(57)【要約】  本発明は、サンプル中の脳脊髄液（ＣＳＦ）の有無の検出に、詳細には、ＣＳＦタンパク質であるリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼ（Ｌ−ＰＧＤＳ）の分析に関する。本発明は、サンプル中のＣＳＦの有無を示すＰＧＤＳの分析のためのアッセイを提供する。
2010502984.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の脳脊髄液の有無を検出するための方法であって：
（１）被験体からサンプルを得る工程と；
（２）リポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの有無について前記サンプルを分析する工程と；
（３）前記サンプル中において前記リポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの有無と前記脳脊髄液の有無とを関連付ける工程と；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記分析工程が、種々の抗体結合を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分析工程が、ｉｎ  ｓｉｔｕの免疫測定を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
サンプル中の脳脊髄液の有無を検出するためのデバイスであって：
吸収メンブレンを備え、該吸収メンブレンが：
リポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼに対する第一のモノクローナル抗体であって、移動性の粒子に対して結合体化された第一のモノクローナル抗体を含むサンプルゾーンと；
前記メンブレンに固定されたリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼに対する第二の抗体を含む試験ゾーンと；
固定されたウサギ抗マウス抗体を含むコントロールゾーンと；
を備える、デバイス。
【請求項５】
前記吸収メンブレンがナイロンメンブレンである、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
前記移動性粒子が着色されたラテックスを含む、請求項４に記載のデバイス。
【請求項７】
前記移動性粒子が金を含む、請求項４に記載のデバイス。
【請求項８】
前記第一のモノクローナル抗体が、発色団指示薬に結合体化される、請求項４に記載のデバイス。
【請求項９】
前記発色団指示薬が蛍光分子である、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記第二の抗体がポリクローナル抗体である、請求項４に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記第二の抗体がモノクローナル抗体である、請求項４に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の脳脊髄液（ＣＳＦ）の有無の検出に、詳細には、ＣＳＦタンパク質であるリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼ（Ｌ−ＰＧＤＳ）の分析に関する。本発明は、サンプル中のＣＳＦの有無を示すＬ−ＰＧＤＳの分析のためのアッセイを提供する。
【背景技術】
【０００２】
神経遮断は、多くの合併症をともなう。なかでも最も懸念されるのは脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む神経系区画の偶発性の認識されない侵入である。ＣＳＦへの穿刺が直ぐに気づかれない場合、またはそれが不正確に診断される場合、その後の薬物投与は、麻痺または死亡を招き得る。手術、出産および疼痛緩和の間の広範な使用にかかわらず、神経遮断の間およびその後に、ＣＳＦを検出する現行の方法は、信頼できず、費用がかさみ、時間を浪費する。
【０００３】
硬膜外麻酔および鎮痛を受けている患者は、ＣＳＦへのニードル穿刺について特別のリスクがある。硬膜外腔は、遮断の前に、空気の、または塩もしくは糖を含む水溶液のシリンジ注射に対する抵抗がないことで、特定される。硬膜外腔へのニードルの留置の後に、漸増的な、糖含有または塩含有水溶液に溶解された薬物の注射が続く。硬膜外遮断が長い間隔にわたって維持されなければならない場合、薬物含有溶液の連続的かつ間欠的注射の両方のためにニードルを通じてカテーテルを装着してもよい。硬膜の穿通およびＣＳＦへの意図しない進入は、どの段階でもあり得るので、ニードルおよびカテーテルは、ＣＳＦの受動的ドレナージについて通常、監視されており、各々の操作および薬物投与の前に液体の戻りについて吸引される。ＣＳＦが存在する場合、薬物注射の際に硬膜外遮断ではなく脊髄を回避するために、ニードルまたはカテーテルの位置の再決定が必要であり得る。
【０００４】
硬膜外麻酔の安全な実施には、ドレナージされるかまたは吸引されたＣＳＦの明らかな特定が必須であるが、管理者はしばしば存在し得る液体の起源がはっきり分からない。ＣＳＦは透明かつ水っぽく、そのため、注射された糖含有または塩含有の溶液および薬物混合物と良く似ている。過去には、注射されるか、または溜まった液体からＣＳＦを区別する試みは、温度のような物理的特性、第二の化合物を用いたインビトロ沈殿、または、グルコース、タンパク質などの該当の液体の潜在的な化学的構成要素やイオン値の測定に依拠していた。しかし、サンプル混合、試験精度の変動および矛盾した試験閾値により、これらの方法はほとんど有益でなく、かつほとんど用いられない。
【０００５】
現在では、サンプル中のβ−２トランスフェリンの測定は、ＣＳＦの明確な識別が可能な臨床診療に達するための唯一の臨床試験であるが、その使用は、多くの点で妨害される。各々のサンプルは、大容積で得られなければならず、１サンプル／分析あたり１〜２ｍＬほどの多さのサンプルを要する。管理者に結果が伝わる所要時間には最大４日間かかる。β−２トランスフェリンを検出するには免疫固定電気泳動が必要であるので、このアッセイは高価であって（１サンプルあたり２３０〜３００ドル）、標本の取り扱い、保管、運搬および貯蔵には複合的な費用が追加される。さらに、試験の正確性および信頼性を保障するためには専門的技術および熟練した技術者が必要であり、そのためβ−２トランスフェリンのアッセイは、専門の研究室で行うことが必要である。
【０００６】
神経遮断の間およびその後に臨床で得られるサンプル中のＣＳＦを明白に特定するために、迅速、確実、費用効果的かつ正確な方法が明らかに必要である。本発明は、その必要性に応えると考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、サンプル中の脳脊髄液の有無の検出に、詳細には、ＣＳＦタンパク質であるリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼ（Ｌ−ＰＧＤＳ）の分析に関する。本発明は、サンプル中のＣＳＦの有無を示す、Ｌ−ＰＧＤＳの分析のためのアッセイを提供する。
【０００８】
したがって、ある実施形態では、本発明は、サンプル中の脳脊髄液を検出するための方法を提供し、この方法は、被験体からサンプルを得る工程と、このサンプル中のリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの有無を検出する工程とを包含する。ある実施形態では、１つ以上のさらなる化合物が、単独で、またはリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼと組み合わせて検出される。ある実施形態では、β−２トランスフェリンが検出される。ある実施形態では、この被験体は、自発性の耳漏または鼻漏を有する。他の実施形態では、この被験体は外傷を受けている。さらなる実施形態では、この被験体は、手術を受けている。好ましい実施形態では、この被験体は、神経遮断を受けている状態であるかまたは受けている。
【０００９】
本発明はまた、リポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの量を、既知の値と関連付けて、サンプル中の脳脊髄液の有無を決定する方法を提供する。好ましい実施形態では、サンプル中の脳脊髄液の有無は、このサンプル中のリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの量を決定する工程を包含する。ある実施形態では、リポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼは、約２．０ｍｇ／Ｌ未満の濃度で存在する。他の実施形態では、リポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼは、約２．０ｍｇ／Ｌと約６．０ｍｇ／Ｌの間の濃度で存在する。さらに他の実施形態では、リポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼは、約６．０ｍｇ／Ｌと約１０．０ｍｇ／Ｌの間の濃度で存在する。さらに他の実施形態では、リポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼは、約１０．０ｍｇ／Ｌよりも大きい濃度で存在する。
【００１０】
本発明はまた、サンプル中の脳脊髄液の有無を決定する方法を提供し、この方法は、サンプル中のリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼに対する、血清中のリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの比を決定する工程を包含する。ある実施形態では、この比は１０未満である。他の実施形態では、この比は１０〜２０である。さらに他の実施形態では、この比は２０より大きい。
【００１１】
