(57)【要約】  本発明は、制御された膜貫通流出及び／又は流入のための、少なくとも1つの膜貫通トリガー輸送系を含む小胞に関する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの膜貫通輸送トリガー系を含む小胞。
【請求項２】
膜貫通流出及び／又は流入トリガー系を含む、請求項1に記載の小胞。
【請求項３】
少なくとも1つの膜貫通チャネルタンパク質、好ましくは孔形成タンパク質を含む、請求項1に記載の小胞。
【請求項４】
少なくとも1つの外膜チャネルタンパク質を含む、請求項1に記載の小胞。
【請求項５】
ポーリン、好ましくはOmpF、PhoE、LamB、FepA、Tsx及びFhuA、並びにその一部及び相同体からなる群より選択される、少なくとも1つのチャネルタンパク質を含む、請求項1に記載の小胞。
【請求項６】
前記タンパク質が標識されている、請求項1に記載の小胞。
【請求項７】
前記タンパク質が、アミノ基標識物質で標識されている、請求項1に記載の小胞。
【請求項８】
前記アミノ基標識物質が、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル及びビオチンジスルフィドN-ヒドロキシスクシンイミドエステルからなる群より選択される、請求項1に記載の小胞。
【請求項９】
前記小胞が、リポソーム、ポリマーソーム及びシントソームからなる群より選択される、請求項1に記載の小胞。
【請求項１０】
封入膜からなる、請求項1に記載の小胞。
【請求項１１】
前記封入膜がブロック共重合体から構成される、請求項10に記載の小胞。
【請求項１２】
以下のステップ：
a）標識物質の溶液又は分散液に膜貫通チャネルタンパク質を添加するステップ、
b）小胞を形成する分子の溶液又は分散液に上記標識膜貫通チャネルタンパク質を添加するステップ、
c）上記標識膜貫通チャネルタンパク質が小胞の膜に組み込まれた小胞を形成するステップ
を含む、請求項1に記載の小胞の製造方法。
【請求項１３】
以下のステップ：
a）標識物質の溶液又は分散液に膜貫通チャネルタンパク質を添加するステップ、
b）小胞を形成する分子の溶液又は分散液に上記標識膜貫通チャネルタンパク質を添加するステップ、
c）ステップb）から得た溶液又は分散液を、小胞内で荷電しようとする物質を含む溶液又は分散液に添加するステップ、
d）上記標識膜貫通チャネルタンパク質が小胞の膜に組み込まれ、かつ上記物質が小胞に封入された小胞を形成するステップ
を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
請求項1に記載の小胞を含む分散液に、化学反応中に標識物質の少なくとも一部を分離することにより膜貫通チャネルタンパク質を開口させる物質を添加する、膜貫通輸送の誘発方法。
【請求項１５】
前記化学反応が、還元、酸化、及び置換からなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制御された膜貫通流出及び／又は流入のための、少なくとも1つの膜貫通トリガー輸送系を含む小胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
小胞は、自己集合した両親媒性分子から構成される球状のケージである。両親媒性物質は、溶質に対する親和性が異なる2つの成分からなる高分子である。両親媒性物質の疎水性部分は、非極性溶媒の方を選択するのに対し、親水性部分は、水性媒質に親和性を有する。また、３つの連結した親水性−疎水性−親水性部分を含む高分子により別の小胞を形成することもできる。これらの構造上の特徴により、選択溶媒において疎水性セグメントの凝集が可能になる。従って、これらの分子は、水性環境において自己集合し、規則正しい構造（ミセル、ロッド、小胞、又はより大きな凝集体）を形成する。 
小胞は主に、例えば、薬剤担体として、封入のために、又は制御された反応を目的とするコンパートメント構築のために用いられる。
【０００３】
例えば、膜安定性、柔軟性又は透過性を考慮して所望の機能性が得られるように小胞を合成するための多くの手法が知られている。 
リポソームは、両親媒性分子であるリン脂質から作製される小胞である。ポリマー小胞は、往々にして「ポリマーソーム」と呼ばれるが、詳しく研究され、その経過が論文にまとめられている［Discherら、Science 2002, 297; 967 973］。ポリマーソーム又はポリマー小胞は、自己集合したジ−若しくはトリブロック共重合体からなる。 
シントソーム（Synthosome）は、官能化ナノコンパートメント系であり、推定生物工学的用途のために開発されたものである［Nardinら、Chem. Commun. 2000, 1433 1434］。シントソームは、ブロック共重合体膜と、操作された膜貫通タンパク質（選択的ゲートとして働く）とを含む、機械的に安定した小胞から構成される中空の球体である。
【０００４】
シントソームは、膜貫通タンパク質の存在下での自己集合によりブロック共重合体から形成される。シントソーム系は、生体模倣の手法において、生体輸送系の非対応選択性と、新規の機能性ふるい（functionalised sieve）に対するポリマーの頑健性とを兼ね備えている。シントソームは、リポソームより機械的に安定で、従来の機能的ビーズ又はポリマーソームより選択的である。
【０００５】
OmpF、マルトポリン（Maltoporin）、及びFhuAのような膜貫通タンパク質は、高分子膜に組み込まれ、選択的化合物通過のためのゲートとして用いられてきた。 
EP 1559790A1に開示されているように、これらのシントソームは、捕捉により標識化合物を分離する、又は、これらの化合物を特定の反応、例えば、酵素による変換に供するための新規の分離機構として用いられている［Onacaら、Biotechnol. J., 2006, 795-805, Nallaniら、J. Biotech., 2006, 50-59］。
【０００６】
この選択は、通過する化合物の大きさ、並びに埋め込まれる膜貫通タンパク質により、又は膜貫通孔と移行化合物との相互作用により形成される孔の開口部の直径に基づいて行われる。
【０００７】
また、制御系、例えば、化合物の膜貫通通過のためのトリガーも必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、このような制御系、例えば、予定時点に孔を介した移行（translocation）を可能にする、化合物の膜貫通通過のためのトリガーを自由に使えるようにすることである。 
このような通過は、所定の化合物にのみ可能となるべきである。すなわち、選択性（選択又は分離）が実施されなければならない。 
さらに本発明の目的は、トリガーが、膜貫通輸送の時点だけではなく、移行速度、例えば、所定時間内の化合物の流出／流入量も制御することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的は、膜貫通輸送トリガー系、及び本明細書に記載の本発明の方法、並びに特許請求の範囲に記載の実施形態を提供することにより、達成されることがわかった。
【００１０】
一実施形態では、本発明の主題は、少なくとも1つの膜貫通輸送トリガー系を含む小胞である。
【００１１】
本発明において、用語「小胞」とは、水又は水溶液中の自己集合両親媒性分子から構成される半透過性球状ケージを意味する。換言すれば、小胞は、自己集合した安定な膜により周囲を囲まれた水溶液のほぼ非透過性又は半透過性バッグを意味し、その安定な膜は、主として、自己集合した両親媒性分子から大部分が構成される。 
半透過性は、溶質、好ましくは水に対する選択的透過性であり、透過性は膜貫通トリガー系（生物学的成分）を介して達成されることが本発明には不可欠である。本発明の小胞膜は、膜からの化合物流出を阻止し、膜貫通トリガー輸送系を機能的形態で提供する。
【００１２】
本発明の一実施形態では、小胞は、リポソーム、ポリマーソーム及びシントソームからなる群から選択される。 
実際、本発明は、溶質、好ましくは水に対する選択的透過性を示す限り、あらゆる種類の小胞（生体膜を含むものであっても）に関連する。 
一実施形態では、本発明は、膜において両親媒性分子の溶質に対する選択的透過性を、好ましくは共有結合により架橋した分子により達成する小胞を提供する。
【００１３】
一実施形態では、本発明の小胞は、封入膜からなる。 
本発明で用いられる封入膜は、膜によって画定される空間体積の内部に含まれる溶質、又はその外部に維持される溶質のいずれかに対し選択的に透過性であることにより、コンパートメント化する。従って、本発明の小胞は、溶液、好ましくは水溶液中の被膜であり、この被膜も、溶液、好ましくは水溶液を含む。
【００１４】
一実施形態では、本発明の小胞は、封入膜がブロック共重合体から構成されるシントソームである。ブロック共重合体は、化学的性質が異なる少なくとも2つの縦列に相互連結した領域を含むポリマーである。各領域は、モノマーの反復配列を含む。従って、「ジブロック共重合体」は、2つのこのような連結領域（A-B）を含み、「トリブロック共重合体」は3つの領域（A-B-C）等を含む。各領域は、それ自身の化学的同一性と、溶媒に対する選択性を有することができる。 
ブロック共重合体から構成される小胞は、Nardinら［Eur. Physical one. J. E 4, (2001), 403-410］及びWO 01/32146号に開示されている。
【００１５】
