(57)【要約】  本発明は、乳用動物における改善された適応度及び生産性を含む、望ましい動物の形質を改善するための方法を提供する。また、適応度及び／又は生産性と関連する多数のマーカーに関する乳用動物の遺伝子型を決定するための方法が提供される。本発明はまた、後代検定又は核群育種などの所定の使用に動物を選抜又は割り当てするための方法、育種用の潜在的親動物を採集するための方法、そして改善された後代動物を生産するための方法を提供する。上の方法の各々は、多数のＳＮＰ間の交互作用効果の組み込みを通して更に改善され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生産性及び／又は適応度についての各動物の予測されるマーカー育種価に従って、使用する一匹又はそれ以上の動物を割り当てる方法であって：
ａ．１つ又はそれ以上の遺伝子座で各動物の遺伝子型を決定するために、一匹又はそれ以上の動物を評価すること；ここで少なくとも１つの遺伝子座は、少なくとも二つの対立遺伝子変異を有し、そして表１に記載された一塩基多型（ＳＮＰ）から選ばれるＳＮＰを含む；
ｂ．どの対立遺伝子変異が存在するかを決定するために、表１に記載されたＳＮＰから選ばれた１つ又はそれ以上のＳＮＰで、少なくとも１つの評価された動物の決定された遺伝子型を解析すること；
ｃ．上記対立遺伝子変異を、表１に記載されたような少なくとも１つの生産性又は適応度形質に関連させること；及び
ｄ．その決定された遺伝子型に従って使用する動物を割り当てること；
を含む方法。
【請求項２】
解析が、表１に記載された少なくとも１つの交互作用効果の解析を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
動物の遺伝子型が、表１に記載されたＳＮＰから選ばれたＳＮＰを含む二つ又はそれ以上の遺伝子座で評価される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
動物の遺伝子型が１０又はそれ以上の遺伝子座で評価される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
動物の遺伝子型が１００又はそれ以上の遺伝子座で評価される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
動物の遺伝子型が２００又はそれ以上の遺伝子座で評価される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
評価されるＳＮＰが、妊娠率（ＰＲ）、娘牛妊娠率（ＤＰＲ）、生産寿命（ＰＬ）、体細胞数（ＳＣＣ）、及び体細胞スコア（ＳＣＳ）からなるグループから選ばれる適応度形質と関連する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
評価されるＳＮＰが、全搾乳量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白質率、乳蛋白質量、全生涯生産量、搾乳速度及び泌乳持続性からなるグループから選らばれる生産性形質と関連する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項９】
全ゲノム解析を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１０】
潜在的後代における適応度及び／又は生産性の品種改良のために一匹又はそれ以上の潜在的親動物を選抜する方法であって：
ａ．少なくとも１つのゲノム遺伝子座で少なくとも１つの潜在的親動物の遺伝子型を決定すること；ここで少なくとも１つの遺伝子座は、少なくとも二つの対立遺伝子変異を有し、そして表１に記載されたＳＮＰから選ばれる一塩基多型（ＳＮＰ）を含む；
ｂ．どの対立遺伝子が存在するかを決定するために、表１に記載されたＳＮＰから選ばれた１つ又はそれ以上のＳＮＰについて、少なくとも１つの評価された動物の決定された遺伝子型を解析すること；
ｃ．同定された対立遺伝子を適応度及び／又は生産性表現型と相関させること；及び
ｄ．その遺伝子型に基づいて育種用に使用するために、少なくとも１匹の動物を割り当てること；
を含む方法。
【請求項１１】
解析が、表１に記載された交互作用効果の少なくとも１つの推定を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
潜在的親動物の遺伝子型が、表１に記載されたＳＮＰから選ばれるＳＮＰを含む５つ又はそれ以上の遺伝子座で評価される、請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
潜在的親動物の遺伝子型が、表１に記載されたＳＮＰから選ばれるＳＮＰを含む少なくとも二つの遺伝子座を含む、１０又はそれ以上の遺伝子座で評価される、請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１４】
潜在的親動物の遺伝子型が、表１に記載されたＳＮＰから選ばれるＳＮＰを含む少なくとも二つの遺伝子座を含む、２０又はそれ以上の遺伝子座で評価される、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
潜在的親動物が、潜在的後代における適応度を改善するために選抜される、請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１６】
潜在的親動物が、潜在的後代における生産性を改善するために選抜される、請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１７】
全ゲノム解析を含む、請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１８】
後代動物の生産方法であって：
ａ．請求項１又は２記載の方法に従って育種するために割り当てられている少なくとも一匹の潜在的親動物を同定すること；
ｂ．以下を含むプロセスを通して割り当てられた動物から後代を生産すること；
ｉ）自然交配；
ｉｉ）人口授精；
ｉｉｉ）体外受精；及び／又は
ｉｖ）動物から精液／精子又は少なくとも二つの卵子を集め、そしてそれを各々、任意の手段によって受胎産物を生産するために、第二の動物からの一つ又は複数の卵子、又は精液／精子と接触させること；
を含む方法。
【請求項１９】
自然交配を通して後代を生産することを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
人口授精、胚移植及び／又は体外受精を通して後代を生産することを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
潜在的親動物の遺伝子型が、表１に記載されたＳＮＰから選ばれたＳＮＰを含む二つ又はそれ以上の遺伝子座で評価される、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
潜在的親動物の遺伝子型が、表１に記載されたＳＮＰから選ばれたＳＮＰを含む５つ又はそれ以上の遺伝子座で評価される、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
潜在的親動物の遺伝子型が、表１に記載されたＳＮＰから選ばれたＳＮＰを含む１０又はそれ以上の遺伝子座で評価される、請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
潜在的親動物の遺伝子型が、表１に記載されたＳＮＰから選ばれたＳＮＰを含む２０又はそれ以上の遺伝子座で評価される、請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
潜在的親動物が、潜在的後代における適応度を改善するために選抜される、請求項１８記載の方法。
【請求項２６】
潜在的親動物が、潜在的後代における生産性を改善するために選抜される、請求項１８記載の方法。
【請求項２７】
更に全ゲノム解析を含む、請求項１８〜２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１００個の多型のどの対立遺伝子かを決定するための核酸アレイ；であって、ここで、以下から選ばれる１つ又はそれ以上の多型とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションできる、１つ又はそれ以上の核酸配列を含む上記アレイ：
ａ．表３及び配列表に記載された多型；及び／又は
ｂ．表３に記載された遺伝子中に位置する多型。
【請求項２９】
アレイが
ａ．表３及び配列表に記載された多型；及び／又は
ｂ．表３に記載された遺伝子中に位置する多型
から選ばれる２つ又はそれ以上の多型を含む、請求項２８記載の核酸アレイ。
【請求項３０】
アレイが
ａ．表３及び配列表に記載された多型；及び／又は
ｂ．表３に記載された遺伝子中に位置する多型
から選ばれる５つ又はそれ以上の多型を含む、請求項２９記載の核酸アレイ。
【請求項３１】
１０又はそれ以上のゲノム遺伝子座で動物の遺伝子型を評価することを含む方法；であって、ここで少なくとも１つの遺伝子座が、表３及び配列表に記載された多型から選ばれる多型を含む、方法。
【請求項３２】
少なくとも二つの遺伝子座が、表３及び配列表に記載された多型から選ばれる多型を含む、１０又はそれ以上の遺伝子座で動物の遺伝子型が評価される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも二つの遺伝子座が、表３及び配列表に記載された多型から選ばれる多型を含む、２０又はそれ以上の遺伝子座で動物の遺伝子型が評価される、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
全ゲノム解析を含む、請求項３１〜３３の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
この出願は、２００７年９月１２日に出願された米国仮出願番号６０／９７１，７５０の利益を主張し、その全体が、参照によって本明細書に組み入れられている。
【０００２】
配列表の取り込み
８４，２１８バイトであって（Microsoft Windows（登録商標）において測定して）、２００８年９月５日に作出された、１７５のヌクレオチド配列を含む「pa_CandGeneInteractionEffects2_annotated.ST25. txt」という名前のファイルを含む配列表が、本明細書と共に提出され、これはその全体が、参照によって本明細書に組み入れられている。
【０００３】
本発明は、乳牛における望ましい形質の向上に関する。より詳しくは本発明は、多数の遺伝マーカー及びそれらのマーカーでの特定の対立遺伝子間の交互作用の同時適用を含む、遺伝マーカーを用いて適応度及び／又は生産性形質に関する乳牛を改善する方法における、遺伝子及び遺伝マーカーの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
乳業の将来の生存可能性及び競争力は、乳の生産性（例えば、乳、脂肪、蛋白質の収量、脂肪％、蛋白質％、及び泌乳持続性）、健康（例えば、体細胞数、乳腺炎発生率）、受胎能（例えば、妊娠率、発情の誇示行動、分娩間隔及び雄牛の非回帰率）、分娩の容易さ（例えば、直接及び母体分娩の容易さ）、寿命（例えば、生産寿命）、及び機能的体型（例えば、懸垂靱帯、適切な足及び脚の形状、適切な尻角度等）におけるたゆまぬ改良に依存している。残念なことに、効率形質は適応度形質としばしば好ましくなく相関付けられる。商用の牛集団においては、適応度形質は全てある程度の潜在的な遺伝的変異を有するが、遺伝率が低いため、又は候補動物についての形質コスト対効果を測定することができないため、それらの多くに対して優れた遺伝的メリットを有する育種動物を選抜する正確性は低い。また、多くの生産性及び／又は適応度形質は雌牛についてしか測定できない。従って、これらの形質に対する従来の選抜の正確性は中程度から低度であり、そして選抜を通して遺伝子を変化させる能力には、特に適応度形質については限界がある。
また、多数の遺伝子座での特定の対立遺伝子の間にしばしば交互作用があり、それが遺伝的メリットの予測を混乱させる。言い換えれば、形質についての対立遺伝子の組み合わせの効果は厳密に相加的ではなく、むしろ相乗的（又は拮抗的）であり得る。これらの交互作用の理解が欠如すると、遺伝的メリットの先験的な推定が明らかにより困難になり、かつより不正確になる。
【０００５】
ゲノミクスは、遺伝的変異を明らかにする遺伝子又は遺伝子に結合する遺伝マーカーの検出を通して、生産性及び適応度形質におけるより大きな改善のための可能性を提供し、そしてより直接的で正確な選抜のために使用できる。生産性及び適応度形質に関連する１０００に近いマーカーが報告されているが（報告されたＱＴＬの検索可能なデータベース用www.bovineqtl.tamu.edu/を参照）、ＱＴＬ位置の分解能はまだ非常に低く、そのためこれらのＱＴＬを、工業的規模でマーカー支援選抜（ＭＡＳ）において使用することを困難にしている。２、３のＱＴＬのみが、強い推定上の又は十分に確認された因果的突然変異で完全に特徴付けられているに過ぎない：染色体１４についてのＤＧＡＴ１（Grisard et al., 2002; Winter et al, 2002; Kuhn et al., 2004）染色体２０についてのＧＨＲ（Blott et al., 2003）、ＡＢＣＧ２（Cohen-Zinder et al., 2005）又は染色体６についてのＳＰＰ１ (Schnabel et al., 2005)。しかしながら、これらの検出は稀であり、生産性形質に対する遺伝的変異の小さな部分を説明するのみであり、そして適応度形質を制御する遺伝子について完全に特徴付けされているものはひとつもない。より成功率が高い戦略では、生産性及び適応度形質にまつわる遺伝的変異の大部分を説明するために、その中に十分な分解能でＱＴＬがマップされているウシの全体ゲノムの全ゲノム高密度走査を使っている。
