(57)【要約】本発明は、第二のプローブが標的細胞の染色体DNAに特異的に結合することが可能な条件下での標的細胞の可視化を可能とする、例えば胎児細胞などの標的細胞のmRNAに特異的に結合するためのプローブ、キット、および方法を提供する。2010535475.tif 000003
2010535475.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも約80℃の融解温度または少なくとも約40%のGC含量を有する第一のプローブが標的細胞内のそのmRNA標的に特異的にハイブリダイズし、かつ、第二のプローブが標的細胞内のその染色体DNA標的に特異的にハイブリダイズすることが可能な条件下で、一つまたは複数の標的細胞を含む生物学的試料に、第一のプローブおよび第二のプローブをインサイチューでハイブリダイズする段階を含む、細胞内のmRNAおよび染色体DNAを検出するための方法。
【請求項２】
第一のプローブが標的細胞のmRNAマーカー用のプローブである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
標的細胞が胎児細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
第一のプローブが胎児細胞のmRNAマーカー用のプローブである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
第一のプローブが、イプシロン-ヘモグロビンmRNA、ゼータ-ヘモグロビンmRNA、ガンマ-ヘモグロビンmRNA、Y-染色体特異的ジンクフィンガータンパク質mRNA(ZFY-mRNA)、胎児アルファ-フェトプロテイン(AFP)mRNA、ガンマ-グルタミル-トランスペプチダーゼ(GGT)mRNA、ヒト胎盤性ラクトゲン1、2、3、および4(hPL、PLAC-1-4としても知られる)mRNA、妊娠関連血漿タンパク質-A(PAPP-A)mRNA、副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRH)mRNA、組織因子経路阻害因子2(TFPI-2)mRNA、KISS-1転移-抑制因子mRNA、およびPLAC-1 mRNA、妊娠特異的ベータ-1-グリコプロテイン-2、3、4、5、6、7、および9 mRNA、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン2および変異体(v1、v2、v3、v4、v5)mRNA、成長ホルモン変異体mRNA、アルファ-ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン変異体mRNA、ジペプチジルペプチダーゼ7 mRNA、フィビュリンmRNA、s100カルシウム結合タンパク質mRNA、前立腺分化因子mRNA、ならびにシトクロムP450、サブファミリーxix mRNAからなる群より選択される胎児細胞のmRNAマーカー用のプローブである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
第一のプローブが一つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
第一のプローブが少なくとも約30%の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
第一のプローブが、ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、2'-OMeヌクレオチドを含む核酸、メチルホスホネートを含む核酸、ホスホロチオエートを含む核酸、モルホリノを含む核酸、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される一つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
第一のプローブが約20から約50ヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
第一のプローブが、検出可能な物質で標識されている、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
第一のプローブがビオチンで標識されている、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
第二のプローブが、インサイチューハイブリダイゼーションのために蛍光標識されたプローブである、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
生物学的試料が血液または子宮頚管粘液試料である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
標的細胞が胎児由来の胎児細胞であり、生物学的試料が胎児の母性宿主由来の血液試料である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
標的細胞が胎児由来の胎児細胞であり、生物学的試料が胎児の母性宿主の血液試料から得られる胎児細胞濃縮試料である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
標的細胞が腫瘍性細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
生物学的試料内の細胞がインサイチューハイブリダイゼーションに適するように処理される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
生物学的試料内の細胞が、少なくとも30分間、室温にてPBS中の約4%パラホルムアルデヒドで処理されている、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
第一のプローブおよび第二のプローブが、ハイブリダイゼーション前に変性条件下で生物学的試料とインキュベートされる、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
条件が、約4時間から約14時間、約37℃から約45℃でハイブリダイズすることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
室温から80℃までの様々な温度での洗浄を含む洗浄工程が、第一のプローブおよび第二のプローブのハイブリダイゼーション後に行われる、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
