(57)【要約】  本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ（例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLynなどのSrcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、ならびに他のタンパク質チロシンキナーゼ、例えばBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体など）と相互作用し、それを調節（例えば阻害）する化合物による処置に対する細胞（例えば前立腺細胞株）の相対的固有感受性または抵抗性と相関することが発見されたポリヌクレオチドを記載する。これらのポリヌクレオチドは、その化合物に対する前立腺細胞株の抵抗性および感受性を予測するのに役立つことが示された。いくつかのポリヌクレオチドの発現レベルまたはリン酸化状態が、特定のタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物による処置によって制御されることから、これらのポリヌクレオチドは、タンパク質チロシンキナーゼシグナル伝達経路、例えばSrcチロシンキナーゼに関与することが示される。その発現レベルが薬物感受性または薬物抵抗性と高く相関し、それらの化合物による処置によって調節される、そのようなポリヌクレオチドは、特にSrcチロシンキナーゼ経路などのタンパク質チロシンキナーゼ経路を介したシグナリングが疾患過程に関与する疾患領域（例えば前立腺がん）において、薬物応答を予測する方法に役立ち、疾患管理に予後指標または診断指標として役立つ、ポリヌクレオチド予測因子またはマーカーセットを構成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドによる処置に対する細胞の応答を予測する発現パターンを持つ複数のポリヌクレオチドを含む予測因子セット。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、
a）表2に記載のポリヌクレオチド；
b）表2に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；
c）表2に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチド
d）表3に記載のポリヌクレオチド；
e）表3に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；
f）表3に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチド；
g）表4に記載のポリヌクレオチド；
h）表4に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；
i）表4に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチド；
j）表5に記載のポリヌクレオチド；
k）表5に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；
l）表5に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチド；
m）CK5、PSA、ARポリヌクレオチド；
n）PSAおよびARポリヌクレオチド；
o）CK5ポリヌクレオチド；
p）uPAポリヌクレオチド；
q）EPHA2ポリヌクレオチド；
r）PSAポリヌクレオチド；
s）ARポリヌクレオチド；および
t）上記ポリヌクレオチドの任意の組合せ
からなる群より選択される、請求項1に記載の予測因子セット。
【請求項３】
N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドによる処置に対する細胞の応答を予測する発現パターンを持つ複数のポリペプチドを含む予測因子セット。
【請求項４】
ポリペプチドが、
a）表2に記載のポリペプチド；
b）表2に記載の感受性予測因子ポリペプチド；
c）表2に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド
d）表3に記載のポリペプチド；
e）表3に記載の感受性予測因子ポリペプチド；
f）表3に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；
g）表4に記載のポリペプチド；
h）表4に記載の感受性予測因子ポリペプチド；
i）表4に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；
j）表5に記載のポリペプチド；
k）表5に記載の感受性予測因子ポリペプチド；
l）表5に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；
m）CK5、PSA、ARポリペプチド；
n）PSAおよびARポリペプチド；
o）CK5ポリペプチド；
p）uPAポリペプチド；
q）EPHA2ポリペプチド；
r）PSAポリペプチド；
s）ARポリペプチド；および
t）上記ポリペプチドの任意の組合せ
からなる群より選択される、請求項3に記載の予測因子セット。
【請求項５】
ある化合物が細胞の活性を調節できるかどうかを予測するための方法であって、
a）細胞の試料を取得するステップ；
b）前記細胞が複数のマーカーを発現させるかどうかを決定するステップ；および
c）前記マーカーの発現を、化合物の、前記細胞の活性を調節する能力と、相関させるステップ
を含む方法。
【請求項６】
複数のマーカーが請求項2に記載のポリヌクレオチドの1つ以上である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
複数のマーカーが請求項5に記載のポリペプチドの1つ以上である、請求項9に記載の方法。
【請求項８】
ある疾患状態に関連する細胞の化合物感受性または化合物抵抗性を予測するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを同定する方法であって、
a）複数の細胞株を1つ以上の化合物に供するステップ；
b）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのマイクロアレイの発現パターンを解析するステップ；および
c）前記マイクロアレイの前記発現パターンを使って、ある疾患状態に関連する細胞の感受性または抵抗性を予測するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを選択するステップ
を含む方法。
【請求項９】
ある疾患状態についての処置を必要としている個体が、前記処置にうまく応答するだろうか応答しないだろうかを予測するための方法であって、
a）前記個体から細胞の試料を取得するステップ；
b）前記細胞が複数のマーカーを発現させるかどうかを決定するステップ；および
c）前記マーカーの発現を、個体の、前記処置に応答する能力と、相関させるステップ
を含む方法。
【請求項１０】
疾患状態が前立腺がん、乳がん、または肺がんである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドに結合しかつ/またはその活性を調節することができる候補化合物についてスクリーニングする方法であって、
a）試験化合物を請求項4に記載のポリペプチドと接触させること；および
b）ポリペプチドに結合しかつ/またはその活性を調節する試験化合物を候補化合物として選択すること
を含む方法。
【請求項１２】
請求項4に記載の1つ以上のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの調節物質を投与することを含む、対象の前立腺がんを処置する方法。
【請求項１３】
a）患者試料におけるカリクレイン3およびアンドロゲン受容体の発現レベルを測定すること（この場合、標準試料に観察されるレベルと比較して上昇したカリクレイン3および/またはアンドロゲン受容体の発現レベルは、前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する少なくとも部分的な抵抗性を示し、標準試料に観察されるレベルと比較して減少したカリクレイン3および/またはアンドロゲン受容体の発現量は、前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す）；
b）患者試料におけるサイトケラチン5の発現レベルを測定すること（この場合、標準試料に観察されるレベルと比較して減少したサイトケラチン5の発現レベルは、前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する少なくとも部分的な抵抗性を示し、標準試料に観察されるレベルと比較して上昇したサイトケラチン5の発現量は、前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す）；
c）患者試料が前立腺細胞系統に関する基底細胞タイプ表現型の徴候を示すかどうかを決定すること（この場合、そのような徴候の存在は、前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す）；
d）患者試料におけるカリクレイン3、アンドロゲン受容体、およびサイトケラチン5の発現レベルを測定すること（この場合、標準試料に観察されるレベルと比較して上昇したカリクレイン3および/またはアンドロゲン受容体の発現レベルならびに標準試料に観察されるレベルと比較して減少した発現レベルは、前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する少なくとも部分的な抵抗性を示し、標準試料に観察されるレベルと比較して減少したカリクレイン3および/またはアンドロゲン受容体の発現量ならびに標準試料に観察されるレベルと比較して上昇したサイトケラチン5の発現レベルは、前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す）；
e）患者試料におけるSCEL、ANXA3、CST6、LAMC2、ZBED2、EREG、AXL、FHL2、PLAU、および/またはARNTL2の発現レベルを測定すること（この場合、標準試料に観察されるレベルと比較して減少したSCEL、ANXA3、CST6、LAMC2、ZBED2、EREG、AXL、FHL2、PLAU、および/またはARNTL2の発現レベルは、前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する少なくとも部分的な抵抗性を示し、標準試料に観察されるレベルと比較して上昇したSCEL、ANXA3、CST6、LAMC2、ZBED2、EREG、AXL、FHL2、PLAU、および/またはARNTL2の発現量は、前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す）；
f）患者試料におけるEPHA2の発現レベルを測定すること（この場合、標準試料に観察されるレベルと比較して減少したEPHA2の発現レベルは、前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する少なくとも部分的な抵抗性を示し、標準試料に観察されるレベルと比較して上昇したEPHA2の発現量は、前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す）；および
g）患者試料におけるUPAの発現レベルを測定すること（この場合、標準試料に観察されるレベルと比較して減少したUPAの発現レベルは、前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する少なくとも部分的な抵抗性を示し、標準試料に観察されるレベルと比較して上昇したUPAの発現量は、前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す）
からなる群より選択される方法を使って、患者がN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドなどのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して応答性でありうるかどうかを予測する方法。
【請求項１４】
がんを患っている患者のための処置レジメンを確立する方法であって、請求項5、6、7、8、9、10、11、12、または13のいずれか一項に従って、患者が、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドなどのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して応答性であると予測されるかどうかを決定するステップと、患者試料が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性であると予測される場合には、より攻撃的な処置レジメンを適用し、患者試料が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して感受性であると予測される場合には、典型的な処置レジメンを適用するステップとを含む方法。
【請求項１５】
がんを患っている患者のタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する応答性を予測するために代用マーカーを使用する方法であって、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドなどのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤の投与前と投与後の両方で予測的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドマーカーの発現レベルを比較するステップを含み、前記投与が無かった場合と比較して前記投与後の前記予測的マーカーの発現量の減少は、前記患者が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して応答性であることを示し、前記予測的マーカーが、表2、3、4、または5に記載の1つ以上の感受性マーカーによって表される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許法第119条(e)項に基づき、米国仮特許出願第60/879,374号（2007年1月9日出願）および米国仮特許出願第60/899,260号（2007年2月2日出願）の利益を主張する。前記出願の教示する内容はその全てが参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、概して薬理ゲノミクスの分野に関し、より具体的には、患者（特に前立腺がんを持つ患者）における薬物感受性を決定するための新しい代替的方法および手法に関する。本発明は、分子レベルでの患者の応答に基づいて疾患および障害を処置するのに役立つ、個別化された遺伝子プロファイルの開発を可能にする。
【背景技術】
【０００３】
前立腺がんは西洋諸国の男性では最もよく見られるタイプのがんである。米国だけで毎年約230,000人の男性が前立腺がんと診断され、約30,000人がこの疾患で死亡すると見積られている（1）。標的治療はがん患者に希望をもたらしてはいるが、前立腺がんの処置におけるそれらの使用例は、まだわずかである。前立腺がん患者が現在利用することのできるレジメンには、早期腫瘍の場合は従来の外科手術、放射線およびホルモン療法、後期転移性腫瘍の場合はタキソール（TAXOL（登録商標））に基づく化学療法がある（2、3）。前立腺がんの標的治療を開発するという未だ満たされていない明確な医療ニーズがあり、臨床において薬物に対する患者の応答を正確に予言し、よって個々の患者に対する治療の個別化を容易にすることができる方法も必要とされている。
【０００４】
この課題は、処置または治療に対する患者の感受性をより良く予測することができる新しいパラメータの同定によって解決されうる。患者試料の分類はがん診断およびがん処置の極めて重要な一側面である。薬物処置に対する患者の応答と分子マーカーおよび遺伝子マーカーとの関連は、非応答患者における薬物開発に新しい機会を切り開くことができ、あるいは他の処置選択肢の中から、効力の信頼度がより高いという理由で、ある薬物の適応を識別することができる。さらに、医薬品、薬物、または併用療法に対してよく応答するであろう患者の事前選択は、臨床研究に必要な患者の数を減少させることができ、あるいは臨床開発プログラムを完了するのに必要な時間を短縮することができる（M. Cockettら, Current Opinion in Biotechnology, 11:602-609 (2000)）。
【０００５】
薬理ゲノミクス研究の大きな目標は、臨床において、薬物に対する所与の患者の応答を正確に予測する遺伝子マーカーを同定することであり、そのような個別化された遺伝子評価は、個人別の処置を著しく容易にするだろう。よく使用される薬剤が多くの患者において無効であり、副作用も頻発するがんの処置および治療には、この種のアプローチが特に必要である。薬物応答はターゲット細胞に固有の性質だけでなくホストの代謝的性質も反映するので、患者における薬物感受性の予測は、その達成がとりわけ困難である。遺伝子情報を利用して薬物感受性を予測しようとする当業者の努力は、主に、幅広い影響を持つ個々のポリヌクレオチド、例えば多剤抵抗性ポリヌクレオチドmdr1およびmrp1などに集中している（P. Sonneveld, J. Intern. Med., 247:521-534 (2000))。
【０００６】
ポリヌクレオチド発現パターンを大規模に特徴づけるためのマイクロアレイ技術の開発は、複数の分子マーカーを体系的に探索すること、およびがんを伝統的な組織病理学的方法では明らかにならない明確なサブグループに分類することを可能にする（J. Khanら, Cancer Res., 58:5009-5013 (1998)；A.A. Alizadehら, Nature, 403:503-511 (2000)；M. Bittnerら, Nature, 406:536-540 (2000)；J. Khanら, Nature Medicine, 7(6):673-679 (2001)；およびT.R. Golubら, Science, 286:531-537 (1999)；U. Alonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:6745-6750 (1999)）。そのような技術および分子ツールにより、任意の所与の時点における、ある細胞内での数多くの転写物の発現レベルをモニターすることが可能になっている（例えばSchenaら, Science, 270:467-470 (1995)；Lockhartら, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996)；Blanchardら, Nature Biotechnology, 14:1649 (1996)；およびAshbyらに対して1996年10月29日に発行された米国特許第5,569,588号を参照されたい）。
【０００７】
差次的ポリヌクレオチド発現が健康および疾患とどのように関連するかは、機能ゲノミクスの基礎であり、機能ゲノミクスは、特定の細胞または細胞群によって発現される全ポリヌクレオチドの研究、および発生時、疾患時または環境曝露時に起こるそれらの発現パターンの変化の研究であると定義される。ポリヌクレオチド発現を研究するために使用されるハイブリダイセーションアレイは、一度に文字どおり何千ものポリヌクレオチドの発現の変化を調べられるようにすることにより、ゲノム規模でのポリヌクレオチド発現解析を可能にする。一般に、ハイブリダイゼーションアレイの場合は、遺伝子特異的配列（プローブ）を固体マトリックス上に固定化する。次に、これらの配列を、生物学的試料（ターゲット）から得た核酸の標識コピーでクエリする。根底にある理論は、遺伝子の発現量が多いほど、標識ターゲットの量が多く、したがってシグナルの出力が大きいというものである（W.M. Freemanら, BioTechniques, 29:1042-1055 (2000)）。
【０００８】
ヒト腫瘍のマイクロアレイ解析によって生成されたポリヌクレオチド発現情報は、臨床成果を予測できることが、最近の研究によって実証されている（L.J. van't Veerら, Nature, 415:530-536 (2002)；M. Westら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:11462-11467 (2001)；T. Sorlieら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:10869-10874 (2001)；M. Shippら, Nature Medicine, 8(1):68-74 (2002)）。これらの知見は、治療に対する個々の腫瘍の応答をより良く予測することによって、がん処置が大きく改善されるだろうという希望をもたらす。
【０００９】
バイオマーカーは、新規抗がん薬の臨床開発の成功と、患者がそのような特異的標的治療から引き出しうる臨床的利益とを、決定づけることができる。HER2の発現を患者選択基準として使用することにより、乳がんにおけるHER2をターゲットとするモノクローナル抗体療法であるハーセプチン（HERCEPTIN（登録商標））の開発を成功させることができた。HER2を過剰発現させることが確認されてからこの治療を受けた乳がん患者は、注目に値する応答率と著しい臨床的利益を示す（10）。対照的に、画期的新薬、例えば上皮増殖因子受容体（EGFR）をターゲットとする小分子ゲフィチニブの治験において、ロバストなバイオマーカーの使用が失敗に終わったことにより、インビトロおよび/または動物モデルで腫瘍細胞成長を阻害するその効力が完全に実証されていたにもかかわらず（13、14）、その臨床開発は後退することになった（11、12）。臨床開発では、患者選択の指針を与えることができ、分子レベルでの薬物効力のモニタリングを可能にする分子バイオマーカーを同定することが、ますます重要になっている。
【００１０】
ダサチニブは、Src、BCR-Abl、c-kit、PDGFRβおよびEphA2を含む複数の細胞質チロシンキナーゼまたは膜結合型チロシンキナーゼをターゲットとする強力な経口活性小分子阻害剤である（4、5）。BCR-ABL突然変異を保因する白血病がん細胞株の大きなパネルに対するその力価（6）およびイマチニブ抵抗性の克服という明確で差し迫った必要性ゆえに、この化合物は白血病に関する治験が急がれた。これらの治験で実証された著しい臨床的利益に基づいて、ダサチニブは最近、イマチニブに対して抵抗性または不耐性である慢性骨髄性白血病（CML）およびフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（ALL）における使用が承認された（7）。細胞移動、接着および血管新生などのいくつかの細胞プロセスにおけるSrcキナーゼの関与、EGFRなどのいくつかの経路へのSrcの参加、および腫瘍形成におけるそれらチロシンキナーゼターゲットの潜在的役割（8、9）が、固形腫瘍を含む他のタイプの悪性疾患におけるダサチニブの潜在的使用に関する調査を促している。
【００１１】
当技術分野で求められているのは、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する分子レベルでの患者の応答に基づいて、疾患および障害、特に前立腺がんなどのがんを処置するのに不可欠な、患者における薬物感受性を決定するための新しい代替的方法および手法である。培養細胞をインビボ効果のモデルとして使用することによって、本発明は、細胞培養において露呈される細胞固有の性質に、有利に焦点を合わせ、本発明には、薬物感受性と相関する同定されたポリヌクレオチドが関わる。インビトロでアッセイされる細胞株中のポリヌクレオチド/マーカーポリヌクレオチド（予測因子ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドセット）の、本明細書に記載する発見および同定は、インビボでの薬物応答と相関させるために使用することができ、したがってこの発見および同定は、薬物および/または化学療法剤（タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤を含む）に対する患者の応答を（特に前立腺がん患者に関して）予測するために同じポリヌクレオチドが使用される臨床的状況に、拡張することができる。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、その発現レベルがタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物に対して感受性または抵抗性である前立腺細胞株における薬物感受性と高く相関するマーカーポリヌクレオチドの同定を記載する。より具体的には、本発明に従って阻害されるタンパク質チロシンキナーゼには、Srcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えば、Src、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびにBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体を含む他のタンパク質チロシンキナーゼが含まれる。これらおよび他のタンパク質チロシンキナーゼを概観するには、例えばP. Blume-JensenおよびT. Hunter「Oncopolynucleotide Kinase Signaling」Nature, 411:355-365 (2001)を参照されたい。これらのポリヌクレオチドの一部は、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物、特にsrcチロシンキナーゼ阻害剤化合物による調節も受け、このことは、それらがタンパク質チロシンキナーゼシグナリング経路に関与することを示す。これらのポリヌクレオチドまたは「マーカー」は、薬物および/または薬物処置に対するホストの応答を予測するのに役立つ。
【００１３】
本発明の一態様は、ある疾患状態と関連する細胞またはある疾患を持つホストと関連する細胞の薬物感受性と相関する発現レベルを持つポリヌクレオチドを同定するための細胞培養モデルを提供することである。本発明に従い、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを利用して無処置細胞株（特に前立腺細胞株）のパネルにおける数多くのポリヌクレオチドの発現レベルを測定すると共に、それらの細胞株について、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物に対する薬物感受性を決定した。無処置細胞におけるポリヌクレオチド発現プロファイルの決定は、化学感受性の予測と、タンパク質チロシンキナーゼまたはタンパク質チロシンキナーゼ（例えばsrcチロシンキナーゼ）が関与する経路を調節（好ましくは阻害）する薬物または化合物に対する感受性と高く相関する発現レベルを持つマーカーポリヌクレオチドの同定とを可能にした。したがって、これらのマーカーポリヌクレオチドは、タンパク質チロシンキナーゼ活性に直接的または間接的に影響を及ぼす薬物または薬物処置に対する患者の応答を予知するための1つ以上の予測因子として利用することができる。
【００１４】
本発明のもう一つの態様は、ある疾患状態、または特定タイプのがんもしくは腫瘍、例えば前立腺がんもしくは前立腺腫瘍について、薬物または化学療法剤による処置または治療を必要としている個体が、その薬物または化学療法剤による処置または治療にうまく応答するだろうか、それとも応答しないだろうかを、そのような処置または化学療法の適用に先だって決定または予測する方法を提供することである。好ましくは、処置または治療には、タンパク質チロシンキナーゼ調節剤、例えばタンパク質チロシンキナーゼ活性の阻害剤が含まれる。本発明の阻害剤化合物によって阻害されうる活性を持つタンパク質チロシンキナーゼには、例えばSrcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびに他のタンパク質チロシンキナーゼ、例えばBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体などが含まれる。また本発明によれば、タンパク質チロシンキナーゼ調節化合物または薬物（好ましくはsrcチロシンキナーゼ阻害剤）による処置に先だって、患者組織試料（例えば前立腺腫瘍または前立腺がんの生検）から得られる細胞をアッセイして、それらのポリヌクレオチド発現パターンを決定する。その結果得られる、当該化合物または薬物に曝露される前の試験細胞のポリヌクレオチド発現プロファイルを、本明細書において説明し提示するポリヌクレオチドの予測因子セット（表2）のポリヌクレオチド発現プロファイルと比較する。また、そのような方法では、1つ以上の予測因子ポリヌクレオチド（すなわち、例えば表2、3、4および5にそれぞれ記載する174、14、10および5ポリヌクレオチド予測因子セット）のポリヌクレオチド発現パターン、および/またはuPA、CK5、EPHA2、ARおよび/またはPSAのポリヌクレオチド発現パターンの測定を、個別に、またはその任意の組合せで、使用することもできる。これらのポリヌクレオチドは、その薬物または化合物に対して抵抗性または感受性であることが決定されている対象無処置細胞パネルから導き出される。
【００１５】
ある薬物による処置の成否は、試験組織（例えば腫瘍またはがん生検）から得られる細胞（試験細胞）のポリヌクレオチド発現パターンが、ポリヌクレオチドの予測因子セットのポリヌクレオチド発現パターンと比較的類似しているか異なっているかに基づいて、決定することができる。したがって、試験細胞が、当該薬物または化合物に対して感受性である対照細胞パネルにおけるポリヌクレオチドの予測因子セットのポリヌクレオチド発現プロファイルと一致するポリヌクレオチド発現プロファイルを示す場合、その個体のがんまたは腫瘍は、その薬物または化合物による処置に対して有利に反応するであろう可能性が高いか、またはそうであるだろうと予測される。これに対し、試験細胞が、当該薬物または化合物に対して抵抗性である対照細胞パネルのポリヌクレオチドの予測因子セットのポリヌクレオチド発現パターンと一致するポリヌクレオチド発現パターンを示す場合、その個体のがんまたは腫瘍はその薬物または化合物による処置に応答しないだろう可能性が高いか、またはそうであるだろうと予測される。
【００１６】
本発明のさらにもう一つの態様は、がん患者が、ある薬物または化合物（特に、タンパク質チロシンキナーゼ活性またはタンパク質チロシンキナーゼ経路に直接的または間接的に関与する薬物または化合物）による処置に対して、感受性であるだろうか抵抗性であるだろうかを決定するためのスクリーニングアッセイを提供することである。そのようなタンパク質チロシンキナーゼには、Srcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびに他のタンパク質チロシンキナーゼ、例えばBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００１７】
より具体的な一態様において、本発明は、がん患者がある薬物または化合物（特にsrcチロシンキナーゼ活性またはsrcチロシンキナーゼ経路に直接的または間接的に関与する薬物または化合物）による処置に対して感受性であるだろうか抵抗性であるだろうかを決定するためのスクリーニングアッセイを提供する。
【００１８】
本発明のもう一つの態様は、タンパク質チロシンキナーゼ（Srcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびに他のタンパク質チロシンキナーゼ、例えばBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体を含む）を調節する化合物または薬剤によって処置することができる疾患を持つ患者の処置をモニターする方法を提供することである。これは、患者組織試料（例えば腫瘍またはがんの生検、例えば前立腺がん試料または前立腺腫瘍試料）から得られる細胞の抵抗性または感受性ポリヌクレオチド発現プロファイルを、タンパク質チロシンキナーゼ活性を阻害する薬物または化合物による処置に先だって比較すると共に、その薬物または化合物による処置後にも再び比較することによって、達成することができる。患者の組織試料から得られる単離された試験細胞をアッセイして、ある化合物または薬物、例えばsrcチロシンキナーゼ阻害剤などへの曝露前および曝露後に、それらのポリヌクレオチド発現パターンを決定する。その結果得られる、処置前および処置後の試験細胞のポリヌクレオチド発現プロファイルを、予測因子セットのポリヌクレオチド発現パターン、または予測因子サブセットのポリヌクレオチド発現パターン、または予測因子ポリヌクレオチドのいずれか一つのポリヌクレオチド発現パターンと、個別に、またはその任意の組合せで、比較する。したがって、患者の応答が、予測因子ポリヌクレオチドの発現プロファイルの相関関係に基づいて、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物による処置に対して感受性であるものになる場合、患者の処置の予後は良好であると認定することができ、処置を継続することができる。また、薬物または化合物による処置後に、試験細胞が、それらのポリヌクレオチド発現プロファイルに、その薬物または化合物に対して感受性である対照細胞パネルと一致する変化を示さない場合、これは、現在の処置を修正し、変更し、さらには中止すべきであるという指標として役立ちうる。そのようなモニタリングプロセスは、ある薬物または化合物による患者の処置の成否を示すことができ、そのモニタリングプロセスは、必要に応じて、または所望どおりに、繰り返すことができる。
【００１９】
本発明のさらにもう一つの態様は、タンパク質チロシンキナーゼまたはタンパク質チロシンキナーゼ経路によるシグナリングが重要性を持つ疾患領域において、例えばがんおよび腫瘍において、免疫障害、免疫異常もしくは免疫機能不全において、または細胞シグナリングおよび/または細胞増殖管理が異常もしくは異所的である疾患状態において、診断価値と予後価値の両方を持つ、予測因子ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの予測因子セットを提供することである。その直接的または間接的調節が疾患状態または病状と関連しうるそのようなタンパク質チロシンキナーゼには、Srcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびに他のタンパク質チロシンキナーゼ、例えばBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体が含まれる。本発明によれば、1つ以上の予測因子ポリヌクレオチド、または予測因子ポリヌクレオチドセットもしくはサブセットの使用（例えば、それぞれ表2、3、4、および5に記載の174、14、10および5ポリヌクレオチド予測因子セット、および/またはuPA、CK5、EPHA2、ARおよび/またはPSAのポリヌクレオチド発現パターンの測定の、個別の、またはその任意の組合せでの使用）は、生物系または細胞応答に関して何らかの知見を得る前に、成果を予想または予言するために行われる。
【００２０】
本発明のさらにもう一つの態様は、異なる生物系において、または細胞応答に関して、タンパク質チロシン阻害剤化合物の効果またはタンパク質チロシンキナーゼシグナリング経路に影響を及ぼす化合物の効果を予測し、または合理的に予言するために、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤薬物または化合物に対する抵抗性または感受性と高く相関する1つ以上のポリヌクレオチド、例えば表2、3、4、および5にそれぞれ列挙したもの、および/またはuPA、CK5、EPHA2、ARおよび/またはPSAのポリヌクレオチド発現パターンの測定を、個別に、またはその任意の組合せでアセンブルして、予測因子ポリヌクレオチドセットにすることである。これらの予測因子ポリヌクレオチドセットを試験細胞による薬物応答のインビトロアッセイに使って、インビボ成果を予測することができる。本発明によれば、本明細書に記載するさまざまな予測因子ポリヌクレオチドセット、またはこれら予測因子セットと、他のポリヌクレオチドもしくはこれらポリヌクレオチドの他の共変量との組合せを使って、例えばがんまたは腫瘍を持つ患者が、タンパク質チロシンキナーゼを調節する化合物、またはタンパク質チロシンキナーゼ制御経路全体によるシグナリングを調節する化合物による治療的介入にどのように応答する可能性があるかを予測することができる。ポリヌクレオチドの予測因子セット、またはこれらポリヌクレオチドの共変量を使って、がんまたは腫瘍を持つ患者が、例えばSrcファミリーのタンパク質チロシンキナーゼメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびに他のタンパク質チロシンキナーゼ、例えばBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体などといったチロシンキナーゼまたはチロシンキナーゼの活性を調節する化合物を使用する治療に対して、どのように応答するかを予測することができる。
【００２１】
本発明のもう一つの目的は、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物に対する感受性または抵抗性と相関する発現プロファイルを示す本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはその組合せを含む1つ以上の専用マイクロアレイ、例えばオリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはcDNAマイクロアレイを提供することである。そのようなマイクロアレイは、例えば腫瘍生検から得られる試験細胞におけるマイクロアレイ上のポリヌクレオチドの発現レベルを評価し、これらの試験細胞がタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物に対して抵抗性である可能性が高いだろうか、感受性である可能性が高いだろうかを決定するためのインビトロアッセイに使用することができる。例えば専用マイクロアレイは、本明細書に記載し、表2、3、4、および5にそれぞれ示す、ポリヌクレオチドの一部もしくは全部、ポリヌクレオチドサブセット、またはその組合せ、および/またはuPA、CK5、EPHA2、ARおよび/またはPSAのポリヌクレオチド発現パターンの測定を、個別に、またはその任意の組合せで使用して、製造することができる。組織生検または臓器生検から得られる細胞を単離して、1つ以上の阻害剤化合物に曝露することができる。無処置細胞および処置細胞の両方から単離された核酸を専用マイクロアレイの1つ以上に適用した後、被験細胞のポリヌクレオチド発現のパターンを決定して、そのマイクロアレイ上の予測因子ポリヌクレオチドセットの生成に使用した対照細胞パネルから得られる予測因子ポリヌクレオチドパターンのそれと比較することができる。試験対象である細胞から得られるポリヌクレオチド発現パターン結果に基づいて、その細胞が抵抗性のポリヌクレオチド発現プロファイルを示すか、感受性のポリヌクレオチド発現プロファイルを示すかを決定することができる。次に、組織生検または臓器生検から得た被験細胞がタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物および処置または治療の経過に応答するだろうか応答しないだろうかを、専用マイクロアレイ解析の結果から収集された情報に基づいて決定または評価することができる。
【００２２】
本発明のさらにもう一つの態様は、ある疾患を持つ患者による感受性または抵抗性を、特にがんまたは腫瘍、すなわち前立腺がんまたは前立腺腫瘍に関して、決定または予測するためのキットを提供することである。そのようなキットは、臨床場面において、ある患者の生検腫瘍またはがん試料を、例えばその患者の腫瘍またはがんが、タンパク質チロシンキナーゼの活性またはタンパク質チロシンキナーゼ活性が関与する細胞シグナリング経路の修飾（好ましくは阻害）と直接的または間接的に関わる薬物、化合物、化学療法剤、または生物剤による所与の処置または治療に対して抵抗性であるだろうか、それとも感受性であるだろうかを、決定または予測する目的で試験するのに役立つ。キットには、タンパク質チロシンキナーゼ調節物質、特にSrcタンパク質チロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLynの阻害剤、ならびにBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体タンパク質チロシンキナーゼの阻害剤に対する抵抗性および感受性と相関するポリヌクレオチドを含む1つ以上のマイクロアレイ、例えばオリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはcDNAマイクロアレイと、患者組織標本または患者試料から得られる細胞を試験する際に使用するための、適切な容器に入った調節物質剤/調節物質化合物と、使用説明書とが用意される。また、本発明が考えるキットは、本発明の予測因子またはマーカーポリヌクレオチドの発現を、当技術分野で実践されている他の技法およびシステムを使って、例えば本明細書でさらに詳しく説明するように、本明細書に記載する予測因子ポリヌクレオチドの1つ以上に基づいて設計されるプライマーを使用するRP-PCRアッセイ、イムノアッセイ、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、イムノブロット法、例えばウェスタンブロット、またはインサイチューハイブリダイゼーションなどを使って、mRNAレベルまたはタンパク質レベルでモニタリングするための試薬類または材料を含むこともできる。本発明のキットは、表2に記載する1つ以上の予測因子ポリヌクレオチド、例えば予測因子ポリヌクレオチドのサブセット（これには、それぞれ表3、4、および5に記載の174、14、10および5ポリヌクレオチド予測因子サブセットが含まれるが、これらに限るわけではない）など、および/またはuPA、CK5、EPHA2、ARおよび/またはPSAのポリヌクレオチド発現パターンの測定も、個別に、またはその任意の組合せで含むことができる。
【００２３】
本発明のもう一つの態様は、本明細書において同定する予測因子ポリヌクレオチドのなかから、疾患を処置するための薬物療法の開発にターゲットとして役立ちうる1つ以上のポリヌクレオチドを提供することである。そのようなターゲットは、特に、前立腺疾患、例えば前立腺がんまたは前立腺腫瘍の処置に応用可能であることができる。これらの予測因子ポリヌクレオチドは感受性細胞と抵抗性細胞とでは差次的に発現されるので、それらの発現パターンは、タンパク質チロシンキナーゼ、例えばSrcタンパク質チロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびにBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体タンパク質チロシンキナーゼなどと相互作用しかつ/またはそれを阻害する化合物による処置に対する細胞の相対的固有感受性と相関する。したがって、抵抗性細胞において多量に発現されるポリヌクレオチドは、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物に対して抵抗性である腫瘍に対する新しい薬物療法の開発に、ターゲットとして役立ちうる。
【００２４】
本発明のさらにもう一つの目的は、予測因子ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはそのペプチドの1つ以上に対する、抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）を提供することである。そのような抗体は、例えば本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドを精製し、検出し、ターゲティングするために、インビトロおよびインビボの診断、検出、スクリーニングおよび/または治療法などを含むさまざまな形で使用することができる。本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドには、Srcタンパク質チロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびにBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体タンパク質チロシンキナーゼが含まれる。
【００２５】
本発明のさらにもう一つの目的は、予測因子ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはそのペプチドの1つ以上に対する、アンチセンス試薬（siRNA、RNAi、およびリボザイム試薬を含む）を提供することである。そのようなアンチセンス試薬は、例えば本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドを検出し、ターゲティングし、その発現を阻害するために、インビトロおよびインビボの診断、検出、スクリーニングおよび/または治療方法などを含むさまざまな形で使用することができる。本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドには、Srcタンパク質チロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびにBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体タンパク質チロシンキナーゼが含まれる。
【００２６】
本発明は、本発明のヒトタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズする少なくとも8〜30ヌクレオチド長のアンチセンス化合物であって、そのヒトタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの発現を阻害するものにも関係する。 
【００２７】
本発明はさらに、ヒト細胞またはヒト組織における本発明のヒトタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの発現を阻害する方法であって、インビトロまたはインビボの前記細胞または組織を、本発明のアンチセンス化合物と、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの発現が阻害されるように接触させることを含む方法に関する。
【００２８】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの生物学的活性を調節する化合物を同定する方法であって、（a）候補調節物質化合物を、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドと、そのタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの活性を拮抗するアンチセンス分子の存在下で混合するステップ、および（b）ペプチドの拮抗作用を逆転させる候補化合物を同定するステップを含む方法にも向けられる。
【００２９】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの生物学的活性を調節する化合物を同定する方法であって、（a）候補調節物質化合物を、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドと、そのタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの活性を拮抗する小分子の存在下で混合するステップ、および（b）ペプチドの拮抗作用を逆転させる候補化合物を同定するステップを含む方法にも向けられる。
【００３０】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの生物学的活性を調節する化合物を同定する方法であって、（a）候補調節物質化合物を、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドと、そのタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの活性を刺激する小分子の存在下で混合するステップ、および（b）ペプチドの刺激作用を逆転させる候補化合物を同定するステップを含む方法にも向けられる。
【００３１】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ活性またはタンパク質チロシンキナーゼ経路のメンバーを調節する化合物による処置に対する細胞の応答を予測する発現パターンを持つ複数のポリヌクレオチドを含む予測因子セットであって、ポリヌクレオチドが、表2に記載のポリヌクレオチド；表2に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；および表2に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチドからなる群より選択されるものにも向けられる。
【００３２】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ活性またはタンパク質チロシンキナーゼ経路のメンバーを調節する化合物による処置に対する細胞の応答を予測する発現パターンを持つ複数のポリヌクレチドを含む予測因子セットであって、ポリヌクレオチドが、表2に記載のポリヌクレオチド；表2に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；表2に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチド；uPA、CK5、EPHA2、ARおよび/またはPSAの1つ以上からなる群より、個別に、またはその任意の組合せで選択され、複数のポリヌクレオチドが、少なくとも約1ポリヌクレオチド；少なくとも約2ポリヌクレオチド；少なくとも約3ポリヌクレオチド；少なくとも約4ポリヌクレオチド；少なくとも約5ポリヌクレオチド；少なくとも約6ポリヌクレオチド；少なくとも約7ポリヌクレオチド；少なくとも約10ポリヌクレオチド；少なくとも約15ポリヌクレオチド；少なくとも約20ポリヌクレオチド；少なくとも約25ポリヌクレオチド；および少なくとも約30ポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド数を含むものにも向けられる。
【００３３】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ活性またはタンパク質チロシンキナーゼ経路のメンバーを調節する化合物による処置に対する細胞の応答を予測する発現パターンを持つ複数のポリヌクレオチドを含む予測因子セットであって、ポリヌクレオチドが、表2に記載のポリヌクレオチド；表2に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；表2に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチド、uPA、CK5、EPHA2、ARおよび/またはPSAの1つ以上からなる群より、個別に、またはその任意の組合せで選択され、複数のポリヌクレオチドが、少なくとも約1ポリヌクレオチド；少なくとも約2ポリヌクレオチド；少なくとも約3ポリヌクレオチド；少なくとも約4ポリヌクレオチド；少なくとも約5ポリヌクレオチド；少なくとも約6ポリヌクレオチド；少なくとも約7ポリヌクレオチド；少なくとも約10ポリヌクレオチド；少なくとも約15ポリヌクレオチド；少なくとも約20ポリヌクレオチド；少なくとも約25ポリヌクレオチド；および少なくとも約30ポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド数を含み、複数のポリヌクレオチドが、表3に記載のポリヌクレオチド；表3に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；表3に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチド；表4に記載のポリヌクレオチド；表4に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；表4に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチド；表5に記載のポリヌクレオチド；表5に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；および表5に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチドからなる群のメンバーを含むものにも向けられる。
