(57)【要約】本発明は、ポリペプチドおよびポリペプチドミミックスを含めた分子生物学および蛋白質生物学の分野に関する。また、本出願は、血漿グルコース代謝、異化、および糖尿病などのような血漿グルコース関連状態の治療および管理の分野にも関する。さらに詳しくは、本発明は、血漿グルコースを迅速に降下させることができる合成ペプチドに関する。本発明は、合成アポリポ蛋白質Ｅ（ＡｐｏＥ）模倣ペプチドを用いる方法を提供する。また、血漿グルコースレベルを低下させるための合成アポリポ蛋白質Ｅ（ＡｐｏＥ）模倣ペプチドの使用方法を開示する。糖尿病および糖尿病合併症を治療するための開示されたアポリポ蛋白質Ｅ（ＡｐｏＥ）模倣ペプチドの使用方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体において血漿グルコースの濃度が減少することを含む、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法。
【請求項２】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、配列番号：１１〜１４、１８〜５７、６０、６１、および６２〜１０３よりなる群から選択される配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、受容体結合ドメインペプチドおよび脂質会合ペプチドを含み、前記脂質結合ドメインペプチドが前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結されている、請求項１記載の方法。
【請求項４】
受容体結合ドメインペプチドがヒト、マウス、ウサギ、サル、ラット、ウシ、ブタおよびイヌよりなる群から選択される種からのものである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
受容体結合ドメインペプチドが、配列番号：１〜２、３、５〜１０、１５、および５８よりなる群から選択される配列を含む、請求項３記載の方法。
【請求項６】
受容体結合ドメインペプチドが突然変異している、請求項３記載の方法。
【請求項７】
受容体結合ドメインペプチドがスクランブル化されている、請求項３記載の方法。
【請求項８】
受容体結合ドメインペプチドが逆向きにある、請求項３記載の方法。
【請求項９】
脂質会合ペプチドが、モデルクラスＡ両親媒性らせん状ペプチド１８Ａである、請求項３〜８記載の方法。
【請求項１０】
前記脂質会合ペプチドが、配列番号：４、１６、１７および５９よりなる群から選択される配列を含む、請求項３〜８記載の方法。
【請求項１１】
脂質会合ペプチドが突然変異している、請求項３〜８記載の方法。
【請求項１２】
脂質会合ペプチドがスクランブル化されている、請求項３〜８記載の方法。
【請求項１３】
脂質会合ペプチドが逆向きにある、請求項３〜８記載の方法。
【請求項１４】
前記受容体結合ドメインが、ドメインがスイッチされた向きにおいて前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、請求項３〜１３記載の方法。
【請求項１５】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、各々、Ｎ末端およびＣ末端においてアセチル基およびアミド基を用いて保護されている、請求項２〜１４記載の方法。
【請求項１６】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、医薬上許容される担体を含む組成物にて投与される、請求項１〜１５記載の方法。
【請求項１７】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物を被験体に投与し、それにより、被験体において血漿グルコースの濃度が減少することを含む、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法。
【請求項１８】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、配列番号：１１〜１４、１８〜５７、６０、６１、および６２〜１０３よりなる群から選択される配列を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、受容体結合ドメインペプチドおよび脂質会合ペプチドを含み、前記脂質結合ドメインペプチドが前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結されている、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
受容体結合ドメインペプチドがヒト、マウス、ウサギ、サル、ラット、ウシ、ブタおよびイヌよりなる群から選択される種からのものである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
受容体結合ドメインペプチドが、配列番号：１〜２、３、５〜１０、１５、および５８よりなる群から選択される配列を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
受容体結合ドメインペプチドが突然変異している、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
受容体結合ドメインペプチドがスクランブル化されている、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
受容体結合ドメインペプチドが逆向きにある、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
脂質会合ペプチドが、モデルクラスＡ両親媒性らせん状ペプチド１８Ａである、請求項１９〜２４記載の方法。
【請求項２６】
前記脂質会合ペプチドが、配列番号：４、１６、１７および５９よりなる群から選択される配列を含む、請求項１９〜２４記載の方法。
【請求項２７】
脂質会合ペプチドが突然変異している、請求項１９〜２４記載の方法。
【請求項２８】
脂質会合ペプチドがスクランブル化されている、請求項１９〜２４記載の方法。
【請求項２９】
脂質会合ペプチドが逆向きにある、請求項１９〜２４記載の方法。
【請求項３０】
前記受容体結合ドメインが、ドメインがスイッチされた向きにおいて前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、請求項１９〜２４記載の方法。
【請求項３１】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、各々、Ｎ末端およびＣ末端においてアセチル基およびアミド基を用いて保護されている、請求項１７〜２９記載の方法。
【請求項３２】
有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法。
【請求項３３】
被験体における血漿グルコースの濃度が減少することをさらに含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、配列番号：１１〜１４、１８〜５７、６０、６１、および６２〜１０３よりなる群から選択される配列を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、受容体結合ドメインペプチドおよび脂質会合ペプチドを含み、前記脂質結合ドメインペプチドが前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結されている、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
受容体結合ドメインペプチドがヒト、マウス、ウサギ、サル、ラット、ウシ、ブタおよびイヌよりなる群から選択される種からのものである、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
受容体結合ドメインペプチドが、配列番号：１〜２、３、５〜１０、１５、および５８よりなる群から選択される配列を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
受容体結合ドメインペプチドが突然変異している、請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
受容体結合ドメインペプチドが、スクランブル化されている、請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
受容体結合ドメインペプチドが逆向きにある、請求項３５記載の方法。
【請求項４１】
脂質会合ペプチドが、モデルクラスＡ両親媒性らせん状ペプチド１８Ａである、請求項３５〜４０記載の方法。
【請求項４２】
前記脂質会合ペプチドが、配列番号：４、１６、１７、および５９よりなる群から選択される配列を含む、請求項３５〜４０記載の方法。
【請求項４３】
脂質会合ペプチドが突然変異している、請求項３５〜４０記載の方法。
【請求項４４】
脂質会合ペプチドがスクランブル化されている、請求項３５〜４０記載の方法。
【請求項４５】
脂質会合ペプチドが逆向きにある、請求項３５〜４０記載の方法。
【請求項４６】
前記受容体結合ドメインが、ドメインがスイッチした向きにおいて前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、請求項３５〜４０記載の方法。
【請求項４７】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、各々、Ｎ末端およびＣ末端においてアセチル基およびアミド基を用いて保護されている、請求項３２〜４６記載の方法。
【請求項４８】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、医薬上許容される担体を含む組成物にて投与される、請求項３２〜４７記載の方法。
【請求項４９】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む有効量の医薬組成物を被験体に投与することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法。
【請求項５０】
被験体における血漿グルコースの濃度が減少することをさらに含む、請求項３２記載の方法。
【請求項５１】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、配列番号：１１〜１４、１８〜５７、６０、６１、および６２〜１０３よりなる群から選択される配列を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、受容体結合ドメインペプチドおよび脂質会合ペプチドを含み、前記脂質結合ドメインペプチドが前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結されている、請求項４９記載の方法。
【請求項５３】
受容体結合ドメインペプチドがヒト、マウス、ウサギ、サル、ラット、ウシ、ブタおよびイヌよりなる群から選択される種からのものである、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
受容体結合ドメインペプチドが、配列番号：１〜２、３、５〜１０、１５、および５８よりなる群から選択される配列を含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
受容体結合ドメインペプチドが突然変異している、請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
受容体結合ドメインペプチドがスクランブル化されている、請求項５２記載の方法。
【請求項５７】
受容体結合ドメインペプチドが逆向きにある、請求項５２記載の方法。
【請求項５８】
脂質会合ペプチドがモデルクラスＡ両親媒性らせん状ペプチド１８Ａである、請求項５２〜５７記載の方法。
【請求項５９】
前記脂質会合ペプチドが、配列番号：４、１６、１７および５９よりなる群から選択される配列を含む、請求項５２〜２７記載の方法。
【請求項６０】
脂質会合ペプチドが突然変異している、請求項５２〜５７記載の方法。
【請求項６１】
脂質会合ペプチドがスクランブル化されている、請求項５２〜５７記載の方法。
【請求項６２】
脂質会合ペプチドが逆向きにある、請求項５２〜５７記載の方法。
【請求項６３】
前記受容体結合ドメインが、ドメインがスイッチされた向きにおいて前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、請求項５２〜５７記載の方法。
【請求項６４】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、各々、Ｎ末端およびＣ末端においてアセチル基およびアミド基を用いて保護されている、請求項４９〜６３記載の方法。
【請求項６５】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、医薬上許容される担体を含む組成物にて投与される、請求項４９〜６３記載の方法。
【請求項６６】
糖尿病を有する被験体を選択し；
有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し；それにより、被験体において糖尿病を治療することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法。
【請求項６７】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、配列番号：１１〜１４、１８〜５７、６０、６１、および６２〜１０３よりなる群から選択される配列を含む、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、受容体結合ドメインペプチドおよび脂質会合ペプチドを含み、前記脂質結合ドメインペプチドが前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結されている、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
受容体結合ドメインペプチドがヒト、マウス、ウサギ、サル、ラット、ウシ、ブタおよびイヌよりなる群から選択される種からのものである、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
受容体結合ドメインペプチドが、配列番号：１〜２、３、５〜１０、１５、および５８よりなる群から選択される配列を含む、請求項６８記載の方法。
【請求項７１】
受容体結合ドメインペプチドが突然変異している、請求項６８記載の方法。
【請求項７２】
受容体結合ドメインペプチドがスクランブル化されている、請求項６８記載の方法。
【請求項７３】
受容体結合ドメインペプチドが逆向きにある、請求項６８記載の方法。
【請求項７４】
脂質会合ペプチドが、モデルクラスＡ両親媒性らせん状ペプチド１８Ａである、請求項６８〜７３記載の方法。
【請求項７５】
前記脂質会合ペプチドが、配列番号：４、１６、１７および５９よりなる群から選択される配列を含む、請求項６８〜７３記載の方法。
【請求項７６】
脂質会合ペプチドが突然変異している、請求項６８〜７３記載の方法。
【請求項７７】
脂質会合ペプチドがスクランブル化されている、請求項６８〜７３記載の方法。
【請求項７８】
脂質会合ペプチドが逆向きにある、請求項６８〜７３記載の方法。
【請求項７９】
前記受容体結合ドメインが、ドメインがスイッチされた向きにおいて前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、請求項６８〜７８記載の方法。
【請求項８０】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、各々、Ｎ末端およびＣ末端においてアセチル基およびアミド基を用いて保護される、請求項６６〜７９記載の方法。
【請求項８１】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、医薬上許容される担体を含む組成物にて投与される、請求項６６〜７９記載の方法。
【請求項８２】
糖尿病を有する被験体を選択し； 
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む有効量の医薬組成物を被験体に投与し；それにより、被験体において糖尿病を治療することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法。
【請求項８３】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、配列番号：１１〜１４、１８〜５７、６０、６１、および６２〜１０３よりなる群から選択される配列を含む、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、受容体結合ドメインペプチドおよび脂質会合ペプチドを含み、前記脂質結合ドメインペプチドが前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結されている、請求項８２記載の方法。
【請求項８５】
受容体結合ドメインペプチドがヒト、マウス、ウサギ、サル、ラット、ウシ、ブタおよびイヌよりなる群から選択される種からのものである、請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
受容体結合ドメインペプチドが、配列番号：１〜２、３、５〜１０、１５、および５８よりなる群から選択される配列を含む、請求項８４記載の方法。
【請求項８７】
受容体結合ドメインペプチドが突然変異している、請求項８４記載の方法。
【請求項８８】
受容体結合ドメインペプチドがスクランブル化されている、請求項８４記載の方法。
【請求項８９】
受容体結合ドメインペプチドが逆向きにある、請求項８４記載の方法。
【請求項９０】
脂質会合ペプチドが、モデルクラスＡ両親媒性らせん状ペプチド１８Ａである、請求項８４〜８９記載の方法。
【請求項９１】
前記脂質会合ペプチドが、配列番号：４、１６、１７および５９よりなる群から選択される配列を含む、請求項８４〜８９記載の方法。
【請求項９２】
脂質会合ペプチドが突然変異している、請求項８４〜８９記載の方法。
【請求項９３】
脂質会合ペプチドがスクランブル化されている、請求項８４〜８９記載の方法。
【請求項９４】
脂質会合ペプチドが逆向きにある、請求項８４〜８９記載の方法。
【請求項９５】
前記受容体結合ドメインが、ドメインがスイッチされた向きにおいて前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、請求項８４〜９４記載の方法。
【請求項９６】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドが、各々、Ｎ末端およびＣ末端においてアセチル基およびアミド基を用いて保護されている、請求項８２〜９５記載の方法。
【請求項９７】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体において酸化的ストレスが低下することを含む、被験体において酸化的ストレスを低下させる方法。
【請求項９８】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物を被験体に投与し、それにより、被験体において酸化的ストレスが低下することを含む、被験体において酸化的ストレスを低下させる方法。
【請求項９９】
被験体が糖尿病を有する、請求項９７〜９８いずれかに記載の方法。
【請求項１００】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体においてβ細胞アポトーシスが低下することを含む、被験体においてβ細胞アポトーシスを低下させる方法。
【請求項１０１】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物を被験体に投与し、それにより、被験体においてβ細胞アポトーシスが低下することを含む、被験体においてβ細胞アポトーシスを低下させる方法。
【請求項１０２】
被験体が糖尿病を有する、請求項１００〜１０１いずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願への相互参照
本出願は、本明細書中に参照によってその全体を援用する、２００７年８月２８日に出願された、発明の名称が「合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ポリペプチドおよび使用方法」である、米国仮出願第６０／９６８，３６２号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、ポリペプチドおよびポリペプチドミミックスを含めた分子生物学および蛋白質生物学の分野に関する。また、本出願は、血漿グルコース代謝、異化、および糖尿病などのような血漿グルコース関連状態の治療および管理の分野にも関する。また、本発明は、一般に、医学の分野にも関する。さらに詳しくは、本発明は、血漿グルコースを迅速に降下させることができる合成ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
真性糖尿病（ＤＭ）は罹患率および死亡率の主な原因である。慢性的に上昇した血中グルコースは消耗性合併症：しばしば透析または腎臓移植を必要とする腎臓障害；末梢神経障害；盲目に至る網膜障害；切断に至る脚および足の潰瘍形成；肝硬変まで進行する場合がある脂肪肝疾患；冠動脈疾患および心筋梗塞、胃不全麻痺、自律神経系に関する疾患、神経状態異常、ｉ．ｖ．コントラスト誘導腎臓障害、（脳内および脳外双方の）小血管疾患、性腺機能低下症、および心不全に対する脆弱性を導く。
【０００４】
ＤＭは、高レベルの血中グルコースによって特徴付けられる障害の群である。ＤＭの有病率は合衆国および世界においてまん延しつつある。２００５年には、合衆国におけるほぼ２１００万人がＤＭを有し、そのうち９０％〜９５％は２型ＤＭ（ＤＭ−２）を有していた。毎時、合衆国においては、およそ４１００のＤＭの新しい症例が診断されており、８１０人がＤＭの合併症で死亡する。２００２年には、ＤＭは合衆国において６番目の死亡の主な原因であり、そのコストは１３２０億ドルであった。２００５年にはＤＭは世界中で１１２０万人の死亡の原因であった。社会通念に反して、ＤＭは世界において全ての社会経済的層に影響する。心血管合併症は、ＤＭ−２における罹患率および死亡率の最も一般的な原因であり、死亡率の７０％を占める。興味深いことには、前糖尿病は、人々が高い血中グルコースを有するが、ＤＭ−２と分類されるのには十分でない場合、合衆国において２０歳を超える５４００万人に影響する。これらの人々はＤＭ−２および心血管疾患の増大した危険性がある。冠動脈心臓疾患の死亡率の有意な減少にも拘わらず、そのような減少の効果は、非糖尿病患者と比較して糖尿病患者においてはあまり重要でない。
【０００５】
２つの主なタイプの糖尿病がある。Ｉ型、すなわちインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、膵島におけるインスリン産生ベータ細胞の自己免疫破壊によるものである。この疾患の発症は通常、子供時代または青春期にある。治療は、主にインスリン用量の調整を導くための血中グルコースレベルの頻繁なテストと組み合わせた、インスリンの１日複数回の注射よりなる。なぜならば、過剰のインスリンは低血糖症および、その結果としての、脳および他の機能の損傷を引き起こし得るからである。ＩＩ型糖尿病（ＤＭ２）、すなわち非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、典型的には、成人期に発症する。ＮＩＤＤＭは、インスリンの作用に対する、脂肪組織、筋肉および肝臓のようなグルコース利用組織の抵抗性に関連する。最初に、膵島ベータ細胞は、過剰のインスリンを分泌することによって埋め合わせる。膵島不全の結果、代償不全および慢性高血糖症がもたらされる。逆に、中程度の膵島機能不全は末梢インスリン抵抗性に先行し、またはそれと同時に起こり得る。
