(57)【要約】  本発明は、オリゴヌクレオチド混合物を含有する組成物に関する。さらに、本発明は、対象の試料における種々のＨＰＶ遺伝子型のための前記のオリゴヌクレオチド混合物の使用に関する。さらに、対象の試料における種々のＨＰＶ遺伝子型を診断するための方法、及び該方法を実施するためのキットを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド混合物を含有する組成物であって、該オリゴヌクレオチド混合物が、
（ａ）配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２において示されるような核酸配列を有するオリゴヌクレオチド、又は
（ｂ）（ａ）のオリゴヌクレオチドによって増幅されるポリヌクレオチドを特に増幅することができるオリゴヌクレオチド
を含有する組成物。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチド混合物が、内因性調整ポリヌクレオチドの増幅のためのオリゴヌクレオチドをさらに含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド混合物が、外因性調整ポリヌクレオチドを含有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか１項に記載の組成物を含有する診断組成物。
【請求項５】
被験者の試料における種々のＨＰＶ遺伝子型を検出するための、請求項１から３までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項６】
前記種々のＨＰＶ遺伝子型が、同時に診断される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記ＨＰＶ遺伝子型が、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３及び８２からなる群から選択される高リスクＨＰＶ遺伝子型である、請求項５又は６に記載の使用。
【請求項８】
以下、
ａ）種々のＨＰＶ遺伝子型を含む疑いのある被験者の試料と請求項１から３までのいずれか１項に記載の組成物とを、ポリヌクレオチドの増幅を可能にする条件下で接触する工程、及び
ｂ）工程ａ）において得られた増幅されたポリヌクレオチドを基礎とする種々のＨＰＶ遺伝子型を決定する工程
を含む、被験者の試料における種々のＨＰＶ遺伝子型を診断するための方法。
【請求項９】
前記ＨＰＶ遺伝子型が、高リスク遺伝子型である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から３までのいずれか１項に記載の組成物を含有する、請求項８又は９の方法を実施するために適したキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチド混合物を含有する組成物に関する。さらに、本発明は、被験者の試料における種々のＨＰＶ遺伝子型を診断するための前記のオリゴヌクレオチド混合物の使用に関する。さらに、被験者の試料における種々のＨＰＶ遺伝子型を診断するための方法、及び該方法を実施するためのキットを含む。
【０００２】
子宮頸癌（子宮頸部の癌）は、約４７００００人の新たに診断されたケースを有する世界中の女性の中で第二の最も一般的な癌であり、及び毎年ほぼ２５００００人の死者がいる（Parkin, DM et al. 2001. Eur. J. Cancer 37(Suppl.8):4-66）。子宮頸癌に関する主な原因は、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）での、特に高リスクＨＰＶ遺伝子型での頸部の感染である。ヒトパピローマウィルスは、ウィルスの大きな集団を形成し、かつ殆どもっぱら皮膚及び粘膜細胞を感染させる小さく、覆われていないＤＮＡウィルスである。現在まで、ヒトパピローマウィルスのほぼ１００個のウィルスの遺伝子型のゲノムが特徴付けられており（de Villiers, E. M., C. Fauquet, T. R. Broker, H. U. Bernard, 及びH.zur Hausen.2004.Classification of papillomaviruses.Virology 324:17-27）、かつ非常に多数のヒトパピローマウィルスが、存在すると考えられている（Hazard K, Andersson K, Dillner J, Forslund O. Human papillomavirus subtypes are not uncommon. Virology. 2007 May 25;362(l):6-9）。
【０００３】
約５０個のＨＰＶ遺伝子型は、粘膜を感染することが公知である。それらの粘膜の遺伝子型は、癌に関する免疫学的関連に基づいて３つの異なる群に分類される："低リスク"ヒトパピローマウィルス（ＬＲ−ＨＰＶ）、"高リスク"ヒトパピローマウィルス（ＨＲ−ＨＰＶ）、及び"推定上の高リスク"ヒトパピローマウィルス（ｐＨＲ−ＨＰＶ）。低リスクヒトパピローマウィルス（例えばＨＰＶ遺伝子型６、１１、４０、４２、４３、４４及び７０を含む）は、性器いぼ及び低グレードの頸部病変において主に見出される。ＨＰＶ２６、５３、６６を含む推定上の高リスクヒトパピローマウィルスは、一貫して、子宮頸癌において見出されない。高リスクヒトパピローマウィルスは、癌になる危険性（Munoz et al. 2003. N. Engl. J. Med. 348:518-527）に関連し、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３及び８２を含む。ＨＰＶ１６及び１８は、それらの遺伝子型が、子宮頸癌患者のほぼ７０％において見出されるような、臨床上最も関連性のあるものと考えられる。
【０００４】
高リスクＨＰＶ遺伝子型の感染は、必ずしも子宮頸癌を導かない。しかしながら、いくつかの研究は、明らかに、高リスクＨＰＶに感染した女性が、未感染の女性又は低リスクＨＰＶに感染している女性よりも、実質的に癌になる高い危険性があることを示している（Bosch, F. X., M. M. Manos, N. Munoz, M. Sherman, A. M. Jansen, J. Peto, M. H. Schiffman, V. Moreno, R. Kurman, and K. V. Shah. 1995. Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer:a worldwide perspective. International biological study on cervical cancer (IBSCC) Study Group. J Natl Cancer Inst 87:796-802.; Bosch, F. X., A. Lorincz, N. Munoz, C. J. Meijer, and K. V. Shah. 2002. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer. J Clin Pathol 55:244- 65)）。さらに、頸部異常を有する及び有さない女性の経過観察の研究は、高リスクＨＰＶ感染の残存が、著しい危険因子であり、かつ子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）の発達、維持及び進行に必要であることを示している（Nobbenhuis, M. A., J. M. Walboomers, T. J. Helmerhorst, L. Rozendaal, A. J. Remmink, E. K. Risse, H. C. van der Linden, F. J. Voorhorst, P. Kenemans, and C. J. Meijer. 1999. Relation of human papillomavirus status to cervical lesions and consequences for cervical-cancer screening:a prospective study.Lancet 354:20-5）。
【０００５】
一般に、ＨＰＶ感染から癌への進行は、非常にゆっくりであり、かつ何年もかかってよい。しかしながら、子宮頸癌の成功した予防のための重大な段階は、高リスクＨＰＶ遺伝子型を有する感染の早期検出である。子宮頸癌のスクリーニングのための、しばしばＰａｐ試験又はＰａｐスミアとも言われるパパニコロー試験の導入は、最も工業化された国々において子宮頸癌によって生じる死亡率の実質的な減少を導く。パパニコロー試験に関して、試料は、頸部から得られ、かつ悪性又は前癌の細胞を示す細胞形態における変化に関して光学顕微鏡によって篩い分けされる。従って、試料は、観察された病変の重症度に依存して分類される。しかしながら、頸部の細胞学による診断は、主観的方法であり、かつその特質は、サービスを提供する研究所の標準に依存する。実際に、細胞学の感受性は、種々の研究において３０〜９０％の範囲を示した（至適基準（ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）としてコルポスコーピー及び組織学と比較して）。これは、市販のキット及び標準プロトコルを使用した場合に、ＨＰＶ ＤＮＡ（全ての研究における感受性＞９０％、平均９６％）の検出によって診断と著しく比較される。さらに、特定のＨＰＶ遺伝子型又はさらに多数の種々のＨＰＶ遺伝子型での感染は、同定されることができない。しかしながら、特定のＨＰＶ遺伝子型の同定は重要であり、種々のＨＰＶ遺伝子型としては、罹患者に対する種々のリスクをもたらしてよい。
【０００６】
従って、新たな試験系が、特定のＨＰＶ遺伝子型の同定を可能にするために開発された。それらの新たな試験系は、もっぱら、ウィルス性の、分子の及び生化学のマーカー、例えばＨＰＶ ＤＮＡ及びＲＮＡの検出に基づく。
【０００７】
ＦＤＡ認可のＨｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ試験系（ＨＣ２）（Digene Corp., USA）は、臨床研修におけるＨＰＶ ＤＮＡ試験のための至適基準とみなされる。この系は信頼でき、感受性があり、かつ取り扱いやすいが、該系は、いくつかの欠点がある：ａ）遺伝子型は実施されず、代わりにＨＰＶ感染は、単独で"低リスク"又は"高リスク"群に帰し、ｂ）多重感染は、識別されることができず、かつｃ）それは、ＰＣＲを基礎とした方法に比べて、よりＨＰＶ検出に感受性が少ない。（Birner et al. 2001. Mod. Pathol. 14:702-709）。
【０００８】
いくつかのＰＣＲを基礎とした方法は、過去数年間で発達し、ＨＰＶ感染のより正確な検出を可能にした。大多数のそれらのＰＣＲ系は、例えばＬ１領域において、ＨＰＶゲノムのより高い保存領域に結合するコンセンサスプライマー又は一般的なプライマーを使用する。増幅されたＰＣＲ生成物は、特定の粘膜のＨＰＶ遺伝子型を同定するための他の解析（例えば、シーケンス、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析又はハイブリダイゼーション）をうける。
【０００９】
ＷＯ ９５／２２６２６号は、種々のＨＰＶ遺伝子型の検出及び同定のための２つのプライマー、ＧＰ５＋及びＧＰ６＋の使用を記載している。ＧＰ５及びＧＰ６（ＷＯ ９１／１０６７５号）と比較して、ＧＰ５＋及びＧＰ６＋プライマーは、ＰＣＲによるヒトパピローマウィルスの検出を改良する伸長させた３’末端がある（Jacobs, M. V., J. M. Walboomers, P. J. Snijders, F. J. Voorhorst, R. H Verheijen, N. Fransen-Daalmeijer, 及びC. J. Meijer. 2000. Distribution of 37 mucosotropic HPV types in women with cytologically normal cervical smears:the age-related patterns for high-risk and low-risk types. Int J Cancer 87:221-7）。それらのプライマーは、ＨＰＶ遺伝子型のＬ１領域内で保存配列領域に方向付けられる。しかしながら、プライマーを方向付けるＨＰＶ配列は、１００％保存されない。最近のデータは、プライマーと特定の遺伝子型の標的配列との間のミスマッチの数及び位置に依存する粘膜のＨＰＶ遺伝子型を増幅する能力に相違を示していた（de Roda Husman, A. M., J. M. Walboomers, A. J. van den Brule, C. J. Meijer, and P. J. Snijders. 1995. The use of general primers GP5 and GP6 elongated at their 3' ends with adjacent highly conserved sequences improves human papillomavirus detection by PCR.J Gen Virol 76 ( Pt 4): 1057-62; Qu, W., G. Jiang, Y. Cruz, C. J. Chang, G. Y. Ho, R. S. Klein, and R. D. Burk. 1997. PCR detection of human papillomavirus: comparison between MY09/MY11 and GP5+/GP6+ primer systems.（ヒトパピローマウィルスのＰＣＲ検出：ＭＹ０９／Ｍｙ１１とＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマー系との比較） J Clin Microbiol 35:1304-10)）。従って、生じた選択的な過剰な及び不十分な増幅は、それぞれ、ＨＰＶ遺伝子型の実際の分布を反映しなくてよい。結果として、これは、頸部の検体におけるあまり検出されることができない遺伝子型の罹患率の不正確な評価を導いてよい（Baay, M. F., W. G. Quint, J. Koudstaal, H. Hollema, J. M. Duk, M. P. Burger, E. Stolz, and P. Herbrink. 1996. Comprehensive study of several general and type-specific primer pairs for detection of human papillomavirus DNA by PCR in paraffin-embedded cervical carcinomas. J Clin Microbiol 34:745-7）。