(57)【要約】  シアル酸を産生する代謝的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ株および当該株を作製する方法。操作されたＥ．ｃｏｌｉ株細胞において、ｎａｎＴ（シアル酸輸送体）遺伝子およびｎａｎＡ（シアル酸アドラーゼ）遺伝子が不活化され、そしてｎａｎＴ−ｎａｎＡ−Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＢ群におけるシアル酸生合成のｎｅｕＣ遺伝子およびｎｅｕＢ遺伝子が導入され、そして過剰発現される。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉのグルコサミン合成酵素遺伝子、ｇｌｍＳが、ｎｅｕＢおよびｎｅｕＣとともに同時過剰発現される。
2010517509.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作された微生物であって：
微生物における第１のＤＮＡ分子における不活化変異であって、ここで第１のＤＮＡ分子はシアル酸輸送体をコードする、不活化変異と；
微生物における第２のＤＮＡ分子における不活化変異であって、ここで第２のＤＮＡ分子はシアル酸アルドラーゼをコードする、不活化変異と；ならびに
第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子であって、ここで第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子は、シアル酸合成酵素およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼからなる群より選択される酵素をコードする、組換えＤＮＡ分子とを含む、微生物。
【請求項２】
第２の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子をさらに含み、ここで第２の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子は、シアル酸合成酵素およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼからなる群より選択される酵素をコードする、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
野生型株と比較して増加されたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃレベルを提供する、組換えＤＮＡ分子またはｇｌｍもしくはｎａｇ経路におけるＤＮＡ分子における変異をさらに含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
グルコサミン合成酵素をコードする組換えＤＮＡ分子をさらに含む、請求項３に記載の微生物。
【請求項５】
グルコサミン合成酵素をコードする組換えＤＮＡ分子がｇｌｍＳ遺伝子である、請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
微生物がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１に記載の微生物。
【請求項７】
不活化変異がｎａｎＴ遺伝子およびｎａｎＡ遺伝子にある、請求項１に記載の微生物。
【請求項８】
第１および第２の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子がｎｅｕＣ遺伝子およびｎｅｕＢ遺伝子である、請求項２に記載の微生物。
【請求項９】
ｎｅｕＣ遺伝子およびｎｅｕＢ遺伝子がＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する、請求項８に記載の微生物。
【請求項１０】
微生物がシアル酸を細胞外に輸送し得る、請求項１に記載の微生物。
【請求項１１】
シアル酸を産生するための、遺伝子操作された微生物を形成する方法であって、以下の工程：
微生物においてシアル酸輸送体をコードする第１のＤＮＡ分子に不活化変異を導入する工程；
微生物においてシアル酸アルドラーゼをコードする第２のＤＮＡ分子に不活化変異を導入する工程；ならびに
微生物において第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子を導入する工程であって、ここで該第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子は、シアル酸合成酵素およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼからなる群より選択される酵素をコードする、工程、を包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、第２の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子を導入する工程をさらに包含し、ここで、第２の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子は、シアル酸合成酵素およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼからなる群より選択される酵素をコードする、方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、野生型株と比較して増加されたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃレベルを提供する、組換えＤＮＡ分子、またはｇｌｍもしくはｎａｇ経路におけるＤＮＡ分子における変異を導入する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１４】
グルコサミン合成酵素をコードする組換えＤＮＡ分子を微生物に導入する工程をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
微生物がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
微生物がシアル酸を細胞外に輸送し得る、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
シアル酸を産生する方法であって、以下の工程：
遺伝子操作された微生物を提供する工程であって、ここで微生物は、微生物におけるシアル酸輸送体をコードする第１のＤＮＡ分子における不活化変異と；微生物におけるシアル酸アルドラーゼをコードする第２のＤＮＡ分子における不活化変異と；および微生物における第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子とを含み、ここで第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子は、シアル酸合成酵素およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼからなる群より選択される酵素をコードする、工程；ならびに
炭素供給源の存在下で微生物を培養する工程、を包含する、方法。
【請求項１８】
微生物が、シアル酸合成酵素およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼからなる群より選択される酵素をコードする第２の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
微生物が、野生型株と比較して増加されたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃレベルを提供する、組換えＤＮＡ分子、またはｇｌｍもしくはｎａｇ経路におけるＤＮＡ分子における変異をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
微生物が、グルコサミン合成酵素をコードする組換えＤＮＡ分子をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
微生物がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
微生物がシアル酸を細胞外に輸送し得る、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
炭素供給源が、グルコース、グリセロール、フルクトース、およびＮ−アセチルグルコサミンからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子操作された微生物であって、以下：
微生物におけるＤＮＡ分子における不活化変異であって、ここでＤＮＡ分子はシアル酸アルドラーゼをコードする、不活化変異と；
第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子であって、ここで第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子はシアル酸合成酵素をコードする、組換えＤＮＡ分子と；ならびに