一実施形態では、両親媒性共重合体は、少なくとも1つの親水性領域Aと少なくとも1つの疎水性領域Bとを含むセグメント化共重合体であり、このセグメント化共重合体は、小胞の形成下で自己集合する。両親媒性共重合体はまた、2以上の親水性セクション又は領域と2以上の疎水性セクション又は領域を含んでいてもよい。好ましくは、共重合体は、2つの親水性セクションと、これらの間に位置する1つの疎水性セクションを含む、ABA構造を有する。本発明の小胞の合成のためには、ブロック共重合体を用いるのが好ましく、好ましくは線状ブロック共重合体、並びに、加えてグラフト共重合体及び／又は櫛型共重合体を用いるが、これらは、少なくとも1つの親水性セクションと少なくとも1つの疎水性セクションを含む。
【００１６】
一実施形態では、両親媒性共重合体は、以下：
ABA-ブロック共重合体：ポリ(2-メチルオキサゾリン)-ポリ(ジメチルシロキサン)-ポリ(2-メチルオキサゾリン)（PMOXA-PDMS-PMOXA）；
ポリ(エチレングリコール)-ポリ-(プロピレンスルフィド)-ポリ(エチレングリコール) （PEG-PPS-PEG）；
AB-ブロック共重合体：ポリ(エチレンオキシド)-ポリ(エチルエチレン)（PEO-PEE）、
ポリ(スチレン)-ポリ(3-(イソシアノ-L-アラニル-アミノ-エチル)-チオフェン)(PS-PIAI)；並びに
高分子電解質系：ポリ(硫化スチレン)、ポリ(アリルアミン)（PSS、PAH）
からなる群より選択される。
【００１７】
一実施形態では、両親媒性共重合体は、ABA-ブロック共重合体：ポリ(2-メチルオキサゾリン)-ポリ(ジメチルシロキサン)-ポリ(2-メチルオキサゾリン)（PMOXA-PDMS-PMOXA）である。 
一実施形態では、両親媒性共重合体は、EP 1559790 A1、段落［0011］〜［0015］に開示されている群から選択する。
【００１８】
一実施形態では、小胞壁の厚さは、5 nm〜100 nm、好ましくは5 nm〜50 nm、6 nm〜30 nm、7 nm〜25 nm、8 nm〜15 nm、さらに好ましくは10 nmの範囲である。一実施形態では、小胞壁の直径は、10 nm〜2,500 nm、20 nm〜1,000 nm、40 nm〜800 nm、50 nm〜400 nm、50 nm〜200 nm、5 nm〜150 nm、200 nm〜400 nm、100 nm〜400 nm、さらに好ましくは100 nm〜200 nmの範囲である。
【００１９】
一実施形態では、本発明の小胞は、サイズ排除クロマトグラフィー、ゼータ電位測定、顕微鏡検査、及び／又は示差走査熱量測定により特性決定する。 
一実施形態では、本発明の小胞は、膜貫通流出及び／又は流入トリガー系を含む。言い換えれば、このトリガー系は、予定時点に、小胞からの制御された膜貫通流出及び／又は小胞内への制御された膜貫通流入を可能にする。 
さらに、このトリガー系により、ある種の所定の及び選択された化合物の制御された膜貫通流出及び／又は流入が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ピリジル−（左側）及びビオチニル−標識（右側）を含む6つの化学修飾リシン（167、344、364、537、556、586；FhuA Δ1-160）の反応スキームを示す。
【図２】還元トリガーDTTの添加前及び添加後のシントソームのカルセイン放出動態（任意単位）（A）及び絶対カルセイン濃度（B）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
一実施形態では、本発明の小胞は、少なくとも1つの膜貫通チャネルタンパク質、好ましくは孔形成タンパク質を含む。この膜貫通チャネルタンパク質は、以下：
a）孔形成膜貫通タンパク質、
b）特に、アラメチシン、メリチン、マガイニン及びデルマセプチンからなる群より選択される、αへリックス膜貫通構造を有する孔形成膜貫通タンパク質、
c）特に、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）ポーリン、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）ポーリン、OmpF、PhoE、OmpK36、Omp、マルトポリン、LamB、ScrY、FepA、FhuA、TolC及びαヘモリジンからなる群より選択される、βバレル膜貫通構造を有する孔形成膜貫通タンパク質、
d）膜貫通構造が膜を貫通し、この膜に孔を形成する、孔形成膜貫通タンパク質、例えば、a）、b）及びc）に記載したタンパク質の一部、該タンパク質の相同体、及び／又は該相同体の一部の膜貫通構造、
e）膜を貫通し、膜に孔を形成し、a）、b）、c）及び／又はd）に記載のタンパク質と相同の構造を有するタンパク質（ここで、相同構造とは、膜に集合したとき、孔を形成する三次及び／又は四次構造を意味する）
の活性を有するポリペプチドからなる群より選択される。
【００２２】
一実施形態では、本発明の小胞は、外膜チャネルタンパク質の活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む。
【００２３】
一実施形態では、本発明の小胞は、ポーリン、好ましくはOmpF、PhoE、LamB、FepA、Tsx及びFhuA、並びにその部分及び相同体からなる群より選択されるチャネルタンパク質の活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む。 
一実施形態では、本発明の小胞は、FhuA、FhuA（Δ1-20）、FhuA（Δ1-40）、FhuA（Δ1-63）、FhuA（Δ1-105）、FhuA（Δ1-160）、並びにその一部及び相同体からなる群より選択されるチャネルタンパク質の活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む。 
一実施形態では、本発明の小胞は、FhuA（Δ1-160）タンパク質又はその相同体の活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む。
【００２４】
本発明において、タンパク質又はポリペプチドは、このような表現が、これが膜に挿入された又は集合した場合に孔を形成するポリペプチドを直接又は間接的に指す場合、段落［0021］〜［0023］に記載するタンパク質の「活性」を有する。 
一実施形態では、挿入されたチャネルポリペプチドの断面は、1 nm〜30 nm、2 nm〜20 nm、2 nm〜10 nm、好ましくは2.7 nm〜4.6 nm、2.7 nm〜3.8 nm、さらに好ましくは3.9 nm〜4.0 nmの範囲である。 
一実施形態では、挿入されたチャネルポリペプチドの高さは、2 nm〜20 nm、好ましくは4.0 nm〜10.0 nm、5.0 nm〜7.0 nm、さらに好ましくは6.5 nm〜6.9 nmの範囲である。
【００２５】
一実施形態において、本発明の小胞は、以下の（a）〜（h）からなる群より選択される核酸分子を含む核酸分子によりコードされる少なくとも１つのポリペプチドを含む：
（a）膜に挿入された又は集合した場合に孔を形成する、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73若しくは配列番号74に示されるポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子；
（b）配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34若しくは配列番号35に示される核酸分子を含む核酸分子；
（c）遺伝子コードの縮重の結果として、（a）又は（b）の核酸分子によりコードされるポリペプチド配列から誘導することができる配列を有し、膜に挿入された又は集合した場合に孔を形成する、核酸分子；
（d）（a）〜（c）の核酸分子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有し、膜に挿入された又は集合した場合に孔を形成するポリペプチドをコードする核酸分子；
（e）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（a）〜（c）の核酸分子とハイブリダイズし、膜に挿入された又は集合した場合に孔を形成する、核酸分子；
（f）配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85若しくは配列番号86に示されるプライマーを用いてcDNAライブラリー又はゲノムライブラリーから核酸分子を増幅することにより得られ、膜に挿入された又は集合した場合に孔を形成する核酸分子を含む核酸分子；
（g）（a）〜（f）の核酸分子の１つによりコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナル抗体を用いて単離され、膜に挿入された又は集合した場合に孔を形成するポリペプチドをコードする核酸分子；
並びに
（h）（a）〜（g）に特定される核酸分子の少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 nt若しくは500 ntを有する、（a）〜（h）の核酸分子の配列の１つを含むプローブ又はその断片を用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることにより取得可能であり、膜に挿入された又は集合した場合に孔を形成する、核酸分子。
