(57)【要約】  本発明は、キメラＶＺＶ糖タンパク質を含む水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の新規キメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）を開示する。本発明はまた、キメラＶＺＶ−ＶＬＰのワクチン製剤、及び対象において免疫応答を誘導する方法も開示する。
2010533737.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスコアタンパク質と、少なくとも１つの水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）タンパク質とを含むキメラＶＬＰであって、ＶＬＰは酵母Ｔｙタンパク質を含まず、且つＶＺＶ核酸を含まない、キメラＶＬＰ。
【請求項２】
前記ＶＺＶタンパク質がキメラであり、且つＶＺＶタンパク質のエクトドメインと、異種タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインとを含む、請求項１に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項３】
前記異種タンパク質が、前記ウイルスコアタンパク質と結合する、請求項２に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項４】
前記ＶＺＶタンパク質が、ｇＥ、ｇＩ、ｇＢ、ｇＨ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＣ、及びｇＭからなる群から選択される、請求項２に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項５】
前記ＶＺＶタンパク質がｇＥである、請求項４に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項６】
前記キメラＶＬＰがｇＥ及びｇＩを含む、請求項４に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項７】
異種タンパク質の前記膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインが、インフルエンザウイルスに由来する、請求項２に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項８】
前記インフルエンザウイルスタンパク質が、赤血球凝集素（ＨＡ）及び／又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）である、請求項７に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項９】
前記ＨＡ及び／又はＮＡが、インフルエンザウイルスA/Indonesia/5/05に由来する、請求項８に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１０】
前記ウイルスコアが、オルトミクソウイルス又はパラミクソウイルスに由来する、請求項１に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１１】
前記ウイルスコアが、インフルエンザウイルスＭ１、ＮＤＶ  Ｍ、ＲＳＶ  Ｍ及びＨＩＶ  ｇａｇからなる群から選択される、請求項１に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１２】
前記ウイルスコアがインフルエンザウイルスＭ１である、請求項１１に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１３】
前記インフルエンザＭ１が、インフルエンザウイルスA/Indonesia/5/05に由来する、請求項１２に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１４】
前記キメラＶＬＰが、配列番号１又は配列番号９を含む、請求項１に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１５】
前記キメラＶＬＰが、配列番号１及び配列番号９を含む、請求項１に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１６】
少なくとも１つのＶＺＶタンパク質とウイルスコアタンパク質とをコードする１つ又は複数のベクターを好適な宿主細胞にトランスフェクトすることと、ＶＬＰを形成可能な条件下で前記キメラＶＺＶ及びウイルスコアタンパク質を発現させることとを含む、キメラＶＬＰを産生する方法であって、前記宿主細胞が酵母Ｔｙタンパク質を含まない、方法。
【請求項１７】
前記ＶＺＶタンパク質がキメラであり、且つＶＺＶタンパク質のエクトドメインと異種タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインとを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記異種タンパク質が、前記ウイルスコアタンパク質と結合する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのＶＺＶタンパク質が、ｇＥ、ｇＩ、ｇＢ、ｇＨ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＣ、及びｇＭからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＶＺＶタンパク質が、ｇＥ又はｇＩである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＶＺＶタンパク質が、ｇＥ及びｇＩである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
異種タンパク質の前記膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインが、インフルエンザウイルスに由来する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記インフルエンザウイルスタンパク質が、ＨＡ及び／又はＮＡである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＨＡ及び／又はＮＡが、インフルエンザウイルスA/Indonesia/5/05に由来する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウイルスコアが、オルトミクソウイルスに由来する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウイルスコアがパラミクソウイルスに由来し、但し前記コア又はマトリクスタンパク質は呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｍであるものとする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルスコアが、インフルエンザウイルスＭ１、ＮＤＶ  Ｍ、ＲＳＶ  Ｍ及びＨＩＶ  ｇａｇからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ウイルスコアが、インフルエンザウイルスＭ１である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記インフルエンザＭ１が、インフルエンザウイルスA/Indonesia/5/05に由来する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記キメラＶＬＰが、配列番号１又は配列番号９を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
前記キメラＶＬＰが、配列番号１及び配列番号９を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項３２】
キメラＶＬＰを含む抗原製剤であって、前記キメラＶＬＰが、少なくとも１つのＶＺＶタンパク質とウイルスコアタンパク質とを含み、且つ酵母Ｔｙタンパク質を含まない、抗原製剤。
【請求項３３】
前記ＶＺＶタンパク質がキメラであり、且つＶＺＶタンパク質のエクトドメインと異種タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインとを含む、請求項３２に記載の抗原製剤。
【請求項３４】
前記異種タンパク質が、前記ウイルスコアタンパク質と結合する、請求項３３に記載の抗原製剤。
【請求項３５】
少なくとも１つのＶＺＶタンパク質が、ｇＥ、ｇＩ、ｇＢ、ｇＨ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＣ、及びｇＭからなる群から選択される、請求項３２に記載の抗原製剤。
【請求項３６】
前記ＶＺＶタンパク質が、ｇＥ又はｇＩである、請求項３５に記載の抗原製剤。
【請求項３７】
前記ＶＺＶタンパク質が、ｇＥ及びｇＩである、請求項３５に記載の抗原製剤。
【請求項３８】
前記コアタンパク質が、インフルエンザウイルスA/Indonesia/5/05由来のインフルエンザＭ１である、請求項３２に記載の抗原製剤。
【請求項３９】
前記キメラＶＬＰが、配列番号１又は配列番号９を含む、請求項３２に記載の抗原製剤。
【請求項４０】
前記キメラＶＬＰが、配列番号１及び配列番号９を含む、請求項３２に記載の抗原製剤。
【請求項４１】
キメラＶＬＰを含むワクチンであって、前記キメラＶＬＰが、少なくとも１つのＶＺＶタンパク質とウイルスコアタンパク質とを含み、且つ酵母Ｔｙタンパク質を含まない、ワクチン。
【請求項４２】
前記キメラＶＺＶタンパク質がキメラであり、且つＶＺＶタンパク質のエクトドメインと異種タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインとを含む、請求項４１に記載のワクチン。
【請求項４３】
前記異種タンパク質が、前記ウイルスコアタンパク質と結合する、請求項４２に記載のワクチン。
【請求項４４】
少なくとも１つのＶＺＶタンパク質が、ｇＥ、ｇＩ、ｇＢ、ｇＨ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＣ、及びｇＭからなる群から選択される、請求項４０に記載のワクチン。
【請求項４５】
前記ＶＺＶタンパク質が、ｇＥ又はｇＩである、請求項４４に記載のワクチン。
【請求項４６】
前記ＶＺＶタンパク質が、ｇＥ及びｇＩである、請求項４４に記載のワクチン。
【請求項４７】
前記コアタンパク質が、インフルエンザウイルスA/Indonesia/5/05由来のインフルエンザＭ１である、請求項４１に記載のワクチン。
【請求項４８】
前記キメラＶＬＰが、配列番号１又は配列番号９を含む、請求項４１に記載のワクチン。
【請求項４９】
前記キメラＶＬＰが、配列番号１及び配列番号９を含む、請求項４１に記載のワクチン。
【請求項５０】
ヒト又は動物において感染に対する防御免疫を誘発する方法であって、ヒト又は動物に対し、キメラＶＺＶ−ＶＬＰを含む抗原製剤又はワクチンを投与することを含み、前記キメラＶＺＶ−ＶＬＰが、少なくとも１つのキメラＶＺＶタンパク質とウイルスコアタンパク質とを含み、前記キメラＶＬＰが、酵母Ｔｙタンパク質を含まず、且つＶＺＶ核酸を含まない、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年９月９日出願の米国仮特許出願第６０／９７０，５９２号、２００８年５月２０日出願の米国仮特許出願第６１／０７１，８３５号、及び２００７年７月１９日出願の米国仮特許出願第６０／９５０，７０７号に対する優先権を主張し、これらの全ては、あらゆる目的のため全体として参照により本明細書に援用される。
【０００２】
電子的に提出されたテキストファイルに関する記載事項