本発明はさらに、身体の表面の開口からサンプルを得たときのサンプル中の脳脊髄液の検出のための方法を提供する。他の実施形態では、このサンプルは身体中のニードルから得る。さらに他の実施形態では、このサンプルは自由流動である。さらに他の実施形態では、サンプルを吸引する。さらなる実施形態では、このサンプルはカテーテルから得る。さらなる実施形態では、このサンプルは、カテーテルから自由に流れている。さらなる実施形態では、このサンプルはカテーテルから吸引される。さらなる実施形態では、このサンプルは、カテーテルが適正な位置にある期間の間、連続的な間隔で得られる。好ましい実施形態では、このサンプルはカテーテルの留置の前に得られる。特に好ましい実施形態では、このサンプルはカテーテルの留置の後に得られる。
【００１２】
ある実施形態では、このサンプルは、液体の投与前に得られる。他の実施形態では、このサンプルは液体の投与後に得られる。好ましい実施形態では、このサンプルは薬物の投与前に得られる。特に好ましい実施形態では、このサンプルは、薬物の投与後に得られる。
【００１３】
ある実施形態では、この被験体は哺乳動物である。他の実施形態では、この被験体はヒトである。さらなる実施形態では、この被験体は手術を受けている。またさらなる実施形態では、この被験体は急性の疼痛管理を受けている。好ましい実施形態では、この被験体は手術後の疼痛管理を受けている。他の実施形態では、この被験体は、外傷後の疼痛管理を受けている。特に好ましい実施形態では、この被験体は、分娩出産時の疼痛管理を受けている。ある実施形態では、この被験体は、慢性疼痛管理を受けている。さらなる実施形態では、この疼痛は、悪性疼痛を包含する。またさらなる実施形態では、この疼痛は、非悪性の疼痛を包含する。
【００１４】
本発明はまた、神経遮断（この時の神経遮断は局所鎮痛を含む）を受けている被験体由来のサンプル中の脳脊髄液の有無を検出するための方法を提供する。ある実施形態では、この局所鎮痛は、脊椎鎮痛（麻酔）を含む。ある実施形態では、脊椎鎮痛は、単回の薬剤投与を包含する。他の実施形態では、脊椎鎮痛は、カテーテルを通じて連続的である。好ましい実施形態では、この局所鎮痛は、硬膜外鎮痛（麻酔）を包含する。ある実施形態では、この硬膜外鎮痛は、単回の薬剤投与を包含する。他の実施形態では、この硬膜外鎮痛は、カテーテルを通じて連続的である。さらなる実施形態では、この局所鎮痛は、脊椎鎮痛および硬膜外鎮痛と組み合わされる。他の実施形態では、この局所鎮痛は、末梢神経ブロックを包含する。さらに他の実施形態では、この局所鎮痛は、神経叢遮断を包含する。さらなる実施形態では、この局所鎮痛は、移植された薬物送達系を包含する。さらなる実施形態では、この局所鎮痛は、神経刺激因子を包含する。
【００１５】
本発明は、サンプル中の脳脊髄液の検出のための方法を提供し、この方法は、被験体からサンプルを得る工程と、任意の適切な方法を用いてこのサンプル中のリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの有無を検出する工程とを包含する。ある実施形態では、検出は、種々の抗体結合を包含する。好ましい実施形態では、検出は、ｉｎ  ｓｉｔｕの免疫測定を包含する。特に好ましい実施形態では、検出は、コロイド状金の標識を用いるｉｎ  ｓｉｔｕの免疫測定を包含する。他の実施形態では、示差的抗体結合は、ウエスタンブロットを含む。さらなる他の実施形態では、示差的な抗体結合は、比濁分析アッセイ（nephelometric assay）を包含する。さらなる実施形態では、サンプル中のリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの有無は、クロマトグラフィーアッセイによって検出される。他の実施形態では、サンプル中のリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの有無は、酵素的アッセイによって検出される。さらに他の実施形態では、サンプル中のリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの有無は、分光学的アッセイによって検出される。
【００１６】
本発明はさらに、神経遮断の前、間または後に、サンプル中のリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの有無を検出するための試薬を含むキットを提供する。ある実施形態では、このキットはさらに、サンプル中のリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの有無を検出するためにキットを用いるための説明書を備える。ある実施形態では、この説明書は、インビトロ診断キットのための米国食品医薬品庁によって必要とされる説明を含む。ある実施形態では、このキットはさらにこのサンプル中のリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの有無に基づいてサンプル中の脳脊髄液の有無を診断するための説明書を備える。ある実施形態では、この試薬は、１つ以上の抗体を含む。他の実施形態では、この試薬は、１つ以上の酵素、酵素阻害剤または酵素活性剤を含む。さらなる他の実施形態では、この試薬は、１つ以上のクロマトグラフの化合物を含む。さらに他の実施形態では、この試薬は、分光学的アッセイのためのサンプルを調製するために用いられる１つ以上の化合物を含む。さらなる実施形態では、このキットは、指示薬の強度、色スペクトル、または他の物理的属性にしたがってリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの有無を解釈するための比較参照物質を備える。
【００１７】
したがって、１態様では、本発明は、サンプル中の脳脊髄液の有無を検出するための方法であって：（１）被験体からサンプルを得る工程と；（２）リポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの有無についてこのサンプルを分析する工程と；（３）このサンプル中においてこのリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの有無と脳脊髄液の有無とを関連付ける工程と；を包含する、方法に関する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、サンプル中の脳脊髄液の有無を検出するためのデバイスであって：リポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼに対する第一のモノクローナル抗体を含むサンプルゾーンを備える吸収メンブレンと；このメンブレンに固定されたリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼに対する第二のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む試験ゾーンと；固定されたウサギ抗マウス抗体を含むコントロールゾーンとを備える、デバイスに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】脊髄の解剖学および硬膜外腔内のニードルの先端の位置を示す。ＣＳＦは脊髄および脊髄円錐を囲んでおり衝撃を和らげる。カテーテルまたはニードルのドレナージまたは吸引におけるＣＳＦの存在によって、硬膜の穿通が示される。硬膜および脊髄の区画へ投与された同一の薬物および投薬量は、薬理学的に活性な薬剤の種々の分布により、広範に相違した反応速度論（たとえば、発現時間、作用期間）および生理学的結果（たとえば、運動、感覚および自律神経系の遮断の程度）を有する。
【００２０】
【図２】ＣＳＦ中および他の体液中のＰＧＤＳの抗体媒介性の検出を示す。ＣＳＦ供給源由来のＰＧＤＳに対する抗ＰＧＤＳ抗体の特異的結合、および他の供給源由来のサンプル中のＰＧＤＳの非存在を示す。
【図３】ＣＳＦ中および他の体液中のＰＧＤＳの抗体媒介性の検出を示す。１２個の異なるヒト供給源由来のＣＳＦのサンプル中のＰＧＤＳの抗ＰＧＤＳ抗体検出を示す。
【図４】ＣＳＦ中および他の体液中のＰＧＤＳの抗体媒介性の検出を示す。硬膜外溶出液中にはＰＧＤＳが存在しないが、ＣＳＦ中にＰＧＤＳが存在することを示す（それぞれ２および３の被験体由来のサンプルにおける抗ＰＧＤＳ抗体結合によって検出された）。
【００２１】
【図５】吸収性ディップスティックとして構成されたＰＧＤＳの臨床抗ＰＧＤＳ ｉｎ ｓｉｔｕの抗体媒介性検出を示す。浸漬後の固相におけるコロイド状金指示薬バンドの存在によって、試験サンプル中のＣＳＦの存在を示す。
【００２２】
【図６】本発明のデバイスの一実施形態を示す。
【００２３】
【図７】本発明のデバイスの作用のメカニズムを示す。
【図８】本発明のデバイスの作用のメカニズムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
ＣＳＦは、外見が水に類似の透明な液体であり、血漿を成分とする。脳および脊髄は、ＣＳＦによって浮かべられて、防御される。臨床的、外科的および偶発的事象によって、ＣＳＦはその生理学的障壁を破るかもしれない。ＣＳＦ漏出は、麻酔および鎮痛のためのニードルおよびカテーテルの配置、外傷、頭蓋骨骨折、頭蓋内手術手順、感染、水頭症、先天性奇形、新生物および自発性の鼻漏および耳漏で生じ得る。
【００２５】
硬膜穿刺およびＣＳＦへの進入のリスクは特に硬膜外麻酔および硬膜外鎮痛で高い。硬膜外オピオイドおよび局所麻酔は最も普通には、腰部および胸部に注射される。硬膜外神経遮断のためのニードルは、脊柱の間を硬膜外腔へ通過する。硬膜外腔は正常には液体を欠き、それを横切る距離は短い（図１）。硬膜外ニードルの進行が進みすぎれば、脊髄、脊髄神経およびＣＳＦを含む硬膜を刺し通す。硬膜中の穴によって、ＣＳＦは硬膜外腔へ漏れるようになり、それによって重篤な頭痛が生じる。頭蓋内圧の上昇した患者では、硬膜外腔の位置決めの際に生じる偶発的な硬膜穿刺は、ＣＳＦの損失に起因して小脳またはテントヘルニア形成の危険を冒す。他の重篤な合併症としては、永久麻痺、心停止および死亡が挙げられる。
【００２６】
ＣＳＦへの望ましくない薬物投与から生じる腰椎ブロックは、麻酔科医の主要な懸念である。これは、硬膜外腔を対象とする医薬が脊髄液に誤って投与される場合に生じ得、これによって突然かつ深刻な低血圧、下肢の麻痺、呼吸障害、および心調律の障害が生じる。これらの状態を予防および診断するために、麻酔科医は、麻酔薬または鎮痛薬の試験用量に対する患者の反応を注意深く評価かつモニターする。しかし、現在では、毎日数千件行われる、このような手順の間の硬膜穿刺およびＣＳＦ漏出の頻度を評価する迅速かつ信頼できる方法はない。
【００２７】
