(57)【要約】ＧＤＦ−１１よりもミオスタチンと優先的に結合し、ミオスタチンに対する強い結合アフィニティを有し、化学分解への抵抗性を示す、抗ミオスタチンモノクローナル抗体。本発明の抗体は、哺乳類及び鳥類の骨密度の増加、筋肉量の増加、又は様々な障害の治療若しくは予防にとり有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＤＦ−１１よりもミオスタチンと優先的に結合する抗ミオスタチンモノクローナル抗体であって、ミオスタチンと約３×１０−８Ｍ以下の親和性で結合し、４℃で１年、２５℃で６ヵ月、３７℃で２ヵ月及び４０℃で４週からなる群から選択される時間及び温度条件下で抗体溶液に存在させたとき、少なくともモノクローナル抗体の９５％が切断されない、モノクローナル抗体。
【請求項２】
ミオスタチンと約９×１０−１０Ｍ以下の親和性で結合する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏミオスタチン／ＳＢＥアッセイにおいて、約２５ｎＭの以下のＩＣ５０を示す、請求項１又は２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
該抗体溶液が、１ｍｇ／ｍＬの該抗体、１０ｍＭのリン酸（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する、請求項１から３のいずれか１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
ＡＮＹＣＳＧＥＣＥＦＶＦＬＱＫＹＰＨＴＨＬＶＨＱＡ（配列番号２９）、及びＣＳＧＥＣＥＦＶＦＬＱＫＹＰＨ（配列番号３０）、からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する、請求項１から４のいずれか１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
配列番号１１の配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、配列番号４、５、６、及び７からなる群から選択される配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を有してなる、抗ミオスタチンモノクローナル抗体。
【請求項７】
配列番号１２の配列を有するＨＣＶＲ、及び配列番号９及び１０からなる群から選択される配列を有するＬＣＶＲを有してなる、抗ミオスタチンモノクローナル抗体。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか１項記載の抗ミオスタチンモノクローナル抗体であって、該抗体がＨＣＶＲとＬＣＶＲを有してなり、
該ＨＣＶＲが、
配列番号２３の配列のＣＤＲＨ１のペプチド、
配列番号２５の配列のＣＤＲＨ２のペプチド、及び
配列番号２７の配列のＣＤＲＨ３のペプチドを有してなり、
該ＬＣＶＲが、
配列番号１３の配列のＣＤＲＬ１のペプチド、
配列番号１４の配列のＣＤＲＬ２のペプチド、及び
配列番号１６、１７、１８及び１９からなる群から選択される配列のＣＤＲＬ３のペプチドを有してなる、該モノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１から５のいずれか１項記載のモノクローナル抗体であって、該抗体がＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを有してなり、
該ＨＣＶＲが、
配列番号２４の配列のＣＤＲＨ１のペプチド、
配列番号２６の配列のＣＤＲＨ２のペプチド、及び
配列番号２８の配列のＣＤＲＨ３のペプチドを有してなり、
該ＬＣＶＲが、
配列番号１３に示す配列のＣＤＲＬ１のペプチド、
配列番号１４の配列のＣＤＲＬ２のペプチド、及び
配列番号２１及び２２からなる群から選択される配列のＣＤＲＬ３のペプチドを有してなる、該モノクローナル抗体。
【請求項１０】
ヒトのフレームワーク領域を有してなる、請求項８又は９記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
定常領域を有してなり、該定常領域が、ヒトのゲノム、又は家畜、競技用動物及び食用動物からなる群から選択される動物のゲノムに由来する、請求項６から１０のいずれか１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
配列番号３２の配列の軽鎖、及び配列番号３３の配列を有する重鎖を有してなる、抗ミオスタチンモノクローナル抗体。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項記載の抗体、及び薬理学的に許容できる担体を含有する組成物。
【請求項１４】
治療用の、請求項１から１２のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１５】
患者の筋肉量を増加させるための薬剤の製造への、請求項１から１２のいずれか１項記載の抗体の使用。
【請求項１６】
筋萎縮、虚弱、加齢に伴う筋肉減少、不使用性萎縮及び悪液質から選択される１つ以上の症状の治療又は予防用薬剤の製造への、請求項１から１２のいずれか１項記載の抗体の使用。
【請求項１７】
本発明の抗ミオスタチンモノクローナル抗体の治療的有効量を投与するステップを有してなる、患者の筋萎縮、虚弱、加齢に伴う筋肉減少、不使用性萎縮及び悪液質の治療方法。
【請求項１８】
本発明の抗ミオスタチンモノクローナル抗体の予防的有効量を投与するステップを有してなる、患者の筋萎縮、虚弱、加齢に伴う筋肉減少、不使用性萎縮及び悪液質の予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この特許出願は、２００６年９月５日に出願の米国仮特許出願第６０／８２４４９８号の優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は医学分野、具体的には抗ミオスタチンモノクローナル抗体に関する。より詳細には本発明は、ＧＤＦ−１１よりもミオスタチンと優先的に結合して、タンパク質分解に対して抵抗性を示す抗ミオスタチンモノクローナル抗体、並びに哺乳類及び鳥類の様々な障害若しくは症状の治療、予防又は診断用の抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ミオスタチン（また成長分化因子−８（ＧＤＦ−８）と呼ばれる）はＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質のメンバーであり、他のＴＧＦ−βファミリーとの構造類似性を有する。ミオスタチンは主に発生中の、及び成人における骨格筋において発現し、また骨格筋の負の調節因子として機能する。ミオスタチンは、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化、並びに間接的に、ブドウ糖ホメオスタシス及び骨形成の阻害などの他の生理的プロセスに関与しうる。
【０００４】
ＧＤＦ−１１又はＢＭＰ−１１と呼ばれる成長分化因子−１１は、ミオスタチンとの相同性が最も高いＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーのタンパク質である。成熟型のヒトミオスタチン及びＧＤＦ−１１のアミノ酸配列は約９０％の相同性を有するが、ＧＤＦ−１１はミオスタチンより広範囲の組織（筋肉及び脂肪組織、並びに歯髄、脳、心臓、腎臓及び肺など）において発現する。ヒトＧＤＦ−１１は、多分化能を有する前駆細胞が明確に異なる神経子孫細胞を生産する能力を維持している期間中に、側頭窓を支配することが最近報告されている。
【０００５】
他のＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質（特にＧＤＦ−１１）の活性の阻害を最小限にしつつ、ミオスタチン活性を特異的に阻害することに対する、治療的ニーズが存在する。更に、サンプル中のミオスタチン濃度をより正確にモニター又は測定するために、他のＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質（特にＧＤＦ−１１）との交差反応が最小である、抗ミオスタチン抗体に対する診断的ニーズが存在する。ＧＤＦ−１１よりもミオスタチンと優先的に結合する抗ミオスタチン抗体は、国際公開第２００５／０９４４４６号において開示されている。ＧＤＦ−１１よりもミオスタチンと優先的に結合するヒト化モノクローナル抗体は、国際公開第２００７／０４４４１１号において開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００５／０９４４４６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７／０４４４１１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
治療用抗体は通常、様々な分解反応（例えば脱アミド化又は切断）を受けやすく、かかる反応はｉｎ  ｖｉｖｏで、又は製造、製剤化、貯蔵及び治療用に使用する間に生じうる。例えば、抗体又は他のポリペプチド中のアスパラギン（Ａｓｎ）残基は特に加水分解の影響を受けやすい。すなわち、ＧＤＦ−１１よりもミオスタチンと優先的に結合し、ミオスタチンに対する強い結合アフィニティ（すなわち約３×１０−８Ｍ以下）を示し、化学的な分解に対する抵抗性を示す、抗ミオスタチン抗体に対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の抗体はＧＤＦ−１１よりもミオスタチンと優先的に結合する。すなわち、それらはミオスタチンと比較し、ＧＤＦ−１１との顕著な反応性を有しない。本発明の抗体は、従来技術の方法、例えば競争的ＥＬＩＳＡ、又はをＢＩＡＣＯＲＥ若しくはＫＩＮＥＸＡアッセイによる測定において、ＧＤＦ−１１との結合と比較し、少なくとも２、３、５、１０、２０、２２又は２５倍ミオスタチンと結合し、すなわち当該抗体が、ＧＤＦ−１１よりもＧＤＦ−８に対して高い親和性（すなわち低いＫＤ）を示す。最も好ましくは、本発明の抗体は、使用する結合アッセイのバックグラウンドレベルを上回る程にＧＤＦ−１１と結合しない。
【０００９】
本発明は、成長因子−１１（ＧＤＦ−１１）よりもミオスタチンと優先的に結合する抗ミオスタチンモノクローナル抗体の提供に関する。該抗体は、ミオスタチンと約３×１０−８Ｍ以下の親和性で結合し、該モノクローナル抗体の少なくとも９５％が、抗体溶液中で、４℃で１年間、２５℃で６ヵ月間、３７℃で２ヵ月間又は４０℃で４週間分解されない。典型的な抗体溶液は、１ｍｇ／ｍＬの本発明の抗体、１０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する。好ましくは、本発明の抗体は更に、本願明細書の実施例４に記載されているｉｎ  ｖｉｔｒｏミオスタチン／ＳＢＥレポーターアッセイで、２５ｎＭ未満のＩＣ５０を有することを特徴とする。
【００１０】
一実施形態では、本発明の抗体は化学的な分解に対する抵抗性を示し、すなわち、抗体溶液中で、４℃で１年、２５℃で６ヵ月、３７℃で２ヵ月及び４０℃で４週、からなる群から選択される温度及び時間において、抗体の１００％、９９％、９８％、９７％、９６％又は９５％が切断されない。好適な上記温度及び時間は、４０℃で４週間である。
【００１１】