【００３４】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ活性またはタンパク質チロシンキナーゼ経路のメンバーを調節する化合物による処置に対する細胞の応答を予測する発現パターンを持つ複数のポリヌクレオチドを含む予測因子セットであって、ポリヌクレオチドが、表2に記載のポリヌクレオチド；表2に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；および表2に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチドからなる群より選択され、複数のポリヌクレオチドが、少なくとも約1ポリヌクレオチド；少なくとも約2ポリヌクレオチド；少なくとも約3ポリヌクレオチド；少なくとも約4ポリヌクレオチド；少なくとも約5ポリヌクレオチド；少なくとも約6ポリヌクレオチド；少なくとも約7ポリヌクレオチド；少なくとも約10ポリヌクレオチド；少なくとも約15ポリヌクレオチド；少なくとも約20ポリヌクレオチド；少なくとも約25ポリヌクレオチド；および少なくとも約30ポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド数を含み、複数のポリヌクレオチドが、表3に記載のポリヌクレオチド；表3に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；表3に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチド；表4に記載のポリヌクレオチド；表4に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；表4に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチド；表5に記載のポリヌクレオチド；表5に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；表5に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチド、ならびにuPA、CK5、EPHA2、ARおよび/またはPSAの任意の1つ以上からなる群より、個別に、またはその任意の組合せで選択され、化合物が、前記ポリヌクレオチドまたはタンパク質チロシンキナーゼ経路の1つ以上のメンバーに対するアンチセンス試薬；前記ポリヌクレオチドまたはタンパク質チロシンキナーゼ経路の1つ以上のメンバーに対するRNAi試薬；前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはタンパク質チロシンキナーゼ経路の1つ以上のメンバーに対する抗体；および小分子化合物からなる群より選択されるものにも向けられる。
【００３５】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ活性またはタンパク質チロシンキナーゼ経路のメンバーを調節する化合物による処置に対する細胞の応答を予測する発現パターンを持つ複数のポリヌクレオチドを含む予測因子セットであって、ポリヌクレオチドが、表2に記載のポリヌクレオチド；表2に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；表2に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチド、ならびにuPA、CK5、EPHA2、ARおよび/またはPSAの任意の1つ以上からなる群より、個別に、またはその任意の組合せで選択され、複数のポリヌクレオチドが、少なくとも約1ポリヌクレオチド；少なくとも約2ポリヌクレオチド；少なくとも約3ポリヌクレオチド；少なくとも約4ポリヌクレオチド；少なくとも約5ポリヌクレオチド；少なくとも約6ポリヌクレオチド；少なくとも約7ポリヌクレオチド；少なくとも約10ポリヌクレオチド；少なくとも約15ポリヌクレオチド；少なくとも約20ポリヌクレオチド；少なくとも約25ポリヌクレオチド；および少なくとも約30ポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド数を含み、複数のポリヌクレオチドが、表3に記載のポリヌクレオチド；表3に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；表3に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチド；表4に記載のポリヌクレオチド；表4に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；表4に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチド；表5に記載のポリヌクレオチド；表5に記載の感受性予測因子ポリヌクレオチド；および表5に記載の抵抗性予測因子ポリヌクレオチドからなる群のメンバーを含み、化合物が、前記ポリヌクレオチドまたはタンパク質チロシンキナーゼ経路の1つ以上のメンバーに対するアンチセンス試薬；前記ポリヌクレオチドまたはタンパク質チロシンキナーゼ経路の1つ以上のメンバーに対するRNAi試薬；前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはタンパク質チロシンキナーゼ経路の1つ以上のメンバーに対する抗体；および小分子化合物からなる群より選択され、化合物がBMS-Aであるものにも向けられる。
【００３６】
前記細胞が、がん細胞、前立腺細胞、前立腺がん細胞、乳房細胞、乳がん細胞、肺細胞、肺がん細胞からなる群のメンバーである、本発明の予測因子セット。
【００３７】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ活性またはタンパク質チロシンキナーゼ経路のメンバーを調節する化合物による処置に対する細胞の応答を予測する発現パターンを持つ複数のポリペプチドを含む予測因子セットにも向けられる。
【００３８】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ活性またはタンパク質チロシンキナーゼ経路のメンバーを調節する化合物による処置に対する細胞の応答を予測する発現パターンを持つ複数のポリペプチドを含む予測因子セットであって、ポリペプチドが、表2に記載のポリペプチド；表2に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表2に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；表3に記載のポリペプチド；表3に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表3に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；表4に記載のポリペプチド；表4に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表4に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；表5に記載のポリペプチド；表5に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表5に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；ならびにuPA、CK5、EPHA2、AR、および/またはPSAポリペプチドの任意の1つ以上からなる群より、個別に、またはその任意の組合せで選択されるものにも向けられる。
【００３９】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ活性またはタンパク質チロシンキナーゼ経路のメンバーを調節する化合物による処置に対する細胞の応答を予測する発現パターンを持つ複数のポリペプチドを含む予測因子セットであって、ポリペプチドが、表2に記載のポリペプチド；表2に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表2に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；ならびにuPA、CK5、EPHA2、AR、および/またはPSAポリペプチドの任意の1つ以上からなる群より、個別に、またはその任意の組合せで選択され、複数のポリペプチドが、少なくとも約1ポリペプチド；少なくとも約2ポリペプチド；少なくとも約3ポリペプチド；少なくとも約4ポリペプチド；少なくとも約5ポリペプチド；少なくとも約6ポリペプチド；少なくとも約7ポリペプチド；少なくとも約10ポリペプチド；少なくとも約15ポリペプチド；少なくとも約20ポリペプチド；少なくとも約25ポリペプチド；および少なくとも約30ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド数を含むものにも向けられる。
【００４０】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ活性またはタンパク質チロシンキナーゼ経路のメンバーを調節する化合物による処置に対する細胞の応答を予測する発現パターンを持つ複数のポリペプチドを含む予測因子セットであって、ポリペプチドが、表2に記載のポリペプチド；表2に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表2に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；ならびにuPA、CK5、EPHA2、AR、および/またはPSAポリペプチドの任意の1つ以上からなる群より、個別に、またはその任意の組合せで選択され、複数のポリペプチドが、少なくとも約1ポリペプチド；少なくとも約2ポリペプチド；少なくとも約3ポリペプチド；少なくとも約4ポリペプチド；少なくとも約5ポリペプチド；少なくとも約6ポリペプチド；少なくとも約7ポリペプチド；少なくとも約10ポリペプチド；少なくとも約15ポリペプチド；少なくとも約20ポリペプチド；少なくとも約25ポリペプチド；および少なくとも約30ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド数を含み、複数のポリペプチドが、表3に記載のポリペプチド；表3に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表3に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；表4に記載のポリペプチド；表4に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表4に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；表5に記載のポリペプチド；表5に記載の感受性予測因子ポリペプチド；および表5に記載の抵抗性予測因子ポリペプチドからなる群のメンバーを含むものにも向けられる。
【００４１】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ活性またはタンパク質チロシンキナーゼ経路のメンバーを調節する化合物による処置に対する細胞の応答を予測する発現パターンを持つ複数のポリペプチドを含む予測因子セットであって、ポリペプチドが、表2に記載のポリペプチド；表2に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表2に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；ならびにuPA、CK5、EPHA2、AR、および/またはPSAポリペプチドの任意の1つ以上からなる群より、個別に、またはその任意の組合せで選択され、複数のポリペプチドが、少なくとも約1ポリペプチド；少なくとも約2ポリペプチド；少なくとも約3ポリペプチド；少なくとも約4ポリペプチド；少なくとも約5ポリペプチド；少なくとも約6ポリペプチド；少なくとも約7ポリペプチド；少なくとも約10ポリペプチド；少なくとも約15ポリペプチド；少なくとも約20ポリペプチド；少なくとも約25ポリペプチド；および少なくとも約30ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド数を含み、複数のポリペプチドが、表3に記載のポリペプチド；表3に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表3に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；表4に記載のポリペプチド；表4に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表4に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；表5に記載のポリペプチド；表5に記載の感受性予測因子ポリペプチド；および表5に記載の抵抗性予測因子ポリペプチドからなる群のメンバーを含み、化合物が、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはタンパク質チロシンキナーゼ経路の1つ以上のメンバーに対するアンチセンス試薬；前記ポリペプチドまたはタンパク質チロシンキナーゼ経路の1つ以上のメンバーに対する抗体；および小分子化合物からなる群より選択されるものにも向けられる。
【００４２】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ活性またはタンパク質チロシンキナーゼ経路のメンバーを調節する化合物による処置に対する細胞の応答を予測する発現パターンを持つ複数のポリペプチドを含む予測因子セットであって、ポリペプチドが、表2に記載のポリペプチド；表2に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表2に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；ならびにuPA、CK5、EPHA2、ARおよび/またはPSAの任意の1つ以上からなる群より、個別に、またはその任意の組合せで選択され、複数のポリペプチドが、少なくとも約1ポリペプチド；少なくとも約2ポリペプチド；少なくとも約3ポリペプチド；少なくとも約4ポリペプチド；少なくとも約5ポリペプチド；少なくとも約6ポリペプチド；少なくとも約7ポリペプチド；少なくとも約10ポリペプチド；少なくとも約15ポリペプチド；少なくとも約20ポリペプチド；少なくとも約25ポリペプチド；および少なくとも約30ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド数を含み、複数のポリペプチドが、表3に記載のポリペプチド；表3に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表3に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；表4に記載のポリペプチド；表4に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表4に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；表5に記載のポリペプチド；表5に記載の感受性予測因子ポリペプチド；および表5に記載の抵抗性予測因子ポリペプチドからなる群のメンバーを含み、化合物が、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはタンパク質チロシンキナーゼ経路の1つ以上のメンバーに対するアンチセンス試薬；前記ポリペプチドまたはタンパク質チロシンキナーゼ経路の1つ以上のメンバーに対する抗体；および小分子化合物からなる群より選択され、化合物がBMS-Aであるものにも向けられる。
【００４３】
本発明は、ある化合物が細胞の活性を調節できるかどうかを予測するための方法であって、細胞の試料を取得するステップ；前記細胞が複数のマーカーを発現させるかどうかを決定するステップ；および前記マーカーの発現を、化合物の、前記細胞の活性を調節する能力と、相関させるステップを含む方法にも向けられる。
【００４４】
本発明は、ある化合物が細胞の活性を調節できるかどうかを予測するための方法であって、細胞の試料を取得するステップ；前記細胞が複数のマーカーを発現させるかどうかを決定するステップ；および前記マーカーの発現を、化合物の、前記細胞の活性を調節する能力と、相関させるステップを含み、複数のマーカーがポリヌクレオチドである方法にも向けられる。
【００４５】
本発明は、ある化合物が細胞の活性を調節できるかどうかを予測するための方法であって、細胞の試料を取得するステップ；前記細胞が複数のマーカーを発現させるかどうかを決定するステップ；および前記マーカーの発現を、化合物の、前記細胞の活性を調節する能力と、相関させるステップを含み、複数のマーカーがポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド、化合物、および細胞が、本明細書に開示するポリヌクレオチド、化合物、および細胞である方法にも向けられる。
【００４６】
本発明は、ある化合物が細胞の活性を調節できるかどうかを予測するための方法であって、細胞の試料を取得するステップ；前記細胞が複数のマーカーを発現させるかどうかを決定するステップ；および前記マーカーの発現を、化合物の、前記細胞の活性を調節する能力と、相関させるステップを含み、複数のマーカーがポリペプチドである方法にも向けられる。
【００４７】
本発明は、その発現レベルがある疾患状態に関連する細胞の化合物感受性または化合物抵抗性と相関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを同定するための複数の細胞株であって、前立腺がん細胞株、乳がん細胞株、または肺がん細胞株である細胞株にも向けられる。
【００４８】
本発明は、ある疾患状態に関連する細胞の化合物感受性または化合物抵抗性を予測するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを同定する方法であって、複数の細胞株を1つ以上の化合物に供するステップ；ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのマイクロアレイの発現パターンを解析するステップ；および前記マイクロアレイの前記発現パターンを使って、ある疾患状態に関連する細胞の感受性または抵抗性を予測するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを選択するステップを含み、前記化合物が本明細書に開示される化合物であり、前記疾患が前立腺がん、乳がん、および/または肺がんである方法にも向けられる。
【００４９】
本発明は、ある疾患状態についての処置を必要としている個体が、前記処置にうまく応答するだろうか応答しないだろうかを予測するための方法であって、前記個体から細胞の試料を取得するステップ；前記細胞が複数のマーカーを発現させるかどうかを決定するステップ；および前記マーカーの発現を、個体の、前記処置に応答する能力と、相関させるステップを含む方法にも向けられる。
【００５０】
本発明は、ある疾患状態についての処置を必要としている個体が、前記処置にうまく応答するだろうか応答しないだろうかを予測するための方法であって、前記個体から細胞の試料を取得するステップ；前記細胞が複数のマーカーを発現させるかどうかを決定するステップ；および前記マーカーの発現を、個体の、前記処置に応答する能力と、相関させるステップを含み、複数のマーカーがポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチドおよび化合物が本明細書に開示されるものである方法にも向けられる。
【００５１】
本発明は、ある疾患状態についての処置を必要としている個体が、前記処置にうまく応答するだろうか応答しないだろうかを予測するための方法であって、前記個体から細胞の試料を取得するステップ；前記細胞が複数のマーカーを発現させるかどうかを決定するステップ；および前記マーカーの発現を、個体の、前記処置に応答する能力と、相関させるステップを含み、複数のマーカーがポリペプチドであり、ポリペプチドおよび化合物が本明細書に開示されるものである方法にも向けられる。
【００５２】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドに結合しかつ/またはその活性を調節することができる候補化合物をスクリーニングする方法であって、試験化合物を本明細書に記載のポリペプチドと接触させること、およびポリペプチドに結合しかつ/またはその活性を調節する試験化合物を候補化合物として選択することを含む方法にも向けられる。
【００５３】
本発明は、対象の前立腺がんを処置する方法であって、1つ以上のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの調節物質を投与することを含み、前記ポリペプチドが、表2に記載のポリペプチド；表2に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表2に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；表3に記載のポリペプチド；表3に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表3に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；表4に記載のポリペプチド；表4に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表4に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；表5に記載のポリペプチド；表5に記載の感受性予測因子ポリペプチド；表5に記載の抵抗性予測因子ポリペプチド；およびuPA、CK5、EPHA2、ARおよび/またはPSAの任意の1つ以上からなる群より、個別に、またはその任意の組合せで選択される方法にも向けられる。
【００５４】
本発明は、患者試料におけるカリクレイン3およびアンドロゲン受容体の発現レベルを測定することによって、患者がN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドなどのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性でありうるかどうかを予測する方法であって、標準試料に観察されるレベルと比較して上昇したカリクレイン3および/またはアンドロゲン受容体の発現レベル（例えば標準の約2倍以上）が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する少なくとも部分的な抵抗性を示し、標準試料に観察されるレベルと比較して減少した発現量（例えば標準の約2分の1以下）が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す方法にも向けられる。発現プロファイリング測定はmRNAレベルでもタンパク質レベルでもよい。
【００５５】
本発明は、患者試料におけるサイトケラチン5の発現レベルを測定することによって、患者がN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドなどのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性でありうるかどうかを予測する方法であって、標準試料に観察されるレベルと比較して減少したサイトケラチン5の発現レベル（例えば標準の約2分の1以下）が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する少なくとも部分的な抵抗性を示し、標準試料に観察されるレベルと比較して上昇したサイトケラチン5の発現量が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す方法にも向けられる。発現プロファイリング測定はmRNAレベルでもタンパク質レベルでもよい。
【００５６】
本発明は、患者試料が前立腺細胞系統に関して基底細胞タイプ表現型の徴候を示すかどうかを決定することによって、患者がN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドなどのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性でありうるかどうかを予測する方法であって、そのような徴候の存在が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す方法にも向けられる。そのような徴候は、そのような表現型の発現プロファイルシグネチャー、細胞の形態、組織化学的シグネチャー、または前立腺細胞系統に関して基底細胞タイプ表現型と関連することが当技術分野で知られている他の徴候を構成しうる。
【００５７】
本発明は、患者試料におけるカリクレイン3、アンドロゲン受容体、およびサイトケラチン5の発現レベルを測定することによって、患者がN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドなどのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性でありうるかどうかを予測する方法であって、標準試料に観察されるレベルと比較して減少したサイトケラチン5の発現レベル（例えば標準の約2分の1以下）を伴う、標準試料に観察されるレベルと比較して上昇したカリクレイン3および/またはアンドロゲン受容体の発現レベル（例えば標準の約2倍以上）が、前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する少なくとも部分的な抵抗性を示し、標準試料に観察されるレベルと比較して上昇したサイトケラチン5の発現レベル（例えば標準の約2倍以上）を伴う、標準試料に観察されるレベルと比較して減少したカリクレイン3および/またはアンドロゲン受容体の発現量（例えば標準の約2分の1以下）が、前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す方法にも向けられる。発現プロファイリング測定はmRNAレベルでもタンパク質レベルでもよい。
【００５８】
本発明は、患者試料におけるSCEL、ANXA3、CST6、LAMC2、ZBED2、EREG、AXL、FHL2、PLAU、および/またはARNTL2の発現レベルを測定することによって、患者がN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドなどのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性でありうるかどうかを予測する方法であって、標準試料に観察されるレベルと比較して減少したSCEL、ANXA3、CST6、LAMC2、ZBED2、EREG、AXL、FHL2、PLAU、および/またはARNTL2の発現レベル（例えば標準の約2分の1以下）が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する少なくとも部分的な抵抗性を示し、標準試料に観察されるレベルと比較して上昇したSCEL、ANXA3、CST6、LAMC2、ZBED2、EREG、AXL、FHL2、PLAU、および/またはARNTL2の発現量（例えば標準の約2倍以上）が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す方法にも向けられる。発現プロファイリング測定はmRNAレベルでもタンパク質レベルでもよい。
【００５９】
本発明は、患者試料におけるEPHA2の発現レベルを測定することによって、患者がN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドなどのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性でありうるかどうかを予測する方法であって、標準試料に観察されるレベルと比較して減少したEPHA2の発現レベル（例えば標準の約2分の1以下）が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する少なくとも部分的な抵抗性を示し、標準試料に観察されるレベルと比較して上昇したEPHA2の発現量（例えば標準の約2倍以上）が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す方法にも向けられる。発現プロファイリング測定はmRNAレベルでもタンパク質レベルでもよい。
【００６０】
本発明は、患者試料におけるUPAの発現レベルを測定することによって、患者がN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドなどのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性でありうるかどうかを予測する方法であって、標準試料に観察されるレベルと比較して減少したUPAの発現レベル（例えば標準の約2分の1以下）が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する少なくとも部分的な抵抗性を示し、標準試料に観察されるレベルと比較して上昇したUPAの発現量（例えば標準の約2倍以上）が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を示す方法にも向けられる。発現プロファイリング測定はmRNAレベルでもタンパク質レベルでもよい。
【００６１】
本発明は、がんを患っている患者のタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する応答性を予測するために代用マーカーを使用する方法であって、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドなどのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤の投与前と投与後の両方で予測的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドマーカーの発現レベルを比較するステップを含み、前記投与が無かった場合と比較して前記投与後の前記予測的マーカーの発現量の減少は、前記患者が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して応答性であることを示し、前記予測的マーカーが表2、3、4または5に記載の1つ以上の感受性マーカー（例えば、限定するわけではないが、SCEL、ANXA3、CST6、LAMC2、ZBED2、EREG、AXL、FHL2、PLAU、および/またはARNTL2）によって表される方法にも向けられる。
【００６２】
本発明は、がんを患っている患者のタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する応答性を予測するために代用マーカーを使用する方法であって、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドなどのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤の投与前と投与後の両方で予測的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドマーカーの発現レベルを比較するステップを含み、前記投与が無かった場合と比較して前記投与後の前記予測的マーカーの発現量の減少は、前記患者が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して応答性であることを示し、前記予測的マーカーが表2、3、4または5に記載の1つ以上の感受性マーカー（例えば、限定するわけではないが、SCEL、ANXA3、CST6、LAMC2、ZBED2、EREG、AXL、FHL2、PLAU、および/またはARNTL2）によって表される方法にも向けられる。
【００６３】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤の有効量を決定する方法であって、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドなどのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤の投与前と投与後の両方で予測的感受性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドマーカーの発現レベルを比較するステップを含み、標準発現レベルより低い指定レベルへの前記予測的マーカーの発現量の減少は、前記患者が前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤の有効量に達していることを示し、前記予測的感受性マーカーが表2、3、4または5に記載の1つ以上の感受性マーカー（例えば、限定するわけではないが、SCEL、ANXA3、CST6、LAMC2、ZBED2、EREG、AXL、FHL2、PLAU、および/またはARNTL2）によって表される方法にも向けられる。
【００６４】
本発明のさらなる態様、特徴および利点は、本発明の詳細な説明を読み、添付の図面と共に考慮すれば、より良く理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ダサチニブに対する感受性と相関するバイオマーカーの同定。（A）潜在的な予測的代用バイオマーカーを同定するための発見戦略。（B）16個の前立腺がん細胞株の、ダサチニブに対するIC50決定および感受性分類。（C）16個の細胞株のダサチニブ感受性/抵抗性分類と高く相関した174遺伝子の相対的発現パターンを示すクラスター分析。ダサチニブ感受性細胞株を赤色で強調し、3つの重要な前立腺細胞マーカーCK5、PSAおよびARの位置をヒートマップ上に示した。これらの遺伝子は感受性群と抵抗性群の間で3倍を超える差次的発現を持つ。（D）16個の細胞株におけるCK5、PSAおよびARの相対的ベースライン遺伝子発現。抵抗性細胞を黒色で、感受性細胞を赤色で示す。X軸上の値はlog2スケールでの発現レベルである。
【図２】EphA2遺伝子発現量とダサチニブに対する感受性との相関関係。（A）EphA2の発現レベル（●）と16個の細胞株に関するIC50（◆）値との間の負の相関関係。ピアソン相関係数は-0.66であり、高い逆相関を示す。（B）5つの感受性細胞株および3つの抵抗性細胞株におけるEphA2タンパク質の発現。全体として、これらの細胞株におけるタンパク質発現レベルは、マイクロアレイで検出されたmRNAレベルとよく相関した。
【図３】mRNAレベルおよびタンパク質レベルで解析したPLAU遺伝子の発現およびダサチニブよる制御。（A）抵抗性細胞株（R、黒色）と感受性細胞株（S、赤色）の間に見られるPLAU遺伝子の差次的ベースライン発現。X値はlog2スケールでの発現レベルである。高レベルのPLAUを発現させる抵抗性細胞株はWPMY1であり、低レベルのPLAUを発現させる感受性細胞株はLNCaPだった。（B）5つの感受性細胞株におけるダサチニブ処置によるPLAU mRNAレベルのダウンレギュレーション。細胞を100nMダサチニブ（+D）またはDMSO（Ctrl）で48時間処理した。対応のあるt検定でp値は0.048だったことから、ダサチニブ処置後のPLAU mRNAの有意な減少が示された。（C）ダサチニブ誘発性PLAU mRNAダウンレギュレーションとダサチニブに対する細胞株の感受性との間の相関関係。これらの5つの感受性細胞に加えて、3つのダサチニブ抵抗性細胞株22Rv、MDAPCa2b、およびVCaPも、図3Bと同じようにダサチニブで処理した。ダサチニブによるPLAUダウンレギュレーションの程度は（Y軸）は、これらの8つの細胞株のlog2IC50値（X軸）と負に相関した。（D）PC3細胞におけるPLAU mRNA発現の用量依存的ダウンレギュレーション。細胞をさまざまな濃度のダサチニブで、またはダサチニブ無しで、4時間または24時間、処置した。対照と比較したPLAU発現レベルをY軸に示した。（E）ダサチニブによって用量依存的に阻害され、タキソール（登録商標）では阻害されない、PC3細胞における分泌uPAタンパク質。細胞をさまざまな用量のダサチニブ、タキソール（登録商標）またはDMSOで24時間処理した。50,000個の生細胞によって培養培地中に分泌されたuPAタンパク質をELISAアッセイによって評価した。
【図４】前立腺細胞株および前立腺腫瘍における5遺伝子モデルの発現パターン。（A）前立腺細胞株における5つの遺伝子AR、PSA、CK5、PLAU、およびEphA2の階層的クラスタリング。ARとPSAの2つは管腔細胞マーカーであり、CK5（KRT5）は基底細胞マーカーである。抵抗性細胞株は、これらの5つの遺伝子によって大半の感受性細胞株（赤色で明示）から分離された。感受性細胞株における高いCK5および/またはPLAU発現、EphA2発現と、抵抗性細胞におけるほぼ反対の発現パターンに注目されたい。（B）52個の前立腺腫瘍におけるこれら5つの遺伝子の発現パターン。この公表データセットの遺伝子発現は、Affymetrix（登録商標）HG-U95遺伝子チップでプロファイリングした。このチップでは、2つのARプローブセット、3つのPSAプローブセット、1つのCK5、PLAUおよびEphA2プローブセットを利用することができ、それらをクラスター分析のために検索した。ダサチニブ感受性パターンを示す腫瘍試料（すなわち、低いARおよびPSA発現量および高いKRT5および/またはPLAU、EphA2発現量を持つもの）を、赤色で強調した。
【図５】BMS-Aに対する腫瘍感受性を予測するための代用物としてのuPA発現レベルの使用。ダサチニブの非存在下または存在下でPC3異種移植片腫瘍を持つマウスの血漿におけるuPAタンパク質レベルを測定した。異種移植片腫瘍をnu/nu無胸腺マウスの皮下に定着させた。それらのマウスを、腫瘍が約200mgに達した後に、それぞれ8匹ずつの3群に分割した。2つの群はそれぞれ15または30mg/kgのダサチニブで処置し、対照である第3の群にはダサチニブを投与しなかった。ダサチニブは、5日間投薬2日間休薬のスケジュールで20回にわたって、1日2回経口投与した。腫瘍サイズ測定および血液試料採取は、処置前と処置開始後2週間にわたって毎週行った。図示するように、BMS-A依存的なuPA発現レベル調節と腫瘍異種移植片成長とが一致した。実験は実施例2で説明するように行った。
【００６６】
表の説明
表1は、IC50結果に基づく、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物BMS-Aに関する、16個の前立腺細胞株の抵抗性/感受性表現型分類を表す。各細胞株のIC50は、実施例1（方法）で説明するMTSアッセイによって評価した。表示するように、各細胞株について2〜5回の個別の決定から、平均IC50値を標準偏差（SD）と共に算出した。IC50の単位はμMである。各細胞株に関する平均IC50をlog10(IC50)に対数変換し、BMS-Aに関して16個の乳房細胞株にわたる平均log10(IC50）を算出し、それを使って各細胞株についてのIC50データを標準化した。0.2μm未満のIC50を持つ細胞株をこの化合物に対して感受性と定義し、0.2μmより高いIC50を持つものを抵抗性とみなした。太字で表した細胞株は、本明細書に記載する薬物誘導研究に使用した。
【表１】
2010517510.tif 000002
【００６７】
表2に、発現パターンとBMS-Aに対する抵抗性/感受性分類との間の高い相関関係を証明する3つの解析アルゴリズムから導き出されたポリヌクレオチドリストを示す。各遺伝子について、表2に配列番号で表すDNA配列およびコードされるアミノ酸配列を、配列表に記載する。遺伝子を変化倍率順に列挙する。
【００６８】
【表２−１】
2010517510.tif 000003
【表２−２】
2010517510.tif 000004
【表２−３】
2010517510.tif 000005
【表２−４】
2010517510.tif 000006
【表２−５】
2010517510.tif 000007
【表２−６】
2010517510.tif 000008
【表２−７】
2010517510.tif 000009
【表２−８】
2010517510.tif 000010
【表２−９】
2010517510.tif 000011
【表２−１０】
2010517510.tif 000012
【表２−１１】
2010517510.tif 000013
【表２−１２】
2010517510.tif 000014
【表２−１３】
2010517510.tif 000015
【表２−１４】
2010517510.tif 000016
【表２−１５】
2010517510.tif 000017
【表２−１６】
2010517510.tif 000018
【表２−１７】
2010517510.tif 000019
【表２−１８】
2010517510.tif 000020
【表２−１９】
2010517510.tif 000021
【表２−２０】
2010517510.tif 000022
【００６９】
【表３】
2010517510.tif 000023
***遺伝子番号175（EPHA2）、遺伝子番号176（POPDC3）および遺伝子番号177（GPD1L）に関するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の配列番号は、それぞれ配列番号9および10、配列番号353および354、ならびに配列番号355および356である。
【００７０】
表4に、10ポリヌクレオチドの予測因子セットを列挙する。これら10個のポリヌクレオチドは、3つの解析方法および薬物処置研究から導き出されたデータに基づいて、表2に示す174個のポリヌクレオチドから選択された。
【００７１】
【表４】
2010517510.tif 000024
【００７２】
表5に、5ポリヌクレオチドの予測因子セットを列挙する。
【表５】
2010517510.tif 000025
【００７３】
表6に、本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリヌクレオチドのそれぞれについて、代表的なRT-PCRプライマーセットを列挙する。各RT-PCRプライマーについて配列番号を記載する（配列番号357〜887）。
【００７４】
【表６−１】
2010517510.tif 000026
【表６−２】
2010517510.tif 000027
【表６−３】
2010517510.tif 000028
【表６−４】
2010517510.tif 000029
【表６−５】
2010517510.tif 000030
【表６−６】
2010517510.tif 000031
【表６−７】
2010517510.tif 000032
【表６−８】
2010517510.tif 000033
【表６−９】
2010517510.tif 000034
【表６−１０】
2010517510.tif 000035
【表６−１１】
2010517510.tif 000036
【表６−１２】
2010517510.tif 000037
【表６−１３】
2010517510.tif 000038
【表６−１４】
2010517510.tif 000039
【表６−１５】
2010517510.tif 000040
【表６−１６】
2010517510.tif 000041
【表６−１７】
2010517510.tif 000042
【表６−１８】
2010517510.tif 000043
【表６−１９】
2010517510.tif 000044
【表６−２０】
2010517510.tif 000045
【表６−２１】
2010517510.tif 000046
【００７５】
発明の詳細な説明
本発明は、薬物、化合物、または生物剤に対する細胞の感受性を決定または予測するための、無処置細胞株の薬物感受性または薬物抵抗性と相関するポリヌクレオチドの同定を記載する。本明細書においてマーカーまたは予測因子ポリヌクレオチドと呼ばれるこれらのポリヌクレオチドは、薬物応答を予測するために使用することができる。これらのマーカーポリヌクレオチドは、化合物または薬物（特にタンパク質チロシンキナーゼまたはタンパク質チロシンキナーゼ活性を調節（例えば阻害）する化合物）に対するその感受性が試験される無処置細胞において、何千もの別個のポリヌクレオチドの発現パターンを、マイクロアレイ技術を利用して同時にモニターするインビトロアッセイにおいて決定された。薬物、化合物、または生物剤に対する応答と関連するタンパク質チロシンキナーゼまたはその活性には、例えばSrcタンパク質チロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびにBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体タンパク質チロシンキナーゼなどが含まれる（例えばP. Blume-JensenおよびT. Hunter「Oncopolynucleotide Kinase Signaling」Nature, 411:355-365 (2001)を参照されたい）。
【００７６】
本発明のアッセイにより、細胞が示す薬物感受性と高く相関する細胞内発現レベルを持つ、本明細書においてタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーと呼ぶマーカーポリヌクレオチドを同定することが、可能になった。そのようなマーカーポリヌクレオチドは上に列挙したタンパク質チロシンキナーゼコードポリヌクレオチドを包含し、薬物、化合物、生物剤、化学療法剤など（好ましくはタンパク質チロシンキナーゼの機能または活性の直接的または間接的な阻害または拮抗作用によってタンパク質チロシンキナーゼ活性に影響を及ぼす薬物および化合物など）に対する応答を予測するための有用な分子ツールとして役立つ。
【００７７】
本発明は、その好ましい態様において、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物（例えば本明細書に記載のBMS-A）による処置に対する前立腺細胞株の感受性または抵抗性と相関するポリヌクレオチドを記載する（図1および表2）。本発明のポリヌクレオチド予測因子セットを同定するために利用したタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物BMS-Aは2000年10月26日に公開されたWO 00/62778に記載されており、これは参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。BMS-Aは、いくつかのタンパク質チロシンキナーゼ、例えば、Src、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLynを含むSrcタンパク質チロシンキナーゼファミリーのメンバー、ならびにBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体タンパク質チロシンキナーゼに対して、強力な阻害活性を持つ。具体的には、解析したBMS-Aタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物の場合、176個の予測因子ポリヌクレオチドの発現が、この化合物に対する前立腺細胞株の抵抗性/感受性と相関することが見出された。
【００７８】
本明細書で使用する「BMS-A」という用語は、以下の構造（I）：
【化１】
2010517510.tif 000047
(I)
を持つ化合物を指す。化合物（I）は、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと呼ぶか、IUPAC命名法に従ってN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-((6-(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル)-2-メチル-4-ピリミジニル)アミノ)-1,3-チアゾール-5-カルボキサミドと呼ぶこともできる。「N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド」という用語の使用は（別段の表示がない限り）化合物（I）の溶媒和物（水和物を含む）および多形型またはその塩（例えば参照によりあらゆる面でその全てが本明細書に組み込まれるUSSN 11/051,208（2005年2月4日出願）に記載されている（I）の一水和物型など）を包含する。N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの医薬組成物には、例えば参照によりあらゆる面でその全てが本明細書に組み込まれるUSSN 11/402,502（2006年4月12日出願）に記載されている組成物など、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと1つ以上の希釈剤、ビヒクルおよび/または賦形剤とを含む薬学的に許容できる組成物が全て包含される。N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを含む医薬組成物の一例は、SPRYCEL（登録商標）（Bristol-Myers Squibb Company）である。SPRYCEL（登録商標）は、ヒプロメロース、二酸化チタン、およびポリエチレングリコールを含む錠剤中に、活性成分としてダサチニブとも呼ばれるN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと、不活性成分または賦形剤としてラクトース一水和物、微結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、およびステアリン酸マグネシウムとを含んでいる。
【００７９】
本発明に従って発見されたアプローチでは、細胞株のサブセットにおけるその発現パターンが、一化合物または化合物の組合せもしくは一連の化合物（細胞増殖、外からの刺激（例えばリガンド結合）に対する細胞応答、またはシグナル伝達に直接的もしくは間接的に関与するタンパク質、酵素、または分子（例えば受容体）の機能、例えばタンパク質チロシンキナーゼの機能を、阻害または活性化することが知られているもの）による処置または治療に対する細胞応答に相関し、そのインビトロ予測因子として使用することができる、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの組合せが同定された。好ましいのは、所与のタンパク質（例えばチロシンキナーゼ）の機能のアンタゴニストまたは阻害剤である。
【００８０】
好ましい一態様では、BMS-Aタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤を使って、前立腺細胞株のパネルにおいて、この化合物への細胞の曝露後に、薬物感受性を決定した。それら細胞株のいくつかは、この阻害剤化合物による処置に対して抵抗性であると決定され、他の細胞株はこの阻害剤に対して感受性であると決定された（表1）。試験した細胞株のサブセットは、本阻害剤化合物ならびに類似する作用様式および/または構造を持つ化合物に対する細胞による応答に相関し、したがってその予測因子として役立つ、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの組合せの発現パターンまたは発現プロファイルを与えた（表2、3、4〜5）。
【００８１】
ある薬物または薬物の組合せに細胞を曝露した後のその細胞の感受性または抵抗性と相関するそのようなポリヌクレオチド発現パターンの予測因子セットは、その薬物または薬物の組合せによる処置を行う前に、がん、腫瘍、または患者試験試料をスクリーニングするための有用なツールになる。このスクリーニング技法は、そのがん、腫瘍、または試験試料が（したがってそのがんおよび/または腫瘍を保有する患者が）その薬物または薬物の組合せによる処置に応答するだろうか応答しないだろうかに関して、予測因子セットのポリヌクレオチド発現結果に基づく、薬物または薬物の組合せに曝露されるがん、腫瘍、または試験試料の細胞の予測を可能にする。さらにまた、これらの予測因子ポリヌクレオチドまたは予測因子ポリヌクレオチドセットは、本明細書で説明するように、ある疾患（例えば前立腺がん）に関してタンパク質チロシンキナーゼ（例えばsrcチロシンキナーゼ）阻害剤化合物または化学療法剤が関わる処置を受けている患者において、疾患処置または疾患治療の進行をモニタリングするために利用することもできる。
【００８２】
本発明の特定実施形態に従い、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物に対するその薬物感受性が決定された16個の無処置前立腺細胞株のパネルにおける22,000個を越えるプローブセットの発現レベルを、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを利用して測定した。この解析は、無処置細胞のポリヌクレオチド発現シグネチャーが、化学感受性を予測するのに十分であるかどうかを決定するために行われた。データ解析により、その発現レベルが薬物感受性と高く相関することが見出されたマーカーポリヌクレオチドを、同定することができた。さらにまた、BMS-Aタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物による細胞の処置も、この化合物に対する感受性を予測するポリヌクレオチド発現シグネチャーをもたらした。したがって本発明は、その実施形態の一つにおいて、細胞を薬物で処置した時または細胞を薬物に曝露した時の薬物応答を予測するのに役立つこれらのポリヌクレオチド、すなわちポリヌクレオチド「マーカー」または「バイオマーカー」または「予測因子」を提供する。特に、マーカーまたは予測因子ポリヌクレオチドは、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質/ポリペプチドをコードするタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリヌクレオチド、例えばsrcチロシンキナーゼ阻害剤バイオマーカーである。
