(57)【要約】本発明は、突然の酸素喪失および/またはエネルギー喪失から生ずるニューロンおよび心臓の疾患を含む虚血に関連する疾病および障害、ならびに一つ挙げるならばアルツハイマー病などの変性疾病に見られるようなニューロン死を抑制する方法に関する。この方法は主として、サイクリン依存性キナーゼであるCDK4およびCDK6に同時に作用する阻害剤の使用を含む。2010513317.tif 000005
2010513317.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CDK4およびCDK6の一方または両方を阻害すると考えられる薬剤の治療上有効な量を、それを必要とする対象に投与する段階を含む、急性または慢性の疾患におけるニューロン変性および/またはニューロン死を改善する、治療するまたは予防する方法。
【請求項２】
薬剤がCDK4およびCDK6の両方の阻害剤である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
薬剤が下記式：
2010513317.tif 000004
およびそれらの薬学的に許容される塩または誘導体を有する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
急性または慢性の疾患が: アルツハイマー病; パーキンソン病; 冠状動脈バイパス移植手術のような疾患に起因するまたはそれによりもたらされる虚血状態; 心停止に起因する全脳虚血; 局所性脳梗塞; 脳出血; 出血梗塞形成; 高血圧性出血; 頭蓋内血管異常の破裂に起因する出血; 頭蓋内動脈瘤の破裂に起因するクモ膜下出血; 高血圧性脳障害; 脳虚血をもたらす頚動脈狭窄または血管閉塞; 心原性血栓塞栓症; 脊髄卒中および脊髄損傷; 脳血管の疾病（アテローム性動脈硬化および脈管炎など）; 黄斑変性症; 心筋梗塞; 心虚血; または上室性不整頻脈である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
疾患が頚動脈狭窄または血管閉塞による脳卒中である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
疾患がアルツハイマー病である、請求項4記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2006年12月14日に出願された米国仮出願第60/874,844号について優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、例えば酸素の突然の喪失に起因するニューロンおよび心臓の疾病を含む、いわゆる、虚血に関連する疾病および障害で見られるようなニューロン死、ならびに特にアルツハイマー病などの、より長期的な変性疾病で見られるようなニューロン死を抑制する方法に関する。この方法は主として、サイクリン依存性キナーゼであるCDK4およびCDK6に同時に作用する阻害剤の使用を含み、その一例は、PD0332991（Pfizer）という化合物である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
本発明は、あるサイクリン依存性キナーゼ（CDK）阻害剤の、より詳細には、これまで抗新生物薬剤としてのみ有用であることが示されていた、CDK4およびCDK6の両方（CDK4/6）の阻害剤の新規な使用へ広く向けられる。そのようなCDK4/6阻害剤およびその合成が、とりわけ米国特許第6,396,612号に開示されている。本発明者らは、そのような化合物がさらに神経保護剤として働く特性も有しており、従ってこれらが、虚血が病理に決定的な役割を果たす急性および慢性の神経系の障害および疾患ならびに他の疾病および障害に役立つことを見出した。
【０００４】
ニューロンのホメオスタシス維持には、分裂終了ニューロンにおける細胞周期機構の活性化が関係することを示す証拠が増加している。最近、本発明者らの研究は、DNA損傷によって誘導されるニューロンのアポトーシスには細胞周期の活性化が不可欠であることを示唆した。
【０００５】
細胞周期機構の活性化が、損傷性刺激に曝露された最終分化したニューロンの死滅に寄与することを示唆する証拠が蓄積している（Kruman, I.I., et al.. 2004. Neuron. 41 : 549-561; Liu, D.X., and L.A. Greene. 2001. Cell Tissue Res. 305:217-228）。有糸分裂細胞において、細胞周期機構は、ゲノムの完全性を維持するための総力の中で損傷を修復するおよび細胞分裂とアポトーシスとを調整する複雑な一連の機構を通じて作用するDNA損傷応答の、主要な寄与因子である (Abraham, R.T. 2003. Bioessays. 25:627-630; Bernstein. C., et al. 2002. Mutat Res. 511 :145-178; Rhind, N. and P. Russell. 2000. Curr Biol.10:R908-R911)。従って、細胞周期調節およびDNA修復のプロセスは、それらがいくつかの共通のタンパク質を用いるという事実によって証拠付けられるように、機能的に統合されている（Slupphaug, G., et al. 2003. Mutat Res. 531 :231-251）。ゲノムの完全性の保護は、外因性の発生源および酸素代謝から発生する内因性のフリーラジカルに起因する遺伝毒性ストレスに絶え間なく曝露されている細胞にとって主要な課題である。ニューロンは、その高い割合の酸化的代謝および低レベルの抗酸化酵素のために、酸化ストレスによる損傷を極めて受けやすい（Brooks, P.J. 2000. Neurochem Int. 37:403-412）。従って、酸化ストレスは様々な神経変性疾病の根底にある神経病理の主要な原因である（Sayre, L.M., et al. 2001. Curr Med Chem. 8:721-738）。DNA損傷は、多種多様な神経病理学的疾患におけるニューロン死の重要な開始因子である（Bogdanov, M., et al. 2000. Free Radic Biol Med. 29:652-658; Jenner, P. and C.W. Olanow. 1998. Ann Neurol. 44(3 Suppl 1):S72-84; Lovell, M., et al., 1999. J. Neurochem. 72:771-776）。DNA損傷と神経変性との関係はまた、毛細血管拡張性運動失調およびコケーン症候群などの様々なヒトの症候群における、欠陥を有するDNA修復に伴う神経異常によっても例証される（Rolig, R.L., and P.J. McKinnon. 2000. Trends Neurosci. 23:417-424）。
【０００６】
最終分化したニューロンは、転写的に活性を有しかつ転写されたゲノムの完全性を全寿命にわたって保持する必要があり、このことはこれらの細胞における適切なDNA損傷応答の重要性を強調している。したがって、DNA損傷応答の欠陥が重度の神経変性を生じさせるという事実によって証明されるように、高い代謝率および酸化ストレスへの絶え間ない曝露は、ゲノムの完全性の管理を、分裂終了ニューロンにとって困難である一方で不可欠な課題にしている。
【０００７】
多数の研究が遺伝毒性作用物質に対する増殖中細胞の応答を研究してきたが、最終分化したニューロンにおけるDNA損傷応答はよく理解されていない。
【０００８】
