に起因しなかったことが確かめられる。それらのプライマー対の濃度は、両方の反応が同じチューブ内で起こるように変更される；しかしながら、内在性遺伝子座のための対は、定常対の５×濃度である。用いられたサイクル数は、感度を上げるために＞３０であった。最も望まれるクローンは、定常領域に対して生成物をもたらすが内在性遺伝子座に対して生成物をもたらさないクローンである。所望のクローンは、コントロール反応物と比べて強度の低い内在性遺伝子座生成物を生じるクローンでもある。このＰＣＲの結果を図１０（ＡおよびＢ）に示す。
【０１９６】
ＧＰＰシンターゼ遺伝子が存在することにより、ＧＰＰシンターゼの発現がもたらされたことを確認するために、ウエスタンブロットを行った。約１×１０8個の藻類細胞をＴＡＰ寒天培地から回収し、０．０５ｍｌの溶解緩衝液（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ；Ｎｏｖａｇｅｎ）に懸濁した。溶液を５分間９５℃に加熱し、次いで、２３℃まで冷却した。溶解物をローディング緩衝液（ＸＴサンプル緩衝液；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と３：１混合し、サンプルを１分間９５℃に加熱し、２３℃まで冷却し、不溶性タンパク質を遠心分離によって除去した。可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。その膜を２３℃において３０分間、ＴＢＳＴ＋５％乾燥脱脂乳でブロッキングし、抗ＦＬＡＧ抗体（ＴＢＳＴ＋５％乾燥脱脂乳中で１：２，５００希釈したもの）と４℃において１０時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄し、西洋ワサビ結合抗マウス抗体（ＴＢＳＴ＋５％乾燥脱脂乳で１：５，０００希釈したもの）と２３℃において１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。化学発光検出を用いてタンパク質を可視化した。複数のクローンの結果（図１０Ｃ）は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ細胞におけるＧＰＰシンターゼ遺伝子の発現が、そのタンパク質の生成をもたらしたことを示している。図１０Ｃ。
【０１９７】
ＧＰＰシンターゼの発現のためのＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ形質転換体の培養は、別段述べられない限り、１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上、５，０００Ｌｕｘの連続照明下、２３℃、液体ＴＡＰ培地中で行った。収集の前に少なくとも４８時間にわたって、１×１０7細胞／ｍｌの密度で培養物を維持した。
【０１９８】
藻類葉緑体内で生成されたＧＰＰシンターゼが機能的な酵素であるか否かを判定するために、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰからのリモネンの生成を調べた。簡潔には、５０ｍＬの藻類細胞培養物を、１５分間にわたる４℃、４０００×ｇでの遠心分離によって収集した。上清をデカントし、反応緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ＝７．２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｎＣ１２、１０％グリセロールおよび５ｍＭ  ＤＴＴ）に細胞を再懸濁した。超音波処理（３５％の力で１０×３０秒）によって細胞を溶解した。１μｇのリモネンシンターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉから調製されたもの）を０．３３ｍｇ／ｍＬのＩＰＰおよび０．３３ｍｇ／ｍＬのＤＭＡＰＰとともにその溶解物に加え、その混合物をガラスバイアルに移した。その反応物をヘプタンで覆い、２３℃で１２時間インキュベートした。その反応物をクエンチし、その混合物をボルテックスすることによって抽出した。０．１ｍＬのヘプタンを除去し、そのサンプルをＧＣ−ＭＳによって解析した。
【０１９９】
（実施例５．Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおけるＦＰＰシンターゼおよびセスキテルペンシンターゼの生成）
この実施例では、Ｇ．ｇａｌｌｕｓ由来のＦＰＰシンターゼおよびＯ．ｂａｓｉｌｉｃｕｍ由来のジンギベレンシンターゼをコードする核酸をＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに導入した。形質転換ＤＮＡを図３に図解で示す。この例において、「トランスジーン１」と表示されているセグメントは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＤ遺伝子に対する５’ＵＴＲおよびプロモーター配列ならびにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＡ遺伝子に対する３’ＵＴＲによって制御されるＦＰＰシンターゼをコードする遺伝子であり（配列番号８２，表５；配列番号１３５，表６）、「トランスジーン２」と表示されているセグメントは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＤ遺伝子に対する５’ＵＴＲおよびプロモーター配列ならびにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＡ遺伝子に対する３’ＵＴＲによって制御されるジンギベレンシンターゼをコードする遺伝子であり（配列番号１０１，表５；配列番号１５４，表６）、そして「選択マーカー」と表示されているセグメントは、細菌由来のカナマイシン耐性コード遺伝子であり、これは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のａｔｐＡ遺伝子に対する５’ＵＴＲおよびプロモーター配列ならびにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｒｂｃＬ遺伝子に対する３’ＵＴＲ配列によって制御される。このトランスジーンカセットは、５’側および３’側で３ＨＢ遺伝子座と隣接するＤＮＡの配列とそれぞれ同一である「相同Ｃ」および「相同Ｄ」と表示されているセグメントを介してＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの３ＨＢ遺伝子座に標的化されている。この形質転換ＤＮＡの構築において行われたすべてのＤＮＡ操作は、本質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）およびＣｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９７，１９２−２０８，１９９８によって記載されているとおりであった。
【０２００】
これらの実験において、すべての形質転換をＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  １３７ｃ（ｍｔ＋）株に対して行った。１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上、４５０Ｌｕｘの連続照明下、２３℃、ＴＡＰ培地（Ｇｏｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ５４：１６６５−１６６９，１９６５（本明細書中で参照により援用される））中、０．５ｍＭ  ５−フルオロデオキシウリジンの存在下において、対数後期まで（約７日間）細胞を生育した。５０ｍｌの細胞を、５分間にわたる２３℃、４，０００×ｇでの遠心分離によって収集した。上清をデカントし、粒子銃（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出，１９９８）によるその後の葉緑体形質転換に向けて、細胞を４ｍｌのＴＡＰ培地に再懸濁した。すべての形質転換をカナマイシン選択下（１００μｇ／ｍｌ）において行い、ここで、耐性は、図３の「選択マーカー」と表示されているセグメントによってコードされる遺伝子によって付与されたものである（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。
【０２０１】
ＰＣＲを使用することにより、形質転換された株を同定した。ＰＣＲ解析のために、１０6個の藻類細胞（寒天プレートまたは液体培養物からの細胞）を１０ｍＭ  ＥＤＴＡに懸濁し、１０分間９５℃に加熱し、次いで、２３℃付近まで冷却した。反応緩衝液、ＭｇＣ１２、ｄＮＴＰ、ＰＣＲプライマー対（表４）、ＤＮＡポリメラーゼおよび水からなるＰＣＲカクテルを調製した。ＥＤＴＡ中の藻類溶解物を加えることにより、反応物に鋳型を提供した。マグネシウム濃度を変化させることにより、加えられたＥＤＴＡ中の藻類溶解物の量および濃度を補った。アニーリング温度の勾配を用いることにより、特異的プライマー対にとって最適なアニーリング温度を決定した。ＦＰＰシンターゼ遺伝子を含む株を同定するために、一方のプライマーが、ｐｓｂＤ  ５’ＵＴＲ内の部位にアニールし（配列番号６２）、他方のプライマーが、ＦＰＰシンターゼをコードするセグメント内にアニールする（配列番号６６）、プライマー対を使用した。ジンギベレンシンターゼ遺伝子を含む株を同定するために、一方のプライマーが、ｐｓｂＤ  ５’ＵＴＲ内の部位にアニールし（配列番号６２）、他方のプライマーが、ジンギベレンシンターゼをコードするセグメント内にアニールする（配列番号６７）、プライマー対を使用した。所望のクローンは、両方の反応において予想されるサイズのＰＣＲ産物をもたらすクローンである。その内在性遺伝子座が置換されている程度（同質細胞質に対する異質細胞質）を判定するために、２セットのプライマー対からなるＰＣＲ反応物を使用した（同じ反応物中で）。第１の対のプライマーは、発現ベクターによって標的化される内在性遺伝子座を増幅する（配列番号６８および６９）。第２の対のプライマー（配列番号５９および６０）は、発現ベクターによって標的化されない定常領域すなわち調節領域を増幅するので、すべての場合において予想されるサイズの生成物を生成するはずである。この反応によって、内在性遺伝子座からのＰＣＲ産物が存在しないことがＰＣＲ反応を阻害する細胞夾雑物および／または他の夾雑物に起因しなかったことが確かめられる。それらのプライマー対の濃度は、両方の反応が同じチューブ内で起こるように変更される；しかしながら、内在性遺伝子座のための対は、定常対の５×濃度である。用いられたサイクル数は、感度を上げるために＞３０であった。最も望まれるクローンは、定常領域に対して生成物をもたらすが内在性遺伝子座に対して生成物をもたらさないクローンである。所望のクローンは、コントロール反応物と比べて強度の低い内在性遺伝子座生成物を生じるクローンでもある。