第２の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子であって、ここで第２の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼをコードする、組換えＤＮＡ分子とを含む、微生物。
【請求項２５】
Ｎ−アシルシアル酸アナログを産生する方法であって、以下の工程：
遺伝子操作された微生物を提供する工程であって、ここで微生物は、微生物におけるシアル酸輸送体をコードする第１のＤＮＡ分子における不活化変異と；微生物におけるシアル酸アルドラーゼをコードする第２のＤＮＡ分子における不活化変異と；ならびに微生物における第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子とを含み、ここで第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子は、シアル酸合成酵素およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼからなる群より選択される酵素をコードする、工程：ならびに
細胞内ＵＤＰ−Ｎ−アシルグルコサミンが生成されるような試薬の存在下で微生物を培養する工程、を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００６年９月２６日に出願された米国仮出願第６０／８２６，９１９号に対して優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、代謝的に操作されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（「Ｅ．ｃｏｌｉ」）に、およびより詳細には、シアル酸の増強された産生のための、代謝的に操作されたＥ．ｃｏｌｉに関する。
【背景技術】
【０００３】
２．先行技術の記載
シアル酸は、細胞シグナル伝達、細菌性病因、および腫瘍転移において重要な役割を果たす生物学的に複雑な炭水化物である。シアル酸の生理化学的な特性は、これを、医薬およびバイオテクノロジーの両方における需要の高まりを伴って、価値ある供給源にする。
【０００４】
より正確には、シアル酸は、真核生物細胞の細胞表面上に優先的に見出される酸性糖の大きなファミリーを記載するために使用される一般的な用語である。最も一般的なシアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸あるいはＮｅｕ５Ａｃ、シアル酸ファミリーのメンバーを生成するためにいくつかの修飾を受ける酸性の９炭糖である。図１において見られるように、シアル酸ファミリーの多様性は、５０個を超える公知のメンバーで表わされる。シアル酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸あるいはＮｅｕ５Ａｃと呼ばれる酸性の、９炭素親化合物に由来する細胞表面炭水化物の大きなファミリーを表す。Ｎｅｕ５Ａｃは、しばしば、アセチル基、リン酸基、メチル基、硫酸基、およびラクチル基で修飾され、これはシアル酸によって媒介される所望の細胞伝達および細胞接着事象に必要とされる。
【０００５】
シアル酸は、多様多数の機能を行い、糖タンパク質安定性、細胞性免疫、溶質輸送、自己認識、神経可塑性、および細胞シグナル伝達のような重要な生物学的プロセスが挙げられる。シアル酸はまた、ヒト疾患において重要な役割を有する。例えば、癌性細胞は、その表面において上昇されたシアル酸レベルおよびシアリル化を有することが示されている。過剰なシアリル化は、侵襲性を促進し、そして細胞内相互作用を減少することが示されており、これは腫瘍転移の特徴である。シアル酸は、現在、インビボで癌組織の非侵襲性の画像化のための道具として研究されている。シアル酸の増加されるレベルは、心臓血管疾患、アルコール依存症、および糖尿病について観察されており、従って、シアル酸を、このような致死的な疾患を診断および検出するためのマーカーにする。いくつかの細菌病原体は、哺乳動物細胞の細胞外表面を模倣することによりマスキング剤として作用する、ポリシアル酸被膜を保有する。ポリシアル酸被膜は、宿主免疫応答から原因となる細菌を防御し、これは細菌が感染を確立することを許容する。ポリシアル酸で被膜された細菌は、髄膜炎（成人および子供において生命を脅かす疾患）の原因因子を導く。最後に、シアル酸のアナログは、インフルエンザノイラミダーゼ阻害剤、例えば、Ｒｅｌｅｎｚａ（登録商標）として、治療薬の安定剤として、および診断薬剤として、医薬産業において重要な役割を見出している。
【０００６】
シアル酸の供給源利用可能性は、制限され、そして費用がかかる。伝統的に、シアル酸は、卵黄、乳清、およびツバメの巣から単離され、これは長期にわたる煩雑な精製プロセスを必要とする。全体的な収率は典型的に低く（約１０〜２０％）、そして純度は不十分である。シアル酸化学における合成経路は、標的の分子が複雑であるために難しい。シアル酸の単離、精製、および合成化学と関連される困難性を回避するために、酵素合成が、現在、シアル酸生成のために好ましい方法である。シアル酸の生合成および分解に関与される酵素のクローニング、およびその後の単離により、研究者らは、直接的な酵素反応によりインビトロでシアル酸を生成することが可能になった。シアル酸の酵素的合成は、高収率（８０％）であり、そして酵素混合物の直接的な結晶化を介して純粋な産物を生成する。シアル酸生成における酵素合成の主な欠点は、そのコストおよび産業レベルでの拡張性である。
【０００７】
上述で考察されるシアル酸を生成するための方法は、医薬およびバイオテクノロジーの産業の大口需要を満たすのに不十分である。例えば、シアル酸単離、精製、合成化学、生成収率、コスト、および産業レベルでの拡張性と関連される問題を首尾よく克服する代謝的操作のアプローチは、当該分野において有意なおよび待望される前進を表す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
３．目的および利点
シアル酸の生成と関連される上記の問題を解決するための、本発明の主な目的および利点は、代謝的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を提供することであり、ここで当該細胞は、シアル酸を産生する。
【０００９】
本発明のさらなる目的および利点は、代謝的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を作製するための方法を提供することであり、ここで当該細胞はシアル酸を産生する。
【００１０】
本発明のさらなる目的および利点は、代謝的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の使用を介してシアル酸を作製するための方法を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的および利点は、いくぶんは自明であり、およびいくぶんは以後明白になる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
本発明の実施態様によれば、シアル酸を産生する代謝的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞、および当該細胞を作製する方法が提供される。詳細には、代謝的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞が提供され、ここではｎａｎＴ（シアル酸輸送体）遺伝子およびｎａｎＡ（シアル酸アルドラーゼ）遺伝子が不活化されており、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＢ群におけるシアル酸生合成のｎｅｕＣおよびｎｅｕＢ遺伝子が、ｎａｎＴ−ｎａｎＡ−Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に導入され、そして過剰発現され、ならびにＥ．ｃｏｌｉのグルコサミン合成酵素遺伝子、ｇｌｍＳが、ｎｅｕＢおよびｎｅｕＣとともに同時過剰発現された。本発明のさらなる実施態様によれば、当該代謝的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の使用を介してシアル酸を作製する方法が提供される。
【００１３】
本発明は、遺伝子操作された微生物を提供し：微生物における第１のＤＮＡ分子における不活化変異であって、ここで第１のＤＮＡ分子はシアル酸輸送体をコードする、不活化変異と；微生物における第２のＤＮＡ分子における不活化変異であって、ここで第２のＤＮＡ分子はシアル酸アルドラーゼをコードする、不活化変異と；ならびに第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子であって、ここで第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子は、シアル酸合成酵素およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼからなる群より選択される酵素をコードする、組換えＤＮＡ分子とを、含む。
【００１４】
