(57)【要約】  本発明はY型分岐のポリエチレングリコールで特定のリジン部位にシングルポイント修飾したインターフェロンα2bとその製造方法を提供する。このポリエチレングリコール化インターフェロンα2bはC型肝炎などのウイルス感染症の治療に使われる医薬組成物の製造に用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有するポリエチレングリコール化インターフェロンα２ｂ。
【化１】
2010538022.tif 000018
（ここで、
ＰａおよびＰｂは同一または異なるポリエチレングリコールであり、
ｊは１〜１２の整数であり、
Ｒｉは水素、置換または無置換のＣ１〜１２のアルキル基、置換されたアラルキル基、アリール基またはヘテロアルキル基であり、
Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して連結基であり、
Ｘ１は（ＣＨ２）ｎであり、
Ｘ２は（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｎＯＣＯ、（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ、（ＣＨ２）ｎＣＯからなる群から選ばれる基であり、
ｎは１〜１０の整数である。）
【請求項２】
以下の構造を有する請求項１に記載のポリエチレングリコール化インターフェロンα２ｂ。
【化２】
2010538022.tif 000019
（ここで、
ＲおよびＲ’はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ４のアルキル基、好ましくはメチル基であり、
ｊは１〜１２の整数であり、
ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数であり、ｍ＋ｍ’は好ましくは６００から１５００までであり、
ポリエチレングリコールの総平均分子量は約１００００〜６００００ダルトンであることが好ましく、最も好ましくは約４００００ダルトンである。）
【請求項３】
ポリエチレングリコールとインターフェロンα２ｂとを連結するアミド結合が、インターフェロンα２ｂにおいて配列番号：１の３１、４９、７０、８３、１１２、１２１、１３１、１３３、１３４または１６４位に対応するリジンの側鎖εアミノ基、あるいはＮ末端アミノ酸のαアミノ基、好ましくは、インターフェロンα２ｂにおいて配列番号：１の１３４位に対応するリジンの側鎖ε−アミノ基にある、請求項１または２に記載のポリエチレングリコール化インターフェロンα２ｂ。
【請求項４】
インターフェロンα２ｂが天然物から抽出、または組み換えバイオテクノロジーによって得られたものであり、好ましくは、配列番号：１に示す配列を有するヒトインターフェロンα２ｂであり、さらに好ましくは、組み換えヒトインターフェロンα２ｂである請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリエチレングリコール化インターフェロンα２ｂ。
【請求項５】
組み換えヒトインターフェロンα２ｂが人工的に合成されたものであり、または原核生物系、例えば大腸菌（E.coli）、真核酵母発現系、例えばピチア、昆虫細胞系あるいは哺乳類細胞系、例えばＣＨＯ細胞からなる群から選ばれる発現系で発現されたものである、請求項４に記載のポリエチレングリコール化インターフェロンα２ｂ。
【請求項６】
薬学的有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリエチレングリコール化インターフェロンα２ｂおよび薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項７】
さらに、マンニトール、アミノ酸、塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウムを含み、好ましくはアミノ酸がアスパラギン酸、アスパラギンおよびグリシンからなる群から選ばれる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリエチレングリコール化インターフェロンα２ｂまたは請求項６あるいは７に記載の組成物の、治療にインターフェロンα２ｂを必要とする疾患を治療するための製剤の製造への使用であって、前記治療にインターフェロンα２ｂを必要とする疾患は、好ましくはウイルス感染症、例えばＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、尖圭コンジローマ、腫瘍、例えば、有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病、低悪性度非ホジキンリンパ腫、細胞性リンパ球溶解、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、喉頭乳頭腫、再発性または転移性腎細胞癌、炎症性障害および疾患、例えば多発性硬化症、関節炎、喘息、嚢胞性線維症および間質性肺炎、および骨髄増殖性疾患に関連する血小板血症からなる群から選ばれる、前記使用。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリエチレングリコール化インターフェロンα２ｂの製造および精製の方法であって、
（ａ）アルカリ条件で、好ましくはｐＨ９．０で、以下の式に示すＹ型分岐構造を有するＰＥＧとインターフェロンα２ｂ溶液とを反応させ、ポリエチレングリコール化インターフェロンα２ｂを得る工程、
【化３】
2010538022.tif 000020
（ここで、
ＲおよびＲ’はそれぞれ独立してにＣ１〜Ｃ４のアルキル基、好ましくはメチル基であり、
ｊは１〜１２の整数であり、
ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数であり、ｍ＋ｍ’は好ましくは６００から１５００までである。）
（ｂ）陰イオン交換樹脂、好ましくはQ Sepharose FFで工程（ａ）で得られた反応生成物を捕獲し、陰イオン勾配、好ましくは塩素イオン勾配溶出で修飾生成物を得る工程、
（ｃ）陽イオン交換樹脂、好ましくはSP Sepharose FFで工程（ｂ）で得られた反応生成物を陽イオン勾配、好ましくはナトリウムイオン勾配溶出して、各ピークを別々に収集する工程、
（ｄ）各ピークの活性を測定し、活性の最も高いピークに対応する反応生成物を得る工程、
を含む前記方法。
【請求項１０】
Ｙ型分岐構造を有するＰＥＧが、分子量が４０ＫＤであり、好ましくは均等アーム型ＹＰＥＧであり、好ましくはＩＦＮ−α２ａとＹＰＥＧとの反応モル比が１：２である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