硬膜穿刺を検出するための最適の方法は、ＣＳＦの有無について試験することである。グルコース、タンパク質、カリウムまたはナトリウムについての液体の化学的分析は、この液体がＣＳＦであるか否かを決定する手段としては信頼できない。放射線学的検査は、ＣＳＦ漏出をわずかにするか、または遅らせるのにごく断続的にしか成功せず、煩雑で、費用がかさみ、時間を浪費し、放射線に、および放射性同位体色素に対する暴露のリスクを伴う。ＣＳＦタンパク質の成分β−２トランスフェリンを検出するための免疫固定と組み合わせた疑わしいＣＳＦ供給源由来の液体の電気泳動は、ＣＳＦを検出する特異的かつ一般的に許容される方法であることが示されている。しかし、β−２トランスフェリンアッセイには、複数の取得および取り扱い工程の協調を要し、神経遮断の間およびその後の使用のためには無理なほど時間がかかり（４日間）、かつ高価である（１アッセイあたり３００ドル）。
【００２８】
リポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼ（Ｌ−ＰＧＤＳ）はまた、β−トレース（beta-trace）タンパク質とも呼ばれ、中枢神経系の脈絡叢、軟膜および乏突起膠細胞での産生後にＣＳＦに分泌される。Ｌ−ＰＧＤＳは、内因性の睡眠促進化合物として働く、プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ）へのプロスタグランジンＨ２の異性化を触媒する。β−２イソ型のみがＣＳＦに特異的であるトランスフェリンに比較して、ＰＧＤＳの全体的構造がＣＳＦに特異的である。したがって、Ｌ−ＰＧＤＳはＣＳＦの有無の迅速かつ特異的な指示薬として本発明における使用に好ましい。
【００２９】
本発明の開発の過程の間に行われる実験によって、Ｌ−ＰＧＤＳがＣＳＦにとって信頼できるマーカーであり、従来の方法よりも高価でなく、かつ時間を浪費しないことが実証される。本発明は、神経遮断の前、間および後に得られたサンプル中でのＣＳＦの迅速な検出のための新規な方法およびキットを提供する。本発明の使用によって、神経遮断の安全な実施が保証され、かつ生命を脅かす合併症の頻度および重篤度が低減する。
【００３０】
＜定義＞
本発明の理解を促進するため、多数の用語を以下に定義する。
【００３１】
本明細書において用いる場合、「被験体」という用語は、入院しているかどうかにかかわらず、ヒトおよび動物を包含する。
【００３２】
本明細書において用いる場合、「Ｌ−ＰＧＤＳ」または「リポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼ」という用語は、中枢神経系の脈絡叢、軟膜および乏突起膠細胞での産生後にＣＳＦに分泌され、プロスタグランジンＤ２へのプロスタグランジンＨ２の異性化を触媒し、ＣＳＦの有無に関連している、特定のタンパク質に対する言及で用いられる。Ｌ−ＰＧＤＳの上記の定義は、造血型ＰＧＤＳからこのタンパク質を識別するのに役立つ。
【００３３】
本明細書において用いる場合、「神経遮断」とは、神経伝達を邪魔する目的で、標的とされた神経構造に直ぐ近い細胞レセプターアゴニストおよびアンタゴニストの投与をいう。神経遮断としては、限定はしないが、局所麻酔（たとえば、脊椎、硬膜外、末梢または神経叢の麻酔）、および局所鎮痛（たとえば、脊椎、硬膜外、末梢または神経叢の鎮痛）が挙げられる。
【００３４】
本明細書において用いる場合、「〜を受けている」という用語は、神経遮断に供されているということを述べるために用いる。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「悪性疼痛（malignant pain）」という用語は、圧力、虚血、壊死、閉塞ならびに腫瘍位置および増殖の他の結果を含む、ガンから生じるかまたは新生物由来の疼痛をいう。
【００３６】
本明細書において用いる場合、「非悪性疼痛（non-malignant pain）」という用語は、ガン以外の原因から生じる疼痛をいう。
【００３７】
本明細書において用いる場合、「局所鎮痛」という用語は、神経遮断に対して言及し、意識を直接障害することなく身体の領域における疼痛を軽減または排除するために用いられる薬剤および手順を指すのに用いる。
【００３８】
本明細書において用いる場合、「持続的」という用語は、神経遮断に対する言及であって、妨害なしに所望の作用部位にカテーテルを通じて薬物が注入される神経遮断に対して用いる。
【００３９】
本明細書において用いる場合、「脊髄」という用語は、神経遮断に対する言及において、硬膜の下および脳脊髄液中への１種または複数種の薬物の投与を指すために用いられる。
【００４０】
本明細書において用いる場合、「硬膜外」という用語は、神経遮断に対する言及において、神経系の硬膜の外の硬膜外腔内への１種または複数種の薬物の投与を指すために用いられる
【００４１】
本明細書において用いる場合、「末梢（の）」という用語は、神経遮断に対する言及において、中枢神経系に対して外側の末梢神経系に直ぐに近い領域への１種または複数種の薬物の投与を指すために用いられる。
【００４２】
本明細書において用いる場合、「神経叢」という用語は、神経遮断に対する言及において、中枢神経系に対して外側の神経叢に直ぐに近い領域への１種または複数種の薬物の投与を指すために用いられる。
【００４３】
本明細書において用いる場合、「移植された薬物送達系」という用語は、持続的注入（インフュージョン）としてまたは患者の要求に応じてのいずれかで、神経系に（たとえば、カテーテルを通じて）１種または複数種の薬物を提供し得る、身体に内在するデバイスを指すのに用いられる。
【００４４】
本明細書において用いる場合、「神経刺激因子」という用語は、悪性および非悪性の疼痛の緩和において、一定または間欠的な電流または電圧を与え得る、身体に内在するデバイスを指すのに用いられる。
【００４５】
「アミノ酸配列」が、天然に存在するタンパク質分子のアミノ酸配列を指すのに本明細書において言及される場合、「アミノ酸配列」などの用語、たとえば、「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、言及されるタンパク質分子に関連する完全な天然のアミノ酸配列にアミノ酸配列を限定することは意味しない。
【００４６】
本明細書において用いられる場合、「フラグメント」または「部分」という用語は、天然のタンパク質に比較してアミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、全長ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列における対応する位置に同一であるポリペプチドをいう。フラグメントは代表的には、少なくとも４アミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも２０アミノ酸の長さ、通常は少なくとも５０アミノ酸の長さ以上であり、その種々のリガンドおよび／または基質との、組成物（本発明で請求される）の分子内結合に必要なポリペプチドの一部にまたがる。
【００４７】
本明細書において用いる場合、「精製される」または「精製する」という用語は、サンプルからの混入物の除去をいう。たとえば、ＰＧＤＳ抗体は、混入する非免疫グロブリンタンパク質の除去によって精製され；それらはまた、ＰＧＤＳに結合しない免疫グロブリンの除去によって精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去、および／またはＰＧＤＳに結合しない免疫グロブリンの除去によって、サンプル中のＰＧＤＳ反応性の免疫グロブリンの割合が増大する。別の例では、組み換えＰＧＤＳポリペプチドは、細菌宿主細胞で発現され、ポリペプチドは、宿主細胞タンパク質の除去によって精製され；それによって、組み換えＰＧＤＳポリペプチドの割合はサンプル中で増大される。「組み換えＤＮＡ分子」という用語は、本明細書において用いる場合、分子生物学技術によって一緒に結合されたＤＮＡのセグメントからなるＤＮＡ分子をいう。
【００４８】
本明細書において用いる場合、「組み換えタンパク質」、または「組み換えポリペプチド」という用語は、組み換えＤＮＡ分子から発現されるタンパク質分子をいう。
【００４９】
本明細書において用いる場合、「天然のタンパク質」という用語は、あるタンパク質がベクター配列によってコードされるアミノ酸残基を含まないことを示す；すなわち、天然のタンパク質とは、これが天然に存在する場合にこのタンパク質で見出されるアミノ酸のみを含む。天然のタンパク質は、組み換え方法によって生成されてもよく、または天然に存在する供給源から単離されてもよい。
【００５０】
「ウエスタンブロット」という用語は、ニトロセルロースまたはメンブレンのような支持体上に固定された１種または複数種のタンパク質（またはポリペプチド）の分析をいう。このタンパク質を、タンパク質を分離するためにアクリルアミドゲル上で泳動して、続いてこのゲルから、ニトロセルロースまたはナイロンメンブレンなどの固体支持体へタンパク質を転写する。次いで、この固定されたタンパク質を目的の抗原に対する反応性を有する抗体に曝す。抗体の結合は、放射性標識抗体の使用を含む、種々の方法によって検出され得る。
【００５１】
本明細書において用いる場合、「抗原性決定基」という用語は、特定の抗体との接触を生じる抗原の部分をいう（すなわち、エピトープ）。タンパク質またはタンパク質のフラグメントを用いて、宿主動物を免疫する場合、タンパク質の多くの領域は、このタンパク質上の所定の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘導し得る；これらの領域または構造は、抗原性決定基と呼ばれる。抗原性決定基は、抗体に対する結合についてインタクトな抗原（すなわち、免疫応答を惹起するために用いられる「免疫原」）と競合し得る。
【００５２】
本明細書において用いる場合、「比濁分析アッセイ」という用語は、ヒトＰＧＤＳに対するウサギ由来のイムノアフィニティー精製したポリクローナル抗体でコーティングされたポリスチレン粒子からなる、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ（Ｌｉｅｄｅｒｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって開発されたアッセイを指すのに用いられる。凝集によって生じる光散乱の増大は、レーザー吸収によって測定される。