【００８３】
本発明が包含するポリヌクレオチド発現およびマーカーポリヌクレオチドの同定解析の遂行を、限定するわけではないが、以下にさらに詳しく説明する。
【００８４】
本発明は、BCR-ABL関連障害を持つ個体を処置する一定の処置レジメンおよび方法に対する、BCR-ABL関連障害を持つ個体の応答性を決定する方法を提供する。
【００８５】
本明細書で使用する用語「BCR-ABL」は野生型BCR-ABLと突然変異型BCR-ABLの両方を包含する。
【００８６】
「BCR-ABL関連障害」は、BCR-ABL活性（突然変異型BCR-ABL活性を含む）に起因し、かつ/またはBCR-ABL（突然変異型BCR-ABLを含む）発現および/もしくは活性の阻害によって軽減される障害である。9番染色体と22番染色体の間で起こる相互転座が発癌性のBCR-ABL融合タンパク質をもたらす。「BCR-ABL関連障害」という表現は「突然変異型BCR-ABL関連障害」を包含する。
【００８７】
本発明の範囲に包含される障害には、例えば、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、およびフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ph+ ALL）などの白血病、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺がん、神経膠腫、胃腸がん、腎がん、卵巣がん、肝がん、直腸結腸がん、子宮内膜がん、腎がん、前立腺がん、甲状腺がん、神経芽細胞腫、膵がん、多形性神経膠芽腫、子宮頸がん、胃がん、膀胱がん、肝細胞癌、乳がん、結腸癌、および頭頚部がん、胃がん、胚細胞性腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー（sinonasal natural killer）、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、肥満細胞症および肥満細胞症に関連する任意の症状が含まれる。また、障害には、色素性じんま疹、肥満細胞症、例えばびまん性皮膚肥満細胞症、ヒトの孤立性肥満細胞腫、ならびにイヌ肥満細胞腫、水胞性、紅皮性および末梢血管拡張性肥満細胞症のようないくつかの稀なサブタイプ、血液障害を伴う肥満細胞症、例えば骨髄増殖性もしくは骨髄異形成症候群、または肥満細胞症に関連する急性白血病、骨髄増殖性障害、および肥満細胞性白血病も含まれる。例えば以下に挙げるようなさまざまな他のがんも、タンパク質チロシンキナーゼ関連障害の範囲に包含される：癌、例えば膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頚部、甲状腺、精巣（特に精巣精上皮腫）、および皮膚の癌（扁平上皮細胞癌を含む）；胃腸間質腫瘍（「GIST」）；リンパ球系統の造血系腫瘍、例えば白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、B細胞性リンパ腫、T細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫およびバーケットリンパ腫；骨髄細胞系統の造血系腫瘍、例えば急性および慢性骨髄性白血病ならびに前骨髄球性白血病；間葉由来の腫瘍、例えば線維肉腫および横紋筋肉腫；他の腫瘍、例えば黒色腫、精上皮腫、奇形癌、神経芽細胞腫および神経膠腫；中枢神経系および末梢神経系の腫瘍、例えば星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、およびシュワン細胞腫；間葉由来の腫瘍、例えば線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫；ならびに他の腫瘍、例えば黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞がん、奇形癌、化学療法不応性非精上皮腫胚細胞性腫瘍、およびカポジ肉腫。一定の好ましい実施形態では、障害が白血病、乳がん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、黒色腫、または固形腫瘍である。一定の好ましい実施形態では、白血病が慢性骨髄性白血病（CML）、Ph+ ALL、AML、イマチニブ抵抗性CML, イマチニブ不耐性CML、移行期CML、リンパ性急性転化期CMLである。
【００８８】
「固形腫瘍」には、例えば肉腫、黒色腫、癌、または他の固形腫瘍がんが包含される。
【００８９】
「がん」「がん性」または「悪性」という用語は、無秩序な細胞成長を典型的特徴とする哺乳動物における生理的条件を指し、または記述する。がんの例には、例えば白血病、リンパ腫、芽細胞腫、癌および肉腫が含まれる。そのようながんのより具体的な例には、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ph+ ALL）、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺がん、神経膠腫、胃腸がん、腎がん、卵巣がん、肝がん、直腸結腸がん、子宮内膜がん、腎がん、前立腺がん、甲状腺がん、神経芽細胞腫、膵がん、多形性神経膠芽腫、子宮頸がん、胃がん、膀胱がん、肝細胞癌、乳がん、結腸癌、および頭頚部がん、胃がん、胚細胞性腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（AML）、および慢性リンパ球性白血病（CML）などがある。
【００９０】
「白血病」とは、造血器官の進行性悪性疾患であり、一般に、血液および骨髄における白血球およびその前駆細胞のゆがめられた増殖および発生を特徴とする。白血病は一般に、（1）疾患の継続期間および特徴−急性または慢性；（2）関与する細胞のタイプ；骨髄（骨髄性）、リンパ（リンパ性）、または単球；ならびに（3）血中の異常細胞数の増加または非増加-白血性または非白血性（亜白血性）に基づいて、臨床的に分類される。白血病には、例えば急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人T細胞白血病、非白血性白血病、白血性白血病（leukocythemic leukemia）、好塩基球性白血病、芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄球性白血病、皮膚白血病、胎児性白血病（embryonal leukemia）、好酸球性白血病、グロス（Gross）白血病、ヘアリー細胞白血病、血球母細胞性白血病（hemoblastic leukemia）、血球芽細胞性白血病（hemocytoblastic leukemia）、組織球性白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性（lymphatic）白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ性（lymphogenous）白血病、リンパ性白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄性顆粒球性白血病、骨髄性単球性白血病、ネーゲリ（Naegeli）白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞（Rieder cell）性白血病、シリング（Schilling）白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、および未分化細胞性白血病が含まれる。一定の態様において、本発明は、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、および/またはフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ph+ ALL）の処置を提供する。
【００９１】
本発明は、異なるBCR-ABL突然変異を保因する患者が、イマチニブおよびN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドのそれぞれに対して、さまざまな抵抗性および/または感受性を持つことの実証に基づく処置方法を包含する。したがって本発明の方法は、例えば、ある個体をN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはその薬学的に許容できる塩、水和物、もしくは溶媒和物で処置すべきかどうか；ある個体を、より攻撃的な投薬レジメンのN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはその薬学的に許容できる塩、水和物もしくは溶媒和物で処置すべきかどうか；あるいは、ある個体を併用療法、すなわちN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはその薬学的に許容できる塩、水和物もしくは溶媒和物などのチロシンキナーゼ阻害剤と追加のBCR-ABL阻害剤（例えばイマチニブ、AMN107、PD180970、GGP76030、AP23464、SKI 606、NS-187、および/またはAZD0530など）との組合せ；N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはその薬学的に許容できる塩、水和物もしくは溶媒和物とチューブリン安定剤（例えばパクリタキソール（paclitaxol）、エポチロン、タキサンなど）との組合せ；N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはその薬学的に許容できる塩、水和物もしくは溶媒和物とファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤との組合せ；N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドと別のタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤との組合せ；N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとATP非競合阻害剤ONO12380との組合せ；N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとオーロラキナーゼ阻害剤VX-680との組合せ；N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとp38 MAPキナーゼ阻害剤BIRB-796との組合せ；本明細書に開示する他の任意の組合せで処置すべきかどうかの決定に、使用することができる。
【００９２】
本明細書で使用する用語「処置する」「処置」および「治療」は、治癒的治療、予防的治療、および緩和的疾患治療を指す。
【００９３】
一定の実施形態において本発明は、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドによる、BCR-ABLキナーゼ活性などのタンパク質チロシンキナーゼ活性の阻害に対して、ある患者が抵抗性であると予測されるかどうかを同定する方法であって、患者もしくは組織試料における、または哺乳動物細胞における、1つ以上の予測因子ポリヌクレオチドの発現レベルを決定することを含む方法を提供する。哺乳動物細胞はヒトがん細胞であることができる。ヒトがん細胞はBCR-ABL関連障害を持つ処置対象個体から得られるものであることができる。
【００９４】
本明細書にいうBCR-ABL阻害剤は、BCR-ABLまたは突然変異型BCR-ABLの活性または発現を部分的に阻害することができる任意の分子または化合物を指す。これらには、Srcファミリーキナーゼ、例えばBCR/ABL、ABL、c-Src、SRC/ABL、ならびに他の形態、例えば限定するわけではないが、JAK、FAK、FPS、CSK、SYK、およびBTKなどの阻害剤が含まれる。Ablに対して並外れて高いアフィニティーと特異性とを持つ2-フェニルアミノピリミジンクラスのファーマコフォアに基づく一連の阻害剤が同定されている（例えばZimmermanら, Bioorg, Med. Chem. Lett., 7:187 (1997)を参照されたい）。これらの阻害剤はいずれも、BCR-ABL阻害剤という用語の範囲に包含される。これらの阻害剤の一つイマチニブは、STI-571とも呼ばれ（かつてはNovartis試験化合物CGP 57148と呼ばれ、グリベック（Gleevec（登録商標））とも呼ばれている）、CMLの治療薬として、臨床試験で成功を収めている。AMN107は、BCR-ABLタンパク質のATP結合部位にイマチニブより高いアフィニティーでフィットするように設計されたもう一つのBCR-ABLキナーゼ阻害剤である。AMN107は、野生型BCR-ABLに対してイマチニブより強力である（IC50＜30nM）だけでなく、33個中32個のイマチニブ抵抗性BCR-ABL突然変異体に対して有意に活性でもある。前臨床試験において、AMN107は、野生型BCR-ABL発現細胞およびイマチニブ抵抗性BCR-ABL発現細胞に対して、インビトロおよびインビボで活性を示した。第I/II相試験において、AMN107は、最初からイマチニブに対して応答しないか、イマチニブ抵抗性を発達させたCML患者において、血液学的および細胞遺伝学的応答をもたらした（Weisbergら, British Journal of Cancer, 94:1765-1769 (2006)、この文献は参照によりその全てがあらゆる面で本明細書に組み込まれる）。SKI-606、NS-187、AZD0530、PD180970、CGP76030、およびAP23464は全て、本発明で使用することができるキナーゼ阻害剤の例である。SKI-606は、CML細胞に対して強力な抗増殖活性を持つことが実証されているAblの4-アニリノ-3-キノリンカルボニトリル阻害剤である（Golasら, Cancer Research, 63:375-381 (2003)）。AZD0530は、固形腫瘍および白血病の処置に関する臨床試験が継続されている二重Abl/Srcキナーゼ阻害剤である（Greenら「Preclinical Activity of AZD0530, a novel, oral, potent, and selective inhibitor of the Src family kinases」EORTC-NCI-AACR（スイス・ジュネーブ、2004年9月28日）において発表されたPoster 3161）。PD180970は、BCR-ABLを阻害し、BCR-ABL発現白血病細胞におけるアポトーシスを誘発することが示されている、ピリド[2,3-d]ピリミジン誘導体である（Roseeら, Cancer Research, 62:7149-7153 (2002)）。CGP76030は、イマチニブ抵抗性BCR-ABLキナーゼを発現させる細胞の成長と生存を阻害することが示された、二重特異性SrcおよびAblキナーゼ阻害剤である（Warmuthら, Blood, 101(2):664-672 (2003)）。AP23464は、イマチニブ抵抗性BCR-ABL突然変異体を阻害することが示されているATPベースのキナーゼ阻害剤である（O'Hareら, Clin. Cancer Res., 11(19):6987-6993 (2005)）。NS-187は、イマチニブ抵抗性BCR-ABL突然変異体を阻害することが示されている選択的二重Bcr-Abl/Lynチロシンキナーゼ阻害剤である（Kimuraら, Blood, 106(12):3948-3954 (2005)）。
【００９５】
その患者または試料または細胞がBMS-Aなどのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性であると予測されるかどうかに基づいて、処置レジメンを確立することができる。例えば本発明には、一般にキナーゼ阻害剤で処置される障害、例えばBCR-ABL関連障害を患いうるまたは患っている個体から得た細胞をスクリーニングすることが包含される。そのような障害には、骨髄性白血病もしくはそれに関連する障害、または本明細書に記載するがんが含まれうる。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルを測定するために、当技術分野で知られる方法を使って、個体の細胞をスクリーニングする。
【００９６】
予測的バイオマーカーポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの増加した発現レベルに関して本明細書で使用する用語「約」は、標準レベルよりも少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10倍もしくはそれ以上高く上昇した発現レベルを指すものとする。
【００９７】
予測的バイオマーカーポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの減少した発現レベルに関して本明細書で使用する用語「約」は、標準レベルと比較してバイオマーカーの正常発現レベルを指すか、または標準レベルよりも少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10倍もしくはそれ以上減少した発現レベルを指すものとする。
【００９８】
患者、試料、または細胞が、あるタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性であると予測される場合は、処置レジメンをしかるべく開発することができる。例えば、標準と比較して試料中のCK5（KRT5）、PLAUおよび/もしくはEphA2の減少した発現レベル、またはARおよび/またはPSAの上昇した発現レベルは、ある個体における細胞が、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドなどのキナーゼ阻害剤による処置に対して、少なくとも部分的に抵抗性であること、または少なくとも部分的に抵抗性になると予測されることを示しうる。本明細書に開示するとおり、そのような場合、処置には、増加した投与頻度または増加した投薬量のN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはその塩、水和物もしくは溶媒和物、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはその薬学的に許容できる塩、水和物もしくは溶媒和物と別のキナーゼ阻害剤薬物、例えばイマチニブ、AMN107、PD180970、GGP76030、AP23464、SKI 606、および/またはAZD0530との組合せ；N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとチューブリン安定剤（例えばパクリタキソール、エポチロン、タキサンなど）との組合せ；N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドとファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤との組合せ；本明細書に開示する他の任意の組合せ；ならびに本明細書に開示するN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドを含む他の任意の組合せまたは投与レジメンの使用を含めることができる。ある態様では、増加したレベルのN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドが、特定の適応症または個体に対する典型的なN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミド用量よりも、約10、20、30、40、50、60、70、80、90、もしくは95％多いか、または特定の適応症または個体に対する典型的なN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドよりも約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、もしくは10倍多いだろう。
【００９９】
治療有効量のN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはその薬学的に許容できる塩、水和物もしくは溶媒和物は、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの酸塩として経口投与することができる。使用する実際の投薬量は、その患者の要件および処置される状態の重症度に依存して、さまざまでありうる。ある特定の状況に関する適正な投薬量の決定は、当技術分野の技量の範囲に含まれる。N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはその薬学的に許容できる塩、水和物もしくは溶媒和物（および化合物I塩）の有効量を当業者は決定することができ、典型的投薬量として、成人の場合で1日あたり約0.05〜約100mg/kg体重のN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはその薬学的に許容できる塩、水和物もしくは溶媒和物が挙げられ、これを単回投与で投与するか、または個々の分割用量の形で、例えば1日あたり1、2、3、または4回投与することができる。一定の実施形態では、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはその薬学的に許容できる塩、水和物もしくは溶媒和物を、70mgの用量で1日に2回投与する。あるいは、例えば50、70、90、100、110、もしくは120のBID投与、または100、140、もしくは180の1日1回投与で投薬することもできる。どの特定対象についても具体的な用量レベルと投与頻度はさまざまであることができ、使用する具体的化合物の活性、その化合物の代謝安定性およびその化合物の作用の長さ、対象の種、年齢、体重、全身の健康状態、性別および食餌、投与形式および投与時刻、排泄速度、併用薬物、ならびにその特定状態の重症度を含むさまざまな因子に依存するだろう。好ましい処置対象には、タンパク質チロシンキナーゼ関連障害に罹りやすい動物、最も好ましくは哺乳動物種、例えばヒト、および家畜、例えばイヌ、ネコなどが含まれる。同じことが、化合物IIもしくは化合物Iと化合物IIの任意の組合せ、または本明細書に開示する任意の組合せにも当てはまりうる。
【０１００】
N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドなどのキナーゼ阻害剤とイマチニブとの組合せに対する、タンパク質チロシンキナーゼ関連障害を患っている個体の応答性を決定する方法を、本明細書に開示する。例えば、突然変異型BCR-ABLキナーゼの存在に基づいて、一定のキナーゼ阻害剤に対して、ある個体が、陽性応答者（positive responder）である（または前記個体由来の細胞がある程度の感受性を持つと予想されうる）と決定することができる。本明細書に開示するように、標準と比較して、試料において、CK5（KRT5）、PLAUおよび/またはEphA2の発現レベルの減少を示す細胞、またはARおよび/またはPSAの発現レベルの上昇を示す細胞は、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはその薬学的に許容できる塩、水和物もしくは溶媒和物に対して少なくとも部分的抵抗性を発達させうる。したがって、タンパク質チロシンキナーゼ関連障害を患っている個体であって、その細胞が、本明細書に開示するもののなかでも、そのようなプロファイルを示す個体は、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはその薬学的に許容できる塩、水和物もしくは溶媒和物による特定処置レジメンに対しては、部分的に陰性応答者（negative responder）であるが、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはその薬学的に許容できる塩、水和物もしくは溶媒和物のより攻撃的な処置レジメン、またはN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはその薬学的に許容できる塩、水和物もしくは溶媒和物とイマチニブもしくは他の治療法とによる併用療法に対しては、陽性応答者である（またはそのように予想されうる）。
【０１０１】
処置レジメンは、1つ以上のキナーゼ阻害剤による処置、ならびに放射線および/または他の薬剤などといった他の治療法（すなわち併用療法）を含みうる、プロテインキナーゼ関連障害を患っている個体に適用される一連の治療である。2つ以上の治療が適用される場合、それらの治療は同時にまたは連続的に適用することができる（例えば2つ以上のキナーゼ阻害剤を一緒に、または異なるスケジュールで異なる時刻に投与することができる）。2つ以上の治療の適用は、異なる時刻に（すなわち連続的に）行われ、なおかつ同じ処置レジメンの一部であることができる。本明細書に開示するように、例えば、プロテインキナーゼ関連障害を患っている個体由来の細胞が、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドに対して、少なくとも部分的抵抗性を発達させるのを見出すことができる。そのような細胞が、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドまたはその薬学的に許容できる塩、水和物もしくは溶媒和物の併用療法またはより攻撃的な投薬もしくは投与レジメンに対して感受性でありうるという本発見に基づいて、単独療法としてのその組合せ、または別のキナーゼ阻害剤と組み合わせたその組合せ、または本明細書に開示する別の薬剤と組み合わせたその組合せによる処置を含む処置レジメンを、確立することができる。さらにまた、その組合せを、放射線または他の既知の処置と一緒に適用することもできる。
【０１０２】
したがって本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ関連障害を患っている個体のための処置レジメンを確立するための方法、またはタンパク質チロシンキナーゼ関連障害を患ってい個体を処置するための方法であって、個体から得た生物学的試料が、あるタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（例えばBMS-A）に対して抵抗性であると予測されるかどうかを決定すること、および突然変異が存在するかどうかに基づいて、その対象に適当な処置レジメンを適用することを含む方法を包含する。この決定は、当技術分野で知られる任意の方法によって、例えば本発明の少なくとも一つの予測因子ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルを測定することなどによって、行うことができる。
【０１０３】
本明細書に記載する発明の数多くの態様を実施するにあたって、生物学的試料は、組織生検（細胞試料またはそこから培養された細胞；骨髄または固形組織の生検、例えば固形腫瘍から得られる細胞を含む）、血液、血液細胞（赤血球または白血球）、血清、血漿、リンパ、腹水、嚢胞液、尿、喀痰、糞便、唾液、気管支吸引液、CSFまたは毛髪など、数多くの供給源から選択することができる。試料から得られる細胞を使用するか、細胞試料の溶解物を使用することができる。一定の実施形態では、生物学的試料が組織生検細胞試料またはそこから培養された細胞、例えば固形腫瘍から取り出された細胞またはその細胞試料の溶解物である。一定の実施形態では、生物学的試料が血液細胞を含む。
【０１０４】
本発明で使用するための医薬組成物には、意図する目的を達成するのに有効な量のBCR-ABLキナーゼの阻害剤を1つ含むか、その組合せを含む組成物が含まれうる。本発明の医薬組成物の有効用量を決定することは、当業者の能力で十分に可能である。治療有効用量とは、症状または状態を改善する活性成分量を指す。治療効力および毒性、例えばED50（集団の50％において治療的に有効な用量）およびLD50（集団の50％にとって致死的な用量）は、標準的な薬学的手法により、細胞培養または実験動物で決定することができる。
【０１０５】
本発明を実施するのに有用なN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドが関わる投薬レジメンは、2003年3月24日に出願された米国特許出願第10/395,503号およびBlood (ASH Annual Meeting Abstracts)(2004) Volume 104: Abstract 20、Moshe Talpazら著「Hematologic and Cytogenetic Responses in imatinib-Resistant Accelerated and Blast Phase Myeloid Leukemia (CML) Patients Treated with the Dual SRC/ABL Kinase Inhibitor N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazolecarboxamide: Results from a Phase I Dose Escalation Study」（これらの文献は、参照によりその全てがあらゆる面で本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１０６】
BCR-ABLキナーゼの阻害剤の「治療有効量」は、その患者、試料、または細胞がタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性であると予測されるかどうかの関数でありうる。例えば、ある患者、試料、または細胞が、あるタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性であると予測される場合は、前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤の投薬量の増加が正当化されるか、より攻撃的な投薬レジメン、例えば投与頻度の増加、または前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤と本明細書に記載する他の薬剤との組合せの投与、または用量の増加、投与頻度の増加、および/もしくは他の薬剤との組合せの任意の組合せが正当化されうる。当業者は、BCR-ABLキナーゼ細胞の感受性の相違を理解し、それに応じた治療有効用量を決定するだろう。
【０１０７】
野生型BCR-ABLキナーゼと比較したN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドに対するBCR-ABLキナーゼの相対的感受性に基づいて正当化されうるN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの予測治療有効用量の例は、発現プロファイリング、細胞増殖、BCR-ABLチロシンリン酸化、ペプチド基質リン酸化、および/または自己リン酸化アッセイなどといった、さまざまなインビトロ生化学アッセイを使って決定することができる。例えば、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドのおよその治療有効用量は、典型的用量と、これらのアッセイのいずれか一つ以上における前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤による患者試料の感受性の変化倍率とを掛け合わせることに基づいて、算出することができる。例えば、試料が感受性の細胞または組織試料よりも2倍抵抗性であることがわかった場合は、約2倍高いレベルの前記タンパク質チロシンキナーゼの投与が正当化されうる。したがって、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して少なくとも部分的に抵抗性であることが見出された任意の試料に関して、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの治療上適切な用量は、処方用量または典型的用量よりも、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、または300倍高用量であることができる。あるいは、N-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-[[6-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]-2-メチル-4-ピリミジニル]アミノ]-5-チアゾールカルボキサミドの治療上適切な用量は、処方用量の、例えば0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍、0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍、0.09倍、0.08倍、0.07倍、0.06倍、0.05倍、0.04倍、0.03倍、0.02倍、または0.01倍であることもできる。
【０１０８】
本発明によれば、投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば治療応答）が得られるように調整される。例えば、単回ボーラスを投与することができ、いくつかの分割用量を時間を掛けて投与することができ、または治療状況の要求するところに応じて用量を比例的に減少もしくは増加させることができる。本発明の医薬組成物における活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物および投与様式ごとに、患者にとって毒性を示すことなく、所望する治療応答を達成するのに有効な活性成分量が得られるように、変動させることができる。選択される投薬量レベルは、使用する特定の本発明組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミド、投与経路、投与時刻、使用されるその特定化合物の排泄速度、処置の継続期間、使用するその組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および/または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および過去の病歴などといった因子を含むさまざまな薬物動態因子に依存する。例えば最新のRemington（「Remington's Pharmaceutical Science」Mack Publishing Company、ペンシルバニア州イーストン）を参照されたい。
【０１０９】
BMS-A感受性と相関するマーカーの同定
この研究において、本発明者らは、前立腺がんにおけるBMS-Aの臨床開発を潜在的に助長しうる予測的かつ代用的なバイオマーカーを同定することを目指した。図1Aに概略を示すように、本発明者らの戦略は、まず、そのベースライン発現レベルが薬物感受性と相関し、追加の変動要件を満たすような遺伝子を同定して、予測的マーカー候補のリストを得ることだった。次に、薬物処置研究において、その発現がBMS-Aによって調節される遺伝子を同定し、予測的バイオマーカー候補のリストと比較することで、薬物感受性と関連するだけでなく、薬物処置による調節も受ける遺伝子のリストを得た。
【０１１０】
BMS-Aに対して16個の前立腺細胞株のIC50値を決定して、図1Bに示した。IC50に基づいて、細胞株を2つの群に分類した：200nM未満のIC50を持つ11個の細胞株は感受性群と名付け、少なくとも2μMより大きいIC50を持つ5個の細胞株を抵抗性群とみなした。これら2つの群の分離は極めて良好であり、200nMという感受性/抵抗性境界設定は最大耐用量に近い用量で処置された患者におけるBMS-A血漿中濃度のピーク範囲内にある。
【０１１１】
Affymetrix（登録商標）遺伝子チップを使って、16個の細胞株のベースライン遺伝子発現をプロファイリングした。2つの統計的検定（一元配置ANOVAおよびlog2IC50値との相関関係）を行って、それぞれ、感受性群と抵抗性群の間で差次的に発現される遺伝子（p＜0.05で5961のプローブセット）、およびIC50と高く相関する遺伝子（p＜0.05で4575のプローブセット）を同定した。これら2つの解析で、合計4248のプローブセットがオーバーラップしたことから、感受性群および抵抗性群というカテゴリー化が、BMS-Aに対する細胞の感受性（IC50）を十分に反映していることが示唆された。そのリストを、全試料にわたって10％のCV、かつ感受性群と抵抗性群の間で最低3倍の差次的発現という要件で、さらにフィルタリングしたところ、213のプローブセットが選択された。発現配列タグ（EST）および重複プローブセットをさらに取り除いて、174遺伝子の予測マーカー候補を生成させた（表2）。
【０１１２】
16個の細胞株における174個の遺伝子の発現パターンを、クラスター分析によって視覚化した。図1Cに示すように、これら16個の細胞株は2つの群に大別された（BMS-A感受性細胞株を強調表示している）。興味深いことに、左側のクラスターに含まれる細胞株は全てBMS-Aに対して感受性であり、右側のクラスター内では、DU145、PC3およびLNCaP細胞も、抵抗性細胞株に比較的近くクラスター化されるものの、BMS-Aに対して高度に感受性だった。DU145およびPC3は、さらに、右側のクラスター内の残りの細胞とは異なる、より小さなサブグループを表しうる。これら174遺伝子のうち、約70％（124/174）は抵抗性細胞株よりも感受性細胞株において高く発現され、約30％（50/174）の遺伝子は抵抗性細胞において、より高く発現された。
【０１１３】
表2には興味深い遺伝子がいくつか含まれている。例えば、アンフィレギュリンおよびエピレギュリンはEGF-EGFR経路の成分であり；TGFα、TGFβ2およびTGFβRIIはトランスフォーミング増殖因子経路遺伝子であり；そして、例えばmetがん原遺伝子および線維芽細胞増殖因子受容体2などの他の受容体チロシンキナーゼである。これらの遺伝子は、感受性細胞株において、より高く発現された。最も目を引くのは、図1Cに印を付けたように、いくつかの重要な前立腺細胞マーカー、例えばカリクレイン3（KLK3または前立腺特異抗原PSA）およびアンドロゲン受容体（AR）が、抵抗性細胞株において過剰発現され、一方、サイトケラチン5（CK5/KRT5）は、感受性細胞株において高く発現されたことである。
【０１１４】
これら16個の細胞株におけるCK5、PSAおよびARの相対的発現レベルを、さらに図1Dに示す。抵抗性細胞株は全て、極めて低レベルのCK5を発現し、感受性細胞株は、DU145、PC3およびLNCaP細胞（図1C参照）を除いて全て、高レベルのCK5を発現させたことが、明白である。CK5は前立腺細胞系統に関して基底細胞タイプのマーカーなので、このデータは、基底表現型を示す細胞がBMS-Aに対して感受性であること、および低レベルのCK5を発現させる細胞は抵抗性である傾向を示すことを示唆している。2つの管腔細胞マーカーであるPSAおよびARの発現パターンは、上記の知見を補完的に補強する。PSAおよびARの高発現は薬物抵抗性と相関し、一方、これら2つの遺伝子の低発現はBMS-A感受性と高く相関した。BMS-Aに対して感受性であり、かつ高レベルのPSAおよびARを発現させたLNCaP細胞株は、この知見に対する唯一の例外である。
【０１１５】
BMS-A処置による調節も受けるマーカーの同定
2つのCK5発現細胞株PWR1EおよびRWPE2と3つのCK5非発現細胞株PC3、DU145およびLNCaPを含む5つのBMS-A感受性細胞株をBMS-Aで処置した。BMS-A処置細胞株と擬似処置した同じ細胞株との間で、対応のあるt検定によって遺伝子発現プロファイルを比較したところ、1628のプローブセットは薬物処理によって有意に調節される（p＜0.05）ことが、明らかになった。これら1628のプローブセットを、予測的マーカー候補のリスト（表2）と比較したところ、10個の遺伝子が両方のリストに共通していることが示された。BMS-Aに対する感受性を予測し、薬物応答の代用物とするために、潜在的に使用しうる、これら10個の遺伝子は、表2の3番目の列で「減少」と示されている。興味深いことに、これら10個の遺伝子は全て、感受性細胞株において高く発現され、BMS-A処置後は発現量が減少した。これらの遺伝子には、EGF-EGFR経路の一成分であるエピレギュリン、FHL2およびAXLキナーゼ類、ならびにプラスミノゲン活性化因子ウロキナーゼ（PLAU）が含まれる。LAMC2、EREGおよびPLAUを含むこれらの10個の遺伝子は、細胞外マトリックスに分泌されるタンパク質をコードする。この遺伝子セットは、その発現が、BMS-Aによって標的とされる遺伝子の制御を受ける遺伝子を表しうる。
【０１１６】
前立腺および乳房前臨床試験で同定された共通のバイオマーカー
乳がんに関するBMS-Aの臨床開発を促進するために、類似の前臨床バイオマーカー試験が、この研究室で行われた（5）。乳房細胞株におけるBMS-A感受性を予測するバイオマーカーが同定され、それらは現在、臨床試験で評価されているところである。大半の乳房腫瘍も上皮由来であるので、本発明者らは、本前立腺がん研究で発見されたバイオマーカーを、乳がん研究で同定されたものと比較した。この目的のために、上述したこれら174個の遺伝子に加えて、本発明者らは、1475プローブセットのリストに、BMS-Aによる有意な調節も受けるプローブセット、すなわち1628プローブのリスト上に存在するものを、前立腺バイオマーカー候補として含め、それらを161遺伝子の乳がんバイオマーカーリスト（5）と比較した。14個の遺伝子が両組織タイプに共通するバイオマーカーとして同定された（表3）。特筆すべきことに、BMS-Aターゲットの一つEphA2は、前立腺細胞株でも乳がん細胞株でも、BMS-A感受性と有意に相関した。表3に示すように、EphA2の平均発現量は、抵抗性細胞株よりも感受性細胞株の方が有意に高かった（2.69倍、t検定でp＝0.005）。
【０１１７】
図2Aに示すように、マイクロアレイベースラインプロファイリングによって検出されるEphA2の発現レベルは、前立腺細胞株のIC50値と相関した（EphA2発現量が高いほど低いIC50または高い感受性、ピアソン相関係数＝-0.66）。検証として、本発明者らは、5つの感受性細胞株と3つの抵抗性細胞株におけるEphA2タンパク質の発現を調べるために、ウェスタンブロット解析も行った（図2B）。総合的に見て、高レベルのEphA2 mRNAを持つ細胞株は比較的高レベルのEphA2タンパク質を発現させたことから、EphA2については遺伝子発現とタンパク質発現の間の良好な一致が示された。PC3、DU145およびLNCaP細胞中のEphA2タンパク質に関する本発明者らのウェスタンブロット結果は、先の報文（15）と合致している。EphA2は、その発現が細胞株におけるBMS-A感受性と相関関係を持ち、薬物のターゲットであることから、前立腺がんにおいてBMS-Aに関する強いバイオマーカー候補となった。
【０１１８】
BMS-AによるuPA発現のダウンレギュレーション
PLAU遺伝子はSrcの制御を受ける分泌タンパク質uPAをコードするので（16）、本発明者らは、PLAU遺伝子の発現と、そのBMS-Aによる調節とを、さらに評価した。図3Aに（そして表2にも）示すように、感受性細胞株におけるPLAU遺伝子の発現レベルは、抵抗性細胞株における発現レベルより、有意に高かった。PLAU遺伝子用のもう一つのプローブセットも、類似する発現パターンを示した。また、その機能においてPLAUとパートナーを組むPLAU受容体用の3つのプローブセットは、全て、これらの細胞株ではPLAUと類似する発現パターンを示した（未掲載データ）。これらは、乳がん細胞株におけるPLAU発現とBMS-A感受性との相関関係（5）と共に、PLAU発現が、そして潜在的にその機能の制御が、BMS-Aに対する細胞の感受性と高く相関することを、強く示唆している。
【０１１９】
ダサチニブによるPLAU mRNA発現のダウンレギュレーションが観察された（図3B）。2つのCK5発現細胞（PWR1EおよびRWPE2）におけるPLAU発現の比較的軽度な減少と比較して、PC3およびDU145細胞における減少は、はるかに強かった（約50％）。はるかに低レベルのPLAUを発現させるLNCaP細胞も減少を示した。本発明者らが同じ薬物処置研究をさらに3つの抵抗性細胞株22Rv、VCaPおよびMDAPCa2bに拡大したところ、図3Cに示すとおり、興味深いことに、BMS-AによるPLAU減少の強さが、BMS-Aに対する細胞の感受性とよく相関し（r＝0.72）、最大の減少が最も感受性の高い細胞株に見られた。これは、BMS-Aの生物学的効果に関する潜在的代用バイオマーカーとしてのPLAUを示唆している。さらにまた、PC3細胞を使った複数回投与処置研究で、本発明者らは、4時間時点におけるダサチニブによるPLAU mRNAレベルの減少は、無処置対照と比較してごくわずかであるが、24時間時点では、変化が用量依存的に劇的であることを見出した（図3D）。
【０１２０】
BMS-AによるPLAU発現のダウンレギュレーションは、タンパク質レベルでも見られた。ELISAアッセイにより、本発明者らは、経時的実験において、PC3細胞によって成長培地中に分泌されるuPAタンパク質の量がBMS-A処置によって減少すること、そして分泌uPAタンパク質レベルの減少の程度が、24時間時点のデータを使って図3Eに示すように、用量依存的であることを見出した。対照として、細胞毒性剤タキソール（登録商標）を使用した場合、本発明者らは、分泌uPAタンパク質レベルに用量依存的な減少を認めなかったことから、BMS-AはPLAU発現を特異的にダウンレギュレートすることが示唆される。
【０１２１】
BMS-A前立腺がん治験における患者層別化の理論的根拠
本発明者ら、その差次的発現に基づいて、CK5、PSA、ARは、BMS-Aに応答するであろう前立腺がん細胞または腫瘍のサブタイプを同定するための予測的バイオマーカーとして役立ちうると推論した。また本発明者らは、PLAUおよびEphA2が、それらの薬物感受性との相関関係および薬物作用機序との関連ゆえに、BMS-A応答をモニターするための代用マーカーとして潜在的に使用しうると推論した。16個の細胞株におけるこれら5つの遺伝子の発現パターンを図4Aに示した。5つのBMS-A抵抗性細胞株WPMY1、MDAPCa2b、22Rv、VCaP、およびDUCaPは、全て、高レベルのAR、PSAおよび低レベルのCK5（KRT5）、PLAUおよびEphA2を発現させた。対照的に、感受性細胞株は、LNCaPを除けば、低レベルのARおよびPSAを発現させ、高レベルのPLAU、EphA2および/またはCK5を発現させた。
【０１２２】
これら5つの遺伝子の発現のダイナミックレンジと、BMS-A応答性発現パターンを示す類似の（approximate）患者集団を、52の腫瘍試料からなる先に公表された前立腺腫瘍データセット（17）を使って調べた。図4Bに記載のクラスター分析によって示すように、患者集団のほぼ44％（23/52、赤色で明示した試料ID）がBMS-A応答性発現パターン、すなわち低いARおよびPSAならびに高いPLAU、EphA2および/またはCK5を示した。残り約56％の患者では、ARおよびPSAの発現が、一致して比較的高く、PLAUおよびEphA2の発現が比較的低かった。これらのデータセットには、ARとCK5のある程度の同時発現ならびに相互排他的発現があり、正常前立腺上皮の基底、中間および管腔細胞におけるこれら2つの遺伝子の発現パターンを暗示した（18、19）。あるいは、前立腺腫瘍および/または試料の不均一性を反映して、収集した試料中に両タイプの上皮細胞（正常または疾患）が存在する結果として、ARおよびCK5の同時発現を説明することもできる。本発明者らのデータは、前臨床モデルから同定されたこれら5つのバイオマーカーが、発現パターンに基づいて患者集団を同定するのに役立ちうることを示唆している。そのような遺伝子発現パターンは、臨床試験における患者層別化に潜在的に使用しうる。
【０１２３】
考察
臨床開発中の薬物のためのバイオマーカーの同定に関する理想的シナリオは、特定の治療を受けている患者から得た試料を使用し、患者応答データとの関連で、遺伝子発現データを解析することである。BMS-Aは初期開発中の新規薬剤なので、前臨床モデルを使って、臨床開発を支援するための潜在的バイオマーカーを同定することが最善の選択肢であると思われる。この研究において、本発明者らは、16個の前立腺細胞株を使って、細胞の感受性と相関し、薬物作用機序と相関するバイオマーカーを同定した。これらのバイオマーカーは、BMS-A応答を予測しモニタリングするために、潜在的に使用することができるだろう。特に、本発明者らは、薬物感受性/抵抗性と高度に関連し、かつ/または薬物処置によって調節される、AR、PSA、CK5、PLAUおよびEphA2を含む5つの遺伝子を同定した。乳がんと同じく、前立腺がんでも、低レベルのARおよびPSAならびに高レベルのCK5の発現、または基底タイプの遺伝子発現パターンは、BMS-A応答と関連するようだった。PLAUおよびEphA2の高い発現レベルも、BMS-Aに対する潜在的応答者を定義するのに役立ちうる。さらにまた、PLAU発現はBMS-Aによって特異的に制御されることが見出され、そのような制御はBMS-Aに対する細胞の感受性と高く相関したことから、PLAU発現は潜在的に薬物作用を追跡するための代用マーカーとして使用できることが示唆された。
【０１２４】
本発明者らは、そのデータ解析において、統計的有意性とサブグループ間での高倍率の差次的遺伝子発現との両方を強調するアプローチを使用した。本発明者らは16個の細胞株しかもたず、これは統計的解析におけるストリンジェントなp値には必ずしも十分に大きくないプールであるため、本発明者らは、10％という変動係数および2つの群間で3倍を超える発現量の変化というストリンジェントなフィルターを含む他の要件を含めた。特筆すべきことに、本発明者らが企てたアプローチは、食品医薬品局の主導によるMicroArray Quality Controlの最近の刊行物に報告されたもの（これは、変化倍率によってランキングされ、ストリンジェントではないが統計的に有意な検定でフィルタリングされた遺伝子リストが、他の解析戦略によって作成されたリストよりも、プラットフォームを越えて再現性が高いことを示している）と基本的に合致している（20）。本発明者らは、正常なおよび/または病的な前立腺バイオロジーを反映する、BMS-Aに対して感受性である細胞のサブタイプと、BMS-Aターゲットの機能を反映する遺伝子とを同定したので、本発明者らが得た結果は、生物学的に有意義である。さらにまた、同定されたバイオマーカーのいくつかは、乳がん研究でも観察された（7）。
【０１２５】
正常前立腺上皮の内部には、上皮細胞の2つの主要タイプ、すなわち基底上皮細胞と管腔上皮細胞が存在する。近年の研究により、上皮細胞は、機能がより専門化していて細胞分化過程の異なる段階に属しうるサブタイプへと、さらに細分されうることが示唆されている。これらのサブタイプには、前立腺幹細胞、移行増幅細胞、中間細胞、および分泌管腔細胞があり、それらは、いくつかの細胞マーカーの発現パターンに基づいて区別することができる。本発明者らは、その研究において、低いAR、PSA発現および高いCK5発現を持つ細胞が、BMS-Aに対して感受性である部分集団を表すことを見出した。この発現パターンは、潜在的に前立腺幹細胞および移行増幅細胞でありうる基底コンパートメント中に存在する上皮細胞が持つものと一致する。これら2つの細胞タイプは自己再生し、急速に増殖して、新しいまたはより分化した細胞を生じることができるので、そのような一致により、Srcおよび他のSrcファミリーメンバー（例えばLYN）を含むBMS-Aターゲットの発現および機能とこれらの細胞の増殖との間の固有の関係が示唆されうる（8）。実際、LYNは管腔層よりも基底層により高く発現されること、および腫瘍ではLYNがより分化度の低い領域でも高い傾向を示すことが見出される（21）。
【０１２６】
患者層別化を助けるために臨床で使用されている十分に確立され確証された乳がんサブタイプの分類（22、23）とは対照的に、ゲノムワイドなプロファイリング技法を使った前立腺がんの分子的分類は探究されてはいるものの（24）、独立した腫瘍コホートでの確証がなされていない。これは、前立腺腫瘍の不均一性および前立腺がん患者から生検を得ることの困難さが間違いなく一つの原因であるだろう。同定された前立腺がんの分子的サブタイプが、正常前立腺上皮に見られる上皮サブタイプを、乳がんに見られるような程度まで（22、23）、模倣しているかどうかは、まだ決定されていなかった。Singhら（17）が公表したデータセットを本発明者らが解析したところ、低レベルのAR、PSAおよび高レベルのCK5を発現させるサブタイプ、すなわち基底タイプを模倣するサブタイプと、それとは反対の発現パターンを持つサブタイプ、すなわち管腔タイプを模倣するサブタイプとが存在するようである。MDAPCa2b、VCaP、DUCaPおよびLNCaPなどといった前立腺がん細胞株の誘導も、管腔タイプの前立腺がんの存在を明確に証明している。PC3およびDU145における低い発現レベルPSA/ARならびにCK5により、管腔サブタイプおよび基底サブタイプ以外のサブタイプも示唆されうる。本発明者らの研究において見られた高いCK5の発現ならびに低いARおよびPSAの発現を持つサブタイプは、主として、不死化された前立腺細胞株に基づくことに注意されたい。しかし最近の研究では、さまざまな分化度を持つ部分細胞集団が、AR発現LAPC-4/LAPC-9ヒトがん異種移植モデルおよびPC3またはDU145がん細胞集団の両方に共存することが示された。もう一つの基底細胞マーカーCD44を発現させる部分集団（25）は、最も高い腫瘍形成性を示した（26）。これらは、正常基底細胞の表現型を持つ細胞のサブタイプが前立腺腫瘍中に存在し、それが腫瘍の悪性度を決定する上で大きな役割を果たしうることを、強く示唆している。より多くの腫瘍試料を、理想的には同じプラットフォームで、プロファイリングすることにより、そしてまた、試料の取得、加工および/またはシグナル増幅が改善されるであろう技法の進歩により、前立腺腫瘍に関する分子サブタイプ分類はより良く理解されるようになり、それが最終的には患者への個別化された医薬品の送達を容易にしうる。