本発明のある実施態様において、微生物はさらに、第２の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子を含み、ここで第２の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子は、シアル酸合成酵素およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼからなる群より選択される酵素をコードする。好ましくは、微生物はさらに、野生型株と比較して増加されたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃレベルを提供する、組換えＤＮＡ分子、またはｇｌｍもしくはｎａｇ経路におけるＤＮＡ分子中の変異を含む。本発明のある実施態様において、微生物はさらに、グルコサミン合成酵素をコードする組換えＤＮＡ分子を含む。好ましくは、グルコサミン合成酵素をコードする組換えＤＮＡ分子はｇｌｍＳ遺伝子である。
【００１５】
本発明のある実施態様において、微生物はＥ．ｃｏｌｉである。好ましくは、微生物における不活化変異は、ｎａｎＴ遺伝子およびｎａｎＡ遺伝子においてである。本発明のさらなる実施態様において、第１および第２の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子はｎｅｕＣ遺伝子およびｎｅｕＢ遺伝子である。好ましくは、ｎｅｕＣ遺伝子およびｎｅｕＢ遺伝子は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する。好ましくは、本発明の微生物は、細胞外にシアル酸を輸送する。
【００１６】
本発明はまた、シアル酸を産生するための、遺伝子操作された微生物を形成する方法を提供し、以下の工程：微生物においてシアル酸輸送体をコードする第１のＤＮＡ分子に不活化変異を導入する工程；微生物においてシアル酸アルドラーゼをコードする第２のＤＮＡ分子に不活化変異を導入する工程；ならびに微生物において第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子を導入する工程であって、ここで当該第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子は、シアル酸合成酵素およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼからなる群より選択される酵素をコードする工程を包含する。
【００１７】
本発明のある実施態様において、シアル酸を産生するための、遺伝子操作された微生物を形成する方法はさらに、第２の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子を導入する工程を包含し、ここで第２の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子は、シアル酸合成酵素およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼからなる群より選択される酵素をコードする。好ましくは、本発明の方法はさらに、組換えＤＮＡ分子、またはｇｌｍもしくはｎａｇ経路におけるＤＮＡ分子における変異を含み、野生型株と比較して増加されたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃレベルを提供する。本発明のいくつかの方法はさらに、グルコサミン合成酵素をコードする組換えＤＮＡ分子を微生物に導入する工程を包含する。
【００１８】
本発明はさらにシアル酸を産生する方法を提供し、以下の工程：遺伝子操作された微生物を提供する工程であって、ここで微生物は、微生物におけるシアル酸輸送体をコードする第１のＤＮＡ分子における不活化変異と；微生物におけるシアル酸アルドラーゼをコードする第２のＤＮＡ分子における不活化変異と；および微生物における第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子とを含み、ここで第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子は、シアル酸合成酵素およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼからなる群より選択される酵素をコードする、工程；ならびに炭素供給源の存在下で微生物を培養する工程を包含する。
【００１９】
本発明のある実施態様において、炭素供給源は、グルコース、グリセロール、フルクトース、またはＮ−アセチルグルコサミンであり得るが、これらに制限されない。
【００２０】
本発明はさらに、遺伝子操作された微生物を提供し：微生物におけるＤＮＡ分子における不活化変異であって、ここでＤＮＡ分子はシアル酸アルドラーゼをコードする、不活化変異と；第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子であって、ここで第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子はシアル酸合成酵素をコードする、組換えＤＮＡ分子と；ならびに第２の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子であって、ここで第２の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼをコードする、組換えＤＮＡ分子とを含む。
【００２１】
本発明はまた、Ｎ−アシルシアル酸アナログを産生する方法を提供し、以下の工程：
遺伝子操作された微生物を提供する工程であって、ここで微生物は、微生物におけるシアル酸輸送体をコードする第１のＤＮＡ分子における不活化変異と；微生物におけるシアル酸アルドラーゼをコードする第２のＤＮＡ分子における不活化変異と；ならびに微生物における第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子とを含み、ここで第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子は、シアル酸合成酵素およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼからなる群より選択される酵素をコードする、工程：ならびに細胞内ＵＤＰ−Ｎ−アシルグルコサミンが生成されるような試薬の存在下で微生物を培養する工程、を包含する。本発明のある実施態様において、試薬はＮ−アシルグルコサミンアナログであり得るが、これに制限されない。
【００２２】
本発明は以下の発明の詳細な説明と、添付の図面とを併せて読むことにより、より十分に理解および認識される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】シアル酸ファミリーの多様性を説明する高水準の図式である。
【図２】本発明の実施態様に従う、代謝的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞によるシアル酸の産生を説明する高水準の図式である。
【図３】本発明の実施態様に従う、代謝的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞におけるシアル酸産生に対する炭素供給源の効果のグラフ図である。
【図４】本発明の実施態様に従う、複数のグルコース供給によるシアル酸産生の最適化のグラフ図である。
【図５】本発明の実施態様に従う、シアル酸の産生に関与される経路を説明する図式である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
細菌のシアル酸代謝は十分に理解され、そして同化経路および異化経路の両方が同定されている。ｎａｎオペロンは、シアル酸異化に必要なタンパク質をコードし、そして何百もの細菌種にわたって見出される。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、この経路は、図２において見られるように、シアル酸輸送体、ＮａｎＴ、シアル酸アルドラーゼ、ＮａｎＡ、ＭａｎＮＡｃキナーゼ、ＮａｎＫ、およびＭａｎＮＡｃ−６−リン酸エピメラーゼ、ＮａｎＥからなる。ＮａｎＴは、これがまた、シアル酸の取り込みおよびポリシアル酸被膜へのシアル酸の組み込みを媒介することにより、ポリシアル酸被膜の合成に関与されることが実証されているので、シアル酸異化におけるその機能に制限されない。
【００２５】