【０２０２】
ＦＰＰシンターゼ遺伝子およびジンギベレンシンターゼ遺伝子が存在することにより、ＦＰＰシンターゼ酵素およびジンギベレンシンターゼ酵素の発現がもたらされたことを確認するために、ウエスタンブロットを行った。約１×１０8個の藻類細胞をＴＡＰ寒天培地から回収し、０．０５ｍｌの溶解緩衝液（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ；Ｎｏｖａｇｅｎ）に懸濁した。溶液を５分間９５℃に加熱し、次いで、２３℃まで冷却した。溶解物をローディング緩衝液（ＸＴサンプル緩衝液；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と３：１混合し、サンプルを１分間９５℃に加熱し、２３℃まで冷却し、不溶性タンパク質を遠心分離によって除去した。可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。その膜を２３℃において３０分間、ＴＢＳＴ＋５％乾燥脱脂乳でブロッキングし、抗ＦＬＡＧ抗体（ＴＢＳＴ＋５％乾燥脱脂乳中で１：２，５００希釈したもの）と４℃において１０時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄し、西洋ワサビ結合抗マウス抗体（ＴＢＳＴ＋５％乾燥脱脂乳で１：５，０００希釈したもの）と２３℃において１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。化学発光検出を用いてタンパク質を可視化した。複数のクローンの結果（図１１）は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ細胞におけるＧＰＰシンターゼ遺伝子の発現が、そのタンパク質の生成をもたらしたことを示している。
【０２０３】
ＦＰＰシンターゼおよびジンギベレンシンターゼの発現のためのＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ形質転換体の培養は、別段述べられない限り、１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上、５，０００Ｌｕｘの連続照明下、２３℃、液体ＴＡＰ培地中で行った。収集の前に少なくとも４８時間にわたって、１×１０7細胞／ｍｌの密度で培養物を維持した。
【０２０４】
藻類葉緑体内で生成されたＦＰＰシンターゼおよびジンギベレンシンターゼが機能的であるか否かを判定するために、ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰからのセスキテルペンの生成を調べる。簡潔には、５０ｍＬの藻類細胞培養物を、１５分間にわたる４℃、４０００×ｇでの遠心分離によって収集する。上清をデカントし、細胞を０．５ｍＬの反応緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ＝７．２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｎＣ１２、１０％グリセロールおよび５ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁する。超音波処理（３５％の力で１０×３０秒）によって細胞を溶解する。その溶解物に０．３３ｍｇ／ｍＬのＦＰＰを加え、その混合物をガラスバイアルに移す。その反応物をヘプタンで覆い、２３℃で１２時間インキュベートする。その反応物をクエンチし、その混合物をボルテックスすることによって抽出する。０．１ｍＬのヘプタンを除去し、そのサンプルをガスクロマトグラフィ−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）によって解析する。
【０２０５】
（実施例６．Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおけるＦＰＰシンターゼおよびセスキテルペンシンターゼの生成）
この実施例では、Ｇ．ｇａｌｌｕｓ由来のＦＰＰシンターゼおよびＺ．ｍａｙｓ由来のセスキテルペンシンターゼをコードする核酸をＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに導入した。形質転換ＤＮＡを図３に図解で示す。この例において、「トランスジーン１」と表示されているセグメントは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＤ遺伝子に対する５’ＵＴＲおよびプロモーター配列ならびにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＡ遺伝子に対する３’ＵＴＲによって制御されるＦＰＰシンターゼをコードする遺伝子であり（配列番号８２，表５；配列番号１３５，表６）、「トランスジーン２」と表示されているセグメントは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＤ遺伝子に対する５’ＵＴＲおよびプロモーター配列ならびにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｐｓｂＡ遺伝子に対する３’ＵＴＲによって制御されるセスキテルペンシンターゼをコードする遺伝子であり（配列番号１０６，表５；配列番号１５９，表６）、そして「選択マーカー」と表示されているセグメントは、細菌由来のカナマイシン耐性コード遺伝子であり、これは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のａｔｐＡ遺伝子に対する５’ＵＴＲおよびプロモーター配列ならびにＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のｒｂｃＬ遺伝子に対する３’ＵＴＲ配列によって制御される。このトランスジーンカセットは、５’側および３’側で３ＨＢ遺伝子座と隣接するＤＮＡの配列とそれぞれ同一である「相同Ｃ」および「相同Ｄ」と表示されているセグメントを介してＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの３ＨＢ遺伝子座に標的化されている。この形質転換ＤＮＡの構築において行われたすべてのＤＮＡ操作は、本質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）およびＣｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９７，１９２−２０８，１９９８によって記載されているとおりであった。
【０２０６】
これらの実験において、すべての形質転換をＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  １３７ｃ（ｍｔ＋）株に対して行った。１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上、４５０Ｌｕｘの連続照明下、２３℃、ＴＡＰ培地（Ｇｏｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ５４：１６６５−１６６９，１９６５（本明細書中で参照により援用される））中、０．５ｍＭ  ５−フルオロデオキシウリジンの存在下において、対数後期まで（約７日間）細胞を生育した。５０ｍｌの細胞を、５分間にわたる２３℃、４，０００×ｇでの遠心分離によって収集した。上清をデカントし、粒子銃（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出，１９９８）によるその後の葉緑体形質転換に向けて、細胞を４ｍｌのＴＡＰ培地に再懸濁した。すべての形質転換をカナマイシン選択下（１００μｇ／ｍｌ）において行い、ここで、耐性は、図３の「選択マーカー」と表示されているセグメントによってコードされる遺伝子によって付与されたものである（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。
【０２０７】
ＰＣＲを使用することにより、形質転換された株を同定した。ＰＣＲ解析のために、１０6個の藻類細胞（寒天プレートまたは液体培養物からの細胞）を１０ｍＭ  ＥＤＴＡに懸濁し、１０分間９５℃に加熱し、次いで、２３℃付近まで冷却した。反応緩衝液、ＭｇＣ１２、ｄＮＴＰ、ＰＣＲプライマー対（表４）、ＤＮＡポリメラーゼおよび水からなるＰＣＲカクテルを調製した。ＥＤＴＡ中の藻類溶解物を加えることにより、反応物に鋳型を提供した。マグネシウム濃度を変化させることにより、加えられたＥＤＴＡ中の藻類溶解物の量および濃度を補った。アニーリング温度の勾配を用いることにより、特異的プライマー対にとって最適なアニーリング温度を決定した。
【０２０８】
ＦＰＰシンターゼ遺伝子を含む株を同定するために、一方のプライマーが、ｐｓｂＤ  ５’ＵＴＲ内の部位にアニールし（配列番号６２）、他方のプライマーが、ＦＰＰシンターゼをコードするセグメント内にアニールする（配列番号６６）、プライマー対を使用した。セスキテルペンシンターゼ遺伝子を含む株を同定するために、一方のプライマーが、ｐｓｂＤ  ５’ＵＴＲ内の部位にアニールし（配列番号６２）、他方のプライマーが、セスキテルペンシンターゼをコードするセグメント内にアニールする（配列番号７０）、プライマー対を使用した。所望のクローンは、両方の反応において予想されるサイズのＰＣＲ産物をもたらすクローンである。その内在性遺伝子座が置換されている程度（同質細胞質に対する異質細胞質）を判定するために、２セットのプライマー対からなるＰＣＲ反応物を使用した（同じ反応物中で）。第１の対のプライマーは、発現ベクターによって標的化される内在性遺伝子座を増幅する（配列番号６８および６９）。第２の対のプライマー（配列番号５９および６０）は、発現ベクターによって標的化されない定常領域すなわち調節領域を増幅するので、すべての場合において予想されるサイズの生成物を生成するはずである。この反応によって、内在性遺伝子座からのＰＣＲ産物が存在しないことがＰＣＲ反応を阻害する細胞夾雑物および／または他の夾雑物に起因しなかったことが確かめられる。それらのプライマー対の濃度は、両方の反応が同じチューブ内で起こるように変更される；しかしながら、内在性遺伝子座のための対は、定常対の５×濃度である。用いられたサイクル数は、感度を上げるために＞３０であった。最も望まれるクローンは、定常領域に対して生成物をもたらすが内在性遺伝子座に対して生成物をもたらさないクローンである。所望のクローンは、コントロール反応物と比べて強度の低い内在性遺伝子座生成物を生じるクローンでもある。
【０２０９】
