(57)【要約】本開示により、とりわけ、例えば、受容体標的化試薬を細胞に結合させる方法、および限定されないが癌および炎症性障害などのさまざまな障害を処置するための方法に有用な受容体標的化試薬（例えば、免疫毒性受容体標的化試薬）を取り上げて記載する。また、被験体（例えば、癌もしくは炎症性障害を有する被験体）に対する適切な処置モダリティの選択および／または細胞増殖性障害などのさまざまな障害の処置に有用な方法、組成物およびキットを取り上げて記載する。
2010536386.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合剤を含む第１の標的化ドメインと、（ｂ）ＩＬ−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）結合剤またはＩＬ−４受容体（ＩＬ４Ｒ）結合剤を含む第２の標的化ドメインを含み、（ａ）が（ｂ）に結合されている、受容体標的化試薬。
【請求項２】
さらに毒性ドメインを含み、前記受容体標的化試薬が免疫毒性である、請求項１に記載の受容体標的化試薬。
【請求項３】
前記毒性ドメインが小分子を含む、請求項２に記載の受容体標的化試薬。
【請求項４】
前記毒性ドメインが放射線剤を含む、請求項２に記載の受容体標的化試薬。
【請求項５】
前記毒性ドメインが毒性ポリペプチドを含む、請求項２に記載の受容体標的化試薬。
【請求項６】
前記毒性ポリペプチドがジフテリア毒素またはその生物学的に活性な断片である、請求項５に記載の受容体標的化試薬。
【請求項７】
前記毒性ポリペプチドが配列番号９または配列番号１０を含む、請求項５に記載の受容体標的化試薬。
【請求項８】
前記毒性ポリペプチドが、配列番号９または配列番号１０からなる、請求項５に記載の受容体標的化試薬。
【請求項９】
前記毒性ポリペプチドがシュードモナス体外毒素Ａまたはその生物学的に活性な断片を含む、請求項５に記載の受容体標的化試薬。
【請求項１０】
前記毒性ポリペプチドがシュードモナス体外毒素Ａまたはその生物学的に活性な断片からなる、請求項５に記載の受容体標的化試薬。
【請求項１１】
前記毒性ポリペプチドが配列番号１１または配列番号１２を含む、請求項５に記載の受容体標的化試薬。
【請求項１２】
前記毒性ポリペプチドが配列番号１１を含み、ここで、
（ｉ）４９０位のアルギニンがアラニンであり、５１３位のアルギニンがアラニンであり、４３２位のアルギニンがグリシンであり、４６７位のアルギニンがアラニンであり、５９０位のリジンがセリンである；
（ｉｉ）４９０位のアルギニンがアラニンであり、５１３位のアルギニンがアラニンであり、４６７位のアルギニンがグリシンであり、５４８位のグルタミン酸がセリンであり、５９０位のリジンがセリンであり、３３２位のグルタミンがセリンであり、３１３位のアルギニンがアラニンである；
（ｉｉｉ）４９０位のアルギニンがアラニンであり、５１３位のアルギニンがアラニンであり、４６７位のアルギニンがグリシンであり、５４８位のグルタミン酸がセリンであり、５９０位のリジンがセリンであり、４３２位のグルタミンがグリシンであり、３１３位のアルギニンがアラニンである；または
（ｉｖ）４９０位のアルギニンがアラニンであり、５１３位のアルギニンがアラニンであり、４６７位のアルギニンがグリシンであり、５４８位のグルタミン酸がセリンであり、５９０位のリジンがセリンであり、４３２位のグルタミンがグリシンであり、３３２位のグルタミンがセリンであり、３１３位のアルギニンがアラニンである、
請求項１１に記載の受容体標的化試薬。
【請求項１３】
前記毒性ポリペプチドが、シュードモナス体外毒素（ＰＥ）、ブリオジン、ゲロニン、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、アンジオゲニン、サポリン、アブリン、原核生物のリボヌクレアーゼ、真核生物のリボヌクレアーゼ、リシン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、アポトーシス促進性ポリペプチド、リボソーム阻害性タンパク質、および前記のもののいずれかの生物学的に活性な断片からなる群より選択される、請求項５に記載の受容体標的化試薬。
【請求項１４】
前記アポトーシス促進性ポリペプチドが、Ｂａｘ、Ｆａｓ、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｋ、Ｂｏｋ、Ｈｒｋ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ−αである、請求項１３に記載の受容体標的化試薬。
【請求項１５】
前記毒性ポリペプチドがＫＤＥＬアミノ酸配列を含む、請求項５〜１４いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項１６】
前記第２の標的化ドメインがＩＬ−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）結合剤を含む、請求項１〜１５いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項１７】
前記ＩＬ１３Ｒ結合剤が、ＩＬ１３Ｒに結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１〜１６いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項１８】
前記ＩＬ１３Ｒ結合剤がＩＬ−１３ポリペプチドまたはそのＩＬ１３結合断片を含む、請求項１〜１６いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項１９】
前記第２の標的化ドメインがＩＬ４Ｒ結合剤を含む、請求項１〜１５いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項２０】
前記ＩＬ４Ｒ結合剤が、ＩＬ４Ｒに結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１〜１５または１９いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項２１】
前記ＩＬ４Ｒ結合剤がＩＬ４  ポリペプチドまたはそのＩＬ４Ｒ結合断片を含む、請求項１〜１５、１９または２０いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項２２】
前記ＥＧＦＲ結合剤がＥＧＦＲに結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１〜２１いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項２３】
前記ＥＧＦＲ結合剤が上皮成長因子ポリペプチドまたはそのＥＧＦＲ結合断片を含む、請求項１〜２２いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項２４】
前記ＥＧＦＲ結合剤が、ベータセルリンポリペプチド、トランスフォーミング増殖因子αポリペプチド、アンフィレギュリンポリペプチド、エピレギュリンポリペプチド、ヘパリン結合ＥＧＦポリペプチド、または前記のもののいずれかのＥＧＦＲ結合断片を含む、請求項１〜２２いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項２５】
前記抗体または抗原結合断片がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１７、２０または２２いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項２６】
前記抗体または抗原結合断片が、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、またはｓｃＦｖ断片である、請求項１７、２０または２２いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項２７】
（ａ）と（ｂ）とが共有結合によって互いに結合されている、請求項１〜２６いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項２８】
（ａ）と（ｂ）とが非共有結合によって互いに結合されている、請求項１〜２６いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項２９】
（ａ）と（ｂ）とが、結合ペアの第１と第２の構成要素によって互いに結合されている、請求項２８に記載の受容体標的化試薬。
【請求項３０】
前記結合ペアがストレプトアビジンとビオチンである、請求項２９に記載の受容体標的化試薬。
【請求項３１】
（ａ）、（ｂ）、または（ａ）と（ｂ）とが前記毒性ドメインに非共有結合によって結合されている、請求項２〜３０いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項３２】
（ａ）、（ｂ）、または（ａ）と（ｂ）とが前記毒性ドメインに共有結合によって結合されている、請求項２〜３０いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項３３】
前記受容体標的化試薬が、（ａ）と（ｂ）を含む融合タンパク質を含む、請求項１〜３２いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項３４】
前記受容体標的化試薬が、前記毒性ドメインおよび（ａ）、（ｂ）、または（ａ）と（ｂ）を含む融合タンパク質を含む、請求項１〜３０、３２または３３いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項３５】
さらに１つ以上のリンカー部分を含む、請求項１〜３４いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項３６】
前記１つ以上のリンカー部分の少なくとも１つがペプチドである、請求項３５に記載の受容体標的化試薬。
【請求項３７】
前記１つ以上のリンカー部分が配列番号１３または配列番号１４を含む、請求項３５または３６に記載の受容体標的化試薬。
【請求項３８】
配列番号１〜３または１８〜２０を含む、請求項１〜３７いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項３９】
さらに１つ以上の検出可能な標識を含む、請求項１〜３８いずれか１項に記載の受容体標的化試薬。
【請求項４０】
請求項１〜３９いずれか１項に記載の受容体標的化試薬および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項４１】
請求項３３〜４０に記載の受容体標的化試薬の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項４２】
配列番号１〜３または１８〜２０のいずれかを含む融合タンパク質をコードする、請求項４１に記載の核酸。
【請求項４３】
配列番号１〜３または１８〜２０のいずれかからなる融合タンパク質をコードする、請求項４１または４２に記載の核酸。
【請求項４４】
請求項４１〜４３いずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４５】
請求項４１〜４３いずれか１項に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項４６】
請求項４５に記載のベクターを含む細胞。
【請求項４７】
請求項４６に記載の細胞を、融合タンパク質の発現に適した条件下で培養することを含む、融合タンパク質の作製方法。
【請求項４８】
さらに、前記タンパク質を前記細胞または該細胞を培養した培養培地から単離することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
細胞を、請求項１〜３９いずれか１項に記載の受容体標的化試薬と接触させることを含む、受容体標的化試薬を細胞に結合させるためのインビトロ方法。
【請求項５０】
さらに、前記細胞がＥＧＦＲ、ＩＬ１３Ｒ、またはＩＬ４Ｒを発現しているかどうかを調べることを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞がＥＧＦＲを発現している、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞がＩＬ１３Ｒを発現している、請求項４９〜５１いずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞がＩＬ４Ｒを発現している、請求項４９〜５２いずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞が癌細胞である、請求項４９〜５３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記癌細胞が、肺癌細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、膵臓癌細胞、腎臓癌細胞、胃癌細胞、肝臓癌細胞、骨癌細胞、血液の癌細胞、神経組織癌細胞、黒色腫細胞、甲状腺癌細胞、卵巣癌細胞、精巣癌細胞、前立腺癌細胞、頚部癌細胞、膣癌細胞、および膀胱癌細胞からなる群より選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記癌細胞が膠芽細胞腫細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項４９〜５６いずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞がヒト細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
被験体に、請求項１〜３９いずれか１項に記載の受容体標的化試薬を送達することを含む、受容体標的化試薬を細胞に結合させるためのインビボ方法。
【請求項６０】
前記被験体が哺乳動物である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記被験体がヒトである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
さらに、前記被験体が癌を有するかどうかを調べることを含む、請求項５９〜６１いずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記被験体が癌を有する、請求項５９〜６２いずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記癌が、肺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌、肝臓癌、骨癌、血液の癌、神経組織の癌、黒色腫、甲状腺癌、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌、頚部癌、腟癌、または膀胱癌である、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記癌が膠芽細胞腫である、請求項６２〜６４に記載の方法。
【請求項６６】
さらに、癌の１つ以上の細胞がＥＧＦＲ、ＩＬ１３Ｒ、またはＩＬ４Ｒを発現しているかどうかを調べることを含む、請求項６２〜６５いずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
細胞を、請求項２〜３９いずれか１項に記載の受容体標的化試薬と接触させることを含み、該細胞と該受容体標的化試薬との接触により該細胞が死滅する、細胞を死滅させるためのインビトロ方法。
【請求項６８】
癌を有する、癌を有することが疑われる、または癌が発生するリスクのある被験体に、請求項２〜３９いずれか１項に記載の受容体標的化試薬を送達することを含む、被験体の癌を処置するためのインビボ方法。
【請求項６９】
前記送達が、前記受容体標的化試薬を前記被験体に投与することを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記送達が、医薬用の前記受容体標的化試薬を前記被験体に静脈内投与することを含む、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記受容体標的化試薬が前記被験体に体循環ポンプを用いて投与される、請求項６８〜７１いずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
被験体に請求項２〜３９いずれか１項に記載の免疫毒性受容体標的化試薬を送達する前に、
該被験体に、（ａ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合剤と、（ｂ）ＩＬ−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）結合剤またはＩＬ−４受容体（ＩＬ４Ｒ）結合剤を含み、（ａ）が（ｂ）に結合されている受容体標的化試薬であって、毒性ドメインを含まない受容体標的化試薬を送達することを含む、
被験体において免疫毒性療法の毒性副作用を低下させるための方法。
【請求項７３】
癌を有する被験体に、（ａ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合剤と、（ｂ）ＩＬ−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）結合剤またはＩＬ−４受容体（ＩＬ４Ｒ）結合剤を含み、（ａ）が（ｂ）に結合されている受容体標的化試薬であって、毒性ドメインを含まない受容体標的化試薬を送達すること；および
該被験体に、請求項２〜３９いずれか１項に記載の免疫毒性受容体標的化試薬を送達すること
を含む、癌を処置するための方法。
【請求項７４】
哺乳動物の癌の１つ以上の癌細胞がＩＬ４Ｒ、ＩＬ１３Ｒ、またはＥＧＦＲを発現しているかどうかを調べること；および
該１つ以上の癌細胞がＩＬ４Ｒ、ＩＬ１３Ｒ、またはＥＧＦＲを発現している場合、該哺乳動物に対する治療用薬剤として請求項２〜３９いずれか１項に記載の受容体結合剤を選択すること
を含む、癌を有する哺乳動物に対する治療用薬剤を選択するための方法。
【請求項７５】
さらに、前記癌の１つ以上の癌細胞がＩＬ４Ｒ、ＩＬ１３Ｒ、またはＥＧＦＲを発現していると判定された後、前記被験体に前記選択した受容体標的化試薬を送達することを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
哺乳動物の癌の１つ以上の癌細胞がＩＬ４Ｒ、ＩＬ１３Ｒ、またはＥＧＦＲを発現している場合、癌を有する哺乳動物に対する治療用薬剤として、請求項２〜３９いずれか１項に記載の受容体結合剤を選択すること
を含む、癌を有する哺乳動物に対する治療用薬剤を選択するための方法。
【請求項７７】
さらに、前記哺乳動物の１つ以上の癌細胞がＩＬ４Ｒ、ＩＬ１３Ｒ、またはＥＧＦＲを発現しているかどうかを調べることを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
請求項１〜３９いずれか１項に記載の受容体標的化試薬；および
該受容体標的化試薬を投与するための使用説明書
を備えるキット。
【請求項７９】
さらに、１種類以上の薬学的に許容され得る担体を備える、請求項７８に記載のキット。
【請求項８０】
さらに、薬学的に許容され得る希釈剤を備える、請求項７９に記載のキット。
【請求項８１】
ＩＬ４Ｒ、ＩＬ１３Ｒ、またはＥＧＦＲの発現を検出するための１種類以上の試薬；および
ＩＬ４Ｒ、ＩＬ１３Ｒ、またはＥＧＦＲの発現が検出された場合、請求項１〜３９いずれか１項に記載の該受容体標的化試薬を投与するための使用説明書
を備えるキット。
【請求項８２】
容器；および
該容器に内包された組成物
を備える、物品であって、
該組成物が哺乳動物の癌を処置するための活性剤を含み、該組成物内の該活性剤が請求項２〜３９いずれか１項に記載の免疫毒性受容体標的化試薬を含み、該容器が、該組成物が哺乳動物の癌の処置における使用のためのものであることを示すラベルを有する、物品。
【請求項８３】
前記ラベルが、さらに、前記哺乳動物の癌の１つ以上の癌細胞がＩＬ４Ｒ、ＩＬ１３Ｒ、またはＥＧＦＲを発現している場合に前記組成物を該哺乳動物に投与することを示すものである、請求項８２に記載の物品。
【請求項８４】
さらに、前記活性剤を前記哺乳動物に投与するための使用説明書を備える、請求項８２または８３に記載の物品。
【請求項８５】
前記組成物が、乾燥または凍結乾燥されている、請求項８２〜８４いずれか１項に記載の物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００７年８月２４日に出願された、米国仮出願第６０／９５７，９３６号（この全体の開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
この出願に記載された研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからのＵ．Ｓ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ助成金（助成金第ＲＯ１−ＣＡ３６７２５号、第ＲＯ１−ＣＡ０８２１５４号および第ＲＯ１−ＣＡ１０８６３７号）による支援を受けた。したがって、米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、一般的に、病原細胞、例えば癌細胞の増殖の抑止（または死滅）に有用な免疫毒素の分野のものである。
【背景技術】
【０００４】
背景
癌（例えば、前立腺癌または多形性膠芽腫などの膠芽細胞腫）は、西洋圏における主要死因であり、一般的に、細胞増殖に対する正常な抑制にもかかわらず過剰で無制御な細胞増殖を特徴とするものである。このような癌細胞は、他の細胞のために正常に確保された領域内に浸潤し、コロニーを形成（転移）し得る。癌治療の様式としては、化学療法、手術、放射線、およびこれらの処置の組合せが挙げられる。多くの抗癌剤が開発されているが、より有効な治療剤の必要性が依然として存在している。
【０００５】
免疫毒素は、分子を対象の標的細胞（例えば、癌細胞または炎症性障害を媒介する免疫細胞）に指向させる標的化ドメインと、標的細胞の増殖を抑止（または標的細胞を死滅させる）毒性ドメインを含む分子である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
本開示において、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合ドメインと、インターロイキン−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）結合ドメイン（またはインターロイキン−４受容体（ＩＬ４Ｒ）結合ドメイン）を含む二重特異性の免疫毒性受容体標的化試薬が、マウスの癌細胞の死滅および腫瘍負荷の低減において、その単一特異的な受容体標的化試薬対応物よりもずっと有効であったという驚くべき知見を詳述する。したがって、本明細書に記載の二重特異性受容体標的化試薬は、とりわけ、さまざまな増殖性障害、例えば癌および炎症性障害の処置方法に有用である。
【０００７】
また、本開示により、被験体に投与された免疫毒性受容体標的化試薬の毒性が、免疫毒素の前に、該被験体に非免疫毒性受容体標的化試薬を投与することにより低減され得るという驚くべき知見について詳述する。したがって、免疫毒素療法の前に非免疫毒性受容体標的化試薬を投与する方法は、例えば、免疫毒性療法の１つ以上の副作用の数または重症度の低減に有用である。かかる方法は、医療従事者が、例えば、被験体の健常組織に実質的に影響を及ぼすことなく疾患（癌または炎症性障害など）が有効に処置される、被験体の治療レジメンを策定するために使用され得る。
【０００８】
一態様において、本開示により、（ａ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合剤を含む第１の標的化ドメインと、（ｂ）ＩＬ−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）結合剤またはＩＬ−４受容体（ＩＬ４Ｒ）結合剤を含む第２の標的化ドメインを含み、（ａ）が（ｂ）に結合されている受容体標的化試薬を取り上げて記載する。
【０００９】
別の態様において、本開示により、（ａ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合剤を含む第１の標的化ドメインと、（ｂ）ＩＬ−４受容体（ＩＬ４Ｒ）結合剤を含む第２の標的化ドメインを含み、該（ａ）が（ｂ）に結合されている受容体標的化試薬を取り上げて記載する。
【００１０】
別の態様において、本開示により、（ａ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合剤を含む第１の標的化ドメインと、（ｂ）ＩＬ−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）結合剤を含む第２の標的化ドメインを含み、該（ａ）が（ｂ）に結合されている受容体標的化試薬を取り上げて記載する。
【００１１】
本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬の一部の実施形態において、ＩＬ１３Ｒ結合剤は、ＩＬ１３Ｒに結合する抗体もしくはその抗原結合断片またはＩＬ−１３ポリペプチドもしくはそのＩＬ１３Ｒ結合断片を含むもの、あるいは該抗体もしくは該断片または該ポリペプチドもしくは該断片からなるものであり得る。
【００１２】
本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬の一部の実施形態において、ＩＬ４Ｒ結合剤は、ＩＬ４Ｒに結合する抗体もしくはその抗原結合断片またはＩＬ−４ポリペプチドもしくはそのＩＬ４Ｒ結合断片を含むもの、あるいは該抗体もしくは該断片または該ポリペプチドもしくは該断片からなるものであり得る。
【００１３】
本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬の一部の実施形態において、ＥＧＦＲ結合剤は、（ｉ）ＥＧＦＲに結合する抗体またはその抗原結合断片；（ｉｉ）上皮成長因子ポリペプチドもしくはそのＥＧＦＲ結合断片；（ｉｉｉ）ベータセルリンポリペプチドもしくはそのＥＧＦＲ結合断片；（ｉｖ）トランスフォーミング増殖因子αポリペプチドもしくはそのＥＧＦＲ結合断片；（ｖ）アンフィレギュリンポリペプチドもしくはそのＥＧＦＲ結合断片；（ｖｉ）エピレギュリンポリペプチドもしくはそのＥＧＦＲ結合断片；または（ｖｉｉ）ヘパリン結合ＥＧＦポリペプチドもしくはそのＥＧＦＲ結合断片を含むもの、あるいは該（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかからなるものであり得る。抗体（例えば、ＥＧＦＲまたはＩＬ１３Ｒに結合する抗体）または抗原結合断片は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、またはｓｃＦｖ断片であり得る。
【００１４】
一部の実施形態において、（ａ）と（ｂ）は、共有結合または非共有結合によって互いに結合され得る。一部の実施形態において、（ａ）と（ｂ）は、結合ペアの第１と第２の構成要素によって互いに結合され得る。結合ペアは、ストレプトアビジン（またはアビジン）とビオチンであり得る。一部の実施形態において、受容体標的化試薬は、（ａ）と（ｂ）を含む融合タンパク質を含むもの、または該融合タンパク質からなるものであり得る。
【００１５】
一部の実施形態において、受容体標的化試薬は、さらに毒性ドメインを含むものであり得、この場合、該受容体標的化試薬は免疫毒性である。毒性ドメインは、小分子、放射線剤（radiological agent）および／または毒性ポリペプチドを含むもの、あるいは小分子、放射線剤および／または毒性ポリペプチドからなるものであり得る。毒性ポリペプチドは、ジフテリア毒素もしくはその生物学的に活性な断片からなるもの、または該毒素もしくは該断片を含むものであり得る。毒性ポリペプチドは、配列番号９または配列番号１０からなるもの、あるいは該配列番号を含むものであり得る。毒性ポリペプチドは、シュードモナス体外毒素Ａもしくはその生物学的に活性な断片からなるもの、または該毒素もしくは該断片を含むものであり得る。毒性ポリペプチドは、配列番号１１または配列番号１２を含むもの、あるいは該配列番号からなるものであり得る。毒性ポリペプチドは、例えば、シュードモナス体外毒素（ＰＥ）、ブリオジン（ｂｒｙｏｄｉｎ）、ゲロニン、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、アンジオゲニン、サポリン、アブリン、原核生物のリボヌクレアーゼ、真核生物のリボヌクレアーゼ、リシン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、アポトーシス促進性ポリペプチド、リボソーム阻害性タンパク質、または前記のもののいずれかの生物学的に活性な断片であり得る。アポトーシス促進性ポリペプチドは、例えば、Ｂａｘ、Ｆａｓ、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｋ、Ｂｏｋ、Ｈｒｋ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、またはＴＮＦ−αであり得る。
【００１６】
一部の実施形態において、受容体標的化試薬は、被験体において該ポリペプチドの免疫原性が低減または抑制されるように修飾された毒性ドメインを含むものであり得る。例えば、受容体標的化試薬は、配列番号１１に示されたアミノ酸配列を有し、（ｉ）４９０位のアルギニンがアラニンであり、５１３位のアルギニンがアラニンであり、４３２位のアルギニンがグリシンであり、４６７位のアルギニンがアラニンであり、５９０位のリジンがセリンである；（ｉｉ）４９０位のアルギニンがアラニンであり、５１３位のアルギニンがアラニンであり、４６７位のアルギニンがグリシンであり、５４８位のグルタミン酸がセリンであり、５９０位のリジンがセリンであり、３３２位のグルタミンがセリンであり、３１３位のアルギニンがアラニンである；（ｉｉｉ）４９０位のアルギニンがアラニンであり、５１３位のアルギニンがアラニンであり、４６７位のアルギニンがグリシンであり、５４８位のグルタミン酸がセリンであり、５９０位のリジンがセリンであり、４３２位のグルタミンがグリシンであり、３１３位のアルギニンがアラニンである；または  （ｉｖ）４９０位のアルギニンがアラニンであり、５１３位のアルギニンがアラニンであり、４６７位のアルギニンがグリシンであり、５４８位のグルタミン酸がセリンであり、５９０位のリジンがセリンであり、４３２位のグルタミンがグリシンであり、３３２位のグルタミンがセリンであり、３１３位のアルギニンがアラニンである毒性ポリペプチドを含むものであり得る。受容体標的化試薬は、配列番号１１のアミノ酸配列および（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つに示した置換を有する毒性ポリペプチドの断片を含むものであってもよいことは理解されよう。例えば、受容体標的化試薬は、配列番号１１のアミノ酸２７６〜６３３のアミノ酸配列であって、（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかに示した置換を含む配列を有する毒性ポリペプチドを含むものであり得る。
【００１７】
一部の実施形態において、（ａ）、（ｂ）、または（ａ）と（ｂ）は、毒性ドメインに非共有結合または共有結合によって結合され得る。受容体標的化試薬は、該毒性ドメインおよび（ａ）、（ｂ）、または（ａ）と（ｂ）を含む融合タンパク質を含むものであり得る。（ａ）および／または（ｂ）は毒性ドメインに、本明細書に記載の任意の配置で結合され得る。
【００１８】
一部の実施形態において、受容体標的化試薬は、さらに、１つ以上のリンカー部分を含むものであり得る。該１つ以上のリンカー部分の少なくとも１つはペプチドリンカーであり得る。ペプチドリンカーは、例えば、配列番号１３もしくは配列番号１４または本明細書に記載の任意の他のリンカーペプチドを含むもの、あるいは該配列番号または該リンカーペプチドからなるものであり得る。
【００１９】
一部の実施形態において、受容体標的化試薬は、配列番号１〜３のいずれかを含むもの、または該配列番号からなるものであり得る。一部の実施形態において、受容体標的化試薬は、配列番号１８〜２０のいずれか１つを含むもの、または該配列番号のいずれか１つからなるものであり得る。
【００２０】
一部の実施形態において、受容体標的化試薬は、１つ以上の検出可能な標識を含むものであり得る。
【００２１】
一部の実施形態において、受容体標的化試薬は細胞に結合するものであり得る。該細胞は、例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であり得る。該細胞は、ＩＬ１３Ｒおよび／またはＥＧＦＲを発現している細胞であり得る。
【００２２】
別の態様において、本開示により、上記の任意の受容体標的化試薬および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を取り上げて記載する。
【００２３】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載の任意のポリペプチド（例えば、配列番号１〜２２のいずれか１つ）をコードする核酸を提供する。
【００２４】
別の態様において、本開示は、上記の任意のポリペプチド受容体標的化試薬を含む融合タンパク質をコードする核酸を提供する。例えば、該核酸は、配列番号１〜３のいずれか１つを含むか、または該配列番号のいずれか１つからなる融合タンパク質をコードするものであり得る。別の例において、該核酸は、配列番号１８〜２０のいずれか１つを含むか、または該配列番号のいずれか１つからなる融合タンパク質をコードするものであり得る。
【００２５】
また別の態様において、本開示により、（ｉ）上記の任意の核酸を含むベクター；（ｉｉ）上記の任意の核酸を含む発現ベクター；および／または（ｉｉｉ）（ｉｉ）の発現ベクターを含む細胞を取り上げて記載する。
【００２６】
別の態様において、本開示は、融合タンパク質の作製方法を提供する。該方法は、直前に記載の発現ベクターを含む細胞を、融合タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程を含む。また、該方法は、該タンパク質を該細胞または該細胞を培養した培養培地から単離する工程も含むものであり得る。
【００２７】
別の態様において、本開示により、上記の任意の核酸にコードされたポリペプチドを取り上げて記載する。
【００２８】
また別の態様において、本開示により、細胞を上記の任意の受容体標的化試薬と接触させる工程を含む、受容体標的化試薬を細胞に結合させるためのインビトロ方法を取り上げて記載する。また、該方法は、該細胞がＥＧＦＲ、ＩＬ１３Ｒ、またはＩＬ４Ｒを発現しているかどうかを調べる工程も含むものであり得る。該細胞は、ＥＧＦＲならびにＩＬ４Ｒおよび／またはＩＬ１３Ｒを発現している細胞であり得る。
【００２９】
また別の態様において、本開示により、細胞を上記の任意の受容体標的化試薬と接触させる工程を含む、受容体標的化試薬を細胞に結合させるためのインビトロ方法を取り上げて記載する。また、該方法は、細胞がＥＧＦＲまたはＩＬ１３Ｒを発現しているかどうかを調べる工程も含むものであり得る。該細胞は、ＥＧＦＲおよび／またはＩＬ１３Ｒを発現している細胞であり得る。
【００３０】
本明細書に記載の任意の方法の一部の実施形態において、該細胞は、癌細胞、例えば限定されないが、肺癌細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、膵臓癌細胞、腎臓癌細胞、胃癌細胞、肝臓癌細胞、骨癌細胞、血液の癌細胞、神経組織癌細胞、黒色腫細胞、甲状腺癌細胞、膠芽細胞腫細胞、卵巣癌細胞、精巣癌細胞、前立腺癌細胞、頚部癌細胞、膣癌細胞、および膀胱癌細胞などであり得る。該細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞などの免疫細胞であり得る。該細胞は、例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であり得る。
【００３１】
また別の態様において、本開示により、受容体標的化試薬を細胞に結合させるためのインビボ方法を取り上げて記載する。該方法は、被験体に上記の任意の受容体標的化試薬を送達する工程を含む。また、該方法は、被験体が癌を有するかどうかを調べる工程も含むものであり得る。癌は、例えば、肺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌、肝臓癌、骨癌、血液の癌、神経組織の癌、黒色腫、甲状腺癌、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌、頚部癌、膠芽細胞腫、腟癌、または膀胱癌であり得る。また、該細胞はＴ細胞またはＢ細胞などの免疫細胞であり得る。被験体はヒトなどの哺乳動物であり得る。被験体は、炎症状態（例えば、本明細書に記載の任意のもの）を有する、該炎症状態を有することが疑われる、または該炎症状態が発生するリスクのある被験体であり得る。また、該方法は、被験体の癌の１つ以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）細胞がＥＧＦＲ、ＩＬ４Ｒおよび／またはＩＬ１３Ｒを発現しているかどうかを調べる工程も含むものであり得る。該方法は、さらに、受容体標的化試薬が該細胞に結合したがどうか、または受容体標的化試薬が該細胞を死滅させた（もしくは該細胞の増殖を抑止した）かどうかを調べる工程を含むものであり得る。被験体が炎症状態を有する、炎症状態を有することが疑われる、または炎症状態が発生するリスクのある被験体である実施形態において、該方法は、炎症状態を処置する方法であり得る。
【００３２】
別の態様において、本開示により、細胞の増殖を抑止するためのインビトロ方法を取り上げて記載する。該方法は、細胞を上記の任意の免疫毒性受容体標的化試薬と接触させる工程を含み、細胞と免疫毒性受容体標的化試薬との該接触により、該細胞の増殖が抑止される。一部の実施形態において、該免疫毒性受容体標的化試薬によって細胞が死滅され得、したがって、該方法は、細胞を死滅させるためのインビトロ方法であり得る。該細胞は、癌細胞（例えば、上記の任意のもの）であり得る。