研究は、細胞周期の活性化がニューロン死に不可欠な役割を果たすことを示してきた。細胞周期の進行に極めて重要なサイクリン依存性キナーゼ（CDK）の抑制が、脳卒中の実験モデルにおいて神経保護的であることが公知である (Johnson K, et al. (2005). J Neurochem. 93:538-548; Katchanov, J., et al. 2001. J. Neurosci. 21 :5045-5053; Kruman, I.I., et al.. 2004. Neuron. 41 :549-561)。例えば、すべてのCDKを阻害する非特異的CDK阻害剤であるフラボピリドールは、インビトロでニューロンのアポトーシスを非常に強力に阻止することが示されており、かつインビボの虚血モデルにおいて保護的であった(Ginsberg D. (2002). FEBS Lett. 529:122-125; Knockaert M, et al. 2002. Trends Pharmacol. Sci. 23:417-425)。
【０００９】
しかしながら、神経保護の機構は十分に理解されていない。本発明者らは、これは、CDK阻害剤を用いた従来の研究が、特定のCDK複合体にあまり特異的ではない薬剤により行われたという事実によるものと考える。例えば、フラボピリドールは非CDK関連キナーゼを含む複数の細胞標的を有する(Fry, D.W., et al. 2004. Mol Cancer Ther. 3:1427-1438)。
【００１０】
本発明は、CDK4/6キナーゼの特異的阻害がニューロンのアポトーシスを阻止するために十分であることを初めて明らかにする。ニューロンにおけるDNA損傷応答および関連するアポトーシスシグナル伝達は、細胞周期の活性化に関連していると仮定されてきた。特定の理論に縛られることなく、本発明から、細胞周期の活性化を標的とし阻止する、従ってアポトーシスを標的とし阻止するCDK4/6阻害薬剤の作用により、ニューロンにおいて神経保護が生じると考えられる。
【００１１】
本発明はこのように、CDK4/6の阻害による、外因性のまたは生理的なストレス下のニューロンを保護するための方法を提供し、従って急性および慢性の神経性の病態を治療するための方法を提供する。
【００１２】
本発明は主として、CDK4およびCDK6の両方に同時に作用する薬剤を目指すものであるが、これらのうちの一つのみを阻害するように作用する薬剤も本明細書に含まれることを意図する。
【００１３】
最近、本発明者らおよび他の人々が、アポトーシスに関わる分裂終了ニューロンにおけるDNA損傷応答が細胞周期に関連する事象を含むことを示した (Klein, J.A., et al. 2002. Nature. 419:367-374; Kruman, I.I., et al. 2004. Neuron. 41 :549-561)。これらの観察は、静止細胞はDNA損傷に応じて、修復できない損傷を有する細胞を除去するために細胞周期機構を活性化しなければならないという考えと合致しているが、本発明はとりわけ、細胞周期機構が分裂終了ニューロンにおけるアポトーシスシグナル伝達に関係しているというさらなる証拠を提供する。
【発明の概要】
【００１４】
サイクリン依存性キナーゼ(CDK)は、セリン/スレオニンプロテインキナーゼの一つのファミリーであり、対応するサイクリンパートナーと複合体を形成して細胞周期の推移を調節する(Vermeulen, K., et al. 2003. Cell Prolif. 36:165-175)。一般に、CDK活性の薬理学的阻害は、細胞周期が推移している細胞に対して選択的な抗増殖効果をもたらす (Gray, N., et al. 1999. Curr Med Chem. 6:859-875)。
【００１５】
CDK4/6阻害剤のニューロンに対する効果は、ストレス条件下におけるニューロンのDNA損傷応答を研究する過程で発見された。ニューロンにおいては、CDK/pRb/E2F経路がニューロンの細胞死の促進において大きな役割を果たしており、CDK阻害剤が神経保護的な効果を有するということを示唆するデータが増加している (Katchanov, J., et al. 2001. J. Neurosci. 21 :5045-5053; Meijer, L. and E. Raymond. 2003. Acc Chem Res.36:417-425; Park, D.S., et al. 2000. Neurobiol Aging. 21 :771- 781)。しかしながら、もし細胞周期機構がDNA修復に関係しているならば、CDKの抑制がDNA修復を妨げるはずである。
【００１６】
この仮説を、細胞周期の活性化にとって不可欠な二つのCDKであるCDK4およびCDK6に対するRNAiを使用して試験した。これらの研究によって本発明者らは、CDK4およびCDK6活性の同時阻害が実際にアポトーシスを妨げることを実証した。これは分裂終了ニューロンにおけるアポトーシスシグナル伝達におけるCDK4およびCDK6の重要な役割を示唆する。したがってこのデータは、細胞周期機構がDNA損傷によって開始されるニューロンのアポトーシスに関係していることを裏付ける。
【００１７】
細胞分裂周期機構は、DNA損傷を受けた細胞を除去するためのアポトーシスカスケードの活性化に関係している (Bernstein. C., et al. 2002. Mutat Res. 511 :145-178; Rhind, N. and P. Russell. 2000. Curr Biol.10:R908-R911)。本明細書に提示されたデータは、分裂終了後の最終分化ニューロンにおいても、細胞周期成分によるシグナル伝達がDNA損傷に対する応答にとって不可欠であることを示唆する。しかしながら、特定のチェックポイントで増殖停止を行う、細胞周期を推移している細胞とは対照的に、ニューロンにおけるDNA損傷シグナル伝達は、細胞周期機構の活性化に関係している。
【００１８】
このニューロンの独特の応答は、ニューロンのDNA修復機構の活性化におけるG1細胞周期成分の特有の関与を反映するものであると考えられる。
【００１９】
神経保護のための薬理学的薬剤は現在市販されていないが、慢性の神経性疾患の治療に使用することが承認されている薬物は存在しており、それはグルタミン酸レセプター(NMDA)アンタゴニストである。そのような薬物の、慢性CNS変性状態における改善効果の証拠が存在するが、NMDAアンタゴニストが単独で虚血に対して、一般的に、特に急性の状況において、実質的な保護を提供することができるようには見えない。
【００２０】
虚血性神経変性に対する神経保護剤としてのグルタミン酸レセプターアンタゴニストの重大な限界は、それらが、ニューロンを変性から単に一時的に防護するように見え; それらが、エネルギー不足を矯正するためには、またはエネルギー不足から二次的に生ずる他の障害を矯正するためには何もしないことである。したがって、これらの薬剤は虚血性神経変性に対してあるレベルの保護を与えるが、この保護は単に部分的であり、ある場合には単に変性の開始時間の遅れである場合がある。
【００２１】
ニューロンは、虚血性損傷などの急性疾患の発症後に極めて急速に変性し始めるので、例えばアポトーシスシグナル伝達を抑制することによってニューロンをさらなる変性および死から積極的に保護すると考えられる治療薬剤の必要性が、明白に存在する。そのような治療薬剤は、単に虚血の急性症例に用いることができるだけでなく、ニューロンの喪失およびニューロンの変性を遅延させることに基づく、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの慢性変性障害におけるニューロン変性の阻止にも用いることができよう。
【００２２】
さらに本発明の化合物は、虚血に類似の病因に起因する耳および目の神経障害、ならびに糖尿病性神経障害を治療するためにも用いることができる。
【００２３】
急性か慢性かにかかわらず、ニューロンへのストレスの結果を予防または治療することができる治療薬剤の開発が、極めて望ましい。
【００２４】
