(57)【要約】本開示は、天然に存在する野生型ケトレダクターゼ酵素と比較して、改善された特性を有する操作型ケトレダクターゼ酵素を提供する。上記操作型ケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、上記操作型ケトレダクターゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および種々のキラル化合物を合成するために、上記操作型ケトレダクターゼ酵素を使用するための方法もまた、提供される。本発明のケトレダクターゼ酵素は、化合物１−［４−（４−フルオロ２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンを、その対応する生成物（Ｒ）１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールに還元または変換することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物１−［４−（４−フルオロ２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンを、配列番号２のポリペプチドの活性の少なくとも１．５倍で１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールに変換することができる組換えケトレダクターゼペプチドポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ（ａ）配列番号２もしくは配列番号４の残基９４に対応するアミノ酸残基において芳香族アミノ酸もしくはＧ、または（ｂ）配列番号２もしくは配列番号４の残基９６に対応するアミノ酸残基においてＳおよびＮ以外のアミノ酸を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列は、配列番号２もしくは配列番号４の残基９４に対応するアミノ酸残基において芳香族アミノ酸もしくはＧを含む、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３】
前記残基９４はＦ、Ｗ、ＨもしくはＹである、請求項２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列は、以下から選択される１つ以上の特徴：残基９６は、Ｓ／Ｎ以外の任意のアミノ酸である；残基１５３は、Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基１９９は、Ｌ以外の任意のアミノ酸基である；残基２０２は、ＧであるかもしくはＡ以外の脂肪族アミノ酸残基である；および残基２０６は、芳香族アミノ酸残基である、をさらに含む、請求項２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５】
前記アミノ酸配列は、以下から選択される１つ以上の特徴：残基１５３は、ＧもしくはＡである；残基１９９は、Ｋ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｑ、もしくはＷである；残基２０２は、Ｉ、Ｌ、もしくはＧである；および残基２０６は、Ｆである、を有する、請求項４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸配列は、以下から選択される特徴のうちの１つ以上：残基４９は、Ｋ以外の極性アミノ酸残基である；残基５３は、酸性アミノ酸残基である；残基５４は、低分子アミノ酸残基もしくはＴ／Ｐ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基６０は、Ｖ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基９５は、Ｖ以外の脂肪族アミノ酸である；残基９７は、低分子アミノ酸もしくはＧである；残基１０９は、Ｋ以外の塩基性アミノ酸残基である；残基１４７は、脂肪族アミノ酸残基である；残基１６５は、ヒドロキシルアミノ酸残基もしくは低分子アミノ酸残基である；残基１９７は、低分子アミノ酸残基もしくはＧである；残基２２３は、Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基である；および残基２３３は、低分子アミノ酸残基もしくはＧである、をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７】
前記アミノ酸配列は、以下から選択される１つ以上の特徴：残基４９はＲである；残基５３はＤである；残基５４はＡである；残基６０はＡである；残基９５はＬである；残基９７はＧである；残基１０９はＲである；残基１４７はＬである；残基１６５はＴである；残基１９７はＧである；残基２２３はＶである；および残基２３３はＧである、を含む、請求項６に記載の組換えポリペプチド。
【請求項８】
前記アミノ酸配列は、以下から選択される１つ以上の特徴：残基５４はＡである；残基１０９はＲである；残基１４７はＬである；および残基２３３はＧである、を有する、請求項７に記載の組換えポリペプチド。
【請求項９】
前記アミノ酸配列は、配列番号２もしくは配列番号４の残基９６に対応するアミノ酸残基において、ＳおよびＮ以外のアミノ酸を含む、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１０】
前記アミノ酸配列は、配列番号２もしくは配列番号４の残基９６に対応するアミノ酸残基において、Ｇ、Ｆ、Ｙ、もしくはＩを有する、請求項９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列は、以下から選択される特徴：残基９４は、芳香族アミノ酸残基もしくはＧである；残基１５３は。Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基１９９は、Ｌ以外の任意のアミノ酸残基である；残基２０２は、Ａ以外の脂肪族アミノ酸残基である；または残基２０６は、芳香族アミノ酸残基である、のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１０に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１２】
前記アミノ酸配列は、以下から選択される特徴：残基９４は、ＦもしくはＧである；残基１５３は、ＧもしくはＡである；残基１９９は、Ｋ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｑ、もしくはＷである；残基２０２は、Ｉ、Ｌ、もしくはＧである；および残基２０６はＦである、のうちの１つ以上を含む、請求項１１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１３】
前記アミノ酸配列は、以下から選択される特徴：残基４９は、Ｋ以外の極性アミノ酸残基である；残基５３は、酸性アミノ酸残基である；残基５４は、低分子アミノ酸残基もしくはＴ／Ｐ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基６０は、Ｖ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基９５は、Ｖ以外の脂肪族アミノ酸である；残基９７は、低分子アミノ酸残基もしくはＧである；残基１０９は、Ｋ以外の塩基性アミノ酸残基である；残基１４７は、脂肪族アミノ酸残基である；残基１６５は、ヒドロキシルアミノ酸残基もしくは低分子アミノ酸残基である；残基１９７は、低分子アミノ酸残基もしくはＧである；残基２２３は、Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基である；および残基２３３は、低分子アミノ酸残基もしくはＧである、のうちの１つ以上をさらに含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１４】
前記アミノ酸配列は、以下から選択される１つ以上の特徴：残基４９はＲである；残基５３はＤである；残基５４はＡである；残基６０はＡである；残基９５はＬである；残基９７はＧである；残基１０９はＲである；残基１４７はＬである；残基１６５はＴである；残基１９７はＧである；残基２２３はＶである；および残基２３３はＧである、を含む、請求項１３に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１５】
前記アミノ酸配列は、以下から選択される特徴：残基５４はＡである；残基１０９はＲである；残基１４７はＬである；および残基２３３はＧである、のうちの１つ以上を有する、請求項１４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１６】
前記アミノ酸配列は、配列番号２もしくは配列番号４の残基９６に対応するアミノ酸残基において、Ｇ、Ｉ、Ｃもしくは芳香族アミノ酸を含む、請求項９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１７】
前記アミノ酸配列は、以下から選択される特徴：残基９４は、芳香族アミノ酸残基もしくはＧである；残基１５３は、Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基１９９は、Ｌ以外の任意のアミノ酸残基である；残基２０２は、Ａ以外の脂肪族アミノ酸残基である；および残基２０６は芳香族アミノ酸残基である、のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１６に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１８】
前記アミノ酸配列は、以下から選択される特徴：残基９４は、ＦもしくはＧである；残基１５３は、ＧもしくはＡである；残基１９９は、Ｋ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｑ、もしくはＷである；残基２０２は、Ｉ、Ｌ、もしくはＧである；および残基２０６はＦである、のうちの１つ以上の含む、請求項１７に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１９】
前記アミノ酸配列は、以下から選択される特徴：残基４９は、Ｋ以外の極性アミノ酸残基である；残基５３は、酸性アミノ酸残基である；残基５４は、低分子アミノ酸残基もしくはＴ／Ｐ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基６０は、Ｖ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基９５は、Ｖ以外の脂肪族アミノ酸である；残基９７は、低分子アミノ酸もしくはＧである；残基１０９は、Ｋ以外の塩基性アミノ酸残基である；残基１４７は、脂肪族アミノ酸残基である；残基１６５は、ヒドロキシルアミノ酸残基もしくは低分子アミノ酸残基である；残基１９７は、低分子アミノ酸残基もしくはＧである；残基２２３は、Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基である；および残基２３３は、低分子アミノ酸残基もしくはＧである、のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２０】
前記アミノ酸配列は、以下から選択される特徴：残基４９はＲである；残基５３はＤである；残基５４はＡである；残基６０はＡである；残基９５はＬである；残基９７はＧである；残基１０９はＲである；残基１４７はＬである；残基１６５はＴである；残基１９７はＧである；残基２２３はＶである；および残基２３３はＧである、のうちの１つ以上を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２１】
前記アミノ酸配列は、以下から選択される特徴：残基５４はＡである；残基１０９はＲである；残基１４７はＬである；および残基２３３はＧである、のうちの１つ以上を有する、請求項２０に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、および１３８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２３】
前記組換えポリペプチドは、単離されたポリペプチドである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２４】
前記単離されたポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチドである、請求項２３に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組換えポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、および１３７からなる群より選択される、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、および１３７からなる群より選択されるポリヌクレオチドに、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
宿主細胞において発現を指向するに適した制御配列と作動可能に連結された、請求項２５および２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項２９】
前記制御配列はプロモーターである、請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項３０】
前記プロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターを含む、請求項２９に記載の発現ベクター。
【請求項３１】
前記制御配列は分泌シグナルである、請求項２９に記載の発現ベクター。
【請求項３２】
請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３３】
野生型ケトレダクターゼ酵素の細胞タイプと同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）であり、該野生型ケトレダクターゼから操作型ケトレダクターゼ酵素が得られる、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
野生型ケトレダクターゼ酵素の細胞タイプと異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であり、該野生型ケトレダクターゼから操作型ケトレダクターゼ酵素が得られる、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
前記細胞はＥ．ｃｏｌｉである、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
前記発現ベクターを構成するコドンは、前記宿主細胞における発現のために至適化されている、請求項３２または３５に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１．関連出願の引用）
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００７年２月８日に出願された出願第６０／９００，４９４号および２００７年２月８日に出願された出願第６０／９００，４３０号（これらの内容は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（２．配列表、表またはコンピュータープログラムへの言及）
米国特許法施行規則§  ｌ．８２ｌ（ｃ）（３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  §  ｌ．８２ｌ（ｃ））の下で本明細書と同時に提出される配列表および米国特許法施行規則§  ｌ．８２ｌ（ｅ）（３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  §  ｌ．８２ｌ（ｅ））の下で提出される配列表のコンピューター読み取り可能な形態（ＣＲＦ）は、その全体が本明細書に参考として援用される。配列表のコピー２つ、コピー１およびコピー２と表示された２枚のコンパクトディスクの各々に対して配列表が提供される。上記配列表の各電子コピーは、ファイルサイズ２２１キロバイトで、２００８年２月８日に作製された。ファイル名は、以下のとおりである：コピー１−３７６２４７−０１５ＷＯ．ｔｘｔおよびコピー２−３７６２４７−０１５ＷＯ．ｔｘｔ。本明細書に参考として援用される上記配列表は、本明細書と同時に提出される配列表のＣＲＦと同一である。
【背景技術】
【０００３】
（３．背景）
ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）またはカルボニルレダクターゼクラス（ＥＣ１．１．１．１８４）に属する酵素は、光学的に活性なアルコールを、その対応するプロキラルケトン基質から合成するために有用である。ＫＲＥＤは、代表的には、ケトン基質を、その対応するアルコール生成物に変換するが、その逆反応（アルコール基質の、その対応するケトン／アルデヒド生成物への酸化）も触媒し得る。ＫＲＥＤのような酵素によるケトンの還元およびアルコールの酸化は、補因子（最も一般的には、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）、および酸化反応については、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ））を必要とする。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、電子供与体として働く一方で、ＮＡＤおよびＮＡＤＰは、電子受容体として働く。ケトレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼは、（その酸化状態または還元状態で）リン酸化補因子または非リン酸化補因子のいずれか一方を受け取るが、両方は受け取らないことが頻繁に観察される。
【０００４】
ＫＲＥＤ酵素は、細菌および酵母の広い範囲において見いだされ得る（総説に関して：Ｋｒａｕｓ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎ，Ｅｎｚｙｍｅ  ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌｓ．１＆２，ＶＣＨ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  １９９５；Ｆａｂｅｒ，Ｋ．，Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．２０００；Ｈｕｍｍｅｌ  ａｎｄ  Ｋｕｌａ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９  １８４：１−１３）。いくつかのＫＲＥＤ遺伝子および酵素配列が、報告された（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＪＣ７３３８；ＧＩ：１１３６０５３８）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ２４５２８．１；ＧＩ：２８１５４０９）、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ１６０７９９；ＧＩ：６５３９７３４）。
【０００５】
重要な化合物の生成のための多くの化学合成手順を回避するために、ケトレダクターゼが、種々のケト基質をキラルアルコール生成物に酵素的に変換するためにますます使用されつつある。これらの適用は、生体触媒的ケトン還元のためにケトレダクターゼを発現する全細胞を使用し得るか、または複数のケトレダクターゼの存在が所望の生成物の特異性および収量に影響を及ぼす場合において精製された酵素を使用し得る。インビトロ適用のために、補因子（ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ）再生酵素（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ホルメートデヒドロゲナーゼなど）は、上記ケトレダクターゼとともに使用される。有用な化合物を生成するためにケトレダクターゼを使用する例としては、４−クロロアセト酢酸エステルの不斉還元（非特許文献１；非特許文献２；特許文献１；特許文献２および特許文献３）；ジオキソカルボン酸の還元（例えば、特許文献４）；ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサノエートの還元（例えば、特許文献５および特許文献６）；ピロロトリアジンベースの化合物の還元（例えば、特許文献７）；置換されたアセトフェノンの還元（例えば、特許文献８）；およびヒドロキシチオランの還元（特許文献９）が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，５５９，０３０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７００，６７０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８９１，６８５号明細書
【特許文献４】米国特許第６，３９９，３３９号明細書
【特許文献５】米国特許第６，６４５，７４６号明細書
【特許文献６】国際公開第０１／４０４５０号パンフレット
【特許文献７】米国特許出願公開第２００６／０２８６６４６号明細書
【特許文献８】米国特許第６，８００，４７７号明細書
【特許文献９】国際公開第２００５／０５４４９１号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８３）１０５：５９２５−５９２６
【非特許文献２】Ｓａｎｔａｎｉｅｌｌｏ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（Ｓ）（１９８４）：１３２−１３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
種々のケト基質をその対応するキラルアルコール生成物に変換するのを実施するために使用され得る他のケトレダクターゼ酵素を同定することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（４．要旨）
本開示は、化合物１−［４−（４−フルオロ２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンを、その対応する生成物（Ｒ）１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールに還元または変換することができる、操作型ケトレダクターゼポリペプチドまたは組換えケトレダクターゼポリペプチドを提供する。上記操作型ケトレダクターゼもしくは組換えケトレダクターゼはまた、アセトフェノンを（Ｒ）−１−フェニルエタノールに還元または変換することができる。本明細書中の実施形態において、上記操作型ケトレダクターゼは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓの天然に存在する野生型ケトレダクターゼ酵素と比較して、上記基質を上記生成物に変換することにおいて、１つ以上の改善された特性を有する。
【００１０】
一局面において、上記１−［４−（４−フルオロ２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンを、その対応する生成物（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールに変換することができる上記組換えポリペプチドは、（１）配列番号２もしくは配列番号４の残基９４に対応するアミノ酸残基において、芳香族アミノ酸もしくはＧ、および／または（２）配列番号２もしくは配列番号４の残基９６に対応するアミノ酸残基において、ＳおよびＮ以外のアミノ酸残基、を有するアミノ酸配列を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ただし、残基９４に対応する残基は、芳香族アミノ酸残基もしくはＧである。上記操作型ケトレダクターゼは、必要に応じて、上記アミノ酸配列内の他の残基位置で１もしくは数個の保存的置換を含み得る。
【００１２】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして配列番号２もしくは配列番号４の残基９４に対応するアミノ酸残基において、芳香族アミノ酸もしくはＧを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、上記１−［４−（４−フルオロ２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンを、その対応する生成物（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールに変換することができる上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４のある領域もしくはそのドメイン（例えば、残基９０〜２３３）に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する領域を含み得るが、ただし、残基９４に対応するアミノ酸残基は、芳香族アミノ酸残基もしくはＧである。これらケトレダクターゼポリペプチドのいくつかの実施形態において、配列番号２もしくは配列番号４の残基９０〜２３３に対応する残りの残基のうちの１もしくは数個は、保存的置換を有し得る。
【００１４】
上記化合物１−［４−（４−フルオロ２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンを、その対応する生成物（Ｒ）１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールに変換することができる上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の残基９４に対応するアミノ酸残基における芳香族アミノ酸もしくはＧに加えて、以下から選択される特徴のうちの１つ以上を含み得る：残基９６は、Ｓ／Ｎ以外の任意のアミノ酸である；残基１５３は、Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基１９９は、Ｌ以外の任意のアミノ酸残基である；残基２０２は、ＧもしくはＡ以外の脂肪族アミノ酸残基である；および残基２０６は、芳香族アミノ酸残基である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、残基９４において特定のアミノ酸を有する上記ケトレダクターゼポリペプチドは、以下から選択されるさらなる特徴：残基４９は、Ｋ以外の極性アミノ酸残基である；残基５３は、酸性アミノ酸残基である；残基５４は、低分子アミノ酸残基もしくはＴ／Ｐ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基６０は、Ｖ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基９５は、Ｖ以外の脂肪族アミノ酸である；残基９７は、低分子アミノ酸もしくはＧである；残基１０９は、Ｋ以外の塩基性アミノ酸残基である；残基１４７は、脂肪族アミノ酸残基である；残基１６５は、ヒドロキシルアミノ酸残基もしくは低分子アミノ酸残基である；残基１９７は、低分子アミノ酸残基もしくはＧである；残基２２３は、Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基である；および残基２３３は、低分子アミノ酸残基もしくはＧである、のうちの１つ以上を含み得る。
