(57)【要約】腫瘍関連マクロファージの活性を標的とした治療を伴う癌の治療方法が提供される。腫瘍関連マクロファージ及び脂肪組織マクロファージを用いた治療を伴う癌、炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療方法もまた提供される。【選択図】図１７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞試料中の炎症関連組織マクロファージ（ＩＲＴＭ）を同定する方法であって、細胞試料を、少なくとも１つのマクロファージに特異的な細胞表面マーカーを特異的に認識する第１の薬剤及び少なくとも１つの樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーを特異的に認識する第２の薬剤と接触させ、少なくとも１つの第１の薬剤及び少なくとも１つの第２の薬剤の両方に認識される細胞の存在を決定することを含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの第１の薬剤及び／又は少なくとも１つの第２の薬剤が、マクロファージに特異的な細胞表面マーカー又は樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの第１の薬剤及び／又は少なくとも１つの第２の薬剤が、抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの第１の薬剤及び／又は少なくとも１つの第２の薬剤が同じ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記分子が、二重特異性抗体、三重特異性抗体、３より多い異なる特異性を有する抗体及び記載される抗体の抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記マクロファージに特異的な細胞表面マーカーが、Ｆ４／８０である、請求項１の方法。
【請求項７】
前記樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーが、ＣＤ１１ｃである、請求項１の方法。
【請求項８】
前記ＩＲＴＭが腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＩＲＴＭが脂肪組織マクロファージ（ＡＴＭ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの第１の薬剤及び少なくとも１つの第２の薬剤の両方に認識される細胞の存在を決定することが、免疫組織化学、蛍光標識細胞分取、磁気細胞分離、アフィニティークロマトグラフィ、ＦＩＳＨ及び免疫顕微鏡法から選択される方法の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞試料が腫瘍試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＴＡＭ又はＡＴＭを細胞の混合物から単離する方法であって、（ａ）細胞試料を、少なくとも１つのマクロファージに特異的な細胞表面マーカーを特異的に認識する第１の薬剤及び少なくとも１つの樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーを特異的に認識する第２の薬剤と接触させ、（ｂ）少なくとも１つの第１の薬剤及び少なくとも１つの第２の薬剤の両方に認識される細胞を単離することを含む、方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの第１の薬剤及び／又は少なくとも１つの第２の薬剤が、マクロファージに特異的な細胞表面マーカー又は樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの第１の薬剤及び／又は少なくとも１つの第２の薬剤が、抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの第１の薬剤及び／又は少なくとも１つの第２の薬剤が同じ分子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記分子が、二重特異性抗体、三重特異性抗体、３より多い異なる特異性を有する抗体及び記載される抗体の抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記マクロファージに特異的な細胞表面マーカーが、Ｆ４／８０である、請求項１２の方法。
【請求項１８】
前記樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーが、ＣＤ１１ｃである、請求項１２の方法。
【請求項１９】
前記単離するステップが、ＦＡＣＳ、アフィニティークロマトグラフィ、及び磁気細胞分離の少なくとも１つを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
対象の増殖性疾患を診断する方法であって、対象におけるＴＡＭの存在及び／又は活性を決定することを含む、方法。
【請求項２１】
前記決定するステップが、少なくとも１つのマクロファージに特異的な細胞表面マーカーを特異的に認識する第１の薬剤及び少なくとも１つの樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーを特異的に認識する第２の薬剤と接触させ、少なくとも１つの第１の薬剤及び少なくとも１つの第２の薬剤の両方に認識される細胞の存在を決定することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記増殖性疾患が乳癌である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの第１の薬剤及び／又は少なくとも１つの第２の薬剤が、マクロファージに特異的な細胞表面マーカー又は樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの第１の薬剤及び／又は少なくとも１つの第２の薬剤が、抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの第１の薬剤及び／又は少なくとも１つの第２の薬剤が同じ分子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記分子が、二重特異性抗体、三重特異性抗体、３より多い異なる特異性を有する抗体及び記載される抗体の抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記マクロファージに特異的な細胞表面マーカーが、Ｆ４／８０である、請求項２１の方法。
【請求項２８】
前記樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーが、ＣＤ１１ｃである、請求項２１の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの第１の薬剤及び少なくとも１つの第２の薬剤の両方に認識される細胞の存在を決定することが、免疫組織化学、蛍光標識細胞分取、磁気細胞分離、アフィニティークロマトグラフィ、ＦＩＳＨ及び免疫顕微鏡法から選択される方法の少なくとも１つを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
対象における腫瘍を段階分けする方法であって、対象におけるＴＡＭの存在及び／又は活性を決定することを含む、方法。
【請求項３１】
前記決定するステップが、少なくとも１つのマクロファージに特異的な細胞表面マーカーを特異的に認識する第１の薬剤及び少なくとも１つの樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーを特異的に認識する第２の薬剤と接触させ、少なくとも１つの第１の薬剤及び少なくとも１つの第２の薬剤の両方に認識される細胞の存在を決定することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記増殖性疾患が乳癌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの第１の薬剤及び／又は少なくとも１つの第２の薬剤が、マクロファージに特異的な細胞表面マーカー又は樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの第１の薬剤及び／又は少なくとも１つの第２の薬剤が、抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの第１の薬剤及び／又は少なくとも１つの第２の薬剤が同じ分子である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記分子が、二重特異性抗体、三重特異性抗体、３より多い異なる特異性を有する抗体及び記載される抗体の抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記マクロファージに特異的な細胞表面マーカーが、Ｆ４／８０である、請求項３１の方法。
【請求項３８】
前記樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーが、ＣＤ１１ｃである、請求項３１の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの第１の薬剤及び少なくとも１つの第２の薬剤の両方に認識される細胞の存在を決定することが、免疫組織化学、蛍光標識細胞分取、磁気細胞分離、アフィニティークロマトグラフィ、ＦＩＳＨ及び免疫顕微鏡法から選択される方法の少なくとも１つを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記決定するステップが、対象から得られた細胞の試料を、集団的に、特異的にＴＡＭに発現する２又はそれ以上の細胞表面受容体を認識する１又は複数の薬剤と接触させ、１又は複数の薬剤に認識された細胞を同定することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
ＴＡＭの生存度又は活性を調節することを含む、対象における腫瘍を治療する方法。
【請求項４２】
ＴＡＭの生存度又は活性の調節が、腫瘍細胞集団又は腫瘍試料からのＴＡＭの選択的除去を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＴＡＭの選択的除去が、（ａ）前記集団又は試料とＴＡＭ結合剤と接触させ、（ｂ）前記ＴＡＭ結合剤に特異的に結合する細胞を前記集団又は試料から選択的に除去することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＴＡＭ結合剤が少なくとも１つの抗体を含み、前記選択的に除去するステップが抗体媒介クリアランス、プロテインＡクロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ、ＦＡＣＳ及び磁気細胞分離から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＴＡＭの生存度及び活性の調節が、腫瘍細胞集団又は腫瘍試料中のＴＡＭを選択的に死滅させることを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
ＴＡＭの選択的な死滅が、（ａ）前記集団又は試料とＴＡＭ結合剤と接触させ、（ｂ）前記ＴＡＭ結合剤に特異的に結合する細胞を前記集団又は試料から選択的に死滅させることを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＴＡＭ結合剤が、少なくとも１つの抗体を含み、前記選択的に死滅させるステップが補体媒介性細胞障害性である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＴＡＭ結合剤が、少なくとも１つの抗体を含み、前記選択的に死滅させるステップが抗体にコンジュゲートした細胞障害性分子に媒介される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
ＴＡＭの生存度又は活性の調節が、腫瘍細胞集団又は腫瘍試料中のＴＡＭの活性を阻害することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
ＴＡＭの活性の阻害が、前記集団又は試料における一又は複数のＴＡＭ分泌サイトカイン又はＴＡＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の阻害を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＴＡＭ分泌サイトカインがＴＧＦβである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
一又は複数のＴＡＭ分泌サイトカイン又はＴＡＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の阻害が、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤の投与を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤が、サイトカイン／ケモカインの活性を阻害する抗体又はその抗原結合フラグメント、サイトカイン又はケモカインに特異的な受容体又は小分子から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
一又は複数のＴＡＭ分泌サイトカイン又はＴＡＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の阻害が、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアンタゴニストの投与を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象がヒト被験者である、請求項４１ないし５４の何れか一項に記載される方法。
【請求項５６】
化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、抗血管新生剤、免疫抑制剤、細胞障害剤、抗炎症剤及び増殖阻害剤からなる群から選択される１又は複数の付加的な治療剤の同時投与又は連続投与をさらに含む、請求項４３、４４及び４６−５５の何れか一項に記載の方法。
【請求項５７】
ＴＡＭの生存度又は活性を調節することを含む、対象の自己免疫疾患を治療する方法。
【請求項５８】
ＴＡＭの生存度又は活性の調節がＴＡＭの活性の刺激を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ＴＡＭの活性の刺激が、ＴＡＭアゴニスト及びＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアゴニストからなる群から選択される１又は複数の化合物の投与を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ＴＡＭの活性の刺激が、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋制御Ｔ細胞、ＩＬ１０＋ＣＤ４＋制御Ｔ細胞及び炎症性ＴＨ１７細胞の少なくとも一つの誘導を生じる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
対象がヒト被験者である、請求項５７ないし６０の何れか一項に記載の方法。
【請求項６２】
化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、抗血管新生剤、免疫抑制剤、細胞障害剤、抗炎症剤及び増殖阻害剤からなる群から選択される１又は複数の付加的な治療剤の同時投与又は連続投与をさらに含む、請求項５９ないし６１の何れか一項に記載の方法。
【請求項６３】
ＴＡＭの生存度又は活性を調節することを含む、対象の免疫寛容導入を阻害する方法。
【請求項６４】
ＴＡＭの生存度又は活性の調節が、ＴＡＭの選択的除去を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ＴＡＭの選択的除去が、（ａ）ＴＡＭ結合剤を投与し、（ｂ）前記ＴＡＭ結合剤に特異的に結合する細胞を前記集団又は試料から選択的に除去することを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＴＡＭ結合剤が少なくとも１つの抗体を含み、前記選択的に除去するステップが抗体媒介クリアランスである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ＴＡＭの生存度及び活性の調節が、腫瘍細胞集団又は腫瘍試料中のＴＡＭを選択的に死滅させることを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
ＴＡＭの選択的な死滅が、（ａ）ＴＡＭ結合剤を投与し、（ｂ）前記ＴＡＭ結合剤に特異的に結合する細胞を選択的に死滅させることを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＴＡＭ結合剤が、少なくとも１つの抗体を含み、前記選択的に死滅させるステップが補体媒介性細胞障害である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＴＡＭ結合剤が、少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、前記選択的に死滅させるステップが抗体又はその抗原結合フラグメントにコンジュゲートした細胞障害性分子に媒介される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
ＴＡＭの生存度又は活性の調節が、腫瘍細胞集団又は腫瘍試料中のＴＡＭの活性を阻害することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項７２】
ＴＡＭの活性の阻害が、一又は複数のＴＡＭ分泌サイトカイン又はＴＡＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の阻害を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＴＡＭ分泌サイトカインがＴＧＦβである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
一又は複数のＴＡＭ分泌サイトカイン又はＴＡＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の阻害が、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤の投与を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤が、サイトカイン／ケモカインの活性を阻害する抗体又はその抗原結合フラグメント、サイトカイン又はケモカインに特異的な受容体又は小分子から選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
一又は複数のＴＡＭ分泌サイトカイン又はＴＡＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の阻害が、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアンタゴニストの投与を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記対象がヒト被験者である、請求項６３ないし７６の何れか一項に記載される方法。
【請求項７８】
化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、抗血管新生剤、免疫抑制剤、細胞障害剤、抗炎症剤及び増殖阻害剤からなる群から選択される１又は複数の付加的な治療剤の同時投与又は連続投与をさらに含む、請求項６３ないし７７の何れか一項に記載の方法。
【請求項７９】
ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋制御Ｔ細胞、ＩＬ１０＋ＣＤ４＋Ｔｒｌ細胞及び炎症性ＴＨ１７細胞の少なくとも一つの成長及び／又は増殖を選択的に誘導する方法であって、ＴＡＭをｎａiｖｅＴ細胞に投与する、もしくは正常な細胞増殖に適した条件下でｎａiｖｅＴ細胞をＴＡＭに暴露させることを含む、方法。
【請求項８０】
ＴＡＭアゴニスト及びＴＡＭ−分泌サイトカイン／ケモカインのアゴニストからなる群から選択される一つ以上の化合物を投与することをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
誘導されたＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋制御Ｔ細胞、ＩＬ１０＋ＣＤ４＋Ｔｒｌ細胞及び／又は炎症性ＴＨ１７細胞を単離することをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
ＩＲＴＭの生存度又は活性を調節することを含む、対象における炎症性疾患を治療する方法。
【請求項８３】
ＩＲＴＭの生存度又は活性の調節が、ＩＲＴＭの活性を刺激することを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
ＩＲＴＭの活性を刺激することが、ＩＲＴＭアゴニスト及びＩＲＴＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアゴニストからなる群から選択される１又は複数の化合物の投与を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
ＩＲＴＭの活性を刺激することが、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋制御Ｔ細胞、ＩＬ１０＋ＣＤ４＋制御Ｔ細胞及び炎症性ＴＨ１７細胞の少なくとも１つの誘導を生じる、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記対象がヒト被験者である、請求項８２ないし８５の何れか一項に記載の方法。
【請求項８７】
サイトカイン、ケモカイン、細胞障害剤、抗炎症剤及び免疫抑制剤からなる群から選択される１又は複数の付加的な治療剤の同時投与又は連続投与をさらに含む、請求項８３ないし８５の何れか一項に記載の方法。
【請求項８８】
ＩＲＴＭの生存度又は活性の調節が、ＩＲＴＭの選択的除去を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８９】
ＩＲＴＭの選択的除去が、（ａ）ＩＲＴＭ結合剤を投与し、（ｂ）前記ＩＲＴＭ結合剤に特異的に結合する細胞を選択的に除去することを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＩＲＴＭ結合剤が、少なくとも１つの抗体を含み、前記選択的に除去するステップが抗体媒介クリアランスである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
ＩＲＴＭの生存度又は活性の調節が、ＩＲＴＭの選択的死滅を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項９２】
ＩＲＴＭの選択的死滅が、（ａ）ＩＲＴＭ結合剤を投与し、（ｂ）前記ＩＲＴＭ結合剤に特異的に結合する細胞を選択的に死滅させることを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＩＲＴＭ結合剤が、少なくとも１つの抗体を含み、前記選択的に死滅させるステップが補体媒介性細胞障害である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＩＲＴＭ結合剤が、少なくとも１つの抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、前記選択的に死滅させるステップが抗体又はその抗原結合フラグメントにコンジュゲートした細胞障害性分子に媒介される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
ＩＲＴＭの生存度又は活性の調節が、ＩＲＴＭの活性を阻害することを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項９６】
ＩＲＴＭの活性の阻害が、一又は複数のＩＲＴＭ分泌サイトカイン又はＩＲＴＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の阻害を含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記ＩＲＴＭ分泌サイトカインがＴＧＦβである、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
一又は複数のＩＲＴＭ分泌サイトカイン又はＩＲＴＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の阻害が、ＩＲＴＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤の投与を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＩＲＴＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤が、サイトカイン／ケモカインの活性を阻害する抗体又はその抗原結合フラグメント、サイトカイン又はケモカインに特異的な受容体又は小分子から選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
一又は複数のＩＲＴＭ分泌サイトカイン又はＩＲＴＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の阻害が、ＩＲＴＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアンタゴニストの投与を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＩＲＴＭがＴＡＭ及びＡＴＭから選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項１０２】
前記対象がヒト被験者である、請求項８２ないし１０１の何れか一項に記載される方法。
【請求項１０３】
サイトカイン、ケモカイン、細胞障害剤、抗炎症剤及び免疫抑制剤からなる群から選択される１又は複数の付加的な治療剤の同時投与又は連続投与をさらに含む、請求項８２ないし１０１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋制御Ｔ細胞、ＩＬ１０＋ＣＤ４＋Ｔｒｌ細胞及び／又は炎症性ＴＨ１７細胞の少なくとも一つの成長及び／又は増殖を選択的に誘導する方法であって、正常な細胞増殖に適した条件下でｎａiｖｅＴ細胞をＴＡＭ及び／又はＡＴＭに暴露させることを含む、方法。
【請求項１０５】
ＴＡＭアゴニスト、ＡＴＭアゴニスト、ＴＡＭ−分泌サイトカイン／ケモカインのアゴニスト及びＡＴＭ−分泌サイトカイン／ケモカインのアゴニストからなる群から選択される１又は複数の化合物を投与することをさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
誘導されたＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋制御Ｔ細胞、ＩＬ１０＋ＣＤ４＋Ｔｒｌ細胞又は炎症性ＴＨ１７細胞を単離することをさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、３７ＣＦＲ１．５３（ｂ）（１）の下の非仮出願であり、３５ＵＳＣ１１９（ｅ）の下で、２００７年７月１３日に出願された仮出願番号第６０／９５９，７２６号及び２００７年１１月１６日に出願された仮出願番号第６１／００３４９９号の優先権を主張し、その内容は本願明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は腫瘍増殖の分野に関する。本発明は、腫瘍関連マクロファージの活性及び特徴、並びに癌及び腫瘍増殖の診断及び治療のためのこの使用に関する。本発明は、自己免疫及び炎症性疾患を治療するための免疫学及び腫瘍関連マクロファージ及び脂肪組織マクロファージの活性及び特徴の使用にも関する。
【０００３】
（背景）
心疾患に次いで、悪性腫瘍（癌）は米国の主要な死因である。癌は、腫瘍質量を形成するために増殖する正常組織に由来される異常又は腫瘍性の細胞数の増加、これらの腫瘍性の腫瘍細胞の隣接組織の浸潤、及び最終的に血液又はリンパ系を経て局部リンパ節まで、及び転移と呼ばれるプロセスにより遠い部位まで広がる悪性細胞の生成によって特徴づけられる。癌性の状態では、細胞は正常細胞が増殖しない条件下で増殖する。癌は、異なる侵襲性及び悪性度の程度によって特徴づけられる多種多様な形で現れる。
【０００４】
ヒト腫瘍には、悪性及び非悪性細胞が含まれる。この後者カテゴリは、間質の繊維芽細胞、内皮細胞及び白血球を含む。腫瘍関連マクロファージ（「ＴＡＭ」）は、大部分の固形腫瘍における白血球の浸透物の顕著な成分である。いくつかの場合では、ＴＡＭは全腫瘍質量の最高５０％を含むことができる（Kelly等、1988; O'Sullivan and Lewis 1994; Leek等、1994; Bingle等、2002）。乳癌及び他のヒト腫瘍のマクロファージ浸透物の高水準は、予後不良と相関していた。乳癌のマウスのモデルの分析は、ＴＡＭが腫瘍の増殖及び転移を促進するという見解を裏づける。例えば、乳癌の遺伝モデルにおけるＴＡＭ分化の抑制は腫瘍発達の速度を減少させ、肺の転移形成を激減させる（Lin等、2001）。  
ＴＡＭがヒト乳癌の増殖に寄与するという提唱された機構は、血管新生因子（例えば血管内皮増殖因子）の産生によるものである；ＴＡＭの高水準は乳房腫瘍内で増加した血管密度と相関していた（Leek等、1996; Lin等、2006）。ＴＡＭを含む骨髄系造血細胞は、直接的に血管新生因子を分泌することによって、又は間接的に細胞間マトリックス分解プロテアーゼを産生することによって、血管新生を刺激することが示され、次々に隔絶された血管由来の因子を放出する（Lewis, C.E. & Pollard, J.W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research 66:605-612 (2006);及びNaldini, A. & Carraro, F. Role of inflammatory mediators in angiogenesis. Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4:3-8 (2005)においてレビューされる）。骨髄性細胞系統の中で、腫瘍をもったマウスの脾臓から単離されるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋始原細胞は、腫瘍細胞を同時注入された場合、血管新生を促進し（Yang, L.等、Expansion of myeloid immune suppressor Gr+CD11b+ cells in tumor-bearing host directly promotes tumor angiogenesis. Cancer Cell 6:409-21 (2004)を参照）、腫瘍浸潤性マクロファージ数は、ヒト腫瘍の予後不良と相関がある。（Balkwill等、in Balkwill, F., Charles, K.A. & Mantovani, A. Smoldering and polarized inflammation in the initiation and promotion of malignant disease. Cancer Cell 7:211-7 (2005)においてレビューされる）。しかしながら、他の研究では、マクロファージはマウスの実験腫瘍の増殖を阻害し、抗癌治療としての可能性を示唆した。Kohchi, C.等、Utilization of macrophages in anticancer therapy: the macrophage network theory. Anticancer Res 24:3311-20 (2004)参照。  
ＴＡＭは、血管新生を促進することに加えて、炎症の促進、マトリックス・リモデリング、腫瘍細胞浸潤、血管内異物侵入及び遠い部位におけるシーディングによって腫瘍成長にも寄与している可能性が示唆された（Lewis等、2000; Lewis and Poloard 2006; Pollard 2004; Hiratsuka等、2002; Lin等、2001; Sica等、2006）。  
ＴＡＭは、腫瘍に由来するケモカインによって悪質組織へと補充される循環単核細胞に由来する。単核細胞は、用途の広さ及び可塑性によって区別されて及び、特異的な微小環境によって、種々の活性化段階でマクロファージに分化することができる。これらの活性化範囲は、２つの異なる極性状態、Ｍ１及びＭ２に操作上定められる。これらの状態がインビトロで定められたのに対して、組織マクロファージがＭ１及びＭ２の連続体として存在することが考えられる。炎症誘発性刺激及びＩ型サイトカインに偏った環境において、単核細胞は、炎症誘発性サイトカインを高水準で発現するＭ１マクロファージに分化して、Ｔｈ１免疫応答を促進し、細胞内寄生体への抵抗を媒介する。逆にいえば、ＩＩ型サイトカイン（すなわちＩＬ−４及びＩＬ−１３）が優勢である環境は、Ｍ２又は「栄養」マクロファージの生成を促進する。Ｍ２マクロファージは、免疫調節性であり、組織修復及びリモデリングを促進する。    
【０００５】
腫瘍の樹状細胞（ＤＣ）の成熟を阻害すると考えられているＩＬ−６、ＣＳＦ−１、ＩＬ−１０及びＴＧＦβ等の特定のサイトカインを分泌することにより、「栄養」Ｍ２としてのＴＡＭは、耐性を誘導するという間接的な役割を有することが提唱された（Mantovani等、2002; Pollard 2004）。ＤＣは、免疫応答を誘導及び制御する能力を有する専門の抗原提示細胞であって、通常組織の抗原捕捉の後に成熟する。それらはＭＨＣＩＩ発現及び共刺激分子を上方制御して、流入領域リンパ節へ移動し、強力なＴ細胞応答を誘導することができる。非炎症性条件下で（すなわち腫瘍組織において）抗原を捕捉するＤＣは、完全には成熟しておらず、したがって抗原提示が正常に機能しない。これらの未発達又は半成熟したＤＣは、共刺激タンパク質を低レベルでしか発現せず、免疫寛容原性反応を強化する調節Ｔリンパ球を潜在的に産生する（Steinman等、2003）。  
調節Ｔ細胞のいくつかのサブセットは、出現部位、表現型マーカーの発現及び抑制性機構に基づいて定められた。特に十分に特徴づけられたサブセットは、自然に発生する胸腺由来ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞である。この種の細胞は、ＦｏｘＰ３及びＧＩＴＲを高水準で発現し、細胞接触依存性のメカニズムによる免疫抑制を媒介する。第２のＣＤ４＋サブセット（Ｔｒ１細胞）は、末梢組織において誘導され、ＩＬ−１０及び／又はＴＧＦβの分泌を経て、接触非依存性の免疫抑制を媒介する。腫瘍の免疫応答の阻害における調節Ｔ細胞の重要性を裏づける証拠が増加している。いくつかの報告は、固形腫瘍における多くの調節ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（Leong等、2006; Liyanage等、2002）及びＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔｒ１細胞（Marshall等、2004; Seo等、2001）の存在を実証する。さらに、ヒト乳癌試料における高いレベルのＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、減少した全体の生残率と相関する（Curiel等、2004; Bates等、2006）。
腫瘍浸透物におけるＴ細胞の存在及び血管新生因子を産生するための潜在性にもかかわらず、腫瘍成長及び発達における役割は、不明なままである。ＴＡＭの生物学的機能及びそれらが産生する因子の発見及び理解へのニーズが存在する。以下の開示のレビューにより明らかなように、本発明はこれら及び他のニーズに対処するものである。
【０００６】
（発明の開示）
一実施態様において、本発明は、試料中の炎症関連組織マクロファージ（ＩＲＴＭ）を同定する方法であって、ＩＲＴＭ結合剤と試料を接触させること及びＩＲＴＭ結合剤が関連する一つ以上の細胞の存在を決定することを含む方法を提供する。一つの態様では、試料は組織試料である。別の態様において、試料はヒトである。別の態様において、ＩＲＴＭ結合剤は抗体又はその抗原結合性フラグメントである。別の態様において、ＩＲＴＭは腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）である。別の態様において、ＩＲＴＭは脂肪組織マクロファージ（ＡＴＭ）である。    
もう一つの実施態様では、本発明は、試料中の炎症関連組織マクロファージ（ＩＲＴＭ）を同定する方法であって、マクロファージに特異的な細胞表面マーカーを特異的に認識する少なくとも一つの第一の剤及び樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーを特異的に認識する少なくとも一つの第二の剤と試料を接触させること、及び少なくとも一つの第一の剤及び少なくとも一つの第二の剤によって認識される細胞の存在を決定することを含む方法を提供する。一つの態様では、少なくとも一つの第一の剤及び／又は少なくとも一つの第二の剤は、マクロファージに特異的な細胞表面マーカー又は樹状細胞に特異的な表面マーカーに結合する。そのような別の態様において、少なくとも一つの第一の剤及び／又は少なくとも一つの第二の剤は、抗体又はその抗原結合性フラグメントである。別の態様において、少なくとも一つの第一の剤及び少なくとも一つの第二の剤は、同じ分子である。別の態様において、分子は二重特異性抗体、三重特異性抗体、３以上の異なる特異性を有する抗体、及び記載された抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される。別の態様において、マクロファージに特異的な細胞表面マーカーは、Ｆ４／８０である。別の態様において、樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーは、ＣＤ１１ｃである。もう一つの態様において、少なくとも一つの第一の剤及び少なくとも一つの第二の剤によって認識される細胞の存在を決定することは、免疫組織化学、蛍光標識細胞分取、磁気細胞分離、アフィニティークロマトグラフィ、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション及び免疫顕微鏡法からなる群から選択される少なくとも一つの方法を有する。別の態様において、細胞試料は腫瘍試料である。別の態様において、ＩＲＴＭはＴＡＭである。別の態様において、ＩＲＴＭはＡＴＭである。
もう一つの実施態様において、本発明は細胞の混合物からＴＡＭを単離する方法であって、（ａ）マクロファージに特異的な細胞表面マーカーを特異的に認識する少なくとも一つの第一の剤及び樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーを特異的に認識する少なくとも一つの第二の剤を細胞試料と接触させること、及び（ｂ）少なくとも一つの第一の剤及び少なくとも一つの第二の剤によって認識される細胞を単離することを含む方法を提供する。一つの態様では、少なくとも一つの第一の剤及び／又は少なくとも一つの第二の剤は、マクロファージに特異的な細胞表面マーカー又は樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合する。別の態様において、少なくとも一つの第一の剤及び／又は少なくとも一つの第二の剤は、抗体又はその抗原結合性フラグメントである。別の態様において、少なくとも一つの第一の剤及び少なくとも一つの第二の剤は、同じ分子である。そのような別の態様において、分子は、二重特異性抗体、三重特異性抗体、３以上の異なる特異性を有する抗体及び記載された抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される。別の態様において、マクロファージに特異的な細胞表面マーカーは、Ｆ４／８０である。別の態様において、樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーは、ＣＤ１１ｃである。別の態様において、単離するステップは、蛍光標識細胞分取、アフィニティークロマトグラフィ及び磁気細胞分離の少なくとも一つを含む。
【０００７】
もう一つの実施態様では、本発明は、被検者における増殖性の疾患を診断する方法を提供し、被験者におけるＴＡＭの存在及び／又は活性を決定することを含む。一つの態様では、決定するステップは、マクロファージに特異的な細胞表面マーカーを特異的に認識する少なくとも一つの第一の剤及び樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーを特異的に認識する少なくとも一つの第二の剤と被検者から得た細胞試料を接触させること、及び少なくとも一つの第一の剤及び少なくとも一つの第二の剤によって認識される細胞を同定することを含む。別の態様において、増殖性の疾患は、乳癌である。別の態様において、少なくとも一つの第一の剤及び／又は少なくとも一つの第二の剤は、マクロファージに特異的な細胞表面マーカー又は樹状細胞に特異的な表面マーカーに特異的に結合する。そのような態様において、少なくとも一つの第一の剤及び／又は少なくとも一つの第二の剤は、抗体又はその抗原結合性フラグメントである。そのような別の態様において、少なくとも一つの第一の剤及び少なくとも一つの第二の剤は、同じ分子である。そのような別の態様において、分子は、二重特異性抗体、三重特異性抗体、３以上の異なる特異性を有する抗体及び記載された抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される。そのような別の態様において、マクロファージに特異的な細胞表面マーカーは、Ｆ４／８０である。そのような別の態様において、樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーは、ＣＤ１１ｃである。そのような別の態様において、同定するステップは、免疫組織化学、蛍光標識細胞分取、磁気細胞分離、アフィニティークロマトグラフィ、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション及び免疫顕微鏡法からなる群から選択される少なくとも一つの方法を含む。
