(57)【要約】  本発明は、Ｂｅｔ  ｖ  １ａまたはＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンからなる低アレルギー性分子に関する。本発明の低アレルギー性分子は、Ｂｅｔ  ｖ  １ａのアミノ酸１００〜１２５の領域内またはこれと対応するＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンの領域内にある、少なくとも４つのアミノ酸残基の変異体を有する。
2010536349.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｅｔ  ｖ  １ａまたはＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンからなる低アレルギー性分子であって、
Ｂｅｔ  ｖ  １ａのアミノ酸１００〜１２５の領域内において、または上記領域に対応するＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンの領域内において少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を有し、
上記少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、Ｂｅｔ  ｖ  １ａの位置１１４またはＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンの位置１１４でのアミノ酸残基の変異である、低アレルギー性分子。
【請求項２】
Ｂｅｔ  ｖ  １ａまたはＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンからなる低アレルギー性分子であって、
Ｂｅｔ  ｖ  １ａのアミノ酸１００〜１２５の領域内において、または上記領域に対応するＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンの領域内において、少なくとも４つのアミノ酸残基の変異を有する、低アレルギー性分子。
【請求項３】
Ｂｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有する上記アレルゲンは、Ｂｅｔ  ｖ  １ａと免疫学的に交差反応を起こしうるものであることを特徴とする、請求項１または２に記載の分子。
【請求項４】
Ｂｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有する上記アレルゲンは、
Ｄａｕ  ｃ  １、特にＤａｕ  ｃ  １．０１０１（Ｕ４７０８７），Ｄａｕ  ｃ  １．０１０２（Ｄ８８３８８），Ｄａｕ  ｃ  １．０１０４（Ｚ８１３６２），Ｄａｕ  ｃ  １．０１０５（Ｚ８４３７６），Ｄａｕ  ｃ  １．０２０１（ＡＦ４５６４８１）またはＤａｕ  ｃ  １．０１０３（Ｚ８１３６１）、Ａｐｉ  ｇ  １，特にＡｐｉ  ｇ  １．０１０１（Ｚ４８９６７）またはＡｐｉ  ｇ  １．０２０１（Ｚ７５６６２）、Ｐｅｔ  ｃ  １（Ｘ１２５７３）、Ｃａｓ  ｓ  １（ＡＪ４１７５５０））、Ｑｕｅ  ａ  １（Ｐ８５１２６）、Ｍａｌ  ｄ  １，特にＭａｌ  ｄ  １．０１０１（Ｘ８３６７２），Ｍａｌ  ｄ  １．０１０２（Ｚ４８９６９），Ｍａｌ  ｄ  １．０１０９（ＡＹ０２６９１０），Ｍａｌ  ｄ  １．０１０５（ＡＦ１２４８３０），Ｍａｌ  ｄ  １．０１０６（ＡＦ１２４８３１），Ｍａｌ  ｄ  １．０１０８（ＡＦ１２６４０２），Ｍａｌ  ｄ  １．０１０３（ＡＦ１２４８２３），Ｍａｌ  ｄ  １．０１０７（ＡＦ１２４８３２），Ｍａｌ  ｄ  １．０１０４（ＡＦ１２４８２９），Ｍａｌ  ｄ  １．０２０１（Ｌ４２９５２），Ｍａｌ  ｄ  １．０２０２（ＡＦ１２４８２２），Ｍａｌ  ｄ  １．０２０３（ＡＦ１２４８２４），Ｍａｌ  ｄ  １．０２０７（ＡＹ０２６９１１），Ｍａｌ  ｄ  １．０２０５（ＡＦ１２４８３５），Ｍａｌ  ｄ  １．０２０４（ＡＦ１２４８２５），Ｍａｌ  ｄ  １．０２０６（ＡＦ０２０５４２），Ｍａｌ  ｄ  １．０２０８（ＡＪ４８８０６０），Ｍａｌ  ｄ  １．０３０２（ＡＹ０２６９０８），Ｍａｌ  ｄ  １．０３０４（ＡＹ１８６２４８），Ｍａｌ  ｄ  １．０３０３（ＡＹ０２６９０９），Ｍａｌ  ｄ  １．０３０１（Ｚ７２４２５），Ｍａｌ  ｄ  １．０４０２（Ｚ７２４２７），Ｍａｌ  ｄ  １．０４０３（Ｚ７２４２８）またはＭａｌ  ｄ  １．０４０１（Ｚ７２４２６）、Ｐｙｒ  ｃ  １，特にＰｙｒ  ｃ  １．０１０１（Ｏ６５２００）、Ｐｒｕ  ａｖ  １，特にＰｒｕ  ａｖ  １．０１０１（Ｕ６６０７６），Ｐｒｕ  ａｖ  １．０２０２（ＡＹ５４０５０８），Ｐｒｕ  ａｖ  １．０２０３（ＡＹ５４０５０９）またはＰｒｕ  ａｖ  １．０２０１（ＡＹ５４０５０７）、Ｐｒｕ  ｐ  １（ＤＱ２５１１８７）、Ｒｕｂ  ｉ  １．０１０１（ＤＱ６６０３６１）、Ｐｒｕ  ａｒ  １，特にＰｒｕ  ａｒ  １．０１０１（Ｕ９３１６５）、Ｃｏｒ  ａ  １，特にＣｏｒ  ａ  １．０４０１（ＡＦ１３６９４５），Ｃｏｒ  ａ  １．０４０４（ＡＦ３２３９７５），Ｃｏｒ  ａ  １．０４０２（ＡＦ３２３９７３），Ｃｏｒ  ａ  １．０４０３（ＡＦ３２３９７４），Ｃｏｒ  ａ  １．０３０１（Ｚ７２４４０），Ｃｏｒ  ａ  １．０２０１（Ｚ７２４３９），Ｃｏｒ  ａ  １／５（Ｘ７０９９９），Ｃｏｒ  ａ  １／１１（Ｘ７０９９７），Ｃｏｒ  ａ  １／６（Ｘ７１０００）またはＣｏｒ  ａ  １／１６（Ｘ７０９９８）、Ｂｅｔ  ｖ  １ｄ（Ｘ７７２６６）、Ｂｅｔ  ｖ  １ｌ（Ｘ７７２７３）、Ｂｅｔ  ｖ  １ａ１−６（非特許文献１）、Ｂｅｔ  ｖ  １ｇ（Ｘ７７２６９）、Ｂｅｔ  ｖ  １ｆ（Ｘ７７２６８）、Ｂｅｔ  ｖ  １ｊ（Ｘ７７２７１）、Ｂｅｔ  ｖ  １ｅ（Ｘ７７２６７）、Ｂｅｔ  ｖ  １ｂ（Ｘ７７２００）、Ｂｅｔ  ｖ  １ｃ（Ｘ７７２６５）、Ｂｅｔ  ｖ  １．０１０１（Ｘ１５８７７）、Ｂｅｔ  ｖ  １．���９０１（Ｘ７７２７２）、Ｂｅｔ  ｖ  １．１１０１（Ｘ７７５９９）、Ｂｅｔ  ｖ  １．１２０１（Ｘ７７６００）、Ｂｅｔ  ｖ  １．１３０１（Ｘ７７６０１）、Ｂｅｔ  ｖ  １．１４０１（Ｘ８１９７２）、Ｂｅｔ  ｖ  １．１５０１（Ｚ７２４２９）、Ｂｅｔ  ｖ  １．１６０１（Ｚ７２４３７）、Ｂｅｔ  ｖ  １．１７０１（Ｚ７２４３０）、Ｂｅｔ  ｖ  １．１８０１（Ｚ７２４３１）、Ｂｅｔ  ｖ  １．１９０１（Ｚ７２４３３）、Ｂｅｔ  ｖ  １．２００１（Ｚ７２４３４）、Ｂｅｔ  ｖ  １．２１０１（Ｚ７２４３５）、Ｂｅｔ  ｖ  １．２２０１（Ｚ７２４３８）、Ｂｅｔ  ｖ  １．２３０１（Ｚ７２４３６）、Ｂｅｔ  ｖ  １．２４０１（Ｚ８０１００）、Ｂｅｔ  ｖ  １．２５０１（Ｚ８０１０１）、Ｂｅｔ  ｖ  １．２６０１（Ｚ８０１０２）、Ｂｅｔ  ｖ  １．２７０１（Ｚ８０１０３）、Ｂｅｔ  ｖ  １．２９０１（Ｚ８０１０５）、Ｂｅｔ  ｖ  １．３００１（Ｚ８０１０６）、Ａｌｎ  ｇ  １（Ｓ５０８９２）、Ｃａｒ  ｂ  １，特にＣａｒ  ｂ  １．０３０１（Ｚ８０１６９），Ｃａｒ  ｂ  １．０３０２（Ｚ８０１７０），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０３（Ｚ８０１５９），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０５（Ｚ８０１６１），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０４（Ｚ８０１６０），Ｃａｒ  ｂ  １／１ａ，Ｃａｒ  ｂ  １．０１０１（Ｘ６６９３２），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０２（Ｘ６６９１８），Ｃａｒ  ｂ  １／１ｂ，Ｃａｒ  ｂ  １／２，Ｃａｒ  ｂ  １．０１０６ａ（Ｚ８０１６２），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０６ｂ（Ｚ８０１６３），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０６ｃ（Ｚ８０１６４），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０６ｄ（Ｚ８０１６５），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０７ａ（Ｚ８０１６６），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０７ｂ（Ｚ８０１６７），Ｃａｒ  ｂ  １．０２０１（Ｘ６６９３３）またはＣａｒ  ｂ  １．０１０８（Ｚ８０１６８）、Ｇｌｙ  ｍ  ４．０１０１（Ｘ６００４３）、Ｖｉｇ  ｒ  １．０１０１（ＡＹ７９２９５６）、Ａｒａ  ｈ  ８．０１０１（ＡＹ３２８０８８）、Ａｓｐ  ａｏ  ＰＲ１０（Ｘ６２１０３）、Ｂｅｔ  ｐ  １ａ（ＡＢ０４６５４０）、Ｂｅｔ  ｐ  １ｂ（ＡＢ０４６５４１）、Ｂｅｔ  ｐ  １ｃ（ＡＢ０４６５４２）、Ｆａｇ  ｓ  １（ＡＪ１３０８８９）、Ｃａｐ  ｃｈ  １７ｋＤ  ａ（ＡＪ８７９１１５）、Ｃａｐ  ｃｈ  １７ｋＤ  ｂ（ＡＪ８７８８７１）、Ｆｒａ  ａ  １．０１０１（ＡＹ６７９６０１）、およびＴａｒ  ｏ  １８ｋＤ（ＡＦ０３６９３１）からなる群より選択されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分子。
