(57)【要約】  本発明はＭＭＰ−９の調節剤に関連し、より具体的には、そのＯＧドメインに対して標的化される調節剤に関連する。本発明により、メタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）の活性を調節する方法が開示される。この方法は、ＭＭＰ−９を、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと特異的に相互作用する作用因子と接触させることを含む。ＯＧドメインと特異的に相互作用することができる分子、その分子を特定する方法、その分子を含む医薬組成物、およびその使用もまた開示される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）の活性を調節する方法であって、ＭＭＰ−９を、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと特異的に相互作用する作用因子と接触させ、それにより、ＭＭＰ−９の活性を調節することを含む方法。
【請求項２】
前記ＭＭＰ−９は天然ＭＭＰ−９である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記活性はコラーゲン溶解活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記活性はゼラチン溶解活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
調節することは、アップレギュレーションすることである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
調節することは、ダウンレギュレーションすることである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記作用因子はポリペプチド作用因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチド作用因子は抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記作用因子は小分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＭＭＰ−９を特異的に調節することができる作用因子を特定する方法であって、推定上のＭＭＰ−９特異的調節剤である作用因子がＭＭＰ−９のＯＧドメインと相互作用することができるかどうかを明らかにすることを含む方法。
【請求項１１】
前記明らかにすることが、作用因子の構造をＭＭＰ−９のＯＧドメインの構造と比較することによって行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記明らかにすることが、前記作用因子をＭＭＰ−９の単離されたＯＧドメインと接触させることによって行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記作用因子はポリペプチドを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドは抗体を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記作用因子は小分子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
ＭＭＰ−９媒介の医学的状態を治療する方法であって、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと特異的に相互作用する作用因子の治療有効量をその必要性のある対象に投与し、それによりＭＭＰ−９媒介の医学的状態を治療することを含む方法。
【請求項１７】
前記作用因子が、請求項７に記載されるように特定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記作用因子は小分子またはポリペプチド作用因子を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチド作用因子は抗体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＭＰ−９の活性を特異的に調節することのできる分子であって、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと相互作用するが、ただし、非ヒト化抗体ではない分子。
【請求項２１】
ＭＭＰ−９のＯＧドメインと特異的に相互作用する抗原認識ドメインを含むヒト化抗体。
【請求項２２】
有効成分として、請求項２０に記載の分子と医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項２３】
前記分子は、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと特異的に相互作用する抗原認識ドメインを含むヒト化抗体を含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＭＭＰ−９の調節剤に関連し、より具体的には、ＭＭＰ−９のＯＧドメインに対して標的化される調節剤に関連する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の生理学的および病理学的役割は様々である。ＭＭＰファミリーのメンバーが、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を異化することによるだけではなく、多くの疾患状態を進行させる様々な可溶性媒介因子をプロセシングすることによっても、結合組織を通り抜ける炎症細胞およびガン細胞の遊走の数多くの局面に関わっている。すべてのＭＭＰが、類似した触媒部位を共有するが、際立った違いが、少なくとも部分的には、非触媒的タンパク質ドメインにおけるさらなる基質結合部位の存在のために、それらの基質特異性において認められる。結果として、異なるＭＭＰは、異なる生物学的機能を有する。ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢとしても知られている）は、その組織損傷役割、ならびにプロテアーゼ阻害剤、ケモカインおよびサイトカインを含む様々な可溶性タンパク質の炎症促進プロセシングを有するゆえに、免疫性疾患におけるプロトタイプ標的となる。
【０００３】
対照的に、ＭＭＰ−２またはゼラチナーゼＡは、おそらくは、炎症性ケモカインの不活性化により、および結合組織の代謝回転を調節することによって、主に抗炎症機能および恒常性機能を有するようである。このことは、これらの非常に類似する酵素を識別する選択的阻害剤が、副作用を伴わない効率的な抗炎症治療のために、極めて重要であることを暗示する。この観点から、酵素の他の非触媒部分が、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９とが区別されるならば、選択的阻害剤を作製するために標的化され得る。
【０００４】
興味深いことに、ＭＭＰ−９とＭＭＰ−２の間における大きな構造的相違は、ＭＭＰ−９における広範にＯ−グリコシル化（ＯＧ）されたドメインの存在である［Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ，Ｇ．ら（２００１）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２２、５７１〜５７９；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｓｔｅｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら（２００６）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８１、１８６２６〜１８６３７］。ＭＭＰ−９における他のドメインもまた、ＭＭＰ−２において見出されており、これらには、潜在性を維持することに関与するプロペプチドドメイン、３つのフィブロネクチン反復が挿入される触媒ドメイン、ならびに、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の内因性阻害剤、すなわち、メタロプロテイナーゼ組織阻害剤１（ＴＩＭＰ−１）が結合するためのエキソサイトを構成する、ヘモペキシン様ドメインとしても知られているＣ末端ドメインが含まれる。多くの疾患状態におけるその大きな重要性にもかかわらず、また、ＭＭＰ−２とは対照的に、ＭＭＰ−９に関して得られる構造情報は、全長の酵素ではなく、その２つの末端ドメインに限られる。プロ触媒ドメインを含有するＮ末端部分のＸ線構造［Ｅｌｋｉｎｓら、２００２、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ、５８、１１８２〜１１９２］は、Ｎ末端部分がマトリキシンフォールドを有することを示す。Ｃ末端のヘモペキシン様ドメインは、擬４回対称性を有する４枚羽根型（？）のプロペラ構造からなる［Ｃｈａら、２００２、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３２０、１０６５〜１０７９］。図１ＡはプロＭＭＰ−９のプロ触媒ドメインおよびヘモペキシン様ドメインの結晶構造を示す。これらのドメインが、（２２個のプロリン残基、６個のグリシン残基およびおよそ１２個〜１４個のＯ結合型グリカンを含有する）６４アミノ酸長のリンカーを表す点線によってつながれる［Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｓｔｅｅｎら（２００１）、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１５２８、６１〜７３］。重要なことに、プロＭＭＰ９のリンカードメインは、ＭＭＰファミリーのコラゲナーゼ、ストロメライシンおよびゼラチナーゼＡのリンカー領域よりも２〜３倍長い（これらについては、典型的なリンカー長はほんの２１〜２７個のアミノ酸残基の範囲に及ぶ）。
【０００５】
別個での、または他のタンパク質ドメインと一緒でのプロＭＭＰ−９におけるリンカードメインの結晶化は、困難であることが判明している。大きな側鎖がグリシンの場合にはないこと、および組み込まれた屈曲がプロリンの場合には存在することが、二次構造の形成を妨げており、また多くの場合、ループまたは構造化されない領域をもたらしている。さらにＯ−グリカンのための結合点としてのクラスター化されたセリンおよびトレオニンの存在が、結晶学的充填を妨げ得る立体効果を生じさせているかもしれない。このドメインは、コラーゲンＶに対するその配列類似性のために、コラーゲンＶ様ドメインとも呼ばれており、近年ではＯ−グリコシル化（ＯＧ）ドメインと名称変更されている。ＯＧドメインは、エキソサイト相互作用を可能にするためのヘモペキシンドメインの配向において活性である。しかしながら、ＭＭＰ−９の全体的な３Ｄ構造およびその生物物理学的性質に対するＯＧドメインの影響については何も知られていない。
【０００６】
米国特許出願公開第２００４０１７５８１７号は、その触媒サブユニットの結晶構造に基づくＭＭＰ−９調節因子の特定を教示する。しかしながら、ＭＭＰは一般に、それらの触媒部位における高い配列相同性を共有するため、触媒部位を標的とするように設計された調節因子は、ＭＭＰ−９に対する選択性がない。
【発明の概要】
【０００７】
ＭＭＰ−９特異的調節剤が求められている。
【０００８】
１つの局面によれば、メタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）の活性を調節する方法が提供され、該方法は、ＭＭＰ−９を、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと特異的に相互作用する作用因子と接触させ、それにより、ＭＭＰ−９の活性を調節することを含む。
【０００９】
別の局面によれば、ＭＭＰ−９を特異的に調節することができる作用因子を特定する方法が提供され、該方法は、推定上のＭＭＰ−９特異的調節剤である作用因子がＭＭＰ−９のＯＧドメインと相互作用することができるかどうかを明らかにすることを含む。
【００１０】
さらに別の局面によれば、ＭＭＰ−９媒介の医学的状態を治療する方法が提供され、該方法は、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと特異的に相互作用する作用因子の治療有効量をその必要性のある対象に投与し、それによりＭＭＰ−９媒介の疾患または状態を治療することを含む。
【００１１】
なおさらに別の局面によれば、ＭＭＰ−９の活性を特異的に調節することのできる分子であって、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと相互作用する分子が提供されるが、この分子は非ヒト化抗体ではない。
【００１２】
追加的局面によれば、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと特異的に相互作用する抗原認識ドメインを含むヒト化抗体が提供される。
【００１３】
さらに追加的局面によれば、有効成分として、ＭＭＰ−９の活性を特異的に調節することができる分子であって、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと相互作用する分子（ただし、この分子は非ヒト化抗体ではない）を含み、かつ、医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物が提供される。
【００１４】
１つの実施形態によれば、ＭＭＰ−９は天然ＭＭＰ−９である。
【００１５】
さらに別の実施形態によれば、活性はコラーゲン溶解活性である。
【００１６】
さらに別の実施形態によれば、活性はゼラチン溶解活性である。
【００１７】
さらに別の実施形態によれば、調節することは、アップレギュレーションすることである。
【００１８】
さらに別の実施形態によれば、調節することは、ダウンレギュレーションすることである。
【００１９】
さらに別の実施形態によれば、作用因子はポリペプチド作用因子を含む。
【００２０】
さらに別の実施形態によれば、ポリペプチド作用因子は抗体を含む。
【００２１】
さらに別の実施形態によれば、作用因子は小分子を含む。
【００２２】
さらに別の実施形態によれば、明らかにすることが、作用因子の構造をＭＭＰ−９のＯＧドメインの構造と比較することによって行われる。
【００２３】
さらに別の実施形態によれば、明らかにすることが、前記作用因子をＭＭＰ−９の単離されたＯＧドメインと接触させることによって行われる。
【００２４】
さらに別の実施形態によれば、作用因子はポリペプチドを含む。
【００２５】
さらに別の実施形態によれば、ポリペプチドは抗体を含む。
【００２６】
さらに別の実施形態によれば、作用因子は小分子を含む。
【００２７】
さらに別の実施形態によれば、作用因子が、本明細書中に記載されるように特定される。
【００２８】
さらに別の実施形態によれば、作用因子は小分子またはポリペプチド作用因子を含む。
【００２９】
さらに別の実施形態によれば、ポリペプチド作用因子は抗体を含む。
【００３０】
さらに別の実施形態によれば、分子は、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと特異的に相互作用する抗原認識ドメインを含むヒト化抗体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