【０００６】
世界中の牛乳生産用に使用される牛の群は、高レベルの生産で知られているホルスタイン又はホルスタイン−フリージアン品種から主として由来している。しかしながら、ホルスタインにおける高生産レベルは、より大きな分娩の難しさ及び低レベルの受胎能とも関連付けられている。これらの好ましくない相関が多面遺伝子多面効果に起因するかどうか、又は単純に連鎖遺伝子に起因するかどうかは不明である。もし、マーカー知識を用いて後者が正しいとすれば、通常であれば頻度があまりにも低くて従来の選択を用いた改良があまりできないいくつかの連鎖遺伝子から、好ましい対立遺伝子を含む好ましい組み換えのための選抜が可能であり得る。ホルスタイン生殖質は、数十年の間、世界的に販売されそして輸送されてきたため、ホルスタイン種は、相対的に中程度の近親交配率に保持されてきた１つの世界的な大集団に事実上なってきている。また、数世代に亘って選抜されたそのように大きな集団の非近交性によって、相対的に短い距離以内（つまり、２、３センチモルガン未満）を除いて、連鎖不平衡を崩壊させることを可能ならしめてきた（Hayes et al., 2006）。また、異なる育種目標を有するいくつかの国における選抜の結果として、いくつかの世代のグローバルな選抜及び育種を介して混在するようになった亜集団内のドリフトの効果のため、比較的近い遺伝子座間の連鎖不平衡が非常に変動し得る。連鎖不平衡のこのパターンを考えると、それらと非常に密接な連鎖不平衡にあるマーカーを見出すための、十分な精密さを有するＱＴＬ位置を改良するために、非常に密なマーカー範囲が要求される。従って、集団ワイドの効果的なＭＡＳ又は全ゲノム選抜（ＷＧＳ）にとって、ＱＬＴと非常に密接な連鎖不平衡にあるマーカーが不可欠である。
【０００７】
ほとんどの生産性及び適応度形質は本来定量的であり、従って、小から中程度のサイズ効果の数百のＱＴＬによって支配される。従って、これらの形質の大部分の変異を説明するために十分なＱＴＬを特徴付けるために、ゲノムにマップされたマーカーのセットを用いて全ゲノムを高分解能（つまり、１マーカー／ｃＭより高い分解能）で走査する必要がある；他方、これは全ゲノム解析として知られている。
【０００８】
更に、血族又はその動物自身について表現型の記録を有しない動物の育種価を正確に予測するために、ＭＡＳにおいて十分な数のＱＴＬが使用されなければならない。生産性及び適応度形質における変異を説明するＱＴＬを発見して細かくマッピングするためのそのような高密度全ゲノムマーカーマップの適用が本明細書に開示される。これらの形質に対する集団の遺伝的メリットを改善し、そして乳業における価値を作出するために、全ゲノム選抜（ＷＧＳ）（Meuwissen et al., Genetics 2001）を含むマーカー選抜又はマーカー支援選抜のいくつかの方法において、多数のこうして得られた連鎖マーカーが使用できる。
【０００９】
１つの因果的突然変異によって完全に説明され得るいくつかの単純な形質とは異なり、多くの生産性及び適応度形質は、動物の表現型性能を正確に予測するために多数のマーカーを必要とする。定量的表現型は一般的に多数の遺伝子、多数の経路及び複雑な交互作用が関与する。ある場合には、この複雑さが、予測することが非常に困難であるマーカー間の交互作用をもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
乳用種形質における定量的変異への候補遺伝子ＳＮＰ間の交互作用の寄与を調べた研究は少ない。そのような交互作用の研究が欠如していることにはいくつかの理由があり得る。第一は、種々の候補遺伝子が種々のグループによって一般的に研究されたこと、そして種々の候補遺伝子の遺伝子型が種々の動物で集められたこと；大部分の候補遺伝子研究の焦点が、彼らに関心がある形質とＳＮＰ間の関連性を発見／確認することに当てられたこと；交互作用効果の研究が一般的により大きなサンプルサイズを必要とすること。
【００１１】
しかしながら、定量的形質の発現は、多数の生理学的経路（例えば、脂質代謝、欲求／満腹等）の交互作用の結果であり、そして多数の遺伝子は一般的に各生理学的経路に関与する。従って、同一又は異なる経路に関与する遺伝子の中で或る程度の交互作用を期待すること、そして遺伝子の定量的変異の比率が交互作用のためであると期待することは合理的であるように思える。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、乳牛での重要な遺伝子における新規形質並びに遺伝子の評価、予測、及び選抜の正確さを実質的に改善するために使用できる、これらの遺伝子間のエピスタシス効果を含む多くの交互作用効果と関連するマーカーを同定した。
【００１３】
このセクションでは本発明の非限定的な要約が提供される。
【００１４】
本発明の種々の実施態様によれば、動物の遺伝子における１つまたはそれ以上の位置で動物の遺伝子型を評価するための方法が提供される。これらの実施態様の種々の側面において、動物の遺伝子型は、表及び配列表に記載のＳＮＰから選択された少なくとも二つのＳＮＰを含むＤＮＡ（対立遺伝子）のセグメント内の位置で評価される。表１及び３にリストアップされたＳＮＰの各々について、ＳＮＰ位置、ＳＮＰ長さ及び対立遺伝子に関する詳細が表４に見出すことができる。
【００１５】
本発明の他の実施態様によれば、生産性及び／又は適応度形質に対するそれらの予測されるマーカー育種価に従って使用する動物を割り当てる方法が提供される。本発明のこの実施態様の種々の側面によれば、ａ）二つ又はそれ以上の多型で動物のゲノム配列を解析（ここで解析された遺伝子座は各々少なくとも二つのＳＮＰを含む）して、それらの多型の各々で動物の遺伝子型を決定すること；ｂ）ＳＮＰのどの対立遺伝子が存在するかを決定するために、各多型について決定された遺伝子型を解析すること；ｃ）二つ又はそれ以上の解析された多型でのその遺伝子型に基づいて使用する動物を割り当てることを含む方法が提供される。本発明のこの実施態様の種々の側面によれば、本願において開示された二つ又はそれ以上の多型での動物の遺伝子型と所望の表現型間の好ましい関連に基づいて使用する動物を割り当てる方法が供される。あるいは、望ましくない表現型に関連するか、又は望ましい表現型に関連しないかいずれかである、二つ又はそれ以上のＳＮＰ対立遺伝子を有するために、一定の使用のために動物を割り当てない方法が提供される。
【００１６】
本発明の他の実施態様によれば、後代を生産するための育種において使用する動物を選抜する方法が提供される。これらの方法の種々の側面は以下を含む：Ａ）二つ又はそれ以上の遺伝子座で、少なくとも二つの潜在的親動物の遺伝子型を決定すること；ここで解析された少なくとも二つの遺伝子座は、表１及び３に記載されたＳＮＰのグループから選ばれたＳＮＰの対立遺伝子を含む；Ｂ）どのＳＮＰ対立遺伝子が存在するかを決定するために、少なくとも二匹の動物に対して、二つ又はそれ以上の位置で決定された遺伝子型を解析すること；Ｃ）解析された対立遺伝子を二つ又はそれ以上の表現型と相関させること；及びＤ）後代を生産するのに使用するために、少なくとも二匹の動物を割り当てること。代替実施態様は、二つ又はそれ以上の遺伝子座で動物の遺伝子型を解析することを含み、ここでこの解析は交互作用効果を評価することを含む。
【００１７】
本発明の他の実施態様によれば、後代動物（後代動物）を生産する方法が提供される。
本発明のこの実施態様の側面は、以下を含む方法が提供される：後代を生産するために本明細書に記載された方法によって育種用に選抜された動物を育種すること。この後代は、純粋に自然な方法によって、又はそれに限定されないが、以下を含む任意の適切な技術的手段の使用を通して生産され得る：人口授精、胚移植（ＥＴ）、過排卵胚移植（ＭＯＥＴ）、体外受精（ＩＶＦ）、又はそれらの任意の組み合わせ。
【００１８】
本発明の他の実施態様によれば、後代を生産するための育種に使用する動物を選抜する方法が提供され、ここで多数のマーカー間の交互作用効果が解析において適用される。
【００１９】
定義
以下の定義は、当業者が本発明の全ての範囲をより容易に理解しそして正しく認識するのを補助するために提供される。しかしながら、以下に供される定義において指示されるように、供される定義は、そのように指示されない限り限定的であることを意図したものではない。むしろ、それらは当業者に本発明の種々の例証的実施態様について焦点を当てさせるために供された好ましいものの定義である。
【００２０】
本明細書において、用語「対立遺伝子関連」は、好ましくは、ｒ2＞０．２によって特に定義されるｆ（Ａi）及びｆ（Ｂj）の積からのｆ（ＡiＢj）の非ランダム偏差を意味し、ここでｒ2は適度に大きい動物のサンプル（例えば１００以上）から測定され、そして以下のように定義される：
【数１】
2010538643.tif 000002
ここでＡ1は１つの遺伝子座での対立遺伝子を表し、Ｂ1は別の遺伝子座での対立遺伝子を表し；集団において、ｆ（Ａ1Ｂ1）はＡ1及びＢ1の両方を有する頻度を示し、ｆ（Ａ1）はＡ1の頻度、ｆ（Ｂ1）はＢ1の頻度である。
【００２１】
本明細書において、用語「使用する動物を割り当てる」及び「使用のための割り当て」は、好ましくは、群（herd）の内で、動物を如何に使用するかを決定する、又は望ましい群の管理目標を達成するために、群の中からそれを除去することを意味する。例えば、動物は、育種用動物として使用されるために割り当てられるであろうし、又は非育種用動物として販売用に割り当てられるであろう（例えば、肉用に販売されることを意図された動物に割り当てられる）。本発明の一定の側面において、動物は、非常に特定の目標（例えば、生産性又は適応度）を有する育種プログラム内のサブグループにおいて使用するために割り当てられ得る。従って、育種目的で割り当てられた動物のグループ内でさえも、より特定の及び／又は特別化された育種目標を達成するために使用するより特定の割り当てがあり得る。
【００２２】
本明細書において、用語一匹又は複数の「動物」は、好ましくは乳牛を意味する。
【００２３】
本明細書において、用語「適応度」は、好ましくは、それに限定されないが下記を含む「形質」を意味する：妊娠率（ＰＲ）、娘牛妊娠率（ＤＰＲ）、生産寿命（ＰＬ）、体細胞数（ＳＣＣ）、及び体細胞スコア（ＳＣＳ）。ＰＲ及びＤＰＲは、各２１日の期間中に妊娠するようになる非妊娠動物のパーセントを意味する。ＰＬは、雌牛を群から除外する（淘汰又は死による）までの全泌乳に亘って合計された、各泌乳における泌乳月数として計算される。ＳＣＳ＝ｌｏｇ2（ＳＣＣ／１００，０００）＋３、ここでＳＣＣは乳１ミリリッターあたりの体細胞である。
【００２４】
本明細書において、用語「成長」は、動物のサイズ／体重における増加に関連する種々のパラメーターの測定を意味する。
【００２５】
本明細書において、用語「連鎖不平衡」は、好ましくはＡ1及びＢ1（対立遺伝子関連の上記定義において使用されたと同様）が同じ染色体上に存在する対立遺伝子関連を意味する。
【００２６】
本明細書において、用語「マーカー支援選択（ＭＡＳ）」は、好ましくは血統及び表現型データとの可能な組み合わせのマーカー情報に基づく動物の選択を意味する。
【００２７】
本明細書において、用語「マーカー育種価（ＭＢＶ）及び「予測されるマーカー育種価（ＰＭＢＶ）」は、特定の形質に関する、そしてその遺伝子型に基づく動物の遺伝的伝達能力の予測を意味する。
【００２８】
本明細書において、用語「自然交配」は、好ましくは受精プロセスにおいて人間の介入なしで動物を交配させることを意味する。つまり、人口授精又は胚移植などの機械的又は技術的方法を使用しないこと。この用語は親動物の選択に言及するものではない。
【００２９】
本明細書において、用語「正味メリット」は、好ましくは典型的な生産の設定における相対的な経済価値に従って重み付けされた、そして産業ベースに対して雌牛１頭当たりの生涯の経済価値として表された、いくつかの通常測定される形質を含む複合的指数を意味する。正味メリットの例には、限定されないが、米国における＄ＮＭ又はＴＰＩ、カナダにおけるＬＰＩなど（これらの指数を計算する式は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、＄ＮＭはＵＳＤＡ／ＡＩＰＬウエブサイト: www.aipl.arsusda.gov/reference.htm上で見出し得る））が挙げられる。
【００３０】
本明細書において、用語「予測値」は、好ましくはその遺伝子型及び血統に基づく、動物の育種価又は伝達能力の推定を意味する。
【００３１】
本明細書において、用語「生産性」及び「生産」は、好ましくは限定されないが以下を含む収量形質を意味する：全搾乳量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白質率、乳蛋白質量、全生涯生産量、搾乳速度及び泌乳持続性。
【００３２】
本明細書において、用語「定量的形質」は、各々が形質に関して小程度から中程度の効果に寄与する多数の（二つ又はそれ以上の、そしてしばしば多くの）遺伝子によって制御される形質を表すために使用される。定量的形質を観察すると、しばしば正規分布に従うことが分かる。
【００３３】
本明細書において、用語「定量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）」は、定量的形質の効果を有する多型を含む遺伝子座を述べるために使用される。
