(57)【要約】  【課題】本発明は、ランチビオティックの分野、より詳細にはランチビオティック１０７８９１およびそのホモログの生合成経路のために必要とされる酵素をコードする核酸分子の単離に関する。  【解決手段】ａ）配列番号１のｍｌｂ遺伝子クラスター（配列番号１）；ｂ）ｍｌｂ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列以外の、配列番号１のｍｌｂ遺伝子クラスターによってコードされる同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｃ）配列番号２〜１８によってコードされるポリペプチドをコードする、ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜１７の任意のヌクレオチド配列；ならびに  ｄ）前記ＯＲＦのヌクレオチド配列以外の、ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）のいずれかによってコードされる同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）１０７８９１およびそのホモログの合成のために必要とされるポリペプチドをコードするｍｌｂ遺伝子クラスター（配列番号１）；
ｂ）ｍｌｂ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列以外の、ｍｌｂ遺伝子クラスター（配列番号１）によってコードされる同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号２〜１８によってコードされるポリペプチドをコードする、ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜１７の任意のヌクレオチド配列；ならびに
ｄ）前記ＯＲＦのヌクレオチド配列以外の、ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）のいずれかによってコードされる同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項２】
ｅ）その長さ全体にわたって、ｍｌｂ  ＯＲＦ２、６〜９、１５〜１６（配列番号３、７〜１０、１６〜１７）のいずれかによってコードされるポリペプチドに、アミノ酸配列が少なくとも６５％、少なくとも８６％、少なくとも９０％および少なくとも９５％またはそれ以上同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項３】
ｍｌｂ  ＯＲＦ６（配列番号７）から成る１０７８９１のプレプロペプチドの合成のために必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または前記ＯＲＦのヌクレオチド配列以外の、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項１または２に記載の単離核酸。
【請求項４】
ｍｌｂ  ＯＲＦ９および１６（配列番号１０および１７）から成るＯＲＦ６ポリペプチドのＣ末端Ｃｙｓ残基の酸化的脱炭酸のために必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または前記ＯＲＦのヌクレオチド配列以外の、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項１または２に記載の単離核酸。
【請求項５】
ｍｌｂ  ＯＲＦ７および８（配列番号８および９）から成る１０７８９１プロペプチド部分の脱水および（メチル）ランチオニン形成のために必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または前記ＯＲＦのヌクレオチド配列以外の、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項１または２に記載の単離核酸。
【請求項６】
ｍｌｂ  ＯＲＦ１５（配列番号１６）から成るアミノ酸４の芳香族残基の塩素化のために必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または前記ＯＲＦのヌクレオチド配列以外の、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載の単離核酸。
【請求項７】
ｍｌｂ  ＯＲＦ２（配列番号３）から成る１０７８９１のアミノ酸１４のプロリン残基のヒドロキシル化のために必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または前記ＯＲＦのヌクレオチド配列以外の、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載の単離核酸。
【請求項８】
１０７８９１若しくはその前駆体の一部を細胞質の外側に輸送するため、ならびにｍｌｂ  ＯＲＦ１、１０、１１、１３、１４および１７（配列番号２、１１、１４、１５および１８）から成る産生株に１０７８９１に対する耐性を付与するためために必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または前記ＯＲＦのヌクレオチド配列以外の、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項１または２に記載の単離核酸。
【請求項９】
ｍｌｂ  ＯＲＦ３および５（配列番号４および６）から成るｍｌｂ遺伝子クラスターの１若しくはそれ以上の遺伝子の発現を調節するために必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または前記ＯＲＦのヌクレオチド配列以外の、同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の組合せを含む、請求項１または２に記載の単離核酸。
【請求項１０】
１０７８９１の合成のために必要とされるポリペプチドをコードするｍｌｂ遺伝子クラスターから成るヌクレオチド配列を含み、プロリン残基のヒドロキシル化のために必要とされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列内にインフレーム欠失が導入されている、請求項１または２に記載の単離核酸。
【請求項１１】
ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）の少なくとも１つ、または前記ｍｌｂ  ＯＲＦのヌクレオチド配列以外の、前記ｍｌｂ  ＯＲＦによってコードされる同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の、少なくとも１つの余分なコピーを担持するヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載の単離核酸配列。
【請求項１２】
ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列である、請求項１〜１１のいずれかに記載の単離核酸。
【請求項１３】
請求項１２のいずれかにおいて定義されるＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡベクター。
【請求項１４】
請求項１３のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）に属する、請求項１４に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１６】
ストレプトスポランギウム科（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ）、ミクロモノスポラ科（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、シュードノカルジア科（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）およびストレプトミセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）から選択される科に属する、請求項１５に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１７】
ミクロビスポラ属（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ）、アクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、プラノモノスポラ属（Ｐｌａｎｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等から選択される属に属する、請求項１６に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１８】
バチルス目（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）に属する、請求項１４に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１９】
バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、乳酸杆菌科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、連鎖球菌科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）またはブドウ球菌科（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）から選択される科に属する、請求項１８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項２０】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）等から選択される属に属する、請求項１９に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項２１】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）種に属する、請求項１４に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項２２】
生合成経路によって１０７８９１またはその前駆体を産生することができる微生物による、１０７８９１またはそのホモログの生産を高めるための方法であって、
−生合成経路によって１０７８９１または１０７８９１前駆体を産生する微生物を請求項１３の組換えＤＮＡベクターで形質転換すること、但し、前記ＤＮＡベクターは、前記経路において律速性である活性の発現をコードする；
−前記ベクターで形質転換した前記微生物を細胞増殖に適する条件下で培養し、前記遺伝子を発現させて、前記抗生物質または抗生物質前駆体を生産すること
を含む、方法。
【請求項２３】
そのゲノム内の１０７８９１生合成遺伝子が請求項１０に記載のヌクレオチド配列の挿入によって修飾されている、１０７８９１またはそのホモログまたはその前駆体若しくは誘導体を産生する形質転換微生物。
【請求項２４】
請求項２３の形質転換１０７８９１産生微生物を培養することを含む、１０７８９１またはその前駆体若しくは誘導体を生産するための工程。
【請求項２５】
そのゲノム内に１０７８９１生合成遺伝子を有し、ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）から選択される１０７８９１生合成遺伝子の少なくとも１つが破壊されている、形質転換１０７８９１産生微生物。