【００３３】
また別の態様において、本開示は、癌を有する、癌を有することが疑われる、または癌が発生するリスクのある被験体に、上記の任意の受容体標的化試薬を送達する工程を含む、被験体の癌を処置するためのインビボ方法を提供する。受容体標的化試薬は免疫毒性であり得る（すなわち、少なくとも１つの毒性ドメインを含む）。送達としては、例えば、静脈内および／または体循環ポンプ（systemic pump）の使用による該受容体標的化試薬の被験体への投与が挙げられ得る。
【００３４】
別の態様において、本開示により、被験体において免疫毒性療法の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つもしくは１０またはそれ以上）の毒性副作用を低減させるための方法を取り上げて記載する。該方法は、被験体に免疫毒素（例えば、本明細書に記載の任意の免疫毒性受容体標的化試薬）を送達する前に、該被験体に、非免疫毒性の試薬（例えば、本明細書に記載の任意の非免疫毒性受容体標的化試薬）であって、毒性ドメインを含まない非免疫毒性の試薬を送達する工程を含む。
【００３５】
一部の実施形態において、該非免疫毒性の試薬は、免疫毒素と同じ結合特異性を有するものであり得る。
【００３６】
別の態様において、本開示は、被験体において免疫毒性療法の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれ以上）の毒性副作用を低減させるための方法を提供する。該方法は、被験体に上記の任意の免疫毒性受容体標的化試薬を送達する前に、該被験体に、（ａ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合剤と、（ｂ）ＩＬ−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）結合剤を含み、該（ａ）が（ｂ）に結合されている受容体標的化試薬であって、毒性ドメインを含まない受容体標的化試薬を送達する工程を含む。
【００３７】
別の態様において、本開示により、癌を処置するための方法を取り上げて記載する。該方法は、癌を有する被験体に、（ａ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合剤と、（ｂ）ＩＬ−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）結合剤またはＩＬ−４受容体（ＩＬ４Ｒ）結合剤を含み、該（ａ）が（ｂ）に結合されている受容体標的化試薬であって、毒性ドメインを含まない受容体標的化試薬を送達する工程；および該被験体に本明細書に記載の任意の免疫毒性受容体標的化試薬を送達する工程を含む。
【００３８】
別の態様において、本開示により、癌を処置するための方法を取り上げて記載する。該方法は、癌を有する被験体に、（ａ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合剤と、（ｂ）ＩＬ−４受容体（ＩＬ４Ｒ）結合剤を含み、該（ａ）が（ｂ）に結合されている受容体標的化試薬であって、毒性ドメインを含まない受容体標的化試薬を送達する工程；および該被験体に本明細書に記載の任意の免疫毒性受容体標的化試薬を送達する工程を含む。
【００３９】
別の態様において、本開示により、癌を処置するための方法を取り上げて記載する。該方法は、癌を有する被験体に、（ａ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合剤と、（ｂ）ＩＬ−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）結合剤を含み、該（ａ）が（ｂ）に結合されている受容体標的化試薬であって、毒性ドメインを含まない受容体標的化試薬を送達する工程；および該被験体に本明細書に記載の任意の免疫毒性受容体標的化試薬を送達する工程を含む。
【００４０】
また別の態様において、本開示により、癌を有する哺乳動物に対する治療用薬剤を選択するための方法を取り上げて記載する。該方法は、哺乳動物の癌の１つ以上の癌細胞がＩＬ１３Ｒ、ＩＬ４Ｒ、またはＥＧＦＲを発現しているかどうか調べる工程；および該１つ以上の癌細胞がＩＬ１３Ｒ、ＩＬ４Ｒ、またはＥＧＦＲを発現している場合、該哺乳動物に対する治療用薬剤として上記の任意の受容体標的化試薬（例えば、上記の任意の免疫毒性受容体標的化試薬）を選択する工程を含む。一部の実施形態において、該方法は、該１つ以上の癌細胞がＩＬ１３Ｒ、ＩＬ４Ｒ、またはＥＧＦＲを発現していると判定された後、該被験体に選択した受容体標的化試薬を送達する工程も含むものであり得る。
【００４１】
また別の態様において、本開示により、癌を有する哺乳動物に対する治療用薬剤を選択するための方法を取り上げて記載する。該方法は、哺乳動物の癌の１つ以上の癌細胞がＩＬ４ＲまたはＥＧＦＲを発現しているかどうかを調べる工程；および該１つ以上の癌細胞がＩＬ４ＲまたはＥＧＦＲを発現している場合、該哺乳動物に対する治療用薬剤として上記の任意の受容体標的化試薬（例えば、上記の任意の免疫毒性受容体標的化試薬）を選択する工程を含む。一部の実施形態において、該方法は、該１つ以上の癌細胞がＩＬ４ＲまたはＥＧＦＲを発現していると判定された後、該被験体に選択した受容体標的化試薬を送達する工程も含むものであり得る。
【００４２】
また別の態様において、本開示により、癌を有する哺乳動物に対する治療用薬剤を選択するための方法を取り上げて記載する。該方法は、哺乳動物の癌の１つ以上の癌細胞がＩＬ１３ＲまたはＥＧＦＲを発現しているかどうかを調べる工程；および該１つ以上の癌細胞がＩＬ１３ＲまたはＥＧＦＲを発現している場合、該哺乳動物に対する治療用薬剤として上記の任意の受容体標的化試薬（例えば、上記の任意の免疫毒性受容体標的化試薬）を選択する工程を含む。一部の実施形態において、該方法は、該１つ以上の癌細胞がＩＬ１３ＲまたはＥＧＦＲを発現していると判定された後、該被験体に選択した受容体標的化試薬を送達する工程も含むものであり得る。
【００４３】
別の態様において、本開示により、哺乳動物の癌の１つ以上の癌細胞がＩＬ１３Ｒ、ＩＬ４Ｒ、またはＥＧＦＲを発現している場合、癌を有する哺乳動物に対する治療用薬剤として、上記の任意の免疫毒性受容体標的化試薬を選択する工程を含む、癌を有する哺乳動物に対する治療用薬剤を選択するための方法を取り上げて記載する。また、該方法は、哺乳動物の該１つ以上の癌細胞がＩＬ１３Ｒ、ＩＬ４Ｒ、またはＥＧＦＲを発現しているかどうかを調べる工程も含むものであり得る。
【００４４】
別の態様において、本開示により、哺乳動物の癌の１つ以上の癌細胞がＩＬ１３ＲまたはＥＧＦＲを発現している場合、癌を有する哺乳動物に対する治療用薬剤として、上記の任意の免疫毒性受容体標的化試薬を選択する工程を含む、癌を有する哺乳動物に対する治療用薬剤を選択するための方法を取り上げて記載する。また、該方法は、哺乳動物の該１つ以上の癌細胞がＩＬ１３ＲまたはＥＧＦＲを発現しているかどうかを調べる工程も含むものであり得る。
【００４５】
上記の任意のインビボ方法の一部の実施形態において、被験体は、例えばヒトなどの哺乳動物であり得る。
【００４６】
一部の実施形態において、上記の任意のインビボ方法は、被験体が癌を有するかどうか、または癌が発生するリスクがあるかどうかを調べる工程を含むものであり得る。また、該方法は、被験体の癌の１つ以上の癌細胞がＩＬ１３Ｒ、ＩＬ４Ｒおよび／またはＥＧＦＲを発現しているかどうかを調べる工程も含むものであり得る。該インビボ方法は、（ｉ）受容体標的化試薬が細胞（例えば、ＥＧＦＲ、ＩＬ４Ｒおよび／またはＩＬ１３Ｒを発現している細胞、例えば、癌細胞もしくは免疫細胞など）に結合したかどうかを調べる工程；および／または（ｉｉ）受容体標的化試薬が細胞の増殖を抑止したかどうか、もしくは結合した細胞を死滅させたかどうかを調べる工程も含むものであり得る。
【００４７】
また別の態様において、本開示により、上記の任意の受容体標的化試薬；および該受容体標的化試薬を投与するための使用説明書を備えるキットを取り上げて記載する。また、キットは、１種類以上の薬学的に許容され得る担体および／または薬学的に許容され得る希釈剤を含むものであってもよい。
【００４８】
別の態様において、本開示により、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ４Ｒ、またはＥＧＦＲの発現を検出するための１種類以上の試薬；およびＩＬ１３ＲまたはＥＧＦＲの発現が検出された場合、被験体に本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬を投与するための使用説明書を備えるキットを取り上げて記載する。
【００４９】
別の態様において、本開示により、ＩＬ４ＲまたはＥＧＦＲの発現を検出するための１種類以上の試薬；およびＩＬ４ＲまたはＥＧＦＲの発現が検出された場合、被験体に本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬を投与するための使用説明書を備えるキットを取り上げて記載する。
【００５０】
別の態様において、本開示により、ＩＬ１３ＲまたはＥＧＦＲの発現を検出するための１種類以上の試薬；およびＩＬ１３ＲまたはＥＧＦＲの発現が検出された場合、被験体に本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬を投与するための使用説明書を備えるキットを取り上げて記載する。
【００５１】
別の態様において、本開示により、容器；および該容器に内包された組成物を備え、該組成物が哺乳動物の癌を処置するための活性剤を含み、該組成物内の活性剤が上記の任意の免疫毒性受容体標的化試薬を含み、該容器が、該組成物が哺乳動物の癌の処置における使用のためのものであることを示すラベルを有する物品を取り上げて記載する。該ラベルは、さらに、哺乳動物の癌の１つ以上の癌細胞がＩＬ１３Ｒ、ＩＬ４Ｒ、またはＥＧＦＲを発現している場合に該組成物を該哺乳動物に投与することを示すものであり得る。物品は、該活性剤を該哺乳動物に投与するための使用説明書も含むものであり得る。該組成物は、液状形態、または乾燥状態もしくは凍結乾燥状態であり得る。
【００５２】
別の態様において、本開示により、容器；および該容器に内包された組成物を備え、該組成物が哺乳動物の癌を処置するための活性剤を含み、該組成物内の活性剤が上記の任意の免疫毒性受容体標的化試薬を含み、該容器が、該組成物が哺乳動物の癌の処置における使用のためのものであることを示すラベルを有する物品を取り上げて記載する。該ラベルは、さらに、哺乳動物の癌の１つ以上の癌細胞がＩＬ４ＲまたはＥＧＦＲを発現している場合に該組成物を該哺乳動物に投与することを示すものであり得る。物品は、該活性剤を該哺乳動物に投与するための使用説明書も含むものであり得る。該組成物は、液状形態、または乾燥状態もしくは凍結乾燥状態であり得る。
【００５３】
別の態様において、本開示により、容器；および該容器に内包された組成物を備え、該組成物が哺乳動物の癌を処置するための活性剤を含み、該組成物内の活性剤が上記の任意の免疫毒性受容体標的化試薬を含み、該容器が、該組成物が哺乳動物の癌の処置における使用のためのものであることを示すラベルを有する物品を取り上げて記載する。該ラベルは、さらに、哺乳動物の癌の１つ以上の癌細胞がＩＬ１３ＲまたはＥＧＦＲを発現している場合に該組成物を該哺乳動物に投与することを示すものであり得る。物品は、該活性剤を該哺乳動物に投与するための使用説明書も含むものであり得る。該組成物は、液状形態、または乾燥状態もしくは凍結乾燥状態であり得る。
【００５４】
本明細書で用いる場合、２つ以上の原子間または分子単位間の相互作用との関連における「結合された」または「〜に結合された」は、２つ以上の原子または分子単位（例えば、２つ以上のドメイン（標的化ドメインもしくは毒性ドメインなど））の互いの任意の共有結合または非共有結合をいう。共有結合の化学的性質（１対以上の価電子を共有する２つの原子）は当該技術分野で知られており、例えば、ジスルフィド結合またはペプチド結合が挙げられる。非共有結合は、対の価電子の共有を伴わない原子間または分子間の化学結合である。例えば、非共有結合による相互作用としては、例えば、疎水性相互作用、水素結合相互作用、イオン結合、ファンデルワールス結合、または双極子間相互作用が挙げられる。かかる非共有結合による相互作用の例としては、抗体−抗原複合体形成または結合ペア相互作用（結合ペアの第１と第２の構成要素の相互作用（ストレプトアビジンとビオチン間の相互作用など））が挙げられる。用語「（ａ）が（ｂ）に結合されている」は、（ａ）と（ｂ）とが標的化ドメインである場合、（ａ）が（ｂ）に、（ｉ）上記の化学結合のいずれか１つ；（ｉｉ）リンカー（結合ペアを含む）；または（ｉｉｉ）毒性ドメインによって結合されていることを意味する。用語「（ａ）が（ｂ）に直接結合されている」は、（ａ）が（ｂ）に、（ｉｉｉ）ではなく（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかによって結合されていることを意味する。
【００５５】
「ポリペプチド」および「タンパク質」は互換的に使用し、長さまたは翻訳後修飾に関係なく、任意のペプチド結合アミノ酸鎖を意味する。
【００５６】
本明細書に記載の受容体標的化試薬の種々の成分（例えば、ドメイン）、例えば、ＥＧＦＲ結合ドメイン、ＩＬ１３Ｒ結合ドメイン、ＩＬ４Ｒ結合ドメイン、または毒性ポリペプチドを含む毒性ドメイン）はいずれも、該ポリペプチドの完全長野生型形態からなるもの、または該野生型形態を含むものであってもよい。ポリペプチドの成熟形態と未成熟形態が存在する場合、本発明の受容体標的化剤に使用されるものは、好ましくは成熟形態である。例えば、ＥＧＦＲ結合ドメインは、完全長上皮成長因子（例えば、ヒト上皮成長因子（アミノ酸配列配列番号６を有する上皮成長因子など））からなるもの、または該因子であり得る。
【００５７】
また、本開示は、（ｉ）生物学的活性バリアント、および（ｉｉ）本明細書に記載の完全長野生型ポリペプチドの生物学的に活性な断片またはその生物学的活性バリアント（例えば、受容体標的化試薬の種々のポリペプチドドメイン）を提供する。完全長の好ましくは成熟野生型タンパク質または該タンパク質の断片の生物学的活性バリアントは、付加、欠失または置換を含むものであり得る。置換を有するタンパク質は、一般的に、５０個以下（例えば、１個以下、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または５０個）の同類アミノ酸置換を有する。同類置換は、あるアミノ酸の、類似した特性を有する別のアミノ酸での置換である。同類置換としては、以下：バリン、アラニンおよびグリシン；ロイシン、バリンおよびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システインおよびトレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシンの群内での置換が挙げられる。非極性疎水性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性天然アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正の電荷を有する（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負の電荷を有する（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。上記の極性塩基性または酸性群の一構成要素の、同じ群の別の構成要素による任意の置換が同類置換とみなされ得る。反対に、非同類置換は、あるアミノ酸の、異なる特性を有する別のアミノ酸での置換である。
【００５８】
欠失バリアントは、（２つ以上のアミノ酸の）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸セグメントまたは非連続単一アミノ酸が欠けたものであり得る。
【００５９】
付加体（付加バリアント）としては、（ａ）少なくとも５個のアミノ酸を含む完全長野生型ポリペプチドまたはその断片；および（ｂ）内部または末端（ＣもしくはＮ）に無関連または非相同アミノ酸配列を含む融合タンパク質が挙げられる。かかる融合タンパク質との関連において、用語「非相同アミノ酸配列」は（ａ）以外のアミノ酸配列をいう。したがって、本明細書に記載のペプチドと非相同アミノ酸配列を含む融合タンパク質は、配列において、天然に存在するタンパク質の全部または一部に対応しない。非相同配列は、例えば、組換えタンパク質の精製に使用される配列（例えば、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン  （例えば、ヘキサヒスチジン）、血球凝集素（ｈｅｍａｇｌｕｔｔａｎｉｎ）（ＨＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））であり得る。また、非相同配列は、診断用または検出可能なマーカーとして有用なタンパク質、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）であり得る。一部の実施形態において、該融合タンパク質は、別のタンパク質由来のシグナル配列（例えば、ＫＤＥＬ（配列番号１５）配列または本明細書に記載の任意の他の配列を含むものである。一部の実施形態において、該融合タンパク質は、例えば、免疫応答の誘導（例えば、抗体生成のため；下記参照）に有用な担体（例えば、ＫＬＨ）を含むものであり得る。一部の実施形態において、該融合タンパク質は外因性メチオニンアミノ酸残基を含むものであり得る。一部の実施形態において、該融合タンパク質は１つ以上のリンカー部分（下記参照）を含むものであり得る。非相同配列は種々の長さのものであり得、場合によっては、非相同配列を結合させる完全長標的タンパク質よりも長い配列であり得る。
【００６０】
「断片」は、本明細書で用いる場合、未成熟タンパク質の完全長より短いポリペプチドセグメントをいう。タンパク質の断片は、末端（カルボキシもしくはアミノ末端）および／または内部の欠失を有するものであり得る。一般的に、タンパク質の断片は、少なくとも４（例えば、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、または少なくとも１００またはそれより長い）アミノ酸長である。
【００６１】
本明細書に記載の任意の標的化ポリペプチドまたは毒性ポリペプチドの生物学的に活性な断片または生物学的活性バリアントは、本明細書において、完全長野生型ポリペプチドの活性の少なくとも２５％（例えば、少なくとも：３０％；４０％；５０％；６０％；７０％；７５％；８０％；８５％；９０％；９５％；９７％；９８％；９９％；９９．５％、または１００％またはさらに大きい）活性を有するものである。標的化ポリペプチドの場合、当該活性は、標的化ポリペプチドが対象の標的（例えば、ＥＧＦＲ受容体、ＩＬ１３Ｒ、またはＩＬ４Ｒ）に結合する能力である。毒性ポリペプチドの場合、当該活性は、細胞の増殖を抑止する（または細胞を死滅させる）能力である。
【００６２】
意図される用途に応じて、該ポリペプチド、その生物学的に活性な断片または生物学的活性バリアントは、任意の種、例えば、線虫、昆虫、植物、鳥類、魚類、爬虫類、または哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、クジラ、サル、もしくはヒト）などのものであり得る。一部の実施形態において、生物学的に活性な断片または生物学的活性バリアントは、該タンパク質の免疫原性の抗原断片を含むものである。免疫原性断片は、当該完全長野生型タンパク質が対象の動物において免疫応答（例えば、抗体応答または細胞性免疫応答）を刺激する能力の少なくとも２５％（例えば、少なくとも：３０％；４０％；５０％；６０％；７０％；７５％；８０％；８５％；９０％；９５％；９７％；９８％；９９％；９９．５％、または１００％またはそれより大きい）能力を有するものである。タンパク質の抗原断片は、当該完全長野生型タンパク質が該タンパク質に特異的な抗体または該タンパク質に特異的なＴ細胞によって認識される能力の少なくとも２５％（例えば、少なくとも：３０％；４０％；５０％；６０％；７０％；７５％；８０％；８５％；９０％；９５％；９７％；９８％；９９％；９９．５％、または１００％またはそれより大きい）能力を有するものである。
【００６３】
特に記載のない限り、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。好ましい方法および材料は以下に記載するが、本明細書に記載のものと類似または均等な方法および材料を本発明の実施および試験において使用することができる。本明細書に挙げたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定を意図しない。
【００６４】
本発明の他の特徴および利点、例えば、癌細胞の増殖を抑止する（または癌細胞を死滅させる）ための方法は、以下の説明、図面および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１Ａは、ＤＴＥＧＦ１３構築物を示す模式図である。二重特異性の単鎖免疫毒素ＤＴＥＧＦ１３をコードする遺伝子断片を、オーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて作製した。この構築物は（５’から３’に）、切断型ジフテリア毒素分子（ＤＴ３９０）をコードする核酸、７アミノ酸（ＥＡＳＰＰＧＥ）（配列番号１４）リンカー（Ｌ）、ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒト筋肉アルドラーゼ（ｈｍａ）のフレキシブル２０アミノ酸セグメント、およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）からなるものであった。ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ制限部位を使用し、ＤＴＥＧＦ１３をコードする核酸配列ｐＥＴ２１ｄ細菌発現ベクター内にクローニングした。図１Ｂは、ＥＧＦ４ＫＤＥＬ構築物を示す模式図である。二重特異性の単鎖免疫毒素ＥＧＦ４ＫＤＥＬをコードする遺伝子断片を、オーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて作製した。この構築物は（５’から３’に）、切断型ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）をコードする核酸、ヒト筋肉アルドラーゼ（ｈｍａ）のフレキシブル２０アミノ酸セグメント、ヒトインターロイキン−４（ＩＬ−４）、シュードモナス体外毒素（ＰＥ）Ａの生物学的に活性な断片（配列番号１２）、およびＫＤＥＬ（配列番号１５）アミノ酸配列からなるものであった。ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ制限部位を使用し、ＥＧＦ４ＫＤＥＬをコードする核酸配列をｐＥＴ２１ｄ細菌発現ベクター内にクローニングした。
【図２】図２Ａは、ＥＧＦＲ＋／ＩＬ１３Ｒ＋  ＰＣ−３細胞におけるＤＴＥＧＦ１３の特異的細胞毒性を示す折れ線グラフである（増殖アッセイにより測定）。ＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＩＬ１３、またはＤＴＥＧＦを、ＰＣ−３前立腺癌細胞とともに７２時間培養した。グラフ上のデータ点は３連の試料の平均±ＳＤを表す。ＩＣ５０（または阻害濃度５０％）は、免疫毒素の非存在下での細胞増殖の割合の５０％を抑止する免疫毒素の濃度である。Ｘ軸は、各免疫毒素の濃度を表す（単位：ナノモル（ｎＭ））。Ｙ軸は、対照（未処理）細胞（対照応答に対する％）と比べたときの細胞増殖％を表す。図２Ｂは、ＥＧＦＲ−／ＩＬ１３Ｒ−  Ｄａｕｄｉ細胞におけるＤＴＥＧＦ１３の特異的細胞毒性を示す折れ線グラフである（増殖アッセイにより測定）。ＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＩＬ１３、またはＤＴＥＧＦを、Ｄａｕｄｉ細胞とともに７２時間培養した。グラフ上のデータ点は、３連の試料の平均±ＳＤ（標準偏差）を表す。Ｘ軸は、各免疫毒素の濃度（単位：ｎＭ）を表す。Ｙ軸は、対照（未処理）細胞（対照応答に対する％）と比べたときの細胞増殖％を表す。
【図３】図３は、ＥＧＦＲ＋／ＩＬ１３Ｒ＋  Ｕ８７細胞におけるＤＴＥＧＦ１３の特異的細胞毒性を示す折れ線グラフである（増殖アッセイにより測定）。ＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＩＬ１３、またはＤＴＥＧＦを、Ｕ８７細胞とともに７２時間培養した。グラフ上のデータ点は３連の試料の平均±ＳＤを表す。Ｘ軸は、各免疫毒素の濃度（単位：ｎＭ）を表す。Ｙ軸は、対照（未処理）細胞（対照応答に対する％）と比べたときの細胞増殖％を表す。
【図４】図４は、抗ＥＧＦ抗体と抗ＩＬ１３抗体がＤＴＥＧＦ１３によるＰＣ−３細胞増殖の抑止をブロックする能力を示す棒グラフである（増殖アッセイにより測定）。ＤＴＥＧＦ１３（０．１ｎＭ）をＰＣ−３細胞とともに、抗ＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１３抗体または対照抗体（Ｌｙ５．２）の存在下または非存在下で７２時間培養した。Ｘ軸は、各実験での試験を表す。Ｙ軸は、対照（未処理）細胞（対照応答に対する％）と比べたときの細胞増殖％を表す。
【図５】図５は、ＥＧＦＲ＋／ＩＬ１３Ｒ＋  ＤＵ−１４５細胞におけるＤＴＥＧＦ１３の特異的細胞毒性を示す折れ線グラフである（増殖アッセイにより測定）。ＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＩＬ１３、またはＤＴＥＧＦを、ＤＵ−１４５細胞とともに７２時間培養した。グラフ上のデータ点は３連の試料の平均±ＳＤを表す。Ｘ軸は、各免疫毒素の濃度（単位：ｎＭ）を表す。Ｙ軸は、対照（未処理）細胞（対照応答に対する％）と比べたときの細胞増殖％を表す。
【図６】図６は、ＥＧＦＲ＋／ＩＬ１３Ｒ＋  Ｕ１１８細胞におけるＤＴＥＧＦ１３の特異的細胞毒性を示す折れ線グラフである（増殖アッセイにより測定）。ＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＩＬ１３、ＤＴＥＧＦ、またはＢｉｃ３（対照）を、Ｕ１１８細胞とともに７２時間培養した。グラフ上のデータ点は３連の試料の平均±ＳＤを表す。Ｘ軸は、各免疫毒素の濃度（単位：ｎＭ）を表す。Ｙ軸は、対照（未処理）細胞（対照応答に対する％）と比べたときの細胞増殖％を表す。
【図７】図７は、ＥＧＦＲ＋／ＩＬ１３Ｒ＋  ＨＴ−２９細胞におけるＤＴＥＧＦ１３の特異的細胞毒性を示す折れ線グラフである（増殖アッセイにより測定）。ＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＩＬ１３、ＤＴＥＧＦ、またはＤＴ２２２（陰性対照）を、ＨＴ−２９細胞とともに７２時間培養した。グラフ上のデータ点は３連の試料の平均±ＳＤを表す。Ｘ軸は、各免疫毒素の濃度（単位：ｎＭ）を表す。Ｙ軸は、対照（未処理）細胞（対照応答に対する％）と比べたときの細胞増殖％を表す。
【図８】図８は、ＥＧＦＲ＋／ＩＬ１３Ｒ＋  Ｃａｌｕ−３細胞におけるＤＴＥＧＦ１３の特異的細胞毒性を示す折れ線グラフである（増殖アッセイにより測定）。ＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＩＬ１３、ＤＴＥＧＦ、またはＤＴ２２２（対照）を、Ｃａｌｕ−３細胞とともに７２時間培養した。グラフ上のデータ点は３連の試料の平均±ＳＤを表す。Ｘ軸は、各免疫毒素の濃度（単位：ｎＭ）を表す。Ｙ軸は、対照（未処理）細胞（対照応答に対する％）と比べたときの細胞増殖％を表す。
【図９】図９は、ＤＴＥＧＦとＤＴＩＬ１３の単一特異性免疫毒素の混合物と比べたときの二重特異性ＤＴＥＧＦ１３免疫毒素の細胞毒性を示す折れ線グラフである。この混合物は、１ｎＭ溶液が０．５ｎＭ  ＤＴＥＧＦと０．５ｎＭ  ＤＴＩＬ１３であるものである。ＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＩＬ１３、ＤＴＥＧＦ、またはＤＴＥＧＦとＤＴＩＬ１３を、ＨＴ−２９細胞とともに７２時間培養した。グラフ上のデータ点は３連の試料の平均±ＳＤを表す。Ｘ軸は、各免疫毒素の濃度（単位：ｎＭ）を表す。Ｙ軸は、対照（未処理）細胞（対照応答に対する％）と比べたときの細胞増殖％を表す。
【図１０】図１０は、ＤＴＥＧＦとＤＴＩＬ１３の単一特異性免疫毒素の混合物と比べたときの二重特異性ＤＴＥＧＦ１３免疫毒素の細胞毒性を示す折れ線グラフである。ＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＩＬ１３、ＤＴＥＧＦ、またはＤＴＥＧＦとＤＴＩＬ１３を、Ｕ８７細胞とともに７２時間培養した。グラフ上のデータ点は３連の試料の平均±ＳＤを表す。Ｘ軸は、各免疫毒素の濃度（単位：ｎＭ）を表す。Ｙ軸は、対照（未処理）細胞（対照応答に対する％）と比べたときの細胞増殖％を表す。
【図１１】図１１は、ＰＣ−３細胞によるＤＴＥＧＦ１３の結合およびインターナリゼーションを示す折れ線グラフである。ＰＣ−３細胞を１１１Ｉｎ標識ＤＴＥＧＦ１３とともに種々の時間（Ｘ軸）インキュベートした。データを、各画分における初期結合タンパク質に対するパーセンテージとして示す（Ｙ軸）。各データ点は、試料平均±ＳＤを表す。
【図１２】図１２Ａは、ＰＣ−３前立腺腫瘍マウスモデルを用いた、腫瘍増殖に対するＤＴＥＧＦ１３処置の効果を示す折れ線グラフである。ＰＣ−３側腹部腫瘍を有するヌードマウスを、ＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＩＬ１３、またはＤＴＥＧＦで腫瘍内（ｉ．ｔ．）処置した（ｎ＝４〜５／処置群）。マウスの平均腫瘍体積を各処置群において示す。横座標の下部の矢印は注射の日を示す。図１２Ｂは、ＰＣ−３前立腺腫瘍マウスモデルを用いた、体重減少に対するＤＴＥＧＦ１３処置の効果を示す折れ線グラフである。ＰＣ−３側腹部腫瘍を有するヌードマウスを、ＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＩＬ１３、またはＤＴＥＧＦでｉ．ｔ．処置した（ｎ＝４〜５／処置群）。マウスの平均体重を各処置群において示す。横座標の下部の矢印は注射の日を示す。
【図１３】図１３は、ＰＣ−３前立腺腫瘍マウスモデルを用いた、腫瘍増殖に対するＤＴＥＧＦ１３処置の効果を示す折れ線グラフである。ＰＣ−３側腹部腫瘍を有するヌードマウスに、ＤＴＥＧＦ１３またはＤＴ２２２の５回の２．５μｇのｉ．ｔ．注射を行なった（ｎ＝４〜５／処置群）。横座標の下部の矢印は注射の日を示す。個々の腫瘍の増殖を時間に対してプロットしている。
【図１４】図１４は、ＤＴＥＧＦ１３で処置されたＰＣ−３側腹部腫瘍の退縮を示す一連の写真である。触知可能なＰＣ−３側腹部腫瘍を有する２匹の雌ヌードマウスを、各々、ＤＴＥＧＦ１３のｉ．ｔ．注射で処置した。腫瘍体積に対する経時的な進歩的効果が写真に示されている。マウス１には第０日から第２８日の間に合計９回注射し、一方、マウス２には第０日から第１０日の間に５回注射した（１日おき；ｑ．ｏ．ｄ．）。
【図１５Ａ】図１５Ａは、Ｕ８７腫瘍マウスモデルを用いた、腫瘍増殖に対するＤＴＥＧＦ１３処置の効果を示す折れ線グラフである。Ｕ８７側腹部腫瘍を有するヌードマウスを、ＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＩＬ１３、またはＤＴＥＧＦでｉ．ｔ．処置した（ｎ＝５／処置群）。マウスの平均腫瘍体積を各処置群において示す。横座標の下部の線は注射の日を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、Ｕ８７腫瘍マウスモデルを用いた、腫瘍増殖に対するＤＴＥＧＦ１３処置の長期効果を示す折れ線グラフである。Ｕ８７側腹部腫瘍を有するヌードマウスを、ＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＩＬ１３、またはＤＴＥＧＦでｉ．ｔ．処置した。横座標の下部の線は注射の日を示す。個々の腫瘍の増殖を時間に対してプロットしている。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、Ｕ８７腫瘍マウスモデルを用いた、体重減少に対するＤＴＥＧＦ１３処置の効果を示す折れ線グラフである。Ｕ８７側腹部腫瘍を有するヌードマウスを、ＤＴＥＧＦ１３またはＤＴ２２２２でｉ．ｔ．処置した（ｎ＝４〜５／処置群）。マウスの平均体重を各処置群において示す。横座標の下部の線は注射の日を示す。
【図１６】図１６は、ＭＩＡＰａＣａ−２培養細胞に対するＤＴＥＧＦ１３とＥＧＦ１３ＫＤＥＬの細胞傷害効果を示す折れ線グラフである。ＤＴＥＧＦ１３またはＥＧＦ１３ＫＤＥＬを、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞とともに７２時間培養した。グラフ上のデータ点は３連の試料の平均±ＳＤを表す。Ｘ軸は、各免疫毒素の濃度（単位：ｎＭ）を表す。Ｙ軸は、対照（未処理）細胞と比べたときの細胞増殖％を表す。
【図１７Ａ】図１７Ａおよび１７Ｂは、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２側腹部腫瘍に対するＤＴＥＧＦ１３のｉ．ｔ．注射の効果を示す１対の折れ線グラフである（実験１）。ＭＩＡ  ＰａＣａ−２側腹部腫瘍は、１×１０７個のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を雄ヌードマウスの左側腹部内に注射することにより確立させた。触知可能な腫瘍が確立されたら（ほぼ第２２日）、マウスを２つの群：図１７Ａ：処置なし；または１７Ｂ：ＤＴＥＧＦ１３処置に分けた。ＤＴＥＧＦ１３処置群のマウスには、ｉ．ｔ．注射で２．５μｇのＤＴＥＧＦ１３を与えた。横座標の下部の線は注射の日を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａおよび１７Ｂは、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２側腹部腫瘍に対するＤＴＥＧＦ１３のｉ．ｔ．注射の効果を示す１対の折れ線グラフである（実験１）。ＭＩＡ  ＰａＣａ−２側腹部腫瘍は、１×１０７個のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を雄ヌードマウスの左側腹部内に注射することにより確立させた。触知可能な腫瘍が確立されたら（ほぼ第２２日）、マウスを２つの群：図１７Ａ：処置なし；または１７Ｂ：ＤＴＥＧＦ１３処置に分けた。ＤＴＥＧＦ１３処置群のマウスには、ｉ．ｔ．注射で２．５μｇのＤＴＥＧＦ１３を与えた。横座標の下部の線は注射の日を示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃ、１７Ｄ、および１７Ｅは、実験２における、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２側腹部腫瘍に対するＤＴＥＧＦ１３のｉ．ｔ．注射の効果を示す一連の折れ線グラフである。腫瘍細胞の注射前に、雄ヌードマウスに、ｘ線照射装置を用いて３００Ｒａｄ  （放射線吸収線量）を照射した。次いで、１×１０７個のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（ＤＭＥＭ：マトリゲルの１：１混合物中）を注射することにより側腹部腫瘍を確立させた。腫瘍がほぼ５０ｍｍ３に達したら、マウスを群分けし、２．５μｇのＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＩＬ１３、ＤＴＥＧＦまたはＰＢＳのｉ．ｔ．注射で処置した。この４つの注射は、各グラフの下部の線による表示のとおりにｑ．ｏ．ｄ．で行なった。図１７Ｃは、各処置群の動物の平均腫瘍体積を示す。図１７Ｄは、ＤＴＥＧＦ１３で処置された個々の腫瘍の増殖を示す。図１７Ｅは、ＤＴＥＧＦ１３処置群の個々のマウス（マウス１〜マウス５）の動物の体重を示す。
【図１７Ｄ】図１７Ｃ、１７Ｄ、および１７Ｅは、実験２における、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２側腹部腫瘍に対するＤＴＥＧＦ１３のｉ．ｔ．注射の効果を示す一連の折れ線グラフである。腫瘍細胞の注射前に、雄ヌードマウスに、ｘ線照射装置を用いて３００Ｒａｄ  （放射線吸収線量）を照射した。次いで、１×１０７個のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（ＤＭＥＭ：マトリゲルの１：１混合物中）を注射することにより側腹部腫瘍を確立させた。腫瘍がほぼ５０ｍｍ３に達したら、マウスを群分けし、２．５μｇのＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＩＬ１３、ＤＴＥＧＦまたはＰＢＳのｉ．ｔ．注射で処置した。この４つの注射は、各グラフの下部の線による表示のとおりにｑ．ｏ．ｄ．で行なった。図１７Ｃは、各処置群の動物の平均腫瘍体積を示す。図１７Ｄは、ＤＴＥＧＦ１３で処置された個々の腫瘍の増殖を示す。図１７Ｅは、ＤＴＥＧＦ１３処置群の個々のマウス（マウス１〜マウス５）の動物の体重を示す。
【図１７Ｅ】図１７Ｃ、１７Ｄ、および１７Ｅは、実験２における、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２側腹部腫瘍に対するＤＴＥＧＦ１３のｉ．ｔ．注射の効果を示す一連の折れ線グラフである。腫瘍細胞の注射前に、雄ヌードマウスに、ｘ線照射装置を用いて３００Ｒａｄ  （放射線吸収線量）を照射した。次いで、１×１０７個のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（ＤＭＥＭ：マトリゲルの１：１混合物中）を注射することにより側腹部腫瘍を確立させた。腫瘍がほぼ５０ｍｍ３に達したら、マウスを群分けし、２．５μｇのＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＩＬ１３、ＤＴＥＧＦまたはＰＢＳのｉ．ｔ．注射で処置した。この４つの注射は、各グラフの下部の線による表示のとおりにｑ．ｏ．ｄ．で行なった。図１７Ｃは、各処置群の動物の平均腫瘍体積を示す。図１７Ｄは、ＤＴＥＧＦ１３で処置された個々の腫瘍の増殖を示す。図１７Ｅは、ＤＴＥＧＦ１３処置群の個々のマウス（マウス１〜マウス５）の動物の体重を示す。
