(57)【要約】本発明者は、回腸胆汁酸結合タンパク質（ｉｌｅａｌ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＩＢＡＢＰ）の新しい変異体を同定し、ＩＢＡＢＰ−Ｌと命名した。ＩＢＡＢＰ−Ｌは、結腸直腸癌のバイオマーカーである。ＩＢＡＢＰ−Ｌの転写物は、代替開始部位から生じ、ＩＢＡＢＰに存在しない３つのエクソンを含む。ＩＢＡＢＰ−Ｌはまた、第４エクソンの一部をＩＢＡＢＰと共有する。ＩＢＡＢＰ−Ｌによってコードされるタンパク質は、ＩＢＡＢＰタンパク質内に見られない推定４９残基のＮ−末端配列を有する。本発明は、例えば、結腸直腸癌を診断および治療するための組成物および方法を提供する。
2010517941.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸直腸癌細胞の増殖または生存を減少させる方法であって、前記細胞を、ＩＢＡＢＰ−Ｌによる胆汁酸結合を減少させる物質を含む有効量の組成物と接触させるステップを含む、方法。
【請求項２】
前記物質は、ＩＢＡＢＰポリペプチドレベルを減少させることなく、前記細胞内のＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドレベルを減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物質は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ遺伝子発現を抑制する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記物質は、ポリヌクレオチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、およびリボザイムから成る群の成員である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記物質は、ｓｉＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドは、前記結腸直腸癌細胞内で発現可能であり、発現時に、ＩＢＡＢＬ−Ｌ、代謝酵素、細胞周期の進行に必須のタンパク質、アポトーシスを抑制するタンパク質、増殖調節シグナル伝達に関与するタンパク質、および結腸直腸癌細胞外への胆汁酸輸送に関与するタンパク質から成る群から選択されるポリペプチドのレベルを減少させるポリヌクレオチドをコードする配列に操作可能に連結される、プロモーターを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドは、前記結腸直腸癌細胞内で発現可能であり、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチドおよびリボザイムから成る群の成員をコードする配列に操作可能に連結される、プロモーターを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドは、前記結腸直腸癌細胞内で発現可能であり、アポトーシス促進タンパク質、腫瘍抑制タンパク質、細胞周期の進行を抑制するタンパク質、および結腸直腸癌細胞の細胞質内への毒性２次胆汁酸の送達に関与するタンパク質から成る群から選択されるポリペプチドをコードする配列に操作可能に連結される、プロモーターを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記物質は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ遺伝子発現の転写活性化を抑制する、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物は、胆汁酸、化学療法薬、非ステロイド性抗炎症薬、自己腫瘍細胞を含むワクチン、腫瘍関連抗原を含むワクチン、腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体、遺伝子修正のための組換え構築物、ウイルス特異的酵素−プロドラッグ治療、およびマトリックスメタロプロテアーゼメ阻害剤から成る群の成員を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物は、コール酸およびデオキシコール酸から成る群から選択される胆汁酸を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物は、胆汁酸の存在下で、前記結腸直腸癌細胞のアポトーシスを生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
結腸直腸癌治療を必要としている患者における結腸直腸癌を治療する方法であって、ＩＢＡＢＰ−Ｌによる胆汁酸結合を減少させる有効量の組成物を、前記患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項１５】
発現時に、ＩＢＡＢＰ−Ｌによる胆汁酸結合を減少させる配列に操作可能に連結されるＩＢＡＢＰ−Ｌプロモーターを含む発現ベクター、ＩＢＡＢＰ−Ｌ遺伝子発現を減少させるｓｉＲＮＡ、ＩＢＡＢＰ−Ｌ遺伝子発現を減少させるアンチセンスポリヌクレオチド、およびＩＢＡＢＰ−Ｌ遺伝子発現を減少させるリボザイムから成る群から選択されるポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項１６】
前記発現ベクターを含む組成物であって、前記配列は、アポトーシス促進タンパク質、腫瘍抑制因子、細胞周期の進行の阻害剤、結腸直腸癌細胞の細胞質内への毒性２次胆汁酸の送達に関与するタンパク質、およびＩＢＡＢＰ−Ｌ遺伝子発現の転写活性化の阻害剤から成る群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記発現ベクターを含む組成物であって、前記配列は、前記結腸直腸癌細胞内のポリペプチドのレベルを減少させるポリヌクレオチドをコードし、前記ポリペプチドは、ＩＢＡＢ−Ｌ、代謝酵素、細胞周期の進行に必須のタンパク質、アポトーシスを抑制するタンパク質、増殖調節シグナル伝達に関与するタンパク質、および結腸直腸癌細胞外への胆汁酸輸送に関与するタンパク質から成る群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記発現ベクターを含む組成物であって、前記配列は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、およびリボザイムから成る群から選択されるポリヌクレオチドをコードする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記発現ベクターを含む組成物であって、前記配列は、胆汁酸の存在下で、結腸直腸癌細胞内で発現される時に、前記結腸直腸癌細胞のアポトーシスを生じさせる、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
担体を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチドに加えて、ＩＢＡＢＰ−Ｌの胆汁酸結合活性を抑制する少なくとも１つの有効成分をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの有効成分は、化学療法薬、非ステロイド性抗炎症薬、自己腫瘍細胞を含むワクチン、腫瘍関連抗原を含むワクチン、腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体、遺伝子修正のための組換え構築物、ウイルス特異的酵素−プロドラッグ治療、およびマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤から成る群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
結腸直腸癌治療を必要としている患者における結腸直腸癌を治療するために有効である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２４】
結腸直腸癌治療を必要としている患者における結腸直腸癌を治療する方法であって、有効量の請求項１５〜２３に記載の組成物のいずれかを、前記患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項２５】
結腸直腸癌治療を必要としている患者における結腸直腸癌を治療するための組成物であって、前記患者におけるＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドのレベルを減少させる有効量のｓｉＲＮＡ構築物を含む、組成物。
【請求項２６】
ＩＢＡＢＰポリペプチドのレベルを実質的に減少させることなく、前記患者において、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドのレベルを減少させる、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物は、胆汁酸をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記胆汁酸は、コール酸およびデオキシコール酸から成る群から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物は、医薬的に容認可能な担体を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３０】
結腸直腸癌治療を必要としている患者における結腸直腸癌を治療する方法であって、有効量の請求項２５〜２９に記載の組成物のいずれかを、前記患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項３１】
前記組成物を、前記患者に経口または直腸投与するステップを含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物を、前記患者に浣腸によって直腸投与するステップを含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
結腸直腸癌細胞の増殖または生存を減少させるのに有効である薬剤を同定するための方法であって、（ａ）ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドを含む試料を、前記薬剤を含む組成物と接触させるステップと、（ｂ）前記組成物が、前記ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドによる胆汁酸結合活性を減少させるかどうかを決定するステップと、を含む方法。
【請求項３４】
前記試料は、結腸直腸癌細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物が、前記結腸直腸癌細胞内のＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドのレベルを減少させるかどうかを決定するステップを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記結腸直腸癌細胞を、前記組成物と接触させるステップと、前記組成物が、前記結腸直腸癌細胞の増殖または生存を減少させるかどうかを決定するステップと、を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
結腸直腸癌細胞の増殖または生存を減少させる薬物を調製するための、ＩＢＡＢＰ−Ｌ活性阻害剤の使用。
【請求項３８】
その治療を必要としている男性における結腸直腸癌を治療する薬物を調製するための、ＩＢＡＢＰ−Ｌ活性阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌の治療のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸直腸癌は、米国において３番目に多い悪性腫瘍であり、２００５年には、約１４５，０００人が新たに結腸直腸癌と診断され、また推定５６，０００人が結腸直腸癌で死亡した［Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ  ２００５，Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｉｎｃ．，２００５）。結腸直腸癌に対する最も一般的な非侵襲的検査は、便潜血検査（ｆｅｃａｌ  ｏｃｃｕｌｔ  ｂｌｏｏｄ  ｔｅｓｔ：ＦＯＢＴ）であり、これは３０年以上もの間使用されている。残念ながら、ＦＯＢＴの感度は約５０％に留まり、全ての腫瘍が出血するとは限らないため、早期悪性腫瘍を検出できない場合がある（Ａｇｒａｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｙｎｇａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２１：５９−６３，２００５）。ＦＯＢＴでは偽陽性が多いことから、依然として結腸鏡検査およびＳ状結腸鏡検査が、大腸癌を検出する最も信頼できる検査法である（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．５５：３１−４４，２００５）。これらの侵襲的検査は、高価であり、高度な訓練を受けたスタッフを必要とし、患者にとって不快であり、腸穿孔の危険性および死亡の可能性を上昇させる（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ５：１９９−２０９，２００５）。その結果として、結腸直腸癌の新しい分子マーカーおよびその診断検査に対する必要性が、依然として高い。
【０００３】
早くも１９４０年には発癌物質として認識され（Ｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １４５：６２７，１９４０）、その後大腸癌の発生率と強く結び付けられている（Ｗｕｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｙ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．５０：１０９９−１１０６，１９７３、Ｃｒｏｗｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３４：１９１−１９８，１９７６、Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ４２：２８３２−２８３８，１９７８、Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ４：５−１９，１９８２、Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ４：６７−７３，１９８２、Ｄｏｍｅｌｌｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ４：１２０−１２７，１９８２）、胆汁酸のような大腸癌の既知の危険因子に関連するタンパク質の発現の変化を発見することが期待され得る。ほんのわずかな研究のみが、結腸直腸癌の潜在的なバイオマーカーとして、胆汁酸応答経路中のタンパク質を検査している（ＤｅＧｏｔｔａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．４９：９８２−９８９，２００４）。
【０００４】
胆汁酸恒常性に関与するタンパク質の１つは、回腸胆汁酸結合タンパク質である（ｉｌｅａｌ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＩＢＡＢＰ）。これは脂肪酸結合タンパク質（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＦＡＢＰ）ファミリーの一部で、１４  ｋＤａの細胞質タンパク質である。ＩＢＡＢＰは、５番染色体上のｆａｂｐ６遺伝子によってコードされ（Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３３：４０６−４２３，１９９５）、ＩＢＡＢＰは、脂肪酸ではなく胆汁酸に結合するので、このタンパク質ファミリーの中でも特有である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：９−１６，１９９９）。さらに、胆汁酸は、腸内の核内ファルネソイドＸ受容体（ｆａｒｎｅｓｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＦＸＲ）に結合することによって（Ｍａｋｉｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１３６２−１３６５，１９９９、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ３：５４３−５５３，１９９９、Ｐａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１３６５−１３６８，１９９９）、ＩＢＡＢＰの発現を誘導（Ｋａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３０（Ｐｔ．１）：２６１−２６５，１９９８）し、それによって、ＩＢＡＢＰプロモーター中の胆汁酸応答エレメント（ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）が活性化される（Ｇｒｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２９７４９−２９７５４，１９９９）。これらの特性、および腸上皮内での局在化に基づいて、ＩＢＡＢＰは、コレステロール恒常性の制御の中核を成す胆汁酸輸送および緩衝活性に、関与し得る（Ｆｕｃｈｓ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８４：Ｇ５５１−Ｇ５５７，２００３）。
【０００５】
結腸直腸癌において、より一層の注目を集める一経路は、ＮＦ−κＢ転写因子によって制御されるものである。静止期では、ＮＦ−κＢのｐ５０およびｐ６５サブユニットは、それらを細胞質中で隔離するＩκＢαとヘテロ３量体複合体を形成する。種々の刺激に反応して、ＩκＢαは分解され、ｐ５０−ｐ６５ヘテロ２量体は、核に転位置され、そこで特異的な制御要素に結合し、遺伝子発現を促進する（Ｂｈａｒｔｉ  ａｎｄ  Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６４：８８３−８８８，２００２）。ＮＦ−κＢは、結腸直腸腺腫および腺癌において上方制御され（Ｋａｒｉｎ，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．４５：３５５−３６１，２００６、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．３１：３８６−３９２，２００５、Ｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ  １３０：３６３−３６９，２００１、Ｋｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２４：６７５−６８１，２００４）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）およびＢｃｌ−２を含む、多くの結腸直腸癌関連遺伝子の発現を制御する（Ｂｈａｒｔｉ  ａｎｄ  Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６４：８８３−８８８，２００２）。また、ＮＦ−κＢは、結腸直腸癌の発症（Ｂｈａｒｔｉ  ａｎｄ  Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６４：８８３−８８８，２００２）、結腸直腸癌に付随する炎症過程（Ｉｔｚｋｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｙｉｏ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８７：Ｇ７−１７，２００４）、および結腸直腸癌の化学療法に対する耐性の発現（Ｃｕｓａｃｋ，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１０：８５２−８６２，２００３、Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：２６２５−２６３２，２００５）にも関与すると考えられている。
【０００６】
患者のために結腸直腸癌の有効な治療法が必要である。本発明は、この必要性および他の必要性を満足させるものである。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者は、ＮＦ−κＢと胆汁酸との予期せぬつながりを発見した。本発明者は、代替転写開始部位から生じるＩＢＡＢＰの変異体を同定した。ファルネソイドＸ受容体／胆汁酸受容体（ＦＸＲ）によって転写されるＩＢＡＢＰとは異なり、ＩＢＡＢＰ−Ｌと命名した新しい変異体は、遠位プロモーター内のＮＦ−κＢ結合部位によって制御される。ＩＢＡＢＰ−Ｌは、ＩＢＡＢＰに存在しない４９アミノ酸を、そのＮ末端に含有する。より重要なことは、ＩＢＡＢＰ−Ｌの転写は、結腸直腸腺癌の全ての病期で上方制御されることである。本明細書では、実際に先の研究（ＤｅＧｏｔｔａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．  ４９：９８２−９８９，２００４、Ｏｈｍａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２：５０９０−５０９５，２００６）で報告された結腸直腸癌におけるＩＢＡＢＰの上方制御が、ＩＢＡＢＰ−Ｌの上方制御に起因し得る一方で、既定の形態のＩＢＡＢＰの発現は、結腸直腸癌において変化しないことを示す。さらに重要なことは、ＩＢＡＢＰＰ−Ｌが、２次胆汁酸の存在下における結腸癌細胞の生存に必要なことである。これらの観察は、治療的有用性に利用することができる、胆汁酸、ＮＦ−κＢおよび結腸直腸癌間の重要な機構的つながりを提供する。
【０００８】
本発明の一実施形態によれば、結腸直腸癌細胞の増殖または生存を減少させるための方法を提供し、該細胞を、ＩＢＡＢＰ−Ｌによって胆汁酸結合を減少させる物質を有効量含む組成物に接触させるステップを含む。
【０００９】
かかる方法において、該物質は、ＩＢＡＢＰポリペプチドレベルを減少させることなく、細胞内のＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドレベルを減少させる。かかる別の方法において、該物質は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ遺伝子発現を抑制する。
【００１０】
かかる別の方法において、該物質は、以下の１つ以上を含むが、これらに限定されないポリヌクレオチドである：ｓｉＲＮＡ（後で定義する）、アンチセンスポリヌクレオチド、またはリボザイム。
【００１１】
かかる別の方法において、該ポリヌクレオチドは、該結腸直腸癌細胞内で発現可能であり、発現時に次の群から選択されるポリペプチドのレベルを減少させるポリヌクレオチドをコードする配列に制御可能に連結されたプロモーターを含む：ＩＢＡＢＰ−Ｌ、代謝酵素、細胞周期の進行に必須のタンパク質、アポトーシスを抑制するタンパク質、増殖調節シグナル伝達に関与するタンパク質、および結腸直腸癌細胞外への胆汁酸輸送に関与するタンパク質。
【００１２】
別のかかる方法において、該ポリヌクレオチドは、該結腸直腸癌細胞内で発現可能であり、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、またはリボザイムをコードする配列に制御可能に連結される、プロモーターを含む。
【００１３】
別のかかる方法において、該ポリヌクレオチドは、該結腸直腸癌細胞内で発現可能であり、次の群から選択されるポリペプチドをコードする配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む：アポトーシス促進タンパク質、腫瘍抑制タンパク質、細胞周期の進行を抑制するタンパク質、および結腸直腸癌細胞の細胞質内への毒性２次胆汁酸の運搬に関与するタンパク質。
【００１４】
別のかかる方法において、該物質は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ遺伝子発現の転写活性化を抑制する。
【００１５】
別のかかる方法において、該組成物は、胆汁酸、化学療法薬、非ステロイド性抗炎症薬、自己腫瘍細胞を含むワクチン、腫瘍関連抗原を含むワクチン、腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体、遺伝子修正のための組換え構築物、ウイルスによる酵素−プロドラッグ治療、およびマトリックスメタロプロテアーゼメ阻害剤から成る群の成員を含む。
【００１６】
別のかかる方法において、該組成物は、コール酸およびデオキシコール酸から成る群から選択される胆汁酸を含む。
【００１７】
別のかかる方法において、該組成物は、胆汁酸の存在下で、該結腸直腸癌細胞のアポトーシスを生じさせる。
【００１８】
本発明の別の実施形態によれば、結腸直腸癌治療を必要としている患者に結腸直腸癌を治療する方法を提供し、上にさらに既定されたように、ＩＢＡＢＰ−Ｌによる胆汁酸結合を減少させる組成物を有効量、該患者に投与するステップを含む。
【００１９】
本発明の別の実施形態によれば、次の群から選択されるポリヌクレオチドを含む組成物が提供される：発現時にＩＢＡＢＰ−Ｌによる胆汁酸結合を減少させる配列に制御可能に連結されるＩＢＡＢＰ−Ｌプロモーターを含む発現ベクター、ＩＢＡＢＰ−Ｌ遺伝子発現を減少させるｓｉＲＮＡ、ＩＢＡＢＰ−Ｌ遺伝子発現を減少させるアンチセンスポリヌクレオチド、およびＩＢＡＢＰ−Ｌ遺伝子発現を減少させるリボザイム。
【００２０】
かかる組成物は、発現ベクターを含み、該ベクター中の配列は、次の群から選択されるポリペプチドをコードする：アポトーシス促進タンパク質、腫瘍抑制因子、細胞周期の進行の阻害剤、結腸直腸癌細胞の細胞質内への毒性２次胆汁酸の運搬に関与するタンパク質、およびＩＢＡＢＰ−Ｌ遺伝子発現の転写活性化の阻害剤。
【００２１】
かかる別の組成物は、発現ベクターを含み、該ベクター中の配列は、該結腸直腸癌細胞内のポリペプチドのレベルを減少させるポリヌクレオチドをコードし、次の群から選択されるポリペプチドをコードする：ＩＢＡＢＰ−Ｌ、代謝酵素、細胞周期の進行に必須のタンパク質、アポトーシスを抑制するタンパク質、増殖調節シグナル伝達に関与するタンパク質、および結腸直腸癌細胞外への胆汁酸輸送に関与するタンパク質。
【００２２】
かかる別の組成物は、発現ベクターを含み、該ベクター中の配列は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、およびリボザイムから成る群から選択されるポリヌクレオチドをコードする。
【００２３】
かかる別の組成物は、発現ベクターを含み、該ベクター中の配列は、胆汁酸の存在下で、結腸直腸癌細胞内で発現される時に、該結腸直腸癌細胞のアポトーシスを生じさせる。
【００２４】
かかる別の組成物は、限定されないが、担体を含む１つ以上の追加成分、または、限定されないが、次のものを含むＩＢＡＢＰ−Ｌの胆汁酸結合活性を抑制する１つ以上の有効成分を含む：化学療法薬、非ステロイド性抗炎症薬、自己腫瘍細胞を含むワクチン、腫瘍関連抗原を含むワクチン、腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体、遺伝子修正のための組換え構築物、ウイルスによる酵素−プロドラッグ治療、またはマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤。
【００２５】
かかる組成物は、結腸直腸癌治療を必要としている患者の結腸直腸癌を治療するために有効であるものを含む。
【００２６】
本発明の別の実施形態によれば、結腸直腸癌治療を必要とする患者の結腸直腸癌を治療する方法を提供し、前述の組成物のいずれかを有効量、該患者に投与するステップを含む。
【００２７】
本発明の別の実施形態によれば、結腸直腸癌治療を必要としている患者の結腸直腸癌を治療するための組成物を提供し、かかる組成物は、該患者のＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドのレベルを減少させるｓｉＲＮＡ構築物を有効量含む。かかる組成物は、ＩＢＡＢＰポリペプチドのレベルを大幅に減少させることなく、該患者において、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドのレベルを減少させるものを含む。かかる組成物は、さらに、限定されないが、コール酸またはデオキシコール酸を含む胆汁酸および／または医薬的に容認可能な担体を含み得る。本発明の関連実施形態によれば、結腸直腸癌治療を必要としている患者の結腸直腸癌を治療するための方法を提供し、前述の組成物のいずれかを有効量、該患者に投与するステップを含む。かかる方法は、該組成物を、該患者に経口または直腸（例えば、浣腸によって）投与するステップを含み得る。
【００２８】
本発明の別の実施形態によれば、結腸直腸癌細胞の増殖または生存を減少させるのに有効な薬剤を同定する方法を提供し、（ａ）ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドを含む試料を、該薬剤を含む組成物と接触させるステップと、（ｂ）該組成物が、該ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドによる胆汁酸結合活性を減少させるかどうかを決定するステップと、を含む。
【００２９】
かかる方法において、該試料は、結腸直腸癌細胞である。かかる方法は、該組成物が、該細胞内のＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドのレベルを減少させるかどうかを決定するステップを含み得る。また、かかる方法は、該結腸直腸癌細胞を、該組成物に接触させるステップ、および該組成物が、該結腸直腸癌細胞の増殖または生存を減少させるかどうかを決定するステップも含み得る。
【００３０】
本発明の別の実施形態によれば、ＩＢＡＢＰ−Ｌ活性の阻害剤を、結腸直腸癌細胞の増殖または生存を減少させるべく、薬物を調製するために使用する。
【００３１】
本発明の別の実施形態によれば、ＩＢＡＢＰ−Ｌ活性の阻害剤を、結腸直腸癌の治療を必要としている男性の結腸直腸癌を治療すべく、薬物を調製するために使用する。
【００３２】
本発明の実施は、特に記載がない限り、当業者の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を用いるものである。かかる技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．ｂｙ  Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｄａｓｓｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｈａｒｆｏｒｄ，ａｎｄ  Ｙａｍａｄａ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９３、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，  １９８７）を参照されたい。
【００３３】
本発明の前述の態様および他の態様は、以下の発明を実施するための形態、添付の図面、および特許請求の範囲からより明らかになるであろう。
【００３４】
特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と同様または均等な方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書に言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照することによりそれら全体が本願明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合には、定義を含めて、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は、例証の目的のみであり、制限することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】エクソン（Ｅ１−Ｅ７）および提案されるプロモーター（Ｐ１およびＰ２）を有するＩＢＡＢＰ−Ｌ（ｆａｂｐ６）の構造を示す図である（縮尺通りに描かれていない）。Ｐ１は、本明細書において同定された新しい変異体（実施例１）であるＩＢＡＢＰ−Ｌの発現を促す。ＩＢＡＢＰ−Ｌは、７つのエクソンを有し、そのうちの最初の３つがＩＢＡＢＰ−Ｌに特有である。Ｐ２は、ＩＢＡＢＰの既知の形態であるＩＢＡＢＰの転写を促進する。ＩＢＡＢＰは、エクソン４ｂからエクソン７までをＩＢＡＢＰ−Ｌと共有する。