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、全体として参照により本明細書に援用される：配列表のコンピュータ取り可能フォーマットコピー（ファイル名：NOVV 035 02WO SeqList_ST25.txt、記録日：２００８年７月２１日、ファイルサイズ３７キロバイト）。
【背景技術】
【０００３】
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）は、ヒトヘルペスウイルス３型（ＨＨＶ−３）としても知られ、ウイルスのうちヘルペスウイルス（Herpesviridae）科のアルファヘルペスウイルス亜科のメンバーである。ＶＺＶはエンベロープを有するウイルスであり、約１２５，０００ヌクレオチドの線状二本鎖ＤＮＡをゲノムとする。そのゲノムは正二十面体のヌクレオカプシドによって囲い込まれている。ヌクレオカプシドとウイルスエンベロープとの間の空間に位置するテグメントは、ウイルスがコードするタンパク質と酵素とからなる構造体である。ウイルスエンベロープは宿主細胞膜から得られ、ウイルスがコードする糖タンパク質を含む。
【０００４】
ヒトヘルペスウイルスのなかで最小のＶＺＶゲノムは、少なくとも７０個のオープンリーディングフレームをコードし、そのうち８個は、ウイルス複製周期の種々の段階で機能する推定上の糖タンパク質（ｇＥ、ｇＩ、ｇＢ、ｇＨ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＣ、及びｇＭ）をコードする。糖タンパク質Ｅ（ｇＥ、ＯＲＦ  ６８とも表記される）はウイルス複製に必須であり（Mallory et al. (1997)J. Virol. 71: 8279-8288；Mo et al. (2002)Virology 304: 176-186）、感染細胞並びに成熟ビリオン中に最も豊富に見られる糖タンパク質である（Grose, 2002, The predominant varicella-zoster virus gE and gI glycoprotein complex, In Structure-function relationships of human pathogenic viruses, Holzenburg and Bogner (eds.), Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY）。糖タンパク質Ｉ（ｇＩ、ＯＲＦ  ６７とも表記される）は感染細胞中でｇＥと複合体を形成し、それによって双方の糖タンパク質のエンドサイトーシスが促進されて、それらはトランス−ゴルジに送り込まれ、そこで最終的なウイルスエンベロープが得られる（Olson and Grose (1998)J. Virol. 72: 1542-1551）。ウイルス侵入において役割を果たすと考えられる糖タンパク質Ｂ（ｇＢ、ＯＲＦ  ３１とも表記される）は中和抗体と結合し、２番目に最もよく見られる糖タンパク質である（Arvin (1996)Clin. Microbiol. Rev. 9: 361-381に論考がある）。糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）は、ウイルスの細胞間伝播を促進する融合機能を有すると考えられる。ｇＥ、ｇＢ、及びｇＨに対する抗体は、自然感染後及びワクチン接種後によく見られ、インビトロでウイルスの感染力を中和することが示されている（Keller et al. (1984)J. Virol. 52: 293-297；Arvin et al. (1986)J. Immunol. 137: 1346-1351；Vafai et al. (1988)J. Virol. 62: 2544-2551；Forghani et al. (1990)J. Clin. Microbiol. 28: 2500-2506）。
【０００５】
ＶＺＶに初感染すると水疱瘡（水痘）を発症し、これは、主に顔面及び体幹上に生じる極めて伝染性の高い皮膚発疹を特徴とする。初期感染後、ウイルスＤＮＡは宿主神経細胞のゲノムに組み込まれ、数年間は潜伏したままとなり得る。成人においてウイルスは再活性化し、帯状疱疹（帯状ヘルペス）の疾患を引き起こし得る。帯状疱疹は、初感染時に生じたものとは異なる皮膚発疹を生じる。この発疹は激痛を伴い、結果として帯状疱疹後神経痛などのより重篤な病態となり得る。
【０００６】
水痘ワクチン（Varivax）は一般公衆に利用可能であり、米国を含むいくつかの国では、子供のワクチン接種推奨スケジュールに加えられている。高齢の集団構成員における帯状疱疹の予防用として、より高濃度の水痘ワクチン製剤（Zostavax）がFood and Drug Administrationにより認可されている。水痘ワクチンは安全性が証明されているものの、ワクチンによって付与されるＶＺＶ感染症に対する免疫は、時間の経過とともに減弱するという証拠がいくつかある（Chaves et al. (2007)N. Engl. J. Med. 356: 1121-1129）。従って、ワクチン接種を受けた個人であっても依然として帯状疱疹に罹り易く、ＶＺＶによって引き起こされるその病態はより重篤である。加えて、ワクチンは弱毒生ウイルスから製造され、そのため個人がワクチン接種によって水疱瘡又は帯状疱疹のいずれかを発症する可能性が生じる。実際、ワクチンに使用された株によって引き起こされたと見られる帯状疱疹の症例がいくつか報告されている（Matsubara et al. (1995). Acta Paediatr Jpn 37: 648-50；Hammerschlag et al. (1989). J Infect Dis. 160: 535-7）。ワクチンに存在する弱毒生ウイルスはまた、免疫無防備状態の個人におけるワクチンの使用も制限する。
【０００７】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、構造的には成熟ビリオンと類似しているが、ウイルスゲノムがなく、ウイルス複製が起こり得ないようにされている。ＶＬＰは、インタクトなウイルスと同じく、カプシドタンパク質及びウイルスエンベロープタンパク質などの抗原タンパク質を含み、さらに、その表面上に外来性の構造タンパク質を発現するように作製することができる。従って、ＶＬＰは免疫原性組成物（例えばワクチン）として安全に投与することができる。さらに、ＶＬＰは天然ウイルスに似ているとともに多価の粒子状構造であるため、ＶＬＰは可溶性抗原と比べて中和抗体の誘導により有効であり得る。
【０００８】
糖タンパク質又はテグメントタンパク質（tegument protein）を発現するＶＬＰが、これまで種々のヘルペスウイルス科のメンバーから作り出されている。エンベロープを有するテグメントタンパク質からなるLight粒子（Ｌ粒子）が、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、ウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）、又は仮性狂犬病ウイルスのいずれかに感染させた細胞から得られている（McLauchlan and Rixon (1992)J. Gen. Virol. 73: 269-276；米国特許第５，３８４，１２２号）。ウイルスＤＮＡ複製阻害薬の存在下でＨＳＶ−１に感染させた細胞から、プレウイルスＤＮＡ複製エンベロープ粒子（pre-viral DNA replication enveloped particle：ＰＲＥＰ）と称される別のタイプのＶＬＰを生成することも可能となった。ＰＲＥＰは構造上はＬ粒子と似ていて、但し異なるタンパク質組成物を含んでいた（Dargan et al. (1995)J. Virol. 69: 4924- 4932；米国特許第５，９９４，１１６号）。酵母Ｔｙレトロトランスポゾンによってコードされるタンパク質ｐ１を使用する技術により、ＶＺＶからｇＥタンパク質の断片を発現するハイブリッドＶＬＰが産生されている（Garcia-Valcarcel et al. (1997)Vaccine 15: 709-719；Welsh et al. (1999)J. Med. Virol. 59: 78-83；米国特許第６，０６０，０６４号）。本発明は、少なくとも１つのＶＺＶタンパク質を含むが、酵母Ｔｙタンパク質は含まない新規キメラＶＬＰについて記載する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ウイルスコアタンパク質と少なくとも１つの水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）タンパク質とを含む精製キメラＶＬＰを含み、ここで前記ＶＬＰは、酵母Ｔｙタンパク質を含まず、且つＶＺＶ核酸を含まない。一実施形態において、前記ＶＺＶタンパク質はキメラであり、ＶＺＶタンパク質のエクトドメインと異種タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインとを含む。別の実施形態において、前記異種タンパク質は、前記ウイルスコアタンパク質と結合する。別の実施形態において、前記ＶＺＶタンパク質は、ｇＥ、ｇＩ、ｇＢ、ｇＨ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＣ、及びｇＭからなる群から選択される。別の実施形態において、前記ＶＺＶタンパク質は、ｇＥ及び／又はｇＩである。別の実施形態において、前記異種タンパク質の前記膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインは、インフルエンザウイルスに由来する。別の実施形態において、前記インフルエンザウイルスタンパク質は、赤血球凝集素（ＨＡ）及び／又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）である。別の実施形態において、前記ＨＡ及び／又はＮＡは、インフルエンザウイルスA/Indonesia/5/05に由来する。別の実施形態において、前記ウイルスコアは、オルトミクソウイルスに由来する。別の実施形態において、前記ウイルスコアは、パラミクソウイルスに由来する。別の実施形態において、前記キメラＶＬＰは、配列番号１及び／又は配列番号９を含む。
【００１０】
本発明はまた、キメラＶＬＰを産生する方法も含み、これは、少なくとも１つのＶＺＶタンパク質とウイルスコアタンパク質とをコードするベクターを好適な宿主細胞にトランスフェクトすることと、ＶＬＰを形成可能な条件下で前記キメラＶＺＶとウイルスコアタンパク質とを発現させることとを含み、ここで前記宿主細胞は、酵母Ｔｙタンパク質を含まない。一実施形態において、前記ＶＺＶタンパク質はキメラであり、ＶＺＶタンパク質のエクトドメインと異種タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインとを含む。別の実施形態において、前記ＶＺＶタンパク質は、ｇＥ及び／又はｇＩである。別の実施形態において、前記異種タンパク質は、前記ウイルスコアタンパク質と結合する。別の実施形態において、前記異種タンパク質の前記膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインは、インフルエンザウイルスに由来する。別の実施形態において、前記コアは、インフルエンザウイルスA/Indonesia/5/05由来のインフルエンザウイルスＭ１である。
【００１１】
本発明はまた、ＶＬＰを含む抗原製剤も含み、ここで前記キメラＶＬＰは、少なくとも１つのＶＺＶタンパク質とウイルスコアタンパク質とを含み、且つ酵母Ｔｙタンパク質を含まない。一実施形態において、少なくとも１つのＶＺＶタンパク質はキメラであり、ｇＥ、ｇＩ、ｇＢ、ｇＨ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＣ、及びｇＭからなる群から選択される。別の実施形態において、前記ＶＺＶタンパク質は、ｇＥ及び／又はｇＩである。別の実施形態において、前記ＶＺＶタンパク質は、ｇＥ及び／又はｇＩである。別の実施形態において、前記コアタンパク質は、インフルエンザウイルスA/Indonesia/5/05由来のインフルエンザウイルスＭ１である。