図２において、代謝的に操作されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるシアル酸の産生が見られる。×印は、遺伝子不活化に起因する経路の阻止を示す。太矢印は、遺伝子過剰発現による代謝の上昇された流動を示す。シアル酸異化は、ｎａｎＴ（シアル酸輸送体）遺伝子およびｎａｎＡ（シアル酸アルドラーセ）遺伝子（×印）の不活化により阻止された。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＢ群におけるシアル酸生合成のｎｅｕＣ遺伝子およびｎｅｕＢ遺伝子が、ｎａｎＴ−ｎａｎＡ−Ｅ．ｃｏｌｉ株に導入され、そして過剰発現された（太矢印）。ＵＰＤ−ＧｌｃＮＡｃ，ｎｅｕＢＣ経路の基質、の代謝流量の増加は、経路中にｇｌｍＳ過剰発現を操作することにより達成された（太矢印）。点線は、未確定の代謝によるシアル酸流動を表す。略語は以下のようである、Ｎｅｕ５Ａｃ：Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＭａｎＮＡｃ：Ｎ−アセチルマンノサミン、ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ：Ｎ−アセチルマンノサミン−６−リン酸、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ：Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン、ＧｌｃＮ−６−Ｐ：グルコサミン−６−リン酸、Ｆｒｕ−６−Ｐ：フルクトース−６−リン酸、ＰＥＰ：ホスフェノールピルビン酸、Ｇｌｎ：グルタミン、Ｇｌｕ：グルタミン酸、ＵＤＰ：ウリジン二リン酸、ｎａｎＴ：シアル酸輸送体、ｎａｎＡ：シアル酸アルドラーゼ、ｎａｎＫ：ＭａｎＮＡｃキナーゼ、ｎａｎＥ：ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐエピメラーゼ、ｇｌｍＳ：グルコサミン合成酵素、ｇｌｕＭ：グルコサミンムターゼ、ｇｌｍＵ：ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐウリジルトランスフェラーゼ／ＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ、ｎｅｕＣ：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ、ｎｅｕＢ：シアル酸合成酵素、ｇｌｍ：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ生合成、ｎａｇ：ＧｌｃＮＡｃ分解。ｎａｎ系の産物はＧｌｃＮＡｃおよびピルビン酸であり、これらは一次代謝において重要な分子である。
【００２６】
シアル酸異化と対照的に、細菌シアル酸生合成は、ポリシアル酸被膜を合成するＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＢ群を包含する病原性細菌の一部に制限される。シアル酸の生合成に関与する２つのタンパク質は、ＮｅｕＣおよびＮｅｕＢである。ＮｅｕＣは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼを加水分解してＭａｎＮＡｃを生成する。ＮｅｕＢは、ＭａｎＮＡｃとホスホエノールピルベートとを合わせてシアル酸を形成する合成酵素である。ｎｅｕ経路の他のタンパク質は、ポリシアル酸被膜中にシアル酸を取り込む。２つのシアル酸生合成経路は、ｎａｎ系およびｎｅｕ系の酵素から操作された。第１の操作される経路は、異化ＮａｎＡＥＫタンパク質を含んだ。ＮａｎＡはインビトロで、過剰のピルビン酸の存在下でシアル酸を合成することが示されているので、ｎａｎＡＥＫ経路は、代謝的に操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の培養物に過剰のＧｌｃＮＡｃを供給することにより、逆転され得ることが仮説された。ＧｌｃＮＡｃはＥ．ｃｏｌｉ細胞により容易に取り込まれ、そして細胞内ＧｌｃＮＡｃは、ＮａｎＥＫタンパク質の補助を介して、ＭａｎＮＡｃに返還されることが期待された。次いで、ＭａｎＮＡｃの高い細胞内濃度は、ＮａｎＡ触媒を介するシアル酸合成を駆動する。シアル酸産生はＢＲＬ０１（ｌａｃ−制御性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有するｎａｎＴ−Ｅ．ｃｏｌｉ株）／ｎａｎＡＥＫの振盪フラスコ実験から観察されず、結果として、ｎａｎＡＥＫ経路は、シアル酸産生に効果がないと結論づけられた。
【００２７】
第２の操作された経路は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＢ群のＮｅｕＣタンパク質およびＮｅｕＢタンパク質に焦点が当てられ、これは以下に考察される。この経路の利点は、ＮｅｕＣの基質特異性であり、これは、図２において見られるように、共通の細菌代謝物、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを、ＭａｎＮＡｃに変換する。ＮｅｕＣ、加水分解ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ、はまた、エピマー化を駆動するために、加水分解反応からのエネルギーを共役するその能力に起因して、ある他のエピメラーゼよりも効果的である。その後の反応を駆動するために、第１の反応から放出されたエネルギーを使用するその能力を有するそのエネルギー効率に起因して、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼは、本発明に従うシアル酸産生に好ましい。
【００２８】
ｎｅｕＢＣ経路の直接的な基質として、細胞内ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃプールは、代謝流動をシアル酸合成経路に制御し、シアル酸力価を制御する。図５は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃプールの維持に関与される経路を示す。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃプールが増加すると、シアル酸生産性および培養力価が増加する。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは、細菌細胞壁生合成の重要な成分であり、そしてｇｌｍ経路（これはフルクトース−６−リン酸（Ｆｒｕ−６Ｐ）をＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する）、およびｎａｇ経路（これは加水分解されたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＦｒｕ−６Ｐに変換する）による中央代謝に連結される。これらの２つの経路は、細菌の中央代謝と、細胞壁合成およびシアル酸産生とをエネルギー的に共役する。本発明は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃプールを増加するために、ｇｌｍ経路を介して流動を増強するための、および／またはｎａｇ経路を介して流動を減少するための方法を提供し、それによりシアル酸生産性が改善される。重要な代謝のかなめのＦｒｕ−６ＰとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとの間のクロストークの程度および方向を制御することは、シアル酸生産性が最適化されることを可能にする。本発明により提供されるように、ｇｌｍおよび／またはｎａｇ経路の制御、および野生型株に比較してＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃレベルの増加は、シアル酸の効率的な量産に不可欠である。
【００２９】
本発明の実施態様によれば、Ｅ．ｃｏｌｉは、シアル酸、複合体、医薬およびバイオテクノロジーの両方において重大な適用を有する生物学的に重要な分子、を産生するように首尾よく操作された。代謝的に操作されたＥ．ｃｏｌｉからのシアル酸産生のコストは、化学合成のコストよりも実質的に低く、そして酵素的合成とは異なり、代謝的に操作されたＥ．ｃｏｌｉはより容易に産業生産に拡張可能である。
【００３０】
低細胞密度振盪フラスコ培養から、シアル酸産生は、最大１．５ｇｌ−１を達成した。本発明に従う、この代謝的に操作された株の高細胞密度発酵への取り込みは、リットル当たり数グラムに、シアル酸産生を増加するようである。事実、シアル酸産生の１０倍の増加が、高密度細胞培養から可能であり、例えば、１５ｇｌ−１よりも多い。産業レベルの産生にて、本発明の方法は、シアル酸についてのコスト効率的な供給源として作用し、医薬界、バイオテクノロジー界、および科学界の絶えず増加する需要を満たすのに十分なシアル酸を供給する。
【００３１】
本発明のある実施態様において、シアル酸産生はさらに、既存の操作されたｎｅｕＢＣｇｌｍＳ経路を改変することにより増強され得る。例えば、グルコサミン合成においてより高い代謝回転速度を有し、より細胞質可溶性であるＧｌｍＳタンパク質を操作することが、行われ得る。
【００３２】
本発明の別の重要な局面は、細胞質から培地へのシアル酸の予期されない流出である。生物学的な膜を横切る糖の輸送に関する当該分野における標準的な教示は、酸性糖は膜を渡り得ないことを示唆する。それらの高いレベルの親水性が、それらの負電荷と伴って、それらの膜を不浸透性にする。このことは、リン酸化糖および硫酸化糖について十分に立証されている。シアル酸およびそのアナログのようなノヌロソン酸は、酸性糖であり、そしてそのように、当該分野における教示は、これらの化合物は膜を渡り得ないことを示す。従って、当該分野における教示によれば、本発明において生じるように、シアル酸が細胞内で産生される場合、これは細胞を離れ得ず、そして培地に入り得ない。しかし、本発明に従って産生されるシアル酸についてこれは事実ではない。本発明は、シアル酸を産生するための微生物および方法を提供し、ここでは高レベルのシアル酸が細胞質において産生され、そしてここではシアル酸は膜を渡り、そして培地に入る。産生細胞はシアル酸を放出するために死亡および溶菌する必要がなく、むしろシアル酸を放出し得、そしてより多くの産物を産生し続け得るので、この膜輸送は、系の生産性を劇的に増加する。従って、本発明の好ましい実施態様において、シアル酸を産生するために使用される微生物は、シアル酸を細胞外に輸送し得る。