ＦＰＰシンターゼ遺伝子およびセスキテルペンシンターゼ遺伝子が存在することにより、ＦＰＰシンターゼ酵素およびセスキテルペンシンターゼ酵素の発現がもたらされたことを確認するために、ウエスタンブロットを行った。約１×１０8個の藻類細胞をＴＡＰ寒天培地から回収し、０．０５ｍｌの溶解緩衝液（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ；Ｎｏｖａｇｅｎ）に懸濁した。溶液を５分間９５℃に加熱し、次いで、２３℃まで冷却した。溶解物をローディング緩衝液（ＸＴサンプル緩衝液；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と３：１混合し、サンプルを１分間９５℃に加熱し、２３℃まで冷却し、不溶性タンパク質を遠心分離によって除去した。可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。その膜を２３℃において３０分間、ＴＢＳＴ＋５％乾燥脱脂乳でブロッキングし、抗ＦＬＡＧ抗体（ＴＢＳＴ＋５％乾燥脱脂乳中で１：２，５００希釈したもの）と４℃において１０時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄し、西洋ワサビ結合抗マウス抗体（ＴＢＳＴ＋５％乾燥脱脂乳で１：５，０００希釈したもの）と２３℃において１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。化学発光検出を用いてタンパク質を可視化した。複数のクローンの結果（図１２）は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ細胞におけるＦＰＰシンターゼ遺伝子の発現が、そのタンパク質の生成をもたらしたことを示している。
【０２１０】
ＦＰＰシンターゼおよびセスキテルペンシンターゼの発現のためのＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ形質転換体の培養は、別段述べられない限り、１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上、５，０００Ｌｕｘの連続照明下、２３℃、液体ＴＡＰ培地中で行った。収集の前に少なくとも４８時間にわたって、１×１０7細胞／ｍｌの密度で培養物を維持した。
【０２１１】
藻類葉緑体内で生成されたＦＰＰシンターゼおよびセスキテルペンシンターゼが機能的であるか否かを判定するために、ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰからのセスキテルペンの生成を調べる。簡潔には、５０ｍＬの藻類細胞培養物を、１５分間にわたる４℃、４０００×ｇでの遠心分離によって収集する。上清をデカントし、細胞を０．５ｍＬの反応緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ＝７．２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｎＣ１２、１０％グリセロールおよび５ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁する。超音波処理（３５％の力で１０×３０秒）によって細胞を溶解する。その溶解物に０．３３ｍｇ／ｍＬのＦＰＰを加え、その混合物をガラスバイアルに移す。その反応物をヘプタンで覆い、２３℃で１２時間インキュベートする。その反応物をクエンチし、その混合物をボルテックスすることによって抽出する。０．１ｍＬのヘプタンを除去し、そのサンプルをガスクロマトグラフィ−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）によって解析する。
【０２１２】
（実施例７．Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおけるジテルペン分子の生成）
この実施例では、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの株を、Ｇ．ｇａｌｌｕｓ由来のＦＰＰシンターゼおよびＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のスクワレンシンターゼを発現するように操作した（上に記載したように）。ＦＰＰシンターゼおよびスクワレンシンターゼの発現のためのＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ形質転換体の培養は、別段述べられない限り、１００ｒｐｍに設定されたロータリーシェーカー上、５，０００Ｌｕｘの連続照明下、２３℃、液体ＨＳＭ培地中で行った。
【０２１３】
いずれかの酵素の発現がジテルペンを生成する代謝経路に影響を与えるか否かを判定するために、フィトール生成を調べた。簡潔には、８００ｍＬの藻類細胞培養物を、５分間にわたる４℃、４０００×ｇでの遠心分離によって収集した。その上清を流し出し、残存した細胞ペレットを１０ｍｌのＨＳＭ培地に再懸濁し、５０ｍＬの遠心管に移した。再度、５分間にわたる３，０００ＲＰＭでの遠心分離によって細胞をペレットにした。その上清のすべてを除去し、細胞の質量を測定した。サンプルを２３℃で維持し、細胞ペレットを０．７５ｍｇのバイオマス：５ｍＬのＭｅＯＨという比でＭｅＯＨ：ＫＯＨ（１：１０）に再懸濁した。３０ｍＬのＭｅＯＨ：ＫＯＨ（１：１０）からなる溶媒ブランクを、浸出のためのコントロールとして５０ｍＬのコニカルバイアル中で保存した。ピペッティングを繰り返すことによって細胞ペレットを可溶化した。溶解物を３０分間５５℃に加熱した（完全な混合を確実にするために１０分間隔で振盪した）。溶解物を約２３℃まで冷却し、４ｍＬの各サンプルを琥珀色のガラスバイアルに移し、８ｍＬのヘプタンで覆い、回転ホイール上、２３℃で１０〜１２時間混合した。１００μＬのヘプタンを回収した。解析をＧＣ−ＭＳについて行った。結果を図１３に示す。これらの結果は、これらの酵素の発現が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおけるフィトールの生成を増加させることを示している。
【０２１４】
（実施例８．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける、モノテルペン生合成経路を構成する酵素の生成）
この実施例では、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＧＰＰシンターゼおよびＭ．ｓｐｉｃａｔａ由来のリモネンシンターゼをコードする核酸をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ−２１細胞に導入した。この例において、ＧＰＰシンターゼをコードする遺伝子（配列番号８９，表５；配列番号１４２，表６）およびリモネンシンターゼをコードする遺伝子（配列番号７４，表５；配列番号１２７，表６）の各々を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位を用いてプラスミドｐＥＴ−２１ａにライゲーションした。得られたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ−２１細胞に形質転換した。この形質転換ＤＮＡの構築において行われたすべてのＤＮＡ操作は、本質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）およびＣｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９７，１９２−２０８，１９９８によって記載されているとおりであった。
【０２１５】
細胞密度がＯＤ＝０．６に達したときに、上記のシンターゼの発現を誘導した。細胞を３０℃において５時間生育し、次いで収集した。ＧＰＰシンターゼ遺伝子およびリモネンシンターゼ遺伝子が存在することにより、それらの酵素の発現がもたらされたことを確認するために、ウエスタンブロットを、本質的に上に記載したように行った。結果（図１４；レーン１：ＭＷラダー；レーン２：ＧＰＰシンターゼ；およびレーン３：リモネンシンターゼ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞におけるＧＰＰシンターゼタンパク質およびリモネンシンターゼタンパク質の発現を示している。
【０２１６】
上記の酵素が機能的であるか否かを判定するために、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰからのリモネンの生成を調べた。簡潔には、５００ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ細胞培養物を１５分間にわたる４℃、４０００×ｇでの遠心分離によって収集した。上清をデカントし、細胞を１０ｍｌの溶解緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２％Ｔｗｅｅｎ−２０）に再懸濁した。超音波処理（３５％の力で３×３０秒）によって細胞を溶解した。１時間にわたる４℃、１４，０００×ｇでの遠心分離によって溶解物を清浄化した。上清を取り出し、抗ＦＬＡＧ抗体結合体化アガロース樹脂とともに４℃において１０時間インキュベートした。その溶解物から樹脂を重力濾過によって分離し、洗浄緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。溶出緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０μｇ／ｍＬ  ＦＬＡＧペプチド）を用いて、その樹脂から酵素を溶出させた。
【０２１７】
リモネンシンターゼならびにＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを加えるか、または加えずに、反応緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ＝７．２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｎＣ１２、１０％グリセロールおよび５ｍＭ  ＤＴＴ）中で反応を行った。その反応物をヘプタンで覆い、２３℃で１２時間インキュベートした。その反応物をクエンチし、その混合物をボルテックスすることによって抽出した。０．１ｍＬのヘプタンを除去し、そのサンプルをガスクロマトグラフィ−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）によって解析する。結果を図１５に示す。大きなピークは、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株から単離されたリモネンシンターゼを含む反応物がもたらした。
【０２１８】
（実施例９．融合された耐性マーカーおよび目的の遺伝子をコードする核酸によるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの核形質転換）