一実施形態では、本発明の抗体は更に、成熟ミオスタチン中の、アミノ酸４０−６４［ヒト：ＡＮＹＣＳＧＥＣＥＦＶＦＬＱＫＹＰＨＴＨＬＶＨＱＡ（配列番号２９）］、４３−５７［ヒト：ＣＳＧＥＣＥＦＶＦＬＱＫＹＰＨ（配列番号３０）］、又は４５−５９［ヒト：ＧＥＣＥＦＶＦＬＱＫＹＰＨＴＨ（配列番号３１）］のドメイン内において、ミオスタチンとの結合性を示すことを特徴とする。他の実施形態では、本発明の抗体は更に、成熟ミオスタチンのアミノ酸４０−６４、４３−５７又は４５−５９からなるポリペプチドとの結合性を示すことを特徴とする。
【００１２】
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１１に示す配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号４、５、６及び７からなる群から選択される配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を有してなる。他の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号１２に示す配列を有するＨＣＶＲ、並びに配列番号９及び１０からなる群から選択される配列を有するＬＣＶＲを有してなる。
【００１３】
一実施形態では、本発明の抗体はＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを有してなり、該ＨＣＶＲは、配列番号２３の配列を有するＣＤＲＨ１のペプチド、配列番号２５の配列を有するＣＤＲＨ２のペプチド、及び配列番号２７の配列を有するＣＤＲＨ３のペプチドを有してなり、該ＬＣＶＲは、配列番号１３に示す配列を有するＣＤＲＬ１のペプチド、配列番号１４の配列を有するＣＤＲＬ２のペプチド、及び配列番号１６、１７、１８及び１９からなる群から選択される配列を有するＣＤＲＬ３のペプチドを有してなる。
【００１４】
他の実施形態では、本発明の抗体はＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを有してなり、該ＨＣＶＲは、配列番号２４の配列を有するＣＤＲＨ１のペプチド、配列番号２６の配列を有するＣＤＲＨ２のペプチド、及び配列番号２８の配列を有するＣＤＲＨ３のペプチドを有してなり、該ＬＣＶＲは、配列番号１３に示す配列を有するＣＤＲＬ１のペプチド、配列番号１４の配列を有するＣＤＲＬ２のペプチド、及び配列番号２１及び２２からなる群から選択される配列を有するＣＤＲＬ３のペプチドを有してなる。
【００１５】
一実施形態では、本発明の抗体は更に定常領域を有してなり、該定常領域は、ヒトゲノム、又は家畜、競技用動物及び食用動物からなる群から選択される動物のゲノムに由来する。より好ましい態様では、本発明の抗体は、配列番号３２に示すアミノ酸配列を有する軽鎖、並びに配列番号３３に示すアミノ酸配列を有する重鎖を有してなる。
【００１６】
本発明の他の実施形態は、本発明の抗体を含有する組成物（例えば医薬組成物）の提供に関する。本発明の組成は、薬理学的に許容できる担体を更に含有してもよい。該組成物において、本発明の抗体は有効成分として機能する。好ましくは、該組成物は本発明の抗ミオスタチン抗体の均一又は実質的に均一な集合物を含有する。治療若しくは予防用の上記組成物は無菌状態であり、凍結乾燥されていてもよく、好ましくは適当な希釈剤と混合されている。
【００１７】
本発明は、動物、好ましくは哺乳類又は鳥類、好ましくはヒトの患者において、少なくとも１つのミオスタチンの生物学的活性を阻害する方法の提供に関し、当該方法は、該哺乳類又は鳥類に、治療的有効量又は予防的有効量の本発明の抗ミオスタチンモノクローナル抗体を投与するステップを有してなる。本発明は更に、筋肉重量を増加させる方法、又はミオスタチン生物活性を中和若しくはアンタゴナイズすることによって改善される疾患若しくは障害若しくは症状を、治療若しくは予防する方法の提供に関し、当該方法は、かかる治療若しくは予防を必要とする患者（例えばヒト）に、治療的若しくは予防的有効量の本発明の抗体を投与するステップを有してなる。
【００１８】
本発明は、本発明の抗体の治療的用途の提供に関する。
【００１９】
本発明はまた、筋萎縮、虚弱、加齢に伴う筋肉減少、不使用性萎縮及び悪液質の治療用薬剤の調製への、本発明の抗体の使用に関する。
【００２０】
本発明はまた、筋萎縮、虚弱、加齢に伴う筋肉減少、不使用性萎縮及び悪液質の予防用薬剤の調製のための、本発明の抗体の使用に関する。
【００２１】
本発明はまた、治療的有効量の本発明の抗体を投与することによって、哺乳類（好ましくはヒト）の患者の筋萎縮、虚弱、加齢に伴う筋肉減少、不使用性萎縮及び悪液質を治療する方法に関する。
【００２２】
本発明は、予防的有効量の本発明の抗体を投与することによって、哺乳類（好ましくはヒト）の患者の筋萎縮、虚弱、加齢に伴う筋肉減少、不使用性萎縮及び悪液質を予防する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】(Ａ)成熟型ヒトミオスタチン及びヒトＧＤＦ−１１のアミノ酸配列のアラインメント、並びにモノクローナル抗体５１０Ｃ２及びＣ１２及びそれらの変異体の抗原エピトープ（下線）を示す。抗原エピトープの中の太字は、ミオスタチンとＧＤＦ−１１との間で異なる残基を示す。(Ｂ)モノクローナル抗体５１０Ｃ２及びＣ１２、及びそれらの変異体が結合する抗原エピトープのリストを示す。
【図２】親モノクローナル抗体５１０Ｃ２及びＣ１２（並びに数個の変異体）のそれぞれの可変領域のアミノ酸配列（ＣＤＲ領域及びフレームワークを含む）を示す。ＣＤＲ領域を太字で示し、ＣＤＲ領域中の変異部位を下線で示す。
【図３】親モノクローナル抗体５１０Ｃ２及びＣ１２、並びに本発明の抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸配列アラインメントを示す。変異部位を太字及び下線で示す。
【図４】本発明のモノクローナル抗体（すなわちＮ９３Ｈ−Ｃ１２）の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列のリストを示す。
【図５】本発明の特定のモノクローナル抗体と、それらの親抗体との、ＥＬＩＳＡ測定による結合アフィニティの比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
本願明細書における用語「成熟ミオスタチン」（配列番号１参照（ヒト、マウス、ラット、チキン、シチメンチョウ、イヌ、ウマ及びブタなどの種））とは、タンパク質分解（例えばヒトの場合、３７５のアミノ酸のミオスタチンのプロタンパク質中のＡｒｇ２６６における切断）の後に生じるタンパク質のモノマー若しくはホモ二量体の形態のことを指す。本願明細書における用語「ミオスタチン」とは、特に明記しない限り成熟のミオスタチンのことを指す。
【００２５】
天然に存在する全長抗体は、相互にジスルフィド結合で結合した４つのペプチド鎖、すなわち２つの重（Ｈ）鎖（全長約５０〜７０ｋＤａ）、及び２つの軽（Ｌ）鎖（全長約２５ｋＤａ）を有してなる免疫グロブリン分子である。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０アミノ酸又はそれ以上からなる可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域である。
【００２６】
軽鎖はκ又はλに分類され、当業者に公知の定常領域を有することを特徴とする。重鎖の各タイプは公知の定常領域を有することを特徴とする。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４は、本発明の抗体の好適なアイソタイプである。各重鎖はN-末端重鎖可変領域（本発明における「ＨＣＶＲ」）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＡでは３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなり、ＩｇＭ及びＩｇＥでは４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本発明における「ＬＣＶＲ」）及び軽鎖定常領域CLからなる。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に再分割でき、それはフレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域中に散在している。各ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは３つのＣＤＲｓ及び４つのＦＲｓからなり、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて以下の順序で配列している：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４。本発明では、重鎖中の３つのＣＤＲｓを「ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３」と称し、軽鎖中の３つのＣＤＲｓを「ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３」と称する。ＣＤＲｓ中の大部分の残基が、抗原と特異的な相互作用を形成する。各ドメインに対するアミノ酸のアサインメントは、周知の慣例［Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）］に従い行う。抗体が特定の抗原と結合する機能は、６つのＣＤＲによって主に影響される。
【００２７】
本明細書で用いられる「抗体」（本発明に係る抗ミオスタチンモノクローナル抗体（又は単に「本発明のモノクローナル抗体」又は「本発明の抗体」））という用語は、モノクローナル抗体のことを指す。特に明記しない限り、本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」又は「Ｍａｂ」とは、キメラ抗体、ヒト化抗体又は全長ヒト抗体のことを指す。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は均一な又は実質的に均一な種類の集合物として存在する。本発明のモノクローナル抗体は、公知のハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、又はかかる公知技術の組合せ、又はその他の公知の技術を使用して容易に調製できる。「モノクローナル抗体」とは、例えば単一の真核生物、原核生物又はファージクローンなどの単一のコピー若しくはクローンに由来する抗体を指すが、それを作製する方法を指すものではない。「モノクローナル抗体」とは、全長抗体（完全又は全長Ｆｃ領域を有する）、実質的な全長抗体、又は抗原結合部（例えばキメラ、ヒト化若しくはヒト抗体のＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片又はＦ（ａｂ’）２断片））を有する抗体の部分若しくは断片であってもよい。
【００２８】
各軽／重鎖対の可変領域は抗体の抗原結合部位を形成する。すなわち、完全なＩｇＧ抗体は２つの結合部位を有する。二官能性若しくは二特異的な抗体を除き、２つの結合部位は同じである。本発明では、「抗原結合部分」又は「抗原結合領域」又は「抗原結合断片（フラグメント）」は同義的に用いられ、抗体分子の可変領域内の部分であって、抗原と相互作用し、その抗体に抗原に対する特異性及び親和性を与えるアミノ酸残基を有する部分のことを指す。当該抗体の抗原結合部分は、抗原結合残基の適当な立体構造を維持するために必要なフレームワークアミノ酸残基を有する。好ましくは、本発明の抗体のフレームワーク領域はヒト由来であるか、又は実質的にヒト由来（少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％ヒト由来）である。