【００５３】
本明細書において用いられる「サンプル」という用語は、その最も広義の意味で用いられる。タンパク質を含有すると疑われるサンプルは、細胞を含んでもよいし、または細胞を含まなくても、組織の一部でも、１つ以上のタンパク質を含む抽出物でも、体液などであってもよい。「自由流動」サンプルとは、身体区画に貫入するニードル、カテーテルまたは他の装置からの体液の受動的ドレナージをいう。
【００５４】
本明細書において用いる場合、「応答（response）」という用語は、アッセイに関して用いる場合、検出可能なシグナルの発生をいう（たとえば、レポータータンパク質の蓄積、イオン濃度の増大、および検出可能な化学的生成物の蓄積）。
【００５５】
本明細書において用いる場合、「この生物学的サンプルにおいてＰＧＤＳポリペプチドの有無を検出するためにこのキットを用いるための説明」は、ＰＧＤＳポリペプチドの検出のためのキットに含まれる試薬を用いるための説明を含む。ある実施形態では、この説明はさらに、インビトロ診断製品の表示における米国食品医薬品庁（ＦＤＡ）に必要な意図される用法の言及を含む。ＦＤＡは、インビトロ診断を医薬デバイスとして分類し、かつそれらが５１０（ｋ）手続きを通じて承認されることを必要とする。５１０（ｋ）のもとでの適用に必要な情報としては以下が挙げられる。１）インビトロ診断製品の名称（そのデバイスの商品名または商標名、一般名または通常名、および分類名称を含む）。２）その製品の意図される用途。３）承認がある場合、５１０（ｋ）サブミッションを提出する所有者または操作者の組織登録番号。そのインビトロ診断製品がＦＤ＆Ｃの条令５１３節、（知られている場合）その適切なパネルのもとで入れられるクラス、または所有者もしくは操作者が、このような節のもとでこのデバイスが分類されていないことを決定する場合は、そのインビトロ診断製品がそのように分類されないという決定およびその決定のための基準の記載。４）そのインビトロ診断製品、その意図される用途、および使用のための指示を記載するために十分な提唱されるラベル、表示、および広告。必要に応じて、写真または設計図が与えられなければならない。５）このデバイスが、米国での商品流通における匹敵するタイプの他のインビトロ診断製品と類似、および／またはそれとは異なることを示す記載であって、この記載を支持するためのデータをともなう記載。６）安全性および有効性のデータの５１０（ｋ）の要約であって、実質的同等性の決定が基づく要約。または実質的同等性のＦＤＡの知見を支持する５１０（ｋ）安全性および有効性の情報が、書面請求の３０日内の任意の人に適用可能であるという記載。７）市場に置かれる前に提出された全てのデータおよび情報が、正直かつ正確であるということ、ならびに重大な事実が省略されていないということを提出者がその最大限の知識に照らして信じているという声明。８）実質的同等性決定を行うためにＦＤＡに必要な要求されるインビトロ診断製品に関する任意の更なる情報。さらなる情報は米国のＦＤＡのインターネットのウェブページで利用可能である。
【００５６】
本明細書において用いる場合、「表面の開口」という用語は、身体の表面における天然または後天性の開口をいう。
【００５７】
上記で示されるとおり、本発明は、サンプル中の脳脊髄液の有無を検出するための方法であって、（１）被験体からサンプルを得る工程と；（２）リポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼ（Ｌ−ＰＧＤＳ）の有無についてこのサンプルを分析する工程と；（３）このサンプル中においてこのリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの有無と脳脊髄液の有無とを関連付ける工程と；を包含する、方法に関する。これらの工程の各々は、下にさらに詳細に説明される。
【００５８】
上記で示されるとおり、本発明の方法で提供されるサンプルとは、その広義の意味で規定されており、細胞または細胞なしの抽出物、組織の一部、１つ以上のタンパク質を含む抽出物、体液などを包含する。このサンプルは、ニードル、カテーテルまたは身体区画に貫入する他の装置由来の体液の受動的ドレナージによって被験体から得られてもよい。
【００５９】
＜Ｌ−ＰＧＤＳタンパク質の検出＞
上述したとおり、ＣＳＦの有無について検出または分析する新規な方法が開発されている。したがって、本発明は、神経遮断を受けている状態であるかまたは受けている被験体を含む被験体由来のサンプル中でＬ−ＰＧＤＳを検出するための方法を提供する。任意の適切な方法を用いて、Ｌ−ＰＧＤＳポリペプチドについて検出または分析してもよい。たとえば、ある実施形態では、Ｌ−ＰＧＤＳの存在が検出可能な色の変化を生じるクロマトグラフィー方法が利用される。他の実施形態では、Ｌ−ＰＧＤＳの存在が、検出可能な酵素活性を起こす酵素的方法が利用される。さらなる実施形態では、サンプル中のＬ−ＰＧＤＳの存在は、原子吸光または原子発光分光法によって検出される。
【００６０】
本発明の特定の実施形態では、Ｌ−ＰＧＤＳタンパク質（「プロスタグランジン−Ｈ２Ｄイソメラーゼ」および「β−トレースタンパク質」とも呼ばれる）は、リポカリンファミリーの分泌タンパク質に属する約２６ｋＤａ（ＥＣ５．３．９９．２）の分子量を有する糖タンパク質である。好ましい実施形態では、Ｌ−ＰＧＤＳタンパク質は、ＰＧＤ２を生成するためのＰＧＨ２の異性化を触媒する。さらなる実施形態では、ヒトＰＧＤＳのｃＤＮＡは、２２アミノ酸残基のＮ末端シグナルペプチドを有する１９０アミノ酸残基をコードする。特に好ましい実施形態では、ＰＧＤＳタンパク質は、脳特異的なＮグリコシル化オリゴ糖鎖を有する「脳型」のイソ型である。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態では、抗体を用いて、サンプルがＣＳＦの有無を示すＬ−ＰＧＤＳを含むか否かを決定する（後述のＬ−ＰＧＤＳ抗体の生成を参照のこと）。抗体結合は、当該分野で公知の技術（たとえば、放射免疫測定、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫測定、免疫放射線測定法、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕの免疫測定（たとえば、コロイド状金、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（たとえば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイなど）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどによって検出する。
【００６２】
一実施形態では、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって検出する。別の実施形態では、一次抗体は、この一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態では、この二次抗体が標識される。多くの方法が、免疫測定において結合を検出するために、当該分野で公知であり、かつ本発明の範囲内である。
【００６３】
ある実施形態では、自動検出アッセイが利用される。免疫測定の自動化のための方法は、米国特許第５，８８５，５３０号、同第４，９８１，７８５号、同第６，１５９，７５０号および同第５，３５８，６９１号（その各々が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される方法を包含する。ある実施形態では、結果の分析および提示も自動化される。たとえば、ある実施形態では、免疫測定の結果に基づく、サンプル中のＰＧＤＳの存在およびＣＳＦの確率に関連するスコアを作成するソフトウェアが利用される。
【００６４】
他の実施形態では、免疫測定は、その各々が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，５９９，６７７号および同第５，６７２，４８０号に記載されるとおりである。
【００６５】
＜Ｌ−ＰＧＤＳ抗体の生成＞
本発明は、単離された抗体または抗体フラグメント（たとえば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ２フラグメントなど）を提供する。ＰＧＤＳタンパク質の検出を可能にする抗体が生成され得る。この抗体は、種々の免疫原を用いて調製され得る。一実施形態では、この免疫原はヒトＬ−ＰＧＤＳを認識する抗体を生成するヒトＬ−ＰＧＤＳペプチドである。このような抗体としては限定はしないが、タンパク質を認識し得る限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリー、または組み換え（たとえば、キメラ、ヒト化など）抗体が挙げられる。抗体は、本発明のタンパク質を従来の抗体または抗血清調製プロセスにしたがって抗原として用いることによって生成され得る。
【００６６】
ＰＧＤＳに対するポリクローナル抗体の産生のためには、当該分野で公知の種々の手順を用い得る。抗体の産生のためには、種々の宿主動物を、限定はしないが、ウサギ、マウス、ヒツジ、ヤギなどを含むＬ−ＰＧＤＳエピトープに対応するペプチドを注射することによって免疫してもよい。好ましい実施形態では、このペプチドを免疫原性キャリア（たとえば、ジフテリア毒素、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に対して結合体化する。宿主の種に応じて、限定はしないがフロイント（完全および不完全）、鉱物ゲル（たとえば、水酸化アルミニウム）、界面活性剤（たとえば、リゾレシチン、プルロニック（pluronic）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント、たとえば、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍを含む種々のアジュバントを用いて、免疫学的応答を増大してもよい。
【００６７】