【請求項５】
上記少なくとも１つのアミノ酸残基における、または上記少なくとも４つのアミノ酸残基における少なくとも１つの変異は、アミノ酸の置換、欠失、または付加であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分子。
【請求項６】
Ｂｅｔ  ｖ  １ａの変異領域、または上記変異領域に対応するＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンの変異領域は、Ｂｅｔ  ｖ  １ａの領域における、または上記領域に対応するＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンの領域における、アミノ酸の位置１０５〜１２０、好ましくはアミノ酸の位置１０８〜１１８、より好ましくはアミノ酸の位置１０９〜１１６を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の分子。
【請求項７】
上記少なくとも１つの変異が、上記領域とＢｅｔ  ｖ  １ａおよびＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンからなる群より選択された別のアレルゲンの対応する領域とが置換されることを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分子。
【請求項８】
上記分子がＢｅｔ  ｖ  １からなり、Ｂｅｔ  ｖ  １のアミノ酸の位置１０９〜１１６が、上記アミノ酸の位置１０９〜１１６に対応するＭａｌ  ｄ  １の領域と置換されていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の分子。
【請求項９】
上記分子がＭａｌ  ｄ  １からなり、Ｍａｌ  ｄ  １のアミノ酸の位置１０９〜１１６が、上記アミノ酸の位置１０９〜１１６と対応するＢｅｔ  ｖ  １の領域と置換されていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の低アレルギー性分子をコードしている、核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸分子を含有する、ベクター。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の低アレルギー性分子を含有する、ワクチン製剤。
【請求項１３】
さらに、薬学的に使用可能な、賦形剤、希釈剤、アジュバントおよびキャリアの少なくとも１つを含有することを特徴とする、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
アレルギーの予防および治療の少なくとも一方のためのワクチンを製造するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の低アレルギー性分子の、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低アレルギー性分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中の約１千万人−２千万人が花粉アレルギーを患い、これらの患者のうち、およそ３分の１が樹木花粉に対してアレルギー性反応を示している。温帯気候地域では、主なシラカンバ花粉アレルゲンであるＢｅｔ  ｖ  １が、ほとんどの樹木花粉症の原因となっている。さらに、シラカンバ花粉アレルギーを患う個人の５０％〜９３％は、花粉関連食品に対して過敏症反応を示す。主としてＢｅｔ  ｖ  １に対して作用する交差反応性ＩｇＥ抗体がこの過敏症反応の間接的な原因となっている。
【０００３】
この種の過敏症は、ｐｏｌｌｅｎ−ｆｏｏｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＰＦＳ）と呼ばれている。これによって、口腔粘膜にアレルゲンが接触するとすぐに拒絶反応が、通常は口腔および咽頭のみに現われる。シラカンバ花粉アレルギーの場合、ＰＦＳと最も頻繁に関連しているアレルゲンのひとつとして、主なリンゴアレルゲンであるＭａｌ  ｄ  １が挙げられる。Ｍａｌ  ｄ  １はＢｅｔ  ｖ  １のアミノ酸配列と６４％の同一性を示しており、交差阻害性実験を行った結果、両方の分子に共通するＩｇＥエピトープが存在することが分かった。
【０００４】
非特許文献１には、野生型Ｂｅｔ  ｖ  １ａに点変異を導入することでＢｅｔ  ｖ  １ａのＩｇＥ反応性を変性させることが記載されている。非特許文献１では、Ｂｅｔ  ｖ  １ａの１０、３０、５７、１１２、１１３および／または１２５の位置に変異を導入した。これらの位置に変異を有するＢｅｔ  ｖ  １ａ分子は、その三次元構造を完全には喪失しないので、そのＩｇＥ反応性は完全には失活しない。
【０００５】
これらの位置における変異は、全ての患者の幾人かにおいては、患者個人のＩｇＥ反応に対する多クローン性に依存して、ＩｇＥ反応性の低下を示したが、全ての患者においてはＩｇＥ反応性の低下を示さなかった。したがって、このような変異は、大多数の人を対象とした治療用分子を生成する方法として用いることができなかった。
【０００６】
非特許文献２には、低いＩｇＥ反応性および高いＴ細胞反応性を示すキメラタンパクを記載されている。このキメラタンパクは、Ｂｅｔ  ｖ  １のシャフリングされたアレルゲンおよびＢｅｔ  ｖ  １同種アレルゲンを含むライブラリから選択されている。
【０００７】
非特許文献３では、Ｂｅｔ  ｖ  １とＭａｌ  ｄ  １との交差反応について議論している。
【０００８】
非特許文献４には、遺伝子シャフリング法を用いたＢｅｔ  ｖ  １ファミリーの試験管内進化について記載されている。
【０００９】
非特許文献５は、５つの点変異を有する低アレルギー性Ｍａｌ  ｄ  １変異体について記載している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ferreira F et. al.，FASEB(1998)12:231-242
【非特許文献２】Wallner et. al.，Allergy Clin. Immunol.,120(2)(2007):374-380
【非特許文献３】Larsen et. al.，Allergy Clin. Immunol.,109(1)(2002):164
【非特許文献４】Wallner et. al.，Allergy Clin. Immunol.,109(1)(2002):164
【非特許文献５】Bolhaar S T H P et. al.，Clin. Exp. Allergy.35(12)(2005):1638-1644
【非特許文献６】Akdis CA et al. Eur J Immunol. 28(3)(1998):914-25
【非特許文献７】Pearson et al. （1988）PNAS USA 85:2444
【非特許文献８】Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) Nucleic Acids Res., 12, 387-395
【非特許文献９】Atschul, S.F., et al., J Molec Biol 215: 403 (1990)
【非特許文献１０】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994
【非特許文献１１】Carillo et al,(1988)SIAM J Applied Math 48 : 1073
【非特許文献１２】Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482
【非特許文献１３】Needleman et al.,(1970)J. Mol. Biol. 48:443
【非特許文献１４】Schwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)
【非特許文献１５】「Vaccine Protocols」（A. Robinson, M.P. Cranage, M. Hudson; Humana Press Inc.,U.S.; 2nd edition 2003）
【非特許文献１６】Sippl M. J., Proteins 17:355-362,1993
【非特許文献１７】Gajhede M, Nat Struct Biol.1996 Dec;3(12):1040-5.
【非特許文献１８】Neudecker P, J Biol Chem.2001 Jun 22;276(25):22756-63.Epub 2001 Apr 3.
【非特許文献１９】Schirmer T, J Mol Biol. 2005 Sep 2;351(5):1101-9.
