(57)【要約】  蛍光ラベル付け。この発明は、一般的に蛍光ラベル付けの技術と、蛍光信号データを処理する方法、装置およびコンピュータプログラムコードに関する。共通のエンティティに関連付けられた、異なる第一および第二の蛍光体のそれぞれについての第一および第二のラベル付け度信号のそれぞれを決定する方法であって、前記第一および第二の蛍光体から第一の蛍光信号を、第一の条件下で決定することと、前記第一および第二の蛍光体から第二の蛍光信号を、前記第一の条件とは異なる第二の条件下で決定することと、前記第一および第二の蛍光信号から前記第一および第二の蛍光体についての前記第一および第二のラベル付け度信号を決定することからなり、前記第一および第二のラベル付け度信号の前記決定は、前記蛍光体の間のエネルギーの結合を表す少なくとも１つの結合値（ｃ１２；ｃ２１）に応じたものである方法。
2010515074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共通のエンティティに関連付けられた、異なる第一および第二の蛍光体のそれぞれについての第一および第二のラベル付け度信号のそれぞれを決定する方法であって、
前記第一および第二の蛍光体から第一の蛍光信号を、第一の条件下で決定することと、
前記第一および第二の蛍光体から第二の蛍光信号を、前記第一の条件とは異なる第二の条件下で決定することと、
前記第一および第二の蛍光信号から前記第一および第二の蛍光体についての前記第一および第二のラベル付け度信号を決定することからなり、
前記第一および第二のラベル付け度信号の前記決定は、前記蛍光体の間のエネルギーの結合を表す少なくとも１つの結合値（ｃ１２；ｃ２１）に応じたものである方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの結合値は、前記蛍光体の１つによって放射され前記蛍光体の他のものによって吸収された光の間の結合を表す、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第一の蛍光体は、前記第二の蛍光体よりも長い波長に放射ピークを有し、前記少なくとも１つの結合値は、前記第二の蛍光体によって放射され前記第一の蛍光体によって吸収された光の間の結合を表す、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第一および第二の条件は、前記第一および第二の蛍光信号の決定のための異なる照射波長と異なる検出波長の一方または両方を規定する、請求項１、２または３記載の方法。
【請求項５】
前記第一および第二の蛍光体の異なる割合の組み合わせの範囲に渡ってカリブレーションを行って、前記少なくとも１つの結合値についての推定を決定することから更になる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記第一および第二のラベル付け度信号の前記決定は、前記第一および第二の蛍光体についての自己消光度のそれぞれに依存する第一および第二のパラメータ（ｂ１；ｂ２）に更に応したものである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記第一および第二の蛍光信号の前記決定は、超伝導トンネルジャンクション装置を使って前記蛍光信号を検出することからなる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記共通のエンティティは、プローブエンティティからなる、請求項１から７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
前記共通のエンティティは、ターゲットエンティティからなる、請求項１から８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光体の１つの他の１つによる蛍光消光についてのマイクロアレイデータを修正することから更になる、先行する請求項のいずれかの方法に従ってマイクロアレイからの蛍光データを処理する方法。
【請求項１１】
前記第一および第二の蛍光信号の前記決定は、前記第一および第二の蛍光信号の入力からなる、実行された時に先行する請求項のいずれかの方法を実装する、プロセッサ制御コードを搬送する搬送体。
【請求項１２】
共通のエンティティに関連付けられた、異なる第一および第二の蛍光体のそれぞれについての第一および第二のラベル付け度信号のそれぞれを決定する装置であって、
前記第一および第二の蛍光体から第一の蛍光信号を、第一の条件下で決定する手段と、
前記第一および第二の蛍光体から第二の蛍光信号を、前記第一の条件とは異なる第二の条件下で決定する手段と、
前記第一および第二の蛍光信号から前記第一および第二の蛍光体についての前記第一および第二のラベル付け度信号を決定する手段からなり、
前記第一および第二のラベル付け度信号を決定する前記手段は、前記蛍光体の間のエネルギーの結合を表す少なくとも１つの結合値（ｃ１２；ｃ２１）に応じたものである装置。
【請求項１３】
請求項１２の装置を組み込んだマイクロアレイスキャニング装置。
【請求項１４】
エンティティを蛍光体でラベル付けする方法であって、
前記蛍光体の光生成効率に依存した第一のパラメータを入力することと、
前記蛍光体の自己消光度に依存した第二のパラメータを入力することと、
前記第一および第二のパラメータを使って前記蛍光体による前記エンティティの最適ラベル付け度の推定を決定することと、
前記推定された最適ラベル付け度に従って前記蛍光体で前記エンティティをラベル付けすることからなる方法。
【請求項１５】
前記第一のパラメータは、前記蛍光体の構造に更に依存する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
推定の前記決定は、複数の蛍光体による前記エンティティの最適ラベル付け度の推定を決定し、前記推定の前記決定は、前記複数の蛍光体の少なくとも２つの間の結合度に依存する第三のパラメータに応じたものである、請求項１４または１５の方法を使って複数の蛍光体でエンティティをラベル付けする方法。
【請求項１７】
前記複数の蛍光体の広範な異なるそれぞれの組み合わせでラベル付けされたエンティティを使ってカリブレーションを行って、前記結合度を推定することから更になる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１４、１５、１６または１７の方法に従って１つ以上の蛍光体でラベル付けされたエンティティ。
【請求項１９】
複数の異なる蛍光体でラベル付けされたエンティティであって、前記異なる蛍光体のそれぞれの数は、前記蛍光体の各々からの蛍光信号（Ｓ（ｎ））が実質的に最大化されるようになっているもの。
【請求項２０】
蛍光体でラベル付けされたプローブのキットであって、前記異なる蛍光体のそれぞれの数は、前記蛍光体の各々からの蛍光信号（Ｓ（ｎ））が実質的に最大化されるようになっているもの。
【請求項２１】
蛍光体でラベル付けされたプローブのキットを製造する方法であって、
前記キットのための蛍光体の組み合わせを決定することと、
前記決定された蛍光体の組み合わせを使って前記キットを製造することからなり、
前記蛍光体の組み合わせの前記決定は、
蛍光体でラベル付けされたプローブの前記キットのための蛍光体のセットと、セットの前記蛍光体の候補についての蛍光輝度良度指数関数を使った前記蛍光体による前記プローブのラベル付け度の一方または両方を選択することからなり、前記蛍光輝度良度指数関数は、前記蛍光体の前記候補の放射および吸収スペクトルの間の重複度に依存する方法。
【請求項２２】
前記関数が前記重複度に依存するものであることに加えてまたは代えて、前記関数は、ｉ）蛍光体の光生成効率に依存するパラメータと、ｉｉ）蛍光体の自己消光度に依存するパラメータの関数からなり、前記選択は更にｉｉｉ）蛍光体と別の蛍光体の間の結合度に依存するパラメータに依存するものである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項２１または２２の方法に従って製造された蛍光体でラベル付けされたプローブのキット。
【請求項２４】
蛍光体のキットからなる蛍光体でラベル付けされたプローブのキットであって、蛍光体でラベル付けされたプローブの前記キットと、前記蛍光体による前記プローブのラベル付け度の一方または両方は、セットの前記蛍光体の候補についての蛍光輝度良度指数関数（Ｒ）を使って選択され、前記蛍光輝度良度指数関数は、前記蛍光体の前記候補の放射および吸収スペクトルの間の重複度に依存するもの。
【請求項２５】
前記関数が前記重複度に依存するものであることに加えてまたは代えて、前記関数は、ｉ）蛍光体の光生成効率に依存するパラメータと、ｉｉ）蛍光体の自己消光度に依存するパラメータの関数からなり、前記選択は更にｉｉｉ）蛍光体と別の蛍光体の間の結合度に依存するパラメータに依存するものである、請求項２４記載のキット。
【請求項２６】
２つ以上の異なる蛍光体でラベル付けされたマイクロアレイからの蛍光データを処理する方法であって、