【図２】ＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰの両方をコードする、ＩＢＡＢＰ遺伝子（配列番号１）（つまり、ゲノム配列）の読み取り枠（オープンリーディングフレーム：ＯＲＦ）を示す図である。ＩＢＡＢＰ（１４ｋＤａ形態）の読み取り枠に下線を付し、ＩＢＡＢＰ−Ｌに対する付加的読み取り枠配列は、グレーでハイライトした。したがって、ＩＢＡＢＰ−Ｌに対する読み取り枠は、ＩＢＡＢＰに対するＯＲＦの大部分に加え、遺伝子５’末端の６２７ヌクレオチドをさらに含有する。ポリ（Ａ）シグナルは太字にして下線を付した。
【図３】ＩＢＡＢＰ−Ｌ（配列番号２）（図２中グレーでハイライトした）に特有であるＩＢＡＢＰ遺伝子からのＤＮＡ配列を示す図である
【図４】ＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰに対するｃＤＮＡ配列アラインメントを示す図である。ＩＢＡＢＰ−Ｌ（上部線）（配列番号３）に対するｃＤＮＡ配列を示し、ＡＴＧ開始部位を太字で表す。ＩＢＡＢＰ（下部線）（配列番号４）に対するｃＤＮＡ配列はグレーでハイライトしている。エクソン１、２および３は、ＩＢＡＢＰ−Ｌに特有である（ＩＢＡＢＰに対するあらゆる相同エクソンの欠乏を示す点線に留意されたい）。エクソン４ａ（下線）は、ＩＢＡＢＰに対するｃＤＮＡ中にのみ存在する。エクソン４ｂ〜７は、ＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰの両方のｃＤＮＡによって共有される。
【図５】ＩＢＡＢＰ−Ｌ（配列番号５）をコードするｃＤＮＡの配列を示す図である。
【図６】ＩＢＡＢＰ−ＬｃＤＮＡ（配列番号６）からのＮ末端４９アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す図である。
【図７】ＩＢＡＢＰ−Ｌ（上部線）（配列番号７）およびＩＢＡＢＰ（下部線、グレーでハイライト）（配列番号８）に対するポリペプチド配列のアラインメントを示す図である。ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドは、そのＮ末端に、ＩＢＡＢＰポリペプチドに存在しない４９アミノ酸配列を含有する。
【図８】ＩＢＡＢＰ−Ｌ（配列番号９）の予測ポリペプチド配列を示す図である。ＩＢＡＢＰポリペプチド中に見られないＩＢＡＢＰ−Ｌの４９アミノ酸Ｎ−末端配列をグレーでハイライトした。
【図９】消化器内のＩＢＡＢＰおよびＩＢＡＢＰ−Ｌの発現を示す図である。ヒト肝臓、胆嚢、および消化器管切片（十二指腸から直腸）から抽出したＲＮＡを鋳型として使用して、ＩＢＡＢＰおよびＩＢＡＢＰ−Ｌの定量化を目的とする定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。各変異体の発現は、ハウスキーピング遺伝子ＡＲＰＰ０を使用して正規化した。
【図１０】ＦＸＲおよびＲＸＲのアゴニストが、ＩＢＡＢＰの発現を調節するが、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現を調整しないことを示す図である。ヒトＣａｃｏ−２（腸細胞様）細胞を、ＦＸＲアゴニストであるケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）もしくはデオキシコール酸（ＤＣＡ）（１００μＭ）とともに、またはＲＸＲアゴニストである９ｃＲＡ（１００ｎＭ）とともに、２４時間インキュベートした。ＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰの発現を、定量ＲＴ−ＰＣＲで測定した。各変異体のｍＲＮＡコピー数は、ハウスキーピング遺伝子ＡＲＰＰ０の発現に対して正規化された。図中の値は、３回の実験の平均を表し、各再現は２度行った。
【図１１】結腸直腸癌におけるＩＢＡＢＰ−Ｌの上方制御を示す図である。総ＲＮＡを、６８セットの一致したヒト結腸直腸および隣接正常粘膜から単離し、これを鋳型として２ステップ定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。変異体に特異的なプライマーを使用して、ＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰをコードするｍＲＮＡを定量化した。値をＡＲＰＰ０の発現に対して正規化した。細胞腫および正常粘膜間の発現差異は、細胞腫および正常粘膜間のＩＢＡＢＰ変異体の倍率変化（Ａ）としてか、または結腸直腸癌（ＲＣ）対隣接正常粘膜（ＲＮ）におけるＩＢＡＢＰ対ＩＢＡＢＰ−Ｌの比率（Ｂ）として表した。エラーバーは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【図１２】ＩＢＡＢＰ−Ｌの上方制御に対する、臨床病期の影響を示す図である。正常組織対ポリープ（ＲＰ／ＲＮ）、および正常組織対腫瘍（ＲＣ／ＲＮ）での変化率、総称してＲＴ／ＲＮを、臨床病期で分けた。バーは、平均±ＳＥＭを示す。病期ＩＩ−ＩＶ細胞腫におけるＲＰ／ＲＮおよびＲＣ／ＲＮ間の差異は有意である（Ｐ＜０．０２）。
【図１３】ｓｈＲＮＡによるＩＢＡＢＰ−Ｌの発現の減少が、ＨＣＴ１１６細胞の増殖を抑制することを示す図である。ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞の増殖を８日間にわたってモニターした。細胞を、ウェル当たり７０００個の細胞密度で、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに播種した。増殖を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒキットを用いて、毎日モニターした。毎日、キットの試薬を２０マイクロリットルウェルに添加し、３７℃で１．５時間インキュベートした。４９０ｎｍでウェルの比色読み取りを記録した。細胞増殖を、初期播種（７０００個の細胞／ウェル）の吸光度のパーセンテージとしてプロットする。ＩＢＡＢＰ−Ｌノックダウンの増殖への効果を測るために、細胞に、ＩＢＡＢＰ−Ｌを標的とするｓｈＲＮＡをコードするｐＳＭ２ｃレトロウイルスベクターを形質移入（トランスフェクション）した（■）。対照は、偽形質移入を行った細胞（◆）、空ベクターを形質移入した細胞（▼）、および無関係のｓｉＲＮＡを形質移入した細胞（▲）を含む。
【図１４】２次胆汁酸の存在下における結腸癌細胞の生存に必要なＩＢＡＢＰ−Ｌを示す図である。ＨＣＴ１１６細胞に、ＩＢＡＢＰ−Ｌを標的とするｓｈＲＮＡをコードするｐＳＭ２ｃレトロウイルスベクター（暗いバー）、無関係のスクランブルｓｈＲＮＡ（グレーバー）、空ベクター（白いバー）を形質移入するか、または単に偽形質移入（斜交平行バー）を行った。細胞は、９６ウェルプレートに、２，０００細胞／ウェルで播種した。４８時間後、細胞を、媒体または２００μＭデオキシコール酸のいずれか一方で２４時間処置した。細胞死は、製造業者のプロトコルに従い、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡｐｌｕｓキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用してモニターした。このキットは、アポトーシスに特有の過程であるＤＮＡ断片化を定量化する。
【図１５】ＩＢＡＢＰ−Ｌを標的とするｓｈＲＮＡベクターの構成を示す図である。ＩＢＡＢＰ−Ｌ（５’−ＧＣＣＣＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＧＴＣ−３’）を標的する配列、およびその逆相補配列（５’−ＧＡＣＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＴＴＧＣＧＧＧＣ−３’）を有する９７ｂｐ二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、レトロウイルスベクターｐＳＭ２（Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３７：１１，１２８１−１２８８，２００５）に挿入した。このレトロウイルスベクターｐＳＭ２は、細胞内でｓｈＲＮＡを発現させるために使用することができる。挿入した配列は、Ｕ６プロモーターを介してＩＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼで転写され、マイクロＲＮＡを産生する。転写されたマイクロＲＮＡは、ＤｒｏｓａおよびＤｉｃｅｒで処理され、両方のＩＢＡＢＰ−Ｌを標的とする特異的ｓｉＲＮＡに変化する。
【図１６】ＩＢＡＢＰ−Ｌノックダウンが、ＤＣＡ誘導の細胞死に対する感受性を高めることを示す図である。（Ａ）ＨＣＴ１１６細胞は、ＩＢＡＢＰ  ｍＲＮＡよりも１３倍高いレベルで、ＩＢＡＢＰ−ＬｍＲＮＡを発現する。（Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞は、ＤＣＡ（１００μＭ）によって誘導される細胞死に対する耐性があり、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現量のノックダウンは、ＤＣＡ誘導の細胞死に対して、細胞の感受性を増大させる。
【図１７】−１５６３から＋７８のＩＢＡＢＰ−Ｌプロモーターのヌクレオチド配列を示す図である。ＮＦ−κＢ結合部位（グレーでハイライト）は、−１１６９で開始し、−１１５３で終わる。転写開始部位（太字および下線）は、プライマー伸長で決定した。
【図１８】ＩＢＡＢＰ−Ｌプロモーター中の機能的ＮＦ−κＢ結合部位の存在を明らかにする、ＩＢＡＢＰ−Ｌプロモーターの欠失を示す図である。
【図１９】ＩＢＡＢＰ−Ｌプロモーター中の機能的ＮＦ−κＢ結合部位の存在を示す、ＩＢＡＢＰ−Ｌプロモーターの種々の欠失の機能分析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明者は、ＩＢＡＢＰの新しい変異体を同定し、それをＩＢＡＢＰ−Ｌと命名した。ＩＢＡＢＰ−Ｌに対する転写物は、ＩＢＡＢＰ遺伝子中の代替開始部位から生じ、ＩＢＡＢＰに存在しない３つのエクソンを含む。ＩＢＡＢＰ−Ｌはまた、第４エクソンの一部をＩＢＡＢＰと共有する。ＩＢＡＢＰ−Ｌによってコードされるタンパク質は、ＩＢＡＢＰポリペプチドにより共有されない特有の４９アミノ酸長のＮ末端配列を含有する。最も重要なことは、ＩＢＡＢＰ−Ｌは、結腸直腸癌の全ての病期および悪性結腸ポリープにおいて上方制御・調節されることである。対照的に、１４ｋＤａ  ＩＢＡＢＰをコードするより短い転写物の発現は、結腸直腸癌において有意に変化しない。
【００３７】
ＩＢＡＢＰ−Ｌ転写物は、正常なヒト腸全体にわたって同様のレベルで発現される。これは、空腸から上行結腸にまで及ぶ腸の切片において桁違いに高いレベルで発現される、ＩＢＡＢＰをコードする転写物とは対照的である。腸のこれらの領域において、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現は、ＩＢＡＢＰより少なくとも１桁低い。また、２つの転写物は、胆汁酸への応答の点でも異なる。胆汁酸は、ＦＸＲ転写経路の一部としてＩＢＡＢＰの発現を刺激するが（Ｇｒｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２９７４９−２９７５４，１９９９）、それらは、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現には影響しない。
【００３８】
本発明者は、６８人の患者からの結腸直腸癌試料中のＩＢＡＢＰおよびＩＢＡＢＰ−Ｌの発現を比較した。ＩＢＡＢＰは、結腸直腸癌において本質的に変化がないが、ＩＢＡＢＰ−Ｌは上方制御される。殆どの場合において、上方制御は大幅なものであり、ｍＲＮＡの相対コピー数の平均増加は３０倍を超える。ＩＢＡＢＰ−Ｌは、早期悪性ポリープにおいて上方制御され、その高発現は、腫瘍分化の後の全ての臨床的分類で。明白に観察される。結腸直腸癌での上方制御の傾向は、２つの転写物を区別できないＰＣＲプライマーでも明らかであるが、ＩＢＡＢＰ−Ｌの特異的計測の方が、はるかに精度が高い。
【００３９】
ＩＢＡＢＰ−Ｌは、バイオマーカーとして有用である。第１に、結腸直腸癌でのＩＢＡＢＰ−Ｌの発現増加は、患者の年齢または性別と無関係である。第２に、結腸癌細胞株の研究に基づくと、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現は、ｐ５３、ＡＰＣ、またはＫ−ｒａｓ等のタンパク質の一般的な発癌性変異とは無関係であると考えられる。それにもかかわらず、ＩＢＡＢＰ−Ｌが、多くの腫瘍において上方制御されるという事実と鑑みると、細胞株からの研究は、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現が、単一癌遺伝子の病変に左右される可能性は極めて低いことを示している。第３に、ＩＢＡＢＰとは異なり、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現は、胆汁酸に影響されない。したがって、ＩＢＡＢＰ−Ｌのレベルは、食事の変化または全体的な健康状態の結果として生じる胆汁酸の変化に関係するとは、予期しないであろう。まとめると、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現は、多くの特性を有し、それによって、結腸直腸癌への広範に適用可能なテストとしての使用に十分に適している。
【００４０】
本発明者は、試料中のＩＢＡＢＰ−Ｌ対ＩＢＡＢＰの発現比（ＲＣ／ＲＮ）が、ＩＢＡＢＰ−Ｌ単独の相対レベルよりも、わずかに良好な結腸直腸癌の予測因子であることを見出した。
【００４１】
また、本発明者は、種々の手段を通じて、ＩＢＡＢＰ−Ｌによって胆汁酸結合を減少させることが、結腸直腸癌の治療に使用し得ることも見出した。これは、例えば、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現を減少させるｓｉＲＮ構築物、アンチセンス構築物またはリボザイムの発現によって、結腸直腸癌細胞中のＩＢＡＢＰ−Ｌのレベルを減少させることにより達成することができる。代わりに、限定されないが、例えば、抗体等のタンパク質、または化学物質（例えばＩＢＡＢＰ−結合活性を抑制する非タンパク性化合物）によって、ＩＢＡＢＰ−Ｌの胆汁酸結合活性を減少させることにより、達成することができる。
【００４２】
本明細書で用いる「結腸直腸癌」という用語は、原発性結腸直腸癌、進行性結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌を含むが、これらに限定されない。また、「結腸直腸癌」という用語は、正常な非癌性細胞と比較したときの、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現の増加に特徴付けられる前癌症状も含む。
【００４３】
さらに、本発明者は、ＩＢＡＢＰプロモーターは、結腸直腸癌を治療するために、結腸直腸癌細胞内の種々のＤＮＡ配列の発現に有用であることが分かった。
【００４４】
以下の定義および方法は、本発明をより明確にするために、かつ当業者による本発明の実施を導くために提供される。特に断りのない限り、用語は、当業者による通常の用法に従って理解されるものとする。また、分子生物学における一般用語の定義は、Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１、およびＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４でも見いだし得る。３７ＣＦＲ１．８２２に記載のＤＮＡ塩基に対する命名法を使用する。また、アミノ酸残基に対する標準的な１文字および３文字命名法を使用する。
ＩＢＡＢＰおよびコレステロール代謝
【００４５】
コレステロールは、膜生合成、カベオラ形成、および胚性シグナリング分子の分布を含む広範囲の生理的過程に必須の多機能分子である。また、ステロイドホルモンおよびオキシステロールを含む、転写活性のある脂質の合成において、前駆物質としても必須である（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｃｅｌｌ  ８９：３３１−３４０，１９９７）。必須ではあるが、コレステロールは高度に不溶性であり、胆石および心疾患を含む種々の疾患に寄与する沈着物を形成し得る（Ｄｏｗｌｉｎｇ，Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４  Ｓｕｐｐｌ．２：３９−４７，２０００、Ｊｏｎｅｓ，Ａｍ．Ｊ．Ｍａｎａｇ．Ｃａｒｅ．７：Ｓ２８９−Ｓ２９８，２００１）。
【００４６】
コレステロールレベルは、腸吸収、内因性生合成、輸送、および排泄を含む種々のレベルで制御される。コレステロール排泄のための主要経路は、コレステロールの水溶性胆汁酸への肝変換を経た後の（Ｃｈｉａｎｇ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．３：Ｄ１７６−Ｄ１９３，１９９８）、胃腸管内への分泌である。分泌された胆汁酸の約９５％は、腸吸収を介して再循環し、門脈血を通って肝臓に戻る。胆汁酸の残り５％は、腸から除去される。したがって、毎日０．５ｇものコレステロールを胆汁酸に変換させることによって、肝臓にこれらの損失を補充させる（Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｃｅｌｌ  ９７：５３９−５４２，１９９９）。したがって、肝臓は、コレステロールを代謝する莫大な能力を有し、この過程を対象とする療法は、食事、合成、および動脈硬化病変（コレステロール逆輸送経路を介する）を含む、様々な源から派生するコレステロールを除去する可能性を有する。
【００４７】
コレステロールを胆汁酸に変換する２つの代謝経路が確認されている（Ｃｈｉａｎｇ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．３：Ｄ１７６−Ｄ１９３，１９９８）。ヒトでは、古典経路が、全胆汁酸合成の少なくとも９０％に関与する。この経路における第１かつ律速段階は、肝臓特異的コレステロール７α−ヒドロキシラーゼであるＣＹＰ７Ａ１によって触媒される。ＣＹＰ７Ａ１の転写は、胆汁酸最終産物によって強く抑制される（Ｍｙａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．１８：１３５−１５３，１９７７）。核内受容体スーパーファミリーの一メンバー（ＦＸＲ、ＮＲ１Ｈ４、以下ＢＡＲと称する）は、内在性胆汁酸に反応してＣＹＰ７Ａ１の転写を抑制する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ３：５４３−５５３，１９９９、Ｍａｋｉｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１３６２−１３６５，１９９９、Ｐａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１３６５−１３６８，１９９９、Ｓｉｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １０２：７３１−７４４，２０００）。２つの胆汁酸応答エレメント（ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ：ＢＡＲＥ）が、ＣＹＰ７Ａ１プロモーター中で確認されている。しかしながら、ＢＡＲは、どちらのエレメントにも直接結合することができず、ＣＹＰ７Ａ１の調節において、ＢＡＲは、間接的役割を果たすことが示唆される（Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１０９１８−１０９２４，２０００）。ＢＡＲが負の転写調節因子であるＳＨＰ（小ヘテロ２量体パートナー）を誘導し、次いで、それが、ＣＹＰ７Ａ１  ＢＡＲＥに結合する転写因子を抑制するメカニズムが提唱されている（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ６：５０７−５１５，２０００、Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ６：５１７−５２６，２０００）。ＣＹＰ７Ａ１を抑制するこのメカニズムは、一時的に過剰発現したＳＨＰを用いた実験に基づいて提案された。ＳＨＰは、これらの条件下で、多数の核内受容体を抑制（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１８７−１９５，２０００、Ｓｅｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １２：１５５１−１５５７，１９９８）および／または活性化（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１５８６−１５９２，２００２）することができるため、ＳＨＰ誘導モデルは、胆汁酸が遺伝子転写を調節する特異性を説明しない。
【００４８】
ＢＡＲによる転写抑制の根底となるメカニズムは不明だが、ＢＡＲが、核内受容体ＲＸＲとともにヘテロ２量体をなし、これが特異的応答エレメント（Ｆｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８１，６８７−６９３，１９９５、Ｌａｆｆｉｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１０６３８−１０６４７，２０００）に結合することによって転写を活性化させることは、既知である。ＳＨＰ、回腸胆汁酸結合タンパク質（ＩＢＡＢＰ）、および肝内胆汁塩輸出ポンプ（ＢＳＥＰ，ＡＢＣＢ  １１）を含むＢＡＲによって転写が活性化される、幾つかの遺伝子が同定されている（Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４３：２−１２，  ２００２）。これらの遺伝子は、胆汁酸恒常性にとって重要である。ＩＢＡＢＰは、胆汁酸の大部分が再吸収される回腸遠位部で発現される、細胞内タンパク質である。ＩＢＡＢＰは、経細胞輸送および／またはこの組織を通過する胆汁酸の高いレベルやその他毒性レベルを緩衝する役割を果たすことが提唱されている。ＢＳＥＰは、胆汁酸の胆汁分泌に関与する胆管側ＡＴＰ結合カセットトランスポーターである。実際、この遺伝子を不活性化させる変異は、家族性進行性肝内胆汁鬱滞（２型）および肝硬変を引き起こす（Ｓｔｒａｕｔｎｉｅｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：２３３−２３８，１９９８）。したがって、コレステロール分解を調節することに加えて、ＢＡＲは、胆汁酸生理機能を協調的に調節する、より一般的な役割を果たす。
【００４９】
また、ＢＡＲは、脂質恒常性の他の態様も制御する。例えば、ＢＡＲアゴニストは、トリグリセリドレベルを減少させ（Ｉｓｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｌｉ，  Ｄｒｕｇｓ  ２１：９０−１１９，１９８１、Ｍａｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．４３，２９７１−２９７４，２０００）、ＢＡＲヌルマウスでは、トリグリセリドレベルが上昇している（Ｓｉｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０２：７３１−７４４，２０００）。これは、ＢＡＲが媒介するアポリポタンパク質ＣＩＩおよび／またはリン脂質輸送タンパク質の調節に関連する可能性がある（Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４３：２−１２，２００２において再調査された）。メカニズムにかかわりなく、ＢＡＲ活性化は、コレステロールおよびトリグリセリドレベルに対する相互効果を促進させるように考えられる。２つのクラスのＢＡＲ修飾因子が同定されている（Ｄｕｓｓａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：７０２７−７０３３，２００３）。最初のクラスは、自然発生の胆汁酸よりも約２５倍強力なアゴニストを含む。これらの化合物は、ＢＡＲを活性化させ、内在性標的遺伝子に、予期される調節パターンを生成する。ＡＧＮ３４は、遺伝子選択的ＢＡＲ修飾因子（ＢＡＲ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ：ＢＡＲＭ）として同定されており、これは、ＣＹＰ７Ａ１に対するアゴニスト、ＩＢＡＢＰに対するアンタゴニストとして作用し、ＳＨＰに対して中性である（Ｄｕｓｓａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：７０２７−７０３３，２００３）。
ポリヌクレオチド
【００５０】
ＩＢＡＢＰ−Ｌに対する転写物（ｍＲＮＡ）は、ＩＢＡＢＰの転写開始部位とは異なる代替開始部位から生じる。ＩＢＡＢＰ−Ｌ転写物は、ＩＢＡＢＰ転写物に存在せず、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドのアミノ（Ｎ）末端で４９アミノ酸配列をコードする３つのエクソン（ＩＢＡＢＰ遺伝子のエクソン１−３）に対応する配列を含む。したがって、エクソン１−３の配列は、ＩＢＡＢＰ−Ｌに特有であり、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチドを同定および定量化するためのプローブおよびプライマーを生成するため、ならびに他の目的のために有用である。
【００５１】
本明細書で用いる「ＩＢＡＢＰ−Ｌエクソン１−３ポリヌクレオチド（またはプローブもしくはプライマー）」という用語は、ＩＢＡＢＰ遺伝子のエクソン１、２および３に対応する配列から成り、かつＩＢＡＢＰ転写物には存在しないポリヌクレオチド（またはプローブもしくはプライマー）、つまり、４９アミノ酸ＩＢＡＢＰ−Ｌ  Ｎ末端ポリペプチド（以下に定義されるような）に対するコード領域を指す。
【００５２】
本明細書で用いる「ＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチド」という用語は、このＩＢＡＢＰ−Ｌ  ｍＲＮＡ、および、限定されないが、そのタンパク質コード領域を含むｃＤＮＡを指す。また、「ＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチド」は、例えば、ＩＢＡＢＰ−Ｌエクソン１−３ポリヌクレオチドを含むＩＢＡＢＰ−ＬのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの部分または断片、ＩＢＡＢＰ−Ｌの抗原決定基をコードする断片（例えば、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドに選択的に結合する抗体を誘発するもの）、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするプローブおよびプライマー等を含むが、これらに限定されない。また、「ＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチド」には、ＩＢＡＢＰ−Ｌ  ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの断片または一部も包含される。また、「ＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチド」には、野生型ＩＢＡＢＰ−Ｌ配列からの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む変異、例えば、ＩＢＡＢＰ−Ｌに選択的に結合する能力を保持し、ＩＢＡＢＰ−Ｌ抗原決定基を含むポリペプチドをコードし、ＩＢＡＢＰ−Ｌ活性を有するポリペプチドをコードする等の変異または変異体ポリヌクレオチドも含む。
【００５３】
本明細書で用いる「選択的にハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、他のポリヌクレオチドよりも実質的に高い程度まで、天然、もしくは野生型ＩＢＡＢＰ−Ｌ  ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ等の標的ポリヌクレオチドに、プローブ、プライマーまたは他のポリヌクレオチドが結合することを指す。ＩＢＡＢＰ−Ｌに選択的にハイブリダイズするプローブおよびプライマーは、ＩＢＡＢＰ−Ｌに特有な配列、つまり、エクソン１−３を含む。特に、ＩＢＡＢＰ−Ｌに「選択的にハイブリダイズする」プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＩＢＡＢＰに実質的にハイブリダイズしないため、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチド（例えば、ＩＢＡＢＰ  ｍＲＮＡ）をＩＢＡＢＰポリヌクレオチドと区別するために使用することができる。同様に、ＩＢＡＢＰ−Ｌに「選択的にハイブリダイズする」プライマーは、ＰＣＲ等の増幅反応下で使用する場合、好適な増幅条件下で、ＩＢＡＢＰの実質的な増幅を生じさせることなく、ＩＢＡＢＰ−Ｌの増幅をもたらす。したがって、全てのまたは実質的に全てのＩＢＡＢＰ−Ｌ選択的プローブまたはプライマーは、特定の手順の感受性を考慮して決定できるように、好適な条件下で標的ＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチドにハイブリダイズする。同様に、本明細書で用いる、ポリヌクレオチドに関する「に対して選択的」という用語は、ポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズすることを示す。
【００５４】
同様に、エクソン４ａ（図４参照）からの配列等、ＩＢＡＢＰに特有の配列を含むプローブまたはプライマーは、ＩＢＡＢＰに選択的にハイブリダイズする。特に、ＩＢＡＢＰに選択的にハイブリダイズするプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＩＢＡＢＰ−Ｌに実質的にハイブリダイズしないため、ＩＢＡＢＰポリヌクレオチド（例えば、ＩＢＡＢＰ  ｍＲＮＡ）をＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチドと区別するために使用することができる。同様に、ＩＢＡＢＰポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするプライマーは、ＰＣＲ等の増幅反応下で使用する場合、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチドの実質的な増幅を生じさせることなく、ＩＢＡＢＰポリヌクレオチドの増幅をもたらす。したがって、全てのまたは実質的に全てのＩＢＡＢＰ選択的プローブまたはプライマーは、特定の手順の感受性を考慮して判断できるように、標的ＩＢＡＢＰポリヌクレオチドにハイブリダイズする。
【００５５】
本明細書で用いる「天然ＩＢＡＢＰエクソン４ａポリヌクレオチド（またはプローブもしくはプライマー）」という用語は、ＩＢＡＢＰ遺伝子のエクソン４ａに対応する配列から成り、ＩＢＡＢＰ−Ｌ転写物には存在しないポリヌクレオチド（またはプローブもしくはプライマー）を指す。
【００５６】
ＩＢＡＢＰ  ｍＲＮＡからの配列はＩＢＡＢＰ−Ｌ  ｍＲＮＡにも存在するため、そのような共有配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列もまた、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチドからの配列に選択的にハイブリダイズし得る。したがって、ＩＢＡＢＰおよびＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチドによって共有される十分な長さの配列を含むプローブまたはプライマーは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＩＢＡＢＰおよびＩＢＡＢＰ−Ｌの両方にハイブリダイズするが、そのような配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、試料中の他のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズしないため、ＩＢＡＢＰおよびＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチドに「選択的に」結合すると考えることができる。
【００５７】
本明細書で用いる、ポリヌクレオチドに関する「野生型」または「天然」という用語は、細胞もしくは生物、またはその断片で見られる参照ポリヌクレオチドとの配列の相同性を１００％有するポリヌクレオチドを指す意で使用される。
【００５８】
ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列は、自動ＤＮＡシーケンサーを使用して、ポリヌクレオチド分子の配列を読み取ることによって決定することができる。この自動手法によって決定されたポリヌクレオチド配列は、誤りを含み得る。実際の配列は、当該技術分野において当該技術分野既知の手動の配列決定方法によって、または自動手段によって、配列を再読み取りすることにより、確認することができる。
【００５９】
