(57)【要約】  基板に設けられたチャネルと、プラズモン共鳴が可能であり、金属部分によって生じた電磁界が前記チャネルを通過する分子と相互作用するのに適した位置で前記チャネルと結合している金属部分と、前記チャネルを通過するように分子を誘導する手段と、前記金属部分において表面プラズモン共鳴を誘導する手段と、前記金属部分によって生じた電磁界と前記チャネルを通過する分子との間の相互作用を検出する手段とを備える、分子を調査するための装置。分子を調査する方法も提供される。
2010538290.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板に設けられた少なくとも１つのチャネルであって、分子が通過するのに適しているチャネルと、
プラズモン共鳴が可能な少なくとも１つの金属部分であって、該金属部分によって生じた電磁界が前記チャネルを通過する分子と相互作用するのに適した位置で前記チャネルと結合している少なくとも１つの金属部分と、
前記チャネルを通過するように分子を誘導する手段と、
前記金属部分において表面プラズモン共鳴を誘導する手段と、
前記金属部分によって生じた電磁界と前記チャネルを通過する分子との間の相互作用を検出する手段とを備える、
分子を調査するための装置。
【請求項２】
基板によって互いに区切られている２つのリザーバを備え、第１のリザーバは、調査する分子を含むサンプルを入れるのに適しており、第２のリザーバは、分子がチャネルを通過次第、該分子が移行するのに適している請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記チャネルが開口である請求項１又は２記載の装置。
【請求項４】
前記開口が約０．５ｎｍ〜１００ｎｍの直径を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記開口が約１ｎｍ〜５０ｎｍの直径を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
前記開口が約１ｎｍ〜３０ｎｍの直径を有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
前記開口が約１ｎｍ〜５ｎｍの直径を有する請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記開口が有機ポアを含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記開口がゲルによって設けられている請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記開口がフィルムなどの基板において設けられている請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記開口が、多孔質の金、コロイド結晶、コロイドのキャビティ及び金属トロイドからなる群より選択されたナノ多孔質材料から形成されている請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
基板を通る複数の開口を備える請求項１〜１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
前記開口がアレイで配置されている請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
前記金属部分が金、銀、銅又はアルミニウムを含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１５】
前記金属部分が実質的に球状である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
前記金属部分が実質的に環状である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
前記金属部分が多角形の角柱である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１８】
前記金属部分が５０ｎｍ〜１５０ｎｍの直径を有する請求項１〜１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
前記金属部分が、チャネルを通過する分子から５０ｎｍ又はそれ以下の位置にあるように配置されている請求項１〜１８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２０】
チャネルを通過するように分子を誘導する手段は、電気泳動を誘導する１つもしくは複数の手段、マイクロ流体工学装置又はレーザートラッピング装置を含む請求項１〜１９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２１】
開口の方へ、開口内へ及び／又は開口を通しての分子の通過を制御する制御手段を備える請求項１〜２０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２２】
前記制御手段が、分子が通過する多孔性のマトリックスを備え、該多孔性のマトリックスが、チャネルへの入り口に直接隣接して位置する請求項２１記載の装置。
【請求項２３】
金属部分と分子との相互作用を検出する手段が、蛍光を検出する手段又はラマン散乱を検出する手段を含む請求項１〜２２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２４】
蛍光を検出する手段が、光電子増倍管又はアバランシェ・フォトダイオードを含む請求項２３記載の装置。
【請求項２５】
ラマン散乱を検出する手段が、ラマン・スペクトロメータを含む請求項２３記載の装置。
【請求項２６】
調査する分子を含む液体のサンプルを準備するステップと、
基板に設けられたチャネルであって、プラズモン共鳴を有するように誘導される結合した金属部分を有するチャネルを通過するように前記分子を誘導するステップと、
前記金属部分によって生じた電磁界とチャネルを通過する分子との間の相互作用を検出するステップとを含む、
分子を調査する方法。
【請求項２７】
前記分子が生体分子である請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記分子が核酸である請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記分子が、金属部分と相互作用する標識を含む請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記標識がフルオロフォアである請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記標識が、ローズ・ベンガル（Rose Bengal）、Ｃ５−マレイミド、Ｃ２−マレイミド、ローダミン・レッド、Ｃ２−マレイミド及びローダミン・グリーンのうちの１種である請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記標識が、前記金属部分の局在表面プラズモン共鳴のピークよりわずかに低いエネルギーでの放出ピークを有する請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
基板に設けられた少なくとも１つのチャネルであって、分子が通過するのに適しているチャネルと、
プラズモン共鳴を誘導することが可能な少なくとも１つの金属部分であって、該金属部分によって生じた電磁界が前記チャネルを通過する分子と相互作用することができるような位置で前記チャネルと結合している少なくとも１つの金属部分とを備える、
