(57)【要約】  フロー・サイトメータ内の複数の検査ポイントから発生したパルスを、フロー・サイトメータ内を流れる特定の粒子に相関付けるための方法、記憶媒体、及びシステムを提供する。この方法、記憶媒体、及びシステムの実施形態は、一意の識別特性を有する較正用粒子を使用してフロー・サイトメータを較正し、フロー・サイトメータ内を流れる粒子の飛行時間を求めるための構成を含む。計算した飛行時間及びフロー・サイトメータのコレクタに対応する検査領域の相対位置に基づいて、この方法、記憶媒体、及びシステムは、他の信号パルスを１又はそれ以上の別の粒子セットの粒子に関連付けるための構成を含むことができる。【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子流路と、
前記粒子流路の複数の異なる検査ポイントに光を向けるように構成された照明システムと、
前記検査ポイントを含む検査領域から光を集めるようにそれぞれが構成され、集めた一定の光を表す信号を生成するようにさらに構成された複数のコレクタと、
プロセッサ及びプログラム命令を含む試験システムと、
を含み、前記プログラム命令は前記プロセッサにより、
前記信号を受信し、
少なくとも２つのコレクタの受信信号を特定の粒子セットに関連する所定の信号範囲と比較し、
前記所定の信号範囲内にそれぞれ収まる信号パルスの検出時に前記特定の粒子セットの粒子を識別し、
前記粒子の飛行時間を計算し、
前記コレクタの各々から受信した、前記計算した飛行時間及び前記コレクタに対応するそれぞれの検査ポイントの相対位置に基づいて異なる時点で発生する他の信号パルスを特定し、
前記他の信号パルスを異なる粒子セットの粒子に関連付ける、
ように実行可能である、
ことを特徴とするフロー・サイトメータ。
【請求項３】
前記試験システムが前記プロセッサにより、前記関連する信号パルスに基づいて前記異なる粒子セットの前記粒子の特性を判定するように実行可能なプログラム命令をさらに含む、
ことを特徴とする請求項１に記載のフロー・サイトメータ。
【請求項４】
前記試験システムが前記プロセッサより、前記特定の粒子セットの粒子の識別時に、別のコレクタから受信したデータ信号が事前設定した信号範囲内であることを識別するように実行可能なプログラム命令をさらに含み、前記他のコレクタから受信した前記信号パルスが、前記計算した飛行時間及び前記２つのコレクタに対応する検査ポイントの位置に対する前記他のコレクタに対応する前記検査ポイントの位置に基づいてある時点に存在する、
ことを特徴とする請求項１に記載のフロー・サイトメータ。
【請求項５】
前記複数の及び異なる検査ポイント間の距離が既知であり、前記試験システムが前記プロセッサにより、前記粒子の速度を求めるように実行可能なプログラム命令をさらに含む、
ことを特徴とする請求項１に記載のフロー・サイトメータ。
【請求項６】
前記複数の及び異なる検査ポイントが、前記粒子流路に沿って均等に間隔を空ける、
ことを特徴とする請求項１に記載のフロー・サイトメータ。
【請求項７】
前記複数の及び異なる検査ポイントが、前記粒子流路に沿って不均等に分布する、
ことを特徴とする請求項１に記載のフロー・サイトメータ。
【請求項８】
前記２つのコレクタに対応する前記２つの検査ポイントが、前記粒子流路に沿って連続的に配置される、
ことを特徴とする請求項１に記載のフロー・サイトメータ。
【請求項９】
少なくとも１つの検査ポイントが、前記２つのコレクタに対応する前記２つの検査ポイント間に存在する、
ことを特徴とする請求項１に記載のフロー・サイトメータ。
【請求項１０】
フロー・サイトメータ内の複数の検査領域から発生するパルスを特定の粒子に相関付ける方法であって、
一意の識別特性を有する較正用粒子を使用して前記フロー・サイトメータを較正し、前記フロー・サイトメータ内を流れる粒子の飛行時間を求めるステップと、
第１のコレクタのチャネル上のパルスを、前記較正用粒子とは異なる前記サイトメータ内を流れる特定の粒子に割り当てるステップと、
前記飛行時間及び前記第１及び第２のコレクタに対応する前記フロー・サイトメータの検査ポイント間の間隔に基づいてある時点で発生する異なる第２のコレクタのチャネル上のパルスを識別するステップと、
前記第２のコレクタの前記チャネル上の前記パルスを前記特定の粒子に割り当てるステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記飛行時間及び前記第１、第２、及び１又はそれ以上のコレクタに対応する検査ポイントの間隔に基づいて複数の時点で発生する１又はそれ以上の他のコレクタのチャネル上のパルスを識別するステップと、
前記１又はそれ以上の他のコレクタの前記チャネル上の前記パルスを前記特定の粒子に割り当てるステップと、
をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記割り当てたパルスに基づいて前記粒子の一定の特性を判定するステップをさらに含む、
ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記フロー・サイトメータを較正するステップが、前記フロー・サイトメータ内の既知の場所の２又はそれ以上の検査ポイントにおいて前記較正用粒子を検査するステップを含む、
ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記フロー・サイトメータを較正するステップが、
前記２又はそれ以上の検査ポイントに対して上流に位置する別の検査ポイントにおいて前記較正用粒子を検査するステップと、
前記他の検査ポイントに関連する前記信号を記憶するステップと、
前記２又はそれ以上の検査ポイントにおいて前記較正用粒子を検査するステップの後に、前記記憶した信号を参照して前記較正用粒子の前記識別を確認するステップと、
をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記フロー・サイトメータを較正するステップの前に、複数の較正用粒子を含む多重アッセイを前記フロー・サイトメータに流すステップをさらに含み、前記多重アッセイは、前記フロー・サイトメータの検査区画に沿って流れる前記粒子の間隔が、前記検査区画内の少なくとも一部の検査ポイント間の分離距離以下となるのに十分な粒子の濃度を含む、
ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記較正用粒子の一意の識別特性が、前記フロー・サイトメータ内を流れる他の粒子のセットのための対応するチャネルに対して設定された信号範囲よりも高い閾値信号値を含む、
ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１及び第２のコレクタの前記チャネル上の前記パルスを前記特定の粒子に割り当てるステップの後に、前記フロー・サイトメータ内を流れる異なる較正用粒子を使用して前記フロー・サイトメータを再較正するステップをさらに含み、前記フロー・サイトメータを再較正するステップが、その後前記フロー・サイトメータ内を流れる粒子の新たな飛行時間を計算するステップを含む、
ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
プログラム命令を含む記憶媒体であって、該プログラム命令はプロセッサにより、
粒子がフロー・サイトメータ内を流れるときに、前記粒子の測定可能パラメータに対応するデータ信号をモニタし、
前記フロー・サイトメータの異なるコレクタから発生する、特定の粒子セットの所定の範囲内にそれぞれ収まる値を有する２つのデータ信号を検出し、
前記２つの検出したデータ信号間の時間差を計算し、
前記２つのデータ信号の検出及び該２つのデータ信号の計算した時間差に基づいて、異なる所定の範囲内のデータ信号が別のコレクタにおいて発生すると見込まれる時点を計算し、
その後、
前記他のコレクタから収集された前記データ信号が前記異なる所定の範囲内にあると判断されたときに、前記特定の粒子セットの粒子が識別されていることを検証するステップと、
前記他のコレクタから収集された前記データ信号が前記異なる所定の範囲内にないと判断されたときに、前記特定の粒子セットの粒子を表すものとして前記２つの検出したデータ信号を拒絶するステップと、