【００１２】
本発明はまた、キメラＶＬＰを含むワクチンも含み、ここで前記キメラＶＬＰは、少なくとも１つのＶＺＶタンパク質とウイルスコアタンパク質とを含み、且つ酵母Ｔｙタンパク質を含まない。一実施形態において、少なくとも１つのＶＺＶタンパク質はキメラであり、ｇＥ、ｇＩ、ｇＢ、ｇＨ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＣ、及びｇＭからなる群から選択される。別の実施形態において、前記ＶＺＶタンパク質は、ｇＥ及び／又はｇＩである。別の実施形態において、前記ＶＺＶタンパク質は、ｇＥ及び／又はｇＩである。別の実施形態において、前記コアタンパク質は、インフルエンザウイルスA/Indonesia/5/05由来のインフルエンザウイルスＭ１（配列番号９）である。
【００１３】
本発明はまた、ヒト又は動物において感染に対する防御免疫を誘発する方法も含み、これは、ヒト又は動物にキメラＶＺＶ−ＶＬＰを含む抗原製剤又はワクチンを投与することを含み、ここで前記キメラＶＺＶ−ＶＬＰは、少なくとも１つのＶＺＶタンパク質とウイルスコアタンパク質とを含み、前記キメラＶＬＰは酵母Ｔｙタンパク質を含まず、且つＶＺＶ核酸を含まない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（Ａ）ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター（ＰｏｌＨ）の下流に鳥インフルエンザA/Indonesia/5/05（Ｈ５Ｎ１）由来のインフルエンザ膜貫通エンドドメインとＣ末端エンドドメインを伴うキメラＶＺＶ  ｇＥ遺伝子を示す。（Ｂ）クマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（左側のパネル）及び抗Ｅモノクローナル抗体によるウエスタンブロット（右側のパネル）を示す。
【図２】精製キメラＶＺＶ  ｇＥ  ＶＬＰのＥＭ分析を示す。ＶＺＶ  ｇＥ（ＨＡ  ＴＭ／ＣＴ）／Ｉｎｄｏ  Ｍ１キメラＶＬＰのＰＴＡによる電子顕微鏡（ＥＭ）ネガティブ染色（高倍率）。黒色バーが１００ｎｍを表す。
【図３】（Ａ）精製キメラＶＺＶ  ｇＥ  ＶＬＰの免疫金ＥＭ分析を示す。ＶＺＶ  ｇＥ（ＨＡ  ＴＭ／ＣＴ）／Ｉｎｄｏ  Ｍ１キメラＶＬＰの免疫金ＥＭ画像。対照である。黒色バーが１００ｎｍを表す。（Ｂ）精製キメラＶＺＶ  ｇＥ  ＶＬＰの免疫金ＥＭ分析を示す。ＶＺＶ  ｇＥ（ＨＡ  ＴＭ／ＣＴ）／Ｉｎｄｏ  Ｍ１キメラＶＬＰの免疫金ＥＭ画像。キメラＶＬＰ上にある６ｎｍの金粒子を示す。黒色バーが１００ｎｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書で使用される用語「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、少なくとも１つの属性がウイルスに似ているが、非感染性であることが立証されている構造体を指す。本発明に係るウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を保持せず、且つＴｙ酵母タンパク質、又はその一部を含有しない。一般に、ウイルス様粒子はウイルスゲノムがなく、複製することができない。加えて、ウイルス様粒子は多くの場合に異種発現によって多量に産生することができ、且つ容易に精製することができる。この用語はまた、以下に記載される方法によって産生される任意のサブウイルス粒子も指す。この用語は、以下に記載される方法又は当該技術分野において公知の方法のうちの任意の方法によって精製することのできるタンパク質凝集体を含む。
【００１６】
本明細書で使用される用語「キメラの」又は「キメラタンパク質」は、ＶＺＶによって産生されることのない成分の一部を含むタンパク質を指す。この用語に酵母Ｔｙ−ｐ１−ＶＺＶ融合タンパク質は含めない。一般に、この用語は、異種タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインと融合したＶＺＶエクトドメインを指す。
【００１７】
本明細書で使用される用語「コアタンパク質」は、宿主細胞からの粒子の出芽及び放出を駆動するタンパク質である。本明細書で使用される用語「コア」及び「マトリクス」タンパク質は同義的に使用される。宿主細胞からの粒子の出芽及び放出を駆動するコアタンパク質の例としては、インフルエンザＭ１及びニューカッスル病タンパク質Ｍが含まれる。
【００１８】
本明細書で使用される用語「抗原製剤」又は「抗原組成物」は、脊椎動物、例えば哺乳動物に投与されると、免疫応答を誘導し得る製剤を指す。
【００１９】
本明細書で使用される用語「精製ＶＬＰ」は、混合物中の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上について他の分子（溶媒を除く）を含まない本発明のＶＬＰの製剤を指す。例えば、本発明のＶＬＰは、本発明のＶＬＰの作製に関連した他のウイルス、タンパク質、脂質、及び炭水化物を実質的に含まないものであり得る。この用語はまた、夾雑（contaminating）ＶＺＶゲノムＤＮＡ又はその一部を有するＶＬＰから単離されたＶＬＰも包含する。
【００２０】
本明細書で使用される用語「キメラＶＬＰ」は、少なくとも２つの異なるウイルス（異種タンパク質）由来のタンパク質、又はその一部を含有するＶＬＰを指す。本発明の目的上、タンパク質の１つは、宿主細胞からＶＬＰの形成を駆動することのできるウイルスに由来し（例えば、インフルエンザＭ１）、他方のタンパク質はキメラＶＺＶタンパク質である。
【００２１】
本明細書で使用される用語「ワクチン」は、本発明のＶＬＰを含有する製剤を指し、これは、脊椎動物に投与可能な形態であり、且つ、感染症を予防及び／又は改善させたり、及び／又は感染症の少なくとも１つの症状を軽減したり、及び／又は追加用量のＶＬＰの効力を亢進したりするための免疫を誘導するのに十分な防御免疫応答を誘導する。
【００２２】
本明細書で使用される用語「有効量」は、所望の生物学的効果を実現するのに必要又は十分なＶＬＰの量を指す。組成物の有効量は、特定の結果を達成する量であり得るとともに、当業者は日常のこととしてかかる量を決定することができるであろう。例えば、感染症を予防し、治療し、及び／又は改善させるための有効量は、本発明のＶＬＰに曝露したとき免疫系を活性化させ、結果として抗原特異的な免疫応答を生じさせるために必要な量であり得る。この用語はまた、「十分量」と同義語でもある。
【００２３】
本明細書で使用される用語「防御免疫」又は「防御免疫応答」は、脊椎動物（例えば、ヒト）によって示される、感染症を予防するか、若しくは改善させたり、又はその少なくとも１つの症状を軽減したりするような感染病原体に対する免疫又は免疫応答の誘発を指す。
【００２４】
本明細書で使用される用語「脊椎動物」又は「対象」又は「患者」は、限定なしに、ヒトと、チンパンジー並びに他の類人猿及びサル種などの非ヒト霊長類を含む他の霊長類とを含む脊索動物亜門の任意のメンバーを指す。ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマなどの家畜；イヌ及びネコなどの家庭飼育用哺乳動物；マウス、ラット（コットンラットを含む）及びモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ及びその他の、アヒル、ガチョウ等の鶉鶏類などの家禽、野鳥及び狩猟鳥を含む鳥類もまた、非限定的な例である。用語「哺乳動物」及び「動物」は、この定義に含まれる。成体及び新生個体の双方とも網羅されることが意図される。
【００２５】
一般に、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）はウイルスゲノムがなく、従って非感染性である。加えて、ウイルス様粒子は多くの場合に異種発現によって産生することができ、且つ容易に精製することができる。ほとんどのＶＬＰが少なくともウイルスコアタンパク質を含む。このコアタンパク質は、通常、宿主細胞からの粒子の出芽及び放出を駆動する。しかしながら、ワクチン又は抗原性生成物が有効であるためには、免疫応答を誘導するよう、抗原がＶＬＰ上で発現して適切に提示されなければならない。本発明は、ＶＺＶタンパク質を含むキメラＶＬＰを含む。一実施形態において、前記ＶＺＶタンパク質はキメラである。本発明のキメラＶＬＰは、ＶＺＶ感染症を治療し、予防し、及び／又は改善させるためのワクチン及び免疫原性組成物の調製に有用である。
【００２６】
前記キメラＶＬＰの１つの重要な特徴は、前記ＶＬＰの表面上でタンパク質を発現させる能力であり、それによって脊椎動物の免疫系は、前記タンパク質に対する免疫応答を誘導することができるようになる。しかしながら、全てのタンパク質がＶＬＰの表面上で発現することができるとは限らない。ＶＬＰの表面上で特定のタンパク質が発現しない、又は発現しにくい理由は、数多くあり得る。１つの理由は、前記タンパク質が宿主細胞の膜に送り込まれないこと、すなわち前記タンパク質が膜貫通ドメインを有しないことである。従って、ＶＬＰの表面上でＶＺＶタンパク質の発現を増加させ、及び／又は前記タンパク質のＶＬＰへの取り込みを増加させる一方法は、異種タンパク質の細胞質ドメイン及び／又は膜貫通ドメインをＶＺＶタンパク質と融合してＶＺＶキメラタンパク質を作成することである。本発明の一実施形態において、前記異種細胞質ドメイン及び／又は膜貫通ドメインは、前記コアタンパク質と結合し得る。特定の理論に制約されないが、前記異種タンパク質の細胞質ドメイン及び／又は膜貫通ドメインのコアとの結合は、前記キメラＶＺＶタンパク質のＶＬＰへの送り込みを促進し得る。従って、本発明の別の実施形態はキメラＶＬＰを含み、これは、ＶＬＰの産生を駆動し、且つキメラＶＺＶタンパク質をＶＬＰに送り込んで取り込ませるよう促すコアタンパク質を含む。別の実施形態において、前記キメラＶＬＰは酵母Ｔｙタンパク質を含まない。
【００２７】
ある実施形態において、本発明は、少なくとも１つのキメラＶＺＶタンパク質を含むキメラＶＬＰを含み、ここで前記キメラＶＺＶタンパク質は、異種タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを含む。一実施形態において、前記ＶＬＰは、ＶＬＰの形成を駆動するコアタンパク質を含む。別の実施形態において、前記異種タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインは、前記コアタンパク質と結合して前記キメラＶＺＶタンパク質をＶＬＰに送り込む。別の実施形態において、前記キメラＶＺＶタンパク質は、ｇＥ、ｇＩ、ｇＢ、ｇＨ、ｇＫ、ｇＬ、ｇＣ、及びｇＭからなる群から選択されるＶＺＶタンパク質の一部を含む。別の実施形態において、前記ＶＺＶタンパク質はｇＥである。別の実施形態において、前記ＶＺＶタンパク質はｇＩである。別の実施形態において、キメラＶＺＶ  ｇＥ及びキメラＶＺＶ  ｇＩは、同じＶＬＰのなかにある。
【００２８】