分子を調査する装置への使用に適した基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子、詳細には核酸又はタンパク質などの生体分子を調べるための装置及び方法に関する。装置及び方法は、これらの分子の迅速かつ詳細な分析の課題へのナノスケールの技術の適用に関する。一態様において、本発明は、核酸を配列決定する装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を迅速に配列決定する能力は、依然として生物学において最も重要なものである。多くのゲノム（ヒトを含む）の全配列は現在では既知であり、更に多くのものが利用できるようになっているが、多くの理由で配列データを得る必要性が残っている。現在の配列決定技術は、主に、サンガー（「ジデオキシ」）技術を基にしており、根気のいるものであり、かつ遅い。ポリメラーゼによる単一のヌクレオチドの挿入の検出を伴う方法は、ポリメラーゼが相補DNA鎖を合成することができる比較的低速なものに本質的に限られている。現在、単一の配列決定装置における最大の配列決定の速度は、約1塩基／秒であり、従来のサンガー配列決定技術を超える改善がなされているが、これは、まだ非常に遅いものである。
【０００３】
DNAが導電性のポアを通過するときに電流の変化を検出することによってDNAを配列決定する方法が提案されている。そのような方法は、検出の理論上の最大速度が高いものであるが、今まで、比較的低い検出速度が達成されており、導電性の標識の全体の設計又は使用の大幅な改良がなければ、検出の限界が低いままである。
【０００４】
生物学のようなナノテクノロジーは、急速に発展し、かつ分子の操作及び分析のための新規なアプローチ及び材料をもたらす領域である。ナノテク技術者は、現在、サブナノメートルのスケールまでの材料を製造し、かつ操作することが可能である。これは、新規かつ以前に考慮されていない可能性を有する装置又は技術の開発の可能性をもたらすものである。しかしながら、ナノテクノロジーが、たとえば電子産業における有用性を見出したものではあるものの、まだ、生物学の分野において幅広く利用されていない。
【０００５】
プラズモン共鳴は、金属の表面上のプラズモンが表面上への光の入射によって励起される現象である。プラズモン共鳴は、Biacore（登録商標）などの多くの従来の分析機器において使用されている。平面上のプラズモンが励起される場合には、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance, SPR）という用語が用いられ、ナノメートルサイズの粒子が励起される場合には、局在表面プラズモン共鳴（localised surface plasmon resonance, LSPR）という用語が現象のこの態様を区別するためによく用いられる。小さい金属粒子が光で照射された際に、振動電界が粒子の電子をコヒーレントに振動させる。これらの電子の集団振動は、双極子プラズモン共鳴と呼ばれている。電子雲における集団振動は、強力な、極めて局在した電磁界（electromagnetic field, EMF）を生じる。これらの集団振動を生じるためには、正確な励起波長を用いなければならない。この波長は、励起される金属粒子又はナノ構造体の大きさ及び形状の両方に依存する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
達成可能な極めて局在したSPRを用い、ナノテクノロジーの技術を用いることによって、生体分子の構造をナノメートルスケールで調査することができることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、
−基板に設けられた少なくとも１つのチャネルであって、分子が通過するのに適しているチャネルと、
−プラズモン共鳴が可能な少なくとも１つの金属部分であって、該金属部分によって生じた電磁界が前記チャネルを通過する分子と相互作用するのに適した位置で前記チャネルと結合している金属部分と、
−前記チャネルを通過するように分子を誘導する手段と、
−前記金属部分において表面プラズモン共鳴を誘導する手段と、
−前記金属部分によって生じた電磁界と前記チャネルを通過する分子との間の相互作用を検出する手段とを備える、
分子を調査するための装置が提供される。
【０００８】
適切には、装置は、２つのリザーバ、すなわち調査する分子を含むサンプルを入れるのに適した第１のリザーバと、分子がチャネルを通過次第、分子が移行するのに適した第２のリザーバとを備える。適切には、２つのリザーバは基板によって互いに区切られており、分子は、少なくとも１つのチャネルを通過して、第１のリザーバから第２のリザーバへ移行しなければならない。従って、基板は、２つのリザーバを分ける膜又は隔壁とみなすことができる。
【０００９】
概して、チャネルの寸法は、調査する分子がチャネルを通過するのに適したものであるべきであり、従って、分子は金属部分の近くで通過することを強いられ、それ故に分子と金属部分によって生じた局在EMFとの間の相互作用が生じる。また、チャネルは、概して、１つの分子のみが同時にチャネルを通過することができるような適した寸法を有するべきである。
【００１０】
概して、チャネルは開口であるのが好ましいが、基板に設けられたスロット又は溝などのチャネルの他の形態も適しており、可能である。
【００１１】
開口は、いずれの適切な形状を有するが、円形又はほぼ円形の開口が最も便利なものとして想定される。
【００１２】
開口（又はチャネル）は、約０．５ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ又はそれ以下、特に３０ｎｍ又はそれ以下の直径を有してもよい。直径という用語を用いるが、当然のことながら、厳密な幾何学的感覚を意図するものではなく、たとえば、非円形の開口又はチャネルの最も小さい寸法に適用してもよい。
【００１３】
多くの場合、基板における小さい開口は、「ポア」と呼ばれ、この用語は、本明細書全体にわたって用いられ、適宜解釈されるべきものである。
【００１４】
調査する分子が核酸である場合、一本鎖の核酸が通過する最も小さい開口は約１ｎｍである。二重鎖の核酸は、約２ｎｍ又はそれ以上の開口を通過する（Heng J. Bら, Biophysical Journal (2006)，90，1098-1106参照）。
【００１５】
従って、一重鎖の核酸を調査する場合、開口は、直径１ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは１ｎｍ〜３０ｎｍ、特に１ｎｍ〜１０ｎｍ、とりわけ１ｎｍ〜５ｎｍである。二重鎖の核酸においては、開口は、直径２ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは２ｎｍ〜３０ｎｍ、特に２ｎｍ〜４ｎｍである。
【００１６】
チャネルは、いずれの適した物質で形成してもよい。チャネルは有機又は無機であってもよい。
【００１７】
一実施態様において、開口は、「有機の」ポア、すなわち、天然に生じる構造体由来のポア、たとえばα−ヘモリシンなどのポアを有するタンパク質又はミトコンドリアの外膜で見られる有機のポアから形成されてもよい。
【００１８】
また、開口は、アガロース又はポリアクリルアミドなどの、核酸又は他の生体分子の操作に従来用いられているゲルで提供することができる。
【００１９】
もう一つの方法として、開口は、窒化ケイ素又は他のそのような材料から形成されたフィルムなどの基板において設計することができる。たとえば、窒化ケイ素からナノメートルの直径のポアを形成する方法について論じるHo C. ら, PNAS(2005), 102(30) 10445-10450を参照されたい。
【００２０】
