(57)【要約】  人体への使用が意図される移植可能装置において、自原性細胞のインビボコロニー形成がしばしば望まれる。装置、特に、移植組織、移植片、シャント、管、臓器または臓器の一部といった義装具装置は、一般に動物またはヒト由来であり、コラーゲンベースの組織マトリックスを含む。本発明は、装置の表面に蓄積され、細胞接着または細胞移動を仲介する細胞外マトリックス関連タンパク質としてのマトリックスタンパク質ＣＣＮ１を含むコーティングを提案する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植可能装置のためのコーティングであって、前記移植可能装置は、レシピエントの自身の細胞によるインビボでの再増殖または再構築が望まれる人体における使用が意図され、前記コーティングは、前記装置の表面に蓄積した、細胞接着もしくは細胞移動を仲介する細胞外マトリックス関連タンパク質またはその断片または細胞接着に関する対応する機能を有するマトリックスタンパク質による構築物を含む、コーティング。
【請求項２】
前記マトリックスタンパク質がＣＣＮファミリーのメンバーである請求項１に記載のコーティング。
【請求項３】
前記マトリックスがＣＣＮ１である請求項２に記載のコーティング。
【請求項４】
前記コーティングが湿性タンパク質リッチコーティングである請求項１から３の何れか１項に記載のコーティング。
【請求項５】
請求項１または４に記載のコーティングで被覆された、自原性細胞、好ましくは内皮細胞によるインビボコロニー形成が望ましいまたは期待される人体における使用が意図される移植可能装置。
【請求項６】
義装具装置である請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記義装具装置が移植組織、移植片、シャント、管、臓器または臓器の一部である、請求項５または６に記載の装置。
【請求項８】
動物またはヒトに由来する組織義装具であり、且つ、コラーゲンベースの組織マトリックスを含む請求項５から７の何れか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記組織義装具が、心臓の一部、心臓弁、動脈、静脈、任意の血管、肺組織または腸組織である請求項５から８の何れか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記装置が脱細胞化組織を含む請求項５から９の何れか１項に記載の装置。
【請求項１１】
以下の工程を含む、請求項５から１０の何れか１項に記載の移植可能且つ脱細胞化装置の製造方法：
ａ）動物またはヒト由来の移植可能組織を提供する；
ｂ）前記組織または臓器から本来の細胞を除去し、組織マトリックスを提供する（脱細胞化）；
ｃ）前記組織マトリックスを、細胞接着または細胞移動を仲介する細胞外マトリックスタンパク質またはその断片または細胞接着に関した対応する機能を有するマトリックスタンパク質による構築物で処理し、前記マトリックスの表面に前記細胞外マトリックスタンパク質を沈着させ、コーティングされた装置を製造する。
【請求項１２】
工程ｂ）の脱細胞化が、以下の技術の１つまたは以下の技術の任意の組み合わせによって達成される請求項１１に記載の方法：
酵素処理、低張および／または高張処理を含む浸透圧性溶解、界面活性剤による処理、細胞毒性化学物質による処理、機械的処理。
【請求項１３】
工程ｃ）の処理が以下の技術の１つである請求項１１または１２に記載の方法：
組織を細胞外マトリックスタンパク質の溶液に浸漬しまたは浸す；組織を細胞外マトリックスタンパク質の溶液でリンスする；組織の表面に細胞外マトリックスタンパク質の溶液を噴霧する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に移植可能装置に関し、より具体的には移植可能装置のためのコーティング、前記装置および前記装置の製造方法に関する。本発明は、特に、脱細胞化（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒａｉｚｅｄ）され、その後コーティングされた、コラーゲンマトリックスベースの生物義装具装置の製造に適している。
【背景技術】
【０００２】