を含む２つの最終的動作の一方を実行する、
ことを特徴とする記憶媒体。
【請求項１９】
前記データ信号が、散乱信号、レポートタグ信号、蛍光信号、磁気信号、及び電磁共鳴信号を含む群から選択される、
ことを特徴とする請求項１８に記載の記憶媒体。
【請求項２０】
前記２つのデータ信号が各々蛍光信号である、
ことを特徴とする請求項１８に記載の記憶媒体。
【請求項２１】
前記他のコレクタから収集された前記データ信号が散乱信号である、
ことを特徴とする請求項１８に記載の記憶媒体。
【請求項２２】
前記プログラム命令が前記プロセッサにより、
前記特定の粒子セットの粒子が識別されたことを検証すると、前記異なるコレクタから受信した、前記粒子の飛行時間及び前記異なるコレクタに対応するそれぞれの検査ポイントの相対位置に基づいて異なる時点で発生した他の信号パルスを検出し、
前記他の信号パルスを複数の異なる粒子セットに関連付け、
前記関連付けられた信号パルスに基づいて前記異なる粒子セットの前記粒子の特性を判定する、
ようにさらに実行可能である、
ことを特徴とする請求項１８に記載の記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にフロー・サイトメトリ・システム、記憶媒体、及び方法に関し、さらにフロー・サイトメータ内を流れる粒子を検査して識別するためのシステム、記憶媒体、及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、フロー・サイトメータは、照射したビーズ又は粒子がフロー・チャンバを直線的に通過する際の蛍光強度の測定を行う。２又はそれ以上の蛍光の測定を使用して、粒子を特定の粒子サブセットに分類することができる。また、「レポータ」として知られているその他の蛍光測定を使用して関心物の化学反応を数値化し、アッセイ中の検体の有無を判断することができる。蛍光測定の各々は異なる波長で行われる。場合によっては、フロー・サイトメータを使用して、以下に限定されるわけではないが、粒子により散乱した光のレベル及び／又は粒子の電気インピーダンスなどの１又はそれ以上の他の粒子特性をさらに測定することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
多くの従来のフロー・サイトメトリ測定システムは、流体流の方向に沿って約３０μｍ〜１００μｍ離れた２つの物理的な場所で粒子を検査する。第１の検査ポイントでは、粒子が、通常「ＤＤ」、「ＣＬ１」、及び「ＣＬ２」と呼ばれる３つのチャネル上で同時に検出されるその散乱及び蛍光で照射される。次に、ミクロスフィアに結合できるレポータ・タグを照明によって励起する第２のポイントで同じ粒子が検査される。このレポータ蛍光は、通常「ＲＰ１」と呼ばれるチャネル上で検出されるが、他の対照を使用することもできる。このような従来のフロー・サイトメータでは、粒子間隔は、フロー・セルの内部で約４００μｍ〜１，０００μｍあると推定されてきた。粒子間隔が検査ポイント間の距離の何倍にものぼる場合、２つの粒子が２つのポイントで同時に検査される見込みはほとんどない。従って、一般には２つの検査ポイントで連続的に収集された測定値が同じ粒子に割り当てられる。しかしながら、システム及び／又は技術は、異なる検査ポイントで複数の粒子を同時検査できる見込みが高いところで使用されるので、フロー・サイトメータ内の異なる検査ポイントで発生するパルスを正確に相関付けることが課題となる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
フロー・サイトメータ内の複数の検査領域から発生したパルスを、フロー・サイトメータ内を流れる特定の粒子に相関付けるための方法、記憶媒体、及びシステムの様々な実施形態についての以下の説明は、添付の特許請求の範囲の主題を限定するものと決して解釈すべきではない。
【０００５】
方法、記憶媒体、及びシステムの実施形態は、一意の識別特性を有する較正用粒子を使用して、フロー・サイトメータ内を流れる粒子の飛行時間を求めるようにフロー・サイトメータを較正するための構成を含む。計算した飛行時間及びフロー・サイトメータのコレクタに対応する検査ポイントの相対位置に基づいて、方法、記憶媒体、及びシステムは、１又はそれ以上の異なる粒子セットの粒子に他の信号パルスを関連付けるための構成をさらに含むことができる。
【０００６】
以下の詳細な説明を読んだときに、及び添付の図面を参照したときに、本発明のその他の目的及び利点が明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】フロー・サイトメータの概略図である。
【図２】図１に示すフロー・サイトメータのための例示的な試験システムの概略図である。
【図３】フロー・サイトメータの検査区画の一部の中の構成部品の概略図である。
【図４】フロー・サイトメータの検査区画の一部の中の構成部品の代替構成の概略図である。
【図５】フロー・サイトメータの検出システムのチャネルＤＤ、ＣＬ１、及びＣＬ２から発生する波形をプロットしたグラフである。
【図６】飛行時間較正用粒子閾値を重ね合わせた図５と同様の波形グラフである。
【図７】ＤＤチャネルの高低信号閾値を表示した図５と同様の波形グラフである。
【図８】個々のチャネル上のパルスを共通粒子に割り当てた図５と同様の波形グラフである。
【図９】フロー・サイトメータ内の複数の検査領域から発生した信号パルスを、アッセイ内の異なる粒子サブセットの粒子に相関付けるための処理のフロー図である。
【図１０】フロー・サイトメータ内を流れる粒子の飛行時間を求めるようにフロー・サイトメータを較正するための処理のフロー図である。
【図１１】フロー・サイトメータの異なる検査ポイントで発生したパルスを相関付けるための処理のフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は様々な修正及び代替形態が可能であるが、本発明の特定の実施形態を例示により図面に示し、本明細書で詳細に説明する。しかしながら、図面及びこれに対する詳細な説明は、開示する特定の形態に本発明を限定することを意図するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲により定めるような本発明の思想及び範囲内にある全ての修正、同等物及び代替手段を含むことを意図するものであると理解すべきである。
【０００９】
図面を参照すると、フロー・サイトメータ内の複数の検査領域から発生したパルスを、フロー・サイトメータ内を流れる特定の粒子に相関付けるための例示的な方法、記憶媒体、及びシステムを示している。具体的には、図１は例示的なフロー・サイトメータの概略図を示している。詳細には、図１は、フロー・システム１２と、照明システム１４と、検出システム１６と、制御装置１８とを含むフロー・サイトメータ１０を示している。一般にフロー・システム１２は、粒子の少なくとも一部を個別に検査できるように、数多くの粒子を有する流体を輸送するように構成されるとともにサンプルに焦点を合わせるようにさらに構成されたシステムを含むことができる。より具体的には、フロー・システム１２を、内部を粒子の大部分が連続的に流れるようにする粒子流路を形成するシース流体を介して流体力学的にアッセイに焦点を合わせるように構成することができる。一般に、このような粒子流路の全体又は一部は、粒子を検査するための複数の検査領域を配置できる検査区画として機能することができる。本明細書で説明する方法、記憶媒体、及びシステムは、粒子を連続的に検査するあらゆるフロー・システムに適用でき、「フロー・サイトメータ」という用語は全てのこのようなシステムを含むことを意図している。また、本明細書で説明する方法、記憶媒体、及びシステムは、関心物の１又はそれ以上の検体の有無の判定を望まれるあらゆる種類のアッセイ、具体的にはあらゆる生物学的、化学的、又は環境的アッセイを分析するためのフロー・サイトメータに適用することができる。
【００１０】