【００２９】
更に、本発明の用語「モノクローナル抗体」は、リンカー配列を有するＬＣＶＲ及びＨＣＶＲをコードするＤＮＡを連結することによって、調製できる単鎖Ｆｖ断片であってもよい（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ  ２６９−３１５，１９９４を参照）。断片又は部分が特定されるか否かに拘わらず、本発明の用語「抗体」とは、かかる断片及び部分、並びに単鎖の形態のものを包含すると解される。当該タンパク質がその標的（すなわちエピトープ又は抗原）と特異的若しくは選択的に結合する能力を保持している限り、それらは用語「抗体」の範疇に包含される。
【００３０】
本明細書で用いられる「親」抗体とは、修飾抗体又は変異体の調製に使用するアミノ酸配列によってコードされるものである。親抗体は、げっ歯類のフレームワークを有してもよいが、好ましくはヒトのフレームワーク領域を有する。親抗体は、げっ歯類であるか、キメラであるか、ヒト化であるか、ヒト抗体でもよい。
【００３１】
本願明細書における「修飾」又は「変異」抗ミオスタチン抗体とは、親抗体配列中における１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失及び／又は置換によって、「親」抗ミオスタチン抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する分子のことを指す。好ましい一実施形態では、変異抗体は、親抗体と比較し、１つ以上のアミノ酸置換を可変領域内に有する。本発明の抗体（変異抗体）は、その親抗体が有する、ＧＤＦ−１１よりもミオスタチンと優先的に結合する能力を保持し、その親抗体と同様若しくはそれ以上のミオスタチンとの結合アフィニティを有し、親抗体より優れた安定性（すなわち化学的安定性）を有する。
【００３２】
「化学的安定性」とは、化学分解（例えばペプチド結合の切断（「切断」））に耐える能力のことを指す。本明細書で用いられる、化学分解に対して「耐性を有する」本発明の抗体は、親抗体と比較し、ペプチド結合の自発的な切断に対する抵抗性を有し、化学的安定性が向上している。好ましくは、本発明の抗体の１００％、９９％、９８％、９７％、９６％又は９５％が、抗体溶液中において、４℃で１年間、２５℃で６ヵ月間、３７℃で２ヵ月間又は４０℃で４週間、化学分解に対する抵抗性を示す（すなわち切断されない）。抗体溶液とは、抗体医薬組成物に使用する溶液のことである。好適な抗体溶液は、１ｍｇ／ｍＬの抗体、１０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．４）、及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する。
【００３３】
本願明細書において特に好適な修飾抗ミオスタチン抗体は、親抗体よりも向上した化学的安定性を有する抗ミオスタチンモノクローナル抗体である。当該抗体は詳細には、親抗体内のＡｓｎ−Ｐｒｏジペプチド中の反応を受けやすいＡｓｎ残基が、好ましくは天然アミノ酸残基で置換され、より好ましくはヒスチジン（Ｈ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）又はアルギニン（Ｒ）残基で置換されることにより排除されている。更に、かかる修飾抗体は、ＧＤＦ−１１よりも優先的にミオスタチンと結合し、約３×１０−８Ｍ未満のミオスタチンとのＫＤを示すことを特徴とし、好ましくは更に、本願明細書の実施例４にて説明されるｉｎ  ｖｉｔｒｏミオスタチン／ＳＢＥレポーターアッセイで測定した場合、２５ｎＭ未満のＩＣ５０を有することを特徴とする。
【００３４】
本明細書で用いられる「反応を受けやすいＡｓｎ残基」という用語は、抗体、タンパク質又はポリペプチド中のアスパラギン残基であって、脱アミド化若しくはペプチド結合の分解がｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで自発的に生じる部位の当該残基のことを指す。
【００３５】
本明細書で用いられる「切断された」又は「切断」という用語は、抗体中のペプチド結合の切断のことを意味する。特に好適な切断部位は、抗体中のＡｓｎ残基のアミノ又はカルボキシル末端のいずれかである。抗体の切断により、タンパク質の安定性の減少、及び／又は活性の減少若しくは損失、又は抗体の結合アフィニティの損失が生じうる。切断を生じさせる自発的な修飾は、治療用製剤の調製中にｅｘ  ｖｉｖｏで生じ、医薬品の製造及び貯蔵に悪影響を与える。切断は、抗体の製造又は貯蔵の間にも、ｅｘ  ｖｉｖｏで発生しうる。更に、自発的な修飾はｉｎ  ｖｉｖｏで生じることもあり、タンパク質又は抗体の有効性及び活性期間に影響を及ぼしうる。しかしながら、切断部位におけるアミノ酸を単に他のアミノ酸で置換しても、抗体の望ましい生物活性（例えば結合アフィニティ又は中和活性）に負の影響が及ぶこともありうる。
【００３６】
用語「エピトープ」とは、抗体中の１つ以上の抗原結合領域を介して抗体により認識され、それと結合できる分子の部分のことを指す。エピトープは多くの場合アミノ酸又は糖側鎖などの、化学的に活性な表面分子団からなり、特異的な三次元構造の特徴及び特異的な荷電特徴を有する。
【００３７】
本発明の用語「エピトープ」とは、動物、好ましくは哺乳動物（例えばマウス又はヒト）において、抗原性及び／又は免疫原性を有する、ポリペプチドの部分を指す。本発明の用語「抗原エピトープ」は、当該技術分野において、周知の方法（例えば従来のイムノアッセイ）で測定した場合において、抗体が特異的に結合できるポリペプチドの部分と定義される。抗原エピトープは必ずしも免疫原性を有するわけではないが、免疫原性を有してもよい。本明細書で用いられる「免疫原性エピトープ」とは、動物の抗体反応を誘発するポリペプチド部分として定義される（例えばＧｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２（１９８３）などの公知の任意の方法で測定できる）。
【００３８】
本発明の抗体に関する「生物学的特性」、「生物活性」、「活性」又は「生物学的活性」とは、本願明細書において同義的に用いられ、例えば限定されないが、エピトープ／抗原への親和性及び特異性、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのミオスタチン活性の中和若しくはアンタゴナイズ能力、本願明細書の実施例４で示すミオスタチン／ＳＢＥレポーターアッセイ若しくは他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性アッセイにおけるＩＣ５０、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の安定性などが挙げられる。抗体が有する他の同定可能な生物学的特性としては、例えば交差反応性（すなわち、通常は標的ペプチドの非ヒトホモログ、又は他のタンパク質又は組織との交差反応性）、及び哺乳動物細胞におけるタンパク質の高発現レベルを維持させる能力が挙げられる。上述した特性又は特徴は、限定されないが、ＥＬＩＳＡ、競争的ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴分析、無制限ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ中和分析、受容体結合、ＢＩＡＣＯＲＥ若しくはＫＩＮＥＸＡ分析、サイトカイン又は成長因子の産生及び／又は分泌、ツメガエル未分化細胞(アニマル・キャップ)の発達、シグナル伝達及び免疫組織化学などの、ヒト、霊長類又は他の適切な供給源に由来する組織切片を用いた当業者に公知の技術を使用して観察、測定若しくはアッセイすることができる。
【００３９】
本発明の「ミオスタチン活性」という用語は、活性型ミオスタチンタンパク質に関連する１つ以上の生理的な成長調節活性若しくは形態形成活性のことを指す。例えば、活性型ミオスタチンは骨格筋重量の負の調節物質である。活性型ミオスタチンは筋肉特異的な酵素（例えばクレアチンキナーゼ）の産生の調節、筋芽細胞増殖の刺激、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化の調節もできる。
【００４０】
本発明の抗体の活性に関して本明細書で用いられる「阻害」又は「中和」という用語は、例えば限定されないが、生物学的活性などの進行又は重度を、実質的にアンタゴナイズ、阻害、妨害、遅延、抑制、崩壊、除去、停止、減速若しくは後退させる能力を指す。好ましくは、抗体がない場合と比較し、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上の活性が阻害又は中和される。
【００４１】
本発明で交換可能に用いられる「個人」、「被験者」及び「患者」とは、動物、好ましくは哺乳動物（非霊長類及び霊長類を含む）、又は鳥類のことを指し、例えばげっ歯類、サル、ヒト、哺乳類の家畜（例えばウシ、ブタ、ヒツジ）、哺乳類の競技用動物（例えばウマ）及び哺乳類のペット（例えばイヌ及びネコ）などが挙げられるがこれらに限定されず、好ましくはヒトのことを指す。当該用語は鳥類を指すこともあり、ニワトリ及び七面鳥が包含されるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、上記の患者（好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト）は更に、ミオスタチン濃度の減少又はその生物活性の低下により利益を得る疾患、障害若しくは症状を有することを特徴とする。他の実施形態では、上記の患者（好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト）は更に、ミオスタチンの濃度減少若しくは生物活性の減少により利益を受ける疾患、障害若しくは症状に罹患する危険性を有することを特徴とする。
【００４２】
抗体の特徴
本発明では、ＧＤＦ１１よりも優先的にミオスタチンと結合し、親抗体より安定で（すなわち親抗体より化学分解に対する抵抗性を有し）、なおかつ親抗体の場合におけるミオスタチンとの結合アフィニティが維持若しくは改善されている抗体を開示する。一実施形態では、親抗体（図２で示すモノクローナル抗体Ｃ１２又はモノクローナル抗体５１０Ｃ２）のＣＤＲＬ３の反応を受けやすいＡｓｎ残基が、異なるアミノ酸により置換されている。
【００４３】
本発明の抗体における好適なアミノ酸置換は、
（１）自発的な化学分解（すなわち切断又は脱アミド化）に対する感受性を低下させ、
（２）その親抗体が示す抗原−抗体結合アフィニティを維持する、置換である。好ましい実施形態では、モノクローナル抗体Ｃ１２のＣＤＲＬ３のＡｓｎ残基がＨ又はＲで置換される。他の好ましい実施形態では、モノクローナル抗体５１０Ｃ２のＣＤＲＬ３のＡｓｎ残基がＨ、Ｓ、Ｔ又はＡで置換される。
【００４４】
一実施形態では、本発明の抗体は自発的な化学分解に対する抵抗性を示し、抗体のすなわち１００％、９９％、９８％、９７％、９６％又は９５％が、抗体溶液中で、４℃で１年、２５℃で６ヵ月、３７℃で２ヵ月及び４０℃で４週、からなる群から選択される時間及び温度で、切断されない。抗体溶液は、抗体を含有する、医薬組成物に適するいかなる溶液であってもよい。典型的な抗体溶液は、１ｍｇ／ｍＬの抗体と、１０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．４）、及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する。