この実施例では、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来のキシラナーゼ２をコードする核酸をＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに導入する。形質転換ＤＮＡを図１６Ａに図解で示す。「トランスジーン」と表示されているセグメントは、キシラナーゼ２コード遺伝子であり、「プロモーター／５’ＵＴＲ」と表示されているセグメントは、イントロンを含むＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＨＳＰ７０／ｒｂｃＳ２  ５’ＵＴＲであり、「選択マーカー」と表示されているセグメントは、ブレオマイシン耐性遺伝子であり、ＣＭ（切断部分）と表示されているセグメントは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のＡ２ウイルスプロテアーゼであり、そして３’ＵＴＲと表示されているセグメントは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ｒｂｃＳ２由来の３’ＵＴＲである。そのブレオマイシン耐性遺伝子、Ａ２およびキシラナーゼ２コード領域は、インフレームで物理的に連結されており、単一のキメラＯＲＦがもたらされる。標準的な手法を用いて、そのＯＲＦの３’末端に金属親和性タグ（ＭＡＴ）およびＦＬＡＧエピトープタグを付加した。この形質転換ＤＮＡの構築において行われたすべてのＤＮＡ操作は、本質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）およびＣｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９７，１９２−２０８，１９９８によって記載されているとおりであった。
【０２１９】
これらの実験において、すべての形質転換を細胞壁欠損株Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＣＣ３３９５（アルギニン栄養要求性変異体ｍｔ−）に対して行う。細胞を生育し、エレクトロポレーションを介して形質転換する。対数中期まで（約２〜６×１０6細胞／ｍｌ）細胞を生育する。収集の前に細胞培養物に０．０５％の濃度となるようにＴｗｅｅｎ−２０を加えることにより、細胞が遠心分離チューブに粘着するのを防いだ。５分間、細胞を穏やかに（２０００〜５０００ｇ）遠沈する。上清を除去し、細胞をＴＡＰ＋４０ｍＭスクロース培地に再懸濁した。１〜２μｇの形質転換ＤＮＡを約１×１０8細胞と氷上で混合し、エレクトロポレーションキュベットに移した。２５μＦに設定されたキャパシタンス、２０００のＶ／ｃｍを送達する８００Ｖの電圧および１０〜１４ｍｓの時定数でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの後、そのキュベットを５〜２０分間にわたって室温に戻す。細胞を１０ｍｌのＴＡＰ＋４０ｍＭスクロース＋５０μｇ／ｍｌアルギニンに移し、１２〜１６時間にわたって連続的に振盪しながら室温で回復させた。次いで、２０００ｇ〜５０００ｇでの遠心分離によって細胞を収集し、０．５ｍｌのＴＡＰ＋４０ｍＭスクロース培地に再懸濁した。０．２５ｍｌの細胞をＴＡＰ＋１００μｇ／ｍｌブレオマイシン＋５０μｇ／ｍｌアルギニン上にプレーティングした。すべての形質転換をブレオマイシン選択下（１００μｇ／ｍｌ）において行い、ここで、耐性は、図１６Ａの「選択マーカー」と表示されているセグメントによってコードされる遺伝子によって付与されたものである。その外因性ＤＮＡの喪失を防ぐために、形質転換された株をブレオマイシンの存在下において維持する。
【０２２０】
ブレオマイシンの存在下において生長したコロニーをドットブロットによってスクリーニングした。簡潔には、コロニーをＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）によって溶解し、Ｃｏ２＋磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示書に従って用いてＭＡＴタグ化タンパク質を分離した。そのタンパク質に曝露した後、そのビーズを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳＴ）１５０μｌで３回、室温において洗浄した。１５０μｌの１０μＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、４００ｍＭ  ＮａＣｌによってビーズからタンパク質を遊離し、その１５０μｌの溶出液をニトロセルロース膜上にドットブロットした。膜をＳｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ（ＴＢＳ）ブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってブロッキングし、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ緩衝液で１：３０００希釈されたマウス抗ＦＬＡＧ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（Ｓｉｇｍａ）で１時間プロービングした。プロービング後、膜をＴＢＳＴで４回洗浄し、次いで、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ化学発光基質（ｓｕｂｒａｔｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて現像し、ＣＣＤカメラ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を用いて撮像した。次いで、このドットブロット解析において陽性の結果を示すコロニーをウエスタンブロッティングによってスクリーニングする。
【０２２１】
ＴＡＰ寒天プレート上で生長した一部の藻類細胞を、５０μｌの還元剤含有１×ＳＤＳサンプル緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）に細胞を再懸濁することによって溶解した。次いで、サンプルを煮沸し、１０％ビス−トリスポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ）において電気泳動し、Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ半乾燥ブロッター（ＢｉｏＲａｄ）を製造者の指示書に従って用いてＰＶＤＦ膜に転写した。膜をＳｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ（ＴＢＳ）ブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってブロッキングし、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ緩衝液で１：３０００希釈されたマウス抗ＦＬＡＧ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（Ｓｉｇｍａ）で１時間プロービングした。プロービング後、膜をＴＢＳＴで４回洗浄し、次いで、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて現像し、ＣＣＤカメラ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を用いて撮像した。５つのコロニー（および野生型コントロール）の結果を図１７に示す。陽性コロニーは、ＷＴバックグラウンドよりも低分子量のバンドを示す。少量のインタクトな融合物（キシラナーゼに融合されたブレオマイシン耐性マーカー）は、上記細胞によって翻訳される；この耐性マーカーは、二量体を形成するので、これらの生成物は、より高分子量に移動する。これらの結果から、キシラナーゼ２が、上記株から生成されていることが示唆される。
【０２２２】
生成されたキシラナーゼが機能的であるか否かを判定するために、酵素活性を調べる。一部の細胞をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）によって５０μｌによってホモジナイズし、ＥｎｚＣｈｅｃｋ  Ｕｌｔｒａ  Ｘｙｌａｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を製造者の指示書に従って使用することにより、キシラナーゼ活性を調べた。
【０２２３】
結果を図１８に示し、形質転換された葉緑体から外因性キシラナーゼを生成するＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ株から単離されたキシラナーゼと比較する。
【０２２４】
プラスミド構築、形質転換、コロニー選択、ウエスタンブロットおよび酵素解析について同様のプロトコルを、表３に列挙されている各酵素を用いて行った。これらの各酵素について、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ炭酸脱水酵素分泌シグナルを用いて融合タンパク質を調製する実験を繰り返した。
【０２２５】
【表１５】
2010538616.tif 000017
【０２２６】
（実施例１０．耐性マーカーおよび目的の遺伝子をコードする核酸によるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの核形質転換）
この実施例では、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来のエンドグルカナーゼをコードする核酸をＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに導入する。形質転換ＤＮＡを図１６Ｂに図解で示す。「トランスジーン」と表示されているセグメントは、エンドグルカナーゼコード遺伝子であり、「プロモーター／５’ＵＴＲ」と表示されているセグメントは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＨＳＰ７０／ｒｂｃＳ２  ５’ＵＴＲであり、「選択マーカー」と表示されているセグメントは、ハイグロマイシン耐性遺伝子であり（本発明者らは非機能性パロモマイシン耐性遺伝子に関する記載を含めるべきであろうか？おそらくそうではないと本発明者は考える）、そして３’ＵＴＲと表示されているセグメントは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ｒｂｃＳ２由来の３’ＵＴＲである。そのハイグロマイシン耐性遺伝子およびエンドグルカナーゼコード領域は、ベータ２−チューブリンプロモーターによって動かされるハイグロマイシンマーカーとともに別々に発現される。エンドグルカナーゼコード配列を、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ炭酸脱水酵素分泌シグナルをコードするＤＮＡフラグメントに融合した。標準的な手法を用いて、そのＯＲＦの３’末端に金属親和性タグ（ＭＡＴ）およびＦＬＡＧエピトープタグを付加した。この形質転換ＤＮＡの構築において行われたすべてのＤＮＡ操作は、本質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）およびＣｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９７，１９２−２０８，１９９８によって記載されているとおりであった。