本明細書では本発明を単に例示し添付図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【図１】図１は、プロＭＭＰ−９を特徴づけるコンピューター作製モデルおよびグラフである。図１Ａは末端ドメインの結晶構造を例示する。プロＭＭＰ−９のＮ末端ドメイン（ＰＤＢコード：１Ｌ６Ｊ）が、プロペプチド（緑色）、３つのＩＩ型フィブロネクチン反復（青色）、および、亜鉛含有活性部位（灰色球）を伴う触媒ドメイン（赤色）から構成される。ＯＧドメイン（点線）は、構造が不明な６４残基のフラグメントを含有し、Ｎ末端ドメインを、４つのプロペラ羽根（シアン色）からなるＣ末端のヘモペキシン様ドメイン（ＰＤＢコード：１ＩＴＶ）につなぐ。図１Ｂは、プロＭＭＰ−９のオリゴマー化学種（ピーク１（１５．８分）およびピーク２（２２．７分））およびモノマー形態（ピーク３、２５．１分）の溶出プロファイルを示すサイズ排除クロマトグラフィーを例示するグラフである。挿入図：ストークス半径が知られているタンパク質標準物のＰｏｒａｔｈプロット［５７］が、ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを校正するために使用された（左から右に、チログロブリン：８５Å、フェリチン：６１Å、カタラーゼ：５２．２Å、アルドラーゼ：４８．１Å、アルブミン：３５．５Å）。Ｋｄの立方根が各タンパク質のストークス半径に対してプロットされ、線形最小二乗フィッティングが示される。図１Ｃはゼラチンザイモグラムの写真である。グリセロール沈降が、モノマーを調製的量で高次のオリゴマー構造から分離するために適用された。それぞれの分画物に由来するアリコートをゼラチンザイモグラムでアッセイした。高次のオリゴマー構造が分画物１〜３に存在する。分画物３はすべてのオリゴマー形態の混合物を含有した。分画物４〜７は主にモノマー形態を含有した。図１Ｄは、沈降係数の分布を計算するために使用された分析超遠心分離沈降速度分析である。挿入図：実験データ（ドット）からの、時間および回転軸からの距離を関数とする沈降プロファイル（線）のモデル化。残留物プロットが上段パネルに示される。明確化のために、分析で使用された１０番目毎のプロファイルのみが示される。
【図２】図２は、プロＭＭＰ−９の構造分析を例示するコンピューター作製モデルおよびグラフである。図２Ａは、溶液中でのプロＭＭＰ−９のＳＡＸＳデータを例示するグラフである。実験のＸ線強度データ（黒色ドット）が、ＣＨＡＤＤを使用する最確モデル（灰色線）と比較される。挿入図：実験によるＳＡＸＳデータの対分布関数。図２Ｂは、ＣＨＡＤＤによって再構築されるプロＭＭＰ−９モデルを例示する。ＳＡＸＳデータから得られるモデルが、５Åの半径を有する白色球によって表される。それぞれのモデルが垂直軸に沿って０°および９０°回転させられた。Ｎ末端およびＣ末端ドメイン［２２、２４］のドッキングされた結晶構造が青色および赤色リボンとしてそれぞれ表される。図２Ｃは、プロＭＭＰ−９の配列におけるＰＯＮＤＲ［３７］による長い無秩序領域（濃い黒色線）の予測、および、対応するドメイン構成（上段の棒：ＰＲＯ−プロペプチド、ＣＡＴ＋ＦＮ−触媒ドメインおよび３つのＩＩ型フィブロネクチン反復、ＯＧ−Ｏ−グリコシル化ドメイン、ＰＥＸ−ヘモペキシン様ドメイン）である。図２Ｄは、再構築されたＯＧドメインを有する全長プロＭＭＰ−９の計算された散乱曲線の、実験データに対するフィッティングを例示する。最も良好な３つのモデルの計算された曲線が、緑色、シアン色および黄色の線で示される。実験データが黒色ドットとして表される。ＯＧドメインのこれら３つの最も良好なモデルが、ＣＨＡＤＤモデルにおいてＲＡＰＰＥＲ［３８、３９］を使用して計算された。図２ＥはＯＧドメインの構造再構築を例示する。最も良好な３つのモデルが、緑色、シアン色および黄色に着色されたリボン標示で示される。
【図３】図３は、野生型および変異型プロＭＭＰ−９のグラフおよびＡＦＭ像である。グルタルアルデヒドが、タンパク質に対する、表面のアミンとの間での共有結合リンカーとして役立った。すべてのスキャンで、スパイク先端が用いられた。図３Ａ〜３Ｃ：野生型プロＭＭＰ−９の半乾燥モードスキャン。図３Ｄ〜３Ｆ：プロＭＭＰ−９ΔＯＧ変異体の半乾燥モードスキャン。図３Ａおよび図３Ｄは２Ｄ標示である。図３Ｂおよび図３Ｅは３Ｄ標示である。図３Ｃおよび図３Ｆは、図３Ａおよび図３Ｄに示される点線に沿ったＸＺ断面である。サンプル調製および画像化条件については、本文を参照のこと。高さスケールが右側に棒によって示され、この場合、Ｚ軸が０Åから５０Åにまで及ぶ（暗い〜明るい）。
【図４】図４は、ＡＦＭによって測定されたときの野生型（左）およびプロＭＭＰ−９ΔＯＧ（右）のサイズ分布ヒストグラムである。すべてのヒストグラムのｙ軸は、カウント数を総集団により除することによって得られる正規化された頻度である。図４Ａおよび図４Ｂ−高さ分布。図４Ｃおよび図４Ｄ−幅分布。幅値は、実験手順の節で記載されるように補正された。図４Ｅは野生型プロＭＭＰ−９のローブ間分布を例示する。プロＭＭＰ−９ΔＯＧにおけるローブ間の分離を解明することができなかった。図４ＦはプロＭＭＰ−９のモデル化途中の立体配座状態を例示する。ローブ間のＡＦＭデータに従って計算されたときの９．５Åの標準偏差が引かれ（左側）、または、ＳＡＸＳ構造再構築によって得られる平均化された構造（中央）のドメイン間の分離距離に加えられた（右側）。Ｎ末端およびＣ末端ドメイン［２２、２４］が青色および赤色漫画によってそれぞれ表される。ＯＧドメインがＲＡＰＰＥＲ［３８、３９］によって再構築され、緑色Ｃα軌跡によって表される。
【図５】図５は、ＳＡＸＳによって得られる再構築されたプロＭＭＰ−９モデルを例示する。図５ＡはＧＡＳＢＯＲモデルである。図５ＢはＣＨＡＤＤモデルである。５Åの半径を有する白色球により、得られたモデルが表される。Ｎ末端およびＣ末端ドメインのドッキングされた結晶構造が青色および赤色漫画によってそれぞれ表される。それぞれのモデルが垂直軸に沿って０°および９０°回転させられた。
【図６】図６は、プロＭＭＰ−９のＡＦＭ像である。グルタルアルデヒドが、タンパク質に対する、表面のアミンとの間での共有結合リンカーとして役立った。酸化物の尖った窒化ケイ素先端が使用された図６Ａのスキャンを除いて、すべてのスキャンで、スパイク先端が用いられた。図６Ａ：緩衝液下での野生型プロＭＭＰ−９。図６Ｂ：周囲条件でスキャンされる野生型酵素の乾燥させたサンプル。図６Ｃ：酵素を加えない同じ固定化手順に供されたブランクサンプル。矢印は、１ｘ１μｍ２のスキャンで観測された１個の粒子を示す。高さスケールが右側に棒によって示され、この場合、Ｚ軸が０Åから５０Åにまで及ぶ（暗い〜明るい）。
【図７】図７Ａは、分泌型ＭＭＰ−９を発現するＨＴ１０８０細胞のインサイチュザイモグラフィーを例示する。緑色蛍光の検出はＩＶ型コラーゲンのタンパク質分解活性を示している。青色は核染色（Ｈｏｅｃｈｓｔ）を示す。図７Ｂは、抗ＭＭＰとのＨＴ１０８０細胞のインキュベーション（９時間）、その後、Ｏｒｅｇｏｎグリーンにコンジュゲート化されたＩＶ型コラーゲンによる重層を例示する。細胞周辺に顕著な緑色蛍光がないことは、ＭＭＰ−９による細胞周囲でのタンパク質分解が阻害されていることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明はＭＭＰ−９の調節剤に関連し、より具体的には、そのＯＧドメインに対して標的化される調節剤に関連する。
【００３３】
本発明の原理および作用が、図面および付随する説明を参照してより十分に理解されることができる。
【００３４】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施または実行される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００３５】
メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのメンバーが、多くの疾患状態を進行させる、結合組織を通り抜ける炎症細胞およびガン細胞の遊走の数多くの局面に関与している。すべてのＭＭＰが、類似した触媒部位を共有するが、それらの基質結合部位は異なる。結果として、異なるＭＭＰは、異なる生物学的機能を有する。例えば、ＭＭＰ−９は組織の損傷および炎症を促進させ、これに対して、ＭＭＰ−２は主に抗炎症機能および恒常性機能を含む。このことは、選択的阻害剤が、これらの非常に類似する酵素を識別するならば、副作用を伴わない効率的な抗炎症治療のために極めて重要であることを暗示する。
【００３６】
本発明の構想中、本発明者らは、ＭＭＰ−９とＭＭＰ−２の間における大きな構造的相違が、ＭＭＰ−９における広範にＯ−グリコシル化（ＯＧ）されたドメインの存在であるという理解に至っている。しかしながら、ＭＭＰ−９に関する利用可能な構造情報はその２つの末端ドメインに限定され、このＯＧドメインを含んでいない。そのため、ＭＭＰ−９の全体的な３Ｄ構造およびその生物物理学的性質に対するＯＧドメインの影響に関する情報は何もない。
【００３７】
発明の実施に際し、本発明者らは、プロＭＭＰ−９の最初の全長構造およびそのＯ−グリコシル化リンカードメインの分子特性を特徴づけるために、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）を単分子原子間力顕微鏡法（ＡＦＳ）画像化と組み合わせた、新たな構造分析を行っている。ＳＡＸＳ、それに続く画像および構造再構築分析は、溶液中におけるその平均化された立体配座を表す全長プロＭＭＰ−９の分子形状をもたらした（図２Ａ〜２Ｅ）。この構造は、高分解能ＡＦＭ画像化（図３Ａ〜３Ｆ、および、図４Ａ〜４Ｅ）および生物物理学的測定によって裏付けられるものであり、ＯＧドメインが２つの末端ドメインの間における柔軟な３０Åの長さのリンカーとして作用する細長いタンパク質を示す（図５Ａ〜５Ｂ）。ＯＧドメインの柔軟性の程度が、単分子画像化によって検出された様々なタンパク質立体配座（図４Ｆ）から統計学的に評価された。プロＭＭＰ−９の全長の構造動的モデルは、ＭＭＰ−９の活性のために要求される、基質、リガンドおよび受容体の認識、結合およびプロセシングの調節におけるタンパク質ドメインの柔軟性の役割に対する新たな見識を提供する。
【００３８】
さらに発明を実施に移しているとき、本発明者らは、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと特異的に相互作用することができる抗体が、そのゼラチン溶解活性ではなく、そのコラーゲン溶解活性を阻止することをインサイチュザイモグラフィーによって示した（図７Ａ〜７Ｂ）。したがって、本発明者らは、ＯＧドメインの柔軟性を調節する作用因子の使用は、この酵素の病理学的活性を制御するために使用され得ることを提案する。
【００３９】
したがって、本発明の１つの局面によれば、メタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）の活性を調節する方法が提供され、該方法は、ＭＭＰ−９を、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと特異的に相互作用する作用因子と接触させ、それにより、ＭＭＰ−９の活性を調節することを含む。
【００４０】
本明細書中で使用される用語「ＭＭＰ−９」（マルチドメイン亜鉛エンドペプチダーゼ−マトリックス−メタロプロテイナーゼ−９、ゼラチナーゼＢとも呼ばれる）は、そのホモログ、オルソログおよびイソ型を含めて、哺乳動物（例えば、ヒト）ＭＭＰ−９ポリペプチド（ＥＣ３．４．２４．３５；Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ番号Ｐ１４７８０）の前駆体形態または活性な形態を示す。ＭＭＰ−９は典型的には、３つのドメイン、すなわち、触媒ドメイン、基質結合ドメイン、および、両者間のリンカードメインを含む。リンカードメインは、本明細書中ではコラーゲンＶ様ドメインまたはＯ−グリコシル化（ＯＧ）ドメインとしても示され、６４個のアミノ酸（そのうちの２２個がプロリン残基であり、そのうちの６個がグリシン残基である）と、およそ１２〜１４個のＯ結合型グリカンとを含む。
【００４１】
本発明のこの局面の１つの実施形態によれば、ＭＭＰ−９は天然のままであり、すなわち、変性されていない。本発明のこの局面の別の実施形態によれば、ＭＭＰ−９は活性であり、好ましくは完全に活性である。
【００４２】
ＭＭＰ−９の活性には、ゼラチン溶解活性、Ｉ型、ＩＩＩ型およびＸＩ型の天然コラーゲンの分解（コラーゲン溶解活性）、エラスチン、アグレカン、ラミニンＡ鎖およびミエリン塩基性タンパク質の分解が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「調節する」は、ダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションすることを示す。ＯＧドメインの柔軟性を阻害する作用因子が、柔軟であることをＯＧドメインに要求するＭＭＰ−９の機能（例えば、そのコラーゲン溶解活性など）をダウンレギュレーションすることが理解される。対照的に、ＭＭＰ−９の特定の３Ｄ構造を要求し、かつ、ＯＧドメインの柔軟性を要求しない活性が、ＯＧドメインと相互作用する作用因子によってアップレギュレーションされ得る。そのような活性の一例がそのゼラチン溶解活性であり、あるいは、受容体および／または増殖因子と相互作用する能力である。
【００４４】
既述したように、本発明の方法は、ＭＭＰ−９を、そのＯＧドメインと特異的に相互作用することができる作用因子と接触させることによって行われる。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「接触（させること）」は、そのような作用因子がそのＯＧドメインと相互作用し（例えば、ＯＧドメインに結合し）、その剛直性に影響を及ぼすことを可能にする条件（すなわち、時間、温度、緩衝液）下で、ＭＭＰ−９がそのような作用因子と接触できるようにすることを示す。該接触は、生体内、生体外または試験管内で行われ得ることが理解される。
【００４６】
本明細書中で使用される表現「特異的に相互作用する」は、ＭＭＰ−９の別のドメイン（例えば、触媒ドメインまたは基質結合ドメイン）とは対照的に、ＭＭＰ−９のＯＧドメインに対する高まった親和性、および、別のメタロプロテイナーゼ酵素（例えば、ＭＭＰ−２）のＯＧドメインを上回るＭＭＰ−９のＯＧドメインに対する高まった親和性の両方を示す。最小の親和性の一例がおそらくは１０−５Ｍである。好ましくは、作用因子は、上記と比較して少なくとも３倍大きい親和性で、より好ましくは、少なくとも５倍大きい親和性で、より好ましくは、少なくとも１０倍大きい、またはそれ以上の親和性でＭＭＰ−９のＯＧドメインと相互作用する。ＭＭＰ−９のＯＧドメインのアミノ酸配列は、（ＭＭＰ−９とＭＭＰ−２の間において非常に相同的である触媒ドメインのアミノ酸配列とは対照的に）ＭＭＰ−９に特異的であるため、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと特異的に相互作用することができる作用因子は、したがって、ＭＭＰ−９を特異的に調節することができることが理解される。
【００４７】
ＭＭＰ−９のＯＧドメインと相互作用することができる本発明によって意図される作用因子（すなわち、分子）には、ポリペプチド作用因子（例えば、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと特異的に相互作用する抗原認識ドメインを含む抗体）、ペプチドおよび小分子が含まれるが、これらに限定されない。作用因子は、特定のアミノ酸配列認識および／または立体配座認識に基づいてＯＧドメインと相互作用し得ることが理解される。
