(57)【要約】  本発明は生物学的試料中においてスタフィロコッカス・アウレウスを検出及び同定する上で有用なスタフィロコッカス・アウレウス特異的核酸プローブに係り、さらに詳しくは、スタフィロコッカス・アウレウスの２３ＳｒＲＮＡ遺伝子から誘導された核酸プローブが固定されたスタフィロコッカス・アウレウス検出及び同定用ＤＮＡチップに関する。本発明によるＤＮＡチップを使用すると、現在使用中の方法であるサンプル培養により感染性疾患を診断する方法よりもさらに迅速で且つ正確に細菌感染を診断することができる。
2010515452.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群より選択されるいずれか１種以上のオリゴヌクレオチドを含むスタフィロコッカス・アウレウス検出及び同定用プローブ。
【請求項２】
請求項１に記載のプローブが基質上に固定されているスタフィロコッカス・アウレウス検出及び同定用ＤＮＡチップ。
【請求項３】
配列番号１〜８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがいずれも固定されていることを特徴とする請求項２に記載のスタフィロコッカス・アウレウス検出及び同定用ＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学的試料中においてスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）を検出及び同定する上で有用なスタフィロコッカス・アウレウス特異的核酸プローブに係り、さらに詳しくは、スタフィロコッカス・アウレウスの２３ＳｒＲＮＡ遺伝子から誘導された核酸プローブが固定されたスタフィロコッカス・アウレウス検出及び同定用ＤＮＡチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
感染疾患は、病原体が血液、体液及び組織内に出現し、活性化することに起因して発病する疾患であり、原因菌の正確な同定及び適切な治療がなされない場合、生命を失う可能性もある疾病である。さらに、最近は、抗生剤投与の濫用移植による免疫抑制剤使用の増加、抗癌治療による薬物投与の増加などにより、病原体は遺伝子の連続的及び代替的な変化にさらされ、病原体の培養率が低下しいる。原因病原体の多様化は、培養検査などの既存の感染疾患を診断する診断方法を、次第に困難にしているのが現状である。このため、これを素早く診断すると共に、原因病原体の種類を確認することが治療においてかなり重要な位置を占める。
【０００３】
これらの感染性病原菌の中で、スタフィロコッカス・アウレウスは黄色ブドウ球菌と呼ばれ、皮膚感染、軟組織感染、骨関節炎、肺炎、敗血症、食中毒などを引き起こす病原菌であり、適切な抗生剤により治療できなかったときに罹患率と致命率が高い。スタフィロコッカス・アウレウス感染は鼻腔保菌者において頻繁に発生し、集中治療室にはメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(ＭＲＡＳ:methicillin-resistant Staphylococcus aureus)に感染した患者や、鼻腔にＭＲＳＡの定着した患者が入院し易いため、これらの患者から他の患者への伝染が起こる可能性が極めて高い。このため、選別検査を通じて適切な予防措置を取ることが重要である。
【０００４】
このような必要性に応じて、長年に亘って原因菌であるスタフィロコッカス・アウレウスを同定しようとする診断方法が研究及び開発されてきている。この１０年間に亘っての微生物の多量検出技術の進歩には目を見張るものがあるが、現在利用中の診断方法は依然として多くの労力を必要とし、しかも、感度及び特異性が低いのが現状である。
【０００５】
ウィルスを除き、あらゆる原核生物は、原核生物の５Ｓ、１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡ分子の相同体をコードするｒＲＮＡ遺伝子を含有する。真核生物の場合には、これらのｒＲＮＡ分子は、原核細胞の分子と実質的に類似の５ＳｒＲＮＡ、５．８ＳｒＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ及び２８ＳｒＲＮＡである。生物学的試料において特定の非ウイルス性生物（non-viral organisms）または非ウイルス性生物群（groups of non-viral organisms）のｒＲＮＡ亜配列を特定の標的として検出するためのプローブが多数公開されている。この種の核酸プローブを周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と併用することにより、従来の診断方法における上記の問題点のほとんどを解決することができた。診断のための核酸プローブ技術においては、増幅させる標的遺伝子の選択が極めて重要であるが、ｒＲＮＡ、特に２３ＳｒＲＮＡ遺伝子が、通常多用されており、これらに対する核酸プローブ配列は、有利なことには、適当な厳密性条件下において他の微生物（microbes）から由来した核酸と交差反応する確率が低いことが知られている（ P. Wattiau et. al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:816, 2001; D.A. Stahlm et. al., J. Bacteriol., 172:116, 1990; Boddinghaus et. al., J. Clin., Microbiol., 28:1751, 1990; T. Rogall et al., J. Gen. Microbiol., 136:1915, 1990; T. Rogall et. al., Int. J. System. Bacteriol., 40:323, 1990; K. Rantakokko-Jalava et. al., J. Clin., Mirobiol., 38:32, 2000; Park et. al., J. Clin., Mirobiol., 38:4080, 2000; A. Schmalenberger et. al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 67:3557, 2001、国際公開９８／５５６４６号、米国特許第６，０２５，１３２号明細書及び米国特許第６，２７７，５７７号明細書）。
【０００６】
本発明者らは、非ウィルス性感染性生物を検出及び同定するために前記感染性生物に、特異的な核酸配列をプローブとして用いたＤＮＡチップに関する特許を出願しており（国際公開０３／０９５６７７Ａ１号）、前記ＤＮＡチップの感度を高めるための研究を行い続けている。
【０００７】
そこで、本発明者らは、スタフィロコッカス・アウレウス感染疑患者のサンプルからスタフィロコッカス・アウレウスを迅速に検出するために鋭意努力した結果、スタフィロコッカス・アウレウスゲノムの２３ＳｒＲＮＡ遺伝子からスタフィロコッカス・アウレウス特異的な配列を発見し、これをスタフィロコッカス・アウレウス検出用プローブとして用いてＤＮＡチップを製作することにより、迅速で且つ正確にスタフィロコッカス・アウレウスを検出することができるということを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【０００８】
《技術的課題》
本発明の目的は、スタフィロコッカス・アウレウスゲノムの２３ＳｒＲＮＡ遺伝子においてスタフィロコッカス・アウレウスに特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドが固定されているスタフィロコッカス・アウレウス検出及び同定用ＤＮＡチップを提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記オリゴヌクレオチドからなるスタフィロコッカス・アウレウス検出及び同定用プローブを提供することにある。
【００１０】
《技術的解決方法》