本明細書では、「粒子」という用語は、一般にミクロスフィア、ポリスチレン・ビーズ、量子ドット、ナノドット、ナノ粒子、ナノシェル、ビーズ、マイクロビーズ、微小粒子、ラテックス粒子、ラテックス・ビーズ、蛍光ビーズ、蛍光粒子、着色粒子、着色ビーズ、組織、細胞、微生物、有機物、非有機物、又は当業で公知のその他のあらゆる離散基質又は物質を意味するために使用する。本明細書では、このような用語はいずれも同義的に使用することができる。場合によっては、粒子は、蛍光物質、磁気物質、電磁共鳴物質、及び放射性物質などの識別に役立つ物質を含むことができる。本明細書で説明する方法及びシステムに使用できる例示的な粒子として、テキサス州オースチンのルミネックス・コーポレーションから商業的に入手できるｘＭＡＰ（登録商標）ミクロスフィアが挙げられる。一般に、本明細書で言及する粒子は、分子反応のための溶剤として機能することができる。
【００１１】
一般に、照明システム１４は、フロー・システム１２により形成される粒子流路の複数の及び異なる検査ポイントの方へ光を向けるように構成される。検査ポイントの数は、２以上のいずれかの複数の検査領域であってよい。以下でより詳細に説明するように、場合によっては、少なくとも３つの検査ポイントを有することが有利となり得るが、本明細書で説明するシステム及び方法はこのように限定されるものではない。いくつかの実施形態では、図４に関連して以下で説明するように、測定する粒子の個々の異なるパラメータごとに異なる検査ポイントを使用することができる。しかしながら、他の実施形態では、図３に示す例に関連して以下で説明するように、１つの検査ポイントで２以上のパラメータを測定することもできる。いずれにせよ、検査ポイント間の距離は、一定の既知の値又はこれらの検査ポイントの相対間隔（すなわち検出器間の同等間隔又は比例間隔）の推測のいずれかによって分かる。このようにして較正用粒子の飛行時間を求め、その後これを適用して、複数の検査領域から発生したパルスを他の粒子サブセットの特定の粒子に相関付けることができる。
【００１２】
一般に、照明システム１４は、単一の光源、或いは同じ種類の光源又は異なる種類の光源からなる複数の光源を含むあらゆる数の光源を含むことができる。いくつかの実施形態では、図３及び図４に示すとともに以下でより詳細に説明する例示的なシステムに示すように、照明システム１４が、個々の検査ポイントごとに異なる光源を含むことができる。このような事例では、フロー・サイトメータの粒子流路の方向へ光を直接投影するように光源を配置できるため、必ずしも照明システム１４が、流路に光を向けるためのビームスプリッタ及び反射鏡を含むとは限らない。このような構成は、フロー・サイトメータのサイズを最小化するために、及び／又はフロー・サイトメータの設計を簡略化するために有利となり得る。他の実施形態では、個々の検査ポイントごとに異なる光源を有する照明システムにビームスプリッタ及び反射鏡を含めることができる。さらに他の事例では、照明システム１４が、光源が光を向けるように構成された検査ポイントの数よりも少ない数の光源を含むことができる。このような実施形態では、照明システム１４は、単一の光源から複数の検査ポイントへ光を向けるためにビームスプリッタを、及び場合によっては反射鏡を含むことができる。従って、図１に示すフロー・サイトメータ１０並びに図３及び図４に示す例示的な構成は、フロー・システム１２及び粒子流路４０にそれぞれ実質的に法線の入射角で光を向けるように示しているが、その他のあらゆる好適な入射角で光を向けるように照明システム１４を構成できると理解すべきである。
【００１３】
いずれにせよ、照明システム１４の（単複の）光源として、以下に限定されるわけではないが、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザ、アーク灯、ファイバー照明器、電球、及び白熱灯などの当業で公知のあらゆる適当な（単複の）光源を挙げることができる。また、いくつかの実施形態では、照明システム１４は、以下に限定されるわけではないが、ビームスプリッタ、反射鏡、視準レンズ、スペクトルフィルタ、減光フィルタ、偏光部品、拡散器、及び／又はホモゲナイザなどの、光源以外の光学部品を含むことができる。場合によっては、粒子に向けられる光が、単色、近単色、多色、又は広帯域となるように、照明システム１４を（青色光及び緑色光などの）異なる光の波長又は波長帯域で粒子を連続して照明するように構成することができる。さらに、フロー・サイトメータ１０内に照明システム１４を含めることは任意であり、一般にはフロー・サイトメータ１０を蛍光放射の検出に使用するかどうか次第とすることができる点に留意されたい。詳細には、いくつかの実施形態では、フロー・サイトメータ１０を使用して化学発光反応を生じさせ、この結果得られるルミネセンス発光を測定することができ、また場合によっては、フロー・サイトメータ１０を使用して蛍光放射を生じさせ測定することができない。このような事例では、照明システム１４をオフにし、又はフロー・サイトメータ１０から省くことができる。
【００１４】
図１に示すように、フロー・サイトメータ１０は検出システム１６を含むことができる。一般に、検出システム１６は、フロー・システム１２の検査区画の検査領域を通過する粒子から放出され及び／又は散乱する光を収集するように構成することができる。より具体的には、検出システム１６は、検査領域から光を集めるように構成されるとともにある程度の集めた光を表す信号を生成するようにさらに構成された複数のコレクタを含むことができる。特に、コレクタの出力電流はこのコレクタに作用する光に比例し、この結果電流パルスが生じる。電流パルスを電圧パルスに変換し、低域フィルタリングし、その後アナログ／デジタル・コンバータによりデジタル化してデータ信号を生み出すことができる。集めた光に応じて、データ信号は、散乱信号、レポート・タグ信号、蛍光信号、磁気信号、及び／又は電磁共鳴信号になり得る。検出システム１６のコレクタの機能を検査ポイントではなく検査領域から集めた光に関連して説明している点に留意されたい。本明細書で使用する「検査ポイント」という用語は、光源が向けられて照らされる粒子流路に沿ったポイントを意味する。本明細書で使用する「検査領域」という用語は、光を集めることができる元である検査ポイントを囲む領域を意味する。一般的には、検査領域の面積は、ほとんどの場合使用するコレクタの構成によって決まり得る。
【００１５】
一般に、検出システム１６は、測定する粒子の個々の異なるパラメータごとに異なるコレクタを含むことができる。コレクタは、以下に限定されるわけではないが、アバランシェ光ダイオード（ＡＰＤ）、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）を含むあらゆる種類の光検出器を含むことができる。また、コレクタは、集められる光の種類に応じて同じ種類のもの又は異なる種類のものであってもよい。場合によっては、検出システム１６は、フィルタ、鏡、及び／又はレンズを含むことができる。いくつかの実施形態では、図４に示すとともに以下でより詳細に説明する例示的なシステムに示すように、検出システム１６のコレクタを１つの検査区画の異なる検査領域から光を集めるように構成することができる。このような事例では、検査領域から直接光を集めるようにコレクタを配置できるため、検出システム１６が、異なるコレクタに光を集めるために必ずしもビームスプリッタ及び反射鏡を含むとは限らない。このような構成は、フロー・サイトメータのサイズを最小化するために、及び／又はフロー・サイトメータの設計を簡略化するために有利となり得る。他の実施形態では、個々の異なる検査領域ごとにコレクタを有する検出システムにビームスプリッタ及び反射鏡を含めることができる。
【００１６】
他の事例では、図３に示すとともに以下でより詳細に説明する例示的なシステムに示すように、検出システム１６のコレクタの一部を同じ検査領域から光を集めるように構成することができる。このような実施形態では、検出システム１６は、検査領域から複数のコレクタへ光を向けるためにビームスプリッタ、及び場合によっては反射鏡を含むことができる。このような追加要素は、図面を簡略化するために図３には示していないため、省かれていると解釈すべきではない。従って、図１に示すフロー・サイトメータ１０並びに図３及び図４に示す例示的な構成は、それぞれ実質的に法線の入射角で光を集めるように示しているが、その他のあらゆる好適な角度で光を集めるように検出システム１６を構成できると理解すべきである。
