(57)【要約】  転写因子デコイ、組成物および方法。シス調節配列およびデコイ配列を同定および使用するための組成物および方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の抗生物質耐性を修飾する方法におけるデコイポリヌクレオチドの使用であって、前記方法は、
（ａ）転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチド（デコイ配列）を提供すること；および
（ｂ）前記ポリヌクレオチドを、前記転写因子の結合部位を含むシス調節配列に機能的に結合した遺伝子を含む細胞に導入することを含み；
前記ポリヌクレオチドの導入は、前記細胞における前記シス調節配列への前記転写因子の結合を減少させ、前記細胞における前記機能的に結合した遺伝子の発現の変更をもたらし、これにより前記細胞の抗生物質耐性を修飾する、使用。
【請求項２】
前記細胞において前記シス調節配列に機能的に結合した前記遺伝子が、抗生物質に対する耐性をコードする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
アミノグリコシド；カルバペネム；セファロスポリン；糖ペプチド；ペニシリン；ポリペプチド系抗生物質；キノリン；スルホンアミド；またはテトラサイクリンの１種以上から選ばれる抗生物質に対する耐性を修飾するための、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記抗生物質が、カナマイシン、メロペネム、セフェピム、バンコマイシン、ダプトマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ペニシリン、ポリミキシシンＢ、レバクイン、バクトリム、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、リファンピシン、およびザイボックスの１種以上から選ばれる、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記シス調節配列に機能的に結合した前記遺伝子が、バンコマイシンに対する耐性をコードする、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記転写因子がＶａｎＲ転写因子である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記細胞が、
（ａ）抗生物質耐性の非病原性モデル；または
（ｂ）病原体である、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記細胞が、
（ａ）アクチノミセス；ストレプトミセス；ミコバクテリウム；クロストリジウム；バチルス；リステリア；スタフィロコッカス；ストレプトコッカス；エンテロコッカスから選ばれる属のグラム陽性菌；あるいは
（ｂ）腸内菌；シュードモナス；モラクセラ；ヘリコバクター；ステノトロフォモナス；ブデロビブリオ；酢酸菌；レジオネラ；シアノバクテリア；スピロヘータ；緑色硫黄細菌；および緑色非硫黄細菌から選ばれる属のグラム陰性菌である、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記細胞が、ヒト型結核菌；ウシ型結核菌；マイコバクテリウム・アフリカヌム；マイコバクテリウム・ミクロティ；癩菌；クロストリジウム・ディフィシル；ボツリヌス菌；クロストリジウム・パーフリンジェス；破傷風菌；サルモネラ属の種；大腸菌；エンテロコッカス・フェシウム；エンテロコッカス・フェカリス；淋菌；髄膜炎菌；モラクセラ・カタラリス；インフルエンザ菌；肺炎桿菌；レジオネラ・ニューモフィラ；緑膿菌；ミラビリス変形菌；汚物腸内菌；セラチア菌；ピロリ菌；腸炎菌；およびチフス菌から選ばれる病原体である、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記細胞が、バンコマイシン耐性病原体またはバンコマイシン耐性の非病原性モデルである、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記デコイポリヌクレオチドにおける前記転写因子結合部位が、遺伝子に機能的に結合していない、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記デコイポリヌクレオチドが、環状二本鎖ＤＮＡもしくは直鎖オリゴヌクレオチド；および／または二次構造の少なくとも１種のエレメント；および／または前記転写因子結合部位の１個より多いコピー；および／または結合部位に付加的な配列；および／または前記ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる修飾された塩基もしくは糖；および／またはプラスミドもしくはプラスミドライブラリー含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記デコイポリヌクレオチドが環状ダンベルを含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記デコイポリヌクレオチドが前記結合部位の複数のダイレクトリピートを含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記デコイポリヌクレオチドが、少なくとも１つの５’コレステロール修飾を有する直鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
前記デコイポリヌクレオチドがプラスミドを含む、請求項１２に記載の使用であって、前記プラスミドはスネア配列を含むモノマー配列の１つ以上のコピーを有し、前記スネア配列は前記転写因子結合部位を含み、当該結合部位は遺伝子に機能的に結合していない、使用。
【請求項１７】
前記プラスミドが、
（ａ）前記モノマー配列の２つ以上もしくは少なくとも１０、２０もしくは３０のコピー；および／または
（ｂ）前記モノマー配列のタンデムリピートを含む、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記モノマーがさらに、
（ａ）ローリングサークル増幅における使用に適したプライマーの結合部位；および／または
（ｂ）１種以上の制限酵素の認識部位および／または切断部位を含む、請求項１６または１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記モノマーが、１０〜１０００個または１０〜５００個のヌクレオチドを含む、請求項１６〜１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
前記スネア配列が、１０〜３０個のヌクレオチドまたは１５〜２０個のヌクレオチドを含む、請求項１６〜１９のいずれかに記載の使用。
【請求項２１】
前記プラスミドが、広範な宿主範囲および／またはシャトルベクターであり、かつ／または高コピー数プラスミドである、請求項１６〜２０のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
前記デコイポリヌクレオチドにおける前記転写因子結合部位が、配列番号２１または配列番号２６の配列を含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチドであって、前記転写因子が、原核生物または真核生物における１種以上の抗生物質耐性遺伝子の発現のレギュレーターであり、前記デコイポリヌクレオチドにおける前記結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、デコイポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項１２〜２２のいずれかで定義された、請求項２３に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項２５】
モノマー配列の１つ以上のコピーを含むプラスミドであって、前記モノマー配列が転写因子結合部位を含むスネア配列を含み、前記結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、プラスミド。
【請求項２６】
（ａ）前記モノマー配列の２つ以上もしくは少なくとも１０、２０もしくは３０のコピー；および／または
（ｂ）前記モノマー配列のタンデムリピートを含む、請求項２５に記載のプラスミド。
【請求項２７】
前記モノマーがさらに、
（ａ）ローリングサークル増幅における使用に適したプライマーの結合部位；および／または
（ｂ）１種以上の制限酵素の認識部位および／または切断部位を含む、請求項２５または２６に記載のプラスミド。
【請求項２８】
前記モノマーが、１０〜１０００個または１０〜５００個のヌクレオチドを含む、請求項２５〜２７のいずれかに記載のプラスミド。
【請求項２９】
前記スネア配列が、１０〜３０個のヌクレオチドまたは１５〜２０個のヌクレオチドを含む、請求項２５〜２８のいずれかに記載のプラスミド。
【請求項３０】
請求項２５〜２９のいずれかに記載のプラスミドであって、前記プラスミドが、広範な宿主範囲および／またはシャトルベクターであり、かつ／または高コピー数プラスミドである、プラスミド。
【請求項３１】
原核細胞で使用するための、請求項２５〜３０のいずれかに記載のプラスミド。
【請求項３２】
前記転写因子結合部位が、原核生物または真核生物における抗生物質耐性をコードする遺伝子の発現を調節するシス調節配列を含むかまたは転写因子結合をめぐって前記シス調節配列と競合する、請求項２５〜３１のいずれかに記載のプラスミド。
【請求項３３】
前記遺伝子が、アミノグリコシド；カルバペネム；セファロスポリン；糖ペプチド；ペニシリン；ポリペプチド系抗生物質；キノリン；スルホンアミド；またはテトラサイクリンの１種以上から選ばれる抗生物質に対する耐性をコードする、請求項３２に記載のプラスミド。
【請求項３４】
前記抗生物質が、カナマイシン、メロペネム、セフェピム、バンコマイシン、ダプトマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ペニシリン、ポリミキシシンＢ、レバクイン、バクトリム、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、リファンピシン、およびザイボックスの１種以上から選ばれる、請求項３３に記載のプラスミド。
【請求項３５】
前記転写因子がＶａｎＲ転写因子である、請求項３４に記載のプラスミド。
【請求項３６】
前記転写因子結合部位が、配列番号２１または配列番号２６の配列を含む、請求項３５に記載のプラスミド。
【請求項３７】
請求項２５〜３６のいずれかに記載の２種以上のプラスミドを含むプラスミドライブラリーであって、前記ライブラリーにおけるスネア配列が全体として、原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡにおけるまたはゲノムＤＮＡの断片におけるすべてまたは実質的にすべてのシス調節配列を含む、プラスミドライブラリー。
【請求項３８】
前記ゲノムＤＮＡまたはその断片が、抗生物質耐性をコードする遺伝子を含む、請求項３７に記載のプラスミドライブラリー。
【請求項３９】
請求項２５〜３６のいずれかに記載の２種以上のプラスミドを含むプラスミドライブラリーであって、各プラスミドにおけるスネア配列は、長さがｎのヌクレオチドのランダム化ヌクレオチドの配列を含み、前記ライブラリーにおいて長さがｎのヌクレオチドのヌクレオチド配列が実質的にすべて表される、プラスミドライブラリー。
【請求項４０】
モノマー配列の１つ以上のコピーを有するプラスミドを調製する方法であって、
（１）下記（ｉ）および（ｉｉ）を含む環状オリゴヌクレオチドを提供すること、
（ｉ）転写因子結合部位を含む、対象となる試験配列、および
（ｉｉ）ローリングサークル増幅における使用に適したプライマーの結合部位（前記モノマー配列は（ｉ）および（ｉｉ）を含む）；
（２）テンプレートとして前記環状オリゴヌクレオチドを使用するローリングサークル増幅を行うこと、これにより前記モノマー配列のリピートを含むポリヌクレオチドを提供すること；ならびに
（３）プラスミドベクターへ前記ポリヌクレオチドをクローニングすること、を含む方法。
【請求項４１】
工程（１）が、
−対象となる試験配列（ｉ）およびローリングサークル増幅における使用に適したプライマーの結合部位（ｉｉ）を含む直鎖一本鎖オリゴヌクレオチドを提供すること；
−前記オリゴヌクレオチドを環化すること；
−任意に、残存する直鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼで消化すること；ならびに
−モノマー性の環状オリゴヌクレオチドを回収すること、を含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項２５〜３６のいずれかに記載のプラスミドまたは請求項３７〜３９のいずれかに記載のプラスミドライブラリーを調製するための請求項４０または４１に記載の方法であって、前記対象となる試験配列（ｉ）は、前記転写因子結合部位を含む、方法。
【請求項４３】
各プラスミドがモノマー配列の１つ以上のコピーを含み、各モノマー配列がゲノムＤＮＡに由来するスネア配列を含む、ゲノムＤＮＡのサンプルからプラスミドライブラリーを調製する方法であって、
（１）抗生物質耐性をコードする遺伝子を含む二本鎖ゲノムＤＮＡのサンプルを提供すること；
（２）前記ゲノムＤＮＡを断片化すること；
（３）（２）からのＤＮＡ断片の各末端へアダプターをライゲーションすること、ここで各アダプターは下記のものを含む、
（ｉｉｉ）前記ＤＮＡ断片の固定化のための手段、
（ｉｖ）認識部位から距離をおいて切断する第１の制限酵素の認識部位、および
（ｖ）第２の制限酵素の認識部位および切断部位；
（４）任意に、ライゲーションされていないアダプターを除去すること；
（５）第１の制限酵素により前記アダプターを持つ断片を消化し、これにより２つのアダプターを付加した断片を産生すること、ここでアダプターを付加した各断片は下記のものを含む、
（ｖｉ）アダプター、および
（ｖｉｉ）より短い鎖と、前記スネア配列を含むより長い鎖とを含むＤＮＡ断片；
（６）（５）において産生されたアダプターを付加した断片を固定化すること；
（７）前記断片を変性させて単一鎖の断片を提供すること；
（８）前記アダプターへ相補的なオリゴヌクレオチドをライゲーションすることによって第２の制限酵素の認識部位を再生成し、第２の制限酵素により前記アダプターを付加した断片を消化し、これにより下記のものを含むアダプター−スネア断片を産生すること、
（ｖｉｉｉ）アダプター断片；および
（ｉｘ）一本鎖スネア配列；
（９）固定化から（８）において産生されたアダプター−スネア断片を解放すること；ならびに
（１０）プラスミドベクターに前記アダプター−スネア断片をクローニングすること、を含む方法。
【請求項４４】
各プラスミドが前記モノマー配列の２つ以上のコピーを含む請求項４３に記載の方法であって、工程（１０）がさらに、
−下記（ｉ）および（ｉｉ）を含む環状オリゴヌクレオチドを提供すること、
（ｉ）前記アダプター−スネア断片、および
（ｉｉ）ローリングサークル増幅における使用に適したプライマーの結合部位（前記モノマー配列は（ｉ）および（ｉｉ）を含む）；
−テンプレートとして前記環状オリゴヌクレオチドを使用するローリングサークル増幅を行うこと、これにより前記モノマー配列のリピートを含むポリヌクレオチドを提供すること；ならびに
−プラスミドベクターへ前記ポリヌクレオチドをクローニングすること、を含む方法。
【請求項４５】
前記環状オリゴヌクレオチドを提供する工程が、
−アダプター−スネア断片（ｉ）、およびローリングサークル増幅における使用に適したプライマーの結合部位（ｉｉ）を含む直鎖一本鎖オリゴヌクレオチドを提供すること；
−前記オリゴヌクレオチドを環化すること；
−任意に、残存する直鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼで消化すること；ならびに
−モノマー性の環状オリゴヌクレオチドを回収すること、を含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１の制限酵素がＭｍｅＩであり、かつ／または前記第２の制限酵素がＮｔ．ＢｂｖＣＩである、請求項４３〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記ゲノムＤＮＡのサンプルが抗生物質耐性をコードする遺伝子含む、請求項４３〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
各プラスミドがモノマー配列の２つ以上のコピーを含み、各モノマー配列が長さがｎのヌクレオチドのランダム化ヌクレオチドの配列を含む、プラスミドライブラリーを調製する方法であって、
（１）下記（ｉ）および（ｉｉ）を含む環状オリゴヌクレオチドを提供すること、
（ｉ）長さがｎのヌクレオチドのランダム化配列、および
（ｉｉ）ローリングサークル増幅における使用に適したプライマーの結合部位（前記モノマー配列は（ｉ）および（ｉｉ）を含む）；
（２）テンプレートとして前記環状オリゴヌクレオチドを使用するローリングサークル増幅を行うこと、これにより前記モノマー配列のリピートを含むポリヌクレオチドを提供すること；ならびに
（３）プラスミドベクターへ前記ポリヌクレオチドをクローニングすること、を含む方法。
【請求項４９】
工程（１）が、
−長さがｎのヌクレオチドのランダム化配列（ｉ）およびローリングサークル増幅における使用に適したプライマーの結合部位（ｉｉ）を含む直鎖一本鎖オリゴヌクレオチドを提供すること；
−前記オリゴヌクレオチドを環化すること；
−任意に、残存する直鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼで消化すること；ならびに
−モノマー性の環状オリゴヌクレオチドを回収すること、を含む請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ｎが５〜５０である、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ライブラリーにおいて、長さがｎのヌクレオチドの実質的にすべてのヌクレオチド配列が表される、請求項４８〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
請求項４０〜５１のいずれかにしたがって調製されたプラスミドまたはプラスミドのライブラリー。
【請求項５３】
ポリヌクレオチドは、遺伝子に機能的に結合していない転写因子（デコイ配列）の結合部位を含む外因性のデコイポリヌクレオチドを含む細胞であって、前記細胞は、前記転写因子の結合部位を含むシス調節配列に機能的に結合した遺伝子を含み；前記デコイポリヌクレオチドは、前記細胞における抗生物質耐性の変更をもたらす、細胞。
【請求項５４】
前記細胞において前記シス調節配列に機能的に結合した前記遺伝子が抗生物質に対する耐性をコードする、請求項５３に記載の細胞。
【請求項５５】
前記デコイポリヌクレオチドが、請求項１２〜２２のいずれかで定義されたものである、請求項５４に記載の細胞。
【請求項５６】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法にしたがって調製された細胞。
【請求項５７】
請求項２５〜３９または５２のいずれかに記載のプラスミドまたはプラスミドライブラリーを含む細胞。
【請求項５８】
アミノグリコシド；カルバペネム；セファロスポリン；糖ペプチド；ペニシリン；ポリペプチド系抗生物質；キノリン；スルホンアミド；またはテトラサイクリンの１種以上から選ばれる抗生物質に対する変更された耐性を有する、請求項５３〜５７のいずれかに記載の細胞。
【請求項５９】
前記抗生物質が、カナマイシン、メロペネム、セフェピム、バンコマイシン、ダプトマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ペニシリン、ポリミキシシンＢ、レバクイン、バクトリム、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、リファンピシン、およびザイボックスの１種以上から選ばれる、請求項５８に記載の細胞。
【請求項６０】
（ａ）抗生物質耐性の非病原性モデル；または
（ｂ）病原体である、請求項５３〜５９のいずれかに記載の細胞。
【請求項６１】
（ａ）アクチノミセス；ストレプトミセス；ミコバクテリウム；クロストリジウム；バチルス；リステリア；スタフィロコッカス；ストレプトコッカス；エンテロコッカスから選ばれる属のグラム陽性菌；あるいは
（ｂ）腸内菌；シュードモナス；モラクセラ；ヘリコバクター；ステノトロフォモナス；ブデロビブリオ；酢酸菌；レジオネラ；シアノバクテリア；スピロヘータ；緑色硫黄細菌；および緑色非硫黄細菌から選ばれる属のグラム陰性菌である、請求項５３〜６０のいずれかに記載の細胞。
【請求項６２】
ヒト型結核菌；ウシ型結核菌；マイコバクテリウム・アフリカヌム；マイコバクテリウム・ミクロティ；癩菌；クロストリジウム・ディフィシル；ボツリヌス菌；クロストリジウム・パーフリンジェス；破傷風菌；サルモネラ属の種；大腸菌；エンテロコッカス・フェシウム；エンテロコッカス・フェカリス；淋菌；髄膜炎菌；モラクセラ・カタラリス；インフルエンザ菌；肺炎桿菌；レジオネラ・ニューモフィラ；緑膿菌；ミラビリス変形菌；汚物腸内菌；セラチア菌；ピロリ菌；腸炎菌；およびチフス菌から選ばれる病原体である、請求項５３〜６１のいずれかに記載の細胞。
【請求項６３】
タンパク質−ＤＮＡ複合体における１つ以上のタンパク質結合部位の境界を同定する方法であって、
１．タンパク質−ＤＮＡ複合体を提供すること；
２．ａ非特異的ＤＮＡニッキング能を有する酵素、および
ｂ．５’−３’エキソヌクレアーゼ、を用いて消化を行うこと；ならびに
３．ＤＮＡ鎖の上の公知の固定点に対する（２）において各ＤＮＡ鎖において生成された５’欠失の位置を決定すること、を含む方法。
【請求項６４】
工程３が、
−（２）からの消化されたＤＮＡを回収しこのＤＮＡを変性して一本鎖を形成すること；
−前記タンパク質結合部位を含む相補ＤＮＡの鎖に一本鎖ＤＮＡをハイブリダイズさせること、ここで相補ＤＮＡの鎖はリンカーを含む；
−前記リンカーに結合する標識プライマーを使用して増幅反応を行うこと；ならびに
−前記標識増幅産物のサイズを決定することを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記相補ＤＮＡの鎖が固定化されている、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記非特異的ＤＮＡニッキング能を有する酵素がＤＮＡｓｅＩであり、かつ／または前記５’−３’エキソヌクレアーゼがＴ７エキソヌクレアーゼである、請求項６３〜６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
消化がインビボで行われる、請求項６３〜６６のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
前記タンパク質−ＤＮＡ複合体がシス調節配列に結合した転写因子を含み、シス調節配列への転写因子の結合が、原核生物または真核生物における１種以上の抗生物質耐性遺伝子の発現を調節する、請求項６３〜６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
原核生物遺伝子または真核細胞遺伝子の発現のシス作用レギュレーターを同定する方法であって、
１．請求項３７〜３９または５２のいずれかに記載のプラスミドライブラリーを提供すること；
２．宿主細胞へ前記プラスミドライブラリーを導入すること、ここで宿主細胞は、遺伝子に機能的に結合した対象となるシス調節配列を含み、その発現は直接的または間接的に決定することができる；ならびに
３．前記プラスミドライブラリーの存在下または非存在下で、前記遺伝子の発現を直接的または間接的に決定すること、を含む方法。
【請求項７０】
原核生物または真核生物の抗生物質耐性遺伝子の発現のシス作用レギュレーターを同定するための、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記宿主細胞における前記シス調節配列が遺伝子に機能的に結合され、その発現がその天然のコンテキストにおいて当該配列によって調節される、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記宿主細胞における前記シス調節配列および／または前記機能的に結合した遺伝子が、前記細胞に対して異種のものである、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記シス調節配列がレポーター遺伝子に機能的に結合した、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記シス調節配列がリプレッサー配列であり、前記レポーター遺伝子が、適切な培養条件下での細胞生存に必要な産物をコードする、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記レポーター遺伝子が抗生物質耐性をコードする、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記シス調節遺伝子がアクチベーター配列であり、前記レポーター遺伝子が自殺レポーター遺伝子である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記レポーター遺伝子産物が代謝産物を毒素に変換する、請求項７３または７６に記載の方法。
【請求項７８】
工程（３）が宿主細胞の生存度を決定することを含む、請求項６９〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
ライブラリーハイブリダイゼーション工程をさらに含む、請求項６９〜７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
請求項６３〜６８のいずれかに記載の方法により前記シス調節配列の境界を決定することをさらに含む、請求項６９〜７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
前記シス調節配列が請求項６９〜８０のいずれかに記載の方法により同定された、請求項１〜２２のいずれかに記載の使用。
【請求項８２】
細菌感染の治療に使用されるデコイポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが転写因子の結合部位を含み、前記結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、デコイポリヌクレオチド。
【請求項８３】
細菌感染を治療するためのデコイポリヌクレオチドの使用であって、前記ポリヌクレオチドが転写因子の結合部位を含み、前記結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、使用。
【請求項８４】
細菌感染を治療するための薬剤の製造のためのデコイポリヌクレオチドに使用であって、前記ポリヌクレオチドが転写因子の結合部位を含み、前記結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、使用。
【請求項８５】
前記転写因子が、原核生物または真核生物における１種以上の抗生物質耐性遺伝子の発現のレギュレーターである、請求項８２に記載のデコイポリヌクレオチドあるいは請求項８３または８４に記載の使用。
【請求項８６】
前記細菌感染の治療が１種以上の抗生物質の使用を含む、請求項８２〜８５のいずれかに記載のデコイポリヌクレオチドまたは使用。
【請求項８７】
前記ポリヌクレオチドが請求項１２〜２２のいずれかに定義されたものである、請求項８２〜８５のいずれかに記載のデコイポリヌクレオチドまたは使用。
【請求項８８】
原核細胞における遺伝子の発現を変更させる方法であって、前記方法は、
（ａ）原核生物の転写因子の結合部位を含むポリヌクレオチドを提供すること、ここで結合部位はポリヌクレオチドにおいて遺伝子に機能的に結合されていない；ならびに
（ｂ）前記細胞へ前記ポリヌクレオチドを導入すること、を含み；
前記細胞は、前記転写因子結合部位を含むかまたは転写因子の結合をめぐって前記転写因子結合部位と競合するシス調節配列に機能的に結合した前記遺伝子を含み；
（ｉ）前記ポリヌクレオチドは、請求項２５〜３９または５２のいずれかに記載のプラスミドまたはプラスミドライブラリーを含む；
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドは、前記結合部位の１個より多いコピーを含む；
（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドは、前記結合部位の複数のダイレクトリピートを含む；
（ｉｖ）前記ポリヌクレオチドは、前記結合部位に対する付加的な配列を含む；
（ｖ）前記ポリヌクレオチドは、二次構造の少なくとも１種のエレメントを含む；
（ｖｉ）前記ポリヌクレオチドは、環状二本鎖ＤＮＡを含む、方法。
【請求項８９】
原核細胞または真核細胞における遺伝子の発現を変更させる方法であって、前記方法は、
（ａ）原核生物または真核生物の転写因子の結合部位を含むポリヌクレオチドを提供すること、ここで結合部位はポリヌクレオチドにおいて遺伝子に機能的に結合されていない；ならびに
（ｂ）前記細胞へ前記ポリヌクレオチドを導入すること、を含み；
前記細胞は、前記転写因子結合部位を含むかまたは転写因子の結合をめぐって前記転写因子結合部位と競合するシス調節配列に機能的に結合した前記遺伝子を含み；かつ
前記シス調節配列は、請求項６９〜８０のいずれかの方法により同定される、方法。
【請求項９０】
真核細胞における遺伝子の発現を変更させる方法であって、当該方法は、
（ａ）真核生物の転写因子の結合部位を含むポリヌクレオチドを提供すること、ここで結合部位はポリヌクレオチドにおいて遺伝子に機能的に結合されていない；ならびに
（ｂ）前記細胞へ前記ポリヌクレオチドを導入すること、を含み；
前記細胞は、前記転写因子結合部位を含むかまたは転写因子の結合をめぐって前記転写因子結合部位と競合するシス調節配列に機能的に結合した前記遺伝子を含み；かつ
前記ポリヌクレオチドは、請求項２５〜３９または５２のいずれかのプラスミドまたはプラスミドライブラリーを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はシス調節配列の同定のための方法および組成物を提供する。本発明は、遺伝子発現パターンの同時変更をともなうインビボのシス調節エレメントへ転写因子の会合の変更によって、細胞表現型（原核生物表現型などの）を特異的に修飾するための方法および組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現は細胞の表現型の主要な決定要素であり、今度は、主としてＤＮＡ−タンパク質相互作用が遺伝子発現のパターンを決定する。産業用微生物、実験モデル、病原体中であっても、またはヒト疾患と闘うためであっても、表現型に影響を与えるような遺伝子発現の修飾は生物学および医学の主要な目的である。このコンテキストにおいて、ゲノム内のシス調節配列（転写装置のＤＮＡコンポーネント）は、介入のための魅力的な標的である。タンパク質と闘うことと比較して、ＤＮＡを研究するほうがはるかに容易である。すなわち、配列決定は高度に自動化され比較的低費用であり、ＤＮＡは容易に操作でき、たやすく増幅または合成することができる。ＤＮＡに基づいた療法もまた、エキサイティングな新しいクラスの療法剤として浮上している。従来の製剤、天然産物、または低分子と比較して、ＤＮＡは、以下のことから、魅力的なタイプの療法剤である。
・合理的なプロセスによって設計される（最も単純には配列データの検討によって）；
・安価に大スケールで製造される（オリゴヌクレオチドの化学合成または生物学的複製によって）；
・低毒性であることが予測される（ＤＮＡは「天然の」化合物であり、典型的には、それ自体としては免疫原性応答を誘導せず、特異性は一連のＤＮＡベース療法によって制御してもよいので）；
・研究開発費が大幅に低減される（従来の薬物開発のすべてのステージ（標的同定、リード化合物探索、医薬品化学）が短縮されるので）。
【０００３】
次に課題は、鍵となるシス調節エレメントをどのように同定するかということになる。ゲノム配列決定プロジェクト（ＤＮＡマイクロアレイを使用する大規模な平行遺伝子発現解析およびゲノムデータベースを注釈するバイオインフォマティクスの使用など）と平行して開発された技術および専門知識は、シス調節エレメントをすべて同定するか、または公知のエレメントに機能を帰着するのには十分ではない。２００３年に、米国の国立衛生研究所は、ヒトゲノム中のシス調節エレメントの１％のカタログを作り（Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４年）３０６：６３６〜６４０；Ｎａｔｕｒｅ（２００７年）４４７：７９９〜８１６）、探索プラットフォームとしてハイスループット技術を開発する、ＥＮＣＯＤＥプロジェクトに着手した。開発された手順は、クロマチン免疫沈降の使用、ＤＮａｓｅＩによるインビボの消化に感受性のある高感受性のプロービング（ＤＮＡマイクロアレイ、ハイスループット定量的ＰＣＲ、およびゲノムライブラリーと共に）、およびバイオインフォマティクスによる検出のための新規のアルゴリズムの開発を含む。これらの技術はシス調節エレメントの探索速度を大幅に促進する可能性を有するが、それらは必ずしも機能的特性評価をもたらさない。すなわち、このプロジェクトのアウトプットはこれらのエレメントの総合的なカタログである。たとえ、かかる研究から、大部分のエレメントの組織特異性、ならびに遺伝子からのそれらの距離およびそれらが結合するトランス作用因子のタイプに従う分類が分かっても、エレメントの生物学的機能が実際何であるかを確定するのには十分ではない。これらの手順のすべてに共通のさらなる短所は、配列決定されている生物のゲノムにこれらの手順が依存するということである。さらに、このコンテキストにおいて、ＤＮａｓｅＩがクロマチン構造についてのプローブであり、同等の構造が原核生物に存在しないので、ＤＮａｓｅＩ消化に対する高感受性を利用する手法は真核細胞に特異なさらなる短所を有する。
【０００４】
さらに、今までのところ、可能性のあるシス調節配列のための多数の配列を迅速にスクリーニングするための手段はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４年）３０６：６３６〜６４０
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ（２００７年）４４７：７９９〜８１６
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、原核生物および真核生物の両方におけるシス調節配列を同定し特性評価する新規な方法を提供することにより当該技術分野におけるこれらの問題に対処した。
【０００７】
個々のシス調節エレメントの機能を同定し特性評価する方法の１つとしては、転写因子デコイ（ＴＦＤ）を使用することである。デコイオリゴヌクレオチドは、転写因子の結合部位を模倣し、転写因子がその同族ゲノム標的に結合するのを阻止するように設計される（結果として遺伝子発現が修飾される）。デコイオリゴヌクレオチドはそれ自体、特定の遺伝子を調節し結果として表現型を決定するＤＮＡ−タンパク質相互作用を操作するためのシンプルで一般的なツールを象徴している。新規なクラスの治療剤として機能する可能性がデコイオリゴヌクレオチドの開発に拍車をかけ、その有用性は主に真核細胞系において実証されている（Ｍａｎｎ＆Ｄｚａｕ（２０００年)Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ１０６：１０７１〜１０７５）。この目的のため、デコイオリゴヌクレオチドは、転写因子ＥＦ２がラットにおける平滑筋増殖を抑制することを実証するため（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら（１９９５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、９５：５８５５〜５８５９）、ＳＴＡＴ３が仲介する癌の増殖をブロックするため（Ｌｅｏｎｇら（２００３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、１００：４１３８〜４１４３）、ならびにｃＡＭＰ応答エレメントの標的化がインビボでの癌の増殖を制御することができることを示すため（Ｐａｒｋら（１９９９年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１５７３〜１５８０）に使用されている。
【０００８】
しかしながら、ＴＦＤを使用するための、ゲノム断片または全ゲノム内での配列の発生毎に照会（querying）することができる系は、大きな規模では開発されていない。現状では、それは、非常に多くのデコイオリゴヌクレオチドの合成、ならびにデコイオリゴヌクレオチドの合成のトランスフェクションおよび表現型の変化についてのスクリーニングを伴う面倒な実験プログラムを必要とする。
【０００９】
本明細書に記載する発明は、配列がゲノム中でシスレギュレーターとして作用するかおよび特異的表現型効果と関連するかどうかを判断するために多数の配列を系統的に試験することができるプラスミド性ライブラリーに基づいた系を開発することによりこの必要性に対処する。我々はこの系を本明細書では「ｎ［スネア］」と呼ぶ。
【００１０】
さらに、関連するシス調節配列が見つかれば、当該配列は遺伝子発現を修飾し表現型を制御するために使用することができるＴＦＤを作成するために使用することができる。デコイは哺乳類細胞において使用するために開発されたが、いくつかの理由のため細菌においての使用により適している。血清および核抽出物において真核生物は速やかに分解される可能性があり（Ｃｈｕ＆Ｏｒｇｅｌ（１９９２年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０：５８５７〜５８５８）、デコイの細胞取り込みおよび核膜を介したデコイの移行は効率が悪い可能性あり（Ｇｒｉｅｓｅｎｂａｃｈら（２００２年）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ９：１１０９〜１１１５）、かついくばくかの処理によって非特異性または毒性の効果が引き起こされる可能性があるので、真核生物においてデコイを作用させることは問題を生じ得る。原核生物においてデコイを使用することによりこれらの問題の多くが回避されるはずであり、デコイはそれ自体、シス作用調節配列（例えば、特定遺伝子およびより大きな調節ネットワークの両方を制御する転写因子結合部位）を迅速に同定するために効果的なツールであると証明される可能性がある。当該手法がうまく実証されたものとしては、シアノバクテリアにおけるＣＯ２応答遺伝子の発現を変更させる、ＡＴに富むデコイの使用であった（Ｏｎｉｚｕｋａら（２００３年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５４２：４２〜４６）。この系では、修飾されたバックボーンを有する相補オリゴヌクレオチド（ヌクレアーゼによる分解を遅延するホスホロチオエートを含む）はアニーリングされて、それまでに同定された転写因子の結合部位を組み込んだ二本鎖デコイオリゴヌクレオチドが形成された。当該デコイオリゴヌクレオチドは培地に直接加えられ、そこから効率的に細胞に入った。しかしながら、この報告は、この手法が特定の原核生物の形質を修飾するためにうまくいったことを我々が知っている唯一の例である。したがって、当該技術分野では、原核生物の転写因子の分野までデコイを用いる方法論を拡大しこれにより様々な原核生物の表現型を変更させるという必要性がある。さらに、当該技術分野では、原核生物系でも真核細胞系でも、シス作用制限因子を同定するための高スループット方法の必要性がある。本特許の開示は、当該技術分野における上記の欠点やニーズに対する解決策を提供する。
【００１１】
１つの特定の態様では、本発明は、細胞（例えば、細菌細胞）の抗生物質に対する感受性を増加させるための新規な手段を提供する。
【００１２】
したがって１つの態様では本発明は、細胞の抗生物質耐性を修飾する方法におけるデコイポリヌクレオチドの使用を提供し、当該方法は、
