(57)【要約】本発明は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）に対する中和抗体を検出する方法に関する。より特定的には、本発明は抗ＢＭＰ中和抗体の存在を検出するための、特異性が高く、強力で、迅速かつ正確な、細胞に基づくアッセイに関する。一実施形態において、上記の方法は、（ａ）サンプルをＢＭＰに接触させるステップと；（ｂ）ＢＭＰへの露出によって発現が調節され得る少なくとも１つの内因性遺伝子を含むＢＭＰ応答性細胞とともに、ステップ（ａ）からのサンプルをインキュベートするステップと；（ｃ）細胞からｍＲＮＡを単離するステップと；（ｄ）逆転写反応によってｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを調製するステップと；（ｅ）定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）によって、ステップ（ｄ）のｃＤＮＡから遺伝子を増幅するステップと；（ｆ）細胞中のステップ（ｅ）において増幅された遺伝子の量を決定するステップなどとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）に対する中和抗体の検出のための方法であって、
（ａ）前記サンプルをＢＭＰに接触させるステップと；
（ｂ）前記ＢＭＰへの露出によって発現が調節され得る少なくとも１つの内因性遺伝子を含むＢＭＰ応答性細胞とともに、ステップ（ａ）からの前記サンプルをインキュベートするステップと；
（ｃ）前記細胞からｍＲＮＡを単離するステップと；
（ｄ）逆転写反応によって前記ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを調製するステップと；
（ｅ）定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）によって、ステップ（ｄ）の前記ｃＤＮＡから前記遺伝子を増幅するステップと；
（ｆ）前記細胞中のステップ（ｅ）において増幅された前記遺伝子の量を決定するステップと；
（ｇ）ＢＭＰのみに接触させた対照細胞における、ステップ（ｅ）に従って増幅された前記遺伝子の量を決定するステップと；
（ｈ）ステップ（ｆ）で決定された前記量がステップ（ｇ）で決定された前記量よりも少ないかまたは多いときに、前記サンプル中の中和抗体の存在を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
（ｉ）定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）によって、ステップ（ｄ）の前記ｃＤＮＡからハウスキーピング遺伝子を増幅するステップと；
（ｊ）前記細胞中のステップ（ｉ）において増幅された前記ハウスキーピング遺伝子の量を決定するステップと；
（ｋ）ステップ（ｊ）で決定された前記ハウスキーピング遺伝子の前記量によって、ステップ（ｆ）で決定された前記遺伝子の前記量を正規化するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＢＭＰは、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびその断片からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＢＭＰはＯＰ−１（ＢＭＰ−７）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルは血清である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記血清はヒト血清である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＢＭＰ応答性細胞は、Ａ５４９、ＳＡＯＳ−２、ＲＯＳおよびＣＳＣ１２からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記ＢＭＰ応答性細胞はＡ５４９細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子は初期遺伝子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記初期遺伝子は、Ｉｄ−１、Ｉｄ−２、Ｉｄ−３、Ｉｄ−４、Ｍｓｘ２、Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ３、Ｄｌｘ５、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｓｍａｄ６、Ｓｍａｄ７およびＲｕｎｘ２からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記初期遺伝子はＩｄ−１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子は後期遺伝子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記後期遺伝子は、ＨＥＹ１、ＤＩＯ２、ＡＤＡＭＴＳ９、ＨＡＳ３、ＦＧＦＲ３、ＭＦＩ２、ＣＨＩ３Ｌ１、ＮＯＧ、ＢＡＭＢＩ、ＧＲＥＭ１、ＧＲＥＭ２およびＳＯＳＴからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルは、ステップ（ａ）において少なくとも３０分間ＢＭＰと接触させられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）からの前記サンプルはＢＭＰ応答性細胞とともに約３時間インキュベートされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体はＯＰ１（ＢＭＰ−７）に対して特異的である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルは、ステップ（ａ）〜（ｈ）を行なう前に少なくとも１つのプレスクリーニングアッセイに供される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
前記プレスクリーニングアッセイは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）に対する中和抗体を検出できる任意のアッセイである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記プレスクリーニングアッセイは、イムノアッセイおよび細胞に基づくアッセイからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記イムノアッセイは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞に基づくアッセイは、レポーター遺伝子の活性化を伴う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記レポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ルシフェラーゼ遺伝子は、ＢＭＰへの露出によって調節され得る遺伝子のプロモーターにつながれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記遺伝子は初期または後期遺伝子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記遺伝子は、Ｉｄ−１、Ｉｄ−２、Ｉｄ−３、Ｉｄ−４、Ｍｓｘ２、Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ３、Ｄｌｘ５、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｓｍａｄ６、Ｓｍａｄ７、Ｒｕｎｘ２、フィブロモジュリン、Ｈｅｙ１およびＳＦＲＰ−２からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞に基づくアッセイは、アルカリホスファターゼの活性のモニタリングを伴う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記アルカリホスファターゼ活性はラット骨肉腫（ＲＯＳ）細胞においてモニタされる、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）に対する中和抗体を検出する方法に関する。より特定的には、本発明は抗ＢＭＰ中和抗体の存在を検出するための、特異性が高く、強力で、迅速かつ正確な、細胞に基づくアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）および軟骨形成タンパク質は、前駆細胞の増殖ならびに機能性の骨、軟骨、腱および／または靭帯組織への分化を誘導できる。本明細書においてはこれらのタンパク質を「骨形成タンパク質（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、「形態形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ）タンパク質」、「形態形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ）タンパク質」、または「モルフォゲン」と呼び、これらのタンパク質は、軟骨内性骨形成を誘導する能力によって同定される骨形成タンパク質（“ＢＭＰ”）ファミリーのメンバーを含む。当該技術分野において、骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）タンパク質は一般的に、成長因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのサブグループとして分類される。非特許文献１。骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）タンパク質は、哺乳動物の骨形成タンパク質１（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１：ＯＰ−１、ＢＭＰ−７としても公知）およびそのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ相同体の６０Ａ、骨形成タンパク質２（ＯＰ−２、ＢＭＰ−８としても公知）、骨形成タンパク質３（ＯＰ−３）、ＢＭＰ−２（ＢＭＰ−２ＡまたはＣＢＭＰ−２Ａとしても公知）およびそのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ相同体のＤＰＰ、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４（ＢＭＰ−２ＢまたはＣＢＭＰ−２Ｂとしても公知）、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびそのネズミ相同体のＶｇｒ−１、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＧＤＦ−３（Ｖｇｒ２としても公知）、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１またはＭＰ５２としても公知），ＧＤＦ−６（ＣＤＭＰ−２としても公知）、ＧＤＦ−７（ＣＤＭＰ−３としても公知）、Ｘｅｎｏｐｕｓ相同体のＶｇ１ならびにＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、およびＮＥＵＲＡＬを含む。
【０００３】
骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）タンパク質は典型的に、共通の構造的特徴を有する分泌ペプチドを含む。前駆体の「プロ形（ｐｒｏ−ｆｏｒｍ）」からプロセシングされた成熟形の骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）タンパク質は、ジスルフィド結合されたホモまたはヘテロ二量体であり、その各々のサブユニットがカルボキシル末端活性ドメインを有する。このドメインは約９７〜１０６アミノ酸残基を有し、システイン残基の保存されたパターンを含む。たとえば、非特許文献２；非特許文献３などを参照。
【０００４】
骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）タンパク質は多数の生物的プロセスを制御でき、その中には発達中の骨格系および成熟した骨格系の両方における新たな骨および軟骨の形成の誘導が含まれる。たとえば、骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）タンパク質は、哺乳動物に投与されると前駆細胞の増殖および分化を刺激できる。その結果として、骨形成タンパク質は、真の置換骨が別様に発生しないような条件において、軟骨内性骨形成を含む骨形成を誘導することができる。骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）タンパク質は、大きな分節骨欠損、脊椎固定、および骨折における新たな骨の形成も誘導できる。
【０００５】
