(57)【要約】  タンパク質又はポリペプチドを分離する分離媒体にスクアレン染料を含有させる。当該媒体は更に、タンパク質又はポリペプチドと複合体を形成する界面活性剤を含有する。本染料は、分離媒体中で励起されると、その蛍光発光において、これまで知られていなかった選択性を示す。すなわち、本染料分子は、大量の分離媒体中に他の染料分子が存在しているにもかかわらず、タンパク質又はポリペプチドと界面活性剤との複合体に会合した場合にのみシグナルを発する。すなわち、本染料は、非会合染料を媒体から除去しなくとも、分離媒体中におけるタンパク質又はポリペプチドの存在及び配置を示し得る。【選択図】図１
2010502955.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質と複合体を形成する界面活性剤を含有する分離媒体中で行われる電気泳動分離プロセスにおいて、前記タンパク質を検出可能とする方法であって、
下記式の光輝性化合物：
【化１】
2010502955.tif 000008
（式中：
Ｒ1は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｔｅ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）、Ｎ（アリール）、
【化２】
2010502955.tif 000009
（式中、＊は、付着部位を示す）からなる群から選択される基であり；
Ｒ11は、ＣＨ2、ＣＨ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）、Ｃ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）2、ＮＨ、及びＮ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）からなる群から選択される基であり；
Ｒ12は、ＣＨ2、ＣＨ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）、Ｃ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）2、ＮＨ、及びＮ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）からなる群から選択される基であり；
Ｒ13は、ＣＨ2、ＣＨ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）、及びＣ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）2からなる群から選択される基であり；
Ｘは、Ｏ及びＳからなる群から選択される基であり；
Ｙは、Ｏ及びＳからなる群から選択される基であり；
Ｚは、Ｏ及びＳからなる群から選択される基であり；
Ｗは、Ｈ及びＣ1−Ｃ4アルキルからなる群から選択される基であり；
ｍは、０又は１、２、３もしくは４の整数のいずれかであり；
Ｒ2は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ（アルキル）、Ｎ（シクロアルキル）、Ｎ（アリール）、Ｃ（Ｒ2I）（Ｒ22）、及びＣ（Ｒ21）＝Ｃ（Ｒ22）からなる群から選択される基であり、ここでのＲ21及びＲ22は、Ｈ及びＣ1−Ｃ4アルキルからなる群から独立して選択される基であるか、又は一緒になってＣ3−Ｃ6アルキレンを形成し、前記群はさらに、カルボキシル、ヒドロキシル、及びスルホからなる群から選択される基で置換されたアルキル、シクロアルキル、及びアルキレン基からなり；
Ｒ3は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ（アルキル）、Ｎ（シクロアルキル）、Ｎ（アリール）、Ｃ（Ｒ31）（Ｒ32）、及びＣ（Ｒ31）＝Ｃ（Ｒ32）からなる群から選択される基であり、ここでのＲ31及びＲ32は、Ｈ及びＣ1−Ｃ4アルキルからなる群から独立して選択される基であるか、又は一緒になってＣ3−Ｃ6アルキレンを形成し、前記群はさらに、カルボキシル、ヒドロキシル、及びスルホからなる群から選択される基で置換されたアルキル、シクロアルキル、及びアルキレン基からなり；
Ｒ4は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ12アルキル、カルボキシ置換Ｃ1−Ｃ12アルキル、ヒドロキシ置換Ｃ1−Ｃ12アルキル、ホスホノ置換Ｃ1−Ｃ12アルキル、及びアリールからなる群から選択される基であり；
Ｒ5は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ12アルキル、カルボキシ置換Ｃ1−Ｃ12アルキル、ヒドロキシ置換Ｃ1−Ｃ12アルキル、ホスホノ置換Ｃ1−Ｃ12アルキル、及びアリールからなる群から選択される基であり；
Ｒ6は、Ｏ-、Ｓ-、Ｓｅ-、Ｔｅ-、ＮＨ2、Ｎ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）2、及びＮ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（アリール）からなる群から選択される基であり、但し、Ｒ1及びＲ6の少なくとも一つは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｔｅ、及びそれらのアニオンではないことを条件とし；
