(57)【要約】立体異性体的に純粋なまたは立体異性体的に豊富化された形態の高甘味度甘味料モナチンを生成するための方法および原料を開示する。例えば、モナチン誘導ラクトンエステルの立体選択的加水分解および分離を用いる方法を開示する。
2010539977.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩＶ：
【化１】
2010539977.tif 000017
［式中、R1 はC1-10 アルキルであり；および−Ｎ（Ｈ）Ｐｒｏｔは適当な保護アミノ基である。］の化合物を加水分解して、式Ｖｂ：
【化２】
2010539977.tif 000018
の化合物および式ＩＶａ：
【化３】
2010539977.tif 000019
の化合物を生成することを含む、方法であって、ここに、前記加水分解は、架橋バシラス・リケニホルミス (Bacillus licheniformis)スブチリシンＡ結晶、バシラス・リケニホルミス (Bacillus licheniformis)スブチリシンＡ遊離酵素、およびそれらの組合せから選択される酵素を使用することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記酵素が、ChiroCLEC-BL、ALCALASE、およびそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１がメチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
-N(H)Protが-NHCbzである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
さらに、式ＩＶａの化合物を式Ｉａ：
【化４】
2010539977.tif 000020
の化合物へ転換することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記転換が、
（ａ）式ＩＶａの化合物を加水分解して式ＶＩａ：
【化５】
2010539977.tif 000021
の化合物を生成し；ついで、
（ｂ）式ＶＩａの化合物を脱保護する
ことを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
さらに、式Ｖｂの化合物を式Ｉｂ：
【化６】
2010539977.tif 000022
の化合物へ転換することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記転換が、
（ａ）式Ｖｂの化合物を脱保護して、式ＶＩＩｂ：
【化７】
2010539977.tif 000023
の化合物を生成し；ついで、    
（ｂ）式ＶＩＩｂの化合物を加水分解する
ことを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記式ＩＶの化合物の加水分解が、式Ｖａ：
【化８】
2010539977.tif 000024
の化合物も生成し、ここに、式Ｖｂの化合物の生成量が式ＶａおよびＶｂの化合物の全生成量の少なくとも９０％を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）モナチンのＳ,ＳおよびＲ,Ｒ立体異性体を含むモナチン組成物を、前記モナチンのＳ,ＳおよびＲ,Ｒ立体異性体のエステル誘導体を生成するのに適当な条件下で反応させ；
（ｂ）Ｓ,Ｓエステル誘導体またはＲ,Ｒエステル誘導体のいずれか１つを立体特異的に加水分解して、酸誘導体を生成し；ついで、
（ｃ）前記エステル誘導体を前記酸誘導体から分離する
ことを含む方法。
【請求項１２】
さらに、非ラクトン体の前記エステル誘導体をラクトン体の前記エステル誘導体へ転換するのに適切な条件下で前記エステル誘導体を反応させることを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｓ,Ｓエステル誘導体を、プロテアーゼ酵素を用いて立体特異的に加水分解する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロテアーゼ酵素がスブチリシンプロテアーゼ活性を有する酵素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロテアーゼ酵素が、架橋バシラス・リケニホルミス (Bacillus licheniformis)スブチリシンＡ結晶、バシラス・リケニホルミス (Bacillus licheniformis)スブチリシンＡ遊離酵素、またはそれらの組合せである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素が、ChiroCLEC-BL、 ALCALASE、またはそれらの組合せである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記酵素が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、または配列番号：４のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロテアーゼ酵素がChiroCLEC-BLである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
さらに、前記モナチン立体異性体上のアミン基を保護することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記分離したＳ,Ｓ誘導体または分離したＲ,Ｒ誘導体のうち少なくとも１つを水素化および加水分解する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｒ,Ｒ誘導体を水素化および加水分解し、前記Ｒ,Ｒ誘導体を加水分解前に水素化する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記モナチン組成物が約６％（ｍ／ｖ）から約１０％（ｍ／ｖ）の濃度範囲を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