【００１６】
別の局面において、上記化合物１−［４−（４−フルオロ２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンを、その対応する生成物（Ｒ）１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールに変換することができる上記組換えケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の残基９６に対応するアミノ酸残基において、ＳおよびＮ以外のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、これら組換えケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の残基９６に対応するアミノ酸残基において、Ｇ、Ｆ、Ｙ、もしくはＩを有するアミノ酸配列を含み得る。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、上記残基９６に対応する残基は、ＳおよびＮ以外のアミノ酸残基である。上記操作型ケトレダクターゼは、必要に応じて、上記アミノ酸配列内の他の位置において、１もしくは数個の保存的置換を含み得る。
【００１８】
いくつかの実施形態において、これらケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み得るが、ただし、上記残基９６に対応する残基は、Ｇ、Ｆ、Ｙ、もしくはＩである。
【００１９】
いくつかの実施形態において、１−［４−（４−フルオロ２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンを、その対応する生成物（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールに変換することができる上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４のある領域もしくはそのドメイン（例えば、残基９０〜２３３）に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する領域を含み得るが、ただし、上記残基９６に対応する残基は、ＳおよびＮ以外のアミノ酸残基である。これらケトレダクターゼポリペプチドのいくつかの実施形態において、配列番号２もしくは配列番号４の残基９０〜２３３に対応する残りの残基のうちの１もしくは数個は、保存的置換を有し得る。
【００２０】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして配列番号２もしくは配列番号４の残基９６に対応するアミノ酸残基において、Ｇ、Ｆ、Ｙ、もしくはＩを含む。これら操作型ケトレダクターゼは、必要に応じて、上記ポリペプチド配列内の他の残基位置において、１もしくは数個の保存的変異を含み得る。
【００２１】
いくつかの実施形態において、上記化合物１−［４−（４−フルオロ２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンを、その対応する生成物（Ｒ）１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールに変換することができる上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の残基９６に対応するアミノ酸残基におけるＧ、Ｆ、Ｙ、もしくはＩに加えて、以下から選択される特徴：残基９４は、芳香族アミノ酸残基もしくはＧである；残基１５３は、Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基１９９は、Ｌ以外の任意のアミノ酸残基である；残基２０２は、Ａ以外の脂肪族アミノ酸残基である；および残基２０６は、芳香族アミノ酸残基である、のうちの１つ以上の特徴を含み得る。
【００２２】
いくつかの実施形態において、残基９６において特定のアミノ酸残基を有する上記ケトレダクターゼポリペプチドは、以下から選択される特徴：残基４９は、Ｋ以外の極性アミノ酸残基である；残基５３は、酸性アミノ酸残基である；残基５４は、低分子アミノ酸残基もしくはＴ／Ｐ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基６０は、Ｖ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基９５は、Ｖ以外の脂肪族アミノ酸である；残基９７は、低分子アミノ酸もしくはＧである；残基１０９は、Ｋ以外の塩基性アミノ酸残基である；残基１４７は、脂肪族アミノ酸残基である；残基１６５は、ヒドロキシルアミノ酸残基もしくは低分子アミノ酸残基である；残基１９７は、低分子アミノ酸残基もしくはＧである；残基２２３は、Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基である；および残基２３３は、低分子アミノ酸残基もしくはＧである、のうちの１つ以上を含み得る。
【００２３】
いくつかの実施形態において、上記化合物１−［４−（４−フルオロ２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンを、その対応する生成物（Ｒ）１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ＩＨ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールに変換することができる上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、および１１８から選択される。
【００２４】
上記のように、上記組換えケトレダクターゼポリペプチドはまた、アセトフェノンを、その対応する生成物（Ｒ）−１−フェニルエタノールに還元もしくは変換することができる。アセトフェノンを、その対応する生成物（Ｒ）１−フェニルエタノールを変換することができるさらなるポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の残基９６に対応するアミノ酸残基において、Ｇ、Ｉ、Ｃもしくは芳香族アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む組換えケトレダクターゼポリペプチドを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、これらケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み得るが、ただし、上記残基９６に対応する残基は、Ｇ、Ｉ、Ｃもしくは芳香族アミノ酸である。これら操作型ケトレダクターゼは、必要に応じて、上記ポリペプチド配列内の他の残基位置において１もしくは数個の保存的変異を含み得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、アセトフェノンを、その対応する生成物（Ｒ）−１−フェニルエタノールに還元もしくは変換することができる上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４のある領域もしくはそのドメイン（例えば、残基９０〜２３３）に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する領域を含み得るが、ただし、上記残基９６に対応する残基は、Ｇ、Ｉ、Ｃもしくは芳香族アミノ酸である。これらケトレダクターゼポリペプチドのいくつかの実施形態において、配列番号２もしくは配列番号４の残基９０〜２３３に対応する残りの残基のうちの１もしくは数個は、保存的置換を有し得る。
【００２７】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、列番号２もしくは配列番号４に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２もしくは配列番号４の残基９６に対応するアミノ酸残基において、Ｇ、Ｉ、Ｃもしくは芳香族アミノ酸を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、アセトフェノンを、その対応する生成物（Ｒ）−１−フェニルエタノールに還元もしくは変換することができる上記ケトレダクターゼポリペプチドは、残基９６に対応するアミノ酸残基におけるＧ、Ｉ、Ｃもしくは芳香族アミノ酸に加えて、以下から選択される特徴：残基９４は、芳香族アミノ酸残基もしくはＧである；残基１５３は、Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基１９９は、Ｌ以外の任意のアミノ酸残基である；残基２０２は、Ａ以外の脂肪族アミノ酸残基である；および残基２０６は、芳香族アミノ酸残基である、のうちの１つ以上を含み得る。
【００２９】
いくつかの実施形態において、アセトフェノンを、その対応する生成物（Ｒ）−１−フェニルエタノールに還元もしくは変換することができる上記ケトレダクターゼポリペプチドは、以下から選択される特徴：残基４９は、Ｋ以外の極性アミノ酸残基であり；残基５３は、酸性アミノ酸残基であり；残基５４は、低分子アミノ酸残基もしくはＴ／Ｐ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基６０は、Ｖ以外の脂肪族アミノ酸残基である；残基９５は、Ｖ以外の脂肪族アミノ酸である；残基９７は、低分子アミノ酸もしくはＧである；残基１０９は、Ｋ以外の塩基性アミノ酸残基である；残基１４７は、脂肪族アミノ酸残基である；残基１６５は、ヒドロキシルアミノ酸残基もしくは低分子アミノ酸残基である；残基１９７は、低分子アミノ酸残基もしくはＧである；残基２２３は、Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基である；および残基２３３は、低分子アミノ酸残基もしくはＧである、のうちの１つ以上をさらに含み得る。
【００３０】
いくつかの実施形態において、アセトフェノンを、その対応する生成物（Ｒ）−１−フェニルエタノールに還元もしくは変換することができる上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、および１１８から選択される。いくつかの実施形態において、アセトフェノンを、その対応する生成物（Ｒ）−１−フェニルエタノールに還元もしくは変換することができる上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号  １２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、および１３８から選択される。
【００３１】
別の局面において、本開示は、本明細書に記載される操作型ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドまたは高度にストリンジェントな条件下でこのようなポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。上記ポリヌクレオチドは、上記コードされる操作型ケトレダクターゼの発現に有用なプロモーターおよび他の調節要素を含み得、そして特定の所望される発現系に最適化されるコドンを利用し得る。例示的なポリヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、および１３７を含み得る。
【００３２】
なお別の局面において、本開示は、上記ポリヌクレオチドおよび／または本明細書に記載される発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。上記宿主細胞は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓであってもよいし、上記宿主細胞は、異なる生物であってもよい。上記宿主細胞は、操作型ケトレダクターゼ酵素（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ）の発現および単離のために使用され得るか、あるいはそれらは、上記ケト基質を、上記キラルアルコール生成物に変換するために直接使用され得る。
【００３３】
当業者によって認識されるように、上記に示される上記還元反応は、補因子（これは、通常、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨである）を概して必要とし、そして上記補因子を再生するための系（例えば、グルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼ）を含み得る。精製された操作型ケトレダクターゼ酵素を使用するいくつかの実施形態において、このような補因子および必要に応じてこのような補因子再生系は、代表的には、上記基質および上記ケトレダクターゼ酵素とともに、反応媒体に添加される。上記操作型ケトレダクターゼ酵素のように、上記補因子再生系を含む任意の酵素は、このような細胞の抽出物もしくは溶解物の形態で、または精製酵素として、上記反応混合物に供給され得る。細胞抽出物または細胞溶解物を使用する実施形態において、上記抽出物もしくは溶解物を生成するために使用される細胞は、上記補因子再生系単独で、または上記操作型ケトレダクターゼ酵素と一緒に含む酵素を発現するために操作され得る。全細胞を使用する実施形態において、上記細胞は、上記補因子再生系および上記操作型ケトレダクターゼ酵素を一緒に含む上記酵素を発現するために操作され得る。
【００３４】
全細胞、細胞抽出物もしくは精製ケトレダクターゼ酵素とともに上記方法を使用するか否かに拘わらず、単一のケトレダクターゼ酵素が使用されてもよいし、あるいは、２つ以上のケトレダクターゼ酵素の混合物が使用され得る。
【００３５】
種々の実施形態において、上記操作型酵素は、９９％以上の鏡像異性選択性（ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）の程度での還元反応または変換反応を行い得る。従って、上記反応は、基準ケトレダクターゼ（例えば、配列番号２もしくは配列番号４のケトレダクターゼ）と比較して、操作型ケトレダクターゼ酵素の活性を評価するために標準的な反応として使用され得る。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作型ケトレダクターゼ酵素は、非常に立体選択的（ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）であるので、構造式（ＩＩ）（「化合物（ＩＩ）」）または構造式（ＩＶ）（「化合物（ＩＶ）」）の得られる生成物は、その対応する鏡像異性体からキラル的にそれを分離する必要性なくして、実質的に立体化学的に純粋な形態で回収され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、規定された基質である化合物（Ｉ）をキラルアルコール生成物である化合物（ＩＩ）へ変換することにおけるケトレダクターゼの役割を示す。この図はまた、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）およびグルコースを要する補因子再生系の使用を示す。
【図２】図２は、規定された基質である化合物（ＩＩＩ）をそのキラルアルコール生成物である化合物（ＩＶ）へ変換することにおけるケトレダクターゼの役割を示す。この図はまた、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）およびグルコースを要する補因子再生系の使用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
（６．詳細な説明）
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のことを示さない限り、複数形への言及を包含する。従って、例えば、「タンパク質」への言及は、１種を超えるタンパク質を含み、そして「化合物」への言及は、１種を超える化合物に言及する。さらに、「または（ｏｒ）」の使用は、別段示されなければ、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、交換可能に使用され、限定することを意図しない。
【００３９】
種々の実施形態の説明が用語「含む」を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の場合において、ある実施形態が、代わりに、語句「〜から本質的になる」または「〜からなる」を使用して記載され得ることが理解されることは、さらに理解されるべきである。
【００４０】
本明細書で使用される節の見出しは、系統立てる目的のために過ぎず、記載される主題を限定するとして解釈されるべきではない。
【００４１】
（６．１  定義）
本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有すると意図される。
【００４２】
「ケトレダクターゼ」および「ＫＲＥＤ」は、あるケト基をその対応するアルコールに還元することができるポリペプチドをいうために、本明細書で交換可能に使用される。より具体的には、本開示のケトレダクターゼポリペプチドは、前出の式（Ｉ）の化合物を、前出の式（ＩＩ）のアルコール生成物（図１を参照のこと）に、および／または前出の式（ＩＩＩ）の化合物を、式（ＩＶ）のアルコール生成物（図２を参照のこと）に、立体選択的に還元することができる。上記ポリペプチドは、代表的には、補因子である還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）を、還元剤として利用する。本明細書で使用される場合、ケトレダクターゼは、天然に存在する（野生型）ケトレダクターゼ、ならびにヒトの操作によって生成される天然に存在しない操作型ポリペプチド（すなわち、組換えポリペプチド）を含む。
【００４３】
「コード配列」とは、あるタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の一部をいう。
【００４４】
「天然に存在する」または「野生型」とは、天然において見いだされる形態に言及する。例えば、天然に存在するまたは野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然における供給源から単離され得かつヒトの操作によって意図的に改変されていない生物に存在する配列である。
【００４５】
例えば、細胞、核酸、またはポリペプチドへの言及に使用される場合、「組換え」とは、物質に、すなわち、その物質の天然の形態もしくはネイティブ形態に対応する物質であって、その物質が、他の状態に天然に存在しない様式で改変されているか、またはどの物質に同一であるが、合成物質から、および／または組換え技術を使用する操作によって、生成されるかまたは誘導される物質に言及する。非限定的な例としては、とりわけ、上記細胞のネイティブ（非組換え）形態で見いだされない遺伝子を発現する組換え細胞、または他の状態で異なるレベルで発現されるネイティブ遺伝子を発現する細胞を含む。
【００４６】
「配列同一性のパーセンテージ」および「パーセント相同性」とは、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの中での比較に言及するために、本明細書で交換可能に使用され、そして比較ウィンドウにわたって、２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定される。ここで上記比較ウィンドウにおける上記ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、上記２つの配列の最適なライン面とのために、参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較した場合、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。上記パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数で除算し、そしてその結果に１００を乗算し、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算され得る。あるいは、上記パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が、両方の配列において存在するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップを入れてアラインメントされるかのいずれかの位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数で除算し、そしてその結果に１００を乗算して、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算され得る。当業者は、２つの配列をアラインメントするために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムがあることを認識している。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）によって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）によって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性方法のための検索（１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４）によって、これらアルゴリズムのコンピューター化実施（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視（一般には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照のこと）によって、行われ得る。％配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，１９７７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３８９−３４０２に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔ���ｏｎウェブサイトから公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントしたときに、ある正の値をとる閾値スコアＴに適合するかまたはこれを満たす、高スコア付け配列対（ＨＳＰ）を同定することを包含する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）といわれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これら最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見いだす検索を開始するためのシーズとして機能する。次いで、このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大されるところまで、各配列に沿って両方向に延ばされる。累積スコアは、二配列に関しては、パラメーターＭ（マッチしている残基の対に関する報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）およびパラメーターＮ（ミスマッチの残基に関するペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列に関しては、スコアリングマトリクスを使用して、累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの延長は、以下の場合に中止される：累積アラインメントスコアが、その最大達成値（ｍａｘｉｍｕｍ  ａｃｈｉｅｖｅｄ  ｖａｌｕｅ）量Ｘだけ減る；累積スコアが、１つ以上の負のスコア付け残基アラインメントの蓄積に起因して、ゼロ以下になる；またはいずれかの配列の末端に達する。上記ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターであるＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。上記ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関して）は、デフォルトとして、ワード長さ（Ｗ）１１、確率（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関しては、上記ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、確率（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照のこと）を使用する。配列アラインメントおよび％  配列同一性の例示的決定は、提供されたデフォルトパラメーターを使用して、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）においてＢＥＳＴＦＩＴプログラムまたはＧＡＰプログラムを使用し得る。
【００４７】
「参照配列」とは、配列比較のための基本として使用される定義された配列をいう。参照配列は、より大きな配列のサブセット（例えば、全長遺伝子もしくはポリペプチド配列のセグメント）であり得る。一般に、参照配列は、長さが少なくとも２０ヌクレオチド残基または２０アミノ酸残基、少なくとも長さ２５残基、少なくとも長さ５０残基、または全長の核酸もしくはポリペプチドである。２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドは、各々（Ｉ）上記２つの配列間で類似である配列を含み得る（すなわち、完全配列の一部）、および（ＩＩ）上記２つの配列間で多様である配列をさらに含み得るので、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列間の配列比較は、代表的には、「比較ウィンドウ」にわたって２つのポリヌクレオチドの配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって行われる。
【００４８】
「比較ウィンドウ」とは、少なくとも約２０個の連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントであって、そこである配列が、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドもしくはアミノ酸の参照配列に対して比較され得かつ比較ウィンドウにおける配列の部分が、上記２つの配列の最適なアラインメントのために、上記参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較される場合、２０％以下の付加もしくは欠失（すなわち、ギャップ）を含み得るものをいう。上記比較ウィンドウは、２０個より長い連続する残基であり得、そして必要に応じて、３０個、４０個、５０個、１００個、またはそれより長いウィンドウを含む。
【００４９】