【０２２７】
これらの実験において、すべての形質転換を、本質的に上に記載したとおり細胞壁株Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＣＣ１９６０（ｍｔ＋）に対して行う。すべての形質転換をハイグロマイシン選択下（２０μｇ／ｍｌ）において行い、ここで、耐性は、図１６Ｂの「選択マーカー」と表示されているセグメントによってコードされる遺伝子によって付与されたものである。形質転換された株をハイグロマイシンの存在下で維持する。
【０２２８】
ハイグロマイシンの存在下において生長したコロニーをドットブロットによってスクリーニングした。簡潔には、コロニーを溶解し、ＭＡＴタグ化タンパク質を先に記載したようにドットブロットのために精製した。そのタンパク質に曝露した後、そのビーズを室温において１５０μｌの１×ＴＢＳＴで２回洗浄し、１５０μｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、４００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭイミダゾールで１回洗浄した。１５０μｌの１０μＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、４００ｍＭ  ＮａＣｌによってビーズからタンパク質を遊離し、その１５０μｌの溶出液をニトロセルロース膜上にドットブロットした。膜をブロッキングし、先に記載したように抗ＦＬＡＧ抗体でプロービングした。
【０２２９】
次いで、上記のドットブロット解析において陽性の結果を示すコロニーをウエスタンブロッティングによってスクリーニングする。対数期の液体培養物から１×１０8個の細胞を５分間、３０００×ｇで収集した。上清をデカントし、細胞を１ｍｌのタンパク質結合緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．５、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール）に再懸濁した。５００μｌのジルコニウムビーズの存在下において最高速度でボルテックスする（１ｍｍ，ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）ことによって細胞を溶解した。１分間にわたる４℃、２４００ｇでの遠心分離によって溶解物を清浄化した。上清を取り出し、４℃で１時間、Ｎｉ２＋アガロース樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートした。２４００ｇでの遠心分離によってその溶解物から樹脂を分離し、タンパク質結合緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．５、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）で３回洗浄した。その樹脂を１００μｌの溶出緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．５、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）とともにインキュベートすることによって、タンパク質を溶出した。その樹脂に結合していたサンプルからの３つのコロニー（および野生型コントロール）の結果（レーン１〜４）および溶出後のサンプル（レーン５〜８）を図１９に示す。陽性のコロニーは、野生型コントロールには存在しないバンド（矢印で示されている）を示す。これらの結果から、エンド−グルカナーゼがこれらの株から生成されていることが示唆される。
【０２３０】
（実施例１１．耐性マーカーおよび目的の遺伝子をコードする核酸によるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの核形質転換）
この実施例では、Ａ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来のＣＢＨ１をコードする核酸をＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに導入する。形質転換ＤＮＡを図１６Ｂに図解で示す。「トランスジーン」と表示されているセグメントは、エキソグルカナーゼコード遺伝子であり、「プロモーター／５’ＵＴＲ」と表示されているセグメントは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＨＳＰ７０／ｒｂｃＳ２  ５’ＵＴＲであり、「選択マーカー」と表示されているセグメントは、ハイグロマイシン耐性遺伝子であり、そして３’ＵＴＲと表示されているセグメントは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ｒｂｃＳ２由来の３’ＵＴＲである。そのハイグロマイシン耐性遺伝子およびＣＢＨ１コード領域は、ベータ−２チューブリンプロモーターによって動かされるハイグロマイシンマーカーとともに別々に発現された。ＣＢＨ１コード配列を、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ炭酸脱水酵素分泌シグナルをコードするＤＮＡフラグメントに融合した。標準的な手法を用いて、そのＯＲＦの３’末端に金属親和性タグ（ＭＡＴ）およびＦＬＡＧエピトープタグを付加した。この形質転換ＤＮＡの構築において行われたすべてのＤＮＡ操作は、本質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）およびＣｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９７，１９２−２０８，１９９８によって記載されているとおりであった。
【０２３１】
これらの実験において、すべての形質転換を、本質的に上に記載したとおり細胞壁株Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＣＣ１９６０（ｍｔ＋）に対して行う。すべての形質転換をハイグロマイシン選択下（２０μｇ／ｍｌ）において行い、ここで、耐性は、図１６Ｂの「選択マーカー」と表示されているセグメントによってコードされる遺伝子によって付与されたものである。形質転換された株をハイグロマイシンの存在下で維持する。
【０２３２】
ハイグロマイシンの存在下において生長したコロニーを、プルダウンアッセイに続いてウエスタンブロット解析によってスクリーニングした。４ｍｌの液体培養物を５分間の３０００×ｇで収集した。上清をデカントし、細胞を１ｍｌのタンパク質結合緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．５、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、０．００５％ＮＰ４０）に再懸濁した。タンパク質精製およびウエスタンブロット解析を、上に記載したように行った。樹脂に結合していたサンプルからの５つのコロニー（および野生型コントロール）の結果（レーン１〜５）および溶出後のサンプル（レーン７〜１１）を図２０に示す。陽性のコロニー（７、８、９）は、野生型コントロールには存在しないバンド（矢印で示されている）を示す。これらの結果から、ＣＢＨ１がこれらの株から生成されていることが示唆される。
【０２３３】
（実施例１２．耐性マーカーおよび目的の分泌される遺伝子をコードする核酸によるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの核形質転換）
この実施例では、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来のキシラナーゼ２をコードする核酸をＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに導入する。形質転換ＤＮＡを図１６Ａに図解で示す。「トランスジーン」と表示されているセグメントは、キシラナーゼ２コード遺伝子であり、「プロモーター／５’ＵＴＲ」と表示されているセグメントは、イントロンを含む（イントロンの位置は示されない）Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＨＳＰ７０／ｒｂｃＳ２  ５’ＵＴＲであり、「選択マーカー」と表示されているセグメントは、ブレオマイシン耐性遺伝子であり、ＣＭ（切断部分）と表示されているセグメントは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のＡ２ウイルスプロテアーゼであり、３’ＵＴＲと表示されているセグメントは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ｒｂｃＳ２由来の３’ＵＴＲである。そのブレオマイシン耐性遺伝子、Ａ２およびキシラナーゼ２コード領域は、インフレームで物理的に連結されており、単一のキメラＯＲＦがもたらされる。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ炭酸脱水酵素遺伝子の分泌シグナル配列をコードする核酸をＡ２配列とキシラナーゼコード配列の５’末端との間に配置した。標準的な手法を用いて、そのＯＲＦの３’末端に金属親和性タグ（ＭＡＴ）およびＦＬＡＧエピトープタグを付加した。この形質転換ＤＮＡの構築において行われたすべてのＤＮＡ操作は、本質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）およびＣｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９７，１９２−２０８，１９９８によって記載されているとおりであった。
【０２３４】