本発明は、治療を必要とする患者にPD 0332991などの特定のCDK4/6阻害剤およびそれらの薬学的に許容される塩またはプロドラッグを投与することにより、ニューロンのストレス状態に起因する障害を予防および/または治療する方法に関する。
【００２５】
本発明は、特定のニューロンストレスまたは虚血に関連した疾患を治療する、改善する、および/または予防する方法も目的とし、任意の原因から生ずる広範囲のおよび局所的な虚血に続くニューロン損傷の治療(およびさらなる虚血性損傷の予防)、オトニューロトキシシティ（otoneurotoxicity）の、および虚血症状を含む眼疾病（黄斑変性など）の治療または予防、外傷または冠動脈バイパス手術による虚血の予防、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン舞踏病などの神経変性疾患の治療または予防、ならびに糖尿病性神経障害の治療または予防を含むがこれらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】培養した皮質ニューロンのアポトーシス死が、100μMのH2O2によって誘起されるが5μMでは誘起されないことを示す。(A) 培養物を、生理食塩水(対照)、5μMのH2O2、または100μMのH2O2のいずれかに24時間曝露し、次にDNA結合性色素であるヨウ化プロピジウム(PI)で染色した。100μMのH2O2に曝露された培養物中の核DNAの凝縮および断片化に注意すること。(B) 培養物を、生理食塩水(対照)、5μMのH2O2、または100μMのH2O2のいずれかに、表示した期間曝露し、細胞集団におけるアポトーシスの動態を決定した。値は平均値およびSD(n=6)である; * p < 0.01;** p < 0.001。(C) 5μM または100μMのH2O2のいずれかに曝露した後に続く表示した期間後の初代皮質ニューロンにおける、開裂されたカスパーゼ-3 (19-および17-kDaの中間体)、フラクチン(開裂されたβ-アクチン; 32-kDa中間体)、開裂されたMcm3（98-kDaの中間体)、および開裂されていないMcm2を示すイムノブロット。対照(C)は未処理の培養物に対応する。メチルメタンスルホン酸(MMS)処理したNIH/3T3細胞からの抽出物が、正の対照として含まれていた。100μMのH2O2に曝露された試料における開裂されたカスパーゼ-3、Mcm3、およびβ-アクチン(フラクチン)の出現に注意すること。
【図２】H2O2 によって誘起されたDNA損傷を示す。(A) 培養物を5μMまたは100μMのH2O2 のいずれかに、示した期間曝露した。示されたインキュベート期間後に、皮質ニューロンにおいて、DNA損傷をアルカリ性または中性のコメット分析によって定量した。対照は未処理の細胞を表す。陽性対照として、本発明者らは1Gyのγ線照射に曝露されたニューロンを用いた。中性のコメット分析と比較してアルカリ性(異なる尺度)であることにおける、より高いDNA損傷のレベルに注意すること。値は、三つの培養物でなされた測定の平均値およびSEMである; * p < 0.005; ** p < 0.001; # p < 0.01; ## p < 0.002。(B) 賦形剤(対照)、5μM、および100μMのH2O2で 6時間処理し、FITC(488、緑)で視覚化した、皮質ニューロンにおけるγ-H2AXに対する免疫反応性を示す顕微鏡写真。細胞をPIで同時染色した。対照培養物とは対照的な、有意なアポトーシス死の前(6時間)の、5μMおよび100μMに曝露された培養物におけるγ-H2AXフォーカスの誘導に注意すること。
【図３】CDK4およびCDK6の発現が抑制された細胞における、アポトーシスの程度の有意な減少を示す。(A) CDK4特異的siRNAおよびCDK6特異的siRNAをコトランスフェクションすることによるCDK4およびCDK6発現のノックダウンの成功が、ウエスタンブロット分析によって示されている。(B) 皮質ニューロンにおけるCDK4およびCDK6の発現をノックダウンし、100μMのH2O2が誘導する細胞死(18時間の曝露)に対する感受性を調べた。非特異的な対照RNAiをトランスフェクションしたニューロン、および100μMのH2O2で処理したニューロンを、対照として用いた。アポトーシスを起こした核を計算することにより、ヘキスト33342で染色した皮質培養物におけるアポトーシスを定量した。値は平均値およびSD(n=6)である; ** p < 0.001。
【図４】PD 0332991によるCDK4およびCDK6の薬理学的抑制が、H2O2で処理した皮質ニューロンにおけるアポトーシスの程度を有意に低下させることを示す。(A) PD 0332991は、分裂終了ニューロンにおけるpRbのリン酸化を下方調節する。培養した皮質ニューロンを、そのままで、または1μMのPD 0332991(PD)での12時間の前処理の後に、生理食塩水または100μMのH2O2のいずれかに6時間曝露し、pRBのリン酸化をウエスタンブロット分析によって確認した。対照 - 未処理の培養物；G1 - 細胞周期G1期に同調されたHeLa細胞。(B) 100μMのH2O2に18時間曝露した皮質培養物におけるアポトーシスを、ヘキスト33342で染色してから、アポトーシスを起こした核を計算することにより、定量した。値は平均値およびSD(n=6)である; * p < 0.002。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、急性または慢性の疾患におけるニューロン変性および/またはニューロン死の、治療的処置、改善または予防を提供する。本発明においては、必要のある対象に、CDK4およびCDK6の一方または両方に阻害剤として働く治療上有効な量の薬剤を投与する。そのような薬剤は、RNAの干渉によって、または小分子の薬理学的薬物として、作用する。好ましい態様では、薬剤はCDK4およびCDK6の両方の阻害剤である。
【００２８】
RNA干渉または薬理学的なPD 0332991(Pfizer)による、CDK4およびCDK6 の特異的な抑制が、過酸化水素に曝露された初代皮質ニューロンのアポトーシスの程度を有意に低下させることが、本明細書において実証される。本結果は、CDK4およびCDK6の抑制が、インビトロでの神経保護に十分であることを示す。PD 0332991という分子は、マウスにおいて腫瘍の退縮を引き起こすのに有効であることが示されており、ヒトの、癌に対する臨床試験で現在用いられている。PD 0332991の構造は
2010513317.tif 000003
である。
【００２９】
本発明者らは、CDK4およびCDK6 (別称「CDK4/6」) の極めて特異的な薬理学的阻害剤として、化合物PD 0332991が、アポトーシスシグナル伝達の活性化にとって不可欠な、細胞周期へのニューロンの再進入を抑制することにより、アポトーシスの酸化的DNA損傷モデルにおいて神経保護効果を発揮することを確認した。この点に関して、PD 0332991(最も好ましい態様)およびCDK4/6の阻害に同様の特異性を示す他の薬剤は、脳卒中のような急性疾患の治療薬剤として、心臓バイパス手術のような場合の予防剤として、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病およびALSなどの慢性神経疾患の改善剤または進行阻害剤として、有用性を有する。
【００３０】