特に明記しない限り、本明細書に記載した各「ヌクレオチド配列」は、デオキシリボ核酸（略称Ａ、Ｇ、ＣおよびＴ）の配列として表す。しかしながら、本明細書では、ＤＮＡ分子の「ヌクレオチド配列」という用語はデオキシリボ核酸の配列を指すが、ＲＮＡ分子に対しては、特定のデオキシヌクレオチド配列内のチミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）が、ウリジンリボヌクレオチド（Ｕ）に置換されたリボ核酸（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ）の対応配列を指す。
【００６０】
「単離された」ポリヌクレオチドは、その天然環境から除去されたポリヌクレオチドを意図する。例えば、ベクターに含まれる組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例は、異種宿主細胞内に維持された組換えポリヌクレオチド、または溶液中の精製された（部分的にまたは大幅に）ポリヌクレオチドを含む。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子の生体内または生体外ＲＮＡ転写物を含む。さらに、本発明による単離されたポリヌクレオチドは、合成された分子を含む。
【００６１】
ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ等のＲＮＡの形か、または例えば、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形であることができる。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であることができる。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としても既知の有意鎖であることができ、また、アンチセンス鎖としても称される非有意鎖であることもできる。ポリヌクレオチドは、非自然発生のヌクレオチドまたはリボヌクレオチド類似体を含むことができる。
【００６２】
本明細書で用いる（ポリヌクレオチドの）「断片」という用語は、例えば、プローブおよびプライマーとして有用である、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、または４０ヌクレオチド（ｎｔ）の長さより長いポリヌクレオチドの一部であるポリヌクレオチドを指す。ＩＢＡＢＰ−ＬｃＤＮＡ（のエクソン１−３つまり、ＩＢＡＢＰ−Ｌの４９アミノ酸Ｎ末端ポリペプチドをコードする配列）の全部または一部、またはさらにその一部分を含む配列から成るポリヌクレオチドは、例えば、ＩＢＡＢＰ−Ｌの全長ｃＤＮＡの断片と見なされるであろう。したがって、例えば、少なくとも長さ２０ヌクレオチドのＩＢＡＢＰ−Ｌの断片は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列からの２０以上の隣接塩基を含む。そのようなＤＮＡ断片は、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を使用して、または制限酵素切断もしくは全長ＩＢＡＢＰ−Ｌ  ｃＤＮＡの（例えば、超音波処理による）剪断によって産生し得る。
【００６３】
また、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で例えばＩＢＡＢＰ−Ｌ転写物（例えばｍＲＮＡ）等のＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドも、本発明に包含される。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌ変性かつ剪断されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液において、４２℃での一晩のインキュベーション、続いて、約６５℃で０．１ｘＳＳＣ中でのフィルターの洗浄を意図する。代替として、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）の遂行に使用される条件である。そのようにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、通常のＤＮＡハイブリダイゼーション技術に準じたプローブとして、またはポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）による標的配列の増幅のためのプライマーとして、診断上有用である。
【００６４】
本明細書で用いる「特異的にハイブリダイズする（または結合する）」という用語は、「選択的にハイブリダイズする（または結合する）」という用語と同じ意味で使用することができ、プローブまたはプライマーの殆どのまたは実質的に全てのハイブリダイゼーションが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、特定のポリヌクレオチドに対して行われることを意味する。
【００６５】
また、本発明は、ポリペプチドの全てまたは一部、例えば、全長ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその一部をコードするポリヌクレオチドも提供する。そのようなタンパク質コードポリヌクレオチドは、限定されないが、特定のポリペプチドまたはその断片のアミノ酸配列をコードする配列を含み得る。また、そのようなタンパク質コードポリヌクレオチドは、限定されないが、例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安定性、付加的な機能性を提供するような付加的アミノ酸をコードしている付加コード配列を含む）に関与しており、転写されるが翻訳されない配列、例えばイントロンおよびコードされない５’および３’配列のような、付加的な非コード配列も含み得る。加えて、ポリペプチドをコードする配列は、異種ポリペプチド、または、例えば、融合したポリペプチドの精製を促進するマーカー配列等のペプチド配列に融合することができる。そのようなマーカー配列の一例は、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）により提供されるヘキサヒスチジンペプチド、ＨＡ等のタグである。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の精製を便利にする。「ＨＡ」タグは、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４）に記述されるインフルエンザ血球凝集素（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＨＡ）タンパク質に由来するエピトープに対応する精製に有用なペプチドである。
【００６６】
さらに本発明は、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドの一部、類似体または誘導体をコードする、本発明の天然または野生型のポリヌクレオチドの変異体に関する。変異体は、天然対立遺伝子変異体のように自然に発生することができる。天然対立遺伝子変異体は、例えるなら、生物の染色体上の所与の座位を占有する遺伝子の幾つかの代替形態のうちの１つである。非自然発生の変異体は、例えば、既知の変異原性技術を用いて、またはＤＮＡ合成によって生成することができる。そのような変異体は、ヌクレオチド置換、欠失または付加によって生成されたものを含む。置換、欠失または付加は、１つ以上のヌクレオチドに関与し得る。変異体では、コード領域もしくは非コード領域またはその両方が変化することも、あり得る。コード領域における変化は、保存または非保存アミノ酸置換、アミノ酸欠失または付加を生成することができる。また、変異体には、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその一部の特性および活性を変化させない、静的置換、付加および欠失も含まれる。
【００６７】
本発明のさらなる実施形態は、例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の天然または野生型ＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチドを有するような高度の配列相同性を有する配列を備えた、単離されたポリヌクレオチド分子を含む。
【００６８】
ポリヌクレオチドは、例えば、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり最大５つの変異（付加、欠失、または置換）を含む点を除けば、それが参照配列と同一である場合に、参照ヌクレオチド配列と、少なくとも９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有すると見なされる。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置で、または参照配列内で、もしくは参照配列内の１つ以上の近接群内のヌクレオチド間に独立して散在された、それらの末端位置間のどこかで、生じ得る。ヌクレオチド配列の同一性は、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）等の既知のコンピュータープログラムを使用して常法により決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９（１９８１）の局在的相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間の相同性の最良のセグメントを発見する。特定の配列が、本発明による参照配列と例えば９５％同一であるかどうかを判定するために、ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、パラメータは、当然ながら、同一性のパーセンテージが、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、参照配列内のヌクレオチドの総数の最大５％の相同性の範囲内でギャップが許容されるように、設定される。
組換え構築物、ベクターおよび宿主細胞
【００６９】
また、本発明は、ベクターを含む、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチドを含む組換えポリヌクレオチド構築物も提供する。ポリヌクレオチド構築物には、限定されないが、ベクターも含む。また、本発明は、そのようなベクターを含む宿主細胞、および組換えまたは合成技術によるＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその断片の生成も、提供する。
【００７０】
「制御可能に連結」。第１の核酸配列が第２の核酸配列との機能的関係をもって配置される場合に、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と「制御可能に連結」されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合には、プロモーターは、コード配列に制御可能に連結されている。概して、制御可能に連結したＤＮＡ配列は、近接しており、２つのタンパク質コード領域を接合させる必要があるならば、読み枠内にある。
【００７１】
「組換え」。「組換え」ポリヌクレオチドは、通常配列が２つ分離しているセグメントの人為的な組み合わせによって、例えば、化学合成によって、または遺伝子工学技術によるポリヌクレオチドの単離されたセグメントの操作によって、作られる。核酸操作の技術は既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２を参照されたい）。ポリヌクレオチドの化学合成方法は、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２，１９８１、およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５，１９８１で検討されている。ポリヌクレオチドの化学合成は、例えば、商業用自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うことができる。
【００７２】
組換えベクターは、標準的な組換え技術によって生成され、感染、形質導入、形質移入、トランスベクション、電気穿孔および形質転換等の既知の技術を使用して、宿主細胞内に導入することができる。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製可能または複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス伝播は、概して、相補宿主細胞内でのみ起こる。
【００７３】
発現ベクターは、好適な宿主細胞内で関心ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの発現を可能にする配列を、含む。そのような発現は、恒常的または非恒常的であり得、例えば、特定の細胞または組織型に特有の環境因子または化学誘導物質によって誘導可能であり得る。発現ベクターは、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクターを含み、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、バキュロウイルス、パポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス、さらには、コスミド、ファージミドおよびそれらの組み合わせ等に由来するベクターを含む。
【００７４】
発現ベクターにおいて、ポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーターに制御可能に連結される。プロモーターは、相同プロモーター、つまり、自然界のポリヌクレオチド挿入物に付随するプロモーターまたはその機能部分、例えば、ＩＢＡＢＰまたはＩＢＡＢＰ−Ｌタンパク質コード領域を有するＩＢＡＢＰプロモーターであり得る。代替として、プロモーターは、異種プロモーター、つまり、自然界のポリヌクレオチド挿入物に付随しないプロモーターまたはその機能部分、例えば、ＩＢＡＢＰ−Ｌタンパク質コード領域に制御可能に連結され、細菌細胞内で多量のタンパク質発現のために使用される細菌プロモーター（または、さらに言えば、ＩＢＡＢＰプロモーター以外のあらゆるプロモーター）であり得る。さらに発現構築物は、転写開始、終結のための部位、ならびに転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を、含有する。構築物によって発現された成熟転写物のコード部分は、開始位置での翻訳開始ＡＵＧ、および翻訳されるポリペプチドの末端にほぼ位置する終結コドンを含む。
【００７５】
ベクターは、そのようなベクターが導入される宿主細胞の選択に好適な１つ以上の選択可能なマーカーを含み得る。そのようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、ならびに大腸菌および他の細菌培養のためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例は、大腸菌、ストレプトミセスおよびネズミチフス菌細胞等の細菌細胞、酵母細胞等の真菌細胞、ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳおよびボウズメラノーマ細胞等の動物細胞、ならびに植物細胞を含む。上述の宿主細胞に対する適切な培地および条件は、当該技術分野において既知である。
【００７６】
好適な細菌プロモーターは、大腸菌ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲおよびＰＬプロモーターならびにｔｒｐプロモーターを含む。真核生物プロモーターは、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ：ＲＳＶ）のもの等のレトロウイルスＬＴＲプロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター等のメタロチオネインプロモーターを含む。
【００７７】
小胞体内腔への、ペリプラスム空間への、または細胞外環境への分泌のために、適切な分泌シグナルが、発現されたポリペプチド中に取り込まれ得る。シグナルは、ポリペプチドに内在性であり得るか、またはそれらは異種シグナルであり得る。
【００７８】
関心ポリペプチドは、融合タンパク質等の修飾された形で発現され得、分泌シグナルのみならず、付加的な異種機能領域も含み得る。例えば、付加的アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、精製時に、またはその後の処理もしくは貯蔵時に、宿主細胞における安定性および持続性を向上させるために、ポリペプチドのＮ末端に付加し得る。また、ペプチド部分が、精製を促進するために、ポリペプチドに付加し得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終的な調製前に除去され得る。ポリペプチドにペプチド部分を添加することにより、分泌または排出を生じさせ、安定性を向上させ、精製を促進させることは、当該技術分野においては通例の技術である。
【００７９】
発現された関心ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む既知の方法によって、組換え細胞培養から回収および精製することができる。
【００８０】
本発明のポリペプチドは、自然産物の精製物、化学合成の産物、ならびに、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞を含む、原核または真核宿主への組換え技術によって生成された産物を、含む。組換え生成法に用いた宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。加えて、本発明のポリペプチドは、宿主が介在する過程の結果として一部の場合において、初期の修飾されたメチオニン残基もまた含み得る。
ポリペプチド
【００８１】
本明細書で用いる「ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチド」という語句は、少なくとも１０、１１、１２、１２、１４、１５、２０、３０、４０、４９、５０、１００以上の長さのアミノ酸残基であり、全長天然、または野生型ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその断片と高度の配列同一性を有するポリペプチドを指す。また、「ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチド」という語句には、天然ＩＢＡＢＰポリペプチド配列において１つ以上のアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含むＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドの変異体形態を含む。このＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドの変異体形態には、限定されないが、関連する生物学的アッセイで測定されるように、全長天然、または野生型ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドまたはその断片の活性と同様であるが、必ずしも同一ではない類似の活性を呈するポリペプチドを含む。
【００８２】
本明細書で用いる、ペプチドまたはポリペプチドに関する「野生型」または「天然」という用語は、細胞もしくは生物、またはその断片に見られる参照ポリペプチドと１００％配列同一性を有するポリペプチドを指す意味で使用される。
【００８３】
本明細書で用いる「ＩＢＡＢＰ−ＬのＮ末端ポリペプチド」、もしくは「ＩＢＡＢＰ−Ｌ  Ｎ末端ポリペプチド」または単に「Ｎ末端ポリペプチド」という用語は、ＩＢＡＢＰポリペプチドの一部ではない、ＩＢＡＢＰ−ＬポリペプチドのＮ末端特有の４９アミノ酸配列を指す。
【００８４】
本明細書で用いる「ペプチド」および「オリゴペプチド」という用語は、同義語と見なし、本明細書で用いる場合、ペプチジル結合によって連結される少なくとも２つのアミノ酸の鎖を指す。本明細書で用いる「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、同義語と見なし、各用語は、約１０より多いアミノ酸残基の鎖を指す。本明細書における全てのオリゴペプチドおよびポリペプチド式または配列は、左から右への方向が、アミノ末端からカルボキシ末端への方向となるように、記載される。
【００８５】
本明細書で用いる「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質という用語は、その天然環境から除去されたポリペプチドまたはタンパク質を指す。例えば、宿主細胞内に発現され、組換えで生成したポリペプチドおよびタンパク質は、任意の好適な技術によって実質的に精製された天然または組換えポリペプチドおよびタンパク質のように、本発明の目的のために単離されたと見なされる。
【００８６】
本明細書で用いる「選択的に結合する」という用語は、「特異的に結合する」という用語と同じ意味で使用することができ、ＩＢＡＢＰポリペプチドに関して使用する場合、例えば、他のポリペプチドよりも実質的に高い程度まで、抗体、リガンド、受容体・レセプター、基質、または他の結合剤による標的ＩＢＡＢＰポリペプチドへの結合を指す。一部の実施形態によれば、抗体または他の結合剤の全てのまたは実質的に全ての結合は、特定の手順の感受性を考慮して決定され得るように、標的ＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチドになされる。抗体、リガンド、受容体、基質または他の結合剤は、それが標的分子に選択的に結合するのであれば、ＩＢＡＢＰ−Ｌ等のポリペプチドまたは他の標的分子「に対して選択的」またはそれ「に対して特異的」であると考えられる。
【００８７】
ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能に有意な影響を及ぼすことなく変えることができる。概して、同様の機能を果たす残基が使用されるのであれば、ポリペプチドまたはペプチドの３次構造に寄与する残基を置換することが可能である。他の場合において、タンパク質の重要でない領域で変化が生じるのであれば、残基の種類は全く重要でない場合がある。
【００８８】
したがって、本発明は、さらに、ＩＢＡＢＰ−Ｌ活性を実質的に示すＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドまたはペプチドの改変物を、含む。そのような変異体は、欠失、挿入、反転、反復、および種類置換（例えば、通例、強い親水性でない残基を強い親水性のある残基に置換するのではなく、ある親水性残基を別の親水性残基に置換すること）を含む。わずかな変化またはそのような「中性」アミノ酸置換は、概して、活性に殆ど影響を及ぼさない。
【００８９】
同類置換として典型的に見られるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間の置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの相互入れ替え、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間での置換である。
【００９０】
どのアミノ酸変化が、表現型的に静的である可能性が高い（つまり、機能に有意な悪影響を及ぼす可能性が低い）かに関する指針は、例えばＢｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６−１３１０，１９９０に記載されている。
【００９１】
したがって、天然または野生型ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、次のものであり得る：（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存または非保存アミノ酸残基で置換され、そのような置換されたアミノ酸残基が、遺伝暗号によってコードされ得るか、またはコードされ得ないもの、（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）等の別の化合物と融合したもの、（ｉｖ）ＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチド等の成熟ポリペプチド、またはリーダーもしくは分泌配列、あるいは成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列に、付加的アミノ酸が融合したもの。
【００９２】
荷電アミノ酸は、別の荷電アミノ酸で置換され得る。また、荷電アミノ酸は、中性または負荷電アミノ酸でも置換され得、減少した正荷電を持つタンパク質をもたらす。凝集の予防は、活性の消失および免疫原性の増加を回避するために非常に望ましい（Ｐｉｎｃｋａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０，１９６７、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：８３８−８４５，１９８７、Ｃｌｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０：３０７−３７７，１９９３）。
【００９３】
また、アミノ酸の置換で、細胞表面受容体に結合するタンパク質の選択性を変化させることもできる。Ｏｓｔａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：２６６−２６８（１９９３）は、２つの既知の種類のＴＮＦ受容体のうちの１つのみに選択的に結合するＴＮＦ−αをもたらす、ある種の変異に関して記載する。
【００９４】
天然配列中の１つ以上のアミノ酸は、その荷電および極性が天然アミノ酸のものと同様である他のアミノ酸で置換することができ、つまり、静的変化をもたらす保存アミノ酸置換を行うことができ、このことは当該技術分野において既知である。天然ポリペプチド配列中のアミノ酸の保存置換は、アミノ酸が属するクラスの他の成員から選択することができる。アミノ酸は、次の４つのグループに分けることができる。（１）酸性アミノ酸、（２）塩基性アミノ酸、（３）中性極性アミノ酸、および（４）中性無極性アミノ酸。これらの種々のグループ内の代表的なアミノ酸は、限定されないが、次のものを含む：（１）アスパラギン酸およびグルタミン酸等の酸性（負荷電）アミノ酸、（２）アルギニン、ヒスチジン、およびリジン等の塩基性（正荷電）アミノ酸、（３）グリシン、セリン、スレオニン、システイン、シスチン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミン等の中性極性アミノ酸、ならびに（４）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニン等の中性無極性（疎水性）アミノ酸。天然ポリペプチド配列中の保存アミノ酸置換は、これらのグループのうちの１つのグループ内のあるアミノ酸を、同じグループ内の別のアミノ酸で置き換えることによって、行うことができる。一態様においては、本発明のタンパク質またはその断片の生物学上機能的均等物は、１０以下、７以下、５以下、４以下、３以下、２、または１つの保存アミノ酸変化を有することができる。したがって、コード化ヌクレオチド配列は、対応する塩基置換を有するため、本発明のタンパク質またはその断片の生物学上機能的均等形態をコードすることが可能である。
【００９５】
ある種のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位等の構造を持つ相互作用的結合能力をそれほど喪失することなく、タンパク質構造内の他のアミノ酸と置換され得ることが理解される。タンパク質の生物学上機能的活性を定義するのは、そのタンパク質の相互作用的能力および性質であるため、ある種のアミノ酸配列の置換は、タンパク質配列および、当然ながらその根底にあるＤＮＡコード配列においてなされ得るが、それにもかかわらず、同様の特性を持つタンパク質を依然として得ることができる。したがって、それらの生物学的有用性または活性をそれほど喪失することなく、本発明のタンパク質もしくは断片のペプチド配列、または該ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列において、種々の変更がなされ得ることが、発明者により考慮される。そのようなアミノ酸変化をコードすることが可能なコドンは、当該技術分野において既知であると理解される。
【００９６】
そのような変更を行うに当たって、アミノ酸のヒドロパシー指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を与える際のヒドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当該技術分野において一般的に理解される（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の相対的なヒドロパシー特性は、結果として生じるタンパク質の２次構造に寄与し、それは、次いで、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等の他の分子とタンパク質との相互作用を明確にすることが認められている。各アミノ酸は、疎水性および荷電特性に基づいて、ヒドロパシー指標を割り当てられており（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２，１９８２）、それらの指標は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）、である。そのような変更を行うに当たって、アミノ酸置換のヒドロパシー指標は、±２、もしくは±１の範囲内、または±０．５の範囲内であり得る。
【００９７】
また、似通ったアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行うことができることも理解される。米国特許第４，５５４，１０１号は、隣接アミノ酸の親水性によって支配されるようなタンパク質の最大局在平均親水性が、タンパク質の生物学的特性と相関することを記載している。
【００９８】
米国特許第４，５５４，１０１号において詳述されるように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±０．１）、グルタミン酸（＋３．０±０．１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±０．１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、およびトリプトファン（−３．４）。天然ポリペプチドまたはペプチド配列への変更を行うに当たって、アミノ酸置換の親水性値は、±２の範囲内、もしくは±１の範囲内、または±０．５の範囲内であり得る。
【００９９】
当然ながら、当業者が行うであろうアミノ酸置換の数は、上記のものを含む多くの要因に依存する。一般的に言えば、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドに対する置換数は、５０、４０、３０、２０、１０、５、３、または２を超えない。
【０１００】
本発明のＩＢＡＢＰ−Ｌタンパク質が機能するために必須なアミノ酸は、部位特異的変異原性またはアラニン走査変異原性等の当該技術分野において既知の方法によって、同定することができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５，１９８９）。後者の手順は、分子中のあらゆる個々の残基に単一のアラニン変異を導入する。次いで、結果として生じる変異体分子に対して、受容体結合もしくは生体外受容体等の生物活性、または生体外増殖活性を試験する。また、リガンド−受容体結合に重要な部位は、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識等の構造解析によって決定することもできる（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４，１９９２、ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２（１９９２）。
【０１０１】
本発明のポリペプチドおよびペプチドは、天然ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドおよびその断片と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の（あるいは、そのような同一性の程度を有する）天然、または野生型ポリペプチドおよびペプチド、ならびにポリペプチドまたはペプチド変異体を含む。
【０１０２】