患者に治療有効量の請求項１〜５のいずれかに記載のポリエチレングリコール化インターフェロンα２ｂまたは請求項６あるいは７に記載の組成物を投与することを含む、治療にインターフェロンα２ｂを必要とする疾患を患う患者の治療方法であって、前記治療にインターフェロンα２ｂを必要とする疾患は、好ましくはウイルス感染症、例えばＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、尖圭コンジローマ、腫瘍、例えば、有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病、低悪性度非ホジキンリンパ腫、細胞性リンパ球溶解、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、喉頭乳頭腫、再発性または転移性腎細胞癌、および骨髄増殖性疾患に関連する血小板血症、炎症性障害および疾患、例えば多発性硬化症、関節炎、喘息、嚢胞性線維症および間質性肺炎からなる群から選ばれる、前記治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はY型分岐のポリエチレングリコール（PEG）でシングルポイント修飾したインターフェロンα2bおよびその製造方法、ならびにシングルポイントPEG化インターフェロンα2bの医薬品分野への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロン(interferon, IFN)は真核細胞がウイルス感染および他の抗原刺激に対して産生する一種の低分子タンパク質あるいは糖タンパク質であり、広い抗ウイルススペクトル、増殖抑制および免疫調節作用を有する。インターフェロンは多種多様の疾患の治療に広く用いられている。例えば、B型肝炎、C型肝炎およびHIVなどのウイルス感染、多発性硬化症、関節炎、喘息、嚢胞性線維症および間質性肺炎などの炎症性疾患、骨髄腫、リンパ腫、肝がん、肺がんおよび有毛細胞白血病などの腫瘍などの疾患である(Kenji Oritani, Paul W Kincade, et al. Type I interferon and limitin: a comparison of structures, receptors, and functions. Cytokine and Growth Factor Reviews, 12, 337-348, 2001; Yu-Sen Wang, Stephen Youngster, et al. Structural and biological characterization of pegylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications. Advance Drug Delivery Reviews, 54, 547-570, 2002)。
【０００３】
化学的、免疫学的および生物学的性質によって、インターフェロンは４種類に分類される。インターフェロンα、β、γおよびεである。インターフェロンαは白血球により分泌される。ヒトインターフェロンαは約２０個の遺伝子からなる多重遺伝子族によりコードされ、コードされたタンパク質のアミノ酸配列は９０％もの相同性を有する(Henco et al. J. Mol. Biol., 185, 227-260, 1985)。ヒトインターフェロンα2bはヒトインターフェロンαファミリーのα２サブファミリーに属し、多様な生物学的活性を有する一本鎖タンパク質である。この一本鎖タンパク質は１６５個のアミノ酸残基からなり、４個のCysを含んでいる。その中のCys1-Cys98およびCys29-Cys138はそれぞれ２組の分子鎖内ジスルフィド結合を形成し、N末端のアミノ酸残基がCysであり、１個の遊離状態のα-NH2基を有する。アミノ酸配列の第３１、４９、７０、８３、１１２、１２１、１３１、１３３、１３４および１６４位はすべてLysであり、これらはいずれも１個の遊離状態のε-NH2基を有する。当該タンパク質はグリコシル化されていないため、、各種のタンパク質酵素に感受性である。ヒトインターフェロンα2bのアミノ酸配列を配列番号：1に示す。
【０００４】
インターフェロンは通常、臨床上非経口投与される。体内半減期が短く(2〜4h)、免疫原性が強いため、投与間隔は短く、投与頻度は高い。抗体の産生により治療効果も顕著に低くなるため、今までも期待以上の臨床効果は得られていない。近年開発されたポリエチレングリコール（PEG）修飾技術は上記問題を有効に解決した。
【０００５】
ポリエチレングリコールは不活性で無毒な生分解性有機ポリマーであり、バイオテクノロジーおよび医薬品分野に広く使われている。PEG修飾技術とは、共有結合でPEGを活性タンパク質に結合することである。タンパク質薬物は、PEG化によりその性質が大幅に改善される。具体的には、薬物代謝半減期が延長し、免疫原性が低下し、安全性が向上し、投与頻度が少なくなり、薬物の溶解性と水溶性が改善し、タンパク酵素分解耐性が強くなり、薬の放出制御が容易になるなどである。詳細についてはInadaら(Inada et al. J. Bioact. and Compatible Polymers, 5, 343, 1990)、Delgadoら(Delgado et al. Critical Reviews in therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249, 1992)、Katreら(Kater. Advanced Drug Delivery Systerms, 10, 91, 1993)およびDavisら(米国特許UP4179337)の報告を参照されたい。
【０００６】
米国特許第4179337号によると、PEGが酵素あるいはインシュリンと連結すると、タンパク質の免疫原性が低下し、同時にタンパク質の活性も低下する。このような効果はG-CSF(Satake-Ishikawa et al., Cell Structure and Function, 17, 157-160, 1992)、IL-2(Katre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1487, 1987)、TNF-α(Tsutsumi et al., Jpn. J. Cancer Res., 85, 9, 1994)、IL-6(Inoue et al., J. Lab. Clin. Med., 124, 529, 1994)およびCD4-IgG(Chamow et al., Bioconj. Chem., 5, 133, 1994)において見出される。
【０００７】
文献で報告されたように(Monfardini et al., Bioconjugate Chem., 6, 62, 1995)、分岐型PEGで修飾したタンパク質のｐH耐性、熱安定性およびタンパク酵素分解耐性は、直鎖型PEGで修飾したものより大幅に優れている。通常、PEG分子はタンパク質分子のN末端のα-アミノ基あるいは分子内のリジンのε-アミノ基に連結してタンパク質を修飾する。タンパク質の修飾に用いられるPEGは通常三つの形式を含んでいる。つまり直鎖型(EP 0593868)、U型分岐(EP 0809996)およびY型分岐(CN1243779)である。
【０００８】
