(57)【要約】  疎水性部分と負の電荷を持つ部分とを有するリガンドを含む多様式又は混合方式の樹脂を使用する組換えタンパク質を精製する方法が記載される。本発明には、充填工程中にｐＨ又は伝導率を調節する必要がなく、高い収率と有効性が得られる単一工程のクロマトグラフィー法であるという利点がある。本方法は、凝固因子の組換え組成物、特に組換え第ＶＩＩＩ因子の精製に使用される。
2010533150.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一又は複数の汚染物質を含む凝固第ＶＩＩＩ因子タンパク質を精製する方法であって、
(ａ)疎水性部分と負の電荷を持つ部分とを有するリガンドを含む多様式又は混合方式樹脂に第ＶＩＩＩ因子タンパク質を接触させ；
(ｂ)少なくとも１．５Ｍの塩と、少なくとも４０％(ｗ／ｖ)のエチレングリコール、プロピレングリコール、又はそれらの混合物、及びカルシウムイオンを含む溶出用バッファーを用いて前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質を溶出させる
工程を含んでなる方法。
【請求項２】
工程(ｂ)から得られた第ＶＩＩＩ因子含有溶液を収集する工程(ｃ)をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程(ａ)の後で工程(ｂ)の前に、カラムに一又は複数の洗浄用バッファーを通す工程(ａ１)をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
一又は複数の洗浄用バッファーが１０ｍＭ〜１０００ｍＭの塩を含有している請求項３に記載の方法。
【請求項５】
洗浄用バッファーが０．５−０．８Ｍの塩を含有している請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程(ｂ)の溶出用バッファーが、少なくとも２Ｍの塩と、少なくとも４５％(ｗ／ｖ)のエチレングリコール、プロピレングリコール、又はそれらの混合物を含む請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程(ｂ)の溶出用バッファーが、２．３−２．６Ｍの塩と４８−５２％(ｗ／ｖ)のエチレングリコール、プロピレングリコール、又はそれらの混合物を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程(ｂ)の溶出用バッファーに含まれる塩が、ＮａＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＣｌ、(ＮＨ４)２ＳＯ４、ＣＨ３ＣＯ２ＮＨ４、又はこれらの二以上の混合物から選択される請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記溶出用バッファーが、ＮａＣｌとエチレングリコールを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
溶出用バッファーが、１ｍＭ〜１００ｍＭ濃度のカルシウムイオンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
工程(ａ)が、
(ｉ)充填溶液のｐＨに等価なｐＨで、及び／又は
(ｉｉ)伝導率を調節しないで、
実施される請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、完全長第ＶＩＩＩ因子、ＦＶＩＩＩ：Ｃ、第ＶＩＩＩ因子のＢ-ドメイン欠失型、第ＶＩＩＩ因子のペグ化誘導体、第ＶＩＩＩ因子のポリシアル化誘導体、及びそれらの組合せ、好ましくは第ＶＩＩＩ因子のＢ-ドメイン欠失型からなる群から選択される請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程(ｂ)の溶出用バッファーが、２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％(ｗ／ｖ)のトゥイーン８０、２．５ＭのＮａＣｌ、及び８Ｍのエチレングリコールからなり、７．５のｐＨである請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）疎水性部分と負の電荷を持つ部分とを有するリガンドを含む多様式樹脂とタンパク質を接触させ；
ｂ）少なくとも１．５Ｍの塩と、少なくとも４０％(ｗ／ｖ)のエチレングリコール、プロピレングリコール、又はそれらの混合物、及びカルシウムイオンを含む溶出用バッファーを用いて、前記タンパク質を溶出させる
工程を含む、一又は複数の汚染物質を含む第ＶＩＩＩ因子タンパク質を精製する単一工程方法であって、
約２５０倍のカラム体積の低減を達成する方法。
【請求項１５】
ａ）疎水性部分と負の電荷を持つ部分とを有するリガンドを含む多様式樹脂とタンパク質を接触させ；
ｂ）少なくとも１．５Ｍの塩と、少なくとも４０％(ｗ／ｖ)のエチレングリコール、プロピレングリコール、又はそれらの混合物、及びカルシウムイオンを含む溶出用バッファーを用いて、前記タンパク質を溶出させる
工程を含む、一又は複数の汚染物質を含む第ＶＩＩＩ因子タンパク質を精製する単一工程方法であって、
少なくとも３０倍の「精製ファクター」を達成する方法。
【請求項１６】
ａ）疎水性部分と負の電荷を持つ部分とを有するリガンドを含む多様式樹脂とタンパク質を接触させ；
ｂ）少なくとも１．５Ｍの塩と、少なくとも４０％(ｗ／ｖ)のエチレングリコール、プロピレングリコール、又はそれらの混合物、及びカルシウムイオンを含む溶出用バッファーを用いて、前記タンパク質を溶出させる
工程を含む、第ＶＩＩＩ因子タンパク質を安定化させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疎水性部分と負の電荷を持つ部分とを有するリガンドを含む多様式又は混合方式の樹脂を使用する組換えタンパク質を精製する方法に関する。関心あるタンパク質は凝固因子であり、特に組換え第ＶＩＩＩ因子の組成物の精製に関連する。
【背景技術】
【０００２】