より詳細には本発明は、例示したPD 0332991などの薬剤が、以下の疾病および疾患の根底にある虚血性の原因の治療に有用であることを意図する：アルツハイマー病; パーキンソン病; 冠動脈バイパス移植手術などの状態に起因するまたはそれによりもたらされる虚血状態; 心停止に起因する全脳虚血; 局所性脳梗塞; 脳出血; 出血梗塞形成; 高血圧性出血; 頭蓋内血管異常の破裂に起因する出血; 頭蓋内動脈瘤の破裂に起因するクモ膜下出血; 高血圧性脳障害; 脳虚血をもたらす頚動脈狭窄または閉塞; 心原性血栓塞栓症; 脊髄卒中および脊髄損傷; 脳血管の疾病（アテローム性動脈硬化および脈管炎など); 黄斑変性ならびに網膜症および緑内障などの他の眼疾病; 心筋梗塞; 心虚血; または上室性不整頻脈。このリストは網羅的なものではなく、本発明は、生理学的虚血症状が病因の中心にある多くの身体的な病気に、即ち、急性慢性にかかわらず(特に)ニューロンの、または他の細胞の変性/細胞死が疾病プロセスの根底に存在する、多くの身体的な病気に適用可能であることを当業者は理解するであろう。
【００３１】
以下に述べるように、本発明者らは、G1(細胞周期)期成分がDNAの修復に寄与し、分裂終了ニューロンのDNA損傷応答に関係しているかどうかを調べた。最終分化した皮質ニューロンにおいて、毒性濃度の過酸化水素(H2O2)による処理が、修復不可能なDNA二重鎖の切断(DSB)および細胞周期機構のG1成分の活性化を引き起こした。重要なことには、G0→G1転移の必須要素であるサイクリン依存性キナーゼ CDK4およびCDK6が抑制された場合は、ニューロンのアポトーシスが減少した。本発明者らのデータは、G1細胞周期の成分が、分裂終了ニューロンのDNA応答およびDNA損傷によって開始されるアポトーシスに関係していることを示唆する。
【００３２】
本発明により、細胞周期機構が分裂終了ニューロンのDNA損傷応答およびアポトーシスシグナル伝達の鍵となる成分であることが示された。これを示すために本発明者らは、分裂終了皮質ニューロンに対する毒性濃度のH2O2 の効果を調べた。データは、毒性濃度のH2O2 への曝露によって誘発された酸化ストレスが、細胞周期機構の活性化およびニューロンのアポトーシスに関連する修復不可能なDSBの形成を引き起こしたことを示す。必須のG1細胞成分であるCDK4およびCDK6が抑制された場合は、アポトーシスが減少した。
【００３３】
そのような結果は、細胞、特にその重要な部分集合がニューロンである細胞に対する損傷を阻止する、改善するまたは予防するために、対象(ヒトまたは他の動物)を治療的に処置する方法を示唆する。
【００３４】
このようにして本発明の開示から、本明細書に開示されたような薬剤を、そのような介入を必要とする患者へ薬学的におよび治療的に適切な方法で投与することができ、それによって患者は細胞変性および細胞死(特にニューロンの死)の影響を克服することを身体的および臨床的に支援されて、患者の症状が改善され、(さらなる)損傷が予防されることが、当業者には明白であろう。
【００３５】
PD 0332991のような化合物(および同様に作用する化合物)が、虚血性細胞傷害に対する神経保護剤として有効であるのは、それのこれまでに提案されてきた公知の唯一の使用法が抗新生物剤としてであったことを考えれば、 驚くべきことであり、かつ予期しないことである。
【００３６】
したがって本発明の態様の一つは、虚血性細胞傷害に対する、特に神経細胞/組織に対する影響の改善を目標とする。本発明はまた、PD 0332991などの化合物の、アルツハイマー病またはパーキンソン病などの慢性神経変性疾患を起こす、家族性のまたは遺伝的な危険性が疑われる対象への予防的投与をも意図する。
【００３７】
本発明において有用な化合物であるCDK4/6阻害剤 (PD 0332991など)およびそれらの合成法は、特に米国特許第6,396,612号に開示されており、当技術分野において周知である。
【００３８】
さらなる局面では本発明は、本発明の方法に有用なCDK4/6阻害剤(PD 0332991など)の薬学的組成物を目標とする。本発明の薬学的組成物は、一つもしくは複数の化合物(または一つもしくは複数の異なる有効成分と一緒にされた化合物の一つ）および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体または希釈剤」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、固体の添加剤(通常は固体の経口剤形で用いられる例えば、結合剤、滑沢剤その他)、被覆剤、抗菌性および抗真菌性の薬剤、等張性の、および吸収を遅延させる薬剤、ならびに生理学的に適合性を有するその他のものを含む。担体の型は意図する投与経路に基づいて選択することができる。
【００３９】
様々な態様において、担体は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所的、経皮的、または経口投与に適している。例えば、薬学的に許容される担体は、滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の、滅菌水溶液または分散液および滅菌散剤を含む。そのような媒体および薬剤の、薬学的活性物質のための使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤は、活性化合物に適合しない場合を除いて、その本発明の薬学的組成物中での使用が意図される。すべての剤形において、補助的活性化合物もまた組成物に組み入れてよい。
【００４０】
好ましくは、投与は経口であって、即時放出性でも遅延放出性でもよい。本発明のそのような経口的薬学的組成物は、製薬産業で典型的に用いられる技術によって製造される。一般に、活性薬剤は好ましくは、当技術分野で公知の方法、例えば湿式製粒法および直接圧縮法を用いて調製された経口投与用の錠剤またはカプセルへ、製剤される。経口錠剤は、当技術分野で公知の任意の適当なプロセスを用いて調製される。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. Gennaro, Ed., Mack Pub. Co.(Easton, PA 1990), Chapters 88-91を参照のこと。通常は有効成分、即ち一つまたは複数のCDK4/6阻害剤を、薬学的に許容される添加剤（例えば結合剤、滑沢剤等）と混合し、圧縮して錠剤にする。好ましくはそのような剤形は、湿式製粒法技術または直接圧縮法によって均一な粒状体を形成するように調製される。あるいは、有効成分を、前もって準備しておいた不活性の粒状体と混合することが可能である。湿った粒状体を次に乾燥し、適当なスクリーニング装置を用いてサイズ分けして散剤とし、それを次に所望のようにカプセルへ充填するか圧縮してマトリックス錠またはカプレットにすることができる。
【００４１】
そのような一つの局面では、錠剤は直接圧縮法を用いて調製される。直接圧縮法には、特に製造の相対的な容易性に関わる、湿式製粒法を上回る多くの潜在的な長所がある。直接圧縮法では、少なくとも一つの薬学的活性薬剤および添加剤または他の成分を、40メッシュのスチール網などのステンレススチール網を通してふるい分ける。次に、ふるい分けられた物質を適当なブレンダーに入れ、適当な時間混ぜ合わせる。次にこの混合物を、適切な成形用具を用いて回転圧縮機上で圧縮して錠剤にする。
【００４２】
あるいは、薬学的組成物はビードレット（beadlet）またはペレットを含むカプセルに含まれる。そのようなペレットを作製するための方法は当技術分野において公知である(Remington's,上掲を参照)。ペレットを、従来技術によってカプセル、例えばゼラチンカプセルへ充填する。
【００４３】
滅菌注射溶液は、所望量の活性化合物を薬学的に許容される液体賦形剤に組み入れてろ過滅菌することにより調製することができる。一般に分散剤は、基礎分散媒を含む滅菌された賦形剤に活性化合物を組み入れることにより調製され得る。滅菌注射溶液を調製するための滅菌散剤の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、それにより有効成分に任意の追加の所望の成分を加えた散剤が、前もって滅菌濾過されたその溶液から得られると考えられる。
【００４４】