もう一つの実施態様では、本発明は被検者における腫瘍を段階分けする方法を提供し、被検者におけるＴＡＭの存在及び／又は活性を決定することを含む。一つの態様では、決定するステップは、マクロファージに特異的な細胞表面マーカーを特異的に認識する少なくとも一つの第一の剤及び樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーを特異的に認識する少なくとも一つの第二の剤と被検者から得た細胞試料を接触させること、及び少なくとも一つの第一の剤及び少なくとも一つの第二の剤によって認識される細胞を同定することを含む。別の態様において、腫瘍は乳癌腫瘍である。別の態様においては少なくとも一つの第一の剤及び／又は少なくとも一つの第二の剤は、マクロファージに特異的な細胞表面マーカー又は樹状細胞に特異的な表面マーカーに特異的に結合する。そのような別の態様において、少なくとも一つの第一の剤及び／又は少なくとも一つの第二の剤は、抗体又はその抗原結合性フラグメントである。そのような別の態様において、少なくとも一つの第一の剤及び少なくとも一つの第二の剤は、同じ分子である。そのような別の態様において、分子は、二重特異性抗体、三重特異性抗体、３以上の異なる特異性を有する抗体及び記載された抗体の抗原結合性フラグメントからなる群から選択される。別の態様において、マクロファージに特異的な細胞表面マーカーは、Ｆ４／８０である。別の態様において、樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーは、ＣＤ１１ｃである。そのような別の態様において、同定するステップは、免疫組織化学、蛍光標識細胞分取、磁気細胞分離、アフィニティークロマトグラフィ、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション及び免疫顕微鏡法からなる群から選択される少なくとも一つの方法を含む。
【０００８】
もう一つの実施態様では、本発明は対象の腫瘍を治療する方法を提供し、ＴＡＭの生存度又は活性を調節することを含む。一つの態様では、ＴＡＭの生存度又は活性を調節することは、腫瘍細胞集団又は腫瘍試料からＴＡＭの選択的除去を含む。そのような態様において、ＴＡＭの選択的除去は、（ａ）ＴＡＭ結合剤と集団又は試料とを接触させること及び（ｂ）集団又は試料からＴＡＭ結合剤に特異的に結合するそれらの細胞を選択的に取り除くことを含む。そのような別の態様において、ＴＡＭ結合剤は少なくとも一つの抗体を含み、選択的除去ステップは、抗体媒介性クリアランス、プロテインＡクロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ、蛍光標識細胞分取及び磁気細胞分離から選択される。別の態様においては、ＴＡＭの生存度又は活性を調節することは、腫瘍細胞集団又は腫瘍試料中のＴＡＭを選択的に死滅させることを含む。そのような態様において、ＴＡＭを選択的に死滅させることは、（ａ）ＴＡＭ結合剤と集団又は試料とを接触させること及び（ｂ）集団又は試料から、ＴＡＭ結合剤に特異的に結合するそれらの細胞を選択的に死滅させることを含む。そのような別の態様において、ＴＡＭ結合剤は少なくとも一つの抗体を含み、選択的死滅ステップは補体媒介性細胞障害性である。そのような別の態様において、ＴＡＭ結合剤は少なくとも一つの抗体を含み、選択的死滅ステップは抗体に結合した細胞障害性分子によって媒介される。別の態様において、ＴＡＭの生存度又は活性を調節することは、腫瘍細胞集団又は腫瘍試料中でＴＡＭの活性を抑制することを含む。そのような態様において、ＴＡＭの活性の抑制は、集団又は試料における一つ以上のＴＡＭ分泌サイトカイン又はＴＡＭ分泌ケモカインの分泌又は活性を抑制することを含む。そのような別の態様において、ＴＡＭ分泌サイトカインは、ＴＧＦβである。そのような別の態様において、一つ以上のＴＡＭ分泌サイトカイン又はＴＡＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の抑制は、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤の投与を含む。そのような別の態様において、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤は、抗体又は抗原結合性フラグメント（サイトカイン又はケモカインに特異的な受容体、又はサイトカイン／ケモカインの活性を抑制する小分子から選択される。もう一つの態様において、一つ以上のＴＡＭ分泌サイトカイン又はＴＡＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の阻害は、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアンタゴニストの投与を含む。別の態様においては、対象は、ヒト被験者である。別の態様において、方法は、化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、抗血管新生剤、免疫抑制剤、細胞障害剤、抗炎症剤及び増殖阻害剤からなる群から選択される一つ以上の付加的な治療薬剤の同時投与又は経時的投与を更に含む。
もう一つの実施態様では、本発明は対象の自己免疫不全を治療する方法を提供し、ＴＡＭの生存度又は活性を調節することを含む。一つの態様では、ＴＡＭの生存度又は活性の調節は、ＴＡＭ活性の刺激を含む。そのような態様において、ＴＡＭ活性の刺激は、ＴＡＭアゴニスト及びＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアゴニストからなる群から選択される一つ以上の化合物を投与することを含む。そのような別の態様において、ＴＡＭ活性の刺激により、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋調節Ｔ細胞、ＩＬ−１０＋ＣＤ４＋調節Ｔ細胞及び炎症性ＴＨ１７細胞の少なくとも一つが誘導される。別の態様においては、対象はヒト被験者である。別の態様において、方法は、サイトカイン、ケモカイン、細胞障害性剤及び免疫抑制剤からなる群から選択される一つ以上の付加的な治療薬剤の同時投与又は経時的投与を更に含む。    
【０００９】
もう一つの実施態様では、本発明は対象の免疫寛容導入を阻害する方法を提供し、ＴＡＭの生存度又は活性を調節することを含む。一つの態様では、ＴＡＭの生存度又は活性の調節は、ＴＡＭの選択的除去を含む。そのような態様において、ＴＡＭの選択的除去は、（ａ）ＴＡＭ結合剤の投与及び（ｂ）ＴＡＭ結合剤に特異的に結合するそれらの細胞の選択的除去を含む。別の態様において、ＴＡＭ結合剤は少なくとも一つの抗体を含み、選択的除去ステップは抗体媒介性クリアランスである。もう一つの態様において、ＴＡＭの生存度又は活性の調節は、選択的なＴＡＭの死滅を含む。そのような態様において、選択的なＴＡＭの死滅は、（ａ）ＴＡＭ結合剤の投与及び（ｂ）ＴＡＭ結合剤に特異的に結合するそれらの細胞の選択的な死滅を含む。そのような別の態様において、ＴＡＭ結合剤は少なくとも一つの抗体を含み、選択的死滅ステップは補体媒介性細胞障害性である。そのような別の態様において、ＴＡＭ結合剤は少なくとも一つの抗体又は抗原結合性フラグメントを含み、選択的死滅ステップは抗体又は抗原結合性フラグメントに結合した細胞障害性分子によって媒介される。もう一つの態様において、ＴＡＭの生存度又は活性の調節は、ＴＡＭ活性の抑制を含む。そのような態様において、ＴＡＭ活性の抑制は、一つ以上のＴＡＭ分泌サイトカイン又はＴＡＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の阻害を含む。そのような態様において、ＴＡＭ分泌サイトカインは、ＴＧＦβである。別の態様において、一つ以上のＴＡＭ分泌サイトカイン又はＴＡＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の抑制は、ＴＡＭサイトカイン／ケモカイン結合剤の投与を含む。そのような態様において、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤は、抗体又は抗原結合性フラグメント、サイトカイン又はケモカインに特異的な受容体、又はサイトカイン／ケモカインの活性を抑制する小分子から選択される。もう一つの態様において、一つ以上のＴＡＭ分泌サイトカイン又はＴＡＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の阻害は、ＴＡＭ−分泌サイトカイン／ケモカインのアンタゴニストの投与を含む。別の態様においては、対象はヒト被験者である。別の態様においては、方法は、サイトカイン、ケモカイン、細胞障害性剤、抗炎症及び免疫抑制剤からなる群から選択される一つ以上の付加的な治療薬剤の同時投与又は経時的投与を更に含む。
【００１０】
もう一つの実施態様では、本発明は、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋調節Ｔ細胞、ＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔｒ１細胞又は炎症性ＴＨ１７細胞の成長及び／又は増殖を選択的に誘導する方法であって、正常な細胞発育に適切な条件下で、ｎａiｖｅＴ細胞にＩＲＴＭを投与すること、又はＩＲＴＭにｎａiｖｅＴ細胞を暴露することを含む方法を提供する。一つの態様では、ＩＲＴＭは、ＴＡＭである。別の態様において、ＩＲＴＭは、ＡＴＭである。一つの方法では、方法は、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭアゴニスト及びＴＡＭのアゴニスト及び／又はＡＴＭ分泌サイトカイン／ケモカインから選択される一つ以上の化合物を投与することを更に含む。別の態様においては、方法は、誘導されたＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋調節Ｔ細胞、ＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔｒ１細胞又は炎症性ＴＨ１７細胞を単離することを更に含む。
もう一つの実施態様では、本発明は対象の炎症性疾患を治療する方法を提供し、ＩＲＴＭの生存度又は活性を調節することを含む。一つの態様では、ＩＲＴＭの生存度又は活性の調節は、ＩＲＴＭ活性の刺激を含む。もう一つの態様において、ＩＲＴＭ活性を刺激することは、ＩＲＴＭアゴニスト及びＩＲＴＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアゴニストからなる群から選択される一つ以上の化合物を投与することを含む。別の態様において、ＩＲＴＭ活性の刺激は、少なくとも一つのＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋調節Ｔ細胞、ＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔｒ１細胞又は炎症性ＴＨ１７細胞を誘導する。別の態様においては、対象はヒト被験者である。別の態様においては、方法は、サイトカイン、ケモカイン、細胞障害剤、抗炎症及び免疫抑制剤からなる群から選択される一つ以上の付加的な治療薬剤の同時投与又は経時的投与を更に含む。もう一つの態様において、ＩＲＴＭの生存度又は活性の調節は、ＩＲＴＭの選択的除去を含む。別の態様において、ＩＲＴＭの選択的除去は、（ａ）ＩＲＴＭ結合剤の投与及び（ｂ）ＩＲＴＭ結合剤に特異的に結合するそれらの細胞の選択的な除去を含む。別の態様において、ＩＲＴＭ結合剤は少なくとも一つの抗体を含み、選択的除去ステップは抗体媒介性クリアランスである。もう一つの態様において、ＩＲＴＭの生存度又は活性の調節は、選択的なＩＲＴＭの死滅を含む。もう一つの態様において、選択的なＩＲＴＭの死滅は、（ａ）ＩＲＴＭ結合剤の投与及び（ｂ）ＩＲＴＭ結合剤へ選択的に結合するそれらの細胞の特異的な死滅を含む。別の態様においては、ＩＲＴＭ結合剤は少なくとも一つの抗体を含み、選択的死滅ステップは補体媒介性細胞障害性である。別の態様においては、ＩＲＴＭ結合剤は少なくとも一つの抗体又は抗原結合性フラグメントを含み、選択的死滅ステップは抗体又は抗原結合性フラグメントに結合した細胞障害性分子に媒介される。もう一つの態様において、ＩＲＴＭ生存度又は活性の調節は、ＩＲＴＭ活性の調節を含む。もう一つの態様において、ＩＲＴＭ活性の阻害は、一つ以上のＩＲＴＭ分泌サイトカイン又はＩＲＴＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の阻害を含む。ＩＮ他の態様、ＩＲＴＭ分泌サイトカインは、ＴＧＦβである。もう一つの態様において、一つ以上のＩＲＴＭ分泌サイトカイン又はＩＲＴＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の阻害は、ＩＲＴＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤の投与を含む。別の態様において、ＩＲＴＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤は、抗体又は抗原結合性フラグメント、サイトカイン又はケモカインに特異的な受容体、又はサイトカイン／ケモカインの活性を抑制する小分子から選択される。もう一つの態様において、一つ以上のＩＲＴＭ分泌サイトカイン又はＩＲＴＭ分泌ケモカインの分泌又は活性の阻害は、ＩＲＴＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアンタゴニストの投与を含む。別の態様において、ＩＲＴＭはＴＡＭ及びＡＴＭから選択される。別の態様において、対象は、ヒト被験者である。別の態様において、方法は、サイトカイン、ケモカイン、細胞障害剤、抗炎症及び免疫抑制剤からなる群から選択される一つ以上の付加的な治療薬剤の同時投与又は経時的投与を更に含む。
もう一つの実施態様では、本発明は、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋調節Ｔ細胞、ＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔｒ１細胞及び／又は炎症性ＴＨ１７細胞の成長及び／又は増殖を選択的に誘導する方法であって、正常な細胞成長に適切な条件下でＴＡＭ及び／又はＡＴＭにｎａiｖｅＴ細胞を暴露することを含む方法を提供する。一つの態様では、方法は、ＴＡＭアゴニスト、ＡＴＭアゴニスト、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアゴニスト及びＡＴＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアゴニストから選択される一つ以上の化合物の投与を更に含む。別の態様においては、方法は、誘導されたＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋調節Ｔ細胞、ＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔｒ１細胞又は炎症性ＴＨ１７細胞を単離することを更に含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１にて説明したように、図１Ａ−１Ｈは、腫瘍試料の免疫組織化学的分析の結果を表す。図１Ａは、顕著な白血球浸潤を示している腫瘍組織の抗ＣＤ４５抗体染色を表す。図１Ｂは、マクロファージを同定するために、腫瘍組織の抗Ｆ４／８０抗体染色を表す。図１Ｃは、Ｔ細胞を同定するために、腫瘍組織の抗ＣＤ３抗体染色を表す。図１Ｄは、ＣＤ４５＋リンパ性腫瘍浸潤物中の免疫細胞の相対比率を示しているグラフである。図１Ｅは、ＮＫ１．１＝ＤＸ５＝ＣＤ１１ｂ＋腫瘍の骨髄性浸潤物中の免疫細胞の相対比率を示しているグラフである。図１Ｆは、内皮細胞と比較して腫瘍組織のＴＡＭの局在を示すために抗Ｆ４／８０及び抗ＣＤ３１抗体で染色した腫瘍試料を表す。図１Ｇは、内皮細胞と比較して腫瘍組織の好中球の局在を示すために抗Ｌｙ−６Ｇ及び抗ＣＤ３１抗体で染色した腫瘍試料を表す。図１Ｈは、内皮細胞と比較して腫瘍組織の炎症性単核細胞（ＭｏＩＦ）の局在を示すために抗Ｌｙ−６Ｃ及び抗ＣＤ３１抗体で染色した腫瘍試料を表す。図１Ｆ−１Ｈのデータは、２〜３回の反復及び６−７の個々の腫瘍を表す。
【図２】図２Ａ−２Ｃは、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ腫瘍の白血球構成を評価しているＦＡＣＳ分析の結果を視覚的に表す。全３つの図において、ＦＶＢコントロール試料は白で示し、ＰｙＭＴｔｇ試料はストライプで示している。図２Ａは、ＰｙＭＴ−誘導腫瘍における末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の総数が、腫瘍がないコントロールＦＶＢマウス試料と比較して２．３倍増加したことを示している。図２Ｂは、腫瘍を有していないコントロールＦＶＢマウスと比較した、腫瘍を有するマウスにおけるＣＤ１１ｂ＋骨髄性ＰＢＭＣ（Ｎｋ１．１＝ＤＸ５＝）細胞の増加を示す。図２Ｃは、好中球の増加を示す：コントロールマウスと比較したＰｙＭＴ腫瘍マウスの単核細胞比。記号「＊」はデータがｐ≦０．０５で有意だったことを示す；記号「＊＊」はデータがｐ≦０．０１で有意なことを示した。
【図３】図３Ａ−３Ｅは、ＴＡＭがマクロファージ及び樹状細胞の特徴を有することを示している、実施例２Ａに記載される実験の結果を表す。図３Ａは、ｂｍＤＣ（白いバー）、腹腔マクロファージ（黒いバー）及びＰｙＭＴｔｇ由来ＴＡＭ（ストライプのバー）のＣＤ１１ｃｍＲＮＡ発現量を示す遺伝子発現解析の結果を表す（最も左のパネル）。図３Ａもまた、ＴＡＭがＣＤ１１ｃ及びＦ４／８０を高水準で発現することを示すＦＡＣＳ分析の結果を表しているのに対して、ｂｍＤＣ又は腹腔マクロファージはＣＤ１１ｃ又はＦ４／８０のどちらかを発現する（右の３枚のパネル）。図３Ｂ−３Ｃは、ＰｙＭＴｔｇ由来腫瘍の凍結切片（図３Ｂ）又はインビトロで６０時間培養された単離されたＦ４／８０＋ＴＡＭ（図３Ｃ）が樹状細胞マーカーＣＤ１１ｃを発現していることを示す免疫組織化学的分析の結果を表す。図３Ｄは、ｂｍＤＣ（白いバー）、腹腔マクロファージ（ストライプのバー）及びＰｙＭＴｔｇ由来ＴＡＭ（点状のバー）のＣＤ２０７ｍＲＮＡ発現量の遺伝子発現解析を表す（最も左のパネル）。図３Ｄもまた、ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｃ＋ＴＡＭがランゲリン（ＣＤ２０７）を発現することを示すＦＡＣＳ分析の結果を表す。図３Ｄのデータは、４つの実験を代表している。図３Ｅは、ｂｍＤＣ（白いバー）、腹腔マクロファージ（ストライプのバー）及びＰｙＭＴｔｇ由来ＴＡＭ（点状のバー）のＴＧＦβＲＩ、Ｒｕｎｘ３及びＩＲＦ−８の発現量を示すリアルタイムＰＣＲ実験の結果を表す。
【図４】図４Ａ−４Ｃは、腫瘍のないＦＶＢマウスと比較して、ＰｙＭＴｔｇマウスの腋窩流入腫瘍及び上腕リンパ節の免疫細胞構成を示している、実施例２Ａに記載される実験の結果を表す。図４Ａは、ＣＤ１１ｂ＋細胞数の上昇が腫瘍を含むマウスのリンパ節において同定されたことを視覚的に示す。図４Ｂは、ＣＤ１１ｃ及びＦ４／８０を同時発現しているＣＤ１１ｂ＋細胞数の増加が腫瘍を含むマウスのリンパ節において同定されたことを示しているＦＡＣＳの結果を示す。図４Ｃは、ＴＡＭの形態がマクロファージよりもｂｍＤＣの形態に近いことを示している顕微鏡写真を表す。
【図５】実施例２Ａに記載されているように、図５Ａ−５Ｃは、ＴＡＭ、腹腔マクロファージ及びｂｍＤＣにおいて発現する遺伝子のマイクロアレイ解析の結果を表す。図５Ａは、それらの３つの細胞集団において発現する遺伝子のヒートマップ像を示す、白い彩色は相対的発現の最小レベルを示し、黒い彩色は相対的発現の最大レベルを示し、灰色は相対的発現が１であることを示している。図５ＢはＴＡＭ、腹腔マクロファージ及びｂｍＤＣの遺伝子発現プロファイリングの統計ＰＣ解析を示しており、ＴＡＭ及び腹腔マクロファージの密接な関係（左パネル）及び分析された個々の主成分の重要性の程度の画像視覚化を示している（右パネル）。図５Ｃは、ＰｙＭＴｔｇ由来ＴＡＭ及びＨｅｒ２ｔｇ由来ＴＡＭの遺伝子発現プロファイリングの統計ＰＣ解析の結果を表しており、他の組織マクロファージ（腹腔マクロファージ及び脾臓マクロファージ及びクッパー細胞）と比較したＴＡＭの固有の遺伝子プロファイル（左パネル）及び分析された個々の主成分の重要性の程度の画像視覚化を示している（右パネル）。図５Ｂ及び５Ｃのデータは、個々に単離された集団の３−５のｍＲＮＡ標本を平均している。
【図６】実施例２Ｂに記載されているように、図６Ａ−６Ｃは、ＭＨＣＩＩ及び共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６のＴＡＭ表面発現を評価しているいくつかのＦＡＣＳ解析を示す。図６Ａは、ＭＨＣ  ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６のＴＡＭ発現のＦＡＣＳ結果を表す。図６Ｂは、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６の腹腔マクロファージ発現のＦＡＣＳ結果を表す。図６Ｃは、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６のｂｍＤＣ発現のＦＡＣＳ結果を表す。
【図７】実施例３に記載されているように、図７Ａ−７Ｂは、ＴＡＭ対腹腔マクロファージのケモカイン及びサイトカイン発現のマイクロアレイ解析の結果を表す。図７Ａは、両方の細胞集団のケモカインＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５及びＫＣの発現量を示す。図７Ｂは、両方の細胞集団のサイトカインＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−１０及びＩＬ−６の発現量を示す。図７Ｃは、ｂｍＤＣ（白いバー）、腹腔マクロファージ（点状のバー）、ＰｙＭＴｔｇ由来されたＴＡＭ（軽いストライプのバー）及び腫瘍細胞（重いストライプのバー）のＴＧＦβ１の発現量を示すリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ実験の結果を表す。示されるデータは、３−５の独立実験の平均である。
【図８】実施例４に記載されているように、図８Ａ−８Ｃは、ｎａiｖｅＴ細胞に対するＴＡＭの効果を評価しているＦＡＣＳ解析の結果を表す。図８Ａは、ＴＡＭ、腹腔マクロファージ又はｂｍＤＣで刺激されたｎａiｖｅＴ細胞培養によって産生されたサイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−２及びＩＬ−１７の相対量を視覚的に示す。図８Ｂは、ＴＡＭ−活性化Ｔ細胞がＩＬ−１０及びＩＬ−１７を産生することを示しているＦＡＣＳ結果を表す。図８Ｃは、、ＴＡＭ−刺激ＣＤ４＋  Ｔ細胞からサイトカイン分泌がＴＡＭによるＴＧＦβ分泌に依存していたことを示す免疫染色実験の結果を視覚的に表す。
【図９】図９Ａ−９Ｄは、ＴＡＭによるＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞の誘導を研究するための、実施例４に記載されているＦＡＣＳ解析の結果を表す。図９Ａは、ＴＡＭ又はｂｍＤＣのいずれかで処理された培養におけるＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞誘導の相違を示しているＦＡＣＳ解析を表す。図９Ｂは、ＴＡＭ−誘導ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞におけるＴＧＦβＲＩＩの封入の効果を示しているＦＡＣＳ解析の結果を表す。図９Ｃは、調節Ｔ細胞のためのマーカーとしてＴＡＭ−誘導ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞上のＧＩＴＲの存在を評価しているＦＡＣＳ解析の結果を表す。図９Ｄは、ＴＡＭ誘導ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞における、末梢性誘導された調節Ｔ細胞に対するマーカーとしてのＣＤ１０３の発現を評価しているＦＡＣＳ解析の結果を表す。
【図１０】実施例４に記載されているように、図１０Ａ−１０Ｄは、ＴＡＭが、先に存在するＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のクローン増殖を刺激することとは対照的に、ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞を誘導したことを確認するための実験の結果を表す。図１０Ａは、本願明細書において用いられるｎａiｖｅＣＤ４＋Ｔ細胞の調節におけるＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の量を評価しているＦＡＣＳ解析の結果を表す。図１０Ｂは、ＣＦＳＥ標識ｎａiｖｅＣＤ４＋Ｔ細胞に対するｂｍＤＣ、ＴＡＭ及び腹腔マクロファージの刺激能を分析している実験の結果を示す。図１０Ｃは、脾細胞全体におけるＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のプールを評価しているＦＡＣＳ解析の結果を表す（図１０Ｃ）。図１０Ｄは、精製されたＣＤ１０３＋ＣＤ２５＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞（図１０Ｄ）からの単離及びＴＡＭでの再処理におけるＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のプールを評価しているＦＡＣＳ解析の結果を表す。
【図１１】実施例５に記載されているように、図１１Ａ−１１Ｃは、ＰｙＭＴマウス（図１１Ａ）対コントロール・マウス（図１１Ｂ）のＩＬ−１０＋及びＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞の生体内での発生率を評価している実験の結果を表す。図１１Ｃは、、ＰｙＭＴマウス（ストライプのバー及び黒丸）対コントロール・マウス（白いバー及び円）の腫瘍流入領域リンパ節（最も左の２枚のパネル）、脾臓（中心及び中心の右パネル）及び腫瘍（右端パネル）において見いだされるＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の相対量及び／又は絶対数を視覚的に示す。
【図１２】実施例６に記載されているように、図１２Ａ−Ｇは、脂肪組織マクロファージ（ＡＴＭ）について行われる実験の結果を表す。図１２Ａは、ＣＤ１１ｂ＋細胞の内容を示しているＦＡＣＳ解析の結果を表す。データは、２０の個体の脂肪組織単離物を表わす。図１２Ｂは、Ｆ４／８０＋ＡＴＭのＣＤ１１ｃ、ＭＨＣＩＩ及びＣＤ８６の発現を示しているＦＡＣＳ解析の結果を表す。データは、いくつかの異なる実験からの１４（ＣＤ１１ｃ）又は５（ＭＨＣＩＩ又はＣＤ８６）の個体の脂肪組織単離物を表わす。図１２Ｃは、ＨＦＤの下で保持された雄のＣ５７ＢＩ／６マウスの精巣上体脂肪に由来する単細胞ＡＴＭ懸濁液におけるＣＤ１４、ＩＣＯＳ  Ｌ及びＴＩＭ３発現を示しているＦＡＣＳ解析の結果を表す。データは、いくつかの異なる実験からの５の個体の脂肪組織単離物を表わす。図１２Ｄは、ＴＡＭにおけるＣＤ１４、ＩＣＯＳ  Ｌ及びＴＩＭ３発現を示しているＦＡＣＳ解析の結果を表す。データは、いくつかの異なる実験からの５つの個体の脂肪組織単離物を表わす。図１２Ｅは、精巣上体脂肪組織（ストライプのバー）、Ｃ５７ＢＩ／６野生型腹腔マクロファージ（白いバー）又は痩せた組織マクロファージ（点状のバー）に由来するＡＴＭのサイトカイン・プロファイルを表す。データは、２つの実験からの６匹のマウスを表わす。図１２Ｆは、ＴＡＭ（白いバー）及びＡＴＭ（ストライプのバー）におけるＴＧＦβ１及びＴＧＦβＲＩの発現量のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を表す。データは１−３の実験からの８つのＴＡＭ及び３つのＡＴＭの個体のＲＮＡプローブ、又は４つの個体の単離したマクロファージのプールを表わす。図１２Ｇは、Ｈ＆Ｅで染色された新たに単離されたＡＴＭ、ＴＡＭ及び腹腔マクロファージの形態を示す。
【図１３】実施例７に記載されているように、図１３Ａ−Ｊは、脂肪組織、リンパ節組織及び精製されたＡＴＭのＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞を誘導するための能力を試験した実験の結果を示す。図１３Ａは、ＡＴＭ（左のパネル）、痩せた脂肪マクロファージ（ＬＴＭ）（真ん中のパネル）又は腹腔マクロファージ（右パネル）で活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＦｏｘＰ３発現のＦＡＣＳ解析の結果を表す。示されるデータは、２個体のマウスを一つの実験で表す。図１３Ｂは、組換えＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃで補充されたＴ細胞培養におけるＴＡＭによるＦｏｘＰ３誘導に対するＴＧＦ−βの影響のＦＡＣＳ解析の結果を表す。示されるデータは、一つの実験における２個体のマウスを表す。１３Ｃ図及び１３Ｄは、雄のＤｂ／Ｄｂマウス及び年齢がマッチしたＣ５７ＢＩ／６マウスの精巣上体脂肪（図１３Ｃ）又は脾臓組織（図１３Ｄ）におけるＣＤ４＋Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３＋Ｔ調節細胞の相対量を評価しているＦＡＣＳ解析の結果を示す。示されるデータは、一つの実験における４個体のマウスを表す。図１３Ｅは、ＡＴＭ−活性化Ｔ細胞によるサイトカイン産生を評価している実験の結果を表す。白いバーは腹腔マクロファージで処理されたＴ細胞に対応し、黒いバーはＡＴＭで処理されたＴ細胞に対応する。示されるデータは、それぞれ２匹のマウスを用いた２回の実験を表す。図１３Ｆは、ＴＡＭによって活性化されたＴ細胞集団におけるＴｒ１及びＴＨ１７細胞の存在を評価しているＦＡＣＳ解析の結果を表す。示されるデータは、それぞれ２匹のマウスを用いた２回の実験を表す。図１３Ｇ−Ｈは、ＰＭＡ／イオノマイシンで刺激された、高脂肪食を給仕されたＣ５７ＢＩ／６マウス（図１３Ｇ）又は野生型Ｃ５７ＢＩ／６マウス（図１３Ｈ）における腫瘍流入領域リンパ節のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を評価している実験の結果を表しており、肥満マウスにおけるＩＬ−１０＋Ｔｒ１及びＴＨ１７Ｔ細胞の顕著な集団の存在を示している。図１３Ｉ及び１３Ｊは、年齢がマッチしたコントロールＦＶＢマウス（白い丸）又は雄のＨＦＤ肥満のＣ５７ＢＩ／６マウス（黒い丸）の脂肪組織（図１３Ｉ）又は流入領域リンパ節組織（図１３Ｊ）におけるＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を評価した実験結果を表す棒グラフを示す。＊＊は、実験がｐ≦０．０１であることを示す。
【図１４】図１４Ａ−Ｆは、選択された免疫細胞及び腫瘍細胞集団の遺伝子発現プロファイルを表す。図１４Ａ−Ｃ及びＥは、野生型ＦＶＢマウス及びｂｍＤＣマウスからの腫瘍細胞、ＰｙＭＴｔｇ由来ＴＡＭ、腹腔マクロファージにおけるサイトカイン（図１４Ａ）、サイトカイン受容体（図１４Ｂ）、ケモカイン（図１４Ｃ）及びケモカイン受容体（図１４Ｅ）の差次的な発現のヒートマップ・プロファイルを表す。図１４Ｄは、腹腔マクロファージ（白いバー）又はＰｙＭＴｔｇ由来ＴＡＭ（ストライプのバー）におけるＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１０の差次的な発現を確認するための実験結果を示す。＊＊は、ｐ＜０．０１を示す。図１４Ｆは、ｂｍＤＣ（白いバー）、腹腔マクロファージ（ストライプのバー）及びＰｙＭＴｔｇ由来ＴＡＭ（点状のバー）におけるＣＣＲ６遺伝子発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を表す。それぞれの図において、データは、３−５の独立した試料、又は３−５の独立した実験の平均値の遺伝子プロファイリングを示す。図１４Ａ−Ｃ及びＥにおいて、最も低い発現量は濃い灰色で、発現で最も高いレベルは淡い灰色によって示される；白い正方形は、その特定の解析のためのデータが利用可能でなかったことを示す。
【図１５】図１５Ａ−Ｂは、野生型ＦＶＢマウス及びｂｍＤＣマウスの腫瘍細胞、ＰｙＭＴｔｇ由来ＴＡＭ、腹腔マクロファージにおけるＭ１（図１５Ａ）及びＭ２（図１５Ｂ）マーカー遺伝子ｍＲＮＡの差次的な発現のヒートマップ・プロファイルを表す。データは、３−５の独立した試料の遺伝子プロファイリング結果を示す。最も低い発現量は濃い灰色で、最も高いレベルの発現は淡い灰色によって示される；白い正方形は、その特定の解析のためのデータが利用可能でなかったことを示す。
【図１６】図１６Ａ−Ｂは、特定の免疫細胞集団によって活性化されるｎａiｖｅＴ細胞のサイトカイン及びケモカイン・プロファイルを示している実験の結果を表す。図１６Ａは、ｂｍＤＣ（白いバー）、ＦＶＢマウスの腹腔マクロファージ（ストライプのバー）又はＴＡＭ（点状のバー）によって刺激されるｎａiｖｅＴ細胞におけるＴＮＦα、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＣＣＬ３発現を示す。図１６Ｂは、Ｃ５７ＢＩ／６マウス（白いバー）又はＡＴＭの腹腔マクロファージ（ストライプのバー）によって刺激されるｎａiｖｅＴ細胞のＴＮＦα、ＩＬ−５及びＩＬ−１３発現を示す。
【図１７】図１７は、特定の免疫細胞集団の遺伝子発現プロファイリングの統計ＰＣ解析の結果を表す。左パネルは、ＡＴＭ、ＣＤ１１ｃ＝ＡＴＭ及びＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭが類似した遺伝子発現プロファイルを有するが、ＰｙＭＴｔｇＴＡＭ、Ｈｅｒ２ｔｇＴＡＭ及び腹腔マクロファージ（「ＰＦ」）とは異なる遺伝子発現プロファイルを有することを証明するグラフを示す。
【図１８】実施例８に記載されているように、図１８は、ＣＤ１１ｃ＝ＡＴＭ（白いバー）又はＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭ（ストライプのバー）のサイトカイン／ケモカイン・プロファイルを表す。＊は、実験がｐ≦０．０５であることを示す；  ＊＊は、実験がｐ≦０．０１であることを示す。
【図１９】実施例８に記載されているように、図１９Ａ及び１９Ｂは、ＣＤ１１ｃ＝ＡＴＭ（白いバー）又はＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭ（ストライプのバー）によって活性化されたＴ細胞のサイトカイン／ケモカイン・プロファイルを表す。
【図２０】実施例９に記載されているように、図２０Ａは、ＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭ（ストライプのバー）と比較して、ＣＤ１１ｃ＝ＡＴＭが有意に高いＣＤ２０９ａ、ＣＤ２０９ｂ及びＣＤ２０９ｃコード化ｍＲＮＡレベルを有すること（白いバー）を証明しているグラフを示す。実施例９に記載されているように、図２０Ｂは、非肥満性雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週間目）又は肥満雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（２４週齢、ＨＦＤ２０週間）の精巣上体脂肪組織に由来したＡＴＭにおけるＣＤ２０９ｂ／ＳＩＧＮ−Ｒ１及びＣＤ１１ｃのＦＡＣＳ解析を表す。データは、４−６の独立したＡＴＭ単離物の個々に単離された集団の３つのアレイの平均値を表す。＊は、ｐ≦０．０５を示す；  ＊＊は、ｐ≦０．０１を示す。
【００１２】
（詳細な説明）
定義
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の組成物又は生物学的システムに限定されるものではなく、もちろん変更されてもよいことを理解されたい。また、本明細書中で用いられる用語は具体的な実施態様を記載する目的のためだけであって、制限することを目的とするものではないと理解されたい。本明細書で用いられる及び添付の特許請求の範囲中の単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、明らかな記載がない限り複数形も含まれる。例えば、したがって、「分子」を指す言葉は場合によって該分子の２以上の組合せなどを包含する。
用語「炎症関連組織マクロファージ」又は「ＩＲＴＭ」は、本願明細書において用いられる場合、炎症及び一つ以上の疾病状態に関連した単核細胞に由来される免疫細胞のクラスを意味する。ＩＲＴＭの例は、腫瘍関連マクロファージ及び脂肪組織マクロファージを含むが、これに限定されるものではない。ある実施態様では、ＩＲＴＭは、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の中枢神経系において見いだされるマクロファージ及び肺胞マクロファージを含むが、これに限定されるものではない。
用語「ＩＲＴＭ結合タンパク質」は、本願明細書において用いられる場合、それがＩＲＴＭに特異的に結合する分子を意味する。ＩＲＴＭ結合タンパク質は、ＩＲＴＭに結合する抗体又はその抗原結合性フラグメント、タンパク質、ペプチド、グリコプロテイン、糖ペプチド、グリコリピド、多糖、オリゴ糖、生物有機化学分子、ペプチド模倣薬、薬剤及びその代謝物、融合タンパク及び受容体分子を含むが、これに限定されるものではない。
このような結合は、例えば、ＩＲＴＭ細胞表面のタンパク質に、又は他のＩＲＴＭ細胞表面分子に対するものであってもよい。
用語「腫瘍関連マクロファージ」又は「ＴＡＭ」は、本願明細書において用いられる場合、腫瘍と関連している免疫浸潤物において見つかる単核細胞に由来する細胞を意味する。
ここに示されるように、ＴＡＭは特定のマクロファージ細胞表面マーカー及び特定の樹状細胞表面マーカーの両方を発現する。
用語「ＴＡＭ結合タンパク質」は、本願明細書において用いられる場合、ＴＡＭに特異的に結合する分子を意味する。ＴＡＭ結合タンパク質は、ＴＡＭに結合する抗体又はその抗原結合性フラグメント、タンパク質、ペプチド、グリコプロテイン、糖ペプチド、グリコリピド、多糖、オリゴ糖、生物有機化学分子、ペプチド模倣薬、薬剤及びその代謝物、融合タンパク及び受容体分子を含むが、これに限定されるものではない。このような結合は、例えば、ＴＡＭ細胞表面のタンパク質に、又は他のＴＡＭ細胞表面分子に対するものであってもよい。
用語「脂肪組織マクロファージ」又は「ＡＴＭ」は、本願明細書において用いられる場合、肥満対象の脂肪組織と関連している免疫浸潤物において見つかる単核細胞に由来する細胞を意味する。ここに示されるように、ＡＴＭは特定のマクロファージ細胞表面マーカー及び特定の樹状細胞表面マーカーの両方を発現する。
用語「ＡＴＭ結合タンパク質」は、本願明細書において用いられる場合、ＡＴＭに特異的に結合する分子を意味する。ＡＴＭ結合タンパク質、ＡＴＭに結合する抗体又はその抗原結合性フラグメント、タンパク質、ペプチド、グリコプロテイン、糖ペプチド、グリコリピド、多糖、オリゴ糖、生物有機化学分子、ペプチド模倣薬、薬剤及びその代謝物、融合タンパク及び受容体分子を含むが、これに限定されるものではない。このような結合は、例えば、ＡＴＭ細胞表面のタンパク質に、又は他のＡＴＭ細胞表面分子に対するものであってもよい。
略語「Ｍｆ」及び「ＭΦ」は、本願明細書において用いられる場合、マクロファージを意味する。略語「ｐＭｆ」及び「ｐＭΦ」は、腹腔マクロファージを意味する。
【００１３】
用語「アンタゴニスト」は、本願明細書において用いられる場合、受容体の場合には一つ以上のリガンドへの結合を、又は、リガンドの場合には一つ以上の受容体への結合を含む、本発明のタンパク質の活性を中和、ブロッキング、阻害、廃止、還元又は干渉することが可能な分子を意味する。アンタゴニストは、抗体又はその抗原結合性フラグメント、タンパク質、ペプチド、グリコプロテイン、糖ペプチド、グリコリピド、多糖、オリゴ糖、生物有機化学分子、ペプチド模倣薬、薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳調節配列、及び類似体を含む。アンタゴニストは、タンパク質に特異的に結合する本発明のタンパク質の小分子インヒビター及び融合タンパク、受容体分子及び誘導体も含み、それによりその標的、タンパク質のアンタゴニスト変異体、本発明のタンパク質のアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー及び本発明のタンパク質に対するリボザイムへの結合を隔絶する。
「ブロッキング」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性度を阻害又は減少させるものである。特定のブロッキング抗体又は、ンタゴニスト抗体は、実質的又は完全に抗原の生物学的活性を阻害する。