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂは、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２側腹部腫瘍に対するＤＴＥＧＦ１３のｉ．ｔ．投与の効果を示す１対の折れ線グラフである（実験３）。図１８Ａ：膵臓癌の異種移植片モデルを、雄ヌードマウス（事前の照射なし）に１×１０７個のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（ＤＭＥＭ：マトリゲルの１：１混合物中）を注射することにより確立した。平均腫瘍体積がほぼ７５ｍｍ３になった第１５日に、マウスを無作為に３群に分けた（ｎ＝６／群）。被処置動物には、２．５μｇのＤＴＥＧＦ１３、ＤＴ２２２２いずれかをｉ．ｔ．注射するか、または処置なしとした。合計６回の注射を、各グラフの下部の線による表示のとおりに２週間にわたって行なった。図１８Ｂは、ＤＴＥＧＦ１３試薬を投与された試験中（図１８Ａに示すデータ）の各動物の体重を示す。
【図１９】図１９Ａは、致死量のＤＴＥＧＦ１３が投与されたマウスの生存に対するＥＧＦ１３予備投与の保護効果を示すカプラン・マイヤープロットである。正常Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６／群）に１００μｇのＥＧＦ１３タンパク質または対照の予備投与を行なった直後に、致死量（５μｇ  ｉ．ｐ．）のＤＴＥＧＦ１３を投与した。対照マウスにはＥＧＦ１３タンパク質を投与しなかった。Ｙ軸は生存％を表し、Ｘ軸は致死量投与後の日数を表す。図１９Ｂは、致死量のＤＴＥＧＦ１３が投与されたマウスの体重減少に対するＥＧＦ１３予備投与の保護効果を示す折れ線グラフである。正常Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６／群）に１００μｇのＥＧＦ１３タンパク質または対照の予備投与を行なった直後に、致死量（５μｇ  ｉ．ｐ．）のＤＴＥＧＦ１３を投与した。対照マウスにはＥＧＦ１３タンパク質を投与しなかった。Ｙ軸は、各マウスの平均体重（単位：グラム（ｇ））を表し、Ｘ軸  は致死量投与後の日数を表す。
【図２０】図２０は、致死量のＤＴＥＧＦ１３が投与されたマウスの生存に対するＥＧＦ１３予備投与の保護効果を示すカプラン・マイヤープロットである。正常Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６／群）に、１００μｇのＥＧＦ１３タンパク質または対照（２２１９）の予備投与を５分間または３０分間のいずれかで行なった後、致死量（５μｇ  ｉ．ｐ．）のＤＴＥＧＦ１３を投与した。Ｙ軸は生存％を表し、Ｘ軸は致死量投与後の日数を表す。
【図２１】図２１Ａは、ＭＩＡＰａｃａ−２細胞腫瘍マウスモデルを用いた、腫瘍増殖に対するＤＴＥＧＦ１３処置の効果を示す折れ線グラフである。ＭＩＡＰａｃａ−２側腹部腫瘍を有するヌードマウスは、２．５μｇのＤＴＥＧＦ１３を体循環ポンプによって投与するか、または処置なしとした。マウスの平均腫瘍体積を各処置群において示す。個々の腫瘍の増殖を時間に対してプロットしている。図２１Ｂは、ＭＩＡＰａｃａ−２細胞腫瘍マウスモデルを用いた、体重減少に対するＤＴＥＧＦ１３処置の効果を示す折れ線グラフである。ＭＩＡＰａｃａ−２側腹部腫瘍を有するヌードマウスは、２．５μｇのＤＴＥＧＦ１３を体循環ポンプによって投与するか、または処置なしとした。マウスの平均体重を各処置群において示す。
【図２２Ａ】図２２Ａ〜２２Ａは、ラット頭蓋内膠芽細胞腫モデルを用いた、ヒト腫瘍に対するＤＴＥＧＦ１３処置の効果を示す一連の生存プロットである。ラットには、頭蓋内注射によってＵ８７ヒト膠芽細胞腫細胞を投与した。次いで、ＤＴＥＧＦ１３（計１μｇ）またはＰＢＳプラセボ（図２２Ａ）またはＤＴ２２２２対照免疫毒素（図２２Ｂ）を、マイクロインフュージョンポンプによって、Ｕ８７腫瘍を有する胸腺欠損ヌードラットの群（Ｎ＝５）に投与した。図２２Ａは、ＤＴＥＧＦ１３またはＰＢＳプラセボで処置されたラットの推定生存率プロットである。図２２Ｂは、ＤＴＥＧＦ１３またはＤＴ２２２２で処置されたラットの推定生存率プロットである。図２Ｃは、図２２Ａと２２Ｂのデータを合わせた（ｎ＝１０／群）データの推定生存率プロットである。統計学的検定として、ログランク検定とカイ二乗検定を使用した。
【図２２Ｂ】図２２Ａ〜２２Ｃは、ラット頭蓋内膠芽細胞腫モデルを用いた、ヒト腫瘍に対するＤＴＥＧＦ１３処置の効果を示す一連の生存プロットである。ラットには、頭蓋内注射によってＵ８７ヒト膠芽細胞腫細胞を投与した。次いで、ＤＴＥＧＦ１３（計１μｇ）またはＰＢＳプラセボ（図２２Ａ）またはＤＴ２２２２対照免疫毒素（図２２Ｂ）を、マイクロインフュージョンポンプによって、Ｕ８７腫瘍を有する胸腺欠損ヌードラットの群（Ｎ＝５）に投与した。図２２Ａは、ＤＴＥＧＦ１３またはＰＢＳプラセボで処置されたラットの推定生存率プロットである。図２２Ｂは、ＤＴＥＧＦ１３またはＤＴ２２２２で処置されたラットの推定生存率プロットである。図２Ｃは、図２２Ａと２２Ｂのデータを合わせた（ｎ＝１０／群）データの推定生存率プロットである。統計学的検定として、ログランク検定とカイ二乗検定を使用した。
【図２２Ｃ】図２２Ａ〜２２Ｃは、ラット頭蓋内膠芽細胞腫モデルを用いた、ヒト腫瘍に対するＤＴＥＧＦ１３処置の効果を示す一連の生存プロットである。ラットには、頭蓋内注射によってＵ８７ヒト膠芽細胞腫細胞を投与した。次いで、ＤＴＥＧＦ１３（計１μｇ）またはＰＢＳプラセボ（図２２Ａ）またはＤＴ２２２２対照免疫毒素（図２２Ｂ）を、マイクロインフュージョンポンプによって、Ｕ８７腫瘍を有する胸腺欠損ヌードラットの群（Ｎ＝５）に投与した。図２２Ａは、ＤＴＥＧＦ１３またはＰＢＳプラセボで処置されたラットの推定生存率プロットである。図２２Ｂは、ＤＴＥＧＦ１３またはＤＴ２２２２で処置されたラットの推定生存率プロットである。図２Ｃは、図２２Ａと２２Ｂのデータを合わせた（ｎ＝１０／群）データの推定生存率プロットである。統計学的検定として、ログランク検定とカイ二乗検定を使用した。
【図２３】図２３は、ラットに頭蓋内投与されたＤＴＥＧＦ１３タンパク質の最大耐用量を示すカプラン・マイヤープロットである。種々の濃度のＤＴＥＧＦ１３（単位：マイクログラム）をラットに第０日と第７日に投与し、生存率（Ｙ軸）を経時的（日；Ｘ軸）に記録した。
【図２４】図２４Ａおよび２４Ｂは、処置ラットの肝臓（血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルによる；図２４Ａ）または腎臓（血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルによる；図２４Ｂ）におけるＤＴＥＧＦ１３処置の毒性に関する試験を示す１対の棒グラフである。ラットを１μｇのＤＴＥＧＦ１３または対照としてのＰＢＳで処置し、ＡＬＴおよびＢＵＮのレベルをラットから採取した血清から測定した。処置をＸ軸に示し、各試験の測定単位（任意単位／Ｌ、図２４Ａおよびｍｇ／Ｌ、図２４Ｂ）をＹ軸に示す。
【図２５Ａ】図２５Ａ〜Ｃは、ＥＧＦＲとＩＬ１３Ｒの両方を発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞、およびＥＧＦＲもＩＬ４Ｒも発現していないＨＰＢ−ＭＬＴヒトＴ細胞腫瘍細胞に対するＥＧＦ４ＫＤＥＬのインビトロ細胞毒性を示す一連の折れ線グラフである。図２５Ａ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を種々の濃度のＥＧＦ４ＫＤＥＬまたは単一特異性免疫毒素ＩＬ４ＫＤＥＬもしくはＥＧＦＫＤＥＬで処理し、細胞を死滅させる能力を、トリチウム標識チミジン取込みアッセイ（上記）を用いて測定した。使用した免疫毒素の濃度をＸ軸に示し、非処置対照と比べたときのバイアビリティのパーセントをＹ軸に示す（対照応答に対する％）。図２５Ｂ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を種々の濃度のＥＧＦ４ＫＤＥＬ、単一特異性免疫毒素ＩＬ４ＫＤＥＬとＥＧＦＫＤＥＬの組合せ、ならびに３種類の対照免疫毒素タンパク質Ｂｉｃ３、２２１９ＥＡ、およびＤＴ２２１９ＡＲＬで処理した。免疫毒素による細胞死滅能力を、トリチウム標識チミジン取込みアッセイ（上記）を用いて測定した。使用した免疫毒素の濃度をＸ軸に示し、非処置対照と比べたときの細胞内の放射能のパーセントをＹ軸に示す（対照応答に対する％）。図２５Ｃ：ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞を種々の濃度のＥＧＦ４ＫＤＥＬまたは陽性対照としてのＢｉｃ３で処理した。免疫毒素による細胞死滅能力を、トリチウム標識チミジン取込みアッセイ（上記）を用いて測定した。使用した免疫毒素の濃度をＸ軸に示し、非処置対照と比べたときのバイアビリティのパーセントをＹ軸に示す（対照応答に対する％）。
【図２５Ｂ】図２５Ａ〜Ｃは、ＥＧＦＲとＩＬ１３Ｒの両方を発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞、およびＥＧＦＲもＩＬ４Ｒも発現していないＨＰＢ−ＭＬＴヒトＴ細胞腫瘍細胞に対するＥＧＦ４ＫＤＥＬのインビトロ細胞毒性を示す一連の折れ線グラフである。図２５Ａ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を種々の濃度のＥＧＦ４ＫＤＥＬまたは単一特異性免疫毒素ＩＬ４ＫＤＥＬもしくはＥＧＦＫＤＥＬで処理し、細胞を死滅させる能力を、トリチウム標識チミジン取込みアッセイ（上記）を用いて測定した。使用した免疫毒素の濃度をＸ軸に示し、非処置対照と比べたときのバイアビリティのパーセントをＹ軸に示す（対照応答に対する％）。図２５Ｂ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を種々の濃度のＥＧＦ４ＫＤＥＬ、単一特異性免疫毒素ＩＬ４ＫＤＥＬとＥＧＦＫＤＥＬの組合せ、ならびに３種類の対照免疫毒素タンパク質Ｂｉｃ３、２２１９ＥＡ、およびＤＴ２２１９ＡＲＬで処理した。免疫毒素による細胞死滅能力を、トリチウム標識チミジン取込みアッセイ（上記）を用いて測定した。使用した免疫毒素の濃度をＸ軸に示し、非処置対照と比べたときの細胞内の放射能のパーセントをＹ軸に示す（対照応答に対する％）。図２５Ｃ：ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞を種々の濃度のＥＧＦ４ＫＤＥＬまたは陽性対照としてのＢｉｃ３で処理した。免疫毒素による細胞死滅能力を、トリチウム標識チミジン取込みアッセイ（上記）を用いて測定した。使用した免疫毒素の濃度をＸ軸に示し、非処置対照と比べたときのバイアビリティのパーセントをＹ軸に示す（対照応答に対する％）。
【図２５Ｃ】図２５Ａ〜Ｃは、ＥＧＦＲとＩＬ１３Ｒの両方を発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞、およびＥＧＦＲもＩＬ４Ｒも発現していないＨＰＢ−ＭＬＴヒトＴ細胞腫瘍細胞に対するＥＧＦ４ＫＤＥＬのインビトロ細胞毒性を示す一連の折れ線グラフである。図２５Ａ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を種々の濃度のＥＧＦ４ＫＤＥＬまたは単一特異性免疫毒素ＩＬ４ＫＤＥＬもしくはＥＧＦＫＤＥＬで処理し、細胞を死滅させる能力を、トリチウム標識チミジン取込みアッセイ（上記）を用いて測定した。使用した免疫毒素の濃度をＸ軸に示し、非処置対照と比べたときのバイアビリティのパーセントをＹ軸に示す（対照応答に対する％）。図２５Ｂ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を種々の濃度のＥＧＦ４ＫＤＥＬ、単一特異性免疫毒素ＩＬ４ＫＤＥＬとＥＧＦＫＤＥＬの組合せ、ならびに３種類の対照免疫毒素タンパク質Ｂｉｃ３、２２１９ＥＡ、およびＤＴ２２１９ＡＲＬで処理した。免疫毒素による細胞死滅能力を、トリチウム標識チミジン取込みアッセイ（上記）を用いて測定した。使用した免疫毒素の濃度をＸ軸に示し、非処置対照と比べたときの細胞内の放射能のパーセントをＹ軸に示す（対照応答に対する％）。図２５Ｃ：ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞を種々の濃度のＥＧＦ４ＫＤＥＬまたは陽性対照としてのＢｉｃ３で処理した。免疫毒素による細胞死滅能力を、トリチウム標識チミジン取込みアッセイ（上記）を用いて測定した。使用した免疫毒素の濃度をＸ軸に示し、非処置対照と比べたときのバイアビリティのパーセントをＹ軸に示す（対照応答に対する％）。
【図２６】図２６は、抗ＥＧＦ抗体と抗ＩＬ４抗体がＥＧＦ４ＫＤＥＬによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞増殖の抑止をブロックする能力を示す棒グラフである（増殖アッセイにより測定）。ＥＧＦ４ＫＤＥＬ（０．１ｎＭ）を細胞とともに７２時間、抗ＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１３抗体または対照抗体（Ｌｙ５．２）の存在下または非存在下で培養した。Ｘ軸は、各実験での試験を表す。Ｙ軸は、対照（未処理）細胞と比べたときのバイアビリティ％を表す。
【図２７】図２７は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ヒト乳癌細胞に対するＤＴＥＧＦ４の細胞毒性を示す折れ線グラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を種々の濃度のＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＥＧＦ４、またはＥＧＦ４ＫＤＥＬで処理し、細胞を死滅させる能力を、トリチウム標識チミジン取込みアッセイ（上記）を用いて測定した。使用した免疫毒素の濃度をＸ軸に示し、非処置対照と比べたときの細胞内の放射能のパーセントをＹ軸に示す。
【図２８】図２８は、ヌードマウスまたはマウスの腫瘍含有器官の生物発光画像の一連の写真である。ホタルルシフェラーゼタンパク質を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞をマウスの脾臓に注射し、注射後第６１日にマウスを致死させ、器官を取り出した。各パネルは、生物発光画像形成を伴う、または伴わない器官（名称によって特定）を示す。画像はすべて３０秒間の曝露時間を表し、すべての関心領域（ＲＯＩ）を単位：光子／秒／ｃｍ２／ｓｒで表示する。生物発光画像の下方に示された数値は、各器官について測定された光子／秒／ｃｍ２／ｓｒを表す。画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ（商標）画像形成システム（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）を用いて取得し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ２．５により解析した。
【図２９Ａ】図２９Ａおよび２９Ｂは、処置なし（図２９Ａ、左パネル）、４マイクログラム（４ｕｇ）のＥＧＦ４ＫＤＥＬ（「ＥＧＦ４ｃｐＩＬ４ｋｄｅｌ」）で処置、または陰性対照としてのＢｉｃ  ３で処置（図２９Ｂ）（週４日間で各々９週間）のいずれかであるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞を有するマウスの蛍光画像の一連の写真である。マウスの画像形成は図２８に示したようにして行なった。写真の十字部分は試験動物の死亡を示す。細胞の注射後の日数を写真の各列の上部に示す（図２９Ａ）。ＥＧＦ４ＫＤＥＬでの処置に応答しなかった腫瘍を有するマウスを、図２９Ａのパネルの右側に「Ｍ６」で示す。
【図２９Ｂ】図２９Ａおよび２９Ｂは、処置なし（図２９Ａ、左パネル）、４マイクログラム（４ｕｇ）のＥＧＦ４ＫＤＥＬ（「ＥＧＦ４ｃｐＩＬ４ｋｄｅｌ」）で処置、または陰性対照としてのＢｉｃ  ３で処置（図２９Ｂ）（週４日間で各々９週間）のいずれかであるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞を有するマウスの蛍光画像の一連の写真である。マウスの画像形成は図２８に示したようにして行なった。写真の十字部分は試験動物の死亡を示す。細胞の注射後の日数を写真の各列の上部に示す（図２９Ａ）。ＥＧＦ４ＫＤＥＬでの処置に応答しなかった腫瘍を有するマウスを、図２９Ａのパネルの右側に「Ｍ６」で示す。
【図２９Ｃ】図２９Ｃは、ＥＧＦ４ＫＤＥＬで処置した４匹のマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ腫瘍の増殖を示す折れ線グラフである。Ｘ軸は、腫瘍細胞注射後の日数を示し、Ｙ軸は、腫瘍増殖の程度（各マウスの腫瘍から生じた生物発光（単位：光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）により測定）を示す。
【図２９Ｄ】図２９Ｄは、マウスにおけるＥＧＦ４ＫＤＥＬ処置（図２９Ａおよび２９Ｂ）の毒性を示す折れ線グラフである。マウスの体重（単位：グラム）をＹ軸に示し、細胞の注射後の日数をＸ軸に示す。ＥＧＦ４ＫＤＥＬでの処置（図２９Ａ）に応答しなかったマウスのデータを示し、グラフにおいて「１１」で特定する。
【図３０】図３０は、ＳＷ１９９０ヒト膵臓癌細胞に対する二重特異性免疫毒素ＥＧＦ１３ＰＥタンパク質および一連の変異型タンパク質の細胞毒性を示す折れ線グラフである。ＳＷ１９９０細胞を、種々の濃度（Ｘ軸（単位：ｎＭ））の野生型（親）ＥＧＦ１３ＰＥ、またはＥＧＦ１３ＰＥ  ５  Ｍｕｔ、ＥＧＦ１３ＰＥ  ７  Ｍｕｔ（７ａ、逆白三角）、ＥＧＦ１３ＰＥ  ７  Ｍｕｔ（７ｂ、白菱形）、またはＥＧＦ１３ＰＥ  ８  Ｍｕｔで処理した。すべての変異型を表１に示す。Ｙ軸は、免疫毒素で処理しなかった細胞と比べたときの生存％を表す（対照応答に対する％）。
【図３１】図３１Ａおよび３１Ｂは、マウスでのヒト膵臓腫瘍に対するＤＴＥＧＦ１３の有効性に対する非毒性の二重特異性免疫毒素での予備処置の効果を示す１対の折れ線グラフである。ルシフェラーゼタンパク質を発現するＭｉａＰａＣａ−２−ｌｕｃヒト膵臓癌細胞を、ヌードマウスの脾臓に注射し、マウスを処置なし（図３１Ａ）または７．５μｇのＤＴＥＧＦ１３で処置（図３１Ｂ）のいずれかとした。ＤＴＥＧＦ１３で処置されたマウスには、ＤＴＥＧＦ１３処置のほぼ３０分前に、２００μｇのＥＧＦ１３（毒性ドメイン含まない）を投与した。Ｘ軸は、腫瘍細胞注射後の日数を示し、Ｙ軸は、腫瘍増殖の程度（各マウスの腫瘍から生じた生物発光（単位：光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）により測定）を示す。
【図３２】図３２は、図３１ＡとＢに示した処置のマウスにおける毒性を示す折れ線グラフである。マウスの体重（単位：グラム）をＹ軸に示し、細胞の注射後の日数をＸ軸に示す。「ＰＤＤ」は、上記のＥＧＦ１３とＤＴＥＧＦ１３の両方での処置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
詳細説明
本開示により、とりわけ、さまざまなインビトロ、インビボ、エキソビボ方法に有用な受容体標的化試薬（例えば、免疫毒性受容体標的化試薬）を取り上げて記載する。例えば、受容体標的化試薬は、受容体標的化試薬を細胞に結合させる方法に有用である。付随の実施例に詳述するように、免疫毒性形態の本明細書に記載の受容体標的化試薬により、培養癌細胞の増殖が抑止され得、完全体の動物モデルでは、非免疫毒性形態の該受容体標的化試薬により、免疫毒性療法と関連する毒性副作用が低減された。したがって、本明細書に記載の受容体標的化試薬は、さまざまな増殖性障害、例えば限定されないが、癌および炎症性障害などの処置に有用である。
【００６７】
また、本明細書において、被験体（例えば、癌もしくは炎症性障害を有する被験体）に対する適切な処置モダリティの選択および／またはさまざまな増殖性障害の処置に有用な方法、組成物およびキットを提供する。
【００６８】
受容体標的化試薬
本開示により、（ａ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合剤を含む第１の標的化ドメインと、（ｂ）ＩＬ−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）結合剤またはＩＬ−４受容体（ＩＬ４Ｒ）結合剤を含む第２の標的化ドメインを含み、該（ａ）が（ｂ）に結合されている受容体標的化試薬を取り上げて記載する。
【００６９】
ＥＧＦＲ結合剤は、ＥＧＦＲ（例えば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４）に選択的に結合する任意の薬剤であり得る。例えば、ＥＧＦＲ結合剤は、ＥＧＦＲに特異的な抗体の全部またはそのＥＧＦＲ結合断片を含むものであり得る。ＥＧＦＲ結合剤は、ＥＧＦＲの天然リガンドの全部もしくは一部（ＥＧＦＲ結合断片）からなるもの、または該全部もしくは一部を含むものである。例えば、ＥＧＦＲ結合剤は、ＨＥＲ１の天然リガンド、例えば限定されないが、上皮成長因子ポリペプチド、ベータセルリンポリペプチド、トランスフォーミング増殖因子αポリペプチド、アンフィレギュリンポリペプチド、エピレギュリンポリペプチド、ヘパリン結合ＥＧＦポリペプチド、もしくは前記のもののいずれかのＥＧＦＲ結合断片などからなるもの、または前記のものもしくは該断片を含むものであり得る。完全長成熟（シグナルペプチドを欠く）ヒトＥＧＦポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＮＳＤＳＥＣＰＬＳＨＤＧＹＣＬＨＤＧＶＣＭＹＩＥＡＬＤＫＹＡＣＮＣＶＶＧＹＩＧＥＲＣＱＹＲＤＬＫＷＷＥＬＲ（配列番号６）。
【００７０】
本明細書に記載の方法に適したＥＧＦＲのさらなる天然リガンドとしては、限定されないが：ニューレグリン（ヘレグリン、ｎｅｕ分化因子、またはグリア細胞増殖因子としても知られている；例えば、ヘレグリンα、ヘレグリンβ）およびニューレグリン−２ｓが挙げられる。
【００７１】
一部の実施形態において、ＥＧＦＲ結合剤は、ＥＧＦＲに結合する小分子、例えば、ＥＧＦＲのＥＧＦ結合部位に結合する小分子であり得る。
【００７２】
受容体標的化試薬は、ＥＧＦＲ結合剤を含む第１の標的化ドメインと、ＩＬ１３Ｒ結合剤を含む第２の標的化ドメインを含むものであり得る。ＩＬ１３Ｒ結合剤は、ＩＬ１３Ｒ（例えば、ヒトＩＬ１３Ｒなどの哺乳動物ＩＬ１３Ｒ）に選択的に結合する任意の薬剤であり得る。例えば、ＩＬ１３Ｒ結合剤は、ＩＬ１３Ｒもしくはその抗原結合断片に結合する抗体からなるもの、または該抗体もしくは該断片を含むものであり得る。ＩＬ１３Ｒ結合剤は、例えば、ＩＬ１３Ｒの天然リガンドの全部または一部（ＩＬ１３Ｒ結合断片）であり得る。また、例えば、ＩＬ１３Ｒ結合剤は、ＩＬ−１３ポリペプチドもしくはそのＩＬ１３結合断片からなるもの、または該ペプチドもしくは該断片を含むものであり得る。完全長成熟（シグナルペプチドを欠く）ヒトＩＬ−１３ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は、以下のとおりである：
【００７３】
【化１】
2010536386.tif 000003
一部の実施形態において、ＩＬ１３Ｒ結合剤は、ＩＬ１３Ｒに結合する小分子、例えば、ＩＬ１３ＲのＩＬ−１３結合部位に結合する小分子であり得る。
【００７４】
受容体標的化試薬は、ＥＧＦＲ結合剤を含む第１の標的化ドメインと、ＩＬ４Ｒ結合剤を含む第２の標的化ドメインを含むものであり得る。ＩＬ４Ｒ結合剤は、ＩＬ４Ｒ  （例えば、ヒトＩＬ４Ｒなどの哺乳動物ＩＬ４Ｒ）に選択的に結合する任意の薬剤であり得る。例えば、ＩＬ４Ｒ結合剤は、ＩＬ４Ｒに結合する抗体もしくはその抗原結合断片からなるもの、または該抗体もしくは該断片を含むものであり得る。ＩＬ４Ｒ結合剤は、例えば、ＩＬ４Ｒの天然リガンドの全部または一部（ＩＬ４Ｒ結合断片）であり得る。また、例えば、ＩＬ４Ｒ結合剤は、ＩＬ−４ポリペプチドもしくはそのＩＬ４結合断片からなるもの、または該ポリペプチドもしくは該断片を含むものであり得る。完全長ヒトＩＬ−４ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は以下のとおりである：
【００７５】
【化２】
2010536386.tif 000004
一部の実施形態において、ＩＬ４Ｒ結合剤は、ＩＬ４Ｒに結合する小分子、例えば、ＩＬ４ＲのＩＬ４結合部位に結合する小分子であり得る。
【００７６】
上記のＥＧＦＲ−、ＩＬ１３Ｒ−、またはＩＬ４Ｒ−特異的抗体（またはその抗原結合断片）は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、またはＥＧＦＲ特異的抗体のＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、もしくはｓｃＦｖ断片であり得る。かかる抗体の作製方法は後述する（「抗体の作製方法」参照）。
【００７７】
一部の実施形態において、受容体標的化試薬は免疫毒性であり得る。すなわち、本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬は、さらに、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１５以上、または２０以上）の毒性ドメインを含むものであり得る。
【００７８】
毒性ドメインは、例えば、小分子からなるもの、または小分子を含むものであり得る。毒性ドメインに適した小分子としては、例えば化学療法剤、例えば限定されないが、シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、アドリアマイシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、エトポシド、ベランピル（ｖｅｒａｍｐｉｌ）、ポドフィロトキシン、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチン（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサートなど、または上記のもののいずれかの類縁化合物が挙げられる。受容体標的化試薬が１つより多くの小分子を含む場合、その種々の小分子は、同じであるか、異なっているか、または上記の両方の混合型であり得る。
【００７９】
毒性ドメインは、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０）の放射性核種からなるもの、または該放射性核種を含むものであり得る。少なくとも１つの放射性核種は、例えば、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、３２Ｐ、１７７Ｌｕ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、または１９９Ａｕであり得る。
【００８０】
一部の実施形態において、放射性核種原子は、大きな分子の一部分（例えば、メタ−［１２５Ｉ］ヨードフェニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（［１２５Ｉ］ｍＩＰＮＨＳ）（これは、遊離アミノ基によって結合して該当タンパク質のメタ−ヨードフェニル（ｍＩＰ）誘導体を形成する）の１２５Ｉ）（例えば、Ｒｏｇｅｒｓら  （１９９７）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３８：１２２１−１２２９を参照のこと）、またはキレートの一部分（例えば、放射性金属原子、例えば、ヒドロキサム酸、ＤＯＴＡ、もしくはＤＴＰＡなどにキレート結合された９９ｍＴｃ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、９０Ｙ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１７７Ｌｕ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１９９Ａｕなど）であり得（ｃａｎ  ｂｅ  ｃａｎ  ｂｅ）、該大きな分子またはキレート自体が受容体標的化試薬の一部分である。受容体標的化試薬が１つより多くの放射性核種原子を含む場合、その種々の放射性核種原子は、すべて同じ放射性核種（例えば、１つより多くの９０Ｙ）、すべて異なる放射性核種、または上記の両方の混合型のいずれかであり得る。放射性核種は、α−、β−、もしくはγ−放射線またはこれらの型の照射の２種類以上の組合せを放出するものであり得る。
【００８１】
付随の実施例に記載のように、毒性ドメインは、毒性ポリペプチドを含むもの、または毒性ポリペプチドからなるものであり得る。例えば、毒性ポリペプチドは、ジフテリア毒素またはその生物学的に活性な断片（毒性断片）もしくはバリアント（毒性バリアント）であり得る。
【００８２】
完全長ジフテリア毒素（これは、アミノ末端リーダー配列：ＭＬＶＲＧＹＶＶＳＲＫＬＦＡＳＩＬＩＧＡＬＬＧＩＧＡＰＰＳＡＨＡ（配列番号８）を含む）  の例示的なアミノ酸配列は、以下のとおりである：
【００８３】
【化３】
2010536386.tif 000005
ジフテリア毒素の生物学的活性バリアント（これは、配列番号９のアミノ酸３３〜４２１（すなわち、配列番号９のＮ末端リーダー配列がない）と、１位に外因性メチオニンを含む）の例示的なアミノ酸配列は、以下のとおりである：
【００８４】
【化４】
2010536386.tif 000006
このアミノ酸配列は、本明細書においてＤＴ３９０とも称する。
【００８５】
一部の実施形態において、毒性ポリペプチドは、シュードモナス体外毒素Ａもしくはその生物学的に活性な断片からなるもの、または該体外毒素Ａもしくは該断片を含むものであり得る。
【００８６】
完全長シュードモナス体外毒素Ａの例示的なアミノ酸配列は、以下のとおりである：
【００８７】
【化５】
2010536386.tif 000007
シュードモナス体外毒素Ａの生物学的活性バリアント（これは、（配列番号１１）のアミノ酸２７６〜６３３を含む）の例示的なアミノ酸配列は、以下のとおりである：
【００８８】
【化６】
2010536386.tif 000008
シュードモナス体外毒素の生物学的活性バリアントの他の例示的なアミノ酸配列としては、（ｉ）４９０位のアルギニンがアラニンであり、５１３位のアルギニンがアラニンであり、４３２位のアルギニンがグリシンであり、４６７位のアルギニンがアラニンであり、５９０位のリジンがセリンである；（ｉｉ）４９０位のアルギニンがアラニンであり、５１３位のアルギニンがアラニンであり、４６７位のアルギニンがグリシンであり、５４８位のグルタミン酸がセリンであり、５９０位のリジンがセリンであり、３３２位のグルタミンがセリンであり、３１３位のアルギニンがアラニンである；（ｉｉｉ）４９０位のアルギニンがアラニンであり、５１３位のアルギニンがアラニンであり、４６７位のアルギニンがグリシンであり、５４８位のグルタミン酸がセリンであり、５９０位のリジンがセリンであり、４３２位のグルタミンがグリシンであり、３１３位のアルギニンがアラニンである；および（ｉｖ）４９０位のアルギニンがアラニンであり、５１３位のアルギニンがアラニンであり、４６７位のアルギニンがグリシンであり、５４８位のグルタミン酸がセリンであり、５９０位のリジンがセリンであり、４３２位のグルタミンがグリシンであり、３３２位のグルタミンがセリンであり、３１３位のアルギニンがアラニンである配列番号１１のアミノ酸配列が挙げられる。
【００８９】
毒性ポリペプチドは、シュードモナス体外毒素（ＰＥ）、ブリオジン、ゲロニン、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、アンジオゲニン、サポリン、アブリン、原核生物のリボヌクレアーゼ、真核生物のリボヌクレアーゼ、リシン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、アポトーシス促進性ポリペプチド、リボソーム阻害性タンパク質、もしくは前記のもののいずれかの生物学的に活性な断片からなるもの、または前記のものもしくは該断片を含むものであり得る。好適なアポトーシス促進性ポリペプチドとしては、限定されないが、Ｂａｘ、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｋ、Ｂｏｋ、Ｈｒｋ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、またはＴＮＦ−αが挙げられる。
【００９０】
一部の実施形態において、毒性ドメインは、例えば、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８つ、またはそれ以上）の毒素（例えば、毒性の小分子、放射性核種、または毒性ポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片）（例えば、本明細書に記載の任意のもの）を含むものであり得る。また、１つより多く（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つ、または１０またはそれ以上）の毒素または１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８つまたはそれ以上）の毒素の生物学的に活性な断片が毒性ドメイン内に含まれ得る。毒性ドメインは、多コピーまたは多数の反復配列の１つ以上の毒素（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、または１０コピー以上の毒素）を含むものであり得る。反復配列が含まれる場合、該配列は、互いに直接隣接していてもよく、１つ以上の標的化断片によって分離されていてもよく、リンカーペプチド（下記参照）によって分離されていてもよく、別の異なる毒素によって分離されていてもよい。
【００９１】
本明細書に記載の受容体標的化試薬の成分（ドメイン、例えば、第１と第２の標的化ドメインおよび毒性ドメイン）は、互いに共有結合または非共有結合によって結合され得る。例えば、受容体標的化試薬の成分は、結合ペアの第１と第２の構成要素によって一緒に結合され得る。すなわち、第１の標的化ドメインは、結合ペアの第１の構成要素に結合され得、第２の標的化ドメインは、該結合ペアの第２の構成要素に結合され得る。結合ペアは、例えば、アビジン（またはストレプトアビジン）とビオチン（またはビオシチン）であり得る。
【００９２】
本明細書に記載の受容体標的化試薬の成分は、任意の数多くの配置またはコンホメーションで分子複合体内に一緒に結合され得る。例えば、第１の標的化ドメイン（ａ）、第２の標的化ドメイン（ｂ）、および毒性ドメイン（ｃ）は、
（ａ）が、（ｃ）に結合された（ｂ）に結合される；
（ｃ）が、（ｂ）に結合された（ａ）に結合される；
（ａ）が、（ｂ）に結合された（ｃ）に結合される；
（ｃ）が、（ａ）に結合された（ｂ）に結合される；
（ｂ）が、（ｃ）に結合された（ａ）に結合される；
（ｂ）が、（ａ）に結合された（ｃ）に結合される；または
（ａ）が（ｂ）に結合され、（ｂ）が（ｃ）に結合され、（ｃ）が（ａ）に結合される
ように一緒に結合され得る。
【００９３】
該ドメインは、本明細書に記載の任意の相互作用によって一緒に結合され得る。受容体標的化試薬のいずれのドメインも、共有結合と非共有結合の混合型によって一緒に結合され得ることは理解されよう。例えば、第１と第２の標的化ドメインは、結合ペアの第１と（ａｎ）第２の構成要素によって一緒に結合され得、毒性ドメインは、第１または第２の標的化ドメイン（または両方）に共有結合によって結合され得る。
【００９４】
受容体標的化試薬のドメインの２つ以上（または全部）が、共有結合により融合タンパク質として一緒に結合されていてもよい。例えば、第１と第２の標的化ドメイン、第１もしくは第２の標的化ドメインと毒性ドメイン、または第１と第２の標的化ドメインと毒性ドメインが、共有結合により単一の融合タンパク質として一緒に結合され得る。
【００９５】
本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬は、受容体標的化試薬のドメイン（例えば、第１の標的化ドメイン、第２の標的化ドメイン、または毒性ドメイン）の１つ以上（または全部）を一緒に連結する１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上）のリンカー部分を含むものであり得る。かかるリンカー部分は、例えば、受容体標的化試薬の２つ以上のドメイン間の立体障害の最小化（例えば、第１と第２の標的化ドメイン間の立体障害の最小化）に有用、または毒性ドメイン（存在する場合）によって１つ以上の標的化ドメインが標的細胞に結合する能力が妨害されるのを抑制するのに有用であり得る。リンカー部分としては、例えば、結合ペアの第１と第２の構成要素またはペプチドリンカーが挙げられ得る。リンカーペプチドは、１アミノ酸長であってもよいが、より長いものであり得る。例えば、リンカーペプチドは、少なくとも２（例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、または少なくとも５５またはそれ以上）のアミノ酸長であり得る。リンカーペプチドは、任意のアミノ酸を含むものであり得る。
【００９６】
一部の実施形態において、ペプチドリンカーは、ヒト筋肉アルドラーゼ（ｈｍａ）タンパク質の一部分（例えば、ＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ（配列番号１３））からなるもの、または該一部分を含むものであり得る。一部の実施形態において、１つ以上のペプチドリンカーは、ＥＡＳＧＧＰＥ（配列番号１４）を含むもの、あるいは該配列からなるものであり得る。一部の実施形態において、１つ以上のペプチドリンカーは、（ｉ）アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号４）を有する凝集低減リンカー（ＡＲＬ）および／または（ｉｉ）モノもしくはポリ−ＧＧＧＧＳ配列（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５））を含むもの、あるいは前記（ｉ）および／または（ｉｉ）からなるものであり得る。受容体標的化試薬が融合タンパク質である実施形態において、該１つ以上のリンカー部分は、該融合タンパク質のドメインの２つ以上を連結するものであり得る。例示的なリンカー部分およびその受容体標的化試薬の２つ以上のドメインの連結における役割は、付随の実施例に記載している。