２つ以上の波長における前記マイクロアレイからの蛍光信号を表す前記蛍光データを入力することと、
前記蛍光信号についてのパリティラインを表すデータを決定することであって、前記パリティラインは、それに沿って前記２つ以上の波長における蛍光からの信号強度が実質的に同等であることが期待されるラインであるものと、
前記決定されたパリティラインを使って前記波長の１つにおける前記マイクロアレイからの前記蛍光信号を修正することからなる方法。
【請求項２７】
前記パリティラインは、を決定するために使われた前記蛍光信号の１つは、制御蛍光強度を表す、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記パリティラインを表すデータの前記決定は、
ＳＧ／ＳＲ＝（ａＧ−ｂＧ）／（ａＲ−ｂＲ）
を使って前記パリティライン上の第一のポイントを決定することからなり、ここでＳＧとＳＲは前記２つ以上の波長の第一および第二の波長のそれぞれにおける蛍光強度信号を表し、ａＧ、ｂＧとａＲ、ｂＲは前記蛍光体の異なるそれぞれの特性を表す、請求項２６または２７記載の方法。
【請求項２９】
前記パリティラインを表すデータの前記決定は、
ＳＧ／ＳＲ＝（ｂＧ＋ｃＲＧ）／ｂＲ
を使って前記パリティライン上の第二のポイントを決定することからなり、ここでＳＧとＳＲは前記２つ以上の波長の第一および第二の波長のそれぞれにおける蛍光強度信号を表し、ｂＲとｂＧは前記蛍光体の特性を表し、ｃＲＧは前記蛍光体の１つからの放射が前記蛍光体の第二のものによって吸収されることを考慮に入れるものである、請求項２６、２７または２８記載の方法。
【請求項３０】
前記蛍光データからｃＲＧのための値を決定することから更になる、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記修正は、前記波長の前記１つにおける前記マイクロアレイからの前記蛍光信号と、前記パリティラインから予測された前記波長の前記１つにおける前記蛍光信号の値の間の差を補償することからなる、請求項２６から３０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
前記マイクロアレイからの固定パターンノイズと、１つのデジタル数の他の１つによる分割から引き起こされるノイズの一方または両方からなる、システマティックなノイズについての前記蛍光データを補償することから更になる、請求項２６から３１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３３】
マイクロアレイからの蛍光データを処理する方法であって、
複数の異なるスポット位置における前記マイクロアレイからの蛍光信号を表す前記蛍光データを入力することと、
前記蛍光データを処理して、前記スポットからの蛍光に関連付けられた生物学的パラメータを決定することからなり、
前記処理は、
前記マイクロアレイからの固定パターンノイズと、１つのデジタル数の他の１つによる分割から引き起こされるノイズの一方または両方からなる、システマティックなノイズについての前記蛍光データを補償することを含む方法。
【請求項３４】
前記パリティラインの前記決定または前記蛍光データの前記処理は、前記蛍光体の１つの他の１つによる蛍光消光を補償することからなる、請求項２６から３３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３５】
実行された時に請求項２６から３４のいずれか１つの方法を実装する、コンピュータプログラムコードを搬送する搬送体。
【請求項３６】
請求項２６から３４のいずれか１つの方法を実装するように構成された装置であって、
前記マイクロアレイからの蛍光信号を表す前記蛍光データを入力する入力と、
処理された前記蛍光データを出力する出力と、
前記入力と、前記出力と、作業メモリと、請求項２６から３４のいずれか１つの方法を実装するプロセッサ制御コードを格納したプログラムメモリと、に結合されたプロセッサからなる装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、一般的に蛍光ラベル付けの技術と、蛍光信号データを処理する方法、装置および計算アルゴリズムを実装したコンピュータプログラムコードに関する。我々が記載する技術は、バイオテクノロジーの応用で特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
通常の生物学的問題は、空間的に一致した蛍光体（染料）からの光放射の測定である。生体セルの機能的構成要素の撮像はしばしば多数の蛍光マーカーの登録を要する。ラベル付けされた核酸（プローブ）のハイブリダイゼーションを定量化してマイクロアレイ（「遺伝子チップ」）中のターゲット分子を固定化することもまた、多数の構成要素の蛍光スペクトルの同時検出を要求することができる。
【０００３】
我々は以前に、ＷＯ０３／０２３３７６（その全体をここで参照によって組み込む）において、例えばＤＮＡ（デオキシリボ核酸）マイクロアレイからの蛍光信号の検出のための低温検出器技術、特に超伝導トンネルジャンクション（ＳＴＪ）を採用したもの、を記載した。ＳＴＪ装置は、一般的には単一光子レベルまで下がる波長（色またはエネルギー）の範囲に渡って感度があると共に、高度に線形な応答と高い信号対雑音比を提示する。光帯域中のＳＴＪのエネルギー解像能力（装置の実施形態はハイパースペクトラルとして記載し得る）は、薬物発見のような応用のためにマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションの同時マルチカラー検出を容易にする。
【０００４】
典型的なマイクロアレイ実験では、２つのサンプルまたはターゲットが、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）に逆転写され、異なる蛍光染料を使ってラベル付けされる。ＤＮＡマイクロアレイは、プローブとして働くＤＮＡシーケンスのアレイからなり、ターゲットは混合されてそれらのプローブとハイブリッド化され、それから洗浄による余分な非束縛材料の除去の後に、一般的にはアレイスポットの各々において蛍光信号に対して応答するスキャナを使って、マイクロアレイが撮像される。２つのターゲットのプローブシーケンスへの差分ハイブリダイゼーションは、大まかに言うと、プローブシーケンスについてのマイクロアレイ上のスポットにおける蛍光強度の比によって決められる。このようにして、２つのターゲット中のプローブシーケンスの各々の相対的豊富さを評価し得る。この基本技術の数多くの変形がある。現在大多数のマイクロアレイはＤＮＡ（ここではｃＤＮＡを含む）からなるが、マイクロアレイはまたＲＮＡ(リボ核酸)、蛋白質、抗体、抗原等を使っても組み立てられ得る。
【０００５】
従来のスキャナは典型的にはマイクロアレイからの信号を記録するのに光電子増倍管を採用するが、我々はパフォーマンスに実質的な向上を提供するのにどのようにＳＴＪ検出器装置を使うことができるかを記載した（ibid; またReview of Scientific Instruments, Volume 74, Number 9, September 2003, “Detection of multiple fluorescent labels using superconducting tunnel junction detectors”, G.W. Fraser, J.S. Helsop-Harrison, T. Schwarzacher, A.D. Holland, P. Verhoeve, and A. Peacock）。例えば生物学的蛍光の研究に使われた１つの検出器は、トンネルバリアのどちらかの側に１００ｎｍ厚のＴａレイヤと３０ｎｍ厚のＡ１レイヤをもった単一の３０×３０μｍ２ＳＴＪであった。検出器は、研磨されたサファイア基板上に蒸着されたＴａ／Ａ１マルチレイヤから写真平板技術を使って作成された。３Ｈｅ低温槽中で３００ｍＫまで冷却すること（即ち、Ｔ〜Ｔｃ／１５、ここでＴｃは超伝導遷移温度を示す）は、熱的に励起された擬似粒子電流を漏れ電流レベルのはるか下に保持した。ＳＴＪは６００ｎｍで１４．１の測定された解像力（λ／Δλ）を有した。サンプルは、水銀ランプ励起をもつLeica顕微鏡でシミュレートされた。蛍光体サンプルからの色の優先的選択は、Omegaトリプルフィルタセットを使って行うことができ、それは４５０ｎｍ（青）、５２０ｎｍ(緑)、６２０ｎｍ(赤)を中心とした狭帯域での送信を与える。積分時間は約３０ｓであった。
【０００６】
そのようなＴａ／Ａ１装置（解像力約１０−２０）は、少なくとも４つのよく分離された蛍光体を同時に測定することができる。より小さいバンドギャップ、より低い動作温度、例えばＲ〜８０をもつＨｆまたはＲ〜４０をもつMｏのようなより良い解像力をもつＳＴＪ装置は、潜在的にはもっと良い。単一ピクセルＳＴＪの控えめなスループットは、大きいフォーマットのアレイを開発することによって向上することができる（Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A 559 (2006) 782-784, “Optical Fluorescence of biological samples using STJs”, G.W. Fraser, J.S. Helsop-Harrison, T. Schwarzacher, P. Verhoeve, A. Peacock, and S.J. Smith参照）。