【００１７】
図１にさらに示すように、フロー・サイトメータ１０は、検出システム１６に動作可能に結合された試験システム１８を含むことができる。一般に、サンプル内の検体の種類及び／又は量を解明できるように、試験システム１８を、検出システムのコレクタから発生した信号を受信し、モニタし、評価するように構成することができる。いくつかの実施形態では、試験システム１８は、フロー・サイトメータ１０の動作を自動化するように構成された制御システムの一部であってもよい。このような事例では、試験システム１８をさらにフロー・システム１２及び照明システム１４に動作可能に結合することができる。他の実施形態では、試験システム１８をこのような制御システムから分離することができる。いずれにせよ、試験システム１８は、図９〜図１１にまとめたフロー図並びに図５〜図８に示すグラフで説明する処理のいずれかを実行するための、プロセッサ及びこのプロセッサが実行可能なプログラム命令を含むことができる。試験システム１８の例示的な構成の概略図を図２に示す。このような構成は例示に過ぎず、従って他の構成も検討できる点に留意されたい。
【００１８】
図２に示すように、試験システム１８は記憶媒体２０及びプロセッサ２４を含む。試験システム１８は、パーソナル・コンピュータ・システム、メインフレーム・コンピュータ・システム、ワークステーション、ネットワーク・アプライアンス、インターネット・アプライアンス、携帯情報端末（ＰＤＡ）、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、又はその他の装置を含む様々な形を取ることができる。いずれにせよ、記憶媒体２０は、出力２８を生成及び送信するためのプロセッサ２４を使用して実行可能できるプログラム命令２２２４を含む。以下でより詳細に説明するように、試験システム１８は、入力２８（すなわち検出システム１６のコレクタから発生する信号）を受信して、プロセッサ２４を通じてプログラム命令２２を起動し、及び／又はプログラム命令２２が処理するデータを提供するように構成される。図２には示していないが、記憶媒体２０は、以下で概説する処理を実行するためにプログラム命令２２がアクセスできるデータベース及び／又は参照テーブルを含むことができる。例示的なデータベース及び／又は参照テーブルは、例えば所定の信号範囲及び／又は閾値を含むことができ、これらを使用して、検出システム１６から受信した信号との比較を行うことができる。他の実施形態では、このような所定の信号範囲及び／又は閾値をプログラム命令２２に含めることができるので、データベース及び／又は参照テーブルを記憶媒体２０から省くことができる。
【００１９】
一般に、本明細書で使用する「記憶媒体」という用語は、以下に限定されるわけではないが、読み出し専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、磁気又は光ディスク、或いは磁気テープなどの、１又はそれ以上のプログラム命令セットを保持するように構成されたあらゆる電子媒体を意味することができる。一般に、「プログラム命令」という用語は、以下でより詳細に説明するように、フロー・サイトメータ内の複数の検査領域から発生したパルスを、フロー・サイトメータ内を流れる特定の粒子に相関付けるような特定の機能を実行するように構成されたプログラム内のコマンドを意味することができる。プルグラム命令は、特に手順に基づく技術、構成部品に基づく技術、及び／又はオブジェクト指向技術を含む様々な方法のうちのいずれかの方法で実装することができる。例えば、必要に応じて「アクティブＸ」制御、Ｃ＋＋オブジェクト、Ｊａｖａ（登録商標）Ｂｅａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｃｌａｓｓｅｓ（「ＭＦＣ」）、又はその他の技術又は方法論を使用してプログラム命令を実装することができる。上述したように、一般にプログラム命令２４は、図５９〜図１１に示すフロー図にまとめた処理を実行するように構成することができる。従って、図９〜図１１に示すフロー図は、ソフトウェアモジュールの使用を通じて実行する方法を一般的に説明するものである。より具体的には、図９〜図１１に関連して説明する方法は、１又はそれ以上のアルゴリズムの使用を通じて比較的大量のデータを分析して計算するステップを含み、従ってコンピュータを通じて最良に実施することができる。このため、図９〜図１１を参照しながら説明する方法を「コンピュータ実施方法」と呼ぶことができる。
【００２０】
図３及び図４は、本明細書で説明する方法及びシステムを検討できるフロー・サイトメータの例示的な検査区画の一部を示している。詳細には、図３及び図４は、照明システムの光源及び検出システムの収集装置の位置をフロー・サイトメータの粒子流路に関して示すフロー・サイトメータの例示的な部分の概略図を示している。なお、図３及び図４の説明図は例示であり、本明細書で説明する方法及びシステムを検討するフロー・サイトメータの構成を限定するものであると解釈すべきではない。むしろ、図３及び図４は、フロー・サイトメータの構成部品のいくつかの考えられる配置を説明するとともに、さらに図５〜図１２を参照しながら説明する処理ステップを説明する上で役立つように使用しているに過ぎない。
【００２１】
図３に示すように、いくつかの実施形態では、照明システム１４が、粒子流路４０の検査領域４１及び４２内の２つの異なる検査ポイントに向けられた２つの光源、すなわち光源３０及び３２を含むことができる。検査領域４１及び４２の受光端上に、コレクタセット５０及びコレクタ５２がそれぞれ存在する。図３に示すように、コレクタセット５０は、チャネルＤＤ、ＣＬ１、及びＣＬ２の各々につき１つの、３つのコレクタを含む。このようにして、図３に示す粒子６０などの単一の通過粒子から放出される散乱及び蛍光を同時に検出することができる。場合によっては、このようなチャネルを使用して粒子６０を特定の粒子セットに分類することができる。その後、（図３に「ＲＰ１」として示す）レポータ・タグチャネルを含むことができるコレクタ５２が光を収集できるように、粒子６０が検査領域４２を通って流れるようになる。一般的には、レポータ・タグ・チャネルを使用して、通過粒子上の検体の量を検出及び／又は数値化することができる。
【００２２】
上述したように、検査領域４１及び４２の検査ポイントは光源３０及び３２からの光の入射により決定されるため、図３に示すように、領域の検査ポイント間の隔たりを間隔Ｘで示す。一般的には、図３に示す間隔Ｘの距離及び粒子の隔たりは、異なる検査ポイントにおける同時検査ができそうにないぐらいのものである。詳細には、検査ポイントが互いに非常に近い（例えば約３０μｍ〜１００μｍ）ので、通過する流体内の粒子間隔（例えば約４００μｍ〜１，０００μｍの粒子間隔）の方が間隔Ｘよりもはるかに大きく、複数の検査ポイントにおける同時粒子検査の可能性が低くなる。上述したように、従来のフロー・サイトメータではこのような検査区画の構成がよく見られる。しかしながら、アッセイ内でより高い粒子濃度の必要性が続くにつれて、このような構成も最終的には通過する流体内の粒子間隔が間隔Ｘ以下になるというシナリオに陥り、異なる検査ポイントにおける同時粒子検査の可能性を高めることができる点に留意されたい。特に、通過する流体内の粒子間隔は、いずれ将来の近い時点で約１００μｍ未満に減少すると考えられる。従って、本明細書で説明する方法及びシステムを、図３で説明するフロー・サイトメータの構成、並びに他のあらゆるフロー・サイトメータの構成に適用できることが企図される。
【００２３】