病気を患った動脈、心臓弁、静脈またはその他の軟部組織を生物義装具装置で置換または修復する能力は、疾病および先天性欠損およびその他の重篤な合併症に起因する弁欠損を治療する方法を外科医に提供してきた。
【０００３】
典型的な方法は以下を含む：
−本来の弁の除去および生物義装具弁による外科的置換；
−本来の動脈または静脈の除去および生物義装具動脈または静脈による外科的置換；
−生物義装具シャントの移植；
−脱細胞化された腸管マトリックスを使用した気管といった血管化マトリックスによる生物学的構造の再構築。
【０００４】
移植の後、術後血栓症、石灰化または感染症になる高いリスクが存在する。
【０００５】
生物義装具移植片による生物学的構造の置換に関して、内皮細胞による表面の集密的な被覆が確実になるよう注意しなければならない。例えば、心臓弁上の内皮細胞層を達成するために、脱細胞化生物学的心臓弁は、バイオリアクターにおいて内皮細胞とともに培養される。これらの技術は、しかしながら、複雑であり、時間を消費しおよび汚染し易いため、限定的な有効性を有する。
【０００６】
米国特許第５，１９２，３１２号は、増殖因子（ｂＦＧＦ）で処理し、増殖因子に応答して移動し増殖する細胞（線維芽細胞）とともにインキュベートした同種移植片または異種移植片を開示している。生存度および寿命を改善でき、移植片の変性を減少させまたは遅延させることができるものの、アレルギー性合併症および有害な免疫反応の回避は、常に利用できるとは限らない自原生細胞によってのみ可能である。
【０００７】
それゆえ、本発明の目的の１つは、容易に利用可能な非−または低−免疫原性生物人工的移植片を提供することである。本発明の別の目的は、レシピエントの内皮細胞によってより容易にインビボで再増殖または再構築される移植可能装置または生物義装具を提供することである。さらに別の目的は、異種移植片の使用を促進し、特に小児患者における同種移植片の不十分な供給を回避することである。
【発明の概要】
【０００８】
生物義装具装置を内皮細胞で覆うために従来技術において使用されるインビトロ技術と比較して、本発明の一側面は、生理活性分子としてのＣＣＮ１により生物義装具をコーティングし、インサイチュで内皮細胞による移植可能装置の全体的再増殖を増強することを含む。ＣＣＮ１処理装置は、内皮細胞によるコロニー形成を大きく増強し、それにより、装置の全体的な生体適合性を増強する。
【０００９】
したがって、本発明の目的を解決するために、一般に、移植可能装置のためのコーティングであって、前記移植可能装置は、レシピエントの自身の細胞、すなわち自原性細胞によるインビボでの再増殖または再構築が望まれ且つ期待される人体における使用が意図され、前記コーティングは、前記装置の表面に蓄積した、細胞接着もしくは細胞移動を仲介する細胞外マトリックス関連タンパク質（「マトリックスタンパク質」）および好ましくは細胞増殖を刺激する増強された成長因子またはこのタンパク質の断片または、基準としてＣＣＮ１と比較して細胞接着に関する対応する基礎的な機能をそれぞれ有するこのタンパク質による構築物を含む。
【００１０】
好ましくは、細胞外マトリックス関連タンパク質は、ＣＣＮファミリーのメンバーであり、最も好ましくはＣＣＮ１である。
【００１１】
細胞外マトリックス関連タンパク質の有する、細胞接着もしくは細胞移動を仲介する能力または成長因子刺激型細胞増殖を増強する能力は、例えば以下の様式で試験される：試験する細胞外マトリックス関連タンパク質のコーティングの有無以外は正確に同一条件下で、組織または移植片材料の試験ピースに対してインビトロで細胞を播種する。細胞接着は、少なくとも２０％まで改善されるべきである。すなわち、一定期間の培養後の表面の細胞密度は、比較サンプルよりも少なくとも２０％高くなるべきである。
【００１２】