用語「ＩＲＴＭアンタゴニスト」は本願明細書において用いられる場合、ＩＲＴＭに結合し、ＩＲＴＭの生物学的活性を阻害又は実質的に減少させる分子を意味する。ＩＲＴＭアンタゴニストの例は、制限されるものではないが、抗体、タンパク質、ペプチド、グリコプロテイン、糖ペプチド、グリコリピド、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機化学分子、ペプチド模倣薬、小分子、薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳調節配列、及びその類似体を含む。本発明の一実施態様において、ＩＲＴＭアンタゴニストは、抗体、特にヒトＩＲＴＭに結合する抗ＩＲＴＭ細胞表面マーカー抗体である。
用語「ＴＡＭアンタゴニスト」は、本願明細書において用いられる場合、ＴＡＭに結合し、ＴＡＭの生物学的活性を阻害又は実質的に減少させる分子を意味する。ＴＡＭアンタゴニストの例は、制限されるものではないが、抗体、タンパク質、ペプチド、グリコプロテイン、糖ペプチド、グリコリピド、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機化学分子、ペプチド模倣薬、小分子、薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳調節配列、及びその類似体を含む。
本発明の一実施態様において、ＴＡＭアンタゴニストは、抗体、特にヒトＴＡＭに結合する抗ＴＡＭ細胞表面マーカー抗体である。
用語「ＡＴＭアンタゴニスト」は、本願明細書において用いられる場合、ＡＴＭに結合し、ＡＴＭの生物学的活性を阻害又は実質的に減少させる分子を意味する。
ＡＴＭアンタゴニストの例は、制限されるものではないが、抗体、タンパク質、ペプチド、グリコプロテイン、糖ペプチド、グリコリピド、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機化学分子、ペプチド模倣薬、小分子、薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳調節配列、及びその類似体を含む。本発明の一実施態様において、ＴＡＭアンタゴニストは、抗体、特にヒトＡＴＭに結合する抗ＡＴＭ細胞表面マーカー抗体である。
【００１４】
用語「Ｆ４／８０アンタゴニスト」は本願明細書において用いられる場合、Ｆ４／８０に結合し、Ｆ４／８０の生物学的活性を阻害又は実質的に減少させる分子を意味する。
Ｆ４／８０アンタゴニストの例は、制限されるものではないが、抗体、タンパク質、ペプチド、グリコプロテイン、糖ペプチド、グリコリピド、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機化学分子、ペプチド模倣薬、小分子、薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳調節配列、及びその類似体を含む。  本発明の一実施態様において、Ｆ４／８０アンタゴニストは、抗体、特にヒトＦ４／８０に結合する抗Ｆ４／８０の抗体である。
用語「ＣＤ１１ｃアンタゴニスト」は、本願明細書において用いられる場合、ＣＤ１１ｃに結合し、ＣＤ１１ｃの生物学的活性を阻害又は実質的に減少させる分子を意味する。
ＣＤ１１ｃアンタゴニストの例は、制限されるものではないが、抗体、タンパク質、ペプチド、グリコプロテイン、糖ペプチド、グリコリピド、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機化学分子、ペプチド模倣薬、小分子、薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳調節配列、及びその類似体を含む。  本発明の一実施態様において、ＣＤ１１ｃアンタゴニストは、抗体、特にヒトＣＤ１１ｃに結合する抗ＣＤ１１ｃ抗体である。
用語「ランゲリンアンタゴニスト」は本願明細書において用いられる場合、ランゲリン、（好ましくはヒトランゲリン）に結合し、ランゲリンの生物学的活性を阻害又は実質的に減少させる分子を意味する。ランゲリンアンタゴニストの例は、制限されるものではないが、抗体、タンパク質、ペプチド、グリコプロテイン、糖ペプチド、グリコリピド、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機化学分子、ペプチド模倣薬、小分子、薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳調節配列、及びその類似体を含む。本発明の一実施態様において、ランゲリンアンタゴニストは、抗体、特に細胞内ヒトランゲリンに結合する抗ランゲリン抗体である。
本発明の他の一実施態様において、ランゲリンアンタゴニストは、ヒトランゲリンに結合する小分子である。
【００１５】
用語「アゴニスト」は、受容体の場合には一つ以上のリガンドへの結合を、又はリガンドの場合には一つ以上の受容体への結合を含む、本発明のタンパク質の活性を刺激、活性化又は増強することが可能な分子を意味する。アゴニストは、抗体又はその抗原結合性フラグメント、タンパク質、ペプチド、グリコプロテイン、糖ペプチド、グリコリピド、多糖、オリゴ糖、生物有機化学分子、ペプチド模倣薬、薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳調節配列、及び類似体を含む。アゴニストは、タンパク質に特異的に結合する本発明のタンパク質の小分子アクチベーター及び融合タンパク、受容体分子及び誘導体も含み、タンパク質の活性、例えばその標的、タンパク質のアゴニスト変異体、本発明のタンパク質のインヒビターに対するアンチセンス分子、本発明のタンパク質のインヒビターに特異的なＲＮＡアプタマー及び本発明のタンパク質のインヒビターに対するリボザイムへの結合を増強する。
用語「ＩＲＴＭアゴニスト」は、例えば、一つ以上のＩＲＴＭ受容体へ結合し、ＩＲＴＭ活性を刺激すること、又は一つ以上のＩＲＴＭインヒビターへ結合し、ＩＲＴＭとインヒビターの相互作用を阻害することによって、ＩＲＴＭの活性を刺激、活性化、又は増強することが可能な分子を意味する。
アゴニストは、ＩＲＴＭインヒビターに対する抗体又はその抗原結合性フラグメント、タンパク質、ペプチド、グリコプロテイン、糖ペプチド、グリコリピド、多糖、オリゴ糖、生物有機化学分子、ペプチド模倣薬、薬剤及びその代謝物、小分子、融合タンパク、受容体分子及びその誘導体、アンチセンス分子、ＲＮＡアプタマ及びリボザイムを含むが、これに限定されるものではない。
用語「ＴＡＭアゴニスト」は、一つ以上のＴＡＭ受容体へ結合し、ＴＡＭ活性を刺激すること、又は一つ以上のＴＡＭインヒビターへ結合し、ＴＡＭとインヒビターの相互作用を阻害することによって、ＴＡＭの活性を刺激、活性化、又は増強することが可能な分子を意味する。アゴニストは、ＴＡＭインヒビターに対する抗体又はその抗原結合性フラグメント、タンパク質、ペプチド、グリコプロテイン、糖ペプチド、グリコリピド、多糖、オリゴ糖、生物有機化学分子、ペプチド模倣薬、薬剤及びその代謝物、小分子、融合タンパク、受容体分子及びその誘導体、アンチセンス分子、ＲＮＡアプタマ及びリボザイムを含むが、これに限定されるものではない。
用語「ＡＴＭアゴニスト」は、一つ以上のＡＴＭ受容体へ結合し、ＡＴＭ活性を刺激すること、又は一つ以上のＡＴＭインヒビターへ結合し、ＡＴＭとインヒビターの相互作用を阻害することによって、ＡＴＭの活性を刺激、活性化、又は増強することが可能な分子を意味する。アゴニストは、ＡＴＭインヒビターに対する抗体又はその抗原結合性フラグメント、タンパク質、ペプチド、グリコプロテイン、糖ペプチド、グリコリピド、多糖、オリゴ糖、生物有機化学分子、ペプチド模倣薬、薬剤及びその代謝物、小分子、融合タンパク、受容体分子及びその誘導体、アンチセンス分子、ＲＮＡアプタマ及びリボザイムを含むが、これに限定されるものではない。
【００１６】
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来の対応するポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。よって、天然配列ポリペプチドは任意の哺乳動物からの天然に生じるポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。このような天然配列ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、あるいは組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列」ポリペプチドという用語は特にポリペプチドの天然に生じる切断型又は分泌型（例えば細胞外ドメイン配列）、ポリペプチドの天然に生じる変異体型（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。
「ポリペプチド鎖」は、その各ドメインが、非共有的相互作用又はジスルフィド結合とは対照的にペプチド結合（一又は複数）によって他のドメイン（一又は複数）に連結しているポリペプチドである。
ポリペプチド「変異体」は対応する天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば一又は複数のアミノ酸（天然に生じるアミノ酸及び／又は天然に生じないアミノ酸）残基が、ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に付加され、又は欠失されたポリペプチドが含まれる。通常は、変異体は天然配列ポリペプチドと少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９５％のアミノ酸配列同一性を有する。また、変異体には、典型的には生物学的に活性な天然配列のポリペプチド断片（例えば、サブ配列、切断型など）が含まれる。
【００１７】
本明細書中の「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとして、選択した配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＩＮ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（DNASTAR）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較プログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって以下に記載のように得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作製され、米国著作権事務所，ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録され、ジェネンテク社、サウスサンフランシスコ，カリフォルニアから好適に入手可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、例えばデジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００１８】
ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００１９】
本明細書中で用いる「タンパク質変異体」なる用語は、上記の変異体及び／又は一又は複数のアミノ酸突然変異を天然のタンパク質配列に含むタンパク質を指す。場合によって、一又は複数のアミノ酸突然変異にはアミノ酸置換(一又は複数)が含まれる。本発明での使用のためのタンパク質及びその変異体は当分野で公知の様々な方法によって調製されうる。タンパク質のアミノ酸配列変異体はタンパク質ＤＮＡの突然変異によって調製されうる。このような変異体には、タンパク質のアミノ酸配列内の残基の例えば欠失、挿入又は置換が含まれる。欠失、挿入及び置換の何かを組み合わせて、所望の活性を有する最終コンストラクトに達成してもよい。変異体をコードするＤＮＡ中に作製される突然変異は、リーディングフレーム外の配列におくべきでなく、好ましくは二次的ｍＲＮＡ構造を生産しうる相補的な領域を作製しないであろう。欧州特許第７５４４４号Ａ。
【００２０】
場合によって、タンパク質変異体は、天然のタンパク質をコードするＤＮＡのヌクレオチド部位特異的突然変異誘発又はファージディスプレイ技術によって、変異体をコードするＤＮＡを産生し、その後組換え細胞培養物中でＤＮＡを発現することによって調節する。
アミノ酸配列変化を導入するための部位は予め決定されているが、突然変異自体は予め決定する必要はない。例えば、ある部位での突然変異のパフォーマンスを最適化するために、ランダムな突然変異誘発を標的コドン又は標的領域で行い、発現されたタンパク質変異体を所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングしてもよい。公知の配列を有するＤＮＡの所定の部位に置換突然変異を作製する技術は、周知の、例えば部位特異的突然変異誘発である。本明細書中に記述されるタンパク質変異体の調製は、ＰＣＴ出願国際公開第００／６３３８０号に記載のものなどのファージディスプレイ技術によって達成されうる。
このようなクローンが選択されたあと、変異したタンパク質領域は取り除かれ、タンパク質産生のために好適なベクター、一般に好適な宿主の形質転換に用いられうる種類の発現ベクターに組み込まれてもよい。
アミノ酸配列欠失は、一般に１〜３０の残基、場合によって１〜１０の残基、場合によって１〜５の残基以下に変動し、一般的に隣接する。
【００２１】
アミノ酸配列の挿入には、１残基から基本的に制限しない長さのポリペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。配列内挿入(すなわち天然のタンパク質配列内の挿入)は、一般的におよそ１〜１０の残基、場合によって１〜５、又は場合によって１〜３に変動しうる。末端挿入の例は、組換え宿主からの分泌を促すためのＮ末端への、宿主細胞に異種性であるか相同的であるかにかかわらないシグナル配列の融合などである。
更なるタンパク質変異体は、天然のタンパク質内の少なくとも一のアミノ酸残基が取り除かれているもの及び、異なる残基がその位置に挿入されているものである。このような置換は、表１に示すものを考慮してなされうる。また、本明細書において記述されるように、タンパク質変異体は非天然のアミノ酸を含んでなってもよい。
アミノ酸はその側鎖の性質の類似性に応じて分類される( Biochemistry, 第２版., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)中のA. L. Lehninger)：
非極性：Ａｌａ（Ａ），Ｖａｌ（Ｖ），Ｌｅｕ（Ｌ），  Ｉｌｅ（Ｉ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｐｈｅ（Ｆ），Ｔｒｐ（Ｗ），Ｍｅｔ（Ｍ）
荷電のない極性：Ｇｌｙ（Ｇ），Ｓｅｒ（Ｓ），Ｔｈｒ（Ｔ），Ｃｙｓ（Ｃ），Ｔｙｒ（Ｙ），Ａｓｎ（Ｎ），Ｇｌｎ（Ｑ）
酸性：Ａｓｐ（Ｄ），Ｇｌｕ（Ｅ）
塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ），Ａｒｇ（Ｒ），Ｈｉｓ（Ｈ）
あるいは、天然に存在する残基は共通の側鎖性質に基づいてグループに分類されてもよい。
疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００２２】
表１
2010533866.tif 000003
【００２３】
「天然に生じるアミノ酸残基」（すなわち遺伝コードによってコードされるアミノ酸残基）は、アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；及び、バリン（Ｖａｌ）からなる群から選択されうる。「非天然に生じるアミノ酸残基」は、上記に挙げる天然に生じるアミノ酸残基以外の、ポリペプチド鎖内の隣接したアミノ酸残基（一又は複数）を共有結合することができる残基を指す。非天然に生じるアミノ酸残基の例には、例えば、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及び、例えば、Ellman等 Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)及び米国公開特許第２００３０１０８８８５号及び同第２００３００８２５７５号に記載されるものなどの他のアミノ酸残基類似体が含まれる。簡単に言うと、これらの手順は、ＲＮＡのインビトロ又はインビボの転写及び翻訳が続く非天然に生じるアミノ酸残基によるサプレッサーｔＲＮＡの活性化を伴う。例として、米国公開特許第２００３０１０８８８５号及び同第２００３００８２５７５号；Noren等 Science 244:182 (1989)；及び、上掲のEllman等を参照。
【００２４】
「単離された」ポリペプチドは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、ポリペプチドの診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。ある実施態様では、ポリペプチドは、（１）ローリー(Lowry)法により定量して、９５重量％のポリペプチドより多くなるほど、又は９９重量％より多くなるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度にまで、あるいは（３）クーマシーブルー又は銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性が得られるように十分な程度にまで精製される。ポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内にインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも一の精製工程により調製される。
【００２５】
「抗体」という用語は最も広義に使用され、モノクローナル抗体（完全長又は無傷のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多価抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片（以下を参照）を具体的に包含する。
特に断らない限りは、本明細書全体を通して「多価抗体」という表現は３又はそれ以上の抗原結合部位を含む抗体を指すために使用される。多価抗体は典型的には３又はそれ以上の抗原結合部位を持つように遺伝子操作されたもので、一般には天然配列ＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。
「抗体断片」は、一般には無傷の抗体の抗原結合を含み、よって抗原に結合する能力を保持している無傷の抗体の一部のみを含む。本定義に包含される抗体断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦａｂ断片；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基を持つＦａｂ断片であるＦａｂ’断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ断片；（ｉｖ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基とＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ’断片；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを持つＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward等, Nature 341, 544-546 (1989)）；（ｖｉｉ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉｉｉ）ヒンジ領域がジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ’断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Bird等, Science 242:423-426 (1988)；及びHuston等, PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)）；（ｘ）同一のポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を持つ「ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」（例えば、欧州特許公報第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；（ｘｉ）相補的軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む「線形抗体」（Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)；及び米国特許第５６４１８７０号）が含まれる。
【００２６】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる天然に生じる突然変異等の可能性のある突然変異を除いて、同一である。したがって、「モノクローナル」なる修飾語は、別の抗体の混合ではない抗体の性質を示す。モノクローナル抗体は非常に特異的で、単一抗原に対するものである。ある実施態様では、モノクローナル抗体は、一般に、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を包含しており、この場合の標的に結合するポリペプチドは、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られたものである。例えば、このような選択プロセスは、複数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールからの、独特のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的に対する親和性を向上させる、標的結合配列をヒト化する、細胞培養液中でのその産生を向上させる、インビボでのその免疫原性を低減する、多特異性抗体を作製する等が可能であること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。一般に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、１の抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、通常他の免疫グロブリンによって汚染されない点で有利である。
「モノクローナル」との修飾詞は、ほぼ均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作ることができ、それらの技術には例えばハイブリドーマ法（例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow等, Antibodies: A loboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Clarkson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照）、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、WO1998/24893; WO1996/34096；WO1996/33735；WO1991/10741；Jackobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；及び同第5,661,016号；Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)；Longerg等, Nature, 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)；及びLongerg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)）が含まれる。
【００２７】
ここに記載のモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から由来するか、特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である一方、鎖の残りが、他の種から由来するか、他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片を含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域からの残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種の高頻度可変領域からの残基(ドナー抗体)によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲｓがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部をまた含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。また例として、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；及び米国特許第 6,982,321号及び同第7,087,409号を参照。また、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)も参照のこと。抗原刺激に応答して抗体を産生するように修飾されているが、その内在性遺伝子座が無効になっているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによってヒト抗体を調製することができる(例として、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関する米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号を参照)。また、例えば、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成したヒト抗体に関するLi等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)も参照のこと。
【００２８】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、当該分野で知られている様々な技術を使用することによって生産することが可能である。一実施態様では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、ここでファージライブラリーがヒト抗体を発現する(Vaughan等, Nature Biotechnology 14:309-314 (1996):Sheets等, PNAS, (USA)95:6157-6162(1998)；Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。また、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウス中に導入することにより産生することができる。暴露時に、遺伝子再構成、アセンブリ及び抗体レパートリーを含む、あらゆる点でヒトに見られるものと密接に類似しているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチ法は、例えば米国特許第５５４５８０７号；第５５４５８０６号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５６６１０１６号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison等, Nature 368: 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して抗体を生産するヒトＢリンパ球の不死化によって調製されてもよい(そのようなＢリンパ球は、個体から回収されてもよいし、インビトロで免疫化されていてもよい)。例えば、Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)；Boerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)；及び米国特許第５７５０３７３号を参照のこと。
【００２９】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性への抗体の関与を示す。
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。例えば、高頻度可変領域は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示す、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。例として、Xu等 (2000) Immunity 13:37-45；Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ)のJohnson and Wu (2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。Hamers-Casterman等 (1993) Nature 363:446-448；Sheriff等 (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736。
【００３０】
多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＨＶＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらＨＶＲのそれぞれからの残基を以下に示す。
ループ    カバット          ＡｂＭ            Chothia           接触
Ｌ１    Ｌ２４−Ｌ３４      Ｌ２４−Ｌ３４    Ｌ２６−Ｌ３２    Ｌ３０−Ｌ３６
Ｌ２    Ｌ５０−Ｌ５６      Ｌ５０−Ｌ５６    Ｌ５０−Ｌ５２    Ｌ４６−Ｌ５５
Ｌ３    Ｌ８９−Ｌ９７      Ｌ８９−Ｌ９７    Ｌ９１−Ｌ９６    Ｌ８９−Ｌ９６
Ｈ１    Ｈ３１−Ｈ３５Ｂ    Ｈ２６−Ｈ３５Ｂ  Ｈ２６−Ｈ３２    Ｈ３０−Ｈ３５Ｂ
（カバット番号付け）
Ｈ１    Ｈ３１−Ｈ３５      Ｈ２６−Ｈ３５    Ｈ２６−Ｈ３２    Ｈ３０−Ｈ３５
（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け）
Ｈ２    Ｈ５０−Ｈ６５      Ｈ５０−Ｈ５８    Ｈ５３−Ｈ５５    Ｈ４７−Ｈ５８
Ｈ３    Ｈ９５−Ｈ１０２    Ｈ９５−Ｈ１０２  Ｈ９６−Ｈ１０１  Ｈ９３−Ｈ１０１
【００３１】
ＨＶＲは、次のような「拡大ＨＶＲ」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら各々を規定するために、Kabat等, 上掲に従って番号を付した。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義する高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００３２】
「カバット(Kabat)による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる言い回しは、上掲のKabat 等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
本明細書及び特許請求の範囲すべてにわたって、一般的に、可変ドメインの残基を指す場合にはカバット番号付けシステムを用いる(およそ、軽鎖の残基１−１０７と重鎖の残基１−１１３)(例として、Kabat 等, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。一般的に、イムノグロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合には、「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」を用いる(ＥＵインデックスはKabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)において報告されており、出典明記によって本明細書中に特別に組み込まれる)。本明細書中で特に述べない限り、抗体の可変ドメイン内の残基の数の参照は、カバット番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する。本明細書中で特に述べない限り、抗体の定常ドメイン内の残基の数の参照は、ＥＵ番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する(例として、米国特許仮出願第６０／６４０３２３号、ＥＵ番号付けについての図を参照)。
【００３３】
イムノグロブリンの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体(イムノグロブリン)は異なるクラスが割り当てられる。イムノグロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１(非Ａ及びＡアロタイプを含む)、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。イムノグロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、一般に、例えばAbbas等 Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)に記載されている。抗体は、抗体と一又は複数の他のタンパク質ないしペプチドとの共有的ないしは非共有的結合によって形成される大きな融合分子の一部であってもよい。
【００３４】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
「Ｆｃ領域」なる用語は、インタクト抗体のパパイン消化によって生成されうる免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は天然配列Ｆｃ領域又は変異形Ｆｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はおよそＣｙｓ２２６の位置又はおよそＰｒｏ２３０からの位置のアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの２つの定常ドメインを含み、場合によってＣＨ４ドメインを含む。
【００３５】
特に明記しない限り、本明細書中の免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、出典明記によって本明細書中に特別に援用される上掲のKabat等のＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号を指す。
本明細書中の「Ｆｃ領域鎖」は、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖の１つを意味する。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」(「Ｃｇ２」ドメインとも呼ばれる)は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで延びている。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと親密な対にならないという点で独特である。代わりに、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、無傷の天然IgG分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。炭水化物はドメイン−ドメイン対の代替物を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化を助けることができると推測される。BurtonによるMolec. Immunol. 22:161-206 (1985)を参照のこと。ここで、ＣＨ２ドメインは天然配列のＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインとすることができる。
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣ末端からＣＨ２ドメインまでの範囲(つまり、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸から約４４７位のアミノ酸)を含む。ここでは、ＣＨ３領域は、天然配列のＣＨ３ドメインか、又は変異体ＣＨ３ドメイン(例えば、その一鎖に「突出部（protruberance）」が導入され、それに対応して他の鎖に「空洞」が導入されたＣＨ３ドメイン：出典明記によって特別に本明細書中に援用される米国特許第５８２１３３３号参照)とすることができる。このような変異体ＣＨ３ドメインを使用して本明細書に開示する多重特異性(例えば二重特異性)抗体をつくることができる。
【００３６】
「ヒンジ領域」は、通常、ヒトＩｇＧ１の約Ｇｌｕ２１６又は約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０まで延びていると定義される(Burton, Molec. Immunol.22:161-206, 1985)。他のＩｇＧイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置に内部重鎖Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を配置することによりIgG1と整列させることができる。本明細書のヒンジ領域は、天然配列のヒンジ領域か、又は変異体ヒンジ領域とすることができる。変異体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、通常、１つのポリペプチド鎖につき少なくとも１つのシステイン残基を保持しており、よって２つの変異体ヒンジ領域のポリペプチド鎖は２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成することができる。本発明の好ましいヒンジ領域はは、天然配列のヒトヒンジ領域、例えば天然配列のヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つの「作動体機能」を有する。例示的「作動体機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)、食作用、細胞表面レセプター(例えばＢ細胞レセプター； ＢＣＲ)の下方制御などが含まれる。そのような作動体機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、そのような抗体の作動体機能を評価するための当技術分野で既知の様々なアッセイを使用して評価される。
「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を包含する。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非Ａ-及びＡ-アロタイプ)；天然配列のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域；並びに、これらの自然に生じる変異体が含まれる。
【００３７】
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を包含するものである。ある実施態様では、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親のポリペプチドのＦＣ領域におよそ１からおよそ１０のアミノ酸置換、好ましくはおよそ１からおよそ５のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、典型的には、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と、例えば少なくともおよそ８０％の同一性を有するか、又は少なくともおよそ９０％の配列同一性を、又は少なくともおよそ９５％の配列又はそれ以上の同一性を有するものであろう。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００３８】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。ある実施態様では、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が一般的に好まれる。エフェクター細胞はその天然源、例えば本明細書中に記載の血液又はＰＢＭＣから単離してもよい。
【００３９】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。いくつかの実施態様では、ＦｃＲは天然ヒトＦｃＲである。いくつかの実施態様では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ)を含んでいる(例としてDaeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲsに関しては、 例えばRavetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。