【００４５】
一実施形態では、本発明の抗体は更に、ミオスタチンとの強力な結合アフィニティ（ＫＤ）（すなわち約３×１０−８Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満又は１×１０−９Ｍ未満）を示すことを特徴とし、好ましくは約９×１０−１０Ｍ未満、８．７×１０−１０Ｍ未満、又はより好ましくは約８×１０−１１Ｍ未満を示す。あるいは、本発明の抗体は、ミオスタチンに対して約３×１０−８Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下又は９×１０−１０Ｍ以下、より好ましくは、約８．７×１０−１０Ｍ以下、最も好ましくは約８×１０−１１Ｍ以下のＫＤを示すことを特徴とする。本発明の抗体の結合アフィニティは、その親抗体のそれと同等であるか、それ以上である。
【００４６】
好ましくは、上記の通り強い結合アフィニティを特徴とする本発明の抗体はまた、本願明細書の実施例４にて説明したように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏミオスタチン／ＳＢＥレポーターアッセイにおいて、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ、１６ｎＭ、１４ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、６ｎＭ又は５．２ｎＭのＩＣ５０を有する。好ましくは、本発明の抗体のＩＣ５０は、その親抗体と同等であるか、それ以上である。本発明のすべての抗体は、ミオスタチンよりも、ＧＤＦ−１１との反応性が顕著に低い、すなわちＧＤＦ−１１よりもミオスタチンと優先的に結合する。
【００４７】
本発明の抗体は好ましくはキメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体、又はその抗原結合部分であり、好ましくは成熟型ミオスタチンのアミノ酸４０−６４の領域、又は、より好ましくは成熟型ミオスタチンのアミノ酸４３−５７及び／又は４５−５９の領域において、ミオスタチンと結合する。更に、本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでミオスタチンの生物学的活性を中和する。本発明の抗ミオスタチンモノクローナル抗体の特異的な結合によって、本発明の抗体がミオスタチン関連の症状、疾患又は障害、すなわちミオスタチン濃度を低下させるか又はミオスタチン生物学的活性をアンタゴナイズ若しくは阻害することから利益を得る症状、疾患又は障害の治療薬又は予防薬として使用できる。更に本発明の抗体は、ミオスタチンのレベル若しくは生物活性の変化により利益を得る症状、疾患又は障害の診断若しくはモニター、又はサンプル中のミオスタチン濃度の測定に使用できる。
【００４８】
本発明の抗ミオスタチンモノクローナル抗体は、成熟ミオスタチンのアミノ酸４０−６４（配列番号１、ヒト）の範囲内、好ましくは成熟ミオスタチンのアミノ酸４３−５７及び／又は４５−５９の範囲内で局所化することが解っている抗原エピトープと結合する。更に、本発明のミオスタチン免疫原性エピトープは、いかなる哺乳類又は鳥類の成熟ミオスタチンにおいても、成熟ミオスタチンのアミノ酸４０−６４（配列番号１、ヒト）の範囲内で、好ましくは成熟ミオスタチンのアミノ酸４３−５７及び／又は４５−５９の範囲内で局所化している。本発明の免疫原性エピトープには、抗原エピトープも包含される。更に、アミノ酸４０−６４の外側の更なるミオスタチン部分は抗原ドメインの立体構造に影響を及ぼし、それにより抗原エピトープへの本発明の抗体の結合性が変化し得る。
【００４９】
単鎖抗体、キメラ、ヒト化抗体、並びにキメラであるかＣＤＲを移植された単鎖抗体など（異なる種に由来する部分を有する）も、本発明及び用語「抗体」又は「修飾抗体」に包含される。これらの抗体の種々の部分は、従来技術によって、化学的に合成することが可能であり、又は遺伝子工学技術を使用して隣接タンパク質として調製することも可能である。例えば、キメラ又はヒト化鎖をコードする核酸を発現させて当該隣接タンパク質を調製することも可能である。
【００５０】
更に、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又は単鎖抗体の抗原結合部分を含む抗体の機能性部分を作製してもよい。上記の抗体の機能性断片は、それらが由来する全長抗体の少なくとも１つの結合能及び／又は生物学的機能又は生物活性を保持する。好ましい機能性断片は、対応する全長抗体の抗原結合機能（例えば哺乳動物の成熟型ミオスタチンに結合する能力）を保持する。特に好ましい機能性部分若しくは断片は、結合活性、シグナル伝達活性及び／又は細胞応答の刺激など、哺乳動物の成熟ミオスタチンの１つ以上の機能又は生物活性特性を阻害する能力を保持する。例えば、一実施形態では、機能性部分若しくは断片は、１つ以上のそのリガンドと成熟ミオスタチンとの相互作用を阻害でき、及び／又は１つ以上の受容体媒介性の機能を阻害できる。
【００５１】
成熟ミオスタチン又はその部分（好ましくは成熟ミオスタチンのアミノ酸４０−６４、４３−５７及び／又は４５−５９の範囲内）と結合しうる抗体部分又は断片としては、限定されないがＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片が挙げられ、本発明に包含される。かかる断片は酵素的な切断又は組換え技術によって調製できる。例えば、パパイン又はペプシン切断により、それぞれＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片を調製できる。最小の抗原結合断片はＦｖであり、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ領域からなる。Ｆａｂ断片はＨＣＶＲ−ＣＨ１とＬＣＶＲ−ＣＬ領域からなり、それらは定常領域の間でジスルフィド結合による共有結合を形成して連結されている。宿主細胞において共同発現させたときに、Ｆｖ中で非共有結合的に連結されたＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ領域が分離する傾向を克服するため、いわゆる単鎖（ｓｃ）Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を調製してもよい。その場合、柔軟で適切な長さを有するポリペプチドが、ＬＣＶＲのＮ末端にＨＣＶＲのＣ末端を結合させるか、又はＬＣＶＲのＣ末端をＨＣＶＲのＮ末端に結合させる。通常用いられるリンカーは１５残基（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドであるが、他のリンカーも従来技術において周知である。また、１つ以上の終止コドンを天然の終止部位の上流に導入した抗体遺伝子を使用し、様々な中断された形態の抗体を調製してもよい。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部をコードするキメラ遺伝子を、重鎖のＣＨ１領域及びヒンジ部位をコードするＤＮＡ配列を有する態様で設計してもよい。
【００５２】
反応を受けやすいＡｓｎ残基の同定：
タンパク質（例えば抗体）中の、反応を受けやすいＡｓｎ残基の自発的な修飾を検出及び定量するための、多くの方法が使用できる。脱アミド化（アスパラギン残基をイソアスパラギン酸塩及びアスパラギン酸塩の混合物に転換させ、タンパク質分解のシグナルを提供しうる修飾）により、負電荷が生じ、タンパク質の分子量（ＮＨ２対ＯＨ、Δ＝１Ｄａ）及び疎水性を変化させる。電子的及びクロマトグラフィ方法（例えばＩＥＦ、ｃＩＥＦ、尿素ゲル電気泳動、逆相ＰＨＬＣ、イオン交換ＰＨＬＣ及び親水性相互作用）などの分離技術を用いて、脱アミド化されたか切断された形の抗体、又はタンパク質又はポリペプチドを分離又は単離することができる。イオン交換クロマトグラフィは、脱アミド化されたタンパク質を単離するために広く使われている。抗体又はタンパク質又はポリペプチドの自発的な修飾の位置及び範囲は、液体クロマトグラフィ／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）及びＮ末端塩基配列決定によって更に解析できる。
【００５３】
反応を受けやすいＡｓｎ残基の置換又はその他の抗体の修飾：
例えばアミノ酸置換によって、抗体又は他のタンパク質の反応を受けやすいＡｓｎ残基を除去する場合、反応を受けやすい当該Ａｓｎ残基を、一個のアミノ酸で置換することができる。当該アミノ酸置換により、抗体：抗原結合アフィニティが変化しない（すなわち負）か、又は変化が最小限である（例えば１０％、５％、４％、３％、２％以下である）ことが望ましい。アミノ酸置換により、抗体の中和、エピトープ特異性及びＧＤＦ−１１よりもミオスタチンと優先的に結合する能力が変わらない（すなわち負）か、又はその変化が最小限であることが更に望ましい。ＥＬＩＳＡは、ミオスタチン又はその抗原エピトープへの親抗体（例えばＣ１２又は５１０Ｃ２抗体）の結合と比較して、同じ抗原に対する本発明の抗体の結合アフィニティ及びＥＬＩＳＡ値への個々のアミノ酸置換の効果を決定するのに用いることができる。あるいは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）又はＫＩＮＥＸＡ（登録商標）アッセイを用いて、抗体の結合アフィニティを測定してもよい。
【００５４】
本発明の抗体は、最適化された所望の特性（例えば結合アフィニティ、ＩＣ５０、特異性など）を有する変異抗体をつくるために、例えば１つ以上のＣＤＲ領域中に、更に突然変異を生じさせ（又は親抗体の不安定性の原因となるＡｓｎ残基の除去前に突然変異を生じさせ）てもよい。アミノ酸置換によって生じる本発明の抗体が好ましく、親抗体分子の少なくとも１つのアミノ酸残基が取り除かれ、その位置に異なる残基を挿入することにより得られる。かかる置換による突然変異の生成にとっての最も好ましい部位としてはＣＤＲ領域が挙げられるが、ＦＲ領域の変異を行ってもよい。
【００５５】
実質的な変異体の簡便な作製方法は、ファージディスプレイを使用したアフィニティ成熟である。簡潔には、幾つかのＣＤＲ領域部位を変異させ、各部位で全ての可能なアミノ酸置換変異体を得る。このようにして得た変異抗体は、融合体としてのフィラメント状のファージ粒子から、各粒子内にパッケージされるＭ１３の遺伝子ＩＩＩの生成物まで、一価の方法でディスプレイされる。本願明細書において開示されるように、ファージディスプレイされた変異体は更に、それらの生物学的活性（例えば結合アフィニティ、特異性、ＩＣ５０）に関するスクリーニングに供される。変更を導入する候補となるＣＤＲ領域場所を同定するため、アラニンスキャニング突然変異誘導を実施し、抗原との結合に顕著に関与するＣＤＲ領域中の残基を確認してもよい。あるいは、又はそれに加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造解析を行い、抗体とミオスタチンとの接触部分を確認してもよい。かかる接触する残基及び隣接する残基が、本願明細書の方法又は従来公知の技術に従って行われる置換の候補となる。あるいは、又はそれに加えて、１つ以上のＣＤＲ配列に１つ以上の残基をランダム突然変異導入（ＣＤＲは可変領域に制御可能に連結されているか、又はＣＤＲは他の可変領域配列から独立しており、変異したＣＤＲを、後に組み換えＤＮＡ技術を用いて可変領域に戻す）してもよい。かかる変異抗体を作製した後、本願明細書に記載のように変異体のパネルをスクリーニングにかけ、１つ以上の関連する分析法で優れた特性を有する抗体を更に選抜して機能を向上させてもよい。