例えば、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％「同一な」アミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリペプチド配列が、参照ポリペプチドの参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり最大５のアミノ酸変化を含み得ることを除いては、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意図する。言い換えると、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸残基の最大５％が欠失され得るか、または別のアミノ酸で置換され得るか、あるいは、参照配列中の総アミノ酸残基の最大５％までの多くのアミノ酸が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置で、または参照配列内もしくは参照配列内の１つ以上の近接群内の残基間に独立して散在された、それらの末端位置間のどこかで生じ得る。
【０１０３】
実際上、参照ポリペプチドと比較した時に、任意の特定のポリペプチドが、特定の度合いのアミノ酸配列と同一性を有するかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）等の既知のコンピュータープログラムを使用して、常法により決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、特定の配列が、本発明による参照配列と例えば９５％同一であるかどうかを判定するために、パラメータは、当然ながら、同一性のパーセンテージが、参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、参照配列内のアミノ酸残基の総数の最大５％の相同性ギャップが許容されるように設定される。
【０１０４】
本発明の別の実施形態においては、本明細書に記述したポリペプチドの断片を提供する。そのような断片は、次のものを含む：ＩＢＡＢＰ−Ｌの４９アミノ酸Ｎ−末端配列を含むポリペプチド、ＩＢＡＢＰ−Ｌの１つ以上の抗原決定基を含む断片、例えば、ＩＢＡＢＰ−Ｌに選択的に結合する抗体を誘発するもの、ならびに、胆汁酸に結合するＩＢＡＢＰ−Ｌの断片。また、そのような断片は、ＩＢＡＢＰ−Ｌに特有な配列と、ＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰによって共有される配列との両方を含む。例えば、そのような一断片は、ＩＢＡＢＰ−Ｌの４９アミノ酸Ｎ末端配列と、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチド中の隣接配列（これは、ＩＢＡＢＰ中にも存在する）との間の接合部に及ぶポリペプチドである。それは、例えＩＢＡＢＰ−ＬのＮ末端配列をわずか４から６アミノ酸残基しか含んでいないとしても、接合部断片に特異的に結合する抗体を惹起するために使用することができる。そのような接合部断片は、ＩＢＡＢＰ−Ｌに特有の配列、特に、４９アミノ酸Ｎ末端ポリペプチドからの配列が存在する場合にのみ存在し、検出可能であるため、そのような接合部断片によって誘発される抗体は、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドに選択的に結合されると考えられる。本発明のポリペプチド断片は、例えば、当業者には既知の方法を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラム上の分子量マーカーとして、哺乳類における抗体産生を誘発するため等、多くの目的のために使用することができる。
【０１０５】
本発明のポリペプチドは、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現を検出するため、または他の診断アッセイに有用なポリクローナルおよびモノクローナル抗体を惹起するために使用することができる。さらに、そのようなポリペプチドは、結合タンパク質を「捕獲」する酵母ツーハイブリッド法において使用することもできる（Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６（１９８９）。
【０１０６】
別の態様においては、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープを持つ部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、総タンパク質が免疫原である時に、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。これらの免疫原性エピトープは、分子上の幾つかの座位に限定されると考えられる。他方では、抗体が結合することができるタンパク質分子の領域は、「抗原エピトープ」として定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、概して、抗原エピトープの数より少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２（１９８４）を参照されたい。
【０１０７】
抗原エピトープ（抗体が結合することができるタンパク質分子の領域を含む）を持つペプチドまたはポリペプチドの選択に関しては、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を、常に誘発できることが、当該技術分野において既知である。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照されたい。タンパク質反応性血清を誘発することが可能なペプチドは、タンパク質の１次配列に示されることが多く、一連の単純な化学規則によって特徴付けられることができ、無傷のタンパク質の免疫優性領域（つまり、免疫原性エピトープ）にも、またアミノまたはカルボキシル末端にも限定されない。極めて疎水性のペプチドおよび６以下の残基のペプチドは、概して、模倣されたタンパク質に結合する抗体を誘導するのに効果がなく、長い可溶性のペプチド、特にプロリン残基を含有するペプチドが通常効果的である（上記６６１のＳｕｔｃｌｉｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．参照）。
【０１０８】
したがって、本発明の抗原エピトープを持つペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドに選択的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起するのに有用である。したがって、抗原エピトープを持つペプチドで免疫化されたドナーからの脾臓細胞の融合によって得られた高比率のハイブリドーマは、概して、天然タンパク質と反応する抗体を分泌する（上記、６６３のＳｕｔｃｌｉｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．参照）。抗原エピトープを持つペプチドまたはポリペプチドによって惹起された抗体は、模倣されたタンパク質を検出するのに有用であり、異なるペプチドに対する抗体は、翻訳後プロセシングを受けるタンパク質前駆物質の種々の領域の運命を追跡するために使用され得る。免疫沈降アッセイにおいて、短いペプチド（例えば、約９アミノ酸）でさえも、より大きなペプチドを結合および置換することができることが示されているため、ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣されたタンパク質への様々な定性または定量アッセイにおいて、例えば、競合アッセイにおいて使用することができる。例えば、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７−７７８（１９８４）を参照されたい。また、本発明の抗ペプチド抗体は、例えば、既知の方法を使用して、吸着クロマトグラフィーによるタンパク質精製のために有用である。
【０１０９】
上記の指針に従って設計された本発明の抗原エピトープを持つペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列中に含まれる、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０または３０以上のアミノ酸配列を含有し得る。しかしながら、約３０から約５０アミノ酸を含有するペプチドまたはポリペプチド、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の大部分を含むペプチドまたはポリペプチド、または本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列を任意の長さで含むペプチドまたはポリペプチドもまた、本発明のエピトープを持つペプチドまたはポリペプチドと見なす。これらもまた、模倣されたタンパク質と反応する抗体を誘導するのに有用である。
【０１１０】
本発明の一実施形態によれば、４９アミノ酸Ｎ末端ポリペプチドと、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドの残部との間の接合部に及ぶ、つまり、ＩＢＡＢＰ−Ｌの特有の配列（例えば、ＩＢＡＢＰ−Ｌの４９アミノ酸Ｎ末端ポリペプチドから４、５、６、７、８、９、１０以上の近接アミノ酸残基）と、ＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰポリペプチドの両方に含まれる配列との両方とを含む、ペプチドおよびポリペプチドを提供する。そのような接合部に及ぶペプチドおよびポリペプチドは、哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト等）において、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドに選択的に結合する抗体の産生を誘発するために使用することができる。
【０１１１】
エピトープを持つペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒において実質的な溶解性を提供するように選択され得る（つまり、比較的親水性の残基を含む配列であり、高度に疎水性の配列は回避され得る）。
【０１１２】
本発明のエピトープを持つペプチドおよびポリペプチドは、本発明の核酸分子を使用した組換え手段を含む、ペプチドまたはポリペプチドを製作するための従来のいかなる手段によっても、生成され得る。例えば、短いエピトープを持つアミノ酸配列は、組換え生成および精製の間に、ならびに抗ペプチド抗体を生成するための免疫化の間に、担体としての機能を果たすより大きなポリペプチドに、融合され得る。また、エピトープを持つペプチドは、既知の化学合成法を使用しても合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製および特徴付けられた（酵素結合免疫吸着測定法［ＥＬＩＳＡ］を用いた結合試験によって）ＨＡ１ポリペプチドのセグメントの単一アミノ酸変異体を表す、１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチド等のペプチドを多数合成する単純な方法を、著述した（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５，１９８５、および米国特許第４，６３１，２１１号）。この方法では、種々のペプチドの固相合成に対する個々の樹脂が、別々の溶媒透過性パケットに含有された。これによって、固相方法に伴う多くの同一かつ反復のステップの最適な使用が可能になった。完全手動の手順でも、５００〜１０００以上の合成を同時に行うことができる。
【０１１３】
本発明のエピトープを持つペプチドおよびポリペプチドを、当該技術分野において既知の方法に従って、抗体を誘導するために使用する。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．、上記Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：９１０−９１４、およびＢｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照されたい。一般的に、動物は、遊離ペプチドで免疫刺激され得るが、しかしながら、抗ペプチド抗体価は、キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍａｃｙａｎｉｎ：ＫＬＨ）または破傷風トキソイド等のマクロ分子担体とペプチドとのカップルによって、促進され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＭＢＳ）等のリンカーを使用して、担体にカップルされ得る。一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒド等のより一般的な連結剤を使用して、担体にカップルされ得る。ウサギ、ラットおよびマウス等の動物は、例えば、約１００μｇのペプチドもしくは担体タンパク質およびフロインドアジュバントを含有するエマルジョンの腹腔内および／または皮下注射によって、遊離ペプチドまたは担体にカップルされたペプチドのいずれかで、免疫誘起される。例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを用いたＥＬＩＳＡアッセイによって検出できるような有用な力価を有する抗ペプチド抗体を提供するためには、例えば約２週間間隔で、幾つかのブースター注射が必要とされ得る。免疫された動物から得られた血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択によって、例えば、常法に従って、固体支持体上にペプチドを吸着させ、選択された抗体を溶出することによって、増加させることができる。
【０１１４】
本発明の免疫原性エピトープを持つペプチド、つまり、総タンパク質が免疫原である時に、抗体応答を誘発するタンパク質の部分は、当該技術分野において既知の方法に従って同定される。例えば、上記のＧｅｙｓｅｎら（１９８４）は、酵素結合免疫吸着測定法において反応させるのに十分な、純度の高い何百ものペプチドが支持された固体支持体上での迅速な同時合成に関する手順を、開示する。次いで、合成されたペプチドの抗体との相互作用は、支持体からそれらを除去せずに、容易に検出される。このようにして、当業者は、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを持つペプチドを、日常的に同定し得る。例えば、口蹄疫ウイルスの外被タンパク質中の免疫学的に重要なエピトープは、タンパク質の全２１３アミノ酸配列を覆う全ての２０８の可能なヘキサペプチドの重複セットを合成することにより、７アミノ酸分解能で、Ｇｅｙｓｅｎらにより位置付けられた。次いで、全ての２０アミノ酸がエピトープ内の各位置で順に置換されたペプチドの完全な置換セットが合成され、抗体との反応に特異性を与える特定のアミノ酸が決定された。したがって、本発明のエピトープを持つペプチドのペプチド類似体は、この方法により日常的に作製することができる。Ｇｅｙｓｅｎ（１９８７）の米国特許第４，７０８，７８１号は、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを持つペプチドを同定する方法に関して、さらに記載している。
【０１１５】
Ｇｅｙｓｅｎ（１９９０）の米国特許第５，１９４，３９２号は、関心抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的なエピトープ（つまり、「ミモトープ」）の位相幾何学的等価物であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する、一般的な方法を記載する。より一般的には、Ｇｅｙｓｅｎ（１９８９）の米国特許第４，４３３，０９２号は、特定の関心受容体のリガンド結合部位に相補的なリガンドの組織分布的等価物であるモノマーの配列を検出または決定する方法を、記載する。同様に、米国特許第５，４８０，９７１号は、線状Ｃ１−７−アルキルペルアルキル化オリゴペプチドおよびそれらのセットおよびそのようなペプチドのライブラリーを開示する。さらには、この特許は、関心アクセプター分子に優先的に結合するペルアルキル化オリゴペプチドの配列を決定するために、そのようなオリゴペプチドセットおよびライブラリーを使用する方法を、開示する。したがって、本発明のエピトープを持つペプチドの非ペプチド類似体は、これらの方法によって日常的に作製することもできる。
【０１１６】
当業者が理解するように、本発明のポリペプチドおよび上記のエピトープを持つ断片は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と組み合わせることができ、これによりキメラポリペプチドが生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、生体内において増加した半減期を示す。このことは、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳類免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインから成るキメラタンパク質に関して、示されている（ＥＰＡ  ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８４−８６（１９８８））。また、ＩｇＧ部分によるジスルフィド結合ダイマー構造を有する融合タンパク質は、他の分子への結合および中和に関して、モノマーＩＢＡＢＰ−Ｌタンパク質またはタンパク質断片単独よりも、効率的になり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。
診断方法
【０１１７】
本発明は、個体からの生体試料等の試料中のＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチド（例えば、ＩＢＡＢＰ−ＬｍＲＮＡ）またはポリペプチドの存在を検出する方法、試料中のＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチドまたはポリペプチドを定量化する方法、および、試料中のＩＢＡＢＰ−Ｌ／ＩＢＡＢＰポリヌクレオチドまたはポリペプチド比率を決定する方法等を、提供する。
【０１１８】
本発明の方法では、ＩＢＡＢＰ−ＬポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはＩＢＡＢＰ−Ｌ／ＩＢＡＢＰ比率の測定値を、「基準」と比較する。本発明の実施形態に応じて、そのような基準は、対照試料における測定値および比率、個体の集団の測定によって得られた基準値、例えば、治療を開始する前等の以前の時点で同じ個体に対して決定された基礎値、または同様の方法のために使用される任意の他の好適な基準を、含むことができる。
【０１１９】
本明細書で用いる「個体」または「患者」という用語は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、類人猿、ヒト、または他の哺乳動物を含む哺乳類を指す。
【０１２０】
「生体試料」は、個体から得られた任意の生体試料を意図し、限定されないが、糞便（便）試料、体液（例えば、血液）、細胞、組織、組織培養、またはＩＢＡＢＰ−Ｌタンパク質またはｍＲＮＡを含有する他の源を含む。哺乳類から便試料、組織生検および他の生体試料を得る方法は、当該技術分野において既知である。
【０１２１】
ｍＲＮＡの検出。全細胞ＲＮＡは、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）に記載されている１ステップのグアニジン−チオシアネート−フェノール−クロロホルム方法等の任意の好適な技術を用いて、生体試料から単離することができる。次いで、ＩＢＡＢＰ−ＬをコードするｍＲＮＡのレベルを、任意の適切な方法でアッセイする。これは、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写と組み合わせたポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、および逆転写と組み合わせたリガーゼ鎖反応（ＲＴ−ＬＣＲ）を含む。
【０１２２】
ノーザンブロット分析は、Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ６３：３０３−３１２（１９９０）に記載されているように行うことができる。簡潔にのべると、全ＲＮＡを、上記のように生体試料から調製する。ノーザンブロットでは、ＲＮＡを、適切な緩衝液（例えば、グリオキサール／ジメチルスルホキシド／リン酸ナトリウム緩衝液）中で変性し、アガロースゲル電気泳動に供し、ニトロセルロースフィルターに転写する。ＲＮＡをＵＶリンカーによってフィルターに連結した後、フィルターを、ホルムアミド、ＳＳＣ、デンハート液、変性サケ精子、ＳＤＳ、およびリン酸ナトリウム緩衝液を含有する溶液中でプレハイブリダイズする。任意の適切な方法（３２Ｐ−マルチプライムＤＮＡ標識システム等）で標識されたＩＢＡＢＰ−Ｌ  ｃＤＮＡをプローブとして使用する。一晩のハイブリダイゼーション後、フィルターを洗浄し、Ｘ線フィルムに曝露する。プローブとして使用するｃＤＮＡは、上記の節に記述した。
【０１２３】
Ｓ１マッピングは、Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ４９：３５７−３６７（１９８７）に記載されているように行うことができる。Ｓ１マッピングで使用されるプローブＤＮＡを調製するために、上記のｃＤＮＡのセンス鎖を鋳型として使用して、標識されたアンチセンスＤＮＡを合成する。次いで、アンチセンスＤＮＡを、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して消化して、所望の長さのさらなるＤＮＡプローブを産生することができる。そのようなアンチセンスプローブは、標的ｍＲＮＡ（つまり、ＩＢＡＢＰ−ＬをコードするｍＲＮＡ）に対応する保護バンドを可視化するために有用である。ノーザンブロット分析は、上記のように行うことができる。
【０１２４】
一実施形態によれば、ＩＢＡＢＰ−ＬをコードするｍＲＮＡのレベルを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むが、これに限定されないポリヌクレオチド増幅方法を用いて、アッセイする。本発明の実施に有用なＰＣＲ法の一つは、例えば、Ｍａｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ２：２９５−３０１（１９９０）に記載されるＲＴ−ＰＣＲ法である。この方法により、ポリアクリルアミドゲルバンド中の増幅されたＤＮＡ産物、すなわち、「増幅産物」または「アンプリコン；単位複製配列」の放射活性は、標的ｍＲＮＡの初期濃度に直線的に相関する。簡潔にのべると、この方法は、ＲＴプライマーおよび適切な緩衝液を含有する反応混合物中に生体試料から単離された全ＲＮＡを添加するステップを包含する。プライマーアニーリングのためのインキュベーション後、混合物に、ＲＴ緩衝液、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅ阻害剤、および逆転写酵素を補充することができる。ＲＮＡの逆転写を達成するためのインキュベーション後、次いで、ＲＴ産物を、標識されたプライマーを用いてＰＣＲに供する。代替として、プライマーを標識するのではなく、標識されたｄＮＴＰをＰＣＲ反応混合物中に含めることができる。ＰＣＲ増幅は、常法に従ってＤＮＡサーマルサイクラー中で行うことができる。増幅を達成するための好適な数のラウンド後、ＰＣＲ反応混合物を、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動する。ゲルの乾燥後、適切なバンド（ＩＢＡＢＰ−ＬをコードするｍＲＮＡに対応する）の放射活性を、画像解析装置を使用して定量する。ＲＴおよびＰＣＲ反応の成分および条件、試薬およびゲル濃度、ならびに標識方法は、当該技術分野において既知である。
【０１２５】
本発明の増幅方法の一実施形態によれば、例えば、（例えば、ＩＢＡＢＰ−Ｌ  Ｎ末端ポリペプチドをコードするＩＢＡＢＰ−ＬｍＲＮＡの領域からの配列を含む）ＩＢＡＢＰ−ＬｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを含むプライマー対が、試料中のＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチドを選択的に増幅するプライマーとして、用いられる。第２のプライマーは、そのような配列がＩＢＡＢＰ−Ｌに特有であるか、またはＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰによって共有されるかにかかわらず、標的ＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチドからの任意の配列を、含むことができる。この実施形態は、例えば、試料中のＩＢＡＢＰ−Ｌ転写物（ｍＲＮＡ）のみを増幅するのに、有用である。
【０１２６】
本発明の別の実施形態によれば、例えば、（例えば、エクソン４ａからの配列を含む）ＩＢＡＢＰ  ｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを含むプライマー対が、ＩＢＡＢＰポリヌクレオチドを選択的に増幅するプライマーとして、用いられる。第２のプライマーは、そのような配列がＩＢＡＢＰ−Ｌに特有であるか、またはＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰによって共有されるかにかかわらず、標的ＩＢＡＢＰポリヌクレオチドからの任意の配列を含むことができる。この実施形態は、例えば、試料中のＩＢＡＢＰ転写物（ｍＲＮＡ）のみを増幅するのに、有用である。
【０１２７】
本発明の別の実施形態によれば、ＩＢＡＢＰ−ＬポリヌクレオチドおよびＩＢＡＢＰポリヌクレオチドの両方を増幅するプライマーが用いられる。例えば長さによって互いを区別することができる増幅産物を生成できるように、１対はＩＢＡＢＰ−Ｌを選択的に増幅し、第２の対はＩＢＡＢＰを選択的に増幅する、２つのプライマー対（つまり、４つのプライマー）を使用することができる。例証目的のための一例として、４プライマー増幅システムは、ＩＢＡＢＰ−Ｌ  ｍＲＮＡを増幅するためのプライマー対と、ＩＢＡＢＰ  ｍＲＮＡを増幅するためのプライマー対とを含み得る。ＩＢＡＢＰ−Ｌ  ｍＲＮＡを増幅するためのプライマー対は、（１）ＩＢＡＢＰ−Ｌの４９アミノ酸Ｎ末端ポリペプチドをコードするＩＢＡＢＰ−Ｌ  ｃＤＮＡの領域からの配列を含む５’プライマー、および（２）３’から５’方向となるＩＢＡＢＰ−Ｌ  ｃＤＮＡからの配列を含む３’プライマー、を含む。ＩＢＡＢＰ  ｍＲＮＡを増幅するためのプライマー対は、（３）（ＩＢＡＢＰ  ｃＤＮＡに特有である）エクソン４ａからの配列を含む５’プライマー、および（４）ＩＢＡＢＰ  ｃＤＮＡ上に存在する３’方向からのエクソン４ａ配列を含む３’プライマー、を含む。代替として、１つはＩＢＡＢＰ−Ｌに選択的にハイブリダイズし、１つはＩＢＡＢＰに選択的にハイブリダイズし、３番目はＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰの両方に選択的にハイブリダイズする（つまり、ＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰの両方によって共有される配列を含む）、３プライマーシステムを使用することができる。例証目的のための一例として、３プライマー増幅システムは、次のプライマーを含み得る：（１）（ＩＢＡＢＰ−ＬｃＤＮＡに特有である）ＩＢＡＢＰ−ＬポリペプチドのＮ末端４９アミノ酸配列をコードするＩＢＡＢＰ−Ｌ  ｃＤＮＡの領域からの配列を含む５’プライマー、（２）（ＩＢＡＢＰ  ｃＤＮＡに特有である）エクソン４ａからの配列を含む５’プライマー、ならびに（３）ＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰ  ｃＤＮＡの両方に存在する３’方向からのエクソン４ａの配列を含む３’プライマー。この実施形態は、例えば、試料中のＩＢＡＢＰ  ｍＲＮＡに対するＩＢＡＢＰ−Ｌ  ｍＲＮＡの比率を決定するのに、有用である。
【０１２８】
当業者は、本明細書に教示された配列に基づいて、ＰＣＲおよび他の増幅方法のためのプライマー、プライマー対、およびプライマーセットを、新たに生成することができるであろう。
【０１２９】
本発明の一実施形態は、本発明に沿った増幅方法に有用なプライマーを含むキットである。また、そのようなキットは、好適なパッケージング、使用上の指示、またはその両方を、含み得る。
【０１３０】
糞便（例えば、便）試料等の生体試料中のＩＢＡＢＰ−Ｌ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の存在を検出する、および／または定量するのに有用な別のＰＣＲ方法は、「バイオバーコード」ナノ粒子の使用を介するものである。タンパク質の検出および／または定量では、例えば、２種類の捕獲粒子が用いられる。一つは、標的タンパク質に対して選択的な抗体を持つマイクロサイズの磁性粒子であり、他方は、同じタンパク質に対して選択的な抗体が付着したナノ粒子である。また、ナノ粒子は、多数（例えば、約１００）の特有かつ共有結合しているオリゴヌクレオチドも、保有する。このオリゴヌクレオチドには、ハイブリダイゼーションによって相補オリゴヌクレオチドが、結合している。後者は、選択したタンパク質に対するマーカーとして機能する「バイオバーコード」である。ナノ粒子プローブは、結合タンパク質ごとに多くのオリゴヌクレオチドを保有するため、タンパク質に比べ、相当な増幅が存在する。銀強化ステップ中で、第２のシグナル増幅がある。結果として、何十から何百もの分子を検出することによって、ＥＬＩＳＡベースのアッセイよりも５〜６桁、タンパク質に対する高い感受性が得られる。例えば、米国特許第６，９７４，６６９号を参照されたい。また、例えば、バイオバーコード化したナノ粒子プローブを用いたタンパク質癌マーカーの検出の例として、Ｓｔｏｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８：８３７８−８３７９，２００６を参照されたい。また、バイオバーコード法は、試料中のｍＲＮＡおよび他のポリヌクレオチドを検出および／または定量するために使用することもできる（Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：ｅ１３７，２００４、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０：１１−１９，２００６、Ｔｈａｘｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ３６３：１２０−１２６，２００６、米国特許第６，９７４，６６９号）。
【０１３１】
ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドの検出および定量。任意の当該技術分野における既知の方法を使用して、生体試料中のＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドの存在をアッセイする、または定量化することができる。
【０１３２】
抗体ベースの技術は、生体試料中のＩＢＡＢＰ−Ｌレベルの存在を検出する、および／またはそれを定量化するのに、有用である。例えば、組織中のＩＢＡＢＰ−Ｌの発現は、伝統的な免疫組織学的方法で研究することができる。これらの場合、特異的認識は、１次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によって提供されるが、２次検出システムは、蛍光、酵素、または他の接合された２次抗体を利用することができる。結果として、病理学検査のための組織切片の免疫組織学的染色が得られる。また、組織は、ウエスタンブロットまたはドット／スロットアッセイのためのＩＢＡＢＰ−Ｌの遊離のために、例えば、尿素および中性界面活性剤を用いて、抽出することができる（Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５，１９８５、Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６，１９８７）。陽イオン性固相の使用に基づくこの技術において、ＩＢＡＢＰ−Ｌの定量化は、単離されたＩＢＡＢＰ−Ｌを標準（検量線）として使用することにより、達成することができる。また、この技術は、体液にも適用することができる。これらの試料を用いたＩＢＡＢＰ−Ｌのモル濃度は、異なる組織、糞便、体液（血清、血漿、尿、滑液、髄液）等に対するＩＢＡＢＰ−Ｌ含有量の標準値を設定するのに、役立つであろう。次いで、ＩＢＡＢＰ−Ｌ量の正常値は、被験体から得られたものと比較可能な健康な個体からの値を使用して、設定することができる。
【０１３３】
ＩＢＡＢＰ−Ｌのレベルを検出するのに有用な他の抗体ベースの方法は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および上記の「バイオバーコード」アッセイ等のイムノアッセイを含む。例えば、ＩＢＡＢＰ−Ｌ選択的モノクローナル抗体は、ＩＢＡＢＰ−Ｌを検出および定量するために、免疫吸着剤としておよび酵素標識プローブとしての両方に、使用することができる。試料中に存在するＩＢＡＢＰ−Ｌの量は、直線回帰コンピューターアルゴリズムを使用して、標準的な調製物中に存在する量を参照することにより、算出することができる。そのような腫瘍抗原を検出するＥＬＩＳＡは、Ｉａｃｏｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  １１：１９−３０，１９８８に記載されている。別のＥＬＩＳＡアッセイでは、体液中のＩＢＡＢＰ−Ｌを検出するために、２つの異なる選択的モノクローナル抗体を使用することができる。このアッセイでは、一方の抗体は免疫吸着剤として使用され、他方は酵素標識プローブとして使用される。