前記モナチン組成物が約１０％（ｍ／ｖ）の濃度を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記エステル誘導体を、トルエン、メタノールおよび１０％トルエンスルホン酸を含む溶液中で反応させることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
前記エステル誘導体を、トルエンおよび１％トルエンスルホン酸を含む溶液中で反応させることを含む、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機的かつ生体触媒的合成の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
モナチンは高甘味度甘味料であって、下記の化学式：
【０００３】
【化１】
2010539977.tif 000003
を有する。
【０００４】
様々な命名規則により、モナチンは以下の：２−ヒドロキシ−２−（インドル−３−イルメチル）−４−アミノグルタル酸；４−アミノ−２−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−インドル−３−イルメチル）−ペンタン二酸；４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）グルタミン酸；および、３−（１−アミノ−１,３−ジカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブト−４−イル）インドールを含む多数の代替的な名称でも知られている。
【０００５】
モナチンは二つのキラル中心を含有して、４つの可能な立体異性配置を生じる。Ｒ,Ｒ配置（「Ｒ,Ｒ立体異性体」すなわち「（Ｒ,Ｒ）−モナチン」）；Ｓ,Ｓ配置（「Ｓ,Ｓ立体異性体」すなわち「（Ｓ,Ｓ）−モナチン」）；Ｒ,Ｓ配置（「Ｒ,Ｓ立体異性体」すなわち「（Ｒ,Ｓ）−モナチン」）；および、Ｓ,Ｒ配置（「Ｓ,Ｒ立体異性体」すなわち「（Ｓ,Ｒ）−モナチン）」）である。異なる立体異性体のモナチンは異なる甘味特性を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
モナチンの特定の異性体は、主に南アフリカのリンポポ地域に生息するが、ムブマランガや北西部にも生息するシュレロチトン・イリシホリアス（Schlerochiton ilicifolius）植物の根皮内に見いだすことができる。しかしながら、乾燥皮内に存在するモナチンの濃度は、酸形態のインドール換算で、約０．００７質量％であることが分かった。米国特許第４,９７５,２９８を参照せよ。モナチンが植物中で産生される正確な方法は、現在知られていない。
【０００７】
少なくとも部分的には、その甘味特性のため、モナチンの経済的な起源を有することが望ましい。さらに、異なる立体異性体の異なる甘味特性のため、Ｒ,Ｒ立体異性体のごときモナチンの単一の立体異性体の経済的な起源を有することが望ましい。かくして、立体異性体的に純粋なまたは立体異性体的に豊富化された形態のモナチンの生成方法を開発する必要性が継続している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、高甘味甘味料モナチンの異性体を分割する方法、特に、モナチンのＲ,ＲおよびＳ,Ｓ立体異性体を分割する方法を提供する。本発明のいくつかの具体例において、モナチンのエステル誘導体が生成され、このモナチン誘導エステルの立体選択的加水分解が、最終的に、立体異性体的に純粋なまたは立体異性体的に豊富化されたモナチンを生じる。いくつかの具体例において、この立体選択的加水分解は、モナチン誘導エステルの一方の立体異性体（例えば、Ｓ,Ｓ）を、モナチン誘導エステルの他方の立体異性体（例えば、Ｒ,Ｒ）に対して優先的にモナチン誘導酸（例えば、Ｓ,Ｓ）転換する。ついで、モナチン誘導酸（例えば、Ｓ,Ｓ）およびモナチン誘導エステル（例えば、Ｒ,Ｒ）を分離でき、一旦分離されれば、各々は、モナチンに逆転換でき、立体異性体的に純粋なまたは立体異性体的に豊富化されたＳ,Ｓモナチンの組成物および立体異性体的に純粋なまたは立体異性体的に豊富化されたＲ,Ｒモナチンの組成物を生じる。いくつかの具体例において、モナチンのラクトンエステル誘導体が生成され、このラクトンエステル誘導体の１つの立体異性体を、酵素を用いて立体特異的に加水分解する。ついで、この反応の加水分解生成物は非加水分解エスエル誘導体から分離でき、加水分解および非加水分解誘導体の各々をモナチンに逆転換できる。
【０００９】
本明細書は、図面を含めて、本発明の特定の具体例を説明する。しかしながら、当業者ならば、それらの記載から、本発明は、本発明の概念および範囲を逸脱しない全ての様々な態様で修正することができると考えるであろう。したがって、明細書および図面は本質的に例示であって、制限的ではないと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の具体例より、（Ｒ,Ｒ）および（Ｓ,Ｓ）立体異性体のモナチンを分離するための反応スキーム。
【００１１】
【図２】本発明の具体例により、モナチン誘導化合物のアミン官能基を保護し、ラクトンを発生させる工程の概略図。
【００１２】
【図３】本発明の具体例により、（Ｒ,Ｒ）および（Ｓ,Ｓ）立体異性体を酵素的に分割する工程の概略図。
【００１３】