【請求項２６】
破壊されている生合成遺伝子が塩素残基の結合に関与する遺伝子である、請求項２５に記載の形質転換微生物。
【請求項２７】
請求項２５の形質転換１０７８９１産生微生物を含む、１０７８９１前駆体または誘導体を生産するための工程。
【請求項２８】
１０７８９１またはその前駆体とは異なるランチビオティックを生産するための方法であって、
−生合成経路によって１０７８９１またはその前駆体とは異なるランチビオティックまたはランチビオティック前駆体を産生する微生物を組換えＤＮＡベクターで形質転換すること、但し、前記ベクターまたはその部分は、前記ランチビオティックまたはランチビオティック前駆体を修飾する酵素活性の発現をコードする、請求項１〜１１のいずれかのヌクレオチド配列を含む；および
−前記ベクターで形質転換した前記微生物を細胞増殖に適する条件下で培養し、前記遺伝子を発現させて、前記抗生物質または抗生物質前駆体を生産すること
を含む、方法。
【請求項２９】
−ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）のいずれかによってコードされるＯＲＦポリペプチド；ならびに
−ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）のいずれかによってコードされるＯＲＦポリペプチドに、アミノ酸配列が少なくとも６５％同一であるポリペプチド、少なくとも９０％同一であるポリペプチドおよび少なくとも９５％またはそれ以上同一であるポリペプチドから成る群より選択されるポリペプチド
から選択される、単離ポリペプチド。
【請求項３０】
ｍｌｂ  ＯＲＦ２、６〜９、１５〜１６（配列番号３、７〜１０、１６〜１７）のいずれか１つである、請求項２９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３１】
ｍｌｂ  ＯＲＦ２、６〜９、１５〜１６（配列番号３、７〜１０、１６〜１７）のいずれか１つによってコードされるｍｌｂ  ＯＲＦポリペプチド、または前記ｍｌｂ  ＯＲＦのいずれかによってコードされるポリペプチドに、アミノ酸配列が少なくとも６５％同一であるポリペプチド、少なくとも９０％同一であるポリペプチドおよび少なくとも９５％若しくはそれ以上同一であるポリペプチドから成る群より選択されるポリペプチドを含む、請求項２９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３２】
ｍｌｂ  ＯＲＦ１、１０〜１１、１３〜１４および１７（配列番号２、１１〜１２、１４〜１５および１８）のいずれかによってコードされるｍｌｂ  ＯＲＦポリペプチド、または前記ｍｌｂ  ＯＲＦのいずれかによってコードされるポリペプチドに、アミノ酸配列が少なくとも６５％同一であるポリペプチド、少なくとも９０％同一であるポリペプチドおよび少なくとも９５％若しくはそれ以上同一であるポリペプチドから成る群より選択されるポリペプチドを含む、請求項２９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３３】
ｍｌｂ  ＯＲＦ３および５（配列番号４および６）のいずれかによってコードされるｍｌｂ  ＯＲＦポリペプチド、または前記ｍｌｂ  ＯＲＦのいずれかによってコードされるポリペプチドに、アミノ酸配列が少なくとも６５％同一であるポリペプチド、少なくとも９０％同一であるポリペプチドおよび少なくとも９５％若しくはそれ以上同一であるポリペプチドから成る群より選択されるポリペプチドを含む、請求項２９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３４】
請求項１〜１２のいずれかの核酸のいずれかによってコードされるポリペプチドから選択される、１０７８９１の生合成経路に関与するポリペプチドを含む単離ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ランチビオティックの分野、より詳細にはランチビオティック１０７８９１およびそのホモログの生合成経路のために必要とされる酵素をコードする核酸分子の単離に関する。１０７８９１の産生に関与する遺伝子産物の機能が開示される。本発明は、１０７８９１の産生のために必要な新規生合成遺伝子、コードされるポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えベクター、前記ベクターで形質転換された宿主細胞、および１０７８９１、その前駆体、その誘導体、または１０７８９１若しくはその前駆体とは異なる修飾ランチビオティックを生産するための方法を含む、前記形質転換宿主細胞を使用してランチビオティックを生産するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
既存の抗生物質に対して耐性な病原菌が増加し続けていることは健康衛生上の世界的な問題であり、そのため耐性菌に対して活性な新しい化合物を発見し、開発することが急務である。これにより、過去にペニシリン、マクロライドおよび糖ペプチドなどの抗生物質の豊かな供給源であった天然生成物に新たな関心が寄せられることになった。抗菌性ペプチド、中でも特にランチビオティックと称されるもの、すなわちランチオニン含有抗生物質も、魅力的な候補物質である。ランチビオティックは抗菌性ペプチドの中で特殊な群を形成し、一次構造および空間構造特徴、独特の生合成経路およびペプチド修飾反応、ならびに強力な抗菌活性などのいくつかの特徴によって区別される。これらは、グラム陽性細菌によって分泌されるペプチド由来の抗菌性化合物の群であり、主としてグラム陽性細菌に作用する。ランチビオティックはプレプロペプチドとしてリボソームで合成され、それらの生物活性形態へと翻訳後修飾される。このプレペプチドは、全く翻訳後修飾を受けず、細胞からの分泌の間にまたは分泌後に切断されるＮ末端リーダー配列、および翻訳後修飾されるＣ末端領域（プロペプチド）から成る。ランチビオティックは種々の細菌によって産生される：これらの化合物の共通の特徴は、チオエーテル結合によって共有結合で架橋される２つのアラニン残基から成る、１またはそれ以上のランチオニン残基の存在である。チオエーテル架橋は、システイン残基がデヒドロアラニンまたはデヒドロブチリン部分と反応して、それぞれランチオニンまたはメチルランチオニン残基を生成するときに形成される。次に、それぞれセリンとトレオニンの脱水によってデヒドロアミノ酸残基が形成される。構造的および機能的性質に基づき、ランチビオティックは通常Ａ型とＢ型の２つの群に分けられる。Ａ型ランチビオティックは、２０〜３４アミノ酸残基にわたる様々な長さの伸長したカチオン性ペプチドである：ナイシン、サブチリン、エピデルミンおよびＰｅｐ５はこの群の成員である。Ｂ型は、実効負電荷を有する球状ペプチドである：この群のランチビオティックの例は、メルサシジン、シンナマイシン、ラクチシン４８１およびアクタガルジンである。これらの構造的相違が作用機構に反映する。Ａ型化合物は、細胞標的脂質ＩＩへの事前のドッキングによって補助されてもよくまたは補助されなくてもよい機構を介して、細胞壁の生合成をブロックすることによっておよび細胞膜に細孔を形成することによって、それらの抗菌活性を及ぼす。Ｂ型ランチビオティックも、ペプチドグリカンの生合成を阻害することによって抗菌活性を及ぼすが、これらの化合物は、ひとたび脂質ＩＩに結合すると孔を形成しない。
【０００３】
ランチビオティックは、食品添加物および抗菌薬として効果と有用性を有することが示された。最も広く検討されているランチビオティック、ナイシンは、ラクチス乳酸菌（ラクトコッカス・ラクティス）（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）によって産生され、薬剤耐性株および食品媒介病原菌であるボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）およびリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を含む多くのグラム陽性細菌に対して低濃度で活性である（低いナノモルＭＩＣ）。ナイシンは、細菌耐性を実質的に発現することなく食品防腐剤として広く使用されてきた。他のランチビオティックは興味深い生物活性を示す：たとえば、エピデルミンはアクネ菌（プロピオニバクテリウム・アクネス）（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）に対して高い効力を示す；シンナマイシンおよびデュラマイシンはホスホリパーゼＡ2およびアンギオテンシン変換酵素を阻害し、それぞれ抗炎症薬としておよび血圧調節のために潜在的な用途を提供する；そしてメルサシジンは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）を含む多くのグラム陽性細菌を阻害する。
【０００４】
ランチビオティックの生合成に関与する遺伝子は、遺伝子座記号ｌａｎによって表されるクラスターに組織化され、各々のランチビオティックについてより詳細な遺伝子型表示が与えられる（たとえば、ナイシンについてはｎｉｓ、ガリデルミンについてはｇｄｍ、シンナマイシンについてはｃｉｎ）。多くのｌａｎ遺伝子が配列決定されており、遺伝子構成における高レベルの類似性を明らかにした。各々のクラスターは、プレペプチドをコードする構造遺伝子ｌａｎＡ；ならびにＬａｎＡのプロペプチド部分中のＳｅｒおよびＴｈｒ残基の脱水のためおよびチオエーテル形成のために必要とされる遺伝子を含む。Ａ型ランチビオティックに関しては、ＬａｎＢが脱水反応を実施し、ＬａｎＣはもっぱらチオエーテル架橋を担当するが、Ｂ型ランチビオティックでは、単一のＬａｎＭ酵素が両方の反応を触媒する。ランチビオティッククラスター内には付加的な遺伝子が通常存在する：ｌａｎＴは、ｌａｎＥＦＧ遺伝子によってコードされる第２の輸送系としばしば共同して、ランチビオティックの分泌のためのＡＢＣ輸送体をコードする；ｌａｎＰはプロセシングプロテアーゼをコードするが、一部のクラスターは、ｌａｎＴの一部であり得るそのような遺伝子を欠くかまたはその機能が細胞プロテアーゼによって提供され得る；ｌａｎＩは、自己防御に関与するタンパク質をコードする；そしてｌａｎＫＲは、ｌａｎ遺伝子の発現を調節する役割を担う。
【０００５】
存在する天然化合物の操作によって改善されたランチビオティックを得る潜在的可能性と有用性が存在する。しかし、ランチビオティックは構造的に複雑なペプチドであり、それらへの化学的アクセスの可能性は分子内の少数の位置に限定される。化学にとっての主要な制限の１つは、ペプチド骨格内に存在するアミノ酸の種類または順序を変更することである。前記を考慮すると、化学的手段によって作製することが難しいまたは不可能な誘導体を得るために、ランチビオティック形成においてこれらの段階を再指令するために有用な遺伝子および酵素を得ることが望ましい。厳密に工作された菌株を用いた発酵工程によって直接的に新規ランチビオティック誘導体を設計するための一般的な方法は、それ故、極めて望ましい。
【０００６】
実際に、ランチビオティックの異常アミノ酸がもっぱらそれらの生物活性に寄与し、同時にそれらの構造安定性も増強する。ランチビオティック生合成に関与する酵素は、所望ペプチドに異常アミノ酸を導入することによるペプチド工作のための高い潜在的可能性を示す。
【０００７】