さらに、ＧＰ５＋／ＧＰ６＋ＰＣＲの使用は、ある程度のＨＰＶ遺伝子型を診断する場合に偽陰性の結果を導いてよい（Kleter, B., L. J. van Doom, L. Schrauwen, A. Molijn, S. Sastrowijoto, J. ter Schegget, J. Lindeman, B. ter Harmsel, M. Burger, and W. Quint. 1999. Development and clinical evaluation of a highly sensitive PCR-reverse hybridization line probe assay for detection and identification of anogenital human papillomavirus. J Clin Microbiol 37:2508-17; Chan, P. K., T. H. Cheung, A. O. Tarn, K. W. Lo, S. F. Yim, M. M. Yu, K. F. To, Y. F. Wong, J. L. Cheung, D. P. Chan, M. Hui, and M. Ip. 2006. Biases in human papillomavirus genotype prevalence assessment associated with commonly used consensus primers. Int J Cancer 118:243-5）。ＧＰ５＋／ＧＰ６＋ＰＣＲが、他のコンセンサス又は広域スペクトルＰＣＲよりも低い範囲まで多重ＨＰＶ感染を検出するという証拠もある（Kleter, B., L. J. van Doom, L. Schrauwen, A. Molijn, S. Sastrowijoto, J. ter Schegget, J. Lindeman, B. ter Harmsel, M. Burger, and W. Quint. 1999. Development and clinical evaluation of a highly sensitive PCR-reverse hybridization line probe assay for detection and identification of anogenital human papillomavirus. J Clin Microbiol 37:2508-17; Qu, W., G. Jiang, Y. Cruz, C. J. Chang, G. Y. Ho, R. S. Klein, and R. D. Burk. 1997. PCR detection of human papillomavirus: comparison between MY09/MY11 and GP5+/GP6+ primer systems. J Clin Microbiol 35:1304-105）。
【００１０】
さらに、ＤＮＡの完全性の調整は、多くの偽陰性の結果を低減するための臨床上の試料の解析における重要な工程である。従来、ＧＰ５＋／ＧＰ６＋は、主に、プライマー、例えばＢＧＣＯ３及びＢＧＣＯ５での外部のベータ−グロビン（ｂ−グロビン）ＰＣＲ、及びゲル電気泳動によるＰＣＲ生成物の続く解析によって予め篩い分けされている試料に適用される（de Roda Husman, A. M., J. M. Walboomers, A. J. van den Brule, C. J. Meijer, and P. J. Snijders. 1995. An internal DNA quality control in the HPV PCR has been already described for the MY09/11 or PGMY09/11 PCR (Gravitt, P. E., C. L. Peyton, T. Q. Alessi, C. M. Wheeler, F. Coutlee, A. Hildesheim, M. H. Schiffman, D. R. Scott, and R. J. Apple. 2000. Improved amplification of genital human papillomaviruses. J Clin Microbiol 38:357-61）。しかしながら、その著者は、使用したｂ−グロビンプライマー、ＧＨ２０及びＰＣ０４が、ＨＰＶのための分析的な感受性を低減することができたことを記載されている。それにもかかわらず、内部のＤＮＡの質の調整は、ＨＰＶ増幅の感受性の同時の障害なしに、いくつかの理由のために所望されうる：時間の増加及び費用の低減に加えて、内部のＤＮＡの質の調整は、ＰＣＲ配合物における間違いによってＨＰＶ ＰＣＲの欠陥を説明することもできる。
【００１１】
ＤＮＡの質の調整と比較して、外因性調整ポリヌクレオチド（内部ＰＣＲの調整、ＩＣ）を含有する組み込まれたＰＣＲ調整は、試料に存在する阻害剤によって又はＰＣＲ配合物における間違いによってＰＣＲ欠陥に関して篩い分けされうる。最近の研究は、粗頸部ＤＮＡ試料の８％が、量的なＨＰＶ１６の増幅のための阻害剤を含有したことを証明している（Lefevre J, Hankins C, Pourreaux K, Voyer H, Coutlee F; Canadian Women's HIV Study Group. Prevalence of selective inhibition of HPV- 16 DNA amplification in cervicovaginal lavages. J Med Virol. 2004 Jan; 72(1): 132-7.）。他の研究は、特異なプライマー対が、ＰＣＲ阻害剤によって均一に感染されないことを証明している（Bezold et al., Detection of herpes simplex virus and varicella-zoster virus in clinical swabs: frequent inhibition of PCR as determined by internal controls, Moｌ Diagn. 2000 Dec; 5(4):279-84）。結果として、ＨＰＶ ＰＣＲの阻害剤のためのスクリーニングは、必須である。
【００１２】
従って、本発明の根底にある技術問題は、種々のヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）遺伝子型、並びに特に前記に挙げられているような欠点を有さない高リスク及び推定上高リスク遺伝子型を効率的及び容易に検出及び診断するための手法及び方法の提供として見出されてもよい。前記の技術問題は、以下の請求項及び本明細書において特徴付けられた実施態様によって解決される。
【００１３】
従って、本発明は、オリゴヌクレオチド混合物を含有する組成物に関し、その際、該オリゴヌクレオチド混合物は、（ａ）配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２において示されるような核酸配列を有するオリゴヌクレオチド、又は（ｂ）（ａ）のオリゴヌクレオチドによって増幅される特にポリヌクレオチドを増幅することができるオリゴヌクレオチドを含有する。
【００１４】
本明細書で意味されるような"オリゴヌクレオチド混合物"という用語は、種々のヌクレオチド分子種の混合物に関する。さらに、該混合物は、オリゴヌクレオチド以外の構成成分、例えば有利にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による粘膜のＨＰＶ遺伝子型のポリヌクレオチドの増幅のための構成成分を含有してよい。かかる構成成分は、制限されることなく、水性緩衝液、水溶性マグネシウム塩、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、及びデオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、並びにＤＮＡポリメラーゼ、例えばサームス・アクアティカス（好熱菌）（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）からの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであってよい。
【００１５】
本明細書において使用されるような"オリゴヌクレオチド"という用語は、オリゴヌクレオチド分子種に関し、その際、分子種の全ての分子は、特異的な核酸配列を有する。有利には、"オリゴヌクレオチド"という用語は、ＤＮＡ増幅技術、例えばＰＣＲのためのプライマーに関する。オリゴヌクレオチドは、標的のポリヌクレオチドの配列伸長に特異的に結合するために十分である多数のヌクレオチドを含有するものとする。有利には、本発明において意味されるようなオリゴヌクレオチドは、長さ１５〜３０ヌクレオチド、より有利には、長さ１８〜２８ヌクレオチド、及び最も有利には長さ２３〜２５ヌクレオチドを有する。有利には、オリゴヌクレオチドの配列は、退化しない。有利には、オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴデゾキシリボ核酸である。しかしながら、自己相補性によって、オリゴヌクレオチドは、ある条件下で（例えば、オリゴヌクレオチドの配列、塩濃度及び温度に依存して）部分的に二本鎖であってよい。有利には、好ましいオリゴヌクレオチドは、前記に言及される特異的な配列及び／又は性質を有する。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、有利には、適切な増幅技術によって、有利にはＰＣＲによって、ポリヌクレオチドに関してコピーされるべき核酸鎖に十分に相補的であるポリヌクレオチドの合成のための出発分子として使用される。本発明のオリゴヌクレオチド混合物は、少なくとも１つの上流（ｆｏｒｗａｒｄ）の、及び少なくとも１つの下流（ｂａｃｋｗａｒｄ）のヌクレオチドを含有するものとする。上流及び下流のオリゴヌクレオチドは、しばしば、上流及び逆オリゴヌクレオチドと、又は５’及び３’オリゴヌクレオチドとも言われる。合成されたポリヌクレオチドは、例えば、オリゴヌクレオチド配列と標的ポリヌクレオチドの配列伸長との間のミスマッチによって、コピーされた標的配列に１００％相補的でなくてよいことが解されるべきである。
【００１７】
有利には、本発明によるオリゴヌクレオチドは、ＨＰＶゲノムの２つの特異的なＬ１コンセンサス領域の１つを標的とする。これらの特異的な領域は、種々の公知の粘膜ＨＰＶ遺伝子型の間で高く（しかし１００％でない）保存され、かつ例えばＷＯ ９５／２２６２６号において開示されており、参照をもって完全に本明細書に組み込まれたものとする。ＧＰ５＋オリゴヌクレオチド（配列表番号：１において示されるような配列）及びＧＰ６＋オリゴヌクレオチド（配列表番号：２において示されるような配列）が、それらの領域を標的とすることは、当業者によく知られている。ＷＯ ９５／２２６２６号におけるＧＰ５＋及びＧＰ６＋オリゴヌクレオチドを有する粘膜ＨＰＶのアライメントは、表１（実施例１）において見出されうる。前記に言及されているような種々のヒトパピローマウィルスの保存された２つのＬ１領域の１つを標的とするために、本発明のオリゴヌクレオチドは、該領域に相補的であるとする。しかしながら、前記のヌクレオチドが、前記の領域に対して１００％相補的である必要がない、すなわちいくつかのミスマッチが生じてよいことが解されるべきである。標的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力は、Ｔｍ（融解温度）によって評価されてよい。Ｔｍは、二本鎖核酸鎖の５０％が、一本鎖に分離される温度である。前記の配列に加えて、Ｔｍは、環境条件（例えば塩濃度）にも依存し、かつ経験的に決定されてよく、又は好適なコンピューターソフトウェア（Le Novere, MELTING, computing the melting temperature of nucleic acid duplex. Bioinformatics. 2001 Dec;17(12):1226-7）を使用することによって推定されてよい。一般に、Ｔｍが高くなればなるほど、二本鎖構造が好適になる。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、標識されてよく、又は増幅生成物及び／もしくはキャリヤーへの結合の検出並びに／又は解析を可能にする他の改質を含んでよい。標識付けは、当業者によく知られている種々の技術によって行われることができ、かつ使用されるべき標識に依存しうる。特に、オリゴヌクレオチドは、増幅生成物のストレプトアビジン表面又は蛍光複合体への結合を可能にするためにビオチン化されてよい。さらに、本発明の記載内容において使用されるべき標識は、制限されることなく、とりわけ、蛍光色素、例えばＲ−フィコエリトリン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ又はＴｅｘａｓ Ｒｅｄを含有する蛍光標識であってよい。しかしながら、前記の標識は、酵素又は抗体であってもよい。標識として使用されるべき酵素は、基質と反応することによって検出可能なシグナルを生じることが認識される。好適な酵素、基質及び技術は、当業者によく知られている。標識として使用されるべき抗体は、直接（例えば、それ自身蛍光である標的分子）又は間接的に（例えば、検出できるシグナルを生じる標的分子、例えば酵素）、検出されることができる標的分子を特に認識してよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、５’制限部位、ロックされた核酸分子（ＬＮＡ）を含有してもよく、又はペプチド核酸分子（ＰＮＡ）の一部であってもよい。かかるＰＮＡは、原則として、例えば抗体によってペプチド部分を介して検出されうる。
【００１９】
有利には、本発明のオリゴヌクレオチド混合物は、配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２において示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含有しうる。
【００２０】