【０１３４】
上記の技術は、本質的に、「１ステップ」または「２ステップ」アッセイとして行われ得る。「１ステップ」アッセイは、ＩＢＡＢＰ−Ｌを固定化抗体と接触させるステップを包含し、洗浄するステップ、混合物を標識された抗体と接触させるステップは含まない。「２ステップ」アッセイは、混合物を標識された抗体と接触させるステップの前に、洗浄するステップを包む。また、他の従来の方法も好適に使用され得る。通常、支持体上にアッセイシステムの１つの成分を固定化することが望ましく、それによってシステムの他の成分を、その成分と接触させ、試料から容易に除去することが可能となる。
【０１３５】
好適な酵素標識は、例えば、基質と反応させることによって過酸化水素の産生を触媒するオキシダーゼグループからのものを、含む。例えば、グルコースオキシダーゼは、良好な安定性を有し、その基質（グルコース）は、容易に利用可能である。オキシダーゼ標識の活性は、酵素標識抗体／基質反応によって形成される過酸化水素の濃度を測定することによって、アッセイされ得る。酵素に加えて、他の好適な標識は、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）等の放射性同位体、ならびにフルオレセインおよびローダミン等の蛍光標識、ならびにビオチンを含む。
【０１３６】
個体から得られた生体試料中のＩＢＡＢＰ−Ｌレベルをアッセイすることに加えて、ＩＢＡＢＰ−Ｌは、画像化によって生体内で検出することもできる。ＩＢＡＢＰ−Ｌの生体内画像化のための抗体標識またはマーカーは、Ｘ線検査、ＮＭＲまたはＥＳＲによって検出可能なものを含む。Ｘ線検査に好適な標識は、バリウムまたはセシウム等の、検出可能な放射線を放つが、被験体に明らかに有害ではない放射性同位体を含む。ＮＭＲおよびＥＳＲに好適なマーカーは、関連するハイブリドーマへの栄養分を標識することによって、抗体に取り込まれ得る、重水素等の検出可能かつ特徴的なスピンを有するものを、含む。
【０１３７】
放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不透過物質、または核磁気共鳴によって検出可能な材料等、適切かつ検出可能な画像化材料で標識されたＩＢＡＢＰ−Ｌ選択的抗体または抗体断片は、疾患の検査がなされる哺乳類に（例えば、非経口的に、皮下に、または腹腔内に）、導入される。被験体の大きさおよび使用する画像化システムによって、診断的画像を生成するために必要な画像化部分の量が決定されることが、当該技術分野において理解される。放射性同位体の場合、ヒト被験体に注射される放射活性の量は、通常約５から２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次いで、標識された抗体または抗体断片は、ＩＢＡＢＰ−Ｌを含有する細胞の位置に優先的に蓄積される。生体内での腫瘍画像化は、Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｄｓ．，Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．，１９８２）に記載されている。
【０１３８】
本発明の使用のためのＩＢＡＢＰ−Ｌ選択的抗体は、無傷のＩＢＡＢＰ−Ｌまたはその抗原ポリペプチド断片に対して惹起することができ、これは、アルブミン等の担体タンパク質と一緒に、またはそれが十分に長い（少なくとも約２５アミノ酸）のであれば担体を伴わずに、動物系（ウサギまたはマウス等）に対して提示され得る。
【０１３９】
本明細書で用いる「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）という用語は、ＩＢＡＢＰ−Ｌに選択的に結合可能な、無傷の分子および抗体の断片（すなわち「断片抗体」）（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２断片等）を含むことを、意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２断片は、無傷の抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、無傷の抗体の非特異的組織結合が少ない（Ｗａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５，１９８３）。
【０１４０】
本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、ＩＢＡＢＰ−Ｌまたはその抗原断片を発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために、動物に投与することができる。一方法において、ＩＢＡＢＰ−Ｌタンパク質の調製物は、天然の混入物を実質的に含まないように、上記のように調製および精製する。次いで、そのような調製物を、より大きな特異的活性のポリクローナル抗血清を生成するために、動物に導入する。
【０１４１】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体（またはそのＩＢＡＢＰ−Ｌ結合断片）を含む。そのようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０−１９９６）、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８），Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６−９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，下記，Ｃｈａｐｔｅｒ  １１）を使用して、調製することができる。概して、そのような手順は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ抗原、またはＩＢＡＢＰ−Ｌ発現細胞で、動物（例えば、マウスまたはウサギ）を免疫化処置するステップを包含する。好適な細胞は、抗ＩＢＡＢＰ−Ｌ抗体に結合する能力によって認識することができる。そのような細胞は、例えば、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で不活性化）を補充し、約１０μｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したアール変法イーグル培地等の、任意の好適な組織培養培地中で培養することができる。そのようなマウスの脾細胞を、抽出し、好適な骨髄腫細胞株と融合する。任意の好適な骨髄腫細胞株は、本発明に従って用いられ得る。融合後、結果として生じるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地中で選択的に維持し、次いで、Ｗａｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８０：２２５−２３２（１９８１）、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，下記，Ｃｈａｐｔｅｒ７に記載されているような限界希釈によって、クローニングする。次いで、そのような選択によって得られたハイブリドーマ細胞を、ＩＢＡＢＰ−Ｌ抗原に結合可能な抗体を分泌するクローンを同定するために、アッセイする。
【０１４２】
代替として、ＩＢＡＢＰ−Ｌ抗原に結合可能な付加的抗体は、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて２ステップ手順で産生し得る。そのような方法は、抗体が、それ自体が抗原であるという事実を使用し、したがって、２次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、マウス等の動物を免疫化処置するために、ＩＢＡＢＰ−Ｌ選択的抗体を使用する。次いで、そのような動物の脾細胞を、ハイブリドーマ細胞を生成するために使用する。そして、ハイブリドーマ細胞を、ＩＢＡＢＰ−Ｌ選択的抗体に結合する能力がＩＢＡＢＰ−Ｌ抗原によってブロックされ得る抗体を生成するクローンを同定するために、スクリーニングする。そのような抗体は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ選択的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、さらなるＩＢＡＢＰ−Ｌ選択的抗体の形成を誘導すべく、動物を免疫化処置するために、使用することができる。
【０１４３】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２および本発明の抗体の他の断片は、本明細書において開示した方法に従って使用され得ることが明らかである。そのような断片は、典型的には、パパイン（Ｆａｂ断片を生成する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する）等の酵素を使用して、タンパク質切断によって生成される。代替として、ＩＢＡＢＰ−Ｌ結合断片は、組換えＤＮＡ技術またはタンパク質合成によって、生成することができる。
【０１４４】
ヒトにおける診断のために、生体内画像化を使用して、上昇したＩＢＡＢＰ−Ｌのレベルを検出する場合、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用し得る。そのような抗体は、上記のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝構築物を用いて、生成することができる。キメラ抗体を生成する方法は、当該技術分野において既知である。総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２，１９８５、Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４，１９８６、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第ＥＰ１７１４９６号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第ＥＰ１７３４９４号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第ＷＯ８６０１５３３号、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第ＷＯ８７０２６７１号、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３，１９８４、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８，１９８５を参照されたい。
【０１４５】
本発明のＩＢＡＢＰ−Ｌ選択的抗体にさらに好適な標識を、以下に提供する。好適な酵素標識の例は、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイド異性化酵素、酵母−アルコール脱水素酵素、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼを含む。
【０１４６】
好適な放射性同位体標識の例は、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、１５２Ｅｕ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ等を含む。１１１Ｉｎは、それが１２５Ｉまたは１３１Ｉで標識したモノクローナル抗体の肝臓による脱ハロゲン化を回避するため、生体内での画像が使用される場合に、利点がある。加えて、このラジオヌクレオチドは、画像化のためにより好ましいγ放出エネルギーを有する（Ｐｅｒｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１０：２９６−３０１，１９８５）、Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：２８１−２８７，１９８７）。例えば、１−（Ｐ−イソチオシアネートベンジル）−ＤＰＴＡを用いてモノクローナル抗体に連結した１１１Ｉｎは、非腫瘍性組織、特に肝臓における取り込みを殆ど示さず、したがって、腫瘍局在化の特異性を増強する（Ｅｓｔｅｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：８６１−８７０，１９８７）。
【０１４７】
好適な非放射性同位体標識の例は、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｔｒ、および５６Ｆｅを含む。
【０１４８】
好適な蛍光標識の例は、１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレサミンを含む。
【０１４９】
好適な毒素標識の例は、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素を含む。化学発光標識の例は、ルミナール、イソルミナール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンを含む。
【０１５０】
核磁気共鳴コントラスト剤の例は、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅ等の重金属核を含む。
【０１５１】
上述の標識を抗体に結合するための典型的な技術は、Ｋｅｎｎｅｄｙら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７０：１−３１，１９７６）、およびＳｃｈｕｒｓら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８１：１−４０，１９７７）により、提供される。後者において言及される連結技術は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル法である。
【０１５２】
本発明の診断的組成物および方法の１つの使用は、患者の結腸直腸癌（またはＩＢＡＢＰ−Ｌの上方制御および／または発現増加を特徴とする別の状態）の存在を検出すること、または結腸直腸癌を発症する危険性が高い個体を同定することである。別の使用は、療法に反応する可能性が高い患者を同定すること、または結腸直腸癌のために行われる療法の効果をモニターすることである。そのような療法は、イリノテカンおよびオキサリプラチンと組み合わせた５−ＦＵ／ＦＡを用いた最先端療法、または本発明の療法を含む他の療法を含む。また、本発明の診断的組成物および方法は、結腸直腸癌の治療および予防のための治療薬・治療法の効果を決定するのに有用である。このような治療薬・治療法には、限定されないが、キナーゼを阻害する薬剤、増殖因子阻害剤、ＮＦ−κＢ阻害剤、胆汁酸置換療法、抗体療法、放射線療法、およびこれらの組み合わせを、含む。研究および臨床背景等における種々の他の使用は、当業者に明らかである。
【０１５３】
試料中のＩＢＡＢＰ−Ｌポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または試料中のＩＢＡＢＰ−Ｌ／ＩＢＡＢＰポリヌクレオチドもしくはポリペプチド比率の測定が行われる方法において、測定は、例えば、個体から得られた対照試料からの同様の測定値、１つ以上の異なる時点（例えば、療法を開始する前の基礎測定値、または療法過程の間および／またはその後の１つ以上の時点での測定値）で取った個体からの測定値、健康な、種々の病期の結腸直腸癌を罹患する、結腸直腸癌を発症する危険性が高い等の個体の集団から取った測定値から算出される値、ならびに他のそのような基準値等の、基準と比較することができる。
ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドの治療的および予防的投与
【０１５４】
本発明のＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドは、結腸直腸癌または他の癌の危険性がある、またはそれを罹患する患者を治療するのに、有用であり得る。実施例１に記載されるように、ＩＢＡＢＰ−Ｌは、２次胆汁酸媒介のアポトーシスに対する防御メカニズムとしての機能を果たし得る。腸管中のＩＢＡＢＰ−Ｌレベルの増加は、より多くの胆汁酸の結合を可能にするため、胆汁酸を細胞外に隔離させ、細胞胆汁酸濃度を減少させ、したがって、発癌物質との接触を和らげ、胆汁酸損傷に対する保護緩衝を提供する。結果として、限定されないが、遺伝的に結腸直腸癌になりやすい患者、結腸直腸癌を治療した患者、および結腸直腸癌の再発の恐れがある患者が、結腸直腸癌（またはその再発）の可能性を減らすために、ＩＢＡＢＰ−Ｌで治療され得る。したがって、ＩＢＡＢＰ−Ｌは、個体の細胞、組織、または体に体外から加えて、治療効果をもたらすことができる。
【０１５５】
当業者は、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドの有効量を、そのようなポリペプチドの投与が適応される各条件について経験的に決定できることを、理解する。ＩＢＡＢＰ−Ｌ活性を有するポリペプチドは、１つ以上の医薬的に容認可能な担体、希釈剤、および／または賦形剤と組み合わせて、医薬組成物中で投与することができる。例証目的のみの一例として、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドは、下部胃腸管中での放出のための腸溶性コーティングを有するカプセルまたは錠剤に封入して、投与することができる。ヒト患者に投与する場合、本発明の医薬組成物の総日使用量は、妥当な医療判断の範囲内で、主治医により決定されることが理解される。任意の特定の患者についての特定の治療有効用量レベルは、達成されるべき応答の種類および程度、特定の組成物および、もしあれば他の用いられる薬剤、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、および食事、投与の時間、投与経路、および組成物の排出速度、治療の持続期間、特定の組成物と組み合わせて、または同時に用いられる薬物（例えば、化学療法剤）、ならびに医療の分野で既知の同様の要因を含む、種々の要因に依存する。
【０１５６】
また、療法に使用されるＩＢＡＢＰ−Ｌ組成物は、個々の患者の臨床状態（特にＩＢＡＢＰ−Ｌ単独での治療の副作用）、ＩＢＡＢＰ−Ｌ組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および施術者に既知の他の要因を考慮して、良好な医療行為と一致した様式で、製剤化および投薬される。
【０１５７】
したがって、本明細書の目的を達成するようなポリペプチド、ポリヌクレオチド、または他の治療物質（あるいは、そのような治療物質を含む組成物）の有効量は、このような考慮の基に決定される。本明細書で用いる「有効量」とは、観察可能な生物学的効果における検出可能な差異をもたらす組成物の量を指す。これには、限定されないが、そのような効果の統計的に有意な差異を含む。検出可能な差異は、組成物中の単一の物質に、組成物中の物質の組み合わせに、または１つより多い組成物の投与の複効果に、起因し得る。例えば、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチド、結腸直腸癌細胞中のＩＢＡＢＰ−Ｌレベルを減少させるポリヌクレオチド、または本発明による他の治療物質を含む組成物の「有効量」は、癌細胞を死滅させる、癌または別の病気もしくは疾患を治療または予防する、あるいは、個体における癌または別の病気もしくは疾患の症状を治療する、組成物の量を指し得る。所与の組成物または治療における、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドと、例えば抗癌剤または他の有効成分等の別の物質との組み合わせは、相乗的組み合わせであり得る。例えば、Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．２２：２７−５５（１９８４）により記述される相乗作用は、組み合わせて投与された時の化合物の効果が、単剤として単独投与された時の化合物の相加効果よりも大きい場合に、生じる。概して、相乗効果は、化合物の準最適濃度で最も明確に示される。相乗作用は、より低い細胞毒性、活性の増加、または個々の成分と比較した組み合わせによる他の何らかの有益な効果の意味であり得る。
【０１５８】
本明細書で用いる「治療」または「治療する」には、次のものを含む：（ｉ）病態の発生を予防または遅延させること（例えば、予防法）、（ｉｉ）病態を抑制すること、または発達もしくは進行を遅滞させること、（ｉｉｉ）病態を軽減させること、および／または病態に付随する１つ以上の症状の重症度または持続期間を減少させること、あるいは任意の他の臨床に関連する有効な処置。
【０１５９】
変化を観察するために必要とされる治療の長さ、および治療後に応答が起きるまでの間隔は、所望の効果に応じて異なるように思われる。
【０１６０】
本発明の医薬組成物の一実施形態は、限定されないが、結腸または直腸を含む患者の消化器へのＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドの送達に好適な、錠剤またはカプセルである。
【０１６１】
ポリペプチド製剤は、持続放出製剤によって投与され得る。持続放出組成物の好適な例は、例えば、フィルムまたはマイクロカプセル等の造形品の形態の半透過性ポリマーマトリックスを、含む。持続放出マトリックスは、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第ＥＰ５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｕ．Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏポリマー２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１），およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，同文献）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第ＥＰ１３３，９８８号）を含む。また、持続放出ＩＢＡＢＰ−Ｌ組成物は、リポソームに封入されたＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドも含む。ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドを含有するリポソームは、既知の方法によって調製される。例えば、ＤＥ３，２１８，１２１、Ｅｐｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２  （１９８５）、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０−４０３４（１９８０）、欧州特許第ＥＰ５２，３２２号、欧州特許第ＥＰ３６，６７６号、欧州特許第ＥＰ８８，０４６号、欧州特許第ＥＰ１４３，９４９号、欧州特許第ＥＰ１４２，６４１号、日本特許出願第８３−１１８００８号、米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号、ならびに欧州特許第ＥＰ１０２，３２４号を参照されたい。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００オングストローム）単層型のものであり、脂質含量は約３０モルパーセントコレステロールより高く、選択される比率は、最適なＩＢＡＢＰ−Ｌ療法のために調製される。
【０１６２】
非経口投与のために、一実施形態においては、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドは、概して、所望の程度の純度で、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、またはエマルジョン）中で、医薬的に容認可能な担体、つまり、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、製剤の他の成分と適合性がある担体と混合することによって、製剤化される。例えば、本発明の一実施形態によれば、製剤は、酸化剤、およびポリペプチドに対して有害であることが既知である他の化合物を含まない。
【０１６３】
製剤は、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドを、液体担体または微細に分割された固体担体またはその両方と均一かつ密接に接触させることにより、調製され得る。次いで、必要な場合、生成物を所望の製剤に成形する。担体は、非経口担体、またはレシピエントの血液と等張である溶液である。そのような担体媒体の例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液を含む。また、固定油およびオレイン酸エチル等の非水性媒体、ならびにリポソームも、担体として有用である。
【０１６４】
担体は、等張性および化学安定性を増強する物質等の添加剤を、少量適切に含有する。そのような材料は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはこれらの塩等の緩衝剤、アスコルビン酸等の抗酸化剤、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド等の低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン等のアミノ酸、セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート化剤、マンニトールまたはソルビトール等の糖アルコール、ナトリウム等の対イオン、および／またはポリソルベート、ポロオキサマー、またはＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤を、含む。
【０１６５】
前述の賦形剤、担体、または安定化剤のある種の使用は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ塩の製剤をもたらすことが、理解される。
【０１６６】
治療的投与のために使用されるべきＩＢＡＢＰ−Ｌは、無菌でなければならない。無菌は、無菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通しての濾過により、容易に達成される。治療的ＩＢＡＢＰ−Ｌ組成物は、概して、無菌の出入り口を有する容器、例えば、静脈用溶液バッグ、または皮下注射針により貫通可能なストッパーを有するバイアルに、入れられる。
【０１６７】
ＩＢＡＢＰ−Ｌは、単位用量または多回用量の容器、例えば、封着されたアンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成のための凍結乾燥製剤として、保存され得る。凍結乾燥製剤の一例として、１０ｍｌバイアルを、濾過滅菌された１％（ｗ／ｖ）ＩＢＡＢＰ−Ｌ水溶液５ｍｌで充填し、結果として生じる混合物を凍結乾燥する。注入溶液は、静菌性の注射用蒸留水を用いて、凍結乾燥されたＩＢＡＢＰ−Ｌを再構成することによって、調製する。
ＩＢＡＢＰ−Ｌの細胞内レベルを減少させることによる、またはＩＢＡＢＰ−Ｌ活性を調節することによる結腸直腸癌の治療
【０１６８】
例えば、ＩＢＡＢＰ−Ｌによる胆汁酸結合等の、ＩＢＡＢＰ−Ｌの細胞内レベルを減少させる、またはＩＢＡＢＰ−Ｌ活性を減少させることによって、結腸直腸癌細胞の増殖を抑制する、またはその死滅を誘発するための組成物および方法を、本明細書に記述する。本発明の方法および組成物は、例えば、原発性結腸直腸癌細胞、進行性結腸直腸癌細胞、および転移性結腸直腸癌細胞を含む任意の種類の結腸直腸癌細胞に関して、またはＩＢＡＢＰ−Ｌが比較され得る非癌性細胞よりも高いレベルで存在する腸（例えば、結腸または直腸）の前癌性細胞に関して、使用することができる。本明細書で用いる「細胞」という用語は、文脈に適切であれば、単一細胞のみならず、組織およびさらに生物全体も含むことを意図する。
【０１６９】
「ＩＢＡＢＰ−Ｌ抑制療法」は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ活性の抑制に基づく療法を指す。例えば、本発明のある実施形態においては、ＩＢＡＢＰ−Ｌ抑制療法は、結腸直腸癌の治療を必要としている患者における結腸直腸癌細胞中のＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドの活性を抑制することを、含む。さらに、ＩＢＡＢＰ−Ｌ抑制療法は、結腸直腸癌細胞中のＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドの発現を抑制することを、含む。ＩＢＡＢＰ−Ｌ抑制療法は、例えば、原発性結腸直腸癌細胞、進行性結腸直腸癌細胞、および転移性結腸直腸癌細胞を含む任意の種類の結腸直腸癌細胞に、あるいは結腸または直腸の前癌性細胞に、適用することができる。他のある実施形態においては、本発明は、限定されないが、胆汁酸結合活性を含むＩＢＡＢＰ−Ｌ活性を抑制する薬剤に関する。
【０１７０】
ＩＢＡＢＰ−Ｌ活性化に関与する分子の抑制。ある実施形態においては、本発明は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ活性化に直接または間接的に関与する１つ以上の分子を抑制することによって、結腸直腸癌細胞中のＩＢＡＢＰ−Ｌを抑制するステップを、考慮する。ＩＢＡＢＰ−Ｌ活性化に関与する分子は、ＮＦ−κＢ等の転写因子に代表されるＩＢＡＢＰ−Ｌ発現に関与する分子を、含む。
【０１７１】
ＩＢＡＢＰ−Ｌの細胞内レベルを減少させるポリヌクレオチド。ＩＢＡＢＰ−Ｌ活性を抑制する分子の治療的使用は、好ましくはＩＢＡＢＰレベルに実質的に影響を及ぼすことなく、ＩＢＡＢＰ−Ｌの細胞内レベルを減少させるポリヌクレオチドの結腸直腸癌細胞への送達を、含む。
【０１７２】
本発明のある実施形態においては、ＩＢＡＢＰ−Ｌ活性は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ活性を抑制するためのアンチセンス、リボザイム、ＲＮＡｉ、および他の核酸に関連した方法および組成物の使用によって、抑制される。本発明の任意の核酸療法は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ核酸に示される核酸配列を標的するように、設計され得る。ある実施形態において本発明の任意の核酸療法は、ＩＢＡＢＰ−Ｌの活性化に関与する分子の核酸配列に示される核酸配列を標的するように、設計され得る。
【０１７３】
ＲＮＡ干渉。「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」という用語は、関心遺伝子に（特に、関心遺伝子のメッセンジャーＲＮＡに）相同性のある１つ以上の二本鎖ＲＮＡを、標的細胞に導入することによって、遺伝子または遺伝子産物の発現を減少させる任意の方法を指す。また、ＲＮＡｉは、（標的に対する）アンチセンス鎖がＲＮＡであるＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの導入によっても、達成され得る。どちらの鎖も、塩基または糖リン酸骨格への１つ以上の修飾を、含み得る。ＲＮＡ干渉効果を達成するように設計された任意の核酸調製物は、本明細書において「ｓｉＲＮＡ」と称する。ｓｉＲＮＡには、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）等およびこれらの模倣体（限定されないが、例えば、２，４−ジフルオロトルイルリボヌクレオシド等の非標準ヌクレオシド模倣体を含むポリヌクレオチド。Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：１７６−１８３，２００６を参照）を、含む。
【０１７４】
本発明のある実施形態は、ＲＮＡｉを用いて、１つ以上ＩＢＡＢＰ−Ｌ遺伝子の発現の減少をもたらす材料および方法を、利用する。本発明の付加的な実施形態は、ＩＢＡＢＰ−Ｌの活性化に関与する１つ以上の遺伝子のノックダウンをもたらすための材料および方法を、利用する。ＲＮＡｉは、真核細胞中で生じ得る配列特異的な転写後遺伝子抑制の手段である。ＲＮＡｉは、線虫（例えば、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１，１９９８を参照）、マウス卵子および胚（Ｗｉａｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：７０−７５，２０００、Ｓｖｏｂｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７：４１４７−４１５６，２０００）、および培養ＲＡＴ−１線維芽細胞（Ｂａｈｒａｍｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９：２７４−２８３，１９９９）を含む、多くの異なる生物において、遺伝子の発現を減少または除去するのに有効であることが示されている。また、ＲＮＡｉは、真核植物および動物（Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：４８５−４９０，２００１）で利用可能であり、古代に進化した経路であると考えられる。ＲＮＡｉは、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞およびＢＨＫ−２１細胞を含む、様々な細胞型において遺伝子発現を減少させる有効な手段であることが、証明されている。