【００３４】
本明細書において、用語「生殖物質」は、限定されないが、「精液、精子、卵子及び接合体」を意味する。
【００３５】
本明細書において、用語「一塩基多型」又は「ＳＮＰ」は、集団内で多型である動物のゲノムにおける位置を意味する。つまり、集団内で、いくつかの個々の動物は、その位置で１つのタイプの塩基種を有し、一方他の動物は異なる塩基を有する。例えば、ＳＮＰは、いくつかの動物がそれらのＤＮＡ配列において「Ｇ」を有し、一方他の動物が「Ｔ」を有するゲノムにおける位置ということもできる。
【００３６】
本明細書において、用語「ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、好ましくは「プローブ」が、他の配列よりも検出可能なほどより大きな程度で（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも５倍）その標的配列にハイブリダイゼーションする条件を意味する。ストリンジェントな条件は標的配列依存型であり、そしてポリヌクレオチドの構造に依存して異なるであろう。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄の条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブに対して１００パーセント相補的である標的配列が同定できる（相同プロービング）。あるいは、より低い程度の類似性を検出するように（異種プロービング）、配列におけるいくつかのミスマッチを許容するためにストリンジェンシー条件を調節することができる。
【００３７】
典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨが７．０から８．３で、塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１から１．０ＭのＮａイオン濃度（又は他の塩）であり、そして短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）に対しては温度が少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドよりも大きい）に対しては少なくとも約６０℃であるものであろう。また、ストリンジェンシーはホルムアミドのような不安定化剤を添加して調節してもよい。低いストリンジェンシーの条件例としては、３７℃で、３０から３５％のホルムアミドの緩衝溶液、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を用いるハイブリダイゼーション、及び５０から５５℃で、１Ｘから２ＸのＳＳＣ（２０Ｘ  ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍ のクエン酸三ナトリウム）での洗浄が挙げられる。中程度のストリンジェンシー条件例としては、３７℃で、４０から４５％のホルムアミドの緩衝溶液、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳを用いるハイブリダイゼーション、及び５５から６０℃で、０．５Ｘから１ＸのＳＳＣにおける洗浄が挙げられる。高いストリンジェンシーの条件例としては、３７℃で、５０％のホルムアミドの緩衝溶液、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳを用いるハイブリダイゼーション、及び６０から６５℃で、０．１ＸのＳＳＣにおける洗浄が挙げられる。ハイブリダイゼーションの継続時間は一般的に約２４時間未満、通常４から約１２時間である。
【００３８】
特異性は、一般的にはハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、そして重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度及び温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのための、熱融点（Ｔm）はMeinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284の式：Ｔm＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％  ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから近似できる；ここで、Ｍは一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアニン及びシトシンヌクレオチドのパーセントであり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセントであり、そしてＬは塩基対におけるハイブリッドの長さである。Ｔmは、（定義されたイオン強度及びｐＨのもとで）５０％の相補的標的配列が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイゼーションする温度である。Ｔmは各１％のミスマッチ当たり約１℃だけ低下する：従って所望の同一性の配列にハイブリダイゼーションするためにＴm、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄の条件が調節できる。例えば、９０％の同一性で配列決定する場合、Ｔmは１０℃低下できる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度及びｐＨでの特定の配列及びその相補（complement）についてのＴmよりも約５℃低くなるように選択される。
【００３９】
しかしながら、高度にストリンジェントな条件では、熱融点（Ｔm）よりも１、２、３、又は４℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄が利用できる；中程度にストリンジェントな条件では、熱融点（Ｔm）よりも６、７、８、９、又は１０℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄が利用できる；低度にストリンジェントな条件では、熱融点（Ｔm）よりも１１、１２、１３、１４、１５又は２０℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄が利用できる。この式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成、及び所望のＴmを使用することで、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーにおけるバリエーションが本質的に開示されていると、当業者は当然のことと理解するであろう。所望のミスマッチ程度によって、４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴmがもたらされる場合、より高い温度が使用できるように、ＳＳＣ濃度を上げることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針が、以下の文献に見出される：Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes）、Part I, Chapter 2 (Elsevier, N.Y.); and Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)。 同じく、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning： A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)を参照。
【００４０】
本明細書において、用語「マーカー育種価（ＭＢＶ）及び「予測されるマーカー育種価（ＰＭＢＶ）」は、各々「その遺伝子型に基づく生産性形質又は適応度形質のどちらかに関する、動物の遺伝的伝達能力の予測」を意味する。
【００４１】
本明細書において、用語「全ゲノム解析」は、好ましくは高マーカー密度（つまり、１ｃＭ当たり約１マーカー）でのゲノム全体のＱＴＬマッピングのプロセス、及びＱＴＬと集団ワイドの連鎖不平衡にあるマーカーの検出を意味する。
【００４２】
本明細書において、用語「全ゲノム選抜（ＷＧＳ）」は、好ましくはマーカーが、中から高密度（例えば、１−５ｃＭ当たり約１マーカー）で又はＱＴＬ領域においては中から高密度でゲノム全体にまたがっている、又はマーカーが、二つ又はそれ以上の形質を制御する遺伝的変異の有意な部分を明らかにするＱＴＬに直接に隣接する又は側面にある、全ゲノムベースでのマーカー支援選抜（ＭＡＳ）のプロセスを意味する。
【００４３】
本明細書において、用語「交互作用効果」は、好ましくは、第二のマーカーの対立遺伝子状態に依存した、第一のマーカーの予測された表現型効果の変化を意味する。例えば、ＳＮＰ２がＡであるとき、ＳＮＰ１が正の対立遺伝子の関連の１０の効果予測を有するが、ＳＮＰ２がＴであるとき、ＳＮＰ１が正の対立遺伝子の関連の５の効果予測を有する場合、１０から５への効果予測における変化が交互作用効果と考えられる。マーカーに基づく交互作用効果は、少なくとも二つのマーカーを含まなければならない。
【００４４】
本明細書において、用語「エピスタシス交互作用」は、好ましくは例えば独立して合わせた（しかしながら連結してもよい）１つ又はいくつかの遺伝子によって１つの遺伝子の作用が改変される場合の、遺伝子の対立遺伝子間の交互作用を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明の種々の実施態様によれば、動物のゲノムにおける１つ又はそれ以上の位置で動物（特に乳用動物）の遺伝子型を評価する方法が提供される。本発明のこれらの実施態様の側面によって、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む１つ又はそれ以上の位置（遺伝子座）で動物のゲノム配列を決定することを含む方法が提供される。特に、本発明によれば、本願の表１及び３に記載されたＳＮＰからなるグループから選択された１つ又はそれ以上のＳＮＰについて、ＳＮＰの二つ又はそれ以上の対立遺伝子のどれが存在するかを決定することによって、動物の遺伝子型を評価する方法が提供される。
【００４６】
これらの実施態様の好ましい側面において、表１及び３に記載されたＳＮＰのグループから選択された１０又はそれ以上のＳＮＰについて、対立遺伝子が存在するかを決定するために、動物の遺伝子型が評価される。更に好ましくは、動物の遺伝子型が２、１０、１００、２００、５００又は１０００又はそれ以上のＳＮＰに対応する位置について決定され、それらの少なくとも二つは表１及び３に記載されている。この発明のいくつかの実施態様において、二つのＳＰＮ間の交互作用が、動物の遺伝子型の解析において使用される。
【００４７】
この実施態様の他の側面において、動物の遺伝子型が、生産性及び／又は適応度に関連していると示されている、少なくとも１つ又はそれ以上のＳＮＰに関して解析される（これらの形質に関連するＳＮＰのリストに対しては表１を参照のこと）。更に、本発明の実施態様によれば、二つ又はそれ以上の、１０又はそれ以上の、１０又はそれ以上の、５０又はそれ以上の、１００又はそれ以上の、２００又はそれ以上の、５００又はそれ以上の、又は１０００又はそれ以上のＳＮＰの遺伝子型を同定する方法が提供され、少なくともその１つが、表１において記載されるような、生産性又は適応度形質に有意に関連していると決定される。
【００４８】
また、本発明の側面によれば、全ゲノム解析及び全ゲノム選抜（ＷＧＳ）（つまり、全ゲノムベースのマーカー支援選抜（ＭＡＳ））の両方が提供される。本発明のこの実施態様の種々の側面によれば、全ゲノム解析又はＷＧＳのいずれかが提供され、ここで動物について解析されたマーカーはその動物のゲノム全体に中から高密度で広がる。つまり、動物のゲノムは、ゲノム中で平均して少なくとも約１から５センチモルガン毎に生じるマーカーを用いてが解析される。更に本発明によれば、全ゲノム解析又はＷＧＳを実行するために使用されるマーカーの解析が提供され、二つ又はそれ以上の、１０又はそれ以上の、５０又はそれ以上の、１００又はそれ以上の、２００又はそれ以上の、５００又はそれ以上の、又は１０００又はそれ以上のマーカーを含み、少なくともそれらの１つが、表１及び３において記載されているマーカーから選ばれる。この実施態様の好ましい側面において、マーカーは適応度又は生産性形質に関連してもよく、又は適応度及び生産性形質の両方に関連してもよい。
【００４９】
本発明の任意の実施態様において、ＳＮＰ遺伝子座でのゲノム配列は、本発明と適合性の任意の手段によって決定することができる。適する手段は、当業者によく知られており、そして限定されないが、直接配列決定、合成による配列決定、プライマー伸長法、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析、ポリメラーゼ連鎖反応法−制限酵素断片長多型、マイクロアレイ／マルチプレックスアレイシステム（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、サンタクララ、カルフォルニアから入手できるもの）及び対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを含む。