本発明で用いることのできるコアタンパク質は、細胞中で発現するとＶＬＰの形成を駆動するウイルスタンパク質である。特に、ウイルスコアタンパク質としては、限定はされないが、ウイルスＧａｇタンパク質、特にレトロウイルスｇａｇタンパク質（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）Ｇａｇウイルスタンパク質（GenBankシリアル番号AAA44987及びｐ５５ｇａｇ  GenBankシリアル番号AAF43628）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）Ｇａｇウイルスタンパク質（GenBankシリアル番号AAA91922））、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）Ｇａｇウイルスタンパク質（GenBankシリアル番号NP040332））、ラブドウイルスマトリクスタンパク質Ｍタンパク質（例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）Ｍタンパク質（GenBank受託番号CAM83684））、フィロウイルスウイルスコアタンパク質（例えば、エボラＶＰ４０ウイルスタンパク質（GenBank受託番号AAN37506））、リフトバレー熱ウイルスＮタンパク質（GenBank受託番号ABK91994）、コロナウイルスＭ、Ｅ及びＮＰタンパク質（ＮＰタンパク質についてはGenBank受託番号AAP49024、Ｍタンパク質についてはAAR86790、Ｅタンパク質についてはAAP82979（ＳＡＲＳコロナウイルスShanghaiQXC1））、ブニヤウイルスＮタンパク質（GenBank受託番号AAA47114）、インフルエンザＭ１タンパク質、パラミクソウイルスＭタンパク質（例えば、ニューカッスル病タンパク質Ｍ（AAK55549）及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｍ（NP_056860））、アレナウイルスＺタンパク質（例えば、ラッサ熱ウイルスＺタンパク質）、ニューカッスル病タンパク質Ｍ（AAK55549）、パラインフルエンザＭ（例えば、ヒトパラインフルエンザウイルス１型MAAB22344））及びこれらの組み合わせを挙げることができる。一実施形態において、前記コア又はマトリクスタンパク質は、オルトミクソウイルスに由来する。別の実施形態において、前記オルトミクソウイルスコアはインフルエンザウイルスＭ１を含まない。別の実施形態において、前記コア又はマトリクスタンパク質は、パラミクソウイルスに由来する。別の実施形態において、前記パラミクソウイルス
コアは、ニューカッスル病ウイルスＭ、ＲＳＶ  Ｍ、又はヒトパラインフルエンザウイルスＭを含まない。
【００２９】
本発明の別の実施形態において、前記異種タンパク質は、前記コアタンパク質と相互作用し、ＶＺＶキメラタンパク質のＶＬＰへの送り込みを促進し得る。例えば、本発明の前記キメラＶＬＰがインフルエンザＭ１を含む場合、ＶＺＶタンパク質と融合する前記異種膜貫通及び／又は細胞質は、インフルエンザウイルスＨＡ及び／又はＮＡに由来し得る。これらのタンパク質は、異種タンパク質のＶＬＰへの送り込みを促進することが示されている（全体として参照により本明細書に援用される同時係属出願中の国際公開第２００８／００５７７７号を参照）。前記コアと異種タンパク質とは、必ずしも同じウイルスに由来しなくともよい。例えば、非ＨＩＶウイルス由来のいくつかの膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインは、ＨＩＶ由来のｐ５５  ｇａｇコアを伴う発現に使用し得ることが示されている（全体として参照により本明細書に援用されるWang et al., J. Virol., 81, 10869-10878を参照）。
【００３０】
特定の実施形態において、前記異種タンパク質の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインは、同じウイルスに由来し得る。一実施形態において、前記キメラＶＬＰは、インフルエンザウイルスＭ１と、インフルエンザＨＡ及び／又はＮＡ由来の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを有するキメラＶＺＶタンパク質とを含む。別の実施形態において、前記キメラＶＬＰは、A/Indonesia/5/05由来のインフルエンザウイルスＭ１と、インフルエンザウイルスＨＡ及び／又はＮＡ由来の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを有するキメラＶＺＶタンパク質とを含む。別の実施形態において、インフルエンザＨＡ及び／又はＮＡ由来の前記膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインは、A/quail/Hong Kong/G1/97、A/Hong Kong/1073/99、A/Hong Kong/2108/03、Duck/HK/Y280/97、CK/HK/G9/97、Gf/HK/SSP607/03、Ph/HK/CSW1323/03、WDk/ST/4808/01、CK/HK/NT142/03、CK/HK/WF126/03、SCk/HK/WF285/03、CK/HK/YU463/03、CK/HK/YU577/03、SCk/HK/YU663/03、Ck/HK/CSW161/03、及びGF/HK/NT101/03から選択される群に由来する。別の実施形態において、インフルエンザウイルスＨＡ及び／又はＮＡの膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインは、A/Indonesia/5/05に由来する。別の実施形態において、前記キメラＶＺＶタンパク質は、インフルエンザＨＡ及び／又はＮＡの膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを有するｇＥのエクトドメインを含む。別の実施形態において、前記ｇＥの膜貫通ドメインは、前記インフルエンザＨＡ及び／又はＮＡに置き換えられる。一実施形態において、前記キメラタンパク質は配列番号１を含む。別の実施形態において、前記キメラＶＺＶタンパク質は、インフルエンザウイルスＨＡ及び／又はＮＡの膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを有するｇＩのエクトドメインを含む。別の実施形態において、前記キメラタンパク質は配列番号３を含む。別の実施形態において、前記キメラＶＬＰは、インフルエンザウイルスＭ１と、キメラｇＥと、キメラｇＩとを含む。別の実施形態において、前記キメラＶＬＰは、インフルエンザウイルスＭ１と、天然ｇＥと、キメラｇＩとを含む。別の実施形態において、前記キメラＶＬＰは、インフルエンザウイルスＭ１と、キメラｇＥと、天然ｇＩとを含む。別の実施形態において、前記天然ｇＥ及びＩｇは改変され、それらの天然膜貫通ドメインが除去されている（それぞれ、配列番号１０及び１２）。ｇＥとＩｇとはヘテロ二量体を形成することから、ＶＬＰに取り込まれるためには、前記二量体のうち一方のメンバーのみが異種膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを有していればよい。
【００３１】
本発明の一実施形態において、前記キメラＶＬＰはニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）タンパク質Ｍと、ニューカッスル病ウイルスタンパク質由来の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを有するキメラＶＺＶタンパク質とを含む。一実施形態において、ＮＤＶタンパク質由来の前記膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインは、融合（Ｆ）タンパク質及び／又は赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質に由来する（ＮＤＶ  ＦについてはGenBank受託番号CAA00288、及びＮＤＶ  ＨＮについてはCAA00292）。別の実施形態において、前記キメラＶＬＰは、ＮＤＶ  ＭとキメラｇＥとを含む。別の実施形態において、前記キメラＶＬＰは、キメラｇＩをさらに含む。
【００３２】
本発明の一実施形態において、前記キメラＶＬＰは、ＲＳＶタンパク質Ｍと、ＲＳＶタンパク質由来の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインを有するキメラＶＺＶタンパク質とを含む。一実施形態において、ＲＳＶタンパク質由来の前記膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインは、融合（Ｆ）タンパク質及び／又はＧタンパク質に由来する（ＲＳＶ  ＦについてはGenBank受託番号AAR14266、及びＲＳＶ  ＧについてはAAR14265）。別の実施形態において、前記キメラＶＬＰは、ＲＳＶ  ＭとキメラｇＥとを含む。別の実施形態において、前記キメラＶＬＰは、キメラｇＩをさらに含む。
【００３３】
特定の実施形態において、前記異種タンパク質（例えばインフルエンザＨＡ及び／又はＮＡ）の膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ドメインは、タンパク質セグメントの間にスペーサー配列を含む。前記スペーサー配列は、ＶＺＶ又は前記異種タンパク質を起源としない任意のアミノ酸であってよい。このスペーサー配列は、前記ＶＺＶキメラタンパク質がＶＬＰの表面上で発現するために重要であり得る。スペーサー配列の例としては、ポリＧアミノ酸が挙げられる。前記スペーサーは、１〜約１００アミノ酸長であり得る。
【００３４】
本発明はまた、本発明のＶＬＰ上又はその中で発現する前記ＶＺＶタンパク質の変異体（前記キメラを含む）も包含する。この変異体は、構成タンパク質のアミノ酸配列に変化を含み得る。ポリペプチドに関連する用語「変異体」は、参照配列に対して１つ又は複数のアミノ酸が変化しているアミノ酸配列を指す。変異体は、例えばロイシンのイソロイシンとの置換など、置換アミノ酸が同様の構造又は化学特性を有する「保存的な」変更を有することができる。或いは、変異体は、例えばグリシンのトリプトファンとの置換など、「非保存的な」変更を有することもできる。類似の小さい変異としてはまた、アミノ酸の欠失若しくは挿入、又はそれらの双方を挙げることもできる。生物学的又は免疫学的活性を失うことなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入、又は欠失することができるかを決定する際の指針は、当該技術分野において周知のコンピュータプログラム、例えば、DNASTARソフトウェアを使用して見出すことができる。
【００３５】
クローニング、突然変異、細胞培養などの、本発明に適用可能な分子生物学的技術について記載している一般的な教本としては、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif.（Berger）；Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000（「Sambrook」）及びCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.,との合弁事業（「Ausubel」）が挙げられる。これらの教本は、突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーター及びその他の、例えば、ＶＺＶのｇＥ、ｇＩ、ｇＭ、ｇＨ、ｇＢ又はテグメントタンパク質のクローニング及び突然変異等に関する多くの関連論題について記載している。従って、本発明はまた、本発明のキメラＶＬＰ上又はその中で発現するタンパク質の特性を改良したり、又は変化させたりするためのタンパク質改変及び組換えＤＮＡ技術の公知の方法も包含する。様々なタイプの突然変異誘発を使用して、タンパク質分子をコードする変異核酸を産生及び／又は単離し、及び／又は本発明のキメラＶＬＰ内又はその上のタンパク質をさらに修飾する／変異させることができる。そうした突然変異誘発としては、限定はされないが、部位特異的突然変異誘発、ランダム点突然変異誘発、相同組換え（ＤＮＡシャフリング）、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップを有する二重鎖ＤＮＡを使用した突然変異誘発などが挙げられる。さらなる好適な方法としては、点ミスマッチ修復（point mismatch repair）、修復欠損宿主株を使用した突然変異誘発、制限選択及び制限精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、二本鎖切断修復などが挙げられる。
【００３６】