【図４】本発明の具体例により、（Ｓ,Ｓ）モナチン誘導体をモナチンに転換する工程の概略図。
【００１４】
【図５】本発明の具体例により、（Ｒ,Ｒ）モナチン誘導体をモナチンに転換する工程の概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
この開示は、グルタミン酸誘導体、特にモナチンの（Ｒ,Ｒ）および（Ｓ,Ｓ）立体異性体を分割する方法を提供する。ここでキラル中心を含有する分子についての言及の各々は、特記がない限り、当該分子の全ての立体異性体を意味する。各立体異性体は別個の化合物であるが、実際は、立体異性体の混合物は、しばしば、例えば、「化合物（±）モナチン前駆体」または「モナチン前駆体」のごとき「化合物」のことを意味する。同様に、ここでキラル中心を含有する分子の構造描写の各々は、特記がない限り、その分子の全ての立体異性体を表し、例えば、くさび型表記の使用により三次元配座を示す。
【００１６】
また、特記がない限りまたは文脈から明らかでない限り、「Ｒ,Ｒモナチン」または「Ｓ,Ｓモナチン」は、モナチンの単一立体異性体または特定の立体異性体が豊富化された混合物を意味する。「豊富化」は、その混合物が、指定されていない立体異性体に対して指定された立体異性体を、それが分割された元のモナチン混合物と比較して高い比率で含むことを意味する。
【００１７】
単一立体異性体は、立体異性体的に豊富化された立体異性体の混合物から、前者を「単一立体異性体」と呼んで区別できる。かくして、例えば、特記がない限りまたは文脈から明らかでない限り、「（Ｓ,Ｓ）モナチンは各立体中心においてＳ配座を持つモナチンの単一立体異性体または、（Ｓ,Ｓ）モナチンがより多量に存在する、（Ｓ,Ｓ）−モナチンおよび（Ｒ,Ｒ）−モナチンの混合物を示す。
【００１８】
なお、小文字が後ろに付くローマ数字で示される各化合物の式は、ここでは、単一の立体異性体または、立体異性体が豊富化された混合物を示す。例えば、式ＩＶ：
【００１９】
【化２】
2010539977.tif 000004
の「化合物」というときは、示された化合物の異性体の混合物をいう。（「（±）」を用いるのは、示された式が異性体の混合物を含むことの指定を明確にするためである）。同様に、式ＩＶａ：
【００２０】
【化３】
2010539977.tif 000005
の「化合物」というときは、特記がない限りまたは文脈から明らかでない限り、示されている単一立体異性体およびその立体異性体が豊富化された混合物の双方をいい、Ｓ,Ｓに対するＲ,Ｒ異性体の比率は、ＩＶａ（Ｒ,Ｒ）で表される混合物中の方が、ＩＶ（±）で表される混合物中よりも高い。（「（Ｒ,Ｒ）」を用いるときは、示された式がＲ,Ｒ立体異性体またはＲ,Ｒ立体異性体が豊富化された混合物を意味することの指定を明確にするためである）。典型的に、ここに記載される化合物に対して、文字「ａ」はＲ,Ｒ配置を有する式を指定し、「ｂ」はＳ,Ｓ配置を有する式を指定する。
【００２１】
特記ない限り、用語「含む」、「含む」「含んでいる」などはオープンエンドであることを意図している。かくして、例えば、「含む」は「限定されないが含む」を意味する。
【００２２】
断わりがあるときを除き、冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、「一以上」を意味する。
【００２３】
ここで用いるとき、用語「約」はいかなる測定でも発生する実験誤差の範囲を包含する。断りない限り、全ての測定値は、語「約」が明示的に用いられていなくても、それらの前に語「約」を有していると推定される。
【００２４】
用語「アルキル」は、それ自体でまたは別の基の一部としてここで用いられるとき、鎖長が限定されていない限り、１０炭素までの直鎖および分枝鎖双方の飽和官能基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、へプチル、４,４−ジメチルペンチル、オクチル、２,２,４−トリメチルペンチル、ノニル、デシルなどである。
【００２５】
図面を参照すると、図１は、モナチンのＲ,ＲおよびＳ,Ｓ立体異性体対の混合物を分割する方法を例示する。具体例によれば、モナチン、特にＲ,ＲおよびＳ,Ｓモナチンのモナチン組成物は反応して、最終的に、モナチンの保護ラクトンエスエル誘導体、特にＲ,ＲおよびＳ,Ｓモナチン誘導ラクトンエステルの混合物を発生する。描写するように、このラクトンエステルモナチン誘導体は多段階工程において発生し、最初は、モナチンのジエステル誘導体およびモナチンのラクトンエステル誘導体が生成する。図２は、モナチンからのモナチンラクトンエステル誘導体の生成を実行するためのより特定の詳細な具体例を例示する。
【００２６】
エスエル化反応で生じた混合物（モナチンのラクトンエスエルおよびジエステル誘導体）を、ジエステル誘導体をラクトンエステル誘導体へ転換するのに適切な反応条件にさらすことができる。いくつかの具体例によれば、可能な限りのジエステル誘導体をラクトンエステル誘導体に転換することが好ましい。これは、特に、立体特異的加水分解を行うために選択された酵素がラクトン体に優先的にまたはそれのみに反応する場合である。
【００２７】
好ましくは、また、図１に示された具体例によれば、ラクトンエステルモナチン誘導体のアミン官能性は酵素加水分解を行う前に保護する。アミン官能性の保護は、当該分野で公知のいかなる手段、例えば、Ｃｂｚ保護によって達成できる。実施例２は、モナチンアミン官能性のＣｂｚ保護のいくつかの方法の詳細を提供する。
【００２８】
ラクトン化反応は、例えば、実施例３ａおよび３ｂに示されるような代替的な反応条件下で行える。他の条件もラクトン化を起こすのに適切である。例えば、いくつかの具体例において、トリフルオロ酢酸をトルエンスルホン酸に代えてまたは加えて用いることができる。好ましくは、ラクトン化は、およそ室温にて、すなわち、約２３から約２５℃までにて行う。理論に拘泥することなく、約６５℃程度の高温は分解を生じ、それゆえ、所望の生成物を回収するためには、カラムクロマトグラフィーの使用のごときさらなる工程が必要であると確信される。
