(57)【要約】  本発明の目的は、ペプチドリンカーの組成物類及びダイマーの形でのアプタマーオリゴヌクレオチドの合成及びアニーリングへのそれらの使用により解決される。本発明は特に、診断及び/又は治療剤としての使用のために前記組成物を供給する。もう１つの好ましい態様においては、本発明は、一定量の本発明の化合物を含んで成るバイアルを含んで成る、放射線医薬製剤を調製するためのキットに関する。本発明のさらなる好ましい態様は、自動ペプチド合成機における前記化合物の合成を含んで成る、前記化合物の生成方法に関する。もう１つの好ましい態様においては、本発明は、薬物の製造、好ましくは増殖性疾病の診断又は治療のためへの本発明の前記化合物の使用に関する。さらなる好ましい態様においては、本発明は、本発明の化合物を投与するか又は利用して、患者を処理するか又は診断するための方法に関する。
2010502657.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（I）
Mal-L1-(A)n-C-(A)m-L2-Mal      （式１）
[式中、Malは、マレイミドであり；
L1及びL2は同じであっても又は異なっていても良く、それぞれ不在であるか、又は枝分かれ鎖又は枝なしの、置換された又は置換されていない（C1-C12）アルキル、（C1-C12）アルコキシから選択されたリンカー構造体、例えばエチレングリコールoであり、ここでoは１〜12の整数であり；
Aは、アミノ酸又はその誘導体であり；
n、mは独立して、0〜20の整数から選択され；
Cは、不在であるか又は金属イオンキレート化基であるか、又はハロゲン担持のシントンの接合のための結合基であり；
A及び/又はCは独立して、１又は複数の、同一又は異なった保護基を含んで成ることができる]
で表される化合物、及び医薬的に許容できるその塩。
【請求項２】
Aの少なくとも１つが、D−アミノ酸である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
nはmと同じであり、そして０，１，２，３，４及び５から選択される請求項１又は２記載の化合物。
【請求項４】
CがN3Sキレート化剤である請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項５】
L1がL2と同一であり、そして-CH2-CH2-CO-である請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物。
【請求項６】
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Dpr-Met-Cys(tブチルチオール)-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal; 
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Dpr-Gly-Cys(tブチルチオール)-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal; 
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Ser-Dpr-Met-Cys(tブチルチオール)-Ser-Ser-Lys-CO-CH2-
CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Ser-Dpr-Gly-Cys(tブチルチオール)-Ser-Ser-Lys-CO-CH2-
CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Ser-Ser-Dpr-Met-Cys(tブチルチオール)-Ser-Ser-Ser-Lys-
CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-D-Ser-D-Ser-D-Ser-Dpr-Met-Cys(tブチルチオール)-D-Ser-D-
Ser-D-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-D-Ser-D-Ser-D-Ser-Dpr-Gly-Cys(tブチルチオール)-D-Ser-D-
Ser-D-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Dpr-Met-Cys-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Dpr-Gly-Cys-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Ser-Dpr-Met-Cys-Ser-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Ser-Dpr-Gly-Cys-Ser-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Ser-Ser-Dpr-Met-Cys-Ser-Ser-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-D-Ser-D-Ser-D-Ser-Dpr-Met-Cys-D-Ser-D-Ser-D-Ser-Lys-
CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-D-Ser-D-Ser-D-Ser-Dpr-Gly-Cys-D-Ser-D-Ser-D-Ser-Lys-
CO-CH2-CH2-Mal
から選択される請求項１〜５のいずれか１項記載の化合物。
【請求項７】
前記化合物が、
【化１】
2010502657.tif 000013
である請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項８】
下記一般式（II）
T1-Mal-L1-(A)n-C-(A)m-L2-Mal-T2      （式II）
[式中、T1及びT2はそれぞれ、標的基である、ここでT1及びT2は独立して、同じであっても又は異なっていても良く、
Malは、マレイミドであり；
L1及びL2は同じであっても又は異なっていても良く、それぞれ不在であるか、又は枝分かれ鎖又は枝なしの、置換された又は置換されていない（C1-C12）アルキル、（C1-C12）アルコキシから選択されたリンカー構造体、例えばエチレングリコールoであり、ここでoは１〜12の整数であり；
Aは、アミノ酸又はその誘導体であり；
n、mは独立して、0〜20の整数から選択され；
Cは、不在であるか又は金属イオンキレート化基であるか、又はハロゲン担持のシントンの接合のための結合基であり；
A及び/又はCは独立して、１又は複数の、同一又は異なった保護基を含んで成ることができる]
で表される化合物、及び医薬的に許容できるその塩。
【請求項９】
T1及びT2の少なくとも１つがアプタマーオリゴヌクレオチドである請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
T1及びT2の少なくとも１つが、N3Sキレート化剤に接合されるアプタマーオリゴヌクレオチドである請求項８又は９記載の化合物。
【請求項１１】
T1及びT2の少なくとも１つが、テナスシン−Cに結合するアプタマーオリゴヌクレオチドから成る群から選択されるアプタマーオリゴヌクレオチドである請求項８〜10のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１２】
T1及びT2の少なくとも１つが、TTA1及びTTA3から選択されたアプタマーオリゴヌクレオチドである請求項８〜11のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１３】
前記化合物が、
【化２】
2010502657.tif 000014
である請求項８〜12のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１４】
前記化合物がさらに、金属イオンを含んで成る請求項１〜13のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１５】
前記金属イオンが、放射線療法又は診断イメージングのために適切な放射性同位体である請求項14記載の化合物。
【請求項１６】
前記金属イオンが、99mTc、86Y、68Ga及び111Inから成る群から選択される請求項14〜15のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１７】
多量の請求項１〜13のいずれか１項記載の化合物を含んで成るバイアルを含んで成る、放射線医薬製剤を調製するためのキット。
【請求項１８】
自動ペプチド合成機において請求項１〜７のいずれか１項記載の化合物の合成を含んで成る、前記化合物の生成方法。
【請求項１９】
マレイミド基を通して請求項１〜７のいずれか１項記載の化合物を、標的成分に結合することを含んで成る、請求項８〜13のいずれか１項記載の化合物の生成方法。
【請求項２０】
治療及び/又は診断への使用のための請求項14〜16のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２１】
増殖性疾病の診断及び/又は治療のための薬物の製造のためへの請求項１〜16のいずれか１項記載の化合物の使用。
【請求項２２】
請求項１〜16のいずれか１項記載の化合物、及び医薬的に適用できるキャリヤー及び/又は賦形剤を含んで成る医薬又は診断組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の分野、及びより具体的には、オリゴヌクレオチドの組成物類、及び診断及び/又は治療剤としてのそれらの使用に関する。特に、本発明は、ダイマー形でのアプタマーオリゴヌクレオチドの合成に関する。本発明はさらに、ペプチドリーカーを有するダイマー又はマルチマーアプタマープローブを供給する。それらのリンカーは、金属結合のためのキレート化単位、又は他のラベリングアプローチ（例えば、色素等）のための接合部位を含むことができる。本発明はさらに、キレート化剤−アプタマー接合体、アプタマー−色素接合体、及びインビトロ及びインビボでの標的化された分析物の検出方法を包含する。そのような分子は、それらの急速な血液クリアランス、腫瘍侵入、腫瘍イメージング、及び標的化された放射性同位体の供給のために、例えば分子イメージング適用のために有用である。その分子はまた、腫瘍治療及び放射性治療法のためにも有用である。
【背景技術】
【０００２】
本発明のために、本明細書に引用されるすべての参考文献は、引用により本明細書に組込まれる。
アプタマーは、ワトソン−クリック型塩基対以外の相互作用を通して非核酸標的物（例えば、タンパク質）又は核酸分子に対して特定の親和性を有する核酸分子である。アプタマーは、例えばアメリカ特許第5,475,096号; 第5,270,163号; 第5,589,332号;及び第5,741,679号に記載される。
【０００３】
アプタマーは、pモル値以下の解離定数を有する、多くの種々のタイプの標的分子、例えば小分子、ペプチド、タンパク質、ウィルス粒子及びさらに完全な細胞に、高い親和性及び選択性を伴って結合することができる（Jayasena S. D. (1999) Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem., 45, 1628-1650; Sullenger B. A. and Gilboa, E. (2002) Emerging clinical applications of RNA. Nature, 418, 252-258; Rimmele M. (2003) Nucleic acid aptamers as tools and drugs: recent developments. Chembiochem, 4, 963-971; Lee J.. F., HesselberthJ. R., Meyers, L. A. and Ellington, A.D. (2004) Aptamer database. Nucleic Acids Res., 32, D95-D100）。これは、精巧な三次元構造を形成するそれらの能力のためである。
【０００４】
核酸から成るアプタマーが、反復した選択及び増幅の方法により、大きな結合ライブラリーから選択される。この方法は、指数的富化によるリガンドの組織的評価（SELEX）として言及される（Tuerk C. and Gold, L. (1990) Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science, 249, 505-510; Ellington A. D. and Szostak, J. (1990) In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature, 346, 818-822; Daniels D. A., Chen, H., Hicke, B. J., Swiderek, K. M. and Gold, L. (2003) A tenascin-C aptamer identified by tumor cell Selex: sys- tematic evolution of ligands by exponential enrichment. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 100, 15416− 15421）。
【０００５】
アプタマーの分子量（10〜15kDaのサイズ、30〜40個のヌクレオチド）は、抗体の分子量（150kDa）よりも低い１つの大きさの程度であり（White R. R., Sullenger, B. A. and Rusconi, C. P. (2000) Developing aptamers into therapeutics. J. Clin. Invest., 106, 929-934）、従って、アプタマーは急速な組織及び腫瘍侵入性、及び早い血液クリアランスを有することが予測される。抗体に比較して、アプタマーは非免疫原性であり、そして初期時点で好ましい標的物：ノイズ比を示すことができる。
【０００６】
従って、アプタマーは、非侵襲性インビボ腫瘍イメージング及び治療のために所望する多くの特徴を示す（Hicke B. J. and Stephens, A. W. (2000) Escort aptamers: a delivery service for diagnosis and therapy. J. Clin. Invest., 106, 923-928; Charlton J., Sennello, J. and Smith, D. (1997) In vivo imaging of inflammation using an aptamer inhibitor of human neutrophil elastase. Chem. Biol., 4, 809-816; Drolet, D. W., Nelson, J., Tucker, C.E., Zack, P. M., Nixon, K., Bolin, R., Judkins, M. B., Farmer, J. A., Wolf, J. L., Gill, S. C. and Bendele, R. A. (2000) Pharmacokinetics and safety of an anti-vascular endothelial growth factor aptamer (NXl 838) following injection into the vitreous humors of rhesus monkeys. Pharm. Res., 17, 1503-1510）。