本発明のＶＺＶタンパク質をクローニングする方法は、当該技術分野において公知である。例えば、特定のＶＺＶタンパク質をコードする遺伝子は、ＶＺＶウイルスに感染させた細胞から抽出したポリアデニル化ｍＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲによって単離することができる。得られる産物遺伝子は、ＤＮＡインサートとしてベクターにクローニングすることができる。用語「ベクター」は、生体、細胞、又は細胞成分の間を核酸が伝播及び／又は転移することができるという意味を指す。ベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などが挙げられ、これらは自己複製するか、又は宿主細胞の染色体に組み込むことができる。ベクターは、ネイキッドＲＮＡポリヌクレオチド、ネイキッドＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内でＤＮＡ及びＲＮＡの双方からなるポリヌクレオチド、ポリリジンコンジュゲートＤＮＡ又はＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートＤＮＡ又はＲＮＡ、又はリポソームコンジュゲートＤＮＡなどであってもよく、これは自己複製しない。全てではないにしろ、多くの一般的実施形態において、本発明のベクターはプラスミドである。
【００３７】
従って、本発明は、本発明のキメラＶＬＰの形成を誘導する細胞中で発現することができる発現ベクターにクローニングされたタンパク質（例えばコアタンパク質及び少なくとも１つのＶＺＶタンパク質又はキメラＶＺＶタンパク質）をコードするヌクレオチドを含む。「発現ベクター」は、プラスミドなどの、取り込んだ核酸の発現並びに複製を促進することが可能なベクターである。典型的には、発現させる核酸はプロモーター及び／又はエンハンサーと「作動可能に連結され」、プロモーター及び／又はエンハンサーによる転写調節制御に供される。一実施形態において、前記ヌクレオチドは、ＶＺＶ  ｇＥ（ＯＲＦ  ６８）タンパク質又はキメラＶＺＶ  ｇＥタンパク質をコードする。別の実施形態において、前記ベクターは、ＶＺＶ  ｇＥと、少なくとも１つのさらなるＶＺＶタンパク質（例えばｇＩ又はキメラｇＩ）とをコードするヌクレオチドを含む。別の実施形態において、前記ベクターは、ＶＺＶ  ｇＥタンパク質と、ｇＩ（ＯＲＦ  ６７）、ｇＭ（ＯＲＦ  ５０）、ｇＨ、ｇＢ及び／又はテグメントＶＺＶタンパク質（又は前記タンパク質のキメラ型）とをコードするヌクレオチドを含む。別の実施形態において、前記ベクターはまた、ＶＬＰの形成を駆動することが可能なコアタンパク質も含む。別の実施形態において、発現ベクターはバキュロウイルスベクターである。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質は突然変異を含んでもよく、この突然変異は、サイレント置換、付加、又は欠失を生じさせるが、コードされたタンパク質の特性若しくは活性又はタンパク質の構成のされ方を変えることはない変化を含む。ヌクレオチド変異を生じさせる理由は様々であってよく、例えば、コドン発現を特定の宿主に対して最適化する（ヒトｍＲＮＡのコドンを、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞によって好ましいコドンに変化させる）ためであり得る。
【００３９】
加えて、ヌクレオチドを配列決定することにより、正しいコード領域がクローニングされたとともに、いかなる不要な突然変異も含まないことを確認することができる。ヌクレオチドを発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）にサブクローニングして、任意の細胞中で発現させ得る。上記は、ＶＺＶウイルスタンパク質をいかにクローニングできるかについての一例に過ぎない。当業者であれば、別の方法が有効且つ可能であることを理解するであろう。
【００４０】
本発明はまた、ｇＥ、ｇＩ、ｇＭ、ｇＨ、ｇＢ、テグメントタンパク質、キメラタンパク質又はその一部を含むＶＺＶタンパク質をコードするＶＺＶヌクレオチドを含むコンストラクト及び／又はベクターも提供する。ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターであってもよい。ｇＥ、ｇＩ、ｇＭ、ｇＨ、ｇＢ、テグメントタンパク質、それらのキメラ、又はその一部を含むＶＺＶ遺伝子を含むコンストラクト及び／又はベクターは、適切なプロモーターに作動可能に連結されなければならず、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーター（又は他のバキュロウイルス）、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌（E. coli）ｌａｃ、ｐｈｏＡ及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、並びにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターが非限定的な例である。他の好適なプロモーターは、宿主細胞及び／又は所望の発現率に依存して、当業者には公知であろう。発現コンストラクトは、転写開始部位と、転写終結部位と、及び転写領域に、翻訳のためのリボソーム結合部位とをさらに含み得る。コンストラクトによって発現した転写産物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの始端に翻訳開始コドンと、末端に適切に位置する終止コドンとを含み得る。
【００４１】
発現ベクターは好ましくは、少なくとも１つの選択可能なマーカーを含み得る。かかるマーカーとしては、真核生物細胞培養について、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、Ｇ４１８耐性又はネオマイシン耐性遺伝子、及び大腸菌（E. coli）及び他の細菌での培養について、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性又はアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。好ましいベクターには、ウイルスベクター、例えば、バキュロウイルス、ポックスウイルス（例えば、ワクチニアウイルス、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、ラクーンポックスウイルス、豚痘ウイルス等）、アデノウイルス（例えば、イヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルス、及びレトロウイルスがある。本発明で使用され得る他のベクターとしては、細菌において用いられるベクターが含まれ、それとしては、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ−９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が含まれる。好ましい真核生物ベクターには、ｐＦａｓｔＢａｃｌ  ｐＷＩＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、並びにｐＳＶＬがある。他の好適なベクターは、当業者には直ちに明らかであろう。
【００４２】
次に、上述の組換えコンストラクトを使用して、トランスフェクション、感染、又は形質転換が行われてもよく、ｇＥ、ｇＩ、ｇＭ、ｇＨ、ｇＢ、及びテグメントタンパク質、又はその一部を含むキメラＶＺＶタンパク質と、少なくとも１つのコアタンパク質とを、真核生物細胞及び／又は原核生物細胞中で発現させることができる。従って、本発明は、ｇＥ、ｇＩ、ｇＭ、ｇＨ、ｇＢ、及びテグメントタンパク質、又はその一部を含むキメラＶＺＶタンパク質と、少なくとも１つのコアタンパク質とをコードする核酸を含有する１つのベクター（又は複数のベクター）を含み、且つＶＬＰを形成可能な条件下でキメラＶＺＶ遺伝子を発現させることができる宿主細胞を提供する。
【００４３】
真核生物宿主細胞には、酵母、昆虫、両生類、鳥類、植物、Ｃ．エレガンス（C. elegans）（すなわち線虫）及び哺乳動物の宿主細胞がある。昆虫細胞の非限定的な例は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ）細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）細胞、例えばHigh Five細胞、及びショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２細胞である。真菌（酵母を含む）宿主細胞の例は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）（Ｋ．ラクチス（K. lactis））、Ｃ．アルビカンス（C. albicans）及びＣ．グラブラタ（C. glabrata）を含むカンジダ（Candida）種、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）（Ｓ．ポンベ（S. pombe））、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、並びにヤロウイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）である。哺乳動物細胞の例は、ＣＯＳ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスＬ細胞、ＬＮＣａＰ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、及びアフリカミドリザル細胞、ＣＶ１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ及びＨｅｐ−２細胞である。アフリカツメガエル卵母細胞、又は他の両生類起源の細胞もまた用いられ得る。原核生物宿主細胞としては、細菌細胞、例えば、大腸菌（E. coli）、Ｂ．スブチリス（B. subtilis）、及びミコバクテリアが挙げられる。
【００４４】
ベクター、例えば、ｇＥ、ｇＩ、ｇＭ、ｇＨ、ｇＢ、及びテグメントタンパク質、又はその一部をコードする遺伝子を含むＶＺＶ遺伝子（又はキメラＶＺＶ遺伝子）のポリヌクレオチドと、少なくとも１つのコアタンパク質とを含むベクターは、当該技術分野において周知の方法に従い宿主細胞にトランスフェクトすることができる。例えば、真核生物細胞への核酸の導入は、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポフェクション、及びポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクションによることができる。一実施形態において、前記ベクターは組換えバキュロウイルスである。別の実施形態において、前記組換えバキュロウイルスは、真核生物細胞にトランスフェクトされる。好ましい実施形態において、前記細胞は昆虫細胞である。別の実施形態において、前記昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【００４５】
別の実施形態において、前記ベクター及び／又は宿主細胞は、キメラＶＺＶタンパク質ｇＥ、又はその一部をコードするヌクレオチドを含む。別の実施形態において、前記ベクター及び／又は宿主細胞は、キメラＶＺＶタンパク質ｇＥ、又はその一部をコードするヌクレオチドから本質的になる。さらなる実施形態において、前記ベクター及び／又は宿主細胞は、キメラＶＺＶタンパク質ｇＩ、ｇＭ、ｇＨ、ｇＢ、及び／又はテグメント、又はその一部をコードするヌクレオチドを含む。ある実施形態において、上記のベクター及び／又は宿主細胞は、キメラＶＺＶ  ｇＥ、ｇＩ、ｇＭ、ｇＨ、ｇＢ、若しくはテグメントタンパク質、又はその一部と、場合により任意のさらなるキメラＶＺＶタンパク質とを含有し、且つ、細胞タンパク質、バキュロウイルスタンパク質、脂質、炭水化物等のさらなる細胞構成要素を含有し得る。
【００４６】