【０００７】
典型的には、スキャナは、例えばデジタル信号プロセッサまたは好適にプログラムされた汎用コンピュータに基づいた画像捕捉／処理システムを含んでおり、撮像されたマイクロアレイからの蛍光信号は典型的には１６ビットＧＩＦ（graphics interchange format）またはＴＩＦＦ（tagged image file format）のような業界標準フォーマットの色画像ファイルとして出力される。異なる蛍光体は異なる放射ピークと、一般的には異なる（より短い波長の）吸収ピークを有する。スキャナは、単一の波長で両吸収ピークを同時に励起してそれから両放射波長を同時に読み取っても良いか、またはマイクロアレイが最初１つの吸収波長でスキャンされそれから他のものでスキャンされても良い。しばしば蛍光を励起するのにレーザーが採用される。再スキャニングはハイブリッド化されたエンティティを損傷することができ、特に光漂白を引き起こすことができるので、多数の蛍光信号(色)を同時に読み取ることが一般的には好ましい。一般的に、励起照射と蛍光放射の間およびオプションで異なる蛍光信号の間を区別するのに通過帯域フィルタリングが採用される。
【０００８】
マイクロアレイデータ分析に関する背景資料は、”Microarray data analysis: from disarray to consolidation and consensus”; David B. Allison, Xiangpin Cui, Grier P. Page and Mahyar Sabripour, NATURE REVIEWS, GENETICS, Volume 7, January 2006, page 55-65; および”Improving false discovery rate estimation”, Bioinformatics 20(11), 2004, page 1737-1745に見つけることができ、本出願の最先の優先日後に出版された資料は、”Speed-mapping quantitative trait loci using microarrays”, Chao-Qiang Lai, Jeff Leips, Wei Zou, Jessica F Roberts, Kurt R Wollenberg, Laurence D Parnell, Zhao-Bang Zeng, Jose M Ordovas & Trudy F C Mackay, NATURE METHODS, Vol. 4 No. 10, October 2007, pages 841-839; および”HoughFeature, a novel method for assessing drug effects in three-color cDNA microarray experiments”, Hongya Zhao and Hong Yan, 17 July 2007, BMC Mioinformatics 2007, 8:256, doi: 10.1186/1471-2105-8-256に見つけることができる。
【０００９】
従来、マイクロアレイからの蛍光信号の処理は、いくつかの暗黙の仮定、特に特定のスポットからの蛍光信号とラベル付けされたサンプルまたはターゲットの相対的豊富さの間に線形の関係があるというもの、に基づいていた。発明者は、しかしながら、これは一般的には真実ではなく、２つの異なる蛍光体の間の結合が非線形性を導入することを認識した。発明者は、非線形性が単一蛍光体システムにおいてさえ起こることができることを更に認識した。非線形性度は部分的には採用された蛍光体に依存する。我々は、それによりこれらの非線形性を考慮に入れることができる技術を記載する。より特定には、我々は、２つの異なる蛍光体でラベル付けされたかまたは関連付けされたエンティティからの信号の向上した処理のための技術と、最適ラベル付け度、即ち、最大の輝度を生成するもの、の決定に関する技術の両方を記載する。
【発明の概要】
【００１０】
発明の第一の側面によると、従って、共通のエンティティに関連付けられた、異なる第一および第二の蛍光体のそれぞれについての第一および第二のラベル付け度信号のそれぞれを決定する方法であって、前記第一および第二の蛍光体から第一の蛍光信号を、第一の条件下で決定することと、前記第一および第二の蛍光体から第二の蛍光信号を、前記第一の条件とは異なる第二の条件下で決定することと、前記第一および第二の蛍光信号から前記第一および第二の蛍光体についての前記第一および第二のラベル付け度信号を決定することからなり、前記第一および第二のラベル付け度信号の前記決定は、前記蛍光体の間のエネルギーの結合、または１つ蛍光体によって放射された光の他の蛍光体による吸収、を表す少なくとも１つの結合値（ｃ１２；ｃ２１）に応じたものである方法、が提供される。
【００１１】
当業者は、マイクロアレイ実験では（非線形性の効果について修正された）信号強度が測定されることを理解するであろう。ラベル付け度は、例えば、特定の分子またはエンティティ上の蛍光体の数かエンティティに束縛される蛍光ラベルされた分子の数のどちらかであっても良い。第一のケースの例は、多数の蛍光体が空間的間隔でＤＮＡに束縛される場合である。第二のケースの例は、例えば抗体が多数の束縛サイトを有し、各々が単一の蛍光体を運びながら複数の分子に同時に束縛される場合である。技術の実施形態は更にまた、共通のエンティティに関連付けられたラベル付け度信号が、同じタイプの異なる個別の分子またはエンティティに付着された、異なる蛍光体の物理的混合から生じる状況においても使うことができる。これの例は、マイクロアレイスポットが同じ共役分子の物理的混合を含み、そのいくつかは１つ以上の蛍光剤Ａ半分が付着されており、その他のものは１つ以上の蛍光剤Ｂ半分が付着されている場合である。
【００１２】
技術の実施形態は、２つの異なる蛍光体からのラベル付け度信号が分離されることを許容し、よって再スキャニングの必要がなくても済むようにし光漂白の有害な効果を最小化する。いくつかの特定の好ましい実施形態では、技術は上述したような超伝導トンネルジャンクション検出器装置からの蛍光信号と共に採用される。検出され得る光子の比較的小さな数のために、技術はこの種の検出器では特に有利である。しかし、より一般的には、方法の実施形態は、あらゆるタイプのマイクロアレイスキャニングシステムと共に採用され得るし、空間的に実質的に一致した蛍光体からの光放射が観察され得る他のシステムのコンテクストにおいても採用され得る。よって、例えば、方法は従来のマイクロアレイスキャン分析ソフトウェアのためのフロントエンドを実装するコンピュータプログラムコードとして具体化され得る。第一および第二の発色団（蛍光体）について決定されたラベル付け度信号は、本質的なラベル付け度信号か、例えばそれらからそれぞれのラベル付け度または他のハイブリダイゼーション情報が後に導出し得る２つの蛍光体からの分離された信号のどちらかであり得る。
【００１３】
方法の好ましい実施形態では、少なくとも１つの結合値は、蛍光体の１つによって放射され蛍光体の他のものによって吸収された光の間の結合を表す。
【００１４】
方法の実施形態では、第一の蛍光体は、第二の蛍光体よりも長い波長に放射ピークを有し、結合値は、第二の蛍光体によって放射され第一の蛍光体によって吸収された光の間の結合を表し、方法の実施形態では、他の方向への結合は実質的に無視され得る。
【００１５】
それらの下で第一および第二の蛍光信号が決定される条件は、一般的に第一および第二の蛍光信号の決定のための異なる照射波長と異なる検出波長の一方または両方を規定する。従って、２つの蛍光信号を決定するように、例えばフィルタによって選択された、異なる波長または波長帯域を使って、単一のスキャンにおいて共通の照射信号をマイクロアレイに印加し得る。
【００１６】
実施形態では、１つ以上の結合値についての推定を、第一および第二の蛍光体の異なる割合の組み合わせの範囲に渡ってカリブレーションを行うことによって決定し得る。方法の好ましい実施形態では、２つのラベル付け度信号の決定はまた、それぞれの自己消光度を表す２つ蛍光体についてのそれぞれのパラメータを考慮に入れる。そのようなパラメータは、公表されたデータから入手可能かまたは導出可能であっても良いし、ここでは各蛍光体について別々に再びカリブレーションを行うことによって決定しても良い。
【００１７】