【００２９】
次に、モナチン誘導体立体異性体混合物は、立体特異的加水分解に付される。より詳しくは、モナチン誘導体のエステル官能性の酸官能性への加水分解は、一つの異性体に対して別の異性体に対してよりも優先的に生じる。理論に拘泥することなく、図１に示すように、アルキルエステルカルボキシ官能基が加水分解反応に関与している。この加水分解は、保護ラクトンカルボン酸誘導体の立体異性体的に純粋なまたは立体異性体的に豊富化されたＳ,Ｓ体および保護ラクトンカルボン酸エステル誘導体の立体異性体的に純粋なまたは立体異性体的に豊富化されたＲ,Ｒ体を生じ、次いで、それらは、例えば、実施例４および図３に示すように相分離によって分離できる。
【００３０】
分離後、Ｓ,Ｓ保護ラクトン誘導体を精製して、（立体異性体的に純粋なまたは立体異性体的に豊富化されたかのいずれかの）Ｓ,Ｓモナチンを再生でき、Ｒ,Ｒ保護ラクトン誘導体を精製して、（立体異性体的に純粋なまたは立体異性体的に豊富化されたかのいずれかの）Ｒ,Ｒモナチンを再生できる。精製は、誘導体を脱保護する水素化反応およびラクトン環を切断し、元の基質、この場合はモナチンを再生する加水分解の双方に関与する。いくつかの具体例において、特に、Ｓ,Ｓ配座が基質の場合、加水分解反応の前に水素化反応を行うことが好ましい（立体化学をスクランブルするエピ化を軽減または最小限化するためである）。いくつかの具体例において、特に、Ｒ,Ｒ体が関与する場合、加水分解を水素化前に行って、ラクタムの生成を回避または軽減する。図４および実施例５はＳ,Ｓラクトン誘導体をＳ,Ｓモナチンに転換する方法を例示する。図５および図６はＲ,Ｒラクトン誘導体をＲ,Ｒモナチンに転換する方法を例示する。
【００３１】
Ｒ,ＲおよびＳ,Ｓモナチン立体異性体の分割に向けた具体例を説明してきたが、本発明はそのように限定されない。当業者ならば、ここの教示から、この分離方法はモナチンに加えて他の化合物にも適用できることを認識するであろう。例えば、本発明は、式ＩＶ：
【００３２】
【化４】
2010539977.tif 000006
［式中、
Ｒ１はＣ１−１０アルキルであり；および
−Ｎ（Ｈ）Ｐｒｏｔは保護アミノ基である］の化合物を加水分解して；式Ｖｂ：
【００３３】
【化５】
2010539977.tif 000007
の化合物および式ＩＶａ：
【００３４】
【化６】
2010539977.tif 000008
の化合物を生成することを含む方法を包含する。式ＶｂおよびＩＶａの化合物は、それぞれ、（Ｓ,Ｓ）−モナチンおよび（Ｒ,Ｒ）−モナチンの生成に有用である。
【００３５】
有用なＲ１は、Ｃ１−１０アルキル、特別にはＣ１−６アルキル、より特別にはＣ１−４アルキルを含む。有用なＲ１の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルおよびブチル、特にメチルおよびエチルを含む。いくつかの具体例において、Ｒ１はエチルである。
【００３６】
有用な-N(H)Protは、（１）検討中の反応に採用する条件下で本質的に反応せず、（２）検討中の反応の進行を本質的に妨げず、かつ、（３）本質的に当該分子の結合性に影響を与えない条件下で除去できるいかなるアミノ基も含む。保護アミノ基は当業者に周知であり、例えば、［T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd ed., New York:  John Wiley & Sons, Inc., 1999 ("Greene")、特に４９４−６１５頁］に記載されている。Protが一反応性基の場合、-N(H)Prot中のＨが存在する。例えば、Protがベンジルの場合、-N(H)Protは -NHBn (Bn = ベンジル)である。Protが二反応性基の場合、例えば、Protがベンジリデンの場合、-N(H)Prot中のＨは存在しない。
【００３７】
有用な-N(H)Protの例は、H2/cat.、例えば、H2/Raney (Ni); H2/Pt, pH 2-4; H2/Pd; H2/Lindlar; または H2/Rhによって開裂され得る基として保護されるアミノ基を含む。そのような保護アミノ基の例は、１,１−ジメチルプロピニル、１−メチル−１−フェニルエチル、１−メチル−１−（４−ビフェニル）エチル、ｔ−ブチル、ビニル、アリル、シンナミル、Ｎ−ヒドロキシピペリジニル、４,５−ジフェニル−３−オキサゾリン−２−オン、ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、３,４−ジメトキシ−６−ニトロベンジル、２,４−ジクロロベンジル、５−ベンズイソオキサゾリルメチル、９−アントリルメチル、ジフェニルメチル、イソニコチニルまたはＳ−ベンジルカルバマートなどのカルバマートとして保護されるアミノ基；Ｎ−ホルミル、Ｎ−ｏ−ニトロフェニルアセチル、Ｎ−２−メチル−２−（ｏ−ニトロフェノキシ）プロピオニル、Ｎ−２−メチル−２−（ｏ−フェニルアゾフェノキシ）プロピオニルまたはＮ−ｏ−ニトロシンナモイルアミドなどのアミドとして保護されるアミノ基；および、Prot が、アリル、ベンジルオキシメチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、トリフェニルメチル、（ｐ−メトキシフェニル）ジフェニルメチル、ジフェニル−４−ピリジルメチル、ベンジリデン、ニトロ、ベンジルスルホニルまたはフェナシルスルホニルである-N(H)Protを含む。いくつかの具体例において、-N(H)Prot は -NHCbz（Cbz = ベンジルオキシカルボニル、すなわち、アミノ基はカルバミン酸ベンジルとして保護されている）である。