洗浄溶液が、1XSSC、ホルムアミド、および任意で一つまたは複数の界面活性剤を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
第一のプローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションおよび第二のプローブのその染色体DNA標的へのハイブリダイゼーションを検出する前に、一つまたは複数のブロッキング剤が添加される、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
標的細胞が胎児細胞であり、第一のプローブがSEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：40からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
第一のプローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションおよび第二のプローブのその染色体DNA標的へのハイブリダイゼーションが同時に行われる、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
第一のプローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションおよび第二のプローブのその染色体DNA標的へのハイブリダイゼーションが同時に検出される、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも約80℃の融解温度または少なくとも約40%のGC含量を有する第一のプローブが胎児細胞内のそのmRNA標的に特異的にハイブリダイズし、かつ、第二のプローブが胎児細胞内のその染色体DNA標的に特異的にハイブリダイズすることが可能な条件下で、胎児由来の一つまたは複数の胎児細胞を含む生物学的試料に、第一のプローブおよび第二のプローブをインサイチューでハイブリダイズすることを含む方法であって、第一のプローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションおよび第二のプローブのその染色体DNA標的へのハイブリダイゼーションが、胎児の遺伝的障害の指標である、胎児の遺伝的障害を検出するための方法。
【請求項２８】
遺伝的障害が、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、フェニルケトン尿症、テイ-サックス病、副腎過形成、ファンコーニ貧血、脊髄性筋萎縮症、デュシェーヌ筋ジストロフィ、ハンチントン病、ベータサラセミア、筋緊張性ジストロフィ、ぜい弱X症候群、ダウン症候群、エドワーズ症候群、パトー症候群、クラインフェルター症候群、3倍性X染色体症候群、XYY症候群、8トリソミー、16トリソミー、ターナー症候群、ロバートソン転座、エンジェルマン症候群、ディ・ジョージ症候群、ウォルフ‐ヒルシュホーン症候群、およびRhD症候群からなる群より選択される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
生物学的試料が胎児の母性宿主由来の血液試料である、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
生物学的試料が、胎児の母性宿主の生物学的試料から得られる胎児細胞濃縮試料である、請求項27記載の方法。
【請求項３１】
染色体DNA標的が、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、フェニルケトン尿症、テイ-サックス病、副腎過形成、ファンコーニ貧血、脊髄性筋萎縮症、デュシェーヌ筋ジストロフィ、ハンチントン病、ベータサラセミア、筋緊張性ジストロフィ、ぜい弱X症候群、ダウン症候群、エドワーズ症候群、パトー症候群、クラインフェルター症候群、3倍性X染色体症候群、XYY症候群、8トリソミー、16トリソミー、ターナー症候群、ロバートソン転座、エンジェルマン症候群、ディ・ジョージ症候群、ウォルフ‐ヒルシュホーン症候群、およびRhD症候群からなる群より選択される遺伝的障害と関連している、請求項27記載の方法。
【請求項３２】
mRNA標的が胎児細胞のmRNAマーカーである、請求項27記載の方法。
【請求項３３】
胎児が少なくとも7週齢である、請求項27記載の方法。
【請求項３４】
SEQ ID NO：1〜40からなる群より選択される核酸配列を含むプローブ。
【請求項３５】
一つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項34記載のプローブ。
【請求項３６】
少なくとも約30%の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項34記載のプローブ。
【請求項３７】
ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、2'-OMeヌクレオチドを含む核酸、メチルホスホネートを含む核酸、ホスホロチオエートを含む核酸、モルホリノ類似体を含む核酸、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される一つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項34記載のプローブ。
【請求項３８】
約20から約50ヌクレオチドを含む、請求項34記載のプローブ。
【請求項３９】
検出可能な物質で標識されている、請求項34記載のプローブ。
【請求項４０】
励起‐発光メカニズムまたは化学発光メカニズムにより発光する直接的または間接的に検出可能な物質で標識されている、請求項34記載のプローブ。
【請求項４１】
フルオレセイン、Cy3、Cy5、Cy7、テキサスレッド、スターブライトグリーン、スターブライトオレンジ、ローダミングリーン、オレゴングリーン、ボディピィ(bodipy)蛍光体、350〜750nmの発光を有するアレクサフルオル(Alexa Fluor)色素、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される直接標識で標識されている、請求項34記載のプローブ。
【請求項４２】
ジゴキシゲニン、ビオチン、ルシファーイエロー、ジニトロフェニル(DNP)、ダンシル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される間接標識で標識されている、請求項34記載のプローブ。