【００４８】
ＭＭＰ−９のＯＧドメインを認識する抗体作用因子が、例えば、Ｓｉｇｍａ、ＣｈｅｍｉｃｏｎおよびＡｂｃａｍから市販されている。
【００４９】
本発明において使用される用語「抗体」には、特定のミトコンドリアタンパク質に結合することができる無傷の分子、ならびに、その機能的フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどが含まれる。より小さい抗体フラグメントは、より容易に組織内に浸透することができ、かつ、身体からより迅速に排出されるので、完全な抗体よりも好都合であり得る。このことは、ＭＭＰ−９特異的抗体の生体内使用については特に関連している。また、抗体フラグメントのさらなる利点が、抗体フラグメントが細菌または酵母において産生され得ることである。
【００５０】
ＭＭＰ−９のＯＧドメインに対してなされる抗体の作製は、ＯＧドメインを含むペプチドを使用することによって影響され得る。そのような抗体は、他のＭＭＰ−９ドメインを負のコントロールとして使用して選択することができる。
【００５１】
本発明を実施するための好適な抗体フラグメントには、免疫グロブリン軽鎖（これは本明細書中では「軽鎖」として示される）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、免疫グロブリン重鎖（これは本明細書中では「重鎖」として示される）のＣＤＲ、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域、軽鎖、重鎖、Ｆｄフラグメント、ならびに、軽鎖および重鎖の両方の本質的に全可変領域を含む抗体フラグメント（例えば、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２など）が含まれる。
【００５２】
軽鎖および重鎖の両方の全可変領域または本質的に全可変領域を含む機能的な抗体フラグメントは下記のように定義される：
（ｉ）Ｆｖ、これは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域からなる遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；
（ｉｉ）単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、これは、好適なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された単鎖分子である；
（ｉｉｉ）Ｆａｂ、これは、完全な抗体を酵素パパインで処理して、無傷の軽鎖と、重鎖のＦｄフラグメント（これはその可変ドメインおよびＣＨ１ドメインからなる）とを生じさせることによって得られる、抗体分子の一価の抗原結合性部分を含有する抗体分子のフラグメントである；
（ｉｖ）Ｆａｂ’、これは、完全な抗体を酵素ペプシンで処理し、その後、還元することによって得られる、抗体分子の一価の抗原結合性部分を含有する抗体分子のフラグメントである（２つのＦａｂ’フラグメントが１つの抗体分子について得られる）；および
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２、これは、完全な抗体を酵素ペプシンで処理することによって得られる、抗体分子の一価の抗原結合性部分を含有する抗体分子のフラグメントである（すなわち、２つのジスルフィド結合によって一緒に結ばれたＦａｂ’フラグメントのダイマー）。
【００５３】
抗体（即ちモノクローナルおよびポリクローナル抗体）を作製する方法は当該技術分野では周知である。抗体は当該技術分野で知られたいくつかの方法のいずれか一つを介して作製されることができ、その方法は、抗体分子のインビボ生成の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニングを用いることができる（Ｏｒｌａｎｄｉ  Ｄ．Ｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：３８３３−３８３７；Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．ら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９）かまたは培養中の連続細胞系によるモノクローナル抗体分子の生成を用いることができる。これらはハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ−Ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ．ら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７，Ｋｏｚｂｏｒ  Ｄ．ら、１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８１：３１−４２，Ｃｏｔｅ  Ｒ．Ｊ．ら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２０２６−２０３０；Ｃｏｌｅ  Ｓ．Ｐ．ら、１９８４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６２：１０９−１２０）を含むがこれらに限定されない。
【００５４】
インビボで抗体を生成するときに、標的抗原が小さすぎて、適切な免疫原応答を誘発することができない場合、そのような抗原（ハプテン）は、抗原的に中性な担体（キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または血清アルブミン［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］などの担体）にカップリングすることができる（例えば、米国特許第５１８９１７８号および同第５２３９０７８号を参照のこと）。担体へのハプテンのカップリングを、この技術分野では広く知られている様々な方法を使用して行うことができる。例えば、アミノ基への直接的なカップリングを行うことができ、必要に応じて、その後、形成されたイミノ連結の還元を行うことができる。代替では、担体を、縮合剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたは他のカルボジイミド脱水剤）を使用してカップリングすることができる。リンカー化合物もまた、そのようなカップリングを行うために使用することができる；ホモ二官能性リンカーおよびヘテロ二官能性リンカーの両方が、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）から入手可能である。得られる免疫原性複合体を、その後、好適な哺乳動物被験体（例えば、マウス、ウサギなど）に注射することができる。好適なプロトコルでは、血清における抗体の産生を増強させるスケジュールに従ったアジュバントの存在下における免疫原の繰り返される注射が伴う。免疫血清の力価を、この技術分野では広く知られている様々な免疫アッセイ手法を使用して容易に測定することができる。
【００５５】
得られた抗血清はそのまま使用することができ、または、モノクローナル抗体を、本明細書において上記されるように得ることができる。
【００５６】
抗体フラグメントを、この技術分野では広く知られている様々な方法を使用して得ることができる［（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと）。例えば、本発明による抗体フラグメントを抗体のタンパク質分解的加水分解によって調製することができ、あるいは、フラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現システム）における発現によって調製することができる。
【００５７】
あるいは、抗体フラグメントを従来の方法による完全な抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。本明細書中上記で記載されたように、（Ｆａｂ’）２抗体フラグメントを、５Ｓフラグメントをもたらすために抗体をペプシンで酵素切断することによって製造することができる。このフラグメントは、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを生じさせるために、チオール還元剤、および、場合により、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基のための保護基を使用してさらに切断することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素切断は、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントと、Ｆｃフラグメントとを直接に生じさせる。そのような方法を実施するための十分な指針が当該分野の文献には提供されている（例えば、米国特許第４０３６９４５号および同第４３３１６４７号、ならびに、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．、１９５９、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、７３、１１９〜１２６を参照のこと）。抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または、他の酵素的技術、化学的技術もしくは遺伝的技術などもまた、フラグメントが、無傷の抗体によって認識される抗原に結合する能力を保持する限り、使用することができる。
【００５８】
本明細書中上記で記載されたように、Ｆｖは、対形成した重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインから構成される。この会合は非共有結合性であり得る（例えば、Ｉｎｂａｒ，Ｄ．他（１９７２）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、６９、２６５９〜２６６２を参照のこと）。あるいは、本明細書中上記で記載されたように、可変ドメインを、分子間ジスルフィド結合によって単鎖Ｆｖを作製するために連結することができ、あるいは、そのような鎖を化学試薬（例えば、グルタルアルデヒドなど）によって架橋することができる。
【００５９】
好ましくは、Ｆｖは単鎖Ｆｖである。
【００６０】
単鎖Ｆｖは、ペプチドリンカーをコードするオリゴヌクレオチドによってつながれた、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子が発現ベクターに挿入され、続いて、発現ベクターが宿主細胞（例えば、大腸菌など）に導入される。組換え宿主細胞により、２つの可変ドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖が合成される。単鎖Ｆｖを製造するための充分な指針が当該分野の文献には提供されている（例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ．およびＦｉｌｐｕｌａ，１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：９７〜１０５；Ｂｉｒｄ他、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６；Ｐａｃｋ他、１９９３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１〜１２７７；およびＬａｄｎｅｒ他、米国特許第４９４６７７８号を参照のこと）。
【００６１】
単離された相補性決定領域ペプチドを、目的とする抗体の相補性決定領域をコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって調製することができる。そのような方法を実施するための充分な指針が当該分野の文献には提供されている（例えば、ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙ、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：１０６〜１１０）。
【００６２】
ヒトの治療のためにはヒト化抗体が好ましくは使用されることが理解される。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト抗体に由来する部分（好ましくは、最小限の部分）を有する遺伝子操作されたキメラな抗体または抗体フラグメントである。ヒト化抗体には、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域が、所望の機能性を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）の相補性決定領域からの残基によって置換される抗体が含まれる。いくつかの場合において、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、あるいは、移入された相補性決定領域配列またはフレームワーク配列においても、そのいずれにも見出されない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、相補性決定領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、かつ、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてが関連のヒトコンセンサス配列のフレームワーク領域に対応する少なくとも１つ（典型的には２つ）の可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は最適には、典型的にはヒト抗体に由来する抗体定常領域（例えば、Ｆｃ領域など）の少なくとも一部もまた含む（例えば、Ｊｏｎｅｓ他、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２９；およびＰｒｅｓｔａ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６を参照のこと）。
【００６３】
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当該分野では広く知られている。一般に、ヒト化抗体は、１つ以上のアミノ酸残基が、非ヒトである供給源からヒト化抗体に導入されている。これらの非ヒト由来のアミノ酸残基は移入残基と呼ばれることが多く、典型的には、移入されている可変ドメインから取られる。ヒト化を、ヒト相補性決定領域を対応する齧歯類相補性決定領域によって置換することにより、本質的には記載されるように行うことができる（例えば、Ｊｏｎｅｓ他、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６；米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。したがって、そのようなヒト化抗体は、無傷のヒト可変ドメインの実質的に一部が、非ヒト種に由来する対応の配列によって置換されているキメラな抗体である。実際には、ヒト化抗体は典型的には、一部の相補性決定領域残基と、可能であれば、一部のフレームワーク残基とが、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換されるヒト抗体である。
【００６４】