【０００７】
さらに、完全に合成分子であるアプタマーは、構造−活性関係（SAR）についての急速なアナログ化、及びユニークなキレート化分子、光活性プローブ、放射性核種、薬物及び薬物動力学的変性剤の結合のための部位特異的修飾及び接合を可能にする（Hilger S., Willis, M. C, Wolters, M. and Pieken, W. A. (1999) Tc-99m-labeling of modified RNA. Nucleosides Nucleotides, 18, 1479-1481; Hilger S., Willis, M. C, Wolters, M. and Pieken, W.A. (1998) Synthesis of Tc-99m labeled, modified RNA. Tetrahedron Lett., 39, 9403-9406; Kuhnast, B., Dolle, F., Terrazzino, S., Rousseau, B., Loc'h, C, Vaufrey, F., Hinnen, F., Doignon, I., Pillon, F., David, C, Crouzel, C. and Tavitian, B. (2000) General method to label antisense oligonucleotides with radioactive halogens for pharmacological and imaging studies. Bioconjug. Chem., 11, 627-636; Tavitian B. (2003) In vivo imaging with oligonucleotides for diagnosis and drug development. Gut, 52 (Suppl. 4), iv40-iv47）。
【０００８】
分子標的化イメージング剤としてのアプタマーの好都合なインビボ適用のための必要条件は、それらの標的物のための高い親和性及び選択性、及びインビボ分解に対する適切な安定性により表される。多くの方法が、標的親和性を維持しながら、3’及び5’エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼに対してアプタマーを安定化するために使用されて来た。
【０００９】
リボース成分の2’位置での化学的修飾、アプタマーの環状化、3’キャッピング及び“スピエゲルマー（spiegelmer）”技法は記載されている（White R. R., Sullenger, B. A. and Rusconi, C. P. (2000) Developing aptamers into therapeutics. J. Clin. Invest., 106, 929-934; Pieken W. A., Olsen, D. B., Benseler, F., Aurup, H. and Eckstein, F. (1991) Kinetic characterization of ribonuclease-resistant 2'-modified hammerhead ribozymes. Science, 253, 314-317; Jellinek D., Green, L. S., Bell, C, Lynott, C. K., Gill, N., Vargeese, C, Kirschenreuter, G., Mc Gee, D. P., Abesinghe, P., Pieken, W. A., Shapiro, R., Rifkin, D. B., Moscatelli, D. and Janjic, N. (1995) Potent 2'-amino-2'-deoxypyrimidine RNA inhibitors of basic fibroblast growth factor. Biochemistry, 34, 1 1363-1 1372; Klussmann S., Nolte, A., Bald, R., Erdmann, V. A. and Fuerste, J. P. (1996) Mirror-image RNA that binds d-adenosine. Nat. Biotechnol., 14, 1 1 12-1 1 15; Nolte A., Klussmann, S., Bald, R., Erdmann, V. A. and Furste, J. P. (1996) Mirror-design of 1- oligonucleotide ligands binding to L-arginine. Nat Biotechnol., 14, 1 1 16-1 1 19; Kim, S. J., Kim, M. Y., Lee, J. H., You, J. C. and Jeong, S. (2002) Selection and stabilization of the RNA aptamers against the human immunodeficiency virus type-1 nucleocapsid protein. Biochem. Biophys. Res. Commun, 291, 925-931）。
【００１０】
アプタマーを安定化するための１つの手段は、非結合領域内に位置する二本鎖領域の熱安定性を高めることである。この観点から、ロックされた核酸（LNA）は、RNA又はDNAとハイブリダイズされる場合、それらの実質的に高められたヘリカル熱安定性及び卓越したミスマッチ識別のために、高い有望性を保持する（Petersen, M. and Wengel, J. (2003) LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics. Trends Biotechnol., 21, 74-81 ; Koshkin A. A., Singh, S. K., Nielsen, P., Rajwanshi, V. K., Kumar, R., Meldgaard, M., Olsen, C. E. and Wengel, J. (1998) LNA (Locked Nucleic Acids) synthesis of the Adenine, Cytosine, Guanine, 5-Methylcytosine, Thymine and Uracil bicyclonucleoside monomers, oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition. Tetrahedron, 54, 3607-3630; Koshkin A. A., Rajwanshi, V. K. and Wengel, J. (1998) Novel convenient synthesis of LNA [2.2.1] bicyclo nucleosides. Tetrahedron Lett., 39, 4381-4384; Braasch, D. A. and Corey, D. R. (2000) Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem. Biol., 55, 1-7; Koshkin, A. A., Nielsen, P., Meldgaard, M., Rajwanshi, V. K., Singh, S. K. and Wengel, J. (1998) LNA (Locked Nucleic Acid): an RNA mimic forming exceedingly stable LNA:LNA duplexes. J. Am. Chem. Soc, 120, 13252-13253)。
【００１１】
LNAのさらなる利点は、ヌクレアーゼによる分解に対するその耐性である (Wahlestedt C, Salmi, P., Good, L., KeIa, J., Johnsson, T., Hokfelt, T., Broberger, C, Porreca, F., Lai, J., Ren, K., Os- sipov, M., Koshkin, A., Jakobsen, N., Skouv, J., Oerum, H., Jacobsen, M. H. and Wengel, J. (2000) Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 97, 5633-5638; Kumar R., Singh, S. K., Koshkin, A. A., Rajwanshi, V. K., Meldgaard, M. and Wengel, J. (1998) The first analogues of LNA (locked nucleic acids): phos- phorothioate-LNA and 2'-thio-LNA. Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, 2219-2222; Kurreck, J., Wy- sko, E., Gillen, C. and Erdmann, V. A. (2002) Design of antisense oligonucleotides stabilized by locked nucleic acids. Nucleic Acids Res., 30, 191 1-1918）。
【００１２】
それらの魅力的な特徴に基づけば、LNA修飾は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（Petersen M. and Wengel, J. (2003) LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics. Trends Biotechnol., 21, 74-81; Frieden M., Christensen, S. M., Mikkelsen, N. D., Rosenbohm, C, Thrue, C. A., Westergaard, M., Hansen, H. F., Orum, H. and Koch, T. (2003) Expanding the design horizon of antisense oligonucleotides with alpha-L-LNA. Nucleic Acids Res., 31, 6365-6372; Jepsen J. S. and Wengel, J. (2004) LNA-antisense rivals siRNA for gene silencing. Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 7, 188-194; Hansen J. B., Westergaard, M., Thrue, C. A., Giwercman, B. and Oerum, H. (2003) Antisense knockdown of PKC-alpha using LNA-oligos. Nucleosides Nucleotides 22, 1607-1609; Grunweller A., Wyszko, E., Bieber, B., Jahnel, R., Erdmann, V. A. and Kurreck, J. (2003) Comparison of different antisense strategies in mammalian cells using locked nucleic acids, 2'-O-methyl RNA, phosphorothioates and small interfering RNA. Nucleic Acids Res., 31, 3185-3193）、DNAayme（Vester B., Lundberg, L. B., Sorensen, M. D., Babu, R., Douthwaite, S. and Wengel, J. (2002) LNAzymes: incorporation of LNA-type monomers into DNAzymes markedly increases RNA cleavage. J. Am. Chem. Soc, 124, 13682-13683; Schubert S., GuI, D. C, Grunert, H. P., Zeichhardt, ., Erdmann, V. A. and Kurreck, J. (2003) RNA leaving ' 10-23' DNAzymes with enhanced stability and activity. Nucleic Acids Res., 31, 5982-5992)、及びデコイオリゴヌクレオチド（Crinelli, R., Bianchi, M., Gentillini, L. and Magnani, M. (2002) Design and characterization of decoy oligonucleotides containing locked nucleic acids. Nucleic Acids Res., 30, 2435-2443）への好都合な適用を見出した。
【００１３】
最近の研究は、アプタマー内のLNA修飾が、核溶解安定性に関して非常に有望であることを示している（Darfeuille F., Hansen, J. B., Orum,H., Di Primo, C. and Toulme, J. J. (2004) LNA/DNA chimeric oligomers mimic RNA aptamers targeted to the TAR RNA element of HIV-I . Nucleic Acids Res., 32, 3101-3107）。
【００１４】
インビボイメージング適用のための新規の強力なプローブを生成するための我々の試みにおいて、我々は、インビボ安定性に関して、機能及び生物分布を標的化するテナスシン−C−アプタマーTTA1（Hicke, B. J., Marion, C, Chang, Y.-F., Gould, T., Lynott, C. K., Parma, D., Schmidt, P. G. and Warren, S. (2001) Tenascin-C aptamers are generated using tumor cells and purified protein. J. Biol. Chem., 276, 48644- 48654）を改良するためにLNA修飾を適用した。
【００１５】
TTA1は、ヒトテナスシス−C（TN-C）を構造的に認識し、そしてそれに、高い親和性（５×10-9MのKd）を伴って結合する39マーのオリゴヌクレオチド（13.4kDaの分子量）である（Hicke B. J., Marion, C, Chang, Y.- F., Gould, T., Lynott, C. K., Parma, D., Schmidt, P. G. and Warren, S. (2001) Tenascin-C aptamers are generated using tumor cells and purified protein. J. Biol. Chem., 276, 48644-48654）。
【００１６】
TN-Cは、腫瘍形成、胚形成及び創傷治療において重要な役割を演じる細胞外マトリックスに見出されるヘキサマータンパク質である（Erickson, H. P. and Bourdon, M. A. (1989) Tenascin: an extracellular matrix protein prominent in specialized embryonic tissues and tumors. Annu. Rev. Cell Biol., 5, 71-92）。この特徴に基づけば、ラクネチウム−99m（Tc-99m）によりラベルされたTTA1は、TN-Cを発現する腫瘍のイメージングのための有望な候補体である。TTA1アプタマーは現在、臨床試験下にある。