【０００６】
インスリン抵抗性はまた、顕著な高血糖症なくしても起こり得るが、一般には、アテローム性動脈硬化症、肥満、高脂血症、および本態性高血圧に関連する。この異常なクラスターは「代謝症候群」または「インスリン抵抗性症候群」を構成する。インスリン抵抗性はまた、慢性炎症（ＮＡＳＨ；「非アルコール性脂肪肝炎」）、線維症、および肝硬変まで進行し得る脂肪肝にも関連する。累積的には、限定されるものではないが、糖尿病を含めたインスリン抵抗性症候群は、４０歳を超える人々の罹患率および死亡の主な原因の多くの基礎となる。
【０００７】
全てのＤＭの９０％〜９５％を占めるＤＭ−２は、インスリン抵抗性およびインスリンの相対的な欠乏によって特徴付けられる。初期の段階においては、これは、比較的非特異的な兆候を伴うグルコース不耐性として発現され得るが、そのようには診断されない場合がある。しかしながら、これらの患者は、多数の器官を含む関連する臨床的な合併症を伴う疾患の継続的な進行に対して増大した危険性がある。ＤＭ−２の発症および進行を遅延させる試みは、混在した成功に合致したものであった。２００２年に公開された、糖尿病予防の研究（ＤＰＰ）は、中程度の運動養生法および食事の変更よりなる生活習慣の変更が、ＤＭ−２の発症速度を妨げ／遅延させるのに効果的であり得ることを示した。しかしながら、行動の変更のような重要な障害はこの戦略のルーチン的な実行を困難とする。メトホルミンのような医薬剤もまた、ＤＭ−２の発症を妨げ／遅延させる有効性が示されている。医学および生活習慣療法の進歩にも拘わらず、ＤＭ−２の発生率および有病率は継続的に増加している。なおより興味深いのは、ＤＭ−２における心血管疾患はより初期に発症し、より攻撃的であるという事実である。ＤＭ−２は、より低い高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）およびより高いトリグリセリド（ＴＧ）の濃度を含めた特徴的なリポ蛋白質の変化を示す。ＤＭ−２における低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）は、対照コホートと比較して顕著に上昇しないであろう。しかしながら、小型高密度ＬＤＬがより大きな濃度で存在する。この特徴的な糖尿病性脂質異常症は、非糖尿病と比較して顕著に増大した心血管疾患死亡率（ＭＲＦＩＴ）と関連する。スタチンは、圧倒的にＬＤＬを降下させるクラスの薬物である。これらの投薬は、ＤＭおよび非ＤＭの双方における心血管疾患の危険性を低下させるのに効果的であるが、ＬＤＬ降下にも拘らず、ＤＭにおける残存するＣＶＤ危険性はプラセボを摂取する非糖尿病患者よりも高いままである。上昇したＨＤＬは、糖尿病患者および非糖尿病患者双方における心血管疾患の危険性の低下のさらなるメカニズムを提供し得る。多数の試行が、糖尿病および非糖尿病集団双方でのＣＶＤ危険性を減少させることにおけるＨＤＬの増大の有効性を評価するために行われている。
【０００８】
そのような障害を治療するための薬物の存在にも拘わらず、糖尿病および他のインスリン抵抗性障害は、主要でありかつ増大する公衆衛生の問題のままである。糖尿病の後期段階の合併症は、国の健康ケアの財源の大きな割合を消費する。現存する薬物よりも副作用がほとんどなく、またはより軽度な副作用にて、インスリン抵抗性および膵島不全の主な欠点に効果的に取り組む新しい活性治療剤に対する要望が存在する。当該分野において必要とされるのは、インスリン抵抗性を治療するための組成物および方法である。
【０００９】
アポリポ蛋白質Ｅは、脂肪に結合し、２つの主なドメインを有する蛋白質である（非特許文献１）。２２ｋＤａアミノ末端ドメインは、Ｘ線結晶学的研究によって、４らせん束であり（非特許文献２）、および正に荷電した受容体結合ドメインを含有することが示されている。その受容体への超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）結合を媒介するためのこの領域については、アポリポ蛋白質はリポ蛋白質表面に会合しなければならず；これは、Ｃ末端両親媒性らせん領域によって可能となる。正に荷電した受容体結合ドメインを含有する４らせん束がリポ蛋白質表面上で開かない場合、ＶＬＤＬは、受容体への結合において欠陥がある。かくして、ＡｐｏＥの正に荷電したアルギニン（Ａｒｇ）リッチなクラスタードメインおよびＣ末端両親媒性らせんドメインは、共に、アテローム形成性ＡｐｏＥ含有リポ蛋白質の増強された摂取が必要とされる。
【００１０】
ＡｐｏＥは、３４，２００の分子量を有する２９９アミノ酸残基蛋白質として分泌される。アポＥの２つの断片へのトロンビン切断に基づき、２ドメイン仮説は、アポＥのＣ末端領域（１９２−２９９）が、高トリグリセリド血症ＶＬＤＬへのその結合にとって必須であり、Ｎ末端の２２ｋＤａドメイン（１−１９１）がＬＤＬ−Ｒに結合するという事実を説明するために最初に提案された（非特許文献３）。蛋白質およびその突然変異体のさらなる物理化学的特徴付けはこの概念まで拡大され、領域１９２−２１１がリン脂質に結合し、他方、アミノ末端ドメイン（１−１９１）は、４らせん束においてＬＤＬ受容体結合ドメインを含有する球状構造であることを示している（非特許文献２）。合成ペプチド（Ｓｐａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．）およびモノクローナル抗体に関する研究は、正に荷電したアミノ酸ＡｒｇおよびＬｙｓが豊富化されたドメインである、残基１２９−１６９の間のアポＥのＬＤＬ受容体結合ドメインに正確に狙いを定めていた（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；および非特許文献７）。
【００１１】
合成ペプチドに関するさらなる研究を用いて、ＬＤＬ受容体とのその相互作用を媒介するアポＥの結合ドメインの構造的特徴を特徴付ける（非特許文献６；非特許文献７；および非特許文献８）。アポＥの残基１４１−１５５は、正に荷電した残基を含有するが、ヒト皮膚線維芽細胞アッセイにおいてＬＤＬの結合に対して競合せずに、タンデム共有結合リピート［すなわち、（１４１−１５５）２］としてのみ競合した。（１４１−１５５）２ペプチドのＮ−アセチル化は、他方、線維芽細胞へのＬＤＬ結合を増強させた（非特許文献９）。Ｎ−アセチル化（１４１−１５５）２アナログはコレステロールリッチなリポ蛋白質と選択的に会合し、インビボにてそれらの急性クリアランスを媒介した（非特許文献９）。さらに、これらの研究は、受容体結合に対する要件は、ペプチドがらせん状であることを示した（非特許文献８）。ＡｐｏＥの天然１２９−１６９配列のＮ末端におけるグリシンのＮ，Ｎ−ジステアリル誘導化によって脂質会合を増大させるように修飾された合成ペプチド（非特許文献１０）を用いて、増強されたＬＤＬ摂取および劣化も観察された（非特許文献１０）。ＬＤＬ結合はヒトＡｐｏＥのカチオン性配列１４１−１５５によって媒介されるが、Ｂｒａｄｄｏｃｋら（非特許文献１１）は、高度に保存されたアニオン性ドメイン（ヒトＡｐｏＥの４１−６０）のモデルペプチドもまた、ＬＤＬの細胞表面受容体への結合および内在化を調節することを示している。しかしながら、これらのペプチドはＬＤＬ分解を増強させない。
【００１２】
カイロミクロンは血漿中に見出されるリポ蛋白質であり、これは、腸からの脂質を他の身体組織に運び、蛋白質リン脂質コーディングによって囲われたトリアシルグリセロールの液滴よりなる。カイロミクロン残留物は、ＡｐｏＥが豊富化されたディッセ腔における隔離（Ｋｗｉｔｅｒｏｖｉｃｈ，Ｂ．Ｏ．，Ｊｒ．，１９９８；Ｄｅｅｄｗａｎｉａ，Ｐ．Ｃ．，１９９５；およびＷａｔｔｓ，Ｇ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８）後に肝臓によって取り込まれる（非特許文献１２）。ＡｐｏＥは、ＬＤＬ受容体またはＬＲＰによる肝臓残留物リポ蛋白質摂取の主要なメディエーターである。６０を超える正常なＶＬＤＬ  Ｓｆ（副画分）の脂肪分解は、脂肪分解残留物のＬＤＬ受容体への結合を可能とする（非特許文献１３；非特許文献１４）。リポ蛋白質リパーゼ（ＬｐＬ）は、ＡｐｏＢ含有リポ蛋白質の膜ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）への局所化を通じて（非特許文献１５；非特許文献１６）、および／またはＬＤＬ受容体関連蛋白質（ＬＲＰ）への結合を通じて（非特許文献１７）の摂取を容易とすることができる。細胞表面ＨＳＰＧはまた、受容体としても機能することができ、ＡｐｏＥの特異的アイソフォームに対する可変結合親和性を有する。特に、ＡｐｏＥは肝臓によって合成され、また単球／マクロファージによっても合成され、コレステロールホメオスタシスに対するその効果を発揮する。ＡｐｏＥの欠如の局所的な効果についてのインビボ証拠は、ＡｐｏＥ欠乏マウスからの骨髄を移植したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける加速化アテローム性動脈硬化症を示したＬｉｎｔｏｎおよびＦａｚｉｏの観察に由来する（非特許文献１８）。ＡｐｏＥ依存性ＬＤＬコレステリルエステルの摂取経路は、ネズミ副腎皮質細胞において示されている（非特許文献１９）。これは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）および２マクログロブリン受容体を含むように思われる。
【００１３】
米国特許第６，５０６，８８０号は、脂質結合がリポ蛋白質上へのペプチドの表面局所化に、およびアポＥの受容体結合ドメインが適切に接近可能にＬＤＬ受容体に結合するのに必須であるので、モデルクラスＡ両親媒性らせん１８Ａのような十分に特徴付けられた脂質会合ペプチドの、アポＥの１４１−１５０ペプチド配列への接合は、生物学的活性を付与するのに十分なはずであるという仮説に基づいて、アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを合成するための最初の努力を示す。
【００１４】
本発明は、ＡｐｏＥの受容体結合ドメインが十分に特徴付けられた脂質会合モデルクラスＡ両親媒性らせん状ペプチドである１８Ａに共有結合した新規な合成ＡｐｏＥ模倣ペプチド、ならびにヒト血漿グルコースレベルを降下させることにおける合成ペプチドの可能な適用を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｍａｈｌｅｙ，Ｒ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．１９９９，４０：６２２−６３０
【非特許文献２】Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１；２５２：１８１７−１８２２
【非特許文献３】Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｗ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２７，４０−４８
【非特許文献４】Ｒａｌｌ，Ｓ．Ｃ．，Ｊｒ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７９，４６９４−４７００
【非特許文献５】Ｌａｌａｚａｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，３５４２−２５４５
【非特許文献６】Ｄｙｅｒ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９６，２２８０３−２２８０６
【非特許文献７】Ｄｙｅｒ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１５００９−１５０１５
【非特許文献８】Ｄｙｅｒ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３６，８０−８８
【非特許文献９】Ｎｉｃｏｕｌｉｎ，Ｉ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０１，２２３−２３４
【非特許文献１０】Ｍｉｍｓ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９−２０５３９−２０６４７
【非特許文献１１】Ｂｒａｄｄｏｃｋ．Ｄ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，１３９７５−１３９８４
【非特許文献１２】Ｈａｖｅｌ，Ｒ．Ｊ．，１９８５，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．５：５６９−５８０
【非特許文献１３】Ｃａｔａｐａｎｏ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：１００７−１００９
【非特許文献１４】Ｓｃｈｏｎｆｉｅｌｄ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．１９７９．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６４：１２８８−１２９７
【非特許文献１５】Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：２０１３−２０２１
【非特許文献１６】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，２７５：２９３２４−２９３３０
【非特許文献１７】Ｂｅｉｓｉｅｇｅｌ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：１６２−１６４
【非特許文献１８】Ｌｉｎｔｏｎ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｆａｚｉｏ，Ｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｅｎｉ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１９９９，１０：９７−１０５
【非特許文献１９】Ｓｗａｒｎａｋａｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６：２１１２１−２１１２６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明はポリペプチド、組成物、および前記ポリペプチドおよび組成物の使用方法を提供する。
【００１７】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体における血漿グルコースの濃度が減少することを含む、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法を本明細書中に開示する。
【００１８】
また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体における血漿グルコースの濃度が降下することを含み、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは配列番号：１１〜１４、１８〜５７、６０、６１、および６２〜１０３よりなる群から選択される配列を含む、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法も開示する。また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体における血漿グルコースの濃度が減少することを含み、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは受容体結合ドメインペプチドおよび脂質会合ペプチドを含み、前記脂質結合ドメインペプチドは前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結している、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法も開示する。
【００１９】
また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体における血漿グルコースの濃度が減少することを含み、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは受容体結合ドメインペプチドおよび脂質会合ペプチドを含み、前記脂質結合ドメインペプチドは前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結しており、受容体結合ドメインペプチドはヒト、マウス、ウサギ、サル、ラット、ウシ、ブタ、およびイヌよりなる群から選択される種からのものである、被験体において、血漿グルコースの濃度を減少させる方法も開示する。
【００２０】
また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体における血漿グルコースの濃度が減少することを含み、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは受容体結合ドメインペプチドおよび脂質会合ペプチドを含み、前記脂質結合ドメインペプチドは前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結しており、受容体結合ドメインペプチドは配列番号：１〜２、３、５〜１０、１５、および５８よりなる群から選択される配列を含む、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法も開示する。
【００２１】
また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体における血漿グルコースの濃度が減少することを含み、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは受容体結合ドメインペプチドおよび脂質会合ペプチドを含み、前記脂質結合ドメインペプチドは前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結しており、受容体結合ドメインペプチドは突然変異している、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法も開示する。
【００２２】
また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体における血漿グルコースの濃度が減少することを含み、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは受容体結合ドメインペプチドおよび脂質会合ペプチドを含み、前記脂質結合ドメインペプチドは前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結しており、受容体結合ドメインペプチドはスクランブル化される（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法も開示する。
【００２３】
また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体における血漿グルコースの濃度が減少することを含み、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは受容体結合ドメインペプチドおよび脂質会合ペプチドを含み、前記脂質結合ドメインペプチドは前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結しており、受容体結合ドメインペプチドは逆向きにある、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法を開示する。
【００２４】
また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体における血漿グルコースの濃度が減少することを含み、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは受容体結合ドメインペプチドおよび脂質会合ペプチドを含み、前記脂質結合ドメインペプチドは前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結しており、脂質会合ペプチドはモデルクラスＡ両親媒性らせん状ペプチド１８Ａである、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法を開示する。
【００２５】
また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体における血漿グルコースの濃度が減少することを含み、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは受容体結合ドメインペプチドおよび脂質会合ペプチドを含み、前記脂質結合ドメインペプチドは前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結しており、脂質会合ペプチドは、配列番号：４、１６、１７および５９よりなる群から選択される配列を含む、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法を開示する。
【００２６】
また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体における血漿グルコースの濃度が減少することを含み、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは受容体結合ドメインペプチドおよび脂質会合ペプチドを含み、前記脂質結合ドメインペプチドは前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結しており、脂質会合ペプチドは突然変異しているか、スクランブル化されるか、またはドメインがスイッチした向き（ｄｏｍａｉｎ  ｓｗｉｔｃｈｅｄ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）にある、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法を開示する。
【００２７】
また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物を被験体に投与し、それにより、被験体における血漿グルコースの濃度が減少することを含む、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法を開示する。また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む有効量の医薬組成物を被験体に投与し、それにより、被験体における血漿グルコースの濃度が減少することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法を開示する。また、糖尿病を有する被験体を選択し；有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し；それにより、被験体において糖尿病を治療することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法を開示する。
【００２８】
また、糖尿病を有する被験体を選択し；合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む有効量の医薬組成物を被験体に投与し；それにより、被験体における糖尿病を治療することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本明細書に援用され、その一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの実施態様を説明し、記載と一緒になって、本発明の原理を説明する役割を果たす。これらは非限定的例である。