ヒト抗体はまた、当該分野で既知の様々なさらなる技術を使用して製造することができ、そのような技術には、ファージディスプレーライブラリーが含まれる（例えば、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ他、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１；Ｃｏｌｅ他、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ他、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６〜９５）。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をコードする配列をトランスジェニック動物（例えば、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウス）に導入することによって作製することができる。抗原による攻撃を受けたとき、遺伝子再配置、鎖の組み立ておよび抗体レパートリーを含めて、すべての点でヒトにおいて認められる抗体と非常に類似するヒト抗体の産生がそのような動物において観測される。そのような方法を実施するための充分な指針が当該分野の文献には提供されている（例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号および同第５６６１０１６号；Ｍａｒｋｓ他、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９〜７８３；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２〜８１３；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５〜８５１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、１９９５、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３を参照のこと）。
【００６５】
ＭＭＰ−９を特異的に調節し得ると推定される作用因子を特定するために、作用因子を、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと相互作用する能力に関して評価することができる。
【００６６】
したがって、本発明の１つの局面によれば、作用因子がＭＭＰ−９の特異的な調節剤であるかどうかを明らかにするための方法が提供され、該方法は、推定されるＭＭＰ−９特異的調節剤である作用因子がＭＭＰ−９のＯＧドメインと相互作用することができるかどうかを明らかにすることを含む。
【００６７】
非常に注意深い実験により、本発明者らは全長プロＭＭＰ−９の３Ｄ構造を明らかにしている。本明細書中に記載される完全なＭＭＰ−９の３Ｄ構造は、ＭＭＰ９の作用を調節する（好ましくは、阻害する）薬物の合理的設計において使用することができる。これらのＭＭＰ９調節因子は、ＭＭＰ９活性の望ましくない物理的性質および薬理学的性質を防止または処理するために使用することができる。したがって、本発明のこの局面の１つの実施形態によれば、作用因子を、その構造をＭＭＰ−９のＯＧドメインの構造と比較することによって、ＭＭＰ−９を特異的に調節する能力について評価することができる。これを、全長ＭＭＰ−９のコンピューターモデルを使用することによって行うことができ、例えば、ＧＡＳＢＯＲおよびＣＨＡＤＤなどのプログラムの助けをかりて本発明者らによって作製されるモデルなどを使用することによって行うことができる。この方法は、ペプチド作用因子および小分子を特定するために好適であり得る。
【００６８】
作用因子の構造が得られると、ＯＧドメインの３Ｄ構造に収まり、できればＯＧドメインの３Ｄ構造を安定化するか、または乱すペプチドを設計することができる。そのようなペプチド／小分子は、ＯＧドメインと特異的に結合するよう、スクリーニングすることができる。
【００６９】
本明細書中上記に記載されるようなペプチド模倣体の作製を、例えば、ディスプレー技術を含めて、様々な取り組みを使用して行うことができる。
【００７０】
そのようなディスプレーライブラリーを構築する様々な方法が当該分野において広く知られている。そのような方法は、例えば、Ｙｏｕｎｇ  ＡＣ他、「Ｔｈｅ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ」Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９７  Ｄｅｃ  １２；２７４（４）：６２２−３４；Ｇｉｅｂｅｌ  ＬＢ他「Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｈａｇｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５  Ｎｏｖ  ２８；３４（４７）：１５４３０−５；Ｄａｖｉｅｓ  ＥＬ他、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９５  Ｏｃｔ  １２；１８６（ｌ）：１２５−３５；Ｊｏｎｅｓ  Ｃ  ＲＴ  ａｌ．「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ」Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  １９９５  Ｊｕｌ  １４；７０７（ｌ）：３−２２；Ｄｅｎｇ  ＳＪ他「Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９５  Ｍａｙ  ２３；９２（１１）：４９９２−６；およびＤｅｎｇ  ＳＪ他「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９４  Ａｐｒ  １；２６９（１３）：９５３３−８に記載され、それらは参照によって本明細書中に援用される。
【００７１】
ペプチド模倣体はまた、計算生物学を使用して見出すことができる。例えば、様々な化合物を、本明細書中下記において実施例の節で記載されるような様々な三次元計算ツールを使用して、ＯＧドメインと結合する能力についてコンピューター計算により分析することができる。三次元構造モデルを表示するために有用なソフトウエアプログラム、例えば、ＲＩＢＢＯＮＳ（Ｃａｒｓｏｎ，Ｍ．、１９９７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２２７、２５）、Ｏ（Ｊｏｎｅｓ，ＴＡら、１９９１、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ４７、１１０）、ＤＩＮＯ（ＤＩＮＯ：Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）、ｗｗｗ．ｄｉｎｏ３ｄ．ｏｒｇ）、および、ＱＵＡＮＴＡ、ＩＮＳＩＧＨＴ、ＳＹＢＹＬ、ＭＡＣＲＯＭＯＤＥ、ＩＣＭ、ＭＯＬＭＯＬ、ＰＡＳＭＯＬおよびＧＲＡＳＰ（Ｋｒａｕｌｉｓ，Ｊ．、１９９１、Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ、２４、９４６に総説される）などを、ＯＧドメインと、予測されるペプチド模倣体との間における相互作用をモデル化し、それにより、ＯＧ領域に結合する最大の確率を示すペプチドを特定するために利用することができる。タンパク質−ペプチド相互作用のコンピューター計算によるモデル化が合理的薬物設計において首尾良く使用されている。さらに詳しくは、Ｌａｍら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３、３８０；Ｗｌｏｄａｗｅｒら、１９９３、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、６２、５４３；Ａｐｐｅｌｔ、１９９３、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ、１、２３；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ、１９９３、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ、１、１０９；および、Ｍａｕｒｏ  ＭＪら、２００２、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２０、３２５〜３４を参照のこと。
【００７２】
本発明のこの局面の別の実施形態によれば、作用因子を単離されたＭＭＰ−９とインキュベーションすることによって、ＭＭＰ−９を特異的に調節する作用因子の能力について評価することができる。ＭＭＰ−９のアミノ酸配列が知られているので、単離されたＭＭＰ−９、または、ＯＧドメインを含むそのフラグメントを、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、または、化学合成によって作製することができる。標準的なタンパク質標識化技術を、標的に対する作用因子の結合をアッセイするために使用することができる。標識化は、（例えば、ＭＭＰ−９のＳ３５標識化によって）直接的であり得るか、または、例えば、二次抗体の使用などによって間接的であり得る。標準的な免疫学的方法（ＥＬＩＳＡ、免疫沈降）および生化学的方法（例えば、ゲルろ過）を、作用因子の結合を評価するために使用することができる。
【００７３】
推定される作用因子が特定されると、推定される作用因子は、該作用因がＭＭＰ−９の機能を調節できることについて、またＭＭＰ−９に対する選択性を有し得ることについてアッセイすることができる。そのようなアッセイの一例が、本明細書中下記において実施例７で記載されるコラーゲン溶解活性のインサイチュザイモグラフィー分析である。
【００７４】
既述したように、ＭＭＰ−９は、その組織損傷役割、ならびに、プロテアーゼ阻害剤、ケモカインおよびサイトカインを含めて、様々な可溶性タンパク質の炎症促進プロセシングのために、炎症性疾患におけるプロトタイプ標的であることが知られている。したがって、ＭＭＰ−９の活性をダウンレギュレーションすることができる作用因子は、ＭＭＰ−９に関連づけられる障害を治療するために使用することができる。
【００７５】
したがって、本発明の１つの局面によれば、ＭＭＰ−９媒介の医学的状態を治療する方法が提供され、該方法は、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと特異的に相互作用する作用因子の治療有効量をその必要性のある対象に投与し、それにより、ＭＭＰ−９媒介の医学的状態を治療することを含む。
【００７６】
本明細書中で使用される用語「その必要性のある対象」は哺乳動物対象を示し、好ましくは、ヒト対象を示す。
【００７７】
本明細書中で使用される用語「治療する」は、ＭＭＰ−９媒介の疾患または状態の有害な影響を防止、治療、後退、減衰、緩和、最小化、抑制、または停止させることを示す。
【００７８】
表現「ＭＭＰ−９媒介の医学的状態」は、ＭＭＰ−９がその発症または進行に関与していると考えられ得る疾患または障害を示す。ＭＭＰ−９媒介の医学的状態の一例がガンであり、例えば、転移性ガンであり、例えば、乳ガン、卵巣ガン、骨肉腫、肺ガン、膵臓ガンおよび前立腺ガンなどである。
【００７９】
ガンにおいて役割を果たすことに加えて、ＭＭＰ−９は、他の病理において、例えば、関節炎において、または、神経変性疾患、例えば、多発性硬化症（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、４：３４８〜３５４（１９９２）；Ｇｉｊｂｅｌｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、４１：２９〜３４（１９９２））などにおいて関与する場合がある。例えば、高いレベルのＭＭＰ−９が、健康な患者または変形性関節炎の患者と比較して、炎症性関節炎（例えば、リウマチ様関節炎など）の患者の血清および滑液において検出されている（Ａｈｒｅｎｓら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、３９：１５７６〜８７（１９９６）；Ｇｒｕｂｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．＆Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、７８：１６１〜１７１（１９９６））。加えて、相関が、関節の関節炎活動スコアと、吸引された滑液におけるＭＭＰ−９の量との間で報告されている（Ｋｏｏｌｗｉｊｋら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、２２：３８５〜３９３（１９９５））。
【００８０】
ＭＭＰ−９の発現がまた、神経系の疾患において検出される。例えば、ＭＭＰ−９の突出した発現が、正常な脳組織と比較して、脱髄性病変部における反応性星状膠細胞およびマクロファージにおいて見出されている（Ｃｕｚｎｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、５５：１１９４〜１２０４（１９９６））。ＭＭＰ−９が、脳脊髄炎において（Ｇｉｊｂｅｌｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．Ｒｅｓ．、３６：４３２〜４４０（１９９３）；Ｐｒｏｏｓｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１９２：１１７５〜１１８１（１１９３））、多発性硬化症の患者の脳脊髄液において（Ｌｅｐｐｅｒｔら、Ｂｒａｉｎ、１２１：２３２７〜２３３４（１９９８）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、７０３：１５１〜１５５（１９９５））、また、ＡＩＤＳ関連認知症の患者において上昇する（Ｃｏｎａｎｔら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、４６：３９１〜３９８（１９９９））。さらに、筋萎縮性側索硬化症の患者では、ＭＭＰ−９の発現が、運動皮質の錐体ニューロンにおいて、また、脊髄の運動ニューロンにおいて見出される（Ｌｉｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、６７：２５１〜２５９（１９９６））。
【００８１】
ＭＭＰ−９はまた、様々な他の炎症性疾患に関連する。例えば、高いレベルのＭＭＰ−９活性が大動脈瘤の血管壁において見出される（Ｆｒｅｅｓｔｏｎｅら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ＆  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１５：１１４５〜１１５１（１９９５）；Ｎｅｗｍａｎら、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０：２６５〜２７６（１９９４）；Ｓａｋａｌｉｈａｓａｎら、Ｊ．Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、２４：１２７〜３３（１９９６））。さらに、巨細胞性動脈炎の患者はＭＭＰ−９の増大したレベルを有しており、ＭＭＰ−９のｍＲＮＡが、炎症を起こした血管の中膜における断片化された弾性組織の領域において平滑筋細胞および線維芽細胞に見出される（Ｓｏｒｂｉら、Ａｒｔｈｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、３５：１７４７〜１７５３（１９９６））。増大したレベルのＭＭＰ−９がまた、嚢胞性線維症の患者の痰において、また、気管支拡張症の患者の気管支肺胞洗浄液において見出される（Ｄｅｌａｃｏｕｒｔら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ＆  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１５２：７６５〜７６４（１９９５）；Ｓｅｐｐｅｒら、Ｃｈｅｓｔ、１０６：１１２９〜１１３３（１９９４））。高いレベルのＭＭＰ−９がまた、水疱性類天疱瘡患者の皮膚病変部からの水疱液において見出されている（Ｓｔａｈｌｅ−Ｂａｃｋｄａｈｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔ．、９３：２０２２〜２０３０（１９９４））。