上記の目的を達成するために、本発明は、配列番号１〜８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群より選択されるいずれか１種以上のオリゴヌクレオチドを含むスタフィロコッカス・アウレウス検出及び同定用プローブを提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記プローブが基質上に固定されているスタフィロコッカス・アウレウス検出及び同定用ＤＮＡチップを提供する。
【００１２】
好ましくは、前記ＤＮＡチップは、配列番号１〜８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがいずれも固定されている。
【００１３】
本発明の他の特徴及び実施態様は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲から一層明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ａは、スタフィロコッカス・アウレウスを含む検体に対するブラインド試験のためのＤＮＡチップのデザインを示すものであり、Ｂは、スタフィロコッカス・アウレウスを含む検体に対するブラインド試験において、アレイワークス・マイクロアレイスキャナーを用いて検索されたハイブリダイゼーションの結果を示すものである。
【図２】Ａは、スタフィロコッカス・アウレウスを含む検体に対するブラインド試験のためのＤＮＡチップのデザインを示すものであり、Ｂは、スタフィロコッカス・アウレウスを含む検体に対するブラインド試験において、アレイワークス・マイクロアレイスキャナーを用いて検索されたハイブリダイゼーションの結果を示すものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、一観点において、スタフィロコッカス・アウレウスゲノムの２３ＳｒＲＮＡ遺伝子においてスタフィロコッカス・アウレウスに特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドからなるスタフィロコッカス・アウレウス検出及び同定用プローブに関する。
【００１６】
本発明においては、スタフィロコッカス・アウレウスの２３ＳｒＲＮＡ塩基配列をこれまで配列が判明した細菌の塩基配列とマルチアラインして比較し、スタフィロコッカス・アウレウスに特異的な配列を確認して、前記スタフィロコッカス・アウレウス特異配列を用いてプローブ候補群を選定し、スタフィロコッカス・アウレウス特異プローブを合成した。
【００１７】
本発明は、他の観点において、スタフィロコッカス・アウレウスゲノムの２３ＳｒＲＮＡ遺伝子においてスタフィロコッカス・アウレウスに特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドが固定されているスタフィロコッカス・アウレウス検出及び同定用ＤＮＡチップに関する。
【００１８】
本発明においては、前記合成されたプローブをアルデヒド−アミン結合を用いてガラス板に固定してスタフィロコッカス・アウレウス検出用ＤＮＡチップを製作した。
【００１９】
また、前記スタフィロコッカス・アウレウス検出用ＤＮＡチップ及びプローブの特異性を検証するために、標準菌株のゲノムを分離し、前記ゲノムを鋳型としてＰＣＲを行ったＰＣＲ産物をＤＮＡチップにハイブリダイズして、前記ＤＮＡチップがスタフィロコッカス・アウレウス検出に効果的であることを確認した。
【００２０】
以下、本発明における使用用語及び表現を説明する。
【００２１】
「分離された」核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。例えば、ゲノムＤＮＡと関連して、用語「分離された」は、ゲノムＤＮＡが天然的に結合している染色体から分離された核酸分子を含む。
【００２２】
「プローブ」または「核酸プローブ」とは、検出しようとする標的塩基配列と十分に相補的であるためハイブリダイズする塩基配列を有する一本鎖の特異的なオリゴヌクレオチドのことを言う。
【００２３】
「組成物」は、細菌または真菌のｒＲＮＡに相補的なプローブが純粋な状態であるか、あるいは、他のプローブと配合されている可能性があることを意味する。なお、プローブは、塩または緩衝剤と配合されて乾燥された状態、沈殿物としてアルコール溶液または水溶液の状態で存在しうる。
【００２４】
「標的」は、本発明によるプローブのいずれとも相補的な配列を有する生物学的試料由来の核酸分子を意味する。標的核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ（任意に増幅後に得る）であってもＲＮＡであってもよく、少なくとも一つのプローブオリゴヌクレオチドと少なくとも部分的な相補性を有する配列を含有する。
【００２５】
「生物学的試料」とは、目的とする標的配列を検出しようとする臨床試料（例えば、濃汁、唾液、血液、尿など）、環境試料、細菌コロニー、汚染培養物または純粋な培養物、精製核酸などの検体を言う。
【００２６】
「オリゴヌクレオチド」は、一般的に、約１０個〜約１００個のヌクレオチドからなるヌクレオチド高分子を意味する。しかしながら、ヌクレオチドの長さは１００個以上であっても１０個以下であってもよい。
【００２７】
「ヌクレオチド」は、フォスフェイト基、５−炭糖及び窒素塩基からなる核酸の基本単位である。ＲＮＡにおいて、５−炭糖はリボースである。ＤＮＡにおいて、５炭糖は２−デオキシリボースである。５−ヌクレオチドの場合、糖は５−炭糖−２においてヒドロキシル基（−ＯＨ）を含有する。この用語は、また、リボースの２位にメトキシ基などの前記基本単位の類似体を含む。
【００２８】
「相同性」は同一性と同意語であり、例えば、９０％相同性を有するポリ核酸とは、配列のアラインメントにおいて、同じ位置において９０％の同じ塩基対を示すことを意味する。
【００２９】
「ハイブリダイゼーション」は、標的核酸（検出しようとする配列）に相補配列をアニールすることを意味する。相補配列を含む両核酸高分子が互いを発見し、塩基対相互作用を通じてアニールする能力は周知の現象である。
【００３０】
「プライマー」とは、複製しようとする核酸本鎖に相補的な延長産物（extension product）の合成のための開始点として作用可能な一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を言う。プライマーの長さ及び配列は、これらが延長産物の合成を開始できる程度であれば良いが、好ましくは、約５〜５０個のヌクレオチドからなる。特定の長さ及び配列は、目的とするＤＮＡまたはＲＮＡ標的の複雑性だけではなく、温度及びイオン強度などのプライマー使用の条件により決定される。
【００３１】
「標識」は、検出可能な（好ましくは、定量可能な）シグナルを提供し、核酸に結合可能なあらゆる原子または分子を言う。標識は、蛍光、放射性、色度、Ｘ線回折または吸収、磁力などにより検出可能なシグナルを提供することができる。
【００３２】
「ハイブリッド」は、相補的な塩基間のワトソン・クリック塩基対または非標準塩基対により２つの一本鎖核酸配列の間に形成された複合体である。
【００３３】
「プローブ特異性」は、標的と非標的配列を区別する能力を記述するためのプローブの特徴を言う。これと関連し、プローブが特異的であるということは、ヌクレオチド配列が定まった標的配列とハイブリダイズし、非標的配列とは実質的にハイブリダイズしないか、あるいは、非標的配列とのハイブリダイズが最小限になされるということを意味する。プローブ特異性は、配列及び検定条件により左右される。
【００３４】
「標準菌株」は、市販中の菌株または入手可能な菌株を言う。
【００３５】
プローブの同定
菌の検出用核酸プローブを製作するためには、各菌にのみ特異性を有する必要があるが、このために、先ず、各菌に対する特異プローブ候補群を選定する。特異プローブ候補群は、あらゆる菌の塩基配列をマルチアラインして一列に整列比較し、各菌にのみ存在する特異的な塩基配列を別途に区分してその内部に存在するプローブ候補群を製作して選別する。プローブ候補群は、細菌の場合、各菌内の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子内において決定し、真菌の場合には１８ＳｒＲＮＡ遺伝子部位内において決定する。プローブ候補群の特異性の有無は、先ず、ＢＬＡＳＴ検索を通じて配列相同性を比較して確認し、実際にハイブリダイゼーション反応に菌株を適用して各菌においてのみ反応するプローブを候補群内において同定用に選別する。加えて、上記のようにして選別された同定用核酸プローブは、種々の生物学的試料を対象とする臨床試験に適応して感度を確認する。