ランチビオティック１０７８９１は、メチシリン耐性およびバンコマイシン耐性株を含むグラム陽性細菌に対して抗菌活性を示すが、グラム陰性細菌（たとえば、一部のモラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）およびヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種）に対しては限られた活性を示す。１０７８９１は、ミクロビスポラ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ）種、ＰＴＡ−５０２４の発酵から単離された（国際公開公報第ＷＯ２００５／０４６２８  Ａ１号）。１０７８９１は、密接に関連する因子Ａ１およびＡ２の複合体から成り、それらの構造は、ランチオニンおよびメチルランチオニンを成分として含む、２４アミノ酸長のペプチド骨格に再構成する（ｒｅｃｏｎｄｕｃｔｅｄ）ことができる。加えて、塩素原子および１または２個の−ＯＨ残基が分子上に存在する。１０７８９１複合体の成分の構造は、図３の式１によって表され、式中、Ｒは、係数Ａ1（Ｒ＝ＯＨ）、係数Ａ2（Ｒ＝−（ＯＨ）2）を有する［ＯＨ］を表す。１０７８９１は、Ａ型およびＢ型ランチビオティックのエレメントを組み合わせると思われる：１０７８９１中の環ＡおよびＢは、Ａ型化合物中の等価環に高度に関連する；しかし、Ｂ型ランチビオティックにおけるように、１０７８９１はむしろ球状であり、柔軟なＣ末端尾部を欠き、荷電アミノ酸残基を有さない。その結果として、１０７８９１形成を担当するｌａｎクラスターが単一ＬａｎＭ酵素をコードするのか、または別々のＬａｎＢおよびＬａｎＣタンパク質をコードするのかは予測できない。さらに、塩素含有ランチビオティックについての先例はなく、それ故この翻訳後修飾に関与する遺伝子を入手可能なデータから予測することはできない。
【０００８】
抗生物質生産のための工業的工程の設計は比較的成功を収めており、１リットル当たり数グラムのレベルに達する抗体力価での大規模発酵をもたらした。これは主として経験的な試行錯誤アプローチに従うことによって達成されたものであり、合理的根拠を欠く。新しい工程の開発と現在の技術の改善は、それ故、依然として多大の時間を要し、不安定で、一貫して機能せず、望ましくない副産物を蓄積する細菌培養物を生じ得る。近年、合理的な方法がストレプトミセス種による抗生物質産生のレベルを高めるために成功裏に適用されており、それらの方法はしばしば、対象遺伝子クラスター内に存在する鍵となる調節エレメントの操作、または経路における律速工程の過剰発現を含んだ。それ故、そのようなクラスター関連調節因子または合成における律速工程をコードする遺伝子は、収率改善のための有効なツールであり得る。しかし、放線菌類においてこれまでに同定されたクラスター関連調節因子はいくつかの異なるタンパク質ファミリーに属する。１つのファミリー内でさえも、配列同一性にはかなりの変動がある。それ故、クラスター関連調節因子の存在、性質、数および配列は、関連抗生物質を規定するものでさえも、他のクラスターとの比較によって予測することができない。一例として、タイロシン遺伝子クラスターは４つの異なる調節因子をコードするが、そのいずれもが、関連するマクロライド系抗生物質、エリスロマイシンを規定するクラスター内では認められなかった。同様に、生合成経路における律速工程についての性質と理由も、推測的に確立することはできない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それ故、１０７８９１の収率を高めるためのツールは極めて望ましい。しかし、ミクロビスポラ属（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ）の他の成員からのクラスターの例はない。そのため、プロデューサー株が１０７８９１の作用から自衛する、その他のｌａｎ遺伝子の発現を支配する、またはｌａｎ遺伝子の発現をその他の細胞プロセスと調整する機構は、予測することができない。これらについての情報は、生産工程を最適化するために非常に有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、微生物におけるランチビオティック１０７８９１の生合成のために必要とされる一組の単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１１】
そこで、その態様の１つによれば、本発明は、ミクロビスポラ種ＰＴＡ−５０２４から単離されたｍｌｂ遺伝子クラスターであり、１０７８９１形成のために必要とされるポリペプチドをコードする１７個のＯＲＦから成る、隣接ＤＮＡ配列（配列番号１）から選択されるポリヌクレオチド分子に関する。
【００１２】
前記１７個のＯＲＦによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２〜１８において提供される。
【００１３】
本発明はまた、
ａ）１０７８９１およびそのホモログの合成のために必要とされるポリペプチドをコードするｍｌｂ遺伝子クラスター（配列番号１）；
ｂ）ｍｌｂ遺伝子クラスター自体のヌクレオチド配列以外の、ｍｌｂ遺伝子クラスター（配列番号１）によってコードされる同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号２〜１８によってコードされるポリペプチドをコードする、ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜１７の任意のヌクレオチド配列；
ｄ）前記ＯＲＦのヌクレオチド配列以外の、ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）のいずれかによってコードされる同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる対象は、
ｅ）その完全長にわたって、ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）のいずれかによってコードされるポリペプチドに、アミノ酸配列が少なくとも６５％、好ましくは８６％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％またはそれ以上同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供することである。
【００１５】
１つの実施形態では、本発明の単離核酸は、１０７８９１のプレプロペプチドの合成のために必要とされるポリペプチドをコードする、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）から選択されるＯＲＦを含む。
【００１６】
もう１つの実施形態では、核酸は、１０７８９１デヒドラターゼ酵素の合成のために必要とされるポリペプチドをコードする、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）から選択されるＯＲＦを含む。さらにもう１つの実施形態では、核酸は、１０７８９１のランチオニンおよびメチルランチオニン残基の合成のために必要とされるポリペプチドをコードする、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）から選択されるＯＲＦを含む。
【００１７】
もう１つの実施形態によれば、本発明の核酸において、１０７８９１のアミノ酸４のトリプトファン残基の塩素化のために必要とされるポリペプチドをコードする、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）から選択されるＯＲＦが提供される。
【００１８】
さらにもう１つの実施形態では、１０７８９１のアミノ酸１４のプロリン残基のヒドロキシル化のために必要とされるポリペプチドをコードする、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）から選択されるＯＲＦを含む核酸が提供される。
【００１９】
さらにもう１つの実施形態では、１０７８９１の２１位と２４位に存在するＳ−［（Ｚ）−２−アミノビニル］−（３Ｓ）−３−メチル−Ｄ−システイン（ＡｖｉＭｅＣｙｓ）残基を生じる酸化的脱炭酸のために必要とされるフラボタンパク質をコードする、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）から選択されるＯＲＦを含む核酸が提供される。
【００２０】
もう１つの実施形態によれば、本発明の核酸において、フラボタンパク質の還元のために必要とされるポリペプチドをコードする、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）から選択されるＯＲＦが提供される。
【００２１】
さらにもう１つの実施形態によれば、１０７８９１の輸送および１０７８９１に対する耐性のために必要とされるポリペプチドをコードする、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）から選択されるＯＲＦの組合せを含む核酸が提供される。
【００２２】
さらにもう１つの実施形態では、ｍｌｂ遺伝子クラスターの発現を調節するために必要とされるポリペプチドをコードする、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）から選択されるＯＲＦの組合せを含む核酸が提供される。
【００２３】
当業者は、１０７８９１生合成経路のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供した本発明が、そのようなポリペプチドに由来するフラグメントをコードするヌクレオチドも同時に提供することを理解する。本発明によれば、当業者は、遺伝暗号は縮重しているため、配列番号２〜８によってコードされる同じポリペプチドが、ＯＲＦ１〜１７の天然または人為的変異体によって、すなわちＯＲＦ１〜１７によって規定されるゲノムヌクレオチド配列以外であるが同じポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によってコードされ得ることを理解する。
【００２４】
さらに、天然に生じるまたは人為的に製造された変異体が配列番号２〜１８によってコードされるポリペプチドについて生じ得ること、そして前記変異体は、前述したもとのポリペプチドと同じ機能を有するが、折りたたみ若しくは触媒機能のために必須でないアミノ酸の付加、欠失若しくは置換、または必須アミノ酸の保存的置換を含むことも了解される。
【００２５】
当業者はまた、１０７８９１生合成のために必要とされるクラスター全体のヌクレオチド配列を提供した本発明が、前記クラスター内に存在する遺伝子の発現のために必要とされるヌクレオチド配列も同時に提供することを理解する。そのような調節配列は、プロモーターおよびエンハンサー配列、アンチセンス配列、転写終結因子および抗転写終結因子配列を含むが、これらに限定されない。これらの配列は、ｍｌｂ遺伝子クラスター内に存在する遺伝子の発現を調節するために有用である。単独のまたは他のヌクレオチド配列に融合した前記ヌクレオチド配列を担持する細胞も、本発明の範囲内に含まれる。
【００２６】
１つの態様では、本発明は、１０７８９１のプレプロペプチドをコードする、ＯＲＦ６ポリペプチド（配列番号７）、または前記ポリペプチドの天然に生じる変異体若しくは誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。
【００２７】
もう１つの態様では、本発明は、ランチビオティック前駆体におけるセリンおよびトレオニン残基の脱水のために有用な、ＯＲＦ７ポリペプチド（配列番号８）、または前記ポリペプチドの天然に生じる変異体若しくは誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００２８】
さらにもう１つの態様では、本発明は、ランチビオティック前駆体におけるランチオニンおよびメチルランチオニン形成のために有用な、ＯＲＦ８ポリペプチド（配列番号９）、または前記ポリペプチドの天然に生じる変異体若しくは誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００２９】