Ｌ−ＰＧＤＳに対するモノクローナル抗体の調製のためには、培養中の連続的細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術が、本発明で利用されると考えられる（たとえば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。これらとしては限定はしないが、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによってもともと開発されたハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７，１９７５）、ならびにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（たとえば、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄ．，４：７２，１９８３を参照のこと）、およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７〜９６頁，１９８５）が挙げられる。
【００６８】
本発明のさらなる実施形態では、モノクローナル抗体は、ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５に記載される技術などを利用して無菌動物で生成される。さらに、ヒト抗体は、ヒトハイブリドーマ（Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２０２６〜２０３０［１９８３］）によって、またはインビトロでＥＢＶウイルスを用いてヒトＢ細胞を形質転換することによって生成されると考えられる（Ｃｏｌｅら、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，第７７〜９６頁，［１９８５］）。
【００６９】
さらに、単鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号；参照によって本明細書に組み込まれる）は、Ｌ−ＰＧＤＳ特異的単鎖抗体を産生するのに利用されると考えられる。本発明のさらなる実施形態は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築について記載された技術（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１，１９８９）を利用して、Ｌ−ＰＧＤＳについて所望の特性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な特定を可能にする。
【００７０】
他の実施形態では、本発明は、Ｌ−ＰＧＤＳに対する組み換え抗体またはそのフラグメントを考慮する。組み換え抗体としては限定はしないが、ヒト化抗体およびキメラ抗体が挙げられる。組み換え抗体を生成するための方法は当該分野で公知である（たとえば、米国特許第６，１８０，３７０号および同第６，２７７，９６９号および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｈ．Ｚｏｌａ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  ２０００．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと；その各々が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００７１】
抗体フラグメントを産生するのに適切な任意の技術は、抗体分子のイディオタイプ（抗原結合領域）を含む抗体フラグメントを生成するのに利用されると考えられる。たとえば、このようなフラグメントとしては限定はしないが以下が挙げられる：抗体分子のペプシン消化によって生成され得るＦ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るＦａｂ’フラグメント、およびパパインおよび還元剤で抗体分子を処理することによって生成され得るＦａｂフラグメント。
【００７２】
抗体の産生では、所望の抗体についてのスクリーニングは、当該分野で公知の技術（たとえば、放射免疫測定、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫測定、免疫放射線測定法、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕの免疫測定（たとえば、コロイド状金、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（たとえば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイなど）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどによって達成されると考えられる。
【００７３】
一実施形態では、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態では、一次抗体は、この一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態では、この二次抗体が標識される。多くの方法が、免疫測定において結合を検出するために、当該分野で公知であり、かつ本発明の範囲内である。当該分野で公知のとおり、免疫原性ペプチドは、任意の免疫化プロトコールで用いられるキャリア分子なしで提供されなければならない。たとえば、ペプチドがＫＬＨに結合体化される場合、これはＢＳＡに結合体化されてもよく、またはスクリーニングアッセイで直接用いられてもよい）。
【００７４】
前述の抗体は、Ｌ−ＰＧＤＳの局在化および構造（たとえば、ウエスタンブロットについて）、適切な生物学的サンプル中でそのレベルを測定することなどに関する当該分野で公知の方法で用いられ得る。この抗体は、個体由来の生物学的サンプル中でＬ−ＰＧＤＳを検出するために用いられ得る。この生物学的サンプルは、生物学的液体、たとえば、限定はしないが、血液、血清、血漿、間質液、尿、脳脊髄液などであってもよい。
【００７５】
次いで、その生物学的サンプルを、適切なストラテジー（たとえば、ＥＬＩＳＡまたは放射免疫測定）およびフォーマット（たとえば、マイクロウェル、ディップスティック（たとえば、国際公開第９３／０３３６７号に記載されるとおり）などを用いてヒトＰＧＤＳの存在について直接試験してもよい。あるいは、サンプル中のタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の有無において、（たとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって、サイズ分離され、そして、免疫ブロット（ウエスタンブロット）によってＬ−ＰＧＤＳの存在が検出されてもよい。免疫ブロット技術は一般には、タンパク質のエピトープに対応するペプチドに対して生成された抗体でさらに有効であって、したがって、本発明に特に適している。
【００７６】
上記で言及した関連工程は、たとえば、蛍光的または比色定量的アッセイで、定性的にまたは定量的に実現され得る。本発明の方法およびデバイスでは、リポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼは、脳脊髄液でのみ見出されるので、サンプル中のリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼの任意の指標は、そのサンプル中の脳脊髄液の存在に直接関連し得る。
【００７７】
＜ＣＳＦの有無を分析するためのキットおよびデバイス＞
本発明はまた、サンプルがＰＧＤＳを含むか否かを決定するためのキットおよびデバイスを提供する。この診断キットおよびデバイスは、種々の方法で作製される。ある実施形態では、このキットおよびデバイスは、Ｌ−ＰＧＤＳタンパク質を特異的に検出するための少なくとも１つの試薬を含む。好ましい実施形態では、このキットおよびデバイスは、Ｌ−ＰＧＤＳタンパク質を検出するための複数の試薬を含む。特に好ましい実施形態では、この試薬はＬ−ＰＧＤＳタンパク質に優先的に結合する抗体である。
【００７８】
ある実施形態では、そのキットまたはデバイスは、サンプルがＬ−ＰＧＤＳを含むか否かを決定するための説明書を含む。好ましい実施形態では、この説明書は、ＣＳＦの有無が被験体（この被験体は神経遮断を受けている状態であるかまたは受けている）由来のサンプル中のＬ−ＰＧＤＳの有無を検出することによって決定されるということを述べている。
【００７９】
サンプル中のＬ−ＰＧＤＳの有無を用いて、治療または他の医学的決定を行うことができる。たとえば、適切な位置の既存のカテーテルを用いるか、または神経遮断の間もしくは後にカテーテルを再留置するかは、カテーテルから得られるサンプル中のＬ−ＰＧＤＳ含有ＣＳＦの有無に基づき得る。
【００８０】
ある実施形態では、このキットおよびデバイスは、付随的試薬、たとえば、緩衝化剤、タンパク質安定化試薬、およびシグナル発生システム（たとえば、ＦＲＥＴシステムなどの蛍光発生システム）を含む。この試験キットまたはデバイスは、任意の適切な方式で、代表的には単一の容器または種々の容器中の構成要素とともに、必要に応じて、試験を行うための説明書のシートとともにパッケージングされてもよい。ある実施形態では、このキットまたはデバイスはまた好ましくは、陽性コントロールサンプルを備える。さらなる実施形態では、このキットまたはデバイスは、指示薬の強度、色スペクトル、または他の物理的属性にしたがってプロスタグランジンＤ２シンターゼの有無を解釈するための比較参照物質を備える。
【００８１】
ＣＳＦ漏出を診断するために保険医療で用いられ得る迅速、再生可能、鋭敏かつ簡易な診断試験の必要性は、非常に重要である。このような試験は、患者のすぐそばで行うことが可能で、サンプルが実験室に分析のために送られたとき、数日ではなく２〜３分で結果を得るという点で、既存の臨床検査、すなわち、免疫固定電気泳動、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および免疫ブロットを上回る明白な利点を有する。側方流動イムノクロマトグラフ試験（lateral flow immunochromatographic test）を、生物学的な液体中でのＣＳＦの検出のための診断キットを作成するために利用してもよい。
【００８２】