【００３８】
いくつかの具体例において、式ＩＶの化合物は式ＩＩＩ：
【００３９】
【化７】
2010539977.tif 000009
の化合物を保護することによって生成することができる。この保護を達成するための有効な試薬は当業者に周知であり、例えば、［Greene,上掲、特に、494-615頁］に記載されている。いくつかの具体例において、式ＩＩＩの化合物はCbzClを用いて保護し、-N(H)Prot が -NHCbzである式ＩＶの化合物を得る。
【００４０】
式ＩＩＩの化合物はいかなる適当な手段でも生成することができる。例えば、米国特許第5,994,559号は、エポキシド中間体の開環による式ＩＩＩの化合物の合成を報告する。あるいは、式ＩＶの化合物（式中、R1 =メチルおよび Prot = Cbz）は、例えば、上記され、または、下のスキーム２に例示されるように、モナチンから生成することができるが、他の有用なR1およびProtを有する式ＩＶの化合物を同様に生成することができる。
【００４１】
エステル化およびラクトン化転換を行うために上で例示した試薬に加えて、これらの転換を行うための他の有用な試薬および条件を用いることができ、例えば、［Greene, 上掲、特に 494-615頁（アミノ保護）］；［M.B. Smith and J. March, March's Advanced Organic Chemistry, 5th ed., New York:  John Wiley & Sons, Inc., 2001 ("March")、特に484-90頁（カルボン酸のエステル化、エステル交換）］；および［R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, 2d ed., John Wiley & Sons, Inc.:  New York (1999) ("Larock")、特に、1861-1927頁（ラクトン生成）および1932-41 頁（カルボン酸のエステル化）］に記載されている。
【００４２】
式ＩVａの化合物が式ＩＶの化合物から他の立体異性体の除去によって「生成される」ことは、当業者には明らかである。すなわち、式ＩＶの化合物が式ＩＶａの化合物および式ＩＶｂの化合物の混合物（例えば、式ＩＶａの化合物および式ＩＶｂの化合物のラセミ混合物）であることが分かっていれば、Ｖｂに対するＩＶｂの優先転換が非水和立体異性体における出発ラセミ体の豊富化につながる。かくして、出発ラセミ体ＩＶは、すでに説明した命名法を用いれば、「式ＩＶａの化合物」となる。
【００４３】
当業者は、あるとしてもわずかな立体特異的反応しか立体異性体間を完全に区別しないことも理解している。かくして、式ＩＶの化合物の加水分解が式Ｖａ：
【００４４】
【化８】
2010539977.tif 000010
の化合物の生成をＩＶａの望ましくない加水分解によって生じるであろう。そのような結果は本発明によって十分に考慮されているが、式Ｖａの単一立体異性体の生成量は式Ｖｂの単一立体異性体の生成量よりも少ない。同様に、例えば、不完全加水分解のため、生成混合物は式ＩＶｂの化合物を含むことがある。
【００４５】
式ＩＶの化合物の加水分解は酵素的または非酵素的に達成することができる。酵素加水分解は、例えば、カルボキシルエステルを基質として（式ＩＶで示されるカルボキシルエステルで例示される）および、生成物としてカルボシラート（式Ｖａで例示される）を生成するためのＨ２Ｏを用いる反応を触媒することができる加水分解酵素 (E.C. 3.-.-.-) のごとき酵素を用いて達成することができる。加水分解酵素の例は、エステラーゼ(EC 3.1.-.-)、リパーゼおよびプロテアーゼである。いくつかの具体例において、前記酵素は、ChiroCLEC-BL (Altus Biologics, Inc., Cambridge, MA)である。いくつかの具体例において、前記酵素は、スブチリシンプロテアーゼ活性(EC 3.4.21.62)を有し、式ＶＩのエステルを選択的に加水分解できる酵素のごとき、セリンエンドペプチダーゼ(E.C. 3.4.21.-)である。
【００４６】
いくつかの具体例において、スブチリシンプロテアーゼ活性を有する酵素は、バシラス・リケニホルミス (Bacillus licheniformis) スブチリシン A (ABL) または スブチリシン・カールスベルグ (Carlsberg) 酵素であり得る。いくつかの具体例において、前記酵素は、遊離酵素、例えば、ABL 遊離酵素、ALCALASER (Novozymes A/S, Denmark)である。他の具体例において、実施例４に示すように、前記酵素は、商品名ChiroCLEC-BL (Altus Biologics, Inc., Cambridge, MA)で販売されている酵素のごとき、架橋ABL結晶である。さらに別の具体例において、前記酵素は、スブチリシン活性を有する酵素の混合物（例えば、ALCALASER と ChiroCLEC-BL）であり得る。スブチリシンプロテアーゼ活性を有する酵素は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの具体例において、配列番号：１の変異体を使用できる。適当な変異体は、配列番号：１と同様の基質特異性およびスブチリシンプロテアーゼ活性を保有するものである。スブチリシンプロテアーゼ活性を有する適当な酵素の他の例は、配列番号：２〜４を含む。
【００４７】