Ａ-は、アニオンであり、但しその存在は、前記タンパク質による前記光輝性化合物の付着を阻害せず、且つ、前記光輝性化合物の蛍光を妨げないものとし； 
ｎは、Ｒ6が負に帯電する場合は０であり、Ｒ6が中性である場合は１である）
を前記媒体中に含有させるを含んでなる方法。
【請求項２】
Ｒ1が、Ｏ及びＳからなる群から選択される基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ1が、Ｏである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ2が、Ｃ（Ｒ21）（Ｒ22）（式中Ｒ11及びＲ12は、それぞれＨ及びＣ1−Ｃ4アルキルからなる群から独立して選択される基である）であり；Ｒ3が、Ｃ（Ｒ31）（Ｒ32）（式中Ｒ31及びＲ32は、それぞれＨ及びＣ1−Ｃ4アルキルからなる群から独立して選択される基である）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ21及びＲ22が、それぞれ独立してＣ1−Ｃ4アルキルであり、且つＲ31及びＲ32が、それぞれ独立してＣ1−Ｃ4アルキルである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ21、Ｒ22、Ｒ31、及びＲ32が、それぞれＣＨ3である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ4及びＲ5が、それぞれＣ1−Ｃ12アルキル、カルボキシ置換Ｃ1−Ｃ12アルキル、及びヒドロキシ置換Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から独立して選択される基である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ4及びＲ5が、それぞれＣ1−Ｃ6アルキル、カルボキシ置換Ｃ1−Ｃ6アルキル、及びヒドロキシ置換Ｃ1−Ｃ6アルキルからなる群から独立して選択される基である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ4及びＲ5が、それぞれ独立してＣ1−Ｃ3アルキルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ4及びＲ5が、それぞれＣＨ3である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ6が、Ｏ-、Ｓ-、ＮＨ2、Ｎ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）2、及びＮ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（アリール）からなる群から選択される基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ6が、Ｏ-、Ｓ-、及びＮ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）2からなる群から選択される基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記光輝性化合物が、
【化３】
2010502955.tif 000010
である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記光輝性化合物が、
【化４】
2010502955.tif 000011
である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記光輝性化合物が、
【化５】
2010502955.tif 000012
である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記光輝性化合物が、
【化６】
2010502955.tif 000013
である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記光輝性化合物が、
【化７】
2010502955.tif 000014
である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記光輝性化合物が、
【化８】
2010502955.tif 000015
である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は２００６年８月２９日付米国特許仮出願Ｎｏ．６０／８２３，８８６の利益を請求する。その内容は全てが援用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、タンパク質標識及び検出の分野に属する。
【背景技術】
【０００３】