特定の抗体の検出は、医学的診断の非常に一般的な形である。たとえば、疾患の診断のための生化学的アッセイにおいては、あらゆる特定の抗原に対して向けられた抗体のタイターを血液から推定できる。臨床免疫学においては、疾患の原因の決定において患者の抗体プロファイルを特徴付けるために、異なるクラスの免疫グロブリンのレベルが有用な場合がある。
【０００６】
治療剤で処置された患者における潜在的免疫原性の発達をモニタするために、中和抗体などの抗体の検出を用いることもできる。たとえば現在、たとえば酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、受容体結合アッセイ、放射性免疫沈降、バイオセンサーに基づくアッセイ、免疫蛍光、ウエスタンブロット、免疫拡散および免疫電気泳動などを含む、複合抗原−抗体の検出に基づくいくつかの免疫診断法を用いて、修正後外側脊椎固定および長骨癒合不全の処置のためにＯＰ−１（ＢＭＰ−７）で処置された患者において、中和抗体が検出されている。さまざまな細胞に基づく系を用いて中和抗体を検出することもできる。こうした細胞に基づくアッセイにおいて、中和抗体は、標的細胞中で治療剤が生物的プロセスを調節する能力を阻害する。これらのアッセイは、たとえばルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子の活性化などを伴ってもよい。代替的には、たとえばアルカリホスファターゼ活性などの生物的機能の読取りを伴う、細胞に基づく系を用いて中和抗体を検出できる。しかし、これらの現行の検出法は、アッセイの感度のレベル、特異性のレベル、および所要時間が長いことを含むいくつかの欠点を有する。
【０００７】
したがって、現在利用可能な方法に関連する問題点を克服するような、抗ＢＭＰ中和抗体の存在を検出するための改善された方法がなおも必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｏｇａｎ、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９６）１０：１５８０−１５９４
【非特許文献２】Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９０）６：５９７
【非特許文献３】Ｓａｍｐａｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１３１９８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、抗ＢＭＰ中和抗体の存在を検出するための、特異性が高く、強力で、迅速かつ正確なアッセイを提供することによって、上述の問題を解決する。したがっていくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）に対する中和抗体の検出のための方法を提供し、この方法は（ａ）前記サンプルをＢＭＰに接触させるステップと；（ｂ）前記ＢＭＰへの露出によって発現が調節され得る少なくとも１つの内因性遺伝子を含むＢＭＰ応答性細胞とともに、ステップ（ａ）からの前記サンプルをインキュベートするステップと；（ｃ）前記細胞からｍＲＮＡを単離するステップと；（ｄ）逆転写反応によって前記ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを調製するステップと；（ｅ）定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＱＰＣＲ）によって、ステップ（ｄ）の前記ｃＤＮＡから前記遺伝子を増幅するステップと；（ｆ）前記細胞中のステップ（ｅ）において増幅された前記遺伝子の量を決定するステップと；（ｇ）ＢＭＰのみに接触させた対照細胞における、ステップ（ｅ）に従って増幅された前記遺伝子の量を決定するステップと；（ｈ）ステップ（ｆ）で決定された量がステップ（ｇ）で決定された量よりも少ないかまたは多いときに、前記サンプル中の中和抗体の存在を検出するステップとを含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ｆ）で決定された量はステップ（ｇ）で決定された量よりも多い。他の実施形態において、ステップ（ｆ）で決定された量はステップ（ｇ）で決定された量よりも少ない。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）に対する中和抗体の検出のための方法を提供し、この方法は、（ｉ）定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）によって、ステップ（ｄ）の前記ｃＤＮＡからハウスキーピング遺伝子を増幅するステップと；（ｊ）前記細胞中の、ステップ（ｉ）で増幅された前記ハウスキーピング遺伝子の量を決定するステップと；（ｋ）ステップ（ｊ）で決定された前記ハウスキーピング遺伝子の量によって、ステップ（ｆ）で決定された前記遺伝子の量を正規化するステップとをさらに含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、骨形成タンパク質は、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびその断片を含むがこれらに限定されない。他の実施形態において、骨形成タンパク質はＯＰ−１（ＢＭＰ−７）である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、サンプルは血清である。他の実施形態において、サンプルはヒト血清である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＢＭＰ応答性細胞は、Ａ５４９、ＳＡＯＳ−２、ＲＯＳおよびＣＳＣ１２を含むがこれらに限定されない。他の実施形態において、ＢＭＰ応答性細胞はＡ５４９細胞である。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ応答性細胞は、骨髄、脂肪または筋肉のいずれかに由来する一次間質細胞を含むがこれに限定されない。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＢＭＰへの露出によって発現が調節され得る内因性遺伝子は、表１（下記参照）に示される遺伝子から選択される遺伝子を含むがこれに限定されない。いくつかの実施形態において、ＢＭＰへの露出によって発現が調節され得る内因性遺伝子は、初期遺伝子である。いくつかの実施形態において、初期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後１分から最高４８時間以内にその発現が調節される遺伝子である。いくつかの実施形態において、初期遺伝子は、Ｉｄ−１、Ｉｄ−２、Ｉｄ−３、Ｉｄ−４、Ｍｓｘ２、Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ３、Ｄｌｘ５、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｓｍａｄ６、Ｓｍａｄ７およびＲｕｎｘ２を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、初期遺伝子はＩｄ−１である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ＢＭＰへの露出によって発現が調節され得る内因性遺伝子は、後期遺伝子である。いくつかの実施形態において、後期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後４８時間より後にその発現が調節される遺伝子である。いくつかの実施形態において、後期遺伝子は、ＨＥＹ１、ＤＩＯ２、ＡＤＡＭＴＳ９、ＨＡＳ３、ＦＧＦＲ３、ＭＦＩ２、ＣＨＩ３Ｌ１、ＮＯＧ、ＢＡＭＢＩ、ＧＲＥＭ１、ＧＲＥＭ２およびＳＯＳＴを含むがこれらに限定されない。
【００１６】
いくつかの実施形態において、遺伝子の発現は、ＢＭＰへの露出によってアップレギュレートされる。他の実施形態において、遺伝子の発現は、ＢＭＰへの露出によってダウンレギュレートされる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、サンプルはステップ（ａ）においてＢＭＰと少なくとも３０分間接触させられる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）からのサンプルはＢＭＰ応答性細胞とともに約３時間インキュベートされる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、抗体はＯＰ−１（ＢＭＰ−７）に対して特異的である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、サンプルは、この方法のステップ（ａ）〜（ｈ）を行なう前に少なくとも１つのプレスクリーニングアッセイ（ｐｒｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙ）に供される。いくつかの実施形態において、プレスクリーニングアッセイとは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）に対する中和抗体を検出できる任意のアッセイである。いくつかの実施形態において、プレスクリーニングアッセイは、イムノアッセイおよび細胞に基づくアッセイからなる群より選択される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、イムノアッセイは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、細胞に基づくアッセイは、レポーター遺伝子の活性化を伴う。いくつかの実施形態において、レポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼ遺伝子は、ＢＭＰへの露出によって調節され得る遺伝子のプロモーターにつながれる。いくつかの実施形態において、遺伝子は初期または後期遺伝子である。いくつかの実施形態において、遺伝子は、Ｉｄ−１、Ｉｄ−２、Ｉｄ−３、Ｉｄ−４、Ｍｓｘ２、Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ３、Ｄｌｘ５、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｓｍａｄ６、Ｓｍａｄ７、Ｒｕｎｘ２、フィブロモジュリン、Ｈｅｙ１およびＳＦＲＰ−２を含むがこれらに限定されない。
【００２３】
いくつかの実施形態において、細胞に基づくアッセイは、アルカリホスファターゼの活性のモニタリングを伴う。いくつかの実施形態において、アルカリホスファターゼ活性はラット骨肉腫（ｒａｔ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ：ＲＯＳ）細胞においてモニタされる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】より高いアッセイ感度が得られたＢＭＰ−７の有効濃度は１５ｎｇ／ｍＬであることを示す図である。２つの異なる濃度（１５ｎｇ／ｍＬおよび２５ｎｇ／ｍＬ）のＢＭＰ−７（各々３つ行なった）を、だんだん増加する濃度の抗ＢＭＰ−７モノクローナル抗体（１２Ｇ３）とともにインキュベートした。Ｉｄ−１遺伝子に対する相対量（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔｉｔｙ：ＲＱ）の値を決定し、１５ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＭＰ−７は、より高いアッセイ感度が得られた有効濃度であることが決定された。
【図２】血清サンプルの最小必要希釈度（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ：ＭＲＤ）は１：４０であることを示す図である。正常ヒト血清（Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ：ＮＨＳ）サンプルを１：１０、１：２０、１：４０および１：８０に希釈し、Ｉｄ−１遺伝子に対する相対量（ＲＱ）の値を決定した。ＭＲＤとは、血清を含有しない対照サンプル（Ｎｏ  ＮＨＳ）と類似のバックグラウンドＲＱ値を示すような血清サンプルの最小希釈度である。
【図３】インキュベーションの期間およびＦＢＳの濃度のアッセイ最適化を示す図である。細胞をだんだん増加する濃度のＢＭＰ−７とともに１９時間または３時間インキュベートして、標的／ハウスキーピング（Ｉｄ−１／ＧＡＰＤＨ）遺伝子発現の比率に対する影響を決定した。応答曲線に基づいて、最適化期間として３時間のインキュベーション期間を選択した。
【図４】ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）はハウスキーピングＧＡＰＤＨ発現率に影響しないことを示す図である。８０個の異なるサンプルのＧＡＰＤＨ発現率（非スパイク／ＯＰ−１スパイク）を調べて、比較的均一であることが示された。
【図５】４０ｎｇ／ｍｌ（ＢＭＰ−７  ４０）および４００ｎｇ／ｍｌ（ＢＭＰ−７  ４００）のＢＭＰ−７で７日間処理した後の、ＦＧＦＲ３、ＤＩＯ２、ＨＥＹ１、ＡＤＡＭＴＳ９、ＨＡＳ３、およびＭＦＩ２のｍＲＮＡ発現の倍数変化を示す図である。ＯＤＭは対照細胞（すなわちＢＭＰ非処理）からのｍＲＮＡを示す。