【０１２７】
本発明者らは、その研究において、アンドロゲン感受性前立腺がん細胞株LNCaP細胞が、BMS-Aに対して、22Rv、MDAPCa2b、VCaPおよびDuCaPを含む他のアンドロゲン感受性細胞株とは異なる感受性を示すことを見出した。転写的には、これら5つの細胞株は、AR/PSA、同定された174遺伝子の発現、ならびにグローバル遺伝子発現に関して、互いに似ている（図1Cおよび他の未掲載データ）。LNCaP細胞で発達したどんな機序がBMS-A感受性を引き起こすのかは明らかでない。AR遺伝子突然変異は興味深い候補であるが、必ずしも直結するものでもない。というのも、LNCaP細胞が一つのT877A突然変異を持つのに対して、他の細胞は突然変異を持たないか（VCaPおよびDuCaP）、他の突然変異（22Rv、H874Y）もしくは追加の突然変異タイプ（MDAPCa2b、L701HおよびT877A）を持つからである（27）。ARの発現または配列の変化は、アンドロゲンへの結合（28）またはシグナリングカスケードによるARのリン酸化などといった他の受容体経路とのクロストーク（29）に関して、ARの機能に影響を及ぼしうる。BMS-Aによる増殖因子および受容体経路の阻害に誘発されて、細胞は、シグナリングネットワークのバランスを再建し、ARの作用様式を変更しうる。BMS-Aの1つ以上のターゲットの機能がLNCaP細胞成長にとって不可欠であることも考えられる。
【０１２８】
薬物処置によってその発現が変化する遺伝子を同定することにより、本発明者らは、BMS-Aの作用機序と相関しうる一組の遺伝子を見出した。これは薬物開発において二通りに望ましい。まず第1に、遺伝子発現に基づく異なる予測因子間の一致は乳がんにおいて確認されているが（30）、作用機序と相関するマーカーは、特定薬物に関する臨床試験においてバイオマーカーが使用される場合に、信頼度を強化するだろう。第2に、感受性分子試験による薬物効力の知見は、少ない患者数で行われる初期治験において、低い病理学的応答ゆえに臨床試験が時期尚早に中断されるのを防ぐのに役立ちうる。特に、BMS-Aは細胞の接着、移動および浸潤を強力に阻害するが、細胞毒性というよりは細胞増殖抑制性であると思われる。したがって、初期治験において薬物効力を評価するには、感受性代用マーカーが極めて重要になる。本発明者らは、その研究において、Srcキナーゼの下流ターゲットであるuPAが、BMS-Aによって有意に調節されること、そしてそのようなダウンレギュレーションがBMS-Aによって特異的に引き起こされ、タキソール（登録商標）などの他の細胞毒性剤では引き起こされないことを見出した。さらにまた、薬物が誘発するuPA減少の強さは、BMS-Aに対する細胞の感受性と極めてよく相関し、感受性細胞株では大きな減少が観察され、抵抗性細胞株ではほとんどまたは全く変化がなかった。これらのデータは、BMS-Aの効果をモニタリングするための代用バイオマーカーとして、uPAを潜在的に使用しうることを示唆している。さらに興味をそそることに、uPAは、前立腺腫瘍形成に重要な役割を果たすことが、数多くの研究で実証されている。例えばこれは、高グレード前立腺腫瘍および転移において高く発現され（31）、腫瘍がアンドロゲン非依存性に進行するとuPA発現レベルが増加した（32）。臨床では、uPAまたはuPA受容体密度の上昇が、前立腺がんにおける生存率の低下と相関することが示され（33）、乳がんでは予後マーカーとしてのその価値が十分に確立されている（34、35）。
【０１２９】
BMS-Aは、いくつかの細胞質または受容体チロシンキナーゼに対する強力な阻害剤である。接着斑キナーゼ経路を介して細胞の接着、移動および浸潤を阻害することによる、前立腺がん細胞株でのSrcキナーゼの阻害におけるその役割が報告されている（36）。興味深いことに、ナノモル濃度領域の酵素IC50を持つBMS-Aのもう一つのターゲットであるEphA2（5）も、前立腺がんの進行と関連づけられている（15）。EphA2は、BMS-Aに対する細胞株の感受性と相関するだけでなく、前立腺細胞（未掲載データ）および乳がん細胞株（5）において、BMS-Aによるダウンレギュレーションも受ける。さらにまた、SrcのsiRNAノックダウンはEphA2発現を減少させるので（5）、EphA2は、Srcキナーゼの下流でも作用しうる。前立腺腫瘍形成におけるEphA2の正確な役割と、阻害されたEphA2活性の、BMS-A誘発性細胞成長阻害に対する寄与は、まだ詳しく決定されていなかった。
【０１３０】
予測的バイオマーカー遺伝子候補リストのうち、いくつかの遺伝子は、EGF-EGFR、TGF-TGFR、FGFRおよびMet経路などといった、細胞の生存および増殖にとって重要なシグナリング経路の成分である。細胞内チロシンキナーゼであるSrcは、これらの受容体チロシンキナーゼの下流において、シグナル伝達物質として作用することができる（8、9、37）。あるいは、Srcキナーゼは、1つ以上の経路とは独立して機能しうる。前立腺がんにおけるこれらの経路とSrc媒介経路との協力またはクロストークの機序はあまりはっきりしないが、それでもそれらは、相加的効果または相乗的効果を達成するための併用療法の候補ターゲット経路になりうる。この仮説は検証されるべきであり、さらなる臨床開発戦略に洞察を与えうる。
【０１３１】
予測を立てるための高相関ポリヌクレオチドの有用性
ある生物系の特定の性質と相関するポリヌクレオチドは、その生物系および他の生物系に関する予測を立てるために使用することができる。「重みつき投票交差検定（weighted-voting cross-validation）アルゴリズム」を使って、性質を予測することができるポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの組合せを選択するために、Geneclusterソフトウェアまたは他のプログラムを使用することができる（T.R. Golubら, Science, 286:531-537 (1999)）。具体的には、Geneclusterソフトウェアを使って、薬物感受性および薬物抵抗性に相関するポリヌクレオチドの有用性を実証する予測因子を構築した。本明細書で使用する用語「予測因子」または「予測因子セット」は以下のように使用される：予測因子または予測因子セットとは、その発現パターンまたは性質を、任意の所与の生物系の性質または特徴に関する予測を異なる誤り率で立てるために使用することができる、単一の遺伝子またはポリヌクレオチドの組合せを指す。
【０１３２】
ポリヌクレオチド発現パターンの、抵抗性/感受性分類を予測する能力を、T.R. Golubら, Science, 286:531-537 (1999)で述べられているように一つ抜き交差検定（leave one out cross-validation）を使用する「重みつき投票交差検定アルゴリズム」を使って、さらに調べた。このプログラムは、所与のタンク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物、例えばBMS-Aに対する抵抗性または感受性に基づく細胞株の分類を、最適な正確度で予測することができるような発現パターンを持つ最適な数のポリヌクレオチドが選択されるようにフォーマットされた。このプログラムの交差検定戦略を簡単に説明する。
【０１３３】
こうして、本発明に従って開発されたアプローチでは、細胞株のサブセットにおけるその発現パターンが、タンパク質チロシンキナーゼの機能を阻害する化合物による処置に対する応答と相関し、それを、タンパク質チロシンキナーゼの機能を阻害する化合物による処置に対する応答の予測因子として使用することができる、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの組合せが発見された。
【０１３４】
予測因子セット、誤り率および有用性の実証に使用したアルゴリズム
任意の所与の予測因子または予測因子セットにおけるポリペプチドの数は、交差検定実験における、および他の数学的アルゴリズムでの、その予測因子セットの誤り率に影響を及ぼしうる。データは、予測因子の誤り率が、予測因子セット中のポリヌクレオチド数ならびに所与の予測因子セットにおける個々のポリヌクレオチドの寄与および交差検定実験で試験される細胞株の数に、ある程度依存することを示している。例えば、ある所与の予測因子セットにおいて、あるポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオチドよりも有意に寄与しうる。
【０１３５】
あるポリヌクレオチドが予測因子セットに対して有意に寄与するとすれば、それを他のポリヌクレオチドと異なる組み合わせで使用して、異なる予測因子セットで異なる誤り率を達成できることは、おそらく間違いないだろう。例えば、ポリヌクレオチドA単独では30％の誤り率を与える。ポリヌクレオチドB、CおよびDと組み合わせると誤り率が10％になり、ポリヌクレオチドB、DおよびEと組み合わせると誤り率が12％になるが、ポリヌクレオチドAとポリヌクレオチドE〜Xの組合せは8％の誤り率を与えるという具合である。図5に示すように、予測因子セット中のポリヌクレオチドの異なる選択および組合せは、交差検定試験において異なる誤り率を達成する。
【０１３６】
同じ組織タイプの試験データに関する予測を立てるための予測因子セットの有用性
本明細書で述べるように、176個のポリヌクレオチド（表2に列挙したもの）は、16個の前立腺がん細胞株においてタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤BMS-Aに対する感受性と相関する発現レベルを持つことが実証された。次に、これら176個のポリヌクレオチドが、個別に、または1つ以上との組合せとして、またはポリヌクレオチドサブセットで表した場合に持つ、BMS-Aに対する細胞株の感受性および/または抵抗性予測を立てる能力を、これらのポリヌクレオチドを同定するために用いた試験試料とは異なる試験試料で評価した。そのような試験試料を利用して、これら176個のポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドの1つ以上の任意の組合せ、および/または予測因子ポリヌクレオチドサブセットの、BMS-Aに対する特定試験株の感受性または抵抗性を正確に予測する能力を、さらに実証した。
【０１３７】
表2に示すマーカーの、タンパク質チロシンキナーゼ、特にsrcファミリーキナーゼ関連シグナリング経路に関連する生物学的機能に基づいて、そしてまた、BMS-A処置によって調節されるそれらの発現レベルの変化に基づいて、表5に列挙する5つのポリヌクレオチドを選択して、ポリヌクレオチド予測因子セットを構成させ、次にそれを利用して、前立腺細胞株試験試料に関して感受性予測を立てた。
【０１３８】
異なる組織タイプの試験データに関する予測を立てるためのポリヌクレオチド予測因子セットの有用性
本明細書で述べるように、表2に列挙したポリヌクレオチドは前立腺がん細胞株から同定された。さらにまた、本明細書に記載する結果が実証するとおり、本予測因子ポリヌクレオチドは、BMS-Aへの曝露に対する前立腺がん細胞株試験試料の感受性および/または抵抗性を正確に予測することができる。しかし、これらの予測因子ポリヌクレオチドが、前立腺組織以外の組織タイプに由来するがん細胞株試験試料の、BMS-Aへの曝露に対する感受性および/または抵抗性を予測できることを実証することも重要だろう。
【０１３９】
こうして、本発明に従って開発されたアプローチでは、前立腺細胞株のサブセットにおけるその発現パターンが、タンパク質チロシンキナーゼの機能を阻害する化合物による処置に対する応答と相関し、それを、同じ組織タイプ（乳房）ならびに異なる組織タイプ（肺）などの他の試料を予測する際に使用することができる、予測因子ポリヌクレオチドおよび/または予測因子ポリヌクレオチドの組合せが発見された。これらの予測因子ポリヌクレオチドは、他の組織タイプ（例えば、限定するわけではないが、結腸および前立腺組織、特に結腸がんおよび前立腺がん組織）の感受性および/または抵抗性の予測に役立つだろうと予想される。
【０１４０】
予測因子セットの応用
異なる応用では異なる誤り率を持つ予測因子セットを使用することができる。異なる生物系におけるタンパク質チロシン調節物質化合物、例えばBMS-A、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、またはタンパク質チロシンキナーゼシグナリング経路に影響を及ぼす化合物の考えうる効果に関する予測を立てるために、それぞれ表2、3、4および5のそれぞれに示すように、表2に列挙するポリヌクレオチドの任意の組合せから、または14、10および5ポリヌクレオチドの予測因子ポリヌクレオチドサブセットから、予測因子セットを構築することができる。本明細書に記載するさまざまな予測因子セット、またはこれらの予測因子セットと他のポリヌクレオチドもしくはこれらのポリヌクレオチドの他の共変量との組合せは、広い有用性を持つことができる。例えばこれらの予測因子セットは疾患管理において診断指標または予後指標として使用することができる。例えば、それらは、がんを持つ患者が、タンパク質チロシンキナーゼファミリー（例えばsrcチロシンキナーゼファミリー）を調節する化合物による治療的介入にどのように応答しそうであるかを予測するために使用することができ、またそれらは、タンパク質チロシンキナーゼ制御経路（例えばsrcチロシンキナーゼ制御経路）全体によるシグナリングを調節する治療的介入に対して患者がどのように応答しそうであるかを予測するために使用することができる。
【０１４１】
本明細書に記載するデータは、がん治療に潜在的有用性を持つ化合物をスクリーニングし同定するために日常的に使用される細胞株で生成されたが、これらの予測因子は、タンパク質チロシンキナーゼまたはタンパク質チロシンキナーゼ経路によるシグナリングが重要性を持つ他の疾患領域、例えば免疫、または細胞シグナリングおよび/または細胞増殖管理に異常を来しているがんもしくは腫瘍において、診断価値と予後価値の両方を持つ。そのようなタンパク質チロシンキナーゼおよびその経路には、例えばSrcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびに他のタンパク質チロシンキナーゼ、例えばBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体が含まれる。本明細書に記載するデータは、具体例としてのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物BMS-Aを使って生成されたものであるが、BMS-Aに加えて、他の3つのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物も試験し、評価した23の乳房細胞株において類似する感受性および抵抗性分類を持つことを見出した。このように、これらの予測因子は、他の阻害剤分子ならびにタンパク質チロシンキナーゼ（例えばSrcチロシンキナーゼ）またはタンパク質チロシンキナーゼシグナリング経路（例えばSrcチロシンキナーゼのもの）に影響を及ぼす任意の分子または治療的介入に関して、診断価値と予後価値の両方を持つことができる。
【０１４２】
乳房組織の細胞株以外の細胞タイプにおいてもタンパク質チロシンキナーゼ経路（例えばSrcチロシンキナーゼ経路）が存在し機能していることは、当業者には理解されるだろう。それゆえに、ここに記載するポリヌクレオチドの予測因子セット、またはその予測因子セット内のポリヌクレオチドの組合せは、疾患状態と関連する他の組織もしくは臓器の細胞または他の組織もしくは臓器タイプに由来するがんもしくは腫瘍においてタンパク質チロシンキナーゼ活性と相互作用し、またはそれを阻害する化合物に対する薬物感受性または薬物抵抗性の予測に関して、有用性を示すことができる。そのような細胞、組織および臓器の限定でない例には、結腸、乳房、肺、心臓、前立腺、精巣、卵巣、子宮頚、食道、膵臓、脾臓、肝臓、腎臓、腸、胃、リンパ細胞および脳が含まれ、それゆえに、本明細書に記載の予測因子ポリヌクレオチドセットには広範で有益な利用可能性がもたらされる。分析用の細胞は、当技術分野で知られる従来の手法、例えば組織生検もしくは臓器生検、吸引、脱落細胞、例えば結腸細胞、臨床もしくは医用組織、または細胞サンプリング手法によって得ることができる。
【０１４３】
予測因子セットを構成するポリヌクレオチドの機能性
予測因子または予測因子セット（例えば予測因子ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの予測因子セット）の使用は、ある生物系に関して何らかの知見を得る前に、成果を予測することを可能にする。基本的に予測因子は、その生物系を分類するために用いられる表現型を予測するのに有用なツールであるとみなすことができる。本発明が提供する具体的実施形態において、「抵抗性」または「感受性」という分類は、ある化合物（例えば本明細書で例示するタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物BMS-A）に対する各細胞株のIC50値に基づく。
【０１４４】
ある具体例として、例えばカベオリン-1およびカベオリン-2など、本明細書に記載するポリヌクレオチド（表2）のいくつかは、srcチロシンキナーゼファミリーの基質であることが知られている（M.T. BrownおよびJ.A. Cooper, Biochemica et Biophysica Acta, 1287:121-149 (1996)）。EphA2はチロシンキナーゼ受容体である。本明細書に提示するデータにより、EphA2は感受性細胞株では高く発現され、その発現レベルと活性は、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物BMS-Aの処置によってダウンレギュレートされることが実証された。高い予測因子正確度に寄与するポリヌクレオチドは、調節されている経路において、おそらく機能的役割を果たすだろうから、これは予想されることである。例えばハーセプチン（HERCEPTIN（登録商標））療法（すなわち、Her2受容体に結合し、内在化によって機能を妨げる抗体）は、Her2ポリペプチドが過剰発現される場合に適応となる。ターゲット酵素が発現されない場合に治療が治療効果を持つことは、あり得なくはないものの、その可能性は低い。
【０１４５】
しかし、予測因子セットを構成するポリヌクレオチドおよびそれらの機能的産物（タンパク質およびmRNA）の一部については、その完全な機能が現時点ではわかっていないものの、ポリヌクレオチドの一部は、Srcチロシンキナーゼシグナリング経路などのタンパク質チロシンキナーゼシグナリング経路に、直接または間接的に関与しそうである。さらにまた、予測因子セット中のポリヌクレオチドの一部は、被験化合物に特異的な代謝経路または他の抵抗性経路において機能しうる。それにもかかわらず、ポリヌクレオチドの機能に関する知識は、本発明の実施によって予測因子の正確度を決定するための必要条件ではない。
【０１４６】
本明細書で述べるように、タンパク質チロシンキナーゼ（例えばSrcチロシンキナーゼ）と相互作用し、それを阻害する化合物による処置に対する前立腺細胞株の相対的固有感受性または抵抗性に相関するポリヌクレオチドが発見された。これらのポリヌクレオチドは、重みつき投票一つ抜き交差検定プログラムにより、これらの化合物に対する前立腺細胞株の固有抵抗性および感受性を予測するのに役立つことが示された。
【０１４７】
本発明の一実施形態は、ある疾患、例えば前立腺がんまたは前立腺腫瘍について薬物または化学療法剤による処置または治療を必要とする個体が、その薬物または化学療法剤にうまく応答する可能性が高いか、それとも応答しない可能性が高いかを、その個体をそのような処置または化学療法に付す前に決定または予測する方法に関する。薬物または化学療法剤は、タンパク質チロシンキナーゼ活性またはタンパク質チロシンキナーゼが関わるシグナリングを調節するものであることができる。そのようなタンパク質チロシンキナーゼの限定でない例には、Srcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびに他のタンパク質チロシンキナーゼ、例えばBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体などがある。本発明の方法では、疾患に関連する組織または臓器、例えば腫瘍またはがんの患者生検、好ましくは前立腺がん生検または前立腺腫瘍生検から得た細胞を、その化合物または薬物（好ましくはタンパク質チロシンキナーゼの阻害剤）によるそれらの処置に先だって、本明細書に記載するインビトロアッセイに付して、それらのマーカーポリヌクレオチド発現パターン（表2から選択されるポリヌクレオチドおよび/または表3、4、もしくは5の予測因子ポリヌクレオチドサブセット）を決定する。その結果得られた、薬物処置前のその細胞のポリヌクレオチド発現プロファイルを、本発明が提供するその薬物または化合物に対して抵抗性または感受性である細胞における同じポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現パターンと比較する。
【０１４８】
もう一つの関連実施形態において、本発明は、ある疾患状態について薬物療法を必要とする個体またはがん（例えば前立腺がん）について化学療法剤を必要とする個体が、処置に応答するかどうかを、処置の適用に先だって予測し、予後判定し、診断し、かつ/または決定する方法を包含する。処置および治療は、好ましくは、タンパク質チロシンキナーゼを調節する薬剤、化合物、または薬物、例えばタンパク質チロシンキナーゼ活性の阻害剤を必要とする。タンパク質チロシンキナーゼには、Srcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびに他のタンパク質チロシンキナーゼ、例えばBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体などが含まれるが、これらに限るわけではない。好ましいのは、srcチロシンキナーゼおよびその阻害剤である。この実施形態では、タンパク質チロシンキナーゼを調節する薬剤、化合物、または薬物による処置に先だって、患者の組織試料（例えば前立腺腫瘍生検または前立腺がん生検）から得た細胞をアッセイして、そのポリヌクレオチド発現パターンを決定する。その結果得られる、化合物または薬物への曝露前の試験細胞のポリヌクレオチド発現プロファイルを、本明細書に記載しそれぞれ表2、表3、4、または5に示す、174、14、10、または5個のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド予測因子サブセットの1つ以上のポリヌクレオチド発現プロファイルと比較する。
【０１４９】
薬物による患者のがんまたは腫瘍の処置の成否は、その薬物または化合物に曝露された細胞の抵抗性または感受性パネルにおける予測因子ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現パターンと比較され、本明細書に詳述する予測因子ポリヌクレオチド解析に付された、その患者の被験細胞のポリヌクレオチド発現パターンに基づいて決定することができる。したがって、薬物への曝露後に、その試験細胞が、その薬物または化合物に対して感受性である対照細胞パネルの予測因子ポリヌクレオチドセットのポリヌクレオチド発現パターンに一致するポリヌクレオチド発現パターンを示す場合、その個体のがんまたは腫瘍は、その薬物または化合物による処置に応答するだろう可能性が非常に高い。これに対し、薬物曝露後に、試験細胞が、その薬物または化合物に対して抵抗性である対照細胞パネルの予測因子ポリヌクレオチドセットのポリヌクレオチド発現パターンに一致するポリヌクレオチド発現パターンを示す場合、その個体のがんまたは腫瘍は、その薬物または化合物による処置に応答しないだろう可能性が非常に高い。
【０１５０】
関連する一実施形態では、患者のがんまたは腫瘍が、薬物または化合物、特にタンパク質チロシンキナーゼ活性またはタンパク質チロシンキナーゼ経路（例えばSrcチロシンキナーゼ活性または経路）に直接的または間接的に関与する薬物または化合物による処置に対して、感受性であるか抵抗性であるか、または感受性であるだろうか抵抗性であるだろうかを、決定するためのスクリーニングアッセイが提供される。
【０１５１】
タンパク質チロシンキナーゼ活性と相互作用し、またはタンパク質チロシンキナーゼ活性を阻害する薬物または化合物が関わる薬物処置の進行をモニターするためのモニタリングアッセイも、本発明によって提供される。これらのモニタリングアッセイに包含されるタンパク質チロシンキナーゼには、Srcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびに他のタンパク質チロシンキナーゼ、例えばBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体などがある。そのようなインビトロアッセイは、タンパク質チロシンキナーゼを調節し、またはタンパク質チロシンキナーゼと相互作用する化合物または薬剤によって処置しうる疾患を持つ患者の処置を、患者組織試料（例えば腫瘍生検またはがん生検、好ましくは前立腺がん試料または前立腺がん腫瘍試料）から得た細胞の抵抗性または感受性ポリヌクレオチド発現パターンを、タンパク質チロシンキナーゼ活性を阻害する薬物または化合物による処置の前に、そしてその薬物または化合物による処置後に再び、本明細書に記載の予測因子ポリヌクレオチドセットの一つ以上またはその組合せの発現パターンと比較することによって、モニターすることができる。患者から単離された細胞をアッセイして、化合物または薬物（好ましくはタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤）への曝露前および曝露後の、それらのポリヌクレオチドパターンを決定することにより、別の薬物または薬剤による処置または現在の処置の中断が正当化されるように、そのポリヌクレオチド発現プロファイルの変化が起こっているかどうかを決定する。その結果得られる、処置前および処置後の被験細胞のポリヌクレオチド発現プロファイルを、その薬物または化合物に対して抵抗性または感受性である細胞において高く発現されることが本明細書において記載され提示されたポリヌクレオチドの予測因子セットのポリヌクレオチド発現パターンと比較する。あるいは、患者が所与の薬物または治療化合物による処置を受けた後にのみ、上述のようにポリヌクレオチド発現プロファイルを得ることによって、薬物処置または薬物治療に関する患者の進行をモニターすることもできる。この方法では、薬物または化合物による処置の前に患者試料を試験する必要がない。
【０１５２】
そのようなモニタリングプロセスは、患者の試料（例えば腫瘍生検またはがん生検）から単離された細胞のポリヌクレオチド発現パターンが、ある薬物または化合物に曝露され、かつ曝露後のそれらのポリヌクレオチド発現プロファイルについて評価された、抵抗性または感受性対照細胞パネルの予測因子ポリヌクレオチドセットのポリヌクレオチド発現パターンと相対的に同じであるか異なるかに基づいて、その薬物または化合物による患者の処置の成否を示すことができる。したがって、ある薬物または化合物による処置後に、試験細胞が、そのポリヌクレオチド発現プロファイルに、処置前に見られたものから、その薬物または化合物に対して抵抗性である対照細胞パネルの予測因子ポリヌクレオチドセットのポリヌクレオチド発現プロファイルと一致するものへの変化を示す場合、それは、現在の処置を修正し、変更し、さらには中止すべきであるという指標として役立ちうる。また、患者の応答が、薬物感受性を示す細胞の予測因子ポリヌクレオチドの発現プロファイルと、処置を受けている患者から得られる細胞から得たポリヌクレオチド発現プロファイルとの相関関係に基づいて、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物（例えばSrcチロシンキナーゼ阻害剤）による処置に対する感受性を示すものである場合には、その患者の処置の予後は良好であると認定することができ、処置を継続することができる。さらに、薬物処置前に患者を試験していない場合は、処置後に得られた結果を使って、薬物に対する細胞の抵抗性または感受性を、予測因子ポリヌクレオチドセットと比較したポリヌクレオチド発現プロファイルに基づいて、決定することができる。
【０１５３】
関連する一実施形態において、本発明は、タンパク質チロシンキナーゼを調節する化合物または薬剤によって処置しうる疾患（すなわち前立腺がん）を持つ患者の処置をモニターする方法を包含する。そのような処置モニタリングアッセイによって包含されるタンパク質チロシンキナーゼには、Srcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびに他のタンパク質チロシンキナーゼ、例えばBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体などがある。これらのアッセイを行うには、患者から得た試験細胞をアッセイして、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物または薬物への曝露前および曝露後に、それらのポリヌクレオチド発現パターンを決定する。その結果得られる、処置前および処置後の試験細胞のポリヌクレオチド発現プロファイルを、その薬物または化合物に対して抵抗性または感受性である細胞において高く発現されることが本明細書に記載され提示されているポリヌクレオチドの予測因子セットのポリヌクレオチド発現パターンと比較する。したがって、ある患者の応答が、予測因子ポリヌクレオチドの発現プロファイルの相関関係に基づいて、あるタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物による処置に対して感受性であるものである場合、またはあるタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物による処置に対して感受性であるものになる場合、その患者の処置の予後は良好であると認定することができ、処置を継続することができる。また、薬物または化合物による処置後に、試験細胞がそのポリヌクレオチド発現プロファイルに、その薬物または化合物に対して感受性である対照細胞パネルのものに一致するプロファイルへの変化を示さない場合、これは、現在の処置を修正し、変更し、さらには中止すべきであるという指標として役立つ。そのようなモニタリングプロセスは、必要に応じて、または所望に応じて、繰り返すことができ、ある薬物または化合物による患者の処置の成否を、その患者の試料から単離された細胞のポリヌクレオチド発現パターンに基づいて示すことができる。所与の薬物処置に対する患者の応答のモニタリングは、薬物または活性化合物による処置の前および後ではなくて、処置後にのみ、記載のアッセイで患者の細胞を試験することも含むことができる。
【０１５４】
好ましい実施形態において、本発明は、srcチロシンキナーゼを調節する化合物または薬剤によって処置しうる疾患（すなわち前立腺がん）を持つ患者の処置をモニターする方法を包含する。患者から得られる試験細胞をアッセイして、srcチロシンキナーゼ阻害剤化合物または薬物への曝露前および曝露後に、それらのポリヌクレオチド発現パターンを決定する。その結果得られる、処置前および処置後の試験細胞のポリヌクレオチド発現プロファイルを、その薬物または化合物に対して抵抗性または感受性である細胞において高く発現されることが本明細書に記載され提示されているポリヌクレオチドの予測因子セットのポリヌクレオチド発現パターンと比較する。したがって、患者の応答が、予測因子ポリヌクレオチドの発現プロファイルの相関関係に基づいて、srcチロシンキナーゼ阻害剤化合物による処置に対して感受性であるものである場合、またはsrcチロシンキナーゼ阻害剤化合物による処置に対して感受性であるものになる場合、その患者の処置の予後は良好であると認定することができ、処置を継続することができる。また、ある薬物または化合物による処置後に、試験細胞が、それらのポリヌクレオチド発現プロファイルに、その薬物または化合物に対して感受性である対照細胞パネルのものに一致するプロファイルへの変化を示さない場合、これは、現在の処置を修正し、変更し、さらには中止すべきであるという指標として役立つ。そのようなモニタリングプロセスは、必要に応じて、または所望に応じて、繰り返すことができ、ある薬物または化合物による患者の処置の成否を、その患者の試料から単離された細胞のポリヌクレオチド発現パターンに基づいて示すことができる。所与の薬物処置に対する患者の応答のモニタリングは、薬物または活性化合物による処置の前後ではなくて、処置後にのみ、記載のアッセイで患者の細胞を試験することも含むことができる。
【０１５５】
もう一つの実施形態において、本発明は、ある生物系、好ましくは罹患個体の組織、臓器、腫瘍またはがんから得られる細胞が、その系を調節する化合物に対して抵抗性であるか感受性であるかを分類する方法を包含する。本発明の好ましい一態様では、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物、または一連の化合物、例えばSrcチロシンキナーゼ阻害剤に対する細胞（例えば腫瘍またはがんから得られるもの）の感受性または抵抗性が決定される。阻害剤には、本明細書において上述したようにタンパク質チロシンキナーゼを直接的または間接的に阻害する化合物、薬物、または生物剤を含めることができる。この方法によれば、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤薬物または化合物への曝露後の細胞の抵抗性/感受性プロファイルを、本明細書に記載するポリヌクレオチド発現プロファイリングプロトコールによって決定することができる。細胞のそのような抵抗性/感受性プロファイルは、適切なアッセイ（例えば実施例1に記載のインビトロアッセイ）を使って決定されるその化合物に対する細胞のIC50値を反映する。この種の手法は、さまざまな細胞タイプおよび化合物（タンパク質チロシンキナーゼと相互作用するか、タンパク質チロシンキナーゼのシグナリング経路におけるその活性に影響を及ぼすもの）を使って行うことができる。
【０１５６】
本発明は、そのもう一つの実施形態において、タンパク質チロシンキナーゼ調節物質（特にsrcチロシンキナーゼの阻害剤）に対する感受性（または抵抗性）と最も高く相関することが実証されている本明細書に記載の予測因子ポリヌクレオチドセットの、表2、3、4、もしくは5に記載のポリヌクレオチド、またはその任意の組合せの全てを含む、1つ以上の専用マイクロアレイ（例えばオリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはcDNAマイクロアレイ）の製造を包含する。好ましくは、予測因子ポリヌクレオチドセットは、本明細書で実証するように、2つ以上のタンパク質チロシンキナーゼ調節物質（例えばSrcチロシンキナーゼ阻害剤などのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤）に共通する。本発明のこの態様では、オリゴヌクレオチド配列またはcDNA配列は、抵抗性細胞または感受性細胞において高く発現される本明細書に記載の予測因子ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せのいずかを含み、それらは、任意の支持材料（例えばガラススライド、ナイロンメンブレンフィルター、ガラスもしくはポリマー製のビーズ、チップ、プレート、または他のタイプの適切な基体材料）と会合して、またはそのような支持材料上に導入されて、マイクロアレイ（例えばオリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはcDNAマイクロアレイ）上に含有される。
【０１５７】
細胞の核酸（例えばRNA）を、本明細書に記載のタンパク質チロシンキナーゼまたはそのシグナリング経路と相互作用する薬物または化合物への曝露後に、試験されている細胞から単離するか、またはその薬物もしくは化合物に対する細胞の感受性の初期決定または初期予測を行って最終的にはその薬物または化合物による処置成果を予測するための試験を受けている細胞から単離する。単離された核酸を適当に標識し、専用マイクロアレイの1つ以上に適用する。その結果得られる、専用マイクロアレイ上のポリヌクレオチド発現のパターンを、本明細書において説明し当技術分野でも知られているように解析する。薬物または化合物に対する感受性または抵抗性と相関するポリヌクレオチド発現のパターンは、例えば、ここでアッセイされたタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に曝露された細胞のパネルに関する図1に示すポリヌクレオチド発現パターンとの比較によって決定することができる。
【０１５８】
本発明の専用マイクロアレイ実施形態では、マイクロアレイが、前立腺細胞タイプによる薬物感受性または薬物抵抗性と高く相関する予測因子ポリヌクレオチドセットもしくはサブセットの1つ以上、またはその組合せのポリヌクレオチド、または表2、3、4、もしくは5のポリヌクレオチドの全てを含有する。試験細胞（例えば腫瘍またはがん細胞、好ましくは前立腺がん細胞または前立腺腫瘍細胞）から単離された核酸ターゲットが、対照と比較して、薬物感受性の予測因子セットのポリヌクレオチドに対して、高レベルの検出可能な結合を示す場合、患者の細胞はその薬物または一連の薬物に応答し、その薬物または一連の薬物に対する患者の応答は好ましいものだろうと予測することができる。
【０１５９】
そのような結果から、その腫瘍またはがんの細胞は、その薬物または一連の薬物を利用した成功する処置または治療法の良い候補であることが予測される。あるいは、試験細胞から単離された核酸ターゲットが、対照と比較して、薬物抵抗性の予測因子セットのポリヌクレオチドに対して、高レベルの検出可能な結合を示す場合、患者はその薬物または一連の薬物に応答しない可能性が高く、その薬物または一連の薬物に対する患者の応答は好ましいものでない可能性が高いと予測することができる。そのような結果から、腫瘍またはがんの細胞は、その薬物または一連の薬物を利用する処置または治療法の良い候補でないことが予測される。
【０１６０】
マイクロアレイ技術の利用は当技術分野では知られており実践されている。簡単に述べると、マイクロアレイ技術を使ってポリヌクレオチド発現を決定するために、ポリヌクレオチド、例えばRNA、DNA、cDNA、好ましくはRNAが、生物学的試料、例えば細胞から、前立腺細胞に関して本明細書で述べるように、当技術分野で実践されている手法および技法を使って単離される。単離された核酸は、例えば蛍光、酵素、放射性核種または化学発光ラベルなどで検出可能に標識され、マイクロアレイ、例えば本発明が提供する専用マイクロアレイに適用される。次に、そのアレイを洗浄して未結合物質を取り除き、利用したラベルのタイプに応じて染色もしくは蛍光または当技術分野で知られる他の手段によって可視化する。
【０１６１】
本発明のもう一つの実施形態では、予測因子ポリヌクレオチド（表2）、または予測因子ポリヌクレオチドセットを含むサブセットの1つ以上（例えば表3、4、または5）を、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物、例えばSrcチロシンキナーゼ阻害剤に対して抵抗性または感受性である細胞に関するバイオマーカーとして使用することができる。予測因子ポリヌクレオチドを掌握していれば、スクリーニングおよび検出アッセイを行って、所与の化合物（好ましくはタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物、例えばSrcチロシンキナーゼ阻害剤化合物）が、細胞（例えば腫瘍生検試料またはがん生検試料（例えば前立腺がん細胞試料）から採取した細胞）をその化合物に曝露した後に、感受性表現型または抵抗性表現型を惹起するかどうかを決定することができる。このように、タンパク質チロシンキナーゼまたはタンパク質チロシンキナーゼ経路と相互作用する薬物または化合物、好ましくは阻害剤化合物（細胞がそれに曝露されるもの）に対する細胞の抵抗性または感受性を決定するための、スクリーニング、モニタリング、検出、予後判定、および/または診断方法が、本発明によって包含される。
【０１６２】
そのような方法は、タンパク質チロシンキナーゼまたはタンパク質チロシンキナーゼ経路と相互作用し、またはそれに影響を及ぼす薬物または化合物に曝露された細胞における、ポリヌクレオチド、特に本明細書に記載する予測因子またはsrcバイオマーカーポリヌクレオチドおよび予測因子ポリヌクレオチドサブセット（表2、3、4、または5）の発現を決定し、評価するための、さまざまな手法およびアッセイを包含し、そのタンパク質チロシンキナーゼには、Srcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびに他のタンパク質チロシンキナーゼ、例えばBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体が含まれる。適切な方法は、核酸（例えばDNA、RNA、mRNA）レベルでのポリヌクレオチドの活性化または発現の検出および評価、ならびにコードされているタンパク質の検出および評価が含まれる。例えば当技術分野で知られ実践されているPCRアッセイを使用して、薬物処置（例えばタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤）に対する感受性に関してアッセイされる細胞におけるRNAまたはDNAを定量することができる（実施例3、RT-PCR参照）。
【０１６３】
もう一つの実施形態において、本発明は、タンパク質チロシン阻害剤化合物またはタンパク質チロシンキナーゼシグナリング経路（例えばSrcチロシンキナーゼ）に影響を及ぼす化合物に対して抵抗性であると予測される、またはこれらの化合物に対して異なる生物系において抵抗性である、細胞、組織および/または患者を同定する方法に向けられる。この方法は（i）そのような化合物に対する抵抗性応答の予測に相関的であることが示されている表2、3、4、または5に列挙したポリヌクレオチドまたはその任意の組合せだけの発現を解析するステップ、（ii）試験細胞、組織および/または患者におけるそれら相関的抵抗性ポリヌクレオチドの観察された発現レベルを、その化合物に対して抵抗性であることがわかっている細胞株における同じポリヌクレオチドの発現レベルと比較するステップ、および（iii）その細胞、組織および/または患者がその化合物に対して抵抗性であるかどうかを、ステップ（ii）におけるそれらポリヌクレオチドの観察された発現の全体的類似性に基づいて、予測するステップを含む。
【０１６４】
もう一つの実施形態において、本発明は、タンパク質チロシン阻害剤化合物またはタンパク質チロシンキナーゼシグナリング経路（例えばSrcチロシンキナーゼ）に影響を及ぼす化合物に対して感受性であると予測される、またはこれらの化合物に対して異なる生物系において感受性である、細胞、組織および/または患者を同定する方法に向けられる。この方法は（i）そのような化合物に対する感受性応答の予測に相関的であることが示されている表2、3、4、または5に列挙したポリヌクレオチドまたはその任意の組合せだけの発現を解析するステップ、（ii）試験細胞、組織および/または患者におけるそれら相関的感受性ポリヌクレオチドの観察された発現レベルを、その化合物に対して感受性であることがわかっている細胞株における同じポリヌクレオチドの発現レベルと比較するステップ、および（iii）その細胞、組織および/または患者がその化合物に対して感受性であるかどうかを、ステップ（ii）におけるそれらポリヌクレオチドの観察された発現の全体的類似性に基づいて、予測するステップを含む。
【０１６５】
本発明はさらに、抗体に基づくアッセイ（例えばイムノアッセイ）および/または検出系を用いた、本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質の1つ以上の検出および/または定量を包含する。上述のように、タンパク質チロシンキナーゼには、Srcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびに他のタンパク質チロシンキナーゼ、例えばBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体が包含される。そのようなアッセイには、本明細書でさらに詳しく説明するように、限定でない以下の例が含まれる：ELISA、免疫蛍光、蛍光活性化細胞選別（FACS）、ウェスタンブロットなど。
【０１６６】
もう一つの実施形態では、本発明のヒトタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドおよび/またはペプチド、またはその免疫原性フラグメントまたはオリゴペプチドを、さまざまな薬物スクリーニング技法で治療薬または治療化合物をスクリーニングするために使用することができる。そのようなスクリーニングアッセイで使用されるフラグメントは、溶解した状態で遊離しているか、固形支持体に固定されているか、細胞表面に担持されているか、細胞内に位置することができる。バイオマーカータンパク質と被験薬剤の間で起こる結合複合体の形成の減少または消滅を測定することができる。したがって本発明は、複数の化合物を、プロテインキナーゼ阻害剤バイオマーカーポリペプチドまたはその結合可能なペプチドフラグメントとの特異的結合アフィニティーに関して、スクリーニングまたは評価するための方法を提供する。本方法は、複数の化合物を用意するステップ、プロテインキナーゼ阻害剤バイオマーカーポリペプチドまたはその結合可能なペプチドフラグメントを前記複数の化合物のそれぞれと、適切な条件下で結合させるのに十分な時間、混和するステップ、および前記複数の試験化合物のそれぞれへのバイオマーカーポリペプチドまたはペプチドの結合を検出し、それによってバイオマーカーポリペプチドまたはペプチドに特異的に結合する化合物を同定するステップを含む。より具体的には、バイオマーカーポリペプチドまたはペプチドが、Srcチロシンキナーゼ阻害剤バイオマーカーのものである。
【０１６７】
本発明によって表2に記載されるヒトタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドおよび/またはペプチドの活性を調節する化合物を同定するための方法は、プロテインキナーゼの化合物調節物質候補または薬物調節物質候補を混合し、その化合物調節物質候補または薬物調節物質候補がタンパク質キナーゼ阻害剤バイオマーカーポリペプチドまたはペプチドの生物学的活性に及ぼす効果を測定することを含む。そのような測定可能な効果には、例えば物理的結合相互作用、適切なプロテインキナーゼ基質を切断する能力、ネイティブおよびクローン化プロテインキナーゼバイオマーカー発現細胞株に対する効果、ならびに調節物質の効果またはプロテインキナーゼが媒介する他の生理学的尺度の効果が含まれる。
【０１６８】
本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの生物学的活性を調節する化合物を同定するもう一つの方法は、タンパク質チロシンキナーゼ生物学的活性（例えばSrcチロシンキナーゼ）の潜在的なまたは候補的な化合物調節物質または薬物調節物質を、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドを発現させるホスト細胞と混合し、その化合物調節物質候補または薬物調節物質候補がそのタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの生物学的活性に及ぼす効果を測定することを含む。ホスト細胞は、例えば誘導性発現によって、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドを発現させるように誘導することもできる。所与の調節物質候補がタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドに及ぼす生理学的効果も測定することができる。したがって、特定のタンパク質チロシンキナーゼ調節物質（例えばsrcキナーゼ調節物質）に関する細胞アッセイは、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの物理的生物学的活性の直接的測定または定量であるか、生理学的効果の測定または定量であることができる。そのような方法は、好ましくは、本明細書に記載のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドを使用するか、本明細書に記載の発現ベクターを含有する適切なホスト細胞中で過剰発現された組換えタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドを使用し、そこでは、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドが、発現されるか過剰発現されるか、またはアップレギュレートされた発現を起こす。
【０１６９】
本発明のもう一つの態様は、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチド（例えばSrcキナーゼバイオマーカーポリペプチド）の生物学的活性を調節する能力を持つ化合物のスクリーニング方法を包含する。本方法は、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはその機能的ペプチドもしくは一部分をコードする核酸配列（例えば、本明細書の表2または配列表に記載するsrcポリペプチド、タンパク質、ペプチド、またはフラグメント配列）を保因する発現ベクターを含有するホスト細胞を用意すること、発現されたタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの生物学的活性を調節物質化合物の非存在下で決定すること、細胞を調節物質化合物と接触させること、および発現されたタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの生物学的活性を調節物質化合物の存在下で決定することを含む。そのような方法では、調節物質化合物の存在下と調節物質化合物の非存在下でのタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの活性の相違が、その化合物の調節効果を示す。
【０１７０】
基本的に任意の化学化合物を、本発明のアッセイにおける潜在的調節物質またはリガンドとして使用することができる。タンパク質チロシンキナーゼ調節物質として試験される化合物は、任意の小化学化合物または生物学的実体（例えばタンパク質、糖、核酸、または脂質）であることができる。試験化合物は典型的には小さな化学分子またはペプチドである。一般に、潜在的調節物質として使用される化合物は、水溶液または有機（例えばDMSOに基づく）溶液に溶解することができる。アッセイは、アッセイステップを自動化し、任意の都合の良い供給源から化合物を用意することによって、大きな化合物ライブラリーをスクリーニングするように設計される。アッセイは典型的には並列的に、例えばロボットを利用したアッセイでマイクロタイタープレート上、マイクロタイターフォーマットで行われる。化学化合物の供給者は、例えばSigma（ミズーリ州セントルイス）、Aldrich（ミズーリ州セントルイス）、Sigma-Aldrich（ミズーリ州セントルイス）、Fluka Chemika-Biochemica Analytika（スイス・ブックス）など、数多く存在する。また、当技術分野で知られる方法によって化合物を合成することもできる。
【０１７１】
本明細書に記載の新規タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカー（例えばsrcバイオマーカー）ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの調節物質の検出には、特に、ハイスループットスクリーニング法が想定される。そのようなハイスループットスクリーニング法では、典型的には、多数の潜在的治療化合物（例えばリガンドまたは調節物質化合物）を含有するコンビナトリアル化合物またはペプチドライブラリーを用意する。次に、所望する特徴的活性を示すライブラリーメンバー（例えば特定の化学種または化学サブクラス）を同定するために、1つ以上のアッセイで、そのコンビナトリアル化合物ライブラリーまたはリガンドライブラリーをスクリーニングする。そうして同定された化合物は、通常のリード化合物として役立つか、またはそれら自体を、潜在的または現実の治療剤として使用することができる。
【０１７２】
コンビナトリアル化合物ライブラリーは、化学的合成または生物学的合成のいずれかによって作成され、いくつかの化学的ビルディングブロック（すなわちアミノ酸などの試薬）を組み合わせることによって製造される、多様な化学化合物の収集物である。一例として、リニア（linear）コンビナトリアルライブラリー（例えばポリペプチドまたはペプチドライブラリー）は、所与の化合物長（すなわちポリペプチドまたはペプチド化合物中のアミノ酸数）に関して、一組の化学的ビルディングブロックを考えうる全ての組み合わせて方で組み合わせることによって作成される。そのような化学的ビルディングブロックのコンビナトリアルな混合により、何百万という化学化合物を合成することができる。
