(57)【要約】  本発明は、インフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物と、水中油型エマルジョンを含むアジュバント組成物とを含む、ヒトへの使用に好適な用量体積のインフルエンザ免疫原性組成物を提供し、該水中油型エマルジョンが、11mg以下のレベルの代謝可能な油及び5mg以下のレベルの乳化剤、並びに任意で12mg以下のレベルのトコール又はステロールを含むものである。好適には、1用量における、株当たりのインフルエンザ抗原の量は、15μg HA、又は例えば15μg未満などの少量のHAである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルス抗原又は抗原調製物と水中油型エマルジョンアジュバントとを組み合わせて含むヒトの使用に好適な用量体積のインフルエンザ免疫原性組成物であって、前記水中油型エマルジョンアジュバントが代謝可能な油及び乳化剤を含み、前記代謝可能な油が前記ヒト1用量当たり11mg未満のレベルで存在し、前記乳化剤が前記ヒト1用量中に5mg未満のレベルで存在する前記インフルエンザ免疫原性組成物。
【請求項２】
前記代謝可能な油がスクアレンである、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記代謝可能な油がヒト1用量当たり、0.5〜10、0.5〜9、1〜10、2〜10、4〜8、1〜2、2〜3、4.5〜5.5、5〜6又は9〜10mgの量で存在する、請求項1又は請求項2に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記乳化剤が非イオン系界面活性剤である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記乳化剤がモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン若しくはトリオレイン酸ソルビタン又は両方の混合物である、請求項4に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンがポリソルベート80又はTween(登録商標)80からなる群より選択され、トリオレイン酸ソルビタンがSpan85である、請求項5に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記乳化剤がヒト1用量当たり0.1〜5、0.2〜5、0.3〜5、0.4〜5、0.4〜1.2、0.5〜4、1〜2、2〜3又は4〜5mgの量で存在する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記アジュバントがさらにトコール、ステロール、又は両方を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記トコールがα-トコフェロールである、請求項8に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記トコールがヒト1用量当たり0.5〜12、1〜11、2〜10、4〜9、5〜6、5〜7、2.5〜3.5、1〜2、1〜3又は10〜11mgの量で存在する、請求項8又は請求項9に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
アジュバントが、（i）ヒト1用量当たり4.5〜5.5又は5〜6mgの代謝可能な油、2〜3mgの乳化剤、及び、存在する場合には5〜7mgのトコールを含むアジュバント；（ii）ヒト1用量当たり2〜3mgの代謝可能な油、1〜1.5mgの乳化剤、及び、存在する場合には2.5〜3.5mgのトコールを含むアジュバント；（iii）ヒト1用量当たり0.5〜1.5mgの代謝可能な油、0.25〜0.75mgの乳化剤、及び、存在する場合には0.5〜1.5mgのトコールを含むアジュバントからなる群より選択される、請求項1〜10に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記ステロールがコレステロールである、請求項8〜11のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記ステロールがヒト1用量当たり0.025〜2.5、0.05〜1.5、0.075〜0.75、0.1〜0.3、又は0.125〜0.25mg（例えば0.2〜0.3、0.1〜0.15、0.25又は0.125mg）の量で存在する、請求項8〜12のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
アジュバントがさらに、TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-7、TLR-8、TLR-9又はそれらの組み合わせから選択されるTLRリガンドを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記TLR-4リガンドが、リピドA誘導体、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（AGP）、並びにER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680、及びER804764からなる群より選ばれる化合物、から選択される、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記リピドA誘導体が3D-MPL又はリピドAの合成誘導体である、請求項15に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記TLR-4リガンドがヒト1用量当たり5〜60、40〜50、10〜50、20〜30、5〜15、10、20、30、40又は50μgの量で存在する、請求項15又は16に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
アジュバントがさらにサポニン又はその誘導体を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記サポニン又はその誘導体がQS21である、請求項18に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記サポニンがヒト1用量当たり5〜60、40〜50、10〜50、20〜30、5〜15、10、20、30、40又は50μgの量で存在する、請求項18又は19に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記ウイルス抗原又は抗原調製物が、ヒト1用量当たり、インフルエンザ株当たり15μg又は15μg未満のHAである、請求項1〜20のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
前記ウイルス抗原又は抗原調製物が、ヒト1用量当たり、インフルエンザ株当たり10μg未満、8μg未満、4μg未満、2μg未満のHA、1μg未満のHA、0.5μg未満、0.1μg未満のHAである、請求項21に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記ウイルス抗原又は抗原調製物が、ヒト1用量当たり、インフルエンザ株当たり2〜7.5μg、又は1〜5μgのHAである、請求項21又は22に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
前記ウイルス抗原又は抗原調製物が、ヒト1用量当たり、インフルエンザ株当たり正確に5μgのHA若しくはそれ未満、又は正確に2.5μg若しくはそれ未満、又は正確に1μg若しくはそれ未満である、請求項21〜23のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
前記組成物が、パンデミック発生に関与しているか又はパンデミック発生に関与する可能性を有する少なくとも1種のインフルエンザ株由来のウイルス抗原又は抗原調製物を含む一価組成物である、請求項1〜24のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
前記組成物が、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、又は少なくとも5種のインフルエンザ株由来のウイルス抗原又は抗原調製物を含む多価組成物である、請求項1〜24のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
前記組成物が、少なくとも3種のインフルエンザ季節性（パンデミック間期の）株に由来するウイルス抗原又は抗原調製物、並びに、任意に、パンデミック発生に関与しているか又はパンデミック発生に関与する可能性を有する少なくとも1種のインフルエンザ株に由来するウイルス抗原又は抗原調製物を含む、請求項26に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
前記多価組成物が、（i）H1N1及びH3N2からなる群より選ばれる2種のパンデミック間期のA型株、並びにB/yamagata及びB/Victoriaからなる群より選ばれる2種のB型株；（ii）H1N1及びH3N2からなる群より選ばれる3種のパンデミック間期のA型株、並びにB/yamagata及びB/Victoriaからなる群より選ばれる1種のB型株；（iii）H1N1及びH3N2からなる群より選ばれる2種のパンデミック間期のA型株、H5N1である1種のパンデミックA型株、並びにB/yamagata及びB/Victoriaからなる群より選ばれる1種のB型株、からなる群より選択されるウイルス抗原又は抗原調製物を含む、請求項26又は27に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
前記パンデミックインフルエンザウイルス株がH5N1、H9N2、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H2N2、H10N7、H5N2、H7N2、H7N1、及びH7N3からなる群より選択される、請求項25、27〜28のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
前記インフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物が卵で又は細胞培養物で増殖させたインフルエンザウイルス由来のものである、請求項1〜29のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１】
前記インフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物が全ウイルス、スプリットウイルス、ビロソーム、又はHA、NA、M1、M2から選ばれる1種以上の精製された抗原を含む、請求項1〜30のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３２】
前記精製された抗原が哺乳動物、鳥類又は昆虫細胞で増殖させたインフルエンザウイルスから調製される、請求項31に記載の免疫原性組成物。
【請求項３３】
前記精製された抗原が遺伝子組換えで作製される、請求項31又は32に記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
前記ヒト用量が0.5ml又はそれ未満、0.5〜1.5ml、0.2〜1.2ml、0.2〜0.7ml、及び正確に0.25、0.5、0.7若しくは1ml又はそれら未満から選択される、請求項1〜33のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】
水中油型エマルジョンの第1の体積とインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を含む水性懸濁液の第2の体積とを混合するステップを含み、第1の体積が第2の体積より大きい、請求項1〜34のいずれか1項に記載のアジュバント添加インフルエンザワクチンを調製する方法。
【請求項３６】
実質的に等しい体積の水中油型エマルジョンとインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を含む水性懸濁液とを混合するステップを含む、請求項1〜34のいずれか1項に記載のアジュバント添加インフルエンザワクチンを調製する方法。
【請求項３７】
水中油型エマルジョンの第1の体積とインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を含む水性懸濁液の第2の体積とを混合するステップを含み、第2の体積が第2の体積より大きい、請求項1〜34のいずれか1項に記載のアジュバント添加インフルエンザワクチンを調製する方法。
【請求項３８】
水中油型エマルジョンを希釈した後、得られる希釈したエマルジョンを前記インフルエンザ水性懸濁液と混合するステップを含む、請求項35〜37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項21〜34のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス抗原成分又はインフルエンザウイルス抗原調製物成分を含み、さらに同時又は逐次投与のための請求項1〜20のいずれか一項に記載のアジュバントを含むワクチンキット。
【請求項４０】
請求項1〜34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物及び製薬上許容される賦形剤を含むワクチン。
【請求項４１】
請求項1〜34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を製薬上許容される賦形剤と混合するステップを含む、請求項40に記載のワクチンを製造する方法。
【請求項４２】
請求項1〜34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又は請求項40に記載のワクチンの免疫防御用量をヒト宿主に投与するステップを含む、インフルエンザ感染により引き起こされる疾患に対してヒト宿主を免疫感作する方法。
【請求項４３】
ヒト宿主が18〜50歳の成人、18〜65歳の成人、65歳以上の高齢者又は0〜18歳の小児であり、疾患が季節性又はパンデミックインフルエンザ感染のいずれか又は両方である、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
ヒト宿主が高齢者であり、疾患が季節性又はパンデミックインフルエンザ感染のいずれか又は両方である、請求項42又は43に記載の方法。
【請求項４５】
医薬における使用のための、請求項1〜34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又は請求項40に記載のワクチン。
【請求項４６】
インフルエンザ感染により引き起こされる疾患の治療又は予防における使用のための、請求項1〜34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又は請求項40に記載のワクチン。
【請求項４７】
インフルエンザ感染により引き起こされる疾患を治療又は予防するための免疫原性組成物の製造における、（a）インフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物、及び（b）請求項1〜20のいずれかに規定した水中油型エマルジョンの使用。
【請求項４８】
前記組成物が、ヒトにおいて、次の応答：（i）アジュバント無添加組成物により得られる応答と比較して、前記抗原又はその抗原調製物に対する改善されたCD4 T細胞免疫応答、（ii）アジュバント無添加組成物により得られる応答と比較して、前記抗原又はその抗原調製物に対する改善された液性免疫応答、（iii）アジュバント無添加組成物により得られる応答と比較して、前記抗原又はその抗原調製物に対する改善されたB記憶細胞応答、の少なくとも1つ、又は少なくとも2つ又は全てを誘導することができる、請求項47に記載の使用、又は請求項46に記載の使用のための組成物。
【請求項４９】
前記組成物が、ヒトにおいて、次の応答：（i）アジュバント成分がより高い量で存在するアジュバント添加組成物により得られる応答と比較して、前記抗原又はその抗原調製物に対する同等のCD4 T細胞免疫応答、（ii）アジュバント成分がより高い量で存在するアジュバント添加組成物により得られる応答と比較して、前記抗原又はその抗原調製物に対する同等の液性免疫応答、（iii）アジュバント成分がより高い量で存在するアジュバント添加組成物により得られる応答と比較して、前記抗原又はその抗原調製物に対する同等のB記憶細胞応答、の少なくとも1つ、又は少なくとも2つ又は全てを誘導することができる、請求項47に記載の使用、又は請求項46に記載の使用のための組成物。
【請求項５０】
前記CD4 T細胞免疫応答が交差反応性CD4 Tヘルパー応答の誘導に関わる、請求項47〜49のいずれか一項に記載の使用又は使用のための組成物。
【請求項５１】
前記液性免疫応答が交差反応性液性免疫応答の誘導に関わる、請求項47〜49のいずれか一項に記載の使用又は使用のための組成物。
【請求項５２】
免疫原性組成物中の抗原が由来する病原菌の変種であるインフルエンザ病原菌により引き起こされる疾患の治療又は予防における使用のための、請求項1〜34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又は請求項40に記載のワクチン。
【請求項５３】
免疫原性組成物中の抗原が由来する病原菌の変種であるインフルエンザ病原菌により引き起こされる疾患の治療又は予防のための免疫原性組成物の製造における、（a）インフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物、及び（b）請求項1〜20のいずれか一項に規定される水中油型エマルジョンの使用。
【請求項５４】
免疫原性組成物中の抗原の変種である抗原を含む病原菌により引き起こされる感染又は疾患に対する防御のための、請求項48〜49のいずれか一項に記載の使用又は使用のための組成物。
【請求項５５】
請求項1〜34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又は請求項40に記載のワクチンで先にワクチン接種した個体にワクチン再接種するための、インフルエンザ免疫原性組成物。
【請求項５６】
請求項1〜34のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又は請求項40に記載のワクチンで先にワクチン接種した個体にワクチン再接種するための、免疫原性組成物の製造における抗原の使用。
【請求項５７】
ワクチン再接種用の組成物が先のワクチン接種に使用した組成物の抗原と共通のCD4 T細胞エピトープを有するインフルエンザ抗原を含む、請求項55〜56のいずれか一項に記載の使用又は使用のための組成物。
【請求項５８】
ワクチン再接種用の抗原又は抗原性組成物がアジュバント添加されたものである、請求項55〜57のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５９】
ワクチン再接種組成物のための水中油型エマルジョンが請求項1〜20のいずれか一項に規定された通りである、請求項58に記載の使用。
【請求項６０】
疾患が、65歳以上の高齢者、18〜50歳若しくは18〜65歳の成人、0〜18歳の小児からなる群より選択されるヒト宿主又はヒト集団の季節性又はパンデミックインフルエンザ感染のいずれか若しくは両方である、請求項46〜59のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザ疾患に対してヒトを免疫感作するためのインフルエンザ免疫原性組成物及びワクチン接種レジメン、医療におけるそれらの使用、特に様々な抗原に対する免疫応答を増強する上でのそれらの使用、並びに調製の方法に関する。とりわけ、本発明は、インフルエンザウイルス抗原又は抗原調製物と、水中油型エマルジョンアジュバントとを組合わせて含むインフルエンザワクチンに関する。ここで該水中油型エマルジョンアジュバントは、代謝可能な油及び乳化剤と、任意でトコール及び／又はステロールを含む。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、世界中に最も偏在するウイルスの1つであり、ヒトと家畜をどちらも侵す。インフルエンザは、大きな経済的負担、罹患率、さらには死亡率をもたらす。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、直径約125nmの粒径を有するRNAエンベロープウイルスである。このウイルスは、脂質二重層構造と外部糖タンパク質を有するウイルスエンベロープで囲まれた内部ヌクレオカプシド又は核タンパク質と会合したリボ核酸（RNA）のコアから基本的になる。ウイルスエンベロープの内層は、マトリックスタンパク質で主に構成され、その外層は、宿主由来の脂質で大部分が構成されている。インフルエンザウイルスは、粒子の表面に10〜12nmの長さのスパイクとして現れる2種の表面抗原、糖タンパク質ノイラミニダーゼ（NA）と赤血球凝集素（HA）を含む。インフルエンザ亜型の抗原特異性を決定するのは、これらの表面タンパク質、特に赤血球凝集素である。ウイルス株は、元来の宿主種、単離の地理学的位置と年、連続番号、及び、インフルエンザA型については、HA及びNAの亜型の血清学的特性によって分類される。16種のHA亜型（H1〜H16）と9種のNA亜型（N1〜N9）がインフルエンザA型ウイルスに対して同定されている（Webster RG et al. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol.Rev. 1992;56:152-179；Fouchier RA et al. Characterization of a Novel Influenza A Virus Hemagglutinin Subtype (H16) Obtained from Black-Headed Gulls. J. Virol. 2005;79:2814-2822）。全てのHA及びNA亜型のウイルスが水鳥から回収されているが、ヒト集団においては、1918年以後に3種のHA亜型（H1、H2、及びH3）と2種のNA亜型（N1及びN2）しか安定な株は樹立されていない。インフルエンザB型ウイルスについては、1種のHAの亜型と1種のNAの亜型が認識されているだけである。
【０００４】
インフルエンザA型ウイルスは連続的に進化しかつ抗原可変性を受ける［Wiley D, Skehel J. The structure and the function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Ann. Rev. Biochem. 1987 ; 56:365-394］。ウイルスRNAポリメラーゼによる効果的な校正がないと急速な転写誤差を生じて、表面タンパク質のアミノ酸置換をもたらしうる。これを「抗原ドリフト」と呼ぶ。セグメント化したウイルスゲノムは第2の型の抗原性変異を生じうる。もし2種のインフルエンザウイルスが同時に宿主細胞に感染すれば、「抗原シフト」と呼ばれる遺伝的再詰め合わせが新しい表面又は内部タンパク質をもつ新規ウイルスを創り出す可能性がある。これらの抗原変化、「ドリフト」と「シフト」の両方は予測不可能であり、最終的に新たなインフルエンザ株の出現をもたらし、またウイルスが免疫系を回避し、周知のエピデミック（epidemic）（流行）をほとんど毎年引き起こしうるため、免疫学的な観点から劇的な影響を与える恐れがある。これらの両方の遺伝的改変がヒトにおけるパンデミックに関わる新しいウイルス変種を生じてきた。
【０００５】
インフルエンザB型ウイルスの抗原ドリフトは、A型株よりも頻度が低く、抗原のシフトは未知である。インフルエンザB型の抗原が異なる系統（通常は2株、例えばB/Yamagata及びB/Victoria）は、年々及び国毎に異なる集団で時折同時に流行するが、インフルエンザワクチンはインフルエンザB型株を１種のみ含有するのが通常である。
【０００６】
HAは、様々なインフルエンザ株の血清学的特異性を定義する上で最も重要な抗原である。この75〜80kDのタンパク質は、数多くの抗原決定基を含有し、そのいくつかは異なる株では配列変化を受ける領域にあり（株特異的決定基）、また他のものは多くのHA分子に共通である領域にある（決定基に共通）。
【０００７】
インフルエンザウイルスは、ほとんど毎冬、エピデミックを引き起こし、A型又はB型ウイルスの感染率は、6週間にわたって40％の高さである。インフルエンザ感染は、潜伏感染から軽度の上気道炎、重篤なウイルス性肺炎まで様々な疾患状態をもたらす。インフルエンザの典型的なエピデミックは、入院率又は死亡率の増大によって証明されるとおり、肺炎及び下部呼吸器疾患の発生率の増大を引き起こす。疾患の重篤度は、宿主の年齢、その免疫状態、及び感染部位によって主として判定される。
【０００８】
65歳以上の高齢者は特に感染しやすく、先進国における全てのインフルエンザ関連死の80〜90％を占める。慢性基礎疾患又は免疫不全を有する個人もまた、そのような合併症を経験する可能性が非常に高い。年少の乳児も重篤な疾患を患う恐れがある。したがって、こうした群は特に防御される必要がある。保健機関は、こうした「危険性がある」群に加えて、保険医療提供者にもワクチン接種することを勧めている。
【０００９】
ワクチン接種は、毎年のインフルエンザのエピデミックを抑制する上で極めて重要な役割を果たす。現在利用可能なインフルエンザワクチンは、不活化インフルエンザワクチン又は弱毒生インフルエンザワクチンのいずれかである。不活化インフルエンザワクチンは、抗原調製物の可能な3つの型:不活化全ウイルス、サブビリオン(精製ウイルス粒子を脂質エンベロープを溶解する界面活性剤若しくは他の試薬を用いて破壊したもの、いわゆる「スプリット」ワクチン）、又は精製HA及びNA（サブユニットワクチン）で構成される。これらの不活化ワクチンは、筋肉内（i.m.）、皮下（i.n.）又は鼻腔内（i.n.）に投与される。
【００１０】
パンデミックの間期に使用する、全ての種類のインフルエンザワクチンは通常三価のワクチンである。こうしたワクチンは通常、2種のインフルエンザA型ウイルス株と1種のインフルエンザB型株に由来する抗原を含有する。0.5mlの標準的な注射用量はほとんどの場合、各株由来の（少なくとも）15μgの赤血球凝集素抗原成分を含有し、これは一元放射免疫拡散法（SRD：single radial immunodiffusion）により測定される（J.M. Wood et al.:An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and sub unit vaccine. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247；J. M. Wood et al., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330）。四価ワクチンもまた報告されており、これは3つの古典的菌株に加えて別のB型株（Commun Dis Intell 2006, 30, 350-357）又は別のH3N2株（Vaccine 1992, 10, 506-511）を含有する。
【００１１】
各シーズンにインフルエンザワクチンに組込むべきパンデミック間期のインフルエンザウイルス株は、世界保健機構（the World Health Organisation）と国家保険当局及びワクチン製造業者の協同により決定される。現在利用可能なパンデミック間期のインフルエンザワクチンは、全ての年齢群において安全であると考えられる（De Donatoら. 1999, Vaccine, 17, 3094-3101）。
【００１２】
しかし、ワクチンの効力は、レシピエントの年齢及び免疫状態、そしてワクチンと流行しているインフルエンザ菌株との一致に影響を受ける。現在のインフルエンザワクチンが2歳未満の小児に効き目がある証拠はほとんどない。さらに、確認された典型的なインフルエンザ疾病を予防するためのワクチン有効性の報告された割合は、高齢者について23〜72％であり、これは、若年成人について報告された有効性の割合60〜90％よりも有意に低い（Govaert, 1994, J. Am. Med. Assoc., 21, 166-1665；Gross, 1995, Ann Intern. Med. 123, 523-527）。インフルエンザワクチンの有効性は、ウイルス株に対する赤血球凝集阻害（HI）抗体の血清力価と相関していることが示され、いくつかの試験により、インフルエンザ免疫の後、高齢者の方が若年成人の場合よりも低いHI力価を示すことがわかっている（Murasko, 2002, Experimental gerontology, 37, 427-439）。
【００１３】
背景として、パンデミック間期（interpandemic）には、前のエピデミックに由来するインフルエンザウイルスに関係のあるインフルエンザウイルスが流行する。ウイルスは、人生の早い時期の感染から様々なレベルの免疫を有する人々の間で広がる。かかる流行（circulation）は、通常2〜3年の期間にわたって、一般集団の間で再びエピデミックを引き起こすのに十分な変化をした新しい株の選択を促進する。この過程は、「抗原ドリフト」と呼ばれる。「ドリフト変種」は1年以内にでも異なるコミュニティ、地域、国又は大陸で異なる影響を及ぼしうるが、数年にわたると、それらの全体的な影響は類似することが多い。典型的なインフルエンザのエピデミックは肺炎及び下気道疾患の発生率の増加を引き起こし、それが入院率又は死亡率の増加に見られる。高齢者又は慢性疾患を根底に有する者はかかる合併症を最も起こしやすいが、幼い小児も重篤な疾患に罹りうる。
【００１４】
予測できない間隔で、新規インフルエンザウイルスが、前シーズンに広まった株と全く異なる亜型の重要な表面抗原、すなわち赤血球凝集素を伴って出現する。この場合、生じる抗原は、以前ヒトで広まっていた株の対応するタンパク質とは、20％から50％変わっている可能性がある。この現象は「抗原シフト」と呼ばれ、その結果ウイルスは「集団免疫」を逃れてパンデミックを確立することができる。言い換えれば、インフルエンザパンデミックは、ヒト集団が免疫をもたない新たなインフルエンザウイルスが出現した場合に起こる。少なくとも過去においては、異なる種、例えばトリ又はブタのインフルエンザウイルス由来のインフルエンザウイルスが種の障壁を超えたときにパンデミックが起こったと思われる。かかるウイルスが人から人へ広がる能力を持てば、これらは2、3ヶ月から1年以内に世界中に広がって、パンデミックを起こしうる。例えば、1957年（アジアかぜパンデミック）に、H2N2亜型のウイルスがH1N1ウイルス（少なくともウイルスが最初に単離された1918年以降ヒト集団で広まっていた）と入れ替わった。1957〜1968年の間、H2 HA及びN2 NAは抗原ドリフトを受けた後、HAは1968年（香港かぜパンデミック）にH3N2インフルエンザ亜型の出現により取って代わられて、その後、N2 NAはH3 HAと共にドリフトし続けた（Nakajima et al., 1991, Epidemiol. Infect. 106, 383-395）。
【００１５】
流行していないH2N2又はH9N2株などのパンデミック株を含有する一価の候補ワクチンを用いて、初回刺激を受けてない集団における安全性と免疫原性を評価するいくつかの臨床研究がなされている。研究は、ミョウバンアジュバント添加又は無添加の、様々なHA濃度（1用量当たり1.9、3.8、7.5又は15μg HA）のスプリット又は全ウイルス製剤について行われた。H2N2亜型のインフルエンザウイルスは、1957から1968年まで巡回した後に「香港パンデミック」の期間にH3N2株により置き換わられた。現在、1968年以後に生まれた個人は免疫学的にH2N2株にナイーブである。これらのワクチン候補は、免疫原性がありかつ良い耐性のあることが示されている。結果は、Hehme, N et al. 2002, Med. Microbiol. Immunol. 191, 203-208；Hehme N. et al. 2004, Virus Research 103, 163-171に報じられており；また、H5N1については2つの研究（Bresson JL et al. The Lancet. 2006:367 (9523):1657-1664；Treanor JJ et al. N Engl J Med. 2006;354:1343-1351）が報じられている。他の研究は、MF59を用いてアジュバント添加したインフルエンザワクチンの結果を報じている。1つの研究は、MF59を用いてアジュバント添加したH5N3インフルエンザワクチンの2回用量が、初回刺激した集団のインフルエンザH5N1に対する免疫を追加免疫（boost）したことを報じ（Stephenson et al., Vaccine 2003, 21, 1687-1693）、そして他の1つの研究は、MF59を用いてアジュバント添加したインフルエンザH5N3ワクチンの3回用量後に、H5N1ウイルスに対する交差反応性抗体を得たことを報じている（Stephenson et al., J. Infect. Diseases 2005, 191, 1210-1215）。
【００１６】
インフルエンザパンデミックの場合のヒトのリスクは、季節性インフルエンザによる合併症について定義されたリスク群とは異なりうる。WHOによると、鳥類インフルエンザ株H5N1が原因であるヒトの場合の50％は20歳未満の人で起こり、90％は40歳未満の間で起こった（WHO、週刊、疫学記録、2006年6月30日）。
【００１７】
パンデミック中に、抗ウイルス薬は必要量をカバーするのに十分又は有効ではないかもしれないし、またインフルエンザのリスクがある個人の数はパンデミック間期のそれより大きいであろう。それ故に、大量生産の可能性と効率的な配布及び投与の可能性を備えた好適なワクチンの開発が必須である。１つの方法は、パンデミックインフルエンザワクチンのある程度の製造能力を迅速に制限しないようにすることである。しかしながら、大規模ワクチン接種はパンデミックの発生後にのみ開始することから、これは菌株を同定し、最初のロットを製造するために必要な時間によって生じる重大な遅延をもたらすことになる。さらに、ワクチン製造業者には一定の、すなわち制限された週間生産量があるだろう。これは、現在の手法が、パンデミック状態となった場合に世界レベルにおいて大部分の集団をほぼ確実に非防御とすることを意味している。大部分の集団にはワクチンの利用が遅くなりすぎ、世界レベルで推定1億8千万〜3億6千万という高い死亡率が予測される。
【００１８】
この現在のジレンマに対処する方法の１つは、パンデミックの前にパンデミックワクチンを作製し、そして免疫学的にナイーブなレシピエントの防御抗体レベルを達成するために2回用量のワクチンが必要であるため主にワクチン体積を減少する目的で、三価ワクチンの代わりに「最良の候補パンデミック株」を含む一価ワクチンを設計することである（Wood JM et al. Med Mircobiol Immunol. 2002;191:197-201. Wood JM et al. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2001;356:1953-1960）。続いてこのワクチンを、パンデミック間期の間に備蓄又は集団に初回刺激するために使用することができる。
【００１９】
残念ながら、現在の製造施設は、北半球及び南半球における年次ワクチン接種のための季節性三価ワクチンの製造にほぼその年度を費やしているため、上述した両方の手法が実現可能ではない。なぜなら、「最良の候補パンでミック株」を製造するさらなる生産力がないためである。さらに、毎年のインフルエンザシーズンに規則的に直面するパンデミック間期のインフルエンザワクチンの欠乏に対処する解決手段を見出す性急な必要性もあることに留意すべきである。１つの解決手段は、さらなる生産力を構築することであるが、その建設に数年が必要であり、数年内に起こるパンデミックの脅威には不十分な手法である。
【００２０】
現在のところ、さらなる生産力を獲得するための唯一の方法は、年次三価ワクチンの製造時間を短縮することである。インフルエンザワクチンの高頻度で起こる欠乏は、重篤なインフルエンザ疾患及び合併症を発症するリスクが高いとみなされる集団の最適な範囲を除外する大部分の国において毎シーズン起こっている。抗原の製造がインフルエンザワクチン製造の速度制限因子であるため、別の抗原節約手法が開発されるべきである。
【００２１】
いくつかの方法はアジュバント添加に依存しており、アジュバント添加の目的は、抗原含量を減少（抗原を節約）できるようにするためワクチンの免疫原性を増強して、利用しうるワクチン用量数を増加することである。アジュバントの使用により、ナイーブな集団における抗原の潜在的に弱い免疫原性も克服しうる。いくつかの方法が公開されている。その例は、アルミニウム塩でアジュバント添加した全不活化H2N2又はH9N2ウイルス（N. Hehme et al. Virus Research 2004, 103, 163-171）、あるいは単味のサブビリオンH5N1ワクチン又は水酸化アルミニウムのアジュバントを添加したスプリットウイルスH5N1ワクチン（Bresson JL et al. The Lancet. 2006:367 (9523):1657-1664；Treanor JJ et al. N Engl J Med. 2006;354:1343-1351）を用いて示されている。この最後の試験の結果は、単味とアジュバント添加したものとの両方のH5N1ウイルスワクチンは90μgまでの抗原用量に対して安全であることを示す（単味のサブビリオンワクチンとしてのみ試験して）。しかしながらこのような高用量の抗原の使用は、パンデミックの場合には必須となる抗原節約手法と適合しない。水中油型エマルジョンの形態であるアジュバントMF59でアジュバント添加されたサブユニットインフルエンザワクチンが、高齢者及びリスクのある集団のために市販されており、アジュバント無添加サブユニットワクチンで得られるものより高い抗体力価を誘導する能力が証明されている（De Donato et al. 1999, Vaccine, 17, 3094-3101）。しかしながら、後の刊行物では、同じワクチンがアジュバント無添加スプリットワクチンと比較して改善されたプロファイルを有しないことが証明された（Puig-Barbera et al., 2004, Vaccine 23, 283-289）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
従って、抗原不足の問題に対処しつつ有効な新ワクチンがなお必要とされる。これらの新ワクチンは、免疫原性（特に、免疫原性が弱いか若しくは無いパンデミック株に対する免疫原性）が改善されていない、又は高齢集団などの免疫無防備の個人のためのものでなくても、許容される。これらの新ワクチンはまた、交差防御能力を有することが理想であり、それによりパンデミックの宣言前又は宣言時に、パンデミック株に対して免疫的にナイーブな集団を初回刺激するためのパンデミック前又は備蓄ワクチンとして使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者は、インフルエンザワクチンの供給を改善するために、アジュバントを含み、それゆえ使用すべきインフルエンザ抗原が少量でよい、新規で有効な免疫原性インフルエンザ製剤を開発できることを見出した。本明細書では、細胞介在性免疫応答及び／又は液性応答に関して、全ての年齢群の十分な防御を付与する抗原節約製剤を可能にする、新規なアジュバント添加組成物を提供する。
【００２４】
本発明者は特に、免疫原性組成物内のアジュバントの個々の成分の各々又は全てが以前に有用と考えられていたレベルよりも低いレベルであることを特徴とするインフルエンザ免疫原性組成物に依存しうることを見出した。これは、抗原に対する免疫原性のレベルを維持する一方、宿主レシピエントにおける反応原性が低減されているという利点を有する。
【００２５】
従って、本発明の第１の態様において、インフルエンザウイルス抗原又は抗原調製物と、水中油型エマルジョンアジュバントとを組み合わせて含む、ヒトへの使用に好適な用量体積のインフルエンザ免疫原性組成物（特にワクチン）を提供し、該水中油型エマルジョンアジュバントが、代謝可能な油及び乳化剤、並びに任意にトコール及び／又はステロールを含み、該代謝可能な油が該ヒト用量中に11mg以下のレベルで存在し、該乳化剤が該ヒト用量中に5mg以下のレベルで存在するものである。前記トコール及び／又はステロールは、存在する場合には、前記ヒト用量中に12mg以下のレベルで存在する。好適には、1用量における、株当たりのインフルエンザ抗原の量は、15μg HA、又は例えば15μg未満のHAなどの少量である。
【００２６】
別の態様において、本発明は、インフルエンザウイルス抗原成分又はインフルエンザウイルス抗原調製物成分と、任意で少量の抗原成分を含み、さらに同時又は逐次投与のために本明細書中で定義するアジュバントを含むワクチンキットを提供する。
【００２７】