脂溶性染料を用いた結合性相互作用によるタンパク質の標識化であって、タンパク質に対する染料の共有結合を伴わないものとしては、２００２年１１月５日発行のDubrow, R.S.等による米国特許第６，４７５，３６４号、及び、１９９７年４月１日発行のHaugland, R.P.等による米国特許第５，６１６，５０２号に開示されている。スクアリン酸に基づく染料であるスクアレン（Squaraine）染料、並びにクロコン酸、ロジゾン酸等に基づく染料は、２００３年３月２５日発行のTerpetschnig, E.A.等による米国特許第６，５３８，１２９号、及び２００５年９月１５日公開の米国特許出願公開第２００５／０２０２５６５号に開示されている。なお、本明細書で引用される全ての特許及び刊行物の内容は、援用により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、蛍光発光の検知により検出を実施する場合に、分離プロセスにおけるタンパク質の標識として、特定のスクアレン染料が極めて有効であるという知見に基づく。共有結合を形成することなくタンパク質に会合するこの染料は、タンパク質との複合体を形成する界面活性剤の存在下、タンパク質及びポリペプチドとの会合複合体（association complex）の形態にある場合にのみ蛍光発光を生じる。すなわち、緩衝化分離媒体に追加の溶質として染料を加えるだけで、検出を行うことが可能となる。染料さえ存在すれば、分離を損なうことなく、高感度でのタンパク質／ポリペプチド検出が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１ａは、Experion（商標）自動電気泳動システムにより、本発明のスクアレン染料を用いて、タンパク質の標準セットのサンプルについて、基準線補正を行わずに作製したトレースであり、図１ｂは、図Ｉａと同一の装置により、同一の染料を用いて、同一のタンパク質のセットについて、基準線補正を行って作製したトレースであり、図１ｃは、図Ｉａのデータからとった、標準中の各タンパク質の移動時間の、各タンパク質の分子量に対するプロットである。
【図２】図２ａは、Experion（商標）自動電気泳動システムにより、ラット肝タンパク質のサンプルについて、本発明のスクアレン染料を用いて作製したトレースであり、図２ｂは、図２ａに示す分離のバーチャルゲルイメージであり、分離されたタンパク質をタンパク質の標準セットの分離と並べて示す図である。
【図３】本発明のスクアレン染料を用いて得られた、炭酸脱水酵素の種々の希釈に対するピーク面積のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明の実施に有用なスクアレン染料としては、以下の一般式を有するものが挙げられる。
【０００７】
【化１】
2010502955.tif 000003
【０００８】
この式において、及び、同一の記号を有する本明細書中の全ての他の式において、記号は以下の意味を有する。
【０００９】
Ｒ1は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｔｅ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）、Ｎ（アリール）、
【化２】
2010502955.tif 000004
のいずれかであり、ここで＊は、式（Ｉ）における付着部位を示し；
Ｒ11は、ＣＨ2、ＣＨ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）、Ｃ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）2、ＮＨ、又はＮ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）であり；Ｒ12は、ＣＨ2、ＣＨ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）、Ｃ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）2、ＮＨ、又はＮ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）であり；Ｒ13は、ＣＨ2、ＣＨ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）、又はＣ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）2であり；Ｘは、Ｏ又はＳであり；Ｙは、Ｏ又はＳであり；Ｚは、Ｏ又はＳであり；Ｗは、Ｈ又はＣ1−Ｃ4アルキルであり；及びｍは、０、１、２、３、又は４であり；但し、後述のＲ6の記載に示す条件とする。なお、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるアスタリスク（＊）はいずれも、文字を含む記号の付着部位を示す。
【００１０】
Ｒ2は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ（アルキル）、Ｎ（シクロアルキル）、Ｎ（アリール）、Ｃ（Ｒ21）（Ｒ22）、又はＣ（Ｒ21）＝Ｃ（Ｒ22）のいずれかである。Ｒ2がＣ（Ｒ21）＝Ｃ（Ｒ22）である場合、式（Ｉ）中央のシクロブタン部位の左側にＮ含有５員環として示す環状部位は、共役二重結合を有する６員環となる。本段落に記すラジカルのＲ21及びＲ22は、同一であっても相違していてもよく、Ｈ又はＣ1−Ｃ4アルキルであるか、或いは一緒になって単一のＣ3−Ｃ6アルキレン部位を形成する。Ｒ21及びＲ22が一緒になってアルキレン部位を形成する場合、Ｒ2は、５員環として示す隣接する環状基と炭素原子を共有する環状基である（Ｒ2がＣ（Ｒ21）（Ｒ22）である場合）か、或いは、５員環として示す隣接する環状基と共に縮合環構造を形成する（Ｒ2がＣ（Ｒ21）＝Ｃ（Ｒ22）である場合）。本段落に挙げるアルキル、シクロアルキル、及びアルキレン基は、カルボキシル、ヒドロキシル、及びスルホ（すなわちＨＯ−Ｓ（Ｏ）2−）基から選択される１又は２以上の置換基により置換されていてもよい。