【００９７】
例示的な受容体標的化試薬は、付随の実施例に記載しており、以下のものが挙げられる：例えば、ジフテリア毒素の生物学的活性バリアント（配列番号１０）、リンカー（配列番号１４）、上皮成長因子（配列番号６）、リンカー（配列番号１３）、およびＩＬ１３（配列番号７）を含み、以下のアミノ酸配列：
【００９８】
【化７】
2010536386.tif 000009
を有するＤＴＥＧＦ１３受容体標的化試薬；
上皮成長因子（配列番号６）、リンカー（配列番号１３）、およびＩＬ１３（配列番号７）を含み、以下のアミノ酸配列：
【００９９】
【化８】
2010536386.tif 000010
を有するＥＧＦ１３受容体標的化試薬；
上皮成長因子（配列番号６）、リンカー（配列番号１３）、ＩＬ１３（配列番号７）、リンカー（配列番号１４）、シュードモナス毒素Ａの生物学的に活性な断片（配列番号１２）、およびＫＤＥＬ（配列番号１５）を含み、以下のアミノ酸配列：
【０１００】
【化９】
2010536386.tif 000011
を有するＥＧＦ１３ＫＤＥＬ受容体標的化試薬；
ジフテリア毒素の生物学的に活性な断片（配列番号１０）、リンカー（配列番号１４）、上皮成長因子（配列番号６）、リンカー（配列番号１３）、およびＩＬ４（配列番号１７）を含み、以下のアミノ酸配列：
【０１０１】
【化１０】
2010536386.tif 000012
を有するＤＴＥＧＦ４受容体標的化試薬；
上皮成長因子の生物学的に活性な断片（配列番号６）、リンカー（配列番号１３）、ＩＬ４（配列番号１７）、リンカー（配列番号１４）、シュードモナス毒素Ａの生物学的に活性な断片（配列番号１２）、およびＫＤＥＬ（配列番号１５）を含み、以下のアミノ酸配列：
【０１０２】
【化１１】
2010536386.tif 000013
を有するＥＧＦ４ＫＤＥＬ受容体標的化試薬；ならびに
上皮成長因子（配列番号６）、リンカー（配列番号１３）、およびＩＬ４（配列番号１７）を含み、以下のアミノ酸配列：
【０１０３】
【化１２】
2010536386.tif 000014
を有するＥＧＦ４受容体標的化試薬。
【０１０４】
上記の各例示的な受容体標的化試薬のリンカー領域に下線を付している。
【０１０５】
また、本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬は、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０以上）の検出可能な標識を含むものであり得る。例えば、受容体標的化試薬は、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくはアセチルコリンエステラーゼ）、蛍光物質（例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、もしくはフィコエリトリン）、発光物質（例えば、ユーロピウム、テルビウム）、生物発光物質（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、もしくはイクオリン）、または放射性核種（例えば、本明細書に記載の任意の放射性核種）を含むものであり得る。
【０１０６】
本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬は、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上）のさらなる「標的化」ドメインおよび／または１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上）のさらなる毒性ドメインを含むものであり得ることは理解されよう。受容体標的化試薬は、１つ以上の第１の標的化ドメイン、１つ以上の第２の標的化ドメインおよび／または１つ以上の毒性ドメインを含むものであり得る。例えば、本明細書に記載の受容体標的化試薬は、２つ以上のＥＧＦＲ結合ドメインおよび／または２つ以上のＩＬ１３Ｒ−もしくはＩＬ４Ｒ結合ドメインを含むものであり得る。
【０１０７】
受容体標的化試薬の種々のドメイン（例えば、第１の標的化ドメイン、第２の標的化ドメイン、または毒性ドメイン）は、互いに対して任意の向きに配列され得る。例えば、毒性ドメインは、１つ以上（または全部）標的化ドメインに対してＮ末端側またはＣ末端側であり得る。別の例において、毒性ドメインは２つの標的化ドメイン間に存在し得る。同様に、標的化ドメインは、互いに隣接していてもよく、例えば毒性ドメインおよび／またはリンカー部分（上記参照）によって分離されていてもよい。
【０１０８】
一部の実施形態において、本明細書に記載の任意のポリペプチド（例えば、毒性ポリペプチド）は、被験体において該ポリペプチドの免疫原性が低減または抑制されるような様式で修飾され得る。本明細書で用いる場合、「低減された免疫原性」を有するように修飾されたポリペプチドは、所与の被験体、被験体コホートにおいて、対応する非修飾ポリペプチドよりも低い免疫応答を惹起するものである。本実施例において例示するように、ポリペプチドをコードする核酸は、標準的な分子生物学的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上掲）によって、コードされたポリペプチドが被験体において該ポリペプチドの免疫原性が低減されるのに有効な１つ以上の置換を含むように修飾され得る。例えば、配列番号１１を有するシュードモナス（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ）体外毒素（ＰＥ）Ａポリペプチドは、限定されないが：（ｉ）４９０位のアルギニンがアラニンであり、５１３位のアルギニンがアラニンであり、４３２位のアルギニンがグリシンであり、４６７位のアルギニンがアラニンであり、５９０位のリジンがセリンである；（ｉｉ）４９０位のアルギニンがアラニンであり、５１３位のアルギニンがアラニンであり、４６７位のアルギニンがグリシンであり、５４８位のグルタミン酸がセリンであり、５９０位のリジンがセリンであり、３３２位のグルタミンがセリンであり、３１３位のアルギニンがアラニンである；（ｉｉｉ）４９０位のアルギニンがアラニンであり、５１３位のアルギニンがアラニンであり、４６７位のアルギニンがグリシンであり、５４８位のグルタミン酸がセリンであり、５９０位のリジンがセリンであり、４３２位のグルタミンがグリシンであり、３１３位のアルギニンがアラニンである；または  （ｉｖ）４９０位のアルギニンがアラニンであり、５１３位のアルギニンがアラニンであり、４６７位のアルギニンがグリシンであり、５４８位のグルタミン酸がセリンであり、５９０位のリジンがセリンであり、４３２位のグルタミンがグリシンであり、３３２位のグルタミンがセリンであり、３１３位のアルギニンがアラニンであるなどの１つ以上の置換（例えば、同類または非同類置換）を含み得る。
【０１０９】
修飾ポリペプチドは、少なくとも２つ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３２、３５、または４０またはそれ以上）のアミノ酸置換を含むものであり得る。修飾ポリペプチドは、２０未満（例えば、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つ）のアミノ酸置換を含むものであり得る。修飾ポリペプチドは、少なくとも２つであるが２０未満のアミノ酸置換を含むものであり得ることは理解されよう。
【０１１０】
ポリペプチドの免疫原性を調べるための好適なインビトロおよびインビボ方法は当該技術分野で知られており、本実施例に記載している。インビトロ方法としては、例えば、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、修飾型または非修飾型）を有する哺乳動物被験体から採取したリンパ系細胞（例えば、ＴおよびＢリンパ球）の培養が挙げられる。リンパ系細胞は、該ポリペプチド、該ポリペプチドが由来するタンパク質または該ポリペプチドが微生物に由来する場合は該ポリペプチドを天然に産生する該微生物に事前に曝露させた被験体由来のものであり得る。あるいはまた、リンパ系細胞のドナーは、これらの存在体のいずれかに曝露されたものである必要はない。該細胞の培養物を、該ポリペプチドのいずれかで必要なだけ多く「再刺激」してもよい。また、該細胞の培養物を種々の時点でモニターし、いつ免疫反応性（例えば、抗体生成またはＣＤ４＋  ヘルパーＴ細胞活性）が生じたかを確認してもよい。かかる実験では、第１の組の細胞が修飾ポリペプチドと接触され得、同一の第２の組の細胞が対応する非修飾ポリペプチドと接触され得る。非修飾ポリペプチドによってもたらされる免疫応答と比べたときの修飾ポリペプチドによってもたらされる免疫応答の低減は、修飾ポリペプチドが低減された免疫原性を有するという表示である。
【０１１１】
インビボ方法では、該ポリペプチド自体が被験体に投与され得る。該ポリペプチドは被験体に、経口、経皮、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内、もしくは肺内投与され得るか、または静脈内、皮下、筋肉内、もしくは腹腔内注射（もしくは注入）され得る。該ポリペプチドは、適切なリンパ系組織（例えば、脾臓、リンパ節、または粘膜関連リンパ系組織（ＭＡＬＴ））に直接送達され得る。ヒト被験体が使用される試験では、該ポリペプチドは皮下投与され得、「ホイール状の発赤（ｗｈｅｅｌ  ａｎｄ  ｆｌａｒｅ）」の発生または重症度は、該被験体に対する該ポリペプチドの免疫原性の表示であり得る。一部の実施形態において、修飾ポリペプチドおよび非修飾ポリペプチドは同じ被験体に、例えば皮膚試験を用いて投与され得る。かかるアッセイでは、試験抗原に特異的な抗体と予備活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞の両方が試験される。１２時間以内の陽性応答は抗体応答を示し、一方、４８〜９６時間の間で最適な応答は、該当する抗原に事前に曝露されたＣＤ４＋  Ｔ細胞の存在を示す。例えば、ヒト被験体には修飾型組成物と非修飾型組成物が、身体の同じ領域内の異なる位置に、例えば、被験体の背中または腹部の異なる位置に皮下投与され得る。動物実験などの一部の実施形態では、１匹の動物または動物（例えば、マウス）の群に修飾ポリペプチドが投与され得、同一の動物または動物の群に対応する非修飾ポリペプチドが投与され得る。インビトロ実験の場合と同様、非修飾ポリペプチドによってもたらされる免疫応答と比べたときの修飾ポリペプチドによってもたらされる免疫応答の低減は、修飾ポリペプチドが低減された免疫原性を有するという表示である。
【０１１２】
免疫応答レベルの測定方法は当該技術分野で知られており、本詳細説明に示し、本実施例に例示している。例えば、抗体生成の測定方法は、標題「抗体の作製方法」のセクションに記載している。
【０１１３】
核酸および受容体標的化試薬の作製方法
また、本明細書に記載のポリペプチド受容体標的化試薬（例えば、完全長ポリペプチド受容体標的化試薬またはそのポリペプチドドメイン）をコードする核酸、および該核酸を含むベクターを取り上げて記載する。該核酸およびベクターは、例えば、ポリペプチド受容体標的化試薬を宿主細胞（例えば、細菌、酵母、または哺乳動物の細胞）内で発現させるため使用され得る。また、該核酸およびベクターは、例えば、後述する処置のエキソビボ方法において使用され得る。
【０１１４】
単一の核酸は、受容体標的化試薬全体、例えば、受容体標的化試薬融合タンパク質をコードするものであり得る。受容体標的化試薬は、場合によっては、２つ以上（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０以上）の異なる核酸にコードされたものであり得る。例えば、受容体標的化試薬の各ドメインが別々の核酸にコードされていてもよい。
【０１１５】
一部の実施形態において、該核酸は、該核酸にコードされたポリペプチド受容体標的化試薬の発現を指令するプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結されたものであり得る。所与のポリペプチド受容体標的化試薬のコード配列は、核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡ配列もしくはｃＤＮＡ配列）を含む単一の発現ベクター内に含めてもよく、２つ以上のベクターに含めてもよい。例えば、３つの異なるドメイン（例えば、第１の標的化ドメイン、第２の標的化ドメイン、および毒性ドメイン）を含むポリペプチド受容体標的化試薬は、３つの異なるベクターに存在する異なる核酸にコードされていてもよく、この場合、各ベクターは、例えば１つのドメインのコード配列を含む。後者の場合、それぞれのベクター内にコードされたドメインは、これらが翻訳後に細胞内で会合し、該細胞内で共有（例えば、ジスルフィド）結合または非共有結合性（例えば、疎水性もしくはイオン性）相互作用のいずれかによって構成されるように設計され得る。あるいはまた、個々の各ドメインをまず単離し、次いで、別の工程で一緒に結合（例えば、化学的または酵素的に一緒に結合）してもよい。
【０１１６】
エンハンサーは、時間、位置およびレベルに関して発現特異性をもたらす。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、プロモーターが存在しているという条件で、転写開始部位から種々の距離で存在させた場合に機能を果たし得る。また、エンハンサーを転写開始部位の下流に存在させてもよい。コード配列をプロモーターの制御下にある状態にするには、ペプチドまたはポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位を、プロモーターの１〜約５０ヌクレオチド下流（３’）に配置することが必要である。対象のプロモーターとしては、限定されないが、サイトメガロウイルスｈＣＭＶ前初期遺伝子、ＳＶ４０アデノウイルスの初期もしくは後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージＡの主要オペレータおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母α接合因子のプロモーター、アデノウイルスＥ１ｂミニマルプロモーター、またはチミジンキナーゼミニマルプロモーターが挙げられる。
【０１１７】
単一の融合タンパク質がコードされている場合、標的化ドメインをコードする核酸配列は、毒性ドメインをコードする核酸の５’側に存在していてもよく、その逆でもよい。２つのコード配列は互いにインフレームであり、互いに直接隣接していてもよく、リンカーペプチドをコードするリンカー領域によって分離されていてもよく、リンカーペプチドは、例えば、標的細胞の表面への第１または第２の標的化ドメインの結合毒性ドメインによる立体障害を抑制する機能を果たし得る。
【０１１８】
一部の実施形態において、該核酸または該核酸を含むベクターは、シグナルペプチドをコードするリーダー配列を含むものであり得る。リーダー配列は、例えば、受容体標的化試薬または受容体標的化試薬全体の融合タンパク質の１つ以上のドメインをコードする配列の５’末端に存在させ得る。シグナルペプチドは、成熟ポリペプチド（例えば、成熟形態の第１もしくは第２の標的化ドメインまたは受容体標的化試薬をコードする融合タンパク質）のＮ末端のすぐ後であり得るが、リーダー配列が該融合タンパク質をコードする核酸配列とインフレームであることを条件として、該末端から１アミノ酸以上（例えば、２、３、４、６、８、１０、１５または２０個分）離れていてもよい。シグナルペプチドは、一般的には分泌前に融合タンパク質から切断され、翻訳中に融合タンパク質を標的化細胞の小胞体（ＥＲ）の内腔内に指向し、次いで、融合タンパク質が分泌小胞によって標的化細胞の環境内に分泌される。このように、標的化細胞は、標的化細胞の細胞質ゾル内での毒素とタンパク質合成機構との相互作用がＥＲおよび分泌小胞の膜二重層によって抑制されるため、バイアブルなまま維持される。有用なリーダーペプチドは、該当する標的化ドメイン（ＩＬ−４、ＥＧＦ、もしくはＩＬ１３もしくはＩＬ１６ポリペプチド）の天然リーダーペプチドまたは該天然リーダーの機能性断片であり得る。あるいはまた、該リーダーは、別のポリペプチドに由来するものであり得る。例えば、シグナルペプチドは、アミノ酸配列ＭＡＩＳＧＶＰＶＬＧＦＦＩＩＡＶＬＭＳＡＱＥＳＷＡ（配列番号１６）を有するものであり得る。また、ペプチド配列ＫＤＥＬ（配列番号１５）は、ＥＲの保持シグナルとして作用することが示されている。一部の実施形態において、シグナルポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸の３’末端（すなわち、核酸にコードされたタンパク質のカルボキシ末端）に存在させ得る。例えば、ＫＤＥＬ（配列番号１５）配列は、受容体標的化試薬（付随の実施例に記載のＥＧＦ１３ＫＤＥＬ試薬など）をコードする核酸の３’末端に存在させ得る。他のシグナル配列は、米国特許第５，８２７，５１６号（その開示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。
【０１１９】
一部の実施形態において、ポリペプチド受容体標的化試薬（例えば、融合タンパク質受容体標的化試薬）または任意のポリペプチド標的化ドメイン、ポリペプチド毒性ドメイン（もしくはその毒性ポリペプチド）をコードする核酸の５’末端に、非天然ＡＴＧ「開始配列」が含まれていてもよい。これは、例えば、完全長ポリペプチドの生物学的に活性な断片またはバリアントをコードする核酸に付加され得るＡＴＧ配列であり、該タンパク質が適正に転写および翻訳されるのが確実になる。リーダー配列は一般的にＡＴＧ開始配列を含むが、含んでいない実施形態では、ＡＴＧ配列が、リーダー配列をコードする核酸の５’末端に付加され得る。当然、これにより、ポリペプチド受容体標的化試薬の対応する配列において非天然メチオニン残基アミノ酸がもたらされる。
【０１２０】
核酸および発現ベクターの構築のための好適な方法は当業者に充分わかり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版  第１巻、２巻および３巻．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，１９８９年１１月（その開示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１２１】
組換え核酸は細胞内にさまざまな方法を用いて導入され得るが、該方法は、少なくとも一部において、核酸が導入される細胞の型に依存し得る。例えば、細菌細胞は、エレクトロポレーションまたはヒートショックなどの方法を用いて形質転換させ得る。酵母細胞をトランスフェクトするための方法としては、例えば、スフェロプラスト手法または塩化リチウムによる全細胞酵母形質転換方法（例えば、米国特許第４，９２９，５５５号；Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；米国特許第４，８７９，２３１号；およびＳｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５９：１１５（各々の開示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）が挙げられる。動物細胞のトランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、ヒートショック、リポソーム、またはトランスフェクション試薬（ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）もしくはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）など）を用いること、または裸の核酸ベクターを細胞と溶液中で接触させること（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）を参照のこと）による細胞内へのベクターの導入を特色とするものであり得る。
【０１２２】
本明細書に記載の受容体標的化試薬小規模または大規模作製に使用され得る発現系としては、限定されないが、本発明の核酸分子を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した微生物（細菌（例えば、大腸菌およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など）；本発明の核酸分子を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、サッカロミセス属およびピキア）；本発明の核酸分子を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；融合タンパク質ヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染させた、あるいは該ヌクレオチド配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）あるいは哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ＣＭＶ  プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、もしくはワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有させた哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、およびＮＩＨ  ３Ｔ３細胞）が挙げられる。また、哺乳動物から採取した、プラスミドベクターでトランスフェクトした、またはウイルスベクター（例えば、ウイルスベクター（特に、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなど；下記のエキソビボ法も参照のこと）に感染させた一次細胞または二次細胞も宿主細胞として有用である。
【０１２３】
本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬の発現後、受容体標的化試薬は、培養細胞から、または細胞を培養した培地から標準的な手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）参照）を用いて単離され得る。タンパク質の単離方法は当該技術分野で知られており、例えば、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、金属キレート化もしくはイムノアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、沈降、または分別可溶化が挙げられる。
【０１２４】
小分子の受容体標的化試薬（またはそのドメイン）、例えば、２００未満（例えば、１７５未満、１５０未満、１２５未満、１００未満、９０未満、８０未満、７０未満、または６０未満）のアミノ酸を有する受容体標的化試薬またはドメインは、標準的な化学反応手段によって化学合成され得る。
【０１２５】
一部の実施形態において、単離された受容体標的化試薬は、凍結、凍結乾燥または固定化させて適切な条件下で保存され得、これにより、該タンパク質が活性（例えば、免疫毒性活性または細胞に対する結合能力）を保持することが可能になる。
【０１２６】
１つ以上のドメインまたは薬剤（例えば、標的化ドメインまたは毒性薬剤）が独立して作製されたものである場合、各ドメインまたは薬剤を共有結合または非共有結合によって、当該技術分野で知られた方法を用いて一緒に連結させ得る。例えば、一方のドメイン（または薬剤）上の末端または内部のシステイン残基が、別のドメインまたは薬剤上の末端または内部のシステイン残基とのジスルフィド結合の形成に利用され得る。
【０１２７】
また、ドメインまたは薬剤を、いくつかの既知の任意の化学的架橋体を用いて架橋させてもよい。かかる化学的架橋体の例は、２つのアミノ酸残基を、「ヒンダード」ジスルフィド結合を含む連結によって連結させるものである。このような連結において、架橋単位内のジスルフィド結合は、例えば、還元型グルタチオンまたは酵素ジスルフィドレダクターゼの作用による還元から保護される（ジスルフィド結合のいずれかの側の立体障害基によって）。適当な化学的架橋体の一例である４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）は、一方のドメイン（または薬剤）上の末端リジンと他方の末端システインを用いて、２つのドメイン（または薬剤）間にかかる連結を形成する。ヘテロ二官能性試薬は、各ドメイン（例えば、各ドメインポリペプチド）または薬剤（例えば、毒性の小分子もしくは放射性核種）上の異なるカップリング部分によって架橋を行なう。したがって、一方のドメインまたは薬剤上のカップリング部分はシステイン残基であり得、他方のものはリジン残基であり得る。このように、得られる二量体は、ホモ二量体またはホモ二量体とヘテロ二量体の混合物のいずれかではなくヘテロ二量体であろう。他の有用な架橋体としては、限定されないが、２つのアミノ基を連結する化学基（例えば、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド）、２つのスルフヒドリル基を連結する化学基（例えば、１，４−ビス−マレイミドブタン）アミノ基とスルフヒドリル基を連結する化学基（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、アミノ基とカルボキシル基を連結する化学基（例えば、４−［ｐ−アジドサリチルアミド］ブチルアミン）、およびアミノ基とアルギニンの側鎖内に存在するグアニジウム（ｇｕａｎａｄｉｕｍ）基を連結する化学基（例えば、ｐ−アジドフェニル  ｇｌｙｏｘａｌ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）が挙げられる。
【０１２８】
このような架橋方法は、任意の該ドメインまたは薬剤に対して天然の残基（「カップリング部分」）を伴うものであり得るが、ポリペプチド鎖内に組み込まれた非天然（「非相同」）配列（例えば、リンカー配列）を架橋させるためにも使用され得る。必ずしもそうではないが、かかる配列は、一般的に、アミノ酸（例えば、システイン、リジン、アルギニン、または任意のＮ末端アミノ酸）で構成されている。非アミノ酸部分としては、限定されないが、例えば、ビシナールジオールが使用された糖質（例えば、糖タンパク質上）が挙げられる（Ｃｈａｍｏｗら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１５９１６−１５９２２）。例えば、架橋剤４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）は、あるドメイン（または薬剤）上の糖質残基と別のドメイン（または薬剤）上のスルフヒドリル基を架橋させるために使用され得る。これらは、例えば、ドメイン（もしくは薬剤）またはドメインもしくは薬剤の一部分の化学的合成の際に付加され得る。あるいはまた、当該技術分野で知られた標準的な組換え核酸手法によって付加してもよい。
【０１２９】
非相同カップリング部分は、得られる受容体標的化試薬の活性が阻害されないことを条件として、融合タンパク質のドメインまたは薬剤内の任意の位置に存在させ得る。したがって、該連結は、標的化ドメインの構造の破壊をもたらし、該ドメインが特異性を有する細胞表面分子に対して実質的に結合できなくなるようなものであってはならない。さらに、該連結は、毒性ドメイン（または薬剤）の構造の破壊をもたらし、該ドメインが実質的にそれぞれの標的細胞の増殖を抑止（または該細胞を死滅させることが）できなくなるようなものであってはならない。当業者にわかる（および付随の実施例に詳述した）標準的な結合アッセイおよび毒性アッセイを使用し、ドメイン上の異なる残基が関与する連結が使用された候補受容体標的化試薬は、対象の標的細胞に結合して増殖を抑止する（または該細胞を死滅させる）能力について試験され得る。分子モデル設計手法を使用し、ドメイン間連結を形成し得る部分の挿入に適切であり得る標的化ドメインまたは毒性ドメイン（または薬剤）上の領域を予測することが高頻度で可能になる。したがって、例えば、標的化ドメインの外側表面上に存在しているが標的分子に対する結合に関与していないようであると予測される領域は、標的化ドメイン内の挿入に適切な部分として有用な領域であり得る。同様に、毒性ドメイン（または薬剤）の外側表面に存在しているが、毒性活性に関与していないようであると予測される領域は、毒性ドメイン内の挿入に適切な部分として有用な領域であり得る。
【０１３０】
カップリング部分は、好ましくは、該ドメインの末端（ＣまたはＮ）に存在させる。該部分は、上記のように、各ドメイン（または薬剤）上のシステイン残基、または一方のシステインと他方のリジンであり得る。該部分が２つのシステイン残基である場合、架橋は、例えば、ドメイン（または薬剤）を酸化条件に曝露することにより行なわれ得る。
【０１３１】
場合によっては、架橋をドメインまたは薬剤に挿入された非天然部分のみに制限するため、例えば、該ドメインまたは薬剤内の１つ以上の天然システイン残基を排除するのが望ましいこともあり得る。場合によっては扱いにくいシステインは、例えば、アラニンまたはチロシン残基で置き換えられ得る。これは、例えば、標準的な組換え手法によって行なわれ得る。当然、このような置き換えは、得られる受容体標的化試薬の活性を阻害するものでないのがよい。
【０１３２】
２つより多くのドメイン（または２種類より多くの薬剤）を連接させる場合、該ドメイン（または薬剤）の少なくとも１つは、１つより多くの架橋部分を有するものであり得る。かかる多量体は、各ドメインまたは薬剤が次のものに、鎖内の末端の２つのドメイン（または薬剤）はドメイン間（または薬剤間）結合に関与する残基を１つだけ有するが、各「内部」ドメイン（または薬剤）はドメイン間結合に関与する部分を２つ有するように連接されるように「逐次」構築され得る。あるいはまた、１つのドメインを多数の（例えば、２、３、４、または５つの）他のドメインまたは薬剤に連結させてもよいｒ。
【０１３３】
受容体標的化試薬のさらなる処理
本明細書に記載の任意のポリペプチド受容体標的化試薬の発現または合成後、該試薬をさらに処理してもよい。例えば、さらなる処理は、受容体標的化試薬に対する１つ以上のドメインの化学的もしくは酵素的付加、または受容体標的化ドメイン内の既存のドメインに対する修飾、または両方を含むものであり得る。該受容体標的化分子のさらなる処理は、非相同アミノ酸配列（ポリマー、担体、またはその他の任意の上記の非相同配列）の付加（共有結合または非共有結合）を含むものであってもよい。該処理は、例えば、受容体標的化試薬に対する放射性核種の付加を含むものであり得る。放射性核種は、毒性のもの（上記）または一般的に非毒性のものまたは低毒性のもの（インビボ診断に使用されている放射性核種など）であり得る。診断用の型の放射性核種の例としては、限定されないが、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、１７７Ｌｕ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１９９Ａｕ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２４Ｉ、１８Ｆ、１１Ｃ、１９８Ａｕ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、１３Ｎ、３４ｍＣｌ、３８Ｃｌ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７６Ａｓ、７２Ｓｅ、７３Ｓｅ、または７５Ｓｅが挙げられる。放射性核種原子（またはこれらを含む大分子／キレート；上記参照）を受容体標的化試薬に結合させる方法は当該技術分野で知られており、受容体標的化試薬を放射性核種とともに、該受容体標的化試薬に対する放射性核種原子または放射性核種原子含有分子もしくはキレートの結合を助長する条件（例えば、ｐＨ、塩濃度および／または温度）下でインキュベートすることを伴うものであり得る（例えば、米国特許第６，００１，３２９号（その開示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１３４】
また、さらなる処理は、受容体標的化試薬の酵素的または化学的処理を伴うものであり得る。例えば、酵素的処理は、改変された標的分子を、例えば１種類以上のプロテアーゼ、ホスファターゼ、またはキナーゼと、該受容体標的化試薬の修飾が誘導されるのに充分な時間接触させることを伴うものであり得る。酵素的処理は、受容体標的化試薬をグリコシル化し得る、または該試薬のグリコシル化を変更し得る１種類以上の酵素（例えば、オリゴサッカリルトランスフェラーゼまたはマンノシダーゼ）と該受容体標的化試薬を接触させることを伴うものであり得る。
【０１３５】
受容体標的化試薬を含む医薬組成物
本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬が医薬組成物に組み込まれ得る。かかる組成物は、典型的には、受容体標的化試薬と薬学的に許容され得る担体を含む。本明細書で用いる場合、文言「薬学的に許容され得る担体」は、医薬の投与に適合性の溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを包含する。受容体標的化試薬は、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、水性液剤、クリーム剤、軟膏、ローション剤、ゲル剤、乳剤などの形態の医薬組成物として製剤化され得る。また、補助活性化合物（例えば、１種類以上の化学療法剤）が該組成物に組み込まれることがあり得る。
【０１３６】
医薬組成物は、一般的に、その意図される投与経路と適合性となるように製剤化される。投与経路の例としては、経口、経直腸、および非経口、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、経皮、または経粘膜が挙げられる。非経口適用に使用される液剤または懸濁剤には、以下の成分：滅菌希釈剤（注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒など）；抗菌剤（ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど）；抗酸化剤（アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸など）；緩衝剤（酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩など）および張度調整剤（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）が含まれ得る。ｐＨは、酸または塩基（塩酸または水酸化ナトリウムなど）で調整され得る。該組成物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは反復用量バイアル内に封入され得る。
【０１３７】
注射用用途に適した医薬組成物としては、滅菌水性液剤（水溶性の場合）または分散剤および滅菌注射用液剤または分散剤の即時調合調製のための滅菌粉末剤が挙げられる。静脈内投与では、好適な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，パーシッパニー，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、該組成物は滅菌されたものでなければならず、易注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるのがよい。該組成物は、製造および保存の条件下で安定であるのがよく、細菌および真菌などの微生物の汚染に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、ならびにその適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合は必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物による汚染の抑制は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによってなされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、塩化ナトリウムを該組成物中に含めることが望ましい。注射用組成物の持続性吸収は、該組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによりもたらされ得る。
【０１３８】
滅菌された注射用液剤は、受容体標的化試薬を必要量で適切な溶媒中に、必要に応じて上記の成分の１種類または組合せとともに組み込んだ後、濾過滅菌することにより調製され得る。一般的に、分散剤は、受容体標的化試薬を、基礎分散媒体と上記のものからの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことにより調製される。滅菌注射用液剤の調製用の滅菌粉末剤の場合、調製方法は真空乾燥および凍結乾燥を含み、これにより、事前に滅菌濾過した液剤から、活性成分＋任意のさらなる所望の成分の粉末剤が得られる。
【０１３９】
経口用組成物には、一般的に、不活性希釈剤または可食担体が含まれる。治療的経口投与の目的のため、受容体標的化試薬は、賦形剤とともに組み込まれ得、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤（例えば、ゼラチンカプセル剤）の形態で使用され得る。また、経口用組成物は、マウスウォッシュとしての使用のための流動性担体を用いて調製され得る。医薬適合性のある結合剤および／または補助物質を、該組成物の一部として含めてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などには、任意の以下の成分、または類似した性質の化合物：結合剤（微晶質セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンなど）；賦形剤（デンプンもしくはラクトースなど）、崩壊剤（アルギン酸、プリモジェルもしくはコーンスターチなど）；滑沢剤（ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなど）；流動促進剤（コロイド状二酸化ケイ素など）；甘味剤（スクロースもしくはサッカリンなど）；またはフレーバー剤（ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジフレーバーなど）が含有され得る。