【００２６】
本発明はさらに、以下の（a）〜（h）からなる群より選択される核酸分子を含む、単離された核酸分子に関する：
（a）膜に挿入された又は集合した場合に孔を形成する、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73若しくは配列番号74に示されるポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子；
（b）配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34若しくは配列番号35に示される核酸分子を含む核酸分子；
（c）遺伝子コードの縮重の結果として、（a）又は（b）の核酸分子によりコードされるポリペプチド配列から誘導することができる配列を有し、膜に挿入された又は集合した場合に孔を形成する、核酸分子；
（d）（a）〜（c）の核酸分子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有し、膜に挿入された又は集合した場合に孔を形成するポリペプチドをコードする核酸分子；
（e）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（a）〜（c）の核酸分子とハイブリダイズし、膜に挿入された又は集合した場合に孔を形成する核酸分子；
（f）配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85若しくは配列番号86に示されるプライマーを用いてcDNAライブラリー又はゲノムライブラリーから核酸分子を増幅することにより得られ、膜に挿入された又は集合した場合に孔を形成する、核酸分子を含む核酸分子；
（g）（a）〜（f）の核酸分子の１つによりコードされるポリペプチドに対して作製されたモノクローナル抗体を用いて単離され、膜に挿入された又は集合した場合に孔を形成するポリペプチドをコードする核酸分子；
並びに
（h）（a）〜（g）に特定される核酸分子の少なくとも15 nt、好ましくは20 nt、30 nt、50 nt、100 nt、200 nt若しくは500 ntを有する、（a）〜（h）の核酸分子の配列の１つを含むプローブ又はその断片を用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で好適な核酸ライブラリーをスクリーニングすることにより取得可能であり、膜に挿入された又は集合した場合に孔を形成する核酸分子であり、
それにより配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34又は配列番号35に示される配列と1又はそれ以上のヌクレオチドで区別される核酸分子。
【００２７】
「単離された」ポリヌクレオチド又は核酸分子は、核酸分子の天然供与源に存在する他のポリヌクレオチド又は核酸分子から分離されている。単離された核酸分子は、数kbの染色体断片であってもよいし、又は好ましくは遺伝子のコード領域のみを含む分子であってもよい。従って、本発明の単離された核酸分子は、隣接5’及び3’であるか又はさらなる隣接染色体領域を含む染色体領域を含んでもよいが、好ましくは、核酸分子が由来する生物においてゲノム又は染色体環境における核酸分子の配列に天然にフランキングするような配列（例えば核酸分子の5’-及び3’-UTRをコードする領域に隣接する配列）を含まない。種々の実施形態において、本発明に係る方法において使用する単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が由来する細胞のゲノムDNAにおいて該核酸分子に天然にフランキングする、約5kb未満、4kb未満、3kb未満、2kb未満、1kb未満、0.5kb未満又は0.1kb未満のヌクレオチド配列を含みうる。
【００２８】
本発明において使用する核酸分子の全配列又はその一部を含む核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応により、この配列又はその一部に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを使用してさらに単離することも可能である。例えば、全配列又はその一部を含む核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応により、まさにこの配列に基づいて生成されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて単離することができる。例えば、mRNAは、（例えば、Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299のグアニジニウム・チオシアネート抽出法を用いて）細胞から単離することができ、cDNAは、逆転写酵素（例えばMoloney MLV逆転写酵素、Gibco/BRL（Bethesda, MD）より入手可能、AMV逆転写酵素、Seikagaku America, Inc.（St.Petersburg, FL）より入手可能）を用いて生成することができる。
【００２９】
ポリメラーゼ連鎖反応による増幅用の合成オリゴヌクレオチドプライマー、例えば配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85又は配列番号86に示されるものは、本明細書に示される配列に基づいて作製することができる。
【００３０】
さらに、本発明の方法において使用するポリペプチド、特に本発明のポリペプチドの配列を用いてタンパク質配列のアライメントを実施することにより、種々の生物からの保存領域を特定することが可能であり、その保存領域から、次に縮重プライマーを誘導することができる。保存領域は、種々の起源のいくつかの相同体（ホモログ）の特定の１位置におけるアミノ酸の非常にわずかな変化を示すものである。
【００３１】
続いて、縮重プライマーを上記活性を有する新規タンパク質の断片を増幅するためにPCRにおいて用いることができる。
【００３２】
これらの断片は、完全な遺伝子配列を単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。別法として、欠損する5’及び3’配列をRACE-PCRにより単離することができる。本発明に係る核酸分子は、鋳型としてcDNAを用いて、あるいは別法ではゲノムDNAを用いて、好適なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的なPCR増幅技法に従って増幅することができる。このようにして増幅された核酸分子を好適なベクターにクローニングし、DNA配列分析により特性決定することができる。本方法において使用する核酸分子の１つに対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成方法、例えば自動DNAシンセサイザーを使用して、生成することができる。
【００３３】
本発明に係る方法にとって有利である核酸分子は、本明細書に開示された核酸分子に対するその相同性に基づいて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイゼーションプローブとしての前記配列若しくはその一部及び以下の標準的なハイブリダイゼーション技術を用いて単離することができる。この文脈においては、例えば、少なくとも15、20、25、30、35、40、50、60個以上のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも15、20又は25ヌクレオチド長の単離された核酸分子であって、上記核酸分子、特に、本発明の方法において用いられるか、若しくは本発明において用いられるタンパク質をコードする核酸分子又は本発明の核酸分子のヌクレオチド配列を包含するものと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸分子を使用することができる。30、50、100、250個以上のヌクレオチドを有する核酸分子を用いることもできる。
【００３４】
用語「相同性」とは、それぞれの核酸分子若しくはコードされるタンパク質が機能的及び／又は構造的に等価であることを意味する。上記核酸分子と相同である核酸分子及び該核酸分子の誘導体である核酸分子は、例えば、同じ生物学的機能を有する改変を示す、特に、同じか又は実質的に同じ生物学的機能を有するタンパク質をコードする、前記核酸分子の変異体である。それらは、他の植物品種若しくは種に由来する配列などの天然の変異、又は突然変異であってよい。これらの突然変異は、天然のものであるか、又は突然変異誘発技術により得られるものであってよい。対立遺伝子変異は、天然の対立遺伝子変異体、並びに合成により生成されるか若しくは遺伝子操作された変異体であってよい。例えば、構造的等価物を、前記ポリペプチドの抗体への結合を試験すること、又はコンピューターに基づく予測により同定することができる。類似する免疫学的特性を有する構造的等価物は、例えば、類似するエピトープを含む。
【００３５】