本発明の薬学的組成物は、それらの意図された目的を達成する任意の手段によって、例えば経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、または頬の経路によって投与してよい。
【００４５】
薬学的組成物中には、活性薬剤(即ち一つまたは複数のCDK4/6阻害剤)が、治療上有効な量だけ存在する。「治療上有効な量」とは、特定の病態または急性の疾患の経過に良い影響を及ぼす所望の治療結果を達成するために、用量の点でおよび必要な期間にわたって有効な量を意味する。この用語はまた、より低用量でありえる、化合物の予防的な様式での治療のための使用も意図しかつ包含しており、そのような態様が本発明に含まれる。もちろん、活性薬剤の治療上有効な量は、個人の病態、年齢、性別および体重、ならびに個人の中で薬剤が所望の応答を引き起こす能力などの因子によって変化する可能性がある。投与計画は、最良の治療反応を与えるように調整してもよい。治療上有効な量はまた、薬剤の治療上有益な効果が、いかなる毒性効果または有害効果よりも勝る量でもある。
【００４６】
組成物中の活性化合物の量は、個人の病態、年齢、性別および体重等の因子によって変化してもよい。投与計画は、最良の治療反応を与えるように調整してもよい。本発明の投与単位形式の仕様は、(a) 活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに (b) 個人毎の感度を処理するためにそのような活性化合物を調合する技術分野に固有の限界に規定され、またこれらに直接依存する。本発明の投与単位は、活性薬剤を、実施例中の研究から導出することができる量とほぼ同じく、またはより好ましくはそれより少ない、その最大耐量以下で有効であると思われる量である、投与計画に適する量だけ含むことを企図する。
【００４７】
本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物の有益な効果を必要とする任意の動物に投与され得る。本発明は主としてヒトへの使用を目標とするが、所望であれば、虚血性の疾病または疾患が疑われる他の哺乳動物を適宜治療してもよい。
【００４８】
本発明はさらに次の実施例によって説明されるが、それは本発明を限定することを意図するものではない。本出願の全体に引用されたすべての参照文献、特許、および公表された特許出願の内容は、具体的にかつ全体として、参照により本明細書に組み入れられる。
【００４９】
実施例
皮質細胞培養物および実験的処理
動物の使用を含むすべての実験は、Georgetown University Medical Center, Washington, DC の IACUC によって承認された。Jackson Laboratories から得た E18 Sprague-Dawleyラットから皮質細胞の初代培養物を樹立した。
【００５０】
細胞を以前に記述された手順に従って平板培養した(Kruman, I.I., et al., 2004. Neuron. 41:549-561)。細胞を穏和なトリプシン処理およびすり潰しによって解離した後、0.025μg/mlのポリ-L-リジンで予めコートしたプラスチック皿またはチャンバースライド上に、B-27サプリメント、1mMのHEPES、2mMのグルタミン酸および 0.001%のゲンタマイシン硫酸塩を含有する Neurobasal培地中1.3×103ニューロン/mm2 の密度で蒔き; 30分後に新鮮な培地に置換した。
【００５１】
全ての実験を、MAP-2-陽性細胞の約3%がS期にある、4日目の培養物で行った (Kruman, I.I., et al., 2004. Neuron. 41 :549-561)。実験ごとにNeurobasal培地中で1mMの過酸化水素(H2O2; Sigma)の新しい原液を調製し、示した濃度(5μMおよび100μM)で加えた。1μMのPD 0332991(Pfizerから取得)による処理を、完全培地中で12時間行い; H2O2 を示した時間および用量で加えた。
【００５２】
ニューロンの生存およびアポトーシスの分析
ニューロンの生存率を、処理後にアポトーシスを起こした核を定量することにより評価した。細胞を固定して、DNA結合性色素であるヨウ化プロピジウム(PI)(10μg/ml; Sigma)で染色し、アポトーシスを起こした核を有する細胞の割合を以前に記述されたように計算した (Kruman,I.I., et al. 2002. J Neurosci. 22:1752-1762; Tenneti, L. and S.A. Lipton. 2000. J Neurochem. 74:134-142)。核染色を、Zeiss蛍光顕微鏡を用いて観察し、写真撮影した。アポトーシスを、対応するニューロンの五つの培養物からの細胞抽出物における、活性化された(開裂された)カスパーゼ-3(ポリクローナル; 1μg/ml; Upstate Cell Signaling Solutions)、開裂されたMcm3(ポリクローナル、1:200; Santa-Cruz)、Mcm2(BM28; モノクローナル; 1:200; BD Biosciences)およびフラクチン(開裂されたβ-アクチン; 1:3000; Chemicon)についての免疫ブロット分析によってさらに確認した。メチルメタンスルホン酸(MMS)処理したNIH/3T3細胞からの抽出物を、陽性対照として用いた(Lakin, N.D.and S.P. Jackson. 1999. Oncogene. 18:7644-7655)。
【００５３】
免疫ブロット分析
全細胞溶解物のため、皮質ニューロンを、63mMのトリス、2mMのEDTA、2mMのEGTA、2%のドデシル硫酸ナトリウム、10%のグリセロール、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma)から成るpH6.0の氷冷した緩衝液中で溶解した。核溶解物の調製のため(サイクリンD1およびγ-H2AXの分析のため)、皮質ニューロンをプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma)を含有する氷冷緩衝液中で溶解し、氷上で30分間塩酸(0.2M)とインキュベートした。
【００５４】
遠心分離の後、酸不溶性の沈殿を捨て、上清を200mlの0.1Mの酢酸に対して2回透析し(毎回1〜2時間)、次に水に対して透析した。陽性対照として、本発明者らは細胞周期のG1期(G1)に同調したHeLa細胞からの抽出物を用いた。HeLa細胞は、0.1μg/mlのノコダゾールを加えることにより有糸分裂時に同調させた。12時間後、有糸分裂細胞をノコダゾールを含まない培地で再び平板培養し、3〜5時間後にG1細胞を集めた。同調はフローサイトメトリーによってモニターした。
【００５５】
SDS-PAGE(10〜15%)によってタンパク質(50μg/レーン)を大きさにより分離し、ニトロセルロース膜に移し、5% 脱脂乳の存在下で30分間インキュベートした。そしてγ-H2AX(モノクローナル; 1μg/ml; Upstate Cell Signaling Solutions)、Ser 795がリン酸化されたRB(ポリクローナル; 1:1000; Cell Signaling Technoogy)、Rb(モノクローナル、1:2000; Cell Signaling Technology)、Mcm3(ポリクローナル; 1:200; Santa Cruz)、Mcm2(BM28モノクローナル; 1:500; BD Biosciences)、開裂されたカスパーゼ-3(ポリクローナル; 1:1000; Cell Signaling Technology)、およびフラクチン(開裂されたβ-アクチン; C末端ポリクローナル抗体; 1:3000; Chemicon)、のいずれかを認識する一次抗体と、終夜4℃でインキュベートした。ローディングコントロールとして、本発明者らは抗-β-アクチン抗体または抗-グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)抗体を用いた。