「実質的同一性」とは、少なくとも２０残基位置の比較ウィンドウにわたって、頻繁には、少なくとも３０〜５０残基のウィンドウにわたって、参照配列と比較して、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％同一性、および８９〜９５％配列同一性、より通常には、少なくとも９８％配列同一性、少なくとも９９％配列同一性または少なくとも９９．５％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列をいう。ここで配列同一性のパーセンテージは、上記参照配列を、上記比較ウィンドウにわたって、上記参照配列の総計２０％以下になる欠失もしくは付加を含む配列に対して比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される特定の実施形態において、用語「実質的同一性」とは、２つのポリペプチド配列が、デフォルトギャップ重み付けを使用して、最適にアラインメントされる場合（例えば、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって）、ｓｈａｒｅ  少なくとも８０％配列同一性、好ましくは、少なくとも８９％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性、少なくとも９８％配列同一性、または少なくとも９９％配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なる。
【００５０】
所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈において使用される場合、「〜に対応する」、「〜への言及」、または「〜に対して」とは、上記所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が特定の参照配列と比較される場合、上記特定の参照配列の残基の番号付けに言及する。言い換えると、所定のポリマーの残基数または残基位置は、上記所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値で表した位置による以外に、上記参照配列に関して設計される。例えば、所定のアミノ酸配列（例えば、操作型ケトレダクターゼのアミノ酸配列）は、上記２つの配列の間の残基マッチを最適化するためにギャップを導入することによって、参照配列に対してアラインメントされ得る。これらの場合において、ギャップは存在し得るが、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、アラインメントされている上記参照配列に対して行われる。
【００５１】
「立体選択性」とは、化学反応もしくは酵素反応において、ある立体異性体よりもう一方の立体異性体を優先的に形成することをいう。立体選択性は、ある立体異性体の形成が、他方のものより有利である場合に、部分的であり得るか、またはある立体異性体のみが形成される場合に、完全であり得る。上記立体異性体が鏡像異性体である場合、上記立体選択性は、鏡像異性選択性、すなわち、両方の合計における１つの鏡像異性体の分数といわれる（代表的には、パーセンテージとして報告される）。鏡像異性選択性は、式［多い方の鏡像異性体−少ない方の鏡像異性体］／［多い方の鏡像異性体＋少ない方の鏡像異性体］に従って、そこから計算される鏡像異性体過剰として（代表的には、パーセンテージとして）、当該分野では一般に報告されている。上記立体異性体がジアステレオマーである場合、上記立体選択性は、ジアステレオ選択性（ｄｉａｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）、すなわち、一方のジアステレオマーと他のジアステレオマーとの合計における、一方のジアステレオマーの分数といわれる（代表的には、パーセンテージとして報告される）。
【００５２】
「非常に立体選択性（ｈｉｇｈｌｙ  ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）」とは、上記基質を、少なくとも約８５％の立体異性体過剰で化学式（ＩＩ）を有するその対応する生成物を変換もしくは還元することができるケトレダクターゼポリペプチドに言及する。
【００５３】
「立体特異性（ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」とは、化学反応もしくは酵素反応において、ある立体異性体よりもう一方の立体異性体を優先的に変換することをいう。立体特異性は、一方の立体異性体の変換がもう一方の立体異性体の変換より有利である場合、部分的であり得るか、またはある立体異性体のみが変換される場合に、完全であり得る。
【００５４】
「改善された酵素特性」とは、参照ケトレダクターゼと比較して、任意の酵素特性において改善を示すケトレダクターゼポリペプチドをいう。本明細書に記載される操作型ケトレダクターゼポリペプチドに関して、比較は、一般に、上記野生型ケトレダクターゼ酵素に対して行われるが、いくつかの実施形態において、上記参照ケトレダクターゼは、別の改善された操作型ケトレダクターゼであり得る。改善が望ましい酵素特性としては、酵素活性（これは、基質の変換％に関して表され得る）、熱安定性、ｐＨ活性プロフィール、補因子要件、インヒビターに対する無反応性（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｉｎｅｓｓ）（例えば、生成阻害）、立体特異性、および立体選択性（鏡像異性選択性を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
「増大した酵素活性」とは、上記操作型ケトレダクターゼポリペプチドの改善された特性をいい、これは、上記参照ケトレダクターゼ酵素と比較して、比活性（例えば、生成される生成物／時間／重量タンパク質）における増加または上記基質をその生成物に変換する％（例えば、特定の量のＫＲＥＤを使用して特定の期間に、出発量の基質を生成物に変換する％）の増加によって表され得る。酵素活性を決定するための例示的方法は、実施例において提供される。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの伝統的な酵素特性を含む、酵素活性に関する任意の特性が、影響を及ぼされ得る。その特性の変化は、増大した酵素活性をもたらし得る。酵素活性の改善は、天然に存在するケトレダクターゼまたは上記ケトレダクターゼポリペプチドが由来する別の操作型ケトレダクターゼより、その対応する野生型ケトレダクターゼ酵素の酵素活性の約１．５倍から、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、またはそれ以上の酵素活性であり得る。特定の実施形態において、上記操作型ケトレダクターゼ酵素は、その親ケトレダクターゼ酵素の酵素活性より、１．５〜５０倍、１．５〜１００倍、またはそれより高い範囲において改善された酵素活性を示し得る。任意の酵素の活性は、触媒性ターンオーバー速度は上記基質（任意の必要とされる補因子を含む）の拡散濃度を超えることができないように制限された拡散であることが、当業者によって理解される。拡散制限（またはｋｃａｔ／Ｋｍ）の理論上の最大は、一般に、約１０８〜１０９（Ｍ−１ｓ−１）である。従って、上記ケトレダクターゼの酵素活性における任意の改善は、上記ケトレダクターゼ酵素が作用する基質の拡散速度に関連した上限を有する。ケトレダクターゼ活性は、ケトレダクターゼを測定するために使用される標準的なアッセイのうちのいずれか１つ（例えば、アルコールへのケトンの付随した還元とともに、その酸化に起因して、ＮＡＤＰＨの吸光度または蛍光の減少、または組み合わせたアッセイにおいて生成された副生成物）によって測定され得る。酵素活性の比較は、本明細書でさらに記載されるように、酵素の規定された調製、設定された条件下での規定されたアッセイ、および１つ以上の規定された基質を使用して行われる。一般に、溶解物が比較される場合、細胞数およびアッセイされるタンパク質の量は、宿主細胞によって生成され、溶解物に存在する酵素の量の変動を最小化するために、同一の発現系および同一の宿主細胞の使用と同様に決定される。
【００５６】
「変換」とは、上記基質を、その対応する生成物に酵素的に変換することをいう。「％変換」とは、特定の条件下である期間内に上記生成物に還元される上記基質の％をいう。従って、ケトレダクターゼポリペプチドの「酵素活性」または活性は、上記基質の、上記生成物への「％変換」として表され得る。
【００５７】
「熱安定性」とは、未処理酵素に比較して、高温（例えば、４０〜８０℃）に一定期間（例えば、０．５〜２４時間）曝露した後に類似の活性（例えば、６０％より高く８０％まで、またはそれ以上）を維持するケトレダクターゼポリペプチドをいう。
【００５８】
「溶媒安定性」とは、未処理酵素に比較して、種々の濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（例えば、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）または溶媒混合物に、一定期間（例えば、０．５〜２４時間）にわたって曝露した後に、類似の活性（例えば、６０％〜８０％を超える）を維持するケトレダクターゼポリペプチドをいう。
【００５９】
「ｐＨ安定性」とは、未処理酵素に比較して、高ｐＨまたは低ｐＨ（例えば、４．５〜６または８〜１２）に、一定期間（例えば、０．５〜２４時間）にわたって曝された後に類似の活性（例えば、６０％〜８０％を超える）を維持するケトレダクターゼポリペプチドをいう。
【００６０】
「熱安定性かつ溶媒安定性（ｔｈｅｒｍｏ−  ａｎｄ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｓｔａｂｌｅ）」とは、熱安定性であるとともに溶媒安定性であるケトレダクターゼポリペプチドをいう。
【００６１】
「〜から得られる、〜に由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）」とは、操作型ケトレダクターゼ酵素の文脈において本明細書で使用される場合、もとのケトレダクターゼ酵素、および／または上記操作が基づく、このようなケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子を明らかにする。例えば、配列番号１０の操作型ケトレダクターゼ酵素は、配列番号２のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒケトレダクターゼ酵素を、コードする遺伝子の複数回の生成にわたって人工的に進化させることによって得られた。従って、この操作型ケトレダクターゼ酵素は、配列番号２の野生型ケトレダクターゼに「由来する」。
【００６２】
「親水性アミノ酸または親水性アミノ酸残基」とは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の正規化されたコンセンサス疎水性スケールに従って、０より小さい疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸またはアミノ酸残基をいう。遺伝的にコードされる疎水性アミノ酸は、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ−Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬ−Ａｒｇ（Ｒ）を含む。
【００６３】
「酸性アミノ酸または酸性アミノ酸残基」とは、この親水性アミノ酸または親水性アミノ酸残基がペプチドまたはポリペプチド中に含まれる場合、約６未満のｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または親水性アミノ酸残基をいう。酸性アミノ酸は、代表的には、水素イオンの喪失に起因して、生理学的ｐＨで負に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされる酸性アミノ酸は、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）を含む。
【００６４】
「塩基性アミノ酸または塩基性アミノ酸残基」とは、この塩基性アミノ酸または塩基性アミノ酸残基がペプチドまたはポリペプチド中に含まれる場合に、約６より高いｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または親水性アミノ酸残基をいう。塩基性アミノ酸は、代表的には、ヒドロニウムイオンとの会合に起因して、生理学的ｐＨで正に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸は、Ｌ−Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ−Ｌｙｓ（Ｋ）を含む。
【００６５】
「極性アミノ酸または極性アミノ酸残基」とは、生理学的ｐＨで荷電していない側鎖を有するが、２つの原子によって共有された電子対が、原子のうちの１つによってより近くに保持される少なくとも１つの結合を有する親水性アミノ酸または親水性アミノ酸残基をいう。遺伝的にコードされた極性アミノ酸は、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）およびＬ−Ｔｈｒ（Ｔ）を含む。
【００６６】
「疎水性アミノ酸または疎水性アミノ酸残基」とは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２の正規化されたコンセンサス疎水性スケールに従って、０より小さい疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸またはアミノ酸残基をいう。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸は、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）を含む。
【００６７】
「芳香族アミノ酸または芳香族アミノ酸残基」とは、少なくとも１つの芳香族環またはヘテロ芳香族環を含む側鎖を有する親水性または疎水性のアミノ酸またはアミノ酸残基をいう。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸は、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｔｙｒ（Ｙ）およびＬ−Ｔｒｐ（Ｗ）を含む。Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）のヘテロ芳香族窒素原子のｐＫａのせいで、Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）はしばしば塩基性アミノ酸として分類されるかまたはその側鎖がヘテロ芳香族環を含むので芳香族残基として分類されるが、本明細書では、ヒスチジンは、疎水性残基として、または「拘束残基（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ）」（以下を参照のこと）として分類される。
【００６８】
「拘束アミノ酸または拘束アミノ酸残基（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｒ  ｒｅｓｉｄｕｅ）」とは、拘束された外形（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）を有するアミノ酸またはアミノ酸残基をいう。本明細書中では、拘束残基は、Ｌ−ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ−ｈｉｓ（Ｈ）を含む。ヒスチジンは、比較的小さなイミダゾール環を有するので、拘束された外形を有する。プロリンは、５員環を有するので、拘束された外形を有する。
【００６９】
「非極性アミノ酸または非極性アミノ酸残基」とは、生理学的ｐＨで荷電しておらず、２つの原子によって共有される電子対が、２つの原子のうちの各々によってほぼ等しく保持されている結合を有する側鎖を有する（すなわち、側鎖は極性でない）疎水性アミノ酸または疎水性アミノ酸残基をいう。遺伝的にコードされた非極性アミノ酸は、Ｌ−Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）およびＬ−Ａｌａ（Ａ）を含む。
【００７０】
「脂肪族アミノ酸または脂肪族アミノ酸残基」とは、脂肪族炭化水素側鎖を有する、疎水性アミノ酸または疎水性アミノ酸残基をいう。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸は、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）およびＬ−Ｉｌｅ（Ｉ）を含む。
【００７１】
「システイン」。アミノ酸Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、他のＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸または他のスルファニル含有アミノ酸もしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド結合を形成し得る点で、普通ではない。「システイン様残基」とは、システインおよびジスルフィド架橋の形成に利用可能なスルフヒドリル部分を含む他のアミノ酸を含む。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）（および−ＳＨ含有側鎖を有する他のアミノ酸）が、還元型の遊離−ＳＨまたは酸化型のジスルフィド架橋形態のいずれかにおいてペプチド中に存在する能力は、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）が正味の疎水性糖性もしくは新彗星特性をペプチドに与えるか否かに影響を及ぼす。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）がＥｉｓｅｎｂｅｒｇ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，１９８４，前出）の正規化されたコンセンサススケールに従って、０．２９の疎水性を示す一方で、本開示の目的で、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）がそれ自体の独特の基に分類されることが理解されるべきである。
【００７２】
「低分子アミノ酸または低分子アミノ酸残基」とは、合計３個以下の炭素および／またはヘテロ原子（a−炭素および水素を除く）から構成される側鎖を有するアミノ酸またはアミノ酸残基をいう。上記低分子アミノ酸または低分子アミノ酸残基は、上記の定義に従って、脂肪族アミノ酸または脂肪族アミノ酸残基、非極性アミノ酸または非極性アミノ酸残基、極性アミノ酸または極性アミノ酸残基、あるいは酸性低分子アミノ酸または酸性低分子アミノ酸残基としてさらに分類され得る。遺伝的にコードされた低分子アミノ酸は、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）を含む。
【００７３】
「ヒドロキシル含有アミノ酸またはヒドロキシル含有アミノ酸残基」とは、ヒドロキシル（−ＯＨ）部分を含むアミノ酸をいう。遺伝的にコードされたヒドロキシル含有アミノ酸は、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）を含む。
【００７４】
「保存的」アミノ酸置換または「保存的」変異とは、類似の側鎖を有する残基の交換可能性をいい、従って、代表的には、同じまたは類似の規定されるクラスのアミノ酸内のアミノ酸で、ポリペプチド中のアミノ酸の置換を包含する。しかし、本明細書で使用される場合、保存的変異は、保存的変異が、代わりに、脂肪族残基から脂肪族残基へ、非極性残基から非極性残基へ、極性残基から極性残基へ、酸性残基から酸性残基へ、塩基性残基から塩基性残基へ、芳香族残基から芳香族残基へ、または拘束残基から拘束残基への置換であり得る場合、親水性残基から親水性残基へ、疎水性残基から疎水性残基へ、ヒドロキシル含有残基からヒドロキシル含有残基へ、または低分子残基から低分子残基への置換を含まない。さらに、本明細書で使用される場合、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＩは、別の脂肪族残基へまたは別の非極性残基へのいずれかへ保存的に変異され得る。以下の表は、例示的に本発明的置換を示す。
【００７５】
【化１】
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「非保存的置換」とは、上記ポリペプチド中のアミノ酸を、顕著に異なる側鎖特性を有するアミノ酸に置換または変異することをいう。非保存的置換は、上記に列挙された定義された群内ではなく、群の間でアミノ酸を使用し得る。一実施形態において、非保存的変異は、（ａ）上記置換の領域においてペプチド骨格の構造に（例えば、グリシンの代わりにプロリン）、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さに影響を及ぼす。
【００７６】
「欠失」とは、参照ポリペプチドに対する１個以上のアミノ酸の除去による、上記ポリペプチドに対する改変をいう。欠失は、酵素活性を保持し、および／または操作型ケトレダクターゼ酵素の改善された特性を保持する一方で、１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、１５個以上のアミノ酸、または２０個以上のアミノ酸の、参照酵素を作り上げるアミノ酸総数の１０％まで、またはアミノ酸総数の２０％までの除去を包含し得る。欠失は、上記ポリペプチドの中間部分および／または末端部分に指向され得る。種々の実施形態において、上記欠失は、連続するセグメントを含み得るか、または不連続であり得る。
【００７７】
「挿入」とは、上記参照ポリペプチドから１個以上のアミノ酸の付加による、上記ポリペプチドへの改変をいう。いくつかの実施形態において、上記改善された操作型ケトレダクターゼ酵素は、天然に存在するケトレダクターゼポリペプチドに対する１もしくは数個のアミノ酸の挿入、および他の操作型ケトレダクターゼポリペプチドへの１もしくは数個のアミノ酸の挿入を含む。挿入は、上記ポリペプチドの内部部分中、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端に対してであり得る。挿入は、本明細書で使用される場合、当該分野で公知のように、融合タンパク質を含む。上記挿入は、アミノ酸の連続するセグメントであり得るか、または天然に存在するポリペプチド中のアミノ酸のうちの１もしくは数個だけ分離し得る。
【００７８】
指定された参照配列に関して、「〜とは異なる（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｒｏｍ）」または「〜とは異なる（ｄｉｆｆｅｒｓ  ｆｒｏｍ）」とは、上記参照配列に対してアラインメントされた場合に、所定のアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列の差異をいう。一般に、上記差異は、上記２つの配列が最適にアラインメントされた場合に決定され得る。差異は、上記参照配列と比較して、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換を包含する。
【００７９】
「フラグメント」とは、本明細書で使用される場合、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が上記配列中の対応する位置に同一であるポリペプチドをいう。フラグメントは、全長参照配列（例えば、野生型（配列番号２もしくは配列番号４）または操作型のケトレダクターゼポリペプチド）の少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長、またはそれ以上、および最大７０％まで、８０％まで、９０％まで、９５％まで、９８％まで、および９９％であり得る。
【００８０】
「単離されたポリペプチド」とは、そのポリペプチドに天然に付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されているポリペプチドをいう。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞もしくはインビトロ合成）から取り出されるかまたは除去されているポリペプチドを包含する。上記改善されたケトレダクターゼ酵素は、細胞内に存在し得るか、細胞媒体中に存在し得るか、または種々の形態（例えば、溶解物または単離された調製物）において調製され得る。このようにして、いくつかの実施形態において、上記改善されたケトレダクターゼ酵素は、単離されたポリペプチドであり得る。
【００８１】
「実質的に純粋なポリペプチド」とは、上記ポリペプチド種が存在する優勢な種である（すなわち、モルベースまたは重量ベースで、組成物中の任意の他の個々の大分子種より豊富）組成物に言及し、一般に、上記目的種がモルまたは％重量で、存在する大分子種の少なくとも約５０％を含む場合に、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なケトレダクターゼ組成物は、上記組成物中に存在するモルまたは％重量で、すべての大分子種のうちの約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、および約９８％以上を含む。いくつかの実施形態において、上記目的種は、本質的に均一になるまで精製され得る（すなわち、夾雑種が従来の検出法によって、上記組成物中で検出できない）。ここで上記組成物は、単一の大分子種から本質的になる。溶媒種、低分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、大分子種とはみなされない。いくつかの実施形態において、上記単離された、改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００８２】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」とは、核酸ハイブリッドが安定である条件をいうために、本明細書で使用される。当業者に公知であるように、ハイブリッドの安定性は、上記ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）において反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含有量、およびカオトロオピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴｍは、融解温度を推定するための公知の方法を使用して計算され得る（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １６８：７６１−７７７；Ｂｏｌｔｏｎら，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：１３９０；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：８８９３−８８９７；Ｆｒｅｉｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；Ｋｉｅｒｚｅｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：７８４０−７８４６；Ｒｙｃｈｌｉｋら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：６４０９−６４１２（ｅｒｒａｔｕｍ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：６９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出）；Ｓｕｇｇｓら，１９８１，Ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ（Ｂｒｏｗｎら，編），ｐｐ．６８３−６９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ  Ｗｅｔｍｕｒ，１９９１，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６：２２７−２５９を参照のこと。全ての刊行物は、本明細書に参考として援用される）。いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードし、本開示の操作型ケトレダクターゼ酵素をコードする配列の相補体に、定義された条件下（例えば、中程度にストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件）でハイブリダイズする。