この試験デバイスは、試験ストリップを備え、これは必要に応じてプラスチックの試験カセットを備える（図６）。抗体をメンブレン上の三つの異なるゾーンに結合させる。これら３つのゾーンは、リポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼに対する第一のモノクローナル抗体を含むサンプルゾーン（Ｓ）と、メンブレンに固定されたリポカリン型プロスタグランジンＤ２シンターゼに対する第二のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む試験ゾーン（Ｔ）と、たとえば、固定されたウサギ抗マウス抗体を含むコントロールゾーン（Ｃ）と、である。サンプル（Ｓ）ゾーン中の第一のモノクローナル抗体は、移動性粒子、たとえば、着色されたラテックス粒子または金粒子に結合体化されてもよい。あるいは、第一のモノクローナル抗体は、発色団の指示薬、たとえば、蛍光分子またはタグ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ），Ａｌｅｘａ，Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄなど）に結合体化されてもよい。
【００８３】
本発明のデバイスは、２つのモノクローナル抗体の使用に基づく免疫クロマトグラフィー試験を利用して実行される。図７および図８に示されるとおり、サンプルがＳ−ゾーンに加えられ、ＰＧＤＳが存在する場合、これが第一のモノクローナル抗体に結合してＰＧＤＳ結合複合体を形成する。この複合体は、メンブレン上にクロマトグラフィー的に移動して、これがＴ−ゾーンにおける固定された抗体に達するとき、凝集が生じて、青色のバンドが形成される。
【００８４】
要するに、かつ一実施形態では、第一のモノクローナル抗体を、可動粒子、たとえば、金またはラテックスビーズに結合体化する。これらのビーズは、赤色（金については）である内色素を有するか、またはラテックスビーズを用いる場合は異なる色になってもよい。サンプルを「Ｓ−ゾーン」に加える場合、マーカー、Ｌ−ＰＧＤＳがサンプル中に存在する場合、第一のモノクローナル抗体に結合して、これが、ビーズに結合体化され、次いでビーズが置かれる側方流動吸収性パッド（lateral flow absorbent pad）により、その複合体（サンプル中に存在する場合は、ビーズ＋抗体＋ＰＧＤＳ）が側方に移動する。一旦複合体が、（二次抗体がストリップ上に固定される）「Ｔ−ゾーン」に達すれば、複合体とともに現在移動されているマーカーが第二の固定された抗体に結合する。二次抗体は静止（stationary）／固定（fixed）／固定化（immobilized）されているので、複合体全体が捕捉されて、この複合体は今や着色されたビーズを含むので、この固定化されたＴゾーンのラインは、用いられるビーズに沿って光る（ラテックスビーズが用いられる場合、金については赤、または異なる色｛青など｝）。過剰の複合体サンプルが、ストリップの末端に移動し、そして「Ｃ−ゾーン」で、このビーズに結合体化した第一の抗体が、固定化された／固定された／静止のウサギ抗マウス抗体によって捕捉され、そして試験の終了を示す着色されたラインを生じる。したがって、着色されたバンドは、陽性の結果を示す（図７）。Ｔ−ゾーンには、有意の陰性の結果のバンドはない（図８）。Ｃ−ゾーンの固定化されたポリクローナル抗体は、陽性および陰性のサンプルの両方を含むラテックス結合体と結合する。この青色のバンドは、正確な試験能力を保証する。
【００８５】
実際に、本発明のキットおよびデバイスは、サンプル中のＣＳＦの存在を決定する種々の臨床設定で利用され得、この臨床設定としては、頭蓋骨骨折、種々の外科手術（内視鏡的鼻内手術、神経外科手術、硬膜外カテーテル設置など）の後のＣＳＦ漏出、突発性頭蓋内低血圧、炭疽菌誘発性頭蓋内低血圧、または鼻漏および耳漏、水頭症、頭蓋内腫瘍、先天性神経形成異常などの状態に関連するＣＳＦ漏出などが挙げられる。
【実施例】
【００８６】
以下の実施例および手順は、本発明の特定の好ましい実施形態および態様を示しかつさらに例証するために提供されており、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００８７】
＜方法論＞
硬膜外溶出液およびＣＳＦサンプルを、ＳＵＮＹ  Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの分娩施設で患者から入手した。体液は、ＳＵＮＹ  Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙラボから入手した。そのサンプルを、リポカリンＰＧＤＳに特異的なポリクローナル抗体の使用によってＰＧＤＳについて分析した（ＣＡＹＭＡＮ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＣＯ．Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．）。
【００８８】
＜硬膜外溶出液＞
署名済みインフォームド・コンセント（ＩＲＢ承認）、および担当する産科医の承認後、硬膜外カテーテルを配置して、慣用的な硬膜外医薬を投与した（３ｃｃのリドカインを１．５％に加えてエピネフリン１：２００，０００；および１０ｃｃのブピバカインを０．１２５％に加えてフェンタニールを５０μｇ）。次いで、この患者に、ブピバカイン０．０６２５％に加えてフェンタニール１．６μｇ／ｃｃという１０ｃｃ／時間の持続硬膜外インフュージョンを配置した。この検討の目的で、硬膜外カテーテルを、硬膜外配置の１〜４時間後に２回吸引した。吸引した液体をＰＧＤＳ免疫ブロットによってＣＳＦの存在について試験した。
【００８９】
＜脊髄液＞
署名済みインフォームド・コンセント（ＩＲＢ承認）、およびその産科医の承認後、選択的帝王切開のために慣用的な脊椎麻酔を留置している患者から少量の脊髄液の提供を受ける。２５Ｇのペンカン脊椎針をくも膜下腔に配置した後、１ｍＬのＣＳＦを麻酔について意図する医薬の注射の前に吸引した。したがって、正常には廃棄されるかまたは注入して患者へ戻されるＣＳＦを用いて、免疫ブロットによってＰＧＤＳの存在を評価した。
【００９０】
＜体液＞
本研究で試験された他の体液は、ＳＵＮＹ  Ｂｒｏｏｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ，Ｎ．Ｙ．の臨床検査室から入手した。担当医によって要求されるこの体液の臨床分析後、これらの体液サンプルは慣用的には廃棄される。それらを破棄するのではなく、ＩＲＢ承認があればこれらのサンプルは免疫ブロットによってＣＳＦマーカーＰＧＤＳの存在の評価のために採取された。
【００９１】
＜免疫ブロット＞
ＣＳＦのサンプル（５〜２０μｌ）および他の供給源由来の体液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、ＰＶＤＦメンブレンに電気転写した。このメンブレンをＴＢＳに含まれる５％の粉ミルクでブロックし、抗プロスタグランジンＤ２シンターゼ（抗ＰＧＤＳ）抗体（ＣＡＹＭＡＮ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＣＯ．Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．）で、次いでＨＲＰで標識した二次抗体でプローブした。次いで、そのブロットを増強化学発光（ＥＣＬ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって発色させた。
【００９２】
（実施例１）
ポリクローナルの抗ＰＧＤＳ抗体は、免疫ブロットの際のＣＳＦ中のＰＧＤＳの存在、および他の体液中にそれがないことを確実かつ特異的に検出する（図２）。５μＬ程度の少量のサンプルが、正確な分析には適切である。
【００９３】
（実施例２）
ポリクローナル抗ＰＧＤＳ抗体は、１２個の異なるヒト供給源由来のＣＳＦサンプル中のＰＧＤＳを確実に検出し、このことは、ＣＳＦ中のＰＧＤＳの抗体媒介性の検出が、抗原特異的であって、患者特異的ではないことを示す（図３）。
【００９４】
（実施例３）
ポリクローナル抗ＰＧＤＳ抗体は、種々の身体区画からの体液の吸引物を確実に識別する。強力な抗ＰＧＤＳ結合が、脊髄供給源由来の液体サンプルで観察されるが、ＰＧＤＳ結合は、硬膜外腔のカテーテル由来の溶出液では見出されない（図４）。
【００９５】
これらの結果によって、体液サンプル中のＰＧＤＳの有無は、その液体の供給源を確実かつ特異的に予想し、それによって脊髄、硬膜外および他の体液区画起源を区別するということが示される。
【００９６】
（実施例４）
−細菌発現ベクターへのＰＧＤＳのクローニング−
ＰＧＤＳの遺伝子を含むプラスミドｐＤＮＲ−ＬＩＢ（１２５〜２２５ｎｇ）を、Ｃｒｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ反応（２０μＬ）中でｐＬＢ−ＰｒｏＴｅｔ−６×ＨＮアクセプターベクター（約２００ｎｇ）とともにインキュベートした。反応を終わらせ、次いでこれを用いてコンピテントなＤＨ５−αおよびＢＬ２１細菌細胞を形質転換し、次いでこれを、３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび７％スクロースを含有するＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）寒天プレートにプレートした。ＰＧＤＳの遺伝子をまた、Ｃ末端にＨｉｓタグを有するｐｅｔ１５ｂベクターにクローニングし、これを用いてＤＨ５−αおよびＢＬ２１細菌細胞を形質転換した。プラスミドＤＮＡを、選択されたコロニーから抽出して、制限酵素によって直線化し、アガロースゲルで泳動した。
【００９７】
（実施例５）
−アフィニティークロマトグラフィーによるｒＰＧＤＳの精製−
ＢＬ２１  Ｅ．ｃｏｌｉ（ＰＧＤＳ遺伝子を保有するＰｒｏ−Ｔｅｔ  Ｒまたはｐｅｔ１５ｂベクターでトランスフェクトされる）の細胞画分をＳｉｇｍａ  Ｌｙｔｉｃ  ＩＩ抽出緩衝液中に抽出して、そのサンプルをＢＤ−ＴＡＬＯＮ  Ｈｉｓ−ＡｒｇアフィニティーカラムまたはＮｉｃｋｅｌ−ＮＴＡカラムに加えて、その結合したｒＰＧＤＳをイミダゾールで溶出した。そのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、ＰＧＤＳ抗体で免疫ブロットした。
【００９８】
（実施例６）
−モノクローナル抗体の生成−