もう１つの態様では、本発明は、抗生物質前駆体におけるＡｖｉＭｅＣｙｓ形成のために有用な、ＯＲＦ９ポリペプチド（配列番号１０）または前記ポリペプチドの天然に生じる変異体若しくは誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。もう１つの態様では、本発明は、ランチビオティック前駆体におけるトリプトファン残基を塩素化するために有用な、ＯＲＦ１５ポリペプチド（配列番号１６）、または前記ポリペプチドの天然に生じる変異体若しくは誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００３０】
さらにもう１つの態様では、本発明は、ランチビオティック前駆体におけるプロリン残基をヒドロキシル化するために有用な、ＯＲＦ２ポリペプチド（配列番号３）、または前記ポリペプチドの天然に生じる変異体若しくは誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００３１】
もう１つの態様では、本発明は、１０７８９１若しくは１０７８９１前駆体の細胞外への輸送のために有用な、ＯＲＦ１、１０〜１１、１３〜１４および１７（配列番号２、１１〜１２、１４〜１５および１８）によって規定されるポリペプチド、または前記ポリペプチドの天然に若しくは人為的に生じる変異体若しくは誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００３２】
もう１つの態様では、本発明は、ランチビオティック産生を調節するために有用な、ＯＲＦ３および５ポリペプチド（配列番号４および６）、または前記ポリペプチドの天然に若しくは人為的に生じる変異体若しくは誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００３３】
１つの実施形態では、本発明は、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）のいずれかから選択される少なくとも１つのＯＲＦを規定するヌクレオチド配列の余分なコピーを担持するランチビオティック産生株を提供する。
【００３４】
１つの好ましい実施形態では、そのようなランチビオティック産生株は、放線菌目に属する任意の菌株である。
【００３５】
さらにもう１つの好ましい実施形態では、そのようなランチビオティック産生株は、ミクロビスポラ属の成員である。
【００３６】
１つの好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１において規定されるヌクレオチド配列内に１またはそれ以上の変異を含むミクロビスポラ属株を提供し、そのような変異は、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）の１またはそれ以上の発現上昇または発現低下を生じさせる。
【００３７】
１つの好ましい実施形態では、本発明は、別の細胞による１０７８９１、その前駆体の１若しくはそれ以上またはその誘導体の生産のために有用な、１またはそれ以上のベクターに担持される、配列番号１によって規定されるヌクレオチド配列またはその部分を含む核酸を提供する。
【００３８】
１つの好ましい実施形態では、前記ヌクレオチド配列またはその部分は、単一ベクター上に担持される。適切なベクターは、本明細書で定義されるｍｌｂクラスター全体を担持することができる任意のコスミド、フォスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＥＳＡＣベクターである。適切なベクターは当業者に周知であり、文献に記載されている（  Ｋｉｅｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００およびその中に記載される参考文献）。
【００３９】
１つの態様では、本発明は、１０７８９１の生産を高めるための方法であって、以下の工程：
−生合成経路によって１０７８９１若しくはそのホモログまたは１０７８９１の前駆体若しくはそのホモログを産生する微生物を、組換えＤＮＡベクターで形質転換すること、但し、前記ＤＮＡベクターは、前記経路において律速性である活性をコードする、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）のいずれかから選択されるＤＮＡ配列を含む；
−前記ベクターで形質転換した前記微生物を細胞増殖に適する条件下で培養し、前記遺伝子を発現させて、前記抗生物質または抗生物質前駆体を生産すること
を含む方法を提供する。
【００４０】
適切な宿主細胞は、放線菌目、ストレプトスポランギウム科（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ）、ミクロモノスポラ科（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、シュードノカルジア科（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）およびストレプトミセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）、ミクロビスポラ属（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ）、アクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、プラノモノスポラ属（Ｐｌａｎｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等である。
【００４１】
もう１つの態様では、本発明は、１０７８９１の誘導体およびそのホモログを生産するための方法であって、以下の工程：
−配列番号１によって定義されるヌクレオチド配列から選択されるセグメントを適切なベクターにクローニングすること、但し、前記セグメントは、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）の１つの少なくとも一部を含み、前記ＯＲＦは、回避しようとする生合成工程を触媒するポリペプチドをコードする；
−前記ポリペプチドの活性のために必須であるアミノ酸を規定する１またはそれ以上のコドンを除去するまたは置換することによって、前記ＯＲＦを不活性化すること；
−生合成経路によって１０７８９１またはそのホモログまたはその１０７８９１前駆体を産生する微生物を前記組換えＤＮＡベクターで形質転換すること；
−生じた形質転換体を、前記ＤＮＡ配列が突然変異コピーによって置換されているものに関してスクリーニングすること；
−突然変異細胞を細胞増殖に適する条件下で培養し、前記経路を発現させて、前記経路の類似体を生産すること
を含む方法を提供する。
さらにもう１つの態様では、本発明は、新規ランチビオティックを生産するための方法であって、以下の工程：
−生合成経路によってランチビオティックまたはそのホモログまたはその前駆体を産生する微生物を組換えＤＮＡベクターで形質転換すること、但し、前記ベクターは、前記ランチビオティックまたはランチビオティック前駆体を修飾することができる酵素をコードする、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）から選択される１またはそれ以上のＯＲＦを含む；
−前記ベクターで形質転換した前記微生物を細胞増殖に適する条件下で培養し、前記遺伝子を発現させて、前記ランチビオティックまたはそのホモログまたはそのランチビオティック前駆体を生産すること
を含む方法を提供する。
【００４２】
さらにもう１つの態様では、本発明は、新規ランチビオティックを生産するための方法であって、以下の工程：
−微生物を組換えＤＮＡベクターで形質転換すること、但し、前記ベクターは、ランチビオティックまたはランチビオティック前駆体を修飾することができる酵素をコードする、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）から選択される１またはそれ以上のＯＲＦを含む；
−前記ベクターで形質転換した前記微生物を細胞増殖に適する条件下で培養し、前記ランチビオティックまたはランチビオティック前駆体の存在下で前記遺伝子を発現させること
を含む方法を提供する。
【００４３】
さらにもう１つの態様では、本発明は、新規ランチビオティックを生産するための方法であって、以下の工程：
−微生物を組換えＤＮＡベクターで形質転換すること、但し、前記ベクターは、ランチビオティックまたはランチビオティック前駆体を修飾する１またはそれ以上のポリペプチドをコードする、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）から選択される１またはそれ以上のＯＲＦを含む；
−前記微生物の細胞抽出物または細胞画分を、活性ポリペプチドの存在に適する条件下で調製すること、但し、前記細胞抽出物または細胞画分は、少なくとも前記ポリペプチドを含む；
−前記細胞抽出物または細胞画分にランチビオティックまたはランチビオティック前駆体を添加し、前記ポリペプチドが前記ランチビオティックまたはランチビオティック前駆体を修飾することができる条件下で前記混合物をインキュベートすること
を含む方法を提供する。
【００４４】
本発明のさらなる態様は、
−ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）のいずれか１つによってコードされるＯＲＦポリペプチド；および
−その完全長にわたって、ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）のいずれか１つによって、好ましくはｍｌｂ  ＯＲＦ１〜３、５〜１１、１３〜１７（配列番号２〜４、６〜１２、１４〜１８）のいずれか１つによってコードされるポリペプチドに、アミノ酸配列が少なくとも６５％、好ましくは９５％またはそれ以上同一であるポリペプチド
から選択される、１０７８９１の生合成経路に関与する単離ポリペプチドを含む。
【００４５】
ポリペプチドの好ましい群は、ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜３、５〜１１、１３〜１７（配列番号２〜４、６〜１２、１４〜１８）のいずれかによってコードされる任意のＯＲＦポリペプチド、またはその完全長にわたって、前記ｍｌｂ  ＯＲＦのいずれかによってコードされるポリペプチドに、アミノ酸配列が少なくとも６５％、好ましくは８６％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％若しくはそれ以上同一である任意のポリペプチドを含む。
【００４６】
定義
本明細書における「単離核酸（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」という用語は、天然または合成起源の、一本鎖または二本鎖であり得る、ゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のいずれかとしてのＤＮＡ分子を指す。この用語はまた、天然または合成起源のＲＮＡ分子をも指す。
【００４７】
本明細書における「ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書で開示するＯＲＦおよび遺伝子間領域の完全長または部分長配列を指す。
【００４８】
本明細書における「ヌクレオチド配列」という用語はまた、配列表に示す本発明のヌクレオチド配列のいずれか１つを指すおよび／またはいずれか１つを含む。配列表のヌクレオチド配列のいずれか１つは、
Ａ）コード配列、
Ｂ）（Ａ）の転写に由来するＲＮＡ分子、
Ｃ）同一ポリペプチドをコードする遺伝暗号の縮重を利用するコード配列、