当業者は、我々が記載する技術は第一および第二の蛍光体が関連付けられた広範なエンティティに適用され得ることを理解するであろう。例えば、マイクロアレイ実験では、２つの蛍光体は、例えば相対的ハイブリダイゼーションを決定するように、別々にタグが付けられたターゲットが付着された共通のプローブエンティティと関連付けられていても良い。加えてまたはそれに代えて、２つの蛍光体は共通のサンプルまたはターゲットエンティティと関連付けされていても良い。典型的には、２つの蛍光体は、プローブターゲット実験の一部であろうが、潜在的には、それらは例えばＤＮＡまたはＲＮＡの紐において異なるように蛍光的にタグ付けされた塩基として、共通の分子の構造に組み込まれていても良い。
【００１８】
いくつかの好ましい実施形態では、方法は、マイクロアレイからの蛍光データを処理するのに採用される。一般的に、これはＤＮＡまたはＲＮＡのマイクロアレイからなるが、加えてまたはその代わりに、マイクロアレイは抗体または抗原からなるものであっても良く、他の応用では、技術は、サンドイッチ検定からの蛍光データを処理するのに採用されても良い。
【００１９】
よって、更なる側面では、２つ以上の異なる蛍光体でラベル付けされたマイクロアレイからの蛍光データを処理する方法であって、２つ以上の波長における前記マイクロアレイからの蛍光信号を表す前記蛍光データを入力することと、前記蛍光信号についてのパリティラインを表すデータを決定することであって、前記パリティラインは、それに沿って前記２つ以上の波長における蛍光からの信号強度が、それらに蛍光体が付着されている実質的に同量のエンティティを表すことが期待されるラインであるものと、前記決定されたパリティラインを使って前記波長の１つにおける前記マイクロアレイからの前記蛍光信号を修正することからなる方法、が提供される。
【００２０】
当業者は、技術が３つ以上の蛍光体に拡張され得て、その場合パリティラインの概念もそれに応じて（即ち、同等の表面またはそのような表面のセットへと）拡張され得ることを理解するであろう。よって、上記方法では、「パリティライン」は「パリティ表面」を含む。方法の実施形態では、蛍光信号は、遺伝子表現レベル等の１つ以上の生物学的パラメータに対応する。方法の実施形態では、パリティラインを決定するために使われた蛍光信号の１つは蛍光の制御レベルを表すことが好ましい（ただし、両方とも生物学的パラメータのレベルを表すときでも、１つの信号を他のものについての制御として使い得るので、これは本質的ではない）。前述したように、１つの信号が制御として使われたときに、他のものは一般的に生物学的パラメータのレベルを表す。
【００２１】
実施形態では、パリティラインの決定は、オプションで外郭データ信号を除外して、ラインの第一および第二のエンドポイントを決定することからなる。１つのエンドポイントは、第一および第二の波長における蛍光強度信号が実質的にゼロ（後の式で言うと、ｎが近似的に１単位であることを仮定して）であるものに相当しても良い。よって、パリティライン上の１つのポイントは、
ＳＧ／ＳＲ＝（ａＧ−ｂＧ）／（ａＲ−ｂＲ）
を使って決定されても良く、ここでａとｂは蛍光体の特性を表し、添え字ＧとＲは、例えば、シアニン３蛍光染料Ｃｙ３（登録商標）のような緑蛍光体とシアニン５蛍光染料Ｃｙ５(登録商標)のような赤蛍光体などの、第一と第二の波長のそれぞれにおいて主に蛍光する蛍光体を表している。
【００２２】
好ましい実施形態では、ライン上の第二のポイントは、
ＳＧ／ＳＲ＝（ｂＧ＋ｃＲＧ）／ｂＲ
を使って決定し、ここでｃＲＧは１つの蛍光体からの放射が他の蛍光体によって吸収されることを考慮に入れるものである。より特定には、ｃＲＧ項は、長波長蛍光放射対による短波長蛍光放射体の消光を考慮に入れる（長波長放射体がこの効果によって短波長放射体よりも少なく摂動されるように）。いくつかの好ましい実施形態では、ｃＲＧのための値は、例えばベストフィット技術によって、蛍光データから決定されても良い。この方法によって決定されたパリティライン上のポイントは、最大蛍光エンドポイント、つまり２つ以上の波長における蛍光強度信号が実質的に最大値にあるところ、であっても良い。
【００２３】
好ましい実施形態では、修正プロセスは、測定変数（即ち、非制御）の蛍光信号と、パリティラインから予測されたその蛍光信号の値の間の差を、例えば１つを他から差し引くことによって、補償することからなる。いくつかの好ましい実施形態では、方法はまた、マイクロアレイからの固定パターンノイズと、１つのデジタル数の他の１つによる分割から引き起こされるノイズの一方または両方からなる、システマティックなノイズについて修正することからなる。固定パターンノイズは、例えば、マイクロアレイの析出によるアーチファクトから引き起こされ、例えば行または列のサブアレイ間隔での巡回的繰り返しを有しても良い。
【００２４】
よって、発明の更なる側面は、マイクロアレイからの蛍光データを処理する方法であって、複数の異なるスポット位置における前記マイクロアレイからの蛍光信号を表す前記蛍光データを入力することと、前記蛍光データを処理して、前記スポットからの蛍光に関連付けられた生物学的パラメータを決定することからなり、前記処理は、前記マイクロアレイからの固定パターンノイズと、１つのデジタル数の他の１つによる分割から引き起こされるノイズの一方または両方からなる、システマティックなノイズについての前記蛍光データを補償することを含む方法、を提供する。
【００２５】
発明は更に、上記方法の実施形態を実装する、特に搬送体上のプロセッサ制御コードを提供する。搬送体は、ＣＤ（コンパクトディスク）またはＤＶＤ（デジタルビデオディスク）ＲＯＭのようなディスク、リードオンリーメモリのようなプログラムされたメモリ、または光または電気信号搬送体のようなデータ搬送体、からなるものであっても良い。プロセッサ制御コードは、例えばＣなどのあらゆる従来のプログラム言語によるソース、オブジェクトまたは実行可能コード、またはハードウェア記述言語のためのコードであっても良い。当業者が理解するであろうように、そのようなコードおよび／または関連するデータは、互いに通信している複数の結合されたコンポーネントの間で配布されても良い。
【００２６】
発明は更に、上記のような方法を実装するように構成された装置を提供する。一般的に、そのような装置は、処理すべき蛍光データを受信する入力と、更なる分析のためかまたは例えば遺伝子表現レベルのセットとして、処理された蛍光データを提供する出力と、入力と、出力と、作業メモリと、蛍光データ処理方法を実装するプロセッサ制御コードを格納  したプログラムメモリと、に結合されたプロセッサからなる。
【００２７】
関連した側面では、発明は、共通のエンティティに関連付けられた、異なる第一および第二の蛍光体のそれぞれについての第一および第二のラベル付け度信号のそれぞれを決定する装置であって、前記第一および第二の蛍光体から第一の蛍光信号を、第一の条件下で決定する手段と、前記第一および第二の蛍光体から第二の蛍光信号を、前記第一の条件とは異なる第二の条件下で決定する手段と、前記第一および第二の蛍光信号から前記第一および第二の蛍光体についての前記第一および第二のラベル付け度信号を決定する手段からなり、前記第一および第二のラベル付け度信号を決定する前記手段は、前記蛍光体の間のエネルギーの結合を表す少なくとも１つの結合値（ｃ１２；ｃ２１）に応じたものである装置、を提供する。
【００２８】
発明者は更に、上記の技術が、より特定には２つ以上の蛍光体によって、蛍光体をもつエンティティの最適ラベル付け度を決定するのにも採用され得ること、を認識した。１つ以上の蛍光タグをもつエンティティをラベル付けする手順は、一般的に面倒で時間のかかる多数のラベル付け実験を要するので、これは有利である。発明者は、利用可能なデータによっては、単一のラベル付け実験のみが必要であり得るか、または潜在的にはラベル付け実験が必要ないこと、を認識した。
【００２９】
よって、発明の更なる側面によると、エンティティを蛍光体でラベル付けする方法であって、前記蛍光体の光生成効率に依存した第一のパラメータを入力することと、前記蛍光体の自己消光度に依存した第二のパラメータを入力することと、前記第一および第二のパラメータを使って前記蛍光体による前記エンティティの最適ラベル付け度の推定を決定することと、前記推定された最適ラベル付け度に従って前記蛍光体で前記エンティティをラベル付けすることからなる方法、が提供される。
【００３０】
実施形態では、推定された最適ラベル付け度は、蛍光強度（輝度）が最大であることが予測される推定されたラベル付け度（例えば分子のようなエンティティ毎の蛍光体の数）からなる。
【００３１】
好ましくは、第一のパラメータは、エンティティの構造、蛍光体の構造、蛍光体とエンティティの間の結合、の１つ以上に更に依存する。いくつかの特に好ましい実施形態では、方法は、複数の蛍光体とともに採用されて、複数の蛍光体の少なくとも２つの間の結合度に依存する第三のパラメータを使って、他のものが在るなかでの蛍光体の各々についての推定された最適ラベル付け度を決定する。結合度は、例えば、複数の蛍光体の広範な異なるそれぞれの組み合わせでラベル付けされたエンティティを使ってカリブレーション実験を行うことによって推定しても良い。
【００３２】