【００５６】
抗体の発現
本発明はまた、本発明の抗ミオスタチンモノクローナル抗体又はその一部を発現する細胞系の提供に関する。本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞系の作製及び単離は、当該技術分野において、公知の標準的技術を使用して実施できる。好ましい細胞系としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＳＰ２／０、ＮＳ０及び酵母などが挙げられる（ＡＴＣＣ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡのような公的な寄託機関から入手できる）。
【００５７】
原核生物（細菌）及び真核生物（例えば酵母、バキュロウイルス、植物、哺乳動物及び他の動物細胞、形質転換動物及びハイブリドーマ細胞）の発現系並びにファージディスプレイによる発現系などの多種多様な宿主発現系が本発明の抗体の発現に使用できる。適切な細菌発現ベクターの例としてはｐＵＣ１１９が挙げられ、適切な真核発現ベクターとしては、弱力化されたＤＨＦＲ選抜システムと組み合わせた修飾ｐｃＤＮＡ３．１ベクターが挙げられる。当該技術分野において、公知の他の抗体発現系の使用も本発明に包含される。
【００５８】
本発明の抗体は、宿主細胞における免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現によって、調製できる。抗体を組み換え発現させるために、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び／又は重鎖をコードするＤＮＡ断片を当該軽鎖及び／又は重鎖が宿主細胞内で発現するように担持させた１つ以上の組換え発現ベクターを用い、宿主細胞を形質転換、形質導入、感染等を行う。重鎖及び軽鎖は、１つのベクター中で、機能的に連結された異なるプロモータからそれぞれに発現させてもよく、あるいは、重鎖を発現する１つのベクターと、軽鎖を発現するもう１つのベクターの２ベクターシステムを用いて、重鎖及び軽鎖を、機能的に連結された異なるプロモーターからそれぞれに発現させてもよい。あるいは、当該重鎖及び軽鎖を異なる宿主において、発現させてもよい。好ましくは、当該組み換え抗体を、細胞培養用の培地に分泌させ、当該抗体を回収若しくは精製することもできる。標準的な組換えＤＮＡ方法を使用して、抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子を得、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、更に当該ベクターを宿主細胞に導入する。
【００５９】
ＨＣＶＲ領域をコードする単離したＤＮＡは、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）をコードする他のＤＮＡ分子にそのＨＣＶＲコードＤＮＡを制御可能に連結することにより、全長重鎖遺伝子へ転換できる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において、公知である。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）を参照。これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、例えば標準的なＰＣＲ増幅によって、調製できる。重鎖定常領域は、いかなるタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）又はサブクラスの定常領域、並びにカバット（上記）に記載のあらゆるアロタイプ変異体であってもよい。あるいは、抗原結合部は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ又は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）であってもよい。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子の場合、ＨＣＶＲをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする他のＤＮＡ分子と制御可能に連結してもよい。
【００６０】
ＬＣＶＲ領域をコードする単離したＤＮＡは、軽鎖定常領域ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子に当該ＬＣＶＲコードＤＮＡを制御可能に連結することによって、全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に転換できる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野において、公知である。例えばＫａｂａｔ（前掲）を参照されたい。これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって、調製できる。軽鎖定常領域はκ又はλ定常領域であってもよい。
【００６１】
ｓｃＦｖ遺伝子を構築する際、ＨＣＶＲ−及びＬＣＶＲをコードするＤＮＡ断片を、例えば、フレキシブルリンカーをコードする（アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−セリン）３をコードする）他の断片と機能的に連結する。それにより、ＬＣＶＲ及びＨＣＶＲ領域がフレキシブルリンカーで連結され、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列が隣接している単鎖タンパク質として発現できる。
【００６２】
本発明の抗体を発現させるために、軽鎖及び／又は重鎖（上記の通りに調製）の一部若しくは全部をコードするＤＮＡを、その遺伝子が機能的に転写及び翻訳制御配列と連結される態様で、発現ベクターに挿入する。発現ベクター及び発現制御配列を、発現に使用する宿主細胞と適合するように選択する。抗体の軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子を別個のベクターに挿入してもよいが、典型的には両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は、標準的な方法によって、発現ベクターに挿入する。更に、組換え発現ベクターは、宿主細胞から抗ミオスタチンモノクローナル抗体の軽鎖及び／又は重鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードしてもよい。抗ミオスタチンモノクローナル抗体の軽鎖及び／又は重鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖の遺伝子のアミノ末端側にインフレームで制御可能に連結する態様でベクターにクローニングしてもよい。当該シグナルペプチドは免疫グロブリンのシグナルペプチド又は他の種類のシグナルペプチドであってもよい。
【００６３】
抗体の重鎖及び／又は軽鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。用語「調節配列」にはプロモーター、エンハンサー及び必要に応じて他の発現制御因子（例えばポリアデニル化シグナル）が包含され、それらは抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する。調節配列の選択を含めた発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの要因に依存する場合がある。哺乳動物宿主細胞発現にとり好ましい調節配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（、ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマウイルスに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーのような、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を可能にするウイルス要素が挙げられる。
【００６４】
抗体の重鎖及び／又は軽鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内でベクターの複製を調節する配列（例えば複製開始点）のような更なる配列、及び１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を有してもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入される宿主細胞の選択を容易にする。例えば、通常用いられる選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する。好ましい選択可能なマーカー遺伝子としては、（メトトレキサート選択／増幅を有するＤＨＦＲ−マイナス宿主細胞において、使用する）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、（Ｇ４１８選択用の）ネオ遺伝子（ｎｅｏ  ｇｅｎｅ）、及び選択／増幅用のＧＳ陰性細胞系（ＮＳ０など）におけるグルタミン合成酵素（ＧＳ）が挙げられる。
【００６５】
軽鎖及び／又は重鎖の発現の場合、重鎖及び／又は軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な方法（例えばエレクトロポーレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、形質導入、感染等）を用いて宿主細胞に導入する。原核生物又は真核生物に由来する宿主細胞で本発明の抗体を発現することは理論的に可能であるが、好ましくは真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞が使用されるが、それはこれらの細胞では抗体が適切にフォールディングして免疫学的に活性を有する形態となり、分泌される可能性が高いからである。本発明の組換え抗体を発現するための好適な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２／０細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞内での抗体の発現に必要な、又より好ましくは宿主細胞を増殖させる培地への抗体の分泌に必要な十分な時間宿主細胞を培養することにより、抗体が産生される。標準的な精製方法を使用して、宿主細胞及び／又は培地から抗体を回収できる。
【００６６】
宿主細胞を用いて、従来技術によって、全長抗体の一部又は断片（例えばＦａｂ断片又はｓｃＦｖ分子）を調製してもよい。上記手順の変法も本発明の範囲内に包含されることは当業者には理解されるであろう。例えば、本発明の抗体の軽鎖又は重鎖をコードするＤＮＡによって、宿主細胞をトランスフェクトすることが望ましい場合もある。また組換えＤＮＡ技術を用いて、ミオスタチンに結合するのに必要ではない、軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去してもよい。かかる切除を受けたＤＮＡ分子から発現される分子もまた本発明の抗体に包含される。
【００６７】