Ｄ）プロモーター、エンハンサー、終結因子および抗終結因子配列を含む遺伝子間領域
である。
【００４９】
本明細書における「遺伝子クラスター」、「クラスター」および「生合成クラスター」という用語は、二次代謝産物の合成のために必要とされるすべての遺伝子を含む微生物のゲノムの隣接セグメントを表す。
【００５０】
本明細書における「ｍｌｂ」という用語は、ミクロビスポラ種ＰＴＡ−５０２４において１０７８９１生合成の役割を担う遺伝的エレメントを指す。この用語は、ミクロビスポラ種ランチビオティック（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ＬａｎｔｉＢｉｏｔｉｃ）の頭字語である。
【００５１】
本明細書における「ＯＲＦ」という用語は、１つのポリペプチドをコードするゲノムヌクレオチド配列を指す。本発明に関して、ＯＲＦという用語は「遺伝子」と同義である。
【００５２】
本明細書における「ＯＲＦポリペプチド」という用語は、ＯＲＦによってコードされるポリペプチドを指す。
【００５３】
本明細書における「ｍｌｂ  ＯＲＦ」という用語は、ｍｌｂ遺伝子クラスター内に含まれるＯＲＦを指す。
【００５４】
本明細書における「二次代謝産物」という用語は、遺伝子クラスターによって規定される一組の遺伝子の発現を介して微生物によって産生される生物活性物質を指す。
【００５５】
本明細書における「ベクター」という用語は、中でも特に、細胞ゲノムへの組込みによって原核生物宿主を形質転換することができるまたは染色体外に存在することができる（たとえば複製起点を有する自律複製プラスミド）、任意のプラスミド、コスミド、ファージを包含すると定義される。
【００５６】
本明細書における「生産宿主」、「宿主細胞」という用語は、二次代謝産物の形成が供与体生物に由来する遺伝子クラスターによって指令される微生物である。
【００５７】
本明細書における「相同な」という用語は、ｍｌｂクラスターによってコードされるポリペプチドのいずれかとその長さ全体にわたって少なくとも６５％の配列同一性を共有する、生合成遺伝子クラスターによってコードされるポリペプチドを指す。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ミクロビスポラ種ＰＴＡ−５０２４の染色体に由来する単離ＤＮＡセグメントを示す。太い線は、配列番号１に記述されるセグメントを示す。前記単離ＤＮＡセグメントを担持するコスミドを１Ｇ６および６Ｈ６と称する。
【図２】ｍｌｂクラスターの遺伝子構成を示す。各々のＯＲＦを矢印によって表し、表１（図４）におけるように番号づけている。方向は図１と同じである。スケールバー上の数字は配列座標（ｋｂ）を指示する。
【図３】１０７８９１複合体の成分の構造を示す。
【図４】ＯＲＦの主要特徴を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
Ａ．ミクロビスポラ種から単離したｍｌｂ遺伝子
【００６０】
１０７８９１は、ミクロビスポラ種ＰＴＡ−５０２４によって産生される密接に関連するペプチド抗生物質の複合体である。本発明は、１０７８９１生合成のためのｍｌｂ遺伝子クラスターの核酸配列および特徴づけを提供する。ｍｌｂ遺伝子クラスターの物理的構成を、隣接するＤＮＡ配列と共に図１に報告しており、図１は、ミクロビスポラ種ＰＴＡ−５０２４のゲノムからの２０ｋｂのゲノムセグメントの物理地図を、そのようなセグメントを定義する２つのコスミドと共に例示する。１０７８９１生合成を支配するＤＮＡセグメントの遺伝子構成を図２に示しており、そのヌクレオチド配列を配列番号１として報告する。
【００６１】
クラスターの正確な境界は、その遺伝子産物の機能から確立することができる。それ故、左端では（図１）、ｍｌｂクラスターは、１０７８９１の輸送に関与するＡＢＣ輸送体をコードするｍｌｂ  ＯＲＦ１（配列番号２）によって境界を定められる。右側では、ｍｌｂクラスターは、膜イオン対向輸送体、ｍｌｂ  ＯＲＦ１７（配列番号１８）によって境界を定められる。ｍｌｂクラスターは約２０，０００塩基対にわたり、ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜ｍｌｂ  ＯＲＦ１７と称される１７個のＯＲＦを含む。配列番号１の隣接ヌクレオチド配列（２０，０００塩基対）は、配列番号２〜１８に列挙される１７個の推定タンパク質をコードする。
【００６２】
ＯＲＦ１（配列番号２）は、配列番号１のヌクレオチド６７〜９６９を翻訳することから推定される３００個のアミノ酸である。
【００６３】
ＯＲＦ２（配列番号３）は、配列番号１のヌクレオチド９６６〜２２１０を翻訳することから推定される４１４個のアミノ酸である。
【００６４】
ＯＲＦ３（配列番号４）は、配列番号１のヌクレオチド２９４１〜３７２３を翻訳することから推定される２６０個のアミノ酸である。
【００６５】
ＯＲＦ４（配列番号５）は、配列番号１のヌクレオチド３９４８〜４６１４を翻訳することから推定される２２１個のアミノ酸である。
【００６６】
ＯＲＦ５（配列番号６）は、相補鎖上の配列番号１のヌクレオチド５２８３〜４６２１を翻訳することから推定される２２０個のアミノ酸である。
【００６７】
ＯＲＦ６（配列番号７）は、配列番号１のヌクレオチド５４１４〜５５８７を翻訳することから推定される５７個のアミノ酸である。
【００６８】
ＯＲＦ７（配列番号８）は、配列番号１のヌクレオチド５７０６〜９０５３を翻訳することから推定される１１１５個のアミノ酸である。
【００６９】
ＯＲＦ８（配列番号９）は、配列番号１のヌクレオチド９０８０〜１０５０７を翻訳することから推定される４７５個のアミノ酸である。
【００７０】
ＯＲＦ９（配列番号１０）は、配列番号１のヌクレオチド１０５３７〜１１１８４を翻訳することから推定される２１５個のアミノ酸である。
【００７１】
ＯＲＦ１０（配列番号１１）は、配列番号１のヌクレオチド１１１８１〜１２１３１を翻訳することから推定される３１６個のアミノ酸である。
【００７２】
ＯＲＦ１１（配列番号１２）は、配列番号１のヌクレオチド１２２５３〜１２９８１を翻訳することから推定される２４２個のアミノ酸である。
【００７３】
ＯＲＦ１２（配列番号１３）は、配列番号１のヌクレオチド１３３５７〜１３９９２を翻訳することから推定される２１１個のアミノ酸である。
【００７４】
ＯＲＦ１３（配列番号１４）は、配列番号１のヌクレオチド１４７９５〜１５５４４を翻訳することから推定される２４９個のアミノ酸である。
【００７５】
ＯＲＦ１４（配列番号１５）は、配列番号１のヌクレオチド１５５４６〜１６２５６を翻訳することから推定される２３６個のアミノ酸である。
【００７６】
ＯＲＦ１５（配列番号１６）は、配列番号１のヌクレオチド１６３７０〜１７９９５を翻訳することから推定される５４１個のアミノ酸である。
【００７７】
ＯＲＦ１６（配列番号１７）は、配列番号１のヌクレオチド１７９９２〜１８５２８を翻訳することから推定される１７８個のアミノ酸である。
【００７８】
ＯＲＦ１７（配列番号１８）は、配列番号１のヌクレオチド１８５２５〜１９８１７を翻訳することから推定される４３０個のアミノ酸である。
【００７９】
ｍｌｂクラスターのゲノム構成および一次配列は１０７８９１をＡ型ランチビオティックに位置づける。
【００８０】
ｍｌｂと他のランチビオティック遺伝子クラスターの間での比較は、重要な相違を明らかにする。実際に、ｍｌｂクラスターは、他のランチビオティッククラスターではホモログが見出されないいくつかのＯＲＦの存在によって特徴づけられる。これらは、ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜６、１２、１５〜１８（配列番号２〜７、１３、１６〜１９）を含む。結論として、本明細書で述べるｍｌｂクラスターの構成は、他のランチビオティックの合成に関与する他のクラスターのものとは実質的に異なる。ｍｌｂクラスターは、それ故、そのようなゲノム構成を有するクラスターの最初の例である。
【００８１】
Ｂ．ｍｌｂ遺伝子の役割
【００８２】
本発明は、１０７８９１のプレプロペプチド前駆体の合成に関与するＤＮＡ配列を開示する。１０７８９１プレプロペプチドは、３３アミノ酸長のリーダーペプチドおよび２４アミノ酸のプロペプチドから成る。本明細書で言及される核酸配列は、１０７８９１プレプロペプチドまたはそのフラグメントをコードするものである。５７アミノ酸の１０７８９１プレプロペプチドは、その長さ全体にわたって、スタフィロコッカス・ガリナルム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からのランチビオティック、ガリデルミンのプレプロペプチド、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２１８３８と４１％だけの同一性を示す新規エレメントである。
【００８３】
ｍｌｂクラスター内に存在する他の遺伝子は、１０７８９１の生産を高めるためまたは新規代謝産物を合成するために有用な新規遺伝的エレメントである。これらの中で、ｍｌｂ  ＯＲＦ７〜８（配列番号８〜９）は、成熟１０７８９１にランチオニン残基を導入する、ｍｌｂ  ＯＲＦ６の翻訳産物の翻訳後修飾に関与するタンパク質をコードする。特に、ｍｌｂ  ＯＲＦ７ポリペプチドは、それぞれデヒドロアラニンおよびデヒドロブチリン（ｄｅｈｙｂｕｔｙｒｉｎｅ）残基を生じる１０７８９１のプレプロペプチド部分のＳｅｒおよびＴｈｒ残基の脱水に関与する。ｍｌｂ  ＯＲＦ８ポリペプチドは、デヒドロアミノ酸残基へのプレプロペプチド内のシステイン残基の求核攻撃を触媒する。これらの遺伝子を異種宿主にクローニングし、発現させて、ランチオニン残基を他のプレプロペプチドに導入することができる活性酵素を生成し得る。
【００８４】
本発明のさらなる他の好ましい核酸分子は、Ｓ−［（Ｚ）−２−アミノビニル］−（３Ｓ）−３−メチル−Ｄ−システイン残基（式Ｉ）を生じる酸化的脱炭酸に関与するタンパク質をコードするｍｌｂ  ＯＲＦ９（配列番号１０）を含む。
【００８５】
本発明のさらなる他の好ましい核酸分子は、１０７８９１のアミノ酸４への塩素原子の付加に関与する、トリプトファンハロゲナーゼをコードするｍｌｂ  ＯＲＦ１６（配列番号１７）を含む。ｍｌｂ  ＯＲＦ１６は、これまで他のランチビオティッククラスターでは報告されていない、新規で独特の遺伝的エレメントである。実際に、塩素化は、公知のランチビオティックの中で１０７８９１のかなり独特の特徴である。この遺伝子を異種宿主にクローニングし、発現させて、ランチビオティック分子のトリプトファン残基を塩素化することができる活性酵素を生成し得る。あるいは、ｍｌｂ  ＯＲＦ１６を産生株において不活性化して、アミノ酸４に結合した塩素を欠く１０７８９１誘導体の形成をもたらすことができる。
【００８６】
本発明のさらなる他の好ましい核酸分子は、１４位のプロリン残基に１または２個の酸素を付加することにより、１０７８９１プレプロペプチドの翻訳後修飾に関与するシトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼをコードするｍｌｂ  ＯＲＦ２（配列番号３）を含む。ｍｌｂ  ＯＲＦ２は、これまで他のランチビオティッククラスターでは一度も報告されたことがない、新規で独特の遺伝的エレメントである。実際に、１０７８９１のプロリンヒドロキシル化プロフィールはランチビオティックの中でかなり独特である。この遺伝子を異種宿主にクローニングし、発現させて、ランチビオティック分子中に存在するプロリン残基を酸化することができる活性酵素を生成し得る。あるいは、ｍｌｂ  ＯＲＦ２を産生株において不活性化して、アミノ酸１４の酸素原子を欠く１０７８９１誘導体の形成をもたらすことができる。
【００８７】