図４は、フロー・サイトメータの検査区画の代替の実施形態を示している。詳細には、図４は、粒子流路４４の検査領域４５〜４８という異なる検査ポイントに向けられた光源３４、３６、３８、及び３２を含む照明システム１４を示している。検査領域４５〜４８の受光端上に、コレクタ５４、５６、５８、及び５２がそれぞれ存在する。より具体的には、検査領域４５は、光源３４とチャネルＤＤを含むコレクタ５４とに関連付けられる。検査領域４６は、光源３６とチャネルＣＬ１を含むコレクタ５６とに関連付けられ、検査領域４７は、光源３８とチャネルＣＬ２を含むコレクタ５８とに関連付けられる。同様に、検査領域４８は、光源３２とチャネルＲＰ１を含む関連コレクタ５２とに関連付けられる。図３とは対照的に、図４は、粒子間隔が（図４に間隔Ｙとして示す）検査ポイントの間隔以下であり、異なる検査ポイントにおける同時粒子検査の可能性が高いフロー・サイトメータの検査区画の一部を示している。図４の例示的な実施形態では、領域４５、４６、及び４７で同時検査が行われている。検査ポイント間隔に対して粒子の間隔が狭いことは、ビーズの間隔が狭いことや、ビーズの数が多いことや、或いは検査ポイントの間隔が広いことなどの様々な条件に起因することができる。上述したように、本明細書で説明する方法及びシステムの範囲から逸脱することなく、検査ポイントの数、間隔、及び励起源を変更することができる。
【００２４】
図５は、図４の３つの検査窓４５〜４７に関連するＤＤ、ＣＬ１、及びＣＬ２上の仮想波形を示している。図５で分かるように、３つのチャネル間に複数の同時波形パルスが存在する。検査区画内を流れる粒子を分類するためには、いずれのパルスが所与の粒子のものであるかを知らなければならない。本明細書で説明する方法及びシステムは、１）既知の検査ポイントの場所、２）飛行時間計算のために一意的に識別可能な粒子、及び３）検出アルゴリズム、を用いた処理を使用して粒子をパルスに相関付ける。以下、このような処理を使用する例について、図４〜図８に関連して説明する。その後、図９〜図１１に示すフロー図について、より完全な処理の範囲を描写しながら説明する。
【００２５】
一般に、本明細書で説明する方法及びシステムは、少なくとも２つのチャネル上の「較正」粒子に関連する一意の信号を識別することにより機能する。これらの一意の信号として、以下に限定されるわけではないが、サイズに起因する一意の散乱信号、一意のレポータ・タグ信号、染料に起因する１又はそれ以上の一意の信号、一意の磁気特性、一意の電磁共鳴、又は放射能を挙げることができる。図４〜図７に関連して以下に示す例は２つの連続チャネルを利用するが、既知の間隔のあらゆるチャネルが動作する。いくつかの実施形態では、比較的大きな間隔のチャネルを使用することが有利となり得る。特に、間隔が大きい方が、粒子の飛行時間を計算する上での誤差許容が大きくなる。従って、いくつかの実施形態では、較正用粒子を識別するために検査区画のいずれかの端部上のチャネルを使用することが望ましいと思われる。
【００２６】
一般的に、較正用粒子サブセットは、アッセイ内のその他の粒子サブセットとは異なる一意の信号値の範囲を有することができる。いくつかの実施形態では、較正用粒子サブセットは、アッセイ内の他の全ての粒子サブセットよりも高い信号の形の一意の信号を有することができる。図６はこのような実施形態を示している。詳細には、図６は、較正用粒子識別閾値６０及び６２をチャネルＣＬ１及びＣＬ２に関してそれぞれ示す図５からの波形を示している。較正用粒子の検出には１又はそれ以上の代替の又は追加のチャネルを使用することができるので、本明細書で説明する方法及びシステムを図６に関連して説明する例に限定すべきではない点に留意されたい。特に、本明細書で説明する実施形態は、異なる粒子の集団を区別するのに使用できる粒子のあらゆる測定可能なパラメータを使用できることを理解すべきである。
【００２７】
図６に示すように、ＣＬ１及びＣＬ２上の識別閾値を横切るパルスピークの時間軸上の場所に、それぞれＴ1及びＴ2としてマークを付けている。ｄｔで示すこのようなパルス間の時間差は、
ｄｔ＝Ｔ2−Ｔ1
により求めることができる。
ＣＬ１及びＣＬ２上の閾値交差信号は、粒子の粒団によるものであった可能性がある。従って、いくつかの実施形態では、単一の較正用粒子が実際に識別されたことを検証することが有利となり得る。この疑問に答えるために、許容限界の範囲内にある信号を求めてＤＤチャネルを観察することができる。ＤＤチャネルは、粒子からの散乱において単一の粒子が発見されたか、又は複数の粒子の粒団が発見されたかを判定する試験を行う。図４〜図７に関連して説明する実施形態では、ＤＤチャネルがＣＬ１の上流に及びこれに隣接して位置する。このような事例では、粒子に対応するＤＤチャネル信号の位置Ｔ0は、
Ｔ0＝Ｔ1−ｄｔ
により求めることができる。
しかしながら、このような計算は、（ＣＬ１及びＣＬ２などの）較正用粒子の検出に使用するチャネルに対するＤＤチャネルの位置によって変化する場合があることに留意されたい。
【００２８】
図７は、ＤＤ信号のレベル境界６４及び６６、並びにＤＤ、ＣＬ１、及びＣＬ２チャネル上のパルスピークＴ0、Ｔ1、及びＴ2の識別をそれぞれ示す図５からの波形である。図７に示すように、Ｔ0におけるＤＤチャネルパルスが許容限界の範囲内にあり、すなわち境界６４と６６の間にあるので、飛行時間較正用粒子の検出が確認されたことになる。ここで、図８に示すようにＤＤ、ＣＬ１、及びＣＬ２信号から粒子を抽出することができる。図８では、参照番号７０で示すように、第１の粒子がチャネルＤＤ、ＣＬ１、及びＣＬ２上の一連の連続信号パルスに関連付けられる。第２の粒子は、チャネル上の異なる一連のパルスに関連付けられるとともに参照番号７２で示され、第３の粒子は、チャネル上のさらに別の一連のパルスに関連付けられるとともに参照番号７４で示される。このような一連の信号パルスの各々は、フロー・サイトメータを通過する較正用粒子のために予め計算した飛行時間と、チャネルＤＤ、ＣＬ１、及びＣＬ２を有するそれぞれの収集装置に関連する検査ポイントの相対位置とに従うものである。図示の実施形態では、較正用粒子信号が飛行時間の計算処理を引き起こす前にＴ0の時点が発生することになるので、処理にはＤＤチャネル信号を保護することが必要とされる。
【００２９】
多くの場合、フロー・サイトメータを通る粒子速度は、頻繁な再較正を正当化するのに十分なほど変化すると考えられる。このような事例では、飛行時間較正が（１秒間に何回ものように）所定の時間に何回も行われることを確実にするために、飛行時間較正用粒子を他の粒子に対して十分な量でサンプルに混合して、粒子速度におけるあらゆる摂動が考慮されることを確実にする。新たな飛行時間較正用粒子が検出された場合、ｄｔが新たな値及び新たな値で識別されたその後のミクロスフィアで再計算され更新される。
【００３０】
本明細書で説明する方法及びシステムが使用できる処理のより完全な範囲をまとめたフロー図を図９〜図１１に示す。詳細には、図９は、較正用粒子の飛行時間を検出して求めるために、並びにその後、計算した飛行時間及びフロー・サイトメータ内の検査ポイントの相対位置に基づいて信号パルスを特定して割り当てるために使用する一般的処理を示している。図１０は、較正処理の実行に使用できる例示的な命令セットを示している。図１１は、図１０に関連して説明する較正処理に基づいて、複数の検査領域から発生するパルスを特定の粒子に相関付けるために使用できる例示的な命令セットを示している。本明細書で説明する方法及びシステムは、図９〜図１１に関連して説明する処理に必ずしも限定されるわけではない点に留意されたい。具体的には、いくつかの実施形態では、処理が、フロー図に示していない追加ステップを含むことができる。また、後述するように、図９〜図１１に関連して説明する処理の１又はそれ以上を任意とすることができるため、いくつかの実施形態ではこれらを省くことができる。
【００３１】
図９のブロック８０に示すように、本明細書で説明する方法及びシステムは、フロー・サイトメータの複数のコレクタからデータ信号を受信するように構成することができる。また、ブロック８２に示すように、本明細書で説明する方法及びシステムは、少なくとも２つのコレクタの受信信号を特定の粒子セット（すなわち較正用粒子セット）に関連する所定の信号範囲と比較するように構成することができる。場合によっては、較正用粒子を検出するためのパラメータに関連しない信号は、基本的にこの時点で無視することができる。より具体的には、この信号をモニタする必要はなく、ましてやメモリに記憶する必要はない。このようなシナリオは、フロー・サイトメータ用の試験システムの処理要件及び／又はメモリ要件を低減させる上で役立つことができる。他の実施形態では、較正用粒子を検出するためのパラメータに関連しない信号をモニタ及び／又は記憶することもできる。