【図１】図１は、Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２が、ＷＨＨＬウサギの血漿において、ＨＤＬ会合パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）（ｐ＜０．０５）活性の増大、および脂質ヒドロペルオキシド（ＬＯＯＨ）（ｐ＜０．０５）の減少を引き起こすことを示す。
【図２】図２は、６００ｍｇ／ｄｌの範囲の初期コレステロール値（１％コレステロールダイエットについて一週間）を有する高脂肪の食事が与えられたウサギへの、Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２の投与を示す。
【図３】図３は、インビトロにて、アポＥヌルマウス血漿において、Ｄ−４Ｆが、α移動粒子から前β移動粒子へのアポＡ−Ｉの主な再分布を引き起こすことを示す。
【図４】図４ＡおよびＢは、対照群（ｎ＝７〜８／群）と比較して、ＨＤＬ（各々、Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２およびＬ−４Ｆ）の特性を模倣するペプチド（５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）が投与された、欠陥があるレプチン受容体を有する５〜６週齢雄ＺＤＦ（ｆａ／ｆａ）のグルコースおよびインスリンレベルを各々示す。
【図５】図５は、ＡｐｏＥ模倣ペプチドの抗糖尿病および抗アテローム性動脈硬化症の効果を示す。
【図６】図６は、どのようにしてＡｐｏＥ模倣ペプチドが膵臓β細胞からのインスリン分泌を増大させるかの経路を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書中で引用された全ての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書中に記載され、および特許請求される発明の日現在、当該分野で当業者に知られた技術水準をより十分に記載するために、前記または後記に拘わらず、本明細書中にその全体を参照によって援用する。
【００３１】
本発明は、もちろん変化し得るが、特定の合成方法、または特に断りのない限りは特定の組換えバイオテクノロジーの方法、または特に断りのない限りは特定の試薬、特定の医薬担体、または特定の医薬製剤もしくは投与養生法に限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書中で用いる専門用語は、特定の実施態様を記載する目的のためであり、限定的なことを意図しないことも理解されるべきである。
１．定義および命名法
本明細書中で用いる専門用語は、特定の実施態様を記載する目的のためだけであり、限定的なことを意図しない。
【００３２】
本明細書および添付の請求の範囲で用いるように、単数形「１つの」および「該」は、文脈が明瞭にそうでないことを示すのでなければ、複数の言及を含むことができる。かくして、例えば、「１つの化合物」への言及は化合物の混合物を含み、「１つの医薬担体」への言及は、２以上のそのような担体の混合物を含む、などである。
【００３３】
範囲は、本明細書中においては、「約」一つの特定の値から、および／または「約」もう一つの特定の値までとして表すことができる。用語「約」は、本明細書中においては、「ほぼ」、「の領域の」、「大まかには」、または「およそ」を意味するのに用いる。用語「約」が数値の範囲と一緒に用いられる場合、それは、記載された数値を超えるおよびそれを下回る境界を拡大することによってその範囲を変更する。一般に、用語「約」は、本明細書中においては、２０％の偏差だけ、述べられた値を超えるかそれを下回る数値を変更するのに用いられる。そのような範囲が表された場合、もう一つの実施態様は、一つの特定の値からおよび／または他の特定の値まで含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用によって近似的なものとして表される場合、特定の値はもう一つの実施態様を形成することが理解されるだろう。各範囲の終点は他の終点に関連して、かつ他の終点とは独立しての両方において有意であることもさらに理解されるだろう。
【００３４】
本明細書中で用いるように、用語「アミノ酸配列」とは、アミノ酸残基を表す略語、文字、記号または単語のリストをいう。本明細書中で用いるアミノ酸の略語はアミノ酸についての慣用的な１文字コードであって、以下のように表される：Ａ、アラニン；Ｃ、システイン；Ｄ、アスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉ、イソロイシン；Ｋ、リシン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、スレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；Ｙ、チロシン。
【００３５】
本明細書中で用いる「ポリペプチド」とは、任意のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、遺伝子産物、発現産物、または蛋白質をいう。ポリペプチドは連続的アミノ酸から構成される。用語「ポリペプチド」は、天然に生じるか、または合成分子を含む。
【００３６】
加えて、本明細書中で用いるように、用語「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、例えば、ペプチド等配電子体などによって相互に連結したアミノ酸をいい、２０の遺伝子にコードされたアミノ酸以外の修飾されたアミノ酸を含んでもよい。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然プロセスによって、または当該分野でよく知られた化学的修飾技術によって修飾することができる。修飾は、ポリペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めたポリペプチドのどこでも起こり得る。同一タイプの修飾は、所与のポリペプチド中のいくつかの部位において同一または変化する程度で存在し得る。また、所与のポリペプチドは多くのタイプの修飾を有することができる。修飾は、限定されるものではないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、共有結合架橋または環化、フラビンの共有結合付着、ヘム部分の共有結合付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合付着、脂質または脂質誘導体の共有結合付着、ホスファチジルイノシトールの共有結合付着、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、システインまたはピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、パージレーション（ｐｅｒｇｙｌａｔｉｏｎ）、蛋白質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、およびアルギニル化のようなアミノ酸の蛋白質へのトランスファーＲＮＡ媒介付加を含む（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｗｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔａｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｎｉｃ，Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−１２（１９８３）参照）。
【００３７】
本明細書中で用いるように、「ペプチドミメティック」は、通常のペプチド化学のいくつかの改変を含む蛋白質の機能の模倣を意味する。ペプチドミメティックスは、典型的には、生物学的特性において、特定の蛋白質の機能を模倣するアミノ酸の短い配列である。ペプチドアナログは、安定性の増大、効率の増大、送達の増強、半減期の増大などのような、元来のペプチドのいくつかの特性を増強させる。公知のポリペプチド配列に基づいてペプチドミメティックスを製造する方法は、例えば、米国特許５，６３１，２８０号；第５，６１２，８９５号；および第５，５７９，２５０号に記載されている。ペプチドミメティックスの使用は、非アミド結合を有する非アミノ酸残基の所与の位置での取込みを含むことができる。本発明の１つの実施態様は、化合物が、適当なミミックで置き換えられた結合、ペプチド骨格またはアミノ酸化合物を有するペプチドミメティックスである。適当なアミノ酸ミミックであり得る非天然のＬ−またはＤ−アミノ酸のいくつかの非限定的例は、β−アラニン、Ｌ−α−アミノ酪酸、Ｌ−γ−アミノ酪酸、Ｌ−α−アミノイソ酪酸、Ｌ−ε−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−リシン、Ｎ−ε−Ｂｏｃ−Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニンスルホン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−ノルバリン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−δＣＢＺ−Ｌ−オルニチン、Ｎ−δ−Ｂｏｃ−Ｎ−α−ＣＢＺ−Ｌ−オルニチン、Ｂｏｃ−ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｂｏｃ−ヒドロキシプロリン、およびＢｏｃ−Ｌ−チオプロリンを含む。
【００３８】
本明細書中で用いるように、単語「または」は、特定のリストの任意の１つのメンバーを意味し、また、そのリストのメンバーの任意の組み合わせを含む。
【００３９】
本明細書中で用いるように、語句「核酸」とは、ワトソンクリック塩基対によって相補的核酸にハイブリダイズすることができる、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、一本鎖または二本鎖、センスまたはアンチセンスであるかを問わず、天然に生じるかまたは合成オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドをいう。本発明の核酸はまた、ヌクレオチドアナログ（例えば、ＢｒｄＵ）、および非ホスホジエステルヌクレオシド間結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはチオジエステル結合）を含むこともできる。特に、核酸は、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡまたはその任意の組み合わせを含むこともできる。
【００４０】
本明細書中で用いるように、「逆向きの」、「逆向き」、「逆アナログ」または「逆配列」とは、ペプチド、または該ペプチドの一部が、非逆向きのペプチドと比較して、逆のアミノ酸配列を有することをいう（すなわち、元来の配列は右側から左側に読まれる（書かれる））。例えば、１つのペプチドがアミノ酸配列ＡＢＣＤＥを有する場合、その逆配列を有する逆アナログまたはペプチドは以下のようになる：ＥＤＣＢＡ。デュアルドメインペプチド、例えば、Ａｃ−ｈＥ−１８Ａ−ＮＨ２においては、ｈＥ配列は右側から左側に読まれるか、または１８Ａ配列は右側から左側に読まれるかのいずれかである。逆アナログでは、ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ−ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦはＲＬＬＲＫＲＬＫＲＬ−ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ（配列番号：６４）またはＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ−ＦＡＥＫＬＫＥＡＶＫＤＹＦＡＫＬＷＤ（配列番号：８４）であり得る。
【００４１】
本明細書中で用いるように、「合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド」は、本明細書中で開示するようにデュアルドメインＡｐｏＥ模倣ペプチドまたは単一ドメインＡｐｏＥ模倣ペプチドを含むことを意味する。
【００４２】
本明細書中で用いるように、「デュアルドメインペプチド」、「デュアルドメイン合成ペプチド」、または「デュアルドメインＡｐｏＥ模倣ペプチド」は、脂質会合ペプチド／ドメインおよび受容体結合ペプチド／ドメインを含むペプチドを意味する。
【００４３】
本明細書中で用いるように、「単一ドメインペプチド」、「単一ドメイン合成ペプチド」または「単一ドメインＡｐｏＥ模倣ペプチド」は、脂質会合ペプチド／ドメインもしくは受容体結合ペプチド／ドメイン、または非極性表面に疎水性残基、および極性表面の中心にアルギニン残基を有する単一ドメイン両親媒性らせんのいずれかを含むペプチドを意味するが、それが全てではない。
【００４４】
本明細書中で用いるように、「ドメインがスイッチされた」、「スイッチされたドメイン」、または「スイッチされた」ペプチドは、脂質会合ペプチドが合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドのＮ末端にあるように、脂質会合ペプチドがアポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインに共有結合により連結していることを意味する。例えば、ペプチド１８Ａ−ｈＥ（配列番号：３８）は、ドメインがスイッチしたペプチドの例である。
【００４５】
本明細書中で用いるように、「スクランブル化」、「スクランブル化バージョン」、または「スクランブル化ペプチド」は、アミノ酸配列の組成がスクランブル化されていないペプチドと同一であるが、アミノ酸の配列が改変されており、かくして、ペプチドがα両親媒性らせんを形成できないようにするか、または脂質会合（またはＨＳＰＧ会合）特性を有しないことを意味する。しかしながら、いくつかの場合においては、本発明に記載されたように、スクランブル化ペプチドは、πらせんのような異なるらせん状構造を形成することができる状態である。例えば、１つのペプチドがアミノ酸配列ＡＢＣＤＥを有する場合、ペプチドのスクランブル化バージョンはアミノ酸配列ＤＥＡＢＣを有することができよう。スクランブル化ペプチドは、しばしば、スクランブル化されたペプチドの部分に先立って「Ｓｃ」を有すると示される。例えば、Ｓｃ−ｈＥ−１８Ａは、ペプチドのｈＥ部分がスクランブル化されていることを示した。
【００４６】
「α両親媒性らせん」は先に議論したが、らせんの１巻き当たり３．６個のアミノ酸残基を有し、他方、「πらせん」は１巻き当たり４．４個のアミノ酸残基を有する。
【００４７】
本明細書中で用いるように、「試料」は動物；動物からの組織または器官；（被験体内か、被験体から直接採取されたか、または培養下で維持されたか、もしくは培養細胞系からのいずれかの）細胞；細胞溶解物（または溶解物画分）または細胞抽出物；または本明細書中で記載されるようにアッセイされた、細胞または細胞材料（例えば、ポリプチドまたは核酸）に由来する１以上の分子を含有する溶液を意味する。試料は、細胞または細胞成分を含有する任意の体液または排出物（例えば、限定されるものではないが、血液、尿、糞、唾液、涙、胆汁）であってもよい。
【００４８】
本明細書中で用いるように、「調節する」は、増大または減少によって改変することを意味する。
【００４９】
本明細書中で用いるように、「脂質結合ドメインＥ」および「脂質会合ペプチド」は相互交換可能に用いられる。本明細書中で用いるように、双方の用語がアポリポ蛋白質Ｅの脂質結合ドメインを意味することができる。
【００５０】
本明細書中で用いるように、「正常な被験体」は、「糖尿病」または「糖尿病性合併症」を有しない個体を意味する。
【００５１】
本明細書中で用いるように、「糖尿病」または「真性糖尿病」は、単一の疾患または状態から区別される、高血糖症（高い血中糖）および他の兆候によって特徴付けられる代謝障害を意味する。本明細書中で用いるように、用語「糖尿病」または「真性糖尿病」は、世界保健機構によって認識される糖尿病の３つの主な形態、すなわち：１型、２型、（妊娠中に起こる）妊娠性糖尿病、および／または若年発症糖尿病、糖尿病性腎臓障害、糖尿病性神経障害および糖尿病性網膜障害のような関連する合併症を含む。本明細書中で用いるように、用語「糖尿病」または「真性糖尿病」は、十分なインスリンを産生して高血糖症を予防することができない膵臓のベータ細胞によって引き起こされる糖尿病の全ての形態を意味する。本明細書中で用いるように、用語「糖尿病」または「真性糖尿病」は、グルコース不耐性および糖尿病グルコース不耐性被験体を含む。
【００５２】
本明細書中で用いるように、「炎症性障害」は、被験体が、いくつかのサイトカインレベルが上昇して、正常な生理的応答を改変する、酸化された脂質によって開始される反応のカスケードを経験する場合を意味する。炎症性障害は、限定されるものではないが、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性紅斑性狼瘡、橋本病、関節リウマチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、アルツハイマー病、強皮症、グッドパスチャー症候群、潰瘍性結腸炎、クローン病、自己免疫溶血性貧血、不妊症、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー氏病、血小板減少症紫斑病、アレルギー；喘息、アトピー性疾患、心筋障害、糸球体腎炎、再生不良性貧血、代謝症候群Ｘ、末梢血管疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、喘息、特発性肺線維症、肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、骨粗鬆症、パジェット病、冠動脈石灰化、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛、ヴェーゲナー肉芽腫症、中枢神経系血管炎（ＣＮＳＶ）、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、ＡＩＤＳ炎症応答、インフルエンザ、鳥類インフルエンザ、ウイルス性肺炎、エンドトキシンショック症候群、敗血症、敗血症症候群、外傷／創傷、核膜潰瘍、慢性／非創傷治癒、再灌流負傷（予防および／または治療）、虚血性再灌流負傷（予防および／または治療）、脊髄負傷（緩和効果）、癌、骨髄腫／多発性骨髄腫、卵巣癌、乳癌、結腸癌、骨癌、変形性関節炎、アレルギー性鼻炎、悪液質、アルツハイマー病、インプラント補綴、バイオフィルム形成、皮膚炎、急性および慢性、湿疹、乾癬、接触皮膚炎、勃起不全、黄斑変性、腎臓障害、神経障害、パーキンソン病、末梢血管疾患、および髄膜炎、器官移植後の認知および拒絶を含む。炎症性疾患は、性質上、細菌性、真菌性、寄生性および／またはウイルス性であり得る。
【００５３】
本明細書中で用いるように、「糖尿病性合併症」は、正常なレベルを超える血漿グルコースレベルの増大によって誘導された合併症を意味する。その例は、限定されるものではないが、しばしば透析または腎臓移植を必要とする腎臓障害；末梢神経障害；盲目に至る網膜障害；切断に至る脚および足の潰瘍形成；肝硬変まで進行する場合がある脂肪肝疾患；冠動脈疾患および心筋梗塞、胃不全麻痺、自律神経系に関する疾患、神経状態異常、ｉ．ｖ．コントラスト誘導腎臓障害、（脳内および脳外双方の）小血管疾患、生殖機能不全、および心不全に対する脆弱性を含む。
【００５４】
本明細書中で用いるように、化合物の「有効量」は、所望の効果を提供するための該化合物の十分な量を意味する。正確な必要量は被験体の種、年齢、および一般的状態、治療すべき疾患の重篤度（または基礎となる遺伝的欠陥）、用いる特定の化合物、その投与様式などに依存して、被験体の間で変化するであろう。かくして、正確な「有効量」を特定するのは不可能である。しかしながら、適当な「有効量」は、ルーチン的実験のみを用いて当業者によって決定され得る。
【００５５】
本明細書中で用いるように、「単離されたポリペプチド」または「精製されたポリペプチド」は、ポリペプチドが本来通常会合している物質を実質的に含まないポリペプチド（またはその断片）を意味する。本発明のポリペプチド、またはその断片は、例えば、天然の源（例えば、哺乳動物細胞）からの抽出、（例えば、細胞において、または無細胞翻訳系において）ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって、またはポリペプチドを化学的に合成することによって得ることができる。加えて、ポリペプチド断片は任意のこれらの方法によって、または全長蛋白質および／もしくはポリペプチドを切断することによって得ることができる。
【００５６】
本明細書中で用いるように、「単離された核酸」または「精製された核酸」は、本発明のＤＮＡに由来する生物の天然に生じるゲノムにおいて、遺伝子に近接する遺伝子を含まないＤＮＡを意味する。該用語は、したがって、例えば、自己複製プラスミドもしくはウイルスのようなベクターに組み込まれた組換えＤＮＡ；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ（例えば、導入遺伝子）；または別々の分子（例えば、ｃＤＮＡ、または、ＰＣＲ、制限エンドヌクレアーゼ消化、または化学的もしくはインビトロ合成によって産生されたゲノム断片またはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。また、それは、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。用語「単離された核酸」とはまた、ＲＮＡ、例えば、単離されたＤＮＡ分子によってコードされるｍＲＮＡ分子、または化学的に合成されるｍＲＮＡ分子、または少なくともいくつかの細胞成分、例えば、他のタイプのＲＮＡ分子またはポリペプチド分子から分離されたか、もしくはそれらを実質的に含まないｍＲＮＡ分子もいう。
【００５７】
本明細書中で用いるように、「治療する」は、疾患もしくは状態の効果の悪化を予防し、または遅延させ、または疾患の効果を部分的にもしくは十分に逆行させるために、脂質障害を有するか、または冠動脈疾患、関節リウマチ、および／もしくは全身性狼瘡を有するヒトまたは他の哺乳動物（例えば、動物モデル）のような被験体に本発明の化合物または分子を投与することを意味する。
【００５８】
本明細書中で用いるように、「予防する」は、糖尿病の発症に対して増大した感受性を有する被験体が糖尿病を発症する可能性を最小限にすることを意味する。
【００５９】
本明細書中で用いるように、「特異的に結合する」は、抗体がその同族抗原（例えば、開示された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド）を認識し、それと物理的に相互作用し、他の抗原を有意に認識することなく、それと相互作用することがないことを意味し；そのような抗体は、当該分野でよく知られた技術によって生じるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよい。
【００６０】