本発明はまた、キメラＶＬＰを産生する方法も提供し、前記方法は、少なくとも１つのコアタンパク質と、ｇＥ、ｇＩ、ｇＭ、ｇＨ、ｇＢ、テグメント又はその一部を含む少なくとも１つのキメラＶＺＶ遺伝子とを、ＶＬＰを形成可能な条件下で発現させることを含む。選択された発現系及び宿主細胞によっては、組換えタンパク質が発現し、且つキメラＶＬＰが形成される条件下で、発現ベクターにより形質転換した宿主細胞を成長させることによってＶＬＰが産生される。一実施形態において、本発明はキメラＶＬＰを産生する方法を含み、これは、ウイルスコアタンパク質とキメラＶＺＶ  ｇＥタンパク質とをコードするベクターを好適な宿主細胞にトランスフェクトし、ＶＬＰを形成可能な条件下で前記タンパク質を発現させることを含む。別の実施形態において、本発明はキメラＶＬＰを産生する方法を含み、これは、ウイルスコアタンパク質と、キメラＶＺＶ  ｇＥ及びキメラＶＺＶ  ｇＩタンパク質とをコードするベクターを好適な宿主細胞にトランスフェクトし、ＶＬＰを形成可能な条件下で前記タンパク質を発現させることを含む。別の実施形態において、前記真核生物細胞は、酵母、昆虫、両生類、鳥類又は哺乳動物細胞からなる群から選択される。別の実施形態において、前記キメラＶＬＰは酵母Ｔｙタンパク質を含まない。適切な成長条件の選択は、当業者の能力の範囲内である。
【００４７】
本発明のキメラＶＬＰを産生するように改変された細胞を成長させる方法としては、限定はされないが、回分、流加、連続及び灌流細胞培養技術が挙げられる。細胞培養とは、バイオリアクター（発酵チャンバ）内での細胞の成長及び伝播を意味し、そこで精製及び単離用に細胞が伝播してタンパク質（例えば、組換えタンパク質）を発現する。典型的には、細胞培養はバイオリアクター内において、無菌下、制御された温度下、且つ大気条件下で実施される。バイオリアクターは、温度、大気、撹拌及び／又はｐＨなどの環境条件をモニタすることのできるなかで細胞を培養するために使用されるチャンバである。
【００４８】
次にキメラＶＬＰは、勾配遠心分離、例えば塩化セシウム、スクロース及びイオジキサノールによるなど、その完全性を維持する方法と、さらに、例えばイオン交換及びゲルろ過クロマトグラフィーを含む標準的な精製技術とを用いて単離される。一実施形態において、本発明は、本発明の精製キメラＶＬＰを含む。別の実施形態において、本発明の前記キメラＶＬＰは、混合物中の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上について、他の分子（溶媒を除く）の存在がない。別の実施形態において、本発明の前記キメラＶＬＰは、本発明のキメラＶＬＰの作製に関連する他のウイルス、タンパク質、脂質、及び炭水化物を実質的に含まない。以下は本発明のキメラＶＬＰを作製、単離及び精製する方法の例である。通常、前記細胞が細胞培養において成長するとキメラＶＬＰが生じるように改変された組換え細胞系統から、キメラＶＬＰは産生される（上記参照）。当業者は、本発明のキメラＶＬＰを作製及び精製するために利用することのできる別の方法が存在することを理解するであろうことから、従って本発明は記載される方法に限定されない。
【００４９】
本発明のＶＬＰの産生は、Ｓｆ９細胞（非感染）を振盪フラスコに播種することから開始することができ、細胞の成長及び増殖に従い細胞を拡張して大規模に（例えば１２５ｍｌフラスコから５０ＬのＷａｖｅバッグに）する。細胞を成長させるために使用される培地は、適当な細胞系に合わせて調合される（好ましくは無血清培地、例えば昆虫用培地ExCell-420、JRH）。次に、最も効率の高い感染多重度のときに前記細胞を組換えバキュロウイルスに感染させる（例えば、細胞１個当たり約１〜約３プラーク形成単位）。感染が起こると、キメラＶＺＶタンパク質及び／又は他のタンパク質は自己組織化してキメラＶＬＰとなり、感染後約２４〜７２時間で細胞から分泌される。通常、感染の効率は、細胞が成長の対数期中期にあり（４〜８×１０６細胞／ｍｌ）、且つ少なくとも約９０％が生細胞であるときに最も高い。
【００５０】
本発明のキメラＶＬＰは感染後約４８〜９６時間で、細胞培養培地中のキメラＶＬＰのレベルがほぼ最大のとき、但し広範に細胞溶解する前に回収され得る。回収した時点でのＳｆ９細胞の密度及び生存能力は、色素排除アッセイによって示されるとおり、約０．５×１０６細胞／ｍｌ〜約１．５×１０６細胞／ｍｌで、少なくとも２０％の生存能力であり得る。次に、培地が除去され、清澄化される。濃度が約０．４〜約１．０Ｍになるまで、好ましくは約０．５Ｍまで、培地にＮａＣｌが添加され、ＶＬＰ凝集が回避される。本発明のＶＬＰを含有する細胞培養培地からの細胞及び細胞デブリの除去は、予め滅菌された使い捨ての中空糸０．５又は１．００μｍフィルタカートリッジ又は同様の装置によるタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）によって達成することができる。
【００５１】
次に、予め滅菌された使い捨ての５００，０００分子量カットオフ中空糸カートリッジを使用した限外ろ過により、清澄化した培養培地のキメラＶＬＰを濃縮することができる。濃縮したＶＬＰは、０．５ＭのＮａＣｌを含有する１０倍容量のｐＨ７．０〜８．０のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対してダイアフィルトレーションを行い、残りの培地成分を除去することができる。濃縮してダイアフィルトレーションを行ったＶＬＰは、０．５ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液中の２０％〜６０％の不連続スクロース勾配において、約４℃〜約１０℃で１８時間にわたり６，５００×ｇで遠心することによりさらに精製することができる。通常、キメラＶＬＰは、（２０％及び６０％の段階勾配において）約３０％〜約４０％スクロースの間又は界面に特有の可視バンドを形成し、これは勾配から集めて保存され得る。この生成物は、精製プロセスにおける次のステップのために、製剤中２００ｍＭのＮａＣｌを含むように希釈することができる。この生成物はキメラＶＬＰを含有し、且つインタクトなバキュロウイルス粒子を含有し得る。
【００５２】
キメラＶＬＰのさらなる精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー、又は４４％等密度スクロースクッション遠心法によって実現することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、スクロース勾配からの試料（上記を参照）、陰イオンの媒質（例えばMatrix Fractogel EMD TMAE）を含有するカラムに負荷され、塩勾配（約０．２Ｍ〜約１．０ＭのＮａＣｌ）を介して溶離されることで、キメラＶＬＰが他の混入物（例えばバキュロウイルス及びＤＮＡ／ＲＮＡ）と分離され得る。スクロースクッション法では、キメラＶＬＰを含有する試料が４４％スクロースクッションに添加され、約１８時間、３０，０００ｇで遠心される。ＶＬＰは４４％スクロースの上層にバンドを形成し、一方、バキュロウイルスは底面に沈殿し、及び他の夾雑タンパク質は上層で０％スクロース層に留まる。
【００５３】
インタクトなバキュロウイルスは、必要に応じて不活化することができる。不活化は、化学的方法、例えば、ホルマリン又はβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）によって達成することができる。インタクトなバキュロウイルスの除去及び／又は不活化は、ほとんどが、上記に例示されるとおり、当該技術分野において公知の選択的沈殿及びクロマトグラフ法を使用して達成することができる。不活化の方法は、０．２％のＢＰＬ中、約２５℃〜約２７℃で３時間にわたり、ＶＬＰを含有する試料をインキュベートすることを含む。バキュロウイルスはまた、０．０５％のＢＰＬにおいて４℃で３日間、次に３７℃で１時間にわたり、ＶＬＰを含有する試料をインキュベートすることによって不活化することもできる。不活化／除去ステップの後、ＶＬＰを含有する生成物をさらなるダイアフィルトレーションステップにかけることにより、不活化ステップからの任意の試薬及び／又は任意の残留スクロースを除去し、キメラＶＬＰを所望の緩衝液（例えば、ＰＢＳ）に入れることができる。キメラＶＬＰを含有する溶液は、当該技術分野において公知の方法により滅菌（例えば、滅菌ろ過）して、冷蔵庫又は冷凍庫で保存することができる。
【００５４】
上記の技術は、様々な規模にわたって実施することができる。例えば、Ｔフラスコ、振盪フラスコ、回転ボトル、工業規模のバイオリアクターに至るまで。バイオリアクターとしては、ステンレス鋼タンク又は予め滅菌されたプラスチック袋（例えば、Wave Biotech, Bridgewater, NJによって販売されているシステム）のいずれかが含まれ得る。当業者は、その目的に最も望ましいものが何か、分かるであろう。
【００５５】
医薬製剤又はワクチン製剤及び投与
本明細書において有用な医薬組成物は、本発明のキメラＶＬＰと、任意の好適な希釈剤又は賦形剤を含む薬学的に許容可能な担体とを含有し、担体としては、それ自体がその組成物を与えられる脊椎動物に有害な免疫応答の発生を誘導することがなく、且つ過度の毒性なく投与され得る任意の医薬品が挙げられる。本明細書で使用される用語「薬学的に許容可能」とは、哺乳動物、及びより詳細にはヒトにおける使用向けとして、連邦政府若しくは州政府の規制当局により認可されているか、又はU.S. Pharmacopia、European Pharmacopia若しくは他の一般に認知されている薬局方に列挙されていることを意味する。こうした組成物は、脊椎動物において防御免疫応答を誘導するためのワクチン製剤及び／又は抗原製剤として有用であり得る。本発明は、少なくとも１つのＶＺＶタンパク質、例えばキメラｇＥタンパク質を含むが、ＶＺＶ核酸又は酵母Ｔｙタンパク質は含まないキメラＶＬＰを含む抗原製剤を包含する。別の実施形態において、前記抗原製剤は、ＶＬＰに組み込まれた少なくとも１つのさらなるキメラＶＺＶタンパク質を含むキメラＶＬＰを含む。別の実施形態において、前記さらなるキメラＶＺＶタンパク質は、ｇＩ（ＯＲＦ  ６７）タンパク質を含む。別の実施形態において、前記さらなるキメラＶＺＶタンパク質は、ｇＭ（ＯＲＦ  ５０）タンパク質を含む。別の実施形態において、前記さらなるキメラＶＺＶタンパク質はｇＨを含む。別の実施形態において、前記さらなるキメラＶＺＶタンパク質はｇＢを含む。別の実施形態において、前記さらなるキメラＶＺＶタンパク質はテグメントタンパク質を含む。別の実施形態において、前記さらなるキメラＶＺＶタンパク質は、ｇＩ、ｇＭ、ｇＨ、ｇＢ又はテグメントタンパク質の組み合わせを含む。別の実施形態において、前記キメラＶＺＶ  ＶＬＰは、ＶＺＶカプシドタンパク質（例えば、ＯＲＦ  ２０、ＯＲＦ  ４０、ＯＲＦ  ４１）を含まない。
【００５６】
典型的には、ワクチンは従来の生理食塩水又は緩衝水溶液媒体を含み、その中に本発明の組成物が懸濁又は溶解される。本発明の組成物は好都合には、この形態で、感染症を予防したり、改善させたり、又はその他の形で治療したりするために使用することができる。ワクチンは宿主に導入されると、限定はされないが、抗体及び／又はサイトカインの産生、及び／又は、細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化、及び／又は他の細胞応答を含む免疫応答を引き起こすことができる。
【００５７】
本発明はまた、少なくとも１つのＶＺＶタンパク質、例えばキメラｇＥを含むが、ＶＺＶ核酸又は酵母Ｔｙタンパク質は含まないキメラＶＬＰを含むワクチン製剤も包含する。別の実施形態において、前記ワクチン製剤は、ＶＬＰに組み込まれた少なくとも１つのさらなるキメラＶＺＶタンパク質を含むキメラＶＬＰを含む。別の実施形態において、前記さらなるキメラＶＺＶタンパク質は、キメラｇＩ（ＯＲＦ  ６７）タンパク質を含む。別の実施形態において、前記さらなるキメラＶＺＶタンパク質は、キメラｇＭ（ＯＲＦ  ５０）タンパク質を含む。別の実施形態において、前記さらなるキメラＶＺＶタンパク質はキメラｇＨである。別の実施形態において、前記さらなるキメラＶＺＶタンパク質はキメラｇＢである。別の実施形態において、前記さらなるキメラＶＺＶタンパク質はキメラテグメントタンパク質を含む。別の実施形態において、前記さらなるキメラＶＺＶタンパク質は、キメラｇＩ、ｇＭ、ｇＨ、ｇＢ又はテグメントタンパク質の組み合わせを含む。別の実施形態において、前記ＶＺＶ  ＶＬＰはＶＺＶカプシドタンパク質（例えば、ＯＲＦ  ２０、ＯＲＦ  ４０、ＯＲＦ  ４１）を含まない。