上記のように、式ＩＶの立体特異的加水分解において式Ｖｂの化合物を生成する意図にあって、式Ｖａの化合物も生成混合物中に存在することがある。好ましくは、式Ｖａの化合物は式Ｖｂの化合物よりも少ない量で存在する。例えば、式Ｖｂの化合物の生成量、すなわち、（Ｓ,Ｓ）立体異性体の生成量は、少なくとも、式ＶａおよびＶｂの化合物の全生成量の６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％を構成する。
【００４８】
いくつかの具体例において、本発明は、さらに、式Ｖｂの化合物を式ＩＶａの化合物から分離することを含む。カルボン酸のそれらに対応するエステルからのそのような分離は当該分野で周知であり、通常業務とみなされている。例えば、前記分離は、有機溶媒と水または水性溶液との間で分配することによるごとく、前記酸の水性溶液中のより高い溶解性を利用することができる。［D.L. Pavia et al., Introduction to Organic Laboratory Techniques, 3d ed., Saunders College Publishing:  Philadelphia, PA (1988)、特に、427-32頁］を参照せよ。そのような分配（分離および抽出）に普通に用いる有機溶媒は当業者に周知であり、ペンタン、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、石油エーテル、リグロイン、エーテル、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、酢酸エチルなどが含まれる。
【００４９】
代替的に、カルボン酸とエステルとの異なる反応性を利用して（［March and Larock, 上掲］を参照）、式Ｖｂまたは式ＩＶａの化合物のうちの１つを、他方から分離する前に、異なる化合物へと変換することができる。例えば、水素化ホウ素は、エステルよりも相当容易にカルボン酸を還元する（例えば、［Marchの１５４４−４６頁］を参照）。かくして、式Ｖｂの化合物を対応するアルコールに選択的に還元する水素化ホウ素を用いる還元条件に、その混合物を付すことができる。ついで、このアルコールを、クロマトグラフィーのごとき標準技術によって式ＩＶａの化合物から分離できる。本発明は、式ＩＶａの化合物またはそれから誘導された化合物を、式ＩＶｂの化合物またはそれから誘導された化合物から上記の選択的加水分解によって分離するそのようないかなる分離をも、立体異性体的に純粋なまたは立体異性体的に豊富化された（Ｒ,Ｒ）−または（Ｓ,Ｓ）−モナチンを得るための手段として、「式Ｖｂの化合物を式ＩＶａの化合物から分離すること」と考える。
【００５０】
いくつかの具体例において、本発明は、さらに、式ＩＶａの化合物を式Ｉａ：
【００５１】
【化９】
2010539977.tif 000011
の化合物、すなわち、（Ｒ,Ｒ）−モナチンに転換することを含む。
【００５２】
いくつかの具体例において、式ＩＶａの化合物の式Ｉａの化合物への転換は、
（ａ）式ＩＶａの化合物を加水分解して、式ＶＩａ：
【００５３】
【化１０】
2010539977.tif 000012
の化合物を生成し；次いで、
（ｂ）式ＶＩａの化合物を脱保護して、式Ｉａの化合物を生成する
ことを含む。
【００５４】
加水分解に有用な試薬は当業者に周知であり、例えば、［March, 上掲、 特に469-74頁］；および［Larock, 上掲、特に1959-68頁］に記載されている。加水分解に有用な試薬の例は、LiOH、NaOH、KOHおよびBa(OH)2のごときＩＡおよびＩＩＡ族アルコキシドを含む。他の有用な試薬はSm/I2/MeOHおよびMgI2を含む。メチルエステルも、例えば、(Na2CO3 もしくは K2CO3)/MeOH/H2O、NaO2/DMSO、KSCN/DMF、EtSH/(AlCl3 もしくは AlBr3)、Me2S/(AlCl3 もしくは AlBr3)、(Li もしくは Na)SeCH3/DMF、NaCN/HMPA、(LiI もしくは LiBr)/DMF、LiI/(NaOAc もしくは NaCN)/DMF、BCl3、AlI3 または MeSiCl3で切断することができる。三級アルキルエステルは、例えば、2 KOtBu、Mg/MeOH または Me3SiCl/NaI/H2Oで切断することができる。ラクトンは、例えば、(Li もしくは Na)SMe、KSeO3K または NaSeCH2Phで切断することができる。いくつかの具体例において、加水分解はMeOHまたはEtOHのごときアルコール性溶媒中でKOHを用いて行う。
【００５５】
脱保護に有用な試薬は、保護基の特性に依存し、当業者に周知であり、例えば、［Greene, 上掲］に記載されている。例えば、上で列記した様々なアミノ保護基は以下：H2/Raney (Ni); H2/Pt、pH 2-4; H2/Pd; H2/Lindlar; および H2/Rhの一以上で除去することができる。いくつかの具体例において、Ｃｂｚ−保護アミノ基の脱保護はPd/C上のH2を用いて達成する。
【００５６】
水素化によって切断される保護基に加えて、酸もしくは塩基によって加水分解的に切断できるか、または、還元によって切断できる窒素のためのいかなる保護基を採用できるであろう。酸化的方法で切断される保護基はあまり適当ではない、インドール核が酸化する疑いのためである。
【００５７】
代替的に、式ＩＶａの化合物の式Ｉａの化合物への転換は
（ａ）式ＩＶａの化合物を脱保護して式ＶＩＩＩａ：
【００５８】
【化１１】
2010539977.tif 000013
の化合物を生成し；次いで、
（ｂ）式ＶＩＩＩａの化合物を加水分解して、式Ｉａの化合物を生成する
ことによって達成することができる。加水分解および脱保護に有用な試薬は、加水分解が脱保護前に実行される転換について上記したものである。しかしながら、加水分解する前に脱保護することは望ましくないラクタム生成につながることがある。
【００５９】
いくつかの具体例において、本発明は、さらに、式Ｖｂの化合物を式Ｉｂ：