抗血友病因子又はＦＶＩＩＩ：Ｃとしても知られているヒト第ＦＶＩＩＩ因子は、８００００ダルトンの軽鎖分子量と、９００００〜２０００００で変動する重鎖分子量を有する２つのポリペプチドからなるヒト血漿タンパク質である。それは、第Ｘ因子がその活性型の第Ｘａ因子へ転換するのに必要な凝固経路における鍵となる補助因子の一つと考えられている。第ＶＩＩＩ因子は、フォン・ヴィルブランド因子との非共有結合複合体(ＦＶＩＩＩ：ＲＰとしても知られている)として血漿中を循環している。出血性疾患の血友病は、異常なレベルの第ＶＩＩＩ因子のために引き起こされる。第ＶＩＩＩ因子レベルが正常の２０％以下になると、ヒトにおいては血友病の状態になるおそれが出てくる。第ＶＩＩＩ因子のレベルが１％未満に低下すると、最も一般的な徴候である自発性関節出血を伴う、重度の出血性疾患に至る。
【０００３】
組換え第ＶＩＩＩ因子の構造及び生化学は、以前より記載されている。
伝統的には、第ＶＩＩＩ因子の単離及び精製は、血漿由来供給源(クリオプレシピテート)からなされる。血漿由来供給源からの精製手順は、第ＶＩＩＩ因子を精製するために、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を使用する免疫親和性精製の使用を探求するものを含む。しかしながら、担体マトリックスからの浸出のため、第ＶＩＩＩ因子流出物にはある程度の残留抗体が含まれている場合があり、それが、最終の使用中、すなわちヒト又は動物系に導入される場合、抗原性を生じるおそれがある。例えば、アガロースビーズでのイオン交換クロマトグラフィーの使用を探る精製手順も、血漿からの第ＶＩＩＩ因子の精製に使用されている。しかしながら、これらの方法では、多くの場合、得られたＦＶＩＩＩ：Ｃが、所定レベルで汚染されてしまう。
【０００４】
しかしながら、遺伝子操作された組換え供給源からの第ＶＩＩＩ因子の精製が、過去１０年間では重要になってきている。タンパク質の回収及び最終生成物の濃縮は、組換えタンパク質の分離において最も重要である。組換え生産されたタンパク質中の汚染物質には、培養培地中の分泌タンパク質、培地成分、細胞溶解物、細胞により生成された所望しないタンパク質、及び核酸が含まれる。
【０００５】
組換えタンパク質の精製時に、関心あるタンパク質が見出される水性供給源材料は、多くの場合、一又は複数のウイルスで汚染されているとみられる。ポリペプチド混合物中においてウイルスを不活性化する技術、例えば溶媒／洗浄剤溶液を使用する化学的方法、照射法、又は熱的方法は、当該分野で知られているが、既知のポリペプチド精製方法とこれらの技術を組合せる試みは、大容量の生産には不向きの多くの工程を持つ方法になってしまっている。また、使用されるウイルス不活性化剤がタンパク質を変性させないか、又は関心あるタンパク質からの分離が困難であるという点に注意を払うこともまた大切である。しかしながら、これらの薬剤は、関心あるポリペプチドを変性させ、又はその分離が困難であり、特別な処理又は分離工程が必要となっていた。ウイルス汚染のおそれのあるポリペプチド含有製剤を処理するための他の一般的な方法、例えば加熱又は照射は、関心あるポリペプチドの有意な変性を生じ、及び／又はウイルスの不活性化には不十分である。多くの商業的に入手可能な組換え第ＶＩＩＩ因子生成物(Advate(登録商標)、Helixate(登録商標)、Kogenate FS(登録商標)、ReFacto(登録商標))は、精製及びウイルス不活性化のための洗浄剤を含む免疫親和性クロマトグラフィーを使用して製造される。
【０００６】
組換えＤＮＡ技術により生産される治療用タンパク質の精製では、所望されるかなりの低レベルまで、ＤＮＡ又は宿主細胞タンパク質(ＨＣＰ)の含有量を低下させようと試みた場合、多くの問題に遭遇することはよく知られている。
Nordfangら(Thrombosis and Haemostasis 58(4), 1043-1048 (1987)には、抗体樹脂、及び５０％のエチレングリコールと高塩濃度を含むバッファーを使用する分離方法が記載されている。
【０００７】
哺乳動物細胞系で発現される組換えタンパク質の精製は、典型的には数工程で実施される。異なった工程は、通常、捕捉、中間、及びポリッシュ工程に分けられる。捕捉工程の目的は２つある；ａ）安定した溶液形態で標的タンパク質を得る、ｂ）容量を低下させる(すなわち、カラムに充填される溶液(「充填」)に対してタンパク質含有量に関して濃縮された溶液を得る)ことである。
後者の工程(容量の低減)は、後続する精製工程を容易にするためには重要である。捕捉工程は、一般的にはイオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーを使用して達成される。イオン交換樹脂を使用することの欠点は、充填物の伝導率及び／又はｐＨを調節しなければならないことである。伝導率を調節し、多くの例では低下させる場合、これは、出発物質の容量を増加させる水の添加によって実施されており、後続工程にとっては実用的ではなくなり、精製目的にとっては全体的に煩雑になってしまっていた。さらに、多くの場合、ｐＨの調節により、精製工程の実施を妨害するおそれのある凝集体が形成されてしまっていた。
【０００８】
捕捉工程の後、ＤＮＡ、ウイルス及び内毒素を含む相当の不純物の殆どを除去する中間精製が続く。これらの不純物は、捕捉においても除去／低減可能である。ポリッシュ工程は最終精製工程とも称され、微量の汚染物質及び不純物が除去され、活性な生物学的産物が得られる。ポリッシュ工程中に除去される汚染物質は、多くの場合、標的分子の配座異性体であるか又は疑わしい漏出産物である。
【０００９】
迅速で効率的であり、第ＶＩＩＩ因子活性が本質的に保持される改善された精製方法が、当該分野で今なお必要とされている。
本発明の方法には、単一工程で、容量が低減され、比活性がかなり増加するという利点がある。よって、本方法では、単一工程において、捕捉と精製工程とが組合せられている。
また本発明は、組換え第ＶＩＩＩ因子の高度に濃縮された非常に純粋な溶液を製造するための効果的な方法を提供するものであり、ここで、第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、分解に対して安定している。本発明では、ＦＶＩＩＩ分子を深刻に不安定化させる危険性がなく、単一工程で、捕捉及び精製工程が組合せられ、粗サンプルの初期精製がなされ、大幅な容量低減が達成され(よって、さらなる精製工程が容易になる)、並びに十分な精製ファクターが得られ(ＦＶＩＩＩ比活性の増加)、タンパク質が分解に対して安定している溶液(「捕捉プール」)を得ることができる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、組換えタンパク質、特に凝固第ＶＩＩＩ因子の、新規で効果的な精製に関する。本発明の発明者は、哺乳動物細胞培養液から第ＶＩＩＩ分子を捕捉するために、多様式（マルチモーダル）カラムを使用すると、タンパク質の活性を失うことなく、培養物から収集されるＦＶＩＩＩタンパク質から汚染物質を除去するための驚くべき迅速で効果的な精製方法となることを見出した。