現在、多種のPEG化治療タンパク質の薬物が臨床に応用されている。1990年にENZON社の最初のPEG化薬用タンパク質、PEG化ウシアデノシンデアミナーゼがFDAに承認され、重症複合型免疫不全症の治療に使用された(pegfamg013102LB, http://www.fda.gov)。1994年に急性リンパ芽球性白血病の治療に別のPEG化薬用タンパク質、PEG化アスパラギナーゼ(pegasprgase, Oncaspar)も米国で販売された(103411s5052lbl, http://www.fda.gov)。2000年Schering-Plough社のPEG化インターフェロンα2b(PEG IFN-α2b, PEG-Intron)がFDAに承認された。Hoffman-la Roche社の別のPEG化インターフェロンα(PEG IFN-α2a, Pegasys)も2002年にFDAに承認された。以上の二つはいずれも肝炎の治療に用いられた(103964s5037lbl, pegsche011901LB, http://www.fda.gov)。2002年にAmgen社のPEG化ヒト顆粒球コロニー刺激因子(PEG-filgrastim, Neulasta)もFDAに承認され、転移性乳がんの治療に用いられた(pegfamg013102LB, http://www.fda.gov)。Pharmacia社のPEG化ヒト成長因子アンタゴニストに関する申請がFDAに受領された。Celltech社のPEG化TNF-α抗体断片、Amgen社のPEG-TNF受容体は、既に後期臨床試験段階に入った。最初のPEG−有機分子複合体、PEG化カンプトテシンは、既に第II相臨床試験段階に入った。2004年PEG化オリゴヌクレオチド(Pegaptanib, MacugenTM)がFDAに承認された。薬物中のPEG部分（あるいはPEG）は体内代謝が明確であり、良好で安全で、副作用のない薬物修飾子であることが実証された。
【０００９】
タンパク質薬物と結合するPEGは通常誘導体化され、PEGの両端にある一つあるいは二つの末端基を化学的に活性化させ、適切な官能基にする必要がある。この官能基は結合する薬物中の少なくとも一つの官能基に対して活性があり、互いに安定な共有結合を形成できる。例えば、PEGはタンパク質ペプチド鎖のLys残基のε-NH2基と結合し、あるいはタンパク質ペプチド鎖N末端のアミノ酸残基のα-NH2基と結合する。ヨーロッパ特許EP0809996に記載されたIFN-αのPEG化は、求核置換反応でPEG-NHSがIFN-αのN末端アミノ酸のα-NH2基あるいはLysのε-NH2基と結合する。前述の特許に記載されたPEG-NHSはU型分岐のPEG誘導体(PEG2-NHS)であり、分子式を以下に示す。
【化１】
2010538022.tif 000002
【００１０】
ここで、RおよびR’は独立して低分子量のアルキル基であり、nおよびn’は600〜1500の間であり、PEGの平均分子量は26KD〜66KDである。IFN-αのPEG2-NHS修飾生成物の分子式を以下に示す。
【化２】
2010538022.tif 000003
【００１１】
一つあるいは多数のPEG2-NHS分子がIFN-αのN末端アミノ酸のα-NH2基あるいはLysのε-NH2基と結合し、生成物は非PEG化、シングルポイントPEG化およびマルチポイントPEG化のIFN-α混合物である。既知の精製手段で、シングルポイントPEG化IFN-αを反応生成物から単離する。IFN-αは一つのN末端アミノ酸と多数のLysを有するため、PEG2-NHSとの反応部位が多数あり、単離したシングルポイントPEG化IFN-αは多種のシングルポイントPEG化異性体の混合物である。
【００１２】
ヨーロッパ特許EP 0593868において、直鎖のPEG誘導体がインターフェロンの修飾に採用されている。修飾生成物の分子式を以下に示す。
【化３】
2010538022.tif 000004
【００１３】
ここで、Rは低分子量のアルキル基であり、R1、R2、R3およびR4は水素あるいは低分子量のアルキル基であり、ｍは１からインターフェロンにおいて可能な修飾部位の数までである。Wは酸素あるいはNHであり、ｘは1〜1000の間であり、ｙとｚは0〜1000の間であり、ｘ＋ｙ＋ｚは3〜1000の間である。R1、R2、R3およびR4の少なくとも一つは低分子量のアルキル基である。Yu-Sen Wangら(Yu-Sen Wang et al, Advanced Drug Delivery Reviws, 54: 547-570, 2002、Yu-Sen Wang et al, Biochemistry, 39, 10634-10640, 2000)が12KDの線状モノメトキシPEG化rIFN-α2b(Peg-Intron)を報告した。HPLC-IEで分離分析し、その生成物は14種以上のシングルポイント修飾した異性体の混合物である。Yu-Sen Wangらが採用した線状PEGの分子式を以下に示す。
【化４】
2010538022.tif 000005
該PEGの平均分子量は12KDである。
【発明の概要】
【００１４】
本発明において使われるPEG誘導体はY型分岐であって、新規の分岐を有するPEG誘導体である。その構造はU型分岐のPEGと異なっている。両者の最大の差異は、本発明で用いるY型PEG誘導体は２本のPEG分岐鎖がN原子により連結したものであるのに対し、EP0809996のU型PEG誘導体は２本のPEG分岐鎖がC原子により連結したものであることである。本発明におけるPEG誘導体の分子構造を以下に示す。
【化５】
2010538022.tif 000006
ここで、PaおよびPbは同一または異なるポリエチレングリコールであり、ｊは1〜12の整数である。Riは水素、置換あるいは無置換のC1〜12アルキル基、置換アラルキル基、アリール基またはヘテロアルキル基である。X1およびX2は独立して連結基であり、X1は(CH2)nであり、X2は(CH2)n、(CH2)nOCO、(CH2)nNHCO、(CH2)nCOからなる群から選ばれる基であり、ｎは1〜12の整数である。Fはヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、治療薬あるいは基材にあるアミノ基、ヒドロキシル基またはメルカプト基と反応して共有結合を形成してもよい。
【００１５】
本発明の好ましい態様における、前記のY型PEG誘導体分子を以下に示す。
【化６】
2010538022.tif 000007
【００１６】
ここで、RおよびR’は独立してC1〜C4のアルキル基、好ましくはメチル基である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数であり、ｍ＋ｍ’は好ましくは600から1500までである。Riは水素、置換あるいは無置換のC1〜12アルキル基、置換したアラルキル基、アリール基またはヘテロアルキル基である。ｊは1〜12の整数である。Fはヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、治療薬あるいは基材にあるアミノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基と反応して共有結合を形成してもよい。好ましくは、ポリエチレングリコールの総平均分子量は約10000〜60000ダルトンであり、最も好ましくは約40000ダルトンである。