【００３３】
本発明の実施態様に従う、代謝的に操作されたＥ．ｃｏｌｉにおけるシアル酸産生の拡張は、有意な量におけるシアル酸アナログ（非天然のシアル酸）の生合成および産生にある。シアル酸アナログは、細胞性相互作用におけるプローブ、インビボで細胞表面を可視化するにおける薬剤、および医薬品中の成分として使用される。現在、シアル酸アナログは、広範な、誘導体化されたマンノサミン糖から合成され、そして細胞内表面に操作される。対照的に、本発明に従う代謝的に操作されたＥ．ｃｏｌｉからのシアル酸アナログ産生は、グルコサミン誘導体を利用し、これはそれらのマンノサミン等価物よりも安価である。シアル酸アナログを含む下流プロセスは、そのマンノサミン前駆体よりも、シアル酸アナログに対する直接的な接近を伴って、より効果的に達成される。それゆえ、本発明に従う、代謝的に操作されたＥ．ｃｏｌｉからのシアル酸産生は、シアル酸、およびＮ−アシルシアル酸アナログのようなその類似体を合成するたに、コスト効率的であり、そして直接的な経路である。Ｎ−アシルシアル酸アナログの例としては、Ｎ−アジドアセチルシアル酸、Ｎ−レブリノイルシアル酸、およびＮ−ブタノイルシアル酸が挙げられるが、これらに制限されない。
【００３４】
本発明のある実施態様において、Ｎ−アシルシアル酸アナログを産生する方法は、以下の工程：遺伝子操作された微生物を提供する工程であって、ここで微生物は、微生物におけるシアル酸輸送体をコードする第１のＤＮＡ分子における不活化変異と；微生物におけるシアル酸アルドラーゼをコードする第２のＤＮＡ分子における不活化変異と；および微生物における第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子とを含み、ここで第１の酵素をコードする組換えＤＮＡ分子は、シアル酸合成酵素およびＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼからなる群より選択される酵素をコードする、工程；ならびに細胞内ＵＤＰ−Ｎ−アシルグルコサミンが生成されるような試薬の存在下で微生物を培養する工程を包含する。任意のＮ−アシルグルコサミン炭素供給源のような任意の適切な試薬が使用され得る。好ましくは、試薬はＮ−アシルグルコサミンアナログである。アシルトランスフェラーゼはまた、試薬の形成または細胞内ＵＤＰ−Ｎ−アシルグルコサミンの生成を容易にするために使用され得る。
【００３５】
本発明の利点は、以下の実施例により説明される。しかし、これらの実施例において引用される特定の材料およびその量、ならびに他の条件および詳細は、当該分野において広く適用すると解釈されるべきであり、そして本発明を、過度に制限および限定すると、いかようにも解釈されるべきでない。
【実施例１】
【００３６】
本実施例は、ｎａｎＴがシアル酸輸送体であり、シアル酸取り込みを担うので、ｎａｎＴ−Ｅ．ｃｏｌｉ変異体を作製するための、重要なＥ．ｃｏｌｉ遺伝子、ｎａｎＴの欠失に関する。
【００３７】
ＦＢ２１０７１と命名されたｎａｎＴノックアウトＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株  ＭＧ１６５５を、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ大学、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩのＢｌａｔｔｎｅｒ研究室から依頼した。この株は、ｎａｎＴ遺伝子中にカナマイシン耐性を付与するＴｎ５挿入を有する。Ｔ７ｌａｃ−プロモータープラスミドからの遺伝子発現を許容するために、ｌａｃ−プロモーター下のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を、λＤＥ３溶原化キット（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用してＦＢ２１０７１の染色体に挿入して、ＢＲＬ０１株を作製した。
【実施例２】
【００３８】
本実施例は、上述で考察されるように、操作されたｎｅｕＢＣ経路に関し、その発現はＴ７ｌａｃプロモーターにより制御される。この実験は、ｌａｃ制御性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有するｎａｎＴ−Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＲＬ０１への、操作されたｎｅｕＢＣ経路の導入を記載する。
【００３９】
本明細書中に考察されるように、ｎａｎＴ−Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＲＬ０１株に導入された、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＢ群のｎｅｕＣおよびｎｅｕＢ遺伝子は、シアル酸生合成遺伝子である。ＮｅｕＣは、細菌における共通の代謝物、ＵＰＤ‐Ｎ‐アセチルグルコサミン（ＵＤＰ‐ＧｌｃＮＡｃ）をＭａｎＮＡｃに変換する加水分解エピメラーゼである。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＢの被膜多糖に関与するｓｉａＡ遺伝子は、Ｎ−アシルグルコサミン−６−リン酸２−エピメラーゼ活性をコードする。ＭａｎＮＡｃは続いて、図２においてみられるように、ＮｅｕＢ触媒を介して、ホスホエノールピルビン酸と縮合されて、シアル酸を生成する。
【００４０】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ−３３５ＤからのゲノムＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用した。Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および熱サイクラーＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ｐｅｒｓｏｎａｌ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を全てのＰＣＲ反応に使用した。ｎｅｕＢおよびｎｅｕＣ遺伝子を、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ＭＣ５８  Ｂ群のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。ｎｅｕＣ遺伝子およびｎｅｕＢ遺伝子をクローニングするために使用した操作された反応部位を伴うプライマー配列（以下に太字で列挙される）は、ＰＣＲ反応あたり０．１μＭにて使用した。列挙される切断部位は、それぞれの遺伝子をベクターｐＫＨ２２にクローン化するために使用した切断部位であった。制限部位を伴う、ＰＣＲに使用したｎｅｕＢプライマーおよびｎｅｕＣプライマーは以下のようである：
ｎｅｕＢ（切断部位−ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ）
cgcacatatgcaaaacaacaacgaatttaaaattgg（正方向、配列番号１）
cagcgaattcttattcaatatcagtttttttgatttgagca（逆方向、配列番号２）
ｎｅｕＣ（切断部位−ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ）
cgcagctagcaaaaggattctttgcattacaggtacc（正方向、配列番号３）
cagcgaattcctagtcataactggtggtacatt（逆方向、配列番号４）
【００４１】
タッチダウンおよびホットスタートＰＣＲを、全ての増幅について行い、そして熱サイクラー条件は、以下のようであった：９５℃５分間の１サイクル、９５℃で３０秒間、７２℃〜５７℃で３０秒間（１サイクルあたり−１℃）、および７２℃で９０秒間の１５サイクル、９５℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、および７２℃で９０秒間の１５サイクル、ならびに７２℃で１０分間の１サイクル。
【００４２】
ｎｅｕＢおよびｎｅｕＣについてのＰＣＲ産物は、製造業者の指示に従ってｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にクローン化した。クローン化遺伝子を配列決定した。ｎｅｕＢにおける内部ＥｃｏＲＩ部位を、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を介して除去した。遺伝子を、続いて、標準的な分子クローニング技術を使用して、ベクターｐＫＨ２２のＴ７ｌａｃ−プロモーター下にサブクローン化して、プラスミドｐＢＲＬ２２（ｐＫＨ２２−ｎｅｕＢｎｅｕＣ）を作製した。プラスミドはアンピシリン耐性マーカーを有する。
【００４３】
プラスミドｐＢＲＬ２２を、ｎａｎＴ−Ｅ．ｃｏｌｉ株  ＢＲＬ０１に挿入して、ＢＲＬ０１／ｐＢＲＬ２２を形成し、ここでは当該分野において周知の、および受容される方法を使用して、ｎｅｕＣ遺伝子およびｎｅｕＢ遺伝子を過剰発現した。