【００５８】
本発明の前記抗原製剤及びワクチン製剤は、上記のとおりの本発明のＶＬＰと、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む。薬学的に許容可能な担体としては、限定はされないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、無菌等張水性緩衝液、及びこれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容可能な担体、希釈剤、及び他の賦形剤についての詳細な考察は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Pub. Co. NJ. 現行版）に掲載されている。製剤は、投与方法に適したものでなければならない。好ましい実施形態において、製剤は、ヒトに対する投与に好適であり、好ましくは無菌で、非粒子状及び／又は非発熱性である。
【００５９】
必要に応じて、本医薬組成物はまた、微量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有し得る。本組成物は、再構成に好適な凍結乾燥粉末、液状溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、徐放製剤、又は粉末などの固体形態であり得る。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬品級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含むことができる。
【００６０】
本発明は、キメラＶＬＰ製剤が、組成物の分量が指示されたアンプル又はサシェなどの密閉シール容器に包装されていることを提供する。一実施形態では、キメラＶＬＰ組成物は液体として供給され、別の実施形態では、密閉シール容器に乾燥滅菌された凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、且つ、例えば水又は生理食塩水により、対象への投与に適切な濃度に再構成することができる。
【００６１】
代替的実施形態において、キメラＶＬＰ組成物は、キメラＶＬＰ組成物の分量及び濃度を指示した密閉シール容器に液状形態で供給される。好ましくは、キメラＶＬＰ組成物の液状形態は、密閉シール容器に、少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、少なくとも約２００μｇ／ｍｌ、少なくとも５００μｇ／ｍｌ、又は少なくとも１ｍｇ／ｍｌが供給される。
【００６２】
概して、本発明のキメラＶＺＶ  ＶＬＰは、１つ又は複数のＶＺＶ株に対する免疫応答を刺激するのに十分な有効量又は分量で投与される。好ましくは、本発明のキメラＶＬＰの投与は、ＶＺＶに対する免疫を誘発する。典型的には、用量はこの範囲内で、例えば、年齢、健康状態、体重、性別、食事、投与時間、及び他の臨床要因に基づき調整され得る。予防ワクチン製剤は、例えば、針及びシリンジ、又は無針注射装置を使用した皮下注射又は筋肉注射によって全身投与される。或いはワクチン製剤は、ドロップ、大型粒子エアロゾル（約１０μｍ超）、又は上気道への噴霧のいずれかによって鼻腔内投与される。上記の送達経路のいずれも免疫応答を引き起こす結果となるが、鼻腔内投与は、ＶＺＶを含む多くのウイルスの侵入部位において粘膜免疫を誘発するというさらなる利点をもたらす。
【００６３】
従って、本発明はまた、哺乳動物に対する感染症又はその少なくとも１つの症状に対する免疫を誘導するワクチン又は抗原組成物を製剤化する方法も含み、これは、前記製剤に有効用量のキメラＶＺＶ  ＶＬＰを添加することを含む。一実施形態において、前記感染症はＶＺＶ感染症である。「有効用量」は、概して、免疫を誘導し、それによって感染症を予防し、及び／又は改善させるか、若しくは感染症の少なくとも１つの症状を軽減し、及び／又は追加用量のキメラＶＬＰの効力を亢進するのに十分な本発明のＶＬＰの量を指す。有効用量は、感染症の発症を遅延させるか、又は最小限に抑えるのに十分なキメラＶＬＰの量を指すこともある。有効用量はまた、感染症の処置又は管理において治療利益を提供するキメラＶＬＰの量を指すこともある。さらに、有効用量は、感染症の処置又は管理において治療利益を提供するような、本発明のキメラＶＬＰに関する単独の、又は他の治療薬と組み合わせた量である。有効用量はまた、感染病原体に対する二次的な曝露に対する対象（例えば、ヒト）自身の免疫応答を亢進するのに十分な量であってもよい。免疫のレベルは、例えば、プラーク中和アッセイ、補体結合アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、又はマイクロ中和アッセイにより、例えば中和分泌抗体及び／又は血清抗体の量を計測することによってモニタすることができる。ワクチンの場合、「有効用量」は、疾患を予防し、及び／又は症状の重症度を軽減する用量である。
【００６４】
上述されるとおり、本発明のＶＬＰは、対象におけるＶＺＶ感染症の少なくとも１つの症状を予防又は軽減する。ＶＺＶ感染によって引き起こされる２つの疾患の症状は、当該技術分野において周知である。一次ＶＺＶ感染によって引き起こされる水疱瘡（水痘）の症状としては、発熱、倦怠、頭痛、腹痛、疲労、食欲不振、並びに主に頭皮、顔面、及び体幹に生じる皮膚病変が挙げられる。潜伏ＶＺＶが再活性化する結果として起こる帯状疱疹（帯状ヘルペス）は、以下の症状、すなわち、皮膚発疹（通常は胸部の皮膚分節に片側性に現れる）、急性神経炎痛、及び過敏症を特徴とする。従って、本発明の方法は、ＶＺＶ感染症に付随する少なくとも１つの症状の予防又は軽減を含む。症状の軽減は主観的に判断されても、又は客観的に判断されてもよく、例えば、対象による自己評価か、臨床医の評価によるか、或いは、例えば、クオリティ・オブ・ライフ評価、ＶＺＶ感染症若しくは別の症状の進行の遅延、ＶＺＶ症状の重症度の軽減、又は好適なアッセイ（例えば抗体力価及び／又はＴ細胞活性化アッセイ）を含めた適切なアッセイ又は測定（例えば体温）を行うことによる。客観的評価は、動物及びヒトの双方の評価を含む。
【００６５】
免疫の刺激は単回用量によることが好ましいが、所望の効果を実現するため、同じ、又は異なる経路によって追加の投薬量が投与されてもよい。新生児及び乳幼児では、例えば、十分なレベルの免疫を誘発するのに複数回投与が必要となり得る。感染症、例えばＶＺＶ感染症に対する十分なレベルの防御を維持するため、必要に応じて間隔を置いた投与が小児期を通じて継続され得る。同様に、反復する、又は重篤な感染症に特に罹り易い成人、例えば、保健医療従事者、デイケア従事者、低年齢小児の家族成員、高齢者、及び心肺機能に障害を有する人は、防御免疫応答を確立及び／又は維持するために複数回の免疫付与が必要となり得る。誘導された免疫のレベルは、例えば、分泌型及び血清中和抗体量を計測することによってモニタすることができ、所望のレベルの防御を誘発及び維持するため、必要に応じて投薬量が調節されたり、又はワクチン接種が反復されたりし得る。
【００６６】
キメラＶＬＰを含む組成物（ワクチン製剤及び／又は抗原製剤）を投与する方法としては、限定はされないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、静脈内及び皮下）、硬膜外投与、及び粘膜投与（例えば、鼻腔内及び口腔若しくは肺経路、又は坐薬による）が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、経口的に、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、又は皮下に投与される。本組成物は、任意の好都合な経路、例えば、注入又はボーラス投与、上皮又は皮膚粘膜の内層を介した吸収（例えば、口腔粘膜、結腸、結膜、鼻咽腔、口腔咽頭、腟、尿道、膀胱及び腸粘膜等）によって投与されてもよく、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与されてもよい。ある実施形態において、本発明のキメラＶＬＰを含む組成物の鼻腔内又は他の粘膜の投与経路は、他の投与経路より実質的に高い抗体又は他の免疫応答を誘導し得る。別の実施形態において、本発明のキメラＶＬＰを含む組成物の鼻腔内又は他の粘膜の投与経路は、他のＶＺＶ株に対する交差防御を誘導し得る抗体又は他の免疫応答を誘導し得る。投与は全身的であっても、又は局所的であってもよい。
【００６７】
本発明のワクチン製剤及び／又は抗原製剤はまた、例えば、ワクチン組成物の初回投与と、続く追加免疫投与といった投薬スケジュールに従い投与されてもよい。詳細な実施形態において、組成物の２回目の用量は、初回投与後２週間から１年まで、好ましくは約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月から約６ヶ月までの範囲内に投与される。加えて、３回目の用量が、２回目の用量の後に、且つ初回投与後約３ヶ月から約２年まで、又はそれ以上、好ましくは約４ヶ月、約５ヶ月、若しくは約６ヶ月、又は約７ヶ月から約１年までに投与されてもよい。３回目の用量は、場合により、２回目の用量後の対象の血清及び／又は尿又は粘膜分泌物中に、特定の免疫グロブリンが検出されないか、検出されるレベルが低いときに投与され得る。好ましい実施形態において、２回目の用量は最初の投与後約１ヶ月に投与され、３回目の用量は最初の投与後約６ヶ月に投与される。別の実施形態において、２回目の用量は最初の投与後約６ヶ月に投与される。別の実施形態において、本発明の前記キメラＶＬＰは、併用療法の一部として投与することができる。例えば、本発明のキメラＶＬＰは、他の免疫原性組成物、抗ウイルス薬及び／又は抗生物質と共に製剤化することができる。
【００６８】
医薬製剤の投薬量は当業者が容易に決定することができ、例えばこれは、まず初めに、例えばウイルス特異的免疫グロブリンの血清力価を測定するか、又は血清試料若しくは尿試料若しくは粘膜分泌物中の抗体の阻害率を測定することによって、予防的又は治療的な免疫応答の誘発に有効な用量を特定することによる。前記投薬量は、動物試験から決定することができる。ワクチンの効力を試験するために用いられる動物を非限定的に列挙すれば、モルモット、ハムスター、フェレット、チンチラ、マウス及びコットンラットが挙げられる。ほとんどの動物は、感染病原体の天然宿主ではないが、それでもなお、疾患の様々な側面を試験するうえで役に立ち得る。例えば、上記の動物のいずれも、ワクチン候補、例えば本発明のキメラＶＬＰを投与することで、誘導された免疫応答を部分的に特徴付けたり、及び／又は任意の中和抗体が産生されたかどうかを決定したりすることができる。例えば、マウスはサイズが小さく安価であることから、研究者が試験を大規模に行うことができるため、多くの試験がマウスモデルで行われている。
【００６９】
加えて、当業者はヒト臨床試験を実施して、ヒトに好ましい有効用量を決定することができる。かかる臨床試験はルーチン的なもので、当該技術分野において周知である。用いられる正確な用量はまた、投与経路にも依存する。有効用量は、インビトロ又は動物試験系から導き出された用量反応曲線から推定されてもよい。
【００７０】