【００１７】
本発明の好ましい態様における、Y型PEG誘導体分子の可能な構造式を下式(I)に示す。
【化７】
2010538022.tif 000008
ここでRおよびR’は独立してC1〜C4のアルキル基、好ましくはメチル基である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数であり、ｍ＋ｍ’は好ましくは600から1500までである。ｊは1〜12の整数である。ポリエチレングリコールの総平均分子量は約40000ダルトンである。
【００１８】
本発明者らは、Y型分岐の側鎖PEG（YPEG）誘導体を採用し、インターフェロンα2b(IFN-α2b)を修飾し、Q Sepharose FFイオン交換クロマトグラフィーで単離し、シングルポイント修飾YPEG−IFN-α2bを得た。さらに、単離したシングルポイント修飾YPEG−IFN-α2bをSP Sepharose FFクロマトグラフィーで、主に配列番号：1の134位に対応するリジンの側鎖にあるε-アミノ基がYPEGと連結したYPEG−IFN-α2b（YPEG−IFN-α2b（134）と称する）を得た。測定によって、YPEG−IFN-α2b（134）の体外比活性は、他のリジン部位でYPEGと連結したYPEG−IFN-α2bより有意に高く、血清薬物代謝半減期も非修飾のIFN-α2bより有意に長い。
【００１９】
従って、本発明はシングルポイント修飾したポリエチレングリコール化インターフェロンα2bを提供し、その構造は以下のとおりである。
【化８】
2010538022.tif 000009
ここで、PaおよびPbは同一または異なるポリエチレングリコールであり、ｊは1〜12の整数である。Riは水素、置換あるいは無置換のC1〜12アルキル基、置換アラルキル基、アリール基またはヘテロアルキル基である。X1およびX2は独立して連結基であり、X1は(CH2)nであり、X2は(CH2)n、(CH2)nOCO、(CH2)nNHCO、(CH2)nCOからなる群から選ばれる基であり、ｎは1〜12の整数である。
【００２０】
本発明の好ましい態様において、ポリエチレングリコール化インターフェロンα2bは、下式IIに示す構造式を有する。
【化９】
2010538022.tif 000010
ここで、RおよびR’は、独立してC1〜C4のアルキル基、好ましくはメチル基である。ｊは1〜12の整数である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数であり、同一または異なる整数である。分子内にY型分岐PEGはシングルポイントでインターフェロンα2b分子に連結する。式IIのYPEG−IFN-α2bの分子量は重合度のｍとｍ’により決まる。好ましくはｍ＋ｍ’は600から1500までであり、対応のYPEGの平均分子量は約26000ダルトンから約66000ダルトンである。さらに好ましくは、ｍ＋ｍ’は795から1030までであり、対応のYPEGの平均分子量は35000ダルトンから45000ダルトンである。特別に好ましくは、ｍ＋ｍ’は885から1030までであり、対応のYPEGの平均分子量は39000ダルトンから45000ダルトンである。最も好ましくは、ｍ＋ｍ’は910であり、対応のYPEGの平均分子量は40000ダルトンである。ｍとｍ’との比は0.5から1.5までの範囲内にあり、好ましくは0.8から1.2までである。
【００２１】
好ましい態様において、本発明のポリエチレングリコール化インターフェロンα2bの中に、ポリエチレングリコールがインターフェロンα2bと連結するアミド結合は、インターフェロンα2bにおいて配列番号：1の31、49、70、83、112、121、131、133、134または164位に対応するリジン側鎖のε-アミノ基、あるいはN末端アミノ酸のαアミノ基にある。
【００２２】
さらに好ましい態様において、本発明のポリエチレングリコール化インターフェロンα2bの中に、ポリエチレングリコールがインターフェロンα2bと連結するアミド結合は、主にインターフェロンα2bにおいて配列番号：1の133位に対応するリジン側鎖のε-アミノ基にある。
【００２３】
任意に、本発明のインターフェロンα2bは天然物から抽出、あるいは組み換えバイオテクノロジーによって得られたインターフェロンα2bである。好ましくは、前記のインターフェロンα2bは天然物から抽出、あるいは組み換えバイオテクノロジーによって得られた、配列番号：1などの配列を有するヒトインターフェロンα2b(hIFN-α2b)である。さらに好ましくは、前記のヒトインターフェロンα2bは組み換えヒトインターフェロンα2b(rhIFN-α2b)である。rhIFN-α2bは人工的に合成されたものであってよく、原核生物発現系、例えば大腸菌(E.coli)で発現されたものであってもよく、真核酵母発現系、例えばピチアで発現されたものであってもよく、ほかの昆虫細胞系あるいは哺乳類細胞系、例えばCHOで発現されたものであってもよい。天然あるいは組み換えIFN-α2bを製造する方法およびIFN-α2bとそのYPEG修飾物の活性検査方法は当該技術分野において既存の技術である。
【００２４】
IFN-α2bと同じように、本発明に記載されているYPEG−IFN-α2bは臨床的に腫瘍および抗ウイルス感染、例えば肝炎、有毛細胞白血病、細胞媒介性リンパ球溶解、カポジ肉腫などの治療に使用される。臨床的に使用される場合、IFNαより、本発明のYPEG−IFN-α2bは安定性、溶解度、血清薬物代謝半減期および臨床効果において明らかに改善されている。投与方法に関し、本発明のYPEG−IFN-α2bは組成物として患者に投与でき、前記の組成物中に薬学的有効量のYPEG−IFN-α2bおよび薬学的に許容できる担体あるいは賦形剤を含む。そのため、他の態様において、本発明は薬学的有効量の本発明のポリエチレングリコール化インターフェロンα2bおよび薬学的に許容できる担体あるいは賦形剤を含む組成物を提供する。好ましくは、前記の組成物はマンニトール、アミノ酸、塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウムを含み、アミノ酸は好ましくはアスパラギン酸、アスパラギンおよびグリシンである。
【００２５】
他の態様において、本発明は、治療にインターフェロンα2bを必要とする疾患を治療するための薬物の製造における、本発明のポリエチレングリコール化インターフェロンα2b、あるいは本発明のポリエチレングリコール化インターフェロンα2bを含む組成物の使用を提供する。好ましくは、前記の治療にインターフェロンα2bを必要とする疾患はウイルス感染、例えばB型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、尖圭コンジローマ、腫瘍、例えば有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病、低悪性度非ホジキンリンパ腫、細胞性リンパ球溶解、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、皮膚T細胞リンパ腫、喉頭乳頭腫、再発性または転移性腎細胞癌、炎症性障害および疾患、例えば多発性硬化症、関節炎、喘息、嚢胞性線維症または間質性肺炎、および骨髄増殖性疾患に関連する血小板血症からなる群から選ばれる。