「ハイブリダイズすること」とは、そのような核酸分子が、慣用のハイブリダイゼーション条件、好ましくは、例えば、Sambrook（Molecular Cloning; A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)）又はCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1〜6.3.6により記載されたものなどのストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【００３６】
本発明において、本発明の核酸のDNA及びRNA分子をプローブとして用いることができる。さらに、機能的相同体の同定のための鋳型として、ノーザンブロットアッセイ及びサザンブロットアッセイを実施することができる。ノーザンブロットアッセイにより、発現された遺伝子産物に関するさらなる情報、例えば発現パターン、プロセシングステップ（スプライシング及びキャッピングなど）の発生などが有利に提供される。サザンブロットアッセイにより、本発明の核酸分子をコードする遺伝子の染色体位置及び組織化に関するさらなる情報が提供される。
【００３７】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（＝SSC）における約45℃でのハイブリダイゼーションと、その後の0.2×SSC、0.1％SDSにおいて50〜65℃（例えば50℃、55℃又は60℃）での１又はそれ以上の洗浄ステップがある。当業者であれば、これらのハイブリダイゼーション条件が核酸の種類の関数として、また例えば有機溶媒が存在する場合には、温度及びバッファーの濃度に関して、相違することを認識している。「標準的なハイブリダイゼーション条件」における温度は、例えば核酸の種類の関数として、0.1×、0.5×、1×、2×、3×、4×又は5×SSC（pH7.2）の濃度の水性バッファー中で、42℃〜58℃、好ましくは45℃〜50℃の間で相違する。有機溶媒（複数でもよい）が上記バッファー（例えば50％ホルムアミド）中に存在する場合には、標準条件における温度は約40℃、42℃又は45℃である。DNA：DNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、例えば0.1×SSC及び20℃、25℃、30℃、35℃、40℃又は45℃、好ましくは30℃〜45℃である。DNA：RNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、例えば0.1×SSC及び30℃、35℃、40℃、45℃、50℃又は55℃、好ましくは45℃〜55℃である。上記ハイブリダイゼーション温度は、例えば約100bp（＝塩基対）長の核酸、及びホルムアミドの不在下における50％のG＋C含量について決定する。当業者であれば、教科書、例えば上述したもの、又は以下の教科書：Sambrook et al., ”Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989；Hames and Higgins (編) 1985, ”Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford；Brown (編) 1991, ”Essential Molecular Biology: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxfordを用いて、必要とされるハイブリダイゼーション条件を決定することを理解している。
【００３８】
そのようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、4×SSCにおける65℃でのハイブリダイゼーションと、その後の0.1×SSCにおける65℃での1時間にわたる洗浄である。あるいは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、50％ホルムアミド、4×SSCにおいて42℃である。さらに、洗浄ステップの間の条件は、低ストリンジェンシー条件（およそ2×SSC、50℃）及び高ストリンジェンシー条件（およそ0.2×SSC、50℃、好ましくは65℃）（20×SSC：0.3Mクエン酸ナトリウム、3M NaCl、pH7.0）を範囲とする条件の範囲から選択することができる。さらに、洗浄ステップの間の温度は、室温、約22℃における低ストリンジェンシー条件から、約65℃におけるより高いストリンジェンシー条件に上昇させてもよい。パラメータである塩濃度及び温度の両方は、同時に変更してもよいし、あるいは2つのパラメータの一方を一定に保ち、他方のみを変化させてもよい。変性剤、例えばホルムアミド又はSDSを、ハイブリダイゼーションにおいて使用してもよい。50％ホルムアミドの存在下では、ハイブリダイゼーションは好ましくは42℃で実施する。関連する因子、例えばi）処理の長さ、ii）塩条件、iii）界面活性剤条件、iv）競合DNA、v）温度、及びvi）プローブ選択などを、全ての可能性を本明細書で言及するものではないが、ケースごとに組み合わせることができる。 
従って、好ましい実施形態では、ノーザンブロットに、Rothi-Hybri-Quickバッファー（Roth, Karlsruhe）を用いて68℃にて2時間かけてプレハイブリダイゼーションを行う。放射性標識プローブを用いたハイブリダイゼーションを68℃において一晩かけて実施する。続く洗浄ステップを1×SSCを用いて68℃において行う。 
サザンブロットアッセイのために、膜に、Rothi-Hybri-Quickバッファー（Roth, Karlsruhe）を用いて68℃にて2時間かけてプレハイブリダイゼーションを行う。放射性標識プローブを用いたハイブリダイゼーションを68℃において一晩かけて実施する。続いて、ハイブリダイゼーションバッファーを廃棄し、フィルターを直ちに2×SSC、0.1％SDSを用いて洗浄する。洗浄バッファーを廃棄した後、新たな2×SSC、0.1％SDSバッファーを添加して、68℃で15分間インキュベートする。この洗浄ステップを2回実施し、その後68℃において10分間、1×SSC、0.1％SDSを用いた追加の洗浄ステップを行う。
【００３９】
DNAハイブリダイゼーション（サザンブロットアッセイ）及び洗浄ステップのための条件のいくつかの例が以下に示される：
（1）ハイブリダイゼーション条件は、例えば、以下の条件から選択することができる：
（a）65℃で4×SSC、
（b）45℃で6×SSC、
（c）68℃で6×SSC、100mg/ml変性断片化魚精子DNA、
（d）68℃で6×SSC、0.5％SDS、100mg/ml変性サケ精子DNA、
（e）42℃で6×SSC、0.5％SDS、100mg/ml変性断片化サケ精子DNA、50％ホルムアミド、
（f）42℃で50％ホルムアミド、4×SSC、
（g）42℃で50％(容量/容量)ホルムアミド、0.1％ウシ血清アルブミン、0.1％フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、50mMリン酸ナトリウムバッファーpH6.5、750mM NaCl、75mMクエン酸ナトリウム、
（h）50℃で2×若しくは4×SSC（低ストリンジェンシー条件）、又は
（i）42℃で30〜40％ホルムアミド、2×若しくは4×SSC（低ストリンジェンシー条件）。
【００４０】
（2）洗浄ステップは、例えば、以下の条件から選択することができる：
（a）50℃で0.015M NaCl/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1％SDS、
（b）65℃で0.1×SSC、
（c）68℃で0.1×SSC、0.5％SDS、
（d）42℃で0.1×SSC、0.5％SDS、50％ホルムアミド、
（e）42℃で0.2×SSC、0.1％SDS、
（f）65℃で2×SSC（低ストリンジェンシー条件）。
【００４１】
さらに、いくつかの用途は、ハイブリダイゼーションの特異性に影響がなく、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件において実施すべきである。例えば、総DNAのサザンブロット分析は、本発明の核酸分子をプローブとして反応させ、低ストリンジェンシー（55℃、2×SSPE、0.1％SDS中）で洗浄することができる。ハイブリダイゼーション分析は、本発明の又は本発明の方法において使用するポリペプチド、例えばファインケミカルを増大させる本明細書に記載の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のみの単純なパターンを明らかにすることができる。そのような低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の別の例は、50℃にて4×SSC、又は30〜40％ホルムアミドを用いて42℃でのハイブリダイゼーションである。このような分子は、本発明の又は本発明の方法において使用するポリペプチドの断片、類似体又は誘導体であるものを含み、そして例えば、アミノ酸及び／又はヌクレオチドの欠失、挿入、置換、付加及び／若しくは組換え（複数でもよい）、又は当技術分野で公知の他の改変（複数でもよい）の単独又は組み合わせで、上述したアミノ酸配列又はその基礎となるヌクレオチド配列とは相違している。しかしながら、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を使用することが好ましい。
【００４２】