第３の態様において、本発明は、パンデミックの状況、パンデミック前の状況又はパンデミック間期（季節性）の状況のためのインフルエンザ免疫原性組成物の製造方法であって、インフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物と、本明細書中に定義する水中油型エマルジョンアジュバントとを混合するステップを含む方法を提供する。特に本発明は、アジュバント添加免疫原性組成物と製薬上許容される賦形剤とを混合するステップ、及び1用量当たり15μg以下のインフルエンザ血球凝集素抗原を含むワクチン単位を準備するステップを含む、インフルエンザワクチンの製造方法を提供する。インフルエンザウイルスは、卵由来、植物由来、細胞培養物由来であってもよいし、又は組換えにより作製されたものであってもよい。インフルエンザウイルス抗原は、卵由来又は細胞培養物由来であることが好適である。
【００２８】
第４の態様において、本発明は、インフルエンザ感染により引き起こされる疾患の治療又は予防における使用のための、本明細書中で定義する免疫原性組成物又はワクチンを提供する。関連する態様において、本発明は、インフルエンザウイルスにより引き起こされる感染又は疾患に対して防御するための免疫原性組成物（例えばワクチン）の製造における、インフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物、及び本明細書中で定義する水中油型エマルジョンの使用を提供する。
【００２９】
また別の態様においては、アジュバント無添加組成物により得られる応答と比較して、ヒトにおけるインフルエンザウイルス抗原又はその抗原組成物に対する、（i）改善されたCD4 T細胞免疫応答、（ii）改善されたB細胞記憶応答、（iii）改善された液性免疫応答、の少なくとも1つを誘導するための免疫原性組成物、またはキットの製造における、（a）本明細書中で定義するような少量の、インフルエンザ株に由来するインフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物、及び（b）本明細書中で定義する水中油型エマルジョンアジュバントの使用を提供する。
【００３０】
さらなる態様においては、免疫原性組成物中の抗原に由来するインフルエンザウイルスの変異体であるウイルスにより引き起こされる感染又は疾患に対する防御のための、本明細書中で定義された方法又は使用が提供される。別の実施形態においては、免疫原性組成物中のその抗原の変異体である抗原を含む病原菌により引き起こされるインフルエンザ感染又は疾患に対する防御のための本明細書中で定義された方法又は使用が提供される。
【００３１】
本発明はまた、抗原及び本明細書中で定義する水中油型エマルジョンアジュバントの送達を含むワクチン接種方法に関する。
【００３２】
本発明の他の態様及び利点を、以下のその好適な実施形態の詳細な説明においてさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】臨床試験：様々な時点での抗HA抗体に関する幾何平均力価（GMT）（免疫原性についてのATPコホート）を示す。
【図２】臨床試験：0日目及び21日目での95％信頼区間でのHI抗体力価に関する血清防御率（SPR）（免疫原性についてのATPコホート）を示す。
【図３】臨床試験：21日目での95％信頼区間でのHI抗体力価に関する血清変換率（SCR）（免疫原性についてのATPコホート）を示す。
【図４】臨床試験：21日目での95％信頼区間でのHI抗体力価に関する血清変換係数（SCF）（免疫原性についてのATPコホート）を示す。
【図５−１】マウス試験：異種亜型株（用量範囲AS03）で初回刺激されたBALB/cマウスにおける血球凝集素阻害試験（GMT +/- IC95）を示す。図５Ａ：抗A/New Caledonia/20/99 HI力価；図５Ｂ：抗A/Panama/2007/99 HI力価。
【図５−２】図５Ｃ：抗B/Shangdong/7/97 HI力価。
【図６】マウス試験：異種亜型株（用量範囲AS03）で初回刺激されたC57Bl/6マウスにおける血球凝集素阻害試験（GMT +/- IC95）を示す。
【図７】マウス試験：異種亜型株（用量範囲AS03）で初回刺激されたC57Bl/6マウスに由来するPBMCにおける細胞性免疫応答（CD4+ T細胞）を示す。
【図８】マウス試験：異種亜型株で初回刺激され、用量範囲AS03でアジュバント添加された低用量抗原（0.5μg）で免疫されたC57Bl/6マウスに由来するPBMCにおける細胞性免疫応答（CD4+ T細胞）を示す。
【図９−１】マウス試験：2種の異なる抗原用量：1.5μg（A、C及びE）又は0.38μg（B、D及びF）に関する、免疫後14日目のH5N1特異的血清Ig ELISA力価（A及びB）並びに抗H5N1 IgG1（C及びD）及びIgG2b（E及びF）アイソタイプ応答（GMT +/- IC95）を示す。
【図９−２】図９−１の続きである。
【図９−３】図９−２の続きである。
【図１０】マウス試験：2種の異なる抗原用量：1.5μg（A）又は0.38μg（B）に関する、免疫後21日目（GMT +/- IC95）の血球凝集素阻害試験（GMT +/- IC95）を示す。
【図１１−１】マウス試験：用量範囲AS03でアジュバント添加された異なる用量のH5N1ワクチン（1.5又は0.38μg）（（A）1.5μgのHA Ag（抗原）又は（B）0.38μgのHA Ag（抗原））で免疫されたナイーブなC57Bl/6マウスにおける細胞性免疫応答（CD4+ T細胞）を示す。
【図１１−２】図１１−１の続きである。
【図１２】ブタ試験：同種株（用量範囲AS03）で初回刺激されたブタにおける血球凝集素阻害試験（GMT +/- IC95）を示す。
【図１３】単味の、又はAS03若しくはAS03/2でアジュバント添加したTIV若しくはQIVで免疫したC57Bl/6ナイーブマウスにおける血球凝集素阻害試験（GMT +/- IC95）を示す。
【図１４】B/Victoria様ウイルスで初回刺激し、単味の、又はAS03若しくはAS03/2でアジュバント添加したTIV若しくはQIVで免疫したC57Bl/6マウスにおける血球凝集素阻害試験（GMT +/- IC95）を示す。
【図１５】ヒト臨床試験（アジュバント用量範囲）：0日及び21日におけるHI抗体力価についてのGMTである。
【図１６】ヒト臨床試験（成人におけるアジュバント用量範囲）：D0及びD21におけるHI抗体力価についての血清防御率（SPR）である。
【図１７】ヒト臨床試験（成人におけるアジュバント用量範囲）：図１７Ａ：PI（DAY21）におけるHI抗体力価についての血清変換率（SCR）である。図１７Ｂ：年齢カテゴリーごとに示す。
【図１８】ヒト臨床試験（成人におけるアジュバント用量範囲）：図１８Ａ：PI（DAY21）におけるHI抗体力価についての血清変換係数（SCF）である。図１８Ｂ：年齢カテゴリーごとに示す。
【図１９−１】ヒト臨床試験（高齢者におけるアジュバント用量範囲）：0日及び21日におけるHI抗体力価についてのGMTである。
【図１９−２】図１９−１の続きである。
【図２０−１】ヒト臨床試験（高齢者におけるアジュバント用量範囲）：0日及び21日における、95％信頼区間でのHI抗体力価についての血清防御率（SPR）（免疫原性HIのATPコホート）である。
【図２０−２】図２０−１の続きである。
【図２１】ヒト臨床試験（高齢者におけるアジュバント用量範囲）：PI(DAY21)におけるHI抗体力価についての血清変換率（SCR）である。
【図２２】ヒト臨床試験（高齢者におけるアジュバント用量範囲）：21日における、95％CIでのHI抗体力価についてのSCF（免疫原性HIのATPコホート）である。
【図２３】ヒト臨床試験（高齢者におけるアジュバント用量範囲）：プールした株について、0日及び21日におけるサイトカイン陽性CD4 T細胞（CMIのATPコホート）である。
【図２４】ヒト臨床試験（高齢者におけるアジュバント用量範囲）：ワクチン接種後7日間（0〜6日目）に、関連する応答型及び非応答型徴候（全等級／等級3）を報じる被験者の割合（％）（全ワクチン接種を受けたコホート）である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明者らは、代謝可能な油及び乳化剤、並びに任意にトコール及び／又はステロールを含み、かつ各成分がヒトワクチン用量当たり従来使用されたレベルより低いレベルで存在するアジュバント組成物は、インフルエンザ調製物に対する免疫応答を改善することができる一方、同時に、ヒト1用量当たりアジュバント成分がより高い（好適には2倍以上高い）レベルで存在する従来技術の一部の製剤の反応原性より低い反応原性を有することを見出した。
【００３５】
本発明者らはさらに、インフルエンザウイルス又はその抗原調製物と一緒に、本明細書に規定したアジュバント、及び任意にさらに3D-MPLなどのリピドA誘導体のような免疫刺激剤を含むインフルエンザ製剤は、i）前記抗原又は抗原性組成物に対するCD4 T細胞免疫応答及び／又は液性免疫応答を、アジュバント無添加のウイルス又はその抗原調製物で得られる応答と比較して改善すること、並びに／あるいは、ii）各成分がより高い（好適には2倍以上高い）レベルで存在するアジュバントを用いてアジュバント添加した組成物により得られる応答と同等の、前記抗原又は抗原性組成物に対するCD4 T細胞免疫応答及び／又は液性免疫応答を生じることを見出した。このアジュバントを用いてアジュバント添加した製剤を用いて、MHCクラスII分子により提示されたインフルエンザエピトープを検出することができる抗インフルエンザCD4 T細胞応答を誘導することは有利である。本出願人は、（ワクチン接種及び感染時に）同種及びドリフトインフルエンザ株に対する応答性を増加する目的で、細胞介在性免疫系を標的化することが有効であることを見出した。
【００３６】
本発明の具体的な実施形態において、本発明に使用する組成物は、ヒトにおいて、（i）アジュバント無添加組成物と比較して、ワクチン再接種後のインフルエンザに対するより優れた血清防御、並びに（ii）インフルエンザ防御相関要因（すなわち血清変換率、変換係数、防御率）のいくつか又は全てを満たすヒト被験体の数により評価した場合に、各成分が高いレベルで存在するアジュバント添加組成物と比較して、ワクチン再接種後のインフルエンザに対する同等の血清防御、のいずれか又は両方を提供することができる。さらに、他の具体的な実施形態において、本発明に使用する組成物はまた、（i）アジュバント無添加組成物と比較して、ヒト被験体の初回ワクチン接種後のより高いB細胞記憶応答及びワクチン再接種後のより高い液性免疫応答、並びに（ii）各成分がより高い（好適には2倍以上高い）レベルで存在するアジュバント添加組成物と比較して、ヒト被験体の初回ワクチン接種後の同等のB細胞記憶応答及びワクチン再接種後の同等の液性免疫応答、のいずれか又は両方を誘導することもできるであろう。
【００３７】
本発明に係るアジュバント添加インフルエンザ組成物はいくつかの利点を有する。これらの利点は、次の項目を同等のアジュバント無添加組成物と比較することにより、又は、各アジュバント成分がより高いレベルで存在するアジュバント添加組成物と比較することにより、評価することができる：
1）アジュバント無添加組成物と比較して改善され、それにより次のいずれか又は全てを可能にする免疫原性：i）免疫原性の低いインフルエンザ株に対する弱い免疫応答を改善して、アジュバント無添加製剤により得られるレベルより高いレベルにすること；ii）高齢者（50歳を超える、典型的には65歳を超える）などの特定の集団における弱い免疫応答（抗体及び／又はT細胞応答）を、若年者に見られるレベルに回復すること；
2）アジュバントの使用によって、ナイーブな集団における又は若年の幼児（6ヶ月〜4歳、特に1歳未満の小児）における抗原の潜在的な弱い免疫原性を克服し、初回感作及び防御を誘導できること；
3）本発明のアジュバント組成物は、古典的ワクチン（例えば、市販スプリットワクチン）と比較して、そのワクチン株に対して少なくとも同等の防御を与えるだけでなく、交差初回免疫感作計画の構築を可能にする交差防御プロファイルの改善、すなわち、交差反応性の増加、変種（ドリフト）インフルエンザ株に対する交差防御を達成することにより、ドリフト株に対するさらなる防御層を付与しうる；これは、前記組成物をプレパンデミックワクチンとして使用する場合、さらに（広まった）パンデミック株に対する防御を高めるのに1用量のパンデミックワクチンだけを必要とすることが可能になるので、特に重要であり；これはまた、このワクチンが他のパンデミック間期のA型H1N1株より速やかに現れがちであるH3N2ドリフトの問題に対処できるので、重要であること。
【００３８】
4）本発明のアジュバント添加組成物は、満足な免疫原性能力を維持する一方、各成分がより高い（好適には2倍以上高い）レベルで存在する組成物により得られるプロファイルと比較して、低下した反応原性プロファイルをもつこと。
【００３９】
さらに低減した抗原用量（典型的には15μg未満/株/用量）でこれらの利点のいずれか又は全てを達成することにより、本発明のアジュバント添加インフルエンザ組成物は、危機の場合における又はパンデミックの状況の準備に対する能力の増強（パンデミックの状況における抗原節約）を確かなものにし、パンデミック間期のワクチン接種季節中に集団が利用しうるワクチン用量数をより高くする可能性を与えるであろう。
【００４０】
抗原投与量の低減及び／又はアジュバント投与量の低減の組み合わせによって、本発明のアジュバント添加インフルエンザ組成物は、より複雑なインフルエンザ組成物、例えば、標準三価ワクチンだけでなく、第2のインフルエンザB型株又はパンデミックインフルエンザ株であってもよい第4の株を含む四価ワクチンの開発を可能にしうる。
【００４１】
本発明の他の態様において、本明細書に規定したアジュバント添加免疫原性組成物は、抗体産生とインフルエンザ特異的（任意に交差反応性）CD4のワクチン接種後頻度との両方について、アジュバント無添加ワクチンにより、又はアジュバント成分がより高いレベルで存在するアジュバント添加ワクチンにより、それぞれもたらされる免疫原性結果と同等の免疫原性結果を示す。この効果は、特に、小児集団又は高齢者集団において価値の高いものであり、現行の市販ワクチンより高い効力を可能にする一方、アジュバント添加ワクチンを受けているがそのアジュバント成分がより高い（好適には2倍高い）量である群と比較して、より低い又は少ない反応原性徴候を示す。
【００４２】
水中油型エマルジョンアジュバント
本発明に係るアジュバントは、エマルジョン、特に水中油型エマルジョンであり、任意に、他の免疫刺激剤を含んでもよい。特に、エマルジョン系の油相は代謝可能な油を含む。代謝可能とは、「代謝によって変換されうる」と定義することができる（Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 第25版(1974)）。この油はレシピエントにとって毒性がなく、代謝によって変換されうる、任意の植物油、魚油、動物油、又は合成油であってよい。堅果、種子、及び穀粒が植物油の一般的供給源である。合成油も本発明の一部分であり、これには市販の油、例えば、NEOBEE(登録商標)などが含まれうる。特に好適な代謝可能な油はスクアレンである。スクアレン(2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサヘキサエン)は、サメ肝油に大量に、またオリーブ油、コムギ胚芽油、コメ糠油、及び酵母に少量存在する不飽和油であり、本発明において使用する油である。スクアレンは、コレステロールの生合成における中間体であるという事実に基づき、代謝可能な油である（Merck index, 第10版, entry no.8619）。
【００４３】
水中油型エマルジョンそれ自体は、当技術分野で周知であり、アジュバント組成物として有用であることが示唆されている（EP 399843）。また、水中油型エマルジョンと他の活性物質との組み合わせもワクチン用アジュバントとして記載されている：（WO95/17210号；WO98/56414号；WO99/12565号；WO99/11241号；WO2006/100109号；WO2006/100110号；WO2006/100111号は、スクアレン、α-トコフェロール、及びTWEEN80に基づき、任意に免疫刺激剤QS21及び／又は3D-MPLと共に製剤されたエマルジョンアジュバントを開示している）。WO90/14837号；WO00/50006号；WO2007/080308号；WO2007/006939号に開示されているように、他の水中油型エマルジョンに基づくアジュバントが記載されていて、これらは全て（特に、スクアレンに基づく場合）油エマルジョン系を形成し、本発明の代わりのアジュバント及び組成物を形成する。
【００４４】
具体的な実施形態において、水中油型エマルジョンは、代謝可能な無毒の油（スクアレン又はスクアレンなど）、任意にトコール、例えばトコフェロール、特にαトコフェロールなど（及び任意にスクアレンとαトコフェロールの両方）、並びに乳化剤（又は界面活性剤）、例えば非イオン系界面活性剤TWEEN80(登録商標)又はポリソルベート80などを含む。具体的な実施形態において、油エマルジョンはさらにステロール、例えばコレステロールなどを含む。
【００４５】
トコール（例えばビタミンE）も、しばしば、油エマルジョンアジュバント（EP0382271B1；米国特許第5667784号；WO95/17210号）に使用される。本発明の油エマルジョン（任意に水中油型エマルジョン）に使用されるトコールはEP0382271B1に記載のように製剤することができ、ここで、トコールは、任意に乳化剤を含んでもよく、また任意に直径が1μm未満の、トコール液滴の分散液であってもよい。あるいは、トコールは他の油と組み合わせて用いて、油エマルジョンの油相を形成してもよい。トコールとの組み合わせで用いることができる油エマルジョンの例は本明細書に記載されていて、例えば、前記の代謝可能な油などである。
【００４６】
水中油型エマルジョンを作製する方法は当業者に周知である。通常、その方法は、油相をPBS／TWEEN80(登録商標)溶液などの界面活性剤と混合するステップ、次いでホモジナイザーを用いてホモジナイズするステップを含んでなり、当業者には、小体積の液体をホモジナイズするためには、混合物を2回シリンジニードルを通過させる方法が好適であることは明らかであろう。同様に、当業者は、マイクロ流体化装置による乳化プロセス（M110S Microfluidics machine、最大50回通過、2分間、最大入口圧力6bar（出口圧力約850bar））を応用して小又は大容積のエマルジョンを生成することができる。この応用は、所要の直径の油滴をもつ調製物ができるまで、得られるエマルジョンの測定を含む通常の実験を行って達成することができる。
【００４７】
水中油型エマルジョン中で、油と乳化剤は水性担体中に存在する必要がある。水性担体は例えば、リン酸緩衝生理食塩水であってもよい。
【００４８】
安定な水中油型エマルジョン中に見出される油滴のサイズは、光子相関分光法により測定した場合に、任意に直径1ミクロン未満であり、実質的に30〜600nmの範囲、任意に実質的に直径ほぼ30〜500nm、そして任意に実質的に直径150〜500nm、特に直径ほぼ150nmであってもよい。この点について、数基準で油滴の80％は前記範囲内にあるに違いなく、数基準で油滴の、任意に90％以上そして任意に95％以上が規定したサイズ範囲内にあるに違いない。
【００４９】
本発明の重要な態様は、免疫原性組成物のアジュバント中に存在する成分が従来有用と思われていたより少量であり、好適には、免疫原性組成物のヒト1用量当たり、11mg未満、例えば、0.5〜11mg、0.5〜10mg又は0.5〜9mgの代謝可能な油（スクアレンなど）、及び5mg未満、例えば、0.1〜5mgの乳化剤（好適にはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなど）であるという事実である。好適には、トコール（例えばα-トコフェロール）は、存在する場合、12mg未満、例えば0.5〜12mgである。本発明のアジュバント組成物は水中油型エマルジョンアジュバントを含み、好適には、前記エマルジョンは0.5〜10mgの量の代謝可能な油、及び0.4〜4mgの量の乳化剤、並びに、任意に0.5〜11mgの量のトコールを含む。好適には、前記エマルジョンは、濃度で少なくとも70％、好適には少なくとも80％が1μm未満の直径である油滴を有する。
【００５０】
本発明はそれ故に、アジュバント添加免疫原性組成物のヒト用量であって、前記アジュバントが代謝可能な油、好適にはスクアレンを、ヒト1用量当たり11mg未満のレベルで含む、好適にはヒト1用量当たり0.5〜11、0.5〜10、0.5〜9、1〜10、1〜11、2〜10、4〜8、又は4.5〜5.5mg（例えば2〜3、5〜6、又は9〜10mg）の代謝可能な油を含む前記ヒト用量を提供する。他の実施形態において、本発明はアジュバント添加免疫原性組成物のヒト用量であって、前記アジュバントが乳化剤、好適にはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Tween 80又はポリソルベート80(登録商標)など）を、ヒト1用量当たり5mg未満のレベルで含む、好適にはヒト1用量当たり0.1〜5、0.2〜5、0.3〜5、0.4〜5、0.5〜4、1〜2又は2〜3mg（例えば0.4〜1.2、2〜3又は4〜5mg）の乳化剤を含む前記ヒト用量を提供する。さらに他の実施形態において、本発明はアジュバント添加免疫原性組成物のヒト用量であって、前記アジュバントがさらにトコール、好適にはα-トコフェロールを、ヒト1用量当たり12mg未満のレベルで含む、好適にはヒト1用量当たり0.5〜12、10〜11、1〜11、2〜10、4〜9、5〜7mg（例えば10〜11、5〜6、2.5〜3.5、1〜2又は1〜3mg）のトコールを含む前記ヒト用量を提供する。
【００５１】
好適には、本発明に係るアジュバント免疫原性組成物のヒト用量において、水中油型エマルジョンアジュバントは、4.5〜5.5又は5〜6mgの代謝可能な油（好適にはスクアレン）、5〜7mgのトコール（好適にはα-トコフェロール）及び2〜3mgの乳化剤（非イオン系界面活性剤であってもよく、好適にはTween 80(登録商標)又はポリソルベート80(登録商標)などのモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）を含む。他の好適な実施形態によれば、本発明に係るアジュバント免疫原性組成物のヒト用量において、水中油型エマルジョンアジュバントは、2〜3mgの代謝可能な油（好適にはスクアレン）、2.5〜3.5mgのトコール（好適にはα-トコフェロール）及び1〜1.5mgの乳化剤（好適にはTween 80(登録商標)又はポリソルベート80(登録商標)などのモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）を含む。さらに他の実施形態では、本発明に係るアジュバント免疫原性組成物のヒト用量において、水中油型エマルジョンアジュバントは、0.5〜1.5の代謝可能な油（好適にはスクアレン）、0.5〜1.5mgのトコール（好適にはα-トコフェロール）及び0.25〜0.75mgの乳化剤（好適にはTween 80(登録商標)又はポリソルベート80(登録商標)などのモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）を含む。いくつかの事例においては、本発明のワクチンがさらに安定剤を含有することが有利でありうる。
【００５２】
用語「ヒト用量」は、ヒトに使用するための好適な体積で送達されるインフルエンザ組成物用量（アジュバント及び抗原成分を混合後）を意味する。一般にそれは0.25〜1.5mlである。一実施形態において、ヒト用量は約0.5mlである。さらなる実施形態において、ヒト用量は0.5mlを超え、例えば約0.6、0.7、0.8、0.9又は約1mlである。さらなる実施形態において、ヒト用量は1ml〜1.5mlである。他の実施形態において、特に免疫原性組成物が小児集団用である場合、ヒト用量は0.5ml未満、例えば0.25〜0.5ml又は正確に0.1ml、0.2ml、0.25ml、0.3ml又は0.4mlであってもよい。本発明は、免疫原性組成物内のアジュバントの個々の成分のそれぞれ又は全てが従来有用であると思われていたより低いレベルであり、典型的には上述の通りであることが特徴である。特に好適な組成物は、ヒト用量の最終体積（好適には約0.5ml又は約0.7ml）中に、次のo/w型アジュバント成分を次の量で含む（表１）。
【表１】
2010524883.tif 000002
【００５３】
表１を含む、全ての所与の数値（例えば、％又はmgで）は5％の変動を許容すると解釈すべきであり、すなわち4.88mgスクアレンは4.64〜5.12mgを意味すると解釈すべきである。
【００５４】
各成分（o/w型エマルジョン及び抗原）の前希釈を実施して、所要のHA量と所要のアジュバント成分量を送達するアジュバント添加ワクチンを製造することができる。
【００５５】
本発明の一態様においては、本発明のアジュバント添加ワクチンのo/w型エマルジョン（前希釈した又はしていないもの）を、全用量体積の半分を超えない、又は好適にはそれより低い体積で添加することができる。説明のために、好適な体積（例えば、125μl〜25μlの範囲）を、表１Ａに説明した製剤A〜Hのエマルジョン成分について示す。従って、本発明の一態様においては、水中油型エマルジョンの第1の体積とインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を含む水性懸濁液の第2の体積とを混合するステップを含むアジュバント添加インフルエンザワクチンを作製する方法であって、第2の体積が第2の体積より大きい前記方法を提供する。好適にはo/w型エマルジョンの第1の体積は濃縮エマルジョンの希釈後に得られる。
【００５６】
あるいは、実質的に等しい体積（前希釈後の又は前希釈なしのもの）のo/w型エマルジョンと抗原懸濁液とを混合して、本発明のアジュバント添加ワクチン組成物を作製する。各成分のそれぞれの体積は、典型的には、その際、最大で他の成分の10％の過剰（すなわち1：1.1〜1.1：1のアジュバントエマルジョン：抗原懸濁液比）、好適には最大で5％の過剰（すなわち1：1.05〜1.05：1のアジュバントエマルジョン：抗原懸濁液比）、好適には最大で2.5％の過剰（すなわち1：1.025〜1.025：1のアジュバントエマルジョン：抗原懸濁液比）であろう。従って、本発明の他の態様においては、実質的に等しい体積の水中油型エマルジョンとインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を含む水性懸濁液とを混合するステップを含むアジュバント添加インフルエンザワクチンを作製する方法を提供する。好適には、o/w型エマルジョンの第1の体積は濃縮エマルジョンの希釈後に得られる。
【００５７】
さらに他の実施形態においては、本発明のアジュバント添加ワクチンのo/w型エマルジョンアジュバントを、全用量体積の半分を超える体積で加える。従って、本発明の一態様においては、水中油型エマルジョンの第1の体積とインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を含む水性懸濁液の第2の体積とを混合するステップを含むアジュバント添加インフルエンザワクチンを作製する方法であって、第1の体積が第2の体積より大きい前記方法を提供する。好適にはo/w型エマルジョンの第1の体積は濃縮エマルジョンの希釈後に得られる。
【００５８】
全ての3つの方法において、最終ヒト用量体積中のエマルジョン成分の量及び任意にHAの量は、従来有用であると思われてきたより低く、本出願の請求の範囲に記載の通りである。好適には、これらは本出願の請求の範囲に記載の具体的な量である。
【００５９】
ワクチン内の各成分の量は、全ワクチン組成のパーセント、すなわち％(v/v)又は％(w/v)で表すことができる。次の変換係数は当業者に公知であり、適用することができる：スクアレン0.855g/ml、α-トコフェロール0.949g/ml、ポリソルベート80 1.080g/ml、及びSpan 85 0.94g/ml。
【００６０】
従って、代謝可能な油（好適にはスクアレン）はワクチン組成中に、全ワクチン体積の0.5％〜2％、好適には0.25〜2、又は0.25〜1.75、又は0.5〜1.65、又は0.6〜1.5、又は0.8〜1.4又は1〜1.25％(w/v)油の量で存在する。他の具体的な実施形態において、代謝可能な油（好適にはスクアレン）はワクチン組成の全体積の約1.25％、又は約0.6％(w/v)の最終量で存在する。他の具体的な実施形態において、代謝可能な油は全ワクチン体積の0.25％(w/v)の最終量で存在する。
【００６１】
トコールの量も、全ワクチン組成物体積のパーセントとして表すことができる。好適には、トコールはワクチン組成物中に、免疫原性組成物の全体積の0.25％〜2％(w/v)の量で存在し、例えば、全ワクチン体積の0.25〜2、又は0.25〜1.75、又は0.5〜1.65、又は0.6〜1.5、又は0.8〜1.4又は1〜1.25％(w/v)トコールの量で存在する。本発明の一実施形態において、トコールは、ワクチン組成物の全体積の0.2％〜2％(v/v)の量で、又は0.5mlワクチン用量体積中の1.25％(v/v)の量で存在する。具体的な実施形態において、トコールは、免疫原性組成物の全体積の約1.25％の最終量で存在する。他の具体的な実施形態において、トコールは全ワクチン体積の0.25％(v/v)、又は0.5mlワクチン用量体積中の1.25％(v/v)又は0.7mlワクチン用量体積中の0.9％(v/v)、又は0.5mlワクチン用量中の0.5％(v/v)又は0.7mlワクチン用量体積中の0.9％(v/v)、又は0.7mlワクチン用量中の0.35〜0.37％若しくは0.36％の最終量で存在する。
【００６２】
本発明の一実施形態において、乳化剤は、ヒト1用量当たり0.1〜5、0.2〜5、0.3〜5、0.4〜5、0.4〜1.2、0.5〜4、1〜2、2〜3又は4〜5mgの量で存在する。Tween80とSpan85の両方が存在する場合のように、1種以上の乳化剤が存在する場合、請求の範囲に記載の量は乳化剤の全量であると解釈される。乳化剤の量は全ワクチン組成物体積のパーセントとして表すことができる。好適には、乳化剤はワクチン組成物中に、免疫原性組成物の全体積の0.125〜0.8％(w/v)、例えば、全ワクチン体積の0.08〜.05、又は0.1〜0.7、又は0.2〜0.6、又は0.25〜0.55、又は0.3〜0.52又は0.4〜0.5％(w/v)の量で存在する。具体的な実施形態において、乳化剤は、全ワクチン組成物体積の1％、0.5％又は0.2％(w/v)の量で存在する。
【００６３】
ある具体的な実施形態において、0.5mlワクチン用量体積は0.5％(w/w) Tween80を含有し、0.7mlワクチン用量体積は0.35％(w/w) Tween80を含有する。他の具体的な実施形態において、0.5mlワクチン用量は0.2％(w/w)乳化剤を含有し、0.7mlワクチン用量は0.14％(w/w)乳化剤を含有する。Span 85（トリオレイン酸ソルビタン）もまた本発明において用いるエマルジョン中に0.1〜1％、好適には約0.5％以下のレベルで存在してもよい。具体的な実施形態において、Span 85は、存在する場合、ポリソルベート80のパーセントと同一のパーセントで組成物に加えられる。
【００６４】
いくつかの事例では、本発明の免疫原性組成物及びワクチンがさらに安定剤、例えば、他の乳化剤／界面活性剤（カプリル酸（merck index, 第10版, entry no. 1739）、例えばトリカプリリンを含む）を含有することが有利でありうる。
【００６５】
本発明はさらに、本明細書に先に規定した個々の成分を先に規定した量で含む、例えば、他を排するものでないが、表１に掲げたように含むアジュバント組成物を提供する。典型的には、かかるアジュバント組成物がヒト用量に好適な体積で存在しうる。アジュバントが液体形態の抗原組成物と組み合わせるための液体形態である場合、アジュバント組成物はヒト用量に好適な体積で存在しうるので、前記体積は意図するヒト用量の最終体積のある割合、例えば、0.7mlを意図するヒト用量については360μl体積、又は0.5mlを意図するヒト用量については250μl体積である。ヒトワクチン用量が増加する場合には、アジュバント成分の量（mg）はこの用量体積の増加によって変化せず、希薄になるだけであることを意図している。アジュバント組成物を抗原組成物と組み合わせてワクチンの最終ヒト用量を提供する場合、アジュバント組成物は必要に応じて希釈される。かかる用量の最終体積はもちろん、アジュバント組成物の初期体積とアジュバント組成物に加えられる抗原組成物の体積に応じて変わりうる。
【００６６】
別の実施形態においては、液体アジュバントを使って凍結乾燥した抗原組成物を再構成する。この実施形態において、ヒト用量に好適なアジュバント組成物の体積はおよそヒト用量の最終体積に等しい。この液体アジュバント組成物は凍結乾燥した抗原組成物を含有するバイアルに加えられる。最終ヒト用量は0.5〜1.5mlの間で変わりうる。ヒト用量が約0.5ml又は約0.7mlである特別な実施形態においては、この実施形態で、本発明のワクチン組成物は11mg未満又は先に規定した量の代謝可能な油のあるレベル、例えば、好適には、0.5mlヒト1用量当たり0.5〜11、1〜11、2〜10、4〜8、又は5〜6mg（例えば2〜3、5〜6、又は9〜10mg）を含みうる；さらにこの実施形態で、本発明のアジュバント組成物は、例えば、アジュバント組成物を液体又は凍結乾燥した抗原組成物と組み合わせることを意図するかどうかに応じてそれぞれ、250μlのアジュバント組成物当たり、又は500μlのアジュバント組成物当たり、11mg未満又は先に規定した量の代謝可能な油のレベル、例えば、好適には0.5〜11、1〜11、2〜10、4〜8、又は5〜6mg（例えば2〜3、5〜6、又は9〜10mg）を含みうる。同じく、ヒト用量が0.5mlである特別な実施形態においては、この実施形態で、本発明のワクチン組成物は乳化剤、好適にはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Tween 80(登録商標)又はポリソルベート80(登録商標)など）のあるレベルを、ヒト1用量当たり5mg未満のレベル、好適には0.5mlヒト1用量当たり0.1〜5、0.2〜5、0.3〜5、0.4〜5、0.5〜4、又は2〜3mg（例えば0.4〜1.2、2〜3又は4〜5mg）の乳化剤のレベルで含みうる。さらにこの実施形態で、本発明のアジュバント組成物は乳化剤、好適にはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Tween 80(登録商標)又はポリソルベート80(登録商標)など）のあるレベルを、アジュバント組成物を液体又は凍結乾燥した抗原組成物と組み合わせることを意図するかどうかに応じてそれぞれ、250μlのアジュバント組成物当たり、又は500μlのアジュバント組成物当たり、ヒト1用量当たり5mg未満、好適には0.1〜5、0.2〜5、0.3〜5、0.4〜5、0.5〜4、又は2〜3mg（例えば0.4〜1.2、2〜3又は4〜5mg）の乳化剤のレベルで含みうる。同様に、ヒト用量が0.5mlである特別な実施形態においては、この実施形態で、本発明のワクチン組成物はトコール、好適にはα-トコフェロールのあるレベルを、ヒト1用量当たり12mg未満のレベル、好適には0.5mlヒト1用量当たり0.5〜12、1〜11、2〜10、4〜9、5〜7mg（例えば10〜11、5〜6、2.5〜3.5、又は1〜3mg）のトコールのレベルで含みうる。さらにこの実施形態で、本発明のアジュバント組成物はトコール、好適にはα-トコフェロールのあるレベルを、アジュバント組成物を液体又は凍結乾燥した抗原組成物と組み合わせることを意図するかどうかに応じてそれぞれ、250μlのアジュバント組成物当たり、又は500μlのアジュバント組成物当たり、ヒト1用量当たり12mg未満、好適には0.5〜12、1〜11、2〜10、4〜9、5〜7mg（例えば10〜11、5〜6、2.5〜3.5、又は1〜3mg）のトコールのレベルで含みうる。
【００６７】
任意に、油（例えばスクアレン）：トコール（例えばα-トコフェロール）の比は1に等しい又はそれ未満であり、この比はより安定なエマルジョンを提供する。
【００６８】
いくつかの場合には、本発明のワクチンはさらに安定剤を含有することが有利でありうる。
【００６９】
免疫原性組成物中のアジュバントとして機能する成分の用量は、好適にはヒトにおいて抗原に対する免疫応答を高めることができる用量である。特に、代謝可能な油、トコール及びモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンの好適な量は、アジュバント無添加組成物と比較して組成物の免疫能を改善する量であるか、又は、標的ヒト集団において他の「より高い」量の前記成分を含むアジュバントを添加した組成物によって得られる免疫能と同様な免疫能を与える一方、反応原性プロファイルから判断して許容される量である。
【００７０】
任意的な免疫刺激剤
本発明の特定の実施形態において、アジュバントは、代謝可能油（スクアレンなど）、トコール（αトコフェロールなど）及び界面活性剤（ポリソルベート80など）を上で定義した量で含む水中油型エマルジョンアジュバントであり、他のいずれの免疫刺激剤を含まない、特に非毒性リピドA誘導体（3D-MPLなど）又はサポニン（QS21など）を含まない。
【００７１】
本発明のさらなる実施形態においては、抗原又は抗原組成物と、水中油型エマルジョンであって、0.5〜10mgの代謝可能油（好適にはスクアレン）、0.5〜11mgのトコール（好適にはαトコフェロール）及び0.4〜4mgの乳化剤を含む水中油型エマルジョン、そして任意で1種以上のさらなる免疫刺激剤を含むアジュバント組成物とを含むワクチン組成物が提供される。
【００７２】
特定の実施形態においては、水中油型エマルジョンアジュバントは、必要に応じてQS21及び／又はMPL以外の1種以上のさらなるアジュバント又は免疫刺激剤を含んでもよい。
【００７３】
別の特定の実施形態においては、水中油型エマルジョンアジュバント及び免疫原性組成物は、リポ多糖である追加の免疫刺激剤、好適にはリピドAの非毒性誘導体、特にモノホスホリルリピドA又はより具体的には3-脱アシル化モノホスホリルリピドA（3D-MPL）をさらに含む。3D-MPLは、GlaxoSmithKline Biologicals N.A.によりMPLの名称で販売されており、本明細書全体においてMPL又は3D-MPLと称する。例えば、米国特許第4,436,727号、同第4,877,611号、同第4,866,034号、及び同第4,912,094号を参照のこと。3D-MPLは、主にIFN-g（Th1）表現型を有するCD4+ T細胞応答を促進する。3D-MPLはGB 2 220 211 Aに開示された方法に従って製造することができる。化学的には、それは3、4、5又は6種のアシル化鎖を有する3-脱アシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。本発明の組成物においては、小粒子3D-MPLを用いる。小粒子3D-MPLは、0.22μmフィルターを通して滅菌濾過することができる粒子径を有する。そのような調製物はWO 94/21292号に記載されている。
【００７４】
前記リポ多糖（3D-MPLなど）は、免疫原性組成物のヒト用量当たり1〜50μgの量で使用することができる。かかる3D-MPLは、約25μg、例えば20〜30μg、好適には21〜29μg又は22〜28μg又は23〜27μg又は24〜26μg、又は25μgのレベルで使用することができる。別の実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、3D-MPLを約10μg、例えば5〜15μg、好適には6〜14μg、例えば7〜13μg又は8〜12μg又は9〜11μg、又は10μgのレベルで含む。さらなる実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、3D-MPLを約5μg、例えば1〜9μg、又は2〜8μg又は好適には3〜7μg又は4〜6μg、又は5μgのレベルで含む。
【００７５】
別の実施形態において、任意的な追加の免疫刺激剤としてリピドAの合成誘導体を使用することができ、その一部はTLR-4アゴニストとして記載されている。それには、限定されるものではないが以下のものが挙げられる：
OM174（2-デオキシ-6-o-[2-デオキシ-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラ-デカノイルアミノ]-4-o-ホスホノ-β-D-グルコピラノシル]-2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-α-D-グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート) （WO 95/14026号）、
OM 294 DP （3S, 9 R)-3--[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9(R)-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1,10-ビス(ジヒドロゲンホスフェート) （WO99 /64301号及びWO 00/0462号）、
OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1-ジヒドロゲンホスフェート10-(6-アミノヘキサノエート) （WO 01/46127号）。
【００７６】
用いることができる他のTLR4リガンドは、WO 9850399号若しくは米国特許第6303347号（AGPの調製のためのプロセスも開示されている）に開示されたものなどのアルキルグルコサミニドホスフェート（AGP）、好適にはRC527若しくはRC529、又は米国特許第6764840号に開示されたAGPの製薬上許容し得る塩である。いくつかのAGPはTLR4アゴニストであり、いくつかはTLR4アンタゴニストである。両方ともアジュバントとして有用であると考えられる。
【００７７】
TLR-4を介するシグナル伝達応答を引き起こすことができる他の好適なTLR-4リガンド（Sabroeら、JI 2003 p1630-5）は、例えば、グラム陰性細菌に由来するリポ多糖及びその誘導体、又はその断片、特に、LPSの非毒性誘導体（3D-MPLなど）である。他の好適なTLRアゴニストは、熱ショックタンパク質（HSP）10、60、65、70、75若しくは90；界面活性剤プロテインA、ヒアルロン酸オリゴ糖、ヘパラン硫酸断片、フィブロネクチン断片、フィブリノゲンペプチド及びb-デフェンシン-2、ムラミルジペプチド（MDP）又は呼吸器合胞体ウイルスのFタンパク質である。一実施形態においては、TLRアゴニストはHSP 60、70又は90である。他の好適なTLR-4リガンドは、WO 2003/011223号及びWO 2003/099195号に記載されているもの、WO2003/011223号の4〜5頁又はWO2003/099195号の3〜4頁に開示されている化合物I、化合物II及び化合物III、特にWO2003/011223号においてER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680及びER804764と開示されている化合物である。好適には、TLR-4リガンドはER804057である。
【００７８】
Toll様受容体（TLR）は、昆虫とヒトの間で進化的に保存されたI型膜貫通受容体である。今までのところ、10種のTLR（TLR 1〜10）が確立されている（Sabroeら、JI 2003 p1630-5）。TLRファミリーのメンバーは類似する細胞外及び細胞内ドメインを有する；その細胞外ドメインはロイシンに富む反復配列を有することが示されており、その細胞内ドメインはインターロイキン-1受容体（IL-1R）の細胞内領域と類似している。TLR細胞は免疫細胞及び他の細胞（血管上皮細胞、脂肪細胞、心筋細胞及び腸上皮細胞など）の間で示差的に発現される。TLRの細胞内ドメインはアダプタータンパク質Myd88と相互作用し、その細胞質領域中にIL-1Rドメインをも有し、サイトカインのNF-KB活性化を誘導することができる；このMyd88経路は、サイトカイン放出がTLR活性化により行われる一方通行である。TLRは、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージなど）などの細胞型において主に発現される。
【００７９】
TLRを介する刺激による樹状細胞の活性化は、樹状細胞の成熟、及びIL-12などの炎症性サイトカインの産生を誘導する。今までのところ行われた研究により、TLRは異なる型のアゴニストを認識するが、いくつかのアゴニストはいくつかのTLRにとって共通であることが見出された。TLRアゴニストは主に細菌又はウイルスから誘導され、フラゲリン又は細菌リポ多糖（LPS）などの分子が挙げられる。「TLRアゴニスト」とは、直接的リガンドとして、又は内因性若しくは外因性リガンドの生成を介して間接的に、TLRシグナリング経路を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができる成分を意味する（Sabroeら、JI 2003 p1630-5）。
【００８０】
別の実施形態においては、TLR分子の他の天然又は合成アゴニストを、任意的な追加の免疫刺激剤として用いる。これらのものとしては、限定されるものではないが、TLR2、TLR3、TLR7、TLR8及びTLR9に対するアゴニストが挙げられる。
【００８１】
従って、一実施形態において、アジュバント及び免疫原性組成物は、TLR-1アゴニスト、TLR-2アゴニスト、TLR-3アゴニスト、TLR-4アゴニスト、TLR-5アゴニスト、TLR-6アゴニスト、TLR-7アゴニスト、TLR-8アゴニスト、TLR-9アゴニスト、又はその組み合わせからなる群より選択される追加の免疫刺激剤をさらに含む。
【００８２】
本発明の一実施形態においては、TLR-1を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを用いる（Sabroeら、JI 2003 p1630-5）。好適には、TLR-1を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを、トリアシル化リポペプチド（LP）；フェノール可溶性モジュリン；マイコバクテリウム・ツベルクロシスのLP；S-(2,3-ビス(パルミトイルオキシ)-(2-RS)-プロピル)-N-パルミトイル-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH、細菌リポタンパク質のアセチル化アミノ末端を模倣するトリヒドロクロリド（Pam3Cys）LP及びボレリア・ブルグドルフェリに由来するOspA LPから選択する。
【００８３】
別の実施形態においては、TLR-2を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを用いる（Sabroeら、JI 2003 p1630-5）。好適には、TLR-2を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストは、1種以上のリポタンパク質、ペプチドグリカン、結核菌（M. tuberculosis）、ボレリア菌（B. burgdorferi）、梅毒トレポネーマ（T. pallidum）に由来する細菌リポペプチド；黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）などの種に由来するペプチドグリカン；リポテイコ酸、マンヌロン酸、ナイセリアポリン、細菌線毛、エルシニアビルレンス因子、CMVビリオン、麻疹血球凝集素、及び酵母由来ザイモサンである。
【００８４】
別の実施形態においては、TLR-3を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを用いる（Sabroeら、JI 2003 p1630-5）。好適には、TLR-3を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストは、二本鎖RNA（dsRNA）、又はポリイノシン-ポリシチジル酸（ポリIC）、ウイルス感染に関連する分子核酸パターンである。
【００８５】
別の実施形態においては、TLR-5を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを用いる（Sabroeら、JI 2003 p1630-5）。好適には、TLR-5を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストは、細菌線毛である。
【００８６】
別の実施形態においては、TLR-6を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを用いる（Sabroeら、JI 2003 p1630-5）。好適には、TLR-6を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストは、マイコバクテリアリポタンパク質、ジアシル化LP、及びフェノール可溶性モジュリンである。さらなるTLR6アゴニストはWO2003043572号に記載されている。
【００８７】
別の実施形態においては、TLR-7を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを用いる（Sabroeら、JI 2003 p1630-5）。好適には、TLR-7を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストは、一本鎖RNA（ssRNA）、ロキソリビン、N7及びC8位でのグアノシン類似体、若しくはイミダゾキノリン化合物、又はその誘導体である。一実施形態においては、TLRアゴニストはイミキモッドである。さらなるTLR7アゴニストはWO02085905号に記載されている。
【００８８】
別の実施形態においては、TLR-8を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを用いる（Sabroeら、JI 2003 p1630-5）。好適には、TLR-8を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストは、一本鎖RNA（ssRNA）、抗ウイルス活性を有するイミダゾキノリン分子、例えば、レシキモッド（R848）である；レシキモッドもTLR-7により認識することができる。用いることができる他のTLR-8アゴニストとしては、WO2004071459号に記載のものが挙げられる。
【００８９】
別の実施形態において、TLR-9を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを用いる（Sabroeら、JI 2003 p1630-5）。一実施形態において、TLR-9を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストはHSP90である。あるいは、TLR-9を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができるTLRアゴニストは、細菌又はウイルスDNA、非メチル化CpGヌクレオチド（特にCpGモチーフとして知られる配列コンテクスト）を含有するDNAである。CpG含有オリゴヌクレオチドは、Th1応答を優勢に誘導する。そのようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えばWO 96/02555号、WO 99/33488号、米国特許第6,008,200号及び同第5,856,462号に記載されている。好適には、CpGヌクレオチドはCpGオリゴヌクレオチドである。本発明の免疫原性組成物における使用にとって好適なオリゴヌクレオチドは、CpG含有オリゴヌクレオチド、場合により、少なくとも3個、好適には少なくとも6個以上のヌクレオチドにより分離された2個以上のジヌクレオチドCpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチドである。CpGモチーフは、シトシンヌクレオチド、次いで、グアニンヌクレオチドである。本発明のCpGオリゴヌクレオチドは、典型的にはデオキシヌクレオチドである。特定の実施形態においては、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間は、ホスホロジチオエート、又は好適にはホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステル及び他のヌクレオチド間結合も本発明の範囲内にある。また、混合ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又はホスホロジチオエートを製造する方法は、米国特許第5,666,153号、5,278,302号及びWO 95/26204号に記載されている。好ましいオリゴヌクレオチドの例は、以下の配列を有する。この配列は、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合を含んでもよい：
OLIGO 1 （配列番号1）: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT （CpG 1826）
OLIGO 2 （配列番号2）: TCT CCC AGC GTG CGC CAT （CpG 1758）
OLIGO 3 （配列番号3）: ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
OLIGO 4 （配列番号4）: TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT （CpG 2006）
OLIGO 5 （配列番号5）: TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT （CpG 1668）
OLIGO 6 （配列番号6）: TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G （CpG 5456）。
【００９０】
好適には、ホスホロチオエート骨格CpG7909（配列番号4）を使用する。別のCpGオリゴヌクレオチドは、重要ではない欠失又は付加を有する上記の特定の配列を含んでもよい。本発明において使用するCpGオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の方法により合成することができる（例えばEP 468520を参照）。このようなオリゴヌクレオチドは、自動合成装置を用いて合成することが簡便である。
【００９１】
別の実施形態において、アジュバント及び免疫原性組成物はさらにサポニンアジュバントを含む。本発明で使用するための特に好適なサポニンは、Quil A及びその誘導体である。Quil Aは、南アフリカの木であるキラジャ・サポナリアモリナ（Quilaja Saponaria Molina）から分離されたサポニン調製物であり、最初にDalsgaardらによって1974年にアジュバント活性を有することが記述された（"Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol.44, Springer Verlag, Berlin, p243-254）。Quil Aの精製断片がHPLCにより分離されているが、これはQuil Aに関連した毒性を有することなくアジュバント活性を保持しており（EP 0 362 278）、例えばQS7及びQS21である（QA7及びQA21としても知られる）。QS-21は、キラジャ・サポナリアモリナの樹皮に由来する天然のサポニンであり、CD8+細胞傷害性T細胞（CTL）、Th1細胞、及び優勢なIgG2a抗体応答を誘発するものであり、本発明において好ましいサポニンである。本発明の好適な形態において、免疫原性組成物中のサポニンアジュバントは、サポナリアモリナquil Aの誘導体、例えばQuil Aの免疫学的活性を有する画分（QS-17又はQS-21など）であり、好適にはQS-21である。一実施形態において、本発明の組成物は、実質的に純粋な形態の免疫学的活性サポニンを含有する。一実施形態において、本発明の組成物は、実質的に純粋な形態のQS21を含有する。すなわち、QS21は、少なくとも90％純粋、例えば少なくとも95％純粋、又は少なくとも98％純粋である。
【００９２】
他の有用なサポニンは、植物セイヨウトチノキ（Aesculus hippocastanum）又はギョフィラ・ストルチウム（Gyophilla struthium）に由来する。文献に記載されている他のサポニンには、ホーストチノキ（Aesculus hippocastanum）の種子に存在するサポニンの混合物として、Merck index（12th ed: entry 3737）に記載されたEscinがある。そのクロマトグラフィーによる単離及び精製（Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)）、並びにイオン交換樹脂による単離及び精製（Erbring et al., 米国特許第3,238,190号）が記載されている。Escinの画分は精製されており、生物学的活性を有することが示されている（Yoshikawa M, et al. （Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Aug;44(8):1454-1464)）。ギョフィラ・ストルチウム（Gyophilla struthium）に由来するサポニンもまた選択肢となる（R. Vochten et al., 1968, J. Pharm.Belg., 42, 213-226）。
【００９３】
前記免疫学的活性を有するサポニン（QS21など）は、免疫原性組成物の1ヒト用量当たり1〜50μgの量で使用することができる。QS21は、約25μg、例えば20〜30μg、好適には21〜29μg又は22〜28μg又は23〜27μg又は24〜26μg、又は25μgのレベルで使用することが有利である。別の実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、QS21を約10μg、例えば5〜15μg、好適には6〜14μg、例えば7〜13μg又は8〜12μg又は9〜11μg、又は10μgのレベルで含む。さらなる実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、QS21を約5μg、例えば1〜9μg、又は2〜8μg又は好適には3〜7μg又は4〜6μg、又は5μgのレベルで含む。
【００９４】
3D-MPL及び／又はQS21の用量は、ヒトにおいて抗原に対する免疫応答を増強することができることが好適である。特に、3D-MPL及び／又はQS21の好適な量は、アジュバント無添加組成物と比較して、又は別の3D-MPL若しくはQS21量でアジュバント添加した組成物と比較して、組成物の免疫学的能力を改善する一方で、反応原性プロファイルから許容可能なものである。典型的には、ヒト投与に関して、サポニン（例えばQS21）及び／又はLPS誘導体（例えば3D-MPL）は、用量当たり1μg〜200μgの範囲、例えば10〜50μg、又は1μg〜25μgで免疫組成物のヒト用量中に存在しうる。
【００９５】
特定の実施形態において、本発明に係るアジュバント及び免疫原性組成物は、上述した油エマルジョン中のサポニン（例えばQS21）及び／又はLPS誘導体（例えば3D-MPL）と、ステロール（例えばコレステロール）とを一緒に含む。これらのステロールは当技術分野で周知であり、例えばコレステロールはMerck Index, 11th Edn.の341頁に、動物性脂肪中に天然に存在するステロールとして開示されている。さらに油エマルジョン （特に水中油型エマルジョン）は、Span 85及び／又はレシチン及び／又はトリカプリリンを含んでもよい。水中油型エマルジョン、ステロール及びサポニンを含むアジュバントはWO 99/12565号に記載されている。別の免疫刺激剤の例が、本明細書及び“Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach” 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Powell, M.F., and Newman, M.J.編, Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X. に記載されている。
【００９６】
スクアレン及びサポニン（任意でQS21）を含有させる場合、この製剤にはステロール（任意でコレステロール）を含有させることが有益である。なぜなら、これによってエマルジョンの油の総レベルが低減するためである。これは、製造コストの削減、ワクチン接種の全体的な快適性の改善、そしてまた得られる免疫応答の質的及び量的改善（IFN-γ産生の改善など）を導く。従って、本発明のアジュバント系は、典型的には200：1〜300：1の範囲の比の代謝可能な油：サポニン（w/w）を含み、また本発明は、1：1〜200：1、任意で20：1〜100：1、又は実質的に48：1の最適範囲である「低油（low oil）」形態で使用することができ、このワクチンは非常に低減された反応原性プロファイルで、成分の全ての有利なアジュバント特性を保持している。従って、いくつかの実施形態は、1：1〜250：1、又は20：1〜200：1、又は20：1〜100：1、あるいは実質的に48：1の範囲の比のスクアレン：QS21（w/w）を有する。任意で、ステロール（例えばコレステロール）を、本明細書に記載のサポニン：ステロールの比で含有させる。
【００９７】
別の免疫刺激剤を任意で含有するアジュバントは、幼児及び／又は高齢者のワクチン製剤に特に好適である。
【００９８】
従って、本発明に係る水中油型エマルジョンアジュバントは、さらに任意で、5〜60、10〜50、又は20〜30μg（例えば5〜15、40〜50、10、20、30、40又は50μg）のリピドA誘導体（例えば3D-MPL）を含有してもよい。水中油型アジュバントは、任意で、0.025〜2.5、0.05〜1.5、0.075〜0.75、0.1〜0.3、又は0.125〜0.25mg（例えば0.2〜0.3、0.1〜0.15、0.25又は0.125mg）のステロール（例えばコレステロール）、1〜60、10〜50、又は20〜30μg（例えば1〜10、5〜15、40〜50、10、20、30、40又は50μg）のリピドA誘導体（例えば3D-MPL又はリピドAの任意の合成誘導体）、及び1〜60、10〜50、又は20〜30μg（例えば1〜10、5〜15、40〜50、10、20、30、40又は50μg）のサポニン（例えばQS21）を含有してもよい。
【００９９】
インフルエンザウイルス株とインフルエンザ抗原、ワクチン接種レジメン、用量及び有効性基準
前記インフルエンザウイルス又はその抗原調製物は、卵由来又は細胞培養物由来とすることができる。例えば、本発明に係るインフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物は、卵でインフルエンザウイルスを増殖させ、回収した尿膜腔液を精製することによる従来の発育鶏卵法に由来するものであってもよい。卵は、直ぐに数多く蓄積することができる。あるいは、上記ウイルス抗原又はその抗原調製物は、細胞若しくは組織培養物を使用してウイルスを増殖させるか又は組換えインフルエンザウイルス表面抗原を発現させる、新しい作製方法のいずれかに由来するものであってもよい。ウイルスを増殖させるための好適な細胞基質には、例えば、MDCK若しくはMDCKのクローン由来の細胞、又はMDCK様細胞などのイヌ腎細胞、Vero細胞を含むAGMK細胞などのサル腎細胞、好適なブタ細胞系、又はワクチン用インフルエンザウイルスを作製するのに好適ないずれかの他の哺乳動物細胞型が含まれる。好適な細胞基質には、ヒト細胞、例えば、MRC-5細胞又はPer.C6細胞も含まれる。好適な細胞基質は細胞系に限られることなく、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞などの一次細胞、及びニワトリ又はアヒル細胞系などのトリの細胞系（例えばEBx細胞系、例としてニワトリ又はアヒル胚性幹細胞からそれぞれ誘導されたEB14又はEB24など）も含まれる。好適な昆虫細胞はSf9又はHi5である。
【０１００】
一実施形態において、本発明に係る使用のためのインフルエンザウイルス又はその抗原調製物は、スプリットインフルエンザウイルス又はそのスプリットウイルス抗原調製物であってもよい。別の実施形態において、インフルエンザ調製物は、他の型の不活化インフルエンザ抗原、例えば、不活化全ウイルス、又は精製HA及びNA（サブユニットワクチン）、又はインフルエンザビロソームを含有してもよい。なおさらなる実施形態において、インフルエンザウイルスは、弱毒生インフルエンザ調製物であってよい。
【０１０１】
本発明に係る使用のためのスプリットインフルエンザウイルス又はそのスプリットウイルス抗原調製物は、好適には、ウイルス粒子が、脂質エンベロープを溶解する界面活性剤又は他の試薬を用いて破壊されている不活化ウイルス調製物である。スプリットウイルス又はそのスプリットウイルス抗原調製物は、好適には、可溶化濃度の有機溶剤又は界面活性剤を用いて感染性又は不活化全インフルエンザウイルスを断片化し、続いて可溶化剤の全て又は大部分及びウイルス性脂質物質の一部又は大部分を除去することによって調製される。このスプリットウイルス抗原調製物とは、スプリットウイルス成分の抗原特性の大部分を保持しながらスプリットウイルスと比較してある程度精製されていてもよいスプリットウイルス調製物を意味する。例えば、卵において製造する場合、スプリットウイルスを卵夾雑タンパク質から採取してもよいし、又は細胞培養において製造する場合、スプリットウイルスは宿主細胞夾雑物から採取してもよい。スプリットウイルス抗原調製物は、2種以上のウイルス株のスプリットウイルス抗原成分を含みうる。スプリットウイルスを含有するワクチン（「インフルエンザスプリットワクチン」と呼ばれる）又はスプリットウイルス抗原調製物は通常、残余のマトリックスタンパク質及び核タンパク質、及び時には脂質、並びに膜エンベロープタンパク質を含有する。このようなスプリットウイルスワクチンは通常、ウイルス構造タンパク質の大部分又は全種類を含有するが、それらは全ウイルスに存在するのと同じ割合であるとは限らない。市販のスプリットワクチンの例は、例えばFLUARIXTM、FlUSHIELDTM、又はFLUZONETMである。
【０１０２】
あるいはまた、インフルエンザウイルスは全ウイルスワクチンの形態であってもよい。これはパンデミックの状況でスプリットウイルスワクチンよりも有利でありうる、というのは、全ウイルスワクチンであれば、新しいインフルエンザウイルス株に対するスプリットウイルスワクチンの製造が成功するかどうかという不確実性が回避されるからである。一部の株については、スプリットウイルスを製造するために使用する慣用の界面活性剤がウイルスに損傷を与えて使用不能にする可能性がある。スプリットワクチンを製造するために様々な界面活性剤を使用する及び／又は様々な方法を開発する可能性は常にあるが、時間がかかりうるし、パンデミックの状況ではかかる時間はないかも知れない。全ウイルス手法は、その確実性の程度が高いだけでなく、スプリットウイルスよりもワクチン生産能力が高い、というのは、好適なスプリットワクチンを調製するために必要な追加の精製工程で相当な量の抗原が失われるからである。
【０１０３】
他の実施形態において、インフルエンザウイルス調製物は、精製サブユニットインフルエンザワクチンの形態である。サブユニットインフルエンザワクチンは通常、2種の主要エンベロープタンパク質、HA及びNAを含有し、サブユニットインフルエンザワクチンは特に若年のワクチン受給者において通常反応原性が少ないので、全ビリオンワクチンに勝る追加の利点を有しうる。サブユニットワクチンは、組換えにより、又は破壊されたウイルス粒子からの精製により作製することができる。市販のサブユニットワクチンの例は、例えばAGRIPPALTM又はFLUVIRINTMである。特定の実施形態において、サブユニットワクチンは、少なくとも１つの主要エンベロープ成分から、例えば血球凝集素（HA）、ノイラミニダーゼ（NA）又はM2などから、好適にはHAから調製される。好適には、これらは、2種以上の抗原、例えばインフルエンザ構造タンパク質HA、NA、マトリックス1（M1）及びM2の少なくとも2種の組み合わせ、好適にはHA及びNAの両方の組み合わせ（任意でM1を含む）を含む。好適には、インフルエンザ成分は、組換えDNA技術により製造される、すなわち組換えDNA操作から生じる核酸（生存組換えベクター（ワクシニア）又は組換えサブユニットタンパク質（バキュロウイルス／昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、酵母、植物若しくは細菌）など）からの結果である又はそれから発現される。好適な昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Sf9）昆虫細胞又はトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）から開発されたHigh Five（Hi5）昆虫細胞（Invitrogen）であり、好適なバキュロウイルスは、オートグラファカリホルニカ核多角体病ウイルス（AcNPV）（Baculogold, Becton Dickinson, PharMingen）、又はいわゆるBacmid系である。
【０１０４】
一実施形態において、インフルエンザウイルス調製物は、ビロソームの形態である。ビロソームは球状の単層小胞であって、これはビロソームのリン脂質二分子膜中に挿入された、信頼しうる高次構造の機能的ウイルスエンベロープ糖タンパク質HA及びNAを保持する。市販のビロソームワクチンの例は、例えばINFLEXAL VTM又はINVAVACTMである。
【０１０５】
別の実施形態において、サブユニットインフルエンザ成分は、ウイルス様粒子（VLP）又はカプソマー（capsomer）の形態、好適には植物製又は昆虫細胞製のVLPにおいて発現させる。VLPは、その天然形態の抗原を提示する。VLPサブユニット技術は、インフルエンザタンパク質に完全に基づいていてもよいし、又はマウス白血病ウイルス（MLV）などの他のウイルスに依存してもよく、従ってMLV gagタンパク質などの非インフルエンザ抗原を含んでもよい。好適なVLPは、少なくとも1種、好適には少なくとも2種のインフルエンザタンパク質、任意で他のインフルエンザ若しくは非インフルエンザタンパク質、例えばM1及びHA、HA及びNA、HA、NA及びM1、又はHA、NA及びMLV gagなどを含む。これは、植物細胞又は昆虫細胞のいずれかで産生させることができる。VLPはまた、2種以上のインフルエンザ株に由来する抗原、例えば2種の季節性株（例えばH1N1及びH3N2）、又は1種の季節性株と1種のパンデミック株（例えばH3N2及びH5N1）に由来するVLPを有してもよい。
【０１０６】
従って、一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、卵又は細胞培養物で増殖させたインフルエンザウイルスに由来するインフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物を含む。別の実施形態において、該インフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物は、全ウイルス、スプリットウイルス、ビロソーム、又はHA、NA、M1、M2から選択される1種以上の精製された抗原を含む。. 別の実施形態において、精製された抗原（複数でもよい）は、哺乳動物、鳥類又は昆虫細胞において増殖させたインフルエンザウイルスから調製される。具体的には、精製された抗原（複数でもよい）は、組換えにより作製される。これらはウイルス様粒子の形態であってもよい。
【０１０７】
インフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物は、いくつかの商業的方法のいずれか、例えば、参照により本明細書に組み込まれる特許第DD 300833号及び第DD 211444号に記載のスプリットインフルエンザ法によって作製することができる。従来より、スプリットインフルエンザは、リン酸トリ-n-ブチル、又はTweenTMとジエチルエーテルとの組合わせ（「Tween-エーテル」スプリット剤として公知）などの溶剤/界面活性剤処理を使用して作製され、この方法は一部の製造施設でまだ使用されている。現在使用されている他のスプリット剤には、界面活性剤、タンパク質分解酵素、又は胆汁酸塩、例えば、参照により本明細書に組み込まれる特許第DD 155875号に記載のデオキシコール酸ナトリウムが含まれる。スプリット剤として使用することができる界面活性剤には、カチオン界面活性剤、例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）、他のイオン界面活性剤、例えば、ラウリル硫酸塩、タウロデオキシコール酸塩、又は非イオン系界面活性剤、例えば、Triton X-100（例えば、Lina et al, 2000, Biologicals 28, 95-103に記載の方法で）及びTriton N-101を含む上記界面活性剤、又は任意の2種以上の界面活性剤の組合せが含まれる。
【０１０８】
スプリットワクチンの調製方法には、いくつかの様々な濾過及び／又は他の分離ステップ、例えば、様々に組み合わされた、超遠心分離、限外濾過、ゾーン遠心分離、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換）ステップ、及び、場合によっては、例えば、加熱、ホルムアルデヒド若しくはβ-プロピオラクトン、又はUVによる不活化ステップ（スプリット前に又は後に実施してもよい）が含まれうる。スプリット法は、バッチ法、連続法、又は半連続法として実施することができる。スプリット免疫原性組成物用の好ましいスプリット及び精製方法は、WO02/097072号に記載されている。
【０１０９】
本発明に係る好ましいスプリットインフルエンザワクチン抗原調製物は、製造過程で残存したある剰余量のTween80及び／又はTriton X-100を含むが、これらは、スプリット抗原の調製後に添加してもよいし、又はその濃度を調節してもよい。一実施形態では、Tween80とTriton X-100が両方とも存在する。ワクチン用量中の、抗原調製物から生じるこのような非イオン系界面活性剤の最終濃度の好ましい範囲は、Tween80が0.01〜1％又は約0.1％（v/v）であり、Triton X-100が0.001〜0.1％（w/v）又は0.005〜0.02％（w/v）である。
【０１１０】
具体的な実施形態において、抗原調製物から生じるTween80の最終濃度は、0.025％〜0.09％w/vの範囲にある。他の具体的な実施形態において、抗原は、2倍濃縮混合物として提供され、この混合物は、0.025％〜0.2％（w/v）の範囲のTween80濃度を有し、アジュバント添加物（又は対照製剤中のバッファー）との最終製剤時に2倍に希釈しなければならない。
【０１１１】
他の具体的な実施形態において、Triton X-100の最終濃度は、0.004％〜0.017％w/vの範囲にある。他の具体的な実施形態において、抗原は、2倍濃縮混合物として提供され、この混合物は、0.005％〜0.034％（w/v）の範囲にあるTriton X-100濃度を有し、アジュバント添加物（又は対照製剤中の緩衝液）との最後の配合時に2倍に希釈しなければならない。
【０１１２】
一実施形態において、インフルエンザ調製物は、低レベルのチメロサール（チオメルサール）の存在下で、又はチメロサールの不在下で調製する。別の実施形態において、得られたインフルエンザ調製物が有機水銀保存剤の不在下で安定であり、特に、調製物は剰余のチメロサールを含有しない。特に、インフルエンザウイルス調製物は、チメロサールの不在下で、又は低レベルのチメロサール（通常5μg/ml以下）で安定化された赤血球凝集素抗原を含む。具体的には、B型インフルエンザ株の安定化は、α-トコフェロールコハク酸塩（コハク酸ビタミンE、すなわちVESとも言う）などのα-トコフェロールの誘導体によって実施される。かかる調製物とこれを調製する方法はWO02/097072号に開示されている。
【０１１３】
好ましい組成物は、適当なインフルエンザシーズンのWHO推奨株から調製した3種の不活化スプリットビリオン抗原を含有する。
【０１１４】
一実施形態においては、インフルエンザウイルス又はその抗原調製物と本発明に係るアジュバントは、同じ容器内に含まれる。これは「1バイアルアプローチ」と呼ばれる。別の実施形態において、バイアルは、予め充填したシリンジである。別の実施形態において、インフルエンザウイルス又はその抗原調製物と本発明に係るアジュバントは、別々の容器又はバイアル又はユニット内に含まれ、被験者への投与直前に又は投与時に混合される。これは「2バイアルアプローチ」と呼ばれる。好適には、二成分ワクチンは、I型ガラスバイアル（抗原容器）で提供される0.5mlの濃縮不活化スプリットビリオン抗原と、アジュバント0.5mlを含有する予め充填したI型ガラスシリンジ（アジュバント容器）から構成される。あるいは、ワクチンは2つのバイアル（1つは抗原用、1つはアジュバント用で、それぞれ10用量である）で提供される二成分ワクチンであって、最初の患者に投与する前に室温で24時間以内に混合物とし、その後は4℃にて短時間（例えば、1週間まで）次の投与用に保存する。注射の時点で、アジュバントを含有する多用量バイアル又はシリンジの内容物を、濃縮されたスプリットビリオン抗原を含有するバイアル中に射出する。混合後、内容物をシリンジ中に吸い込み、そして注射針を筋肉用注射針と取り替える。用事調製したアジュバント添加インフルエンザ候補ワクチンの1用量は0.5mlに相当する。
【０１１５】
一実施形態において、免疫原性組成物の各ヒト用量は、SRIDで測定した場合に、1用量当たり、インフルエンザ株当たり15μgのHAを含む。これは、高齢者集団に特に有用である。
【０１１６】
本発明の重要な態様は、インフルエンザ抗原（複数でもよい）を、以前に有用と考えられていたよりも低い量で、好適にはウイルス1株当たり15μg未満のHAのレベルで、例えば免疫原性組成物のヒト用量当たり、1株当たり1〜10μgのHAのレベルで用いることができるという事実である。
【０１１７】
従って、一実施形態において、免疫原性組成物の各ヒト用量は、低用量の血球凝集素（HA）、すなわち一元放射免疫拡散法（SRD）により測定して、1用量当たり15μg未満、好適には10μg未満の量のHAとして定義されるHAを含有する（J.M. Wood et al.: J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood et al., J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330）。特定の実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、1株当たりある用量の血球凝集素（HA）を、約10μg、例えば5〜15μg、好適には6〜14μg、例えば7〜13μg又は8〜12μg又は9〜11μg、又は10μgのレベルで含む。別の実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、1株当たりある用量の血球凝集素（HA）を、約5μg、例えば1〜9μg、又は2〜8μg又は好適には3〜7μg又は4〜6μg、又は5μgのレベルで含む。好適な量は、1.9μg、2.5μg、3.8μg、5.0μg、7.5μg、又は10μgのHA、あるいはワクチン組成物が本明細書で定義する効力基準を満たすように決定されうる15μg未満の好適な量のHAである。有利には、表２に定義される規制基準を満たす可能性のある1μgのHA又はそれ未満のHA、例えば0.5μgのHAのHA用量でも、用いることができる。好適なHAの量は、例えば、免疫原性組成物のヒト用量当たり、1インフルエンザ株当たり1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13又は14μg（w/v）のいずれかである。このような少量のHAは、その量が以下に詳述した有効性に関する国際的、例えばEU又はFDA判定基準に適合するワクチンの製剤を可能にすることを条件として、実用的に実現しうるだけ低いものである（表２及び先に記載した具体的なパラメータを参照）。
【０１１８】
好適には、0.5mlのワクチン用量を使用する。1mlのワクチン用量（0.5mlのアジュバント＋0.5mlの抗原調製物）もまた好適である。有利には、本発明に係るワクチン用量、特に低HA用量ワクチンは、一般に1用量につき約0.5、0.7又は1mlである従来の注射式スプリットインフルエンザワクチンよりも、少ない体積で提供することができる。本発明において低体積用量は、1用量当たり、好適には500μl未満、典型的には300μl未満、好適には約200μl以下である。通常、用量体積は元のバルク試料中のHA濃度に応じて又は送達経路に応じて（鼻腔内又は皮内経路はより少ない用量を与える）標的集団に応じて（例えば乳児には成人ヒト用量の半分を投与しうる）、若干調節される。
【０１１９】
好適には、免疫原性又はワクチン組成物に含有させる1又は複数のインフルエンザウイルス株は、パンデミック間期（季節性）株、又はパンデミックの発生に関与している若しくはパンデミックの発生に関与する可能性のある株、あるいは好適には、多価組成物ではこれらの株の混合物である。
【０１２０】
パンデミック間期の株は、例えば、パンデミック間期の間に世界レベルで流行する株、例えば限定するものではないが、H1N1、H1N2、H3N2又はB型である。市販のインフルエンザワクチンは、1種のインフルエンザB型株と2種のインフルエンザA型株（H1N1、H3N2）を含む三価の組み合わせである。
【０１２１】