【００１１】
Ｒ3は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｎ（アルキル）、Ｎ（シクロアルキル）、Ｎ（アリール）、Ｃ（Ｒ31）（Ｒ32）、又はＣ（Ｒ31）＝Ｃ（Ｒ32）のいずれかである。Ｒ3がＣ（Ｒ31）＝Ｃ（Ｒ32）である場合、式（Ｉ）中央のシクロブタン部位の右側にＮ含有５員環として示す環状部位は、６員環になる。本段落に記すラジカル中のＲ31及びＲ32は、同一であっても相違していてもよく、Ｈ又はＣ1−Ｃ4アルキルであるか、或いは一緒になって単一のＣ3−Ｃ6アルキレン部位を形成する。Ｒ31及びＲ32が一緒になってアルキレン部位を形成する場合、Ｒ2は、５員環として示す隣接する環状基と炭素原子を共有する環状基である（Ｒ3がＣ（Ｒ31）（Ｒ32）である場合）か、或いは、５員環として示す隣接する環状基と共に縮合環構造を形成する（Ｒ3がＣ（Ｒ31）＝Ｃ（Ｒ32）である場合）。本段落に挙げるアルキル、シクロアルキル、及びアルキレン基は、カルボキシル、ヒドロキシル、及びスルホ（すなわちＨＯ−Ｓ（Ｏ）2−）基から選択される１又は２以上の置換基により置換されていてもよい。
【００１２】
Ｒ4は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ12アルキル、カルボキシ置換Ｃ1−Ｃ12アルキル、ヒドロキシ置換Ｃ1−Ｃ12アルキル、スルホ置換Ｃ1−Ｃ12アルキル（すなわちＨＯ−Ｓ（Ｏ）2−アルキル）、ホスホノ置換Ｃ1−Ｃ12アルキル（すなわち（ＨＯ）2Ｐ（Ｏ）−アルキル）、又はアリールのいずれかである。
【００１３】
Ｒ5は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ12アルキル、カルボキシ置換Ｃ1−Ｃ12アルキル、ヒドロキシ置換Ｃ1−Ｃ12アルキル、スルホ置換Ｃ1−Ｃ12アルキル（すなわちＨＯ−Ｓ（Ｏ）2−アルキル）、ホスホノ置換Ｃ1−Ｃ12アルキル（すなわち（ＨＯ）2Ｐ（Ｏ）−アルキル）、又はアリールのいずれかである。
【００１４】
Ｒ6は、Ｏ-、Ｓ-、Ｓｅ-、Ｔｅ-、ＮＨ2、Ｎ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）2、又はＮ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（アリール）のいずれかである。但し、Ｒ1及びＲ6の少なくとも１つは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｔｅ、及びそれらのアニオンではないことを条件とする。
【００１５】
Ａ-は、アニオンである。但しその存在は、スクアレン染料のタンパク質との付着を阻害せず、且つ、スクアレン染料が蛍光発光を生じる妨げとならないものである。
【００１６】
係数「ｎ」は、Ｒ6が負に帯電する場合は０であり、Ｒ6が中性の場合は１である。
【００１７】
本発明の実施において、上記記号の下位概念（subgenera）として重要な基及びラジカルは、以下の通りである。Ｒ1の重要な下位概念（subgenus）はＯ及びＳであり、重要なラジカルはＯである。ｍを有するＲ1クラスのメンバーにおいて、ｍとしては０、１、又は２が好適であり、１が最適である。Ｒ2の重要な下位概念の一つとして、置換されていてもよいメチレン基Ｃ（Ｒ21）（Ｒ22）が挙げられる。同様に、Ｒ3の重要な下位概念として、置換されていてもよいメチレン基Ｃ（Ｒ31）（Ｒ32）が挙げられる。さらに重要なＲ2の下位概念としては、Ｒ21及びＲ22がいずれもＣ1−Ｃ4アルキル（これらは同一でも異なっていてもよい）である基が挙げられ、さらに重要な下位概念としては、Ｒ21及びＲ22が共にＣＨ3である基が挙げられる。同様に、さらに重要なＲ3の下位概念としては、Ｒ31及びＲ32がともにＣ1−Ｃ4アルキル（これらは同一でも異なっていてもよい）である基が挙げられ、さらに重要な下位概念としては、Ｒ31及びＲ32が共にＣＨ3である基が挙げられる。
【００１８】
Ｒ4の重要な下位概念としては、Ｃ1−Ｃ12アルキル、カルボキシ置換Ｃ1−Ｃ12アルキル、及びヒドロキシ置換Ｃ1−Ｃ12アルキルが挙げられ、さらに重要な下位概念としては、Ｃ1−Ｃ6アルキル、カルボキシ置換Ｃ1−Ｃ6アルキル、及びヒドロキシ置換Ｃ1−Ｃ6アルキルが挙げられ、さらに重要な下位概念としては、Ｃ1−Ｃ3アルキルが挙げられ、さらに重要なラジカルとしては、ＣＨ3が挙げられる。同じ下位概念及びラジカルは、Ｒ5についても重要である。Ｒ6の重要な下位概念としては、Ｏ-、Ｓ-、ＮＨ2、Ｎ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）2、及びＮ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（アリール）が挙げられ、さらに重要な下位概念としては、Ｏ-、Ｓ-、及びＮ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）2が挙げられ、さらに重要な下位概念としては、Ｏ-及びＮ（Ｃ1−Ｃ4アルキル）2が挙げられ、重要なラジカルとしては、Ｏ-及びＮ（Ｃ2Ｈ5）2が挙げられる。重要なＡ-のアニオンとしては、