【０１４０】
粉末剤および錠剤には、１％〜９５％（ｗ／ｗ）の受容体標的化試薬が含まれ得る。一部の特定の実施形態において、受容体標的化試薬は５％〜７０％（ｗ／ｗ）の範囲である。好適な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどである。用語「調製物」は、カプセル剤を提供する担体としてカプセル化材料を有する受容体標的化試薬の製剤を包含するものとし、カプセル剤では、受容体標的化試薬（他の担体ありまたはなし）が担体に囲まれ、したがって担体と合体している。同様に、カシェ剤およびロゼンジ剤も包含される。錠剤、粉末剤、カプセル剤、丸剤、カシェ剤、およびロゼンジ剤は、経口投与に適した固形投薬形態として使用され得る。
【０１４１】
経口使用に適した水性液剤は、活性成分を水に溶解させ、所望により適当な着色剤、フレーバー、安定剤および増粘剤を添加することにより調製され得る。経口使用に適した水性懸濁剤は、微粉化した活性成分を水中に、粘性物質（天然または合成ガム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）および他のよく知られた懸濁化剤とともに分散させることにより作製され得る。
【０１４２】
吸入による投与では、該化合物は、適当な噴霧推進剤（例えば、二酸化炭素などのガス）が内包された加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエーロゾルスプレー剤の形態で送達される。
【０１４３】
経表面投与に適した受容体標的化試薬は、例えば、クリーム剤、スプレー剤、フォーム剤、ゲル剤、軟膏、膏薬、または速乾性擦式製剤（ｄｒｙ  ｒｕｂ）として製剤化され得る。速乾性擦式製剤は、投与部位で再水和され得る。また、受容体標的化試薬は、経表面投与のための包帯、ガーゼまたはパッチ剤内に直接注入する（例えば、浸漬させて乾燥させる）ために製剤化され得る。また、受容体標的化試薬は、経表面投与のための包帯、ガーゼまたはパッチ剤内で半液状、ゲル状、または完全な液状状態に製剤化され得る（例えば、米国特許第４，３０７，７１７号（その内容は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１４４】
また、全身投与は経粘膜または経皮手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与では、バリア層に浸透させるのに適切な浸透剤が製剤中に使用される。かかる浸透剤は、当該技術分野で一般的に知られており、例えば、経粘膜投与のためには、デタージェント、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔内スプレー剤または坐剤によって使用によってなされ得る。経皮投与には、受容体標的化試薬は、当該技術分野で一般的に知られている軟膏、膏薬、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤化される。
【０１４５】
また、受容体標的化試薬は、坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの慣用的な坐剤基剤を使用）または経直腸送達用の持続性注腸剤の形態に調製され得る。
【０１４６】
一実施形態において、受容体標的化試薬は、該受容体標的化試薬を体内からの急速な排出から保護する担体を用いて調製される（制御放出製剤、例えば、埋入物およびマイクロカプセル封入送達系など）。生分解性で生体適合性のポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などが使用され得る。かかる製剤の調製方法は当業者には自明である。また、これらの物質は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。リポソーム懸濁剤（例えば、ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞に標的化されるリポソーム）もまた、薬学的に許容され得る担体として使用され得る。これは、当業者にはわかる方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の方法に従って調製することができる。
【０１４７】
経口用または非経口用組成物を、容易な投与および均一な投薬量のために単位投薬形態に製剤化することは特に好都合である。単位投薬形態は、本明細書で用いる場合、処置対象の被験体に対する単回投薬量に適応させた物理的に独立した単位であって、各単位が、所望の治療効果がもたらされるように計算された所定量の受容体標的化試薬を、必要な医薬用担体とともに含むものをいう。また、投薬単位に使用のための使用説明書が添付されていてもよい。
【０１４８】
本明細書に記載の任意の医薬組成物は、容器、パック、またはディスペンサー内に、以降のセクションに記載する投与の使用説明書とともに内包され得る。
【０１４９】
抗体の作製方法
本明細書に記載のＥＧＦＲ（例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｏｒ  ＨＥＲ４）、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４Ｒに特異的な抗体の作製方法は、当該技術分野で知られている。例えば、１つ以上の遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体または抗体断片の作製方法は、例えば動物を用いた免疫処置による、またはファージディスプレイなどのインビトロ方法による作製であり得る。抗体または抗体断片の作製には、標的タンパク質の全部または一部（例えば、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４Ｒの全部または一部）を含むポリペプチドが使用され得る。
【０１５０】
該ペプチドは、これで適当な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物）を免疫処置することにより抗体を調製するために使用され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、化学合成されたペプチドまたは組換えにより発現させたペプチドを含むものであり得る。該調製物は、さらに、アジュバント（フロイント完全もしくは不完全アジュバントなど）、または類似した免疫賦活薬を含んでいてもよい。適当な被験体を免疫原性ペプチド調製物で免疫処置すると、ポリクローナル抗ペプチド抗体応答が誘導される。
【０１５１】
抗体という用語は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、該ペプチドに特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）をいう。本明細書に記載のペプチドに特異的に結合する抗体は、該ペプチドに結合するが、試料中の他の分子には実質的に結合しない抗体である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。
【０１５２】
該抗ペプチド抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体調製物であり得る。モノクローナル抗体という用語は、本明細書で用いる場合、該ペプチドと免疫反応を行い得る抗原結合部位を１種のみ含む抗体分子集団をいう。したがって、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、免疫反応する特定のペプチドに対して単一の結合親和性を示す。
【０１５３】
ポリクローナル抗ペプチド抗体は、上記のように適当な被験体をペプチド免疫原で免疫処置することにより調製され得る。免疫処置された被験体における抗ペプチド抗体の力価は、標準的な手法、例えば、固定化ペプチドを使用する酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などによって経時的にモニターされ得る。所望により、該ペプチドに対する抗体分子を哺乳動物（例えば、血液）から単離し、プロテインＡクロマトグラフィーなどの手法によってさらに精製し、ＩｇＧ画分を得てもよい。免疫処置後、適切な時点で、例えば抗ペプチド抗体の力価が最大になったとき、抗体産生細胞を被験体から採取し、標準的な手法、例えば、ハイブリドーマ手法（最初にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ  （１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７によって報告）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、またはＥＢＶ−ハイブリドーマ手法（Ｃｏｌｅら（１９８５），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）により、モノクローナル抗体の調製に使用することができる。リンパ球と不死化細胞株の融合に使用されている多くのよく知られた任意のプロトコルが、抗ペプチドモノクローナル抗体の作製の目的に適用され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（上掲）；Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０５２；Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）；ａｎｄ  Ｌｅｒｎｅｒ  （１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２を参照のこと）。
【０１５４】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの調製の択一例として、本明細書に記載のペプチドを用いて組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングし、該ペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリー構成要素を単離することにより、モノクローナル抗ペプチド抗体が同定および単離され得る。
【０１５５】
抗ペプチド抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの手法によって該ペプチドを単離するために使用され得る。さらに、抗ペプチド抗体は、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにおいて該ペプチドを検出するために使用され得る。抗体を、任意選択で、検出可能な標識（例えば、本明細書に記載の任意のもの）または結合ペアの第１もしくは第２の構成要素（例えば、ストレプトアビジン／ビオチンもしくはアビジン／ビオチン）（この第２の構成要素を検出可能な標識にコンジュゲートさせてもよい）にカップリングさせてもよい。
【０１５６】
また、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４Ｒに対する非ヒト抗体を非ヒト宿主（例えば、齧歯類）において産生させ、次いで、例えば、米国特許第６，６０２，５０３号、ＥＰ２３９  ４００、米国特許第５，６９３，７６１号、および米国特許第６，４０７，２１３号に記載のようにしてヒト化してもよい。
【０１５７】
ＥＰ  ２３９  ４００（Ｗｉｎｔｅｒら）には、ある種のＣＤＲを別の種由来のものと置換すること（所与の可変領域内で）により抗体を改変することが記載されている。ＣＤＲ置換抗体は、含有されている非ヒト成分がかなり少ないため、真のキメラ抗体と比べてヒトにおいて免疫応答が惹起されにくいものであり得る。Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，１５３４−１５３６参照。典型的には、マウス抗体のＣＤＲは、所望の置換型抗体をコードする配列が得られる組換え核酸手法を使用することにより、ヒト抗体の対応する領域内で置換される。所望のアイソタイプ（例えば、ＣＨのγＩおよびＣＬのκ）のヒト定常領域遺伝子セグメントを付加し、ヒト化重鎖および軽鎖遺伝子を哺乳動物細胞において共発現させると、可溶性のヒト化抗体が産生され得る。
【０１５８】
ＷＯ  ９０／０７８６１には、元のマウス抗体のＶ領域フレームワークとの最適なタンパク質配列相同性に関するコンピュータ解析によってヒトＶフレームワーク領域を選び出すこと、およびマウスＶ領域の３次構造をモデル設計し、マウスＣＤＲと相互作用する可能性のあるフレームワークアミノ酸残基を可視化することを含む方法が記載されている。このようなマウスアミノ酸残基を、次いで、相同なヒトフレームワーク上に重ね合わせる。米国特許第５，６９３，７６２号；同第５，６９３，７６１号；同第５，５８５，０８９号；および同第５，５３０，１０１号もまた参照のこと。Ｔｅｍｐｅｓｔら，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，２６６−２７１では、マウス残基の原子団の導入なしのＣＤＲグラフティングで、標準として、それぞれＮＥＷＭおよびＲＥＩの重鎖および軽鎖に由来するＶ領域フレームワークが使用されている。ＮＥＷＭおよびＲＥＩ系ヒト化抗体を構築するためにＴｅｍｐｅｓｔらのアプローチを使用する利点は、ＮＥＷＭとＲＥＩの可変領域の３次元構造がｘ線結晶構造解析からわかり、したがって、ＣＤＲとＶ領域フレームワーク残基間の特異的相互作用がモデル設計され得ることである。
【０１５９】
非ヒト抗体は、例えば、コンセンサスヒトアミノ酸残基を、ヒト免疫グロブリン配列内の特定の位置に、例えば、以下の位置：（軽鎖の可変ドメインのフレームワーク内の）４Ｌ、３５Ｌ、３６Ｌ、３８Ｌ、４３Ｌ、４４Ｌ、５８Ｌ、４６Ｌ、６２Ｌ、６３Ｌ、６４Ｌ、６５Ｌ、６６Ｌ、６７Ｌ、６８Ｌ、６９Ｌ、７０Ｌ、７１Ｌ、７３Ｌ、８５Ｌ、８７Ｌ、９８Ｌおよび／または（重鎖の可変ドメインのフレームワーク内の）２Ｈ、４Ｈ、２４Ｈ、３６Ｈ、３７Ｈ、３９Ｈ、４３Ｈ、４５Ｈ、４９Ｈ、５８Ｈ、６０Ｈ、６７Ｈ、６８Ｈ、６９Ｈ、７０Ｈ、７３Ｈ、７４Ｈ、７５Ｈ、７８Ｈ、９１Ｈ、９２Ｈ、９３Ｈおよび／または１０３Ｈ（Ｋａｂａｔによる番号付け）の１つ以上（例えば、少なくとも５、１０、１２または全部）に挿入する置換を含むように修飾され得る。例えば、米国特許第６，４０７，２１３（その開示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）号を参照のこと。
【０１６０】
ＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４Ｒに結合する完全ヒトモノクローナル抗体は、例えば、Ｂｏｅｒｎｅｒら，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７，８６−９５に記載のインビトロ初回刺激ヒト脾細胞を用いて作製され得る。これは、Ｐｅｒｓｓｏｎら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：２４３２−２４３６またはＨｕａｎｇおよびＳｔｏｌｌａｒ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．方法  １４１，２２７−２３６に記載のレパートリークローニングによって調製され得る；米国特許第５，７９８，２３０号も参照のこと（各々の開示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。また、非免疫処置されていないヒトの大型ファージディスプレイライブラリーの使用により、標準的なファージ手法を用いてヒト用治療剤として開発され得る高親和性抗体が単離され得る（例えば、Ｖａｕｇｈａｎら，１９９６；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０；およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２：３７１−８；ＵＳ２００３−０２３２３３３を参照のこと）。
【０１６１】
本明細書で用いる場合、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」は、免疫グロブリン可変ドメインの構造が形成され得るアミノ酸配列をいう。例えば、該配列は、天然に存在する可変ドメインのアミノ酸配列の全部または一部を含むものであり得る。例えば、該配列は、１つ、２つまたはそれ以上のＮ−またはＣ末端のアミノ酸、内部アミノ酸がなくてもよく、１つ以上の挿入またはさらなる末端のアミノ酸を含んでいてもよく、他の改変を含んでいてもよい。一実施形態において、免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むポリペプチドは、別の免疫グロブリン可変ドメイン配列と結合させ、標的結合構造（すなわち「抗原結合部位」）、例えば、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４Ｒと相互作用する構造が形成されるようにし得る。
【０１６２】
抗体のＶＨまたはＶＬ鎖に、さらに、重鎖または軽鎖の定常領域の全部または一部を含め、それにより、それぞれ免疫グロブリンの重鎖または軽鎖が形成されるようにしてもよい。一実施形態において、抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖と２つの免疫グロブリン軽鎖の四量体である。免疫グロブリンの軽鎖と重鎖は、ジスルフィド結合によって連結させ得る。重鎖定常領域は、典型的には、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、典型的にはＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には、宿主組織または因子（例えば、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ））に対する抗体の結合を媒介する。
【０１６３】
抗体の１つ以上の領域がヒト由来、有効なヒト由来、またはヒト化のものであり得る。例えば、可変領域の１つ以上がヒト由来または有効なヒト由来であり得る。例えば、ＣＤＲの１つ以上、例えば、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３がヒト由来であり得る。各軽鎖ＣＤＲがヒト由来であってもよい。ＨＣ  ＣＤＲ３がヒト由来であってもよい。フレームワーク領域（ＦＲ）の１つ以上、例えば、ＨＣまたはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４がヒト由来であってもよい。一部の実施形態において、すべてのフレームワーク領域がヒト由来、例えば、ヒト体細胞（例えば、免疫グロブリン産生造血細胞または非造血細胞）由来である。一実施形態において、ヒト由来配列は、例えば、生殖細胞系の核酸にコードされた生殖細胞系の配列である。定常領域の１つ以上が、ヒト由来、有効なヒト由来、またはヒト化のものであり得る。別の実施形態において、フレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３の集合、またはＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の集合）または抗体全体の少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、または９８％がヒト由来、有効なヒト由来、またはヒト化のものであり得る。例えば、ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３の集合が、ヒト由来生殖細胞系のセグメントにコードされたヒト由来配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９８、または９９％同一であり得る。
【０１６４】
「有効なヒト由来」免疫グロブリン可変領域は、該免疫グロブリン可変領域によって正常なヒトにおいて免疫原性応答が惹起されないような充分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含む免疫グロブリン可変領域である。「有効なヒト由来」抗体は、該抗体によって正常なヒトにおいて免疫原性応答が惹起されないような充分な数のヒトアミノ酸位置を含む抗体である。
【０１６５】
「ヒト化」免疫グロブリン可変領域は、ヒトにおいて修飾形態によって惹起される免疫応答が非修飾形態よりも低くなるように修飾された、例えば、該免疫グロブリン可変領域によって正常なヒトにおいて免疫原性応答が惹起されないような充分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含むように修飾された免疫グロブリン可変領域である。「ヒト化」免疫グロブリンの説明は、例えば、米国特許第６，４０７，２１３号および米国特許第５，６９３，７６２号（各々の開示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に示されている。場合によっては、ヒト化免疫グロブリンの１つ以上のフレームワークアミノ酸位置に非ヒトアミノ酸を含めてもよい。
【０１６６】
抗体の全部が免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントにコードされていてもよく、その一部がコードされていてもよい。例示的なヒト免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、または無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。完全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤａまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端の可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）と、ＣＯＯＨ末端のκまたはλ定常領域遺伝子にコードされている。完全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０ｋＤａまたは４４６アミノ酸）は、同様に、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）と上記の他方の定常領域遺伝子の１つ、例えば、γ（約３３０アミノ酸をコード）にコードされている。
【０１６７】
完全長抗体の用語「抗原結合断片」は、対象の標的（すなわち、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４Ｒ）に特異的に結合する能力を保持している完全長抗体の１つ以上の断片をいう。完全長抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片（ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる）；（ｉｖ）Ｆｖ断片（抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなる）；（ｖ）ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）（ＶＨドメインからなる）；ならびに（ｖｉ）機能性を保持している単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬとＶＨは別々の遺伝子にコードされているが、組換え方法を使用し、ＶＬ領域とＶＨ領域のペアが単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる一価分子を形成している単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーにより、これらを連接させてもよい。例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（各々の開示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０１６８】
受容体標的化試薬を細胞に結合させるための方法
本開示は、受容体標的化試薬を細胞に結合させるためのさまざまなインビトロ、インビボ、エキソビボ方法を提供する。受容体標的化試薬が免疫毒性である（すなわち、受容体標的化試薬が１つ以上の毒性ドメインを含む）場合、該方法は、細胞（例えば、癌細胞または炎症性障害を媒介する免疫細胞）の増殖を抑止する（または細胞を死滅させる）ために使用され得る。受容体標的化試薬が検出可能に標識された実施形態では、かかる試薬は、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４Ｒの１種類以上を発現している細胞（例えば、癌細胞または炎症性障害を媒介する免疫細胞）の存在を検出するために有用であり得る。したがって、該インビボまたはエキソビボ方法は、とりわけ、癌または炎症性障害の処置および／または診断に有用であり、該病状としては、本明細書に記載の任意の癌または炎症性障害（例えば、自己免疫疾患）が挙げられる。
【０１６９】
また、一部の実施形態において、受容体標的化試薬を細胞に結合させるための方法は、例えば、受容体標的化試薬を細胞に接触させるための方法  、細胞を死滅させるための方法、細胞の増殖を抑止するための方法、または細胞の有無を検出するための方法であり得る。
【０１７０】
受容体標的化試薬を細胞に結合させるためのインビトロ方法
本明細書において、受容体標的化試薬を細胞に結合させるためのインビトロ方法を提供する。該方法は、例えば、培養癌細胞の増殖の抑止（もしくは該細胞の死滅）における免疫毒性受容体標的化試薬の有効性を評価する試験において、または特定の受容体（例えば、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲもしくはＩＬ４Ｒ）を発現している１つ以上の細胞を同定するための診断用アッセイにおいて有用である。例えば、検出可能に標識された受容体標的化試薬を、被験体から採取した細胞試料に接触させ、該細胞試料の１つ以上の細胞がＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４Ｒを発現しているかどうかを調べることができる。また、該方法は、類似した活性（例えば、類似した細胞結合能力または受容体標的化試薬が免疫毒性である場合は、類似した免疫毒性特性）を有する化合物を同定するためのアッセイにおいて「陽性対照」としての機能を果たすことがあり得る。
【０１７１】
受容体標的化試薬を細胞に結合させるインビトロ方法は、細胞を本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬と接触させる工程を含む。細胞を本明細書に記載の受容体標的化試薬と接触させるための方法は、付随の実施例に詳述している。例えば、接着細胞が固相支持体マトリックス（例えば、プラスチック組織培養プレート、またはマルチウェル（９６もしくは３８６ウェル）組織培養プレート）上に平板培養され、適切な培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ培地）中で培養され得る。固相支持体上への細胞の播種後、該細胞を培養している培地に受容体標的化試薬が添加され（種々の濃度で）、該細胞とともに、該細胞に対する受容体標的化試薬の結合が起こるのを可能にする条件下で、（種々の時間量で）インキュベートされ得る。
【０１７２】
また、該方法は、任意選択で、該細胞がＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４Ｒを発現しているかどうかを調べる工程を含むものであり得る。発現は、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４ＲのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現であり得る。タンパク質またはｍＲＮＡの発現を検出するための好適な方法は当業者に充分わかり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）に記載されている。このような方法は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）／標的タンパク質に特異的な抗体を使用するウエスタンブロッティング手法（上記の「抗体の作製方法」参照）、またはＲＴ−ＰＣＲもしくはｍＲＮＡ発現の検出のためのノザンブロッティング手法を含むものであり得る。
【０１７３】
また、該方法は、任意選択で、受容体標的化試薬を該細胞と接触させた後、受容体標的化試薬が該細胞に結合したかどうかを調べる工程を含むものであり得る。例えば、受容体標的化試薬は上記のように検出可能に標識され得、該細胞を検出可能に標識された受容体標的化試薬と接触させた後、該細胞に対する該試薬の結合が、該検出可能な標識の存在を検出することによって検出され得る。あるいはまた、該細胞を検出可能に標識されていない受容体標的化試薬と接触させた後、該細胞に対する受容体標的化試薬の結合を、受容体標的化試薬と、検出可能に標識され、受容体標的化試薬に特異的に結合する抗体とを接触させることによって検出してもよい。
【０１７４】
検出可能な標識の検出および／または定量方法は、標識の性質に依存し、当該技術分野で知られている。検出可能な標識の検出に有用な検出器の例としては、限定されないが、ｘ線フィルム、放射能測定装置、シンチレーションカウンター、分光測光器、比色計、蛍光光度計、ルミノメーター、およびデンシトメーターが挙げられる。
【０１７５】
また、受容体標的化試薬が該細胞に結合したかどうかを調べるための好適な方法も付随の実施例に詳述している。
【０１７６】
細胞は、ＥＧＦＲ（例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３もしくはＨＥＲ４）、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４Ｒの１種類以上を発現しているものであり得る。該細胞には、原核生物細胞（例えば、細菌細胞）と真核生物細胞の両方が含まれる。真核生物細胞としては、例えば、真菌（例えば、酵母）、昆虫、植物、魚類、爬虫類、および哺乳動物の細胞（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ウシ、クジラ、サル、またはヒト）が挙げられ得る。細胞は、正常、形質転換型、または悪性であり得、任意の組織学的型のもの、例えば限定されないが、上皮細胞、線維芽細胞、リンパ系細胞、マクロファージ／単球、顆粒球、ケラチノサイト、または筋肉細胞であり得る。癌細胞としては、限定されないが、肺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌、肝臓癌、骨癌、血液の癌、神経組織の癌（例えば、膠芽細胞腫）、黒色腫、甲状腺癌、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌、頚部癌、腟癌、または膀胱癌などの癌に由来する細胞が挙げられ得る。好適な細胞株としては、付随の実施例に記載のもの、例えば、膠芽細胞腫または前立腺癌細胞株が挙げられる。
【０１７７】
インビトロ方法が、細胞を、免疫毒性受容体標的化試薬（本明細書に記載の任意のものなど）と接触させることを含む実施形態では、該方法はまた、癌細胞または炎症性障害を媒介する免疫細胞などの細胞の増殖を抑止（または該細胞を死滅させる）方法であり得る。該方法は、任意選択で、免疫毒性受容体標的化試薬が該細胞を死滅させた（または該細胞の増殖を抑止した）かどうかを調べる工程を含むものであり得る。一般的に、細胞は、例えば、壊死（細胞膨潤および破砕）またはプログラムされた細胞死（アポトーシス）によって死滅し得る。細胞が死滅しているかどうかを調べるための方法は当該技術分野で知られており、付随の実施例に記載している。例えば、免疫毒性受容体標的化試薬との接触後に残留している細胞集団内のバイアブル細胞数が、試薬と接触させなかった対照細胞集団内のバイアブル細胞の数と比較される。
【０１７８】
細胞（または細胞集団）のバイアビリティを測定するための方法の一例はトリパンブルー排除解析である。例えば、組織培養皿のウェルの細胞が該プレートでトリプシン処理され、洗浄され、色素（例えば、トリパンブルー）で染色され、顕微鏡または機械的細胞計数器（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ１（商標）  Ｓｅｒｉｅｓ  ＣＯＵＬＴＥＲ  ＣＯＵＮＴＥＲ（登録商標）Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて計数され得る。トリパンブルーなどの色素は、死細胞または死にかけている細胞によってのみ取り込まれるため、この方法により、集団内においてバイアブル細胞とバイアブルでない細胞との識別（すなわち、青色または白色の細胞）が可能になる。
【０１７９】
細胞（または細胞集団）のバイアビリティを測定するための方法の別の例は代謝アッセイ、例えば、ＭＴＴ−代謝アッセイ（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＵＳＡ）社のＭＴＴ−代謝アッセイ）である。ＭＴＴジフェニルテトラゾリウムブロミドは、ミトコンドリア呼吸鎖に属し、バイアブル細胞内でのみ活性なコハク酸デヒドロゲナーゼ系によって切断されてホルマザン結晶になるテトラゾリウム塩（黄色っぽい色）である。ミトコンドリアコハク酸デヒドロゲナーゼは、電子結合試薬の存在下でＭＴＴ結晶を紫色のホルマザンに還元する。細胞を化合物で処理した後、該細胞をＭＴＴ試薬に曝露すると、よりバイアブルな細胞がウェル内に存在し、より多くのホルマザン色素が生成される。ホルマザン色素の程度は、例えば、分光測光器を用いて測定され得る。他の一般に使用されている細胞死増大の検出方法としては、細胞集団におけるＤＮＡ合成のモニタリング（すなわち、細胞集団におけるＤＮＡ合成量の低減）が挙げられる。また、例えば、免疫毒性受容体標的化試薬の存在下または非存在下で増殖させた細胞を、細胞分裂すると該細胞のＤＮＡ内に組み込まれ得るヌクレオチド類縁化合物で処理する。かかるヌクレオチド類縁化合物の例としては、例えば、ＢｒｄＵまたは３Ｈ−チミジンが挙げられる。各場合において、細胞（所与の阻害剤の存在下および非存在下で培養）内に組み込まれた標識の量が定量され、標識取込み量は、細胞集団内の残留バイアブル細胞の量に正比例する。これに関連して、細胞バイアビリティ（例えば、癌細胞バイアビリティ）は、免疫毒性受容体標的化試薬の非存在下での細胞バイアビリティと比べて、少なくとも１０％（例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％ｏまたはそれ以上）低減され得る。
【０１８０】
上記の方法は、受容体標的化試薬が標的細胞の増殖を抑止したかどうかを調べるためにも使用され得ることは理解されよう。
【０１８１】
免疫毒性受容体標的化試薬とともに培養した細胞とそうでない細胞との間のアポトーシスの程度の比較は、一群のインジケーター、例えば、ＤＮＡ断片化、カスパーゼ活性、ミトコンドリアの膜電位の低下、反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成の増大、細胞内酸性化、クロマチン凝縮、細胞表面のホスファチジルセリンレベル、または細胞透過性の増大を測定することにより行なわれ得る。
【０１８２】
ＤＮＡ断片化は、例えば、ＴＵＮＥＬアッセイ（末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識）によって測定され得る。市販のアッセイ形態、例えば、ＡＰＯ−ＢｒｄＵＴＭ  ＴＵＮＥＬアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＰＯ−ＤＩＲＥＣＴＴＭキット（ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＡｐｏＡｌｅｒｔＴＭ  ＤＮＡ断片化アッセイキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が広く利用可能である。
【０１８３】
カスパーゼ活性は、所与のカスパーゼ（例えば、カスパーゼ３またはカスパーゼ９）に特異的な蛍光発生物質、色原体物質、および発光物質によって測定され得る。さまざまなカスパーゼ（カスパーゼ３、カスパーゼ７、カスパーゼ８、およびカスパーゼ９など）に対して市販のキットが利用可能である（ＢＤ−ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ参照）。
【０１８４】
ミトコンドリアの膜電位低下は、完全性と機能性に基づいてミトコンドリアの種々の区画内に選択的に蓄積する蛍光色素により測定され得る。かかる色素の非限定的な一例は、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１８５】
反応性酸素種の生成は、Ｈ２ＤＣＦＤＡなどの蛍光色素を用いてモニターされ得る。
【０１８６】
クロマチン凝縮は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２またはヨウ化プロピジウムなどの色素を用いて測定され得る。
【０１８７】
ホスファチジルセリン（ＰＳ）レベルは細胞表面において測定され得る。例えば、ＰＳに対して高親和性を有するアネキシンＶが、細胞表面上のＰＳに対するプローブとして使用され得る。数多くの市販のアッセイキットがかかる測定に適している（ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ参照）。