【００１１】
一態様では、本発明は、一又は複数の汚染物質を含む凝固第ＶＩＩＩ因子タンパク質を精製する方法を提供するものであり、該方法は、
(ａ)疎水性部分と負の電荷を持つ部分とを有するリガンドを含む多様式又は混合方式樹脂と、第ＶＩＩＩ因子タンパク質を接触させ；
(ｂ)少なくとも１．５Ｍの塩と、少なくとも４０％(ｗ／ｖ)のエチレングリコール、プロピレングリコール、又はそれらの混合物、及びカルシウムイオンを含む溶出用バッファーを用いて、該第ＶＩＩＩ因子タンパク質を溶出させる
工程を含む。
【００１２】
別の実施態様では、本方法は、工程(ｂ)から得られた第ＶＩＩＩ因子含有溶液を収集する工程(ｃ)をさらに含み；及び／又は本方法は、工程(ａ)の後で工程(ｂ)の前に、カラムに一又は複数の洗浄用バッファーを通す工程(ａ１)をさらに含む。
その様々な実施態様では、一又は複数の前記洗浄用バッファーは、１０ｍＭ〜１０００ｍＭの塩を含有し、及び／又は工程(ｂ)の溶出用バッファーは、少なくとも２Ｍの塩と、少なくとも４５％(ｗ／ｖ)のエチレングリコール、プロピレングリコール、又はそれらの混合物、例えば２．３−２．６Ｍの塩と４８−５２％(ｗ／ｖ)のエチレングリコール、プロピレングリコール、又はそれらの混合物を含有し；及び／又は工程(ｂ)の溶出用バッファーに含有される塩は、ＮａＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＣｌ、(ＮＨ４)２ＳＯ４、ＣＨ３ＣＯ２ＮＨ４、又はこれらの２又はそれ以上の混合物から選択される。
【００１３】
他の態様では、本発明は、
ａ）疎水性部分と負の電荷を持つ部分とを有するリガンドを含む多様式樹脂と、タンパク質を接触させ；
ｂ）少なくとも１．５Ｍの塩と、少なくとも４０％(ｗ／ｖ)のエチレングリコール、プロピレングリコール、又はそれらの混合物、及びカルシウムイオンを含む溶出用バッファーを用いて、前記タンパク質を溶出させる
工程を含む、一又は複数の汚染物質を含む第ＶＩＩＩ因子タンパク質を精製する単一工程の方法を提供するものであり、該方法は、約２５０倍のカラム体積への低減を達成する。
【００１４】
他の態様では、本発明は、
ａ）疎水性部分と負の電荷を持つ部分とを有するリガンドを含む多様式樹脂と、タンパク質を接触させ；
ｂ）少なくとも１．５Ｍの塩と、少なくとも４０％(ｗ／ｖ)のエチレングリコール、プロピレングリコール、又はそれらの混合物、及びカルシウムイオンを含む溶出用バッファーを用いて、該タンパク質を溶出させる
工程を含む、一又は複数の汚染物質を含む第ＶＩＩＩ因子タンパク質を精製する単一工程の方法を提供するものであり、該方法は、少なくとも３０倍の「精製ファクター」を達成する。
【００１５】
他の態様では、本発明は、
ａ）疎水性部分と負の電荷を持つ部分とを有するリガンドを含む多様式樹脂と、タンパク質を接触させ；
ｂ）少なくとも１．５Ｍの塩と、少なくとも４０％(ｗ／ｖ)のエチレングリコール、プロピレングリコール、又はそれらの混合物、及びカルシウムイオンを含む溶出用バッファーを用いて、該タンパク質を溶出させる
工程を含む、第ＶＩＩＩ因子タンパク質を安定化させる方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａは、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度、平衡、充填、洗浄及び溶出による精製操作中の伝導率及びｐＨを示すクロマトグラムである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１のクロマトグラムの洗浄及び溶出部分の拡大図を示す。
【図２】図２は、充填、フロースルー(ＦＴ)及び溶出の精製工程における、カプト(Capto)ＭＭＣカラムを使用して得られた精製度を例証する、銀染色されたＳＤＳゲル電気泳動を示す。レーン１：ＭＷ標準体、レーン２：細胞培養培地、レーン３：空、レーン４：カプトＭＭＣカラムからのブレイクスルー(未結合の物質)、レーン５：空、レーン６：捕捉プール(結合し、カプトＭＭＣカラムから溶出したタンパク質物質)。
【図３】図３は、種々の濃度のＮａＣｌ又はＮＨ４Ｃｌ及びエチレングリコールを含む異なる溶出用バッファーとカプトＭＭＣ樹脂を使用して精製された組換え第ＶＩＩＩ因子のパーセント収率を示すヒストグラムである。
【図４】図４は、捕捉プール中の第ＶＩＩＩ因子の安定性に対する凍結／解凍の繰返しサイクルの影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
凝固第ＶＩＩＩ因子を精製する本方法は、疎水性で負の電荷を持つ樹脂を用いてなされる多様式クロマトグラフィーを使用して実施される。精製されるタンパク質の溶液、例えば哺乳動物細胞発酵から得られたタンパク質含有上清は、前記樹脂を含むクロマトグラフィー用カラムに溶液を通すことによって、多様式樹脂に適用される。溶液(充填物)は、典型的には濾過され(例えば、デッドエンド濾過又はクロスフロー濾過による)、及び／又は遠心分離されて、樹脂に充填される前に細胞及び粒子が除去される。充填工程では、ｐＨ又は伝導率の調節は必要ない。充填後、カラムは、典型的には一又は複数の洗浄用バッファーで洗浄され、該洗浄用バッファーの一つは高濃度の塩を含む。一実施態様では、カラムは、充填後、平衡化バッファーを用いて洗浄され、場合によってはその後、高濃度の塩を含む第２のバッファーを用いて洗浄される。
吸着した物質を回収するために、高濃度の塩と有機溶媒を含有する溶出用バッファーをカラムに通すことで、溶出が実施される。
【００１８】
本発明により、充填サンプルの容量に対して(から算出して)、約２５０倍のカラム体積(ＣＶ)の低減がなされ、よって、優れた容量低減が達成される。「容量低減」とは、タンパク質を含有する充填溶液(例えば、発酵プロセスから清浄化された粗サンプル)の容量と比較した場合に、タンパク質を含有する溶出溶液の容量が低減することを意味する。