さらに、本発明は、オリゴヌクレオチド混合物を含有する組成物にも関し、その際、該オリゴヌクレオチド混合物は、配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２において示されるような核酸配列を有するオリゴヌクレオチドによって増幅されたポリヌクレオチドを特に増幅することができるオリゴヌクレオチドを含有する。オリゴヌクレオチド混合物は、下流及び上流のオリゴヌクレオチド、有利には１つ以上の下流のオリゴヌクレオチド及び１つ以上の上流のオリゴヌクレオチド、より有利には、３つの下流のオリゴヌクレオチド及び９つの上流のオリゴヌクレオチドを含有することが理解されるべきである。オリゴヌクレオチド混合物中に含まれるオリゴヌクレオチドの配列は、検出されるべき粘膜のヒトパピローマウィルスのＬ１領域の２つの逆配列を比較／アライメントすることによって決定されうる（表１、実施例を参照）。アライメント後に、オリゴヌクレオチドの配列は、次の基準で決定してもよい：１）１つのオリゴヌクレオチドにおいて、検出されるべきあらゆるＨＰＶ遺伝子型の逆配列に関する３つのミスマッチまで、従って、ミスマッチなし、１つのミスマッチ、２つのミスマッチ、３つのミスマッチ、その際、有利には、該ミスマッチは、オリゴヌクレオチドの５’末端に近く、かつ３つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドは、該ヌクレオチドの３’末端と、それぞれのオリゴヌクレオチドの３’末端に最も近いミスマッチとの間の少なくとも５つの完全なミスマッチのヌクレオチドを有し、又は２）対応するオリゴヌクレオチド対において、すなわち上流及び下流のオリゴヌクレオチドにおいて、５つのミスマッチまで、従ってミスマッチなし、１つのミスマッチ、２つのミスマッチ、３つのミスマッチ、４つのミスマッチ、又は５つのミスマッチ（例えば、上流のプライマーにおいて４つのミスマッチがある場合に、対応する下流のプライマーにおけるミスマッチ数は、１つのミスマッチを超えてはならない）、その際４つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドの３’末端とそれぞれのオリゴヌクレオチドの３’末端に最も近いミスマッチとの間の少なくとも８つの完全なミスマッチのヌクレオチドを有する。
【００２１】
本発明によって、オリゴヌクレオチド混合物を含有する組成物も含まれ、その際、該オリゴヌクレオチドは、配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２において示されるような核酸配列を有し、かつ１つ以上、有利には２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つの該オリゴヌクレオチドが、消失、置換及び／又は付加されている。本発明の組成物に添加されてよい、かつ／又は本発明のオリゴヌクレオチド（配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２において示されるような核酸配列を有する）のあらゆる１つを置換してよいオリゴヌクレオチドの配列は、有利には、前記のような判断基準を適用することによって決定されてよい。従って、該オリゴヌクレオチドは、配列表番号：１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２において示されるような核酸配列を有してよい。従って、本発明による組成物は、オリゴヌクレオチド混合物を含有してもよく、その際該オリゴヌクレオチド混合物は、（ａ）配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２において示されるような核酸配列を有するオリゴヌクレオチド、又は（ｂ）（ａ）のオリゴヌクレオチドによって増幅されたポリヌクレオチドを特に増幅することができるオリゴヌクレオチドを含有する。
【００２２】
オリゴヌクレオチド混合物における本発明のオリゴヌクレオチドの量及び／又は濃度は、適切と考えられるあらゆる量又は濃度であってよい。該オリゴヌクレオチド混合物は、上流のオリゴヌクレオチド及び下流のオリゴヌクレオチドの種々の量を含有してよい（本発明の実施態様において使用されてよい上流及び下流のオリゴヌクレオチドのリストに関して、実施例１を参照）。例えば、オリゴヌクレオチド混合物は、ＨＰＶ ＤＮＡ又はＲＮＡの増幅のための３つの上流のオリゴヌクレオチド及び９つの下流のオリゴヌクレオチドを含有してよい。従って、本発明の個々のオリゴヌクレオチドの量及び／又は濃度は異なってよく、かつ、従って、該オリゴヌクレオチドを含有する溶液は、オリゴヌクレオチドに関して等モルでなくてよい。ポリヌクレオチドの増幅に好適な溶液中でのオリゴヌクレオチドの好ましい濃度は、実施例において見出されうる。それぞれの上流のオリゴヌクレオチドの特に好ましい濃度は、それぞれの下流のオリゴヌクレオチドに関して０．２μＭ及び０．４μＭである。さらに、当業者は、ＨＰＶ特異性ヌクレオチドの増幅を最適化するために、及び従って無造作に診断の感受性及び特異性を最適化するために、本発明のオリゴヌクレオチドの濃度を調整することができることを理解すべきである。
【００２３】
有利には、本発明の組成物によって含まれるオリゴヌクレオチド混合物は、種々の粘膜のＨＰＶ遺伝子型の、特に高リスクＨＰＶ遺伝子型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３及び８２、推定上高リスクＨＰＶ遺伝子型２６、５３及び６６、並びに低リスクＨＰＶ型６、１１及び７０の検出を可能にする。
【００２４】
有利には、オリゴヌクレオチド混合物を含有する組成物が、十分な検出のため、及び従って目的の試料における粘膜のＨＰＶ遺伝子型を診断するために要求されることが、本発明を基礎とする研究において見出されており、その際、該オリゴヌクレオチド混合物は、（ａ）配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２において示されるような核酸配列を有するオリゴヌクレオチド、又は（ｂ）（ａ）のオリゴヌクレオチドによって増幅されるポリヌクレオチドを特に増幅することができるオリゴヌクレオチドを含有する。特に、オリゴヌクレオチド混合物を含有する組成物の使用は、多数の粘膜のＨＰＶ遺伝子型が、先行技術よりも高い感受性を有する試料中で同時に検出されうるように、先行技術よりも確実であることが示されており、その際、該オリゴヌクレオチド混合物は、配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２において示されるような核酸配列を有するオリゴヌクレオチド（すなわち、ＨＰＶゲノムのＬ１領域において相対的に保存された配列に方向付けられるオリゴヌクレオチド）を含有する（実施例を参照）。本発明に基づく研究において、ＨＰＶ型６、１１、１６、１８、２６、３０、３１、３３、３５、３９、４２、４３、４４、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６７、６８（亜型Ａ及びＢ）、６９、７０、７３、８２（ＩＳ３９及びＭＭ４を含有する）が、検出された。本発明の組成物を使用する場合に、ＧＰ５＋／ＧＰ６＋ＨＰＶ検出系によって不十分に検出されることが公知であるＨＰＶ遺伝子型、例えばＨＰＶ３０、３９、４２、４４、５１、５２、５３、６８、７３、及び８２を再現性良く検出することさえできる。追加のＨＰＶ遺伝子型（他の試験された遺伝子型）が、前記の組成物を使用する場合に検出されてよいことも理解されるべきである。さらに、外因性調整ポリヌクレオチド（ＨＰＶ ＰＣＲ阻害剤のためのスクリーニングを可能にする）、及び内因性調節ポリヌクレオチドの増幅のためのオリゴヌクレオチド、例えば既に試料によって含まれるＤＮＡは、本発明の組成物中に含まれた。驚くべきことに、外因性調節ポリヌクレオチド、及び内因性ポリヌクレオチドの増幅のためのオリゴヌクレオチドの使用は、ＨＰＶ遺伝子型の検出に著しく影響を及ぼす。これは、特に、ＨＰＶ感染及びＤＮＡの質の同時モニタリングに有益であり、かつ偽陰性の結果があってよい。通常の外部のＤＮＡの質調整と比較して、それらのアプローチは、時間及び費用の集約がほとんどなく、ＰＣＲ阻害剤のためのスクリーニングを可能にし、かつそれによってＨＰＶ ＰＣＲの欠陥を監視する。先行技術は、粘膜のＨＰＶ遺伝子型の、並びにＧＰ５＋／ＧＰ６＋オリゴヌクレオチドを使用した場合に外因性調節ポリヌクレオチドの及び内因性調節ヌクレオチドの、有効な同時の増幅（単管中で）を教示していない。従って、本発明による組成物及び方法は、適用される場合に、早く、より信頼でき、及びシグナルの経済的な診断、並びに種々のＨＰＶ遺伝子型での、特に高リスク遺伝子型での多重感染を可能にするような、健康システムに非常に有益である。
【００２５】
ＨＰＶのウィルス量は、子宮頸癌の発展における重要な役割を果たしていると考えられる（Snijders, P. J., C. J. Hogewoning, A. T. Hesselink, J. Berkhof, F. J. Voorhorst, M. C. Bleeker, and C. J. Meijer. 2006. Determination of viral load thresholds in cervical scrapings to rule out CIN 3 in HPV 16, 18, 31 and 33-positive women with normal cytology. Int J Cancer 119:1102-7）。有利には、本発明の組成物は、本明細書において記載されているような種々のＨＰＶ遺伝子型の検出を可能にするだけでなく、該組成物が、試料における種々のＨＰＶ遺伝子型のウィルス量のための測定も可能にする。特に、本発明の組成物を使用することによって増幅された増幅生成物は、種々のハイブリダイゼーションシグナルの強度を評価することによって定量された。観測されたハイブリダイゼーションシグナルの強度は、ＨＰＶ感染の重症度に、及び従ってウィルス量に関連することが示された。例えば、ＨＳＩＬ（高グレードの扁平上皮内病変）、すなわちＨＰＶ感染のより重症型に選別された試料に関するハイブリダイゼーションシグナルの中間強度は、ＮＩＬＭ（上皮内病変ではない、ＨＰＶ感染の軽症型、実施例、並びに図３及び図４を参照）に選別された試料の中間強度のおよそ１０倍であった。従って、本発明の組成物は、ＨＰＶ感染の軽症型と重症型とを識別することも可能にし、かつ従って、ＨＰＶ感染の重症度を評価する。診断の感受性及び特異性は、本発明の組成物が、内因性調整ポリヌクレオチド（内因性調整という用語の性つめ胃に関しては、以下を参照）の増幅のためのオリゴヌクレオチドをさらに含有する場合に、さらにより高められうる。特に、オリゴヌクレオチドは、ヒトベータグロビン遺伝子を特に増幅する組成物中に含まれた（オリゴヌクレオチドの配列は、配列表番号：１３及び配列表番号：１４において示される）。内因性調整遺伝子の増幅は、高いウィルス量を有する試料において抑制されることが示された（ＨＰＶ感染のより重症型を示す）。従って、大量のウィルスＤＮＡを有する使用において、増加された強度のハイブリダイゼーションシグナルが、ＨＰＶに関して観察されたが（低いウィルス量を有する試料のハイブリダイゼーションシグナルと比較して）、内因性調整に関するハイブリダイゼーションシグナルの強度は、低減された（低いウィルス量を有する試料のハイブリダイゼーションシグナルと比較して）。従って、増加されたＨＰＶポリヌクレオチドの量と、内因性調整ＤＮＡに関する増幅された生成物の量との比を計算することによって、種々のＨＰＶ遺伝子型、有利には高リスクＨＰＶ遺伝子型での感染の重症度を測定することができる。
【００２６】
本発明の組成物は、有利には、内因性調整ポリヌクレオチド配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドをさらに含有する。
【００２７】
本明細書における意味として"内因性調整ポリヌクレオチド配列の増幅のためのオリゴヌクレオチド"という用語は、試料によって含まれる内因性調整ポリヌクレオチド配列を特に増幅するオリゴヌクレオチドに関する。当業者は、かかるオリゴヌクレオチドが、例えば鋳型核酸の、及び従って試料の質を推定するためのＰＣＲ反応混合物における正の制御として含まれうることを知っていた。"試料"という用語は、この適用における他の場合に規定される。さらに、ＰＣＲ反応を構成する場合に生じるエラーは、場合により内因性調整ポリヌクレオチド配列を特に増幅するオリゴヌクレオチドを使用することによって評価される。内因性調整ポリヌクレオチドの効率的な増幅は、有利には、増幅反応が成功し、かつ十分な品質のＤＮＡであったことを示すのに対し、非効率な増幅は、有利には、増幅反応が、不適切な試料及びＰＣＲ構成におけるエラーによって成功しなかったことを示す。後者の場合において、ＰＣＲ反応が、例えば新たに得られた使用及び新たに精製されたＤＮＡ又はＲＮＡで繰り返されるべきであってよい。従って、内因性調整ポリヌクレオチド配列を特に増幅するオリゴヌクレオチドの使用は、偽陰性の結果を妨げてよい。
【００２８】
有利には、内因性調整ポリヌクレオチド配列を特に増幅するオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヒトのポリヌクレオチド配列を増幅する。それというのも、本発明の記載内容において分析されるべき試料が、ヒトから得られた試料であるからである（以下を参照）。内因性調整ポリヌクレオチド配列は、被験者の試料中に既に存在する内因性ポリヌクレオチドの配列又は配列伸長である。内因性調整ポリヌクレオチド配列は、有利には、β−グロビン、ＧＡＰＤＨ、アクチン及びユビキチンＣからなる群から選択された遺伝子のポリヌクレオチド配列である。内因性調整ポリヌクレオチドは、ヒトゲノムの"１コピー"ポリヌクレオチド、すなわち一度だけ単相ヒトゲノムに存在する配列であってよく、又はオリゴヌクレオチドは、多コピー領域に方向付けられてもよい。内因性調整ポリヌクレオチド配列の増幅に好適なヌクレオチドに関する例は、例えばＰＣＲによって、ヒトβ−グロビン核酸配列の一部分の増幅を可能にするオリゴヌクレオチドである。有利には、増幅されたポリヌクレオチド内因性調節配列は、前記に挙げられたような種々のＨＰＶ遺伝子型のＬ１領域の増幅されたポリヌクレオチド配列よりも著しく短く又は長くなく、より有利には、増幅されたポリヌクレオチド内因性調整配列は、１５０〜３００ｂｐ、最も有利には１８０〜２２０ｂｐの長さを有する。内因性調整ポリヌクレオチド配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドの使用が、有利には、同様のアッセイで（例えば同様の管又は容器中で）実施された他のＰＣＲ増幅の増幅効率に著しく影響を及ぼさず、例えばプライマー二量体及びプライマーにおけるヘアピン構造の形成が、妨げられるべきである。当業者は、内因性調整ポリヌクレオチドの増幅のためのオリゴヌクレオチドの使用が、同様のアッセイで実施されたポリヌクレオチドの増幅の増幅効率に著しく影響を及ぼすかどうかを決定する方法（例えば、内因性調整ポリヌクレオチド配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドで、又は該オリゴヌクレオチドなしで本発明による組成物を使用する増幅反応を実施することによって、及び従って得られた増幅生成物を定量化することによって）を知っている。
【００２９】
最も有利には、内因性調整ポリヌクレオチド配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドは、配列表番号：１３及び／又は配列表番号：１４において示されるような核酸配列を有する。
【００３０】
さらに、本発明の組成物は、有利には、さらに外因性調整ポリヌクレオチドを含有する。
【００３１】