【化３】
2010502955.tif 000005
が挙げられる。
【００１９】
本発明の範囲に含まれる式（Ｉ）の構造の変形例としては、式中に６員環として示す２つの環の一方又は両方に１又は２以上のハロゲン置換を含むものが挙げられる。好適なハロゲンは塩素及び臭素である。別の変形例としては、式中に示す６員環の一方又は両方に縮合した１又は２以上の追加の環が存在する構造が挙げられる。
【００２０】
本明細書で使用される用語「アルキル」には、直鎖及び分岐鎖の何れのアルキル基も含まれ、また、環状基も非環状基も含まれる。アルキル基の炭素原子数が明記されない場合、当該基は、特定の数に限定されることを意図するものではないが、炭素原子数１〜１２個が好適であり、炭素原子数１〜６個がより好適である。環状アルキル基は、炭素原子数４〜８個、好適には５個又は６個の環状基を含む意である。本明細書で使用される用語「アリール」は、フェニル及びナフチル基を意味し、好適にはフェニルを有する。用語「独立して選択される」は、２つ以上存在する記号の基又はラジカルの列挙の前に付される場合、各記号が当該列挙中の１つの基又はラジカルを表すとともに、種々の記号が同一のラジカル又は基を表していてもよく、異なるラジカル又は基を表していてもよいことを意味する。すなわち、１つの記号におけるラジカル又は基の選択は、別の記号の選択から独立している。用語「１の（a, an）」は、「１又は２以上（one or more）」を意味する意図である。用語「含んでなる」は、工程又は要素の前に付される場合、更なる工程又は要素を追加してもよく、かかる追加が除外されないことを意味する意図である。
【００２１】
本発明の範囲に含まれる具体的なスクアレン染料の例を以下に挙げる。
【００２２】
【化４】
2010502955.tif 000006
【００２３】
【化５】
2010502955.tif 000007
【００２４】
本発明の実施において、式（Ｉ）のスクアレン染料は、タンパク質又はポリペプチドの移動性の違いに基づいて分離を行う任意のタンパク質又はポリペプチド分離手順において、サンプルを分析し、サンプル中のタンパク質又はポリペプチドを検出するために用いることができる。特に重要な分離手順としては、キャピラリー電気泳動及びマイクロ流体系における電気泳動が挙げられる。これらの系の何れにおいても、分離チャネルは、染料、分離媒体、界面活性剤、緩衝剤を、何れも一般的な溶液中に含有する。また、任意でポリマーマトリクスを含んでいてもよい。分離媒体は液体でもゲルでもよい。染料は、サンプルを系内に導入する前に分離媒体に加えてもよく、サンプルに加えてもよい。界面活性剤は、サンプル中のタンパク質又はポリペプチドと複合体を形成する。かかる界面活性剤の例としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ビス−２−エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、臭化ペルフルオロデシル、臭化セチルトリメチルアンモニウム、臭化ジドデシルアンモニウム、Triton X-100、ポリオキシエチレン１０−オレイルエーテル、ポリオキシエチレン１０−ドデシルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミン−Ｎ−オキシド、Brij 35、Tween-20、ソルビタンモノオレエート、レシチン、ジアシルホスファチジルコリン、スクロースモノラウレート、及びスクロースジラウレートが挙げられる。中でもアニオン性界面活性剤が好適である。アニオン性界面活性剤の例としては、硫酸アルキル及びスルホン酸アルキルが挙げられ、その主な例としては、ドデシル硫酸ナトリウム、オクタデシル硫酸ナトリウム、及びデシル硫酸ナトリウムが挙げられる。特に好適な界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。
【００２５】
界面活性剤としてＳＤＳを使用する場合、界面活性剤の濃度は、約０．０１％〜約０．５％が好適である。タンパク質分離への使用が知られている任意の緩衝剤も、同様に使用することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用途で一般に使用される緩衝剤の例としては、トリス、トリスグリシン、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸）、ＣＡＰＳ（３−（シクロヘキシルアミノ）−ｌ−プロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、トリシン（４−（２−ヒドロキシエチル）−ｌ−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチル］グリシン）、及びそれらの組み合せが挙げられる。弱イオン強度の緩衝剤が好適である。例としては両性イオン緩衝剤、特にヒスチジン及びトリシン等のアミノ酸が挙げられる。システム系内で比較的低い移動度を有する、比較的大きなイオンである緩衝剤も好適である。緩衝剤の濃度も様々であるが、最良の結果が得られるのは、多くの場合、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度、好適には約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度である。緩衝剤としてトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン）−トリシンを使用される場合、適切な濃度範囲は約２０ｍＭ〜約１００ｍＭである。界面活性剤−緩衝剤の組み合せの例は、濃度約０．０３％〜約０．１％のＳＤＳと、濃度約２０ｍＭ〜約１００ｍＭのトリス−トリシンとの組み合わせであるが、標準的な分離工程及び分離媒体の操作条件下での操作時に、溶液を臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以下とする必要がある場合には、さらに調整される。