本明細書中で用いるように、「プローブ」、「プライマー」またはオリゴヌクレオチドは、相補的配列（「標的」）を含有する第二のＤＮＡまたはＲＮＡ分子に対して塩基対合できる定義された配列の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。得られたハイブリッドの安定性は、生じる塩基対の程度に依存する。塩基対の程度は、プローブおよび標的分子の間の相補性の程度、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの程度のようなパラメーターによって影響される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーの程度は温度、塩濃度、およびホルムアミドのような有機分子の濃度のようなパラメーターによって影響され、当業者に公知な方法によって決定される。開示された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードすることができる核酸に特異的なプローブまたはプライマー（例えば、遺伝子および／またはｍＲＮＡ）は、それらがハイブリダイズする開示された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードすることができる核酸の領域に対して少なくとも８０％〜９０％の配列相補性、好ましくは少なくとも９１％〜９５％配列相補性、より好ましくは少なくとも９６％〜９９％配列相補性、最も好ましくは１００％配列相補性を有する。プローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドは、当業者によく知られた方法によって、放射能により、あるいは非放射能により検出可能に標識することができる。プローブ、プライマー、およびオリゴヌクレオチドは：核酸配列決定、逆転写および／またはポリメラーゼ連鎖反応による核酸増幅、一本鎖立体配座多形（ＳＳＣＰ）分析、制限断片多形（ＲＦＬＰ）分析、サザンハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、ならびに電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）のような核酸ハイブリダイゼーションに関連する方法に用いる。
【００６１】
本明細書中で用いるように、「特異的にハイブリダイズする」は、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドが、高ストリンジェンシー条件下で、実質的に相補的な核酸（例えば、開示された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドをコードすることができる核酸）を認識し、それと物理的に相互作用し（すなわち、塩基対合）、他の核酸とは実質的に塩基対合しないことを意味する。
【００６２】
本明細書中で用いるように、「高ストリンジェンシー条件」は、６５℃の温度で、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１％ＢＳＡ（画分Ｖ）を含有する緩衝液、または４２℃の温度で、４８％ホルムアミド、４．８×ＳＳＣ、０．２Ｍトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および０．１％ＳＤＳを含有する緩衝液中で、長さが少なくとも約４０ヌクレオチドのＤＮＡプローブの使用から得られるのと匹敵するハイブリダイゼーションを可能とする条件を意味する。ＰＣＲ、ノザン、サザン、またはインサイチュハイブリダイゼーション、ＤＮＡ配列決定などのような高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションのための他の条件は、分子生物学の分野における当業者によってよく知られている（例えば、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，１９９８参照）。
２．組成物
開示された組成物を調製するのに用いられる成分、ならびに本明細書中で開示する方法内で用いられる組成物それ自体を開示する。これらのおよび他の物質は本明細書中で開示され、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示され、他方、これらの化合物の各々の種々の個々の組み合わせおよび順列ならびに集合的組み合わせおよび順列の特定の言及が明示的に開示され得ない場合、各々は本明細書中においては具体的に考えられ、かつ記載されると理解される。かくして、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスが開示され、ならびに分子Ｄ、ＥおよびＦのクラス、および組み合わせ分子Ａ−Ｄの例を開示する場合、たとえ各々が個々に引用されていなくても、各々は個々にかつ集合的に考えられ、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆを意味し開示されていると考えられる。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも開示されている。かくして、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブグループは開示されていると考えられるであろう。この概念は、限定されるものではないが、開示された組成物を製造し、および使用する方法における工程を含めた、本出願の全ての態様に適用される。かくして、実行することができる種々のさらなる工程がある場合、これらのさらなる工程の各々は、開示された方法の任意の特定の実施態様または実施態様の組み合わせにて実行することができると理解される。
【００６３】
また、開示された組成物を調製するのに用いられる成分、ならびに本明細書中に開示された方法内で用いられる組成物それ自体も開示する。これらのおよび他の物質は本明細書中に開示されており、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示され、他方、これらの化合物の種々の個々のおよび集合的組み合わせおよび順列の特定の言及が明示的に開示しなくてもよい場合、各々が本明細書中においては具体的に考えられ、かつ記載されている。
使用方法
また、本発明は、本明細書中に開示された核酸、ペプチド、ポリペプチド、ベクター、抗体および組成物を用いる多くの治療方法を提供する。例えば、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体において血漿グルコースの濃度が減少することを含む、被験体において、血漿中のグルコースの濃度を減少させる方法を開示する。以下の実施例セクションは、本発明の核酸、ペプチド、ポリペプチド、ベクター、および抗体、ならびに組成物をどのように用い、テストすることができるかの例を提供する。当業者であれば、本明細書中に開示された核酸、ペプチド、ポリペプチド、ベクター、抗体、および組成物をテストし、使用するために、実施例セクションにおいて提供された方法を変更することができるであろう。被験体はヒトのような哺乳動物であってよい。加えて、被験体は、ヒト治療剤をテストするのに用いるモデル系であり得る動物であり得る。そのような動物の非限定的な例は、イヌ、ブタ、霊長類、ネズミ、ネコ、ウシ、またはウマ動物を含む。
【００６４】
上記したように、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、デュアルドメインＡｐｏＥ模倣ペプチドまたは単一ドメインＡｐｏＥ模倣ペプチドであり得る。例えば、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、配列番号：１１〜１４、１８〜５７、６０、６１、および６２〜１０３よりなる群から選択される配列を含むことができる。また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体における血漿グルコースの濃度が減少することを含み、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは医薬上許容される担体を含む組成物にて投与される、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法も開示する。
【００６５】
また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物を被験体に投与し、それにより、被験体において血漿グルコースの濃度が減少することを含む、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法も開示する。
【００６６】
本明細書中に記載された方法において、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む組成物として投与することができる。開示された方法のための被験体は１型、２型、（妊娠中に起こる）妊娠性糖尿病、若年発症糖尿病、糖尿病性腎臓障害、糖尿病性神経障害、および糖尿病性網膜障害を有し得る。
インスリン抵抗性
インスリン抵抗性は人口の２０〜２５％においてまん延しており、その状態は２型真性糖尿病の主な構成要素であって、心血管疾患およびある形態の癌についての危険因子である（Ｒｅａｖｅｎ  ＧＭ，  Ｐａｎｍｉｎｅｒｖａ  Ｍｅｄ．２００５，４７：２０１−２１０）。肥満は個体にインスリン抵抗性の発症の素因を与え、いくつかのメカニズムが、増大した脂肪症が栄養素の摂取および貯蔵のインスリン刺激にどのようにして拮抗するかを説明するために提案されている。幾人かの肥満個体において、増大した脂肪組織塊は、末梢組織においてインスリン作用を阻害する、グルココルチコイド（Ｈｅｒｍａｎｏｗｓｋｉ−Ｖｏｓａｔｋａ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００５  Ａｕｇ  １５；２０２：５１７−５２７）または炎症性サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子アルファ）（Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｌ  ＧＳ，Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｄｉａｂａｔｅｓ．１９９９；１０７（２）：１１９−２５）の合成および／または分泌の要因となり得る。加えて、過剰の脂質は脂肪貯蔵に適してない非脂肪組織（すなわち、骨格筋および肝臓）に送達することができ、かくして、インスリンシグナリングおよび作用に直接的に拮抗する特異的代謝産物の形成に導く（Ｓｃｈｍｉｔｚ−Ｐｅｉｆｆｅｒ  Ｃ，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．２０００  Ｏｃｔ；１２（９−１０）：５８３−９４；ＭｃＧａｒｒｙ  ＪＤ，Ｄｉａｂａｔｅｓ．２００２  Ｊａｎ；５１（１）７−１８）。
【００６７】
開示されたペプチドを用いて、インスリン抵抗性を調節することもできる。例えば、本明細書中で開示するのは、開示されたデュアルドメインペプチドの１以上を被験体に投与し、それにより、被験体においてインスリン抵抗性を調節することを含む、被験体においてインスリン抵抗性を調節する方法である。
【００６８】
また、本明細書中に開示するのは、調節されたインスリン抵抗性を必要とする細胞を同定し、次いで、該細胞に開示されたデュアルドメインペプチドの１以上を投与し、それにより、細胞においてインスリン抵抗性を調節することを含む、細胞においてインスリン抵抗性を調節する方法である。
【００６９】
本明細書中の他の個所に記載されているように、細胞はインビトロ、インビボまたはエクスビボであり得る。細胞が被験体にある場合、該被験体は以下の疾患および障害：代謝症候群、肥満、（ＩＩ型のような）糖尿病、またはクッシング病のいずれか１以上を有し得る。被験体は炎症も有し得る。被験体はゴーシェ病も有し得る。これらの疾患および障害、ならびにその他は本明細書中の他の個所により詳細に開示されている。
【００７０】
上記したように、２型糖尿病を含めた、インスリン抵抗性はいくつかの方法で発現させることができる。２型糖尿病は、インスリン抵抗性に最も明白に関連した疾患である。代償性高インスリン血症は、明白な糖尿病が発症する前に、しばしば数十年間、正常なグルコースレベルを維持するのを助ける。結局は、膵臓ベータ細胞は、過剰分泌を通じてインスリン抵抗性を克服することができない。グルコースレベルは上昇し、糖尿病の診断をなすことができる。２型糖尿病を有する患者は、彼らが疾患の進行した段階になるまでは、高インスリン血症のままである。
【００７１】
インスリン抵抗性はまた、高血圧も含むことができる。本態性高血圧を有する患者の１／２はインスリン抵抗性であって、高インスリン血症である。血圧がインスリン抵抗性の程度に関連するという証拠がある。
【００７２】
高脂血症もまたインスリン抵抗性に関連している。２型糖尿病を有する患者の脂質プロフィールは減少した高密度リポ蛋白質コレステロールレベル（心臓疾患についての重要な危険因子）、増大した血清超低密度リポ蛋白質コレステロールレベルおよびトリグリセリドレベル、および増大した小型高密度低密度リポ蛋白質コレステロールレベルを含む。インスリン抵抗性は、低レベルの高密度リポ蛋白質を有する個体において見出されている。インスリンレベルは超低密度リポ蛋白質の合成レベルおよび血漿中トリグリセリドレベルにも関連している。
【００７３】
アテローム性動脈硬化症心臓疾患もまた、肥満のように、インスリン抵抗性に関連する。上記でリストした状態の１以上を有する多くの個体は肥満である。肥満は症候群の構成要素であるが、肥満に由来するよりもむしろ肥満がインスリン抵抗性を促進する。インスリン抵抗性に関連した他の異常が高尿酸血症で、プラスミノゲンアクチベータ阻害剤１の上昇したレベル、および小さなサイズの低密度リポ蛋白質粒子の優位性を含む。より高いプラスミノゲンアクチベータ阻害剤１のレベルおよび減少した低密度リポ蛋白質粒子の直径が、冠動脈心臓疾患の危険性を増大させると考えられる。
【００７４】
（症候群Ｘとしても知られた）代謝症候群が、以下の症候群：インスリン抵抗性；腹部脂肪−男性においては、これは４０インチ以上のウエスト、女性においては、３５インチ以上のウエストと定義される；高い血糖レベル−絶食後にデシリットル当たり少なくとも１１０ミリグラム（ｍｇ／ｄＬ）；高グリセリド−血流中で少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬ；低ＬＤＬ−４０ｍｇ／ｄＬ未満；プロ血栓状態（例えば、血液中の高フィブリノゲンまたはプラスミノゲンアクチベータ阻害剤）；または１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧のうち少なくとも３つを有することによって特徴付けられる。代謝症候群と、全てが心血管疾患についての危険因子である、肥満、高血圧および高レベルのＬＤＬ「悪玉」コレステロールのような他の状態との間で、ある関係が見出されている。例えば、代謝症候群およびアテローム性動脈硬化症の間の増大した関連が示されている。代謝症候群を有する人々もまた、２型糖尿病、ならびに女性においてはＰＣＯＳ（多嚢胞性卵巣症候群）および男性においては前立腺癌の発症の傾向がより強い。
【００７５】
本明細書中において、症候群Ｘを有する被験体を同定し、開示されたデュアルドメインペプチドの１以上を被験体に投与し、それにより被験体を治療することを含む、症候群Ｘを有する被験体を治療する方法を開示する。
組成物の送達
本発明の組成物のインビトロまたはインビボいずれかでの細胞への送達のために、多数の直接送達系を用いることができる。これらはリポソーム融合、遺伝子銃注射、エンドサイトーシス、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、または細胞への遺伝物質の導入を介すること、またはカチオン性リポソームのような担体を含む。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、またはＤＮＡのエレクトロポレーションおよび直接拡散のような物理機械的方法を含めた適当なトランスフェクションのための手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８（１９９１）によって記載されている。エクスビボ方法が使用される場合、当該分野でよく知られた標準的なプロトコルに従って、細胞または組織を取り除き、体外に維持することができる。組成物は、例えば、リン酸カルシウム媒介遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはプロテオリポソームのような任意の遺伝子導入メカニズムを介して細胞に導入することができる。次いで、形質導入された細胞を（例えば、医薬上許容される担体に）注入し、または細胞型もしくは組織型についての標準的な方法に従って被験体に戻して同位置に移植することができる。種々の細胞の被験体への移植または注入についての標準的な方法が知られている。そのような方法は当該分野でよく知られており、かつ本明細書中に記載された組成物および方法で用いるのに容易に適合させることができる。ある場合には、該方法を変更して、大きなＤＮＡ分子と特異的に機能させる。さらに、これらの方法を用いて、担体の標的化特徴を用いることにより、ある種の疾患および細胞集団を標的化することができる。
治療的使用
一般的には、治療で用いる場合は、治療組成物は局所鼻内投与または吸入器による投与を含めて、経口、非経口（例えば、静脈内または皮下投与）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮、体外、腔内投与、経皮、または局所などにより投与することができる。局所投与は眼科的、経膣的、直腸的、または鼻内によることができる。本明細書中で用いるように、「局所鼻内投与」は、外鼻孔の一方または双方を通じての組成物の鼻および鼻通路への送達を意味し、スプレーイングメカニズムまたは液滴メカニズムまたは核酸もしくはベクターのエアロゾル化による送達を含むことができる。吸入器による組成物の投与は、スプレーイングまたは液滴メカニズムによる送達を介しての鼻または口を経由することができる。送達はまた、挿管法を介して呼吸器系の任意の領域（例えば、肺）に直接的に行うこともできる。必要な組成物の正確な量は被験体の種、年齢、体重および一般的状態、治療すべき障害の重篤度、用いる特定の核酸またはベクター、その投与の様式などに依存して、被験体の間で変化するであろう。特定の組成物および特定の被験体についての適当な量は、本明細書中における所与の教示を考えると、ルーチン的な実験のみを用いて当業者によって決定され得る。
【００７６】
組成物の非経口投与は、用いられる場合、一般的には、注射によって特徴付けられる。注射剤は液状溶液または懸濁液、注射に先立っての液体中の懸濁液の溶解に適した固体形態として、またはエマルジョンとして、慣用的な形態で調製することができる。非経口投与は、一定の用量が維持されるような、持続放出、適時放出または徐放放出系の使用を含む。
【００７７】
組成物を投与するための効果的な用量またはスケジュールは経験的に決定してもよく、そのような決定を行うのは当業者の技量内のものである。組成物の投与のための用量範囲は、障害の兆候が影響される所望の効果を生じさせるのに十分大きなものである。用量は、望まない交差反応、アナフィラキシー反応などのような有害な副作用を引き起こすほどあまり大きくすべきではない。一般に、用量は患者における年齢、状態、性別および疾患の程度、投与の経路、または他の薬物が養生法に含まれているか否かで変化し、これは当業者によって決定することができる。用量は任意の反対の適応性（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）の事象において個々の医師によって調整することができる。用量は変化させることができ、１日または数日の間、毎日１以上の用量投与において投与することができる。ガイダンスは、医薬製品の所与のクラスについて適当な用量に対する文献で見出すことができる。例えば、１以上の開示された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体における血漿グルコースの濃度が減少し、それにより、被験体において糖尿病を治療することを含み、前記合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの量で投与される方法を開示する。
【００７８】
糖尿病を治療し、抑制し、または予防するための合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドのような開示された組成物の投与の後、治療ペプチドの効果を当業者によく知られた種々の方法で評価することができる。例えば、当業者であれば、本明細書中に開示されたペプチドのような組成物が、本明細書中に開示されるように、血漿グルコースレベルを低下させ、またはアッセイにおいて存在するグルコースの量を低下させることを観察することによって、被験体において糖尿病を治療または抑制するのに有効であることを理解するであろう。本明細書中に開示されるように、増大した血漿グルコースレベル、または増大したインスリンレベルを抑制する組成物は、糖尿病の危険性がある患者または被験体に予防的に投与してもよい。
【００７９】
本発明のペプチド、ポリペプチド、核酸、抗体、ベクターおよび治療組成物は、既に使用されている他のよく知られた治療または予防ワクチンと組み合わせることができる。本発明の組成物はまた、糖尿病患者を治療し／低インスリンレベルを治療し／インスリンレベルを増大させるのに用いられる薬物と組み合わせて用いることもできる。そのような薬物はＡＣＥ−Ｉ、ＡＲＢ−Ｉ、ＡＳＡ、ＴＺＤのフィブレート、スタチン、ニクロサミド、ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−δ、ＰＰＡＲγ、ナイアシン、インスリン、スルホニル尿素、メトホルミン、グリブリド、エゼチミブを含む。このように、本発明のペプチド、ポリペプチド、核酸、抗体、ベクターおよび治療組成物は、本明細書中に開示された任意の方法において、既に用いられている他のよく知られた治療および予防ワクチンと組み合わせることができ、および／または糖尿病患者を治療し／低インスリンレベルを治療し／インスリンレベルを増大させるのに用いられる薬物と組み合わせて用いることができる。
【００８０】
開示されたペプチドは、糖尿病患者を治療し／低インスリンレベルを治療し／インスリンレベルを増大させるのに用いられる他の薬物と組み合わせて用いる場合、糖尿病患者を治療し／低インスリンレベルを治療し／インスリンレベルを増大させるのに用いられる他の薬物と関連することが知られている副作用を低下させるのを助けることもできる。例えば、開示されたペプチドは、被験体に投与されるスタチンの用量を低下させ、したがって、スタチン投与に関連する副作用を低下させ、または全く無くすることができるように、スタチンと組み合わせて用いることができる。
【００８１】
加えて、本明細書中に開示されたデュアルドメインペプチドを含めた組成物は、他のペプチドと組み合わせて用いることができる。本組成物と組み合わせて用いることができる他のペプチドの例は、限定されるものではないが、その全てを本明細書中に参照によってその全体を援用する、米国特許第６，６６４，２３０号；第６，９３３，２７９号；第７，１４４，８６２号；第７，１６６，５７８号；第７，１９９，１０２号；および第７，１４８，１９７号に開示されたペプチドを含む。本組成物と組み合わせて用いることができる他のペプチドは、限定されるものではないが、その全てを本明細書中に参照によってその全体を援用する、米国特許出願第６０／４９４，４４９号；第１１／４０７，３９０号；および第１０／９１３，８８０号に記載されたペプチドを含む。本発明の組成物は、任意のこれらの薬物と組み合わせることができる。本発明のペプチドの組み合わせは、本治療とで追加的効果または相乗的効果を生じさせることができる。このように、デュアルドメインペプチドを含めた本明細書中に開示された組成物は、本明細書中に開示された任意の方法においても、他のペプチドと組み合わせて用いることができる。
【００８２】