【００１７】
ヌクレオ溶解分解に対するTTA1の適切な安定性は、2’−デオキシ−2’−フルオロヌクレオチドによるすべてのピリミジンリボヌクレオチドの置換により、及び19のプリンリボヌクレオチドの14個のリボヌクレオチドの2’−デオキシ−2’−OMeヌクレオチドによる置換により達成されて来た。さらに、その3’末端は、3’-3’-チミジンキャップにより阻止される。さらに構造特徴は、（CH2CH2O）6スペーサー及び5’-ヘキシル−アミノリンカーを包含する。
【００１８】
後者を通して、N2Sペプチジル放射性金属キレート（Hilger, S., Willis, M. C, Wolters, M. and Pieken, W. A. (1999) Tc-99m-labeling of modified RNA. Nucleosides Nucleotides, 18, 1479-1481; Hilger, S., Willis, M. C, Wolters, M. and Pieken, W. A. (1998) Synthesis of Tc-99m labeled, modified RNA. Tetrahedron Lett., 39, 9403-9406）は、TTA1に結合され得る。制限されたSAR研究が、TTA1に関して、これまで行われて来た。
【００１９】
アプタマーはしばしば、高い標的物：非標的物比を導く、10分以下の半減基を有する急速な腎臓クリアランスにより特徴づけられる（Healy, J. M., Lewis, S. D., Kurz, M., Boomer, R. M., Thompson, K. M., Wilson, C, McCauley, T. G. (2004) Pharmacokinetics and Biodistribution of Novel Aptamer Compositions, Pharmaceutical Research, 21, 2234-2246）。他方では、化合物のこの急速な排除は、標的器官又はそれぞれの結合部位における最適な蓄積のために十分なインビボ残留時間を確保するために、いくつかの正確な調節を必要とする。尿濾過は、例えば分子量における定義される上昇により低められ得る。
【００２０】
特注分子量は、インビボでの化合物の残留時間を調節するための容易な修飾手段である。オリゴヌクレオチドの分子量を変えるための最も通常の手段は、分子中へのポリエチレングリコール（PEG）基の導入により達成される（Watson,S. R., Chang, Y. F., O'Connell, D., Weigand, L., Rinquist, S., Parma, D. H. (2000) Anti-L- selectin aptamers: binding characteristics, pharmacokinetic parameters and activity against an intravascular target in vivo. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 10, 63-75）。アプタマーの主鎖への親水性鎖の導入はまた、分子量の定義された上昇のほかに、化合物を、より腎排除の方に向けることができる。
【００２１】
二量体化は、PEG化された鎖の導入の他に、アプタマーの分子量を高めるためのもう１つの選択である。ダイマーアプタマーは、血液保持及び組織侵入時間を延長する、高められた分子量により特徴づけられる。さらに、ダイマーは実質的に、標的タンパク質に、二価的に及び従って、より活動的に結合することができる。このより活動的な結合は、標的分子からのより遅い解離により、腫瘍標的化性質を改良する。あらゆるテナスシン−Cマトリックスタンパク質が６個の可能性ある結合部位を有することを考慮して、ダイマーアプタマーは、１つの標的分子に二価的に結合し、モノマー形に比較して、遅いオフ−レート（off-rate）を生む。
【００２２】
David Parma及びSteve Rngquistは、L−セレクチン発現リンパ球に対してアッセイされた二価アプタマーが単価アプタマーよりも、増強された親和性及び標的物からの遅いオフ−レートを表すことを示した（Ringquist, S., and Parma, D. (1998) Anti-L-Selectin Oligonucleotide Ligands Recognize CD62L-Positive Leukocytes: Binding Affinity and Specificity of Univalent and Bivalent Ligands, Cytometry, 33, 394-405）。
【００２３】
キレートは、金属イオンと錯化剤との間での水溶性錯体である。それは通常、溶液においては、容易に解離せず、しかも不活性錯体を形成する。しかしながら、不安定錯体においては、金属イオンは容易に交換され得る。遷移元素の金属錯体は良く知られており、キレート化はより広範囲の元素内で生じる。可溶性金属錯体を生成するキレート化剤はまた、金属イオン封鎖剤とも呼ばれる（Chaberek, S., and Martell, A. E. Organic Sequestering Agents, Wiley, New York 1959）。キレート化剤は、金属に１対の電子を供与する少なくとも２つの官能基、例えば＝O, -NH2又は-COO-を有する。さらに、それらの基は、金属と環形成を可能にするよう配置されるべきである。キレート化剤は、生存システムに広く見出され、そして細胞代謝において重要なものである。
【００２４】
金属器レート化残基は、金属、特に金属イオンへの結合の目的、及びそのような金属イオンを組織に補充するよう作用する。多くの種類のそのような金属キレート化成分は、当業界において知られており、そして例えばアメリカ特許第5,654,272号、アメリカ特許第 5,681,541号、アメリカ特許第 5,788,960号、アメリカ特許第 5,81 1,394号、アメリカ特許第 5,720,934号、アメリカ特許第 5,776,428号、アメリカ特許第 5,780,007号、 アメリカ特許第 5,922,303号、アメリカ特許第 6,093,383号、 アメリカ特許第 6,086,849号、アメリカ特許第 5,965,107号、アメリカ特許第 5,300,278号、アメリカ特許第 5,350,837号、アメリカ特許第 5,589,576号、アメリカ特許第 5,679,778号、 アメリカ特許第 5,789,659号及びアメリカ特許第6,358,491号に記載される。
【００２５】
従って、放射性診断及び/又は治療に使用される場合、特に好都合である、改良されたアプタマー分子を供給することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【００２６】
本発明の目的は、ペプチドリンカーの組成物、及びダイマーの形でのアプタマーオリゴヌクレオチドの合成及びアニーリングのためへのそれらの使用により解決される。本発明は特に、診断及び/又は治療剤としての使用のために前記組成物を提供する。
【００２７】
その１つの好ましい観点においては、本発明は、下記一般式（I）
Mal-L1-(A)n-C-(A)m-L2-Mal      （式１）
[式中、Malは、マレイミドであり；L1及びL2は同じであっても又は異なっていても良く、それぞれ不在であるか、又は枝分かれ鎖又は枝なしの、置換された又は置換されていない（C1-C12）アルキル、（C1-C12）アルコキシから選択されたリンカー構造体、例えばエチレングルコールoであり、ここでoは１〜12の整数であり；Aは、アミノ酸又はその誘導体であり；n、mは独立して、0〜20の整数から選択され；Cは、不在であるか又は金属イオンキレート化基であるか、又はハロゲン担持のシントンの接合のための結合基であり；A及び/又はCは独立して、１又は複数の、同一又は異なった保護基を含んで成ることができる]
で表される化合物、及び医薬的に許容できるその塩を供給する。
【００２８】
本発明のもう１つの好ましい態様は、下記一般式（II）
T1-Mal-L1-(A)n-C-(A)m-L2-Mal-T2      （式II）
[式中、T1及びT2はそれぞれ、標的基である、ここでT1及びT2は独立して、同じであっても又は異なっていても良く、Malは、マレイミドであり；L1及びL2は同じであっても又は異なっていても良く、それぞれ不在であるか、又は枝分かれ鎖又は枝なしの、置換された又は置換されていない（C1-C12）アルキル、（C1-C12）アルコキシから選択されたリンカー構造体、例えばエチレングルコールoであり、ここでoは１〜12の整数であり；Aは、アミノ酸又はその誘導体であり；n、mは独立して、0〜20の整数から選択され；Cは、不在であるか又は金属イオンキレート化基であるか、又はハロゲン担持のシントンの接合のための結合基であり；A及び/又はCは独立して、１又は複数の、同一又は異なった保護基を含んで成ることができる]
で表される化合物、及び医薬的に許容できるその塩を供給する。
【００２９】
もう１つの好ましい態様においては、本発明は、多量の本発明の化合物を含んで成るバイアルを含んで成る、放射線医薬製剤を調製するためのキットに関する。
本発明のさらに好ましい態様は、自動ペプチド合成機において前記化合物の合成を含んで成る、前記化合物の生成方法に関する。
もう１つの好ましい態様においては、本発明は、増殖性疾病の診断及び/又は治療のための薬物の製造のためへの本発明の化合物の使用に関する。
さらに好ましい態様においては、本発明は、本発明の化合物を投与するか又は利用することを含んで成る、患者の処理又は診断方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ペプチドの合成を示す。ａ）ピペリジン、DMF、ｂ）ヒドラジン、DMF、ｃ）N−スクシンイミジル−マレイミド−プロピオネート、ｄ）TFA分解。
【図２】図２は、キレート成分Dpr-Gly-Cys (a)及びDpr-Met-Cys (b)を示す。
【図３】図３は、アプタマーダイマー反応混合物及び出発材料のゲル電気泳動分析を示す。
【図４】図4は、ゲル電気泳動のために使用されるゲルの例を示す。
【図５】図５は、精製成功のHPLC対照を示す。
【図６】図６は、精製されたダイマー（22）のPAGEを示す。
【００３１】
【図７】図７は、（22）の質量スペクトルを示す。
【図８】図８は、ヒト血漿におけるTc-99mによりラベルされたダイマーの血漿安定性を示す。
【図９】図９は、（2A）、（22A）及び（23A）の力学的器官分布を示す。
【図１０】図10は、U251腫瘍担持のNMRIヌードマウスにおける（2A）、（22A）及び（23A）の器官分布を示す。
【図１１】図11は、NMRIヌードマウスにおける（2A）及び（23A）の力学的イメージング研究を示す。A:力学的イメージ、B:時間依存性での（2A）の血液クリアランス、C:時間依存性での（23A）の血液クリアランス。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明を下記に詳細に記載する前、本発明は、特定の方法論、プロトコール、及び変更できるものとして本明細書に記載される試薬に限定されないことは理解されるべきである。本明細書に使用される用語は、特定の態様を単に記載するためであり、本発明の範囲を制限するものではないことが理解されるべきである。特にことわらない限り、本明細書に使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。
【００３３】
好ましくは、本明細書に使用される用語は、“生物技術の多種用語解：（IUPAC推薦）”、Leuenberger, H.G.W., Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1996),Wiley-VCH, Weinheimに記載のように定義される。
【００３４】
本明細書に及び続く請求の範囲を通して、特にことわらない限り、用語“含んで成る（comprise）”、及び変型、例えば“含んで成る（compraises及びcomprising）”とは、言及される整数又は段階、又は整数又は段階のグループの包含を意味するが、しかしいずれか他の整数又は段階、又は整数又は段階のグループの排除を意味するものではないことが理解されるであろう。
【００３５】
上記に概略されるように、診断及び/又は治療剤としての使用のために高められた腫瘍蓄積及び保持、及び高められたインビボ半減期を有する化合物を供給する必要が従来技術に存在する。本発明は、ペプチドリンカーの組成物、及びダイマー又はそれよりも高いマルチマーの形でのアプタマーオリゴヌクレオチドの合成及びアニーリングへのそれらの使用に基づかれる。そのような分子は、分子イメージング適用、例えば急速腫瘍侵入、血液クリアランス、腫瘍放射性イメージング、放射性同位体の標的化された供給のために有用である。分子はまた、腫瘍及び一般的治療のために有用である。
【００３６】
第１の観点においては、本発明は、下記一般式（I）：
Mal-L1-(A)n-C-(A)m-L2-Mal      （式Ｉ）
[式中、Malはマレイミドを表す]
で表される化合物を供給する。それは本明細書において、Nとして簡略された形で言及され得る。
【００３７】
L1及びL2は同じであっても又は異なっていても良く、それぞれ不在であるか、又は枝分かれ鎖又は枝なしの、置換された又は置換されていない（C1-C12）アルキル、（C1-C12）アルコキシから選択されたリンカー構造体、例えばエチレングルコールoであり、ここでoは１〜12の整数である。本発明の範囲内で、枝分かれ鎖又は枝なしの、置換された又は置換されていない“アルキル”とは例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、ペンチル、イソペンチル、又はヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル又はドデシルである。
【００３８】
本発明の範囲内で、“アルコキシ”とは例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ブチルオキシ、イソブチルオキシ、sec−ブチルオキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ又はドデシルオキシである。
【００３９】
用語“リンカー”とは、マレイミドに１点で共有結合される化学成分を言及する。リンカー自体は多くの異なった成分から成ることができ、それぞれの成分は、ユニークな利点を提供する特徴的性質を有する。有機合成の当業者は、必要とされる官能価を有する多くの種類のリンカーを企画し、そして合成できる。広範囲の適切なリンカーは、通常の実験の適用により企画され、そして合成され得る（Sandler and Karo, Polymer Synthesis Vol. 1, Academic Press, Inc. (1992); Sandler and Karo, Polymer Synthesis Vol. 2, Academic Press, Inc. (1994)）。
Aは、アミノ酸又はその配列、又はアミノ酸誘導体である。
【００４０】
用語“アミノ酸”とは、天然に存在するか、又は純粋に合成起源のものであり得、そして光学的に純粋、すなわち単一の鏡像異性体、及び従って、キラル、又は鏡像異性体の混合物であり得る、L−又はD−アミノ酸、アミノ酸類似体又はアミノ酸疑似体を意味する。好ましくは、本発明のアミノ酸は、光学的に純粋である。用語“アミノ酸”とは、約135ドルトンの平均分子量を有する非常に小さな生分子を言及する。それらの有機酸は、カルボン酸成分がイオン化され、そして塩基性アミノ基がプロトン化されている、両性イオン状態で天然において存在する。