更なる側面では、発明は、上記方法を使って１つ以上の蛍光体でラベル付けされたエンティティを提供する。よって、実施形態では、エンティティは１つ以上の蛍光体によって実質的に最適なラベル付け度を有する。最適ラベル付け度は、関係のある蛍光体についてのラベル付けされたエンティティからの実質的な最大蛍光発生量に対応するラベル付け度として規定され得る。
【００３３】
よって、更なる側面では、発明は、複数の異なる蛍光体でラベル付けされたエンティティおよび蛍光プローブのキットであって、前記異なる蛍光体のそれぞれの数は、前記蛍光体の各々からの蛍光信号（Ｓ（ｎ））が実質的に最大化されるようになっているもの、を提供する。
【００３４】
発明は更にまた、その例が後述される良度指数（Ｒ）掛ける複数の異なる他の蛍光体についてのそれぞれの良度指数に対する蛍光のピーク値の測定されたセットから決定された比例定数の積によって決定された、ラベル付けしている蛍光体の数を有する蛍光体ラベル付けされたエンティティを提供する。例えば、比例定数は、後述する、図７に示されたもの、＋／−５０％、であっても良い。
【００３５】
発明は更にまた、蛍光体でラベル付けされたプローブのキットを製造する方法であって、前記キットのための蛍光体の組み合わせを決定することと、前記決定された蛍光体の組み合わせを使って前記キットを製造することからなり、前記蛍光体の組み合わせの前記決定は、蛍光体でラベル付けされたプローブの前記キットのための蛍光体のセットと、セットの前記蛍光体の候補についての蛍光輝度良度指数関数（Ｒ）を使った前記蛍光体による前記プローブのラベル付け度の一方または両方を選択することからなる方法、を提供する。
【００３６】
実施形態では、蛍光輝度良度指数関数は、前記蛍光体の前記候補の放射および吸収スペクトルの間の重複度に依存する。好ましくは、Ｒはまた、前記候補蛍光体、蛍光体の消滅係数の最大値、からなる。加えてまたはそれに代えて、前記関数は、ｉ）蛍光体の光生成効率に依存するパラメータと、ｉｉ）蛍光体の自己消光度に依存するパラメータの関数からなり、前記選択は更にｉｉｉ）蛍光体と別の蛍光体の間の結合度に依存するパラメータに依存するものである。
【００３７】
実施形態では、蛍光体でラベル付けされたプローブのキットは、マイクロアレイまたは他の診断プラットフォームのためのカリブレーションキットからなる。実施形態では、カリブレーション蛍光体の数は、実験的蛍光体の数と合致する。いくつかの好ましい実施形態では、蛍光体でラベル付けされたプローブのキットは、ＳＴＪ検出器とともに使用されるためのものである。
【００３８】
発明はまた、蛍光体のキットからなる蛍光体でラベル付けされたプローブのキットであって、蛍光体でラベル付けされたプローブの前記キットと、前記蛍光体による前記プローブのラベル付け度の一方または両方は、セットの前記蛍光体の候補についての蛍光輝度良度指数関数（Ｒ）を使って選択され、前記蛍光輝度良度指数関数は、前記蛍光体の前記候補の放射および吸収スペクトルの間の重複度に依存するもの、を提供する。
【００３９】
実施形態では、蛍光体および／または蛍光体のラベル付け度は、後続の信号検出および／または測定および／またはスペクトルデコンボルーションを最適化するように選択される。
【００４０】
発明のこれらおよびその他の側面が、添付された図面を参照して、例としてのみここで更に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、Alexa（Invitrogen Corp.の登録商標）488（個々の四角）、Fluorescein-EX（丸）、およびAlexa（登録商標）546（三角）についての測定された輝度データの比較を、式３ｂとテーブル２に与えられたパラメータａおよびｂについてのベストフィット値に基づく計算されたカーブと共に示す（Alexa（登録商標）蛍光体についてはimmunoglobulin、F-EXについてはstreptavidinのＧ構造形に基づくGAM IgG Goat Anti-Mouse（二次抗体共役））。
【図２】図２は、Alexa（登録商標）350（ダイヤモンド；streptavidin共役）、Alexa（登録商標）555（四角；GARテーブル１共役（Goat Anti-Rabbit（二次抗体共役））、ＡＭＣＡ(fluorophore amino-methylcoumarin acetic acid)（ぺけ；streptavidin）およびＣｙ３（白丸；streptavidin共役；黒丸GAR共役）についての測定されたおよび計算された輝度データの比較を示す。
【図３】図３は、Oregon Green 514（ダイヤモンド）、Oregon Green 488（四角）、ＦＩＴＣ(fluorophore fluorescein isothiocyanate)（丸）、およびRhodamine Red-X（丸）（全てのケースにおいてGAM共役）についての測定されたおよび計算された輝度データの比較を示す。
【図４】図４は、Alexa（登録商標）647でラベル付けされた共役についての測定された（個々のシンボル）および計算された（完全なカーブ）輝度関数の比較を示す：十字−streptavidin共役；四角−transferrin Transferrin（蛋白質）；丸−concanavidin A；ダイヤモンド−GAR IgG；ぺけ−GAM IgG；単一の理論的カーブはa = 1.5, b = 0.14について計算されている。
【図５】図５は、Texas Red-Xでラベル付けされた共役についての測定された（個々のシンボル）および計算された（完全なカーブ）輝度関数の比較を示す
【図６】図６は、両方ともGAMに共役された、Alexa（登録商標）532およびRhodamine 6Gについての測定されたおよび計算された輝度データの比較を示す。
【図７】図７は、テーブル２のGAM共役についての測定されたｎpeakと良度指数Ｒの間の線形関係を示す；この図は輝度関数Ｓ（ｎ）の最大が、それについてＲの値を構築することができるあらゆる（GAM共役された）蛍光体について推定されることを許容する。
【図８】図８は、発明に従った技術の実施形態を実装した装置を示す。
【図９】図９ａ−９ｃは、それぞれ、発明の実施形態に従ったパリティラインの構築を示すマイクロアレイデータスキャッタープロットを示し、図９ａのプロットは、図９ａのパリティラインからの蛍光レベル予測に基づく蛍光体間蛍光消光について修正された蛍光データと、修正されたデータについてのいわゆるＭＡプロット（変換された軸をもつスキャッタープロット）をもち、また信号対雑音（Ｓ／Ｎ）閾値を課することを描いている。
【図１０】図１０ａ−１０ｄは、それぞれ、HFF-PDS(Human foreskin fibroblasts, infected with the PDS strain of the parasite Toxoplasma gondii（マラリアを引き起こす有機体の近い親類）のモジュロ２８で折り畳まれたデータセットからの背景ノイズを示し、固定パターンノイズ、１つの小さなデジタル数の他の１つによる分割から引き起こされるシステマティックノイズによるアーチファクト、どのようにノイズが遺伝子表現と誤解釈され得るかを描いたシミュレーションの結果、および現実の生のマイクロアレイを示す同様の例（ＳＭＤデータセット３９３２から）を描いている。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
大まかに言うと、我々は、蛍光放射の自己消光のモデルを記載し、これを光発生量対生物学で一般に用いられる数々の蛍光体（染料）についてのラベル付け度の測定と比較する。モデルは物理的には同種の分子による光の放射と吸収に基づいている。モデルは、最大光発生量に対応する最適ラベル付け度が、蛍光体の基本パラメータの組み合わせから予測可能であることを示す。しかしながら、最大は蛍光体の共役分子にも依存することができる。モデルのマルチ蛍光体システムへの拡張が、そのようなシステムにおけるラベル付け度信号を決定する方法と、非線形性が存在する中でそのようなシステムにおける生物学的情報の復元のための手順とともに記載される。
【００４３】
染料ラベル付けされた生物学的システムでは、蛍光体信号ISはラベル付け度ｎ−共役分子当りの存在する蛍光体の数、に常に線形に関連しているわけではない。（以下では、
【数１】
2010515074.tif 000003
【００４４】
は、出力フィルタバンドパス[λ1≦λ≦λ2]に渡る波長依存放射関数ｉの積分を形式的に表記する。共役分子は、それに蛍光体が付着される生物学的に活性な蛋白質または抗体である。自己消光の現象−高ラベル付け密度について観察される蛍光信号の減少−は,多くの場合にそれが最大輝度のための良く定義されたラベル付け度（ｎ＝ｎｐｅａｋ）へと導くにも関わらず、あまり良く理解されていない[S. Hamann, J.F. Kiilgaard, T. Litman, F.J. Alvarez-Leefmans, B.R. Winther and Zeuthen, J. Fluorescenece 12 (2002) 139]。
【００４５】