【非特許文献２０】Wallner M et al., Method 2004,32(3):219-26
【非特許文献２１】Sippl M. J. et al., Stat.mechanics, protein struct & protein.substrate interactions; 0:, pp. 297-315, (1994)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、Ｂｅｔ  ｖ  １ａの交差反応性アレルゲンによって引き起こされるｐｏｌｌｅｎ−ｆｏｏｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅの治療に用いられる、野生型アレルゲンと比べて全くＩｇＥ反応性を示さない、またはＩｇＥ反応性が著しく低い低アレルギー性分子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために、本発明は、Ｂｅｔ  ｖ  １ａ（配列番号１）からなる、またはＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンからなる低アレルギー性分子であって、Ｂｅｔ  ｖ  １ａのアミノ酸１００〜１２５の領域内において、または、Ｂｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンにおける上記領域に対応する領域内において、少なくとも４つのアミノ酸残基の変異を有する低アレルギー性分子に関する。
【００１３】
Ｂｅｔ  ｖ  １ａまたはＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有する（好ましくは、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％もしくは８０％の同一性を有する）アレルゲンのアミノ酸１００〜１２５の領域内に、少なくとも４つのアミノ酸残基の変異を有することによって、三次元構造が失われたことでＩｇＥ反応性が実質的に低下したもしくは完全に排除された低アレルギー性分子が得られる。
【００１４】
変異アレルゲンのＩｇＥ反応性は、対応する野生型アレルゲンと比べ、低下している。抗体（ＩｇＥ）に基づく生物学的アッセイ（ＥＬＩＳＡまたはＲＡＳＴの阻害、好塩基性球の炎症メディエーター放出等）によれば、野生型アレルゲンの場合に得られた最大半減値に到達するまでに、少なくとも５０倍、好ましくは少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも５００倍、さらに好ましくは少なくとも１０００倍、変異アレルゲンの濃度を高くする必要がある。これは、非特許文献１と照らし合わせると驚くことである。なぜなら、非特許文献１では、この領域内のアミノ酸残基を３つ変異させても、本発明の分子の特性を有する低アレルギー性分子は得られなかったからである。
【００１５】
本発明の低アレルギー性分子の低アレルギー特性は、野生型アレルゲンと比べて、三次元構造が破壊された結果として得られる。非特許文献６では、天然様折り畳み構造のアレルゲン、ここではハチ毒アレルゲンホスホリパーゼＡ（ＰＬＡ）が、同一タンパク質の非天然様折り畳み構造を有するアレルゲンと異なる免疫反応を引き起こすことを記載している。
【００１６】
折り畳み構造のＰＬＡは、Ｂ細胞にＩｇＥ抗体を引き起こし、Ｔヘルパー（ＴＨ）２細胞を刺激する。これら細胞は共にアレルギー免疫反応のマーカーである。これに対し、非再折り畳み構造のＰＬＡまたは還元アルキル化ＰＬＡは、共にＢ細胞内のＩｇＧ４反応を引き起こすＴＨ１優勢サイトカイン形態を引き起こす。ＴＨ１主導の免疫反応は、アレルギー疾患に対する治療剤として用いられる分子に特に好適である。したがって、本発明の分子の折り畳まれていない構造は非常に重要である。
【００１７】
３つの他のアミノ酸残基の次に、Ｂｅｔ  ｖ  １ａまたはＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンの少なくともアミノ酸残基１１３またはアミノ酸残基１１４を変異することが特に好ましい。
【００１８】
本発明の他の様態は、Ｂｅｔ  ｖ  １ａまたはＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンからなる低アレルギー性分子であって、Ｂｅｔ  ｖ  １ａのアミノ酸１００〜１２５の領域内またはこれに対応するＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンの領域内に少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を有し、上記少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、Ｂｅｔ  ｖ  １ａまたはＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンの位置１１４でのアミノ酸残基の変異を有する低アレルギー性分子である。
【００１９】
驚くことに、少なくともアミノ酸残基１１４の変異は、対応する野生型アレルゲンの三次元構造とは異なる三次元構造を有する低アレルギー性分子を生成する可能性があることが分かった。Ｂｅｔ  ｖ  １ａまたはＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンのアミノ酸１１４の変異は、結果として低アレルギー性分子の生成につながる。
【００２０】
本発明の好適な実施の形態によれば、この低アレルギー性分子は、さらに少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つ）のＢｅｔ  ｖ  １ａのアミノ酸１００〜１２５内またはこれに対応するＢｅｔ  ｖ  １ａと４０％の同一性を有するアレルゲンの領域内の変異を含んでいる。特に、低アレルギー性分子は、Ｂｅｔ  ｖ  １ａのアミノ酸残基１０２およびアミノ酸残基１２０の少なくとの一方において変異を有することが好ましい。本発明の特に好適な実施の形態では、Ｂｅｔ  ｖ  １ａまたはＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンのアミノ酸残基１１４は、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）で置換されている。
【００２１】
本発明の好適な実施の形態によれば、Ｂｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有する上記アレルゲンは、Ｂｅｔ  ｖ  １ａと免疫学的に交差反応を起こしうる。ここで、免疫交差反応は特定分子に抗体を結合させることとして定義され、アフィニティー精製したウサギ抗Ｂｅｔ  ｖ  １ａポリクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡによって判定することができる。Ｂｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有し、これらの抗体で認識される分子は、Ｂｅｔ  ｖ  １ａと免疫交差反応を起こしうると考えられる。
【００２２】
Ｂｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンがＢｅｔ  ｖ  １ａと免疫学的に交差反応を起こしうることは有利なことである。なぜなら、このことにより、免疫システムがＢｅｔ  ｖ  １ａだけではなく多くの場合Ｂｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有する食物アレルゲンと結合しうる抗体を生成できるため、本発明の低アレルギー性分子をｐｏｌｌｅｎ−ｆｏｏｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  （ＰＦＳ）の防止または治療に用いることができるからである。
【００２３】
アレルゲンがＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有すると、より有利である。
【００２４】
本明細書で用いられる「同一性」とは、いかなる２つ（またはそれ以上）のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列が一定の度合いで互いに「同一」のアミノ酸配列を有しているか否か（「％の同一性」）を示す。この度合いは、例えば、非特許文献７に記載のデフォルトパラメータを用いて、「ＦＡＳＴＡ」プログラムといった公知のコンピュータアルゴリズムによって判断することができる（他のプログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献８）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ(非特許文献９、非特許文献１０、および非特許文献１１等が挙げられる)。例えば、ＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴツールを同一性判断に用いることができる。他の商業的または公然に提供されているプログラムとして、ＤＮＡＳｔａｒの「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびウィスコンシン大学遺伝子コンピュータグループ（ＵＷＧ）の「Ｇａｐ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））が挙げられる。
【００２５】
タンパク質分子の同一性割合は、例えば、ＧＡＰコンピュータプログラム（例えば、非特許文献１２によって改訂された非特許文献１３）を用いて配列情報を比較することで決定することができる。簡単に言えば、ＧＡＰプログラムは、類似性を、同一の配列記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を、２つの配列のうち短い配列にある記号の合計数で割った数として定義している。
【００２６】
ＧＡＰプログラムのデフォルト（初期値）パラメータは、次を含むことができる：（１）単一比較マトリクス（同一性および非同一性を有する１の値を有する）、および非特許文献１４に記載のGribskov et al. 14:6745の加重比較マトリクス；（２）各間隙に３．０のペナルティと、各間隙内の各記号につき、追加で０．１０ペナルティ；および（３）各末端の間隙にはペナルティがない。