また、「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))と、免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie and Ward, Immunol. Today 18: 592-8 (1997)；Ghetie等, Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)；Hinton等, J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)；国際公開第2004/92219号 (Hinton等)を参照)。
インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又は変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。国際公開公報２０００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。例としてShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
【００４０】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更してＣ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体(変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチド)は、米特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開第１９９９／５１６４２号に記述される。また例としてIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照のこと。
「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。一実施態様では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００４１】
ここでの「可動(フレキシブル)リンカー」とはペプチド結合によって結合した２又はそれ以上のアミノ酸残基を含むペプチドを意味し、それによって結合された(例えば２つのＦｄ領域のような)２つのポリペプチドに対してより大なる回転自由度を提供する。そのような回転自由度により、可動リンカーによって結合された２又はそれ以上の抗原結合部位がそれぞれより効率的に標的抗原(一又は複数)に接近できるようになる。適切な可動リンカーペプチド配列の例には、gly-ser、gly-ser-gly-ser、ala-ser、及びgly-gly-gly-serが含まれる。
「二量体化ドメイン」は少なくとも２つのアミノ酸残基(一般にはシステイン残基)又は少なくとも２つのペプチド又はポリペプチド(これは同じか異なったアミノ酸配列を持ちうる)の結合(association)によって形成される。ペプチド又はポリペプチドは共有的及び／又は非共有的結合(一又は複数)によって互いに相互作用しうる。ここでの二量体化ドメインの例には、Ｆｃ領域；ヒンジ領域；ＣＨ３ドメイン；ＣＨ４ドメイン；ＣＨ１-ＣＬ対；出典明示によりここに取り込まれる米国特許第５８２１３３３号に記載されたような、遺伝子操作された「ノブ(knob)」及び／又は「隆起(protruberance)」を持つ「インターフェース」；ロイシンジッパー(例えば、ｊｕｎ／ｆｏｓロイシンジッパー、Kostelney等, J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)を参照；又は酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパー)；イソロイシンジッパー；レセプター二量体対(例えばインターロイキン-８レセプター(ＩＬ-８Ｒ)；及びインテグリンヘテロ二量体、例えばＬＦＡ-１及びＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ)、又はその二量体化領域(一又は複数)；二量体リガンドポリペプチド(例えば、神経成長因子(ＮＧＦ)、ニューロトロフィン-３(ＮＴ-３)、インターロイキン-８(ＩＬ-８)、血管内皮細胞成長因子(ＶＥＧＦ)、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ、ＰＤＧＦメンバー、及び脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)；Arakawa等, J. Biol. Chem. 269(45): 27833-27839 (1994)及びRadziejewski等 Biochem. 32(48): 1350 (1993)を参照)、又はその二量体化領域(一又は複数)；ジスルフィド結合を形成可能なシステイン残基対；ペプチド又はポリペプチドの間にジスルフィド結合が形成可能なようにそれぞれが少なくとも一つのシステイン残基(例えば約１、２又は３から約１０のシステイン残基)を有するペプチド又はポリペプチドの対(以下、「合成ヒンジ」)；及び抗体可変ドメインが含まれる。ここでの最も好適な二量体化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域である。
【００４２】
抗体の「機能的抗原結合部位」は標的抗原に結合可能なものである。抗原結合部位の抗原結合親和性は、抗原結合部位が由来する親抗体と必ずしも同じほどは強くはないが、抗原に結合する能力は、抗原に結合する抗体を評価するために知られている既知の様々な方法の何れか一つを使用して測定できるものでなければならない。更に、ここの多価抗体の抗原結合部位の各々の抗原結合親和性は定量的に同じである必要はない。ここの多量体抗体に対して、機能的抗原結合部位の数は超遠心分離分析法を使用して評価することができる。この分析法によれば、多量体抗体に対する標的抗原の異なった比を組み合わせ、複合体の平均分子量を、機能的結合部位の異なった数を仮定して算定する。これらの理論値を、機能的結合部位の数を評価するために得られた実際の実権値と比較する。
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体は同じ抗原に結合する他の抗体とは区別されるその抗体の生物学的特性の一又は複数を保有するものである。
対象の抗体が結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載のものなどの常套的な交差遮断(cross-blocking)アッセイを行ってもよい。
【００４３】
一又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時(同時期)及び／又は任意の順序での連続した投与を含む。
治療のための「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又は愛玩動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタなどを含む。典型的には、哺乳動物はヒトである。
「疾患」は本発明の分子による治療によって利益を得る任意の症状である。これには、哺乳動物が問題とする疾患に罹らしめる病理学的症状を含む、慢性及び急性の疾患ないし疾病が含まれる。疾患は、細胞増殖性疾患、血管形成性疾患および炎症性疾患、血管形成性疾患、および免疫疾患（自己免疫不全を含むがこれに限定されない）を含む。
【００４４】
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖および／または肥大を伴う疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
「炎症性疾患」および「免疫疾患」なる用語は、異常な免疫機構および／または異常なサイトカイン・シグナル伝達（例えば、異常なインターフェロン・シグナル伝達）によって生じる疾患を指すかまたは記載する。炎症性疾患と免疫疾患の例は、自己免疫疾患、免疫不全症候群および過敏症を含むが、これに限定されるものではない。
「炎症性疾患」なる用語は、炎症性の状態に基づくかまたは関連した疾患又は病状を指す。炎症性疾患は、自己免疫疾患、高血糖疾患及びとインスリン耐性と関連する疾患を含むが、これに限定されるものではない。
【００４５】
「自己免疫疾患」なる用語は、個体自身の組織から生じ、該組織に対する非悪性疾患又は障害である。自己免疫疾患は典型的には免疫系に破壊された自己反応性免疫細胞不全によって特徴付けられる：自己反応性リンパ球は、過剰発現する、生存促進アポトーシス因子の活性を増加させる、又はアポートシス促進因子の発現又は活性を減少させることが同定されている。本明細書において、自己免疫疾患は、悪性のまたはガン疾患または病状、特にＢ細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病と慢性骨髄芽球性白血病を除外する。自己免疫疾患又は障害の例には、これらに限るものではないが、炎症反応、例えば乾癬及び皮膚炎(例えばアトピー性皮膚炎)を含む炎症性皮膚病；全身性強皮症及び硬化症；炎症性腸疾患(例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎)に関連した反応；呼吸困難症候群(成人性呼吸困難症候群；ＡＲＤＳを含む)；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；アレルギー病状、例えば湿疹及び喘息及びＴ細胞の浸潤に関連した他の病状及び慢性炎症反応；アテローム性動脈硬化症；白血球付着欠損症；リウマチ様関節炎；全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)（ループス腎炎、皮膚狼瘡を含むがこれに限らず）；真性糖尿病(例えば、Ｉ型真性糖尿病又はインスリン依存性真性糖尿病)；多発性硬化症；レノー症候群；自己免疫甲状腺炎；橋本甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年発症糖尿病；及び結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽種症及び血管炎に典型的に見出されるＴリンパ球及びサイトカインにより媒介される急性及び遅延高血圧に関連した免疫反応；悪性貧血(アジソン病)；白血球血管外遊出に関連した疾患；中枢神経系(ＣＮＳ)炎症障害；多臓器傷害症候群；溶血性貧血(限定するものではないが、クリオグロブリン血症又はクームズ陽性貧血)；重症筋無力症；抗原-抗体複合体媒介性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランベルト-イートン筋無力症症候群；類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫多腺性内分泌障害；ライター病；スティフマン症候群；ベーチェット疾患；巨細胞動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性神経障害；免疫血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)又は自己免疫血小板減少病等が含まれる。
【００４６】
「高血糖性疾患」なる用語は、糖尿病と関連した疾患／障害を含むがこれに限定されるものではなく、高血糖障害によって生じる高脂血症と肥満を含むがこれに限定されるものではない。
「インスリン耐性と関連する疾患」なる用語は、インスリン耐性、多嚢胞性卵巣症候群、冠状動脈疾患および末梢血管疾患を含むが、これに限定されるものではない。
【００４７】
「有効量」又は「治療的有効量」という用語は、哺乳類の疾病や疾患の治療のために有効な薬剤の量に相当する。癌の場合は、有効量の薬剤により、癌細胞の数を減少させ；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、典型的には止める)し；腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、典型的には止める)し；腫瘍の成長をある程度阻害し；腫瘍の治療を可能にする；及び／又は疾患に関連する一又は複数の症状をある程度和らげることが可能である。ある程度、薬剤は、成長を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺すことが可能で、細胞分裂停止性及び／又は細胞障害性である。癌治療に対しては、インビボにおける効力は、例えば生存期間、病状の進行時間(ＴＴＰ)、応答速度(ＲＲ)、応答期間、及び／又は生活の質の測定により測定される。大腸腺腫の場合、治療的有効量の薬剤により、例えば、腺腫細胞数の減少；腺腫サイズの減少；腺腫数の減少；腺腫の成長のある程度の阻害；及び／又は本疾患に関係する一又は複数の症状のある程度の軽減しうる。
「治療」は、治療的処置及び予防的又は防止的な処置を指す。治療を必要とするものには、既に疾患を有するもの、並びに予防すべき疾患があるものが含まれる。本発明のある実施態様では、治療は、腫瘍増殖の抑制、又は自己免疫疾患の抑制を指してもよい。
本発明のポリペプチドに関して「生物学的活性」及び「生物学上活性な」なる用語は、標的に特異的に結合して細胞の応答、例えば増殖、移動などを調節する分子の能力を指す。また、細胞性応答には、レセプターによって媒介されるもの、例えば限定するものではないが、移動及び／又は増殖が含まれる。ここでは「調節する」なる用語には促進及び阻害が含まれる。
【００４８】
「癌」及び「癌性」なる用語は、、一般的に調節されない細胞増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は記述する。癌の例には、限定するものではないが、カルチノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより具体的な例には、腎臓又は腎性癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、肺癌、例として小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、扁平細胞癌(例えば上皮の扁平細胞癌)、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肝癌、膀胱癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃(gastric、stomach)癌、消化管間質腫瘍(ＧＩＳＴ)、膵癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、莢膜細胞腫、男化腫瘍、肝細胞癌、非ホジキンリンパ腫を含む血液悪性腫瘍(ＮＨＬ)、多発性骨髄腫及び急性の血液系悪性腫瘍、子宮内膜ないし子宮カルチノーマ、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛膜癌、唾液腺カルチノーマ、外陰部癌、甲状腺癌、食道カルチノーマ、肝癌、肛門部のカルチノーマ、陰茎カルチノーマ、上咽頭癌、喉頭のカルチノーマ、カポシ肉腫、メラノーマ、皮膚カルチノーマ、シュワン腫、乏突起細胞腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉種、平滑筋肉腫、尿路カルチノーマ、甲状腺カルチノーマ、ウィルムス腫瘍、並びにＢ細胞リンパ腫(例えば低グレード／濾胞性非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；小リンパ球性(ＳＬ)ＮＨＬ；中間グレード／濾胞性ＮＨＬ；中間グレード広汎性ＮＨＬ；高グレード免疫芽細胞ＮＨＬ；高グレードリンパ芽球ＮＨＬ；高グレード小型非分割細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変(bulky disease)ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連のリンパ腫；及び、 ワルデンシュトレームマクログロブリン血症)；慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)；急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)；線毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び、移植後のリンパ増殖性疾患(ＰＴＬＤ)、並びに母斑症、浮腫(脳腫瘍と関係しているものなど)及びメイグス症候群と関係している異常な血管性増殖が含まれる。本明細書中で用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性のいずれであっても、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖、及びすべての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。 
【００４９】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学治療薬、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素を含むように意図されている。
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロ及び／又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期で細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール(登録商標)、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００５０】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標)；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、CPT-11(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９−アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照)；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣＩリポソーム注射剤(DOXIL(登録商標))及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(gemcitabine) (GEMZAR(登録商標))、テガフル(tegafur) (UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(capecitabine) (XELODA(登録商標))、エポチロン(epothilone)、及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド類、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標))、パクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(ABRAXANETM)、及びドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、及び５-ＦＵ及びロイコボビン(leucovovin)とオキサリプラチン(ELOXATINTM)を組み合わせた治療法の略称であるFOLFOXが含まれる。
【００５１】
またこの定義に含まれるものには、癌の増殖を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ(ＳＥＲＭ)を含み、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)(EVISTA(登録商標))、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(FARESTON(登録商標))；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節剤(ERD)；卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)アゴニスト、例えば酢酸リュープロリド(LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標))、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；その他抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール(MEGASE(登録商標))、エキセメスタン(AROMASIN(登録商標))、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ボロゾール(RIVISOR(登録商標))、レトロゾール(FEMARA(登録商標))、及びアナストロゾール(ARIMIDEX(登録商標))である。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート(例えばBONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、エチドロン酸(DIDROCAL(登録商標))、NE-58095、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ZOMETA(登録商標))、アレンドロネート(FOSAMAX(登録商標))、パミドロン酸(AREDIA(登録商標))、チルドロン酸(SKELID(登録商標))、又はリセドロン酸(ACTONEL(登録商標))、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)；THERATOPE(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤(例えばLURTOTECAN(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばABARELIX(登録商標))；ラパチニブ(lapatinib ditosylate)(GW572016としても知られるＥｒｂＢ-２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤)；セレコシブ(celecoxib)などのＣＯＸ-２阻害剤(CELEBREX(登録商標)；４-(５-(４-メチルフェニル)-３-(トリフルオロメチル)-１Ｈ-ピラゾル-１-イル)ベンゼンスルホンアミド；及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００５２】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−α及び−β；ミューラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（例えばＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ）；胎盤由来の増殖因子（ＰｌＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ、例えばＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ）；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えばＮＧＦ−α；血小板増殖因子；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；オステオインダクティブ因子；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β、−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、  ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、  ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−３０のインターロイキン（ＩＬ）；セクレトグロビン／ウテログロビン；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）；ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合は、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００５３】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, :375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), 247-267項, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
【００５４】
「血管新生因子又は薬剤」は、血管の発達を刺激する、例えば、血管新生、血管内皮細胞増殖、血管及び／又は脈管形成の安定性などを促進する増殖因子である。例えば、血管新生因子には、限定するものではないが、例えば、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦファミリのメンバー、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリ、線維芽細胞増殖因子ファミリ（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンギオポイエチン）、エフリン、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４などが含まれる。また、創傷治癒を促す因子、例として、成長ホルモン、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＩＧＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦ、及びそのファミリのメンバー、及びＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βが含まれる。例としてKlagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Tonini等, Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例えば、血管新生因子を列挙する表１)；及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)を参照。
「抗血管新生剤」又は「血管新生インヒビター」は、小分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はこれらのコンジュゲートないし融合タンパク質を指し、直接又は間接的に、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を阻害するものである。例えば、抗血管新生剤は、上記に定義するように、血管新生剤に対する抗体又は他のアンタゴニスト、例えばＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターシグナル伝達を遮断する小分子（例えばＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、ＳＵＴＥＮＴ／ＳＵ１１２４８（リンゴ酸スニチニブ）、ＡＭＧ７０６）である。また抗血管新生剤には、天然の血管新生インヒビター、例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなどが含まれる。例としてKlagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)(例えば、悪性メラノーマの抗血管新生療法を列挙する表３)；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Tonini等, Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例えば、抗血管新生因子を列挙する表２)；及び、Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)(例えば、臨床試験で用いられる抗血管新生剤を挙げる表１)を参照。
【００５５】
本明細書中で用いる「免疫抑制剤」なる用語は、本明細書において治療される哺乳動物の免疫系を抑制するか又は隠すために作用する物質を指し、炎症を調製することを含む。これには、限定するものではないが、サイトカイン産生を抑制する物質、自己抗原発現を下方制御は又は抑制する物質、又は、ＭＨＣ抗原をマスキングする物質が含まれる。このような薬剤の例には、２-アミノ-６-アリル-５-置換ピリミジン(米国特許第４６６５０７７号を参照)；非ステロイド性抗炎症薬(ＮＳＡＩＤ)；ガンシクロビル、タクロリムス、糖質コルチコイド、例として、コルチゾール又はアルドステロン、抗炎症剤、例として、シクロオキシゲナーゼインヒビター、５-リポキシゲナーゼインヒビター又はロイコトリエンレセプターアンタゴニスト；プリンアンタゴニスト、例として、アザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル(ＭＭＦ)；アルキル化剤、例として、シクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタールアルデヒド(ＭＨＣ抗原をマスキングするもの、米国特許第４１２０６４９号に記載)；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；ステロイド、例として、副腎皮質ステロイド又は糖質副腎皮質ステロイド又は糖質コルチコイド類似体、例えばプレドニゾン、メチルプレドニゾロン及びデキサメサゾン；ジヒドロ葉酸レダクターゼインヒビター、例えばメトトレキセート(経口又は皮下)；ヒドロキシクロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカインないしはサイトカインレセプター抗体、例えば抗インターフェロン-α、-β又は-γ抗体、抗腫瘍壊死因子-α抗体(インフリキシマブ又はアダリムマブ)、抗ＴＮＦ-αイムノアドヘシン(エタネルセプト)、抗腫瘍壊死因子-β抗体、抗インターロイキン２抗体及び抗ＩＬ-２レセプター抗体；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ-１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種性の抗リンパ球グロブリン；パン-Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(１９９０年７月２６日に発行の国際公開第１９９０／０８１８７号)；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ-β；ストレプトドルナーゼ；宿主のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター(Cohen等、米国特許第５１１４７２１号)；Ｔ細胞レセプター断片(Offner等, Science, 251: 430-432 (1991)；国際公開第１９９０／１１２９４号；Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公開第１９９１／０１１３３号)；及び、Ｔ細胞レセプター抗体(欧州特許第３４０１０９号)、例えばＴ１０Ｂ９が含まれる。
「非ステロイド系抗炎症薬」又は「ＮＳＡＩＤ」の例は、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、これらの塩類及び誘導体などが含まれる。
【００５６】
ここで使用される「標識」なる語句は、ポリペプチドに直接的に又は間接的に抱合した検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自体が検出可能(例えば、放射性標識又は蛍光標識)であり得、あるいは酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変化を触媒しうる。
「単離された」核酸分子は、同定され、ポリペプチド核酸の天然源に通常付随している少なくとも一の汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるポリペプチドを通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
【００５７】
本発明の方法
本発明は、ＩＲＴＭ、特にＴＡＭ及びＡＴＭの特定の新規な特性及び活性を同定し、これは治療目的のための本発明の方法を用いて有効に用いられる。慢性炎症は、例えば癌、ＩＩ型糖尿病及びアテローム性動脈硬化など異なる疾病原因の起源を有する多くの疾患の共通の特徴である。最近、マクロファージはこれらの疾患の発病学に直接関係していることが示された（Mantovani et al., Immunol. Today 13:265-70, 1992; Pollard, Nat. Rev. Cancer 4: 71-8, 2004; Arkan et al., Nat. Med. 11: 191-8, 2005; Lumeng et al., J. Clin Invest. 117: 175-84, 2007; Liang et al., Circ. Res. 100: 1546-55, 2007; Choudhury, Nat Clin Pract Cardiovasc Med 2 (6): 309-15, 2005）。腫瘍の機能を理解するために、ヒト浸透乳管癌の多くの側面を再現するＰｙＭＴｔｇモデルにおいてＴＡＭを特徴づけるための実験が行われた（Lin et al., Am J. Pathol 163: 2113-26, 2003）。他の炎症性疾患（ＩＩ型糖尿病及びインシュリン耐性を含むがこれに限られない）における機能を理解するために、慢性的な高脂肪食を給餌されたマウスからのＡＴＭを特徴づけるための実験が行われた。
ここに示され、公知技術として知られるように、ＴＡＭは腫瘍免疫細胞浸潤において共通に見いだされる。高レベルのＴＡＭは、ヒト腫瘍の予後不良と相関しており、乳癌の遺伝モデルにおけるＴＡＭ分化の抑制は腫瘍発達及び転移の速度を減少させることを示した（Lin et al., 2001）。ＴＡＭがＶＥＧＦのような血管新生の因子を産生し、それにより腫瘍の血管系を増大するすることによって腫瘍増殖に寄与することが提唱された（Leek等、1996; Lin等、2006）。他にも、ＴＡＭが腫瘍におけるプロフェッショナル抗原提示細胞（例えば樹状細胞）の成熟を阻害する特定のサイトカインを分泌することにより耐性を誘導し、免疫系に異常な腫瘍細胞を提示する細胞の能力を弱めることにおいて間接的な役割を有することにより、腫瘍に対する効果的免疫応答が上昇しないことが示唆された（Mantovanti等、2002; Pollard et al., 2003）。  
ここに、上記の活性に加えて、ＴＡＭが２つの特異的なＣＤ４＋Ｔ制御細胞サブセット：ＦｏｘＰ３＋Ｔ制御細胞及びＩＬ−１０＋Ｔｒ１細胞を誘導することが示される。ｎａiｖｅＴ細胞とのＴＡＭのインキュベーションは、それらの細胞型から産生されると思われるサイトカインの産生及びＩＬ−１０＋Ｔｒ１及びＦｏｘＰ３＋Ｔ制御細胞の増殖を誘導したが、ｎａiｖｅＴ細胞とのｂｍＤＣのインキュベーションは同じ効果を有しなかった。ＴＡＭによるこの誘導は、培養のＴＧＦβＲＩＩの混入によって抑制され、ＴＧＦβがＴＡＭ−誘導性のそれらの細胞型の誘導にとって重要なことを示唆した。これらの制御Ｔ細胞サブセットの上昇したレベルは、固形腫瘍及び減少した全乳癌生残率と相関していた（Leong et al., 2006; Liyanage et al., 2002; Marshall et al., 2004; Seo et al., 2001; Curiel et al., 2004;及びBates et al., 2006）ＴＡＭはインビトロで炎症性ＴＨ１７細胞を誘導することもまた示され、腫瘍を有しているＰｙＭＴｔｇの流入領域リンパ節において観察される増加した数のＴＨ１７細胞と相関した。ＴＡＭはＩＬ−１７＋Ｔ細胞を誘導する能力においてｂｍＤＣ又は腹腔マクロファージと類似していたのに対して、他の型のマクロファージはいずれも制御及び炎症誘発性Ｔ細胞サブセットを誘導できなかった。ＴＡＭによってインビトロで誘導されるＴ細胞のプロファイルは、乳腫瘍を有している動物において増大されるＴ細胞の型と同一だった。本発明は、腫瘍増殖及び活性の開始、進行又は重症度を調節するために、インビトロ及びインビボにおけるＩＬ−１０＋Ｔｒ１及びＦｏｘＰ３＋制御Ｔ細胞及び炎症性ＴＨ１７細胞のＴＡＭ−媒介性誘導を調節する方法を提供する。本発明は、ＴＡＭの存在、量及び／又は活性を検出することによって、腫瘍形成、進行の検出する、及び／又は腫瘍の段階づける方法も提供する。  
【００５８】
齧歯動物と同様にヒトにおいて、肥満は、脂肪組織マクロファージ（ＡＴＭ）の増加した浸潤と関連している。肥満は、心臓血管疾患、糖尿病、腎臓疾患及びある種の癌と相関していた（Flegal et al., JAMA 298(17): 2028-37, 2007).肥満は、対象のインシュリン耐性及びＩＩ型糖尿病の発達の素因となる慢性炎症とも関連している。いくつかの最近の研究は、ＡＴＭが、脂肪細胞におけるインシュリン作用をブロックでき、全身性インシュリン耐性の誘因として提唱されている炎症性サイトカインを産生することを証明した（Weisberg et al., J. Clin. Invest. 112: 1796-808, 2003; Arkan et al., Nat. Med. 11: 191-8, 2005; Neels and Olefsky, J. Clin. Invest. 116: 33-5, 2006; Lumeng et al., J. Clin. Invest. 117: 175-84, 2007）。ここで、ＴＡＭの様に、ＡＴＭが２つの特異的なＣＤ４＋Ｔ制御細胞サブセット：ＦｏｘＰ３＋Ｔ制御細胞及びＩＬ−１０＋Ｔｒ１細胞を誘導すること、及び炎症性ＴＨ１７細胞を誘導することが示される。
正常なシステムにおいて、制御Ｔ細胞は、通常のＴ細胞を抑制し、活性を下方制御することによって免疫寛容導入を誘導する際に重要な役割を演じる。制御Ｔ細胞は種々の実験的な自己免疫疾患設定において治療的であることを示した（Suri-Payer and Fritzsching, Springer Semin. Immun. (2006) 28:3-16を参照）。免疫不全、特に炎症性及び自己免疫疾患のような特定の疾患において選択的に制御Ｔ細胞（このような細胞が治療的価値を有する）を誘導する能力は、明確な治療的価値を有する。本発明は、ＴＡＭ又はＡＴＭの存在又は活性を調節することによってＩＬ−１０＋Ｔｒ１及びＦｏｘＰ３＋制御Ｔ細胞誘導を開始及び／又は刺激する方法も提供し、この方法は炎症性及び自己免疫疾患の開始、進行又は重症度を調節するために用いられてもよい。
ＴＨ１７細胞も、腫瘍及び脂肪組織の流入領域リンパ節において高いレベルで存在する。癌又はＩＩ型糖尿病の病理学におけるＴＨ１７細胞の役割は、まだ明確でない。他の炎症誘発性メディエータ（例えばＴＮＦα、ＩＬ−１β及びＩＬ−６）の発現を誘導することによって、ＩＬ−１７は間接的に腫瘍増殖を促進しているかもしれない。ＩＬ−１７は、ＴＮＦαがＮＦ−κＢを活性化するように、腫瘍に対する生存促進及び血管新生の因子として、直接作用するかもしれない（Lin, and Karin, J Clin Invest 117 (5): 1175-83, 2007; Takahashi, et al., Immunol Lett 98 (2): 189-93, 2005; Numasaki et al., J Immunol 175 (9): 6177-89, 2005）。興味深いことに、コントロール・マクロファージでなく、ＡＴＭ及びＴＡＭがインビトロで制御Ｔ及びＴＨ１７細胞を誘導し、これらの集団の両方とも腫瘍をもったマウス及び肥満マウスにおいて増加する。これらのデータは、炎症誘発性及び抗炎症性メカニズムが共存し、慢性炎症の状態に導かれることを再び強調する。このような慢性炎症は、ＴＡＭ又はＡＴＭの存在又は活性を調節することによって調節される可能性がある。  
【００５９】