ＣＣＮ１は、システインリッチ血管形成誘導物質、６１（ＣＹＲ６１）、ＧＩＧ１、またはインスリン様成長因子結合タンパク質１０（ＩＧＦＢＰ１０）とも呼ばれる。ＣＣＮ１は、分子量４２ｋＤａであり、３８１アミノ酸からなり、そのうち３６がシステインである。ＣＣＮ１は、インテグリンおよびヘパリンに結合する細胞外マトリックスタンパク質である。ＣＣＮ１は、特に、細胞増殖、化学走性、血管形成および細胞接着を促進する。ＣＣＮ１は、皮膚の線維芽細胞において、血管形成、炎症およびマトリックス再構築に関する多くの遺伝子の発現をアップレギュレートすることで、創傷治癒において役割を果たすようである。このアップレギュレーションは、ＶＥＧＡ−Ａ、ＶＥＧＡ−Ｃ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＴＭＰ１、ｕＰＡ、ＰＡＩ１およびインテグリンアルファ−３およびアルファ−５を含むが、一方、コラーゲンタイプ１のアルファ−１およびアルファ−２サブユニットの発現はダウンレギュレートされる。ＣＣＮ１仲介遺伝子調節は、ヘパリン結合依存的である。ＣＣＮ１は、インテグリンアルファ−６／ベータ１を介して細胞接着および接着シグナル伝達を促進し、インテグリンアルファ−ｖ／アルファ−５を介して細胞移動を促進し、および、インテグリンアルファ−ｖ／アルファ−３相互作用を介して細胞増殖を促進する。ＣＣＮ１は、基礎的な線維芽細胞成長因子シグナル伝達、血管形成を調節し、インテグリンアルファ（ｖ）ベータ（３）に結合する細胞外マトリックス関連タンパク質を代表する。当該タンパク質は市販されている。
【００１３】
ＣＣＮ１はＣＣＮファミリーに属し、当該ファミリーは、細胞外マトリックスと特に関連する分泌タンパク質の一群である。これらのＣＣＮタンパク質は、モジュラー構造を示し、４つの異なる機能的ドメインから成る（Leask, A. Abraham, D.J., J. Cell Sci, 2006, 119:4803-10 and Brigstock, D. R., "The CCN family ...", Journal of Endocrinology (2003), 178, 169-175）。
【００１４】
驚くべきことに、ＣＣＮ１は、移植可能組織マトリックス、すなわち、全ての種類の組織パッチ、生物人工的移植片装置、または事故または外科手術後の回復のための生物義装具の調子を整え、移植後のそれらの耐久性および寿命を改善することに特に適していることが判明した。特に且つ好ましくは、レシピエントに対する免疫原性が低下した脱細胞化マトリックスが使用され、好ましくは、脱細胞化軟部組織コラーゲンマトリックスが本発明によって処理される。
【００１５】
これらの発見によれば、少なくとも内皮細胞接着の促進に関する同一の機能を基本的に有する全ての分子は、ＣＣＮ１と等価とみなすことができる。ここで使用される「ＣＣＮ１」という用語は、ＣＣＮ１およびその機能的等価物、たとえば、点変異による本来のＣＣＮ１から外れた修飾物ならびにＣＣＮ１の断片であり、特に少なくとも１つの完全な機能ドメインを含むもの、または、ＣＣＮ１による構築物、たとえば、輸送または担体分子と連結したものまたはその他の化学的な接続分子と連結したものを指すが、細胞接着に重点を置いたＣＣＮ１の基本的機能は維持されているものを指す。
【００１６】
したがって、内皮細胞単独の集団またはその他の多様な細胞集団と組み合わせた内皮細胞の集団が期待されまたは意図される上述の装置とは異なるその他の移植可能装置においてでさえ、本発明によるコーティングは顕著な利点を生むと結論できる。このことは、例えば、組織マトリックスがコラーゲンから人工的に構築された場合、または、バイオポリマーが組織マトリックスのためのコラーゲンの代わりに使用される場合に当てはまる。
【００１７】
さらに、本発明のコーティングは、以下の例に記載される特定の装置に限定されず、天然の臓器または血管系の中のまたは近傍の移植のための任意の装置に使用してよい。
【００１８】
本発明は、さらに、移植可能生物義装具であって、レシピエントの自原性細胞、好ましくはレシピエントの内皮細胞によるインビボコロニー形成が望まれ且つ期待される人体における使用が意図され、本発明のコーティングによって被覆された移植可能生物義装具、および、以下の工程を含む、前記生物義装具の製造方法を包含する：
ａ）動物またはヒト由来の移植可能組織を提供する；
ｂ）前記組織または臓器から本来の細胞を除去し、組織マトリックスを提供する（脱細胞化）；
ｃ）前記組織マトリックスを、上に定義される細胞外マトリックス関連タンパク質またはその断片または細胞接着に関した対応する機能を有するそのタンパク質による構築物で処理し、前記マトリックスの表面に前記タンパク質を沈着させ、コーティングされた装置を製造する。