【請求項４３】
請求項34記載のプローブを含むキット。
【請求項４４】
胎児細胞内の染色体DNA標的に対する第二のプローブをさらに含む、請求項43記載のキット。
【請求項４５】
胎児における遺伝的障害に関連した染色体DNA標的に対する第二のプローブをさらに含む、請求項43記載のキット。
【請求項４６】
プローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションに適した緩衝剤をさらに含む、請求項43記載のキット。
【請求項４７】
胎児細胞内の染色体DNA標的に対する第二のプローブと、プローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションおよび第二のプローブのその染色体DNA標的へのハイブリダイゼーションに適した緩衝剤とをさらに含む、請求項43記載のキット。
【請求項４８】
洗浄緩衝剤およびブロッキング剤をさらに含む、請求項47記載のキット。
【請求項４９】
インサイチューハイブリダイゼーションに適したものとなるように細胞試料を処理するための試薬をさらに含む、請求項48記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「In-situ Hybridization to Detect RNA and DNA Markers」と題される2007年8月3日に出願された米国特許仮出願第60/953,812号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本質的に、胎児細胞の生物マーカーには二つの種類があり、これらは胎児細胞表面抗原に対する抗体、ならびに、母体細胞においてよりも胎児細胞において好ましくは発現している遺伝子に関する細胞質タンパク質および遺伝子発現マーカーである。抗体マーカーは、直接的または間接的に標識され、蛍光技術を用いて可視化することができる。しかしながらこの方法には、抗体結合に対して陽性に染色された胎児細胞の蛍光シグナルにヘムの自発蛍光が干渉する;および、母体細胞上の抗原と通常交差反応する抗体の非特異性が、胎児細胞により生成されるシグナルに極度に干渉するおびただしいバックグランドとなる、という二つの問題がある。遺伝子発現マーカーは、標的とされるRNAが通常不安定であり、そのためリガンドとの結合に利用できないというそれ自体の問題を有する。
【０００３】
胎児細胞を可視化するための現在公知の方法は、細胞を染色することを含む。この目的に用いられる染色は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)によるさらなる分析を妨害し、その結果問題を提起する。
【０００４】
例えば、胎児細胞、特に胎児細胞に関連した遺伝的および/または遺伝子マーカーを検出するための非侵襲性の方法などのさらなる方法の開発が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、特にDNAマーカーの他にRNAマーカーもインサイチュー検出することが可能な条件下で、同一細胞内でDNAマーカーの他にRNAマーカーも検出可能であるという発見に、一部基づく。したがって、本発明は、RNAおよびDNAマーカー、ならびにこれらに関連する遺伝的障害を検出するために有用なプローブ、キット、および方法を提供する。
【０００６】
本発明の一つの態様において、本発明は細胞内のmRNAおよび染色体DNAを検出するための方法を提供する。該方法は、一つまたは複数の標的細胞を含む生物学的試料への第一のプローブおよび第二のプローブのインサイチューハイブリダイゼーションを含む。ハイブリダイゼーションは、第一のプローブが標的細胞内のそのmRNA標的に特異的にハイブリダイズし、かつ、第二のプローブが該標的細胞内のその染色体DNA標的に特異的にハイブリダイズすることが可能な条件下で行われる。一般に、第一のプローブとそのmRNA標的との間に形成される二重鎖は少なくとも約80℃の融解温度を有する。あるいは、第一のプローブは少なくとも約40％のGC含量を有する。
【０００７】
本発明の別の態様において、本発明は、胎児の遺伝的障害を検出するための方法を提供する。該方法は、胎児由来の一つまたは複数の胎児細胞を含む生物学的試料への第一のプローブおよび第二のプローブのインサイチューハイブリダイゼーションを含む。ハイブリダイゼーションは、第一のプローブが胎児細胞内のそのmRNA標的に特異的にハイブリダイズし、かつ、第二のプローブが該胎児細胞内のその染色体DNA標的に特異的にハイブリダイズすることが可能な条件下で行われる。一般に、第一のプローブとそのmRNA標的との間に形成される二重鎖は少なくとも約80℃の融解温度を有するか、または代わりに、第一のプローブは少なくとも約40％のGC含量を有する。第一のプローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションおよび第二のプローブのその染色体DNA標的へのハイブリダイゼーションは、胎児の遺伝的障害の指標である。
【０００８】
本発明のまた別の態様において、本発明は胎児細胞内のmRNA標的に特異的にハイブリダイズするプローブを提供する。
【０００９】
本発明のさらに別の態様において、本発明は、本発明のプローブを含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】細胞内のmRNAへのプローブのインサイチューハイブリダイゼーションおよびmRNA結合プローブの検出を示す。
【図２】mRNA標的に特異的に結合するプローブ内に含まれる例示的な修飾されたヌクレオチドを示す。
【図３】本発明の例示的なプローブおよびいくつかのそれらの特徴のリストである。小文字は正常なDNA塩基を示し、一方大文字はロックド核酸(LNA)塩基を示す。
【図４】インサイチューmRNAハイブリダイゼーションおよびそれに続く胎児細胞の検出の例示的なフローチャートである。
【図５】図5Aおよび図5Bは、mRNAおよびFISHの両方に陽性である胎児細胞の蛍光像である。図5Aはテキサス-レッドに結合した抗DIG-モノクローナル抗体にDIGが結合しているDIG標識イプシロン-mRNA-プローブを用いた4個の胎児nRBCの染色を示す。図5Bは、DAPIによる染色後の同じ4個のnRBCからのFISHシグナルを示す。