ｍｌｂクラスターはまた、１０７８９１産生の間に生合成遺伝子および耐性遺伝子の発現を直接的または間接的に活性化する役割を担う、多くの調節遺伝子を含む。これらの遺伝子は、ｍｌｂ  ＯＲＦ３および５（配列番号４および６）を含む：ｍｌｂ  ＯＲＦ３（配列番号４）は、一部には、１０７８９１産生の調節の役割を担う、別個の定数感知ペプチド（ｑｕｏｒｕｍ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）である；そしてｍｌｂ  ＯＲＦ５（配列番号６）は、正の転写調節因子として働くＲＮＡポリメラーゼσ因子の細胞質外機能ファミリーである、Ｓｉｇｍａ−７０に強く関連する。ｍｌｂ  ＯＲＦ３および５は、他のランチビオティッククラスターには存在しない、新規遺伝的エレメントである。２つの遺伝子、ｍｌｂ  ＯＲＦ３および５を、形成される産物の収率を高めるために別のランチビオティックプロデューサー株に個別にまたはそれらの任意の組合せでクローニングし、発現させることができる。
【００８８】
宿主株は、放線菌目、ストレプトスポランギウム科、ミクロモノスポラ科、シュードノカルジア科およびストレプトミセス科、ミクロビスポラ属、アクチノプラネス属、プラノモノスポラ属、ストレプトミセス属等に属する菌株を含むが、これらに限定されない。あるいは、これらの遺伝子を、１０７８９１の収率を高めるために１０７８９１産生株において個別にまたはそれらの任意の組合せで過剰発現させることができる。
【００８９】
ｍｌｂクラスターはまた、ランチビオティック中間体または最終産物を細胞質から外側に輸送する、およびプロデューサー細胞に耐性を付与する役割を担う、多くの遺伝子を含む。これらの遺伝子は、ｍｌｂ  ＯＲＦ１、１０〜１１、１３〜１４および１７（配列番号２、１１〜１２、１４〜１５および１８）を含む。ｍｌｂ  ＯＲＦ１、１０〜１１、１３〜１４は、１０７８９１またはその中間体のＡＴＰ依存性排出に関与する、ＡＢＣクラスの輸送体をコードする。ｍｌｂ  ＯＲＦ１７は、プロトン勾配に逆らって１０７８９１またはその中間体を輸送することに関与する、Ｎａ／Ｋイオン対向輸送体をコードする。これらの遺伝子を、形成される産物の収率を高めるために別のランチビオティックプロデューサー株に個別にまたはそれらの任意の組合せでクローニングし、発現させることができる。宿主株は、放線菌目、ストレプトスポランギウム科、ミクロモノスポラ科、シュードノカルジア科およびストレプトミセス科、ミクロビスポラ属、アクチノプラネス属、プラノモノスポラ属、ストレプトミセス属等に属する菌株を含むが、これらに限定されない。あるいは、これらの遺伝子を、１０７８９１の収率を高めるために１０７８９１産生株において個別にまたはそれらの任意の組合せで過剰発現させることができる。
【００９０】
Ｃ．ｍｌｂクラスターの使用
【００９１】
本発明はまた、１０７８９１分子全体、その前駆体のいずれかまたはその誘導体の発現のための核酸を提供する。そのような核酸は、１０７８９１の構築を指令するのに十分なポリペプチドをコードするＯＲＦを含有する単離遺伝子クラスターを含む。一例では、ｍｌｂクラスター全体（配列番号１）を適切なベクターに導入し、所望の生産宿主を形質転換するために使用できる。もう１つの態様では、ｍｌｂクラスターを２つの別々のセグメントとして、所望の生産宿主において適合性であり得る２つの異なるベクターにクローニングする。さらにもう１つの態様では、ｍｌｂクラスターを３つのセグメントに細分し、各々を別々の適合性ベクターにクローニングすることができる。１、２または３ベクター系の使用の例は文献に記載されている。
【００９２】
ひとたびｍｌｂクラスターが１またはそれ以上のベクターに適切にクローニングされれば、それを多くの適切な生産宿主に導入することができ、前記生産宿主では、ネイティブ宿主におけるよりも高い効率でランチビオティックの生産が起こり得る。好ましい宿主細胞は、放線菌類遺伝子を効率良く発現することができる種または菌株の宿主細胞である。そのような宿主は、放線菌目、ストレプトスポランギウム科、ミクロモノスポラ科、シュードノカルジア科およびストレプトミセス科、ミクロビスポラ属、アクチノプラネス属、プラノモノスポラ属、ストレプトミセス属等を含むが、これらに限定されない。あるいは、１またはそれ以上の適切なベクターにクローニングされたｍｌｂクラスターの第２のコピーを１０７８９１産生株に導入することができ、前記産生株においてｍｌｂ遺伝子の第２のコピーは１０７８９１の収率を上昇させる。
【００９３】
十分に特徴づけられた宿主に生産能力を導入することは、主要な最適化および開発の過程のいくつかの部分を実質的に改善することができる：産生株における天然産物の力価をより有効に高めることができる；天然産物の精製を、起こり得る干渉作用が公知であるバックグラウンドで実施することができる；複合体の組成物をより有効に制御することができる；天然産物の変化した誘導体を、発酵条件の操作を介してまたは経路の工作によってより有効に生産することができる。
【００９４】
あるいは、生合成遺伝子クラスターを修飾し、宿主細胞に挿入して、多種多様な代謝産物を合成するまたは化学修飾するために使用することができる：たとえば、オープンリーディングフレームを並べ替えて、修飾し、他のランチビオティック生合成遺伝子クラスターと組み合わせることができる。
【００９５】
本明細書で提供する情報を利用して、常套的な周知の方法を用いて１０７８９１核酸のクローニングおよび発現を達成することができる。
【００９６】
もう１つの可能な使用では、ｍｌｂ遺伝子クラスターからの選択ＯＲＦを、常套的な分子生物学手法を用いて単離し、不活性化する。ミクロビスポラ種ＰＴＡ−５０２４染色体内で前記ＯＲＦに隣接するＤＮＡセグメントを含む適切なベクターにクローニングした突然変異ＯＲＦを前記ミクロビスポラ株に導入し、前記株において相同的組換えの２つの二重交差事象がプロデューサー株における前記ＯＲＦの不活性化を生じさせる。この手順は、１０７８９１の前駆体または誘導体の効率的な生産のために有用である。
【００９７】
もう１つの可能な使用では、ｍｌｂ遺伝子クラスターからの選択ＯＲＦを単離し、所望のプロモーターの制御下に置く。適切なベクターにクローニングした工作ＯＲＦを、次に、前述したようにもとのＯＲＦを置換することによって、または前記ＯＲＦの付加的なコピーとして、ミクロビスポラ種ＰＴＡ−５０２４に導入する。この手順は、１０７８９１分子、その前駆体または誘導体の生産のために重要なＯＲＦの発現レベルを高めるまたは低下させるために有用である。
【００９８】
実験項
以下の実施例は、それを介して１０７８９１遺伝子クラスターを同定する原理および方法、ならびにすべてのｍｌｂ遺伝子を同定し、分析する原理および方法を説明するのに役立つ。これらの実施例は、本発明の原理および方法を説明するのに役立つが、その範囲を限定することを意図されない。
【００９９】
一般的方法
特に指示されない限り、細菌株およびクローニングベクターはすべて、公的コレクションまたは市販の供給源から入手することができる。分子生物学のための標準的な手順を使用する。ミクロビスポラ菌は、ＨＴ寒天およびＶ６培地（２０ｇ／ｌグルコース、５ｇ／ｌ酵母抽出物、３ｇ／ｌカゼイン加水分解産物、５ｇ／ｌ肉エキス、５ｇ／ｌペプトン、１．５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、０．５％グリセロール）中で増殖させた。公表されている手順に従ってランチビオティックを単離する。配列解析は標準的なプログラムを使用して実施する。データベース検索は、公的サイトでＢｌａｓｔまたはＦａｓｔａプログラムを用いて実施する。
【実施例１】
【０１００】
１０７８９１生合成遺伝子の単離
【０１０１】
接合性コスミドベクターＳｕｐｅｒｃｏｓ  ３においてミクロビスポラ種ＰＴＡ−５０２４からのＤＮＡを用いてゲノムライブラリーを作製する。これは、ｐＳＥＴ１５２からのａａｃＩＶ−ｏｒｉＴ−ｉｎｔФＣ３１カセットを以下のようにＳｕｐｅｒｃｏｓ  １（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ  ９２０３７）に挿入することによって構築した：ａａｃＩＶ−ｏｒｉＴ−ｉｎｔФＣ３１カセットを、ＰＣＲによってベクターｐＳＥＴ１５２から３．８ｋｂ長のＮｒｕｌフラグメントとして得、Ｓｕｐｅｒｃｏｓ  １の同じ部位に挿入する。フラグメントの大きさを４０ｋｂの範囲内に最適化するため、ミクロビスポラ種ＰＴＡ−５０２４からの全ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分消化する。部分消化したＤＮＡをアルカリホスファターゼで処理し、あらかじめＢａｍＨＩで消化したＳｕｐｅｒｃｏｓ  ３に連結する。連結混合物をインビトロでパッケージングし、大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞をトランスフェクトするために使用する。生じたコスミドライブラリーをオリゴヌクレオチドプローブ５’−ＧＴＳ  ＡＣＳ  ＷＳＳ  ＴＧＧ  ＷＳＳ  ＹＴＳ  ＷＳＳ  ＡＣＳ  ＧＧＳ  ＣＣＳ  ＴＧＣ  ＡＣＳ  ＷＳＳ  ＣＣＳ  ＧＧＳ  ＧＧＳ  ＷＳＳ  ＡＡＣ  ＷＳＳ  ＷＳＳ  ＴＣＣ  ＷＳＳ  ＴＧ−３’（配列番号１９）とのハイブリダイゼーションによってスクリーニングする。オリゴヌクレオチドは、１０７８９１の構造から推定したアミノ酸配列から設計する。このプローブに対して陽性の２つのコスミドを単離し、制限酵素で物理地図を作製する。そのような実験から、図１に報告するコスミドを同定する。このようにしてミクロビスポラ種ＰＴＡ−５０２４のゲノムから同定したセグメントは、抗生物質１０７８９１の合成の役割を担うｍｌｂ遺伝子クラスターを含む。
【０１０２】
上記実施例は、それを介してｍｌｂクラスターを単離することができる原理および方法を説明するのに役立つ。ｍｌｂクラスターが様々なベクターにクローニングできることは当業者に認識される。しかし、当業者は、ｍｌｂクラスターの２０ｋｂという大きさを考慮すると、好ましいベクターは、λ、コスミドおよびＢＡＣベクターのような、大きな挿入物を担持することができるものであることを理解する。当業者は、そのようなライブラリーからｍｌｂクラスターを同定するために他のプローブも使用できることを理解する。配列番号１に報告する配列から、任意のフラグメントをミクロビスポラ種ＰＴＡ−５０２４  ＤＮＡからＰＣＲ増幅することができ、そのようなＤＮＡを用いて作製したライブラリーをスクリーニングするために使用できる。配列番号１によってカバーされる任意のセグメントを含む、前記ライブラリーからの１またはそれ以上のクローンを同定することができる。さらに、表１で提供される情報を利用して、他のｌａｎクラスターに由来するもののような異種プローブの使用を介してｍｌｂクラスターを同定することも可能である。あるいは、二次代謝産物の合成を指令する他の遺伝子クラスターは、異種ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な程度でｍｌｂ遺伝子に関連する遺伝子を含む。これらの変法はすべて本発明の範囲内に包含される。
【実施例２】
【０１０３】
１０７８９１遺伝子クラスターの配列解析
【０１０４】
実施例１で述べたように同定したｍｌｂクラスターをショットガンアプローチによって配列決定する。ｍｌｂクラスターの配列は、本明細書において配列番号１として提供される。生じたＤＮＡ配列を解析して推定コード配列を同定し、それを他のｌａｎクラスターと比較するかまたはＧｅｎＢａｎｋに対して検索する。各々のＯＲＦについての正確な開始コドンは、関連配列のマルチプルアラインメントによって、または上流のリボソーム結合部位を探索することによって確立される。全体で、ｍｌｂ  ＯＲＦ１〜ＯＲＦ１７と称される１７個のＯＲＦが同定される。これらの解析の結果を表１に要約し、本明細書では配列番号２〜配列番号１８として配列表に提示する。詳細を以下で述べる。