【００６０】
【化１２】
2010539977.tif 000014
の化合物、すなわち、（Ｓ,Ｓ）−モナチンに転換することを含む。
【００６１】
いくつかの具体例において、式Ｖｂの化合物の式Ｉｂの化合物への転換は、
（ａ）式Ｖｂの化合物を脱保護して、式ＶＩＩｂ：
【００６２】
【化１３】
2010539977.tif 000015
の化合物を生成し；次いで、
（ｂ）式ＶＩＩｂの化合物を加水分解して、式Ｉｂの化合物を生成する
ことによって達成することができる。
【００６３】
代替的に、式Ｖｂの化合物の式Ｉｂの化合物への転換は、
（ａ）式Ｖｂの化合物を加水分解して式ＶＩｂ：
【００６４】
【化１４】
2010539977.tif 000016
の化合物を生成し；次いで、
【００６５】
（ｂ）式ＶＩｂの化合物を脱保護して、式Ｉｂの化合物を生成する
ことによって達成することができる。加水分解および脱保護に有用な試薬は、加水分解が脱保護前に実行される転換について上記したものである。しかしながら、加水分解する前に脱保護することは、望ましくないエピ化を抑制する助けとなる。
【００６６】
本発明の特定の工程を以下の実施例に例示する。多数の具体例がここに開示されるが、本発明の他の具体例は、本明細書の全体の査読から当業者に明らかになるであろう。ここの記載から理解されるべきことは、本発明は、本発明の概念および範囲から逸脱することなく様々な局面において修正できることである。したがって、図面および記載の全体は本質的に例示的であって、限定的なものでないと見なされるべきである。
【実施例】
【００６７】
分析方法：以下の方法を下記実施例に用いた。
【００６８】
逆相ＨＰＬＣ：
カラム  ：Varian Microsorb-MVTM 100 Å C18 4.6 mm x 150 mm
移動相  ：ACN:H2O (0.1% TFA) = 10:90、6 分間; 勾配 ACN 10% から 90% まで 25 分間
保持時間：モナチン (I) 10.6 分; モナチン ラクトン／メチル エスエル (III) 13.5分; Cbz-保護 モナチン ラクトン／メチル エスエル (IV) 18.5 分; (モナチン純品 8.3 分)
【００６９】
全ての反応中間体についてのキラルＨＰＬＣ：
カラム  ：ChiraPak AD, 4.6 mm x 250 mm
移動相  ：Hexane:IPA (0.1% TFA) = 60:40; 1 mL/分, 220 および 273 nmにてモニター
【００７０】
モナチンについてのキラルＨＰＬＣ：
カラム  ：Chirobiotic T カラム 4.6 x 250 mm
移動相  ：メタノール:AcOH:NH4OH = 100:0.2:0.05; 1 mL/分, 220 および 279 nmにてモニター
【００７１】
実施例１：モナチンメチルエステル生成
１ａ．ＨＣｌガスで飽和させたメタノール中室温にてメチル化を行った。１００ｇモナチン（Ｉ）を１．６Ｌ無水メタノール中（すなわち、約６％（ｍ／ｖ）の濃度に）溶解した。混合物を室温にて２２時間攪拌した。ＨＰＬＣは、反応が完了したことを示した。ＨＣｌおよび溶媒を室温にて蒸発させた。残渣を、引き続き実施例２において精製せずに用いた。生成物はジメチルエステル（ＩＩ．１）およびラクトン／モノメチルエステル（ＩＩＩ）の混合物であった。
【００７２】
１ｂ．１ａの工程を、約１０％（ｍ／ｖ）の濃度にて２時間の反応時間でも行うことができる。
【００７３】
実施例２：カルボキシベンゾイル保護
２ａ．実施例１ａからの粗生成物（ＩＩ．１およびＩＩＩの混合物）を１Ｌ酢酸エチルに溶解し、ついで、２．０Ｌ飽和NaHCO3を添加した。この混合物のｐＨを９．０に調節した。４℃にて、１当量のCbzCl （４８．９ｍＬ）を３０分間かけて滴下した。反応は３時間未満で行った。有機層を分離し、水層をEtOAc（２×５００ｍＬ）で抽出した。合わせたEtOAc層を飽和NaHCO3で洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、蒸発させて１５０ｇの生成物（ＩＩ．２およびＩＶの混合物）を得た。
【００７４】
２ｂ．２ａの工程を、約２０％（ｍ／ｖ）の基質濃度にて１時間の反応時間でも行うことができる。
【００７５】
実施例３：ラクトン化
３ａ．実施例２ａからの生成物を３００ｍＬメタノールおよび３００ｍＬトルエンに溶解した。７．０ｇのTsOHを添加した。この混合物を６５℃にて３時間攪拌した。ＨＰＬＣは、ラクトン化が完了したことを示した。溶媒を蒸発させ、残渣を、塩化メチレンおよび酢酸エチル（９：１）で溶出する１ｋｇのシリカゲルカラムで３回精製した。８５．９ｇ（出発物質からの全収率５８．８％、ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度８９．０％）の（ＩＶ，Ｒ１はメチル）を得た。
【００７６】
３ｂ．３ａの工程は、典型的に、約２５％（ｍ／ｖ）の基質濃度にて、１０％TsOHを添加した１：１メタノール：トルエン中で行う。この工程は、トルエン中、約１０−２０％（ｍ／ｖ）の基質濃度範囲にて１％TsOHを添加して行うこともでき、分解が少ない傾向にある。この工程の変形を用いて、反応を室温にて１５時間行い、生成物をトルエンから沈殿させて、カラムクロマトグラフィーの必要を排除する。この工程の変形は、典型的に、７０％の収率（モナチンから）を生じ、生成物は、ＨＰＣＬにより９８％純度である。
【００７７】
実施例４：酵素加水分解
実施例３ａ（ＩＶ、R1 はMeであり、 −N(H)Prot は −NHCbzである）を、６４０ｍＬのＡＣＮおよび２．０４Ｌのリン酸バッファー、０．３Ｍ、ｐＨ７．５に溶解した。６０ｍＬのCLEC-BL (lot: Bl03010A)を添加した。反応物を室温にて６．５時間攪拌した。ＨＰＬＣは、加水分解が５０％に近かったことを示した。