（ａ）転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチド（デコイ配列）を提供すること；および
（ｂ）前記ポリヌクレオチドを、前記転写因子の結合部位を含むシス調節配列に機能的に結合した遺伝子を含む前記細胞に導入することを含み；
前記ポリヌクレオチドの導入は、前記細胞における前記シス調節配列への前記転写因子の結合を減少させ、前記細胞における前記機能的に結合した遺伝子の発現の変更をもたらし、これにより前記細胞の抗生物質耐性を修飾する。
【００１３】
本発明はまた下記のものも提供する。
・転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチドであって、前記転写因子が、原核生物または真核生物における１種以上の抗生物質耐性遺伝子の発現のレギュレーターであり、前記デコイポリヌクレオチドにおける前記結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、デコイポリヌクレオチド。
【００１４】
・モノマー配列の１つ以上のコピーを含むプラスミドであって、前記モノマー配列が転写因子結合部位を含むスネア配列を含み、前記結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、プラスミド。
【００１５】
・本発明の２種以上のプラスミドを含むプラスミドライブラリーであって、前記ライブラリーにおけるスネア配列が全体として、原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡにおけるまたはゲノムＤＮＡの断片におけるすべてまたは実質的にすべてのシス調節配列を含む、プラスミドライブラリー。
【００１６】
・本発明の２種以上のプラスミドを含むプラスミドライブラリーであって、各プラスミドにおけるスネア配列は、長さがｎのヌクレオチドのランダム化ヌクレオチドの配列を含み、前記ライブラリーにおいて長さがｎのヌクレオチドのヌクレオチド配列が実質的にすべて表される、プラスミドライブラリー。
【００１７】
・モノマー配列の１つ以上のコピーを含むプラスミドを調製する方法であって、
（１）下記（ｉ）および（ｉｉ）を含む環状オリゴヌクレオチドを提供すること、
（ｉ）対象となる試験配列、および
（ｉｉ）ローリングサークル増幅における使用に適したプライマーの結合部位（前記モノマー配列は（ｉ）および（ｉｉ）を含む）；
（２）テンプレートとして前記環状オリゴヌクレオチドを使用するローリングサークル増幅を行うこと、これにより前記モノマー配列のリピートを含むポリヌクレオチドを提供すること；ならびに
（３）プラスミドベクターへ前記ポリヌクレオチドをクローニングすること、を含む方法。
【００１８】
・各プラスミドがモノマー配列の１つ以上のコピーを含み、各モノマー配列がゲノムＤＮＡに由来するスネア配列を含む、ゲノムＤＮＡのサンプルからプラスミドライブラリーを調製する方法であって、
（１）二本鎖ゲノムＤＮＡのサンプルを提供すること；
（２）前記ゲノムＤＮＡを断片化すること；
（３）（２）からのＤＮＡ断片の各末端へアダプターをライゲーションすること、ここで各アダプターは下記のものを含む、
（ｉｉｉ）前記ＤＮＡ断片の固定化のための手段、
（ｉｖ）認識部位から距離をおいて切断する第１の制限酵素の認識部位、および
（ｖ）第２の制限酵素の認識部位および切断部位；
（４）任意に、ライゲーションされていないアダプターを除去すること；
（５）第１の制限酵素により前記アダプターを持つ断片を消化し、これにより２つのアダプターを付加した断片を産生すること、ここでアダプターを付加した各断片は下記のものを含む、
（ｖｉ）アダプター、および
（ｖｉｉ）より短い鎖と、前記スネア配列を含むより長い鎖とを含むＤＮＡ断片；
（６）（５）において産生されたアダプターを付加した断片を固定化すること；
（７）前記断片を変性させて単一鎖の断片を提供すること；
（８）前記アダプターへ相補的なオリゴヌクレオチドをライゲーションすることによって第２の制限酵素の認識部位を再生成し、第２の制限酵素により前記アダプターを付加した断片を消化し、これにより下記のものを含むアダプター−スネア断片を産生すること、
（ｖｉｉｉ）アダプター断片；および
（ｉｘ）一本鎖スネア配列；
（９）固定化から（８）において産生されたアダプター−スネア断片を解放すること；ならびに
（１０）プラスミドベクターに前記アダプター−スネア断片をクローニングすること、を含む方法。
【００１９】
・各プラスミドがモノマー配列の２つ以上のコピーを含み、各モノマー配列が長さがｎのヌクレオチドのランダム化ヌクレオチドの配列を含む、プラスミドライブラリーを調製する方法であって、
（１）下記（ｉ）および（ｉｉ）を含む環状オリゴヌクレオチドを提供すること、
（ｉ）長さがｎのヌクレオチドのランダム化配列、および
（ｉｉ）ローリングサークル増幅における使用に適したプライマーの結合部位（前記モノマー配列は（ｉ）および（ｉｉ）を含む）；
（２）テンプレートとして前記環状オリゴヌクレオチドを使用するローリングサークル増幅を行うこと、これにより前記モノマー配列のリピートを含むポリヌクレオチドを提供すること；ならびに
（３）プラスミドベクターへ前記ポリヌクレオチドをクローニングすること、を含む方法。
【００２０】
・本発明の方法にしたがって調製されたプラスミドまたはプラスミドのライブラリー。
【００２１】
・遺伝子に機能的に結合していない転写因子（デコイ配列）の結合部位を含む外因性のデコイポリヌクレオチドを含む細胞であって、前記細胞は、前記転写因子の結合部位を含むシス調節配列に機能的に結合した遺伝子を含み；前記デコイポリヌクレオチドは、前記細胞における抗生物質耐性の変更をもたらす、細胞。
【００２２】
・本発明のプラスミドまたはプラスミドのライブラリーを含む宿主細胞または細胞。
【００２３】
・タンパク質ＤＮＡ複合体における１つ以上のタンパク質結合部位の境界を同定する方法であって、
１．タンパク質ＤＮＡ複合体を提供すること；
２．ａ非特異的ＤＮＡニッキング能を有する酵素、および
ｂ．５’−３’エキソヌクレアーゼ、を用いて消化を行うこと；ならびに
３．ＤＮＡ鎖の上の公知の固定点に対する（２）において各ＤＮＡ鎖において生成された５’欠失の位置を決定すること、を含む方法。
【００２４】
・原核生物遺伝子または真核細胞遺伝子の発現のシス作用レギュレーターを同定する方法であって、
１．本発明のプラスミドライブラリーを提供すること；
２．宿主細胞へ前記プラスミドライブラリーを導入すること、ここで宿主細胞は、遺伝子に機能的に結合した対象となるシス調節配列を含み、その発現は直接的または間接的に決定することができる；ならびに
３．前記プラスミドライブラリーの存在下または非存在下で、前記遺伝子の発現を直接的または間接的に決定すること、を含む方法。
【００２５】
・原核細胞における遺伝子の発現を変更させる方法であって、
（ａ）原核生物の転写因子の結合部位を含むポリヌクレオチドを提供すること、ここで結合部位はポリヌクレオチドにおいて遺伝子に機能的に結合されていない；ならびに
（ｂ）前記細胞へ前記ポリヌクレオチドを導入すること、を含み；
前記細胞は、前記転写因子結合部位を含むかまたは転写因子の結合をめぐって前記転写因子結合部位と競合するシス調節配列に機能的に結合した前記遺伝子を含み；
（ｉ）前記ポリヌクレオチドは、本発明のプラスミドまたはプラスミドライブラリーを含む；
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドは、前記結合部位の１個より多いコピーを含む；
（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドは、前記結合部位の複数のダイレクトリピートを含む；
（ｉｖ）前記ポリヌクレオチドは、前記結合部位に対する付加的な配列を含む；
（ｖ）前記ポリヌクレオチドは、二次構造の少なくとも１種のエレメントを含む；
（ｖｉ）前記ポリヌクレオチドは、環状二本鎖ＤＮＡを含む、方法。
【００２６】
・原核細胞または真核細胞における遺伝子の発現を変更させる方法であって、
（ａ）原核生物または真核生物の転写因子の結合部位を含むポリヌクレオチドを提供すること、ここで結合部位はポリヌクレオチドにおいて遺伝子に機能的に結合されていない；ならびに
（ｂ）前記細胞へ前記ポリヌクレオチドを導入すること、を含み；
前記細胞は、前記転写因子結合部位を含むかまたは転写因子の結合をめぐって前記転写因子結合部位と競合するシス調節配列に機能的に結合した前記遺伝子を含み；かつ
前記シス調節配列は、本発明の方法により同定される、方法。
【００２７】
・真核細胞における遺伝子の発現を変更させる方法であって、
（ａ）真核生物の転写因子の結合部位を含むポリヌクレオチドを提供すること、ここで結合部位はポリヌクレオチドにおいて遺伝子に機能的に結合されていない；ならびに
（ｂ）前記細胞へ前記ポリヌクレオチドを導入すること、を含み；
前記細胞は、前記転写因子結合部位を含むかまたは転写因子の結合をめぐって前記転写因子結合部位と競合するシス調節配列に機能的に結合した前記遺伝子を含み；かつ
前記ポリヌクレオチドは、本発明のプラスミドまたはプラスミドライブラリーを含む、方法。
【００２８】
・本発明の方法によって調製された細胞。
【００２９】
・細菌感染の治療に使用されるデコイポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが転写因子の結合部位を含み、前記結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、デコイポリヌクレオチド。
【００３０】
・細菌感染を治療するためのデコイポリヌクレオチドの使用であって、前記ポリヌクレオチドが転写因子の結合部位を含み、前記結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、使用。
【００３１】
・細菌感染を治療するための薬剤の製造のためのデコイポリヌクレオチドに使用であって、前記ポリヌクレオチドが転写因子の結合部位を含み、前記結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、使用。
【００３２】
したがって、本特許の開示の１つの実施形態では、我々は、迅速に候補シス作用調節モチーフを同定するための、デコイ手法とシンプルなインビボフットプリント法とを組み合わせた方法を提供する。当該配列の機能的な確認は、環状の構造がエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解を抑制するダンベルデコイオリゴヌクレオチドに配列を組み込み［Ａｈｎら（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３１０：１０４８〜１０５３］）、インビボで表現型に対する当該配列の効果を試験することにより達成された。
【００３３】
本発明による他の実施形態では、我々は、フットプリント法を適用して同定されたデコイオリゴヌクレオチドを使用して、放線菌における抗生物質産生の程度を有意に変更させることができることを実証する。
【００３４】
本発明によるさらに実施形態では、我々は、治療的な手法において原核生物のデコイを利用することができ、これによりバンコマイシンに耐性を有する病原菌が治療濃度域で抗生物質に再び感受性を有するようになることを実証する。
【００３５】
したがって、本発明者らは、一般的なスクリーニング系を提供し、当該スクリーニング系によって、任意のゲノムにおいてシス作用調節エレメントが同定され、この様式で同定されたかかるエレメントに由来する配列は、本発明のさらなる実施形態によって説明されたものにしたがって実証されたものと類似の様式で、選択された表現型を変更するために利用される。
【００３６】
本発明者らはまた、原核生物において使用されるデコイオリゴヌクレオチド技術を適応し拡張させて、抗生物質産生を増加させる能力を実証する。
【００３７】
さらに、本発明者らは、デコイオリゴデオキシヌクレオチドは、病原体を処理する際に抗生物質耐性を克服するために都合よく利用することができることを実証した。
【００３８】
本発明の他の実施形態、有用性、および詳細は、本明細書に提供する具体例および本開示に添付する請求項（それらの均等物を含む）を含む本開示全体を検討することにより理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ｎ［スネア］プラスミドの構築および試験。このプロトコルも、ランダム化オリゴヌクレオチドから「一般的な」ｎ［スネア］ライブラリーを、または断片化ゲノムから種特異的ライブラリーを製造するために使用することができる。
【図２】遺伝子発現に影響させるためにどのようにｎ［スネア］プラスミドを使用することができるかを図で表したものである。ｎ［スネア］プラスミドは、標準的な手段により標的細胞（例えば、原核生物）へ導入され、その安定した増殖はそのマーカー（通常は抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子）を選択することにより確保される。このように細胞へ導入されると、ｎ［スネア］プラスミドは、ゲノムプロモーターから転写因子「Ｂ」をタイトレーションすることにより下流遺伝子の転写的な抑制を解放して（横長の四角「Ｄ」として示す、右上）、標的遺伝子の発現に影響することができる。
【図３】ｎ［スネア］手法の実証。ｎ［スネア］プラスミドは、表現型における付随する変化を伴って予測可能な様式で遺伝子発現の制御を修飾することができる。当該プラスミドは、より安価に製造され、デコイより容易に細胞へ導入され、より持続的な効果をもたらし、そして、非常に重要なことには、当該プラスミドにより、重要な調節エレメントの発見にライブラリー手法を用いることが可能になる。
【図４】カスタムｎ［スネア］プラスミドライブラリーを作成する工程の一部（ゲノム断片を短い一本鎖ヌクレオチドに変換する工程）。ｎ［スネア］プラスミドライブラリーは、ＤＮＡ内のシス調節配列がすべてライブラリーにおいて示されるようにＤＮＡの大切片から作成される。
【図５】ｎ［スネア］プラスミドライブラリーは、抗生物質産生などの標的表現型を制御するために使用することができる。接合によるライブラリーのメンバーの導入に続いて、シンナマイシン産生の増加に基づいてクローンが選択される（右）。
【図６】抗生物質耐性を減らすことにｎ［スネア］を適用することに関するさらなる詳細。この図における概略図は、機構の遺伝経路について何もわかっていない場合に、抗生物質耐性を制御するシス調節配列を同定するためにどのようにｎ［スネア］プラスミドのライブラリーが使用されるかを示す。
【図７】ｎ［スネア］プラスミドライブラリー内でシス調節エレメントを同定するように開発されたリポーター構築物。この図において、Ｓ．シンナモネウスの産生株のシンナマイシン生合成クラスターからのｃｉｎ７遺伝子の標的プロモーターは、抗生物質であるカナマイシンに対する耐性をコードするｎｅｏ遺伝子の発現を駆動するために使用される。
【図８】一般的なリポーター系およびカスタムｎ［スネア］ライブラリーを使用してシンナマイシン産生の負のシスレギュレーターを検出すること。標的プロモーターにより駆動されるグルコースキナーゼ遺伝子（ｇｌｋＡ）のコード配列を組み込んだキメラレポーター遺伝子からなるカセットを作成することによってシンプルな適応法で、正の調節を検出することができるリポーター系が作成される。
【図９】候補クローンを同定するためのライブラリーハイブリダイゼーション。全シグナルの大部分を形成する「バックグラウンド」メンバーと、本当に転写を妨害できるｎ［スネア］プラスミドとを区別するため、標準的な方法を使用してライブラリーハイブリダイゼーション法が開発された。
【図１０】一般的なリポーター系およびカスタムｎ［スネア］ライブラリーを使用したシンナマイシン産生を調節することができるシスレギュレーターを検出するための、当該手法の独立したリピートから候補を検出するためのハイブリダイゼーションスクリーン。この実施例では、２つの独立したＳ．シンナモネオウスライブラリーはリポーター株と試験され、それぞれから最もカナマイシンに耐性のあるクローン９６個を使用して各クローン（Ｆ１およびＦ２）のｎ［スネア］プラスミドならびに２つのプローブセット（Ｐ１およびＰ２）を含むフィルタを作成した。クロスハイブリダイゼーション（Ｆ１対Ｐ２、Ｆ２対Ｐ１）により同定されたクローンはすべて有力な候補と考えられ、両方のクロスハイブリダイゼーション実験に共通のもの（赤で円を描いた）を最も重視した。
【図１１】大腸菌Ｋ１２ゲノムｎ［スネア］ライブラリーの制限消化分析によって、当該ライブラリーが予想される配列特性を有することが確認される。このプラスミドの混合物はＥｃｏＲＩで消化されて、ｎ［スネア］ライブラリーを作成するために使用される断片を再生成し、当該断片はＭｍｅＩ消化に供されて、分子生物学的に構築がうまくいったかを確認した。予想したように、挿入物のサイズは大きく、ＭｍｅＩでの消化が完了するまでに３０ｂｐのモノマーにまで崩壊した。
【図１２】ｎ［スネア］ライブラリーは、事前に遺伝的ネットワークに関する情報が無くても表現型を設計するために使用される。この過程は４回繰り返され、細胞の生存率は毎回測定された。
【図１３】インビボＴ７エキソヌクレアーゼ／ＤＮａｓｅＩマッピング手順のプロトコルの図式的概観。フットプリント法におけるＴ７エキソヌクレアーゼおよびＤＮａｓｅＩの新規な組み合わせは、プロモーター領域内のＤＮＡ−タンパク質複合体（選択された制限部位に最も近いものだけでなく）のすべての境界の検出を可能にする。
【図１４】ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４のプロモーター内の候補調節モチーフのＴ７エキソヌクレアーゼ／ＤＮａｓｅＩマッピング。（Ａ）Ｓ．セリカラーＭ１４５の細胞は、アクチノロージン産生が目視できる前の時点（矢印で示す）で、栄養豊富な（Ｒ５）培地中で増殖させた培養物から集菌された。（Ｂ）図１３に記載のように両方の鎖上で境界がマッピングされ、境界の位置は１２％非変性ＰＡＧＥによるサイズ分析、その後のＤＩＧ標識産物の化学発光検出の後に決定された。（Ｃ）推定上のシス調節因子の位置（マッピングプロトコルにおいて使用されたプライマーに対する）を示すａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４プロモーターの配列。
【図１５】デコイオリゴヌクレオチドがＳ．セリカラーにおける抗生物質産生に影響を及ぼすことができることを実証するプレートアッセイ。フィルターディスクをデコイの溶液または対照としての緩衝液（図示）で飽和させ、ＳＮＡ培地で上塗りしたＳ．セリカラーＭ１４５の菌叢に塗布した。
【図１６】デコイオリゴヌクレオチドの取り込みおよび安定性。活発に増殖する細胞は、デコイを含む溶液でトランスフェクトされ、オリゴヌクレオチドの取り込みおよびその安定性は、量的リアルタイムＰＣＲ（ｑｒｔ−ＰＣＲ）により推定された。
【図１７】デコイが仲介する、Ｒ５液体培地中で増殖させた培養物におけるアクチノロージン産生の増加。Ｓ．セリカラーＭ１４５は２０時間増殖させた後、（Ａ）デコイを含まない対照または（Ｂ）Ａ２４．５デコイでトランスフェクションした（矢印で示す）。
【図１８】デコイが仲介する、ＳＭＭ液体培地中で増殖させた培養物におけるアクチノロージン産生の増加。（Ａ）模擬トランスフェクトされた対照および（Ｂ）デコイＡ２４．５で処理された培養液を用いて得られたデータを比較すると、デコイオリゴヌクレオチドはアクチノロージン産生の顕著な増加をもたらすことが示された。
【図１９】ＳＣＯ５８１２を欠失させると、Ｒ５寒天上でアクチノロージンの産生が不足し、ＳＭＭＳ寒天上でウンデシルプロジギオシンの産生が過剰となる。Ｍ１４５（プレートの左側）およびＭ１４５ΔＳＣＯ５８１２（プレートの右側）は、（Ａ）Ｒ５寒天培地または（Ｂ）ＳＭＭＳ寒天培地上に画線され、それぞれ７２時間および９６時間培養された。
【図２０】抗生物質耐性を減らすことに転写因子デコイ（ＴＦＤ）手法を適用することを示す。この模式図は、病原菌において公知の抵抗機構に対抗するためにＴＦＤがどのように使用されるか示す。処方された抗生物質バンコマイシンに対する耐性を例として用いる。
【図２１】バンコマイシン遺伝子の構造。Ｈｏｎｇら、２００４年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５２：１１０７〜１１２１。
【図２２】オリゴヌクレオチドデコイｖａｎＨ５の環化の証拠。オリゴヌクレオチドは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（当該酵素の製造業者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により供給されたままで）および４００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼにおいて１００ｐｍｏｌ／ｕｌの終末濃度で再懸濁され、１６℃で様々な期間培養された。
【図２３】ｖａｎＨ５デコイのレベルを増加させた場合とさせなかった場合のバンコマイシン耐性菌を培養する効果を示す。Ｓ．セリカラー株Ｍ６００はＭＭＣＧＴ液体培地中で増殖させ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５２：１１０７〜１１２１）、増殖は培養液の４３０ｎｍでの吸光度を記録（Ｃｅｌｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）することにより測定し、培養時間の関数としてプロットした。
【図２４】配列番号２４および２５ならびに適切なベクター基質（実施例７．２）中でプライマーを使用して得られた増幅産物を示す。
【図２５】実施例８（ａ）および８（ｂ）にそれぞれ記載のように、ＶＡＮ転写因子デコイ配列またはネガティブコントロール（ＣＯＮ）のいずれかで処理した後のバンコマイシンの存在下で増殖させたＥ．フェシウムの増殖曲線を示す。
【図２６】実施例８（ａ）および８（ｂ）にそれぞれ記載のように、ＶＡＮ転写因子デコイ配列またはネガティブコントロール（ＣＯＮ）のいずれかで処理した後のバンコマイシンの存在下で増殖させたＥ．フェシウムの増殖曲線を示す。
【図２７−１】Ｐｏｏｌｅ（２００５年）Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５６、２２〜２４の表１および２を複写したものであり、それぞれ、非フルオロキノリン抗生物質およびフルオロキノリン抗生物質に対する、排出が仲介する耐性を記載している。右側欄の参考番号は当該文献中の番号を指す。
【図２７−２】Ｐｏｏｌｅ（２００５年）Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５６、２２〜２４の表１および２を複写したものであり、それぞれ、非フルオロキノリン抗生物質およびフルオロキノリン抗生物質に対する、排出が仲介する耐性を記載している。右側欄の参考番号は当該文献中の番号を指す。
【図２７−３】Ｐｏｏｌｅ（２００５年）Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５６、２２〜２４の表１および２を複写したものであり、それぞれ、非フルオロキノリン抗生物質およびフルオロキノリン抗生物質に対する、排出が仲介する耐性を記載している。右側欄の参考番号は当該文献中の番号を指す。
【００４０】
（配列の簡単な説明）
配列番号１：ＡｆｓＲ結合部位を含むデコイオリゴヌクレオチド（実施例１）。
配列番号２：一般的に用いられるプライマーＴ７の部分的補体を含む連結ヌクレオチドＲ−Ｔ７（実施例１）。
配列番号３：ＡｆｓＲ結合部位を含むオリゴヌクレオチドおよび実施例１における環化デコイ配列を作成するための使用。
配列番号４および５：二本鎖アダプター分子のそれぞれの鎖の配列（実施例２）。
配列番号６：Ｂｂｖ相補オリゴヌクレオチド（実施例２）。
配列番号７：ＮｏｔＩ部位およびランダム化ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、ここで各ランダム化ヌクレオチドは「ｎ」と表される（実施例４）。
配列番号８〜１２：それぞれシス調節配列Ａ２４．１、Ａ２４．２、Ａ２４．３、Ａ２４．４、およびＡ２４．５に基づいて設計されたデコイオリゴヌクレオチド（実施例５）。
配列番号１３：スクランブル化Ａ２４．５配列に基づいて設計されたデコイオリゴヌクレオチド（実施例５）。
配列番号１４〜２０：実施例５のように定量ＰＣＲにおいて使用されるＰＣＲプライマー。
配列番号２１：リン酸化ＶａｎＲの結合部位を含むｖａｎＨ５デコイオリゴヌクレオチド（実施例６）。
配列番号２２および２３：実施例７．１のような、ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクターからの標的配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２４および２５： 実施例７．２のような、ダンベルデコイの産生におけるｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクターからの標的配列の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２６：実施例８（ａ）および実施例８（ｂ）で使用され、Ｅ．フェシウムにおけるＶａｎＡ型耐性の誘導を制御する調節エレメントを含むＶＡＮデコイ配列。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
より詳細に本明細書において記載されるように、本発明者は、原核生物および真核生物におけるシス調節配列の同定、特性評価および標的化のための方法および組成物を考案した。
【００４２】
シス調節配列またはシス調節エレメントは、一般的に、遺伝子の上流（５’）または下流（３’）に存在し、遺伝子の発現を修飾するように機能するヌクレオチド配列を指す。典型的には、シス調節配列は、所与の遺伝子の転写を調節するタンパク質（転写因子）の結合部位を含む。配列へのタンパク質の結合は、遺伝子の発現の直接的または間接的な修飾をもたらす。例えば、結合されたタンパク質は、転写のために必要とされる近くの領域に結合されたもう一つのタンパク質と相互作用し正しい位置にタンパク質を固着するか、または転写のために必要なもう一つのタンパク質の結合を阻害する可能性がある。典型的には、シス調節配列またはシス調節エレメントは遺伝子のプロモーター領域中に存在するが、原核生物においては、シス調節配列が影響を与える遺伝子の何百塩基対も上流または下流に位置するのはまれではない。真核生物において、シス調節配列は遠距離で作用して、典型的には１〜２ｋｂのオーダーで遺伝子の発現に影響を及ぼすことができるが、１００ｋｂ〜１Ｍｂにわたって配列が働くことが知られていないわけではない。
【００４３】
シス調節配列は、抑制的（転写因子が結合した場合に遺伝子の転写を阻害または低減する）、または活性的（転写因子が結合した場合に遺伝子の転写を活性化または増加する）であってもよい。したがって、シス調節配列を結合する転写因子は、負のエフェクター（リプレッサータンパク質）または正のエフェクター（アクチベーター）であってもよい。
【００４４】
例えば、シス調節配列の影響力が別の遺伝子上にあり、次に、それが標的遺伝子の発現に影響を及ぼす場合、特定の遺伝子の発現は間接的効果によってもまた修飾されることになる。これは、例えば、標的遺伝子が一部分である調節ネットワークへの変化を引き起こすことによって、または標的遺伝子の発現の修飾を引き起こす、より全体的な効果（ショック応答など）に起因して起こってもよい。
【００４５】
シス調節配列でのタンパク質結合の修飾は、細胞における遺伝子発現の修飾のための有用な手段を提供し得る。これを行う１つの方法としては、デコイヌクレオチド配列を提供することである。デコイ配列は、天然のシス調節配列または内在性シス調節配列を含むかまたは、細胞において同族転写因子への結合をめぐって競合する転写因子結合部位を含む。デコイは、天然の配列への転写因子の結合を低減することによって、発現が細胞におけるシス調節配列によって通常は調節される遺伝子の発現を変更する。かかる変更は、表現型の（例えば、原核細胞の代謝産物生産または抗生物質耐性の）有用な変更を提供することができる。本明細書では、デコイ機能は、この方法で、同族転写因子への結合をめぐってシス調節配列と競合する配列の能力を指す。
【００４６】
本発明者は、転写因子結合をめぐって細胞転写因子結合部位と競合して、細胞の遺伝子発現を変更する配列を同定し、したがって新規のシス調節配列およびデコイ配列を提供し得る新しい手段を開発した。
【００４７】
（ｎ［スネア］プラスミド）
本明細書において記載される手法は、インビボでの発現の修飾に使用される「デコイ」オリゴヌクレオチド技術の真核生物において公知な適用に関して、重要な適合を行うことである。デコイオリゴヌクレオチドのロジックは単純でありすべての生物学的系に関連する。すなわち転写因子の同族部位への結合を混乱させることによって遺伝子制御を行う。我々は、遺伝子調節の解析のための一般的なハイスループット手法の提供によってこの技術を改良する。第１の修飾は、デコイ配列のホモポリマーをクローニングする方法の開発によって手法をプラスミドによるものにして、高コピーの「ｎ［スネア］」プラスミドを生成するようにすることを含む。これらは、すべての細菌へと容易に導入されて正の選択によって維持され、オリゴヌクレオチドは細胞へと導入するのが困難であってエキソヌクレアーゼに対する感受性のため半減期が比較的短いというデコイ手法の主要な欠点を回避する。
【００４８】
ｎ［スネア］プラスミドを生成するために使用される分子生物学プロトコルの概要を図１に示す。ｎ［スネア］プラスミドがどのように遺伝子調節に影響を与えるかの概要を図２に示す。ｎ［スネア］プラスミドの有効性の実証を図３に示し、ここではこのプラスミドを使用して、抗生物質合成の正の多機能レギュレーター（ＡｆｓＲ）からの公知のシス調節配列の導入によって、Ｓ．セリカラー（coelicolor）における抗生物質の産生を弱める。
【００４９】
１．ｎ［スネア］プラスミドの設計
シス調節の生物学的活性の同定における使用のために、デコイ自体ではなくデコイオリゴヌクレオチドのプラスミド性バージョンを生成するという利点は、以下のものを含む。
１．製造コスト：以下に記載する分子生物学的プロトコルは単純で着実であり、合成されたオリゴヌクレオチドまたは多様なソースからのＤＮＡ断片のいずれかに対して適用されてもよい。プラスミドは自己複製するので、大量のプラスミドを産生する必要はない。これは、高価な恐れのあるヌクレオチド骨格の修飾による大量のデコイオリゴヌクレオチドの生成の潜在的な必要性と比較して優れている；
２．分解に対する耐性：デコイと比較して、プラスミドはヌクレアーゼによるインビボの分解に対する感受性をほとんど示さない；
３．プラスミド濃度が維持される：プラスミドは自己複製し（およびそれらの細胞内濃度またはコピー数を制御する機構を有してもよい）、必要であるならば、正の選択を行うことができるので、ｎ［スネア］プラスミドの半減期は理論的には無限である；
４．宿主が広範である：実施例１において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（遺伝子操作の容易性のために）およびＳ．セリカラー中にたやすく形質転換および増殖させることができる「シャトルプラスミド」が使用される。広範な細菌宿主の形質転換を可能にする多くのプラスミドが、当業者に公知である；
５．別個のｎ［スネア］プラスミドを使用して、シス調節配列の組み合わせを試験してもよい。すなわち、適合性のあるプラスミドを使用して、２つ以上のｎ［スネア］プラスミドによる同時処理が相乗効果を有しているかどうかを決定できる可能性がある。
【００５０】
したがって、１つの態様において、本発明は、公知であるかまたは推定上のシス調節配列の見込まれるデコイ機能を試験するために、または新規のシス調節配列（それはデコイ配列として働く可能性のある）についてスクリーニングするために適切なプラスミドを提供する。このプラスミドはｎ［スネア］プラスミドと呼ばれる。
【００５１】
ｎ［スネア］プラスミドの使用の原理を図２に示す。このプラスミドは「スネア」配列（図中では複数のコピーで示される）を含む。「スネア」が細胞性シス調節配列と転写因子への結合をめぐって競合する転写因子結合部位を含むならば、細胞へのｎ［スネア］プラスミドの導入は、転写因子を細胞性シス調節配列からスネア上へとタイトレーションすることになる。これは、遺伝子の発現の変化として検出することができ、その発現は、そのシス調節配列によってまたは細胞の表現型の変更によって細胞中で調節される。遺伝子発現または表現型のアウトプットの変化は、したがって、スネアがデコイ機能を有する配列を含むことを示し、プラスミドをシス調節配列の機能を同定または確認するために使用することができる。
【００５２】
一般に、ｎ［スネア］プラスミドは、プラスミドベクターおよびインサート配列（スネアを含むインサート）を含む。プラスミド中にスネア配列を組み込むことは、当該技術分野におけるデコイ分解の問題に対処し、細胞におけるデコイの安定した維持（および遺伝子発現に対する任意の影響）を可能にする。
【００５３】
インサート配列は、モノマー配列（スネアを含む）の１つ以上のコピーを含む。したがって、インサートは（例えば）１〜２００のモノマー配列を含んでもよい。典型的には、２つ以上のコピー、例えば、２〜２００のコピー、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、または１９０のコピーが存在する。例えば、５〜２００、５〜１５０、５〜１００、１０〜１５０、１０〜５０、５〜５０、５〜４０、１０〜４０、５〜３０のコピーが存在し得る。例えば、モノマー配列の３０のコピーが存在してもよい。プラスミドは、典型的にはモノマーのホモポリマーを含む。典型的には、それらはモノマーの複数のコピーであり、例えばモノマー配列の複数のダイレクトリピートである。モノマーの（およびしたがってスネアの）複数のコピーの提供は、デコイのタイトレーション力を増加させる。
【００５４】
モノマー配列はスネア配列を含む。スネアは、本明細書において記載されるようなシス調節機能またはデコイ機能について試験または使用されるヌクレオチド配列を含む。
【００５５】
例えば、スネアは、公知のシス調節配列もしく推定上のシス調節配列、デコイ配列、デコイ機能について試験される配列の断片（例えば、プロモーター断片などゲノム断片）もしくはランダム化ヌクレオチド配列、またはシス調節配列の組み合わせ（例えば、２、３または４つ以上のシス調節配列）を含んでもよい。ｎ［スネア］プラスミドライブラリーは、ゲノムまたはゲノム断片の配列（またはシス調節配列）の実質的にすべてに由来するスネア配列を含みそしてそれらをカバーするように、調製されてもよい。スネア配列が、所与の長さ（「ｎ」ヌクレオチド長）のランダム化ヌクレオチド配列を含むｎ［スネア］プラスミドライブラリーもまた調製してもよい。好ましくは、すべてのまたは実質的にすべての長さがｎの見込まれる配列がこのライブラリーにおいて表される。これらのライブラリーは、細胞性シス調節配列を含み、および／または転写因子結合をめぐってそれと競合する配列を同定し、したがって新規のシス調節配列およびデコイ配列を同定するスクリーニングのために有用であり得る。
【００５６】
典型的には、スネア中の転写因子結合部位は、遺伝子（例えば、スネアまたはスネアプラスミド中の）へ機能的に結合されていない。その意味で、結合部位はその同族遺伝子から隔離されている。スネア中の結合部位は、その同族プロモーター中の他のエレメントからも隔離されていてもよい。１つの例では、モノマー配列は遺伝子を含まない。
【００５７】
モノマーはスネアに加えてさらなる配列を含んでもよい。しばしば、かかるさらなる配列は、スネアおよび／またはプラスミドインサートを産生するために使用される方法に由来する。例えば、モノマーは、「カスタム」スネアが本明細書における方法に従ってカスタムｎ［スネア］ライブラリーのために産生される場合に典型的に生じるアダプター配列などの、アダプター配列を含んでもよい。アダプター配列は、例えば、１つ以上の制限酵素のための認識部位および／または切断部位を含んでもよい。
【００５８】
モノマーは、プライマー（例えば、モノマーの産生または複数のモノマーを含むインサートの産生において使用されるプライマー）の結合部位を提供するヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００５９】
例えば、本明細書において記載のようなローリングサークル増幅方法を使用してプラスミドインサートが調製される場合、モノマーは典型的にはローリングサークル複製において使用されるプライマー（例えば、Ｔ７プライマー）の結合部位に対応するセグメントを含む。
【００６０】
典型的にはランダム化スネア配列を含むモノマーは、定常配列領域もまた含む。例えば、ｎヌクレオチドのランダム化スネア配列に、定常配列の領域が隣接してもよい。あるいは、定常配列の中央コアに、ランダム化ヌクレオチド配列領域が隣接してもよい。
【００６１】
モノマーの長さは、例えば、１０００までのヌクレオチド、例えば、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、または１０までのヌクレオチドであり得る。典型的には、モノマーの長さは、例えば、１０〜１００、１０〜５０、２０〜７５、３０〜６０、３０〜５０、３５〜５４などの３５〜５５ヌクレオチドの範囲である。例えば、モノマーの長さは、３０、４０または５０ヌクレオチドであってもよい。
【００６２】
モノマーのスネア部分は典型的には１０〜３０ヌクレオチド、例えば、１５、１６、１７、１８、１９または２０（例えば、１９）などの、１０〜２５、１０〜２０、１５〜２０ヌクレオチドのサイズにわたってもよい。
【００６３】
アダプター配列は、例えば、５〜３０ヌクレオチド、例えば、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチドなどの、５〜２５、５〜２０、５〜１５または５〜１０ヌクレオチドを含んでもよい。
【００６４】
典型的には、ｎ［スネア］プラスミド中のインサートは、本明細書において記載のようなモノマーの１つ以上のコピーを含む。インサートがモノマーの複数のリピートを含む場合、これらはタンデムリピートであってもよい。
【００６５】
プラスミドベクター中のインサートは、例えば、約１．５ｋｂ、例えば、１〜２ｋｂ、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、または１．８ｋｂを含んでもよい。しかしながら、適切な宿主細胞中でのプラスミドの安定した維持および本方法における効率的な使用を可能にする任意の適切なインサートサイズを使用してもよい。
【００６６】
典型的には、単一プラスミド中のすべてのモノマーの配列は同一である。
【００６７】
ｎ［スネア］プラスミドにおいて使用されるプラスミドベクターは、原核生物宿主または真核生物宿主における使用に適していてもよい。例えば、ベクターは、細菌宿主（例えば、放線菌宿主）などの原核生物宿主において使用してもよい。例えば、プラスミドベクターは、ストレプトミセス属（Streptomycete）株または大腸菌株、例えば１つ以上のストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、例えば、Ａ３（２）（またはＭ１４５株またはＭ６００株）、大腸菌、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトミセス・シンナモネオウス（Streptomyces cinnamoneous）における使用に適していてもよい。適切な宿主は本明細書においてさらに記載されている。
【００６８】
典型的には、ベクターは広範な宿主範囲および／またはシャトルベクターであり、したがって、１つ以上の宿主において維持および増殖させることができる。プラスミドは接合性プラスミドであってもよい。これは接合によって１つの細胞からもう一つの細胞への容易な伝播を可能にする。
【００６９】
好ましくは、プラスミドは自己複製する。典型的には、プラスミドは高コピー数プラスミドである。例えば、プラスミドは、例えば１細胞あたり２０〜１００個のコピー、例えば１細胞あたり２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または９５または１００個のコピーで維持されていてもよい。高コピー数は、スネア中のデコイ配列のタイトレーション力を増加させる。
【００７０】