【００３６】
本発明に従い選別された核酸プローブは、少なくとも１５量体（１５ｍｅｒ）のオリゴヌクレオチドであり、好ましくは、検出しようとする標的の完全な相補配列と７０％、８０％、９０％または９５％以上の相同性を有する。本発明による各菌の検出及び同定用核酸プローブのオリゴヌクレオチドの長さは約５０個であり、それを超えてもよい。本発明において使用されるヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド及びイノシンまたは修飾基を含有するヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドも採用可能であるが、これらはハイブリダイズの特徴に本質的に影響を及ぼしてはならない。
【００３７】
プローブ利用
本発明の核酸プローブは、診断目的上、生物学的試料中において標的核酸の有無を試験するに当たって、公知のあらゆるハイブリダイゼーション技術、例えば、ドットブロットと呼ばれるフィルター上におけるポイント沈着技術（MANIATIS et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982）、サザンブロットと呼ばれるＤＮＡ転写技術（SOUTHERN, E.M., J. Mol. Biol., 98:503, 1975）、ノーザンブロットと呼ばれるＲＮＡ転写技術を使い分けることができる。
【００３８】
また、本発明の核酸プローブは、核酸プローブ系のアッセイの特異性を高めるサンドイッチハイブリダイゼーションシステムに使用可能である。核酸プローブ系のアッセイにおいて、サンドイッチハイブリダイゼーションの原理及び使用は既に公知である（DUNN and HASSEL, Cell, 12:23, 1977; RNAKI et al., Gene, 21:77, 1983）。サンドイッチハイブリダイゼーション技術には、捕獲プローブ及び／または検出プローブが使用され、これらのプローブは標的核酸の異なる両領域とハイブリダイズ可能であり、それらのうち少なくとも一つ（一般的に、検出プローブ）が目的とする菌に対して特異的な標的の領域とハイブリダイズ可能である。捕獲プローブと検出プローブは少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列を有する必要がある。直接的なハイブリダイゼーション検定が有利な力学を提示するが、サンドイッチハイブリダイゼーションはシグナル対ノイズの割合が高いという点において有利である。また、サンドイッチハイブリダイゼーションは、核酸プローブ系のアッセイの特異性を高めることができる。サンドイッチハイブリダイゼーション過程の主な段階を構成するインキュベーション及び後続する洗浄段階は、それぞれ恒温、約２０〜６５℃において実施する。核酸ハイブリッドは、ハイブリダイズされた塩基の数により左右され（温度は、ハイブリッドのサイズに比例して増加する）、また、ハイブリダイズされた塩基の性質及びそれぞれのハイブリダイズされた塩基の場合に隣り合う塩基の性質により左右される解離温度を有することが知られている。サンドイッチハイブリダイゼーション技術において使用されるハイブリダイズ温度は、与えられたプローブと相補的な配列の標的間に形成されたハイブリッドの半解離温度（half-dissociation temperature）以下において選択される必要がある。このような半解離温度は、簡単な通常の実験により決定することができる。
【００３９】
また、本発明の核酸プローブは、競合ハイブリダイゼーションプロトコールに使用することができる。競合ハイブリダイゼーションにおいて、標的分子は、特定のプローブとこの相補体との間におけるハイブリッド形成と競合する。存在する標的の数が増大するに伴い、プローブとこの相補体との間に形成されたハイブリッドの量は減少する。特定の標的が存在することを指示する陽性シグナルは、標的未添加のシステムと比較して、ハイブリダイゼーションが減少することが判明した。特定の様態として、便宜性のために、標識された特異的オリゴヌクレオチドプローブを標的分子とハイブリダイズする。次いで、混合物を特異的プローブと相補的なオリゴヌクレオチドが固定されたマイクロタイターディッシュウェルに入れ、ハイブリダイゼーション反応を行い続ける。洗浄後、相補的なオリゴヌクレオチドとプローブとの間のハイブリッドを、好ましくは、使用された標識によって定量する。
【００４０】
また、本発明の核酸プローブは、リバースハイブリダイゼーション（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6230, 1989）に使用することができる。この場合には、先ず、標的配列を５ビオチン化プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより酵素的に増幅することができる。第２の段階においては、増幅された産物は、固体支持体上に固定された特定のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせて検出する。リバースハイブリダイゼーションは、増幅せずに行うことができる。この場合には、生物学的試料に存在する核酸はハイブリダイズ前に化学的に、または、特定の染料を添加して特異的に、または、非特異的に標識または修飾しなければならない。
【００４１】
本発明の核酸プローブは、前記本発明において目的とする病原菌の存否を迅速に決定する上で使用可能なキットに含まれうる。キットは、病原菌の存在を検定する上で必要となるあらゆる構成要素を含む。通常の概念では、キットは、標識プローブの安定した製剤、標的とプローブ核酸のハイブリダイズを誘導するための乾燥状のまたは液状のハイブリダイゼーション液、望ましくない核酸または未ハイブリダイズの核酸を洗い取るための溶液、標識ハイブリッドを検出するための基質及び場合により標識を検出するための機器を含む。
【００４２】
本発明の特定の態様は、サンドイッチアッセイの概念を利用するキットを含む。このキットには、患者の特定の部位において検体を集めるための第１要素、例えば、検体を削り取る器具またはペーパーポイント、収容バイアル、分散及び溶解緩衝液が含まれる。第２要素は、標的とプローブ核酸との間のハイブリダイゼーションのための乾燥状または液状の媒質、及び未ハイブリダイゼーション及び望ましくない形態を洗い取るための媒質を含む。第３要素は、標的核酸の一部に相補的な非標識核酸プローブが固定または結合されている固体支持体を含む。多数の標的を分析する場合には、それぞれのｒＲＮＡに対して特異的な１種以上の捕獲プローブが計深棒（dipstick）の他の個別領域に適用される。第４要素は、第３要素が固定され、非標識核酸プローブがハイブリダイズされる同じｒＲＮＡ本鎖の第２の他の領域に相補的な標識プローブを含有する。ここで、核酸プローブは凍結乾燥された核酸などの乾燥形態、またはアルコール沈殿された核酸などの沈殿形態、または緩衝液としてプローブの配合物を含む。標識は、周知のいかなる標識も可能でありうる。例えば、プローブは、通常の手段によりビオチン化可能であり、ビオチン化されたプローブの存在は、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素に結合されたアビジンを添加した後、ペルオキシダーゼと反応したときに視覚的にモニターリングされたり、色度計または分光計を用いた装備によりモニターリング可能な基質と接触させて検出することができる。このような標識方法及びその他の酵素形態の標識は、放射能標識方法と比較して経済的であり、高度に敏感である他、比較的に安全であるというメリットを有する。検定キットの完成品には、標識プローブの検出のための種々の試薬及びその他のキットに含まれるもの、例えば、ガイドライン、陽性及び陰性対照群、並びに種々の成分を混合反応させるための容器などが含まれる。
【００４３】
ＤＮＡチップ