【００７８】
溶液をｐＨ２．０に酸性化し、ついで、塩化メチレンで抽出した（４×０．７Ｌ）。合わせた塩化メチレン層をNa2SO4上で乾燥した。溶液を蒸発させた。残渣を１．２Ｌ塩化メチレンおよび１．２Ｌ飽和NaHCO3に溶解した。
【００７９】
相分離は、Ｖｂの凝集のため明確ではなかった。有機相を分離し、固−液相を塩化メチレンで洗浄した（２×２００ｍＬ）。ＨＰＬＣは、固相には依然として５％を超えるＩＶａを含有されていることを示した。液−固相をｐＨ２．０に調節し、５００ｍＬの塩化メチレンを添加した。乳白濁の懸濁液が形成され、固体は再溶解できなかった。この乳白濁懸濁液を調節して１０に戻した。有機相を分離した。合わせた有機相を２００ｍＬの飽和NaHCO3で洗浄し、蒸発させて、４２ｇのＩＶａ（Ｒ,Ｒ）を得た。固−液相をろ過した。固体を乾燥して、４０．０ｇのＶｂ（Ｓ,Ｓ）ナトリウム塩を得た。
【００８０】
４ｂ．上記したように、４ａの工程は８５ｇの出発物質を用いて行った。この工程はより大規模、例えば、５００ｇの出発物質を用いて、１９時間の反応時間で行うこともできる。塩化メチレン（２．５Ｌ）を添加した後、ろ過によって酵素を除去する。水相と有機相とを分離し、水相を塩化メチレンで抽出する（３．２５Ｌ）。合わせた有機相をさらなる加工をなにもせずに次の段階に用いる。代替的に、合わせた有機相を減圧濃縮して、粘稠な油を得る。その油をトルエンで処理して、純粋なＩＶａ（Ｒ,Ｒ）の沈殿物を生じるが、ある程度の収率の損失がある。
【００８１】
塩化メチレン（２．５Ｌ）を水相に添加し、１０％水性ＨＣｌ（約１．５Ｌ）を用いてｐＨを２に調節した。生成物Ｖｂ（Ｓ,Ｓ）が沈殿し、ろ過で収集する。
【００８２】
本発明者のうちの何人かの者が実施例４ａの結果を再現することができなかった点で、実施例４ｂの工程は、４ａのものよりも好ましいと考えられる。
【００８３】
実施例５：式Ｉｂへの加水分解および水素化
５ａ．実施例４ａからの生成物Ｖｂを１５０ｍＬのエタノールに溶解し、ついで、４００ｍＬの２ＮのNaOHを添加した。混合物を室温にて３時間攪拌した。ＨＰＬＣは、加水分解が完了したことを示した。この溶液のｐＨを１．５に調節し、塩化メチレンで抽出した(８００ｍＬおよび４００ｍＬ)。塩化メチレン抽出物をNa2SO4上で乾燥し、蒸発させた。（ラクトン化を回避するために、化合物は完全に乾燥させなかった。）二酸ＶＩａを１１．６Ｌのメタノールに溶解した。溶液をN2ガスでパージし、ついで、３．２ｇの１０％Pd/Cを添加した。混合物をH2ガスでパージし、ついで、大気圧H2下で３時間攪拌した。ＨＰＬＣは、水素化が完了したことを示した。触媒をろ過除去した。溶液を４００ｍＬにまで濃縮し、ついで、１．６ＬのEtOAcを攪拌しながら添加した。白色沈殿が生成し、それをろ過し、乾燥して、２２．４ｇのＩｂ、すなわち、（Ｓ,Ｓ）−モナチンを得た。
【００８４】
５ｂ．実施例５ａに記載された転換は、最初に脱保護し、ついで、加水分解することによって実行することもできる。生成物ＶｂをMeOHに溶解し、基質濃度を約１０％（ｍ／ｖ）にした。Pd/C（１０％ Pd/Cの５０％湿潤ペーストの１０％(m/m)）を添加し、混合物を３バールH2および４０℃にて１時間水素化した。混合物を２５℃に冷却し、１０％水性KOH（４当量）を添加し、混合物を３０分間攪拌した。触媒をろ過によって除去し、ｐＨをAcOHで７．５に調節した。混合物を減圧下で濃縮し、EtOHで処理した（EtOH中モナチンの１０％溶液を作製した）。ゲルが生成し、それをヌッチェ加圧ろ過によりろ過し、真空オーブン中で乾燥した。残りの沈殿を３回EtOHで洗浄し、Ｉｂをモノカリウム塩として回収した。
【００８５】
実施例６：式Ｉａの加水分解および水素化
６ａ．実施例５ａに記載したのと同じ工程を用いて、実施例４ａからの生成物ＩＶａを２０．４ｇのＩａ、すなわち、（Ｒ,Ｒ）−モナチンに転換した。
【００８６】
６ｂ．実施例５ａに記載の転換（ＶｂからＩｂ）は、（ＩＶａからＩａ）と同じように実行することができる。１０％水性KOH（４当量）を塩化メチレン（５Ｌ）中の生成物ＩＶａ（酵素加水分解の後、実施例４ｂに記載するように、単離する）に添加し、基質濃度は約１０％であり、二相混合物を生成する。反応混合物を３０分間２５℃にて攪拌する。液相を分離し、AcOHを用いて、ｐＨを８−８．５に調節する。MeOH (２．５  Ｌ) およびPd/C（１０％ Pd/Cの５０％湿潤ペーストの１０％  (m/m)）を添加し、３バールH2および４０℃にて１時間水素化した。触媒をろ過によって除去し、混合物を減圧下で濃縮し、EtOHで処理した（EtOH中モナチンの１０％溶液を作製した）。ゲルが生成し、それをヌッチェ加圧ろ過によりろ過し、真空オーブン中で乾燥した。残りの沈殿を３回EtOHで洗浄し、Ｉａをモノカリウム塩として回収した。
【００８７】
本発明を今まで完全に説明してきたが、本発明の範囲やそのいかなる具体例にも影響を与えることなく、条件、組成および他のパラメータの広範かつ等価な範囲内で、同じことが行えることを当業者は理解するであろう。ここに引用される全ての特許および刊行物はここに出典明示して、それらの全てが完全に本明細書に含まれるものとみなされる。
【図１】
2010539977.tif 000025
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2010539977000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月1日(2010.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010539977000001.app
【国際調査報告】
2010539977.tif 000034