【図６】４０ｎｇ／ｍｌ（ＢＭＰ−７  ４０）および４００ｎｇ／ｍｌ（ＢＭＰ−７  ４００）のＢＭＰ−７で７日間処理した後の、Ｎｏｇｇｉｎ、ＢＡＭＢＩ、ＧＲＥＭ１、ＧＲＥＭ２、およびＳＯＳＴのｍＲＮＡ発現の倍数変化を示す図である。ＯＤＭは対照細胞（すなわちＢＭＰ非処理）からのｍＲＮＡを示す。
【図７】４０ｎｇ／ｍｌ（ＢＭＰ−７  ４０）および４００ｎｇ／ｍｌ（ＢＭＰ−７  ４００）のＢＭＰ−７で７日間処理した後の、ＣＨＩ３Ｌ１のｍＲＮＡ発現の倍数変化を示す図である。ＯＤＭは対照細胞（ＢＭＰ非処理）からのｍＲＮＡを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書に記載される発明を完全に理解するために、以下に詳細な説明を示す。
【００２６】
別様に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を有する。本発明の実施またはテストにおいて、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料が用いられてもよいが、好適な方法および材料を以下に記載する。材料、方法および実施例は単なる例示的なものであり、限定的なものとは意図されない。本明細書で言及されるすべての出版物、特許およびその他の文書はその全体にわたって引用により援用される。
【００２７】
この明細書全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という言葉または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べられる完全体または完全体の群を含むことを意味するが、あらゆるその他の完全体または完全体の群を排除することは意味しないことが理解されるであろう。
【００２８】
本発明をさらに定義するために、本明細書において以下の用語および定義を提供する。
【００２９】
本明細書において、「骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）」、「骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）」、「形態形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ）タンパク質」、または「形態形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ）タンパク質」という用語は互いに交換可能に用いられ、ＤＮＡおよびアミノ酸配列の相同性に基づいてタンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーのＢＭＰファミリーに属するタンパク質（ＢＭＰファミリー）を示す。本発明に従うと、あるタンパク質が、ＢＭＰタンパク質ファミリーを特徴付ける保存されたＣ末端システインリッチドメイン内で少なくとも１つの公知のＢＭＰファミリーメンバーと少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有するとき、そのタンパク質はＢＭＰファミリーに属する。好ましくは、そのタンパク質は保存されたＣ末端システインリッチドメイン内で少なくとも１つの公知のＢＭＰファミリーメンバーと少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する。ＢＭＰファミリーのメンバーは、全体で５０％未満のＤＮＡまたはアミノ酸配列同一性を有していてもよい。ＢＭＰは、局所環境の指示に依存して、前駆細胞を誘導して増殖および／または分化経路を開始することによって、軟骨、骨、腱、靭帯、腎臓、肝臓、筋肉、神経または他のタイプの組織形成をもたらすことができてもよく、よってＢＭＰは異なる環境において異なる振舞いをしてもよい。たとえば、ＢＭＰは１つの処置部位において骨組織を誘導し、異なる処置部位において神経組織を誘導してもよい。
【００３０】
本発明の実行において有用な骨形成タンパク質は、活性形のＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＵＮＩＶＩＮ、ＮＯＤＡＬ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰまたはＮＥＵＲＡＬ、およびそれらのアミノ酸配列変異体を含む。
【００３１】
「アミノ酸配列相同性」という用語は、アミノ酸配列の同一性および類似性の両方を含むことが理解される。相同配列は同一および／または類似のアミノ酸残基を共有し、ここで類似の残基とは、整列した参照配列中の対応するアミノ酸残基の保存的置換または「許容される点突然変異」である。よって、参照配列と７０％のアミノ酸相同性を有する候補ポリペプチド配列においては、整列した残基のうちいずれか７０％が参照配列中の対応残基と同一であるか、またはその保存的置換である。特定の特に好ましい形態形成ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１および関連タンパク質の保存された７システインドメインを定義するＣ末端１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも６０％、好ましくは７０％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００３２】
アミノ酸配列相同性は、当該技術分野において周知の方法によって決定することができる。たとえば、７システインドメインの配列に対する候補アミノ酸配列のパーセント相同性を決定するためには、まず２つの配列を整列させる。整列は、たとえばＮｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，ｐｐ．４４３（１９７０）に記載される動的プログラミングアルゴリズム、およびＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．によって生産される商業的ソフトウェアパッケージであるＡｌｉｇｎ  Ｐｒｏｇｒａｍなどによって行なうことができる。両方の出典による教示は本明細書において引用により援用される。関連タンパク質のファミリーの多配列アラインメントとの比較によって、初期アラインメントを精密化できる。アラインメントを行なって精密化してから、パーセント相同性スコアを算出する。２つの配列の整列したアミノ酸残基同士の類似性を順に比較する。類似性の要素は、類似のサイズ、形および電荷を含む。アミノ酸類似性を決定する特に好ましい方法の１つは、本明細書において引用により援用されるＤａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５，ｐｐ．３４５−３５２（１９７８＆Ｓｕｐｐ．）に記載されるＰＡＭ２５０マトリックスである。類似性スコアは最初に、整列対に関するアミノ酸類似性スコアの合計として算出される。パーセント相同性および同一性の目的のために、挿入および欠失は無視される。したがって、この計算にはギャップペナルティは用いられない。この生スコアを、次いで候補配列および７システインドメインのスコアの相乗平均で割ることによって正規化する。相乗平均とはこれらのスコアの積の平方根である。この正規化された生スコアがパーセント相同性である。
【００３３】
「保存的置換」という用語は、対応する参照残基と物理的または機能的に類似の残基を示す。すなわち、保存的置換とその参照残基とは、類似のサイズ、形、電荷、共有結合もしくは水素結合の形成能力を含む化学的性質、またはその類似物を有する。好ましい保存的置換は、上記のＤａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．において許容される点突然変異に対して定義された基準を満たすものである。保存的置換の例は、次のグループ内での置換である：（ａ）バリン、グリシン；（ｂ）グリシン、アラニン；（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン；（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸；（ｅ）アスパラギン、グルタミン；（ｆ）セリン、スレオニン；（ｇ）リジン、アルギニン、メチオニン；および（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。「保存的変異体」または「保存的変形」という用語は、所与の親アミノ酸配列中のアミノ酸残基の代わりに置換アミノ酸残基を使用することも含み、ここで親配列に対して特異的な抗体は、結果的に得られる置換ポリペプチド配列に対しても特異的であり、すなわち「交差反応」または「免疫反応」する。
【００３４】
「骨形成タンパク質（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＯＰ）」という用語は、前駆細胞を誘導して軟骨および／または骨を形成できる形態形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ）タンパク質を示す。骨は膜内骨または軟骨内性骨であってもよい。ほとんどの骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）タンパク質はＢＭＰタンパク質ファミリーのメンバーであり、したがってＢＭＰでもある。本明細書の別の場所に記載されるとおり、このクラスのタンパク質はヒト骨形成タンパク質（ｈＯＰ−１）を代表とする。本発明とともに用いるために好適な骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）タンパク質は、ＲｅｄｄｉおよびＳａｍｐａｔｈ（Ｓａｍｐａｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４，ｐｐ．７１０９−１３，本明細書において引用により援用される）によって記載される当該技術分野に認識されるバイオアッセイを用いたルーチン実験によって同定できる。
【００３５】
「形態形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ）活性」、「形態形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ）活性」、「誘導（ｉｎｄｕｃｉｎｇ）活性」および「組織誘導（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）活性」という用語は、骨形成タンパク質が標的細胞を刺激して、任意に細胞分化をもたらし得る１つまたはそれ以上の細胞分裂（増殖）を起こす能力を代替的に示す。こうした標的細胞は、本明細書において一般的に前駆細胞と呼ばれる。細胞増殖は典型的に細胞周期制御の変化を特徴とし、ＤＮＡ合成速度または細胞生育速度の測定を含むいくつかの手段によって検出されてもよい。細胞分化の初期段階は典型的に、前駆細胞のものに対する遺伝子発現パターンの変化を特徴とし、これは特定の細胞運命または細胞型への関与を示していてもよい。細胞分化の後期段階は、遺伝子発現パターン、細胞生理および形態の変化を特徴としてもよい。遺伝子発現、細胞生理または形態のあらゆる再現性のある変化を用いて、ＢＭＰによって誘導される細胞分化の開始および程度を評価してもよい。
【００３６】
「抗体」という用語は、完全な抗体、たとえば２本の重鎖および２本の軽鎖を含む抗体など、または完全な抗体の抗原結合断片を示し、供給源、起源の種、生産方法および特徴に関わらず、抗原結合部位を含むあらゆるポリペプチドを包含する。限定的でない例として、「抗体」という用語は、ヒト、オランウータン、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジおよびニワトリ抗体を含む。この用語は、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多特異性、非特異性、ヒト化、１本鎖、キメラ、合成、組換え型、混成、変異型、およびＣＤＲ移植抗体を含むがこれらに限定されない。「抗体」という用語は、さまざまなプロテアーゼによる分解によって生成される抗体断片、化学的切断および／または化学的解離によって生成される抗体断片、および組換えによって生成される抗体断片も含むがこれらに限定されない。これらの断片の中には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、および抗原結合機能を保持するその他の抗体断片がある。抗体またはその断片は、公知の抗体アイソタイプおよびその高次構造のいずれかであってもよく、たとえばＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ単量体、ＩｇＡ二量体、ＩｇＡ三量体、またはＩｇＭ五量体などであってもよい。
【００３７】
「中和抗体」という用語は、その抗体が特異的である分子に結合してその少なくとも１つの生物活性を妨げることができるようなあらゆる抗体またはその断片を示す。中和抗体は、その抗体が特異的である分子の１つまたはそれ以上の活性を、その分子のその他の活性を阻害することなく阻害（すなわち除去または低減）してもよい。
【００３８】
「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「調節している（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」という用語は、別の化合物または分子の少なくとも１つの活性、たとえば遺伝子転写のレベルまたは遺伝子発現のレベルなどをアップレギュレートまたはダウンレギュレートする能力を示す。