さらに、開示された組成物は、ＣＥＴＰ阻害剤、ＦＴＹ７２０、サーティカン、ＤＰＰ４阻害剤、カルシウムチャネルブロッカー、ＡｐｏＡ１誘導体またはミメティックまたはアゴニスト、ＰＰＡＲアゴニスト、ステロイド、グリーベック、コレステロール吸収ブロッカー（ゼチア）、ビトリン、任意のレニンアンジオテンシン経路ブロッカー、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（ディオバンなど）、ＡＣＥ阻害剤、レニン阻害剤、ＭＲアンタゴニストおよびアルドステロンシンターゼ阻害剤、ベータブロッカー、アルファアドレナリンアンタゴニスト、ＬＸＲアゴニスト、ＦＸＲアゴニスト、スカベンジャー受容体Ｂ１アゴニスト、ＡＢＣＡ１アゴニスト、アディポネクチン受容体アゴニストまたは誘導剤、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼＩ（ＳＣＤ１）阻害剤、コレステロール合成阻害剤（非スタチン）、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼＩ（ＤＧＡＴ１）阻害剤、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ２阻害剤、ＰＡＩ−１阻害剤、ＬＰ−ＰＬＡ２阻害剤、ＧＬＰ−１、グルコキナーゼアクチベータ、ＣＢ−１アゴニスト、ＡＧＥ阻害剤／ブレーカー、ＰＫＣ阻害剤、抗血栓／凝固剤、アスピリン、ＡＤＰ受容体ブロッカー、例えば、クロピジグレル、第Ｘａ因子阻害剤、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、第ＶＩＩａ因子阻害剤、ワルファリン、低分子量ペパリン、組織因子阻害剤、抗炎症薬物、プロブコールおよび誘導体、例えば、ＡＧＩ−１０６７など、ＣＣＲ２アンタゴニスト、ＣＸ３ＣＲ１アンタゴニスト、ＩＬ−１アンタゴニスト、ニトレートおよびＮＯドナー、およびホスホジエステラーゼ阻害剤よりなる群から選択される薬物と組み合わせて投与することができる。
【００８３】
例えば、有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよびスタチンを被験体に投与し、それにより、被験体における血漿中グリコースの濃度が減少し、それにより、被験体において糖尿病を治療することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法を開示する。
【００８４】
また、有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよびスタチンを被験体に投与し、それにより、被験体において血漿グルコースの濃度が減少し、それにより、被験体において糖尿病合併症を治療することを含む、糖尿病を有する被験体を治療することを開示する。
組成物
上記したように、アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは種々の方法で用いることができる。ヒトアポリポ蛋白質Ｅ（アポＥ）は、２つの区別されるドメインである、脂質会合ドメイン（残基１９２−２９９）、およびＬＤＬ受容体結合部位（残基１２９−１６９）を含有する球状ドメイン（１−１９１）よりなる。最小のアルギニンリッチなアポＥ受容体結合ドメイン（１４１−１５０）が、クラスＡ両親媒性らせんに共有結合により連結した場合に、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）および超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）の摂取およびクリアランスを増強させるのに十分であるという仮説を検定するために、Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．は、ヒトアポＥの受容体結合ドメイン、ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ（「ｈＥ」とも言われるｈＡｐｏＥ［１４１−１５０］、配列番号：１）が、よく特徴付けられた高親和性脂質会合ペプチド（「１８Ａ」ともいわれる、ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ、配列番号：４）である１８Ａに連結されて、ｈＡｐｏＥ［１４１−１５０］−１８Ａ（「ｈＥ−１８Ａ」ともいわれる、配列番号：１１）で表されるペプチドを生じさせるペプチドを合成した（特異的アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよびそれらの使用のその教示については、本明細書中に参照によってその全体を援用する米国特許第６，５０６，８８０号参照）。また、Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２（配列番号：１２）として表されるｈＥ−１８Ａの末端保護アナログも合成した。リシン残基の重要性、および受容体結合ドメインにおける疎水性残基の役割もまた、二つのアナログ、ＬＲＲＬＲＲＲＬＬＲ−１８Ａ（「ｈＥ（Ｒ）−１８Ａ」ともいわれる、配列番号：１３）およびＬＲＫＭＲＫＲＬＭＲ−１８Ａ（「ｍＥ１８Ａ」ともいわれる、配列番号：１４）を用いて研究され、それにより、ヒトアポＥの受容体結合ドメインを修飾して、位置１４３および１４６におけるリシン（Ｋ）残基に代えてアルギニン（Ｒ）残基で置換（配列番号：３）し、それにより、各々、マウスアポＥの受容体結合ドメイン（配列番号：２）を１８Ａに連結させた。次いで、デュアル形質ペプチドの効果を決定した。
本発明のポリペプチドおよびペプチドの非限定的例
本発明は、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドまたはポリペプチドを用いる方法に関する。開示された方法で用いることができる合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドまたはポリペプチドの非限定的例を以下に提供する。
【００８５】
配列番号：１５のアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン；および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを本明細書中に開示する。このように、受容体結合ドメインは、ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲ（ｈＡｐｏＥ［１４１−１５０］、配列番号：１）の位置１４８および１４９における２つのロイシン（Ｌ）残基を２つのフェニルアラニン（Ｆ）残基で置き換えた。これらの合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドのための脂質会合ペプチドは、モデルクラスＡ両親媒性らせん状ペプチド１８Ａであり得る。例えば、脂質会合ペプチドは配列番号：１６または配列番号：１７のアミノ酸配列を含むことができる。
【００８６】
また、配列番号：１７のアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｅの脂質結合ドメイン；および受容体結合ドメインペプチドを含み、前記脂質結合ドメインは前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結されている合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも本明細書中に開示する。このように、脂質結合ドメインが、ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ（１８Ａ、配列番号：１６）の２つのロイシン（Ｌ）残基を２つのフェニルアラニン（Ｆ）残基で置き換え、その結果、配列ＤＷＦＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＦＫＥＡＦ（配列番号：１７、修飾された１８Ａまたはｍ１８Ａともいう）が得られた。合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドについての受容体結合ドメインペプチドは、ＡｐｏＥのヒト受容体結合ドメインペプチドであり得る。例えば、開示された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの受容体結合ドメインペプチドは、配列番号：１、配列番号：３、または配列番号：１５のアミノ酸配列を含むことができる。そのような合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの受容体結合ドメインペプチドは、マウス、ウサギ、サル、ラット、ウシ、ブタ、およびイヌよりなる群から選択される種からのものでもあり得る。
【００８７】
合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドについての受容体結合ドメインペプチドは、アポリポ蛋白質Ｂ（ＡｐｏＢ）のＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）結合ドメインでもあり得る。ＡｐｏＢのＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）結合ドメインは、配列ＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号：１０４）を有することができる。ＡｐｏＢ−１００は、ＬＤＬ受容体についての結合ドメインとしての役割を果たす、９つのアミノ酸（３３５９−３３６７）を有する５５０，０００Ｄａ糖蛋白質である（Ｓｅｇｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．４２，ｐｐ．１３４６−１３６７（２００１））。クラスリン被覆ピットにおけるＬＤＬＲへの結合に際して、ＬＤＬをエンドサイトーシスを介して内在化し、エンドソームに移動させ、そこで、ｐＨの降下は受容体をＬＤＬから解離させる。受容体は細胞の表面まで戻ってリサイクルされ、他方、ＬＤＬはリソソームに移動され、そこで、粒子は分解される（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１，ｐｐ．１−３９（１９８５））。ＡｐｏＢのＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）結合ドメインは、開示されたペプチドと共に用いる場合、ＡｐｏＥについて本出願を通じて記載されるように改変、および／または修飾することもできる。例えば、ＡｐｏＢのＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）結合ドメインは、開示された脂質会合ペプチドと共に用いることができ、ＡｐｏＢのＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）結合ドメインは、前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている。加えて、ＡｐｏＢのＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）結合ドメインがスクランブル化され、逆向きとし、以下に記載するようにドメインがスイッチされたペプチドの一部であり得る。
【００８８】
このように、有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、血漿グルコースおよび血漿中コレステロールの濃度が減少することを含む、被験体において血漿グルコースおよび血漿中コレステロールを減少させる方法も開示する。
【００８９】
また、有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体において血漿グルコースおよび血漿中コレステロールの濃度が減少し、それにより、被験体において糖尿病を治療することを含む、糖尿病を有する患者を治療する方法も開示する。
【００９０】
また、有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体において血漿グルコースおよび血漿中コレステロールの濃度が減少し、それにより、被験体において糖尿病合併症を低下させることを含む、被験体において、糖尿病合併症を低下させる方法も開示する。
【００９１】
開示された方法に用いられる、開示された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドに用いることができる受容体結合ドメインペプチドの例を表１に掲げる。
【００９２】
【表１】
2010538005.tif 000002
表１におけるイタリック体の残基はヒト配列からの変化を示す；しかしながら、アミノ酸の特性は保存されている。表１中の太字−イタリック体の残基は、その位置におけるヒト配列からの差を示す。
【００９３】
また、アポリポ蛋白質Ｅの開示された受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合より連結されている、開示された方法に用いることができる合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。開示された組成物に用いることができるさらなる脂質会合ペプチドは、脂質会合ペプチドのその教示について、本明細書中に参照によってその全体を援用する、米国特許出願第１１／４０７，３９０号（Ｆｏｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。例えば、米国特許出願第１１／４０７，３９０号の表２〜６の脂質会合ペプチドは、開示された組成物に用いることができる。
【００９４】
また、アポリポ蛋白質Ｂの開示された受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。開示された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの非限定的例を表２に掲げる。
【００９５】
また、アポリポ蛋白質Ｅの開示された受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインは、ドメインがスイッチされた向きで、前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、開示された方法に用いることができる合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。また、アポリポ蛋白質Ｂの開示された受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインが、ドメインがスイッチされた向きで前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。これらのペプチドは「ドメインがスイッチされた」、「スイッチされたドメイン」、または「スイッチされた」ペプチドということができる。例えば、アポリポ蛋白質Ｅの開示された受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインが、上記、および表２において記載されたものに対してドメインがスイッチされた向きで前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを開示する。具体的には、脂質会合ペプチドは、前記脂質会合ペプチドが合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドのＮ末端にあるように、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインに共有結合により連結されている。開示された方法に用いることができる開示された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドのさらなる非限定的例を表３に掲げる。
【００９６】
【表２】
2010538005.tif 000003
開示された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドはまた、アセチル基およびアミノ基を用いてＮ末端保護することもできる。
【００９７】
また、アポリポ蛋白質Ｅの開示された受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインは、ドメインがスイッチされた向きで前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、開示された方法に用いることができる合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。また、アポリポ蛋白質Ｂの開示された受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチド組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインは、ドメインがスイッチされた向きで前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。これらのペプチドは、「ドメインがスイッチされた」、「スイッチされたドメイン」、または「スイッチされた」ペプチドということができる。例えば、アポリポ蛋白質Ｅの開示された受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインが、上記、および表２に記載されたものに対してドメインがスイッチされた向きで前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを開示する。具体的には、脂質会合ペプチドは、前記脂質会合ペプチドが合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドのＮ末端にあるように、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインに共有結合により連結されている。
【００９８】
開示された方法に用いることができる開示された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドのさらなる非限定的例を表３に掲げる。
【００９９】
【表３】
2010538005.tif 000004
開示されたドメインがスイッチされた合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドはまた、アセチル基およびアミノ基を用いてＮ末端保護することもできる。
【０１００】
また、アポリポ蛋白質Ｅの開示された受容体結合ドメインン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインは、逆向きに前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、開示された方法に用いることができる合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。例えば、アポリポ蛋白質Ｅの開示された受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、受容体結合ドメインの配列、または脂質会合ペプチドの配列、または双方の配列のいずれかが逆向きである、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを開示する。また、アポリポ蛋白質Ｂの開示された受容体結合ドメイン、および開示された脂質会合ペプチドの組み合わせよりなり、前記受容体結合ドメインは逆向きに前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを開示する。開示された方法に用いることができる開示された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドのさらなる非限定的例を表４に掲げる。
【０１０１】
【表４】
2010538005.tif 000005
開示された逆向き合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドはまた、アセチル基およびアミド基を用いてＮ末端およびＣ末端保護することができる。
【０１０２】
また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインはスクランブル化されている、開示された方法に用いることができる合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。例えば、配列番号：５８のアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン；および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを開示する。また、アポリポ蛋白質Ｂの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインが前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、アポリポ蛋白質Ｂの受容体結合ドメインがスクランブル化されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを開示する。
【０１０３】
また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、および脂質会合ペプチドよりなり、前記受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、該脂質会合ペプチドはスクランブル化されている、開示された方法に用いることができる合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。例えば、本明細書中において、配列番号：５９のアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｅの脂質結合ドメイン、および受容体結合ドメインペプチドを含み、前記脂質結合ドメインは前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結されている、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを開示する。
【０１０４】
また、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメイン、およびアポリポ蛋白質Ｅの脂質会合ペプチドよりなり、受容体結合ドメインは前記脂質会合ペプチドに共有結合により連結されており、受容体結合ドメインおよび脂質会合ペプチドの双方はスクランブル化されている、開示された方法に用いることができる合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。開示された方法に用いることができる開示されたスクランブル化合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドのさらなる非限定的例を表５に掲げる。
【０１０５】
【表５】
2010538005.tif 000006
開示されたスクランブル化合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドはまた、アセチル基およびアミド基を用いてＮ末端およびＣ末端保護することもできる。開示されたスクランブル化合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドはまた、上記したように逆向きとすることもできる。
【０１０６】