パンデミック又はパンデミックインフルエンザ株に関与するインフルエンザ疾患の発生を引き起こす可能性のあるインフルエンザウイルス株の特長は、次のとおりである：すなわち、その株は現在流行している株の赤血球凝集素と比較して新しい赤血球凝集素を含み、それ故にほとんど全ての人が免疫学的にナイーブであること；ヒト集団で水平伝染することができること；及び、ヒトに病原性であること。新しい赤血球凝集素は、H2のように長期間、おそらく数十年間ヒト集団に顕れなかった可能性がある。又は、それは以前にヒト集団で広まっていなかった赤血球凝集素、例えば鳥類の種（トリ）に存在するH5、H9、H7又はH6である可能性がある。いずれにせよ集団の大多数、又は少なくともその大部分、又はその全てでさえ、以前にその抗原に遭遇したことがなく、免疫学的にそれにナイーブである。現在のところ、WHOが潜在的にヒトでパンデミックを引き起こしうると同定しているインフルエンザA型ウイルスは、強力な病原性H5N1トリインフルエンザウイルスである。それ故に、本発明によるパンデミックワクチンは好適にはH5N1を含みうる。請求の範囲に記載の組成物に含めるための他の２つの好適な株はH9N2又はH7N1である。
【０１２２】
ある特定の集団は、一般に、パンデミックの状況下でインフルエンザに感染するリスクが高い。高齢者、慢性病患者及び小児は特に感受性であるが、多くの若い成人で見かけ上健康な人々も危険にさらされる。H2インフルエンザについては、1968年以降に生まれた集団の部分のリスクが高い。これらの群をできるだけ早く、かつ簡単な方法で効果的に防御することが重要である。
【０１２３】
リスクの高い他の集団は旅行者である。現在、以前にもまして多くの人々が旅行をし、新しいウイルスのほとんどが出現する地域である中国及び東南アジアは、近年人気の旅行目的地となっている。この旅行パターンの変化は、新しいウイルスが数ヶ月又は数年でなく、数週間で世界中に到達することを可能にする。
【０１２４】
したがって、パンデミックの状況又は潜在的パンデミックの状況で、これらの人々の集団をインフルエンザから防御するワクチン接種が特に必要である。好適な株は、限定されるものでないが、H5N1、H5N8、H5N9、H7N4、H9N2、H7N7、H7N3、H2N2及びH1N1である。他のヒトにおけるパンデミック株はH7N3（カナダで報じられた2例）、H10N7（エジプトで報じられた2例）及びH5N2（日本で報じられた1例）及びH7N2である。パンデミック株又はパンデミックが関係する可能性のある株であるインフルエンザ株を本明細書では簡潔に「パンデミック株」と称する。
【０１２５】
本発明のインフルエンザ医薬品は、好適には、ワクチンに対するある特定の国際判定基準に適合する。インフルエンザワクチンの効力を測定するための標準が国際的に応用されている。血清学的変数は、インフルエンザワクチンの年度認可手順に関係する、臨床試験のためのヒト用医薬品評価欧州機関（European Agency for the Evaluation of Medicinal Products for human use）の判定基準により評価した（CHMP/BWP/214/96, Committee for Proprietary Medicinal Products （CPMP）. Note for harmonization of requirements for influenza vaccines（インフルエンザワクチンに対する要件の調和についての注釈）, 1997. CHMP/BWP/214/96 circular No. 96-0666:1-22）（表２）。要件は、成人集団（18〜60歳）及び高齢者集団（＞60歳）で異なる（表２）。パンデミック間期のインフルエンザワクチンについては、評価（血清変換係数、血清変換率、血清防御率）の少なくとも1つが、ワクチンに含まれるインフルエンザの全ての株に対して欧州要件に適合しなければならない。1：40以上の力価の比率が最も妥当であるとみなされる、何故ならば、これらの力価は最良の防御相関要因であると予想されるからである［Beyer W et al. 1998. Clin Drug Invest.;15:1-12］。
【０１２６】
「Guideline on dossier structure and content for pandemic influenza vaccine marketing authorisation application（パンデミックインフルエンザワクチンのマーケティング認可出願に関する文書の構成と内容のガイドライン）（CHMP/VEG/4717/03、2004年4月5日）」、又はより最近の「Guidelines on flu vaccines prepared from viruses with a potential to cause a pandemic（パンデミックを引き起こす可能性のあるウイルスから調製されるインフルエンザワクチンのガイドライン」（EMEA/CHMP/VWP/263499/2006、2007年1月24日、www.emea.eu.intから入手可）に記載されているように、流行していない株由来のインフルエンザワクチンに対する判定基準が存在しない中で、パンデミック候補ワクチンは、2回用量のワクチン投与後に、初回刺激を受けてない成人又は高齢被験者において現存ワクチンに対する現行標準セットの、好適には、3つ全てに適合するのに十分な免疫応答を（少なくとも）惹起すべきであると予想されている。EMEAガイドラインは、パンデミックの状況では、集団は免疫学的にナイーブであり、それゆえ季節性ワクチンの3つのCHMP基準の全てをパンデミック候補ワクチンが満たすと仮定している。ワクチン接種前の血清陰性被験者においてそれを証明するための明示的な要件は要求されていない。
【０１２７】
本発明の組成物は、組成物中に含まれる、好適には、パンデミック株に対する少なくとも1つのかかる判定基準（1つの判定基準が認可を得るのに十分である）、好適には少なくとも2つの又は典型的には少なくとも3つ全ての表２Ａに掲げた防御に対する判定基準に適合する。
【表２】
2010524883.tif 000003
【０１２８】
*血清変換率は、各群における防御性のワクチン接種後力価≧1：40を有する被験者の比率として定義される。単純におかれた血清変換率は、ワクチン接種前に＜1:10及びワクチン接種後に≧1：40のHI力価を有する被験者の％である。しかし、もし初期力価が≧1：10であれば、その時には、ワクチン接種後の抗体の量が少なくとも4倍増加である必要がある。  
**変換係数は、各ワクチン株について、ワクチン接種後の血清HI幾何平均力価（GMT）の増加倍率として定義される。  
***防御率は、ワクチン接種前に血清陰性であってワクチン接種後に≧1：40の（防御性）HI力価を有するか、又はワクチン接種前に血清陽性であってワクチン接種後に力価の有意な4倍増加を有する被験者の比率として定義される：これは通常、防御を示すものとして容認されている。
【０１２９】
70％血清防御率は欧州保健規制機関（European health regulatory authority）（CHMP：Committee for Medicinal Products for Human Use）が定義した年度季節性インフルエンザワクチンに適合するために通常要求される3つの判定基準の1つであり、かつCHMPがパンデミック候補ワクチンも適合することを期待しているものである。しかし、数学モデルは、ある特定のドリフト株に対して30％しか有効でないワクチンも、集団レベルでは、パンデミックの大きさを減じる助けになりうること、そしてパンデミック株に対して30％有効な（プレパンデミック）ワクチン（交差防御30％）を用いたパンデミックワクチン接種キャンペーンが、臨床的発病率を75％低減するのに有効であり、結果的に集団内の罹患率／死亡率を低減するのに有効であることを示している（Ferguson et al、Nature 2006）。
【０１３０】
FDAは、パンデミックインフルエンザワクチンの実施権を支持するために必要な臨床データに関する草案ガイダンス（CBER基準草案）を公開していて（the Office of Communication、Training and Manufacturers Assistance （HFM-40）、1401 Rockville Pike、Suite 200N、Rockville、MD 20852-1448から、又は電話1-800-835-4709 又は 301-827-1800により、又はインターネットhttp：//www.fda.gov/cber/guidelines.htmから入手可能である）、その提案された判定基準もCHMP判定基準に基づいている。FDAはわずかに異なる年齢のカットオフ点を使用している。適当な終点には同様に次が含まれる：1）HI抗体力価≧1：40を達成する被験者の％、及び 2）ワクチン接種後におけるHI 抗体力価の4倍上昇として定義される血清変換率。幾何平均力価（GMT）が結果に含まれなければならないが、血清変換の発生率の95％信頼区間の下限、そして1:40以上のHI力価の42日目の発生率が目標値を超える必要がある。これらのデータ及びこれらの評価の点見積値の95％信頼区間（CI）が提供されなければならない。FDAの草案ガイダンスは、この両方の目標を満たすことを必要としている。これを表２Ｂにまとめる。
【０１３１】
2010524883.tif 000004
【０１３２】
* 血清変換率は次のとおり定義される：a）基線力価が≧1:10である被験者については4倍以上の上昇、又はb）基線力価が＜1:10である被験者については≧1:40までの上昇。  
これらの基準は、真の値について95％ CIの下限において満たす必要がある。
【０１３３】
従って、本発明の一態様においては、想定されるインフルエンザ組成物の投与により誘発される前記免疫応答又は防御が全て3つのインフルエンザワクチン効力に対するEU規制判定基準に適合するものである、本請求の範囲に記載の組成物、方法又は使用が提供される。好適には、次の判定基準の少なくとも1つ、好適には2つ又は3つが本組成物の１つの株又は各株に適合する：
・成人集団（18〜60歳）において、及び／又は、好適には高齢者集団（＞60歳）においても、＞50％の、＞60％の、＞70％の、好適には＞80％の、又は＞90％の血清変換率；
・成人集団（18〜60歳）において、及び／又は、好適には高齢者集団（＞60歳）においても、＞75％、＞80％、＞85％、好適には、＞90％の防御率；
・成人集団（18〜60歳）において、及び／又は、好適には高齢者集団（＞60歳）においても、＞4.0の、＞5.0の、＞6.0の、＞7.0の、＞8.0の、＞9.0の、又は10の、又は10を超える変換係数。
【０１３４】
具体的な実施形態において、本発明に係る組成物は、成人集団において＞60％、又は＞70％、又は好適には、＞80％の血清変換率と＞75％、好適には、＞80％の防御率の両方に適合しうる。他の具体的な実施形態において、本発明に係る組成物は、成人集団において＞5.0、又は＞7.0又は好適には、＞10.0の変換係数と＞60％、又は＞70％、又は好適には、＞80％の血清変換率の両方に適合しうる。他の具体的な実施形態において、本発明に係る組成物は、成人集団において＞5.0、又は＞7.0又は好適には、＞10.0の変換係数と＞75％、好適には、＞80％の防御率の両方に適合しうる。さらに他の具体的な実施形態において、本発明に係る組成物は、10.0以上の変換係数、80％以上の血清変換率、及び80％以上の防御率の全てに適合しうる。
【０１３５】
他の実施形態においては、請求の範囲に記載のワクチン、好適には、パンデミック株又はパンデミックと関連していると考えられる株を含むプレパンデミックワクチンは、流行しているパンデミック株に対して30％の効力を有する（交差防御30％）。特に請求の範囲に記載のワクチンは、ドリフト株に対して少なくとも30％の、好適には、ドリフト株に対して少なくとも40％、又は ＞50％ 又は ＞60％の血清防御率に適合しうる。好適には、その血清防御率はドリフト株に対して＞70％、又は好適には、＞80％でありうる。かかる交差防御を付与することができるプレパンデミックワクチンは、全体的な感染症の発病率を実質的に少なくとも50％、又は好適には少なくとも75％低減し、結果的に集団内の発病率／死亡率を低減する可能性がある。
【０１３６】
また別の実施形態において、請求の範囲に記載のアジュバント添加ワクチンは、ドリフト株又は異なる分岐群からの株に対して、少なくとも50％の被験者、少なくとも60％、好適には少なくとも70％、又は好適には75％を超える被験者において中和抗体を誘導することができる。好適には、この効果は、少量の抗原、例えば7.5μgのHA、又はよりさらに低用量の抗原、例えば3.8μg若しくは1.9μgのHAにより達成される。
【０１３７】
好適には、かかる判定基準のいずれか又は全てはまた、例えば、小児及び免疫低下した集団などの他の集団についても適合する。
【０１３８】
本発明の一態様において、免疫原性組成物のヒト用量は単一インフルエンザ株からの赤血球凝集素（HA）を含有し、「一価」インフルエンザ組成物と呼ばれる。本発明の他の態様において、免疫原性組成物のヒト用量は２種以上のインフルエンザ株からの赤血球凝集素（HA）を含有し、「多価」インフルエンザ組成物と呼ばれる。本発明に係る好適な多価組成物は二価組成物（他を排するものではないが、パンデミックに関与しているか又はパンデミックに関与しやすいと思われる2種の株などの2種のインフルエンザウイルス株由来の赤血球凝集素（HA）、例えばH5+H2を含む）、三価組成物（任意に、2種のA型株と、限定されるものでないが、B/yamagata又はB/Victoriaなどの1種のB型株由来の3種のインフルエンザ株由来の赤血球凝集素（HA）を含む）、四価組成物（4種のインフルエンザ株由来の赤血球凝集素（HA）を含む）、又は五価組成物（5種のインフルエンザ株由来の赤血球凝集素（HA）を含む）である。好適な四価組成物は、2種のA型株と異なる系統からの2種のB型株（例えば、B/yamagata又はB/Victoria）からの赤血球凝集素を含む。あるいは、四価組成物は、3種のA型株（任意にH1N1、H3N2、及びパンデミックに関与しているか又はパンデミックに関与しやすいと思われる1種のA型株）と1種のB型株（例えば、B/yamagata又はB/Victoria）を含む。他の別の四価組成物は、H5+H2+H7+H9のような鳥類株などのパンデミックに関与しているか又はパンデミックに関与しやすいと思われる株からの4種のA型株由来の赤血球凝集素を含む。特に、パンデミック二価（例えばH5+H2）又は三価又は四価（例えばH5+H2+H7+H9）などのアジュバント添加多価パンデミック組成物は、パンデミックインフルエンザA型脅威亜型に対する先制免疫感作及び脅威亜型に対する持続性初回刺激の利点を提供する。典型的には、2用量を6週齢から好都合なスケジュール（例えば、6〜12ヶ月間隔）を用いてかつ任意に定期的な追加免疫を見越して（例えば、10年）投与する。任意に、かかるパンデミックワクチンを季節性ワクチンと組み合わせる。
【０１３９】
多価組成物はまた、6、7、8、9又は10種のインフルエンザ株などの5種以上のインフルエンザ株を含んでもよい。
【０１４０】
2種のB型株を多価季節性組成物に用いる場合、それらは2種の異なる系統（任意にB/Victoria 及び B/Yamagata由来の）からのものでありうる。前記B型株の少なくとも1種、好適には、B型株の両方は流行している系統からのものであろう。かかる組成物は、特に小児に好適である。好適には、小児に使用する多価組成物が2種のB型株を含む場合、B型株に通常割り当てられる抗原の量は2種のB型株に分割される。特に、アジュバント添加した四価（H1+H3+B型系統の両方）インフルエンザワクチンは、アジュバント無添加ワクチンと比較して優れた効力として、ナイーブな小児に対する高い予防（同種及びドリフト防御の両方と、2種の流行しているB型系統に対する効力によって）及び年齢に基づいて可能な通年免疫感作の利点を提供する。1用量又は2用量を、好適には、早ければ6週齢から、又は6〜35月齢の間に投与する。
【０１４１】
ある具体的な実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、2種のA型株（任意にH1N1、H3N2）及び1種のB型株由来の赤血球凝集素（HA）を含む、三価免疫原性又はワクチン組成物である。好適には、株当たりのHAは少量のHA（任意に株当たり10μg以下のHA）であり、先に規定した通りである。好適には、株当たりのHAは、約5μg以下、約2.5μg以下である。アジュバントは本明細書に規定した通り、特に表１に規定した通りである。好適には、アジュバント組成物は、スクアレン、α-トコフェロール、及びポリソルベート80を、1用量当たりそれぞれ5〜6mg、5〜6mg及び2〜3mgの量で含む水中油型エマルジョンである。あるいは、アジュバント組成物は、スクアレン、α-トコフェロール、及びポリソルベート80を1用量当たりそれぞれ2.5〜3.5mg、2〜3mg及び1〜2mgの量で含む水中油型エマルジョンである。これらのアジュバント添加免疫原性組成物又はワクチンは、特に、成人（18〜60歳）又は年長の小児（3〜17歳）集団に対して好適であり、H3N2ドリフト変種に対する及び異なる系統由来のB型株に対する交差防御を提供することができる。
【０１４２】
他の具体的な実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、2種のA型株（任意にH1N1、H3N2）及び2種のB型株（任意にB/Victoria及びB/Yamagata由来などの異なる系統由来の）由来の赤血球凝集素（HA）を含む四価免疫原性の又はワクチン組成物である。好適には、1用量当たり株当たりのHAは約15μgである。好適には、株当たりのHAは少量のHA（任意に、最大1用量当たり40〜45μg HAを達成するために、1用量当たり、1株当たり約10μg HA以下）であり、先に規定した通りである。好適には、株当たりのHAは、約5μg以下、約2.5μg以下である。アジュバントは本明細書に規定した通り、特に表１に規定した通りである。好適には、アジュバント組成物は、スクアレン、α-トコフェロール、及びポリソルベート80を、1用量当たりそれぞれ5〜6mg、5〜6mg及び2〜3mgの量で含む水中油型エマルジョンである。あるいは、アジュバント組成物は、スクアレン、α-トコフェロール、及びポリソルベート80を1用量当たりそれぞれ2.5〜3.5mg、2〜3mg及び1〜2mgの量で含む水中油型エマルジョンである。第2のB型株を含むかかる組成物は、とりわけ、先行曝露又は初回刺激が重要である非常に若い小児に特に好適である。アジュバントは、この集団に高い防御を送達する利点を提供しうる。小児集団に対する免疫原性組成物のヒト用量は、好適には、成人ヒト用量の半分であり、好適には、株当たり2.5μgのHAと、スクアレン、α-トコフェロール及びポリソルベート80を1用量当たりそれぞれ2.5〜3.5mg、2〜3mg及び1〜2mgの量で含む水中油型エマルジョンとを含みうる。
【０１４３】
あるいは、四価組成物に関しては、先に規定した特徴を備えかつ量である前記のさらなるB型株を一価組成物の形態で、先に記載した三価組成物に加えてもよい。少量のHA、例えば、10μg以下、若しくは5μg以下、又は、任意に若年の小児については2.5μg未満を用いることは、グローバルなワクチン供給に与える添加インフルエンザ株の影響を制限する利点を有しうる。好適には、2種のB型株がワクチン組成物に含まれる場合、B型株に通常割り当てられる抗原の量は2種のB型株に分割される。
【０１４４】
他の具体的な実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、2種のパンデミック間期のA型株（任意にH1N1、H3N2）、1種のB型株及びパンデミックに関与しているか又はパンデミックに関与しやすいと思われる1種のA型株（任意にH5N1、H9N2、H7N7、H5N8、H5N9、H7N4、H7N3、H2N2、H10N7、H5N2、H7N2及びH7N1）からの赤血球凝集素（HA）を含む四価免疫原性又はワクチン組成物である。好適には、株当たりのHAは少量のHA（任意に株当たり10μg以下のHA）であり、先に規定した通りである。好適には、株当たりのHAは、約5μg以下、約2.5μg以下である。アジュバントは本明細書に規定した通り、特に表１に規定した通りである。好適には、アジュバント組成物は、スクアレン、α-トコフェロール、及びポリソルベート80を、1用量当たりそれぞれ5〜6mg、5〜6mg及び2〜3mgの量で含む水中油型エマルジョンである。あるいは、アジュバント組成物は、スクアレン、α-トコフェロール、及びポリソルベート80を1用量当たりそれぞれ2.5〜3.5mg、2〜3mg及び1〜2mgの量で含む水中油型エマルジョンである。
【０１４５】
他の具体的な実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、3種のパンデミック間期のA型株（任意に、H1N1及び2種のH3N2株）及び1種のB型株由来の赤血球凝集素（HA）を含む四価免疫原性又はワクチン組成物である。好適には、株当たりのHAは少量のHA（任意に、株当たり10μg以下のHA）であり、先に規定した通りである。好適には、株当たりのHAは、約5μg以下、約2.5μg以下である。アジュバントは本明細書に規定した通り、特に表１に規定した通りである。好適には、アジュバント組成物は、スクアレン、α-トコフェロール、及びポリソルベート80を、1用量当たりそれぞれ5〜6mg、5〜6mg及び2〜3mgの量で含む水中油型エマルジョンである。あるいは、アジュバント組成物は、スクアレン、α-トコフェロール、及びポリソルベート80を1用量当たりそれぞれ2.5〜3.5mg、2〜3mg及び1〜2mgの量で含む水中油型エマルジョンである。第3の季節性A型株を含む、かかる組成物は、非常に若年の小児に特に好適である。好適には、3種のパンデミック間期の株のうちの2種はH3N2株であり、第2のH3N2株は第1のH3N2株と比較して近縁の、又は遠縁の分岐群（クレード）である。アジュバントはこの集団に高い防御を送達する利点を提供する。小児集団に対する免疫原性組成物のヒト用量は、好適には、成人ヒト用量の半分であり、好適には、株当たり2.5μgのHAと、スクアレン、α-トコフェロール及びポリソルベート80を1用量当たりそれぞれ2.5〜3.5mg、2〜3mg及び1〜2mgの量で含む水中油型エマルジョンとを含みうる。
【０１４６】
他の具体的な実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、2種のパンデミック間期のA型株（任意に、H1N1、H3N2）、2種のB型株（任意に、B/Victoria及びB/Yamagata由来などの異なる系統から）及びパンデミックに関与しているか又はパンデミックに関与しやすいと思われる1種のA型株（任意に、H5N1、H9N2、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H7N3、H2N2、H10N7、H5N2及びH7N1）からの赤血球凝集素（HA）を含む五価の免疫原性又はワクチン組成物である。好適には、1用量当たり、1株当たりのHAは約15μgである。好適には、株当たりのHAは少量のHA（任意に、最大1用量当たり40〜45μg HAを達成するために、1用量当たり株当たり約10μg HA以下）であり、先に規定した通りである。好適には、株当たりのHAは、約5μg以下、約2.5μg以下である。アジュバントは本明細書に規定した通り、特に表１に規定した通りである。好適には、アジュバント組成物は、スクアレン、α-トコフェロール、及びポリソルベート80を、1用量当たりそれぞれ5〜6mg、5〜6mg及び2〜3mgの量で含む水中油型エマルジョンである。あるいは、アジュバント組成物は、スクアレン、α-トコフェロール、及びポリソルベート80を1用量当たりそれぞれ2.5〜3.5mg、2〜3mg及び1〜2mgの量で含む水中油型エマルジョンである。
【０１４７】
他の具体的な実施形態において、免疫原性組成物のヒト用量は、3種のパンデミック間期のA型株（任意にH1N1、及び2種のH3N2株）、並びに2種のB型株（任意にB/Victoria及びB/Yamagata由来などの異なる系統から）からの赤血球凝集素（HA）を含む五価の免疫原性又はワクチン組成物である。好適には、株当たりのHAは少量のHA（任意に株当たり10μg以下のHA）であり、先に規定した通りである。好適には、株当たりのHAは、約5μg以下、約2.5μg以下である。アジュバントは本明細書に規定した通り、特に表１に規定した通りである。好適には、アジュバント組成物は、スクアレン、α-トコフェロール、及びポリソルベート80を、1用量当たりそれぞれ5〜6mg、5〜6mg及び2〜3mgの量で含む水中油型エマルジョンである。あるいは、アジュバント組成物は、スクアレン、α-トコフェロール、及びポリソルベート80を1用量当たりそれぞれ2.5〜3.5mg、2〜3mg及び1〜2mgの量で含む水中油型エマルジョンである。
【０１４８】
従って具体的な実施形態において、本発明は、スクアレン：HA全重量（全インフルエンザ株が含まれる）の重量比が約50〜150又は約150〜400（例えば約200〜300）の範囲にある、スクアレンとHAを含むインフルエンザ免疫原性組成物を提供する。かかる組成物は、他を排するものではないが、高齢者集団での使用に好適であり、反応原性と免疫原性の良好なバランスが保たれている。他の実施形態においては、スクアレン：HA全重量（全インフルエンザ株が含まれる）の重量比が約50〜400、例えば約50〜100、75〜150、75〜200、75〜400、100〜200、100〜250又は200〜400の範囲にある、スクアレンとHAを含むインフルエンザ免疫原性組成物を提供する。この比は、好適には、防御に対する少なくとも2つの、好適には3つの全ての判定基準（表２）が特定の集団に適合するものでありうる。TLRアゴニスト、好適にはTLR-4（例えば3D-MPL、MPL；RC527又はRC529などのAGP分子、又はER804057から選ばれる）又はTLR-9（好適にはCpGオリゴヌクレオチド、例えばCpG7909）アゴニストが含まれてもよい。好適なスクアレン：TLR-4の重量比は、約100〜450、例えば50〜250、50〜150、100〜250、200〜250、350〜450の範囲にある。好適なスクアレン：TLR-9の重量比は、約50〜1000、例えば50〜500、100〜1000、100〜400、400〜600の範囲にある。HAは季節性インフルエンザ株でありうる。かかる組成物は、好適には、他を排するものでないが、成人又は小児集団での使用に好適であり、反応原性と免疫原性が良好なバランスをとっている。好適には、HAは少なくとも3種、少なくとも4種のインフルエンザ株由来である。好適には、3種の季節性株（例えば、H1N1、H3N2、B）が存在する。好適には、4種の株が存在する場合、それらは、4種の季節性株（例えば、H1N1、H3N2、2種のB型株；又はH1N1、B型、2種のH3N2株）の群又は1種のパンデミック（例えば鳥類）株と3種の季節性株（例えば、H1N1、H3N2、B型）の群からのものである。
【０１４９】
請求の範囲に記載のアジュバント添加免疫原性組成物又はワクチンは全て、アジュバントに依存して、好適には、ワクチン接種後、6カ月、好適には12カ月を超える期間にわたり、持続的な免疫応答を有利に提供することができる。
【０１５０】
好適には、上記応答は、同じ継続する初回刺激応答の間に投与された1回用量後に又は典型的には2回用量後に得られる。免疫応答がたった1用量のアジュバント添加した組成物又はワクチン投与後に得られることが、請求の範囲に記載の組成物の特別な利点である。また、好適にはナイーブ又は免疫不全の集団又は個体には、2回用量を同じ持続している一次免疫応答の間に投与することも好適である。好適には、小児、特に以前にワクチン接種を受けていない6歳又は9〜10歳以下の小児には2回用量が必要と考えられる。
【０１５１】
従って、本発明の一態様においては、インフルエンザに対する1回用量又は2回用量ワクチン接種用のワクチン組成物の製造における、非生パンデミックインフルエンザウイルス抗原調製物、特にスプリットインフルエンザウイルス又は抗原調製物の使用であって、その1回用量又は2回用量ワクチン接種がインフルエンザワクチンに対する少なくとも1つの、好適には2つ又は3つの国際規制要件に適合する免疫応答を生じることを特徴とする前記使用が提供される。他の特別な実施形態において、前記1用量ワクチン接種はまた、又はさらに、アジュバント無添加ワクチンを用いて得られるより高いCD4 T細胞免疫応答及び／又はB細胞記憶応答も生じる。特別な実施形態において、前記免疫応答は交差反応性抗体応答、若しくは交差反応性CD4 T細胞応答、又はそれらの両方である。具体的な実施形態において、そのヒト患者はワクチン接種株に対して免疫学的にナイーブである（すなわち、予め免疫が存在しない）。具体的には、そのワクチン組成物は少量のHA抗原及び、以前に有用と考えられていた用量よりも低い用量であり、本明細書に記載の量である成分を含む水中油型エマルジョンアジュバントを含有する。特にワクチン組成物の免疫原性特性は本明細書に定義した通りである。好適には、ワクチンは筋肉内に投与される。
【０１５２】
本発明のワクチン接種（任意で初回ワクチン接種）に使用する免疫原性組成物の免疫原性特性
本発明において、アジュバント添加免疫原性組成物は、アジュバント無添加の、すなわち、いかなる外来アジュバントも含有しない対応組成物（本明細書では「単味組成物」とも呼ぶ）によって得られるCD4+ T細胞免疫応答と比較して、成分抗原の少なくとも1つ又は抗原組成物に対して、改善されたCD4+ T細胞免疫応答を好適に誘導することができる。インフルエンザ免疫原性組成物が複数種のインフルエンザ菌株に由来するものであり、そのうち１株が第２のB型株、又は第３のパンデミック間期のA型株、又はパンデミック株である場合の具体的な実施形態において、前記改善されたCD4+ T細胞免疫応答はこれらの株の少なくとも１株に対するものである。別の実施形態において、以前に有用と考えられていたレベルよりも低いレベルであり、そして典型的には上で定義した通りであるアジュバント成分（複数でもよい）を含むアジュバント添加免疫原性組成物は、好適には、成分抗原の少なくとも１つ又は抗原組成物に対して、従来技術の一部のアジュバントでアジュバント添加した組成物で得られるものと少なくとも同等の、CD4+ T細胞免疫応答を誘導することが可能である。この特徴は、本明細書の以下において「同等のCD4+ T細胞免疫応答」と称する。
【０１５３】
「改善されたCD4+ T細胞免疫応答」とは、本明細書に記載のアジュバント添加免疫原性組成物を投与した後に、アジュバント無添加の同じ組成物の投与後に得られる応答より高いCD4+応答が、ヒト患者で得られることを意味する。例えば、インフルエンザウイルス又はその抗原調製物と、代謝可能な油（任意でスクアレン）、トコフェロール（任意でα-トコフェロール）及び乳化剤（任意でモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、例えばTween 80TM又はポリソルベート80TMなど）を含む水中油型エマルジョンアジュバントとを一緒に含む免疫原性組成物を投与することにより、アジュバント無添加のインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を含む免疫原性組成物の投与後に誘導される応答と比較して、より高いCD4+ T細胞応答がヒト患者で得られる。かかるアジュバント添加製剤を使用して、MHCクラスII分子により提示されるインフルエンザエピトープを検出できる抗インフルエンザCD4+ T細胞応答を有利に誘導しうる。
【０１５４】
好適には、本発明に用いるアジュバント添加スプリットインフルエンザ組成物によって引き起こされる前記免疫学的応答は、サブユニットインフルエンザワクチンや全インフルエンザウイルスワクチンなどの、任意の他のアジュバント無添加の従来のインフルエンザワクチンによって引き起こされる免疫学的応答より高い。
【０１５５】
特に、限定するものではないが、前記「改善されたCD4+ T細胞免疫応答」又は「同等の（comparable）CD4+ T細胞免疫応答」は、免疫学的に初回刺激がなされてない患者において、すなわち前記インフルエンザウイルス若しくは抗原に対して血清陰性の患者において得られる。この血清陰性は、前記患者が、かかるウイルス又は抗原にこれまで遭遇したことがなく(いわゆる「ナイーブ」患者)、あるいは前記抗原に遭遇したときに応答できなかった結果でありうる。好適には、前記改善されたCD4+ T細胞免疫応答は、免疫低下した被験者、例えば高齢者（一般的には少なくとも50歳、典型的には65歳以上）若しくは高リスクの医学的症状を有する65歳未満の成人（「高リスク」成人）、又は２歳未満の小児において得られる。
【０１５６】
（改善された）CD4+ T細胞免疫応答は、下記のサイトカインのいずれかを産生する細胞の数を測定することによって、評価することができる：
・少なくとも2種の異なるサイトカイン（CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα）を産生する細胞
・少なくともCD40L及び他のサイトカイン（IL-2、TNFα、IFNγ）を産生する細胞
・少なくともIL-2及び他のサイトカイン（CD40L、TNFα、IFNγ）を産生する細胞
・少なくともIFNγ及び他のサイトカイン（IL-2、TNFα、CD40L）を産生する細胞
・少なくともTNFα及び他のサイトカイン（IL-2、CD40L、IFNγ）を産生する細胞。
【０１５７】
上記サイトカインのいずれかを産生する細胞が、アジュバント添加組成物の投与後にアジュバント無添加組成物の投与と比べて、より多量である場合、「改善された」CD4+ T細胞免疫応答があることになる。典型的には、上に挙げた5つの条件のうち、少なくとも1つ、好ましくは2つが満たされる。特別な実施形態において、4種のサイトカイン全てを産生する細胞は、アジュバント無添加群と比較して、アジュバント添加群においてより多く存在する。従来技術の一部のアジュバントでアジュバント添加した組成物（すなわち同じ成分を高レベルで含む）で得られるものと比較して、以前に有用と考えられていたレベルよりも低いレベルであり、そして典型的には上で定義した通りであるアジュバント成分（複数でもよい）を含むアジュバント添加免疫原性組成物で得られる応答に有意な低下がない、任意で、統計学的に有意な低下がない場合に、「同等の」CD4+ T細胞応答があるだろう。
【０１５８】
具体的な実施形態において、改善されたCD4 T細胞免疫応答を本発明のアジュバント添加インフルエンザ組成物によって付与することができ、そして理想的には1回の単一投与後に得ることができる。単一用量の手法は、例えば、急速に展開する発生状況において極めて好適である。ある特定の状況では、特に高齢者集団について、又はインフルエンザに対して初めてワクチン接種された若年の小児(9歳未満)の場合に、あるいはパンデミックの場合に、そのシーズンに対する同じ組成物の2回用量を投与することが有益でありうる。前記同じ組成物の第2用量（依然として「初回ワクチン接種用組成物」とみなされる）は、進行中の1次免疫応答中に投与してもよく、十分に間隔を置く。典型的には、組成物の第2用量は、第1用量の2〜3週間後又は約1ヶ月後に、例えば2週間、3週間、4週間、5週間、又は6週間後に与えて、非応答性の又は応答不十分な個人の免疫系を初回刺激するのを助ける。具体的な態様においては、原ワクチン接種（primo-vaccination）に続いて、異種インフルエンザ株を含有するアジュバント添加ワクチン製品の次のワクチン接種コースを行う。
【０１５９】
具体的な実施形態において、前記免疫原性組成物の投与は、代わりに又はさらに、アジュバント無添加組成物で免疫感作した個体で誘導されるB記憶細胞応答と比較して、アジュバント添加免疫原性組成物を投与した患者において改善されたB記憶細胞応答を誘導する。改善されたB記憶細胞応答とは、in vitro分化の刺激によって測定した、抗原との遭遇時に抗体分泌形質細胞に分化しうる末梢血Bリンパ球の頻度の増加を意味するものとする(実施例のセクション、例えばElispot B細胞記憶の方法を参照)。別の実施形態において、以前に有用と考えられていたレベルよりも低いレベルであり、そして典型的には上で定義した通りであるアジュバント成分（複数でもよい）を含むアジュバント添加免疫原性組成物は、好適には、成分抗原の少なくとも１つ又は抗原組成物に対して、従来技術の一部のアジュバントでアジュバント添加した組成物で得られるものと同等の（すなわち有意に又は任意で統計学的に有意に非劣性ではない）B記憶細胞応答を誘導することができる。この特徴を本明細書中では「同等のB記憶細胞応答」と呼ぶ。
【０１６０】
そのうえ、さらなる具体的な実施形態において、アジュバント添加した初回ワクチン接種用の組成物によるワクチン接種は、CD8応答に対して測定可能な影響を及ぼさない。
【０１６１】
好適には、水中油型エマルジョンアジュバント、特に、代謝可能な油（任意でスクアレン）、トコール（任意でα-トコフェロール）、及び乳化剤（任意でモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、例えばTween 80TM又はポリソルベート80TMなど）を本明細書に定義するように少量で含む水中油型エマルジョンアジュバント、を用いて製剤したインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を含む、請求の範囲に記載の組成物は、免疫低下した又は免疫学的にナイーブなヒト集団において、T細胞応答を促進するのに有効でありうる。好適には、本発明で記載した、初回ワクチン接種のためにアジュバント添加免疫原性組成物の単一用量を投与すると、インフルエンザに対するワクチン再接種後に、インフルエンザワクチンの防御相関要因によって評価される通り、アジュバント無添加インフルエンザワクチンを用いてワクチン接種を行うよりも優れた血清防御を提供できるであろう。請求の範囲に記載のアジュバント添加製剤はまた、インフルエンザウイルスに対して、アジュバント無添加製剤で得られるものと比較して、改善されたCD4 T細胞免疫応答を誘発するために有利である。この特性は、ワクチン接種又はインフルエンザ抗原曝露に対する感染時の反応性の増加に関連しうる。さらに、この特性はまた、交差反応性、すなわち、変種インフルエンザ株に対する高い応答能力にも関連しうる。この定性的に及び／又は定量的に改善された応答は、パンデミックの場合に、全集団に、とりわけ免疫能力の低下したヒト集団、例えば高齢者集団（65歳以上）及び特に高リスク高齢者集団に有益でありうる。この特性はまた、大部分がナイーブの乳幼児集団(5歳未満、好適には2歳未満)にも有益でありうる。組成物が少なくとも１種のパンデミック株を含む場合、この改善された応答は、例えば、パンデミック発生前又は発生時に、ドリフト変種を含有する備蓄ワクチンによる初回刺激への利用に有益でありうる。これは、全体的な罹患率及び死亡率を低下させることができ、肺炎及びその他のインフルエンザ様の病気の場合の緊急入院を防止することができる。さらに、アジュバント無添加製剤で引き起こされた応答と比較して、時間的にもっと持続する、例えば初回ワクチン接種の１年後に依然として存在するCD4 T細胞応答を誘発することを可能にする。請求の範囲に記載の組成物ではこれらの利点が全て得られる一方で、より多量の成分を有するアジュバントと比較して全体的な反応原性が低下している。
【０１６２】
好適には、初回刺激していない被験者で得られる「改善された」又は「同等の」CD4 T細胞免疫応答のようなCD4 T細胞免疫応答は、交差反応性CD4 Tヘルパー応答の誘導に関わる。特に、交差反応性CD4 T細胞の量が増加する。「交差反応性」CD4応答とは、インフルエンザ株（任意で異なる分岐群又は系統由来の株）間で共有されるエピトープをCD4 T細胞が標的化することを意味する。
【０１６３】
通常、利用可能なインフルエンザワクチンは、類似した抗原特性の赤血球凝集素を有するインフルエンザウイルスの感染株に対してのみ有効である。感染性（流行している）インフルエンザウイルスが、表面糖タンパク質、特に赤血球凝集素に小さな変化（例えばアミノ酸の変化をもたらす点変異や点変異の蓄積など）を経た場合（抗原性ドリフト変種ウイルス株）、ワクチンは依然としていくらかの防御をもたらすことはできるが、新たに生成した変種は、従来のインフルエンザ感染又はワクチン接種により引き起こされる免疫性を逃れる可能性があるので、限定された防御しか提供し得ない。抗原のドリフトは、パンデミック間期に生ずる例年の伝染病の原因となる（Wiley & Skehel, 1987,Ann. Rev. Biochem. 56, 365-394）。交差反応性CD4 T細胞の誘発によって、本発明の組成物にさらなる利点がもたらされる、すなわち、交差防御、言い換えれば異種感染に対する防御、すなわち免疫原性組成物中に含有されるインフルエンザ株の変種（例えばドリフト）である流行中のインフルエンザ株によって引き起こされる感染に対する防御を提供しうる。これは、流行中の株を卵で増殖するのが難しい場合、又は細胞培養物中で作製するのが難しい場合、ドリフト株の使用を実用的な代替案にできることから、有利でありうる。これは、被験者が初回ワクチン接種と2回目のワクチン接種とを数ヶ月又は1年間隔で受け、かつ2回目の免疫感作で使用する免疫原性組成物中のインフルエンザ株が、初回ワクチン接種で使用した組成物中の株のドリフト変種株である場合にも有利である。
【０１６４】