【００２６】
本発明の実施において、染料分子からの蛍光発光によるタンパク質の検出時には、界面活性剤の濃度をＣＭＣ以下とする。ＣＭＣ以下というこの条件は、ＣＭＣに影響を与える緩衝剤又は緩衝添加物を選択し、界面活性剤自体の濃度を制御することによって、或いは界面活性剤濃度及び緩衝剤組成物を共に制御することによって達成される。かかる条件は分離手順及び検出を通じて維持してもよく、或いは検出の直前に媒体を希釈することにより、分離後且つ検出前にかかる条件を導入してもよい。界面活性剤濃度をＣＭＣ以下のレベルに維持することによって、染料からのバックグラウンド信号を最小限にすることが可能となる。
【００２７】
分離及び特性決定の対象となるサンプルを、通常は界面活性剤を含有する緩衝溶液で前処理し、サンプル中のポリペプチド（本明細書で本用語は、タンパク質を含む意で使用される）と界面活性剤との複合体を形成させる。別途、スクアレン染料を分離媒体に加え、キャピラリー又はマイクロ流体チャネルに導入する。その後、界面活性剤で処理したサンプルを、キャピラリー又はマイクロ流体チャネルに、通常はキャピラリー又はチャネル区画の一端に導入する。キャピラリー又はチャネルの全長に亘って電場を印加し、ポリペプチド−界面活性剤複合体を、その大きさ若しくは電荷、又はそれら両方に応じて異なる速度で、分離媒体内を泳動させる。当該複合体は分離媒体中でスクアレン染料分子と接触し、これを適切な波長で外部光源により励起すると、ポリペプチド−界面活性剤複合体の内部又は極近傍の染料分子のみが、大量の分離媒体中に懸濁した染料分子よりも十分に大きなレベルの蛍光発光を生じる。こうして検出システムにより、ポリペプチド−界面活性剤複合体と会合している染料分子を、会合していない染料分子から識別することが可能となる。すなわち、ポリペプチド検出前に、分離媒体から未結合の染料分子を除去する必要はない。
【００２８】
界面活性剤を含有する緩衝剤でサンプルを前処理する場合には、前処理段階における界面活性剤の濃度は、重量／容積基準で、サンプルのポリペプチド濃度よりも大きいことが好適であり、少なくとも約１．４倍であることが好ましい。前処理段階における界面活性剤の濃度は、処理緩衝剤中の界面活性剤濃度の約０．５倍〜約３．０倍の範囲とすることが可能であるが、処理緩衝剤中の界面活性剤濃度未満又はこれとほぼ同等が好適であり、処理緩衝剤中の界面活性剤濃度未満が最適である。界面活性剤としてＳＤＳを用いる場合、前処理緩衝剤中の界面活性剤の濃度は、約０．０５％〜２％が好適であり、約０．０５％〜約１％がより好適であり、約０．５％未満が最適である。サンプルを分離媒体に加える前に希釈する場合、分離媒体に加えるサンプル中の界面活性剤のレベルは、約０．００２５％〜約１％が好適であり、約０．００２５％〜０．５％が最適である。なお、本明細書におけるパーセントはいずれも、別途明記しない限り、重量／容積である。
【００２９】
分離媒体中にポリマーマトリクスが存在すると、比較的小さいポリペプチドに比べて比較的大きなポリペプチドの当該媒体中における移動性が減少するので、分離度が上昇する。また、ポリマーマトリクスによって、チャネル内部における当該媒体の電気浸透流を低減又は除去し得る。架橋ポリマー及び可ゲル化ポリマーを含め、任意の種々のポリマーをポリマーマトリクスとして使用することができる。非架橋（すなわち「直鎖」）ポリマーは、キャピラリー及びマイクロ流体チャネルに容易に導入し得るという点で好適である。適切な非架橋ポリマー溶液の例としては、米国特許第５，２６４，１０１号、第５，５５２，０２８号、第５，５６７，２９２号、及び第５，９４８，２２７号に開示のものが挙げられる。最も一般的に利用される非架橋ポリマーはポリアクリルアミドポリマーであり、好適にはポリジメチルアクリルアミドポリマー溶液が挙げられる。これは中性でも、正帯電でも、負帯電でもよい。例としては、負帯電ポリジメチルアクリルアミド−コ−アクリル酸（例えば米国特許第５，９４８，２２７号に開示のもの）が挙げられる。非架橋ポリマーの濃度は、約０．０１％〜約３０％の範囲とすることが可能であるが、約０．０１％〜約２０％が好適であり、約０．０１％〜約１０％が最適である。ポリマーの平均分子量は様々な値とすることができる。高ポリペプチド分解能が求められるサンプルの場合、比較的高分子量のポリマーが必要であるが、より単純な分離の場合には、低分子量のポリマーで十分である。多くの場合、最良の結果が得られるポリマーの平均分子量の範囲は、約１ｋＤ〜約６，０００ｋＤ、好適には約１ｋＤ〜約１，０００ｋＤ、最適には約１００ｋＤ〜約１，０００ｋＤである。また、粘性に基づいてポリマーを選択してもよい。好適なポリマーは、分離媒体中で約２〜約１，０００センチポイズ、好適には約２〜約２００センチポイズ、及び最適には約５〜約１００センチポイズの粘性を有するものである。