【０１７５】
ＲＮＡｉをもたらすために使用される二本鎖オリゴヌクレオチドは、長さ３０塩基対未満であり得、例えば、約２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８または１７塩基対のリボ核酸を含む。任意に、適用されるｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、３’オーバーハング末端を含み得る。ｄｓＲＮＡｓは、化学的に合成され得るか、または適切な発現ベクターを使用して生体外または生体内で生成され得る。合成ＲＮＡには、当該技術分野において既知の方法（例えば、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ＲＮＡホスホラミダイトおよびチミジンホスホラミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用して化学的に合成したＲＮＡを含む。合成オリゴヌクレオチドは、当該技術分野において既知の方法を使用して、脱保護またはゲル精製され得る（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８−２００，２００１を参照）。より長いＲＮＡは、当該技術分野において既知のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター等のプロモーターから転写され得る。生体外プロモーターの下流の両方の可能な配向に置かれた単一ＲＮＡ標的は、標的の両方の鎖を転写して、所望の標的配列のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを生じさせる。上記の任意のＲＮＡ種は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ核酸に示される核酸配列の一部を含むように、設計され得る。さらに、本発明のＲＮＡｉ構築物は、ＩＢＡＢＰ−Ｌの活性化に関与する遺伝子に示される核酸配列の一部を含むように設計されたＲＮＡｉ構築物を、含む。適切なオリゴヌクレオチドを設計するための方法および組成物は、例えば、米国特許第６，２５１，５８８号に見られ、その内容は参照することにより本願明細書に組み込まれる。さらなる組成物、方法およびＲＮＡｉ技術の応用は、米国特許第６，２７８，０３９号、第５，７２３，７５０号および第５，２４４，８０５号に提供され、参照することにより本願明細書に組み込まれる。
【０１７６】
例えば、ｓｉＮＡ分子が遺伝子の発現を選択的に減少させる、または抑制する時に、遺伝子は、本発明によるｓｉＮＡによって「標的」される。本明細書で用いる「選択的に減少させる、または抑制する」という語句は、１つの遺伝子の発現に影響を及ぼすｓｉＮＡ、ならびに１つより多い遺伝子の発現に影響を及ぼすｓｉＮＡを包含する。ｓｉＮＡが、１つより多い遺伝子の発現に影響を及ぼす場合では、標的とされた遺伝子は、任意の他の遺伝子の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、または１００倍、影響を受ける。代替として、ｓｉＮＡは、ｓｉＮＡがストリンジェントな条件下で遺伝子転写物にハイブリダイズする時に、遺伝子を標的する。ｓｉＮＡの遺伝子を標的する能力は、生体外または生体内で試験することができる。
【０１７７】
標的遺伝子配列の短い断片（例えば、長さ１９〜４０ヌクレオチド）を、本発明のｓｉＮＡの配列として選択する。一実施形態においては、ｓｉＮＡはｓｉＲＮＡである。そのような実施形態においては、標的遺伝子配列の短い断片は、標的遺伝子ｍＲＮＡの断片である。好適実施形態において、候補ｓｉＲＮＡ分子となるべき標的遺伝子ｍＲＮＡからの配列断片を選択する判断基準は、次のものを含む：１）天然ｍＲＮＡ分子の５’または３’末端から少なくとも５０〜１００ヌクレオチドである標的遺伝子ｍＲＮＡからの配列、２）３０％から７０％、最も好ましくは約５０％のＧ／Ｃ含有量を有する標的遺伝子ｍＲＮＡからの配列、３）反復配列（例えば、ＡＡＡ、ＣＣＣ、ＧＧＧ、ＴＴＴ、ＡＡＡＡ、ＣＣＣＣ、ＧＧＧＧ、ＴＴＴＴ）を含有しない標的遺伝子ｍＲＮＡからの配列、４）ｍＲＮＡ中で利用可能な標的遺伝子ｍＲＮＡからの配列、ならびに５）標的遺伝子に特有の標的遺伝子ｍＲＮＡからの配列。標的遺伝子ｍＲＮＡからの配列断片は、上で特定した判断基準の１つ以上を満たし得る。標的遺伝子ｍＲＮＡの断片が上で特定した判断基準の全てより少ない基準を満たす実施形態においては、天然配列は、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子ｍＲＮＡの断片よりも多く判断基準に適合するように、変更され得る。好適な実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、６０％を下回るＧ／Ｃ含有量を有し、および／または反復配列を欠く。
【０１７８】
一部の実施形態においては、本発明の各ｓｉＮＡは、１つの遺伝子を標的とする。特定の一実施形態においては、標的領域に相補的なｓｉＮＡの一部は、標的領域に完全に相補的である。別の特定の実施形態においては、標的領域に相補的なｓｉＮＡの一部は、標的領域に完全に相補的でない。また、標的配列に対する挿入、欠失および点変異を有するｓｉＮＡも、本発明に包含される。したがって、配列同一性は、当該技術分野において既知の配列比較およびアラインメントアルゴリズム（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１、および本明細書に引用された参考文献を参照）、ならびにヌクレオチド配列間のパーセント差異を算出することによって、例えば、デフォルトパラメータを用いたＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラム（例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）において実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによって、算出され得る。ｓｉＮＡと標的遺伝子の一部との間で、９０％、９５％、または９９％より大きい配列同一性が、好適である。代替として、ｓｉＮＡと天然ＲＮＡ分子間の相補性は、ハイブリダイゼーションによって、機能的に解明され得る。本発明のｓｉＮＡ配列は、ストリンジェントな条件（例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０  ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、摂氏５０度または摂氏７０度での１２〜１６時間のハイブリダイゼーションと、続いて洗浄）下で、標的遺伝子転写物の一部とハイブリダイズすることが可能である。また、本発明のｓｉＮＡ配列は、標的遺伝子の発現を減少させる、または抑制する能力によって機能的に定義することもできる。遺伝子発現をもたらすｓｉＮＡの能力は、生体内または生体外のいずれかで経験的に決定することができる。
【０１７９】
１つの遺伝子のみを特異的に標的するｓｉＮＡに加えて、変性ｓｉＮＡ配列は、複数の遺伝子の相同領域を標的するために使用され得る。国際公開第ＷＯ２００５／０４５０３７号は、付加的な標的配列を提供することができる、例えば不適正および／またはゆらぎ塩基対等の非標準塩基対を組み入れることによって、そのような相同配列を標的するｓｉＮＡ分子の設計を記載する。不適正・ミスマッチが同定された場合において、非標準塩基対（例えば、不適正および／またはゆらぎ塩基）は、１つより多い遺伝子配列を標的とするｓｉＮＡ分子を産生するために、使用することができる。限定されない例において、ＵＵおよびＣＣ塩基対等の非標準塩基対は、配列相同性を共有する異なる標的に対する配列を標的することが可能なｓｉＮＡ分子を産生するために、使用される。したがって、本発明のｓｉＮＡを使用する１つの利点は、単一ｓｉＮＡが、相同遺伝子間で保存されたヌクレオチド配列に相補的な核酸配列を含むように、設計され得ることである。この手法において、単一ｓｉＮＡは、異なる遺伝子を標的する１つより多いｓｉＮＡ分子を使用する代わりに、１つより多い遺伝子の発現を抑制するために、使用することができる。
【０１８０】
本発明の一部の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は二本鎖である。一実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子は、平滑末端を含む。別の実施形態においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子は、オーバーハングしているヌクレオチド（例えば、１〜５ヌクレオチドオーバーハング、好ましくは、２ヌクレオチドオーバーハング）を含む。特定の実施形態においては、オーバーハングしているヌクレオチドは、３’オーバーハングである。別の特定の実施形態においては、オーバーハングしているヌクレオチドは、５’オーバーハングである。任意の種類のヌクレオチドがオーバーハングの一部であることができる。一実施形態においては、オーバーハングしているヌクレオチドは、リボ核酸である。別の実施形態においては、オーバーハングしているヌクレオチドは、デオキシリボ核酸である。好適な実施形態においては、オーバーハングしているヌクレオチドは、チミジンヌクレオチドである。別の実施形態においては、オーバーハングしているヌクレオチドは、修飾された、または非典型的ヌクレオチドである。オーバーハングしているヌクレオチドは、非典型的なヌクレオチド間結合（例えば、ホスホジエステル結合以外）を、有し得る。
【０１８１】
ｓｉＲＮＡがｄｓＲＮＡである実施形態においては、二本鎖ＲＮＡ分子を得る場合に、アニーリングステップが必要である。簡潔にのべると、３０．ｍｕ．ｌの各ＲＮＡオリゴ５０．ｍｕ．Ｍ溶液を、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム中で混合する。次いで、溶液を摂氏９０度で１分間インキュベートし、１５分間遠心分離して、摂氏３７度で１時間インキュベートする。
【０１８２】
ｓｉＲＮＡが低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である実施形態においては、ｓｉＲＮＡ分子の２つの鎖は、リンカー領域（例えば、ヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカー）によって接続され得る。
【０１８３】
ＲＮＡｉ、アンチセンス、およびリボザイム手法のために使用されるポリヌクレオチドの調製。ＩＢＡＢＰ−Ｌの細胞内レベルを減少させるＲＮＡｉ、アンチセンス、およびリボザイム手法のためのポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成に関する当該技術分野における既知の任意の方法によって、調製され得る。これらは、例えば、固相ホスホラミダイト化学合成等の、オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成する技術を含む。代替として、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列の生体外および生体内転写によって、産生され得る。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーター等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み入れた様々なベクターに組み入れられ得る。代替として、使用するプロモーターに応じて、アンチセンスＲＮＡを恒常的または誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を、細胞株内に安定的に導入することができる。さらに、核酸分子に対する種々の既知の修飾は、細胞内安定性および半減期を増加させる手段として、導入され得る。可能な修飾は、限定されないが、分子の５’および／または３’末端への、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、あるいはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合よりむしろホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用を含む。当業者は、ＲＮＡ分子内に組み込まれ得る他の種類の化学修飾を認識する（修飾の種類の概説に関しては、国際公開第ＷＯ０３／０７０７４４号および国際公開第ＷＯ２００５／０４５０３７号を参照されたい）。
【０１８４】
一実施形態においては、修飾は、分解に対する耐性の向上または取り込みの向上を提供するために、使用することができる。そのような修飾の例は、ホスホロチオエートヌクレオチド内連鎖、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に、二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖上）、２’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「汎用性塩基」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆位デオキシ脱塩基残基取り込みを、含む（概して、ＧＢ２４０６５６８を参照）。
【０１８５】
別の実施形態においては、修飾は、安定性を増強させるためまたは標的効率を増大させるために使用することができる。例えば、ｓｉＲＮＡに関して、修飾は、ｓｉＲＮＡの２つの相補鎖間の化学的架橋、ｓｉＲＮＡ鎖の３’または５’末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、２’−フルオロ修飾リボヌクレオチドならびに２’−デオキシリボヌクレオチドを、含む（概して、国際公開第ＷＯ２００４／０２９２１２号を参照）。
【０１８６】
別の実施形態においては、例えば、ｓｉＲＮＡに関して、修飾は、標的ｍＲＮＡ内および／または相補ｓｉＲＮＡ鎖内の相補ヌクレオチドに対する親和性を増加または減少させるために、使用することができる（概して、国際公開第ＷＯ２００５／０４４９７６号を参照されたい）。例えば、未修飾ピリミジンヌクレオチドは、２−チオ、５−アルキニル、５−メチル、または５−プロピニルピリミジンに、置換することができる。さらに、未修飾プリンは、７−デザ、７−アルキル、または７−アルケニルプリンで、置換することができる。別の実施形態においては、ｓｉＮＡが二本鎖ｓｉＲＮＡである場合、３’末端ヌクレオチドのオーバーハングヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドによって置き換えられる（概して、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，１５：１８８を参照）。
【０１８７】
アンチセンスポリヌクレオチド。さらなる実施形態においては、本発明は、例えば、ＩＢＡＢＰ−Ｌ核酸の転写および／または翻訳を抑制することによって、発現を抑制する単離された「アンチセンス」核酸の使用に関する。アンチセンス核酸は、通常の塩基対相補性によって、または例えばＤＮＡ二本鎖に結合する場合には二重らせんの主溝における特異的な相互作用を通じて、創薬標的（潜在的な薬の標的）に、結合し得る。概して、これらの方法は、当該技術分野において一般的に用いられる技術の範囲を指し、オリゴヌクレオチド配列への特異的結合に依存する任意の方法を含む。
【０１８８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそのキメラ混合物あるいはその誘導体または修飾された形であり、一本鎖または二本鎖であることができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を向上させるために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格を、修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３−６５５６，  １９８９、Ｌｅｍａｉｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８−６５２，１９８７、１９８８年１２月１５日公開のＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０９８１０号を参照）または血液脳関門（例えば、１９８８年４月２５日公開のＰＣＴ公開第ＷＯ８９／１０１３４号を参照）を通過する輸送を促進するペプチドまたは薬剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６，１９８８参照）あるいはインターカレーター・挿入剤（例えば、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９，１９８８を参照）等の他の付属基を、含み得る。この目的で、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤等に、抱合され得る。
【０１８９】
リボザイム。ある実施形態においては、本発明は、ＲＮＡの特異的切断を触媒することが可能な酵素ＲＮＡ分子（総説については、Ｒｏｓｓｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：４６９−４７１，１９９４を参照）であるリボザイム、およびＤＮＡ酵素を含む、結腸直腸癌細胞内のＩＢＡＢＰ−Ｌの活性を抑制する他の核酸療法に関する。また、ＩＢＡＢＰ−Ｌ  ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子は、対象ＩＢＡＢＰ−Ｌ  ｍＲＮＡの翻訳および／またはＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドの発現を防ぐためにも、使用することができる（例えば、１９９０年１０月４日公開のＰＣＴ国際公開第ＷＯ９０／１１３６４号、Ｓａｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２−１２２５，１９９０、および米国特許第５，０９３，２４６号を参照）。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様に特定の標的核酸配列を認識し、しかしながら、リボザイムと同様触媒的に標的核酸を特異的に切断するように、設計される。ＤＮＡ酵素を製作および投与する方法は、例えば、米国特許第６，１１０，４６２号に見いだすことができる。
【０１９０】
胆汁酸結合のまたはＩＢＡＢＰ遺伝子発現の小分子阻害剤。本発明により熟慮される薬剤は、胆汁酸のＩＢＡＢＰ−Ｌ結合のまたはＩＢＡＢＰ遺伝子発現の潜在的な阻害剤のライブラリーから選択された化合物も、含む。小分子阻害剤の同定のために使用されるライブラリーは数多くあり、化学ライブラリー、天然産物ライブラリー、およびランダムペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機分子から構成されたコンビナトリアルライブラリーを含む。
【０１９１】
様々な化学ライブラリーが使用され得る。例えば、このように使用される化学ライブラリーには、ランダム化学構造を含む化学ライブラリーが使用され得る。化学ライブラリーには、既知の化合物の類似体、または創薬スクリーニングにおいて「ヒット」または「リード」として同定された化合物の類似体、天然産物由来のもの、ならびに、非定方向合成有機化学から生じたものを、含む。
【０１９２】
天然産物ライブラリーは、スクリーニングのための混合物を作製するために使用され、微生物、動物、植物、または海洋生物の産物の収集物を、含む。天然産物ライブラリーは、ポリケチド、非リボソームペプチド、およびこれらの変異体（非自然発生的）を含む（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：６３−６８（１９９８）に総説される）。コンビナトリアルライブラリーは、混合物として、数多くのペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機化合物から構成されたものを、含む。コンビナトリアルライブラリーは、非ペプチドコンビナトリアルライブラリーを含む。さらに他のコンビナトリアルライブラリーは、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣薬、多重並行合成収集物、組換え、ポリペプチド、抗体、およびＲＮＡｉライブラリーを、含む。コンビナトリアル化学およびそれから作製されるライブラリーの総説については、Ｍｙｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０１−７０７（１９９７）を参照されたい。本明細書に記載される種々のライブラリーの使用を通して阻害剤を同定することによって、活性を調節する「ヒット」の能力を最適化するように、候補「ヒット」または「リード」を修飾することが、可能になる。
【０１９３】
ＩＢＡＢＰ−Ｌによる胆汁酸結合を調節する抗体。抗体を、例えばＩＢＡＢＰ−Ｌ等の特定のタンパク質の活性の修飾因子として、使用することができる。抗体は、例えば、結合を立体的に妨げることによって、またはＩＢＡＢＰ−Ｌの高次構造を変化させることによって、胆汁酸結合が減少または除去されるように、あるいはＩＢＡＢＰ−Ｌによる胆汁酸結合を減少できるように、ＩＢＡＢＰ−Ｌに結合することができる。ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチド、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ＦｖおよびｓｃＦｖ等を含む抗体断片等の特定のポリペプチドに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体（Ａｂ）はどちらも、ＩＢＡＢＰ−Ｌ等の特定のタンパク質の作用をブロックするために使用することができる。
【０１９４】
変異体ポリペプチドおよびペプチド断片は、ＩＢＡＢＰ−Ｌの機能等の特定のタンパク質の機能を、刺激または拮抗することができる。そのような変異体および断片の例は、ＩＢＡＢＰ−Ｌのドミナントネガティブ変異体のような、恒常的に活性なまたはドミナントネガティブな、特定のタンパク質の変異体を含む。拮抗性変異体は、任意の多数の方法で機能し得る。当業者は、特定のポリペプチド、またはその断片に少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列を有する変異体を、容易に製作し得る。また、当業者は、ＩＢＡＢＰ−Ｌの機能を刺激または拮抗する変異体を同定することができる。同様に、ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドの機能を刺激または拮抗するペプチド模倣体（例えば、ペプチド模倣薬）を、製作することができる。
医薬組成物
【０１９５】
本発明に従って用いる医薬組成物は、１つ以上の生理的に容認可能な担体または賦形剤を使用して、常法で製剤化され得る。したがって、化合物ならびにこれらの生理的に容認可能な塩および溶媒和化合物は、例えば、注射、吸入もしくはガス注入（口または鼻のいずれかを通して）による投与、または経口、頬側、非経口もしくは（例えば、浣腸による）直腸投与のために、製剤化され得る。
【０１９６】
例えば、ある実施形態においては、本発明の組成物は、リポソーム系等の送達系と混合されたＲＮＡｉを含み、任意に、容認可能な担体または賦形剤を含む。
【０１９７】
そのような療法のために、対象となる化合物は、全身および局所または局在投与を含む、様々な多くの投与のために、製剤化することができる。技術および製剤については、概して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ中に見いだし得る。本発明の薬剤は、全身投与され得、また、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下注射を含む注射により、投与され得る。全身投与は、経粘膜的または経皮的手段によっても行うことができる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーによって、または座薬を使用して行われ得る。
【０１９８】
本発明の薬剤は、注射による投与、例えば、ボーラス投与または持続点滴による非経口投与のために、製剤化され得る。注射のための製剤は、単位剤形で、例えば、防腐剤を加えたアンプルまたは多回用量の容器中に存在し得る。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態を取り得る。また、組成物は、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤等の製剤化剤を含有し得る。代替として、有効成分は、使用前に、好適な媒体、例えば、無菌の発熱物質を含まない水と構成するために、粉末形状中に存在し得る。  
【０１９９】
また、本発明の薬剤は、例えばココアバターまたは他のグリセリド類等の従来の坐薬基剤を含有する坐薬または停留浣腸等の直腸組成物中で、製剤化され得る。
【０２００】
前述の製剤に加えて、また、化合物は、持効性製剤としても製剤化され得る。そのような長時間作用性製剤は、インプラント（例えば皮下または筋肉内）によって、または筋肉注射によって投与され得る。したがって、例えば、化合物は、好適なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、容認可能な油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂とともに、あるいは難溶性誘導体、例えば、難溶性塩として、製剤化され得る。
【０２０１】
ポリヌクレオチドの投与を伴う治療のために、そのようなポリヌクレオチドを、全身および局所または局在投与を含む種々の形態の投与のために、製剤化することができる。全身投与では、薬剤は注射され得、筋肉内、静脈内、腹腔内、節内、および皮下への注射を含む。用いられるポリヌクレオチドは、液体溶液中で、好ましくは、ハンクス溶液またはリンゲル溶液等の生理的に適合性を有する緩衝液中で、製剤化することができる。加えて、ポリヌクレオチドは、固形中で製剤化され得、使用の前に再溶解または懸濁され得る。また、凍結乾燥形態も含まれる。
【０２０２】
本発明の治療薬の毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物にて、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％の致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％の治療有効用量）を決定する標準的な薬学手順により、決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指標であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指標を示す化合物が好適である。毒性副作用を示す化合物が使用され得るが、非罹患細胞に対して生じ得る損傷を最小限にして、副作用を減少させるために、結腸直腸等の罹患組織、部位への、そのような化合物が標的とする送達系を設計するには、注意を要する。
【０２０３】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトへの使用のために、ある範囲の投与量を処方するのに、使用することができる。そのような化合物の投与量は、殆ど毒性を有さない、または無毒性のＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあり得る。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内で異なり得る。本発明の方法に使用されるいずれの化合物に関しても、治療有効用量は、細胞培養アッセイからまずは推定することができる。用量は、細胞培養中で決定されるＩＣ５０（つまり、症状の最大の抑制の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成する動物モデル中で、定式化され得る。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより精密に決定するために、使用することができる。血漿中での薬剤レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーで測定され得る。
結腸直腸癌細胞中の遺伝子配列を発現するＩＢＡＢＰプロモーターの使用
【０２０４】
したがって、本発明の別の実施形態によれば、ＩＢＡＢＰプロモーターを、治療目的のために結腸直腸癌細胞中で種々のタンパク質の発現を促進するために、使用する。そのようなタンパク質は、限定されないが、例えば、シトクロムＣ、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ３、６、７、８、９）、およびＢａｘ等のプロアポトーシス促進タンパク質、ＰＴＥＮ、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）等の癌抑制タンパク質、例えばｐ２１、ｐ２７、ＡＰＣ（大腸腺腫症）タンパク質等の細胞周期の進行を抑制するタンパク質、例えば頂端ナトリウム依存性胆汁酸輸送体ＡＳＢＴ（ＳＬＣ１０Ａ２）等の結腸癌細胞の細胞質への毒性２次胆汁酸の送達に関与するタンパク質、ならびにＩＢＡＢＰ−Ｌ、を含む。
【０２０５】
本発明の別の実施形態によれば、ＩＢＡＢＰプロモーターを、治療目的で、結腸直腸癌細胞におけるアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの発現を促進するために、使用する。例えば、ＩＢＡＢＰプロモーターは、限定されないが、次のようなタンパク質の発現を減少させるアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの発現を促進するために有用である：脂肪酸シンターゼ、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、アセチルｃｏ−Ａカルボキシラーゼ、またはグルコース−６リン酸デヒドロゲナーゼ等の代謝酵素、サイクリン依存性キナーゼまたはｓｋｐ−２を含む細胞周期の進行に必須のタンパク質、ＩＡＰファミリー（ｃ−ＩＡＰ１、Ｃ−ＩＡＰ２、ＸＩＡＰ、ＮＡＩＰ、およびサバイビング）のメンバーを含むアポトーシスを抑制するタンパク質、Ａｋｔキナーゼ等の増殖調節シグナル伝達に関与するタンパク質、ならびにＩｌｅｏｃｙｔｅ  Ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｏｌｕｔｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（または有機溶質輸送体−α／β複合体）を含む結腸癌細胞外への胆汁酸輸送に関与するタンパク質。
治療方法
【０２０６】
本発明は、患者（例えば、哺乳類、特に、ヒト）の大腸癌を治療、予防、または処置するための方法を包含し、本発明の１つ以上の治療薬を有効量投与するステップを含む。
【０２０７】
一実施形態においては、治療薬の単一の種類、例えばｓｉＲＮＡが、本発明の治療的方法において投与される。別の実施形態においては、本発明の治療薬は、本発明の別の治療薬と（例えば、第２のｓｉＲＮＡとの）組み合わせて、および／または結腸直腸癌の治療、予防または処置において有用な１つ以上の他の標準的な治療薬と組み合わせて、投与される。「と組み合わせて」という用語は、全く同時に治療薬を投与することに限定されず、むしろ、組み合わせの利点が他の方法で投与された場合の利点よりも大きくなるように、本発明の治療薬および他の薬剤が、ある順序で、およびある時間間隔内で患者に投与されることを、意味する。例えば、各治療薬は、任意の順序かつ異なる時点で、同時にまたは順次投与され得るが、同時に投与されない場合、それらは、所望の治療効果を提供できるように、十分に近い時間内に投与されるべきである。各治療薬は、適切な形態および任意の好適な経路で、別々に投与することができる。
【０２０８】
本発明の治療薬の治療的有効量は、結腸直腸癌の治療または処置において有用性を提供する。また、このような有効量は、例えば、療法全体を向上させる量、望ましくない効果を減少または回避する量、あるいは、別の治療薬の治療効果または別の治療薬との相乗作用を増強する量を、提供する。本発明の組成物の有効量は、標準的な研究技術によって決定することができる。例えば、疾患の治療、予防または処置に有効な組成物の投与量は、例えば、本明細書に開示したまたは当業者に既知の動物モデル等に組成物を投与することによって、決定することができる。加えて、生体外アッセイを、最適な投与量範囲を同定するのに役立つように任意に用い得る。代替として、投与量は、用量を有効レベルに到達するまで滴定することにより、個体に対して決定され得る。
【０２０９】