【００２７】
Ｂｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲン（Ｚ８００９８）は、Ｂｅｔ  ｖ  １と、以下からなる群より選択されるアレルゲンとで構成されていることが好ましい：Ｄａｕ  ｃ  １，特にＤａｕ  ｃ  １．０１０１（Ｕ４７０８７），Ｄａｕ  ｃ  １．０１０２（Ｄ８８３８８）Ｄａｕ  ｃ  １．０１０４（Ｚ８１３６２），Ｄａｕ  ｃ  １．０１０５（Ｚ８４３７６），Ｄａｕ  ｃ  １．０２０１（ＡＦ４５６４８１）またはＤａｕ  ｃ  １．０１０３（Ｚ８１３６１）；Ａｐｉ  ｇ  １，特にＡｐｉ  ｇ  １．０１０１（Ｚ４８９６７）またはＡｐｉ  ｇ  １．０２０１（Ｚ７５６６２）；Ｐｅｔ  ｃ  １（Ｘ１２５７３）；Ｃａｓ  ｓ  １（ＡＪ４１７５５０））；Ｑｕｅ  ａ  １（Ｐ８５１２６）；Ｍａｌ  ｄ  １，特にＭａｌ  ｄ  １．０１０１（Ｘ８３６７２），Ｍａｌ  ｄ  １．０１０２（Ｚ４８９６９），Ｍａｌ  ｄ  １．０１０９（ＡＹ０２６９１０），Ｍａｌ  ｄ  １．０１０５（ＡＦ１２４８３０），Ｍａｌ  ｄ  １．０１０６（ＡＦ１２４８３１），Ｍａｌ  ｄ  １．０１０８（ＡＦ１２６４０２），Ｍａｌ  ｄ  １．０１０３（ＡＦ１２４８２３），Ｍａｌ  ｄ  １．０１０７（ＡＦ１２４８３２），Ｍａｌ  ｄ  １．０１０４（ＡＦ１２４８２９），Ｍａｌ  ｄ  １．０２０１（Ｌ４２９５２），Ｍａｌ  ｄ  １．０２０２（ＡＦ１２４８２２），Ｍａｌ  ｄ  １．０２０３（ＡＦ１２４８２４），Ｍａｌ  ｄ  １．０２０７（ＡＹ０２６９１１），Ｍａｌ  ｄ  １．０２０５（ＡＦ１２４８３５），Ｍａｌ  ｄ  １．０２０４（ＡＦ１２４８２５），Ｍａｌ  ｄ  １．０２０６（ＡＦ０２０５４２），Ｍａｌ  ｄ  １．０２０８（ＡＪ４８８０６０），Ｍａｌ  ｄ  １．０３０２（ＡＹ０２６９０８），Ｍａｌ  ｄ  １．０３０４（ＡＹ１８６２４８），Ｍａｌ  ｄ  １．０３０３（ＡＹ０２６９０９），Ｍａｌ  ｄ  １．０３０１（Ｚ７２４２５），Ｍａｌｄ１．０４０２（Ｚ７２４２７），Ｍａｌｄ１．０４０３（Ｚ７２４２８）またはＭａｌｄ１．０４０１（Ｚ７２４２６）；Ｐｙｒ  ｃ  １，特にＰｙｒ  ｃ  １．０１０１（Ｏ６５２００）；Ｐｒｕ  ａｖ  １，特にＰｒｕ  ａｖ  １．０１０１（Ｕ６６０７６），Ｐｒｕ  ａｖ  １．０２０２（ＡＹ５４０５０８），Ｐｒｕ  ａｖ  １．０２０３（ＡＹ５４０５０９）またはＰｒｕ  ａｖ  １．０２０１（ＡＹ５４０５０７）；Ｐｒｕ  ｐ  １（ＤＱ２５１１８７）；Ｒｕｂ  ｉ  １．０１０１（ＤＱ６６０３６１）；Ｐｒｕ  ａｒ  １，特にＰｒｕ  ａｒ  １．０１０１（Ｕ９３１６５）；Ｃｏｒ  ａ  １，特にＣｏｒ  ａ  １．０４０１（ＡＦ１３６９４５），Ｃｏｒ  ａ  １．０４０４（ＡＦ３２３９７５），Ｃｏｒ  ａ  １．０４０２（ＡＦ３２３９７３），Ｃｏｒ  ａ  １．０４０３（ＡＦ３２３９７４），Ｃｏｒ  ａ  １．０３０１（Ｚ７２４４０），Ｃｏｒ  ａ  １．０２０１（Ｚ７２４３９），Ｃｏｒ  ａ  １／５（Ｘ７０９９９），Ｃｏｒ  ａ  １／１１（Ｘ７０９９７），Ｃｏｒ  ａ  １／６（Ｘ７１０００）またはＣｏｒ  ａ  １／１６（Ｘ７０９９８）；Ｂｅｔ  ｖ  １ｄ（Ｘ７７２６６）；Ｂｅｔ  ｖ  １ｌ（Ｘ７７２７３）；Ｂｅｔ  ｖ  １ａ１−６（Ｆｅｒｒｅｉｒａ  Ｆら、ＦＡＳＥＢ（１９９８）１２：２３１−２４２）；Ｂｅｔ  ｖ  １ｇ（Ｘ７７２６９）；Ｂｅｔ  ��  １ｆ（Ｘ７７２６８）；Ｂｅｔ  ｖ  １ｊ（Ｘ７７２７１）；Ｂｅｔ  ｖ  １ｅ（Ｘ７７２６７）；Ｂｅｔ  ｖ  １ｂ（Ｘ７７２００）；Ｂｅｔ  ｖ  １ｃ（Ｘ７７２６５）；Ｂｅｔ  ｖ  １．０１０１（Ｘ１５８７７）；Ｂｅｔ  ｖ  １．０９０１（Ｘ７７２７２）；Ｂｅｔ  ｖ  １．１１０１（Ｘ７７５９９）；Ｂｅｔ  ｖ  １．１２０１（Ｘ７７６００）；Ｂｅｔ  ｖ  １．１３０１（Ｘ７７６０１）；Ｂｅｔ  ｖ  １．１４０１（Ｘ８１９７２）；Ｂｅｔ  ｖ  １．１５０１（Ｚ７２４２９）；Ｂｅｔ  ｖ  １．１６０１（Ｚ７２４３７）；Ｂｅｔ  ｖ  １．１７０１（Ｚ７２４３０）；Ｂｅｔ  ｖ  １．１８０１（Ｚ７２４３１）；Ｂｅｔ  ｖ  １．１９０１（Ｚ７２４３３）；Ｂｅｔ  ｖ  １．２００１（Ｚ７２４３４）；Ｂｅｔ  ｖ  １．２１０１（Ｚ７２４３５）；Ｂｅｔ  ｖ  １．２２０１（Ｚ７２４３８）；Ｂｅｔ  ｖ  １．２３０１（Ｚ７２４３６）；Ｂｅｔ  ｖ  １．２４０１（Ｚ８０１００）；Ｂｅｔ  ｖ  １．２５０１（Ｚ８０１０１）；Ｂｅｔ  ｖ  １．２６０１（Ｚ８０１０２）；Ｂｅｔ  ｖ  １．２７０１（Ｚ８０１０３）；Ｂｅｔ  ｖ  １．２９０１（Ｚ８０１０５）；Ｂｅｔ  ｖ  １．３００１（Ｚ８０１０６）；Ａｌｎ  ｇ  １（Ｓ５０８９２）；Ｃａｒ  ｂ  １，特にＣａｒ  ｂ  １．０３０１（Ｚ８０１６９），Ｃａｒ  ｂ  １．０３０２（Ｚ８０１７０），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０３（Ｚ８０１５９），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０５（Ｚ８０１６１），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０４（Ｚ８０１６０），Ｃａｒ  ｂ  １／１ａ，Ｃａｒ  ｂ  １．０１０１（Ｘ６６９３２），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０２（Ｘ６６９１８），Ｃａｒ  ｂ  １／１ｂ，Ｃａｒ  ｂ  １／２，Ｃａｒ  ｂ  １．０１０６ａ（Ｚ８０１６２），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０６ｂ（Ｚ８０１６３），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０６ｃ（Ｚ８０１６４），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０６ｄ（Ｚ８０１６５），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０７ａ（Ｚ８０１６６），Ｃａｒ  ｂ  １．０１０７ｂ（Ｚ８０１６７），Ｃａｒ  ｂ  １．０２０１（Ｘ６６９３３）またはＣａｒ  ｂ  １．０１０８（Ｚ８０１６８）；Ｇｌｙ  ｍ  ４．０１０１（Ｘ６００４３）；Ｖｉｇ  ｒ  １．０１０１（ＡＹ７９２９５６）；Ａｒａ  ｈ  ８．０１０１（ＡＹ３２８０８８）；Ａｓｐ  ａｏ  ＰＲ１０（Ｘ６２１０３）；Ｂｅｔ  ｐ  １ａ（ＡＢ０４６５４０）；Ｂｅｔ  ｐ  １ｂ（ＡＢ０４６５４１）；Ｂｅｔ  ｐ  １ｃ（ＡＢ０４６５４２）；Ｆａｇ  ｓ  １（ＡＪ１３０８８９）；Ｃａｐ  ｃｈ  １７ｋＤ  ａ（ＡＪ８７９１１５）；Ｃａｐ  ｃｈ  １７ｋＤ  ｂ（ＡＪ８７８８７１）；Ｆｒａ  ａ  １．０１０１（ＡＹ６７９６０１）；およびＴａｒ  ｏ  １８ｋＤ（ＡＦ０３６９３１）。
【００２８】
特に、Ｍａｌ  ｄ  １（配列番号２）が好ましい。
【００２９】
本発明の好適な実施の形態によれば、少なくとも４つのアミノ酸残基の上記少なくとも１つの変異は、アミノ酸の置換、欠失、または付加である。
【００３０】
アレルゲン内の上記少なくとも４つのアミノ酸残基の変異はいかなる種の変異であってもよい。しかしながら、単一アミノ酸残基または分子内における一続きのアミノ酸残基を置換することが好ましい。なぜなら、こうすることで、Ｂｅｔ  ｖ  １ａと比べて低アレルギー性分子の長さが全く影響を受けないからである。
【００３１】
本発明の好適な実施の形態によれば、Ｂｅｔ  ｖ  １ａの変異領域またはこれに対応するＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンの領域は、Ｂｅｔ  ｖ  １ａまたはこれに対応するＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンの領域のアミノ酸１０５〜１２０、好ましくはアミノ酸１０８〜１１８、より好ましくは、アミノ酸１０９〜１１６を含む。
【００３２】
本発明の好適な実施の形態によれば、上記少なくとも１つの変異が、上記領域とＢｅｔ  ｖ  １ａおよびＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンからなる群より選択された別のアレルゲンの対応する領域とが置換されることを含む。
【００３３】
上記領域を置換することによって、Ｂｅｔ  ｖ  １ａもしくはＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンのＴ細胞エピトープを備える低アレルギー性分子が生成できるだけでなく、潜在的に特定のＢｅｔ  ｖ  １ａエピトープまたはＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンのエピトープを備える分子を生成することができる。このことで、花粉関連食物アレルギーを患っているまたは患うリスクのある個人に、前記低アレルギー性分子を含む、１つのアレルゲンだけではなく２つ目のアレルゲンに対しても免疫反応を引き起こすワクチンを投与することができる。
【００３４】
本発明の他の好適な実施の形態によれば、分子はＢｅｔ  ｖ  １からなり、Ｂｅｔ  ｖ  １のアミノ酸１０９〜１１６の領域がＭａｌ  ｄ  １の対応する領域と置換される（結果として、配列番号３を得る）。
【００３５】
本発明の特定の好適な実施形態によれば、上記分子はＭａｌ  ｄ  １からなり、Ｍａｌ  ｄ  １のアミノ酸１０９〜１１６の領域はこれに対応するＢｅｔ  ｖ  １の領域と置換されている。
【００３６】
Ｂｅｔ  ｖ  １ａまたはＢｅｔ  ｖ  １ａと少なくとも４０％の同一性を有するアレルゲンは、前記定義された領域の少なくとも一部を、異なるアレルゲンに由来する、置換される領域と同一領域のアミノ酸断片で置換することによって変性してもよい。
【００３７】
本発明の他の様態は、本発明に係る低アレルギー性分子をコードするための核酸分子に関する。