【０１８８】
受容体標的化試薬を細胞に結合させるためのインビボ方法
また、受容体標的化試薬を細胞に結合させるためのインビボ方法を取り上げて記載する。該方法は、被験体に本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬を送達する工程を含む。被験体は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト（例えば、ヒト患者）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、ヒヒ、またはサル）、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ウマ、家畜系（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、もしくはヤギ）、イヌ、ネコ、またはクジラであり得る。被験体は、癌もしくは炎症性障害を有する、癌もしくは炎症性障害を有することが疑われる、または癌もしくは炎症性障害が発生するリスクのある被験体であり得る。
【０１８９】
受容体標的化試薬が免疫毒性の（すなわち、受容体標的化試薬が１つ以上の毒性ドメインを含む）場合、受容体標的化試薬を細胞に結合させるためのインビボ方法は、癌細胞の増殖を抑止する（または癌細胞を死滅させる）方法であり得る。
【０１９０】
一般的に、被験体に送達される受容体標的化試薬は、薬学的に許容され得る担体（例えば、生理食塩水）中に懸濁させ、経口、経直腸、非経口で投与、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内、または肺内（上記）注射される。また、受容体標的化試薬は、細胞または組織（例えば、腫瘍細胞）に直接送達され得る。受容体標的化試薬が免疫毒性である場合、該方法は、腫瘍細胞もしくは炎症性障害を媒介する免疫細胞を死滅させるため、または例えば、外科的腫瘍切除後の腫瘍床内の任意の残留腫瘍細胞を死滅させるために使用され得る。
【０１９１】
必要とされる投薬量は、投与経路の選択；製剤の性質；患者の疾病の性質；被験体の体格、体重、表面積、年齢、および性別；投与されている他の薬物；ならびに担当医師の判断に依存する。好適な投薬量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。必要とされる投薬量には、受容体標的化試薬の多様性および種々の投与経路の効率の差異に鑑みると、広範な変動性が予測される。例えば、経口投与には、静脈内注射による投与よりも高い投薬量が必要とされ得る。このような投薬量レベルの変動性は、最適化（当該技術分野で充分理解されている）のための標準的で経験的な常套手段を用いて調整され得る。
【０１９２】
投与は、単回または反復（例えば、２−、３−、４−、６−、８−、１０−、２０−、５０−，１００−、１５０回またはそれ以上）であり得る。適当な送達媒体（例えば、ポリマー微粒子または埋入可能なデバイス）内への受容体標的化試薬のカプセル封入により、送達、特に経口送達の効率が増大し得る。
【０１９３】
あるいはまた、受容体標的化試薬をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドは、哺乳動物の適切な細胞に送達され得る。コード配列の発現は、被験体の体内の任意の細胞に指向され得る。しかしながら、発現は、好ましくは標的細胞自体に、場合によっては、バイアビリティの低減が所望される細胞近傍に指向される。これは、例えば、当該技術分野で知られた生分解性ポリマー微粒子またはマイクロカプセル剤送達デバイスの使用によって行われ得る。核酸の取込みを行なうための別の様式は、標準的な方法によって作製されるリポソームの使用である。ベクターは、このような送達媒体内に単独で組み込んでもよく、組織特異的または腫瘍特異的抗体と一緒に組み込んでもよい。あるいはまた、静電気力または共有結合力によってポリ−Ｌ−リジンに結合されたプラスミドまたは他のベクターで構成された分子コンジュゲートを作製してもよい。ポリ−Ｌ−リジンは、標的細胞上の受容体に結合し得るリガンドに結合する（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏら（１９９５），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７３：４７９（その開示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる））。あるいはまた、組織特異的標的化が、当該技術分野で知られた組織特異的転写調節エレメント（ＴＲＥ）の使用によって行なわれ得る。筋肉内、皮内または皮下部位への「裸のＤＮＡ」（すなわち、送達媒体なし）の送達は、インビボ発現を行なうための別の手段である。
【０１９４】
ポリヌクレオチドは、薬学的に許容され得る担体にて投与され得る。薬学的に許容され得る担体は、ヒトへの投与に適した生物学的に適合性のビヒクルであり、例えば、生理食塩水またはリポソームである。治療有効量は、処置被験体において医学的に望ましい結果（例えば、癌細胞の増殖の低減）がもたらされ得る該ポリヌクレオチドの量である。医療分野でよく知られているように、任意の一患者に対する投薬量は、多くの要素、例えば、患者の体格、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与の期間および経路、一般健康状態、ならびに併用投与されている他の薬物に依存する。投薬量は種々であるが、ポリヌクレオチド投与の好ましい投薬量は、ほぼ１０６〜ほぼ１０１２コピーの該ポリヌクレオチド分子である。この用量は、必要に応じて反復して投与され得る。スケジュールおよび共投与は、本明細書に記載の任意のものであり得る。（例えば、「処置方法」を参照）。
【０１９５】
一部の実施形態において、該インビボ方法は、被験体が癌または炎症性障害を有するかどうかを調べる工程を含むものであり得る。被験体が癌または炎症性障害を有する（またはを有すると判定された）場合、該方法は、被験体の癌の１つ以上の細胞または被験体の炎症状態を媒介する１つ以上の免疫細胞がＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４Ｒを発現しているかどうかを調べる工程を含むものであり得る。ＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４Ｒの発現を調べるための方法は、上記に記載している。
【０１９６】
免疫毒性受容体標的化試薬またはその医薬組成物は、一部の実施形態において、被験体に、例えば、免疫毒性療法と関連する１つ以上の副作用の数または重症度を低減するために、被験体に非免疫毒性受容体標的化試薬を投与した後に投与され得る（下記参照）。
【０１９７】
また、任意の受容体標的化試薬は、場合によっては、１つ以上のさらなる治療剤または治療用薬剤（化学療法剤など）とともに共投与され得る。共投与のための方法、ならびに本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬とともに共投与され得る例示的なさらなる治療法および治療用薬剤は、以下に詳述する。
【０１９８】
被験体に送達される受容体標的化試薬が検出可能に標識されている場合、該インビボ方法は、細胞、例えば、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４Ｒを発現している細胞の存在を検出するために使用され得る。すなわち、検出可能に標識された任意の本明細書に記載の受容体標的化試薬は、例えば、手術をガイドするため、または疾患を検出するためのプローブとして使用され得る。例えば、癌細胞（例えば、原発腫瘍または微視的転移）を含むことが疑われる領域が、該細胞に結合し得る（ＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４Ｒによって）受容体標的化試薬に曝露され得る。したがって、受容体標的化試薬が結合する癌細胞はすべて、非癌細胞から分化したものであり、癌の処置（例えば、癌の外科的除去または標的化化学療法）を補助するものであり得る。別の例において、本明細書に記載の受容体標的化試薬によって検出可能に標識された細胞は、非標識細胞から単離され得る。例えば、特定の型または集団の細胞（例えば、Ｂ細胞もしくはＴ細胞集団（例えば、炎症性障害を媒介するＢ細胞もしくはＴ細胞集団）または幹細胞集団）が検出され、検出可能に標識されていない細胞から単離され得る。また、検出可能に標識された細胞をインビボで可視化し、例えば、その位置を調べてもよい。受容体標的化試薬を検出するインビボ方法は、もちろん、検出可能な標識の性質に依存し、例えば、生物発光画像法、マイクロ陽電子断層撮影法／単光子放射型コンピュータ断層撮影法、磁気共鳴画像法、および生体顕微鏡検査（例えば、Ｄｕｓｔｉｎ  （２００３）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．５：１６５−１７１（その開示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）が挙げられ得る。
【０１９９】
適当なインビボ方法（例えば、本明細書に記載の受容体標的化試薬を用いる処置方法）のさらなる説明は、「処置方法」を見るとよい。
【０２００】
受容体標的化試薬を細胞に結合させるためのエキソビボ法
エキソビボストラテジーは、処置対象の被験体（または別の被験体）から採取した細胞を、例えば、標的細胞に結合し得る、または標的細胞を死滅させ得る受容体標的化試薬（例えば、免疫毒性受容体標的化試薬）をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトまたは形質導入することを伴うものであり得る。トランスフェクトまたは形質導入した細胞を、次いで、被験体に投与する。細胞は、広範な型の任意のもの、例えば限定されないが、造血細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞、もしくはＢ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、または筋肉細胞であり得る。かかる細胞は、被験体内で生存している限り、受容体標的化試薬の供給源としての機能を果たす。あるいはまた、腫瘍細胞または炎症細胞（例えば、免疫細胞）（好ましくは、被験体から採取したもの（自己）であるが、場合によっては該被験体以外の同じ種の被験体から採取したもの（同種異系））は、受容体標的化試薬をコードするベクターによってトランスフェクトまたは形質転換させ得る。次いで、腫瘍細胞（好ましくは、増殖能を消去する薬剤（例えば、イオン化照射）で処理したもの）を、被験体に導入すると、該細胞は受容体標的化試薬を分泌する。
【０２０１】
該エキソビボ方法は、細胞を被験体から採取する工程、該細胞を培養する工程、該細胞を発現ベクターで形質導入する工程、および該細胞を受容体標的化試薬の発現に適した条件下に維持する工程を含む。このような方法は、分子生物学の分野で知られている。形質導入工程は、エキソビボ遺伝子療法に使用されている任意の標準的な手段、例えば、リン酸カルシウム、リポフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス感染、および微粒子銃遺伝子導入（上記も参照）によって行なわれる。あるいはまた、リポソームまたはポリマー微粒子が使用され得る。成功裡に形質導入された細胞は、例えば、コード配列または薬物耐性遺伝子の発現に関して選択され得る。次いで、細胞は、致死線量が照射され（所望により）、同じまたは別の被験体に注射または移植され得る。
【０２０２】
一部の実施形態において、該エキソビボ方法は、細胞混合物から、ある細胞集団を一掃するために使用され得る。例えば、癌（例えば、本明細書に記載した任意の癌）を有する被験体から採取した細胞混合物（例えば、骨髄または任意の他の幹細胞集団）から、その中の任意の癌細胞が一掃され得る。細胞混合物は、本明細書に記載の免疫毒性受容体標的化試薬と接触させると、混合物中の癌細胞が死滅され得る。癌細胞の死滅後、細胞混合物は、例えば被験体を化学療法剤で処置した後、該被験体に戻され得る。
【０２０３】
免疫毒性療法のための被験体のプレコンディショニング方法
また、免疫毒性療法のための被験体のプレコンディショニングのためのインビボおよびエキソビボ方法を取り上げて記載する。付随の実施例に示すように、哺乳動物に免疫毒素を投与する前に、該哺乳動物に非免疫毒性受容体標的化試薬を投与することにより、免疫毒素と関連する毒性副作用が有意に低減された。したがって、本明細書に記載の方法は、免疫毒性療法と関連する１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、または８つ以上）の副作用の数および／または重症度の低減に有用である。
【０２０４】
本明細書で用いる場合、「免疫毒素」は、薬剤を対象の標的細胞（例えば、癌細胞または炎症性障害を媒介する免疫細胞）に指向する少なくとも１つの標的化ドメインと、標的細胞の増殖を抑止する（または該細胞を死滅させる）少なくとも１つの毒性ドメインとを含む任意の免疫毒性薬剤をいう。免疫毒素としては、本明細書に記載の免疫毒性受容体標的化試薬が挙げられ得る。
【０２０５】
本明細書で用いる場合、「非免疫毒性受容体標的化試薬」は、毒性ドメイン（例えば、本明細書に記載の任意の毒性ドメイン）を含まない受容体標的化試薬である。したがって、本明細書で用いる場合、非免疫毒性受容体標的化試薬は、薬剤を対象の標的細胞（例えば、癌細胞または炎症性障害を媒介する免疫細胞）に指向する１つ以上の標的化ドメインを含むが毒性ドメインを含まない受容体標的化剤である。このような受容体標的化剤は、本明細書において、本質的に１つ以上のかかる標的化ドメインからなると記載している場合がある。例えば、非免疫毒性受容体標的化試薬は、本質的に：（ａ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合剤と、（ｂ）ＩＬ−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）結合剤またはＩＬ−４受容体（ＩＬ４Ｒ）結合剤からなり、該（ａ）が（ｂ）に結合されているものであり得る。しかしながら、本質的に１つ以上の標的化ドメインからなる受容体標的化試薬には毒性ドメイン以外の成分、例えば限定されないが、リンカー、検出可能な標識、または翻訳後修飾（例えば、リン酸化もしくはグリコシル化など）（上記参照）などが含まれていてもよいことは理解されよう。
【０２０６】
免疫毒性療法と関連する副作用は、例えば、免疫毒素（受容体標的化試薬の毒性ドメイン）の性質、その処置を受ける被験体の一般健康状態、免疫毒素の投薬量および／または免疫毒素が被験体に投与される期間に応じて種々である。副作用としては、例えば、筋肉への影響（例えば、眼瞼下垂、舌の麻痺、もしくは嚥下困難）、呼吸困難、体重減少、肝毒性、低アルブミン血症、毛細管漏出症候群、筋肉痛、または前記のもののいずれかの１つ以上の組合せが挙げられ得る。場合によっては、免疫毒性療法により、被験体において極端な毒性（ほとんど致命的な毒性）がもたらされることがあり得る。
【０２０７】
免疫毒性療法のための被験体のプレコンディショニングのためのインビボ方法
免疫毒性療法（免疫毒性療法と関連する１つ以上の副作用を低減するための方法）のための被験体のプレコンディショニングのためのインビボ方法は、被験体に免疫毒素を送達する前に、該被験体に、免疫毒素と同じ標的に結合するが毒性ドメインを含まない（すなわち、免疫毒性でない）非免疫毒性試薬を送達する工程を含む。
【０２０８】
免疫毒素（例えば、免疫毒性受容体標的化試薬）は、任意のさまざまな標的被検物質に特異的に結合するものであり得る。例えば、免疫毒素は、任意の数の細胞表面分子（受容体（例えば、ＥＧＦＲ、インターロイキン受容体（例えば、インターロイキン１〜３０のいずれか１つに対する受容体（ＩＬ１３ＲもしくはＩＬ４Ｒ））など）、接着分子（例えば、インテグリン、アドヘシン、コヒーシン、もしくはカドヘリン）、または細胞特異的マーカー（例えば、免疫障害もしくは種々の癌を媒介するＢ細胞もしくはＴ細胞に対する細胞特異的マーカー）に結合するものであり得る。免疫毒素は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性もしくは三重特異性）の免疫毒素であり得る。例えば、免疫毒素は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合剤、ＩＬ−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）結合剤、またはＩＬ−４受容体（ＩＬ４Ｒ）結合剤を含むものであり得る。免疫毒素は、例えば、（ａ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合剤を含む第１の標的化ドメイン；および（ｂ）ＩＬ−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）結合剤またはＩＬ−４受容体（ＩＬ４Ｒ）結合剤を含む第２の標的化ドメインを含むものであり得る。
【０２０９】
免疫毒素は、本明細書に記載の任意の毒性ドメインの１つ以上を含むものであり得る。例えば、免疫毒素は、上記の放射性核種、毒性の小分子、毒性ポリペプチド（例えば、ジフテリア毒素またはシュードモナス毒素Ａ）の１つ以上を含むものであり得る。
【０２１０】
免疫毒性療法のための被験体のプレコンディショニング方法における使用のためのさらなる免疫毒素は、例えば、米国特許公開公報第２００２００４８５５０号および米国特許第７，１０１，５４２号（各々の開示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２１１】
一般的に、免疫毒素と非免疫毒性試薬は、標的と結合価に関して同じ特異性を有する。例えば、免疫毒素が単一特異性である（例えば、ＥＧＦＲ結合ドメインを含む）場合、非免疫毒性試薬もまた単一特異性（例えば、ＥＧＦＲ結合ドメインを含むもの）であり得る。免疫毒素が多重特異性（例えば、二重特異性）である場合、非免疫毒性試薬もまた多重特異性であり得る。すなわち、多重特異性免疫毒素が標的Ａと標的Ｂに結合するものである場合、非免疫毒性試薬も標的Ａと標的Ｂに結合するものであり得る。しかしながら、非免疫毒性試薬は単一特異性であってもよい。例えば、多重特異性免疫毒素が標的Ａと標的Ｂに結合するものである場合、非免疫毒性試薬は標的Ａまたは標的Ｂに結合するものであり得る。
【０２１２】
免疫毒素が多重特異性であり、非免疫毒性試薬が単一特異性である実施形態では、１種類より多くの単一特異性の非免疫毒性試薬が免疫毒素の前に投与され得る。例えば、標的Ａに特異的な単一特異性の非免疫毒性試薬と標的Ｂに特異的な単一特異性の非免疫毒性試薬の混合物が被験体に、標的Ａと標的Ｂに特異的な多重特異性免疫毒素を投与する前に投与され得る。
【０２１３】
免疫毒素と非免疫毒性試薬は、毒性ドメインの存在のみが異なるものであり得るが、それ以外の点では同一であり得る。例えば、免疫毒素は、ＥＧＦＲ結合ドメインとジフテリア毒素からなるものであり得、非免疫毒性試薬はＥＧＦＲ結合ドメインからなるものであり得る。
【０２１４】
一部の実施形態において、非免疫毒性試薬は被験体に、免疫毒素を該被験体に投与する前の２４時間未満（例えば、２２時間未満、２０時間未満、１６時間未満、１５時間未満、１２時間未満、１１時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、６時間未満、５時間未満、３時間未満、２時間未満、９０分未満、６０分未満、５５分未満、５０分未満、４５分未満、４０分未満、３５分未満、３０分未満、２５分未満、２０分未満、１５分未満、１０分未満、９分未満、８分未満、７分未満、６分未満、５分未満、４分未満、３分未満、２分間、または１分未満）の時点に投与され得る。
【０２１５】
一部の実施形態において、非免疫毒性試薬は被験体に、対応する免疫毒素と同じ時点で（同時に）投与され得る。
【０２１６】
一部の実施形態において、非免疫毒性試薬は被験体に、単回用量として投与され得る。一部の実施形態において、非免疫毒性試薬は被験体に、多数回の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５回またはそれ以上の）個別用量で投与され得る。
【０２１７】
一部の実施形態において、免疫毒性療法のための被験体のプレコンディショニングのインビボ方法は、被験体に本明細書に記載の任意の免疫毒性受容体標的化試薬を送達する前に、該被験体に、対応する（例えば、特異性と結合価において）本明細書に記載の非免疫毒性受容体標的化試薬を送達することを含む。例えば、免疫毒性受容体標的化試薬は、（ａ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合剤；（ｂ）ＩＬ−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）結合剤またはＩＬ−４受容体（ＩＬ４Ｒ）結合剤、および毒性ドメインを含み；該（ａ）が（ｂ）に結合されているものであり得、非免疫毒性受容体標的化試薬は、（ａ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）結合剤と、（ｂ）ＩＬ−１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）結合剤またはＩＬ−４受容体（ＩＬ４Ｒ）結合剤を含み、該（ａ）が（ｂ）に結合されており、毒性ドメインを含まないものであり得る。
【０２１８】
また、プレコンディショニングのための任意のインビボ方法は、例えば、被験体が癌もしくは炎症性障害を有するかどうかを調べる工程、または被験体が癌もしくは炎症性障害を有する（または有すると判定された）場合、被験体の癌の１つ以上の細胞もしくは炎症性障害を媒介する１つ以上の免疫細胞が、免疫毒素もしくは非免疫毒性試薬によって標的化される被検物質を発現しているかどうかを調べる工程も含むものであり得る。例えば、免疫毒素（および／または非免疫毒性試薬）がＥＧＦＲ結合ドメインとＩＬ１３Ｒ結合ドメインを含むものである場合、ＥＧＦＲおよび／またはＩＬ１３Ｒの発現（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現）が上記のようにして測定され得る。
【０２１９】
あるいはまた、該プレコンディショニングのためのインビボ方法は、１種類以上の標的被検物質が、被験体の癌の１つ以上の細胞または炎症性障害を媒介する１つ以上の免疫細胞上に存在しているかどうかを調べる工程を含むものであり得る。例えば、１種類以上の特異的受容体（例えば、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４Ｒ）の存在が決定され得ると、次いで、適切な免疫毒素および対応する非免疫毒性試薬（１種または複数種）が選択および／または被験体に投与され得る。
【０２２０】
該インビボ方法は、免疫毒性療法の１つ以上の副作用の数または重症度が低減されたかどうかを調べる工程も含むものであり得る。かかる副作用は、上記に記載しており、該副作用の数または重症度の評価方法は医療分野で知られている。
【０２２１】
上記のように、免疫毒性療法（すなわち、免疫毒性療法の１つ以上の副作用の低減）のための被験体のプレコンディショニングは、処置対象の被験体（または別の被験体）から採取した細胞を、受容体標的化試薬（例えば、毒性ドメインを含まない受容体標的化試薬）をコードし、例えば、免疫毒性療法のための被験体のプレコンディショニングがなされ得るポリヌクレオチドでトランスフェクトまたは形質導入するエキソビボ手法を伴うことがあり得る。
【０２２２】
免疫毒性療法のための被験体のプレコンディショニングのための適当なインビボ方法（例えば、投薬、併用療法など）のさらなる説明は、「処置方法」を見るとよい。
【０２２３】
受容体標的化試薬を含む治療剤により治療可能な疾患
本明細書に記載の受容体標的化試薬（例えば、免疫毒性受容体標的化試薬）は、さまざまな増殖性障害および／または炎症性障害を処置するために使用され得る。増殖性障害としては、例えば、癌、特定の免疫障害（炎症性障害、または疣など）が挙げられる。１種類以上の受容体標的化試薬の投与によって処置（または場合によっては予防）され得る具体的な障害の一例を、以下のセクションに概説する。
【０２２４】
癌
癌は、制御不能な細胞分裂と、浸潤による隣接組織内への直接増殖または転移による遠隔部位への移植（癌細胞が血流もしくはリンパ系によって輸送される場合）のいずれかによるその播種能とを特徴とする疾患または障害の一類型である。癌はあらゆる年齢の人が罹患し得るが、そのリスクは、年齢とともに増大する傾向にある。癌の型としては、例えば、肺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌、肝臓癌、骨癌、血液の癌、神経組織の癌（例えば、多形性膠芽腫などの膠芽細胞腫）、黒色腫、甲状腺癌、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌、頚部癌、腟癌、または膀胱癌が挙げられ得る。
【０２２５】
本明細書で用いる場合、「癌が発生するリスクのある」被験体は、癌の発生に対する素因、すなわち、癌の発生に対する遺伝的素因（腫瘍抑制遺伝子における変異（例えば、ＢＲＣＡ１、ｐ５３、ＲＢ、もしくはＡＰＣにおける変異）など）を有する被験体、または癌が生じ得る条件に曝露されたことがある被験体である。したがって、変異原性または発癌性レベルの特定の化合物（例えば、アクロレインなどの煙草の煙に含まれる発癌性化合物、ヒ素、ベンゼン、ベンズアントラセン、ベンゾピレン、ポロニウム−２１０（ラドン）、ウレタン、または塩化ビニル）に曝露された場合も、被験体は「癌が発生するリスクのある」被験体であり得る。さらに、被験体は、例えば、大量の紫外光もしくはＸ−照射に曝露された場合、または腫瘍発生性／関連ウイルス（パピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、もしくはヒトＴ細胞白血病−リンパ腫ウイルスなど）に曝露された（例えば、感染した）場合、「癌が発生するリスクのある」被験体であり得る。上記のことから、「癌が発生するリスクのある」被験体は、対象の種内のすべての被験体ではないことは明白である。
【０２２６】
被験体「癌を有することが疑われる」は、癌の１つ以上の症状を有する被験体であり得る。癌の症状は当業者には充分わかり、限定されないが、胸のしこり、乳頭の変化、乳房嚢胞、乳房痛、体重減少、虚弱、過大な疲労、摂食障害、食欲減退、慢性咳嗽、息切れ．の悪化、喀血、血尿、血便、吐き気、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、鼓脹、腹腔内液貯留、腟出血、便秘、腹部膨隆、結腸の穿孔、急性腹膜炎  （感染、発熱、疼痛）、痛み、吐血、多汗、発熱、高血圧、貧血、下痢、黄疸、眩暈、寒気、筋痙攣、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移、および膵臓転移、嚥下困難などが挙げられる。
【０２２７】
本明細書に記載の１種類以上の受容体標的化試薬の投与に加え、癌は、化学療法剤、イオン化放射線、免疫療法剤、または温熱療法剤（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ）によっても処置され得る。化学療法剤としては、限定されないが、シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、アドリアマイシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、エトポシド、ベランピル、ポドフィロトキシン、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチン、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキサートが挙げられる。上記のように、これらの任意の非受容体標的化試薬治療剤が、本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬とともに共投与（併用療法レジメンにて投与）され得る（以下の「処置方法」参照）。
【０２２８】
炎症性障害
「炎症性障害」は、本明細書で用いる場合、１種類以上の物質（例えば、被験体に天然に存在しない物質）が、白血球（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞）の作用によって、病理的応答（例えば、病理的免疫応答）を不適切に誘発する過程をいう。したがって、炎症応答に関与するかかる免疫細胞は「炎症細胞」と称される。不適切に誘発された炎症応答は、異物（例えば、抗原、ウイルス、細菌、真菌）が被験体内または被験体上に存在していない場合のものであり得る。不適切に誘発された応答は、炎症細胞によって自己成分（例えば、自己抗原）が標的化される場合のもの（例えば、多発性硬化症などの自己免疫障害）であり得る。また、不適切に誘発された応答は、大きさまたは持続期間が不適切な応答（例えば、アナフィラキシー）であり得る。したがって、不適切に標的化された応答は、微生物感染（例えば、ウイルス、細菌、または真菌）の存在によるものであり得る。炎症性障害の型（例えば、自己免疫疾患）としては、限定されないが、変形性関節症、関節リウマチ（ＲＡ）、脊椎関節症、ＰＯＥＭＳ症候群、クローン病、対宿主性移植片病、多中心性キャッスルマン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋ジストロフィー（ＭＤ）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、皮膚筋炎、多発性筋炎、炎症性の神経障害（ギヤン‐バレー症候群など）、血管炎、例えば、ヴェーゲナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、側頭動脈炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病、チャーグ‐ストラウス症候群、または高安症候群がが挙げられる。また、炎症性障害には、特定の型のアレルギー、例えば、鼻炎、副鼻腔炎、じんま疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ／ｈｉｖｅｓ）、血管浮腫、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー（例えば、ナッツアレルギー）、薬物アレルギー（例えば、ペニシリン）、昆虫アレルギー（例えば、蜂刺傷に対するアレルギー）、または肥満細胞症などが包含される。また、炎症性障害には、潰瘍性大腸炎および喘息が包含されることがあり得る。
【０２２９】
「炎症性障害が発生するリスクのある」被験体は、１つ以上の炎症性障害の家族歴（例えば、１つ以上の炎症性障害に対する遺伝的素因）を有する被験体、または１回以上の炎症誘導性条件に曝露されたことがある被験体をいう。例えば、被験体は、ウイルスまたは細菌のスーパー抗原（限定されないが、ブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）、化膿性連鎖球菌体外毒素（ＳＰＥ）、黄色ブドウ球菌毒性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、連鎖球菌マイトジェン体外毒素（ＳＭＥ）および連鎖球菌スーパー抗原（ＳＳＡ）など）に曝露されたことがある被験体であり得る。上記のことから、「炎症性障害が発生するリスクのある」被験体は、対象の種内のすべての被験体ではないことは明白である。
【０２３０】
「炎症性障害を有することが疑われる」被験体は、炎症性障害の１つ以上の症状を示す被験体である。炎症性障害の症状は当該技術分野でよく知られており、限定されないが、発赤、腫脹（例えば、関節腫脹）、熱をもった（ｗａｒｍ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｏｕｃｈ）関節、関節痛、硬直、関節機能の低下、発熱、寒気、疲労、活力低下、頭痛、食欲減退、筋肉硬直、不眠、掻痒、鼻詰まり、くしゃみ、咳、１つ以上の神経性の症状（眩暈、発作または疼痛）が挙げられる。
【０２３１】
１種類以上の本明細書に記載の改変された受容体標的化試薬の投与に加え、炎症性障害は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、生体応答修飾薬、またはコルチコステロイド薬によっても処置され得る。生体応答修飾薬としては、例えば、抗ＴＮＦ剤（例えば、ＴＮＦに特異的な可溶性のＴＮＦ受容体または抗体（アダリムマブ、インフリキシマブ、またはエタネルセプトなど））が挙げられる。上記のように、これらの任意の非受容体標的化試薬治療剤が、本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬とともに共投与（併用療法レジメンにて投与）され得る（以下の「処置方法」参照）。
【０２３２】
被験体に適切な治療モダリティを選択するための方法
また、本明細書において、被験体（例えば、ヒト（癌または炎症性障害を有するヒトなど））に適切な治療モダリティを選択するための方法であって、例えば、医療専門家が、癌または炎症性障害などの障害を有する被験体を有効かつ適切に処置するのに有用な方法を提供する。
【０２３３】
該方法は、被験体の癌の１つ以上の癌細胞、または被験体の炎症性障害を媒介している１つ以上の免疫細胞がＩＬ１３ＲおよびＩＬ４ＲまたはＥＧＦＲを発現している場合、癌または炎症性障害を有する被験体に対する治療用薬剤として、本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬（例えば、本明細書に記載の任意の免疫毒性受容体標的化試薬）を選択する工程を含むものであり得る。また、該方法は、被験体の癌の１つ以上の癌細胞、または被験体の炎症性障害を媒介している１つ以上の免疫細胞がＩＬ１３Ｒ、ＥＧＦＲまたはＩＬ４Ｒを発現しているかどうかを調べる工程も含むものであり得る。細胞がＩＬ１３Ｒ、ＩＬ４Ｒ、またはＥＧＦＲ受容体を発現しているかどうかを調べる方法は、上記に記載している。
【０２３４】
医療従事者が被験体に対して免疫毒性受容体標的化試薬を含む治療剤を選択する一部の場合において、医療従事者は、非免疫毒性受容体標的化試薬を含む治療剤を選択してもよい。例えば、医療専門家は、非免疫毒性受容体標的化試薬を含む第１の治療剤と、免疫毒性受容体標的化試薬を含む第２の治療剤を選択することがあり得る。医療専門家によっては、２種類の異なる治療剤（例えば、免疫毒性受容体標的化試薬を含む治療剤と、非免疫毒性受容体標的化試薬を含む治療剤）が被験体に対して選択されることがあり得ることは理解されよう。例えば、第１の医療専門家によると、被験体に対して免疫毒性受容体標的化試薬を含む第１の治療剤が選択され得、第２の医療専門家によると、被験体に対して非免疫毒性受容体標的化試薬を含む治療剤が選択され得る。
【０２３５】
本明細書に記載の方法によると、任意の医療従事者（例えば、医師または看護師）が、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲまたはＩＬ４Ｒを発現している１つ以上の癌細胞（または炎症性障害を媒介する免疫細胞）を有すると同定された被験体に対し、適切な治療モダリティを選択することができる。被験体に対する治療剤の選択は、例えば、（ｉ）薬の処方箋を書くこと；（ｉｉ）被験体に薬を与えること（だが、必ずしも投与することではない）（例えば、患者が診察室に居るときに、患者に処方薬のサンプルを手渡すこと）；（ｉｉｉ）患者に対する提案もしくは推奨治療モダリティ（例えば、本明細書に記載の免疫毒性受容体標的化試薬）の連絡（口頭、書面（処方箋以外）、または電子的手段（ｅメール、安全なサイトへの書込み））；または（ｉｖ）被験体に対する適当な治療モダリティの特定および例えば患者記録による他の医療関係者に対する情報普及であり得る。後者の（ｉｖ）は、例えば、１種類より多くの治療用薬剤が医療従事者によって患者に投与される場合に有用であり得る。電子的手段の連絡は、例えば、コンピュータまたは他の電子媒体（ＤＶＤ、ＣＤ、もしくはフロッピー（登録商標）ディスクなど）に格納されたもの、あるいは書面（例えば、印刷）形態であり得ることは理解されよう。
【０２３６】
被験体に対して適切な治療モダリティが選択された後、医療従事者（例えば、医師または看護師）により、該適切な治療モダリティ（例えば、本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬）が該被験体に投与され得る。哺乳動物への受容体標的化試薬（例えば、免疫毒性受容体標的化試薬）の投与方法を、以下および付随の実施例に記載する。
【０２３７】
処置方法
本明細書に記載の受容体標的化試薬またはその医薬組成物の投与は、全身または局所であり得る。上記のように、医薬組成物は、非経口および／または非経口投与に適するように製剤化され得る。具体的な投与モダリティとしては、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、髄腔内、経口、経直腸、口腔内、経表面、経鼻、眼内、関節内、動脈内、クモ膜下、気管支内、リンパ経由、経膣、および子宮内投与が挙げられる。
【０２３８】