【００３０】
上述のように、緩衝添加物の好適な選択、並びに界面活性剤濃度の好適な維持又は調節は、少なくともタンパク質又はポリペプチドの検出段階の際に、界面活性剤が臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以下、好適にはＣＭＣ未満の濃度となるように行われる。ＣＭＣは、界面活性剤が緩衝溶液中で独立したミセルを形成することにより、タンパク質検出を有意に妨げ始める濃度である。また、ＣＭＣは、単量体の界面活性剤の最高濃度、ひいては最も高い界面活性剤能が得られる濃度としても定義できる。Helenius等がMethods in Enzymol. 56(63):734-749(1979)で開示するように、界面活性剤溶液のＣＭＣは、界面活性剤分子の非極性部位のサイズが増加するほど、また、当該分子上の極性基のサイズ及び極性が減少するほど低下する。すなわち、界面活性剤溶液がＣＭＣを上回るか下回るかは、界面活性剤の濃度のみではなく、ＣＭＣに影響を及ぼす他の溶液の成分、すなわち緩衝剤の濃度、及び溶液の総イオン強度並びに他の添加剤によっても決定される。溶液がＣＭＣを下回るか否かを決定する方法としては、種々の方法が公知である。例えば、Rui等, Anal. Biochem. 152:250-255 (1986)は、蛍光Ｎ−フェニル−１−ナフチルアミン染料を用いた界面活性剤溶液のＣＭＣの決定法を開示する。すなわち、溶液をＣＭＣ未満とする界面活性剤濃度は、当技術分野で公知の方法により実験的に決定することができる。本明細書に開示のスクアレン染料を用いれば、溶液の蛍光を界面活性剤濃度の関数として測定することにより、界面活性剤溶液中の相対ミセル濃度を測定することができる。ＣＭＣは通常、蛍光強度の急激な増大によって表される。分離媒体の組成にもよるが、ＣＭＣは多くの場合、界面活性剤濃度約０．０１％〜約０．５％、且つ、緩衝剤濃度約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの場合に生じる。上に挙げた任意の界面活性剤及び緩衝剤を、分離媒体に使用することができる。
【００３１】
また、本発明に係る分離媒体中のスクアレン染料の濃度を変化させてもよい。かかる改変が本発明の新規性又は有用性に影響を与えることはない。多くの場合、有効な結果が得られる濃度は、約０．１μＭ〜約１ｍＭ、好適には約１μＭ〜約２０μＭの範囲である。
【００３２】
キャピラリー電気泳動により分離を行なう場合、キャピラリーは、溶融シリカ、ガラス又はポリマー材料から形成することができる。緩衝化分離媒体は圧力ポンプ又は毛細管現象によってキャピラリーチャネルに導入される。分離及び特性決定の対象となるサンプルは、キャピラリーチャネルの一端から注入により導入される。サンプル溶質、すなわちタンパク質及びポリペプチドが、電場の影響によりチャネルに沿って移動すると、スクアレン染料が溶質と会合し、チャネルのカソード末端に向うチャネル内の一部位で、従来のキャピラリー電気泳動検出システムにより検出される。分離に伴って、必要に応じて別の緩衝溶液を、分離ピャピラリーに連結された別の流路又はキャピラリーを通じて、当該溶質の流路に導入してもよい。
【００３３】
マイクロ流体デバイスで分離を行なう場合、分離媒体は、単体構成の集積固体基板（通常は積層構造）内に配置されたマイクロスケールキャピラリーチャネルのネットワークの１又は２以上のチャネル中に含有される。通常のマイクロ流体デバイスでは、分離チャネルは少なくとも１のサンプル注入チャネルと交差する。分離チャネル中の一部位に検出器が集中配置され、当該場所を通過する分離タンパク質が検出される。大抵の場合、マイクロ流体デバイスは複数のサンプルウェルを有し、これらが一般的なサンプル注入チャネルと流体連結され、これが分離チャネルと流体連結されることにより、サンプル間にデバイス洗浄及び再導入を行うことなく、多数のサンプルを分析することが可能となる。本発明に従って使用可能なマイクロ流体デバイスの例としては、２０００年５月２２日発行の米国特許第６，２３５，１７５号に開示且つ説明されるものが挙げられる。操作時には、まず分離緩衝剤を容器内に入れると、毛細管現象でデバイスの全チャネル内に吸引され、チャネルが充填される。分離及び特性決定の対象となるサンプルを別途、デバイスの他の容器内に入れる。適切な電極を通電し、最初のサンプルを電気泳動力によって、その容器から適切なチャネルへと、そして交差点を通じて分離チャネルへと移送する。その後、電極通電パターンを変化させ、分離チャネルを通じたサンプルの電気泳動移動及び分離を生じさせる。最初のサンプルの分離の間に、適切な電極に選択的に通電することによって、次の分析対象サンプルを分離チャネルへの入り口に通じる部位へ移送し、その後に分離チャネル内で分離を行う。かかる工程をサンプル毎に繰り返す。
【００３４】