可能な消光メカニズムの内、動的蛍光消光は、蛍光体自体から区別された消光エージェントとの衝突性エネルギー交換に依存するため、普遍的なプロセスとは考えられない。対照的に、静的消光は、蛍光体と消光剤による非放射性分子複合体の形成に依存する。３番目に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、その２つの成分が約ナノメートルの距離だけしか離れていないシステムにおけるドナー放射スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルの重複を要求する。
【００４６】
ここで、我々は自己消光−信号非線形性を導く−は、主に蛍光体分子によるそれら自体が放射した光の吸収によるものと仮定する。つまり我々は、原理的には自己消光は、そうでなければ透明なシステムにおける同じ染料分子での吸収および放射スペクトルの重複から引き起こされるものと考える。以下で我々は、我々のモデルの予測を、文献に報告された輝度関数Ｓ（ｎ）の測定と比較し、最大信号に対応するラベル付け密度であるｎｐｅａｋを計算する。
【００４７】
テーブル１は、量子収量の推定のための特定の蛍光体、共役分子、および参照標準を表記するのに以下で使われる頭字語をまとめている[R.F. Rubin and A.N. Fletcher, J. Luminescence 27 (1982) 445]。
【００４８】
テーブル１
生物学的エンティティの頭字語

AMCA       Amino-methylcoumarin acetic acid （蛍光体）
CTMR       Cardboxyltetramethylrhodamine （参照標準）
DDAO       Dodecyldimethylamine Oxide （参照標準）
FITC       Fluorescein Isothiocynanate （蛍光体）
GAM IgG    immunoglobulinのG構造形に基づくGoat Anti-Mouse （二次抗体共役）
GAR IgG    Goat Anit-Rabbit （二次抗体共役）
S101       Sulforhodamine 101 （参照標準）

テーブル１
蛍光強度の計算
厚さがｄで容積がＶの染料ラベル付けされた生物学的サンプル中での、強度I0（光子／ｃｍ２／ｓ）で波長λＳの単色ソースからの光の吸収を考える。弱く吸収しているシステムでは、蛍光体による吸収度Ａは、
A = ε.d.C                                                          -(1a)
または
A = N.σ.d                                                          -(1b)
ここで：
εはｃｍ−１Ｍｏｌ−１の単位での消滅係数
ＣはＭｏｌでの濃度
σはｃｍ２の単位での波長依存吸収断面
Ｎは単位容積当りの蛍光体分子の数
のどちらかとして書き得る一方、もしdΩがサンプルにおいて理想的な検出器がなす立体角でありＱが蛍光体の絶対量子効率であれば、信号強度IS（検出光子／ｓ）は、
IS = I0AQ[V/d][dΩ/4π]                                             -(1c)
である。
【００４９】
式（１ａ，ｂ）は、それぞれ生物学者と物理学者にとって、同じ根元的なBeer-Lambertの法則を表現する。我々は、式（１ｂ）から、それは吸収度を量的に決定する、単位容積当りの蛍光体の数、Ｎ、であることが分かるが、生物学においてほぼ常に報告されるパラメータは、Ｍｏｌ／Ｍｏｌで測定された共役分子当りの蛍光体の数、ｎ、であることを上記から注意されたい。しかしもしＭ、共役分子の質量（例えば蛋白質streptavidin については５２，８００Ｄａ）が、蛍光体のそれ（例えば、以下の蛍光体については３００−９００Ｄａ）よりもはるかに大きければ、Ｎとｎの間の関係は単純である。グラム単位のＭでは、
N = [n.Na.ρ]/M                                                      -(2)
ここで：
Naはアボガドロ数
ρは共役分子の実効密度
である。
【００５０】
（式１ｂから）Ａと（式２から）Ｎを式（１ｃ）に代入すると、我々は、いくらかの操作の後に、
IS = I0nQNcσ[dΩ/4π]= I0S(n)Ncσ[dΩ/4π]                          -(3)
ここでNcはサンプル中の共役分子の数であり、物理的輝度関数Ｓ（ｎ）＝ｎＱは量子効率がラベル付け度、ｎ、に依存する可能性を組み入れている、であることを見つける。
【００５１】
この分析は、与えられたｎの値について、共役分子の質量がより低いと、共役の間で密度が殆ど変動しないとして、単位容積当りに比例してより多くの蛍光体があることになるので、輝度関数Ｓ（ｎ）はより高いはずであることを示唆する。
【００５２】
輝度関数
Ｓ（ｎ）の形を推定するために、我々はソースフラックスの吸収を第一に、染料分子の同じ集団による蛍光放射の再吸収を第二に考える必要がある。式（１ｂ，２）を適用して、蛍光光放射の確率およびサンプル内でのその蛍光光子の再吸収の確率はどちらもｎ、共役分子当りの蛍光体の数、に比例する。我々は、蛍光体の放射スペクトルのピークに対応する波長についてλｐ（＞λｓ）と書く。
【００５３】
よって、サンプルのジオメトリーと蛍光体のそのホスト分子との相互作用の両方の詳細を無視すると、任意の単位で輝度関数はそれから、生成および再吸収確率の積から次のように見つけられる。
【００５４】
S = [k1n][1-k2n]                                                    -(4a)
これは、
S = an-bn2                                                          -(4b)
の形であり、ここでａ＝k1、ｂ＝ａk2は蛍光体の特性である。前者の定数の緊密な同定は、輝度関数の生物学的定義：
S(n) = n.RQY(n)                                                      -(5)
ここでRQY(n)はラベル付け度、ｎ、についての相対的量子収量を表記する、から得られる。式（４ｂ）から、
【数２】
2010515074.tif 000004
【００５５】
が得られる。
【００５６】
式（４ｂ）を微分すると、我々は、もしnpeakが最大光発生量に対応するｎの値であれば、我々が、
【数３】
2010515074.tif 000005
【００５７】
をもつことを見つける。
【００５８】
従って、最適ラベル付け度は、定数ａとｂ（または単純にk2）が決定されているあらゆる蛍光体について推定することができる。同じ分析は、それについて信号が完全に消光される、最大有用ラベル付け密度nzeroを与える。
【００５９】
nzero = 2npeak                                                          -(8)
よって、自己吸収による自己消光を見せる蛍光体を定義する特性は、最大ラベル付け度が、最大光発生量の丁度２倍であることである。形式的には、この結果は弱い吸収という最初の数学的仮定およびほとんどの蛍光体について吸収スペクトルは放射スペクトルと完全には重複しないという物理的観測と相容れない。輝度関数の物理的（上記）および生物学的定義は、参照標準の絶対量子収量である積算ファクターによってのみ異なる（下記参照）。
【００６０】
公表されたデータとの比較
図１から６は、公表されたＳ（ｎ）データセットを式（４ｂ）に基づいた計算と比較する。我々は、ａとｂの決定された値について、自己消光の「自己吸収」モデルから導出された普遍的関数は、様々な生物分子に共役された、多数の良く知られた染料での測定によって良く支持されていることが分かる[B. Randolph and A.S. Waggoner, Nucleic Acids Research 25 (1997) 2923; N. Panchuk-Voloshina and seven co-authors, Bioconjugate Chem. 11 (2000) 696; J.E. Berlier and fourteen co-authors, J. Histochemistry and Cytochemistry 51 (2003) 1699; Invitrogen (formerly Molecular Probes Inc., Oregon) Online Handbook, Section 1, http://www.probes.com/handbook/sections/0001.html; C. Lefevre, H.C. Kang, R.P. Haugland, N. Malekzadeh, S. Arttamangkul and R.P. Haugland, Bioconjugate Chem. 7 (1996) 482]。F-EXとTexas Red-Xデータセット（それぞれ図１と５）は特に完全消光に対応するラベル付け度の半分において最大光発生量を見せる。