本発明の抗体の組換え発現のための好適なシステムでは、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、例えばリン酸カルシウムを用いて、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションする。組換え発現ベクター中で、重鎖及び軽鎖い抗体遺伝子をエンハンサー／プロモーター調節エレメントに各々機能的に連結させ、遺伝子の転写レベルを向上させる。当該組換え発現ベクターはＤＨＦＲ遺伝子も有し、それにより、当該ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の、メトトレキサート選択／増幅を利用した選択が可能となる。選択された形質転換体宿主細胞を培養して抗体の重鎖及び軽鎖を発現させ、全長抗体を培地から回収する。標準的な分子生物学的手法を用いて、組換え発現ベクターを構築し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収できる。本発明の抗体（又はその抗原結合部）は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したトランスジェニック動物（例えばマウス）において発現させることができる（Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−９５，１９９２を参照）。
【００６８】
用途
本発明の抗体は、本明細書に記載のように治療、予防、診断及び研究用途に有用である。本発明の抗体は、ヒトミオスタチンの発現に関連する障害又は疾病の診断に使用できる。同様にして、本発明の抗体は、ミオスタチンに関連する症状の治療を受けている患者のミオスタチンレベルをモニターするための検査に使用できる。
【００６９】
本発明の抗体の治療への使用
ミオスタチンは、筋肉の発達及び多くの関連する障害又は疾患に関与する。成人においては、ミオスタチンｍＲＮＡは主に骨格筋において検出され、また低い濃度ではあるが脂肪組織及び心臓組織で検出される（Ｓｈａｒｍａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８０：１，１９９９）。ミオスタチンノックアウトマウスは、その野生型同腹仔よりも筋肉量が２倍〜３倍増加している。その筋肉量の増加は、繊維肥大及び過形成の結果である（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：８３−９０，１９９７  ａｎｄ  Ｚｈｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７４：７１）。更に、ミオスタチンノックアウトマウスでは、その野生型同腹仔より脂肪蓄積が少ないが、それ以外は外観上正常かつ健康である。またミオスタチンは、脂肪合成の重要な調節因子であることが最近示されている（Ｒｅｂｂａｐｒａｇａｄａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．２３：７２３０−７２４２，２００３）。更に、骨の構造及び含量に関する研究が、ミオスタチン欠損マウスにおいて近年行われている（Ｈａｍｒｉｃｋ  Ｍ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１０２５，２００３、  Ｈａｍｒｉｃｋ，Ｍ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ  ７１：６３，２００２）。
【００７０】
したがって、本発明の抗ミオスタチンモノクローナル抗体を含有する組成物は、筋肉量を増加させ、骨密度を上昇させ、筋萎縮を減少させるために使用でき、更には、ミオスタチンの存在によって望ましくない病理的効果を生じさせるか、又はミオスタチン濃度の減少により哺乳類（好ましくはヒト）にとり治療効果が生じうる、各種症状の治療若しくは予防に有用でありえる。好ましくは、本発明の抗ミオスタチンモノクローナル抗体から成る組成物は、筋肉量を増加させるために用いることができる。
【００７１】
本発明の抗体は好ましくは、筋萎縮、筋肉の損傷、手術、筋肉の傷害の修復、虚弱、加齢に伴う筋肉減少、不使用性萎縮、骨粗鬆症、骨関節炎、靭帯の発達及び修復、肥満及び体脂肪蓄積の抑制、肥満、あらゆるタイプの筋ジストロフィー、集中治療筋疾患、アルコール性筋疾患、悪液質、（例えば癌関連若しくはＨＩＶ誘発による、又はＣＯＰＤ、慢性肺疾患、敗血症からの回復、腎不全、肝不全、心不全又は心臓疾患に由来する悪液質）、メタボリックシンドローム、熱傷後の筋萎縮及びＩＩ型糖尿病の治療若しくは予防に使用する。本発明の抗体はより好ましくは、筋萎縮、虚弱、加齢に伴う筋肉減少、不使用性萎縮及び悪液質の治療若しくは予防に用いる。最も好ましくは、本発明の抗体は不使用性萎縮又は悪液質の治療若しくは予防に用いる。
【００７２】
不使用性萎縮は、限定されないが、臓器移植、関節の置換、脳卒中、脊髄損傷、重度の熱傷からの回復、慢性的な定坐性の血液透析、敗血症後の回復及び低い重力状態などの、長期にわたる静止、不使用若しくは寝たきりの状態に至る、あらゆる障害、疾患若しくは症状を含む、多くの原因又は出来事から生じうる。ミオスタチンは多くの種にわたり、配列及び機能が高度に保存されているため、本発明の抗体は、ヒト以外の哺乳類又は鳥類（例えば家畜（イヌ及びネコなど）、競技用動物（例えばウマ）、食用動物（ウシ、ブタ、ヒツジなど）、鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、他の猟鳥又は家禽など））の筋肉量の増加、骨密度の増加、又は、症状の治療若しくは予防に使用できる。当該症状とは、ミオスタチンの存在が望ましくない病理に影響を与える若しくは関与するか、又はミオスタチン濃度の減少が治療効果につながるものである。
【００７３】
本発明には、上述した障害のうちの少なくとも１つを治療若しくは予防するための本発明の抗ミオスタチンモノクローナル抗体の使用が包含され、当該障害は、ミオスタチン活性が有害であるか、又は生理活性ミオスタチン濃度の減少により利益を得られるものである。更に、少なくとも１つの該障害の治療用薬剤の製造への、本発明の抗ミオスタチンモノクローナル抗体の使用も包含される。
【００７４】
本発明の用語「治療」、「治療する」等は、所望の薬理学的及び／又は生理学的な効果を得ることを指す。効果は、疾患の部分的又は完全な治療効果及び／又は疾患が引き起こす悪影響への治療効果であってもよい。本発明の用語「治療」は、疾患又は症状の治療用の本発明の化合物を哺乳類（特にヒト）に投与することを含み、具体的には（ａ）疾患を阻害する（すなわちその発達を抑える）こと、及び
（ｃ）疾患を緩和する（すなわち疾患又は障害を後退させる、又は徴候若しくはその合併症を減弱させる）ことが挙げられる。投与計画は、最適な所望の反応を提供できるように調整することができる。
【００７５】
本発明の用語「予防すること」とは、疾患又はその症状を完全に若しくは部分的に予防することを指す。本発明の用語「予防」には、疾患に罹りやすい体質であるが、まだ罹患していると診断されていない患者が当該疾患に罹るのを防止するため、本発明の化合物を投与することも包含される。
【００７６】
組成物
本発明の抗体を、患者への投与に適する医薬組成物中に添加してもよい。本発明の化合物は、一回若しくは複数回の投与において、それ単独で投与してもよく、又は薬理学的に許容できる担体、希釈剤及び／又は賦形剤と組み合わせて投与してもよい。投与用組成物は、実際に行う投与様式に適する態様でデザインされ、必要に応じて、分散助剤、バッファ、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などの、薬理学的に許容できる希釈剤、担体及び／又は賦形剤が用いられる。該組成物は、公知の方法に従いデザインされる（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５、（当業者に公知の製剤技術を解説した文献））。
【００７７】
本発明の組成は、本発明の抗体を好ましくは「治療的有効量」又は  「予防的有効量」で含有する。「治療的有効量」とは、所望の治療効果を得るのに必要な投与量及び時間量のことを指す。当該抗体の治療的有効量は、患者の病状、年齢、性別及び体重、並びに当該個人において、所望の応答を誘導する当該抗体若しくは抗体部分の能力などの要因に応じて変化し得る。治療的有効量はまた、治療的に有益な効果が、当該抗体のいかなる毒性又は有害な効果をも上回る態様のことを指す。「予防的有効量」とは、所望の予防的結果を得るのに必要となる投与量及び時間量のことを指す。概して、予防投与量は疾患の初期又はそれ以前に被験者に使用されるのであるから、予防的有効量は治療的有効量より少なくてもよい。
【００７８】
治療的有効量若しくは予防的有効量は、被検者に治療的利点を与えるために必要となる、最小限量より多く、かつ毒性投与量より少ない量の有効成分のことを指す。換言すると、治療的有効量の本発明の抗体とは、哺乳類（好ましくはヒト）の筋肉量を増加させ、骨密度を増加させ、又は、哺乳類（好ましくはヒト）において、ミオスタチンの存在によって望ましくない病理学的効果が生じる若しくはそれが引き金となる症状、又は、ミオスタチン濃度の減少により有益な治療効果が得られる症状（限定されないが筋萎縮、筋肉損傷、手術虚弱、加齢による骨格筋減少症、不使用性萎縮、骨粗鬆症、骨関節炎、靭帯成長及び修復、肥満、体脂肪蓄積抑制、あらゆるタイプの筋ジストロフィー、集中治療筋疾患、悪液質（例えば癌関連若しくはＨＩＶ誘発による、又はＣＯＰＤ、慢性肺疾患、敗血症からの回復、腎不全、肝不全、心不全又は心臓疾患に由来する悪液質）、メタボリックシンドローム及びＩＩ型糖尿病）を治療するのに十分な、抗体の量である。不使用性萎縮は、臓器移植、関節の置換、脳卒中、脊髄損傷、重度の熱傷からの回復、慢性的な定坐性の血液透析、敗血症後の回復及び低い重力状態への暴露などの、長期にわたる静止、不使用若しくは寝たきりの状態に至る、あらゆる障害、疾患若しくは症状を含む、多くの原因又は出来事から生じうる。
【００７９】
本発明の抗体における投与経路は、非経口的投与経路である。好ましくは、本発明の抗体は非経口投与に適した医薬組成物中に含有させることができる。本発明で使用される用語「非経口」としては、静脈内、筋肉内、皮下、直腸内、膣内又は腹膜内投与が挙げられる。静脈内又は腹膜内又は皮下注射による末梢への全身輸送が好ましい。かかる注射に用いる適切な担体は当該技術分野において、簡便に入手できる。
【００８０】
組成物は典型的には、製造及び使用する容器における貯蔵条件下で、例えば密封されたバイアル又はシリンジ中で無菌状態であり、安定である必要がある。ゆえに上記組成物は、製剤後にフィルターで滅菌するか、又は、微生物学的に許容されうるように処理するのが好ましい。静脈内注入用の典型的な組成物は、２０〜１０００ｍＬの液体（例えば無菌のリンガー溶液、生理的食塩水、ブドウ糖溶液及びＨａｎｋ’ｓ溶液）、及び治療的有効量の抗体（例えば１〜１０００ｍｇ）を含有してもよい。投与量は疾患の種類及び重症度に応じて変化し得る。医療分野で周知のように、患者への投与量は、患者の体の大きさ、体表面積、年齢、投与する具体的な化合物、性別、投与時間及び経路、健康状態又は同時に投与する他の薬剤などの多数の要因を考慮しながら決定される。典型的な投与量は例えば１〜１０００ｍｇの範囲であるが、上述の要因を考慮しつつ、この典型的な範囲以下、又は以上の投与量としてもよい。典型的な投与計画を、毎日、毎週、隔週又は毎月単位で設定してもよい。典型的な非経口投与計画は、総体重に対して約１０μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約２０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇとすることができる。症状の進行を定期的にモニターしてもよい。反復投与する場合、症状に応じて、疾患の症状が所望どおりに抑制されるか、又は、疾患の症状が所望どおりに予防されるまで、治療を反復してもよい。しかしながら、他の投与計画も有用であると考えられ、本発明の範囲から除外されることはない。