好適な有効投与量の選択は、当業者に既知の幾つかの要因の考慮に基づいて、当業者によって（例えば、臨床試験を通じて）決定することができる。そのような要因には、治療または予防される疾患、伴う症状、患者の体重、患者の免疫状態、および投与される医薬組成物の正確性を反映する当業者により既知の他の要因を、含む。
【０２１０】
また、製剤中に用いられる精密な用量は、投与経路、および疾患の重篤度にも依存し、施術者の判断および各患者の状況に従って決定すべきである。有効量は、生体外または動物モデル試験系から算出される用量反応曲線に基づいて、外挿推定され得る。
【０２１１】
本発明の治療薬（例えば、ｓｉＲＮＡ）が結腸直腸癌組織に直接投与される場合、概して、体重１ｋｇ、及び一日あたり、０．３ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、または０．８ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇの量の間で投与され得る。治療薬が静脈内に投与される場合、概して、１注射あたり、０．５ｍｇ〜２０ｍｇ、または０．８ｍｇ〜１０ｍｇ、または１．０ｍｇ〜２．０ｍｇの量の間で投与され得る。
製剤および投与経路
【０２１２】
本発明のｓｉＮＡｓは、当該技術分野において既知の任意の医薬組成物中内に、製剤化され得る（例えば、Ａｌｆｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．，１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５を参照）。本発明の方法において使用するための１つ以上のｓｉＮＡを含む製剤は、多数の形態であり得る。そして、このような形態は、各患者に特異的な種々の要因（例えば、疾患の種類および重症度、投与されるｓｉＮＡの種類、年齢、体重、応答、および患者の既往歴）、製剤中のｓｉＮＡの数および種類、組成物の形態（例えば、液体、半液体または固形）、治療計画（例えば、治療薬を、緩徐に注入、単回ボーラス、１日１回、１日数回または数日おきに１回として経時的に投与するかどうか）、および／または投与経路（例えば、局所、経口、静脈内、筋肉、動脈内、髄内、くも膜下腔内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、または舌下手段）に、依存し得る。
【０２１３】
これらの組成物は、水溶液および非水溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、水性および非水ゲル、クリーム、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、持続放出製剤等の形態を採ることができる。また、本発明のｓｉＮＡは、送達剤（限定されないが、リポソーム、ミクロスフェア、微小粒子、ナノスフェア、ナノ粒子、生分解性ポリマー、ハイドロゲル、シクロデキストリンポリ（乳酸‐コ‐グリコール）酸（ＰＬＧＡ）を含む）中に被包することができ、また、ポリエチレンイミンおよびその誘導体（ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体等）と複合体を形成することができる。
【０２１４】
本発明の組成物には、医薬担体、媒体、賦形剤、または希釈剤が、含まれ得る。このような医薬担体、媒体、賦形剤、または希釈剤には、限定されないが、水、生理食塩水溶液、緩衝生理食塩溶液、油（例えば、石油、動物油、植物油または合成油）、澱粉、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム，モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、エタノール、バイオポリマー（例えば、カルボポール、ヒアルロン酸、ポリアクリル酸等）、デキストロース、透過促進剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコールおよびアミノ酸）、ならびに親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）等が、含まれ得る。また、所望される場合、組成物は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を、含有することもできる。
【０２１５】
非経口投与に好適な医薬製剤は、水溶液中で、好ましくは、ハンクス液、リンゲル溶液、または生理的緩衝食塩水等の生理的適合性のある緩衝液中で、製剤化され得る。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン等の懸濁液の粘度を増大させる物質を、含有し得る。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶媒または媒体は、ゴマ油等の脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、あるいはリポソームを含む。また、任意に、懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能とするために、化合物の溶解性を増大する好適な安定化剤または薬剤をも、含み得る。
【０２１６】
医薬組成物は、例えば、対象の作用部位付近（つまり、結腸直腸癌組織）で、全身または局所投与することができる。さらに、全身投与は、特定の領域または関心のある種類の組織を標的とすることができる投与を包含することを意図する。
【０２１７】
また、本発明の治療薬は、他の有効成分と組み合わせて製剤化することができる。このような有効成分には、限定されないが、結腸直腸癌を治療するために使用される治療化合物（例えば、市販薬）を含む。癌がリンパ節に転移した患者等の結腸直腸癌患者の多くは、手術に加えて、場合によっては放射線療法と併用して化学療法（術後補助療法）を受ける。結腸直腸癌を治療するために使用される化学療法薬は、５’−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカン、およびカペシタビンを含む。また、フルオロウラシルおよびロイコボリンのような薬物の組み合わせも、使用される。また、結腸直腸癌および前癌症状に対する他の治療も調査されており、使用され得る。このような治療には、限定されないが、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、スリンダクおよびＣＯＸ−２阻害剤）、自己腫瘍細胞のワクチン接種、腫瘍関連抗原（癌胎児抗原等）に対するワクチン接種、および腫瘍抗原（例えば、１７−１Ａ抗原）に対するモノクローナル抗体等の免疫療法、遺伝子修正（例えば、野生型ｐ５３遺伝子を修復するため）およびウイルスによる酵素−プロドラッグ治療（例えば、抗真菌薬フルオロシトシンを抗悪性腫瘍薬フルオロウラシルに変換する細菌シトシンデアミナーゼ、またはプロドラッグＣＢ１９５４を変換するニトロレダクターゼの発現）を含む遺伝子治療、マリマスタット等のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を、含む。これらの治療は、単独または組み合わせでの任意で、本発明による治療薬（例えば、細胞内のＩＢＡＢＰ−Ｌレベルを減少させるためのｓｉＲＮＡ）および上記の結腸直腸癌に対する治療の１つを含む単一組成物を投与することによって、または本発明による治療薬を含む組成物および結腸直腸癌に対する別の治療または他の有効成分を含む別の組成物を投与することによって、本発明による治療薬を使用した治療と組み合わせることができる。
【０２１８】
代替として、ｓｉＲＮＡ等のポリヌクレオチドの場合は、治療薬は、プロモーターの制御下で、逆補体ｓｉＮＡ配列を含有するベクターを細胞に形質移入することにより、関心細胞（例えば、結腸直腸癌細胞）内で、直接発現することができる。ｓｉＮＡ等の二本鎖ポリヌクレオチドについては、プロモーターの制御下で、各鎖への逆補体ｓｉＮＡ配列を発現する１つ以上のベクターを、細胞に形質移入することができる。関心細胞は、本発明の組成物を投与することなく、ポリヌクレオチドを直接発現する。
【０２１９】
本明細書に記載した全ての公開論文、本、参照マニュアルおよび要約の内容は、本発明が関連する最新技術をより詳細に説明するために、参照することによりそれら全体が、本願明細書に組み込まれる。
【０２２０】
本発明は、本発明を実施するために既知の最良の形態を単に例示するよう意図された以下の実施例を参照することにより、さらに理解されよう。本発明の範囲は、これに限定されるものではない。
【実施例】
【０２２１】
実施例１：結腸直腸癌のバイオマーカーとしてのＩＢＡＢＰ−Ｌ
本発明者は、ＩＢＡＢＰが、結腸直腸癌のバイオマーカーとして有用であることを発見した。最近の研究により、直腸結腸腫瘍中では、ＩＢＡＢＰの発現が上方制御されることが示唆された（ＤｅＧｏｔｔａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．４９：９８２−９８９，２００４）。しかしながら、ＩＢＡＢＰの遺伝子構造に関する我々の詳細な分析は、意外にも、ＩＢＡＢＰの新しい変異体を明らかにした。我々は、これを、ＩＢＡＢＰ−Ｌと命名した。ＩＢＡＢＰ−Ｌは、ＩＢＡＢＰ遺伝子中の代替開始部位から生じ、その結果として、ＩＢＡＢＰ−Ｌの４９残基のＮ末端配列をコードする。最も重要なことは、ＩＢＡＢＰ−Ｌは、結腸直腸癌の全て病期および悪性結腸ポリープにて、上方制御・調節されることである。我々は、また、先の研究（ＤｅＧｏｔｔａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．４９：９８２−９８９，２００４）で報告されたＩＢＡＢＰの上方制御が、ＩＢＡＢＰ−Ｌの上方制御に完全に起因し得、１４ｋＤａ  ＩＢＡＢＰをコードするより短い転写物の発現が、結腸直腸癌では有意に変化しないことも、示す。
材料および方法
【０２２２】
細胞株および組織試料。ヒト結腸直腸癌細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した、Ｃａｃｏ−２、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６、ＬＳ  １７４Ｔ、ＬｏＶｏ、ＳＷ４０３、ＷｉＤｒ，およびＨＴ−２９）を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）中で増殖させた。この培地は、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有し、また、この培地には、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔａｒｚａｎａ，ＣＡ）が、補充された。細胞を、１００ｍｍ標準細胞培養皿（Ｆａｌｃｏｎ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中で維持し、５％ＣＯ２下、３７℃で増殖させた。
【０２２３】
適合ヒト結腸直腸癌および隣接正常粘膜は、Ａｓｔｅｒａｎｄ，Ｉｎｃ．（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）から購入したか、またはＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤによるサービス）から入手した。患者は、科学的目的のための組織の使用に関して、同意する書面を提供している。合計、６８の適合ヒト結腸直腸癌試料を検査した（５２．９％男性ドナー、８６．８％コーカサス人種）。患者の年齢は、２１歳から８９歳（７６．５％が５０歳を超える）に及ぶ。結腸直腸癌は、次のように腸の領域に分布した：盲腸１１．３％、結腸４８．３％、および直腸４０．３％、組織学的分類によると、高分化２７．１％、中分化６１．０％、および低分化１１．９％、ならびに臨床病期によると、病期１期１１、病期２期２０、病期３期１７、病期４期１５、分類不可能５（提供された病理報告に明記されていない）。また、１１のポリープ試料を検査した。そのうち５つは局所性高度異形成を含有し、１例は、家族性大腸腺腫症（ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ：ＦＡＰ）家系からのもので、１例は、遺伝性若年性ポリポーシス症候群であった。
【０２２４】
ＰＣＲによるＩＢＡＢＰの発現の評価。消化管に沿ったＩＢＡＢＰ−Ｌ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＤＱ１３２７８６）およびＩＢＡＢＰ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１４４５）をコードするｍＲＮＡの発現を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＢｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｈａｙ  ｗａｒｄ，ＣＡ）から購入した正常なヒト腸および肝臓からのＲＮＡを用いて、定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ＡＲＰＰ０の発現を、対照・コントロールとして使用した。ヒト腫瘍および隣接正常組織中のＩＢＡＢＰおよびＩＢＡＢＰ−Ｌの発現を、Ａｓｔｅｒａｎｄ，Ｉｎｃ．（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、および上記のＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋから購入した組織を用いて、測定した。
【０２２５】
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を併用しつつ、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、プロトコルに従って、総ＲＮＡを単離した。各試料に対して、凍結組織（約０．１ｇ）を切断して、これを事前冷却したＲＮＡｌａｔｅｒ−ＩＣＥ安定化溶液（１．０ｍｌ、Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）に、−２０℃で２４時間浸漬した。組織を、手術用メスを使用して分割し、ＴＲＩＺＯＬ（１．０ｍｌ）中に浸し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）を用いてホモジナイズした。クロロホルム（２００μｌ）をホモジナイズした組織に添加し、試料を３０秒間ボルテックスすることにより混合した。試料を遠心分離して（１２，０００ｘｇ、４℃で１０分間）、相を分離した。水相を除去し、等容積の７０％エタノールを添加し、ピペット操作により混合して、ＲＮｅａｓｙカラムに入れた。ＲＮＡ結合後、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造業者の使用説明書に従ってオンカラムデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）消化プロトコルを行った。
【０２２６】
ＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰの相対発現量を決定するために、２ステップ定量ＲＴ−ＰＣＲ手順を使用した。第１のステップでは、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を全ＲＮＡから合成した。各試料に対して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡ（２．０μｇ）を、１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス（１．０μｌ）、０．５ｕｇ／ｍｌオリゴ（ｄＴ）１２−１８（１．０μｌ）、０．１Ｍ  ＤＴＴ（２．０μｌ）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（４．０μｌ）、１０Ｘ  ＲＴ緩衝液（２．０μｌ）、ＲＮａｓｅＯＵＴ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１．０μｌ）、およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（１．０μｌ）を含有する２０μｌ最終反応体積中で、逆転写した。逆転写は、４２℃で５０分間行い、７０℃で１５分間加熱し、次いで、氷上で試料を冷却することにより、終了した。鋳型ＲＮＡを、リボヌクレアーゼＨ（１．０μｌ）で３７℃２０分間インキュベートすることにより、切断した。第２のステップでは、定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）を、希釈ｃＤＮＡ（１：２０、２．０μｌ）、１Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、およびＩＢＡＢＰ−Ｌ、ＩＢＡＢＰ、またはＡＲＰＰ０に対するプライマー（０．２５μＭ）を含有する溶液を使用して、Ｍｘ  ３０００Ｐ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）上で、行った。プライマーセットは、ＩＢＡＢＰ：５’ＣＣＡＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＴＣＴＧＣＴＣ３’（配列番号１０）（エクソン４ａ中）、５’ＡＣＣＡＡＧＴＧＡＡＧＴＣＣＴＧＣＣＣＡＴＣＣＴＧ３’（配列番号１１）（エクソン５中）、ＩＢＡＢＰ−Ｌ：５’ＡＣＡＴＧＧＧＴＧＡＧＣＣＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＣ３’（配列番号１２）（エクソン３中）、５’ＣＣＧＧＡＧＴＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＴＧＡＡＧＴ３’（配列番号１３）（エクソン５中）、ＡＲＰＰ０：５’ＣＡＡＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＴＧＧ３’（配列番号１４）、５’ＡＡＴＣＴＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＴＧＧ３’（配列番号１５）である。全てのプライマーは、ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ（登録商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して設計し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）により合成された。次のサイクリングパラメータを使用した：９５℃で１５秒間の変性、５６℃で２０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長、および７８℃で５秒間の検出。４０サイクル後、ＰＣＲ産物に解離曲線分析を行い、ＰＣＲ特異性を確認した。ＱＰＣＲから得られた値は、ＡＲＰＰ０の発現に対して、正規化した。
【０２２７】
Ｃａｃｏ−２細胞におけるＩＢＡＢＰ変異体の発現調節。Ｃａｃｏ−２細胞を、６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に、２ｘ１０５細胞／ウェルで、播種した。培地は、細胞が１００％コンフルエンスに達し、自発分化を始めるまで、２日ごとに交換した。遊離酸としてＣＤＣＡおよびＤＣＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の貯蔵液を、無水エタノール（１００ｍＭ）中で調製して、−２０℃で保存した。９−シスレチノイン酸（９ｃＲＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の原液を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、１００μＭ）中に溶解して、−２０℃で保存した。コンフルエントなＣａｃｏ−２細胞を、ＣＤＣＡもしくはＤＣＡ（１００μＭ）、９ｃＲＡ（１００ｎＭ）、またはＤＭＥＭのみ（０．１％溶媒濃度）を含有する培地中で、２４時間３７℃でインキュベートした。細胞を収集し、細胞ＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、ＩＢＡＢＰ変異体の発現を上記のようにＱＰＣＲで決定した。
【０２２８】
転写開始部位の決定。プライマー伸長は、Ｈｕｍａｎ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを使用して、製造業者のマニュアルに従って、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて行った。簡潔にのべると、最初のＰＣＲは、プライマーＡＰ１（キットに含まれる）および遺伝子特異的プライマー１（ＧＳＰ１）５’−ＡＣＡＴＴＡＴＡＴＴＴＴＣＴＴＧＣＣＡＡＧＴＡＧＡＧＧＡ−３’（エクソン２）を使用して行い、続いて、プライマーＡＰ２（キットに含まれる）およびＧＳＰ２  ５’−ＡＣＴＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴ−３’（エクソン３）を用いて、ネスティッドＰＣＲを行った。最長のＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１  Ｔ／Ａクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローン化し、１２の個々のクローンを配列決定した。ＧＳＰ２から７８ヌクレオチド離れた位置に、異論なく転写開始部位を位置付けた。記述を単純化するために、転写開始部位ＴＳＳ「Ｃ」の位置を、＋１に設定した。
【０２２９】
ＩＢＡＢＰ−Ｌに対する抗体の産生および免疫組織化学的研究。ＩＢＡＢＰ−Ｌの４９残基のＮ末端配列中に存在する配列ＣＴＷＶＳＲＫＧＤＬＱＲＭＫＱＴＨＫＧＫＰＰＳＳ（配列番号１６）を有するペプチドを合成し、キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ：ＫＬＨ）に抱合させ、抗原として使用してウサギを免疫刺激した。免疫刺激された動物からの抗血清に対して、ウエスタンブロットによって、組換えＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰに対する反応性を試験した。組換えＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰは、ｐＧＥＸシステムを使用して、発現および精製した。組換えタンパク質は、ヒスチジンタグを持つ融合タンパク質として発現され、そのヒスチジンタグは、タンパク質がニッケル樹脂に結合された状態で、トロンビンでの消化によって除去された。消化後、トロンビンをベンズアミジン−セファロースで除去した。
【０２３０】
パラフィン包埋スライドを抗ＩＢＡＢＰ−Ｌ抗血清（１：２０００）で染色し、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ系を用いて、ジアミノベンジジンによる検出を行った。次いで、スライドをヘマトキシリンで対比染色した。
【０２３１】
データ分析および統計。病変結腸組織と対応する隣接正常粘膜間のＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰのＲＮＡ発現の変化を、２つの戦略を用いて分析した。最初の方法において、隣接正常粘膜に対する癌またはポリープ組織中での変異体の発現レベルは、各変異体について、倍数の変化値をもたらした。２倍カットオフ制限を使用して、２．０以上の値は上方制御を表し、０．５未満の値は下方制御を表す。２番目の方法において、癌またはポリープ組織（ＲＣおよびＲＰ）および隣接正常粘膜（ＲＮ）中のＩＢＡＢＰに対するＩＢＡＢＰ−Ｌの比率を計算した。再び２倍カットオフを使用して、２．０以上の比率は癌またはポリープ中でのＩＢＡＢＰ−Ｌの上方制御を表し、０．５未満の値は下方制御を表す。両方の戦略からの値を、臨床検体（性別、年齢、人種、腫瘍サイズ、腫瘍局所性、分化レベル、および臨床病期）のパラメータに従って分類し、発現レベルと臨床パラメータとの間の相関関係を、ｔ検定および一元分散分析によって分析した。
結果
【０２３２】
ＩＢＡＢＰ−Ｌをコードする遺伝子の特徴付け。ＮＭ＿００１４４５を使用したＮＣＢＩ  ヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴＮ検索により、新たに発見された転写物が、Ｎ末端でＩＢＡＢＰに存在しない４９−ａａ配列を有するタンパク質をコードすることを除いては、ＩＢＡＢＰと概して同一な２つのＥＳＴ（ＢＭ９７４２１９およびＢＵ６８３５６０）を明らかにした。この変異体の転写物は、ＩＢＡＢＰのものより長いため、我々は、それをＩＢＡＢＰ−Ｌと命名した。ＩＢＡＢＰ−Ｌに対する遺伝子（染色体５ｑ３３．３−ｑ３４、コンティグＮＴ＿０２３１３３）は、既知の形態ＩＢＡＢＰのものと同一である。しかしながら、ＩＢＡＢＰ−ＬをコードするｍＲＮＡは、７つのエクソンを有し、そのうち３つは特有であり、遺伝子の５’末端に存在する。より短いタンパク質ＩＢＡＢＰは、４つのエクソンのみを有し、その転写は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ（ｆａｂｐ６）遺伝子の第３イントロン内で開始する。図１は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ（ｆａｂｐ６とも称する）の構造を示す。
【０２３３】
したがって、ＩＢＡＢＰの２つの変異体は、エクソン５から７を共有する。両方の変異体をコードする転写物は、ヒト腸内で検出される。ＩＢＡＢＰ−Ｌに特有のエクソンの存在により、ＩＢＡＢＰとＩＢＡＢＰ−Ｌの発現を区別する変異体特異的プライマーの設計が可能となった。以下に説明するように、これらのプライマーは、ＲＴ−ＰＣＲによって、正常なヒト腸から抽出されたｍＲＮＡ中の各変異体の発現を検出するために使用した。
【０２３４】
ＩＢＡＢＰ−Ｌ転写物の完全なヌクレオチド配列は、アクセッション番号ＤＱ  １３２７８６でＧｅｎｅｂａｎｋに受け入れられた。
【０２３５】
図２は、ＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰの両方をコードするＩＢＡＢＰ遺伝子（つまり、ゲノム配列）の読み取り枠を示す。図２中、ＩＢＡＢＰ（１４ｋＤａ形態）の読み取り枠に下線を引き、ＩＢＡＢＰ−Ｌに対する付加的な読み取り枠配列をハイライト（グレー）した。したがって、ＩＢＡＢＰ−Ｌに対する読み取り枠は、ＩＢＡＢＰに対するＯＲＦの大半を含有するが、遺伝子の５’末端上の６２７ヌクレオチドを、加えて含有する。図３は、ＩＢＡＢＰ遺伝子からの、ＩＢＡＢＰ−Ｌに特有なＤＮＡ配列を示す（図２中グレーでハイライトした）。
【０２３６】
図４は、ＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰに対するｃＤＮＡ配列のアラインメントを示す。ＩＢＡＢＰ−Ｌ（上部線）に対するｃＤＮＡ配列は、太字で示したＡＴＧ開始部位とともに示す。ＩＢＡＢＰ（下部線）に対するｃＤＮＡ配列はグレーでハイライトした。エクソン１、２および３は、ＩＢＡＢＰ−Ｌに特有である（ＩＢＡＢＰに対するあらゆる相同エクソンの欠乏を示す点線に留意されたい）。エクソン４ａ（下線）は、ＩＢＡＢＰに対するｃＤＮＡ中にのみ存在する。エクソン４ｂ〜７は、ＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰの両方に対するｃＤＮＡによって共有される。
【０２３７】
図５は、ＩＢＡＢＰ−ＬをコードするｃＤＮＡ配列を示し、図６は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ  ｃＤＮＡからのＮ末端４９アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
【０２３８】
図７は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ（上部線）およびＩＢＡＢＰ（下部線、グレーでハイライト）に対するポリペプチド配列のアラインメントを示す。ＩＢＡＢＰ−Ｌポリペプチドは、ＩＢＡＢＰポリペプチドに存在しないそのＮ末端に、４９アミノ酸配列を含有する。図８は、ＩＢＡＢＰ−Ｌの予測ポリペプチド配列を示す。ＩＢＡＢＰポリペプチド中に見られないＩＢＡＢＰ−Ｌの４９アミノ酸Ｎ−末端配列を、グレーでハイライトした。
【０２３９】
胃腸組織におけるＩＢＡＢＰおよびＩＢＡＢＰ−Ｌの発現パターン。
ＩＢＡＢＰ遺伝子は、腸内で主に発現される。したがって、消化器管、特に、腸肝胆汁酸サイクルに関連する組織（ヒト肝臓、胆嚢および腸の切片）中のＩＢＡＢＰおよびＩＢＡＢＰ−Ｌをコードする転写物の発現を、比較した。各変異体の増幅を選択的にプライミングできるオリゴヌクレオチドを使用して、リアルタイムＱ−ＰＣＲ反応を開始した。ｍＲＮＡ転写物のコピー数は、前立腺および大腸癌調査（Ｃｈｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１  １：７９８−８０４，２００４、Ｃａｃｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｔ  ５４：１１２９−１１３５，２００５）において内在性対照として使用されることが多い、リボソームタンパク質巨大Ｐ０（ＲＰＬＰ０）としても知られるハウスキーピング遺伝子酸性リボソームリンタンパク質（ＡＲＰＰ０）の発現に対して、正規化した。図９は、消化器管内のＩＢＡＢＰおよびＩＢＡＢＰ−Ｌの発現を示す。ＩＢＡＢＰ−Ｌをコードする転写物は、より低いレベルで発現された直腸を除いて、試験した全ての組織において、同様のレベルで見られた（図９）。対照的に、ＩＢＡＢＰの発現は、空腸から上行結腸に及ぶ腸の部分に局在している。これらの部分において、ＩＢＡＢＰの発現は、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現よりも１０倍から１０００倍高かった。
【０２４０】
胆汁酸はＩＢＡＢＰの変異体を特異的に制御する。胆汁酸恒常性に関与する遺伝子の多くは、胆汁酸に直接結合するＦＸＲ核内ホルモン受容体（Ｆｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８１：６８７−６９３，１９９５）を介して調節される（Ｍａｋｉｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１３６２−１３６５，１９９９、Ｐａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１３６５−１３６８，１９９９）。実際、ＩＢＡＢＰの発現は、ＦＸＲによっても調節される（Ｋａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３０（Ｐｔ．１）：２６１−２６５，１９９８、Ｇｒｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２９７４９−２９７５４，１９９９）。ＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰの発現への、胆汁酸およびＲＸＲ（ＦＸＲのパートナー）に対するリガンドである９−シスレチノイン酸の効果を研究した。Ｃａｃｏ−２細胞を、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、または９ｃＲＡのいずれかで処置し、ＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰをコードする転写物の相対発現を、定量ＲＴ−ＰＣＲで測定した（図１０）。予想通り、ＣＤＣＡおよびＤＣＡは、ＩＢＡＢＰの発現を１３倍まで増加させたが、予想外に、これらの薬剤は、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現に影響を及ぼさなかった。また、同様に、９ｃＲＡは、ＩＢＡＢＰの上方制御を誘発したが、ＩＢＡＢＰ−Ｌには影響を及ぼさなかった。これらの結果は、ＩＢＡＢＰの２つの変異体が別々の転写開始部位から生じる考えと一致する。
【０２４１】
ＩＢＡＢＰ−ＬをコードするｍＲＮＡは、結腸直腸癌において上方制御される。ＩＢＡＢＰの各変異体の発現を、ＩＢＡＢＰまたはＩＢＡＢＰ−Ｌ選択的プライマーセットを使用して、定量ＲＴ−ＰＣＲで、大腸癌の種々の病期において、測定した。全ての場合において、癌腫中の転写物のレベルを、隣接正常組織中の転写物のレベルと比較した。ＩＢＡＢＰ−Ｌをコードする転写物は、結腸癌において大幅に上方制御され、一部の場合において、それは、正常組織中よりも１００倍を超える高いレベルで発現された（図１１Ａ）。ＩＢＡＢＰ−Ｌは、２倍カットオフを使用すると、結腸直腸癌の７６％（５２／６８）において、上方制御された（Ｐ＜．０００１）。対照的に、癌組織中のＩＢＡＢＰの発現には、有意な変化はなかった。
【０２４２】
ＩＢＡＢＰおよびＩＢＡＢＰ−Ｌの発現量における患者間の変動に対して正規化する付加的な戦略として、我々は、大腸癌におけるそれらの発現比を比較した。この例において、結腸直腸癌中のＩＢＡＢＰ−Ｌ／ＩＢＡＢＰ比（Ｒｃ）を、隣接正常組織中の発現比（ＲＮ）と比較した（図１１Ｂ）。結腸直腸癌において、Ｒｃは、隣接正常組織ＲＮと有意に異なった（Ｐ＜．０００１）。２倍カットオフを使用すると、ＲＣ／ＲＮ比は、結腸直腸癌の７８％（５３／６８）で増加し、この測定が悪性組織を同定するための良好な予測ツールであることを示す。