また、本発明の核酸プローブは、遺伝子チップにおいて使用される。本発明の好適な態様は、本発明の核酸プローブが固体支持体に固定されたＤＮＡチップを提供する。ＤＮＡチップは、小さな基板上に多数の塩基配列の断片が高密度にて集積されたものであり、基板に固定されたＤＮＡとこれに相補的な未知のＤＮＡ試料との間のハイブリダイゼーションにより未知試料のＤＮＡを検出するのに使用する。プローブを固定する基板は、ガラス、シリコンなどの無機質、または、アクリル系、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレンなどの高分子物質からなり、基板の表面が平らなもの、あるいは、多数の孔が穿孔されているものを使用することができる。プローブの固定は、５’または３’の位置が基板に共有結合により固定される。固定化方法は、通常の技術として、例えば、静電気的な力を利用したり、合成されたオリゴ上にアミン基を付着してアルデヒドコーティングされたスライドに付着してこれらの両方間の結合を誘導したり、アミン基コーティングされたスライド上に、または、Ｌ−リシンがコーティングされたスライド上に、または、ニトロセルロース膜がコーティングされたスライド上に集積することにより行われる。本発明の態様として、プローブを合成するときに、３’位置にアミノ残基を有する塩基を挿入してアルデヒド残基でコーティングされたガラス板に共有結合させる。
【００４４】
基板の表面に相異なるプローブを固定、配列するには、ピンマイクロアレイ、インクジェット、フォトリソグラフィ、電気的アレイなどの方法を使用する。本発明の態様としては、プローブを緩衝溶液に溶解させた状態で公知の方法により製作されたマイクロアレイヤーを用いて（Yoon et al, J. Microbiol. Biotechnol., 10:21, 2000）集積する。マイクロアレイヤーの原理は、微細に製作されたピンがＤＮＡをプレートから把持して基板にコンピュータが指定した同じ場所にトランスファーすることが挙げられる。マイクロアレイヤーによりトランスファーされたプローブの固定のために、約４５％〜６５％、好ましくは、約５０％〜５５％の湿度が維持される条件下においてプローブの３’位置のアミン基とガラス板にコーティングされているアルデヒド基との間の反応を円滑に行わせるために１時間以上反応を誘導し、６時間以上放置してＤＮＡプローブを固定する。
【００４５】
生命体から由来した細胞または生命体そのものを検出するために、必要に応じて、これらの細胞を化学的及び／または物理的方法により部分的にまたは完全に溶解させてこれらの細胞のＲＮＡ及び／またはＤＮＡへの接近を容易にさせ、本発明のプローブと接触させる。接触は、液体媒質または溶液中においてニトロセルロース、セルロースまたはナイロンフィルターなどの適切な支持体上において行うことができる。このような接触は、最適条件、下位の最適条件または制限条件下において行うことができる、このような条件は、温度、反応物濃度、核酸の塩基対の最適温度を下げる物質（例えば、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド及びウレア）の存在及び反応体積を低減させ、及び／または、ハイブリッド形成を加速化させる物質（例えば、デキストランサルフェイト、ポリエチレングリコールまたはフェノール）の存在を含む。
【００４６】
プローブ製作
核酸プローブは、通常のクローニング方法を用いて目的とする配列をクローニングしたり、市販のＤＮＡ合成機を用いて化学的に合成して多量に得ることができる。
【００４７】
本発明のプローブは、通常の方法に従い一本鎖または二本鎖から製作することができる。一本鎖のプローブを得る方法として最も代表的な例は、自動ＤＮＡ合成機においてＤＭＴ（ジメトキシトリチル）オフ方式により合成して脱保護反応を行った後、所望の数の塩基からなるプローブを合成するものである。このようにして製作されたプローブは、合成時に一方の鎖の末端にＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）などの蛍光物質を付着して特定の核酸の存否を確認することができる。他の方式としては、一本鎖のＤＮＡを鋳型としてそれに相補的な塩基配列を有するプローブを作成する方法であり、鋳型のＤＮＡにプライマーをアニールさせ、そのプライマーからクレノウ酵素と蛍光物質が付着した塩基（ｄＮＴＰ）を用いてプローブを合成する。これは、ＤＮＡ内部への蛍光物質の付着をもたらし、その結果、高い感度及び特異性を有するプローブを合成することができる。二本鎖のプローブを得る方法として、ゲノムＤＮＡ若しくはプラスミドＤＮＡを特定の制限酵素により切断して所望の部分の遺伝子若しくは塩基部分を含むプローブを得ることが挙げられる。ランダムプライミング方法は、６個のランダムヘキサマーと鋳型ＤＮＡをハイブリダイズさせた後、蛍光物質が付着している種々の長さのプローブを合成する方法であり、他の方式としては、ＤＮＡの５’末端に３２Ｐを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて移して蛍光物質が付着したプローブを合成することもでき、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）Ｉを用いて二本鎖のＤＮＡに切断部分を作った後、このＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ重合酵素Ｉと蛍光物質が付着した塩基（ｄＮＴＰ）を用いてプローブを合成することができる。このようにして二本鎖に合成されたプローブは、変性過程を経て一本鎖にした後、ハイブリダイゼーション反応に使用される。
【００４８】
本発明のプローブは、有利に標識可能である。いかなる通常の標識も使用可能である。プローブは、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１４Ｃなどの放射性同位元素を用いて標識することができる。放射性標識は、３または５位置を放射性標識されたヌクレオチド、ポリヌクレオチドキナーゼ、末端トランスフェラーゼまたはリガーゼを用いて末端標識するなどの通常の方法により行うことができる。放射性標識の他の方法は、本発明のプローブを化学的にヨード化することであり、このようなヨード化によりプローブ上に数個の１２５Ｉ原子が結合することになる。このように本発明のプローブの一つが放射性標識されれば、一般的に、オートラジオグラフィー、液体シンチレーション、ガンマカウンターまたは他の通常の方法を用いて放射線を検出する。また、本発明のプローブは、免疫特性を有する残基（例えば、抗原またはハプテン）、一部の試薬に対して特異的親和性を有する残基（例えば、リガンド）、検出可能な酵素反応を提供した残基（例えば、酵素、補助酵素、酵素基質または酵素反応に参与する基質）またはある波長において蛍光、発光または吸光の物理的な特性を提供する残基と結合して非放射性標識されることができる。また、プローブと標的により形成されたハイブリッドを特異的に検出する抗体を使用することができる。非放射性標識は、本発明のプローブを化学的に合成するときに提供することができる。アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン及びウラシル残基は、他の化学残基と容易に結合し、これは、プローブまたはプローブと相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ断片との間に形成されたハイブリッドの検出を可能にする。
【００４９】
標的
生物学的試料において細菌を検出し且つ同定するのに使用するための核酸基質を提供するために、試料から核酸を抽出する。核酸は、標準技術または市販中のキットを用いて種々の試料から抽出することができる。例えば、組織試料からＲＮＡまたはＤＮＡを分離するのに使用するキットは、Qiagen, Inc.（米国カリフォルニア）及びStratagene（米国カリフォルニア）から購入することができる。ＱＩＡＡＭＰブラッドキットは、血液だけではなく、骨髄、体液または細胞懸濁液からのＤＮＡの分離を可能にする。ＱＩＡＡＭＰ組織キットは、筋肉及び器官からのＤＮＡの分離を可能にする。生物学的試料が目的とする菌株の存在を指示するｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを含有するかどうかを決定する好適な方法として、核酸を菌株細胞から音波粉砕、例えば、Murphyらの米国特許５，３７４，５２２に開示された方法により放出することが挙げられる。細胞を粉砕する他の公知の方法としては、酵素の使用、浸透圧ショック、化学処理及びガラスビーズとのボルテックスが挙げられる。菌株から核酸を放出可能な他の好適な方法が、Clarkらの米国特許５，８３７，４５２及びKacianらの米国特許５，３６４，７６３に開示されている。ｒＲＮＡの放出後または放出と同時に標識プローブをハイブリダイゼーション促進剤の存在下において添加し、最適なハイブリダイズ温度において有意なハイブリダイゼーション反応に達するのに必要となる時間をかけてインキュベーションすることができる。