本明細書において使用されるような"外因性調整ポリヌクレオチド"という用語は、被験者の試料中で天然に生じず、かつ従って該試料と無関係であるポリヌクレオチドに関する。"試料"という用語は、この適用における別の場合に規定される（下記参照）。外因性調整ポリヌクレオチドは、付加され、かつ従って、本発明の組成物によって含有され、かつＨＰＶ特異性ポリヌクレオチドの増幅の効率に関する調整として提供する。有利には、外因性調整ポリヌクレオチドが、本発明によるオリゴヌクレオチド混合物によって（例えば配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２において示されるような核酸配列を有するオリゴヌクレオチドによって）、増幅、例えば同時に増幅されうる。有利には、外因性調整ポリヌクレオチドの核酸配列が、ＨＰＶ配列に関連しない内側のポリヌクレオチド領域、並びに配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２において示されるような核酸配列を有するオリゴヌクレオチドによって標的とされうる２つの外側のポリヌクレオチド領域（５’から内側のポリヌクレオチド領域の１領域、及び３’から内側のポリヌクレオチド領域の１領域）を含む。前記の外側の領域は、本発明のオリゴヌクレオチド混合物を使用する場合に外因性調整ポリヌクレオチド配列の増幅を可能にする。内側のポリヌクレオチド領域は、有利には、増幅されたＨＰＶ特異性ポリヌクレオチドから認識されうることを提供された、増幅された内因性調整ポリヌクレオチドからのあらゆる配列であってよい（すなわち、増幅されたＨＰＶ及びそれらのポリヌクレオチドの検出を妨げてよい内因性調整ポリヌクレオチドに類似する重要な配列を示さない）。当業者は、前記の内側のポリヌクレオチド領域の配列を決定することができる。有利には、外因性調整ポリヌクレオチドは、本願明細書において挙げられるように増幅されたＨＰＶポリヌクレオチド配列よりも著しく短い又は長くなく、より有利には、増幅されたポリヌクレオチドの外因性調整配列は、１００〜１８０ｂｐ、より有利には１２０〜１６０ｂｐの長さを有する。有利には、外因性調整ポリヌクレオチドの増幅は、ＨＰＶ遺伝子型の型特異的検出に影響を及ぼさない。有利には、外因性調整ポリヌクレオチドは、外因性調整ポリヌクレオチド配列に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブの使用によって検出されうる。より有利には、外因性調整ポリヌクレオチドは、外因性調整ポリヌクレオチド配列の内側のポリヌクレオチド配列に特異的であるオリゴヌクレオチドプローブの使用によって、及び従って外側のポリヌクレオチド領域（前記に挙げられるような）を標的としないオリゴヌクレオチドもしくはあらゆる配列の増幅されたＨＰＶポリヌクレオチドの、又は内因性調整ポリヌクレオチドの使用によって検出されうる。外因性調整ポリヌクレオチドは、適切だと思われるあらゆる方法によって製造されてよく、例えば合成ポリヌクレオチド、例えば化学的に合成されたポリヌクレオチドであってよい。さらに、前記の外因性調整ポリヌクレオチドは、プラスミド中に存在してよい。外因性調整ポリヌクレオチドを製造する方法は、実施例において示されている。外因性調整ポリヌクレオ��ドの使用は、特に、ＰＣＲ阻害剤が診断試料中に存在する場合に、及びエラーが別の方法で検出されない偽陰性の結果を導いてよいＰＣＲ反応の構成中に生じる場合に、特に有益である。外因性調整ポリヌクレオチドの効率的な増幅は、有利には、ＨＰＶ増幅反応が成功したことを示すのに対し、非効率な増幅は、有利には、ＨＰＶ増幅反応が、例えば阻害剤及び／又はＰＣＲ反応におけるエラーによって成功しなかったことを示す。従って、外因性調整ポリヌクレオチドの効率的な増幅は、より有利には、本発明のオリゴヌクレオチド混合物を使用する増幅反応のために得られた結果が、種々のＨＰＶ遺伝子型の確実な診断を可能にしてよいことを示す。外因性調整ポリヌクレオチドは、ＨＰＶ特異性ポリヌクレオチドの効率的な増幅を可能にする量で、存在するＨＰＶ感染を診断するための感受性を著しく低減することなく、本発明の組成物によって含有されることを解すべきである。本発明の組成物中での外因性調整ポリヌクレオチドの好ましい濃度は、あらゆる不適当な実験で当業者によって、例えば、外因性調整ポリヌクレオチドの種々の希釈で増幅反応を実施することによって決定されうる。
【００３２】
最も有利には、外因性調整ポリヌクレオチドは、配列表番号：１５において示されるような核酸配列を有する。
【００３３】
さらに、本発明は、被験者の試料における種々のＨＰＶ遺伝子型を診断するための本発明の組成物の使用に関し、その際該組成物は、さらに、ＤＮＡの質調整としての内因性ポリヌクレオチド、及び／又は内部ＰＣＲ調整としての外因性ポリヌクレオチドの増幅のためのオリゴヌクレオチドを含有してよい。
【００３４】
"種々のＨＰＶ遺伝子型"という用語は、少なくとも１つのＨＰＶ遺伝子型、例えば、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０以上の遺伝子型に関する。本発明の記載内容において診断されてよいＨＰＶ遺伝子型は、有利には、アルファ属の粘膜ＨＰＶ遺伝子型６、１１、１３、１６、１８、２６、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３９、４２、４３、４４、４５、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６１、６２ｃ、６４、６６、６７、６８（亜型Ａ及びＢ）、６９、７０、７１  ７２、７３、７４、８１、８２（ＩＳ３９及びＭＭ４を含有する）、８３、８４、８５ｃ、８６ｃ、８７ｃ、８９ｃ／Ｃｐ６１０８、９０ｃ、９７、１０２及び１０６、アルファ属の皮膚ＨＰＶ遺伝子型２、３、７、１０、２７、２８、２９、４０、５７、７７、９１ｃ及び９４、より有利には６、１１、１３、１６、１８、２６、３０、３１、３２、３３、３５、３９、４２、４３、４４、４５、５１、５２、５３、５４、５６、５８、５９、６６、６７、６８（亜型Ａ及びＢ）、６９、７０、７２、７３、８２（ＩＳ３９及びＭＭ４を含有する）、８９ｃ／Ｃｐ６１０８、並びに最も有利には推定上高リスクＨＰＶ遺伝子型２６、５３、６６、及び高リスクＨＰＶ遺伝子型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３及び８２である。有利には、種々のＨＰＶ遺伝子型が、同時に診断される。種々のＨＰＶ遺伝子型の診断及び／又は測定は、種々のＨＰＶ遺伝子型に特異的な、及び本発明による組成物の使用によって得られる増幅されたポリヌクレオチドを同定することによって行われる（明細書において他の場所に記載されている）。有利には、ＨＰＶ遺伝子型−特異性ポリヌクレオチドの増幅、及び／又は種々のＨＰＶ遺伝子型の測定は、同時に、より有利には同一の容器中で（従って同一の溶液中で）実施される。
【００３５】
さらに、本発明は、
ａ）種々のＨＰＶ遺伝子型を含む疑いのある被験者の試料と本発明の組成物とを、ポリヌクレオチドの増幅を可能にする条件下で接触する工程、及び
ｂ）工程ａ）において得られた増幅されたポリヌクレオチドを基礎とする種々のＨＰＶ遺伝子型を決定する工程
を含む、被験者の試料における種々のＨＰＶ遺伝子型を診断するための方法に関する。
【００３６】
本発明の方法は、有利には、生体外法である。さらに、本発明の方法は、明確に前記で挙げられている工程に加えた工程を含んでよい。例えば、他の工程は、試料の前処理、又は該方法によって得られた結果の評価に関してよい。本発明の方法は、少なくとも１つのＨＰＶ遺伝子型での感染をモニタリング又は確認するために使用されてもよい。該方法は、手動で実施され、又は自動化によって補助されてよい。有利には、工程（ａ）及び／又は（ｂ）は、全体で又は一部分、自動化によって、例えば工程（ｂ）において決定するための好適なロボット及び感覚装置によって補助されてよい。
【００３７】
本明細書において使用される"診断"という用語は、被験者が、疾患、感染又は本明細書で言われる状態に、有利には種々のＨＰＶ遺伝子型での感染にかかっている、又はかかるであろう確率を評価することを言う。当業者によって理解されるべきであるように、かかる評価が、通常、診断されるべき被験者の１００％に関して正確であることを意図しない。しかしながら、前記の用語は、被験者の統計上有意な部分が、疾患又は状態に苦しむことを正確に診断されうることを要求する。一部分が統計上有意であるかどうかは、種々のよく知られている統計学的評価ツール、例えば信頼区間の決定、ｐ−値決定、スチューデントｔ検定、マン−ホイットニー検定等を使用して、無造作に当業者によって決定されうる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983において見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％である。ｐ−値は、有利には、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、又は０．００１である。有利には、本発明によって予想された確率は、診断が少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の与えられたコホート又は集団の被験者に関して正確であることを認める。
【００３８】
本明細書において使用されるような"被験者"という用語は、ヒトの年齢、性別又は亜集団にかかわらずヒトに関連する。しかしながら、該被験者が、本明細書における他の場所で記載されているようなＨＰＶ感染にかかってよいことが、本発明によって予想される。さらに、本発明に従って言われる被験者は、有利には、１つ以上の種々のＨＰＶ遺伝子型、有利には種々の粘膜ＨＰＶ遺伝子型、より有利には種々の高リスクＨＰＶ遺伝子型を含有することを疑われた被験者、又はＨＰＶ感染に関連した症状をさらに発達させない被験者、すなわち症状的に健康である被験者である。被験者は、例えば陽性のＰａｐ試験によって又は種々のＨＰＶ遺伝子型を含有する被験者との性的接触によって、少なくとも１つのＨＰＶ遺伝子型を含むことが疑われてよい。該被験者は、男性又は女性であってよい。有利には、該被験者は女性である。
【００３９】
本記載内容において"ＨＰＶ遺伝子型を含有する"という用語は、ＨＰＶ遺伝子型に感染しているものとする。
【００４０】
本明細書において使用される"ポリヌクレオチド増幅を可能にする条件下"という用語は、当業者によって理解される。ポリヌクレオチド増幅という用語は、その最初の量に関して核酸分子の量の増加をもたらす鋳型依存法に関連する。本発明に従って、目的のポリヌクレオチドの増幅は、適切だと考えられている、及び／又は例えば本明細書において以下に記載されているあらゆる方法によってその検出を可能にするものとする。目的のポリヌクレオチドの増幅は、よく知られている方法によって、有利にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施されてよいが、しかし、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、及びプライマーとしてポリメラーゼ及び特異的オリゴヌクレオチドを使用する等温増幅方法によってでもよい。ＰＣＲ法は、当業者によく知られている。本発明の記載内容においてＰＣＲの好ましい実施態様は、実施例において記載されている。さらに、ＰＣＲを実施するために要求される構成は、本記載内容において前記に記載されている。当業者は、例えばｄＮＴＰ、鋳型、オリゴヌクレオチド、もしくは鋳型濃度を調整することによって、種々の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、ＰＣＲサイクルプログラムを調整することによって（例えばアニーリング温度、ランプ速度（ｒａｍｐｉｎｇ ｒａｔｅ）を調整することによって）、十分な量のそれぞれの増幅生成物を増幅するためのＰＣＲプロトコルを最適化する方法を知っている。ＰＣＲによる増幅は、擬陽性の結果を生じてよい鋳型又は反応混合物全体のあらゆる他の成分の汚染を妨げる条件下で実施される。本記載内容における"汚染"という用語は、十分に理解されている。当業者は、試料の汚染を妨げる基準をとる方法を知っている。
【００４１】
"試料"という用語とは、体液の試料を、分離細胞の試料を、又は組織もしくは器官からの試料を、又は外側もしくは内側の体表面から得られた洗浄／すすぎ液の試料を言う。該試料はポリヌクレオチドを含有し、有利には該試料はＤＮＡを含有する。試料は、よく知られている技術によって得られることができ、かつ有利には尿生殖路、肛門周辺領域、肛門管、口腔、上部気道消化管及び表皮からの断片又は生検を含む。かかる試料は、ブラシ、（綿の）綿棒、スパチュラ、すすぎ／洗浄液、パンチ生検装置、針又は手術器具での腔の穿刺の使用によって得られうる。有利には、その断片は、粘膜細胞を含有する。しかしながら、血液、血漿、血清、尿、唾液、涙液、便の試料は、本発明の方法によっても含まれる。組織又は器官試料は、例えば生検又は他の手術法によって、あらゆる組織又は器官から得られてよい。分離細胞は、分離技術、例えば濾過、遠心分離もしくは細胞選別によって体液又は組織もしくは器官から得られてよい。有利には、細胞、組織又は器官の試料は、公知であり、又はアルファ属ＨＰＶ遺伝子型、より有利には粘膜ＨＰＶ遺伝子型の疑いのある標的である細胞、組織又は器官から得られ、かつ従って、ＨＰＶ特異的ポリヌクレオチドを含有してよい。試料が、本発明の方法を実施するために、さらに処理されてよいことを理解すべきである。特に、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、有利にはＤＮＡは、当業者に公知の方法及び手段によって得られた試料から抽出及び／又は精製されてよい（例えば実施例を参照）。従って、試料という用語は、前記に挙げられたようなあらゆる試料から精製された及び／又は抽出された、ポリヌクレオチド、有利にはＤＮＡに関連してもよい。
【００４２】
"増幅されたポリヌクレオチドに基づく種々のＨＰＶ遺伝子型を決定すること"という用語は、種々の、個々のＨＰＶ遺伝子型に特異的である増幅されたポリヌクレオチドを同定することに関する（本明細書において別の場所に記載されている）。有利には、これは、検出されるべきＨＰＶ遺伝子型に特異的である増幅されたポリヌクレオチドの存在又は不在を検出することによって得られる。その結果に基づいて、診断されることができる。個々のＨＰＶ遺伝子型に特異的である増幅されたポリヌクレオチドが存在する場合に、その時それぞれのＨＰＶ遺伝子型での感染が、診断されうる。あるＨＰＶ遺伝子型に特異的であるポリヌクレオチドのために増幅生成物がない場合に（従って、増幅されたポリヌクレオチドがない場合に）、その時それぞれのＨＰＶ遺伝子型での感染は、診断されることができない。１つの高リスクＨＰＶ遺伝子型の１つ以上が、被験者の試料中で決定される場合に、該被験者は、子宮頸癌又は他のＨＲ−ＨＰＶ−関連癌の発達の危険があり、被験者の試料中で低リスクＨＰＶ遺伝子型のみが検出される又はＨＰＶ遺伝子型が全く検出されない場合に、該被験者は、有利には、子宮頸癌又は他のＨＲ−ＨＰＶ−関連癌の発達の危険性はない。本記載内容における他のＨＲ−ＨＰＶ−関連癌は、制限されることなく、食道癌、口腔癌、咽頭癌、陰茎癌、肛門周囲癌、外陰癌、喉頭癌、喉頭いぼ状癌、扁桃癌及び膣癌であってよい。好適な治療は、診断によって開始されてよい。治療の成功、すなわち感染した又は病気にかかった細胞もしくは組織の除去は、本発明の方法によって監視されてよい。