【発明の詳細な説明】
【００１９】
本発明のコーティングは、基質、すなわち移植可能装置の上にまたは内部にＣＣＮ１を蓄積させる様々な技術を使用して達成してよい。
【００２０】
本発明の装置、好ましくは脱細胞化生物義装具の一側面は、ＣＣＮ１（上述の通り定義される意味を有するＣＣＮ１）を含む溶液中に浸漬されまたは浸される。ＣＣＮ１は、また移植片表面に噴霧することができ、または当該分野の当業者に既知の任意のその他の技術によって適用することができる。溶媒は任意の適した液体であってよく、例えば細胞培養培地、生理的溶液等であってよい。１回または複数回の浸漬または浸し、一般には移植片の表面または表面の少なくとも一部のＣＣＮ１の蓄積の後、コーティングされた装置は好ましくは乾燥されないものの、慎重な乾燥が除外されるわけではない。ＣＣＮ１蓄積工程は、装置に密接な接着生理活性分子の薄いフィルムを付与し、好ましくは平面に集密的に付与する。
【００２１】
好ましい実施態様において、コーティングは、それゆえ湿性タンパク質リッチコーティングである。
【００２２】
本発明による移植可能装置は、レシピエントの内皮細胞のインビボ再増殖または再構築が期待されまたは意図される人体における使用が意図され、ＣＣＮ１またはその断片または細胞接着に関して対応する機能を有するＣＣＮ１の構築物を有し、装置の表面に蓄積される。
【００２３】
装置は、好ましくは、事故または外科手術で失った天然の組織または臓器または臓器の一部に置き換えられる手段である義装具装置である。
【００２４】
義装具装置は、したがって、移植のための組織、移植片、シャント、管または臓器もしくは臓器の一部であり得る。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様に関して、組織義装具は動物またはヒトに由来し、コラーゲンベースの組織マトリックスを含む。
【００２６】
さらに、組織義装具は、心臓の一部、心臓弁、動脈、任意の血管、肺組織または腸組織、特に、ＥＰ１２３０９３９Ｂ１に開示される血管化腸組織であることが好ましい。
【００２７】
生物義装具の抗原性の大幅な低減のために、本来の生物学的組織は完全に脱細胞化されるべきである。それゆえ、本発明の好ましい実施態様に係る装置は、脱細胞化組織マトリックスを含む。脱細胞化はそれ自体、当業者に周知の工程であり、当業者は適用のために適切な技術を選択してよい。
【００２８】
好ましくは、脱細胞化は、酵素処理、低張−および／または高張−処理を含む浸透圧性溶解、界面活性剤および／または細胞毒性化学物質による処理、キレート剤、機械的手段または２以上のこれらの手段の組み合わせのいずれかによって行うことができる。
【００２９】
酵素処理には、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％／０．０２％）が好ましい。浸透圧性溶解には、低張溶液（１０ｍＭ）および高張溶液（１．５Ｍ  ＫＣｌ）の連続した処理が最も好ましく、特にＤＥ１０  ２００５  ０２３  ５９９Ａ１に開示される処理が好ましい。トリス緩衝液による脱細胞化、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（０．５％）、ＳＤＳ（０．５％）、Ｎａ−デオキシコレート（０．５％）等による界面活性剤脱細胞化、または、何れか任意の濃度でのこれらの任意の組み合わせおよび様々なインキュベーション温度も同様に良好であり、適している。
【００３０】
本発明の移植可能および脱細胞化装置の製造方法は、以下の工程を含む：
ａ）動物またはヒト由来の移植可能組織の提供；
ｂ）組織または臓器から本来の細胞を除去し、組織マトリックスを提供する（脱細胞化）；
ｃ）ＣＣＮ１またはその断片または細胞接着に関する対応する機能を有するＣＣＮ１による構築物によって前記組織マトリックスを処理し、マトリックスの表面にＣＣＮ１を蓄積させ、コーティングされた装置を製造する。
【００３１】
上に定義されるように、工程ｃ）の処理は、好ましくは以下の技術の１つを含む：組織をＣＣＮ１の溶液に浸漬しまたは浸す；組織をＣＣＮ１の溶液でリンスする；組織の表面にＣＣＮ１の溶液を噴霧する、ここにおいて、ＣＣＮ１は、上のとおり定義される意味に解されるべきである。