これらの実験において、すべての形質転換を細胞壁欠損株Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＣＣ３３９５（アルギニン栄養要求性変異体ｍｔ−）に対して行った。細胞を生育し、エレクトロポレーションを介して形質転換した。対数中期まで（約２〜６×１０6細胞／ｍｌ）細胞を生育した。収集の前に細胞培養物に０．０５％の濃度となるようにＴｗｅｅｎ−２０を加えることにより、細胞が遠心分離チューブに粘着するのを防いだ。５分間、細胞を穏やかに（２０００〜５０００ｇ）遠沈する。上清を除去し、細胞をＴＡＰ＋４０ｍＭスクロース培地に再懸濁した。１〜２μｇの形質転換ＤＮＡを約１×１０8細胞と氷上で混合し、エレクトロポレーションキュベットに移した。２５μＦに設定されたキャパシタンス、２０００のＶ／ｃｍを送達する８００Ｖの電圧および１０〜１４ｍｓの時定数でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの後、そのキュベットを５〜２０分間にわたって室温に戻す。細胞を１０ｍｌのＴＡＰ＋４０ｍＭスクロース＋５０μｇ／ｍｌアルギニンに移し、１２〜１６時間にわたって連続的に振盪しながら室温で回復させた。次いで、２０００ｇ〜５０００ｇでの遠心分離によって細胞を収集し、０．５ｍｌのＴＡＰ＋４０ｍＭスクロース培地に再懸濁した。０．２５ｍｌの細胞をＴＡＰ＋１００μｇ／ｍｌブレオマイシン＋５０μｇ／ｍｌアルギニン上にプレーティングした。すべての形質転換をブレオマイシン選択下（１００μｇ／ｍｌ）において行い、ここで、耐性は、図１６Ａの「選択マーカー」と表示されているセグメントによってコードされる遺伝子によって付与された。その外因性ＤＮＡの喪失を防ぐために、形質転換された株をブレオマイシンの存在下において維持する。
【０２３５】
ブレオマイシンの存在下において生長したコロニーをドットブロットによってスクリーニングした。簡潔には、コロニーをＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）によって溶解し、Ｃｏ２＋磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示書に従って用いてＭＡＴタグ化タンパク質を分離した。そのタンパク質に曝露した後、そのビーズを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳＴ）１５０μｌで３回、室温において洗浄した。１５０μｌの１０μＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、４００ｍＭ  ＮａＣｌによってビーズからタンパク質を遊離し、その１５０μｌの溶出液をニトロセルロース膜上にドットブロットした。膜をＳｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ（ＴＢＳ）ブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってブロッキングし、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ緩衝液で１：３０００希釈されたマウス抗ＦＬＡＧ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（Ｓｉｇｍａ）で１時間プロービングした。プロービング後、膜をＴＢＳＴで４回洗浄し、次いで、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて現像し、ＣＣＤカメラ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を用いて撮像した。次いで、このドットブロット解析において陽性の結果を示すコロニーをウエスタンブロッティングによってスクリーニングする。５０ｍｌの容積で藻類細胞を培養し、細胞溶解を避けるように慎重に遠心した。製造者の指示書に従って、コバルト被覆（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をその条件培地に加え、インキュベートし、洗浄した。１５０μｌの１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、４００ｍＭ  ＮａＣｌによってビーズからタンパク質を遊離し、その溶出液に５０μｌの還元剤含有４×ＳＤＳサンプル緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）を加えた。次いで、サンプルを煮沸し、１０％ビス−トリスポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ）において電気泳動し、Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ半乾燥ブロッター（ＢｉｏＲａｄ）を製造者の指示書に従って用いてＰＶＤＦ膜に転写した。膜をＳｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ（ＴＢＳ）ブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってブロッキングし、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ緩衝液で１：３０００希釈されたマウス抗ＦＬＡＧ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（Ｓｉｇｍａ）で１時間プロービングした。プロービング後、膜をＴＢＳＴで４回洗浄し、次いで、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて現像し、ＣＣＤカメラ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を用いて撮像した。
【０２３６】
【表１６】
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【０２３７】
【表１７】
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【０２３８】
【表１８】
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【０２３９】
【表１９】
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【０２４０】
【表２０】
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【０２４１】
【表２１】
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【０２４２】
【表２２】
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【０２４３】
【表２３】
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【０２４４】
【表２４】
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【０２４５】
【表２５】
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【０２４６】
【表２６】
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【０２４７】
【表２７】
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【０２４８】
【表２８】
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【０２４９】
【表２９】
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【０２５０】
【表３０】
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【０２５１】
【表３１】
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【０２５２】
【表３２】
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【０２５３】
【表３３】
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【０２５４】
【表３４】
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【０２５５】
【表３５】
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【０２５６】
【表３６】
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【０２５７】
【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【０２６０】
【表４０】
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【０２６１】
【表４１】
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【０２６２】
【表４２】
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【０２６３】
【表４３】
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【０２６４】
【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【０２６８】
【表４８】
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【０２６９】
【表４９】
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【０２７０】
【表５０】
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【０２７１】
【表５１】
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【０２７２】
【表５２】
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【０２７３】
【表５３】
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【０２７４】
【表５４】
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【０２７５】
【表５５】
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【０２７６】
【表５６】