標準的なプロトコール（Ｌｉｐｓｉｃｈら、１９８３）を用いて、ＰＧＤＳに対するモノクローナル抗体を生成した。３つのマウスに、４回の隔週注射でＰＧＤＳペプチドで免疫して、血清をＥＬＩＳＡによって試験した。マウスを、抗原に対する１：１０００の抗体力価を有することに基づいて融合について選択し、抗原を用いて再度ブーストして、続いて４日後に脾臓融合した。単離された脾臓細胞を、１０％Ｆｅｔａｌ  ＣｌｏｎｅＩ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）ならびにペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で５分間１０００ｒｐｍで一緒にペレット化することによって、マウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／Ｏと、１０：１の脾臓細胞と骨髄腫細胞で融合した。そのペレットをＤＭＥＭ培地中の３５％ＰＥＧ  １５００（Ｒｏｃｈｅ）中に再懸濁して、その細胞を直ちに、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＰＥＧを吸引して、その融合した細胞を、１５％Ｆｅｔａｌ  Ｃｌｏｎｅ  Ｉ、１０％ＮＣＴＣ１０９（Ｇｉｂｃｏ）、非必須アミノ酸、ペニシリンおよびストレプトマイシン、１０−４Ｍのヒポキサンチン、４×１０−７Ｍのアミノプテリン、１．６×１０−５Ｍのチミジンを補充したＤＭＥＭｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ）、ならびに１０％マクロファージ馴化培地中に懸濁して、１０個の９６ウェルプレートに入れた。マクロファージ馴化培地は、記載（Ｒａｔｈｅｊａｎら、１９８５）のとおり、ただし改変（Ｓｕｇａｓａｗａｒａら、１９８５）して調製した。要するに、Ｊ７７４．Ａ１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、１０％ウマ血清を補充したＤＭＥＭ培地中においてスピナーフラスコ中で培養した（ＨｙＣｌｏｎｅ）。リポポリサッカライド（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＰＳ  ０５５：Ｂ５，Ｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）をこのスピナー培養物に５μｇ／ｍＬまで添加し、そしてこの細胞を２０時間インキュベートした。次いで細胞を１０００ｒｐｍで１０分間回収して、半分の容積のＰＢＳ中で洗浄した。１０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後、その上清を破棄して、細胞を、ウマ血清なしのＩｓｃｏｖｅｓ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ，Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁して、スピナーフラスコに移した。次いで、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。その培地を、１５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって培地から細胞をペレットにすることによって回収した。次いでこのマクロファージ馴化培地を濾過して、４℃で貯蔵した。融合の２週間後、オボアルブミンに結合体化されたＰＧＤＳペプチドに対するＥＬＩＳＡによってウェルをスクリーニングした。スクリーニングの前日、０．１ｍＬの培地を１０個の９６ウェル融合プレートの各々のウェルから取り出して、新鮮な培地の１ウェルあたり０．１ｍＬで置き換えた。ＥＬＩＳＡおよび細胞増殖によって両方陽性の応答を示すウェルを翌日ＥＬＩＳＡによって再スクリーニングして、応答を確認した。再試験に対して陽性の応答を示すウェル中の細胞を増殖して、培養中で３０ｍＬまで増殖し、３つの１０ｍＬのアリコートをペレットにして、凍結保存のために凍結培地（１０％ジメチルスルホキシド、９０％Ｆｅｔａ���  Ｃｌｏｎｅ  Ｉ）中に再懸濁した。陽性サンプルをＣＳＦおよびｒＰＧＤＳに対するドットブロットによってスクリーニングして、クローンを限界希釈によってサブクローニングについて選択した。サブクローンをＥＬＩＳＡによってスクリーニングして、サブクローンをさらなる研究のために選択し、増殖して、Ｔ−１７５フラスコ中で１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を補充したＤＭＥＭ中で１０００ｍＬの容積まで増殖した。サブクローンを血清なしのＤＭＥＭに移して、３日間インキュベートを続けた。上清は、細胞を１５００ｒｐｍで１０分間ペレットにすることによって回収して、４℃で保管した。
【００９９】
融合の１０〜１４日後、クローンを最初のスクリーニングとしてＥＬＩＳＡによって４０００ウェルから試験した。陽性のクローンをＥＬＩＳＡによって再試験して、さらに、ドットブロットなどの二次スクリーニングによって２または３日内に試験した。組み換えＰＧＤＳを、ドットブロット装置を用いてＰＶＤＦメンブレンに移して、モノクローナル抗体産生のスキーム中で生成されるハイブリドーマ由来の腹水でプローブした。
【０１００】
（実施例７）
ＣＳＦ中の天然および変性ＰＧＤＳの検出
ＣＳＦ（１０μｌ）を、Ｂｉｏ−Ｒａｄドットブロット装置を用いてＰＶＤＦに移す（天然のタンパク質）か、またはＰＶＤＦメンブレンに電気泳動して転写し（変性タンパク質）、ＰＧＤＳ抗体でプローブした。そのメンブレンを、ＥＣＬ検出キットを用いることによって発色した。その結果は、Ｌ−ＰＧＤＳ特異的抗体を用いるタンパク質の検出を示す。
【０１０１】
（実施例８）
−硬膜外手順の間に得られたサンプル中のＰＧＤＳの存在を評価すること、およびＣＳＦ漏出に起因するＷｅｔ−Ｔａｐｓを特定すること−
ＩＲＢの承認後の臨床の共同研究者による硬膜外手順の間に得たサンプルを、ＣＳＦマーカー（ＰＧＤＳ）の存在について評価した。その研究は、サンプルを分析して、後に指定されたサンプルと関連付けるまで盲検であった。指定された脊髄サンプルはＣＳＦマーカーの強力な存在を示したが、指定された硬膜外サンプルはマーカーがない。
【０１０２】
（実施例９）
−組み換えタンパク質およびＩｇＧの増大および精製−
アフィニティークロマトグラフィー技術を、精製組み換えタンパク質および選択されたサブクローニング由来の抗体について用いる。
【０１０３】
−ｒＰＧＤＳの大規模精製−
ＰＧＤＳＨＮ標的化遺伝子を保有する発現ベクターＰｒｏ−Ｔｅｔ６Ｘ−ＨＮ、またはＨｉｓ標的化ＰＧＤＳ遺伝子を保有するｐｅｔ１５ｂベクターで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ−２１ＰＲＯ細胞を、Ｓｕｐｅｒブロス中で増殖する。タンパク質発現の誘導は、細胞密度（Ａ６００）が０．６〜０．７に達するとき、８００ｍｌの細菌培養物に対して８ｍｌの１００ｍＭアンヒドロテトラサイクリンを添加することによって２０〜２３℃で行ってもよい。細菌細胞を、結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフッ化物、および１ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．９）に再懸濁し、続いて超音波処理してもよい。標的化組み換えＬ−ＰＧＤＳを、製造業者のプロトコール（ＢＤ  Ｌｉｆe  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，またはＣｌｏｎＴｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）にしたがって、ＴＡＬＯＮまたはＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて精製する。遠心分離後（３９，０００×ｇ）、細胞抽出物を、３００μｌ（総容積）のＴＡＬＯＮまたはＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて４℃で１〜２時間インキュベートする。ビーズを１０ｍｌの洗浄緩衝液（１０ｍＭのイミダゾール以外は結合緩衝液と同じ）を用いて３回洗浄する。タンパク質を、３００〜５００μｌの溶出緩衝液（１００ｍＭのイミダゾール以外は結合緩衝液と同じ）を用いて溶出してもよい。溶出されたサンプルを上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットによって分析する。精製されたタンパク質を、マイクロコンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて１ｍｌあたり１〜２ｍｇに濃縮してもよく、これらのサンプルを用いて、ＥＬＩＳＡまたは等温滴定熱量計（Isothermal Titration Calorimetry）のいずれかによって、選択された抗体の特異性を決定してもよい。
【０１０４】
−大規模モノクローナル抗体産生（インビトロの腹水「ＩＶＡ」）−
【０１０５】
一連の陽性クローン（ＥＬＩＳＡ、ドットブロットおよび免疫ブロットの方法による天然および変性の両方の抗原を特定する能力について）を、インビトロの腹水に対する大規模産生のために選択する。細胞を、抗体産生を増強する添加物を補充した、無血清培地を用いて、Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｔｅｒｌａｎｄ）が作製したメンブレンＣｅＬＬｉｎｅによって区画に分けられた容器中で高密度まで増殖させる。
【０１０６】
−モノクローナル抗体の精製−