【００８２】
ＭＭＰ−９の発現はまた、いくつかの他の疾患の病因に関係している。例えば、ＭＭＰ−９が、多発性嚢胞腎疾患（Ｍｕｒｒａｙら、Ｃｏｎｎ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．、３３：２４９〜２５６（１９９６））、膜性腎症（ＭｃＭｉｌｌｉｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９７：１０９４〜１１０１（１９９６））およびアルツハイマー病（Ｌｉｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、６８：１６０６〜１６１１（１９７７））において関係している。
【００８３】
したがって、本発明では、ＭＭＰ−９のＯＧドメインと選択的に相互作用することができる作用因子を使用する、上記で示される疾患または状態のすべての治療が意図される。
【００８４】
本発明の作用因子は、それ自体で、または、生理学的に許容され得るキャリアも含む医薬組成物の一部として対象に投与されることができる。医薬組成物の目的は、生物に対する有効成分の投与を容易にすることである。
【００８５】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【００８６】
本明細書中で使用される用語「有効成分」は、意図される生物学的効果、すなわちＭＭＰ−９の活性のダウンレギュレーションの役割を担うことができる作用因子を示す。
【００８７】
本明細書中以降、表現「生理学的に許容され得るキャリア」および表現「医薬的に許容され得るキャリア」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。医薬的に許容され得るキャリアに含まれる成分の１つは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることができ、これは有機媒体および水性媒体の両方における広範囲の溶解性を有する生体適合性ポリマーである（Ｍｕｔｔｅｒ他（１９７９））。
【００８８】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００８９】
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【００９０】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれることができる。
【００９１】
あるいは、例えば、患者の身体の組織領域に直接的に調製物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に調製物を投与することができる。
【００９２】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
【００９３】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容され得るキャリアを使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【００９４】
注射の場合、本発明の医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【００９５】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容され得るキャリアと組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのようなキャリアは、本発明の医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
【００９６】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。
【００９７】
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【００９８】
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【００９９】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
【０１００】
本明細書中に記載される調製物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１０１】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１０２】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
【０１０３】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
【０１０４】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量」は、処置されている対象の障害（例えば、虚血）の症状を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（例えば、核酸構築物）の量を意味する。
【０１０５】
治療有効量の決定は、特に本明細書中に示される詳細な開示を考慮に入れると十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１０６】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外アッセイおよび細胞培養アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、所望の濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて決定されることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０１０７】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照のこと）。
【０１０８】
投薬量および投薬間隔は、生物学的効果を誘導または抑制するために十分な、有効成分の血漿レベル（これは最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる）をもたらすために個々に調節することができる。ＭＥＣは、それぞれの調製物について変化するが、場合により、生体外データ全体から推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個人の特性および投与経路に依存する。血漿中濃度を求めるために検出アッセイが使用されることができる。
【０１０９】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０１１０】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
【０１１１】
本発明の組成物は、もし望むなら、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態を含有しうるパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供されることができる。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随しうる。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、通知を伴うことがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きでありうるか、または、承認された製品添付文書でありうる。医薬的に許容されうるキャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物はまた、上記でさらに詳述されるような適応状態を処置するために、調製され、適切な容器に入れられ、かつ表示され得る。
【０１１２】
本発明の追加の目的、利点および新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０１１３】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なお、これら実施例によって本発明は限定されない。
【０１１４】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組換えＤＮＡの技術が広く含まれている。これらの技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，バルチモア，メリーランド（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」、１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９８）；米国特許第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻  Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編、「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、ノーウォーク，ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ編、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている：米国特許第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲ��  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；なお、これらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用されるものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１１５】
一般的な材料および方法
ＭＭＰ−９の発現：組換えプロＭＭＰ−９を、ヒトプロＭＭＰ−９のｃＤＮＡを有するバキュロウイルスによるＳｆ９昆虫細胞への感染によって発現させた［１９］。細胞培養液のリットル量を遠心分離し、ろ過し、ゼラチン−セファロースクロマトグラフィーによって均一に精製した［５２］。この物質を、さらなる処理の前に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２（緩衝液Ｃ）において広範囲に透析し、約２０ｍｇを本研究において使用した。ＯＧドメインを欠く変異体（ＭＭＰ−９ΔＯＧ）を同様の方法で調製した［１９］。
【０１１６】
小角Ｘ線散乱：溶液におけるＳＡＸＳ実験を、標準的な手順に従って、Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、英国）のステーション２．１［５３］で行った。タンパク質溶液を、４℃で測定する前に１３０００ｘｇで５分間遠心分離した。散乱曲線が、１．５４Åの波長（λ）において、１ｍ（７ｍｇ／ｍｌ、１００μｌ）および４．２５ｍ（０．８ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、１００μｌ）のサンプル−検出器間距離で二次元マルチワイヤー比例カウンターにより集められ、これにより、散乱曲線は、０．００８＜ｑ＜０．７８Å−１（ｑ＝４πｓｉｎθ／λ、式中、２θは散乱角度である）の運動量移行範囲を包含した。データが３０の連続する１分フレームで集められ、その後、入射ビームの強度に対して正規化され、６０°の扇形に関して動径積分され、フレーム数に関して平均化され、検出器応答に対して正規化された。その後、緩衝液の散乱が引かれ、低角度および高角度曲線が０．０５〜０．１５Å−１のｑ範囲にわたって併合された。時間の関数としての強度の再現性が、モノマー状プロＭＭＰ−９サンプルの放射線損傷がないために明白であった。回転半径（Ｒｇ）を、ｑＲｇ＜１．３についてはＩ（ｑ）＝Ｉ（０）ｅｘｐ（−ｑ２Ｒｇ２／３）のギニエ近似［５４］を使用して評価し、また、間接的フーリエ変換プログラムＧＮＯＭ［５５］により散乱曲線全体からも評価した。ＧＮＯＭはまた、粒子の距離分布関数ｐ（ｒ）、および、ｐ（ｒ）がゼロになる点として定義されるその最大値Ｄｍａｘを与える。ｐ（ｒ）を決定するために、ｐ（０）＝０およびｐ（Ｄｍａｘ）が、まず最初に、選ばれたｒ間隔が正しかったかどうかを判定するために自由に割り当てられた。Ｄｍａｘは、最も低い正のｐ（Ｄｍａｘ）をもたらす最低値であった。Ｄｍａｘを固定した後、ｐ（０）およびｐ（Ｄｍａｘ）がゼロに固定された。その後、データを、ｐ（ｒ）関数が収束するまで低角度および高角度領域で切り詰めた。
【０１１７】
２つのＭＭＰ−９ドメイン（Ｎ末端の触媒ドメインおよびＣ末端のヘモペキシン様ドメイン）の結晶構造を、それらの対応する理論的散乱曲線を計算するために、プログラムＣＲＹＳＯＬ［３６］を使用して分析した。これらは、それらの理論的な対分布関数を得るためにさらにフーリエ変換され、同時に、Ｄｍａｘ値およびＲｇ値が計算された。ＳＡＸＳ曲線のアブイニシオモデル化が下記で詳しく記載された。構造図をＰｙＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ，Ｗ．Ｌ．、Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（２００２）、ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ、アメリカ合衆国、ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）により作製した。
【０１１８】
モデルの正確性をさらに確認するために、その溶液流体力学的特性を、ＨＹＤＲＯＰＲＯ［３４］を使用して計算し、その後、実験値と比較した。殻状ミニビーズの半径を６回の増分で２．２Åから４．２Åにまで変化させた。溶媒の密度および粘度、ならびに、タンパク質の部分比容積を、ＳＥＤＮＴＥＲＰ［２７］を使用して計算した。流体力学的殻状モデルについての球半径が３．８〜５．３Åの間で変化した。ＳＡＸＳモデルにおけるダミー残基（ＤＲ）の半径は３．８Åである。しかしながら、殻状モデルの実際の半径はタンパク質の水和のためにわずかにより大きく、それにもかかわらず、拡大の程度は、決定することが困難である［３４］。ＤＲ半径を１．５Å増大することにより、水和が確実に考慮に入れられることが以前に提案された［５６］。
【０１１９】