【００６１】
図４と５はまた、最大光発生量が、（テーブル１に定義された）GAMのような（はるかに重たい）二次抗体共役についてよりも、蛋白質streptavidinに共役された蛍光体についての方がより高いｎ値で起こることを示す。これらの抗体の質量は文献で見つけることは難しいが、それだけで約５０，０００Ｄａの質量をもつimmunoglobin(Ig)の単一の重い（Ｈ）鎖は、streptavidinとほぼ同じ重さである。よって、蛍光信号は共役分子の質量の逆数に依存すべきである、という我々の予測は確認されたように見える。図３に表された他の蛋白質−Concanavidin A−は、１０４ｋＤａにおいてstreptavidinよりも約２倍重たい。
【００６２】
新しい蛍光体の自己消光性質の予測
基本的な物理的データだけが与えられたときに、新しい蛍光体について最適ラベル付け度を予測できることは有用である。
【００６３】
式（４）に戻って、蛍光体定数k1は、蛍光光生成プロセスの詳細と、与えられた吸収体ジオメトリーにおける蛍光光波長依存損失を考慮に入れ、それは蛍光体とその共役生物分子の間の化学結合の微妙さを含む。従って測定された量で言うと、k1は、既に実証された（式（６））ように、量子収量Ｑ（蛍光光子／吸収された光子）と、消滅係数の最大値、εmax、に関連する。対照的に蛍光体定数k2は、蛍光体の放射および吸収スペクトルの間の重複度も考慮に入れるべきである。この重複の１つの尺度は、最大放射の波長における消滅係数の値、ε(λp)、である。従って、測定可能な量の組み合わせ：
R = Qεmax/ε(λp)                                                   -(9)
は、もし自己消光の自己吸収モデルが正しければ、npeakを追跡すべきであると主張し得る。
【００６４】
この仮説をテストするために、我々は、共通のラベル付け度、ｎ＝１、について（理想的に）測定された、絶対量子収量Ｑの値を使う。容易に利用可能な効率値は通常スペクトル的に同様な蛍光体のペア毎の比較を参照し、蛍光体ペアの吸収度に合致するように選ばれたラベル付け度について（Ｓ１０１のような）参照標準に対して測定されたものである。テーブル２（下記）は、相対的量子収量RQY(n)についての値と、
【数４】
2010515074.tif 000006
【００６５】
を通じて望ましい絶対量子収量Ｑ（ｎ＝１）に到達するのに使われる修正ファクターとを与える。
【表１】
2010515074.tif 000007
【００６６】
よって、我々は、全ての基本データが利用可能なGAMに共役された８つの蛍光体について、npeakと図６に示された良度指数Ｒの間の関係を構築することができる。一つの外郭を別として、関係は線形で、Ｒの推定が利用可能ではない２つの更なる蛍光体−Alexa（登録商標）568とAlexa（登録商標）594−についてのnpeakの値を予測することを可能にする。Alexa（登録商標）568については、R=1.28であり、輝度関数が約２蛍光体／分子において最大を有するべきであることを暗示している。Alexa（登録商標）594については、R=2.39であり、ｎ〜４におけるピークを暗示している。
【００６７】
２つ以上の蛍光体への拡張
もし２つの蛍光体（１と２で下つき添え字された）が同じ共役分子をそれぞれn1とn2の度合でラベル付けし、両方の蛍光体が独立に自己吸収による自己消光を見せるならば、輝度関数Ｓは：
S(n1,n2) = a1n1-b1n12+a2n2-b2n22-(c12+c21) n1n2                    -(11a)
の形を有する。
【００６８】
項c12は、蛍光体２によって吸収される蛍光体１からの放射を考慮に入れる一方、c21は蛍光体１によって吸収される蛍光体２からの放射を記述する。つまり、２つの信号チャネルにおいて観察される相互消光がある可能性が高い。
【００６９】
典型的には、二重ラベル付け実験のために選ばれた蛍光体は、非常に区別された（吸収および）放射スペクトルを有する。良く定義されたバンドパスで測定すると、従ってペアの１つの蛍光体だけの印を見ることを期待するであろうが、我々のモデルはそうではないことを示す。蛍光体番号１に適切なバンドパスでは：
S１(n1,n2) = S(n1)-c12n1n2<S(n1)                                  -(11b)
および                        
(IS )1 = I0S1(n1,n2)Ncσ1[dΩ/4π]                                -(11c)
であり、蛍光体番号２についての同様な表現：
S2(n1,n2) = S(n2)-c21n1n2<S(n2)                                   -(11d)
(IS )2 = I0S2(n1,n2)Ncσ2[dΩ/4π]                                -(11e)
がある。
【００７０】
この議論から多くのポイントが現れ、それは（例えば）ＤＮＡマイクロアレイデータの解釈に有用な含蓄を持つ。
【００７１】
出力バンドパス間で放射スペクトルのこぼれが完全に無い場合でも、二重（または、拡張により、多重）ラベル付け実験は、相互消光のため出力チャネルにおいて相互依存した信号強度を見せることが期待できる。その濃度が一定に保たれた、１つの蛍光体からの蛍光強度は、第二の蛍光体の濃度の増加によって低減される。
【００７２】
式（１１ｃ）と（１１ｅ）に記載された信号強度は従って、マイクロアレイ実験における「本当の」表現度の過小評価を導く。更に、もし蛍光体が最大放射の増加する波長によって並べられていれば、我々はc21＜＜c12であることを期待する。つまり、二重ラベル付け実験における赤い蛍光体の応答は、第二の種の存在によって、青い蛍光体のそれよりもより少なく摂動される。
【００７３】
上記考察は、検出器カリブレーションのための蛍光体キットのための２つ以上の蛍光体を選択するのに使うことができることも、当業者は理解するであろう。蛍光体は、例えば、
最適には検出器感度を考慮に入れて、上記式に従って各々からの信号を最適化（最大に）するように選択されても良い。
【００７４】
これらの予測は、特にＳＴＪ検出器と共に希釈実験の形の実験的テストを受けることができ、半導体トンネルジャンクション（ＳＴＪ）検出器の使用は、Alexa（登録商標）488（トリプルバンド出力フィルターの５１０−５４３ｎｍ帯における放射）とＣｙ３（より長い波長帯６０７−６５９ｎｍにおける放射）の両方と共に、１：４から４：１の比率の範囲で、ラベル付けされたＤＮＡから光子毎のベースでの蛍光スペクトルの登録を許容する。これら２つの帯域における計数レートはテーブル３（下記）にまとめられている。計数レートの比は、希釈比に大体線形に従うが、ダイナミックレンジは、蛍光体の既知の量から期待される１６：１ではなく、６．４：１だけである。本コンテクストでより興味深いのは、存在するＣｙ３の量がパリティより上に増加されるにつれたAlexa（登録商標）488信号の減少（０．４５から０．２７〜０．３２カウント／秒まで）と、Alexa（登録商標）488の量の増加につれたＣｙ３信号の減少（１．８５から０．８〜１．３９カウント／秒まで）である。これらの結果は、様々なサンプル中に存在する染料の絶対量の微妙な変動のアーチファクトであり得るが、第二の蛍光体の増加された存在による１つの蛍光体の信号強度の抑制は、式（１１ａ−ｅ）にもはっきりと具現化されている。
【００７５】
これらの結果は、（マイクロアレイのような）多数蛍光体システムからの生物学的情報の完全な復元が、自己および相互消光による非線形な振る舞いを考慮に入れるために、テーブル３にまとめられた種類の準備的カリブレーション実験から恩恵を受けることを示唆する。
【表２】
2010515074.tif 000008
【００７６】
上述した輝度関数は、数々の異なる方法で採用されても良いことを当業者は理解するであろう。例えば、c12の値（およびオプションでc21も）は、組み合わされた輝度関数Ｓがn1とn2の異なる値の範囲について測定されたカリブレーション手順によって決定されても良い。それからS(n1,n2)の値を測定しても良く、c12を知ることで、S(n1)の値を決定しても良く、S(n2)についても同様である。式１１ａを使って、自己消光を考慮に入れても良い（k2と関連しているbを通じて）。
【００７７】
図８は、記載された方法の実施形態を実装するように構成されたマイクロアレイスキャナおよび分析システム８００のブロック図を示す。システムは、式９ｂに従って、２つの異なる蛍光体でタグ付けされたエンティティについてのラベル付け度信号を決定するためのコードを格納しているデータプロセッサ８０６に出力を提供するインターフェース８０４に結合された、超伝導トンネルジャンクション検出器を採用しているマイクロアレイスキャナ８０２を含む。このデータプロセッサの出力は、マイクロアレイからの蛍光データを更に分析するように更なるデータプロセッサ８０８に提供される。
【００７８】
マイクロアレイ分析への応用