【００８３】
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」とは、核酸のこのような洗浄条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシー、続いて、より高いストリンジェンシーを除く種々のストリンジェンシーの洗浄の条件下で行われる。用語「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」とは、標的ポリヌクレオチドが、上記標的ポリヌクレオチドに対して約６０％配列同一性、約７５％  配列同一性、約８５％  配列同一性；約９０％  配列同一性、または約９５％以上の配列同一性を有する相補的ポリヌクレオチドに結合することを可能にする条件をいう。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、４２℃で、５０％  ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、続いて、４２℃で、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳ中での洗浄に等価な条件である。
【００８４】
「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」とは、一般に、規定されるポリヌクレオチド配列のための溶液条件下で決定される場合、融解温度Ｔｍから約１０℃以下である条件をいう。いくつかの実施形態において、高ストリンジェンシー条件とは、６５℃において０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件をいう（すなわち、ハイブリッドが６５℃において０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中で安定でない場合、本明細書中で企図されるように、高ストリンジェンシー条件下で安定でない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、４２℃において５０％  ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％  ＳＤＳに等しい条件でのハイブリダイゼーション、続いて、６５℃において０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％  ＳＤＳ中での洗浄によって提供され得る。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、および中程度にストリンジェントな条件とは、上記で引用される参考文献中に記載される
「異種」ポリヌクレオチドとは、実験技術によって宿主細胞に導入される任意のポリヌクレオチドをいい、宿主細胞から除去され、実験操作に供され、次いで、宿主細胞に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
【００８５】
「コドン最適化」とは、コードされるタンパク質が目的の生物で効率的に発現されるように、特定の生物において優先的に使用されるものへの、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの変更をいう。遺伝的コドンは、大部分のアミノ酸がいくつかのコドン（「シノニム」または「類似の（ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ）」コドンといわれる）によって表される点で縮重であるが、特定の生物によるコドン使用頻度が、無作為でなくかつ、特定のコドントリプレットに偏っていることは周知である。このコドン使用頻度偏りは、所定の遺伝子、共通の機能または先祖起源の遺伝子、低コピー数タンパク質に対して高度に発現されるタンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域（ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）に関してより高いかもしれない。いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物から最適な生成のためにコドン最適化され得る。
【００８６】
「好ましい、最適な、高いコドン使用頻度偏りのコドン」とは、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりタンパク質コード領域において高い頻度で使用されるコドンに対して交換可能に言及される。好ましいコドンは、単一の遺伝子、共通の機能または起源の遺伝子セット、高く発現される遺伝子、生物全体（ｗｈｏｌｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連する生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはその組み合わせにおけるコドン使用頻度に関して決定され得る。頻度が遺伝子発現のレベルに伴って増えるコドンは、代表的には、発現のために最適なコドンである。例えば、クラスター分析または対応する分析を使用する、コドン頻度（例えば、類似のコドン使用頻度に比較するコドン使用頻度）および特定の生物におけるドン優先性（多価分析（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を含む）、および遺伝子において使用されるコドンの有効な数（ＧＣＧ  Ｃｏｄｏｎ  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ，Ｊｏｈｎ  Ｐｅｄｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，Ｊ．Ｏ，１９９８，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４：３７２−７３；Ｓｔｅｎｉｃｏら，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２２４３７−４６；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｆ．，１９９０，Ｇｅｎｅ  ８７：２３−２９）を決定するための種々の方法が公知である。コドンし得頻度表は、生物の増えつつあるリストに関して利用可能である（例えば、Ｗａｄａら，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８；Ｎａｋａｍｕｒａら，２０００，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２；Ｄｕｒｅｔら，前出；Ｈｅｎａｕｔ  ａｎｄ  Ｄａｎｃｈｉｎ，「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ」  １９９６，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら編，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ｐ．２０４７−２０６６を参照のこと）。コドン使用頻度を得るためのデータ供給源は、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依存し得る。これらデータセットは、発現されるタンパク質をコードすることが実際の公知の核酸配列（例えば、完全タンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の推定コード領域（例えば、Ｍｏｕｎｔ，Ｄ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２５９−２８１；Ｔｉｗａｒｉら，１９９７，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：２６３−２７０を参照のこと）が挙げられる。
【００８７】
「制御配列」とは、本開示のポリペプチドの発現に必要なまたは有利な全ての成分を含むことが、本明細書で定義される。各制御配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列に対してネイティブであってもよいし、外来のものであってもよい。このような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。最低でも、上記制御配列は、プロモーター、および転写終止シグナルおよび翻訳終止シグナルを含む。上記制御配列は、上記制御配列と、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域との連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的で、リンカーとともに提供され得る。
【００８８】
「作動可能に連結される」とは、上記制御配列が、ポリヌクレオチドおよび／または上記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの発現を指向するかまたは影響を及ぼすように、ポリヌクレオチド配列のコード配列に関する位置において制御配列が適切に配置される配置として、本明細書で定義される。
【００８９】
「プロモーター配列」とは、ポリヌクレオチド（例えば、コード領域を含むポリヌクレオチド）の発現のための宿主細胞によって認識される核酸配列である。一般に、上記プロモーター配列は、上記ポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。上記プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得る。それらとしては、変異プロモーター、短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）プロモーター、およびハイブリッドプロモーターが挙げられる。そして上記プロモーターは、上記宿主細胞に対して同種または異種のいずれかである細胞外ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【００９０】
「補因子再生系」とは、上記補因子の酸化型形態を還元する反応（例えば、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨへ）に関与する反応物のセットをいう。上記ケト基質のケトレダクターゼ触媒された還元によって酸化される補因子は、上記補因子再生系によって還元された形態で再生される。補因子再生系は、還元する水素等価物の供給源である化学量論的還元剤を含み、上記補因子の酸化型形態を還元することができる。上記補因子再生系は、上記還元剤によって上記補因子の酸化型形態の還元を触媒する触媒（例えば、酵素触媒）をさらに含み得る。ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋から、それぞれＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを再生する補因子再生系は、当該分野で公知であり、本明細書に記載される方法において使用され得る。
【００９１】
（６．２  ケトレダクターゼ酵素）
本開示は、規定されたケト基質を、その対応するアルコール生成物へ還元もしくは変換し、そしてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓから得られた上記天然に存在する野生型ケトレダクターゼ酵素、または別の参照ケトレダクターゼ酵素（例えば、別の操作型ケトレダクターゼ酵素）と比較した場合に改善された特性を有することができる操作型または組換えケトレダクターゼ（「ＫＲＥＤ」）酵素を提供する。本明細書中の実施形態において、上記組換えケトレダクターゼポリペプチドは、以下でさらに議論されるように、上記基質１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オン（式（Ｉ）の構造によって表される）を、その生成物（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オール（式（ＩＩ）の構造によって表される）へと立体選択的に還元もしくは変換することができる。上記ケトレダクターゼは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｃｉｌｌｕｓの上記天然に存在するケトレダクターゼ酵素と比較して、式（Ｉ）の基質を、式（ＩＩ）の生成物へ還元することにおいて改善された特性を有する。
【００９２】
いくつかの実施形態において、上記組換えケトレダクターゼポリペプチドはまた、以下にさらに議論されるように、上記基質アセトフェノン（構造式（ＩＩＩ）によって表される）をそのキラルアルコール生成物（Ｒ）１−フェニルエタノール（式（ＩＶ）の構造によって表される）に還元もしくは変換することができる。従って、上記操作型ケトレダクターゼは、上記基質１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンもしくはアセトフェノン、または両方を使用して、参照ケトレダクターゼに対して比較され得る。いくつかの実施形態において、１つの参照基質（例えば、１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オン）は、上記操作型ケトレダクターゼの活性を、上記参照ケトレダクターゼ（例えば、配列番号２もしくは配列番号４）の活性と比較する場合、他の参照基質（例えば、アセトフェノン）で置換され得る。
【００９３】
本明細書中の実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２および４の、それぞれ野生型Ｌ．ｋｅｆｉｒもしくはＬ．ｂｒｅｖｉｓ配列の対応する残基位置において、少なくとも（１）芳香族アミノ酸残基もしくはＧである９４位のアミノ酸残基、および／または（２）Ｓ／Ｎ以外のアミノ酸である９６位のアミノ酸残基を含む。従って、本明細書中の種々の実施形態において、本開示のケトレダクターゼは、配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列に対応するポリペプチドに関して、少なくとも以下のアミノ酸置換を含む：（１）残基９４は、Ａ→芳香族アミノ酸残基もしくはＧに改変される、そして／または（２）残基９６は、Ｓ／Ｎ→Ｓ／Ｎ以外の任意のアミノ酸に改変される。
【００９４】
これらの天然に存在しないケトレダクターゼは、種々の周知の技術（例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓのケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝物質のインビトロ変異誘発もしくは指向された進化）によって、望ましい特性を有する操作された酵素を発現するポリヌクレオチドを同定することによって生成され得る。上記ＫＲＥＤの能力は、上記野生型酵素に存在し得るように、単一ポリペプチドとしてのそれらの特性、またはマルチマーの形態でのそれらの特性に言及し得る。
【００９５】
本明細書中の目的に有用な変異誘発および指向された進化技術は、以下の文献に詳細に記載される：Ｌｉｎｇら，１９９７，「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ」，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−７８；Ｄａｌｅら，１９９６，「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−７４；Ｓｍｉｔｈ，１９８５，「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら，１９８５，「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０１；Ｃａｒｔｅｒ，１９８６，「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７；Ｋｒａｍｅｒら，１９８４，「Ｐｏｉｎｔ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ」，Ｃｅｌｌ，３８：８７９−８８７；Ｗｅｌｌｓら，１９８５，「Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ」，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら，１９９９，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ」，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ３：２８４−２９０；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら，１９９９，「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ＡＺＴ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：２５９−２６４；Ｃｒａｍｅｒｉら，１９９８，「ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら，１９９７，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｒｓｅｎａｔｅ  ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：４３６−４３８；Ｚｈａｎｇら，１９９７，「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｆｒｕｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：４５−４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉら，１９９６，「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３１５−３１９；Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，「Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅ��ｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１；Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，「ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１；ＷＯ  ９５／２２６２５；ＷＯ  ９７／００７８；ＷＯ  ９７／３５９６６；ＷＯ  ９８／２７２３０；ＷＯ  ００／４２６５１；ＷＯ  ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号。すべての刊行物は、本明細書に参考として援用される。
【００９６】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓの天然に存在するケトレダクターゼ（「アルコールデヒドロゲナーゼ」または「ＡＤＨ」ともいわれる）をコードする天然に存在するポリヌクレオチドは、ケトレダクターゼ活性をコードすることが公知の単離されたポリヌクレオチド（例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒについてのＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＰ９４０２９  ＧＩ：３３１１２０５６およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓについてのＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＤ６６６４８  ＧＩ：２８４００７８９）から得られ得る。あるいは、上記天然に存在するケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、ケトレダクターゼコード遺伝子の報告されたポリヌクレオチド配列に基づいて、当該分野で公知のポリヌクレオチド合成方法論によって合成され得る。種々の実施形態において、さらに以下に記載されるように、上記ケトレダクターゼをコードする天然に存在するポリヌクレオチド、および同様に操作型ケトレダクターゼのものは、上記酵素の発現のために使用される特定の宿主細胞によって好まれるコドンにコドン最適化され得る。
【００９７】
上記天然に存在するかまたは野生型のケトレダクターゼをコードする親ポリヌクレオチドまたは参照ポリヌクレオチドは、変異誘発プロセス（例えば、ランダム変異誘発および組換え）に供されて、上記ポリヌクレオチドに変異が導入される。上記変異ポリヌクレオチドが発現および翻訳され、それによって、上記ポリペプチドに対して改変を有する操作型ケトレダクターゼ酵素を生成する。本明細書で使用される場合、「改変」とは、アミノ酸の置換、欠失、および挿入を包含する。改変のうちの１つまたは改変の組み合わせは、上記天然に存在する、酵素的に活性なポリペプチドに導入されて、操作型酵素が生成され得、次いで、この操作型酵素は、特定の酵素活性において望ましい改善を有するポリペプチドおよび対応するポリヌクレオチドを同定するための種々の方法によってスクリーニングされる。改善された特性を有する操作型ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、さらなるラウンドの変異誘発処置に供して、所望の酵素活性においてさらなる改善を有するポリペプチドを生成し得る。改善が望ましい酵素特性としては、望ましくは、酵素活性、熱安定性、ｐＨ活性プロフィール、補因子要件、インヒビターに対する耐性（例えば、生成物阻害）、立体特異性、立体選択性、および溶媒安定性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
いくつかの実施形態において、上記組換えケトレダクターゼは、配列番号２のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒケトレダクターゼもしくは配列番号４のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓケトレダクターゼに由来する操作型ポリペプチドを包含し、従って、配列番号２のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒケトレダクターゼもしくは配列番号４のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓケトレダクターゼに対して比較され得る。本明細書の説明において、上記アミノ酸残基位置は、参照ポリペプチドに関して決定される。配列番号２もしくは配列番号４の参照配列に関して、番号付けは、最初のメチオニン（Ｍ）残基（すなわち、Ｍは、１位の残基を表す）から始まるが、最初のメチオニン残基を欠いている成熟タンパク質を生成するために、この最初のメチオニン残基が、生物学的プロセシング機構（例えば、宿主細胞、またはインビトロ翻訳系において）によって除去され得ることは、当業者によって理解される。同じ残基位置におけるアミノ酸残基が、上記２つの参照ケトレダクターゼ間で異なる場合、上記異なる残基は、「／」で示され、その並べ方は、「ｋｅｆｉｒ残基／ｂｒｅｖｉｓ残基」である。参照配列（例えば、配列番号２および配列番号４の野生型ケトレダクターゼ）におけるアミノ酸残基の、異なるアミノ酸残基での置換である置換変異は、記号「→」によって示される。
【００９９】
改善されたケトレダクターゼ特性を生じる参照ポリペプチド（例えば、配列番号２もしくは配列番号４の天然に存在するポリペプチド）に対する改変の数は、１もしくは数個のアミノ酸、２もしくは数個のアミノ酸、３もしくは数個のアミノ酸、４もしくは数個のアミノ酸、５もしくは数個のアミノ酸、６もしくは数個のアミノ酸、８もしくは数個のアミノ酸、１０もしくは数個のアミノ酸、または１５もしくは数個のアミノ酸、２０もしくは数個のアミノ酸、上記参照酵素配列のアミノ酸総数の１０％まで、アミノ酸総数の２０％まで、またはアミノ酸総数の３０％までを含み得る。このようにして、本開示のポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０または２５もしくは数個のアミノ酸において、あるいは上記参照配列のアミノ酸総数の５％まで、上記アミノ酸の１０％まで、上記アミノ酸の２０％まで、または上記アミノ酸の３０％まで、上記参照ポリペプチド（例えば、配列番号２もしくは配列番号４）とは異なり得る。
【０１００】