本発明の精製方法により、７０−１００％のタンパク質収率がさらに得られ、精製ファクター(比活性の増加)は１００倍までである。得られた精製タンパク質は、−７０℃で少なくとも２ヶ月、溶出用バッファー中で安定している。
さらに、本発明の方法は、安定した第ＶＩＩＩ因子溶液を提供するものである：捕捉溶出液は、活性の有意な喪失なく、少なくとも３回は凍結させ解凍することができる。
【００１９】
本発明では、汚染物質から関心ある第ＶＩＩＩ因子タンパク質を分離するために、多様式クロマトグラフィー樹脂が使用される。２又はそれ以上の、異なるが共同して作動する部位が標的と相互作用する多様式クロマトグラフィーは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質の精製に適したシステムであることは決定されている。本発明において、組換えタンパク質の精製に使用されるクロマトグラフィー樹脂は、例えばカプトＭＭＣＴＭ(GE Healthcare)又はＭＢＩハイパーセル(HyperCel)ＴＭ(Pall, formerly BioSepra)等、商業的に入手可能である。
【００２０】
カプトＭＭＣは、伝統的なイオン交換体と比較して、異なる選択性を付与する多様式機能性を有するリガンドを含有し、０．５Ｍ〜１．０Ｍと同程度の高い塩分濃度で、タンパク質と結合する可能性を提供する。ここで、リガンドは、標的分子との相互作用に対して様々な機能性を示し、よってイオン性相互作用、水素結合、及び疎水性相互作用が提供される。本発明の一実施態様において、多様式樹脂はカプトＭＭＣＴＭである。
【００２１】
ＭＢＩハイパーセルＴＭ(Pall)、さらなる他の多様式クロマトグラフィーは、タンパク質ベースの親和性カラムからの漏出、及び安定性の問題への取り組みにおいて効果的である。特に、ＭＢＩハイパーセルＲＴＭ(Pall)、マルカプト-ベンズイミダゾール-スルホン酸リガンドを含む吸着体により、疎水性、並びに付与されたタンパク質とのイオン相互作用性が提供される。疎水性相互作用は芳香環系に対するためであると想定されているが、イオン相互作用は、強カチオン交換体として公知の、ＳＯ３-置換基に対するためであるとされている。さらに、ＭＢＩリガンドの芳香族系の窒素原子は、所定条件下で帯電可能であり、従って、負の電荷を持つ基とのイオン相互作用が提供可能となる。
【００２２】
有利な実施態様において、汚染物質は多様式リガンドに吸着し、凝固第ＶＩＩＩ因子の特に純粋なフラクションは、後続する選択的溶出により回収される。捕捉工程により、少なくとも８０倍、例えば８０〜１００倍、９０〜１００倍、又は１００〜１６０倍の精製ファクター(比活性の増加)が提供される。
得られた捕捉プールは、少なくとも１０％純度、例えば少なくとも２０％、又は約３０％〜６０％、例えば３０％〜５０％の第ＶＩＩＩ因子タンパク質を含有する。純度は、タンパク質の全量における第ＶＩＩＩ因子の量を％(ｗ／ｗ)と定めたものである。
【００２３】
本方法の一実施態様において、多様式クロマトグラフィー樹脂に充填される溶液は、哺乳動物細胞発酵からの第ＶＩＩＩ因子含有収集体である。一実施態様において、前記収集体は濾過及び／又は遠心分離されて、細胞及び粒子が除去され；他の実施態様において、収集体は、充填溶液のｐＨ又は伝導率を何ら調節することなく、樹脂に充填される。
【００２４】
本発明は、充填工程が、哺乳動物細胞発酵からの第ＶＩＩＩ因子含有収集体、場合によっては濾過された収集体のｐＨ及び伝導率に類似したｐＨ及び伝導率で、樹脂にタンパク質を含有する充填溶液を充填することを含む方法を、特に包含する。
これにより、さもなければ充填溶液の伝導率を調節(低減)する必要がある容量を制限することで、最初の捕捉工程においては大きな利点が達成される。
【００２５】
一実施態様において、第ＶＩＩ因子含有収集体は、イミダゾール(例えば、収集体１リットル当たり１-１０ｍｍｏｌのイミダゾール)を添加することにより安定化される。収集体の容量と比較して、添加されるイミダゾールの容量が少量であるため、収集体のｐＨ及び／又は伝導率における幾ばくかの変化は無視できる。さらなる実施態様において、収集体は(ｉ)濾過及び／又は遠心分離されて、細胞及び粒子が除去され、(ｉｉ)さらに化学物質を添加することなく樹脂に充填される。
【００２６】
本発明の方法は、典型的には：カラムの平衡化、充填及び溶出といった、複数の工程で実施される。一又は複数の洗浄工程を、充填後、また溶出前に含めてもよい。洗浄工程(類)は、典型的には、高濃度の塩を含有する少なくとも一のバッファーを使用して実施される。一実施態様において、洗浄工程では、１０ｍＭ〜１０００ｍＭの塩、例えば１００-１００ｍＭ、又は２５０-１０００ｍＭ、又は５００-１０００ｍＭ、又は５００-８００ｍＭの塩を含有するバッファーが使用される。他の実施態様において、本方法は洗浄工程を含み、ここで、充填後、カラムは、まず平衡化バッファーで洗浄され、ついで、高濃度の塩を含む第２の洗浄用バッファーを用いて洗浄される。
【００２７】
一実施態様において、平衡化バッファーは、緩衝剤(例えば、５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲のイミダゾール、例えば２０ｍＭのイミダゾール)、Ｃａ塩(１ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば１０ｍＭのＣａＣｌ２)、洗浄剤(例えば０．００１％〜０．１％の範囲のトゥイーン(Tween)ＴＭ８０、例えば０．０２％(ｗ／ｖ)のトゥイーンＴＭ８０)、及び塩(１０ｍＭ〜１０００ｍＭ、例えば５０ｍＭのＮａＣｌ)を含有する。平衡化バッファーは６．０〜８．０のｐＨに維持され；好ましくは、ｐＨ条件は７．３〜７．５に維持される。当業者であれば、ここで例証される第ＶＩＩＩ因子タンパク質は約６．０〜８．０のｐＨで安定であり、よって、平衡化バッファーは７．３-７．５、好ましくは７．５のｐＨであると理解するであろう。