また、開口は、多孔質の金、コロイド結晶、コロイドのキャビティ、金属トロイドなどのナノ多孔質材料から形成することもできる。Nettiらは、金のナノキャビティの形成及びその表面プラズモンを形成する能力について説明している（Netti M.C. ら, Advanced Materials (2001), 13(18), 1368-1370参照）。Aizpurua O.らは、金のナノリングの形成について説明している（Aizpuruaら, Physical Review Letters (2003), 90(5), 057401-1-057401-4参照）。Lesuffleurらは、プラズモン共鳴が増大した金のナノポアのアレイについて論じている（Lesuffleur A. ら, Applied Physics Letter (2007), 90, 243110参照）。開口自体がLSPRを示すことが可能な金属物質から形成されている場合、別個の金属部分が必要ではないことは明らかであろう。
【００２１】
本発明に適した種々の構造体を製造するためのナノ工学の手段は周知であるが、これも、急速に発展している技術分野である。そのようなものとして、本発明で必要とされている基板にてチャネルを形成するのに適した新規の技術及び材料が将来開発されることが期待され、そのような技術は本発明の範囲内である。
【００２２】
概して、装置が、基板を通る複数の開口を備えることが好ましい。開口は、各開口の位置を調整する場合、アレイで配置することができ、これは、ナノ工学を用いて基板に開口を形成する場合に特に好都合である。別の方法として、開口を、その位置の調整なしで基板にわたって散らすことができる。
【００２３】
金属部分は、表面プラズモンを形成することができ、それ故に、局在EMFを該部分の周辺に形成することができなければならない。この機能を達成するのに適しているいずれの材料も金属部分において使用するのに適している。金、銀、銅及びアルミニウムの金属が、プラズモンの形成及び伝搬の点からみて望ましい特性を有するとみられ、それ故に、概して、金属部分が、主として又は完全に、１種又は複数のこれらの金属から形成されているのが好ましい。
【００２４】
ナノテクノロジーによって、基本的にいずれの形状の金又は銀の粒子の形成が可能となる。形状は、粒子によって生じたEMFにかなりの影響を与えることができる（Mock J.J.ら, Journal of Chemical Physics, 116(15), 6755-6759参照）。
【００２５】
球状又は実質的に球状（たとえば球又は回転楕円体）の粒子は適した特性を有し、それ故に、金属部分の適した実施態様を形成する。５０ｎｍ〜１５０ｎｍの直径を有する球状の金属粒子が、高レベルの蛍光増感のために、特に適していることが見出されている（Nakamura及びHayashi, Japanese Journal of Applied Physics, 44(9A), 6833-6837参照）。
【００２６】
別の実施態様において、環状の金属部分をもちいてもよい。そのような環状の部分は特定の利益を有し、環内のEMFが強く、かつ環によって定められる内側の領域にわたって比較的一定であることが示されている（Aizpuruaらの前記の論文参照）。金属部分が環である場合、環自体が、分子が通過する開口を形成することができることは明らかである。そのようなナノの環を製造する方法は、Aizpuruaらの論文に示されている。
【００２７】
多角形の角柱又は他の複数の面を持った形状などの他の形状も適している。
【００２８】
明確にするために、特定のチャネルと結合している金属部分が１以上あってもよく、１以上の種類の金属を用いてもよいことを指摘する。実際には、各部分の区別可能なEMFの組み合わせの結果として最大のEMFの領域が生じるように、２又は３以上の金属材料を用いることが望ましい。これによって、極めて局在した領域において非常に高いEMFの値が生じる。
【００２９】
概して、金属部分が、ポアを通過する分子と相互作用する位置に配置されるが、ポアから十分に間隔を空けられていて、分子から放射されたシグナルのクエンチングを防ぐか、又は緩和することが重要である。これは多くの方法で達成できる。分子が通過するようにチャネルを成形し、かつその大きさを調整し、金属部分から近くなりすぎないか（それ故にクエンチングを避ける）、又は遠くなりすぎない（それ故に相互作用を確実にする）ような位置に制限し、これは、ポア自体がクエンチングの活性を有さない場合に特に適している。別の方法として、制御手段を用いて、金属部分に近くなりすぎないように分子を導いてもよい。
【００３０】
典型的には、金属部分の表面は、チャネルを通過する分子から５０ｎｍ又はそれ以下、好ましくは３０ｎｍ又はそれ以下、特に１０ｎｍ又はそれ以下の位置に配置されているべきである。
【００３１】
チャネルを通過するように分子を誘導する手段は、電気泳動を誘導する１つもしくは複数の手段、マイクロ流体工学装置又はレーザートラッピング装置であってもよい。しかしながら、チャネルへ及び／又はチャネルを通って移動するように分子を誘導するのに適したいずれの他の手段も適している。
【００３２】
装置は、開口の方へ、開口内へ及び／又は開口を通しての分子の通過を制御する制御手段を備えてもよい。制御手段は、速度、方向、位置又は分子の構造の１又は複数を制御するように適合されていてもよい。
【００３３】
制御手段の種類は、調査する分子の種類及び必要とされる制御の種類に応じて様々である。核酸の配列決定が必要とされる場合、直線状の核酸分子のチャネルの通過速度を制御することが重要である。配列決定において、核酸分子を直線状の構造に保持することも望ましい。
【００３４】
一実施態様において、制御手段は、分子が通過する多孔性のマトリックスを備え、該多孔性のマトリックスは、チャネルへの入り口に直接隣接して位置する。多孔性のマトリックスを用いる場合、電気泳動によってマトリックスを通過するように分子を誘導することが好都合である。電気泳動の条件と組み合わせての多孔性マトリックスの特性によって、マトリックスを通しての及びチャネルへの分子（たとえば核酸）の移動の良好な制御が可能になる。ゲルを通しての核酸の移動の速度の正確な制御を達成できる。多孔性マトリックスによる電気泳動の更なる利益は、直線状の分子の構造を、配列決定に特に適している引き伸ばされた直線状の形態に引き伸ばすことである。適した多孔性のマトリックスを、ポリアクリルアミド又はアガロースなどの核酸及びタンパク質を操作するのに使用されている従来の材料から形成してもよい。別の方法として、他のナノ多孔性材料も適している。
【００３５】
上記の制御手段は、核酸及び他の直線状の分子の制御に適している。他の分子は、異なるレベルの制御を必要とするか、又は制御の程度がより高いか、もしくはより低い。
【００３６】
チャネルを通過する分子を誘導する手段及び制御手段が、同じ手段によって提供されてもよいことに留意すべきである。たとえば、液体媒体単独における電気泳動は、構造及び速度の正確な制御を必要としない場合に分子を制御するのに適している。別の方法として、レーザートラッピングを用いて、チャネルの方への及びチャネル内への分子の移動を正確に制御してもよい。
【００３７】
金属部分と分子との相互作用を検出する手段は、当然ながら、該部分によって生じた局在EMFと該部分にかなり近接している分子との間の相互作用を検出することができるいずれの適した装置であってもよい。適した手段としては、蛍光を検出する手段又はラマン散乱を検出する手段が挙げられる。
【００３８】
蛍光を検出するのに適した手段としては、EMFの領域を通過するフルオロフォアから放出された光子を検出するのに十分な感度を有するいずれの装置も挙げられる。適した装置としては、光電子増倍管又はアバランシェ・フォトダイオードが挙げられる。蛍光は、本質的に蛍光を発する分子又はフルオロフォアで標識された分子を検出するのに適している。
【００３９】