キャピラリーシステム及びマイクロ流体デバイスの何れにおいても、当該染料で標識されたポリペプチドの検出は光学的手段によって、分離チャネル内の検出領域で行うことができる。かかるデバイスは通常は透明であり、検出窓は事実上、チャネルの全長に沿った任意のポイントに設置することができる。染料と会合した溶質が検出窓を通過する際に、染料は励起放射線を受け、染料からの蛍光発光が検出される。電極及び検出器を操作するための要素を内蔵するマイクロ流体デバイスの例としては、Experion（商標）自動電気泳動システム（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, カリフォルニア、米国）が挙げられる。別の例としては、米国特許第５，９７６，３３６号に開示のAgilent Technologiesの2100 Bioanalyzerが挙げられる。蛍光発光の技術分野で公知の、キャピラリー電気泳動及びマイクロ流体系用の検出の方法論及び装置を使用することができる。
【００３５】
以下の実施例は説明のために提供される。かかる実施例で報告される実験では、何れも上記Experion（商標）自動電気泳動システムを、Experion（商標）Pro260分析キット（同じくBio-Rad Laboratories, Inc.製）に連結して用いた。本発明のスクアレン染料を用いた実験は、キット添付の染料であるＳＹＴＯ（商標）６０の代わりに、スクアレン染料を用いることにより行った。
【実施例】
【００３６】
［実施例１］
上記式（６）のスクアレン染料を、６．７５％ドデシル硫酸ナトリウムのジメチルスルホキシド中溶液に溶解させ、染料濃度１４０μＭとした。得られた溶液をExperion Pro260分析キットで染色試薬の代わりに使用し、最終濃度０．２５％のドデシル硫酸ナトリウムと、最終濃度５．２μＭの染料とを含有する緩衝ポリマー溶液からなる分離媒体を得た。次いで、１０、２０、２５、３７、５０、７５、１００、１５０及び２６０ｋＤａの分子量を有する組み換えタンパク質からなる分子量の「ラダー（ladder）」を形成するように選択したタンパク質標準セットをサンプルとして用い、かかるサンプルを本システムの取扱説明書に付された標準的な手順に従って本システムにかけた。
【００３７】
本システム付属のソフトウェアを用いて分析を行い、蛍光対時間のトレースを作成した。図Ｉａのトレースは、本機器ソフトウェアによって得られた、基準線補正なしの検査染料の分析分析を表し、図Ｉｂのトレースは、基準線補正を伴う検査染料の分析を表し、図Ｉｃのトレースは、標準セットにおける各タンパク質の移動時間対分子量のプロットを表す。本データは、染料がタンパク質を可視化する上で有効に機能していることを示し、標準セットのタンパク質の移動時間は、染料の存在下でも、タンパク質の分子量の平滑関数となっている。
【００３８】
［実施例２］
上記式（５）のスクアレン染料を、６．７５％ドデシル硫酸ナトリウムのジメチルスルホキシド中溶液に溶かして、染料濃度１００μＭとした。得られた溶液をExperion Pro260分析キットの染色試薬の代わりに使用し、最終濃度０．２５％のドデシル硫酸ナトリウムと最終濃度３．７μＭの染料とを含有する緩衝ポリマー溶液からなる分離媒体を得た。９容積のリン酸緩衝生理食塩水及び１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフロライド中で、凍結ラット肝のサンプルを粉砕することにより、サンプルとして用いるラット肝タンパク質抽出物を調製した。抽出物を遠心分離によって清澄化し、Experionシステムで分離を行うべく、システム付属の取扱説明書に従って処理した。続いて、処理後の抽出物を、当該システムの取扱説明書に付された標準的な手順に従って当該システムにかけた。結果をシステムのソフトウェアで分析した。図２ａでは蛍光発光対時間のトレースとして、図２ｂではゲル図の様式で、システム添付の分子量「ラダー（ladder）」標準タンパク質混合物と一緒に表わす。本結果は、複合タンパク質混合物のマイクロ流体分離を可視化するとともに、タンパク質標準品の移動度との比較に基づいて構成タンパク質の分子量を評価する上で、当該染料が有効に使用され得ることを表している。
【００３９】
［実施例３］
本実施例は、本発明のスクアレン染料を使用して、蛍光強度とタンパク質濃度の間の相関性を説明する。
【００４０】
上記式（５）のスクアレン染料を、６．７５％ドデシル硫酸ナトリウムのジメチルスルホキシド中溶液に溶解させ、染料濃度１５０μＭとした。得られた溶液をExperion Pro260分析キットで染色試薬の代わりに使用し、最終濃度０．２５％のドデシル硫酸ナトリウムと最終濃度５．６μＭの染料とを含有する緩衝ポリマー溶液からなる分離媒体を得た。上記実施例のタンパク質混合物の代わりに、精製ウシ炭酸脱水酵素（Sigma-Aldrich）の段階希釈物をサンプルとして使用した。当該段階希釈サンプル中の炭酸脱水酵素の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．１２５ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．０３ｍｇ／ｍＬ、及び０．０１５ｍｇ／ｍＬであった。各希釈物を当該システムの取扱説明書に付された標準的な手順に従って当該システムにかけ、結果を当該システムのソフトウェアによって分析した。当該ソフトウェアで決定されるピーク面積と炭酸脱水酵素濃度とのプロットを図３に示す。応答がサンプル中のタンパク質量に比例することが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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