【０１０５】
２Ａ．１０７８９１プレプロペプチドの合成
【０１０６】
ｍｌｂ  ＯＲＦ６はプレプロペプチドの合成の役割を担う。プレプロペプチドは、４９アミノ酸のリーダー配列、および翻訳後修飾されて成熟ランチビオティックを生成する２４アミノ酸のプロペプチド（配列番号７）を含む。ランチビオティックリーダーペプチドの２つの共通の特徴は１０７８９１において保存されている：Ａ型ランチビオティックの保存された配列（たとえばＦ−Ｄ／Ｎ−Ｌ−Ｄ／Ｅモチーフ）および２位のプロリン残基。プレプロペプチドのＣ末端部分（配列番号７）は、公表されている１０７８９１一次構造およびその提案されているプロペプチド配列と一致する。
【０１０７】
２Ｂ．１０７８９１プロペプチドの翻訳後修飾
【０１０８】
ｍｌｂ  ＯＲＦ７〜９（配列番号８〜１０）およびｍｌｂ  ＯＲＦ１７（配列番号１８）によってコードされる４つのタンパク質は、１０７８９１プレプロペプチドの翻訳後修飾に関与する。これらの遺伝子産物のホモログは多くのランチビオティッククラスターで認められる。他のランチビオティッククラスターで認められるデヒドラターゼおよびシクラーゼとの配列同一性およびそれらの役割に基づき、以下の予測を立てることができる。ｍｌｂ  ＯＲＦ７ポリペプチドは、１０７８９１プロペプチドの３、５、１３、１８および２１位のセリン残基ならびに２および８位のトレオニン残基を脱水して、対応する脱水残基を生成する役割を担う。ｍｌｂ  ＯＲＦ８ポリペプチドは、１０７８９１プロペプチド中に存在するシステイン残基を４つのデヒドロアラニン残基および１つのデヒドロブチリン残基に位置特異的および立体特異的にコンジュゲート付加して、対応する５つのチオエーテルを生成することを触媒する。特に、ｍｌｂ  ＯＲＦ８ポリペプチドは、３〜７、１３〜２０、１８〜２３および２１〜２４のランチオニンならびに８〜１１のメチルランチオニン（ｍｅｔｈｙｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅ）の形成に関与する。
【０１０９】
エピデルミンおよびメルサシジンクラスターによってコードされるデカルボキシラーゼとの間で認められる配列同一性に基づき、ｍｌｂ  ＯＲＦ９は、２１〜２４ランチオニン部分の脱炭酸の役割を担う酵素をコードする。他の抗生物質クラスターによってコードされるフラビンレダクターゼとの間で認められる配列同一性に基づき、ｍｌｂ  ＯＲＦ１６はフラボタンパク質レダクターゼをコードした。エピデルミンおよびメルサシジン形成の間の酸化的脱炭酸に関して予測される役割を考慮すると、ｍｌｂ  ＯＲＦ９および１６ポリペプチドは、１０７８９１中に存在するＳ−［（Ｚ）−２−アミノビニル］−Ｄ−システイン残基（式Ｉ）の形成を触媒する。
【０１１０】
２Ｃ．β−ヒドロキシプロリンの形成およびトリプトファンの塩素化
【０１１１】
ｍｌｂ  ＯＲＦ２および１５（配列番号３および１６）によってコードされる２つのタンパク質は、１０７８９１プロペプチドの１４位のプロリン残基への１または２個のβ−ヒドロキシル基の付加、および４位のトリプトファン残基の塩素化に関与する。ｍｌｂ  ＯＲＦ２ポリペプチドは、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼに有意の同一性を示し（表１）、プロリン残基のヒドロキシル化に関与する。ｍｌｂ  ＯＲＦ２のホモログは他のランチビオティッククラスターでは認められておらず、それによりこの遺伝子は、ランチビオティック分子のヒドロキシル化に関与するＰ４５０モノオキシゲナーゼの唯一の例である。加えて、他のハロゲナーゼとの同一性のレベルに基づき、ｍｌｂ  ＯＲＦ１５ポリペプチドはトリプトファンの塩素化に関与し、ランチビオティック分子の修飾に関与するハロゲナーゼの唯一の例である。
【０１１２】
２Ｄ．輸送および耐性
【０１１３】
ＯＲＦ１、１０、１１、１３、１４および１７（配列番号２、１１、１２、１４、１５および１８）によってコードされる５つのタンパク質は、１０７８９１またはその前駆体を細胞質の外側に輸送すること、および産生株に対する耐性を付与することに関与する。それらの予測される役割は以下のとおりである。
【０１１４】
ＯＲＦ１（配列番号２）のホモログは他のランチビオティッククラスターでは認められない。この遺伝子は、付加的なＡＢＣ型輸送体をコードし（表１）、それ故、産生株であるミクロビスポラ種ＰＴＡにおいて１０７８９１に対する耐性を付与することに関与する。ＯＲＦ１０、１３〜１４および１７（配列番号１１、１４〜１５および１８）のホモログは他のランチビオティッククラスターに存在する（表１）。それらは、それぞれＡＢＣ型輸送体およびイオン依存性膜貫通輸送体をコードする。それらは、従って、１０７８９１またはその前駆体の輸送および／または区画化（ｃｏｍｐａｒｔｉｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）に関与する。ｍｌｂ  ＯＲＦ１７は、プロトン勾配に逆らって１０７８９１またはその中間体を輸送する役割を担う、Ｎａ／Ｋイオン対向輸送体をコードする。
【０１１５】
２Ｅ．調節
【０１１６】
ＯＲＦ３および５（配列番号４および６）によってコードされる２つのタンパク質は、ｍｌｂ遺伝子の１またはそれ以上の発現を調節することに関与する。ｍｌｂ  ＯＲＦ５ポリペプチド（配列番号６）は、そのホモログが他のランチビオティッククラスターでは認められない、新規遺伝的エレメントである。このタンパク質は、正の転写調節因子として働くσ因子の細胞質外機能ファミリーに属する。ＯＲＦ３ポリペプチド（配列番号４）は、ＬｕｘＲ型転写調節因子のファミリーに属する。ＯＲＦ３（配列番号４）は、それ故、ｍｌｂ遺伝子の１またはそれ以上の発現のために必要である可能性が高い。
【０１１７】
２Ｆ．付加的な機能
【０１１８】
２つの付加的なＯＲＦ、すなわちＯＲＦ４（配列番号５）およびＯＲＦ１２（配列番号１３）がｍｌｂクラスター内に存在する。２つのＯＲＦは、それぞれ海産放線菌（サリニスポラ・トロピカ）（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ  ｔｒｏｐｉｃａ）およびストレプトミセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）に存在する未知の機能のタンパク質に関連する（表１）。しかし、１０７８９１生合成におけるそれらの正確な役割はまだ予測することができない。
【実施例３】
【０１１９】
遺伝子置換による１０７８９１経路の操作
【０１２０】
実施例２で提供される情報を利用して、ＯＲＦ２内のインフレーム欠失を以下のように構築する。フラグメントＡは、オリゴヌクレオチド５’−ＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＧＣＧＴＣＣＴＧＣ−３’（配列番号２０）および５’−ＴＣＴＡＧＡＣＧＧＴＣＣＧＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧ−３’（配列番号２１）を用いた増幅を介して得た；そしてフラグメントＢは、オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＴＡＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＣＣＧＧＣＧＧＧＴＧＧＣＣＧ−３’（配列番号２２）および５’−ＧＡＡＴＴＣＣＧＧＴＣＧＣＴＣＴＣＣＴＣＧＴＣＣＴＴＴＧＣＣ−３’（配列番号２３）を用いた増幅を介して得る。
【０１２１】
次に、フラグメントＡをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、フラグメントＢをＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して、両者を、あらかじめＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＳＥＴ１５２に連結する。大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換後、ｐＤＭ１と称される生じたプラスミドは、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでの消化後に４ｋｂおよび１．５ｋｂのフラグメントの存在によって認識される。ｐＤＭ１のアリコートを大腸菌ＥＴ１２５６７（ｐＵＢ３０７）細胞に移入し、ＤＭ１株を生成する。次に、ＬＢでの一晩培養からの約１０8ＣＦＵのＤＭ１細胞を、Ｒａｒｅ３培地で約８０時間増殖させた約１０7ＣＦＵのミクロビスポラ種ＰＴＡ−５０２４と混合する。生じた混合物をＨＴプレートに塗布し、次にそれを２８℃で約２０時間インキュベートする。水で静かに洗って過剰の大腸菌細胞を除去した後、プレートを、ナリジクス酸２００μｇおよびアプラマイシン１５μｇ／ｍｌを含む軟寒天３ｍｌに重ね合わせる。２８℃で３〜５週間のさらなるインキュベーション後、アプラマイシンを含む新鮮培地にミクロビスポラ接合完了体（ｅｘｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ）を線条接種する。Ｍｂ−ＤＭ１株と命名された１つのそのような接合完了体をさらに処理する。Ｍｂ−ＤＭ１株を、次に、アプラマイシンを含まないＨＴ培地で数継代増殖させ、適切な希釈物を、アプラマイシンを含まないＨＴ寒天に塗布する。個々のコロニーを、その後、オリゴヌクレオチド５’−ＣＧＣＧＣＴＧＣＴＣＧＧＧＧＣＣＡＡＣ−３’（配列番号２４）および５’−ＡＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＴＧＧ−３’（配列番号２５）を用いてＰＣＲによって分析する。
【０１２２】
ＯＲＦ２の欠失対立遺伝子を含むコロニーは、１．５ｋｂのバンドの存在によって認識される。Ｍｂ−ＤＭ２と称される１つのそのようなコロニーをＨＴ培地で増殖させ、デヒドロキシル−１０７８９１の形成を標品との比較によって確認する。
【０１２３】
前記実施例は、１０７８９１産生株であるミクロビスポラ種ＰＴＡ−５０２４において、それを介して配列番号２〜１８によって規定されるもののいずれかから選択されるＯＲＦを突然変異コピーで置換することができる原理および方法を説明するのに役立つ。ＯＲＦ２（配列番号３）が、配列番号１によって規定されるクラスター内にインフレーム欠失を作製するための方法の単なる一例であることは当業者に認識される。
【０１２４】
当業者はまた、インフレーム欠失が突然変異を生じさせるための単なる１つの方法にすぎないこと、そしてフレームシフト突然変異、挿入および部位指定突然変異を含むがこれらに限定されない他の方法も、配列番号２〜１８によって規定されるＯＲＦのいずれかにおいてヌル突然変異体を生成するために使用できることを理解する。
【０１２５】
当業者はまた、配列番号１によって規定されるＯＲＦのいずれかにおいて突然変異を生じさせるための方法が確立されているので、これらの同じ方法がこれらの同じＯＲＦの発現レベルを変化させるために適用できることを理解する。これを達成できる方法の例は、ミクロビスポラ種ＰＴＡ−５０２４ゲノムの任意の位置への前記ＯＲＦの多数のコピーの組込み、前記ＯＲＦの発現を制御するプロモーターにおける変化、それらの発現に干渉するアンチセンスＲＮＡまたは転写終結因子の除去を含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
最後に、ミクロビスポラ種ＰＴＡ−５０２４に突然変異対立遺伝子を導入するために使用されるベクター、供与体株と受容体株の接合および培養のための条件、接合完了体およびそれらの誘導体を選択し、スクリーニングするための方法におけるバリエーションは、すべて本発明の範囲内に包含される。
【実施例４】