典型的には、ｎ［スネア］プラスミドは複製起点を含む。適切な起点は当該技術分野において公知である。典型的には、プラスミドはさらに１つ以上の検出可能なマーカー遺伝子、例えば、抗生物質耐性をコードする１つ以上の遺伝子（例えば、アプラマイシン耐性をコードするａａｃ遺伝子）を含む。マーカー遺伝子の発現によって、宿主細胞中のプラスミドの維持に関してスクリーニングをすることが可能になる。
【００７１】
適切なプラスミドベクターの例は、例えば、ｐＩＪ８６を含む。適切なベクターは当該技術分野において公知である。
【００７２】
モノマー配列またはスネアの配列は、本明細書において記載された、かつ／または本明細書において記載された方法に従って同定された、シス調節配列またはデコイ配列を含んでもよい。
【００７３】
例えば、プラスミド中の転写因子結合部位は、代謝産物産生の役割を有する遺伝子の発現を調節するシス調節配列を含むか、または転写因子結合をめぐってそれと競合してもよい。代謝物質は、例えば抗生物質、酵素または医薬品であってもよい。抗生物質は、例えば、アクチノロージン、ウンデシルプロジギオシン、またはシンナマイシンであってもよい。
【００７４】
例えば、スネアは、ＡｆｓＲタンパク質（Ｓ．セリカラーにおける抗生物質合成の多機能レギュレーター）の結合部位を含んでもよい。ＡｆｓｒＲ結合部位は配列番号１において太字で示されている（実施例１）。したがって、モノマーは配列番号１を含んでもよい。したがって、モノマーは、実施例１におけるような配列番号１の二重鎖バージョンであってもよい。１つの例では、モノマーの３０個のリピートであってもよく、かつ／またはプラスミドはシャトルベクターｐＩＪ８６を含んでもよい。したがって１つの態様では、本発明は、実施例１における方法に従って調製されたｎ［スネア］プラスミドに関する。
【００７５】
他の例では、本明細書において記載のように、スネアは、Ｓ．セリカラーのａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４プロモーター中のシス調節配列（例えば、リプレッサーシス調節配列）、またはかかる配列と転写因子結合をめぐって競合する配列を含んでもよい。例えば、シス調節配列は、本明細書において同定された配列Ａ２４．１、Ａ２４．２、Ａ２４．３、Ａ２４．４、またはＡ２４．５を含んでもよい。１つの態様では、モノマーは、本明細書において記載の配列番号８〜１２のうちの１つまたは配列番号１３を含んでもよい。
【００７６】
プラスミド中の転写因子結合部位は、本明細書においてリストされた任意の１つ以上の遺伝子などの、抗生物質耐性を決定する役割を有する遺伝子の発現を調節するシス調節配列を含むか、または転写因子結合をめぐってそれと競合してもよい。
【００７７】
例えば、スネアは、ＶａｎＲ転写因子の結合部位（例えば、エンテロコッカス・フェシウム（Entercoccus faecium）またはＳ．セリカラーのｖａｎＨプロモーター中に位置するＶａｎＲ結合部位）、またはかかる部位と競合する配列を含んでもよい。３０ｂｐのＶａｎＲ結合部位の例は配列番号２１において示され（大文字で書かれる）、さらなる例は、エンテロコッカス属（Enterococci）のＶａｎＲ結合部位を含む配列番号２６において提供される。１つの例では、モノマーは、対象となる細胞における天然のＶａｎＲ結合部位とＶａｎＲ転写因子の結合をめぐって競合する配列番号２１もしくは配列番号２６、またはそのバリアントを含んでもよい。例えば、バリアントは、他の種または株における天然のＶａｎＲ結合部位を含んでもよい。
【００７８】
プラスミド中の転写因子結合部位は、溶媒耐性（例えば、ブタノール耐性）を決定する役割を有する遺伝子の発現を調節するシス調節配列を含むか、または転写因子結合をめぐってそれと競合してもよい。
【００７９】
スネアは、ゲノムまたはゲノム断片に由来するか、またはそれから単離された配列を含んでもよい。ゲノム断片は、特定の機能もしくは対象となる表現型、例えば抗生物質（例えば、シンナマイシン、アクチノロージン、ウンデシルプロジギオシン）などの代謝物質の産生、特定の溶媒（例えば、ブタノール）もしくは毒素に対する耐性、特定の抗生物質に対する耐性、または対象となる他の機能もしくは表現型をコードする遺伝子を含んでもよい。スネアは、例えば、かかる遺伝子のプロモーター領域または周囲の配列、例えば、プロモーターよりも遺伝子からの距離が長い配列（例えば、最大２００ｂｐまたはそれ以上）に由来するか、またはそれから単離された配列を含んでもよい。
【００８０】
本明細書において記載のように、スネアは転写因子結合をめぐってかかる配列と競合する配列を含んでもよい。例えば、スネアは、シンナマイシン生合成の遺伝子のクラスターを含む、Ｓ．シンナモネウス（cinnamoneus）ゲノムの断片に由来するシス調節配列またはデコイ配列を含んでもよい。かかるスネアを調製する方法は本明細書において記載されている。本明細書において記載のように、スネアは、Ｓ．シンナモネウスｃｉｎ７プロモーターからのシス調節配列、または転写因子結合をめぐってかかる配列と競合する配列を含んでもよい。
【００８１】
スネアは、溶媒耐性を示す原核生物（例えば、ブタノール耐性を有する大腸菌Ｋ１２）のゲノムまたはゲノム断片に由来するか、またはそれから単離した配列を含んでもよい。特に、スネアは、溶媒耐性をコードする遺伝子のプロモーターに由来するかもしくはその発現が溶媒耐性に関連するシス調節配列、または転写因子結合をめぐってかかるシス調節配列と競合する配列を含んでもよい。かかるスネアを調製する方法は本明細書において記載されている。
【００８２】
スネアは、抗生物質耐性を示す原核生物のゲノムまたはゲノム断片（典型的には断片が、耐性をコードする遺伝子を含む）に由来するか、またはそれから単離した配列（例えば、シス調節配列またはデコイ配列）を含んでもよい。ゲノム断片は、抗生物質耐性をコードする遺伝子を含んでもよい。スネアは、抗生物質耐性をコードする遺伝子のプロモーターからのシス調節配列、または転写因子結合をめぐってかかる配列と競合するデコイ配列を含んでもよい。対象となる任意の抗生物質耐性を標的としてもよい。例えば、以下のものに対する抗生物質耐性がある。アミノグリコシド（カナマイシンおよびゲンタマイシンなど）；糖ペプチド（バンコマイシンなど）；ペニシリン（アンピシリン、カルベニシリンおよびペニシリンなど）、β−ラクタマーゼ阻害剤およびその組み合わせ（ピペラシリンおよびタゾバクタムなど）、セファロスポリン（セフェピムなど）、カルバペネム（メロペネムなど）、モノバクタム（アズトレオナムなど）を含むβ−ラクタム；ポリペプチド系抗生物質（ポリミキシシン（polymixcin）Ｂなど）；キノリン（レバクインなど）；フルオロキノリン（fluorquinolines）（シプロフロキサシンなど）；スルホンアミド（バクトリムなど）；テトラサイクリン（テトラサイクリンなど）；マクロライドおよびケトライド（アジスロマイシンなど）；オキサゾリジノン（リネゾリドなど）；ニトロイミダゾール（メトロニダゾールなど）；ニトロフラン（ニトロフラントインなど）；ストレプトグラミン（ダルホプリトシン（dalfopritsin）など）；環状リポペプチド（ダプトマイシンなど）；リンコマイシン（クリンダマイシンなど）ならびにクロラムフェニコール、リファンピシン、イソニアジド、エタンブトール、テルバンシン（telvancin）、テイコプラニン、オリタバンシン、ダルバンシン（dalbvancin）、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、ホスホマイシン、ニトロフラントインおよびチゲサイクリン、およびザイボックスなどとして公知の抗生物質のクラス。
【００８３】
例えば、以下のものに対する抗生物質耐性がある。アミノグリコシド（カナマイシンなど）；カルバペネム（メロペネムなど）；セファロスポリン（セフェピムなど）；糖ペプチド（バンコマイシンなど）；ペニシリン（アンピシリン、カルベニシリン、およびペニシリンなど）；ポリペプチド系抗生物質（ポリミキシシン（polymixcin）Ｂなど）；キノリン（レバクインなど）；スルホンアミド（バクトリムなど）；テトラサイクリン（テトラサイクリンなど）；ならびにクロラムフェニコール、リファンピシン、ザイボックス、およびダプトマイシンなどとして公知の抗生物質のクラス。
【００８４】
（ｎ［スネア］プラスミドライブラリー）
単一シス調節エレメントの機能的活性を確立することができるｎ［スネア］プラスミドの生成について記載してきたが、これらの配列を見出して特性を評価することができ、ｎ［スネア］プラスミドのライブラリーの使用を介する方法を含み、ハイスループットスクリーニングと適合性のある方法論である方法を、本明細書において一般化する。
【００８５】
この方法論の全体的な目的は、真核生物遺伝子に加えて原核生物遺伝子のシス作用レギュレーターを迅速に同定する新規の方法を開発し、その過程でインビボでの発現を修飾できる手法を生み出すことである。本方法は、規模の大きな調節ネットワークの詳しい調査を可能にする。遺伝子調節の機構の理解において期待される進歩は、マイクロアレイトランスクリプトーム解析によってもたらされた進歩に匹敵することになる。
【００８６】
この研究は、遺伝的修飾因子を同定し、遺伝子ノックアウトまたは挿入変異の生成など既存の技術と異なる方法で経路を決定する。これらのアプローチは一般的にトランス作用レギュレーター（転写因子など）を同定する。シス作用因子の同定によって、この技術は、これらの従来のアプローチに関連した以下の問題を回避する。冗長性：転写調節に固有の複雑さに起因する（１つ以上の転写因子が同じ部位で結合できることを意味する）；極性効果：変異誘発は、同じ転写ユニット中の変異部位の３’に位置する遺伝子の発現に影響を与えることができる；高コストおよび所要時間：単一ノックアウトの生成および検証は数週間〜数年（種に依存して）かかり、飽和変異誘発の実行は時間がかかり高価な手順である；種特異性：本明細書において記載のアプローチは、すべての実験系における潜在的な有用性を有しており、ユニバーサル「デコイ」ライブラリーを適用して大多数の種における調節をマッピングできることが予想される。
【００８７】
実施例１では、高コピーの「ｎ［スネア］」プラスミドを生成するために、デコイ配列のホモポリマーをクローニングする方法の開発によって手法をプラスミド的にする修飾が報告され、デコイ技術に関する実質的な改善を実証する。これらは、多くの細菌種へと容易に導入されて正の選択によって維持され、オリゴヌクレオチドは細胞へと導入するのが困難であってエキソヌクレアーゼに対する感受性のために半減期が比較的短いというデコイアプローチの主要な欠点が回避される。第２の修飾および改善において、我々は、全ゲノムの断片（実施例２において詳述される）またはランダム化オリゴヌクレオチド（実施例４において記載される）に由来する配列のいずれかからなる、ｎ［スネア］ライブラリーを生成する。これらの手法は、平行してスクリーニングされる調節エレメントの包括的な回収を可能にし、スクリーニング目的のためのデコイの使用（確定された配列の連続的な試験に限定されている）よりもはるかに有力な手法である。以下に、実施例３において、モデルとして抗生物質産生の調節を使用するレポーター系は、ライブラリー内の正のレギュレーターおよび負のレギュレーターを選択する１つの例示的な実施形態において使用される。
【００８８】
図４は、カスタムｎ［スネア］プラスミドライブラリーがどのように構築されるかのプロセスの一部分を示す概略図である。
【００８９】
図５は、ストレプトミセス・シンナモネオウスからの抗生物質シンナマイシンの産生をアップレギュレートできるシス調節エレメントを検出するｎ［スネア］ライブラリーを使用する実験的なアプローチを示す。
【００９０】
図６は、抗生物質耐性との闘いへのｎ［スネア］の適用についての詳細をさらに提供する。
【００９１】
（探索ツールとしてのｎ［スネア］プラスミドライブラリー）
遺伝子発現、および付随する表現型効果の大部分は、ＤＮＡ−タンパク質相互作用によって制御される。遺伝子発現を理解し制御する取り組みは、一般的に、転写装置のタンパク質コンポーネントが結合するＤＮＡ配列（シス調節エレメント）よりもむしろ、転写装置のタンパク質コンポーネント（転写因子などトランス作用因子）を操作することにより重点を置く。トランス作用因子とは対照的に、シス調節エレメントを標的とすることは以下の長所を有する。標的としたタンパク質の遺伝子欠失を行うよりも細胞の中へオリゴヌクレオチドをトランスフェクションするほうが容易である；オリゴヌクレオチドの使用はハイスループット解析に、より適応可能である；１つの特定の転写因子の欠失が同じシス調節配列へ結合する他の因子の活性によって償われる場合、シス作用エレメントの使用により調節ネットワーク中の冗長性の問題が回避される。しかしながら、デコイアプローチによる潜在的な障害は候補配列の同定である。
【００９２】
この目的のため、ｎ［スネア］ベクターの有用性は、ゲノム断片からライブラリーを生成し、生じるライブラリーのメンバーがその断片上に含まれる遺伝子によって合成された産物の制御を行うことができるかどうかを確かめる試験を行うことによって実証される。さらに、ライブラリー生成を分子生物学的に試験する（ライブラリーが十分に複雑で、同じ配列のダイレクトリピートの予想される分子構造を有することを確認するため）。これらの成功をさらに発展させて、幅広く一般的な適用を備えた有力なスクリーニング方法を作り出す。
【００９３】
したがって上述されるように、本発明は、ｎ［スネア］プラスミドライブラリーにも関する。プラスミドライブラリーを本発明の方法に従って使用して、原核生物または真核生物のいずれかにおける新規のシス調節配列およびデコイ配列についてスクリーニングしてもよい。スクリーニングのためのｎ［スネア］ライブラリーの使用は、デコイ機能について複数の配列のハイスループットスクリーニングを可能にする。
【００９４】
ライブラリーにおけるプラスミドのスネア配列は、ゲノム断片またはゲノムＤＮＡに由来してもよい。次に、ライブラリーは、実質的にすべてのゲノム断片またはゲノム配列を表すか、またはカバーするスネア配列を含んでもよい。このタイプのプラスミドライブラリーは本明細書においてカスタムｎ［スネア］ライブラリーと呼ばれる。あるいは、ライブラリーにおけるプラスミドのスネア配列は、長さが「ｎ」のヌクレオチドのランダム化配列を含んでもよい。次に、本明細書において記載されるように、ライブラリーは、長さが「ｎ」のあらゆるヌクレオチド配列を実質的に含んでもよい。かかるライブラリーは、ユニバーサルｎ［スネア］ライブラリーと本明細書において記載される。
【００９５】
（カスタムｎ［スネア］プラスミドライブラリー）
典型的には、スネアはゲノム断片またはゲノムＤＮＡ（原核生物または真核生物の）に由来する。例えば、細菌（例えば、Ｓ．シンナモネウス、Ｓ．リビダンス、もしくはＳ．セリカラーなどのストレプトミセス属、または大腸菌）などの原核生物のゲノムまたはゲノム断片である。
【００９６】
ライブラリーが由来するゲノムまたはゲノム断片は、対象となる特定の機能または表現型、例えば抗生物質（例えば、シンナマイシン、アクチノロージン、ウンデシルプロジギオシン）などの代謝物質の産生、特定の溶媒もしくは毒素に対する耐性、特定の抗生物質に対する耐性、または対象となる他の機能もしくは表現型をコードする遺伝子を含んでもよい。スネアは、かかる遺伝子のプロモーター領域に由来するか、またはそれから単離した配列を含んでもよい。適切な遺伝子および機能／表現型はスネア配列に関して上述されている。
【００９７】
したがって、ゲノムＤＮＡまたは断片は、例えば、代謝物質が抗生物質、酵素または医薬品である場合、代謝産物産生における役割を有する遺伝子、または抗生物質耐性の決定における役割を有する遺伝子、または溶媒耐性の決定における役割を有する遺伝子を含んでもよい。
【００９８】
特定の機能または表現型をコードする遺伝子を含むゲノム断片は、機能または表現型をコードする遺伝子の異種細胞への水平伝播の検出によって同定されてもよい。
【００９９】
特定の機能または表現型をコードする遺伝子を含むゲノム断片は、バイオインフォマティクスによる解析によって同定されてもよい。あるいは、それはかかる断片のコレクションの機能的スクリーニングによって同定されてもよい。
【０１００】
カスタムｎ［スネア］ライブラリーを調製する方法は本明細書において記載されている。
【０１０１】
（ユニバーサルライブラリー）
ユニバーサルライブラリーにおいて、スネアは、典型的には、長さがｎのヌクレオチドのランダム化ヌクレオチド配列を含む。ライブラリーは、長さがｎのヌクレオチドの配列のすべてまたは実質的にすべての順列を表すスネアを含んでもよい。一般に、ｎは、５〜５０、例えば１０〜５０、例えば２０〜４０、例えば２５〜３５、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドにわたることができる。
【０１０２】
かかるライブラリーにおけるモノマーはさらに定常配列を含んでもよい。したがって、ランダム化配列（可変領域）に片側または両側で定常領域が隣接してもよい。あるいは、モノマーに可変領域が隣接する確定されたコア配列を含んでもよい。ヌクレオチドバイアスは可変領域中に導入されてもよい。例えば、可変領域中の高ＧＣバイアスが適切である場合、例えばライブラリーが、高ＧＣバイアスを示すＤＮＡを持つ生物におけるシス調節配列についてのスクリーニングにおける使用のためのものである場合、可変領域はより高いＧＣバイアスを有してもよい。
【０１０３】
１つの例では、スネアはランダム化９ヌクレオチド配列（ｎ＝９）を含む。ｎ［スネア］プラスミドにおけるモノマーは、配列番号７のオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。ユニバーサルｎ［スネア］ライブラリーを産生する方法は、本明細書において記載されている。
【０１０４】
（ｎ［スネア］プラスミドを調製する方法）
一般に、本明細書において記載のようなｎ［スネア］プラスミドは、
・１つ以上のコピーのモノマー配列を含むポリヌクレオチドを提供することと；
・適切なプラスミドベクターへとポリヌクレオチドをクローニングすることと
を含む方法によって調製してもよい。
【０１０５】
モノマーの組成は、ｎ［スネア］プラスミドについて本明細書において記載のとおりである。適切なプラスミドベクターもまた記載されている。
【０１０６】
１つ以上のコピーのモノマー配列を含むポリヌクレオチドは下記工程を含む方法により提供されてもよい。
（１）下記（ｉ）および（ｉｉ）を含む環状オリゴヌクレオチドを提供すること；
（ｉ）対象となる試験配列（図１中のＢ）；
（ｉｉ）ローリングサークル増幅における使用に適したプライマーの結合部位（図１中のＡ）；
ここで上記モノマー配列は（ｉ）および（ｉｉ）を含む；
（２）鋳型として上記環状オリゴヌクレオチドを使用するローリングサークル増幅を実行すること。これによってモノマー配列のリピートを含むポリヌクレオチドが提供される。
【０１０７】
上記方法の工程（１）は、ＰＣＲによってローリングサークル増幅産物を増幅し、必要とされるサイズのポリヌクレオチド断片（例えば、３０〜５０個のモノマー配列のリピートを含む断片）を単離することをさらに含んでもよい。これは、例えばＰＡＧＥ解析によって行うことができる。
【０１０８】
環状オリゴヌクレオチドは下記工程を含む方法により調製してもよい。
・対象となる試験配列（ｉ）と、ローリングサークル増幅における使用に適したプライマーの結合部位（ｉｉ）とを含む直鎖一本鎖オリゴヌクレオチドを提供すること；
・典型的にはユニバーサル連結オリゴヌクレオチドの存在下において、例えばＴａｑリガーゼを使用して、オリゴヌクレオチドを直鎖状にすること；
・任意に、エキソヌクレアーゼにより残存する直鎖ＤＮＡを消化すること；
・例えばＰＡＧＥを使用して、単量体環状オリゴヌクレオチドを回収すること。
【０１０９】
ローリングサークル増幅における使用に適したプライマーは当該技術分野において公知である。例えば、Ｔ７プライマーを使用してもよい。
【０１１０】
ローリングサークル増幅を実行する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、ＢｓｔＩポリメラーゼを使用してもよい。
【０１１１】
１つの例では、ローリングサークル増幅産物のＰＣＲ増幅は、ローリングサークル増幅に使用した同じプライマー（例えば、Ｔ７プライマー）を使用して実行される。
【０１１２】
一般に、モノマーにおける試験配列（ｉ）は、本明細書において記載されるようなスネア配列を含む。
【０１１３】
本明細書において記載のように、スネア配列は、ゲノムＤＮＡから（例えば、全ゲノムから）またはゲノム断片から単離してもよい。いったん単離されたら、スネア配列は、上記の方法によってｎ［スネア］プラスミドを形成するために使用されてもよい。したがって、ゲノムまたはゲノム断片に由来するｎ［スネア］プラスミドのライブラリー（本明細書において記載のようなカスタムライブラリー）を調製してもよい。
【０１１４】
ゲノムまたはゲノム断片からのスネア配列の調製のためのプロトコルを図４に示す。典型的には、方法は下記工程を含む。
（１）二本鎖ゲノムＤＮＡのサンプルを提供すること；
（２）ゲノムＤＮＡを断片化すること；
（３）（ｂ）からのＤＮＡ断片の各末端へアダプターをライゲーションすること、
ここで各アダプターは下記のものを含む、
（ｉｉｉ）ＤＮＡ断片の固定化のための手段、
（ｉｖ）認識部位から（例えば、下流（３’）の）距離をおいて切断する第１の制限酵素のための認識部位、および
（ｖ）第２の制限酵素のための認識部位および切断部位；
（４）任意に、ライゲーションされていないアダプターを除去すること；
（５）第１の制限酵素によりアダプターを持つ断片を消化し、これにより２つのアダプターを付加した断片を産生すること、
ここでアダプターを付加した各断片は下記のものを含む、
（ｖｉ）アダプター、および
（ｖｉｉ）より短い鎖と、スネア配列を含むより長い鎖（例えば、３’突出を備えた）とを含むＤＮＡ断片；
（６）（５）において産生されたアダプターを付加した断片を固定化すること；
（７）断片を変性させて単一鎖の断片を提供すること；
（８）アダプターへの相補オリゴヌクレオチドのライゲーションによって第２の制限酵素のための認識部位を再生成し、第２の制限酵素によりアダプターを付加した断片を消化し、これにより下記のものを含むアダプター−スネア断片を産生すること、
（ｖｉｉｉ）アダプター断片；および
（ｉｘ）一本鎖スネア配列；ならびに
（９）固定化からアダプター−スネア断片を解放すること。
【０１１５】
（８）において産生されたアダプター−スネア断片は、一本鎖スネア配列、および第２の制限酵素による消化後に残存するアダプターの断片（第２の酵素の認識部位とスネアに結合されるアダプターの末端との間のアダプターの部分に対応する）を含む。結果として生ずるｎ［スネア］プラスミド（上記の試験配列（ｉ））中のモノマーは、アダプタースネア断片を含むことになる。
【０１１６】
ゲノムＤＮＡサンプルは、原核生物細胞または真核生物細胞に由来してもよい。ゲノムＤＮＡサンプルはゲノム断片または全ゲノムを含んでもよい。サンプルは、天然の株（例えば、病原体）または臨床分離株などの、対象となる特定の表現型（例えば、特定の代謝物質の産生、特定の抗生物質に対する耐性）を示す細胞からであり得る。例えば、サンプルは、シンナマイシンを産生するＳ．シンナモネウスから、アクチノロージン、ウンデシルプロジギオシンを産生するＳ．セリカラーから、ブタノールに対する耐性を示す大腸菌Ｋ１２から、またはバンコマイシンに対する耐性を示すエンテロコッカス・フェシウムもしくはＳ．セリカラーからであってもよい。サンプルは、例えば、遺伝子の水平伝播によって特定の表現型または機能を獲得した細菌モデルからのものであってもよい。
【０１１７】
典型的には、工程（２）において産生された断片は約５００ｂｐの長さであるが、例えば、２００〜９００、３００〜８００、４００〜６００ｂｐなど、１５０、２５０、３５０、４５０、５５０、６５０、７５０、８５０、９５０ｂｐなどの、１００〜１０００ｂｐにわたってもよい。任意の適切な断片化方法を使用して、断片を産生してもよい。好ましくは、当該方法はランダム化断片またはバイアスがない断片を産生する。例えば、超音波処理を使用してもよい。
【０１１８】
工程（２）において産生された断片は、異なるタイプの末端（例えば、平滑末端、または異なる長さの５’もしくは３’突出）を含んでもよい。したがって、断片化工程（ｋ）において産生された断片をさらに処理して、各断片が同じ３’デオキシリボヌクレオチド３リン酸突出（ｄＡまたはｄＴ）を有するという点で均質な断片の集団を産生してもよい。これは、例えば、必要であるならばＴａｑポリメラーゼおよび適切なｄＮＴＰにより断片末端を修復し、３’ｄＮＴＰを追加する（例えば、ｄＡ突出）処理をすることによって、行うことができる。
【０１１９】
アダプターは任意の適切な手段によって断片へ結合してもよい。例えば、アダプターは、断片の各々の３’ｄＮＴＰ突出に対して相補的な５’ｄＮＴＰ突出を含んでもよい。したがって、例えば、工程（ｂ）において産生された断片が３’ｄＡ突出を含むならば、アダプターは５’ｄＴ突出を含んでもよい。
【０１２０】
上述の方法において、アダプターは、ＤＮＡ断片の固定化のための手段を含む。固定化は本方法にとって必須ではないが、実験のバックグラウンドを低減するという長所を有する。アダプターは任意の断片の固定化に適切な手段を含んでもよい。例えば、アダプターは、１対の結合分子のうちの１つのメンバーを含んでもよく（典型的にはＤＮＡ断片の遠位末端で）、ここでペア中の結合分子は互いに結合し、ペアの他のメンバーは適切な固定化マトリクス中に含まれてもよい。例えば、ペア中の結合分子は、ビオチンおよびストレプトアビジンであってもよい。ビオチン化アダプターを使用することができ、アダプターを付加した断片はストレプトアビジンマトリクス上に捕捉される。
【０１２１】
第１の制限酵素は、その認識部位から距離をおいて切断する。例えば、酵素は、その認識部位の下流（３’）で切断してもよい。この酵素が切断する距離は、スネア配列の長さを決定する。スネア配列に適切な長さは本明細書において記載されている。使用してもよい酵素の例としてはＭｍｅＩがある。他の例としては、ＧｓｕＩ、ＢｐｍＩ、およびそのアイソシゾマーが挙げられる。さらなる例としては、ＩＩｓ型として知られる制限酵素のファミリーのメンバーがあげられ、これらはその認識部位の外側の片側で切断する。本記載において、３’側で切断する酵素が使用され、最も長い距離（典型的には１５〜２５ヌクレオチド）で切断するものが好ましい（Ｇｅｎｅ（１９９１年）１００；１３〜２６中で概説される）。導入された二本鎖切断の性質は重要ではないが、本明細書で記載された方法においては３’突出が使用される。本方法は、５’突出および平滑切断の両方の使用に適合させることができる。スネアの性質をそれに応じて変更してもよい。例えば、もしより長い５’突出を備えた非対称の産物を与える酵素が使用されるならば、５’突出をスネアに転化することが有利となる。認識部位（それは典型的には非対称である）がアダプター中でどのように位置するかにも依存して、その認識部位の５’で切断を導入する酵素を使用してもよい。
【０１２２】
第２の制限酵素はアダプター配列中で切断する。使用してもよい酵素の例としては、Ｎｔ．Ｂｂｖ．ＣＩが挙げられる。この酵素はニックを入れるエンドヌクレアーゼとして公知であり、上部鎖中に一本鎖ニックを導入しスネアの回収を可能にするので、本出願において使用される。しかしながら、本方法は大多数の一般的には入手可能な制限酵素の使用に適合させることができる。使用してもよい酵素の例としては、３’突出もしくは５’突出を生成するか、または平滑末端切断部を生成するものが挙げられる。
【０１２３】
一旦調製されたならば、ｎ［スネア］プラスミドライブラリーは、その構築物中のバイアスについて試験してもよい。典型的には、これは、プラスミドを単離し、消化してインサートを放出させ、さらに消化して（例えば、第１の制限酵素による）モノマー配列を単離することによって行われる。
【０１２４】
カスタムｎ［スネア］プラスミドライブラリーの生成は本実施例中に記載されている。実施例２において、ライブラリーはＳ．シンナモネオウスのシンナマイシン生合成遺伝子クラスターから調製され、実施例４において、ライブラリーは大腸菌Ｋ１２ゲノムＤＮＡから作成される。本発明は、これらの実施例において調製されるようなライブラリーに関する。
【０１２５】
本明細書において記載のように、スネア配列はランダム化ヌクレオチド配列を含んでもよい。典型的には、スネアは、長さが「ｎ」のヌクレオチドのランダム化（または可変）ヌクレオチド配列を含む。一般に、ｎは、５〜５０、例えば１０〜５０、例えば２０〜４０、例えば２５〜３５、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドにわたってもよい。スネアが長さｎのランダム化配列を含むプラスミドのライブラリーを作成してもよい。かかるライブラリーはユニバーサルｎ［スネア］ライブラリーである。
【０１２６】
ランダム化配列（および、任意で、記載のような定常配列）を含むオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において公知の方法を使用して合成してもよい。典型的には、ｎ［スネア］ユニバーサルライブラリーのためのスネアの調製において、長さｎの可能なヌクレオチド配列をすべてまたは実質的にすべて含むオリゴヌクレオチドが調製される。
【０１２７】
ヌクレオチドバイアスを、オリゴヌクレオチドのランダム化（または可変）領域の中へ導入してもよい。例えば、適切であればＧＣバイアスを導入してもよい。
【０１２８】
上記の方法では対象となるモノマーまたは試験配列（図１中のＢ）は、このように調製されたオリゴヌクレオチドを含んでもよい。次に、記載のようにｎ［スネア］プラスミドを調製してもよい。
【０１２９】
実施例４は、ｎ＝９であるユニバーサルｎ［スネア］ライブラリーの作成について記載する。本発明は、実施例４における方法に従って調製されたライブラリーに関する。
【０１３０】
１つの態様では、本発明は、本明細書において記載されたおよび／または本明細書において記載された方法に従って同定されたシス調節配列またはデコイ配列を含むモノマーおよび／またはスネアを含むｎ［スネア］プラスミド（実施例を含む、本明細書において記載されたおよび／または本明細書の方法に従って調製された、いずれのｎ［スネア］プラスミドまたはプラスミドライブラリーも包含する）に関する。
【０１３１】
（宿主細胞）
本発明はまた、本明細書において記載のようなｎ［スネア］プラスミドまたはプラスミドライブラリーを含む宿主細胞に関する。本発明は、本明細書において記載のようなデコイポリヌクレオチド（デコイ分子）を含む宿主細胞にさらに関する。特に、本発明は、プラスミド、またはデコイポリヌクレオチドの存在に起因して変更された遺伝子発現および／または表現型（例えば、プラスミド／デコイ分子が存在しない細胞と比較して、抗生物質または酵素などの代謝物質または発酵産物の産生の増加、溶媒に対する耐性の増加、１種以上の抗生物質に対する感度の増加）を示す宿主細胞に関する。
【０１３２】
典型的には、プラスミドまたはプラスミドライブラリーまたはポリヌクレオチドは、適切な手段（例えば、形質転換、トランスフェクション、接合）によって細胞に導入されている。
【０１３３】
本方法で使用される宿主細胞は、原核生物または真核生物であってもよい。例えば、細菌細胞などの原核生物を使用してもよい。宿主は、例えばストレプトミセス属の種などの放線菌、例えばＳ．セリカラー、例えばＳ．セリカラーＡ３（２）、（Ｍ１４５株またはＭ６００株）、Ｓ．リビダンス、Ｓ．シンナモネオウス、または大腸菌であってもよい。他の例としては、放線菌綱（Actinobacteria）の群からのもの（例えば、病原細菌のヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ウシ型結核菌（M.bovis）、Ｍ．アフリカヌム（africanum）、およびＭ．ミクロティ（microti）；癩菌（M.leprae）などのマイコバクテリウム属からの細菌などのグラム陽性菌の他の種を挙げることができる。グラム陽性菌の属のさらなる例としては、クロストリジウム・アセチルブチリクタム（Clostridium acetylbutylictum）、Ｃ．サーモセラム（thermocellum）、およびＣ．リュングダリイ（ljungdahlii）などの産業使用の可能性のある細菌に加えて、Ｃ．ディフィシル（difficile）（ヒト病原体）、ボツリヌス菌（C.botulinum）、クロストリジウム・パーフリンジェス、および破傷風菌（C.tetani）などの病原細菌が挙げられるクロストリジウム属である。グラム陽性菌の他の種類としては、桿菌（バチルス属（Bacillus）、リステリア菌（リステリア属（Listeria））、ブドウ球菌（スタフィロコッカス属（Staphylococcus））、紡錘状菌（クロストリジウム属）、コリネバクテリア（コリネバクテリア属（Corynebacterium））、連鎖球菌（ストレプトコッカス属（Streptococcus））、および腸球菌（エンテロコッカス属）を挙げることができる。宿主細胞は、サルモネラ菌および大腸菌などのヒト病原体を含む腸内菌属を含むグラム陰性菌でもあり得る。グラム陰性菌の属の他の例としては、シュードモナス属（Pseudomonas）、ボルデテラ属（Bordetella）、ボレリア属（Borrelia）、ブルセラ属（Brucella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、フランキセラ属（Francisella）、ヘモフィルス属（Haemophillus）、クレブシエラ属（Klebsiella）、ナイセリア属（Neisseria）、プロテオバクテリア門（Proteobacteria）、リケッチア属（Rickettsia）、ビブリオ属（Vibrio）、エルシナ属（Yersina）、モラクセラ属（Moraxella）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、ステノトロフォモナス属（Stenotrophomonas）、ブデロビブリオ属（Bdellovibrio）、酢酸菌、レジオネラ属（Legionella）、シアノバクテリア、スピロヘータ目（spirochaetes）、緑色硫黄細菌および緑色非硫黄細菌、ならびに他の多くのものを挙げることができる。重要なグラム陰性菌病原体としては、性感染症（淋菌（Neisseria gonorrhoeae））、脳膜炎（髄膜炎菌（Neisseria meningitidis））、および呼吸器症状（モラクセラ・カタラリス（Moraxella catarrhalis））を引き起こす球菌種が挙げられる。他の医学的に適切なグラム陰性嫌気性菌としては多くの種が挙げられる。それらのうちのいくつかは、主として呼吸器障害（インフルエンザ菌（Hemophilus influenzae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、レジオネラ・ニューモフィラ菌（Legionella pneumophila）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa））、主として泌尿器疾患（大腸菌、ミラビリス変形菌（Proteus mirabilis）、汚物腸内菌（Enterobacter cloacae）、セラチア菌（Serratia marcescens））、および主として胃腸障害（ピロリ菌（Helicobacter pylori）、腸炎菌（Salmonella enteritidis）、チ��ス菌（Salmonella typhi））を引き起こす。宿主細胞は、酵母（その例としては、サッカロミセス属（Saccharomyces）（出芽酵母（S.cerevisiae）など）、シゾサッカロミセス属（Schizosacharromyces）（分裂酵母（S.pombe））およびメチルトローフ（methyltrophic）酵母属のピキア属［Ｐ．パストリス（pastoris）など］およびカンジダ属（Candida）、またハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）などの産業的生産に使用されるもの；カンジダ属［Ｃ．アルビカンス（albicans）およびＣ．トロピカリス（tropicalis）など］、またクリプトコッカス属［Ｃ．ネオフォルマンス（neoformans）など］などの病原性酵母を挙げることができる）、真菌（カンジダ属、アスペルギルス属（Aspergillus）［Ａ．フミガーツス（fumigatus）およびＡ．フラブス（flavus）など］、クルプトコッカス属（Crptococcus）、ヒストプラスマ属（Histoplasma）［Ｈ．カプスラーツム（capsulatum）など］、ニューモシスティス属（Pneumocystis）［ニューモシスティス肺炎菌（P.jirovecii）など］、スタキボチルス属（Stachybotyrus）［Ｓ．チャルタルム（chartarum）など］などの病原性真菌；アスペルギルス属［特に、黒色コウジ菌（A.niger）およびコウジ菌（A.oryzae）］などの産業的生産において使用される真菌を挙げることができる）、ニューロスポラ属のメンバー（アカパンカビなど）、細胞培養または組織の一部のいずれかにおける植物細胞や哺乳類細胞、トリ細胞、などの真核生物も挙げることができる。
【０１３４】
一般に、宿主細胞はプラスミドベクターと適合性がある。例えば、細胞は複製のプラスミド起点と適合性がある。当該細胞は、典型的には、プラスミドが安定的に維持され複製してもよい細胞である。宿主細胞はまた、典型的には、プラスミド中の任意の検出可能なマーカー遺伝子とも適合性があり、遺伝子が宿主細胞中で発現することができ、これによってプラスミド導入の成功および維持について宿主細胞をスクリーニングすることができる。
【０１３５】
宿主細胞は、単にプラスミドまたはポリヌクレオチドの操作を意図してもよい。好ましくは、かかる株は、実験室条件下で容易に操作できかつ維持できる実験室株（例えば大腸菌）である。
【０１３６】
あるいはまたはさらに、宿主細胞を使用して、本発明に従ってｎ［スネア］プラスミドライブラリーを使用してシス調節配列についてスクリーニングすること、および／または本明細書において記載のようなｎ［スネア］プラスミドを使用して推定上のシス調節配列のデコイ機能について試験してもよい。宿主細胞はまた、本明細書において記載のようなｎ［スネア］プラスミドまたは他のデコイ分子を使用して、遺伝子発現を変更することが所望される細胞であってもよい。
【０１３７】
一般に、宿主細胞は、対象となるシス調節配列（すなわちスクリーニングされるシス調節配列）、またはそれと競合するように意図される細胞へと導入されたデコイ配列を含む。典型的には、細胞において、シス調節配列は、遺伝子に機能的に結合され、その発現は直接的または間接的に検出されてもよい。典型的には、細胞は、遺伝子に機能的に結合されたシス調節配列を含むプロモーターを含む。「機能的に結合された」により、遺伝子の発現を調節するようにシス調節配列および／またはプロモーターが機能することができる（適切な条件、例えば、必要とされる転写因子の存在下で）ような様式で、当該シス調節配列および／またはプロモーターが遺伝子に結合されることが意味される。したがって、同族転写因子が結合した場合、シス調節配列は遺伝子の発現を調節する（抑制または活性化する）ように機能する。プロモーターは、例えば、本明細書において記載のどの遺伝子または表現型などの対象となる表現型をコードする遺伝子を調節するものであってもよい。
【０１３８】
細胞におけるシス調節配列の機能は、結合する遺伝子の発現についてモニタリングすることによって決定することができる。これは遺伝子の発現について直接モニタリングすることによって、または遺伝子の発現に関連する特定の表現型の発現についてモニタリングすることによって行うことができる。例えば、機能についてのスクリーニングは、所与の代謝物質または発酵産物（例えば、シンナマイシン、アクチノロージン、および／またはウンデシルプロジギオシンなどの抗生物質）の産生について；特定の抗生物質（例えば、バンコマイシン）に対する耐性について；またはブタノールなどの溶媒に対する耐性についてのスクリーニングを含んでもよい。スクリーニング方法は本明細書において記載されている。
【０１３９】
１つの態様において、プラスミドは、宿主細胞の遺伝子発現および／または表現型の変化（例えば、細胞における抗生物質合成の増加、抗生物質耐性の減少、または溶媒耐性の増加）をもたらす。
【０１４０】