【００３９】
「ＢＭＰ応答性細胞」という用語は、ＢＭＰ受容体を発現してＢＭＰに誘導されるタンパク質シグナリングの形質導入を可能にすることによって、ＢＭＰと細胞受容体との相互作用に応答して遺伝子発現制御要素の調節をもたらすようなあらゆる細胞を示す。
【００４０】
「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は動物を示す。いくつかの実施形態において、動物は、ヒト、ウシおよびげっ歯動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物である。他の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００４１】
骨形成タンパク質ファミリー
ＢＭＰファミリーは、その代表的な骨形成（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ／ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）タンパク質ファミリーのメンバーの名を取って名付けられており、ＴＧＦ−βタンパク質スーパーファミリーに属する。主に配列相同性に基づいて単離された、報告される「ＢＭＰ」（ＢＭＰ−１からＢＭＰ−１８）のうち、ＢＭＰ−１を除くすべてがなおも形態形成タンパク質のＢＭＰファミリーのメンバーとして分類されている（Ｏｚｋａｙｎａｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，９，ｐｐ．２０８５−９３（１９９０））。
【００４２】
ＢＭＰファミリーは、形態形成タンパク質であるその他の構造的に関連するメンバーを含んでおり、その中にはショウジョウバエデカペンタプレジック遺伝子複合物（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ  ｇｅｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＤＰＰ）産物、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓのＶｇ１産物およびそのネズミ相同体Ｖｇｒ−１（例、本明細書において引用により援用されるＭａｓｓａｇｕｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６，ｐｐ．５９７−６４１（１９９０）を参照）が含まれる。
【００４３】
ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−１（ＢＭＰ−７）のＣ末端ドメインはＢＭＰ−２と約６０％同一であり、ＢＭＰ−６およびＯＰ−１のＣ末端ドメインは８７％同一である。ＢＭＰ−６はおそらくネズミＶｇｒ−１のヒト相同体である（Ｌｙｏｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，ｐｐ．４５５４−５９（１９８９））；この２つのタンパク質はアミノ酸配列レベルで全体的に９２％同一である（本明細書において引用により援用される米国特許第５，４５９，０４７号）。ＢＭＰ−６はＸｅｎｏｐｕｓ  Ｖｇ−１産物と５８％同一である。
【００４４】
天然に存在する骨形成タンパク質は、Ｃ末端領域（ドメイン）にかなりのアミノ酸配列相同性を有する。典型的に、天然に存在する骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）タンパク質は前駆体として翻訳され、それは典型的に約３０残基未満のＮ末端シグナルペプチド配列を有し、その後に続く「プロ」ドメインが切断されて、約９７〜１０６アミノ酸の成熟Ｃ末端ドメインが得られる。シグナルペプチドは、Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４，ｐｐ．４６８３−４６９１（１９８６）の方法を用いて所与の配列において予測可能な切断部位において、翻訳の際に迅速に切断される。プロドメインは典型的に、完全にプロセシングされた成熟Ｃ末端ドメインの約３倍の大きさである。
【００４５】
ＢＭＰタンパク質ファミリーメンバーの別の特徴は、二量化するという明らかな能力である。いくつかの骨由来骨形成タンパク質（ＯＰ）およびＢＭＰは、活性形においてホモおよびヘテロ二量体であることが見出されている。ＯＰおよびＢＭＰがヘテロ二量体を形成する能力は、骨形成タンパク質に付加的な、または変更された形態形成誘導能力を与えてもよい。ヘテロ二量体は、ＯＰおよびＢＭＰ受容体分子に対してホモ二量体とは質的または量的に異なる結合親和性を示すかもしれない。結合親和性が変わることで、異なるシグナリング経路に介在する受容体の異なる活性化がもたらされてもよく、その結果最終的には異なる生物活性または結果がもたらされてもよい。結合親和性の変更が組織または細胞型に特異的な態様で現れることによって、特定の前駆細胞型のみを誘導して増殖および／または分化を起こしてもよい。
【００４６】
好ましい実施形態において、一対の骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）または形態形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ）ポリペプチドのアミノ酸配列は、その各々が参照骨形成タンパク質のアミノ酸配列との決定された関係を有する配列を含む。本明細書において、好ましい骨形成または形態形成ポリペプチドは、活性ヒトＯＰ−１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中に存在する配列との決定された関係を有する。しかし、本明細書に開示される天然に存在する配列または生合成配列のあらゆる１つまたはそれ以上が同様に参照配列として用いられてもよい。好ましい骨形成または形態形成ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１の少なくともＣ末端６システインドメイン、すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基３３５〜４３１との決定された関係を有する。好ましくは、骨形成または形態形成ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１の少なくともＣ末端７システインドメイン、すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基３３０〜４３１との決定された関係を有する。すなわち、骨形成活性を有する二量体タンパク質中の好ましいポリペプチドの各々は、参照配列に対応する配列またはそれと機能的に同等の配列を含む。
【００４７】
機能的に同等の配列は、参照配列内に配置されたシステイン残基の機能的に同等の配置を含み、それはこれらのシステインの線形的配置は変えても二量体骨形成タンパク質の折畳まれた構造におけるそれらの関係を物質的に損なわないようなアミノ酸挿入または欠失を含み、そこにはこれらのシステインが形態形成活性のために必要であり得るこうした鎖内または鎖間ジスルフィド結合を形成する能力が含まれる。機能的に同等の配列は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、たとえばヒトＯＰ−１のＣ末端７システインドメイン（本明細書においては保存された７システイン骨格とも呼ばれる）などの参照配列の対応する残基と異なっているような配列をさらに含むが、ただしこの相違はその配列の生物活性に影響しないものとする。したがって、参照配列中の対応するアミノ酸の保存的置換が好ましい。参照配列中の対応する残基に対する保存的置換であるアミノ酸残基とは、対応する参照残基と物理的または機能的に類似の残基、たとえば類似のサイズ、形、電荷、共有結合もしくは水素結合の形成能力を含む化学的性質、またはその類似物を有する残基などである。特に好ましい保存的置換は、その教示が本明細書において引用により援用される上記のＤａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．において許容される点突然変異に対して定義された基準を満たすものである。
【００４８】
骨形成タンパク質ＯＰ−１は説明されている（たとえば、本明細書において引用により援用されるＯｐｐｅｒｍａｎｎら、米国特許第５，３５４，５５７号などを参照）。成熟した未変性形の天然由来骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）タンパク質はグリコシル化された二量体であって、典型的にはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される約３０〜３６ｋＤａの見かけの分子量を有する。還元されると、３０ｋＤａのタンパク質は約１６ｋＤａおよび１８ｋＤａの見かけの分子量を有する２つのグリコシル化ペプチドサブユニットを生じる。還元された状態では、このタンパク質は検出可能な骨形成活性を有さない。非グリコシル化タンパク質も骨形成活性を有し、これは約２７ｋＤａの見かけの分子量を有する。還元されると、この２７ｋＤａのタンパク質は約１４ｋＤａから１６ｋＤａの分子量を有する２つの非グリコシル化ポリペプチドを生じ、これは哺乳動物における軟骨内性骨形成を誘導できる。骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）タンパク質は、異なるグリコシル化パターン、異なるＮ末端を有する形、および未変性タンパク質の活性切断型または変異型を含んでもよい。上述のとおり、特に有用な配列は、ＤＰＰ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来）、Ｖｇ１（Ｘｅｎｏｐｕｓ由来）、Ｖｇｒ−１（マウス由来）、ＯＰ−１およびＯＰ−２タンパク質（本明細書において引用により援用される米国特許第５，０１１，６９１号およびＯｐｐｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．を参照））、ならびにＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４（本明細書において引用により援用される国際公開８８／００２０５号、米国特許第５，０１３，６４９号および国際公開９１／１８０９８号を参照）、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６（本明細書において引用により援用される国際公開９０／１１３６６号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０１６３０号を参照）、ＢＭＰ−８およびＢＭＰ−９と呼ばれるタンパク質のＣ末端の９６または１０２アミノ酸配列を含む配列を含む。
【００４９】
本発明の好ましい骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）タンパク質または形態形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ）タンパク質は、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、ＣＯＰ−１６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＭＰ１２１、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ドルサリン１、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、その種相同体を含むアミノ酸配列変異体および相同体ならびにその断片を含むがこれらに限定されない少なくとも１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、このタンパク質は、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、その種相同体を含むアミノ酸配列変異体および相同体ならびにその断片を含むがこれらに限定されない少なくとも１つのポリペプチドを含む。他の実施形態において、このタンパク質は、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、その種相同体を含むアミノ酸配列変異体および相同体ならびにその断片を含むがこれらに限定されない少なくとも１つのポリペプチドを含む。このタンパク質は、以下から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む：好ましくは、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２またはＣＤＭＰ−３；より好ましくは、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２またはＣＤＭＰ−３；さらにより好ましくは、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＢＭＰ−５またはＢＭＰ−６；最も好ましくはＯＰ−１（ＢＭＰ−７）。
【００５０】
これらの配列ならびにその化学的および物理的性質を開示する出版物は、以下を含む：