【００５０】
本発明の他の実施態様によれば、その後の使用のために（例えば、種雄又は種雌として使用するために、又は肉用又は乳用目的で販売するために）、生産性又は適応度についてのそれらの予測される値に従って動物を割り当てる方法が提供される。本発明のこの実施態様の種々の側面は、表１及び３に記載されたＳＮＰのグループから選ばれた少なくとも二つのＳＮＰについて少なくとも二匹の動物の遺伝子型を決定することを含む（二つ又はそれ以上のＳＮＰについて動物の遺伝子型を決定する方法は、上述されている）。従って、使用のための動物の割り当ては、１つ又はそれ以上の、二つ又はそれ以上の、１０又はそれ以上の、１０又はそれ以上の、５０又はそれ以上の、１００又はそれ以上の、３００又はそれ以上の、５００又はそれ以上の、又は１０００又はそれ以上のＳＮＰでのその遺伝子型に基づいて決定され得る。動物の割り当てには更に、少なくとも二つのＳＮＰ間の交互作用効果の解析が含まれる
【００５１】
本発明によれば、表１及び３において記載されたＳＮＰの遺伝子型の解析が、実行された唯一の解析である実施態様が提供される。他の実施態様によれば、本明細書に開示されたＳＮＰの解析が、他の所望のタイプのゲノム又は表現型解析（例えば、本発明に開示されたもの以外の任意の遺伝マーカーの解析）を組み合わされる方法が提供される。更に、解析されるＳＮＰは、生産性にのみ関連する、又は適応度にのみ関連するＳＮＰから選択してもよく、又は解析は適応度及び生産性の任意の所望の組み合わせから選ばれたＳＮＰについて実行してもよい。種々の形質と関連するＳＮＰが表１にリストアップされている。
【００５２】
本発明のこれらの実施態様の種々の側面に従えば、選択されたＳＮＰについての動物の遺伝子配列が一旦決定されると、この情報が評価されて、少なくとも二つの選択されたＳＮＰについて、ＳＮＰの対立遺伝子が存在するかが決定される。好ましくは、全ての決定されたＳＮＰについて動物の対立遺伝子の相補が評価される。最後に、評価された二つ又はそれ以上のＳＮＰ位置についてのその遺伝子型に基づいて、動物が使用のために割り当てられる。好ましくは、評価された各ＳＮＰでの動物の遺伝子型を考慮して割り当てがなされるが、その割り当ては評価されたＳＮＰの任意の１つ又は複数のサブセットに基づいてもよい。
【００５３】
本発明の実施態様の種々の側面に従えば、選択されたＳＮＰについての動物の遺伝子配列が一旦決定されると、この情報が評価されて、少なくとも二つの選択されたＳＮＰについて、ＳＮＰの対立遺伝子が存在するかが決定される。好ましくは、全ての決定されたＳＮＰについて動物の対立遺伝子の相補が評価される。ＳＮＰの対立遺伝子の配向の解析が行なわれ、そして好ましくは、解析の結果には、少なくとも１つの交互作用効果に関する情報が含まれる。最後に、評価された二つ又はそれ以上のＳＮＰ位置についてのその遺伝子型に基づいて、動物が使用に割り当てられる。好ましくは、評価された各ＳＮＰでの動物の遺伝子型を考慮して割り当てがなされるが、その割り当ては評価されたＳＮＰ任意の１つ又は複数のサブセットに基づいてもよい。
【００５４】
割り当ては任意の適切な基準に基づいて為されてもよい。任意のＳＮＰについて、対立遺伝子の１つが望ましい形質に関連しているか／相関しているか、又は望ましくない形質と関連しているかの決定がなされ得る。更に、この決定には、好ましくは多数のマーカー間の交互作用効果に関する情報が含まれる。この決定は、育種又は群の管理目標にしばしば依存する。対立遺伝子が望ましい表現型形質に関連しているかの決定は、任意の適切な手段によって為され得る。これらの関連を決定する方法は当技術分野ではよく知られている：更に、これらの方法の使用の側面は以下の実施例において一般的に述べられる。
【００５５】
本発明のＳＮＰに関連され得る表現型形質には、限定されるものではないが、適応度形質及び生産性形質が挙げられる。適応度形質には、限定されるものではないが、妊娠率（ＰＲ）、娘牛妊娠率（ＤＰＲ）、生産寿命（ＰＬ）、体細胞数（ＳＣＣ）、及び体細胞スコア（ＳＣＳ）が挙げられる。生産性形質には、限定されるものではないが、全搾乳量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白質率、乳蛋白質量、全生涯生産量、搾乳速度及び泌乳持続性が挙げられる。
【００５６】
本発明のこの実施態様の種々の側面に従えば、動物の使用のための割り当てには、所望の遺伝子型を有する動物の正の選抜（例えば、所望の遺伝子型を有する動物は、生産性形質用に選抜される）、望ましくない遺伝子型を有する動物の負の選択（例えば、望ましくない遺伝子型を有する動物は、群から淘汰される）、又はこれらの方法の任意の組み合わせのどれかを伴い得る。本発明のこの実施態様の好ましい側面に従えば、望ましい表現型に関連するＳＮＰ対立遺伝子を有するとして同定された動物が、その表現型にふさわしい使用のために割り当てられる（例えば、適応度と正に関連する表現型に基づいて、育種用に割り当てられる）。あるいは、所望の表現型と正に相関するＳＮＰ遺伝子型を有しない（又は、その表現型と負に相関するＳＮＰ対立遺伝子を有する）動物は、その形質について正の相関を有するものとして同じ使用のために割り当てられない。
【００５７】
本発明の他の実施態様によれば、潜在的後代における適応度及び／又は生産性を改善するために潜在的親動物を選抜する（つまり、育種のための割り当て）方法が提供される。本発明のこの実施態様の種々の側面は、表１及び３に記載されたＳＮＰのグループから選択された少なくとも二つのＳＮＰについて少なくとも二匹の動物の遺伝子型を決定することを含む。更に、潜在的親動物として動物が使用されるか、そしてどのように使用されるかの決定は、表１及び３に記載された少なくとも１つのＳＮＰを含む、二つ又はそれ以上の、１０又はそれ以上の、５０又はそれ以上の、１００又はそれ以上の、３００又はそれ以上の、又は５００又はそれより多くのＳＮＰでのその遺伝子型に基づくものであり得る。更に、使用のための他のタイプの割り当てと同様に、本発明のこの実施態様の種々の側面によれば、為される唯一の解析が、表１及び３に記載された二つ又はそれ以上のＳＮＰについての動物の遺伝子型を決定することである方法が提供される。これらの実施態様の他の側面によれば、本明細書中に開示された二つ又はそれ以上のＳＮＰの解析が、任意の他の所望のゲノム又は表現型解析（例えば、本発明において開示されたもの以外の任意の遺伝マーカーの解析）と組み合わされる方法が提供される。更に、解析されたＳＮＰは全て、適応度形質にのみ相関する、又は生産性形質にのみ関連するものから選択され得る。逆に、これらの又は他の如何なる望ましい組み合わせから選ばれたＳＮＰに対しても解析が実行され得る。
【００５８】
本発明のこれらの実施態様の種々の側面に従えば、選択されたＳＮＰのサイトで動物の遺伝子配列が一旦決定されると、この情報が評価されて、選択された少なくとも二つの、ＳＮＰについて、ＳＮＰの対立遺伝子が存在するかが決定される。好ましくは、全ての配列決定されたＳＮＰについての動物の対立遺伝子の相補が評価される。追加的に、動物の対立遺伝子の一組（complement）が解析され、そしてこの動物後代が二つ又はそれ以上の表現型形質を表すであろう確率と相関される。最後に、二つ又はそれ以上の評価されたＳＮＰ位置についてのその遺伝子型に基づいて育種に使用するために動物が割り当てられ、そしてそれが所望の遺伝子型／対立遺伝子をその後代に受け渡すであろう確率が評価される。好ましくは、評価された各ＳＮＰでの動物の遺伝子型を考慮して育種割り当てがなされる。しかしながら、その育種割り当ては評価されたＳＮＰの任意の１つ又は複数のサブセットに基づいてもよい。
【００５９】
育種割り当ては任意の適した基準に基づいて為されてもよい。例えば、育種割り当ては、他の形質よりも優先して、集団における単一の一定の望ましい形質（例えば、向上した適応度又は適応度の部分として特に体細胞スコア（ＳＣＳ）を低下させることさえも）を増強させる確率を高めるためになされ得る；あるいは、選抜は、形質の組み合わせに基づく全生産を一般的に最大化するために為され得る。選ばれる割り当ては育種目標に依存する。適応度内に属するサブカテゴリーには、とりわけ娘牛妊娠率（ＤＰＲ）、生産寿命（ＰＬ）、及び体細胞スコア（ＳＣＳ）が含まれる。生産性内に属するサブカテゴリーにはとりわけ乳脂率、乳脂量、全搾乳量、乳蛋白質率、及び全乳蛋白質が含まれる。
【００６０】
本発明の他の実施態様によれば、後代動物を生産する方法が提供される。本発明のこの実施態様の種々の側面に従えば、後代を生産するために使用される動物は、本発明の任意の実施態様に従う育種のために割り当てられているものである。後代を生産するために動物の使用者が必要な解析を実行してもよく、又は代替として後代の生産者は他の者によって解析された動物を得てもよい。後代は、限定されるものではないが、（ｉ）自然交配、（ｉｉ）人口授精、（ｉｉｉ）体外受精（ＩＶＦ）、又は（ｉｖ）動物から精液／精子及び／又は少なくとも二つの卵子を集め、そしてそれを各々、任意の手段によって受胎産物を生産するために、第二の動物からの一つ又は複数の卵子類／卵子又は精液／精子と接触させることを含む、任意の適切な手段によって生産してもよい。
【００６１】
本発明のこの実施態様の好ましい側面に従えば、後代は、自然交配を含むプロセスによって生産される。この実施態様の他の側面において、後代は、標準的な人口授精（ＡＩ）、体外受精、複数排卵胚移植（ＭＯＥＴ）、又はそれらの任意の組み合わせを含むプロセスを通して生産される。
【００６２】
本発明の他の実施態様によれば、育種目的で動物を割り当てること、そしてその動物から遺伝物質を集め／単離することを含む方法が提供される：ここで、遺伝物質は、限定されるものではないが、精液、精子、卵子、接合体、血液、組織、血清、ＤＮＡ及びＲＮＡが挙げられる。
【００６３】
当然ながら本発明によって提供される方法及び情報の最も効率的かつ効果的な使用は、コンピュタープログラム、及び／又は本出願において開示された配列の全て又は一部を含む電子的にアクセス可能なデータベースを用いることである。従って、本発明の種々の実施態様によれば、表１及び３に記載された少なくとも２つのＳＮＰに対応する配列の全て又は一部を含むデータベースが提供される。これらの実施態様の好ましい側面においては、これらのデータベースは表１及び３に記載された１つ又はそれ以上の、５つ又はそれ以上の、１０又はそれ以上の、２０又はそれ以上の、５０又はそれ以上の、又は実質的に全てのＳＮＰについての配列を含む。
【００６４】
更に、当然ながら本発明によって提供される方法及び情報の効率的な解析及び使用においては、自動化された遺伝子型決定の使用が採用されることになる；特に、多数（例えば１００個）のマーカーを評価する場合に。限定されないが、マイクロアレイの使用を含むそのような遺伝子型の決定を行うために、当技術分野で公知の任意の適した方法が使用され得る。
【００６５】
本発明の他の実施態様によれば、本明細書に開示された二つ又はそれ以上のＳＮＰ配列データベースが、コンピュータが実行可能な二つ又はそれ以上のプログラムによってアクセスされる方法が提供される。そのような方法には、限定されるものではないが、ＳＮＰと、表現型形質又は他のユーザーが定義した形質（例えば、遺伝子発現レベル、蛋白質発現レベル、又は化学的プロファイルのような二つ又はそれ以上の測定基準を用いて測定された形質）間の関連性を解析するプログラム、及び育種又は市場用に動物を割り当てるために使用されるプログラムによるデータベースの使用が含まれる。
【００６６】
本発明の他の実施態様によれば、育種のために割り当てられた動物から遺伝物質を集めることを含む方法が提供される。ここで、動物は、本発明の部分として開示された任意の方法によって育種用に割り当てられる。
【００６７】
本発明の他の実施態様によれば、ＳＮＰの対立遺伝子がサンプルに存在するかを決定するための診断キット又は他の診断装置が提供される；ここで、表１及び３に記載されたＳＮＰのグループからＳＮＰが選択される。本発明のこの実施態様の種々の側面において、キット又は装置は、ＳＮＰに対応する核酸が存在するかどうかに関しての決定を容易にする試薬／器具を備える。そのようなキット／又は器具は更に、ＳＰＮの対立遺伝子が存在するかついての決定を容易にする。本発明のこの実施態様の一定の側面において、キット又は装置は、ＤＮＡ増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を通した）に適する少なくとも二つの核酸オリゴヌクレオチドを含む。本発明の他の側面では、キット又は装置は、表１及び３に記載された少なくとも二つのＳＮＰの少なくとも二つの対立遺伝子を用いて、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイゼーションできる精製された核酸断片を含む。
【００６８】
本発明のこの実施態様の特に好ましい側面においてば、キット又は装置は、表１及び３に記載された二つの又はそれ以上のＳＮＰの対立遺伝子がサンプル中に存在するかを決定できる少なくとも二つの核酸アレイ（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）を含む。本発明のこの実施態様の好ましい側面によれば、二つ又はそれ以上のＳＮＰについて、対立遺伝子がサンプル中に存在するかを同時に決定できるＤＮＡマイクロアレイが提供される。好ましくは、ＤＮＡマイクロアレイは、１０又はそれ以上の、５０又はそれ以上の、１００又はそれ以上の、２００又はそれ以上の、５００又はそれ以上の、又は１０００又はそれ以上のＳＮＰについてサンプル中にＳＮＰ対立遺伝子が存在するかを決定できる。そのようなアレイを作成する方法は当業者に公知であり、そしてそのようなアレイは市販品として入手可能である（例えば、Affymetrix、サンタクララ、カリフォルニア）。