原子間力顕微鏡による画像化：画像化を、１４ｘ１４μｍ２の最大スキャン範囲により、Ｅ−スキャナーを備えるマルチモード原子間力顕微鏡（ＭＭＡＦＭ  Ｖｅｅｃｏ／Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ、アメリカ合衆国）を使用して行った。サンプルを、Ｔａｐｐｉｎｇ  Ｍｏｄｅを使用して、空気中または緩衝液中で画像化した。偽の吸着物（主に、塩の堆積）から生じる人為物を有しないサンプルを得るために、徹底した洗浄手順が要求された。アミン修飾シラン表面および架橋手順を使用することによって、タンパク質の著しい表面濃度を維持しながら、（ブランク操作によって明らかにされるような）バックグラウンドのほぼすべてが除かれた表面を調製することが可能であった。
【０１２０】
加えられる力の量を最小限に抑えるために、振幅設定点が、安定的な軌跡を与えた最大値に調節された。空気中での生物学的サンプルの高分解能像が、「スパイク」先端（Ｍｉｋｒｏｍａｓｃｈ（エストニア）から得られるＤＰ１４“ＨＩ’ＲＥＳ（商標）”プローブ）を使用して得られた。これらのプローブは、約１６０ｋＨｚの共鳴周波数、約５Ｎ／ｍの力定数、および、１ｎｍ以下の定格曲率半径を有しており、しかし、粗い表面での多数の接触を生じさせ得るさらなる「スパイク」の存在のために、２０ｎｍ未満のｒｍｓ粗さを有する表面での測定に適するだけである。２０ｎｍの公称半径を有するＤＮＰ−Ｓプローブ（Ｖｅｅｃｏ）を、標準的なＭＭＡＦＭ液体セルで行われた液体測定のために使用した。タンパク質分子のサイズを断面分析から求めた。その後、幅値を、典型的な高分解能ＳＥＭ像から観察されるような先端エンベロープを差し引くことによって、先端による広がりについて補正した。
【０１２１】
サイズ排除クロマトグラフィー：プロＭＭＰ−９のオリゴマー混合物を、４℃で平衡化および操作されるＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム（３００ｘ１０ｍｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に負荷した。サンプル体積が１．１ｍｇ／ｍｌのプロＭＭＰ−９の１００μｌであり、流速が０．５ｍｌ／分であった。溶出を２８０ｎｍでの吸光度によってモニターした。ストークス半径を、ＰｏｒａｔｈプロットおよびＬａｕｒｅｎｔ−Ｋｉｌｌａｎｄｅｒプロットの両方を使用して、校正曲線に関して溶出時間の分析によって求めた［Ｓｉｅｇｌｅ，Ｌ．Ｍ．およびＭｏｎｔｙ，Ｋ．Ｊ．（１９９６）、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１１２、３４６〜３６２］。校正曲線のために使用された、ストークス半径が知られている５個の標準タンパク質（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が、チログロブリン（８５Å）、フェリチン（６１Åｎｍ）、カタラーゼ（５２．２Å）、アルドラーゼ（４８．１Å）およびアルブミン（３５．５Å）であった。ブルーデキストランによって測定される空隙体積が１６．２３分の保持時間（ｔ０）を有し、ビタミンＢ−１２によって求められる総体積が３９．４４分の保持時間（ｔＴ）を有した。これらの値から、所与のタンパク質の分配係数（Ｋｄ）を、Ｋｄ＝（ｔｅ−ｔ０）／（ｔＴ−ｔ０）（式中、ｔｅは所与タンパク質の保持時間である）として計算した。非常に類似する結果がＰｏｒａｔｈプロットおよびＬａｕｒｅｎｔ−Ｋｉｌｌａｎｄｅｒプロットの両方について得られた。３回繰り返した実験についての保持時間における不確かさが平均で０．５％であった。線形最小二乗フィッティングはｒ２＝０．９７の相関係数をＰｏｒａｔｈプロットおよびＬａｕｒｅｎｔ−Ｋｉｌｌａｎｄｅｒプロットの両方について有した。
【０１２２】
グリセロール勾配での沈降：精製されたプロＭＭＰ−９のサンプル（０．２ｍｇ）を、緩衝液における（ＧｒａｄｉｅｎｔＭａｓｔｅｒ  ＢｉｏＣｏｍｐ（商標）で調製された）１０〜４５％のグリセロール勾配を含有する４本のポリアロマーチューブに重層した。その後、チューブを、ＳＷ４１ローターにおいて、４℃で６３時間、３７０００ｒｐｍで遠心分離した。その後、勾配物を０．５ｍｌのサンプルに分画化し、サンプルをゼラチンザイモグラフィー［Ｍａｓｕｒｅ，Ｓ．、Ｐｒｏｏｓｔ，Ｐ．、Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ，Ｊ．およびＯｐｄｅｎａｋｋｅｒ，Ｇ．（１９９１）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９８、３９１〜３９８］によってモノマー構造体および他のオリゴマー構造体の存在についてアッセイした。均一なモノマー構造体を含有する分画物をプールし、緩衝液に対して透析して、過剰なグリセロールを除いた。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して求めた。
【０１２３】
分析超遠心分離：沈降速度実験を、Ａｎ−５０Ｔｉローターを備えるＢｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＬ−Ａ分析超遠心分離で行った。実験を緩衝液Ｃにおいて２０℃で行った。タンパク質濃度が０．４ｍｇ／ｍｌであるサンプルを１２ｍｍの光路セルに入れ、５００００ｒｐｍで遠心分離した。２８０ｎｍにおける吸光度を、６〜７．３ｃｍの半径方向の範囲にわたって、０．００１ｃｍの半径方向の間隔を使用して１６０秒毎に記録した。
【０１２４】
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【０１２５】
ＡＦＭ画像化のためのアミン官能化基体の調製：これらの表面を、タンパク質を架橋し、かつ、タンパク質と結合するグルタルアルデヒドと相互作用する第一級アミン基のそれらの高濃度のために選択した。グルタルアルデヒドは、アミン表面基に対するアミド連結を形成する。グルタルアルデヒドのフリーアルデヒドが、タンパク質の外側表面に遍在するアミン基に対する共有結合性相互作用によって自発的にタンパク質を架橋する。したがって、タンパク質を表面に付けるために、操作または修飾を何ら必要としない。さらに、この方法は、表面におけるタンパク質の立体配座および配向におけるランダム分布をほんの最小限に乱すだけである。
【０１２６】
タンパク質と特異的に結合するために使用されるアミン官能化基体（Ｖｅｅｃｏ  Ｍｅｔｒｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ、部品番号ＦＳＵＢ−１１）の調製および特徴づけが簡単に記載される。１ｃｍ２のシリコンチップを、研磨された＜１１１＞ウエハー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗａｆｅｒ  Ｓｅｒｖｉｖｅ  ＩＮＣ．、デンマーク）からさいの目に切った。シリコンチップを、アミン官能化基体を作製するためにプラズマエンハンスト化学気相成長（４ｔｈ  Ｓｔａｔｅ，ＬＬＣ、Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）によってアミン末端シランにより修飾した。基体の表面組成を、アミン官能化の前および後の両方で、１４８６．６ｅＶでの単色化Ａｌｋ？Ｘ線源を伴うＫｒａｔｏｓ  Ａｘｉｓ  Ｕｌｔｒａ（Ｋｒａｔｏｓ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、英国）を使用してＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって分析した。アミン基（これはＸＰＳスペクトルにおける窒素ピークによって示される）が、アミン官能化の後でのみ、表面に存在した。処理された基体の二乗平均平方根（ＲＭＳ）表面粗さが、ＯＴＥＳＰプローブ（ＶＥＥＣＯ）を用いて空気中でタッピングモードを適用する原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）によって求められたとき、１．８Åであった。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）アッセイを使用して、アミン官能化基体の結合能を求めた。ＨＲＰ標識された抗体を、グルタルアルデヒド架橋剤を介してアミン官能化基体に固定化した。基体を超音波処理して、すべての結合していない抗体を除き、その後、ＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ１  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｓ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）により分析した。結合活性を、吸光度を４５０ｎｍで読み取ることによって求めた。
【０１２７】
タンパク質固定化手順：アミン化ダイを４℃でデシケーターにおいて保存した。使用直前に、プロＭＭＰ−９を、下記の手順によって、グルタルアルデヒド架橋剤を介してアミン官能化基体に固定化した：０．１Ｍ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ９）における１．２５％グルタルアルデヒドをアミン官能化基体の上で一晩インキュベーションした。その後、基体を炭酸ナトリウム溶液により徹底的に洗浄して、結合していないグルタルアルデヒドを除いた。モノマー形態を含有するように分画化されたプロＭＭＰ９ΔＯＧ変異体または野生型プロＭＭＰ−９の０．１ｍｇ／ｍｌの単分散溶液を含有する１００μｌのサンプル体積を、その後、ダイの上で３時間インキュベーションした。サンプルを、２００μｌの緩衝液により２回、続いて、２００μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水により５回、穏やかに洗浄し、最後に、窒素流のもとで乾燥した。グルタルアルデヒドは、アミン化表面へのタンパク質の共有結合架橋剤として役立った。これは、表面へのタンパク質分子の堅固な結合を洗浄およびその後の画像化の期間中に保証した。緩衝液中で行われるＡＦＭ実験のために、サンプルは、連続して水和されたまま維持された。
【０１２８】
ＳＡＸＳ曲線のアブイニシオモデル化：プログラムのＧＡＳＢＯＲ［Ｓｖｅｒｇｕｎ，Ｄ．Ｉ．、Ｐｅｔｏｕｋｈｏｖ，Ｍ．Ｖ．およびＫｏｃｈ，Ｍ．Ｈ．（２００１）、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ、８０、２９４６〜２９５３］およびＣＨＡＤＤ［Ｐｅｔｏｕｋｈｏｖ，Ｍ．Ｖ．、Ｅａｄｙ，Ｎ．Ａ．、Ｂｒｏｗｎ，Ｋ．Ａ．およびＳｖｅｒｇｕｎ，Ｄ．Ｉ．（２００２）、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ、８３、３１１３〜３１２５］を使用して、低分解能のモデルを作製した。プロＭＭＰ−９におけるグルコシル化を考慮に入れるために、１つのグリカンが、その電子密度および長さに従って、約１．６個のアミノ酸残基と等価であることを仮定した［Ｒｅｃｅｖｅｕｒ，Ｖ．、Ｃｚｊｚｅｋ，Ｍ．、Ｓｃｈｕｌｅｉｎ，Ｍ．、Ｐａｎｉｎｅ，Ｐ．およびＨｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．（２００２）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７、４０８８７〜４０８９２］。この値は、グリカンおよび残基の平均化された分子量との間における関係を表すことも見出された。その後、ＤＲの総数を、アミノ酸配列と、以前に特徴づけられたグリカン組成［Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｓｔｅｅｎ，Ｐ．Ｅ．、Ｖａｎ  Ａｅｌｓｔ，Ｉ．、Ｈｖｉｄｂｅｒｇ，Ｖ．、Ｐｉｃｃａｒｄ，Ｈ．、Ｆｉｔｅｎ，Ｐ．、Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｃ．、Ｍｏｅｓｔｒｕｐ，Ｓ．Ｋ．、Ｆｒｙ，Ｓ．、Ｒｏｙｌｅ，Ｌ．、Ｗｏｒｍａｌｄ，Ｍ．Ｒ．、Ｗａｌｌｉｓ，Ｒ．、Ｒｕｄｄ，Ｐ．Ｍ．、Ｄｗｅｋ，Ｒ．Ａ．およびＯｐｄｅｎａｋｋｅｒ，Ｇ．（２００６）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８１、１８６２６〜１８６３７］とに基づいて計算した。
【０１２９】
ランダム・モンテカルロ・フィッティング手法により一意解へのモデルの収束について調べるために、同じ入力パラメーターのいくつかのモデルをそれぞれの方法について作製した。これらのモデルを、最も確実な解を選ぶために、また、平均化された正規化空間不一致（ＮＳＤ）値をコンピューター計算するために、ＤＡＭＡＶＥＲ［Ｖｏｌｋｏｖ，Ｖ．Ｖ．およびＳｖｅｒｇｕｎ，Ｄ．Ｉ．（２００３）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、３６、８６０〜８６４］を使用して精査した（補足データの結果を参照のこと）。その後、末端ドメインの結晶構造［Ｅｌｋｉｎｓ，Ｐ．Ａ．、Ｈｏ，Ｙ．Ｓ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｗ．、Ｊａｎｓｏｎ，Ｃ．Ａ．、Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ，Ｋ．Ｊ．、ＭｃＱｕｅｎｅｙ，Ｍ．Ｓ．、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍ．Ｄ．およびＲｏｍａｎｉｃ，Ａ．Ｍ．（２００２）、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ、５８、１１８２〜１１９２；Ｃｈａ，Ｈ．、Ｋｏｐｅｔｚｋｉ，Ｅ．、Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．、Ｌａｎｚｅｎｄｏｒｆｅｒ，Ｍ．およびＢｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ，Ｈ．（２００２）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３２０、１０６５〜１０７９］を、ソフトウエアＳＵＰＣＯＭＢ［Ｋｏｚｉｎ，Ｍ．Ｂ．およびＳｖｅｒｇｕｎ，Ｄ．Ｉ．（２００１）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、４、３３〜４１］を使用して代表的モデルにおいてドッキングした。
【０１３０】
コラーゲン溶解活性のインサイチュザイモグラフィー分析：インサイチュザイモグラフィー［Ｄｅｓｈａｎｅ、２００３］を、６０ｎＭの抗ＭＭＰ９ｈｒ、または、対照のための対応する緩衝液、および、４５０ｎＭの標識されたコラーゲン（分子内で消光されるＯｒｅｇｏｎグリーン標識されたＩＶ型コラーゲン−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）とのヒト線維肉腫ＨＴ１０８０（ＣＣＬ−１２１；ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）細胞の３７℃での１６時間のインキュベーションによって行った。コラーゲンの分解により、正味のコラーゲン溶解活性を示す緑色蛍光が生じる。画像化の前に、サンプルを、核を標識するために３．８μｇ／ｍｌの最終濃度でＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）により染色した。サンプルを、ＣＣＤカメラ（ＤＭＸ１２００Ｆ；Ｎｉｋｏｎ）につながれたＰｌａｎ  Ｆｌｕｏｒ対物レンズを備える蛍光顕微鏡（Ｅ６００；Ｎｉｋｏｎ、東京、日本）によって調べ、写真撮影した。実験を６回繰り返した。像を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して組み立てた。