【００５１】
【化１】
2010539932.tif 000002
上記の出版物は本明細書において引用により援用される。
【００５２】
別の実施形態において、有用なタンパク質は生物的に活性な生合成構成物を含み、そこには新規の生合成骨形成タンパク質および２つまたはそれ以上の公知の骨形成タンパク質からの配列を用いて設計されたキメラタンパク質が含まれる。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態の１つにおいて、骨形成タンパク質はジスルフィド結合されて二量体種を生じる一対のサブユニットを含み、そのサブユニットの少なくとも１つはＢＭＰタンパク質ファミリーに属する組換えペプチドを含む。本発明の別の好ましい実施形態において、骨形成タンパク質は非共有的相互作用によって形成された二量体種を生じる一対のサブユニットを含み、そのサブユニットの少なくとも１つはＢＭＰタンパク質ファミリーに属する組換えペプチドを含む。非共有的相互作用は、ファンデルワールス、水素結合、疎水性相互作用および静電相互作用を含む。二量体種はホモ二量体またはヘテロ二量体であってもよく、細胞増殖および／または組織形成を誘導できる。他の好ましい実施形態において、骨形成タンパク質は単量体である。
【００５４】
特定の好ましい実施形態において、本明細書において有用な骨形成タンパク質は、前述の天然に存在するタンパク質から選択された参照骨形成タンパク質と少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性または「類似性」を有し、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の相同性または類似性を有する配列を含むアミノ酸配列を有するものを含む。好ましくは参照タンパク質はヒトＯＰ−１であり、その参照配列は骨形成活性を有する形のヒトＯＰ−１に存在するＣ末端７システインドメイン、すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基３３０〜４３１である。特定の実施形態において、参照骨形成ポリペプチドと機能的に同等であることが推測されるポリペプチドは、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）などのコンピュータプログラムによって便利に実施される上記のＮｅｅｄｌｅｍａｎらの方法を用いて、参照骨形成ポリペプチドと整列される。上記に示したとおり、候補と参照配列とのアミノ酸配列相同性または同一性のレベルとして従来から表わされる定義済みの関係を算出する目的のために、候補配列中の内部ギャップおよびアミノ酸挿入は無視される。
【００５５】
本明細書において、「アミノ酸配列相同性」とはアミノ酸配列の同一性および類似性の両方を含むと理解される。相同配列は同一および／または類似のアミノ酸残基を有し、ここで類似の残基とは整列した参照配列中の対応するアミノ酸残基の保存的置換または「許容される点突然変異」である。よって、参照配列と７０％のアミノ酸相同性を有する候補ポリペプチド配列においては、整列した残基のうちいずれか７０％が参照配列中の対応残基と同一であるか、またはその保存的置換である。現在好ましい実施形態において、参照配列はＯＰ−１である。したがって、本明細書において有用な骨形成タンパク質は、好ましい参照配列の対立遺伝子および系統的対応物ならびにその他の変異体を含み、それは天然に存在するかまたは生合成により生成されたものであり（例、「ムテイン」または「突然変異タンパク質」を含む）、さらにタンパク質の一般的な形態形成ファミリーの新規のメンバーを含み、そこには上記に示して識別したものが含まれる。特定の特に好ましい骨形成ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１の好ましい参照配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有し、さらにより好ましくは参照配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％のアミノ酸同一性を有する。
【００５６】
別の実施形態において、有用なタンパク質は、本明細書において定義したとおり、保存された７システインドメインを有し、かつＣ末端活性ドメインにおいて少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性（類似性）を有するタンパク質を含む。
【００５７】
さらに別の好ましい実施形態において、有用な活性タンパク質は、低い、中程度または高い厳密性のハイブリダイゼーション条件下で、参照骨形成配列をコードするＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズする核酸にコードされる配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を有し、その参照骨形成配列は、たとえばＯＰ−１、ＯＰ−２、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、６０Ａ、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、およびその類似物の保存された７システインドメインを決定するＣ末端配列などである。本明細書において用いられる高い厳密性のハイブリダイゼーション条件とは、４０％のホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＰＥ、５Ｘデンハート液、および０．１％のＳＤＳ中で３７℃にて一晩おき、０．１Ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ中で５０℃にて洗浄するという公知の技術に従ったハイブリダイゼーションとして定義される。標準的な厳密な条件は、商業的に入手可能な標準的な分子クローニングのテキストにおいてよく特徴付けられている。たとえば、その開示を本明細書において引用により援用するＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ編，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編．１９８４）；およびＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）などを参照されたい。
【００５８】
上記に示したとおり、本発明において有用なタンパク質は一般的に、上記のポリペプチドの折畳まれた対を含む二量体タンパク質である。こうした骨形成タンパク質は還元されたときには不活性であるが、酸化ホモ二量体のとき、および本発明の他のタンパク質と組合せて酸化されてヘテロ二量体を生成するときは活性である。よって、形態形成活性を有するタンパク質中の骨形成ポリペプチドの折畳まれた対のメンバーは、上記において言及した特定のポリペプチドのいずれかから独立して選択されてもよい。いくつかの実施形態において、骨形成タンパク質は単量体である。
【００５９】
本発明の材料および方法において有用な骨形成タンパク質は、上に記載したポリペプチド鎖のいずれかを含むタンパク質を含み、それは天然に存在する供給源から単離されても、組換えＤＮＡまたはその他の合成技術によって生成されてもよく、そこにはこれらのタンパク質の対立遺伝子および系統的対応物変異体、ならびにそのムテイン、その断片およびさまざまな切断型および融合構成物が含まれる。欠失または付加変異体も活性であると考えられ、そこには保存されたＣ末端の６または７システインドメインを変更し得る変異体が含まれるが、ただしその変更は折畳まれた構造におけるこれらのシステインの関係を機能的に阻害しないものとする。したがって、こうした活性形は本明細書に開示される特定的に記載された構成物と同等のものと考えられる。このタンパク質は、さまざまなグリコシル化パターン、さまざまなＮ末端、アミノ酸配列相同性の領域を有する関連タンパク質のファミリー、および天然または生合成タンパク質の活性切断型または変異型を有する形を含んでもよく、それは宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によって生成されてもよい。
【００６０】
本明細書において予期される骨形成タンパク質は、原核または真核宿主細胞中で完全型もしくは切断型のｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡから発現されて、精製、切断、再折畳みおよび二量化されることによって形態形成活性を有する組成物を形成してもよい。現在好ましい宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉを含む原核生物または酵母を含む真核生物、または哺乳動物細胞、たとえばＣＨＯ、ＣＯＳもしくはＢＳＣ細胞などを限定的でなく含む。当該技術分野の通常の当業者は、その他の宿主細胞が有効に用いられ得ることを認めるであろう。本発明の実施において有用な骨形成タンパク質の詳細な説明は、その作成、使用および骨形成活性のテストの方法を含めて、多数の出版物に開示されており、そこにはその開示が本明細書において引用により援用される米国特許第５，２６６，６８３号および第５，０１１，６９１号、ならびにその開示が本明細書において引用により援用される本明細書中で引用される出版物のいずれかが含まれる。
【００６１】
よって、熟練した遺伝子工学研究者は、本開示および当該技術分野において入手可能な知識に鑑みて、ｃＤＮＡまたはさまざまな異なる生物種のゲノムライブラリーから適切なアミノ酸配列をコードする遺伝子を単離するか、またはオリゴヌクレオチドからＤＮＡを構築でき、次いで原核生物および真核生物の両方を含むさまざまなタイプの宿主細胞中でその遺伝子を発現させて、哺乳動物中の骨および軟骨形成を刺激できる大量の活性タンパク質を生成できる。加えて、熟練作業者はインビボで本発明のタンパク質を発現する核酸分子も調製できる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、骨形成タンパク質は、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびそのアミノ酸配列変異体を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、骨形成タンパク質は、ヒトＯＰ−１の保存された７システインドメインを含むＣ末端１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記骨形成タンパク質は骨および／または軟骨の欠損の修復を誘導できる。
【００６３】
好ましい実施形態において、骨形成タンパク質はＯＰ−１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６およびＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２またはＣＤＭＰ−３である。より好ましい実施形態において、骨形成タンパク質はＯＰ−１、ＢＭＰ−５またはＢＭＰ−６である。最も好ましい実施形態において、骨形成タンパク質はＯＰ−１である。
【００６４】
ＢＭＰに対する中和抗体を検出するためのアッセイ
本発明は、サンプル中の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）に対する中和抗体を検出する方法を提供する。中和抗体の可能性のあるものを含有するサンプルを、前記ＢＭＰへの露出によって発現が調節され得る少なくとも１つの内因性遺伝子を含むＢＭＰ応答性細胞とともにインキュベートする前に、まずＢＭＰと接触させる。ＢＭＰ応答性細胞からｍＲＮＡを単離した後に、逆転写反応を用いて前記ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを調製することによって、前記内因性遺伝子の発現を決定する。次いで、このｃＤＮＡを定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）によって増幅する。増幅された内因性遺伝子の量を決定して、ＢＭＰのみに接触させた対照細胞から増幅された同じ内因性初期遺伝子の量と比較する。増幅された内因性遺伝子の量が、ＢＭＰのみに接触させた対照細胞から増幅された同じ内因性遺伝子の量よりも少ないかまたは多いときに、サンプル中の中和抗体の存在が検出される。いくつかの実施形態において、増幅された遺伝子の量は対照細胞から増幅された同じ内因性遺伝子の量よりも多い。他の実施形態において、増幅された遺伝子の量は対照細胞から増幅された同じ内因性遺伝子の量よりも少ない。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）によって、サンプル処理した細胞のｃＤＮＡからハウスキーピング遺伝子を増幅するステップと、増幅された前記ハウスキーピング遺伝子の量を決定するステップとをさらに含む。次いで、ハウスキーピング遺伝子の決定された量を用いて、内因性初期遺伝子の決定された量を正規化する。遺伝子発現を内因性遺伝子のものに対して正規化することによって、アッセイ内およびアッセイ間のばらつきを制御できる。
【００６６】