【００６９】
表に記載された任意のＳＮＰと対立遺伝子関連にある適応度及び／又は生産性についての遺伝マーカーは、当業者に公知の任意の適した手段によって同定され得る。例えば、表に記載されたＳＮＰの任意の配列について特異的であるプローブを用いて、ゲノムライブラリーをスクリーニングし得る。このようにして、その配列の少なくとも一部を含むクローンが同定できて、次いで３’及び／又は５’フランキング染色体配列の最大３００キロ塩基が決定できる。この手段によって、表に記載されたＳＮＰと対立遺伝子関連にある遺伝マーカーが同定される。
【００７０】
本発明の他の実施態様によれば、表現型変異に関連し得る遺伝子を同定する方法が提供される。これらの実施態様の種々の側面に従えば、当業者によく知られた手段によって格別な表現型変異と関連するＳＮＰの染色体位置が決定され得る。一旦、染色体位置が決定されると、表現型の決定に関与していると疑われる遺伝子が解析できる。そのような遺伝子は、染色体の隣接部分を配列することによって、又はヒト遺伝マップ（又は他の種についての公知の遺伝マップ）の類似セクションと比較することによって同定され得る。保存された遺伝子のクラスターの存在の初期の例はWomack (1987）においてレビューされ、ここでは、１つの種における同一染色体への遺伝子マッピングが、他の密接に関連する種における同一染色体にマッピングするために、観察された。マッピングの分解能が改善されるにつれ、遺伝子構造及び保存された染色体領域内の順序の保存についての報告が公表されるようになった（例えば、Grosz et al., 1992)。もっと最近では、大規模放射ハイブリッドマッピングとＢＡＣ配列により、ヒトと牛のゲノム間で（Everts-van der Wind et al., 2005）、ヒト及び豚のゲノム間で（Yasue et al., 2006) 及び脊椎動物のゲノム間で (Demars et al., 2006)、 染色体規模での比較マッピング予測がもたらされている。
【００７１】
本発明の他の実施態様によれば、二つ又はそれ以上の定量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）が根底にある因果的突然変異を同定する方法が提供される。本発明のこの実施態様の種々の側面によれば、表１及び３に記載された二つの又はそれ以上のＳＮＰと対立遺伝子関連にあるＱＴＬの同定が提供される。一旦、これらのＳＮＰが同定されると、そのようなＳＮＰの近くに位置する突然変異を同定することは当業者の能力範囲内にある。更に、当業者は、因果的突然変異を含み易いものを選抜するために、同定されたＳＮＰの近くに位置する遺伝子を同定でき、そしてこれらの遺伝子を評価できる。一旦、同定されると、因果的突然変異を同定するために、突然変異の存在についてこれらの遺伝子及び周囲の配列が解析され得る。
【００７２】
更に、一旦、表現型変異に関連する遺伝子が同定されると、交互作用効果を調べることによって解析の正確性が改善できる。ＱＴＬ間の交互作用効果が無い場合は、より迅速な遺伝的改善に対して、個々のＱＴＬの限界効果を利用することができる。一般に、育種の決定をするために、各対立遺伝子又は遺伝子型の育種価が推定され、そして動物の多遺伝子性の育種価と共に、推定された育種価が使用される。
【００７３】
交互作用効果が存在する場合、多数のＱＴＬからの多型からなるハプロタイプの真の育種価は、各ＱＴＬでの個々の多型の育種価の総和と異なる。従って、非対立遺伝子交互作用が存在しない場合に設計された前記のようなアプローチは次善策となる。そうではなく、遺伝的改善の最適化についてのハプロタイプ又は遺伝子型立体配置の育種価を推定すべきである。
【００７４】
ハプロタイプの集団頻度が、ハプロタイプの育種価の推定において使用される。集団に関して連鎖不平衡が存在すると、ハプロタイプの頻度は、対応する対立遺伝子頻度の積とは異なる。この場合、育種価の推定に対してハプロタイプの頻度を使用することがより適切である。
【００７５】
育種プログラムにおいて交互作用効果を適切に使用することによる付加的利益は、ハプロタイプの真の育種価及び対応する対立遺伝子の育種価の和の間の差からもたらされる。差の大きさは、交互作用効果の大きさ及び交互作用するＱＴＬの間の集団に関する連鎖不平衡の程度によって決定される。
【００７６】
交互作用効果は、商業生産のより高い効率のための、遺伝的に優れた交雑種の又は雑種の動物を生産するためにも使用できる。一例として、遺伝子型Ａ1Ａ2Ｂ1Ｂ2 が最良の遺伝子型であり、そして遺伝子型 Ａ1Ａ2及びＢ1Ｂ2の育種価（及び遺伝子型値）の総和よりも優れていると仮定しよう。それを利用する１つの方法は、遺伝子型Ａ1Ａ1Ｂ1Ｂ1及びＡ2Ａ2Ｂ2Ｂ2をそれぞれ有する二つの系統を作出することである。これら二つの系統は、理想的な交雑種を作出するための異なる品種から、又は理想的な雑種を作出するための既存品種の集団内由来のものであり得る。これらの二つの系統から作出される交雑種又は雑種は、全て商業生産の効率を改善する遺伝子型Ａ1Ａ2Ｂ1Ｂ2を有するであろう。
【００７７】
交互作用効果は、商業生産のより高い効率のための遺伝的に優れた後代を生産するためのコンピュータ交配プログラム内でも使用できる。一例として、遺伝子型Ａ1Ａ2Ｂ1Ｂ2 が最良の遺伝子型であり、そして遺伝子型 Ａ1Ａ2及びＢ1Ｂ2の育種価（及び遺伝子型値）の総和よりも優れていると仮定しよう。それを利用する１つの方法は、雌牛及び雄牛が遺伝子型Ａ1Ａ1Ｂ1Ｂ1及びＡ2Ａ2Ｂ2Ｂ2を有するかを同定することである。潜在的交配動物を、交配プログラムにランク付けする場合、潜在的後代の推定される育種価を計算するときに、交互作用効果を含め得る。例えば、Ａ1Ａ1Ｂ1Ｂ1を有する個体について、Ａ2Ａ2Ｂ2Ｂ2遺伝子型を有する潜在的交配動物は、その好ましい交互作用項からのさらなる交配値を有することになる。もちろん、この考えは、好ましい又は好ましくない交互作用を有する多数の組の遺伝子座のセット間の多数の交互作用に対して拡張され得るであろう。人口授精の通常の適用においては、この情報量を管理することが非常に困難となるため、交配の管理及び最適化のためにコンピュータ交配が使用され得る。
【００７８】
上述の通り（段落７６を参照）、全ての商業的後代が商業生産の効率を改善するＡ1Ａ2Ｂ1Ｂ2遺伝子型を有するように、二つの亜系統の交配を介して理想的な雑種を作出するために、既存の品種集団内からこれら二つの明確な亜系統が作出され得る。しかしながら、多数の交互作用の交互作用項を最大化するために最適化された亜系統の作出は、非常に複雑なものであり得る。１つの解決方法は、最適化された雑種の生産における最終的な使用のための、理想的な亜系統を作出するために、コンピュータ交配を使用することである。異なる形質の最終的な商業価値に依存して、異なる育種目標についての交互作用効果を最適化するために、いくつかの亜系統が作出され得る。
【実施例】
【００７９】
以下の実施例は、本発明の一般的な実施態様を実証するために挙げられる。当業者は、以下の実施例に開示された技術が、本発明の実施において十分機能するように発明者によって見出された技術を表し、従ってその実施のための好ましい態様を構成すると考えることができると正しく認識すべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施例において多くの変更を為すことができ、なおかつ本発明から逸脱することなく同様の又は類似の結果が得られると正しく認識するはずである。
【００８０】
本明細書において開示されそして請求された全ての組成物及び方法は、本開示に照らして過度な実験なしに、製作しそして行なうことができる。本発明の組成物及び方法が好ましい実施側面の形で述べられているものの、本発明の概念及び範囲から逸脱することなく変更が適用され得ることは、当業者には明白であろう。
【００８１】
実施例１：遺伝マーカーと表現型形質間の関連の決定
定量的形質（定量的形質遺伝子座：ＧＴＬ）の基礎にある全ゲノム領域ベースの遺伝子に関する同時検出（discovery）及び詳細マッピング（fine-mapping）には、ゲノム全体を密にカバーする遺伝マーカーが必要である。この実施態様において述べるように、ウシのゲノムにおける位置の以前の推定を用いたマイクロサテライト及び一塩基多型（ＳＮＰ）マーカーから、及びヒトの配列との相同及びヒト／雌牛の比較マップに基づく、ウシのゲノムにおける推定位置を用いたＳＮＰマーカーから、全ゲノムの密にカバーするマーカーマップを構築した。血統の明らかな家畜集団における全ゲノム領域に亘る密に間隔をとったマーカーのより効率的なマッピングを可能ならしめるために、ＣＲＩＭＡＰソフトウエア（Green et al., Washington University School of Medicine, St. Louis, 1990）の拡張として、新規なリンケージマッピング・ソフトウエアパッケージが開発された（Liu and Grosz Abstract C014; Grapes et al. Abstract W244; 2006 Proceedings of the XIV Plant and Animal Genome Conference, www.intl-pag.org）。その新規な連鎖マッピングツールは、大きな血統の分割、染色体割り当て（assignment）の自動化、及び二点連鎖解析を通して、そして完全な染色体中へのサブマップの合体（merging）を通して、効率を改善するために、ＣＲＩＭＡＰにプログラムされる基本マッピング原理を、構築する。得られた全ゲノム検出マップ（ＷＧＤＭ）は、２．１８マーカー／ｃＭの平均マップ密度に対して、６，９９６マーカー及び３，２９０ｃＭのマップ長を含んでいた。マーカーの間の平均ギャップは０．４７ｃＭ、そして最大ギャップは７．８ｃＭであった。このマップは、乳牛における生産性及び適応度における変動に寄与する全ゲノム解析及びＱＴＬの詳細マッピングについての基礎を提供する。
【００８２】
検出及びマッピング
検出及びマッピング集団のためのシステムは多くの形をとることができる。母集団ワイドマーカー／ＱＴＬの関連を決定するための最も効果的な戦略には、非遺伝的な作用を説明することを可能ならしめる設計で集められた、関心ある表現型測定値を有する個体の大量でかつ遺伝的に様々なサンプルが含まれ、そして測定された個体の血統に関する情報が含まれる。本実施態様において、ＱＴＬを検出してマップするために、孫娘設計（Weller et al., 1990）に従う非近交系集団が使用された：ホルスタイン品種からの集団は、各々が平均６．１頭の遺伝子型の息牛を有する５２９頭の種雄牛を有し、そして各息牛が乳量データを有する平均４２１６頭の娘牛を有した。多数の種雄牛及び祖父牛系統群を代表して、約３，２００頭のホルスタイン雄牛、及び他の乳牛品種からの約３５０頭の雄牛からＤＮＡサンプルが集められた。
【００８３】
表現型解析
評価段階の乳形質には、搾乳量 （“ＭＩＬＫ”）（ポンド）、脂肪収量（“ＦＡＴ”）（ポンド）、脂肪パーセント（“ＦＡＴＰＣＴ”）（パーセント）、生産寿命（“ＰＬ”）（月）、体細胞スコア（“ＳＣＳ”）（Ｌｏｇ）、娘牛妊娠率（“ＤＰＲ”）（パーセント）、蛋白質収量（“ＰＲＯＴ”）（ポンド）、蛋白質パーセント（“ＰＲＯＴＰＣＴ”）（パーセント）、及び正味メリット（“ＮＭ”）（ドル）のような従来の形質が含まれる。これらの形質は、雄の動物については個々の表現型が全く測定され得ない故に、限性である。代わりに、ＰＴＡ（予測伝達能力）として定義されるこれらの形質の遺伝的メリットが、全ての血族の表現型を用いて推定された。大部分の乳用雄牛は、かなり大きな数の娘牛（例えば５０頭を超える）で後代検定され、そしてそれらのＰＴＡ推定は、個々の雌牛表現型データよりも一般により正確又はかなり正確である。米国のホルスタイン集団の従来の乳形質についての遺伝的評価は、ＵＳＤＡによって四半期ごとに行なわれる。この評価において使用される形質、遺伝的評価手順、及び遺伝的パラメーターの詳細な記述がＵＳＤＡのＡＩＰＬウエブサイト（www.aipl.arsusda.gov）で見出すことができる。この実施態様において評価された乳形質が独立したものではないと注記することは意味がある：ＦＡＴ及びＰＲＯＴは、ＭＩＬＫ及びＦＡＴＰＣＴ、並びにＭＩＬＫ及びＰＲＯＴＰＣＴそれぞれの複合形質である。ＮＭは、蛋白質収量、脂肪収量、生産寿命、体細胞スコア、娘牛妊娠率、分娩の困難さ及びいくつかのタイプの形質に基づいて計算される指数形質である。蛋白質収量及び脂肪収量は一緒でＮＭの５０％を超える値を占め、そして搾乳量、脂肪含量及び蛋白質含量は、蛋白質収量及び脂肪収量を介して説明される。
【００８４】
後代検定データを有する全ての雄牛のＰＴＡデータは、２００５年１１月にＡＩＰＬサイトで公表されたＵＳＤＡ評価からダウンロードされた。ＰＴＡデータは以下の二つのモデルを用いて解析された：
【数２】
2010538643.tif 000003
ここで、 yi (yij) は、ｉ番目の雄牛のＰＴＡ（ｉ番目の種雄牛（sire）のｊ番目の息牛のＰＴＡ）であり；ｓiはｉ番目の種雄牛の効果であり；（ＳＰＴＡ）iは、全サンプルのｉ番目の雄牛の種雄牛のＰＴＡであり；μは集団平均であり；ＰＴＡｄi（ＰＴＡｄij）は  残差雄牛ＰＴＡである。
【００８５】