【００４１】
全種類のアミノ酸は、有機カルボン酸基の通常の主鎖、及び飽和炭素原子に結合されるアミノ基を有する。この基の最も単純なメンバーはグリシンであり、ここで飽和炭素原子は置換されておらず、光学的に不活性のままである。20の最も通常のアミノ酸の残りは、光学的に活性であり、D及びL立体異性体として存在する。タンパク質中に組込まれる、天然に存在するアミノ酸は、大部分、左旋性（L）異性体である。α（又は飽和）炭素原子上の置換基は、低級アルキル基〜芳香族アミノ及びアルコールを変動する。また、酸性及び塩基性側鎖、及び２種の類似するアミノ酸間でジチオール連鎖に酸化され得るチオール鎖が存在する。
【００４２】
式Iの化合物のアミノ酸が多くの鏡像異性体形で存在する場合、すべてのそれらの形及びまた、それらの混合物（例えば、DL形）も包含される。
【００４３】
さらに、また構造要素、例えばN−末端修飾された又はカルボキシ−末端修飾された誘導体は、本発明の一部である。アミノ末端メチル−、エチル−、プロピル−、ブチル−、tert−ブチル−、ネオペンチル−、フェニル−又はベンジル−基、アミノ−末端基、例えばBOC, Mtr, CBZ, Fmoc, 及び特にアセチル、ベンゾイル又は（インドール−３−イル）カルボン酸基、さらにカルボキシ−末端メチル−、エチル−、プロピル−、ブチル−、tert−ブチル−、ネオペンチル−又はベンジルエステル、メチル−、エチル−、プロピル−、ブチル−、tert−ブチル−、ネオペンチル−又はベンジルアミド、及び特にカルボキサミドが好ましい。
【００４４】
Cは、不在であるか、又は金属イオンキレート化基であるか；又はハロゲン担持シントンの接合のための結合基である。
用語“金属イオンキレート化剤”とは、中心金属イオンと共に複数の配位を形成する有機化学物質である。複素環式環は、環の部分として中心金属と共に形成される。いくつかの生物学的システムは、金属キレート、例えばヘモグロビンのイオン結合ポルフィリン基及び植物のマグネシウム−結合クロロフィルムを形成する（Hawley's Condensed Chemical Dictionary, 12th ed）。
【００４５】
用語“シントン（synthon）”とは、シントンに結合され得るリンカーであるCが選択される場合、Cを通して式（I）の化合物の連続されるのに適切なハロゲン原子を担持するいずれかの予備配合された化学構造体を意味する。そのようなシントンの例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：
【００４６】
N−スクシンイミジル−４−[18F]フルオロベンゾエート（SFB）、N−スクシンイミジル−３−（４−ヒドロキシ−[125I]ヨードフェニル）プロピオネート（[125I] Bolton & Hunter reagent, Ref: J Russell, JA O'Donoghue, R Finn, J Koziorowski, S Ruan, JL Humm, CC Ling, (2002) Iodination of Annexin V for Imaging Apoptosis, The Journal of Nuclear Medicine, 43 671-677）、N−（４−[18F]フルオロベンジル）−２−ブロモアセトアミド（Ref: F Dolle, F Hinnen, F Vaufrey, B Tavitian, C Crouzel, (1997) A general method for labeling Oligodeoxynucleotides with F for in vivo PET imaging, Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals, 39 319-330）、N−｛４−[（４−[18F]フルオロベンジリデン）アミノオキシ]ブチル｝−マレイミド（Ref: T Toyokuni, JC Walsh, A Dominguez, ME Phelps, JR Barrio, SS Gambhir, N Satyamurthy, (2003) Synthesis of a new Heterobifunctional Linker, N-[4-(Aminooxy)butyl]maleimide, for Facile Access to a Thiol- Reactive 18F-Labeling Agent, Bioconjugate Chemistry, 14 1253-1259）、１−[３−（２−[18F]フルオロピリジン−３−イルオキシ）−プロピル]−ピロール−２，５−ジオン、４−[18F]フルオロベンジルアルデヒド及びブロモ[18F]フルオロエタン。
【００４７】
n、 mはそれぞれ独立して、0〜20の整数であり；いずれかのA及び/又はCは、お互い独立して、１又は複数の同じか又は異なった、結合される保護基を有する。
【００４８】
用語“保護基”とは、一般的に知られている用語であり、そして化学反応に対してアミノ基を保護する（ブロックする）ために適切であるが、しかし除去するのが容易である基、すなわち所望しない化学反応を阻害するか又は抑制するが、しかし分子の残りを変性しない温和な十分な条件下で問題の官能基から切断され得るのに十分に反応性であるよう企画される基に関する。典型的なそのような基は、特に置換されていないか又は置換されたアシル、アリール、アラルコキシメチル、又はアラルキル基である。さらに、アミノ酸は、式Iの化合物の構成成分として、それ自体知られている対応する保護基を供給され得る。Asp及びGluの誘導体、特に側鎖のメチル−、エチル−、プロピル−、ブチル−、tert−ブチル−、ネオペンチル−又はベンジルエステル、又はTyrの誘導体、特に側鎖のメチル−、エチル−、プロピル−、ブチル−、tert−ブチル−、ネオペンチル−又はベンジルエステルが好ましい。
【００４９】
保護基は、当業者に良く知られており、そして適切には、次のものから選択される：Boc（ここで、Bocはtert−ブチルオキシカルボニルである）、Fmoc（ここで、Fmocはフルオレニルメトキシカルボニルである）、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Dde[すなわち、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシク−ロヘキシリデン）エチル]又はNpys（すなわち、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）；メチルエステル、tert−ブチルエステル、ベンジルエステル、アセチル、ベンゾイル、トリチル（Try）又はテトラブチルジメチルシリル。他の適切な保護基は、トリチル及び４−メトキシベンジルである。追加の保護基の使用は、'Protective Groups in Organic Synthesis', Greene, Theorodora W., and Wuts, Peter G. M. (John Wiley & Sons, 1991)に記載されている。
【００５０】
式Iの化合物は、例えば適切なアミノ又はカルボキシ構築ブロックを適用する、当業界において知られている溶液又は固体状態合成技法（Gysin, B. F., and Merrifield, R. B. (1972) J. Am. Chem. Soc, 94, 3102; or Merrifield, R. B. (1985) Angew. Chemie Int. Ed., 24(10), 799-810）を用いて、部分的に又は完全に合成され得る。連続的合成が企画される。他の有機合成方法、例えばHouben-Weyl, Methods of Organic Chemistry, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgartに記載される方法が、式Iの化合物の合成に使用され得る。
【００５１】
一般式（I）の化合物の好ましい態様においては、Aは天然及び/又は非天然アミノ酸から本発明に従って選択される。
【００５２】
本発明の範囲内で、Aはいずれかの天然に存在するアミノ酸を意味することができる。それらのアミノ酸は、標準の１文字又は３文字コード（G. Zubay, Biochemistry (2d. ed.), 1988, Mac Millan Publishing: New York, p.33に見出され得る）を用いて、略語形で本明細書において言及され得る。用語“天然のアミノ酸”とは、天然に存在するアミノ酸置換された誘導体を包含する。
【００５３】
本発明によれば、アミノ酸の“置換された誘導体”とは、アミノ、ヒドロキシル、N−アルキル（ここで、アルキルはC1-C4アルキルを表す）、N−アリール、N−アシル、O−アルキル（ここで、アルキルはC1-C4アルキルを表す）、O−アリール、O−アシル、S−アルキル（ここで、アルキルはC1-C4アルキルを表す）、S−アリールのような置換を包含する。側鎖の芳香環を含むアミノ酸に適用される場合、前記用語はまた、o−、m−、及びｐ−置換、例えばo−アミノ、m−アミノ、ｐ−アミノ、アミノ、o−ヒドロキシル、m−ヒドロキシル、ｐ−ヒドロキシル、及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００５４】
(A)n又は(A)mを構成することができる、特に好ましい天然又は非天然のアミノ酸は、アニリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、プロリン、アルキニル、セリン、トレオニル、トリプトファン、バリン、チロシン、tert−ブチルグリシン、N−メチルフェニルアラニン(NMe)Phe, Hey, Hhc, Pen, Aib, NaI, Aca, Ain, HIy, Achxa, Amf, Aec, Ape, Aes, Aps, Abu, Nva, FD, WD, YD, Cpa, Thp, D-NaI, Dpg, NIe, (I)NaI, (2)Nal, (N-CH3)CyS, (N-CH3)Hcy, (N-CH3)Tyr, (N-CH3)Tty, (N-CH3)Tyr(CH2CH2SH), Tpi, Thr(OH), Ser(ol), Asp(ol), Glu(ol), Gln(ol), Asn(ol), (4)PaL, Phe(4-F), Phe(4-NH2), ε-ロイシン, δ-Orn, γ-Dab 及び β-Dabである。
【００５５】
本明細書において使用される場合、次のアミノ酸及びアミノ酸類似体が次の略語により示される：Heyはホモシステインであり；Hheはホモホモシステイン（３−メルカプトプロピルグリシン）であり；Penはペニシルアミンであり；Aibはアミノイソ酪酸であり；Nalは２−ナフチルアラニンであり；Acaは６−アミノカプロン酸であり；Ainは２−アミノインダン−２−カルボン酸であり；Hlyはホモリシンであり；Achxaは４−アミノ−シクロヘキシルアラニンであり；Amfは４−アミノメチル−フェニルアラニンであり；Amfは４−アミノメチル−フェニルアラニンであり； AecはS−（２−アミノエチル）システインであり；ApcはS−（３−アミノプロピル）システインであり；AesはO−（２−アミノエチル）セリンであり；AspはO−（３−アミノプロピル）セリンであり；Abuは２−アミノ酸であり；Nvaはノル-バリンであり; FD はD-フェニルアラニンであり; WD はD-トリプトファンであり; YDはD-チロシンであり; Cpaは L-(4-クロロフェニル)アラニンであり; Thpは 4-アミノ-テトラヒドロチオピラン-4-カルボン酸であり; D-NalはD-2-ナフチルアラニンであり; Dpgはジプロピルグリシン; Nｌe はノルロイシンであり; (N-CH3)CySはN-メチル-システインであり; (N-CH3)HcyはN- メチル-ホモシステインであり; (N-CH3)Tyr はN-メチル-チロシンであり; (N-CH3)TtyはN-メチル-チオチロシンであり(すなわち、N-メチル-4-メルカプトフェニルアラニンであり); (N-CH3)Tyr(CH2 CH2 SH)はN-メチル-O-2- メルカプトエチルチロシンであり；Thr(OH)はトレオニオール残基であり（ここで、アミノ酸のカルボキシル基は、Neuge- bauer など. (1990, Peptides: Proceedings of the 11th American Peptide Symposium, pp. 1020- 21の方法を用いて、ペプチド中に導入される第１アルコールに還元される）；Ser(ol)はセリノールであり; Asp(ol)はアスパルチオールであり; Glu(ol)はグルタリノールであり; Gln(ol)はグルタミノールであり; Asn(ol) はアスパラギノールであり; Phe(4-F) は 4-フルオロ-フェニルアラニンであり; Phe(4-NH2) は4-アミノ-フェニルアラニンであり；ε−Lysはリシン残基の側鎖上のε−アミノ基を通して共有結合を表し；δ−Omは、δ−アミノ基がペプチド結合を形成するために隣接するアミノ酸のカルボキシル基に共有結合されているオルニチン残基を表し；γ−Dabは、γ−アミノ基がペプチド結合を形成するために隣接するアミノ酸のカルボキシル基に共有結合されている2,4−ジアミノ酪酸残基を表し；β−Dapは、β−アミノ基がペプチド結合を形成するために隣接するアミノ酸のカルボキシル基に共有結合されている2,3−ジアミノプロピオン酸残基を表す。
【００５６】
本発明のより好ましい態様においては、一般式（I）の化合物の少なくとも１つのAは、本発明によれば、D-アミノ酸である。
【００５７】
用語“D−アミノ酸”とは、天然に存在するL−アミノ酸の立体異性体を言及する。D−アミノ酸は、それらは天然に存在するが、タンパク質には決して見出されていない。D−アミノはしばしば、ポリペプチド抗生物質に見出されている。天然のタンパク質は、D−鏡像異性体よりもむしろ、左旋性アミノ酸をほとんど独占的に使用する。しかしながら、改良された分析方法により、D−アミノ酸は、多細胞生物の種々のペプチドにおいて検出されている。それにもかかわらず、得られる分子は、不活性ではないが、しかしむしろ、L−鏡像異性体とほとんど交差反応性ではない、ユニーク免疫反応を誘発することができる。さらに、L−及びD−配列の交差反応はまた、たぶん形成されるMHC−抗原−T細胞受容体複合体の異なった立体配座のために、T細胞レベルで制限される。D−アミノ酸から独占的に構築されるポリペプチドは、比較的低い濃度でのみ構成形成を誘導し、他方では、それらは免疫的無能性を誘発する。
【００５８】
本発明の化合物の整数n及びmは同じであり、そして好ましくは、０，１，２，３，４及び５から選択されることは特に好ましい。
本発明のもう１つの好ましい態様においては、前記化合物のCは、N3Sキレート化剤である。
【００５９】
用語“N3Sキレート化剤”とは、チオール−含有二官能価キレート化剤であるトリアミドメルカプチドを言及する。N3Sキレート化剤の１つの例として、MAG（３）が、99mTcによりペプチド、タンパク質、DNA及び他のキャリヤーをラベリングするために都合よく使用されており、すなわちトリアミドメルカプチド（N3S）の種類がTc-99m−キレート化剤として開発された（Fritzberg など., "Synthesis and biological evaluation of Tc-99m-MAG3 as a hippuran replacement" J. Nucl. Med. 27, 1 1 1-1 16 (1986)）。今日まで、99mTc−メルカプトアセチルトリグリシン（[99mTcO-MAG3]-）は、機能的腎イメージングのための最も好都合な剤の１つであると思われる。原則的に、N3Sキレート化剤は、いずれかの天然又は非天然のアミノ酸を組込むために使用され得る。