【００５０】
標的核酸が二本鎖である場合には、検出過程を行う前に変性を実施することが好ましい。二本鎖核酸の変性は、化学的、物理的または酵素的変性の公知方法、特に、適切な温度、８０℃以上の温度に加熱することにより行うことができる。
【００５１】
また、プローブとハイブリダイズをする標的ＤＮＡは、普通、２種類の方法により準備可能である。第一の方法は、サザンブロットまたはノーザンブロット時に使用される方法であり、ゲノムＤＮＡ若しくはプラスミドＤＮＡを適当な制限酵素により切断した後、アガロスゲル上において電気泳動をしてサイズ別にＤＮＡ断片を分離して使用する方法である。第二の方法は、ＰＣＲ方法を用いて所望の部分のＤＮＡを増幅させて使用する方法である。このときに使用するＰＣＲ方法を調べてみると、順方向と逆方向のプライマー対を同量使用して増幅させる最も普遍的なＰＣＲと、順方向及び逆方向のプライマー対を非対称的に添加して２本鎖と１本鎖のバンドを同時に得られる非対称増幅方法（非対称ＰＣＲ）、種々のプライマー対を入れて一括して増幅可能な多重増幅方法（多重ＰＣＲ）、特異的な４個のプライマーとリガーゼを用いて増幅した後、酵素免疫法により蛍光量を判定するリガーゼ連鎖反応（Ligase Chain Reaction；ＬＣＲ）方法、これらの他にも、ホットスタートＰＣＲ、ネストＰＣＲ、変性オリゴヌクレオチドプライマーＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、半定量的逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）、競合的ＰＣＲ、連鎖反復（shorttandemrepeats；ＳＴＲ）、１本鎖構造多形化（Single Strand Conformation Polymorphism；ＳＳＣＰ）、ＤＤＲＴ−ＰＣＲ（Differential Display Reverse Transcriptase ＰＣＲ）などの方法がある。
【００５２】
特定ＰＣＲ産物の増幅のための鋳型として、比較的に均質な試料（例えば、血液、細菌コロニーまたは腦脊髓液）の方がより複合的な試料（例えば、尿、唾液または排泄物）よりも一層好適であることが知られている（Shibata in PCR:The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., Birkhauser, Boston (1994), pp, 47-54）。腦脊髓液のように増幅しようとする標的核酸の複製物が比較的に少量含有された試料はＰＣＲに直接的に添加することができる。血液試料は、赤血球の抑制特性によりＰＣＲ時に特別に取り扱わなければならないが、ＰＣＲに血液を使用する前に赤血球細胞を除去しなければならない。この目的のために多くの方法が利用されており、例えば、ＣＨＥＬＥＸ１００カラム（BioRad）などを通過させることと、ＱＩＡＡＭＰブラッドキットを使用することが挙げられる。唾液から核酸を抽出することには、目的とする菌以外の他の細菌種を死滅させたり成長を抑制する事前の浄化過程（prior decontamination）が求められる。このような浄化過程は、試料をＮ−アセチル−Ｌ−システイン及びＮａＯＨにより処理することにより達成される。このような浄化過程は、唾液試料を分析する前に培養するときにのみ必要となる。
【００５３】
本発明の好適な態様は、分離された検体のＤＮＡを鋳型として非対称増幅方法を行うことにより断片遺伝子を製作する。断片遺伝子は、順方向プライマーと逆方向プライマーの添加割合を１：５とすることにより、１回のポリメラーゼ連鎖反応により獲得する。このときに使用するプライマーは、細菌の場合、共通的に１６ＳｒＲＮＡ〜２３ＳｒＲＮＡに存在する塩基配列部分であり（Pirkko K. et al., Clin. Micorbiol., 36:2205, 1999）、下記の通りである：
プライマー１−Ｓ（センス）：Ｐ−ＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣ（１５８５Ｆｗ：配列番号９）
プライマー１−Ａ（アンチセンス）：Ｃｙ３−ＴＴＴＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＣＧＧＴＡＣＴ（２３ＢＲ：配列番号１０）
プライマー２−Ｓ（センス）：Ｐ−ＡＧＴＡＣＣＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＣＧＡＡ（２３ＢＦｗ：配列番号１１）
プライマー２−Ａ（アンチセンス）：Ｃｙ３−ＴＧＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＴ（ＭＳ３７Ｒ：配列番号１２）
プライマー３−Ｓ（センス）：Ｐ−ＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＣＴＴＡＧＡＡＧＣＡ（ＭＳ３７Ｆ：配列番号１３）
プライマー３−Ａ（アンチセンス）：Ｃｙ３−ＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴ（ＭＳ３８Ｒ：配列番号１４）
【００５４】
これらのプライマーの概略の位置は、図１の通りであり、Ｆは５’末端に付着されたＦＩＴＣ蛍光物質を示す。ＰＣＲを行うとき、プローブと結合したＤＮＡを確認するために、５−ＦＩＴＣが付着されたプライマーを用いて増幅し、その後、蛍光を通じて結合を確認することにより、感染の有無と感染菌の種類を検知する。また、これらのプライマーにより増幅不可能な部分を得るために、バイオインフォマティクス方法によりマルチアライン、ＢＬＡＳＴを実施してプライマーをデザインする。
【００５５】
本発明の好適な態様として、ＰＣＲ反応は、１０ＸＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）５μＬ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰがそれぞれ２．５ｍＭ）４μＬ、１０pmoleの順方向プライマー０．５μＬ、１０pmoleの逆方向プライマー２．５μＬ、１／１０に希釈した鋳型ＤＮＡ（１００ｎｇ）１μＬ、Ｔａｑポリメラーゼ（５unit／μＬ、Takara Shuzo Co., Shiga, Japan）０．５μＬを添加後、総体積が５０μＬになるように水を添加する。最初の変性は９４℃において７分間、２回目の変性は９４℃において１分間行う。アニールは５２℃において１分、延長は７２℃において１分間行い、これを１０回繰り返し行う。この後、さらに３回目の変性は９４℃において１分、アニールは５４℃において１分、延長は７２℃において１分間行い、これを３０回繰り返し行う。この後、７２℃において５分間最後の延長を１回行う。ＰＣＲ反応の結果として生成された産物は、アガロスゲル電気泳動法により確認する。
【００５６】
ハイブリダイゼーション及び洗浄
ハイブリダイゼーション技術は、本発明において特定的なものではない。この技術は、一般的に、文献（Gall and Pardue, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 63:378, 1969, John, Burnsteil and Jones, Nature, 223:582, 1969）に開示されている。
【００５７】