【００２６】
YPEG修飾したIFN-α2bを得るために、本発明の好ましい態様において、まずYPEGの活性化誘導体、例えばポリエチレングリコールスクシンイミジルエステル(YPEG−NHS)を、求核置換反応によって、PEG部分を共有結合でタンパク質のアミノ基(-NH2)と連結する。ここで、アミノ基は、タンパク質N末端のα-アミノ基およびリジン残基のε-アミノ基を含む。IFN-α2bとYPEGとを反応させ、YPEG-IFN-α2bを生成する反応方程式を以下に示す。
【化１０】
2010538022.tif 000011
【００２７】
反応条件は穏やかであり、pH範囲は4.5〜9.5にあり、温度は0〜25℃であり、撹拌あるいはほかの混合手段が必要である。具体的条件例については、実施例を参照されたい。各種分子量のYPEGはすべて本方法でIFN-α2bに連結することができ、反応生成物はシングルポイント(YPEG-IFN-α2b)、ダブルポイント(YPEG2-IFN-α2b)とマルチポイント(YPEGn-IFN-α2b)修飾物を含み、反応条件をコントロールすることによってシングルポイント置換生成物を主生成物にすることができる。
【００２８】
次に陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは排除クロマトグラフィーなどの方法で、各種のYPEG修飾したIFN-α2b混合物からシングルポイントYPEG-IFN-α2b修飾物を単離し、さらにシングルポイントYPEG-IFN-α2b修飾物を解析し、特定の部位においてYPEGと結合したYPEG-IFN-α2bを得る。常用の方法は例えば陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィーなどである。当該技術分野に既知の方法で性質を分析する。例えば質量分析、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどで生成物の分子量を分析し、さらに前記の精製方法でシングルポイント修飾物を、マルチポイント修飾生成物および未修飾IFN-α2bから区別し、また、シングルポイント修飾物を解析し、異なる修飾部位の各種の異性体を得ることができる。各種の修飾物の体外生物活性検査は既知のインターフェロン検査法に準じて行う。例えば細胞変性抑制法。シングルポイントPEG化IFNに対して、異なる修飾部位の異性体におけるPEG成分は、IFN活性構造の保持に影響し、異性体の生物活性は大いに違っている。
一般的に言えば、PEG修飾後IFNの体外生物活性はすべて著しく低下するが、本発明においてイオン交換クロマトグラフィーで得た三つのピークの分離物に対して、体外比活性を測定した結果、３番目のピークの分離物(SP2)が、他のピークの分離物およびPEGASYS(Roche Inc.)より有意に高い比活性を有し、未修飾のIFN-α2bより有意に長い血清薬物代謝半減期を有した。
【００２９】
さらに一つの態様において、分離したSP2のY分岐にPEGと連結したペプチドのアミノ酸配列をエドマン分解法で測定した結果、SP2の主成分はYPEG-IFN-α2b(134)であった。
【００３０】
そのため、一態様において、本発明はYPEG-IFN-α2b(134)の製造および精製方法を提供する。この方法は、
【００３１】
(a)アルカリ条件で、好ましくはpH9.0において、式(I)で表されるY型分岐構造を有するPEGとインターフェロンα2b溶液とを反応させ、PEG化インターフェロンα2bを得る工程；
【化１１】
2010538022.tif 000012
【００３２】
ここで、RおよびR’は、独立してC1〜C4のアルキル基、好ましくはメチル基である。ｊは1〜12の整数である。ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数であり、ｍ＋ｍ’は好ましくは600から1500までである。
【００３３】
(b)陰イオン交換樹脂、好ましくはQ Sepharose FFで、工程(a）で得られた反応生成物を獲得し、陰イオンで勾配、好ましくは塩素イオン勾配溶出で、修飾生成物を得る工程、
【００３４】
(c)陽イオン交換樹脂、好ましくはSP Sepharose FFで、工程(b）で得られた反応生成物を陽イオンで勾配溶出、好ましくはナトリウムイオン勾配溶出して、個別に各ピークを収集する工程、
【００３５】
(d)各ピークの活性を測り、活性の一番高いピークに対応する反応生成物を選択する工程、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、２バッチのY-PEG(40KD)でIFN-α2bのSDS-PAGEの結果を示した図である。分離ゲルの濃度は12%であり、クマシーブリリアントブルーR-250で呈色した。図１のSDS-PAGE電気泳動の結果によると、この反応条件で、rhuIFN-α2bのPEG修飾率は30〜50%の間であり、安定であった。修飾生成物は主にシングルポイント修飾生成物(YPEG-IFN-α2b)であり、マルチポイント修飾物(YPEGn-IFN-α2b)もあった。レーン１：IFN-α2b NHS-YPEG 40KDで0hの修飾反応；レーン２：IFN-α2b NHS-YPEG 40KDで060604-1バッチ2hの修飾反応；レーン3：IFN-α2b NHS-YPEG 40KDで060604-2バッチ2hの修飾反応；レーン4：marker, GE Lifescience。
【００３７】
【図２】図２は、SP Sepharose FFで分離精製したYPEG-IFN-α2b修飾部位異性体のグラフである。
【００３８】
【図３】図３は、SP Sepharose FFで精製したYPEG-IFN-α2bサンプルの12% SDS-PAGE電気泳動銀染色の結果を示した図である。レーン１：分子量参照、GE Lifescience; レーン２：SP Sepharose FFで精製したYPEG-IFN-α2bのピーク１；レーン３：SP Sepharose FFで精製したYPEG-IFN-α2bのピーク２；レーン４：SP Sepharose FFで精製したYPEG-IFN-α2bのピーク３；レーン５：SP Sepharose FFで精製したYPEG-IFN-α2bのピーク４。
【００３９】
【図４】図４は、SP Sepharose FFで精製したYPEG-rHuIFN-α2bサンプルの見かけの分子量を測定した7.5% SDS-PAGE還元型電気泳動銀染色の結果を示した図である。レーン１：分子量参照、GE Lifescience；レーン２：YPEG-rHuIFN-α2b SP1、2μg；レーン３：YPEG-rHuIFN-α2b SP2、2μg；レーン4：YPEG-rHuIFN-α2b SP3、2μg。
【００４０】