【図６】図6Aおよび6Bは、mRNAおよびFISHの両方に陽性である胎児細胞の蛍光像である。図6Aは、3個のイプシロン-mRNA-プローブ染色した胎児nRBCを示し、図6Bは、DAPI染色後の同じ3個の細胞からのFISH XYシグナルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本明細書において、以下の用語は以下の意味を有するものとする。
【００１２】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、同じ意味を有し、全体的に互換的に用いられる。これらは、5'末端から3'末端へ共有結合した2個を上回るヌクレオチドサブユニットで作られた一本鎖の、方向性を持つヌクレオチドポリマーを意味する。
【００１３】
本明細書を通して用いられ、特定の核酸塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは核酸を意味する省略形は、従来の一文字省略形である。それゆえ、ポリヌクレオチド中に含まれる場合、最も一般的な天然のコード核酸塩基は、以下のように略される：アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)、およびウラシル(U)。特記しない限り、一本鎖核酸配列は、一連の一文字省略形として示される。
【００１４】
一方の配列が逆平行センスにある他方の配列にハイブリダイズでき、「二重鎖」または「二本鎖」を形成する場合、2つの配列を「相補的」であるといい、各配列の3'末端は、他方の配列の5'末端と結合し、それゆえ一方の配列のA、T(U)、G、およびCは、それぞれ他方の配列のT(U)、A、C、およびGと整列する。
【００１５】
当業者に周知である分子生物学および核酸化学の従来の技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Sambrookら、1989、Molecular Cloning--A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y.；Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait, ed., 1984);およびNucleic Acid Hybridization (B. D. HamesおよびS. J. Higgins. eds., 1984)を参照のこと。
【００１６】
本発明は一部、特にDNAマーカーの他にRNAマーカーもインサイチュー検出することが可能な条件下で、同じ細胞内のDNAマーカーの他にRNAマーカーも検出可能であるという発見に基づく。したがって、本発明は、RNAおよびDNAマーカーならびにこれらに関連する遺伝的障害を検出するために有用なプローブ、キット、および方法を提供する。
【００１７】
本発明の一つの局面によれば、本発明は、例えばDNA/プローブ二重鎖の他に安定なRNA/プローブ二重鎖のインサイチューでの形成も可能とする等の検出条件下で、プローブとハイブリダイズさせることにより、同じ細胞内でDNAマーカーの他に一つまたは複数のRNAマーカーも検出するための方法を提供する。
【００１８】
本発明によれば、かかる検出条件には、プローブが例えばそれらの個別のRNAおよびDNA標的にインサイチューでハイブリダイズすることを可能とする任意の適した手段を含む。一つの態様において、本発明の検出条件は、DNAマーカーのFISHアッセイにより必要とされる変性条件下で熱安定性RNA/プローブ二重鎖を形成することを可能とするRNAマーカーに対するプローブを用いることを含む。例えば、かかるプローブは、少なくとも70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、85℃または90℃の融解温度を有するプローブであることができる。別の例において、かかるプローブは、少なくとも20%、25%、30%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、70%または75%のGC含量を有するプローブであることができる。
【００１９】
一般的に、本発明のプローブは、修飾されたおよび/または修飾されていない核酸を有する任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであることができる。例えば、本発明のプローブは、修飾されたおよび/または修飾されていないデオキシ-ヌクレオチドまたはリボ-デオキシヌクレオチドを包含できる。修飾された核酸の例は、限定するものではないが、ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、2'-OMeヌクレオチドを含む核酸、メチルホスホネートを含む核酸、ホスホロチオエートを含む核酸、およびモルホリノを含む核酸を包含する。
【００２０】
通常、修飾された核酸は、修飾されていないものよりも、その相補的な核酸とより安定な相互作用を提供する。それゆえ、本発明のプローブに含まれる修飾された核酸の程度は、他の要因の中でも特に、安定性要件、例えばプローブの熱安定性の要件などによる。一つの態様において、本発明のプローブはデオキシ-ヌクレオチドまたはリボ-デオキシヌクレオチドおよび修飾されたデオキシ-ヌクレオチドまたはリボ-デオキシヌクレオチドを含む、キメラプローブである。他の態様において、修飾された核酸は、本発明のプローブの一方または両方の末端に位置する。さらに別の態様において、修飾された核酸は本発明のプローブの全体に位置する。さらなる別の態様において、本発明のプローブは、約10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％または80％の修飾された核酸を含む。さらに他の態様において、本発明のプローブは、約10％、15％、20％、25％、30％、35％または40％の修飾された核酸を含む。
【００２１】
本発明によれば、プローブの長さは、その標的および本発明の検出条件に影響を及ぼす他の要因に基づいて変わり得る。一つの態様において、本発明のプローブはRNAマーカーに対して指向性を有し、その長さは約10ヌクレオチドから約50、100、200、300または400ヌクレオチドである。別の態様において、本発明のプローブはRNAマーカーに対して指向性を有し、その長さは約20ヌクレオチドから約25、26または27ヌクレオチドである。さらに別の態様において、本発明のプローブはRNAマーカーに対して指向性を有し、その長さは約30ヌクレオチドから約40、45または46ヌクレオチドである。一般に、DNAマーカー、例えば核DNAマーカーに対する本発明のプローブは、例えば遺伝子座のFISH検出に用いられるプローブの任意の混合物などのFISHアッセイに適した任意のプローブであることができる。