【０１７３】
コンビナトリアル化合物ライブラリーの製造およびスクリーニングは当業者にはよく知られている。コンビナトリアルライブラリーには、ペプチドライブラリー（例えば米国特許第5,010,175号；Furka, 1991, Int. J. Pept. Prot. Res., 37:487-493；およびHoughtonら, Nature, 354:84-88 (1991)）などがあるが、これらに限るわけではない。化学的多様性ライブラリーを作成するための他の化学も使用することができる。化学的多様性ライブラリーの限定でない例には、ペプトイド（PCT公開番号WO 91/019735）、コード化されたペプチド（PCT公開番号WO 93/20242）、ランダムバイオオリゴマー（PCT公開番号WO 92/00091）、ベンゾジアゼピン類（米国特許第5,288,514号）、ダイバーソマー（diversomer）（例えばヒダントイン類、ベンゾジアゼピン類、およびジペプチド類）（Hobbsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6909-6913 (1993)）、ビニロガス（vinylogous）ポリペプチド（Hagiharaら, J. Amer. Chena. Soc., 114:6568 (1992)）、グルコーススキャフォールドを持つ非ペプチド型ペプチドミメティック（Hirschmannら, J. Amer. Chenu. Soc., 114:9217-9218 (1992)）、小化合物ライブラリーの類似有機合成（Chenら, J. Amer. Chen. Soc., 116:2661 (1994)）、オリゴカルバメート類（Choら, Science, 261:1303 (1993)）および/またはペプチジルホスホネート（Campbellら, J. Org. Chez., 59:658 (1994)）、核酸ライブラリー（Ausubel, BergerおよびSambrook, いずれも前掲）、ペプチド核酸ライブラリー（米国特許第5,539,083号）、抗体ライブラリー（例えばVaughnら, Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996)およびPCT/US96/10287）、糖質ライブラリー（例えばLiangら, Science, 274-1520-1522 (1996)および米国特許第5,593,853号）、小有機分子ライブラリー（例えばベンゾジアゼピン類、Baum, C & EN, p.33 (Jan. 18, 1993)および米国特許第5,288,514号）、イソプレノイド類（米国特許第5,569,588号）、チアゾリジノン類およびメタチアザノン類（米国特許第5,549,974号）、ピロリジン類（米国特許第5,525,735号および同第5,519,134号）、モルホリノ化合物（米国特許第5,506,337号）などがある。
【０１７４】
コンビナトリアルライブラリーを製造するための装置は市販されている（例えば357 MPS、390 MPS、Advanced Chem Tech（ケンタッキー州ルイビル）；Symphony、Rainin（マサチューセッツ州ウォーバーン）；433A、Applied Biosystems（カリフォルニア州フォスターシティ）；9050 Plus、Millipore（マサチューセッツ州ベッドフォード））。さらにまた、コンビナトリアルライブラリーも数多く市販されている（例えばComGenex（ニュージャージー州プリンストン）；Asinex（ロシア・モスクワ）；Tripos, Inc.（ミズーリ州セントルイス）；ChemStar, Ltd.（ロシア・モスクワ）；3D Pharmaceuticals（ペンシルバニア州エクストン）；Martek Biosciences（メリーランド州コロンビアなど）。
【０１７５】
ある態様において、本発明は、チロシンキナーゼタンパク質/ポリペプチド/ペプチドを発現させる細胞または組織が固相基体に取付けられた、ハイスループットフォーマットの固相ベースインビトロアッセイを提供する。そのようなハイスループットアッセイでは、1日に数千もの異なる調節物質またはリガンドをスクリーニングすることができる。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルを使って、選択した潜在的調節物質に対して、別々のアッセイを行ったり、あるいは濃度またはインキュベーション時間の効果を観察すべき場合には、それぞれ5〜10個のウェルを使って、1つの調節物質を試験することができる。したがって、1枚の標準的マイクロタイタープレートを使って、約96個の調節物質をアッセイすることができる。1536ウェルプレートを使用する場合は、1枚のプレートで約100〜約1500個の異なる化合物を、容易にアッセイすることができる。1日につき数枚の異なるプレートをアッセイすることが可能であり、したがって例えば、記載の統合システムを使って、約6,000〜20,000個もの異なる化合物のアッセイスクリーニングを行うことができる。
【０１７６】
本発明は、そのもう一つの態様において、所与のタンパク質、すなわちチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはペプチド（例えばSrcチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはペプチド）に結合することができる小分子の検出または同定を伴う、スクリーニングおよび小分子（例えば薬物）検出アッセイを包含する。特に好ましいのは、ハイスループットスクリーニング法に適したアッセイである。
【０１７７】
そのような結合に基づく検出、同定、またはスクリーニングアッセイでは、機能アッセイは通例、必要でない。一般的には、ターゲットタンパク質（好ましくは実質的に精製されたもの）および化合物（例えばリガンド、薬物、または小分子）のライブラリーもしくはパネル、またはタンパク質ターゲットへの結合に関してスクリーニングまたはアッセイされるべき生物学的実体があれば十分である。好ましくは、ターゲットタンパク質に結合するほとんどの小分子が、そのタンパク質上の機能的領域または機能的部位への優先的かつより高アフィニティーな結合によって、何らかの形で、ターゲットの活性を調節する。
【０１７８】
そのようなアッセイの一例は、Pantolianoらの米国特許第6,020,141号および同第6,036,920号に記載されている蛍光ベースの熱シフトアッセイ（3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc.（3DP）（ペンシルバニア州エクストン）である（J. Zimmermanら, Gen Eng, News, 20(8) (2000)も参照されたい）。このアッセイでは、発現された（好ましくは精製された）チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質/ポリペプチド/ペプチド（例えばSrcチロシンキナーゼ）に結合する小分子を、タンパク質-薬物またはリガンド複合体の熱アンフォールディング曲線を解析することによる結合アフィニティー決定に基づいて検出することができる。所望であれば、この技法によって決定される薬物または結合分子を、その分子がターゲットタンパク質の機能または活性に影響を及ぼすかどうか、またはターゲットタンパク質の機能または活性を調節するかどうかを決定するために、本明細書に記載するような方法によって、さらにアッセイすることができる。
【０１７９】
生物学的結合またはリガンド結合アッセイを測定するためのチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはペプチド（例えばSrcチロシンキナーゼ）を精製するには、標準的なプロテアーゼインヒビターの存在下で連続的凍結融解サイクル（例えば1〜3回）を行うことによって調製することができる全細胞溶解物を、供給源とすることができる。チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドは、標準的なタンパク質精製方法（例えば本明細書に記載する特異的抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー）によって、またはやはり本明細書に記載する組換えチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチド分子中に工学的に導入されたエピトープタグに特異的なリガンドによって、部分的にまたは完全に精製することができる。次に、記載のとおり、結合活性を測定することができる。
【０１８０】
本明細書に提示する方法に従って同定される、本発明のチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの生物学的活性または生理機能を調節または制御する化合物は、本発明の好ましい実施形態である。そのような調節化合物は、チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチド（例えばSrcチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチド）によって媒介される疾患を処置するための処置方法および治療方法であって、そのような処置を必要とする個体に、治療有効量の、本明細書に記載する方法によって同定される化合物を投与することによる方法に使用することができると考えられる。
【０１８１】
さらにまた、本発明は、本発明のチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドによって媒介される疾患、障害または状態に関して、そのような処置を必要とする個体を処置するための方法であって、その個体に、治療有効量の、本明細書に記載する方法によって同定されるチロシンキナーゼバイオマーカー調節化合物を投与することを含む方法も提供する。本発明によれば、本発明によって包含されるチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはタンパク質には、Srcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびに他のタンパク質チロシンキナーゼ、例えばBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体が含まれる。
【０１８２】
特に本発明は、本発明のSrcバイオマーカーポリペプチドによって媒介される疾患、障害、または状態に関して、そのような処置を必要とする個体を処置するための方法であって、その個体に、治療有効量の、本明細書に記載の方法によって同定されるSrcバイオマーカー調節化合物を投与することを含む方法を提供する。
【０１８３】
本発明はさらに、表2に記載するタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーの1つ以上のアミノ酸配列（好ましくはSrcバイオマーカーアミノ酸配列）を持つポリペプチドのエピトープを含むか、あるいはそのエピトープからなるポリペプチドを包含する。本発明は、本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーのポリペプチド配列のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列も包含する。
【０１８４】
本明細書で使用する用語「エピトープ」は、動物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）中で抗原活性または免疫原活性を持つポリペプチドの部分を指す。好ましい実施形態において、本発明は、エピトープを含むポリペプチド、ならびにこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。本明細書にいう「免疫原エピトープ」とは、当技術分野で知られる任意の方法（例えば後述の抗体作製方法）によって決定される、動物中で抗体応答を惹起するタンパク質の部分を指す（例えばGeysenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998-4002 (1983)を参照されたい）。本明細書で使用する用語「抗原エピトープ」は、当技術分野でよく知られている任意の方法（例えば本明細書に記載するイムノアッセイ）によって決定される、抗体がその抗原に免疫特異的に結合することができるようなタンパク質の部分を指す。免疫特異的結合は、非特異的結合を排除するが、必ずしも他の抗原との交差反応性を排除しない。抗原エピトープは必ずしも免疫原性である必要はない。全長タンパク質または抗原性ペプチドフラグメントのいずれかを使用することができる。抗体は、好ましくは、エピトープを含むチロシンキナーゼバイオマーカー核酸およびタンパク質配列中のこれらの領域から、またはエピトープを含むチロシンキナーゼバイオマーカー核酸およびタンパク質配列中の領域内の離散したフラグメントから作製される。エピトープとして機能するポリペプチドまたはペプチドフラグメントは、任意の通常の手段によって製造することができる（例えばHoughten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5131-5135 (1985)；および米国特許第4,631,211号に記載されているものを参照されたい）。
【０１８５】
さらにまた、抗体は、本明細書に記載のSrcキナーゼバイオマーカーを含むタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーのポリペプチドおよびペプチドの任意の領域から作製することもできる。さらにまた、ポリペプチドが受容体タンパク質である場合、抗体は、レセプター全体またはレセプターの一部分（例えば細胞内カルボキシ末端ドメイン、アミノ末端細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン全体、特定の膜貫通セグメント、細胞内もしくは細胞外ループのいずれか、またはこれらの領域の任意の部分）に対して産生させることができる。抗体は、特定の機能部位、例えばリガンド結合の部位、または糖鎖付加、リン酸化、ミリスチル化、もしくはアミド化される部位に対して産生させることもできる。
【０１８６】
本発明において、抗体を生成させるための抗原エピトープは、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、より好ましくは少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、最も好ましくは約15〜約30個のアミノ酸残基の配列を含有する。免疫原エピトープまたは抗原エピトープを含む好ましいポリペプチドは、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100アミノ酸残基長である。他の好ましい抗原エピトープとして、本明細書に開示する抗原エピトープ、その一部、ならびにそれら抗原エピトープの2、3、4、5個またはそれ以上の任意の組合せが挙げられるが、これらに限るわけではない。そのような抗原エピトープは、イムノアッセイにおけるターゲット分子として使用することができる（例えばWilsonら, Cell, 37:767-778 (1984)；およびSutcliffeら, Science, 219:660-666 (1983)）。ただし、本明細書に記載するフラグメントは、本発明より前に開示されていたかもしれないフラグメントを包含すると解釈すべきではない。
【０１８７】
抗体応答を惹起する1つ以上の免疫原エピトープを含むタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドは、担体タンパク質と一緒に、動物系（例えばウサギまたはマウス）に導入することができる。あるいは、ポリペプチドが十分な長さ（例えば少なくとも約15〜25アミノ酸）を持つ場合は、そのポリペプチドを担体なしで提示することもできる。しかし、わずか5〜10個程度のアミノ酸を含む免疫原エピトープでも、（例えばウェスタンブロット法で）変性ポリペプチド中の少なくとも線状エピトープに結合する能力を持つ抗体を産生させるのに十分であることが示されている。
【０１８８】
本発明のエピトープ保持ポリペプチドは、当技術分野においてよく知られる方法（例えば限定するわけではないが、インビボ免疫処置、インビトロ免疫処置、およびファージディスプレイ法）に従って抗体を誘導するために、使用することができる。例えばSutcliffeら、前掲；Wilsonら、前掲；およびBittleら、前掲を参照されたい。インビボ免疫処置を使用する場合は、適当なサイズの遊離ペプチドで動物を免疫処置することができるが、そのペプチドを高分子担体（例えばキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）または破傷風トキソイド（TT））にカップリングすることによって抗ペプチド抗体価を増強することもできる。例えばシステイン残基を含有するペプチドは、マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）などのリンカーを使って担体にカップリングすることができ、他のペプチドはより一般的な連結剤、例えばグルタルアルデヒドを使って、担体にカップリングすることができる。
【０１８９】
エピトープを含有するペプチドは、J. P. Tamら（Biomed. Pept., Proteins, Nucleic Acids, 1(3):123-32 (1995)）およびCalvoら（J. Immunol., 150(4):1403-12 (1993)）によって初めて記載された多抗原ペプチド（MAP）として合成することもでき、これらの文献は参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。MAPは、非免疫原性リジンコアに取付けられた複数コピーの特異的ペプチドを含有する。MAPペプチドは通常、4コピーまたは8コピーのペプチドを含有し、それらはしばしば、MAP4またはMAP8ペプチドと呼ばれる。限定でない例として、MAPは、ポリエチレングリコール-ポリスチレン（PEG-PS）支持体に取付けられたリジンコアマトリックス上に合成することができる。9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）化学を使って、関心対象のペプチドを、リジン残基上に合成する。例えばApplied Biosystems（カリフォルニア州フォスターシティー）から、MAPを合成するために使用することができるMAPレジン（例えばFmoc Resin 4 BranchおよびFmoc Resin 8 Branch）が市販されている。レジンからのMAPの切断は、当技術分野で知られる標準的なトリフルオロ酢酸（TFA）ベースのカクテルを使って行われる。MAPの精製は、脱塩以外は、一般に必要でない。MAPペプチドは、そのMAPと、そのペプチドの由来となったネイティブタンパク質との両方を認識する抗体を惹起する免疫ワクチンに使用することができる。
【０１９０】
本発明のエピトープ保持ペプチドは、ウイルスのコートタンパク質中に組み入れることもでき、次にそれを、抗エピトープ抗体の産生を刺激する目的で動物（ヒトを含む）を免疫処置するための免疫原またはワクチンとして使用することができる。例えば、ヒト免疫不全ウイルスタイプ1（HIV-1）のgp120糖タンパク質のV3ループが、ライノウイルスの表面上に発現されるように操作されている。V3ループペプチドをディスプレイするライノウイルスによる免疫処置は、有効と思われるHIV-1免疫原ミメティックをもたらした（抗HIV-1抗体によって中和されるというその能力、ならびに細胞培養においてHIV-1を中和する能力を持つ抗体の産生を惹起するその能力によって測定）。操作されたウイルス粒子を免疫原として使用するというこの技法は、Smithら, Behring Inst Mitt Feb, (98):229-239 (1997)；Smithら, J. Virol., 72:651-659 (1998)；およびZhangら, Biol. Chem., 380:365-374 (1999)に詳述されており、これらの文献は参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【０１９１】
さらにまた、本発明のエピトープを含有するポリペプチドまたはペプチドは、例えばペプチドのアミノ末端および/またはカルボキシ末端にアミノ酸を付加することなどによって改変することができる。そのような改変は、例えば、ネイティブタンパク質中のエピトープに、より密接に関連するコンフォメーションを持つことになるように、エピトープ保持ポリペプチドのコンフォメーションを変化させるなどの目的で行われる。本発明の改変エピトープ保持ポリペプチドの一例は、2つのシステイン間でのジスルフィド結合の形成を可能とし、それゆえに非還元性条件下でエピトープ保持ポリペプチドの安定なループ構造をもたらすように、1つ以上のシステイン残基がポリペプチドに付加されているポリペプチドである。ジスルフィド結合は、ポリペプチドに付加されシステイン残基と、天然エピトープのシステイン残基との間で形成するか、またはどちらも天然エピトープ保持ポリペプチドに付加された2つのシステイン間で形成することができる。
【０１９２】
さらにまた、ジスルフィド結合したループ構造の形成を促進するために、天然エピトープ保持ポリペプチドの1つ以上のアミノ酸残基を、システインによる置換で改変することも可能である。合成ペプチドの環状チオエーテル分子は、常法により、例えばPCT公開公報WO 97/46251（これは参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）に記載されているような当技術分野で知られる技法を使って作製することができる。本発明によって想定されるエピトープ保持ポリペプチドの他の改変には、ビオチン化が含まれる。
【０１９３】
インビボで抗体を産生させるために、ホスト動物（例えばウサギ、ラット、マウス、ヒツジ、またはヤギ）を、遊離の、または担体とカップリングした、ペプチドまたはMAPペプチドを使って、例えば腹腔内注射および/または皮下注射によって免疫処置する。注射物質は、典型的には、ペプチドまたは担体タンパク質とフロイントアジュバントまたは免疫応答を刺激することで知られている他の任意のアジュバントとを含有する乳剤である。固体表面に吸着させた遊離ペプチドを用いるELISAアッセイなどで検出することができる抗ペプチド抗体の有用な力価を得るには、例えば約2週間の間隔で、数回の追加免疫注射が必要かもしれない。免疫処置した動物から得られる血清中の抗ペプチド抗体の力価は、例えば、当技術分野でよく知られる方法に従って、固形支持体へのペプチドの吸着などによって抗ペプチド抗体を選択し、選択された抗体を溶出させることにより、増加させることができる。
【０１９４】
当業者には理解されるであろうように、または上述のとおり、免疫原エピトープまたは抗原エピトープを含む本発明のチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチド（これには例えば、Src、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLynなどのSrcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、ならびにBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体などといった他のタンパク質チロシンキナーゼが含まれる）は、他のポリペプチド配列と融合することができる。例えば本発明のポリペプチドを、免疫グロブリンの定常ドメイン（IgA、IgE、IgG、IgDまたはIgM）もしくはその一部（例えばCH1、CH2、CH3）、またはそれらの任意の組合せ、およびその一部と融合するか、アルブミン（限定するわけではないが、組換えヒトアルブミンを含む）、またはそのフラグメントもしくは変異体（例えば、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる米国特許第5,876,969号；EP特許第0 413 622号；および米国特許第5,766,883号を参照されたい）と融合して、キメラポリペプチドを生じさせることができる。そのような融合タンパク質は精製を容易にしうると共に、生体内半減期を増加させうる。これは、ヒトCD4ポリペプチドの最初の2つのドメインと哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域のさまざまなドメインとを含有するキメラタンパク質について示されている（例えばTrauneckerら, Nature, 331:84-86 (1988)を参照されたい）。
【０１９５】
FcRn結合パートナー（例えばIgGまたはFcフラグメント）にコンジュゲートした抗原（例えばインスリン）では、上皮性関門を横切ってなされる免疫系への抗原の送達が強化されることが実証されている（例えばPCT公開WO96/22024およびWO 99/04813を参照されたい）。IgG部分のジスルフィド結合ゆえにジスルフィドで連結された二量体構造を持つIgG融合タンパク質は、単量体型ポリペプチドまたはそのフラグメントだけの場合よりも効率よく、他の分子を結合し中和することも見出されている（例えばFountoulakisら, J. Biochem., 270:3958-3964 (1995)を参照されたい）。
【０１９６】
エピトープをコードする核酸は、発現されたポリペプチドの検出および精製を助けるためのエピトープタグ（例えば赤血球凝集素（「HA」）タグまたはフラッグ（flag）タグ）として、関心対象の遺伝子と組換えることもできる。例えばヒト細胞株中で発現された非変性融合タンパク質を迅速精製するための系が、Janknechtら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8972-897 (1991)）によって記載されている。この系では、関心対象の遺伝子を、そのポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームが6個のヒスチジン残基を持つアミノ末端タグに翻訳的に融合されるように、ワクシニア組換えプラスミドにサブクローニングする。このタグは融合タンパク質のマトリックス結合ドメインとして役立つ。その組換えワクシニアウイルスに感染させた細胞から得た抽出物をNi2+ニトリロ酢酸-アガロースカラムにのせ、ヒスチジンタグ付きタンパク質をイミダゾール含有バッファーで選択的に溶出させる。
【０１９７】
遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エキソンシャフリング、および/またはコドンシャフリング（「DNA」シャフリングと総称する）の技法を使って、さらなる本発明の融合タンパク質を作製することができる。DNAシャフリングを使って、本発明のポリペプチドの活性を調節することができ、そのような方法を使って、活性が変化したポリペプチドを生成させると共に、そのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成させることができる。一般論については、例えば米国特許第5,605,793号；同第5,811,238号；同第5,830,721号；同第5,834,252号；および同第5,837,458号、ならびにPattenら, Curr. Opinion Biotechnol., 8:724-33 (1997)；Harayama, Trends Biotechnol., 16(2):76-82 (1998)；Hanssonら, J. Mol. Biol., 287:265-276 (1999)；ならびにLorenzoおよびBlasco, Biotechniques, 24(2):308-313 (1998)を参照されたい（これら各文献の内容は参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。
【０１９８】
本発明の一実施形態において、表2に記載のsrcバイオマーカーポリヌクレオチド配列の1つ以上に対応するポリヌクレオチドおよびそれらのポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、DNAシャフリングによって変化させることができる。DNAシャフリングでは、ポリヌクレオチド配列を変異させるために、相同組換えまたは部位特異的組換えによって2つ以上のDNAセグメントを集合させる。本発明のもう一つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらがコードするポリペプチドを、組換えに先だって、エラープローンPCR、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法によるランダムミュタポリヌクレオチドシス（mutapolynucleotidesis）に付すことによって、変化させることができる。もう一つの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの1つ以上のコンポーネント、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどを、1つ以上の異種分子の1つ以上のコンポーネント、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどと組換えることができる。
【０１９９】
本発明のもう一つの実施形態は、本発明の、表2に記載のsrcバイオマーカーアミノ酸配列の1つ以上のポリペプチド、ポリペプチドフラグメントもしくは変異体、および/またはそのエピトープに免疫特異的に結合する（特異的な抗体-抗原結合をアッセイするための当技術分野でよく知られるイムノアッセイによって決定される）、抗体およびT細胞抗原受容体（TCR）に関する。
【０２００】
二重特異性抗体または二機能性抗体は、2つの異なる重鎖/軽鎖対と2つの異なる結合部位とを持つ人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab'フラグメントの連結などといったさまざまな方法によって製造することができる（例えばSongsivilaiおよびLachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990)；Kostelnyら, J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)を参照されたい）。さらにまた、二重特異性抗体は、「ダイアボディ（diabody）」（Holligerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照されたい）または「ヤヌシン（Janusin）」（Trauneckerら, EMBO J., 10:3655-3659 (1991)およびTrauneckerら, Int. J. Cancer Suppl. 7:51-52 (1992)を参照されたい）として、形成させることもできる。
【０２０１】
本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、Fab発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Id）抗体（例えば本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む）、細胞内で産生される抗体（すなわちイントラボディ（intrabody））、および上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントが含まれるが、これらに限るわけではない。本明細書で使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分またはフラグメント、すなわち抗原を免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のどのタイプ（例えばIｇG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY）、クラスもしくはサブクラス（例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）であってもよい。好ましくは、免疫グロブリンはIgG1、IgG2、またはIgG4アイソタイプである。
【０２０２】
免疫グロブリンは重鎖と軽鎖の両方を持ちうる。一連のIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY重鎖はカッパタイプまたはラムダタイプの軽鎖と対にすることができる。最も好ましくは、本発明の抗体はヒト抗原結合性の抗体および抗体フラグメントであり、これには、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、単鎖Fvs（scFv）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Fvs（sdFv）、およびVLまたはVHドメインのどちらか一方を含むフラグメントが含まれるが、これらに限るわけではない。抗原結合性抗体フラグメント（単鎖抗体を含む）は、可変領域を単独で、またはヒンジ領域、ならびにCH1、CH2およびCH3ドメインの全部または一部と組み合わせて、含むことができる。また、本発明に関連して、可変領域とヒンジ領域ならびにCH1、CH2およびCH3ドメインとの任意の組合せを含む抗原結合性フラグメントも包含される。本発明の抗体は、鳥および哺乳動物を含む任意の動物に由来することができる。好ましくは抗体は、ヒト、ネズミ（例えばマウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ由来である。本明細書にいう「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を持つ抗体が包含され、後述のように、そしてまた例えば米国特許第5,939,598号に記載されているように、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体または1つ以上のヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックであって内在性免疫グロブリンを発現させない動物から単離された抗体が包含される。
【０２０３】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多重特異性を持つことができる。多重特異性抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であるか、本発明のポリペプチドと異種エピトープ（例えば異種ポリペプチドまたは固形支持体材料）との両方に対して特異的であることができる（例えばWO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tuttら, J. Immunol., 147:60-69 (1991)；米国特許第4,474,893号；同第4,714,681号；同第4,925,648号；同第5,573,920号；同第5,601,819号；ならびにKostelnyら, J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)を参照されたい。
【０２０４】
本発明の抗体は、それらが認識しまたは特異的に結合する本発明のポリペプチドのエピトープまたは部分という観点から、説明し、指定することができる。エピトープまたはポリペプチド部分は、例えばN末端およびC末端の位置によって、または近接するアミノ酸残基のサイズによって、または本明細書の表2に定義する配列に提示するとおりに、指定することができる。さらに、本発明によれば、本明細書に記載するストリンジェントな（または中等度にストリンジェントな）ハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに結合する抗体も包含される。
【０２０５】
本発明の抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含む分子、あるいはその抗体フラグメントまたは変異体からなる分子を含む）は、本発明のヒトタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメント、または本発明のヒトタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーの変異体（例えば、表2に記載のSrcバイオマーカータンパク質、および/またはサルsrcバイオマーカータンパク質）に免疫特異的に結合することができる。
【０２０６】
限定でない例として、ある抗体が第1の抗原に、第2の抗原に対するその抗体の解離定数（Kd）よりも小さいKdで結合する場合、その抗体は第1の抗原に優先的に結合するとみなすことができる。もう一つの限定でない実施形態において、ある抗体が第1の抗原に、第2の抗原に対するその抗体のKaよりも少なくとも一桁低いアフィニティーで結合する場合、その抗体は第1の抗原に優先的に結合するとみなすことができる。もう一つの限定でない実施形態において、ある抗体が第1の抗原に、第2の抗原に対するその抗体のKdよりも少なくとも2桁低いアフィニティーで結合する場合、その抗体は第1の抗原に優先的に結合するとみなすことができる。
【０２０７】
もう一つの限定でない実施形態において、ある抗体が第1の抗原に、第2の抗原に対するその抗体の解離速度（koff）よりも小さい低いkoffで結合する場合、その抗体は第1の抗原に優先的に結合するとみなしうる。もう一つの限定でない実施形態において、ある抗体が第1の抗原に、第2の抗原に対するその抗体のkoffよりも少なくとも1桁低いアフィニティーで結合する場合、その抗体は第1の抗原に優先的に結合するとみなすことができる。もう一つの限定でない実施形態において、ある抗体が第1の抗原に、第2の抗原に対するその抗体のkoffよりも少なくとも2桁低いアフィニティーで結合する場合、その抗体は第1の抗原に優先的に結合するとみなすことができる。
【０２０８】
本発明の抗体は、本発明のチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチド（例えばSrcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えばSrc、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLyn、ならびにBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体を含む他のタンパク質チロシンキナーゼ）に対するその結合アフィニティーという観点から、説明し、指定することもできる。好ましい結合アフィニティーには、5×10-2M未満、1×10-2M未満、5×10-3M未満、1×10-3M未満、5×10-4M未満、または1×10-4M未満の解離定数すなわちKdを持つものが含まれる。より好ましい結合アフィニティーには、5×10-5M未満、1×10-5M未満、5×10-6M未満、1×10-6M未満、5×10-7M未満、1×10-7M未満、5×10-8M未満、または1×10-8M未満の解離定数すなわちKdを持つものが含まれる。さらに好ましい抗体結合アフィニティーには、5×10-9M未満、1×10-9M未満、5×10-10M未満、1×10-10M未満、5×10-11M未満、1×10-11M未満、5×10-12M未満、1×10-12M未満、5×10-13M未満、1×10-13M未満、5×10-14M未満、1×10-14M未満、5×10-15M未満、または1×10-15M未満の解離定数すなわちKdを持つものが含まれる。
【０２０９】
具体的実施形態において、本発明の抗体は、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチド、またはそのフラグメント、もしくは変異体に、約5×10-2秒-1以下、1×10-2秒-1以下、5×10-3秒-1以下、または1×10-3秒-1以下の解離速度（koff）で結合する。より好ましくは、本発明の化合物は、srcバイオマーカータンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に、約5×10-4秒-1以下、1×10-4秒-1以下、5×10-5秒-1以下、1×10-5秒-1以下、5×10-6秒-1以下、1×10-6秒-1以下、5×10-7秒-1以下、または1×10-7秒-1以下の解離速度（koff）で結合する。
【０２１０】
別の実施形態では、本発明の抗体がタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に、1×103M-1秒-1以上、5×103M-1秒-1以上、1×104M-1秒-1以上、または5×104M-1秒-1以上の会合速度（kon）で結合する。より好ましくは、本発明の抗体は、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に、1×105M-1秒-1以上、5×105M-1秒-1以上、1×106M-1秒-1以上、5×10-6M-1秒-1以上、または1×10-7M-1秒-1以上の会合速度で結合する。
【０２１１】
本発明は、競合的結合を決定するための当技術分野で知られる任意の方法（例えば本明細書に記載のイムノアッセイ）によって決定される、本発明のエピトープへの抗体の結合を競合的に阻害する抗体も提供する。好ましい実施形態では、その抗体が、エピトープへの結合を、競合的に、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、または少なくとも50％阻害する。
【０２１２】
本発明の抗体は、本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる。例えば本発明は、受容体/リガンドと本発明のポリペプチドとの相互作用を部分的にまたは完全に妨害する抗体を包含する。本発明は、受容体特異的抗体とリガンド特異的抗体をどちらも包含する。本発明は、リガンド結合を妨げないが、受容体活性化を妨げる、受容体特異的抗体も包含する。受容体活性化（すなわちシグナリング）は、本明細書に記載する技法によって決定するか、当技術分野で知られる他の方法で決定することができる。例えば、免疫沈降法と、それに続くウェスタンブロット解析とを使って、受容体またはその基質の（例えばチロシンまたはセリン/スレオニンでの）リン酸化を検出することにより、受容体活性化を決定することができる。具体的実施形態では、リガンド活性または受容体活性を、その抗体の非存在下での活性の少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％または少なくとも50％阻害する抗体が提供される。
【０２１３】
本発明のもう一つの実施形態では、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーまたはそのフラグメントもしくは変異体に免疫特異的に結合する抗体が、本発明の抗タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカー抗体発現細胞株によって発現される重鎖のいずれか一つおよび/または本発明の抗タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカー抗体発現細胞株によって発現される軽鎖のいずれか一つのアミノ酸配列を持つポリペプチドを含む。
【０２１４】
本発明のもう一つの実施形態では、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質またはそのフラグメントもしくは変異体に免疫特異的に結合する抗体が、抗タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカー抗体発現細胞株によって発現される重鎖のVHドメインのいずれか一つ、および/または抗タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカー抗体発現細胞株によって発現される軽鎖のVLドメインのいずれか一つのアミノ酸配列を持つポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、本発明の抗体が、単一の抗タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現されるVHドメインおよびVLドメインのアミノ酸配列を含む。これに代わる実施形態では、本発明の抗体が、2つの異なる抗タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカー抗体発現細胞株によって発現されるVHドメインとVLドメインのアミノ酸配列を含む。
【０２１５】
チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質（例えばSrcチロシンキナーゼ）に免疫特異的に結合する抗タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカー抗体発現細胞株によって発現されるVHおよび/またはVLドメインの抗体フラグメントまたは変異体を含むか、あるいはそれらからなる分子も、それらVHおよびVLドメイン、分子、フラグメントおよび/または変異体をコードする核酸分子と同様に、本発明に包含される。
【０２１６】
本発明は、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質（例えばSrcキナーゼバイオマーカータンパク質）のポリペプチド、またはポリペプチドフラグメントもしくは変異体に免疫特異的に結合する抗体であって、1つ以上の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現される重鎖に含有されるVH CDRの任意の1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むか、あるいはそのようなポリペプチドからなる抗体も提供する。特に本発明は、タンパク質キナーゼバイオマーカータンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、1つ以上の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現される重鎖に含有されるVH CDR1のアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むもの、あるいはそのようなポリペプチドからなるものを提供する。もう一つの実施形態では、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質に免疫特異的に結合する抗体が、1つ以上の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現される重鎖に含有されるVH CDR2のアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むか、あるいはそのようなポリペプチドからなる。好ましい実施形態では、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質に免疫特異的に結合する抗体が、1つ以上の本発明の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現される重鎖に含有されるVH CDR3のアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むか、あるいはそのようなポリペプチドからなる。これらの抗体またはその抗体フラグメントもしくは変異体を含む分子、あるいはこれらの抗体またはその抗体フラグメントもしくは変異体からなる分子も、これらの抗体、分子、フラグメントおよび/または変異体をコードする核酸分子と同様に、本発明に包含される。
【０２１７】
本発明は、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質（例えばSrcキナーゼバイオマーカータンパク質）のポリペプチド、またはポリペプチドフラグメントもしくは変異体に免疫特異的に結合する抗体であって、1つ以上の本発明の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現される重鎖内に含有されるVL CDRの任意の1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むか、あるいはそのようなポリペプチドからなる抗体も提供する。特に本発明は、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質に免疫特異的に結合する抗体であって、1つ以上の本発明の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現される重鎖内に含有するVL CDR1のアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むか、あるいはそのようなポリペプチドからなる抗体を提供する。もう一つの実施形態では、srcバイオマーカータンパク質に免疫特異的に結合する抗体が、1つ以上の本発明の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現される重鎖に含有されるVL CDR2のアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むか、あるいはそのようなポリペプチドからなる。好ましい実施形態では、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質に免疫特異的に結合する抗体が、1つ以上の本発明の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現される重鎖に含有するVL CDR3のアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むか、そのようなポリペプチドからなる。チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質またはそのチロシンキナーゼバイオマーカータンパク質フラグメントもしくは変異体に免疫特異的に結合するこれらの抗体、またはその抗体フラグメントもしくは変異体を含む分子、あるいはこれらの抗体、またはその抗体フラグメントもしくは変異体からなる分子も、これらの抗体、分子、フラグメントおよび/または変異体をコードする核酸分子と同様に、本発明に包含される。
【０２１８】
本発明は、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質、ポリペプチドまたはチロシンキナーゼバイオマーカータンパク質（例えばSrcバイオマーカータンパク質）のポリペプチドフラグメントもしくは変異体に免疫特異的に結合する抗体（抗体フラグメントまたは変異体を含む分子、あるいは抗体フラグメントまたは変異体からなる分子を含む）であって、1つ以上の本発明の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現される重鎖または軽鎖に含有される1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のVH CDRおよび1つ、2つ、3つまたはそれ以上のVL CDRを含む、あるいはそれらからなる抗体も提供する。特に本発明は、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントもしくは変異体に免疫特異的に結合する抗体であって、1つ以上の本発明の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現される重鎖または軽鎖免疫グロブリン分子に含有されるVH CDRとVL CDRのうち、VH CDR1とVL CDR1、VH CDR1とVL CDR2、VH CDR1とVL CDR3、VH CDR2とVL CDR1、VH CDR2とVL CDR2、VH CDR2とVL CDR3、VH CDR3とVH CDR1、VH CDR3とVL CDR2、VH CDR3とVL CDR3、またはその任意の組合せを含む、あるいはそれらからなる抗体を提供する。好ましい実施形態では、これらの組合せの一つ以上が、単一の、本発明の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株に由来する。チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質に免疫特異的に結合するこれらの抗体のフラグメントまたは変異体を含む分子、あるいはそれらからなる分子も、これらの抗体、分子、フラグメントまたは変異体をコードする核酸分子と同様に、本発明に包含される。
【０２１９】