ラマン散乱を検出するのに適した手段としては、ラマン・スペクトロメータが挙げられる。ラマン散乱を用いて、非標識及び非蛍光性の分子を検出してもよい。ラマン散乱を検出する技術は本技術分野において周知である。本発明におけるラマン散乱を用いる検出は、表面増強ラマン分光の現象に基づく（背景について、Jeanmaire, David L.: Richard P. van Duyne (1977). “Surface Raman Electrochemistry Part I.Heterocyclic, Aromatic and Aliphatic Amines Absorbed on the Anodized Silver Electrode”. Journal of Electroanalytical Chemistry 84: 1-20参照）
【００４０】
多くの実施態様において、分子の標識に頼らない検出方法を用いるのが好ましい。これによって、調査するサンプルの準備が簡素化され、また、チャネルを通しての分子の通過を妨げる可能性のある標識の存在が必要でない。
【００４１】
更なる態様において、本発明は、
−調査する分子を含む液体のサンプルを準備するステップと、
−基板に設けられたチャネルであって、プラズモン共鳴を有するように誘導される結合した金属部分を有するチャネルを通過するように前記分子を誘導するステップと、
−前記金属部分によって生じた電磁界とチャネルを通過する分子との間の相互作用を検出するステップとを含む、
分子を調査する方法を提供する。
【００４２】
好ましくは、分子は生体分子、たとえば核酸又はタンパク質／ペプチドである。核酸又は直線状のタンパク質／ペプチドなどの直線状の分子が、本方法を用いる調査に特に適している。一本鎖の核酸が本方法を用いる調査に特に適している。
【００４３】
好ましい実施態様において、前記方法は、核酸を配列決定する方法である。
【００４４】
しかしながら、他の種類の分子の調査に前記方法を用いてもよく、配列決定に用いる必要はない。サンプル中の個々の分子の計数及び直線状の分子上のマーカーのマッピングのために前記方法を使用することが、他の可能性のある用途の中でも想定される。
【００４５】
金属部分と相互作用する標識を分子が含むことが、必須ではないが、好ましい。従って、前記方法は、更に、前記金属部分と相互作用する標識で分子を標識するステップを含んでもよい。
【００４６】
適した標識としては、フルオロフォアが挙げられる。フルオロフォアは、すべての種類の生体分子の蛍光標識に関連する分野において周知である。本発明において、フルオロフォアが、標識した分子のチャネルの通過を阻害しないほどに十分に小さいことが重要である。典型的には、フルオロフォアは、２ｎｍ又はそれ以下の有効なサイズを有し、好ましくは、色素分子はどの寸法においても１ｎｍ以下である。
【００４７】
適したフルオロフォアの例としては、ローズ・ベンガル（Rose Bengal）、アレクサ・フルオル４８８ Ｃ５−マレイミド（Alexa Fluor 488 C5-maleimide）、アレクサ・フルオル５３２ Ｃ２−マレイミド（Alexa Fluor 532 C2-maleimide）及びローダミン・レッドＣ２−マレイミド（Rhodamine Red C2-maleimide）及びローダミン・グリーンが挙げられる。これらのフルオロフォアは、それぞれ、本技術分野において既知の技術を用いて核酸の塩基を標識するのに用いることができる。
【００４８】
適切には、前記分子は、特定の塩基の大部分又はすべてが標識されている核酸である。好ましい実施態様において、分子中の１種もしくは複数種の塩基の大部分又はすべてが標識されており、各種類の塩基は、個々に識別可能な発光スペクトルを持つ標識を有する。特に好ましい実施態様において、すべての又はほぼすべての塩基が標識されており、各種類の塩基は、個々に識別可能な発光スペクトルを持つ標識を有する。核酸の高濃度の標識は、Tasaraら, Nucleic acids Research, 2003, 31(10), 2636-2646に記載されている。
【００４９】
標識として選択されたフルオロフォアが、金属部分によって生じたEMFと相互作用することが可能であることが重要である。特定の特性の金属部分にフルオロフォアを適合させるのは日常的な事項である。概して、金属部分とフルオロフォアとの間の良好な相互作用について、フルオロフォアが、金属部分の局在表面プラズモン共鳴のピークよりわずかに低いエネルギーでの発光ピークを有する、すなわち、フルオロフォアの発光ピークがLSPRのピークからわずかに赤方偏移されていることが好ましい。約２０〜１５０ｍｅＶの赤方偏移が適しており、好ましくは約４０〜１２０ｍｅＶである（Chenら, Nano Letters(2007), 7(3), 690-696参照）。
【００５０】
更なる態様において、本発明は、
−基板に設けられた少なくとも１つのチャネルであって、分子が通過するのに適しているチャネルと、
−プラズモン共鳴を誘導するのに適した少なくとも１つの金属部分であって、該金属部分によって生じた電磁界が前記チャネルを通過する分子と相互作用することができるような位置で前記チャネルと結合している少なくとも１つの金属部分とを備える、
分子を調査する装置への使用に適した基板を提供する。
【００５１】
好ましい基板の更なる詳細は、上述した通りである。
【００５２】
本発明の実施態様を、実施例によって、図面を参照して説明するが、本発明は、これら実施例に制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、本発明に使用するのに適したポア及び電極を示す図である。
【図２】図２は、ポアと電極とを備える基板を示す図である。
【図３】図３は、本発明に従う装置の態様の概略を示す図である。
【図４】図４は、本発明に従う装置の実施態様の概略を示す図である。
【図５】図５は、基板の別の構造の概略を示す図である。
【図６】図６は、基板の別の構造の概略を示す図である。
【図７】図７は、基板の別の構造の概略を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
背景
小さい球状の金属粒子に光を照射した際、振動する電界が粒子の電子をコヒーレントに振動させる。これらの電子の集団振動は、双極子プラズモン共鳴と呼ばれている。電子における集団振動によって、強力な、極めて局在した電磁界（EMF）が生じる。これらの集団振動を引き起こすために、正確な励起波長を用いなければならない。このような波長は、励起される金属粒子の大きさ及び形状に依存する。特定の粒子についての正確な波長は、容易に実験で決定でき、また、特定の形状についてのものは、既知のモデリング技法を用いて予測することが可能である。
【００５５】
金又は銀のナノ粒子などの金属コロイドのプラズモン共鳴によって生じたEMFを、数ある中でもCy5及びローズ・ベンガルなどの一般に使用されている蛍光標識を励起するのに用いることができることが［1]に示されている。これらの実験は、金又は銀のナノ粒子を表面上に置き、増強したEMFから恩恵を受けるようにフルオロフォアを位置づけることを伴う。これによって、いわゆる金属増強蛍光（metal enhanced fluorescence, MEF）がもたらされる。
【００５６】
フルオロフォアをプラズモン共鳴を示す金属粒子の近くに置いた場合、フルオロフォアは、局在EMFと蛍光の寿命が減少するあまり解明されていない現象との両方から恩恵を受ける。同様の現象は、分子のラマン散乱を調べる際に生じる。局在表面プラズモン共鳴を示す金属粒子に分子がかなり近い場合、ラマン散乱のレベルの劇的な増加がみられる。
【００５７】
フルオロフォアの最大の光子の放出を、その量子収量及び蛍光の寿命によって決定すると、より短い蛍光の寿命によって、より高い光子の放出がもたらされる。９０％の量子収量及び２．５ｎｓの蛍光寿命を有するフルオロフォアは、最大３億６千万の光子／ｓを放出することができる。実際には、蛍光色素は、劣化する前に数百万の光子を放出することができる。
【００５８】