ハイブリダイゼーションは、少なくとも5、10、15、20、25、30、35又は40 bp、有利には少なくとも50、60、70又は80 bp、好ましくは少なくとも90、100又は110 bpの断片を用いて実施することも有利でありうる。最も好ましくは少なくとも15、20、25又は30 bpの断片である。また、好ましくは少なくとも100 bp又は200 bp長、特に非常に好ましくは少なくとも400 bp長を用いたハイブリダイゼーションである。特に好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、上述した条件において全核酸配列を用いて実施すべきである。
【００４３】
「断片」、「配列の断片」又は「配列の一部」という用語は、参照する元の配列の切断型配列を意味する。切断型配列（核酸又はタンパク質配列）は、長さが大きく異なることができ、その最小サイズは、参照する元の配列の少なくとも同等の機能及び／又は活性を有する配列、あるいは本発明の又は本発明の方法において使用する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を提供するために十分なサイズの配列であり、一方、その最大のサイズは重要ではない。いくつかの用途では、その最大のサイズは通常、元の配列の所望の活性及び／又は機能を提供するために必要なものよりも実質的に大きくはない。
【００４４】
従って、本発明は、上述した活性、例えば膜に挿入された場合にチャネル又は孔を形成する活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子に関する。かかるポリペプチドは、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73又は配列番号74に示される配列に含まれる配列とはアミノ酸配列が異なり、かつ本明細書に記載する上記活性を保持するものである。核酸分子は、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73又は配列番号74に示されるアミノ酸配列と少なくとも約50％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。好ましくは、核酸分子によりコードされるタンパク質は、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73又は配列番号74に示される配列と少なくとも約60％の同一性、より好ましくは配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73又は配列番号74に示される配列の１つと少なくとも約70％の同一性、よりさらに好ましくは配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73又は配列番号74に示される配列と少なくとも約80％、90％、95％の相同性、最も好ましくは配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73又は配列番号74に示される配列と少なくとも約96％、97％、98％又は99％の同一性を有する。
【００４５】
2つのアミノ酸配列又は2つの核酸分子の相同性（％）（＝同一性、本明細書では互換的に用いられる）を決定するためには、前記配列を、最適な比較のために他方の下に一方を書く（例えば、他のタンパク質又は他の核酸との最適なアラインメントを作製するために、タンパク質又は核酸の配列中にギャップを挿入してもよい）。
【００４６】
次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又は核酸分子を比較する。一方の配列中の位置が、他方の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又は同じ核酸分子により占有される場合、この分子はこの位置で相同である（すなわち、本発明の文脈において用いられるアミノ酸又は核酸の「相同性」は、アミノ酸又は核酸の「同一性」と一致する）。2つの配列間の相同性％は、これらの配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝同一の位置の数／位置の総数×100）。かくして、用語「相同性」及び「同一性」は、同義であると考えるべきである。
【００４７】
2つ以上のアミノ酸又は2つ以上のヌクレオチド配列の相同性（＝同一性）％の決定のために、いくつかのコンピューターソフトウェアプログラムが開発されている。2つ以上の配列の相同性を、例えば、現在はfasta 3（W. R. Pearson及びD. J. Lipman (1988), Improved Tools for Biological Sequence Comparison.PNAS 85:2444-2448；W. R. Pearson (1990) Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, Methods in Enzymology 183:63-98；W. R. Pearson及びD. J. Lipman (1988) Improved Tools for Biological Sequence Comparison.PNAS 85:2444-2448；W. R. Pearson (1990); Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTAMethods in Enzymology 183:63-98）バージョンで用いられている、fastaソフトウェアを用いて算出することができる。異なる配列の相同性の算出のための別の有用なプログラムは、Biomax pedantソフトウエアBiomax, Munich, Federal Republic of Germany）に含まれる、標準的なblastプログラムである。blastは常に対象と参照の完全な配列を含むわけではないため、これは、不幸なことに、最適ではない結果をもたらすことがある。にもかかわらず、このプログラムは非常に効率的であるため、多数の配列の比較に用いることができる。典型的には、配列のそのような比較のためには以下の設定が用いられる：
-p  プログラム名 [String]；-d  データベース [String]；デフォルト＝nr；-i  クエリーファイル[File In]；デフォルト＝stdin；-e  期待値 (E) [Real]；デフォルト＝10.0；-m  アラインメントビューオプション：0＝pペアワイズ；1＝同一性を示すクエリー-アンカー；2＝同一性を示さないクエリー-アンカー；3＝フラットクエリー-アンカー、同一性を示す；4＝フラットクエリー-アンカー、同一性を示さない；5＝フラットクエリー-アンカー、同一性を示さない、かつ平滑末端；6＝フラットクエリー-アンカー、同一性を示さない、かつ平滑末端；7＝XML Blast出力；8＝表形式；9 コメントラインを含む表形式[整数]；デフォルト＝0；-o  BLASTリポート出力ファイル[File Out]  オプション；デフォルト＝stdout；-F  フィルタークエリー配列（blastnを用いるDUST、他を用いるSEG）[String]；デフォルト＝T；-G  ギャップを開くためのコスト（0はデフォルト動作を引き起こす）[整数]；デフォルト＝0；-E  ギャップを拡張するためのコスト（0はデフォルト動作を引き起こす）[整数]；デフォルト＝0；-X  ギャップ付加されたアラインメントに関するX下落値（ビット）（0はデフォルト動作を引き起こす）；blastn 30、megablast 20、tblastx 0、他の全部15 [整数]；デフォルト＝0；-I  デフラインGIを示す[T/F]；デフォルト＝F；-q  ヌクレオチド不一致に関するペナルティ（blastnのみ） [整数]；デフォルト＝-3；-r  ヌクレオチド一致に関する報酬（blastnのみ）[整数]；デフォルト＝1；-v  (V)に関する1行記述を示すデータベース配列の数[整数]； デフォルト＝500； -b  (B)に関するアラインメントを示すデータベース配列の数[整数]；デフォルト＝250；-f  拡張ヒットに関する閾値、デフォルト 0の場合；blastp 11、blastn 0、blastx 12、tblastn 13；tblastx 13、megablast 0 [整数]；デフォルト＝0；-g  ギャップ付加アラインメントを実行（tblastxでは利用不可）[T/F]；デフォルト＝T；-Q  使用するクエリー