【図５】図５は、SP Sepharose FFで分離したYPEG-IFN-α2bのMALDI-TOF MS分子量の測定結果を示した図である。
【００４１】
【図６】図６は、YPEG-NHS(40KD) のMALDI-TOF MS分子量の測定結果を示した図である。
【００４２】
【図７】図７は、カニクイザルに30μg・kg-1のYPEG-rhIFN-α2bを単回投与した後の、血清薬物濃度および活性の比較を示した図である。
【００４３】
【図８】図８は、トリプシン消化YPEG-rHuIFN-α2b SP2の膵酵素ペプチドマッピングのブランクコントロールを検査した結果を示した図である。71.674minと17.589 minのいずれにおいても１つの小さいピークを検出し、2-3minの間にTrypsinのピークを検出した。
【００４４】
【図９】図９は、YPEG-rHuIFN-α2b SP2を0hトリプシン消化したサンプルのHPLC-RPC18検査結果を示した図である。YPEG-rHuIFN-α2b SP2の保持時間は62.114minであり、71.908minのピークは背景ピークであり、2〜3min。
【００４５】
【図１０】図１０は、YPEG-rHuIFN-α2b SP2を48hトリプシン消化したサンプルのペプチドマッピング検査結果を示した図である。60.5min〜63.2minの間に基質YPEG-rHuIFN-α2b SP2のピーク(62.114min)が検出されず、サンプルが全て消化されたことが示された。
【００４６】
【図１１】図１１は、YPEG-rHuIFN-α2b SP2を完全にトリプシン消化したサンプル中の、YPEGで修飾したペプチドのSephacryl S-100HR分離スペクトルを示した図である。ピーク別にサンプルを収集し、S100-1はYPEG修飾したペプチド、つまり目的サンプルであった。
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明を下記の態様においてさらに説明するが、任意の例あるいはこれらの組合せに、本発明の範囲あるいは態様を限定するものではない。本発明の範囲は添付の請求の範囲に限定され、本明細書および当該技術分野の一般的な常識を組み合わせて、当業者は、請求の範囲により限定される範囲を明確に理解することができる。
【００４８】
例1
Y型分岐PEGで修飾した組み換えヒトインターフェロンα2bの製造
(1)少量のY型分岐PEGで修飾した組み換えヒトインターフェロンα2bの製造
166.1mgのYPEG(式I、平均分子量40KD、均等アーム型、ロットナンバーRD010P041)(Beijing JenKem Technology Co., Ltd.)を1mlの2mM HCl(広東光華化学株式会社)に溶解し、40mgのIFN-α2b(厦門特宝生物工程株式会社)および50mMホウ酸−ホウ砂緩衝溶液(pH9.0)(中国医薬集団上海化学試薬公司)を加え、反応系の全体積を10mlにした。この反応系において、IFN-α2b反応最終濃度は4mg/mlであり、IFN-α2bとYPEGとの反応モル比は1:2であった。撹拌しながら0〜20℃の湯浴に2h放置し、PEG化IFN-α2bを生成した。氷酢酸(汕頭市西隆化工場)を加え、pH＜4まで調節し反応を終止した。サンプリングして、SDS-PAGE電気泳動を行った。反応系に水を加え50倍希釈し、0.2μmで濾過し、4℃で放置した。
【００４９】
Q Sepharose FFクロマトグラフィーで残留したPEGとPEG加水分解物、マルチポイントYPEG化IFN-α2b、シングルポイントYPEG化IFN-α2bと未修飾のIFN-α2bを分離した。Q Sepharose FF(GE Healthcare)クロマトグラフィーカラム(Ф12mm×90mm、1CV=10ml)を3CVの20mMホウ酸/ホウ砂緩衝溶液(pH9.0)-1M NaCl(BBI)で再生し、5CVの20mMホウ酸/ホウ砂緩衝溶液(pH9.0)で平衡化した。紫外検出波長を280nmに設定した。4℃で放置したサンプルを全てロードした。ロード後、3CVの20mMホウ酸/ホウ砂緩衝溶液(pH9.0)で平衡化し、20mMホウ酸/ホウ砂緩衝溶液(pH9.0)-12mM NaClで一番目のピークが完全に出るまで溶出し、このピークは残留したPEGであった。20mMホウ酸/ホウ砂緩衝溶液(pH9.0)-60mM NaClでさらに溶出し、この溶出ピークにおいて収集したサンプルはは主にシングルポイントPEG化YPEG-IFN-α2bの修飾生成物であった。さらに20mMホウ酸/ホウ砂緩衝溶液(pH9.0)-500mM NaClで溶出し、溶出したピークは未修飾のIFN-α2bであった。
【００５０】
目的生成物は主にシングルポイントPEG化YPEG-IFN-α2bであり、収率は20〜40%であった。
【００５１】
(２)Y型分岐PEG化修飾した組み換えヒトインターフェロンα2bの大規模製造
4982.4mgのYPEG(式I、平均分子量40KD、均等アーム型、ロットナンバーRD010P041)(Beijing JenKem Technology Co., Ltd.)を25mlの2mM HClに溶解し、1200mgのIFN-α2bおよび50mMホウ酸−ホウ砂緩衝溶液(pH9.0)を加え、反応系の全体積を200mlにした。この反応系において、IFN-α2bの反応最終濃度は6mg/mlであり、IFN-α2bとYPEGとの反応モル比は1:2であった。撹拌しながら0〜20℃の湯浴に2h放置し、氷酢酸を加え、pH＜4まで調節し反応を終止した。サンプリングしてSDS-PAGE電気泳動を行った。反応系に水を加え50倍希釈し、0.2μmで濾過し、4℃で放置した。
【００５２】
Q Sepharose FFクロマトグラフィーで残留したPEGおよびPEG加水分解物、マルチポイントYPEG化IFN-α2b、シングルポイントYPEG化IFN-α2bおよび未修飾のIFN-α2bを分離した。Q Sepharose FF(GE Healthcare)クロマトグラフィーカラム(Ф38mm×265mm、1CV=300ml)を3CVの20mMホウ酸/ホウ砂緩衝溶液(pH9.0)-1M NaCl(BBI)で再生し、5CVの20mMホウ酸/ホウ砂緩衝溶液(pH9.0)で平衡化した。紫外検出波長を280nmに設定した。4℃で放置したサンプルを全てロードした。ロード後、3CVの20mMホウ酸/ホウ砂緩衝溶液(pH9.0)で平衡化し、20mMホウ酸/ホウ砂緩衝溶液(pH9.0)-12mM NaClで一番目のピークが完全に出るまで溶出し、このピークは残留したPEGであった。20mMホウ酸/ホウ砂緩衝溶液(pH9.0)-60mM NaClでさらに溶出し、この溶出ピークにおいて収集したサンプルは主にシングルポイントPEG化YPEG-IFN-α2bの修飾生成物であった。さらに20mMホウ酸/ホウ砂緩衝溶液(pH9.0)-500mM NaClで溶出し、溶出したピークは未修飾のIFN-α2bであった。
【００５３】
目的生成物は主にシングルポイントPEG化YPEG-IFN-α2bであり、収率は35〜50%であった。
【００５４】