【００８１】
上記で提案される抗体量は、大いに治療的判断の対象となる。適当な投与量及び投与計画を選択する際の鍵となる要因は得られる結果である。かかる要因としては、治療しようとする具体的な障害、治療しようとする具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、抗体の輸送部位、抗体の具体的なタイプ、投与方法、投与計画及び医師にとり公知の他の要因などが挙げられる。
【００８２】
本発明の治療薬は凍結又は凍結乾燥して保存でき、使用前に適切な無菌の担体中で再調製してもよい。凍結乾燥及び再調製は抗体活性の損失を生じさせるため、それを補填するために使用量を調節するのが好ましい。通常ｐＨは６〜８が好ましい。
【００８３】
製品
本発明の他の一実施態様は、上記の障害若しくは症状の治療若しくは予防に有用な材料を有してなる製品の提供に関する。当該製品は容器とラベルとを有してなる。好ましい容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。上記の容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成できる。上記の容器は障害又は症状の予防又は治療に効果的な本発明の組成を保持し、無菌のアクセスポート（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルでもよい）を有する。当該組成物中の有効成分は本発明の抗ミオスタチン抗体である。容器上に貼り付けたラベル、若しくは容器に結び付けられたラベルには、当該組成物が所定の症状の治療に用いられることが示されている。当該製品は、薬理学的に許容できるバッファ（例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びブドウ糖溶液）が内包されている第二容器を更に有してもよい。商取引上の観点及びユーザの観点から、他の材料を更に有してもよく、例えば他のバッファ、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及び使用説明を記載した印刷物などが挙げられる。
【００８４】
以下の実施例は本発明を説明する目的でのみ提供するものであり、いかなる形であれ本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。
【実施例】
【００８５】
実施例１：
モノクローナル抗体Ｃ１２及び５１０Ｃ２の切断部位の同定：
様々なバッファー条件（１０ｍＭのクエン酸（ｐＨ５）、１０ｍＭのクエン酸（ｐＨ６）、１０ｍＭのクエン酸（ｐＨ７）及び１０ｍＭのクエン酸／１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７））中で、１ｍｇ／ｍＬの抗体溶液を、４週間複数の温度条件（−２０℃、４℃、２５℃及び４０℃）でインキュベートした。培養後、サンプルをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析した。Ｃ１２又は５１０Ｃ２の可変ドメインを含んでいる抗体（複数のＦｃ−アイソタイプ）の場合、抗体の重鎖及び軽鎖の予想されるバンドを越えた位置に、更なるバンドが観察された。これらのバンドはｐＨ７（ＮａＣｌの有無にかかわらず）でインキュベートしたサンプルの場合にのみ観察された。サンプルの還元条件下では２つのバンドが観察され（〜８〜１０ｋＤａ及び〜１２〜１４ｋＤａの見かけの分子量）、非還元条件下では〜８〜１０ｋＤａの見かけの分子量の単一バンドが観察された。これらのバンドの相対密度によって測定される切断の程度は、ｐＨ依存的（ｐＨ６でインキュベートしたサンプルではバンドが弱く、ｐＨ５でインキュベートしたサンプルでは不明確である）及び温度依存的であると考えられる。切断部位を決定するため、及び切断の程度を定量化するため、同じ抗体溶液を、液体クロマトグラフィ／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）及びＮ末端塩基配列決定によって更に解析した。
【００８６】
ＬＣ／ＭＳによるサンプルの分析は、以下の通りに実施した。抗体の部分的な還元のため、各４μＬのサンプルと３６μＬの水を混合した。次に、１５μＬの各溶液を、０．５μＬの３Ｍトリス−ＨＣｌバッファ（ｐＨ８．０）、０．５μＬの５０ｍｇ／ｍＬのＤＴＴ、及び４５μＬの水と混合した。両溶液をサンプル毎にＬＣ／ＭＳにより分析した。抗体の非グリコシル化反応は、各サンプル３μＬを、６０μＬの水、１．０μＬの３ＭトリスＨＣｌバッファ（ｐＨ８．０）、１．０μＬのＰＮＧａｓｅ  Ｆ溶液（ＰＲＯＺＹＭＥ（登録商標）、１Ｕ／ｍＬ）と混合することにより行わせた。溶液を３７℃で６時間インキュベートし、更にＬＣ／ＭＳで分析した。完全にトリプシン消化させるため、各サンプル２０μＬを、高速真空システム下で凍結乾燥し、更に４．５μＬの７Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、０．４ＭのトリスＨＣｌバッファ（ｐＨ８．０）、及び０．５μＬの５０ｍｇ／ｍＬのＤＴＴ溶液中で再調製した。溶液を３７℃で４０分間インキュベートし、更に９５μＬの水で希釈した。各溶液を３７℃で３時間、０．５ｍｇ／ｍＬのブタトリプシン２．０μＬで処理した。溶液を酢酸で酸性化し、更にＬＣ／ＭＳ又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した。完全な、部分的に還元された、及び非グリコシル化されたサンプルを、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣ／ＬＣＴプレミア又はＱ−ＴＯＦマイクロ質量分析機を使用して分析した。ＨＰＬＣ及び質量分析機のパラメータ設定は、サンプル及び条件に基づいて調整した。
【００８７】
ノイズ除去した、Ｃ１２抗体の質量スペクトル（ｐＨ７で４０℃で４週間インキュベート）では、１３４８９４及び１４５１１６Ｄａの分子量の２つのピークが示された。それらの分子量の違いは約１０２２０Ｄａであり、それは軽鎖のＮ末端ペプチド１−９３（予想：１０２２１．４Ｄａ）の予想される残基質量に合致する。この結果を、部分的還元サンプルのＬＣ／ＭＳ分析により確認した。このサンプルでは、３つの分子量が検出された（２３３１２．７、１３０９１．３及び、１０２３９．４Ｄａ）。それらは完全な軽鎖１−２１９（予想：２３３１３．１Ｄａ）、軽鎖Ｃ末端ペプチド９４−２１９（予想：１３０９１．６Ｄａ）、及び軽鎖Ｎ末端ペプチド１−９３（予想：１０２３９．４のＤａ）と整合している。基本的に同一の結果が５１０Ｃ２抗体の場合も得られたが、切断生成物の相対的な量はこの抗体では低かった。表１は、部分的に還元されたサンプルの分析において測定された、切断された軽鎖のパーセンテージをまとめたものである。
【００８８】
Ｎ末端配列決定により、インキュベートしたサンプルも解析した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社（ＡＢＩ）の気相（ＧＰ−ＰＶＤＦ）方法を利用して、ＰＲＯＳＯＲＢ（登録商標）サンプル調製カートリッジにアプライした検体に関して、自動化エドマン分解アミノ酸配列分析を実施した。各残基を、ｓｐｈｅｒｅ−５  ＰＴＨ  ２２０×２．１ｍｍ  ＡＢＩ  ＢＲＯＷＮＬＥＥ（登録商標）カラム（５５℃、３２５μＬ／分の流速）で分析した。ＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ６１０Ａデータ分析プログラムを利用してデータを分析した。４０℃でインキュベートした抗体サンプルでは、２つの配列が観察された。Ｃ１２で観察される２つの配列は、“ＤＩＱＭＴＱ”（配列番号３４）（Ｃ１２軽鎖の予想されるＮ末端に対応）、及び“ＰＬＴＦＧＧ”（配列番号３５）（Ｃ１２軽鎖の残基９４−９９に対応）であった。インキュベートされた５１０Ｃ２抗体溶液の分析においても、同一の結果が得られた。各配列の相対量から、切断された生成物の濃度を算出し、表１にまとめた。
【００８９】
表１：
Ａｓｎ９３−Ｐｒｏ９４ペプチド結合における切断度の要約
【表１】
2010502633.tif 000002
【００９０】
実施例２：
Ｃ１２及び５１０Ｃ２抗体の化学的切断部位の除去
Ｃ１２及び５１０Ｃ２の切断部位を除去するため、個々のアミノ酸の１アミノ酸置換を用いて、両方のモノクローナル抗体のＣＤＲＬ３のアスパラギン残基を置換した。ＥＬＩＳＡを用いて、ミオスタチンとの親和性に与える個々のアミノ酸置換の効果をＣ１２又は５１０Ｃ２のＦａｂと比較して解析した。
【００９１】
ＥＬＩＳＡプレートに、炭酸バッファ（５０ｍＭのＮａＨＣＯ３ｐＨ８．３）で４μｇ／ｍｌに希釈したミオスタチン溶液をウェル毎に５０μＬ添加し、コーティングした。プレートを封止テープで覆い、４℃で一晩インキュベートした。その後、プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｕ字底プレート、Ｃａｔ＃６５００６１）を、ＰＢＳ−Ｔ（０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回、自動プレート洗浄機を使用して洗浄した。全てのウェルにブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％  ＢＳＡ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を２００μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、５０μｌのサンプルを各ウェルに添加した。ペリプレップ（ｐｅｒｉｐｒｅｐ）Ｆａｂを含有するサンプルをＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡで１：３希釈し、更に１／２ログステップで連続希釈した。プレートを洗浄し、５０μＬの二次抗体溶液（１：２０００  ＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ中、ヤギ抗ヒトκＡＰ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｃａｔ＃２０６０−０４）を全ウェルに添加した。更なる洗浄の後、ＡＰ基質を１００μＬずつウェルに添加し、室温で約１０分間インキュベートした。５６０ｎｍの吸収度（ＯＤ）を測定した。親和性の対照標準として、Ｃ１２又は５１０Ｃ２を各ＥＬＩＳＡプレートに添加した。Ｆａｂの濃度は、タンパク質捕獲用の抗Ｆｄ抗体（ヒツジ抗Ｆｄ，Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）を用いた定量的ＥＬＩＳＡ、及び検出用のヤギ抗ヒトκＡＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で測定した。精製されたＦａｂ標準を各プレートでランさせ、濃度測定用の標準曲線を作成した。
【００９２】