例示的２色マイクロアレイ分析の望ましい結果は、正常または制御状態に対して疾病または実験状態において顕著に過大または過小表現されている遺伝子の同定である。実験状態信号は、第二の色チャネル（Ｃｙ５で表された赤）中の強度に対する１つの色チャネル（下記の例では蛍光体Ｃｙ３で表された緑）中の蛍光強度によって表される。あらゆるマイクロアレイ分析における決定的なステップは、従って、パリティライン−２つのチャネルでの表現度−信号強度によって外部的に表される−が等しいポイントの場所、を確立することである。上記の分析は、パリティラインを緊密に近似する明瞭な方法を示唆する。
【００７９】
実験強度の制御強度に対する比をＧ／Ｒと表記することにする。すると、
【数５】
2010515074.tif 000009
【００８０】
この一般的表現は、マイクロアレイのコンテクストではｎの物理的値を同定することが簡単ではないので特に有用ではないが、有用である２つの制限的ケースを同定することができるる。
【数６】
2010515074.tif 000010
【００８１】
のとき、ｎは１単位に近づき、
【数７】
2010515074.tif 000011
【００８２】
のとき、ｎは無限に近づく。
【００８３】
あらゆる与えられた蛍光体について、２つの波長独立な定数：ａとｂがある。上記式において、下つき添え字Ｇは緑蛍光体（例えばＣｙ３）を表記する。下つき添え字Ｒは赤蛍光体（例えば、Ｃｙ５）を表記する。aG、bG、aR、bR の値は、光発生量対ラベル付け度の公表されたカーブの分析からは独立に決定される。残りの結合定数（cRG）は、蛍光体間の相互自己消光を表現し、データへの適合によって固定される自由パラメータである。
【００８４】
式（１３ａ，ｂ）の全てのパラメータは、cRG を除き、個々のＣｙ３およびＣｙ５蛍光体の以前の特性付けから既知であり、cRG は希釈なケース、式（１３ａ）、では安全に０であると近似できるが、集中的なケース、式（１３ｂ）、ではそうではない。よって、我々は、データ（cRG）に適合されるべき自由パラメータを１つだけもち、システムの生物学に関する先験的な仮定のない、ローカルなパリティラインの制限的表現を有する。
【００８５】
手順は、Stamford Microarray Database (SMD)からのデータセットを使って図９（ａ，ｂ）に描かれている。データセットＳＭＤ３９３２からの最初の１０００個の遺伝子（合計２３，０００個から）は（基数２）log-log空間にプロットされており、上位９００と下位９０２の「タンジェント」ラインが、差し込み図に記録され以下に示された蛍光体パラメータの値をもつ式１３ａ，ｂから見つけられた：
aG = 0.55
bG = 0.044
aR = 1.65
bR = 0.55
cRG = 0.4(適合された)
SG = K.SR
ライン９００について、ｋ＝(bG+cRG)/bR
ライン９０２について、ｋ＝(aG-bG)/(aR-bR)
ライン９０４について、ｋ＝1
全体的なパリティラインは、データポイントの大部分を含んでいる「ボックス」の左下（ライン９０２の底）と右上（ライン９０４の頭）を結んだ対角的直線であると取られている。
【００８６】
図９（ｂ）は、測定された緑信号強度と、赤信号強度と真のパリティラインの知識から予測されたものとの間の差をポイント毎のベースで差し引くことによって、このパリティライン上にデータをつぶした結果を示す。図９（ｂ）はまた、最初の１０００個のデータポイントへのベストフィットは、シーケンス中の次の１０００個（異なる形状のデータポイントは、２つの異なる１０００ポイントデータセットを表す）についても良好であることを示す。
【００８７】
よって、上記例は、マイクロアレイデータスキャッタープロットを「ボックス」化するように蛍光体輝度関数比Ｓ（ｎ）Ｃｙ３／Ｓ（ｎ）Ｃｙ５の制限的ケースを使う。ボックスの隅を結ぶことは、２つの蛍光体応答の非線形性を考慮に入れて、真のパリティラインへの良好な近似を与える。そして、データポイントと確立されたパリティラインの間のｙ軸での差を計算することにより、データが名目上のパリティライン上につぶされる。図９ｃは、変換後の、単位信号対雑音比Ｓ／Ｎラインの同定（単位Ｓ／Ｎ閾値を課すること）をもつ、ｌｎ２比対制御Ｃｙ５信号、（もし何らかの遺伝子表現があれば平均化はｘ軸をよりノイズが多いものにするので、Ｃｙ３とＣｙ５の平均に対してではない）、のＭＡプロットを示す。オプションとして、それから、例えば、固定パターンノイズのようなシステマティックなノイズに基づいてポイントの拒絶があっても良い。
【００８８】
システムHFF-PDS(no. 3932)についてのマイクロアレイデータの２８×２７のサブアレイパターンに関連する固定ノイズパターンの証拠がある。図１０ａでは、データ列をモジュロ（この例では）２８で折り畳むことは、信号チャネル１中のノイズのその平均からの巡回的なずれを生成する。よって、全てのサイクルのチャネル８−１０と２５−２８は信頼できないものとしてフラグ付けされても良い。また、低信号レベルにおいて、１つのデジタル数の他のものによる分割と関連付けられた「好まれた位置」の証拠がある。図１０ｂは、（８±２）の範囲内の２つの整数の１つを他によって割ることの２５個の可能性のある結果を示す。更に、ローエンドにおける信号レベルの広がりは、両チャネルでのポアソン統計によって摂動された厳密なパリティ（Ｒ＝Ｇ）を仮定することによって説明ができる。これは図１０ｃに示されたシミュレーションによって確認されるが、これは「過大」および「過小」表現された遺伝子と同定され得るものを生成する。
【００８９】
図１０ｃは、リアルデータをそれに変換することができるモデルテンプレートを提供する。図１０ｄは、このテンプレート上にオーバーレイされた生の３９３２データセットを示す。
【００９０】
従って分析は、好ましくは、システマティックエラー分析と修正、特に：固定データパターンに対応するデータポイントの除去（上記の例ではｘ＝２８）；理論的および測定されたＬｎ（Ｇ／Ｒ）対Ｌｎ（Ｒ）パターン（ＲとＧは、例えば赤と緑のような第一および第二の色の信号データからなる）の間の合致の（客観的な）最小化を目的とした上述したようなアプローチ、の１つ以上を含む。
【００９１】
精密な検査では、モジュロ−ｘ（例えば２８）固定パターンノイズ効果は、「間違って表現された」遺伝子に対する最も有効な判別式ではないことが分かる。もしピンアレイがχ×ｙ（２７×２８）のサイズまたはモジュロχｙ（例えば７５６）サイクルを有すれば−それは実験的に確認されている：モジュロ２８効果は小さいさざ波として観察可能であるが、サイクルの同じ部分に繰り返す「波」と「巨大な逸脱」も起きる。よって、単純に「全ての２８番目のイベント」を拒絶することよりもより効率的に固定パターンノイズを削減するやり方は、閾値より大きな平均ノイズ値をもつか、例えば２００−５５０のような決められた範囲の外にある全てのイベントを、（例えば）チャネル１とチャネル２の両方で拒絶することである。
【００９２】
平均ノイズが例えば５５０のような閾値レベルよりも少ないこと、という要求を課することは、約８ビットのＳ／Ｎ＝１レベルより上の明らかに過小表現された遺伝子の数を、殆ど０まで削減する。平均ノイズレベルが例えば２００のような閾値レベルよりも下に落ちるべきではない、という条件を課することは、過大表現された遺伝子上に同様の効果を持つ。
【００９３】
多くの他の効果的な代替形が当業者に思い浮かぶことは疑いようが無い。特に我々が記載する技術の応用は、ＳＴＪ型検出器を使うことに限定はされない。
【００９４】
我々が記載する技術はまた、例えば高スループットの薬物発見のような、全体または生体セルを巻き込んだ実験を含んだ、マイクロ滴定プレート上で行われた比較生化学からの蛍光画像を修正すること、に応用されても良い。また、フローサイトメトリーを巻き込んだ生物学的実験において蛍光体がタグ付けされた半分が付着された全体または生体セルまたは合成粒子の蛍光撮像に応用されても良い。また、特に例えば癌の発達の最初期ステージの同定のための、単一分子検出のレベルまで下がる蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡による組織および全体セル撮像に応用されても良い。全体セル中の個々の蛋白質の空間的位置と動きは、基礎生物医学的研究および薬物発見の両方において初期発展下にある。大半の全体セル実験は現在は質的な性質のものであるが、量的な撮像への増加する需要があり、それには蛍光体間の結合とエネルギー移動についての理解と修正が要求される。特に全体セル中のバイオマーカーの自動蛍光の特性付けを巻き込んだ、現在は揺籃期にある将来の研究の重要な領域でも同様である。
【００９５】
発明は記載された実施形態に限定はされず、ここに添付された請求項の精神と範囲内に入る当業者に明らかな変形を包含することが理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【国際調査報告】
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