また、開示された方法に用いることができる単一ドメイン合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドも開示する。単一ドメイン合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、アポリポ蛋白質Ｅの受容体結合ドメインまたは脂質会合ペプチドよりなり得る。受容体結合ドメインまたは脂質会合ペプチドは、上記したように修飾または改変することができる。例えば、受容体結合ドメインまたは脂質会合ペプチドは突然変異される、スクランブル化される、および／または逆向きにすることができる。デュアルドメインポリペプチドについて、本明細書中で開示された任意の他の修飾または改変もまた、単一ドメインペプチドに用いることもできる。
【０１０７】
開示された方法に用いることができる本明細書中で開示されたペプチドの多数の他の変種または誘導体も考えられる。例えば、スクランブル化ペプチドを逆向きにすることもでき、またはスイッチされた向きとすることもできる。加えて、逆向きのペプチドをスイッチされた向きとすることができる。開示されたペプチドの全ての他の組み合わせも考えられる。該ペプチドの非限定的例は本明細書中に記載される（例えば、表１〜５参照）。本明細書中で用いるように、用語「アナログ」は「変種」および「誘導体」と相互交換可能に用いられる。変種および誘導体が当業者によく理解されており、アミノ酸配列の修飾を含むことができる。そのようなアミノ酸配列の修飾は、典型的には、３つのクラス：実質型変種；挿入型変種；または欠失型変種のうちの１以上に該当する。挿入はアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合ならびに単一アミノ酸残基または複数アミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入型は、通常は、例えば、１〜４の残基の順序で、アミノ末端融合またはカルボキシル末端融合の挿入よりも小さな挿入である。これらの変種は、通常、蛋白質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発させ、それにより、変種をコードするＤＮＡを生じさせ、その後、該ＤＮＡを組換え細胞培養において発現させることによって調製される。公知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位において置換突然変異を行うための技術はよく知られており、例えば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発である。アミノ酸置換は、典型的には、単一残基のものであるが、一度に多数の異なる位置において起こり得る。置換、欠失、挿入またはその任意の組み合わせを合わせて、最終の誘導体またはアナログに到達することができる。置換変種は、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されているものである。そのような置換が、一般には、表６および７に従ってなされ、保存的置換と言われる。
【０１０８】
機能または免疫学的同一性の実質的変化は、表６中のそれよりも保存的でない置換を選択する、すなわち、（ａ）例えば、シートまたはらせん立体配座としての置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを維持することに対してそれらの効果がより有意に異なる残基を選択することによってなされる。一般に、蛋白質特性の最大の変化を生じさせると予測される置換は：（ａ）親水性残基、例えば、セリルまたはスレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルに対して（またそれによって）置換される；トリプトファン、チロシニル（ｂ）システインまたはプロリンが任意の他の残基に対して（またはそれによって）置換される；（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、またはヒスチジルが電気陰性残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルに対して（またはそれによって）置換される；（ｄ）大きな側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有しないもの、例えば、この場合はグリシンに対して（またはそれによって）置換される、または（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化のための部位の数を増大させる置換である。
【０１０９】
本明細書中における開示された蛋白質の変種および誘導体を定義する１つの方法は、それらを、特定の公知の配列に対する相同性／同一性の点で定義することであると理解される。本明細書中で具体的に引用された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドに対して少なくとも７０％または少なくとも７５％または少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％相同性を有する、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、および本明細書中に開示された他の蛋白質またはペプチドの変種を具体的に開示する。当業者であれば、どのようにして２つの蛋白質の相同性を決定するかを容易に理解する。
【０１１０】
【表６】
2010538005.tif 000007
本明細書中で種々のポリペプチドおよびポリペプチド配列を議論するように、それらのポリペプチド配列をコードすることができる核酸もまた開示することは理解される。これは、具体的ポリペプチド配列に関連する全ての縮重配列、すなわち、１つの特定のポリペプチド配列をコードする配列を有する全ての核酸、ならびに蛋白質配列の開示された変種および誘導体をコードする、縮重核酸を含めた全ての核酸を含むであろう。かくして、各特定の核酸配列は本明細書中においては記載されなくてもよく、各々およびあらゆる配列は事実開示され、開示されたポリペプチド配列を通じて本明細書中に記載されると理解される。
【０１１１】
【表７】
2010538005.tif 000008
ブロッキング／保護基およびＤ残基
本明細書中に記載される種々の組成物は保護基無しで示すことができる一方で、（例えば、特に経口投与のための）ある実施態様においては、それらは１、２、３、４以上の保護基を有することができる。保護基は、ペプチドのＣ末端および／またはＮ末端、および／またはペプチドを含む１以上の内部残基にカップリングさせることができる（例えば、構成要素のアミノ酸上の１以上のＲ基をブロックすることができる）。かくして、例えば、ある実施態様においては、本明細書中に記載される任意のペプチドが、例えば、アミノ末端を保護するアセチル基および／またはカルボキシル末端を保護するアミド基を有することができる。そのような「デュアル保護ペプチド」の１つの例はＡｃ−ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＲＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ−ＮＨ２（ブロッキング基を有する配列番号：１２）であり、これらの保護基のいずれかまたは双方は、本明細書中に記載されるように、脱離、および／またはもう１つの保護基で置換することができる。
【０１１２】
特定の理論によって拘束されないが、特に、本発明の主題のペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端の封鎖は、経口送達を改良することができ、また血清半減期を増大させることができる。
【０１１３】
広く多数の保護基がこの目的に適している。そのような基は、限定されるものではないが、Ｎ末端保護のために特に好ましいアセチル基およびアルキル基、カルボキシル末端保護のために好ましいアミド基を有するアセチル基、アミド基、およびアルキル基を含む。例えば、保護基は、限定されるものではないが、脂肪酸におけるようなアルキル鎖、プロペオニル、ホルミルその他を含むことができる。カルボキシル保護基はアミド、エステルを含み、エーテル形成保護基を用いることもできる。例えば、アセチル基を用いてアミノ末端を保護することができ、アミド基を用いて、カルボキシル末端を保護することができる。これらのブロッキング基はペプチドのらせん形成傾向を増強させる。さらなるブロッキング基は種々の長さのアルキル基、例えば、ｎが１〜約２０、好ましくは約１〜約１６または１８、より好ましくは約３〜約１３、最も好ましくは約３〜約１０の範囲である式：ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯを有する基を含む。
【０１１４】
加えて、保護基は、限定されるものではないが、脂肪酸におけるようなアルキル鎖、プロペオニル、ホルミルその他を含む。例えば、カルボキシル保護基はアミド基、エステル基、およびエーテル形成保護基を含むことができる。これらのブロッキング基はペプチドのらせん形成傾向を増強させることができる。ブロッキング基は、種々の長さのアルキル基、例えば、ｎが約３〜約２０、好ましくは約３〜約１６、より好ましくは約３〜約１３、最も好ましくは約３〜約１０の範囲である式：ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯを有する基を含むことができる。
【０１１５】
他の保護基は、限定されるものではないが、Ｆｍｏｃ、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、９−フルオレンアセチル基、１−フルオレンカルボキシル基、９−フルオレンカルボキシル基、９−フルオレノン−１−カルボキシル基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、トリチル（Ｔｒｔ）、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ）、４，４−ジメトキシベンズヒドリル（Ｍｂｈ）、トシル（Ｔｏｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、４−メチルベンジル（Ｍｅｂｚｌ）、４−メトキシベンジル（ＭｅＯＢｚｌ）、ベンジルオキシ（ＢｚｌＯ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル（Ｄｄｅ）、２，６−ジクロロベンジル（２，６−ＤｉＣｌ−Ｂｚｌ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、シクロヘキシルオキシ（ｃＨｘＯ）、ｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ）、ｔ−ブトキシ（ｔＢｕＯ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、アセチル（Ａｃ）、およびトリフルオロアセチル（ＴＦＡ）を含む。
【０１１６】
保護／ブロッキング基は、そのような基を本発明のペプチドを含む適当な残基へカップリングさせる方法がそうであるように、当業者によく知られている（例えば、Ｇｒｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｙｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，Ｎ．Ｊ．参照）。例えば、アセチル化は、ペプチドが無水酢酸を用いる樹脂の上にある場合、合成の間に達成することができる。アミド保護は、合成のための適切な樹脂の選択によって達成することができる。
【０１１７】
本明細書中に開示された組成物はまた、本明細書中に記載されるように１以上のＤ−形態（レボよりはむしろデキストロ）アミノ酸を含むこともできる。例えば、少なくとも２つのエナンチオマーアミノ酸、少なくとも４つのエナンチオマーアミノ酸、または少なくとも８または１０のエナンチオマーアミノ酸は「Ｄ」形態のアミノ酸であり得る。加えて、本明細書中に記載されるペプチドのあらゆる他の、またはあらゆるアミノ酸（例えば、あらゆるエナンチオマーアミノ酸）でさえＤ−形態アミノ酸である。加えて、エナンチオマーアミノ酸の少なくとも５０％は「Ｄ」形態であり得、エナンチオマーアミノ酸の少なくとも８０％は「Ｄ」形態であり、エナンチオマーアミノ酸の少なくとも９０％、または全てのエナンチオマーアミノ酸でさえが「Ｄ」形態のアミノ酸であり得る。
ポリペプチドの製造
開示された方法に用いることができるポリペプチドは、当該分野で公知の任意の方法によって製造することができる。開示されたポリペプチドを製造する１つの方法は、蛋白質化学技術によって、２以上のアミノ酸残基、ペプチドまたはポリペプチドを一緒に連結させることである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）化学物質またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学物質（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）いずれかを用い、現在入手可能な実験室器具を用いて化学的に合成される。ペプチドまたはポリペプチドは合成することができ、その合成樹脂から切断することはできず、他方、ペプチドまたは蛋白質の他の断片は合成でき、引き続いて、樹脂から切断することができ、それにより、末端基を露出させ、これは、他の断片上に機能的にブロックキングすることができる。ペプチド縮合反応によって、これらの２つの断片は、各々、それらのカルボキシル末端およびアミノ末端においてペプチド結合を介して共有結合により連結することができる（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  Ｍ  ａｎｄ  Ｔｒｏｓｔ  Ｂ．，Ｅｄ．（１９９３）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，ＮＹ）。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドはインビボにて独立して合成される。一旦単離されれば、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドを連結させて、同様なペプチド縮合反応を介してペプチドまたはその断片を形成することができる。
【０１１８】
例えば、クローン化ペプチド断片または合成ペプチド断片の酵素のライゲーションによって、比較的短いペプチド断片が連結されてより大きなペプチド断片、ポリペプチドまたは全蛋白質ドメインを生じさせることができる（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドの天然化学ライゲーションを利用して、より短いペプチド断片から大きなペプチドまたはポリペプチドを合成により構築することができる。この方法は２工程化学反応よりなる（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６−７７９（１９９４））。最初の工程は、保護されていない合成ペプチド−チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含有するもう１つの保護されていないペプチドセグメントとを化学選択的に反応させて、最初の共有結合生成物としてチオエステル連結中間体を得ることである。反応条件の変化なしで、この中間体は自然発生的で迅速な分子内反応を受けて、ライゲーション部位において天然ペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｍ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：６６２３−３０（１９９４））。
【０１１９】
あるいは、保護されていないペプチドセグメントは、化学的に連結され、化学的ライゲーションの結果としてペプチドセグメントの間に形成された結合は非天然（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１（１９９２））。この技術は、蛋白質ドメインのアナログ、ならびに十分な生物学的活性を有する大量の比較的純粋な蛋白質を合成するのに用いられてきた（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  Ｒｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５７−２６７（１９９２））。
【０１２０】
また、開示された方法に用いることができる開示されたＡｐｏＥ模倣ペプチドを調製するのに用いられる成分、ならびに本明細書中で開示された方法内で用いられる組成物それ自体も開示する。これらの、および他の物質は本明細書中に開示されており、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示され、他方、これらの化合物の各々の種々の個々の組み合わせおよび集合的組み合わせおよび順列の特定の言及が明示的に開示され得ない場合、各々は、本明細書中において、具体的に考えられ、記載されていると理解される。例えば、特定のポリヌクレオチドが開示され、議論されており、かつポリヌクレオチドを含めた多数の分子に対して行うことができる多数の修飾が議論されている場合、具体的に反対のことが示されているのでない限り、ポリヌクレオチドの各々およびあらゆる組み合わせおよび順列、および可能である修飾が具体的に考えられる。かくして、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスが開示され、ならびに分子Ｄ、ＥおよびＦのクラス、および組み合わせ分子Ａ−Ｄの例を開示する場合、たとえ各々が個々に引用されていなくても、各々は個々にかつ集合的に考えられ、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆを意味し開示されていると考えられる。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも開示されている。かくして、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブグループは開示されていると考えられるであろう。この概念は、限定されるものではないが、開示された組成物を製造し、および使用する方法における工程を含めた、本出願の全ての態様に適用される。かくして、実行することができる種々のさらなる工程がある場合、これらのさらなる工程の各々は、開示された方法の任意の特定の実施態様または実施態様の組み合わせにて実行することができると理解される。
【０１２１】
本明細書中において開示された遺伝子および蛋白質の任意の公知の変種および誘導体、または生起するかもしれないものを定義する１つの方法は、特定の公知の配列に対する相同性の点で、変種および誘導体を定義することによるものであると理解される。具体的に開示されているのは、記載された配列に対して少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセント相同性を有する本明細書中に開示された遺伝子および蛋白質の変種である。当業者であれば、２つの蛋白質、または遺伝子のような核酸の相同性をどのようにして決定するかを容易に理解する。例えば、相同性は、該相同性がその最高レベルとなるように２つの配列を整列させた後に計算することができる。
【０１２２】
相同性を計算するもう１つの方法は、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比較のための配列の最適な整列は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性のための検索によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって、または調査によって行うことができる。
【０１２３】
相同性の同一のタイプは、核酸については、例えば少なくとも核酸整列に関連する物質について本明細書中に参照によって援用する、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９に開示されたアルゴリズムによって得ることができる。
【０１２４】
例えば、本明細書中で用いるように、もう１つの配列に対して特定のパーセント相同性を有するとして引用された配列とは、上記した計算方法の任意の１以上によって計算されるような引用相同性を有する配列をいう。例えば、Ｚｕｋｅｒ計算方法を用いて第一の配列が第二の配列に対して８０パーセント相同性を有すると計算される場合、たとえ第一の配列が任意の他の計算方法によって計算されるように第二の配列に対して８０パーセント相同性を有しなくても、第一の配列は、本明細書中で定義するように、第二の配列に対して８０パーセント相同性を有する。もう１つの例として、Ｚｕｋｅｒ計算方法ならびにＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ計算方法の双方を用いて、第一の配列が第二の配列に対して８０パーセント相同性を有すると計算される場合、たとえＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒ  ｍａｎ計算方法、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ計算方法、Ｊａｅｇｅｒ計算方法、または他の計算方法のいずれかによって計算するように、第一の配列が第二の配列に対して８０パーセント相同性を有しなくても、第一の配列は、本明細書中で定義するように、第二の配列に対して８０パーセント相同性を有する。なおもう１つの例として、（実践的には、異なる計算方法は、しばしば、異なる計算された相同性パーセンテージをもたらすが）各々の計算方法を用いて、第一の配列が第二の配列に対して８０パーセント相同性を有する場合、第一の配列は、本明細書中に定義するように、第二の配列に対して８０パーセント相同性を有する。
組成物の送達
本明細書中で記載された方法において、組成物（例えば、ＡｐｏＥ模倣ポリペプチド）の細胞への送達は、種々のメカニズムを介することができる。上記で定義したように、本明細書中で開示するのは、医薬上許容される担体のような担体も含んでもよい本発明の組成物を製造するのに用いることができる本明細書中に記載されたポリペプチド、核酸、ベクターおよび／または抗体のいずれかの１以上を含む組成物である。例えば、本明細書中に開示する合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチド、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を開示する。
【０１２５】
ポリペプチドは（例えば、ミクロ粒子、リポソームまたは細胞に取り込まれた）溶液または懸濁液とすることができる。これらの組成物は、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定の細胞タイプに標的化することができる。当業者であれば、本発明の組成物でどのようにしてそのような標的化剤を製造し、使用するのかを知っている。標的化剤は、抗体コンジュゲート型リポソームなどのようなビヒクル；細胞特異的リガンドを通じてのＤＮＡの受容体媒介標的化、およびインビボでの細胞の高度に特異的なレトロウイルス標的化などであり得る。任意のそのようなビヒクルは、本発明の組成物の一部であり得る。一般に、受容体は、構成的またはリガンドで誘導されたかのいずれかである、エンドサイトーシスの経路に関与する。クラスリン被覆ピット中のこれらの受容体クラスターはクラスリン被覆小胞を介して細胞に侵入し、そこで受容体がソーティングされる酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面にリサイクルされるか、細胞内に貯蔵されるか、またはライソゾーム中で分解されるかのいずれかである。内在化経路は、栄養素摂取、活性化蛋白質の除去、マクロ分子のクリアランス、ウイルスおよびトキシンの日和見的侵入、リガンドの解離および分解、リガンド結合価、およびリガンド濃縮のような種々の機能を発揮する。