一実施態様において、洗浄用バッファーは、緩衝剤(例えば、５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲のイミダゾール、例えば２０ｍＭのイミダゾール)、Ｃａ塩(１ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば１０ｍＭのＣａＣｌ２)、洗浄剤(例えば０．００１％〜０．１％の範囲のトゥイーンＴＭ８０、例えば０．０２％(ｗ／ｖ)のトゥイーンＴＭ８０)、及び塩(５０ｍＭ〜１０００ｍＭの範囲のＮａＣｌ)を含有する。
【００２８】
溶出工程は、少なくとも１．５Ｍの塩と、少なくとも４０％(ｗ／ｖ)のエチレングリコール、プロピレングリコール、又はそれらの混合物、及びカルシウムイオン(１ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば１０ｍＭのＣａＣｌ２)を含有する溶出用バッファーを用いて実施される。溶出用バッファーは６．０〜８．０のｐＨを有し；好ましくは、ｐＨ条件は７．３〜７．５に維持される。所望のｐＨ条件を維持するために、溶出用バッファーはさらに緩衝剤を含有する。
「緩衝剤(buffering agent)」なる用語は、溶液のｐＨを所望の範囲−本発明中では６．０〜８．０、例えば７．３〜７．５の範囲に維持可能な薬剤を含む。バッファーの濃度範囲は、溶液の好ましいｐＨが維持されるように選択される。また緩衝剤は少なくとも２の緩衝剤の混合物であってよく、ここで混合物は特定の範囲のｐＨ値を提供することができるものである。緩衝剤には、限定されるものではないが、(ナトリウム又はカリウムの)クエン酸塩、(アンモニウム、ナトリウム又はカルシウムの)酢酸塩、ヒスチジン(Ｌ-ヒスチジン)、(ナトリウム又はカリウムの)リン酸塩、酒石酸、コハク酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、イミダゾール、トリス、エタノールアミン、及びその２又はそれ以上の混合物が含まれ得る。一実施態様において、使用される緩衝剤は、５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲のイミダゾールである。
【００２９】
好ましい塩は、ＮａＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＣｌ、(ＮＨ４)２ＳＯ４、ＣＨ３ＣＯ２ＮＨ４(酢酸アンモニウム、ＮＨ４Ａｃ)、又はその２又はそれ以上の混合物である。一実施態様において、溶出用バッファーは約２．５Ｍの塩と少なくとも４０％のグリコールを含有し；他の実施態様において、溶出用バッファーは約２．５Ｍの塩と約５０％のグリコールを含有する。一実施態様において、塩はＮａＣｌであり；他において、塩はＮＨ４Ｃｌである。一実施態様において、グリコールはエチレングリコールであり；他において、グリコールはプロピレングリコールである。さらなる他の実施態様において、溶出用バッファーはＮａＣｌとエチレングリコールを含有する。
他の実施態様では、２．５Ｍ濃度のＮＨ４Ｃｌとエチレングリコールが、タンパク質の溶出に使用される。さらなる他の実施態様では、溶出用バッファーは、洗浄剤をさらに含有する。本方法の特定の実施態様では、溶出液は２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％(ｖ／ｖ)のトゥイーン８０、２．５ＭのＮａＣｌ、及び８Ｍのエチレングリコールを含み、７．５のｐＨである。
【００３０】
他の実施態様では、ＭＢＩハイパーセルＴＭ樹脂が、第ＶＩＩＩ因子を精製するために、本方法で使用される。一実施態様では、ＭＢＩハイパーセルＴＭカラムを使用する組換え第ＶＩＩＩ因子の結合は、１００ｍＭのＮａ２ＳＯ４を収集体に添加した後に実施され、１ＭのＮａＣｌ及び５Ｍのグリセロールを使用して溶出がなされる。
【００３１】
本発明の特定の実施態様では、本方法は、
ａ）疎水性部分と負の電荷を持つ部分とを有するリガンドを含む多様式又は混合方式樹脂と、第ＶＩＩＩ因子を接触させ；
ｂ）２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％(ｗ／ｖ)のトゥイーン８０、及び５０ｍＭのＮａＣｌを含有する平衡化バッファー、及び２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％(ｗ／ｖ)のトゥイーン８０、及び１．５ＭのＮａＣｌを含む洗浄用バッファーをカラムに通し；
ｃ）２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％(ｖ／ｖ)のトゥイーン８０、２．５ＭのＮａＣｌ、及び８Ｍのエチレングリコールを含む溶出用バッファーを用いて、該タンパク質を溶出させる
工程を含む。
【００３２】
最も標準的な環境下で、哺乳動物細胞中で発現された組換えタンパク質を精製する第１の工程は、多量の充填容量を扱う。商業的なタンパク質精製の場合、容易に取り扱いができる容量まで低減させることが重要である。さらに、精製工程は、商業的な目的又はその他の目的から、プロセス経済を達成するために有意な収率を有していなければならない。第１の工程において容量を約２０〜１００倍低減することが、タンパク質精製の第１の工程において通常目標とされ、これは健全な低減とみなされる。
【００３３】
一実施態様において、精製されるタンパク質を含有する充填容量は、５００カラム体積(ＣＶ)以上である。溶出したタンパク質は１００倍以上の最終容量に低減している。本発明は、５０−６００ＣＶの充填容量を含む。容量の低減は、好ましくは約１００−３００倍である。一実施態様において、充填容量は、約５００ＣＶ以上、又は約４５０−６００ＣＶであり、第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、約２５０倍の容量低減を達成する約２ＣＶで溶出する。
【００３４】
他の実施態様では、捕捉工程は、一又は複数のウイルス不活性化剤、例えばトリトン(Triton)-Ｘ(例えば、約１％(ｗ／ｖ)濃度)と組合せることができる。ウイルス不活性化剤は、例えば一又は複数の使用されるバッファーに添加されてもよい。
【００３５】
流速が３０−３５０ｃｍ／時間である溶出及びクリーン-イン-プレイス(ＣＩＰ)工程を除き、流速は、精製プロセスの全ての工程において、３００−９５０ｃｍ／時間で操作される。一実施態様において、充填時の流速は４５０ｃｍ／時間であり；溶出及びＣＩＰ中、流速は３０ｃｍ／時間まで低下させる。本発明の一実施態様において、充填時の流速は約４５０−６００ｃｍ／時間である。