【００３８】
本発明のさらなる様態は、本発明に係る核酸分子を含有するベクターに関する。
【００３９】
本発明のベクターは、本発明の低アレルギー性分子をコードする核酸断片と、原核性（例えば、細菌）生物内で増殖しうるベクター要素を含んでいる。このベクターは、プロモーター、転写結合部位等の機能的ポリヌクレオチド配列を有する。このベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであってもよい。
【００４０】
低アレルギー性分子の精製を容易にするために、上記分子は、タグ、特にヒスチジンまたはグルタチオンＳトランスフェラーゼに融合されていてもよい。したがって、公知の好適な発現ベクターを用いてもよい。
【００４１】
本発明の他の様態は、本発明に係る低アレルギー性分子を含有するワクチン製剤に関する。
【００４２】
本発明の好適な実施の形態によれば、上記製剤はさらに少なくとも１つの薬学的に使用可能な、賦形剤類、希釈剤類、アジュバント類および／またはキャリア類を含有する。
【００４３】
個人の皮下、筋肉、静脈、粘膜等に投与されるワクチン製剤を提供するには、その製剤はさらに賦形剤類、希釈剤類、アジュバント類および／またはキャリア類を含む必要がある。アジュバント類としては、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）およびミョウバンを用いるのが好ましい。ワクチン製造のプロトコルとしては、当業者に公知のものを好適に用いることができる。例えば、非特許文献１５に記載されているプロトコルなどを用いることができる。
【００４４】
本発明の他の様態は、アレルギー予防および／または治療用ワクチンの製造するために本発明に係る低アレルギー性分子を使用する方法に関する。
【００４５】
本発明の低アレルギー性分子は、アレルギーの治療および予防、特に花粉症を患う患者がさらに食物アレルギーを経験する（例えば口腔周りにおける痒みや掻痒症から一般的な蕁麻疹そしてさらにアナフィラキシーまで引き起こす場合がある）ｐｏｌｌｅｎ−ｆｏｏｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅと関連したアレルギーの治療および予防に用いることができる。
【００４６】
Ｐｏｌｌｅｎ−ｆｏｏｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅでは、花粉に存在するアレルゲンを個人が吸入することで、個人が感作される。その後、個人が感作アレルゲンと交差反応を起こしうるタンパク質を含む植物由来の食品と接触することで、即時性病徴が引き起こされ始める。経口感作が終了すると、個人が同じタンパク質と接触するたびにアレルギー症状が引き起こされる。
【００４７】
Ｂｅｔ  ｖ  １ａは非常に交差反応を起こしやすいアレルゲンであり、多数の食物由来のアレルゲンと交差反応を起こしやすい。特に、野菜や果物に由来するものが交差反応を起こしやすい。したがって、Ｂｅｔ  ｖ  １ａを原因とする花粉アレルギーを患う患者は、食物由来アレルギーに対してもアレルギー性を有している可能性がある。
【００４８】
本発明は以下の図面および実施例を参照してさらに説明する。ただし、本発明はこれらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１ａ】１６０アミノ酸長（開始メチオニンを含む）の変異アレルゲンＢＭ１，２，３，５の概略図である。タンパク質は、テンプレートアレルゲンＢｅｔ  ｖ  １ａに７つの連続するアミノ酸を有するＭａｌ  ｄ  １．０１０８のエピトープを接いで構成されている。Ｂｅｔ  ｖ  １ａのアミノ酸と一致する一続きは白色で示し、Ｍａｌ  ｄ  １．０１０８から挿入されたエピトープは灰色で示している。交換されたエピトープを構成するアミノ酸は、１文字コードで列挙されている。両方のタンパク質で同一の残基は黒色で示し、異なるアミノ酸は灰色で示している。
【図１ｂ】ＢＭ１，２，３，５モデルを算出し、その構造をＢｅｔ  ｖ  １の三次元折り畳み構造と比較した図である。ＢＭ１，２，３，５とＢｅｔ  ｖ  １ａとで同一の残基は灰色で示し、Ｍａｌ  ｄ  １．０１０８に由来するエピトープは黒色で表している。下側のパネルは、タンパク質を１８０°Ｃ回転させて示している。
【図１ｃ】ＢＭ１，２，３，５の二次構造とＢｅｔ  ｖ  １とを円偏光二色性（ＣＤ）で比べた図である。データは、特定の波長および基準線補正された平均残差モル楕円率［θ］ＭＲＷとして示している。
【図２ａ】アフィニティー精製されたＢＭ１，２，３，５（各レーンにそれぞれ５μｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット分析を示す図である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、タンパク質をクーマシーブリリアントブルー染色（左パネル）によって可視化した。免疫ブロット分析では、マウス抗Ｂｅｔ  ｖ  １  モノクローナル抗体を用いてタンパク質を検出した。
【図２ｂ】ＥＬＩＳＡを用いて、Ｂｅｔ  ｖ  １ａ、Ｍａｌ  ｄ  １．０１０８およびＢＭ１，２，３，５のＩｇＥ結合活性を、ＰＦＳの臨床症状のないＢｅｔ  ｖ  １アレルギー患者（ｎ＝１２）またはリンゴおよび他のＢｅｔ  ｖ  １関連食品に対してＰＦＳ症状のあるＢｅｔ  ｖ  １  アレルギー患者（ｎ＝１１）の血清を用いて、分析を行った。アレルゲンはコーティングするために滴定され、最適な抗原コーティング濃度を０．５ｍｇ／ｍｌに決定した。Ｂｅｔ  ｖ  １（Ｐ＞０．９９）とのＩｇＥ結合に関しては、両グループの患者の間で著しい違いは観察されなかった。予想通り、Ｍａｌ  ｄ  １とのＩｇＥ結合は、ＰＦＳグループの方がより強固だった。ＰＦＳを患う変異ＢＭ１，２，３，５の患者では、ＩｇＥ結合が著しく増加した（Ｐ＜０．０１）。記号は、それぞれ個々の患者を表し、線は平均を表す。Ｐ値はｔテストによって算出した（＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図３】実施例２に係る変異アレルゲンＢＭ４の概略図である。
【図４】Ｂｅｔ  ｖ  １ａおよびＢＭ４のｃｌｕｓｔａｌＷアライメントを示す図である。下線部はＢＭ４の交換されたエピトープを示し、斜体太字はＢｅｔ  ｖ  １ａの免疫優勢Ｔ細胞エピトープを示している。太字のアミノ酸は、エピトープ交換の「コア」を示し、患者のＢｅｔ  ｖ  １のＩｇＥ結合にとって必要不可欠なアミノ酸である。
【図５】Ｍａｌ  ｄ  １．０１０８およびＢＭ４のｃｌｕｓｔａｌＷアライメントを示す図である。下線部はＢＭ４の交換されたエピトープを示している。太字のアミノ酸はエピトープ交換の「コア」を示し、患者のＢｅｔ  ｖ  １のＩｇＥ結合にとって必要不可欠なアミノ酸である。
【図６】ＢＭ４のＳＤＳ−Ｐａｇｅを示す図である。
【図７】Ｂｅｔ  ｖ  １ａのＣＤスペクトルをＢＭ４の２０℃および９５℃でのＣＤスペクトルと比較して示す図である。全ての曲線は基準線補正がされている。データは平均残差モル楕円率で示している。タンパク質濃度は、アミノ酸分析によって決定された。ＢＭ４は２０℃だけではなく９５℃においても、ランダムコイルタンパク質の典型的なＣＤスペクトルを示した。
【図８】Ｂｅｔ  ｖ  １ａ（Ｂｉｏｍａｙ）、ＢＭ４、および卵白アルブミンのＥＬＩＳＡを示す図である。卵白アルブミンは関連性のないコントロール抗原として、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。アレルゲン（２００ｎｇ／ウェル）は固定化された。全ての計測を重複して行い、結果はバックグラウンド除去後の平均ＯＤ値として算出した。シラカンバ花粉アレルギーを患う１３個人の血清を検査した。コントロールとしては、いかなるタンパク質にも信号を示さなかったＮＨＳを用いた。ＢＭ４はＥＬＩＳＡにおいて、仮想的には患者のＩｇＥ結合を全く示さない。
【図９】シラカンバ花粉アレルギー患者の血清ＩｇＥを用いて、ｈｕＦｃεＲＩを形質移入したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を感作させて判定したＢＭ４アレルギー活性を示す図である。ＢＭ４は、Ｂｅｔ  ｖ  １ａと比べて、１００倍−１０００倍少ないアナフィラキシー活性を示した。
【図１０】シラカンバ花粉アレルギーの患者の末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣ）を、６ｘｈｉｓにてタグ化されたＢＭ４またはＢｅｔ  ｖ  １ａを、２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌもしくは３μｇ／ｍｌ用いて判定したものを示す図である。ＢＭ４の平均刺激指数（ＳＩ）は、Ｂｅｔ  ｖ  １ａの平均刺激指数よりも高かった。図中の各記号は各患者のそれぞれを示し、各バーは各患者の平均を示している。
【図１１】ＰＤＢタンパク質データバンクから入手したＢｅｔ  ｖ  １（１ｂｖ１）の配列を示す図である。図中のボックス内「□」は変異タンパク質ＢＭ４で置換された配列領域を示している。
【図１２】変異タンパク質ＢＭ４において置換された配列領域を示す図である。患者の４１％で観察されたＢｅｔ  ｖ  １の関連Ｔ細胞エピトープ（ＳＩＬＫＩＳＮＫＹＨＴＫ；配列番号４）を斜体太字で示している。これの１つ前のペプチド（ＤＧＧＳＩＬＫＩＳＮＫ；配列番号５）は患者の６％、後のペプチド（ＫＩＳＮＫＹＨＴＫＧＤＨ；配列番号６）は患者のいずれにも観察されなかった。ＰＢＭＣデータは、今までのところ、低下どころかむしろよりよいＴ細胞刺激を示している。したがって、ＢＭ４のＴ細胞刺激特性に関して問題が発生するとは考えにくい。
【図１３】Ｂｅｔ  ｖ  １、およびアイソフォームを含む果物、ナッツまたは野菜といった他の花粉源から見つかるＢｅｔ  ｖ  １の異種同形アレルゲンのＣｌｕｓｔａｌＷ多重整列を示す図である。Ｂｅｔ  ｖ  １ａにおいて置換されたエピトープは、ＢＭ４のＭａｌ  ｄ  １．０１０８の１つと置換されている。