【０１２６】
例えば、本明細書中に記載された組成物は医薬上許容される担体を含むことができる。「医薬上許容される」とは、当業者によく知られているように、有効成分の任意の分解を最小限とし、および被験体において任意の有害副作用を最小限とするように選択されるであろう物質または担体を意味する。担体の例はジミリストイルホスファチジル（ＤＭＰＣ）、リン酸緩衝生理食塩水またはマルチ小胞リポソームを含む。例えば、ＰＧ：ＰＣ：コレステロール：ペプチドまたはＰＣ：ペプチドを本発明において担体として用いることができる。他の適当な医薬上許容される担体およびそれらの製剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。典型的には、適当な量の医薬上許容される塩を製剤に用いて、製剤を等張とする。医薬上許容される担体の他の例は、限定されるものではないが、生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む。溶液のｐＨは約５〜約８、または約７〜約７．５とすることができる。さらなる担体は、組成物を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような維持放出調製物を含み、そのマトリックスは、成形された製品、例えば、フィルム、（血管形成術手法の間に血管にインプラントされる）ステント、リポソームまたはミクロ粒子の形態である。ある種の担体は、例えば、投与経路、および投与される組成物の濃度に依存して、より好ましいであろうことは当業者に明らかであろう。これらは、最も典型的には、滅菌水、生理食塩水、および生理学的ｐＨの緩衝溶液のような溶液を含めた、ヒトへの薬物の投与のための標準的な担体であろう。
【０１２７】
本発明のポリペプチド、ペプチド、核酸、ベクターの意図した活性が影響を受けない限り、医薬組成物はまた担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存剤などを含んでもよい。医薬組成物はまた、抗微生物剤、抗炎症剤、麻酔剤などのような（本発明の組成物に加えて）１以上の有効成分を含んでもよい。医薬組成物は、局所または全身治療が求められるか、および治療すべき領域に依存して多数の方法で投与することができる。
【０１２８】
非経口投与の調製物は滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射有機エステルである。水性担体は、生理食塩水および緩衝媒体を含めて、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む。非経口ビヒクルは塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、加乳リンゲル、または不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは流体および栄養素補充液、（リンゲルデキストロースに基づくもののような）電解質補充液などを含む。例えば、抗微生物剤、抗オキシダント、キレート化剤、および不活性ガスなどのような保存剤および他の添加剤も存在させてもよい。
【０１２９】
眼投与用の製剤は軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点剤、坐薬、スプレー、液体および粉末を含んでもよい。慣用的な医薬担体、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤などが必要であり、または望ましいであろう。
【０１３０】
経口投与用の組成物は粉末または顆粒、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ剤または錠剤を含む。増粘剤、フレーバー剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、またはバインダーが望ましいであろう。
【０１３１】
組成物のいくつかは、潜在的には、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸のような無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸のような有機酸との反応によって、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基、ならびにモノアルキル、ジアルキル、トリアルキルおよびアリールアミン、および置換エタノールアミンのような有機塩基との反応によって形成された、医薬上許容される酸付加塩または塩基付加塩として投与してもよい。
本発明の組成物の製造方法
本明細書中に開示された組成物、および開示された方法を実行するのに必要な組成物は、特に別の記載がない限り、その特定の試薬または化合物について当業者に知られた任意の方法を用いて製造することができる。例えば、合成化学方法および標準分子生物学方法のようなこれらの組成物を製造するのに用いることができる種々の方法がある。
【０１３２】
本明細書中に開示されたペプチドまたはポリペプチドを用いて、本発明のある他の態様を実施することができる。例えば、本発明のペプチドおよびポリペプチドを用いて、本発明の抗体を産生することができる。本発明の核酸およびベクターを用いて、本発明のペプチドおよびポリペプチドおよび他の組換え蛋白質を産生することができる。本発明の宿主細胞を用いて、本発明の核酸、蛋白質、ペプチド、抗体、およびトランスジェニック動物を作成することができる。これらの合成方法は上記される。
【０１３３】
上記したように、本発明のポリペプチドまたはペプチドを用いて、ポリペプチドまたはポリペプチドの断片に特異的に結合する抗体を生じさせてもよい。得られた抗体を免疫親和性クロマトグラフィー手法に用いて、ポリペプチドを単離するか、もしくは精製し、またはポリペプチドが生物学的試料に存在するか否かを決定することができる。そのような手法において、抽出物のような蛋白質調製物または生物学的試料を、本発明のポリペプチド、それに実質的に同一の配列、またはこれまでの配列の断片の１つに特異的に結合することができる抗体と接触させる。
【０１３４】
免疫親和性手法において、抗体をビーズまたはカラムマトリックスのような固体支持体に結合させる。蛋白質調製物を、抗体が本発明のポリペプチドの１つに特異的に結合する条件下で抗体に接触させる。非特異的に結合した蛋白質を除去するための洗浄の後、特異的に結合したポリペプチドを溶出させる。
【０１３５】
抗体に結合する生物学的試料中の蛋白質の能力は、当業者が精通した種々の任意の手法を用いて決定することができる。例えば、結合は、蛍光剤、酵素標識、または放射性同位体のような検出可能な標識で抗体を標識することによって決定することができる。あるいは、抗体の試料への結合は、そのような検出可能な標識をその上に有する二次抗体を用いて検出することができる。特定のアッセイはＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチアッセイ、ラジオイムノアッセイ、およびウエスタンブロットを含む。
【０１３６】
本発明の抗体を固体支持体に結合させ、これを用いて、本発明のアポリポ蛋白質Ｅまたはポリペプチドを固定化することができる。本発明のポリペプチドに対して生じるポリクローナル抗体は、ポリペプチドの動物への直接注射によって、またはポリペプチドを動物に投与することによって得ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体はポリペプチドそれ自体に結合するであろう。このようにして、ポリペプチドの断片のみをコードする配列さえ用いて、全天然ポリペプチドに結合することができる抗体を生じさせることができる。次いで、そのような抗体を用いて、そのポリペプチドを発現する細胞からポリペプチドを単離することができる。
【０１３７】
以下の実施例を参照して本発明をさらに説明するが、本発明はそのような実施例に限定されないことは理解されるべきである。むしろ、本発明を実施するための現在の最良の形態を記載する本開示に鑑みて、多くの変更および変形は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者にそれら自体を提示する。特許請求の範囲の意味および均等な範囲内の全ての変化、変更、変形はそれらの範囲内にあると考えるべきである。
３．方法
ＤＭは低ＨＤＬ−Ｃ、高ＴＧおよび高ｓｄＬＤＬによって特徴付けられる。さらに、低ＨＤＬを有する個体は高インスリン血症およびインスリン抵抗性も有し得、かつＤＭを発症する増大した危険性にある。薬物に関する臨床的研究および生活習慣の変更は、増大したＨＤＬレベルが糖尿疾患または心血管疾患の危険性の減少に関連することを示した。ＤＭ−２はＨＤＬの定量的な低下のみならず、定性的な変化にも関連する（ｗｗｗ．ｎｉｄｄｋ．ｎｉｈ．ｇｏｖ；Ｋｎｏｗｌｅｒ  ＷＣ  ｅｔ  ａｌ  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．（２００２）３４６（６）：３９３−４０３；Ｓｈａｔｅｎ  ＢＪ  ｅｔ  ａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ．（１９９３）１６：１３３１−９；Ｂｅｔｔｅｒｉｄｇｅ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２００５）６８Ｓ２：Ｓ１５−２；およびｗｗｗ．ｆｒａｍｉｎｇｈａｍｈｅａｒｔｓｔｕｄｙ．ｏｒｇ）。ＤＭ−２から単離されたＨＤＬの組成分析はＴＧ豊富化、コレステロールの枯渇、およびアポリポ蛋白質（ａｐｏ）Ａ−Ｉの増強した酸化的架橋を示す（Ｂｅｔｔｅｒｉｄｇｅ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２００５）６８Ｓ２：Ｓ１５−２２，Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  ＳＪ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．（２００６）４７（５）：９９２−７）。これらの変化は、ＨＤＬおよびその蛋白質の構成要素アポＡ−Ｉの抗炎症特性、抗オキシダント特性および抗アテローム性動脈硬化症特性の減衰に関連する。ＤＭ−２の発症および進行における炎症の重要な役割に対する増大しつつある証拠がある。これは、ＣＲＰ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよび血清アミロイドＡのような種々の急性相反応体がＤＭ−２において上昇するという事実によって裏付けられる。Ｎｆ−κＢは、ＤＭ−２をもたらす炎症カスケードの中枢的メディエーターの一つであり得る。反応性酸素種（ＲＯＳ）もまた、インスリン抵抗性の多数の形態における原因的役割を有する。Ｈｏｕｓｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．は、ＲＯＳの増加は検出可能なインスリン抵抗性の発症に先行することを示した。ＲＯＳのさらなる減少は、改善されたインスリン感受性およびグルコースホメオスタシスに関連する。ＨＤＬ、およびアポＡ１およびパラオキサナーゼ（ＰＯＮ）のようなその関連蛋白質は優れた抗オキシダントであって、したがって、インスリン感受性を改善し得るか、または同様にグルコース不耐性の発症または進行を妨げ得る。しかしながら、ＤＭ−２はＨＤＬおよびそのより優れた亜種ＨＤＬ−２の減少したレベルに関連する。さらに、糖尿病患者に存在するＨＤＬは、非糖尿病患者から得られたものと逆コレステロール輸送について同等に優れていない。さらに、糖尿病患者に存在するＨＤＬは、非糖尿病患者からのものとＬＤＬ酸化を妨げるのに同程度に効果的ではないだろう。これは、ＤＭ−２が有意なプロオキシダント状態およびプロ炎症状態のみならず、正に少なくとも機能不全であるその様なメカニズムに対立する正常なホメオスタシスメカニズムによって特徴付けられることを示す。オキシダント、炎症および脂質異常症効果もまた膵臓ベータ細胞のアポトーシスをもたらす。ベータ細胞の喪失の結果、減少したインスリン分泌およびＤＭ−２の進行がもたらされる。
【０１３８】
ＤＭ−２における潜在的治療標的はリポ蛋白質、特に、炎症環境も改変し得るＨＤＬであり得る。ＨＤＬ療法の分野において出現する領域は、アポミメティックペプチドの開発である（Ｌｉｎｓｅｌ−Ｎｉｔｓｃｈｋｅ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．（２００５）４（３）：１９３−２０５）。その右旋性の形態において、４Ｆは、高親和性脂質会合ペプチド１８Ａ（ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ）の修飾された形態を表す、（Ｄ−アミノ酸での合成のための）経口的に活性なアポＡ−Ｉミメティックペプチドである（Ｌｉｎｓｅｌ−Ｎｉｔｓｃｈｋｅ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．（２００５）４（３）：１９３−２０５；Ｏｔｖｏｓ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．（２００６）；１１３（１２）：１５５６−６３；Ｂｒｏｗｎ  ＢＧ  ｅｔ  ａｌ  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．（２００１）３４５（２２）：１５８３−９２；Ｎｉｓｓｅｎ  ＳＥ  ｅｔ  ａｌ  ＪＡＭＡ．（２００７）；２９７（１２）：１３６２−７３）。このクラスＡ両親媒性らせん状ペプチドは小さなＨＤＬ様粒子または前βＨＤＬを形成する（Ｌｉｎｓｅｌ−Ｎｉｔｓｃｈｋｅ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．（２００５）４（３）：１９３−２０５）。Ｄ−４Ｆは血漿ＨＤＬ濃度および／またはパラオキソナーゼ−１（ＰＯＮ−１）、酸化されたリン脂質を加水分解する抗オキシダント酵素の増加を刺激する（Ｌｉｎｓｅｌ−Ｎｉｔｓｃｈｋｅ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．（２００５）４（３）：１９３−２０５）。ヒト内皮細胞のアポＡ−Ｉミメティックペプチドとのインキュベーションは、ＬＤＬ酸化を阻害する天然ＨＤＬの能力を模倣する（Ｂｒｏｗｎ  ＢＧ  ｅｔ  ａｌ  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．（２００１）  ３４５（２２）：１５８３−９２；ＦＩＥＬＤ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ  Ｌａｎｃｅｔ（２００５）３６６：１８４９−１８６１；Ｎｉｓｓｅｎ  ＳＥ  ｅｔ  ａｌ  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．（２００７）；３５６（１３）：１３０４−１６）。また、アポＡ−ＩミメティックペプチドはＬＤＬ誘導単球遊走能、およびマクロファージの高コレステロール血症マウスの大動脈弓への浸潤を低下させる（Ｌｉｎｓｅｌ−Ｎｉｔｓｃｈｋｅ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．（２００５）４（３）：１９３−２０５）。他の研究は、インターロイキン６の発現の阻害によって、アポＡ−Ｉミメティックが抗炎症効果を発揮することを示す（Ｎａｖａｂ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．（２００６）２（９）：５０４−１１）。本明細書中において、他の個所で開示したように、デュアルドメインペプチドといわれるペプチドのもう１つのクラスがある。これらのペプチドもまた、スーパーオキシドの生成を阻害し、内皮機能を改善する。４ＦのようなアポＡ−Ｉミメティックスとは対照的に、これらのペプチドはまた、アポリポ蛋白質Ｅと同様な血漿からアテローム形成性リポ蛋白質を除去する。したがって、これらのペプチドは脂質降下、およびまた、抗オキシダント特性および抗炎症特性を保有する。例えば、以下に記載す���ように、ペプチドＬ−４ＦはＤＭ−２のよく確認されたモデルであるＺＤＦラットにおいてグルコースホメオスタシスを改善する。記載されたデュアルドメインペプチドを用いる方法を以下に記載する。
【０１３９】
被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法を本明細書中に開示する。例えば、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体において血漿グルコースの濃度が減少することを含む、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法を開示する。
【０１４０】
また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体において血漿グルコースの濃度が減少することを含み、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは医薬上許容される担体を含む組成物にて投与される、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法を開示する。
【０１４１】
また、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法も開示する。例えば、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物を被験体に投与し、それにより、被験体において血漿グルコースの濃度が減少することを含む、被験体において血漿グルコースの濃度を減少させる方法を開示する。
【０１４２】
また、糖尿病を有する患者を治療する方法も開示する。例えば、有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体において血漿グルコースの濃度が減少することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法を開示する。
【０１４３】
さらに、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む有効量の医薬組成物を被験体に投与し、それにより、被験体において血漿グルコースの濃度が減少することを含む、糖尿病を有する患者を治療する方法を開示する。
【０１４４】
ペプチドはまた、被験体における血漿グルコースの濃度に影響することなく、糖尿病を有する被験体を治療し、および／または被験体において糖尿病合併症を低下させるのに効果的であり得る。例えば、有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体において血漿グルコースの濃度が改変しないことを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法を開示する。
【０１４５】
また、有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体において、血漿グルコースの濃度が改変しないことを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法も開示する。
【０１４６】
また、有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体において血漿グルコースの濃度が改変しないことを含む、被験体において糖尿病合併症を低下させる方法も開示する。
【０１４７】
また、（ａ）糖尿病を有する被験体を選択し；（ｂ）有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し；それにより、被験体において糖尿病を治療することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法も開示する。被験体は、糖尿病を有する患者を同定する任意の公知の方法を用いて選択することができる。例えば、被験体は、高ＨｇｂＡ１ｃレベル、（例えば、ランダム血漿グルコースまたは絶食血漿グルコーステストを介する）異常な血漿グルコースレベル、（例えば、グルコース耐性テストを介する）グルコースを代謝する無能力、（例えば、インスリン耐性テストを介する）血漿グルコースレベルを低下させる外因性インスリンの無能力に基づいて選択することができる。また、被験体は、ＣＲＰおよびＳＡＡのような炎症マーカーの存在に基づいて、または被験体の家族歴に基づいて選択することもできる。例えば、経口グルコース耐性テストの間に、ランダム血液グルコース濃度１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ（２００ｍｇ／ｄＬ）または絶食血漿グルコース７．０ｍｍｏｌ／Ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）または２時間血漿グルコース１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ（２００ｍｇ／ｄＬ）を有する被験体は、糖尿病を有する被験体と示すことができる。２型ＤＭを有する被験体は、３つの病理生理学的異常：低下したインスリン分泌、末梢インスリン抵抗性、および／または過剰な肝グルコース産生によって特徴付けられるか、または同定することができる。
【０１４８】
また、（ａ）糖尿病を有する被験体を選択し；（ｂ）合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む有効量の医薬組成物を被験体に投与し；それにより、被験体において、糖尿病を治療することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法も開示する。
【０１４９】
また、有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体において血漿グルコースの濃度が減少し、それにより、被験体において糖尿病を治療することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法も開示する。
【０１５０】
また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む有効量の医薬組成物を被験体に投与し、それにより、被験体において血漿グルコースの濃度が減少し、それにより、被験体において糖尿病を治療することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法を開示する。
【０１５１】
また、糖尿病を有する被験体を選択し；有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し；それにより、被験体において糖尿病を治療することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法も開示する。
【０１５２】
また、糖尿病を有する被験体を選択し；合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む有効量の医薬組成物を被験体に投与し；それにより、被験体において糖尿病を治療することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法も開示する。
糖尿病合併症
糖尿病合併症は多くの器官系に影響し、該疾患に関連する罹患率および死亡率の大部分の原因となる。慢性合併症は血管および非血管合併症に分類することができる。血管合併症は、さらに、微小血管（網膜障害、神経障害、腎臓障害）および大血管合併症（冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳血管疾患）に細かく分けられる。非血管合併症は胃不全麻痺、乾癬、皮膚変化のような問題を含む。慢性合併症の危険性は高血糖症の持続の関数として増大し；それらは、通常、高血糖症の次の十年で明らかになる。２型ＤＭはしばしば高血糖症の長い無症状期間を有するので、２型ＤＭを有する多くの個体は診断の時点において合併症を有する。