【０２４３】
ＩＢＡＢＰ−Ｌタンパク質は、結腸直腸癌において発現および上方制御される。
ＩＢＡＢＰ−Ｌタンパク質が、結腸組織または大腸癌で発現されるかどうかを決定する研究を行った。まず、ＩＢＡＢＰ−Ｌに見られる４９残基のＮ末端配列内のペプチドＣＴＷＶＳＲＫＧＤＬＱＲＭＫＱＴＨＫＧＫＰＰＳＳ（配列番号１６）で免疫刺激することによって、ＩＢＡＢＰ−Ｌに対する抗血清を、ウサギで惹起させた。免疫刺激された動物からの抗血清は、ウエスタンブロットによって、組換えＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰに対する反応性を試験した。組換えＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロースに転写して、抗血清（１：２０００希釈）でプローブした。ＩＢＡＢＰ−Ｌペプチドに対する抗血清または組換えＩＢＡＢＰに対して惹起された抗血清を用いて、ウエスタンブロットをプローブした。ＩＢＡＢＰ−Ｌに対する抗血清の特異性を、可溶性ペプチド抗原との競合によって確認した。この場合において、２μＬの抗血清を、ウエスタンブロットでの使用前に、１または１０μｇの抗原とともにインキュベートした。抗血清は、ＩＢＡＢＰ−Ｌに高度に特異的であり、ＩＢＡＢＰに結合しないことが分かった。さらに、抗血清のＩＢＡＢＰ−Ｌへの結合は、可溶性ペプチド抗原との競合によってブロックされ得る。
【０２４４】
また、ＩＢＡＢＰ−Ｌ選択的抗血清を用いた免疫組織化学によって、ＩＢＡＢＰ−Ｌタンパク質の発現を、ヒト結腸直腸癌において測定した。ヒト結腸直腸癌およびその隣接正常組織のパラフィン包埋スライドを、ＩＢＡＢＰ−Ｌ選択的ペプチドに対して惹起されたウサギ抗血清によって染色し、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ系を用いたジアミノベンジジンによる検出を行った。また、ヒト胎児の結腸スライド（Ｂｉｏｃｈａｉｎ）および正常成人の回腸（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ）も同じ方法で染色した。一部の場合において、絨毛の尖部の上皮細胞は、ＩＢＡＢＰ−Ｌに対して薄い染色を示した。しかしながら、絨毛および陰窩における上皮細胞の大部分は、染色を欠いている。対照的に、ほぼ全ての癌細胞が、陽染された。染色は、腫瘍の分化状態とは無関係であるようであった。興味深いことに、胎児回腸もまたＩＢＡＢＰ−Ｌに対する抗血清によって染色された。胎児上皮細胞は全てＩＢＡＢＰ−Ｌを発現したが、この発現は、殆どの成熟上皮細胞において失われた。重要なことは、成人回腸は、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現を欠くことである。この発見は、ＩＢＡＢＰが、回腸において高レベルで発現される事実とは対照的である（Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３３：４０６−４１３，１９９５、Ｇｒｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２９７４９−２９７５４，１９９９）。
【０２４５】
ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現およびＩＢＡＢＰ−Ｌ／ＩＢＡＢＰの比率への腫瘍病期の影響。腫瘍病期がＩＢＡＢＰ−Ｌの発現に有意に影響を及ぼすかどうかを決定する実験も、また行った。我々は、腫瘍病期に応じてＩＢＡＢＰ−ＬをコードするｍＲＮＡの発現が増加する明白な傾向を発見したが、この傾向は完全に統計学的に有意ではなかった。したがって、ＩＢＡＢＰ−Ｌにおける患者間の変動が、ＩＢＡＢＰ発現レベルで割ることによって正規化され得るかどうかを調査した。ＩＢＡＢＰ−Ｌ／ＩＢＡＢＰの比率は、腫瘍組織（ＲＴ）および正常隣接組織（ＲＮ）に対して算出した。図１２に示すように、大腸癌の最初の４つの病期（ポリープから病期３期）にわたってＲＴ／ＲＮが増加する傾向が見られる。ポリープと病期１期、または病期２期から病期４期との間の差異は有意ではないが、これらの２つの群は統計的に有意である。癌におけるＩＢＡＢＰ−Ｌ／ＩＢＡＢＰの比率もまた、患者の年齢、性別、分化レベル、および腫瘍局所性とは無関係であった。
【０２４６】
ＩＢＡＢＰ−Ｌは、明白な発癌性病変を含有する結腸癌細胞株内で発現される。結腸直腸癌は、癌遺伝子Ｋ−ｒａｓ内の変異や、癌抑制遺伝子ＤＣＣ、ＡＰＣおよびｐ５３内の変異および欠失を含む、多くの遺伝子病変によって始まり得ることが、現在明らかである。結腸癌細胞株を用いて、発癌性病変の種類が、ＩＢＡＢＰ−ＬとＩＢＡＢＰ間の発現比に影響されるかどうかを決定する実験を行った。これらの研究は、明白な病変を含有する結腸癌細胞株において行った（下記表１）。７つの細胞株のＩＢＡＢＰ−Ｌ／ＩＢＡＢＰ比率が、２．０を超え（２．１７から１９．６５）、ＳＷ４８０のみが２．０未満（１．４２）であった。その結果として、発癌性病変の種類は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ対ＩＢＡＢＰの比率に殆ど影響がない。これらの観察から、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現の評価は、広範囲の発癌性病変から生じる大腸癌の検出に適用できる可能性が高いことが示唆される。
考察
【０２４７】
我々は、ＩＢＡＢＰの新しい変異体を同定し、それをＩＢＡＢＰ−Ｌと命名した。ＩＢＡＢＰ−Ｌに対する転写物は、代替開始部位から生じ、ＩＢＡＢＰに存在しない３つのエクソンを含む。ＩＢＡＢＰ−Ｌはまた、第４エクソンの一部をＩＢＡＢＰと共有する。ＩＢＡＢＰ−Ｌによってコードされるタンパク質は、ＩＢＡＢＰには見られない推定４９残基のＮ末端配列を含む。ＩＢＡＢＰ−Ｌ転写物は、正常なヒト腸全体にわたって同じようなレベルで発現される。これは、空腸から上行結腸にまで及ぶ腸の部分において桁違いに高いレベルで発現されるＩＢＡＢＰをコードする転写物とは対照的である。腸のこれらの領域において、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現は、ＩＢＡＢＰよりも少なくとも１桁低い。また、２つの転写物は、胆汁酸への応答においても異なる。胆汁酸は、ＦＸＲ転写経路の一部としてＩＢＡＢＰの発現を刺激するが（Ｇｒｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２９７４９−２９７５４，１９９９）、それらは、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現に影響しない。
【０２４８】
ＩＢＡＢＰは、ＦＸＲの発現減少と併せて、結腸直腸癌で上方制御されることが最近報告された（ＤｅＧｏｔｔａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．  Ｓｃｉ．４９：９８２−９８９，２００４）。しかしながら、その研究は、我々がＩＢＡＢＰ−Ｌを発見する前に行われ、ＩＢＡＢＰの２つの形態を区別しなかった。そこで我々は、６８人の患者からの結腸直腸癌試料中のＩＢＡＢＰおよびＩＢＡＢＰ−Ｌの発現を比較した。ＩＢＡＢＰは、結腸直腸癌において本質的に変化がないが、その代替転写物であるＩＢＡＢＰ−Ｌは、上方制御されることを、我々は報告する。殆どの場合において、上方制御は大幅なものであり、ｍＲＮＡの相対コピー数の平均増加は３０倍を超える。ＩＢＡＢＰ−Ｌは、早期悪性ポリープで上方制御され、その高発現は、腫瘍分化のその後の全ての臨床的分類において明らかである。結腸直腸癌における上方制御の傾向は、２つの転写物を区別できないＰＣＲプライマーで明らかであるが、ＩＢＡＢＰ−Ｌの特異的計測の方が、はるかに精度が高い。
【０２４９】
他の３つの要因が、ＩＢＡＢＰ−Ｌのバイオマーカーとして使用を考慮するために重要である。第１に、結腸直腸癌におけるＩＢＡＢＰ−Ｌ発現の増加は、患者の年齢または性別とは無関係である。第２に、結腸癌細胞株の研究に基づいて、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現は、ｐ５３、ＡＰＣ、またはＫ−ｒａｓ等のタンパク質への一般的な発癌性変異とは無関係であると考えられる。ＩＢＡＢＰ−Ｌとこれらの発癌性変異との間の任意のわずかな関連は、患者からの腫瘍試料のさらなる総合的解析によって、よりよく研究されるであろう。それにもかかわらず、ＩＢＡＢＰ−Ｌが殆どの腫瘍において上方制御されるという事実と併せると、細胞株からの研究は、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現が、単一癌遺伝子中の病変に依存している可能性が極めて低いことを示す。第３に、ＩＢＡＢＰとは異なり、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現は、胆汁酸に影響されない。したがって、ＩＢＡＢＰ−Ｌのレベルが食事の変更または全体的な健康状態の結果として生じる胆汁酸の変化に関係するとは、予期しないであろう。まとめると、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現は、多くの特性を有しており、それによって、結腸直腸癌への広範に適用可能なテストとしての使用に、十分に適している。
【０２５０】
患者集団全体のバイオマーカーレベルを比較する多くの研究と同様に、我々は、正規化手順を使用した。この研究において、我々は、酸性リボソームリンタンパク質（ＡＲＰＰ０）を正規化標準物質として選択した。その理由としては、それが癌中の遺伝子発現の研究において正規化のためにかなり広く受け入れられており（Ｃｈｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１１：７９８−８０４，２００４、Ｃａｃｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｕｔ  ５４：１１２９−１１３５，２００５）、また、我々の予備的な分析により、この遺伝子が結腸直腸腫瘍において最も一貫した発現量を有したことが示されたためである。しかしながら、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現量を正規化するために使用され得る「ハウスキーピング」遺伝子は、他にもある。我々は、腫瘍試料の小規模な調査を行い、シクロフィリンＡ、ＧＡＤＰＨ、およびβ−アクチン等の他の標準物質の適用性を評価した。興味深いことに、β−アクチンをＩＢＡＢＰ−Ｌの正規化のために使用した場合、アッセイは、ＡＲＰＰ０を使用した場合に見落とされた腫瘍を検出した。実際、ＡＲＰＰ０に対して正規化されたＩＢＡＢＰ−Ｌの変化が２倍未満であった１６の腫瘍において、９つは、β−アクチンに対して正規化された場合に、ＩＢＡＢＰ−Ｌが２倍を超える増加を示した。β−アクチンレベルは大腸癌において変化する（Ｋｈｉｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３８：７３９−７４５，２００５）と報告されているため、全ての６８の腫瘍の分析では、β−アクチンを正規化標準物質として選択しなかった。正規化への別の手法として、試料中のＩＢＡＢＰ−ＬとＩＢＡＢＰ（ＲＣ／ＲＮ）との間の発現比もまた算出し、この比率は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ単独の相対的水準よりも、結腸直腸癌のわずかに良好な予測因子であることが分かった。
【０２５１】
大腸癌におけるＩＢＡＢＰ−Ｌの発現およびその上方制御は、大腸癌の発症および進行における２次胆汁酸の役割に関する我々の理解に、影響を与える可能性が高い。２次胆汁酸は、単独で発癌させるには不十分であるが、腫瘍形成を強く促す（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．５８９：４７−６５，２００５）。ＩＢＡＢＰ−Ｌは、２次胆汁酸媒介のアポトーシスに対する防御メカニズムとして最初に上方制御され得る。増加したＩＢＡＢＰ−Ｌレベルは、胆汁酸のより多くの結合を可能にするため、細胞胆汁酸濃度を減少させ、したがって、発癌物質との接触を和らげる。胆汁酸損傷に対する保護緩衝作用は、細胞増殖の利点を最初にもたらし得る。しかしながら、制御されない細胞増殖の発癌プログラム、すなわち過形成から最終的な浸潤性の表現型への進行は、あらゆる本来の利点に取って代わる場合がある。この作用のメカニズムは不明なままであるが、ＩＢＡＢＰ−Ｌの上方制御が、最終的に、未知の発癌促進経路におけるシグナル分子としての関与を示す可能性がある。
【０２５２】
要約すれば、我々は、正常結腸組織と大腸癌間でＩＢＡＢＰ−Ｌの転写に有意な差異を観察した。ＩＢＡＢＰ−Ｌ発現の統計的に有意な差異は、ポリープから病期４期に及ぶ大腸癌の全ての病期で明らかである。したがって、ＩＢＡＢＰ−Ｌは、大腸癌に対する特に有力なバイオマーカーである。
【０２５３】
実施例２：結腸直腸癌の治療としてＩＢＡＢＰ−Ｌのレベルを減少させる
ＩＢＡＢＰ−Ｌは、結腸直腸癌細胞の増殖に関与する。我々は、ＩＢＡＢＰ−Ｌが結腸直腸癌細胞の増殖にも関与することも、実証した。図１３は、ｓｈＲＮＡを有するＩＢＡＢＰ−Ｌの発現減少が、ＨＣＴ１１６細胞の増殖を抑制することを示す。ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞の増殖を８日間にわたってモニターした。細胞を、ウェル当たり７０００個の細胞密度で、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに播種した。増殖を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒキットを用いて毎日モニターした。毎日、この試薬２０マイクロリットルをウェルに添加し、３７℃で１．５時間インキュベートした。４９０ｎｍで、ウェルの比色読み取りを記録した。細胞増殖を、初期播種（７０００個の細胞／ウェル）の吸光度のパーセンテージとしてプロットした。増殖へのＩＢＡＢＰ−Ｌのノックダウンの効果を測るために、細胞に、ＩＢＡＢＰ−Ｌを標的とするｓｈＲＮＡをコードするｐＳＭ２ｃレトロウイルスベクターを形質移入した。対照は、偽形質移入を行った細胞、空ベクターを形質移入した細胞、および無関係なｓｉＲＮＡを形質移入した細胞の培養物を含む。対数増殖期のＨＣＴ１６６結腸癌細胞に、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現をノックダウンするｓｈＲＮＡをコードするベクターを形質移入した時、相対増殖率は、３５％（Ｐ＜０．００１）減少した。細胞増殖へのＩＢＡＢＰ−Ｌのノックダウンの効果は、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、２次胆汁酸の存在下で細胞が増殖された場合に、さらに顕著であった。これらの観察は、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現の減少が結腸癌細胞の増殖を減少させることを示す。このタンパク質の細胞内レベルの減少は、結腸直腸癌を治療するために有用である。
【０２５４】
ＩＢＡＢＰ−Ｌは、２次胆汁酸に対する結腸直腸癌細胞の感受性を抑制する。回腸胆汁酸結合タンパク質はまた、デオキシコール酸等の２次胆汁酸の毒作用から結腸癌細胞を保護するために必須である。図１４に示すように、ＨＣＴ１１６細胞に、ＩＢＡＢＰ−Ｌを標的とするｓｈＲＮＡをコードするｐＳＭ２ｃレトロウイルスベクター、無関係のスクランブルｓｈＲＮＡ、空ベクターを形質移入するか、または単に偽形質移入を行った。ｐＳＭ２−ＩＢＡＢＰ  ｓｈＲＮＡの構成を図１５に示す。細胞は、９６ウェルプレートに、２，０００細胞／ウェルで播種した。４８時間後、細胞を、媒体または２００μＭデオキシコール酸のいずれか一方で、２４時間処置した。細胞死は、製造業者のプロトコルに従い、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡｐｌｕｓキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、モニターした。このキットは、アポトーシスに特有の過程であるＤＮＡ断片化を定量化する。ＨＣＴ１１６結腸癌細胞を２００μＭのデオキシコール酸（ＤＣＡ）で処置した場合、細胞は生存し、殆どアポトーシスを示さなかった。しかしながら、同じ細胞に、ＩＢＡＢＰ−Ｌを標的とするｓｈＲＮＡをコードするベクターを形質移入し、次いで、ＤＣＡで処置した場合、殆ど全ての細胞がアポトーシスにより死滅した。この発見により、生理的レベルの２次胆汁酸存在下で結腸癌細胞が生存するのに、ＩＢＡＢＰ−Ｌが必須であることが示唆される。その結果として、結腸癌細胞でのＩＢＡＢＰ−Ｌの発現を減少または除去することを目的とする治療は、そのような細胞の死滅を誘発する可能性がある。
【０２５５】
ＩＢＡＢＰ−Ｌが、結腸癌細胞内で胆汁酸耐性を与える役割を担うかどうかを判断するために、さらなる研究を行った。モデルシステムとして、我々は、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞株を選択した。理由としては、それは、高レベルのＩＢＡＢＰ−Ｌを発現するが、ＩＢＡＢＰの発現は、殆ど検出できないレベルだからである（図１６Ａ）。したがって、この細胞株は、ヒト大腸癌組織で観察されたＩＢＡＢＰ−ＬおよびＩＢＡＢＰの発現パターンを再現する。ＲＮＡ干渉を、ＨＣＴ１１６細胞内のＩＢＡＢＰ−Ｌの発現をノックダウンするために使用した。構築物をコードするｓｈＲＮＡは、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から購入した。それらの構築物は、ｐＳＭ２ｃベクター中に存在し、ＩＢＡＢＰまたはスクランブルｓｈＲＮＡをコードする。そして、これらのｓｈＲＮＡは、Ｕ６プロモーターを介して、ＩＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼによって転写される。ＨＣＴ１１６細胞懸濁液に偽形質移入を行うか、または２００ｎｇ  ＤＮＡ／１０００細胞で、ｐＳＭ２ｃ−ＩＢＡＢＰ、ｐＳＭ２ｃ−スクランブル、もしくはｐＳＭ２ｃのいずれかを形質移入し、そしてこれらを１０００細胞／ウェルでウェルプレートに播種した。形質移入後、細胞を３７℃で７２時間インキュベートし、異なる濃度のＤＣＡで、２４時間処置した。サンドイッチ酵素免疫測定法ベースの方法を使用して切断されたＤＮＡ／ヒストン複合体の量を検出するＣｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡｐｌｕｓキット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＮ）を使用して、細胞アポトーシスを測定した。値は、比色分析９６ウェルプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ）を使用して決定し、４重複で行った３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）で表した。ＩＢＡＢＰ−ＬをコードするｍＲＮＡの定量化では、発現が５０％減少し、この抑制レベルが４日間維持されたことが示された。ＩＢＡＢＰ−Ｌのノックダウンの２日後、細胞を、１００μＭ  ＤＣＡで２４時間インキュベートし、アポトーシスを生じた細胞の数を決定した。ＩＢＡＢＰ−Ｌがノックダウンされた細胞のアポトーシスレベルは、スクランブルｓｈＲＮＡ、または他の対照群を形質移入した細胞内のものよりも、大幅に高かった（図１６Ｂ）。我々は、カスパーゼ８およびカスパーゼ９の活性化レベルをも分析し、ほぼ同じ結果を見出した。この観察は、ＤＣＡが両方のカスパーゼを活性化することを示した文献の報告と一致する（Ｙｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．［Ｔｏｋｙｏ］１３８：１５１−１５７，２００５）。
【０２５６】
上記のｓｉＲＮＡに加えて、幾つかの他のｓｉＲＮＡ配列が、ＩＢＡＢＰ−Ｌのノックダウンをもたらし、これにより、増殖率を減少させて、結腸癌細胞内のアポトーシスを増加させることが予期される。幾つかの例を以下の表２に示す。これらのｓｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）およびｓｉＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎ  Ｔｏｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ）と呼ばれるウェブベースのツールを使用して設計された。重要なことは、ＩＢＡＢＰ−Ｌは、ＩＢＡＢＰと相当な同一性を共有し、したがって、ＩＢＡＢＰを標的するｓｉおよびｓｈＲＮＡ分子もまた、ＩＢＡＢＰ−Ｌをノックダウンし、結腸癌細胞への同じ生物学的効果を呈することが予期される。
考察
【０２５７】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）において、ＩＢＡＢＰ−Ｌは、ＮＦ−κＢによって上方制御され、この上方制御は、胆汁酸誘導のアポトーシスに対する結腸癌細胞の耐性に必須であると考えられる。これらの発見により、ＮＦ−κＢによって制御され、２次胆汁酸の存在下で結腸癌細胞の生存に必須なＩＢＡＢＰ−Ｌを必要とする、胆汁酸応答経路の存在が示唆される。
【０２５８】
ＩＢＡＢＰとＩＢＡＢＰ−Ｌとの恐らく最も重要な相違は、それらの発現が調節される方法である。ＩＢＡＢＰは、胆汁酸に応答し、回腸全体にわたるそれらの再吸収を調節するＦＸＲ転写経路の一部である。対照的に、ＩＢＡＢＰ−ＬはＦＸＲによって調節されず、ＮＦ−κＢによって調節される。ＩＢＡＢＰに関する文献における逆説的な発見の１つは、それがＣＲＣ中で上方制御される一方で、その主要調節因子ＦＸＲは、下方制御されるという観察である。ＩＢＡＢＰの外観上の上方制御が、実際にはＩＢＡＢＰ−Ｌの上方制御であるという発見と、この転写物がＮＦ−κＢによって調節されるという事実により、この逆説が解決される。
【０２５９】
ＩＢＡＢＰ−Ｌの異なった発現および調節に加えて、我々は、結腸腫瘍形成におけるＩＢＡＢＰ−Ｌの生物学的機能を提供する。ＩＢＡＢＰ−Ｌは、毒性２次胆汁酸、生理的レベルのＤＣＡの存在下で、結腸癌細胞の生存のために必須である。正常な被験体の糞中水分中のＤＣＡ濃度は、約１００μＭである。我々は、結腸癌細胞はこれらのレベルのＤＣＡによって誘導される細胞死に耐性があることを観察した。しかしながら、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現がノックダウンされた場合、細胞はアポトーシスを受けることも観察した。また、ＩＢＡＢＰ−Ｌは、結腸直腸癌患者で観察された濃度（正常レベルよりも約２倍高い）のＤＣＡ存在下での細胞の生存にも必須である。これらの観察は、ＩＢＡＢＰ−Ｌが、毒性胆汁酸の存在下でのＣＲＣ細胞の生存を促し、結腸腫瘍形成に寄与する可能性があることを示す。
【０２６０】
胆汁酸、ＮＦ−κＢおよびＩＢＡＢＰ−Ｌ間の興味深い関連は、結腸直腸癌への介入に対する新規標的を提供し得る。文献における発見と併せて、我々の研究は、ＣＲＣ中のＮＦ−κＢの恒常的活性化の結果として、ＩＢＡＢＰ−Ｌが上方制御されることを示す。ＮＦ−κＢとＩＢＡＢＰ−Ｌのこの結合は、結腸癌細胞が毒性胆汁酸を緩衝することを可能にし、アポトーシスから細胞を保護する。ＩＢＡＢＰ−Ｌを、２つの方法において治療標的として利用することができる。第１に、ＩＢＡＢＰ−Ｌの阻害剤は、ＮＦ−κＢ阻害剤の化学予防効果および治療効果を増強し得る。第２に、ＩＢＡＢＰ−Ｌは、胆汁酸の存在下で腫瘍細胞生存に必要であるため、その抑制は、結腸内での腫瘍細胞死を引き起こすことが予測されるであろう。
【０２６１】
実施例３：結腸直腸癌細胞において治療上有用な遺伝子を発現するためのＩＢＡＢＰ−Ｌプロモーターの使用
ＤＮＡ調節要素としてのＩＢＡＢＰ−Ｌのプロモーター領域は、結腸癌細胞内で治療上有用な遺伝子の発現を促進するために使用できる。我々の先行特許は、ヒト大腸癌組織中で５０倍（平均で）のＩＢＡＢＰ−Ｌの上方制御を示したため、このプロモーターが、遺伝子治療により送達されるタンパク質を過剰発現するために使用することができることを提案する。この節では、このプロモーターの「機能的解剖」の結果を説明する。この結果は、ＩＢＡＢＰ−Ｌ発現の促進に関与する主要転写因子の１つが、ＮＦ−κＢであることを示す。最小のモチーフとして我々はこれを確かに主張するが、この短い配列に限定すべきでなく、付加的な制御部位を含有する可能性があるため、−１５６８（開始部位の前）までの全プロモーターを主張すべきである。
【０２６２】
ＩＢＡＢＰ−Ｌの転写は、ＮＦ−κＢによって制御される。ＩＢＡＢＰ−Ｌの転写制御・調節を理解するための第１のステップとして、プライマー伸長を行って転写開始部位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｓｔａｒｔ  ｓｉｔｅ：ＴＳＳ）を同定した。この情報は、ＩＢＡＢＰ−Ｌプロモーターのマッピング領域に対するアンカーポイントを提供した。Ｐ−Ｍａｔｃｈプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．ｃｏｍ）を使用して、ＴＳＳの１．６Ｋｂ上流に伸長するＩＢＡＢＰ−Ｌのゲノム配列を、転写因子結合部位を推定するため、分析した。
【０２６３】
図１７は、ＩＢＡＢＰ−Ｌプロモーターのヌクレオチド配列（ヌクレオチド−１５６３から＋７８）を示す。推定ＮＦ−κＢ結合モチーフは、ＴＳＳの１．１６Ｋｂ上流と同定され、ヌクレオチド位置−１１６９で始まり、−１１５３で終わる（図１７および１８）。
【０２６４】
ＮＦ−κＢが応答エレメントに結合し、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現を促進することを検証するため、図１８に示すような、レポーター遺伝子（ＰＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  ルシフェラーゼ）に連結したプロモーターの欠失および変異を用いて、多くの研究を行った。これらの研究は、ＩＢＡＢＰ−Ｌの高度発現を有するＨＣＴ１１６結腸癌細胞で行った。推定ＮＦ−κＢ結合モチーフ（−１５６３／＋７８）を含有する領域を、ＰＣＲでヒトゲノムＤＮＡから増幅した。このプロモーターの欠失構築物は、ＰＣＲまたは制限酵素消化によって製作された。Ｇ→Ｃ変異は、部位特異的変異原性によって製作された。野生型および改変されたプロモーターを、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）レポーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有するＰＧＬ３ベクターに挿入した。推定ＮＦ−κＢ結合モチーフ全体を欠失させるか、またはこのモチーフ内で最も保存された「Ｇ」を「Ｃ」に変異させたレポーターベクターを構築した。野生型プロモーターおよび改変されたレポーターをＨＣＴ１１６細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性を２４時間後に分析した。
【０２６５】
図１９Ａ〜Ｃに示すように、ＩＢＡＢＰ−Ｌプロモーターの関数解析を行った。図１９Ａにおいて、レポーター構築物を、ウミシイタケルシフェラーゼをコードするｐＲＬ−ＣＭＶと一緒にＨＣＴ１１６細胞内に導入した（図１９Ａ）。ルシフェラーゼ活性を２４時間以内に測定して、ＩＢＡＢＰ−Ｌプロモーターを欠いたウミシイタケルシフェラーゼのシグナルに対して、正規化した。図１９Ｂは、形質移入されたＨＣＴ１１６細胞を、測定の５時間前に２５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを用いてまたは用いることなく処置したことを除けば、図１９Ａに示したものと同様の実験の結果を示す。図１９Ｃは、野生型および改変されたＩＢＡＢＰ−Ｌプロモーターの活性レポーター構築物を、ＮＦ−κＢ複合体ｐ６５／ｐ５０をコードする構築物と同時形質移入を行い、または行わず、ＨＥＫ２９３細胞内に導入した実験の結果を示す。ルシフェラーゼ活性を２４時間以内に測定して、正規化した。ｐＲＬ−ＣＭＶをあらゆる形質移入に含めた。ＩＢＡＢＰ−Ｌに対する野生型プロモーターは、基本レポーターと比較して、ルシフェラーゼ活性が７．５倍増加した（図１９Ａ）。推定ＮＦ−κＢ結合モチーフの配列上流の欠失は、ルシフェラーゼ活性に影響を及ぼさなかった。しかしながら、結合モチーフ全体がＰＣＲまたは制限酵素消化のいずれかによって欠失された場合、レポーター構築物は、その転写活性を無効にした。より重要なことは、ＮＦ−κＢ結合モチーフの最も保存された領域での「Ｇ」から「Ｃ」への単一ヌクレオチド置換も、プロモーター活性の損失をたらした（図１９Ａ）。さらに、ＮＦ−κＢの活性化因子である腫瘍壊死因子α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  α：ＴＮＦα）は、野生型プロモーターの転写活性を増加させたが、改変されたプロモーターの転写活性は増加させなかった（図１９Ｂ）。
【０２６６】
また、ＩＢＡＢＰ−Ｌプロモーターの活性を、ＮＦ−κＢの内在性レベルが低いＨＥＫ２９３細胞でも試験した。この細胞では、ＩＢＡＢＰプロモーターは、低い活性を有したが、その活性は、ＨＥＫ２９３細胞に、ＮＦ−κＢタンパク質のｐ６５およびｐ５０をコードする構築物を同時形質移入した場合に増加した（図１９Ｃ）。ｐ６５／ｐ５０によるこの活性化は、機能的ＮＦ−κＢ結合部位を欠くＩＢＡＢＰ−Ｌプロモーターを試験した時には観察されなかった（図１９Ｃ）。これらの発見は、総合して、ＮＦ−κＢがＩＢＡＢＰ−Ｌプロモーターの転写活性を調節するという考えを、強く支持する。
【０２６７】
考察。ＩＢＡＢＰ−Ｌの差次的発現および調節に加えて、結腸腫瘍形成におけるＩＢＡＢＰ−Ｌへの生物学的機能を提供する。ＩＢＡＢＰ−Ｌは、毒性２次胆汁酸であるＤＣＡの生理的レベルでの存在下で、結腸癌細胞の生存のために必須である（Ｎａｇｅｎｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３１：１０６７−１０７０，１９９５）。正常な被験体の糞中水分中のＤＣＡ濃度は、約１００μＭである（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．５８９：４７−６５，２００５）。我々は、結腸癌細胞は、これらのレベルのＤＣＡによって誘導される細胞死に耐性があることを観察した。しかしながら、ＩＢＡＢＰ−Ｌの発現がノックダウンされる場合、細胞はアポトーシスを受けることも観察した。また、結腸直腸癌患者において観察される、正常レベルよりも約２倍高い濃度（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３５：３４０３−３４０６，１９７５）のＤＣＡ存在下でも、ＩＢＡＢＰ−Ｌは、細胞の生存のために必須である。これらの観察は、ＩＢＡＢＰ−Ｌが、毒性胆汁酸の存在下でＣＲＣ細胞の生存を促し、結腸腫瘍形成に寄与する可能性があることを示す。
【０２６８】
胆汁酸、ＮＦ−κＢおよびＩＢＡＢＰ−Ｌ間の興味深い関連は、結腸直腸癌への介入に対する新規標的を提供する。文献での発見と併せて、我々の研究は、結腸直腸癌中のＮＦ−κＢの恒常的活性化（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１８：５３２−５３９，２００６、Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ  ａｎｄ  Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４７１４８−４７１５８，２００４）の結果として、ＩＢＡＢＰ−Ｌが上方制御されることを示す。かかるＮＦ−κＢとＩＢＡＢＰ−Ｌとの結合は、結腸癌細胞が毒性胆汁酸を緩衝することを可能にし、アポトーシスから細胞を保護する。ＩＢＡＢＰ−Ｌは、２つの方法で治療標的として利用することができる。第１に、ＩＢＡＢＰ−Ｌの阻害剤は、ＮＦ−κＢ阻害剤の化学予防効果および治療効果を増強し得る（Ｇｉｌｍｏｒｅ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｃｏｖｉｔｃｈ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５：６８８７−６８９９）。第２に、ＩＢＡＢＰ−Ｌは、胆汁酸の存在下における腫瘍細胞の生存に必要であるため、その抑制が結腸内での腫瘍細胞死を引き起こすことが予測されるであろう。
【０２６９】
全ての文献、特許および特許出願は、参照することにより本願明細書に組み込まれる。前述の明細書において、本発明をそのある実施形態との関連で説明し、多くの詳細を例示の目的で記載したが、本発明が付加的な実施形態を許容し、本明細書に記載された特定の詳細が、本発明の基本原理から逸脱することなく、相当に変更し得ることが、当業者には明らかであろう。
【表１】
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【表２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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