遺伝子コード[整数]；デフォルト＝1；-D  DB遺伝子コード（tblast[nx]についてのみ） [整数]；デフォルト＝1；-a  使用するプロセッサーの数[整数]；デフォルト＝1；-O  SeqAlignファイル[File Out] オプション；-J  クエリーデフラインを信じる[T/F]；デフォルト＝F；-M  マトリックス[String]；デフォルト＝BLOSUM62；-W  ワードサイズ、デフォルト 0の場合（blastn 11, megablast 28, 他の全部 3）[整数]；デフォルト＝0；-z  データベースの有効長さ（実際のサイズについては0を使用する）[Real]；デフォルト＝0；-K  保持する領域から得られる最良のヒットの数（デフォルトにより除去、使用する場合、100の値が推奨される）[整数]；デフォルト＝0；-P  複数ヒットについては0、単一ヒットについては1[整数]；デフォルト＝0；-Y  検索スペースの有効長さ（実際のサイズについては0を使用する）[Real]；デフォルト＝0；-S  データベースに対して検索するためのクエリー標準（blast[nx]、及びtblastxについて）；3は両方、1は上、2は下である[整数]；デフォルト＝3；-T  HTML出力を作製 [T/F]；デフォルト＝F；-l  GIの一覧に対するデータベースの限定的検索[String]  オプション；-U  FASTA配列のフィルタリングには小文字を使用する[T/F]  オプション；デフォルト＝F；-y  ビットで示される非ギャップ付加拡張のためのX下落値（0.0はデフォルト動作を引き起こす）；blastn 20, megablast 10, 他の全部 7 [Real]；デフォルト＝0.0；-Z  ビットで示される最終的なギャップ付加アラインメントに関するX下落値（0.0はデフォルト動作を引き起こす）；blastn/megablast 50, tblastx 0, 他の全部 25 [整数]；デフォルト＝0；-R  PSI-TBLASTN チェックポイントファイル[File In]  オプション；-n  MegaBlast検索 [T/F]；デフォルト＝F；-L  クエリー配列上の位置[String] オプション；-A  複数ヒットウィンドウサイズ、デフォルト 0の場合（blastn/megablast 0, 他の全部 40 [整数]；デフォルト＝0；-w  フレームシフトペナルティ（blastxに関するOOFアルゴリズム）[整数]；デフォルト＝0；-t  HSPを連結するためにtblastnにおいて許容される最大のイントロンの長さ（0は連結不可）[整数]；デフォルト＝0。
【００４８】
Needleman及びWunsch又はSmith及びWatermanのアルゴリズムを用いることにより、高い品質の結果が達成される。従って、前記アルゴリズムに基づくプログラムが好ましい。有利には、配列の比較を、PileUpプログラム（J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higginsら、CABIOS, 5 1989: 151-153）、又は好ましくは、それぞれ、Needleman及びWunsch［J. Mol. Biol. 48；443-453 (1970)］並びにSmith及びWaterman［Adv. Appl. Math. 2；482-489 (1981)］のアルゴリズムに基づくGap及びBestFitプログラムを用いて行うことができる。両プログラムは、GCGソフトウェアパッケージ［Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)；Altschul ら(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389以下参照］の一部である。従って、好ましくは、配列相同性の割合（％）を決定するための計算を、配列の全範囲にわたってGapプログラムを用いて行う。核酸配列の比較のために以下の標準的な調整を用いた：ギャップ重み：50、長さ重み：3、平均の一致：10.000、平均のミスマッチ：0.000。
【００４９】
例えば、配列番号１の配列と核酸レベルで80％の相同性を有する配列は、上記パラメータ設定を用いたGapプログラムアルゴリズムにより配列番号１の配列と比較した場合に、80％の相同性を有する配列を意味するものと理解される。
【００５０】
2つのポリペプチド間の相同性は、プログラムアルゴリズムGAP（Wisconsin Package Version 10.0、University of Wisconsin, Genetics Computer Group（GCG）、Madison, USA）を用いて、以下のパラメータ設定：
ギャップ重み8            長さ重み： 2
平均の一致：2,912        平均のミスマッチ：-2,003
による比較により計算された、全配列長の各文字にわたるアミノ酸配列の同一性を意味するものと理解される。
【００５１】
例えば、配列番号36の配列とタンパク質レベルで80％の相同性を有する配列は、配列番号36の配列と上記プログラムのアルゴリズムで上記パラメータ設定により比較した場合に、配列が80％の相同性を有することを意味するものと理解される。
【００５２】
本発明に係る配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73又は配列番号74に示されるポリペプチドの１つから、置換、挿入又は欠失により誘導される機能的等価物は、本発明に係る配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73又は配列番号74に示されるポリペプチドの１つと、少なくとも30％、35％、40％、45％又は50％、好ましくは少なくとも55％、60％、65％又は70％、好ましくは少なくとも80％、特に好ましくは少なくとも85％又は90％、91％、92％、93％又は94％、特に非常に好ましくは少なくとも95％、97％、98％又は99％の相同性を有し、また配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73又は配列番号74に示されるポリペプチドと本質的に同じ特性によって区別される。
【００５３】
本発明に係る配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34又は配列番号35に示される核酸配列から、置換、挿入又は欠失により誘導される機能的等価物は、本発明に係る配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73又は配列番号74に示されるポリペプチドの１つと、少なくとも30％、35％、40％、45％又は50％、好ましくは少なくとも55％、60％、65％又は70％、好ましくは少なくとも80％、特に好ましくは少なくとも85％又は90％、91％、92％、93％又は94％、特に非常に好ましくは少なくとも95％、97％、98％又は99％の相同性を有し、また配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73又は配列番号74に示されるポリペプチドと本質的に同じ特性を有するポリペプチドをコードする。
【００５４】
機能的等価物の「本質的に同じ特性」は、中でも、機能的等価物が、上述した活性、例えば膜に挿入された場合にチャネル又は孔を形成する活性を有することを意味するものと理解される。
【００５５】
配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73又は配列番号74の配列と相同性を有するタンパク質をコードする核酸分子は、１又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失がコードされるタンパク質に導入されるように、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列、特に配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34又は配列番号35 のヌクレオチド配列に１又はそれ以上のヌクレオチドの置換、付加又は欠失を導入することにより作製することができる。変異は、標準的な方法、例えば部位特異的突然変異誘発法及びPCRを利用した突然変異誘発法などにより、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34又は配列番号35のコード配列に導入することができる。
【００５６】
好ましくは、保存的アミノ酸置換を、１又はそれ以上の推定非必須アミノ酸残基に対して行う。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を類似した側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えるものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例：リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例：アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例：グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例：トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例：チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【００５７】
従って、本発明のポリペプチド又は本発明の方法において使用するポリペプチド中の推定非必須アミノ酸残基を、同じファミリーの別のアミノ酸残基と置き換えることが好ましい。あるいは、別の実施形態において、本発明の又は本発明の方法において使用する核酸分子のコード配列の全体又は一部に対して、例えば飽和突然変異誘発法により変異をランダムに導入してもよく、得られる変異体を、本明細書に記載の活性についてスクリーニングして、上述した活性、例えばファインケミカルの内容物の増大を付与する活性を保持する又はその活性が増大している変異体を同定することができる。
【００５８】