【００３６】
一態様では、本発明は、
(ｉ)第ＶＩＩＩ因子タンパク質；及び(ｉｉ)少なくとも１．５Ｍの塩と、少なくとも４０％(ｗ／ｖ)のエチレングリコール、プロピレングリコール、又はその混合物、及びカルシウムイオンを含有するバッファー；
を含有し、第ＶＩＩＩ因子が３０％〜６０％純度である製剤(調製物)に関する。
【００３７】
(定義)
本発明において、「第ＶＩＩＩ因子タンパク質」とは、完全長第ＶＩＩＩ因子、ＦＩＩＩ：Ｃ、及び凝固活性を有する完全長第ＶＩＩＩ因子の欠失誘導体を含むことを意味している。欠失誘導体とは、Ｂ-ドメインの全て又は一部が欠損しているが、凝固活性は保持されている第ＶＩＩＩ因子を意味する。第ＶＩＩＩ因子のこのようなＢ-ドメイン欠失形態は、例えば国際公開第９１／０９１２２号に記載されている。第ＶＩＩＩ因子の構造及び生化学は、一般的にKaufman(Trends in Biotechnology, 9, p.353-359(1991)、及びHematology, 63, p.155-165(1991))に記載されている。さらに、第ＶＩＩＩ因子配列変異体及び誘導体には、特徴的な第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性を維持している、第ＶＩＩＩ因子のペグ化、アシル化、及びポリシアル化形態が含まれる。第ＶＩＩＩ因子は、組換え手段により得ることができる。一実施態様において、第ＶＩＩ因子は組換え的に生産された第ＶＩＩＩ因子である。一実施態様において、第ＶＩＩＩ因子は全長第ＶＩＩＩ因子であり；他の実施態様において、第ＶＩＩＩ因子タンパク質はＢ-ドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子である。さらなる他の実施態様において、第ＶＩＩＩ因子は、ペグ化、アシル化、又はポリシアル化された第ＶＩＩＩ因子である。
ヒト血漿由来の第ＶＩＩＩ因子濃縮物は、Anderssonら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, p.2979-2983(1986))により記載されているいくつかの断片化された完全活性化第ＶＩＩＩ因子形態を含む。最も小さな活性化形態は、１７０ｋＤａの分子量を有し、金属イオン(類)により互いに保持されている９０ｋＤａと８０ｋＤａの２本の鎖からなる(例えば欧州特許第197901号を参照)。このような第ＶＩＩＩ因子の断片も含まれる−このような断片の精製は、本発明の一実施態様を構成する。
第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性は、例えば実施例に記載されているようにしてアッセイされる(以下を参照)。 
【００３８】
「溶出液」なる用語は、当該分野で特定されるその一般的な意味を意味しており、分離用マトリックスから一又は複数のタンパク質又は化合物を放出するのに適したｐＨ及び／又はイオン強度を有するバッファー又はバッファー類のことである。
【００３９】
ここで使用される場合、溶出工程における「塩」とは、アルカリ土類、アルカリ金属、又はアンモニウムの塩、すなわちアルカリ土類又はアルカリ金属の原子からのカチオン、又はアンモニウムカチオンを有する、また無機又は有機(炭化水素ベースの)アニオンを有する塩を称する。このような塩の例には、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸アンモニウム、リン酸マグネシウム、リン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム等が含まれる。ここでの好ましい塩は塩化物又は硫酸塩である。ここで最も好ましい塩は塩化ナトリウムである。
【００４０】
「多様式(マルチモーダル)クロマトグラフィーリガンド」なる用語は、結合したタンパク質と相互作用する少なくとも２の、異なるが共同して作動する部位を提供可能なリガンドを意味する。これらの部位の一つが、リガンドと関心ある物質との間に、誘引タイプの電荷-電荷相互作用を与える。他方の部位は、典型的には、電子受容体-供与体相互作用、及び／又は疎水性及び／又は親水性相互作用を与える。本発明は、特に疎水性の相互作用を指向している。電子供与体-受容体相互作用には、例えば水素結合、ｐｉ-ｐｉ、カチオン-ｐｉ、電荷移動、双極子-双極子、誘起双極子等の相互作用が含まれる。ここで使用等される多様式クロマトグラフィーリガンドは、「混合方式(ミックストモード)」クロマトグラフィーリガンドとしてもまた知られている。
【００４１】
液体クロマトグラフィーにおいて、「捕捉工程」なる用語は、分離手順の最初の工程を意味する。最も一般的には、捕捉工程には、清浄化、濃縮、安定化、及び可溶性汚染物質からの有意な精製が含まれる。捕捉工程後に中間精製が続き、ＤＮＡ、ウイルス及び内毒素を含む、相当の不純物のほとんどが除去される。またこれらの不純物は、捕捉によっても除去／低減することができる。
【００４２】
「ポリッシュ(polishing)工程」なる用語は最後の精製工程を意味し、ここで微量の汚染物質及び不純物が除去され、活性な生物学的産物が得られる。ポリッシュ工程中に除去される汚染物質は、多くの場合、標的分子の配座異性体であるか又は疑わしい漏出生成物である。
【００４３】
クロマトグラフィーの分野で知られている「カラム体積」なる用語は、パッキングを含む管の部分の幾何学的容積を意味する。本発明によれば、充填容量は、約５０カラム体積(ＣＶ)以上、又は多かれ少なかれ約３００−６００ＣＶ、又は４５０−６００ＣＶである。精製の最終工程で溶出されるタンパク質は、約１００倍〜３５０倍、例えば約２５０倍の容量低減を達成する約２−５ＣＶである。
【００４４】
「精製ファクター(purification factor)」とは、比活性の増加として定義される：つまり、精製工程後のＵ／ｍｇタンパク質と比較した精製工程前のＵ／ｍｇタンパク質である。凝固第ＶＩＩＩ因子の比活性は、商業的に入手可能な活性アッセイ、例えば、製造者のプロトコルに従い、コアテスト(CoaTest)(登録商標)クロモゲニックス(Chromogenix)ＴＭ(Instrumentation Laboratory, Belgium)を使用するか、又は以下の実施例に記載されているようにしてアッセイすることができる。
【００４５】