種々の実施形態において、上記改善された酵素特性を生じるための上記参照ポリペプチドに対する改変は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０、２５または数個のアミノ酸の置換、または参照配列（例えば、配列番号２もしくは配列番号４）のアミノ酸の総数の５％まで、上記アミノ酸の１０％まで、上記アミノ酸の２０％まで、または上記アミノ酸の３０％までを含み得る。改善されたケトレダクターゼを生じるための置換は、保存的置換、非保存的置換、ならびに保存的置換と非保存的置換との組み合わせを含み得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の野生型参照ケトレダクターゼの活性と比較して、上記基質１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンを、上記生成物（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールへ立体選択的に還元もしくは変換することにおいて増大した酵素活性を有する。いくつかの実施形態において、上記増大した酵素活性は、上記野生型参照ポリペプチドの酵素活性の少なくとも１．５倍以上である。いくつかの実施形態において、上記増大した酵素活性は、配列番号２もしくは配列番号４の参照ポリペプチドの活性と比較して、少なくとも２．０倍以上の酵素活性、少なくとも３．０倍以上の酵素活性、少なくとも５倍以上の酵素活性、少なくとも１０倍以上の酵素活性、少なくとも２０倍以上の酵素活性、少なくとも２５倍以上の酵素活性、少なくとも５０倍以上の酵素活性、少なくとも７５倍以上の酵素活性、少なくとも１００倍以上の酵素活性である。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、規定された条件下での配列番号２もしくは配列番号４の野生型参照ケトレダクターゼの変換速度と比較して、１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンを、上記生成物（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールを立体選択的に還元もしくは変換させることにおいて増大した変換速度を有する。いくつかの実施形態において、上記操作型ケトレダクターゼは、規定された条件下で上記基質の、７０％より大きい、８０％より大きい、９０％より大きい、９５％より大きい、９８％より大きいまたは９９％より大きい変換によって特徴づけられる。例示的な規定された条件は、１０ｇ／Ｌ基質と、約１０ｇ／Ｌ  ＫＲＥＤとの２４時間での変換である。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の野生型参照ケトレダクターゼの活性と比較して、上記基質アセトフェノンをその生成物（Ｒ）−１−フェニルエタノールへ立体選択的に還元もしくは変換することにおいて、増大した酵素活性を有する。いくつかの実施形態において、上記増大した酵素活性は、上記野生型参照ポリペプチドの少なくとも１．５倍以上の酵素活性である。いくつかの実施形態において、上記増大した酵素活性は、配列番号２もしくは配列番号４の参照ポリペプチドの活性と比較して、少なくとも２．０倍以上の酵素活性、少なくとも３．０倍以上の酵素活性、少なくとも５倍以上の酵素活性、少なくとも１０倍以上の酵素活性、少なくとも２０倍以上の酵素活性、少なくとも２５倍以上の酵素活性、少なくとも５０倍以上の酵素活性、少なくとも７５倍以上の酵素活性、少なくとも１００倍以上の酵素活性である。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、規定された条件下で配列番号２もしくは配列番号４の野生型参照ケトレダクターゼの活性と比較して、上記基質アセトフェノンをその生成物（Ｒ）−１−フェニルエタノールへ立体的選択的に還元もしくは変換することにおいて増大した変換速度を有する。いくつかの実施形態において、上記操作型ケトレダクターゼは、規定された条件下で上記基質の、７０％より大きい、８０％より大きい、９０％より大きい、９５％より大きい、９８％より大きいまたは９９％より大きい変換によって特徴づけられる。例示的な規定された条件は、１０ｇ／Ｌ  基質と、約１０ｇ／Ｌ  ＫＲＥＤとの２４時間での変換である。
【０１０５】
種々の実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の活性の少なくとも１．５倍で、上記基質１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンをその生成物（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールへ立体選択的に還元もしくは変換させることができ、そして（１）配列番号２もしくは配列番号４の参照配列の対応する残基９４位において、芳香族アミノ酸もしくはＧ、または（２）配列番号２もしくは配列番号４の参照配列の対応する残基９６位において、Ｓ／Ｎ以外のアミノ酸、を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記対応する残基９６位におけるアミノ酸残基は、ＳおよびＮ以外である。これら実施形態のうちのいくつかにおいて、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、以下で議論されるように、上記参照配列と比較して、２もしくは数個のアミノ酸残基、３もしくは数個のアミノ酸残基、または４もしくは数個のアミノ酸残基において、上記参照配列とは異なり得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、上記基質１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンをその生成物（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールへ立体選択的に還元もしくは変換することができる上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４参照配列の対応する残基９４位において芳香族アミノ酸もしくはＧを有するアミノ酸配列を含む。このようにして、いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の対応する配列の残基９４において、Ａ→芳香族アミノ酸残基もしくはＧへの改変を含む。これら実施形態のうちのいくつかにおいて、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、以下で議論されるように、上記参照配列と比較して、２もしくは数個のアミノ酸残基、３もしくは数個のアミノ酸残基、または４もしくは数個のアミノ酸残基において、上記参照配列とは異なり得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の残基９４の対応するアミノ酸残基において、アミノ酸Ｆ、Ｗ、Ｈ、もしくはＹを有するアミノ酸配列を含む。このようにして、いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の対応する配列の残基９４において、Ａ→Ｆ、Ｗ、Ｈ、もしくはＹへの改変を含む。いくつかの実施形態において、残基９４のアミノ酸はＦである。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、上記基質１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンをその生成物（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールに立体選択的に変換することができる、残基９４に特定のアミノ酸を有する上記ケトレダクターゼポリペプチドは、その対応する配列番号２もしくは配列番号４の他のアミノ酸残基において改変（非保存的置換もしくは保存的置換を含む）を有し得る。非保存的置換は、以下でさらに議論されるように、残基５３位、５４位、９６位、９７位、１４７位、１６５位、１５３位、１９７位、１９９位、２０６位、２２３位、および２３３位に対応するアミノ酸残基においてであり得る。さらなる置換は、存在する場合は、他のアミノ酸残基位置において１もしくは数個の保存的置換を含み得る。
【０１０９】
従って、いくつかの実施形態において、上記組換えケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２とは１〜２５個のアミノ酸位置が異なるアミノ酸配列を含み得るが、ただし、上記配列番号２もしくは配列番号４の残基９４に対応するアミノ酸残基は、芳香族アミノ酸もしくはＧである。このようにして、いくつかのポリペプチドは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、もしくは２５個のアミノ酸位置において、例えば、１〜２５個のアミノ酸位置において、１〜２０個のアミノ酸位置において、１〜１８個のアミノ酸位置において、１〜１６個のアミノ酸位置において、１〜１４個のアミノ酸位置において、１〜１２個のアミノ酸位置において、１〜１１個のアミノ酸位置において、１〜１０個のアミノ酸位置において、１〜９個のアミノ酸位置において、１〜８個のアミノ酸位置において、１〜７個のアミノ酸位置において、１〜６個のアミノ酸位置において、１〜５個のアミノ酸位置において、１〜４個のアミノ酸位置において、１〜３個のアミノ酸位置において、または１〜２個のアミノ酸位置において、配列番号２もしくは配列番号４とは異なるアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、上記基質１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンをその生成物（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールへ立体選択的に還元もしくは変換することができる上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の残基９４に対応する残基において、芳香族アミノ酸もしくはＧを有するアミノ酸配列を含み、そして以下から選択される特徴のうちの１つ以上を含む：（１）残基９６に対応する残基におけるアミノ酸は、Ｓ／Ｎ以外の任意のアミノ酸である；（２）残基１５３に対応するアミノ酸残基は、Ｌ以外の脂肪族アミノ酸である；（３）残基１９９に対応するアミノ酸残基は、Ｌ以外の任意のアミノ酸残基である；（４）残基２０２に対応するアミノ酸残基は、ＧもしくはＡ以外の脂肪族アミノ酸である；および（５）残基２０６に対応するアミノ酸残基は、芳香族アミノ酸である。従って、いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、残基９４においてＡ→芳香族アミノ酸残基もしくはＧへの改変、および以下から選択される１個以上の改変：配列番号２もしくは配列番号４の対応する配列の残基９６（Ｓ／Ｎ→Ｓ／Ｎ以外の任意のアミノ酸）；残基１５３（Ｌ→Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基）；残基１９９（Ｌ→Ｌ以外の任意のアミノ酸残基）；残基２０２（Ａ→ＧもしくはＡ以外の脂肪族アミノ酸残基）；および残基２０６（Ｍ→芳香族アミノ酸残基）を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、上記アミノ酸残基、および上記残基における対応する変異は、以下から選択される：残基１５３はＧもしくはＡである；残基１９９は、Ｋ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｑ、もしくはＷである；残基２０２は、Ｉ、Ｌ、もしくはＧである；および残基２０６はＦである。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、上記基質１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンをその生成物（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールへ立体選択的に還元もしくは変換することができる上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の残基９６に対応するアミノ酸残基において、Ｇ、Ｆ、Ｙ、もしくはＩを有するアミノ酸配列を含む。このようにして、いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の対応する配列の残基９６において、Ｓ／Ｎ→Ｇ、Ｆ、Ｙ、もしくはＩへの改変を含む。これら実施形態のうちのいくつかにおいて、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、以下で議論されるように、上記参照配列と比較して、２もしくは数個のアミノ酸残基、３もしくは数個のアミノ酸残基、または４もしくは数個のアミノ酸残基において、参照配列とは異なり得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドはまた、上記基質アセトフェノンをその生成物（Ｒ）−１−フェニルエタノールへと立体選択的に還元もしくは変換することができる。これら実施形態のうちのいくつかにおいて、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の残基９６に対応するアミノ酸残基において、Ｇ、Ｉ、Ｃもしくは芳香族アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。このようにして、いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の対応する配列の残基９６において、Ｓ／Ｎ→Ｇ、Ｉ、Ｃもしくは芳香族アミノ酸残基への改変を含む。これら実施形態のうちのいくつかにおいて、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、以下で議論されるように、上記参照配列と比較して、２もしくは数個のアミノ酸残基、３もしくは数個のアミノ酸残基、または４もしくは数個のアミノ酸残基において、上記参照配列とは異なり得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、残基９６において特定のアミノ酸を有する上記ケトレダクターゼポリペプチドは、上記対応する配列番号２もしくは配列番号４の他のアミノ酸残基において改変（非保存的置換もしくは保存的置換を含む）を含み得る。非保存的置換は、以下でさらに議論されるように、５３位、５４位、９６位、９７位、１４７位、１６５位、１５３位、１９７位、１９９位、２０６位、２２３位、および２３３位の残基に対応するアミノ酸残基においてであり得る。さらなる置換は、存在する場合、他のアミノ酸残基位置において１もしくは数個の保存的置換を含み得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、１〜２５個のアミノ酸位置が配列番号２とは異なるアミノ酸配列を含むが、ただし、配列番号２もしくは配列番号４の残基９６に対応するアミノ酸残基は、Ｇ、Ｆ、Ｙ、もしくはＩである。このようにして、いくつかのポリペプチドは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、もしくは２５個のアミノ酸位置において、例えば、１〜２５個のアミノ酸位置において、１〜２０個のアミノ酸位置において、１〜１８個のアミノ酸位置において、１〜１６個のアミノ酸位置において、１〜１４個のアミノ酸位置において、１〜１２個のアミノ酸位置において、１〜１１個のアミノ酸位置において、１〜１０個のアミノ酸位置において、１〜９個のアミノ酸位置において、１〜８個のアミノ酸位置において、１〜７個のアミノ酸位置において、１〜６個のアミノ酸位置において、１〜５個のアミノ酸位置において、１〜４個のアミノ酸位置において、１〜３個のアミノ酸位置において、または１〜２個のアミノ酸位置において、配列番号２もしくは配列番号４とは異なるアミノ酸配列を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、ケトレダクターゼポリペプチドは、１〜２５個のアミノ酸位置において、配列番号２とは異なるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２もしくは配列番号４の残基９６に対応する残基において、Ｇ、Ｉ、Ｃ、もしくは芳香族アミノ酸を含む。このようにして、いくつかのポリペプチドは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、もしくは２５個のアミノ酸位置において、例えば、１〜２５個のアミノ酸位置において、１〜２０個のアミノ酸位置において、１〜１８個のアミノ酸位置において、１〜１６個のアミノ酸位置において、１〜１４個のアミノ酸位置において、１〜１２個のアミノ酸位置において、１〜１１個のアミノ酸位置において、１〜１０個のアミノ酸位置において、１〜９個のアミノ酸位置において、１〜８個のアミノ酸位置において、１〜７個のアミノ酸位置において、１〜６個のアミノ酸位置において、１〜５個のアミノ酸位置において、１〜４個のアミノ酸位置において、１〜３個のアミノ酸位置において、または１〜２個のアミノ酸位置において、配列番号２もしくは配列番号４とは異なるアミノ酸配列を含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、上記配列番号２もしくは配列番号４の残基９６において特定のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み、以下の特徴のうちの１つ以上を含む：（１）残基９４に対応する残基におけるアミノ酸は、芳香族アミノ酸もしくはＧである；（２）残基１５３に対応するアミノ酸残基は、Ｌ以外の脂肪族アミノ酸である；（３）残基１９９に対応するアミノ酸残基は、Ｌ以外の任意のアミノ酸である；（４）残基２０２に対応するアミノ酸残基は、ＧもしくはＡ以外の脂肪族アミノ酸である；および（５）残基２０６に対応するアミノ酸残基は、芳香族アミノ酸である。
【０１１８】
従って、いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、残基９６において、Ｓ／Ｎ→Ｇ、Ｆ、Ｙ、もしくはＩへの改変、および以下の１つ以上の改変：配列番号２もしくは配列番号４の対応する配列の残基９４（Ａ→芳香族アミノ酸残基もしくはＧ）；残基１５３（Ｌ→Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基）；残基１９９（Ｌ→Ｌ以外の任意のアミノ酸残基）；残基２０２（Ａ→ＧもしくはＡ以外の脂肪族アミノ酸残基）；および残基２０６（Ｍ→芳香族アミノ酸残基）を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、残基９６において、Ｓ／Ｎ→Ｇ、Ｉ、Ｃへの改変および以下の残基における１つ以上の改変：配列番号２もしくは配列番号４の対応する配列の残基９４（Ａ→芳香族アミノ酸残基もしくはＧ）；残基１５３（Ｌ→Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基）；残基１９９（Ｌ→Ｌ以外の任意のアミノ酸残基）；残基２０２（Ａ→ＧもしくはＡ以外の脂肪族アミノ酸残基）；および残基２０６（Ｍ→芳香族アミノ酸残基）を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、上記アミノ酸残基、および上記残基における対応する変異は、以下のうちの１つ以上から選択され得る：残基９４はＦもしくはＧである；残基１５３はＧもしくはＡである；残基１９９はＫ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｑ、もしくはＷである；残基２０２はＩ、Ｌ、もしくはＧである；および残基２０６はＦである。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、さらなる変異は、上記ケトレダクターゼポリペプチド実施形態のすべてに組み込まれて、上記ポリペプチド活性（例えば、とりわけ、酵素活性、熱安定性、および／もしくは溶媒安定性）のうちの１つ以上の特性を増強し得る。従って、いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、上記実施形態のすべてに加えて、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る：（１）残基４９に対応する残基におけるアミノ酸は、Ｋ以外の極性アミノ酸残基である；（２）残基５３に対応する残基におけるアミノ酸は、酸性アミノ酸残基である；（３）残基５４に対応する残基におけるアミノ酸は、低分子アミノ酸残基もしくはＴ／Ｐ以外の脂肪族アミノ酸残基である；（４）残基６０に対応する残基におけるアミノ酸は、Ｖ以外の脂肪族アミノ酸残基である；（５）残基９５に対応する残基におけるアミノ酸は、Ｖ以外の脂肪族アミノ酸である；（６）残基９７に対応する残基におけるアミノ酸は、低分子アミノ酸もしくはＧである；（７）残基１０９に対応する残基におけるアミノ酸は、Ｋ以外の塩基性アミノ酸残基である；（８）残基１４７に対応する残基におけるアミノ酸は、脂肪族アミノ酸残基である；（９）残基１６５に対応する残基におけるアミノ酸は、ヒドロキシルアミノ酸残基もしくは低分子アミノ酸残基である；（１０）残基１９７に対応する残基におけるアミノ酸は、低分子アミノ酸残基もしくはＧである；（１１）残基２２３に対応する残基におけるアミノ酸は、Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基である；および（１２）残基２３３に対応する残基におけるアミノ酸は、低分子アミノ酸残基もしくはＧである。
【０１２２】
従って、これら実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、上記ケトレダクターゼのあらゆる実施形態について記載される特定の改変を有するアミノ酸配列を含み得、以下の改変のうちの１つ以上を含む：配列番号２もしくは配列番号４の対応する配列の４９（Ｋ→Ｋ以外の極性アミノ酸残基）；５３（Ｇ／Ｔ→酸性アミノ酸残基）；５４（Ｔ／Ｐ→低分子アミノ酸残基もしくはＴ／Ｐ以外の脂肪族アミノ酸残基）；６０（Ｖ／Ｆ→Ｖ以外の脂肪族アミノ酸残基）；９５（Ｖ→Ｖ以外の脂肪族アミノ酸）；９７（Ｋ→低分子アミノ酸もしくはＧ）；１０９（Ｋ→Ｋ以外の塩基性アミノ酸残基）；１４７（Ｆ→脂肪族アミノ酸残基）；１６５（Ｉ→ヒドロキシルアミノ酸残基もしくは低分子アミノ酸残基）；１９７（Ｄ→低分子アミノ酸残基もしくはＧ）；２２３（Ｉ→Ｌ以外の脂肪族アミノ酸残基）；および２３３（Ｄ／Ｎ→低分子アミノ酸残基もしくはＧ）。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、その残基は、以下に対応する（１）残基９４は、芳香族アミノ酸残基もしくはＧである、および／または（２）残基９６は、Ｓ／Ｎ以外のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、対応する残基９６位におけるアミノ酸残基は、ＳおよびＮ以外である。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、その残基は、以下に対応する：（１）残基９４は、Ｆ、Ｗ、Ｈ、もしくはＹである；（２）残基９６は、Ｇ、Ｆ、Ｙ、もしくはＩである；または（３）残基９６は、Ｇ、Ｉ、Ｃもしくは芳香族アミノ酸である。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、本発明のケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の領域もしくはそのドメイン（例えば、残基９０〜２３３）に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する領域を含み得るが、ただし、その残基は、以下に対応する：（１）残基９４は、芳香族アミノ酸残基もしくはＧである、および／または（２）残基９６は、配列番号２もしくは配列番号４の対応する残基のＳ／Ｎ以外のアミノ酸残基。いくつかの実施形態において、対応する残基９６位におけるアミノ酸残基は、ＳおよびＮ以外である。これらケトレダクターゼポリペプチドのうちのいくつかの実施形態において、配列番号２もしくは配列番号４の残基９０〜２３３に対応する残りの残基のうちの１つ以上は、保存的に置換され得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の領域もしくはそのドメイン（例えば、残基９０〜２３３）に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する領域を含み得るが、ただし、その残基は、以下に対応する：（１）配列番号２もしくは配列番号４の対応する残基の残基９４は、Ｆ、Ｗ、Ｈ、もしくはＹである；（２）残基９６は、Ｇ、Ｆ、Ｙ、もしくはＩである；または（３）残基９６は、Ｇ、Ｉ、Ｃもしくは芳香族アミノ酸である。これらケトレダクターゼポリペプチドのうちのいくつかの実施形態において、配列番号２もしくは配列番号４の残基９０〜２３３に対応する残りの残基のうちの１つ以上は、保存的に変異され得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、上記操作型ケトレダクターゼポリペプチドは、表１に記載されるアミノ酸配列から選択される。表１は、ＡＤＨ−ＬＫ（配列番号２）を使用して測定される活性と比較して、上記列挙された操作型ケトレダクターゼポリペプチドを使用して、１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オンをその生成物（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オールに還元もしくは変換するために測定される酵素活性をランク付けする。
【０１２８】
【表１−１】
2010517574.tif 000003
【０１２９】
【表１−２】
2010517574.tif 000004
【０１３０】
【表１−３】
2010517574.tif 000005
【０１３１】
【表１−４】
2010517574.tif 000006
１活性ランク付け：＋  ＡＤＨ−ＬＫと比較して、活性が最大２０倍まで改善。＋＋  ＡＤＨ−ＬＫと比較して、活性が２１〜８０倍改善。＋＋＋  ＡＤＨ−ＬＫと比較して、活性が８０倍を超えて改善。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、上記操作型ケトレダクターゼ酵素は、表２において記載されるアミノ酸配列から選択される。表２は、ＡＤＨ−ＬＫ（配列番号２）を用いて測定される活性と比較して、ＡＤＨ−ＬＫから得られる列挙された操作型ケトレダクターゼポリペプチドを使用して、アセトフェノンを（Ｒ）−１−フェニルエタノールに還元もしくは変換するために測定される酵素活性をランク付けする。
【０１３３】
【表２−１】
2010517574.tif 000007
【０１３４】
【表２−２】
2010517574.tif 000008