【図１４】Ｍａｌ  ｄ  １．０１０８のエピトープが移植された様々なＢｅｔ  ｖ  １ａ変異の混合スコア（Ｚスコア）を算出したものを示す図である。したがって、Ｍａｌ  ｄ  １．０１０８の重複している非配列同一なひと続きの配列（１０ａａ；ｎ＝１０３）をＢｅｔ  ｖ  １ａ構造に置換し、ソフトウェアツールＰｒｏＳａ  ＩＩを用いてＺスコアを算出した。このソフトウェアは、公知のタンパク質構造に由来する、既知ポテンシャルを用いて、ネイティブな球形タンパク質の平均特性について、タンパク質構造の質を反映したスコアを得るべく、原子対および溶媒相互作用の観点から捕捉する（非特許文献１６）。算出結果から、Ｂｅｔ  ｖ  １ａにＭａｌ  ｄ  １．０１０８のアミノ酸１０９〜１１６（ＳＧＳＴＩＫＳＩ；配列番号７）をエピトープ置換することが、高Ｚスコアを示す最も不安定な置換の１つであることが分かった。このことにより、タンパク質構造において、同一アレルゲンＢＭ４の折り畳まれていない構造の原因が分かった。
【図１５】各変異アレルゲンＢＭ１、ＢＭ２、ＢＭ３、ＢＭ４、ＢＭ５、ＢＭ１，２，３，４，５およびＢＭ１，２，３，５を概略的に示す図である。これらアレルゲンは、Ｍａｌ  ｄ  １．０１０８からＢｅｔ  ｖ  １ａの骨格にエピトープ移植をすることで生成された。移植されたエピトープ配列は図に示しているとおりであり、Ｂｅｔ  ｖ  １ａと同一のアミノ酸は黒で示し、下線部はＭａｌ  ｄ  １．０１０８から挿入されたアミノ酸を示している。各変異アレルゲンは大腸菌に発現した。異なる各変異アレルゲンのＢｅｔ  ｖ  １のような折り畳み構造は、ドットブロットの抗体結合または精製されたアレルゲンの円偏光二色性分光法によって分析した。Ｍａｌ  ｄ  １．０１０８のエピトープ１０９〜１１６（ＳＧＳＴＩＫＳＩ；配列番号７）を有する各変異アレルゲンはＢｅｔ  ｖ  １のような折り畳み構造を有していない。しかしながら、Ｍａｌ  ｄ  １．０１０８の他のエピトープを有する変異アレルゲンは、Ｂｅｔ  ｖ  １のように折り畳み構造を得られた。
【図１６】ＥＬＩＳＡ阻害によって分析した、野生型Ｂｅｔ  ｖ  １ａと比較した、Ｂｅｔ  ｖ  １特異的患者のＩｇＥを結合するＢＭ４の能力の低下を示す図である。Ｂｅｔ  ｖ  １ａをＥＬＩＳＡプレートにウェルごとに２００ｎｇ固定化し、阻害剤（例えば、非関連コントロール抗原として、Ｂｅｔ  ｖ  １ａ、ＢＭ４または卵白アルブミン（ＯＶＡ））の順次希釈にて患者の血清を培養した。全ての計測は複数行われ、バックグラウンド除去の後、結果を平均ＯＤ値として示した。シラカンバ花粉アレルギーの５個人の血清をテストした。コントロールとして、いずれのタンパク質にも反応を示さないＮＨＳを用いた。Ｂｅｔ  ｖ  １ａと比べて、ＢＭ４はおよそ１００倍−１０００倍低い患者のＩｇＥ結合能を示した。
【図１７】非関連コントロール抗原として用いられるＢＭ４、Ｂｅｔ  ｖ  １ａおよびＯＶＡの免疫ブロットを示している。結合血清ＩｇＥを、Ｉ125標識ウサギ抗ヒトＩｇＥ（ＭｅｄＰｒｏ）を用いて検出した。ＢＭ４はほとんどＩｇＥ結合を示さなかった。コントロールとして、健常なヒト血清または検出抗体のみを用いた。
【図１８ａ−１】ＵＶおよびトリプル検出器システムを用いたオンラインＳＥＣ光拡散法（ＳＥＣＴＤＡ）にてＢＭ４の均質性を評価した。ＢＭ４は、保持容量が９．３ｍｌ、ＭＷがおよそ２０ｋダルトン、そしてＲＨが＞３．２ｎｍを有する単一ピークを有するように示された。観察されたピークの尾行は、折り畳まれていないタンパク質の引き伸ばされた立体構造による吸着効果および高ＲHによるものである可能性がある。
【図１８ａ−２】検出器は、ＭＷが６６ｋダルトンでＲHが３．１ｎｍのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で調節された結果を示す。
【図１８ａ−３】ＭＷが１７ｋダルトンでＲHが１．９ｎｍのｒＢｅｔ  ｖ  １ａを用いて、システム適性を確認した結果を示す。
【図１８ｂ−１】ＳＥＣのボイド（５．７ｍｌ）および合計保持容量（１２ｍｌ）の間でさらなるピークが検出されなかったため、非凝集化されたＢＭ４において９９％を超える均質性が観察されたことを示している。ＨＰ１１００分析クロマトグラフィーシステム（ヒューレット・パッカード、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、米国）において７．８ｘ３００ｍｍＴＳＫゲルＧ２０００SWXLカラム(トーソー・バイオサイエンス、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、ドイツ)を用いて、ＰＢＳにて０．５ｍｌ／分でＨＰＳＥＣを行った。２８０ｎｍで測定する内臓ＵＶ検出器、および屈折率（ＲＩ、破線）、固有粘度（ＩＶ、一点長鎖線）、および光散乱（ＲＡＬＳ、長鎖線）検出システム（ＴＤＡ  ３０２、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、米国）を組み合わせて、近似分子量（ＭＷ、太線）および流体力学半径（ＲＨ、二点長鎖線）を算出した。図１８ｂ−１では、光散乱（ＲＡＬＳ）検出および屈折率（ＲＩ）検出の各結果を示す。
【図１８ｂ−２】上記検出における、ＵＶ検出および固有粘度（ＩＶ）検出の各結果を示す。
【図１９ａ】動的光散乱（ＤＬＳ）によるＢＭ４の溶液内凝集挙動を示す図である。ＢＭ４の９７％を超えるものにおいて、流体力学半径（ＲＨ）が３．５ｎｍ、多分散度が１８．４％の単量体分子であることが示された（図１９（ａ））。参考までに、ｒＢｅｔ  ｖ  １ａはＲＨが２．１ｎｍ、多分散度が１６．７％であった（図１９（ｂ））。したがって、ＢＭ４は、おそらくは折り畳まれていない構造であるがゆえに、より高いＲHとなっている。そのほか、３％未満のＢＭ４が、分子量＞１Ｍダルトンのマルチマーとして示された。リン酸ナトリウム１０ｍＭ内において１４，０００×ｇで１０分間、遠心分離した後、ＤＬＳ  ８０２（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、米国）を用いて動的光散乱を行った。この際、水用の溶媒設定を用いた。１０〜２０×１０秒のデータを累積し、組み合わせたデータ曲線に相関関数を当てはめた。ＯｍｎｉＳｉｚｅTMソフトウェアパッケージ（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）は、この相関関数を用いて質量分布を算出した。
【図１９ｂ】参考として、ｒＢｅｔ  ｖ  １ａはＲＨが２．１ｎｍ、多分散度が１６．７％であることを示す。
【図２０】精製された組換えＢｅｔ  ｖ  １，ＢＭ４，Ｍａｌ  ｄ  １，Ｄａｕ  ｃ  １，Ａｐｉ  ｇ  １，Ｃｏｒ  ａ  １，シロイヌナズナＰＲ−１０タンパク質、サーマス・サーモフィラスＰＲ−１０タンパク質、およびＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉＰＲ−１０タンパク質（各レーンに３μｇずつ）にＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理を施し、クーマシーブルーで染色した（ａ）。（ｂ）は、ＢＭ４と相同タンパク質の交差反応を実証するべく、ウサギ抗Ｂｅｔ  ｖ  １ポリクローナル抗体（１：５０００）を用いてＥＬＩＳＡを行ったものである。組換えＢｅｔ  ｖ  １、ＢＭ４およびＣｏｒ  ａ  １はウサギ抗体によって広範に認識され、Ｄａｕ  ｃ  １，Ｍａｌ  ｄ  １，およびＡｐｉ  ｇ  １は構造的交差反応も示した。シロイヌナズナ、サーマス・サーモフィラス、およびメタノサルシナ・マゼイから精製されたＰＲ−１０タンパク質からはポジティブ信号は得られなかった。（ｃ）は、ＢＭ４と比較したＰＲ−１０タンパク質の配列同一性を示している。アミノ酸配列および同一性プロットはＡｌｉｇｎＸ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ，インビトロジェン）によって行った。
【図２１】各変異アレルゲンＭＢ１、ＭＢ２、ＭＢ３、ＭＢ４、ＭＢ５およびＭＢ１，２，３，４，５を概略的に示す図である。アレルゲンはＭａｌ  ｄ  １．０１０８の骨格にＢｅｔ  ｖ  １ａのエピトープを移植することで生成された。移植エピトープ配列は図に示しており、Ｍａｌ  ｄ  １．０１０８と同一のアミノ酸は黒色、Ｂｅｔ  ｖ  １ａから挿入されたアミノ酸は灰色で示している。各変異アレルゲンは大腸菌において発現された。Ｂｅｔ  ｖ  １および食料源だけでなく他の花粉で見つかる相同物の折り畳み構造は、Ｘ線結晶解析の結果、非常に類似していることが分かった（非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９）。この共通の折り畳み構造によって、よい抗体交差反応結果が得られる。したがって、異なるＭａｌ  ｄ  １．０１０８変異アレルゲンにおけるＢｅｔ  ｖ  １のような折り畳み構造の有無を、Ｍａｌ  ｄ  １と交差反応することが示されたシラカンバ花粉アレルギー患者の血清またはアフィニティー精製されたウサギ抗Ｂｅｔ  ｖ  １ポリクローナル抗体を用いて、ドットブロット内の抗体結合性を基に評定した。これらの免疫ブロットの結果、Ｂｅｔ  ｖ  １ａのエピトープ１０９−１１６（ＤＧＧＳＩＬＫＩ）を有する変異アレルゲンはＢｅｔ  ｖ  １のような折り畳み構造を有さないことがわかった。しかしながら、Ｂｅｔ  ｖ  １ａの他のエピトープを有する変異アレルゲンは、Ｂｅｔ  ｖ  １のように折り畳むことができた。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００５０】
Ｐｏｌｌｅｎ−ｆｏｏｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＰＦＳ）とは、花粉アレルギーを患う患者に関連する、果物類、ナッツ類、および野菜類に対する食物アレルギーである。主要なリンゴアレルゲンであるＭａｌ  ｄ  １は、ＰＦＳを患うシラカンバ花粉アレルギー患者が最も一般的に関連している食物アレルゲンの一つである。免疫学的には、このアレルギーは、シラカンバ花粉アレルゲンのＢｅｔ  ｖ  １に対して元々発生した交差反応を起こしうるＩｇＥ抗体に起因している。
【００５１】
Ｂｅｔ  ｖ  １に特異的なＩｇＥ抗体がＭａｌ  ｄ  １と交差反応しうるとはいえ、全てのＢｅｔ  ｖ  １アレルギー患者がリンゴに対して発症反応を起こすわけではない。このことによって、両方の同種アレルゲンに存在する特定のＩｇＥエピトープがＰＦＳの発症の発現を起こしていることがわかる。このことを分析するために、４つのＭａｌ  ｄ  １のひと続きをＢｅｔ  ｖ  １に移植した。移植された領域は、７アミノ酸長であり、Ｂｅｔ  ｖ  １のＩｇＥ認識に必要不可欠なアミノ酸残基を含んでいる。