「単一工程法」なる用語は、一又は複数の汚染物質を含む第ＶＩＩＩ因子タンパク質を精製する方法を意味し、ここで、該方法は、容量の低減と比活性の増加(精製ファクター＞１)の双方を達成している。
本発明の一実施態様では、本方法は、(ｉ)約２５０倍のカラム体積の低減、及び(ｉｉ)少なくとも３０倍の「精製ファクター」を提供する。
本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに十分に理解されるであろう。しかしながら、これらの実施例は、本発明の範囲を限定すると解してはならない。
【実施例】
【００４６】
組換え第ＶＩＩＩ因子の構造及び生化学は、以前より記載されている(例えば、Trends in Biotechnol. 1991, 9:353-359, Transfus. Med. Rev. 1992, 6:235-246を参照)。
さらに、第ＶＩＩＩ因子並びに第ＶＩＩＩ因子の組換え産物(完全長及び変異体／切断型)の単離は当該分野で記載されている：
組換えＤＮＡ技術により、形質移入された哺乳動物細胞において、第ＶＩＩＩ因子タンパク質の融合産物を発現させるプラスミドの構築が可能となった。細胞培養における第ＶＩＩＩ因子の組換え生産は、 Woodら(Nature, 1984, 312:330-337を参照)により報告されている。第ＶＩＩＩ因子タンパク質及びそれらをコードするＤＮＡ配列の活性変異体及び類似体も報告されている(米国特許第４８６８１１２号、欧州特許第０７８６４７４号、国際公開第８６／０６１０１号、及び国際公開第８７／０７１４4号)。遺伝子配列の様々な操作により、第ＶＩＩＩ因子のＢ-ドメインが凝血活性にとって重要ではなく、活性な凝血タンパク質は、Ｂ-ドメインを欠く、第ＶＩＩＩ因子のコード化ヌクレオチド領域の発現により発現可能であることが示された。このような変異体及び類似体における重要な修飾には、Ｂ-ドメインの一部又は全てが欠失しているか、及び／又は特異的なアミノ酸位置が修飾されている、例えば通常はプロテアーゼに不安定な部位が、例えばトロンビン又は活性化タンパク質Ｃによるタンパク質分解に対して耐性があるということが含まれる。他の類似体には、一又は複数のリジン及び／又はチロシン残基での修飾が含まれる。タンパク質の切断型は、１４３８のアミノ酸からなる１７０ｋＤａの糖タンパク質である。このＢ-ドメインが欠失したタンパク質は、血漿由来の第ＶＩＩＩ因子の翻訳後修飾であり、親の抗血友病活性に匹敵する。
【００４７】
第ＶＩＩＩ活性アッセイ
第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性を推定するためのアッセイは、当業者によく知られており、このようなアッセイは、多くの供給者から商業的に入手可能である。精製された第ＶＩＩＩ因子の活性は、例えば製造者のプロトコルに従い、コアテスト(登録商標)クロモゲニックスＴＭ(Instrumentation Laboratory, Belgium)を使用してアッセイすることができる。
【００４８】
実施例１
第ＶＩＩＩ因子の組換え生産は当業者によく知られている；例えば、米国特許第５６３３１５０号(Genentech)及び米国特許第７１３８５０５号(Novo Nordisk/Novartis)を参照できる。
組換え第ＶＩＩＩ因子は、商業的に入手可能な無血清培地中においてＣＨＯ細胞で発現させた。発酵からのタンパク質収集体をさらに精製に使用した。
【００４９】
実施例２
組換え第ＶＩＩＩ因子の精製
組換えタンパク質を精製するために、カプトＭＭＣ(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)樹脂を使用した。床(充填層)高１２ｃｍ、床(充填層)体積２４ｍｌでカラムに充填した。
最初の工程として、精製プロセスは充填を含み、発酵からの収集体をカラムに適用した。充填のカラム体積(ＣＶ)は４５０ＣＶであった(表１)。これに続き、２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％(ｖ／ｖ)のトゥイーン８０、及び５０ｍＭのＮａＣｌからなる平衡化バッファーをカラムに通した。平衡化バッファーのｐＨを７．５に調節した。平衡化バッファーに対して等価なｐＨ、すなわち７．５で、洗浄用バッファー(２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％(ｖ／ｖ)のトゥイーン８０、及び１．５ＭのＮａＣｌ)を用いて、カラムをさらに洗浄した。平衡及び洗浄工程のカラム体積は３ＣＶであった(表１)。
【００５０】
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溶出を、カラムに溶出用バッファーを通すことにより実施した。溶出用バッファーは、２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％(ｖ／ｖ)のトゥイーン８０、及び２．５ＭのＮａＣｌ、及び８Ｍのエチレングリコールからなる。
流速が３０ｃｍ／時間である溶出及びＣＩＰを除き、精製の全ての工程において、流速を４５０ｃｍ／時間に維持した。
平衡、充填、洗浄、及び溶出を伴う精製実験にわたる２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を示すクロマトグラムを図１に示す。
【００５１】
実施例３
活性アッセイ
精製された第ＶＩＩＩ因子の活性を、コアテスト(登録商標)ＳＰアッセイの修正法を使用して測定した：