１活性ランク付け：実施例１６の方法において、アセトフェノンを（Ｒ）１−フェニルエタノールへ変換する：＋  ＜７０％変換；＋＋  ７０〜９０％変換；＋＋＋  ＞９０％変換。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで上記アミノ酸配列は、表１または表２に列挙されるポリペプチド配列のうちのいずれか１つに含まれる変異のセットのうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、表１または表２の特定の残基位置におけるアミノ酸残基のセットのうちのいずれか１つを含み、それは、約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１６、１〜１８、１〜２０、もしくは１〜２５個のアミノ酸位置からの対応する配列とは異なる。いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、表１もしくは表２に列挙された変異の設置のうちのいずれか１つを含み、さらに、他の残基において約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１６、１〜１８、１〜２０、もしくは１〜２５個の保存的置換から異なる。従って、いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、表１もしくは表２のアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０、もしくは２５個のアミノ酸位置において異なり得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、もしくは１１８の領域もしくはそのドメイン（例えば、残基９０〜２３３）に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する領域を含み得る。いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、もしくは１３８の領域もしくはそのドメイン（例えば、残基９０〜２３３）に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する領域を含み得る。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、および１１８から選択される。いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、および１３８から選択される。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４の残基９４に対応する残基において、芳香族アミノ酸（ａｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｉｄ）もしくはＧを有するアミノ酸配列を含む場合、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、１６、２０、２２、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、および１２８のアミノ酸配列から選択され得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドが、配列番号２もしくは配列番号４の残基９６に対応する残基において、Ｓ／Ｎ以外のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む場合、上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２６、２８、３０、３６、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１０４、１０８、１１０、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３２、１３４、および１３６のアミノ酸配列から選択され得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドのセグメントは、ポリペプチドフラグメントを生成するために欠失され得る。用語「フラグメント」とは、本明細書で使用される場合、残りのアミノ酸配列がその配列において対応する位置に同一である、アミノ末端欠失および／またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドをいう。フラグメントは、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長またはそれ以上であり得る。いくつかの実施形態において、上記フラグメントは、上記の全長組換えケトレダクターゼポリペプチドの７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％までである（配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、および１１８のケトレダクターゼポリペプチドのフラグメントを含む）。いくつかの実施形態において、上記フラグメントは、上記の全長組換えケトレダクターゼポリペプチドの７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％までである（配列番号１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、および１３８のケトレダクターゼポリペプチドのフラグメントを含む）。
【０１４１】
上記改善されたケトレダクターゼ酵素は、細胞内に存在し得るか、細胞媒体中に存在し得るか、または種々の形態（例えば、溶解物もしくは単離された調製物）において調製され得る。このようにして、いくつかの実施形態において、上記改善されたケトレダクターゼ酵素は、単離されたポリペプチドであり得る。用語「単離されたポリペプチド」とは、それに天然に付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されているポリペプチドをいう。上記用語は、それらの天然に存在する環境もしくは発現系（例えば、宿主細胞もしくはインビトロ合成）から取り出されているかもしくは精製されているポリペプチドを包含する。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、上記単離され改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。用語「実質的に純粋なポリペプチド」とは、上記ポリペプチド種が存在する優勢な種である（すなわち、モルベースもしくは重量ベースで、上記組成物中の任意の他の個々の大分子種よりも豊富である）組成物をいい、かつ一般に、目的の種がモルまたは％重量で存在する大分子種の少なくとも約５０％を構成する、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なケトレダクターゼ組成物は、上記組成物に存在するモルもしくは％重量ですべての大分子種の約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、および約９８％以上を構成する。いくつかの実施形態において、上記目的の種は、本質的に均一（すなわち、夾雑する種が従来の検出法によって上記組成物中で検出できない）になるまで精製され、ここで、上記組成物は、単一の大分子種から本質的になる。溶媒種、低分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、大分子種とはみなされない。
【０１４３】
（６．３  操作型ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチド）
別の局面において、本開示は、上記操作型ケトレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。上記ポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製するために、遺伝子発現を制御する１種以上の異種の調節配列もしくは制御配列に、作動可能に連結され得る。上記操作型ケトレダクターゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物は、上記対応するケトレダクターゼを発現するのに適切な宿主細胞に導入され得る。
【０１４４】
種々のアミノ酸に対応するコドンの知識が原因で、ポリペプチド配列の有効性は、本発明のポリペプチドをコードすることができるすべてのポリヌクレオチドの説明を提供する。同じアミノ酸が代替のもしくは類似のコドンによってコードされる場合の遺伝コードの縮重によって、極めて多くの核酸を作製することが可能になり、そのすべては、本明細書で開示される改善されたケトレダクターゼ酵素をコードする。従って、特定のアミノ酸配列が同定されると、当業者は、上記タンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で、１つ以上のコドンの配列を単純に改変することによって、任意の数の異なる核酸を作製し得る。この点に関して、本開示は、考えられるコドン選択に基づいた組み合わせを選択することによって作製され得るポリヌクレオチドの各々のすべての考えられるバリエーションを具体的に企図し、このようなバリエーションはすべて、表１および表２に示されるアミノ酸配列を含む、本明細書に開示された任意のポリペプチドについて具体的に開示されるとみなされるべきである。このようにして、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、もしくは１３８のケトレダクターゼポリペプチドをコードする任意のかつすべての考えられるポリヌクレオチド配列を包含する。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な生成のためにコドン最適化され得る。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌における遺伝子を発現するために使用される；酵母において使用される好ましいコドンは、酵母における発現のために使用される；そして哺乳動物において使用される好ましいコドンは、哺乳動物細胞における発現のために使用される。例示によれば、配列番号１のポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化されているが、他の部分では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒの天然に存在するケトレダクターゼをコードする。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、すべてのコドンが、上記ケトレダクターゼのコドン使用頻度を最適化するために置換される必要があるわけではない。なぜなら、天然の配列は、好ましいコドンを含みかつ好ましいコドンの使用は、すべてのアミノ酸残基に必要とされるわけではないからである。結論として、上記ケトレダクターゼ酵素をコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドは、全長コード領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％超で好ましいコドンを含み得る。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、上記操作型ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、および１１７から選択される。いくつかの実施形態において、上記操作型ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、および１３７から選択される。
【０１４８】
これらポリヌクレオチドは、表１および表２に列挙されるアミノ酸配列によって表され、Ｅ．ｃｏｌｉコドン最適化されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ遺伝子を本明細書に記載される指向された遺伝子進化技術に供することによって、得られた対応するポリペプチドをコードする。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリペプチドをコードするが、操作型ケトレダクターゼをコードする参照ポリヌクレオチドに対するヌクレオチドレベルにおいて、約８０％以上配列同一性、約８５％以上配列同一性、約９０％以上配列同一性、約９１％以上配列同一性、約９２％以上配列同一性、約９３％以上配列同一性、約９４％以上配列同一性、約９５％以上配列同一性、約９６％以上配列同一性、約９７％以上配列同一性、約９８％以上配列同一性、もしくは約９９％以上配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、上記参照ポリヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、および１１７のポリヌクレオチド配列から選択される。いくつかの実施形態において、上記参照ポリヌクレオチドは、配列番号１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、および１３７の配列から選択される。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードし、そして規定された条件（例えば、中程度にストリンジェントな、または高度にストリンジェントな条件）下で、本開示の操作型ケトレダクターゼ酵素をコードする配列の相補体にハイブリダイズする。このようにして、いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、および１１７から選択されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、上記ケトレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、および１３７から選択されるポリヌクレオチドに高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【０１５１】
改善されたケトレダクターゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドの発現を提供するための種々の方法において操作され得る。上記単離されたポリヌクレオチドのベクターに挿入する前の操作は、上記発現ベクターに依存して、望ましいかまたは必須であり得る。組換えＤＮＡ方法を利用するポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技術は、当該分野で周知である。ガイダンスは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９８，２００６に改訂において提供される。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、上記制御配列は、上記宿主細胞に対して同種もしくは異種のいずれかである細胞外ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る、適切なプロモーター配列であり得る。細菌宿主細胞に関して、本開示の核酸構築物の転写を指向するのに適切なプロモーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ（ａｇａｒａｓｅ）遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  マルトース生成アミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ）遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡ遺伝子およびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）、ならびにｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）から得られるプロモーターが挙げられる。さらなるプロモーターは、「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９８０，２４２：７４−９４；およびＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）において記載される。
【０１５３】
糸状菌宿主細胞に関して、本開示の核酸構築物の転写を指向するために適したプロモーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  中性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒもしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  トリオースホスフェートイソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  アセトアミダーゼ（ａｃｅｔａｍｉｄａｓｅ）、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ  ９６／００７８７）の遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  中性α−アミラーゼの遺伝子およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースホスフェートイソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、ならびにその変異体、短縮型、およびハイブリッドプロモーターを包含する。
【０１５４】
酵母宿主において、有用なプロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセレートキナーゼの遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら，１９９２，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８によって記載される。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、上記制御配列はまた、適切な転写終結配列（転写を終結させるために宿主細胞によって認識される配列）であり得る。上記終結配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択された上記宿主細胞において機能する任意の終結因子は、本発明において使用され得る。
【０１５６】
例えば、例示的な糸状菌宿主細胞のための転写終結因子は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒα−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られ得る。
【０１５７】
酵母宿主細胞の例示的な終結因子は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロームＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの遺伝子から得られ得る。酵母宿主細胞のための他の有用な終結因子は、Ｒｏｍａｎｏｓら，１９９２，前出によって記載される。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、上記制御配列はまた、適切なリーダー配列（上記宿主細胞による転写にとって重要なｍＲＮＡの短縮されていない領域）であり得る。上記リーダー配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択された上記宿主細胞において機能する任意のリーダー配列は、使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダー配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースホスフェートイソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセレートキナーゼキナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、上記制御配列はまた、ポリアデニル化配列（上記核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写される場合には、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列）であり得る。選択された上記宿主細胞において機能する任意のポリアデニル化配列は、本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  α−グルコシダーゼの遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ  １５：５９８３−５９９０によって記載される。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、上記制御はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードしかつ上記コードされたポリペプチドを上記細胞の分泌経路に指向するシグナルペプチドコード領域であり得る。上記核酸配列のコード配列の５’末端は、上記分泌ポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳リーディングフレームにおいて天然に連結されるシグナルペプチドコード領域を本質的に含み得る。あるいは、上記コード配列の５’末端は、上記コード領域に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含み得る。上記外来性のシグナルペプチドコード領域は、上記コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然に含まない場合、必要であり得る。
【０１６１】
あるいは、上記外来性のシグナルペプチドコード領域は、上記ポリペプチドの分泌を増強するために、上記天然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換し得る。しかし、上記発現されるポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に指向する任意のシグナルペプチドコード領域は、本発明において使用され得る。
【０１６２】
細菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣｌＢ  １１８３７  マルトース生成性アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  α−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓズブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  β−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ５７：１０９−１３７によって記載される。
【０１６３】
糸状菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドコード領域は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域であり得る。
【０１６４】
酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  インベルターゼの遺伝子に由来し得る。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Ｒｏｍａｎｏｓら，１９９２（前出）によって記載される。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、上記制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であり得る。その得られたポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（またはある場合にはチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に、不活性であり、そして上記プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒性切断もしくは自触媒作用性切断によって、成熟な活性ポリペプチドへと変換され得る。上記プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子，  Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼ（ＷＯ  ９５／３３８３６）の遺伝子から得られ得る。
【０１６６】
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方が、ポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、上記プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、そして上記シグナルペプチド領域は、上記プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
【０１６７】
上記宿主細胞の増殖に対して上記ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することも、望ましくあり得る。調節系の例は、化学的刺激もしくは物理的刺激（調節性化合物の存在を含む）に応じてスイッチが入るまたはスイッチが切れるように、遺伝子の発現を引き起こすものである。原核生物宿主細胞において、適切な調節性配列としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞において、適切な調節系としては、例として、ＡＤＨ２系もしくはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌において、適切な調節性配列としては、ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
【０１６８】
調節性配列もしくは制御配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系において、これらは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（これは、メトトレキセートの存在下で増幅される）、およびメタロチオネイン遺伝子（これは、重金属で増幅される）を含む。これらの例において、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードする核酸配列は、上記制御配列と作動可能に連結される。
【０１６９】
従って、別の局面において、本開示はまた、導入されるべき宿主の型に依存して、操作型ケトレダクターゼポリペプチドまたはその改変体をコードするポリヌクレオチド、および１つ以上の発現調節領域（例えば、プロモーターおよび終結因子、複製起点など）を含む組換え発現ベクターに関する。種々の核酸および上記に記載される制御配列は、１つ以上の都合の良い制限部位を含んで、このような部位において上記ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にし得る組換え発現ベクターを生成するために一緒に結合され得る。あるいは、本開示の核酸配列は、上記核酸配列または発現のための適切なベクターに上記配列を含む核酸構築物を挿入することによって発現され得る。上記発現ベクターを作出するにあたって、上記コード配列は、上記コード配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるように、上記ベクターに位置する。
【０１７０】
上記組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に便利に供され得、かつ上記ポリヌクレオチド配列の発現をもたらし得る任意のベクター（例えば、プラスミドもしくはウイルス）であり得る。上記ベクターの選択は、代表的には、上記ベクターと、上記ベクターが導入されるべき宿主細胞との適合性に依存する。上記ベクターは、線状プラスミドもしくは閉じた環状プラスミドであり得る。
【０１７１】