いくつかの実施形態においては、アッセイが適切に機能していることを確認するために、正および負の対照サンプルによって誘導される応答を決定する。典型的に、負の対照はＢＭＰに露出されていない対象からの血清サンプルである。いくつかの場合には、負の対照サンプルは未処置の対象からのプール血清サンプルであってもよい。負の対照サンプルは、ＢＭＰのみによって誘導される生物応答を測定する。いくつかの実施形態においては、一体化した負の対照として働く、サンプル添加前のＢＭＰおよび細胞から生物活性を読取る。
【００６７】
いくつかの実施形態において、対照は、ＢＭＰで処理された対象からの血清サンプルを含む。他の実施形態において、対照は、ＢＭＰで処理された対象からの血清サンプルを含み、さらに陽性中和抗体を含む。いくつかの実施形態において、血清サンプルはプールされる。他の実施形態において、血清はヒト血清である。
【００６８】
付加的な対照は、ある範囲のＢＭＰ濃度を含有する標準溶液を含んでもよい。これらの標準をテストサンプルの不在下で細胞とともに個々にインキュベートすることによって、変化するＢＭＰ濃度において誘導される生物応答のプロファイルを生成する。
【００６９】
テストサンプルによって誘導される応答を標準によって誘導される応答と比較することによって、テストサンプル中に含まれる中和活性の定量化が可能になる。たとえば、テストサンプルに用いられたＢＭＰ濃度の５０％を含有する標準に等しい応答を誘導したテストサンプルは、ＢＭＰ活性の５０％を中和したことになる。これらの比較を用いて、各テストサンプルに対して中和活性の単位を決定してもよい。
【００７０】
いくつかの実施形態において、中和抗体の可能性のあるものを含有するサンプルをまずＢＭＰと接触させる。アッセイに用いられるＢＭＰの量は、細胞中の生物応答を誘導するために十分な量である。しかし、細胞中の最大の生物応答を誘導するために十分な量を超えない量のＢＭＰが用いられるときに、中和抗体の検出は最も感度が高い。この量を超えるＢＭＰは、アッセイ読出しを検出可能なほど変えることなくサンプル内の中和抗体に結合する可能性がある。
【００７１】
ＢＭＰの量は、アッセイのパラメータ、たとえば使用される細胞の量、アッセイ容器のサイズ、およびＢＭＰに対する細胞の感受性などによって変動する。ＢＭＰの量を滴定することによって、過剰なＢＭＰによってアッセイを飽和させることなく細胞中の生物応答を誘導するために十分な最適量（または「有効濃度」）を決定できる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、アッセイに用いられるＢＭＰの濃度は以下のとおりであってもよい：少なくとも１ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも６０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも７０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも８０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも９０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬ、少なくとも５００μｇ／ｍＬ、または少なくとも１ｍｇ／ｍＬ。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本発明のサンプルは、中和抗体またはタンパク質を含有し得るあらゆる体液であってもよい。例として、血液、血清、リンパ、血漿、滑液、脳脊髄液、涙、生検または組織サンプル、細胞懸濁液、唾液、口腔液、粘液、羊水、初乳、乳腺分泌物、尿、汗、および組織培養培地を含むがこれらに限定されない。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明のサンプルを複数の希釈度でアッセイすることによって、サンプル中に存在する中和活性の正確な定量化を得てもよい。各サンプルが希釈された量に基づいて、各サンプル中の中和活性の単位を算出してもよい。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本発明のサンプルを希釈することによって、サンプルの非特異的なバックグラウンド構成要素による干渉を避けてもよい。たとえば、血清中に高濃度見出されるタンパク質は、いくつかの条件においてアッセイの構成要素と非特異的に相互作用してアッセイの感度を低減させることがある。サンプル希釈によって非特異的結合を低減または除去することによって、アッセイのシグナル対ノイズ比を増加させてもよい。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本発明のサンプルは希釈せずにアッセイされてもよい。他の実施形態において、本発明のサンプルは、たとえば１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：８０、１：１００、１：５００、１：１０００、または１：５０００などの希釈係数にてアッセイされてもよい。他の実施形態において、本発明のサンプルはさらに大きい希釈係数にてアッセイされてもよい。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本発明のＢＭＰ応答性細胞は、ＢＭＰ受容体を発現してＢＭＰに誘導されるタンパク質シグナリングの形質導入を可能にすることによって、ＢＭＰと細胞受容体との相互作用に応答して遺伝子発現制御要素の活性化をもたらすような、細胞のあらゆる集団であってもよい。いくつかの実施形態において、本発明のアッセイは１個の細胞または細胞の集団を用いてもよい。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ応答性細胞は、Ａ５４９、ＳＡＯＳ−２、ＲＯＳおよびＣＳＣ１２を含むがこれらに限定されない。他の実施形態において、ＢＭＰ応答性細胞はＡ５４９細胞である。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ応答性細胞は、骨髄、脂肪または筋肉のいずれかに由来する一次間質細胞を含むがこれに限定されない。
【００７８】
細胞は、本発明のアッセイに用いられるときには、通常の細胞生育のために適切なあらゆる密度で生育される。適切な密度を得るために用いられる細胞の数は、部分的にはアッセイに用いられる組織培養皿またはプレートのサイズおよび表面積によって決められる。
【００７９】
アッセイにおいて細胞はあらゆる密度で用いられてもよい。いくつかの実施形態において、細胞はアッセイにおいて以下の細胞密度にて用いられてもよい：少なくとも１０％コンフルエント、少なくとも２５％コンフルエント、少なくとも５０％コンフルエント、少なくとも８０％コンフルエント、少なくとも９０％コンフルエント、または少なくとも９９％コンフルエント。
【００８０】
いくつかの実施形態において、細胞は本発明のアッセイにおいて以下の濃度にて用いられる：少なくとも１×１０３／ｍＬ、少なくとも５×１０３／ｍＬ、少なくとも１×１０４／ｍＬ、少なくとも５×１０４／ｍＬ、少なくとも１×１０５／ｍＬ、少なくとも５×１０５／ｍＬ、少なくとも１×１０６／ｍＬ、少なくとも５×１０６／ｍＬ、または少なくとも１×１０７／ｍＬ。いくつかの実施形態においては、１細胞／サンプルから１０９細胞／サンプルが本発明のアッセイにおいて用いられてもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態において、細胞は細胞系である。いくつかの実施形態において、細胞は対象から単離されてエクスビボで培養された細胞である。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本発明の細胞は哺乳動物または非哺乳動物のものであってもよい。細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスターおよびその他の脊椎動物種を含むがこれらに限定されないあらゆる種のものであってもよい。細胞は、たとえば昆虫細胞などの非脊椎動物種からのものであってもよい。細胞は、たとえばバクテリア細胞などの原核細胞であってもよい。
【００８３】
細胞は、当該技術分野において公知の技術のいずれかに従って培養されてもよい。細胞は、細胞培養に好適なあらゆる培養フラスコ、プレートまたは皿において生育されてもよい。細胞培養に適した培地、補助剤および培養条件は当業者に周知である。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＢＭＰへの露出によって発現が調節され得る内因性初期遺伝子を測定する。内因性遺伝子の転写をモニタすることは、レポーター遺伝子を駆動する短いプロモーター領域を含有する組換え構成物からの発現を測定することよりも、インビボ活性をよりよく反映する。さらに、ＢＭＰ処置の後に初期に遺伝子発現を測定することによって、より高いアッセイ特異性が得られ、かつ血清サンプル中に見出される非ＢＭＰ構成要素の干渉を受けにくくなる。たとえば、いくつかのヒト血清サンプルによって誘導される細胞毒性と、ＢＭＰ応答要素に駆動されるルシフェラーゼレポーターアッセイにおける低いシグナル測定値とは明らかな相関関係がある。これに対して、ＱＰＣＲアッセイの読取は細胞の生存性（毒性）に影響されなかった。
【００８５】
いくつかの実施形態において、ＢＭＰへの露出によって発現が調節され得る内因性遺伝子は、表１に示される遺伝子から選択される遺伝子を含むがこれらに限定されない：
【００８６】
【表１−１】
2010539932.tif 000003
【００８７】
【表１−２】
2010539932.tif 000004
【００８８】
【表１−３】
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【００８９】
【表１−４】
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【００９０】
【表１−５】
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【００９１】
【表１−６】
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【００９２】
【表１−７】
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【００９３】
【表１−８】
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【００９４】
【表１−９】
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【００９５】
【表１−１０】
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いくつかの実施形態において、ＢＭＰへの露出によって発現が調節され得る内因性遺伝子は、初期遺伝子である。いくつかの実施形態において、本発明の内因性初期遺伝子は、ＢＭＰへの露出の際にシグナルプロセス経路の初期段階において発現する遺伝子を含んでもよい。
【００９６】
いくつかの実施形態において、初期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後４８時間以内にその発現が調節される遺伝子である。いくつかの実施形態において、初期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後２４時間以内にその発現が調節される遺伝子である。いくつかの実施形態において、初期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後１８時間以内にその発現が調節される遺伝子である。いくつかの実施形態において、初期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後１２時間以内にその発現が調節される遺伝子である。さらに他の実施形態において、初期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後６時間以内にその発現が調節される遺伝子である。他の実施形態において、初期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後４時間以内にその発現が調節される遺伝子である。他の実施形態において、初期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後２時間以内にその発現が調節される遺伝子である。他の実施形態において、初期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後１時間以内にその発現が調節される遺伝子である。他の実施形態において、初期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後３０分以内にその発現が調節される遺伝子である。
【００９７】