【００６０】
金属イオンの不在下でポリペプチド又は炭水化物にキレート化剤を接合することは、いくつかの用途において、より便利である。例えば、本発明により企画される放射性核種のいくつか（例えば、99mTc）は、比較的短い半減期を有するので、キレート化剤−接合されたポリペプチド又炭水化物成分を調製し、そして次に、投与の直前、前記キレート化合物−接合されたポリペプチド又は炭水化物成分と興味ある放射性核種とを反応せしめることが所望される。
【００６１】
例えば、カルボン酸基は、ポリペプチドに結合され、アミド結合が形成され、続いて、弱く複合体化された形で金属が添加される。他方では、遊離第一アミン基を有するキレート化合物に関しては、N3Sキレート化合物が、上記で論じられたように、第ニ又は第三アミン結合を形成するために穏やかな還元条件下で、炭水化物の過ヨウ素酸塩処理に続いて、炭水化物成分に第一アミンを結合することにより、炭水化物成分に結合され得；次に、この方法に続いて、放射性核種との適切な反応が行われ、所望する放射性ラベルされた炭水化物成分が形成される。
【００６２】
最初に、金属イオンは、ポリペプチド又は炭水化物に非特異的に及び特異的に結合する。しかしながら、N3Sリガンド中心は、非特異的部位よりも高い安定性のキレートを形成すべきであり、そして平衡条件下での金属イオンはN3Sキレート基に移動する。N3Sキレート基に結合されないそれらの金属は、キレート化剤、例えばEDTA、又は非イオン性界面活性剤により、穏やかな条件下で洗浄され得る。便利には、金属イオンは、弱くキレート化されたイオンとして、又は弱くキレート化する基、例えばウロネート、例えばグルコネート又はタルトレートの存在下で添加され得る。
【００６３】
本発明のより好ましい態様においては、前記化合物のCは、基Dpr-Met-Cys及びDpr-Gly-Cysの金属イオンキレート化剤から選択される。
【００６４】
キレート化単位Dpr-Met-Cys及びDpr-Gly-Cysを含むペプチドリンカーは、自動ペプチド合成機により合成され得る。ペプチド配列におけるキレート化部位がDpr-Met-Cys及びDpr-Gly-Cysにより形成される場合、グリシンの代わりにアミノ酸メチオニンを含むペプチドは、金属複合体に追加の安定性を付加することができるキレート化配列における追加の側鎖を提供する。これは、追加のドナーとして作用することができるエチルスルファニルメタンにおける硫黄原子の単独の電子対のためである。このキレート化配列は、インビトロでの接合の成功及び血漿安定性質に対するそれらの因子の影響を研究するために、長さ及び親水性において変えられえる２種のスペーサー配列に隣接する。
【００６５】
本発明のより好ましい態様においては、前記化合物のL1は、L2と同じであり、そして−CH2-CH2-CO−である。
【００６６】
本発明の最も好ましい態様においては、前記化合物は、下記群から選択される：
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Dpr-Met-Cys(tブチルチオール)-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal; 
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Dpr-Gly-Cys(tブチルチオール)-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal; 
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Ser-Dpr-Met-Cys(tブチルチオール)-Ser-Ser-Lys-CO-CH2-
CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Ser-Dpr-Gly-Cys(tブチルチオール)-Ser-Ser-Lys-CO-CH2-
CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Ser-Ser-Dpr-Met-Cys(tブチルチオール)-Ser-Ser-Ser-Lys-
CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-D-Ser-D-Ser-D-Ser-Dpr-Met-Cys(tブチルチオール)-D-Ser-D-
Ser-D-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal;
【００６７】
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-D-Ser-D-Ser-D-Ser-Dpr-Gly-Cys(tブチルチオール)-D-Ser-D-
Ser-D-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Dpr-Met-Cys-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Dpr-Gly-Cys-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Ser-Dpr-Met-Cys-Ser-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Ser-Dpr-Gly-Cys-Ser-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-Ser-Ser-Ser-Dpr-Met-Cys-Ser-Ser-Ser-Lys-CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-D-Ser-D-Ser-D-Ser-Dpr-Met-Cys-D-Ser-D-Ser-D-Ser-Lys-
CO-CH2-CH2-Mal;
Mal-CH2-CH2-CO-βAla-D-Ser-D-Ser-D-Ser-Dpr-Gly-Cys-D-Ser-D-Ser-D-Ser-Lys-
CO-CH2-CH2-Mal、
及び医薬的に許容されるそれらの塩。
【００６８】
本発明の特に好ましい化合物は、下記式で表される化合物である：
【化１】
2010502657.tif 000003
【００６９】
その第２の観点においては、本発明は、下記一般式（II）
T1-Mal-L1-(A)n-C-(A)m-L2-Mal-T2      （式II）
[式中、T1及びT2はそれぞれ、標的基である、ここでT1及びT2は独立して、同じであっても又は異なっていても良く、Malは、マレイミドであり；L1及びL2は同じであっても又は異なっていても良く、それぞれ不在であるか、又は枝分かれ鎖又は枝なしの、置換された又は置換されていない（C1-C12）アルキル、（C1-C12）アルコキシから選択されたリンカー構造体、例えばエチレングルコールoであり、ここでoは１〜12の整数であり；Aは、アミノ酸又はその誘導体であり；n、mは独立して、0〜20の整数から選択され；Cは、不在であるか又は金属イオンキレート化基であるか、又はハロゲン担持のシントンの接合のための結合基であり；A及び/又はCは独立して、１又は複数の、同一又は異なった保護基を含んで成ることができる]
で表される化合物、及び医薬的に許容できるその塩を提供する。
【００７０】
用語“標的化成分”とは、標的化成分及び/又は標的化成分に結合される接合体と、標的物の表面との間の物理的結合を引起す、標的物上の結合部位と機能的に相互作用する化合物を言及する。従って、標的化成分は、１又は複数のタイプの標的物のための特異性又は結合親和性を提供する。
【００７１】
本発明の一般式（II）の化合物の好ましい態様においては、T1がT2は同じである。
本発明の一般式（II）の化合物のもう1つの好ましい態様においては、T1及びT2の少なくとも１つは、アプタマーオリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体又はそのフラグメントの群から選択される。
【００７２】
用語“アプタマーオリゴヌクレオチド”とは、高い親和性及び特異性で、興味ある特定分子に結合できる核酸分子を言及する（Tuerk and Gold, (1990) Science 249, 505; Ellington and Szostak, (1990) Nature 346, 818）。典型的にはRNAであるアプタマーへのリガンドの結合は、アプタマーの配座を変える。配座変更は、アプタマーが位置するmRNAの翻訳を阻害するか、又は他方では、核酸の正常活性を妨げる。アプタマーはまた、DNAから構成され得るか、又は非天然のヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含んで成る。アプタマーは、最も典型的には、標的分子の結合のためにインビトロ選択により得られて来た。しかしながら、アプタマーのインビボ選択もまた可能である。
【００７３】
アプタマーは、同じ環境下での他の物質が核酸に複合体化されない環境において意図される標的分子と複合体を形成できる特定結合領域を有する。結合の特異性は、一般的ん前記環境又は無関係な分子において、他の材料についてのアプタマーの解離定数（Kd）に比較して、そのリガンドについてのアプタマーの比較解離定数により定義される。典型的には、そのリガンドに関するKdは、前記環境下で無関係な材料又は付随する材料に関してのKdよりも少なくとも約10倍、低いであろう。さらにより好ましくは、前記Kdは、少なくとも50倍、より好ましくは少なくとも約100倍、及び最も好ましくは少なくとも約200倍、低いであろう。アプタマーは典型的には、約10〜約300の長さのヌクレオチドであろう。より通常には、アプタマーは、約30〜約100の長さのヌクレオチドであろう。
【００７４】
用語“ペプチド”及び“タンパク質”とは、交換可能的に使用され得、そしてペプチド結合又は修飾されたペプチド結合（例えば、ペプチドイソ立体）により共有結合される少なくとも２つのアミノ酸残基から構成される化合物を言及する。タンパク質又はペプチドを含んで成るアミノ酸の最大数には制限はない。本明細書及び請求項に記載されるペプチド又はタンパク質を含んで成るアミノ酸は、D又はLアミノ酸のいずれかであり、そしてLアミノ酸が好ましいことが理解されている。本明細書に記載されるペプチド又はタンパク質を含んで成るアミノ酸は、当業界において良く知られている、天然の工程、例えば後翻訳プロセッシング、又は化学的修飾技法により修飾され得る。
【００７５】
修飾はペプチドのいずれかの位置、例えばペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端で存在し得る。同じタイプの修飾が、所定のペプチドにおいていくつかの部位で、同じか又は種々の程度、存在できることが理解されている。また、所定のペプチドは、多くのタイプの修飾を含むことができる。修飾は、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーRNA介在性付加、例えばアルギニル化、及び偏在化（ubiquitination）を包含する。
【００７６】
例えば、"Proteins- Structure and Molecular Properties", 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993 and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, 1-12 in "Posttranslational Covalent Modification of Proteins", B. C. Johnson, Ed., Aca- demic Press, New York, 1983; Seifter et al., (1990) Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182, 626-646 and Rattan et al., (1992) Protein Synthesis: Posttranslational Modifications及び Aging, Ann N. Y. Acad Sci 663, 48-62（それらの前開示は引例により本明細書に組込まれる）を参照のこと。
【００７７】
用語“抗体及びそのフラグメント”とは、抗体−抗原結合ドメインであるか又はそれと相同である少なくとも１つの抗原結合ドメインを含んで成るいずれかのポリペプチド又はタンパク質を言及する。用語“抗原結合ドメイン”は、抗原の一部又はすべてに対して特異的に結合し、そしてそれに対して相補的である領域を含んで成る抗体又はフラグメントの一部を説明する。抗原が大きい場合、抗体は、エピトープと呼ばれる、抗原の特定部位にのみ結合することができる。抗原結合ドメインは、１又は複数の抗体可変ドメインを含んで成ることができる。
【００７８】
好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体L鎖可変領域（VL）及び抗体H鎖可変領域（VH）を含んで成る。可変領域VH及びVL内で、抗原結合ドメインの結合特異性を決定する部分は、相補性決定領域又はCDRと呼ばれる。従来、抗体可変ドメインのCDRは、特異的抗原認識のために必須な残基を含む、それらの超可変抗体配列として同定されて来た。抗体の例は、免疫グロブリンイソタイプ及びそれらのイソタイプサブクラス、及び抗原結合ドメインを含んで成るフラグメントである。
【００７９】
そのようなフラグメントの例は次のものである：（I）VL, VH, CL及びCH1ドメインを含んで成るFabフラグメント；（II）VH及びCH1ドメインを含んで成るFdフラグメント；（III ）VL及びVHドメインを含んで成るVvフラグメント；（IV）VHドメインを含んで成るdAbフラグメント（Ward など. (1989) Nature, 9, 341, 544-546）；（V）単離されたcDR領域；（VI）２種の連結されるFabフラグメント含んで成るF(ab’)2フラグメント、すなわち二価フラグメント；（VII）VHドメイン及びVLドメインがポリペプチドリンカーにより連結されている、scFvフラグメント（Bird など. (1988) Science, 242, 423-426; Huston など. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5879-83）；（VIII ）二特異的scFvダイマー（PTC/US92/09965号）；（LX）；及び（IX）ニ抗体、すなわち多価又は多特異的フラグメント（WO94/13804号; Holliger など. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6444-48）。
【００８０】
他の形のニ特異的抗体は、例えばNeri など. (1995) J. MoI. Biol., 246, 367-73より記載される一本鎖CRABである。当技法の状態は、元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はフラグメント、例えばscFv又はIgGを生成するために、Fab抗体からの抗原結合ドメイン、又は１つの抗体又はフラグメントの相補的決定領域（CDR）を、もう１つの抗体型の骨格中に移植するためへの組換えDNA技法の使用により容易にされる。例えば、中でも、EP-A-184187号、GB 2188638A号又は EP-A-239400号を参照のこと。
【００８１】