本明細書中で定義したアジュバント添加インフルエンザ免疫原性組成物は、したがって、ワクチン接種した高齢者又は幼児被験者において血清防御及び交差反応性CD4 T細胞を誘導する、より高い能力を有する。この特徴は、上記免疫原性組成物中に存在する株の変種株に対して応答する能力が、より高いことに結びつけることができる。このことは、パンデミックの状況において重要な利点であることを証明しうる。例えば、少なくとも１種のパンデミック株、任意でH5、H2、H9、H7又はH6株のいずれかを含むインフルエンザ免疫原性組成物は、パンデミック変種株、すなわち前記パンデミック株のドリフト株に対するより高い応答能力を、前記ドリフト株を用いたその後のワクチン接種時に、又は前記ドリフト株による感染時に提供することができる。例えば、アジュバント添加ワクチン組成物は、A/Indonesian株を含み、1種、好適には2種以上のドリフト株、例えばA/Hong Kong、A/Turkey、A/Vietnam及び／又はA/Anhui株などに対する交差防御性及び／又は交差反応性免疫応答を生じることができる。
【０１６５】
インフルエンザワクチンによるワクチン接種後の、交差反応性CD4 T細胞の検出
古典的な三価インフルエンザワクチンの投与後（3週間）、ワクチン内に存在する抗原性株（H3N2:A/Panama/2007/99、H1N1:A/New Caledonia/20/99、B:B/Shangdong/7/97）と同種である抗原性株調製物（全ウイルス又はスプリット抗原）に応答する末梢血CD4 T細胞の頻度に実質的な増加が見られる（実施例III参照）。ドリフト株として分類されたインフルエンザ株（H3N2:A/Sydney/5/97、H1N1:A/Beijing/262/95、B:B/Yamanashi/166/98）を用いて末梢血CD4 T細胞を再刺激すれば、同程度の頻度の増加が認められる。対照的に、末梢血CD4 T細胞が、この分野の専門家によってシフト株として分類されるインフルエンザ株(H2N2:A/Singapore/1/57、H9N2:A/Hongkong/1073/99)により再刺激を受ければ、ワクチン接種後に観察可能な増加はない。
【０１６６】
同種とドリフトインフルエンザ株の両方を認識できるCD4 T細胞を、本発明の文書では「交差反応性」と呼ぶ。本明細書に記載のアジュバント添加インフルエンザ組成物は、ドリフトインフルエンザ株に対する観察可能な交差反応性が存在することから、異種亜型の交差反応性を示す能力を有する。上に記載のとおり、少なくとも１種のパンデミック株を含むワクチン製剤がドリフトパンデミック株に対して有効であるという能力は、パンデミックの場合に重要な特性であることを証明しうる。
【０１６７】
上記観察と合致して、異なるインフルエンザ株により共有されるCD4 T細胞エピトープがヒトにおいて確認されている（Gelder C et al. 1998, Int Immunol. 10(2):211-22；Gelder CM et al. 1996 J Virol. 70(7):4787-90； Gelder CM et al. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506）。
【０１６８】
その免疫原性特性によって、請求範囲に記載の組成物は、パンデミック発生に対してより優れた準備をするための、パンデミック前のワクチンの備蓄を含むヒトインフルエンザパンデミックの脅威に対する前向きなワクチン接種戦略を確立できるであろう。また、ワクチン組成物中に存在する株（複数でもよい）と正確に一致するわけではない流行株に対する防御的ワクチン接種戦略を確立することも可能である。特定の実施形態において、アジュバント添加組成物は、現在利用可能なワクチンでは効力がない、血球凝集素に主要な変化（例えば2つの異なる種間の遺伝子組換えなど）（抗原シフト）を受けた流行株に対する良好な防御を提供することができるというさらなる利点を与えうる。
【０１６９】
具体的には、プレパンデミックワクチンは、鳥類集団で現在流行している株に類似した少なくとも１種のパンデミック株（任意でH5N1（鳥類インフルエンザ））を含むものであり、例えば、逆遺伝学を利用して作製されている。プレパンデミックワクチンに反応して発生する免疫は、免疫系が待機して「初回刺激される」又は「教育される」ことを可能にし、それにより、実際にパンデミックウイルス株が現れた後に、より迅速な防御免疫応答の発生を可能にし、関係するインフルエンザパンデミック株に対する感受性を低下させる。WHOがパンデミックを宣言しかつ最終的なパンデミック株が同定され（それがドリフト株であってもなくても）、パンデミックワクチンが利用可能になる時には、プレパンデミックワクチンも、そのパンデミックワクチンに対する、より迅速な免疫応答を可能にするであろう。
【０１７０】
ワクチン再接種及びワクチン再接種に使用する組成物 （追加免疫用組成物）
本発明の一態様において、第1のインフルエンザ株の変種であるインフルエンザ株により引き起こされるインフルエンザ感染に対する防御のための本明細書中で定義する免疫原性組成物の製造における
（a）第1のインフルエンザ株由来のインフルエンザウイルス又はその抗原調製物、及び
（b）本明細書中で定義する水中油型エマルジョンアジュバント
の使用を提供する。
【０１７１】
また、第1のインフルエンザ株の変種であるインフルエンザ株によって引き起こされるインフルエンザ感染に対するヒト又はヒト集団の防御における使用のための、第1のインフルエンザ株に由来するインフルエンザウイルス又はその抗原調製物と、本明細書中で定義した水中油型エマルジョンアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供する。
【０１７２】
本発明の一態様は、本明細書中で定義するアジュバント添加インフルエンザ組成物で以前にワクチン接種された（1回又は2回用量で）ヒトのワクチン再接種用のインフルエンザ免疫原性組成物の製造におけるインフルエンザ抗原の使用を提供する。また、本明細書中で定義するアジュバント添加インフルエンザ組成物で以前にワクチン接種された（1回又は2回用量で）ヒトのワクチン再接種における使用のための、インフルエンザウイルス又はその抗原調製物と、任意で本明細書中で定義する水中油型エマルジョンアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供する。
【０１７３】
一実施形態において、ワクチン再接種のための免疫原性組成物は、最初のワクチン接種で使用したインフルエンザウイルス又はその抗原調製物と共通のCD4 T細胞エピトープを有するインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を含有する。共通CD4 T細胞エピトープとは、同じCD4細胞により認識されうる異なる抗原からのペプチド／配列／エピトープを意味するものとする（Gelder C et al. 1998, Int Immunol. 10(2):211-22; Gelder CM et al. 1996 J Virol. 70(7):4787-90; Gelder CM et al. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506に記載されているエピトープの例を参照されたい）。
【０１７４】
本発明の一態様において、第1のインフルエンザ（任意でパンデミック）株の変種であるインフルエンザ株によって引き起こされるインフルエンザ感染に対する防御のための、本明細書中で定義するようなアジュバント添加免疫原性組成物の製造における、第1のインフルエンザ（任意でパンデミック）株に由来するインフルエンザウイルス又はその抗原調製物の使用を提供する。また、第1のインフルエンザ（任意でパンデミック）株の変種であるインフルエンザ株によって引き起こされるインフルエンザ感染に対する防御における使用のための、第1のインフルエンザ（任意でパンデミック）株に由来するインフルエンザウイルス又はその抗原調製物と本明細書中で定義するアジュバントとを含むアジュバント添加免疫原性組成物を提供する。
【０１７５】
別の態様において、本発明は、本明細書中で請求するアジュバント添加インフルエンザ組成物、又は変種インフルエンザ株と本明細書中で定義するアジュバントとを含むアジュバント添加インフルエンザ組成物で以前にワクチン接種されたヒトのワクチン再接種用のインフルエンザ免疫原性組成物の製造におけるインフルエンザウイルス又はその抗原調製物の使用を提供する。また、本明細書中で請求するアジュバント添加インフルエンザ組成物、又は変種インフルエンザ株と本明細書中で定義するアジュバントとを含むアジュバント添加インフルエンザ組成物で以前にワクチン接種されたヒトのワクチン再接種における使用のための、インフルエンザウイルス又はその抗原調製物と、任意で本明細書中で定義する水中油型エマルジョンアジュバントとを含むインフルエンザ免疫原性組成物を提供する。
【０１７６】
本発明の別の態様においては、本発明は、ヒト集団又は個人に1種のインフルエンザウイルス株に対してワクチン接種し、次いで、前記ヒト又は集団に変種インフルエンザウイルス株に対してワクチン再接種する方法であって、前記ヒトに、（i）第1のインフルエンザウイルス株由来のインフルエンザウイルス又はその抗原調製物と本明細書で定義するアジュバントとを含む第1組成物、及び（ii）第1のインフルエンザウイルス株のインフルエンザウイルス株変種を含む第2の免疫原性組成物、を投与するステップを含む方法を提供する。ある具体的な実施形態において、第1の株は、パンデミックに関与しているか又はパンデミックの発生に関与する可能性がある。ある具体的な実施形態において、前記変種株は、パンデミックに関与しているか又はパンデミックの発生に関与する可能性がある。特に、ワクチン再接種は、流行しているパンデミック株である少なくとも１種の株を含むインフルエンザ組成物で行われる。別の実施形態において、前記変種株はドリフト変種であり、任意で第1の株として使用したH3N2の近縁又は好適には遠縁の分岐群からのものである。別の実施形態において、前記変種株は、第1のB型株（B/yamagata又はB/Victoria、異なる系統に属する）の系統とは異なる系統のB型株である。初回刺激用組成物及び追加免疫用組成物の両方は、一価又は好適には多価であり、すなわち少なくとも2種のインフルエンザウイルス株を含み、例えば二価、三価、四価又は五価のワクチンである。組成物（複数でもよい）が多価である場合には、少なくとも1種の株は、好適にはパンデミック株、B型株（B/yamagata又はB/Victoriaなど）、H3N2株からなる群より選択され、任意で、最初のワクチン接種に使用したワクチン中に存在する株のドリフト変種である。
【０１７７】
最初のワクチン接種は、好適には、上で定義したとおり、同じ持続中の免疫応答の間に数週間以内に投与される2回用量を含みうる。典型的には、ワクチン再接種は、最初のワクチン接種の数ヶ月後に、好適には最初のワクチン接種の少なくとも3ヶ月又は4ヵ月後に、好適には8〜14ヵ月後に、好適には約10〜12ヶ月後又はそれ以上後に行う。ワクチン再接種は、最初のワクチン接種の少なくとも6ヶ月後に行うことが適当である。好適には、ワクチン再接種は、次のインフルエンザシーズンに近い時期又はその時期に、例えば最初の免疫原性組成物のおよそ1年後に行う。追加免疫用組成物はまた、その後毎年（3回、4回、5回目のワクチン接種など）に提供してもよい。
【０１７８】
従って、一実施形態において、本発明は、（i）本発明に係るアジュバント添加組成物により行われる、その年の任意の時点（すなわちインフルエンザシーズン外）における、1回用量又は2回用量の初回ワクチン接種（好適には、3〜6週間又は3〜4週間の間隔をおく）と、その後の（ii）最初のワクチン接種の少なくとも6週間から1年後に投与される追加免疫ワクチン接種を含む、ワクチン接種スキーム（又はそのスキームに使用するための組成物）を提供する。初回ワクチン接種時に2回用量を投与する場合には、最初の用量は、アジュバント添加の三価又は四価季節性ワクチンで行い、続いてアジュバント添加パンデミック（例えば一価）ワクチンの2回目の用量を行う。好適には、追加免疫は、最初のワクチン接種の少なくとも6週間後で、通常の免疫カレンダー（例えば小児用）の任意の時点で、又は次のインフルエンザシーズンに投与する。追加免疫用組成物は、市販の認可されたインフルエンザワクチン（例えば古典的な、アジュバント添加若しくはアジュバント無添加の三価ワクチン、例えばFluAdTM）で行ってもよいし、又は本発明に係るアジュバント添加組成物（例えばアジュバント添加の三価若しくは四価ワクチン）で行ってもよい。好適には、追加免疫用組成物は、初回ワクチンに存在する株からのドリフト変種でありうる、そのシーズンの流行中の季節性株を含む。このワクチン接種スキームは、小児集団に好適であり、人生の初期（例えば6ヶ月齢以下、又は2ヶ月齢以下）にその時点で利用可能なワクチンで初回刺激を受け、初回組成物に存在する株からのドリフト変種でありうる流行株を含む組成物で追加免疫を受ける。
【０１７９】
ワクチン再接種用の免疫原性組成物（追加免疫用組成物）は、不活性化又は生弱毒化のいずれかの任意の種類の抗原調製物を含むことができる。これは、最初のワクチン接種に使用した免疫原性組成物と同じ種類の抗原調製物、例えばスプリットインフルエンザウイルス若しくはその抗原調製物、全ビリオン、又は精製されたHA及びNA（サブユニット）ワクチンなどを含んでもよい。追加免疫用組成物は、最初のワクチン接種に使用したものと同じ亜型のインフルエンザ抗原（複数でもよい）を含有しうる。例えば、最初のワクチン接種をパンデミックの宣言時に行い、ワクチン再接種をその後行う場合には、ワクチン再接種は、最初のワクチン接種用に使用されたのと同じ亜型（例えば、H5N1 Vietnam）であるインフルエンザ株（例えば、H5N1 Vietnam）を含むワクチンを用いて行う。あるいは、追加免疫用組成物は、最初のワクチン接種に使用したものと同じ亜型のインフルエンザ抗原（複数でもよい）のドリフト株、例えばH5N1 Indonesiaを用いて行われる。他の実施形態においては、ワクチン再接種に使用されるインフルエンザ株は、シフト株である、すなわち、最初のワクチン接種に使用されたものとは異なる、例えば、それは異なるHA又はNA亜型、例えばH5N2（H5N1と同じHA亜型であるが異なるNA亜型である）又はH7N1（H5N1と異なるHA亜型であるが同じNA亜型である）を有する。例えば、最初の免疫用のワクチン組成物は、A/Indonesian株を含み、追加免疫用組成物はA/Hong Kong、A/Turkey、A/Vietnam及び／又はA/Anhui株を含む。
【０１８０】
一実施形態において、スプリットウイルスを使用する。追加免疫用組成物は、アジュバント添加されていても又はアジュバント無添加であってもよい。アジュバント無添加の追加免疫用組成物は、筋肉内投与されるFluarixTM/α-Rix(登録商標)/Influsplit(登録商標)であり、適当なインフルエンザシーズンのWHO推奨株から調製された3種の不活化スプリットビリオン抗原を含む。特に、インフルエンザウイルス株又はその抗原調製物は、ワクチン再接種の年次に流行しているインフルエンザ株に適合するような、世界保健機構により配布されている基準に従って選択される。アジュバント添加した追加免疫用組成物は、好適には本明細書で定義する水中油型エマルジョンアジュバントと、任意で追加の免疫刺激剤、例えばTLR-4リガンド（3D-MPL又はサポニンなど）を含む。
【０１８１】
好適には、本明細書に定義のアジュバントを含む組成物によるワクチン再接種は、アジュバント無添加インフルエンザウイルス又はその抗原調製物を用いて最初のワクチン接種した後に誘導される相当する応答と比較して、下記事項のいずれか1つ、好適には2つ又は全てを誘導する：（i）インフルエンザウイルス又はその抗原調製物に対する改善されたCD4+ T細胞応答、あるいは（ii）改善されたB細胞記憶応答、あるいは（iii）改善された液性応答。好適には、本明細書に定義のアジュバントを含む組成物によるワクチン再接種は、高レベルで（その成分が）存在するアジュバントを用いてアジュバント添加したインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を用いて最初のワクチン接種した後に誘導される相当する応答と比較して、下記事項のいずれか1つ、好適には2つ又は全てを誘導する：（i）インフルエンザウイルス又はその抗原調製物に対する同等のCD4+ T細胞応答、あるいは（ii）同等のB細胞記憶応答、あるいは（iii）同等の液性応答。
【０１８２】
本発明の一態様において、インフルエンザウイルスと、代謝可能な油（任意でスクアレン）、トコール（任意でα-トコフェロール）及び乳化剤（任意でモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）を上で定義した量で含む水中油型エマルジョンアジュバントとを含む追加免疫用組成物を用いた被験体のワクチン再接種は、アジュバント無添加組成物を用いて初回ワクチン接種され、アジュバント無添加組成物を用いて追加免疫された人の集団における対応する抗体力価よりも高い抗体力価を示しうる。ワクチン再接種における抗体応答を増強するというアジュバントの作用は、ワクチン接種又はインフルエンザウイルス感染に対する応答が低いことが知られている高齢者又は幼児集団において、特に重要である。特に、アジュバント添加組成物に伴う利点はまた、ワクチン再接種後のCD4 T細胞応答の改善という点においても際立つであろう。
【０１８３】
ワクチン再接種用のアジュバント添加組成物は、対照ワクチンにより付与される防御と比較して、ドリフト株（次のインフルエンザシーズン由来のインフルエンザ株）に対してよりよい交差応答性を誘発する能力を有しうる。前記交差応答性は、アジュバント無添加製剤により得られる応答性と比較して高い持続性を示した。アジュバントのドリフト株に対する交差応答性の増強作用は、パンデミック状況において重要である。
【０１８４】
さらなる実施形態において、本発明は、最初のワクチン接種を、潜在的にパンデミックを引き起こしうるインフルエンザ株を含有するインフルエンザ組成物、好ましくはスプリットインフルエンザ組成物を用いて行い、かつワクチン再接種を、少なくとも1種の流行している株（パンデミック株又は従来株のいずれか）を含む、一価若しくは多価のいずれかの組成物を用いて行うことを特徴とする、ワクチン接種レジメンに関する。
【０１８５】
特定の実施形態において、ワクチン再接種用の免疫原性組成物のヒト用量は、水中油型エマルジョンアジュバントでアジュバント添加されている。好適には、限定されるものではないが、このアジュバントはトコールを含む。好適には、1用量当たり、1株当たりのHAは約15μgである。特定の実施形態において、1株当たりのHAは、少量のHA（任意で、1用量当たり最大40〜45μg HAを達成するために、1用量当たり、1株当たり約10μg HA又はそれ以下）であり、上で定義した通りである。好適には、株当たりのHAはおよそ5μg又はそれ以下、およそ2.5μg又はそれ以下である。好適には、アジュバント組成物は、スクアレン、α-トコフェロール及びポリソルベート80を、1用量当たりそれぞれ5〜6mg、5〜6mg及び2〜3mgの量で含む水中油型エマルジョンである。あるいは、アジュバント組成物は、スクアレン、α-トコフェロール及びポリソルベート80を、1用量当たりそれぞれ2.5〜3.5mg、2〜3mg及び1〜2mgの量で含む水中油型エマルジョンである。ワクチン再接種用の免疫原性組成物のヒト用量は、好適には、初回ワクチン接種用に使用した組成物中に存在する成分の半分を含む水中油型エマルジョンアジュバントを含み、好適にはスクアレン、α-トコフェロール及びポリソルベート80を、1用量当たり2.5〜3.5mg、2〜3mg及び1〜2mgの量で含む水中油型エマルジョンを含む。特定の実施形態において、そのワクチン再接種用量は、初回ワクチン接種のおよそ１年後又はおよそ２年後に与えられる。
【０１８６】
HAのCD4エピトープ
この抗原ドリフトは、主にウイルス表面タンパク質赤血球凝集素(HA)及びノイラミニダーゼ(NA)のエピトープ領域に存在する。宿主免疫系の適応反応を避けるためにウイルスが用いる、異なるインフルエンザ株の間でのCD4及びB細胞エピトープの何らかの差が、インフルエンザワクチン接種で主要な役割を果たしうることが知られている。
【０１８７】
異なるインフルエンザ株によって共有されるCD4 T細胞エピトープは、ヒトにおいて同定されている(例えば、Gelder C et al. 1998, Int Immunol. 10(2):211-22； Gelder CM et al. 1996 J Virol. 70(7):4787-90；及びGelder CM et al. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506を参照)。
【０１８８】
具体的な実施形態において、ワクチン再接種は、初回ワクチン接種に使われたインフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物と共通のCD4 T細胞エピトープを有するインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を含む追加免疫用組成物を用いて行われる。したがって、本発明は、複数用量ワクチンの初回ワクチン接種成分の製造における、パンデミックインフルエンザウイルス又はその抗原調製物と、上で定義した水中油型エマルジョンアジュバントとを含む免疫原性組成物の使用に関するものであって、前記複数用量ワクチンはさらに、追加免疫用量として、初回ワクチン接種時に与える用量中のパンデミックインフルエンザウイルス抗原又はそのウイルス抗原調製物と共通のCD4 T細胞エピトープを有するインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を含む。
【０１８９】
ワクチン接種方法
本発明の組成物は、皮内、粘膜、例えば鼻腔内、経口、筋肉内又は皮下など、いずれかの適当な送達経路で投与することができる。他の送達経路は当技術分野において公知である。
【０１９０】
筋肉内送達経路は特にアジュバント添加インフルエンザ組成物用に好適である。本発明に係る組成物は、1用量容器、又は場合によっては、特にパンデミックワクチン用に好適である複数用量容器に入れて提供しうる。この場合、チメロサールなどの抗菌保存剤が典型的には存在して使用中の汚染を防止する。チメロサール濃度は25μg/0.5ml用量（すなわち50μg/mL）としうる。5μg/0.5ml用量（すなわち、10μg/ml）又は10μg/0.5ml用量（すなわち、20μg/ml）のチメロサール濃度が好適である。好適なIM送達デバイスは、無針液ジェット式注入デバイス、例えばBiojector 2000 （Bioject、Portland、OR）などを使用しうる。あるいは、エピネフリンの自宅での送達用に用いられるような、ワクチンの自己投与を可能にするペン注射器デバイスを使用しうる。かかる送達デバイスの使用は、特に、パンデミック中に必要とされうる大規模免疫キャンペーンに受け入れられよう。
【０１９１】
皮内送達が他の適当な経路である。皮内送達のためにいずれかの好適なデバイスを使用することができ、例えば、短針デバイスがある。皮内ワクチンは、皮膚への針の有効貫入長を制限するデバイス、例えば参照により本明細書に組み込まれているWO 99/34850号及びEP 1092444に記載されているもの、及びその機能等価物によって投与することもできる。液体ジェット注射器を介して又は角質層を貫通して真皮に到達するジェットを起こさせる針を介して液体ワクチンを真皮に送達するジェット式注射デバイスも好適である。粉状のワクチンを加速させて皮膚外層を通し真皮へ到達させるために圧縮ガスを使う、バリスティック粉体/粒子送達デバイスも好適である。さらに、従来の注射器を、皮内投与の古典的マントゥー法で使うこともできる。
【０１９２】
他の適当な投与経路は、皮下経路である。皮下送達のためにいかなる適当なデバイスでも、例えば古典的な針も使うことができる。好適には、無針ジェット式注射器方式を使用する。好適には、前記デバイスに液体ワクチン製剤が予め充填されている。
【０１９３】
あるいは、ワクチンは鼻腔内に投与される。典型的には、ワクチンは、好適には、肺に吸入されることなく、鼻咽頭の領域に局所投与される。肺に全く又は実質的に入らないように、ワクチン製剤を鼻咽頭の領域に送達する鼻腔内送達デバイスを使うことが望ましい。
【０１９４】
本発明に係るワクチンの鼻腔内投与のための好適なデバイスは、噴霧デバイスである。市販の好適な鼻内噴霧デバイスとしては、AccusprayTM (Becton Dickinson)がある。ネブライザーは非常に微細な噴霧を生成し、肺中に容易に吸入され、それ故に鼻粘膜に有効に到達しない。したがって、ネブライザーは好ましくない。
【０１９５】
鼻腔内の使用のための好適な噴霧デバイスは、デバイスの性能が使用者の加える圧力に依存しないデバイスである。これらのデバイスは、圧力閾デバイスとして知られる。閾値圧を加えたときだけ、液体はノズルから放出される。これらのデバイスは、一定の液滴サイズを有する噴霧の達成をより簡単にする。本発明での使用に好適な圧力閾デバイスは当技術分野で公知であり、例えば、本明細書で参照により組み込まれているWO 91/13281号及びEP 311 863 B及びEP 516 636に記載されている。かかるデバイスはPfeiffer GmbHから市販され、Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999にも記載されている。
【０１９６】
好適な鼻腔内デバイスは、1〜200μm、好適には、10〜120μmの範囲の液滴（液体として水を使って測定）を生成する。10μm以下では吸入のリスクがあるので、10μm以下の液滴は約5％以下であることが望ましい。120μmより大きい液滴はそれより小さな液滴のように都合よく拡散しないので、120μmを上回る液滴は約5％以下であることが望ましい。
【０１９７】
二用量送達は、本発明に係るワクチンで使用するための鼻腔内送達系のさらなる好適な機構である。二用量デバイスは、単一ワクチン用量の2サブ用量を含有し、1サブ用量をそれぞれの鼻孔へ投与する。一般に、2サブ用量が単一チャンバー内に存在し、デバイスの構造によって一度に単一サブ用量の効率的送達が可能になる。代わりに、本発明に係るワクチンを投与するために、単用量デバイスを使ってもよい。
【０１９８】
代わりに、本発明では表皮又は経皮のワクチン接種経路も意図している。
【０１９９】
本発明の一態様においては、初回投与のためのアジュバント添加免疫原性組成物を筋肉内投与してもよく、追加免疫用組成物をアジュバント添加の有無にかかわらず異なる経路により、例えば皮内、皮下又は鼻腔内に投与してもよい。具体的な実施形態においては、初回投与用の組成物はパンデミックインフルエンザ株については15μg未満のHA量を含有し、追加免疫用組成物は15μgの標準量又は、好適には、少量、すなわち15μg未満のHAを含有してもよく、これらの量は、投与経路に応じてより少ない量で与えてもよい。
【０２００】
本発明のワクチンは単回用量で投与することができるが、その成分はまた、同時に又は異なる時点で一緒に併用投与してもよい（例えば、インフルエンザ抗原は別々に、好適にはアジュバントの投与と同時に投与することができる）。単一の投与経路のほか、2回の注射を投与する場合には2つの異なる投与経路を用いてもよい。例えば、アジュバント添加インフルエンザ抗原の最初の投与（例えば初回刺激用量）をIM（又はID）で投与し、2回目の投与（例えば追加免疫用量）をIN（又はID）で投与することができる。さらに本発明のワクチンは、初回刺激用量をIMで、追加免疫用量をINで投与することができる。
【０２０１】
ワクチン中のインフルエンザ抗原の含有量は、典型的には、インフルエンザ株当たり0.1〜15μg HAの範囲、好適には1〜10μg、最も典型的には1〜8μgの範囲である。インフルエンザ抗原の好適な含有量は、ワクチン中に含まれるインフルエンザ株当たり正確に5μg HA又はそれ未満である。最初のワクチン接種後、被験者には適当な間隔をおいて1回又は数回の追加免疫を投与しうる。
【０２０２】
ワクチン接種をする集団
ワクチン接種をする標的集団は、全集団、例えば、健康な成人（例えば、18〜50歳若しくは18〜60歳）、高齢者（典型的には60歳超）又は乳幼児／小児である。標的集団は、特に免疫低下した集団であってもよい。免疫低下したヒトは、一般に健康な成人と比較して、抗原、特にインフルエンザ抗原に対して良好に反応することができない。
【０２０３】
本発明の一態様において、標的集団はインフルエンザに対して初回刺激されていない集団であり、ナイーブであるか(例えばパンデミック株に対して)、又は以前にインフルエンザ感染若しくはワクチン接種に応答しなかった集団である。好適には、標的集団は、高齢者（好適には少なくとも60歳、又は65歳以上）、より若い高リスクの成人（すなわち18歳〜60歳）、例えば保健機関労働者、又は心血管及び肺の疾患若しくは糖尿病などの危険因子を有する若年成人である。他の標的集団は、年齢が2ヶ月齢以上若しくは6ヶ月齢以上の全ての小児、特にインフルエンザ関連の入院率が比較的高い6〜23ヶ月齢の小児である。別の標的集団は生後から6ヶ月齢の乳児である。
【０２０４】
特許出願及び許可された特許を含む、本明細書中の全ての参考文献の教示は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。本出願が優先権を主張するいずれの特許出願も参照により本明細書にその全てが、開示物及び参考文献として本明細書に記載されたものとして、組み入れられる。
疑問を回避するため、本明細書の用語「含んでいる」及び「含む」は、各事例において、場合により用語「からなっている」及び「からなる」でそれぞれ代替可能であるものとする。本明細書における本発明の「ワクチン組成物」に関する実施形態はまた、本発明の「免疫原性組成物」に関する実施形態にも適用可能であり、またその逆も可能である。数値全てにおける「約」（又は「ほぼ」）という用語は、5％の変動を許容する。すなわち、約1.25％という値は1.19％〜1.31％を意味するだろう。
【実施例】
【０２０５】
本発明を、以下の、非限定的な実施例を参照することによりさらに説明する。
【０２０６】
実施例Iは、マウス、フェレット、ブタ及びヒト試験において用いられる免疫学的読み出し方法を記載する。
【０２０７】
実施例IIは、例示された試験において用いられる水中油型エマルジョン及びアジュバント製剤の調製を記載する。
【０２０８】
実施例IIIは、スプリットインフルエンザ抗原調製物及び2つの用量のAS03アジュバントを含むワクチンを用いた18〜59歳の成人集団における臨床試験を示す。
【０２０９】
実施例IVは、初回刺激（プライミング）したBALB/cマウスにおけるアジュバント添加及びアジュバント無添加スプリットインフルエンザワクチン（様々な用量のAS03アジュバントを含む）の前臨床評価を示す。
【０２１０】
実施例Vは、初回刺激したC57Bl/6マウスにおけるアジュバント添加及びアジュバント無添加スプリットインフルエンザワクチン（様々な用量のAS03アジュバントを含む）の前臨床評価を示す。
【０２１１】
実施例VIは、初回刺激したC57Bl/6マウスにおけるアジュバント添加及びアジュバント無添加スプリットインフルエンザワクチン（様々な用量のAS03アジュバント及び低用量の抗原を含む）の前臨床評価を示す。
【０２１２】
実施例VIIは、ナイーブなC57Bl/6マウスにおけるアジュバント添加及びアジュバント無添加スプリットH5N1ワクチン（様々な用量のAS03アジュバント及び抗原を含む）の前臨床評価を示す。
【０２１３】
実施例VIIIは、初回刺激した巨大白ブタにおけるアジュバント添加及びアジュバント無添加インフルエンザワクチンの前臨床評価を示す。
【０２１４】
実施例IXは、ナイーブな初回刺激したC57Bl/6マウスにおけるアジュバント添加およびアジュバント無添加スプリットTIVまたはQIV季節性ワクチン（種々の用量のAS03アジュバント及び抗原を含む）の前臨床評価を示す。
【０２１５】
実施例Xは、スプリットインフルエンザ抗原調製物とAS03アジュバントの様々な用量とを含有するワクチンによる、18〜64歳の成人集団における臨床試験を示す。
【０２１６】
実施例XIは、スプリットインフルエンザ抗原調製物と様々なアジュバントを含有するワクチンによる、65歳以上の高齢者集団における臨床試験を示す。
【０２１７】
実施例I−免疫学的読み出し方法
I.1. マウス方法
I.1.1. 血球凝集阻害試験
試験原理（古典的手順）
3種の（季節性）インフルエンザウイルス株に対する抗血球凝集素抗体力価を、血球凝集阻害試験（HI）を用いて決定する。HI試験の原理は、インフルエンザウイルス血球凝集素（HA）による赤血球（RBC）の血球凝集を阻害する特定の抗インフルエンザ抗体の能力に基づく。熱不活化血清をKaolin及びRBCにより処理して、非特異的阻害因子を除去する。予備処理後、血清の2倍希釈液を、4血球凝集単位の各インフルエンザ株と共にインキュベートする。次いで、赤血球を添加し、凝集の阻害をスコア化する。血球凝集を完全に阻害した血清の最も高い希釈率の逆数として、力価を表す。血清の最初の希釈率が1:20である場合、検出不可能なレベルを10に等しい力価としてスコア化する。
【０２１８】
H5N1への適合（ウマ赤血球を用いるHIの具体的説明）：
抗HA抗体を決定するための古典的HIアッセイはH5N1株についてはよく機能しないと記録されているため、ウマRBCを用いて改変したプロトコルを用いた。ウマの赤血球を、H5N1パンデミック株のために用いた。0.5％BSA（ウシ血清アルブミン、最終濃度）を含むリン酸バッファー中の0.5％（最終濃度）のウマ赤血球細胞懸濁液。この懸濁液を、同じリン酸バッファーを用いた赤血球の洗浄工程、次いで遠心分離工程（10分、2000 rpm）により毎日調製する。この洗浄工程を、1回繰り返す必要がある。血清とウイルス懸濁液の反応混合物へのウマ赤血球の添加後、ウマ赤血球の低い沈降速度に起因して、室温（RT、20℃+/-2℃）で2時間、プレートをインキュベートする必要がある。
【０２１９】
統計学的分析
統計学的分析を、UNISTATを用いてワクチン接種後のHI力価に対して実施した。分散の分析のために適用したプロトコルを、以下のように簡単に説明することができる：
・データのLog変換、
・群分布の正規性を検証するための各集団（群）に対するShapiro-Wilk検定、
・異なる集団（群）間の分散の均一性を検証するためのCochran検定、
・選択されたデータに対する分散の分析、
・2方向ANOVAの相互作用に関する検定、
・複数比較のためのTukey-HSD検定。
【０２２０】
I.1.2. 細胞内サイトカイン染色
この技術は、サイトカイン産生に基づいて抗原特異的Tリンパ球の定量化を可能にする：エフェクターT細胞及び／若しくはエフェクター記憶T細胞はIFN-γを産生し、並びに／又は中央記憶T細胞はIL-2を産生する。PBMCを、免疫の7日後に採集する。
【０２２１】
リンパ球を、分泌阻害剤（Brefeldine）の存在下でin vitroで再刺激する。次いで、これらの細胞を、蛍光抗体（CD4、CD8、IFN-γ及びIL-2）を用いる従来の免疫蛍光手順により処理する。結果を、CD4/CD8 T細胞内のサイトカイン陽性細胞の頻度として表す。T細胞のサイトカインの細胞内染色を、2回目の免疫の7日後にPBMCに対して実施した。血液をマウスから回収し、ヘパリン添加培地RPMI+Add中にプールした。血液については、RPMI+Addで希釈されたPBL懸濁液を、推奨されたプロトコルに従ってLympholyte-Mammal勾配（2500 rpm、室温で20分間遠心分離）上で層化した。境界面の単核細胞を取り出し、RPMI+Add中で2回洗浄し、PBMC懸濁液をRPMI 5％ウシ胎仔血清中、2×106細胞/mlに調整した。
【０２２２】
PBMCのin vitroでの抗原刺激を、Whole FI （1μgHA/株）と共に1×107細胞/ml（チューブFACS）の最終濃度で実行した後、抗CD28及び抗CD49d（両方とも1μg/ml）を添加して37℃で2時間インキュベートした。
【０２２３】
抗原再刺激工程の後、PBMCを、37℃のBrefeldin（1μg/ml）の存在下で37℃で一晩インキュベートして、サイトカイン分泌を阻害する。IFN-γ/IL-2/CD4/CD8染色を以下のように実施した：細胞懸濁液を洗浄し、2％Fcブロッキング試薬（1/50；2.4G2）を含む50μlのPBS 1％FCS中に再懸濁した。4℃で10分間インキュベートした後、抗CD4-PE（2/50）及び抗CD8 perCp（3/50）の混合物50μlを添加し、4℃で30分間インキュベートした。PBS 1％FCS中で洗浄した後、200μlのCytofix-Cytoperm（Kit BD）中に再懸濁することにより細胞を透過処理し、4℃で20分間インキュベートした。次いで、細胞をPerm Wash （Kit BD）で洗浄し、Perm Wash中に希釈した抗IFN-γAPC（1/50）＋抗IL-2 FITC（1/50）の混合物50μlで再懸濁した。4℃で最小で2時間、最大で一晩インキュベートした後、細胞をPerm Washで洗浄し、PBS 1％FCS＋1％パラホルムアルデヒド中に再懸濁した。サンプル分析をFACSにより実施した。生細胞をゲート化し（FSC/SSC）、約20,000事象（リンパ球）又はCD4+T細胞における35,000事象に対して獲得した。IFN-γ+又はIL2+の割合を、CD4+及びCD8+ゲート化集団上で算出した。
【０２２４】
I.1.3. 抗H5N1 ELISA
抗H5N1 Ig、IgG1及びIgG2b抗体力価の定量を、コーティングとしてスプリットH5N1を用いるELISAにより実施した。ウイルス及び抗体溶液を、100μl/ウェルで用いた。スプリットウイルスH5N1を、PBS中、1μg/mlの最終濃度で希釈し、96穴マイクロタイタープレート（Maxisorb Immunoplate Nunc 439454）のウェルに4℃で一晩吸着させた。次いで、プレートを、200μl/ウェルの1％BSA及び0.1％Tween 20（飽和バッファー）を含むPBSと共に37℃で1時間インキュベートした。飽和バッファー中の血清の12個の2倍希釈液をH5N1被覆プレートに添加し、37℃で1時間30分インキュベートした。プレートをPBS 0.1％Tween 20で4回洗浄した。1/500に希釈されたビオチン化コンジュゲート化抗マウスIg （Prozan-E0413）若しくはビオチン化コンジュゲート化抗マウスIgG1 （Imtech 1070-08）、又はPBS 1％BSA 0.1％Tween 20中に1/4000に希釈されたビオチン化抗マウスIgG2b （Imtech 1090-08）を各ウェルに添加し、37℃で1時間30分インキュベートした。洗浄工程の後、PBS 1％BSA Tween 20中で1/10000に希釈されたストレプトアビジン-ビオチン-プレオキシダーゼコンジュゲート（Prozan P0397）と共に30分間インキュベートした。
【０２２５】
比色状況のために、プレートを、0.1 Mクエン酸バッファーpH 4.2中の0.04％ o-フェニルジアミン（Sigma P4664）及び0.03％ H2O2の溶液と共に22℃で20分間インキュベートした。反応を2N H2SO4を用いて停止させ、マイクロプレートを490〜630 nmで読み取った。
【０２２６】
I.2. フェレット方法
I.2.1. 血球凝集阻害試験（HI）
試験手順
3種のインフルエンザウイルス株に対する抗血球凝集素抗体力価を、血球凝集阻害試験（HI）を用いて決定した。HI試験の原理は、インフルエンザウイルス血球凝集素（HA）によるニワトリ赤血球（RBC）の血球凝集を阻害する特定の抗インフルエンザ抗体の能力に基づく。最初に血清を25％ノイラミニダーゼ溶液（RDE）で処理し、熱不活化して、非特異的阻害因子を除去した。予備処理後、血清の2倍希釈液を、4血球凝集単位の各インフルエンザ株と共にインキュベートした。次いで、ニワトリ赤血球を添加し、凝集の阻害をスコア化した。血球凝集を完全に阻害した血清の最も高い希釈率の逆数として、力価を表した。血清の最初の希釈率が1:10である場合、検出不可能なレベルを5に等しい力価としてスコア化した。
【０２２７】
統計学的分析
統計学的分析を、UNISTATを用いてHI力価（41日目、チャレンジ前）に対して実施した。分散の分析のために適用したプロトコルを、以下のように簡単に説明することができる：
・データのLog変換、
・群分布の正規性を検証するための各集団（群）に対するShapiro-Wilk検定、
・異なる集団（群）間の分散の均一性を検証するためのCochran検定、
・1方向ANOVAの相互作用に関する検定、
・複数比較のためのTuckey-HSD検定。
【０２２８】
I.2.2. 体温モニタリング
個体の温度を、トランスミッターを用いて、及びテレメトリー記録によりチャレンジ期間の間にモニターした。全ての埋込み物を調べ、改造し、新しい補正をDSI（Data Sciences International, Centaurusweg 123, 5015 TC Tilburg, The Netherlands）により実施した後、腹腔中に入れた。全ての動物を、これらの測定の間に1個のケージ中で個々に飼育した。
【０２２９】
温度をチャレンジの4日前からチャレンジの7日後まで15分毎に記録した。
【０２３０】
I.2.3. 鼻洗浄
覚醒した動物の両方の鼻孔に5 mlのPBSを投与することにより、鼻洗浄を行った。接種物をペトリ皿中に回収し、ドライアイス上のサンプル容器中に入れた。
【０２３１】
鼻洗浄液中のウイルス滴定
全ての鼻サンプルを最初にSpin Xフィルター（Costar）を通して滅菌濾過して、任意の細菌夾雑物を除去した。鼻洗浄液の連続10倍希釈液50μlを、50μlの培地を含むマイクロタイタープレート（10ウェル／希釈液）に移した。100μlのMDCK細胞（2.4×105細胞/ml）を各ウェルに添加し、35℃で5〜7日間インキュベートした。