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【表５７】
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【０２７８】
【表５８】
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【０２７９】
【表５９】
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【０２８０】
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【表６２】
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【０２８４】
【表６４】
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【０２８５】
【表６５】
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【０２８６】
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【表６７】
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【表６８】
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【０２８９】
【表６９】
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【０２９０】
【表７０】
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【０２９１】
【表７１】
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【０２９２】
【表７２】
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【０２９３】
【表７３】
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【０２９４】
【表７４】
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【表７５】
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【０２９６】
【表７６】
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【表７７】
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【表７８】
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【０２９９】
【表７９】
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【０３００】
【表８０】
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【０３０１】
【表８１】
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【表８３】
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【０３０４】
【表８４】
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【０３０５】
【表８５】
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【０３０６】
【表８６】
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【０３０７】
【表８７】
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【０３０８】
【表８８】
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【０３０９】
【表８９】
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【０３１０】
【表９０】
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【０３１１】
【表９１】
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【０３１２】
【表９２】
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【０３１３】
【表９３】
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【０３１４】
【表９４】
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【０３１５】
【表９５】
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【０３１６】
【表９６】
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【０３１７】
【表９７】
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【０３１８】
【表９８】
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【０３１９】
【表９９】
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【０３２０】
【表１００】
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【０３２１】
【表１０１】
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【０３２２】
【表１０２】
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【０３２３】
【表１０３】
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【０３２４】
【表１０４】
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【０３２５】
【表１０５】
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【０３２６】
【表１０６】
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【０３２７】
【表１０７】
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【０３２８】
【表１０８】
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【０３２９】
【表１０９】
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【０３３０】
【表１１０】
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【０３３１】
【表１１１】
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【０３３２】
【表１１２】
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【０３３３】
【表１１３】
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【０３３４】
別段定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されている意味を有する。当業者に公知の様々な材料および方法について参照が本明細書中でなされている。組換えＤＮＡ技術の一般的な原理を説明している標準的な参考資料としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９５；およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ｅｄ．，“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１が挙げられる。本発明の選択された態様にとって有用な酵母遺伝学の一般的な方法および原理を教示している標準的な参考文献としては：Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６およびＧｕｔｈｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１が挙げられる。
【０３３５】
ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限の間のそれぞれの介在値（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｖａｌｕｅ）もまた明確に開示されると理解される。記載の任意の値または記載の範囲内の介在値と、他の任意の記載の値またはその記載の範囲内の介在値との間のより狭い範囲の各々が、包含される。これらのより狭い範囲の上限および下限は、独立して、その範囲の中に含められ得るか、または除外され得、その記載の範囲内の任意の明確に除外される限界値を条件として、一方もしくは両方の限界値がそのより狭い範囲内に含められるか、または両方の限界値がそのより狭い範囲内に含められない各範囲もまた包含される。その記載の範囲が、一方または両方の限界値を含む場合、その含められる限界値のいずれかまたは両方を除外した範囲もまた包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
2010538616000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月10日(2010.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレノイドを生成する方法であって：