いくつかの実施形態において、内因性初期遺伝子は、Ｉｄ−１、Ｉｄ−２、Ｉｄ−３、Ｉｄ−４、Ｍｓｘ２、Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ３、Ｄｌｘ５、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｓｍａｄ６、Ｓｍａｄ７およびＲｕｎｘ２を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、内因性初期遺伝子はＩｄ−１遺伝子である。転写因子ＩＤ−１は塩基性へリックス−ループ−へリックスタンパク質のドミナントネガティブ阻害物質であり、ＢＭＰの直接的標的である。ＢＭＰはＩＤ−１プロモーターを強力に活性化し、ＩＤタンパク質の異所的発現はＢＭＰに誘導される応答を模倣できる。したがって、Ｉｄ−１遺伝子の活性化はＢＭＰシグナル伝達に対する初期マーカーとして有用であり得る。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ＢＭＰへの露出によって発現が調節され得る内因性遺伝子は、後期遺伝子である。いくつかの実施形態において、後期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後４８時間より後にその発現が調節される遺伝子である。いくつかの実施形態において、後期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後４８時間より後だが７２時間以内にその発現が調節される遺伝子である。いくつかの実施形態において、後期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後４８時間より後だが９６時間以内にその発現が調節される遺伝子である。いくつかの実施形態において、後期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後４８時間より後だが１２０時間以内にその発現が調節される遺伝子である。いくつかの実施形態において、後期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後４８時間より後だが１４４時間以内にその発現が調節される遺伝子である。いくつかの実施形態において、後期遺伝子は、ＢＭＰへの露出後４８時間より後だが１６８時間以内にその発現が調節される遺伝子である。
【００９９】
いくつかの実施形態において、後期遺伝子は、ＨＥＹ１、ＤＩＯ２、ＡＤＡＭＴＳ９、ＨＡＳ３、ＦＧＦＲ３、ＭＦＩ２、ＣＨＩ３Ｌ１、ＮＯＧ、ＢＡＭＢＩ、ＧＲＥＭ１、ＧＲＥＭ２およびＳＯＳＴを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、後期遺伝子は、ＦＧＦＲ３、ＤＩＯ２、ＨＥＹ１、ＨＡＳ３、ＡＤＡＭＴＳ９、およびＭＦＩ２を含むがこれらに限定されない。他の実施形態において、後期遺伝子は、ＮＯＧ、ＢＡＭＢＩ、ＧＲＥＭ１、およびＧＲＥＭ２を含むがこれらに限定されない。
【０１００】
いくつかの実施形態において、遺伝子の発現は、ＢＭＰへの露出によってアップレギュレートされる。他の実施形態において、遺伝子の発現は、ＢＭＰへの露出によってダウンレギュレートされる。
【０１０１】
いくつかの実施形態においては、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）を用いて、サンプル処理された細胞または未処理の細胞中の内因性遺伝子のｃＤＮＡを増幅する。ＱＰＣＲは非常に感度が良い方法のため、目的の遺伝子の転写の非常に小さな変化の検出が可能である。したがって、ＱＰＣＲに基づくアッセイは感度が高く、生物サンプル中に存在する少量の中和抗体の検出に有用であり得る。ＴａｑＭａｎプローブを用いた定量リアルタイムＰＣＲの方法は当該技術分野において周知である。リアルタイム定量ＰＣＲのための詳細なプロトコルは、たとえばＧｉｂｓｏｎら、“Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ”，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１０：９９５−１００１（１９９６）およびＨｅｉｄら、“Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ”，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１０：９８６−９９４（１９９６）などに記載されている。
【０１０２】
いくつかの実施形態においては、本発明のサンプルをプレスクリーニングして、目的のＢＭＰに特異的な抗体が存在するかどうかを決定してから、その抗体が中和抗体かどうかを決定してもよい。本発明のサンプルは、一次中和抗体アッセイで陽性反応を示したものであって、今回中和抗体の存在を確認するアッセイとして本発明のアッセイを受けるものであってもよい。いくつかの実施形態において、サンプルはＥＬＩＳＡアッセイなどのイムノアッセイによってプレスクリーニングされる。他の実施形態において、サンプルは細胞に基づくアッセイ、たとえばレポーター遺伝子の活性化などによってプレスクリーニングされる。レポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子であってもよい。ルシフェラーゼ遺伝子は、ＢＭＰへの露出によって調節され得る遺伝子のプロモーターにつながれてもよい。こうした遺伝子は初期または後期遺伝子であってもよく、Ｉｄ−１、Ｉｄ−２、Ｉｄ−３、Ｉｄ−４、Ｍｓｘ２、Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ３、Ｄｌｘ５、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｓｍａｄ６、Ｓｍａｄ７、Ｒｕｎｘ２、フィブロモジュリン、Ｈｅｙ１およびＳＦＲＰ−２を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、サンプルは細胞に基づくアッセイ、たとえばラット骨肉腫（ＲＯＳ）細胞などにおけるアルカリホスファターゼ活性のモニタリングを伴うアッセイなどによってプレスクリーニングされる。
【０１０３】
本発明のいくつかの実施形態において、アッセイは、同じアッセイプレート上にテストサンプルと対照サンプルとを含有する９６ウェルプレート上で行なわれる。他の実施形態において、アッセイはハイスループットスクリーニングによって行なわれる。
【０１０４】
本明細書において例示のためにのみ提供され、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない以下の実施例によって、本発明の実施がさらにより完全に理解されるであろう。
【実施例】
【０１０５】
（実施例１）
定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）によるヒト血清サンプル中のＯＰ−１に対する中和抗体の検出
１％のＦＢＳを含有する培地（１％のＦＢＳを含有するＦ−１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．＃３０−２００４）中のＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ．＃ＣＣＬ−１８５）を、最適な播種密度で９６ウェル組織培養マイクロタイタープレート上に播き、細胞が単層中でプレートに安定に付着するまで３７℃にてインキュベートした。このステップは細胞型によって数時間から最高２４時間までかかってもよい。Ａ５４９細胞の場合には、細胞は２４時間でプレートに付着する。
【０１０６】
予め決定された有効ＢＭＰ濃度を正常ヒト血清（ＮＨＳ）プールにスパイクしたものからなる正の対照は、９７．５μＬのＮＨＳプールを２．５μＬの２４μｇ／ｍＬのＯＰ−１スパイクと混合することによって調製した。
【０１０７】
ＮＨＳ中の４０μｇ／ｍＬ（「１２Ｇ３／１０００」の抗ＢＭＰ抗体（１２Ｇ３モノクローナル抗体）からなる正の対照は、以下のとおり調製した。１２Ｇ３モノクローナル抗体を、プールされたＮＨＳ中で２００μｇ／ｍＬに希釈した。次いでこの抗体をＮＨＳでさらに希釈して４０μｇ／ｍＬにし、合計体積を９７．５μＬにした。次いで２．５μＬ体積の２４μｇ／ｍＬのＯＰ−１スパイクを混合物に加えた。
【０１０８】
ＮＨＳ中の２０μｇ／ｍＬ「１２Ｇ３／５００」の抗ＢＭＰ抗体（１２Ｇ３モノクローナル抗体）からなる正の対照は、以下のとおり調製した。１２Ｇ３モノクローナル抗体を、プールされたＮＨＳ中で２００μｇ／ｍＬに希釈した。次いでこの抗体をＮＨＳでさらに希釈して２０μｇ／ｍＬにし、合計体積を９７．５μＬにした。次いで２．５μＬ体積の２４μｇ／ｍＬのＯＰ−１スパイクを混合物に加えた。
【０１０９】
サンプルに「有効ＢＭＰ濃度」をスパイクして、細胞刺激の前に最低３０分間プレインキュベートさせた。
【０１１０】
「有効ＢＭＰ濃度」は、１５ｎｇ／ｍＬまたは２５ｎｇ／ｍＬのいずれかのＢＭＰ−７（各々３つずつ行なった）をだんだん増加する濃度の抗ＢＭＰ−７モノクローナル抗体（１２Ｇ３）とともにインキュベートすることによって決定した。２つの濃度に対する相対量（ＲＱ）値（以下により詳細に考察する）を比較して、１５ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＭＰ−７を有効濃度と決定した。
【０１１１】
対照およびサンプルをすべて最小必要希釈度（ＭＲＤ）に希釈して、予めプレート培養された細胞を含有するプレートに最低２つ分を加えた。ＭＲＤは、異なる希釈度（１：１０、１：２０、１：４０、１：８０）の非スパイクＮＨＳプールをテストして、血清を含有しない対照サンプル（Ｎｏ  ＮＨＳ）と類似のバックグラウンドＲＱ値を示すような血清サンプルの最小希釈度を決定することによって決定した。図２に示すとおり、ＭＲＤは１：４０であることが決定された。
【０１１２】
サンプル添加の後、プレートを３７℃にて３時間インキュベートした。３時間というインキュベーション期間は、異なるインキュベーション期間における標的／ハウスキーピング（Ｉｄ−１／ＧＡＰＤＨ）遺伝子発現の比率を比較する研究に基づいて選択された、最適化期間であった。簡単に述べると、細胞をだんだん増加する濃度のＢＭＰ−７とともに１９時間または３時間インキュベートして、標的／ハウスキーピング（Ｉｄ−１／ＧＡＰＤＨ）遺伝子発現の比率に対する影響を決定した。図３に示すとおり、応答曲線に基づいて、最適化期間として３時間のインキュベーション期間を選択した。標的／ハウスキーピング（Ｉｄ−１／ＧＡＰＤＨ）遺伝子発現の比率に対する異なる濃度のＦＢＳを比較する研究に基づいて、アッセイで用いるＦＢＳの濃度も最適化した。簡単に述べると、細胞を１％または５％のＦＢＳ中のだんだん増加する濃度のＢＭＰ−７とともに３時間インキュベートして、標的／ハウスキーピング（Ｉｄ−１／ＧＡＰＤＨ）遺伝子発現の比率に対する影響を決定した。図３に示すとおり、応答曲線に基づいて、最適化条件として１％のＦＢＳを選択した。
【０１１３】
細胞を溶解し、９６ウェルＴｕｒｂｏ  Ｃａｐｔｕｒｅプレート（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてポリＡ＋  ｍＲＮＡを単離した。
【０１１４】
次いで、単離したｍＲＮＡを鋳型として用いて、逆転写反応におけるｃＤＮＡ合成を行なった。まずサンプルを５分間２５℃に調整し、次いで４２℃にて３０分間逆転写反応を行なった。次いでサンプルを８５℃にて５分間インキュベートしてＲＴ酵素を変性させてから４℃に冷却した。
【０１１５】
予め確認した遺伝子特異的なＴａｑＭａｎ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、ＱＰＣＲによって標的（Ｉｄ−１）およびハウスキーピング（ＧＡＰＤＨ）遺伝子発現を測定した。２つの遺伝子の各々に対して各ｃＤＮＡサンプルを３つのウェルで分析し、ｃＤＮＡサンプル当り合計６つのＱＰＣＲ反応および血清サンプル当り１２の反応を行なった。ＰＣＲ反応は、たとえばＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いてＡＢＩ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムなどで行なわれてもよい。デルタデルタＣｔ法（ＬｉｖａｋおよびＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ、２００１）を用いて、標的（Ｉｄ−１）およびハウスキーピング（ＧＡＰＤＨ）遺伝子発現を定量した。簡単に述べると、標的（Ｉｄ−１）およびハウスキーピング（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の両方に対して、遺伝子の増幅が閾値を超えるＰＣＲサイクル（Ｃｔ）を記録した。３つの標的遺伝子反復実験（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）の平均Ｃｔから３つのハウスキーピング遺伝子反復実験の平均Ｃｔを引くことによって、各細胞培養ウェルの平均デルタＣｔを算出した。次いで、各未知試料のデルタＣｔから、ＮＨＳプールにスパイクされたＢＭＰからなる較正物質サンプルのデルタＣｔを引いて、デルタデルタＣｔを得た。各未知試料のデルタデルタＣｔは、較正物質サンプルのデルタデルタＣｔに対して表わされ、これを相対量またはＲＱ値と呼んだ。次いで、処置反復実験からのＲＱ値の平均、標準偏差およびパーセントＣＶを算出して報告した。
【０１１６】
表２に示されるとおり、標的Ｉｄ−１遺伝子およびハウスキーピングＧＡＰＤＨ遺伝子は類似の効率で増幅された。遺伝子発現の正規化のためには標的およびハウスキーピング遺伝子の類似の効率が必要であるため、このことは重要な特徴である。
【０１１７】