【００４４】
ｎａｎＴ−Ｅ．ｃｏｌｉ宿主ＢＲＬ０１は、これが培地からシアル酸を取り込むことができないので、任意のシアル酸産物を異化し得ないことが仮説されたが、ＢＲＬ０１／ｐＢＲＬ２２（ＢＲＬ０１／ｎｅｕＢＣ）を含む振盪フラスコ実験は、炭素供給源として０．５％  ＧｌｃＮＡｃの単回供給を伴って、低いが、検出可能な量のシアル酸を、２０ｍｇｌ−１にて生成した。
【００４５】
低収率は、内因性ＮａｎＡによる分解に起因する。それゆえ、シアル酸収率を増加するために、以下の実施例において考察されるように、ＢＲＬ０１においてｎａｎＡ遺伝子を、ラムダＲｅｄ系を使用して欠失して、ＢＲＬ０２株を作製した。
【００４６】
あるいは、別の微生物（例えば、別のＥ．ｃｏｌｉ株）のシアル酸アルドラーゼをコードする遺伝子における不活化変異（例えば、ｎａｎＡ遺伝子の不活化変異または欠失）がシアル酸を産生するために使用され得、ここでは微生物は、実施例５および６において考察されるように、機能的なシアル酸輸送体を有する。
【実施例３】
【００４７】
本実施例は、ＢＲＬ０２株を作製するために遺伝子置換え戦略を使用した、ＢＲＬ０１のｎａｎＡ遺伝子の欠失、およびその後の、ＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ２２を形成するための、ＢＲＬ０２への実施例２のプラスミドｐＢＲＬ２２の取り込みを記載する。
【００４８】
ｎａｎＴ−ｎａｎＡ−Ｅ．ｃｏｌｉ変異体の作製は、ｎａｎＴ遺伝子がシアル酸取り込みに関与し、およびｎａｎＡ遺伝子がシアル酸分解に関与するので重要である。ＮａｎＴは、前記されるように、シアル酸輸送体であり、およびシアル酸取り込みを担い、そしてＮａｎＡは、シアル酸を、ピルビン酸とＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）とに切断するアルドラーゼである。ｎａｎＡ遺伝子およびｎａｎＴ遺伝子の除去は、図２において見られるように、シアル酸異化を無効にする。
【００４９】
シアル酸分解を完全に排除し、そしてシアル酸力価を増加するために、ラムダＲｅｄ系を使用して、ＢＲＬ０１のｎａｎＡ遺伝子をノックアウトして、ｎａｎＴ−ｎａｎＡ−Ｅ．ｃｏｌｉ変異体、ＢＲＬ０２を作製した。
【００５０】
簡潔には、テトラサイクリン耐性をコードするカセットを、プライマー
5′-atggcaacgaatttacgtggcgtaatggctgcactcctgactccttttgatcatgtttgacagcttatcatcgat-3′（配列番号５）
および
5′-tcacccgcgctctgcatcaactgctgggccagcgccttcagttctggcatccaattcttggagtggtgaatccg-3′（配列番号６）
を使用して、ベクターｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から増幅した。プライマーは、ｎａｎＡとの５０ヌクレオチド相同性（下線）およびテトラサイクリン耐性遺伝子との２５ヌクレオチド相同性（下線されず）からなった。使用した熱サイクラー条件は、実施例２において上記された条件と同一であった。テトラサイクリン耐性カセットを、ＰＣＲ反応からゲル精製し、次いでエタノール沈殿により濃縮した。ｐＫＤ４６で形質転換されたＢＲＬ０１は、組換えに必要なラムダＲｅｄタンパク質を保有し、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で、３０℃にて、振盪、１５０ｒｐｍ、を伴ってＯＤ６００＝０．１まで増殖された。次いで、ラムダＲｅｄ遺伝子の発現を０．１％アラビノースで誘導し、そして誘導された細胞は、０．５のＯＤ６００が達成されるまで、増殖を継続した。細胞をエレクトロコンピテントにし、そして（５０μｌ細胞あたり１００ｎｇＤＮＡ）のテトラサイクリン耐性カセットで形質転換した。形質転換細胞を、ＬＢ中で１時間、３７℃にて、振盪を伴って回復させ、次いでカナマイシン（５０μｇ  ｍｌ−１）およびテトラサイクリン（１０μｇ  ｍｌ−１）を補充したＬＢ培地上に播種した。形質転換体を、ＰＣＲにより、ｎａｎＡ欠失およびｎａｎＴ欠失についてスクリーニングした。
【００５１】
実施例２のプラスミドｐＢＲＬ２２を、ｎａｎＴ−ｎａｎＡ−Ｅ．ｃｏｌｉ株、ＢＲＬ０２に挿入して、ＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ２２を形成し、ここでは当該分野において周知の、および受容される方法を使用して、ｎｅｕＣ遺伝子およびｎｅｕＢ遺伝子を過剰発現した。
【実施例４】
【００５２】
本実施例は、ＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ２２株に関する単回供給の振盪フラスコ実験を記載する。ＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ２２株を、グリセロール、マルトース、グルコース、フルクトース、およびＧｌｃＮＡｃを含む炭素供給源原料を、シアル酸産生についてスクリーニングするために使用した。これらの単回供給の実験のために、最初の単回炭素供給源を０．５％にて培地に供給した。培養物を、導入後４８時間増殖させ、そしてシアル酸力価を決定した。
【００５３】
リットル当たり、６．６２ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４、３．０ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｇ  ＮＨ４ＳＯ４、１７０．５ｍｇ  ＭｇＳＯ４、および０．５％の、以前に記載されるような濾過滅菌された炭素供給源からなるＦ１最少培地を、全ての振盪−フラスコ実験に使用した。そうでないと記載しない限り、全ての培地を、適切な抗生物質：カナマイシン（５０μｇ  ｍｌ−１）、カルベンシリン（５０μｇ  ｍｌ−１）、およびテトラサイクリン（１０μｇ  ｍｌ−１）で補充した。すべての実験を三連で行った。複製あたり、１０ｍｌ開始培養物を、３７℃にて１８時間、振盪、２５０ｒｐｍを伴って、ＬＢ培地中で増殖した。開始培養物からの細胞を採集し、そして２５０−ｍｌ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中で５０ｍｌのＦ１に希釈した。接種された培養物を、３０℃にて、振盪、１５０ｒｐｍを伴って増殖し、そしてそれらがＯＤ６００＝０．６〜０．８の時、０．１ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。誘導された培養物を４８時間増殖し、１ｍｌのサンプルを、間隔をおいて採取した。細胞を遠心分離によりサンプルから除去し、そして上清を１０分間、煮沸した。
【００５４】
シアル酸の産生を、Ｂｒｕｋｅｒ  ３００ＭＨｚ装置を使用して、Ｄ２Ｏ中のプロトンＮＭＲにより確認した。シアル酸を、記載されるように、遠心分離を介して細胞を除去し、次いでイオン交換クロマトグラフィーにより上清中のシアル酸を単離することにより、培養ブロスから精製した。
【００５５】
煮沸した上清を、説明されるように、ＮａｎＡ／ＬＤＨアッセイによりシアル酸活性について定量した。簡潔には、シアル酸濃度を、記載されるように、シアル酸アルドラーゼ−乳酸脱水素酵素（ＮａｎＡ／ＬＤＨ）アッセイを使用して決定した。ＬＤＨは、Ｒｏｃｈｅ（Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、そしてＮａｎＡを組換えＥ．ｃｏｌｉから単離した。吸光度を、ＧＥＮＥＳＹＳ  ２０分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）において測定した。アッセイのダイナミックレンジは０．０３５〜０．００２ｍｇ  ｍｌ−１（０．１１〜０．００６ｍｍｏｌ  ｌ−１）シアル酸であることが見出された。反応条件は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１５ｍＭ  ＮＡＤＨ、２．５μｇ  ｍｌ−１  ＬＤＨ、５μｇ  ｍｌ−１  ＮａｎＡ、および０．０１０〜０．０３０ｍｇ  ｍｌ−１のシアル酸からなった。反応を、ＮａｎＡ以外は上述の全ての成分を用いて、３７℃にて１時間行った。次いで、３４０ｎｍでの最初の吸光度を記録した。次いでＮａｎＡを反応に添加し、そして反応を、３７℃にて３時間、インキュベートした。最終的な吸光度を測定し、そして最初の吸光度値と最後の吸光度値との間の差異を標準曲線に対して近似して、サンプル中のシアル酸濃度を定量した。
【００５６】
これらの単回供給実験の結果は図３に示され、そしてｍｇ  ｌ−１において以下のようである：ＧｌｃＮＡｃ、１０３；グルコース、８７；グリセロール、５７；フルクトース、４０；マルトース、１９。
【００５７】
ＮａｎＡの不在は、実施例２において記載された結果と比較して、力価を５倍に増加した。驚くことではないが、原料としてＧｌｃＮＡｃは、最も高いシアル酸力価を生じた；細胞内ＧｌｃＮＡｃは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、重要な細胞壁前駆体、に変換され、従って、その結果、これはｎｅｕＢＣ経路の基質である。
【００５８】