【００２２】
通常、本発明のプローブは検出可能な物質で直接的または間接的に標識されている。例えば、本発明のプローブは末端で、例えば一方もしくは両方の末端を、または内部を、例えばプローブ全体にわたって、標識することができる。一つの態様において、本発明のプローブは、例えば励起‐発光メカニズムまたは化学発光メカニズムなどの任意のメカニズムにより発光する直接的または間接的に検出可能な物質で標識することができる。他の態様において、本発明のプローブは、限定するものではないが、フルオレセイン；Cy3；Cy5；Cy7；テキサスレッド；スターブライトグリーン；スターブライトオレンジ；ローダミングリーン；オレゴングリーン；ボディピィ(bodipy)蛍光体；350〜750nmの発光を有するアレクサフルオル(Alexa Fluor)色素；ならびにこれらの組み合わせを含むリストより選択される直接標識で標識される。
【００２３】
さらに別の態様において、本発明のプローブは、限定するものではないが、ジゴキシゲニン；ビオチン；ルシファーイエロー；ジニトロフェニル(DNP)；西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、ルシフェラーゼまたはガラクトシダーゼなどの酵素分子；ダンシル；およびこれらの組み合わせを含むリストより選択される間接標識で標識されている。このようなプローブは、蛍光体と結合した、ストレプトアビジン(ビオチニル化プローブ用)または抗体(例えば、ジゴキシゲニンプローブ用の抗DiG-抗体)のいずれでも可視化できる。同様に、プローブが酵素分子で標識されている場合、このようなプローブは適当な酵素蛍光基質を用いて可視化することができる。
【００２４】
本発明によれば、本発明のプローブはその標的に完全に一致するか、またはその標的に対し、例えば1％、2％、3％、4％または5％ミスマッチなどの一つもしくは複数のミスマッチを含んでいることもできる。一般に、DNAマーカーに対する本発明のプローブは、遺伝子マーカーまたは遺伝子座用のFISHアッセイに通常用いられるプローブの混合物である。RNAマーカーに対する本発明のプローブに関しては、このプローブは、例えば標的細胞の起源、性質、同一性、または細胞期を示すRNAマーカーなどの任意のRNAマーカーを標的とすることができる。
【００２５】
一つの態様において、本発明のプローブは、例えば遺伝子マーカーまたは遺伝子座などのDNAマーカーと同様に胎児細胞内の一つまたは複数のRNAマーカーを標的とするプローブを包含する。他の態様において、本発明のプローブは、遺伝的障害と関連するDNAマーカーに対するプローブの他に胎児細胞内のRNAマーカーに対するプローブも包含する。さらに別の態様において、本発明のプローブは、例えば、7〜11週齢の胎児において通常発現しているイプシロンもしくはゼータ-ヘモグロビンmRNAまたは11週齢より大きい胎児において通常発現しているガンマ-ヘモグロビンmRNAなどの胎児の特定の発育段階に関連するRNAマーカーに対するプローブを包含する。さらなる別の態様において、本発明のプローブは、細胞の細胞学および形態学に基づく同定を可能にする細胞質内mRNAマーカーに対するプローブを包含する。さらに別の態様において、本発明のプローブは、特定の懐胎期間、すなわち、第一、第二、または第三トリメスターの間に発現されるmRNAマーカーに対するプローブを包含する。さらに別の態様において、本発明のプローブは、妊娠の第一のトリメスターの間に胎児において発現されるmRNAマーカーに対するプローブを包含する。さらに別の態様において、本発明のプローブは、妊娠の約5、6または7週から約11、12または13週の間の胎児において発現されるmRNAマーカーに対するプローブを包含する。
【００２６】
胎児細胞用の例示的なRNAマーカーには、限定されるものではないが、イプシロン-ヘモグロビンmRNA；ゼータ-ヘモグロビンmRNA；ガンマ-ヘモグロビンmRNA；Y染色体特異的ジンクフィンガータンパク質mRNA(ZFY-mRNA)；胎児アルファ-フェトプロテイン(AFP)mRNA；ガンマ-グルタミル-トランスペプチダーゼ(GGT)mRNA；ヒト胎盤性ラクトゲン1、2、3、および4(hPL、PLAC-1-4としても知られる)mRNA；妊娠関連血漿タンパク質-A(PAPP-A)mRNA；副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRH)mRNA、組織因子経路阻害因子2(TFPI-2)mRNA、KISS-1転移-抑制因子mRNA；およびPLAC-1 mRNA；妊娠特異的ベータ-1-グリコプロテイン-2、3、4、5、6、7、および9 mRNA；絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン2および変異体(v1、v2、v3、v4、v5)mRNA；成長ホルモン変異体mRNA；アルファ-ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン変異体mRNA；ジペプチジルペプチダーゼ7 mRNA；フィビュリンmRNA；s100カルシウム結合タンパク質mRNA；前立腺分化因子mRNA；ならびにシトクロムP450、サブファミリーxix mRNAが包含される。胎児細胞のRNAマーカーに対する本発明の例示的なプローブには、限定されるものではないが、SEQ ID NO：1から40より選択される核酸配列を含むプローブが包含される。
【００２７】
本発明によれば、RNAマーカーに対する本発明のプローブは、DNAマーカーに対するプローブと同時にまたはこれに続いてその標的にハイブリダイズすることができ、例えば、RNAマーカーに対するプローブは、それらの標的に、DNAマーカーに対するプローブがそれらの標的にハイブリダイズするよりも前に、その間に、および/または後でハイブリダイズする。一般に、RNAマーカーおよびDNAマーカーに対する本発明のプローブは、同じ条件下で取り扱うことができ、例えば、それらは同じ変性、ハイブリダイゼーション、および洗浄条件下でそれらの標的にハイブリダイズできる。一つの態様において、ハイブリダイゼーションは、一つまたは複数のプローブがそれらのDNA標的にハイブリダイズする間、RNAマーカーに対する一つまたは複数のプローブがそれらのRNA標的にハイブリダイズし、それらのRNA標的にハイブリダイズしたままでいることを可能とする条件下で行われる。
【００２８】