【００３２】
いずれにせよ、図９のブロック８４及び８６においてそれぞれ示すように、較正用粒子セットに関連する所定の信号範囲内にそれぞれ収まる信号パルスを検出すると、これらの２つの検出信号に対応する粒子の飛行時間が計算される。本明細書で使用する場合、「飛行時間」という用語は、一般にフロー・サイトメータの２つの検査ポイント間などの既知の距離を粒子が移動するのにかかる時間を意味することができる。いくつかの実施形態では、飛行時間が、２つの検出器から受信した信号パルス間の時間差しか含まない場合がある。このような事例では、検出器に対応する検査ポイント間の既知の距離が、フロー・サイトメータの全ての検出器間の等間隔、或いはフロー・サイトメータの検出器間の既知の比例間隔のいずれかによって推測される。後者の実施形態では、「既知の比例間隔」は、一般に互いに比例する連続して配置された検査ポイント間の距離を意味することができる。例えば、図４を参照すると、コレクタ５８と５２との間の間隔が距離Ｙで示されている。粒子流路４４全体を通じて等間隔を置くのではなく、コレクタ５４及び５６の間隔を相対距離Ｙだけ比例的に空けることができる。例えば、コレクタ５６は、コレクタ５８から距離１／２Ｙの間隔を空けることができ、コレクタ５４は、コレクタ５６から距離２Ｙの間隔を空けることができる。その他の比例距離を検討することもできるので、本明細書で説明する方法及びシステムは前述の例には限定されない。
【００３３】
さらに他の事例では、飛行時間が粒子の速度を含むことができる。このような実施形態では、検出器の各々の間の距離が同じであるか又は異なるかにかかわらず、検出器の各々の間の距離は既知の固定値となる。粒子の速度を計算することは、（必ずしも以下に限定されるわけではないが）フロー・サイトメータの検査区画全体を通じて検査ポイントが均等に分布していない場合、及び／又は問題の検査ポイントがフロー・サイトメータの検査区画内に連続して配置されていない場合に特に適用可能となり得る。
【００３４】
場合によっては、ブロック８４における信号パルスの検出は、２つの検出信号に対応する粒子を特定の粒子セットの粒子として具体的に識別するステップを含むことができる。このような事例では、ブロック８８〜９４に概説するように、方法は、粒子が実際に特定の粒子セットの一部であるかどうかを判定するというルートと、このような処理をスキップし、方法を直接ブロック９６及び９８へ誘導して他の信号パルスを異なる粒子セットの粒子に割り当てるというルートの２つのルートのうちの一方に従うことができる。図９は、後者の実施形態を代替選択肢として示す点線をブロック８６と９６との間に含む。両選択肢を考慮すると、ブロック８２〜８６に概説する処理及びブロック８２〜９４に概説する処理は各々、一意の識別特性を有する較正用粒子を使用してフロー・サイトメータを較正し、フロー・サイトメータ内を流れる粒子の飛行時間を求めるステップと呼ぶことができる。以下、個々の選択肢を選択する利点についてより詳細に説明する。
【００３５】
粒子のアッセイ内での凝集しやすさにより、ブロック８４に関連して検出される２つの信号は、較正用粒子セットの単一の粒子ではなく粒子の粒団に起因するものである可能性がある。フロー・サイトメータ内の粒子の流量及びフロー・サイトメータの検査ポイント間の分離距離次第では、粒子の粒団と単一の粒子との間の速度差はかなり類似する可能性があり、従って複数の検査領域から発生するパルスを特定の粒子に相関付けるために、粒子の粒団の飛行時間を適用できるということが仮定される。従って、いくつかの実施形態では、較正用粒子が検出されたか、或いは粒子の粒団が検出されたかにかかわらず、方法は直接ブロック９６及び９８へ進み、異なる粒子セットの粒子に他の信号粒子を割り当てることができる。このような選択肢は、別のコレクタにおける検出を検証するという余計なステップ（以下でブロック８８〜９４に関連してより詳細に説明する処理）を回避できるため、本明細書で説明する方法及びシステムのためのプログラム命令を簡略化することができる。
【００３６】
他の実施形態では（一般には、相対的に高い流量の粒子及び／又はより狭い分離間隔の検査ポイントを使用する場合）、粒子の粒団と単一の粒子との間の速度差が大きく異なる可能性があることも理論化される。このような事例では、粒子の粒団から不正確な飛行時間が計算される恐れがあり、これから得られる粒子の相関付けが適さない可能性がある。従って、いくつかの実施形態では、ブロック８４に関連して検出された２つの信号が、実際に信号較正用粒子であるかどうかどうかを検証することが有利となり得る。このような事例では、図９にまとめた処理はブロック８８へ進み、ブロック８６に関連して説明した２つのデータ信号の検出及び計算した飛行時間に基づいて、別のコレクタにおいて異なる所定の範囲内のデータ信号の発生が予期される時点を計算する。具体的には、計算した飛行時間及び２つのコレクタに対応する検査ポイントの位置に対する他のコレクタに対応する検査ポイントの位置に基づいて時間が計算される。このような時間計算は、較正用粒子を識別するために使用する２又はそれ以上の検査ポイントに対して上流又は下流のいずれかに位置する検査ポイントに関するものであってもよい。上流に位置する検査ポイントに関して時間を計算する場合、本明細書で説明する方法及びシステムは、他の検査ポイントに関連する信号を記憶し、その後２又はそれ以上の検査ポイントにおいて較正用粒子を検査した後に記憶した信号を基準として較正用粒子の識別を確認するように構成することができる。
【００３７】
いずれにせよ、検証処理に使用するコレクタは、単一の粒子と粒子の塊とを区別する信号を生成するように構成されたあらゆるチャネルを含むことができる。散乱光は一般に物質のサイズを示すので、（ＤＤチャネルなどの）分析中の物質から散乱した光に基づいて信号を生成するように構成されたコレクタは実行可能な選択肢である。図９のブロック９０に示すように、他のコレクタからのデータ信号が事前設定した信号範囲内に収まるかどうかに関して判定が行われる。ブロック９２に示すように、他のコレクタから収集されたデータ信号が別の事前設定した範囲内にないと判定されると、２つの検出したデータ信号が、特定の粒子セットの粒子（すなわち較正用粒子）を表すものとして拒絶され、処理はブロック８２へ戻り、受信データ信号を特定の粒子セットに関連する所定の信号範囲と比較し続ける。この一方、他のコレクタから収集されたデータ信号が別の事前設定した範囲内にあると判定されると、ブロック９４に示すように、特定の粒子セットの一部であるとして粒子の識別が検証される。
【００３８】
図１０は、フロー・サイトメータを較正し、特に較正用粒子を識別し、較正用粒子の飛行時間を計算し、及び較正用粒子が粒子の塊ではなく単一の粒子であることを検証するための例示的なフロー図を示す。図１０は例示的なものであるため、図９のブロック８０〜８４に概説する処理を実行する他の方法も使用できる点に留意されたい。例えば、図１０は、特に粒子の飛行時間を計算するために時間差（ｄｔ）の計算を必要とする。一方これとは別に、上述したように飛行時間の計算は粒子の速度を計算するステップを含むことができる。同様に、或いはこれとは別に、上述の説明に基づいて、図１０に示す命令の他の変形形態を使用することもできる。図１０に示すように、較正処理は、ｄｔ＿ｃａｌｃ＿ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを読み取るブロック１００を含む。このような処理を図９のブロック８２に相関付けた場合、「ｄｔ＿ｃａｌｃ＿ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」というパラメータは、フロー・サイトメータの較正に使用する２又はそれ以上のチャネルに特有の較正セットに関連する所定の信号範囲を意味する。図１０にまとめた実施形態では、（チャネル１及びチャネル２と呼ぶ）２つのチャネルから得られる信号が、ｄｔ＿ｃａｌｃ＿ｔｈｒｅｓｈｏｌｄの値と比較される。
【００３９】