【０１５３】
糖尿病合併症は、限定されるものではないが、しばしば透析または腎臓移植を必要とする腎臓障害；末梢神経障害；盲目に至る網膜障害；切断に至る脚および足の潰瘍形成；肝硬変まで進行する脂肪肝疾患；動脈疾患および心筋梗塞、胃不全麻痺、自律神経系に関連する疾患、神経状態異常、ｉ．ｖ．コントラスト誘導腎臓障害、（脳内および脳外双方の）小血管疾患、性腺機能低下症および心不全に対する脆弱性を含む。
【０１５４】
このように、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与することを含み、被験体における糖尿病合併症が低下することを含む、被験体において糖尿病合併症を低下させ、または治療する方法を開示する。また、本明細書中の他の個所に記載された方法も開示され、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、既に使用されている他のよく知られた療法および予防ワクチンと組み合わせて、および／または糖尿病患者を治療し／低インスリンレベルを治療し／インスリンレベルを増大させるのに用いられる薬物と組み合わせて、または糖尿病患者を治療し／低インスリンレベルを治療し／インスリンレベルを増大させるのに用いられる薬物と組み合わせて用いることができる。
【０１５５】
本明細書中に記載される方法に用いられる合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、１以上の任意の上記したアポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドであり得る。例えば、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは、配列番号：１１〜１４、１８〜５７、６０、６１、および６２〜１０３よりなる群から選択される配列を含む。合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドは受容体結合ドメインペプチドおよび脂質会合ペプチドを含むことができ、前記脂質結合ドメインペプチドは前記受容体結合ドメインペプチドに共有結合により連結している。
Ｂ細胞アポトーシス
ＤＭは、発症の年齢または療法タイプのようなより初期の基準とは反対に、高血糖症に至る病理的プロセスに基づいて分類される。上記したように、ＤＭの二つの広いカテゴリーは１型および２型と命名される。１Ａ型ＤＭは、インスリン欠乏に至る自己免疫ベータ細胞の破壊に由来する。１Ｂ型ＤＭを有する個体は、ベータ細胞の自己免疫破壊プロセスを示す免疫学的マーカーを欠如する。しかしながら、彼らは未知のメカニズムによってインスリン欠乏を発症し、ケトーシスの傾向がある。
【０１５６】
開示されたペプチドを用いて、β細胞アポトーシスを阻害することもできる。β細胞アポトーシスを阻害することによって、β細胞集団を維持することができ、それにより、インスリンレベルを保持する。インスリンレベルを保持することによって、増大した血漿グルコースレベルに関連する場合がある酸化的ストレスを低下させることができる。換言すれば、インスリンレベルをサルベージすることによって、抗オキシダント効果がある。
【０１５７】
このように、被験体においてβ細胞アポトーシスを低下させる方法を開示する。例えば、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体におけるβ細胞アポトーシスが低下することを含む、被験体においてβ細胞アポトーシスを低下させる方法を開示する。また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物を被験体に投与し、それにより、被験体においてβ細胞アポローシスが低下することを含む、被験体においてβ細胞アポトーシスを低下させる方法を開示する。加えて、有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体においてβ細胞アポトーシスが低下することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法を開示する。また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む有効量の医薬組成物を被験体に投与し、それにより、被験体においてβ細胞アポトーシスが低下することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法も開示する。被験体は、糖尿病を有する被験体、または糖尿病合併症を有する被験体であり得る。
【０１５８】
また、被験体において酸化的ストレスを低下させる方法も本明細書中で開示する。例えば、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体において酸化的ストレスが低下することを含む、被験体において酸化的ストレスを低下させる方法を開示する。また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む医薬組成物を被験体に投与し、それにより、被験体において酸化的ストレスが低下することを含む、被験体において酸化的ストレスを低下させる方法も開示する。加えて、有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、被験体において酸化的ストレスが低下することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法を開示する。また、合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドおよび医薬上許容される担体を含む有効量の医薬組成物を被験体に投与し、それにより、被験体において酸化的ストレスが低下することを含む、糖尿病を有する被験体を治療する方法も開示する。被験体は糖尿病を有する被験体、または糖尿病合併症を有する被験体であり得る。
【０１５９】
上記した全ての方法は、本明細書中に記載される他の方法について記載されるように行うことができる。加えて、上記した方法を用いて、血漿グルコースレベルを低下させること、ならびにインスリンレベルを増大させることの双方を行うこともできる。例えば、単独で、または上記したように糖尿病患者を治療し／低インスリンレベルを治療し／インスリンレベルを増大させるのに用いられるもう１つの薬物と組み合わせて、開示された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドの１以上を投与することによって、被験体のβ細胞アポトーシスを低下させ、および／または酸化的ストレスを低下させることによって、被験体において、血漿グルコースレベルを低下させ、およびインスリンレベルを増大させることができる。
移植
移植された心臓または心臓同種移植片血管症（ＣＡＶ）における慢性拒絶は、心臓移植レシピエントの間で晩年の死亡の主な原因である。ＣＡＶを制御するための戦略は、伝統的には、リンパ球の機能に焦点を当ててきた。Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．は、優れた抗炎症／抗オキシダント特性を有する単一ドメインアポＡ−ＩミメティックペプチドであるＤ−４ＦがＣＡＶを減衰させることができることを示している（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２００７）８４（２）：２３８−２４３）。Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．は、従前に、ＣＡＶの特徴付けられたネズミモデルを用いた。Ｂ６．Ｃ−Ｈ２心臓はＣ５７ＢＬ／６マウスに異所的に移植された。レシピエントマウスは２０ｍｇのＤ−４Ｆまたは担体いずれかで毎日処理された。ドナーの心臓を移植から２４日後に採取した。レシピエントのＤ−４Ｆでの処理は血管内膜病変の重症度を低下させた（６２．５＋／−３．４％対３１．１＋／−８．７％，ｐ＜０．００９）。また、処理の結果、グラフト浸潤ＣＤ４リンパ球およびＣＤ８リンパ球ならびにＣＸＣＲ３＋Ｔリンパ球サブセットの数の減少がもたらされた。ドナー心臓におけるヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）遺伝子転写体をＤ−４Ｆ処理でアップレギュレートし、ＨＯ−１の遮断は、部分的に、Ｄ−４Ｆの有利な効果を逆行させた。インビトロ実験は、Ｄ−４Ｆが同種異系Ｔ−リンパ球の増殖およびエフェクターサイトカインの産生を低下させることを示した。これらのプロセスはＨＯ−１非依存的であった。この実験は、プロトタイプのアポＡ−ＩミメティックペプチドであるＤ−４Ｆが、グラフトにおけるＨＯ−１の誘導を介するＣＡＶ、およびＴリンパ球機能に対する直接効果を制御するのに効果的であることを示唆する。抗炎症特性／抗オキシダント特性を有するペプチドのこのクラスは、ＣＡＶの処置における新規な戦略を提供する。このように、開示された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを用いて、被験体においてＣＡＶを治療することもできる。例えば、有効量の合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを被験体に投与し、それにより、グラフト浸潤ＣＤ４リンパ球およびＣＤ８リンパ球ならびにＣＸＣＲ３＋Ｔリンパ球サブセットの数が低下し、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）遺伝子転写体が増大し、ＨＯ−１遮断が逆行し、および／または同種異系Ｔリンパ球の増殖およびエフェクターサイトカインの産生が低下することを含む、ＣＡＶを有する被験体を治療する方法を開示する。
【０１６０】
開示された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを膵臓移植に用いることもできる。上記したように、開示された合成アポリポ蛋白質Ｅ模倣ペプチドを用いて、β細胞移植において価値を有するβ細胞アポトーシスを低下させることができる。膵臓移植を受ける被験体においてβ細胞アポトーシスを低下させることによって、被験体のベータ細胞は機能的なままであり得、したがって、インスリンレベルを維持することができる。このように、酸化的ストレスを、膵臓移植を受ける被験体において低下させることもできる。
均等論
当業者であれば、本明細書中で具体的に記載された特定の実施形態に対する多数の均等論を、ルーチン的に過ぎない実験を用いて認識し、または確認することができるだろう。そのような均等論は、特許請求の範囲の範囲内に含まれることを意図する。
【実施例】
【０１６１】
（実施例１）
従前の研究は、抗オキシダントおよび抗炎症特性を示したアポミメティックペプチド（４Ｆ、Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２）で行われてきた。ＷＨＨＬウサギにおいて内皮機能の改善におけるＡｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２の効果もまた従前に示されている（Ｇｕｐｔａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．（２００５）：１１１（２３）：３１１２−８）。これらのウサギは欠陥があるＬＤＬ受容体を有し、したがって、増大したアテローム形成性リポ蛋白質（おもにＬＤＬ）を有する。Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２ペプチドの単一の投与の結果、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールの劇的な減少がもたらされたことが判明した。これは、改善された大動脈内皮機能に関連するものであった。内皮機能におけるこの改善は、部分的には、血漿脂質ヒドロペルオキシドの関連する減少が伴うＰＯＮ活性の増大によって媒介された（図１）。また、図１は、ＷＨＨＬウサギが欠陥のあるＬＤＬ受容体を有し、したがって、脂質異常症によるアテローム性動脈硬化症の傾向があることを示す。ＰＯＮはＨＤＬに関連する抗オキシダント酵素であり、血漿中のＬＯＯＨの捕捉に関与する。１％コレステロールを与えたＮＺＷウサギにおけるＡｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２の脂質降下効果もまた示されている。これらの動物は、ＶＬＤＬタイプの粒子が豊富な上昇コレステロールを有する。
【０１６２】
Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２を、図面に示したように、２回静脈内投与した（ｎ＝４）。１４日（高脂肪性食事の開始から２１日後）の最後に、対照ウサギにおける血漿コレステロールレベルは２０００ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝４）の範囲にあったが、該ペプチドを投与したウサギは１０００ｍｇ／ｄｌの範囲のコレステロール値を示した。ペプチドのただ２回の投与は、総コレステロールを有意に低下させるのに効果的であった（図２）。
【０１６３】
実験のもう１つの組において、Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２は１％コレステロールを与えたＮＺＷウサギにおいて、血漿混濁を一掃することが認められた。３ｍｇ／ｋｇのペプチドを毎週静脈内投与した。食事の開始から５１日後にウサギを屠殺にした。大動脈を収穫し、オイルレッドＯ染色組織試料についてエンフェイス（ｅｎ  ｆａｃｅ）分析を行った。結果は、Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２が、１％コレステロールを与えたＮＺＷウサギにおいてアテローム性動脈硬化症を阻害することを示した。これは、５１日目における、アテローム形成性リポ蛋白質の減少およびアテローム性動脈硬化症の阻害に関連した。
【０１６４】
げっ歯類モデルにおいて、ＬＰＳ誘導ＶＣＡＭ−１発現および、敗血症経路を妨げる４Ｆの抗炎症効果、ならびに４Ｆの多数の抗炎症特性および抗オキシダント特性もまた従前に報告されている。４Ｆの作用の重要なメカニズムの１つは、図３に描かれたように、前βＨＤＬの形成に関連させることができる。Ｄ−４Ｆおよびスクランブル化Ｄ−４Ｆの双方はかなり水溶性であると決定された。２ミリグラムのＤ−４Ｆまたはスクランブル化Ｄ−４Ｆ（Ｓｃ  Ｄ−４Ｆ）を秤量し、５００μＬのアポＥヌルマウス血漿に溶解させ、さらなる血漿で５００μｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈し、温和に混合しつつ３７℃にて２０分間インキュベートした。血漿を第１の次元においてアガロース電気泳動、および第２の次元において天然ＰＡＧＥによって分画し、抗マウスＡｐｏＡ−Ｉでのウエスタン分析に付した。図３は、インビトロ、アポＥヌルマウス血漿において、Ｄ−４ＦがアポＡ−Ｉのα移動粒子から前β移動粒子への主な再分布を引き起こすことを示す。
【０１６５】
この実施例は、ＤＭ−２の発症および進行の防止におけるこれらのペプチドの効果の評価を行った研究を概説する。図４は（Ａ）欠陥があるレプチン受容体を有する５〜６週齢雄ＺＤＦ（ｆａ／ｆａ）に、ＨＤＬの特性を模倣するペプチド（各々、Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２およびＬ−４Ｆ）（５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）、またはビヒクル（対照）単独（ｎ＝７〜８／群）が投与されたことを示す。ベースライン絶食血漿をペプチドの投与に先立って回収した。２週間毎の注射（Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２群について６回、およびＬ−４Ｆ群について５回、第１８日の前に投与した）。１８日〜３３日に、さらなるペプチド／ビヒクル注射は行わなかった。対照動物は、増大する絶食血漿グルコースレベルを示した。比較において、ペプチド処理動物は、１８日目および３３日目において血漿グルコースの軽度な増大のみを示した。（Ｂ）対応するインスリンレベルを、対照およびＡｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２群のみにおいて示す。対照動物は、高インスリン血症および高血糖症によって示されるように、１８日目において比較的インスリン抵抗性となる。３３日までに、対照動物はより高い血漿グルコースにもかかわらず血漿インスリンの減少を示し、ベータ細胞機能の喪失を示す。対照的に、Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２処理動物は、より低い血漿中インスリンレベルおよび正常な血漿グルコースレベルによって示されるように、１８日目においてかなり少ないインスリン抵抗性を示す。これらの動物に対してペプチドを更に投与しないにもかかわらず、それらは血漿インスリンの増大および血漿グルコースのより軽度な増大と共に比較的保存されたベータ細胞の機能を継続的に示す。データは平均±ＳＥＭとして表す；＊ｐ＜０．０５。
【０１６６】
以下の結果は、アポミメティックペプチドがＤＭ−２の発症および進行の防止において、極端に優れていることを示す（図４）。ビヒクルと比較して、ペプチドの比較的頻繁でない注射（２週間毎）は、ＺＤＦラットにおいてグルコースホメオスタシスを改善することができた。この研究から、ペプチド処理動物におけるアディポネクチンレベルは３３日目において対照よりもかなり高いと決定された（５．７±１対３±０．２μｌ／ｍｌ，ｐ＜０．０５）。アディポネクチンレベルは、インスリン感受性と相関することが従前に示されている。アディポネクチンはプロ炎症性ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の産生および作用も妨げ、抗炎症サイトカインＩＬ−１０およびＩＬ−１受容体アンタゴニストを誘導する。肝臓、膵臓、末梢組織、血液および血管に対するペプチドの潜在的効果のまとめを図５に示す。
【０１６７】
上昇した血漿グルコースが、Ｃａイオンの細胞への流入の結果である膵臓β細胞によるインスリンの分泌をもたらすことが知られている（図６）。β細胞における増大したコレステロールは、インスリン分泌の阻害をもたらし得る。さらに、炎症性傷害（サイトカイン、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）およびグルコース）は、逆コレステロール輸送を阻害できる。同因子はまた、他の組織におけるβ細胞のアポトーシスおよびインスリン抵抗性を促進することができる。アポリポ蛋白質およびアポミメティックスはＡＢＣＡ−１を刺激することによる逆コレステロール輸送、および前βＨＤＬ粒子の形成を促進することによって、炎症性傷害（サイトカイン）、ＦＦＡおよびグルコースの作用を阻害することができる。同様に、これらのメカニズムは、他の個所において（血管、末梢組織および血液において）、増大した逆コレステロール輸送、脂質ヒドロペルオキシドの捕捉、およびＰＯＮのような抗オキシダント酵素のアップレギュレーションと共に抗炎症効果および抗オキシダント効果を引き起こすことができる。また、これらのペプチドのいくつかは、肝臓を介するクリアランスについてアテローム形成性粒子を動員する。
【０１６８】
（実施例２）
ＨＤＬ機能を調節するアポＡ−Ｉ、ＨＤＬリポ蛋白質およびアポミメティックペプチド（４Ｆ、Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２）がげっ歯類モデルにおいてＤＭ−２の発症および進行を阻害できるか否かもまた決定することができる。ＤＭ−２は、既に記載したように、貧弱なＨＤＬ質と共に低ＨＤＬ−Ｃレベルによって特徴付けられる。これは低下した抗炎症効果および抗オキシダント効果によって反映される。これらの変化は、血漿グルコースの上昇を伴わないインスリン抵抗性が認められる疾患プロセスにおいて初期に見られる。炎症およびオキシダントストレスはインスリン抵抗性の重要なメディエーターである。これらのメカニズムは、結局は、ＤＭ−２の後期の段階における膵臓β細胞塊の減少に導く。ＤＭ−２の多くのげっ歯類モデルがある。欠陥があるレプチン受容体を有するＺＤＦラットは、インスリン抵抗性およびＤＭ−２の通常に用いられるモデルである。これらの動物は高レプチン血症であるが、低下したレプチン作用を示す。ホモ接合性ＺＤＦ（ｆａ／ｆａ）雄ラットは、初期にインスリン抵抗性を発症し、標準的な食事を与えた場合に、これらの動物は７週齢までに高血糖症を示す。該ラットは７〜１０週齢の間は高インスリン血症であり、引き続いて、インスリンレベルは降下する。１２週齢までに、これらの動物は低インスリン血症および高血糖症を示す。これらの動物の、膵臓β細胞においてはＧｌｕｔ−２トランスポーターの喪失、および骨格筋においてはＧｌｕｔ−４トランスポーターの喪失があり、この結果、低下したインスリン分泌および低下した末梢グルコース摂取がもたらされる。総じて、これらのげっ歯類はアポトーシスによる膵臓β細胞塊の喪失、ならびにＤＭ−２による脂質異常症および多器官関与を含めたＤＭ−２の他の発現も示す。ヘテロ接合性ＺＤＦ雄ラットは標準的な食事で糖尿病表現型を示さず、したがって、良好な対照としての役割を果たす。
【０１６９】
アポＡ−ＩおよびＨＤＬがＺＤＦ（ｆａ／ｆａ）雄ラットにおいてＤＭ−２の発症および進行を妨げるか否か、およびアポミメティック合成ペプチド（４Ｆ、Ａｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２）がＺＤＦ（ｆａ／ｆａ）雄ラットにおいてＤＭ−２の発症および進行を妨げるか否かを決定することもできる。そのような研究では、ＡｐｏＡ−ＩはＨＰＬＣを用いてげっ歯類およびヒト血漿から単離することができる。ＨＤＬは遠心によって単離することができる。テストペプチドを合成することができ、スクランブル化ペプチドおよびビヒクルはそのような実験についての対照としての役割を果たし得る。
【０１７０】
（実施例３）
従前に記載されたように、予備的観察はアポミメティックペプチドの抗糖尿病効果を裏付ける。ペプチドのこれらの効果は３つのメカニズム：（ｉ）改善されたインスリン分泌；（ｉｉ）膵臓β細胞アポトーシスまたは細胞死滅の減少；および／または（ｉｉｉ）末梢組織の改善されたインスリン感受性によるようである。ペプチドのこれらの効果はそれらの抗炎症メカニズム、抗オキシダントメカニズムおよび逆コレステロール促進メカニズムによって媒介され、これは図５および６にまとめられる。このように、アポＡ−Ｉ、ＨＤＬおよびアポミメティックペプチド（４ＦおよびＡｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２）が膵臓β細胞においてアポトーシスを妨げるか否か、アポＡ−Ｉ、ＨＤＬおよびアポミメティックペプチド（４ＦおよびＡｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２）が末梢インスリン感受性を改善するか否か、およびアポＡ−Ｉ、ＨＤＬおよびアポミメティックペプチド（４ＦおよびＡｃ−ｈＥ１８Ａ−ＮＨ２）が逆コレステロール輸送を促進するか否かを研究することもできる。
【図１】
2010538005.tif 000009
【図２】
2010538005.tif 000010
【図３】
2010538005.tif 000011
【図４】
2010538005.tif 000012
【図５】
2010538005.tif 000013
【図６】
2010538005.tif 000014
【配列表】
2010538005000001.xml