前記（in sid）に示される配列を有する、使用する核酸配列の相同体は、示されるヌクレオチド配列若しくは上述のように誘導された核酸配列、又はそれらの相同体、誘導体若しくは類似体、又はこれらの一部の１つと、少なくとも約30％、35％、40％又は45％の相同性、好ましくは少なくとも約50％、60％又は70％、より好ましくは少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％又は95％、そしてさらに好ましくは少なくとも約96％、97％、98％、99％又はそれ以上の相同性を有する対立遺伝子変異体を含んでもよい。対立遺伝子変異体は、特に、示される配列又は誘導される核酸配列からヌクレオチドの欠失、挿入又は置換により得られる機能的変異体を包含する。
【００５９】
一実施形態において、本発明の小胞は、EP 1559790 A1の段落[0022]〜[0031]に開示されている群から選択される、少なくとも１つの孔形成ポリペプチドを含む。
【００６０】
本発明の一実施形態において、膜貫通チャネルタンパク質は標識されている。
【００６１】
本発明の一実施形態において、膜貫通チャネルタンパク質は、以下：
アミノ-、ヒドロキシル-、カルボキシル-及びスルフヒドリル-、ジアゾ基標識物質
からなる群より選択される標識物質により標識されている。 
本発明の一実施形態において、膜貫通チャネルタンパク質は、アミノ基標識物質により標識されている。本発明において、アミノ基標識物質は、ポリペプチドからのアミノ酸の（遊離）アミノ基と反応し、共有結合する化合物である。
【００６２】
アミノ基標識物質は、別の官能基をさらに含む化合物である。一実施形態において、官能基は、化合物と反応し、伸長する。この反応の生成物は、以下：
エーテル、エステル、チオエーテル、チオエステル、ジチオエーテル、ジスルフィド、アミン、アミド、金との結合又は錯体金属（特にRh、Ru、Fe、Ni、Cu、Zn）との配位
からなる群より選択される。 
一実施形態において、官能基は、化合物と反応し、短縮される。例えば標識物質の一部が切り離される。この反応の生成物は、以下：
アルコール、有機酸、チオール、硫化物、アミン
からなる群より選択される。
【００６３】
一実施形態では、官能基と反応する化合物は、以下：
アルコール、有機酸、チオール、硫化物、アルカリ性溶液、酸化剤及び還元剤
からなる群より選択される。 
一実施形態では、官能基と反応する化合物は、以下：
1,4-ジチオ−DL-トレイトール（DTT）、メルカプトエタノールなどのジスルフィド結合還元剤、酸性溶液中のZnのような金属
からなる群より選択される還元剤である。 
一実施形態では、官能基と反応する化合物は、pH9のホウ酸ナトリウムのようなジアゾ結合破壊試薬である。
【００６４】
本発明の一実施形態では、以下：
イソチオシアネート、イソシアネート、アジ化アシル、NHSエステル、塩化スルホニル、アルデヒド及びグリオキサール、エポキシド及びオキシラン、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、並びにビオチンジスルフィドN-ヒドロキシスクシンイミドエステル
からなる群より選択されるアミノ基標識物質で膜貫通チャネルタンパク質を標識する。 
本発明の一実施形態では、ピリジル−及びビオチニル標識で膜貫通チャネルタンパク質の6つのリシン残基を標識する。 
本発明の一実施形態では、以下：
チオール−ジスルフィド交換試薬、アリール化剤、アクリロイル誘導体、アジリジン、マレイミド、ハロアセチル及びアルキルハライド誘導体
からなる群より選択されるチオール基標識物質で膜貫通チャネルタンパク質を標識する。本発明の一実施形態では、以下：
エポキシド及びオキシラン、カルボニルジイミダゾール、ジスクシンイミジルカーボネート、N-ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルメート、アルキルハロゲン及びイソシアネート
からなる群より選択されるヒドロキシル基標識物質で膜貫通チャネルタンパク質を標識する。
【００６５】
本発明はさらに、以下のステップ：
a）標識物質の溶液又は分散液に膜貫通チャネルタンパク質を添加するステップ、
b）小胞を形成する分子の溶液又は分散液に、標識した膜貫通チャネルタンパク質を添加するステップ、
c）標識膜貫通チャネルタンパク質が小胞の膜に組み込まれた小胞を形成するステップ
を含む、本発明の小胞の製造方法を提供する。
【００６６】
本発明の一実施形態では、例えば、Sambrook（Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)）に開示の周知の方法に従い、膜貫通チャネルタンパク質をクローニング、発現、抽出及び精製する。
【００６７】
別の実施形態では、Nallaniら、第51〜53頁、第2.1章、第2.2章、又はEP 1559790 A1、段落［0053］〜［0058］に従い、膜貫通チャネルタンパク質をクローニング、発現、抽出及び精製する。 
本発明の一実施形態では、以下：
直接分散法、エタノール法、インクジェット、押出し及びフィルム水和法
からなる群より選択される方法により小胞を形成する。別の実施形態では、Nallaniら、第53頁、第2.3章、又はEP 1559790 A1、段落［0059］〜［0061］に従い、小胞を形成する。
【００６８】
本発明は、さらに、以下のステップ：
a）標識物質の溶液又は分散液に膜貫通チャネルタンパク質を添加するステップ、
b）小胞を形成する分子の溶液又は分散液に上記標識膜貫通チャネルタンパク質を添加するステップ、
c）ステップb）から得た溶液又は分散液を、小胞内で荷電しようとする物質を含む溶液又は分散液に添加するステップ、
d）上記標識膜貫通チャネルタンパク質が小胞の膜に組み込まれ、上記物質が小胞内に封入された小胞を形成するステップ
を含む、本発明の小胞の製造方法を提供する。
【００６９】
本発明の一実施形態では、以下：
直接分散法、エタノール法、インクジェット、押出し及びフィルム水和法
からなる群より選択される方法により小胞を形成する。別の実施形態では、Nallaniら、第53頁、第2.3章、又はEP 1559790 A1、段落［0059］〜［0061］に従い、小胞を形成する。
【００７０】
本発明はさらに、本発明の小胞を含む分散液に、化学反応中に少なくとも一部の標識物質を分離することにより膜貫通チャネルタンパク質を開口させる化合物を添加する、膜貫通輸送の誘発（トリガー）方法を提供する。 
一実施形態では、前記化学反応は、標識物質の還元、酸化、置換又は熱-、pH-若しくは光により誘発された不安定性からなる群より選択される。
【００７１】
本発明に従って誘発（トリガー）することにより、選択的透過性膜を有する小胞を介した化合物通過の制御された開始及び／若しくは停止又は可逆性開始／停止、好ましくは開始が可能になる。
【００７２】
また、これにより、チャネルを形成するポリペプチドと、様々な標識物質との組み合わせにより、膜を貫通する化合物の選択も可能になる。標識物質と反応する化合物の選択により、さらなる選択が可能である。
【００７３】
この誘発（トリガー）は、膜貫通輸送の時点だけではなく、輸送の速度、例えば、特定の時間で移行された化合物の量も制御する。
【００７４】
本発明の小胞は、制御された酵素触媒反応にも用いられる。小胞内に酵素を封入することにより、生体触媒媒質に存在するせん断力、プロテアーゼ又は有機溶媒から小胞を保護するようにし、基質及びそれぞれの産物の輸送は膜タンパク質により媒介される。一実施形態では、酵素は、以下：
βラクタマーゼ、ヒドロラーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びデヒドロゲナーゼからなる群より選択される。酵素は、Nallaniら、第55頁、第2.7章、及びOnacaら、第799頁、第2.5.1章〜第2.5.3章に記載の方法により封入する。
【００７５】
本発明の小胞は、荷電化合物の制御された選択的回収及び放出に用いられる。荷電ポリマー化合物を小胞内に封入することにより、媒質に存在するせん断力又は有機溶媒から小胞を保護するようにし、反対の電荷を帯びた化合物の輸送は膜タンパク質により媒介される。 
一実施形態では、荷電ポリマー化合物は、以下：
ポリヒスチジンなどのポリカチオン性分子、又はDNA、RNA若しくはアニオン性多糖などのポリアニオン性分子
からなる群より選択される。 
荷電ポリマー化合物の封入は、Nallaniら、第54頁、第2.6章、及びOnacaら、第799頁、第2.5.4章に記載の方法により実施する。
【００７６】
一本鎖DNA（プライマーなど）を捕捉するために、ナノ蛍光体DNAコンジュゲートを本発明の小胞内に封入する。 
ナノ蛍光体DNAコンジュゲートの封入は、Onacaら、第799頁、第2.5.5章に記載の方法により実施する。 
同じコンジュゲートを用いて、RNA、特に短いRNA断片、例えば、siRNAを捕捉することができる。
【実施例】
【００７７】
別に記載のない限り、用いる化学薬品はすべて、分析用試薬グレード又はそれより高品質のものであり、Sigma-Aldrich Chemie（ドイツ国タウフキルヒェン）及びApplichem（ドイツ国ダルムシュタット）から購入した。以前記載（Nallani）されているように、大腸菌BE株BL 21（DE3）omp8（F hsdSB(rB-mB-)gal ompT dem (DE3)ΔlamB  ompF::Tn5 ΔompA ΔompC）［Prilipov, 1998］を用いて、FhuA Δ1-160変異体を発現させ、抽出した後、均質になるまで精製した。標準的BCAキット（Pierce Chemical Co、米国ロックフォード）を用いて、タンパク質濃度を決定した。