診断へのそれらの既知使用の他に、抗体及びそのフラグメントは、治療剤として有用であることが示されている。例えば、免疫療法、又は治療目的のためへの抗体の使用は、癌を処理するために最近、使用されている。受動的免疫療法は、癌処理へのモノクローナル抗体の使用を包含する。例えば、Cancer: Princi- pies and Practice of Oncology, 6.sup.th Edition (2001) Chapt. 20 pp. 495-508を参照のこと。それらの抗体は、腫瘍細胞増殖又は生存性の直接的阻害により、及び身体の免疫システムの天然細胞殺害活性を補充するそれらの能力により、固有の治療生物学的活性を有することができる。それらの剤は、単独で、又は放射線又は化学療法剤と共に投与され得る。
【００８２】
本発明の一般式（II）の化合物のもう１つの好ましい態様においては、T1及びT2の少なくとも１つは、アプタマーオリゴヌクレオチドである。
本発明の一般式（II）の化合物のさらなる好ましい態様においては、T1及びT2の少なくとも１つは、二価アプタマーオリゴヌクレオチドである。
【００８３】
用語“二価アプタマーオリゴヌクレオチド”とは、スペーサーを通して連結される２種の薬物を含む化合物を言及する。それらは、一定の標的物の構造的組織及び有意性をプローブするための手段として有用であるべきである。結合実験は、二価アプタマーが二価抗体の親和性及び解離速度に近づくことができ、そして好ましくは、インビボでの実質的に有用な卓越性である細胞を、可溶性標的物に比較して、認識することができることを示唆している。
【００８４】
本発明の一般式（II）の化合物のさらにより好ましい態様においては、T1及びT2の少なくとも１つは、DNA又はRNA、又はその組合せを含んで成るアプタマーオリゴヌクレオチドである。
本発明の核酸のアプタマーは、完全にRNAから構成され得る。しかしながら、本発明の他の態様においては、アプタマーは、代わりに、完全にDNA、又は部分的DNA、又は部分的に他のヌクレオチド類似体から構成され得る。
【００８５】
アプタマーは典型的には、SELX(指数的富化によるリガンドの組織的開発)として知られている既知のインビボ又はインビトロ（最も典型的には、インビトロ）選択技法を用いることにより、特定のリガンドを結合するよう開発される。アプタマーの製造方法は、例えばEllington and Szostak, (1990) Nature 346, 818; Tuerk and Gold, (1990) Science 249, 505; アメリカ特許第5,582,981号, PCT 公開番号WO 00/20040号; アメリカ特許第5,270,163号; Lorsch and Szostak, (1994) Biochemistry, 33, 973; Mannironi など., (1997) Biochemistry 36, 9726; Blind, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 3606-3610; Huizenga and Szostak, (1995) Biochemistry, 34, 656-665, PCT公開番号WO 99/54506号; WO 99/27133号; WO 97/42317号 及びアメリカ特許第5,756,291号に記載されている。
【００８６】
一般的に、それらのほとんどの塩基性形において、RNAアプタマーを同定するためのインビトロ選択技法はまず、ランダム化されるか、又は突然変異誘発される少なくともいくらかの領域を含む、所望する長さのDNA分子の大きなプールを調製することを包含する。例えば、アプタマー選択のための通常のオリゴヌクレオチドプールは、PCRプライマーの結合のために有用な定義された配列の約15〜25個の長さのヌクレオチド領域を両端に有する、20〜100個のランダム化されたヌクレオチドの領域を含む。オリゴヌクレオチドプールは、標準PCR技法を用いて増幅される。次にDNAプールは、インビトロ転写される。次に、RNA転写体は、親和性クロマトグラフィーにゆだねられる。
【００８７】
転写体は最も典型的には、カラムを通されるか、又は磁気ビーズ又は同様のものと接触され、このビーズ上に標的リガンドが標的物リガンドが固定されている。リガンドに結合する、プールにおけるRNA分子は、非結合配列を洗浄しながら、カラム又はビーズ上に保持される。次に、リガンドを結合するRNA分子は逆転写され、そしてPCRにより再び増幅される（通常、溶出の後）。次に、選択されたプールが、もう１度の同じタイプの選択に置かれる。典型的には、プール配列は、合計約３〜10度の選択工程に置かれる。次に、cDNAが、標準の方法を用いて、増幅され、クローン化され、そして配列決定され、標的リガンドのためのアプタマーとして作用することができるRNA分子の配列が同定される。
【００８８】
本発明への使用のために、アプタマーは好ましくは、通常の生理学的条件を模倣する塩濃度及び温度の存在下でリガンド結合のために選択される。
アプタマー配列が都合よく同定されると、アプタマーはさらに、突然変異誘発されたアプタマー配列を含んで成るオリゴヌクレオチドのプールから出発して、追加の選択を実施することにより最適化され得る。
【００８９】
アプタマーが入手できるかどうかに関係なく、適切なリガンドを一般的に選択することができる。ほとんどの場合、当業者により、選択の小さな有機分子を結合するアプタマーを得ることができる。インビトロ選択工程のユニーク性質は、どのタイプの構造体が所望するリガンドを結合するかに関して従来の知識の完全な不足にもかかわらず、所望するリガンドを結合する適切なアプタマーの単離を可能にする。
【００９０】
本発明の一般式（II）の化合物のもう１つのより好ましい態様においては、T1及びT2の少なくとも１つは、N3Sキレート化剤に結合されるアプタマーオリゴヌクレオチドである。
本発明の一般式(II)の化合物のさらなるより好ましい態様においては、T1及びT2の少なくとも１つは、テナスシン−Cに結合するアプタマーオリゴヌクレオチド群から選択されたアプタマーオリゴヌクレオチドである。
【００９１】
用語“テナスシン−C”とは、異なった種類におけるイソフォームの発現に依存して、120〜300kDの範囲の分子量を有するサブユニットから構成されるジスルフィド−結合されたヘキサマーを言及する。前記サブユニットは、テナスシン−Cの成長促進性質と同一基準の上皮成長因子（ECF）−様及びフィブロネクチン−様反復体を含む（Swindle, C. S., Tran, K. T., Johnson, T. D., Banerjee, P., Mayes, A. M., Griffith, L., and Wells, A. (2001) Epidermal growth factor (EGF)-like repeats of human tenascin-C as ligands for EGF receptor. J. Cell. Biol., 154, 459-68）。
【００９２】
テナスシン−C、すなわちタンパク質特有のテナスシンは、本来、胚組織から単離された（Chiquet-Ehrismann, R., Mackie, E. J., Pearson, C. A., and Sakakura, T. (1986), Tenascin: an extracellular matrix protein involved in tissue interactions during fetal development and oncogenesis. Cell. 47, 131-139; Erickson, H. P. and Bourdon, M. A. (1989) Tenascin: an extracellular matrix protein prominent in specialized embryonic tissues and tumors. Annu. Rev. Cell Biol., 5, 71-92）。
【００９３】
それは最も広く分布されたテナスシンであり、そして典型的には、成熟組織において上皮−間葉相互作用の部位でのみ見出される。それは、種々の細胞機能、例えば成長促進、赤血球凝集、T−細胞の免疫抑制、脈管形成の促進、及び軟骨形成に包含される。それはまた、多くの細胞型に対して抗接着効果も有する（Fischer, A., Cavazzana-Calvo, M., De Saint Basile, G., De Villartay, J. P., Di Santo, J. P., Hivroz, C, Rieux-Laucat, F., and Le Deist, F. (1997) Naturally occurring primary deficiencies of the immune system. Annu. Rev. Immunol., 15, 93-124）。
【００９４】
本発明の一般式（II）の化合物のもう１つのより好ましい態様においては、T1及びT2の少なくとも１つは、TTA1及びTTA3から選択されたアプタマーオリゴヌクレオチドである。
【００９５】
“TTA1及びTTA3”とは、テナスシン−Cアプタマーを言及する。TTA1は、ヒトテナスシン−Cを構造的に認識し、そしてそれに、高い親和性（５×10-9MのKd）で結合する39マーのオリゴヌクレオチド（13.4kDaの分子量）である（Hicke, B. J., Marion, C, Chang, Y.-F., Gould, T., Lynott, C. K., Parma, D., Schmidt, P. G. and Warren, S. (2001) Tenascin-C aptamers are generated using tumor cells and purified protein. J. Biol. Chem., 276, 48644-48654.）。
【００９６】
テナスシン−Cは、腫瘍形成、胚形成及び創傷治療において重要な役割を演じる細胞外マトリックスに見出されるヘキサマータンパク質である（Erickson, H. P. and Bourdon, M. A. (1989) Tenascin: an extracellular matrix protein prominent in specialized embryonic tissues and tumors. Annu. Rev. Cell Biol., 5, 71-92）。この特徴に基づいて、テクネチウム−99m（Tc−99m）によりラベルされたTTA1は、テナスシン−Cを発現する腫瘍のイメージングのための有望な候補体である。TTA1アプタマーは現在、臨床学的試験下にある。類似する適用は、TTA3に対してである。
【００９７】
本発明の特に好ましい化合物は、下記式である：
【化２】
2010502657.tif 000004
【００９８】
本発明に一般式（II）の化合物のもう１つの好ましい態様においては、化合物はさらに、金属イオンを含んで成る。
本発明の一般式（II）の化合物のもう１つのより好ましい態様においては、化合物は、放射性療法又は診断イメージングのために適切な放射性同位体である金属イオンを含んで成る。
【００９９】
当業者は、本発明の化合物が共有結合された放射性同位体、例えばハロゲン及び特に、18F, 125I, 131I, 1231, 76Br, 77Br, 80Br, 82Br and 211Atによりラベルされ得る。１又は複数のそれらの放射性同位体が、本発明の化合物に、共有結合により結合される。原則的に、放射性同位体は、それぞれの放射性同位体に結合を形成できる、化合物内のいずれかの成分に結合され得る。
【０１００】
用語“放射性療法”とは、多くのタイプの癌のための治療処理を言及し、疾病、その位置及びその段階に依存して、種々の手段で供給される。そのような治療は、外部照射のための放射線源として異なった異性体、例えばセシウム、イリジウム、ヨウ素又はコバルトを包含する。放射線療法は全身体照射であり得るか、又は身体における身体上の特定部位又は組織に局部的に向けられ得る。典型的には、放射線療法は、約１〜約２週間にわたってパルスで投与される。
【０１０１】
しかしながら、放射線療法は、より長い期間にわたって投与され得る。任意には、放射線療法は、一回の用量又は、複数回の連続した用量として投与され得る。放射線療法の例は、相似放射線療法、冠動脈近接照射療法、高速中性子放射線療法、強度調節された放射線療法（IMRT）、手術間放射線療法、介在性近接照射療法、介在性乳房近接照射療法、器官保存療法及び定位放射線手術を包含する。放射線治療はまた、本発明により開示される放射線医薬の前進性投与により行われ得る。治療用放射線医薬の使用はまた、本発明により包含される。
【０１０２】
本発明の一般式（II）の化合物のさらなる好ましい態様においては、化合物は金属イオンを含んで成り、ここで前記金属イオンは、107Ag, 109Ag, 1 11Ag, 75As, 77As, 197Au, 198Au, 199Au, 209Bi, 212Bi, 213Bi, 63Cu, 65Cu, 67Cu, 156Dy, 158Dy, 160Dy, 161Dy, 162Dy, 163Dy, 164Dy, 165Dy, 162Er, 164Er, 166Er, 167Er, 168Er, 169Er, 170Er, 171Er, 172Er, 67Ga, 68Ga, 69Ga, 71Ga, 154Gd, 155Gd, 156Gd, 157Gd, 158Gd, 159Gd, 160Gd, 165Ho, 166Ho, 123I, 127I, 129I, 131I, 1 1 1In, 1 13In, 191Ir, 192Ir, 193Ir, 175Lu, 177Lu5 92Mo, 94Mo, 95Mo, 96Mo, 97Mo , 98Mo, 99Mo, 100Mo, 31P, 32P, 33P, 102Pd, 103Pd, 104Pd, 105Pd, 106Pd, 108Pd, 109Pd, 1 10Pd, 141Pr, 142Pr, 143Pr, 185Re, 186Re, 188Re, 103Rh, 105Rh, 45Sc, 47Sc, 144Sm, 149Sm, 150Sm, 152Sm, 153Sm, 154Sm, 1 12Sn, 1 14Sn, 1 15Sn, 1 16Sn, 1 17Sn, 1 17mSn, 1 18Sn, 1 19Sn, 120Sn, 121Sn, 122Sn, 124Sn, 84Sr, 86Sr, 87Sr, 88Sr, 89Sr, 159Tb, 161Tb, 94mTc, 97Tc, 98Tc, 99Tc, 99mTc, 120Te, 122Te, 124Te, 125Te, 126Te, 127Te, 128Te, 169Tm, 172Tm, 86Y, 89Y, 90Y, 168Yb, 169Yb, 170Yb, 171Yb, 172Yb, 173Yb, 174Yb, 175Yb, 及び176Ybの群から選択される。
【０１０３】
本発明の一般式（II）の化合物のさらなる好ましい態様においては、前記化合物は金属イオンを含んで成り、ここで前記金属は、99mTc, 86Y, 68Ga, 111In, 186Re, 188Re, 90Y, 64Cu, 67Ga, 177Luから成る群から選択される。
これに関しては、いずれかの金属イオンが前記化合物に結合され得るが、好ましい金属は、γ−放出性放射性核種、例えば111In、67Ga及び99mTc, β−放出性放射性核種、例えば90Y、186Re、188Re及び177Lu、又はポジトロン放出性放射性核種、例えば68Ga及び86Yである。
【０１０４】
さらにもう１つの好ましい観点においては、本発明は、多量の本発明の化合物を含んで成るバイアルを含んで成る、放射線医薬製剤を調製するためのキットに関する。好ましくは、前記キットは、予定された量の本発明の化合物を含む密封されたバイアルを含んで成る。
さらなる好ましい観点においては、本発明は、自動ペプチド合成機における合成を包含する、本発明の一般式（I）の化合物の生成方法を提供する。
【０１０５】