より安価な原料のフルクトース、グリセロール、およびグルコースは、図２においてみられるように、これらが、最初にＧｌｃＮＡｃ生合成経路に組み込まれなければならないので、ＧｌｃＮＡｃの力価ほど高い力価を生じなかった。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＧｌｃＮＡｃ生合成は、グルコサミン合成酵素ＧｌｍＳの作用による、グルコサミンへのフルクトースの変換とともに開始され、これはＧｌｃＮＡｃ代謝において重要な酵素である。従って、以下の実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉのｇｌｍＳ遺伝子の、ｎｅｕＢＣ経路への、過剰発現に関連する。
【実施例５】
【００５９】
本実施例は、機能的ＮａｎＴを発現し、そして機能的ＮａｎＡを欠損するＥ．ｃｏｌｉにおいてシアル酸を産生するために必要とされる試薬の構築を記載する。シアル酸輸送体、ＮａｎＴをコードする遺伝子を、ＸＬ１Ｂｌｕｅ  Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ＰＣＲに使用したプライマーは
5′-GACGCATATGGGCATCGCCCACCG-3′（配列番号７）
および
5′-GACGTTAACTTTTGGTTTTGACTAAATCGT-3′（配列番号８）
であった。導入されたＮｄｅＩ部位は斜体で示される。増幅したｎａｎＴ  ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、そして製造業者の指示に従ってｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化して、ｐＢＲＬ５０を作製した。ｎａｎＴにおける最初のＥｃｏＲＩ部位を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅを使用して除去して、プラスミドｐＢＲＬ５４を作製した。ｎａｎＴ遺伝子を、続いて、標準的な分子クローニング手順を使用して、ｐＫＨ２２のＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローン化して、プラスミドｐＢＲＬ５５を作製した。プラスミドｐＢＲＬ５５を、Ａｖｒ  ＩＩおよびＸｂａＩで消化し、そしてＡｖｒ  ＩＩ−ＸｂａＩ  ｎａｎＴフラグメントを、ｐＢＲＬ４７のＡｖｒ  ＩＩ部位に正方向においてクローン化した。これは、多シストロン性転写因子（５′−３′方向）ｎｅｕＢ−ｎｅｕＣ−ｇｌｍＳ−ｎａｎＴをコードする、プラスミドｐＢＲＬ５７を作製した。
【実施例６】
【００６０】
本実施例は、機能的なＮａｎＴを発現し、および機能的なＮａｎＡを欠損するＥ．ｃｏｌｉにおけるシアル酸の産生を記載する。ＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ４７細胞またはＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ５７細胞を、２５０ｍＬ振盪フラスコにおいて、３０℃／１５０ｒ．ｐ．ｍ．にて、５０μｇ  ｍＬ−１カルベニシリン、５０μｇ  ｍＬ−１カナマイシン、１０μｇ  ｍＬ−１テトラサイクリン、および０．５％（ｗ／ｖ）グルコースを補充した５０ｍＬのＦ１最少培地中で増殖した。光学密度（ＯＤ６００）が０．７〜０．９であった時、培養物を０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、そして７２時間増殖させた。さらなる用量の０．５％（ｗ／ｖ）グルコースを、誘導後、ｔ＝０、１２、２４、３６、４８時間にて添加した。定期的にサンプルを回収し、そして確立されたＮａｎＡ／ＬＤＨアッセイによりシアル酸力価についてアッセイした。簡潔には、細胞を遠心分離により取り除き、そして上清を１０分間煮沸し、そして続いてアッセイした。
【００６１】
ＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ５７細胞は、３１５ｍｇ  Ｌ−１のシアル酸の、シアル酸平均力価を生じ、一方ＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ４７細胞は、５６８ｍｇ  Ｌ−１の平均力価を生じた。対照的に、細胞湿重量当たりのシアル酸は、ＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ４７の、６４ｍｇ（ｍｇ細胞湿重量）−１よりも、ＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ５７細胞について多く、５１５ｍｇ（ｍｇ細胞湿重量）−１であった。
【実施例７】
【００６２】
本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉのグルコサミン合成遺伝子、ｇｌｍＳの、ｎｅｕＢＣ経路への操作を記載する。特に、本実施例は、グルコースおよびフルクトースを含む、低コストの糖原料から生じるシアル酸を増加するための、Ｅ．ｃｏｌｉのグルコサミン合成遺伝子、ｇｌｍＳ（ＰＣＲにより増幅し、そしてｐＢＲＬ２２にクローン化して、プラスミドｐＢＲＬ４７を作製した）の同時過剰発現に関する。Ｇｌｍｓは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ｎｅｕＢＣ経路の基質、の生合成において重要な酵素であり、そしてｇｌｍＳの過剰発現は、より多くの利用可能な原料の糖を、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの生合成に指向することが期待された。
【００６３】
本実施例は、プラスミドｐＢＲＬ４７（ｐＫＨ２２−ｎｅｕＢｎｅｕＣｇｌｍＳ）を作製するために、ｎｅｕＢおよびｎｅｕＣ遺伝子の増幅およびクローニングに関して、実施例２の方法および材料を組み込み、以下を伴った：ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からのゲノムＤＮＡがＰＣＲに使用された。Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および熱サイクラーＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ｐｅｒｓｏｎａｌ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、全てのＰＣＲ反応に使用した。ｇｌｍＳ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。操作された制限部位を伴うプライマー配列（太字で以下に列挙される）を、ｇｌｍＳ遺伝子のクローニングに使用し、ＰＣＲ反応当たり０．１μＭにて使用した。列挙される切断部位は、それぞれの遺伝子をｐＫＨ２２にクローン化するために使用した。制限部位を伴う、ＰＣＲに使用されたｇｌｍＳプライマーは以下のようである：
ｇｌｍＳ（切断部位−ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ）
gcgccatatgtgtggaattgttggcgcg（正方向、配列番号９）
gcgcgaattcttactcaaccgtaaccgattttgc（逆方向、配列番号１０）
【００６４】
タッチダウンおよびホットスタートＰＣＲを、全ての増幅に使用し、そして熱サイクラー条件は以下のようであった：９５℃５分間の１サイクル、９５℃で３０秒間、７２〜５７℃（サイクル当たり−１℃）で３０秒間、および７２℃で９０秒間の１５サイクル、９５℃で３０秒、５７℃で３０秒間、７２℃で９０秒間の１５サイクル、および７２℃で１０分間の１サイクル。クローン化遺伝子を配列決定した。遺伝子を、続いて、標準的な分子クローニング技術を使用して、ベクターｐＫＨ２２のＴ７ｌａｃ−プロモーター下にサブクローン化して、プラスミドｐＢＲＬ４７（ｐＫＨ２２−ｎｅｕＢｎｅｕＣｇｌｍＳ）を作製した。プラスミドｐＢＲＬ４７は、Ｔ７ｌａｃ−プロモーターからのｎｅｕＢｎｅｕＣｇｌｍＳ転写産物をコードするので、これは転写のために機能的なＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを必要とする。プラスミドはアンピシリン耐性マーカーを有する。
【００６５】
プラスミドｐＢＲＬ４７を、ｎａｎＴ−ｎａｎＡ−  Ｅ．ｃｏｌｉ株  ＢＲＬ０２に挿入して、ＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ４７を形成し、ここでは当該分野において周知の、および受容される方法を使用して、ｇｌｍｓ遺伝子を、ｎｅｕＣ遺伝子およびｎｅｕＢ遺伝子とともに過剰発現した。
【実施例８】
【００６６】
ＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ４７株に関する単回供給の振盪−フラスコ実験のみが、炭素供給源としてフルクトースを用いて行われた以外は、実施例４において記載された全ての材料および方法が、本実施例で組み込まれる。
【００６７】
結果は、ＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ４７の単回のフルクトース供給実験が、１３０ｍｇ  ｌ−１のシアル酸力価を生成したことを示す。従って、操作された経路へのｇｌｍＳの添加を伴って、シアル酸産生の３倍の増加、４０から１３０ｍｇ  ｌ−１、が、フルクトース供給について観察された。