【００５６】
タンパク質のバンドを、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した二次抗体 (1:3000; Jackson Immunological Research Laboratories Inc.) で可視化し、化学発光 (ECLキット、Amersham Corp.) を用いて増強した。ブロットの濃度測定分析を、KodakのソフトウェアID3.5.3 USB を用いて行ない、シグナル強度(β-アクチンシグナルに対して標準化した)を対照シグナルに対する比として表示した。
【００５７】
siRNAの調製およびトランスフェクション
各々が、対応する遺伝子の異なる領域に向けられた四つのsiRNAのカクテルである、CDK4およびCDK6を標的とするsiRNAオリゴヌクレオチド (SMARTpool試薬、Dharmacon) を、メーカーのガイドラインに従って設計し用いた。MAPK1を標的とするsiRNAオリゴヌクレオチド (Qiagen) を、対照siRNAとして用いた。対応するsiRNAヌクレオチドの混合物をsiRNA緩衝液 (Dharmacon) と混合して50μMの溶液とすることにより、二重鎖siRNAを生成した。反応混合液を90℃に1分間加熱し、-20℃で保存した。RNAオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを、メーカーの推奨に従って、RNAiスターターキット(Qiagen)を用い、最終オリゴヌクレオチド濃度を100 nMとして行なった (CDK4 RNAiおよびCDK6 RNAiのコトランスフェクションには、50 nMの各RNAiを用いた)。24時間後、生存率を調べ、タンパク質発現を、CDK4(モノクローナル; 1:250; BD Biosciences)、CDK6(モノクローナル; 1:400; Biosource)のいずれかを認識する一次抗体を用いて、ウェスタンブロッティングによって評価した。全ての実験を3重に行なった。
【００５８】
単一細胞のゲル電気泳動 (コメットアッセイ)
DNA損傷を、アルカリ性または中性の単一細胞のゲル電気泳動法(コメットアッセイ)を用いて評価した(Kruman, I.I., et al., 2004, Neuron. 41:549-561; Kruman, I.I., et al. 2002. J Neurosci. 22:1752-176229)。本発明者らは、DSBの検出用の中性コメットアッセイを用いた(Wojewodzka, M., et al. 2002. Mutat Res. 518:9-20)。処理の後にニューロンをかき取り、細胞懸濁液(約10,000個の細胞)をスライドの上で0.5%の低融点アガロース(Trevigen, Gaithersburg, MD)に包埋した。1%のトリトンX-100および10%のDMSOを含有する冷溶解緩衝液(Trevigen)による処理の後に、スライドを、新たに調製した電気泳動緩衝液である、300mMの酢酸ナトリウム、100mMのトリスHCl、pH 8.3(中性コメットアッセイ)、または300mMのNaOH、1mMのEDTA、pH > 13(アルカリ性コメットアッセイ)の中で1時間インキュベートした。次に、14Vおよび60mAで1時間(中性コメットアッセイ)、または25Vおよび300mAで30分間(アルカリ性コメットアッセイ)、8℃で電気泳動を行ない、SYBRグリーン(Trevigen)で染色し、Olympus BX51蛍光顕微鏡およびコメットアッセイ画像分析ソフトウェア(Loats Associates Inc.)を用いて分析した。損傷を受けたDNAを有する核は、明るい頭部および尾部を備えたコメットの外観を有し、尾部は損傷を受けたDNAを表わしており、これはしばしば断片化していて、その結果その電気泳動度はより大きい。損傷を受けていないDNAを有する核は円形に見え、尾部は無い。各スライドから、無作為に選択した50個の細胞の画像を分析した。データ分析は、平均の集団応答に、または細胞間の損傷の分布に基づいて行った。DSB形成の対照として、本発明者らはγ線照射された皮質ニューロンを採用した。細胞を、RS 2000 Biological irradiator (Rad Source Technologies, Inc.)を用いて1Gyのγ線照射で処理した。
【００５９】
免疫蛍光法
カバーガラス上で増殖させたニューロンを、新たに調製した4%のホルムアルデヒド中で30分間4℃で固定し、次にPBS中で調製された0.5%トリトンX-100含有1%BSA中で10分間透過処理し、それを1%のBSA中で1時間室温でブロッキングしてから、一次抗体と室温で1時間インキュベートした。本発明者らは次の特異的抗体を用いた: 抗γ-H2AX(モノクローナル;1:500; Upstate Cell Signaling Solutions)。対比染色として、本発明者らはPIを用いた。カバーガラスをVectashield封入剤(Vector Laboratories)によって装着し、Spotデジタルカメラおよびソフトウェアを装備したNikon Eclipse E800蛍光顕微鏡によって検査した。
【００６０】
統計分析
統計分析をMicrosoft Excelで行ない、分散分析(ANOVA)およびFisherのポストホックテストを用いてp値を得た。p値＜0.05で、有意とした。
【００６１】
結果
DNA損傷を受けた最終分化ニューロンにおいてG1細胞周期成分が活性化されるかどうかを判断するために、過酸化水素(H2O2)によってもたらされた酸化ストレスの影響を先ず確認した。
【００６２】
H2O2 は、正常な代謝産物として生成され、神経変性に寄与することが示唆されている様々なフリーラジカルの細胞膜透過性前駆物質であり(Behl, C. 1999. Prog Neurobiol. 57: 301-323)、また二本鎖切断(DSB)を生ずることが公知である(Slupphaug, G., et al. 2003. Mutat Res. 531 :231-251)。
【００６３】
ラット皮質ニューロンを培養するために、本発明者らは、ニューロン特異的MAP-2の免疫蛍光検出によって＞99%純粋であると評価されるニューロン集団を生じる、以前に報告された方法(Kobayashi, S., et al. 2002. Nucleic Acids Res Suppl (2):283-284)を採用した。4日目までの培養で、MAP-2陽性かつGFAP陰性の培養物には、神経芽細胞の混入が最小(3%)であった。H2O2 の毒性の(100μM)および準毒性の(5μM)濃度を、以前に記述されたように(Kruman, I.I., et al. 2002．J Neurosci.22:1752-1762)、アポトーシスを起こした核を有する細胞を計数してH2O2 の毒性を評価するために、用量-応答実験に基づいて選んだ(データは示さない)。
【００６４】
皮質ニューロンの100μMのH2O2 による処理は、ヨウ化プロピジウムで染色した培養物中のアポトーシスを起こした核の出現(図1A、B)によって、およびウエスタンブロット分析(図1C)により評価される開裂されたカスパーゼ-3中間体(19および17kDa、それらは初期のアポトーシスにおけるカスパーゼ-3活性化のマーカーとして役立つ)によって証明されるように、曝露後9時間までに開始される有意なアポトーシス死をもたらした。メチルメタンスルホン酸(MMS)処理されたNIH/3T3細胞からの抽出物を、陽性対照として用いた(Lakin, N.D.and S.P. Jackson. 1999. Oncogene. 18:7644-7655)。さらに、ウエスタンブロット分析(図1C)によって評価される、開裂されたβ-アクチン断片(32-kDa C11末端断片)の出現は、アポトーシスの間にβ-アクチンのような細胞骨格タンパク質を開裂するカスパーゼ-3の活性化の証拠である(Salvesen, G. S. and V.M. Dixit. 1999. Proc Natl Acad Sci USA. 96:10964-10967)。