本発明の他の態様によれば、本発明の検出条件は、ハイブリダイゼーション条件、洗浄条件、洗浄緩衝剤、細胞の固定、変性条件などに関連した条件の一つまたは組み合わせを包含する。一つの態様において、本発明の検出条件は、約30℃、35℃、37℃から約45℃、50℃、55℃、60℃、または65℃の温度での、少なくとも1、2、3、4、5、または6時間の最小ハイブリダイゼーション時間を包含する。別の態様において、本発明の検出条件は、ストリンジェンシーのより低いハイブリダイゼーション後の洗浄工程、例えば、1Xまたは2X SSCを含み、および一般に用いられる界面活性剤と共にまたはこれ無しで、任意で約25%から約75％のホルムアミドを含む洗浄溶液を用いた低温度洗浄(例えば、室温から約80℃までのさまざまな温度)を含む。
【００２９】
さらに別の態様において、本発明の検出条件は、ハイブリダイゼーション前の、例えば少なくとも15、20、25、30、35、または40分間の細胞の固定を包含する。例えば、細胞を約1%から約4%のパラホルムアルデヒドを含有するPBSで約30から約60分間、約25℃から約37℃で処理することができる。他の例では、細胞を少なくとも約4%のパラホルムアルデヒドを含有するPBSで30分間、室温で処理することができる。さらに別の例では、任意で、はじめの処理の後、細胞を約0.01%から約1%のTriton X-100で約2から約30分間、約25℃から約37℃で処理してそれらを透過性にすることできる。さらなる別の例では、細胞を様々な条件下、例えば一定時間pH2から7で、0.01%から約5%のプロテイナーゼKで処理することにより透過性にすることができる。
【００３０】
またさらに別の態様において、本発明の検出条件には、非特異的ハイブリダイゼーションを妨げるかまたは減らすために一つまたは複数のブロッキング剤を用いることが包含される。例えば、この工程は一般に、プローブのその標的に対するハイブリダイゼーションの検出前に行うことができる。非特異的バックグランドハイブリダイゼーションの検出を妨げるかまたは最小限にできる任意の化合物がこの目的に適当である。剤の例示的なリストには、限定されるものではないが、BSA、カゼイン、PericeのSuperBlockおよびFcブロッカーが包含される。
【００３１】
本発明によれば、DNAマーカーの他にRNAも検出するための本発明の方法は、生物学的試料由来の任意の標的細胞において行うことができる。一つの態様において、生物学的試料は、細胞または組織試料、例えば一つまたは複数の細胞を含有することが疑われるものまたは含有する可能性のあるものである。別の態様において、生物学的試料は、限定するものではないが、血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄、または子宮頚管粘液試料を包含する体液である。他の態様において、生物学的試料は、例えば一つまたは複数の腫瘍またはがん細胞などの新生細胞を含む可能性があるかまたは含むことが疑われる任意の試料である。
【００３２】
さらに別の態様において、標的細胞は、胎児由来細胞、例えば、nRBC、リンパ球、トロホブラストなどであり、生物学的試料は、一つまたは複数の胎児細胞を含む胎児の母性宿主由来の試料である。胎児細胞を含むことが既知のまたは後に発見される任意の母性宿主試料を本発明に用いることができる。例えば、胎児細胞の原料として用いることのできる母性宿主試料には、限定するものではないが、血液、血漿、血清、唾液、尿、または子宮頚管粘液試料が包含される。
【００３３】
さらに別の態様において、標的細胞は胎児由来の胎児細胞であり、生物学的試料は胎児細胞が濃縮された胎児の母性宿主由来の試料である。このような胎児細胞濃縮試料は、限定されるものではないが、血液、血漿、血清、唾液、尿、および子宮頚管粘液を包含する胎児細胞を含むことが既知のまたは後に発見される任意の母体の生物学的試料から得ることができる。一つの態様において、胎児細胞濃縮試料は胎児の母性宿主の血液試料から得られる。
【００３４】
母性宿主由来の生物学的試料は、任意の公知の手段または後に発見される手段によって胎児細胞に関して濃縮できる。一つの態様において、母体の生物学的試料を、胎児細胞よりもむしろ母体細胞に結合するリガンドと接触させる。結果として、リガンドは生物学的試料から母体細胞を取り除き、それにより胎児細胞が生物学的試料で濃縮される。他の態様において、母体の生物学的試料を母体細胞よりもむしろ胎児細胞に結合するリガンドと接触させる。その後胎児細胞濃縮試料は、リガンドおよび胎児細胞を分離するのに適した条件下で緩衝剤を使用して、結合しているリガンドから胎児細胞を洗浄することにより得ることができる。このような条件および緩衝剤は、当業者に公知である。
【００３５】
本発明の他の局面によれば、DNAマーカーの他にRNAマーカーも検出するための本発明の方法は、遺伝子マーカーと関連する任意の状態を検出するため、特に同時に細胞型の同定または確認を必要とする細胞の任意の遺伝的状態を検出するために用いることができる。一つの態様において、本発明の方法は遺伝子マーカーと関連する新生物の状態を検出するために用いることができる。例えば、RNAマーカーに対する本発明のプローブは、標的細胞の細胞型のRNAマーカー用のプローブであることができ、一方、DNAマーカーに対するプローブは、同じ標的細胞の新生物の状態の余地があるかまたはこれを示す遺伝的状態用のプローブであることができる。
【００３６】
他の態様において、本発明の方法は、遺伝子マーカーと関連する胎児の状態を検出するために用いることができる。例えば、RNAマーカーに対する本発明のプローブは、胎児細胞の同定用のプローブであることができ、一方、DNAマーカーに対するプローブは、例えば胎児の染色体構成または遺伝的構成などの胎児の遺伝的状態用のプローブであることができる。さらに別の態様において、本発明の方法は胎児の遺伝的障害を検出するために用いることができる。例えば、胎児細胞の一つまたは複数のRNAマーカーおよび遺伝的障害に関連するDNAマーカーに対する本発明のプローブを本発明の方法に従って用いて、一つまたは複数の胎児の遺伝的障害、例えば、染色体欠失、付加、転座、および遺伝子突然変異、欠失、重複などを検出することができる。
【００３７】
例示的な遺伝的障害には、限定するものではないが、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、フェニルケトン尿症、テイ-サックス病、副腎過形成、ファンコーニ貧血、脊髄性筋萎縮症、デュシェーヌ筋ジストロフィ、ハンチントン病、ベータサラセミア、筋緊張性ジストロフィ、ぜい弱X症候群、ダウン症候群、エドワーズ症候群、パトー症候群、クラインフェルター症候群、3倍性X染色体症候群、XYY症候群、8トリソミー、16トリソミー、ターナー症候群、ロバートソン転座、エンジェルマン症候群、ディ・ジョージ症候群、ウォルフ‐ヒルシュホーン症候群、およびRhD症候群が包含される。