宿主細胞は、その天然の（同族）遺伝子に機能的に結合された（すなわち、配列（またはプロモーター）が天然で出現する際に発現を調節する遺伝子に結合された）シス調節配列（例えば、配列を含むプロモーター）を含んでもよい。したがって、例えば、対象となるシス調節配列（またはその天然のプロモーター）が代謝物質（例えば、抗生物質または酵素）産生をコードする遺伝子を調節する場合、宿主細胞は天然の産生細胞を含んでもよい。対象となるシス調節配列（またはその天然のプロモーター）が抗生物質耐性をコードする遺伝子を調節する場合、宿主細胞は天然の抗生物質耐性株（例えば、病原体）または臨床分離株を含んでもよい。したがって、細胞のシス調節配列は遺伝子に機能的に結合することができ、その発現はその天然のコンテキスト中のその配列によって調節される。
【０１４１】
例えば、本実施例において記載されるように、Ｓ．セリカラーはアクチノロージンおよびウンデシルプロジギオシンの天然の産性菌である。これらの抗生物質の産生が、ａｓｆＳ遺伝子の上流の結合部位へのＡｓｆＲタンパク質の結合を必要とすることが報告されている。したがって、Ｓ．セリカラーは、ＡｓｆＲ結合部位を含む配列の存在についてスネアをスクリーニングする場合（またはかかる配列と競合するデコイ配列を導入する場合）、宿主細胞として使用されてもよい。天然の細胞性ＡｓｆＲ結合部位との競合は抗生物質産生の減少をもたらすことになる。
【０１４２】
また、実施例において記載のように、Ｓ．シンナモネオウスはシンナマイシン抗生物質を産生する。Ｓ．シンナモネオウスを宿主として使用して、Ｓ．シンナモネオウスのシンナマイシン生合成クラスター中の遺伝子のプロモーターにおけるシス調節配列の存在についてスネアをスクリーニングしてもよい（あるいは、かかる配列と競合するデコイを導入する場合）。本明細書において記載のように、形質転換された株におけるシンナマイシンの産生のモニタリングによって天然のシス調節配列との競合についてスクリーニングしてもよい。
【０１４３】
また記載のように、大腸菌Ｋ１２はブタノール耐性をコードする遺伝子を含む。大腸菌Ｋ１２細胞を使用して、当該耐性をコードする遺伝子のプロモーター中のシス調節配列の存在についてスネアをスクリーニングしてもよい（あるいは、かかる配列と競合するデコイを使用する場合）。形質転換細胞における競合する配列の存在は、様々な濃度のブタノールの存在下における細胞の生存能力を測定することによって分析してもよい。
【０１４４】
あるいは、宿主細胞は、代謝産物産生または抗生物質耐性などの所与の細胞表現型のモデル（例えば、細菌モデル）を含んでもよい。かかるモデルは、天然の遺伝子に機能的に結合された対象となるシス調節配列（例えば、当該配列を含むプロモーター）を含むが、異種細胞中に含む。言いかえればシス調節配列（およびその天然のプロモーター）および機能的に結合された遺伝子は、細胞中に内在的に存在しない。
【０１４５】
典型的には、モデル宿主細胞は、天然の株よりも実験室条件下でより容易に操作される細菌種または株を含み、例えば、非病原性あるか、または遺伝子導入に対してより感受性がある。一般に、本明細書において記載のｎ［スネア］プラスミドまたはデコイ分子の非存在下において、遺伝子の発現はシス調節配列（例えば、そのプロモーター中の）によって調節される。したがって、細胞は、シス調節配列が正常な方法で機能するのに必要なコンポーネント（例えば、当該配列に結合し、遺伝子の発現を抑制または活性化する転写因子）を含む。
【０１４６】
モデル宿主細胞は、当該細胞へ導入されたシス調節配列および遺伝子を持つプラスミドを含んでもよいし、またはシス調節配列および遺伝子は宿主ゲノム中に組み込まれてもよい。モデル宿主は、シス調節配列および遺伝子を含むゲノム断片を含んでもよく、ここで当該断片は、例えば水平伝播によって天然の細胞から獲得されたものである。
【０１４７】
モデル細胞は、対象となる所与の表現型（例えば、代謝産物産生、抗生物質産生、抗生物質耐性、溶媒耐性）を付与する遺伝子を獲得していてもよく、例えば、モデル株は、その表現型（例えば、抗生物質産生および／または抗生物質耐性）をコードする遺伝子の水平伝播によって特定の表現型を獲得していてもよい。かかるモデル株は、コーディング遺伝子の予備的知識なしに調製してもよい。これは、天然の株（対象となる表現型を示している）からモデル株へのＤＮＡの水平伝播によって、および表現型の増加についてスクリーニングすることによって行われる。
【０１４８】
細胞がカスタムｎ［スネア］ライブラリーに対する宿主になる場合、細胞は、例えば、ゲノムＤＮＡまたはゲノム断片（ライブラリーが由来する）を含んでもよい（内在的にまたは遺伝子獲得によって）。
【０１４９】
適切な宿主細胞は当該技術分野において公知であり、本明細書の本実施例において記載されている。例えば、実施例６は、バンコマイシン（vancomyin）耐性の細菌モデルであるＳ．セリカラーＭ６００株について記載する。
【０１５０】
（レポーター細胞）
宿主細胞は、対象となるシス調節配列、またはシス調節配列を含む対象となるプロモーター（天然のコンテキスト中では当該配列またはプロモーターによって発現が調節されない遺伝子（非天然の遺伝子）に機能的に結合された）、を含んでいてもよい。かかる遺伝子はレポーター遺伝子と呼ばれる。典型的には、レポーター遺伝子は、対象となるシス調節配列を含むプロモーター配列に機能的に結合されている。
【０１５１】
シス調節配列の機能はレポーター遺伝子の発現を判定することによって決定することができる。典型的には、レポーター遺伝子はその発現が容易に検出されスクリーニングされ得る遺伝子である。例えば、レポーター遺伝子は、蛍光化合物または抗生物質耐性をコードしてもよい。レポーター遺伝子の例は、ルシフェラーゼ、またはカナマイシン耐性をコードするｎｅｏ遺伝子である。シス調節配列（またはプロモーター）が、容易にスコアリングできる表現型を持たない遺伝子の発現を生来は制御する場合、かかるレポーター細胞は特に有用である。
【０１５２】
１つの実施形態では、レポーター遺伝子は、対象となるシス調節配列に転写因子（転写リプレッサー）が結合することによって負に調節される。かかる宿主細胞は、同族遺伝子の発現を負に調節する（抑制する）シス調節配列についてスクリーニングするために適している。他の実施形態では、レポーター遺伝子は、シス調節配列に転写因子（転写アクチベーター）が結合することによって正に調節される。かかる宿主細胞は、同族遺伝子の発現を正に調節するシス調節配列についてスクリーニングするために有用である。
【０１５３】
任意の適切な宿主株がレポーター系において使用されてもよい。適切な株は当該技術分野において公知であり、本明細書において記載されている。適切な場合、レポーター遺伝子のゲノムコピーを含まない株が選択されることになる。同様に、レポーター株は、真のレポーター遺伝子の導入前に、ゲノムからのレポーターとして使用される遺伝子の標的化欠失によって操作することができる。
【０１５４】
レポーター遺伝子およびシス調節配列（例えば、プロモーター中の）はプラスミド性であり得る。あるいは、レポーター遺伝子およびシス調節配列（またはプロモーター）は宿主ゲノム中に組み込まれてもよい。例えば、レポーター系は組み込み型プラスミド（例えば、ｐＳＥＴ１５２）上で宿主に導入されてもよい。系がプラスミド性である場合、典型的には、プラスミドは宿主細胞においてプラスミドについて正の選択を可能にする検出可能なマーカー遺伝子を含む。例えば、検出可能なマーカー遺伝子は抗生物質耐性（例えば、アプラマイシンに対する耐性をコードするａａｃ遺伝子）をコードしてもよい。
【０１５５】
本発明者は、例えば、本明細書において記載のｎ［スネア］プラスミドライブラリーまたはｎ［スネア］プラスミドにおけるシス調節配列の存在についてスクリーニングするために使用してもよい一般的なレポーター細胞系を開発した。スクリーニング細胞および方法により、細胞の生存能力に基づいてシス調節配列の存在についてスクリーニングすることが可能となる。レポーター遺伝子の発現により、適切な培養条件下の細胞の生存能力または生存について決定することができる。分析の条件下において、配列が、転写因子の結合をめぐって対象となるシス調節配列（例えば、対象となるプロモーター中の）と競合している細胞の中へ導入された場合に限り、宿主細胞は生存能力がある。この系は、「生死（dead or alive）」スクリーニング系と呼ばれる。系は自動化可能であり、液体培地中で培養された細胞のスクリーニングに使用することができるという長所を有する。
【０１５６】
対象となるシス調節配列が機能して、機能的に結合された遺伝子の発現を抑制する場合、レポーター遺伝子は、典型的には、適切な培養条件下の細胞生存に必要な産物をコードする。例えば、レポーター遺伝子は、宿主細胞が抗生物質の存在下において培養された場合、レポーターに結合したシス調節配列への転写因子の結合を阻害し、かつレポーターの抗生物質遺伝子の発現を可能にする競合配列の存在下においてのみ細胞の生存が可能なように、抗生物質耐性をコードし得る。適切な抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子ｎｅｏが挙げられる。これは、転写リプレッサーが結合するシス調節配列の検出を可能にする。他の適切な遺伝子は当該技術分野において公知である。
【０１５７】
この事例において、宿主細胞は、典型的には、シス調節配列の機能に必要な他のコンポーネントを含む。細胞は、典型的には、シス調節配列への結合に必要な転写因子を含む（例えば、発現する）。宿主細胞は、シス調節配列（例えば、シス調節配列を含むプロモーター）を既に含んでもよい。宿主細胞は、対象となるシス調節配列が由来するゲノム断片を含んでもよい。
【０１５８】
シス調節配列が機能的に結合された遺伝子の発現を活性化するように機能する場合、レポーター遺伝子は適切な培養条件下の細胞にとっては致死性の産物をコードする。かかる遺伝子はしばしば自殺レポーター遺伝子と呼ばれる。細胞は、当該レポーターへ結合したシス調節配列への転写因子結合を阻害または防止する競合配列の存在下において（適切な培養条件下で）のみ生存能力がある。自殺レポーター遺伝子の例としては、例えば、グルコースキナーゼ遺伝子（ｇｌｋＡ）がある。この遺伝子は、代謝物質（２−デオキシグルコース（ＤＯＧ））を毒素に変換する。したがって、ＤＯＧの存在下において培養された場合、ｇｌｋＡ遺伝子の発現は細胞に対して致死性である。これは、転写アクチベーターが結合するシス調節配列の検出を可能にする。他の適切な遺伝子は当該技術分野において公知である。
【０１５９】
典型的には、この系において、宿主は通常レポーター遺伝子を発現しないが、シス調節配列が機能するのに必要なコンポーネントを含む。当該細胞は、典型的にはシス調節配列への結合に必要な転写因子を含む（例えば、発現する）。かかる系において、シス調節配列でのいかなる活性も宿主細胞ゲノムに由来する正の転写因子（アクチベーター）によるものとなる。このバックグラウンドで探索することにより、宿主の染色体からの異種発現のアップレギュレーターを見出すことが可能である。レポーターへ結合したシス調節配列からデコイ配列（例えば、ｎ［スネア］プラスミド）上へのこれらのアクチベーターのタイトレーションによって、レポーター遺伝子（例えば、ｇｌｋＡ）の発現が妨害され、ＤＯＧ代謝物質の存在下において増殖させた場合でさえ、細胞は生存能力がある。
【０１６０】
生死レポーター系は、本明細書において記載および／または同定されたどのような適切なシス調節配列のどれとの使用にも適合させることができる。例えば、実施例３において記載のように、ｃｉｎ７プロモーター（Ｓ．シンナモネオウスにおけるシンナマイシン生合成クラスターに由来する）を使用してもよい。ｃｉｎ７プロモーターは、実施例において記載のようにカナマイシン耐性をコードするｎｅｏ遺伝子へ機能的に結合してもよい。これは、実施例において使用されるｐＳＥＴ１５２骨格などの組み込み型プラスミド中に含まれてもよい。当該プラスミドは、適切なマーカー遺伝子（アプラマイシン耐性をコードするａａｃ遺伝子）もまた保有する。プラスミドは、シンナマイシン生合成経路をさらに保有するＳ．リビダンス宿主株（１３２６）へと導入または組み込まれてもよい。かかるレポーター細胞は、例えば、本明細書において記載のような、シンナマイシン生合成クラスターを含む、Ｓ．シンナモネオウスゲノムまたはゲノム断片に由来するｎ［スネア］プラスミドライブラリーのスクリーニングに適している。
【０１６１】
あるいは、ｃｉｎ７プロモーターをｇｌｋＡレポーター遺伝子へ機能的に結合し、同じ方法で組み込み型プラスミドへと組み込むことができる。この事例において、適切な宿主株は、シンナマイシン生合成クラスターを欠き、ｇｌｋＡ遺伝子もまた欠くＳ．リビダンスＴＫ２４株となる。
【０１６２】
１つの態様では、本発明は、本実施例に従って記載および調製されたレポーター細胞に関する。
【０１６３】
（シス調節配列を同定および特性を評価する方法）
本ｎ［スネア］プラスミドの使用の原理を図２に示す。プラスミド中のスネア配列が、プラスミドを導入する細胞におけるシス調節配列を含み、および／またはそれと転写因子結合を競合する転写因子結合部位を含むならば、これは、細胞におけるそのシス調節配列によって調節される遺伝子の発現の変化として検出することができる。したがって、ｎ［スネア］プラスミドを使用して、シス調節配列およびデコイ配列を同定することができる。プラスミドは、既知のデコイ配列を含むスネアと共に使用して、細胞における遺伝子発現を破壊することもできる。
【０１６４】
したがって、本発明のｎ［スネア］プラスミドは多くの異なる目的について使用することができる。上述のように、ｎ［スネア］プラスミドのライブラリーを使用して、例えば、ゲノムＤＮＡの断片中の推定上のシス調節配列について、カスタムｎ［スネア］ライブラリーを使用してスクリーニングしてもよい。ｎ［スネア］プラスミドを使用して、デコイ機能について特定の配列を試験してもよい。これらの方法のうちのいずれでも、ｎ［スネア］プラスミド中のスネアが宿主において存在するシス調節配列から転写因子をタイトレーションできるならば、スネア配列は、シス調節配列、またはシス調節配列と転写因子結合をめぐって競合する配列を含むものとして同定される（遺伝子発現または宿主細胞表現型の変更によって決定されるものとして）。したがって、本方法を使用して同定された配列はデコイ配列としてもまた作用することができ、１つの態様では、本方法はデコイ配列および分子を同定する方法と考えることができる。デコイ配列を含むｎ［スネア］プラスミドを使用して、宿主細胞における遺伝子発現および／または表現型を修飾することができる。
【０１６５】
したがって、１つの態様では、本発明は、シス調節およびデコイ配列を同定および／または特性を評価する方法を提供する。一般に、かかる方法は、
１．本明細書において記載のようなｎ［スネア］プラスミドまたはｎ［スネア］プラスミドライブラリーを提供すること；
２．宿主細胞へとｎ［スネア］プラスミドまたはプラスミドライブラリーを導入すること、ここで当該宿主細胞は、遺伝子（その発現が直接的または間接的に決定され得る）に機能的に結合された対象となるシス調節配列を含む；ならびに
３．ｎ［スネア］プラスミドまたはプラスミドライブラリーの存在下および非存在下において、遺伝子の発現または表現型の変更を決定すること、
を含む。
【０１６６】
本方法において使用されるｎ［スネア］プラスミドまたはｎ［スネア］プラスミドライブラリーは、本明細書において記載のようなものであってもよい。各プラスミド中のスネアは、競合機能について試験されるべき配列を含む。
【０１６７】
一般に、宿主細胞は、遺伝子に機能的に結合した対象となるシス調節エレメント（例えば、シス調節エレメントを含むプロモーター）を含み、その発現は、直接的または間接的にモニタリングまたは決定できる。例えば、当該発現は、特定の遺伝子の発現の決定によって、または遺伝子によってコードされた特定の表現型についてモニタリングすることによって、モニタリングしてもよい。
【０１６８】
本方法で使用される適切な宿主細胞は本明細書において記載されており、例えば、天然の株、臨床分離株、研究室モデル、およびレポーター細胞が挙げられる。本明細書において記載の「生死」レポータースクリーニング系を使用してもよい。
【０１６９】
本明細書における実施例１および２において、デコイオリゴヌクレオチドアプローチがプラスミドフォーマットに適合させることができることが実証される（定義された配列のシスレギュレーターを同定するためにライブラリーを使用できることの確認を含む）。ｎ［スネア］ライブラリーに基づいた手法というこの反復法についての考えられる制約は、それが微妙なまたは複雑な表現型の変化のレギュレーターに対して最も適切なものではない可能性があるということである。多くの状況において、表現型の変更は簡単には検出可能でなく、クロマトグラフ分析による代謝産物産生の定量などの複雑なスコアリング系を必要とする可能性がある。表現型スコアリングが標準化されてｎ［スネア］ライブラリスのクリーニングが促進されそれによりハイスループットで行うことができるレポーター系の生成には明らかな利点がある。
【０１７０】
実施例２において用いた手法について考えられる技術的な制約（すなわち表現型の変化についてのライブラリーの全メンバーのスクリーニング）は、ライブラリー全体の全メンバーを物理的にプレーティングまたは培養する必要があるのでどれだけのコロニーをスクリーニングできるか、したがって調査できるＤＮＡの量に対しての実際的な制約があるということである。１０００００以上のメンバー（およそ２５ｋｂの配列に該当する）を有するライブラリーを生成する大きなゲノム断片を調査することは実行可能ではない。以下に記載されるように、本発明者によって開発された系において使用されるレポーター遺伝子はいずれも、候補シス調節エレメントを含むｎ［スネア］プラスミドを有する細胞への生存能力を付与する。従って、単純に候補プラスミドを含まない大多数の細胞を消滅させることにより、液体培養での候補配列の迅速な濃縮を可能にする生存能力によって選択が行われる。
【０１７１】
従って、本発明者は、本明細書において記載のｎ［スネア］ライブラリーアプローチを適応させて、一般的なレポーターに基づいたアッセイ系の開発によるこれらの問題に取り組んできた。この反復法において、負のレギュレーターおよび正のレギュレーターは、抗生物質耐性をコードするレポーター遺伝子（図７）、または図８において示すような代謝物質感受性（自殺レポーター）をコードするレポーター遺伝子に対する効果によって検出される。標的プロモーターをレポーターカセットへと導入して、負の調節（転写リプレッサー）または正の調節（転写アクチベーター）のいずれかの検出を可能にする。正常な状況下で各レポーターは細胞死を引き起こし、細胞が増殖できるのはライブラリーからのｎ［スネア］プラスミドが転写因子をタイトレーションすることによって救助（relieve）する場合のみであるので、この手法により、スコアリング可能な表現型を必要とするという問題が解決される。従って、両方のレポーターについての選択は細胞生存に依存し、それはスクリーニングプロセスを大幅に促進する。本系の他の特色は、迅速で包括的なハイスループットスクリーニングを基盤として、かかる生死スクリーニングをたやすく自動化できるということである。天然のコンテキストにおいて容易にスコアリングできる表現型を有していないプロモーターを制御する調節配列を同定することもまた可能である。
【０１７２】
プラスミドまたはプラスミドライブラリーは、任意の適切な手段によって本方法の宿主細胞に導入される。適切な手段は当該技術分野において公知である。ｎ［スネア］プラスミドが接合性であるならば、プラスミドは接合によって導入してもよい。トランスフェクション／形質転換などの他の手段もまた使用してもよい。
【０１７３】
次に、典型的には、宿主細胞は、本明細書において記載されるようなプラスミド上で検出可能なマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）の発現について選択されることによって、プラスミドの安定した増殖がモニタリングされる。細胞は、例えば抗生物質の存在下において、特定のマーカーを発現する細胞を選択する条件下で培養される。
【０１７４】
好ましくは、上記方法は、１つ以上の適切な対照の使用を含む。例えば、かかる対照は、プラスミドにより処理されていない宿主細胞、空のプラスミドベクターを導入した宿主細胞、およびスクランブル化した推定上のシス調節配列を含むｎ［スネア］プラスミドを導入した宿主細胞を含む。
【０１７５】
いったんプラスミドが細胞へと導入されたならば、細胞は、対象となるシス調節配列（またはプロモーター）に機能的に結合された遺伝子の発現についてスクリーニングされる。スネア配列（ｎ［スネア］プラスミド中の）の存在下における発現は、スネアの非存在下における発現と比較される。シス調節配列を含む可能性が高いものとして、試験遺伝子の発現の変更（例えば、細胞表現型の変更）を生ずるクローンが選択される。これらのクローンからＤＮＡが単離され、推定上のシス調節配列（またはデコイ配列）が単離される。
【０１７６】
遺伝子発現における変更についてのスクリーニングは任意の適切な方法によって実行してもよい。スクリーニングは、例えば遺伝子産物の機能を分析することによる遺伝子の発現産物の検出または測定を含んでもよいし、あるいは遺伝子の発現に関連する宿主細胞表現型の変化の決定を含んでもよい。
【０１７７】
例えば、代謝物質（例えば、抗生物質）の産生をコードする遺伝子の発現の変化は、所与の代謝物質の発現（例えば、代謝物質の量（または代謝物質が非存在であるか）または代謝物質の機能）の決定によってモニタリングしてもよい。
【０１７８】
例えば、アクチノロージンおよびウンデシルプロジギオシンは色素性の抗生物質である。アクチノロージンは青色であり、ウンデシルプロジギオシンは赤色である。したがって、これらの抗生物質の発現は、容易に比色定量技術によってモニタリングすることができる。
【０１７９】
いくつかの代謝物質または抗生物質の産生は指示菌株および適切なプレート分析の使用によってモニタリングすることができる。例えば、シンナマイシンの産生は指示株である枯草菌（Bacillus subtilis）を使用するプレート分析、および適切な培地（例えば、固体のＲ２ＹＥ寒天）によって検出することができる。細胞は、典型的には、指示株を播種した寒天プレート上に培養される。抗生物質の発現は、指示株の反応進行度（例えば、死滅）によって（例えば、寒天プレート上のハロの直径によって）決定される。
【０１８０】
抗生物質耐性遺伝子または表現型の発現（例えば、バンコマイシン耐性、カナマイシン耐性）は、抗生物質の存在下において宿主細胞を培養し、抗生物質に対する感度の判定によって決定してもよい。典型的には、細胞は対照として抗生物質の非存在下においても培養される。
【０１８１】
同様に、溶媒耐性（例えば、ブタノール耐性）をコードする遺伝子は、溶媒の存在下において細胞を培養することによってモニタリングしてもよい（やはり、典型的には、細胞は溶媒の非存在下において培養されて対照が実行される）。
【０１８２】
いくつかの場合では、適切な遺伝子の発現についてのスクリーニングは、適切な培養条件下での宿主細胞の生存能力を決定することを含む。例えば、遺伝子が抗生物質耐性をコードする場合、スクリーニングは、抗生物質の存在下において細胞を培養し、細胞生存能力があるかどうかを決定することを含んでもよい。「生死」レポーター宿主細胞を含むスクリーニングにおいて、所与の培養条件下で、細胞へと導入されたｎ［スネア］プラスミドが対象となるシス調節配列と競合し得る配列を含む場合に限り細胞は生存能力がある。したがって、細胞のスクリーニングは、レポーター遺伝子（対象となるシス調節配列に機能的に結合された遺伝子）の発現が宿主細胞生存能力について決定できる条件下で細胞を培養すること、および生存細胞を単離することを含む。
【０１８３】
例えば決定される細胞表現型が細胞の生存能力であるならば、本方法は、本明細書において記載のように、液体培地中での宿主細胞の培養を含んでもよい。これは少数の細胞のみが分析されるという利点がある。スクリーニングは、本明細書において記載のようなＤＮＡサブトラクション法の使用を含んでもよい。適切な遺伝子の発現が細胞の生存能力に（適切な培養条件下で）影響を与える場合、これは特に有用であり得る。
【０１８４】
典型的には、ＤＮＡサブトラクション工程は、所与の表現型を有する細胞からのＤＮＡの集団および当該表現型がない細胞からのＤＮＡの集団を引き算することを含む。
【０１８５】
いくつかの場合では、例えば、競合するシス調節配列を含む配列の導入は適切な培養条件下で生存能力のない宿主細胞をもたらすことになる。これは、例えば、対象となるシス調節配列が抗生物質耐性遺伝子の発現を活性化するか、致死遺伝子の発現（特定の培養条件下で致死性の発現産物）を抑制する場合のケースである。例えばｎ［スネア］プラスミドのスネア中の、競合するシス調節配列が細胞へと導入される場合、競合する配列は転写因子をタイトレーションし、抗生物質耐性遺伝子の発現減少または致死性遺伝子の発現をもたらす。
【０１８６】
形質転換細胞は、典型的には、（ａ）シス調節配列からの発現が破壊された細胞に生存能力がない条件下で；および（ｂ）細胞に生存能力のある条件下で、培養される。２つの培養液からＤＮＡの集団を単離し（典型的には導入されたＤＮＡ（例えば、ｎ［スネア］プラスミドまたはプラスミドインサート）の単離および／または増幅後に）、引き算をする（例えば、ハイブリダイゼーションによって）。次いで、培養液（ａ）における細胞から欠損しており、競合シス調節配列を含む可能性が高いＤＮＡを決定することができる。
【０１８７】
例えば、研究している表現型が抗生物質耐性であるならば、例えばｎ［スネア］プラスミドのスネア中の、宿主細胞へと導入された対象となるシス調節配列は、抗生物質に対する感度を回復させることができる。形質転換細胞は、（ａ）抗生物質の存在下において；および（ｂ）抗生物質の非存在下において培養される。対象となるシス調節配列を含む細胞は、抗生物質の存在下において死滅することになる。ＤＮＡを両方の培養液から単離し、スネア配列を含む核酸を、例えばＰＣＲ増幅によって単離する。スネア配列の集団を引き算することによって、抗生物質により処理されたサンプルに欠損しているものを単離することが可能である。
【０１８８】
１つの態様では、次いで、スネア配列の濃縮された集団を再クローン化し、選択プロセスを繰り返してもよい。
【０１８９】
変更された遺伝子発現または表現型を示す細胞がいったん単離されたならば、これらの細胞からのＤＮＡが単離される。典型的には、細胞へと導入されたＤＮＡ（例えば、ｎ［スネア］プラスミドＤＮＡおよび／またはプラスミドインサート）が、単離される。次に、変更された発現を引き起こし、シス調節（または、デコイ）配列を含む可能性が高いスネアを決定することができる。これは、例えば、ＰＣＲ増幅によって行ってもよい。
【０１９０】
本方法がｎ［スネア］プラスミドライブラリーの使用を含む場合、当該方法はさらに１つ以上のさらなる工程を含んでもよい。
【０１９１】
例えば、上記方法はライブラリーのハイブリダイゼーション工程を含んでもよい。これらの種類の濃縮手順において使用されるライブラリーの複雑さに起因して、所望される配列のみから成るサンプルを生じることはまれである。一般的に、濃縮されたサンプル内には偽陰性のバックグラウンドがあり、それは排除する必要があり、さらなる解析には用いられない。ライブラリーハイブリダイゼーション戦略は、スクリーニングプロセスのすべての独立したリピートに共通のｎ［スネア］プラスミドの検出によって行われるように設計されており、同じ配列を有するプラスミドがバックグラウンドより上の出現率で独立したリピートにおいて検出されるならば、このプラスミドはさらなる解析に用いられるべきものであるというロジックである。プロセスの概要を図９に示す。
【０１９２】
典型的には、ライブラリーハイブリダイゼーション戦略を使用する場合、上記のスクリーニング方法（工程（１）、（２）、および（３）を含む）のｘ回の独立したリピートが実行される。例えば、ｘは、２、３、４、５、６、７、または８であってもよい。
【０１９３】
各リピートにおいて、記載されるように、遺伝子発現／表現型の変更を生ずるクローンが選択される。プラスミドＤＮＡをクローンから単離し標識して、プールされたプローブサンプル（Ｐ）を生成する。例えば、プラスミドＤＮＡは、ランダムプライミングＰＣＲ（例えば、本実施例におけるようなＤＩＧ標識ｄＵＴＰ分子を使用して）によって標識してもよい。
【０１９４】
クローンは、個々のコロニーを区別できる濃度で適切な培地上にプレーティングされる。典型的にはこのステージで、各コロニーのサンプルを得て、後のステージで必要であるならば、プラスミドＤＮＡのソースを提供するようにさらに培養される。
【０１９５】
全ＤＮＡを各コロニーから抽出し、例えばハイブリダイゼーションによって適切なマトリクス（例えば、ナイロン膜）上に固定化する。各コロニーからのＤＮＡはマトリクス上の番地付けできる位置にある。次に、各マトリクスは、プローブセットの各々と個別にハイブリダイズされる。典型的には、１より多いリピートに共通のサンプルはさらなる解析のために選択される。
【０１９６】
したがって例えば、ｘ＝４ならば、４つのプローブセットおよび４つのマトリクス（例えば、４つのナイロン膜）が調製される。４つのプローブセット（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４）の各々を、４つのフィルター（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、およびＦ４）の各々にハイブリダイズする。Ｆ１とＰ１のハイブリダイゼーションから、すべてのサンプルが検出されるクロマトグラムが産生される。Ｐ１とハイブリダイズするＦ２、Ｆ３、またはＦ４サンプルが、さらなる解析のための有力候補となる。より多くのプローブサンプルがコロニーにハイブリダイズするほど、そのクローンは候補として確かである。
【０１９７】
自己ハイブリダイゼーション（例えば、Ｆ１とＰ１）を使用して、スクリーニングにおける偽陽性を検出してもよい。
【０１９８】
本発明の方法は選択プロセスを１回または複数回を繰り返すことをさらに含んでもよく、その結果選択は反復的である。したがって、第１のスクリーニングから選択されたクローンを使用して再び宿主細胞を形質転換することができ、スクリーニングは繰り返される。
【０１９９】
本明細書において記載されたｎ［スネア］ライブラリーアプローチを使用して、重要な医学的結果を有する細菌表現型に影響を与えるシス調節配列を同定することができ、例としてはヒトに感染する病原細菌における抗生物質耐性機構の誘導の防止である（図６）。この図における概略図は、機構の遺伝経路について何もわかっていない場合に、抗生物質耐性を制御するシス調節配列を同定するためにどのようにｎ［スネア］プラスミドのライブラリーが使用されるかを示す。この例において、抗生物質耐性を付与する遺伝子は、好都合な細菌モデルを生成する水平遺伝子導入によって、Ｓ．セリカラーまたは大腸菌などの好都合な細菌宿主へと移される。これは抗生物質耐性の増加をスクリーニングすることによって、遺伝子が何であるかの予備的知識なしに行うことができる。類似する機構により、病院において検出される病原性株へと同じ耐性遺伝子が移されることになる。ｎ［スネア］プラスミドのライブラリーは、耐性遺伝子を保有するゲノム断片、天然の耐性分離株もしくは臨床分離株の全ゲノム、または考えられる限りではあらゆるシス調節配列を含むユニバーサルライブラリーを生成するランダムオリゴヌクレオチドから生成される。かかるライブラリーは細菌モデルへと導入され、形質転換体は標的化抗生物質に対する感受性の増加についてスクリーニングされる。これは、表現型の直接的なスコアリングによって、または確立しているＤＮＡサブトラクション技術の使用によって遂行される。系の複雑度に依存して、単独でまたは反復してプロセスを実行して単一シス調節配列またはかかる配列のカクテルを同定し、次にそれを使用して対応するＴＦＤを合成または製造する。次に、これらは耐性分離株または臨床分離株のいずれかで検証された後、適切な動物モデル（マウスモデルなど）へ進み、ここではデコイの有効性が抗生物質単独による治療に対する耐性のある病原性株に感染した動物の治療によって試験される。
【０２００】
上述したように、ゲノムの生物学、遺伝子発現のパターンおよび複製のタイミングは、ＤＮＡ−タンパク質相互作用によって主に制御され、これらの相互作用のマッピングは遺伝子を制御する試みに対する前提条件である可能性がある。マイクロアレイ解析は、どの遺伝子が発現されるのかを同定するための全ゲノムの調査ができるが、現在までに、同じようなスケールで、発現のパターンを決定するタンパク質（トランスレギュレーター）およびそれらの同族結合部位（シス調節エレメント）を同定する技術は存在しない。本明細書における実施例４および本発明において記載される実施形態はこの不備に対処し、ゲノムの全体にわたって迅速にシス調節エレメントを同定することができる一般的なツールを形成する本技術を発展させて、遺伝的ネットワークを正確に記載しそれらに対する制御を行う。本発明のこの態様に従う方法は、標的とされた遺伝子の発現を制御する調節エレメントをゲノムの全体にわたって同定する。調節ネットワークを正確に記載するための高速で一般的な系として、このツールは、システムバイオロジー（systems biology）に向けての推進力を支援する基準となるデータ、および知識ベースの遺伝子工学のための領域の規定における有用性をもたらし、疾患を引き起こす遺伝変異のマッピングを促進する能力を有する。
【０２０１】
いくつかの場合では、標的とされた表現型を下支えする遺伝子機構（例えば、シンナマイシンクラスター内の公知のプロモーター）の先験的知識がある。より一般的には、遺伝的ネットワーク、および標的とされた表現型を下支えする遺伝的ネットワークの調節についての情報はほとんど知られていない。例えば、病院中で出現する病原性感染の中の抗生物質耐性の多くの機構は遺伝子レベルで理解されず、この事実は、この問題を解決する治療の開発に対する大きな障壁である。同様に、産業的バイオテクノロジーのコンテキストにおいて、遺伝的決定基の予備的知識の必要性なしに細菌の複雑な特質を都合好く変更できる技術は有益となる。この例としては、細菌を溶媒耐性に操作して、バイオ燃料産生のプロセスにおける糖の発酵における細菌の有効性を改善することである。本技術の臨床的および産業的な適用の例は、本明細書において示されている。
【０２０２】
遺伝経路の予備的知識のないシス調節エレメントを検出するこのアプローチの有効性を実証するために、本発明者はｎ［スネア］ライブラリーを使用して大腸菌におけるブタノール耐性を増加させた（実施例４）。ライブラリーの１つは、実施例２において記載のものと類似の技術を使用して、大腸菌ゲノム全体に由来するものであった。第２のライブラリーは、考えられる限り、可能性のある９ヌクレオチド配列すべて、または任意のかかる所望される長さの直接的なコピーから成る「ユニバーサルｎ［スネア］」ライブラリーであった。ユニバーサルｎ［スネア］ライブラリーは、定義されたシス調節配列を有する中心セクションを含むオリゴヌクレオチド配列の代わりに、ランダム配列を挿入すること以外は、単一ＡｆｓＲのｎ［スネア］プラスミドの生成のために実施例２において記載されたものと類似の方法を使用して作製される（およびこのステージで配列の長さを制御することができる）。ブタノール耐性の新規のシスレギュレーターの検出にかかるｎ［スネア］ライブラリーを使用するための手順は、溶媒の濃度の増加に対する生存能力の測定によって標的とされた表現型をスコアリングするという点で、実施例３において記載された手順に類似する。
【０２０３】
記載されたようなおよび／または本明細書の方法に従って調製したｎ［スネア］プラスミドライブラリーを使用して、１つ以上の転写因子による結合についてライブラリーを直接スクリーニングすることによって、シス調節配列を同定することもできる。
【０２０４】
シス調節エレメントを同定し特性を評価する本方法は、本明細書において記載されるようなフットプリント法およびエキソヌクレアーゼの組み合わせを使用するマッピング手順の使用をさらに含んでもよい。
【０２０５】
（シス調節配列の境界をマッピングする方法）
１つの態様では、本発明は、ＤＮＡ中のタンパク質結合性部位の境界をマッピングする方法を提供する。この方法はかかる結合部位の境界のより正確なマッピングのために使用してもよい。
【０２０６】
上記方法はシス調節配列の境界のマッピングに使用してもよい。本方法は、シス調節配列の同定および特性の評価のための本明細書において記載された方法（例えば、本明細書において記載のようなｎ［スネア］プラスミドまたはプラスミドライブラリーを使用する方法）と組み合わせて使用してもよい。シス調節エレメントについてのより正確な配列情報およびしたがって転写因子などのタンパク質レギュレーターについての結合部位の提供によって、本方法は、適切な細胞へ導入した場合に、細胞においてタンパク質レギュレーターの結合をめぐってシス調節配列と競合するデコイオリゴヌクレオチドの設計のために有用である。
【０２０７】
本方法は、修飾フットプリント法において、非特異的ＤＮＡニッキング能を有する酵素または化学薬剤（例えば、ＤＮａｓｅＩ）、および５’−３’エキソヌクレアーゼ酵素（例えば、Ｔ７エキソヌクレアーゼ）の組み合わせを使用する。ＤＮａｓｅＩの代わりとしては、過マンガン酸カリウム、または水酸化物によって生成されるフリーラジカルによる細胞の処理が挙げられる。使用できる適切なエキソヌクレアーゼの他の例としては、λエキソヌクレアーゼである。当該プロトコルは、ＤＮＡの各鎖上のタンパク質−ＤＮＡ複合体の５’境界をマッピングし、従ってシス調節エレメントを含む複合体内のＤＮＡの保護された領域を定義するように設計される。ＤＮａｓｅＩは複合体の周囲のＤＮＡへとニックを導入する。これらは、５’−３’エキソヌクレアーゼ酵素の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性のための基質として働く。２つの酵素の組み合わせ作用は、各ＤＮＡ鎖上のタンパク質−ＤＮＡ複合体の５’境界を区別する。したがって、本方法は、単に制限部位に最も近いものではなく、所与の領域（例えば、プロモーター領域）におけるＤＮＡタンパク質複合体の境界をすべて検出できるという長所を有する。
【０２０８】
本マッピング方法の原理を図１３に示す。典型的には、当該方法は以下の工程を含む。
１．タンパク質−ＤＮＡ複合体を提供すること；
２．以下のもので消化を行うこと、
ａ．非特異的ＤＮＡニッキング能を有する酵素（例えばＤＮａｓｅＩ）、
ｂ．５’−３’エキソヌクレアーゼ（Ｔ７エキソヌクレアーゼ）；
ｃ．任意に、ＤＮＡ−タンパク質複合体の可能性の高い位置の上流から短い距離をおいて切断する制限酵素；ａｃｔＩＩｏｒｆ４遺伝子の場合には、これはＳａｃＩであるとわかった；ならびに
３．ＤＮＡ鎖の上の公知の固定点に対して（２）において各ＤＮＡ鎖において生成された５’欠失の位置を決定すること。
【０２０９】
タンパク質−ＤＮＡ複合体は対象となるどの複合体でもよい。１つの例では、当該方法を使用して、ＤＮＡプロモーター領域におけるタンパク質−ＤＮＡ複合体（例えば、シス形調節配列でのタンパク質−ＤＮＡ複合体）の境界がマッピングされる。１つの例では、タンパク質−ＤＮＡ複合体は、原核生物または真核生物における１つ以上の抗生物質耐性遺伝子の発現を調節する転写因子−ＤＮＡ複合体であってもよい。他の例において、当該方法を使用して、本実施例におけるようなＳ．セリカラーａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４プロモーター中のタンパク質−ＤＮＡ結合部位がマッピングされてもよい。
【０２１０】
マッピングは、対象となる転写状態の間に行われてもよい（例えば、対象となるシス調節エレメントが抑制に関与する（すなわち転写リプレッサーが結合する）場合は抑制中に、あるいは対象となるシス調節エレメントに転写アクチベーターが結合する場合はプロモーターからの活発な発現中に）。
【０２１１】
したがって、例えば、１つの態様において、マッピングは、細胞における遺伝子発現が抑制または活性化されていることが分かっている段階でインビボ（例えば、新たに採取した細胞を使用して）行われてもよい。典型的には、細胞は、培養されて適切な転写段階で単離される。細胞は、酵素が細胞に入ることを可能にする洗浄剤を用いて透過処理されてもよい。したがって、マッピングされるタンパク質−ＤＮＡ複合体が所与の遺伝子または表現型の発現を抑制する機能がある場合、当該タンパク質−ＤＮＡ複合体は、当該遺伝子または表現型の発現が抑制されている時点で試験される。反対に、マッピングされるタンパク質−ＤＮＡ複合体が所与の遺伝子または表現型の発現を活性化する機能がある場合、当該タンパク質−ＤＮＡ複合体は、当該遺伝子または表現型の発現が活性化されている時点で試験される。典型的には、細胞は、所与の遺伝子または表現型の発現についてモニタリングされ、適切な段階で単離され得る。
【０２１２】
例えば、対象となるシス調節配列（タンパク質−ＤＮＡ複合体における）が抗生物質産生の抑制に役割を果たし、抗生物質の産生が細胞増殖の後期で起こることが分かっている場合、産生細胞は培養されてこの増殖後期以前に採取される。