図１０のブロック１０２及び１０４に示すように、チャネル１からの信号が読み取られ、このチャネルのｄｔ＿ｃａｌｃ＿ｔｈｒｅｓｈｏｌｄと比較される。チャネル１からの信号が、このチャネルのｄｔ＿ｃａｌｃ＿ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ未満である場合、処理はブロック１０２へ戻り、チャネル１からの信号をモニタし続ける。この一方、チャネル１からの信号が、このチャネルのｄｔ＿ｃａｌｃ＿ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ以上である場合、処理はブロック１０６へ進み、信号のタイミング（すなわち現在の時刻ｔ）を変数Ｔ1に割り当てる。その後、ブロック１０８及びブロック１１０において最小時間遅延（ｍｉｎ＿ｄｅｌａｙ）が読み取られ、現在の時間ｔがＴ1＋最小時間遅延以上であるかどうかに関して判定が行われる。一般に、最小時間遅延は、フロー・サイトメータを通る流体の予想流量及び検査ポイントの間隔に基づいて検査ポイント間で生じると見込まれる最小時間を表す。このような遅延の考慮は、検査ポイント間で連続して流れている可能性がある、誤った飛行時間の計算につながり得る異なる較正用粒子の検出を防ぐ上で役立つ。図１０に示すように、現在の時間ｔがＴ1＋最小時間遅延以上でない場合、そう判定されるまで処理はブロック１１０へ戻る。
【００４０】
その後、ブロック１１２において、チャネル２から発生する信号が読み取られる。チャネル１の場合のブロック１０４及び１０６と同様に、チャネル２から発生した信号がブロック１１２及び１１４においてそれぞれ読み取られ、このチャネルのｄｔ＿ｃａｌｃ＿ｔｈｒｅｓｈｏｌｄと比較される。チャネル２からの信号がこのチャネルのｄｔ＿ｃａｌｃ＿ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ未満である場合、処理はブロック１１２へ戻ってチャネル２からの信号をモニタし続ける。この一方、チャネル２からの信号がこのチャネルのｄｔ＿ｃａｌｃ＿ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ以上である場合、処理はブロック１１６へ進んで信号のタイミング（すなわち現在の時刻ｔ）を変数Ｔ2に割り当てる。その後、ブロック１１８において、信号のタイミング間の時間差（ｄｔ）が生成される。次に、ブロック１２０において、Ｔ1からこの時間差を減じることにより、チャネル１から同じ距離だけ間隔を空けた別のコレクタ（すなわちチャネル０）において異なる所定の範囲内のデータ信号が生成されると見込まれる時間（Ｔ0）が計算される。ブロック１２２に示すように、時間（Ｔ0）にチャネル０において発生する信号が読み取られる。ブロック１２４において、チャネル０において発生する信号が有効であるかどうか（すなわち、チャネル０の較正用粒子セットの所定の信号範囲内に収まるかどうか）に関して判定が行われる。信号が有効でないと判断されると、処理はブロック１０２に戻って再びフロー・サイトメータを較正しようと試みる。反対に、「チャンネル」０において発生する信号が、飛行時間較正用粒子を確認する許容限度内にある場合、ブロック１２６に示すように変数ｄｔ＿ｖａｌｉｄが１に設定される。ｄｔが計算され有効値を有する場合、ｄｔ＿ｖａｌｉｄは１の「ブール」変数となり、一方でｄｔがまだ計算されていない場合、ｄｔ＿ｖａｌｉｄは０となる。明確にするために、図１０並びに図１１のフロー図で使用する定数、変数、及び処理については以下でさらに定義する。
【００４１】
図９を参照すると、較正用粒子の識別がブロック８６〜９４を通じて検証されるかどうか、或いは処理がブロック８６からブロック９６へ直接進むかどうかにかかわらず、本明細書で説明する方法及びシステムは、ブロック９６に示すようにコレクタの各々から受信した、計算した飛行時間及びコレクタに対応するそれぞれの検査ポイントの相対位置に基づいて異なる時点で発生する他の信号パルスを特定するように構成することができる。その後、ブロック９８に示すように、他の信号パルスが異なる粒子セットの粒子に関連付けられる。上記とは別に、このような一連の処理は、第１のコレクタのチャネル上のパルスを特定の粒子に割り当て、飛行時間及び第１及び第２のコレクタに対応するフロー・サイトメータの検査ポイント間の間隔に基づいてある時点で発生する別の第２のコレクタのチャネル上のパルスを識別し、この第２のコレクタのチャネル上のパルスを特定の粒子に割り当てるものであると説明することができる。また、この方法及びシステムは、飛行時間及び第１の、第２の、及び１又はそれ以上のコレクタに対応する検査ポイントの間隔に基づいて複数の時点で発生する１又はそれ以上の他のコレクタのチャネル上のパルスを識別するステップと、この１又はそれ以上の他のコレクタのチャネル上のパルスを特定の粒子に割り当てるステップとをさらに含むことができる。図９に示すように、処理をさらにブロック９６へ戻して、コレクタから受信した他の信号パルスを識別し、このようなパルスを粒子に割り当てることができる。また、この方法は、ブロック９９へ進み、関連する信号パルスに基づいて粒子の特性を判定することもできる。
【００４２】
上述したように、多くの場合、フロー・サイトメータを通る粒子速度は、頻繁な再較正を正当化するのに十分なほど変化すると考えられる。従って、ブロック９８及び８２を接続する矢印で示すように、方法は、関連する信号パルスを特定の粒子に割り当てるステップの後に、フロー・サイトメータ内を流れる異なる較正用粒子を使用してフロー・サイトメータを再較正するステップを含むことができる。較正用粒子セットの所定の信号範囲内にそれぞれ収まる２つの信号パルスを検出することによって較正用粒子を検出した際に、このような再較正処理を自動的に開始できる点に留意されたい。このような検出の前に、他のいくつかの信号パルスセットを識別して粒子に割り当てることができる。換言すれば、較正用粒子が検出されるまでブロック９６〜９９に概説する処理を反復的に繰り返すことができる。
【００４３】
図１１は、計算した粒子の飛行時間及び検査ポイントの間隔に基づいて、複数の検査ポイントから発生するパルスを特定の粒子に相関付けるための例示的なフロー図を示している。図１１は例示的なものであるため、図９のブロック９６及び９８に概説する処理を実行する他の方法も使用できる点に留意されたい。例えば具体的には、図１１は、異なる検査ポイントにおいて発生するパルスを相関付けるために同じ時間差（ｄｔ）を使用することを必要とし、従って均等に間隔を空けた検査領域を有するフロー・サイトメータ構成を前提としている。一方これとは別に、上述したように、検査ポイントが検査区画内で不均等に分布することもでき、従ってパルスを相関付けるために使用する時間差が検査ポイント間で異なってもよい。同様に又はこれとは別に、上述の説明に基づいて、図１１に示す命令の他の変形形態を使用することもできる。図１１のブロック１３０に示すように、処理は、図１０にまとめた処理により設定された「ブール」変数ｄｔ＿ｖａｌｉｄを読み取るステップを含むことができる。ブロック１３２において、ｄｔ＿ｖａｌｉｄが１に等しいかどうかに関して判定が行われ、そうでなければ処理はブロック１３４へ進み、図１０に関連して説明した処理のようなｄｔ計算処理を実行する。
【００４４】
ｄｔ＿ｖａｌｉｄが１に等しいと判定されると、処理はブロック１３６へ進み、ここで有効な単一のパルス（すなわち、試験中のアッセイ内の粒子のサブセットのいずれかからの粒子がチャネル０に対応する検査ポイントに存在することを示す最小閾値よりも高いパルス）が検出される。その後、現在の時刻ｔがＴ0＋ｄｔ（すなわちチャネル０において信号が検出された時間と、フロー・サイトメータ内を流れる較正用粒子の飛行時間の計算のために計算した時間差とを加えたもの）に等しくなるようにブロック１３８において時間遅延が発生する。時間遅延の後、ブロック１４０に示すように、チャネル１における信号が読み取られる。ブロック１４２において、チャネル１において読み取られた信号に関して２つの判定が行われる。具体的には、信号がｄｔ＿ｃａｌｃ＿ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（すなわちチャネル１に特有の較正用粒子セットに関連する所定の信号範囲）以上であるかどうか、或いは、信号が「ｍｉｎ＿ｄｅｔｅｃｔ」（すなわち試験中のアッセイ内の粒子のサブセットのいずれかからの少なくとも１つの粒子がチャネル１に対応する検査ポイントに存在することを示す最小閾値）未満であるかどうかの判定が行われる。