ここに記載されている研究は、ＴＡＭ及びＡＴＭのさらなる特徴を提供する。例えば、ＴＡＭは、サイトカイン／ケモカイン産生及び細胞表面マーカーに関して腹腔マクロファージ及びｂｍＤＣの特定の特性を有することが示された。ここに示されるように、ＴＡＭはマクロファージ・マーカーであるＦ４／８０と、樹状細胞マーカーであるランゲリン及びＣＤ１１ｃを発現する。ＡＴＭは、マクロファージ・マーカーであるＦ４／８０と、樹状細胞マーカーであるＣＤ１１ｃを発現する。さらにまた、各々のＴＡＭ及びＡＴＭはケモカイン、サイトカイン、ケモカイン受容体及びサイトカイン受容体の異なるサブセットを発現し（図１４Ａ−Ｃ及びＥを参照）、それはＴＡＭ又はＡＴＭの存在及び／又は活性のマーカーとして個々に又は集合的に用いることができる。本発明は、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭマーカーを検出するために一つ以上の試薬を集団又は試料と接触させ、残りの集団又は試料から選択的にＴＡＭ及び／又はＡＴＭを分離することによって、細胞の集団又は細胞を含む試料からＴＡＭ及び／又はＡＴＭを同定／検出及び単離する方法を提供する。  本発明は、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭを調節する方法も提供する。例えば、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭの活性もしくは機能は、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭを選択的に取り除く又は死滅させることによって抑制される可能性がある。これを達成する方法は、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭ−結合剤で特異的にＴＡＭ及び／又はＡＴＭを標的にして（すなわち、マクロファージ特異的かつＤＣ特異的な細胞表面マーカーを同時に有する細胞だけを標的とすることによって）、集団から特異的に標的とされた細胞を選択的に取り除くことである。例えば、特異的にＦ４／８０及びＣＤ１１ｃを認識する二重特異性抗体又はその断片は、例えばプロテインＡクロマトグラフィ又はＦＡＣＳ、アフィニティークロマトグラフィ及び磁気細胞選別を含むがこれに限られない公知技術の抗体捕捉及び分離の他の方法によって、特異的にＴＡＭ及び／又はＡＴＭを結合し、残りの細胞集団／試料からＴＡＭ及び／又はＡＴＭを分離するために用いられる可能性がある。他の方法では、特異的にＴＡＭ及び／又はＡＴＭを標的にすることができ（すなわち、マクロファージ特異的かつＤＣ特異的な細胞表面マーカーを同時に有する細胞だけを標的とすることによって）、集団から特異的に標的とされた細胞を選択的に死滅させることができる。例えば、上記の通りの同じ二重特異性抗体（又はその断片）のシナリオは用いられ得るが、抗体はさらに細胞障害性分子と融合されていてもよく、抗体のエフェクタ機能はそれ自体で抗体と結合するＴＡＭ及び／又はＡＴＭのクリアランス及び滅失を誘発するのに十分であってもよい。二重特異性又は多重特異性抗体を用いる必要はない；
【００６０】
当業者は、同じゴールが、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭと関連する細胞の混合物から選択的に除く手段を提供する二個以上別々の抗体又はその断片、又は他の結合分子を用いても達成し得ると認識している。このような選択のための適切なＴＡＭおよび／またはＡＴＭ細胞表面マーカーは、例えば、図１４Ｂ及び１４Ｅにおいて見いだされ、Ｉ型ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ４Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα；ＩＬ−１７Ｒα；ＴＧＦβＲＩＩ；ＣＣＲ６；及びＣＸ３ＣＲ１を含むがこれに限定されるものではなく、それぞれＴＡＭ対ＡＴＭで差次的な発現を示す。  
本発明は、ＴＡＭおよび／またはＡＴＭ機能を特異的に抑制することによってＴＡＭおよび／またはＡＴＭを調節する方法をも提供する。例えば、サイトカイン又はケモカインなどの一つ以上の細胞メッセンジャーの分泌によってＴＡＭおよび／またはＡＴＭは、特定のその効果及び活性を媒介する可能性がある（すなわち、ここに示されるようなＴＧＦβ活性を必要とする特定の制御Ｔ細胞又は炎症性Ｔ細胞のＴＡＭ−媒介誘導）。特異的に分泌を阻害又はブロックする、及び／又は環境からＴＡＭおよび／またはＡＴＭによって通常分泌される一つ以上の細胞メッセンジャーを取り除くことは、ＴＡＭおよび／またはＡＴＭの効果及び活性を抑制する効果を有する。このような阻害は、例えばＴＡＭ及び／又はＡＴＭサイトカイン／ケモカイン結合剤（抗細胞メッセンジャー抗体又はその断片（例えば抗ＴＧＦβ抗体）及び小分子を含むがこれに限らない）を投与することによってでもよい。ＴＡＭ又はＡＴＭによって発現されるケモカイン及びサイトカインは、１４Ａ及び１４Ｃ図に示されるサイトカイン及びケモカインを含むが、これに限定されるものではない。
本発明は、特定の免疫細胞を選択的に産生及び／又は単離する方法を提供する。ここに示されるように、ＴＡＭ及びＡＴＭはマクロファージ及び樹状細胞の両方の特定の特性を有する分化した免疫細胞である。ＴＡＭは、腫瘍の免疫浸潤物のごく一部であり、取得することは難しかった。特定の樹状細胞及び特定のマクロファージの細胞表面マーカーの発現に基づいてＴＡＭを単離するための本発明の方法は、調査又は治療的な用途のための、混合された細胞集団からＴＡＭを得る有用な方法を提供する。同様に、特定の樹状細胞及び特定のマクロファージの細胞表面マーカーの発現に基づいてＡＴＭを単離するための本発明の方法は、調査又は治療的な用途のための混合された細胞集団からＡＴＭを得る有用な方法を提供する。ＴＡＭ及びＡＴＭは、細胞型間で異なる細胞表面マーカーの組合せに基づいた単離又は精製により別々に単離又は精製されてもよいことは当業者によって認められている。限定しない一つの例としては、ＴＡＭはＩＬ−４Ｒαを発現するがＡＴＭはしない。他の例として、ＴＡＭ及びＡＴＭにおいて特異に発現されるそれらのサイトカイン受容体及びケモカイン受容体を含むが、これに限定されるものではない（図１４Ｂ及び１４Ｅを参照）。本発明は、ＴＡＭ又はＡＴＭで培養を刺激することによってｎａiｖｅＴ細胞培養から選択的にＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔｒ１細胞、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ制御細胞および／またはＴＨ１７細胞を誘導する方法を提供する。多くのこれらの３つのＴ細胞型を再現的に産生しうることは、治療的及び調査に有用である。
【００６１】
上で記載されている剤の一つ以上を含んでいる組成物（すなわち、ＩＲＴＭ−ターゲッティング剤（すなわちＴＡＭ−ターゲッティング剤又はＡＴＭ−ターゲッティング剤）及び／又はＩＲＴＭ細胞メッセンジャ−ターゲッティング剤（すなわちＴＡＭ細胞メッセンジャ−ターゲッティング剤又はＡＴＭ細胞メッセンジャ−ターゲッティング剤）が提供される本発明は、特異的にＩＲＴＭを標的とする一つ以上の剤（すなわちＴＡＭ−又はＡＴＭ−ターゲッティング剤及び／又はＴＡＭ又はＡＴＭによって分泌される細胞メッセンジャー）だけでなく一つ以上の化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、抗血管新生剤、免疫抑制因子、細胞障害性剤又は増殖阻害剤を含む組合せ治療方法及び組成物を提供する。これらの組合せ治療は、腫瘍の血管新生及び増殖を抑制でき、及び／又は炎症性又は自己免疫疾患を治療できる。組合せ治療は、同時又は経時的に投与されてもよい。  
さらに、キットが提供される。このようなキットは、ここに記載されている一つ以上の組成物又は組合せ治療を含んでもよく、さらにこのような治療を必要とする対象に適切な投薬を測定及び／又は投与するための手段を含んでもよく、選択的に更に使用説明書を含んでもよい。  
【００６２】
診断方法
本発明は、細胞増殖性の疾患、血管新生疾患及び炎症性、血管新生性及び免疫性疾患（自己免疫不全を含むがこれに限らず）を診断するための方法及び組成物をも提供する。本発明の特定の実施態様において、本発明の方法は、試験及び基準細胞集団に存在するＴＡＭ又はＡＴＭのレベルを比較する。公知技術のタンパク質及び核酸の検出システムと組み合わせたマクロファージ及び樹状細胞とＴＡＭ及び／又はＡＴＭを区別するＴＡＭ及びＡＴＭの表面マーカーに関するここに開示される情報は、存在の検出及び異なる細胞集団／試料に存在する相対量の比較を可能にする。  
試験細胞集団は、いかなる数の細胞、つまり一つ以上の細胞であってもよく、インヴィトロ、インビボ又はエクスビボで提供されてもよい。ある実施態様では、試験試料（例えば腫瘍細胞集団）にできる限り類似した基準細胞集団中の細胞は組織型に由来する。いくつかの実施態様において、基準細胞集団は試験細胞集団と同じ対象に由来し、例えば試験細胞集団の起源の領域に由来される。いくつかの実施態様において、基準細胞集団は試験細胞集団と同じ組織型に由来したが、異なる時間（例えば、試験細胞集団より早い時間）にその対象から採取された。いくつかの実施態様において、一連の基準細胞集団試料は、対象から一定の時間間隔で採取される（例えば、毎日、毎週、毎月又は毎年）。本発明の一実施態様において、基準細胞集団は複数の細胞に由来する。例えば基準細胞集団は、ＴＡＭのデータベース及び／又は前に試験された細胞からのＡＴＭ発現パターンであってもよい。
【００６３】
タンパク質及び核酸検出方法
本発明のタンパク質の存在、活性又は量を検出することは、公知技術の方法を用いて容易に行うことができる。発現は、タンパク質レベルで、すなわちポリペチドのレベルを測定することによって測定することができる。このような方法はその分野でよく知られており、例えば、タンパク質に対する抗体に基づくイムノアッセイを含む。被覆細胞集団のタンパク質配列の一つ以上の発現量が、基準細胞集団からの一つ以上の細胞の配列の発現量と比較することができる。細胞の試験及びコントロール群の配列の発現は、核酸配列の発現を比較するのためのその分野で認識されている方法を用いて比較することができる。例えば、発現は、米国特許番号５，８７１，６９７及びShimkets et al., Nat. Biotechnol. 17:798-803において記載されるように、ＧＥＮＥＣＡＬＬＩＮＧＴＭ法を用いて比較することができる。本発明の特定の実施態様において、１、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、２０以上、２５以上のタンパク質配列の発現は、測定される。
例えばはヘテロジーニアス又はホモジーニアスな位相において実行される競合的結合アッセイ、直接的または間接的なサンドイッチ・アッセイ及び免疫沈降アッセイなど、その分野で知られる様々なアッセイ技術を用いてもよい（Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158）。アッセイにおいて用いられる抗体又はその抗原結合性フラグメントは、検出可能な成分で標識化され得る。検出可能な成分は、直接又は間接的に検出可能なシグナルを産生可能であるべきである。例えば、検出可能な成分は、ラジオアイソトープ（たとえば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ）、蛍光又は化学発光化合物（たとえばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン）又は酵素（たとえばアルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼ又はワサビペルオキシダーゼ）であってもよい。検出可能な成分に抗体を融合するための当分野で周知の方法が使用されてもよく、Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981);及びNygren, J. Histochem. And Cytochem., 30:407 (1982)に記載されているそれらの方法を含む。
核酸検出技術もまた当分野において周知であり、ある実施態様において、一つ以上のＴＡＭ及び／又はＡＴＭ細胞表面マーカー又は他のＴＡＭ及び／又はＡＴＭ−特異的分子のｍＲＮＡの存在を評価し、細胞試料が取り出された細胞集団におけるＴＡＭ及び／又はＡＴＭの存在又は量を決定するために用いられてもよい。ある実施態様では、少なくとも２つの異なるＴＡＭおよび／またはＡＴＭ細胞表面マーカーをコード化しているｍＲＮＡの存在又は量が評価される。核酸の存在、量又は活性を評価するために用いることができる組換えＤＮＡ技術で当分野において共通に知られる方法は、例えばAusubel等、eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY及びKriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記載されている。
選択的に、差次的に発現された配列の試験細胞集団及び基準細胞集団間の比較は、発現がパラメータ又は測定されるコンディションには依存しないコントロール核酸に対しても行われる。試験及び基準核酸におけるコントロール核酸の発現量は、比較された集団のシグナルレベルを標準化するために用いることができる。適切なコントロール核酸は、当業者によって容易に決定されることができる。 
【００６４】
診断又はマーカー・セット
また、本発明は、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭを同定するためのマーカーセットを提供する。
ある実施態様では、これらのマーカーセットは、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭの存在を評価するためのキットとして提供される。例えば、マーカーセットには、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、２０以上、又はすべての分子セットが含まれる。前記分子は、細胞内タンパク質、分泌タンパク質又はＴＡＭ及び／又はＡＴＭの細胞表面マーカーをコードする核酸であり、Ｆ４／８０、ＣＤ１１ｃ及びランゲリンを含むがこれに限定されるものではない。本発明の一実施態様では、一以上のそのようなタンパク質を検出する抗体が提供される。ここに示されるように、ＴＡＭ及びＡＴＭがマクロファージ及び樹状細胞の細胞表面マーカーの両方を発現しており、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭを検出するためマーカーセットはマクロファージ・マーカー及び樹状細胞マーカーを含んでもよい。樹状細胞マーカーは一般にＴＡＭ、ＡＴＭ及び樹状細胞を単独で検出するために用いることができ、マクロファージ・マーカーは一般的にＴＡＭ、ＡＴＭ及びマクロファージを単独で検出するために用いられることは認識されている。
【００６５】
治療上の用途
本発明によれば、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭアゴニスト、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭアンタゴニスト、ＴＡＭ−結合剤、ＡＴＭ−結合剤、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアゴニスト、ＡＴＭ分泌サイトカインのアゴニスト、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアンタゴニスト、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアンタゴニスト、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤及びＡＴＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤（化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、抗血管新生の剤、免疫抑制因子、細胞障害性剤及び増殖阻害剤を含むがこれに限られない）を含むモジュレーターの組合せ単独又は互いの組み合わせ、もしくはその他の治療薬との組み合わせが、細胞増殖性の疾患、血管新生性疾患及び炎症性、血管新生性及び免疫性疾患（自己免疫不全を含むがこれに限られない）のような様々な条件を治療するために用いることができることが考えられる。一実施態様において、ＴＡＭ生存度、存在又は活性のモジュレーターは、癌細胞又は腫瘍増殖の阻害において用いられる。本発明の特定の実施態様において、ＴＡＭ−結合剤、ＴＡＭアンタゴニスト、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアンタゴニスト及び／又はＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤は、増殖性の疾患を処理するために、例えば、癌細胞又は腫瘍の増殖を阻害又は腫瘍の転移を阻害するために用いられる。ここに記載される組み合わせ治療と題するセクションを参照。治療される腫瘍性疾患の例は用語「癌」及び「癌性の」として記載されるものを含むが、これに限定されるものではない。もう一つの実施態様では、ＴＡＭ生存度、存在又は活性のモジュレーターは、免疫疾患（自己免疫疾患を含むがこれに限定されない）の治療において用いられる。本発明の特定の実施態様において、ＴＡＭアゴニスト、ＴＡＭ−結合剤、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアゴニストおよび／またはＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤がＴＡＭ存在を刺激するために用いられ、増殖および／または活性は、ＴＡＭ−誘導増殖及びｎａiｖｅＴ細胞集団からのＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔｒ１細胞及びＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋制御Ｔ細胞への分化を刺激することによって自己免疫疾患を治療するために用いられる。治療される自己免疫不全の例は、用語「自己免疫疾患」として記載されるものを含むが、これに限定されるものではない。もう一つの実施態様では、ＡＴＭの生存度、存在又は活性のモジュレーターは、炎症性疾患（高血糖性疾患及びインシュリン耐性疾患を含むがこれに限定されない）の阻害に用いられる。本発明の特定の実施態様において、ＡＴＭ−結合剤、ＡＴＭアンタゴニスト、ＡＴＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアンタゴニスト及び／又はＡＴＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤は、炎症性疾患（高血糖性疾患及びインシュリン耐性疾患を含むがこれに限定されない）の阻害に用いられる。  
【００６６】
併用療法
上記のように、本発明は、ＴＡＭ結合剤、ＡＴＭ結合剤、ＴＡＭアゴニスト、ＡＴＭアゴニスト、ＴＡＭアンタゴニスト、ＡＴＭアンタゴニスト、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤、ＡＴＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアゴニスト、ＡＴＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアゴニスト、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアンタゴニスト又はＡＴＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアンタゴニストが他の治療法と組み合わせて投与される併用療法を提供する。例えば、ＴＡＭ結合剤は、例えば増殖性の疾患又は自己免疫疾患を治療するために、本発明の異なる剤、アゴニスト又はアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。別の例として、ＡＴＭ結合剤は、炎症性疾患（例えば、高血糖性疾患又はインシュリン耐性疾患を含むがこれに限定されない）を治療するために、本発明の異なる剤、アゴニスト又はアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。ある実施態様では、付加的な剤（例えば化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、抗血管新生剤、免疫抑制剤、細胞障害性剤、消炎性及び増殖阻害剤が使用されてもよい。本発明の薬剤、アゴニスト及びアンタゴニストは、連続的に、又はそれらの目的のために効果的である他の剤と組み合わせて、同じ組成物又は別の組成物として投与することができる。代替的又は付加的に、本発明の多重アンタゴニスト、薬剤及び／又はアゴニストを投与することができる。
本発明のアゴニスト、アンタゴニストおよび／または薬剤の投与は、例えば一つの組成物として、又は同じもしくは異なる投与ルートを用いて二個以上異なる組成物として同時に行うことができる。代替的又は付加的に、投与は、いかなる順番でも、経時的に行うことができる。ある実施態様では、分から日、週、月まで変動する間隔が、二個以上の組成物の投与において示され得る。しかしながら、本発明の異なるアゴニスト、アンタゴニスト又は薬剤の同時投与又は投与もまた考えられる。  
本発明のアゴニスト、アンタゴニスト又は薬剤と組み合わせて投与される治療剤の有効量は、医師又は獣医の裁量である。治療される症状を最大限管理するために用量投与及び調節がなされる。用量は、さらに、使用される治療薬の種類及び治療される特定の患者などの因子に依存するであろう。ある実施態様では、いくつかの分子（例えばいくつかのアンタゴニスト）の組合せは、単一の分子の有効性を増強する。「増強」なる用語は、その一般的又は認可された用量での治療薬の有効性の改善を意味する。本明細書中の「製薬的組成物」と題したセクションを参照。
特定の本発明の態様において、本発明のＴＡＭ及び／又はＡＴＭ結合剤、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭアンタゴニスト、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭ分泌サイトカイン／ケモカイン及びＴＡＭのアゴニスト及び／又はＡＴＭ分泌結合剤との組合せ腫瘍治療のために有用な他の治療剤は、他の癌治療（例えば手術、放射線治療（例えば、放射性物質の照射又は投与を含む）、化学療法、ここに一覧が示され、当分野で周知の抗癌剤又はその組合せを用いた治療）を含む。代替的又は付加的に、ここに開示される同じもの又は二以上の抗原に結合する二個以上の抗体は、患者に同時投与することができる。時に、患者へ一以上のサイトカインを投与することは、有益であり得る。  
【００６７】
化学療法剤
特定の態様において、本発明は、有効量のＴＡＭのアンタゴニスト、ＴＡＭ結合剤、ＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアンタゴニスト及び／又はＴＡＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤と一又は複数の化学療法剤を、癌に罹りやすい患者又は癌と診断された患者に投与することによって、腫瘍増殖又は癌細胞の増殖を遮断する又は低減する方法を提供する。様々な化学療法剤が本発明の併用治療方法で用いられてもよい。考慮する化学療法剤の例示的及び非限定的リストを本明細書中の用語「化学療法剤」のセクションに示す。
当業者によって理解されるように、化学療法剤の適切な用量は、一般的に、化学療法剤が単独ないしは他の化学療法剤と組み合わせて投与される臨床治療に既に用いられる用量の程度であろう。用量の変更はおそらく治療する症状に応じて行うであろう。治療を行う医師は、個々の被検体ごとに適当な用量を決定し得る。
【００６８】
抗体
本発明の抗体には、本発明のタンパク質の抗体、及び本発明のタンパク質の抗体の抗体断片が含まれる。本発明のポリペプチドないしタンパク質には、限定するものではないが、ＴＡＭ細胞表面マーカー（図１４Ｂ及び１４Ｅに記載されるＦ４／８０、ＣＤ１１ｃ及びＴＡＭによって発現されるサイトカイン及びケモカイン受容体を含むがこれに限定されない）及びＴＡＭサイトカイン又はケモカイン（図１４Ａ及び１４Ｃに記載されるＴＧＦβ及び例えばＴＡＭによって発現されるサイトカイン及びケモカインを含むがこれに限定されない）が含まれる。特定の態様において、本発明のポリペチド又はタンパク質は、ＴＡＭ細胞表面マーカー（図１４Ｂ及び１４Ｅに記載されるＦ４／８０、ＣＤ１１ｃ及びＴＡＭによって発現されるサイトカイン及びケモカイン受容体を含むがこれに限定されない）及びＴＡＭサイトカイン又はケモカイン（図１４Ａ及び１４Ｃに記載されるＴＧＦβ及び例えばＴＡＭによって発現されるサイトカイン及びケモカインを含むがこれに限定されない）を特異的に結合する抗体である。  
本発明の抗体は、抗血管新生剤又は血管新生インヒビターである抗体、骨髄性細胞減少剤である抗体、抗癌剤である抗体又はここに記載されている他の抗体を更に含む。例示的な抗体には、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、断片、多重特異性、ヘテロコンジュゲート、多価性、エフェクター機能有する抗体などが含まれる。
【００６９】
ポリクローナル抗体
本発明の抗体はポリクローナル抗体を含みうる。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に公知である。例えば本発明の抗体に対するポリクローナル抗体は、関連する抗原とアジュバントを一又は複数回皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射することにより、動物に産生される。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する抱合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する抱合）、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲへ、関連する抗原をコンジュゲートさせるために有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、本発明の分子、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。典型的には、動物を、同じ抗原であるが異なるタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なる架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートにより追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００７０】
モノクローナル抗体
本明細書中に記載の抗原に対するモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスター又はマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を典型的には含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
典型的な骨髄腫細胞は、効率的に融合するものであって、選択された抗体産生細胞によって安定したハイレベル抗体作成を裏づけて、及び、培地（例えばＨＡＴ培地）から感受性である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、興味がある標的に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。このような技術及びアッセイは当分野で公知である。例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。 
所望の特異性、親和性、及び／又は活性な抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、インビボで増殖させることができる。
【００７１】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィーのような常套的なイムノグロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。また、モノクローナル抗体は、米国特許第４８１６５６７号に記載のもののような組み換えＤＮＡ法によって作製されうる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外ではイムノグロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体の組み換え産生を以下に詳細に記載する。
他の実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成（Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)）、、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え（Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)）を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
ま  た、ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(ＣＨ及びＣＬ)のコード配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４８１６５６７号；Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾することができる。
典型的には、前記の非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００７２】
ヒト化及びヒト抗体
本発明の抗体はヒト化抗体又はヒト抗体を含みうる。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる（Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)）。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151:2623 (1993)）。
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、典型的な方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
あるいは、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993);及びDuchosal等、Nature 355:258 (1992)を参照。また、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリからも得られる（Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan等、Nature Biotech 14:309 (1996)）。
また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む当分野で公知の様々な技術を用いて産生することができる（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)）。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択に基づいても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる（例えば、Johnson, K S. and Chiswell, D J., Cur Opin in Struct Biol 3:564-571 (1993)においてレビューされる）。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、例えばMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)、又は、Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)に記載の技術に基本的に従うことで単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照また、Cole等及びBoerner等の技術はヒトモノクローナル抗体の調製に有用である（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)及びBoerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)）。また、ヒト抗体はインビトロで活性化したＢ細胞により産生することができる(米国特許第５５６７６１０号及び同５２２９２７５号)。
【００７３】
抗体フラグメント
また、抗体断片も本発明に包含される。抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan et al., Science, 229:81(1985)を参照)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の連結部位を有する唯一の種である；従って、インビボで使用している間の減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のどちらかで、エフェクタータンパク質の融合体が生成されるように構成されてもよい。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
【００７４】
多重特異性抗体(例えば二重特異性)
また、本発明の抗体には、例えば、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する多重特異性抗体が含まれる。このような分子は通常２つの抗原を結合するだけであるが(すなわち二重特異性抗体、ＢｓＡｂ)、本明細書中で用いられる場合には三重特異性抗体などの更なる特異性を有する抗体がこの表現に包含される。ＢｓＡｂの例には、腫瘍細胞抗原に対する一アームと細胞障害トリガー分子に対するもう一つのアームを有するもの、例えば抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞(１Ｄ１０)、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５ＨＥＲ２、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎臓細胞カルチノーマ、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ-３、抗ＣＤ３／Ｌ-Ｄ１(抗大腸カルチノーマ)、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激ホルモン類似体、抗ＥＧＦレセプター／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、、抗神経細胞付着分子(ＮＣＡＭ)／抗ＣＤ３、抗葉酸剤結合タンパク質(ＦＢＰ)／抗ＣＤ３、抗パンカルチノーマ結合抗原(ＡＭＯＣ-３１)／抗ＣＤ３；腫瘍抗原に特異的に結合する一アームと毒素に結合する一アームを有するＢｓＡｂ、例として抗サポリン／抗Ｉｄ-１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン-α(ＩＦＮ-α)／抗ハイブリドーマイディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイド；酵素活性化プロドラッグを転換するためのＢｓＡｂ、例として抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ(マイトマイシンアルコールへのマイトマイシンリン酸塩プロドラッグの変換を触媒する)；線維素溶解剤として用いられうるＢｓＡｂ、例として抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲン活性化因子(ｔＰＡ)、抗フィブリン／抗ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性化因子(ｕＰＡ)；細胞表面レセプターに免疫複合体をターゲティングするためのＢｓＡｂ、例として抗低密度リポプロテイン(ＬＤＬ)／抗Ｆｃレセプター(例えばＦｃγＲI、ＦｃγＲII又はＦｃγＲIII)；感染症の治療に用いるためのＢｓＡｂ、例として、抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)、抗Ｔ細胞レセプター：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶ；インビトロ又はインビボで腫瘍を検出するためのＢｓＡｂ、例えば抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ハプテン；ワクチンのアジュバントとしてのＢｓＡｂ；そして、診断用ツールとしてのＢｓＡｂ、例として抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗物質Ｐ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β-ガラクトシダーゼが含まれる。
三重特異性抗体の例には、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が含まれる。特定の本発明の態様において、二重特異性抗体の一つは、マクロファージ特異的な細胞マーカーに結合してもよく、もう一方は樹状細胞特異的な細胞マーカーに結合してもよい。ある実施態様では、このような抗体は、マクロファージ特異的な細胞マーカー及び樹状細胞特異的な細胞マーカーの両方を有する細胞に対して、どちらか一方のマーカーだけを有する細胞に対してよりきつく結合する。  
二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体)として調製されてもよい。二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている（Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)において開示されている。 
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が抗体の最適な収率をもたらす態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな（フレキシビリティ）が与えられる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。  
この手法の一実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照。  
【００７５】
国際公開第９６／２７０１１号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体の定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた当分野において周知である。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)は、無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再変換し、他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。  最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ’−ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞、及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。  
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等、J. Immunol. 147: 60 (1991)。
【００７６】
ヘテロコンジュゲート抗体
二重特異性抗体には、本発明の抗体である架橋された又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。このような二重特異性抗体は、例えば、望ましくない細胞に免疫系細胞をターゲティングすること(米国特許第4676980号)、そしてＨＩＶ感染の治療のため(国際公開第91/00360号、国際公開第92/200373号及び欧州特許第03089号)が考えられている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋結合方法を用いて作られてもよい。好適な架橋剤は当分野で公知であり、多くの架橋技術とともに、米国特許第4676980号に開示されている。 
【００７７】
多価抗体
本発明の抗体には多価抗体が含まれる。多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する（又はそれらからなる）。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖（好ましくは２つのポリペプチド鎖）を有し、ポリペプチド鎖（類）は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖（類）はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖（類）は：ＶＨ−ＣＨ１−柔軟なリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ（好ましくは４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。多価抗体は、同じもの抗原に対する多重結合部位、又は二以上の抗原に対する結合部位を有し得る。  
【００７８】
エフェクター機能エンジニアリング
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌を治療する際の抗体の有効性を向上させることは望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性(ＡＤＣＣ)を有する可能性がある。Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等、Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように設計して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等、Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【００７９】