金及び銀のコロイドのアレイ［1,2]と同様に、コロイドのナノ結晶［3]、光結晶のナノキャビティ［4]、金属ナノリング［5]及び多孔性の薄い金属フィルム［6]を用いて実証されるものなどの極めて局在した増強EMFを誘導し、該EMFから恩恵を受けるようにフルオロフォアを位置づけることによって、MEFを誘導することができ、フルオロフォアを検出することができるか、又はその代わりにラマン散乱を検出することができる。
【００５９】
一つのみのフルオロフォアがいずれの任意の時間にてMEFから恩恵を受けることが可能である空間の領域があるように装置を作製した場合、そのフルオロフォアの位置を知ることができる。開口（ポア）の周囲に又は近くにプラズモン構造体（たとえば金属部分）を配置することによって、蛍光粒子を、最大の蛍光の増強（maximum fluorescent enhancement, MaxFE）の領域を通過するように方向づけることができる。適したポアとしては、ゲル（ポリヌクレオチドを閉じ込めるために一般に使用される）、α-ヘモリシンなどの有機ポア、窒化ケイ素で作製することができるものなどの固体の状態のポア、多孔性の金、コロイド結晶、コロイドキャビティ、金属トロイドなどのナノ多孔性材料、又は直径１０ｎｍ以下、好ましくは直径５ｎｍ以下、特に１．５〜２．５ｎｍのいずれの他のポアが挙げられる。
【００６０】
以下の事項：
−２つのプラズモン共鳴する表面の間のEMFが、それら表面の間の距離が減少する際に増大すること、
−プラズモン共鳴する表面への接近も、フルオロフォアの蛍光寿命を減少させること、
−これらの表面の間の距離を５ｎｍ以下とすることができること、並びに
−コロイド、多孔性の薄いフィルム、２Ｄの結晶アレイ、及び他のナノ構造体を、２ｎｍ以下の大きさにすることができること
を考えると、最大の光子の放出を極めて小さい領域において発生するようにすることができることを予想することは理にかなっている。
【００６１】
同様に、分子の特定の性質、又は分子内の領域は、ラマン散乱の特有のパターンによって特定することができる。これは、特定のフルオロフォアの位置の特定と同様に、識別可能なラマンスペクトルを有する特定の特徴をもつものの位置を、そのプラズモン構造体への接近によって特定することができる。
【００６２】
たとえばマイクロ流体工学又は電気泳動によってポアを通過するようにイオンを誘導する場合、単一のイオン−フルオロフォアの抱合体を検出するか、又は特定のラマンスペクトルを有する領域を検出することができるように、該イオンがこのMaxFEの領域を通過するようにすることができる。
【００６３】
１つのみのイオンが一度にポアを通ることができるようにタンパク質などの蛍光標識した荷電イオンを誘導してナノポアを通過させることによって、イオンの定量化が以下に記載するように可能である。すなわち、
−２つの同一の蛍光粒子／イオン抱合体を考えると、第１のものがポアを通過し、限定したEMFに入ると、フルオロフォアが光子を放出し始める。フルオロフォアがMaxFEの領域にさらに近付くように移動するにつれて、フルオロフォアの数が増加して放出される。MaxFEの領域への距離が減少するにつれて指数関数的に次々に増加しているEMFの強度と光子の放出が直接関連しているとき、光子の放出も指数関数的に増加し、MaxFEの領域において光子の放出ピークを生じさせ、抱合体がMaxFEの領域から離れるにつれて減少する。第２の同一の蛍光粒子は、同様のパターンの光子放出を生じる。ピークの光子の放出が、２つのフルオロフォア／イオン抱合体の間の距離より少ない厚さを有する別個の領域にて発生する限り、これら２つのフルオロフォアによって生じた蛍光は識別することができる。
−２つの抱合体が非常に密接に共にあるような間隔（０．５ｎｍ以下）で置かれている場合、個々の検出は困難であり、MaxFEの領域における２つ以上のフルオロフォアの存在は、光子の放出によって決定することができる。同等のEMFの強さに曝された２つの同一のフルオロフォアは、単一のフルオロフォアの約２倍の光子／ｓを放出すべきである。MaxFEの領域が２、３又は４以上の抱合体を含むことができると考えると、それら抱合体がEMFを通る速度が知られている場合、EMFを通過する抱合体の数の定量化を達成することができる。
【００６４】
イオンがポアを介して片面から他の面へ通過することのみできるようにする障壁で隔てられた２つのチャンバーを作製することによって、MaxFEの領域が２、３又は４以上の抱合体を含むことができるかどうかにかかわらず、数が決定されるかぎり、移動するように誘導することができるイオンを定量化することができる。
【００６５】
核酸の標識
蛍光標識は、通常、一本鎖（single stranded, ss）及び二本鎖（double stranded, ds）の両方のポリヌクレオチドDNA及びRNAに組み込まれる。DNAポリメラーゼと蛍光修飾されるヌクレオチドの両方の慎重な選択によって、蛍光標識をDNAに組み込む多くのよく確立された方法があり、４種の塩基（CGTA）の１種又は複数種のすべてを蛍光標識することができることが［7]に示されている。dsDNA及びdsRNAにおけるヌクレオチドの間の距離は、０．３４ｎｍであることが知られており、一方で、ssDNA及びssRNAにおいて、ポリマーが直線状の構造であることができ、それによって最大の空間的隔離がより大きくなるようにすることが可能であるが、正確な距離は、強制された伸縮力に応じて０．５ｎｍ〜１ｎｍの間で変動する［8]。
【００６６】
配列決定のプロセス
一本鎖DNAがα−ヘモリシンなどの有機ポア［10]又は窒化ケイ素における固体状態のポアを通過する速度の正確な制御が達成できることが知られている［8,9]。ポリヌクレオチドの塩基の１種又は複数種のすべてが蛍光標識されるようにポリヌクレオチドを標識し、ヌクレオチドが少なくとも１つの蛍光標識ヌクレオチドを含むことができるMaxFEの領域を通過するように、マイクロ流体工学、電気泳動または既知の速度でEMFを通過させるいくつかの他の手段によってポリヌクレオチドを誘導することによって、DNA断片に沿う標識したヌクレオチドの位置を決定できる。
【００６７】
完全なポリヌクレオチド配列は、以下の方法で構築することができる。
【００６８】
すなわち、１種の塩基のすべてが一度に標識されていると仮定して、C、T、G又はAのヌクレオチド塩基のすべてがそれぞれにおいて蛍光標識されている４つのPCR反応を行うことができる。次に、鎖を変性し、ssDNA又はssRNAを形成する。次いで、既知の速度でナノポアを通過し、かつ既知の数のヌクレオチドを含むことができるMaxFEの領域を通過するように各鎖を誘導する。標識したヌクレオチドがEMFを通過した際に、その位置を他の標識したヌクレオチドと比較して決定することができ、４つの同一であるが異なる標識がなされたポリヌクレオチドのそれぞれについての距離のマップが得られる。次に、これらの４つの距離のマップを容易に組み合わせて完全なポリヌクレオチドの配列を構築することができる。
【００６９】
全ゲノムの配列決定
本方法を用いてゲノムを配列決定するためには、全ゲノムの増幅に利用可能なものなどの蛍光標識したランダムプライマーを用いることができる。これらのプライマーの配列は既知であり、蛍光標識は、ポアを通過するDNA断片の５‘又は３’の方向を示す機能を果たすことができる。また、標識したプライマーは、標識したヌクレオチドの距離マップを関係づけることができる最初の基準点として機能を果たすこともできる。優先的には、４種の塩基の２種以上のすべてを蛍光標識し、異なる放出スペクトルを有する蛍光標識を用いて、これらの塩基を区別する。また、標識が別個の最大の放出スペクトルを有する場合には、２つ以上の蛍光標識スペクトルを用いて、１種の塩基のすべてを標識することもできる。
【００７０】