【００３２】
本発明は幾つかの利点を有する。
【００３３】
様々な生物義装具装置上にコーティングされる薄膜の、密接な接着生理活性分子は、前記装置に、内皮細胞によるコロニー形成を誘引する特性を提供する。結果として、生物義装具装置は、その他の装置にとって好ましい状況で使用してよく、従って、外科医および患者に更なる選択肢を提供する。例えば、同種移植片は、活発な心内膜炎を患う患者における弁の置換のための好ましい装置となっている。同種移植片は、供給は低いものの需要は高く、典型的に小児の症例のために準備される。従って、生理活性コーティングを有する生物義装具装置は、成人の心内膜炎の症例において顕著な新たな選択肢を提供する。
【００３４】
小児患者のための同種移植片の供給の低さを回避するために、生理活性コーティングを有する異種移植片由来の生物義装具装置は、代替として役立つ可能性がある。生理活性コーティングを有する生物義装具動脈−静脈シャントの透析患者における移植は、透析に適した生きた人工的且つ穿刺耐性の管の速いインビボ形成を可能にするだろう。
【００３５】
本発明は好ましい実施態様に関して記述されているものの、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形式および詳細について変更がなされてよいと認識するだろう。
【００３６】
例えば、特定の技術が好ましいとして開示されたものの、コーティングの蓄積のための化学的方法または脱細胞化の機械的方法を含むその他の方法が本発明の範囲に含まれる。
【実施例】
【００３７】
［実施例１］
ヒツジＰＶ（ヒツジ由来の肺動脈弁）を、界面活性剤溶液（０．５％Ｎａデオキシコレート／０．５％ＳＤＳ）を使用して脱細胞化した。脱細胞化の完全性は、組織学的染色（Ｈ＆Ｅ）よって評価した。脱細胞化ＰＶの内腔表面のコーティングは、５００ｎｇの組み換えＣＣＮ１（ＡＢＮＯＶＡ社（台湾））を含む１０ｍＬ細胞培養培地ＤＭＥＭにより、１２時間ゆっくりと回転させて行った。免疫染色により、コーティングされたＰＶの内腔表面上にＣＣＮ１により完全な被覆が確認された。
【００３８】
内皮細胞による効率的な再増殖は、播種し、インビトロのバイオリアクター中での拍動性流動培養で実証した。これらのＣＣＮ１コーティング弁の優位性は、しかしながら、インビボ試験によって確認した。
【００３９】
これらの脱細胞化しＣＣＮ１でコーティングしたＰＶを、若いヒツジの同所の位置に移植した。３ヵ月後、弁の機能を心エコー図法によって評価し、全ての場合（ｎ＝４）において、弁は漏れの徴候なく十分適切であった。ヒツジを安楽死させた後、弁の組織学的分析から、内皮単層により十分に覆われ、壁および心室および弁尖頭の肺側が覆われたことがわかった。これは、脱細胞化したがＣＣＮ１でコーティングしていない弁が、ヒツジモデルにおいて移植から３ヶ月後、インビボ内皮細胞化を欠いたことと対照的である。
【００４０】
［実施例２］
完全に脱細胞化した生物学的血管新生化腸マトリックスの現存の血管性ベッドを、５００ｎｇ組み換えＣＣＮ１（ＡＢＮＯＢＡ社（台湾））を含む３ｍＬのＥＢＭ−２培地の溶液を、椎弓根の動脈分枝からの注射によって満たした。５％ＣＯ２を補充した空気で構成される完全に加湿した大気中において３７℃で一晩インキュベーションした。このインキュベーション時間の際、生物学的血管新生化マトリックスは、ＥＢＭ−２を含むペトリ皿（ｄ＝１０ｃｍ）におき、マトリックスが乾燥しないようにした。この処理は血管性ベッドの壁の完全なコーティングをもたらしたことが、ＣＣＮ１に対する免疫組織化学的染色によって実証された。
【００４１】
この方法は、患者への移植の前における、少ない数の内皮細胞による効率的なインビボの再播種を可能にするだろう。
【００４２】
要約すると、脱細胞化マトリックスの組み換えＣＣＮ１を含む培地に対する曝露は、この分子による表面のコーティングをもたらし、その結果、バイオリアクターでインキュベーションした場合にインビトロでの内皮細胞の接着をもたらし（実施例１＆２）、ヒツジモデルの同所の位置に移植した場合にインビボでの接着をもたらす（実施例１）。
【国際調査報告】
2010535548.tif 000002
2010535548.tif 000003
2010535548.tif 000004