【表２】
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ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）もハウスキーピングＧＡＰＤＨ遺伝子の発現に影響しなかった。図４に示されるとおり、テストされた８０個の異なるサンプルにおいて、ＧＡＰＤＨ発現率（非スパイク／ＯＰ−１スパイク）は比較的均一であった。
【０１１８】
（実施例２）
切点の決定
アッセイ確認の際に行なわれた実験からのデータを用いて、アッセイ切点を決定した。この研究からのデータを以下の表３にまとめている。
【０１１９】
【表３】
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１５ｎｇ／ｍｌのＯＰ−１をスパイクした５０個の異なるＮＨＳサンプルをテストすることによって、アッセイ切点を決定した。各サンプルを１回ずつテストすることによって、５０サンプルすべてを同じ組織培養プレート上で評価できるようにした。３枚のこうしたプレート（プレート１、プレート２およびプレート３）を同じ日にセットアップすることによって、アッセイ切点を決定するときにプレート間のばらつきを考慮できるようにした。プールＮＨＳ中の１５ｎｇ／ｍＬのＯＰ−１からなる対照溶液を参照として用いて、デルタデルタＣｔ法を用いて各サンプルに対するＲＱ値を算出した。各プレートにおけるこの対照溶液の４つの反復実験すべてからの平均ＲＱ値を参照として設定した。
【０１２０】
以下の表４に示されるとおり、各プレートに対するＲＱ分布の正規性を評価するために、３つの統計的テスト（ＫＳ，Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ  ＆  Ｐｅａｒｓｏｎ，およびＳｈａｐｉｒｏ  ＆  Ｗｉｌｋ）を行なった。プレート１およびプレート２の場合は、３回のテストすべてがＲＱ分布が正規であることを示した。プレート３については、３回のテストのうち１回のみがＲＱ分布が正規であることを示した。しかし、まとめるとこれらの結果は正規性の傾向を示す。その結果、パラメトリック法を用いてこのアッセイに対する切点を決定した。
【０１２１】
【表４】
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各プレートからのＲＱに対する下側９５％信頼限界（ｌｏｗｅｒ  ９５％  ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｌｉｍｉｔ：９５％ＬＣＬ）を決定した。次いで、この研究における３枚のプレートに対する平均９５％ＬＣＬを算出した。この値は０．９９７であることが見出され、このアッセイに対する切点として指定された。０．９９７以下のＲＱを有するサンプルは、抗ＯＰ−１中和抗体の存在に対して陽性であるとみなした。０．９９７より高いＲＱ値を有するサンプルは陰性であるとみなした。
【０１２２】
（実施例３）
中間精度の確認
個別に調製した６つの１５ｎｇ／ｍｌのＯＰ−１スパイクを、最低１枚のプレート上で３日間テストすることによって中間精度を調べた。６サンプルの各々を、組織培養プレートの２つのウェルにてテストした。デルタデルタＣｔ法を用いてＲＱ値を算出した。プールＮＨＳ中の１５ｎｇ／ｍＬのＯＰ−１からなる対照溶液の４つの反復実験からの平均ＲＱ値を参照として設定した。２つのウェルごとの平均から、平均ＲＱおよびパーセント差異も算出した。
【０１２３】
中間精度の研究からのデータを以下の表５にまとめている。
【０１２４】
【表５】
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２つの処置ウェルの平均からのパーセント差異≦３０％という基準に基づき、中間精度研究で分析した１５ｎｇ／ｍｌのＯＰ−１スパイクはすべて有効であった。
【０１２５】
３日間にわたる有効スパイクすべての平均ＲＱは、１．１３２に等しい。有効スパイクの標準偏差および％ＣＶは、それぞれ０．１１９および１０．４８４に等しい。スパイクに対するＲＱが３０以下の％ＣＶを生じるとき、このアッセイに対する中間精度は許容可能とみなされた。この予め定義された許容基準に基づいて、このアッセイの中間精度は許容可能とみなされた。
【０１２６】
（実施例４）
再現性の確認
個別に調製した６つの１５ｎｇ／ｍｌのＯＰ−１スパイクを、１日に３枚のプレート上でテストし、テストを１人の分析者が行なうことによって、アッセイ内の精度を調べた。６サンプルの各々を、組織培養プレートの２つのウェルにてテストした。デルタデルタＣｔ法を用いてＲＱ値を算出した。プールＮＨＳ中の１５ｎｇ／ｍＬのＯＰ−１からなる対照溶液の４つの反復実験からの平均ＲＱ値を参照として設定した。２つのウェルごとの平均から、平均ＲＱおよびパーセント差異も算出した。
【０１２７】
中間精度の研究からのデータを以下の表６にまとめている。
【０１２８】
【表６】
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２つの処置ウェルの平均からのパーセント差異≦３０％という基準に基づき、アッセイ内精度研究で分析した１５ｎｇ／ｍｌのＯＰ−１スパイクはすべて有効であった。
【０１２９】
３枚のプレートの有効スパイクすべての平均ＲＱは１．０１７に等しい。有効スパイクの標準偏差および％ＣＶは、それぞれ０．１１０および１０．７６７に等しい。各有効スパイクの平均ＲＱが、各別個のプレート上のすべての有効スパイクに対する平均ＲＱの±３０％以内であるとき、このアッセイに対するアッセイ内精度は許容可能とされた。この予め定義された許容基準に基づいて、アッセイ内精度は許容可能とみなされた。
【０１３０】
（実施例５）
感度の確認
検出限界パラメータによって、このアッセイにおいて測定可能な中和影響をもたらす最低の抗ＯＰ−１抗体濃度を確認した。４つの異なる１２Ｇ３抗体濃度（７５、１５０、２５０および５００ｎｇ／ｍｌ）とともにＯＰ−１スパイク（１５ｎｇ／ｍｌ）をプレインキュベートすることによって、検出限界（感度）を調べた。各１２Ｇ３濃度について、１日で３枚のプレートにわたるプレート当り６つのＮＨＳサンプルにおいて評価した。上記に考察した他のパラメータについては、これらのサンプルを２つのウェルにてテストした。デルタデルタＣｔ法を用いてＲＱ値を算出した。プールＮＨＳ中の１５ｎｇ／ｍＬのＯＰ−１からなる対照溶液の４つの反復実験からの平均ＲＱ値を参照として設定した。２つのウェルごとの平均から、平均ＲＱおよびパーセント差異も算出した。
【０１３１】
検出限界（感度）の研究からのデータを以下の表７にまとめている。
【０１３２】
【表７】
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検出限界（感度）に対する結果は、プレート有効性に対する許容基準を満たす。
【０１３３】
この研究においては４つの濃度の１２Ｇ３を評価した。それらは７５ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ／ｍｌであった。２つの処置ウェルの平均からのパーセント差異≦３０％という基準に基づき、検出限界（感度）研究で分析した１２Ｇ３スパイクはすべて有効であった。有効スパイクすべてがプレート特異的切点より下の平均ＲＱ値を有するとき、検出限界（感度）は許容可能である。このアッセイに対する切点は０．９９７のＲＱ値と決定された。表７に示されるとおり、１日における３枚のプレートの５００ｎｇ／ｍｌの１２Ｇ３スパイクすべての平均ＲＱは＜０．９９７である。他の３つの１２Ｇ３濃度（７５、１５０および２５０ｎｇ／ｍｌ）は、このパラメータに対する許容基準を満たさなかった（表７において、切点（すなわち０．９９７）よりも高い平均ＲＱを有する特定の反復実験を下線で示す）。
【０１３４】
この予め定義された許容基準に基づいて、このアッセイの許容可能な検出限界（感度）は５００ｎｇ／ｍｌである。
【０１３５】
（実施例６）
定量ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現分析
初代のヒト骨髄由来間充織幹細胞（ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｈＭＳＣ）、ならびに間充織幹細胞増殖培地（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＭＳＣＧＭ）および骨形成分化培地（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＯＤＭ）を含むｈＭＳＣ培養培地は、Ｌｏｎｚａ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。細胞をインビトロで展開し、最初の解凍から５継代以内に実験に用いた。ＯＤＭ中でＢＭＰ−７処置を適用した。ＯＤＭは、提供されたアスコルビン酸およびベータグリセロリン酸の補助剤を用いて、ただしデキサメタゾンは除いて、製造者の指示に従って調製した。ＭＳＣＧＭおよびＯＤＭ中のＦＢＳの濃度は約１０％だった。ＢＭＰ−７をＯＤＭ中で示される濃度に希釈した。
【０１３６】
初代ｈＭＳＣをＴ−７５組織培養フラスコ中で１ｃｍ２当り１．５×１０４細胞で播種した。２４時間後に細胞をＯＤＭ単独で、または４０ｎｇ／ｍｌもしくは４００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−７を含有するＯＤＭで処置した。ＢＭＰ−７処置後のさまざまな時点（１、２、３、４、５、６および７日）の後に細胞を採取し、ＲＴ−ＱＰＣＲ分析のために処理した。
【０１３７】
対照（すなわちＯＤＭ単独）およびＢＭＰ−７処置したヒト間充織幹細胞（ｈＭＳＣ）からのＲＮＡを、ＴｕｒｂｏＣａｐｔｕｒｅ  ９６  ｍＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造者のプロトコルに従って単離した。２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの  ＭｇＣｌ２、５００μＭの各ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および５ｎｇ／μｌのＲａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含有する緩衝液において、４０ユニットのＭ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて逆転写反応を行なった。逆転写反応は２３℃にて１０分間、４２℃にて５０分間行なわれ、その後に８５℃にて５分間の不活性化ステップが行なわれた。遺伝子発現分析のためのすべての試薬および計測手段は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から得られた。定量ＰＣＲは、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍおよび予め設計されたＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓを用いて、製造者の仕様書に従って行なった。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの推奨手順に従って、相対定量の標準曲線法を用いて、ＧＡＰＤＨ、ＨＥＹ１、ＤＩＯ２、ＡＤＡＭＴＳ９、ＨＡＳ３、ＦＧＦＲ３、ＭＦＩ２、ＣＨＩ３Ｌ１、ＮＯＧ（Ｎｏｇｇｉｎ）、ＢＡＭＢＩ、ＧＲＥＭ１、ＧＲＥＭ２およびＳＯＳＴ遺伝子の発現を測定した。
【０１３８】
ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）は、ｈＭＳＣにおいてＦＧＦＲ３、ＤＩＯ２、ＨＥＹ１、ＨＡＳ３、ＡＤＡＭＴＳ９およびＭＦＩ２遺伝子を強力にアップレギュレートした。ＱＰＣＲによって、ＢＭＰ−７処理後のこれらの遺伝子の発現の調節を確認した。６つの遺伝子はすべて、７日間にわたってＢＭＰ−７処理されたｈＭＳＣにおいて用量応答性の発現増加を示し、その最大アップレギュレーションは約５８０倍（ＦＧＦＲ３）、４９０倍（ＤＩＯ２）、２５０倍（ＨＥＹ１）、１６０倍（ＡＤＡＭＴＳ９）、１１０倍（ＨＡＳ３）および４０倍（ＭＦＩ２）であった。これらの遺伝子に対して極端な大きさのアップレギュレーションが観察されたことから、これらの遺伝子がＢＭＰ７の媒介する造骨細胞の分化において重要な役割を果たしている可能性が示唆される。図５を参照。
【０１３９】
ＢＭＰ−７は、ヒト間充織幹細胞においてＢＭＰ阻害物質であるＮｏｇｇｉｎ、ＢＡＭＢＩ、ＧＲＥＭ１およびＧＲＥＭ２遺伝子の発現も顕著にアップレギュレートした。図６を参照。
【０１４０】
ＢＭＰ−７は、ヒト間充織幹細胞においてＣＨＩ３Ｌ１（軟骨糖タンパク質３９／ＹＫＬ−４０／キチナーゼ３様１）遺伝子の発現をダウンレギュレートした。ＱＰＣＲによって、ＢＭＰ−７処理によるこの遺伝子の発現の調節を確認した。ＣＨＩ３Ｌ１は、７日間にわたってＢＭＰ−７処理されたｈＭＳＣにおいて用量依存性の態様で連続的にダウンレギュレートされ、より高用量のＢＭＰ−７において未処理細胞に比べて最大２４倍のダウンレギュレーションが観察された。図７を参照。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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