【００６５】
皮質ニューロンの、5μMではなく100μMのH2O2 による処理は、アポトーシスの初期に典型的な核基質Mcm3の開裂(98-kDa断片)をもたらしたが、Mcm2は開裂されなかった(図1C)。これらのデータは、Mcm3はアポトーシスにおけるタンパク質分解の初期の標的であるが、複製タンパク質のMcmファミリーの他のメンバーはそうではないという以前の考え (Schwab, B. L., et al. 1998. Exp Cell Res. 238:415-421)と合致しており、これはMcm3の積極的な破壊がMcm複合体を不活性化し、細胞死プログラム遂行中の、時機を失したDNA複製事象を予防する役目を果たすことを示唆する。100μMのH2O2 とは対照的に、5μMのH2O2は曝露後24時間(図l)または48時（データは示さない）までには、皮質ニューロンのアポトーシスを引き起こさなかった。総合すると、いくつかの独立したアポトーシスマーカーを用いることに基づく本発明者らの結果は、100μMのH2O2 は培養皮質ニューロンに有毒であることを示す。分裂終了ニューロンにおいて、細胞周期の活性化が致命的なDSBの形成を伴うという仮説を試験するために、本発明者らは、培養皮質ニューロンにおけるDSB形成に対する毒性および準毒性の濃度のH2O2の効果を比較した。
【００６６】
DNA損傷の変化は、DNAを損傷させる薬剤の濃度および曝露時間に依存し、DNA損傷とDNA修復との間のバランスを反映する。本発明者らは、H2O2 によって生成された傷害を、真核細胞中でのDNA鎖切断を確認するための標準となっている感度のよい方法である単一細胞のゲル電気泳動法(コメットアッセイ)を用いて分析した。アッセイは、低密度アガロース層中に捕捉された少数の細胞のゲル電気泳動を必要とする。
【００６７】
アッセイの原理は、電気泳動中に、変性したDNA断片が細胞の外に移動する能力に基づく。損傷を受けたDNAを有する核は、明るい頭部と尾部を有するコメットの外観を有するが、一方損傷を受けていないDNAを有する核は円形に見え、尾部はない。
【００６８】
「アルカリ性」(pH13)型のコメットアッセイは、DSBおよび一本鎖切断(SSB)、ならびにアルカリ不安定性(alkaline-labile)部位(ALS)および切れ目を含む種々の異なるDNA傷害を検出する(Collins, A.R. 2004. Mol Biotechnol. 26:249-261)。「中性」(pH8.3)型のコメットアッセイは、DNA変性ステップを省略し、したがって、DSBは電場中を移動することからDSBのみを検出する(Wojewodzka, M., et al. 2002. Mutat Res. 518:9-20)。中性コメットアッセイは、放射線誘発性DSBの誘導および修復の研究に適した手段であることが示されている(Olive, P.L., et al. 1991. Cancer Res. 51 :4671-4676; Singh, N.P. and R.E. Stephens. 1997. Mutat Res. 383:167-175; Wojewodzka, M., et al. 2002. Mutat Res. 518:9-20)。中性コメット分析はDNAのDSBの確認を可能にするが、これらの傷害ははるかに有毒でありかつそれほど頻繁ではない(DSBはSSBよりも25〜40倍低い頻度で生じる)ことから、本発明者らは、SSBと比較してはるかに低レベルのDSBを観察することを期待した(Olive, P.L.1999. Int. J. Radiat. Res. 75:395-405)。
【００６９】
二本鎖切断と他の種類のDNA損傷を区別するために、本発明者らはアルカリ性および中性という二つの種類のコメットアッセイを行い、かつγ線照射を、以前に記述されたようにDSB形成の対照として用いた (Kruman, I.I., et al., 2004. Neuron. 41 :549-561; Morris, E.J., et al. 1999. Biotechniques. 26:282-283, 286-289; Olive, P.L., et al. 1991. Cancer Res. 51 :4671-4676; Singh, N.P. and R.E. Stephens. 1997. Mutat Res. 383:167-175; Wojewodzka, M., et al. 2002. Mutat Res. 518:9-20)。
【００７０】
中性コメットアッセイの結果は、図2Aに図示したように、準毒性である5μMのH2O2(6時間)に曝露した細胞中でのDNA損傷の有意な増加(著しくより大きなコメット尾部)を実証している。5μMおよび100μMのH2O2で処理した皮質ニューロンにおける、DNA損傷のアルカリ性および中性のコメットアッセイによる比較を、図2Aに示す。DNA損傷を、一般に用いられるパラメーターである、尾部中のDNA量と、頭部領域質量中心および尾部領域質量中心間の距離との積を表わすオリーブテールモーメント(OTM)の値で表示した。
【００７１】
予想通り、アルカリ性型のアッセイに対比して、処理された細胞の中性アッセイで得られたテールモーメントは小さかった; しかしながら、この上昇は、5μMのH2O2での処理の1時間後および6時間後に試験された細胞においては、未処理の対照細胞と比較して有意であった。重要なことには、DNA損傷は、アルカリ性および中性型の両方のコメットアッセイによって評価されるように、5μMのH2O2に曝露された集団においては有意に減少したが、100μMのH2O2ではそうではなかった。これらの知見は、5μMのH2O2 によって誘起されたDNA損傷は、100μMのH2O2 によって誘起されたDNA損傷とは対照的に、修復可能であることを示唆する。DSBの追加の尺度として、本発明者らは、DSBを囲む部位に起こり免疫染色により確認することができる、ヒストンH2AX(γ-H2AX)のセリン139におけるリン酸化のレベルをモニターした。
【００７２】
最近の報告は、γ線照射された細胞におけるγ-H2AXの脱リン酸化およびγ-H2AXフォーカスの分散がDSB修復と相関していること(MacPhail, S., et al. 2003. Int J Radiat Biol, 79:351-358; Nazarov, I., et al. 2003. Radiat Res. 160:309-317; Rothkamm, K. and M. Lobrich. 2003. Proc Natl Acad Sci USA. 100:5057-5062)、およびこれらのパラメーターがDSB部位の定量的な尺度を与えること(Sedelnikova, O. A., et al. 2002. Radiat Res.l58:486-492)を示している。したがって、γ-H2AXフォーカスはDSBを示しており(Rothkamm, K. and M. Lobrich. 2003. Proc Natl Acad Sci USA. 100:5057-5062)、そのためDSBの存在の指標として用いることができる。5μMおよび100μMのH2O2による処理の影響を、DSB DNA損傷の際のニューロンの死滅および生存に関連付けるために、本発明者らは、未処理の培養物における、ならびに毒性および準毒性の両方のH2O2濃度に曝露した培養物における、H2AXのリン酸化を測定した。免疫蛍光法によって評価されたH2AXリン酸化の程度は、γ-H2AXフォーカス/細胞の平均数が、処理された細胞において著しく高いことを明らかにした(図2B)。これらのデータは、コメットアッセイの結果(図2A)と一致し、ならびに100μMのH2O2では見られたが5μMのH2O2では見られなかった、続いて起こるアポトーシス(図1)とも一致する。