上記発現ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、染色体外実体として存在するベクター）であり得、その複製は、染色体複製とは無関係である（例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、もしくは人工染色体）。上記ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含み得る。あるいは、上記ベクターは、上記宿主細胞に導入される場合に、ゲノムに組み込まれかつ組み込まれている染色体と一緒に複製されるものであり得る。さらに、単一のベクターもしくはプラスミド、または上記宿主細胞のゲノム、もしくはトランスポゾンに導入されるべき総ＤＮＡを一緒に含む２つ以上のベクターもしくはプラスミドが、使用され得る。
【０１７２】
本発明の発現ベクターは、好ましくは、１種以上の選択マーカーを含み、この選択マーカーは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする。選択マーカーは遺伝子であり、その生成物は、殺生物性もしくはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性などを提供する。細菌戦宅マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール（実施例１）もしくはテトラサイクリン耐性のような抗生物質耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞に適したマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。
【０１７３】
糸状菌宿主細胞において使用するための選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ）、ｓＣ（スルフェートアデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにその等価物が挙げられるが、これらに限定されない。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞において使用するための実施形態は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓもしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳ遺伝子およびｐｙｒＧ遺伝子、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子を含む。
【０１７４】
本発明の発現ベクターは、好ましくは、上記宿主細胞のゲノムにベクターを組み込むことを可能にする要素、またはゲノムとは無関係に、上記細胞においてベクターの自己複製を可能にする要素を含む。上記宿主細胞ゲノムに組み込むために、上記ベクターは、上記ポリペプチドをコードする核酸配列または相同組換えもしくは非相同組換えによるゲノムへの組み込みのためのベクターの任意の他の要素に依存し得る。
【０１７５】
あるいは、上記発現ベクターは、上記宿主細胞のゲノムへの相同組み込みによって組み込みを指向するためのさらなる核酸配列を含み得る。上記さらなる核酸配列は、上記ベクターが、染色体における正確な位置において上記宿主細胞ゲノムに組み込まれることを可能にする。正確な位置における組み込みの可能性を増大させるために、上記組み込み要素は、好ましくは、相同組換えの確率を増大させるために、対応する標的配列と高度に相同である十分な数の核酸（例えば、１００〜１０，０００塩基対、好ましくは、４００〜１０，０００塩基対、および最も好ましくは、８００〜１０，０００塩基対）を含むべきである。上記組み込み要素は、上記宿主細胞のゲノムにおける標的配列と相同である任意の配列であり得る。さらに、上記組み込み要素は、非コード核酸配列もしくはコード核酸配列であり得る。他方で、上記ベクターは、非相同組換えによって、上記宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。
【０１７６】
自己複製については、上記ベクターは、上記ベクターが、問題の上記宿主細胞において自立的に複製することを可能にする複製近点をさらに含み得る。細菌の複製起点の例は、Ｐ１５Ａ  ｏｒｉ（図５のプラスミドにおいて示される）もしくはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣｌ７７（これらのプラスミドは、Ｐ１５Ａ  ｏｒｉを有する）の複製起点、またはＥ．ｃｏｌｉにおいて複製を可能にするｐＡＣＹＣ１８４、およびＢａｃｉｌｌｕｓにおいて複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、もしくはｐＡＭ．ｂｅｔａ．１である。酵母宿主細胞において使用するための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組み合わせ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６との組み合わせである。上記複製起点は、上記宿主細胞において機能性の温度感受性にする変異を有するものであり得る（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ，１９７８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１４３３を参照のこと）。
【０１７７】
本発明の核酸配列の１つより多いコピーは、その遺伝子産物の生成を増大させるために、上記宿主細胞に挿入され得る。上記核酸配列のコピー数における増大は、上記宿主細胞ゲノムに、配列の少なくとも１つのさらなるコピーを組み込むことによって、または上記核酸配列を有する増幅可能な選択マーカー遺伝子を含むことによって、得られ得る。ここで上記選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含む細胞、およびそれによって、上記核酸配列のさらなるコピーが、適切な選択剤の存在下で細胞を培養することによって選択され得る。
【０１７８】
本発明において使用するための発現ベクターの多くは、市販されている。適切な市販の発現ベクターとしては、ｐ３ｘＦＬＡＧＴＭＴＭ発現ベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．）が挙げられ、これは、ＣＭＶプロモーターと哺乳動物宿主細胞における発現のためのｈＧＨポリアデニル化部位とｐＢＲ３２２複製起点とＥ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのアンピシリン耐性マーカーとを含む。他の適切な発現ベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（登録商標）およびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡから市販されておいる）、ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）もしくはｐＰｏｌｙ（Ｌａｔｈｅら，１９８７，Ｇｅｎｅ  ５７：１９３−２０１）から得られるプラスミドである．
（６．４  ケトレダクターゼポリペプチドの発現のための宿主細胞）
別の局面において、本開示は、本開示の改善されたケトレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（このポリヌクレオチドは、上記宿主細胞における上記ケトレダクターゼ酵素の発現のための１種以上の制御配列に作動可能に連結される）を含む宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされる上記ケトレダクターゼポリペプチドを発現することにおいて使用するための宿主細胞は、当該分野で周知であり、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅもしくはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８）））；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；および植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および増殖条件は、当該分野で周知である。
【０１７９】
上記ケトレダクターゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当該分野で公知の種々の方法によって、細胞に導入され得る。技術としては、とりわけ、エレクトロポレーション、バイオリスティック・パーティクル・ボンバードメント（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リポソーム媒介性トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。ポリヌクレオチドを細胞に導入するための種々の方法は、当業者に明らかである。
【０１８０】
例示的な宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０である。上記発現ベクターを、改善されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを、ｌａｃＩリプレッサーの制御下でｌａｃプロモーターに作動可能に連結されたプラスミドｐＣＫ１１０９００に作動可能に連結することによって作出した。上記発現ベクターはまた、Ｐ１５ａ  複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでいた。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０において本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を、上記細胞をクロラムフェニコール選択に供することによって単離した。
【０１８１】
（６．５  操作型ケトレダクターゼポリペプチドを生成するための方法）
本開示の改善されたケトレダクターゼポリヌクレオチドおよびポリペプチドを作製するために、還元反応を触媒する、天然に存在するケトレダクターゼ酵素は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓから得られる。いくつかの実施形態において、親ポリヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞において上記ケトレダクターゼの発現を増強するために、コドン最適化されている。例示として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒの野生型ケトレダクターゼポリペプチドをコードする上記親ポリヌクレオチド配列を、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおいて入手可能なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ  ＫＲＥＤ配列の公知のポリペプチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＰ９４０２９  ＧＩ：３３１１２０５６）に基づいて調製されるオリゴヌクレオチドから構築した。上記親ポリヌクレオチド配列（配列番号１として指定される）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化し、このコドン最適化したポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングし、ｌａｃプロモーターおよびｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下で、上記ケトレダクターゼ遺伝子を発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて上記活性ケトレダクターゼを発現するクローンを同定し、上記遺伝子を配列決定して、それらの同一性を確認した。指定された配列（配列番号１）は、上記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ  ケトレダクターゼから進化させた操作型ケトレダクターゼのすべての発現およびライブラリー構築物のための出発点として利用した親配列であった。
【０１８２】
上記操作型ケトレダクターゼは、上記で議論されるように、上記天然に存在するケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを、変異誘発および／または指向性進化方法に供することにいって得られ得る。例示的な指向性進化技術は、変異誘発および／またはＳｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１；ＷＯ  ９５／２２６２５；ＷＯ  ９７／００７８；ＷＯ  ９７／３５９６６；ＷＯ  ９８／２７２３０；ＷＯ  ００／４２６５１；ＷＯ  ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号に記載されるように、ＤＮＡシャッフリングである。使用され得る他の指向性進化手順としては、とりわけ、少しずつ場所をずらして配置した伸長プロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳｔＥＰ）、インビトロ組換え（Ｚｈａｏら，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２５８-２６１）、変異誘発性ＰＣＲ（Ｃａｌｄｗｅｌｌら，１９９４，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３：Ｓ１３６−Ｓ１４０）、およびカセット変異誘発（Ｂｌａｃｋら，１９９６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：３５２５−３５２９）が挙げられる。
【０１８３】
変異誘発処理後に得られるクローンは、望ましい改善された酵素特性を有する操作型ケトレダクターゼについてスクリーニングされる。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨがＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋に変換されるので、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの濃度の減少速度を（吸光度もしくは蛍光の減少を介して）モニターする標準的な生化学的技術を使用して行われ得る。この反応において、上記ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨは、上記ケトレダクターゼがケトン基質をその対応するヒドロキシル基に還元するので、上記ケトレダクターゼによって消費（酸化）される。単位時間あたりのＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの濃度の減少速度は、吸光度もしくは蛍光における減少によって測定される場合、固定量の溶解物（またはそれらから作製した凍結乾燥粉末）における上記ケトレダクターゼポリペプチドの相対（酵素）活性を示す。望ましい、改善された酵素特性が熱安定性である場合、酵素活性は、上記酵素調製物を規定の温度に供し、そして熱処理後に残っている酵素活性の量を測定した後に測定され得る。ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含むクローンは、次いで、単離され、配列決定されて、上記ヌクレオチド配列変化を同定し（あるとすれば）、そして宿主細胞において酵素を発現させるために使用される。
【０１８４】
上記操作型ポリペプチドの配列が知られている場合、上記酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成法に従って、標準的な固相法によって調製され得る。いくつかの実施形態において、約１００塩基までのフラグメントは、個々に合成され得、次いで、結合されて（例えば、酵素的もしくは化学的な連結法によって、またはポリメラーゼ媒介性方法によって）、任意の所望の連続する配列を形成し得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら，１９８１，Ｔｅｔ  Ｌｅｔｔ  ２２：１８５９−６９によって記載される伝統的なホスホルアミダイト方法によって、またはＭａｔｔｈｅｓら，１９８４，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８０１−０５によって記載される方法を用いて、例えば、自動化合成法において代表的には実施されるように、化学合成によって調製され得る。ホスホルアミダイト方法に従って、例えば、自動ＤＮＡ合成機においてオリゴヌクレオチドが合成され、精製され、アニールされ、連結され、そして適切なベクターにクローニングされる。さらに、本質的に任意の核酸が、種々の市販の供給源（例えば、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡなど）のうちのいずれかから得られ得る。
【０１８５】
宿主細胞において発現される操作型ケトレダクターゼ酵素は、タンパク質精製のための周知の技術（とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィーが挙げられる）のうちの１つ以上を使用して、上記細胞および／または培養培地から回収され得る。溶解のための適切な溶液および細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）からのタンパク質の高効率抽出は、商標名ＣｅｌＬｙｔｉｃ  ＢＴＭ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の下で市販されている。
【０１８６】
上記ケトレダクターゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技術としては、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、正味の電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などのような因子に部分的に依存し、そして当業者に明らかである。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、アフィニティー技術は、上記改善されたケトレダクターゼ酵素を単離するために使用され得る。アフィニティークロマトグラフィー精製については、上記ケトレダクターゼポリペプチドを特異的に結合する任意の抗体が使用され得る。抗体の生成については、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラッドなどが挙げられるが、これらに限定されない）が、化合物での注射によって免疫され得る。上記化合物は、側鎖官能基もしくは側鎖官能基に結合されるリンカーによって、適切なキャリア（例えば、ＢＳＡ）に結合され得る。種々のアジュバントが、宿主の種に依存して、免疫学的応答を増大させるために使用され得、これらとしては、フロイント（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン）、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８８】
（６．６  上記操作型ケトレダクターゼ酵素を使用するための方法および上記酵素で調製される化合物）
本明細書に記載されるケトレダクターゼ酵素は、式（Ｉ）の構造によって表される基質１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オン：
【０１８９】
【化２】
2010517574.tif 000009
の、式（ＩＩ）の構造によって表される、そのキラルアルコール生成物（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４，］トリアジン−６−イルオキシ］−プロパン−２−オール：
【０１９０】
【化３】
2010517574.tif 000010
への還元を触媒し得る。
【０１９１】
プロテインキナーゼインヒビターの合成において有用な上記化合物は、米国特許出願第２００６／０００４００７号、同第２００６／０１２８７０９号；同第２００６／０２５７４００号；同第２００６０２６４４３８号；および同第ＵＳ２００６０２８６６４６号（すべての刊行物は、本明細書に参考として援用される）に記載される化合物のクラス内に包含される。従って、必須のケト基を有するクラスの他の化合物は、本明細書に開示されるケトレダクターゼに対する基質として使用され得る。
【０１９２】
種々の実施形態において、上記方法は、式（Ｉ）の化合物と、本開示のケトレダクターゼとを、上記基質を構造式（ＩＩ）の化合物へ変換させるに適した反応条件下で接触もしくは混合させる工程を包含し得る。例示的な反応条件は、実施例に記載される。他の適切な反応条件は、当業者に明らかである。上記方法において使用され得る例示的なケトレダクターゼポリペプチドとしては、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、および１１８が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるケトレダクターゼポリペプチドは、構造式（ＩＩＩ）によって表される基質アセトフェノン：
【０１９４】
【化４】
2010517574.tif 000011
を、構造式（ＩＶ）によって表される、その対応するキラルアルコール生成物（Ｒ）−１−フェニルエタノール：
【０１９５】
【化５−１】
2010517574.tif 000012
へ変換させることができる。
【０１９６】
種々の実施形態において、上記方法は、式（ＩＩＩ）の化合物と、本開示のケトレダクターゼとを、上記基質を構造式（ＩＶ）の化合物に変換するのに適した反応条件下で接触もしくは混合する工程を包含し得る。例示的な反応条件は、実施例に記載される（例えば、実施例１５を参照のこと）。他の適切な反応条件は、当業者に明らかである。上記方法において使用され得る例示的なケトレダクターゼポリペプチドとしては、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、もしくは１３８が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、アセトフェノンを（Ｒ）１−フェニルエタノールに還元もしくは変換するために使用され得る上記ケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、もしくは１３８のポリペプチドから選択される。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、得られる生成物は、特定の立体異性体（すなわち、化合物（ＩＩ）もしくは化合物（ＩＶ））が豊富である。本明細書で使用される場合、化合物は、特定の立体異性体が、上記化合物において存在する任意の他の立体異性体より過剰に存在する場合に、特定の立体異性体が「豊富」である。特定の立体異性体が豊富な化合物は、代表的には、少なくとも約６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、もしくは９９．５％以上の特定の立体異性体を構成する。特定の立体異性体の富化の量は、当業者によって慣用的に使用される従来の分析法を使用して確認され得る。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、望ましくない立体異性体の量は、１０％未満、例えば、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満またはさらに０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．２％未満、もしくは０．１％未満であり得る。望ましい立体異性体の少なくとも約９９．５％以上を構成する立体異性的に富化された化合物は、「実質的に純粋な」立体異性体として、本明細書で言及される。いくつかの実施形態において、特定の立体異性体が実質的に純粋な化合物は、９９．０％を超える、９９．２％を超える、９９．４％を超える、９９．６％を超える、９９．８％を超える、もしくはさらに大きな純度を含む。所望の立体異性体の９９．９％を構成する立体異性的に富化された化合物は、「純粋な」立体異性体として本明細書で言及される。
【０１９９】
当業者によって公知であるように、ケトレダクターゼ触媒性還元反応は、代表的には、補因子を要する。本明細書に記載される操作型ケトレダクターゼ酵素によって触媒される還元反応はまた、代表的には、補因子を要するが、上記操作型ケトレダクターゼの多くの実施形態は、野生型ケトレダクターゼ酵素で触媒される反応より遙かに少ない補因子しか要しない。本明細書で使用される場合、用語「補因子」とは、ケトレダクターゼ酵素と組み合わせて機能する非タンパク質化合物をいう。本明細書に記載される操作型ケトレダクターゼ酵素とともに使用するために適切な補因子としては、ＮＡＤＰ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート）、ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰ＋の還元型）、ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）およびＮＡＤＨ（ＮＡＤ＋の還元型）が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、上記補因子の還元型が、反応混合物に添加される。上記還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、補因子再生系を使用して、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）＋から必要に応じて再生され得る。
【０２００】
使用され得る適切な例示的補因子再生系としては、グルコースとグルコースデヒドロゲナーゼ、ホルメートとホルメートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートとグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、２級（例えば、イソプロパノール）アルコールと２級アルコールデヒドロゲナーゼ、ホスファイトとホスファイトデヒドロゲナーゼ、分子状水素とヒドロゲナーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの系は、補因子として、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ＋／ＮＡＤＨのいずれかと組み合わせて使用され得る。ヒドロゲナーゼを使用する電子化学的再生は、補因子再生系として使用され得る。例えば、米国特許第５，５３８，８６７号および同第６，４９５，０２３号（これらはともに、本明細書に参考として援用される）を参照のこと。金属触媒と還元剤（例えば、分子状水素もしくはホルメート）とを含む化学的補因子再生系はまた、適切である。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ２０００／０５３７３１（これは本明細書に参考として援用される）を参照のこと。