式２は種雄牛モデルと称され、ここで種雄牛が固定因子として当てはめられた。全てのＵＳＡホルスタインの後代検定された雄牛の中で、かなり多くの数の種雄牛は、非常に少ない数の後代検定された息牛（例えば、幾頭かは一頭の息牛を有する）のみを有し、そしてそれは、これらの場合における固定因子として種雄牛を当てはめることは明らかに望ましくない。過去数十年間、従来の乳形質においてＵＳＡホルスタイン群が着実で急速な遺伝的進歩を示してきたこと、そしてそれは種雄牛の効果を雄牛の生まれた年を当てはめることによって部分的に説明できることを意味するのはよく知られている。後代検定された息牛が１０頭未満である種雄牛については、それらの種雄牛は式２における息牛の生まれた年で置き換えられた。式３はＳＰＴＡモデルと称され、ここでは種雄牛のＰＴＡが共変量として当てはめられる。残差ＰＴＡ（ＰＴＡｄi又はＰＴＡｄij）は線形回帰を用いて推定された。
【００８６】
ＳＮＰ−形質関連解析
本実施態様において、連鎖不平衡（ＬＤ）マッピングは、観察されたマーカー遺伝子型を条件として推定された個体の順序付けられた遺伝子型の確率に基づく統計的解析を用いて、前述の検出集団において実行された。第一ステップは、祖父牛及び後代のマーカー遺伝子型データを条件として全ての連鎖マーカーでの種雄牛の順序付けられた遺伝子型の確率を推定することであった。血統のサイズ及び複雑さ、並びに連鎖マーカーの数が増すにつれて、正確な計算はすぐに計算上実行不可能になる。例えば、種雄牛がｋ個の連鎖のヘテロ接合遺伝子座を有する場合、全ての連鎖遺伝子座に対して、全部で２kの順序付けられた遺伝子型がある。全ての連鎖マーカーでの種雄牛の順序付けられた遺伝子型の確率の推定のために、尤度比検定に基づいて展開されたステップワイズ手順が使用された。
【００８７】
関心ある遺伝子座での順序付けられた遺伝子型の確率が、隣接情報マーカーを条件として以下のようにして推定された：
【数３】
2010538643.tif 000004
ここで、
【数４】
2010538643.tif 000005
は、観察された遺伝子型データＭを条件として全ての連鎖遺伝子座でのハプロタイプの対
【数５】
2010538643.tif 000006
（又は順序付けられた遺伝子型）を有する種雄牛の確率であり；そして
【数６】
2010538643.tif 000007
は、全ての連鎖遺伝子座及び観察された遺伝子型データＭでの種雄牛の順序付けられた遺伝子型
【数７】
2010538643.tif 000008
を条件として、関心ある遺伝子座での順序付けられた遺伝子型
【数８】
2010538643.tif 000009
を有する息牛の確率である。
【００８８】
ハプロタイプの確率と形質表現型間の関連を決定するために、各染色体と交差して隣接する（及び／又は隣接しない）マーカーのハプロタイプが、染色体間隔の最大長、及び含めようとするマーカーの最小数及び最大数を設定することによって定義された。明らかに、ハプロタイプ評価についてのマーカー遺伝子座のグループを形成し又は定義するために、類似パラメーターを設定することが必要である。事前に調整された形質表現型とハプロタイプ（又は順序付けられた遺伝子型と代わりに呼ばれるハプロタイプ対）間の関連が、以下のモデルを用いる回帰法を介して評価された。
【数９】
2010538643.tif 000010
ここで、ＰＴＡｄkは、種雄牛モデルの下、式３において定義される通りのｋ番目の雄牛の事前に調整されたＰＴＡであり、そしてＳＰＴＡモデルの下、式３において定義される通りのＰＴＡｄｉで代替できて、そしてｅkは、残差であり；Ｐ（Ｈsik）及びＰ（Ｈdik）は、ハプロタイプｉである個体ｋの父性及び母性のハプロタイプの確率であり；Ｐ（ＨsikＨdik）は、個体ｋが式４を用いて推定できる父性ハプロタイプｉ及び母性ハプロタイプｊを有する確率であり；全てのβは対応する回帰係数である。式５、６、７及び８は、父性ハプロタイプ、母性ハプロタイプ、追加ハプロタイプ、及び遺伝子型効果をそれぞれモデル化するために設計される。
【００８９】
表現型形質、及び効果の有意性を試験するために使用される正規Ｆ−検定に及ぼすハプロタイプ又はハプロタイプ対の効果を推定するために最小二乗法が使用された。タイプＩエラー率（ｐ値）を推定するために、父系半きょうだい家系内の表現型並べかえ（２０，０００）に基づいて、並べ替え検定が実行された。
【００９０】
実施例２：多数の遺伝マーカー間の交互作用効果の解析
候補遺伝子からのＳＮＰのクラスタリング。主として、小さく、効果的な集団サイズ及び強い選抜故に、固く連鎖したＳＮＰからの対立遺伝子は一般的に動物集団において関連している（例えば、 Farnir et al., 2000; Du et al., 2007）。明らかに、もし二つのＳＮＰが完全なＬＤにあれば、関心ある形質との関連及び関心ある形質についての他のＳＮＰとの交互作用は類似することになり、それはさらに多くの追加の統計的証拠を与えない。従って、単一遺伝子で多数のＳＮＰの遺伝子型が決定される場合に、それは同じ候補遺伝子からＳＮＰをクラスター化するために役立つ。
【００９１】
形質表現型の事前調整。この研究は、以下を含む従来の乳形質に焦点をあてる：搾乳量（“ＭＩＬＫ”）（ポンド）、脂肪収量（“ＦＡＴ”）（ポンド）、脂肪パーセント（“ＦＡＴＰＣＴ”）（パーセント）、生産寿命  （“ＰＬ”）（月）、体細胞スコア（“ＳＣＳ”）（Ｌｏｇ）、娘牛妊娠率（“ＤＰＲ”）（パーセント）、蛋白質収量（“ＰＲＯＴ”）（ポンド）、蛋白質パーセント（“ＰＲＯＴＰＣＴ”）（パーセント）、及び正味メリット（“ＮＭ”）（ドル）。これらの形質は、雄の動物については個々の表現型が全く測定できない故に、限性である。代わりに、ＰＴＡ（予測伝達能力）として定義されるこれらの形質の遺伝的メリットが、全ての血族の表現型を用いて推定された。大部分の乳用雄牛は、かなり大きな数の娘牛（例えば５０頭を超える）で後代検定され、そしてそれらのＰＴＡ推定は、個々の雌牛表現型データよりも一般により正確又はかなり正確である。米国のホルスタイン集団の伝統的な乳形質に対する遺伝的評価は、ＵＳＤＡによって四半期ごとに行なわれる。この評価において使用される形質、遺伝的評価手順、及び遺伝的パラメーターの詳細な記述がＵＳＤＡのＡＩＰＬウエブサイト（www.aipl.arsusda.gov）で見出すことができる。この実施態様において評価された乳形質が独立したものではないと注記することは意味がある：ＦＡＴ及びＰＲＯＴは、ＭＩＬＫ及びＦＡＴＰＣＴ、並びにＭＩＬＫ及びＰＲＯＴＰＣＴそれぞれの複合形質である。ＮＭは、蛋白質収量、脂肪収量、生産寿命、体細胞スコア、娘牛妊娠率、分娩の困難さ及びいくつかのタイプの形質に基づいて計算される指数形質である。
【００９２】
後代検定データを有する全ての雄牛のＰＴＡデータは、ＡＩＰＬサイトで公表されたＵＳＤＡ２００７年２月の遺伝的評価からダウンロードされた。ＰＴＡデータは以下の二つのモデルを用いて解析された：
【数１０】
2010538643.tif 000011
ここで、 yi (yij) は、ｉ番目の雄牛のＰＴＡ（ｉ番目の種雄牛のｊ番目の息牛のＰＴＡ）であり；ｓiはｉ番目の種雄牛の効果であり；（ＳＰＴＡ）iは、全サンプルのｉ番目の雄牛の種雄牛のＰＴＡであり；μは集団平均であり；ＰＴＡｄi（ＰＴＡｄij）は  残差雄牛ＰＴＡである。
【００９３】
式９は種雄牛モデルと称され、ここで種雄牛が固定因子として当てはめられた。全てのＵＳＡホルスタインの後代検定された雄牛の中で、かなり多くの数の種雄牛は、非常に少ない数の後代検定された息牛（例えば、幾頭かは一頭の息牛を有する）のみを有し、そしてそれは、これらの場合における固定因子として種雄牛を当てはめることは明らかに望ましくない。過去数十年間、従来の乳形質においてＵＳＡホルスタイン群が着実で急速な遺伝的進歩を示してきたこと、そしてそれは種雄牛の効果が雄牛の生まれた年を当てはめることによって部分的に説明できることを意味するのはよく知られている。後代検定された息牛が１０頭未満である種雄牛に対して、それらの種雄牛は式９における息牛の生まれた年で置き換えられた。式１０はＳＰＴＡモデルと称され、ここでは種雄牛のＰＴＡが共変量として当てはめられる。残りのＰＴＡ（ＰＴＡｄi又はＰＴＡｄij）はＳＡＳＰＲＯＣＧＬＭ手順を用いて推定され、そしてこの研究における更なる候補遺伝子解析のために使用された。
【００９４】
候補遺伝子の交互作用の解析。以下の線形モデルを用いて、ＳＮＰと各乳形質の残りのＰＴＡ間の関連が解析された。
【数１１】
2010538643.tif 000012
ここで、ＰＴＡｄiは、種雄牛モデルの下、式１０において定義される通りのｉ番目の雄牛の事前に調整されたＰＴＡであり、そしてＳＰＴＡモデルの下、式９において定義される通りのＰＴＡｄiで置き換えることができ；ｎgjはＳＮＰｊ（ｊ＝１，２）での順序付けられていない遺伝子型の数であり；ｅiは残差効果であり；βkは遺伝子型指標Ｉijkの効果であり、そしてδkhは１番目のＳＮＰでの遺伝子型指標Ｉi1kと２番目のＳＮＰでの遺伝子型指標Ｉi2h間の交互作用効果であり；そして遺伝子型指標Ｉijkは以下の如く定義される：
【数１２】
2010538643.tif 000013
【００９５】
全体の解析は二つの工程からなる。ＵＳＤＡ（式９及び１０）によって評価された全ての雄牛を用いて、元のＰＴＡデータが最初に事前調節され、そしてＳＮＰと形質間の統計的関連について、事前調節されたＰＴＡが式１１を用いて解析された。式９及び１１、並びに式１０及び１１の組み合わせを、それぞれ種雄牛モデル及びＳＰＴＡモデルと言及した。
【００９６】
この解析の結果を表１に示す。
【００９７】
実施例３：後代形質を改善するための一塩基多型（ＳＮＰ）の使用
選択された形質について集団の平均的な遺伝的メリットを改善するために、その形質に有意な関連を有する二つ又はそれ以上のマーカーを、育種動物の選抜において使用できる。各々の検出された遺伝子座の場合において、好ましいＱＴＬ対立遺伝子を有する集団ワイドＬＤにおけるマーカー対立遺伝子（又は多数のマーカー対立遺伝子のハプロタイプ）を有する動物を使用すると、育種において使用される動物の育種価が増加し、時間経過と共に集団におけるそのＱＴＬ対立遺伝子の頻度を高め、そしてそれによって、その形質についての集団の平均的な遺伝的メリットが向上することになる。この高められた遺伝的メリットは、価値の完全な実現のために商業集団に対して広めることができる。
【００９８】
例えば、後代検定スキームにより、遺伝的進歩のその速度、又は若齢の雄牛をスクリーニングするためのマーカーの使用を介した格付け成功率（graduation success rate）が大いに改善され得るであろう。典型的には、後代検定プログラムで、約０．５の正確さを有するプログラムにエントリーさせるための候補として若齢の雄牛を選抜するために、血族の血統情報及び血族の性能が使用されるであろう。しかしながら、マーカー情報を追加することによって、もっとより高い正確さで若い雄牛をスクリーニングし、そして選抜できるであろう。この実施態様においては、ＱＴＬとの連鎖不平衡におけるゲノムワイドのマーカーのセットを用いて潜在的な雄牛の母牛及びその雄の後代からのＤＮＡサンプルをスクリーニングでき、そして最良のマーカープロファイルを有する雄牛の母牛候補が特定の雄牛と交配させるために縁組することができた。過剰排卵及び胚移植（ＥＴ）を使用する場合は、賦勢手順（flush procedure）当たり、雄牛の母牛当たり５〜１０後代のセットが生産され得るであろう。その場合、後代検定プログラム用の候補として、最良の雌後代を選抜するために、マーカーのセットがまた使用され得るであろう。ゲノムワイドのマーカーを使用する場合は、マーカー選択の正確さが０．８５という高さに達し得るであろうと推定された（Meuwissen et al., 2001）。このさらなる正確さは、後代検定プログラムにエントリーする候補の遺伝的メリットを大いに改善するために使用でき、そのことによって、市場性のある後代検定された雄牛の格付け成功確率を高める。この情報は、また、格付け成功の数を同じに維持しながら試験される若齢雄牛の候補数を減らすことによってプログラムコストを低減させるために使用できる。極端な場合、後代検定を全く必要とすること無く、若齢雄牛からの精液を直接市販するために、非常に正確なマーカー育種価（ＭＢＶ）を使用できる。幼牛が４．５から５年ではなく、今では春機発動期から市販できるという事実故に、世代間隔を半分よりも多く短くでき、そして利得率を６８．３％も多く高めることができる（Schrooten et al., 2004）。後代検定の必要性がなくなれば、人口授精事業のための遺伝的改善のコストを大幅に改善することになる（Schaeffer, 2006）。
【００９９】
代替実施態様において、ＭＢＶに基いて後代検定に又は直接販売に使用する若齢雄牛を生産するために、牛の集中した又は分散した遺伝子核（ＧＮ）集団を維持することができた。雌牛の上位１０から１５％が、過排卵及び胚移植（ＭＯＥＴ）スキームにＥＴドナーとして使用されると仮定して、１０００頭の雌牛のＧＮ群は、１年当たりおおまかに３０００頭の子を生産すると期待され得る。しかしながら、マーカーは、有効性ＭＯＥＴスキーム及び体外胎仔生産を変えることができるであろう。これまで、余分な遺伝的獲得量の観点からＭＯＥＴ核スキームが有望であることが証明されているが、核群の操作コストは、若齢動物に関する限られた情報と共に、広範囲での採用を制限してきた。しかしながら、マーカー情報を使用すると、以前よりもさらにより正確に若齢動物が選抜でき、その結果、世代間隔が非常に低減され、そして遺伝的応答率が上昇した。以前は全きょうだいの育種価が同じであったが、マーカー情報を使用すると、最良の全きょうだいが寿命の早い時期に同定できる故に、ＭＯＥＴ核群スキームにおいてこれは特に真実である。血統情報についての選択圧力が低下し、そして個々のマーカー情報についての選択圧力が増す故に、マーカー情報はまた近親交配の制限にも役だつであろう。初期の研究（Meuwissen and van Arendonk, 1992）で、核群シナリオにおいてマーカーを使用した場合、高々２６％の追加の遺伝的獲得量の利点しか見出されず；一方、正規の後代検定における利益はさらに低かった。