ハイブリダイズ条件は、厳密性（stringency）、すなわち、作用条件の厳しさにより決定される。ハイブリダイズが行われる厳密性が高度になればなるほど、ハイブリダイズは一層特異的になる。厳密性は、特に、プローブ／標的結合体の塩基組成だけではなく、両核酸間の不整合の度合いの関数である。厳密性はまた、ハイブリダイゼーション溶液に存在するイオンの濃度及び種類、変性剤の性質及び濃度及び／またはハイブリダイゼーション温度などのハイブリダイゼーション反応の変数の関数でありうる。ハイブリダイゼーション反応が行われるべき条件の厳密性は、特に、使用されたプローブに依存する。これらの全てのデータは周知であり、適切な条件は個々の場合に通常の実験により決定することができる。一般的に、使用されたプローブの長さによって、ハイブリダイゼーション反応の温度は、約０．８〜１Ｍ濃度の塩水溶液中において約２０℃〜６５℃、特に、３５℃〜６５℃である。
【００５８】
標識オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションは、Hoganらの米国特許５，０３０，５５７に記述された手続きに従い、非標識ヘルパーオリゴヌクレオチドを用いて増強することができる。ヘルパーオリゴヌクレオチドは、プローブにより結合される領域外の他の標的核酸の領域と結合する。この結合は、一本鎖核酸の標的領域に新たな二次及び３次構造を取ってプローブの結合速度を加速化する。
【００５９】
当業者であれば、プローブと標的との間に形成されたハイブリッドの熱安定性に影響を及ぼす因子もまた、プローブ特異性に影響を及ぼしうることが理解できるであろう。このため、プローブと標的のハイブリッドの溶融温度（melting temperature）を含んで、融点プロファイルがそれぞれのプローブと標的のハイブリッドに対して経験的に決定されなければならない。このような決定は、Arnoldらの米国特許第５，２８３，１７４号に記述された方法により行うことができる。プローブと標的のハイブリッドの溶融温度を決定する一つの方法は、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイを行うことを含む。この検定方法によれば、リチウムラウリルサルフェイトを含有するリチウムサクシネート緩衝溶液中の過量の標的の条件下においてプローブと標的のハイブリッドを形成する。予め形成されたハイブリッドの一部をハイブリダイゼーション緩衝液に希釈し、予想される溶融温度（典型的に、５５℃）以下から始まって２〜５℃を増加させた種々の温度において５分間インキュベーションする。その後、この溶液を弱アルカリ性ホウ酸緩衝液により希釈し、より低い温度（例えば、５０℃）において１０分間インキュベーションする。一本鎖プローブに連結されたアクリジニウムエステルは、これら条件下において加水分解される一方、ハイブリダイズされたプローブに連結されたアクリジニウムエステルは相対的に保護される。この手続きをハイブリダイゼーションプロテクションアッセイという。化学発光の残留量はハイブリッドの量に比例し、過酸化水素に続き、アルカリを次第に添加して発光計測器により測定する。このデータを温度に対する最大シグナル（普通、最低温度）のパーセントにてプロットする。溶融温度は、最大シグナルの５０％が残っているポイントであると定義される。他の方法として、プローブと標的のハイブリッドに対する溶融温度は、放射性同意元素により標識されたプローブを用いて決定することができる。あらゆる場合において、与えられたハイブリッドに対する溶融温度は、ハイブリダイゼーション溶液に含有されている塩、洗浄剤及びその他の溶質の濃度によって様々である。これらの全ての因子は熱変性中に相対的なハイブリッド安定性に影響を与える。
【００６０】
ハイブリダイゼーション条件は、いくつかの変数、例えば、ハイブリダイゼーション温度、媒質成分の性質及び濃度、形成されたハイブリッドと洗浄時温度などを考慮してモニターリングすることができる。ハイブリダイゼーション及び洗浄温度は、プローブの塩基配列、種類及び長さによって上位値に限定し、最大ハイブリダイゼーション温度または洗浄温度は約３０℃〜６０℃である。より高い温度において二本鎖プローブと標的との間に形成されたハイブリッドの解離または変性と競合する。ハイブリダイゼーション媒質は、例えば、約３ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、約２５ｍＭリン酸塩緩衝液ＰＨ７．１及び２０％脱イオンホルムアミド、０．０２％フィコール、０．０２％牛血清アルブミン、０．０２％ポリビニールピロリドン及び約０．１ｍｇ／ｍＬ切削されて変性された鮭精子ＤＮＡを含有する。洗浄媒質は、例えば、約３ｘＳＳＣ、２５ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．１及び２０％脱イオンホルムアミドを含有する。プローブ及び媒質の修飾によって、目的とする特異性を得るためにハイブリダイゼーションまたは洗浄温度は、周知の連関性によって変えなければならない。このような観点から、一般的に、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドはＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドよりも安定性に劣るため、検出されるハイブリッドの性質によってハイブリダイゼーション条件は特異的検出を達成するために適切に調整されなければならない。
【００６１】
本発明の好適な特定の態様として、ハイブリダイゼーション緩衝溶液（６×ＳＳＰＥ（０．１５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７、ｐＨ７．０）、２０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド）をＰＣＲ増幅遺伝子と混合し、プローブが固定されたガラス板の上に分注した後、３０℃において６時間反応させて相補的な結合を誘導する。時間経過後、３×ＳＰＥ、２×ＳＳＰＥ、１×ＳＳＰＥの順にそれぞれ５分ずつ洗浄する。
【００６２】
ハイブリッドの定量は、通常の方法に従い、標的をのように蛍光若しくは放射性同意元素により標識して行われる。標識は、プライマーそのものにしてもよく、増幅及び転写時に蛍光及び放射性同意元素が標識された塩基残基を使用することにより行われてもよい。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を、実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界における通常の知識を持った者にとって自明である。
【００６４】
《実施例１：スタフィロコッカス・アウレウスを同定するためのＤＮＡプローブ候補群の選別》
スタフィロコッカス・アウレウスを検出及び同定するために、スタフィロコッカス・アウレウスに特異的なプローブを製作した。特異プローブの製作のために、スタフィロコッカス・アウレウスにのみ特異性を有する特異プローブ候補群を選定した。特異プローブ候補群はＧｅｎＢａｎｋにおいて公知であるスタフィロコッカス・アウレウスの２３ＳｒＲＮＡ塩基配列をこれまで判明した細菌の塩基配列とマルチアラインして比較し、スタフィロコッカス・アウレウスにのみ存在する特異的な塩基配列を区分してその内部に存在するプローブ候補群を製作した。プローブ候補群は、スタフィロコッカス・アウレウスゲノムの２３ＳｒＲＮＡ遺伝子において決定した。プローブ候補群の特異性の有無はＢＬＡＳＴ検索を通じて配列相同性を比較することにより確認した。その結果、選別されたプローブ候補群は、下記表１に示す通りであった。
【００６５】
【表１】
2010515452.tif 000003
【００６６】
《実施例２：核酸プローブの合成》
ＤＮＡチップに適用するために、前記実施例１において選別された各プローブ候補群を合成した。モノヌクレオチド（Proligo Biochemie GmbH Hamburg Co.）を自動核酸合成機（ExpediteTM 8900, PE Biosystems Co.)に投入し、目的とするプローブの塩基配列と０．０５μmole合成スケールを入力して純粋な核酸プローブを得た。得られたプローブは電気泳動を通じて合成の有無を確認した。
【００６７】
《実施例３：ＤＮＡチップの製作》
実施例２において合成されたＤＮＡプローブを固定化するために、アルデヒド基−アミン基間の結合を用いた。ＤＮＡプローブを固定化するために全てのＤＮＡ断片プローブを合成するとき、３’−最初の位置にアミノリンカーカラム（Cruachem, Glasgrow, Scotland）を用いてアミン残基を有する塩基を挿入し、ガラス板はアルデヒド残基によりコーティングされているものを購入（CEL Associates, Inc. Huston, Texas, USA）した。