本発明は、本発明の抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含む分子、あるいはその抗体フラグメントまたは変異体からなる分子を含む）をコードする核酸分子（一般に単離されたもの）も提供する。具体的実施形態において、本発明の核酸分子は、本発明の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現される重鎖のVHドメインのいずれか一つのアミノ酸配列を持つVHドメインと、本発明の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現される軽鎖のアミノ酸配列を持つVLドメインとを含むか、あるいはそれらからなる抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含む分子、あるいはその抗体フラグメントまたは変異体からなる分子を含む）をコードする。もう一つの実施形態では、本発明の核酸分子が、本発明の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現される重鎖のVHドメインのいずれか一つのアミノ酸配列を持つVHドメイン、または本発明の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現される軽鎖のアミノ酸配列を持つVLドメインを含むか、あるいはそれらからなる抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含む分子、あるいはその抗体フラグメントまたは変異体からなる分子を含む）をコードする。
【０２２０】
本発明は、本明細書に記載する抗体分子（例えばVHドメインおよび/またはVLドメイン）の変異体（誘導体を含む）を含む、あるいはそれらからなる抗体であって、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質（例えばSrcチロシンキナーゼポリペプチド）またはそのフラグメントもしくは変異体に免疫特異的に結合する抗体も提供する。
【０２２１】
例えばアミノ酸置換をもたらす部位特異的ミュタポリヌクレオチドシスおよびPCRによるミュタポリヌクレオチドシスなど、当業者に知られる標準的技法を使って、本発明の分子をコードするヌクレオチド配列中に突然変異を導入することができる。好ましくは、その分子は免疫グロブリン分子である。また好ましくは、変異体（誘導体を含む）は、基準VHドメイン、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLドメイン、VL CDR1、VL CDR2、またはVL CDR3との比較で、50個未満のアミノ酸置換、40個未満のアミノ酸置換、30個未満のアミノ酸置換、25個未満のアミノ酸置換、20個未満のアミノ酸置換、15個未満のアミノ酸置換、10個未満のアミノ酸置換、5個未満のアミノ酸置換、4個未満のアミノ酸置換、3個未満のアミノ酸置換、または2個未満のアミノ酸置換をコードする。
【０２２２】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野では明確に定められている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を持つアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。あるいは、コード配列の全部または一部にわたって、例えば飽和ミュタポリヌクレオチドシスなどによって、突然変異をランダムに導入することもできる。その結果得られる突然変異体は、活性を保っている突然変異体を同定するために、生物学的活性についてスクリーニングすることができる。
【０２２３】
例えば、抗体分子のフレームワーク領域のみまたはCDR領域のみに突然変異を導入することが可能である。導入される突然変異は、サイレント突然変異または中立ミスセンス突然変異変異であること（すなわち抗体の抗原結合能力に全くまたはほとんど影響を持たないこと）ができる。これらのタイプの突然変異は、コドン使用の最適化またはハイブリドーマ抗体産生の改善に役立ちうる。あるいは、非中立ミスセンス突然変異により、抗体の抗原結合能力を変化させることもできる。最もサイレントかつ中立的なミスセンス突然変異の位置はフレーム領域内にあり、一方、最も非中立的なミスセンス突然変異の位置はCDR内にあるだろうが、これは絶対的要件ではない。当業者は、例えば抗原結合活性の改変がないこと、または結合活性が改変されていること（例えば抗原結合活性の改善または抗体特異性の変化）など、所望の性質を持つ突然変異体分子を設計し、試験することができる。ミュタポリヌクレオチドシス後に、コードされるタンパク質を常法で発現させ、コードされるタンパク質の機能的および/または生物学的活性を、本明細書に記載の技法を使って、または当技術分野において知られ実践されている技法を常法に従って改変することにより、決定することができる。
【０２２４】
ある具体的実施形態において、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に免疫特異的に結合する本発明の抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含む分子、あるいはその抗体フラグメントまたは変異体からなる分子を含む）は、1つ以上の本発明の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現されるVHまたはVLドメインの一つをコードするものに相補的なヌクレオチド配列に、好ましくはストリンジェントな条件（例えば6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）中、フィルターに結合したDNAへの、約45℃でのハイブリダイゼーションと、それに続く、0.2×SSC/0.1％SDS中、約50℃〜65℃での1回以上の洗浄）下、好ましくは高度にストリンジェントな条件（例えば6×SSC中、フィルターに結合した核酸への、約45℃でのハイブリダイゼーションと、それに続く0.1×SSC/0.2％SDS中、約68℃での1回以上の洗浄）下、または当業者に知られる他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えばAusubel, F.M.ら編「Current Protocols in Molecular Biology」Vol. 1（Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons, Inc., ニューヨーク）の 6.3.1-6.3.6頁および2.10.3頁（1989）を参照されたい）下で、ハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、あるいはそのようなアミノ酸配列からなる。これらの抗体をコードする核酸分子も本発明に包含される。
【０２２５】
類似するアミノ酸配列を持つポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体が、しばしば類似する構造を持ち、多くの同じ生物学的活性を持つことは、当技術分野ではよく知られている。したがってある実施形態において、チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドのフラグメントもしくは変異体に免疫特異的に結合する抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含む分子、あるいはその抗体フラグメントまたは変異体からなる分子を含む）は、本発明の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現される重鎖のVHドメインのアミノ酸配列と少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一なアミノ酸配列を持つVHドメインを含むか、あるいはそのようなVHドメインからなる。
【０２２６】
もう一つの実施形態において、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質ポリペプチド、またはチロシンキナーゼバイオマーカータンパク質ポリペプチドのフラグメントもしくは変異体に免疫特異的に結合する抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含む分子、あるいはその抗体フラグメントまたは変異体からなる分子を含む）は、本発明の抗チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質抗体発現細胞株によって発現される軽鎖のVLドメインのアミノ酸配列と少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一なアミノ酸配列を持つVLドメインを含むか、あるいはそのようなVLドメインからなる。
【０２２７】
本発明は、例えばFACS分析または免疫蛍光アッセイなどの当技術分野で知られる任意の方法によって決定した場合に、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質の細胞表面発現をダウンレギュレートする抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含む分子、あるいはその抗体フラグメントまたは変異体からなる分子を含む）も提供する。限定するわけではないが、仮説として、そのようなダウンレギュレーションは、抗体が誘発するチロシンキナーゼバイオマーカータンパク質の内在化の結果でありうる。そのような抗体は、本発明の抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体のアミノ酸配列を持つVHまたはVLドメインの一部（例えばVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、またはVL CDR3）を含むか、あるいはそのような一部からなることができる。
【０２２８】
もう一つの実施形態において、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質の細胞表面発現をダウンレギュレートする抗体は、本発明の抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体のVHドメインおよび本発明の抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体のVLドメインのアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むか、あるいはそのようなポリペプチドからなる。もう一つの実施形態では、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質の細胞表面発現をダウンレギュレートする抗体が、単一の本発明の抗体（またはscFvもしくはFabフラグメント）またはそのフラグメントもしくは変異体に由来するVHドメインおよびVLドメインのアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むか、あるいはそのようなポリペプチドからなる。もう一つの実施形態では、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質の細胞表面発現をダウンレギュレートする抗体が、本発明の抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体の、VHドメインのアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むか、あるいはそのようなポリペプチドからなる。もう一つの実施形態では、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質の細胞表面発現をダウンレギュレートする抗体が、本発明の抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体のVLドメインのアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むか、あるいはそのようなポリペプチドからなる。
【０２２９】
好ましい一実施形態では、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質の細胞表面発現をダウンレギュレートする抗体が、本発明の抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体のVH CDR3のアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むか、あるいはそのようなポリペプチドからなる。もう一つの好ましい実施形態では、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質の細胞表面発現をダウンレギュレートする抗体が、本発明の抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体のVL CDR3のアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むか、あるいはそのようなポリペプチドからなる。これらの抗体をコードする核酸分子も本発明に包含される。
【０２３０】
もう一つの好ましい実施形態では、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質の活性を強化する抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体が、本発明の抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体のVL CDR3のアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むか、あるいはそのようなポリペプチドからなる。これらの抗体をコードする核酸分子も本発明に包含される。
【０２３１】
限定ではない一例として、本発明の抗体は、本発明のタンパク質チロシンキナーゼポリペプチドの精製、検出、ターゲティング（インビトロ、インビボ、両方の診断方法、検出方法、スクリーニング方法、および/または治療方法を含む）に使用することができる。例えば抗体は、生物学的試料中のsrcバイオマーカーポリペプチドのレベルを定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイで使用されている（例えば、参照によりその全てが本明細書に組み込まれるHarlowら「Antibody: A Laboratory Manual」第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)を参照されたい）。
【０２３２】
もう一つの限定でない例として、本発明の抗体は、受動免疫処置の一形態として個体に投与することができる。あるいは、本発明の抗体を、その抗体によって結合されるエピトープを同定するためのエピトープマッピングに使用することもできる。この方法で同定されたエピトープは、次に、例えばワクチン候補として、すなわち1つ以上の天然型チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質に対する抗体を惹起する目的で個体を免疫処置するために、使用することができる。
【０２３３】
以下により詳しく議論するように、本発明の抗体は、単独で、または他の組成物と組み合わせて、使用することができる。これらの抗体はさらに、異種ポリペプチドにN末端またはC末端で組換え的に融合すること、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的にコンジュゲートすること（共有結合的および非共有結合的コンジュゲーションを含む）ができる。例えば本発明の抗体は、検出アッセイにおけるラベルとして有用な分子およびエフェクター分子（例えば異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素）に、組換え的に融合するか、コンジュゲートすることができる。例えばPCT公開公報WO 92/08495；WO 91/14438；WO89/12624；米国特許第5,314,995号およびEP 396,387を参照されたい。
【０２３４】
本発明の抗体には、修飾された（すなわち、その抗体に何らかのタイプの分子を共有結合で取付けることによって修飾された）誘導体が包含される。例えば、限定するわけではないが、抗体誘導体には、例えばグリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞のリガンドまたは他のタンパク質への連結などによって修飾されている抗体が包含される。数多くの化学修飾は、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含めて（ただしこれらに限るわけではない）どれでも、既知の技法によって行うことができる。さらにまた、抗体誘導体は1つ以上の非古典的アミノ酸を含有することもできる。
【０２３５】
本発明の抗体は、当技術分野で知られる任意の適切な方法で作製することができる。関心対象の抗原または免疫原に対するポリクローナル抗体は、当技術分野でよく知られているさまざまな手法で製造することができる。例えば本発明のチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはペプチドを、上で解説したようにさまざまなホスト動物に投与して、そのバイオマーカー抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導することができる。免疫学的応答を増加させるために、ホストの種に応じて、さまざまなアジュバントも使用することができ、アジュバントには、フロイントのアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなど鉱物ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG（カルメットゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルブム（corynebacterium parvum）などの潜在的に有用なヒトアジュバントなどがあるが、これらに限るわけではない。そのようなアジュバントも当技術分野ではよく知られている。
【０２３６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術およびファージディスプレイ技術の使用、またはそれらの組合せなど、当技術分野で知られる多種多様な技法を使って製造することができる。例えば、当技術分野で知られかつ実践され、例えばKohlerおよびMilstein, Nature, 256:495-497 (1975)；Harlowら「Antibodies: A Laboratory Manual」第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)；およびHammerlingら,「Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas」（Elsevier, ニューヨーク）の563〜681頁（1981）（これらの文献の内容は参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）などに教示されているハイブリドーマ技術を使って、モノクローナル抗体を製造することができる。本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって製造される抗体に限定されるわけではない。「モノクローナル抗体」という用語は、単一のクローン（真核クローン、原核クローン、またはファージクローンを含む）に由来する抗体を指すのであって、必ずしもその製造方法を指すわけではない。連続細胞株培養物が関わる技法も使用することができる。ハイブリドーマ技法の他にも、トリオーマ技法、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法（Kozborら, Immunol. Today, 4:72(1983)）、およびEBV-ハイブリドーマ技法（Coleら, 「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」（Alan R. Liss, Inc.）の77〜96頁）などの技法がある。
【０２３７】
ハイブリドーマ技術を使って特異的抗体を製造し、それをスクリーニングするための方法は、当技術分野では常法であり、よく知られている。限定でない一例として、本発明のチロシンキナーゼポリペプチドもしくはペプチド、またはその変異体を使って、あるいはそのポリペプチドもしくはペプチドまたはその変異体を発現させる細胞を使って、マウスを免疫処置することができる。免疫応答が検出されたら（例えば抗原に特異的な抗体が免疫処置マウスの血清中に検出されたら）、その脾臓を収集し、脾細胞を単離する。次に、その脾細胞を周知の技法により、任意の適切なミエローマ細胞（例えばATCC（登録商標）から入手可能な細胞株SP2/0またはP3X63-AG8.653由来の細胞）に融合する。限界希釈法によって、ハイブリドーマを選択し、クローン化する。次に、そのハイブリドーマクローンを、当技術分野で知られる方法でアッセイすることにより、本発明のポリペプチドに結合する能力を持つ抗体を分泌する細胞を決定し、選択する。一般に高レベルの抗体を含有する腹水は、陽性ハイブリドーマクローンでマウスを免疫処置することによって生成させることができる。
【０２３８】
ポリクローナルヒトB細胞株とモノクローナルヒトB細胞株の両方を作製するためのもう一つの周知の方法は、エプスタイン・バーウイルス（EBV）を使った形質転換である。EBV形質転換B細胞株を生成させるためのプロトコールは、例えば参照によりその全てが本明細書に組み込まれるColiganら編「Current Protocols in Immunology」John Wiley & Sons, ニューヨーク（1994）のChapter 7.22に概説されているプロトコールなど、当技術分野では広く知られている。形質転換用のB細胞の供給源は、一般的には、ヒト末梢血であるが、形質転換用のB細胞は、他の供給源、例えば限定するわけではないが、リンパ節、扁桃腺、脾臓、腫瘍組織、および感染組織などから得ることもできる。組織は、一般に、EBV形質転換前に単細胞懸濁液として調製される。さらにまた、B細胞試料中に存在しうるT細胞を、物理的に除去するか、（例えばシクロスポリンAを用いる処理によって）失活させることができる。抗EBV抗体に関して血清陽性である個体のT細胞はEBVによるB細胞不死化を抑制することができるので、多くの場合、T細胞の除去が有益である。一般的には、ヒトB細胞を含有する試料にEBVを接種し、3〜4週間培養する。EBVの典型的供給源は、B95-8細胞株（ATCC；VR-1492）の培養上清である。EBV形質転換の物理的徴候は、一般に、3〜4週間の培養期間の終わり近くに見ることができる。
【０２３９】
位相差顕微鏡では、形質転換細胞が大きく、クリアに、かつ「毛髪状」に見え、それらは密な細胞クラスターに凝集する傾向を持つ。最初、EBV株は一般にポリクローナルである。しかし、長期間にわたる細胞培養で、EBV株は、特定B細胞クローンの選択的増殖の結果としてモノクローナルになる場合がある。あるいは、ポリクローナルEBV形質転換株を（例えば限界希釈法で）サブクローニングするか、適切な融合パートナーと融合し、限界希釈濃度でプレーティングして、モノクローナルB細胞株を得ることもできる。EBV形質転換細胞の適切な融合パートナーには、ミエローマ細胞株（例えばSP2/0、X63-Ag8.653）、ヘテロミエローマ細胞株（ヒト×マウス；例えばSPAM-8、SBC-H20およびCB-F7）およびヒト細胞株（例えばGM 1500、SKO-007、RPMI 8226およびKR-4）などがある。したがって本発明は、本発明のタンパク質チロシンキナーゼポリペプチドおよびペプチドまたはそのフラグメントに対するポリクローナルまたはモノクローナルヒト抗体を生成させる方法であって、ヒトB細胞のEBV形質転換を含む方法も包含する。
【０２４０】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の技法によって生成させることができる。例えば本発明のFabおよびF(ab')2フラグメントは、パパイン（Fabフラグメントを与える）やペプシン（F(ab')2フラグメントを与える）などの酵素を使った免疫グロブリン分子のタンパク質加水分解的切断によって製造することができる。F(ab')2フラグメントは可変領域、軽鎖定常領域およびおよび重鎖CH1ドメインを含有する。
【０２４１】
本発明に包含される抗体は、当技術分野で知られるさまざまなファージディスプレイ法を使って生成させることもできる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を運ぶファージ粒子の表面にディスプレイされる。ある特定の実施形態では、そのようなファージを利用して、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えばヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインをディスプレイすることができる。関心対象の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現させるファージは、抗原を使って（例えば標識された抗原または固体表面もしくはビーズ上に結合もしくは捕捉された抗原を使用するなどして）選択または同定することができる。これらの方法で使用されるファージは、通例、fdやM13などの繊維状ファージであり、結合ドメインは、ファージポリヌクレオチドIIIまたはポリヌクレオチドVIIIタンパク質に組換え的に融合されたFab、Fv、またはジスルフィド安定化抗体ドメイとして、ファージから発現される。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレー法の例には、Brinkmanら, J. Immunol. Methods, 182:41-50 (1995)；Amesら, J. Immunol. Methods, 184:177-186 (1995)；Kettleboroughら, Eur. J. Immunol., 24:952-958 (1994)；Persicら, Gene, 187:9-18 (1997)；Burtonら, Advances in Immunology, 57:191-280 (1994)；PCT出願番号PCT/GB91/01134；PCT公開公報WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO95/15982 ；WO 95/20401；ならびに米国特許第5,698,426号；同第5,223,409号；同第5,403,484号；同第5,580,717号；同第5,427,908号；同第5,750,753号；同第5,821,047号；同第5,571,698号；同第5,427,908号；同第5,516,637号；同第5,780,225号；同第5,658,727号；同第5,733,743号および同第5,969,108号（これらはそれぞれ参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）に開示されているものがある。
【０２４２】
上記の参考文献に記載されているように、ファージ選択後に、そのファージの抗体コード領域を単離し、それを使ってヒト抗体を含む抗体全体、または所望する他の任意の抗原結合フラグメントを生成させ、所望する任意のホスト（哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む）で、例えば以下に詳述するように発現させることができる。
【０２４３】
単鎖Fvおよび単鎖抗体を製造するために使用することができる技法の例には、米国特許第4,946,778号および同第5,258,498号；Hustonら, Methods in Enzymology, 203:46-88 (1991)；Shuら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7995-7999 (1993)；ならびにSkerraら, Science, 240:1038-1040 (1988)に記載されているものがある。ヒトでのインビボ使用や、インビトロ検出アッセイなど、いくつかの用途には、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を使用することが好ましいだろう。キメラ抗体は、例えばマウスモノクローナル免疫グロブリンに由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを持つ抗体など、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来している分子である。キメラ抗体を製造するための方法は当技術分野では知られている（例えば、参照によりその全てが本明細書に組み込まれるMorrison, Science, 229:1202 (1985)；Oiら, BioTechniques, 4:214 (1986)；Gilliesら, J. Immunol. Methods, 125:191-202 (1989)；ならびに米国特許第5,807,715号；同第4,816,567号；および同第4,816,397号を参照されたい）。
【０２４４】
ヒト化抗体は、所望の抗原に結合し、かつ非ヒト種由来の1つ以上の相補性決定領域（CDR）と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを持つ、非ヒト種由来の抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させ、好ましくは改善させるために、ドナー抗体のCDRおよびフレームワーク領域由来の対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は当技術分野でよく知られる方法によって、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するためのCDR残基とフレームワーク残基の相互作用のモデリングによって、および特定の位置で稀なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される（例えば、参照によりその全てが本明細書に組み込まれるQueenら, 米国特許第5,693,762号および同第5,585,089号；ならびにRiechmannら, Nature, 332:323 (1988)を参照されたい）。抗体は、例えばCDR移植（EP 239,400；PCT公開公報WO 91/09967；米国特許第5,225,539号；同第5,530,101号；および同第5,585,089号)；ベニアリング（veneering）またはリサーフェイシング（resurfacing）（EP 592,106；EP 519,596；Padlan, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498 (1991)；Studnickaら, Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994)；Roguskaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:969-973 (1994)）および鎖シャフリング（米国特許第5,565,332号）などといった、当技術分野で知られるさまざまな技法を使ってヒト化することができる。
【０２４５】
完全ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から誘導される抗体ライブラリーを使用する上記ファージディスプレイ法など、当技術分野で知られるさまざまな方法によって作製することができる。米国特許第4,444,887号および同第4,716,111号；ならびにPCT公開公報WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、およびWO 91/10741も参照されたい（これらはそれぞれ参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。
【０２４６】
完全ヒト抗体は、外来タンパク質に対する免疫反応を回避しまたは軽減するために、ヒト患者の治療的処置には、特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から誘導される抗体ライブラリーを使用する上記ファージディスプレイ法など、当技術分野で知られるさまざまな方法によって作製することができる。See also, 米国特許第4,444,887号および同第4,716,111号；ならびにPCT公開公報WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、およびWO 91/10741も参照されたい（これらはそれぞれ参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。
【０２４７】
ヒト抗体は、機能的な内在性免疫グロブリンを発現させる能力を持たないがヒト免疫グロブリンポリヌクレオチドを発現させることができるトランスジェニックマウスを使って製造することもできる。例えばヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンポリヌクレオチド複合体を、ランダムに、または相同組換えによって、マウス胚性幹細胞中に導入することができる。あるいは、ヒト重鎖および軽鎖ポリヌクレオチドに加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域をマウス胚性幹細胞中に導入してもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリンポリヌクレオチドは、相同組換えにより、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別個に、またはそれと同時に、非機能的にすることができる。特に、JH領域のホモ接合型欠失は、内在性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を拡大し、胎盤胞中に微量注入して、キメラマウスを作出する。次ぎにそのキメラマウスを交配して、ヒト抗体を発現させるホモ接合型子孫を作出する。そのトランスジェニックマウスを、選択した抗原（例えば本発明のポリペプチドの全部または一部）で通常どおり免疫処置する。
【０２４８】
したがって、そのような技法を使用することにより、有用なヒトIgG、IgA、IgM、IgDおよびIgE抗体を製造することができる。ヒト抗体を製造するための技術について概観するには、LonbergおよびHuszar, Intl. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を製造するための技術ならびにそのような抗体を製造するためのプロトコールに関する詳細な議論については、例えばPCT公開公報WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；欧州特許第0 598 877号；米国特許第5,413,923号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,569,825号；同第5,661,016号；同第5,545,806号；同第5,814,318号；同第5,885,793号；同第5,916,771号；同第5,939,598号；同第6,075,181号；および同第6,114,598号を参照されたい（これらは参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）。さらにまた、Abgenix, Inc（カリフォルニア州フリーモント）、Protein Design Labs, Inc.（カリフォルニア州マウンテンビュー）およびGenpharm (カリフォルニア州サンホゼ）などの会社に、上述の技術と類似する技術を使って、選択した抗原に対するヒト抗体を提供するように依頼することもできる。
【０２４９】
選択したエピトープを認識する完全ヒト抗体は「ガイド選択（guided selection）」と呼ばれる技法を使って生成させることができる。この方法では、選択した非ヒトモノクローナル抗体（例えばマウス抗体）を使って、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドする（Jespersら, BioTechnology, 12: 899-903 (1988）。
【０２５０】
さらに、本発明のタンパク質チロシンキナーゼポリペプチドに対する抗体を利用して、今度は、本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドを「模倣」する抗イディオタイプ抗体を、当業者によく知られる技法で生成させることもできる（例えばGreenspanおよびBona, FASEB J., 7(5):437-444 (1989)ならびにNissinoff, J. Immunol., 147(8):2429-2438を参照されたい）。例えば、リガンドに結合して、本発明ポリペプチドのポリペプチド多量体化および/またはリガンドへの結合を競合的に阻害する抗体を使って、ポリペプチド多量体化および/または結合ドメインを「模倣」し、その結果として、例えば治療レジメンにおいて、ポリペプチドおよび/またはそのリガンドに結合し、それらを中和する抗イディオタイプを生成させることができる。そのような中和抗イディオタイプ抗体またはそのような抗イディオタイプ抗体のFabフラグメントを使って、ポリペプチドリガンドを中和することができる。例えばそのような抗イディオタイプ抗体を使って、本発明のポリペプチドを結合し、かつ/またはそのリガンド/受容体を結合し、それによってその生物学的活性を活性化または遮断することができる。
【０２５１】
イントラボディは、組換え核酸分子から発現され、細胞内に保持される（例えばホスト細胞の細胞質、小胞体、またはペリプラズム内に保持される）ように操作された抗体（多くの場合、scFv）である。例えばイントラボディを使って、そのイントラボディが結合するタンパク質の機能を消失させることができる。イントラボディの発現は、そのイントラボディをコードする核酸を含む核酸発現ベクターに誘導性プロモーターを使用することによって制御することもできる。本発明のイントラボディは、例えばChenら, Hum. Polynucleotide Ther., 5:595-601 (1994)；Marasco, W.A., Polynucleotide Ther., 4:11-15 (1997)；RondonおよびMarasco, Annu. Rev. Microbiol., 51:257-283 (1997)；Probaら, J. Mol. Biol., 275:245-253 (1998)；Cohenら, Oncogene, 17:2445-2456 (1998)；OhageおよびSteipe, J. Mol. Biol., 291:1119-1128 (1999)；Ohageら, J. Mol. Biol., 291:1129-1134 (1999)；WirtzおよびSteipe, Protein Sci., 8:2245-2250 (1999)；ならびにZhuら, J. Immunol. Methods, 231:207-222 (1999)に開示され、概観されている方法など、当技術分野で知られる方法を使って製造することができる。
【０２５２】
本発明のXENOMOUSE（登録商標）技術抗体は、好ましくは、ヒト抗体産生ゲノムの実質的部分がゲノムに挿入されているが、内在性マウス抗体の産生については欠損させたトランスジェニックマウス（例えばAbgenix Inx.（カリフォルニア州フリーモント）から入手できるXENOMOUSE（登録商標）株）を利用することによって製造される。そのようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子を産生する能力を持ち、マウス免疫グロブリンの産生については事実上欠損している。これを達成するために利用される技術は、本明細書に開示する特許、特許出願、および参考文献に開示されている。
【０２５３】
YACにメガ塩基サイズのヒト遺伝子座をクローニングし再構築できること、およびそれらをマウス生殖系列に導入できることは、非常に大きい遺伝子座または大まかにマッピングされた遺伝子座の機能コンポーネントを解明するため、ならびに有用なヒト疾患モデルを作製するための強力なアプローチになる。さらにまた、そのような技術を利用して、マウスの遺伝子座をそのヒト等価物で置換すれば、発生時のヒトポリヌクレオチド産物の発現および制御、それらと他の系とのコミュニケーション、ならびに疾患の誘発および進行におけるそれらの関与について、ユニークな洞察が得られるだろう。そのような戦略の重要な実用的応用は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内在性Igポリヌクレオチドが非働化されているマウスへのヒト免疫グロブリン（Ig）遺伝子座の導入は、プログラムされた抗体の発現および集合の基礎を成す機序ならびにB細胞発生におけるそれらの役割を研究する機会をもたらす。さらにまた、そのような戦略は、ヒト疾患における抗体療法という希望を実現させる上で重要なマイルストーンである完全ヒトモノクローナル抗体（Mab）を製造するための理想的供給源にもなる。
【０２５４】
完全ヒト抗体は、マウスモノクローナル抗体またはマウス誘導化モノクローナル抗体に固有の免疫原性およびアレルギー性応答を最小限に抑え、したがって、投与される抗体の効力および安全性を増加させると予想される。完全ヒト抗体の使用は、抗体の反復投与を必要とする、がんなどの慢性および再発性ヒト疾患の処置に、かなりの利点を持つと予想することができる。
【０２５５】
この目標への一つのアプローチは、マウス抗体産生に欠陥を持つマウス株を、ヒトIg遺伝子座の大きなフラグメントを保因するように操作することだった。これは、そのようなマウスが、マウス抗体の非存在下で、ヒト抗体の大きなレパートリーを産生するだろうと予期して行われるものである。大きなヒトIgフラグメントでは、大きな可変ポリヌクレオチド多様性ならびに抗体産生および抗体発現の適正な制御が保存されるだろう。マウスが持つ抗体多様化および抗体選択のための機構と、ヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如とを利用することにより、これらのマウス株で再生されるヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含む、任意の関心対象抗原に対する高アフィニティー抗体をもたらすはずである。ハイブリドーマ技術を使って、所望の特異性を持つ抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を容易に生産し、選択することができるだろう。
【０２５６】
この一般法は、1994年に公表された最初の「XENOMOUSE（登録商標）T」株の作出に関連して実証された。例えばGreenら, Nature Genetics, 7:13-21を参照されたい。XENOMOUSE（登録商標）株が、ヒト重鎖遺伝子座およびカッパ軽鎖遺伝子座のそれぞれ245kbサイズおよび10,190kbサイズの生殖系列構成フラグメント（コア可変および定常領域配列を含有するもの）を含有する酵母人工染色体（YAC）で操作された。前掲書参照。ヒトIg含有YACは、抗体の再配列についても発現についても、マウス系に適合することが判明し、非働化されたマウスIgポリヌクレオチドに取って代わることができた。これは、B細胞発生を誘導し、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を生成させるという、その能力によって実証された。これらの結果から、より多くのVポリヌクレオチド、さらなる制御要素、およびヒトIg定常領域を含有する、ヒトIg遺伝子座のより大きな部分を導入すれば、感染に対するヒト体液性応答および免疫化の特徴を示す実質上完全なレパートリーが再現されうることが示唆された。Greenらの研究は、近年、それぞれヒト重鎖遺伝子座およびカッパ軽鎖遺伝子座のメガ塩基サイズの生殖系列配置YACフラグメントを使ってXENOMOUSE（登録商標）マウスを作出することにより、ヒト抗体レパートリーの約80％以上の導入にまで拡大された。Mendezら, Nature Genetics, 15:146-156 (1997)；GreenおよびJakobovits, J. Exp. Med., 188:483-495 (1998)；ならびにGreen, Journal of Immunological Methods, 231:11-23 (1999)を参照されたい（これらが開示する内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２５７】
ヒト抗マウス抗体（HAMA）応答は、産業界を、キメラ抗体またはそれ以外のヒト化抗体の製造に導くことになった。キメラ抗体は通例、ヒト定常領域とマウス可変領域とから構成されるが、一定のヒト抗キメラ抗体（HACA）応答が（特にその抗体の長期利用または反復投与利用が関わる処置では）観察されるだろうと予想される。したがって、HAMAまたはHACA応答の懸念および/または影響を減じるために、タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドに対する完全ヒト抗体を提供することが望ましい。
【０２５８】
本発明の抗体は化学合成するか、組換え発現系を利用して産生させることができる。したがって本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明は、例えば上で定義したような、ストリンジェントな条件下、またはそれよりストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件下で、抗体（好ましくは、本発明のタンパク質チロシンキナーゼポリペプチドに特異的に結合する抗体、より好ましくは、表2に記載するタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカー配列（例えばSrcチロシンキナーゼバイオマーカー）の1つ以上のアミノ酸配列を持つポリペプチドに結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。
【０２５９】
当技術分野で知られる任意の方法によって、ポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。例えば抗体のヌクレオチド配列がわかっている場合は、その抗体をコードするポリヌクレオチドを（例えばKutmeierら, BioTechniques, 17: 242 (1994）に記載されているように）化学合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。簡単に述べると、この方法では、抗体をコードする配列の一部を含有する部分的に重複したオリゴヌクレオチドを合成し、それらのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ライゲートした後、ライゲートされたオリゴヌクレオチドをPCRによって増幅する。
【０２６０】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドを、適切な供給源に由来する核酸から生成させることもできる。ある特定抗体をコードする核酸を含有するクローンは入手できないが、その抗体分子の配列がわかっている場合には、その免疫グロブリンをコードする核酸を化学合成するか、適切な供給源、例えば抗体cDNAライブラリー、またはその抗体を発現させる任意の組織または細胞（例えば本発明の抗体を発現させるように選択されたハイブリドーマ細胞）から作製されたcDNAライブラリー（またはそのような組織または細胞から単離された核酸、好ましくはポリA＋ RNA）から、その配列の3'端および5'端にハイブリダイズしうる合成プライマーを使ったPCR増幅によって入手することができる。あるいは、同定されるべきその特定ポリヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（例えば所望の抗体をコードするcDNAライブラリー由来のcDNAクローン）を使ったクローニングも使用することができる。PCRによって生成する増幅された核酸は、次に、当技術分野でよく知られる任意の方法を使って、複製可能なクローニングベクター中にクローニングすることができる。
【０２６１】
抗体のヌクレオチド配列とそれに対応するコードされたアミノ酸配列が決定されたら、当技術分野でよく知られるヌクレオチド配列操作法、例えば組換えDNA技法、部位特異的ミュタポリヌクレオチドシス、PCRなど（例えばSambrookら「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー (1990)；およびAusubelら編「Current Protocols in Molecular Biology」John Wiley & Sons, ニューヨーク（これらは参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）を参照されたい）を使って、抗体のヌクレオチド配列を操作することにより、例えばアミノ酸置換、欠失および/または挿入を生じさせる目的で、異なるアミノ酸配列を持つ抗体を生成させることができる。
【０２６２】
具体的一実施形態では、当技術分野でよく知られる方法により、例えば他の重鎖および軽鎖可変領域の既知アミノ酸配列と比較して配列超可変領域を決定することなどにより、重鎖および/または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を調べてCDRの配列を同定する。常法である組換えDNA技法を使って、そのCDRの1つ以上をフレームワーク領域内（例えばヒトフレームワーク領域中）に挿入することにより、上述のように非ヒト抗体をヒト化することができる。フレームワーク領域は天然のフレームワーク領域またはコンセンサスフレームワーク領域であることができ、好ましくはヒトフレームワーク領域である（ヒトフレームワーク領域の一覧については、例えばChothiaら, J. Mol. Biol., 278:457-479 (1998)を参照されたい）。
【０２６３】
フレームワーク領域とCDRとの組合せによって生成するポリヌクレオチドは、好ましくは、本発明のチロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。また好ましくは、上述のように、フレームワーク領域内で1つ以上のアミノ酸置換を行うこともでき、そのようなアミノ酸置換は、その抗原に対する抗体の結合を改善する（例えば抗体結合アフィニティーを高める）という目的で行われる。さらにまた、そのような方法を使って、鎖間ジスルフィド結合に参加する1つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換またはアミノ酸欠失を行うことにより、1つ以上の鎖間ジスルフィド結合を欠く抗体分子を生成させることもできる。ポリヌクレオチドに加えることができる他の改変も本発明に包含され、当技術分野の知識で可能である。
【０２６４】
本発明の抗体のインビトロ親和性成熟など、いくつかの用途では、1つ以上の本発明の抗体の重鎖および軽鎖のVHおよびVLドメインを、上述のファージディスプレイ法を使って、ファージディスプレイライブラリーで、単鎖抗体またはFabフラグメントとして発現させることが有用である。例えば、1つ以上の本発明の抗体のVHおよびVLドメインをコードするcDNAを、ファージディスプレイライブラリーを使って、考えうるあらゆる組合せで発現させ、その結果として、本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドに好ましい結合特性（例えば改善されたアフィニティーまたは改善された解離速度）で結合するVH/VLの組合せの選択を可能にすることができる。さらにまた、1つ以上の本発明の抗体のVHおよびVLセグメント、特にVHおよびVLドメインのCDR領域を、インビトロで突然変異させることもできる。ファージディプレイライブラリーにおける「突然変異型」CDRを持つVHおよびVLドメインの発現は、受容体ポリペプチドであるタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカー（例えばSrcチロシンキナーゼバイオマーカータンパク質）に好ましい結合特性（例えば改善されたアフィニティーまたは改善された解離速度）で結合するVH/VLの組合せの選択を可能にする。
【０２６５】
本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学合成されるか、または組換え発現されたら、それを、免疫グロブリンまたはポリペプチド分子を精製するための当技術分野で知られる任意の方法、例えばクロマトグラファイー（例：イオン交換、アフィニティー、特に特異的抗原プロテインAに対するアフィニティーによるもの、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、または他の任意の標準的タンパク質精製法で精製することができる。さらにまた、精製を容易にするために、本発明の抗体またはそのフラグメントを本明細書に記載する異種ポリペプチド配列または当技術分野で知られる他の異種ポリペプチド配列に融合することもできる。
【０２６６】