【０２３２】
インキュベーションの5〜7日後、培養培地を穏やかに除去し、100μlの1/20 WST-1を含有する培地を添加し、さらに18時間インキュベートした。
【０２３３】
生細胞によるWST-1の還元の際に産生された黄色ホルマザン染料の強度は、ウイルス滴定アッセイの終わりにウェル中に存在する生細胞数に比例し、好適な波長（450ナノメートル）での各ウェルの吸光度を測定することにより定量する。カットオフを、未感染対照細胞のOD平均と定義する-0.3 OD（0.3 ODは未感染対照細胞のODの+/-3標準偏差に対応する）。ODがカットオフより小さい場合、正のスコアを定義し、対照的に、ODがカットオフより大きい場合、負のスコアを定義する。ウイルス出芽力価を、「Reed及びMuench」により決定し、Log TCID50/mlとして表した。
【０２３４】
I.3. ブタ方法
I.3.1. 血球凝集阻害試験（HI）
試験手順
3種のインフルエンザウイルス株に対する抗血球凝集素抗体力価を、血球凝集阻害試験（HI）を用いて決定した。HI試験の原理は、インフルエンザウイルス血球凝集素（HA）によるニワトリ赤血球（RBC）の血球凝集を阻害する特定の抗インフルエンザ抗体の能力に基づく。最初に血清を25％ノイラミニダーゼ溶液（RDE）で処理し、熱不活化して、非特異的阻害因子を除去した。予備処理後、血清の2倍希釈液を、4血球凝集単位の各インフルエンザ株と共にインキュベートした。次いで、ニワトリ赤血球を添加し、凝集の阻害をスコア化した。血球凝集を完全に阻害した血清の最も高い希釈率の逆数として、力価を表した。血清の最初の希釈率が1:10である場合、検出不可能なレベルを5に等しい力価としてスコア化した。
【０２３５】
統計学的分析
統計学的分析を、UNISTATを用いてHI力価（41日目、チャレンジ前）に対して実施した。分散の分析のために適用したプロトコルを、以下のように簡単に説明することができる：
・データのLog変換、
・群分布の正規性を検証するための各集団（群）に対するShapiro-Wilk検定、
・異なる集団（群）間の分散の均一性を検証するためのCochran検定、
・1方向ANOVAの相互作用に関する検定、
・複数比較のためのTuckey-HSD検定。
【０２３６】
I.4. ヒトにおける免疫応答を評価するためのアッセイ
I.4.1. 血球凝集阻害アッセイ
免疫応答を、WHO Collaborating Centre for influenza, Centres for Disease Control, Atlanta, USA (1991)により記載された方法を用いてHI抗体を測定することにより決定した。
【０２３７】
4血球凝集阻害単位（4 HIU）の好適な抗原及び0.5％トリ赤血球懸濁液を用いる標準化され、徹底的に検証された微小化方法を用いて、解凍された凍結血清サンプルに対して抗体力価測定を行った。非特異的血清阻害因子を、熱処理及び受容体破壊酵素により除去した。
【０２３８】
得られた血清を、HI抗体レベルについて評価した。最初の1:10の希釈率から開始して、連続希釈液（2倍ずつ）を、1:20480の最終希釈率まで調製した。
【０２３９】
滴定の終点を、血球凝集の完全な阻害（100％）を示す最も高い希釈率として採用した。全てのアッセイを二重で行った。
【０２４０】
I.4.2. ノイラミニダーゼ阻害アッセイ
このアッセイをフェツイン被覆マイクロタイタープレート中で実施した。抗血清の2倍連続希釈液を調製し、標準化された量のインフルエンザA型H3N2、H1N1又はインフルエンザBウイルスと混合した。この試験は、フェツインからノイラミン酸を酵素的に放出するノイラミニダーゼの生物学的活性に基づくものであった。末端ノイラミン酸の切断後、β-D-ガラクトース-N-アセチル-ガラクトサミンを脱マスキングした。ガラクトース構造に特異的に結合する、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）標識ラッカセイ（Arachis hypogaea）由来ピーナッツ凝集素をウェルに添加した。結合した凝集素の量を検出し、テトラメチルベンズイジン（TMB）を用いた基質反応において定量することができる。ウイルスノイラミニダーゼ活性を依然として少なくとも50％阻害する最も高い抗体希釈率を示し、これがNI力価である。
【０２４１】
I.4.3. 中和抗体アッセイ
中和抗体測定を、解凍された凍結血清サンプルに対して行った。血清中に含まれる抗体によるウイルス中和を、微小中和アッセイにおいて決定した。該アッセイにおけるさらなる処理を用いずに、血清を用いた。各血清を3回試験した。標準化された量のウイルスを、血清の連続希釈液と混合し、抗体とウイルスとの結合を可能にするためにインキュベートした。次いで、規定量のMDCK細胞を含む細胞懸濁液をウイルスと抗血清の混合物に添加し、33℃でインキュベートした。インキュベーション期間の後、ウイルスの複製を、ニワトリ赤血球の血球凝集により可視化した。血清の50％中和力価を、Reed及びMuenchの方法により算出した。
【０２４２】
I.4.4. 細胞媒介性免疫をサイトカインフローサイトメトリー（CFC）により評価した
末梢血抗原特異的CD4及びCD8 T細胞をin vitroで再刺激して、その対応する抗原と共にインキュベートした場合、IL-2、CD40L、TNF-α及びIFNを産生することができる。結果として、抗原特異的CD4及びCD8 T細胞を、細胞表現型並びに細胞内サイトカイン産生の従来の免疫蛍光標識によるフローサイトメトリーにより数えることができる。本研究においては、インフルエンザワクチン抗原並びに特定のインフルエンザタンパク質から誘導されたペプチドを抗原として用いて、インフルエンザ特異的T細胞を再刺激した。結果を、CD4又はCD8 T細胞サブ集団内のサイトカイン陽性CD4又はCD8 T細胞の頻度として表した。
【０２４３】
I.4.5. 統計学的方法
I.4.5.1. 主要評価項目
・ワクチン接種後の7日間の追跡期間（すなわち、ワクチン接種日及びその後の6日間）と全体の間の応答型局所及び全身兆候及び徴候の割合、強度及びワクチン接種との関係。 
・ワクチン接種後の21日間の追跡期間（すなわち、ワクチン接種日及びその後の20日間）と全体の間の非応答型局所及び全身兆候及び徴候の割合、強度及びワクチン接種との関係。 
・試験全体の間の重篤な有害事象の発生。
【０２４４】
I.4.5.2. 二次評価項目
液性免疫応答について：
観察される変数：
・0日及び21日目：ワクチン中に示される3種のインフルエンザウイルス株（抗H1N1、抗H3N2及び抗B型抗体）の各々に対して別々に試験された、血清血球凝集阻害（HI）及びNI抗体力価。 
・0日及び21日目：ワクチン中に示される3種のインフルエンザウイルス株の各々に対して別々に試験された、中和抗体力価。
【０２４５】
誘導される変数（95％信頼区間で）：
・ワクチン接種の前後での95％信頼区間（95％CI）での血清HI抗体の幾何平均力価（GMT）
・21日目での血清変換率（95％CI）*
・21日目での変換係数（95％CI）**
・21日目での血清防御率（95％CI）***
・全ての時点での血清NI抗体GMT（95％信頼区間で）。 
*各ワクチン株につき、0日目と比較した21日目での血清HI力価における少なくとも4倍の増加を有するワクチン被接種者の割合として定義された血清変換率。 
**各ワクチン株につき、0日目と比較した21日目での血清HI GMTにおける増加倍率として定義された変換係数。 
***通常は防御を示すと許容されるワクチン接種後（各ワクチン株につき）の血清HI力価＝40であるワクチン被接種者の割合として定義された防御率。
【０２４６】
いくつかの臨床試験については、反応原性／安全性が二次評価項目であり、免疫原性が主要評価項目であってよいことが理解されるべきである。
【０２４７】
細胞媒介性免疫（CMI）応答について：
観察される変数：
0日及び21日目：異なる試験における106個あたりのサイトカイン陽性CD4/CD8細胞の頻度。 
各試験は以下のものに対するCD4/CD8 T細胞の応答を定量するものである：
・ペプチドインフルエンザ（pf）抗原（これらの抗原の正確な性質及び起源を示す／説明する必要がある）
・スプリットインフルエンザ（sf）抗原
・全インフルエンザ（wf）抗原。
【０２４８】
誘導される変数：
・少なくとも2種の異なるサイトカイン（CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα）を産生する細胞
・少なくともCD40L及び別のサイトカイン（IL-2、TNFα、IFNγ）を産生する細胞
・少なくともIL-2及び別のサイトカイン（CD40L、TNFα、IFNγ）を産生する細胞
・少なくともIFNγ及び別のサイトカイン（IL-2、TNFα、CD40L）を産生する細胞
・少なくともTNFα及び別のサイトカイン（IL-2、CD40L、IFNγ）を産生する細胞。
【０２４９】
I.3.5.3. 免疫原性の分析
免疫原性分析は全ワクチン接種コホートに基づいていた。各処理群について、以下のパラメーター（95％信頼区間で）を算出した：
・0日及び21日目でのHI及びNI抗体の幾何平均力価（GMT）
・0日及び21日目での中和抗体力価の幾何平均力価（GMT）
・21日目での変換係数
・0日目と比較した21日目での血清HI力価における少なくとも4倍の増加を有するワクチン被接種者の割合として定義された21日目での血清変換率（SC）
・血清HI力価＝1:40を有するワクチン被接種者の割合として定義された21日目の防御率
・各ワクチン接種群、各時点（0日目、21日目）及び各抗原（ペプチドインフルエンザ（pf）、スプリットインフルエンザ（sf）及び全インフルエンザ（wf））について、応答時のCD4/CD8 Tリンパ球分泌の頻度をまとめた（記述統計）
・それぞれ5つの異なる試験における各ワクチン接種群及び各抗原（pf、sf、及びwf）に関する時点（POST-PRE）間応答の個々の差異における記述統計
・ノンパラメトリック検定（Kruskall-Wallis検定）を用いて3群間の位置の差異を比較し、それぞれ5つの異なる試験において各抗原について統計学的p値を算出した。全ての有意差検定は両側検定であった。0.05以下のP値を、統計学的に有意であると考えた。
【０２５０】
実施例II−水中油型エマルジョン及びアジュバント製剤の調製
特に指摘しない限り、以後の実施例で用いられる油／水型エマルジョンは、2つの油（α-トコフェロール及びスクアレン）からなる有機相、並びに乳化剤としてTween 80TM又はポリソルベート80TMを含むPBSの水相から構成される。特に指摘しない限り、以下の水中油型エマルジョン成分（最終濃度で与えられる）：2.5％スクアレン（v/v）、2.5％α-トコフェロール（v/v）、0.9％モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（v/v）（Tween 80）（WO 95/17210号を参照）を含む、以後の実施例で用いられる水中油型エマルジョンアジュバント製剤を作製した。以後の実施例においてはAS03と呼ばれるこのエマルジョンを、2倍濃縮物として以下のように調製した。
【０２５１】
II.1. エマルジョンSB62の調製
この方法を、臨床及び前臨床実施例の節で報告される試験において用いた。SB62エマルジョンの調製物を、疎水性成分（DL-α-トコフェロール及びスクアレン）から構成される油相並びに水溶性成分（陰イオン系界面活性剤Tween 80及びPBS mod（改変）、pH 6.8）を含有する水相の強力な攪拌下での混合により作製する。攪拌しながら、油相（1/10全量）を水相（9/10全量）に移し、混合物を室温で15分間攪拌する。次いで、得られる混合物を、マイクロフルイダイザー（15000 PSI-実施例IIIに報告される臨床試験において用いられるアジュバント中で8サイクル、又は3サイクル）の相互作用チャンバー中で剪断、衝撃及びキャビテーション力に供して、マイクロメートル以下の液滴（100〜200 nmの分布）を製造する。得られるpHは6.8±0.1である。次いで、SB62エマルジョンを0.22μmの膜を通す濾過により滅菌し、滅菌バルクエマルジョンを2〜8℃でCupac容器中で冷蔵して保存する。滅菌不活性ガス（窒素又はアルゴン）を、少なくとも15秒間、SB62エマルジョンの最終バルク容器のデッドボリューム中にフラッシュする。
【０２５２】
SB62エマルジョンの最終的な組成は以下の通りである：
Tween 80：1.8％（v/v） 19.4 mg/ml；スクアレン：5％（v/v） 42.8 mg/ml；α-トコフェロール：5％（v/v） 47.5 mg/ml；PBS-mod：NaCl 121 mM、KCl 2.38 mM、Na2HPO4 7.14 mM、KH2PO4 1.3 mM；pH 6.8±0.1。
【０２５３】
実施例III−スプリットインフルエンザ抗原調製物と2つの用量のAS03アジュバントを含むワクチン（Flu-LD-004）を用いる18〜59歳の成人集団における臨床試験
III.1. はじめに
フェーズIIのランダム化比較単盲検を、2006年に18〜59歳の成人集団において行って、2つの用量のAS03アジュバントを含むGlaxoSmithKline Biologicalsの低用量インフルエンザ候補ワクチン（すなわち、株あたり5μgのHAを含む）の免疫原性、安全性及び反応原性を評価した。
【０２５４】
液性免疫応答（すなわち、抗血球凝集素）を、1用量のAS03アジュバント添加ワクチンの筋肉内投与の21日後に測定した。FluarixTMを参照として用いた。
【０２５５】
III.2. 試験設計
3群の被験者には並行して以下のワクチンを筋肉内投与した：
・100人の被験者の1群は、AS03でアジュバント添加された5μgのHAを含む低用量のスプリットウイルスインフルエンザワクチン（FluLD1/1）の1回の注射を受ける
・100人の被験者の1群は、半用量のAS03（AD03 1/2）でアジュバント添加された5μgのHAを含む低用量のスプリットウイルスインフルエンザワクチン（FluLD1/2）の1回の注射を受ける
・100人の被験者の1群は、1用量のFluarixTM（Fluarix）を受ける。
【０２５６】
スケジュール：0日目にインフルエンザワクチンの1回のIM注射、0日目及び21日目に試験サイト訪問、血液サンプル回収（HI抗体決定）、並びに30日目にさらに電話連絡（試験結果）。
【０２５７】
この試験において用いた標準三価スプリットインフルエンザワクチン-FluarixTMは、GlaxoSmithKline Biologicalsにより開発及び製造され、2006/2007年から北半球で市販されているワクチンである。
【０２５８】
III.3. 試験評価項目
III.3.1. 主要評価項目
・抗血球凝集素抗体力価に関して試験ワクチンにより誘導される液性免疫応答を評価すること：
0日及び21日目の観察される変数：血清血球凝集阻害抗体力価
誘導される変数（95％信頼区間で）：
・0日及び21日目の血清抗体の幾何平均力価（GMT）
・21日目の血清変換率*
・21日目の血清変換係数**
・0日及び21日目の血清防御率***
*血球凝集素抗体応答の血清変換率を、ワクチン接種前の力価1:10未満かつワクチン接種後の力価1:40以上を有するか、又はワクチン接種前の力価1:10以上かつワクチン接種後の力価における少なくとも4倍の増加を有するワクチン被接種者の割合と定義する。 
**0日目と比較してワクチン接種後の血清HI GMTにおける増加倍率として定義された血清変換係数；
***通常は防御を示すと許容されるワクチン接種後、40以上の血清HI力価を有するワクチン被接種者の割合として定義される血清防御率。
【０２５９】
III.3.2. 二次評価項目
・応答型局所及び全身有害事象、非応答型有害事象及び重篤な有害事象に関して試験ワクチンの安全性及び反応原性を評価すること：
1. 各群における各ワクチン接種後の7日間の追跡期間（すなわち、ワクチン接種日及びその後の6日間）の間の応答型局所及び全身兆候及び徴候の発生、強度及びワクチン接種との関係、
2. 各群における各ワクチン接種後の30日間の追跡期間（すなわち、ワクチン接種日及びその後の29日間）の間の非応答型局所及び全身兆候及び徴候の発生、強度及びワクチン接種との関係、
3. 各群における全試験期間の間の重篤な有害事象の発生及び関係。
【０２６０】
III.4. ワクチン組成物及び投与
III.4.1. ワクチン調製物
アジュバント無添加インフルエンザワクチンは、3種の一価ウイルス抗原バルク（それぞれ、インフルエンザA/H1N1株、A/H3N2株及びB型株から調製）からなる三価スプリットビリオン不活化インフルエンザワクチンである。このワクチン中に存在する抗原は、1992年以来FluarixTM（α-Rix（登録商標））として市場で入手可能であるライセンス化されたFluarixTMワクチンと同じであり、用量あたり15μgのHA/株を含む。FluLD臨床ロットに含まれるインフルエンザ株は、2006/2007年の北半球のために選択された株である：
・A/New Caledonia/20/99（H1N1）様株：A/New Caledonia/20/99（H1N1）IVR-116
・A/Wisconsin/67/2005（H3N2）様株：A/Wisconsin/67/2005（H3N2）NYMCX-161
・B/Malaysia/2506/2004。
【０２６１】
抗原は卵中で増殖させたウイルスから誘導されたものである。分割（スプリッティング）をデオキシコール酸ナトリウムを用いて実行した後、不活化工程を行って、デオキシコール酸ナトリウム及びホルムアルデヒドのその後の作用を介して実施する。
【０２６２】
AS03アジュバント添加低用量インフルエンザ（FluLD）ワクチン（臨床ロット）は、市販のFluarixTMワクチン（それぞれ、インフルエンザA/H1N1株、A/H3N2株及びB型株から調製）に基づくものであるが、より少量の抗原含量を有し、GSKアジュバント系AS03を用いてアジュバント添加されたものである。AS03は、2種の生分解性油、スクアレン及びα-トコフェロール（ビタミンE）、並びに界面活性剤ポリソルベート80（Tween 80）を含む水中油型エマルジョン（SB62）からなる。インフルエンザ抗原を、エマルジョンと単純に混合することによりアジュバント系の水相中に組み入れる。ワクチンロット中のインフルエンザ抗原を用いて導入されたアジュバントの量が異なる2種の製剤を試験した。アジュバント添加ワクチンは、アジュバント系AS03の全用量（AS03）又は半分の用量（AS03 1/2）と混合された、用量あたり各インフルエンザウイルス株の5μgの血球凝集素（HA）を含む。賦形剤は以下のもの：ポリソルベート80（Tween 80）、オクトキシノール10（Triton X-100）、α-トコフェリル水素コハク酸塩、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム、注射用水である。AS03アジュバント添加低用量インフルエンザワクチン（FluLD、AS03の全用量又は半用量）は保存剤を含まないワクチンである。しかしながら、それらは、初期段階の製造プロセスに由来する微量のチオメルサール（用量あたり1.25μg未満のHg）を含む。それらを両方とも、0.5 ml／用量の体積で予備充填されたガラス（I型）シリンジ中の単回用量ワクチンとして提供する。
【０２６３】
III.4.1.1. AS03アジュバント添加インフルエンザワクチンの組成
1用量のFluLD（AS03の全用量又は半用量）は0.5 mlに一致する。その組成を表３に提供する。用量あたりのHA含量は、両製剤について5μgであり、唯一の差異は最終的な容器中に存在するAS03の量である。
【表３】
2010524883.tif 000005
【０２６４】
III.4.1.2. スプリット不活化インフルエンザ抗原調製物の製造
インフルエンザ抗原は、FluarixTM（インフルエンザウイルスワクチン）に含まれるものと同一である。一価バルクは、孵化鶏卵中に個々に増殖させた、インフルエンザウイルスの3種の株、すなわちA型（H1N1及びH3N2）並びにB型の種株から調製された精製不活化スプリットウイルスからなる。これらの種株は、年1回のWHO推奨後にWHO共同センターから受領した株に由来する。抗原参照物を調製するためのプロセスについては、例えば、WO 02/097072号に示されている。3種の一価バルクの容量は、製剤化の前の各一価バルク中で測定されたHA含量及び標的製造容量に基づく。
【０２６５】
10倍濃縮されたリン酸緩衝生理食塩水（1倍濃縮の場合、pH 7.4）並びにTween 80とα-トコフェリル水素コハク酸塩の予備混合物を、注射用水で希釈した後、室温で5〜30分間攪拌する。
【０２６６】
次いで、3種の濃縮された一価バルクを、得られるリン酸緩衝生理食塩水／Tween 80-α-トコフェリル水素コハク酸塩溶液中、中間三価バルク1 mLあたり、
それぞれA型1価バルク（H1N1、H3N2）の20μgのHA
B型1価バルクの23.32μgのHA
の濃度に連続希釈する（5μg HAの各A型一価バルク及び5.83μg HAのB型/500μl三価最終バルク）。
【０２６７】
各一価バルクの添加の間に、混合物を室温で10〜30分間攪拌し、最後の一価バルクの添加後15〜30分間攪拌する。「プレプール」とも呼ばれるこの中間三価バルクを+2〜+8℃で保持するか、又は同じ日に最後の製剤化工程に加工することができる。プレプールの最終容量は、用量あたり250μlである。
【０２６８】
III.4.1.3. AS03アジュバントを含むワクチン組成物の調製
アジュバント添加ワクチン：LD AS03 1/1（表４）
PBS mod 10倍濃縮液（1倍濃縮の場合、pH 7.4；137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4、1.47 mM KH2PO4、pH 7.4）並びにTween 80、Triton X-100及びVESを含む混合物（株中に存在する界面活性剤を考慮に入れた量）を、注射用水に添加する。5〜30分間攪拌した後、1 mlの各株H1N1及びH3N2あたり20μgのHA並びに1 mlのB型株あたり23.32μgのHAを、各添加の間に10〜30分間攪拌しながら添加する。15〜30分間攪拌した後、少量のいわゆる「中間バルク」を分析のために廃棄し、+2〜+8℃で保存する。中間バルクはPBS mod中、1倍濃縮されたものである。標的の界面活性剤濃度は、1 mlあたり488μgのTween 80、1 mlあたり73.6μgのTriton X-100及び1 mlあたり66.6μgのVESである。
【０２６９】
次いで、最終的な製剤を調製する：等量のSB62（実施例IIにおける調製を参照）を、それぞれ250μlのプレプール中間バルクに添加し、室温で30〜60分間混合する。pHを、6.8〜7.5の範囲であるように調べる。製剤を窒素でフラッシュした後、+2〜8℃で保存した後、充填する。
【表４】
2010524883.tif 000006
【０２７０】
アジュバント添加ワクチン：LD AS03 1/2（表５）
PBS modの10倍濃縮液（1倍濃縮の場合、pH 7.4-上記組成を参照）並びにTween 80、Triton X-100及びVESを含む混合物（株中に存在する界面活性剤を考慮に入れた量）を、注射用水に添加する。5〜30分間攪拌した後、1 mlの各株H1N1及びH3N2あたり20μgのHA並びに1 mlのB型株あたり23.32μgのHAを、各添加の間に10〜30分間攪拌しながら添加する。15〜30分間攪拌した後、少量のいわゆる「中間バルク」を分析のために廃棄し、+2〜+8℃で保存する。PBS modは中間バルク中、1倍濃縮されたものである。標的の界面活性剤濃度は、1 mlあたり488μgのTween 80、1 mlあたり73.6μgのTriton X-100及び1 mlあたり66.6μgのVESである。
【０２７１】
次いで、最終製剤を調製する：SB62をPBS modバッファーで最初に希釈し、RTで15〜30分間攪拌する。次いで、等量のこの希釈されたSB62を、それぞれ250μlの中間バルクのプレプールに添加する。RTで30〜60分間攪拌した後、pH6.8〜7.5の範囲にあるようにpHを調べる。製剤を窒素でフラッシュした後、+2〜8℃で保存した後、充填する。
【０２７２】
両製剤の最終容量は、用量あたり500μlであり、最終HA濃度は、三価最終バルク1 mlあたり、10μgの各A型一価バルク及び11.66μgのB型一価バルクである。最終的なTween 80、Triton X-100（H3N2一価バルク製造の残留物）及びα-トコフェロール水素コハク酸塩（α-トコフェリル水素コハク酸塩はRRR（D異性体）-α-トコフェリルのエステル型である）標的濃度は、それぞれ、244μg/ml、58.6μg/ml及び33.3μg/mlである。
【表５】
2010524883.tif 000007
【０２７３】
III.4.2. ワクチン投与
ワクチンを、1.25 mlの滅菌I型（Ph. Eur.）ガラスシリンジ中に充填する。各シリンジを、0.57 mlの標的に充填する（範囲：0.54〜0.60 ml）。ワクチンを、利き腕と逆の腕の三角筋領域中に筋肉内投与した。全てのワクチンを、予め充填されたシリンジ（0.5 ml）として提供した。ワクチンの適切なIM注射を確保するために、少なくとも25G及び少なくとも長さ2.5 cmの針を用いた。
【０２７４】
III.5 試験集団結果
合計300人の被験者をこの試験に登録した：それぞれ3群の100人の被験者。ワクチン接種の時点での全ワクチン接種コホートの平均年齢は、13.67歳の標準偏差を有する36.7歳であった。3つのワクチン群全体における被験者の平均年齢及び性別分布は類似していた。
【０２７５】
III.6. 免疫原性結果
免疫原性の分析を、免疫原性に関するATPコホートに対して実施した（297人の被験者）。
【０２７６】
液性免疫応答
AS03でアジュバント添加された低用量インフルエンザ候補ワクチンにより誘導された液性免疫応答を評価するために、以下のパラメーター（95％信頼区間で）を各処理群について算出した：
・0日及び21日目でのHI抗体力価の幾何平均力価（GMT）；
・21日目での血清変換率（SC）；
・21日目での変換係数；
・0日及び21日目での防御率。
【０２７７】
III.6.1 HI幾何平均力価（GMT）
95％CIでのHI抗体のGMTを表６及び図１に示す。群間で調整されたGMT比を表７に示す。
【０２７８】
全部で3種のワクチン株に関するHI抗体のワクチン接種前のGMTは、3つの処理群において同じ範囲内にあった。アジュバント添加群について21日目に観察されるGMTは、A/Wisconsinワクチン株についてFluLD1/1及びFluarix間で統計学的差異（95％CIの重複なし、調整されたGMT比は値1を含まなかった）を有する全部で3種の株について、Fluarix群よりも高い傾向を有する。B/Malaysiaワクチン株についてFluLD1/2とFluarixの間でも統計学的差異（調整されたGMT比は値1を含まなかった）が観察された。
【表６】
2010524883.tif 000008
【０２７９】
【表７】
2010524883.tif 000009
【０２８０】
III.6.2. 抗HI抗体力価の血清変換係数、血清防御率及び血清変換率（ヒトにおけるインフルエンザワクチンについて確立された防御について相関する）
結果を、血清防御率については表８−図２、血清変換率については表９−図３に、及び変換係数については表１０−図４に提供する。
【０２８１】
全ての群において、血清防御率に関する欧州当局により要求される閾値（70％）に到達した（少なくとも94.9％）。各ワクチン株について、3群に関する21日目の血清防御率は同じ範囲内にあった。
【０２８２】
全ての群において、血清変換率に関する欧州当局により要求される閾値（40％）に到達した（少なくとも65％）。
【０２８３】
A/New Caledoniaワクチン株について、3群に関する21日目のSCRは同じ範囲内にあった。
【０２８４】
A/Wisconsinワクチン株について、FluLD1/1群に関する21日目のSCRは、Fluarix群と比較してより高い傾向があった。FluLD1/2群に関する21日目のSCRは、Fluarix群と比較して同じ範囲内にあった。
【０２８５】
B/Malaysiaワクチン株について、FluLD1/2群に関する21日目のSCRは、Fluarix群と比較してより高い傾向があった。FluLD1/1群に関する21日目のSCRは、Fluarix群と比較して同じ範囲内にあった。
【０２８６】
全ての群において、血清変換係数（2.5）に関する欧州当局により要求される閾値に到達した（少なくとも6.2）。
【０２８７】
A/New Caledoniaワクチン株について、3群に関する21日目のSCFは、同じ範囲内にあるようであった。FluLD1/2群について観察された値は、Fluarix群について観察された値より低かったが、FluLD1/2群における高い方のワクチン接種前の血清防御率により説明することができた。
【０２８８】
A/Wisconsinワクチン株について、FluLD1/1群に関する21日目のSCFは、Fluarix群と比較してより高い傾向があった。FluLD1/2群に関する21日目のSCFは、Fluarix群と比較して同じ範囲内にあった。
【０２８９】
B/Malaysiaワクチン株について、2つのアジュバント添加群に関する21日目のSCFは、Fluarix群と比較してより高いものである傾向があった。
【表８】
2010524883.tif 000010
【０２９０】
【表９】
2010524883.tif 000011
【０２９１】
【表１０】
2010524883.tif 000012
【０２９２】
III.7. 安全性結論
Fluarix群と比較したアジュバント添加ワクチン群における応答型（局所／全身）及び非応答型徴候に関するより高い反応原性は、この試験において観察された全体的な傾向であった。アジュバント添加ワクチン中のAS03含量の低下は、全ての全身及び局所等級3徴候に対する有意な影響を有する。
【０２９３】
非応答型徴候の発生は、Fluarix群（35％）と比較して、アジュバント添加ワクチン群（55％及び47％の被験者）においてより高い傾向があった。
【０２９４】
これらの結果から、候補ワクチンの反応原性及び安全性プロフィールが満足のいくものであり、臨床的に許容し得ると結論付けることができる。
【０２９５】
III.8. 全体の結論
III.8.1. 免疫原性結果
この試験の主要評価項目は、2つの異なる濃度のAS03アジュバントを含む低用量のインフルエンザワクチン、及びFluarixにより誘発される液性免疫応答（抗HI抗体力価）を評価することであった。
【０２９６】
21日目に、3種のワクチンは、スプリットビリオンインフルエンザワクチンの毎年の登録に関する欧州当局の要件を超えた（毎年の株の変化の免疫学的評価に関する「Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for influenza Vaccines」-CPMP/BWP/214/96）。GMTは、A/Wisconsin（FluLD1/1対Fluarix）及びB/Malaysiaワクチン株（FluLD1/2対Fluarix）について観察された統計学的に有意な差異と共に、Fluarix群と比較してアジュバント添加群においてより高い傾向にあった。3種全部のワクチン群において、94.9％〜99％の範囲で、同様の血清防御率が観察された。血清変換率及び血清変換係数は、Fluarix群におけるよりもアジュバント添加群においてより高いことが観察された。この試験からのデータはまた、AS03アジュバントの用量の半分を含むワクチンにより誘導された免疫原性が、当該アジュバントの全用量により誘導されるものと同等であることを明らかにした。
【０２９７】
III.8.2. 反応原性及び安全性結果
AS03でアジュバント添加された低用量インフルエンザ候補ワクチンの投与は安全であり、試験集団、すなわち、18〜59歳の年齢の成人において臨床的によく寛容された。半用量のアジュバント添加ワクチンは、全用量のアジュバント添加ワクチンと比較して、応答型局所及び全身徴候の発生の顕著な低下を示した。
【０２９８】
実施例IV−初回刺激されたBALB/cマウスにおけるアジュバント添加及びアジュバント無添加スプリットインフルエンザワクチン（様々な用量のAS03アジュバントを含む）の前臨床評価
IV.1. 実験設計及び評価項目
インフルエンザで初回刺激されたマウスにおける実験を実施して、この水中油型アジュバントを用いて製剤化されたインフルエンザワクチンにより誘導されたAS03による液性応答の増加を評価した。ヒトの状況により近づけるために（およそ2年毎に推移する菌株によって反復的に感染するために人は血清陽性となっている）、異種亜型株で初回刺激されたマウスを用いて実験を行った。異種亜型の初回刺激はまた、同種亜型株で初回刺激した場合と比較してよりストリンジェントなモデルであり、異なるアジュバントを区別するために良好なモデルである。
【０２９９】
IV.1.1. 処理／群（表１１）
27匹の成体雌BALB/cマウスの群を、三価全ホルマリン不活化インフルエンザウイルス（各株につき5μgのHA）を用いて0日目に鼻内に（20μl容量）初回刺激した。初回刺激株は、ワクチン中に含まれるものよりも早いドリフト変異体（5μgのHA全不活化H1N1 A/Johannesburg/82/96、H3N2 A/Sydney/5/97、B/Harbin/7/94）からなっていた。28日後、合計容量50μlで筋肉内に単回用量のワクチン候補をマウスにワクチン接種した。スプリット抗原のみ（三価スプリット単味）を含む製剤又は2種の用量のAS03（全量若しくは1/5）でアジュバント添加されたスプリット抗原を含む製剤を用いて、マウスを免疫した。免疫に用いた株は、H1N1 A/New Caledonia/20/99、H3N2 A/Panama/2007/99、B/Shangdong/7/97ウイルス抗原（1.5μg/株、ヒト用量の1/10）を含んでいた。
【表１１】
2010524883.tif 000013
【０３００】
IV.1.2. ワクチン製剤の調製
Tween 80、Triton X-100及びコハク酸ビタミンE（VES）のプレミックスを調製して、750μg/mlのTween 80、110μg/mlのTriton X100及び100μg/mlのVESのワクチン中の最終濃度を達成する。プレミックス中で用いられる量を、株中に既に存在する界面活性剤及びVESの量を考慮に入れて算出する。
【０３０１】
1リットルの10倍濃縮塩水バッファー（PBS pH 7.4）の調製：0.800 lの注射用水に、NaCl 80 g、KCl 2 g、Na2HPO4 11.44 g、KH2PO4 2 gを添加する。溶解させた後、注射用水で1.0 Lに調整する。10倍希釈した場合、pHは7.4であろう。
【０３０２】
三価スプリット／単味
1回分の50μl用量の製剤を、以下の順番に従って即時調製する：注射用水＋塩水バッファー（10倍濃縮PBS pH 7.4）＋プレミックス、室温で5分間、磁気攪拌、＋1.5μg HA H1N1株、室温で10分間、磁気攪拌、＋1.5μg HA H3N2株、室温で10分間、磁気攪拌、＋1.5μg HA B型株、室温で15分間、磁気攪拌。この製剤を、その調製の終わりの後1時間以内に注射する。
【０３０３】
三価スプリット／AS03
Tween 80、Triton X100及びコハク酸ビタミンE（VES）のプレミックスを調製して、750μg/mlのTween 80、110μg/mlのTriton X100及び100μg/mlのVESのワクチン中の最終濃度を達成する。プレミックス中で用いられる量を、株中に既に存在する界面活性剤及びVESの量を考慮に入れて算出する。
【０３０４】
1回分の50μl用量の製剤を、以下の順番に従って即時調製する：注射用水＋塩水バッファー（10倍濃縮PBS pH 7.4）＋プレミックス、室温で5分間、磁気攪拌、＋1.5μg HA H1N1株、室温で10分間、磁気攪拌、＋1.5μg HA H3N2株、室温で10分間、磁気攪拌、＋1.5μg HA B型株、室温で15分間、磁気攪拌、＋全用量AS03については25μlのSB62エマルジョン又は1/5用量のAS03については5μlのSB62エマルジョン、室温で15分間、磁気攪拌。この製剤を、その調製の終わりの後1時間以内に注射する。
【０３０５】
IV.1.3. 読み出し（表１２）
ワクチン接種に対する液性免疫応答を、免疫の前（28日目）及び免疫の14日後に測定した（27匹のマウス／群）。血清サンプルを、血球凝集阻害（HI）試験により試験した。
【表１２】
2010524883.tif 000014
【０３０６】
IV.2. 結果
IV.2.1. 液性免疫
結果を図５に提供する。異種亜型初回刺激、次いで1回のワクチン接種のこのマウスモデルにおいては、AS03及びその希釈液は単味ワクチンと比較してより高いHI力価を誘導することが示された。全てのインフルエンザA型株について、HI力価の統計学的に有意な増加が観察された（p<0.05）。また、H1N1株については、HI力価の有意差がAS03とAS03 1/5の間で観察された（p<0.05）。少量のAS03は、単味ワクチンと比較してB型株についてHI力価を増加させることができなかった。B型株（B/Shangdong）に対しては、非常に低い応答が観察された。これは、初回刺激に用いられたB型株とワクチンとの間での有意な抗原ドリフトに起因するものである可能性がある。
【０３０７】
IV.3. 結果及び結論のまとめ
結論においては、単味ワクチンと比較して、AS03アジュバント添加ワクチンを用いる場合、異種亜型株で初回刺激された動物において、HI力価の増加が観察された。全用量のAS03は、3種全部のインフルエンザワクチン株に対して強固なHI力価を得るのに最適であった。
【０３０８】
実施例V−初回刺激されたC57Bl/6マウスにおけるアジュバント添加及びアジュバント無添加スプリットインフルエンザワクチン（様々な用量のAS03アジュバントを含む）の前臨床評価
V.1. 実験設計及び評価項目
インフルエンザで初回刺激されたマウスにおける実験を実施して、この水中油型アジュバントを用いて製剤化されたAS03誘導インフルエンザワクチンによる液性応答及び細胞性応答の増加を評価した。
【０３０９】
ヒトの状況をシミュレートするために、異種亜型株で初回刺激されたマウスを用いて実験を行った。
【０３１０】
V.1.1. 処理／群（表１３）
25匹の成体雌C57Bl/6マウスの群を、三価全ホルマリン不活化インフルエンザウイルス（各株につき5μgのHA）を用いて0日目に鼻内（20μl容量）に初回刺激した。初回刺激株は、ワクチンに含まれるものよりも早いドリフト変異体（5μg HA全不活化H1N1 A/Beijing/262/95、H3N2 A/Panama/2007/99、B/Shangdong/7/97）からなっていた。28日後、合計容量100μlで筋肉内に単回用量のワクチン候補をマウスにワクチン接種した。スプリット抗原のみ（三価スプリット単味）を含む製剤又は3種の用量のAS03（全量、1/2若しくは1/5）でアジュバント添加されたスプリット抗原を含む製剤を用いて、マウスを免疫した。免疫に用いた株は、H1N1 A/New Caledonia/20/99、H3N2 A/New York/55/2004、B/Jiangsu/10/2003ウイルス抗原（1.5μg/株、ヒト用量の1/10）を含んでいた。
【表１３】
2010524883.tif 000015
【０３１１】
V.1.2. ワクチン製剤の調製
三価スプリット／単味
100μl用量の製剤を、以下の順番に従って即席に調製する：注射用水＋塩水バッファー（実施例IVに教示されたように調製された10倍濃縮PBS pH 7.4）＋Fluarix Lot DFLUA014（最終用量中に、株あたり1.5μg）。
【０３１２】
三価スプリット／AS03
100μl用量の製剤を、以下の順番に従って即席に調製する：注射用水＋塩水バッファー（実施例IVに教示されたように調製された10倍濃縮PBS pH 7.4）＋Fluarix Lot DFLUA014（最終用量中に、株あたり1.5μg）＋全用量については25μlのSB62エマルジョン又は1/2用量については12.5μlのSB62エマルジョン又は1/5用量については5μlのSB62エマルジョン。この製剤を、調製の終わりの後1時間以内に注射する。
【０３１３】
V.1.3. 読み出し（表１４）
ワクチン接種に対する液性免疫応答を、免疫の21日後に測定し（10匹のマウス／群）、血清サンプルを、血球凝集阻害（HI）試験により試験した。細胞性免疫応答（15匹のマウス／群）を、細胞内サイトカイン染色（ICS）により免疫の7日後に試験した。
【表１４】
2010524883.tif 000016
【０３１４】
V.2. 結果
V.2.1. 液性免疫（10匹のマウス／群）
結果を図６に提供する。異種亜型初回刺激、次いで1回のワクチン接種のこのマウスモデルにおいては、AS03及びその希釈液（1/2及び1/5）は単味ワクチンと比較してより高いHI力価を誘導することが示された。3種全部の株について、全用量AS03又は低用量のAS03でアジュバント添加されたワクチンを受容するマウス間でHI力価の差異は観察されなかった。
【０３１５】
V.2.2. 細胞性免疫（15匹のマウス／群）