【００４３】
増幅されたポリヌクレオチドに基づいて種々のＨＰＶ遺伝子型を決定することは、当業者に公知のあらゆる方法によって行われ、かつ適切であると考えられうる。該決定は、個々の、増幅されたポリヌクレオチドの検出及び／又は同定に基づく。種々のＨＰＶ遺伝子型の検出／同定は、増幅されたポリヌクレオチドにおける遺伝子型の特定の配列の変種のために可能である。これは、種々の増幅された個々のポリヌクレオチド間の識別を可能にする。従って、増幅されたポリヌクレオチドの、及び従って種々のＨＰＶ遺伝子型の存在又は不在は、増幅生成物の同定を可能にする当業者に公知の方法及び手法によって評価されうる。これは、例えば、増幅生成物をシーケンスすることによって、及び得られた配列を公知のＨＰＶ配列と比較することによって行われてよい。さらに、生成物は、ゲル電気泳動によって、又はＲＦＬＰ（制限断片長多型）解析によって同定されてよい。さらに、増幅されたポリヌクレオチドは、増幅されたポリヌクレオチドにおける個々の遺伝子型配列に相補的であるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを含む方法によって決定されうる。かかるポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、実施例において、又は本明細書に参照をもって完全に組み込まれる、例えばSchmitt et al, Bead-Based Multiplex Genotyping of Human Papillomaviruses. 2006. J. Clin. Microbiol. 44(2): 504-512において、又はan den Brule et al., GP5+/6+ PCR followed by reverse line blot analysis enables rapid and high-throughput identification of human papillomavirus genotypes. 2002. J Clin Microbiol 40:779-87において記載されている。ハイブリダイゼーション、及びハイブリダイゼーションの発生の検出は、例えばサザンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイによって、又は膜を基礎とした逆ラインブロットによって、適切と考えられるあらゆる条件下であらゆる方法で実施されてよい（Melchers et al., Prevalence of genital HPV infections in a regularly screened population in The Netherlands in relation to cervical cytology. 1988. J Med Virol 25:11-6; van den Brule et al., GP5+/6+ PCR followed by reverse line blot analysis enables rapid and high-throughput identification of human papillomavirus genotypes. 2002. J Clin Microbiol 40:779-87; Melchers et al., Optimization of human papillomavirus genotype detection in cervical scrapes by a modified filter in situ hybridization test. 1989. J Clin Microbiol 27:106-10）。ＨＰＶ遺伝子型の特異的な増幅生成物の検出及び同定のための特に好ましい方法は、Schmitt et al. (loc. cit)において記載されているような、Multiplex HPV Genotyping（MPG）アッセイの改良である：ＨＰＶ遺伝子型の特的なプローブは、好適な、有利には厳しい条件下で増幅生成物とハイブリダイズされる蛍光標識されたポリスチレンビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ懸濁アレイ（suspension array）技術）に結合される。さらに、増幅生成物は、好適なキャリヤーに連結されるＨＰＶ遺伝子型の特異的なオリゴヌクレオチドを含有するＤＮＡチップの使用によって同定されてよい。さらに、内因性調整ポリヌクレオチド及び／又は外因性調整ポリヌクレオチドの増幅は、前記で挙げられた方法によって決定されてよい。
【００４４】
本発明の方法の文脈において使用される"接触"という用語は、当業者によって理解される。有利には、該用語は、物理的に本発明の組成物と試料とを接触すること、及びそれによって、例えば試料及び組成物を相互作用させることに関する。接触は、さらに、試料において存在する細胞を溶解すること、及び／又はＤＮＡもしくはＲＮＡの抽出又は精製を含んでよい。
【００４５】
前記のように、本発明の組成物は、有利には、試料中でのウィルス量を評価することも可能にする。従って、前記の方法は、有利には、さらに、種々のＨＰＶ遺伝子型のウィルス量を、該ＨＰＶ遺伝子型の種々の増幅されたポリヌクレオチドの量を測定することによって評価する工程を含む。
【００４６】
従って、本発明は、
ａ）種々のＨＰＶ遺伝子型を含有すると思われる被験者の試料と、本発明の組成物とを、ポリヌクレオチドの増幅を可能にする条件下で接触する工程、
ｂ）工程ａ）において得られた増幅されたポリヌクレオチドに基づいて種々のＨＰＶ遺伝子型を決定する工程、及び
ｃ）工程ａ）において得られた増幅されたポリヌクレオチドの量に基づいて工程ｂ）において決定された種々のＨＰＶ遺伝子型のウィルス量を評価する工程
を含む、被験者の試料における、種々のＨＰＶ遺伝子型を診断するための、及び種々の遺伝子型のウィルス量を評価するための方法にも関する。
【００４７】
有利には、試料中に存在する（及び、従って検出された遺伝子型の）ＨＰＶ遺伝子型に関するウィルス量のみが、評価される。より有利には、試料中に存在する高リスク遺伝子型のウィルス量のみを評価する。
【００４８】
本発明において使用される"ウィルス量"という用語は、被験者の試料におけるＨＰＶ ＤＮＡの量に関する。試料中に存在する特異的なＨＰＶ遺伝子型のウィルス量の評価は、有利には、種々のＨＰＶ遺伝子型に特異的である増幅されたポリヌクレオチドの量を測定することによって得られる。ポリヌクレオチドの量の測定のための方法は、当業者によく知られており、かつ例えば実施例において記載されている。ポリヌクレオチドの量の測定のための好ましい方法は、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＮＡＳＢＡ、又はＨｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、及びデンドリマーを含むシグナル増幅方法である。
【００４９】
ウィルス量を測定することによって、ＨＰＶでの感染の重症度が評価されうる。
【００５０】
従って、本発明は、被験者の試料において、種々のＨＰＶ遺伝子型を診断するための、及び種々のＨＰＶ遺伝子型でのＨＰＶ感染の重症度を評価するための方法に関する。有利には、該方法は、
ａ）種々のＨＰＶ遺伝子型を含有すると思われる被験者の試料と、本発明の組成物とを、（ＨＰＶ）ポリヌクレオチドの増幅を可能にする条件下で接触する工程、
ｂ）工程ａ）において得られた増幅されたポリヌクレオチドに基づいて種々のＨＰＶ遺伝子型を決定する工程、及び
ｃ）工程ｂ）において決定されたＨＰＶ遺伝子型の工程ａ）において得られた増幅されたポリヌクレオチドの量を測定する工程、
ｄ）工程ｃ）において測定された量を基準量と比較する工程、及び
ｅ）ＨＰＶ感染の重症度を評価する工程
を含む。
【００５１】
工程ｃ）〜ｅ）は、有利には、少なくとも１つのＨＰＶ遺伝子型が、被験者の試料中で検出される場合にのみ実施される。より有利には、工程ｃ）〜ｅ）は、少なくとも１つの高リスクＨＰＶ遺伝子型が、被験者の試料中で検出される場合にのみ実施される。さらにより有利には、工程ｃ）〜ｅ）は、少なくとも１つの高リスクＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、４５が、被験者の試料中で検出される場合に実施される。最も有利には、工程ｃ）〜ｅ）は、ＨＰＶ１６及び／又はＨＰＶ１８が、被験者の試料中で検出される場合に実施される。
【００５２】
本明細書で使用されるように、"ＨＰＶ感染の重症度の評価"という語句は、有利には、ＨＰＶ１６感染の重症型からＨＰＶ１６感染の軽症型までの分別に関する。当業者によって理解されるべきであるように、かかる評価が、通常、診断されるべき被験者の１００％に関して正確であることを意図しない。しかしながら、前記の用語は、被験者の統計上有意な部分が、正確に評価されうることを要求される。一部分が統計上有意であるかどうかは、種々のよく知られている統計学的評価ツール、例えば信頼区間の決定、ｐ−値決定、スチューデントｔ検定、マン−ホイットニー検定等を使用して、無造作に当業者によって決定されうる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983において見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％である。ｐ−値は、有利には、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、又は０．００１である。有利には、本発明によって予想された確立は、評価が少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の与えられたコホート又は集団の被験者に関して正確であることを認める。
【００５３】
本発明で意図される"ＨＰＶ感染の軽症型"は、有利には、通常の頸部組織としてもしくはＣＩＮ１（最小の又は軽症の子宮頸部異形性）として組織学的に分類され、又はＮＩＬ／Ｍ（上皮内病変又は悪性疾患に関する陰性）として、もしくはＬＳＩＬ（低グレードの扁平上皮内病変）として細胞学的に分類される、ＨＰＶ感染の型に関する。従って、ＨＰＶ感染の軽症型は、有利には良性の頸部病変を包含する。
【００５４】
本明細書で意図される"ＨＰＶ感染の重症型"は、有利には、ＣＩＮ２（中程度の頸部上皮性異形性）又はＣＩＮ３（重症の頸部異形性）又は癌性（原位置又は侵襲性）として組織学的に分類されるＨＰＶ感染の型に関する。従って、"ＨＰＶ１６感染の重症型"という用語は、有利には、ＨＳＩＬ（高グレードの扁平上皮内病変）又は癌性として細胞学的に分類されるＨＰＶ１６感染の型に関する。従って、ＨＰＶ感染の重症型は、有利には悪性の頸部病変を包含する。
【００５５】
本明細書で使用される"比較すること"という用語は、本発明の方法の工程ａ）において得られた増幅されたポリヌクレオチドの量と、本明細書における他の場所で記載された好適な基準源の量とを比較することを包含する。本明細書で使用されるような比較は、対応するパラメータ又は値の比較に関することを理解すべきである。有利には、試験試料の増幅されたポリヌクレオチドに関する強度シグナルは、基準試料の強度シグナルの同様の型と比較される。本発明の前記の方法の工程（ｄ）において参照される比較は、手動で又はコンピュータ支援で実施されてよい。コンピュータ支援の比較に関して、測定された量の値は、コンピュータプログラムによってデータベースで保存された好適な参照に対応する値と比較されてよい。コンピュータプログラムは、比較の結果、さらに評価され、すなわち好適な出力形式で所望の評価を自動的に提供してよい。工程ｃ）において測定された量と基準量との比較に基づいて、試験試料が得られる被験者におけるＨＰＶ感染の重症度を評価することができる。従って、基準量は、有利には、異なって又は同様に、比較される量において、被験者がＨＰＶ感染の軽症型又は重症型にかかっているかどうかを評価することが可能であるように選択されるべきである（ＨＰＶ感染の"軽症型"及び"重症型"という用語の説明は本明細書の他の場所で見出されうる）。
【００５６】
従って、本明細書で使用される"基準量"という用語は、被験者において、ＨＰＶ感染の重症度、有利には高リスク遺伝子型での感染の重症度の評価を可能にする量に関する。従って、基準は、（ｉ）ＨＰＶ感染の重症型にかかっていることが公知な被験者、又は（ｉｉ）ＨＰＶ感染の軽症型にかかっていることが公知な被験者から由来してよい。さらに、本発明の基準量は、閾値よりも大きい増幅されたポリヌクレオチドの量が、ＨＰＶ感染の重症型にかかっている被験者のための表示とするのに対して、閾値よりも低い量は、ＨＰＶ感染の軽症型にかかっている被験者のための表示とすることによって、閾量を定義してよい。好適な基準量は、試験試料と共に、すなわち同時に又は続けて、解析されるべき基準試料から、本発明の方法によって決定されてよい。有利には、試験試料及び基準試料のための測定としての量は、標準化される。
【００５７】
有利には、基準量よりも多いＨＰＶ感染の増幅されたポリヌクレオチドの量は、被験者が前記の遺伝子型を有するＨＰＶ感染の重症型にかかっていることを示す。
【００５８】
有利には、基準量よりも少ない増幅されたポリヌクレオチドの量は、被験者がＨＰＶ感染の軽症型にかかっていることを示す。
【００５９】
本発明の前記の方法の好ましい一実施態様において、ＨＰＶ感染の重症度の評価は、
ｉ）工程ａ）において得られた増幅されたＨＰＶポリヌクレオチドの量を測定する工程、
ｉｉ）増幅された内因性調整ポリヌクレオチドの量を測定する工程、
ｉｉｉ）工程ｉ）において測定された前記の増幅されたＨＰＶポリヌクレオチドの量と、工程ｉｉ）において測定された前記の増幅された内因性調整ポリヌクレオチドの量との比を計算する工程、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）において計算された比と基準比とを比較する工程、及び
ｖ）ＨＰＶ感染の重症度を評価する工程
を含む。
【００６０】
有利には、（ｉｉｉ）において計算された比は、増幅されたＨＰＶポリヌクレオチドの量（工程ｉ）において測定された）と、増幅された内因性調整ポリヌクレオチドの量（工程ｉｉ）において測定された）との比である。有利には、基準比よりも多い増幅されたポリヌクレオチドの量と増幅された内因性調整ポリヌクレオチドの量との比は、試料が解析された被験者が、ＨＰＶ感染の重症型にかかっていることを示す。有利には、基準比よりも少ない増幅されたＨＰＶポリヌクレオチドの量と増幅された内因性調整ポリヌクレオチドの量との比は、被験者が、ＨＰＶ感染の軽症型にかかっていることを示す。