二つのロットのYPEG(40KD)化IFN-α2bのSDS-PAGE結果を図１に示す。図１のSDS-PAGE電気泳動の結果によると、本反応条件で、rhIFN-α2bのPEG修飾率は35〜50％の間であり、安定である。修飾生成物は主にシングルポイント修飾物(YPEG-IFN-α2b)であり、マルチポイント修飾物(YPEGn-IFN-α2b)もある。
【００５５】
例２
YPEG-IFN-α2b  SP Sepharose FFの解析
Q Sepharose FFで得たYPEG-IFN-α2bサンプルを20％酢酸でpＨ5.0まで調節し、5mM NaAc/HAc(pH5.0)(汕頭市西隆化工場)で15倍希釈し、0.5mg/mlの負荷容量でSP Sepharose FF100ml(GE Healthcare)(Ф18mm×394mm)にロードし、3CVの5mM NaAc/HAc(pH5.0)で平衡化し、0％〜30％の2.5CVの5mM NaAc/HAc-70mM NaCl(pH5.0)で勾配溶出し、30％〜100％の50CVの5mM NaAc/HAc-70mM NaCl(pH5.0)で勾配溶出した。YPEG-IFN-α2bはSP Sepharose FF100mlによって四つのピークに分割された。ピークにしたがってサンプルを収集し、サンプリングしてSDS-PAGE電気泳動を行い、銀染色で呈色する。電気泳動の結果によると、SP Sepharose FFで分割されたピーク１は主にYPEGマルチポイント修飾物(YPEGn-IFN-α2b)であり、SP Sepharose FFで分割されたピーク２は主にシングルポイント修飾物(YPEG-IFN-α2b)であり、マルチポイント修飾物も一部含まれた。SP Sepharose FFで分割されたピーク3およびピーク4はいずれもシングルポイント修飾物であった。SP Sepharose FFで分割された2〜4ピークは異なるYPEG修飾部位のシングルポイント修飾物の異性体で、それぞれをYPEG-IFN-α2b SP1、YPEG-IFN-α2b SP2およびYPEG-IFN-α2b SP3と称する。分割スペクトルと電気泳動銀染色の結果を図２および図３に示す。
【００５６】
YPEG-IFN-α2b SP1〜3サンプルそれぞれに、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、マンニトール、アスパラギン酸を加え、0.22μｍでろ過除菌し、4℃で放置した。
【００５７】
例３
YPEG-IFN-α2b修飾部位異性体の性質分析
（１）タンパク質濃度の測定
ケルダール法によりYPEG-IFN-α2b修飾部位異性体のタンパク質濃度を測定した。
【００５８】
（２）タンパク質の見かけ分子量の測定
SDS-PAGE電気泳動法によりYPEG-IFN-α2b修飾部位異性体の見かけ分子量を測定した。実験方法はLaemmli(Nature 227:680, 1970)の報告にしたがって行い、ゲル濃度は7.5％であり、銀染色法で呈色した。YPEG-IFN-α2b修飾部位異性体の見かけ分子量はほぼ一致しており、約123KDであった(図4)。
【００５９】
（３）MALDI-TOF MS法で分子量の測定
ドイツBRUKER社のautoflex TOF/TOFシステムでMALDI-TOF MS法に準じてYPEG-rHuIFN-α2b修飾部位異性体の分子量を測定した。シナピン酸(Sinapinic acid,SA,C11H12O5,MW 224.22; ロット2006 236870 002、ドイツBRUKER社)を基質として使用し、タンパク分子量標準物質はBRUKER社のProtein Calibration Standard II(Part No.207234)を用い、分析ソフトはflexAnalysis Ver.3.0.54.0であった。YPEG-IFN-α2b修飾部位異性体のMS分子量が一致しており、約59000ダルトンであった（図5）。
【００６０】
（４）エンドトキシン含量の測定
リムルス試験法（『中華人民共和国薬局方』2005年改正第三部付録XC）に準じてYPEG-IFN-α2bのエンドトキシン含量を測定した。各サンプルの測定結果はいずれも＜5.0EU/mgであった。
【００６１】
（５）YPEG-IFN-α2b SP2の動物体内活性および薬物動態研究
〔１〕YPEG-IFN-α2b SP2の動物体内活性研究
IFNの作用メカニズムにおいて、一部分は体に作用して2’-5’AS(2’5’-オリゴアデニル酸合成酵素)の生成を促進し、さらに抗ウイルスなどの作用を発揮する。125Iをトレーサーとして、体内の2’-5’AS活性を測定することにより、IFNの薬力学パラメータが反映される。poly(I)poly(C)寒天の存在下で2’-5’ASはATPから2’-5’A(2’-5’オリゴアデニル酸；2’-5’ASの活性は生成した2’-5’Aの濃度で表す)の生成を触媒する。まず、サンプルの中の2’-5’ASがpoly(I)poly(C)寒天に吸着し、活性化されてから、基質ATPから2’-5’Aの生成を触媒する。125I標識した2’-5’A、抗2’-5’A抗血清および二次抗体の混合物を加え、インキュベートし、遠心分離した。上清を捨て、ガンマカウンターで沈殿物の放射活性を測定した。最初に加えた125I標識した2’-5’Aの結合率を計算し、4パラメータロジスティック回帰により、標準曲線を作成した。未知サンプルの中の2’-5’ASに誘導され生成した2’-5’Aの濃度を計算した。
【００６２】
表１および図７は、2’-5’A法でカニクイザル（18匹（Guangxi Weimei Biotechnology Co., Ltd.（認証Ｎo.：S.CXK桂2002-0001））、体重2.5〜5.5ｋｇ、雌6匹、雄12匹、ケージ別に飼育され、標準サル餌を与え、水を自由に与えた）に30μg・kg-1のYPEG-IFN-α2b SP2を単回皮下注射(s.c.)後、血清中の2’-5’Aの濃度を測った結果である。図８に示すように、平均ピーク到達時間は64±27.71hであり、ピーク濃度は292.30±148.08Pmol・dL-1であった。投与後血清中の2’-5’ASの活性は明らかに向上し、血清中の2’-5’Aのピーク到達時間はYPEG-rhIFNα2b SP2より遅れた。
【表１】
2010538022.tif 000013
【００６３】
〔２〕YPEG-IFN-α2bおよびrhIFN-α2bのカニクイザル体内薬物動態研究
カニクイザルにYPEG-IFN-α2bを10、30、100μg/kgで単回皮下注射した。投与前後1、2、4、8、10、12、24、48、72、96、168、240および312ｈに投与群の投与部位の反対側の後肢静脈から1ｍL採血した。カニクイザルにIFN-α2bを30μg・kg-1で単回皮下注射した。投与前後0.5、1、2、3、4、5、6、8、24ｈに投与群から1ｍL採血し、血液サンプルを４℃にて30min放置してから2000回転で10min低温遠心して、速やかに血清を分離し、-20℃で保存し分析に供する。
【００６４】