次に、これらのDNA断片を、光子放出によって決定された速度で上記のポアを通過するように誘導することができる。Cy5の色素を用いて、３億〜９億光子／ｓのMEFにおける光子の放出速度が得られる［1］。これによって、DNAが１億ヌクレオチド塩基／秒／ナノ構造体よりわずかに低い速度で通過可能となる。ナノ構造体のアレイは、この速度をアレイの大きさによって増加させることを可能にする。これらのプライマーがランダムであり、ゲノム内のDNA断片における距離マップの位置が知られていない場合、完全なショットガン配列決定に用いられるものなどの全ゲノム構築ソフトウェアが正確なアライメント及び構築に必要とされる。
【００７１】
本発明の利点
本発明は、他のDNA配列決定方法のみならず、他の単一の分子の検出方法を超える様々な利点をもたらす：
・本発明は、機能強化された単一の分子の検出を可能にする。
・本発明を用いて、単一の分子の位置及び速度を決定することができる。
・PCRを用いて単一の分子を蛍光標識することができるが、本装置及び方法は、化学的な又は酵素の反応に依存しない。
・何十、何百、何千又は何百万のこれらのナノ構造体を一度に作動した状態にすることができるように本装置を配列することができる。
・上記で概略を説明した本方法を用いるDNAの配列決定は非常に速い。本方法を用いる配列決定のコストは、蛍光標識、ヌクレオチド、ポリメラーゼ及び他の比較的重要でない消耗品などの４つしかないPCRの試薬のコストに限られている。
【００７２】
構成方法
本発明の中心は、制御された様式で極めて局在したEMFを通過するように単一の分子を誘導し、分子とEMFとの間の相互作用を検出することにある。ゲル、有機ポア、固体状態のポア、ビーズへの結合及び表面上への固定化を含めたタンパク質及びポリヌクレオチドの両方を制御する多くのよく研究されている方法がある。これによって、極めて局在したEMFを通過させることができるようにタンパク質又はDNA断片などの単一の分子を制御できる幅広い範囲の装置を構成できるようになる。
【００７３】
本発明は、入射EMFによって誘導されるプラズモン共鳴が蛍光標識された単一の分子におけるMEFまたはSERSを誘導するかぎり、いずれの表面も用いることを可能にし、単一の分子を、MaxFEの領域を通過するように誘導することができる。
【００７４】
本発明は、マイクロ流体工学、電気泳動又はレーザートラッピングを含めた、MaxFEの領域を通過するように単一の分子を誘導するいずれの手段も可能にする。
【００７５】
蛍光が選択した検出方法である場合、本発明は、使用される表面の最大のプラズモン共鳴の周波数で蛍光を発するいずれの蛍光標識も使用することを可能にする。理想としては、蛍光標識は、高い量子収量、低い蛍光寿命、低い分子量を有し、かつ容易にポリメラーゼで組み込まれる。好ましくは、ヌクレオチド自体が本質的に蛍光を発するものである。
【００７６】
SERSは、標識をまったく必要としないという利点を有するが、特定する分子の特性の特有のラマンスペクトルを知るべきである。
【００７７】
これらの特徴は、すくなくとも３つの一般的な方法で本発明を設計することを可能にし、各方法は、異なる利点を有する：
−単一の分子を制御するのに「有機」ポアを使用することは、金のナノ粒子をポア自体又は周囲の脂質に共有結合させることを可能にする。もう一つの方法として、窒化ケイ素で作製できるものなどのより大きな固体状態のナノポアの内側に有機ポアを設置することができ、プラズモン構造体（たとえば金属部分）を、有機ポア内の分子又は分子の一部にMEF又はSERSを最適化するように位置づけることができる。別の方法として、光子のナノキャビティなどのプラズモン構造体の内側に有機ポアを設置することができる（図５及び６参照）。この方法の利点としては、そのようなポアを通過するように誘導された単一の分子のよく特徴づけられた性質、有機ポアが可能にする小さくかつ極めて再生可能なポアの直径、並びにそのような有機ポアを製造する低いコストが挙げられる。
−固体状態のナノポアを使用することによって、ポアの直径にわたる制御及びMEF又はSERSが最適化されるようにプラズモン構造体をナノで位置づけすることが可能となる。理想としては、光子の放出を、導波管を用いてさらに制御することができる。これによって、より効率的な光子の検出及びより高い検出速度が可能になる。
−第３の一般的な構成方法は、多孔性の表面上のいずれの任意の点での電界強度が知られていないような極めて局在したEMFのランダムな分布を可能にし、単一の分子が、制御された速度で、制御されていない位置でこの表面を通過できるようにするものである（図７）。これは、EMF又は単一の分子の位置も分布も正確に制御されていないという点で他の２つの方法を超える多大な利点を有し、そのような装置が構成できる容易さは相応してより卓越したものである。２０ｎｍのポアと、ランダムに分布したEMFを含む表面との交差位置での単一の分子の速度を制御する方法は、以下に記載する。この方法は、本質的に多重化されているという利点を有する。EMFを通過する単一の分子によって生じた蛍光が、秒当たり１つのみの分子を検出できるようなものであっても、数百又は数千又は数百万のポアが一度に作動した状態であるように装置を多重化できる。
【００７８】
本発明に従う装置の構成方法及び配列決定を行う方法
本発明に従う装置は、以下のものを備える：
−数μｌの溶液を入れることができ、底面の表面に埋め込まれた電極２６を含む第１のリザーバ１９；
直径が２０ｎｍであり、表面にエッチングされて１μｍ離れて間隔を空けられているナノポア１０のアレイを有するシリコン（基板）の層１１。電極１２が、各々２０ｎｍの直径のポア１０が電極１２を含むようにシリコンの層１１に埋め込まれており、各電極１２は、高いスキューレートを有する電圧源に接続されている（図示せず）；
−金のナノ粒子１４の規則的なアレイが堆積されている多孔性の膜２２がシリコンの層に結合している。金のナノ粒子１４は、既知の大きさ及び幾何学的性質を有するものであり、適切な周波数で励起させた際、EMFを生じる；
−アガロース又はポリアクリルアミドなどのゲル２４が、ssDNA２０が誘導されてゲル２２を通って移動する際にほぼ直線状の構造を取るような平均孔径を有する膜２２に貼り付けられている。これは、本発明の実施態様における制御手段を形成するものである；
−第２のリザーバ２１が、分子がポアを通った後に通過する基板２２の反対側に設けられている；
−高いスキューレートを有する電圧モジュレータのアレイ（図示せず）がアバランシェ・フォトダイオードなどの高感度の光子検出器（図示せず）に接続されている；
−アバランシェ・フォトダイオードなどの光子検出器（図示せず）が設けられている；
−光子検出器（図示せず）からの入力に基づく電圧源のアレイを制御する手段が設けられている；
−既知の大きさ及び幾何学的性質の金属コロイドにおいてプラズモン共鳴を誘導することが可能な周波数のレーザー（図示せず）が設けられている。
【００７９】
配列決定を行うための操作方法：
与えられたssDNAの鎖における２種の塩基（C及びA又はG及びT）のすべてを、使用した金属コロイド１４のプラズモン共鳴の周波数に近いが、好ましくは該周波数に対してわずかに赤方偏移した最大の放出を有する蛍光標識を用いて蛍光標識するように、DNAを前述のPCRによって標識する。
【００８０】