モノクローナル抗体の精製は、記載（Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，１９９９）のように１×１０ｃｍのＥｃｏｎｏｃｏｌｕｍｎｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中でＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇアガロース（Ｓｉｇｍａ）の１ｍＬのカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって達成し得る。代表的には、５００ｍＬの血清含有上清を、１／１０容積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０で希釈する。そのサンプルを、Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  Ｐｕｍｐ  Ｐ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ）で制御される、カラムを通して０．８ｍｌ／分の流速で流し、続けて０．１ＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０を用いる１０カラム容積の洗浄、および１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０の１０カラム容積の洗浄を、０．８ｍＬ／分の流速で行う。抗体を、１／１０容積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中に５０ｍＭのグリシンｐＨ３．０の０．５ｍＬ画分で溶出する。抗体含有画分を２８０ｎｍで光学密度を観察することによって特定して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し、次いで、プールして緩衝液を２回交換してＰＢＳに対して４℃で一晩透析する。タンパク質収率は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で決定する。
【０１０７】
（実施例１０）
−精製されたＩｇＧの特徴付けおよび品質管理−
等温滴定熱量計およびＥＬＩＳＡを利用して、抗体を、組み換えタンパク質とのそれらの結合等温線によって特徴付けてもよい。
【０１０８】
−等温滴定熱量計−
抗体産生の質を分析する一般に使用される方法、たとえば、電気泳動またはクロマトグラフィーは、結合活性についての情報を得ることなく分子構造を特徴付ける。これは、抗体機能のロット間の変動の評価では特にそのとおりである。等温滴定熱量計（ＩＴＣ）によって、抗体および抗体産物の品質管理および特徴付けのための非常に簡易かつより正確な方法が得られる。ＩＴＣを用いて、抗体または抗原に対する抗体親和性（Ｋａ）、抗原結合の熱（ΛＨ）および活性な結合部位のみかけの数（ｎ）などの、広範な物理的特徴を迅速かつ有効に測定し得る。構造の変化（断片化、部分的変性および結合剤による改変）を、結合親和性における変化と関連付けてもよい。さらに、結合の熱は、インビトロおよびインビボの両方で抗体抗原反応の予測因子として用いられ得る。
【０１０９】
ＩＴＣでは、リガンド（たとえば、レセプター、抗体など）の溶液を、結合パートナーの溶液に対して一定温度で滴定する。それらの相互作用の際に放出された熱（ΛＨ）を経時的にモニターする。連続的な量のリガンドを、セルに滴定するとき、吸収または放出された熱の量は、結合発生の量に対して直接比例する。このシステムが飽和に達するとき、シグナルは、希釈熱のみが観察されるまで減じる。次いで、結合曲線を、細胞中のリガンドの比および結合パートナーに対して各々の注射由来の熱のプロットから得る。標準プロトコールにしたがって、ＩＴＣを用いて精製された抗体の特異性および感度を決定する（Ｓａｗａｓら、２００４）。
【０１１０】
−抗原検出のためのＥＬＩＳＡ−
ポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレートを、炭酸塩重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で１μｇ／ｍｌ（１００μｌ／ウェル）で、精製された組み換え抗原（ＰＧＤＳ）を用いて一晩４℃でコーティングする。そのプレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、次いで０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中の１％脱脂粉乳を用いて３７℃で１時間ブロックする。培養上清中の異なる希釈のモノクローナル抗体をウェルに添加し（１００μｌ／ウェル）、プレートをＲＴで１．５時間、室温で３０分間インキュベートする。次いでそのプレートをＰＢＳＴで５回洗浄して、１００μｌの抗マウスＨＲＰＯ（ＰＢＳＴ中、１：１０００）を添加し、プレートを３７℃でさらに３０分間インキュベートする。上記の洗浄工程を繰り返した後、酵素活性を、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の１ウェルあたり１００μｌを用いてＲＴで１５分間インキュベートすることによって評価し得る。反応を終わらせるために２．５ＮのＨ２ＳＯ４を１ウェルあたり２５μｌ添加した後、４５０ｎｍの光学密度は、自動マイクロプレートリーダーを用いて測定してもよい。
【０１１１】
（実施例１１）
−臨床サンプル中のＣＳＦを特定するための側方流動デバイス−
本発明のデバイスは、２つのモノクローナル抗体の使用に基づいて免疫クロマトグラフィー試験を利用して行う。この試験デバイスは、プラスチック試験カセットとともに試験ストリップ（たとえば、０．８ｃｍ〜６．２ｃｍ）を含む（図６）。この抗体を、メンブレン上の３つの異なるゾーンに結合させる。これらのゾーンは、サンプルゾーン（Ｓ）、試験ゾーン（Ｔ）、およびコントロールゾーン（Ｃ）である。ラテックス粒子に結合体化されたＰＧＤＳ−ｍＡｂ１をＳ−ゾーンに結合させる。ＰＧＤＳ−ｍＡｂ２はＴ−ゾーンに永続的に固定され、ウサギ抗マウス抗体はＣ−ゾーンに固定される。
【０１１２】
−ラテックス粒子に対するＰＧＤＳ−ｍＡｂ１の結合体化−
一実施形態では、本発明のデバイスは、移動性粒子、たとえば、ラテックス粒子（Ｍａｇｓｐｈｅｒｅ  Ｉｎｃ，Ｐａｓａｄｅｎａ  ＣＡ）または金粒子（Ｂｉｏａｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｓ，Ｉｊａｍｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に結合体化された第一のＰＧＤＳモノクローナル抗体を利用する。このラテックス粒子は好ましくは、青に染色され、０．３ｍｍ直径のポリスチレンから作製される。ラテックス粒子（５０ｍｌ、１０％溶液）を、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、５０ｍＭ  ｐＨ５．５中で室温で１回洗浄する。そのペレットを６００ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ，Ｓｉｇｍａ）ｐＨ７．４に再懸濁し、３００ｍｇのＰＧＤＳ−ｍＡｂ１と混合する。その懸濁液を室温で２時間混合する。抗体−ラテックス懸濁液をＴｒｉｓ（−ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液、１００ｍＭ、ｐＨ８．０（０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有）中で２回洗浄する。次いで、そのペレットを５００ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液中に再懸濁して、４℃で保管する。その結合体化された懸濁液（１００ｍｌ）を、結合体パッド（０．５ｃｍ〜３０ｃｍ）上に自動エアブラシ・システム（Ｂｉｏ−Ｄｏｔ  Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）によって加えて、室温で６０分間乾燥する。
【０１１３】
−ＰＧＤＳ−Ｍａｂ２およびウサギ抗マウス抗体の固定−
第二のＰＧＤＳモノクローナル抗体（ＰＧＤＳ−ｍＡｂ２）およびウサギ抗マウス抗体も、本発明のデバイスで用いる。ＰＧＤＳ−ｍＡｂ２およびウサギ抗マウス抗体を、５ｍｇ／ｍｌの濃度で、２つの自動エアブラシ・システム（Ｂｉｏ−Ｄｏｔ）を用いて、市販の５ｍｍの細孔サイズを有するナイロンメンブレン（４ｃｍ〜３０ｃｍ）への２つの別のラインとして加えてもよい。そのメンブレンを３０分間乾燥し、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４（０．２５％のカゼインを含む）を用いてシェーカー上で１５分間ブロックしてもよい。そのメンブレンを３７℃で６０分間乾燥し、乾燥剤を有する密閉バッグで保管する（ＥｓｆａｎｄｉａｒｉおよびＫｌｉｎｇｅｂｏｒｎ，２０００）。
【０１１４】
−試験手順−
ここで図７および図８を参照して、サンプルを含む少量のＰＧＤＳをＳ−ゾーンに添加する。図７に示すとおり、サンプル中に存在するＰＧＤＳは、ラテックス結合体に結合して、ＰＧＤＳ−結合体−複合体を形成し、メンブレン上にクロマトグラフィー的に移動する。この複合体が、Ｔ−ゾーンにおける固定された抗体に達するとき、ビーズ−マーカー−Ｍａｂ１複合体は、固定されたＭａｂ２から構成される「Ｔ−ゾーン：上に補足され、青い着色されたバンドが形成される。この結果は、「Ｔ−ゾーン」上の着色ラテックスまたは金ビーズに沿った抗原−抗体複合体の凝集であり、これが次に、ビーズの取り込みのおかげで着色されたラインの出現を生じる。Ｔ−ゾーン中の３〜５分内で示される青いバンドは、陽性の結果を示す（図７）。Ｔ−ゾーンにおいてバンドが示されない場合は陰性の結果を意味する（図８）。Ｃ−ゾーン中の固定されたポリクローナル抗体は、陽性および陰性のサンプルの両方を含むラテックス結合体と結合する。この青色のバンドは、正確な試験能力を保証する。
【０１１５】
−ＣＳＦ検出デバイスの使用−
本発明のデバイスは、サンプル中の脳脊髄液（ＣＳＦ）の存在を決定するための種々の臨床設定で利用され得る。このデバイスは、以下の条件におけるＣＳＦの検出のために用いられ得る（ただしこれに限定はしない）：
・ＣＳＦの漏出を伴う頭蓋骨骨折（主に基部の頭蓋骨骨折）
・内視鏡的鼻内手術後のＣＳＦ漏出
・神経外科手術後のＣＳＦ漏出
・硬膜外カテーテル留置後のＣＳＦ漏出
・ＣＳＦ漏出後の突発性頭蓋内低血圧
・ＣＳＦ漏出をともなう炭疽菌誘発性頭蓋内低血圧
・鼻漏および耳漏に関連するＣＳＦ漏出
・水頭症に関連するＣＳＦ漏出
・頭蓋内腫瘍に関連するＣＳＦ漏出
・先天性神経形成異常に関連するＣＳＦ漏出。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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