【０１２７】
ランチビオティックのインビトロハロゲン化
【０１２８】
実施例２で提供される情報を利用して、ｍｌｂ  ＯＲＦ１５（配列番号１６）を以下のように大腸菌において過剰発現させる。オリゴヌクレオチド５’−ＴＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＧ−３’（配列番号２６）および５’−ＴＴＴＴＴＧＴＣＧＡＣＣＴＡＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＣＧＧＴＣＣＧＧＡＣＴ−３’（配列番号２７）を用いた増幅によって得られる１．６ｋｂフラグメントをＮｃｏＩとＳａｌＩで消化し、あらかじめＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化したｐＥＴ２２ｂに連結する。大腸菌ＤＨ５ａ細胞を形質転換した後、ＮｄｅＩとＸｈｏＩによる消化後に５．５ｋｂと１．６ｋｂのフラグメントの存在が認識できる、生じたプラスミドｐＨＡＬを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に導入する。ｐＨＡＬを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の培養物をＬＢ中２０℃で０．６のＯＤ６００まで増殖させる。次に、ＩＰＴＧを１ｍＭまで添加し、細胞をさらに６時間増殖させる。細胞を採集し、超音波処理によって破壊して、ＨｉｓタグＯＲＦ１５ポリペプチドをＮｉ−アガロースカラムから回収する。ラクチシン４８１または９７５１８などの基質のインビトロハロゲン化を実施し、ランチビオティックの塩素誘導体の形成をＭＳ分析によって確認する。
【０１２９】
前記実施例は、それを介して配列番号２〜１８によって規定されるもののいずれかから選択されるＯＲＦを好都合な宿主において過剰発現させ、生じた酵素を過剰生産して、ランチビオティック天然産物を異なる化合物に形質転換するために使用することができる原理および方法を説明するのに役立つ。ＯＲＦ１５（配列番号１６）が、単に、配列番号１によってコードされる任意のポリペプチドを過剰生産するための方法の一例として使用されていることは当業者に認識される。当業者はまた、異なるアフィニティータグの使用、異なるベクター、異なる宿主菌株および誘導方法の使用を含むがこれらに限定されない、タンパク質を過剰生産するための他の方法も、ＯＲＦ１〜１７（配列番号２〜１８）によって規定されるポリペプチドを過剰生産するために使用できることを理解する。
【０１３０】
トリプトファン残基を含むまたは含まない他のランチビオティック基質を、ＯＲＦ１５（配列番号１６）による塩素原子の付加のために使用できることは当業者に認識される。また、ｍｌｂクラスター（配列番号１）によって規定される他のＯＲＦポリペプチドが、他のランチビオティックプレプロペプチドの翻訳後修飾のために使用できることも当業者に認識される。このために使用できるＯＲＦポリペプチドは、ＯＲＦ２（配列番号３）を含むが、これに限定されない。特に、ＯＲＦ７および８（配列番号８および９）は、他のランチビオティックプレプロペプチドにおける脱水およびチオエーテル架橋の導入のために使用できる；ＯＲＦ９および１６（配列番号１０および１７）は、Ｃ末端Ｃｙｓ残基を含む他のランチビオティックを脱炭酸するために使用できる；そしてＯＲＦ２（配列番号３）は、他のプロリン含有ランチビオティックをヒドロキシル化するために使用できる。
【実施例５】
【０１３１】
異種宿主におけるｍｌｂクラスターの発現
【０１３２】
実施例１および２で提供される情報を利用して、ｍｌｂクラスター全体（配列番号１）を含むコスミド１Ｇ６（図１）を、Ｋｉｅｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００によって記述されたように接合によってストレプトミセス・アルバス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｓ）に導入する。アプラマイシン耐性接合完了体を適切な条件下で増殖させ、１０７８９１を記述されているように精製する。
【０１３３】
当業者はまた、Ｓ．アルバスは単に１つのプロデューサー株にすぎないこと、ならびに他の菌株もｍｌｂクラスター全体（配列番号１）を導入するためおよび１０７８９１の生産のために使用できることを理解する。好ましい宿主細胞は、放線菌類遺伝子を効率良く発現することができる種または株の細胞である。そのような宿主は、放線菌目、ストレプトスポランギウム科、ミクロモノスポラ科、シュードノカルジア科およびストレプトミセス科、ミクロビスポラ属、アクチノプラネス属、プラノモノスポラ属、ストレプトミセス属等を含むが、これらに限定されない。当業者は、適切なプロモーターがｍｌｂオペロンの前に置かれていれば、生産宿主は放線菌類遺伝子を効率良く発現することができる細胞に限定される必要がないことを理解する。この後者の範疇の適切な生産宿主は、遺伝的に操作しやすいもの、または他のランチビオティックを天然に生産するものの中から見出すことができる。そのような生産宿主の例は、大腸菌および関連種、バチルス種、連鎖球菌種、乳酸杆菌種、ブドウ球菌種等を含むが、これらに限定されない。
【０１３４】
当業者はまた、この実施例で述べる方法を使用して、ｍｌｂクラスターをもとの１０７８９１プロデューサー株、ミクロビスポラ種ＰＴＡ−５０２４に第２のコピーとして導入することができ、前記株においてｍｌｂ遺伝子の第２のコピーは１０７８９１の収率を上昇させることを理解する。
【０１３５】
当業者はまた、ｍｌｂクラスターを導入するための異なるベクター、異なる方法、ｍｌｂクラスターを担持する組換えクローンを選択する異なる方法、前記組換えクローンを増殖させるための異なる方法および条件、ならびに１０７８９１産生を検出するための異なる方法が、異種宿主におけるｍｌｂクラスターの発現のために有効であり得ることを理解する。
【実施例６】
【０１３６】
１０７８９１変異体のライブラリーの作製
【０１３７】
実施例２、３および５で提供される情報を利用して、ｍｌｂ  ＯＲＦ６（配列番号７）を、１０７８９１の変異体を産生するように以下のように修飾する。まず第一に、ＯＲＦ６を増幅するために、ＯＲＦ６（配列番号７）内にインフレーム欠失を担持するベクターを、フラグメントＡについてはオリゴヌクレオチド５’−ＧＣＡＧＣＣＡＧＧＣＴＣＧＣＡＣＣＧＧＣ−３’およびＣＧＣＣＣＧＴＡＡＣＧＡＧＣＧＡ（配列番号２８および２９）を使用し、フラグメントＢについてはオリゴヌクレオチド５’−ＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡ−３’および５’−ＴＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＴＴ−３’（配列番号３０および３１）を使用して実施例３の方法に従って構築する。生じた構築物を、実施例３の方法に従って、実施例５で述べたようにして得られたＳ．アルバス株においてＯＲＦ６を置換するために使用し、ＳＡ−Ｄ６株を作製する。次に、オリゴヌクレオチド５’−ＣＣＧＧＡＡＡＧＧＡＧＣＧＡＧＣＡＴＡＴＧ−３’（配列番号３２）および５’−ＣＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＡＴＡＣＡＧＴ−３’（配列番号３３）を用いた増幅によって得られるｍｌｂ  ＯＲＦ６（配列番号７）のプレペプチド部分をＮｄｅＩとＢｇｌＩＩで消化し、あらかじめＮｄｅＩとＢｇｌＩＩで消化したｐＩＪ８６００（Ｋｉｅｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０００）に連結して、プラスミドｐＰＲＥ１を作製する。並行する実験では、オリゴヌクレオチドＡ  ５’−Ｃ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＧＧＧ  ＣＣＧ  ＧＣＧ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＡＧＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＴＧＣ  ＡＣＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＴＧＣ  ＮＮＮ  ＡＧＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＡＧＣ  ＮＮＮ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＮＮＮ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＴＣＴ−３’およびオリゴヌクレオチドＢ  ５’−Ｔ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＮＮＮ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＮＮＮ  ＧＣＴ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＣＴ  ＮＮＮ  ＧＣＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＣＴ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＣＧＣ  ＣＧＧ  ＣＣＣ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＧＡＴ  ＣＧＡ−３’（配列番号３４および３５）を変性し、アニーリングして、チオエーテル形成に関与するもの（具体的にはアミノ酸３、７、８、１１、１３、１８、２０、２１、２３および２４）を除く、ＯＲＦ６ポリペプチドのプロペプチド領域のアミノ酸配列におけるすべての可能な変更を有するポリペプチドをコードする、ＤＮＡセグメントの混合物（配列番号３６）を作製する。このＤＮＡセグメントの混合物を、あらかじめＢＳＡ  ＯＩとＢｇｌＩＩで消化したプラスミドｐＰＲＥ１に連結して、リーダーペプチドをコードするＯＲＦ６セグメントに融合したプロペプチドをコードする、ＯＲＦ６セグメントのすべての可能な変異形態（（メチル）ランチオニン架橋を除く）を担持するプラスミドのライブラリーを作製する。このプラスミドライブラリーをＳＡ−Ｄ６株に導入し、μｇ／ｍｌチオストレプトンの存在下で増殖させた、生じる接合完了体を、生物学的アッセイまたはＨＰＬＣ分析によって１０７８９１変異体の産生に関してスクリーニングする。興味深い変異体を、ＯＲＦ６変異体のプロペプチド部分を配列決定���ることおよび構造解明によってさらに特徴づける。
【０１３８】
当業者は、ＯＲＦ６ポリペプチドのリーダーペプチド部分も、翻訳後修飾に関与する酵素（配列番号８および９）がそれらの異なるリーダーペプチドを認識することができる限り、修飾し得ることを理解する。ＯＲＦ６ポリペプチドのリーダーペプチド部分の変異は本発明の範囲内に包含される。
【０１３９】
ＯＲＦ６変異体のライブラリーを構築するために、異なるオリゴヌクレオチド、ベクター、誘導系および宿主株の使用を含むがこれらに限定されない、他の方法が使用できることは当業者に認識される。さらに、当業者は、付加的なＯＲＦ６変異体を作製するためにメチルランチオニン残基をランチオニン残基によって置換し得ること、またはその逆も実施し得ることを理解する。当業者はまた、ＯＲＦ６の選択変異体を作製して、１０７８９１の特定誘導体の産生を生じさせるために部位指定突然変異誘発が利用できることを理解する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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