本発明は、融合タンパク質が生成するように、本発明のポリペプチド（またはその一部、好ましくはそのポリペプチドの少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90または100アミノ酸）に組換え的に融合されるか、または化学的にコンジュゲート（共有結合的コンジュゲーションと非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む）された抗体を包含する。この融合は直接的である必要は必ずしもなく、リンカー配列を介して行うこともできる。抗体は、本発明のポリペプチド（またはその一部、好ましくはそのポリペプチドの少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90または100アミノ酸）以外の抗原に特異的であることができる。例えば、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合またはコンジュゲートすることにより、抗体を使って、本発明のポリペプチドを、特定の細胞タイプに、インビトロでまたはインビボでターゲティングすることができる。
【０２６７】
さらに本発明は、可変領域ドメイン以外の抗体ドメインに融合またはコンジュゲートされた本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドを含む組成物を包含する。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体Fc領域またはその一部に融合またはコンジュゲートすることができる。本発明のポリペプチドに融合される抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、またはドメイン全体もしくはその一部の任意の組合せを含むことができる。ポリペプチドを上記抗体部分に融合またはコンジュゲートして、多量体を形成させることもできる。例えば、本発明のポリペプチドに融合した免疫グロブリン分子のFc部分は、Fc部分間のジスルフィド結合により、二量体を形成させることができる。より高次の多量体型は、IgAおよびIgMの部分にポリペプチドを融合することによって作製することができる。本発明のポリペプチドを抗体部分に融合またはコンジュゲートするための方法は、当技術分野では知られている（例えば米国特許第5,336,603号；同第5,622,929号；同第5,359,046号；同第5,349,053号；同第5,447,851号；同第5,112,946号；EP 307,434；EP 367,166；PCT公開公報WO96/04388；WO 91/06570；Ashkenaziら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10535-10539 (1991)；Zhengら, J. Immunol., 154:5590-5600 (1995)；およびVilら, Proc. Call. Acad. Sci. USA, 89:11337-11341（これらは参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【０２６８】
上述のように、表2に記載するタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーアミノ酸配列の1つ以上のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、または変異体に対応するポリペプチドは、そのポリペプチドのインビボ半減期を増加させるために、または当技術分野で知られる方法を用いるイムノアッセイで使用するために、上記の抗体部分に融合またはコンジュゲートすることができる。さらに、表2に記載するタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカー（例えばsrcバイオマーカー）配列の1つ以上に対応するポリペプチドは、精製を容易にするために、上記の抗体部分に融合またはコンジュゲートすることもできる。参考までに、ヒトCD4ポリペプチドの最初の2つのドメインと哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域のさまざまなドメインとを持つキメラタンパク質が記載されている（EP 394,827；Trauneckerら, Nature, 331:84-86 (1988)）。ジスルフィドで連結された二量体構造（IgGによるもの）を持つ抗体またはその一部に融合またはコンジュゲートされた本発明のポリペプチドは、例えば、単量体型の分泌タンパク質またはタンパク質フラグメントだけの場合よりも効率よく他の分子を結合し中和することができる。Fountoulakisら, J. Biochem., 270: 3958-3964 (1995)）。多くの場合、融合タンパク質中のFc部分は治療法、診断法および/またはスクリーニング法において有益であり、したがって例えば薬物動態特性の改善をもたらしうる（EP 232,262 A）。創薬においては、例えば、huIL-5などのヒトタンパク質が、huIL-5のアンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイのために、Fc部分と融合されている（Bennettら, J. Molecular Recognition, 8:52-58 (1995)；およびJohansonら, J. Biol. Chem., 270:9459-9471 (1995)を参照されたい）。あるいは、融合タンパク質を発現させ、検出し、精製した後に、そのFc部分を削除することが望ましい場合もあるだろう。例えば、融合タンパク質を免疫処置用の抗原として使用する場合は、Fc部分が治療および診断の邪魔になりうる。
【０２６９】
さらにまた、本発明の抗体またはそのフラグメントは、その精製を容易にするために、マーカー配列（例えばペプチド）に融合することもできる。好ましい実施形態では、そのマーカーアミノ酸配列が、その多くが市販されている数あるマーカーのなかでも、ヘキサヒスチジンペプチド（例えばpQEベクター（QIAGEN, Inc.、カリフォルニア州チャッツワース）中に用意されているタグ）である。Gentzら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-824 (1989)中に記載されているとおり、例えばヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に役立つ他のペプチドタグには、例えば、限定するわけではないが、インフルエンザ赤血球凝集素（HA）タンパク質に由来するエピトープに相当する「HA」タグ（Wilsonら, Cell, 37:767 (1984)）や、「flag」タグがある。
【０２７０】
さらに本発明は、診断剤または治療剤にコンジュゲートした抗体またはそのフラグメントを包含する。抗体は、例えば、所与の処置レジメンの効力を決定するなどの目的で、臨床検査手法の一部として腫瘍の発生または進行をモニターするために、診断的に使用することができる。検出可能な物質にカップリングすることにより、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の限定でない例には、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子放射断層撮影法を用いる陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンがある。検出可能な物質は、当技術分野で知られる技法を使って、抗体（またはそのフラグメント）に直接的に、または中間体（例えば当技術分野で知られるリンカーなど）を介して間接的に、カップリングまたはコンジュゲートすることができる（本発明の診断薬として使用するための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンについては、例えば米国特許第4,741,900号を参照されたい）。
【０２７１】
適切な酵素の限定でない例にはセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼがあり；適切な補欠分子族の限定でない例にはストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンがあり；適切な蛍光物質の限定でない例にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイシチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンがあり；発光物質の限定でない例にはルミノールがあり；生物発光物質の限定でない例にはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンがあり；そして適切な放射性物質の限定でない例にはヨウ素（125I、131I）、炭素（14C）、硫黄（3sus）、トリチウム（3H）、インジウム（111Inおよびインジウムの他の放射性同位体）、テクネチウム（99Tc、99mTc)、タリウム（20'Ti）、ガリウム（68Ga、67Ga）、パラジウム（103Pd）、モリブデン（99Mo）、キセノン（133Xe）、フッ素（19F）、153Sm、177Lu、Gd、放射性Pm、放射性La、放射性Yb、166Ho、90Y、放射性Sc、放射性Re、放射性Re、142Pr、105Rh、および97Ruがある。
【０２７２】
具体的実施形態では、放射性金属イオン（例えば、限定するわけではないが、111In、177Lu、90Y、166Ho、および153Sm）をポリペプチドにコンジュゲートするのに役立つ大環状キレーターに、本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドを取付ける。好ましい一実施形態では、本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドに取付けられた大環状キレーターと会合させる放射性金属イオンが111Inである。もう一つの好ましい実施形態では、本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドに取付けられた大環状キレーターと会合させる放射性金属イオンが90Yである。具体的実施態様では、大環状キレート因子が1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸（DOTA）である。他の具体的実施態様では、DOTAがリンカー分子を介して本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドに取付けられる。
【０２７３】
DOTAをポリペプチドにコンジュゲートするのに役立つリンカー分子の例は、当技術分野では一般に知られている（例えばDeNardoら, Clin. Cancer Res., 4(10):2483-90 (1998)；Petersonら, Bioconjug. Chem., 10(4):553-557 (1999)；およびZimmermanら, Nucl. Med. Biol., 26(8):943-950 (1999)（これらは参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。さらにまた、抗体にコンジュゲートすることができるキレート剤と、それらを製造し使用するための方法が開示されている米国特許第5,652,361号および同第5,756,065号も、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。米国特許第5,652,361号および同第5,756,065号ではキレート剤を抗体にコンジュゲートすることに焦点が絞られているが、当業者であれば、キレート剤を他のポリペプチドにコンジュゲートするために、そこに開示されている方法を容易に適合させることができる。
【０２７４】
抗体は、ターゲット抗原のイムノアッセイまたは精製にとりわけ役立つ固形支持体に取付けることもできる。そのような固形支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンなどがあるが、これらに限るわけではない。治療部分を抗体に取付けるための技法は、よく知られている。例えば、Reisfeldら編「Monoclonal Antibodies AND Cancer Therapy」（Alan R. Liss, Inc.）の243-256頁、Arnonら著「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy」(1985)；Robinsonら編「Controlled Drug Delivery」第2版（Marcel Dekker, Inc.）の623-653頁、Hellstromら著「Antibodies For Drug Delivery」(1987)；Pincheraら編「Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications」の475-506頁、Thorpe著「Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review」(1985)；Bldwinら編「Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy」（Academic Press）の303-316頁、「Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」(1985)；およびThorpeら「The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates」Immunol. Rev., 62:119-158 (1982)を参照されたい。あるいは、例えばSegalらの米国特許第4,676,980号（これは参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）に記載されているように、抗体を第2の抗体にコンジュゲートして、抗体ヘテロコンジュゲートを形成させることもできる。抗体、すなわち本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドに特異的な抗体（そこに治療部分がコンジュゲートされているもの、またはコンジュゲートされていないもの、そして単独で投与されるもの、または細胞毒性因子および/もしくはサイトカインと組合せて投与されるもの）は、治療薬として使用することができる。
【０２７５】
さらに本発明の抗体は、細胞株および生物学的試料の免疫表現型検査に使用することができる。本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーコードポリヌクレオチドの翻訳産物は、細胞特異的マーカーとして、より具体的には、特定細胞タイプのさまざまな分化および/または成熟段階で差次的に発現される細胞マーカーとして役立ちうる。特異的なエピトープまたはエピトープの組合せに対するモノクローナル抗体は、そのマーカーを発現させる細胞集団のスクリーニングを可能にする。例えば抗体被覆磁気ビーズを使った磁気分離、固形マトリックス（例えば組織培養プレート）に取付けられた抗体による「パンニング」、およびフローサイトメトリーなど、モノクローナル抗体を利用するさまざまな技法を使って、そ（れら）のマーカーを発現させる細胞集団についてスクリーニングすることができる（例えば米国特許第5,985,660号；Morrisonら, Cell, 96:737-749 (1999)；およびL.J. WysockiおよびV.L. Sato, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75(6):2844-2848 (1978)を参照されたい）。
【０２７６】
これらの技法により、血液学的悪性疾患に見出されうるような特定細胞集団（すなわち急性白血病患者における微小残存病変（MRD））のスクリーニングや、移植片対宿主病（GVHD）を防止するための、移植における「非自己」細胞のスクリーニングが可能になる。あるいは、これらの技法により、ヒト臍帯血に見出されうるような増殖能および/または分化能を持つ造血幹細胞および前駆細胞のスクリーニングも可能になる。
【０２７７】
本発明の抗体は、当技術分野で知られる任意の方法により、免疫特異的結合についてアッセイすることができる。使用することができるイムノアッセイには、例えば限定するわけではないが、例えばBIAcore分析、FACS（蛍光励起細胞分取装置）分析、免疫蛍光法、免疫細胞化学、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイなどの技術を用いる競合的および非競合的アッセイシステムなどがある。これらのアッセイは当技術分野では常法であり、よく知られ、実践されている（例えば、参照によりその全てが本明細書に組み込まれるAusubelら編「Current Protocols in Molecular Biology」第1巻, John Wiley & Sons, Inc., ニューヨーク（1994）を参照されたい）。限定するわけではないが、イムノアッセイの典型例を、以下に簡単に説明する。
【０２７８】
免疫沈降プロトコールは一般に、溶解バッファー、例えばプロテインホスファターゼおよび/またはプロテアーゼ阻害剤（例えばEDTA、PMSF、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補足したRIPAバッファー（すなわち1％NP-40またはTriton X-100、1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.01Mリン酸ナトリウム、pH 7.2、1％TRASYLOL（登録商標））中で細胞集団を溶解し；その細胞溶解物に関心対象の抗体を加え；ある期間（例えば1〜4時間）にわたって4℃でインキュベートし；プロテインAおよび/またはプロテインGセファロースビーズを細胞溶解物に加え；約60分以上にわたって4℃でインキュベートし；溶解バッファー中でビーズを洗浄し；そしてビーズをSDS/試料バッファー中に再懸濁することを含む。特定の抗原を免疫沈降させる関心対象抗体の能力は、例えばウェスタンブロット解析によって評価することができる。抗原への抗体の結合を増加させ、バックグラウンドを減少させるために変更することができるパラメータ（例えば細胞溶解液をセファロースビーズで予備清掃すること）について、当業者は精通しているだろう。免疫沈降プロトコールに関するさらなる解説については、例えばAusubelら編「Current Protocols in Molecular Biology」（第1巻, John Wiley & Sons, Inc., ニューヨーク, 1994）の10.16.1を参照されたい。
【０２７９】
ウェスタンブロット解析は一般に、タンパク質試料を調製し；ポリアクリルアミドゲル（例えば抗原の分子量に応じて8％〜20％のSDS PAGE）でタンパク質試料を電気泳動し；ポリアクリアミドゲルからメンブレン（例えばニトロセルロース、PDVFまたはナイロン）にタンパク質試料を転写し；ブロッキング溶液（例えば3％BSAまたは脱脂乳を含むPBS）中でメンブレンをブロッキングし；メンブレンを洗浄バッファー（例えばPBS-Tween 20）中で洗浄し；ブロッキングバッファーに希釈した一次抗体（関心対象の抗体）でメンブレンをブロッキングし；メンブレンを洗浄バッファー中で洗浄し；ブロッキングバッファーに希釈した酵素基質（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば32Pまたは125I）にコンジュゲートした二次抗体（一次抗体を認識するもの、例えば抗ヒト抗体）で、メンブレンをブロッキングし、；メンブレンを洗浄バッファー中で洗浄し；そして結合した抗原の存在を検出することを含む。検出されるシグナルを増加させ、バックグラウンドノイズを低減するために変更することができるパラメータについて、当業者は精通しているだろう。ウェスタンブロットプロトコールに関するさらなる解説については、例えばAusubelら編「Current Protocols in Molecular Biology」（第1巻, John Wiley & Sons, Inc., ニューヨーク, 1994）の10.8.1を参照されたい。
【０２８０】
ELISAは、抗原を調製し；96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原で被覆し；酵素基質（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物にコンジュゲートされた関心対象の抗体をウェルに加え；ある期間にわたってインキュベートし；そして抗原の存在を検出することを含む。ELISAでは、関心対象の抗体が検出可能な化合物にコンジュゲートされている必要はなく；その代わりに、検出可能な化合物にコンジュゲートされた二次抗体（抗原に結合した関心対象の抗体を認識するもの）をウェルに加えることもできる。さらに、ウェルを抗原で被覆する代わりに、抗体をまずウェル上に被覆することもできる。その場合は、関心対象の抗原を加えた後に、検出可能な化合物にコンジュゲートされた二次抗体を抗体被覆ウェルに加えることができる。検出されるシグナルを増加させるために変更することができるパラメータ、ならびに当技術分野で知られるELISAの他の変形について、当業者は精通しているだろう。ELISAに関するさらなる解説については、例えばAusubelら編「Current Protocols in Molecular Biology」（第1巻, John Wiley & Sons, Inc., ニューヨーク, 1994）の11.2.1を参照されたい。
【０２８１】
抗原に対する抗体の結合アフィニティーおよび抗体-抗原相互作用の解離速度は、競合的結合アッセイによって測定することができる。競合的結合アッセイの一例は標識抗原（例えば3Hまたは125I）またはそのフラグメントもしくは変異体を、標識抗原の存在量を増大させながら、関心対象の抗体と共にインキュベートし、その標識抗原に結合した抗体を検出するラジオイムノアッセイである。タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質に対する関心対象抗体のアフィニティーおよび結合解離速度は、スキャッチャードプロット解析により、データから決定することができる。第2の抗体による競合もラジオイムノアッセイを使って測定することができる。その場合は、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質を、存在する非標識第2抗体の量を増加させながら、標識化合物（例えば3Hまたは125Iで標識した化合物）にコンジュゲートされた関心対象抗体と共にインキュベートする。2つの抗体間のこの種の競合アッセイを使って、2つの抗体が抗原上の同じエピトープに結合するか異なるエピトープに結合するかを決定することもできる。
【０２８２】
好ましい一実施形態では、BIAcore速度解析を使って、チロシンキナーゼバイオマーカータンパク質またはチロシンキナーゼバイオマーカータンパク質のフラグメントに対する抗体（その抗体フラグメントまたは変異体を含む）の結合会合速度および結合解離速度を決定する。速度解析は、チップ表面に固定化されたチロシンキナーゼバイオマーカータンパク質を持つチップからの抗体の結合および解離を解析することを含む。
【０２８３】
例えば分子生物学が関わる組換え技法、ならびにポリヌクレオチドおよびタンパク質の解析に関係する他の技法によって、抗体分子を産生し、発現させ、単離し、操作するための上述の技法は、本発明のさまざまな実施形態に従って適宜、本明細書に記載する本発明の他のポリペプチドまたはペプチド分子（特にチロシンキナーセバイオマーカーポリペプチドまたはペプチド自体）に応用することができることも理解すべきである。
【０２８４】
本発明は、疾患を持つ患者、特にがんまたは腫瘍（好ましくは前立腺がんまたは前立腺腫瘍）を持つ患者による薬物感受性または薬物抵抗性を決定し、予測し、または予後判定するためのキットも包含する。そのようなキットは、例えば患者の腫瘍またはがんが、ある薬物、化合物、化学療法剤、または生物学的処置剤による所与の処置または治療法に対して抵抗性であるか感受性であるかを決定または予測するなどの目的で行われる、生検によって得られた患者の腫瘍またはがん試料の検査における使用に、臨床場面において有用である。このキットには、特定の生物系におけるタンパク質チロシンキナーゼ調節物質、特にタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性および感受性と相関するポリヌクレオチドを含む、好ましくはマイクロアレイを含む予測因子セットと；適切な容器に入った、患者組織または患者試料から得られる細胞を抵抗性/感受性について試験する際に使用される調節物質化合物と；使用説明書とが用意される。そのようなキットは、タンパク質チロシンキナーゼ（例えば、Src、Fgr、Fyn、Yes、Blk、Hck、LckおよびLynなどのSrcチロシンキナーゼファミリーのメンバー、ならびに他のタンパク質チロシンキナーゼ、例えばBcr-abl、Jak、PDGFR、c-kitおよびEph受容体）の調節物質に対する抵抗性および感受性と相関するポリヌクレオチドを含む。
【０２８５】
また、上で説明したとおり、本キットは、マイクロアレイに限るわけではなく、予測因子/マーカーポリヌクレオチドの発現を、例えばRT-PCRなどのPCRアッセイや、ELISAなどのイムノアッセイにより、mRNAレベルとタンパク質レベルの両方でアッセイおよび/またはモニターすることができるさまざまな方法およびシステムも包含することができる。例えばPCRまたはインサイチューハイブリダイゼーションを行うためのキットでは、その方法を行うのに必要なバッファーおよび試薬類、ならびに使用説明書に加えて、予測因子ポリヌクレオチド（例えば本明細書に記載するもの）の1つ以上の配列に由来する核酸プライマーまたはプローブが供給される。イムノアッセイ（例えばELISA、イムノブロットアッセイなど）を行なうためのキットでは、その方法を行うのに必要なバッファーおよび試薬類、ならびに使用説明書に加えて、本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドまたはその抗原性もしくは免疫原性ペプチドに対する抗体またはその結合可能部分が供給される。
【０２８６】
もう一つの実施形態において、本発明は、ここで同定された予測因子ポリヌクレオチドのうち、疾患を処置するための薬物療法の開発にターゲットして役立ちうるもののなかから、1つ以上のポリヌクレオチドの使用を包含する。そのようなターゲットは、特に、前立腺疾患、例えば前立腺がんまたは前立腺腫瘍の処置に応用可能でありうる。実際、これらの予測因子ポリヌクレオチドは、感受性細胞と抵抗性細胞とでは発現の仕方が異なるので、それらの発現パターンは、タンパク質チロシンキナーゼと相互作用してそれを阻害する化合物による処置に対する細胞の相対的固有感受性と相関する。したがって、抵抗性細胞中で高く発現されるポリヌクレオチドは、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤化合物（例えばSrcチロシンキナーゼ阻害剤）に対して抵抗性である腫瘍に対する薬物療法を開発するためのターゲットとして役立ちうる。
【０２８７】
もう一つの実施形態において、本発明は、本発明の予測因子ポリヌクレオチドの特異的調節物質としてのアンチセンスおよび/またはsiRNAi試薬を包含する。具体的実施形態では、本発明のアンタゴニストが、配列番号1〜176として記載する配列の1つ以上に含まれる配列またはその相補鎖に対応する核酸である。ある実施形態では、アンチセンス配列が生物の内部で生成され、もう一つの実施形態では、アンチセンス配列が個別に投与される（例えばO'Connor, Neurochem., 56:560 (1991)；「Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression」CRC Press, フロリダ州ボカラトン (1988)を参照されたい）。アンチセンス技術を使って、遺伝発現をアンチセンスDNAまたはRNAによって、または三重らせん形成によって抑制することができる。アンチセンス技法は、例えばOkano, Neurochem., 56:560 (1991)；「Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression」CRC Press, フロリダ州ボカラトン (1988)に解説されている。三重らせん形成は、例えばLeeら, Nucleic Acids Reserach, 6:3073 (1979)；Cooneyら, Science, 241:456 (1988)；およびDervanら, Science, 251:1300 (1991)に解説されている。これらの方法は、相補的なDNAまたはRNAへのポリヌクレオチドの結合に基づいている。
【０２８８】
例えば、c-mycおよびc-mybアンチセンスRNAコンストラクトを使った非リンパ球性白血病細胞株HL-60および他の細胞株の成長の阻害が、過去に記述されている（Wickstromら (1988)；Anfossiら (1989)）。これらの実験は、細胞をオリゴリボヌクレオチドと共にインキュベートすることにより、インビトロで行われた。インビボ使用のための同様の手法が、WO 91/15580に記載されている。簡単に述べると、所与のアンチセンスRNAについて、一対のオリゴヌクレオチドを、以下のように作製する。すなわち、オープンリーディングフレームの最初の15塩基に相補的な配列を、5'端ではEcoR1部位に、3'端ではHindIII部位に隣接させる。次に、そのオリゴヌクレオチド対を90℃で1分間加熱した後、2×ライゲーションバッファー（20mM TRIS HCl pH 7.5、10mM MgCl2、10MMジチオスレイトール（DTT）および0.2mM ATP）中でアニールさせ、次にレトロウイルスベクターPMV7のEcoR1/HindIII部位にライゲートする（WO 91/15580）。
【０２８９】
例えば、本発明の成熟ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの5'コード部分を使って、約10〜40塩基対の長さを持つアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計することができる。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的になり、その結果として、受容体の転写および産生が妨げられるように設計される。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボでmRNAにハイブリダイズし、そのmRNAが受容体ポリペプチドに翻訳されるのを阻止する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖RNAは、Paddisonら, Proc. Nat. Acad. Sci., 99:1443-1448 (2002)；国際公開番号WO 01/29058およびWO 99/32619（これらは参照により本明細書に組み込まれる）の教示する内容に基づいて設計することができる。
【０２９０】
ある実施形態では、本発明のアンチセンス核酸が、外因性配列からの転写により、細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部が転写されて、本発明のアンチセンス核酸（RNA）を産生する。そのようなベクターは、本発明のアンチセンス核酸をコードする配列を含有するだろう。そのようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスRNAを産生することができる限り、エピソームのまま留まってもよいし、染色体に組み込まれた状態になってもよい。そのようなベクターは、当技術分野において標準的な組換えDNA技術の方法で構築することができる。ベクターは、脊椎動物細胞における複製および発現に使用されるプラスミドベクター、ウイルスベクター、または当技術分野で知られる他のベクターであることができる。本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする配列の発現は、脊椎動物細胞（好ましくはヒト細胞）内で作用することが当技術分野で知られている任意のプロモーターによることができる。そのようなプロモーターは誘導性であっても構成的であってもよい。そのようなプロモーターには、SV40初期プロモーター領域（BernoistおよびChambon, Nature, 29:304-310 (1981)）、ラウス肉腫ウイルスの3'末端反復配列に含まれるプロモーター（Yamamotoら, Cell, 22:787-797 (1980)）、ヘルペスチミジンプロモーター（Wagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78:1441-1445 (1981)）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Brinsterら, Nature, 296:39-42 (1982)）などがあるが、これらに限るわけではない。
【０２９１】
本発明のアンチセンス核酸は、関心対象である遺伝子のRNA転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含む。しかし、絶対的な相補性は、好ましくはあるものの、必要ではない。本明細書にいう「あるRNAの少なくとも一部に相補的」な配列とは、そのRNAとハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することができるだけの十分な相補性を持つ配列を意味する。したがって、本発明の二本鎖アンチセンス核酸の場合は、その二重鎖DNAの一本の鎖を試験するか、または三重鎖形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズできるかどうかは、アンチセンス核酸の相補性の度合と長さとの両方に依存するだろう。一般に、ハイブリダイズする核酸が大きいほど、それは本発明のRNA配列とのミスマッチをより多く含有することができ、それでもなお安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を形成することができる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的手法を利用して、許容できるミスマッチの度合を確かめることができる。
【０２９２】
メッセージの5'端（例えばAUG開始コドンまで（AUG開始コドンを含む）の5'非翻訳配列）に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳の阻害に最も効率よく機能するはずである。しかし、mRNAの3'非翻訳配列に相補的な配列も、mRNAの翻訳を阻害するのに有効であることが示されている。例えば一般論として、Wagner, R., Nature, 372:333-335 (1994)を参照されたい。したがって、本発明のポリヌクレオチド配列の5'-または3'-非翻訳非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンスアプローチで使用することにより、内在性mRNAの翻訳を阻害することができるだろう。mRNAの5'非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドはAUG開始コドンの相補鎖を含むべきである。mRNAコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それほど効率のよい翻訳阻害剤ではないが、本発明に従って使用することができるだろう。mRNAの5'-領域、3'-領域、またはコード領域のいずれにハイブリダイズするように設計されるにせよ、アンチセンス核酸は少なくとも6ヌクレオチド長であるべきであり、好ましくは6〜約50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。具体的態様では、オリゴヌクレオチドが少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチドまたは少なくとも50ヌクレオチドである。
【０２９３】
本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の、DNA、RNA、キメラ混合物、またはその誘導体もしくは修飾体であることができる。オリゴヌクレオチドは、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖部分で修飾することができる。オリゴヌクレオチドには、他の基、例えばペプチド（例えばインビボでホスト細胞受容体をターゲティングするために）、または細胞膜（例えばLetsingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:6553-6556 (1989)；Lemaitreら, Proc. Natl. Acad. Sci., 84:648-652 (1987)；PCT公開番号WO 88/09810（1988年12月15日公開）を参照されたい）または血液脳関門（例えばPCT公開番号WO 89/10134（1988年4月25日公開）を参照されたい）を横切って行われる輸送を容易にする薬剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えばKrolら, BioTechniques, 6:958-976 (1988)を参照されたい）またはインターカレート剤（例えばZon, Pharm. Res., 5:539-549 (1988)を参照されたい）などが付加されていてもよい。この目的を達成するために、オリゴヌクレオチドをもう一つの分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤などにコンジュゲートすることができる。
【０２９４】
二本鎖RNAは、Paddisonら, Proc. Nat. Acad. Sci., 99:1443-1448 (2002)；国際公開番号WO 01/29058およびWO 99/32619（これらは参照により本明細書に組み込まれる）の教示する内容に基づいて設計することができる。
【０２９５】
本発明では特にsiRNA試薬が考えられる。そのような試薬は、本発明のポリヌクレオチドの発現を阻害するのに有用であり、治療効力を持ちうる。siRNA試薬の投与によって障害の治療的処置を行うための方法が、当技術分野ではいくつか知られている。そのような方法の一つは、Tiscorniaら（Proc. Nat. Acad. Sci., 100(4):1844-1848 (2003)）によって記載されており、この文献は参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【０２９６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、限定するわけではないが、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6-ジアミノプリンから選択される少なくとも一つの修飾塩基部分を含みうる。
【０２９７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、限定するわけではないが、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含む群から選択される少なくとも一つの修飾糖部分も含みうる。
【０２９８】
さらにもう一つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、例えば、限定するわけではないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはその類似体を含む群より選択される少なくとも一つの修飾リン酸エステル主鎖を含む。
【０２９９】
さらにもう一つの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドがa-アノマーオリゴヌクレオチドである。a-アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的RNAと共に、通常のb-ユニットとは異なり鎖が互いに平行に伸びている特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Gautierら, Nucl. Acids Res., 15:6625-6641 (1987)）。このオリゴヌクレオチドは2-O-メチルリボヌクレオチド（Inoueら, Nucl. Acids Res., 15:6131-6148 (1987)）またはキメラRNA-DNA類似体（Inoueら, FEBS Lett., 215:327-330 (1987)）である。
【０３００】
本発明のポリヌクレオチドは、当技術分野で知られる標準的方法によって、例えば自動化DNA合成装置（例えばBiosearch、Applied Biosystemsなどから市販されているもの）を利用して、合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはSteinらの方法（Nucl. Acids Res., 16:3209 (1988)）によって合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドはコントロールドポアガラスポリマー支持体を使って製造することができる（Sarinら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:7448-7451 (1988)）。
【０３０１】
本発明のコード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドを使用することもできるだろうが、転写された非翻訳領域に相補的なものが最も好ましい。
【０３０２】
潜在的な本発明のアンタゴニストには、触媒RNA、すなわちリボザイムも含まれる（例えばPCT国際公開公報WO 90/11364（1990年10月4日公開）；Sarverら, Science, 247:1222-1225 (1990)を参照されたい）。特異的認識配列でmRNAを切断するリボザイムは、本発明のポリヌクレオチドに対応するmRNAを破壊するために使用することができ、ハンマーヘッド型リボザイムの使用は好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、ターゲットmRNAとの相補的塩基対を形成する隣接領域によって指定される位置で、mRNAを切断する。唯一の要件は、ターゲットmRNAが以下の2塩基配列：5'-UG-3'を持つことである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築と製造は当技術分野ではよく知られており、HaseloffおよびGerlach, Nature, 334:585-591 (1988)に、より詳しく説明されている。配列表に開示する各ヌクレオチド配列内には、数多くの潜在的ハンマーヘッド型リボザイム切断部位が存在する。好ましくは、切断認識部位が本発明のポリヌクレオチドに対応するmRNAの5'端近くに位置することになるように、すなわち、効率を増加させ、非機能的mRNA転写物の細胞内蓄積が最小限に抑えられるように、リボザイムを工作する。
【０３０３】
アンチセンスアプローチの場合と同様に、本発明のリボザイムは（例えば安定性、ターゲティング性などが改善されるように）修飾オリゴヌクレオチドから構成させることができ、インビボで本発明のポリヌクレオチドを発現させる細胞に送達されるべきである。リボザイムをコードするDNAコンストラクトは、アンチセンスコードDNAの導入に関して上述した方法と同じ方法で細胞中に導入しうる。好ましい送達方法では、トランスフェクトされた細胞が内在性メッセージを破壊し翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生することになるように、強力な構成的プロモーター、例えばpolIIIまたはpoIIプロモーターなどの制御下にリボザイムを「コード」しているDNAコンストラクトを使用する。リボザイムはアンチセンス分子とは異なり触媒作用を持つので、より低い細胞内濃度でも有効である。
【０３０４】
アンタゴニスト/アゴニスト化合物は、新生物細胞および新生物組織に対する本発明のポリペプチドの細胞成長および細胞増殖効果（すなわち腫瘍の血管新生の刺激）を阻害し、よって例えば腫瘍形成または腫瘍成長における異常な細胞成長および細胞増殖を遅延させ、または防止するために、使用することができる。
【０３０５】
本アンタゴニスト/アゴニストは、血管過多疾患を防止し、水晶体嚢外白内障手術後の上皮水晶体細胞の増殖を防止するためにも使用することができる。本発明のポリペプチドの有糸分裂促進活性の防止は、バルーン血管形成術後の再閉塞などといった場合にも、望ましいかもしれない。
【０３０６】
本アンタゴニスト/アゴニストは、創傷治癒時の瘢痕組織の成長を防止するためにも使用しうる。
【０３０７】
本アンタゴニスト/アゴニストは、本明細書に記載の疾患を処置、予防、および/または診断するためにも使用しうる。
【０３０８】
したがって本発明は、（a）本発明のポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子および/または（b）本発明のポリヌクレオチドに対するリボザイムを患者に投与することによって、本発明のポリヌクレオチドの過剰発現に関係する疾患、障害および/または状態、例えば限定するわけではないが、本願に記載する疾患、障害および/または状態などを、処置または予防する方法を提供する。
【０３０９】
参考文献
1．Jemal, A.ら「Cancer statistics, 2006」CA Cancer J. Clin., 56:106-130 (2006).
2．Denmeade, S.R.ら「A history of prostate cancer treatment」Nat. Rev. Cancer, 2:389-396 (2002).
3．Tannock, I.F.ら「Docetaxel plus prednisone or mitoxantrone plus prednisone for advanced prostate cancer」N. Engl. J. Med., 351:1502-1512 (2004).
4．Lombardo, L.J.ら「Discovery of N-(2-chloro-6-methyl-phenyl)-2-(6-(4-(2-hydroxyethyl)-piperazin-1-yl)-2-methylpyrimidin-4-ylamino)thiazole-5-carboxamide (BMS-354825), a dual Src/Abl kinase inhibitor with potent antitumor activity in preclinical assays」J. Med. Chem., 47:6658-6661 (2004).
5．Huang, F.ら「Identification of candidate molecular markers predicting sensitivity in solid tumors to dasatinib: rationale for patient selection」Cancer Res., 67(5):2226-2238 (2007).
6．Shah, N.P.ら「Overriding imatinib resistance with a novel ABL kinase inhibitor」Science, 305:399-401 (2004).
7．Talpaz, M.ら「Dasatinib in imatinib-resistant Philadelphia chromosome-positive leukemias」N. Engl. J. Med., 354:2531-2541 (2006).
8．Yeatman, T.J.「A renaissance for SRC」Nat. Rev. Cancer, 4:470-480 (2004).
9．Ishizawar, R.ら「c-Src and cooperating partners in human cancer」Cancer Cell, 6:209-214 (2004).
10．Pegram, M.D.ら「Phase II study of receptor-enhanced chemosensitivity using recombinant humanized anti-p185HER2/neu monoclonal antibody plus cisplatin in patients with HER2/neu-overexpressing metastatic breast cancer refractory to chemotherapy treatment」J. Clin. Oncol., 16:2659-2671 (1998).
11．Castro, M.「The simpleton's error in drug development」J. Clin. Oncol., 20:4606-4607 (2002).
12．Betensky, R.A.ら「Influence of unrecognized molecular heterogeneity on randomized clinical trials」J. Clin. Oncol., 20:2495-2499 (2002).
13．Sirotnak, F.M.ら「Efficacy of cytotoxic agents against human tumor xenografts is markedly enhanced by coadministration of ZD1839 (Iressa), an inhibitor of EGFR tyrosine kinase」Clin. Cancer Res., 6:4885-4892 (2000).
14．Ciardiello, F.ら「Inhibition of growth factor production and angiogenesis in human cancer cells by ZD1839 (Iressa), a selective epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor」Clin. Cancer Res., 7:1459-1465 (2001).
15．Walker-Daniels, J.ら「Overexpression of the EphA2 tyrosine kinase in prostate cancer」Prostate, 41:275-280 (1999).
16．Bell, S.M.ら「Plasminogen activator gene expression is induced by the src oncogene product and tumor promoters」J. Biol. Chem., 265:1333-1338 (1990).
17．Singh, D.ら「Gene expression correlates of clinical prostate cancer behavior」Cancer Cell, 1:203-209 (2002).
18．Marker, P.C.ら「Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development」Dev. Biol., 253:165-174 (2003).
19．Litvinov, I.V.ら「Low-calcium serum-free defined medium selects for growth of normal prostatic epithelial stem cells」Cancer Res., 66:8598-8607 (2006).
20．Guo, L.ら「Rat toxicogenomic study reveals analytical consistency across microarray platforms」Nat. Biotechnol., 24:1162-1169 (2006).
21．Goldenberg-Furmanov, M.ら「Lyn is a target gene for prostate cancer: sequence-based inhibition induces regression of human tumor xenografts」Cancer Res., 64:1058-1066 (2004).
22．Sorlie, T.ら「Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:8418-8423 (2003).
23．Perou, C.M.ら「Molecular portraits of human breast tumours」Nature, 406:747-752 (2000).
24．Lapointe, J.ら「Gene expression profiling identifies clinically relevant subtypes of prostate cancer」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:811-816 (2004).
25．Abate-Shen, C.ら「Molecular genetics of prostate cancer」Genes Dev., 14:2410-2434 (2000).