（ａ）２つのホスフェートを用いてイソプレノイドを生成する酵素をコードする第１の核酸、およびボトリオコッセンシンターゼ、リモネンシンターゼ、シネオールシンターゼ、ピネンシンターゼ、カンフェンシンターゼ、サビネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼ、タキサジエンシンターゼ、ビサボレンシンターゼ、ジアポフィトエンデサチュラーゼ、ジアポフィトエンシンターゼ、モノテルペンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、ジンギベレンシンターゼ、オシメンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、クルクメンシンターゼ、ファルネセンシンターゼ、ゲラニルゲラニルレダクターゼ、クロロフィリドヒドロラーゼ、β−カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンＡシンターゼ、８−エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、（＋）−δ−カジネンシンターゼ、ゲルマクレンＣシンターゼ、（Ｅ）−β−ファルネセンシンターゼ、カスベンシンターゼ、ベチスピラジエンシンターゼ、５−エピ−アリストロケンシンターゼ、アリストロケンシンターゼ、α−フムレン、（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセンシンターゼ、（−）−β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、（＋）−ボルニル二リン酸シンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、（Ｅ）−γ−ビサボレンシンターゼ、コパリルピロリン酸シンターゼ、カウレンシンターゼ、ロンギホレンシンターゼ、γ−フムレンシンターゼ、δ−セリネンシンターゼ、β−フェランドレンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、（＋）−３−カレンシンターゼ、ｓｙｎ−コパリル二リン酸シンターゼ、α−テルピネオールシンターゼ、ｓｙｎ−ピマラ−７，１５−ジエンシンターゼ、ｅｎｔ−サンダラコピマラジエンシンターゼ、ステルネル−１３−エンシンターゼ、Ｅ−β−オシメン、Ｓ−リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、ガンマ−テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ、Ｅ−β−オシメンシンターゼ、ｅｐｉ−セドロールシンターゼ、α−ジンギベレンシンターゼ、グアイアジエンシンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、ｃｉｓ−ムウロラジエンシンターゼ、アフィジコラン−１６ｂ−オールシンターゼ、エリザベスアトリエンシンターゼ、サンダロールシンターゼ、パチョウロールシンターゼ、ジンザノールシンターゼ、セドロールシンターゼ、スカレオールシンターゼ、コパロールシンターゼまたはマノオールシンターゼをコードする少なくとも１つのさらなる核酸で非維管束光合成生物を形質転換する工程；および
（ｂ）前記形質転換された生物によって生成された少なくとも１つのイソプレノイドを回収する工程
を包含する、前記方法。
【請求項２】
前記生物が、イソプレンシンターゼまたはメチル−ブテノールシンターゼで形質転換されない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２つのホスフェートを有する前記イソプレノイドが、ＧＰＰ、ＩＰＰ、ＦＰＰ、ＧＧＰＰまたはＤＭＡＰＰである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の核酸が、配列番号８２、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、１１８、１１９、１２６であるか、または配列番号８２、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、１１８、１１９もしくは１２６に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのさらなる核酸が、配列番号７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８３、８４、８５、８６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、または配列番号７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８３、８４、８５、８６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１２０、１２１、１２２、１２３もしくは１２４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸のうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記非維管束光合成生物が、光合成細菌、シアノバクテリア、藍色植物門（ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）、原核緑色植物門（ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、不等毛植物門（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ）、黄緑藻植物門（ｔｒｉｂｏｐｈｙｔａ）、灰色植物門（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、クロララクニオン植物（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ類（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）、黄金色植物門（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、クリプト植物門（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）、クリプト藻類（ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｄｓ）、渦鞭毛植物門（ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）、双鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）、プリムネシウム植物門（ｐｙｒｍｎｅｓｉｏｐｈｙｔａ）、珪藻植物門（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、黄緑色植物門（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）、ユースティグマトフィータ（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ）、ラフィド藻門（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ）、褐藻植物（ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）または植物プランクトンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生物が、微細藻類である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記微細藻類が、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄ．ｓａｌｉｎａ、Ｈ．ｐｌｕｖａｌｉｓ、Ｓ．ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓまたはＤ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の核酸および前記少なくとも１つのさらなる核酸で葉緑体を形質転換する工程をさらに包含する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物が、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）またはアルスロスピラ属（Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ）の細菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物を水性環境中で生育する工程であって、ＣＯ２が前記生物に供給される工程をさらに包含する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＯ２が、燃焼された化石燃料から少なくとも部分的に得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＯ２が、煙道ガスから少なくとも部分的に得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記回収工程が、以下の工程：（ａ）前記形質転換された生物を収集する工程；（ｂ）前記イソプレノイドを細胞培養液から収集する工程；（ｃ）前記生物を機械的に破壊する工程；または（ｄ）前記生物を化学的に破壊する工程のうちの１つ以上を包含する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物が、高塩環境下で生長することができ、前記高塩環境は、０．５から４．０モル濃度の塩化ナトリウムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物が、Ｄ．ｓａｌｉｎａである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
選択的条件下で目的のタンパク質を発現するトランスジェニック非維管束光合成生物を作出する方法であって：
単一のオープンリーディングフレームを含む核酸で非維管束光合成生物を形質転換する工程であって、前記オープンリーディングフレームが、前記目的のタンパク質、切断部分および選択マーカーを含む融合タンパク質をコードする、工程；
を包含し、
ここで、前記切断部分は、自己切断型プロテアーゼであり、前記生物は、前記生物が継続して生存するために前記選択マーカーの発現を必要とする環境条件下で該選択マーカーを発現することができ、それによって、前記目的のタンパク質が発現する、前記方法。
【請求項１８】
前記自己切断型プロテアーゼが、口蹄疫ウイルス由来のＡ２領域の機能部分である、請求項１７に記載の方法。
【国際調査報告】
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