【００６８】
プローブを固定するときには、３×ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＣ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７、ｐＨ７．０）緩衝溶液にプローブを溶解させた状態でマイクロアレイヤー（MicroGrid spotter, Biorobotics Inc, England）を用いてスポットした後、約５５％の湿度が維持される条件において１時間以上化学反応を誘導し、６時間以上放置することによりＤＮＡプローブを固定化した。菌検索用プローブは、１００pmole／μＬの濃度にて全プローブを２５０〜２７５μｍの間隔をおいて順番に集積化させてプローブが固定されたＤＮＡチップを製作した。
【００６９】
プローブのアミン基とガラス板上のアルデヒドとの反応が円滑になされて固定化が上手く行われたかを確認するために、SYBRO green II（Molecular Probe, Inc., Leiden, Netherlands）により染色して確認した。
【００７０】
《実施例４：標的試料の分離及び増幅》
下記の５９種の標準菌株からゲノムＤＮＡを別途に抽出した。
【００７１】
【表２】
2010515452.tif 000004
2010515452.tif 000005
【００７２】
先ず、適正培地において培養した菌を２００μＬの滅菌蒸留水に懸濁し、１４，０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離した後、上澄液を捨て、菌体のみを得た。
【００７３】
グラム陰性菌の場合、前記菌体をＡＴＬ溶液（Tissue Lysis溶液、DNeasy Tissue Kit、QIAGEN）１８０μＬに浮遊させ、ProteinaseＫ２０μＬを入れて溶菌し、次いで、５５℃において１時間反応させた後、ＡＬ溶液（Lysis溶液、DNeasy Tissue Kit、QIAGEN）２００μＬを入れて７０℃において１０分間反応させて、溶菌液として使用した。前記溶菌液にエタノール（１００％）２００μＬを入れて混ぜた後、DNeasyミニカラム入り２ｍＬチューブに全溶液を移して８，０００ｒｐｍ以上において１分間遠心分離して下部のチューブに溜まる液を除去した。さらに上部チューブにＡＷ１溶液（洗浄溶液１、DNeasy Tissue Kit、Qiagen）５００μＬを入れ、８，０００ｒｐｍ以上において１分間遠心分離して流出物を除去し、さらにＡＷ２溶液（洗浄溶液２、DNeasy Tissue Kit、QIAGEN）５００μＬを入れて１５，０００ｒｐｍにおいて３分間遠心分離してDNeasy膜を乾燥し、流出物を除去した。前記DNeasyカラムに溶出溶液を入れて室温において１５分間静置した後、８，０００ｒｐｍ以上において１分間遠心分離してゲノムＤＮＡを溶出した。
【００７４】
グラム陽性菌の場合、前記菌体をリソザイム溶菌溶液（20mm Tris-Cl, pH8.0, 2mM EDTA, 1.2% TritonX-100, 20mg/mL lysozyme）１８０μＬに懸濁し、次いで、３７℃において３０分以上反応させた後、ProteinaseＫ２５μＬとＡＬ溶液（溶菌溶液、DNeasy Tissue Kit, QIAGEN）２００μＬを入れてよく混ぜた。その後、７０℃において３０分間反応させて溶菌液として使用し、この後、ゲノム分離は上記の方法と同様にして行った。
【００７５】
上記のようにして分離された標準菌株のＤＮＡを鋳型とし、下記のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲを行うとき、プローブと結合したＤＮＡを確認するために、５’末端にＣｙ３が付着された逆方向プライマーを用いて増幅することにより蛍光を通じて結合を確認した。ＰＣＲ反応には、下記の３対のプライマーが同時に使用された。
【００７６】
プライマー１−Ｓ（センス）：Ｐ−ＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣ（１５８５Ｆｗ：配列番号９）
プライマー１−Ａ（アンチセンス）：Ｃｙ３−ＴＴＴＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＣＧＧＴＡＣＴ（２３ＢＲ：配列番号１０）
プライマー２−Ｓ（センス）：Ｐ−ＡＧＴＡＣＣＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＣＧＡＡ（２３ＢＦｗ：配列番号１１）
プライマー２−Ａ（アンチセンス）：Ｃｙ３−ＴＧＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＴ（ＭＳ３７Ｒ：配列番号１２）
プライマー３−Ｓ（センス）：Ｐ−ＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＣＴＴＡＧＡＡＧＣＡ（ＭＳ３７Ｆ：配列番号１３）
プライマー３−Ａ（アンチセンス）：Ｃｙ３−ＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴ（ＭＳ３８Ｒ：配列番号１４）
【００７７】
前記配列の５’末端に表示されたＰはリン酸基を示し、Ｃｙ３はＣｙ３蛍光物質を示す。
【００７８】
ＰＣＲ反応は、下記の条件下において行った。１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）５μＬ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰがそれぞれ１０ｍＭ）１μＬ、１０pmole順方向プライマー１μＬ、１０pmole逆方向プライマー１μＬ、１／１０に希釈した鋳型ＤＮＡ（１００ｎｇ）１μＬ、Ｔａｑポリメラーゼ（５unit／μＬ、Solgent Co., Korea）０．２μＬを添加した後、総体積が５０μＬになるように蒸留水を添加した。
【００７９】
９４℃において５分間最初の変性を行い、変性９４℃において５０秒、アニール５６℃において５０秒、延長７２℃において１分１０秒を１サイクルとして１０回繰り返した後、変性９４℃において５０秒、アニール５８℃において５０秒、延長７２℃において１分１０秒を１サイクルとして２０回繰り返し行った。最後に、７２℃において５分間最後の延長を１回行った。ＰＣＲ反応結果として生成された産物は、アガロスゲル電気泳動法により各菌株に対してＤＮＡ二本鎖が合成されていることを確認した。ＰＣＲを通じて得られたＤＮＡはＰＣＲ精製キット（QIAGEN Co.）を用いて精製し、ラムダエキソヌクレアーゼ（New England Biolabs Inc., Netherlands）を１μＬ添加して３７℃において１時間反応させた後、１本鎖ＤＮＡを得た。ラムダエキソヌクレアーゼは５’末端にリン酸基が付着されているＤＮＡ鎖を選択的に切断して分解する酵素である。このため、５’末端にリン酸基を付着して合成した順方向プライマーをもってＰＣＲを行うと、ＰＣＲ産物のＤＮＡ鎖にリン酸基が付着することになる。ここに、ラムダエキソヌクレアーゼを処理すると、増幅されたＤＮＡ二本鎖のうち５’末端にリン酸基が付着されている鎖は分解されるため、結局には５’末端にＣｙ３蛍光物質が付着されている１本鎖だけが残ることになる。
【００８０】
《実施例５：ハイブリダイゼーション及び洗浄》
プローブ候補群の特異性と感度を確認するために、実施例４において増幅したＰＣＲ産物を実施例３において製作した核酸プローブが固定されたＤＮＡチップに適用してハイブリダイゼーション反応を実施した。前記核酸プローブが固定されたＤＮＡチップをスタフィロコッカス・アウレウス標準菌株から分離したゲノム遺伝子のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせた後、シグナルが現れる場合、残りの種に対する交差反応（特異性）の有無を試験した。
【００８１】