結果を図７に提供する。AS03の希釈率に関わらず、三価スプリット単味で免疫されたマウスと比較して、AS03でアジュバント添加された三価スプリットワクチンで免疫されたマウスにおいて、より高いCD4+ T細胞応答が観察された。全用量AS03でアジュバント添加された三価スプリットで免疫されたマウスにおいて誘導された応答と比較して、マウスをより低用量のAS03でアジュバント添加された三価スプリットで免疫した場合、より少ない細胞性応答の傾向が観察された。
【０３１６】
V.3. 結果及び結論のまとめ
結論において、単味ワクチンと比較して、AS03アジュバント添加ワクチンを用いる場合、異種亜型株で初回刺激された動物において、液性及び細胞性応答の増加が観察された。全用量又は分割用量のAS03アジュバントで免疫されたマウス間で、類似する規模の液性応答が観察された。しかしながら、アジュバント用量の減少は、CD4+ T細胞応答の低下した規模に関する傾向と関連していた。
【０３１７】
実施例VI−初回刺激されたC57Bl/6マウスにおけるアジュバント添加及びアジュバント無添加スプリットインフルエンザワクチン（様々な用量のAS03アジュバント及び低用量の抗原を含む）により誘導される細胞性免疫応答の前臨床評価
VI.1. 実験設計及び評価項目
インフルエンザで初回刺激されたマウスにおける実験を実施して、低用量の抗原（0.5μg/株、1/30ヒト用量）を含み、この水中油型アジュバントと共に製剤化されたインフルエンザワクチンにより誘導されるAS03による細胞性免疫応答の増加を評価した。ヒトの状況をシミュレートするために、異種亜型株で初回刺激されたマウスを用いて実験を行った。
【０３１８】
VI.1.1. 処理／群（表１５）
15匹の成体雌C57Bl/6マウスの群を、三価全ホルマリン不活化インフルエンザウイルス（各株につき5μg HA）を用いて0日目に鼻内に（20μl容量）初回刺激した。初回刺激株は、ワクチンに含まれるものよりも早いドリフト変異体（5μg HA全不活化H1N1 A/Beijing/262/95、H3N2 A/Panama/2007/99、B/Shangdong/7/97）からなっていた。28日後、合計容量50μlで筋肉内に単回用量のワクチン候補をマウスにワクチン接種した。スプリット抗原のみ（三価スプリット単味）を含む製剤、又は3種の用量のAS03（全量、1/2若しくは1/5）でアジュバント添加されたスプリット抗原を含む製剤を用いて、マウスを免疫した。免疫に用いた株は、H1N1 A/New Caledonia/20/99、H3N2 A/New York/55/2004、B/Jiangsu/10/2003ウイルス抗原（1.5μg/株、ヒト用量の1/30）を含んでいた。
【表１５】
2010524883.tif 000017
【０３１９】
VI.1.2. ワクチン製剤の調製
三価スプリット／単味
50μl用量の製剤を、以下の順番に従って即時調製する：注射用水＋塩水バッファー（実施例IVに教示されたように調製された10倍濃縮PBS pH 7.4）＋Fluarix Lot DFLUA014（最終用量中に、株あたり0.5μg）。
【０３２０】
三価スプリット／AS03
50μl用量の製剤を、以下の順番に従って即時調製する：注射用水＋塩水バッファー（実施例IVに教示されたように調製された10倍濃縮PBS pH 7.4）＋Fluarix Lot DFLUA014（最終用量中に、株あたり0.5μg）＋全用量については25μlのSB62エマルジョン又は1/2用量については12.5μlのSB62エマルジョン又は1/5用量については5μlのSB62エマルジョン。この製剤を、調製の終わりの後1時間以内に注射する。
【０３２１】
V.1.3. 読み出し（表１６）
細胞性免疫応答を、細胞内サイトカイン染色により免疫の7日後に試験した。
【表１６】
2010524883.tif 000018
【０３２２】
VI.2. 結果
VI.2.1. 細胞性免疫
結果を図８に示す。三価スプリット単味で免疫したマウスと比較して、AS03（全用量若しくは1/2用量）でアジュバント添加された三価スプリットワクチンで免疫したマウスにおいて、わずかにより高いCD4+ T細胞応答が観察された。三価スプリット単味又は全用量若しくは半用量のAS03でアジュバント添加されたワクチンで免疫されたマウスにおいて誘導された応答と比較して、マウスを1/5用量のAS03でアジュバント添加された三価スプリットで免疫した場合、より高い細胞性応答が観察された。
【０３２３】
VI.3. 結果及び結論のまとめ
結論においては、単味ワクチンと比較して、AS03でアジュバント添加されたワクチンを用いる場合、異種亜型初回刺激動物において、CD4+ T細胞応答の最小的な増加が観察された。この実験においては、アジュバント用量応答は観察されなかったが、実際に1/5のAS03用量により、より高いアジュバント用量を用いる場合に認められるものよりも高い頻度の抗原特異的CD4+ T細胞が誘導された。1株当たり0.5μgのHAを用いて得られたこれらのデータは、全体として、1株当たり1.5μgのHAを用いて得られる他の前臨床試験のデータとは類似しなかった。
【０３２４】
実施例VII−ナイーブなC57Bl/6マウスにおけるアジュバント添加及びアジュバント無添加スプリットH5N1ワクチン（様々な用量のAS03アジュバント及び抗原を含む）の前臨床評価
VII.1. 実験設計及び評価項目
H5N1にナイーブなマウスにおける実験を実施して、この水中油型アジュバントと共に製剤化されたH5N1スプリットワクチンにより誘導されるAS03による液性及び細胞性免疫応答の増加を評価した。パンデミックの場合、世界全体の集団が新規に流行するパンデミックインフルエンザ株に対して免疫学的にナイーブであると予想される。このナイーブな状態に起因して、パンデミックワクチンは新しいインフルエンザ株により引き起こされる感染及び重篤な疾患から個人を防御するための2種のワクチン用量を必要とする可能性が高い。以前の曝露のこの欠如を表すために、ナイーブなマウスモデルを開発して、ワクチンの免疫原性を評価した。
【０３２５】
VII.1.1. 処理／群（表１７）
15匹の成体雌ナイーブC57Bl/6マウスの群を、全量50μlで筋肉内にパンデミックH5N1ワクチン候補を用いて0日目及び28日目に免疫した。マウスを、スプリットH5N1抗原のみ（H5N1スプリット単味）を含む製剤又は様々な用量のAS03（2倍、全量、1/2若しくは1/5）でアジュバント添加されたスプリット抗原を含む製剤で免疫した。免疫に用いた株は、H5N1 A/ベトナム/1194/04ウイルス抗原（ヒト用量の1/10に対応する1.5又は0.38μg/株）を含んでいた。1回の50μlのH5N1スプリット/AS03全用量＋1回の50μlのAS03用量の同時注射よりもむしろ、2倍のAS03用量を用いて製剤化を行わなかった。
【表１７】
2010524883.tif 000019
【０３２６】
VII.1.2. ワクチン製剤の調製
1リットルの最終バルクバッファー（PBS pH 7.2±0.2）の調製：0.800 lの注射用水に、NaCl 7.699 g、KCl 0.200 g、MgCl2 x 6H2O 0.100 g、Na2HPO4 x 12 H2O 2.600 g、KH2PO4 0.373 gを添加する。溶解後、注射用水で1.0 Lに調整する。
【０３２７】
H5N1スプリット／単味
50μl用量の調製：
チオメルサール（株中でのその濃度を考慮に入れた量）及びTriton X100を、最終バルクバッファーに添加する。Tween 80を内容物として添加せず、製剤中の標的を、株のTween濃度により達成する。最終濃度は、1.5μg製剤用量中、10μg/mlのチオメルサール、368μg/mlのTween 80及び35μg/mlのTriton X100である。それらは、0.38μgの製剤用量中では、チオメルサールについては10μg/ml、Tween 80については93μg/ml及びTriton X100については8.9μg/mlである。5〜30分間磁気攪拌した後、1.5又は0.38μgのHA （H5N1株）を添加する。製剤を30〜60分間攪拌する。pHを調べる。製剤化の終わりの後1時間以内に注射を行う。
【０３２８】
H5N1スプリット/AS03
50μl用量の調製：
チオメルサール（株中でのその濃度を考慮に入れた量）及びTriton X100を、最終バルクバッファーに添加する。Tween 80を内容物として添加せず、製剤中の標的を、株のTween濃度により達成する。最終濃度は、1.5μg製剤用量中、10μg/mlのチオメルサール、368μg/mlのTween 80及び35μg/mlのTriton X100である。それらは、0.38μgの製剤用量中では、チオメルサールについては10μg/ml、Tween 80については93μg/ml及びTriton X100については8.9μg/mlである。5〜30分間磁気攪拌した後、1.5又は0.38μgのHA （H5N1株）を添加する。30〜60分間攪拌した後、25又は12.5又は5μlのSB62エマルジョンを添加する。製剤を30〜60分間攪拌する。pHを調べる。製剤化の終わりの後1時間以内に注射を行う。
【０３２９】
VII.1.3. 読み出し（表１８Ａ）
抗Ig、IgG1及びIgG2b抗体力価（図９Ａ〜Ｆ）により、免疫の14日後（10匹のマウス／群）に液性免疫応答を測定した。また、抗H5N1血球凝集阻害アッセイにより、免疫の21日後（10匹のマウス／群）に液性免疫応答を測定した（図１０Ａ〜Ｂ）。
【０３３０】
細胞性免疫応答を、フローサイトメトリーにより数えた抗原特異的CD4+ T細胞の細胞内サイトカイン染色（ICS）により免疫の6日後（3匹のマウス／群の5つのプール）に細胞性免疫応答を試験した（図１１Ａ〜Ｂ）。
【表１８】
2010524883.tif 000020
【０３３１】
VII.2. 結果
VII.2.1. 液性免疫応答：ELISA及びアイソタイプ
結果を図９及び表１８Ｂに示す。
【０３３２】
2010524883.tif 000021
【０３３３】
各用量のH5N1スプリットワクチンで、全てのアジュバント添加群は、アジュバント無添加H5N1スプリットワクチンと比較して、より高い抗H5N1 Ig、IgG1及びIgG2b抗体力価を誘導した（図９Ａ〜Ｆ）。各用量のH5N1スプリットワクチンで、抗H5N1 IgG1抗体応答は、抗H5N1 IgG2b抗体応答よりも4〜5倍高かった（図９Ｃ〜Ｆ）。1.5μg HA用量のH5N1スプリットワクチンと各用量のアジュバントを混合した場合、抗H5N1 Ig、IgG1及びIgG2b抗体応答の差異は観察されなかった（図９Ａ、Ｃ及びＥ）。
【０３３４】
0.38μg HA用量のH5N1スプリットワクチンを用いる場合、AS03/2（p=0.7315）及びAS03 1/5（p=0.9744）でアジュバント添加されたH5N1スプリットワクチンにより誘導される応答と比較して、2倍〜全用量でアジュバント添加されたH5N1スプリットワクチンを用いる免疫後に、より高い抗H5N1 Ig力価に関する傾向が得られた（図９Ｂ）。また、この傾向は抗H5N1 IgG1抗体応答についても観察された（図９Ｄ）。しかしながら、この力は統計学的有意差を観察するには十分ではなかった（1.7倍の差異については25％の力、又は2倍の差異については47％）。
【０３３５】
VII.2.2. 液性免疫応答：HI力価
1.5μg HA用量／マウスの場合
各アジュバント用量で、AS03でアジュバント添加されたH5N1スプリットワクチンで免疫された全てのマウスは、アジュバント無添加H5N1スプリットワクチンで免疫されたマウスにおいて得られる応答と比較して、より高いHI力価を誘導した（図１０Ａ）。H5N1スプリットワクチンを一定用量範囲のAS03でアジュバント添加した場合、HI力価の統計学的有意差は観察されなかった（図１０Ａ）。
【０３３６】
0.38μg HA用量／用量の場合
各アジュバント用量で、AS03でアジュバント添加されたH5N1スプリットワクチンで免疫された全てのマウスは、アジュバント無添加H5N1スプリットワクチンで免疫されたマウスにおいて得られる応答と比較して、より高いHI力価を誘導した（図１０Ｂ）。
【０３３７】
AS03/2でアジュバント添加されたH5N1スプリットワクチンを用いて得られる応答と比較して、2倍全用量のAS03でアジュバント添加されたH5N1スプリットワクチンを用いる場合、有意により高いHI力価が観察された（4倍の差異についてはp=0.032）（図１０Ｂ）。
【０３３８】
2倍全用量のAS03若しくは全用量のAS03でアジュバント添加されたH5N1スプリットワクチンで免疫されたマウスにおいて、又はAS03/2若しくはAS03/5でアジュバント添加されたH5N1スプリットワクチンで免疫されたマウス間で、HI力価の統計学的有意差は観察されなかった（図１０Ｂ）。
【０３３９】
抗原用量間での比較（1.5μg又は0.38μg）
AS03/5でアジュバント添加された1.5μg HAスプリットH5N1で免疫されたマウスが2倍全用量のAS03でアジュバント添加された0.38μg HAスプリットH5N1で免疫されたマウスよりも有意に低い（p＝0.01）HI力価を示したことを除いて、AS03、AS03/2又はAS03/5でアジュバント添加されたそれぞれのHA用量のH5N1スプリットワクチンで免疫されたマウス間で、HI力価の統計学的有意差は観察されなかった（図１０）。
【０３４０】
VII.2.3. 細胞性免疫応答
三価の季節性インフルエンザワクチンにより誘導される細胞性免疫応答を評価するため、1株あたり1μgのスプリット抗原のHAをCD4 T細胞の再刺激のために使用した。一価H5N1インフルエンザワクチンと同じ再刺激条件を維持するため、この実験では3μgの一価スプリット抗原のHAを使用した。この濃度はまた、種々のアジュバントを区別するために最適であることが示されている。結果を図１１に提供する。
【０３４１】
各用量のH5N1スプリットワクチン（1.5又は0.38μg）で、アジュバント無添加H5N1スプリットワクチンで免疫されたマウスと比較して、様々な用量のAS03でアジュバント添加されたH5N1スプリットワクチンで免疫されたマウスにおいて、より高いCD4+ T細胞応答が観察された。
【０３４２】
1.5μgのH5N1スプリットワクチン用量で、AS03用量の減少はCD4+ T細胞頻度の低下に一致した（図１１Ａ）。しかしながら、0.38μgのH5N1スプリットワクチン用量で、AS03でアジュバント添加されたH5N1スプリットワクチンで免疫されたマウスにおける異なるアジュバント用量間でCD4+ T細胞応答の差異は観察されなかった。
【０３４３】
VII.3. 結果及び結論のまとめ
マウスにおける免疫原性試験により、アジュバント添加されたH5N1スプリットワクチンは、アジュバント無添加のH5N1スプリットワクチンにより誘導されるものよりも、有意により高い液性応答（抗H5N1 ELISA及びHI力価）並びに細胞性応答（CD4+ T細胞）を誘導することが示された。
【０３４４】
1.5μg及び0.38μgのアジュバント添加されたH5N1スプリットワクチンで免疫されたマウス間で、セクションVII.2.2で述べた2つの群以外は、液性免疫応答について抗原用量応答効果は観察されなかったが、これは、このモデルにおいて用量応答効果を観察するためには、アジュバントの存在下で、より低用量のHAでも必要であることを示唆している。
【０３４５】
単味H5N1ワクチンと比較して、AS03アジュバント添加H5N1パンデミックワクチンを用いる場合、ナイーブなマウスにおいてCD4+ T細胞応答の強力な増加が観察された。0.38μgのH5N1スプリットワクチン用量をワクチン候補として用いる場合、AS03希釈液の影響は観察されなかったが、1.5μgのH5N1スプリットワクチンを少量のAS03でアジュバント添加した場合、CD4 T細胞応答の低下が観察された。
【０３４６】
以前に観察されたように、全用量のAS03又はAS03/2でアジュバント添加されたH5N1スプリットワクチン（いずれかの抗原用量）で免疫されたマウス間で、液性及び細胞性免疫応答の差異は観察されなかった。2倍全用量のAS03をワクチン製剤中で用いる場合、免疫応答のいくらかの増強が検出され、従って、AS03/5をワクチン製剤中で用いる場合、免疫応答の低下が検出された。
【０３４７】
全体として、ここで報告されたデータは、このワクチン製剤におけるこの新規アジュバント系の効力を支持している。
【０３４８】
実施例VIII−初回刺激された巨大白ブタにおけるアジュバント添加及びアジュバント無添加インフルエンザワクチンの前臨床評価
VIII.1. 実験設計及び評価項目
インフルエンザで初回刺激されたブタにおける実験を実施して、この水中油型アジュバントと共に製剤化されたAS03により誘導されたインフルエンザワクチンによる液性応答の増加を評価した。
【０３４９】
ヒトに近い動物モデルにおけるAS03の用量範囲を評価するために、ブタを用いた。ブタは、ごくわずかの例外を除いて、ヒトに生理学的に最も近いものとしてこの動物を確立する長い一覧の生物学的類似性を示す（Douglas R., 1972）。さらに、ブタにおけるインフルエンザ感染の徴候が一般的に観察される。
【０３５０】
VIII.1.1. 処理／群（表１９）
10匹の成体巨大白ブタの群を、全量200μlで鼻内に、三価全ホルマリン不活化インフルエンザウイルス（各株につき25μg HA）を用いて0日目に初回刺激した。初回刺激株は、ワクチン株と同種の株（25μg HA全不活化H1N1 A/New Caledonia/20/99、H3N2 A/Panama/2007/99及びB/Shangdong/7/97）からなっていた。28日後、全量500μlで筋肉内に、単回用量のワクチン候補をブタにワクチン接種した。ブタを、スプリット抗原のみ（三価スプリット単味）を含む製剤又は一定用量範囲のAS03（全量、1/2若しくは1/5）でアジュバント添加されたスプリット抗原を含む製剤で免疫した。免疫に用いた株は、H1N1 A/New Caledonia/20/99、H3N2 A/Panama/2007/99及びB/Shangdong/7/97ウイルス抗原（H1N1 A/New Caledonia/20/99、H3N2 A/Panama/2007/99株については15μg HA及び1回ヒト用量において17.5μgのB/Shangdong/7/97株）を含んでいた。
【０３５１】
群（10匹／群）：
【表１９】
2010524883.tif 000022
【０３５２】
VIII.1.2. ワクチン製剤の調製
三価スプリット／単味
Tween 80、Triton X100及びコハク酸ビタミンE（VES）のプレミックスを、750μg/mlのTween 80、110μg/mlのTriton X100及び100μg/mlのVESのワクチン中の最終濃度を達成するために調製する。プレミックス中で用いられる量は、株中でのそれらの含量を考慮に入れる。
【０３５３】
1回の500μl用量の製剤を、以下の順序に従って即時調製する：注射用水＋塩水バッファー（実施例IVに教示されたように調製された10倍濃縮PBS pH 7.4）＋プレミックス、室温で5分間磁気攪拌、＋15μg HA H1N1株、室温で10分間磁気攪拌、＋15μg HA H3N2株、室温で10分間磁気攪拌、＋17.5μg HA B型株、室温で15分間磁気攪拌。この製剤をその調製の終わりの後1時間以内に注射する。
【０３５４】
三価スプリット／AS03
Tween 80、Triton X100及びコハク酸ビタミンE（VES）のプレミックスを、750μg/mlのTween 80、110μg/mlのTriton X100及び100μg/mlのVESのワクチン中の最終濃度を達成するために調製する。プレミックス中で用いられる量は、株中でのそれらの含量を考慮に入れる。
【０３５５】
1回の500μl用量の製剤を、以下の順序に従って即時調製する：注射用水＋塩水バッファー（実施例IVに教示されたように調製された10倍濃縮PBS pH 7.4）＋プレミックス、室温で5分間磁気攪拌、＋15μg HA H1N1株、室温で10分間磁気攪拌、＋15μg HA H3N2株、室温で10分間磁気攪拌、＋17.5μg HA B型株、室温で15分間磁気攪拌、＋全用量AS03については250μlのSB62エマルジョン若しくは1/2用量のAS03については125μlのSB62エマルジョン若しくは1/5用量のAS03については50μlのSB62エマルジョン、室温で15分間磁気攪拌。この製剤をその調製の終わりの後1時間以内に注射する。
【０３５６】
VIII.1.3. 読み出し（表２０）
ワクチン接種に対する液性免疫応答を、鼻内初回刺激の前（0日目）、免疫の前（28日目）及び免疫の14日後に測定した（10匹のブタ／群）。血清サンプルを、血球凝集阻害（HI）試験により試験した。
【表２０】
2010524883.tif 000023
【０３５７】
VIII.2. 結果及び結論
VIII.2.1. 液性免疫
結果を図１２に提供する。アジュバントの希釈率に関わらず、AS03でアジュバント添加された三価スプリット製剤は、同種初回刺激のこのモデルにおいて、単味三価製剤よりも、全ての株に対してより強力なHI応答を誘導したが、3種全部の株について、統計学的有意差は常に達成されるわけではなかった。アジュバント用量効果は、株間でわずかな差異と共に観察された。B/Shangdongなどの免疫原性の低い株については、全用量のAS03でアジュバント添加された三価スプリットワクチンのみが、単味ワクチンと有意に異なっていた。全用量のAS03でアジュバント添加された三価スプリットワクチンと対照的に、少量のAS03は、単味ワクチンについて認められたものと比較して上記の3種の全部の株についてHI力価を増加させることができなかった。
【０３５８】
実施例IX ナイーブな初回刺激したC57Bl/6マウスにおけるアジュバント添加及びアジュバント無添加スプリット三価又は四価（第2のB型株を含有する）ワクチンの前臨床評価
IX.1.  実験設計と目的
この水中油型エマルジョンアジュバント（AS03又はAS03半用量）を用いて製剤したインフルエンザスプリット三価又は四価（第2のB型株を含有する）ワクチンにより誘導される液性免疫応答の増加を評価する目的で、ナイーブかつ初回刺激したマウスにおける実験を実施した。最近の単離体であるインフルエンザBウイルスの系統学的分析は、この遺伝子が1980年代半ばからB/Victoria/2/87様及びB/Yamagata/16/88様ウイルスと表される2つの抗原的に異なる系統に進化したことを実証した。これらの実験は、四価インフルエンザワクチン（QIV）中の第2のB型株の存在が液性免疫応答に与える影響を、三価インフルエンザワクチン（TIV）により誘導される応答と比較して評価した。
【０３５９】
IX.1.1.  処置／群（表２１）
これらの実験は、成熟雌性C57Bl/6のナイーブな10匹のマウス、又はワクチン株と比較して異種の株で初回刺激したマウスの群を用いて実施した。
【０３６０】
ナイーブなマウスは、0日及び28日に、三価又は四価インフルエンザワクチン候補を用いて、筋肉内に1000μlの全体積で免疫感作した。
【０３６１】
初回刺激したマウスは、最初、0日に三価ホルマリン不活化全インフルエンザウイルス（各株について5μgHA）による鼻腔内投与（20μl体積）を受けた。初回刺激株は、ワクチン中に含まれる株のドリフト変種（5μg HA全不活化H1N1A/Beijing/262/95、H3N2A/Wellington/1/04及びB/Brisbane/32/02）から成った。28日後、このマウスをワクチン候補の単一用量を用いて筋肉内に100μlの全体積でワクチン接種した。
【０３６２】
マウスは、TIV又はQIVだけを含有する製剤（単味ワクチン）、又はAS03の異なる用量（全用量又は半用量（1/2））をアジュバント添加したTIV若しくはQIVを含有する製剤を用いて免疫感作した。免疫感作に用いた株は、H1N1 A/New Caledonia/20/99、H3N2A/Wisconsin/52/05及びB/Shangdong/7/97（TIV及びQIVの両方に含まれるB/Victoria系統）を含み、QIVワクチンについてはB/Jiangsu/10/03（QIVにだけ含まれるB/Yamagata系統）（ヒト用量の1/10に対応する1.5μg/株）も含んだ。
【表２１】
2010524883.tif 000024
【０３６３】
IX.1.2.  ワクチン製剤の調製
TIV単味（アジュバント無添加）
100μl用量の調製：
10倍濃縮したPBSと、Tween 80、Triton X-100及びVESの前混合物（株中に存在する界面活性剤を考慮した量）とを注射用水に加える。製剤中の最終濃度は、Tween 80が354μg/ml、Triton X-100が52μg/ml、VESが47.37μg/mlである。5分間の磁石攪拌後、各株（H1N1、H3N2、B型株）の1.5μgを、それぞれの添加の間に10分間磁石攪拌して加える。次いで製剤を15分間攪拌する。pHをチェックする。注射は、製剤の終了後、その時間内に行う。
【０３６４】
TIV AS03又はAS03 1/2
100μl用量の調製：
10倍濃縮したPBSと、Tween 80、Triton X-100及びVESの前混合物（株中に存在する界面活性剤を考慮した量）とを、注射用水に加える。製剤中の最終濃度は、Tween 80が354μg/ml、Triton X-100が52μg/ml、VESが47.37μg/mlである。5分間の磁石攪拌後、各株（H1N1、H3N2、B型株）の1.5μgを、それぞれの添加の間に10分間磁石攪拌して加える。15分間の磁石攪拌後、SB62エマルジョンの25μl又は12.5μlを加える。次いで製剤を15分間攪拌する。pHをチェックする。注射は、製剤の終了後、その時間内に行う。
【０３６５】
QIV単味（アジュバント無添加）
100μl用量の調製：
10倍濃縮したPBSと、Tween 80、Triton X-100及びVESの前混合物（株中に存在する界面活性剤を考慮した量）とを、注射用水に加える。製剤中の最終濃度は、Tween 80が472μg/ml、Triton X-100が69.44μg/ml、VESが63.16μg/mlである。5分間の磁石攪拌後、各株（H1N1、H3N2、2種のB型株）の1.5μgを、それぞれの添加の間に10分間磁石攪拌して加える。次いで製剤を15分間攪拌する。pHをチェックする。注射は、製剤の終了後、その時間内に行う。
【０３６６】
QIV AS03又はAS03 1/2
100μl用量の調製物：
10倍濃縮したPBSと、Tween 80、Triton X-100及びVESの前混合物（株中に存在する界面活性剤を考慮した量）とを、注射用水に加える。製剤中の最終濃度は、Tween 80が472μg/ml、Triton X-100が69.44μg/ml、VESが63.16μg/mlである。5分間の磁石攪拌後、各株（H1N1、H3N2、2種のB型株）の1.5μgを、それぞれの添加の間に10分間磁石攪拌して加える。15分間の磁石攪拌後、SB62エマルジョンの25μl又は12.5μlを加える。次いで製剤を15分間攪拌する。pHをチェックする。注射は、製剤の終了後、その時間内に行う。
【０３６７】
IX.1.3.  読み取り（表２２）
ナイーブなマウスにおいては、最初の免疫感作後28日（D28 Post-I）及び第2の免疫感作後21日（D21 Post-II）の液性免疫応答を、1群当たり10匹のマウスについて、赤血球凝集阻害アッセイにより測定した（図１３）。
【０３６８】
初回刺激したマウスにおいては、初回刺激後28日（D28 Post-Prim）及び単一免疫感作後21日（D21 Post-Imm）の液性免疫応答を、1群当たり10匹のマウスについて、赤血球凝集阻害アッセイにより測定した（図１４）。
【０３６９】
単純化してこの実験の目的に焦点を合わせるため、B型株に対して誘導された液性免疫応答だけを記載した。
【表２２】
2010524883.tif 000025
【０３７０】
IX.2.  結果
IX.2.1.  ナイーブなマウスにおける液性免疫応答：HI力価
アジュバント添加したインフルエンザスプリットワクチンで免疫感作したナイーブなマウスは、アジュバント無添加のインフルエンザスプリットワクチンで免疫感作したマウスにおいて得られた応答と比較して、より高いHI力価を誘導した（図１３Ａ及びＢ）。
【０３７１】
アジュバントが（AS03又はAS03/2）のどちらであっても、アジュバント添加したTIV又はアジュバント添加したQIVで免疫感作したナイーブマウスは、B/Shangdong/7/97（TIV及びQIVの両方に含まれるB/Victoria様ウイルス）に対して類似のHI力価を誘導した（図１３Ａ）。
【０３７２】
アジュバントが（AS03又はAS03/2）のどちらであっても、アジュバント添加したQIVで免疫感作したナイーブマウスは、アジュバント添加したTIVで免疫感作したナイーブマウスにおいて観察されたHI力価の不在と比較して、B/Jiangsu/10/03（QIVにだけ含まれるB/Yamagata様ウイルス）に対してより高いHI力価を誘導した（図１３Ｂ）。
【０３７３】
IX.2.2.  初回刺激したマウスにおける液性免疫応答：HI力価
B/Victoria様ウイルスで初回刺激しかつアジュバント添加したインフルエンザスプリットワクチンで免疫感作したマウスは、アジュバント無添加のインフルエンザスプリットワクチンで免疫感作したマウスで得られた応答と比較して、より高いHI力価を誘導した（図１４Ａ及びＢ）。
【０３７４】
アジュバントが（AS03又はAS03/2）のどちらでも、Victoria様ウイルスで初回刺激しかつアジュバント添加したTIV又はアジュバント添加したQIVで免疫感作したマウスは、B/Shangdong/7/97ウイルス（TIV及びQIVの両方に含まれるB/Victoria様ウイルス）に対して類似のHI力価を誘導した（図１４Ｂ）。
【０３７５】
アジュバントが（AS03又はAS03/2）のどちらでも、Victoria様ウイルスで初回刺激しかつアジュバント添加したQIVで免疫感作したマウスは、アジュバント添加したTIVで免疫感作したナイーブマウスにおいて観察されたHI力価の不在と比較して、B/Jiangsu/10/03（QIVにだけ含まれるB/Yamagata様ウイルス）に対してより高いHI力価を誘導した（図１４Ｂ）。
【０３７６】
IX.3.  結果の総括と結論
アジュバント添加した（AS03又はAS03/2）TIV又はQIVワクチンを用いて免疫感作した、ナイーブなマウス又はB/Victoria様ウイルスで初回刺激したマウスは、ワクチンに含まれるホモ型B/Victoria様ウイルス又は同じB/Victoria系統に属するヘテロ亜型ウイルスに対して交差反応性を示した。アジュバント添加した（AS03又はAS03/2）TIVワクチンを用いて免疫感作した、ナイーブなマウス又はB/Victoria様ウイルスで初回刺激したマウスは、他の系統に属する異種亜型ウイルス（この実施例ではB/Yamagata様ウイルス）に対して、ワクチンに含まれるB型ウイルスと比較して、何の交差反応性も示さなかった。
【０３７７】
これらの実験は、B/Victoria系統とB/Yamagata系統の両方に属するB型ウイルスに対する交差反応性を誘導するためには、第2のB型株とアジュバント（AS03又はAS03/2）が必要であることを実証した。
【０３７８】
実施例X スプリットインフルエンザ抗原調製物とAS03アジュバント（Flu-LD-012）の様々な用量とを含有するワクチンによる、18〜64歳の集団における臨床試験
X.1.  はじめに
AS03アジュバントの様々な用量と共に筋肉内投与したGlaxoSmithKline Biologicalsの低用量インフルエンザ候補ワクチン（すなわち、株当たり5μgのHAを含有する）の免疫原性、安全性及び反応原性を、対照として用いたFluarixTM（GlaxoSmithKline Biologicals）と比較して評価する目的で、フェーズIIのランダム化比較単純盲研を18〜64歳齢の成人集団について2007年に実施した。
【０３７９】
X.2.  研究設計
5群の被験者（1群当たり200人）は次のワクチンの筋肉内投与を並行して受けた：
-FluLD1/1：AS03の1/1用量をアジュバント添加したインフルエンザワクチンの5μgHA/株
-FluLD1/2：AS03の1/2用量をアジュバント添加したインフルエンザワクチンの5μgHA/株
-FluLD1/4：AS03の1/4用量をアジュバント添加したインフルエンザワクチンの5μgHA/株
-FluLD1/8：AS03の1/8用量をアジュバント添加したインフルエンザワクチンの5μgHA/株
-FluarixTM15μgHA/株の1回全用量を受ける被験者200人の1群。
【０３８０】
スケジュール：0日にインフルエンザワクチンの1回の筋肉内注射、ワクチン接種後0日、21日、及び180日に血液サンプル採集。
【０３８１】
この研究に用いた標準三価スプリットインフルエンザワクチンのFluarixTMは、GlaxoSmithKline Biologicalsが開発しかつ製造した2007/2008年北半球の市販ワクチンである。
【０３８２】
X.2.  研究目的
X.2.1.  主要な目的：免疫原性
ワクチン接種後21日に全被験者において、AS03（1/1、1/2、1/4、1/8用量のAS03）をアジュバント添加した低用量インフルエンザワクチンのFluarixに対する免疫学的非劣性（immunological non-inferiority）（GMT）を実証することである。
【０３８３】
観察変数：
0日及び21日：全被験者における、3種のワクチン株のそれぞれに対する、血清赤血球凝集阻害（HI）抗体力価。
【０３８４】
誘導変数：
0日及び21日におけるHI抗体力価の幾何平均力価（GMT）。
【０３８５】
X.2.2.  二次的な目的
・液性免疫応答を、AS03（1/1、1/2、1/4、1/8用量のAS03）をアジュバント添加した低用量インフルエンザワクチン及びFluarixにより誘導される抗赤血球凝集素（HI）抗体力価として、ワクチン接種後21日に全被験者において評価すること。 
・AS03（1/1、1/2、1/4、1/8用量のAS03）をアジュバント添加した低用量インフルエンザワクチン及びFluarixにより誘導されるHI抗体の持続性を、ワクチン接種後180日に全被験者において評価すること。 
・AS03（1/1、1/2、1/4、1/8用量のAS03）をアジュバント添加した低用量インフルエンザワクチン及びFluarixにより誘導される細胞媒介性免疫応答を、インフルエンザ特異的CD4/CD8 Tリンパ球の頻度として、0、21及び180日に被験者のサブセットにおいて評価すること。 
・液性免疫応答を、AS03（1/1、1/2、1/4、1/8用量のAS03）をアジュバント添加した低用量インフルエンザワクチン及びFluarixにより誘導される中和抗体力価として、0、21及び180日に被験者のサブセットにおいて評価すること。 
・AS03（1/1、1/2、1/4、1/8用量のAS03）をアジュバント添加した低用量インフルエンザワクチン及びFluarixの安全性と反応原性を、全研究期間中、全被験者において評価すること（7日間の応答型徴候のフォローアップ、21日間の非応答型徴候のフォローアップ、6カ月間の重篤な有害事象及び医療上有意な症状のフォローアップ）。
【０３８６】
液性免疫応答についての観察変数：
・0、21及び180日において：全被験者における、3種のワクチン株のそれぞれに対する血清赤血球凝集-阻害（HI）抗体力価。  
・0、21及び180日において：被験者のサブセットにおける、ワクチンに表される3種のインフルエンザ株のそれぞれに対して別々に試験した中和抗体力価。
【０３８７】
誘導変数：
・0、21及び180日におけるHI抗体力価の幾何平均力価
・21日における血清変換率*
・21日における血清変換係数**
・0及び21日における血清防御率***
*血清変換率は、ワクチン接種前力価＜1：10及びワクチン接種後力価≧1：40、又はワクチン接種前力価≧1：10及び少なくともワクチン接種後力価の4倍増加を有する、ワクチンレシピエントのパーセントとして定義される。  
**血清変換係数は、0日と比較したワクチン接種後の血清HI GMTの増加倍率として定義される。  
***血清防御率は、ワクチン接種後に通常、防御を示すと容認される血清HI力価≧1：40を有するワクチンレシピエントのパーセントとして定義される。
【０３８８】
CMI応答に対する観察変数（被験者のサブセットにおける）：
・0、21及び180日における：
−少なくとも2つの異なるシグナル分子（IL-2、IFN-γ、TFN-α及びCD40L）を産生する試験における、106細胞当たりのサイトカイン陽性CD4/CD8細胞の頻度。  
−少なくともCD40Lと他のシグナル分子（IL-2、IFN-γ、TFN-α）を産生する試験における、106細胞当たりのサイトカイン陽性CD4/CD8細胞の頻度。  
−少なくともIL-2と他のシグナル分子（CD40L、IFN-γ、TFN-α）を産生する試験における、106細胞当たりのサイトカイン陽性CD4/CD8細胞の頻度。  
−少なくともTFN-αと他のシグナル分子（IL-2、IFN-γ、CD40L）を産生する試験における、106細胞当たりのサイトカイン陽性CD4/CD8細胞の頻度。  
−少なくともIFN-γと他のシグナル分子（CD40L、IL-2、TFN-α）を産生する試験における、106細胞当たりのサイトカイン陽性CD4/CD8細胞の頻度。
【０３８９】
誘導変数：
各試験に対する、0、21、180日における、特異的インフルエンザCD4/CD8Tリンパ球の幾何平均（GM）。
【０３９０】
X.2.3.  さらなる目的：
・液性免疫応答を、ワクチン異種HI力価（ドリフト株に対する血清赤血球凝集阻害（HI）抗体力価）として、0、21及び180日に被験者のサブセットにおいて評価すること。  
・液性免疫応答を、ワクチン異種中和抗体力価（交差反応性インフルエンザ特異的ウイルス株（ドリフト株））として、0、21及び180日に被験者のサブセットにおいて評価すること。  
・CMI応答を、交差反応性インフルエンザ特異的CD4/CD8Tリンパ球（異種株）（ドリフト株又は保存されたインフルエンザエピトープ）の頻度として、0、21及び180日に被験者のサブセットにおいて評価すること。
【０３９１】
誘導変数及び判定基準（血清防御、血清変換率及び血清変換係数）は先に記載の通りである。
【０３９２】
X.3.  ワクチン組成物と投与
X.3.1. ワクチン調製物
本研究で使用されるAS03アジュバント添加低用量インフルエンザワクチンは、AS03アジュバントを添加した3種の異なるスプリット不活化インフルエンザ抗原の等量（すなわち3×5μg HA）の液体混合物である。これは、0.5ml/用量の体積で予め満たしたガラス製（I型）シリンジに入った単回用量ワクチンとして提示される。AS03アジュバントを添加した低用量インフルエンザ候補製剤は次の株を含有した：
・A/Solomon Islands/3/2006（H1N1）様株：A/Solomon Islands/03/2006（IVR-145）、
・A/Wisconsin/67/2005（H3N2）様株： A/Wisconsin/67/2005（NYMCX）-161B、
・B/Malaysia/2506/2004様株：B/Malaysia/2506/2004。
【０３９３】
ワクチンは、1用量当たり各インフルエンザウイルス株の5μg赤血球凝集素（HA）を、アジュバント系AS03の全用量、半用量、1/4用量又は1/8用量と組み合わせて含有した。インフルエンザ抗原は、エマルジョンとの単純な混合によりアジュバント系の水相に組み入れられる。
【０３９４】
ワクチンは、薬物の製造プロセスに由来する次の残留物を含有する：製造プロセスの初期段階からのチメロサール、オボアルブミン、スクロース、ホルムアルデヒド及びデオキシコール酸ナトリウム、及び残余レベルのチメロサール（1用量当たり＜1μg）。不活化スプリットビリオン抗原の3種の一価バルクの生産は、市販FluarixTMワクチンの製造プロセスに従って実施する。これは、第III.4.1.2節に説明した通りに行う。分割（スプリッティング）をデオキシコール酸ナトリウムで行った後に、不活化ステップをホルムアルデヒドを用いて行う。
【０３９５】
X.3.2.  ワクチン組成物
FluLDの1用量（AS03の全、半用量、1/4用量又は1/8用量）は0.5mlに相当する。その組成を表２３に示す。1用量当たりのHA含量は、全製剤について約5μgであり、唯一の相違は最終容器中に存在するAS03の量である。
【表２３】
2010524883.tif 000026
【０３９６】
X.3.3.  AS03アジュバント添加ワクチン組成物の調製
抗原調製物（「中間体バルク」）：  Tween 80、Triton X-100及びVESを、中間体バルク中の最終濃度がそれぞれ952.5μg/mL、130.9μg/ml及び119.1μg/mLとなる量だけ、PBS mod Na/K（132.7mM NaCl、2.7mM KCl、1.1mM MgCl2、7.26mM Na2HPO4、2.72mM KH2PO4、pH 7.2）に加える。15〜45分間攪拌後、35.71μgのHA H1N1株/ml、36.90μgのHA H3N2株/mL及び39.29μgのHA B型株/mlをそれぞれ加える。
【０３９７】
アジュバント添加ワクチン：  PBS mod Na/K（132.7mM NaCl、2.7mM KCl、1.1mM MgCl2、7.26mM Na2HPO4、2.72mM KH2PO4、pH 7.2）を注射用水に加え、0.5mL/ヒト用量の最終体積とする。15〜45分間攪拌後、いわゆる「中間体バルク」のある体積を加え、15〜45分間混合する。次いで、PBS mod 20×濃縮物（2.74M NaCl、54mM KCl、142.8mM Na2HPO4、26mM KH2PO4、pH 6.8）を加え、15〜45分間混合する。このPBS mod 20×濃縮物はAS03エマルジョンに用いたものと同じ組成であるので、加える量はAS03用量の関数であり、エマルジョン含量が低下してもワクチンのイオン組成を一定に保つように計算される。最後に、エマルジョンの所要量（31.25又は62.5又は125又は250μl/用量）を加え、15〜45分間混合して、表２３に記載した最終目標値に到達する。