【０２１３】
細胞は原核生物のものであっても真核生物のものであってもよい。１つの例では、細胞は原核生物のもの（例えば細菌細胞）である。例えば、ストレプトミセス属の種などの放線菌、例えば、Ｓ．セリカラー、例えば、Ｓ．セリカラーＡ３（２）、（Ｍ１４５株またはＭ６００株）、Ｓ．リビダンス、Ｓ．シンナモネオウス、または大腸菌が使用されてもよい。
【０２１４】
典型的には、上記方法で使用される非特異的酵素（ＤＮａｓｅＩ）およびエキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔ７）の量は、本実施例において本明細書に記載のように、経験的に決定される。
【０２１５】
ＤＮＡ−タンパク質複合体の可能性の高い位置の上流の制限部位で切断する制限酵素（ｃ）の使用は、すべての複合体に関して標準的な５’末端を産生し、続く捕捉工程および増幅工程においてこれにオリゴヌクレオチドをアニーリングすることができる。
【０２１６】
（２）における消化が完了すれば、消化された核酸は回収される。消化により各ＤＮＡ鎖上に５’欠失が形成される。各鎖の上の当該５’欠失の位置（例えば、鎖上の公知の固定点に対する）を決定することにより、ＤＮＡ上のタンパク結合部位を正確にマッピングすることができる。
【０２１７】
各鎖上の５’欠失の位置を決定する１つの方法としては以下のとおりである。一旦回収されると、消化されたＤＮＡは、加熱または１Ｍ ＮａＯＨなどの塩基性溶液で処理することにより変性され、対象となる結合部位を含む相補ＤＮＡ鎖へハイブリダイズされる。例えば、相補ＤＮＡは、プロモーターの断片（対象となるシス調節配列を含む）を含んでもよい。プロモーターのＰＣＲ断片を使用することができる。一般に、相補ＤＮＡ鎖は一方の末端にリンカーを含む。次いで、プロモーターまたはリンカーに結合する標識プライマーを用いて、増幅反応（例えば、ＰＣＲ）を行うことができる。
【０２１８】
次いで、標識増幅産物のサイズが決定される（例えばＰＡＧＥ、またはキャピラリー電気泳動などの他の方法によって）。一般に、タンパク質−ＤＮＡ複合体の正確な境界が分かっていなくても、およその位置、ひいては対象となるタンパク質結合部位を含むＤＮＡ領域の配列をこのデータから決定することができる。例えば、プロモーター領域の配列が分かることになるので、標識断片のサイズやプライマー結合部位の位置とタンパク質結合部位を含むＤＮＡ領域の配列とを比較することにより、ＤＮＡ配列におけるタンパク質−ＤＮＡ結合複合体の５’境界の正確な位置を決定することができる。
【０２１９】
反対のＤＮＡ鎖上の境界は同じの方法でマッピングされるが、反対の末端にリンカーを有するＤＮＡ鎖が用いられる。
【０２２０】
典型的には、相補ＤＮＡ鎖が固定される。例えば、リンカーは、固体マトリクスへの固定化を可能にし得る。例えば、当該リンカーはストレプトアビジンマトリクスへの固定化のためビオチン化されてもよい。固定化は、消化された全ＤＮＡサンプルから対象となる消化されたＤＮＡ鎖を容易に単離することができるという利点を有する。
【０２２１】
１つの態様では、本発明は、原核細胞遺伝子または真核細胞遺伝子の遺伝子発現のシス作用レギュレーターを同定する方法に関し、この方法は、下記のいずれかまたは両方を含み、
（ａ）保護された核酸配列のマッピングを行うこと；
（ｂ）ｎ［スネア］分子のライブラリーを提供すること（ここで、このライブラリーは上記原核細胞または上記真核細胞のゲノムからの可能性のあるすべての調節配列を表す配列を含む）、そして（ｉ）上記ライブラリーに結合する因子を同定することあるいは（ｉｉ）標的遺伝子の差次的活性化または差次的抑制を示し得る（上記ｎ［スネア］分子が導入されていない場合と比較して）生物へ上記ｎ［スネア］分子ライブラリーを導入することを含む。上記方法はインビボで行われてもよい。上記方法がインビボで行われる場合、上記方法は細菌を用いて行い、転写因子により保護された調節配列が元のままに保たれる一方でこの細菌のゲノムの残りが破壊されるように有効量のＤＮａｓｅ１およびＴ７エキソヌクレアーゼをこの細菌と接触させることを含んでもよい。
【０２２２】
本明細書の方法にしたがって同定されたならば、シス調節配列は、転写因子を同定するためにスクリーニングアッセイにおいて使用してもよい。
【０２２３】
（遺伝子発現および／または表現型を修飾する方法）
本明細書のｎ［スネア］プラスミドおよび方法は、同族転写因子への結合をめぐって細胞において所与のシス調節配列と競合する配列を同定し特性を評価するために使用されてもよい。
【０２２４】
かかる配列は、デコイ配列を調製するために使用されてもよい。デコイ配列は、調節タンパク質（例えば、転写因子）の天然の結合部位（シス調節配列）を模倣する。シス調節配列を含む適切な宿主細胞へ導入されると（本明細書に記載の方法や他の方法により）、デコイ配列は細胞において同族転写因子への結合をめぐってシス調節配列と競合する。
【０２２５】
かかる競合が起こると、発現がシス調節配列によって調節される遺伝子の発現において、付随する変更が起こる。本明細書に記載のように、これは、細胞表現型（例えば、抗生物質産生、抗生物質耐性、溶剤耐性）の修飾をもたらし得る。
【０２２６】
なお、本明細書に記載の方法による遺伝子発現または表現型の変更をもたらすｎ［スネア］プラスミドは、本方法におけるデコイ分子として使用されてもよい。本明細書に記載の方法によって、転写因子結合をめぐってシス調節配列と競合すると同定されたスネア配列は、デコイ配列として使用されてもよい。
【０２２７】
したがって、１つの態様では、本発明は細胞における遺伝子発現および／または表現型を修飾する方法に関し、デコイ配列を使用することを含む。
【０２２８】
一般に、本発明による遺伝子の発現を修飾する方法は、以下の工程を含む。
（ａ）転写因子（デコイ配列）の結合部位を含むポリヌクレオチドを提供すること；および
（ｂ）ポリヌクレオチドを細胞に導入すること、ここで細胞は、転写因子結合部位を含むかまたは転写因子の結合をめぐって転写因子結合部位と競合するシス調節配列に機能的に結合した遺伝子を含む。
【０２２９】
一般に、ポリヌクレオチド中のデコイ配列（転写因子結合部位）は、遺伝子に機能的に結合されていない。転写因子結合部位は、同族プロモーターの他のエレメントから単離されてもよい。
【０２３０】
デコイ配列を含むポリヌクレオチドは、デコイポリヌクレオチドと呼ばれる場合がある。
【０２３１】
デコイポリヌクレオチドは、プラスミドベクターを含んでもよい。例えば、本明細書に記載されたかつ／または本明細書に記載の方法よって調製されたデコイポリヌクレオチドは、ｎ［スネア］プラスミドを含んでもよい。
【０２３２】
デコイポリヌクレオチドは、デコイ配列の１個より多いコピーを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、デコイ配列の複数のコピーを含む多重体分子を含んでもよい。例えば１〜１０００個のコピーである。典型的には、２個以上のコピー、例えば、２〜１０００個のコピー、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００または９００個のコピーが存在する。例えば、１０〜２００、１０〜１５０、２０〜１２０、２０〜１００、３０〜１００、３０〜８０、３０〜５０、３０〜４０個のコピーが存在してもよい。例えば、デコイ配列の３０個のコピーが存在してもよい。典型的には、デコイの複数のコピー、例えば、デコイ配列の複数のダイレクトリピートが存在する。
【０２３３】
デコイポリヌクレオチドは、デコイ配列に付加的な配列を含んでもよい。典型的には、付加的な配列は、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼの作用によるデコイ配列の分解に対する耐性増進をもたらす。デコイポリヌクレオチドは、二次構造の少なくとも１種のエレメントを含んでもよい。典型的には、この二次構造は、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼの作用によるデコイ配列の分解に対する耐性増進をもたらす。デコイポリヌクレオチドは、より高いヌクレアーゼ耐性を付与するために修飾塩基または糖を含んでもよい。デコイポリヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼ活性を減少または阻害させるため、ポリヌクレオチドの末端に２’ＯＨヌクレオチドまたはアミンを含んでもよい。１つの態様では、デコイポリヌクレオチドは、直鎖オリゴヌクレオチドを含んでもよい。デコイポリヌクレオチドは、環状二本鎖ＤＮＡ（いわゆるダンベル構造）を含んでもよい。１つの態様では、デコイポリヌクレオチドは、分子の一方のまたは各５’末端にコレステロール修飾を含んでもよい。
【０２３４】
デコイポリヌクレオチドは、１つ以上の上記の特徴を任意の適切な組み合わせで含んでもよい。
【０２３５】
適切な宿主細胞に導入されると、デコイポリヌクレオチドにおけるデコイ配列は、内因性のシス調節配列に結合する転写因子の結合をめぐってシス調節配列と細胞中で競合することができる。配列は、本明細書に記載の方法によりこの機能についてスクリーニングすることができる。デコイ配列が競合するシス調節配列は、本明細書に記載されかつ／または本明細書に記載の方法よって同定されるシス調節配列のいずれのものであってもよい。
【０２３６】
例えば、シス調節配列は、例えば代謝物質が抗生物質（例えば、アクチノロージン、ウンデシルプロジギオシン、またはシンナマイシン）、酵素、または医薬品である場合、代謝産物産生において役割を有する遺伝子の発現を調節するものであってもよい。細胞における代謝産物産生が増進してもよい。
【０２３７】
シス調節配列は、抗生物質耐性の決定において役割を有する遺伝子の発現を調節するものであってもよい。細胞における抗生物質耐性が減少してもよい。シス調節配列は、溶媒（例えばブタノール）耐性の決定において役割を有する遺伝子の発現を調節するものであってもよい。細胞における溶剤耐性が増進されてもよい。
【０２３８】
例えば、シス調節配列は、ＡｆｓＲタンパク質（Ｓ．セリカラーにおける抗生物質合成の多面発現レギュレーター）の結合部位をコードする配列を含んでもよい。ＡｆｓｒＲ結合部位は配列番号１において太字で示されている（実施例１）。
【０２３９】
他の例において、シス調節配列は、Ｓ．セリカラーのａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４プロモーターにおけるものであってもよい（例えば、リプレッサーシス調節配列）。例えば、シス調節配列は、本明細書において同定される配列Ａ２４．１、Ａ２４．２、Ａ２４．３、Ａ２４．４、またはＡ２４．５を含んでもよい。
【０２４０】
さらなる例では、シス調節配列は、ＶａｎＲ転写因子の結合部位（例えば、エンテルコッカス・フェシウムまたはＳ．セリカラーのｖａｎＨプロモーター中にあるＶａｎＲ結合部位）を含んでもよい。３０ｂｐのＶａｎＲ結合部位の例は、配列番号２１中で示されており、さらなる例は、配列番号２６中にある。
【０２４１】
シス調節配列は、対象となる特定の機能または表現型、例えば抗生物質（例えば、シンナマイシン、アクチノロージン、ウンデシルプロジギオシン）などの代謝産物の産生、特定の溶媒または毒素に対する耐性、特定の抗生物質に対する耐性、あるいは他の対象となる機能または表現型をコードする遺伝子の発現を調節するように機能するものであってもよい。典型的には、当該配列はかかる遺伝子のプロモーター領域にある。
【０２４２】
例えば、シス調節配列は、Ｓ．シンナモネウスにおけるシンナマイシン生合成遺伝子の発現を調節してもよい（例えば、ｃｉｎ７プロモーターからのシス調節配列）。
【０２４３】
シス調節配列は、例えば原核生物における、溶剤耐性（例えば、大腸菌Ｋ１２におけるブタノール耐性）をコードする遺伝子の発現を調節してもよい。
【０２４４】
シス調節配列は、原核生物の抗生物質耐性遺伝子の発現を調節するものであってもよい（典型的には、抗生物質耐性をコードする遺伝子のプロモーターからのシス形調節配列）。いずれの対象となる抗生物質耐性も標的となり得る。例えば、以下のものに対する抗生物質耐性である。アミノグリコシド（カナマイシンなど）；カルバペネム（メロペネムなど）；セファロスポリン（セフェピムなど）；糖ペプチド（バンコマイシンおよびダプトマイシンなど）；ペニシリン（アンピシリン、カルベニシリン、およびペニシリンなど）；ポリペプチド系抗生物質（ポリミキシシン（ｐｏｌｙｍｉｘｃｉｎ）Ｂなど）；キノリン（レバクインなど）；スルホンアミド（バクトリムなど）；テトラサイクリン（テトラサイクリンなど）；ならびにクロラムフェニコール、リファンピシン、およびザイボックスなどとして知られる抗生物質のクラス。
【０２４５】
１つの態様では、抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子は、特定の抗生物質または、ある場合には、上記にリストした抗生物質およびクラスなどの抗生物質のクラスに対する耐性をもたらすタンパク質をコードする。かかる抗生物質耐性遺伝子は、抗生物質または抗生物質のクラスの特定のメカニズムまたは構造を標的とするタンパク質をコードしてもよい。多くの場合、かかる耐性遺伝子は、抗生物質への暴露後に細菌により獲得される。
【０２４６】
１つの態様では、抗生物質耐性遺伝子は、以下の遺伝子または以下のタイプの遺伝子の１つ以上を含んでもよい。
【０２４７】
ＶａｎＲ転写因子により調節されるｖａｎＨＡＸオペロン遺伝子は、腸球菌（例えば、Ｅ．フェカリス、Ｅ．フェシウム）、ブドウ球菌（例えば、Ｓ．アウレウス）を含む多くの細菌において生じ（Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ（２００６年）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４２、Ｓ２５）、他の病原細菌においてはまれであると報告されている（Ｗｅｒｎｅｒ（２００８年）Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３、５４７）。これら遺伝子は、発現すると、抗生物質バンコマイシンに対するＶａｎＡ型の耐性をもたらす。ｖａｎＨＡＸ遺伝子を標的とするデコイ配列は、未変性ＶａｎＲ結合部位（配列番号２１または配列番号２６中のものなど）または未変性部位のバリアントを含み、これらは対象となる細胞においてＶａｎＲ結合をめぐって未変性部位と競合する。
【０２４８】
ベータラクタムクラスの抗生物質（特に、ペニシリン、セファロスポリン、セファマイシン、およびカルバペネム（ｃａｒａｂａｐｅｎｅｍｓ））に対する耐性をもたらすベータラクタマーゼをコードする遺伝子。当該遺伝子は、Ｃ．フロインディ（ｆｒｅｕｎｄｉ）、Ｐ．エルギノーサ、そしてますますＫ．ニューモニア、大腸菌、およびサルモネラ菌種を含む細菌で現れる広域スペクトルベータラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）として知られるベータラクタマーゼのサブクラスを含むグラム陰性菌感染において特に医学的に重要である。現在見つかっているベータラクタマーゼの調査は、Ｐａｔｅｒｓｏｎ（２００５年）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１８、６５７に見られる。
【０２４９】
ベータラクタマーゼの主要なタイプ、当該ベータラクタマーゼが影響する生物の例および抗生物質、ならびに原因となる遺伝子は以下のとおりである。ＴＥＭベータラクタマーゼ：大部分のグラム陰性菌（大腸菌、肺炎桿菌、インフルエンザ菌、および淋菌を含む）におけるアンピシリン耐性に影響するＴＥＭ−１遺伝子によるのが最も一般的であるが、１４０種類を超えるＴＥＭ型酵素が同定されている（Ｇｅｏｒｇｅ（２００５年）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５２、３８０）；ＳＨＶベータラクタマーゼ：最も一般的にはＳＨＶ−５およびＳＨＶ−１２（例えば、肺炎桿菌におけるアンピシリン耐性をもたらす）（Ｐａｔｅｒｓｏｎ（２００３年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４７：３５５４）；ＣＴＸ−Ｍベータラクタマーゼ：例えば、大腸菌およびＳ．エンテリカにおけるセフォタキシム（cefotaximine）および他のオキシイミノ−ベータラクタマーゼ（セフタジディム、セフトリアキソン、またはセフェピムなど）に対する耐性をもたらし、４０種類のＣＴＸ−Ｍ酵素が記載されている（Ｃａｎｔｏｎ（２００８年）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆ．１４：１３４）；ＯＸＡベータラクタマーゼ：例えば、大腸菌および肺炎桿菌および緑膿菌などの腸内細菌におけるオキサシリンおよびクロキサシリンに対する耐性をもたらす；阻害剤耐性ベータラクタマーゼ：例えば、クラブラン酸（calvulinic acid）および他の阻害剤に耐性を有する、大腸菌および肺炎桿菌において見られるＴＥＭ−ベータラクタマーゼのバリアントなど；ＡｍｐＣ−ベータラクタマーゼ：セファロスポリンに対する広域スペクトル耐性をもたらすエンテロバクター属の種を含む多くのグラム陰性菌で見られる；カルバペネマーゼ（セファマイシン、セファロスポリン、およびカルバペネムに対する耐性をコードする）：このタイプのベータラクタマーゼは、ＩＭＰ型（グラム陰性菌、特にシュードモナスおよびアシネトバクター属において存在する）、ＶＩＭ（例としては、緑膿菌中で主に見られるＶＩＭ−２であるドミナントバリアントであり、モノバクタムを除くあらゆるベータラクタムに対する耐性をコードするもの）、およびＫＰＣ（肺炎桿菌におけるカルバペネム耐性をコードする）に分類することができる。
【０２５０】
積極的に細菌から抗生物質を排出する排出ポンプをコードする遺伝子、当該遺伝子に関して５種類の主要なスーパーファミリー（Ｐｏｏｌｅ（２００７年）Ａｎｎ．Ｍｅｄ．３９：１６２）：主要なファシリテーター（ＭＦＳ）、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）、低分子多剤耐性（ＳＭＲ）、耐性ノジュレーション（ＲＮＤ）、ならびに多剤および毒性化合物排出（ＭＡＴＥ）がある。これら排出系のそれぞれにより作用される抗生物質、原因となる遺伝子、ならびにそれが最も一般的に生じる生物は、Ｐｏｏｌｅ（２００５年）Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５６、２０の表１にありかつ図２７に示されている。医学的に重要な耐性遺伝子は次のものを包含する：マクロライド耐性は、一般に、例えば連鎖球菌（Ｐｏｚｚｉ（２００４年）Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｏｒｄ．４、２０３）、およびグラム陰性菌においてＭｅｆ（Ａ）遺伝子によりコードされる；ＭｓｒＤは、例えば、肺炎球菌においてケトライド耐性をコードする（Ｄａｌｙ（２００４年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：３５７０）；クロラムフェニコール耐性は、緑膿菌、肺炎桿菌、およびＳ．エンテリカにおいて記載のように、例えば、Ｃｍｌ／ＣｍｌＡＢ排出系によりコードされる（Ｓｃｈｗａｒｚ（２００４年）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２８：５１９）；エリスロマイシン耐性はシュードモナス菌種においてＭｅｘＣＤ−ＯｐｒＪによりコードされる（Ｔａｕｃｈ（２００３年）Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２６８：５７０）；テトラサイクリン耐性は、グラム陰性菌において、Ｔｅｔファミリー（一般に、ＴｅｔＡ、ＴｅｔＢ、ＴｅｔＣ、ＴｅｔＤ、ＴｅｔＥ、Ｔｅｔ３０、およびＴｅｔ３９）によりコードされ（Ｒｏｂｅｒｔｓ（１９９６年）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：１およびＢｕｔａｙｅ（２００３年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ２２：２０５年）、グラム陽性菌においてＴｅｔＫおよびＴｅｔＬによりコードされる（Ｂｕｔａｙｅ（２００３年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ２２：２０５）；インフルエンザ菌におけるベータラクタムおよびアミノグリコシド耐性は、ＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣによりコードされる（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２０００年）Ｊ．Ｂａｃ．１８２：１７５４）。ＭＡＴＥスーパーファミリーからの排出ポンプは、とりわけフルオロキノリンに対する耐性を付与し、原因となる遺伝子は次の菌において同定されている。大腸菌（ＮｏｒＥ、Ｍｏｒｉｔａ［１９９８年］Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：１１７８）、淋菌（ＮｏｒＭ、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ−Ｌｏｕｇｈｌｉｎ［２００３年］Ｊ．Ｂａｃ１８５：１１０１）、インフルエンザ菌（ＨｍｒＭ、Ｘｕ［２００３年］Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：９３７），緑膿菌（ＰｍｐＭ、Ｈｅ［２００４年］Ｊ．Ｂａｃ．１８６：２６２）、Ｃ．ディフィシル（ＣｄｅＡ、Ｋａａｔｚ［２００５年］Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｔｈｅｒ．４９：１８５７）、黄色ブドウ球菌（ＭｅｐＡ、Ｋａａｔｚ［２００５年］Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ���ｈｅｒ．４９：１８５７）、および大腸菌（ＡｃｒＡＢ、Ｎｉｓｈｉｎｏ［２００１年］Ｊ．Ｂａｃ．１８３：５８０３）。
【０２５１】
アミノグリコシド（ストレプトマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、アミカシンなど）に対する耐性をコードする遺伝子。耐性は、Ｎ−アセチル化（アミノグリコシドアセチルトランスフェラーゼ、ＡＡＣ）、アデニリル化（アミノグリコシドヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＡＮＴ）、またはＯ−リン酸化（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ＡＰＨ）により最も一般的に抗生物質を修飾する酵素を産生する遺伝子により一般にコードされる（Ｓｈａｋｉｌ［２００８年］Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉ．１５：５）。かかる遺伝子の例は、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方で見られる：ＡＡＣ（６’）−Ｉｅ ＡＰＨ（２”）Ｉａは、腸球菌およびブドウ球菌において広域スペクトルアミノグリコシド耐性を付与する（Ｈｅｄｇｅ［２００１年］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４５８７６）；ＡＡＣ（３）ファミリーは最も大きく（Ｓｕｎａｄａ［２００３年］Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ）５２：８０９）、例えば、腸球菌においてアミノグリコシドに対する広域耐性を付与する（Ｄｒａｋｅｒ［２００４年］Ｂｉｏｃｈｅｍ．４３：４４６）；ａｎｔ（２”）ｏよびａｎｔ（４”）遺伝子は、グラム陰性菌においてゲンタマイシンおよびトブラマイシンに対する耐性をコードする一方でａｎｔ（４’）、ａｎｔ（６）およびａｎｔ（９）はグラム陽性菌においてゲンタマイシンおよびトブラマイシンに対する耐性をコードする（Ｊａｎａ［２００６年］Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７０：１４０）；グラム陽性生物において、ａｐｈ（３’）遺伝子は広く分布しており、特にブドウ球菌および腸球菌において、様々なアミノグリコシドに対する耐性を付与する（ＭｃＫａｙ［１９９６年］Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４０：２６４８）。
【０２５２】
さらに、ｅｒｍＢ遺伝子が、特に連鎖球菌性感染において、ジスロマックス／アジスロマイシンなどのエリスロマイシンに対する耐性の決定に関与する（Ｒｉｃｈｔｅｒ［２００５年］Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４１：５９９）。
【０２５３】
１つの態様では、本方法は、上記の耐性遺伝子または遺伝子のタイプ（例えばベータラクタマーゼをコードする遺伝子、アミノグリコシド修飾酵素をコードする遺伝子）のいずれか１種以上の発現の調節を標的とするために使用されてもよく、これにより、例えば上記にリストされた菌株において、対応する抗生物質に対する耐性が変更される。遺伝子の調節を標的とするデコイ配列は、本明細書に記載のように同定され試験されてもよい。
【０２５４】
デコイ配列は、シス調節配列自体または、例えば、必要な競合作用を保持するそのバリアントもしくは断片を含んでもよい。シス調節配列は、本明細書に記載されかつ／または本明細書に記載の方法のいずれかによって同定されたいずれのものを含んでもよい。デコイ配列は、本明細書に記載されかつ／または本明細書で同定されたようなスネア配列、あるいは必要な競合作用を保持するそのバリアントもしくは断片を含んでもよい。
【０２５５】
特定のセットの遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を標的とするデコイ配列は、細胞における未変性の転写因子結合部位に基づいて調製されてもよい。例えば、配列は発表済みの文献に記載されている。１つの態様では、テストデコイ配列は、内因性の結合部位またはコンセンサス配列または未変性部位のバリアントもしくは断片を含んでもよい。
【０２５６】
次いで、テストデコイ配列を、デコイ機能に関して評価することができる。典型的には、デコイ配列は、本明細書に記載のようにデコイポリヌクレオチドとして調製される。デコイポリヌクレオチドは、遺伝子に機能的に結合した所与の転写因子の結合部位を含む宿主細胞に導入され、この遺伝子の発現は直接的または間接的に検出できる。例えば、スクリーニングは、調節遺伝子の発現について直接的に試験すること、あるいは遺伝子の発現と因果的に繋がった表現型について試験することを含んでもよい。遺伝子の発現の変更をもたらすデコイ配列は、デコイ機能を有すると言われている。
【０２５７】
デコイ機能を試験するための適切な方法（例えば、ｎ［スネア］プラスミド、リポーター系を使用して）は、本明細書に記載されている。
【０２５８】
テストデコイ配列はまた、ｎ［スネア］プラスミドライブラリーを使用する本明細書に記載の方法および／またはタンパク質結合部位の境界を同定する方法により決定することができる。これら方法は、細胞における表現型に関しての遺伝的な根拠を検査するために使用することができる。例えば、臨床分離株における抗生物質耐性に関しての遺伝的な根拠を検査するために使用することができる。
【０２５９】
デコイポリヌクレオチドは、本明細書に記載のいずれのデコイ配列を含んでもよく、記載のような付加的な配列を含んでもよい。
【０２６０】
デコイポリヌクレオチドは、実施例に記載のいずれのデコイ配列および／またはデコイポリヌクレオチドを含んでもよい。したがって、例えば、ＡｆｓＲ結合部位を含むデコイポリヌクレオチドは、実施例１のｎ［スネア］プラスミドもしくはこれに含まれるスネア、または環状デコイダンベルデコイ構造を形成する配列番号３のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。デコイポリヌクレオチドは、実施例２もしくは３においてシンナマイシン産生のアップレギュレーションをもたらすと確認されたｎ［スネア］プラスミドまたはこれに含まれるスネアを含んでもよい。デコイポリヌクレオチドは、実施例４においてブタノール耐性の増加をもたらすと確認されたｎ［スネア］プラスミドまたはこれに含まれるスネアを含んでもよい。実施例５に記載のように、デコイポリヌクレオチドは、配列番号８、９、１０、１１、または１２のうちのどれを含んでもよい。デコイポリヌクレオチドは、環状ダンベルデコイを形成する配列番号２１のオリゴヌクレオチド、または配列番号２６、またはＶａｎＲ結合部位のバリアントである種を含んでもよい。
【０２６１】
デコイポリヌクレオチドは、任意の適切な方法により調製されてもよい。例えば、実施例７．２に記載のように、ダンベルデコイは、適切なプライマーを使用してＰＣＲにより調製されてもよい。各プライマーは、一般に、ダンベル構造のステムループを形成する部分を含む。かかるプライマーの例は、配列番号２４および２５に示されている。典型的には、プライマーを使用するＰＣＲ増幅の後、増幅産物の制限消化およびライゲーションを行い、閉環ダンベルを形成させる。
【０２６２】
あるいは、ダンベルは、実施例７．３に記載のように、プラスミドの制限消化により調製することができる。消化の後、ライゲーションを行い、閉環ダンベル構造が形成される。
【０２６３】
本方法は、原核細胞または真核細胞における遺伝子発現を変更するために使用されてもよい。１つの態様では、当該方法が真核細胞において適用されると、デコイポリヌクレオチドは本明細書に記載のようなｎ［スネア］プラスミドを含み、かつ／あるいはデコイ配列は本明細書に記載の方法にしたがって同定されたシス調節配列と競合し、かつ／あるいはデコイ配列は本明細書に記載の方法にしたがって同定されたシス調節配列またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【０２６４】
デコイポリヌクレオチドは、任意の適切な手段により宿主細胞に導入されてもよい。例えば、形質転換、トランスフェクション、接合が挙げられる。例えば、ポリヌクレオチドが接合性プラスミドを含む場合、このポリヌクレオチドは接合により導入されてもよい。デコイポリヌクレオチド（例えば、環状ダンベル構造）は、トランスフェクションにより細胞に導入されてもよい。細胞は培養液中にあってもよく、デコイはこの液に加えられてもよい。あるいは、細胞は固体培地上で培養されてもよく、デコイはデコイで飽和させた吸収紙ディスクからトランスフェクトされ、培地に上塗りされてもよい。典型的には、デコイポリヌクレオチドは培地に加えられ、細胞に取り込まれる。細胞が固体培地上で培養される場合、デコイポリヌクレオチドはろ紙ディスクに加えられ、ディスクから細胞に取り込まれてもよい。トランスフェクションを補助するため透過性緩衝液を使用してもよい。
【０２６５】
１つの態様では、デコイポリヌクレオチドのトランスフェクションは、コレステロールの使用を含んでもよい。特に、当該方法は、一方または両方の５’末端にコレステロール修飾を有する直鎖デコイポリヌクレオチドを使用してもよい。この修飾は、細胞による取り込みを促進すると考えられている。
【０２６６】
デコイはさらに、例えば、５’末端において、蛍光染料（例えば、Ｃｙ５）などの検出可能な標識で標識されていてもよい。これは、細胞における取り込みおよび保持のモニタリングを促進することになる。
【０２６７】
実施例７．１に記載のように、コレステロールデコイおよび／または検出可能な標識デコイは、コレステロールプライマーおよび／または検出可能な標識プライマーを使用して調製されてもよい。
【０２６８】
細胞へのデコイポリヌクレオチドのトランスフェクションは、９個のＤ−アルギニンの直鎖に結合したコレステロール分子から成るＲ９−コレステロールの使用を含んでもよい（Ｋｉｍ Ｗ．Ｊ．ら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ ２００６年 １４：３４３〜３５０）。
【０２６９】
一般に、細胞におけるデコイポリヌクレオチドの取り込みおよび／または保持はモニタリングされる。例えば、プラスミドデコイは、プラスミドの存在について正の選択を可能にしプラスミド増殖のモニタリング可能にする検出可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性をコードする）を含んでもよい。デコイポリヌクレオチドの存在もｑｒｔ−ＰＣＲによりモニタリングすることができる。
【０２７０】
一般に、デコイが導入される細胞は、転写因子結合をめぐってデコイが競合するシス調節配列（典型的には、当該配列を含むプロモーター）を含むものであり、遺伝子（その発現が修飾される）と機能的に結合している。適切な宿主細胞は本明細書に記載されている。典型的には、上記方法がある細胞表現型を変更するために使用される場合、宿主細胞は上記デコイの非存在下でその表現型を示す。医学的または治療的に関連のある表現型を変更（例えば、抗生物質感受性を増加させる）するためのデコイは、一連の細胞においてスクリーニングされてもよい。例えば、デコイは、その表現型のバクテリアモデル（例えば、抗生物質耐性モデル）においてまず試験され、次いで、例えば、病原体または臨床分離株においてさらに検証されてもよい。本明細書に記載のように、デコイは動物モデルにおいてさらに検証されてもよい。
【０２７１】
デコイポリヌクレオチドが細胞へ導入されると、典型的には、細胞は遺伝子発現の修飾についてスクリーニングされる。スクリーニングは直接的であっても間接的であってもよい。細胞における遺伝子発現および／または表現型の修飾についてのスクリーニング方法は、シス調節配列を同定する方法に関連して本明細書に記載されている。
【０２７２】
さらなる態様では、１つより多いデコイポリヌクレオチドが細胞へ導入されて、表現型が変更されてもよい。例えば、ｎ［スネア］プラスミドの組み合わせを使用してもよいが、但し当該プラスミドは適合性のあるものである。
【０２７３】
１つの態様では、本明細書に記載の方法はインビボでの方法である。
【０２７４】
本明細書に記載の表現型を修飾する方法は、例えば、工業的および治療的に多くの用途がある。
【０２７５】
上記方法は、例えば、有用な代謝産物の産生を増加させるため、工業的に重要な細胞における表現型を変更させるために使用されてもよい。したがって、１つの態様では、本発明は、細胞における代謝産物の産生を修飾する（増加または減少させる）、本明細書に記載の方法を含む方法を提供する。典型的には、当該方法において、対象となるシス調節配列は、代謝産物の産生に必要なタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する。
【０２７６】
１つの態様では、シス調節配列は、本明細書で同定されたＡ２４．１、Ａ２４．２、Ａ２４．３、Ａ２４．４、またはＡ２４．５の１つを含む。本発明は、本明細書で同定されたＡ２４．１、Ａ２４．２、Ａ２４．３、Ａ２４．４、またはＡ２４．５のいずれの、例えば、Ａ２４．１、２４．３、Ａ２４．５（例えば、Ａ２４．５）の使用、あるいは転写因子の結合をめぐって上記のもののいずれとも競合するデコイ分子の使用を含む抗生物質産生を修飾する方法に関する。本発明はさらに、配列番号８〜１２のいずれの使用を含む、抗生物質産生を修飾する方法に関する。
【０２７７】
上記方法はまた、細胞（例えば、細菌細胞）を抗生物質に対してより感受性のあるものにするために使用されてもよい。したがって、本発明はさらに、本明細書に記載の方法を含む、細胞（例えば、細菌細胞）の抗生物質感受性を修飾する（増加または減少させる）方法を提供する。典型的には、当該方法において、対象となるシス調節配列は、抗生物質耐性に必要なタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する。
【０２７８】
したがって、１つの態様では、本発明は、細胞の抗生物質耐性を修飾するためのデコイポリヌクレオチドの使用を提供する。一般に、この修飾は、細胞における抗生物質耐性遺伝子の発現の変更によりもたらされる。この効果は、特定の抗生物質に、またはある場合においては抗生物質のクラスに特異的なものであってもよい。
【０２７９】
一般に、細胞は、転写因子の結合部位を含むシス調節配列に機能的に結合した遺伝子を含み、デコイポリヌクレオチドは、同じ結合部位を有するか、または、転写因子結合をめぐって細胞の結合部位と競合する部位を有するデコイ配列を含む。細胞へのポリヌクレオチドの導入は、細胞におけるシス調節配列への転写因子の結合を減少させ、細胞における遺伝子の発現の変更をもたらし、これにより細胞の抗生物質耐性を修飾する。
【０２８０】
典型的には、細胞における標的シス調節配列は、本明細書に記載のように、抗生物質耐性遺伝子の発現を調節する。デコイは、遺伝子の発現の調節をかく乱し、これにより細胞における抗生物質耐性の変更（例えば、減少）をもたらす。
【０２８１】
細胞は、耐性の実験モデルまたは未変性の耐性菌（例えば、病原体または臨床分離株）であってもよい。適切な細胞は本明細書に記載されている。
【０２８２】
１つの態様では、本発明は、シアノバクテリアにおけるＣＯ２応答性遺伝子の発現レベルとは別に原核生物の表現型を変更させる方法に関し、この方法は、デコイを原核生物と接触させた際、転写因子が原核生物のゲノムにおいてその同族結合部位に結合することを競合的に阻害されるように、原核生物の転写因子が結合する配列をコードする核酸を過剰に含むデコイを提供することを含み、ここで当該配列は本明細書に記載の方法によって同定される。
【０２８３】
本発明はまた、シアノバクテリアにおけるＣＯ２応答性遺伝子の発現レベルとは別に原核生物の表現型を変更させる方法に関し、この方法は、デコイを原核生物と接触させた際、転写因子が原核生物のゲノムにおいてその同族結合部位に結合することを競合的に阻害されるように、原核生物の転写因子が結合する配列をコードする核酸を過剰に含むデコイを提供することを含む。デコイは、原核細胞遺伝子のプロモーターの一部を含んでもよい。デコイは、原核細胞遺伝子（例えば、抗生物質合成遺伝子または調節遺伝子）のプロモーターからの転写因子結合部位を含んでもよい。転写因子へのデコイの結合は、原核生物が通常耐性を有する抗生物質に対してこの原核生物に感受性を発生させ得る。例えば、上記原核生物は、抗生物質であるバンコマイシンに通常耐性があるが、当該デコイの存在下ではこの原核生物はもはや耐性を有さない。原核生物は病原体であってもよい。あるいは、転写因子へのデコイの結合は、原核生物による抗生物質の産生を増進させる。
【０２８４】
１つの例では、本方法にしたがって変更される表現型が抗生物質耐性である場合、推定上のデコイ配列はまず、本明細書に記載のように、実験室モデル細胞またはリポーター細胞において試験される。次いで、候補のデコイ配列は、一般に、未変性の耐性細胞（例えば、病原細胞または臨床分離株）において試験される。一般に、本方法はさらに、適切な動物モデルにおいて候補のデコイ配列を試験することを含む。例えば、マウスモデルを使用してもよい。一般に、動物モデルは、抗生物質のみでの処理に耐性を有する病原株に感染される。
【０２８５】
ある場合では、デコイ配列（モデル細菌種における結合部位配列に基づく）が臨床分離株のパネルに対して試験される場合、上記処理に抵抗性（refractive）を有するいくつかの分離株が存在することが見つかる可能性がある。かかる場合では、これらの分離株が同定され、ＴＦＤが模倣する調節配列内に変異があるかどうか判断するために配列分析を行ってもよい。その場合、当該変異の発生率を推定し、臨床での発症率に大まかに対応したモデル配列とバリアント配列とを両方含むＴＦＤのカクテルが作成される。
【０２８６】
本デコイポリヌクレオチドには、医学的および獣医学的用途やインビトロ使用を含む多くの用途がある。
【０２８７】
例えば、１つ以上の抗生物質に対する細胞の感受性を増加させるデコイポリヌクレオチドは、ヒトもしくは動物における細菌感染の治療、または原核生物を死滅させるかもしくは阻害する生体外の方法（例えば、抗菌性洗浄組成物中で）に使用することができる。
【０２８８】
典型的な使用では、デコイは、抗生物質と組み合わせて使用されることになる（当該デコイにより細胞がこの抗生物質に対してより感受性を持つようになる）。抗生物質は、デコイと同時または前または後に投与されてもよい。抗生物質およびデコイは、同じまたは別々の組成物中で投与されてもよい。
【０２８９】