コアテスト(登録商標)ＳＰキットの試薬及びバッファー保存溶液を使用した。全ての試薬を、実験開始前に室温にした。コアテストアッセイ用バッファー(５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＢＳＡ、ｐＨ７．３、保存料を含有)で試料を約２ｍＵ／ｍｌに希釈した。アッセイ用バッファーで、参照血漿を５−０．５ｍＵ／ｍｌに希釈した。試料を、アッセイ用バッファーで１２及び９Ｕ／ｍｌに、ついでＶＷＦ(Dade Behring)を有するＦＶＩＩＩ欠失血漿で１０倍に、最終的に、コアテスト(登録商標)アッセイ用バッファーで１０倍及び２０倍に希釈した(試料当たり４回の希釈になる)。５０μｌの試料、標準、及びバッファーのネガティブコントロールを、２つ、９６ウェルマイクロタイタープレート(Nunc)に添加した。第ＩＸａ因子／第Ｘ因子の試薬、リン脂質試薬、及びコアテスト(登録商標)ＳＰキットからのＣａＣｌ２を、５：１：３(ｖｏｌ：ｖｏｌ：ｖｏｌ)に混合し、この７５μｌをウェルに添加した。室温で１５分インキュベートした後、５０μｌの第Ｘａ因子基質Ｓ-２７６５／トロンビンインヒビターＩ-２５８１混合物を添加し、反応物を室温で１０分インキュベートし、２５μｌの２％クエン酸を添加した。参照波長として６１２ｎｍの吸光度を使用して、スペクトラマックス(Spectramax)(登録商標)マイクロタイタープレートリーダー(Molecular Devices)で、４１５ｎｍでの吸光度を測定した。ネガティブコントロールに対する値を全てのサンプルから引き、ｍＵ／ｍｌで、プロットされた吸光度の値対ＦＶＩＩＩ濃度の直線回帰により、較正曲線を作成した。
【００５２】
ＥＬＩＳＡアッセイ
第ＶＩＩＩ因子抗原を、特に製造者が記載しているようにして、Affinity Biologicalsから市販されているＥＬＩＳＡキット(VisuLize Factor VIII Antigen Kit, Lot AG8-0006)を使用して、測定した。
組換え第ＶＩＩＩ因子を、上の実施例２に記載された発酵収集体から精製した。精製ファクター及び第ＶＩＩＩ因子タンパク質の収率を、上述のＣｏＡ及びＥＬＩＳＡにより測定した。
【００５３】
2010533150.tif 000004
上の結果から分かるように、１１０００ｍｌから４５ｍｌ(２４４倍)にＦＶＩＩＩ含有培地を濃縮することができ、同時に、５５Ｕ／ｍｇから５３００Ｕ／ｍｇに比活性が増加し、例えば、活性測定により計測して９６倍の精製ファクターが得られた。
【００５４】
2010533150.tif 000005
上の結果から分かるように、１１０００ｍｌから４５ｍｌ(２４４倍)にＦＶＩＩＩ含有培地を濃縮することができるようになり、同時に、０．００４６ｍｇの第ＶＩＩＩ因子／全タンパク質から０．６ｍｇの第ＶＩＩＩ因子／ｍｇ全タンパク質に比活性が増加し、例えば、ＥＬＩＳＡにより計測されて、１３０倍の精製ファクターが得られた。
【００５５】
実施例４
タンパク質のゲル電気泳動
ＳＤＳゲル電気泳動を、本質的に製造者(Invitrogen)が記載しているようにして、作動用バッファーとしてトリスアセテートを用いる、７％のヌページ(NuPage)(登録商標)トリスアセテートゲルを使用して実施した。簡単に述べると、ゲル電気泳動を、５０分、１５０ボルトで実施し、製造者の使用説明書に記載されているようにして、シルバークエスト(SilverQuest)(登録商標)染色キット(Invitrogen)を用いて、試料を染色した。使用した分子量(ＭＷ)標準は、Invitrogenのマーク(Mark)１２であった。
多量の重鎖(ＨＣ)及び軽鎖(ＬＣ)バンド(図２中に矢印で示す)が存在することで例証されるように、組換え第ＶＩＩＩ因子が捕捉プール中では非常にリッチであることが、図２に示す結果に現れている。
【００５６】
実施例５
ＳＤＳ−ゲル電気泳動により可視化された精製
電気泳動用のタンパク質試料を変性させ、５０ｍＭのＤＴＴを含むＬＤＳサンプルバッファー(Invitrogen)中で７０℃にて１０分間還元した。分離用ゲルは７％のトリスアセタート(ＴＡ)プレ-キャスト・ノヴェックス(Pre-Cast Novex)ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen)であり、陽極及び陰極バッファーとして、トリスアセテートバッファー(Invitrogen)を用い、１５０Ｖの制限電圧で６０分間、電気泳動を実施した。製造者の記載に従い、シルバークエスト(登録商標)(Invitrogen)を使用し、銀染色を実施した。
ゲルは、捕捉用ＭＭＣカラムを使用して得られる大規模精製を例証する。細胞培地は一連のタンパク質を含んでいる。これらのタンパク質のほとんどがカラムを通過するが、第ＶＩＩＩ因子は、カラムから捕捉プール中で高度に濃縮される。
【００５７】
実施例６
溶出条件
カプトＭＭＣ樹脂について様々な溶出条件を試験した。組換え第ＶＩＩＩ因子を含む収集物に、５％の最終濃度のグリセロールと５ｍＭのＣＨＡＰＳを添加した。２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＣａＣｌ２、トゥイーン８０(０．２％ｖ／ｖ)、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣＨＡＰＳ、及び５％のグリセロールの平衡化バッファー、ｐＨ７．５を用いて、平衡を実施した。２０ｍＭのエタノールアミン、１０ｍＭのＣａＣｌ２、トゥイーン８０(０．２％ｖ／ｖ)の溶出用バッファー、ｐＨ８．３で、種々の塩及びエチレングリコール濃縮物を含有するものを使用し、これは次のものを含む：ａ．添加なし；ｂ．１ＭのＮＨ４Ｃｌ；ｃ．２．５ＭのＮＨ４Ｃｌ；ｄ．３Ｍのエチレングリコール；ｅ．１ＭのＮＨ４Ｃｌ＋３Ｍのエチレングリコール；ｆ．２．５ＭのＮＨ４Ｃｌ＋３Ｍのエチレングリコール；ｇ．８Ｍのエチレングリコール；ｈ．１ＭのＮＨ４Ｃｌ＋８Ｍのエチレングリコール；Ｉ．２．５ＭのＮＨ４Ｃｌ＋８Ｍのエチレングリコール；２．５ＭのＮａＣｌ＋８Ｍのエチレングリコール。溶出条件は、収率パーセントに基づいて決定した。図３には、２．５ＭのＮＨ４Ｃｌ又は２．５ＭのＮａＣｌ、及び８Ｍのエチレングリコール濃度で、タンパク質の収率パーセントが最大であることが示されている(図３)。
【００５８】
実施例７
捕捉プールの凍結／解凍安定性
実施例２に記載されたカプトＭＭＣ樹脂から溶出した捕捉プールのアリコートに、−８０℃で一晩凍結させ、次の日に４℃で解凍する凍結／解凍サイクルを複数回施した。第ＶＩＩＩ因子活性を、実験終了時に、ＣｏＡアッセイ(実施例３に記載したコアテスト(登録商標)クロモゲニックスＴＭ)を使用し、全ての試料について同時に測定した。
2010533150.tif 000006
【図１Ａ】
2010533150.tif 000007
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2010533150.tif 000013
2010533150.tif 000014
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