イムノコンジュゲート
また、本発明は、化学療法薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞障害性剤、あるいは放射性同位体(即ち、放射性コンジュゲート)とコンジュゲートしている本明細書中に記載の抗体を含むイムノコンジュゲートに関する。種々の放射性核種は、放射性コンジュゲート抗体の産生に利用可能である。例には、限定するものではないが２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが含まれる。
このようなイムノコンジュゲートの生成に有用な化学療法薬は上記した。例えば、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)など(本明細書中の「化学療法薬」の定義も参照のこと)が本発明の抗体ないしその断片にコンジュゲートされうる。
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体ないしその断片を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、限定するものではないが２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、２１２Ｐｂ、１１１Ｉｎ及びＬｕの放射性同位体などが含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えば９９ｍｔｃ又は１２３Ｉ、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）映像（磁気共鳴映像、ＭＲＩとしても公知）用のスピン標識、例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射−又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えば９９ｍｔｃ又は１２３Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ及び１１１Ｉｎは、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム−９０はリジン残基を介して結合可能である。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49 57）は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、例として「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。  
【００８０】
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照。    
抗体と細胞障害性剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等、Science 238: 1098 (1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレン−トリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは細胞中の細胞障害性剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る（Chari et al., Cancer Research 52:127 131 (1992); 米国特許第５２０８０２０号）。
別法として、抗ＶＥＧＦ及び／又は本発明の抗体の抗たんぱく質と細胞障害性剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
ある実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」（例えばストレプトアビジン）に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体−レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害性剤にコンジュゲートする「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
ある実施態様では、イムノコンジュゲートは、抗体及び核酸分解性の活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えばデオキシリボヌクレアーゼ；  Ｄｎアーゼ）の間で形成される。
【００８１】
メイタンシン及びメイタンシノイド
本発明は、一又は複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートしている本発明の抗体をさらに提供する。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ−３メイタンシノールエステルを生成することが発見された（米国特許第４１５１０４２号）。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されている。
本発明の抗体は、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子にコンジュゲートすることができる。１分子の毒素／抗体は、ネイキッド抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。一実施態様では、メイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
【００８２】
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari et al., Cancer Research 52:127 131 (1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。典型的なカップリング剤には、ジスルフィド結合を提供するためのＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）及びＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ)（Carlsson et al., Biochem. J. 173:723 737 [1978]）が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位で生じる。結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ−３位で形成される。 
【００８３】
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子とコンジュゲートした本発明の抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１（Hinman et al., Cancer Research 53:3336 3342 (1993)、Lode et al., Cancer Research 58:2925 2928 (1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許）が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【００８４】
他の抗体修飾
本明細書において抗体の他の修飾が意図される。例えば、抗体は、様々な非タンパク質性ポリマーの一つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのコポリマーに連結されうる。また、抗体は、例えば、コアセルベーション技術によって又は界面重合法(例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタキレート)マイクロカプセル)によって調製されるマイクロカプセルに、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)に、又はマイクロエマルジョンに内包されうる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示される。
【００８５】
リポソーム及びナノ粒子
本発明のポリペプチドはリポソームとして処方することができる。例えば本発明の抗体はイムノリポソームとして処方することができる。抗体を含有するリポソームは、例えばEpstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。。一般的に、製剤とリポソームの使用は当業者に公知である。  
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin等、J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。
場合によっては、化学療法剤(ドキソルビジンなど)はリポソーム内に包含される。Gabizon等、J. National Cancer Inst.81(19)1484 (1989)を参照。    
【００８６】
本発明のポリペプチドに対する共有的修飾
本発明のポリペプチド、例えば本発明のタンパク質、本発明のタンパク質の抗体、ポリペプチドアンタゴニスト断片、融合分子(例えば免疫融合分子)などの共有結合による修飾は本発明の範囲内に包含される。それらは、適当であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又はポリペプチドの化学的切断によりなされうる。他の種類のポリペプチドの共有的修飾は、選択される側鎖又はＮ末端ないしはＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤とポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を反応させることによって、又は、修飾アミノ酸ないしは非天然のアミノ酸を発達するポリペプチド鎖に組み込むことによって、分子内に導入される。例えばEllman等、Meth. Enzym. 202:301-336 (1991); Noren等、Science 244:182 (1989)；及び、米国公開特許第２００３０１０８８８５号及び同第２００３００８２５７５号。    
最も一般的には、システイニル残基は、α−ハロアセタート（及び対応するアミン）、例えば、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応し、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイン残基もまたブロモトリフルオロアセトン；α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸；クロロアセチルホスフェート；Ｎ−アルキルマレイミド類；３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド；メチル−２−ピリジルジスルフィド；ｐ−クロロ水銀安息香酸；２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール；又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５−７．０でジエチルピロカルボナートとの反応によって誘導体化されるが、この薬剤はヒスチジル側鎖に対して比較的特異的である。パラ-ブロモフェナシルブロミドもまた有用である；この反応は、典型的にはｐＨ６．０で０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中で行われる。
リジニル及びアミノ末端残基はコハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応させられる。これらの試薬を用いた誘導体形成は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化する他の適当な試薬には、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミデート、リン酸ピリドキサル、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、及びグリオキシレートを用いたトランスアミナーゼにより触媒される反応である。
アルギニル残基は一あるいは幾つかの従来の試薬との反応によって修飾され、とりわけ、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンがある。アルジニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのために反応がアルカリ性条件下で行われることを必要とする。更に、これらの試薬はリジンの基並びにアルギニンε−アミノ基と反応しうる。
チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基内へのスペクトル標識の導入に特に興味をもって、なされる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールとテトラニトロメタンを使用して、それぞれがＯ−アセチルチロシル種と３−ニトロ誘導体を形成する。チロシル残基はラジオイムノアッセイでの使用のための標識化タンパク質を調製するために１２５Ｉ又は１３１Ｉを用いてヨウ素化される。
【００８７】
カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）がカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）（ここで、ＲとＲ’は異なったアルキル基である）、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応によって選択的に修飾される。更に、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基へ変換される。
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へしばしば脱アミド化される。これらの残基は中性又は塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は本発明の範囲内に入る。
その他の修飾には、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79-86頁 (1983))、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。 
他のタイプの共有的修飾は本発明のポリペプチドに対してグリコシドを化学的又は酵素的にカップリングさせることを含む。これらの手順は、それらがＮ−又はＯ−結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞中でのポリペプチドの生産を必要としない点で有利である。用いられるカップリング態様に応じて、糖（類）は、（ａ）アルギニンとヒスチジンに、（ｂ）遊離のカルボキシル基に、（ｃ）遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインのものに、（ｄ）セリン、スレオニン又はヒドロキシプロリンのもののような遊離のヒドロキシル基に、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのような芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は１９８７年９月１１日公開の国際公開第８７／０５３３０号並びにAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
成本発明のポリペプチドに存在するあらゆる炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的になすことができる。化学的脱グリコシル化には、ポリペプチドを化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は等価化合物に暴露することを必要とする。この処理により、ポリペプチドをインタクトなままにしながら、結合糖(Ｎ-アセチルグルコサミン又はＮ-アセチルガラクトサミン)を除く殆どの又は全ての糖の切断が生じる。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin,等、Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987)及びEdge等、Anal. Biochem., 118:131 (1981)により記載されている例えば抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等、Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成できる。
本発明のポリペプチドの共有結合的修飾の他のタイプは、ポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることを含む。
【００８８】
ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明のポリペプチドは直ぐに得られる技術と材料を使用して組換え的に製造することができる。  
本発明のポリペプチド、例えば本発明のタンパク質、本発明のタンパク質の抗体、例えば抗ＶＥＧＦ抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離して配列決定される。。例えば、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを用いて単離し、配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には一般に、限定するものではないが、シグナル配列、複製起点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終末配列の一又は複数が含まれる。 
【００８９】
シグナル配列成分
本発明のポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、典型的にはシグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても産生される。典型的に選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然ポリペプチドシグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母の分泌に関しては、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。このような前駆体領域のＤＮＡは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに読み枠を一致させて結合される。 
【００９０】
複製開始点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列はクローニングベクターにおいて、宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は様々な細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点が典型的には初期プロモーターを有しているため用いられる)。
【００９１】
選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含みうる。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)例えばバシラス菌に対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
選択技術の一例においては、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換されるこれらの細胞は、抗薬物性を付与し、選択療法を生存するタンパク質を生産する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸又はハイグロマイシンが使用される。  
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することのできるもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、典型的には、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である。  
あるいは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地における細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85：12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、トリプトファンの不存在下における成長による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
また、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え子ウシのキモシンの大量生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株からの、組換えによる成熟したヒト血清アルブミンを分泌する安定した複数コピー発現ベクターも開示されている。Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)。
【００９２】
プロモーター成分
通常、発現及びクローニングベクターは、宿主生体により認識され、本発明のポリペプチドをコードする核酸に作用可能に結合するプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモーターもまた本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。事実上、全ての真核生物の遺伝子は、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に位置するＡＴ富化領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される更なる利点を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に用いられる好適なベクターとプロモーターは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの本発明のポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及び典型的にはサルウイルス４０(ＳＶ４０)のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーターによって、提供されるこのようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。 
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄIIIＥ制限断片として簡便に得られる。
ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現する系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変更例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。
また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)を参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。 
【００９３】
エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物のプロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)もまた参照。エンハンサーは、ポリペプチドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、典型的にはプロモーターから５'位に位置している。
【００９４】
転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、本発明のポリペプチドをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示した発現ベクターを参照。
【００９５】
宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクターに本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びＢ．リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。典型的には大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、本発明のポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能で、ここで使用でき、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ．ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ．ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(欧州特許第４０２２２６号)；ピチア・パストリス(欧州特許第１８３０７０号)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(欧州特許第２４４２３４号)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属(Aspergillus)宿主、例えば偽巣性コウジ菌(A. nidulans)及びクロカビ(A. niger)が使用できる。
本発明のグリコシル化ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、このようなウイルスは本発明においてここに記載したウイルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞のトランスフェクションに使用できる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することもできる。 
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になった。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株  （ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での成長のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ハムスター乳児腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；サルの腎細胞  （ＣＶＩ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザルの腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞  （ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞  （ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；  バッファローラット肝細胞  （ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞  （Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞  （Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＴＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mother et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒト肝癌株（ＨｅｐＧ２）である。宿主細胞は、本発明のポリペプチド生産のための上述した発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適当に修飾された常套的栄養培地で培養する。
【００９６】
宿主細胞の培養
本発明のポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地、例えばハム（Ham）のＦ１０（Sigma）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Sigma）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）、及びダルベッコの改良イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58：44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102：255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０；国際公開第８７／００１９５；又は米国特許再発行第３０９８５号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシンＴＭ薬）、微量元素（最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される）、及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。  
【００９７】
ポリペチド精製
本発明のポリペプチドないしタンパク質は被検体から採取されうる。組換え技術を用いる場合、本発明のポリペプチドは、細胞内に、細胞膜周辺腔に、又は培地に直接分泌されうる。本発明のポリペプチドは、培養培地又は宿主細胞溶解物から回収されてもよい。
膜結合である場合、適切な清浄液（例えばトリトン−Ｘ１００）を用いるか、又は酵素の切断によって膜から放出されうる。本発明のポリペプチドの発現に用いられる細胞は、様々な物理的又は化学的な手段、例として、凍結−解凍循環、超音波処理、物理的な破壊又は細胞溶解剤によって破壊されうる。
適切なタンパク質精製手順の例は以下の手順である：イオン交換カラムによる分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；二酸化ケイ素によるクロマトグラフィ、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭによるクロマトグラフィ、陰イオン又陽イオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム、ＤＥＡＥなど）によるクロマトグラフィ；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、セファデックスＧ−７５を用いたゲル濾過；ＩｇＧなどの混入物を除去するためのプロテインＡセファロースカラム；及び、本発明のポリペプチドのエピトープタグ付加形態を結合するための金属キレートカラム。タンパク質精製に様々な方法が用いられてもよく、このような方法は当分野で公知であり、例えばDeutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)の実施例に記述される。選択される精製工程(一又は複数)は、例えば、使用する生産プロセス及び生産される本発明の特定のポリペプチドの性質に依存するであろう。 
例えば、細胞から調製されるＶＥＧＦ組成物は、例えば、ヒドロキシラパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティクロマトグラフィ、及び典型的な親和性技術であるアフィニティクロマトグラフィを用いて精製されうる。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABXTM樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えば上記のものも回収する抗体に依存して利用可能である。また、大腸菌の周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載しているCarter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)も参照のこと。  
【００９８】
薬剤的組成物
本発明の薬剤の製薬的製剤（ＴＡＭ及び／又はＡＴＭ結合剤又はＴＡＭ及び／又はＡＴＭ分泌細胞メッセンジャー結合剤）とその組み合わせ及び本発明に関して用いられる本明細書中に記載のものは、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.[1980])、凍結乾燥又は水溶液の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。  
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ−粒子及びナノカプセル）に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.[1980]に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、本発明のポリペプチドを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、３７℃の水分に曝露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。例として、高分子電解質被覆によるカプセルを記載している米国特許第６６９９５０１号も参照。
【００９９】
さらに、本発明の薬剤（例えばＴＡＭアゴニスト、ＴＡＭアンタゴニスト又はＴＡＭサイトカイン／ケモカイン分泌のアゴニスト又はアンタゴニスト）が遺伝子治療によって被検体に導入されうることを考慮する。遺伝子治療は、被検体への核酸の投与によって行われる治療を指す。遺伝子治療適用において、例えば欠損した遺伝子の置換のために、遺伝子を細胞に導入して、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成する。「遺伝子治療」には、永続的な効果が単一の治療によって達成される従来の遺伝子治療と遺伝子治療薬の投与の両方が含まれ、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回の投与又は繰り返し投与を伴う。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡはインビボのある遺伝子の発現を遮断するための治療剤として用いられる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜による取り込みに制限されて細胞内濃度が低くなるが、インヒビターとして働く細胞内に移入することができることが既に報告されている(Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 (1986))。オリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電するホスホジエステル基を非荷電基に置換することによって修飾して、それらの取り込みを上げることができる。遺伝子治療の方法の一般的な概念については、例として、Goldspiel等、Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan Science 260:926-932 (1993); Morgan and Anderson Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993);及びMay TIBTECH 11:155-215 (1993)を参照。用いられうる組換えＤＮＡ技術の当分野で公知の共通の方法は、Ausubel等、eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; and Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記述される。
核酸を生細胞に導入するために利用可能な様々な技術がある。技術は、核酸がインビトロ又はインビボで意図した宿主の細胞の培養細胞にトランスファーされるかどうかによって異なる。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸のトランスファーに好適な技術には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などが含まれる。
一般に好適なインビボ遺伝子導入技術には、ウイルス(一般的にレトロウイルス)ベクターによる形質移入及び、ウイルスコートタンパク質-リポソーム媒介性形質移入が含まれる(Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993))。例えば、インビボ核酸導入技術には、ウイルスベクター(例えばアデノウイルス、単純ヘルペスIウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス又は、アデノ関連ウイルス)及び脂質ベースのシステム(遺伝子の脂質媒介トランスファーに有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ-Ｃｈｏｌである)が含まれる。遺伝子治療にウイルスベクターを使用する例は、Clowes等、J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem等、Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); Grossman and Wilson Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993); Bout等、Human Gene Therapy 5:3 -10 (1994); Rosenfeld等、Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld等、Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli等、J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993);及びWalsh等、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300 (1993)に見られる。 
ある場合では、標的細胞を標的とする薬剤、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターのリガンドなどを核酸供給源に供給することが望ましい。リポソームが使用される場合、エンドサイトーシスに関与する細胞表面膜タンパク質と結合するタンパク質は、例えばある種類の細胞に向性があるキャプシドタンパク質又はその断片、細胞周期への内部移行を行うタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし、細胞内半減期を亢進するタンパク質のターゲティングのため及び／又はこれらの取り込みを容易にするために用いられうる。レセプター媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987);及びWagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)に記載される。遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概要については、Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992)を参照。
【０１００】
用量及び投与
本発明の薬剤（ＴＡＭ及び／又はＡＴＭ結合剤、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭアゴニスト、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭアンタゴニスト、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭ分泌サイトカイン／ケモカイン結合剤、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアゴニスト、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭ−分泌サイトカイン／ケモカインアンタゴニスト）は、ヒト患者に、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路、及び／又は皮下投与などにより投与される。