【００３８】
本発明によれば、胎児の遺伝的障害は懐胎期間の任意の時期、すなわち、第一、第二、または第三トリメスターの間で検出することができる。一つの態様において、遺伝的障害は妊娠の第一トリメスターの間で検出される。別の態様において、遺伝的障害は、妊娠の約5、6、または7週から約11、12、または13週の間で検出される。さらに別の態様において、遺伝的障害は、胎児が少なくとも5または6または7週齢の時に検出される。
【００３９】
一般に、本発明の方法におけるプローブのそのRNA標的へのハイブリダイゼーション、およびプローブのそのDNA標的へのハイブリダイゼーションは、一方または両方の標的に関連した状態を示す。一つの態様において、プローブのそれぞれの標的へのハイブリダイゼーションにより示されるRNA標的またはDNA標的の一方または両方の存在は、標的の一方または両方に関連する状態を示す。他の態様において、ハイブリダイゼーションシグナルまたはパターン、例えばハイブリダイゼーションシグナルの数または強さにより示されるRNA標的もしくはDNA標的またはその両方の存在に関する強さまたは量は、一方または両方の標的に関連する状態を示す。例えば、プローブは、障害または状態に関連するRNA標的またはDNA標的内の配列を認識する、例えばこれにハイブリダイズする配列を含むことができる。あるいは、プローブはRNA標的またはDNA標的内の配列を認識する、例えばこれにハイブリダイズする配列を含むことができ、この場合、かかる配列のコピーの通常の数よりも多いかまたは少ない存在が障害または状態に関連する。例えば、正常な胎児細胞は21番染色体を2コピー含むはずである。21番染色体の3コピーを示す本発明の方法を用いる任意のハイブリダイゼーションは、21番染色体の余分なコピーを有することに関連する遺伝的障害、例えばダウン症候群を示す。
【００４０】
本発明の他の態様によれば、本発明の方法に有用なキットが提供される。一つの態様において、本発明のキットは一つまたは複数の本発明のプローブを含む。例えば、本発明のキットは、特定の細胞型用のRNAマーカーに対する一つまたは複数のプローブを包含でき、任意でDNAマーカーに対する一つまたは複数のプローブ、例えば、公知のDNA FISHプローブおよび/または遺伝的状態に関連する遺伝子用のFISHプローブなどの利用可能なプローブ、または13番染色体、18番染色体、21番染色体、X染色体およびY染色体用のFISHプローブを含むプローブを包含する。
【００４１】
他の態様において、本発明のキットは一つまたは複数のRNAマーカーに対する一つまたは複数のプローブ、および、例えば本発明の方法に従って、一つまたは複数のDNAマーカーに対する一つまたは複数のプローブと関連してかかるプローブを使用するための説明書を含む。
【００４２】
さらに別の態様において、本発明のキットは、本発明の一つまたは複数のプローブおよび本発明の方法に有用な一つまたは複数の緩衝剤を含む。例えば、本発明のキットは、本発明の一つまたは複数のプローブおよび例えば本発明の方法に従って、固定、変性、ハイブリダイゼーション、および/または洗浄の工程に有用な緩衝剤を包含できる。本発明のキットはさらに、一つまたは複数のブロッキング剤または本発明の方法に有用な任意の他の剤も包含できる。
【００４３】
さらなる別の態様において、本発明のキットは、本発明の一つまたは複数のプローブおよび関心対象の特定の細胞型が濃縮された試料、例えば、母体の生物学的試料由来の濃縮された胎児細胞または宿主対象の生物学的試料由来の濃縮された新生細胞を含む。
【００４４】
実施例
以下の実施例は、限定するものではないが、明確にまたは潜在的に、任意の方法、形状、または形態で本発明を説明しようとするものである。これらは典型的に用いられるものであるが、当業者に公知の他の手順、方法、または技術を代わりに用いてもよい。
【００４５】
実施例1:胎児mRNAのインサイチューハイブリダイゼーションおよび胎児細胞の検出
インサイチューmRNAハイブリダイゼーションおよび続く胎児細胞の検出の例示的なフローチャートを図4に示す。血液試料をCyto-Chexおよび/またはTransFix(1:1)のいずれかの中に集めた。これらの細胞安定剤は細胞およびそれらの含量の安定性に必須であり、製造者の説明書に従って用いた。以下の工程は、フローチャートに従って行った。
【００４６】
工程1:胎児細胞濃縮:
細胞安定剤Cyto-Chex(Streck Labs)および/またはTransFix(1;1)(Cytomark Ltd.)中に集めた10 mlの母体血からの単核細胞を以下のプロトコルに従って、Histopaque 1.083から1.190(Sigma)またはPercoll 1.13を用いて密度勾配遠心分離法により単離した:
1% BSAを含む1X PBSを最終量30mlで各血液チューブに加えた。ピペットで数回上げ下げし、混合した。
25ml血清学ピペットを用い、20mlのHistopaque 1.083から1.190(Sigma)またはPercoll 1.13の上に試料を注意深く層にし、Histopaque層が乱れないことを確実にした。
試料チューブを400xgで45分間遠心分離し、確実にブレーキをオフにした。
トップ層の約1〜2mlを残し、第一および第二の層の中間の単層を破壊することなく、25ml血清学ピペットを用いて各チューブから上層を除去および廃棄した。
トランスファーピペットを用いて中間層およびFicoll層を取り出し、適当なラベルが付けられた事前にブロックされた50mlチューブに注意深く移した。赤血球細胞(RBC)層上の約1mlのFicollを残した。
【００４７】
*円運動を用いて頂部の縁から吸引した。
*最終量が50mlに等しくなるように25ml血清学ピペットを用いて各チューブ(中間層およびFicoll層を含む)に1%BSAを含むPBSを加えた。
ピペットで数回上げ下げして混合した。
*ブレーキを1にセットし、加速をFASTにセットして、400xgで45分間、試料チューブを遠心分離した。
各チューブに約5ml残して室内真空吸引システムを用いて注意深く上澄みを吸引した。
*1000μlピペットでペレットを穏やかに再懸濁した(10回、ゆっくり)。
最終量が50mlに等しくなるように25ml血清学ピペットを用いて各チューブに1%BSAを含むPBSを加えた。ピペットで数回上げ下げし混合した。