【００６８】
フルクトース供給は、実施例４におけるグルコースのシアル酸力価よりも、有意に低い力価を生じたので（図３を参照のこと）、シアル酸産生のためのＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ４７株は、それゆえ、複数のグルコース供給を伴って最適化された（グルコースは、糖新生を介してまずフルクトースに変換されなければならないが）。図４において見られるように、シアル酸産生は、振盪−フラスコ条件下で、グルコース供給を伴って、リットルあたり１．５グラムに最適化された。シアル酸産生を、ＮａｎＡ／ＬＤＨアッセイにより測定した（点線）。増殖を、６００ｎｍでの光学密度またはＯＤ６００を測定することによりモニターした（実線）。ＢＲＬ０２／ｎｅｕＢＣｇｌｍＳ細胞に、誘導後、０、１２、２４、３６、および４８時間にて、０．５％グルコースおよび水酸化アンモニウム（マーカーにより示される）を供給した。シアル酸産生は、実験期間中、上昇し続けたが、増殖は誘導後４８時間にて、停止した。この図は、操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞が、増殖要件が満たされる場合、シアル酸を継続的に産生し得たことを示唆する。
【実施例９】
【００６９】
本実施例は、グルコースを炭素供給源として用いた、ＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ４７株に関する複数回の供給のみの振盪−フラスコ実験を記載する。単回のグルコース供給により、実施例６において列挙される力価に匹敵する、シアル酸力価が生じることが予期された。本実施例で、以下の節において注記する以外は、振盪フラスコ実験、シアル酸の産生の確認、およびシアル酸濃度の測定を含む、同じ方法および材料を、実施例６におけるように追従し、そして使用した。
【００７０】
炭素供給源としてグルコースの複数回の供給を介して、シアル酸産生を、ＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ４７について最適化した。０．５％グルコースおよび水酸化アンモニウムの用量を、誘導後、０、１２、２４、３６、および４８時間にて添加し、そして誘導されたＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ４７細胞を９８時間増殖し（実施例４において記載される４８時間とは対照的に）、そしてシアル酸力価を決定した。水酸化アンモニウムは、ｐＨ６．９〜７．１を維持するように、そして窒素供給源として作用した。
【００７１】
グルコースの複数回の供給を伴うＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ４７（ｎｅｕＢＣｇｌｍＳ）細胞に関するこれらの実験の結果は、１．５ｇ  ｌ−１の最大のまたは最適化されたシアル酸力価を示した。さらに、この結果は、図４において見られるように、０．５％グルコースの合計６回の供給を伴って得られた（１．５ｇのシアル酸当たり３０．０ｇのグルコース）。この結果は、ＢＲＬ０２におけるｎｅｕＢＣとｇｌｍＳとの同時過剰発現は、低コストの糖原料からのシアル酸産生を３倍に増加したことを示す。
【００７２】
この力価はＧｌｃＮＡｃの複数回の供給を伴いＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ２２（ｎｅｕＢＣ）を使用する類似の実験から得られる力価に匹敵し、これは１．４ｇ  ｌ−１の力価を生じた。
【実施例１０】
【００７３】
本実施例は、Ｎ−ブタノイルシアル酸、シアル酸のアナログ、の産生に関する。Ｎ−ブタノイルシアル酸を産生するために、Ｎ−ブタノイルグルコサミンを先ず合成した。グルコサミン塩酸塩（５．０ｇ、２３ｍｍｏｌ、１．０当量）およびトリエチルアミン（１６ｍＬ、１１５ｍｍｏｌ、４．８当量）を、室温にてＤＭＦ（４８ｍＬ）中に懸濁した。反応混合物を３０分間攪拌し、その時点で無水酪酸（４．５ｍＬ、２７ｍｍｏＬ、１．２当量）を滴下して添加した。反応を、室温にて１８時間攪拌した。酢酸エチルおよびヘキサン（８００ｍＬ、１：３ｖ：ｖ）を添加して生成物を沈殿した。混合物を３０分間攪拌し、濾過し、そして固体をヘキサンで繰り返し洗浄した。固体をメタノール（２００ｍＬ）中に溶解し、濾過し、そして減圧下で乾燥して、５．１ｇ（２０ｍｍｏｌ、８７％の収率）のＮ−ブタノイルグルコサミンのα：βアノマーの１：１混合物を得た。
【００７４】
ＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ４７からのＮ−ブタノイルシアル酸産生を、以前の振盪フラスコ実験において記載されるように行い、そして０．３％  グリセロールと、０．３％  Ｎ−ブタノイルグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン（ネガティブコントロール）のいずれかとの複数回の供給により最適化した。原料および水酸化アンモニウムの用量を、誘導後０、１２、２４、３６、および４８時間にて添加し、そして誘導されたＢＲＬ０２／ｐＢＲＬ４７細胞を、９８時間増殖した。水酸化アンモニウムは、ｐＨ６．９〜７．１を維持するように、および窒素供給源として作用した。シアル酸とＮ−ブタノイルシアル酸との複合力価を、ＮａｎＡ／ＬＤＨアッセイにより決定した。Ｎ−ブタノイルグルコサミン供給からの平均複合力価は、６７±２６ｍｇ／Ｌであった。Ｎ−アセチルグルコサミン供給からの平均複合力価は、８２２±２３ｍｇ／Ｌであった。
【実施例１１】
【００７５】
本実施例は、機能的なＮａｎＴ酵素、ＮａｎＡ酵素、およびＮａｇＡ酵素を保有しないＥ．ｃｏｌｉ株の構築を記載する。ＢＲＬ０２におけるｎａｇＡ遺伝子を、Ｒｅｄリコンビナーゼ系を使用して欠失した。クロラムフェニコールカセットを、以下のプライマー
5′-ATGTATGCATTAACCCAGGGCCGGATCTTTACCGGCCACGAATTTCTTGAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′（配列番号１１）
および
5′-TTATTGAGTTACGACCTCGTTACCGTTAACGATGGTCTTGGTGATTTTAACATATGAATATCCTCCTTAG（配列番号１２）
を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して、プラスミドｐＫＤ３から増幅した。プライマーは、ｐＫＤ３に対するプライミング部位（斜体）およびｎａｇＡに対する５０ｂｐの相同性からなった。ＰＣＲ増幅したカセットをゲル精製し、エタノール沈殿により濃縮し、そして１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０中に、４０ｎｇ  μＬ−１の濃度に懸濁した。約８０ｎｇのクロラムフェニコールカセットを、ＢＲＬ０２／ｐＫＤ４６細胞にエレクトロポレートし、これは文献の手順に従って調製された。クロラムフェニコール耐性クローンを選択し、そしてｎａｇＡ遺伝子座での置換について、ＰＣＲによりスクリーニングし：これはＢＲＬ０３株を作製した。ＢＲＬ０３におけるクロラムフェニコールマーカーの除去を、ＦＬＰリコンビナーゼをコードするプラスミドｐＣＰ２０での形質転換により行った。形質転換体を、アンピシリン耐性について選択し、そしてクロラムフェニコール耐性については選択しなかった。ＢＲＬ０３／ｐＣＰ２０細胞を、４３℃にて１８時間、コロニー精製した。クローンを、クロラムフェニコール感受性について試験し、そしてクロラムフェニコールマーカーの除去について、ＰＣＲによりスクリーニングした。クロラムフェニコールマーカーの除去は、ｎａｇＡ−株のＢＲＬ０４を作製した。
【実施例１２】
【００７６】
本実施例は、機能的なＮａｎＴ酵素、ＮａｎＡ酵素、およびＮａｇＡ酵素を保有しないＥ．ｃｏｌｉ株からのシアル酸の産生を記載する。本研究は、ｎａｇ経路のダウンレギュレートが、シアル酸力価、および細胞当たりの単位時間当たりのシアル酸生産性を最適化するために使用され得ることを実証する。ＢＲＬ０４細胞を、ｎｅｕＢ−ｎｅｕＣ−ｇｌｍＳポリシストロン性転写産物をコードするｐＢＲＬ４７で形質転換した。シアル酸産生実験を、三連で行った。ＢＲＬ４／ｐＢＲＬ４７細胞を、１６×１２５ｍｍ  滅菌試験管において、１００μｇ  ｍＬ−１アンピシリン、５０μｇ  ｍＬ−１カナマイシン、１０μｇ  ｍＬ−１テトラサイクリン、および０．５％（ｗ／ｖ）グルコースを補充した２ｍＬのＦ２細胞培地中で増殖した。Ｆ２最少培地は、Ｆ１最少培地に、前者が２倍濃度のリン酸緩衝液を有する以外は、同一である。培養物を６時間増殖し、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、そして３６時間増殖した。シアル酸力価を、ＮａｎＡ／ＬＤＨアッセイを介して、無細胞上清から決定した。ＢＲＬ０４／ｐＢＲＬ４７細胞は、１リットルの培養ブロス当たり０．４６ｇ  Ｌ−１のシアル酸の平均力価を生じた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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