【０１００】
ＭＡＳと共に、雌牛の選抜もまた、特に、マーカーが実質的な遺伝的変異量を明らかにする場合、遺伝的改善の重要な源となり得る。移植の前の胎仔のマーカー試験は、更なる効率を獲得できる（Bredbacka, 2001）。このことは、移植及び受容動物コストをかける前に劣性のマーカープロファイルを有する胎仔を廃棄することができるように、胎仔についてかなりの選抜を生じさせることになる。このことはまた胎仔の事前選択がより小さな核群で同等に進歩させることになる故に、核群のコスト対効果を高めることになる。あるいは、このことは、雄牛が後代検定に入る前の事前選抜の更なる機会を与え、その結果、従来の後代検定よりも最大３１％も速いと予測された遺伝的応答率を与える（Schrooten et al., 2004）。
【０１０１】
育種価の推定、及びＧＮにおける選択のためのＳＮＰの使用における第一工程は、ＧＮにおける種畜として又は他の商業的集団（本実施態様においては、毎年、ＧＮで生産される３０００頭の後代）における種畜としての選抜のための候補となるであろう全ての後代からＤＮＡを収集することである。１つの方法は、生まれた直後に、各仔牛から少量の耳組織、髪サンプル又は血液を標識が付いた（バーコードが付けられた）チューブ内に採取することである。この組織から抽出されたＤＮＡは、本質的に無制限の数のＳＮＰマーカーを分析するために使用でき、そしてその結果は、動物が育種年齢に達する前の選抜決定に含めることができる。
【０１０２】
価値あるＱＴＬ対立遺伝子（実施例１参照）を有する、集団ワイドのＬＤにあると決定されたマーカー（又はマーカーハプロタイプ）を選抜決定に組み込むための１つの方法は、古典的な定量的遺伝学及び選抜指数理論に基づく（Falconer and Mackay, 1996; Dekkers and Chakraborty, 2001）。選抜の対象とされる集団におけるマーカー効果を推定するために、関心ある形質に対する表現型測定値を有する動物のランダムサンプルが、固定効果として又は共変量として当てはめられたマーカーを有する混合動物モデルを用いて解析できる（対立遺伝子コピー数に関する表現型の回帰）。マーカー効果を当てはめるどちらの方法からの結果も、対立遺伝子置換効果を引き出すために、そして次にマーカーの育種価を引き出すために使用できる：
【数１３】
2010538643.tif 000014
ここで α1及びα2は、対立遺伝子１及び２それぞれの平均効果であり；αは対立遺伝子置換の平均効果であり；ｐ及びｑは、対立遺伝子１及び２それぞれの集団における頻度であり；ａ及びｄはそれぞれ相加効果及び優性効果であり；ｇA1A1、ｇA1A2及びｇA2A2は、マーカー遺伝子型Ａ１Ａ１、Ａ１Ａ２及びＡ２Ａ２をそれぞれ有する動物に対する（マーカー）育種価である。動物の総形質育種価は、考慮される各マーカー（又はハプロタイプ）についての育種価及び残りの多遺伝子性の育種価の和である：
【数１４】
2010538643.tif 000015
ここでＥＢＶijは、ｉ番目の動物の推定形質育種価であり；
【数１５】
2010538643.tif 000016
はｊ＝１からｎまでの合計のマーカー育種価であり、ここでｎは検討中のマーカー（ハプロタイプ）の総計数であり；そして
【数１６】
2010538643.tif 000017
は、マーカー遺伝子型当てはめ後のｉ番目の動物の多遺伝子性の育種価である。
【０１０３】
これらの方法は、多数の形質の選択候補についての育種価、並びに多数のマーカー（ハプロタイプ）からの情報を含む各形質についての育種価、並びに選抜指数理論及び各形質の相対的重要性を設定する特定の育種目的のコンテキスト内の全てを推定するために容易に拡張できる。マーカー及びＱＴＬの間の再結合（例えば、Fernando and Grossman, 1989）、及び全ゲノム選択における全ての検出されたマーカー情報の潜在的包含（Meuwissen et al., Genetics 2001）を明らかにするランダムモデルを含め、多数の形質についての育種価の推定におけるマーカー情報を最適化するために、他の方法も存在する。これらの任意の方法を通して、価値あるＱＴＬ対立遺伝子を有する集団ワイドのＬＤにあると決定されている、本明細書において報告されたマーカーが、選抜のより大きな正確さ、より大きな遺伝的改善率、及び乳業におけるより大きな価値蓄積を提供するために使用され得る。
【０１０４】
実施例４：後代形質を改善するための、交互作用効果を有する多数のＳＮＰの使用
育種プログラムにおける交互作用効果の使用を説明するために、二つの二対立遺伝子ＱＴＬ（Ａ及びＢによって表示される）での二つの因果的突然変異（causal mutation）を考えてみる。Ａ1及びＡ2並びにＢ1及びＢ2がそれぞれ二つの対立遺伝子ＱＴＬ、Ａ及びＢ、であるとしよう。両方の交互作用及び主効果をモデル化する１つの方法は、全ての遺伝子型立体配置の効果を当てはめることである：
【数１７】
2010538643.tif 000018
ここで、ａiは多遺伝子性のランダム効果を示し；（ＡtＡj；ＢsＢk）は、Ａ及びＢでの遺伝子型からなる遺伝子型立体配置を示し；β（ＡtＡj；ＢsＢk）は遺伝子型立体配置（ＡtＡj；ＢsＢk）に対する回帰係数であり；Ｉ（ＡtＡj；ＢsＢk）は以下の如く定義される指数関数である：
【数１８】
2010538643.tif 000019
【０１０５】
式［２０］は、交互作用効果の検出及び利用の両方のために使用できる。式［２０］における遺伝子型立体配置（ＡtＡj；ＢsＢk）の効果は、固定効果又はランダム効果として当てはめることができる。
【０１０６】
各ＱＴＬからの１つの対立遺伝子からなるハプロタイプの育種価は下記を用いて計算できる：
【数１９】
2010538643.tif 000020
ここで、ｆ（ＡkＢs）（ｋ，ｓ＝１，２） は、ハプロタイプＡkＢsの頻度を表す。尚、ｆ（ＡkＢs）は、集団ワイドの連鎖不平衡の存在における、対応する対立遺伝子頻度の積に等しくないことに留意すべきである。
【０１０７】
遺伝子型立体配置（ＡiＡj；ＢkＢs）を有する動物の育種価は下記の如く計算できる：
【数２０】
2010538643.tif 000021
ここで、ｐ（ＡiＢj）は配偶子ハプロタイプＡiＢjを有するこの動物によって生産される配偶子の確率である。尚、全てのあり得るハプロタイプの確率の和は１に等しく、そしてｐ（ＡiＢj）の値は、遺伝子型立体配置が両方の遺伝子座でヘテロ接合である場合におけるＱＴＬのＡ及びＢ間の再結合分率の関数である。連鎖効果を明らかにするために、さらに遺伝子型Ａ1Ｂ1／Ａ2Ｂ2（すなわち、ハプロタイプＡ1Ｂ1及びＡ2Ｂ2からなる）を有する動物を考えてみよう。この動物に対する４つの異なるハプロタイプの確率は下記の如く計算できる：
【数２１】
2010538643.tif 000022
ここでθABは、遺伝子座Ａ及びＢの間の再結合分率を表す。
【０１０８】
遺伝子型構成の育種価は、従来の多遺伝子性の育種価と同じように、遺伝的改善目的で使用できる。
【０１０９】
尚、交互作用効果は、種々の統計的モデルを用いて推定できることに留意されたい。尚、上記手順は、多数の対立遺伝子及び／又は多数の遺伝子座を用いる場合に（例えば、式２０に全てのあり得る遺伝子型立体配置を含めることによって）容易に拡張できることにも留意されたい。
【０１１０】
実施例５：ＳＮＰの同定
核酸配列は、それが表１及び３、及び配列表に記載された多型を含む及び／又は多型に隣接する、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含む場合、本発明のＳＮＰを含む。あるいは、本発明のＳＮＰは、連続したヌクレオチドのより短い配列がウシゲノムにおいて独特である場合、表１及び３、及び配列表に記載された多型を含む又は多型に隣接する連続したヌクレオチドのより短い伸展によって同定されてもよい。ＳＮＰサイトは通常、中に多型サイトが含まれるコンセンサス配列、多型サイトの位置、及び多型サイトでの種々の対立遺伝子によって特徴付けられる。「コンセンサス配列」とは、アラインされた配列のクラスターの各ヌクレオチドの位置でコンセンサスとして構築されたＤＮＡ配列を意味する。そのようなクラスターは、遺伝子座での対立遺伝子におけるＳＮＰ及びＩｎｄｅｌ（挿入／欠失）多型を同定するためにしばしば使用される。コンセンサス配列は、遺伝子座でのどれかのＤＮＡ鎖に基づくことができ、遺伝子座における各ＳＮＰ対立遺伝子のどれか１つのヌクレオチド塩基及び遺伝子座における全てのＩｎｄｅｌのヌクレオチド塩基、又は退化コードを用いた両方のＳＮＰ対立遺伝子をいう（ＩＵＰＡＣコード：Ａ又はＣに対するＭ；Ａ又はＧに対するＲ；Ａ又はＴに対するＷ；Ｃ又はＧに対するＳ；Ｃ又はＴに対するＹ；Ｇ又はＴに対するＫ；Ａ又はＣ又はＧに対するＶ；Ａ又はＣ又はＴに対するＨ；Ａ又はＧ又はＴに対するＤ；Ｃ又はＧ又はＴに対するＢ；Ａ又はＣ又はＧ又はＴに対するＮ；我々が使用する追加コードは、“−”又はＡに対するＩ；“−”又はＣに対するＯ；“−” 又はＧに対するＥ；“−”又はＴに対するＬを含む；ここで“−”は欠失を意味する）。このように、コンセンサス配列は実際のＤＮＡ配列のコピーではないかもしれないが、コンセンサス配列は、遺伝子座における実際の多型のプライマー及びプローブを精密に設計するために有用である。
【０１１１】
そのようなＳＮＰは、多型を含む又は多型に隣接する動物のＤＮＡのセグメントのいずれかの鎖において同じ数のヌクレオチドの配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の、又は更により好ましくはいくつかの対立遺伝子に対して少なくとも９８％の、そして多くの場合少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を有する。動物のＤＮＡのそのようなセグメントの１つの鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１から配列番号１７５から成るグループおける配列において見出され得る。少なくともいくつかの対立遺伝子にとって、多型サイトそれ自体では全く同一性がないことは、多型の本質によって当然のことと理解される。従って、配列同一性は、多型配列を除いた配列について定めることができる。各遺伝子座における多型は表１及び３中に記載されている。
【０１１２】
以下に互いに一致する公開されたウシＳＮＰの例を示す：
ＳＮＰss38333809とss38333810は、各配列からの４１の塩基（中央で多型サイトを有する）が互いに完全に一致するために、同一であると決定された（長さ＝４１、同一性＝１００％、で一致）。
【化１】
2010538643.tif 000023
【０１１３】
ＳＮＰss38333809とss38334335は、各配列からの４１の塩基（中央で多型サイトを有する）が、１つの塩基を除く全ての塩基で互いに完全に一致するために、同一であると決定された（長さ＝４１、同一性＝９７％、で一致）。
【化２】
2010538643.tif 000024
【０１１４】
実施例６：生産形質の定量及びそれに対する遺伝評価
生産形質の定量は、各搾乳での又は一定の時間間隔のみにおける雌牛の乳及び乳組成を測定することによって達成できる。ＵＳＤＡ収量評価においては、乳生産データはＩＣＡＲで承認されている方法を用いてDairy Herd Improvement Associations (DHIA)によって集められる。遺伝的評価には、公知の種雄牛と共に全ての雌牛及び１９６０年以降における最初の分娩、及び誕生年が１９５０年以降の血統が含まれる。３０５日未満の泌乳は、３０５日まで延長される。全ての記録は、分娩時の年齢、分娩の月、１日当たりの搾乳回数、オープン前日数（previous days open）、及び異質分散の効果に対して事前調整される。遺伝評価は、単一形質ＢＬＵＰ再現性モデルを用いて行なわれる。本モデルには、管理グループ（群×年×季節プラス登録状態）、出産歴×年齢、及び近親交配の固定効果、並びに種雄牛交互作用による永続的環境及び群のランダム効果が含まれる。ＰＴＡは１年に４回（２月、５月、８月及び１１月）推定されて公表される。ＰＴＡは５年のステップワイズベースと比較して、つまり、２０００年に生まれた全ての雌牛の平均からの差として計算される。雄牛のＰＴＡは、有効な泌乳記録を有する少なくとも１０頭の娘牛を有する雄牛について娘牛性能を推定して公表される。
【０１１５】
実施例７：娘牛（雌牛）及び種雄牛のＰＴＡにおける繁殖形質の定量
分娩の容易さ（ＣＥ）、死産（ＳＢ）の発生及び娘牛妊娠率（ＤＰＲ）などの繁殖能力の定量及び遺伝評価。分娩の容易さは、容易に分娩する特定の雌牛（娘牛）の能力の尺度である。ＣＥは所有者によって１から５の尺度で採点される：１は何の問題も生じない又は観察されない出産を意味し、そして５は非常に困難であることを意味する。種雄牛のＣＥ  ＰＴＡは、初産の娘若雌牛における困難な出産のパーセント（％ＤＢＨ）として表示され、ここで困難な出産は、かなりの力が必要又は非常に困難として採点されるものである（５点尺度で４又は５）。ＳＢは、所有者によって１から３の尺度で採点され、１は子牛が生きて生まれそして分娩後４８時間生きたことを意味し、２は子牛が死産したことを意味し、そして３は子牛が生きて生まれたが分娩後４８時間以内に死んだことを意味する。ＳＢスコアの２と３は、評価用には組み合わされて１つの範疇にされる。種雄牛についてのＳＢ  ＰＴＡは娘若雌牛における死産のパーセント（％ＳＢＨ）として表示され、ここで死産した仔牛は、出産時点で死んでいた、又は生きて生まれたが生まれて４８時間以内に死んだとして採点されるものである（３点尺度で２又は３）。妊娠率は、分娩と成功裏の育種間の日数であるオープン日数の関数である。ＤＰＲは、各２１日期間中に妊娠する非妊娠雌牛（娘牛）のパーセントとして定義される。ＤＰＲ  ＰＴＡが「１」ということは、この雄牛からの娘牛が、その発情同期中に、ゼロのＤＰＲ  ＰＴＡを有する雄牛よりも１％より多く妊娠し易いことを意味する。