【０３９８】
X.4.  免疫原性結果−液性免疫応答
X.4.1  HI幾何平均力価（GMT）
HI抗体のGMT（95％ CI）を表２４と図１５に示す。HI抗体に対するGMT（95％ CI）／年齢群（18〜49歳及び50〜64歳）を表２５に示す。
【表２４】
2010524883.tif 000027
【表２５】
2010524883.tif 000028
2010524883.tif 000029
【０３９９】
中間的結論
A/Solomon Island（H1N1）については、GMTは全研究群について同じ範囲であった。全てのアジュバント添加群は、全株及び全年齢カテゴリーについてFluarix群に劣らない。A/Wisconsin（H3N2）については、AS03濃度低下とともに免疫応答低下の傾向が示されたものの、統計的に有意差はなかった。B/MalaysiaについてもAS03濃度低下とともに免疫応答低下の傾向がみられたが、FluLD1/2とFluLD1/8で誘導されたGMTの間にだけ統計的有意差が示された（図１５を参照）。
【０４００】
同様の結果は、データを年齢群により分析した場合に見られた。しかしB/Malaysiaについては、若い年齢群（18〜49歳）においてFluLD1/2で誘導されたGMTがFluLD1/4で誘導されたものより統計的に有意に高かった。
【０４０１】
X.4.2  抗HI抗体力価の血清変換係数、血清防御率及び血清変換率（ヒトにおいてインフルエンザワクチンに対して確立された防御との相関）
結果を、血清防御率については表２６及び２６−図１６、血清変換率については表２８及び２９−図１７Ａ及び１７Ｂ、並びに変換係数については表３０及び３１−図１７に示す。
【表２６】
2010524883.tif 000030
【表２７】
2010524883.tif 000031
2010524883.tif 000032
【０４０２】
中間的結論
SPRは、全群及び全3株について、CHMP（平均＞70）及びFDA判定基準（95％CIのLL＞70）に適合する。SPRは全群について同じ範囲内にあることを示した。
【表２８】
2010524883.tif 000033
【表２９】
2010524883.tif 000034
【０４０３】
中間的結論
SCRは、全研究ワクチン及び全3株に対するCHMP（平均＞40）及びFDA判定基準（95％CIのLL＞40）に適合する。B/Malaysia（全結果が同じ範囲内にあることを示した）を除いて、AS03濃度低下とともに免疫応答低下の傾向が示された。A/Solomon Islandについては、FluLD1/1は、FluLD1/8と比較して、統計的に有意に高いSCRを誘導した。全群について、FluLD1/2とFluLD1/4により誘導されたSCRは同じ範囲内にあった。
【表３０】
2010524883.tif 000035
【表３１】
2010524883.tif 000036
【０４０４】
中間的結論
全研究ワクチンについて、SCFは全3株に対するCHMP判定基準を遥かに超えた（＞2）。SCFは全研究ワクチンについて、同じ範囲内にあった。
【０４０５】
X.4.3  Fluarixと比較したアジュバント添加低用量ワクチンの非劣性（GMT）
Fluarixと比較したアジュバント添加低用量ワクチンの非劣性（GMT）を、3種のウイルスについて、21日におけるGMT比として表３２に示す。
【表３２】
2010524883.tif 000037
【０４０６】
中間的結論
FluLD 1/1、1/2、1/4は全3株が、Fluarixに対してGMT比として非劣性であることが示された。FluLD 1/8は、H1N1及びH3N2株についてはFluarixに対して非劣性であるが、B型株についてはそうでないことが示された。
【０４０７】
X.5.  全体的結論
X.5.1  安全性結論
本発明のアジュバント添加ワクチンについて、市販Fluarixワクチンで示されたのと比較して、より高い反応原性が示された。アジュバント添加ワクチンについて、ASO3の量の低下とともに、反応原性の低下する傾向が示された。全体として、FluDL1/4とFluDL1/8について、類似した反応原性プロファイルが得られた。非応答型徴候は全ワクチン群について同じであった。
【０４０８】
X.5.2 免疫原性の結論
この研究の主要な目的は、D21におけるFluarixに対するLDワクチン製剤の非劣性（GMT）を評価することであった。アジュバント添加ワクチンFluDL1/1、FluDL1/2、及び FluDL1/4の1用量によるワクチン接種後21日における全3株に対するGMT比は、Fluarixで得たものに対して非劣性であることが示された。この研究において、ワクチンFluDL1/8について得たGMT比は、H1N1及びH3N2株については非劣性であるが、B型株に対してはそうでないことが示された。アジュバント量の低下と共に示された免疫応答の低下傾向にも関らず、全ワクチンは、全株について、規制認可のための全3つのCHMP判定基準に適合することが示された。
【０４０９】
実施例XI スプリットインフルエンザ抗原調製物と様々なアジュバントを含有するワクチンによる、65歳以上の集団における臨床試験
XI.1.  はじめに
高齢者におけるFluarixTMなどの古典的スプリットインフルエンザワクチンの効果は、成人又は若年者集団におけるよりも有意に低い。免疫系の老化（すなわち免疫老化）は、高齢者にみられる効果の相対的な欠如の原因であることが示唆され、従って、より強い免疫応答を刺激することによるワクチン改善の余地が残されている。そこで、フェーズIIのランダム化比較単盲検を、65歳以上の高齢者集団において2007年に実施し、筋肉内投与した8種の異なるアジュバント製剤によるインフルエンザ候補ワクチンの免疫原性、安全性及び反応原性を、対照として用いたFluarixTM（GlaxoSmithKline Biologicals）と比較して評価した。
【０４１０】
1用量当たり水中油型エマルジョンと25μgの3D-MPLを含むアジュバント添加インフルエンザワクチンは既に試験されていて、有効であることが証明されている（WO2006/100111号）。その研究においては、各成分の量が水中油型エマルジョンの250μl及びMPLの25μgに固定されていた。本研究は、観察される反応原性／安全性プロファイルの達成と免疫原性プロファイルの達成とをバランスをとる最適なワクチン製剤を決定することを目的とする。
【０４１１】
XI.2.  研究設計と目的
10群の被験者（65歳以上で1群当たり200人、18〜40歳のFluarix YNG群を除く）に並行して次のインフルエンザワクチンを筋肉内に投与した：
・FluAS03 1/1：o/w型エマルジョンの全用量（AS03 1/1）を用いてアジュバント添加したワクチン
・FluAS03 1/2：o/w型エマルジョンの1/2用量（AS03 1/2）を用いてアジュバント添加したワクチン
・FluAS03 1/4：o/w型エマルジョンの1/4用量（AS03 1/4）を用いてアジュバント添加したワクチン
・FluAS25 1/1：25μg MPL＋o/w型エマルジョンの全用量（AS25A）を用いてアジュバント添加したワクチン
・FluAS25 1/2：25μg MPL＋o/w型エマルジョンの1/2用量（AS25B）を用いてアジュバント添加したワクチン
・FluAS25 1/4：25μg MPL＋o/w型エマルジョンの1/4用量（AS25C）を用いてアジュバント添加したワクチン
・FluAS50 1/2：50μg MPL＋o/w型エマルジョンの1/2用量（AS25E）を用いてアジュバント添加したワクチン
・FluAS50 1/4：50μg MPL＋o/w型エマルジョンの1/4用量（AS25F）を用いてアジュバント添加したワクチン
・Fluarix ELD（≧65歳）：FluarixTM
・Fluarix YNG（18〜40歳）：FluarixTM。
【０４１２】
スケジュール：0日にインフルエンザワクチンの1回の筋肉内注射、ワクチン接種後0日、21日、及び180日に血液サンプル採集。この研究に用いた標準三価スプリットインフルエンザワクチンのFluarixTMは実施例Xで使用したものと同じである。ワクチン製剤を表３１〜３２に記載する。
【０４１３】
XI.2.1.  主要な目的：免疫原性
主要な目的は、65歳以上の被験者に筋肉内に与えたアジュバント添加インフルエンザワクチンの最適な製剤（1回のo/w型エマルジョン投与量と1回のMPL投与量の組み合わせ）を、ワクチン接種後21日に3種のワクチン株に対する免疫原性（GMT）に基づいて、Fluarixと比較して同定することである。変数は実施例X.2.1の通りで、65歳以上の被験者に対する前記変数（21日におけるHI抗体力価及びHI抗体力価のGMT）である。
【０４１４】
X.2.2.  二次的な目的は次を評価することである：
・インフルエンザワクチンでワクチン接種した全被験者における安全性及び反応原性。  
・全被験者における、ワクチン接種後21日のインフルエンザワクチンの免疫原性（GMT、SCF、SCR及びSPR）。  
・全被験者における、初回ワクチン接種後180日のHI抗体の持続性。  
・（被験者のサブセットだけに対して）、0、21及び180日に少なくとも2種のサイトカイン（IFN-γ、IL-2、CD40L、又はTNF-α）を産生するインフルエンザ特異的CD4/CD8 Tリンパ球の頻度としての、インフルエンザワクチンにより誘導される細胞介在性免疫（CMI）応答。
【０４１５】
観察した及び誘導した変数（及び定義）は実施例Xに記載の通りである。
【０４１６】
XI.3.  ワクチン組成物と投与
アジュバント添加したインフルエンザワクチンは、1992年以後、GSK Bio.が販売した市販のFluarixワクチンに基づく。候補製剤は、三価スプリットビリオン、すなわち3種の一価ウイルスの抗原バルク（それぞれ2007/2008年、北半球に対して推奨されたインフルエンザA/H1N1株、A/H3N2株及びB型株から調製した；実施例Xを参照）から構成される不活化インフルエンザ抗原と、MPL及び／又は水中油（o/w）型エマルジョンに基づくアジュバント系との組み合わせから成る。
【０４１７】
GSK Bio所有のアジュバント系の2つのファミリーがその試みで試験される：
・アジュバント添加ワクチンのヒト1用量当たりエマルジョン量によりカテゴリー分類したASO3ファミリー（1/1 - 1/2 - ・・・）；
・MPLを補充し、アジュバン添加ヒトワクチンのヒト1用量当たり各成分量によりカテゴリー分類した水中油型エマルジョンのAS25ファミリー（A、B、...）。
【０４１８】
XI.3.1.  ワクチン組成物
孵化した雌ニワトリの卵中で個々に増殖させた3種のインフルエンザウイルス株、A型（H1N1及びH3N2）及びB型の実験シード株（seed）から調製したスプリット不活化ビリオン抗原の3種のモノバルクの生産は、既に記載の通りである（実施例Xを参照）。臨床ロットは、1用量当たり各インフルエンザウイルス株の15μg赤血球凝集素（HA）を含有する。インフルエンザ抗原を、3-O-脱アシル-4'-モノホスホリルリピドA（MPL）及び／又は水中油（o/w）型エマルジョンAS03を用いてアジュバント添加した。ASの8通りの異なる製剤をスプリットビリオンインフルエンザ抗原と組み合わせることにした。アジュバントの調製方法はWO 2006/100111号の実施例IIに記載の方法から改変し、個々の成分の量は表３１及び３２に示す情報に従って適合させた。賦形剤は次の通りである：ポリソルベート80（Tween-80）、オクトキシノール10（Triton(登録商標)X-100）、α-トコフェリル水素コハク酸塩、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム、及び注射用水。アジュバント添加インフルエンザワクチンの異なる製剤は保存剤を含まない製剤である。しかし、これらは生体への負荷を減ずるために加えられる医薬物質製造プロセスの初期段階からの痕跡量のチオメルサール（1用量当たり＜1.25μgのHg）を含有する。
【０４１９】
注射用のアジュバント添加インフルエンザワクチンは、アジュバントが添加された、スプリット精製インフルエンザウイルスの白っぽい無菌エマルジョンである。これは、抗原を含有するI型ガラス製バイアル（懸濁液）及びアジュバントを含有する予め充填したI型ガラス製シリンジ（PFS）（エマルジョン）から成る2成分ワクチンとして提供される。ワクチンは2〜8℃にて貯蔵される。注射時に、抗原を予め充填したシリンジの内容物を、濃縮三価不活化スプリットビリオン抗原を含有するバイアル中に注射する。内容物を混合した後にシリンジ中に吸い出し、その針を筋肉内注射針と交換する。再構成したアジュバント添加インフルエンザ候補ワクチンの1用量は0.7mLに対応する（表３３及び３４）。
【表３３】
2010524883.tif 000038
【表３４】
2010524883.tif 000039
【０４２０】
XI.3.2.  ワクチン調製物
AS03製剤は、リン酸バッファー（Na/K 191.4 mM P043-、2.74 mM NaCl、54 mM KCL、pH 6.8、9.57 mM P043-に調節）を注射用水で希釈することにより調製する（15〜45分間、室温で均一になるまで攪拌する）。次いで、適当な量の水中油型エマルジョンバルクを加える。混合物を15〜45分間、室温で攪拌し、pHを測定する。次いで混合物を0.2μm膜を通して濾過により滅菌する。無菌の不活性ガス（窒素）を最小限1分間流し、充填した容器中に不活性ガスの頭部空間を作る。1.25mlの無菌I型（Ph.Eur.）ガラスシリンジ中に無菌充填するまで、無菌AS03アジュバントは+2〜8℃にて貯蔵する。各シリンジは60μlの体積超過（280μl+60μl過充填）を含有する。
【０４２１】
AS25製剤は、リン酸塩バッファーを注射用水で希釈することにより調製する（15〜45分間室温にて均一になるまで攪拌する）。次いで、SB62バルクとMPL液体バルクの適当量を加える。残りの手順は前記の通りである。
【０４２２】
再構成したアジュバント添加インフルエンザワクチンの1用量は0.7mLに相当する。最終HA濃度は、三価最終バルク1mL当たり各一価バルク21.4μgである。抗原（Ag）の最終バルクを3mlガラスバイアルに充填するが、三価インフルエンザ抗原の1用量は0.42mlの体積に相当する。アジュバント最終バルクを1.25mlガラスPFSに充填するが、1用量は0.28mlの体積に相当する。再構成後の最終ワクチン用量は0.7mlであろう。
【０４２３】
再構成後に名目上の体積（0.7mL）を注射できるように、各Agバイアルに0.51mlの目標体積を充填し、各ASシリンジに0.34mlの目標体積を充填する。
【０４２４】
XI.4.  免疫原性結果−液性免疫応答
XI.4.1  HI幾何平均力価（GMT）
95％CIでのHI抗体に対するGMTを、表３５及び図１９に示す。
【表３５】
2010524883.tif 000040
2010524883.tif 000041
【０４２５】
中間的結論
AS03の全用量及びMPL（AS25_1_1）の25μgを用いてアジュバント添加したインフルエンザワクチンは、年齢≧65歳の被験者において、Fluarixと比較して、B/Malaysia 株に対し統計的に有意に優れたHI応答を誘導する。他の2種の株については、AS03の用量の1/8によるものを除く全てのアジュバント添加したワクチンは、本研究で、年齢≧65歳の被験者において、Fluarixに十分比較しうるものであった。
【０４２６】
XI.4.2  抗HI抗体力価の血清変換係数、血清防御率及び血清変換率（ヒトにおいてインフルエンザワクチンに対して確立される防御と相関がある）
結果を、血清防御率は表３６と図２０（株当たり1枚のシート）に、血清変換率は表３７と図２１に、血清変換係数は表３８と図２２に表す。
【表３６】
2010524883.tif 000042
2010524883.tif 000043
【表３７】
2010524883.tif 000044
【表３８】
2010524883.tif 000045
【０４２７】
液性免疫応答に対する中間的結論
AS03（水中油型エマルジョン）の明確な用量効果がHIデータに見られる。
【０４２８】
GMTは、A/Solomon Islands株（AS03_1_4及びAS50_1_4を除く）及びA/Wisconsin株については、Flu_ELD群と比較して、アジュバント添加インフルエンザワクチン群において統計的に有意に高かった。B/Malaysia 株については、GMTが、Flu_ELD 群と比較して、AS25_1_1 群において統計的に有意に高かった。H3N2株（A/Wisconsin）については、エマルジョンの1/4量を用いた群を除く全てのアジュバント添加インフルエンザワクチン群において、液性応答が、若年の成人に見られるレベルへ高まる。
【０４２９】
SCRは、A/Solomon Islands株（AS25_1_4及びAS50_1_4を除く）及びA/Wisconsin株については、Flu_ELD群と比較して、アジュバント添加インフルエンザワクチン群において、統計的に有意に高かった。B/Malaysia株については、SCRが、Flu_ELD群と比較して、AS25_1_1群において統計的に有意に高かった。
【０４３０】
XI.5.  細胞介在性免疫応答の分析
プールしたワクチン株で再刺激した細胞について、0日及び21日における、少なくとも2種のサイトカイン（全て二重）を産生するインフルエンザ特異的CD4 T細胞の頻度を、表３９及び図２３に示した。
【表３９】
2010524883.tif 000046
2010524883.tif 000047
【０４３１】
細胞介在性免疫応答についての中間的結論
5種のアジュバント添加したワクチン（AS03_1_1、AS03_1_2、AS25_1_1、AS50_1_2及びAS50_1_4）は、年齢が65歳以上の被験者において、Fluarixと比較して、全てのサイトカイン組み合わせについて、個々の差（D21-D0）として、プールした株に対する有意に高いCMI応答を誘導した。これらのアジュバント添加ワクチンのうちの3種（AS03_1_1、AS03_1_2 及び AS25_1_1）はまた、若年の成人において、Fluarixと比較して、全てのサイトカイン組み合わせについて、個々の差（D21-D0）として、プールした株に対する有意に高いCMI応答を誘導した。
【０４３２】
XI.6.  反応原性
局所徴候
ワクチン接種後7日間に、応答型局所的徴候（いずれかのグレード／グレード3）を報じる被験者のパーセントを、定量化しうる徴候についてEMEA及びFDA等級付けを用いて評価した。
【０４３３】
EMEA等級付け：斑状出血（いずれかの等級[＞0mm]及び等級3[＞50mm]）；疼痛（いずれかの等級）；等級3疼痛；発赤（いずれかの等級[＞0mm]及び等級3[＞50mm]）及び腫脹（いずれかの等級[＞0mm]）；等級3腫脹（＞50mm）。FDA等級付け：斑状出血（いずれかの等級[≧25mm]及び等級3[＞100mm]）、等級3発赤（＞100mm）；等級3腫脹（＞100mm）、発赤（いずれかの等級[≧25mm]）；腫脹（いずれかの等級[≧25mm]）。
【０４３４】
全般的徴候
EMEA等級付け：熱（≧37.5℃）、等級3熱（＞39.0℃）。FDA等級付け：熱（≧38℃）及び等級3熱（＞40℃）。
【０４３５】
ワクチン接種後7日（0〜6日）間に報じられたいずれかの及び3等級の応答型及び非応答型徴候の全体的な出現と性質を図２４に掲げる。
【０４３６】
結論
少なくとも1つの全身的症候を報じる被験者のパーセントは、アジュバント添加インフルエンザワクチン群において、Flu_ELD群と比較して、統計的に有意に高かったが、Flu_YNG群（AS03_1_4を除いて）については同じ範囲であった。  
少なくとも1つの3等級の全身的徴候を報じる被験者のパーセントは、全群について同じ範囲である。  
少なくとも1つの局所的症候を報じる被験者のパーセントは、Flu_ELD群と比較してアジュバント添加インフルエンザワクチン群において、及びFlu_YNG群と比較してAS25_1_1群において、統計的に有意に高かった。  
少なくとも1つの3等級の局所的徴候を報じる被験者のパーセントは、AS03_1_1、AS25_1_2、AS25_1_1及びAS50_1_2群において、Flu_ELD及びFlu_YNG群と比較して、統計的に有意に高かった。
【０４３７】
XI.7.  全体的結論
これらのデータは、ヒト集団において免疫応答／有害効果の適当なバランスをとるために重要である。  
HI免疫原性としての明確なアジュバント効果が実証され、特に、H1N1及びH3N2について、全てのアジュバント投与量で有意な増加が見られた。有意な増加は、B型株について、主にAS25 1/1で得られたが、AS03 1/1、AS03 1/2及びAS50 1/2でも得られた。用量-効果が、アジュバントの水中油型エマルジョン成分で、また、アジュバントのMPL成分についても示されたが、後者は前者ほど明確ではなかった。  
細胞介在性免疫応答としてのアジュバント効果も実証され、高齢者において、プールした株に対して、AS03 1/1、AS03 1/2、AS25 1/1及びAS50 1/2について、Fluarixと比較して有意差（頻度、全尺度）があった。最高の応答はAS25 1/1、AS03 1/1及びAS03 1/2により得られた。
【０４３８】
反応原性については、アジュバント添加ワクチンは、ワクチンの水中油型エマルジョン成分と、またそれほど顕著ではないが存在するMPLの用量効果とも関係して、Fluarixより反応原性が高い。AS03 1/2はAS03 1/1より反応原性が低い一方、この高齢者集団において満足な免疫原性プロファイルを示す。
【図１】
2010524883.tif 000048
【図２】
2010524883.tif 000049
【図３】
2010524883.tif 000050
【図４】
2010524883.tif 000051
【図５−１】
2010524883.tif 000052
2010524883.tif 000053
【図５−２】
2010524883.tif 000054
2010524883.tif 000055
【図６】
2010524883.tif 000056
【図７】
2010524883.tif 000057
【図８】
2010524883.tif 000058
【図９−１】
2010524883.tif 000059
【図９−２】
2010524883.tif 000060
【図９−３】
2010524883.tif 000061
【図１０】
2010524883.tif 000062
【図１１−１】
2010524883.tif 000063
【図１１−２】
2010524883.tif 000064
【図１２】
2010524883.tif 000065
【図１３】
2010524883.tif 000066
【図１４】
2010524883.tif 000067
【図１５】
2010524883.tif 000068
【図１６】
2010524883.tif 000069
【図１７】
2010524883.tif 000070
【図１８】
2010524883.tif 000071
【図１９−１】
2010524883.tif 000072
【図１９−２】
2010524883.tif 000073
【図２０−１】
2010524883.tif 000074
【図２０−２】
2010524883.tif 000075
【図２１】
2010524883.tif 000076
【図２２】
2010524883.tif 000077
【図２３】
2010524883.tif 000078
【図２４】
2010524883.tif 000079
【配列表】
2010524883000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年2月19日(2009.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルス抗原又は抗原調製物と水中油型エマルジョンアジュバントとを組み合わせて含むヒトの使用に好適な用量体積のインフルエンザ免疫原性組成物であって、該アジュバントが、（i）ヒト1用量当たり5〜6mgのスクアレン、2〜3mgの乳化剤、及び5〜7mgのトコールを含むアジュバント；（ii）ヒト1用量当たり2〜3mgのスクアレン、1〜1.5mgの乳化剤、及び2.5〜3.5mgのトコールを含むアジュバント；（iii）ヒト1用量当たり0.5〜1.5mgのスクアレン、0.25〜0.75mgの乳化剤、及び0.5〜1.5mgのトコールを含むアジュバントからなる群より選択される、前記インフルエンザ免疫原性組成物。
【請求項２】
前記乳化剤が非イオン系界面活性剤である、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記乳化剤がモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン若しくはトリオレイン酸ソルビタン又は両方の混合物である、請求項2に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンがポリソルベート80又はTween(登録商標)80からなる群より選択され、トリオレイン酸ソルビタンがSpan85である、請求項3に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記トコールがα-トコフェロールである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記アジュバントがさらにステロールを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記ステロールがコレステロールである、請求項6に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記ステロールがヒト1用量当たり0.025〜2.5、0.05〜1.5、0.075〜0.75、0.1〜0.3、又は0.125〜0.25mg（例えば0.2〜0.3、0.1〜0.15、0.25又は0.125mg）の量で存在する、請求項6又は7に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
アジュバントがさらに、TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-7、TLR-8、TLR-9又はそれらの組み合わせから選択されるTLRリガンドを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記TLR-4リガンドが、リピドA誘導体、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（AGP）、並びにER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680、及びER804764からなる群より選ばれる化合物、から選択される、請求項9に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記リピドA誘導体が3D-MPL又はリピドAの合成誘導体である、請求項10に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記TLR-4リガンドがヒト1用量当たり5〜60、40〜50、10〜50、20〜30、5〜15、10、20、30、40又は50μgの量で存在する、請求項10又は11に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
アジュバントがさらにサポニン又はその誘導体を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記サポニン又はその誘導体がQS21である、請求項13に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記サポニンがヒト1用量当たり5〜60、40〜50、10〜50、20〜30、5〜15、10、20、30、40又は50μgの量で存在する、請求項13又は14に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記ウイルス抗原又は抗原調製物が、ヒト1用量当たり、インフルエンザ株当たり15μg又は15μg未満のHAである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記ウイルス抗原又は抗原調製物が、ヒト1用量当たり、インフルエンザ株当たり10μg未満、8μg未満、4μg未満、2μg未満のHA、1μg未満のHA、0.5μg未満、0.1μg未満のHAである、請求項16に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記ウイルス抗原又は抗原調製物が、ヒト1用量当たり、インフルエンザ株当たり2〜7.5μg、又は1〜5μgのHAである、請求項16又は17に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記ウイルス抗原又は抗原調製物が、ヒト1用量当たり、インフルエンザ株当たり正確に5μgのHA若しくはそれ未満、又は正確に2.5μg若しくはそれ未満、又は正確に1μg若しくはそれ未満である、請求項16〜18のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記組成物が、パンデミック発生に関与しているか又はパンデミック発生に関与する可能性を有する少なくとも1種のインフルエンザ株由来のウイルス抗原又は抗原調製物を含む一価組成物である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、又は少なくとも5種のインフルエンザ株由来のウイルス抗原又は抗原調製物を含む多価組成物である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
前記組成物が、少なくとも3種のインフルエンザ季節性（パンデミック間期の）株に由来するウイルス抗原又は抗原調製物、並びに、任意に、パンデミック発生に関与しているか又はパンデミック発生に関与する可能性を有する少なくとも1種のインフルエンザ株に由来するウイルス抗原又は抗原調製物を含む、請求項21に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記多価組成物が、（i）H1N1及びH3N2からなる群より選ばれる2種のパンデミック間期のA型株、並びにB/yamagata及びB/Victoriaからなる群より選ばれる2種のB型株；（ii）H1N1及びH3N2からなる群より選ばれる3種のパンデミック間期のA型株、並びにB/yamagata及びB/Victoriaからなる群より選ばれる1種のB型株；（iii）H1N1及びH3N2からなる群より選ばれる2種のパンデミック間期のA型株、H5N1である1種のパンデミックA型株、並びにB/yamagata及びB/Victoriaからなる群より選ばれる1種のB型株、からなる群より選択されるウイルス抗原又は抗原調製物を含む、請求項21又は22に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
前記パンデミックインフルエンザウイルス株がH5N1、H9N2、H5N8、H5N9、H7N4、H7N7、H2N2、H10N7、H5N2、H7N2、H7N1、及びH7N3からなる群より選択される、請求項20、22〜23のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
前記インフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物が卵で又は細胞培養物で増殖させたインフルエンザウイルス由来のものである、請求項1〜24のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
前記インフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物が全ウイルス、スプリットウイルス、ビロソーム、又はHA、NA、M1、M2から選ばれる1種以上の精製された抗原を含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
前記精製された抗原が哺乳動物、鳥類又は昆虫細胞で増殖させたインフルエンザウイルスから調製される、請求項26に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
前記精製された抗原が遺伝子組換えで作製される、請求項26又は27に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
前記ヒト用量が0.5ml又はそれ未満、0.5〜1.5ml、0.2〜1.2ml、0.2〜0.7ml、及び正確に0.25、0.5、0.7若しくは1ml又はそれら未満から選択される、請求項1〜28のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
水中油型エマルジョンの第1の体積とインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を含む水性懸濁液の第2の体積とを混合するステップを含み、第1の体積が第2の体積より大きい、請求項1〜29のいずれか1項に記載のアジュバント添加インフルエンザワクチンを調製する方法。
【請求項３１】
実質的に等しい体積の水中油型エマルジョンとインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を含む水性懸濁液とを混合するステップを含む、請求項1〜29のいずれか1項に記載のアジュバント添加インフルエンザワクチンを調製する方法。
【請求項３２】
水中油型エマルジョンの第1の体積とインフルエンザウイルス又はその抗原調製物を含む水性懸濁液の第2の体積とを混合するステップを含み、第2の体積が第2の体積より大きい、請求項1〜29のいずれか1項に記載のアジュバント添加インフルエンザワクチンを調製する方法。
【請求項３３】
水中油型エマルジョンを希釈した後、得られる希釈したエマルジョンを前記インフルエンザ水性懸濁液と混合するステップを含む、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項16〜29のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス抗原成分又はインフルエンザウイルス抗原調製物成分を含み、さらに同時又は逐次投与のための請求項1〜15のいずれか一項に記載のアジュバントを含むワクチンキット。
【請求項３５】
請求項1〜29のいずれか一項に記載の免疫原性組成物及び製薬上許容される賦形剤を含むワクチン。
【請求項３６】
請求項1〜29のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を製薬上許容される賦形剤と混合するステップを含む、請求項35に記載のワクチンを製造する方法。
【請求項３７】
請求項1〜29のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又は請求項35に記載のワクチンの免疫防御用量をヒト宿主に投与するステップを含む、インフルエンザ感染により引き起こされる疾患に対してヒト宿主を免疫感作する方法。
【請求項３８】
ヒト宿主が18〜50歳の成人、18〜65歳の成人、65歳以上の高齢者又は0〜18歳の小児であり、疾患が季節性又はパンデミックインフルエンザ感染のいずれか又は両方である、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
ヒト宿主が高齢者であり、疾患が季節性又はパンデミックインフルエンザ感染のいずれか又は両方である、請求項37又は38に記載の方法。
【請求項４０】
医薬における使用のための、請求項1〜29のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又は請求項35に記載のワクチン。
【請求項４１】
インフルエンザ感染により引き起こされる疾患の治療又は予防における使用のための、請求項1〜29のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又は請求項35に記載のワクチン。
【請求項４２】
インフルエンザ感染により引き起こされる疾患を治療又は予防するための免疫原性組成物の製造における、（a）インフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物、及び（b）請求項1〜15のいずれかに規定した水中油型エマルジョンの使用。
【請求項４３】
前記組成物が、ヒトにおいて、次の応答：（i）アジュバント無添加組成物により得られる応答と比較して、前記抗原又はその抗原調製物に対する改善されたCD4 T細胞免疫応答、（ii）アジュバント無添加組成物により得られる応答と比較して、前記抗原又はその抗原調製物に対する改善された液性免疫応答、（iii）アジュバント無添加組成物により得られる応答と比較して、前記抗原又はその抗原調製物に対する改善されたB記憶細胞応答、の少なくとも1つ、又は少なくとも2つ又は全てを誘導することができる、請求項42に記載の使用、又は請求項41に記載の使用のための組成物。
【請求項４４】
前記組成物が、ヒトにおいて、次の応答：（i）アジュバント成分がより高い量で存在するアジュバント添加組成物により得られる応答と比較して、前記抗原又はその抗原調製物に対する同等のCD4 T細胞免疫応答、（ii）アジュバント成分がより高い量で存在するアジュバント添加組成物により得られる応答と比較して、前記抗原又はその抗原調製物に対する同等の液性免疫応答、（iii）アジュバント成分がより高い量で存在するアジュバント添加組成物により得られる応答と比較して、前記抗原又はその抗原調製物に対する同等のB記憶細胞応答、の少なくとも1つ、又は少なくとも2つ又は全てを誘導することができる、請求項42に記載の使用、又は請求項41に記載の使用のための組成物。
【請求項４５】
前記CD4 T細胞免疫応答が交差反応性CD4 Tヘルパー応答の誘導に関わる、請求項42〜44のいずれか一項に記載の使用又は使用のための組成物。
【請求項４６】
前記液性免疫応答が交差反応性液性免疫応答の誘導に関わる、請求項42〜44のいずれか一項に記載の使用又は使用のための組成物。
【請求項４７】
免疫原性組成物中の抗原が由来する病原菌の変種であるインフルエンザ病原菌により引き起こされる疾患の治療又は予防における使用のための、請求項1〜29のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又は請求項35に記載のワクチン。
【請求項４８】
免疫原性組成物中の抗原が由来する病原菌の変種であるインフルエンザ病原菌により引き起こされる疾患の治療又は予防のための免疫原性組成物の製造における、（a）インフルエンザウイルス抗原又はその抗原調製物、及び（b）請求項1〜15のいずれか一項に規定される水中油型エマルジョンの使用。
【請求項４９】
免疫原性組成物中の抗原の変種である抗原を含む病原菌により引き起こされる感染又は疾患に対する防御のための、請求項43〜44のいずれか一項に記載の使用又は使用のための組成物。
【請求項５０】
請求項1〜29のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又は請求項35に記載のワクチンで先にワクチン接種した個体にワクチン再接種するための、インフルエンザ免疫原性組成物。
【請求項５１】
請求項1〜29のいずれか一項に記載の免疫原性組成物又は請求項35に記載のワクチンで先にワクチン接種した個体にワクチン再接種するための、免疫原性組成物の製造における抗原の使用。
【請求項５２】
ワクチン再接種用の組成物が先のワクチン接種に使用した組成物の抗原と共通のCD4 T細胞エピトープを有するインフルエンザ抗原を含む、請求項50〜51のいずれか一項に記載の使用又は使用のための組成物。
【請求項５３】
ワクチン再接種用の抗原又は抗原性組成物がアジュバント添加されたものである、請求項50〜52のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５４】
ワクチン再接種組成物のための水中油型エマルジョンが請求項1〜15のいずれか一項に規定された通りである、請求項53に記載の使用。
【請求項５５】
疾患が、65歳以上の高齢者、18〜50歳若しくは18〜65歳の成人、0〜18歳の小児からなる群より選択されるヒト宿主又はヒト集団の季節性又はパンデミックインフルエンザ感染のいずれか若しくは両方である、請求項41〜54のいずれか一項に記載の使用。
【国際調査報告】
2010524883.tif 000080
2010524883.tif 000081
2010524883.tif 000082
2010524883.tif 000083