【０１３１】
（実施例１）
そのモノマー形態でのプロＭＭＰ−９の単離および特徴づけ
プロＭＭＰ−９モノマーの分子サイズおよび分子形状の決定、構造の再構築、ならびに、単分子像の分析では、単分散された均一なタンパク質サンプルが要求される。下記の実施例では、プロＭＭＰ−９のモノマー形態を発現させ、単離し、特徴づけるための様々な方法の組合せが記載される。分子半径の特徴づけを、分光学的形状決定の妥当性を確認するために使用した。
【０１３２】
結果
組換えプロＭＭＰ−９を、以前に報告されたように［１９］、発現させ、バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞から精製した（材料および方法を参照のこと）。この酵素は、モノマーおよび他の高次オリゴマー化学種の混合物を形成する［２０］。
【０１３３】
図１Ｂは、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって求められるような、そのオリゴマー化学種に対するプロＭＭＰ−９モノマーの相対的な分子比率を示す。クロマトグラムにおける主ピーク（Ｎｏ．３）がプロＭＭＰ−９モノマーを含み、ストークス半径が４５．４Åである（挿入図を参照のこと）。ストークス半径が、従来の手順を使用して、対応する保持時間に基づいて決定された。
【０１３４】
高次オリゴマー化学種からのプロＭＭＰ−９モノマーの調製的量での単離をグリセロール勾配沈降［２６］によって達成した。図１Ｃは様々な分画物のザイモグラフィー分析を示す。単離されたモノマー分画物を、そのストークス半径をさらに推定するための分析超遠心分離（ＡＵＣ）に供した（図１Ｄ）。この沈降速度実験において、一様なプロＭＭＰ−９溶液が重力場に供される。これは、メニスカス付近における溶質の枯渇、および、枯渇化した領域と、沈降しつつある溶質の一様な濃度との間における鮮明な境界の形成を生じさせる（図１Ｄ、挿入図）。この境界の移動速度を測定することができ、この境界の移動速度は、粒子の質量に直接に依存し、かつ、結果的には有効サイズおよび形状の尺度である摩擦比に逆比例的に依存する沈降係数の決定をもたらす。
【０１３５】
プロＭＭＰ−９モノマーが、サンプルにおける総タンパク質の９１％を表す主ピークを伴って単一化学種として沈降し、正規化された沈降係数（ｓ０２０，ｗ）が４．４Ｓであることが見出された（図１Ｄ）。この値は近年の測定［１９］と矛盾していない。４４．１Åのストークス半径が、０．７３２８ｃｍ３／ｇの計算された部分比容積を使用して、プログラムＳＥＤＮＴＥＲＰ［２７］によって計算された。ＡＵＣに基づく形状分析（実験の摩擦比を使用する場合）は、１：６の軸比（ａ／ｂ）を有する楕円形状を示した。ＡＵＣによって得られる分子半径の結果は、ＳＥＣによって得られる値（４５．４Å）と一致している。加えて、ＳＥＤＮＴＥＲＰによる半径の理論的推定は、プロＭＭＰ−９の分子量ならびにアミノ酸およびグリカン組成を使用する場合、２８．７Åの分子等価球半径をもたらした。実験によるストークス半径からのこの値のずれは、細長い空洞または合体している空洞のどちらかであるが、非球状の形状についての別の目安を提供する。
【０１３６】
（実施例２）
小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）によるプロＭＭＰ−９の分子形状分析は細長い三次元構造を明らかにする
結果
プロＭＭＰ−９モノマーの溶液中での全体的な立体配座がＳＡＸＳによって調べられた。ＳＡＸＳでは、散乱プロファイルが、ランダムに配向した分子の集団全体に由来し、（ほぼナノメートルの程度での）それらの平均化された立体配座に関する情報をもたらす。したがって、ＳＡＸＳは、高分子の取得困難な高品質の結晶を必要とする結晶学的構造分析とは異なり、溶液中のタンパク質を研究するための数少ない構造的技術の１つである。この方法は、標的分子の電子による入射Ｘ線光子の弾性散乱を利用する。分子における原子の配置によって支配されるような電子密度分布により、干渉パターンがもたらされる。その後、分子の三次元形状が散乱プロファイルから再構築される［２８］。
【０１３７】
散乱強度が、１４＜ｒ＜７８５Åのｄ間隔範囲に対応する０．００８＜ｑ＜０．４６Å−１の運動量移行範囲にわたって観測された（図２Ａ）。下方側の値（１４Å）により、測定で得ることができる最終的な分解能が決まる。散乱強度は、ｑが小さい領域では直線的であり（散乱プロファイル、図２Ａを参照のこと）、ギニエ則によって見事にフィッティングされる。傾きがタンパク質濃度と弱く相関することが見出された。このことは、凝集または粒子間干渉のどちらもシグナルに著しく寄与していないことを意味する。測定から得られる回転半径（Ｒｇ）が５０±２．７Åである。関数ｐ（ｒ）は分子内における原子間距離の分布を表す（対分布関数−図２Ａ、挿入図）。Ｒｇをｐ（ｒ）から求めることにより、匹敵する値（４９．２Å）が得られ、このことは、（フィッティング手順に先立つ）予備的なデータ分析が正確であることを示している。最大原子間距離（Ｄｍａｘ）が１６０Åである。ｐ（ｒ）の形状は細長い楕円構造を示す（例えば、［２９〜３１］を参照のこと）。
【０１３８】
プロＭＭＰ−９の三次元再構築モデルが、ＧＡＳＢＯＲ［３２］およびＣＨＡＤＤ［３３］のプログラムを使用して得られた。理論的な散乱曲線が、全体的なタンパク質形状を形成するために結合する、タンパク質の残基を表す球中心（またはダミー残基）の三次元配置からシミュレーションされる。最終的なタンパク質形状が、シミュレーションされた理論的曲線を実験データに対してフィッティングすることの繰り返しによって決定される。ＣＨＡＤＤの利点は、データ分析手順における制約を導入するために、単離されたドメインの利用可能な結晶構造から得られる演繹的知識の使用にある。対照的に、ＧＡＳＢＯＲによって作製されるモデルは、演繹的知識を何ら用いることなく計算される。ＣＨＡＤＤと、ＧＡＳＢＯＲとの間での詳細な比較が、本明細書中下記において実施例３に記載される。
【０１３９】
図２ＢはプロＭＭＰ−９の三次元の再構築された構造を示す。プロＭＭＰ−９の再構築された構造のストークス半径が、プログラムＨＹＤＲＯＰＲＯ［３４］を使用して計算された。この計算された半径は４４．９〜４７．１Åの間に及び、ＳＥＣおよびＡＵＣによってそれぞれ得られる４５．４Åおよび４４．１Åの測定された値と一致する。さらに、ＳＡＸＳモデル、および、ＡＵＣによって得られる軸比パラメーターはともに、細長い形状を示唆する。したがって、実験的ＳＡＸＳプロファイルから復元される再構築された形状は、ＳＥＣおよびＡＵＣの両方によって得られる測定された流体力学的データと一致している。
【０１４０】
この構造のシミュレーションされた曲線のフィッティング分析が図２Ａ（灰色曲線）に示される。プロ触媒ドメインのα炭素骨格の位置が構造再構築分析における制約として使用され、一方、ＯＧおよびヘモペキシン様ドメインが、ＣＨＡＤＤを使用して再構築された。最後に、プロ触媒ドメインの結晶構造［２２］およびヘモペキシン様ドメインの結晶構造［２４］が、ソフトウエアＳＵＰＣＯＭＢ［３５］を使用して、輪郭密度に対して連続してドッキングされた（図２Ｂ）。残っている密度が、これら２つの末端ドメインを約３０Åで隔てるＯＧドメインに属する。この値が、理論的なｐ（ｒ）曲線を、ソフトウエアＣＲＹＳＯＬ［３６］を使用して、単離されたＮ末端およびＣ末端ドメインの結晶構造に基づいて計算することによってさらに確認された。これらのドメインについての計算されたＤｍａｘ値がそれぞれ、８０Åおよび５０Åである。これらの値を全長プロＭＭＰ−９の実験的Ｄｍａｘ（１６０Å）から引くことにより、これらの末端ドメインが約３０Å離れている再構築された構造のさらなる確認がもたらされる。
【０１４１】
ＯＧおよびヘモペキシン様ドメインによって占められる体積を精査することにより、それらは、類似する体積であることが明らかにされる。しかしながら、Ｏ−グリカンを含むＯＧドメインの計算された分子量はヘモペキシン様ドメインの約半分である。ＰＯＮＤＲ［３７］を使用するＯＧドメインのコンピューター計算による配列分析では、この領域が、他のドメインと比較して、著しく乱れていることが明らかにされた（図２Ｃ）。したがって、その観測されたコンパクトな立体配座にもかかわらず、このプロリンリッチなＯＧドメインは、比較的低い密度の乱れた構造を有する。したがって、ＳＡＸＳによって検出されるＯＧドメインの比較的嵩高い電子密度は、溶液中においてこのリンカーペプチドによって保持される様々な立体配座を表す。このことは、ＯＧリンカードメインが柔軟であることを示唆する。構造モデル化プログラムＲＡＰＰＥＲ［３８、３９］が、観測された散乱プロファイルおよび密度マップに合致する可能なリンカーの立体配座をモデル化するために使用された。具体的には、５００個の計算された立体配座異性体のうちの８個がリンカーのＳＡＸＳモデルに合致する。理論的な散乱曲線が、全体的なプロＭＭＰ−９モデル構造について（ＳＡＸＳプログラムＣＲＹＳＯＬ［３６］を使用して）計算された。図２Ｄおよび２Ｅは、プロＭＭＰ−９の実験的散乱曲線およびＳＡＸＳ密度マップの両方に合致する最も良好なリンカーモデルを記述する。ＯＧリンカーは、多数の推定される構造化されない立体配座を示すようである。
【０１４２】
（実施例３）
ＳＡＸＳデータを分析するためのモデル化ソフトウエアの比較
結果
プログラムのＧＡＳＢＯＲ［Ｓｖｅｒｇｕｎ，Ｄ．Ｉ．、Ｐｅｔｏｕｋｈｏｖ，Ｍ．Ｖ．およびＫｏｃｈ，Ｍ．Ｈ．（２００１）、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ、８０、２９４６〜２９５３］およびＣＨＡＤＤ［Ｐｅｔｏｕｋｈｏｖ，Ｍ．Ｖ．、Ｅａｄｙ，Ｎ．Ａ．、Ｂｒｏｗｎ，Ｋ．Ａ．およびＳｖｅｒｇｕｎ，Ｄ．Ｉ．（２００２）、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ、８３、３１１３〜３１２５］を使用して、プロＭＭＰ−９の低分解能モデルを作製した。両方のプログラムでは、測定された散乱曲線を再現する球状の散乱中心の３Ｄ配置によるタンパク質の表示が見出される。ＣＨＡＤＤの利点は、単離されたドメインの結晶構造によって決定されるようなＣα位置の一部分の演繹的知識の使用にあり、一方、分子の残りがモデル化される。これに対して、ＧＡＳＢＯＲは、演繹的知識を取り込むことなく、構造全体をモデル化する。これらのプログラムのそれぞれにおいて、いくつかの独立したコンピューター計算が、解構造の集束を分析するために比較される。
【０１４３】
８回の独立したＧＡＳＢＯＲ計算は、一方の端部がより大きいサイズであり、Ｎ末端ドメインの結晶構造を有することができ、これに対して、反対側の端部が、Ｃ末端ドメインの結晶構造を受け入れることができる円板様形状を取る細長い全体的な立体配座の一意解に集束した（図５Ａ）。これらの末端ドメインが、プログラムＳＵＰＣＯＭＢ［Ｋｏｚｉｎ，Ｍ．Ｂ．およびＳｖｅｒｇｕｎ，Ｄ．Ｉ．（２００１）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、３４、３３〜４１］を使用してＧＡＳＢＯＲモデルにドッキングされた。残っている密度が、これらの末端ドメインを、ＯＧドメインの長さとして理解される５０Åで隔てるＯＧドメインに属する。８回の計算における正規化された空間不一致（ＮＳＤ）が１．４２から１．５７にまで及んでいた。ＮＳＤ値は解構造間における類似性の尺度である。すなわち、より低い値が、より良好な重なりに対応する。ＮＳＤ値が、最確解（χ２＝１．３８）を選ぶことができるＤＡＭＡＶＥＲ［Ｐｅｔｏｕｋｈｏｖ，Ｍ．Ｎ．およびＳｖｅｒｇｕｎ，Ｄ．Ｉ．（２００３）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、３６、５４０〜５４４］を使用して、また、外れ値を決定するために計算された。
【０１４４】
既知の構造情報を使用する、代わりのモデル化スキームにおいて、全長のプロＭＭＰ−９構造が、ＣＨＡＤＤを使用して再構築された。１１個の独立した計算がコンピューター計算され、外れ値を伴わない１．５９〜１．７５のＮＳＤ値を示した。このことは、一意モデルに向かう解の集束を示唆する。最確解（χ２＝１．６６）が図５Ｂに示される。このモデルは、比較的低い密度のＯＧドメインによってつながれた円板様ドメインを有する大きい二峰形状を示す細長い３−ドメイン構造を示している。プロ触媒ドメインおよびヘモペキシンドメインの結晶構造が、ソフトウエアＳＵＰＣＯＭＢ［Ｋｏｚｉｎ，Ｍ．Ｂ．およびＳｖｅｒｇｕｎ，Ｄ．Ｉ．（２００１）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、３４、３３〜４１］を使用して輪郭密度に連続してドッキングされた。残っている密度が、これら２つの末端ドメインを、ＣＲＹＳＯＬによってコンピューター計算されるようなＯＧドメインの理論的サイズとよく一致する値である約３０Åで隔てるＯＧドメインに属する。
【０１４５】
２つの独立したモデル化アルゴリズムによって得られるこれら２つの構造は、いくつかの計算が一意解に集束したことの結果である。１．６８のＮＳＤ値が、ＧＡＳＢＯＲモデルと、ＣＨＡＤＤモデルとの間における類似性を調べるために得られた。このことはモデル間の良好な一致を示している。ＧＡＳＢＯＲモデルは（３０Åとは対照的に５０ÅのＯＧドメインにより）かなり細長いが、両方のモデルは、非常に類似する特徴をともに有する。すなわち、リンカーによってつながれる２つのかなり球状のドメイン（ＯＧリンカーによって結ばれる楕円状のＮ末端およびＣ末端ヘモペキシン）が、リンカーによってつながれる２つのかなり球状のドメインから構成される全体的な細長い構造をもたらす。ＯＧドメインのサイズが、ＣＲＹＳＯＬによってコンピューター計算された値と一致すること、および、ＡＦＭ結果に対する全体的形状における類似性により、結果的に本発明者らは、ＣＨＡＤＤをより信頼できるモデルとして選択した。
【０１４６】
（実施例４）
単分子画像化によるプロＭＭＰ−９の形状およびドメイン柔軟性の特徴づけ
結果
ＳＡＸＳ分析をさらに確認するために、本発明者らは、図２Ｂおよび２Ｅにおいて予測されるように、プロＭＭＰ−９の形状を直接に可視化し、また、そのＯＧドメインの分子特性を評価するための実験を設計した。具体的には、本発明者らは、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用して、プロＭＭＰ−９の野生型およびＯＧ欠失変異体（プロＭＭＰ−９？ＯＧ）の単分子画像化分析を行った。プロＭＭＰ−９分子１つ１つの再現性ある像（図３）が、タンパク質サンプルを、ＡＦＭ画像化の前に、Ｓｉ（１１１）表面のアミン修飾されたシラン化層に架橋することによって得られた。
【０１４７】
サンプルを緩衝液下および空気中の両方で画像化した（図６Ａ〜６Ｃ）。最も良好な像が、「スパイク」先端を使用して半乾燥モードで得られた。図３Ａ〜３Ｃは、修飾されたＳｉ（１１１）表面に固定化された野生型プロＭＭＰ−９の単分子像を示す。報告されているＳＡＸＳ分析と一致して、タンパク質像は細長いマルチドメイン構造を有する。幅に対する高さを表す像断面（図３Ｃ）は、ＯＧリンカーによっておそらくはつながれる２つの離れたタンパク質ドメインを明らかにする。対照的に、６４残基のＯＧドメインを欠くプロＭＭＰ−９？ＯＧ変異体は、ドメイン分離が未解明であるかなり球状の形状を示す（図３Ｄ〜３Ｆ）。
【０１４８】
（実施例５）
プロＭＭＰ−９の原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）画像化のための条件およびコントロールの選択