したがって、例えば、バンコマイシンに対する耐性を低下させるためにｖａｎＨＡＸオペロンのＶａｎＲ調節を標的とするデコイは、典型的には、バンコマイシン抗生物質と組み合わせて使用されることになる。
【０２９０】
治療するためにデコイが使用される特定の感染または関連症状は、一般に、デコイが標的とする病原性細胞によって決まる。
【０２９１】
例えば、Ｅ．フェシウムおよびＥ．フェカリスなどのバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）は、腹部感染、皮膚感染、尿路感染、血液感染に関連している。したがって、ＶＲＥにおいてバンコマイシン耐性遺伝子のＶａｎＲ調節を標的とするデコイは、典型的にはバンコマイシンと組み合わせて、かかる感染の治療に使用されてもよい。
【０２９２】
例えば、ペニシリンに対する広範な耐性を示す広域スペクトルベータラクタマーゼをコードする遺伝子を有するグラム陰性菌（大腸菌および肺炎桿菌など）の感染は、尿路および腸の重篤な感染症に関連している。１つの態様では、ペニシリンと組み合わせた、ベータラクタマーゼをコードする遺伝子（ＣＴＭ−Ｘファミリーの遺伝子など）の発現を阻止するまたはダウンレギュレートするように設計されたデコイを用いた治療は、かかる感染の治療に使用されてもよい。
【０２９３】
１つの態様では、黄色ブドウ球菌、肺炎球菌、または肺炎クラミジア（C. pneumoniae）におけるｍｅｆＡまたはｅｒｍＢ遺伝子の発現によりもたらされ、耳および喉の感染において顕著なジスロマックス耐性は、かかる生物においてｍｅｆＡおよびｅｒｍＢの調節を標的とするデコイを、典型的には上記抗生物質と組み合わせて、適用することにより治療することができる。
【０２９４】
１つの態様では、肺炎をもたらす肺炎球菌などのフルオロキノロン（fluoroguinolone）耐性感染症は、ｎｏｒＡ（排出ポンプをコードする遺伝子）調節を標的とするデコイにより治療することができ、上記抗生物質と組み合わせて投与できる。
【０２９５】
１つの態様では、肺炎をもたらす肺炎クラミジア感染症においてクラリスロマイシン（例えば、バイアクシン（Biaxin））などのマクロライド耐性は、上記抗生物質と組み合わせて、耐性遺伝子ｅｒｍＢの調節を標的とするデコイの投与により治療することができる。
【０２９６】
１つの態様では、ベータラクタム（例えば、オーグメンチンなどのペニシリンなど）に対する耐性をコードするａｍｐＣ遺伝子を標的とするデコイは、病院環境中で上記抗生物質と共に注射により、広範なグラム陽性およびグラム陰性の院内感染に対する治療剤として使用することができる。
【０２９７】
１つの態様では、本発明は、デコイポリヌクレオチドと、生理学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物に関する。組成物はさらに、記載のような１つ以上の抗生物質を含んでもよい。
【０２９８】
治療的な使用のための許容される担体または希釈剤は薬学の分野で周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５年）に記載されている。医薬担体、賦形剤、または希釈剤は、意図した投与経路および標準的な薬務に関連して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤、または希釈剤として、またはこれらに加えて、任意の適切なバインダー、潤滑剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤を含んでもよい。
【０２９９】
デコイは、例えば、静脈注射、局所適用、または経口送達など任意の適切な手段によって投与されてもよい。上記のように、投与は、適切な投与量の抗生物質と組み合わせもよく、当該抗生物質は、デコイと同時にまたは別々に投与される。
【０３００】
抗生物質耐性を増加させるデコイポリヌクレオチドも殺菌剤などの洗浄組成物において使用することができ、この場合もまた典型的には抗生物質（当該デコイポリヌクレオチドにより細胞が当該抗生物質に対してより感受性をもつようになる）と組み合わせておよび／または１つ以上の抗菌剤と組み合わせてもよい。１つの態様では、本発明はかかる洗浄組成物に関する。
【０３０１】
本発明はさらに、本明細書に記載のようなデコイポリヌクレオチドと１種以上の抗生物質または抗菌剤とを含むキットを提供し、ここでデコイおよび抗生物質もしくは抗菌剤は、細菌などの原核生物を死滅させるまたは阻害する際に組み合わせて使用される。
【０３０２】
１つの態様では、したがって、本発明はさらに、被験者における細菌感染を治療するための薬剤の製造のための、本明細書で記載および／または同定されたデコイポリヌクレオチドの使用に関する。本発明はさらに、細菌感染の治療のためのデコイポリヌクレオチドならびに本明細書に記載のようなデコイポリヌクレオチドを投与することを含む細菌感染に関して被験者を治療する方法に関する。
【０３０３】
本発明はさらに、本明細書で記載および／または同定されたデコイポリヌクレオチドを含む組成物および薬剤に関する。さらなる態様としては、本明細書で同定および／または記載のようなデコイポリヌクレオチドを１種以上の抗生物質または他の抗菌治療剤と組み合わせて被験者に投与する併用療法が挙げられる。
【０３０４】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の方法にしたがって同定されたシス調節配列に関し、また、例えばデコイ配列における、当該シス調節配列の使用に関する。特に、本発明は、本実施例において同定されたシス調節配列（例えば、本明細書で同定されたＡ２４．１、Ａ２４．２、Ａ２４．３、Ａ２４．４、またはＡ２４．５を含むシス調節配列、およびこれらを含むデコイポリヌクレオチド）に関する。本発明はさらに、本明細書に記載のようなおよび／または本明細書に記載のようなデコイポリヌクレオチド（例えば、配列番号３、８〜１２、および２１）に関する。
【０３０５】
本発明はさらに、本明細書に記載のおよび／または本明細書に記載の方法にしたがって調製されたいずれのｎ［スネア］プラスミドもしくはプラスミドライブラリー（本実施例において調製されたものを含む）にも関する。
【０３０６】
本発明はさらに、本明細書に記載のようなｎ［スネア］プラスミドおよび／またはデコイポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。特に、本発明は、変更された遺伝子発現および／または表現型を示すかかる宿主に関する。例えば、本発明は、所与の代謝産物（例えば、抗生物質）の産生の増加、抗生物質に対する感受性の増加、または所与の溶媒に対する耐性の増加を示す宿主細胞に関する（本実施例において調製されたものを含む）。
【０３０７】
したがって、１つの態様では、本発明は、本明細書に記載のようなデコイポリヌクレオチド（本明細書に記載のようなｎ［スネア］プラスミドまたはプラスミドライブラリーを含む）を含む宿主細胞（本明細書に記載のものなど）に関する。特に挙げられるものとしては、抗生物質に対する変更された感受性を有し（例えば、感受性を増加させた）、本明細書の方法にしたがって調製された細胞である。したがって、１つの態様では、本発明は、本明細書に記載のようなデコイポリヌクレオチドを使用して抗生物質に対してさらに感受性を持たせた病原体または臨床分離株に関する。
【０３０８】
（本発明の特定の実施形態のさらなる説明）
本発明による第１の実施形態では、シス調節エレメントを同定するための一般的な方法を提供する。ほとんどのグッドサイエンス（good science）と同様に、ゲノム配列解析プロジェクトは、それがもたらした回答よりも多くの疑問をもたらした。本質的には、当該プロジェクトが導き出したものは生物内の全遺伝子のリスト（ゲノム）だったが、これによって当該遺伝子のどれがいつそしてどのような条件で使用（発現）されるかという疑問がもたらされた。発現のパターンは、遺伝子の機能の手掛かりを提供し、重要な特性（表現型）の原因である遺伝子を同定させるのでこれは考慮すべき重要な事項である。ヒトの細胞を考えてみると、どの細胞も同じ遺伝子を含んでいるが、発現のパターンは、ある細胞が肝臓または脳由来であるかどうか（組織特異的調節）に左右される（かつ、そうであるかどうかを恐らく決定する）。遺伝子発現のパターンを説明することができる新規な技術（マイクロアレイ技術）が開発されており、例えば、病気に対する耐性など医学的に重要な表現型の原因となる遺伝子のセットを同定することができる。ゲノム配列解析プロジェクトの公約の１つは、そのような知識が新薬の設計を促進し病気治療の戦略を支援することであった。しかしながら、この可能性を実現させるためには新規なツールが必要となる。
【０３０９】
我々は現在、表現型を決定する遺伝子を同定することができるので、次なるチャレンジは、当該遺伝子を制御すること、およびそうすることによって表現型発現を制御することである。これは、我々の生物学一般の理解、薬物の新規な標的の同定に対して、そしてまた我々が工業用の細菌（例えば、いわゆる発酵産物）からの医学的および商業的に重要な化合物の生産を向上するために根本的に重要である。発酵産物は、食品、医薬品、そしてますます工業用の酵素および燃料にわたる。持続可能なソース（細菌）からこれら産物を誘導することは、従来からの環境的に犠牲の大きい（石油）化学的な製造方法に依存することに対するものとして価値あるゴールである。
【０３１０】
遺伝子は、スペシャリストタンパク質（すなわち転写因子）によりオン／オフが切り替えられる。スペシャリストタンパク質には２つの機能がある。特異的なＤＮＡ配列（調節エレメント）（通常は標的遺伝子の近く）に結合することと、発現されている遺伝子の蓋然性を変更させることである。初期の試みは、転写因子自体の特性または量を変えることに主眼を置いた。我々の手法は、転写因子が結合する調節エレメントを標的にすることである。我々が作り上げた方策の１つは、転写因子が上記ゲノムのバージョンに結合するのを競合的に妨げそのようにして下流遺伝子へのいかなる影響もブロックするように、過剰の当該調節エレメント（「デコイ」と名付けた）を導入することである（本発明の第２および第３の実施形態に関する下記記述を参照のこと）。本発明のこの実施形態では、我々は、調節エレメントのどのセットが所期の効果を有しているか識別するために迅速に試験することができるデコイのライブラリー（ある種からの全調節エレメントまたは可能な限りの調節エレメントを有するユニバーサルバージョンのいずれかを含む）を構築する。当該手法の鍵となる部分は、工業用の細菌からの収率の増加などの複雑な現象の変化を探す代わりに、抗生物質に対する耐性を付与し検出するのが容易な外来のレポーター遺伝子の発現の変化により、うまくいった修飾をモニタリングするように一般的「リポーター系」を構築することにある。この系は、スクリーニングが高スループットで行うことができるように設計されている。したがって、本発明のこの態様は、高品質なデータを高速にそして全ゲノムに関して作成しなければならないゲノム時代の技術である。ユニバーサルデコイライブラリーと一般的リポーター系の組み合わせは、バイオテクノロジー産物のデリバリーを速やかに向上させ、かつ貴重な研究用ツールとなることが予想される。
【０３１１】
より具体的には、本発明のこの実施形態によれば、我々は、「デコイ」オリゴヌクレオチド手法を、原核生物における遺伝調節の制御およびストレプトミセス・セリカラーにおける抗生物質産生の制御を達成するように適合させた。しかしながら、デコイは、分解しやすく、当該手法は高スループット化には向いていない。我々は、本発明による方法におけるいずれの問題点にも対処している（実施例１〜４を参照のこと）。一般的には、ＤＮＡ増幅のローリングサークル機構を使用して、オリゴヌクレオチドは一連の（約３０個の）二本鎖ダイレクトリピートに変換された。当該リピートは、高コピーシャトルベクター（大腸菌およびストレプトミセスの両方で増殖可能）にクローニングされ、接合によりＳ．セリカラーに導入された。プラスミドは抗生物質選択により維持された。我々は、この系がデコイよりもうまくいくことを見出した。すなわち、抗生物質産生の抑制がより大きく、これは実験期間中にわたって持続した。合成ランダムオリゴヌクレオチドから一般的ライブラリーを作ることができる、あるいは全ゲノムの断片から種特異的ライブラリーを作ることができるように、ライブラリーを構築する方法を適合させた。ユニバーサルなスクリーニング系を作成するために、負および正の選択用のリポーターが、異種発現のための共通の宿主（トレプトミセス・リビダンス）において作成される。標的プロモーターは、カナマイシン耐性遺伝子（ｇｌｋＡ）の上流でクローニングされる（これは代謝産物である２−デオキシグルコース（ＤＯＧ）に対する感受性を決定する）。ライブラリーの形質転換に続いて、形質転換体は、培養液中で、カナマイシンの耐性の増加（負の調節を検出する）についてまたはＤＯＧに対する感受性の増加（正の調節を検出する）についてスクリーニングされる。選抜が培養液中で行われるため、クローンの大部分は失われ、続く分析に供されるクローンの数は少なくなり、扱いやすくなる。独立したスクリーニングからのコロニーのセットのうちのどれが他のセットのメンバーとクロスハイブリダイズするかを調べるためにテストされる確認系が開発される。このようにして、ライブラリーで再発し配列分析の良好な候補であるクローンを同定することが可能である。
【０３１２】
本発明による第２の実施形態では（実施例５を参照のこと）、我々は、デコイオリゴヌクレオチドを使用して、ストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）における青色色素性抗生物質アクチノロージンの調節を研究した。この生物は、特に抗生物質産生を制御する発生的および環境的刺激に関して、複雑で適応性のある遺伝子調節のパターンを有する（原核生物としては）比較的大きなゲノム（８．７ｍｂ）を含む（Ｂｉｂｂ（２００５年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：２０５〜２１５）。Ｓ．セリカラーも放線菌についてのモデル生物であり、この菌株における抗生物質産生の調節についての理解を深めることは、これらの生物により産生される様々な二次代謝産物を利用するための新規な方策についての情報を与え得る。これらの化合物の多くは、医薬において、例えば抗生物質としておよび農業において重要な用途があり（Ｂｅｒｄｙ（２００５年）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．５８：１〜２６）、放線菌は依然として新薬および酵素の有益なソースである（Ｗａｒｄ（２００６年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：２７９〜２８６）。
【０３１３】
恐らく抗生物質産生の複雑な調節の結果として、遺伝子スクリーニングにより同定された多くの多面発現変異株は条件的である。例えば、ｒｅｌＡヌル変異株の抗体非生産表現型は非常に媒体依存性である（Ｃｈａｋｒａｂｕｒｔｔｙ（１９９７年）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：５８５４〜５８６１）。栄養条件的表現型の発生は、遺伝子スクリーニングが抗生物質産生に影響を及ぼす制限因子の数を過小評価している可能性があることを示唆する。使用される条件下で標的遺伝子の活性化が代替となる転写因子または調節経路により仲介され得る場合、本当の転写因子の不活性化が見落とされてしまう可能性がある。デコイの利点の１つは、デコイが、遺伝子発現を制御するＤＮＡ−タンパク質相互作用の配列コンポーネントを同定し操作するということであり、１つの部位と多数の転写因子が相互作用することを潜在的にブロックする。本発明によるこの実施形態では（実施例５を参照）、我々は、調節配列を標的化することは比較的容易であること、ならびに従来の遺伝子スクリーニングと相補的な方法で新規な調節遺伝子を迅速に同定できることを実証する。
【０３１４】
本発明による第３の実施形態では（実施例６を参照）、我々は、通常は抗生物質に対して耐性を有する細菌にこの抗生物質に対する感受性を与えるというデコイオリゴデオキシヌクレオチドの有用性を実証する。当業者であれば、いわゆる「スーパーバグ（超強力な細菌）」が我々の病院を含めてどこでも見つかる可能性があるという時代において本発明のこの態様が非常に重要であることが分かる。しばしば抗生物質の広範な使用のせいにされる、かかるいわゆるスーパーバグの発生には汎流行性（パンデミック）の感染を起こす可能性がある。しかしながら、本発明のこの態様によって、当業者であれば、病原体が特定の抗生物質に対する耐性を達成するメカニズムを適切に理解することによって、本発明の方法にしたがって同定されたデコイオリゴヌクレオチドは、その特定の抗生物質の投与の前に、同時に、またはその前と同時の両方で使用されてもよいことを理解する。
【０３１５】
多くの遺伝子は、制限因子とシス調節部位との相互作用を通して様々なレベルで制御される。形成される核タンパク複合体は、組織特異的、発生段階特異的、または刺激依存的に制御される可能性がある。要するに、インビボＤＮＡ−タンパク質相互作用は、生理学的に決定され、２種類の動的コンポーネント（トランス作用性環境を構成するＤＮＡ結合タンパク質およびシス調節配列）間の相互作用を表す。遺伝子発現のパターンについての我々の知識は近年相当に増加した一方で、それに対応する特定の細胞過程に作用する特定の遺伝子を制御する制限因子についての我々の知識は、遺伝子発現のパターンの知識の増加に匹敵するものではない。我々は、本明細書の技術を利用することで原核生物の遺伝調節の複雑さに対する新たな洞察がもたらされ、従来の遺伝子分析に対して相補的な手法として当該技術が確立される可能性が高いことを予期している。
【０３１６】
本明細書で言及される文書はすべて参照により援用される。
【０３１７】
（実施例）
好ましい実施形態および最良の形態と共に本発明を全般的に説明したが、次の具体例はさらなる説明と併せて本発明の記載を十分に実施可能にし発展させるために提供される。しかしながら、当業者であれば、本発明は実施例の詳細に限定して解釈されるべきではないことを理解する。むしろ、本発明の範囲を理解する目的のためには、本開示に添付される請求項（その均等物を含む）を参照するべきである。
【０３１８】
一般に、本明細書において言及される技術の多くは当該技術分野において周知であるが、特にＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌを参照してもよい。
【０３１９】
（実施例１）
デコイオリゴヌクレオチドのプラスミド性バージョンの生成および表現型の修飾におけるその有用性の実証
この作業を達成するため、まずｎ［スネア］プラスミドを作成し得る分子生物学プロトコルを開発することが必要であった。かかるプラスミドベクターに所望される特徴は、ＤＮＡの同一の断片のダイレクトコピーから成るセクションを含むということである。通常、当該コピーの数は３０個であるが、１〜１０００個までの数に及んでもよく、リピート配列の長さは３５〜５４ｂｐの範囲であるが、より長く（例えば、１０００ｂｐまで）てもよい。下記の作成の例では、このリピート配列内に、すべてのｎ［スネア］プラスミドに共通し、製造方法の結果であるセグメント（２７ｂｐ）が存在する。また、この例では、プラスミドベクターは次の目的のために選択された：（ｉ）大腸菌およびＳ．セリカラーの形質転換および増殖を可能にすること；（ｉｉ）抗生物質アプラマイシンに対する耐性をコードする選択マーカー遺伝子を含むこと；ならびに（ｉｉｉ）細胞内で高いコピー数（典型的には細胞１つ当たり１００個のコピーにおよぶ）を維持すること。
【０３２０】
（ＡｆｓＲ結合部位を含むｎ［スネア］プラスミドを作成する方法）
プロセスの概要を図１に示す。一本鎖オリゴヌクレオチドをキメラ構造（（Ａ）Ｔ７プライマーのアニーリング部位および（Ｂ）シス調節配列または推定上のシス調節配列を含む領域）を用いて合成する。オリゴヌクレオチドは、ユニバーサル連結オリゴヌクレオチドの存在下でＴａｑリガーゼの作用により環化される。直鎖ＤＮＡを消化するためのエキソヌクレアーゼを用いた消化に続いて、モノマー環は分取アクリルアミドゲルから回収される。当該モノマー環は、続いて、ＢｓｔポリメラーゼおよびＴ７プライマーを使用したローリングサークル増幅反応においてテンプレートとして使用される。同じプライマーがＰＣＲ反応において再び使用され、産物をアガロースゲル上で分離した。高分子量断片（典型的には３０〜５０個のリピートを含む）が単離され、ＰＣＲベクターへクローニングされた後、高コピーシャトルベクターへサブクローニングして、ｎ［スネア］プラスミドを形成させる。機能を決定するため、ｎ［スネア］プラスミドは、未変性の株またはジェネリックレポーター株に形質転換される。このプロトコルはまた、ランダムオリゴヌクレオチドから作成された「一般的」ｎ［スネア］ライブラリーを製造するため、または断片化されたゲノムからの種特異的ライブラリーを製造するために使用できる。ｎ［スネア］プラスミドがどのように標的遺伝子の発現に作用するかの図を図２に示す。この図の左上では、遺伝子（横棒「Ａ」で示す）は、遺伝子のプロモーター内でシス調節配列（横棒「Ｃ」）への転写抑制因子（丸「Ｂ」）の結合により転写的に不活性である。転写因子結合部位を構成するシス調節配列の配列は、生物情報分析（bioinformatic analysis）、プロモーターの「フットプリント」、本明細書に記載の様々なｎ［スネア］法を含む様々な技術により決定されてもよい。遺伝子の発現に影響を及ぼすために、この配列はデコイオリゴヌクレオチドに組み込まれるが、ここで示されるのは多数の（典型的には３０個の）ダイレクトリピートにおいて選択プラスミドへクローン化されて、ｎ［スネア］プラスミドが作成される。このプラスミドは通常「シャトル」プラスミドであり、これは大腸菌（遺伝子操作の容易さのため）および標的生物の両方において増殖できることを意味し、さらに、このプラスミドは通常「高コピー」であり、これは典型的には宿主細胞においてプラスミド自身の１００個におよぶコピーを産生するということを意味する。ｎ［スネア］プラスミドは、標準的な手段により標的原核生物へ導入され、その安定した増殖は、そのマーカー（通常は抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子）を選択することにより確保される。このように細胞へ導入されると、ｎ［スネア］プラスミドは、ゲノムプロモーターから転写因子「Ｂ」をタイトレーションすることにより、標的遺伝子の発現に作用することができ、下流遺伝子の転写的な抑制を解放する（横長の四角「Ｄ」として示す、右上）。
【０３２１】
ＡｆｓＲ結合部位を含むデコイオリゴヌクレオチドが合成された。これは次の配列を有していた。
５’−リン酸− ａａｔ ａｃｇ ａｃｔ ｃａｃ ｔａｔ ａｇｇ ｇｇｃ ｇｔｔ ｇａｇ ｃｇａ ａｃｇ ｔｔｔ ｔｔｃ ｇｃｇ ｇｃｃ ｇｃ−３’（配列番号１）
ここでＡｆｓＲ結合部位は太字の配列で示され、ＮｏｔＩ制限部位には下線が引かれている。オリゴヌクレオチドは５’末端にてリン酸基で合成されている。
【０３２２】
「連結」ヌクレオチドＲ−Ｔ７も合成され、これはＲ−Ｔ７が一般に用いられているプライマーＴ７の部分的補体を含んでいるのでこのように呼ばれる。
５’−ｃｃｃ ｔａｔ ａｇｔ ｇａｇ ｔｃｇ ｔａｔ ｔｇｃ ｇｇ−３’（配列番号２）
【０３２３】
プライマーはいずれも、１×Ｔａｑリガーゼ緩衝液（製造業者であるＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓにより供給のまま）および５０Ｕ Ｔａｑリガーゼから成る反応緩衝液において２５０ｐｍｏｌ／μｌの終末濃度で再懸濁した。混合物を９５℃まで１０分間加熱した後、４５℃まで冷却し、ここで反応物に４Ｕ／ｍｌＴａｑリガーゼを補充し、反応物を一晩４５℃で培養した。
【０３２４】
反応物１μｌを、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、７０ｎＭ Ｔ７プライマー（Ｒ−Ｔ７に対する補体）および１２０ Ｕ／μｌ Ｂｓｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を補充した１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反応緩衝液（製造業者であるＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓにより供給のまま）から成るインキュベーション混合液におけるローリングサークル増幅（ＲＣＡ）のテンプレートとして使用した。この混合物を一晩６０℃で培養した。
【０３２５】
増幅されたＤＮＡを、市販のカラム系（Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ）上でのクリーンアップ工程に続いて回収し、このＤＮＡ１μｌを、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、５％ＤＭＳＯ、２５ｐｍｏｌ Ｔ７プライマー、および０．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を補充した１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（製造業者であるＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓにより供給）から成る標準的なＰＣＲ反応液において使用した。ＰＣＲは次の環化パラメーターを使用して行われた。９５℃で５分間、次いで次のシーケンスを２５回繰り返す：９３℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で２分間、次いで７２℃で２分間。
【０３２６】
反応生成物は、１％アガロース／ＴＢＥゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色したゲルの透過照射により視覚化した。
【０３２７】
うまくいった調製は、配列の「ハシゴ」として現われ、ほぼ５０ｂｐのリピート長があり、見かけの大きさが１．５ｋｂである十分な量の物質が移動しており精製が可能である（５０ｂｐのモノマーのほぼ３０個のリピートに相当する）。
【０３２８】
一般に、この手順を行う場合、産物のサイズが主に小さければ（５００ｂｐ未満のサイズ）、まず増幅を繰り返して、使用されるテンプレートの量を変更し、ＰＣＲ反応においては、用いられる増幅のサイクル数を変更する。これで所望のサイズの産物が産生されない場合は、代替の手法が用いられ、ここではＢｓｔ増幅の産物のＮｏｔＩ部分的消化が行われ、標準的なＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ ＰＣＲ反応（ＬＭ−ＰＣＲ）における効率的な増幅を可能にするために、断片は大きさによって分画されてＮｏｔＩに適合性があるリンカーにライゲーションされた１．５ｋｂのテンプレートが単離される。
【０３２９】
１．５ｋｂの断片は、Ｐｒｏｍｅｇａからの市販のｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクターへサブクローニングされる（これはＰＣＲ産物の効率的なクローニングのため３’Ｔ突出でアレンジされている）。標準的な分子生物学的技術を使用して、断片は、ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙライブラリーのアリコートから単離されたＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化に続いて回収され、ゲル精製される。ＥｃｏＲＩ断片の収集物は、次いで、シャトルベクター（我々の場合は、大腸菌およびＳ．セリカラーの両方において複製できるｐＩＪ８６）における同様の制限部位へサブクローニングされる。ｐＩＪ８６性ｎ［スネア］断片は、次いで、標準的な方法を使用して接合によりＳ．セリカラーへ導入される（Ｋｉｅｓｅｒら（２０００年）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）。
【０３３０】
（Ｓ．セリカラーにおける抗生物質産生表現型を変更させるａｆｓＲ ｎ［スネア］プラスミドの使用）
ＡｆｓＲは、Ｓ．セリカラーにおける抗生物質産生の多面発現レギュレーターであり、この遺伝子の人工的な欠失は、これがＳ．セリカラーにおいて２種類の色素性抗生物質（アクチノロージン（青）およびウンデシルプロジギオシン（undecylprodigisin）（赤））の産生に不可欠であることを示した（Ｈｏｎｇら（１９９１年）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７３：２３１１〜２３１８）。ＡｆｓＲ結合部位として作用する鍵となるシス調節配列は、ａｆｓＳ遺伝子の上流で見つかっており（Ｌｅｅら（２００２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ４３：１４１３〜１４３０）、ｎ［スネア］プラスミドを試験するために使用されたのはこの配列であった。この部位を含むデコイ（比較目的で平行して製造された）またはｎ［スネア］プラスミドは、プロモーターから活性化ＡｆｓＲタンパク質をタイトレーションすることによりａｆｓＳの発現を阻害し結果としていずれの色素性抗生物質の産生も減少すると予想されると結論付けられた。それゆえ、対照となる未処理のＳ．セリカラー、ＡｆｓＲ部位を含む環化ＴＦＤで処理された培養物（上記され太字で示され、
５’−リン酸−ａｔａ ｇｃｇ ｔｔｇ ａｇｃ ｇａａ ｃｇｔ ｔｔｔ ｔｃ ｇｃｇ ｔｔｔｔ ｃｇｃ ｇａ ａａａ ａｃｇ ｔｔｃ ｇｃｔ ｃａａ ｃｇｃ ｔａｔ ａｇ ｔｔｔｔ ｃｔ−３’（配列番号３）
のオリゴヌクレオチドを使用した）、およびＡｆｓＲ ｎ［スネア］プラスミドで形質変換された株について、３つの増殖曲線がモニタリングされた（図３）。この図では、ａｆｓＳの野生型プロモーターは左上の「Ａ」として示され、ＡｆｓＲ（楕円形の「Ｂ」）はその同族部位（長方形の「Ｃ」）へ結合して調節遺伝子の発現を活性化する。右上のグラフ「Ｉ」は、培養物の増殖曲線ならびに２種類の色素性抗生物質アクチノロージン（Ａｃｔ）およびウンデシルプロジギオシン（Ｒｅｄ）の産生を示す（左の縦軸＝抗生物質産生、右の縦軸＝細菌増殖、実線はバクテリアの乾燥重量測定値を示し、ひし形はアクチノロージン（Ａｃｔ）産生を表し、正方形はウンデシルプロジギオシン（Ｒｅｄ）産生を表す）。グラフ「ＩＩ」は、環状ダンベルデコイ（＋デコイ；中央左）の導入（これはＡｆｓＲ結合をめぐって競合をもたらして、ａｆｓＳによりコードされるレギュレーターの発現を抑制し、付随して抗生物質産生（中央右のグラフＩＩ）が減少する）を示す。シス調節配列「Ｃ」（左下）のホモポリマーリピートを含むｎ［スネア］プラスミドは、抗生物質産生（ｎ［スネア］）の抑制においてより効果的であることを証明し、これはプラスミドに関する正の選択によるものであるようである。そして、抑制作用は、実験中を通して観察される（グラフＩＩＩ右下）。ｎ［スネア］プラスミドは、表現型における付随する変化を伴って予測可能な様式で遺伝子発現の制御を修飾することができる。当該プラスミドは、より安価に製造され、デコイより容易に細胞へ導入され、より持続的な効果をもたらし、そして、非常に重要なことには、当該プラスミドにより、鍵となる調節エレメントの発見にライブラリー手法を用いることが可能になる。
【０３３１】
それゆえ、対照培養物（図３、上の列）と比較して、抗生物質産生は、デコイで処理された培養物およびｎ［スネア］で処理された培養物の両方で抑制されると結論付けられた。しかしながら、デコイ処理では抗生物質産生は４８時間後に回復し、当該効果は主として一時的である一方、ｎ［スネア］処理では、抑制効果は実験期間を越えて持続した。デコイフォーマットにおけるそしてｎ［スネア］プラスミドに導入されたＡｆｓＲ結合配列のスクランブル化バージョンを使用した対照実験では、抗生物質産生の有意な抑制は無かった。これら所見は、ｎ［スネア］プラスミドをシス調節配列の同定および特性評価のために使用することができるという推定を支持するものであり、いくらかの点（安定性および表現型が修飾される程度）において当該プラスミドは、デコイオリゴヌクレオチドの既存の技術よりも優れている。
【０３３２】
（実施例２）
ｎ［スネア］ライブラリーを使用して、原核生物または真核生物における表現型を修飾するためのシス調節エレメント、ひいてはデコイを同定する方法
この実施例において、ｎ［スネア］ライブラリーは、１７．０８３ｋｂのシンナマイシン生合成クラスターから単離された短いＤＮＡ断片から作成され（Ｗｉｄｄｉｃｋ ａｎｄ Ｂｉｂｂ（２００３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、１００：４３１６〜４３２１）、このライブラリーはストレプトミセス・シンナモネウスの産生株へ再導入された。抗生物質の検出はプレートアッセイを使用して行われ、ここで産生株のコロニーを、リポーター菌株である枯草菌が播種された軟栄養寒天で上塗りされた寒天プレート上で増殖させる。抗生物質が指示株を死滅させた場所である透明な栄養寒天のハロが産生コロニーの周りに現われ、栄養寒天の他の場所では菌株の増殖が継続することによりにより不明瞭に見える。このハロの直径は、産生されたシンナマイシンの量の指標であり、ｎ［スネア］ライブラリーの導入後は、接合完了体コロニーの過剰産生についての便利なスクリーニングとして使用することができる。このようにして、ライブラリーのメンバーが抗生物質の産生をアップレギュレートすることができるかどうか判断すること、およびＴＦＤに導入されうる候補シス調節エレメントについて相当な数のゲノム断片をスキャニングするための発見ツールとしての当該手法の有用性を確認することが可能である。当該手法の論理を発展させて、はるかに規模の大きい調査（全ゲノムを含む）においてｎ［スネア］ライブラリーに候補配列を検出させる方策を開発することができ、当該手法の実証およびその潜在的な有用性を下記実施例において記載する。しかしながら、当業者であれば、当該方法は本実施例の詳細部分に限定されないこと、ならびに本質的に対象となる任意の形質の表現型の変更を達成するために他の原核生物または真核生物の表現型をこの方法論を用いて同様に調査できることが分かる。
【０３３３】
１．カスタムｎ［スネア］ライブラリーの構築
当該断片を生成する手順の模式図を図４に示す。ｎ［スネア］プラスミドライブラリーは、ＤＮＡ内のシス調節配列がすべてライブラリーにおいて示されるようにＤＮＡの大切片から作成される。この図において、ゲノムＤＮＡまたはゲノムのフラクション（生合成クラスターなど）は超音波処理で断片化され、遊離末端はＴａｑポリメラーゼおよびｄＮＴＰで処理することにより修復されて、ＤＮＡの３’末端に単一のｄＡ突出を有する末端が生成されることが示される。当該末端に、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ（濃い四角）、ＭｍｅＩ（薄い四角）、および相補的な５’ｄＴ突出の制限部位を含むビオチン化リンカーがライゲーションされる。ライゲーションされていないアダプターはライゲーション混合物から除去された後、修飾された断片がＭｍｅＩ（認識部位の２０／１８ヌクレオチド下流で切断する酵素）で消化され、ｄＴが突出に導入される。得られた分子は、ゲノムＤＮＡの１９／１７ヌクレオチドストレッチを有するインタクトビオチン化アダプターから成り、我々はこれを「スネア」と呼ぶ。当該分子は、ストレプトアビジンでコーティングしたマトリクス上で捕捉され、トップストランド（１９ｎｔストレッチを含む）をビーズに結合したままにしておくように変性される。Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ部位を再作成するように設計されたさらなるオリゴヌクレオチドがここでアニーリングされ、これは続いて当該酵素で消化されて、スネア配列を有するアダプターの一部から成るＤＮＡの一本鎖断片を放出する。これは、ｎ［スネア］ライブラリーを作成する次の工程で使用される。
【０３３４】
１．１ＤＮＡフラグメントの調製
ほぼ１７ｋｂのシンナマイシン生合成クラスターを含むＤＮＡ断片は、それがあらかじめクローニングされたコスミドから単離された。この断片はゲル精製され、５００ｂｐの平均長まで超音波処理された（ＴＢＥ／アガロースゲル上の電気泳動によりＤＮＡのアリコートを分析することにより判断した）。超音波処理は、異なる長さの３’および５’突出で終結するＤＮＡと２本鎖切断が生じる平滑末端化ＤＮＡとの不均一集団を産生する。これらを３’ｄＡ突出を有する末端からなる均一集団に変換するため、ＤＮＡはＴａｑポリメラーゼで処理された。
【０３３５】
１．２ゲノム断片からの１８ヌクレオチド長の「スネア」の作成
「スネア」なる語は、ｎ［スネア］プラスミドを作成するために使用されるゲノム配列の断片に由来するＤＮＡの短い一本鎖部分を意味するために使用される。
【０３３６】
標準的な方法を使用して、下記の配列（Ｐはリン酸を表す）のビオチン化アダプターを作成し、処理されたＤＮＡ断片にライゲーションされる。
５’−ビオチン−ｇｇｔ ｃｃｇ ｇｇｃ ｃａｃ ｇｇｔ ｇｇｔ ｃｔａ ｃｇａ ｇｃｃ ｔｃａ ｇｃｃ ａｇｇ ｔｃｃ ｇａｃ ｔ−３’（配列番号４）
Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ        ＭｍｅＩ
３’−ａｇｔ ｃｇｇ ｔｃｃ ａｇｇ ｃｔｇ−Ｐ−５’（配列番号５）
【０３３７】
ＤＮＡ断片は、次いで、ＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キットを使用して、取り込まれていないリンカーから分離され、３０μｌの溶出緩衝液において再懸濁される（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８）。適応したＤＮＡ断片は、次いで、２０ユニットのＭｍｅＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む５０μＭ Ｓ‐アデノシルメチオニンを捕足した２００μｌ反応緩衝液（１×Ｂｕｆｆｅｒ４［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ］）において３７℃で１６時間消化される。消化に続いて断片は析出され１２％未変性アクリルアミドゲル上で分離され、バンドが分析される。遊離アダプター、ならびによりゆっくりと泳動する種類のアダプターであってＩＩＳ型制限酵素ＭｍｅＩによるゲノム断片の非対称的な消化により生成された１９／１６ｎｔ突出を有するものがはっきりと見られる。このバンドはゲルから削除され、そして断片は標準的な技術を使用して回収された。上方の鎖上の１９ｎｔは、デコイ配列の候補としてｎ［スネア］プラスミドに導入された遺伝物質の部分である。当該断片はビオチン化されるとともに、ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性マトリクス（例えば、ＤｙｎａｌからのＭ−２８０ビーズ）上に捕捉される。当該ビーズ上のＤＮＡは０．５Ｍ ＮａＯＨ中で変性され続いて８０℃まで加熱され、得られる一本鎖ＤＮＡは１×Ｂｕｆｆｅｒ４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で洗浄される。下記の配列を有する１００ｐｍｏｌのＢｂｖ相補オリゴヌクレオチド（下線が引かれているＮｔ．ＢｂｖＣＩ部位を含む）は、捕捉された一本鎖ＤＮＡにアニーリングされ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ制限部位が作成される。
５’−ｇｇａ ｃｃｔ ｇｇｃ ｔｇａ ｇｇｃ ｔｃｇ ｔａｇ ａｃｃ ａｃｃ ｇｔｇｇｃｃ ｃｇｇ ａｃｃ−３’（配列番号６）
消化の前に、ビーズはライゲーションしていないオリゴヌクレオチドをすべて除去するため十分に洗浄される。混合物にはここで２５ユニットの酵素が追加され、反応物は４時間３７℃で培養され、この後、混合物は６０℃まで１５分間加熱されてニッキングされたＤＮＡを変性する。「スネア」部分はビーズから解放される一方で、残りの部分は保持される（図４）。磁性スタンド上へのビーズの捕捉に続いて、上清からのＤＮＡは回収され、上に記載と同様の方法を使用してｎ［スネア］プラスミドを作成するために使用される。
【０３３８】
２．その天然宿主における抗生物質シンナマイシンの産生をアップレギュレートするためのｎ［スネア］プラスミドのライブラリーの使用