【００７３】
H2AXのリン酸化ならびにコメットアッセイにおける増大したOTMは、アポトーシスでのDNA断片化によって引き起こされた可能性がある (Rogakou, E.P., et al. 2000. J Biol Chem. 275:9390-9395); しかしながら、両方のDSBは100μMのH2O2 への24時間の曝露でニューロン培養物に見られるアポトーシス死(図l)に先行するので、それらの培養物における、γ-H2AX形成、またはコメットアッセイによって確認されるDNA損傷のいずれかは、アポトーシスに先行するように思われた。したがって、100μMのH2O2はアポトーシスに寄与した累積的な切断をもたらした。
【００７４】
本発明者らが以前に示したように、分裂終了ニューロンは、DNA損傷によって開始されるアポトーシスを細胞周期活性化後に起こし、細胞周期への再進入は、古典的なDSBインデューサーであるγ線照射およびエトポシドによって開始されるDSB媒介アポトーシスの実行にとって不可欠であった (Kruman, I.I., et al.. 2004. Neuron. 41 :549-561)。
【００７５】
DNA損傷によって開始されたニューロンのアポトーシスにおける細胞周期への再進入の役割を確かめるために、本発明者らはRNA干渉(RNAi)に基づく方法を採用して、細胞周期活性化に不可欠である二つのCDKであるサイクリン依存性キナーゼCDK4およびCDK6の発現を抑制し、H2O2 によって誘起されたアポトーシスに対するこれらの介入の影響を検討した(Davidson, M.K., et al. 2004. J Biol Chem. 279: 50857-50863)。初代皮質ニューロンに、その各々が対応する転写物の異なる領域に向けられた四つのsiRNAのカクテル (SMARTpool reagents, Dharmacon)であるCDK4およびCDK6を標的とするsiRNA、または対照siRNAを、コトランスフェクションした。複数種のsiRNAが同時に存在することは、より有効な遺伝子抑制を誘発し、一方で、個々のsiRNAはより低濃度(約12.5 nM)で用いられるので、個々のsiRNAから標的以外への影響を最小限にする。トランスフェクションの24時間後、細胞を集め、CDKの発現をウエスタンブロット分析により分析した。
【００７６】
図3Aは、トランスフェクションの24時間後の皮質ニューロン中のCDK4およびCDK6のレベルの著しい減少を示す。24時間後に細胞を100μMH2O2で18時間処理し(有意な数のアポトーシス細胞が予期される際、図1B)、アポトーシスを起こした核を評価した。本発明者らは、CDK4およびCDK6が抑制された細胞においてアポトーシスの程度の有意な減少を見出した(図3B)。これらの知見は、細胞周期への再進入が、DSB DNA損傷に曝露された分化したニューロンにおけるアポトーシスプログラムの活性化にとって不可欠であるという考えを支持する。
【００７７】
CDK4およびCDK6の極めて特異的な阻害剤である PD 0332991 (Fry, D.W., et al. 2004. Mol Cancer Ther. 3:1427-1438)による処理が、PD 0332991で前処理された細胞のアポトーシスの程度の有意な減少をもたらした(図4B)。
【００７８】
総合して、これらの観察は、細胞周期機構の活性化が分裂終了ニューロンにおけるアポトーシスシグナル伝達において不可欠であることを強く示唆する。
【００７９】
実験の結論
この実施例において、細胞周期機構の活性化が、DNA損傷によって開始されるニューロンのアポトーシスに寄与するという証拠が提供されている。本発明者らの知る限り、この研究は、G1細胞周期成分が、DNA損傷によって開始されるニューロンのアポトーシスに関係していることを実証する最初のものである。
【００８０】
有糸分裂細胞において、細胞周期機構は、損傷を受けたDNAを除去すること（DNA修復)または損傷を受けた細胞をアポトーシスによって除去することを機能とする複雑な防御機構であるDNA損傷応答に対する、主要な寄与因子である (Bernstein.C., et al. 2002. Mutat Res. 511:145-178)。後者の機構は、修復不能なDNA改変が、損傷を受けた細胞の子孫に引き継がれないことを保証する。DNA修復およびアポトーシスは両方とも、細胞分裂周期の進行と調和しており、ゲノムの完全性を維持するために共同して作用している (Rhind, N. and P. Russell. 2000. Curr Biol.10:R908-R911)。このように、増殖している細胞では、DNA損傷応答の重要な役割は、細胞周期のチェックポイントを活性化することである(Shiloh, Y. 2003. Nat Rev Cancer. 3:155-168)。
【００８１】
ニューロンにおいては対照的に、それらの分裂が終了しているという性質のため、DNA損傷応答は細胞周期のチェックポイントを活性化するとは予想されなかった。しかし、神経変性が、逆説的に細胞周期への再進入に関連していることを示唆する証拠が蓄積しつつある（Liu, D.X., and L.A.Greene. 2001. Cell Tissue Res. 305:217-228)。死滅しつつある分裂終了ニューロンにおけるDNA損傷と細胞周期への再進入との間の関連性についてのインビトロおよびインビボの両方の証拠が存在しており (Klein, J.A., et al. 2002. Nature. 419:367-374, Kruman, I.I., et al.. 2004. Neuron. 41 :549-561)、細胞周期活性化およびアポトーシスがDNA損傷応答の必須成分であることを示唆している。DNA修復の欠陥に関連する遺伝病が神経の異常および進行性神経変性に関連しているという事実 (Rolig, R.L., and P.J. McKinnon. 2000. Trends Neurosci. 23:417-424)によって支持されるように、DNA修復は神経系にとって極めて重要である。
【００８２】
本発明者らは、分裂終了ニューロン中のDSBが、H2O2 によってもたらされる酸化ストレスから生じることができ、アポトーシスをもたらす可能性があることを見出した。
【００８３】
本発明者らの結果は、DSB修復の失敗がアポトーシスの開始に結び付くことを示す。
【００８４】
上の実施例において、生存しているニューロン中の修復不可能なDNA DSBの存在には、細胞周期機構の活性化およびG0→Gl移行が伴なっていた。
【００８５】
本発明者らの以前の研究は、DNA損傷によって開始されるアポトーシスが起こる運命にある分裂終了ニューロンにおいて、細胞周期が活性化されることを実証した (Kruman, I. I., et al. 2004. Neuron. 41:549-561)。これらの観察は、本研究と共に、細胞周期機構がDNA損傷に曝露されたニューロンのアポトーシスシグナル伝達に中心的役割を果たすという、および、CDK4およびCDK6の極めて特異的な阻害剤(この例ではPD 0332991)による処理が、そのような阻害剤で前処理された細胞のアポトーシスの程度の有意な減少をもたらすという、科学的に合理的な結論へとつながる。
【図１】
2010513317.tif 000006
【図２】
2010513317.tif 000007
【図３】
2010513317.tif 000008
【図４】
2010513317.tif 000009