結果
サンプルを緩衝液下および空気中の両方で画像化した。前者のモードは生理学的条件に近いが、像の画質が不良であった（図６Ａ）。像の不良な画質はいくつかの要因から生じ得る：（１）湿潤条件のために使用されるように設計された先端は、周囲条件で使用される「スパイク」先端よりも著しく大きい半径を有していた。（２）完全に水和されたサンプルは、先端圧力のもとではより軟らかく、より変形し易くなり得る。（３）表面に対するタンパク質の結合は依然として、完全に水和された条件下である程度の動きを可能にし得る。したがって、像の画質を改善するために、サンプルが洗浄され、過剰な水が２〜３分の穏やかな窒素流によって除かれた周囲条件が適用された。この手順は薄い水和層をサンプル上に残す可能性があり、したがって、「半乾燥モード」と呼ばれる。水和層が何ら存在しない場合のタンパク質の形状を調べるために、本発明者らは、微細特徴の喪失、タンパク質の収縮、および、断面における像ノイズをもたらした徹底的な乾燥を適用した（図６Ｂ）。
【０１４９】
これらの半乾燥測定において主に困難なことは、偽の吸着物（主に、塩の堆積）に由来する人為物を含まないサンプルを得ることであった。徹底した洗浄手順が、そのような吸着物を除くために要求され、しかし、これはまた、タンパク質の多くの除去を引き起こした。アミン修飾シラン表面および架橋手順を使用することによって、（ブランク操作によって明らかにされるような）バックグラウンドのほぼすべてが除かれ、同時に、完全に水和された条件のもとで認められるタンパク質の表面濃度と類似する、タンパク質の著しい表面濃度を維持する表面を調製することが可能であった。サンプルと同一条件ではあるが、プロＭＭＰ−９の非存在下でのインキュベーションによって調製されたブランク（図６Ｃ）は、典型的には、１μｍ２の像において最大でも１つの特徴を含有する。プロＭＭＰ−９を伴うサンプルとの比較により、平均で、観測された特徴の５％未満が、破片または乾燥した塩に起因する人為物であった可能性があることが示された。
【０１５０】
ＡＦＭ画像の統計学的分析：高さ、幅およびローブ間距離の統計学的分析が野生型プロＭＭＰ−９およびプロＭＭＰ−９？ＯＧについて明らかにされた。これらのデータがヒストグラムとして図４Ａ〜４Ｅに示され、本明細書中下記の表１にまとめられる。２つの部分集団の存在はバイアスを平均値に加え得るので、最確値が報告される。標準偏差が括弧で報告される。値は野生型プロＭＭＰ−９（ｎ＝９０）およびプロＭＭＰ−９ΔＯＧ変異体（ｎ＝１２０）に対応する。ローブ間距離がＸＺ断面でのピーク間で測定された。値が、表面におけるタンパク質の配向が２つの明瞭なドメインの特定を可能にした場合にだけ得られた（ｎ＝８３）。プロＭＰ−９ΔＯＧにおけるローブ間の分離は識別することができなかった。
【０１５１】
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【０１５２】
最確高の値が、野生型および変異体についてそれぞれ、３４Åおよび２２Åであった。結晶構造［Ｅｌｋｉｎｓ，Ｐ．Ａ．、Ｈｏ，Ｙ．Ｓ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｗ．、Ｊａｎｓｏｎ，Ｃ．Ａ．、Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ，Ｋ．Ｊ．、ＭｃＱｕｅｎｅｙ，Ｍ．Ｓ．、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍ．Ｄ．およびＲｏｍａｎｉｃ，Ａ．Ｍ．（２００２）、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ、５８、１１８２〜１１９２；Ｃｈａ，Ｈ．、Ｋｏｐｅｔｚｋｉ，Ｅ．、Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．、Ｌａｎｚｅｎｄｏｒｆｅｒ，Ｍ．およびＢｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ，Ｈ．（２００２）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３２０、１０６５〜１０７９］から得られる可能な高さ値との比較では、表面との相互作用から生じ得るタンパク質像の平坦化、または、ＡＦＭ先端の真下での構造の何らかの圧縮が示唆される。図４Ａのヒストグラムの形状は、野生型タンパク質が、分布における１つだけのピークを有するＯＧ欠失変異体（図４Ｂ）とは対照的に、２つの部分集団に分布することを明らかにする。最確幅の値が、野生型（図４Ｃ）およびプロＭＭＰ−９？ＯＧ（図４Ｄ）についてそれぞれ、１９０Åおよび１３０Åであった。この違いは、ＯＧドメインが野生型タンパク質の幅に対して著しく寄与していることを示している。高さの値および幅値における広がりの一部が、表面に対するタンパク質の異なる結合立体配置の結果として生じることが予想される。タンパク質が球状でないので、主軸が表面の法線に関して種々の角度で配向する結合状態により、ＡＦＭによって測定されるような異なる最大高さおよび最大幅がもたらされる。したがって、高さがこの角度のコサインとして変化し、幅がこの角度のサインとして変化する。
【０１５３】
最確ローブ間距離の値が、野生型プロＭＭＰ−９については７８Åであった（図４Ｅ）。この距離は、ＳＡＸＳによって得られるローブ間の値に劣ることなく匹敵する。ＳＡＸＳモデルから得られる可能な値の範囲は、個々のドメインの許容される配向に依存して、７５〜８７Åの範囲である。
【０１５４】
（実施例６）
ＳＡＸＳを伴う単分子画像化の統計学的分析は、ＯＧドメインにより媒介されるタンパク質ドメインの柔軟性を明らかにする
結果
２つの酵素種を対比する際立った特徴の１つが、野生型についての幅値および高さ値の両方における広がりが変異体の場合よりも著しく大きいことである（図４Ａ〜４Ｅ）。そのような差が、２つのローブがより大きく制限される変異体とは対照的に、ＯＧドメインによって野生型構造に与えられるさらなる自由度から生じ得る。サイズの不均一性が、２つの主要な変数から、すなわち、表面におけるタンパク質の種々の配向、および、種々のタンパク質立体配座から生じる。変異体はＯＧドメインを含有しないため、低下した立体配座不均一性を有する。このことは、値の広がりが、主として表面における種々の配向に由来することを意味する。
【０１５５】
タンパク質柔軟性に対するＯＧドメインの影響が、ローブ間距離の測定を報告する図４Ｅにおいて明瞭に認められる。距離の広がりが５５Åから８５Åにまで及び、２つの部分集団に分けることができる。注目すべきことに、これらの結果は、ＯＧドメインの柔軟な分子的性向によって媒介される多数の酵素立体配座の存在を裏付けている。図４Ｆは、推定ローブ間距離に基づく様々なタンパク質立体配座のいくつかの可能なモデルを示す。ローブ間距離は、１標準偏差（９．５Å）の範囲内で変化することが可能であった。図４Ｆに示される様々なＯＧドメイン立体配座は、構造モデル化プログラムＲＡＰＰＥＲ［３８、３９］を使用して計算された。
【０１５６】
プロＭＭＰ−９のタンパク質柔軟性が、この新たな分子分析によって検出されたため、プロＭＭＰ−９のタンパク質柔軟性は、ゼラチナーゼＡ／ＭＭＰ−２を含めて、ＭＭＰファミリーの他のメンバーを上回るプロＭＭＰ−９の構造・機能の独特さを強調する、この酵素の全体的構造および動力学に対する新しい分子的見識をもたらす［２１］。例えば、コラゲナーゼ−１／ＭＭＰ−１では、はるかに短いリンカー領域の柔軟性が、ヘモペキシンドメイン、プロドメイン間における相互作用によってさらに制約される［４０］。同様に、ＭＭＰ−２では、ヘモペキシンドメインの２番目のブレードが水素結合によりフィブロネクチンドメインに連結される（Ｍｏｒｇｕｎｏｖａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９）。
【０１５７】
（実施例７）
プロＭＭＰ−９の酵素機能におけるタンパク質ドメイン柔軟性の役割
結果
ＭＭＰ−９は分泌型酵素であり、ＭＭＰ−９がどのようにその正しい場所に標的化され、また、その活性がどのように細胞周囲空間において制御されるか［４１］は不明である。具体的には、様々なドメインの役割が、効果的なタンパク質−基質およびタンパク質−タンパク質相互作用を触媒反応期間中に媒介することにおいて何であるかが明らかではない。ここで報告されるプロＭＭＰ−９の全長構造は、新たな見識をこの酵素の構造に導入し、また、その明らかなドメイン柔軟性に導入する。具体的には、報告されている結果は、ＭＭＰ−９における観測されたタンパク質柔軟性が、その機能を媒介するために要求されるという可能性を増大させる。
【０１５８】
ＯＧドメインの寄与が、より初期の研究では、末端ドメインの独立した動きを可能にするスペーサー成分であると主張された［１９、４２、４３］。興味深いことに、すべての利用可能なデータベースのバイオインフォマティクス“ＢＬＡＳＴ”検索［４４、４５］では、プロＭＭＰ−９におけるＯＧドメインが、数多くの細胞表面会合およびＥＣＭ結合タンパク質における類似する乱れたドメインに対して相同的であることが明らかにされた（本明細書中下記の表２を参照のこと）。表２に報告される結果は設定省略時Ｅ値の閾値を越えている。同一性および類似性の値は百分率である。
【０１５９】
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【０１６０】
注目すべきことに、近い構造的相同性が、プロＭＭＰ−９のＯＧリンカーおよび全体的なドメイン構成と、真菌セルラーゼとの間に見出された［２９、３１］。真菌セルラーゼについては、セルラーゼにおけるリンカーの役割が、タンパク質−セルロースの結合および無傷なマトリックスにおける酵素の移動を媒介することであると提案された。このことは、プロＭＭＰ−９がその生物学的機能および酵素活性を細胞表面会合および／または固体基質（例えば、ＥＣＭ）との相互作用によって媒介することを示唆する。近年、Ｏｗｅｎらは、好中球の細胞表面でのＴＩＭＰ−１抵抗性のＭＭＰ−９活性を記載した［４６］。ＭＭＰ−９ヘモペキシンドメインを細胞につなぎ止めることを達成するための１つの方法は、細胞表面でのＭＴ６−ＭＭＰ／ＴＩＭＰ−１複合体の相互作用を介してであり得る。今回のデータは、ＯＧドメインの柔軟性により、ＭＭＰ−９のＮ末端が細胞周囲環境において複雑な基質ネットワーク（例えば、コラーゲン様分子）に接近することが可能になることを示唆する。そのようなタンパク質−基質相互作用の安定化が、ＭＭＰ−９のＯＧドメインに存在するプロリンリッチ配列［４７］によって媒介される非特異的なタンパク質−タンパク質相互作用によって達成され得る。対照的に、プロＭＭＰ−９におけるヘモペキシン様ドメインおよびフィブロネクチンドメインは、非常に高い親和性で基質と化学量論的に結合することが示された［４８、４９］。このことは、プロＭＭＰ−９がその基質との特異的および非特異的な相互作用の両方によりその触媒活性を媒介することを示唆する。この分子シナリオでは、２つの末端ドメインが基質特異性を提供し、一方、柔軟なＯＧドメインが、例えば、コラーゲンタイプの基質の三次構造を弱い非特異的な相互作用により脱安定化するために使用される。
【０１６１】
重要なことに、ＴＩＭＰ−１、ＬＲＰ−１およびメガリンとの正しい相互作用では、ＯＧドメインの関与が、ヘモペキシン様および触媒ドメインの適正な配向を達成するために要求される［１９］。ＯＧ欠失変異体は、これらの分子に対する低下した親和性を示した。このことは、ＯＧドメインが、活性なＭＭＰ−９の生物学的利用性を調節するために必須であることを示唆する。単分子画像化の結果は、末端ドメイン間の間隔が一定でないことを示しているが、ＳＡＸＳモデル再構築によって得られるようなＯＧドメインの擬似球状形状は２つのドメインの間における最小の分離を保証し、これにより、調節剤が、Ｎ末端の触媒ドメインからの立体障害を伴うことなくＣ末端ドメインに結合することを可能にする。そのようなドメイン柔軟性がＭＭＰ−２については観測されない。このことから、ＬＲＰ−１に対する効果的な結合を達成するために、なぜＭＭＰ−９はＬＲＰ−１に直接に結合することができ、一方、ＭＭＰ−２は、ＴＩＭＰ−２との前駆体複合体の形成［５０］、または、トロンボスポンジンとの前駆体複合体の形成［５１］を要求するのかを説明することができる。
【０１６２】
ＭＭＰ−９のコラーゲン溶解活性におけるＯＧドメインの役割を調べるために、インサイチュ阻害アッセイを行った。抗ＭＭＰ−９−ヒンジ領域を使用した（Ｓｉｇｍａ、ＣｈｅｍｉｃｏｎおよびＡｂｃａｍの３つの異なる供給元から得られる抗ＭＭＰ−９ｈｒ）。この市販されている抗体は、ＯＧドメイン内のペプチドに対して惹起された。使用された基質が、増大した蛍光を分解時に示す蛍光標識されたＩＶ型コラーゲンであった。図７Ａ〜７Ｂは、抗体が、ＯＧドメインの柔軟性を妨げること、または、インサイチュザイモグラフィーによって示されるような酵素−基質の接触を乱す立体障害のどちらかによって、コラーゲン溶解活性をダウンレギュレーションすることを示す。
【０１６３】
蛍光標識されたＩＶ型コラーゲンがＭＭＰ−２／９産生細胞のＨＴ−１０８０に重ねられた。この細胞株によって産生されるＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９はともにＩＶ型コラーゲンを分解することができ、しかしながら、精製されたＭＭＰの７０％超が、ＭＭＰ−２に関して、ＩＶ型コラーゲンに対する４倍の比活性を示すＭＭＰ−９であることが示された。コラーゲン溶解活性を、抗ＭＭＰ−９ｈｒの存在下（図７Ａ）または非存在下（図７Ｂ）、細胞の周辺部で調べた。抗ＭＭＰ−９ｈｒを加えたとき、コラーゲン溶解活性が、基準物の拡散し得る活性との比較では、より大きく制限される。
【０１６４】
まとめると、ＯＧドメインに影響を及ぼすことはコラーゲン溶解能を低下させるが、ゼラチン溶解活性は影響されないことが仮定され得る。
【０１６５】
結論
本研究は、構造分析の新たな組合せによって明らかにされる全長のヒトプロＭＭＰ−９の最初の実験的構造決定を表す。単分子画像化およびＳＡＸＳの組合せが、この重要な酵素に対する構造的および動力学的な見識をもたらす包括的な分子モデルを得るために利用された。注目すべきことに、今回の結果は、触媒酵素コアと、ヘモペキシンドメインとをつなぐ柔軟かつ構造化されていないＯＧドメインの存在を明らかにする。この構造は、他のファミリーメンバーと比較して、特有なドメイン構造様式をプロＭＭＰ−９にもたらす。そのような構造的排他性を、ＭＭＰ−９についてのイソ型選択的阻害剤を設計するために利用することができる。ＭＭＰ−９についての調節剤の設計では、目標を、そのドメイン柔軟性を制限することに向けることができ、これにより、その病理学的活性を特定の疾患状態において阻止することができる。
【０１６６】
明確にするため別個の実施形態で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０１６７】
本発明はその特定の実施形態によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本明細書中で言及した刊行物、特許および特許願ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はすべて、個々の刊行物、特許もしくは特許願またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【０１６８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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