【０１１６】
実施例８：生産寿命（ＰＬ）の定量及びそれに対する遺伝評価
生産寿命（ＰＬ）は、自発的な又はやむを得ない淘汰（健康又は不妊問題による）、又は死亡によって除外される前に、雌牛が搾乳群において留まる期間の長さとして定義される。ＰＬは通常、最初の分娩からその雌牛が群れを出る（死亡、淘汰又は非搾乳目的での売却のため）までの日数、月数、又は泌乳日数（ＤＩＭ）として測定される。幾頭かの牛はデータ収集の時点でまだ生きているため、それらの記録は見積られ（VanRaden, P.M. and E.J.H. Klaaskate. 1993）又は打ち切りとして取り扱われる（Ducroc、987）。ＰＬに関するＵＳＤＡの遺伝評価は、１９６０年以降に最初に分娩した（血統に対しては１９５０年以降に生まれた）、全ての雌牛を含む。有効な種雄牛ＩＤ及び最初の泌乳記録を有する、評価の少なくとも３年前に生まれた雌牛は考慮される。ＰＬは７歳で完了されるとみなされる。まだ生きていて、搾乳目的で売却され、又はその群の検定が中止されたために、７歳に達する機会がもたなかった雌牛に対しては、記録が延長される。搾乳目的で売却された又は検定を中止した群れ中の雌牛に対しては、もしそれらが３歳に達する機会を有したならば、記録の延長扱いを受ける；その他の場合はそれらの記録は廃棄される。遺伝評価の方法は、単一形質ＢＬＵＰ動物モデルである。統計的モデルには管理グループ（最初の泌乳及び出産日の群に基づく）、及び群交互作用による種雄牛の効果が含まれる。ＰＬについての種雄牛のＰＴＡは、５年段階のベースで比較して、つまり、２０００年に生まれた全ての雌牛の平均ＰＬからの差として計算される。
【０１１７】
実施例９：娘牛（雌牛）及び種雄牛のＰＴＡにおける体細胞スコアの定量
体細胞スコア（ＳＣＳ）の定量は、ｌｏｇ2 （ＳＣＣ／１００，０００）＋３を計算することによって達成され、ここでＳＣＣは雌牛（娘牛）１ミリリッターの乳あたりの体細胞数である。種雄牛についてのＳＣＳ  ＰＴＡはゼロのＳＣＳ  ＰＴＡからの偏差として表される。
【０１１８】
実施例１０：候補遺伝子内のＳＮＰの新規関連の発見
動物サンプル及び遺伝子型決定。この研究用に資源集団を形成するために、ＮＡＡＢコードを有する合計で３１４５頭のホルスタイン雄牛がＵＳＤＡ  ＡＩＰＬウエブサイト（http://aipl.arsusda.gov）からダウンロードされた。１０個の候補遺伝子（レプチン、poulF1、κカゼイン、オステオポンチン、ベータ２−アドレナリン受容体、成長ホルモン受容体、プロティナーゼ阻害因子、乳がん耐性蛋白質、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ）から合計で２２のＳＮＰ（一塩基多型）について、ＡＢＩ  Ｔａｑｍａｎプラットホームを用いて内部で、又は種々の化学薬品を用いて外部で（Genaissance Pharmaceuticals, Inc., New Haven, CT）、遺伝子型が決定された。
【０１１９】
この研究において使用された全てのＳＮＰは二つの対立遺伝子を有し、その結果、各ＳＮＰ（二つのホモ接合体及び１つのヘテロ接合体）について合計で３つの順序付けられていない遺伝子型が得られた。もし３００頭未満の雄牛が、マイナーな対立遺伝子についてホモ接合であれば、複合遺伝子型（遺伝子型ｉｉｉｊは遺伝子型ｉｉ及びｊｊの両者に対して表示される）を形成するために、マイナーな対立遺伝子ホモ接合体クラスをヘテロ接合体と合体できるが、又は解析から除外する。その結果、解析は、元の遺伝子型、複合遺伝子型、及び最も少ない頻度の遺伝子型を有する雄牛の数が３００頭より小さい場合にはその最も少ない頻度の遺伝子型を除外するデータを用いて行なうことができる。
【０１２０】
形質表現型の事前調整。解析された形質には搾乳量 （“ＭＩＬＫ”）（ポンド）、脂肪収量（“ＦＡＴ”）（ポンド）、脂肪パーセント（“ＦＡＴＰＣＴ”）（パーセント）、生産寿命  （“ＰＬ”）（月）、体細胞スコア（“ＳＣＳ”）（Ｌｏｇ）、娘牛妊娠率（“ＤＰＲ”）（パーセント）、蛋白質収量（“ＰＲＯＴ”）（ポンド）、蛋白質パーセント（“ＰＲＯＴＰＣＴ”）（パーセント）、及び正味メリット（“ＮＭ”）（ドル）が含まれる。これらの形質は限性であり、従ってこれらの形質の遺伝的メリットはＰＴＡ（予測伝達能力）として定義され、そして全ての血族の表現型を用いて推定された。この評価において使用される形質、遺伝評価手順、及び遺伝パラメーターの詳細な記述がＵＳＤＡのＡＩＰＬウエブサイト（www.aipl.arsusda.gov）にて見出すことができる。この研究において評価された乳形質が独立したものではないと注記することは意味がある。
【０１２１】
後代検定データを有する全ての雄牛のＰＴＡデータは、２００５年１１月にＡＩＰＬサイトで公表されたＵＳＤＡの評価からダウンロードされた。ＰＴＡデータは以下の二つのモデルを用いて解析された：
【数２２】
2010538643.tif 000025
ここで、 yi (yij) は、ｉ番目の雄牛のＰＴＡ（ｉ番目の種雄牛のｊ番目の息牛のＰＴＡ）であり；ｓiはｉ番目の種雄牛の効果であり；（ＳＰＴＡ）iは、全サンプルのｉ番目の雄牛の種雄牛のＰＴＡであり；μは集団平均であり；ＰＴＡｄi（ＰＴＡｄij）は  残差雄牛ＰＴＡである。
式２６は種雄牛モデルと称され、ここで種雄牛が固定因子として当てはめられた。後代検定された息牛が１０頭未満である種雄牛に対しては、それらの種雄牛は式２６における息牛の生まれた年で代替された。式２７はＳＰＴＡモデルと称され、ここでは種雄牛のＰＴＡが共変量として当てはめられる。残差ＰＴＡ（ＰＴＡｄi又はＰＴＡｄij）はＳＡＳ
ＰＲＯＣＧＬＭ手順を用いて推定され、そしてこの研究における更なる候補遺伝子解析のために使用された。
【０１２２】
候補遺伝子の解析。各乳形質のＳＮＰと残差ＰＴＡ間の関連が、以下の線形モデルを用いて解析された：
【数２３】
2010538643.tif 000026
ここで、ＰＴＡｄkは、種雄牛モデルの下、式２６において定義される通りのｉ番目の雄牛の事前に調整されたＰＴＡであり、そしてＳＰＴＡモデルの下、式２７において定義される通りのＰＴＡｄiで置き換えることができる；ｘiはｉ番目の雄牛が有する特定のＳＮＰ対立遺伝子のコピー数であり、そしてβ2はｘiに対する回帰係数であり；ｎgは順序付けられていない遺伝子型の数であり；ｅiは残差効果であり；βkは以下の如く定義される遺伝子型指標Ｉikの効果である：
【数２４】
2010538643.tif 000027
【０１２３】
全体の解析は二つの工程からなる。ＵＳＤＡ（式２６及び２７）によって評価された全ての雄牛を用いて、元のＰＴＡデータが最初に事前調節され、そしてＳＮＰと形質間の統計的関連について、事前調節されたＰＴＡが式２８及び２９を用いて解析された。式２６及び２８、２６及び２９、２７及び２８並びに２７及び２９の組み合わせを、種雄牛＿対立遺伝子、雄牛＿遺伝子型、ＳＰＴＡ＿対立遺伝子、ＳＰＴＡ＿遺伝子型モデルと、それぞれ言及した。
【０１２４】
形質に関するＳＮＰの効果が、相加（＝（Ｇii−Ｇjj）／２）、優性（＝Ｇij−（Ｇii−Ｇjj）／２）、又は二つの遺伝子型間の差（Ｇij−Ｇjj）によって記述され、ここでｉ及びｊはＳＮＰの二つの対立遺伝子を示し、そしてＧjjは、遺伝子型ｉｊの平均を表す。
【０１２５】
この解析の結果を表１及び配列表において示す。形質に対する略号には以下のものが含まれる：妊娠率（ＰＲ）、娘牛妊娠率（ＤＰＲ）、生産寿命（ＰＬ）、体細胞数（ＳＣＣ）、及び体細胞スコア（ＳＣＳ）を含む適応度形質；全搾乳量 （ＭＹ）、乳脂肪率（ＦＰ）、乳脂肪量（ＦＹ）、乳蛋白質率（ＰＰ）、乳蛋白質量（ＰＹ）、全寿命生産（ＰＬ）；及び正味メリット（ＮＭ）を含む生産性形質。
【０１２６】
【表１】
2010538643.tif 000028
【０１２７】
【表２】
2010538643.tif 000029
【０１２８】
【表３】
2010538643.tif 000030
【０１２９】
実施例１１：ＣＡＴＳＰＥＲ、ＣＤ１４、ＩＧＦ２Ｒ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＲＣＮ３、ＲＩＭ２及びＴＬＥ４遺伝子における新規マーカーの検出、及び乳生産性形質との関連
全てのウシ染色体に対して、乳生産性形質の定量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）を同定するために、３０００頭のホルスタイン雄牛を用いて全ゲノム走査を行なった。この発明は染色体ＢＴＡ０７（ＣＤ１４）、ＢＴＡ０８（ＴＬＥ４）ＢＴＡ０９（ＩＧＦ２Ｒ）、ＢＴＡ１４（ＲＩＭ２）、ＢＴＡ１７（ＬＩＦ、ＯＳＭ）、ＢＴＡ１８（ＲＣＮ３）、及びＢＴＡ２９（ＣＡＴＳＰＥＲ）上のＱＴＬ（及び選択された候補遺伝子）に関する。乳生産性形質に関連することが見出された全ゲノム走査において使用されたＳＮＰの隣接配列が、公開されたウシゲノム配列アセンブリーに対するＢＬＡＳＴに使用された。遺伝子は、ＱＴＬのＳＮＰ位置の近位及び遠位（約５ｃＭ以内）で同定され、そして推定される機能を決定するために研究された。染色体 ＢＴＡ０７、ＢＴＡ０８、ＢＴＡ０９、ＢＴＡ１４、ＢＴＡ１７、ＢＴＡ１８及びＢＴＡ２９上の選択されたＱＴＬについて、候補遺伝子ＣＤ１４、ＴＬＥ４、ＩＧＦ２Ｒ、ＲＩＭ２、ＬＩＦ及びＯＳＭ、ＲＣＮ３及びＣＡＴＳＰＥＲをそれぞれ新規マーカーの検出のために選択した。遺伝子及びＮＣ
ＢＩ遺伝子ＩＤ番号が下表２（www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=Gene）に示されている。
【０１３０】
【表４】
2010538643.tif 000031
【０１３１】
全ゲノム走査に対して使用された３０００頭から選抜された、合計で２３頭のホルスタイン雄牛を、候補遺伝子の配列決定をし、そして２３の全てのサンプルの間のフォワード及びリバース鎖配列を比較することによって、新規遺伝マーカー（ＳＮＰ及び挿入−欠失、又はＩＮＤＥＬ）を同定するための検出パネルとして使用した。全てのホルスタインのＤＮＡが、標準プロトコールを用いて精液から抽出された。配列決定のための遺伝子のコード領域及び調節領域を含むＤＮＡ断片を増幅するために標準的なラボ用ＰＣＲを使用した。標準的な直接ＰＣＲ生産配列決定をＡＢＩ３７３０ｘｌ、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Applied Biosystems, Foster City, CA）で実行し、そして解明した。
【０１３２】
関連解析を実行するために、１０８頭の追加ホルスタイン（全ゲノム走査に使用された３０００頭から選ばれた８８頭と共に、１０８頭の動物パネルに対して独特な２０頭）のパネルに関する配列決定によって、２３頭のホルスタインのパネルを用いて候補遺伝子で検出された遺伝マーカーの遺伝子型を決定した。１０８頭の動物パネルの遺伝子型を、遺伝マーカー当たり合計で１３１個の遺伝子型の２３の動物検出パネルからの遺伝子型と組み合わせた。関連解析が前述のように実行された。
【０１３３】
この実験により、ＣＤ１４、ＴＬＥ４、ＩＧＦ２Ｒ、ＲＩＭ２、ＬＩＦ及びＯＳＭ、ＲＣＮ３、及びＣＡＴＳＰＥＲの中及び周囲に関連有りと確認された番号、並びに多くの数のＳＮＰの同定が得られた。関連研究の結果が、更に表１及び配列表に記載されており、そして新規多型が表３及び配列表に同定されている。各々の場合、各多型についての位置、長さ及び対立遺伝子に関する詳細が表４に述べられている。
【０１３４】
【表５】
2010538643.tif 000032
【０１３５】
【表６】
2010538643.tif 000033
【０１３６】
【表７】
2010538643.tif 000034
【０１３７】
【表８】
2010538643.tif 000035
【０１３８】
【表９】
2010538643.tif 000036
【０１３９】
【表１０】
2010538643.tif 000037
【０１４０】
【表１１】
2010538643.tif 000038
【０１４１】
【表１２】
2010538643.tif 000039
【０１４２】
【表１３】
2010538643.tif 000040
【０１４３】
【表１４】
2010538643.tif 000041
【０１４４】
【表１５】
2010538643.tif 000042
【０１４５】
【表１６】
2010538643.tif 000043
【０１４６】
参考文献
前記及び下記の両方で、この出願において引用された参考文献は、参照することにより特に本明細書に組み込まれているものとする。
【０１４７】
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【０１４８】
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【表１７】
2010538643.tif 000044
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