投与は、医薬組成物のボーラスの定期的な注射によるものであってもよく、外部（例えば、ＩＶバッグ）または内部（例えば、生体腐食性埋入物、バイオ人工器官、もしくは受容体標的化試薬産生細胞のコロニーの移植）の貯蔵部からの静脈内または腹腔内投与による中断なしのまたは連続的なものであってもよい。例えば、米国特許第４，４０７，９５７号、同第５，７９８，１１３号、および同第５，８００，８２８号（各々は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。医薬組成物の投与は、適当な送達手段、例えば、ポンプ（例えば、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，２７：９１２  （１９９３）；Ｃａｎｃｅｒ，４１：１２７０  （１９９３）；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４：１６９８  （１９８４）（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）；マイクロカプセル封入（例えば、米国特許第４，３５２，８８３号；同第４，３５３，８８８号；および同第５，０８４，３５０号（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）；連続放出ポリマー埋入物（例えば、Ｓａｂｅｌ，米国特許第４，８８３，６６６号（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）；マイクロカプセル封入（例えば、米国特許第５，２８４，７６１号、同第５，１５８，８８１号、同第４，９７６，８５９号および同第４，９６８，７３３号およびＰＣＴ特許出願公開公報ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ  ９５／０５４５２（各々の開示は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）；皮下、静脈内、動脈内、筋肉内いずれか、もしくは他の適当な部位への注射；またはカプセル剤、液剤、錠剤、丸剤、もしくは持効性放出製剤での経口投与などを用いて行なわれ得る。
【０２３９】
医薬組成物の治療有効量は、それを必要とする被験体に、当業者によって確認可能な投薬量レジメンで投与され得る。例えば、該組成物は被験体に、例えば、０．００１μｇ／ｋｇ〜１０，０００μｇ／ｋｇ被験体体重／投与の投薬量で全身投与され得る。別の例では、投薬量は１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ被験体体重／投与である。別の例では、投薬量は１μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ被験体体重／投与、例えば、３μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇ被験体体重／投与である。
【０２４０】
治療有効性を最適化するため、受容体標的化試薬（例えば、免疫毒性受容体標的化試薬）は、最初は種々の投与レジメンで投与され得る。単位用量およびレジメンは、例えば、哺乳動物の種、その免疫状態、哺乳動物の体重などの要素に依存する。典型的には、組織中の受容体標的化試薬のレベルは、例えば、所与の処置レジメンの有効性を調べるために、臨床試験手順の一部として、適切なスクリーニングアッセイを用いてモニターされ得る。
【０２４１】
受容体標的化試薬の投与頻度は、医療従事者（例えば、医師または看護師）の技能と臨床判断の範囲である。典型的には、投与レジメン（ｒｅｇｉｍｅ）は、最適な投与パラメータが確立され得る臨床試験によって確立される。しかしながら、医療従事者によっては、被験体の年齢、健康、体重、性別および医学的状態に応じて、かかる投与レジメンが変更されることがあり得る。投与頻度は、処置が予防用であるか治療用であるかによって異なり得る。
【０２４２】
かかる受容体標的化試薬（例えば、免疫毒性受容体標的化試薬）またはその医薬組成物の毒性と治療有効性は、既知の製薬手順によって、例えば細胞培養物または実験動物において測定され得る。このような手順は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を調べるために使用され得る。毒性効果と治療効果の用量比は治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比で表示され得る。高い治療指数を示す医薬組成物が好ましい。毒性の副作用を示す医薬組成物を使用してもよいが、正常細胞（例えば、非標的細胞）に対する損傷の可能性を最小限にし、それにより副作用が低減されるように、かかる化合物を罹患組織部位に標的化させる送達系の設計には注意すべきである。
【０２４３】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、適切な被験体（例えば、ヒト患者）における使用のための投薬量の範囲を設定するために使用され得る。かかる医薬組成物の投薬量は、一般的に毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内である。投薬量は、使用される投薬形態および使用される投与経路に応じてこの範囲内で異なり得る。本明細書に記載のようにして（例えば、被験体の増殖性障害の処置のために）使用される医薬組成物では、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから概算され得る。該用量は、動物モデルにおいて、細胞培養物において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半数の抑制が達成される医薬組成物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲が得られるように設定され得る。かかる情報は、ヒトにおける有用な用量を、より厳密に決定するために使用され得る。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。細胞培養物における受容体標的化試薬のＩＣ５０の決定方法は、付随の実施例に詳述している。
【０２４４】
本明細書において定義する場合、受容体標的化試薬の「治療有効量」は、処置被験体において、医療上望ましい結果（例えば、増殖性障害の１つ以上の症状の改善、癌細胞もしくは炎症性障害を媒介する免疫細胞の増殖の低減、または免疫毒性療法と関連する１つ以上の副作用の低減）がもたらされ得る該試薬の量である。受容体標的化試薬の治療有効量（すなわち、有効投薬量）としては、ミリグラム、マイクログラム、ナノグラム、またはピコグラム試薬量／キログラム被験体または試料重量（例えば、約１ナノグラム／キログラム〜約５００マイクログラム／キログラム、約１マイクログラム／キログラム〜約５００ミリグラム／キログラム、約１００マイクログラム／キログラム〜約５ミリグラム／キログラム、もしくは約１マイクログラム／キログラム〜約５０マイクログラム／キログラム）が挙げられる。
【０２４５】
被験体は、本明細書に記載の任意の被験体、例えば、ヒトなどの哺乳動物であり得る。
【０２４６】
本明細書に記載の受容体標的化試薬またはその医薬組成物は被験体に、別の処置剤、例えば、増殖性障害（例えば、癌または炎症性障害）の処置剤との併用療法として投与してもよい。例えば、併用療法は、増殖性障害を有する、または増殖性障害が発生するリスクのある（または増殖性障害を有することが疑われる）被験体に、治療有益性をもたらす該１種類以上のさらなる薬剤を、被験体に（例えば、ヒト患者）に投与することを含むものであり得る。したがって、受容体標的化試薬または医薬組成物と該１種類以上のさらなる薬剤は、同じ時点で投与され得る。あるいはまた、受容体標的化試薬を、第１の時点で投与し、該１種類以上のさらなる薬剤を第２の時点で投与してもよい。該１種類以上のさらなる薬剤を第１の時点で投与し、受容体標的化試薬を第２の時点で投与してもよい。受容体標的化試薬は、以前または現在投与中の治療剤を置換または増強するものであり得る。例えば、受容体標的化試薬での被験体の処置の際、該１種類以上のさらなる薬剤により、中止または低減、例えば、より低いレベルでの投与となり得る。また、以前の治療剤の投与を維持してもよい。場合によっては、以前の治療剤は、受容体標的化試薬のレベル（例えば、投薬量またはスケジュール）が、治療効果がもたらされるのに充分なレベルに達するまで維持され得る。これらの２種類の治療剤は、併用して投与され得る。
【０２４７】
以前の治療剤が特に毒性である場合では、受容体標的化試薬の投与は、以前の治療剤の量を、同じまたは改善された治療有益性がもたらされるのに充分であるが毒性レベルは同じでないレベルに補正および／または削減するために使用され得ることは認識されよう。もちろん、医療従事者は、被験体に免疫毒性受容体標的化試薬を投与する前に、該被験体に非免疫毒性受容体標的化試薬を投与してもよい。
【０２４８】
場合によっては、被験体に本発明の受容体標的化試薬または医薬組成物を投与する場合、最初の治療を中止する。被験体は、第１の予備選択結果、例えば、増殖性障害の１つ以上の症状（例えば、本明細書に記載の任意のもの）（例えば、上記参照）の改善についてモニターされ得る。場合によっては、第１の予備選択結果が観察された場合、受容体標的化試薬での処置は軽減または中止される。次いで、被験体は、受容体標的化試薬での処置中止後の第２の予備選択結果、例えば、増殖性障害の症状の悪化についてモニターされ得る。第２の予備選択結果が観察された場合、被験体に対する受容体標的化試薬の投与が再開もしくは増強され得、あるいは最初の治療剤の投与が再開されるか、または、被験体に受容体標的化試薬と最初の治療剤の両方が投与されるか、または受容体標的化試薬の量と最初の治療レジメンが増強される。
【０２４９】
また、受容体標的化試薬は、疾患（例えば、増殖性障害）の１つ以上の症状に対する処置剤とともに投与してもよい。例えば、受容体標的化試薬は、例えば鎮痛剤とともに共投与され得る（例えば、同じ時点で、または上記の任意の併用レジメンによって）。
【０２５０】
このセクションに記載の処置方法により、上記のインビボ方法（適用可能な場合）が増強されることは理解されよう。
【０２５１】
キットおよび物品
また、本明細書において、１種類以上の本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬と、任意選択で、該１種類以上の受容体標的化試薬を被験体（例えば、ヒトまたは本明細書に記載の任意の被験体）に投与するための使用説明書が内包されたキットを提供する。被験体は、癌もしくは炎症性障害を有する、または癌もしくは炎症性障害を有することが疑われる被験体であり得る。また、キットは、任意選択で、１種類以上の薬学的に許容され得る担体または希釈剤も含むものであり得る。
【０２５２】
また、ＥＧＦＲ、ＩＬ４Ｒおよび／またはＩＬ１３Ｒの発現を検出するのに有用なキットを取り上げて記載する。キットは、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ４Ｒ、またはＥＧＦＲの発現を検出するための１種類以上の試薬；およびＩＬ１３Ｒ、ＩＬ４Ｒ、またはＥＧＦＲの発現が検出された場合、本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬（例えば、本明細書に記載の免疫毒性受容体標的化試薬）を投与するための使用説明書を内包するものであり得る。
【０２５３】
キットは、任意選択で、例えば、ＥＧＦＲ、ＩＬ４ＲまたはＩＬ１３ＲのｍＲＮＡまたはタンパク質を含むことがわかっている対照試料（陽性対照）、含まないことがわかっている対照試料（陰性対照）を含んでいてもよい。一部の実施形態において、キットは、試料（例えば、細胞試料）を処理するための１種類以上の試薬を含むものであり得る。例えば、キットは、試料からｍＲＮＡまたはタンパク質を単離するための試薬、および／または単離したｍＲＮＡを増幅させるための試薬（例えば、逆転写酵素、逆転写もしくはＰＣＲ増幅のためのプライマー、またはｄＮＴＰ）、および／またはタンパク質発現（例えば、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３ＲもしくはＩＬ４Ｒに特異的な１種類以上の抗体）を検出するための試薬を含むものであり得る。
【０２５４】
また、本開示は、容器、および該容器に内包された組成物を内包する物品を提供する。該組成物は、哺乳動物の癌（または炎症性障害）を処置するための活性剤である。該組成物中の活性剤は、本明細書に記載の任意の免疫毒性受容体標的化試薬を含むもの、あるいは該試薬からなるものであり得、容器は、該組成物が哺乳動物の癌（または炎症性障害）の処置における使用のためのものであることを示すラベルを有していてもよい。該ラベルは、さらに、哺乳動物の癌の１つ以上の癌細胞（または１つ以上の炎症性障害を媒介する免疫細胞）がＩＬ１３Ｒ、ＩＬ４Ｒ、またはＥＧＦＲを発現している場合、該組成物が該哺乳動物に投与されることを示すものであり得る。また、物品には、該組成物（例えば、再水和型組成物）を哺乳動物に投与するための使用説明書が内包されていてもよい。
【０２５５】
一部の実施形態において、該組成物は、乾燥状態または凍結乾燥状態であり得る。該組成物は、再水和またはさらなる製剤化の必要なく投与の準備ができたものであり得る。
【０２５６】
以下の実施例は本発明の例示を意図するものであり、限定を意図するものではない。
【実施例】
【０２５７】
実施例
実施例１．材料および方法
ＤＴＥＧＦ１３の構築。二重特異性単鎖免疫毒素（ＢＩＴ）ＤＴＥＧＦ１３をコードするハイブリッド遺伝子の合成およびアセンブリングは、ＤＮＡシャッフリングおよびＤＮＡクローニング手法を用いて行なった。完全にアセンブリングされた融合構築物は（５’末端から３’末端に）、Ｎｃｏ１制限酵素部位、ＡＴＧ転写開始コドン、ジフテリア毒素（ＤＴ）分子の最初の３８９アミノ酸をコードするヌクレオチド配列（本明細書においてＤＴ３９０と称する）、７アミノ酸ＥＡＳＧＧＰＥ（配列番号１４）リンカーをコードするヌクレオチド配列、ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）をコードするヌクレオチド配列、ヒト筋肉アルドラーゼ（ｈｍａ）の２０アミノ酸セグメント（ＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ（配列番号１３）をコードするヌクレオチド配列、インターロイキン１３（ＩＬ１３）をコードするヌクレオチド配列、およびＸｈｏＩ制限部位からなるものであった。得られた１，７５５塩基対（ｂｐ）のＮｃｏＩ／ＸｈｏＩフランキング断片遺伝子を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性Ｔ７プロモーターの制御下、ｐＥＴ２１ｄ発現ベクター内でクローニングした（図１）。ＤＮＡ配列決定解析（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ，ミネソタ大学）を使用し、クローニングされた遺伝子のヌクレオチド配列が正しく、インフレームであることを確認した。ＤＴ３９０とヒトＥＧＦ（ＤＴＥＧＦ）またはＤＴ３９０とヒトＩＬ１３（ＤＴＩＬ１３）の単一特異性免疫毒素（ＭＩＴ）−融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、同じ手法を用いて構築した。  
【０２５８】
ＤＴ３９０断片を含むさらなる二重特異性融合タンパク質を、特異性対照として作製した。ＤＴ２２２２対照は、ヒト抗ＣＤ２２抗体に特異的な２つの反復ｓＦｖ分子をＤＴ３９０に連接することにより構築した。
【０２５９】
ＤＴ２２１９ＥＡの構築。標準的な分子生物学的手法を使用し、ＤＴ２２１９の変異型ＤＴ２２１９ＥＡを構築した。ＤＴ２２１９ＥＡ構築物には、Ｎｃｏ  Ｉ制限部位、続いて下流ＡＴＧ開始コドンを含む核酸配列、ＤＴの最初の３８９アミノ酸（ＤＴ３９０）、ヒト筋肉アルドラーゼ（ｈｍａ）の２０アミノ酸セグメントによって連結された抗ＣＤ２２（ｓＦｖ）と抗ＣＤ１９のＶＨ領域とＶＬ領域をコードする核酸配列、およびＸｈｏ１適合性制限部位を含めた。３つのアミノ酸Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ（ＴＨＷ）を、抗ＣＤ２２  ｓＦｖのＶＨのＣＤＲ３領域の１００位、１００Ａ位および１００Ｂ位のＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ  （ＳＳＹ）の代わりに使用するとＣＤ２２に対する親和性が増強されたため、これらの同じアミノ酸を、ｐＤＴ２２１９ｈｍａＥＡ（すなわち親和性増強型（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ））と称するアセンブリングプラスミドにおいて変異させた。
【０２６０】
ＤＴ２２１９ＡＲＬの構築。ＤＴ２２１９ＡＲＬをコードするハイブリッド遺伝子を、アセンブリＰＣＲを用いて構築した。ＤＴ２２１９ＡＲＬとＤＴ２２１９ＥＡの主な２つの違いは、１）ＶＨ鎖とＶＬ鎖の向きが逆。ＤＴ２２１９ＡＲＬでは、ＶＬをＶＨの前にしたこと（ｐｒｏｃｅｄｅ）；ならびに２）各ｓＦｖのＶＬ遺伝子およびＶＨ遺伝子を、ＡＲＬリンカー（ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ；配列番号２１）をコードする断片によって連結させ、この２つのｓＦｖ遺伝子を、Ｇ４Ｓリンカーをコードする断片によって連結させたことであった。その最終配置において、ＤＴ２２１９ＡＲＬ  Ｎｃｏ１／Ｘｈｏ１遺伝子断片は、開始コドン、続いてＤＴ３９０である最初の３８９アミノ酸、続いて７アミノ酸リンカーＥＡＳＰＥＥＡ（配列番号２２）、続いて抗ＣＤ２２  ｓＦｖ、続いてＣＤ１９  ｓＦｖをコードした。この最終標的遺伝子を、標準的な分子生物学的手法を使用し、ｐＥＴ２１ｄベクター発現ベクター内にクローニングし、細菌内で発現させた。
【０２６１】
封入体の単離。上記の融合タンパク質をコードする発現プラスミドで、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）である細菌を形質転換した。一夜培養後、細菌を２リットル容フラスコ内で、５０ｍｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する８００ｍｌのルリアブイヨン（ＬＢ）中、振とうしながら３７℃で培養した。８ｍｌの１００ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＦｉｓｈｅｒＢｉｏｔｅｃｈ，Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ）を添加することにより、培養培地がＯＤ６００  ０．６５に達すると、融合タンパク質の発現が誘導された。誘導開始から２時間後、細菌を遠心分離によって回収した。細菌細胞ペレットをバッファー溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）中に再懸濁させ、ポリトロンホモジナーザーを用いてホモジナイズした。ホモジナイズした後、細菌ホモジネートを遠心分離に供し、得られたペレットを、０．３％デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％グリセリン、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有するバッファー中に再懸濁させて洗浄した。
【０２６２】
リフォールディングおよび精製。封入体を２０：１（ｍｇ湿潤重量：ｍＬ）で、可溶化バッファー（７Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．０）中に溶解させた。３７℃で１時間のインキュベーション後、混合物を遠心分離に供し、ペレットを廃棄した。上清みをリフォールディングバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．８ｍＭ  Ｌ−アルギニン、２０％グリセリン、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭ  ＧＳＳＧ、ｐＨ８．０）で２０倍に希釈し、４℃で２日間インキュベートした。塩酸グアニジンを溶液から透析（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）に対して１０倍透析）によって除去した。高速タンパク質用液体クロマトグラフィー−イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（商標），Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用し、０．２〜０．５Ｍ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）の連続塩勾配にて４カラム容量で、リフォールディングされたタンパク質を精製した。
【０２６３】
細胞培養。ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５およびＰＣ−３、ヒト結腸直腸癌細胞株ＨＴ−２９、ヒトバーキットリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉ、およびＣａｌｕ−３（ヒト肺腺癌）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ）から入手した。ヒト膠芽細胞腫細胞株Ｕ−８７およびＵ−１１８は、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）を有する患者由来のものとし、また、ＡＴＣＣからも入手した。Ｕ８７細胞とＵ１１８細胞はＤＭＥＭ中で培養したが、その他の細胞株は、１０％ウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍＬ  ペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ＮＪ）中に維持した。癌腫細胞はすべて単層として培養したが、Ｄａｕｄｉ細胞は、培養フラスコを用いて浮遊培養した。細胞培養物を、３７℃の５％ＣＯ２含有加湿雰囲気内でインキュベートした。接着細胞が８０〜９０％コンフルエントになったとき、トリプシン−ＥＤＴＡを使用し（培養皿から細胞を剥離するため）、継代培養した。トリパンブルー排除による測定で＞９５％のバイアビリティを有する細胞のみ、本明細書に記載の実験（下記参照）に使用した。
【０２６４】
細胞増殖を測定するためのバイオアッセイ。ＤＵ−１４５、Ｕ１１８、Ｕ８７−ＭＧ、ＨＴ−２９、Ｄａｕｄｉ細胞、および以下に記載する他の細胞株に対するＤＴＥＧＦ１３の効果を調べるため、３Ｈ−チミジン取込みを測定する増殖アッセイを使用した。細胞を９６ウェル平底プレート内に播種し（１０４細胞／ウェルで）、一晩３７℃（５％ＣＯ２）でインキュベートし、細胞を接着させた。種々の濃度の免疫毒素をウェルに３連で添加した。処理した細胞を３７℃および５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。最後の８時間のインキュベーションでは、［メチル−３Ｈ］−チミジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を各ウェルに添加した（１μＣｉ／ウェル）。インキュベーション後、プレートを凍結して細胞を剥離させ、次いで、剥離した細胞をガラス繊維フィルター上に回収し、洗浄し、乾燥させ、標準的なシンチレーション法を用いて計数した。未処理ウェル内のバックグラウンドシンチレーション計数は７３，８２０±８，４９９計数／分（ｃｐｍ）〜１０４，３７２±１１，３５９ｃｐｍの範囲であった。ＰＣ−３細胞は３Ｈ−チミジンの取込みができなかったため、これらの細胞に対するＤＴＥＧＦ１３の効果を、３Ｈ−ロイシン取込みによって示されるタンパク質合成を測定することにより解析した。３Ｈ−ロイシン取込み測定するアッセイは３Ｈ−チミジンアッセイと、ロイシン無含有培地中で行なった点、および標識ロイシンとのインキュベーションを８時間ではなく２４時間持続させた点のみが異なっていた。これらの各増殖アッセイのデータは、対照計数に対するパーセンテージとして報告した。
【０２６５】
いくつかの場合において、細胞増殖の阻害を、トリパンブルー排除実験手法によっても調べた。簡単には、免疫毒素（上記）または対照で処理した細胞、未処理細胞を回収し、洗浄し、トリパンブルーで染色し、計数した。免疫毒素を含む培養ウェルで得られた細胞数は、免疫毒素を含まないウェルで得られた細胞数と比べて少なかった。また、対照細胞における細胞死の量と比べると、免疫毒素で処理した細胞では、細胞死の量の増大（すなわち、トリパンブルー陽性細胞数の増加）が観察された。このような結果により、細胞の免疫毒素処理によって細胞の死滅がもたらされることが示された。
【０２６６】
また、ＤＴＥＧＦ１３の特異性を試験するため、ブロック試験も実施した。簡単には、抗ＥＧＦまたは抗ＩＬ１３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ）抗体を、５０μｇ／ｍｌの最終濃度で０．１ｎＭ  ＤＴＥＧＦ１３含有培地に添加した。得られた混合物を、ＰＣ−３またはＵ８７細胞の入ったウェルに添加した。ＰＣ−３細胞増殖を、３Ｈ−ロイシン取込みによって測定した。マウス白血球特異的抗体Ｌｙ  ５．２を陰性対照として含めた。
【０２６７】
放射性標識ＩＴの結合およびインターナリゼーション。ＤＴＥＧＦ１３の結合およびインターナリゼーション効率を測定するため、該タンパク質のアリコートを１１１Ｉｎで標識した。簡単には、ＭＸ−ＤＴＰＡ  １Ｂ４Ｍキレート剤を２．５：１のモル比で該タンパク質に、５ｍＭ重炭酸ナトリウム、１５ｍＭ塩化ナトリウム、および０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ９．２）からなるコンジュゲーションバッファーを用いてコンジュゲートさせた。ほぼ２５０μｇの１Ｂ４Ｍ−キレート化ＤＴＥＧＦ１３を２０μＣｉの１１１Ｉｎで標識し、標識効率は＞９０％であった。次いで、ＰＣ−３細胞（３×１０５／チューブ）を１００μｌのＲＰＭＩ中に懸濁させ、４℃で３０分間置いた。次いで、この氷冷ＲＰＭＩ中の１００μｌの６００ｎＭ  １１１Ｉｎ標識ＤＴＥＧＦ１３を各チューブに添加し、次いで、インターナリゼーションを抑制するために細胞を４℃で  ３０分間インキュベートした。冷ＰＢＳで２回洗浄後、細胞を再懸濁させ、３７℃で指定のインキュベーション時間培養した。２つの細胞試料を初期結合タンパク質の計算のために確保した。インキュベーション時間後、細胞をペレット化し、培地を各チューブから吸引した。細胞を５００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。各チューブの洗浄液のインキュベーション培地とＰＢＳをすべてプールし、未結合画分として確保した。次いで、ＰＣ−３細胞をＲＰＭＩ（ｐＨ３．０）で２回洗浄し、結合タンパク質を放出させ、培地を結合画分として確保した。また、細胞ペレットも確保し、結合放射能を、インターナリゼーションされたタンパク質として計数した。すべてのチューブ内に存在する放射能を、Γカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ  ＭＡ）を用いて計数した。各画分中に存在する初期結合活性のパーセンテージを、各試料について計算した。
【０２６８】
ＰＣ−３側腹部腫瘍に対するＤＴＥＧＦ１３のインビボ有効性試験。雄ｎｕ／ｎｕマウスを、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ａｒｅａ  （Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から購入し、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅの認可を受けた特定の無菌施設に、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ミネソタ大学の管理の下に収容した。動物研究プロトコルは、ミネソタ大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに承認されたものであった。動物はすべてマイクロアイソレーターケージ内に収容し、混入ウイルスによる感染の可能性を最小限にした。
【０２６９】
側腹部腫瘍試験では、マウスの左側腹部に、４×１０６（実験１）または６×１０６（実験２）個のＰＣ−３細胞（１００μｌのＲＰＭＩ／マトリゲルの１：１混合物中に懸濁）を注射した。触知可能な腫瘍が形成されたら（第１８日）、マウスを群分けし、ＤＴＥＧＦ１３の反復注射により処置した。ＩＴはすべて、２９ゲージ針を有する３／１０ｃｃ容シリンジを用いて腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射によって投与した。処置群にはすべて、１００μｌ容量の滅菌ＰＢＳにて投与した。デジタル式カリパスを用いて腫瘍サイズを測定し、長さ、幅および高さの積として体積を求めた。
【０２７０】
ＰＣ−３側腹部腫瘍に対するＤＴＥＧＦ１３のインビボ有効性試験。側腹部腫瘍試験では、雌ｎｕ／ｎｕマウスに６×１０６個のＵ８７細胞を注射し、腫瘍がほぼ２００ｍｍ３のサイズに達したら（約第１４日）、マウスを群分けし、ＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＥＧＦ、ＤＴＩＬ１３、またはＤＴ２２２２のいずれかで処置した。免疫毒素はすべて、１００μｌ容量の滅菌ＰＢＳにてｉ．ｔ．注射によって投与し、スケジュール（下記参照）どおりに行なった。デジタル式カリパスを用いて腫瘍サイズを測定し、長さ、幅および高さの積として体積を求めた（上記）。動物体重を測定することにより、処置関連毒性をモニターした。
【０２７１】
化学発光Ｕ８７側腹部腫瘍に対するＤＴＥＧＦ１３の効果。また、Ｕ８７異種移植片に対するＤＴＥＧＦ１３のｉ．ｔ．投与の効果を、生物発光画像法を用いて測定した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現するＵ８７／Ｌｕｃ細胞は、Ｊｏｈｎ  Ｏｈｌｆｅｓｔ博士（ミネソタ大学）のご好意によりご提供頂いた。Ｕ８７／Ｌｕｃ細胞は、増殖特性とＤＴＥＧＦ１３に対する感受性が親Ｕ８７細胞と同一であった。異種移植片の初期処理のため、雌ヌードマウスの側腹部に、６×１０６個のＵ８７／Ｌｕｃ細胞（１００μｌのＰＢＳ中）を注射した。腫瘍がほぼ７５ｍｍ３の体積に達したら（第１２日）、２．５μｇのＤＴＥＧＦ１３のｉ．ｔ．投与での処置を開始した。マウスはＤＴＥＧＦ１３で、第１２、１４、１６、２１、２４、２６、３１および３３日に処置した。処置したマウスの画像を、第１２日（処置前）、第１７および３４日に取得し、ルシフェラーゼ活性のレベルをモニターした。画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｉｖｉｓ画像法システムを用いて取得し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ２．５ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｐｋｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）により解析した。画像形成前、マウスを、２００μｌの８ｍｇ／ｍｌケタミン、１ｍｇ／ｍｌアゼプロマジン、および０．１ｍｇ／ｍｌブトルファノールのカクテルの腹腔内投与によって麻酔した。画像形成の１０分前、すべてのマウスに、１００μｌの３０ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−ルシフェリン水溶液（Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を与えた。画像はすべて１０秒間の曝露時間を表し、すべての関心領域（ＲＯＩ）を単位：光子／秒で表示する。
【０２７２】
ＭＩＡＰａＣａ−２細胞側腹部腫瘍モデル、実験１。１×１０７個のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（ＤＭＥＭ中）をヌードマウス（ｎ＝２０）の左側腹部に注射することにより側腹部腫瘍を初期処理した。第２２日、触知可能な腫瘍を有するマウスをＤＴＥＧＦ１３処置群または処置なし群に無作為に分けた。処置マウスには、２．５μｇのＤＴＥＧＦ１３（１００μｌのＰＢＳ中）をｉ．ｔ．注射で投与した。合計１０回の注射を、グラフ（図１７Ｂ）に表示の頻度で行なった。
【０２７３】
ＭＩＡＰａＣａ−２細胞側腹部腫瘍モデル、実験２。細胞注射の１日前、雄ヌードマウスに、Ｘ線照射装置を用いて３００ｒａｄを照射した。１×１０７個のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（ＤＭＥＭとマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）の１：１混合物中）を注射することにより、側腹部腫瘍を確立させた。腫瘍がほぼ５０ｍｍ３に達したら（第１８日）、マウスを群分けし（ｎ＝５／群）、処置を開始した。２．５μｇのＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＥＧＦ、または  ＤＴＩＬ１３の４回の腫瘍内注射を１日おき（ｑ．ｏ．ｄ．）に行なった。対照群のマウスには１００μｌのＰＢＳの腫瘍内注射を行なった。
【０２７４】
ＭＩＡＰａＣａ−２細胞側腹部腫瘍モデル、実験３。実験３の側腹部腫瘍試験では、ヌードマウスに１×１０７個のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（ＤＭＥＭとマトリゲルの１：１混合物中）を注射した。側腹部腫瘍がほぼ７５ｍｍ３に達した第１５日、マウスを処置群（ｎ＝６／群）に分けた。処置マウスには、２．５μｇのＤＴＥＧＦ１３またはＢ細胞標的化免疫毒素ＤＴ２２２２のいずれかの腫瘍内注射を合計６回行なった。注射は週３回、２週間行なった。
【０２７５】
統計解析。連続データの群別比較を、スチューデントのｔ検定により行なった。生命表のコンパイルおよびログランク検定による統計学的解析のためのコンピュータプログラムを使用し、生存データを解析した。確率（ｐ）値＜０．０５を有意とみなした。
【０２７６】
実施例２．ＤＴＥＧＦ１３の構築および精製
ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ消化後、二重特異性ＩＴ  ＤＴＥＧＦ１３をコードするＤＮＡ断片を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性Ｔ７プロモーターの制御下、ｐＥＴ２１ｄ発現ベクター内でクローニングした（図１）。また、単一特異性ＩＴ遺伝子（ＤＴＥＧＦおよびＤＴＩＬ１３）を含む構築物も合成した。ＤＮＡ配列決定解析（これは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ（ミネソタ大学，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で行なわれた）により、構築物配列が正しいことが確認された。精製（上記）後、ＤＴＥＧＦは、予測分子量６３．６ｋＤａを有すると測定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析すると、ＩＴはすべて＞９５％純粋であった。
【０２７７】
実施例３．ＤＴＥＧＦ１３が前立腺および膠芽細胞腫細胞を死滅させる能力の測定
ＤＴＥＧＦ１３が上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）−およびインターロイキン１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）−発現癌腫細胞を死滅させる能力を調べるため、ＥＧＦＲ＋およびＩＬ１３Ｒ＋前立腺癌細胞株ＰＣ−３をＤＴＥＧＦ１３で処理し、ＰＣ−３細胞増殖の阻害を細胞増殖アッセイによって測定した。単一特異性ＤＴＩＬ１３はＰＣ−３細胞を死滅させることができ、ＩＣ５０は０．０３８ｎＭであった（図２Ａ）。単一特異性免疫毒素ＤＴＥＧＦは、ＰＣ−３細胞の死滅において有効性がずっと低く、１００ｎｍにおいて、増殖の阻害はわずか２０％であった。しかしながら、二重特異性細胞毒（ＣＴ）ＤＴＥＧＦ１３は、０．０４２ｐＭのＩＣ５０を示し、これはＤＴＩＬ１３と比べて９０５倍高い活性、およびＤＴＥＧＦと比べて少なくとも７ｌｏｇ高い活性を示す。ＤＴＥＧＦ１３および単一特異性ＩＴは、ＥＧＦ１３ＲおよびＩＬ１３Ｒ陰性細胞株Ｄａｕｄｉに対して最小限細胞増殖阻害を示した（図２Ｂ）。
【０２７８】
また、ＤＴＥＧＦ１３をＥＧＦＲ＋およびＩＬ１３Ｒ＋膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７  ＭＧに対して試験した。図３に示す通り、単一特異性ＤＴＥＧＦはＵ８７細胞を死滅させることができ、ＩＣ５０が１．２ｎＭであった。単一特異性ＤＴＩＬ１３はあまり有効ではなく、ＩＣ５０は１０ｎＭであった。しかしながら、ＤＴＥＧＦ１３は０．０１５ｎＭのＩＣ５０を示し、これは、ＤＴＥＧＦと比べて８０倍高い活性、およびＤＴＩＬ１３と比べて６６５倍高い活性を示す。ＤＴＥＧＦ１３は、ＥＧＦ１３Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−Ｂリンパ腫細胞株ＤａｕｄｉおよびＴ細胞白血病細胞株のジャーカットおよびＣＥＭに対して最小限の活性を示した。
【０２７９】
また、ＤＴ３９０のないＥＧＦ１３タンパク質も、９５％より高い純度で合成した（上記参照）。ＰＣ−３細胞またはＵ８７細胞に添加した１，０００ｎＭものＥＧＦ１３タンパク質は阻害性ではなく、これは、ＥＧＦ１３部分それ自体は抗癌活性をもたないことを示す。
【０２８０】
実施例４．抗ＥＧＦおよび抗ＩＬ１３抗体またはＥＧＦ１３がＤＴＥＧＦ１３誘導性死滅をブロックする能力の測定
ＥＧＦとＩＬ１３がともにＰＣ−３細胞のＤＴＥＧＦ１３誘導性死滅に重要であることを確認するため、ブロック実験を行なった。５０μｇ／ｍｌの抗ＥＧＦまたは抗ＩＬ１３抗体を、ＤＴＥＧＦ１３によるＰＣ−３細胞の死滅をブロックする能力について試験した（図４）。０．１ｎＭのＤＴＥＧＦ１３に添加すると、両抗体は、抗増殖効果の約７０〜８０％をブロックすることができたが、いずれの抗体も単独で添加すると、ＤＴＥＧＦ１３誘導性のＰＣ−３死滅は完全にブロックされず、これは、おそらく、単一特異性ブロック剤が一方のリガンドしかブロックできず、他方はブロックされないためである。両抗体によるブロックにより１００％ブロックがもたらされた。対照的に、対照抗マウスＬｙ５．２抗体の添加にはブロック効果はなかった。Ｕ８７  ＭＧ細胞を用いると同様の結果が得られた（図２Ｃ）。
【０２８１】
総合すると、これらのデータにより、両方のリガンド（ＥＧＦおよびＩＬ１３）がＤＴＥＧＦ１３分子の活性に重要であることが示された。
【０２８２】
非免疫毒性形態のＤＴＥＧＦ１３受容体標的化試薬が、ＭｉａＰａＣａ−２ヒト膵臓癌細胞のＤＴＥＧＦ１３誘導性死滅をインビトロで低減させることができるかどうかを調べるため、ブロック実験を行なった。細胞を種々の濃度のＤＴＥＧＦ１３と、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、もしくは１０００ｎＭのＥＧＦ１３の存在下で、または対照としてＥＧＦ１３なしで接触させた。実験結果により、ＥＧＦ１３（非免疫毒性受容体標的化試薬）はＭｉａＰａＣａ−２細胞のＤＴＥＧＦ１３誘導性死滅の低減に有効であることが示された。