シンナマイシン生合成クラスターから作成されたｎ［スネア］ライブラリーは接合により産生株Ｓ．シンナモネウスに導入され、Ｒ２ＹＥ寒天上にプレーティングされ（Ｋｉｅｓｅｒら（２０００年）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、３日間増殖させた。Ｓ．シンナモネウスが未処理または空のベクター含む（どのダイレクトリピートも含まない）ドナー株と接合された平行した対照実験が行われた。当該対照は、「ハロ」のサイズの平均サイズおよび分布の予測を可能にしたので、ｎ［スネア］で処理されたサンプルにおけるハロのサイズの測定は統計的に有意な過剰産生株を決定するために使用される。ｎ［スネア］接合完了体におけるハロのサイズの増加の例を図５に示す。固体Ｒ２ＹＥ媒体上にプレーティングされると、Ｓ．シンナモネウスは寒天中に抗生物質（シンナマイシン）を分泌し、これは産生コロニーがその株の培養物で上塗りされた場合に枯草菌細胞を死滅させることができるものである（左側）。このハロの直径は、産生されたシンナマイシンの量の指標として使用される。産生は、１７．０８３ｋｂのシンナマイシン生合成クラスターに由来する断片を含むｎ［スネア］ライブラリーの導入により増加する。接合によるライブラリーのメンバーの導入に続いて、シンナマイシン産生の増加に基づいてクローンが選択される（右）。
【０３３９】
この手法を使用して、抗生物質産生をアップレギュレートできるｎ［スネア］プラスミドを同定すること、および、拡大解釈すれば、産生を制御するシンナマイシン生合成クラスター内で鍵となるシス調節配列を見出すことが可能であった。１つの用途では、ｎ［スネア］プラスミドにおけるまたはＴＦＤに組み込まれたかかる配列は、抗生物質および他の工業上有益な生物製剤の産生を操作するために使用することができる。この手法を使用して、我々は、前もって同定した放線菌由来化合物の産生レベルを増強することができた（図５）。これは、しばしば天然産物の商業上の開発における主な障壁であり、この技術は、いわゆる「潜在的な」二次代謝遺伝子クラスター（Ｚａｚｏｐｏｕｌｏｓ(２００３年)Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：１８７〜１９０）の発現を活性化または大幅に増強することにより放線菌の商業上の可能性を十分に活用するあるいは工業バイオテクノロジーの収率一般を増加させるのに適している。このプラットフォーム技術は、したがって、ヒトおよび動物両方のヘルスケアに有益であることが予想され、ゲノム配列決定およびゲノミクスの成果の両方を併せて利用したよい例である。
【０３４０】
（実施例３）
人工的なリポーター系を使用して表現型を修飾するためのシス調節エレメント、ひいてはデコイを同定するためのｎ［スネア］ライブラリーを使用する方法
【０３４１】
１．ｎ［スネア］ライブラリーおよびｃｉｎ７−リポーター株を用いたシンナマイシン産生レギュレーターの同定
シンナマイシン生合成クラスターは、過去に記述されており（Ｗｉｄｄｉｃｋ ａｎｄ Ｂｉｂｂ（２００３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、１００：４３１６〜４３２１）、同定された遺伝子のうちのいくつかの役割は生物情報的分析および遺伝子分析により確認されている。酵素的に変換されてシンナマイシン抗生物質を与える短いタンパク質（ｃｉｎＡ）をコードするｃｉｎＭＸＴＨオペロンの転写を制御するプロモーターがｃｉｎ７遺伝子に先行することが知られている（Ｓｅａｎ Ｏ’ＲｏｕｒｋｅおよびＭｅｒｖｙｎ Ｂｉｂｂ、未発表データ）。我々は、ｃｉｎ７プロモーターにより駆動されるポーター系を作成し、この構築物を全シンナマイシン生合成経路を有するストレプトマイセス・リビダンス株（１３２６株）へ導入した。当該手法を実証するため、シンナマイシンカスタムｎ［スネア］ライブラリー（実施例２に記載）は接合により菌株へ導入され、接合完了体は、通常は致死濃度のカナマイシン中での生存ついてスクリーニングされた。
【０３４２】
２．ｎ［スネア］ライブラリーおよびリポーターに基づいた系を用いて負の調節を検出する手順
標的遺伝子（ｃｉｎ７）のプロモーターは、図７に示すように、カナマイシン耐性を付与する遺伝子であるｎｅｏの上流に配置される。この図において、Ｓ．シンナモネウスの産生株のシンナマイシン生合成クラスターからのｃｉｎ７遺伝子の標的プロモーターは、抗生物質であるカナマイシンに対する耐性をコードするｎｅｏ遺伝子の発現を駆動するために使用される。ｃｉｎ７プロモーター内のシス調節配列は棒「Ａ」として示され、これには転写リプレッサーが結合され（楕円「Ｂ」）、これにより下流のｎｅｏ遺伝子が不活性化され、したがって当該菌株はカナマイシン感受性を有する。典型的には、このキメラ遺伝子は、組み込み型ベクターの使用により産生株のゲノムへ導入される。この場合Ｓ．シンナモネウスゲノムリポーター株の分画されたＤＮＡから作成されたカスタムｎ［スネア］ライブラリーが導入され、形質転換体／接合完了体はカナマイシンの濃度増加に対しての耐性についてスクリーニングされる。より耐性のある細胞がさらなる分析に供される。
【０３４３】
それゆえ、異種産生株Ｓ．リビダンス１３２６中でシンナマイシン生合成クラスターにおいて転写がないまたはほとんどない場合、ｃｉｎ７プロモーターは転写的に不活性であり、宿主細胞はカナマイシン選択に感受性があり、５μｇ／ｍｌ未満の濃度でカナマイシンに対する耐性をコードするプロモーターを持たないｎｅｏ遺伝子を有するプラスミドを含む株において細胞死が生じる（Ｌａｂｅｓら（１９９７年）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４３：１５０３〜１５１２）。ｃｉｎ７−ｎｅｏキメラ遺伝子は組み込み型プラスミド上にあり（ｐＳＥＴ１５２バックボーンに基づく、Ｋｉｅｓｅｒら（２０００年）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ)、当該組み込み型プラスミドはまた、抗生物質アプラマイシンに対する耐性をコードするａａｃＣ遺伝子を有する。我々は、当該技術分野において周知の方法によりＳ．リビダンス株１３２６（シンナマイシン生合成クラスターを含む）へこのカセットを導入し、ゲノムに安定して組み込まれたキメラ遺伝子を有する新規な株 （ＭＭ１４）を作成した。実施例２に記載のように作成されたシンナマイシンカスタムｎ［スネア］ライブラリーは、標準的な方法によりＭＭ１４へ導入され、ライブラリーの胞子懸濁液を生成した。一定数の胞子を使用してＲ３液体培地に播種し（Ｓｈｉｒａｈａｍａら（１９８１年）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４５：１２７１〜１２７３）、濃度が増加するカナマイシンの存在下における増殖がモニタリングされた。各濃度での細胞の生存率は、培養液から同じ容量のアリコートを回収し、寒天プレート（ＤＮＡ培地）上にアリコートを散布することにより決定され、培養液１ｍｌ中のコロニー形成単位を決定し、これから生細胞のパーセントを決定した。このデータは、この実験では６５０μｇ／ｍｌのカナマイシンで生存度は０．０１％未満であったことを示し、これは５０ｍｌの培養液において１２００コロニー形成単位に等しいと推定される。これは、抗生物質に対して増加した抵抗性を有するものを大幅に増やし、扱いやすい数の細胞になったので、カナマイシンの至適濃度であると考えられた。１５０μｇ／ｍｌでの生存度は８５％であり、ｃｉｎ７−ｎｅｏ構築物のベースライン活性を実証した。
【０３４４】
ライブラリーハイブリダイゼーション工程が行われた。この実施例において、４種類の独立した複製物中で、ＭＭ１４株はシンナマイシンカスタムライブラリーと接合された。各リピートについてのカナマイシンの最適濃度は経験的に決定された。最終的に、最適濃度で生存した各リピートからの９６個のクローンがＲ３培地中で培養され、次いで２つのアリコートへ分割された。一方からは、プラスミドは、ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかによる汚染を防ぐように注意して、標準的な手順を使用して細胞から抽出された。このプラスミドＤＮＡは、次いで、標準的な方法（Ｒｏｃｈｅマニュアル）にしたがってＤＩＧ標識ｄＵＴＰ分子を使用したランダムプライミングＰＣＲにより標識化され、プローブサンプルが作成された。他方のアリコートは希釈され、個々のコロニーがはっきりと見える濃度でＤＮＡ寒天プレート上に散布された。プレートは３０℃で１６時間培養され、その後コロニーはいまだワックスのような粘度を維持し、まだ硬化していなかった。９６個のかかるコロニーは爪楊枝でスクラップされ、この爪楊枝はまず別のＤＮＡプレート（５０μｇ／ｍｌのアプラマイシンを捕足）上に筋を作るために使用され、次いで２５μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で混ぜられ、９５℃まで１０分間加熱し、次いで冷却して、クローンに由来した全ＤＮＡの溶液を作成した。後にＤＮＡサンプルが候補ｎ［スネア］プラスミドを含むと分かった場合、生存する接合完了体（ｎ［スネア］プラスミドを有するＭＭ１４株）を回収しやすいように、筋およびＤＮＡ溶液にはそれぞれ番号が付された。
【０３４５】
本当に転写を妨害できるｎ［スネア］プラスミドを同定するため（全シグナルの大部分を形成する「バックグラウンド」メンバーと、本当に転写を妨害できるｎ［スネア］プラスミドとを区別するため）、ライブラリーハイブリダイゼーション法が開発された。この実施例において、標準的な方法を使用して、各リピートの９６個のクローンからのＤＮＡサンプルが処理され、番地付けができる位置にそれぞれをナイロン膜に対してハイブリダイズした。行われた方法を図９に示す。各リピートについて、４つのかかるフィルタ（それぞれ各リピートに由来したＦ１、Ｆ２、Ｆ３、およびＦ４）が作成され、次いで異なるプローブを用いて別々にハイブリダイズされた（したがって最終的にはすべてのプローブセットがフィルタのそれぞれに対してハイブリダイズされる）。Ｐ１およびＦ１のハイブリダイゼーションは、すべてのサンプルが検出されるクロマトグラムを検出する。ライブラリーにおいて複数回生じるｎ［スネア］配列は比例してより明るいので、検出は均一的であるとは期待できない。この実施例では、Ｆ３およびＦ４とのＰ１およびＰ２のハイブリダイゼーションは、全ライブラリーに共通のサンプルを検出する。当該サンプルは、長期の検査の有力な候補と考えられる。
【０３４６】
かかるスクリーニングの典型的なデータを図１０に示す。この実施例では、シンナマイシンライブラリーの２つの独立したリピートはリポーター株を用いて試験され、それぞれから最もカナマイシンに耐性のあるクローン９６個が使用されて、各複製物（Ｆ１およびＦ２）におけるｎ［スネア］プラスミドならびに２つの対応するプローブセット（Ｐ１およびＰ２）を含むフィルタを作成した。クロスハイブリダイゼーション（Ｆ１対Ｐ２、Ｆ２対Ｐ１）により同定されたクローンはすべて有力な候補と考えられ、両方のクロスハイブリダイゼーション実験に共通のもの（赤で円を描いた）を最も重視した。調査した６個のクローンのうち３個の配列は、ｃｉｎ７プロモーターの一部を同定し、他の２つはシンナマイシンクラスターｃｉｎＲ内で他の遺伝子からの潜在的なシスレギュレーターを取り囲み、このシスレギュレーターはクラスターの調節における役割を有すると提案されている。最後の配列は同定されず、Ｓ．リビダンス染色体に由来するかアーチファクト的であると推定された。
【０３４７】
いくつかのコンテキストでは、Ｆ１とＰ１とのハイブリダイゼーションおよび他の自己ハイブリダイゼーション実験は、例えば、真核生物ライブラリーにおける反復配列の増加による偽陽性クローンを検出することができる可能性がある。これらは、ライブラリーにおいて量が多いのではるかに強いシグナルを生成することになる。つまり、ライブラリーにおいて二度以上生じると推定される真陽性より多いが反復ＤＮＡ（このタイプは質量基準でヒトゲノムの１０％を占め得る）ほどではない。
【０３４８】
３．正の調節を検出するためのリポーターの適応
正の調節を検出することができるリポーター系を作成するために、標的プロモーターにより駆動されるグルコースキナーゼ遺伝子（ｇｌｋＡ）のコード配列を組み込んだキメラレポーター遺伝子からなるカセットを作成することによるシンプルな適応法が使用される。この酵素は、代謝産物２−デオキシグルコース（ＤＯＧ）を当該化合物の毒性を有するリン酸化バージョンに変換する。それゆえ、ｃｉｎ７プロモーターからなるキメラレポーター遺伝子をｇｌｋＡ遺伝子に結合させ、これをｇｌｋＡ−欠失を有するＳ．リビダンス株に安定的に組み込むことにより、かかるリポーター系が提供される（図８）。
【０３４９】
この実験のコンテキストでは、Ｓ．リビダンスのＴＫ２４株が使用される。これはシンナマイシン生合成クラスターを含んでおらず（産生を制御する負のシス調節エレメントを検出する際に使用した株には含まれる）、そのためｃｉｎ７プロモーターのどのような活性もＳ．リビダンスゲノムに由来する正のレギュレーターによるものである。それゆえ、このバックグラウンドにおいて正のシス調節配列を探索することにより、Ｓ．リビダンス宿主の染色体から異種発現のアップレギュレーターが見つかることが期待される。ｃｉｎ７プロモーターからｎ［スネア］プラスミド上に当該正のレギュレーターをタイトレーションすることにより、ｇｌｋＡの発現が阻止され、ＤＯＧの存在下で細胞が成長する。現在まで、シグマ因子および翻訳機構のコンポーネントなどの転写装置の特定の成分の過剰発現によりもたらされる可能性がある異種生産のかかる一般的なレギュレーターを検出するために、従来の遺伝子スクリーニングを使用して、相当な研究がなされてきた。さらに、ＳＡＲＰとして知られる転写因子のクラス（Ｂｕｔｌｅｒら（２００３年）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６１：５１２〜５１６）が同定され、当該因子が結合するシス調節エレメントはこのスクリーニングについての考えられる標的である。当該スクリーニングは、過去に記述されたのと同一の方法で行われ同様の利点がある、例えば、高スループット処理、標準化方法、および容易にスコアリングすることができる表現型との適合性である。
【０３５０】
（実施例４）
未決定の遺伝子系における表現型を修飾するためのシス調節エレメント、ひいてはデコイを同定するためにｎ［スネア］ライブラリーを使用する方法
【０３５１】
１．ゲノムのｎ［スネア］ライブラリーの作成
精製された大腸菌Ｋ１２株ゲノムＤＮＡは超音波処理されて、５００ｂｐの平均サイズにした。次いで、断片は実施例２に記載のように処理された。すなわち、簡便な制限部位を含むビオチン化されたリンカーで適応され、１９／１７ヌクレオチド突出を有するアダプターを産生させるために消化され、ストレプトアビジンマトリクス上で捕捉された後、制限および変性されて、１９ヌクレオチド突出を有するアダプターの一部を含む一本鎖ＤＮＡ断片を放出する。これらのタイプの分子は、次いで、実施例２に記載のような技術を使用してｎ［スネア］プラスミドのライブラリーを作成するために使用される。
【０３５２】
大腸菌Ｋ１２ゲノムｎ［スネア］ライブラリー（以下「Ｋ１２ライブラリー」と呼ぶ）の１つのバージョンは、１，５６０，０００個のメンバー有すると推定された。これは、ゲノムおよびｎ［スネア］ライブラリーを構築するために使用された断片両方のサイズを考えれば、標準的な分析を使用すると、全ゲノムの９９．８％までのカバレッジに対応する。それゆえ、ライブラリーの作成に配列的な偏りがなければ、Ｋ１２ライブラリーの３種類の独立したバージョンが、ゲノムの完全なカバレッジを可能にする。ライブラリーにおいて偏りがあったかどうか評価するため、プラスミドは上記液体倍地中で増殖した培養物のアリコートから単離された。このプラスミドの混合物はＥｃｏＲＩで消化されて、ｎ［スネア］ライブラリーを作成するために使用された断片を再生成し、当該断片はＭｍｅＩ消化に供されて、分子生物学的に構築がうまくいったかを確認した。予想したように、挿入物のサイズは大きく、ＭｍｅＩでの消化が完了するまでに３０ｂｐのモノマーにまで崩壊した（図１１）一方で、部分消化によってサイズが３０ｂｐのリピートのマルチマーである中間体が生じた。プラスミドの収集物の配列決定により、「スペーサー」エレメントの配列はアダプターに由来し、このスペーシングは少なくとも１０個のコピーにわたってよく保存されていることがはっきりと確認された。予想したように、プラスミド収集物の「スネア」部分は、１９の位置のいずれにおいてもヌクレオチドの偏りがほとんど無い本質的にランダムな配列であった。
【０３５３】
２．ユニバーサルｎ［スネア］ライブラリーの作成
次の配列を有するオリゴヌクレオチドが合成された。
５’−リン酸−ａａｔ ａｃｇ ａｃｔ ｃａｃ ｔａｔ ａｇｇ ｇｎｎ ｎｎｎ ｎｎｎ ｎｇｃ ｇｇｃ ｃｇｃ−３’（配列番号７）
ここでＮｏｔＩの制限部位には下線が引かれ、ランダム化ヌクレオチドは「ｎ」で表されている。この実施例において、ランダム化ヌクレオチドの数は９であるが、この数は変わり得る。可変領域によりコードされる配列のタイプも、例えば、配列中の定常領域（すわなち、可変配列に隣接する確定されたコア配列）を介在させることによりあるいは可変領域にヌクレオチドの偏りを導入することにより（すなわち、より高いＧＣ含量を有するランダム化配列を作成する時間の６０％は「ｎ」がｄＧＴＰまたはｄＣＴＰであると規定することにより）修飾されることができる。ランダム化配列を含むこのオリゴヌクレオチドを有するｎ［スネア］プラスミドひいてはユニバーサルｎ［スネア］ライブラリーを作成するプロトコルは、実施例２で示したものと同様である。我々は、ここで、ランダム化オリゴヌクレオチドに由来した当該ｎ［スネア］ライブラリーをユニバーサルライブラリーと呼ぶ。
【０３５４】
ライブラリーの１つのバージョンのタイター（titre）は、２００万を超えることが分かった。標準的な分析を使用すれば、かかるタイターのライブラリーが９ｂｐの配列のすべての可能な組み合わせを含む信頼性は７．５×１０５となる。しかしながら、ＰＣＲバイアス対ＧＣリッチ配列または広範な二次構造を有する配列ならびにＭｍｅＩまたはＮｏｔＩ部位を含む収集物中の配列などの特定の配列は多くの理由でライブラリーから失われるのでかかるライブラリーが真にユニバーサルである可能性は低いように感じられる。しかしながら、作成されたものはｎ［スネア］ライブラリー手法において使用するための見込みのあるシス調節配列の本質的および包括的な収集物である可能性があるということが分かる。
【０３５５】
３．未決定の遺伝的ネットワークを有するシスレギュレーターの表現型を検出するためにｎ［スネア］ライブラリーを使用するための手順
大腸菌株Ｋ１２は、ゲノムｎ［スネア］ライブラリーまたはユニバーサルライブラリーの一バージョンのいずれかで形質転換され、培養液中で増殖させた。増殖が対数期の中間段階に達した時（培養液の吸光度を見る（Ａ６００数値が０．４）ことにより推定される）、アリコートを使用して無溶媒または０．５％〜５％まで様々な異なる濃度のブタノールを捕足した培地に播種した。培養物はさらに１時間培養され、次いで細胞の生存率を計算するためにコロニー形成単位を測定した。細胞は、生存率が１０，０００分の１まで減少した（０．０１％以下まで）培養物から単離され、溶媒を含まない培地中で洗浄され、溶媒を含まない新しい培地に再び播種するために使用された。この実験サイクルが繰り返された。つまり、この培養物を密度が０．４になるまで増殖させ、増加した濃度のブタノールを捕足した培地に播種するために使用した。この過程は４回繰り返され、細胞の生存率は毎回測定された（図１２）。選択過程を反復することによって（ブタノールを１回通過した後に存在していたメンバーからのライブラリーを抽出して、大腸菌Ｋ１２を形質変換に用いた）、選択過程を繰り返す回数の関数として生存数が増加した。Ｋ１２ｎ［スネア］ライブラリーで処理されなかった大腸菌を「０」で示し（黒いひし形で表す）、１度処理されたものは黒い正方形で表し、２度処理されたものは黒い三角形で表し、３度処理されたものは白丸で表し、４度処理されたものはアスタリスクで表す。ｎ［スネア］挿入物を有さないプラスミドバックボーンからなるまたは形質転換されていない対照形質転換体と比較してｎ［スネア］ライブラリーで形質転換された細菌は、高濃度のブタノールの存在下で培養された場合に実質的により高い細胞の生存数を示すことが明らかになった。さらに、選択過程を反復することは、選択手順を繰り返す回数の関数として生存数を増加させることが明らかになった。
【０３５６】
大腸菌Ｋ１２カスタムライブラリーは、ユニバーサルｎ［スネア］ライブラリーよりも結果がよく、このライブラリーが菌株のゲノムをよりよく表していることと一致していた。
【０３５７】
（実施例５）
デコイオリゴヌクレオチドを用いたストレプトミセス・セリカラーＡ３（２）における抗生物質産生の操作および理解
ここまで記載してきたのは、表現型の制御に関連する鍵となるシス調節配列を同定するための一連の革新的な手法である。当該技術は、あらゆる生物に広く一般に適用可能である。次に、当該配列についての知識がインビボで遺伝子発現を修飾させることができるツールを作成するために使用することができることを示す。当該ツールは、やはり、あらゆる生物において機能するが、次の実施例の焦点は原核生物における使用である。転写因子デコイ手法は原核生物における使用に適応され、遺伝子発現を修飾することができる系を開発するためにｎ［スネア］プロトコルにより生成される情報を動員する強力な方法であることが示される。当該２つの手法の組み合わせを本明細書では「調節工学（regulatory engineering）」と呼ぶ。
【０３５８】
下記の実施例において、ストレプトミセス・セリカラーにおける抗生物質産生に影響を及ぼすシス調節配列は、新規なマッピング手順により決定され、当該配列は、デコイオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。デコイはＳ．セリカラーへ導入されて試験され、当該デコイの取り込み、安定性、および抗生物質産生の効果がモニタリングされる。使用された方法の完全な説明は本実施例の第７節に示す。
【０３５９】
１．ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４プロモーター内のマッピング調節エレメント
ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４の発現を制御するＤＮＡ−タンパク質相互作用は、インビボＤＮａｓｅＩ／Ｔ７エキソヌクレアーゼマッピングにより調査された。この方法は、機能的研究のためデコイオリゴヌクレオチドを設計するために推定配列を使用することができるように、シス作用性調節エレメントの境界を同定するために開発された。当該手法の概略を図１３に示す。Ｓ．セリカラーゲノム内の特定位置におけるＤＮＡ−タンパク質複合体のインビボ境界をマッピングするため、高濃度のＤＮａｓｅＩおよびＴ７エキソヌクレアーゼが新たに採取された細胞に加えられた。ＤＮａｓｅＩは複合体を取り囲むＤＮＡへ「ニック」を導入し、次いでこれはＴ７エキソヌクレアーゼの５’−３’のエキソヌクレアーゼ活性の基質としての機能を果たした。それゆえ、酵素の連合作用は、複合体の５’境界を規定する。ＤＮＡは処理された細胞から回収され、標的プロモーター（ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４）からの断片は、プロモーターのＰＣＲ断片の固定化された鎖（ビオチン化リンカーを取り込んでいる）へのハイブリダイゼーションにより捕捉される。捕捉された断片の集団内の境界の位置は、ビオチン化リンカーにハイブリダイズする第二のＤＩＧ非放射性標識プライマー（ジオキシゲニン、ＤＩＧ［Ｒｏｃｈｅ］を取り込む）を使用して、ＰＣＲ反応を行うことによりマッピングされる。標識産物のサイズはＰＡＧＥおよび化学発光検出により決定される。逆鎖上の境界は、反対の末端にビオチン化リンカーを有するＰＣＲ産物を使用して、同様の方法でマッピングされる。標識ＰＣＲ断片は、１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に続いてサイズ分画され、断片の存在およびそのサイズは化学発光検出に続いて決定された。フットプリント法におけるＴ７エキソヌクレアーゼおよびＤＮａｓｅＩの新規な組み合わせは、プロモーター領域内のＤＮＡ−タンパク質複合体（選択された制限部位に最も近いものだけでなく）のすべての境界の検出を可能にする。
【０３６０】
我々の意図はａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４発現の抑制に関与する調節エレメントを発見することであったので、栄養豊富な液体培地（Ｒ５）における転写的にダウンレギュレートされたプロモーターをマッピングした。これら条件下では、リプレッサーがプロモーターを占有し、発現を阻止する可能性がある。増殖曲線は細胞密度（培養物のＡ４３０）を測定することにより導き出し、２種類の色素性抗生物質の産生(青色のアクチノロージンおよび赤色のウンデシルプロジギオシン［Ｋｉｅｓｅｒら（２０００年）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ］およびａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４の転写活性を決定した。後者は増殖の後期段階で誘導されることが公知であり、したがって、マッピング用サンプルはアクチノロージン産生が視覚的に検出できる前に集菌された(図１４Ａにおいて矢印で示す)。Ｓ．セリカラーＭ１４５の細胞は、アクチノロージン産生が目視できる前の時点（矢印で示す）で、栄養豊富な（Ｒ５）培地中で増殖させた培養物から集菌された。細胞増殖（ひし形）ならびにアクチノロージン（三角形）およびウンデシルプロジギオシン（丸）の産生は、終始モニタリングされた。消化に必要な酵素の量は経験的に決定され、ＤＮａｓｅＩの濃度は慎重な至適化が必要であった。例えば、ＤＮａｓｅＩが過剰であると、ＤＮＡ−タンパク質複合体内での切断によってシグナルの明瞭さが失われる一方で、酵素が少なすぎるとマッピングには効果が無かった。ほとんどの場合、１反応当たり２５０ＵのＴ７エキソヌクレアーゼでうまくいったが、当該酵素はあまりプロセッシブではなく、また消化は至適な緩衝液において行われたのでもなかったので過剰の酵素を加える必要があった。図１３に記載のように両方の鎖上で境界がマッピングされ、境界の位置は１２％非変性ＰＡＧＥによるサイズ分析、その後のＤＩＧ標識産物の化学発光検出の後に決定された（図１４Ｂ）。標準的なサイズのハシゴと比較することにより、転写的にサイレントなａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４プロモーター領域におけるＤＮＡ−タンパク質複合体の境界を規定することができた（図１４Ｃ）。推定上のシス調節因子の位置（マッピングプロトコルにおいて使用されたプライマーに対する）を示すａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４プロモーターの配列。囲みの付いた領域は、上流遺伝子（ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ３）およびａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４自身のコード配列を示す。大文字で書かれた配列は、候補調節エレメント（上にその名前を示す）を示す。下線を引いた配列はａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４プロモーターの−３５および−１０ボックスを示し、アスタリスクは転写開始部位の位置を示し、収束する矢印はＡ２４．４に存在する逆方向リピートを示す。
【０３６１】
我々は、これらの領域により規定される配列を調節エレメントと呼び、合計で５つ見られた。調節エレメントはＡ２４．１〜Ａ２４．５と名付け（転写開始部位に向かって）、これらの配列は次の機能的研究において使用されるデコイオリゴヌクレオチドを設計するために使用された。
【０３６２】
２．寒天プレート上のデコイ機能についての迅速なスクリーニング
我々は、デコイが抗生物質産生に効果があるかどうか試験するための寒天プレートに基づいた迅速なアッセイを開発した。Ｒ２ＹＥ寒天が使用された。これはＲ２ＹＥ寒天は目視により容易に検出できるレベルで両方の色素性抗生物質の産生を促進するためである。プレートは希釈した胞子懸濁液で播種され、２４時間３０℃で培養されて、Ｓ．セリカラーのコンフルエントな菌叢が形成された。この段階で、ウンデシルプロジギオシン（赤色）の産生が開始していたが、アクチノロージン（青色）はまだであった。図１５に示すように、プレートは、０．５％アガロース中のＳＮＡの薄層で覆われ、これが固まる前に、小さな円盤状のワットマン紙（抗生物質効力検定用ディスク）を培地上に置き、１５μｌのデコイオリゴヌクレオチド溶液（１０ｐｍｏｌ／μｌ）または対照溶液で飽和させた。フィルターディスクをデコイの溶液または対照としての緩衝液（図示）で飽和させ、ＳＮＡ培地(軟栄養寒天：０．５％Ｄｉｆｃｏ Ａｇａｒ ｗ／ｖ)で上塗りしたＳ．セリカラーＭ１４５の菌叢に塗布した。細菌の増殖が継続すると、増加した抗生物質産生の発生は、ディスク内およびそのまわりの色素性抗生物質の初期蓄積によって確認することができた（デコイの添加後４８時間ではっきりと分かる）。陰性対照（緩衝液のみ、またはデコイＡ２４．５の「スクランブル化」バージョン）は、早期の産生を示さなかった。サンプルはすべて、トランスフェクションの効率を向上させることがわかっている２種類の非イオン性洗浄剤ＮＰ−４０およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．５％（ｖ／ｖ）含む緩衝液中で調製された。対照は緩衝液のみまたはＡ２４．５デコイの配列がランダム化されたスクランブル化デコイオリゴヌクレオチドからなっていた。プレートは、さらに３０℃で培養され、抗生物質産生の量またはタイミングに影響があったかどうか判断するために定期的に検査された。紫色／赤色のハロはＡ２４．５で浸したディスク周囲に見られ、Ａ２４．３および、デコイＡ２４．１〜Ａ２４．４のカクテルにもより小さい程度で見られた（図１５、４８時間後；より早い時点では、分子がｐＨ指示薬として作用するのでアクチノロージンは赤く見えるが、ハロは分泌されたウンデシルプロジギオシンのバックグラウンドの上方にはっきりと見えた）。アクチノロージン合成が開始したことを確認するため、４８時間後ディスクは回収され、色素は抽出され分光学的に定量されて、デコイＡ２４．５は初期のアクチノロージン産生を強く活性化した一方でＡ２４．３およびデコイのカクテルはより小さい程度で活性化したことが示された（データ図示せず）。対照ディスクの周りでは初期のアクチノロージン産生は見られなかった。９６時間後までに、Ｓ．セリカラーＭ１４５の菌叢全体は両方の抗生物質を多量に産生し（図示せず）、どのディスクの周りにも増殖が阻害された区域は見られなかった。早い時点のアクチノロージンの産生を増加させるいくつかのデコイの能力（可能性としてはａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４プロモーター領域内での同定された部位に対するリプレッサーの結合を妨害することによる）は、当該手法の有効性を実証し、我々に液体培地中で増殖させた細胞へデコイを導入することよるより広範な機能的研究を行うよう促した。
【０３６３】
３．液体培地におけるデコイの取り込みおよび安定性
次に取り組むべき問題は、デコイを効率的に培養液中の菌糸体に導入することができるかどうかであり、そうであった場合、どれくらいの期間持続するかということであった。Ｓ．セリカラーＭ１４５の６種類の培養液がＳＭＭ培地において作成され（Ｋｉｅｓｅｒら（２０００年）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、対数期の中期まで増殖された。細胞は軽く遠心分離することにより採取され、元の体積の１０分の１の透過性緩衝液（プレートアッセイにおいて使用されたのと同一濃度の洗浄剤を含む）中に再懸濁された後、様々な量のデコイＡ２４．１（０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、および１００ｍＭ）でトランスフェクションされた。短期間の培養に続いて、細胞は維持培地中で再懸濁され、培養を継続した。デコイオリゴヌクレオチドの取り込みは、ダンベルデコイの形成で導入された連結に及ぶ小さな断片（４０ｂｐ）を増幅するように設計されたプライマーを使用してｑｒｔ−ＰＣＲにより測定された。標準曲線への参照を用いて細胞内に存在するデコイのコピーの絶対数を計算し（遠心分離および２度の洗浄工程の後）、これはゲノム対照を参照して補正された。安定性を評価するため、アリコートは様々な時点（０〜７２時間）で取り出された。取り込み速度は２０ｍＭより高い濃度で飽和した。至適な取り込みは２０ｍＭのトランスフェクションで達成され、この２時間後デコイの４５％が細胞に入った（図１６）。活発に増殖する細胞は、デコイを含む溶液でトランスフェクトされ、オリゴヌクレオチドの取り込みおよびその安定性は、量的リアルタイムＰＣＲ（ｑｒｔ−ＰＣＲ）により推定された。２０ｍＭのＡ２４．１でのトランスフェクションに続いて、細胞は採取および洗浄された後、ｑｒｔ−ＰＣＲを使用して時間の関数としての細胞中に残存するデコイのコピーを推定した。データは３つの独立した測定について示している。添加の７２時間後に細胞内でデコイを検出することができ、３６時間後に２２％が持続する（細胞に入ったものの半数に相当する）。定常期に近づいたときに培養液がトランスフェクトされたので、デコイは、希釈により失われたのではなく内因性のヌクレアーゼによりデコイがゆっくりと分解されたと考えられた。したがって、デコイは菌糸体に入り、長期間持続することができ、これはこの手法が培養液中の遺伝子発現を変更させるために使用することができることを示唆している。
【０３６４】
４．抗生物質産生を制御するためのデコイオリゴヌクレオチドの使用
同定された調節エレメントに対応する５種類のデコイを使用して、Ｒ５またはＳＭＭ液体培地中で増殖させたＳ．セリカラーＭ１４５の培養液をトランスフェクトした。トランスフェクションは、ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４の発現の前に行われ、デコイにその同族転写因子と相互作用しアクチノロージン産生に影響を及し得る機会を与えた。対照実験は、プレートアッセイにおいて使用されたものと類似し、模擬トランスフェクション手順または３種類のスクランブル化デコイ（デコイＡ２４．１、Ａ２４．３、およびＡ２４．５の配列に基づく）の導入のいずれかから成った。各実験において、トランスフェクションに続いて一定の間隔で、培養物の増殖、色素性抗生物質の産生、およびａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４の発現が測定された。どのデコイも細胞の増殖を変更しなかったが、いくつかのものはアクチノロージンの産生に影響があり、いくつかの場合にはウンデシルプロジギオシンの産生に影響があった。抗生物質産生が比較的高いＲ５培地では、デコイＡ２４．５はアクチノロージン産生をアップレギュレートし、９６時間後の時点で収率を９５％増加させた（図１７ＡおよびＢ）。Ｓ．セリカラーＭ１４５は２０時間増殖させた後、（Ａ）デコイを含まない対照または（Ｂ）Ａ２４．５デコイでトランスフェクションした（矢印で示す）。細胞増殖（ひし形）およびウンデシルプロジギオシンの産生量（丸）は２種類の培養液中で類似しており、観察された唯一の違いはアクチノロージン（三角形）の蓄積であり、これはデコイＡ２４．５での処理後に促進された。データは、３つの独立した測定の平均を表し、棒は標準誤差を示す。デコイＡ２４．１およびＡ２４．３の効果は比較的穏やかであり、両方の色素性抗生物質のアップレギュレーションをもたらした。アクチノロージン産生の増加が生じた処理ではどれも、ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４発現の絶対値が対応して増加した（ｑｒｔ−ＰＣＲにより測定；データ図示せず）。それゆえ、結果はプレート上で見られたものと概して一致しており、デコイの効果が特異的で予測可能であることを示唆している。デコイはまた、Ｒ５と比較してより少ない抗生物質産生を支持する最少培地であるＳＭＭ培地中で試験された。デコイＡ２４．５でトランスフェクションするとアクチノロージン産生が倍増した（図１８ＡおよびＢ）。（Ａ）模擬トランスフェクトされた対照および（Ｂ）デコイＡ２４．５で処理された培養液を用いて得られたデータを比較すると、デコイオリゴヌクレオチドはアクチノロージン産生の顕著な増加をもたらすことが示された。データは、図１７のように示され、３つの独立した測定の平均である。棒は標準誤差を示す。この培地において、アクチノロージン産生の増加は、デコイＡ２４．１およびＡ２４．３（データ図示せず）でも見られた。それゆえ、デコイは、ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４プロモーター内のシス作用調節エレメントの同定を確認するための便利なツールとして機能し、我々が抗生物質産生の開始に影響を及ぼすことを可能にした。上記に示したように、いくつかのデコイはウンデシルプロジギオシン産生もアップレギュレートした。この同時制御（co-regulation）の考えられる理由を下記に述べる。
【０３６５】
５．アクチノロージン産生の新規な修飾因子の発見
新規なマッピング技術とデコイオリゴヌクレオチドとの組み合わせを使用して、アクチノロージン調節遺伝子ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４の発現を制御する３種類の調節エレメントを確認した。我々は次に、これらの調節モチーフが他の遺伝子のプロモーター領域で生じるかどうか、かかる遺伝子もまた抗生物質産生の調節に関与する可能性があるか、を問うた。５種類のデコイ配列すべてを用いてＢＬＡＳＴ検索を行い、１種類のかかる遺伝子が同定された。ＳＣＯ５８１２は、Ａ２４．１（１４のうち１０のラン）およびＡ２４．３（１８のうち１１のラン）に対する強い一致を含んでいた。遺伝子自体はリボヌクレアーゼＨＩＩの可能性のあるホモログであり、それ自身が抗生物質産生において以前に同定された多面発現変異体ａｂｓＢと類似の機能を有する可能性があり（ＳＣＯ５５７２；Ａｄａｍｉｄｉｓ＆Ｃｈａｍｐｎｅｓｓ（１９９２年）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：４６２２〜４６２８）、これはＲＮａｓｅＩＩＩのホモログであり、転写プロセシングに関与すると考えられている（Ｃｈａｎｇら（２００５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：３３２１３〜３３２１９）。抗生物質産生におけるＳＣＯ５８１２の役割（もしそのような役割があれば）を実証するため、我々は、Ｍ１４５から当該遺伝子を欠失させ、産生についてＲ５およびＳＭＭＳ培地上で親株と比較した（図１９）。この図において、Ｍ１４５（プレートの左側）およびＭ１４５ΔＳＣＯ５８１２（プレートの右側）は、（Ａ）Ｒ５寒天培地または（Ｂ）ＳＭＭＳ寒天培地上に画線され、それぞれ７２時間および９６時間培養された。ＳＣＯ５８１２の欠失はＲ５寒天上のアクチノロージン産生を劇的に減少させた一方で、ＳＭＭＳ上のウンデシルプロジギオシン産生を増強した。興味深いことには、Ａ２４．１またはＡ２４．３のいずれかでトランスフェクトされた細胞は、ウンデシルプロジギオシン産生のわずかなアップレギュレーションを示し、これはこれらの部位へ結合する転写因子が両方の抗生物質生合成遺伝子クラスターの発現に影響を及ぼす可能性があることを示唆している。また、試験されたデコイの一つであるＡ２４．４（６ｂｐ逆方向リピートを含む）（図１４）は、ウンデシルプロジギオシン生合成クラスターの経路特異的アクチベーター遺伝子であるｒｅｄＤのプロモーター領域中に一致（１２のうち８）を有することが分かった（Ｔａｋａｎｏら（１９９２年）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２７９７〜２８０４）。このモチーフは、核様体タンパク質ＩＨＦの予測された結合部位（以前に同定された部位に対する配列相同性に基づく）であり、これは、当該部位が、直接的に転写に影響しているのではなく核タンパク複合体における構造上の役割があるという可能性を提起している。
【０３６６】
６．結論