ダブルサンドイッチ免疫定量法で測定する。組換えヒトインターフェロンαに特異的なモノクローナル抗体をマイクロプレートにプレコーティングしておいた。標準物質およびサンプルをウェルに入れ、その中のIFN-α2bまたはYPEG-IFN-α2b SP2を固相化抗体と結合した。結合していない物質を洗浄除去し、ヒトインターフェロンα抗体IgG（二次抗体）をウェルに加え、完全に反応させてからプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)をウェルに加えた。結合していない酵素試薬を全て洗浄除去して、ウェル内にHRPの基質溶液を加えたことにより生じた色は、最初の段階で結合したIFN-α2bまたはYPEG-IFN-α2b SP2の量に比例する。反応を終止し色の強度を測定した。吸光度OD値が高ければ高いほど、サンプルの中のIFN-α2bまたはYPEG-IFN-α2b SP2の濃度が高い。二つのサンプルの標準曲線を作成し、各血液サンプルの血清薬物濃度を測定した。
【００６５】
キット(米国Biomedical社、Lot#3271)の説明書に従い、１ウェルあたり標準物質または血清サンプルを100μL加え、プレートミキサーで軽く均一に混合し、未知サンプルの予想濃度に応じて、希釈液でサンプルを標準曲線濃度範囲まで希釈した。各プレートについて、IFN-α2bまたはYPEG-IFN-α2b SP2の標準曲線をプロットし、当該プレートにおける未知サンプル濃度の計算に使用した。室温で1hインキュベートした。プレート洗浄液でプレートを一回洗い、各ウェルに二次抗体を100μL加え、続けて室温で1h反応させた。３回洗い、各ウェルにHRP結合体を100μL加え、室温で1h反応させた。プレートを4回洗浄し、各ウェルにTMB基質を100μL加え、室温において遮光下で15min放置した。各ウェルに終止液を100μL加え、軽く振り混ぜ、反応を終止させた。5min以内にマイクロプレートリーダーで450nm波長の吸光OD値を測定した。各サンプルの濃度を測定した。
【００６６】
カニクイザルに10、30、100μg/kgの低、中、高投与量でYPEG-IFN-α2bを単回S.Cした後のT1/2は、それぞれ48.87±11.67、51.94±3.52および49.60±2.97ｈであった。カニクイザルに30μg/kgでIFN-α2bを単回S.Cした後、T1/2は3.22±0.10ｈであった。YPEG修飾後、IFN-α2b末端半減期は少なくとも１０倍以上延長した。
【００６７】
（６）体外比活性測定
細胞変性効果阻害試験でYPEG-IFN-α2bの各修飾部位の異性体の体外生物学活性を測定した。「中華人民共和国薬局方」2005年改正第三部付録XCの「インターフェロン効力測定法」に準じて、インターフェロンがヒト羊膜細胞(WISH)を保護し、水疱性口内炎ウイルス(VSV)の破壊を避ける作用によって、生き残ったWISH細胞をクリスタルバイオレットで染色し、570nmで吸光度を測定し、WISH細胞に対するインターフェロンの保護効果の曲線を作成し、インターフェロンの体外生物活性を測定した。各サンプルの体外生物活性の測定結果を表２に示す。各サンプルに対して同時に三つのパラレルテストを行った。YPEG修飾後、シングルポイント修飾物の各修飾部位の異性体の中で、SP2の体外比活性がもっとも強く、SP1およびSP3ならびにPEGASYS(スイスホフマン・ラ・ロシュ株式会社製造、上海ロシュ株式会社分装、産品ロットB1016、分装ロットSH0020)より１〜２倍強く、分割していないサンプルより約１倍強かった。
【表２】
2010538022.tif 000014
【００６８】
(7) YPEG-IFN-α2b SP2修飾部位の解析
KYPEG-IFN-α2b SP2を5Ｋ限外ろ過膜(Millipore, ポリエーテルスルホン材質)でろ過し、溶媒系を50mM NH4HCO3 pH8.0に変え、紫外線スキャナーでタンパク濃度を測定したところ3.82mg/mlであった。TPCKトリプシン(Promega)を商品付属の溶解液で0.5μg/mlに調製した。表３に示すようにサンプルを加えた。
【表３】
2010538022.tif 000015
【００６９】
反応系を37℃の水浴に48ｈ置き、1.52mlの20%酢酸を加え反応を終止させた。少量のサンプルを取りHPLC-RP C18ペプチドマッピング測定を行った。測定用機器はWaters HPLCシステムであり、タイプ600のコントローラを有し、検出器は2487二波長検出器であり、データー処理ソフトはEmpower 2であった。HPLCカラムはJupiter C18であり、粒径5μm、孔径300Å、Ф4.6×150mm、米国Phenomenex社製造であった。移動A相は0.1%TFA/H2Oであり、移動Ｂ相は0.1%TFA/90%ACN/H2Oであった。測定流速は1ml/min、検出波長は214nmであった。溶出勾配を表４に示し、結果を図8〜10に示す。
【表４】
2010538022.tif 000016
【００７０】
検査結果によると、サンプルは全て酵素分解された。反応終生成物はDTT還元処理を行った。Sephacryl S-100HR(Ф18×255mm、1CV=64ml、GE Healthcare)を予め３CVの20mM PBNa-400mM NaCl(pH7)で平衡化し、３％CVのYPEG-IFN-α2b SP2のTPCKトリプシン完全酵素分解サンプルを静水圧でロードし、20mM PBNa-400mM NaCl(pH7)で溶出し、検出波長を280nmに設定した。第一の溶出ピークのサンプルを収集し（サンプル番号：YPEG-IFN-α2b SP2 S100-1、図11）、5K限外ろ過で溶媒系を5mM PBNa(pH7)に変え、真空凍結乾燥した。Edman分解法で凍結乾燥したサンプルのN末端アミノ酸配列を決定した。サンプルのN末端における７つのアミノ酸配列はXYSPXAW(表５)であり、ここでXはEdman分解法で検出できないαアミノ酸のシステイン(Cys)、非αアミノ酸およびほかの修飾アミノ酸を指している。配列番号：1に示す配列と比較し、YPEG-IFN-α2b SP2が主にLys134のYPEG修飾生成物であることがわかった。
【表５】
2010538022.tif 000017
【図１】
2010538022.tif 000021
【図２】
2010538022.tif 000022
【図３】
2010538022.tif 000023
【図４】
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【図５】
2010538022.tif 000025
【図６】
2010538022.tif 000026
【図７】
2010538022.tif 000027
【図８】
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【図９】
2010538022.tif 000029
【図１０】
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【図１１】
2010538022.tif 000031
【配列表】
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【国際調査報告】
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