【００５２】
Ｂｅｔ  ｖ  １−Ｍａｌ  ｄ  １のキメラタンパクから設計されたＢＭ１，２，３，５を大腸菌において発現させ、均質性を有するように精製した。ＢＭ１，２，３，５は、（ｉ）リンゴの摂取時に発症症状を示さないＢｅｔ  ｖ  １アレルギー患者の血清および（ｉｉ）リンゴおよび他のＢｅｔ  ｖ  １関連食品の摂取時にアレルギー症状を示すＢｅｔ  ｖ  １アレルギー患者の血清に対してテストされた。患者のＩｇＥ結合を、ＥＬＩＳＡで評価した。
【００５３】
ＢＭ１，２，３，５に対して、ＰＦＳを患う患者はシラカンバアレルギーのみを患う個人に比べてより強く反応を示した。このことで、リンゴアレルギーと関連のあるＢｅｔ  ｖ  １のＢ細胞エピトープの識別に成功した。
【００５４】
各方法
患者の血清：
ＰＦＳを患っている、およびＰＦＳを患っていないシラカンバ花粉アレルギー患者を、典型的な病歴、陽性皮膚プリックテストおよび放射性アレルギー吸着試験（ＲＡＳＴ）のクラス３以上によって選択した。相対的なＢｅｔ  ｖ  １およびＭａｌ  ｄ  １とのＩｇＥ結合と臨床症状との相互関係を、両方の患者グループに対して、対応する抗原を用いてＥＬＩＳＡで確認した。
【００５５】
ＢＭ１，２，３，５のクローニング
ＢＭ１，２，３，５を、Ｂｅｔ  ｖ  １ａ（Ｘ１５８７７）の変異断片をＰＣＲ増幅することによって生成した。クローニングに用いられたｉｎｔｅｒｎａｌ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｐｒｉｍｅｒは：
Ｍｕｔ１０Ｆ  ５’ＣＧＣＣＡＴＴＧＴＴＴＴＣＡＡＴＴＡＣＧＡＡＡａＴＧＡＧｔｔＣＡＣＣＴＣＴＧａｇＡＴＣ３’（配列番号８），
Ｍｕｔ３０Ｆ  ５’ＧＡＴＧＧＣＧＡＴＡＡＴＣＴＣａＴＴＣＣＡＡＡＧａＴＴＧＣＡＣＣＣＣＡＡ３’（配列番号９），
Ｍｕｔ３０Ｒ  ５’ＡＴＧＧＣＴＴＧＧＧＧＴＧＣＡＡｔＣＴＴＴＧＧＡＡｔＧＡＧＡＴＴＡＴＣＧ３’（配列番号１０），
Ｍｕｔ５７Ｆ  ５’ＡＴＴＡＡＧＡＡＧＡＴＣＡｃＣＴＴＴｇｇＣＧＡＡＧＧＣＴＴＣ３’（配列番号１１），
Ｍｕｔ５７Ｒ  ５’ＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧｃｃＡＡＡＧｇＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＡＡＴ３’（配列番号１２），
Ｍｕｔ１２５Ｆ  ５’ＣＡＣＡＣＣＡＡＡＧＧＴａＡＣａｔＴＧＡＧａＴｃＡＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧ３’（配列番号１３），
Ｍｕｔ１２５Ｒ  ５’ＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＴＴｇＡｔＣＴＣＡａｔＧＴｔＡＣＣＴＴＴＧＧＴＧＴＧ３’（配列番号１４）であった。
【００５６】
交換された塩基は小文字で表している。変異断片はゲル精製され、プライマーなしのＰＣＲにプールさせて組み上げられた。完全長遺伝子は、各プライマーである、ＢｅｔＦ  ５’ＧＧＣＣＣＡＴＡＴＧＧＧＴＧＴＴＴＴＣＡＡＴＴＡＣＧＡＡ３’（配列番号１５）およびＢｅｔＲ  ５’ＴＣＧＧＣＴＣＧＡＧＧＴＴＧＴＡＧＧＣＡＴＣＧＧＡＧＴＧ３’（配列番号１６）にて増幅された。各制限部位は下線により示された。ＢＭ１，２，３，５は、Ｎｄｅ  Ｉ制限部位およびＸｈｏ  Ｉ制限部位を用いて、ｐＨｉｓ−Ｐａｒａｌｌｅｌ２ベクターにクローニングされた（非特許文献２０を参照下さい）。
【００５７】
ＢＭ４の発現および精製
発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にて形質転換し、上記大腸菌を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを補充したＬＢ培地内において、３７℃にて、ＯＤ６００が０．８となるまで成育した。培地を１６℃まで冷却し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．３ｍＭ加えることでタンパク質発現を引き起こした。１８時間培養した後、低速度遠心分離で細胞を取り出し、適切なｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した。ＢＭ１，２，３，５は６ｘＨｉｓＴａｇ融合タンパク質で発現し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、可溶細菌溶解物から精製された（非特許文献２０）。組換えタンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）で透析し、−２０℃で保管した。
【００５８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット
大腸菌溶解物および精製されたタンパク質を、１５％ゲルを用いる、変性したドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。タンパク質は、クーマシープリリアントブルーＲ−２５０（Ｂｉｏｒａｄ）で染色して可視化された。
【００５９】
免疫ブロット分析のため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質をニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）にて電気ブロットした。タンパク質は、モノクローナルＢｅｔ  ｖ  １抗体ＢＩＰ−１（１：１０．０００）を用いて検出した（非特許文献１）。結合ＢＩＰ−１は、ＡＰ共役ウサギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）により検出された。
【００６０】
円偏光二色性
タンパク質の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは、Ｎｅｓｌａｂ  ＲＴＥ−１１１Ｍ温度コントロールシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｎｅｓｌａｂ社）が取り付けられたＪＡＳＣＯ  Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ）を用い、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）にて記録された。得られた曲線は、基準線（ベースライン）が補正された。補正された結果を所定波長における平均残差モル楕円率［θ］ＭＲＷとして示した。ＣＤシグナルを正規化するためのタンパク質濃度はＯＤ２８０にて判定された。
【００６１】
分子モデリング
モデリングは、比較モデリングツールＭＯＤＥＬＬＥＲを用いて行い、ＰｒｏＳａ２００３によって評価された。全てのモデルはＰＤＢ構造ファイル１ｂｖ１（Ｂｅｔ  ｖ  １）に基づき、ＰｙＭＯＬ０．９８を用いて示された。
【００６２】
ＥＬＩＳＡ実験
ＩｇＥのＥＬＩＳＡ実験を行うべく、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）は、ウェル毎に、ＰＢＳ５０μｌ中のアレルゲンを滴定し、４℃で１晩おいてコートされた。プレートは、ＴＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡにてブロックされ、１：５で希釈した患者の血清で１晩、４℃にてインキュベートされた。３７℃で１時間、４℃で１時間インキュベートした後、結合ＩｇＥをアルカリンホスファターゼで共役した抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で検出した。
【００６３】
あるいは、Ｂｅｔ  ｖ  １および相同タンパク質は、ウェル毎にＰＢＳ５０μｌにおいて、４μｇ／ｍｌの濃度にて１晩、４℃でコートされた。Ｂｅｔ  ｖ  １および相同タンパク質は、上記アレルゲンと同様にブロックされ、様々な希釈度（１：５．０００−１：２０．０００）のウサギ抗ｒＢｅｔ  ｖ  １ポリクローナル抗体にてインキュベートされた。検出はアルカリンホスファターゼ共役ヤギ抗ウサギ抗体を用いて行った。１０ｍＭの４−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を基質として用いて、ＯＤを４０５ｎｍ／４９２ｎｍで計測した。測定は、３回の繰り返し（ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ）または２回の繰り返し（ウサギ抗Ｂｅｔ  ｖ  １抗体）にて行った。結果は平均ＯＤ値で示した。
【００６４】
結果
本実施例の目的は、リンゴに対するＢｅｔ  ｖ  １関連ＰＦＳの発症症状の原因となる、交差反応を起こしうるＢ細胞エピトープの識別である。したがって、変異アレルゲンＢＭ１，２，３，５は、Ｍａｌ  ｄ  １．０１０８の特定のエピトープを、Ｂｅｔ  ｖ  １ａ配列の対応する位置に移植することで設計される（図１Ａ）。
【００６５】
移植された領域は、Ｂｅｔ  ｖ  １および相同物のＩｇＥ認識に必要不可欠と既に説明されている残基を含む７つ連続するアミノ酸として定義されている。これらの特定の残基（Ｂｅｔ  ｖ  １ａ内のＴｈｒ１０，Ｐｈｅ３０，Ｓｅｒ５７，およびＡｓｐ１２５）は、Ｂｅｔ  ｖ  １へのＩｇＥ結合を変化させるだけでなく、Ｍａｌ  ｄ  １のＩｇＥ認識も、その対応する位置のアミノ酸に非常に大きく依存している。
【００６６】
記載部位での特定変異の導入は、円偏光二色性（ＣＤ）によって示されるようにアレルゲンの全体構造を変えるものではないが、分子のアレルゲン性に大きく影響する可能性がある。ＢＭ１，２，３，５に対する患者のＩｇＥ結合を調べることで、移植されたエピトープはＢｅｔ  ｖ  １およびＭａｌ  ｄ  １の交差反応の指標となる。
【００６７】
Ｂｅｔ  ｖ  １のＩｇＥエピトープが立体配座であるため、ハイブリッドの完全な構造が重要であった。ＢＭ１，２，３，５の三次元折り畳み構造は、まず、分子モデルを算出し、その後、Ｂｅｔ  ｖ  １の３Ｄ画像と比べることで評価された。モデルは、テンプレートアレルゲンと同様の保存形状を示した。
【００６８】