我々は、Ｓ．セリカラーにおける抗生物質産生のリプレッサーの結合部位を同定し確認するための新規な技術を使用した。確認はデコイオリゴヌクレオチドを用いて行った（当該調節エレメントのコピーのトランスフェクションは、標的遺伝子の抑制解除およびアクチノロージンの産生の増加をもたらした）。我々の研究の意図は、デコイオリゴヌクレオチドが、遺伝的ネットワークを迅速に描写するために原核生物における有益なツールになり得ることを実証することであった。これがうまくいったかどうかについては、２つの意味ではうまくいった。試験した５種類のデコイのうちの３種類は期待した活性を示した。最も強い効果を有するデコイＡ２４．５は、プロモーターに活性がある場合にＴｅｔＲ様転写レギュレーターＡｔｒＡに結合されることが最近示された（Ｕｇｕｒｕら（２００５年）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：１３１〜１５０）。ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４のリプレッサーを同定するための親和性精製を使用した我々自身の研究は、同様に、この部位に結合したＴｅｔＲ様転写因子を同定した。これにより我々は、デコイＡ２４．５がａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４の転写前に加えられると、これらの推定上のリプレッサーの結合を減少させることにより発現を可能にすると仮説を立てる。
【０３６７】
７．材料および方法
７．１ 菌株および増殖条件
放線菌（streptomycetes）の取り扱いについての一般的な技術に関する標準的な参考文献は、Ｋｉｅｓｅｒら（２０００年）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎである。Ｓ．セリカラーＡ３（２）株Ｍ１４５の胞子は、同時に熱処理をすることにより発芽させ、連続的に振とうを行いながら３０℃でＳＭＭまたはＲ５培地中で増殖させた。培養液の増殖およびアクチノロージン産生は、上記のように測定された。Ｒ２ＹＥおよびＳＮＡが、デコイによる抗生物質産生の寒天プレートアッセイに使用された。ＳＣＯ５８１２の欠失は、標的化ＰＣＲ（PCR-targeting）により達成した（Ｇｕｓｔら（２００３年)Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、１００：１５４１〜１５４６）。
【０３６８】
７．２ インビボＴ７エキソヌクレアーゼマッピング
フットプリント試薬で処理する前に、Ｓ．セリカラーの菌糸断片の培養液に、０．５ｍＭのＣａＣｌ２および５０ユニットのＤＮａｓｅＩを捕足し（細胞外のＤＮＡを除去するため）、さらに１５分間３０℃で培養した。菌糸体は低速遠心分離により集菌され、５ｍＭのＥＤＴＡを捕足したＴＥＳ緩衝液（１３）中で十分に洗浄した。ＤＮａｓｅＩフットプリントのため、細胞は０．５％（ｖ／ｖ）のＮＰ−４０および０．５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を捕足したＴＥＳ中で洗浄し、３０℃で１５分間培養した。次いで、細胞はあらかじめ３０℃まで温めたＤＮａｓｅＩ消化緩衝液（ＤＤＢ）中で洗浄し、異なる量のＤＮａｓｅＩを用いて５分間消化させた。反応は等容積のＳＴＯＰ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、ｐＨ８）を加えて停止し、一晩５５℃で培養した。核酸はフェノール−クロロホルムで２度抽出した後、エタノールで析出させた。サンプルは、ＲＮａｓｅＡで消化させた後、再析出および定量化した。
【０３６９】
７．３ デコイオリゴヌクレオチド研究
使用したすべてのオリゴヌクレオチドの配列を表１に記載する。デコイオリゴヌクレオチドを合成し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）でライゲーションして、ダンベルを作成した（Ｍａｎｎ＆Ｄｚａｕ（２０００年)Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ１０６：１０７１〜１０７５）。１００ｐｍｏｌの各デコイオリゴヌクレオチドは、２０μｌ反応容量の１×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ緩衝液（５０μＭ ＡＴＰ、２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、５００Ｕ ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅを捕足）の中で混合し、１時間６０℃で培養した。混合物は直鎖ＤＮＡを除去するために過剰のエキソヌクレアーゼＩで処理し、残存する共有結合の環を析出させた。各標本は１２％非変性ゲル電気泳動で分析し、産物の大多数が１価の共有結合の環であることを確認した。サンプルは、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液において２００ｐｍｏｌ／μｌで再懸濁させた。１０μｌの各デコイは、３ｍｍの抗生物質効力検定用ディスク上にスポッティングし、次いで、２４時間でコンフルエントにさせたＳ．セリカラーＭ１４５（Ｒ２ＹＥ寒天プレート上で増殖させた）の菌叢上に注がれたＳＮＡ寒天の薄層へ静かに圧入した。抗生物質産生の誘導は、ディスク周りの着色の局在的な増加をもたらす。あるいは、ダンベルデコイオリゴヌクレオチドは、指数関数的に増殖するＳ．セリカラーＭ１４５の培養液から菌糸体をトランスフェクトするために使用された。トランスフェクションは、０．５％（ｖ／ｖ）のＮＰ−４０および０．５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を捕足した等容積のＴＥＳ緩衝液中で細胞を洗浄すること、次いでデコイオリゴヌクレオチドを捕足した洗浄剤を有するＴＥＳ中で細胞の元の体積の１０分の１まで細胞を再懸濁させることを含んでいた。細胞は、軽く混合しながら３０℃で１５分間培養し、保持した培地中で希釈し、培養を継続した。この処理に続いて増殖速度は一時的に低下したが、すぐに回復した。その後、サンプルを取り出して、２種類の色素性抗生物質（アクチノロージンおよびウンデシルプロジギオシン（１３））の産生水準を評価した。サンプルは、ＲＮＡ分析用に同時に取り出した。
【０３７０】
７．４ 遺伝子発現およびデコイのコピー数の分析
発現解析は、量的リアルタイムＰＣＲ（ｑｒｔ−ＰＣＲ）により行った。ｃＤＮＡの調製は、過去に記載のように行った（Ｒｙｄｉｎｇら（２００２年）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：７９４〜８０５）。手短に記載すると、１μｇのＲＮＡを熱変性し（７０℃で１０分間培養し、次いで氷の上に置いた）、供給業者が推奨する緩衝液２０μｌ中で０．５Ｕ ＡＶＭ逆転写酵素（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、１ｍＭ ｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌカスタムプライマーと混合した。反応物は、順次４５℃、５０℃および５５℃の３つの温度で培養した（それぞれ３０分間）。この反応物４μｌは、１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯと２５ｐｍｏｌの標的遺伝子（ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４）用カスタムフォワードおよびリバースプライマーと内部基準（ＳＣＯ４７４２、マイクロアレイ分析後に発現がほとんど変わらないと分かった仮説的保存タンパク質［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｃｏｍ／１４７１−２１６４／８／２６１／ａｂｓｔｒａｃｔ］）を捕足したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎｅｒ反応ミックス中で調製されたｑｒｔ−ＰＣＲ反応物２０μｌにおいてテンプレートとして使用された（表１)。増幅および分析は、ＢｉｏＲａｄ Ｃｈｒｏｍｏ４上で行った。デコイのコピー数の決定は、ＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎでの検出を使用して同様に行った。プライマーは、環化デコイオリゴヌクレオチドを検出するように設計され（表１）、そのコピー数は菌糸体の超音波処理およびエキソヌクレアーゼ処理されたデコイの既知量に対する比較により決定された（当該値は、存在するＳＣＯ４７４２のコピー数を参照することによりサンプル中のゲノムの数に対して補正された。
【０３７１】
７．５ 表１オリゴヌクレオチドプライマー
デコイオリゴヌクレオチドのそれぞれにおけるシス調節配列には下線が引かれている。
【０３７２】
【表１】
2010539965.tif 000002
【０３７３】
（実施例６）
病原体における抗生物質耐性を克服するためにデコイオリゴデオキシヌクレオチドを治療的コンテキストにおいて使用できることの実証
バンコマイシンに対する感受性を変更させることができるデコイを同定するために採られた手法全体や、遺伝子レベルで特性決定された他の抗生物質耐性メカニズムを図２０に示す。この模式図は、病原菌において公知の抵抗機構に対抗するためにＴＦＤがどのように使用されるか示す。処方された抗生物質バンコマイシンに対する耐性を例として使用する。これは、ヒト病原菌であるエンテルコッカス・フェシウム、およびストレプトミセス・セリカラーの株で生じる。両方の細菌において、耐性は、ＶａｎＲタンパク質により誘導されるｖａｎＨＡＸオペロンによりコードされる。ゲノムにおける同族部位へのＶａｎＲの結合を妨害するようにデコイを設計することにより、ｖａｎＨＡＸの誘導を阻止することが可能であり、このようにして細菌をバンコマイシンに対して感受性を有するようにできる。この実施例では、デコイは、病原菌に対する同様の耐性メカニズムを含む細菌（非病原性）モデルまたは水平遺伝子導入によりモデルへ移動した実際のメカニズムにおいて機能的に検証される。続いて、デコイは臨床分離株のなどの病原性モデル上で試験され、バンコマイシン耐性エンテロコッカス属（ＶＲＥ）またはバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌に感染したマウスなどの動物モデルに最終的に移される。なお、当該手法は、かかる遺伝子スイッチにより制御される様々な細菌の表現型に適用することができる。これらは、制限されるものではないが、細菌をペニシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ダプトマイシンなどの他の抗生物質に感受性を持たせるようにできる他のデコイまたはデコイの組み合わせを発見することを含む。
【０３７４】
ストレプトミセス・セリカラーにおけるバンコマイシン耐性オペロンの構造を図２１に示す(Ｈｏｎｇら、２００４年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５２：１１０７〜１１２１から)。矢印で示すように、バンコマイシンオペロンは４つのオペロンから成る。ｖａｎＲＳオペロンは、バンコマイシンの存在を感知し（直接的または間接的に）、バンコマイシン耐性メカニズムをコードするｖａｎＨＡＸオペロンの発現を誘導する二成分調節系をコードする。ｖａｎＨＡＸオペロンは、プロモーター内で結合するＶａｎＲのリン酸化バージョンにより誘導され、ＶａｎＳはバンコマイシンが検知されるとＶａｎＲをリン酸化するキナーゼである。我々は、我々のデコイがｖａｎＨプロモーターにおける部位へのリン酸化ＶａｎＲの結合をかく乱すると予想している。
【０３７５】
なお、病院で見られるバンコマイシン耐性感染症のうちのいくつかの原因であるエンテロコッカス・フェカリスにおける耐性遺伝子の進化の源は、バンコマイシン産生放線菌であると考えられている。
【０３７６】
使用するｖａｎＨ５デコイの配列を下記に示す。リン酸化ＶａｎＲの結合部位を大文字で書く。
５’−Ｐ−ａｔａ ｔｃｔａｔａｔｇａａ ｇｃｇａｃｇｔｇｇｔ ｃｇａｔｇａｇｃｃｇ ｃａｇｃｇ ｔｔｔｔ ｃｇｃｔｇ ＣＧＧ ＣＴＣ ＡＴＣ ＧＡＣ ＣＡＣ ＧＴＣ ＧＣＴ ＴＣＡ ＴＡＴ ＡＧＡ ｔａｔａｇ ｔｔｔｔ ｃｔ−３’（配列番号２１）
【０３７７】
オリゴヌクレオチドは、図２２に示すように環状ダンベルデコイとして調製された。オリゴヌクレオチドは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（当該酵素の製造業者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により供給されたままで）および４００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼにおいて１００ｐｍｏｌ／ｕｌの終末濃度で再懸濁され、１６℃で様々な期間培養された。培養時に、オリゴヌクレオチドはステムループ構造を形成し、これは、リガーゼの活性により、ＤＮＡの共有結合的に結合した一本鎖の「環状」分子に変換され得る。この環化の程度はリガーゼとの培養時間に左右される（最長の培養（１６時間）はほぼ完全な転換をもたらした）。それゆえ、オリゴヌクレオチドをＴ４ ＤＮＡリガーゼで０、１、２、４、６、および１６時間（それぞれａ〜ｆ）で培養後、各反応からアリコートを取り出し、熱処理して酵素を不活性化し、ＤＮＡをエタノール沈澱により回収した後、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動および臭化エチジウム染色で可視化して分析した。レーンａ〜ｆは、移動が遅い直鎖一本鎖ＤＮＡ分子の環状ダンベル型閉環二本鎖（これは移動が速い（レーンｆ））への変換を示す。
【０３７８】
デコイは「環状ダンベル」構造であるが（Ａｈｎ ＪＤ、Ｋｉｍ ＣＤ、ＭａｇａｅＪ、Ｋｉｍ ＹＨ、Ｋｉｍ ＨＪ、Ｐａｒｋ ＫＫ、Ｈｏｎｇ Ｓ、Ｐａｒｋ ＫＧ、Ｌｅｅ ＩＫ、Ｃｈａｎｇ ＹＣ（２００３年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ３１０：１０４８〜１０５３）、これは必須ではない。他の形態のオリゴデオキシヌクレオチドが使用されてもよく、例えば、限定されるものではないが次のものが含まれる。（ａ）この配列を含む、より長い二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（エキソヌクレアーゼが、デコイ機能の喪失の前にオリゴヌクレオチドの長さを実質的に減少させる必要がある）；（ｂ）より強いヌクレアーゼ耐性を与えるために修飾された塩基または糖を含むオリゴデオキシヌクレオチド；（ｃ）エキソヌクレアーゼ活性をブロックする（これはすべてのダンベルがすることである）オリゴヌクレオチドの末端に結合した２’−ＯＨヌクレオチドまたはアミン；（ｄ）小さな環状二本鎖ＤＮＡ分子；あるいは（ｅ）活性デコイ配列の複数のコピーを含む多量体分子。
【０３７９】
本質的には、使用されるＯＤＮが、小さいステムループ構造により囲まれたｖａｎＨプロモーター内に標的配列、または他の配列を取り込む二本鎖領域を有することが必要とされる。環状ダンベル構造に関して、分子は直鎖オリゴヌクレオチドとして合成され、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで培養されることにより環化される。
【０３８０】
ストレプトミセス・セリカラー株Ｍ６００の培養液へのｖａｎＨ５と呼ばれるデコイの導入を示すチャートを図２３に示す。Ｓ．セリカラー株Ｍ６００はＭＭＣＧＴ液体培地中で増殖させ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ５２：１１０７〜１１２１）、増殖は培養液の４３０ｎｍでの吸光度を記録（Ｃｅｌｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）することにより測定し、培養時間の関数としてプロットした。４つの培養液の増殖をモニタリングした。（１）培地に何も加えなかった（ひし形「Ｍ６００」）；（２）０時間時点で亜致死濃度の２０μｇ／ｍｌの抗生物質バンコマイシンを捕足した培地（正方形「２０μｇ／ｍｌ ＶＡＮを加えた」）；（２）と同様であったが、２０時間の培養に続いてデコイオリゴヌクレオチドＨ５を６４ｐＭの終末濃度まで加えた（三角形「６４ｐＭ Ｈ５を加えたＶＡＮ」）；（２）と同様であったが、２０時間の培養に続いてデコイオリゴヌクレオチドＨ５を２５６ｐＭの終末濃度まで加えた（三角形「２５６ｐＭ Ｈ５を加えたＶＡＮ」）。
【０３８１】
このデータから、Ｍ６００は、２０ｕｇ／ｍｌのバンコマイシンの存在下で（培養工程の最初に加えても加えなくても）比較的良好に増殖することが明らかであり、菌株がバンコマイシンに対して耐性を有していることを裏付けている。２０ｕｇ／ｍｌのバンコマイシンの存在下では、６４ｐＭの終末濃度までの環化デコイｖａｎＨ５の添加では、検出可能な効果はほとんどなかった一方で、２５６ｐＭまでの添加では細胞はほぼ１８時間にわたって増殖を停止した。これは口語的には「治療濃度域（therapeutic window）」と呼ばれることがあり、ここではデコイは細胞に入り、ｖａｎＨプロモーターへのｖａｎＲレギュレーターの結合を阻害し、これにより耐性メカニズムの誘導を阻止した。１８時間後、他の系からの我々の証拠は、デコイの分解が起こり（細胞内のエンドヌクレアーゼにより）、これは当該デコイの有効性に影響する可能性があることを示唆している。
【０３８２】
ｖａｎＨデコイが一見すると制菌効果を有する理由については、我々は、これは耐性のメカニズムがバンコマイシンの作用を阻止する細菌細胞壁に対する修飾となっていることによると考える。バンコマイシンが培養液に加えられる場合、これは実験の初めである。デコイは２０時間後に加える。この時点では、細菌は増殖して修飾された細胞壁を有していることになる。デコイが添加されると、その時点からデコイが消費されるまで、細菌細胞壁を修飾する能力がブロックされる。この結果、より古い細胞は生き残ることができるが、新たに増殖する細菌はバンコマイシンに感受性を持つ。デコイが消費されると、バンコマイシン耐性が残った生存する細胞は再び増殖可能となる。バンコマイシンの前にデコイを加えても、耐性オペロンが活性化されていないので効果はほとんどない。しかしながら、我々は、同時にデコイＯＤＮを投与すると殺菌性効果が誘導されると予想する。
【０３８３】
したがって、この実施例は、ＴＦＤの非存在下ではなく、ＴＦＤの存在下でのバンコマイシンに対するＳ．セリカラーの感受性を実証する。これは、Ｅ．フェカリスなどの病原菌における効果を実証するための許容範囲のサロゲートとして当業者には受け入れられるだろう。Ｅ．フェシウムｖａｎオペロンは同一のメカニズムにより誘導される（ｖａｎＨに結合するｖａｎＲ）（当該２つの系の間での配列レベルでの相同性はあまり高くないのであるが）。当業者であれば、病原菌で使用するデコイ配列を容易に修飾することができる。
【０３８４】
ｖａｎＨ５デコイは、原核生物のゲノムにおける同族標的への転写因子の結合が減少するか消失するように原核生物の転写因子に結合することができるオリゴデオキシヌクレオチドの一例である。
【０３８５】
２．病原菌における抗生物質耐性と闘うためのＴＦＤの設計
バンコマイシン感受性を回復するためのＴＦＤの使い方の原理を上記に記載した。原因となる遺伝子が分かっていない場合には、本発明により提供される病原菌のゲノムＤＮＡから作成されたユニバーサルｎ［スネア］ライブラリーまたはカスタムライブラリーが使用される。図６に示すように、ライブラリーが実験室条件下で病原菌に導入されてもよいし、耐性を決定する遺伝エレメントがクローニングされ、モデル系として作用させるため非病原性の実験室株へ導入されてもよい（これは次いで形質転換されてもよい）。細胞は次いで選択された抗生物質の非存在下で培養され、培養液中でライブラリーが形質転換により細胞へ導入され、サンプルはこの時点で分割されており、抗生物質はサンプルの半分に加えられ、培養が継続される。細胞集団は回収され、コンカタマライズされた（concatamerized）ＴＦＤはＰＣＲによりプラスミドから増幅される。これらの２つの集団は、抗生物質で処理されたサンプルから欠損しているＴＦＤを単離するために引き算される、したがって感受性が与えられたものである。この濃縮されたＴＦＤの集団は再度クローニングされ、細胞を抗生物質感受性にすることができるＴＦＤにおいて十分に濃縮されるまで選択工程が繰り返される。
【０３８６】
かかる手法の考えられる標的としては、臨床的に処方される抗生物質の多く、および抗生物質耐性が有効性を制限し始める今後の抗生物質に対する耐性のメカニズムの研究が挙げられる。抗生物質耐性を打破するためにｎ［スネア］法およびそれに続くＴＦＤ処理を用いた調査に関して考えられる現在の抗生物質の例としては次のものを包含する。アミノグリコシド（カナマイシンなど）として知られる抗生物質のクラスからのもの；カルバペネム（メロペネムなど）からのもの；セファロスポリン（セフェピムなど）；糖ペプチド（バンコマイシンおよびダプトマイシンなど）；ペニシリン（アンピシリン、カルベニシリン、およびペニシリンなど）；ポリペプチド系抗生物質（ポリミキシンＢなど）；キノリン（レバクインなど）；スルホンアミド（バクトリムなど）；テトラサイクリン（テトラサイクリンなど）；ならびにクロラムフェニコール、リファンピシン、ザイボックスなど。
【０３８７】
（実施例７）
７．１ ストレプトリジンＯの存在下でのコレステロール標識ＴＦＤ
オリゴヌクレオチドプライマー（１つは５’コレステロール修飾を有しており、もう１つはその５’末端または他に類似の修飾（例えば、Ｃｙ５などの蛍光染料など、容易にＴＦＤの取り込みを測定することができるように）を有する）を使用して、ＴＦＤをＰＣＲにより調製する。ＴＦＤが前もってベクター（ｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙ）へクローニングされている場合、プライマーは、挿入物に最も近接するベクター配列にアニーリングするように設計される、例えば：
Ｃｈｏｌ＿ＴＥｆ：５’コレステロール−ＴＥＧ−ｇｇｃ ｃｇｃ ｃａｔ ｇｇｃ ｇｇｃ ｃｇｃ ｇｇｇ ａａｔ ｔｃ（配列番号２２）
Ｃｙ５＿ＴＥｒ：５’Ｃｙ５−ＡＧＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＧＡ ＡＴＴＣＡＣ ＴＡＧ ＴＧ（配列番号２３）
【０３８８】
ＴＦＤとして使用される配列がクローニングされていない場合、直接的に合成（十分に短い場合）およびアニーリングされてＴＦＤを形成させるか、あるいはＴＦＤ内でアニーリングするように設計されたプライマーを使用してゲノムＤＮＡから直接的に増幅される。
【０３８９】
ＰＣＲ産物はエタノール中で析出され、５００〜１０００ｎｇ／μｌの濃度でＴＥ緩衝剤中で再懸濁される。典型的には、抗生物質感受性アッセイは、各ウェルが２００ｍｌの培養液を含む９６ウェルプレートを使用して行なわれる。例えば、エンテロコッカス・フェシウムの場合は、この培養液は、０．２Ｕ／ｍｌストレプトリジンＯ（Ｓｉｇｍａ）および５μｇ／ｍｌバンコマイシン抗生物質を捕足したＢＨＩ培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから）であり、Ｅ．フェシウムのバンコマイシン耐性株で播種される。
【０３９０】
７．２ ＰＣＲによるダンベルの調製
ダンベルデコイは、標的因子の結合部位を含み、ステムループ構造が隣接する、二本鎖中心を特徴とする共有結合的に閉環した一本鎖ＤＮＡである。ステムループは、通常はデコイポリヌクレオチドを分解するエキソヌクレアーゼの作用を阻止することによりデコイを安定化させる。それゆえ、ダンベルデコイ（ＤＢ）はその特徴的形状のためにそう呼ばれる。
【０３９１】
ＤＢは、７．１に記載のように、標的結合部位を含むｐＧＥＭＴＥａｓｙ由来プラスミドをテンプレートとして使用するＰＣＲにより調製される。
増幅において使用されるプライマーは次のとおりである：
ＤＢＴＥｆ：５’Ｐ−ＣＴＴＧＧ ＴＴＴＴＴ ＣＣＡＡＧ ＡＧＡＡＧＡＧＣ ｃｃｇ ｃｃａ ｔｇｇ ｃｇｇ ｃｃｇ ｃｇｇ ｇａａ ｔｔｃ（配列番号２４）
ＤＢＴＥｒ：Ｐ−ＣＣＧ ＴＣＴ ＴＴＴ ＴＧＡ ＣＧＧ ＣＧＡ ＡＧＡ ＧＣＡ ＧＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＣＴ ＡＧＴ ＧＡ（配列番号２５）
【０３９２】
プライマーのステムループを形成することになる部分に下線を引く。適切なベクターを用いた増幅は、図２４に示すＤＮＡ産物を生じ、ここで転写因子に結合するＤＢの部分は「ＮＮＮ ＮＮＮ」として示す。太字の配列は、ニッキング制限酵素（nicking restriction enzyme）Ｎｔ．ＢｓｐＱ１の結合部位を表す。図２４の第二部では、Ｎｔ．ＢｓｐＱ１でＰＣＲ産物を消化した結果が示され、これは一本鎖領域としてステムループ構造を示し、これはステムループを形成することになり続いてＴ４ ＤＮＡリガーゼで処理されてライゲーションされることができ、共有結合的に閉じた環およびＤＢが形成される。
【０３９３】
７．３ プラスミドの制限消化によるダンベルオリゴヌクレオチドの調製
代わりに、ＤＢは、ｐＧＥＭＴＥａｓｙなどの適切なＰＣＲクローニングベクターへ図２４に示す平滑末端化ＰＣＲ産物をクローニングすることにより作成することができ、同一性やプラスミドの調製が確認される。次いで、プラスミドは消化させることができ、挿入物が放出され、これはＮｔ．ＢｓｐＱ１でさらに消化されて図２４の二つ目の部分に示す断片を放出する。これは、ＤＮＡ分子を共有結合的に閉環させそしてＤＢを形成させるため、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで同様に処理することができる。
【０３９４】
この手法の利点としては、ＤＢが多量に必要な場合に、実用的にも経済的にもスケールアップしやすいことである。
【０３９５】
７．４ Ｒ９コレステロール剤を用いたトランスフェクション
Ｒ９コレステロールは、真核細胞においてｓｉＲＮＡ（または他の核酸ベースの治療剤）分子などのトランスフェクションを支援する特性に関して記載されている（米国特許：２００７０２０７９６６）。ここで、我々はＴＦＤを用いて様々な細菌をトランスフェクトしてＲ９コレステロー有用性を記載する。
【０３９６】
９個のＤ−アルギニン直鎖に結合したコレステロール分子から成るＲ９−コレステロールは過去に記載されたように合成した（Ｋｉｍ Ｗ．Ｊ．ら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ ２００６年 １４：３４３〜３５０）。ＴＦＤは、５％グルコースを捕足したＴＥベース緩衝液においてＲ９−コレステロールの量を増やして混合した。この混合物を室温で１時間培養し、次いで、トランスフェクションにおいて直接使用あるいはアガロースゲル電気泳動により分析した。典型的には、ゲル中でＤＮＡとの複合体が動かない最少の量のＲ９−コレステロールを使用した（つまり、核酸バックボーンの電荷はポリアルギニンの結合により中和された）。コレステロール分子は、ＴＦＤが細菌細胞膜と会合し、そうして細胞に入ることを支援する。
【０３９７】
ＴＦＤ／Ｒ９−コレステロール接合体は、９６ウェルプレートにおいて、２００μｌの培養液に様々な濃度で混合された。例えば、エンテロコッカス・フェシウムの場合は、この培養液は、０．２Ｕ／ｍｌストレプトリジンＯ（Ｓｉｇｍａ）および５μｇ／ｍｌバンコマイシン抗生物質を捕足したＢＨＩ培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから）であり、Ｅ．フェシウムのバンコマイシン耐性株で播種される。
【０３９８】
（実施例８）
エンテロコッカス・フェシウムにバンコマイシンに対する感受性を持たせるためのＶａｎデコイ配列の使用
【０３９９】
８（ａ）ストレプトリジンＯの存在下でのコレステロール標識ＴＦＤの使用
コレステロール／Ｃｙ５標識デコイポリヌクレオチドは、実施例７．１のように調製した。アッセイは９６ウェルプレートを使用して行い、各ウェルは、０．２Ｕ／ｍｌストレプトリジンＯ（Ｓｉｇｍａ）および５μｇ／ｍｌバンコマイシン抗生物質を捕足したＢＨＩ培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから）からなる２００ｍｌの培養液を含み、Ｅ．フェシウムのバンコマイシン耐性株で播種した。
【０４００】
様々な濃度の１μｌのコレステロール／Ｃｙ５標識デコイが各ウェルに加えられ、Ｅ．フェシウムの細菌増殖に対する効果はインキュベーション時に間隔を置いて培養液の吸光度を測定することによりモニタリングした。プレートは振とうさせながら３７℃で培養し、吸光度の測定値（４５０ｎＭでの）はプレートリーダーを使用して得た。２種類のデコイを試験した（ＶＡＮは、ＶａｎＡ型抗生物質耐性の誘導を制御する調節エレメントを含む。ＣＯＮは、Ｅ．フェシウムゲノムにおいて発生しないデコイ配列であり、ネガティブコントロールとして使用した）。ＶＡＮデコイ配列の配列（Ｃｈｏｌ＿ＴＥｆおよびＣｙ５＿ＴＥｒプライマーを用いたＰＣＲ増幅工程で使用するプラスミドを作成するためにｐＧＥＭＴ−Ｅａｓｙベクターにクローニングされた部分）は以下のものであった。
ＶＡＮ ＴＦＤ ５’ ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＡＡ ＴＣＡ ＴＣＡ ＴＣＴ ＴＡＡ ＧＡＡ ＡＴＴ ＣＴＴ ＡＧＴ ＣＡＴ ＴＴＡ ３’（配列番号２６）
【０４０１】
得られた増殖曲線を図２５に示す。データ点はすべてトリプリケートで行った。４０ｎＭという低い濃度でのＶＡＮ ＴＦＤ処理によりＥ．フェシウム株はバンコマイシンに対して再度感受性を有したが、ＣＯＮネガティブコントロールは効果がなかったことが明らかである。ＴＦＤの取り込みはｑＰＣＲおよび蛍光顕微鏡法で確認された。
【０４０２】
８（ｂ）Ｒ９コレステロール剤を用いたトランスフェクションの使用
アレイは９６ウェルプレートを使用し、各ウェルは、０．２Ｕ／ｍｌストレプトリジンＯ（Ｓｉｇｍａ）および５μｇ／ｍｌバンコマイシン抗生物質を捕足したＢＨＩ培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから）からなる２００ｍｌの培養液を含み、Ｅ．フェシウムのバンコマイシン耐性株で播種した。
【０４０３】
様々な濃度の１μｌのＴＦＤ／Ｒ９コレステロール接合体が各ウェルに加えられ、細菌増殖に対する効果はインキュベーション時に間隔を置いて培養液の吸光度を測定することによりモニタリングした。プレートは振とうさせながら３７℃で培養し、吸光度の測定値（５９５ｎＭでの）はプレートリーダーを使用して得た。２種類のダンベルＴＦＤを試験した（ＶＡＮは、ＶａｎＡ型抗生物質耐性の誘導を制御する調節エレメントを含む（配列番号２６と同じ配列を含む）。ＣＯＮは、Ｅ．フェシウムゲノムにおいて発生しないデコイ配列であり、ネガティブコントロールとして使用された（実施例８（ａ）のＣＯＮと同じ配列を含む）。
【０４０４】
得られた増殖曲線を図２６に示す。データ点はすべてトリプリケートで行った。４０ｎＭという低い濃度でのＶＡＮ ＴＦＤ処理によりＥ．フェシウム株はバンコマイシンに対して再度感受性を有したが、ネガティブコントロールは細胞増殖に対して負の影響がなかったことが明らかである。
【図２４】
2010539965.tif 000003
【図２５】
2010539965.tif 000004
【図２６】
2010539965.tif 000005
【図２７−１】
2010539965.tif 000006
【図２７−２】
2010539965.tif 000007
【図２７−３】
2010539965.tif 000008
【図１】
2010539965.tif 000009
【図２】
2010539965.tif 000010
【図３】
2010539965.tif 000011
【図４】
2010539965.tif 000012
【図５】
2010539965.tif 000013
【図６】
2010539965.tif 000014
【図７】
2010539965.tif 000015
【図８】
2010539965.tif 000016
【図９】
2010539965.tif 000017
【図１０】
2010539965.tif 000018
【図１１】
2010539965.tif 000019
【図１２】
2010539965.tif 000020
【図１３】
2010539965.tif 000021
【図１４】
2010539965.tif 000022
【図１５】
2010539965.tif 000023
【図１６】
2010539965.tif 000024
【図１７】
2010539965.tif 000025
【図１８】
2010539965.tif 000026
【図１９】
2010539965.tif 000027
【図２０】
2010539965.tif 000028
【図２１】
2010539965.tif 000029
【図２２】
2010539965.tif 000030
【図２３】
2010539965.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月26日(2010.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の抗生物質耐性を修飾する方法におけるデコイポリヌクレオチドの使用であって、前記方法は、
（ａ）転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチド（デコイ配列）を提供すること；および
（ｂ）前記ポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること（前記細胞は、前記転写因子の結合部位を含むシス調節配列に機能的に結合した遺伝子を含む）、を含み；
前記ポリヌクレオチドの導入は、前記細胞における前記シス調節配列への前記転写因子の結合を減少させ、前記細胞における前記機能的に結合した遺伝子の発現の変更をもたらし、これにより前記細胞の抗生物質耐性を修飾する、使用。
【請求項２】
前記細胞において前記シス調節配列に機能的に結合した前記遺伝子が抗生物質に対する耐性をコードする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
アミノグリコシド；カルバペネム；セファロスポリン；糖ペプチド；ペニシリン；ポリペプチド系抗生物質；キノリン；スルホンアミド；またはテトラサイクリンの１種以上から選ばれる抗生物質に対する耐性を修飾するための、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記シス調節配列に機能的に結合した前記遺伝子がバンコマイシンに対する耐性をコードする、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記転写因子がＶａｎＲ転写因子である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記細胞が、
（ａ）抗生物質耐性の非病原性モデル；または
（ｂ）病原体である、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記細胞が、
（ａ）アクチノミセス；ストレプトミセス；ミコバクテリウム；クロストリジウム；バチルス；リステリア；スタフィロコッカス；ストレプトコッカス；エンテロコッカスから選ばれる属のグラム陽性細菌；あるいは
（ｂ）腸内菌；シュードモナス；モラクセラ；ヘリコバクター；ステノトロフォモナス；ブデロビブリオ；酢酸菌；レジオネラ；シアノバクテリア；スピロヘータ；緑色硫黄細菌；および緑色非硫黄細菌から選ばれる属のグラム陰性細菌である、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記細胞が、ヒト型結核菌；ウシ型結核菌；マイコバクテリウム・アフリカヌム；マイコバクテリウム・ミクロティ；癩菌；クロストリジウム・ディフィシル；ボツリヌス菌；クロストリジウム・パーフリンジェス；破傷風菌；サルモネラ属の種；大腸菌；エンテロコッカス・フェシウム；エンテロコッカス・フェカリス；淋菌；髄膜炎菌；モラクセラ・カタラリス；インフルエンザ菌；肺炎桿菌；レジオネラ・ニューモフィラ；緑膿菌；ミラビリス変形菌；汚物腸内菌；セラチア菌；ピロリ菌；腸炎菌；およびチフス菌から選ばれる病原体である、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記細胞が、バンコマイシン耐性病原体またはバンコマイシン耐性の非病原性モデルである、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記デコイポリヌクレオチドにおける前記転写因子結合部位が、遺伝子に機能的に結合していない、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記デコイポリヌクレオチドが、環状二本鎖ＤＮＡもしくは直鎖オリゴヌクレオチド；および／または二次構造の少なくとも１種のエレメント；および／または前記転写因子結合部位の１より多いコピー；および／または結合部位に付加的な配列；および／または前記ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる修飾された塩基もしくは糖；および／またはプラスミドもしくはプラスミドライブラリー含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記デコイポリヌクレオチドが環状ダンベルを含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記デコイポリヌクレオチドが、少なくとも１つの５’コレステロール修飾を有する直鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記デコイポリヌクレオチドにおける前記転写因子結合部位が、配列番号２１または配列番号２６の配列を含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
転写因子の結合部位を含むデコイポリヌクレオチドであって、前記転写因子が、原核生物または真核生物における１種以上の抗生物質耐性遺伝子の発現のレギュレーターであり、前記デコイポリヌクレオチドにおける前記結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、デコイポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１１〜１３のいずれかで定義された、請求項１５に記載のデコイポリヌクレオチド。
【請求項１７】
細菌感染の治療に使用されるデコイポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが転写因子の結合部位を含み、前記結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、デコイポリヌクレオチド。
【請求項１８】
細菌感染を治療するためのデコイポリヌクレオチドの使用であって、前記ポリヌクレオチドが転写因子の結合部位を含み、前記結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、使用。
【請求項１９】
細菌感染を治療するための薬剤の製造のためのデコイポリヌクレオチドに使用であって、前記ポリヌクレオチドが転写因子の結合部位を含み、前記結合部位が遺伝子に機能的に結合していない、使用。
【請求項２０】
前記転写因子が、原核生物または真核生物における１種以上の抗生物質耐性遺伝子の発現のレギュレーターである、請求項１７に記載のデコイポリヌクレオチドあるいは請求項１８または１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記細菌感染の治療が１種以上の抗生物質の使用を含む、請求項１７〜２０のいずれかに記載のデコイポリヌクレオチドまたは使用。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドが請求項１１〜１４のいずれかに定義されたものである、請求項１７〜２０のいずれかに記載のデコイポリヌクレオチドまたは使用。
【国際調査報告】
2010539965.tif 000032
2010539965.tif 000033
2010539965.tif 000034
2010539965.tif 000035
2010539965.tif 000036
2010539965.tif 000037
2010539965.tif 000038