*ブレーキを1にセットし、加速をFASTにセットして、400xgで45分間、試料チューブを遠心分離した。
各チューブに約5ml残して室内真空吸引システムを用いて注意深く上澄みを吸引した。
細胞ペレット上に約800μl残して、トランスファーピペットを用いて残りの上澄みを注意深く吸引した。
【００４８】
工程2:胎児有核赤血球細胞(fnRBC)の捕捉:
上記の中間層およびFicoll層由来の細胞を胎児細胞表面抗原に対する抗体で被覆された専用の細胞捕捉装置に通した。細胞捕捉装置は、米国特許出願第11/458,668号および第11/331,988号において記載され、これらは両方、その全体が本明細書に組み入れられる。使用される抗体には、限定されるものではないが、抗グリコホリンA抗体(GPA)、抗トランスフェリン-レセプター抗体(CD71)、抗HLA-G233抗体、および/または抗CD34抗体などの幹細胞捕捉抗体が包含される。典型的には、抗グリコホリンA抗体は親水性ポリマーを介して細胞捕捉装置に連結される。細胞捕捉後、装置を0.155MのNH4Clに1から2分間曝すことにより大部分の赤血球細胞を溶解し、その後PBS洗浄で溶解液を除去した。
【００４９】
工程3:細胞固定および透過処理:
上記の工程2で捕捉された細胞を室温にて30分間4%パラホルムアルデヒド含有PBSで処理した。
【００５０】
PBSで洗浄後、細胞を室温にて10分間0.5%のTriton X-100で処理し、これらを透過化した。細胞を再度PBSで洗浄し、その後70%、90%および100%エタノールで連続洗浄し脱水した。
【００５１】
工程4:インサイチューmRNAおよび核DNA(FISH)ハイブリダイゼーション:
以下の組成のハイブリダイゼーション緩衝液(HB)を用意した:
50% 脱イオン化ホルムアミド
0.3M塩化ナトリウム
20 mM Tris. HCl、pH8.0
5 mM EDTA
10 mM リン酸ナトリウム
10% デキストラン
1X デンハート
mRNAおよびFISHプローブカクテル:
30μMイプシロン-ヘモグロビンプローブストック=2μl
30μMゼータ-ヘモグロビンプローブストック    =2μl
CEP-X Spectrum Green FISHプローブ           =1μl(Vysis)
CEP-Y Spectrum Orange FISHプローブ          =1μl(Vysis)
HB                                          =14μl
総量                                         =20μl
典型的なインサイチューハイブリダイゼーション実験において、20μlの上記のプローブカクテルを、細胞捕捉装置内の固定された細胞に加えた。
【００５２】
工程5:変性:
装置を80℃にて7分間加熱することにより変性を行った。
【００５３】
工程6:ハイブリダイゼーション:
ハイブリダイゼーションを37℃から45℃にて4〜14時間行った。
【００５４】
工程7:洗浄:
過剰な使用されなかったプローブのハイブリダイゼーション後の洗浄を、続けて以下のように行った:
洗浄i=45℃にて5分間2X SSC中50%ホルムアミド
洗浄ii=45℃にて2分間2X SSC
洗浄iii=室温にて5分間2X SSC
【００５５】
工程8: ブロッキング:
非特異的バックグランドを最小にするために、細胞を5%カゼイン含有PBAまたはPericeのSuperBlockのいずれかで1時間37℃にてブロッキングした。
【００５６】
工程9:胎児mRNAおよび核染色体DNAの可視化:
工程8からのブロッキング溶液を2X SSCで洗い流した後、好ましい蛍光体、すなわち、テキサスレッド、アレクサフルオル(Alexa fluor)などに結合する1μg/μlストレプトアビジン(ビオチニル化プローブ用)または抗DIG(DIG標識プローブ用)の溶液のいずれかで細胞を処理した。この処理は、37℃にて1時間行い、この後、過剰の試薬を37℃にて2X SSCで複数回(3〜5)の洗浄により洗い流した。
【００５７】
DIG-抗DIG複合体の安定化:
4%パラホルムアルデヒドなどのクロスリンカーまたはPierceのSulfo-EGS(エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシナート))などの他の2官能性クロスリンカーとクロスリンクすることによりDIG-抗DIG複合体を安定化する必要があった。保持しているmRNAシグナルにおいて有用な他のクロスリンカーは一般式:R-(CH2-CH2-O)n-Rのものであり、式中、n=2〜80であり、R=スルフォ-NHS、イミドエステルであることができる。
【００５８】
この工程がない場合、mRNAシグナルは時間とともに弱くなった。本発明者らはこれを、FISH後に核を可視化するために細胞に適用したDAPI-アンチフェード溶液の存在下での抗DIG-DIG-複合体の不安定性によるものであるとした。
【００５９】
典型的には、pH7.0の、1〜5%のクロスリンカー含有PBS溶液を室温にて1時間細胞と反応させた。過剰なリンカーをその後洗い流した。
【００６０】
工程10: mRNAおよびFISHシグナルの可視化:
市販のDAPI-アンチフェード溶液を20μl導入後、細胞を蛍光顕微鏡下で分析した。mRNAおよびFISHの両方が陽性である胎児細胞の典型的な蛍光像を図5Aおよび5Bに示す。
【００６１】
現在好ましい態様に関して本発明を説明しているが、当業者に明らかなさまざまな変更および改変を本発明の精神から逸脱することなく行えることを理解しなくてはならない。したがって、本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
2010535475.tif 000004
【図２】
2010535475.tif 000005
【図３】
2010535475.tif 000006
【図４】
2010535475.tif 000007
【図５】
2010535475.tif 000008
【図６】
2010535475.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月7日(2010.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010535475000001.app
【国際調査報告】
2010535475.tif 000010
2010535475.tif 000011
2010535475.tif 000012
2010535475.tif 000013