【０２８３】
実施例５．ＤＴＥＧＦ１３が前立腺細胞株ＤＵ−１４５および膠芽細胞腫細胞株Ｕ１１８を死滅させる能力の測定
ＤＴＥＧＦ１３を第２の前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５に対して試験した。単一特異性ＤＴＩＬ１３は、ＤＵ−１４５細胞に対して低い死滅活性を示し、１００ｎＭより高いＩＣ５０を有した（図５）。ＩＣ５０が０．０１８ｎＭである単一特異性免疫毒素ＤＴＥＧＦは、ＤＴＩＬ１３よりも有効であった。しかしながら、ＤＴＥＧＦは、１００ｎＭであってもＤＵ−１４５応答を完全に阻害することができなかった。対照的に、ＤＴＥＧＦ１３（ＩＣ５０は０．００２１ｎＭ）は、０．１ｎＭでＤＵ−１４５応答を完全に阻害した。陰性対照ＩＴであるＤＴ２２２２は阻害性がかなり低かった。ＤＴＥＧＦ１３と単一特異性ＩＴでは、ＬＮＣａＰ由来Ｃ４−２前立腺癌細胞株と同様の所見が観察された。
【０２８４】
ＤＴＥＧＦ１３を、第２の膠芽細胞腫細胞株Ｕ１１８に対して試験した。図６は、Ｕ−１１８細胞に対して、単一特異性ＤＴＩＬ１３が２ｎＭのＩＣ５０を示したことを示す。単一特異性ＤＴＥＧＦは３ｎＭのＩＣ５０を示した。対照的に、ＤＴＥＧＦ１３は、Ｕ１１８細胞に対して０．０２ｎＭのＩＣ５０を示し、少なくとも１００倍高かった。陰性対照ＩＴであるＢｉｃ３は阻害性が低く、＞３００ｎＭのＩＣ５０を示した。
【０２８５】
同様の結果が、ＰＡＮＣ−１（ＤＴＥＧＦ１３  ＩＣ５０は０．０３５ｎＭ）、ＳＷ−１９９０（ＤＴＥＧＦ１３  ＩＣ５０は０．０００１３ｎＭ）、およびＡＳＰＣ−１（ＤＴＥＧＦ１３  ＩＣ５０は０．０５２ｎＭ）ヒト膵臓癌細胞株を用いた実験で得られた。
【０２８６】
総合すると、これらの細胞株データにより、ＢＩＴが単鎖分子上のＥＧＦリガンドおよびＩＬ１３リガンドに結合すると、いずれかの単一特異性ＩＴと比べ、いくつかの異なる前立腺癌細胞株に対する免疫毒性効力が増大することが示された。
【０２８７】
実施例６．ＨＴ−２９ヒト結腸直腸癌細胞およびＣａｌｕ−３ヒト肺腺癌腫細胞に対するＤＴＥＧＦ１３の選択的細胞傷害性
ＨＴ−２９ヒト結腸直腸癌細胞に対するＤＴＥＧＦ１３の細胞傷害的有効性を調べるため、細胞をＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＥＧＦ、またはＤＴＩＬ１３で処理し、その増殖に対する免疫毒素の効果を測定した（上記）。ＤＴＥＧＦ１３は、ＨＴ−２９ヒト結腸直腸癌細胞株に対して高度に活性であった（図７）。ＤＵ−１４５の場合と同様、ＤＴＩＬ１３はＤＴＥＧＦ１３よりも有効性が低く、９５ｎＭのＩＣ５０を有した。ＤＴＥＧＦ１３は有効性が高く、ＩＣ５０は０．０８８ｎＭであった。ＤＴＥＧＦ１３はいずれかの単一特異性ＩＴよりも活性が高く、ＩＣ５０は０．００１２ｎＭであった。この実験では、陰性対照ＤＴ２２２２は、ＨＴ−２９細胞増殖に対して効果はなかった。
【０２８８】
また、Ｃａｌｕ−３細胞でも、ＤＴＥＧＦ１３は、ＤＴＥＧＦまたはＤＴＩＬ１３よりも有効であり、０．００１８ｎＭのＩＣ５０を示した（図８）。ＤＴＥＧＦは０．０９ｎＭのＩＣ５０を示し、ＤＴＩＬ１３は３．１ｎＭのＩＣ５０を示した（陰性対照の効果は最小限であった）。
【０２８９】
総合すると、これらの結果は、ＤＴＥＧＦ１３が、他の形態の癌腫に対しても、その単量体対応物より有効であることを示す。
【０２９０】
実施例７．ＤＴＥＧＦ１３の高活性は単一分子上のＥＧＦおよびＩＬ１３リガンドの存在によるものである
ＤＴＥＧＦ１３の高活性がその２つの異なるリガンドの存在によるものであるのかどうかを調べるため、増殖アッセイを行ない、ＤＴＥＧＦ１３で処理したＨＴ−２９細胞を、単量体のＤＴＥＧＦとＤＴＩＬ１３の混合物（または個々の各単量体形態）で処理したＨＴ−２９細胞と比較した。この単一特異性免疫毒素の混合物は、単鎖ＤＴＥＧＦ１３上の結合分子の数に相当する結合分子数１：１で含むものであった。ＤＴＥＧＦとＤＴＩＬ１３の混合物は、ＨＴ−２９細胞に対して、ＤＴＥＧＦ単独と同じ細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｃ）効果を示した（図９）。対照的に、ＤＴＥＧＦ１３分子は０．００１５ｎＭのＩＣ５０を有し、これは、ＤＴＥＧＦとＤＴＩＬ１３の混合物のＩＣ５０よりも３０７倍強力であった。
【０２９１】
また、Ｕ８７細胞を用いて同様の実験を行なった。この場合に行なった増殖アッセイでは、ＤＴＥＧＦ１３で処理したＵ８７細胞を、単量体のＤＴＥＧＦとＤＴＩＬ１３の混合物（または個々の各単量体形態）で処理したＵ８７細胞と比較した。この単一特異性免疫毒素の混合物も、単鎖ＤＴＥＧＦ１３上の結合分子の数に相当する結合分子数を１：１で含むものであった。ＤＴＥＧＦとＤＴＩＬ１３の混合物は、Ｕ８７細胞に対してＤＴＥＧＦ単独と同じ細胞傷害効果示した（図１０）。対照的に、ＤＴＥＧＦ１３分子は、０．００７ｎＭのＩＣ５０を有し、これは、ＤＴＥＧＦとＤＴＩＬ１３の混合物のＩＣ５０よりも１０００倍超強力であった。
【０２９２】
ＭＩＡＰａＣａ−２ヒト膵臓癌細胞およびＨ２９８１−Ｔ３ヒト肺癌細胞を用いた実験でも同様の結果が得られた。
【０２９３】
これらのデータは、ＤＴＥＧＦ１３で観察された高活性は、大部分が、ＤＴＥＧＦ１３中の該２つの異なるリガンドの存在によるものであることを示す。
【０２９４】
実施例８．ＤＴＥＧＦ１３の結合およびインターナリゼーション
ＤＴＥＧＦ１３の結合およびインターナリゼーションを調べるため、ＤＴＥＧＦ１３を１１１Ｉｎ放射性標識で標識し、ＰＣ−３細胞またはＵ８７  ＭＧ細胞とともに、０〜２時間の種々の時間量インキュベートした。インキュベーション後、各タンパク質の結合画分を優先的に放出させ、細胞に結合されたすべての残留放射能を、ＤＴＥＧＦ１３がインターナリゼーションされた結果とみなした。１時間の間にＰＣ−３細胞に対して結合およびインターナリゼーションされた標識ＤＴＥＧＦ１３の画分の量を図１１に示す（同様の結果がＵ８７  ＭＧ細胞についても得られた）。ＤＴＥＧＦ１３の結合は、免疫毒素が細胞によってインターナリゼーションされるにつれて減少した。同様の結果が、単量体の免疫毒素分子ＤＴＥＧＦとＤＴＩＬ１３でも観察された。
【０２９５】
実施例９．腫瘍内ヌードマウス側腹部腫瘍モデルにおけるＤＴＥＧＦ１３
ＰＣ−３側腹部腫瘍モデル。ＤＴＥＧＦ１３が腫瘍増殖をインビボで抑止する能力を試験するため、２つの別々の実験において、ＰＣ−３細胞をヌードマウスの左側腹部内に注射した。腫瘍が確立されて触知可能になったら、マウスをＤＴＥＧＦ１３の反復ｉ．ｔ．注射で処置した。ヒトＥＧＦおよびＩＬ１３（ＤＴＥＧＦ１３）は、それぞれ、マウスＥＧＦＲおよびＩＬ１３Ｒに結合するため、ＤＴＥＧＦ１３をマウスモデルにおいて試験した。図１２Ａは、マウス群（ｎ＝４〜５／群）に対して、第１、３、５、８、１０、１２、２３、２５日にＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＥＧＦ、ＤＴＩＬ１３のいずれかのｉ．ｔ．注射（２．５μｇ／注射）を行なうか、または未処置とした第１の実験の平均腫瘍体積データを示す。ＤＴＥＧＦ１３の反復注射は、未処置対照と比べ、第２５日に注射を中止するまで腫瘍増殖の抑制に有意に有効であった。第２９日、ＤＴＥＧＦ１３処置マウスにおいて、４匹のうち２匹のマウスで腫瘍が再発生しており４匹のうち２匹のマウスでは検出不能であった。ＤＴＥＧＦおよびＤＴＩＬ１３で処置した腫瘍は未処置対照腫瘍と類似した速度で増殖しており、したがって、有意な阻害効果はなかった。
【０２９６】
体重減少は、細胞毒（ＣＴ）および免疫毒素（ＩＴ）試験において毒性の表示として高頻度に使用されている。図１２Ｂは、反復投与後、実験終了時のＤＴＥＧＦ１３処置に起因する体重減少が処置前の体重の１０％を超えていないことを示す。したがって、このＤＴＥＧＦ１３の投薬量は許容量であった。
【０２９７】
第２の実験では、確立されたＰＣ−３腫瘍を、第１日〜第１０日の間で１日おき（ｑ．ｏ．ｄ．）に（計５回の注射）、ＤＴＥＧＦ１３または陰性対照ＤＴ２２２２のｉ．ｔ．注射で処理した（図１３）。腫瘍体積を個々の処置マウスについて示す。ＤＴ２２２２で処理した腫瘍は、処置にかかわらず、継続してサイズが徐々に増大した。対照的に、ＤＴＥＧＦ１３での処理では、５匹中５匹のマウスで腫瘍増殖が抑止され、処理を第１０日に停止したことにもかかわらず、第５７日においても腫瘍増殖の停止が維持された。ＤＴ２２２２処置マウスとＤＴＥＧＦ１３処置マウスの腫瘍体積の差は有意であった（ｐ＜０．０００１）。ＤＴＥＧＦ１３処置マウスでは有意な体重減少はなかった。
【０２９８】
独立した試験において、反復ＤＴＥＧＦ１３処置を受けた２匹のマウスの腫瘍の写真撮影を、処置後、種々の時点で行なった（図１４）。動物には、その腫瘍（約０．２ｃｍ３であった）内に１０日間にわたって５回の注射を行なった。マウス１の腫瘍の方が退縮が遅く、早くも第２日にわずかな潰瘍形成の徴候が示された。これは、第２８日までに元の腫瘍サイズの約８０％に縮小した。第４７日までに完全に検出不能となった。マウス２の腫瘍の縮小の方が速かった。腫瘍サイズは第１０日までに１００％低減された。この腫瘍は２０日後に再発した。
【０２９９】
Ｕ８７側腹部腫瘍モデル。ＤＴＥＧＦ１３が腫瘍増殖をインビボで抑止する能力をさらに試験するため、Ｕ８７細胞をヌードマウスの側腹部に注射した。腫瘍が体積約０．２ｃｍ３に達したら、マウスを上記のようなＤＴＥＧＦ１３の反復ｉ．ｔ．注射で処置した。図１５Ａは、マウス群（ｎ＝５／群）に対して、第１４、１７  ２０、２４、２７、３１、３４および３８日に、ＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＥＧＦ、ＤＴＩＬ１３またはＤＴ２２２２のいずれかの注射（２．５μｇ／注射）を行なった第１の実験の平均腫瘍体積データを示す。ＤＴＥＧＦ１３の反復注射は、ＤＴ２２２２陰性対照と比べ、腫瘍増殖の抑制に有意に有効であった（第２７日と第３１日でｐ＜０．０４）。ＤＴＥＧＦとＤＴＩＬ１３で処理した腫瘍は、ＤＴ２２２２処理対照腫瘍と類似した速度で増殖し、したがって、有意な阻害効果はなかった。
【０３００】
図１５Ｂでは、個々のマウスデータをＤＴＥＧＦ１３群に対してプロットしている。第３８日以降、５つのうち２つの腫瘍が再発し、処置中に増殖した。５つのうち３つの腫瘍は、実験を終了した第６２日まで、継続してさらなるＤＴＥＧＦ１３処置に応答した。
【０３０１】
ＤＴＥＧＦ１３処置と関連する体重減少は、これらの試験有意な問題ではなく、ＤＴＥＧＦ１３処置投薬量は許容量であった（図１５Ｃ）。
【０３０２】
第２の実験では、ＤＴＥＧＦ１３を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を安定的に発現するＵ８７細胞に対して試験した。細胞（Ｕ８７／ｌｕｃ）は、インビトロでのＤＴＥＧＦ１３と類似した応答を示した。この細胞を胸腺欠損ヌードマウスの側腹部内に注射した。腫瘍が確立されて触知可能になったら（第１２日）、ルシフェラーゼ活性に関する４匹の各マウスの画像を取得した。処置は第１２日に開始し、マウスは、第１２、１４、１６、２１、２４、２６、３１、および第３３日に処置した。３つの応答パターンがみとめられた。パターン１では、マウス１において腫瘍が完全に退縮し、それぞれ、第１７日と第３４日に３つの画像を取得した。マウス４では、腫瘍増殖が遅かったが腫瘍は退縮しなかった。マウス５では、腫瘍は第１７日までに退縮したが、その後、第３４日に再度出現した。
【０３０３】
総合すると、２つの異なる腫瘍モデルを用いたこれらの試験では、ＤＴＥＧＦ１３のヒトＥＧＦおよびＩＬ１３がマウスＥＧＦおよびＩＬ１３と交差反応性であるモデルにおいて、ＤＴＥＧＦ１３が高度に有効な抗腫瘍剤であることが示された。また、この所見により、該薬剤が前立腺癌および膠芽細胞腫に対する作用において高度に活性であること、ならびに同じ分子上でのＥＧＦ部分とＩＬ１３部分の両方の位置が、その卓越した抗腫瘍効果に寄与していることが示された。
【０３０４】
実施例１０．ＭＩＡＰａＣａ−２膵臓腺癌腫腫瘍細胞に対するＤＴＥＧＦ１３とＥＧＦ１３ＫＤＥＬの効果
他の毒素部分がＥＧＦ１３免疫毒素のＤＴ３９０として有効に作用し得るかどうかを調べるため、ＤＴ３９０部分の核酸配列をＥＧＦ１３コード配列から除き、シュードモナス体外毒素ＡＫＤＥＬ配列をコードする核酸配列をＥＧＦ１３部分の３’末端に、標準的な分子生物学的手法を用いて付加した。ＭｉａＰａＣａ−２膵臓腺癌腫瘍細胞を、種々の濃度のＤＴＥＧＦ１３またはＥＧＦＫＤＥＬのいずれかで７２時間処理した。７２時間後、３Ｈ−チミジン取込みによって細胞増殖を測定し、これを、対照細胞に対するパーセンテージとして報告する（図１６）。ＥＧＦ１３ＫＤＥＬ免疫毒素は、．０００００１４ｎＭのＩＣ５０値を示したのに対し、ＤＴＥＧＦ１３はＩＣ５０値が０．００２２ｎＭであった。これらのデータは、さらなる毒性ドメインが免疫毒性ＥＧＦ１３組成物においてに有効であることを示す。
【０３０５】
実施例１１．ＭＩＡ  ＰａＣａ−２腫瘍内ヌードマウス側腹部腫瘍モデルにおけるＤＴＥＧＦ１３
ＤＴＥＧＦ１３が膵臓腫瘍増殖をインビボで抑止する能力を試験するため、ヒトＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞をヌードマウスの側腹部に異種移植した。腫瘍が確立されて触知可能になったら、マウスを上記のＤＴＥＧＦ１３の反復ｉ．ｔ．注射で処置した。図１７（図１７Ａおよび１７Ｂ）に示す実験１では、ＤＭＥＭ中に懸濁させた１×１０７個の腫瘍細胞を、全身照射（ＴＢＩ）に供しなかったマウスの側腹部内に注射した。この方法では、腫瘍確立の割合が不充分であった（注射動物の＜４０％）。腫瘍が発生した動物のうち３匹には、３週間の期間で１０回のＤＴＥＧＦ１３注射という集中的な過程を行なった。この実験では、対照腫瘍増殖は、ほとんどの動物において所望されたよりも遅かった（図１７Ａ）。しかしながら、ＤＴＥＧＦ１３処置は、試験期間を通して腫瘍増殖のブロックにおいて有効であった（図１７Ｂ）。
【０３０６】
実験２では、動物を、１×１０７個のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の注射の１日前に、３００Ｒａｄ（放射線吸収線量）のＴＢＩに曝露した。より良好な腫瘍増殖を促進するため、細胞を、ＤＭＥＭとマトリゲルの１：１混合物にて注射した。ＴＢＩとマトリゲルの組合せにより、腫瘍生着率が＞９５％に増大した。第１８日、腫瘍生着後、実験マウスに、２．５μｇのＤＴＥＧＦ１３、ＤＴＥＧＦ、またはＤＴＩＬ１３いずれかの４回のｉ．ｔ．注射をｑ．ｏ．ｄ．で行ない、一方、対照マウスには、ＰＢＳのｉ．ｔ．注射を同じスケジュールで行なった。図１７Ｃは、最高度の抗腫瘍有効性がＤＴＥＧＦ１３投与で得られたことを示し、図１７Ｄは、ＤＴＥＧＦ１３処置群内の個々の動物の腫瘍体積を示す。各動物は、顕著な腫瘍体積の縮小を示し、腫瘍の１つは完全に退縮した。しかしながら、処置関連毒性は、この実験で動物に施した全身照射によって増強された（図１７Ｅ）。これまでは充分許容されていた処置レジメンに従ったにもかかわらず、体重減少と死亡例（３匹／５匹の動物）が生じた。
【０３０７】
実験３では、非照射マウスの左側腹部に、１×１０７個のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（ＤＭＥＭとマトリゲルの１：１混合物１００μｌに懸濁）を皮下注射した。この方法により、ＴＢＩに関連する望ましくない副作用が導入されることなく、１００％の腫瘍確立が助長された。図１８Ａは、未処置である（ｔｈｅ  ｗｅｒｅ  ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）か、または陰性対照ＤＴ２２２２で処置したマウス群で観察された腫瘍進行と比べたときの、ＤＴＥＧＦ１３の有意な抗腫瘍効果を示す。マウスにおける腫瘍増殖はＤＴＥＧＦ１３処置によって抑止されたが、ＤＴＥＧＦ１３処置の中止後、一部において再発が生じた。２．５μｇのＤＴＥＧＦ１３の６回のｉ．ｔ．注射の過程は許容され、動物の体重で示される有意な毒性はなかった（図１８Ｂ）。
【０３０８】
総合すると、これらの試験は、ＤＴＥＧＦ１３のヒトＥＧＦおよびＩＬ−１３がマウスＥＧＦＲおよびＩＬ−１３Ｒと交差反応性であるモデルにおいて、ＤＴＥＧＦ１３が高度に有効な抗腫瘍剤であること、該試薬がヒト膵臓癌に対して高度に有効であること、ならびに同じ分子内に存在するＥＧＦ部分とＩＬ−１３部分の両方がその卓越した抗腫瘍効果に寄与していることを示す。
【０３０９】
実施例１２．ＥＧＦ１３の予備投与によりマウスは致死量のＤＴＥＧＦ１３から保護される
ＤＴ３９０毒性ドメインのないＥＧＦ１３ポリペプチドの投与により、マウスが致死量のＤＴＥＧＦ１３から保護され得るかどうかを調べるため、正常マウスにＥＧＦ１３（または対照生理食塩水溶液）を腹腔内（ｉ．ｐ．）にて予備投与し、次いで、致死量のＤＴＥＧＦ１３（５μｇ）をｉ．ｐ．投与した。各動物の体重と生存を１３日間にわたってモニターした（図１９）。致死量のＤＴＥＧＦ１３の前にＥＧＦ１３予備投与を受けなかった対照マウスの８０％が体重減少を示し、第３日までに死亡した（図１９Ａ）。対照的に、ＥＧＦ１３の予備投与を受けたマウスはいずれも実質的な体重減少を示さず、これらのマウスはすべて、試験の第１３日まで生存していた（図１９Ｂ）。これらの結果は、ＥＧＦ１３の予備投与によりマウスがＤＴＥＧＦ１３の致死性負荷刺激から保護されることを示す。
【０３１０】
ＥＧＦ１３の予備投与のタイミングが、致死量のＤＴＥＧＦ１３からのマウスの保護効果に重要であるどうかを調べるため、正常マウスに、ＥＧＦ１３（または対照タンパク質「２２１９」）の予備投与を、ＤＴＥＧＦ１３の投与の５分前または３０分前のいずれかで行なった。「２２１９」タンパク質は、ＣＤ１９タンパク質に特異的なｓＦｖ免疫グロブリン断片に結合されたＣＤ２２タンパク質に特異的なｓＦｖ免疫グロブリン断片からなるものであった。このタンパク質はＥＧＦ受容体またはＩＬ１３受容体を認識することができず、したがって、これらの試験の対照として供した。予備投与により、タイミングに関係なく、動物はすべて保護された。非反応性２２１９タンパク質が投与された、または予備投与なしの対照マウスはほぼすべてが第５日までに死亡した。対照的に、ＤＴＥＧＦ１３投与の５分前または３０分前に予備投与を受けたマウスはすべて、試験の第１１日まで生存した（図２０）。これらの結果は、予備投与のタイミングは、致死量のＤＴＥＧＦ１３からの保護効果に実質的に影響しないことを示す。
【０３１１】
実施例１３．体循環ポンプを用いたマウスへのＤＴＥＧＦ１３の送達
マウスにおける腫瘍増殖に対する体循環ポンプによるＤＴＥＧＦ１３免疫毒素の送達の有効性を調べるため、１０７個のＭＩＡＰａｃａ−２細胞（細胞混合物：マトリゲルが１：１）を、雄ヌードマウスの側腹部に投与した。腫瘍注射後の第１１日に、Ａｌｚｅｔ  １００７Ｄ浸透圧ポンプを右肩甲骨（左側腹部腫瘍と反対側）付近に埋入し、マウスに５０μｇのＤＴＥＧＦ１３（またはビヒクル対照）を送達するのに使用した。マウスにおける腫瘍増殖をデジタル式カリパスで測定した。図２１Ａに示されるように、ＤＴＥＧＦ１３の体循環ポンプ送達により、処置なしと比べると、処置マウスにおいて平均腫瘍体積が低減された。処置動物において、体循環ポンプ送達されたＤＴＥＧＦ１３による体重減少はなかった（図２１Ｂ）。
【０３１２】
実施例１４．ラットＵ８７（膠芽細胞腫）腫瘍モデルにおけるＤＴＥＧＦ１３の有効性
ＤＴＥＧＦ１３が膠芽細胞腫増殖をインビボで抑止する能力を試験するため、ヒトＵ８７−ｌｕｃ細胞（ルシフェラーゼタンパク質をコードする核酸を安定的に発現するＵ８７膠芽細胞腫細胞）を胸腺欠損ヌードラットに頭蓋内注射した。ＤＴＥＧＦ１３（計１μｇ）は、腫瘍注射後の第８日と第１５日に、Ｕ８７−ｌｕｃ腫瘍を有するラット群（Ｎ＝５）にマイクロインフュージョンポンプによって頭蓋内注射した。プラセボ（リン酸緩衝生理食塩水；ＰＢＳ）を受けた５匹の対照ラット群（これらはすべて第４２日までに死亡した）と比べると、５匹の処置ラットのうち３匹が完全な腫瘍退縮を示した（図２２Ａおよび２２Ｃ）。また、ＤＴＥＧＦ１３注射後、最小限の体重減少が検出され、これは、該化合物がラットにおいて充分許容されることを示す。ＤＴＥＧＦ１３化合物のヒトＥＧＦおよびＩＬ１３はマウスＥＧＦＲおよびＩＬ１３Ｒに結合し、これは、ラットモデルにおけるＤＴＥＧＦ１３のオンターゲット効果を示す。
【０３１３】
第２の実験では、ヒトＵ８７−ｌｕｃ細胞（ルシフェラーゼタンパク質をコードする核酸を安定的に発現するＵ８７膠芽細胞腫細胞）を胸腺欠損ヌードラットに頭蓋内注射した。ＤＴＥＧＦ１３（計１μｇ）は、腫瘍注射後の第８日と第１５日に、Ｕ８７−ｌｕｃ腫瘍を有するラット群（Ｎ＝５）にマイクロインフュージョンポンプによって頭蓋内注射した。この場合、ＤＴＥＧＦ１３で処置した５匹のラットのうち２匹は完全な腫瘍退縮を示した。最初は退縮を示したが後に再発したラットが１匹いた。ＤＴ２２２２（上記）対照免疫毒素を受けた５匹の対照ラットのうち４匹は、第４２日までに死亡した（図２２Ｂおよび２２Ｃ）。
【０３１４】
これらの結果により、ＤＴＥＧＦ１３は、ヒト膠芽細胞腫増殖をインビボで抑止することができ、場合によっては、その完全な退縮をもたらし得ることが示された。
【０３１５】
実施例１５．ＤＴＥＧＦ１３の最大耐用量の決定および毒性の評価
ラットにおけるＤＴＥＧＦ１３の最大耐用量（ＭＴＤ）を調べるため、正常ラット（ｎ＝３／群）に種々の濃度（０．５、１、２、４および８μｇ）のＤＴＥＧＦ１３または対照としてのＰＢＳを、第０日と第７日に頭蓋内注射した。動物の物理的外観および行動変化を毎日モニターした。生存曲線を図２３に示す。この実験の結果により、ラットにおけるＤＴＥＧＦ１３頭蓋内注射のＭＴＤは１μｇ／注射であることが示された。
【０３１６】
ＤＴＥＧＦ１３化合物がラットモデルにおいて、なんらかの肝臓毒性または腎臓毒性を示すかどうかを調べるため、正常ラット（ｎ＝５／群）に１μｇのＤＴＥＧＦ１３または対照としてのＰＢＳを、第０日と第７日に頭蓋内注射した。例えば、Ｒｕｓｔａｍｚａｄｅｈら（２００６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １２０：４１１−４１９に記載のようにして、正常ラット（Ｎ＝５／群）において、ＤＴＥＧＦ１３処置に起因する任意の肝臓損傷を、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを測定することによりモニターし、腎臓損傷を、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルを測定することによりモニターした。最後の注射の後、第２１日と第１４日に各ラットから血液を採取し（顔面静脈）、解析した。ＡＬＴ（図２４Ａ）またはＢＵＮ（図２４Ｂ）レベルにおいて、対照群と比べたとき、ＰＢＳとＤＴＥＧＦ１３処置群間に有意差は観察されず、これは、この用量が腫瘍の処置に有効であっただけでなく、重要な器官系に毒性をもたらさなかったことを示す。
【０３１７】
ヒト被験体における本明細書に記載の任意の受容体標的化試薬の使用のための有効性および／または安全性パラメータの確立において、他の前臨床試験動物（例えば、マウス、ウサギ、モルモット、ブタ、イヌ、ネコ、または非ヒト霊長類）において、および他の投与経路（例えば、全身投与）で、同様の解析が行なわれ得ることは理解されよう。
【０３１８】
実施例１６．ＥＧＦ４ＫＤＥＬがＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を死滅させる能力の測定
ＥＧＦおよびＩＬ−４を含む二重特異性免疫毒素もまた、腫瘍細胞毒性の増強を示すかどうかを調べるため、ＥＧＦ、ＩＬ−４、およびシュードモナス体外毒素の生物学的に活性な断片／ＫＤＥＬ配列（構築物命名法において「ＫＤＥＬ」と称されている）を含む融合タンパク質（ＥＧＦ４ＫＤＥＬ）をコードする核酸（上記の手法を使用；ＥＧＦＫＤＥＬ分子のアミノ酸配列を配列番号１９に示す）を構築した。ＥＧＦ４ＫＤＥＬ免疫毒素を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞の死滅における有効性について試験した。該細胞を種々の濃度のＥＧＦ４ＫＤＥＬ、ＩＬ４ＫＤＥＬ、およびＥＧＦ４ＫＤＥＬで処理し、細胞の増殖に対する免疫毒素の効果を測定した（上記のとおり；図２５Ａ参照）。ＥＧＦ４ＫＤＥＬは、乳癌細胞の死滅において高度に有効であり、１×１０−７未満のＩＣ５０を有したのに対し、単一特異性ＩＬ４ＫＤＥＬ試薬ではＩＣ５０が０．０００９および単一特異性ＥＧＦ４ＫＤＥＬ試薬ではＩＣ５０が０．０００１であった。同様の結果が、いくつかの他のヒト乳癌細胞株、例えば、ＭＣＦ−７細胞（ＩＣ５０は０．００４ｎＭ）、ＳＫＢＲ３細胞（ＩＣ５０は０．０３ｎＭ）、およびＢＴ４７４細胞（ＩＣ５０は０．００２ｎＭ）などでも得られた。また、Ｕ８７細胞、Ｕ１１８細胞、ＭｉａＰａＣａ−２細胞、ＰＣ−３細胞、ＳＷ１９９０細胞、およびＨＴ２９細胞でも同様の結果が得られ、これは、ＤＴＥＧＦ１３免疫毒素などのＥＧＦ４ＫＤＥＬ免疫毒素が、広範なヒト癌細胞（例えば、乳癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、および結腸癌の細胞、ならびに膠芽細胞腫細胞）において広く有効であることを示す。
【０３１９】
ＥＧＦ４ＫＤＥＬ免疫毒素の活性の特異性を調べるため、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を種々の濃度のＥＧＦ４ＫＤＥＬ、ＩＬ４ＫＤＥＬ、およびＥＧＦ４ＫＤＥＬ、またはＢｉｃ３、２２１９ＥＡ、およびＤＴ２２１９ＡＲＬ対照で処理し、該細胞の増殖に対する免疫毒素の効果を測定した。Ｂｉｃ３、ＤＴ２２１９ＡＲＬ、および２２１９ＥＡ二重特異性免疫毒素はこの乳癌細胞に結合しない。一方、ＥＧＦ４ＫＤＥＬは、この場合も、乳癌細胞の死滅において高度に有効であり、０．０００００１１のＩＣ５０を有したが、Ｂｉｃ３、ＤＴ２２１９ＡＲＬ、および２２１９ＥＡが有したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する死滅効果は最小限であった（図２５Ｂ）。
【０３２０】
別の実験において、ＥＧＦ４ＲまたはＩＬ４Ｒを発現しないヒトＴ細胞株であるＨＰＢ−ＭＬＴ細胞をＥＧＦ４ＫＤＥＬおよびＢｉｃ３で処置し、該細胞の増殖に対する効果を測定した。ＨＰＢＭＬＴ細胞増殖は、Ｂｉｃ３陽性対照試薬によって有意にもたらされたが、ＥＧＦ４ＫＤＥＬによる阻害は最小限に留まった（図２５Ｃ）。これらの結果は、ＥＧＦ４ＫＤＥＬ試薬が、ＥＧＦ４ＲおよびＩＬ４Ｒを発現する細胞の死滅において有効で特異的であることを示唆する。
【０３２１】
実施例１７．抗ＥＧＦおよび抗ＩＬ４抗体がＥＧＦ４ＫＤＥＬ誘導性死滅をブロックする能力の測定
ＥＧＦおよびＩＬ４がともに、ＭＤＱ−ＭＢ−２３１細胞のＥＧＦ４ＫＤＥＬ誘導性死滅に重要であることを確認するため、ブロック実験を行なった。５０μｇ／ｍｌの抗ＥＧＦまたは抗ＩＬ４抗体を、ＥＧＦ４ＫＤＥＬによる細胞の死滅をブロックする能力について試験した（図２６）。ＥＧＦ４ＫＤＥＬ（０．１ｎＭ）を細胞とともに、抗ＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１３抗体または対照抗体（Ｌｙ５．２）の存在下または非存在下で、７２時間培養した。いずれかの抗体をＥＧＦ４ＫＤＥＬに添加すると、両抗体は、抗増殖効果の約７０〜８５％をブロックすることができた。対照的に、対照抗マウスＬｙ５．２抗体の添加はブロック効果がなかった。
【０３２２】
総合すると、これらのデータにより、両方のリガンド（ＥＧＦおよびＩＬ４）がＥＧＦ４ＫＤＥＬ分子の活性に重要であることが示された。
【０３２３】
実施例１８．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１癌細胞増殖に対するＤＴＥＧＦ４の効果
毒性領域としてジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素を含むＥＧＦ４構築物もまた、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を死滅させることができるかどうかを調べるため、ジフテリア毒素（ＤＴ）分子の最初の３８９アミノ酸をコードする核酸、７アミノ酸ＥＡＳＧＧＰＥ（配列番号１４）リンカーをコードするヌクレオチド配列、ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）をコードするヌクレオチド配列、ヒト筋肉アルドラーゼ（ｈｍａ）の２０アミノ酸セグメント（ＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ（配列番号１３）をコードするヌクレオチド配列、インターロイキン４（ＩＬ４）をコードするヌクレオチド配列を構築した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、種々の濃度のＥＧＦ４ＫＤＥＬ、ＤＴＥＧＦ４、およびＤＴＥＧＦ１３免疫毒素で処理し、該細胞の増殖に対する該毒素の効果を測定した。ＥＧＦ４ＫＤＥＬ、ＤＴＥＧＦ４、ＤＴＥＧＦ１３は、各々、乳癌細胞の死滅において高度に有効であり、それぞれ、０．００２ｎＭ、０．１ｎＭ、および０．０２ｎＭのＩＣ５０を有した（図２７）。
【０３２４】
これらのデータにより、少なくとも２種類の異なる毒素を含む二重特異性ＥＧＦ４分子が腫瘍細胞の死滅に有効であることが示された。
【０３２５】
実施例１９．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍内ヌードマウス腫瘍モデルにおけるＥＧＦ４ＫＤＥＬ
ＥＧＦ４ＫＤＥＬが乳腺腫瘍増殖をインビボで抑止する能力を試験するため、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞をヌードマウスの脾臓内に異種移植した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ホタルルシフェラーゼタンパク質をコードする外因性核酸を含み、これを安定的に発現するものであった（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞）。１×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞をマウスに、脾臓内（ＩＳ）注射によって投与した。第６１日、器官を取り出し、蛍光分光法によって画像を取得し、発生中の腫瘍の位置を調べた（図２８）。このデータは、脾臓内注射により、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞が肝臓および他の器官に転移し、そこで安定的にゆっくり増殖するモデルがもたらされることを示す。
【０３２６】
別の実験において、１×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞をマウス（Ｎ＝４）に、ＩＳ注射によって投与した。また、マウスに４μｇのＥＧＦ４ＫＤＥＬ、またはＢｉｃタンパク質（上記）もｉ．ｐ．によって、各週４日間で９週間投与した。腫瘍発生の阻害がＥＧＦ４ＫＤＥＬで処置したマウス４匹のうち３匹（７５％）において観察され、そのうち２匹のマウスでは、第６８日において腫瘍の形跡が示されなかった（図２９ＡおよびＣ）。陰性対照Ｂｉｃ３を受けたマウスの腫瘍は治療に応答しなかった（図２９Ｂ）。治療応答群マウスにおいて有意な体重減少はみられなかったが、治療に応答しなかったマウスでは体重の変化がみられた（図２９Ｃ）。
【０３２７】
別の実験において、１×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞をマウスにＩＳ注射によって投与した。また、マウスに、４μｇのＥＧＦ４ＫＤＥＬ、または２２１９ＡＲＬＫＤＥＬ対照タンパク質（上記）もｉ．ｐ．によって、各週４日間で９週間投与した。腫瘍増殖の抑止がＥＧＦ４ＫＤＥＬで処置したマウスにおいて観察されたが、陰性対照２２１９ＡＲＬＫＤＥＬ毒素を受けたマウスの腫瘍は治療に応答しなかった。
【０３２８】
総合すると、これらの試験は、ＥＧＦ４ＫＤＥＬのヒトＥＧＦおよびＩＬ−４がマウスＥＧＦＲおよびＩＬ４Ｒと交差反応性であるモデルにおいて、ＥＧＦ４ＫＤＥＬが高度に有効な抗腫瘍剤であることを示す。該試薬はヒト乳癌に対して高度に有効であること、および同じ分子内に存在するＥＧＦ部分とＩＬ４部分がその卓越した抗腫瘍効果に寄与していることを示す。
【０３２９】
実施例２０．変異による毒素の免疫原性の低減
二重特異性免疫毒素の毒素成分の免疫原性が低減される効果において、ＥＧＦ１３融合タンパク質が、一連のアミノ酸置換を有するシュードモナス体外毒素（ＰＥ）タンパク質（配列番号１１）のＣ末端融合部を含む一連のＥＧＦ１３変異型を構築した。各タンパク質は、表１に概略を示す一連の置換を含むものとした。
【０３３０】
【表１】
2010536386.tif 000015
７つの顕著な免疫優性エピトープがＰＥ毒素内に見出された（例えば、Ｏｎｄａら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００８年８月４日（出版前に電子公開）を参照）。種々のタンパク質を抗膵臓癌活性について、上記のチミジン取込み増殖アッセイを用いてインビトロで試験した。４種類のＰＥ変異型を作製し、すべての免疫原性のエピトープ（１〜７）に置換を有する「７」変異バリアントと、さらなる置換アミノ酸を有する「８」変異バリアントを含めた。「５」変異バリアントは、エピトープ１〜５のみに置換を含むものとした。変異型タンパク質を発現させ、単離し、９５％より高い純度まで精製した。次いで、これを、ＥＧＦＲおよびＩＬ１３Ｒ発現ＳＷ１９９０膵臓癌細胞を死滅させる能力について試験した。８変異構築物は、２ｌｏｇ低い活性を有し、これは、該毒素の立体配置の改変を示す。２つの７変異構築物（これらは、各７エピトープ領域に変異を有する）および５変異構築物で示されたインビトロで膵臓癌細胞を死滅させる能力の低下は最小限であった（図３０Ａ）。
【０３３１】
５変異ＥＧＦ１３ＰＥタンパク質を、ＩｇＧ抗体反応性についてサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにて試験した。このアッセイは、高度に精製されたＰＥ毒素の使用に基づくものであり、該毒素をまずプレートに接着させ（ＥＧＦ１３ＰＥ毒素のタンパク質と同じアミノ酸配列）、続いて、試験血清と、マウスＩｇＧに特異的であり、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＰ）にコンジュゲートさせた二次抗体とを添加する。ＰＥ毒素に対するマウス血清中の抗体の結合を、比色定量アッセイを用いて測定する。親ＰＥ毒素を使用し、標準曲線によってｒ２＝０．９５５２が求められた。同ＰＥタンパク質の週４回注射を行い、次いで、最後の注射の４日後に採血した８匹の正常ＢＡＬＢ／ｃマウスのプール由来の第１の試験血清試料が、その血清中において高レベル（１，０７２μｇ／ｍｌ）の抗ＰＥ抗体を示した（表１）。２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスをＥＧＦ１３  ５  ｍｕｔタンパク質（表１）で同じように免疫処置し、次いで、個々に試験した。これらの２匹のマウスは、それぞれ、血清中に１８．６および２２６．４μｇ／ｍｌの抗ＰＥ抗体を有すると測定され、非変異型形態のＰＥからの約８０％および９８％の低減であった。これらのデータにより、７つの免疫優性エピトープのうち５つにおいてＥＧＦ１３ＰＥを変異させると、毎週反復注射に対する抗体応答を生じる能力が有効に低減されることが示された。ＥＧＦ１３ＰＥ  ７  ｍｕｔタンパク質でも同様の結果が得られることが予測される。
【０３３２】
実施例２１．インビボ腫瘍モデルにおける予備投与の効果
上記の試験（実施例１２）により、毒素を含む二重特異性分子を投与する前に、動物に非毒性二重特異性分子を予備投与することは、正常マウスにおいて、該二重特異性免疫毒素分子と関連する毒性の低減に有効であることが示された。インビボ腫瘍モデルにおいて予備投与（またはプロフェクティシャス（ｐｒｏｆｅｃｔｉｔｉｏｕｓ）薬物送達またはＰＤＤ）の有効性を試験するため、ＭｉａＰａＣａ−２同所性膵臓癌モデルを使用した。ＭｉａＰａＣａ−２細胞は、ホタルルシフェラーゼタンパク質をコードする外因性核酸を含み、これを安定的に発現させるものであった（ＭｉａＰａＣａ−２−ｌｕｃ細胞）。１×１０６個のＭｉａＰａＣａ−２−ｌｕｃ−ｌｕｃ細胞を、マウスの膵臓に注射によって投与した。また、マウスに、７．５μｇのＤＴＥＧＦ１３または２００μｇのＥＧＦ１３と７．５μｇのＤＴＥＧＦ１３もｉ．ｐ．注射によって投与した。ＥＧＦ１３とＤＴＥＧＦ１３の両方を受けた動物において、ＥＧＦ１３の注射は、ＤＴＥＧＦ１３タンパク質の注射の約３０分前に行なった。動物には、３回の注射をＱＯＤで５週間行なった。処置を受けなかった動物は進行性の膵臓癌を示したが（図３１Ａ）、非免疫毒性のＥＧＦ１３の予備投与を受けた動物は、腫瘍負荷の劇的な低減を示した（図３１Ｂ）。また、ＰＤＤは、動物の体重によって測定した場合でも、毒性の低減に有効であった。各ＤＴＥＧＦ１３の注射はＭＴＤの１５倍を超え、動物は合計１５回の注射を受けた。このことにもかかわらず、上記のＰＤＤ群（マウス８〜１４）の動物の平均体重は減少せず（図３２）、これは、このレジメンの毒性が最小限であることを示す。
【０３３３】
他の実施形態
本発明を、その詳細説明に関して説明したが、前述の説明は例示を意図するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって規定される。他の態様、利点および変形例は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図１Ａ】
2010536386.tif 000016
【図１Ｂ】
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【図３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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