Ｃ１２及び５１０Ｃ２（ＣＤＲＬ３のＡｓｎ残基が、Ｃ１２ではＨ又はＲで置換されるか、又は５１０Ｃ２ではＨ、Ｓ、Ｔ又はＡで置換される）に由来する修飾されたＦａｂは、ＥＬＩＳＡで測定したとき、ミオスタチンに対する親和性が、親抗体のＦａｂのそれと同様に保たれている。これらの各置換によっても、同じ濃度のＦａｂで、同様の吸光度測定を行った場合の、それぞれの親抗体Ｆａｂコントロールと同様のＥＬＩＳＡ親和性曲線が得られる（図４を参照）。しかしながら、ＣＤＲＬ３のアスパラギン残基がＣ１２においてバリン、プロリン、グリシン、グルタミン、トリプトファン、チロシン、システイン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、セリン、リジン、アラニン、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸で、又は５１０Ｃ２においてアルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、トリプトファン又はプロリンで置換される場合、これらの置換の各々により、親抗体のＦａｂと比較し、修飾Ｆａｂのミオスタチンへの結合アフィニティが低下する。更に、ジペプチドＡｓｎ−ＰｒｏのＰｒｏ残基の修飾の試みは失敗した。その理由は、全ての置換が、親抗体のＦａｂと比較し、修飾されたＦａｂのミオスタチンへの結合アフィニティを低下させるからである。
【００９３】
実施例３：
Ｃ１２抗体及び変異体ＬＣ−Ｎ９３Ｈにおける、切断の比較
１０ｍＭのリン酸（ｐＨ７．４）／１５０ｍＭのＮａＣｌ液中の１ｍｇ／ｍＬの抗体溶液を、複数の温度（４℃、２５℃及び４０℃）で４週間インキュベートした。培養後、サンプルを上記の通り、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＮ末端配列決定によって解析した。これらの条件下では、４０℃でインキュベートしたＣ１２抗体サンプルにおいて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより抗体の重鎖及び軽鎖の予想されるバンドを越えた更なるバンドが観察された。観察されたバンドは、非還元条件下で〜８ｋＤａ移動し、還元条件下では〜８ｋＤａ及び〜１４ｋＤａ移動した。一方、ＬＣ−Ｎ９３Ｈ変異体では更なるバンドが観察されなかった。インキュベートされたサンプルのＮ末端配列決定により、軽鎖のＡｓｎ９３とＰｒｏ９４との間の切断が、Ｃ１２抗体のサンプルで確認され、配列の〜１０〜２０％が、新規なＮ末端（ＰＬＴＦＧＧ、配列番号３５）に対応していたが、ＬＣ−Ｎ９３Ｈ変異体では予想されるＮ末端以外の軽鎖配列は存在しなかった。
【００９４】
実施例４：
ミオスタチン／ＳＢＥレポーターアッセイ
このレポーターアッセイでは、ＳＭＡＤ結合要素の下流にルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミド（ＳＢＥ−ルシフェラーゼ）、より詳しくは（ＣＡＧＡ）１２が、ミオスタチン、ＧＤＦ−１１又は他のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの分子がそれ自身の受容体と結合するとき、ルシフェラーゼタンパク質を発現し、それによりＳＭＡＤシグナリングが活性化され、ＳＢＥに結合できるリン酸化ＳＭＡＤ複合体が得られる。ＣＡＧＡ配列は、ＴＧＦ−β誘導された遺伝子ＰＡＩ−１（Ｄｅｎｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：３０９１−３１００（１９９８））のプロモーター内の、ＴＧＦ−β応答性配列である。ＳＢＥの繰り返し配列（ｔｃｇａｇａｇｃｃａｇａｃａａａａａｇｃｃａｇａｃａｔｔｔａｇｃｃａｇａｃａｃｔｃｇａｇａｇｃｃａｇａｃａａａａａｇｃｃａｇａｃａｔｔｔａｇｃｃａｇａｃａｃｔｃｇａｇａｇｃｃａｇａｃａａａａａｇｃｃａｇａｃａｔｔｔａｇｃｃａｇａｃａｃｔｃｇａｇａｇｃｃａｇａｃａａａａａｇｃｃａｇａｃａｔｔｔａｇｃｃａｇａｃａｃｔｃｇａｇａｇｃｃａｇａｃａａａａａｇｃｃａｇａｃａｔｔｔａｇｃｃａｇａｃａｃ（配列番号３６））を、ｐＧＬ３ベースのベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社、＃Ｅ１７５１）のＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングしてプラスミドを調製した。ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞への過渡的トランスフェクションにこのプラスミドを用いた。
【００９５】
測定される光の量は産生されるルシフェラーゼの量と比例しており、すなわち細胞が曝露されたミオスタチンの量と比例する。阻害剤（例えばミオスタチンと結合する抗体）の存在により、ＳＢＥを活性化できるミオスタチンの量が減少し、最終的に光の発生量が減少する。
【００９６】
このアッセイにおいて、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（３：１）（Ｇｉｂｃｏ９３−０１５２ＤＫ）、１０％のＦＢＳ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、４ｍＭのＬ−グルタミン（「完全培地」）中のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、ポリリジンで内壁をコーティングした９６穴プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ  ３５−４４６１）に、ウェルあたり約２５０００個の細胞を播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ  ３１９８５−０７０）をウェル当たり５０μＬ添加した。細胞を、以下のＳＢＥ−ルシフェラーゼＤＮＡ混合液５０μＬでトランスフェクションした。８０μｌのリポフェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ  １１６６８−０１９）を１．５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭと混合して５分間静置し、次にチューブに添加し、更に２０μｇのＳＢＥ−ルシフェラーゼＤＮＡを、１．５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ及び２００μＬのＰｌｕｓ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と混合し、５分間静置した。これらの２つの混合液を混合した後、この溶液を激しく撹拌し、３０分間静置し、この溶液（「トランスフェクション培地」）５０μＬを各ウェルに添加した。細胞を更に、５％のＣＯ２条件下、３７℃で一晩インキュベートした。細胞を含む各ディッシュにおいて、ミオスタチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ７８８−Ｇ８）を、完全培地で２０ｎｇ／ｍｌまで希釈した。試験する本発明の各抗体が約４０μｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌの濃度となるように完全培地で滴定した。トランスフェクション培地をウェルから除去し、抗体希釈液５０μＬをウェル毎に添加し、ＧＤＦ−８（ミオスタチン）又はＧＤＦ−１１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を５０μＬ、ウェル毎に添加した。細胞入りのプレートを、更に５％のＣＯ２条件で、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、溶媒を吸引して除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、７５μＬの溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ２６６Ａ）を添加した。細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を、製造業者の指示に従い、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ２６２０）を使用して測定した。Ｍａｂ濃度（μｇ／ｍｌ）Ｌｏｇ１０に対する蛍光をプロットし、ミオスタチン及びＧＤＦ−１１に対する各モノクローナル抗体のＩＣ５０を算出した。
【００９７】
モノクローナル抗体Ｃ１２及びＣ１２に由来する修飾モノクローナル抗体（Ｃ１２−Ｎ９３Ｈ）を、これらの条件でミオスタチンで試験した結果、それぞれ９．５９ｎＭ及び７．０３ｎＭのＩＣ５０値であった。ミオスタチンの代わりにＧＤＦ−１１で試験したとき、Ｃ１２もＣ１２−Ｎ９３Ｈもこのアッセイでは中和活性を示さなかった。すなわち、その親抗体と同様、修飾した抗体も、ＧＤＦ−１１よりもミオスタチンと優先的に結合することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年2月27日(2009.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月6日(2009.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを有してなる抗ミオスタチンモノクローナル抗体であって、該ＨＣＶＲが、
ａ）配列番号２３の配列のＣＤＲＨ１のペプチド、
ｂ）配列番号２５の配列のＣＤＲＨ２のペプチド、
ｃ）配列番号２７の配列のＣＤＲＨ３のペプチドを有してなり、
該ＬＣＶＲが、
ａ）配列番号１３の配列のＣＤＲＬ１のペプチド、
ｂ）配列番号１４の配列のＣＤＲＬ２のペプチド、
ｃ）配列番号１６、１７、１８及び１９からなる群から選択される配列のＣＤＲＬ３のペプチドを有してなる、該モノクローナル抗体。
【請求項２】
ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを有してなる抗ミオスタチンモノクローナル抗体であって、該ＨＣＶＲが、
ａ）配列番号２４の配列のＣＤＲＨ１のペプチド、
ｂ）配列番号２６の配列のＣＤＲＨ２のペプチド、
ｃ）配列番号２８の配列のＣＤＲＨ３のペプチドを有してなり、
該ＬＣＶＲが、
ａ）配列番号１３の配列のＣＤＲＬ１のペプチド、
ｂ）配列番号１４の配列のＣＤＲＬ２のペプチド、
ｃ）配列番号２１及び２２からなる群から選択される配列のＣＤＲＬ３のペプチドを有してなる、該モノクローナル抗体。
【請求項３】
ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのフレームワーク領域が、ヒトのフレームワーク領域である、請求項１又は２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
配列番号１１の配列のＨＣＶＲを有してなり、配列番号４、５、６及び７からなる群から選択される配列のＬＣＶＲを有してなる、抗ミオスタチンモノクローナル抗体。
【請求項５】
配列番号１２の配列のＨＣＶＲ、及び配列番号９及び１０からなる群から選択される配列のＬＣＶＲを有してなる、抗ミオスタチンモノクローナル抗体。
【請求項６】
配列番号３２の配列の軽鎖、及び配列番号３３の配列の重鎖を有してなる、抗ミオスタチンモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項記載の抗体、及び薬理学的に許容できる担体を含有する医薬組成物。
【国際調査報告】
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