ガラス板に核酸プローブが固定されたＤＮＡチップに水蒸気を当てて加水化させた後、７０％エタノールに浸漬することによりガラス板に固定されていないプローブを除去した。この後、ハイブリダイゼーション過程中に蛍光物質がガラス板表面に残っているアルデヒド残基に付着されて全体的なシグナルを高めて特異的なプローブのシグナル効果を阻害することを防止するために、ガラス板をブロッキング溶液（１．３ｇＮａＢＨ４、３７５ｍＬＰＢＳ、１２５ｍＬ１００％エタノール）に浸漬した後、攪拌器において５分間反応させた。０．２％ＳＤＳにより５分間洗浄後、滅菌水により１分間５回洗浄し、次いで、遠心分離器を用いてガラス板にある水気を除去した（１，５００ｒｐｍ、３分間）。
【００８２】
ハイブリダイズさせる溶液は、ハイブリダイゼーション緩衝溶液（６×ＳＳＰＥ；２０ＸＳＳＰＥ；３ＭＮａＣｌ、０．２ＭＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０２ＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、２０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド；Sigma Co., St. Louis）に実施例４において増幅させたＤＮＡ断片を５０μＬ入れて総体積が２００μＬになるように製造した。製造された溶液をプローブが固定化されているガラス板の上に分注した後、プローブ−クリッププレス−シール培養チャンバー（Sigma Co., St. Louis, MO.）で覆った。
【００８３】
ハイブリダイゼーション中にガラス板の周辺が乾燥されることを防止するために、ハイブリダイゼーションチャンバーにウェットティッシュを入れた後、３０℃恒温培養器において８時間以上反応させて相補的な結合を誘導した。時間経過後、３×ＳＳＰＥ（０．４５ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＣ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７、ｐＨ７．０）、１×ＳＳＰＥ（０．１５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７、ｐＨ７．０）の順にそれぞれ５分ずつ洗浄した後、遠心分離器を用いてガラス板にある水気を除去した（１，５００ｒｐｍ、３分間）。
【００８４】
《実施例６：ハイブリッドの検出》
ハイブリダイゼーション反応の結果はアレイワークス・マイクロアレイスキャナー（ArrayWorks, Applied Precision, Inc., USA）を用いて検索し、その結果を下記表３に示す。
【００８５】
【表３】
2010515452.tif 000006
【００８６】
《実施例７：ブラインド試験》
実施例３において製作されたＤＮＡチップを用いてスタフィロコッカス・アウレウスに対するブラインド試験を実施した。図１のＡ及び図２のＡは、ブラインド試験のためのＤＮＡチップのデザインを示すものである。これらの図面に記載の名称は、前記表１に示すプローブがガラス板に固定されている位置を示す。ポジションマーカーとしてアミン３’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−５’−ＦＩＴＣを使用し、Ｍと表記した。なお、陰性対照群としてプローブを溶かしたバッファ（３ＸＳＳＣ）を使用し、空欄で表示した。
【００８７】
この実施例に使用された検体は６４名の病原性感染患者の特定部位から採取されたものを一日中培養後に得たサンプルであり、菌の感染有無は培養方法により確認した。
【００８８】
培養された検体からゲノムＤＮＡを下記のようにして抽出した。検体が体液である場合、１０ｍＬの体液をＥＤＴＡチューブ若しくはプレインチューブに集めた。検体の量が１０ｍＬ以上であれば５，０００×ｇにおいて１５分間遠心分離し、１０ｍＬ以下であれば１４，０００ｒｐｍにおいて１５分間遠心分離した後、沈殿物を１．５ｍＬチューブに集めた。前記沈殿物をリソザイム緩衝液（２０ｍＭ Tris−Ｃｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭのＥＤＴＡ、１．２％のTritonＸ−１００、２０ｍｇ／ｍＬ lysozyme）１８０μＬに懸濁して、３７℃において３０分間インキュベーションした後、プロテイナーゼＫ２０μＬとＡＬ溶液（溶菌溶液、QIAamp DNA Blood Mini Kit, QIAGEN）２００μＬを入れて静かに混ぜた後、５５℃において２時間反応させ、さらに９５℃において１０分間反応させた。１００％エタノール２００μＬを入れて混ぜた後、ＱＩＡａｍｐスピンカラム入り２ｍＬチューブに全溶液を移して８，０００ｒｐｍにおいて１分間遠心分離してチューブに溜まる液を除去した。前記スピンカラムにＡＷ１溶液（洗浄溶液１、QIAamp DNA Blood Mini Kit, QIAGEN）５００μＬを入れて８，０００ｒｐｍにおいて１分間遠心分離して流出物を捨て、さらにＡＷ２溶液（洗浄溶液２、QIAamp DNA Blood Mini Kit, QIAGEN）５００μＬを入れて１４，０００ｒｐｍにおいて１分間遠心分離して流出物を捨てた。ＱＩＡａｍｐスピンカラムを１．５ｍＬの新たなチューブに移してＡＥ溶液（溶出溶液、DNA Blood Mini Kit, QIAGEN）３００μＬを入れて室温において１５分間静置した後、８，０００ｒｐｍにおいて３分間遠心分離してゲノムＤＮＡを溶出した。前記溶出液に１００％エタノール７５０μＬを入れて−２０℃において１時間静置し、１４，０００ｒｐｍにおいて２０分間遠心分離した後、上澄液のエタノールを捨てて乾燥させた。その後、ＤＮＡペレットは２０μＬの滅菌蒸留水に溶かして濃縮させた。
【００８９】
検体が血液である場合、１０ｍＬ血液をＥＤＴＡチューブにサンプリングした。４℃、１，８００ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離して血漿層を１．５ｍＬチューブに分け、１４，０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離した後、沈殿物を１．５ｍＬチューブに分けた後、上記の方法と同様にしてゲノムＤＮＡを濃縮した。
【００９０】
増幅、ハイブリダイゼーション反応、洗浄及びハイブリッドの検出は、前記実施例４及び実施例５に記載の方法と同様にして実施し、その結果を下記表４に示す。表中、分母は検体の適用回数であり、分子はハイブリダイゼーションによるシグナルが現れた回数を示す。
【００９１】
【表４】
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【００９２】
図１のＢ及び図２のＢは、スタフィロコッカス・アウレウスを含む検体に対するブラインド試験において、スキャンアレイ５０００を用いて検索された図１Ａ及び図２ＢのＤＮＡチップにおけるハイブリダイゼーションの結果を示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
以上、詳述及び立証したように、本発明は、スタフィロコッカス・アウレウスゲノムの２３ＳｒＲＮＡ遺伝子においてスタフィロコッカス・アウレウスに特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドが固定されていることを特徴とするスタフィロコッカス・アウレウス検出及び同定用ＤＮＡチップ及び前記オリゴヌクレオチドからなるスタフィロコッカス・アウレウス検出及び同定用プローブを提供する効果がある。本発明によるＤＮＡチップを使用すれば、現在使用中の方法であるサンプル培養により感染性疾患を診断する方法よりもさらに迅速で且つ正確に細菌感染を診断することができる。
【００９４】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。本発明の単純な変形や変更はこの分野における通常の知識を持った者によって容易に利用可能であり、このような変形や変更はいずれも本発明の領域に含まれると見られる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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