次に、標識したssDNAを第１のリザーバ１９に入れる。ナノ多孔性のゲル２４で被覆されており、かつ金のナノ粒子１４のほぼ均一な分布を、該ナノ粒子間の間隔が１ｎｍ〜１００ｎｍの間でランダムに変動するように含む膜２２を第１のリザーバ１９上へ設置する。次いで、シリコンの層１１を膜２２上に設置し、すべてのアセンブリーを導電溶液中に浸すことができる。次に、第２のリザーバ２１を通ってゲル２４へ移動し、直線状の構造でゲル２４を通過し、プラズモン共鳴によって生じたEMFを通過する際に光子を放出する金のナノ粒子１４のアレイを通るようにssDNA２０を誘導するように、２０ｎｍのポア１０の内側の電極１２に正電荷を与える。蛍光標識したランダムプライマーをPCR反応に使用した際、第１の光子の放出が、５’又は３’のプライマーのいずれかによって生じる。プライマーから得られた光子の放出は、ssDNA２０の断片がEMFを通って移動するように誘導でき、かつ明確なシグナルがまだ得られる速度を直ちに示す。金の球体１４に対するssDNA２０の位置づけが、ssDNA断片２０ごとの２０ｎｍのポア１０のそれぞれの内側で異なる場合、最適な電圧を常に各ポア１０に加えることができる。上記の概略のように、互いに対しての及び既知のプライマーに対しての距離を含む距離マップを光子放出のデータから作成できる。次に、このデータを組み合わせて全ゲノム配列を構築することができる。
【００８１】
更なる基板の作製方法及び更なる配列決定を行う方法
ナノテクノロジーの技術を用いて適した基板を製造できる多くの方法がある。以下に、２つの可能な方法及び配列決定のプロトコールを行う様態を説明する。
【実施例】
【００８２】
実施例１−プラズモンのナノキャビティにおける有機ポア（図５および６に図示）
１）光子のナノキャビティ３０などのプラズモン構造体のアレイを、［4］に記載されている適した材料３２から作り、該ナノキャビティは、図５にあるような内径８〜１０ｎｍを有するか、又は図６にあるような内径４〜５ｎｍを有する。
２）次に、α−ヘモリシンなどの有機ポア３４を、該有機ポア３４が約１μｍ離れて間隔を空けられているように、［13］に示唆されている手段によってこれらのプラズモン構造体の内側に位置づける。
３）次いで、これらのナノキャビティ３０のプラズモン共鳴の波長を正確に決定し、レーザー及び蛍光色素スペクトルを、定められたプラズモン共鳴と一致するように選択する。蛍光色素スペクトルを、プラズモン共鳴のピークからわずかに赤方偏移すべきである（２０〜１５０ｍｅＶ）。
４）有機ナノポア３４を介した電解輸送を［10］に記載されているように実施する。
５）蛍光標識からの光子の放出を、本技術分野において周知のアバランシェ・フォトダイオード検出システムを用いて検出する。
６）選択した遺伝子源からDNAを抽出した後、ssDNAを、PCR及び全ゲノム増幅に用いられているものなどのランダムプライマーを用いて蛍光標識する。PCR反応において存在する４種のヌクレオチドのうち、１種が染色で修飾された形態でのみ存在し、これによって、選択したヌクレオチドの高密度の蛍光標識が確実にもたらされる。長い解読の長さでの高密度の標識を確実にするために、いくつかの蛍光色素を、［7］に記載されている種々のポリメラーゼを用いて試験する必要がある。
７）続いて、このようなPCR反応を、残りの３種のヌクレオチドについて行い、従って、４種のPCR反応を実施し、その結果として、それぞれC、T、G及びAのヌクレオチドのすべてにおいて蛍光標識したDNAを含有する４種のサンプルがもたらされる。
８）DNAが配列決定装置を通過する直前に、PCR反応物を本技術分野で周知のように変性して、標識したssDNAがナノポア３４を通過できるようにする。
９）１種の同時に変性したPCR反応物をナノポア３４に通過できるようにする。
１０）色素分子からの光子の放出が、１秒の１００万分の１の精度のAPDによって得られる。光子の放出のこれらの突発のタイミングを、ssDNAのポアを通しての転位置に関して、既知のものを用いて標準化し、同一のヌクレオチド間の間隔を明らかにする数千又は数百万の距離マップを作製する。
１１）次に、これらの距離マップを、最初に、同一のヌクレオチドの４種の完全に再構築した配列に再構築し、全ゲノム配列に合成する。
【００８３】
実施例２−合成ナノポア（図７に図示）
１）３０ｎｍ又はそれ以下の先端における内側半径を有する円錐状のナノポアのアレイを、半導体の窒化ケイ素又は導体の金属の膜４０に、本技術分野において周知の電子ビーム・リソグラフィを用いてエッチングする。これらのナノポアは、１μｍ離れて間隔を空けられている。エッチングしたシリコン膜を、［11］に記載されているステージ上に取り付け、電気メッキ槽として働く小さいテフロン（登録商標）チューブ（直径２ｍｍ）内の電気メッキ液に入れる。１．１７％（ｗ／ｗ）KAu(CN)２を含むTEMPEREX 8400（田中貴金属）を、室温での電気メッキ液として用いる。金のワイヤー（直径０．５ｍｍ）をカウンター電極として溶液に浸漬する。続いて、１．４〜１．５Ｖのバイアス電圧を、システムにおけるカウンター電極に対する最初の電極に印加する。これに続いて、最初の電極の表面上へ金が電着する。典型的には、０．２ｍＡの起誘導電流によって、室温での１Ａ°／秒の電気メッキ速度が可能になる。
２）次に、金４２の層を、［11]記載の電着を用いて堆積させて、直径１．５〜２．５ｎｍのポアを製造する。適切な波長の入射波によって励起した際、この構造体は、円錐状のポアの先端に集中した極めて局在したEMFを生じる［12］。
３）電気泳動によって、ポア４４を通して移動するように標識したssDNAを誘導した際、個々の標識は、ポア４４のエッジ４３と接触する。ポア４４のエッジの周囲にEMFが極めて局在しているとき、蛍光標識が領域を通過する際、光子の放出が期待される。しかしながら、ポア４４の先端における金の表面と蛍光標識したssDNAとの間の接触によって、蛍光のクエンチングが誘導される。標識したssDNAがポアの先端を過ぎてチャネルへ移動し続ける際、チャネルが膨張する。この膨張によって、プラズモン構造体の表面との接触及び結果として起こる蛍光のクエンチングがなくなる。
４）続いて、これらの電気メッキした円錐状のポア４４のプラズモン共鳴の波長を正確に決定し、レーザー及び蛍光色素スペクトルを、定められたプラズモン共鳴と一致するように選択する。蛍光色素スペクトルをプラズモン共鳴のピークからわずかに赤方偏移すべきである（２０〜１５０ｍｅＶ）。
５）円錐状のナノポア４４を介した電解輸送を、［8,9］に記載されているように実施する。
６）蛍光標識からの光子の放出を、本技術分野において周知のアバランシェ・フォトダイオード検出システムを用いて検出する。
７）選択した遺伝子源からDNAを抽出した後、ssDNAを、PCR及び全ゲノム増幅に用いられているものなどのランダムプライマーを用いて蛍光標識する。PCR反応において存在する４種のヌクレオチドのうち、１種が染色で修飾された形態でのみ存在し、これによって、選択したヌクレオチドの高密度の蛍光標識が確実にもたらされる。長い解読の長さでの高密度の標識を確実にするために、いくつかの蛍光色素を、［7］に記載されている種々のポリメラーゼを用いて試験する必要がある。
８）続いて、このようなPCR反応を、残りの３種のヌクレオチドについて行い、従って、４種のPCR反応を実施し、その結果として、それぞれC、T、G及びAのヌクレオチドのすべてにおいて蛍光標識したDNAを含有する４種のサンプルがもたらされる。
９）DNAが配列決定装置を通過する直前に、PCR反応物を本技術分野で周知であるもののように変性して、標識したssDNAがナノポア４４を通過できるようにする。
１０）１種の同時に変性したPCR反応物がナノポア４４を通過できるようにする。
１１）色素分子からの光子の放出が、１秒の１００万分の１の精度のAPDによって得られる。光子の放出のこれらの突発のタイミングを、ssDNAのポア４４を通しての転位置に関して、既知のものを用いて標準化し、同一のヌクレオチド間の間隔を明らかにする数千又は数百万の距離マップを作製する。
１２）次に、これらの距離マップを、最初に、同一のヌクレオチドの４種の完全に再構築した配列に再構築し、全ゲノム配列に合成する。
【００８４】
参考文献：
[1] Fu, Yi, Lakowicz; Joseph R., "Single molecule studies of enhanced fluorescence on silver island films", Plasmonics, Vol. 2, No. 1, 2007.