ある実施態様では、本発明の治療は本発明の組成物と一又は複数の治療剤（例えば化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、抗血管新生剤、免疫抑制剤、細胞障害剤及び増殖阻害剤）との併用投与を含む。本発明は、同じ抗原に対する複数の抗体又は本発明の異なるタンパク質に対する複数の抗体の投与を考慮する。一実施態様では、異なる化学療法剤の混合物が、本発明の組成物と投与される。併用投与は、別々の製剤又は単一の製薬的製剤による同時投与、及び／又はいずれかの順序での連続投与が含まれる。一実施態様では、両方(又はすべて)の活性剤が同時にその生物学的活性を及ぼす一定時間がある。
疾患の予防又は治療のために、本発明の薬剤の好適な用量は、上記に定義した治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及びインヒビターへの応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。インヒビターは一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。併用療法投与計画では、本発明の組成物は治療的有効量又は治療的相乗作用量で投与される。本明細書中で用いられるように、治療的有効量は、本発明の組成物の投与及び／又はＶＥＧＦアンタゴニスト及び一又は複数の他の治療剤の同時投与により標的とする疾患又は症状が減少又は阻害される量である。薬剤の組み合わせの投与効果は付加的であってもよい。一実施態様では、投与の結果は相乗効果である。治療的相乗作用量は、特定の疾患に関係する状態又は症状を相乗作用的に又は有意に減少ないし除去するために必要な、本発明の組成物及び一又は複数の他の治療剤、例えば化学療法剤又は抗癌剤の量である。
疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ)のＶＥＧＦアンタゴニスト又は骨髄性細胞減少剤、化学療法剤、又は抗癌剤が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量である。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。しかしながら他の用量処方が有用であるかもしれない。
典型的には、臨床医は、必要とされる生物学的な効果が生じる用量(一又は複数)が達成されるまで本発明の分子(一又は複数)を投与するであろう。本発明の治療の経過は従来の技術及びアッセイにより用意にモニターされる。
例えば、血管新生インヒビター、例えばアバスチン（登録商標）(Genentech)などの抗ＶＥＧＦ抗体の調製及び投与計画は製造者の指示に従って用いられても、当業者によって経験的に決定されてもよい。他の例では、このような化学療法剤の調製及び投与計画は製造者の指示に従って用いられても、当業者によって経験的に決定されてもよい。化学療法の調製及び投与計画はChemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載される。  
【０１０１】
治療の有効性
本発明の治療の有効性は、いくつかの態様において、当分野で周知の様々なエンドポイントにより測定することができる。一実施態様において、TAMに基づく治療の有効性は、腫瘍性又は非腫瘍性疾患を評価する際に用いられる様々なエンドポイントを用いて測定されてもよい。例えば、癌治療は、限定するものではないが、腫瘍再発、腫瘍重量ないしサイズの収縮、進行時間、生存期間、進行がない生存、全体の応答速度、応答の継続期間、生活の質、タンパク質の発現及び／又は活性などで評価されてもよい。本明細書に記載の薬剤は腫瘍の血管及び浸潤を標的とし、腫瘍性細胞自体を標的とする必要はないので、抗癌剤の特定のクラスを示し、それゆえに薬剤に対する臨床応答の特定の測定と定義を必要としうる。例えば、二次元分析において５０％より大きい腫瘍の収縮は応答を示す標準のカットオフである。しかし、本発明のインヒビターは原発性腫瘍を収縮することなく転移の拡がりを阻害するか、又は単に腫瘍抑制(tumouristatic)効果を及ぼしうる。したがって、例えば血管新生の血漿又は尿路マーカーの測定及び放射線画像法による応答の測定などの、治療の有効性を決定する手法が用いられうる。  
他の実施態様において、本発明の治療の有効性は、自己免疫不全を評価する際に共通に用いられる様々なエンドポイントを用いて測定されてもよい。例えば、自己免疫疾患の治療は、限定するものではないが、疾患の第１又は第２の特徴の減少又は停止、腫瘍増殖停止時間、生存期間、無憎悪生存期間、全奏功率、応答の持続期間、生活の質、タンパク質の発現及び／又は活性などで評価されてもよい。同じ論理は、本発明の治療が対処することを目的とされる特定の疾患を評価するために、当業者によって共通に用いられるエンドポイントを用いて本発明の治療の有効性を測定するために適用されてもよい。
【０１０２】
製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾病の治療又は診断に有用な材料を具備する製造品が提供される。該製造品は容器、ラベル及びパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。一実施態様では、容器は、症状を治療するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる）。一実施態様において、組成物の少なくとも一つの活性剤は、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭ結合剤又はＴＡＭ及び／又はＡＴＭ−サイトカイン／ケモカイン結合剤である。もう一つの実施態様では、組成物の少なくとも一つの活性剤は、ＴＡＭ及び／又はＡＴＭアゴニスト又は少なくとも一つのＴＡＭ及び／又はＡＴＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアゴニストである。もう一つの実施態様では、組成物の少なくとも一つの活性剤はＴＡＭ及び／又はＡＴＭアンタゴニスト又は少なくとも一つのＴＡＭ及び／又はＡＴＭ分泌サイトカイン／ケモカインのアンタゴニストである。ある実施態様では、組成物は、限定されないが、化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、抗血管新生剤、免疫抑制剤、細胞障害性剤及び増殖阻害剤を含む第二の活性分子を少なくとも更に含む。容器に添付又は付属するラベルは、組成物が選択した症状の治療に使用されることを示す。さらに製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の容器を更に具備してもよい。本発明の製造品には、更なる活性剤、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１０３】
本明細書に記載の実施例及び実施態様は例示的な目的のためだけであって、その見地への様々な修飾又は変更が当業者に示唆され、本出願の精神及び権限内及び添付の特許請求の範囲内に包含されるものであることは理解されるであろう。本明細書は、当業者による本発明の実施を十分可能にするものであると考えられる。本明細書で引用したすべての出版物、特許及び特許出願は、あらゆる目的のためにその全体が出典明記によって援用される。    
【０１０４】
（実施例）
実施例１：骨髄性浸潤物の構成及び局在
ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴに誘導された乳腺腫瘍の免疫浸潤物の構成及び局在は、免疫組織化学によって評価された。フレンド白血病ウィルスＢ系統（「ＦＶＢ」）に感受性の野生型マウスが購入され（Charles River）、ＦＶＢを背景とするＭＭＴＶ．ＰｙＭＴｔｇ又はＭＭＴＶ．Ｈｅｒ２ｔｇ腫瘍を含むマウスが病原体を含まない施設において交配された。ＭＭＴＶ．ＰｙＭＴｔｇマウスからの腫瘍は、ＯＣＴ溶液において包埋され、凍結された。凍結切片は、５ミクロン切片に切られて、室温で乾燥し、標準手順を用いて氷冷アセトンで固定した。内因性のペルオキシダーゼは、３７℃で６０分の間のグルコースオキシダーゼを用いて消光された。切片はＰＢＳでリンスされ、内因性のアビジン及びビオチンは製造業者の指示に従ってＡｖｉｄｉｎ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｋｉｔ（Vector）を用いてブロックした。切片は、室温で３０分間の３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の１０％ウサギ血清でブロックされ、室温で６０分間ブロッキング血清に希釈された適当な抗体と共にインキューベートした。また、ネガティブコントロールとしてラットＩｇＧ２ｂを用いた。切片は、ＴＢＳＴでリンスされ、室温で３０分間、適当なビオチン化二次抗体と共にインキューベートした。切片は、標準手順に従って作成された。ラット抗ＣＤ４５（ＬＣＡ）抗体はPharmingenから得られ、ウサギ抗ＣＤ３抗体はＤＡＫＯから得られ、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ及びビオチン化ウサギ抗ラットＩｇＧはＶｅｃｔｏｒから得られ、ラット抗Ｆ４／８０抗体はＳｅｒｏｔｅｃから得られた。
腫瘍試料は、白血球を検出するために、最初に抗ＣＤ４５抗体で処理された。図１Ａに示されているように、顕著な白血球の浸潤が腫瘍及びストローマの中で同定された。更に浸潤物の構成を解明するために、試料は、マクロファージ及びＴ細胞のマーカーとしてそれぞれ抗Ｆ４／８０の抗体又は抗ＣＤ３抗体で処理された。抗Ｆ４／８０抗体処理で観察される染色パターンは、抗ＣＤ４５抗体処理で観察されたのと類似しており、ＣＤ４５＋白血球の主要部がマクロファージであったことを示している（図１Ａと図１Ｂとの比較）。ＣＤ３＋細胞が腫瘍浸潤物中に観察されたのに対して、それらはＦ４／８０ｈｉｇｈマクロファージよりも優勢でなかった（図１Ｂと図１Ｃとの比較）。
結果は、フローサイトメトリによって確認及び伸長された。簡潔には、腫瘍は、切り分けられ、３７℃で１５分間コラゲナーゼＩＩ、ＩＶ及びＤＮＡ分解酵素（Gibco及びSigma）で消化した。用意をされた腫瘍細胞試料は、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＧＲ−１、抗Ｎｋ１．１、抗ＤＸ５、抗ＭＨＣＩＩ、抗ＣＤ１１ｃ、抗Ｆ４／８０及び抗ＰＤ−Ｌ１（Pharmingen、Serotec及びeBioscience）を含む異なる骨髄性のサブセットに特異的な蛍光性標識化された抗体で処理された。全ての細胞は、標準技術を用いて、染色の前に適当な血清又は精製されたＩｇＧでブロックされ、死細胞を除外するためにヨウ化プロピジウムでも染色された。解析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ又はＬＳＲＩＩを用いて行われた（共にBecton Dickinson）。  
【０１０５】
リンパ系の腫瘍浸潤物において支配的な細胞型は、ＣＤ１１ｂ＋細胞であった（図１Ｄを参照）。８．４±１．８％のＮＫ１．１＝ＤＸ５＝ＣＤ１１ｂ＋骨髄性浸潤物が観察された。それらの骨髄性細胞の大多数は、Ｇｒ−１＝Ｆ４／８０ｈｉｇｈマクロファージ（７７．９±１１．３％）であった。残りのＣＤ１１ｂ＋細胞の、１１．５±４．３％がＧｒ−１＝Ｆ４／８０ｌｏｗ常在組織単核細胞（ＭｏＲＴ）、１．１±０．５％がＧｒ−１＋炎症性単核細胞（ＭｏＩＦ）及び９．５±４．３％がＧｒ−１＋好中球であった（図１Ｅを参照）。腫瘍を有する宿主は共通して白血球増多症を示すことが報告された（Serafini et al., 2004）。したがって、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスの末梢白血球組成は、上記の通りにＦＡＣＳ解析によってもまた評価された。腫瘍を有していないコントロールＦＶＢマウス（４．２±１．１×１０６）と比較して、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ誘導腫瘍を有するマウスでは末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）（９．７±３．２×１０６）数の２．３倍の増加が観察された（図２Ａ）。この観察された腫瘍を有すルマウスにおける全白血球の増加は、腫瘍を有していないコントロール・マウスの発生率（１９．１±５．５％）と比較して、ＣＤ１１ｂ＋骨髄性細胞（７０．１±１５．１％）の頻度の増加が伴っていた（図２Ｂ）。並んで、ＣＤ１１ｂ＋細胞の増加した頻度を伴った全ＰＢＭＣの増加により、腫瘍を有するマウスの末梢骨髄性細胞の８．５倍の増加が生じた。この増加は、主に好中球の１２．５倍の増殖によるものであり（６．０±１．５×１０６／ｍＬ対コントロール・マウスにおける０．５±０．２×１０６／ｍＬ）、ＭｏＩＦ及びＭｏＲＴはそれぞれ５倍（０．５±０．２×１０６／ｍＬ対０．１±０．０４×１０６／ｍＬ）及び２．５倍（０．５±０．２×１０６／ｍＬ対０．２±０．１×１０６／ｍＬ）だけ増大した。血中の単核細胞に対する好中球の比は、コントロール動物において観察されたのと比較してもわずかに増大された（図２Ｃ）。
増殖する腫瘍において、脈管形成の程度は不均一であり、低い酸素分圧領域は共通で、多くの場合壊死と関連している。更に腫瘍における骨髄性細胞の役割を理解するために、免疫蛍光染色が、ＰｙＭＴｔｇ腫瘍の維管束系に対してＭｏＩＦ、好中球及び腫瘍関連マクロファージ（「ＴＡＭ」）を局所化するために用いられた。１０−１４週齢のＭＭＴＶ．ＰｙＭＴｔｇマウスからの腫瘍は、ＯＣＴ溶液中に包埋され、瞬間凍結された。ＯＣＴ凍結された腫瘍組織は、標準手順を用いてＦ４／８０（Serotec）、Ｌｙ−６C（Pharmingen）又はＬｙ−６Ｇ（Pharmingen）（それぞれ、ＴＡＭ、ＭｏＩＦ又は好中球を同定するため）、及び内皮マーカーＣＤ３１（Pharmingen）（組織の血管を視覚化するため）に特異的な抗体で染色された（実施例１を参照）。結果は、図１Ｆ−Ｈに示す。像は、Ｆ４／８０＋ＴＡＭが内皮細胞及び腫瘍の壊死性領域に接近して局在していることを示す（図１Ｆを参照）。同様に、好中球は、内皮細胞の付近、及び腫瘍の壊死性領域において検出された（図１Ｇを参照）。対照的に、ＭｏＩＦは、ほぼ完全に腫瘍の壊死性領域の中又は付近に局在していた（図１Ｈを参照）。  
単核細胞が腫瘍の低酸素領域に移動し、マクロファージに分化することは、以前に示唆されていた（Yamashire et al., 1994; Murdoch et al., 2004）。低酸素状態に応答して、ＴＡＭが低酸素誘導因子ＨＩＦ−１ａ及びＨＩＦ−２ａの発現を上方制御することは公知であり、それによりＴＡＭの血管新生性、代謝性及び食細胞性活性が変わる(Mantovani et al., 2006; Lewis and Murdoch, 2005)。特に、低酸素条件のインビトロで培養されたＭｏＩＦ及びＭｏＩＦ由来マクロファージは、ＭｏＲＴ及びＭｏＲＴ由来マクロファージより非常に高いレベルのＶＥＧＦ−Ａを分泌した（データ未掲載）。  
【０１０６】
実施例２：ＴＡＭの特性評価
Ａ．ＴＡＭは、ＣＤ１１ｃ及びランゲリンを発現し、プロフェッショナル抗原提供細胞の特徴を示す。
マクロファージ及び樹状細胞（「ＤＣ」）は、抗原を捕獲し、Ｔ細胞にそれらを示す能力を有する。よりよくＴ細胞応答の調節におけるＴＡＭの役割を理解するために、腫瘍内の抗原提示と関連している遺伝子の発現が評価された。通常は骨髄性又はＤＣ細胞に発現されるマーカーの免疫組織化学的解析は、実施例１に記載されている方法に従って、ＴＡＭについて行われた。ラット抗Ｆ４／８０抗体はＳｅｒｏｔｅｃから得られ、ラット抗ＣＤ１１ｂ抗体はeBioscienceから得られ、ラット抗ＣＤ１１ｃ抗体はPharmingenから得られた。抗ヒトランゲリン（ＣＤ２０７）の免疫組織化学は実施例１に記載されているように一般的に行われたが、組織切片は、脱ろうされ、後の２０分間のクールダウンを伴う２０分間の９９℃のＬａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ’ｓ  ＰＴ  Ｍｏｄｕｌｅを用いる繧フクールダウンを伴う９９℃、２０分間のＬａｂ  ＶｉｓｉｏｎのＰＴ  Ｍｏｄｕｌｅを用いてＴａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌバッファ（ｐＨ  ６．０、Dako Cytomation）中で抗原賦活化された。ヤギ抗ランゲリンはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから得られ、ビオチン化ウサギ抗ヤギＩｇＧはＶｅｃｔｏｒＬａｂｓから得られた。
２、３の例外を除いて、大多数の組織常在性マクロファージ（例えば腹腔マクロファージ）は、ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｃ＝細胞であり、骨髄性ＤＣ（例えば骨髄由来ＤＣ）は、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞であって、Ｆ４／８０の発現を欠いている。驚くべきことに、ＰｙＭＴ由来腫瘍からのＣＤ１１ｂ＋ＴＡＭは細胞表面にＦ４／８０だけでなく、ＣＤ１１ｃを高水準で発現することが観察された（図３Ａ）。同様の結果が、ＭＭＴＶ−ＨＥＲ２ｔｇマウスから単離されたＴＡＭにおいて観察された（データ未掲載）。ＰｙＭＴｔｇマウスからのＯＣＴ凍結された腫瘍の組織学は、ＴＡＭがＦ４／８０及びＣＤ１１ｃ（図３Ｂ）を共発現していることを示しており、更にインビトロで６０時間培養された単離ＴＡＭの免疫蛍光研究によって確認された（図３Ｃ）。同様に驚くべきことに、ＰｙＭＴｔｇマウスからのＴＡＭは、主にランゲルハンスＤＣ（ＬｈＤＣ）によって発現されることが知られていたタンパク質であるＣ型レクチンランゲリンをも発現していた（Kissenpfennig and Milissen, Trends Immunol 27: 132-9, 2006; Kaplan et al., Immunity 23: 611-20, 2005）（図3D）。  
マウス及びヒト・ランゲルハンスＤＣ（ＬｈＤＣ）の発達はＴＧＦβ１シグナリングに依存しているので（Borkowski et al., J Exp Med 184: 2417-22, 1996; Jaksits et al., J Immunol 163: 4869-77, 1999）、このサイトカインの発現はＴＡＭにおいて調査された。実際、ｂｍＤＣ（ΔΔｃｔ＝１．０±０．０６）及び腹腔マクロファージ（ΔΔｃｔ＝３９．９±１．６）において観察される量と比較して、ＴＡＭはＴＧＦβＲ１をコード化するｍＲＮＡを高レベルで発現していた（ΔΔｃｔ＝７０７．３±４７．３）。ＴＡＭが、ＬｈＤＣ発達及びＴＧＦβシグナル伝達カスケードに関係する２転写因子であるＲｕｎｘ３（ＴＡＭ：ΔΔｃｔ＝９．８±１．１；ｂｍＤＣ：ΔΔｃｔ＝１．０±０．０６；腹腔マクロファージ：ΔΔｃｔ＝１．０２±０．０５）及びＩＲＦ−８（ＴＡＭ：ΔΔｃｔ＝７．９±０．６；ｂｍＤＣ：ΔΔｃｔ＝１．０±０．０６；腹腔マクロファージ：ΔΔｃｔ＝０．９８±０．０５）コード化ｍＲＮＡを比較的より高いレベルで発現していることが観察された（図３Ｅ）（Woolf et al., Dev Biol 303: 703-14, 2007;; Schiavoni et al., Blood 103: 2221-8, 2004）。Ｒｕｎｘ３はＣＤ１１ｃの発現を制御することが示され、Ｒｕｎｘ３．ＫＯ及びＩＲＦ−８．ＫＯマウスはＬｈＤＣｓの生成に欠陥がある（Borkowski et al., J Exp Med 184: 2417-22, 1996）。総合すると、データは、観察されたＴＡＭの生物学に対してＴＧＦβが重要な因子であることを示唆している。  
プロフェッショナルな抗原提示細胞が、免疫反応を開始するために流入領域リンパ節に移動することは公知である。したがって、ＰｙＭＴｔｇマウスの腋窩流入腫瘍及び上腕リンパ節の免疫細胞組成は、実施例１に記載されているように、腫瘍を有していないＦＶＢマウスのコントロール・リンパ節と比較してＦＡＣＳ解析を用いて評価された。ＣＤ１１ｂ＋細胞数の上昇（図４Ａ）と、Ｆ４／８０及びＣＤ１１ｃを発現しているＣＤ１１ｂ＋細胞数の上昇（図４Ｂ）が、腫瘍を含んでいるマウスのリンパ節において同定された。このデータの解釈は、ＴＡＭが他の免疫細胞に対して腫瘍抗原を示すために流入領域リンパ節へ移動するかもしれないということには限定されない。
【０１０７】
比較全ゲノム・マイクロアレイ解析は、ＦＶＢコントロール・マウスのＴＡＭ及び腹腔マクロファージ及び骨髄由来樹状細胞（「ｂｍＤＣ」）間の相違を更に調査するために行われた。簡潔には、１マイクログラムのトータルＲＮＡは、Ｌｏｗ  ＲＮＡ  Ｉｎｐｕｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて二本鎖ｃＤＮＡに変換された。ｃＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡから合成され、同時にシアニン３−又はシアニン５−で標識化されたＣＴＰを取り込んだ。標識化されたｃＲＮＡは、アフィニティ樹脂カラム（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）で精製され、２６０ｎｍの吸光度を測定することによって定量化された。染料の取り込みは、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（NanoDrop Technologies）を用いて、シアニン３−及びシアニン５−標識化ＣＴＰの吸光度を測定することによって決定された。７５０ｎｇのシアニン３標識化ｃＲＮＡ及び７５０ｎｇのシアニン５標識化ｃＲＮＡは、断片化バッファ中で３０分間、６０℃のインキュベーションにより断片化された（Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ−Ｐｌｕｓ；  Agilent）。断片化は、ＬｉＣｌ及びリチウム・ラウリル硫酸塩を含むハイブリダイゼーション・バッファの添加によって終了された。試料は、６０℃で１７時間マイクロアレイにハイブリダイズされた。アレイは、ＳＳＣバッファで洗浄され、アセトニトリルで乾燥した。アレイはＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒを用いてスキャンされた（Agilent）。  
未分化のｂｍＤＣは、１５０ｎｇ／ｍＬのマウスＩＬ−４及び２０ｎｇ／ｍＬのマウスＧＭ−ＣＳＦ（R&D Biosystems）を添加されたＲＰＭＩ１６４０培地（Sigma-Aldrich）中で５×１０５細胞／ｍＬで５％ＣＯ２、３７℃で６日間培養された赤血球を減少する骨髄細胞から作製された。一日おきに培地の半分は取り除かれ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４が添加された新しいＲＰＭＩ１６４０と交換された。６日目に、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞はＦＡＣＳ選別によって単離された。Ｆ４／８０ｈｉｇｈ腹腔マクロファージは、ＰＢＳ／ＥＤＴＡで腹膜透析から得られた単細胞溶液からＦＡＣＳ選別された。１０−１４週間目のＭＭＴＶ．ＰｙＭＴｔｇマウスからの腫瘍は、３７℃で１５分間、コラゲナーゼＩＩ、ＩＶ及びＤＮＡ分解酵素（Gibco及びSigma）で消化された。腫瘍関連Ｆ４／８０ｈｉｇｈマクロファージ（ＴＡＭ）は抗Ｆ４／８０ＰＥ及び抗ＰＥ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを用いた磁気細胞分離によって濃縮された（Miltenyi Biotech）。選別された細胞の精製度はフローサイトメトリによって確認され、磁気細胞選別によって精製された細胞は９５％以上、フローサイトメトリによって精製された細胞は９８％以上であった。全ての細胞は、染色の前に適切な血清又は精製されたＩｇＧの１０−２０％を用いてブロックされた。ＦＡＣＳ選別は、Ｖａｎｔａｇｅ又はＡｒｉａソーター（Becton Dickinson）でＰＩ除外により行われた。階層的クラスタ分割及び主成分分析（ＰＣＡ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｗｈｏｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ（ＷＭＧ）又はＭ１Ａ（マクロファージ・サブセットの比較）Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｌｏｇ２比率データ（Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA）に対してＰａｒｔｅｋ（登録商標）  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＳｕｉｔｅＴＭソフトウェア、バージョン６．３（Partek Inc., St. Louis, MO）を用いて行われた。ユークリッド距離は、行又は列間の相違点、クラスタ間の距離を算出する平均連結法及び階層的クラスタ分割における「２−Ｐａｓｓ」クラスタリング方法を測定するために用いられた。ＰＣＡにおいて、分散マトリックスは共分散であり、固有ベクトルは標準化される。Ｐａｒｔｅｋ  Ｂａｔｃｈ  Ｒｅｍｏｖｅｒは、ＰＣＡのデータ視覚化上のマウス系統差異の効果を取り除くために用いられた。Ａｇｉｌｅｎｔ  ｌｏｇ２比率の発現値は、強度プロット線のｚ−スコアに変換された。
それらの３つの細胞型の発現遺伝子のヒートマップ像は、ＴＡＭが腹腔マクロファージ及びｂｍＤＣとは異なることを示している（図５Ａ）。データは、３つの異なる遺伝子発現プロファイルの関係を推定するために、三次元主成分分析（「ＰＣＡ」）によって、統計学的にも調べられた。集団のクラスタリングはＴＡＭが両方のコントロール群とは異なることを示したが、ＴＡＭはｂｍＤＣよりも腹腔マクロファージと関連があるようであった（図５Ｂ）。図５Ｃは、ＴＡＭが、腹腔マクロファージ、脾臓マクロファージ及びクッパー細胞などの他のマクロファージとは区別可能であることを示している。  
ＴＡＭの形態は、腹腔マクロファージ及びｂｍＤＣの形態と比較された（図４Ｃ）。ＴＡＭ及びｂｍＤＣは、多くの液胞と共に散在する大きい細胞原形質及び小さい核を有している大細胞であった。対照的に、腹腔マクロファージは、サイズがとても小さく、液胞を欠くホモロガスな細胞原形質及び大核を有していた。したがって、ＴＡＭは、腹腔マクロファージとは顕著に異なるが、ｂｍＤＣと類似しているように見えた。  
【０１０８】
Ｂ：  免疫寛容原性抗原提供細胞のＴＡＭ表示特徴
上記のＰｙＭＴｔｇマウスから単離されたＴＡＭのｂｍＤＣに対する形態学的類似点及び腹腔マクロファージに対する相違点を仮定すると、特にＰｙＭＴ腫瘍から単離されたＴＡＭが抗原提供細胞として作用するかどうか判断するために、これらの細胞型間の分子的類似点及び相違点の更なる解析が行われた。ＭＨＣＩＩ、共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６及びＣＤ８３（成熟ＤＣのマーカー）の発現は、上記のようにＦＡＣＳ解析によってＴＡＭ、ｂｍＤＣ及び腹腔マクロファージにおいて測定された。特に、腹腔マクロファージがＭＨＣＩＩの適度なレベルを発現するだけだったのに対して、ＴＡＭは半成熟したｂｍＤＣに観察されるのと同様に高レベルでＭＨＣＩＩを発現した（図６Ａ−Ｃの最も左のパネルの比較）。ＴＡＭは、ＣＤ８０又はＣＤ８３のいずれをもほとんど発現せず、ＣＤ８６の適度な量を発現した。休止期の腹腔マクロファージはＣＤ８０及びＣＤ８３を低レベルで発現し、ＣＤ８６を高レベルで発現したが、ｂｍＤＣ（未分化及び半成熟のＤＣの不均一な集団）は、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ８６を低レベルから適度なレベルで発現した（図６Ａ−Ｃ）。  
【０１０９】
実施例３：ＴＡＭ  ケモカイン及びサイトカインプロファイル
抗腫瘍免疫応答と同様にどのようにＴＡＭが腫瘍成長及び進行に影響するかを更に理解するために、ＴＡＭのサイトカイン及びケモカイン・プロファイルが評価された。遺伝子の選択されたセットについて、実施例２に記載されるように、マイクロアレイ解析が行われた：ケモカインＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１６及びＫＣ及びサイトカインＩＬ−１α（ＩＬ−１β、ＩＬ１  ＲＡ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ及びＬＴβ）。腹腔マクロファージ及びＴＡＭは、異なるケモカイン及びサイトカイン・プロファイルを示した（表２及び図７Ａを参照）。ＴＡＭは、例えばｂｍＤＣと比較して、特定のケモカイン（ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１６及びＫＣ（表２及び図７Ａを参照））をコード化するｍＲＮＡをより多く産生した。このようなケモカインの発現は、単核細胞、未分化のＤＣ、ＮＫ細胞及びＴ細胞のような腫瘍において典型的に見出される種々のリンパ球を誘因するであろう。ＴＡＭにおけるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１残気、ＴＮＦα及びＬＴβコード化ｍＲＮＡの強化されたレベルは、ｂｍＤＣと比較して検出された（データ未掲載）。
表２：ｂｍＤＣと比較したＴＡＭにおけるケモカインｍＲＮＡ発現
2010533866.tif 000004
＊膜貫通タンパク質；切断された(shedded)形は、スカベンジャー受容体として作用する
【０１１０】
腫瘍細胞、腹腔マクロファージ及びｂｍＤＣと比較したＴＡＭの遺伝子発現のヒートマップ解析もまた行われた。トータルＲＮＡは、製造業者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙミニ・キット（Qiagen）を用いて精製された。ＲＮＡの質はＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上でＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｐｉｃｏ  Ａｓｓａｙを用いて評価され、Ｌｏｗ  ＲＮＡ  Ｉｎｐｕｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔは蛍光ｃＲＮＡプローブ（Agilent）を用意するために用いられた。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍ１Ａマイクロアレイは、遺伝子発現を評価するために用いられた。それぞれの細胞型のための６つの反復試験試料はＣｙ５で標識化され、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Stratagene）はＣｙ３で標識化された。７５０ｎｇの標識化Ｃｙ５及びＣｙ３プローブは、３０分間断片化され、両方のプローブはそれぞれのチップ上にロードされた。オーバーナイトハイブリダイゼーションは６０  ℃で行われ、スライドは６ｘＳＳＣ及び０．１ｘＳＳＣ中でその後洗浄され、その後アセチル・ニトリル乾燥工程が続いた。マイクロアレイは、１００に設定されたスキャナ感度でスキャンされた。  
結果は、ＴＡＭが炎症性サイトカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＴＮＦα及びＬＴβ）及び抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１０及びＴＧＦβ１）をコード化するｍＲＮＡを上昇したレベルで発現したが、ＩＬ−６、ＴＧＦβ２又はＴＧＦβ３をコード化するｍＲＮＡを低いレベルで発現したことを示した（図１４Ａ）。これらの解析は、ＴＡＭがＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−１０Ｒα、ＩＬ−１０Ｒβ、ＩＬ−１３Ｒα、ＩＬ−１７Ｒα、ＴＧＦβＲ１及びＴＧＦβＲ２の上昇したレベルの固有のサイトカイン受容体発現パターンを示すことをも見いだした（図１４Ｂ）。ＴＡＭは、多くの炎症性ケモカイン（ＣＣＬ２、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１４及びＣＸＣＬ１６）をコード化するｍＲＮＡも高いレベルで発現した（図１４Ｃ）。ＣＣＬ２の発現が腹腔マクロファージの発現（２．７±１．０ｎｇ／ｍｌ対３．９±０．９ｎｇ／ｍｌ）と類似していたのに対して、精製されたＴＡＭはＣＣＬ３（１．１±０．３ｎｇ／ｍｌ  対腹腔マクロファージの検知されない量）、ＣＣＬ５（１．８±０．６ｎｇ／ｍｌ対腹腔マクロファージの検知されない量）及びＣＸＣＬ１０（５．５±１．３ｎｇ／ｍｌ対腹腔マクロファージの１．３±０．３ｎｇ／ｍｌ）を高レベルで分泌した（図１４Ｄ）。この異なるケモカイン・プロファイルは、ＴＡＭが腫瘍へ能動的に白血球を補充することを示唆した。ＴＡＭはＣＣＲ６、ＣＸＣＲ４及びＣＸ３ＣＲ１、ＴＧＦβ１によって誘導されることが公知のケモカイン受容体（Chen, S. et al., Immunology 114: 565-74, 2005; Yang, D., et al., J Immunol 163: 1737-41, 1999; Chen, S., J Neuroimmunol 133: 46-55, 2002）、及びＣＣＲ２、ＣＣＲ１２及びＣＣＲ５をコード化するｍＲＮＡを上昇したレベルで発現した（図１４Ｅ）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＴＡＭにおいて上昇したＣＣＲ６  ｍＲＮＡレベルの存在を確認した（ＴＡＭ：ΔΔｃｔ＝４６７．８±３３２．０；ｂｍＤＣ：ΔΔｃｔ＝１．０±０．６；ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ΔΔｃｔ＝６．４±６．１）（図１４Ｆ）。
ＴＡＭにおいて観察される、この異なるケモカイン及びサイトカインのｍＲＮＡプロファイルが発現タンパク質レベルにおいても存在するかどうかを試験するために、ＴＡＭは上記の通りにＰｙＭＴｔｇマウスから精製され、特定のサイトカイン及びケモカイン・タンパク質の産生は腹腔マクロファージのタンパク質発現と比較して２１時間の培養後に評価された。ＦＡＣＳ解析は、実施例１に記載されているようにして行われた。ＴＡＭ及び腹腔マクロファージは、３７℃及び５％ＣＯ２、ＲＰＭＩ１６４０培地において２×１０６／ｍＬの濃度で、フィブロネクチン・コーティング付き丸底９６ウェルプレートで２１時間培養された。上清に分泌されるサイトカインは、Ｌｕｍｉｎｅｘ解析によって検出された。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析もまた行われた。選別された免疫細胞のＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（Qiagen）を用いて単離され、ＤＮエースＩ（Sigma）で消化された。細胞のトータルＲＮＡは、逆転写され、製造業者の説明書に従って７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems）を用いて、三通りでリアルタイムＴａｑＭａｎ  ＰＣＲによって分析された。発現遺伝子の任意の発現単位は、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのそれの倍数発現として求められた。それぞれの遺伝子に対するプライマーは、標準プロトコルに従ってエキソン／イントロンの境界上に設計され、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得られた。  
【０１１１】
結果は、図７Ｂに示す。ＴＡＭ及び腹腔マクロファージが両方ともＩＬ−１０を適度なレベルで分泌したのに対して（ＴＡＭにおいて０．８１±０．１３ｎｇ／ｍＬ対腹腔マクロファージにおいて０．６９±０．１９ｎｇ／ｍＬ）、ＴＡＭはＴＮＦαを相対的に高レベルで（ＴＡＭにおいて０．５７±０．１２ｎｇ／ｍＬ対腹腔マクロファージにおいて０．０８±０．０１）、ＩＬ−６を超低レベルで（ＴＡＭにおいて３．５±０．５ｎｇ／ｍＬ対腹腔マクロファージにおいて４８．５±１２．７ｎｇ／ｍＬ）産生した。さらに、ＴＡＭはＩＬ−１αをわずかに低いレベルで分泌したが（ＴＡＭにおいて０．０５±０．０１ｎｇ／ｍＬ対腹腔マクロファージにおいて０．０５±０．０２ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１βは有意に上昇したレベルで分泌された（０．１２±０．０４ｎｇ／ｍＬ対０．０５±０．０２ｎｇ／ｍＬ）。  
ケモカイン解析は、ほとんどの場合、上記のマイクロアレイ解析によって観察されたＴＡＭプロファイルを明確に裏づけた。ＴＡＭは、ＣＣＬ３（ＴＡＭにおいて１．１±０．３ｎｇ／ｍＬ、腹腔マクロファージにおいて検知されない）；ＣＣＬ５（ＴＡＭにおいて１．８±０．６ｎｇ／ｍＬ、腹腔マクロファージにおいて検知されない）；及びＣＸＣＬ１０（ＴＡＭにおいて５．５±１．３ｎｇ／ｍＬ対腹腔マクロファージにおいて１．３±０．３ｎｇ／ｍＬ）のｍＲＮＡを高レベルで発現した（図７Ｂ）ＫＣｍＲＮＡの発現が減少された（ＴＡＭにおいて６．４の±０．７ｎｇ／ｍＬ対腹腔マクロファージにおいて１８．６の±６．９ｎｇ／ｍＬ）のに対して、ＴＡＭにおけるＣＣＬ２  ｍＲＮＡの発現は腹腔マクロファージのそれと類似していた（ＴＡＭにおいて２．７±１．０ｎｇ／ｍＬ対腹腔マクロファージにおいて３．７±１．０ｎｇ／ｍＬ）（図７Ｂ）。ＰｙＭＴｔｇ由来ＴＡＭ、腹腔マクロファージ、ｂｍＤＣ及び腫瘍細胞におけるＴＧＦβ１発現のリアルタイムＰＣＲ解析は、ＴＡＭがそのサイトカインを最も高く発現することを示した（図７Ｃ）。ＩＬ−６の超低レベルの発現とＴＧＦβ、ＩＬ−１０及びＴＮＦαの適度な発現の組合せは、ＴＡＭが免疫抑制性特性を有していることを示唆する。さらにまた、観察されたＴＡＭケモカイン・プロファイルは、ＴＡＭが多種多様なケモカインを分泌することによって腫瘍において観察される白血球浸潤を調節しうることを示唆する。  
文献に認識されたＭ１／Ｍ２パラダイム（Mantovani et al., Trends Immunol 25 (12): 677-86, 2004； Gordon, Nat Rev Immunol 3 (1): 23-35, 2003を参照）は、そのマクロファージが典型的な炎症性条件（ＩＦＮγ／ＬＰＳ）又は選択的に活性化された条件（ＩＬ−４／ＩＬ−１３）のいずれかにおいて、固有の機能特性を有する分化したサブセット（それぞれＭ１、Ｍ２）に分化することを示唆する。典型的なＭ１マクロファージが炎症反応を裏づけることが提唱されたのに対し、Ｍ２マクロファージは抑制性ＩＬ−１０及びＴＧＦβの豊富な微小環境の発達を刺激する。文献は、ＴＡＭを「選択的に活性化された」Ｍ２マクロファージとして分類した（Mantovani et al., Trends Immunol 23: 549-55, 2002; Sica et al., Eur J Cancer 42: 717-27, 2006）。Ｍ１又はＭ２表現型のいずれかに関連した分子のｍＲＮＡ発現プロファイル分子のヒートマップ解析により、ＴＡＭは、中性腹腔マクロファージと比較すると特定のＭ２関連分子（ＳｃａＲ  Ｂ、ＭＲ１、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、Ｆｉｚｚ１、ＩＬ−１ＲＩＩ及びＩＬ−１ＲＡ）の高いｍＲＮＡレベルを発現するが、他のＭ２関連分子（Ｍｇｌ１、Ｍｇｌ２、ＳｃａＲ  Ａ、ＭＲ２、ＦｃｅＲＩＩ、Ａｒｇ１、Ｙｍ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２及びＣＣＬ２４）の発現を欠いており、更に、Ｍ１関連分子（ＩＬ−１β、ＦｃＲＩａ、ＦｃＲＩＩｂ、ＦｃＲＩＩＩａ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１及びＣＸＣＬ１６）の高いｍＲＮＡレベルを発現することが見いだされた（図１５Ａ−Ｂ）。これらの観察されたサイトカイン及びケモカイン・プロファイルは、ＴＡＭが抑制性サイトカインを分泌するにもかかわらず、Ｍ２マクロファージとは異なることを証明している。ＴＡＭは、多くの炎症性Ｍ１特徴（例えばＴＮＦａ及びＩＬ−１βの産生及びＦｃＲ１、ＦＣＲＩＩｂ及びＦｃＲＩＩＩａの発現）を示す。ＴＡＭは、例えばＮＫ細胞に走化性の多くの炎症性「Ｍ１」ＣＣ及びＣＸＣケモカインを分泌したが、ＴＨ２又はＴ調節細胞を誘引する古典的なＭ２ケモカインＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２及びＣＣＬ２４は分泌しなかった。  
【０１１２】
実施例４：インビトロにおけるＴ細胞に対するＴＡＭの作用