26．Patrawala, L.ら「Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells」Oncogene, 25:1696-1708 (2006).
27．van Bokhoven, A.ら「Molecular characterization of human prostate carcinoma cell lines」Prostate, 57:205-225 (2003).
28．Chen, C.D.ら「Molecular determinants of resistance to antiandrogen therapy」Nat. Med., 10:33-39 (2004).
29．Guo, Z.ら「Regulation of androgen receptor activity by tyrosine phosphorylation」Cancer Cell, 10:309-319 (2006).
30．Fan, C.ら「Concordance among gene-expression-based predictors for breast cancer」N. Engl. J. Med., 355:560-569 (2006).
31．Cozzi, P.J.ら「Evaluation of urokinase plasminogen activator and its receptor in different grades of human prostate cancer」Hum. Pathol., 37:1442-1451 (2006).
32．Rocchi, P.ら「Molecular analysis integrating different pathways associated with androgen-independent progression in LuCaP 23.1 xenograft」Oncogene, 23:9111-9119 (2004).
33．Miyake, H.ら「Elevation of urokinase-type plasminogen activator and its receptor densities as new predictors of disease progression and prognosis in men with prostate cancer」Int. J. Oncol., 14:535-541 (1999).
34．Urban, P.ら「Increased expression of urokinase-type plasminogen activator mRNA determines adverse prognosis in ErbB2-positive primary breast cancer」J. Clin. Oncol., 24:4245-4253 (2006).
35．Janicke, F.ら「Randomized adjuvant chemotherapy trial in high-risk, lymph node-negative breast cancer patients identified by urokinase-type plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor type 1」J. Natl. Cancer Inst., 93:913-920 (2001).
36．Nam, S.ら「Action of the Src family kinase inhibitor, dasatinib (BMS-354825), on human prostate cancer cells」Cancer Res., 65:9185-9189 (2005).
37．Thomas, S.M.「Cellular functions regulated by Src family kinases」Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 13:513-609 (1997).
【０３１０】
実施例
本明細書の実施例は、本発明を実施するためのさまざまな態様の例示を意図するものであって、決して本発明の範囲を限定しようとするものではない。本実施例では、使用する通常の方法（例えばベクターの構築においては、そのベクターへのcDNAの挿入、または得られたベクターの適当なホストへの導入）を詳細には説明しない。そのような方法は当業者にはよく知られており、例えばSambrook, FritschおよびManiatis「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, (1989)）など、数多くの刊行物に記載されている。
【実施例１】
【０３１１】
方法
細胞株および細胞培養物
ミシガン大学のKenneth Pienta博士から入手したDUCaPを除き、細胞株はいずれもAmerican Type Culture Collection（バージニア州マナッサス）から入手した。PWR1EおよびMDAPCa2b細胞はBRFF-HPC1無血清培地（AthenaES、メリーランド州ボルチモア）で成長させ、他の細胞は全て、10％ウシ胎仔血清、100IU/mlペニシリン、および100mg/mlストレプトマイシン（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド）を補足したRPMI1640で培養した。DUCaP細胞は、DUCaP細胞の下に容易に剥がれる層を形成する不死化マウス線維芽細胞細胞株の存在下で維持した。細胞は5％CO2を循環させながら37℃でインキュベートした。
【０３１２】
インビトロ細胞増殖アッセイ
BMS-A（ダサチニブ）処置が細胞増殖に及ぼす影響を、MTS比色法（Promega、ウィスコンシン州マディソン）を使って測定した。96ウェルプレートに播種して線形性を得るのに最適な細胞数をパイロット実験で決定した。細胞を96ウェルプレートに2000〜5000細胞/ウェルの密度でプレーティングし、一晩培養した。次に、段階希釈したダサチニブで細胞を処理した。3日後に、MTSを培地に加え、SpectraMax（登録商標）測光プレートリーダー（Molecular Devices、カリフォルニア州サニーベール）を使って490nmで定量した。その結果を薬物濃度に対してプロットし、Prism4ソフトウェア（GraphPad、カリフォルニア州サンディエゴ）を使ってIC50を算出した。このIC50は、対照と比較して細胞増殖を50％減少させるであろうダサチニブの濃度である。各細胞株につき最低3回の独立したアッセイを行った。化合物に対する抵抗性が高く正確なIC50を得ることが困難だった細胞株以外は、平均±標準偏差（SD）を算出した。抵抗性が高くて正確なIC50を得ることが困難だった例では、細胞増殖を着実に減少させることができるダサチニブの濃度をIC50として使用した。細胞成長に関するダサチニブの阻害は、顕微鏡下で視覚的にも確認された。DMSOに溶解したダサチニブ原液は10mg/mlとした。
【０３１３】
マイクロアレイ解析
約22,000プローブセットを含有するAffymetrix（登録商標）HG-U133v2遺伝子チップを遺伝子発現プロファイリングに使用した（Affymetrix、カリフォルニア州サンタクララ）。RNeasyキット（Qiagen、カリフォルニア州バレンシア）を使って全RNAを細胞から単離した。Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent、カリフォルニア州サンタクララ）を使って、RNAの品質を評価した。ビオチン標識cRNAの調製には10μgの全RNAを使用した。チップハイブリダイゼーション、スキャニングおよびデータ収集は、製造者が提供する「Expression Analysis Technical Manual」に従って行った。
【０３１４】
データ解析
RMAアルゴリズムを使って生発現データを標準化し、Partek（登録商標）Discovery Suiteソフトウェア（Partek、ミズーリ州セントルイス）で解析した。16個の前立腺細胞株においてそのベースライン発現レベルがダサチニブに対する感受性と相関する遺伝子を同定するために、感受性細胞株群と抵抗性細胞株群の間の遺伝子発現を比較するための一元配置ANOVAと、遺伝子発現レベルとlog2IC50値の間のピアソン相関とを含む、2つの統計的解析を行った（どちらの解析でもp値＜0.05）。変動フィルター（variation filter）(全試料にわたる遺伝子発現値の変動係数が10％、およびIC50によって定義される感受性細胞群と抵抗性細胞群の間で最低3倍の差次的発現）によって、遺伝子リストをさらに絞った。ESTおよび遺伝子重複物は最終リストから排除した。薬物処置（100nMで2日間）した細胞株の遺伝子発現を、対応のあるt検定を使ってDMSO対照の遺伝子発現と比較した（p値＜0.05）。GeneClusterソフトウェアを使ってクラスタリング分析を行い、それぞれ高発現または低発現を示す赤色および緑色を使って、ヒートマップを作成した。
【０３１５】
ウェスタンブロット解析
非同期的に成長した細胞から、プロテアーゼ阻害剤（Roche Diagnostics、インディアナ州インディアナポリス）およびホスファターゼ阻害剤（Sigma、ミズーリ州セントルイス）カクテルを補足したRIPAバッファーを使って、細胞溶解物を調製した。BCAキット（Pierce、イリノイ州ロックフォード）を使ってタンパク質濃度を決定した。30μgの溶解物を、NuPAGE（登録商標）Novex 4-12％ビス-トリスゲル（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド）にのせて、分割した。そのブロットをマウスモノクローナル抗EphA2（Upstate Biotechnology、ニューヨーク州レイクプラシッド）および抗チューブリン抗体（Abcam、マサチューセッツ州ケンブリッジ）でプローブし、化学発光試薬ECL Plus（登録商標）（GE Healthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で発光させた。
【０３１６】
uPAタンパク質ELISAアッセイ
細胞を24ウェルプレートに25,000細胞/ウェルの密度で播種した。2日後に、その細胞をPBSで2回洗浄し、0.1％FBSおよび異なる濃度のダサチニブまたはTAXOL（登録商標）を含有するRPMI1640に変えた。0、2、4、8、24、および48時間時点で培地の試料を採取し、直ちに10,000gで5分間遠心分離した。分析まで上清を-80℃で凍結した。細胞計数器を使って細胞の総数も定量し、生細胞の数をトリパンブルーで評価した。uPA ELISAキット（America Diagnostica、コネティカット州スタンフォード）を使って上清中のuPAタンパク質の量を決定し、50,000個の生細胞が培地中に分泌したuPAの濃度を算出した。
【実施例２】
【０３１７】
ダサチニブによって誘発されるPC3異種移植片腫瘍の成長の減少と相関する血漿中のuPAタンパク質レベルのダウンレギュレーション
腫瘍成長の減少に関する代用マーカーとしてuPAを使用できることを確認する試みとして、ダサチニブの非存在下または存在下で、PC3異種移植片腫瘍を持つマウスの血漿におけるuPAタンパク質レベルを調べた。nu/nu無胸腺マウスの皮下に異種移植片腫瘍を定着させた。腫瘍が約200mgに達した後に、それらのマウスを、各群8匹の3群に分割した。2つの群をそれぞれ15または30mg/kgのダサチニブで処置し、3番目の群には対照としてダサチニブを与えなかった。ダサチニブを、5日間投薬/2日間休薬のスケジュールで20回にわたって1日2回経口投与した。腫瘍サイズ測定および血液試料採取を処置前と処置開始後2週間にわたって毎週1回行った。腫瘍重量は以下の等式を使って決定した：腫瘍重量＝(長さ×幅2)/2。使用したELISAキットは、ヒトuPAタンパク質だけを検出し、マウスuPAタンパク質を検出しないことに注意されたい（未掲載データ）。30mg/kgが15mg/kgよりも高い腫瘍成長阻害活性を示すことはなかったものの、予想どおり、PC3異種移植片腫瘍成長は、試験した2つの用量レベルのダサチニブによって阻害された。血漿uPAレベルは、ダサチニブ処置の最初の1週間後に（30m/kg（約30％）では特に）著しく減少した。そのようなダウンレギュレーションの強さは、腫瘍が2週目に進行するにつれて減少したが、その傾向は保たれた。パクリタキセルと組み合わされたダサチニブは、前臨床モデルにおいて、単剤よりも高い抗腫瘍活性を示したので、併用研究ではuPAのダウンレギュレーションがより強く起こり、したがって代用マーカーとしてより良く使用されうる。この知見は、転移性腫瘍の場合がそうであるように、腫瘍測定が実用的でない場合に、特に重要である。
【０３１８】
これらの知見はuPA発現プロファイルのもう一つの用途を表す。本明細書に概略を記すように、ある試料における低レベルのuPA発現は、その試料がタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して少なくとも部分的に抵抗性であるだろう可能性の高さと相関した。しかし、uPA発現レベルが上昇しているか、少なくとも正常である場合、その試料はタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対して感受性であるだろう可能性が高い。この例では、異種移植片移植を使って試験した細胞株が、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤による処置に応答して、減少したuPA発現を示す感受性細胞株だった。そのような発現量の減少は、uPAがタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性マーカーであり、有効な処置を推測するための代用物として使用しうることを裏付けている。
【実施例３】
【０３１９】
PCR発現プロファイリング
Taqman（登録商標）リアルタイムPCR蛍光アッセイを使ってRNA定量を行う。Taqman（登録商標）アッセイは、核酸テンプレートの濃度をアッセイするための最も正確な方法の一つである。
【０３２０】
標準的方法を使って、好ましくはQiagen（カリフォルニア州バレンシア）から市販されているRNeasy Maxi Kitを利用して、RNAを調製する。リアルタイムPCR用のcDNAテンプレートは、RT-PCR用のSuperscript（登録商標）First Strand Synthesisシステムを使って作製することができる。本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリヌクレオチドのそれぞれについて、代表的なフォワードおよびリバースRT-PCTプライマーを、表6に記載する（配列番号357〜887）。
【０３２１】
SYBR（登録商標）GreenリアルタイムPCR反応は、以下のように準備する。反応混合物は、20ngの第1鎖cDNA；50nMフォワードプライマー；50nMリバースプライマー；0.75×SYBR（登録商標）Green I（Sigma）；1×SYBR（登録商標）Green PCR Buffer（50mM Tris-HCl pH8.3、75mM KCl）；10％DMSO；3mM MgCl2；300μMの各dATP、dGTP、dTTP、dCTP；1UのPLATINUM（登録商標）Taq DNA Polymerase High Fidelity（カタログ番号11304-029；Life Technologies；メリーランド州ロックビル）を含有する。リアルタイムPCRは、Applied Biosystems 5700 Sequence Detection Systemを使って行われる。条件は95℃で10分間（変性およびPLUTINUM（登録商標）Taq DNA Polymeraseの活性化）、40サイクルのPCR（95℃で15秒間、60℃で1分間）である。5700 Sequence Detection Systemに組み込まれている解析アルゴリズムを使って、PCR産物を一様な融解について解析する。
【０３２２】
テンプレート量の標準化に用いるcDNA定量はTaqman（登録商標）技術を使って行う。Taqman（登録商標）反応は以下のように準備する：反応混合物は、20ngの第1鎖cDNA；25nM GAPDH-F3フォワードプライマー；250nM GAPDH-R1リバースプライマー；200nM GAPDH-PVIC Taqman（登録商標）プローブ（蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプライマー）；1×バッファーA（Applied Biosystems）；5.5mM MgCl2；300μM dATP、dGTP、dTTP、dCTP；および1U Amplitaq GOLD（登録商標）（Applied Biosystems）を含む。mRNAレベルを標準化するための対照としてGAPDH（D-グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ）を使用する。リアルタイムTaqman（登録商標）PCRはApplied Biosystems 7700 Sequence Detection Systemを使って行う。条件は95℃で10分間（変性およびAmplitaq GOLD（登録商標）の活性化）、40サイクルのPCR（95℃で15秒、60℃で1分）である。
【０３２３】
Taqman（登録商標）で使用するGAPDHオリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりである：
GAPDH-F3：5'-AGCCGAGCCACATCGCT-3'（配列番号888）；
GAPDH-R1：5'-GTGACCAGGCGCCCAATAC-3'（配列番号889）；および
GAPDH-PVIC Taqman（登録商標）プローブ-VIC-5'-CAAATCCGTTGACTCCGACCTTCACCTT-3' TAMRA（配列番号890）。
【０３２４】
Sequence Detection Systemは、各投入cDNAテンプレートの濃度を算出するために使用されるCt（閾値サイクル）値を生成する。関心対象である各ポリヌクレオチドのcDNAレベルは、投入試料中の総cDNA量のばらつきを相殺するためにGAPDH cDNAレベルに対して標準化される。これは、各細胞株についてGAPDH Ct値を生成することによって行われる。関心対象のポリヌクレオチドおよびGAPDHに関するCt値を、各特定cDNAに関するGAPDH標準化相対cDNAレベルを算出するために用いられるδδCt式の修正版（Applied Biosystems Prism（登録商標）7700 Sequence Detection System User Bulletin #2）に代入する。δδCt式は以下のとおりである：核酸テンプレートの相対量＝2δδCt＝2(δCta-δCtb)。式中、δCta＝Ctターゲット-Ct GAPDH、およびδCtb＝Ct基準-Ct GAPDHである（相対量の算出には基準細胞株を使用せず、δCtbを21と定義した）。
【実施例４】
【０３２５】
タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドに対する抗体の産生
本発明の抗タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチド抗体は、上に詳述したさまざまな方法で製造することができる。抗体生産方法の一例として、本発明のポリペプチドを発現させる細胞を、免疫原として動物に投与して、発現されたポリペプチドに対するポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導する。好ましい一方法では、当技術分野で一般に実践されている技法を使って、発現されたポリペプチドを調製し、好ましくは単離および/または精製して、天然夾雑物を実質的に含まない状態にする。次に、そのような調製物を動物に導入することで、発現され単離されたポリペプチドに対して、より特異的な活性を持つポリクローナル抗血清を産生させる。
【０３２６】
最も好ましい一方法において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（またはそのタンパク質結合性フラグメント）であり、上に詳述したハイブリドーマ技術を使って製造することができる。ポリペプチドを発現させる細胞は、任意の適切な組織培養培地で培養することができる。しかし多くの場合、10％ウシ胎仔血清（約56℃で非働化）を含有するように補足し、約10g/l非必須アミノ酸、約1.0U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシを含有するように補足した、アール変法イーグル培地で細胞を培養することが好ましい。
【０３２７】
免疫処置（および追加免疫）したマウスの脾細胞を摘出し、適切なミエローマ細胞株と融合させる。適切なミエローマ細胞株はどれでも本発明に従って使用できるが、ATCC（登録商標）から入手できる親ミエローマ細胞株SP2/0を使用することが好ましい。融合後は、結果として生じたハイブリドーマ細胞をHAT培地で選択的に維持した後、例えばWandsら（Gastroenterology, 80:225-232 (1981)）に記載されているように、限界希釈法でクローン化する。次に、そのような選択プロセスによって得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、ポリペプチド免疫原またはその一部に結合する能力を持つ抗体を分泌する細胞クローンを同定する。
【０３２８】
あるいは、ポリペプチドに結合する能力を持つさらなる抗体を、抗イディオタイプ抗体を用いる2段階手法で製造することもできる。そのような方法では、抗体がそれ自体、抗原であり、それゆえに第1の抗体に結合する第2の抗体を得ることができるという事実を利用する。この方法では、タンパク質特異的抗体を使って、動物、好ましくはマウスを免疫処置する。次に、そのような免疫処置された動物の脾細胞を使ってハイブリドーマ細胞を作製し、それらのハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、タンパク質特異的抗体に結合する能力がそのタンパク質によって遮断されうるような抗体を産生するクローンを同定する。そのような抗体は、タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、さらなるタンパク質特異的抗体の形成を誘導する目的で動物を免疫処置するために使用することができる。
【０３２９】
ヒトにおける抗体のインビボ使用には、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましいかもしれない。そのような抗体は、上述のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝子コンストラクトを使って製造することができる。キメラ抗体の製造方法は当技術分野では知られ、実践されている（概観するには、例えばMorrison, Science, 229:1202 (1985))；Oiら, BioTechniques, 4:214 (1986)；Cabillyら, 米国特許第4,816,567号；Taniguchiら, EP 171496；Morrisonら, EP 173494；Neubergerら, WO 8601533；Robinsonら, WO 87/02671；Boulianneら, Nature, 312:643 (1984)；およびNeubergerら, Nature, 314:268 (1985)を参照されたい）。
【実施例５】
【０３３０】
免疫蛍光アッセイ
以下の免疫蛍光プロトコールは、例えば細胞におけるタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカー発現を立証するために、または例えば細胞の表面に発現されたタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカー（ポリペプチドまたはペプチド）を結合する1つ以上の抗体の存在についてチェックするために使用することができる。簡単に述べると、Lab-Tek（登録商標）IIチャンバースライドを、カルシウムおよびマグネシウムを含有するDPBS（DPBS++）中の10μg/mlウシII型コラーゲンで、4℃で終夜コーティングする。次に、そのスライドを冷DPBS++で2回洗浄し、本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーのコード配列を含むベクターでトランスフェクトされた約8000個のCHO細胞、またはベクターのみでトランスフェクトされたCHO細胞（対照）を125μlの総液量で播種し、95％酸素/5％二酸化炭素の存在下、37℃でインキュベートする。
【０３３１】
その後、培養培地を吸引によって静かに取り除き、接着細胞を周囲温度のDPBS++で2回洗浄する。0.2％BSA（ブロッキング剤）を含有するDPBS++で、スライドを0〜4℃で1時間ブロックする。ブロッキング溶液を吸引によって静かに取り除き、125μlの抗体含有溶液を加える（抗体含有溶液は、例えば、通常希釈せずに使用されるハイブリドーマ培養上清であるか、通常約1：50、1：100、1：1000などの希釈度で希釈される血清/血漿であることができる）。そのスライドを0〜4℃で1時間インキュベートする。次に抗体溶液を吸引によって静かに取り除き、細胞を400μlの氷冷ブロッキング溶液で5回洗浄する。次に、ブロッキング剤溶液中の1μg/mlローダミン標識二次抗体（例えば抗ヒトIgG）125μlを、細胞に加える。再び細胞を0〜4℃で1時間インキュベートする。
【０３３２】
次に二次抗体溶液を吸引によって静かに除去し、細胞を400μlの氷冷ブロッキング溶液で3回、冷DPBS++で5回洗浄する。次に細胞をDPBS++中の3.7％ホルムアルデヒド125μlで周囲温度で15分間固定する。その後、細胞を周囲温度のDPBS++400μlで5回洗浄する。最後に細胞を50％グリセロール水溶液に封入し、ローダミンフィルターを使って蛍光顕微鏡で観察する。
【実施例６】
【０３３３】
相補的配列
タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドをコードする配列に相補的なアンチセンス分子もしくは核酸配列、またはその一部を使って、天然タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの発現を減少させまたは阻害する。約15〜35塩基対を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは相補的オリゴヌクレオチドの使用について説明するが、それより小さいまたは大きい核酸配列フラグメントでも、基本的に同じ手法が使用される。例えば配列番号1〜356に記載するタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドのコード配列に基づくオリゴヌクレオチドを使って、天然タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの発現を阻害する。相補的オリゴヌクレオチドは、典型的には、最もユニークな5'配列から設計され、なかんずく、コード配列へのプロモーター結合を妨げることによって転写を阻害するために、またはリボソームがタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーをコードする転写物に結合するのを妨げることによって翻訳を阻害するために使用される。しかし他の領域をターゲットにしてもよい。
【０３３４】
配列番号1〜356のシグナル配列および5'配列の適当な部分を使用する効果的アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号1〜356に記載のポリペプチドのさまざまな領域のなかでも、なかんずくシグナル配列または5'配列に翻訳される領域にまたがる任意の約15〜35ヌクレオチドを含む。適当なオリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェアとタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドコード配列（配列番号1〜356）を使って設計することができる。好ましいオリゴヌクレオチドはデオキシヌクレオチドに基づくか、キメラデオキシヌクレオチド/リボヌクレオチドに基づき、それらを以下に記載する。オリゴヌクレオチドは基本的に米国特許第5,849,902号（これは参照によりその全てが本明細書に組み込まれる）に記載の化学を使って合成することができる。代表的RNAi試薬配列は以下のとおりである：
2010517510.tif 000048
【０３３５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる休止後（post-quiescent）A549細胞のトランスフェクション
必要な材料：
・A549細胞は、10％ウシ胎仔血清、2mM L-グルタミン、および1×ペニシリン/ストレプトマイシンを補足したDMEM/高グルコース（Gibco-BRL）で維持することができる。
・Opti-MEM（Gibco-BRL）
・リポフェクトアミン2000（Invitrogen）
・アンチセンスオリゴマー（Qiagen）
・ポリスチレンチューブ
・組織培養処理プレート
【０３３６】
休止細胞は次のように調製される：
0日目：300,000個のA549細胞を、10mlのA549培地（上に指定したもの）に入れて、T75組織培養フラスコに播種し、湿潤培養器中、37℃、5％CO2で、48時間インキュベートする。
2日目：T75フラスコを振とうして、緩く接着している細胞を除去し、A549成長培地を除去し、10mlの新鮮なA549培地を補充する。培地を変えずに細胞を6日間培養して、休止細胞集団を生成させる。
8日目：休止細胞をマルチウェル形式でプレーティングし、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトする。
【０３３７】
A549細胞を下記に従ってトランスフェクトする：
1．休止A549細胞集団を含有するT75フラスコをトリプシン処理する。
2．細胞を計数し、24ウェルプレートに1ウェルあたり60K個の休止A549細胞を播種する。
3．細胞を組織培養プレートに接着させる（約4時間）。
4．以下に従って、細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび対照オリゴヌクレオチドをトランスフェクトする：
a．リポフェクトアミン2000の10×原液（10μg/mlが10×である）を調製することができる。希釈した脂質を室温で15分間静置しておく。
リポフェクトアミンの原液は1mg/mlである。
トランスフェクション用の10×溶液は10μg/mlである。
10×溶液を調製するために、1mlのOpti-MEM（無血清培地）につき10μlのリポフェクトアミン2000原液を希釈する。
b．トランスフェクションで使用するために各オリゴマーの10×原液を調製することができる。
オリゴマーの原液は20mM HEPES（pH7.5）中、100μMである。
10×濃度のオリゴマーは0.25μMにすることができる。
10×溶液を調製するために、1mlのOpti-MEMにつき2.5μlのオリゴマーを希釈する。
c．等体積の10×リポフェクトアミン2000原液と10×オリゴマー溶液とを混和し、室温で15分間インキュベートして、オリゴマーと脂質の複合体を形成させる。その結果得られる混合物は5×である。
d．15分間の複合体形成後に、4体積の完全成長培地をオリゴマー/脂質複合体に加える（溶液は1×であるだろう）。
e．培地を細胞から吸引し、0.5mlの1×オリゴマー/脂質複合体を各ウェルに加える。
f．細胞を湿潤CO2培養器中、37℃で16〜24時間インキュベートする。
g．ノックダウンのレベルを評価するために、RNA単離およびタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチド発現のTAQMAN（登録商標）解析用に、細胞ペレットを収集する。
【０３３８】
TAQMAN（登録商標）反応
DNaseIで処理した全RNA調製物で、またはポリA選択RNAで、定量RT-PCR解析を行うことができる。Dnase処理は当技術分野で知られる方法を使って行うことができるが、好ましくは、DNAseI処理がカラムで行われるQiagen RNeasyキットを使って、RNA試料を精製する。
【０３３９】
簡単に述べると、試薬類のマスターミックスを、下記の表に従って調製することができる：
DnaseI処理
2010517510.tif 000049
【０３４０】
次に、5μlのマスターミックスを、96ウェルPCR反応プレート（PEパーツ番号N801-0560）の各ウェルに分注することができる。RNA試料を0.1μg/μlになるように（必要であれば）DEPC処理H2Oで調整し、分注したマスターミックスに、最終反応体積が25μlになるように加えることができる。
【０３４１】
ストリップウェルキャップ（PEパーツ番号N801-0935）を使ってウェルに蓋をし、プレートに入れ、プレート遠心分離器（Beckman）で短時間遠心して、全体積をチューブの底に集める。一般に、SORVALL（登録商標）RTで500rpmまでの短い遠心で十分である。
【０３４２】
プレートを37℃で30分間インキュベートする。次に、等体積の0.1mM EDTA/10mM Trisを各ウェルに加え、70℃で5分間熱失活させることができる。完了したらプレートを-80℃で保存する。
【０３４３】
RT反応
試薬類のマスターミックスは下記の表に従って調製することができる：
RT反応
2010517510.tif 000050
【０３４４】
500ngのRNAが各RT反応に加えられるような濃度（RNなしは100ng）に、試料を調整する。最大19μlをRT反応混合物に加えることができる（RTなしは10.125μl）。最大値までの残りの体積は、総反応体積が50μl（RT）または25μl（RTなし）になるように、DEPC処理H2Oで満たすことができる。
【０３４５】
96ウェルPCR反応プレート（PEパーツ番号N801-0560）に、37.5μlのマスターミックスを分注し（22.5μlのRTなしマスターミックス）、総反応体積が50μ（RTなしは25μl）になるようにRNA試料を加えることができる。標準曲線の作成に十分なテンプレートが得られるように、対照試料を2つまたは3つの異なるウェルに充填する。
【０３４６】
ストリップウェルキャップ（PEパーツ番号N801-0935）でウェルに蓋をし、プレートに入れ、プレート遠心分離器（Beckman）で短時間遠心して、全体積をチューブの底に集める。一般に、SORVALL（登録商標）RTで500rpmまでの短い遠心で十分である。
【０３４７】
RT-PCR反応には、下記の熱プロファイルを使用することができる：
a．25℃で10分
b．48℃で30分
c．95℃で5分
d．4℃で保持（1時間）
e．完了したら-20℃以下でプレートを保存。
【０３４８】
TAQMAN（登録商標）反応（テンプレートはRTプレートから得られる）
マスターミックスは下記の表に従って調製することができる：
TAQMAN（登録商標）反応（1ウェルあたり）
2010517510.tif 000051
【０３４９】
RT-PCR反応で使用する各タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドコード領域に対して、適当なフォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブプライマーを設計することができる。
【０３５０】
GILSON（登録商標）P-10リピートピペッターを使って、96ウェル光学プレートの各ウェルに22.5μlのマスターミックスを分注する。次にP-10ピペッターを使って、2.5μlの試料を個々のウェルに加える。一般に、RT試料は、使用した各プライマー/プローブセットで3重に実行し、RTなし試料は、プライマー/プローブセットを1つだけ（多くの場合gapdh（または他の内部対照））使って、1回実行する。
【０３５１】
次に、標準曲線を構築し、プレート上にのせる。この曲線は5点＋テンプレートなしの対照1点（NTC＝DEPC処置H2O）を持つ。この曲線は、試料50ngの高い点（未知試料中の総RNA量の2倍）と、25、10、5、および1ngの連続試料とを使って作成することができる。この曲線は、対照試料（上記参照）から作成することができる。
【０３５２】
光学ストリップウェルキャップ（PEパーツ番号N801-0935）でウェルに蓋をし、プレートに入れ、遠心分離器で遠心して、全体積をチューブの底に集める。一般に、SORVALL（登録商標）RTで500rpmまでの短い遠心で十分である。
【０３５３】
プレートをPE5700配列検出器に、プレートが右上角のノッチと正しく合わされているのを確認してのせる。蓋を堅く締め、5700と5700定量プログラムおよびSYBR（登録商標）プローブとを使って、以下の熱プロファイルで実行する：
50℃で2分
95℃で10分
および以下の以下を40サイクル：
95℃で15秒
60℃で1分。
反応体積を25μlに変更する。
【０３５４】
反応が完了したと思われたら、バックグラウンドシグナルを最小限に抑えるために、約0.1のマニュアル閾値を設定することができる。GENEAMP（登録商標）5700機の操作に関する追加情報は、以下のマニュアルを参照すれば見出すことができる：Perkin-Elmerから入手することができ、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる、「GeneAmp 5700 Sequence Detection System Operator Training CD」および「User's Manual for 5700 Sequence Detection System」。
【０３５５】
本発明の各タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドに合わせて上記のプロトコールに変更を加える必要があるかもしれないことは、当業者には理解されるだろう。A549以外の細胞株を使用することができること、A549は一例として記載されているにすぎないことも、当業者には理解されるだろう。相補的オリゴヌクレオチド（例えば配列番号534〜557に記載のRNAi試薬）の能力を評価するために、例えば限定するわけではないがウェスタンブロットおよびELISAアッセイをはじめとする他の手段を使用しうることも、当業者には理解されるだろう。
【実施例７】
【０３５６】
本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの発現レベルを調節する相補的配列の能力を評価する代替的方法
本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドの発現レベルを調節するその能力について評価することができる好ましい相補的配列を配列番号14〜37として記載する。他の相補的配列は、配列番号1〜356として記載する本発明のタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドのコード領域に基づいて設計することができ、本発明では特に考えられる。
【０３５７】
同時トランスフェクションRNAi
トランスフェクション：
トランスフェクションの前日に、24ウェルディッシュの1ウェルにつき2×105個のHeLa細胞を播種する。翌日、細胞は90〜95％コンフルエントになるはずである。トランスフェクトすべき各RNAiについて、20μMストックRNAi（配列番号14〜37の1つ以上）4.5μLを、ポリスチレンチューブ（チューブA）中のOptimem 50μLに希釈する。穏やかなタッピングによって混合する。もう一つのポリスチレンチューブで、2μLのリポフェクトアミン2000を50μLのOptimemと混合する（チューブB）。穏やかなタッピングによって混合する。室温で5分間静置する。50μLのチューブBを各チューブAの50μLと混合する。穏やかなタッピングによって混合する。室温で15分間静置する。500μLの血清/抗生物質非含有MEMを各チューブに加えて、最終RNAi濃度を150nMにする。（RNAiとプラスミドの同時トランスフェクションには、チューブAにおいて、1μLの20μMストックRNAi（最終濃度33nM）を1μgのベクターDNAと共に使用してから、上記のトランスフェクションプロトコールを進める）。HeLaプレートから培地を除去し、600μLのトランスフェクションミックスで置き換える。37℃、5％CO2の培養器に4〜5時間入れる。培地を10％FBSを含有するMEMで置き換える。
【０３５８】
トランスフェクションに含めるべき対照には、トランスフェクション効率を算出するための蛍光オリゴヌクレオチド対照（1U/μL＝20μM）、非特異的陰性対照としてGFP B、標準化ノックダウン対照としてのCDC2、およびDNAを受け取らない非トランスフェクト対照が含まれる。
【０３５９】
溶解：
トランスフェクションの48時間後に、培地を吸引し、1ウェルにつき約500μLの冷1×PBSで細胞を1回洗浄する。吸引し、プロテアーゼ阻害剤（ミニBMプロテアーゼ阻害剤タブレット1個/10mL 1×RIPA）を含有する冷RIPA 100μLで置き換える。プレートを数回振とうおよびタッピングし、10〜15分間、4℃に置く。さらに数回、プレートをタッピング/振とうする。200μLピペットマンを使って、5〜10回吸引し、ウェルを洗浄して、全ての物質の完全な溶解および移動を保証する。溶解物をエッペンドルフチューブに移し、5〜10回、ピペットに出し入れする。試料がまだ粘稠である場合は、さらに数回、ピペットに出し入れする。試料を14000RPM、4℃で10分間遠心する。この時点で、試料を-20℃で保存するか、ローディングの準備をすることができる。
【０３６０】
ウェスタンブロッティング/Novex：
20μLの溶解物を3μLの還元試薬および7μLの4×ゲルローディング色素と混合することによって、試料を調製する。70℃で10分間加熱した後、試料を氷上に置く。試料を加熱している間に、コームとシールテープを取り除くことによって、所望のゲル（通常は4-12％Bis-Trisゲル）を準備する。ゲルをゲルボックスに入れ、内外のチャンバーを所望のバッファー（1×MESまたはMOPS−各ゲルボックスにつき50mLの20×バッファーを950mLのdH2Oに加える）で満たす。600μLの酸化試薬を内部チャンバーに加える。500μLのバッファーを流し込むことにより、各ウェルを洗浄する。第1ウェルには、5μLのマーカー（InvitrogenのSeeBlue（登録商標）Plus2）をロードする。以降のレーンに試料をロードする。ゲルを200Vで45〜50分間泳動する。1×転写バッファーを調合する（50mL 20×転写バッファー、メタノール（ゲル1枚を転写する場合は100mL、同じ装置でゲル2枚を転写する場合は200mL）およびdH2Oで計1000mL）。ブロッティングパッドをdH2Oに浸漬し、次に転写バッファーに浸漬する（気泡を取り除くために必ずパッドを押し下げること）。プレカットHybond-ECLメンブレン（Amersham ニトロセルロース）をdH2Oに浸漬し、次に転写バッファーに浸漬する。Biorad濾紙を転写メンブレンのサイズに合うように切り出す。1枚のゲルを転写する場合は、ブロッティングチャンバーに2枚のブロッティングパッドを入れる。ゲルが2枚の場合は、1枚のパッドを敷く。濾紙を転写バッファーに短時間浸漬し、ブロッティングパッドに注意深く重ねる。ゲルカセットを分解工具で開き、ゲルの上、下、側面を切り離す。それを手短にすすいでから、気泡が存在しないことを確認しながら注意深く濾紙に重ねる。再び気泡が存在しないように注意しながら転写メンブレンを重層する。濾紙を置く。1枚のゲルを転写する場合は、サンドイッチが完成するように、2枚のブロッティングパッドを置く。2枚を転写する場合は、1枚のブロッティングパッド、濾紙、ゲル、メンブレン、濾紙、ブロッティングパッドを置く。この時点でゲルは転写の準備ができている。ゲルサンドイッチを押しつぶし、転写装置に入れる。内外のチャンバーを転写バッファーで満たす。ゲルを30Vで1時間転写する。
【０３６１】
メンブレンを取り出し、それらをSuperblock（登録商標）（Pierce）に入れ、最低でも1時間〜一晩は室温で振とうする（本発明者はメンブレンをSuperblock（登録商標）中に週末にかけて4℃で保存しておいた）。一次抗体および標準化抗体をSuperblock（登録商標）：1×PBS/0.3％Tween-20の1：10混合物に希釈する。メンブレンを一次抗体中、室温で、最低でも1時間〜一晩はインキュベートし、振とうする。次にメンブレンを1×PBS/0.3％Tween-20中で十分に洗浄する。本発明者は通常、手短に数回すすいだ後、1×PBS/0.3％Tween-20中で5分間のすすぎを3回行う。最終洗浄中に、HRPコンジュゲート二次抗体を1×PBS/0.3％Tween-20に希釈する。これをメンブレンに加え、室温で最低30分間は振とうする。メンブレンを十分に洗浄する。本発明者は通常、手短に数回すすいだ後、1×PBS/0.3％Tween-20中で5分間のすすぎを3回行う。メンブレンを洗浄バッファーから取り出し、メンブレンの角をペーパータオルの上に保持することによって、過剰なバッファーを排液させる。作業台の上で平らにして気泡を取り除いておいたサランラップの上に、メンブレンを置く。十分なECL試薬を加えてメンブレンを1分間覆う。メンブレンを取り出し、過剰なECLをペーパータオル上で排液させる。気泡を取り除くように注意しながらメンブレンを2枚の透明シートの間に挟む。
【０３６２】
定量：
FluorS-Maxを使ってメンブレンを露光する。RNAi処置ありの各バンドの強度をRNAi処置なし（対照）の各バンドの強度と比較することによって、相対阻害率を決定することができる。各レーンについて関心対象のバンドを標準化バンドで割ることによって、レーンを標準化する。各処置試料に関する標準化値を対照の標準化値で割る。次に式：(1-上記の値)×100を使って、阻害率を算出することができる。
【０３６３】
本発明の各タンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーポリペプチドに合わせて上記のプロトコールに変更を加える必要があるかもしれないことは、当業者には理解されるだろう。
【０３６４】
本明細書で言及する特許、特許出願、公開されたPCT出願および論文、書籍、参考文献、リファレンスマニュアル、抄録、配列表、およびインターネットウェブサイトは全て、本発明が属する分野の水準をより詳しく説明するために、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【０３６５】
上述の内容には、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、さまざまな改変を加えることができるので、上記の説明に含まれる内容または添付の特許請求の範囲で明示される内容は全て、本発明を説明し例示するものであると解釈されるものとする。上記の教示内容に照らせば、本発明には多くの変更および変形が考えられる。
【０３６６】
配列表の簡単な説明
配列番号1〜配列番号912を含む配列表には、本明細書の表2に提示するタンパク質チロシンキナーゼバイオマーカーの核酸配列およびアミノ酸配列と、本明細書に記載するフォワードおよびリバースプライマー対ならびにRNAi試薬のヌクレオチド配列が含まれ、これらは、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。配列表はコンパクトディスク（すなわちCD-ROM）に記録して、その同一コピー3通を本明細書と共に提出する。IBM/PC MS-WINDOWS（登録商標）テキスト形式の本配列表は2007年2月1日に初めて作成され、サイズは153MBである。
【図２】
2010517510.tif 000052
【図３】
2010517510.tif 000053
【図５】
2010517510.tif 000054
【図１】
2010517510.tif 000055
【図４】
2010517510.tif 000056
【配列表】
2010517510000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年9月8日(2009.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010517510000001.app
【国際調査報告】
2010517510.tif 000057
2010517510.tif 000058
2010517510.tif 000059
2010517510.tif 000060