化合物を直接的に合成するために適切である化学ペプチド合成技法（手動及び自動技法を包含する）はまた、当業者に良く知られている。例えば、化合物は、従来の固相合成方法を用いて、新たに合成され得る。そのような方法においては、ペプチド鎖は、一連のカップリング反応により調製され、ここで構成成分アミノ酸が所望する順序で、成長するペプチド鎖に付加される。
【０１０６】
種々のN−保護基、例えばカルボベンゾイルオキシ基又はｔ−ブチルオキシカルボニル基の使用；種々のカップリング試薬、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド又はカルボニルジイミダゾール；種々の活性エステル、例えばN−ヒドロキシフタルイミド又はN−ヒドロキシスクシンイミドのエステル；及び種々の切断試薬、トリプルオロ酢酸（TFA）、ジオキサン中、HCl、硼素トリス−（トリフルオロアセテート）及び臭化シアン；及び中間体の単離及び精製を伴っての溶液における反応は、当業者に良く知られている。
【０１０７】
好ましい化学ペプチド合成方法は、当業者に良く知られている従来のMerrifield固相方法に従う。固相合成方法についての追加の情報は、Steward and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1969; the review chapter by Merrifield in Advances in Enzymology 32, 221- 296, (NoId, F. F., ed.), Interscience Publishers, New York, 1969; and Erickson and Merrifield (1990), The Proteins 2, 61-64（それらの開示は引用により本明細書に組込まれる）に言及される。
【０１０８】
さらなる好ましい観点においては、本発明は、本発明の一般式（I）の化合物を、マレイミド基を通して標的成分に結合することを含んで成る、本発明の一般式（II）の化合物の生成方法を提供する。
本発明の一般式（I）の化合物を、マレイミド基を通して標的成分に結合することを含んで成る、本発明の一般式（II）の化合物の生成方法のもう１つの好ましい態様においては、標的成分は、アプタマーオリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体又はそれらのフラグメントの群から選択される。
【０１０９】
本発明の方法の特に好ましい態様においては、標的成分は、アプタマーオリゴヌクレオチドである。
さらに好ましいその観点においては、本発明は、治療及び/又は診断への使用のための本発明の化合物に関する。
【０１１０】
さらなる好ましい観点においては、本発明は、増殖性疾病の診断及び/又は治療のための薬物の製造のためへの本発明の化合物の使用に関する。
もう１つの観点においては、前記増殖性疾病は、腫瘍、前癌、形成異常、及び化生から成る群から選択される。
さらなる観点においては、前記腫瘍は、一次腫瘍又は転移である。
【０１１１】
さらなるその観点においては、前記腫瘍は、胃腸又は結腸直腸管、肝臓、膵、腎臓、膀胱、甲状腺、前立腺、子宮内膜、卵巣、こう丸の悪性腫、メラノーマ、形成異常経口粘膜、侵襲性経口癌、小細胞又は非小細胞肺癌；乳癌、例えばホルモン依存性乳癌、ホルモン無関係乳癌、移行性及び鱗状細胞癌、神経学的に悪性、例えば神経芽腫、グリオーム、星状細胞腫、骨肉腫、髄膜腫；軟組織肉腫；血管芽腫及び内分泌学的腫瘍、例えば脳下垂体腺腫、クロム親和細胞腫、傍神経節腫、血液学的悪性腫瘍、例えばリンパ腫、及び白血病又は上記腫瘍の１つに起因する転移である。
【０１１２】
もう１つの好ましい態様においては、本発明は、有効量の本発明の化合物を、その必要な患者に投与することを含んで成る、患者の処理方法を提供する。
もう１つの好ましい態様においては、前記患者は、増殖性疾病を有する。
もう１つのその好ましい観点においては、本発明は、本発明の化合物を用いての患者の診断方法を提供する。
【０１１３】
さらなる好ましい態様においては、本発明は、本発明の化合物を用いての患者の診断方法に関し、ここで前記患者は増殖性疾病を有する。
１つのさらなる好ましい態様においては、本発明は、本発明の一般式（I）及び（II）の化合物、及び医薬的に適用できるキャリヤー及び/又は賦形剤を含んで成る医薬組成物に関する。
【実施例】
【０１１４】
本発明は次の例により示される。それらの例は、本発明の選択された態様を単に示し、本発明を制限するものではない。本発明の範囲は付随された請求項によって決められる。
例１：ペプチドの合成：
ペプチド配列を、標準のカップリング方法を用いて、自動ペプチド合成機（Advanced ChemTech, 396多重ウェルペプチド合成機）において合成した（図１を参照のこと）。DMF中、アミノ酸の0.5M溶液800μl、DMF中、６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）及びO−ベンゾトリアゾール、N, N, N’, N’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート（HBTU）の0.5M溶液800μl、及び800μlの１Mのジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）溶液を、ウェルに添加した。反応ブロックにおける反応混合物を、800rmpで45分間、混合し、その後、ウェルを空にし、そしてDMFにより洗浄し、その後、新しいカップリングサイクルを開始した。最後のカップリングの後、樹脂を、ジクロロメタン（CH2Cl2）、テトラヒドロフラン（THF）及びDMFにより洗浄した。
【０１１５】
Fmoc（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基を、DMF中、50％ピペリジンにより分解し、そして続いて、ivDde（[１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）３−メチル−ブチル]）保護基を、DMF中、２％ヒドラジンを用いて分解し、マレイミド構築ブロックに接合される遊離アミン基を残した。2mlのDMF中、0.6mモルのN−スクシンイミジル３−マレイミドプロピオネート及び0.6mモルのジイソプロピルエチルアミンを、0.2mモルの樹脂に添加した。その反応混合物を１時間、撹拌し、その後、溶媒を除去し、そして樹脂をDMFにより集中的に洗浄した。ニンヒドリン標準試験を使用し、未反応の遊離アミン基を示した。続いて、ペプチドを樹脂から分離した。85％TFA、５％フェノール、５％水、５％トリイソプロパンシランにおける分解反応の間、第三ブチル保護基を同様に排除した。切断されたペプチドは、システインにおいてSH−基を保護する１つの保護基S−tBuを含む。
【０１１６】
ペプチドP1−P6（表１を参照のこと）を、Apex396多重ウェルペプチド合成機（Advanced ChemTech, Louisville, KY）上で自動ペプチド合成を用いて調製した。40−ウェルブロックの10個のウェルを、個々のウェルにおける0.1mモルの樹脂と共に使用した。
【０１１７】
標準カップリング方法：
DMF中、0.5Mのアミノ酸溶液0.8ml、DMF中、0.5Mの６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）及びO−ベンゾトリアゾール、N, N, N’, N’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート（HBTU）溶液0.8ml、及び1Mのジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）溶液0.8mlを、反応ブロックのウェルに添加した。反応混合物を含む反応ブロックを、800rpmで45分間、混合した。その後、ウェルを窒素により空にし、そしてDMFにより洗浄した。カップリングを、所望するペプチド配列が終わるまで、反復し、そして続いて、樹脂をCH2Cl2、THF及びDMFにより洗浄した。
【０１１８】
標準Fmoc保護解除：
1.8mlのDMFをウェルに移し、続いてDMF中、50％ピペリジン1.2mlを移した。反応ブロックを800rpmで５分間、混合し、次に空にし、そしてウェルをDMFにより洗浄した。保護解除を、この時点で20分間、反復した。次に樹脂を、DMF、CH2Cl2及びDMFにより洗浄した。
【０１１９】
iv-ddeグループの保護解除：
DMF中、２％ヒドラジンを、樹脂と共に反応バイアルに添加した。10分後、ヒドラジン溶液を除去した。保護解除反応を２度、反復した。その後、樹脂をDMFにより５度、洗浄した。ニンヒドリン標準試験を実施し、保護解除成功をプールした。
【０１２０】
マレイミド基の付加：
2mlのDMF中、160mg（0.6mモル）のN−スクシンイミジル−３−マレイミドプロピオネート及び130mg（0.6mモル）のジイソプロピルエチルアミンを含む反応溶液を、樹脂に添加した。１時間後、溶媒を除去し、そして樹脂をDMF及びジクロロメタンにより集中的に洗浄した。ニンヒドリン標準試験を用いて、未反応の遊離アミン基を示した。
【０１２１】
樹脂の分解：
すべての分解を、85％トリフルオロ酢酸、５％フェノール、５％トリイソプロピルシラン及び５％水の混合物を用いて行った。５時間後、樹脂を濾過により除去し、そして少量のCH2Cl2により洗浄した。次にペプチドを、冷ｔ−ブチルメチルエーテル（１：５の最少比での溶解剤：エーテル）を用いて沈殿し、そしてanice−浴において30分間、冷却した。その後、それを3000rpmで５〜10分間、遠心分離した。上清液をデカントし、そして追加のエーテルを添加した。再び、生成物を冷却し、そして遠心分離し、そしてデカントした。次に、ペプチドを、アルゴンの流れ下で乾燥し、凍結乾燥し、そしてHPLC及び質量スペクトルにより分析した。
【０１２２】
生成物の精製：
ペプチドの精製を、分離用HPLC-MSを用いて行い、そして生成物を塊状物として集めた。従って、凍結乾燥されたサンプルを、80％水＋0.1％TFA/20％アセトニトリル＋0.1％TFA溶液３〜４mlに溶解し、その後、それらをカラム（YMC-pack ODS-AQ 150x20 mm）上に負荷した。
【０１２３】
生成物を含む画分を組合し、そして凍結乾燥した。最終生成物のHPLC及び質量スペクトルは、その純度を示した。
ペプチドP6及びP7を樹脂上にもたらし、そして従って、それらの２種のペプチドの取り扱いを、Fmoc−保護解除段階で開始した。
【表１】
2010502657.tif 000005
【０１２４】
例２：アプタマーの二量体化のためのペプチド放射性金属キレート化剤：
二量体アプタマー接合体の合成のために、キレート化単位Dpr-Gly-Cys 又は Dpr-Met-Cysを含むペプチドリンカーを、自動ペプチド合成機において合成した。合成された化合物は、表１に列挙される。
【０１２５】
この論点におけるアプタマー二量体化の基礎をなす考えは、２種の隣接するリンカーを有する金属キレート化単位を含むペプチドを合成することである。個々のリンカーは、アプタマーにおいてスルフヒドリル官能基への接合のためのマレイミド基を担持する。ペプチドリンカーは、[Tc(V)O]3+の配位のために設定されたN3Sドナーを提供するスペーサー中へのペプチド配列の導入により達成された、99mTcによる放射性ラベリングを可能にすべきである。ペプチド配列におけるキレート化部位は、Dpr-Gly-Cys 及び Dpr-Met-Cysにより形成される。グリシンの代わりにアミノ酸メチオニンを含むペプチドは、金属複合体への追加の安定性を付加するキレート化配列に追加の側鎖を提供する。これは、追加のドナーとして作用するエチルスルファニルメタンにおける硫黄原子の単一の電子対のためである。２種のキレート化成分が図１に示される。
【０１２６】
このキレート化配列は、インビトロでの接合成功及び血漿安定性質に対するそれらの要図の影響を研究するために、長さ及び親水性において変更され得る２種のスペーサー配列上に隣接される。それらのペプチドが自動ペプチド合成機において合成される考慮下で、いくつかの配列を同じ時点で合成することができる。
スペーサーの長さの効果を研究するために、リンカー領域内のセリンアミノ酸構築ブロックの数を変更した。セリンを、腎排除に関して陽性の効果を有するその親水性質のために、選択した。
【０１２７】
例３：アプタマーダイマー形成のためのペプチドDpr-Gly-Cys 及び Dpr-Met-Cys：
二官能ペプチド（P1-P7）を、アプタマー二量体化及び放射性金属複合体化のために使用した。MAG2に接合されるTTA1を、リンカーのマレイミド基によるそのスルフヒドリル基の二量体化のために使用した。アプタマーへのペプチドの接合及びチオール保護基の続く還元がスキーム１に示されている。
【０１２８】
接合の後、反応混合物を、10×TBE−ウレアゲル上に負荷した。出発材料及び反応混合物(TTA1-MAG2)2P5のPAGEの例は図２に示される。このPAGEは、出発材料における不純物を示す。ゲル上での移動パターンに関して、不純物は、２種のTTA1−MAG2分子間のジスルフィド橋により形成されるダイマーであり得る。反応混合物における出発材料：ダイマーの比は、ダイマー形成の方に移行される。この発現は、ペプチド結合されたアプタマーダイマー(TTA1-MAG2)2P5の形成を示す。
【０１２９】
スキーム１：アプタマーダイマーの合成：
ａ）１．TTA1−MAG2、リン酸緩衝液（0.1M、pH7.4）、１時間、室温；２．TCEP、酢酸ナトリウム緩衝液（0.1M, pH6）、１時間、室温。
【０１３０】
【化３】
2010502657.tif 000006
【０１３１】
反応混合物を、分離用PAGEにより精製した。50分の実施時間の後、ゲルを、未反応のTTA1−MAG2及びアプタマーダイマーを含む水平バンドに切断した。ゲル電気溶出のために使用されるダイマー及び出発材料バンドを有するゲルのサンプルが図３に示される。ダイマーを、１×TBEにおける電気溶出、続く生成物のTCEP還元により、ゲルから溶出した。TCEPは、tBu-S保護基、すなわち放射性金属複合体化のための必要条件を除去する。他方では、それは、TTAl-MAG2-MAG2-TTAlの形成の場合、またジスルフィド結合を還元する。次に、得られるTTA1−MAG2モノマーを、第２のPAGE精製及びゲル電気溶出によりTTA1-MAG2-P-MAG2-TTA1ダイマーから分離した。
【０１３２】
精製されたダイマーをHPLC, PAGEにより特徴づけ、そしてサンプルを質量分光法のために提出した。精製成功の遂行を、RP-HPLCにより追跡した。図５は、それらのクロマトグラムを示す。
精製の後、生成物及びモノマー出発材料TTA1−MAG2のPAGEを、可視化するために実施した。図６は、化合物(TTAl -MAG2)2P5 (22)のPAGEを示す。
【０１３３】
この方法を、６種の異なったペプチドスペーサー（P1-P7）（表１）及び２種の異なったアプタマー、TTAl-MAG2 (2) 及びTTA3-MAG2 (13)を用いて、８個のアプタマーダイマーを合成するために使用した。アプタマーダイマー配列は、表２に示されている。
【０１３４】