４つの変異エピトープの全てをタンパク質表面に曝すことによって、ＢＭ１，２，３，５への抗体結合に影響を与えることができた（図１Ｂ）。算出されたアレルゲンは、クローニングされ、６ｘＨｉｓＴａｇ融合タンパク質として大腸菌内にて発現され、均質性を有するように精製された。
【００６９】
コンピュータ内でタンパク質構造のデータを確認するべく、ＢＭ１，２，３，５およびＢｅｔ  ｖ  １ａの遠紫外線ＣＤスペクトルをそれぞれ記録し、信号を［θ］ＭＲＷ単位に正規化させた後にＢＭ１，２，３，５およびＢｅｔ  ｖ  １ａの各タンパク質構造のデータを比較した。両スペクトルのオーバーレイは、ほとんど同一の二次構造を示した（図１Ｃ）。
【００７０】
抗Ｂｅｔ  ｖ  １モノクローナル抗体を抗体結合することで、同様の折り畳み構造のさらなる徴候が現われた。この抗体結合で、両タンパク質において同様にＢＭ１，２，３，５のＢｅｔ  ｖ  １のような折り畳み構造を示した（図２Ａ）。
【００７１】
ＢＭ１，２，３，５のＩｇＥ抗体結合を調べるため、２つのグループの患者：（ｉ）ＰＦＳを患っていないＢｅｔ  ｖ  １アレルギー患者および（ｉｉ）リンゴの摂取後にＰＦＳ症状を示すＢｅｔ  ｖ  １アレルギー患者に対してＥＬＩＳＡ実験を行った。なお、アレルゲンとしては、Ｂｅｔ  ｖ  １ａアレルゲンおよびＭａｌ  ｄ  １．０１０８アレルゲンを用いた。
【００７２】
２つのグループのいずれにおいても、Ｂｅｔ  ｖ  １（Ｐ＞０．９９）に対する患者のＩｇＥ結合では大きな違いが観察できなかった。Ｍａｌ  ｄ  １．０１０８に対するＩｇＥ結合では、非ＰＦＳ患者に比べてＰＦＳグループの方が強いＩｇＥ結合を観察したが、後者グループはＥＬＩＳＡでも主要リンゴアレルゲンを認識した。
【００７３】
しかしながら、ＢＭ１，２，３，５に対するＩｇＥ結合は、ＰＦＳを患う患者（Ｐ＜０．０１）と比べて非ＰＦＳ患者グループでは著しく低下した（図２Ｂ）。ＥＬＩＳＡデータは、移植エピトープがシラカンバ花粉ＰＦＳに関連していることを示している。ＰＦＳを患っていないＢｅｔ  ｖ  １アレルギー個体のＩｇＥ抗体は効率よくＢＭ１，２，３，５と結合することができなかったが、ＰＦＳを患っている個体の交差反応を起こしうる抗体は、変異アレルゲンを認識し得た。
【実施例２】
【００７４】
変異アレルゲンＢＭ４は、８アミノ酸のエピトープがＭａｌ  ｄ  １．０１０８のエピトープと置換されたＢｅｔ  ｖ  １ａのタンパク質バックボーンに基づいている。Ｍａｌ  ｄ  １エピトープを組み込むことで、結果としてＢｅｔ  ｖ  １のように折り畳むことができず、折り畳み構造でないタンパク質を得た。この折り畳まれていないタンパク質は溶液中に存在でき、安定している。
【００７５】
ＢＭ４は、ｐＨｉｓ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  ２ベクター内で５’Ｎｃｏ  Ｉ、３’Ｅｃｏ  Ｒ  Ｉにてクローニングされ、Ｎ−末端ＨｉｓＴａｇを有する６ｘＨｉｓＴａｇ融合タンパク質として、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において生成された。
【００７６】
タンパク質は、大腸菌の不溶性部分から、６Ｍ尿素含有Ｎｉ2+バッファを用い、Ｎｉ2+カラムに負荷させ、カラム上にて再び折り畳んで、イミダゾールにて溶出させて精製された。続いて、精製されたＨｉｓＴａｇタンパク質は、ｒＴＥＶプロテアーゼで切断され、ＴａｇされていないＢＭ４は、再度ＩＭＡＣで精製され、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ８）で透析された。１Ｌ  ＬＢ  Ａｍｐ培地での収率は、精製後のＢＭ４の約２００ｍｇである。
【００７７】
タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでモニタリングし、９９％を超える純度を示した。完全なタンパク質の正しい質量はＥＳＩ−Ｑ  ＴＯＦ質量分析（測定された質量は１７６９０、算出された平均タンパク質質量は１７６８９ダルトン（Ｄａ））によって確認された。ＢＭ４の凝集状態はサイズ排除クロマトグラフィーで判断した。高分子量凝集体の量は０．５％未満であり、タンパク質の９９．５％が単量体であることが判明した。タンパク質の二次構造は、円偏光二色性分光法によって判断した。タンパク質は折り畳み構造でないことが判明した。
【００７８】
検出抗体としてＩ125標識ウサギ抗ヒトＩｇＥ（ＭｅｄＰｒｏ）を用いる、Ｂｅｔ  ｖ  １アレルギー患者からの血清プールを用いた免疫ブロットでは、ＢＭ４へのＩｇＥ結合は検出されなかった。ヒトＦｃεＲＩ受容体で形質移入したラット好塩基性白血病細胞およびＢｅｔ  ｖ  １アレルギー患者の血清を用いたメディエーター放出実験では、Ｂｅｔ  ｖ  １ａと比べて、ＢＭ４では１００倍−１０００倍、アナフィラキシー反応の可能性の低下したことを観察した。
【００７９】
ＢＭ４のＴ細胞増殖について調べられた。シラカンバ花粉アレルギー患者から得たヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖反応では、ＢＭ４が、Ｂｅｔ  ｖ  １ａまたはＭａｌ  ｄ  １．０１０８と比べて高いことが判明した。
【００８０】
臨床前のモデルでは、さらにＢＭ４を特性を調べる必要がある。マウスをＢＭ４で免疫化し、免疫学的パラメータを評価した。ＥＬＩＳＡを用いて、Ｂｅｔ  ｖ  １ａおよびＢＭ４に対するＩｇＧ滴定およびＩｇＥ滴定を判定した。さらに、ＩｇＥ結合を、ラット好塩基性白血病細胞を用いてメディエーター放出実験で評価した。
【００８１】
Ｂｅｔ  ｖ  １ａに対するブロッキング抗体（ＩｇＧ）の誘導を、免疫化マウスからの血清をエンドポイント滴定で間接的にＥＬＩＳＡで判定した。マウスのＴ細胞反応はＥＬＩＳｐｏｔ実験によって分析し、ＢＭ４の免疫化によって引き起こされたＴヘルパー細胞を、Ｂｅｔ  ｖ  １ａでマウスを免疫化することで引き起こされたＴヘルパー細胞と比較した。
【００８２】
ＴａｇされていないＢＭ４の構造（コンストラクト）は、以下のようにクローニングされた。ＢＭ４を５’Ｎｃｏ  Ｉおよび３’Ｅｃｏ  Ｒ  ＩとともにｐＥＴ  ２８ｂベクター（Ｋａｎ  Ｒ）に挿入し、大腸菌ＢＬ２１  ＳｔａｒTM（ＤＥ３）（インビトロジェン）細胞に形質移入した。上記構造は、配列され、タンパク質発現および精製テストについて実行された。
【００８３】
上記構造の生成物は、以下のように生成された。形質移入した細胞を１Ｌ  ＬＢ  ａｍｐ培地にて振盪フラスコ内で生育し、タンパク質発現を、ＯＤ６００が０．８の状態のとき、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧにより誘導した。細胞は、低速度遠心分離で分離してから破砕され、上記細胞の不溶性内臓体から、６Ｍ尿素、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４を用いて、ＢＭ４を回収した。ＢＭ４のタンパク質は、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファでの透析で再度折り畳まれた。
【００８４】
ＢＭ４の二次構造要素は、円偏光二色性分光法によって分析された。大腸菌内において、Ｔａｇされていない組換えタンパク質として生成されたＢＭ４は、折り畳み構造を有していないことが判明した。
【実施例３】
【００８５】
Ｂｅｔ  ｖ  １ａの各アミノ酸残基１０２、１１４、１２０の変異が結果として低アレルギー性分子を生成することを示すために、いくつかのＢｅｔ  ｖ  １ａ変異を作製した。これらの分子の全ては、野生型Ｂｅｔ  ｖ  １ａに比べてＩｇＥ反応性が低いことを示す。
【００８６】
表１は、Ｂｅｔ  ｖ  １ａおよびその各変異体のＺスコアを示す。Ｚスコアは、タンパク質の３Ｄ構造を判断するために用いられる。
【００８７】
【表１】
2010536349.tif 000003
【００８８】
変異タンパク質の説明は、テンプレートタンパク質のｐｂｄファイル（非特許文献２１）を示している。これは、変異体の骨格として用いられており、本明細書ではＢｅｔ  ｖ  １である（ｐｄｂエントリー：１ｂｖ１）。さらに、変異した位置も記載している（例えば、Ｉ１０２Ｋは、位置１０２のＩがＫと置換されていることを意味する）。
【図１ａ】
2010536349.tif 000004
【図１ｂ】
2010536349.tif 000005
【図１ｃ】
2010536349.tif 000006
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
2010536349.tif 000010
【図５】
2010536349.tif 000011
【図６】
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【図７】
2010536349.tif 000013
【図８】
2010536349.tif 000014
【図９】
2010536349.tif 000015
【図１０】
2010536349.tif 000016
【図１１】
2010536349.tif 000017
【図１２】
2010536349.tif 000018
【図１３−１】
2010536349.tif 000019
【図１３−２】
2010536349.tif 000020
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８ａ−１】
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【図１８ａ−２】
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【図１８ａ−３】
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【図１８ｂ−１】
2010536349.tif 000028
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【図１８ｂ−２】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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