ＴＡＭの上記の特性がＴ細胞とのＴＡＭ相互作用を反映するかどうか調査するために、ｎａiｖｅＴ細胞増殖及びサイトカイン分泌を誘導するＴＡＭの能力が腹腔マクロファージ及びｂｍＤＣのＴ細胞誘導活性と比較して評価された。ＰｙＭＴｔｇ腫瘍モデルがヒト転移性乳癌発達の多くの態様を模倣するにもかかわらず、それはもまたＦＶＢの背景を必要とし、抗原特異性Ｔ細胞の研究の実施を難しくする。その代わりに、選択された免疫細胞及びＣＦＳＥ標識化ＣＤ４＋Ｔ細胞のインヴィトロでの共培養が行われた。ｎａiｖｅＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＦＶＢマウスの脾臓及び末梢リンパ節から調製された。単個細胞浮遊液は、ＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋及びＣＤ１０３＋細胞が減少されたＭＡＣＳであった（eBioscience及びMiltenyi Biotech）。ネガティブ画分中のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４−ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Miltenyi Biotech）で濃縮され、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲｂｈｉｇｈＣＤ２５＝ＣＤ６９＝ＣＤ１０３＝ｎａiｖｅＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＦＡＣＳ選別により単離された（eBioscience又はPharmingenから全ての抗体）。ＴＡＭ、腹腔マクロファージ又はｂｍＤＣによって誘導されるＴ細胞増殖は、０．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体と１×１０５ｎａiｖｅＴ細胞を用いて２×１０４のＴＡＭ、腹腔マクロファージ又はｂｍＤＣを培養することによって調査された。細胞は、５％ＣＯ２、３７℃でフィブロネクチン・コーティング付き丸底９６ウェルで培養された。５日間の培養後、細胞上清は、標準手順を用いたＥＬＩＳＡアッセイによるサイトカイン解析のために−８０℃で凍結された。ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ−１０、ＫＣ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ及びＴＮＦαは、製造業者の説明書に従って、Ｌｉｎｃｏｐｌｅｘ  ｋｉｔ（Ｌｉｎｃｏ）を用いて培養液上清中で検出された。Ｔ細胞増殖は、ＦＡＣＳによって調べられた。  ＣＳＦＥの希釈の測定値は、ＴＡＭがプロフェッショナル抗原提示細胞腹腔マクロファージ及びｂｍＤＣ（示されないデータ）によって誘導されるそれらと同等のレベルでＴ細胞増殖を誘導することを示した。ｂｍＤＣとは対照的に、ＴＡＭ−感作Ｔ細胞はＩＬ−１０（ＴＡＭ−感作細胞において２．５±０．４ｎｇ／ｍＬ対ｂｍＤＣ−感作細胞において検知されない）及びＩＦＮγ（ＴＡＭ−感作細胞において５．６±１．２ｎｇ／ｍＬ対ｂｍＤＣ−感作細胞において０．２±０．１ｎｇ／ｍＬ）を高水準で分泌し、ＩＬ−２（ＴＡＭ−感作細胞において０．３±０．１ｎｇ／ｍＬ対ｂｍＤＣ−感作細胞において５．４±０．６ｎｇ／ｍＬ）を超低レベルで分泌し、ＩＬ−４（ＴＡＭ−感作細胞において検知されない対ｂｍＤＣ−感作細胞において０．２±０．１ｎｇ／ｍＬ）を分泌しなかった（図８Ａ）。ｎａiｖｅＣＤ４＋  Ｔ細胞においてＴＡＭがＩＬ−４を誘導できないことは、１：１の比率でより劇的であり、ｂｍＤＣによる非常に高いＩＬ−４の誘導（２．７±０．２ｎｇ／ｍＬ）と比較して、ＴＡＭ初回抗原刺激ではＩＬ−４の誘導の完全に近い欠如を示した（０．２±０．０２ｎｇ／ｍＬ）（図８Ａ）。ＴＡＭ又はｂｍＤＣで刺激されたＴ細胞は、同程度のＩＬ��５、ＩＬ−１３及びＴＮＦαを発現した（データ未掲載）。ＴＡＭによって活性化されたＣＤ４＋  Ｔ細胞からのサイトカイン分泌パターンは、ＴＡＭがＩＬ−１０＋  Ｔｒ１  Ｔ細胞を誘導することを示唆した。ＴＡＭもまたＩＬ−１７を高レベルで誘導した（ｂｍＤＣ−感作Ｔ細胞において０．７±０．１ｎｇ／ｍＬ対ＴＡＭ−感作Ｔ細胞において１．６±０．６ｎｇ／ｍＬ）（図８Ａ、右パネル）。
【０１１３】
それらのＴ細胞サイトカインがＴ細胞によって分泌されたことを確認するために、ＴＡＭ及び他の免疫細胞活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞培養（上記の通りの）は固定され、それぞれの主要サイトカインについて細胞内染色された。簡潔には、ＴＡＭ、腹腔マクロファージ又はｂｍＤＣと共に５日間間培養されたＴ細胞は、５０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ及び７５０  ｎｇ／ｍＬのイオノマイシンで６時間、最後の４時間は５μｇ／ｍＬ  Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａを添加して再刺激し、そしてブロッキング試薬及びＣＤ４について表面染色された。細胞は固定され、製造業者の説明書に従ってＦａｓｔＩｍｍｕｎｅ（登録商標）ＣＤ４  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ）を用いてＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＬ−１７の細胞内発現について染色された。ＦＡＣＳ解析は、実施例１に記載されているように行われた。図８Ｂに示すように、ＴＡＭ−感作ＣＤ４＋  Ｔ細胞はＩＬ−１０及びＩＬ−１７を高レベルで、ＩＬ−２を低下したレベルで分泌し、この分泌はＴＡＭによるＴＧＦβ分泌に依存していた。組換えＴＧＦβＲＩＩの添加によるＴＧＦβの中和によって、ＩＬ−１０（２７．４±２２．１％）及びＩＬ−１７（７９．４±９．９％）の発現の減少及びＩＬ−２分泌の２５９．９±６８．０％の増加が生じた（図８Ｃ）。このデータは、上記の所見とともに、ＴＡＭがそれらの培養においてＩＬ−１０＋Ｔｒ１及びＩＬ−１７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導しているであろうことを確認した。  
ＴＡＭが少なくとも一つの特定の調節Ｔ細胞サブセットを誘導するであろうことが証明されたので、ＴＡＭもまたＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞を誘導しうるかどうかを決定するために実験が行われた。ＦｏｘＰ３誘導を評価するために、２×１０４のＴＡＭ、又は、ｂｍＤＣは、５％ＣＯ２、３７℃でフィブロネクチン・コーティング付き丸底９６穴プレートで、１×１０５ｎａiｖｅＣＤＳＥ＋Ｔ細胞（ＣＤ２５−ＣＤ６９−ＣＤ１０３−ＣＤ４５ＲｂｈｉｇｈＣＤ６２ＬｈｉｇｈであってＦｏｘＰ３ネガティブ（０．３％  ＦｏｘＰ３＋））及び０．００２μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３抗体と共に培養された。５日間後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞による細胞内ＦｏｘＰ３発現はマウス及びラットＦｏｘＰ３（eBioscience）に特異的な結合抗体を用いて、製造業者の説明書に従って分析された。結果は、図９に示す。ｂｍＤＣ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞とは対照的に、ＴＡＭを処理された培養中の３．３±０．９％ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の存在によって証明されたように、ＴＡＭ活性化は調節Ｔ細胞の誘導を支持したのに、ｂｍＤＣを処理された培養は０．８±０．５％のＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞を示すだけだった（図９Ａを参照）。組換えＴＧＦβＲＩＩでのＴＧＦβの中和によりＴＡＭ処理されたＴ細胞においてほぼ８０％  ＦｏｘＰ３の発現がＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞において０．７±０．２％に減少したことから、ＴＡＭで活性化されるＴ細胞におけるＦｏｘＰ３の誘導はＴＡＭによるＴＧＦβの産生にも依存していた（図９Ｂ）。
ＴＡＭ−誘導ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞が制御能力を有することを確認するために、細胞は自然発生のＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞において発現されることが公知のタンパク質について染色された。他のＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、ＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞でＧＩＴＲが高レベルで発現されることは公知だった（McHugh et al., Immunity 16: 311-23, 2002）。ＴＡＭ−誘導Ｔ細胞もまた高レベルのＧＩＴＲ発現をしており（図９Ｃ）、それらの細胞が制御能力を有するＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞であることを示唆した。同様に、ＴＡＭ誘導ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞（およそ６．３％、図９Ｄを参照）はＣＤ１０３（インビボで末梢性−誘導制御Ｔ細胞に発現することが知られているマーカー）を低レベルで発現しており、ＴＡＭ−誘導ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞が制御特性を有する制御Ｔ細胞であることを示唆する。ＴＡＭが、単離の後でｎａiｖｅＴ細胞のプールに残っているわずかなＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の増殖を刺激するだけであるのに対して、ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞を誘導したことを確認するために（０．３％、図１０Ａを参照）、ＣＤ４＋Ｔ細胞プールにおいて８．７±０．２％ＦｏｘＰ３＋細胞を含む脾細胞が同じ条件の下で刺激された。図１０Ｃに示すように、ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞のプールは２．２±１．５％に減少しており、ＴＡＭが直接ＦｏｘＰ３＋制御ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導しうることを示唆した。実験は脾細胞の代わりにＴ制御細胞を用いて繰り返され、結果は同じであった（図１０Ｄと１０Ｃとの比較）。ｎａiｖｅＣＤ４＋Ｔ細胞に対する異なる抗原提示細胞の刺激能もまた評価された。図１０Ｂに示すように、各々のｂｍＤＣ、ＴＡＭ及び腹腔マクロファージは、同程度にＣＦＳＥ標識化ｎａiｖｅＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激することができた。したがって、ＴＡＭによるＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の誘導は、他の抗原提示細胞と比較してＴＡＭによるＴ細胞誘導の一般的な増加によるものではない。
【０１１４】
実施例５：インビボでのＴ細胞に対するＴＡＭの作用
前の実施例の組み合わせられたデータは、ＴＡＭがインビトロでＩＬ−１０＋及びＦｏｘＰ３＋制御Ｔ細胞、さらにＩＬ−１７＋ＴＨＩＬ−１７のＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導することを示唆した。このような細胞集団を誘導するインビボでの関連性を評価するために、インビボでのそれらの細胞サブセットの存在及び局在が決定された。ＰｙＭＴｔｇマウスの腋窩及び上腕リンパ節の単個細胞浮遊液は、標準技術を用いて調製された。上述したように、細胞懸濁液は６時間刺激され、ＣＤ４、ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＬ−１７に特異的な抗体で染色された。インビトロにおけるデータと十分に一致して、ＩＬ−４−及びＩＬ−１０＋ＣＤ４＋Ｔｒ１細胞はインビボで検出され、ＩＬ−１７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１１Ａ）も同様に検出された。これらのサイトカインの有意な発現は、年齢を合わせたコントロールＦＶＢマウスに由来する腋窩及び上腕リンパ節のＣＤ４＋Ｔ細胞では検出されなかった（図１１Ｂ）。興味深いことに、全てのサイトカイン産生ＣＤ４＋Ｔ細胞は、調査されたサイトカインの一つだけを発現した（すなわち、ＩＬ−１０又はＩＬ−１７のいずれかであって、両方ではない）。  
腫瘍モデル・マウス対ＦＶＢマウスにおけるインビボでの制御ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の発生率の頻度もまた調査された。ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞における有意な増加は、ＦＶＢコントロールと比較して、ＰｙＭＴｔｇマウスの腫瘍−流入腋窩及び上腕リンパ節において観察された（８．６±０．９％  対６．３±１．２％  、ｐ＝０．０３３）（図１１Ｃ）。ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞における有意な増加は、ＦＶＢコントロールと比較して、ＰｙＭＴｔｇマウスの脾臓において観察された（１２．３±５．４％対７．６±０．５％、ｐ＝０．０２７）（図１１Ｃ）。ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の高い頻度は、ＰｙＭＴｔｇマウスの腫瘍において観察された（１９．０±７．８％）（図１１Ｃ）。  
【０１１５】
実施例６：ＴＡＭは脂肪組織マクロファージに対する類似性を示す
上記の研究によりＴＡＭが行うことが示されたが、Ｆ４／８０＋脂肪組織マクロファージ（ＡＴＭ）がＣＤ１１ｃ発現を場合によっては得ることができると最近報告された（Lumeng et al., J Clin Invest 117: 175-84, 2007）。糖尿病のような特定の疾患が軽度であるが、慢性炎症と関連していることから（Neels and Olefsky, J Clin Invest 116: 33-5, 2006）、上記の結果はＴＡＭが腫瘍生物学に寄与することを示唆しているが、ＴＡＭ及びＡＴＭ細胞集団の比較は、ＡＴＭがこの慢性炎症に寄与するかどうかをより理解するために行われた。
食餌誘発性肥満のＣ５７ＢＩ／６雄マウス（Jackson Laboratory）は、６週齢から６０  ｋｃａｌ％脂肪からなる高脂肪食（ＨＦＤ）を２０週間供給されることによってインスリン耐性となった。ｄＢ／ｄＢマウス、若い又は年齢が合ったコントロール・マウス（１０  ｋｃａｌ％脂肪からなる標準食事を供給した）もまた得られた。腋窩の及び上腕の腫瘍流入及び鼠蹊部脂質流入領域リンパ節の赤血球溶解した単個細胞浮遊液は、ＦＡＣＳ解析のために用いられた。簡潔に、ｎａiｖｅＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＦＶＢ又はＣ５７ＢＩ／６コントロール・マウスの脾臓、末梢及び腸間膜のリンパ節の赤血球溶解された単細胞懸濁液から調製された。細胞は、最初ＭＡＣＳが減少したＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋及びＣＤ１０３＋細胞であり、ＣＤ４−Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Miltenyi Biotech）で濃縮された。最終的に、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲｂｈｉｇｈＣＤ２５ＣＤ６９＝ＣＤ１０３＝ｎａiｖｅＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＦＡＣＳ選別によって単離された。ＦＡＣＳ及びＲＴ−ＰＣＲ実験は、前の実施例にて説明したように行われた。顕微鏡法研究は、標準技術を用いて、遠心によって組織サンプルから集められる新たに単離されたＡＴＭ、ＴＡＭ及び腹腔マクロファージについて行われ、ヘマトキシリン−エオジン染色法で染色された。
結果は、図１２に示す。５ヵ月間の高脂肪食を給餌された雄Ｃ５７ＢＩ／６マウスは、年齢が合ったコントロール・マウスのように、精巣上体脂肪組織の骨髄性細胞において高い比率を示した（ＨＦＤ：３５．９±６．７％（図１２Ａ）；年齢が合ったコントロール・マウス：３２．９±７．１％（データ未掲載））。２ヵ月齢の雄Ｃ５７ＢＩ／６マウスは、しかしながら、精巣上体脂肪組織のＣＤ１１ｂ＋細胞の有意に低い比率を示した（１５．５±１１．０％、ｎ＝４（データ未掲載））。以前の所見を確認すると（Lumeng et al., J Clin Invest 117: 175-84, 2007）、脂肪組織のＦ４／８０＋ＡＴＭの３２．９±６．７％もまたＣＤ１１ｃを供発現することが判明したが（図１２Ｂ）、普通食を給餌された年齢が合ったマウス又は２ヵ月齢のマウスの精巣上体脂肪組織から単離されたマクロファージはごくわずかなＣＤ１１ｃ発現しか示さなかった（データ未掲載）。更に、ＡＴＭはＭＨＣＩＩを高レベルで、ＣＤ８６を低レベルで発現することが見いだされ、ＴＡＭの所見と類似していた（図１２Ｂ））。上の調査において同定されたさらなるＴＡＭ表面マーカーは、ＡＴＭ集団において試験された。ＡＴＭ及びＴＡＭはＣＤ１４の類似した発現量を有しているが、ＩＣＯＳ  Ｌ及びＴＩＭ３の発現を欠如していることが判明し、その両方はＴＡＭにおいて中程度から強度の発現を示した（図１２Ｃと１２Ｄとの比較）。  
特に、２０週間の高脂肪食を給餌された雄Ｃ５７ＢＩ／６マウスから精製されたＡＴＭのサイトカイン及びケモカイン・プロファイルは、ＴＡＭのそれと類似していた。これらの特定のＡＴＭはＩＬ−１０を高レベルで発現し（０．８４±０．０１ｎｇ／ｍｌ対腹腔マクロファージにおいて観察された０．４７±０．１８ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６を中間レベルで発現し（１０．９±７．９ｎｇ／ｍｌ対腹腔マクロファージにおいて観察される３８．１  ±  ３０．６  ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦαを低レベルで発現した（０．１３±０．０４ｎｇ／ｍｌ対腹腔マクロファージの０．１３±０．０６ｎｇ／ｍｌ）（図１２Ｅ）。ＡＴＭは、高レベルのＣＣＬ２（５．９±１．８ｎｇ／ｍｌ対腹腔マクロファージにおいて観察された４．３±２．７ｎｇ／ｍｌ）及びＣＸＣＬ１０（２３．５±８．１ｎｇ／ｍｌ対腹腔マクロファージにおいて観察された２８．７±１６．５ｎｇ／ｍｌ）、低レベルのＣＣＬ３（０．９７±０．５７ｎｇ／ｍｌ対腹腔マクロファージの検知されない量）及びＣＣＬ５（０．２±０．２ｎｇ／ｍｌ対腹腔マクロファージにおいて検出できない）を分泌することも見いだされた（図１２Ｅを参照）。さらに、ＡＴＭは、同様のレベルのＴＧＦβ１、及びわずかに低いレベルのＴＧＦβＲ１を発現した（ＴＡＭと比較して３．６倍少ないが、腹腔マクロファージより４．９倍多い）（図１２Ｆ）。しかしながら、ＴＡＭに対する明確な対照として、ＡＴＭはＲｕｎｘ３又はＩＲＦ−８を発現せず（データ未掲載）、それはＡＴＭにおけるランゲリン発現の欠如と相関する。更なる顕微鏡法研究は、ＡＴＭ及びＴＡＭの形態が互いに類似しているが、腹腔マクロファージ形態とは異なることを示唆した（図１２Ｇ）。ＴＡＭ及びＡＴＭの両方は大きく、小さい核及び大きい空胞のある細胞原形質（図１２Ｇを参照）を有している。
結果は、Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｃ＋マクロファージが特殊な微小環境に制限される異なる免疫細胞サブセットでないことを示し、炎症を起こした組織に存在するマクロファージの新規な亜集団を特徴づけた。更に、このマクロファージ亜集団は、それ自体で、異なるサイトカイン発現及び細胞表面マーカー発現を有している少なくとも２つの亜型から成る。
【０１１６】
実施例７：ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＡＴＭの作用
上の実施例は、ＴＡＭがＦｏｘＰ３＋制御Ｔ細胞を誘導しうることを証明した（図１０Ａを参照）。同様の実験は、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が肥満の高脂肪食（ＨＦＤ）給餌マウスにおいて増大されたかどうか、更に、ＡＴＭがＦｏｘＰ３＋制御Ｔ細胞を同様に誘導可能であるかどうかを決定するために行われた。
ｎａiｖｅＦｏｘＰ３＝ＣＤ４＋Ｔ細胞は、それぞれの組織及び抗ＣＤ３で活性化された。肥満マウスからの１×１０４の脂肪組織マクロファージ（ＡＴＭ）は、０．００２μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３（BD Bioscience）及び５×１０４ｎａiｖｅＣＤ４＋Ｔ細胞と共に丸底９６穴プレートに蒔かれ、２００μＬの最終的な量で培養されたＬ（３７℃、５％ＣＯ２で完全ＲＰＭＩ１６４０）。５日間後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、採取され、ＦｏｘＰ３発現について分析された。  
ＡＴＭがＦｏｘＰ３＋制御Ｔ細胞を誘導するかどうかを決定するために、２×１０４の  ＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭ、腹腔マクロファージ又は痩せた脂肪組織マクロファージ（ＬＴＭ）は１×１０５ｎａiｖｅＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞及び０．００２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３と共に５日間培養された。細胞は、その後固定されてＦｏｘ  Ｐ３について染色されるか、培養液上清は採取され、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＬ−１７の存在を試験された。ヒートマップ解析は、実施例３に記載されているように行われた。ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１０の差次的な発現を確認するために、野生型ＦＶＢマウス又はＰｙＭＴｔｇ由来ＴＡＭからの腹腔マクロファージは、更なる刺激を伴わずに２×１０６／ｍｌの濃度で培養された。上清に分泌されるケモカインは、２１時間後に分析された。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、実施例３に記載されているように行われた。インターロイキン測定値は、実施例４に記載されているように行われた。
腫瘍における免疫浸潤と同様に、肥満ＨＦＤマウスからの精巣上体脂肪組織は年齢が合ったコントロールと比較して、かなりより高い割合のＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を含んだ（１８．５±６．２％対コントロールの７．９±３．７％；、図１３Ｉを参照）。さらにまた、肥満ＨＦＤマウスからの脂肪流入領域リンパ節は、年齢が合ったコントロールと比較して、かなりより高いレベルのＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を含んだ（１７．２±３．３％対コントロールの１３．４±０．６％；図１３Ｊを参照）。
【０１１７】
図１３Ａに示すように、腹腔マクロファージ又は痩せた脂肪組織マクロファージ以外のＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭは、ＦｏｘＰ３＋制御Ｔ細胞を誘導し得た（活性化ｎａiｖｅＴ細胞の８．３±１．７％；左パネルと、中心及び右パネルとの比較）。このインビトロでのデータは、インビボ・データによって更に裏づけられた。腫瘍を有するマウスにおいて観察されるように、増加したレベルのＦｏｘＰ３＋  制御Ｔ細胞が肥満Ｄｂ／Ｄｂマウスの脾臓（２３．６±１．６％対コントロールにおいて１４．４±１．６％）及び精巣上体脂肪組織（２４．９±６．２％対コントロールの８．５±１．３％）ＣＤ４＋Ｔ細胞において検出され（１３Ｃ図及び１３Ｄ）、ＡＴＭは出現率が増加することが知られている。ＡＴＭが制御Ｔ細胞の分化にとって重要なことが前に示されたサイトカインであるＴＧＦβ１を発現することは公知であるので、このサイトカインのＡＴＭのＦｏｘＰ３＋細胞誘導に対する影響が評価された。アッセイへのＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃの取り込みによるＴＧＦβの遮断は、ＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭによってほぼ完全にＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の誘導を抑制した（活性化ｎａiｖｅＴ細胞の２．２±０．１％）（図１３Ｂ）。
Ｔ細胞の他の型を誘導するＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭの能力もまた評価された。図１３Ｅに示すように、ＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭ活性化ｎａiｖｅＴ細胞は、ＦｏｘＰ３＋制御Ｔ細胞集団を含まれるだけではなく、Ｔｒ１及びＴＨ１７サイトカイン・プロファイルを示した。特に、ＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭ活性化ｎａiｖｅＴ細胞は、ＩＬ−１０を高レベルで分泌し（０．５±０．１ｎｇ／ｍｌ対腹腔マクロファージで活性化されたＴ細胞における０．６±０．１５ｎｇ／ｍｌ）、超低レベルのＩＬ−２（０．０２±０．０１ｎｇ／ｍｌ対腹腔マクロファージで活性化されたＴ細胞の０．１±０．０４  ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（０．１±０．０３ｎｇ／ｍｌ対腹腔マクロファージで活性化されたＴ細胞における０．１±０．０３ｎｇ／ｍｌ）を分泌した。更に、ＡＴＭはＴ細胞において発現されるＩＬ−１７を高レベルで誘導した（１．６±０．６ｎｇ／ｍｌ対腹腔マクロファージで活性化されたＴ細胞における３．４±０．２ｎｇ／ｍｌ）。ＡＴＭ−誘導Ｔ細胞培養試料のＦＡＣＳ解析は、ＡＴＭがｎａiｖｅＴ細胞培養からＴｒ１及びＴＨ１７Ｔ細胞への誘導を刺激することを確認した（図１３Ｆ）。さらに、ＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭで刺激されたｎａiｖｅＴ細胞は、ＴＮＦα、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の有意な量を分泌した（図１６Ｂ）。ＰｙＭＴｔｇマウスについての上記の実験の結果への類似性において、増大したレベルのＩＬ−１０（１．０±０．２％対コントロールにおける０．３±０．１％）及びＩＬ−１７（０．６±０．２％対コントロールにおける０．３±０．１％）の産生細胞は、コントロール・マウスと比較して高脂肪食を給餌された肥満マウスの脂肪流入領域リンパ節において検出された（１３Ｇ図及び１３Ｈ）。ＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭ及びＣＤ１１ｃ＋ＴＡＭは炎症性条件下で同様に機能するようだったにもかかわらず、ＰＣＡ解析は、ＡＴＭ及びＴＡＭが組織マクロファージ中の異なる細胞集団であることを明らかにした（図１７）。
ＴＡＭが、反対の文献報告にもかかわらず、標準的なＭ１又はＭ２マクロファージ・カテゴリーに適合しないことは、上記実施例に示した（実施例３を参照）。文献はＡＴＭがＭ１表現型を表示することを示唆した（Lumeng et al., J Clin Invest 117: 175-84, 2007）。事実、ここで示される結果はＡＴＭがＩＬ−１０、ＴＧＦβ及びＩＬ−１ＲＡを分泌することを示唆し、Ｍ２表現型の典型的な特徴であるＭｇｌ１、Ｍｇｌ２、ＣＤ１４及びＣＤ１６３を発現する。これらの結果も、ＡＴＭが抑制性制御Ｔ細胞及び炎症性ＴＨ１７細胞の産生を誘導することを明瞭示し、ＴＡＭと同様に、ＡＴＭがＭ１及びＭ２マクロファージ・クラスの特性に及んでいる。
【０１１８】
実施例８：ＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭ及びＣＤ１１ｃ−ＡＴＭ間の機能的相違
実施例３に示すように、ＴＡＭは特徴的なサイトカイン発現プロファイルを示す。ＣＤ１１ｃ−及びＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭのサイトカイン発現プロファイルが調べられた。ＣＤ１１ｃ＋及びＣＤ１１ｃ−ＡＴＭは、上記の通りに食餌誘発性肥満のＣ５７ＢＩ／６雄マウスからの精製され、それぞれの細胞集団における特定のサイトカイン及びケモカイン・タンパク質の産生は２１時間の培養後に評価された。ＦＡＣＳ解析は、実施例１に記載されているように行われた。ＡＴＭは、３７℃、５％  ＣＯ２でＲＰＭＩ１６４０培地において２ｘ１０６／ｍＬの濃度で、２１時間フィブロネクチン・コーティング付き丸底９６ウェルプレートにおいて培養された。上清中に分泌されるサイトカインは、ルミネックス解析によって検出された。結果は、図１８に記載される。ＣＤ１１ｃ＝ＡＴＭは、ＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭと比較して、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦα及びＧ−ＣＳＦのより高い発現量を示した。しかしながら、ＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭは、ＣＤ１１ｃ＝ＡＴＭより高いＶＥＧＦの発現量を示した。Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１ｂ、ＭＩＧ／ＣＸＣＬ９、ＭＩＰ−２／ＣＸＣＬ２、ＲＡＮＴＥＳ及びＫＣ／ＣＸＣＬ１レベルはＣＤ１１ｃ−ＡＴＭ及びＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭの間で同程度であり、ＣＤ１１ｃ−ＡＴＭもＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭもＩＬ−１ａ又はｅｏｔａｘｉｎを発現しなかった（データ未掲載）。異なるサイトカイン発現プロファイルに基づいて、このデータは、ＣＤ１１−ＡＴＭ及びＣＤ１１＋ＡＴＭがおそらく異なる生理機能を有する異なる細胞集団であることを更に示している。
実施例４に記載されているように、ＴＡＭは、ｎａiｖｅＴ細胞集団からＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞を誘導する。ＣＤ１１ｃ−ＡＴＭ及びＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭのＴ細胞−感作潜在性を調査するために、１×１０４ＣＤ１１ｃ−又はＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭは、２００μＬの最終量で０．５μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３及び５×１０４ｎａiｖｅＣＤ４＋Ｔ細胞と共に丸底９６穴プレートで培養された。ＡＴＭ及びｎａiｖｅＴ細胞の生存を促進するために、９６穴プレートは、あらかじめ組換えマウスのフィブロネクチンでコーティングされるか、組換えヒトＩＬ−２が培養に添加された。５日間後に、上清は採取され、解析まで−８０℃で保存された。上清のサイトカイン及びケモカインは、サイトカインＥＬＩＳＡによって、解凍された上清中に後に検出された（Lincoplex(登録商標)キット（Linco）、製造業者の説明書）。ＣＤ４ｎａiｖｅＴ細胞のサイトカイン産生の評価のために、流入領域リンパ節の単個細胞浮遊液又は培養細胞は、最後の４時間はＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａを添加して、６時間のＰＭＡ／イオノマイシンで再刺激された。染色の前に、細胞は適切な血清又は精製されたＩｇＧでブロッキングされた。収集はＰＩ除外（表面染色）を含み、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ又はＬＳＲ  ＩＩで行われ（Becton Dickinson）、ＪｏＦｌｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）で解析された。  
結果は、図１９Ａ及び１９Ｂに表される。ＣＤ１１ｃ−ＡＴＭは、非刺激Ｔ細胞と比較して、ＩＬ−４、ＴＮＦα、ＣＣＬ５、ＩＦＮγ及びＩＬ−１７発現の軽度の増加及びＩＬ−１３、ＩＬ−１０及びＩＬ−５発現の非常に大きな増加（ＩＬ−６発現は２５倍以上の増加）をＴ細胞に誘導した。ＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭは、非刺激Ｔ細胞と比較して、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ１０、ＴＮＦα、ＣＣＬ５及びＩＦＮγ発現のわずかな増加、及びＩＬ−１７及びＩＬ−６発現のより大きい増加（ＩＬ−６発現は３０倍以上の増加）をＴ細胞に誘導した。ＣＤ１１ｃ−ＡＴＭを誘導されたＴ細胞及びＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭを誘導されたＴ細胞間のサイトカイン／ケモカイン発現量パターンの比較により、ＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭ−誘導細胞よりも、ＣＤ１１ｃ−ＡＴＭ誘導細胞が実質的により増大したＩＬ−１０及びＩＬ−１３の発現、同程度のＩＬ−４、ＴＮＦα、ＣＣＬ５及びＩＦＮγの発現及びより少ないＩＬ−１７及びＩＬ−６の発現を示すことが証明された（図１９Ａ及び１９Ｂを参照）。この結果は、ＣＤ１１ｃ−ＡＴＭ及びＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭが異なる生理機能を有する２つの異なる細胞集団であることを更に証明する。 
【０１１９】
実施例９：ＡＴＭによるＴｈ１対Ｔｈ２細胞の誘導
樹状細胞がＴｈ１又はＴｈ２細胞に分化するためにＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する方法は、その表面にあるＣ型レクチン分子のｎａiｖｅＣＤ４＋Ｔ細胞との相互作用によるものである。例えばＳＩＧＮ−Ｒ１及びＤＣ−ＳＩＧＮなどの特定のＣ−ｔｙｐｅレクチンは、Ｔｈ２細胞の誘導に偏っている（Wieland et al., Microbes Infect. (2007) 9:134-41; Soilleux et al., J. Pathol. (2006) 209: 182-9; Bergman et al., J. Exp. Med. (2004) 200: 979-90; Ryan et al., J. Immunol. (2002) 169: 5638-48;及び't Hart and van Kooyk, Trends Immunol. (2004) 7: 353-359）。ＡＴＭがマクロファージ及び樹状細胞の両方の特徴を有していることから、ＡＴＭによるこれら特定のＣ型レクチンの発現が調査された。簡潔には、ＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭ及びＣＤ１１ｃ−ＡＴＭ細胞集団のＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９ａ）、ＳＩＧＮ−Ｒ１（ＣＤ２０９ｂ）及びＳＩＧＮ−Ｒ２（ＣＤ２０９ｃ）のｍＲＮＡ発現のマイクロアレイ解析は、実施例２に記載されているように、マイクロアレイ解析を用いて行われた。ＡＴＭ細胞の混合集団におけるＳＩＧＮ−Ｒ１タンパク質発現のＦＡＣＳ解析は、実施例１に記載されるプロトコルに従って行われた。
ＣＤ１１ｃ−ＡＴＭ及びＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭについての様々なＣ型レクチンのｍＲＮＡ発現のマイクロアレイ解析は、ＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭよりもＣＤ１１ｃ−ＡＴＭがＤＣ−ＳＩＧＮ、ＳＩＧＮ−Ｒ１及びＳＩＧＮ−Ｒ２ｍＲＮＡを有意に多く発現することを明らかにした（図２０Ａを参照）。発現タンパク質に関するＦＡＣＳ調査は、正常な食事を給餌された８−週齢の正常ＢＩ６マウス（すなわち、非肥満性マウス）のリンパ節から得られた免疫細胞が有意な数のＳＩＧＮ−Ｒ１を発現するＣＤ１１−細胞を含むことを示した（図２０Ｂ、左パネル）。しかしながら、高脂肪食を２４週間給餌されたＢＩ６マウス（すなわち肥満マウス）からの試料は、１０％未満がＳＩＧＮ−Ｒ１を発現するＣＤ１１ｃ＋細胞を実質的により多く含んだ（図２０Ｂ、右パネル）。同時に、このデータは、ＨＦＤを給餌されたマウスにおいて炎症性ＡＴＭ（ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ−ＳＩＧＮ−）細胞集団は増加し、抗炎症性ＡＴＭ（ＣＤ１１ｃ−ＤＣ−ＳＩＧＮ＋）細胞集団は減少することを示唆する。
【０１２０】
実施例１０：異なるＡＴＭ集団によるＴ−細胞感作
ＣＤ１１ｃ−ＡＴＭ及びＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭのＴ細胞-感作潜在性は、１×１０４ ＣＤ１１ｃ−及びＣＤ１１ｃ＋ＡＴＭを２００μＬの最終量で０．５μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３及び５×１０４ｎａiｖｅＣＤ４＋Ｔ細胞と共に丸底９６穴プレートで培養することにより調査された。ＡＴＭ及びｎａiｖｅＴ細胞の生存を促進するために、９６穴プレートは、あらかじめ組換えマウスのフィブロネクチンでコーティングされるか、組換えヒトＩＬ−２が培養に添加されてもよい。ＳＩＧＮ−Ｒ１シグナリングは、１０μｇ／ｍＬ抗ＳＩＧＮ−Ｒ１又は１０μｇ／ｍＬ組換えヒトＩＣＡＭ−３の添加によってブロックキングされる。５日間の増殖の後、培養液上清は、採取され、解析まで−８０℃で保存される。上清のサイトカイン及びケモカインは、前の実施例に記載されているように、サイトカインＥＬＩＳＡによって、解凍された上清において検出することができる（すなわち、製造業者の説明書につきＬｉｎｃｏｐｌｅｘ（登録商標）キットを用いる）。  
【０１２１】
まとめると、これらの実験は、ＴＡＭがプロフェッショナル免疫寛容原性ＡＰＣの表現型を示し、ＩＬ−１０＋Ｔｒ１、ＦｏｘＰ３＋制御Ｔ細胞及びＴＨ１７Ｔ細胞を誘導できることを示す。ＴＡＭはＡＴＭの特定の表現型及び機能的類似性を共有しており、多様な炎症性条件の下で、組織マクロファージがＴＡＭに類似した特徴を得る（が、際立った特徴を保持する）ことを示唆する。ＡＴＭ及びＴＡＭ間の共通性は、マウス及びヒトにおける肥満と発癌との間に観察される相互関係（Yakar et al., Endocrinology 147(12): 5826-34, 2006; Calle et al., N Engl J Med 348(17): 1625-38, 2003）、及び乳癌（Wolf et al., Lancet Oncol. 6(2): 103-11, 2005）の１０−２０％上昇するリスクと２型糖尿病との相互関係を説明するのに役立ち得る。両方の疾患において、軽度であるが慢性的な炎症には患部組織のマクロファージの顕著な蓄積が付随し（Balkwill and Mantovani, Lancet, 357 (9255): 539-45, 2001; Neels and Olefsky, J Clin Invest 116: 33-5, 2006）、研究は慢性炎症及び腫瘍発達のいずれか（Mantovani et al., Immunol Today 13: 265-70, 1992; Pollard, Nat Rev Cancer 4: 71-8, 2004）、又はインシュリン耐性（Kamei et al., J Biol Chem 281: 26602-14, 2006; Weisberg et al., J Clin Invest 116(1): 115-24, 2006;; Arkan et al., Nat Med 11: 191-8, 2005）に伴う増加した数の組織マクロファージに関連していた。同様に、ＣＤ１１ｃ＋Ｆ４／８０＋骨髄性ＤＣの存在は、他の慢性炎症モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）において記載されていた（Ponomarev et al., J Neurosci Res 81: 374-89, 2005; Fischer and Reichmann, J Immunol 166: 2717-26, 2001; Miller et al., Ann N Y Acad Sci 1103: 179-91, 2007）。示された免疫細胞が樹状細胞であると著者が述べているにもかかわらず、上記実施例からの結果からみて、それらは活性化マクロファージのようであった。更に、軽度であるが持続性の炎症を有する肺組織において見いだされる常在組織マクロファージのサブセットである肺胞マクロファージは、ＣＤ１１ｃを発現することもまた見いだされた（Padilla et al., J Immunol 174(12): 8097-105, 2005; Fulton et al., Infect Immun 72(4): 2101-10, 2004）。Ｆ４／８０発現がそれらの肺胞マクロファージにまだ示されなかったにもかかわらず、肺胞の微小環境は炎症誘発性及び抗炎症性サイトカインが豊富であり、前の実験からの結果からみて、組織常在性マクロファージのこの特殊なサブセットの分化を誘導しているかもしれない。
【０１２２】
（文献の部分的なリスト）
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【図２】
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【図３−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図１２−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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