【００６１】
有利には、増幅されたＨＰＶポリヌクレオチドの量と増幅された内因性調整ポリヌクレオチドの量との比を計算すること、及び該比と基準比とを比較することは、ＨＰＶ感染の重症度を評価することの感受性及び特異性の双方を高めることが、本発明を基礎とする研究において示されている（実施例８、並びに図３及び図４を参照）。特に、高いＨＰＶ量（ＨＰＶ感染のより重症型を示す）の存在で、内因性調整ポリヌクレオチドの増幅が低減されることが示されている。従って、試料中の増加されたウィルス量は、増幅されたＨＰＶポリヌクレオチドの増加された量、及び増幅された内因性調整ポリヌクレオチドの低減された量をもたらす。
【００６２】
さらに、本発明は、被験者の試料における種々のＨＰＶ遺伝子型の診断する、種々のＨＰＶ遺伝子型のウィルス量及び／又は種々のＨＰＶ遺伝子型での感染の重症度を評価するための本発明による組成物の使用に関する。
【００６３】
最終的に、本発明は、本発明の前記の方法のあらゆる１つを実施するためのキットを含み、その際該キットは、本発明による組成物を含む。
【００６４】
本明細書で使用される"キット"という用語は、前記の手法、例えば、有利には、別々に又はシグナル容器の中で提供される、ポリヌクレオチドの増幅及び増幅されたポリヌクレオチドに基づく種々のＨＰＶ遺伝子型の決定を可能にする条件下で試料を接触するための手法の収集に関する。前記容器は、有利には、本発明の方法を実施するための指示も含んでよい。キットの構成は、有利には、"すぐ使用できる"方法で提供され、例えば濃度が、それに応じて調整される。
【００６５】
本明細書に挙げられた全ての参照は、それらの全体の開示内容及び本明細書に明確に挙げられている開示内容に関して、参照をもって本明細書に組み込まれたものとする。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ＨＰＶ ＰＣＲ感受性に対するＨＰＶ共増幅の効果を示す図。
【図２】バックグラウンドＤＮＡの種々の量でのＨＰＶ８２増幅のためのＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲの解析感受性を示す図。
【図３】頸部の剥離された細胞におけるＨＰＶ１６のウィルス量を示す図。
【図４】頸部の剥離された細胞におけるＨＰＶウィルス量を示す図。
【００６７】
図は以下を示す。
【００６８】
図１  ＨＰＶ ＰＣＲ感受性に対するＨＰＶ共増幅の効果。ヒト胎盤（ＨＰ）−ＤＮＡ１００ｎｇ中で希釈したＨＰＶ１６、３９、６６及び８２プラスミドを、その後それぞれｂ−グロビンプライマーを有する（白）又は有さない（黒）広域スペクトルの一般的なプライマーＰＣＲ（ＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲ）と言われる、配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２及び１６を有するオリゴヌクレオチドで増幅した。点線は、陽性の仕切りである。ＨＰＶ：ヒトパピローマウィルス、ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応、ＭＦＩ：中央値蛍光強度。
【００６９】
図２  バックグラウンドＤＮＡの種々の量でのＨＰＶ８２増幅のためのＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲの解析感受性。ヒト胎盤（ＨＰ）−ＤＮＡの１００〜１０００ｎｇ中のＨＰＶ８２プラスミドの希釈系列を、それぞれｂ−グロビンの存在（白）及び不在（黒）で増幅した。点線は、陽性の仕切りである。ＨＰＶ：ヒトパピローマウィルス、ＭＦＩ：中央値蛍光強度、＋ｂｇ：同時のベータグロビン増幅、−ｂｇ：ベータグロビン増幅なし、ＨＰ：ヒト胎盤。
【００７０】
図３  頸部の剥離された細胞におけるＨＰＶ１６のウィルス量。"上皮内病変又は悪性ではない"（ＮＩＬ／Ｍ）として細胞学的に診断された７３試料、"意義不明の異型扁平細胞"（ＡＳＣＵＳ）を有する１６試料、"低グレードの扁平上皮内病変"（ＬＳＩＬ）を有する６試料、高グレードの扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）を有する６試料、及び扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）を有する５９試料から抽出されたＨＰＶ ＤＮＡを、ＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲによって増幅し、そして生成物を、本明細書に記載されているようにハイブリダイズした。ＨＰＶ１６陽性反応に関する中央値蛍光強度（ＭＦＩ）に与えられたハイブリダイゼーション強度を、細胞学的診断によって分類された箱形図として呈示した。ＨＰＶ１６値を赤で、ＨＰＶ１６とベータグロビンシグナルとの比を灰色で示す。箱の中の線は、中央値を示し、かつその箱は、第一及び第三四分位数によって設定される。ウィスカーは、１０及び９０百分位数を示す。異常値は、それぞれ円で示される。子宮頸癌の系列からの５９のＨＰＶ １６ＤＮＡ−陽性試料を、子宮頸部異常の完全スペクトルを含むためにグラフに加える。
【００７１】
図４：頸部の剥離された細胞におけるＨＰＶウィルス量。"上皮内病変又は悪性ではない"（ＮＩＬ／Ｍ）として細胞学的に診断された８４６試料、"意義不明の異型扁平細胞"（ＡＳＣＵＳ）を有する８６試料、"低グレードの扁平上皮内病変"（ＬＳＩＬ）を有する２９試料、高グレードの扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）を有する１３試料、及び扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）を有する８３試料から抽出されたＨＰＶ ＤＮＡを、ＢＳＧＰ５＋／６＋によって増幅し、そして生成物を、ＭＰＧでハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション強度を、それぞれのＨＰＶ型に関する最大のＭＦＩに標準化した。最大ＭＦＩの中央値百分率を、ＨＰＶ１６のみに関して、他の共に高リスク型（１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３、８２）に関して、及び共に低リスク型（６、１１、２６、３０、５３、６６、６７、４２、４３、４４、７０）に関して、示す。
【００７２】
次の実施例は、本発明を単に説明するものとする。該実施例は、何ら、本発明の範囲を制限すると解釈されないものとする。
【００７３】
実施例１
ＨＰＶ配列アライメント及びＨＰＶプライマー設計
約５０個の完全に配列を決定されたＨＰＶ遺伝子型、すなわち高リスクＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３、８２、推定上のＨＲ ＨＰＶ２６、５３及び６６、並びにＬＲ ＨＰＶ６、７、１１、１３、３０、３２、３４、４０、４２、４３、４４、５４、５５、６１、６２ｃ、６４、６７、６９、７０、７２、７４、８１、８３、８４、８５ｃ、８６ｃ、８７ｃ、９０、９７、１０２、１０６のＬ１領域のヌクレオチド配列を、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）ヌクレオチド配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）から得て、そしてＴ−ＣＯＦＦＥＥ(Notredame, C, D. G. Higgins, and J. Heringa. 2000. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. J MoI Biol 302:205-17)で整列した。ＢＳＧＰ５＋／６＋プライマー設計のための基準は、以下のようにした：プライマー配列における変性塩基部位の付加でなくオリゴヌクレオチドのプールを、プライマー配列における合成変性を妨げるために選択した。全てのプライマーは、ＧＰ５＋／６＋として同様の領域を標的とする。あらゆるＨＰＶ型は、Ｉ）少なくとも１つのプライマーに対してわずか３つのミスマッチ、又はＩＩ）双方のプライマーにおけるミスマッチの合計数が、５以下のミスマッチであることを有する。あらゆるプライマーに対して３つのミスマッチの場合Ｉ）において、３’末端に対する最も近いミスマッチは、少なくとも５つの完全に適合したヌクレオチドに従うべきである。ＩＩ）の場合において、プライマー配列に対して４つのミスマッチを示すプライマーは、最初のミスマッチとそれらの３’末端との間で少なくとも８つの完全な適合を呈する。
【００７４】
ＧＰ５＋／６＋プライマー結合領域を有するＨＰＶ配列アライメントは、表１において示される。さらに、表１ａは、名称、方向付け（上流又は下流）、及び配列表番号：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２において示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドの核酸配列を挙げる。さらに、表１ａにおいて含まれるのは、ＧＰ５＋オリゴヌクレオチド（配列表番号：１の上流）及びＧＰ６＋オリゴヌクレオチド（配列表番号：２の下流）の配列である。表１ａにおいて挙げられたオリゴヌクレオチド（上流及び下流）は、前記のような基準を満たした。表１ｂは、前記の基準を満たし、かつ種々のＨＰＶ遺伝子型のポリヌクレオチドの特異的な増幅のためにうまく使用される追加のオリゴヌクレオチドの核酸配列を挙げる。
【００７５】
表１  ＢＳＧＰ５＋／６＋及びＧＰ５＋／６＋配列アライメント。ＧＰ５＋／６＋プライマー結合領域を有するＨＰＶ配列アライメントを、左側に示す。ヌクレオチド相同性を点で示し、かつミスマッチを、大文字で対応する配列におけるヌクレオチド変化で示した。右側に、最も適切なＢＳＧＰ５＋／６＋プライマーを有するアライメント、新たなミスマッチを、小文字で示す（次頁を参照）。
【表１−１】
2010536393.tif 000002
【表１−２】
2010536393.tif 000003
【表１−３】
2010536393.tif 000004
【００７６】
実施例２
内因性調整ポリヌクレオチドの増幅のための新たなｂ−グロビンの開発。
【００７７】
長さ２０〜２２ヌクレオチド（Ｔｍ：４５〜５０℃）を有する新たなｂ−グロビンの種々のセットを、プライマー３(Rozen et al, 2000. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods MoI Biol 132:365-86)で、基準配列としてｂ−グロビン遺伝子（ＡＹ２６０７４０）を使用して設計して、長さ２００〜２４０ヌクレオチドを有する断片を増幅した。
【００７８】
内部のＤＮＡの質の調整は、ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲに関してさらに記載されていない。代わりに、種々の外部ｂ−グロビンＰＣＲが、ＤＮＡの完全性を調整するために役立つが、しかしそれらによって、ＨＰＶ ＰＣＲの性能、並びにそれ自体のＨＰＶ ＰＣＲ反応におけるＤＮＡの存在及び完全性を調整することができなかった。その制限を改良するために、新たなｂ−グロビンプライマーを、ＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲ及び標準ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲに組み込んだ。
【００７９】
ＧＰ５＋／６＋又はＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲの、ＤＮＡの質を調整するｂ−グロビンを共増幅する能力を評価するために、ＣＯ３／５プライマーセット(de Roda Husman, A. M., J. M. Walboomers, A. J. van den Brule, C. J. Meijer, and P. J. Snijders. 1995. The use of general primers GP5 and GP6 elongated at their 3' ends with adjacent highly conserved sequences improves human papillomavirus detection by PCR. J Gen Virol 76 ( Pt 4): 1057-62)及び７つの新たに設計されたプライマー対（ＭＳｌ−７ｆｗ及びＭＳｌ−７ｂｗ）を、ヒト胎盤ＨＰ−ＤＮＡ１００ｎｇのバックグラウンドでＨＰＶ１６、１８、３１及び３３からのゲノムＤＮＡを含有するプラスミドの１０倍希釈で、種々の組合せで試験した。ｂ−グロビン及びＨＰＶ ＰＣＲ生成物を、アガロースゲル電気泳動で視覚化した。ＣＯ3/5プライマーは、ｂ−グロビン遺伝子を共増幅することに失敗した。新たに設計したプライマーの組合せは、所望のＰＣＲ断片を増幅することに成功した。３つのプライマーセットを、細胞系列ＳｉＨａ及びＣａｓＫｉのＨＰ ＤＮＡ含有ヒト子宮頸癌細胞、並びに臨床検体から単離されたＤＮＡを、さらに試験した。それらの条件下で、ＭＳ３ｆｗ／ｂｗプライマーは、ゲル中で認識できるＰＣＲ断片を増幅した。ｂ−グロビンＰＣＲ生成物の多重検出を、ＭＰＧアッセイにおいて含まれる特異的なプローブによって得た。
内因性ｂ−グロビン調整ポリヌクレオチド配列の増幅に最適であるオリゴヌクレオチドの配列は、以下である：
2010536393.tif 000005
【００８０】
実施例３
ＧＰ５＋／６＋及びＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲによるクローン化ＨＰＶ ＤＮＡの増幅。
【００８１】
ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲを、ＷＯ  ９５／２２６２６号及び Roda Husman, A. M., J. M. Walboomers, A. J. van den Brule, C. J. Meijer, and P. J. Snijders. 1995. The use of general primers GP5 and GP6 elongated at their 3' ends with adjacent highly conserved sequences improves human papillomavirus detection by PCR. J Gen Virol 76 (Pt 4): 1057-62において明らかに記載されているように、いくつかの変法で実施した。簡単に、頸部の引掻から抽出されたＤＮＡ１０μＬ又はＨＰＶプラスミド希釈１μＬを、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．８ｇ／Ｌ ＮｏｎｉｄｅｔＴＭ Ｐ４０、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．８（１０×ＰＣＲ緩衝液、ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＧｍｂＨ、Ｓｔ．Ｌｅｏｎ Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、それぞれデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）２００μＭ、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ2（Ｂｉｏｚｙｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ、Ｈｅｓｓｉｓｃｈ Ｏｌｄｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＤＮＡ ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の１Ｕ、並びにＧＰ５＋及び５’−ビオチン化ＧＰ６＋プライマー（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のそれぞれ５００ｎＭを含有する５０μＬ中で増幅した。組み込まれたｂ−グロビン／ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲの場合に、新たなｂ−グロビンプライマーＭＳ３ｆｗ及び５’ビオチン化ＭＳ３ｂｗのそれぞれ１００ｍＭを、ＰＣＲ混合物毎に添加した。９４℃で４分の変性工程は、ＰＣＲサーモサイクラー（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）又はマスターサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で４０サイクルの増幅に従った。それぞれのサイクルは、２０秒間９４℃で変性工程、３０秒間３８℃でアニーリング工程、及び８０秒間７０℃で伸長工程を含んだ。最終の伸長工程を、さらに４分間延長した。マスターサイクラーのためのランプ速度を、最近記載された（Snijders, P. J., A. J. van den Brule, M. V. Jacobs, R. P. Pol, and C. J. Meijer. 2005. HPV DNA detection and typing in cervical scrapes. Methods MoI Med 119:101-14）：９４℃から３８℃まで１．８℃／ｓ、３８℃から７１℃まで２．０℃／ｓ及び７１℃から９４℃まで２．８℃／ｓのように、調整した。それぞれのＰＣＲ実験を、陽性の及びいくつか陰性のＰＣＲ調整で実施した。
【００８２】
広域スペクトルＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲアッセイのために、配列表番号：３、４、５、６、７、８、９、１１、１２及び１６において示されるような、８つの追加の上流の、及び２つの追加の５’−ビオチン化させた下流のプライマーが、ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲ反応に付加した。それぞれの上流（ＧＰ５＋を含む）２００ｎＭ、それぞれの下流（ＧＰ６＋を含む）４００ｎＭ、及びそれぞれのｂ−グロビンプライマーＭＳ３ｆｗ及び５’−ビオチン化ＭＳ３ｂｗ３００ｎＭを使用した。別の方法で、ＰＣＲ緩衝液、試薬及び増幅プロフィールは、前記に記載されているものと同一であった。
【００８３】
ＢＳＧＰ５＋／６＋プライマーの解析感受性を、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、２６、３１、３３、３５、３９、４２、４３、４４、４５、５１、５２、５３、５６、５８、５９、６６、６８（ＭＥ１８０）、７０、７３及び８２（表２）のプラスミドクローンに関して決定した。プラスミド配合物を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡ）又はＨｉｔａｃｈｉ Ｕ−１１００ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｌｔｄ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して定量した。それぞれのＨＰＶ型に関するコピー数を、それぞれのプラスミドの分子量に基づいて決定した。１０倍の終点の希釈系列を、合計量３０μＬでヒト胎盤（ＨＰ−）ＤＮＡ１００ｎｇ／μＬで製造した。それぞれの希釈を、２〜３回繰り返して単独で解析した。
【００８４】
それぞれ、ＢＳＧＰ５＋／６＋及びＧＰ５＋／６＋の双方においてｂ−グロビンプライマーの組み込み後に、双方のプライマーセットの解析感受性を、少なくとも二重反復試験で実施される、ＰＣＲ、及び２４ＨＰＶ型からのゲノムＤＮＡを含有するＨＰ−ＤＮＡ１００ｎｇ中でプラスミドの１０倍希釈系列を使用するＭＰＧを使用して比較した（表２）。ｂ−グロビンの共増幅にもかかわらず、全てのＨＰＶ遺伝子型を増幅したＢＳＧＰ５＋／６＋プライマーセットは、全ての解析されたＨＰＶ型に関して１０〜１０００コピーの感受性の再現性のあるレベルに達して解析された。標準ＧＰ５＋／６＋プライマーは、１０〜１００００００コピーの検出限界でＨＰＶを増幅する能力で、より特異な変動を示した。この差は、独立したｂ−グロビン共増幅であった（次の段落を参照）。ＨＰＶ１１、１６、１８、３１、３３、４３、５８及び５９に関して、双方のＰＣＲプライマーセットは、同様の解析感受性を示した。ＨＰＶ６、３５、４２、４５、５２、７０及び７３に関して、ＢＳＧＰ５＋／６＋プライマーセットは、少なくとも１０倍であり、ＨＰＶ２６、３９、５６、６８（ＭＥ１８０）及び５１に関しては、１００倍、及びＨＰＶ４４、５３及び８２に関しては、少なくとも１０００倍、ＧＰ５＋／６＋よりもより感受性があった。それらの結果は、クローン化ＨＰＶ遺伝子型に関する新たなＢＳＧＰ５＋／６＋プライマーの改良された感受性を示した。
【００８５】
前記に関する実験の結果を、表２において示す。
【００８６】
種々のＨＰＶ遺伝子型の増幅をさらに最適化するために、種々の組合せで表１ａ及び１ｂからのオリゴヌクレオチドを使用する追加の実験は、表２において挙げられた物と同様の検出限界をもたらした。配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２及び１６を有するオリゴヌクレオチドの比較において、配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２において示されるような配列を有するオリゴヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチド混合物の使用は、例えば、さらに亜型の１０倍のＨＰＶ６８（Ｘ６７１６１）の検出を改良した一方で、他の型の検出の感受性は、変化しなかった。
【００８７】
表２．種々のＰＣＲ：通常のＧＰ５＋／６＋ＰＣＲ、及びＧＰ５＋／６＋ＰＣＲ、並びに双方とも組み込まれたｂ−グロビンＰＣＲを有するＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲでの、ＨＰ ＤＮＡ１００ｎｇにおけるＨＰＶプラスミドコピー数において与えられたＨＰＶ型検出限界。
【表２】
2010536393.tif 000006
【００８８】
実施例４
ｂ−グロビン特異性オリゴヌクレオチドによる内因性調整ポリヌクレオチドの増幅
次に、ｂーグロビンプライマー濃度を、ＢＳＧＰ５＋／６＋及びＧＰ５＋／６＋ＰＣＲにおける組み込みのために、それぞれＨＰＶ ＰＣＲの同時競合なしに、最適化した。このために、ＭＳ３ｆｗ／ｂｗ ｂ−グロビンプライマーの種々の量を、ＨＰ−ＤＮＡのバックグラウンドでＨＰＶ１６の固定された量で試験した。ｂ−グロビンプライマー濃度１００ｎＭを、ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲにおいて使用した一方で、３００ｎＭを、ＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲにおいて使用して、同様のｂ−グロビンシグナル強度に達した（データは示されていない）。それぞれＨＰＶ及びｂ−グロビンＰＣＲは、ＨＰ−ＤＮＡ１０ｎｇ（約１７００ゲノム当量）未満の検出限界に達した。
【００８９】
ＨＰＶ増幅に対するｂ−グロビン共増幅の効果を調べるために、ＨＰ−ＤＮＡ１００ｎｇの一定量でＨＰＶ１６、３９、６６及び８２の希釈系列を、ＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲによる二重反復試験で、それぞれｂ−グロビン共増幅を有して、又は有さずに増幅した。ｂ−グロビン共増幅にかかわらず、ＨＰＶ検出限界は、同一であり、かつＨＰＶシグナル強度は、高い頑強性を示した（図１）。ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲにおいて、ｂ−グロビン共増幅は、ＨＰＶ検出限界にも影響しなかった（データは示されていない）。
【００９０】
ＨＰＶ検出限界に対するＨＰ−ＤＮＡの量を増加する効果を研究するために、ＨＰ−ＤＮＡの１００〜１０００ｎｇのバックグラウンドにおけるＨＰＶ８２の希釈系列（１０〜１０００コピー数）を、二重反復試験におけるｂ−グロビン共増幅を有して、又は有さずにＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲによって試験した。ＨＰ−ＤＮＡ１００ｎｇと比較して、ＨＰ−ＤＮＡ１０００ｎｇにおけるＨＰＶ８２の１００コピーの増幅は、４倍のより弱いシグナルをもたらした。ＨＰＶ８２の検出限界は、ＨＰ−ＤＮＡの３３３〜１０００ｎｇが存在する場合に、１０〜１００コピーまで上昇した（図２）。ｂ−グロビンプライマーを有さないＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲとの比較として、ｂ−グロビンの共増幅は変化しなかった。ＨＰＶ８２検出限界は、バックグラウンドＨＰ−ＤＮＡ１００〜１０００ｎｇが使用される場合に、一致するＨＰＶシグナル強度を示した。合計で、ＨＰＶ８２を検出するためのＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲの能力は、バックグラウンドＨＰ−ＤＮＡの量と相互に関連し、かつｂ−グロビン共増幅に依存した。
【００９１】
前記に関する実験の結果を、図２において示す。
【００９２】
実施例５
臨床試料でのＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲの評価
ＤＮＡ単離のために、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）溶液（Ｃｙｔｙｃ Ｃｏｒｐ．、Ｂｏｘｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で、サイトブラシ（Ｃｅｒｖｅｘ−Ｂｒｕｓｈ、Ｒｏｖｅｒｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｂ．Ｖ．、５３４７ ＫＶ、Ｈｏｌｌａｎｄ）で採取された頸部の削り落としたものの２．０ｍｌ（合計２０ｍｌから）を、製造者の指示書によるＲｏｃｈｅ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔによって精製した。ＤＮＡを、溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５）０．２ｍｌで溶出し、そして−２０℃でさらに使用するまで貯蔵した。小片を、２ヶ月、４℃で、ＤＮＡを抽出する前に維持した。
【００９３】
解析の結果を実証するために、組み込まれたｂ−グロビンＰＣＲを有するＢＳＧＰ５＋／６＋を、ｂ−グロビンＰＣＲを有さないＧＰ５＋／６＋と、２つの異なる群からの１１１２個の頸部スミアに対して比較した。群１は、合計９５人の癌患者を含み、かつ群２は、一般集団からの１０１７人の女性からなる。実験変動を避けるために、双方のＰＣＲ法を、同様のＰＣＲランで実施し、そして同様のプレート上で、２６のＨＰＶ型に関してＭｕｌｔｉｐｌｅｘ ＨＰＶ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ（ＭＰＧ）によって解析した。１１１２個の頸部検体の中から、２７個を、２４個はＢＳＧＰ５＋／６＋によるｂ−グロビン増幅に関して陰性であり、かつ双方のＰＣＲ法によるＨＰＶに関して陰性であったために、除去した。残りの３つの検体は、ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲによってより強く型分けされたＨＰＶ１６又は３１の陽性であり、ＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲがベータグロビン又はＨＰＶのどちらも増幅に失敗したために、排除された。
【００９４】
１０８５個の臨床検体におけるＨＰＶ罹患率に関する一般的な合計は、癌患者からの９３個の頸部スミア及び一般集団からの９９２個の頸部スミアを含有し、表３において示される。全体で２６個のＨＰＶ型に関して型分けされた１０８５個の試料は、それぞれＰＣＲ法に関する２８２１０個の型分けの結果を得た。切断片として５個の正味のＭＦＩを使用して、６３９個の型分けの結果が、一致して陽性であり（２．２％）、２８３７８個は、一致して陰性であり（９６．９％）、かつ２７８個は、不一致であり（０．９％）、カッパ値０．８１５を得た。これは、１０８５個の臨床試料のうちの８５８個の同一の型分け（７９．１％）をもたらし、かつｂ−グロビン共増幅にかかわらず、ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲによる４１．４％に関して、ＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲによって４６．０％の増加された全てのＨＰＶ罹患率をもたらした。
【００９５】
ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲと比較して、ＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲは、６６個の感染を検出することに失敗したが、しかし２１２個の追加の感染を同定した。表３は、特異的なＨＰＶ型の検出率における絶対差を示す。いくつかのＨＰＶ型が、どちらか一方の方法でのみによって組織的によりよく検出された一方で、他方は、双方のＰＣＲ法によって追加の弱い陽性（正味１５ＭＦＩ未満）を有する弱い不一致を示した。検出における差は、ＨＰＶ６、２６及び６７に関して見出されなかった。ＨＰＶ６９は、この研究において検出されなかった。検出における弱い不一致を、ＨＰＶ１１、１６、１８、３３、３５、４３、４５、５６、５９及び７０で観測した。ＨＰＶ３０、３９、４２、４４、５１、５２、５３、６８（ＭＥ１８０）、７３及び８２の検出を、ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲと比較されるこれらの型の検出の、１．２〜９．５倍のより頻繁な検出をもたらすＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲによって組織的に改良した。これらの型の追加の検出は、少なくとも５０％の場合において正味約１５ＭＦＩの値をもたらし（表３）、かつ単独及び多重感染が見出された。これらの追加の反応の中で、強いＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲシグナル（本研究において観測された最大のＨＰＶプローブシグナル（シグナルmax）の３分の１多い）は、ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲによって損なわれた。単独及び多重感染において、ＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲは、シグナルmaxより３分の１多いシグナルでＨＰＶ８２を、シグナルmaxより半分多いシグナルでＨＰＶ３０及び６８（ＭＥ１８０）を、並びにシグナルmaxと同等のシグナルでＨＰＶ４４及び５３を、さらに検出した。取り立てて、ＬＲ ＨＰＶ４４を、ＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲによってのみ検出した。ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲは、それぞれ１．４倍及び１．２倍のより頻繁な検出を示す、ＨＰＶ型３１及び６６のよりよい検出を示した。１３個のＨＰＶ３１感染の中から、ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲによって、ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲで境界シグナルを示した７個をさらに検出した（正味１５未満のＭＦＩ）。残りの６個（正味４８のＭＦＩを意味する）の反応を、次のＨＰＶ１６、５１、５２、５３、５８及び５９の１つを有する少なくとも１つの附随の強い感染での多重感染において見出した。ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲによって単独で検出されたＨＰＶ６６感染は、全て正味１２未満のＭＦＩの境界値を示した。
【００９６】
２つのＰＣＲ法の注意すべき差は、それらの多重感染の一部として特異的な型を検出する能力が比較される場合に見出された。ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲでのＨＰＶ陽性試料において検出された多重感染の全ての割合は、４４９個のうちの１５６個（３４．７％）であったのに対して、ＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲでは、４９９個のうち１９２個（３８．５％）であった（表４）。一般集団（ｎ＝９９２）の中で、多重感染の割合は、ＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲで１６．８％であった一方で、ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲでは、１４．１％の多重の陽性を見出した。一般集団との比較において、多重感染は、ＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲを使用して癌患者（ｎ＝９３）において著しくより頻繁であった（２６．９％、ｐ＝０．００７）一方で、罹患率は、ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲを使用して著しい変化がなかった（１７．２％、ｐ＝０．０８４％）。
【００９７】
前記に関する実験の結果を、表３及び４において示す。
【表３】
2010536393.tif 000007
【表４】
2010536393.tif 000008
【００９８】
実施例６
ＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲでのＨＰＶ３１感受性の最適化
ＨＰＶ３１のためのＢＳＧＰ５＋／６＋プライマーの外見上のより低い感受性に関する理由を試験するために、最初にそれぞれ２００ｎＭから５００ｎＭまで、及び４００ｎＭから６００ｎＭまでＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲにおける標準ＧＰ５＋及びＧＰ６＋プライマーの濃度を、増加した。ＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲによって明らかにＨＰＶ３１陰性であった多重感染を有する全ての１３個の臨床試料を、再解析した。改質されたＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲに対する初期のＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲを比較して、１３個の明らかに失敗したＨＰＶ３１反応のうちの７個が検出された。ＨＰＶ６６の増幅を、８個の明らかにＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲ陰性感染のうち３個の検出をもたらす最適化もした。最初のＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲによるＨＰＶ型の改良された検出は、この改質によって変更されなかった（データは示されていない）。
【００９９】
実施例７
外因性調整ポリヌクレオチドの改良
外因性調整ポリヌクレオチド（配列表番号：１５、図３）を、予め決定されたＤＮＡのヒトではない及びＨＰＶではない配列、ここではネズミポリオーマウィルスからのＶＰ１に相補的であった３’末端、それぞれＧＰ５＋及びＧＰ６＋に殆ど同一であったが、それぞれのプライマーに対して２つのミスマッチを示した中央部分、並びにＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩに関する制限酵素部位を内部に持つ５’末端を含有する２つの伸長されたプライマーを使用して生成した。ＰＣＲ反応を、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼで、及び次のプロトコルに従って実施した：９８℃、３０ｓ；９８℃、３０ｓを３５サイクル；６８℃、３０ｓ；７２℃３０ｓ及び７２℃最終の伸長を１０分間。その断片は、制限酵素部位を除いた１４４ｂｐであり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）中でクローン化され、そしてシーケンスによって調整された。エレクトロコンピテントＤＨ５α細胞の形質転換後に、プラスミドＤＮＡを、製造者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用することによって抽出した。
【０１００】
プラスミド配合物を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡ）又はＨｉｔａｃｈｉ Ｕ−１１００ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｌｔｄ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して定量した。そのコピー数を、プラスミドの分子量に基づいて決定した。１０倍の終点の希釈系列を、合計量３０μＬでヒト胎盤（ＨＰ）ＤＮＡ１００ｎｇ／μＬで製造した。
【０１０１】
外因性調整ポリヌクレオチドの１０００コピー未満を、ＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲによって検出し、そして続いてＭＰＧを使用して特異的なオリゴヌクレオチドプローブによって検出した。他のオリゴヌクレオチドプローブでの交叉反応性は観察されなかった。ＰＣＲ阻害剤に関する調整のために、内部調整を、ＰＣＲマスターミックス中に低濃度でスパイクすることができ、従ってＨＰＶ増幅との競合を避ける。
【０１０２】
実施例８
ＨＰＶ高リスク遺伝子型での感染の重症度の評価
ＨＰＶのウィルス量は、子宮頸癌の発達における重要な役割を果たすと考えられる。多いウィルス量は、低いウィルス量よりも悪い予後に関連すると考えられる。本発明の組成物が、ＨＰＶでの感染の重症度を評価することもできるかどうかを解析した。
【０１０３】
ＮＩＬ／Ｍ、ＡＳＣＵＳ、ＬＳＩＬ、ＨＳＩＬ及びＳＣＣを含む頸部検体からのＨＰＶ ＤＮＡを、本発明の組成物を使用して増幅した（配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２及び１６を有するオリゴヌクレオチド）。ベータグロビン遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドも含まれる（配列表番号：１３及び配列表番号：１４を有するオリゴヌクレオチド）。増幅生成物を、本明細書の他の場所に記載されているようにハイブリダイズした。結果を、図３及び図４において示す。
【０１０４】
細胞学的な異常を有するＨＰＶ ＤＮＡ罹患率の増加に加えて、ＨＰＶ１６ハイブリダイゼーションシグナル強度の増加を観察した。ＭＦＩ値は、ＮＩＬＭにおいて１４３の中央値から、ＨＳＩＬにおいて１２８３まで、及び癌の場合において１２４２まで増加した。さらに、ＨＰＶ１６とベータ−グロビンとのＭＦＩ値比は、ＮＩＬＭからＨＳＩＬまで増加し、かつ子宮頸癌患者においてはさらにわずかに減少した（図３）。
【０１０５】
ＨＰＶ１６以外のＨＰＶ型に関して、細胞異常に対するＭＦＩ値の同様の相互関係が観察された。ＭＰＧにおいて使用されたＨＰＶプローブが種々のハイブリダイゼーション強度を示したために、ＨＰＶシグナルは、それぞれのＨＰＶ型の最大のＭＦＩに標準化されるべきであった。ＭＦＩの中央百分率を、ＨＰＶ１６のみに関して並びに、それぞれの細胞群において見出された他のＨＰＶ ＤＮＡ型との陽性反応の制限によって、共に他の高リスク型及び低リスク型に関して計算した。ＨＰＶ １６のＭＦＩの中央百分率は、ＮＩＬＭ（３５）からＨＳＩＬ（７４）まで増加し、かつさらにＳＣＣ（７２）においてわずかに減少した。集団の他の高リスク型は、同様の傾向を示したが、しかしより低い値を有した。対照的に、低リスク型に関する最大ＭＦＩ値の中央百分率は、ＬＳＩＬ（３７）において最も高く、かつＨＳＩＬ（３）において及びＳＣＣ（１２）群において減少した（図４）。
【０１０６】
ＨＰＶ１６ＭＦＩ対ベータ−グロビンＭＦＩの比は、頸部病変のグレードを増加しながら、増加した。同様の、しかしより弱い増加を、他の高リスク型に関しても観察した。ウィルス量を評価する、組み込まれたベータグロビン増幅を有するＢＳＧＰ５＋／６＋ＰＣＲの能力は、高グレード病変における高いウィルス量が、ＨＰＶの競合及びベータグロビン増幅を導く事実によって説明されうる。ＨＰＶ増幅が、ＤＮＡポリメラーゼにおける制限及びｄＮＴＰの質によって、全てのＰＣＲサイクルが実施される前に、限界に達する場合に、ベータグロビン遺伝子の低い親和性のプライマー媒介増幅は、遅いＰＣＲサイクルにおいて低減される。従って、ＢＳ−ＭＰＧは、頸部スミアにおけるウィルス量を量的に評価することの目安を提供すし、かつ子宮頸部異常のグレードを迅速に評価することにおいて有用であってよい。
【図１】
2010536393.tif 000009
【図２】
2010536393.tif 000010
【図３】
2010536393.tif 000011
【図４】
2010536393.tif 000012
【配列表】
2010536393000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月1日(2009.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド混合物を含有する組成物であって、該オリゴヌクレオチド混合物が、
（ａ）配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２において示されるような核酸配列を有するオリゴヌクレオチド、又は
（ｂ）（ａ）のオリゴヌクレオチドによって増幅されるポリヌクレオチドを特に増幅することができるオリゴヌクレオチドを含有する組成物。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチド混合物が、配列表番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２において示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド混合物が、内因性調整ポリヌクレオチドの増幅のためのオリゴヌクレオチドをさらに含有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチド混合物が、外因性調整ポリヌクレオチドを含有する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項の組成物を含有する診断組成物。
【請求項６】
被験者の試料における種々のＨＰＶ遺伝子型を検出するための、請求項１から５までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項７】
前記種々のＨＰＶ遺伝子型が、同時に診断される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記ＨＰＶ遺伝子型が、ＨＰＶ１６、１８、３１，３３、３５、３９，４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３及び８２からなる群から選択される高リスクＨＰＶ遺伝子型である、請求項６又は７に記載の使用。
【請求項９】
以下、
ａ）種々のＨＰＶ遺伝子型を含む疑いのある被験者の試料と請求項１から４までのいずれか１項に記載の組成物とを、ポリヌクレオチドの増幅を可能にする条件下で接触する工程、及び
ｂ）工程ａ）において含まれる増幅されたポリヌクレオチドを基礎とする種々のＨＰＶ遺伝子型を決定する工程
を含む、被験者の試料における種々のＨＰＶ遺伝子型を診断するための方法。
【請求項１０】
前記ＨＰＶ遺伝子型が、高リスク遺伝子型である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から４までのいずれか１項に記載の組成物を含有する、請求項９又は１０の方法を実施するために適したキット。
【国際調査報告】
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