【００７８】
FhuA Δ1-160標識及びナノコンパートメント形成
3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（76.8 mM）又は(2-[ビオチンアミド]エチルアミド)-3,3’-ジチオジプロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（8.2 mM）を含むDMSO（100 μL）溶液にFhuA Δ1-160（50μL、4μM）を滴下しながら添加し、撹拌した（3,000 rpm、1時間；RCT basic IKAMAG、IKA-Werke GmbH、ドイツ国スタウフェン）。得られた溶液を用い、これ以上後処理をせずに、以前報告（Nallani）されたエタノール法に従って、カルセイン（50 mM）をローディングしたナノコンパートメントの形成に用いた。
【００７９】
ABA（PMOXA-PDMS-PMOXA）トリブロック共重合体（50 mg；分子量約20,000 g/モル）をエタノール（250μl；98％）中に溶解し、30分撹拌した。得られた透明な溶液を、カルセイン（50mM）含有Tris-KClバッファー（5 ml；10 mM Tris、100 mM KCl、pH 7.4）に滴下しながら添加した後、撹拌した（3,000 rpm；周囲温度；3〜4時間）。FhuA Δ1-160（0.13μM最終濃度）並びにアミノ基標識FhuA Δ1-160（0.13μM最終濃度）を含む、カルセイン（50 mM）をローディングしたナノコンパートメントを、エタノール法｛Nallani｝を用いて調製したが、その濃度及び容量は記載の通りである。次に自己集合により形成されたナノコンパートメントを押出す（6回、0.22μm Milexフィルター（Millipore Corporation、米国マサチューセッツ州ベッドフォード））ことにより、均一の球体形状をしたナノコンパートメントを形成した。
【００８０】
以前記載されている［Graff, 2002］ように、Tris-KClバッファー（5 ml；10 mM Tris、100mM KCl、pH 7.4）中のSepharose 4B（Sigma-Aldrich）を用いて、ゲルろ過によりナノコンパートメントを精製した。ナノコンパートメントの平均直径は、Zeta-Sizer（Zeta-Sizer Nano Series；英国ウスターシア、モールヴァン）を用いて慣用的に決定した。
【００８１】
シントソームを用いたカルセイン放出アッセイ
すべてのカルセイン放出測定に、480 nmの励起波長及び520 nmの発光波長を用いた。Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer（Varian, Inc. Corporate Headquarters、米国パロアルト）を用いて、高速動態（fast kinetics）を15分記録した（反応間隔1μs）。120分までの測定については、Saphire Fluorescence Spectrophotometer（Tecan Trading AG、スイス国マンドルフ／ズーリッヒ）を用いた（反応間隔60秒）。高速動態測定において、精製ナノコンパートメント又はシントソーム懸濁液（500μl；Tris-KClバッファー（5 ml；10 mM Tris、100 mM KCl、pH7.4））にDTT（10μl、1M）を添加し、ピペット（Eppendorf、ドイツ国ハンブルグ）操作により穏やかに混合した後、各実験に用いた。500μlの懸濁液を石英キュベット（Hellma GmbH&Co. KG、ドイツ国ミュールハイム）に速やかに移し、カルセイン放出動態を記録した。
【００８２】
長時間の測定のために、マイクロタイタープレート（Flat-Bottom、ブラック、96ウェル、Greiner Bio-One、ドイツ国フリケンハウゼン）において、クロマトグラフィーにより精製したナノコンパートメント又はシントソーム懸濁液200μlにDTT（10μl、1 M）を添加し、ピペット（Eppendorf、ドイツ国ハンブルグ）で混合した後、各実験に用いた。Zeta-Sizer（Zeta-Sizer Nano Series；英国ウスターシア、モールヴァン）を用いて、動的光散乱実験における粒度分布及び強度を比較することにより、ナノコンパートメント及びシントソームの完全性を決定した。
【００８３】
図1は、ピリジル−（左側）及びビオチニル−標識（右側）を含む6つの化学修飾リシン（167、344、364、537、556、586；FhuA Δ1-160）の反応スキームを示す。ジスルフィド結合をDTTで還元すると、3-チオ−プロピオンアミド基が、いずれの標識についても、FhuA Δ1-160のこれら6つのリシン残基に残っている（図1；上部）。図1におけるFhuA Δ1-160チャネルの平面図は、ピリジル標識及びビオチニル標識が、どのようにしてリシン修飾後の移行を制限するかについての印象を与えるものである。特に、立体的に、より要求の高いビオチニル標識について、稠密にパッキングされたβバレルを観察することができる。図1は、DTT添加によりビオチン標識及びピリジル標識を放出後、どのようにして「左側」膜貫通チャネル部分でトンネルが通じるのかを十分に示している。
【００８４】
図2は、還元トリガーDTTの添加前及び添加後のシントソームのカルセイン放出動態（任意単位）（A）及び絶対カルセイン濃度（B）を示す。FhuA Δ1-160膜貫通タンパク質が存在しない場合、DTTの添加前及び添加後に検出可能なカルセイン放出はない（図2；約11AUのデータセット；1）。非標識FhuA Δ1-160の場合、以前記載されている（Nallani）ように、カルセインがFhuA Δ1-160を介して移行し、そのため、シントソーム精製中に消失する（図2；約15AUのデータセット；2）と予想することができる。ビオチン標識FhuA Δ1-160の場合、DTT還元後に、最初の2分間において初期速度0.59分-1で、線状の放出動態を観察することができる。立体的に要求の低いピリジル標識の場合、約30倍高速（最初の2分間）で、指数的初期カルセイン放出を観察することができ、これは還元後に、同じ3-チオ−プロピオンアミド標識FhuA Δ1-160となる（図1）。初期放出動態の強い大きさ依存性は、FhuA Δ1-160チャネル内のビオチン標識のより強力な非共有結合を示している。興味深いことに、いずれの場合にも、放出動態は、約6分後にほぼ同じ速度に達し、これが2時間にわたってほぼ一定に維持される（データは示していない）。これらの知見は、チャネル内のビオチンのより強力な非共有結合をさらに支持するものであり、この結合により、該ビオチンの急速な放出が阻止される。
【００８５】
表1におけるカルセイン放出動態の比較を改善するために、以下の実験式：
【数１】
2010533669.tif 000002
【００８６】
（式中、P1、P2、P3は、実験カルセイン動態（図2）から計算される実験パラメーターである）
を用いた。パラメーターP1は、バルク溶液中のナノコンパートメント内部、及びナノコンパートメント外部のカルセイン濃度の差に依存する。使用したサンプルは、精製後にZeta-Sizerで分析し、溶離ピークにより量を正規化したことから、ピリジル標識FhuA Δ1-160チャネルについての有意に高い値（図2；表1；28.5ピリジル−対7.4ビオチニル−）は、FhuA Δ1-160に制限された拡散によるものと考えられる。パラメーターP2は、FhuA Δ1-160チャネルタンパク質を介したナノコンパートメントサンプルからの流出を説明するカルセイン放出過程の時間定数を表す。ピリジル標識FhuA Δ1-160は、ブロッキング除去後、ビオチニル標識FhuA Δ1-160（時間定数13.88分）より4倍速い時間定数（3.99分）を示す。P2はナノコンパートメント当たりのFhuA Δ1-160分子の数、FhuA Δ1-160チャネル特性（大きさ、電荷、動態、化学標識）、及びDTT濃度に依存する。標識アミノ基以外、すべての要因は同一であった。従って、差は、使用した標識試薬に直接関連する。パラメーターP3は、ナノコンパートメント系のバックグラウンド蛍光を表す。ピリジル標識FhuA Δ1-160チャネルの有意に高いバックグランド値（図2）は、保存中のカルセインの低速放出によるものと考えられる。ピリジル標識FhuA Δ1-160懸濁液は、ビオチン標識FhuA Δ1-160懸濁液とは対照的に、一晩の保存後、カルセイン蛍光増大を示す。120分後の長時間蛍光記録の場合、放出速度は、ビオチニル標識FhuA Δ1-160よりピリジル標識FhuA Δ1-160が高く、その差32.89％が算出された。
【００８７】
表1：実験式：
【数２】
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【００８８】
を用いて、記録した放出動態からP1、P2及びP3を決定することにより、ピリジル化及びビオチニル化FhuA Δ1-160シントソームのカルセイン放出動態を比較する
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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