【００４５】
いずれの判定が行われても、処理はブロック１３４へ戻ってｄｔ計算処理を実行し、新たな較正用粒子の飛行時間及び対応するｄｔを設定して、複数の検査ポイントにおけるパルスを１つの粒子に相関付けることができる。詳細には、チャネル１から発生した信号が「ｄｔ＿ｃａｌｃ＿ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」以上である場合、このような信号は較正用粒子又は粒子の粒団を示すものである可能性があり、従ってこのような信号の検出に基づいて、フロー・サイトメータの再較正が望ましいものとなり得る。反対に、チャネル１から発生した信号がｍｉｎ＿ｄｅｔｅｃｔ未満である場合、このような信号は、フロー・サイトメータ内の粒子の飛行時間が、検査区画を通過する最も新しい較正用粒子に関して求めた飛行時間と比べて変更されていることを示すものである可能性があり、従ってフロー・サイトメータの再較正が望ましいものとなり得る。ブロック１４２に示すいずれかのシナリオを検出した後に、処理をブロック１３４へ戻してフロー・サイトメータを再較正するのではなく、いくつかの実施形態では、方法がブロック１３６へ戻り、チャネル０上の有効な信号を検出するサブ処理を開始できる点に留意されたい。詳細には、ブロック１４２に示すシナリオの一方が検出される度にフロー・サイトメータを再較正しないようにすることが望ましいものとなり得る。いくつかの実施形態では、ブロック１４２に示すシナリオの検出に基づいて処理の経路を選択することができる。
【００４６】
いずれにせよ、ブロック１４２においていずれのシナリオも検出されない場合、処理はブロック１４６へ進み、ブロック１４４によって特定された時間遅延の後にチャネル２において発生する信号を読み取ることができる。ブロック１４８及び１５０に示すように、フロー・サイトメータ内の検査ポイントの数であるｎ回だけこのような処理を繰り返すことができる。場合によっては、ブロック１４２に関して説明したように、チャネルの１又はそれ以上において信号を読み取った後に判定ブロックを処理に組み入れて、信号がｍｉｎ＿ｄｅｔｅｃｔ以上であるかどうかをそれぞれのチャネルに関して判定することができる。信号がｍｉｎ＿ｄｅｔｅｃｔ未満である場合、このような信号は、フロー・サイトメータ内の粒子の飛行時間が、検査区画を通過する最も新しい較正用粒子に関して求めた飛行時間に比べて変更されていることを示すものである可能性があり、従ってこのようなポイントではフロー・サイトメータの再較正が望ましいものとなり得る。図面を簡略化するために、図１１にはこのような追加処理は示していないが、ブロック１４６と１４８との間の３つの接続点線によりこのような包含を暗示することができる。明確にするために、図１１並びに図１０のフロー図で使用する定数、変数、及び処理については以下でさらに定義する。
【００４７】
本開示を利用できる当業者であれば、本発明が、フロー・サイトメータ内の複数の検査領域から発生するパルスを、フロー・サイトメータ内を流れる特定の粒子に相関付けるための方法、記憶媒体、及びシステムを提供するものであると考えられることを理解できよう。本説明に照らして、当業者には本発明の様々な態様のさらなる修正及び代替実施形態が明らかであろう。従って、本説明は例示にすぎないと解釈すべきであり、当業者に本発明を実施する一般的な態様を教示することを目的とするものである。本明細書で図示し説明した本発明の形態は、現在のところ好ましい実施形態と受け取るべきであることを理解されたい。要素及び材料は、本明細書で図示し説明したものと置き換えることができ、部品及び処理は反転させることができ、本発明のいくつかの特徴は個別に利用することができ、全ては本発明の説明を利用した後に当業者に明らかとなるであろう。以下の特許請求の範囲に記載するように、本明細書で説明した要素は、本発明の思想及び範囲から逸脱することなく変更することができる。
【００４８】
変数及び定数の定義
図１０及び図１１のフロー図で使用する変数及び定数は以下の通りである。
Ｃｈａｎｎｅｌ０：これは「ＤＤ」の一般名である。
Ｃｈａｎｎｅｌ１：これは「ＣＬ１」の一般名である。
Ｃｈａｎｎｅｌ２：これは「ＣＬ２」の一般名である。
Ｃｈａｎｎｅｌｎ：これは、検出チャネルの数が限定されていないことを示す一般名である。
Ｃｈａｎｎｅｌ０＿ｓｉｇｎａｌ：これは、チャネル０上の信号の振幅を割り当てた変数である。
Ｃｈａｎｎｅｌ１＿ｓｉｇｎａｌ：これは、チャネル１上の信号の振幅を割り当てた変数である。
Ｃｈａｎｎｅｌ２＿ｓｉｇｎａｌ：これは、チャネル２上の信号の振幅を割り当てた変数である。
ｍｉｎ＿ｄｅｌａｙ：これは連続するチャネルパルス間の最小遅延を含む定数である。この定数を使用することにより、検査ポイント間を連続して流れている可能性のある異なる較正用粒子の検出が防がれる。
ｄｔ：検査ポイント間におけるミクロスフィアの移動時間であり、従って連続チャネル上のパルス間の時間である。
ｄｔ＿ｖａｌｉｄ：ブール変数であり、１の場合はｄｔが「ｄｔ＿ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ」処理で判定されたことを意味し、０の場合はｄｔが未知の値を含み信用すべきでないことを意味する。
ｄｔ＿ｃａｌｃ＿ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：これは、Ｃｈａｎｎｅｌ１＿ｓｉｇｎａｌとＣｈａｎｎｅｌ２＿ｓｉｇｎａｌとが交差する必要がある閾値を較正用ミクロスフィアを考慮するように設定する定数である。
ｍｉｎ＿ｄｅｔｅｃｔ：試験中のアッセイ内の粒子のサブセットのいずれかから得られる少なくとも１つの粒子が検査ポイントに存在することを示す最低閾値である。
ｔ：実行時間の指標を含む変数である。
Ｔ0：Ｃｈａｎｎｅｌ０＿ｓｉｇｎａｌがいつ下限閾値を超えたかを示す時間指標を含む変数である。
Ｔ1：「ｄｔ＿ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ」処理で使用するチャネル１のピークを示す時間指標を含む変数である。
Ｔ2：「ｄｔ＿ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ」処理で使用するチャネル２のピークを示す時間指標を含む変数である。
【００４９】
処理の定義
ここに挙げるのは、図１０及び図１１のフロー図で使用する処理である。
ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ＿ｐｅａｋ＿ｄｅｔｅｃｔ：複数のチャネル上の信号パルスを相関付けてミクロスフィア検出イベントを発生させる処理である。
ｄｔ＿ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ：ｄｔを計算してｄｔ＿ｖａｌｉｄを１に設定するサブ処理である。
Ｃｈａｎｎｅｌ０＿ｐｅａｋ＿ｄｅｔｅｃｔ：チャネル０上の有効な信号パルスを発見するサブ処理である。
Ｃｈａｎｎｅｌ１＿ｄｅｔｅｃｔ：チャネル１上の信号を読み取るサブ処理である。
Ｃｈａｎｎｅｌ２＿ｄｅｔｅｃｔ：チャネル２上の信号を読み取るサブ処理である。
Ｃｈａｎｎｅｌｎ＿ｄｅｔｅｃｔ：チャネルｎ上の信号を読み取るサブ処理である。
【符号の説明】
【００５０】
１０  フロー・サイトメータ；  １２  フロー・システム；  
１４  照明システム；  １６  検出システム；  １８  試験システム１８；  
２０  記憶媒体；  ２２  プログラム命令；  ２４  プロセッサ；  
２８  出力；  ３０，３２，３４，３６，３８，３２  光源；  
４０，４４  粒子流路；  ４１，４２， ４５，４６，４７，４８ 検査領域；  
５０  コレクタセット；  ５２，５４，５６，５８，５２  コレクタ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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