[2] Nakamura, Toshihiro; Hayashi, Shinji, "Enhancement of dye fluorescence by gold nanoparticles: Analysis of Particle Size Dependence", Japanese Journal of Applied Physics, Vol. 44, No. 9A, pp.6833 - 6837, 2005.
[3] Pompa, P.P. et al, "Metal enhanced fluorescence of colloidal nanocrystals with nanoscale control", Nature, published online 3 November, 2006.
[4] Netti, M. Caterina et al, "Confined plasmons in gold photonic nanocavities", Advanced Materials, Vol. 13, No. 18, 2001.
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[11] Kashimura, Yoshiaki et al, "Fabrication of nano-gap electrodes using electroplating technique" Thin Solid Films 438 - 439, 2003.
[12] Downes, Andrew; Salter, Donald; Elfick, Alistair, "Simulations of atomic resolution tip-enhanced optical microscopy" OPTICS EXPRESS, Vol. 14, No. 23, 2006.
[13] Bayley, Hagan; Cremer, Paul S., "Stochastic sensors inspired by biology", NATURE, Vol. 413, September 2001. 
【符号の説明】
【００８５】
１０  ナノポア
１１  シリコン（基板）の層
１２  電極
１４  金のナノ粒子
１９  リザーバ
２０  ssDNA
２１  リザーバ
２２  膜
２４  ゲル
２６  電極
３０  ナノキャビティ
３２  材料
３４  有機ポア
４０  膜
４２  金
４３  エッジ
４４  ポア
【図１】
2010538290.tif 000003
【図２】
2010538290.tif 000004
【図３】
2010538290.tif 000005
【図４】
2010538290.tif 000006
【図５】
2010538290.tif 000007
【図６】
2010538290.tif 000008
【図７】
2010538290.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月4日(2009.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板に設けられた少なくとも１つのチャネルであって、分子が通過するのに適しているチャネルと、
プラズモン共鳴が可能な少なくとも１つの金属部分であって、該金属部分によって生じた電磁界が前記チャネルを通過する分子と相互作用するのに適した位置で前記チャネルと結合している少なくとも１つの金属部分と、
前記チャネルを通過するように分子を誘導する手段と、
前記金属部分において表面プラズモン共鳴を誘導する手段と、
前記金属部分によって生じた電磁界と前記チャネルを通過する分子との間の相互作用を検出する手段とを備える、
分子を調査するための装置。
【請求項２】
基板によって互いに区切られている２つのリザーバを備え、第１のリザーバは、調査する分子を含むサンプルを入れるのに適しており、第２のリザーバは、分子がチャネルを通過次第、該分子が移行するのに適している請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記チャネルが開口である請求項１又は２記載の装置。
【請求項４】
前記開口が約０．５ｎｍ〜１００ｎｍの直径を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記開口が約１ｎｍ〜５０ｎｍの直径を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
前記開口が約１ｎｍ〜３０ｎｍの直径を有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
前記開口が約１ｎｍ〜５ｎｍの直径を有する請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記開口が有機ポアを含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記開口がゲルによって設けられている請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記開口がフィルムなどの基板において設けられている請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記開口が、多孔質の金、コロイド結晶、コロイドのキャビティ及び金属トロイドからなる群より選択されたナノ多孔質材料から形成されている請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
基板を通る複数の開口を備える請求項１〜１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
前記開口がアレイで配置されている請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
前記金属部分が金、銀、銅又はアルミニウムを含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１５】
前記金属部分が実質的に球状である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
前記金属部分が実質的に環状である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
前記金属部分が多角形の角柱である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１８】
前記金属部分が５０ｎｍ〜１５０ｎｍの直径を有する請求項１〜１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
前記金属部分が、チャネルを通過する分子から５０ｎｍ又はそれ以下の位置にあるように配置されている請求項１〜１８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２０】
チャネルを通過するように分子を誘導する手段は、電気泳動を誘導する１つもしくは複数の手段、マイクロ流体工学装置又はレーザートラッピング装置を含む請求項１〜１９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２１】
開口の方へ、開口内へ及び／又は開口を通しての分子の通過を制御する制御手段を備える請求項１〜２０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２２】
前記制御手段が、分子が通過する多孔性のマトリックスを備え、該多孔性のマトリックスが、チャネルへの入り口に直接隣接して位置する請求項２１記載の装置。
【請求項２３】
金属部分と分子との相互作用を検出する手段が、蛍光を検出する手段又はラマン散乱を検出する手段を含む請求項１〜２２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２４】
蛍光を検出する手段が、光電子増倍管又はアバランシェ・フォトダイオードを含む請求項２３記載の装置。
【請求項２５】
ラマン散乱を検出する手段が、ラマン・スペクトロメータを含む請求項２３記載の装置。
【請求項２６】
調査する分子を含む液体のサンプルを準備するステップと、
基板に設けられたチャネルであって、プラズモン共鳴を有するように誘導される結合した金属部分を有するチャネルを通過するように前記分子を誘導するステップと、
前記金属部分によって生じた電磁界とチャネルを通過する分子との間の相互作用を検出するステップとを含む、
分子を調査する方法。
【請求項２７】
前記分子が生体分子である請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記分子が核酸である請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記分子が、金属部分と相互作用する標識を含む請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記標識がフルオロフォアである請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記標識が、ローズ・ベンガル（Rose Bengal）、Ｃ５−マレイミド、Ｃ２−マレイミド、ローダミン・レッド、Ｃ２−マレイミド及びローダミン・グリーンのうちの１種である請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記標識が、前記金属部分の局在表面プラズモン共鳴のピークよりわずかに低いエネルギーでの放出ピークを有する請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
基板に設けられた少なくとも１つのチャネルであって、分子が通過するのに適しているチャネルと、
プラズモン共鳴を誘導することが可能な少なくとも１つの金属部分であって、該金属部分によって生じた電磁界が前記チャネルを通過する分子と相互作用することができるような位置で前記チャネルと結合している少なくとも１つの金属部分とを備える、
分子を調査する装置への使用に適した基板。
【請求項３４】
核酸を配列決定する方法であって、
配列決定される核酸を含む液体のサンプルを準備するステップと、
基板中のポアを直鎖状の構造で通過するように単一の核酸分子を誘導するステップであって、前記ポアは、直径が０．５〜１００ｎｍであり、プラズモン共鳴を有するように誘導される結合した環状の金属部分を有するステップと、
前記環状の金属部分によって生じた電磁界とチャネルを通過する分子との間の相互作用を検出するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
前記ポアは、直径が１〜５０ｎｍであることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記核酸における４種の塩基の１種又は複数種のすべてをフルオロフォアで標識化することを特徴とする請求項３４又は３５に記載の方法。
【国際調査報告】
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