同様に当該技術分野において周知のとおり、特定の組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる非特異的免疫応答の刺激薬を使用することによって亢進させることができる。用語「アジュバント」は、製剤中の特定の免疫原（例えばＶＬＰ）と組み合わせて用いられるとき、得られる免疫応答を増進するか、又はその他の形で変化させたり、若しくは改良したりする化合物を指す。免疫応答の改良としては、抗体免疫応答及び細胞性免疫応答のいずれか又は双方の特異性の強化又は拡大が挙げられる。免疫応答の改良はまた、特定の抗原特異的免疫応答を低下させるか、又は抑制することも意味し得る。アジュバントは、未知の抗原に対する免疫の全身的な上昇を促進するために実験的に用いられている（例えば、米国特許第４，８７７，６１１号）。長年にわたり、免疫化プロトコルには応答を刺激するためアジュバントが用いられており、そのためアジュバントは当業者に周知である。アジュバントのなかには、抗原の提示のされ方に影響を及ぼすものもある。例えば、タンパク質抗原をミョウバンによって沈降させると、免疫応答は増加する。抗原の乳化もまた、抗原提示期間を延長させる。あらゆる目的のため全体として参照により本明細書に援用されるVogel et al., ”A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2nd Edition)”に記載される任意のアジュバントを含めることが、本発明の範囲内で想定される。
【００７１】
例示的に、アジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（死滅結核菌（Mycobacterium）を含有する非特異的免疫応答刺激薬）、不完全フロイントアジュバント及び水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。他のアジュバントとしては、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、ＭＤＰ化合物、例えば、ｔｈｕｒ−ＭＤＰ及びｎｏｒ−ＭＤＰ、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、リピドＡ、並びにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）が含まれる。細菌から抽出された３つの成分、ＭＰＬと、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）と、細胞壁骨格（ＣＷＳ）とを２％スクアレン／Tween 80乳剤中に含有するRIBIもまた、企図される。MF-59、Novasomes（登録商標）、ＭＨＣ抗原もまた用いられ得る。
【００７２】
本発明の一実施形態において、アジュバントはパウシラメラ（paucilamellar）脂質ベシクルであり、これは水層によって隔てられた約２〜１０の二重層が、脂質二重層のない大きい無定形の中心空洞を取り囲んで実質的に球状シェルの形態に配置されているものである。パウシラメラ脂質ベシクルは、非特異的刺激薬として、抗原の担体として、別のアジュバントの担体として、及びこれらの組み合わせとして、免疫応答をいくつかの方法で刺激する働きをし得る。パウシラメラ脂質ベシクルは、例えば、抗原がベシクルの細胞外に留まるように予め形成されたベシクルと抗原を混ぜ合わせることによってワクチンが調製されると、非特異的免疫刺激薬として働く。抗原をベシクルの中心空洞内に封入することにより、ベシクルは免疫刺激薬及び抗原の担体の双方として働く。別の実施形態において、ベシクルは主に非リン脂質ベシクルから構成される。他の実施形態において、ベシクルはNovasomes（登録商標）である。Novasomes（登録商標）は、約１００ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲のパウシラメラ非リン脂質ベシクルである。これらは、Brij 72、コレステロール、オレイン酸及びスクアレンを含む。Novasomesは、インフルエンザ抗原の有効なアジュバントであることが示されている（あらゆる目的のため全体として参照により本明細書に援用される米国特許第５，６２９，０２１号、同第６，３８７，３７３号、及び同第４，９１１，９２８号を参照）。
【００７３】
本発明のキメラＶＬＰはまた、「免疫刺激薬」と共に製剤化することもできる。用語「免疫刺激薬」は、生体自身の化学的メッセンジャー（サイトカイン）を介して免疫応答を亢進する化合物を指す。こうした分子としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；成長因子（例えば、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；及び他の免疫賦活性分子、例えば、マクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２等の、免疫賦活活性、免疫強化活性、及び炎症誘発活性を有する様々なサイトカイン、リンホカイン及びケモカインが含まれる。免疫刺激分子は、本発明のＶＬＰと同じ製剤で投与されてもよく、又は別個に投与されてもよい。タンパク質又はタンパク質をコードする発現ベクターのいずれも、投与によって免疫賦活効果を生じさせることができる。従って一実施形態において、本発明は、アジュバント及び／又は免疫刺激薬を含む抗原製剤及びワクチン製剤を含む。
【００７４】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明され、この実施例は限定と見なされてはならない。本願全体を通じて引用される全ての参考文献、特許、及び公開された特許出願の内容、並びに図及び配列表は、あらゆる目的のため参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【００７５】
実施例１
以下では、Ｓｆ９昆虫細胞中にキメラｇＥ（ＨＡ  ＴＭ／ＣＴ）糖タンパク質（配列番号１）と鳥インフルエンザＭ１（A/Indonedia/5/05  Ｈ５Ｎ１株）マトリクスタンパク質（配列番号９）とを含むキメラＶＺＶ  ＶＬＰのクローニング、発現及び精製方法が記載される。キメラｇＥ及び鳥インフルエンザＭ１は、ＶＬＰを形成可能な条件下でバキュロウイルス発現系にクローニングし、発現させた。このコンストラクトが図１Ａに示される。
【００７６】
ＶＬＰが作製されたことを確認するため、ＶＺＶ  ｇＥ（ＨＡ  ＴＭ／ＣＴ）／Ｉｎｄｏ  Ｍ１キメラのコンストラクトを含むバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞を含有するＳｆ９細胞培養培地を、バキュロウイルス感染後６４時間で低速遠心により遠心した。５００ｋＤａのＭＷＣＯ中空糸フィルタ（GE healthcare）による限外ろ過（ＵＦ）によって無細胞培地を濃縮した。残留液を、ダイアフィルトレーション（ＤＦ）によって２５ｍＭのＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌに緩衝液交換した。同じ緩衝液中で平衡させたイオン交換カラム（Fractogel TMAE）にＵＦ／ＤＦ残留液を負荷した。
【００７７】
次に、ＶＬＰ及びバキュロウイルスを含有するフロースルー画分を限外ろ過によってさらに濃縮した後、２５ｍＭのＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌで平衡させたSephacryl S500サイズ排除カラム（GE healthcare）に負荷した。S500カラムの空隙容量にＶＬＰ及びバキュロウイルス画分が溶離され、一方、後のクロマトグラフィー画分に可溶性タンパク質及び細胞断片が溶離された。S500カラムの空隙ピークを、３００ｍＭ  ＮａＣｌで第２のTMAEカラムに負荷した。こうした条件下では、ＶＬＰはアニオン性樹脂と結合せず、一方、より負に帯電したバキュロウイルスがカラムと結合する。これは、ＶＬＰにＤＮＡ又はＲＮＡゲノムがなく、一方、バキュロウイルスは、１３７ｋＤａの大型の二本鎖ＤＮＡゲノムを含有し、それによりバキュロウイルスの負電荷が、ひいてはウイルスの結合特性が増大するという事実に依存する、決定的に重要な分離ステップであった。ＶＬＰを含有する第２のTMAEフロースルー画分を、３０％スクロースクッションを介した超遠心法（１００Ｋ  ｇ  時間）により濃縮した（図１Ｂ、レーン２）。次に精製したキメラＶＺＶ  ｇＥ（ＨＡ  ＴＭ／ＣＴ）／Ｉｎｄｏ  Ｍ１キメラＶＬＰを、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析、ウエスタンブロット分析、電子顕微鏡（ＥＭ）分析及び免疫金分析に使用した。
【００７８】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析及びウエスタンブロット分析は、先述のとおり実施した。これらの結果が図１Ｂに示される。レーン１は第２のTMAEイオン交換クロマトグラフィーカラムからのＶＬＰであり、レーン２及びレーン３は、高速遠心後にそれぞれ３０％スクロースの界面及びペレットの上層近傍で回収されたＶＬＰである。超遠心法によって微量のバキュロウイルス及びＶＺＶキメラＶＬＰがペレット状になったが、大部分のｇＥ／Ｍ１キメラＶＬＰは浮遊密度がより高く、３０％スクロース界面の近傍にあったことに留意されたい。キメラｇＥ（ＨＡ  ＴＭ／ＣＴ）はバキュロウイルスタンパク質ＧＰ６４と同じ分子量を有し、それらのバンドはゲル上で重なることに留意されたい。従って、レーン２の６４ｋＤａのタンパク質（精製ＶＬＰを含む）は、主にキメラｇＥ（ＨＡ  ＴＭ／ＣＴ）であり、及びレーン３の同じサイズのバンド（ＶＬＰ及びバキュロウイルスを含む）は主にバキュロウイルスエンベロープ糖タンパク質ＧＰ６４である。この結論は、クマシーブルー染色ゲルと抗ｇＥウエスタンブロットとの比較によって導き出された。精製キメラＶＺＶ  ＶＬＰ（レーン１）は純度が９０％超で、主要なタンパク質は、Ｍ１、及びＳＤＳによって完全には破壊されないＭ１二量体（２５ＫＤａ及び５０ＫＤａ）、並びにキメラｇＥ（６０ＫＤａ）であった。従って、これらの結果は、キメラＶＬＰが産生され、精製されたことを示している。
【００７９】
次に、電子顕微鏡法（ＥＭ）ネガティブ染色によりキメラＶＬＰを撮像した（図２）。これらのＥＭ画像は、キメラＶＬＰが、高度に構造化されたエンベロープを伴う球状コアを有することを示している。
【００８０】
ＶＬＰの免疫金染色を実施して、ＶＺＶ  ｇＥがキメラＶＬＰの表面上で発現するかどうかを判定した。ＥＭ画像を撮る前、キメラＶＬＰは正常マウスＩｇＧ（Ａ）又はマウス抗ＶＺＶ−ｇＥ（Santa Cruzからのクローン9C8）（Ｂ）のいずれかと共にインキュベートし、続いてマウスに対する金標識二次抗体と共にインキュベートした。６ｎｍの金粒子がキメラＶＬＰ上にあったことから、ＶＬＰ上にｇＥタンパク質が存在することが確認された。図３に示されるとおり、抗体は確かにＶＬＰを染色した。従って、ＶＬＰはＶＺＶ  ｇＥを確かに発現する。
【００８１】
これらのデータは、キメラＶＺＶタンパク質を含むキメラＶＺＶ  ＶＬＰが産生され、且つ精製され得ることを示している。
【００８２】
本明細書の全ての特許、刊行物及び特許出願は、個々の各特許、刊行物又は引用特許出願が、参照によって援用されるとして具体的且つ個別に指摘された場合と同じ範囲において、参照により援用される。
【００８３】
前述の詳細な説明は、理解を明確にするために与えられたに過ぎず、当業者には改良が明らかであろうことから、そこからいかなる不必要な限定も解釈されてはならない。これは、本明細書に提供された任意の情報が先行技術である、若しくは本明細書に特許請求される発明に関するものであること、又は具体的若しくは非明示的に参照される任意の刊行物が先行技術であることを認めるものではない。
【００８４】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００８５】
本発明はその特定の実施形態に関連して記載されているが、さらなる改良が可能であるとともに、概して本発明の原理に従い、且つ本開示からのかかる逸脱を含む、本発明のいかなる変形、使用、又は適応も、本発明が関わる技術分野における公知の、又は通常の実践の範囲内にあるものとして、且つ以上に記載された本質的な特徴に適合し得るものとして、且つ添付の特許請求の範囲の範囲に従うものとして網羅されることを、本願は意図していることが理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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