最終生成物の予測される質量は、26931.31g/モル〜28371.86g/モルの範囲である。オリゴヌクレオチドによる質量分光法は、それらの高い負の表面電荷及び多数の関連されるカチオン（Na+, K+）のために複雑である。ESI（電気噴霧イオン化）質量分析は通常、低い分解能を伴ってのかなり複雑な質量スペクトルを生成する（Esmans, E. L., Broes, D., Hoes, I., Lemiere, F., and Vanhoutte, K. (1998) Liquid chromatography- mass spectrometry in nucleoside, nucleotide and modified nucleotide characterization, Journal of chromatography A, 794, 109-127; Banoub, J. H., Newton, R. P., Esmans, E., Ewing, D. F., Mackenzie, G. (2005) Recent Developments in Mass Spectrometry for the Characterization of Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Chemical Reviews, 1-43）。
【０１３５】
スペクトルの分解能を改善する精製方法は、ダイマーアプタマー化合物の分析のために必須である。エタノールにおける生成物の沈殿は、良く知られており、そして精製のための効果的な方法である（Limbach, P. A., Crain, P. F., McCloskey, J. A. (1995) Molecular Mass Measurement of Intact Ribonucleic Acids Via Electrospray Ionization Quadropole. Mass Spectrometry, 6, 27-39）。
【０１３６】
凍結乾燥されたサンプルを、10Mの酢酸アンモニウム緩衝液10μlに溶解した。５分間の撹拌の後、100μlの冷エタノールをサンプルに添加し、そしてその混合物を−20℃で３時間、貯蔵し、オリゴヌクレオチド化合物の完全な沈殿を確保した。その後、混合物を遠心分解した。残留物をデカントし、ペレットを70％エタノール溶液300μlにより洗浄し、そして沈殿物を酢酸アンモニウム緩衝液に再溶解し、この方法を反復した。３回の精製サイクルの後、沈殿されたサンプルを洗浄し、そして凍結乾燥した。図７は、（22）の質量スペクトルを示す。
【０１３７】
【表２】
2010502657.tif 000007
【０１３８】
接合反応は、リンカーの長さによりわずかに影響された。表３に示されるように、リンカーの長さがその収率と相互関係する傾向がある。リンカーP5及びP6は28％の最高の接合収率を有し、そしてP1はわずか22％の収率を付与した。さらに、リンカーP5、P6及びP7は最高数のセリン構築ブロックを含み、そしてより早い腎クリアランスを助けることができる。従って、安定化されたアプタマーTTA3(4)を、比較研究のためにP5により二量体化した。
【０１３９】
代謝安定化のためにペプチドリンカー配列中へのD−アミノ酸の導入は行われている。タンパク質は単に、L−アミノ酸から構成され、従ってD−アミノ酸に対するL−アミノ酸の置換は、ほとんどのプロテアーゼがD−アミノ酸残基を分解することはできないので、より高い代謝安定性を提供する（G Guichard, N Bankirane, G Zeder-Lutz, MHV Van Regenmortel, JP Briand, S Muller, Antigenic mimicry of natural L-peptides with retro- inverso-peptidomimetics, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1994, Vol. 91, pp. 9765- 9769）。
【０１４０】
安定化されたペプチドによりダイマーを形成するために結合されるアプタマーは、改良されたインビボ安定性を有するべきである。ここで、安定化は、D−セリン構築ブロックに対するすべてのL−セリンを交換することにより、ペプチドスペーサーにおいて行われた。最長のリンカーが、D−アミノ酸の導入のために選択された。同じ量のセリン構築ブロックを含むが、しかし異なったキレート化部位（Dpr-Met-Cys (P6) 及び Dpr-Gly-Cys (P7)）を保持する２種のペプチドを合成した（P6, P7）。安定化されたアプタマーダイマーを、TTA1-MAG2から合成した。
【０１４１】
【表３】
2010502657.tif 000008
【０１４２】
例４：ダイマーアプタマーDpr-Gly-Cys及びDpr-Met-Cys接合体の99mTc（V）ラベリング：
アプタマーダイマー接合体（18）−（25）を、リン酸緩衝液（pH7.4、 0.1M）に溶解されたアプタマーダイマー接合体（100μg、3.8nモル）を、酒石酸ナトリウム溶液（200μl、20μモル）、[99mTcO4]-（1.85GBq）及び塩化第II錫溶液（10μl、264nモル）とを混合することにより99mTcによりラベリングした。ラベリングを、95℃で15分間行い、そして生成物の続く精製を回転透析により行った。ラベリング成功は、RP-HPLC、 ITLC及びPAGEにより確証された。ダイマー生成物のRP-HPLCにより決定された、放射線化学収率（RCY）及び放射線化学純度（RCP）が表４に示されている。放射線ラベルされたダイマーは、番号（18A）-(25A)を担持する。
【０１４３】
【表４】
2010502657.tif 000009
【０１４４】
ラベリング収率に関して、ペプチドスペーサー又は追加の側鎖の長さの影響は観察されなかった（例１を参照のこと）。ダイマーのラベリングは、すべてのリンカーの長さに対して平等に良好に作動する。サンプルの安定性を、24時間、塩溶液において調査し、そしてRP-HPLC及びPAGEにより決定した。この研究の結果は、表５に示される。
【０１４５】
【表５】
2010502657.tif 000010
【０１４６】
例５：アプタマーダイマーの生物学的性質：
親和性効果のために、二価生分子、例えばダイマーは、それらの標的物からの遅い解離を有することが予測される（Ringquist, S. and Parma, D. (1998) Anti-L-Selectin Oligonucleotide Ligands Recognize CD62L-Positive Leukocytes: Binding Affinity and Specificity of Univalent and Bivalent Ligands, Cytometry, 33, 394-405）。溶液における放射性ラベルされたアプタマーダイマーの化学的安定性研究に関して、リンカーの長さと化合物の安定性との間に卓越した相互関係が観察した。
【０１４７】
それらの結果に基づけば、アプタマーへのそれらのリンカーの接合収率は、より長いリンカーに関して、高かった。従って、より長いリンカー（22A）を有する放射性ラベルされたダイマーを、例えば結合研究のためのダイマーとして選択した。ヒトテナスシン−Cへの（22A）の結合親和性を、鉛化合物に対する競争結合アッセイにおいて測定した。(TTA1-MAG2)2P5についてのEC50値は3.6nMであり、そして従って、ダイマーの結合は、モノマーの結合よりもわずかに良好である（IC50＝5.6nM）。修飾されたアプタマーTTA3をまた、ペプチドリンカーP5(25)を用いて二量体化した。この化合物は、18.64nMのヒトテナスシン−Cに対する結合親和性を有する。
【０１４８】
すべての放射性ラベルされたアプタマーダイマー接合体を、ヒト血漿におけるそれらの安定性について試験し、そしてお互い比較した。図８は、鉛化合物に比較して、異なったダイマー（18A）−（25A）の血漿安定性を示す。６時間のインキュベーションの後、安定化されていないダイマー（18A）−（22A）及び（25A）についての安定性は、80〜85％であり、この安定性は鉛化合物に比較できる。安定性の著しい上昇が、安定化されたアプタマー（23A）及び（24A）について観察される。D−セリンに対するL−セリンの交換は、血漿においてインキュベーションの６時間後、90％の安定性に導く。
【０１４９】
この結果は、D−アミノ酸がリソソームプロテアーゼに対する耐性のために、ヒト血漿において、延長された安定性を有することが以前、見出されているので、文献によるものである（Hong, S. Y., Oh, J. E., and Lee, K. H. (1999) Effect of D-Amino Acid Substitution of the Stability, the Secondary Structure, and the Activity of Membrane- Active Peptide, Biochemical Pharmacology, 58, 1775-1780; Ehrenreich, B. A., and Cohn, Z. A. (1969) The fate of peptides pinocytosed by macrophages in vitro, J. Exp. Med., 129, 227-243）。
【０１５０】
アプタマーダイマー化合物：
放射性ラベルされたダイマー化合物の安定化及び親和性効果が薬理学的挙動性に対する影響を有するかどうかを調べるために、（22A）及び（23A）による器官分布研究を実施した。表６においては、U251 NMRI腫瘍担持のマウスにおける生分布の結果が示されている。（22A）の生分布は、高められた結合の傾向を表さず、腫瘍摂取はモノマーの腫瘍摂取に相当する。これは、高められた腎臓及び肝臓摂取及び早い血液クリアランスを伴う。さらに、長い親水性リンカーのために、腎臓を通しての排除の予測される上昇は観察され得ない。高められた腫瘍摂取も、延長された血液保持時間についての観察も存在せず、アプタマーダイマー接合体(TTA1-MAG2)2P5は、インビボで不安定であり、そしてかなりすばやくモノマーに分解することを示す。この問題を回避するためのアプローチは、リンカーへのD−アミノ酸の付加であり得る。
【０１５１】
【表６】
2010502657.tif 000011
【０１５２】
安定化されたアプタマーダイマー（23A）の器官分布は、鉛化合物に比較して、高められた腫瘍摂取を表した。これは、親和性効果の結果であり得る。それらの結果は、単鎖Fvフラグメント（scFv）モノマー対scFvマルチマーの薬理学的差異を調べる種々の研究グループの発見を支持する（Hudson, P. J., and Kortt, A. A. (1999) High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies, Journal of Immunological Methods, 231, 177- 189; Tahtis, K., Lee, F. T., Smyth, F. E., Power, B. E. Renner, C, Brechbiel, M. W., Old, L. J., Hudson, P. J., and Scott, A. M. (2001) Biodistribution Properties of 111indium-labeled C-Functionalized trans-Cyclohexyl Diethylenetriamine- pentaacetic Acid Humanized 3Sl93 Diabody and F(ab')2 Constructs in a Breast Carcinoma Xenograft Model, Clinical Cancer Research, 7, 1061- 1072）。
【０１５３】
親和性効果のために、抗原への機能的結合は、マルチマーscFvsの場合、高められた。さらに、高分子量抗体フラグメントの長い血液耐性時間は、長い腫瘍侵入時間を可能にし、そして高い腫瘍摂取を導く（Wu, A. M., Chen, W., Raubitschek, A., Williams, L. E., Neumaier, M., Fischer, R., Hu, S. Z., Odom-Maryon, T., Wong, J. Y. C, and Shively, J. E. (1996) Tumor localization of anti-CEA single-chain Fvs: improved targeting by non-covalent dimers, Immunotechnology, 2, 21 - 36）。
【０１５４】
高められた腫瘍摂取により、腫瘍：血液の比はまた高められる。しかしながら、ダイマーアプローチの重度の欠点は、（22A）について観察された、肝臓及び腎臓におけるそれらの高く且つ持続的摂取である。これは、尿排泄が、親水性リンカーが早い腎臓排除の方に分子の排泄を向ける傾向を有する場合、増強されるので、予測できない現象である。鉛化合物に比較して、肝臓及び腎臓からのダイマーの排泄パターンが、図９に示される。このグラフは、肝臓及び腎臓における蓄積と分子との相互関係を明白に示し、ところが安定化されたダイマー（23A）は最高の蓄積を有する。
【０１５５】
(2A)及び(22A)の両者は、血液及び腫瘍のクリアランスに関して、類似する薬物力学的挙動性を示す。安定化されたダイマーは、増強された腫瘍摂取を有し、そしてそれにより、鉛化合物に比較して、改善された腫瘍：血液比を有する。これは、図10に示される。scFvモノマー（約30kDa）に比較して、マルチマーscFv（約60〜90kDa）について観察される、インビボでの長い血液保持時間（Todorovska, A., Roovers, R. C, Dolezal, O., Kortt, A. A., Hoogenboom, H. R., and Hudson, P. J. (2001) Design and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting, Journal of Immunological Methods, 248, 47 - 66）は、生分布研究においてアプタマーダイマー化合物について観察されない。それは、分子量の小さな差異に帰因し、従って、血液保持時間の延長はわずか数分であるはずである。
【０１５６】
ダイマーアプタマー接合体による力学的イメージング研究：
分子量の倍増は、血液保持時間に対する影響を有し、そしてそれが二量体化されたアプタマー接合体について当てはまるかどうかを再調査するために、放射性ラベルされた化合物（2A）及び（23A）を、力学的イメージング研究において比較した。従って、放射性プローブを、マウスの尾の静脈に注入し、そして続いて、マウスを平面シンチグラフィーにより映像化した。興味ある領域（ROI）を、全体の血液活性と同一水準である、マウスの心臓の領域上に配置し、そして計数を、１分のフレームで記録した。合計60のフレームを測定し、そして続いて、単一フレームの計数をグラフに転換した。２種の化合物のグラフは、時間の関数としての化合物（2A）及び（23A）の血液における活性を示し、そして図11に示される。
【０１５７】
それらのグラフは、放射性ラベルされたアプタマーダイマーについて長い血液保持時間を示す。血液における鉛構造体の半減期は、約10分であり、そして血液におけるダイマー化合物の保持性は、約20分の半減期を有する。これに関して、血液保持時間を延長し、そして腫瘍摂取を高めるための概念は、好結果をもたらし、生分子の分子量が血流におけるその保持性に関連していることが証明された。しかしながら、血液保持時間の延長はかなり短く、そして従って高い腫瘍摂取性はこの効果により説明され得ないが、しかしむしろ、親和性活性により説明される。
【０１５８】
特に好ましい態様：
本発明者は、好ましいアプタマーダイマーについての好ましい構造を同定しており、それらは下記表７に列挙される。
“Pn”（nは１〜７である）は、前に定義されたような“ペプチドリンカー”である。本発明のすべての化合物は、実施例内に記載される方法により調製され得る（上記を参照のこと）。
【０１５９】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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