【０２０１】
用語「グルコースデヒドロゲナーゼ」および「ＧＤＨ」は、それぞれ、Ｄ−グルコースとＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋の、グルコン酸とＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨへの変換を触媒するＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋依存性酵素をいうために、本明細書で交換可能に使用される。以下の式（１）は、グルコースによる、ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋の上記グルコースデヒドロゲナーゼ触媒性還元を記載する。
【０２０２】
【化５−２】
2010517574.tif 000013
本明細書に記載される方法の実施において使用するのに適切なグルコースデヒドロゲナーゼは、天然に存在するグルコースデヒドロゲナーゼ、および天然に存在しないグルコースデヒドロゲナーゼの両方を包含する。天然に存在するグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、文献中に報告されてきた。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ６１２９７  ＧＤＨ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてそのネイティブ宿主において生成される酵素と同じ物理化学的特性を示すことが報告された（Ｖａｓａｎｔｈａら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７８５）。Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＧＤＨ遺伝子の遺伝子配列（これは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１２２７６に対応する）は、Ｌａｍｐｅｌら，１９８６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６６：２３８−２４３によって報告され、そしてＹａｍａｎｅら，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２：３０４７−３０５６によって、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ５０４５３として修正形態で報告された。天然に存在するＧＤＨ遺伝子はまた、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９のＧＤＨをコードするもの（Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２３：８７−９１；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ０１７０１３）およびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのＧＤＨをコードするもの（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８８，１７４：４８５−４９０，Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ１２３７０；Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９９０，７０：３６３−３６９，Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＧＩ２１６２７０）を含む。Ｂａｃｉｌｌｕｓ種のグルコースデヒドロゲナーゼは、ＰＣＴ公開ＷＯ  ２００５／０１８５７９において配列番号１０および１２（上記ＰＣＴ公開のそれぞれ、配列番号９および１１に対応するポリヌクレオチド配列によってコードされる）として提供される（その開示は、本明細書中に参考として援用される）。
【０２０３】
天然に存在しないグルコースデヒドロゲナーゼは、公知の方法（例えば、変異誘発、指向性進化など）を使用して生成され得る。適切な活性を有するＧＤＨ酵素は、天然に存在しようと、天然に存在しなかろうと、ＰＣＴ公開ＷＯ  ２００５／０１８５７９（その開示は、本明細書に参考として援用される）の実施例４において記載されるアッセイを使用して容易に同定され得る。例示的な天然に存在しないグルコースデヒドロゲナーゼは、配列番号６２、６４、６６、６８、１２２、１２４、および１２６として、ＰＣＴ公開ＷＯ  ２００５／０１８５７９において提供される。それらをコードするポリヌクレオチド配列は、ＰＣＴ公開ＷＯ  ２００５／０１８５７９において、それぞれ、配列番号６１、６３、６５、６７、１２１、１２３および１２５として提供される。これら配列のすべては、本明細書に参考として援用される。本明細書に開示されるケトレダクターゼ触媒性還元反応において使用するのに適している、さらなる天然に存在しないグルコースデヒドロゲナーゼは、米国特許出願公開番号２００５／００９５６１９号および同第２００５／０１５３４１７号（これらの開示は、本明細書に参考として援用される）において提供される。
【０２０４】
本明細書に記載されるケトレダクターゼ触媒性還元反応において使用されるグルコースデヒドロゲナーゼは、ＰＣＴ公開ＷＯ  ２００５／０１８５７９の実施例４に記載されるアッセイにおいて、少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇ、およびときおり少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇもしくは約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇ、約１０４μｍｏｌ／分／ｍｇまで、またはそれ以上の活性を示し得る。
【０２０５】
本明細書に記載されるケトレダクターゼ触媒性還元反応は、一般に、溶媒中で行われる。適切な溶媒としては、水、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエンなど）、およびイオン性液体（例えば、１−エチル４――メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェートなど）が挙げられる。いくつかの実施形態において、水性溶媒（水および水性共溶媒系を含む）が使用される。
【０２０６】
例示的な水性共溶媒系は、水と１種以上の有機溶媒を有する。一般に、水性共溶媒系の有機溶媒成分は、上記ケトレダクターゼ酵素を完全には不活性化しないように選択される。適切な共溶媒系は、酵素活性アッセイ（例えば、本明細書で記載されるもの）を利用して、上記候補溶媒系において目的の規定された基質で、上記特定された操作型ケトレダクターゼ酵素の酵素活性を測定することによって容易に同定され得る。
【０２０７】
水性共溶媒系の上記有機溶媒成分は、単一の液相を提供する上記水性成分と混和性であり得るか、または２つの液相を提供する上記水性成分と部分的に混和性であるかもしくは非混和性であり得る。一般に、水性共溶媒系が使用される場合、それは、二相（水が有機溶媒中に分散されるかまたはその逆である）であるように選択される。一般に、水性共溶媒系が利用される場合、上記水相から容易に分離され得る有機溶媒を選択することが望ましい。一般に、上記共溶媒系における水：有機溶媒の比は、代表的には、約９０：１０〜約１０：９０（ｖ／ｖ）の有機溶媒：水の範囲、および８０：２０〜２０：８０（ｖ／ｖ）の間の有機溶媒：水である。上記共溶媒系は、上記反応混合物に添加する前に予め形成され得るか、またはそれは、上記反応容器中で、インサイチュで形成され得る。
【０２０８】
上記水性溶媒（水または水性共溶媒系）は、ｐＨ緩衝化されてもよいし、緩衝化されなくてもよい。一般に、上記還元は、約１０以下のｐＨで行われ、通常は、約５〜約１０の範囲で行われ得る。いくつかの実施形態において、上記還元は、約９以下のｐＨで行われ、通常は、約５〜約９の範囲で行われる。いくつかの実施形態において、上記還元は、約８以下のｐＨで行われ、しばしば約５〜約８の範囲で行われ、そして通常、約６〜約８の範囲で行われる。上記還元はまた、約７．８以下、もしくは７．５以下のｐＨで行われ得る。あるいは、上記還元は、中性ｐＨ（すなわち、約７）で行われ得る。
【０２０９】
上記還元反応の過程の間に、上記反応混合物のｐＨは、変化し得る。上記反応混合物のｐＨは、上記反応の過程の間に酸もしくは塩基の添加によって、望ましいｐＨにおいてもしくは望ましいｐＨ範囲内で維持され得る。あるいは、上記ｐＨは、緩衝剤を含む水性溶媒を使用することによって制御され得る。望ましいｐＨ範囲を維持するのに適した緩衝剤は、当該分野で公知であり、例えば、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液などが挙げられる。緩衝化と酸もしくは塩基の付加との組み合わせもまた、使用され得る。
【０２１０】
グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ補因子再生系が使用される場合、グルコン酸の同時生成（ｐＫａ＝３．６）は、式（３）において表されるように、上記得られる水性グルコン酸が他の方法で中和されなければ、上記反応混合物のｐＨを低下させる。上記反応混合物のｐＨは、標準的な緩衝化技術によって（ここで上記緩衝液は、提供される緩衝化能力までグルコン酸を中和する）、または上記変換の過程と同時に塩基を添加することによって、望ましいレベルにおいて維持され得る。緩衝化と塩基添加との組み合わせもまた、使用され得る。望ましいｐＨ範囲を維持するために適した緩衝剤は、上記に記載される。グルコン酸の中和のために適切な塩基は、有機塩基（例えば、アミン、アルコキシドなど）、および無機塩基（例えば、水酸化物塩（例えば、ＮａＯＨ）、炭酸塩（ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｓａｌｔ）（例えば、ＮａＨＣＯ３）、炭酸水素酸塩（ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｓａｌｔ）（例えば、Ｋ２ＣＯ３）、塩基性リン酸塩（例えば、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４）などである。上記変換の過程と同時の塩基の添加は、上記反応混合物のｐＨをモニターすると同時に手動で、またはより簡便には、ｐＨスタット（ｐＨ  ｓｔａｔ）として自動滴定装置（ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｔｉｔｒａｔｏｒ）を使用することによって、行われ得る。部分的緩衝化能と塩基添加との組み合わせはまた、プロセス制御のために使用され得る。
【０２１１】
塩基添加が、ケトレダクターゼ触媒性還元反応の間に放出されたグルコン酸を中和するために使用される場合、上記変換の進行は、上記ｐＨを維持するために添加される塩基の量によってモニターされ得る。代表的には、上記還元の過程にわたって緩衝化されないもしくは部分的に緩衝化された反応混合物に添加される塩基は、水溶液中に添加される。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、上記補因子再生系は、ホルメートデヒドロゲナーゼを含み得る。用語「ホルメートデヒドロゲナーゼ」および「ＦＤＨ」とは、ホルメートとＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋とを、それぞれ、二酸化炭素とＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨとに変換することを触媒する、ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋依存性酵素をいうために、本明細書で交換可能に使用される。本明細書に記載されるケトレダクターゼ触媒性還元反応において補因子再生系として使用するために適しているホルメートデヒドロゲナーゼとしては、天然に存在するホルメートデヒドロゲナーゼ、および天然に存在しないホルメートデヒドロゲナーゼの両方を含む。ホルメートデヒドロゲナーゼは、ＰＣＴ公開ＷＯ  ２００５／０１８５７９（その開示は、本明細書に参考として援用される）の配列番号７０（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）および７２（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）（これらは、それぞれ、ＰＣＴ公開ＷＯ  ２００５／０１８５７９の配列番号６９および７１に対応するポリヌクレオチド配列によってコードされる）に対応するものを包含する。本明細書に記載される方法において使用されるホルメートデヒドロゲナーゼは、天然に存在しようと、天然に存在しなかろうと、少なくとも約１μｍｏｌ／分／ｍｇ、ときおり、少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇ、または少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇ、最大約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇまで、またはそれ以上の活性を示し得、ＰＣＴ公開ＷＯ  ２００５／０１８５７９の実施例４においてキシされるアッセイにおいて活性について容易にスクリーニングされ得る。
【０２１３】
本明細書で使用される場合、用語「ホルメート」とは、ホルメートアニオン（ＨＣＯ２−）、ギ酸（ＨＣＯ２Ｈ）、およびこれらの混合物をいう。ホルメートは、塩の形態（代表的には、アルカリ塩もしくはアンモニウム塩（例えば、ＨＣＯ２Ｎａ、ＫＨＣＯ２ＮＨ４など））において、ギ酸の形態（代表的には、ギ酸水溶液）で、またはこれらの混合物の形態で提供され得る。ギ酸は、中程度の酸である。そのｐＫａ（水中でｐＫａ＝３．７）の厳しいｐＨ単位内の水溶液中では、ホルメートは、ＨＣＯ２−およびＨＣＯ２Ｈの両方として、平衡濃度で存在する。約ｐＨ  ４より高いｐＨ値では、ホルメートは、主に、ＨＣＯ２−として存在する。ホルメートがギ酸として提供される場合、上記反応混合物は、代表的には、所望のｐＨ（代表的には、約ｐＨ５以上）を提供するために塩基を添加することによって、緩衝化されるかまたは酸性でないようにされる。ギ酸の中和のための適切な塩基としては、有機塩基（例えば、アミン、アルコキシドなど）、および無機塩基（例えば、水酸化物塩（例えば、ＮａＯＨ）、炭酸塩（ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｓａｌｔ）（例えば、ＮａＨＣＯ３）、炭酸水素酸塩（ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｓａｌｔ）（例えば、Ｋ２ＣＯ３）、塩基性リン酸塩（例えば、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４）など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１４】
約ｐＨ５（そのｐＨで、ホルメートは、主にＨＣＯ２−として存在する）を上回るｐＨ値に関して、以下の式（２）は、ホルメートによるＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋のホルメートデヒドロゲナーゼ触媒性還元を記載する。
【０２１５】
【化６】
2010517574.tif 000014
ホルメートとホルメートデヒドロゲナーゼとが、上記補因子再生系として使用される場合、上記反応混合物のｐＨは、標準的な緩衝化技術（ここで上記緩衝剤は、提供される上記緩衝化能までプロトンを放出させる）によって、または上記変換の過程と同時に酸を添加することによって、所望のレベルに維持され得る。上記ｐＨを維持するために上記反応の過程の間に添加されるために適した酸は、有機酸（例えば、カルボン酸、硫酸、リン酸など）、無機酸（ｍｉｎｅｒａｌ  ａｃｉｄ）（例えば、ハロゲン化水素酸（ｈｙｄｒｏｈａｌｉｃ  ａｃｉｄ）（例えば、塩酸）、硫酸、リン酸など、酸性塩（例えば、リン酸二水素酸塩（例えば、ＫＨ２ＰＯ４）、硫酸水素酸塩（例えば、ＮａＨＳＯ４）など）を包含する。いくつかの実施形態はギ酸を利用し、それによって、上記ホルメート濃度と上記溶液のｐＨとの両方が維持される。
【０２１６】
酸添加が、上記ホルメート／ホルメートデヒドロゲナーゼ補因子再生系を使用して還元反応の間に上記ｐＨを維持するために使用される場合、上記変換の進行は、上記ｐＨを維持するために添加される酸の量によってモニターされ得る。代表的には、上記変換の過程にわたって緩衝化されないまたは部分的に緩衝化された反応混合物に添加される酸は、水溶液中に添加される。
【０２１７】
用語「２級アルコールデヒドロゲナーゼ」および「ｓＡＤＨ」とは、２級アルコールと、ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋とを、それぞれ、ケトンとＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨとに変換することを触媒するＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋依存性酵素をいうために、本明細書で交換可能に使用される。以下の式（３）は、２級アルコール（イソプロパノールによって例示される）による、ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋の還元を記載する。
【０２１８】
【化７】
2010517574.tif 000015
本明細書に記載されるケトレダクターゼ触媒性還元反応において補因子再生系として使用するために適している２級アルコールデヒドロゲナーゼは、天然に存在する２級アルコールデヒドロゲナーゼ、および天然に存在しない２級アルコールデヒドロゲナーゼの両方を包含する。天然に存在する２級アルコールデヒドロゲナーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏａｎｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｔｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ由来の既知のアルコールデヒドロゲナーゼが挙げられ、天然に存在しない２級アルコールデヒドロゲナーゼとしては、それらから由来する操作型アルコールデヒドロゲナーゼが挙げられる。本明細書に記載される方法において使用される２級アルコールデヒドロゲナーゼは、天然に存在しようと、天然に存在しなかろうと、少なくとも約１μｍｏｌ／分／ｍｇ、ときおり、少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇ、または少なくとも約１０２μｍｏｌ／分／ｍｇ、最大約１０３μｍｏｌ／分／ｍｇまたはそれ以上の活性を示し得る。
【０２１９】
適切な２級アルコールとしては、低級２級アルコール、およびアリール−アルキルカルビノールが挙げられる。低級２級アルコールの例としては、イソプロパノール、２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、３，３−ジメチル−２−ブタノールなどが挙げられる。一実施形態において、上記２級アルコールは、イソプロパノールである。適切なアリール−アルキル（ａｋｙｌ）カルビノールとしては、不飽和および置換された１−アリールエタノールが挙げられる。
【０２２０】
２級アルコールおよび２級アルコールデヒドロゲナーゼが、上記補因子再生系として使用される場合、得られるＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋は、上記２級アルコールを上記２級アルコールデヒドロゲナーゼによって上記ケトンへ、組み合わされた酸化（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）によって、還元される。いくつかの操作型ケトレダクターゼはまた、２級アルコール還元剤を脱水素する活性を有する。２級アルコールを還元剤として使用するいくつかの実施形態において、上記操作型ケトレダクターゼおよび上記２級アルコールデヒドロゲナーゼは、同じ酵素である。
【０２２１】
補因子再生系を使用する、本明細書に記載されるケトレダクターゼ触媒性還元反応の実施形態をおこなうにあたって、上記補因子の酸化型もしくは還元型のいずれかが、最初に提供され得る。上記のように、上記補因子再生系は、酸化型補因子をその還元型に変換し、次いで、これは、上記ケトレダクターゼ基質の還元において利用される。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、補因子再生系は使用されない。補因子再生系の使用せずに行われる還元反応については、上記補因子は、還元型で上記反応混合物に添加される。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、上記プロセスが宿主生物の全細胞を使用して行われる場合、上記全細胞は、上記補因子を天然に供給し得る。あるいは、または組み合わせて、上記細胞は、上記グルコースデヒドロゲナーゼを、天然にまたは組換えで提供し得る。
【０２２４】
本明細書に記載される鏡像異性選択的還元反応を行うにあたって、上記操作型ケトレダクターゼ酵素、および選択肢的な補因子再生系を含む任意の酵素は、上記精製酵素、上記酵素をコードする遺伝子で形質転換された全細胞、ならびに／または細胞抽出物および／もしくはこのような細胞の溶解物の形態において上記反応混合物に添加され得る。上記操作型ケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子および上記選択肢的な補因子再生系酵素は、宿主細胞に別個に、または同じ宿主細胞に一緒に形質転換され得る。例えば、いくつかの実施形態において、宿主細胞の１セットは、上記操作型ケトレダクターゼ酵素をコードする遺伝子で形質転換され得、そして別のセットは、上記補因子再生酵素をコードする遺伝子で形質転換され得る。形質転換された細胞の両方のセットは、全細胞の形態で、またはそれらに由来する溶解物もしくは抽出物の形態で、上記反応混合物中でいっしょに利用され得る。他の実施形態において、宿主細胞は、上記操作型ケトレダクターゼ酵素および上記補因子再生酵素の両方をコードする遺伝子で形質転換され得る。
【０２２５】
操作型ケトレダクターゼ酵素および／または上記選択肢的な補因子再生酵素をコードする遺伝子で形質転換された全細胞、あるいは細胞抽出物および／もしくはその溶解物は、種々の異なる形態（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  固体（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥など）または半固体（例えば、粗製ペースト）において使用され得る。
【０２２６】
上記細胞抽出物もしくは細胞溶解物は、沈澱（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理など）、続いて、凍結乾燥前の脱塩手順（例えば、限外濾過、透析など）によって部分的に精製され得る。上記細胞調製物のいずれかは、公知の架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）もしくは固相への固定（例えば、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃ，など）を用いて架橋することによって安定化され得る。
【０２２７】
上記固体反応物（例えば、酵素、塩など）は、種々の異なる形態（粉末（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥など）、溶液、エマルジョン、懸濁物などを含む）において反応系に提供され得る。上記反応物は、当業者に公知である方法および装置を使用して、容易に凍結乾燥もしくは噴霧乾燥され得る。例えば、上記タンパク質溶液は、少量ずつ−８０℃で凍結され、次いで、予め冷却された凍結乾燥チャンバに加えられ、続いて、真空に適用される。上記サンプルから水を除去した後、上記温度は、代表的には、真空から外し、凍結乾燥サンプルを回収する前に２時間にわたって４℃に上昇させられる。
【０２２８】
上記還元反応において使用される反応物の量は、一般に、所望される生成物の量、および同時に、使用されるケトレダクターゼ基質の量に依存して変動する。以下のガイドラインは、使用すべきケトレダクターゼ、補因子、および選択肢的な補因子再生系の量を決定するために使用され得る。一般に、ケト基質は、約５０ｍｇ〜約５ｇのケトレダクターゼおよび約１０ｍｇ〜約１５０ｍｇの補因子を使用して、約２０〜３００ｇ／リットルの濃度において使用され得る。当業者は、生産性の所望のレベルおよび生成のスケールにまでそれらを目的に合わせて調整するためにこれらの量をどのように変動させるかを容易に理解する。選択肢的な補因子再生系の適切な量は、利用される補因子および／もしくはケトレダクターゼの量に基づいて、慣用的な実験によって容易に決定され得る。一般に、上記還元剤（例えば、グルコース、ホルメート、イソプロパノールなど）は、ケトレダクターゼ基質の本質的に完全なもしくはほぼ完全な変換を達成するために、ケトレダクターゼ基質の等モルレベルを上回るレベルで利用される。
【０２２９】
反応物の添加順序は、重要ではない。上記反応物は、溶媒（例えば、単相溶媒、二相水性共溶媒系など）に同時にいっしょに添加され得るか、あるいは上記反応物のうちのいくつかが、別個に、そしていくらかは異なる時点でいっしょに添加され得る。例えば、上記補因子再生系、補因子、ケトレダクターゼ、およびケトレダクターゼ基質は、最初に、上記溶媒に添加され得る。
【０２３０】
改善された混合効率のために、水性共溶媒系が使用される場合、上記補因子再生系、ケトレダクターゼ、および補因子が添加され得、そして上記水相に最初に混合され得る。上記有機相は、次いで、添加され得、そして混合され、続いて、上記ケトレダクターゼ基質が添加され得る。あるいは、上記ケトレダクターゼ基質は、上記水相に添加する前に、有機相中に予め混合され得る。
【０２３１】
本明細書に記載されるケトレダクターゼ触媒性還元反応を行うための適切な条件は、広く種々の条件を包含し、その条件は、上記操作型ケトレダクターゼ酵素および基質を実験ｐＨおよび温度で接触させること、ならびに例えば、以下に提供される実施例に記載される方法を用いて、生成物を検出することが挙げられるが、これらに限定されない、慣用的実験によって容易に最適化され得る。
【０２３２】
上記ケトレダクターゼ触媒性還元は、代表的には、約１５℃〜約７５℃の範囲の温度において行われる。いくつかの実施形態について、上記反応は、約２０℃〜約５５℃の範囲の温度において行われる。さらに他の実施形態において、上記反応は、約２０℃〜約４５℃の範囲の温度において行われる。上記反応はまた、周囲条件下で行われ得る。
【０２３３】
上記還元反応は、一般には、本質的に完全またはほぼ完全な基質の還元が得られるまで、進められる。基質を生成物に還元することは、基質および／または生成物を検出することによって、公知の方法を用いてモニターされ得る。適切な方法としては、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどが挙げられる。上記反応混合物中で生成されるアルコール還元生成物の転換収率は、一般に、約５０％より高く、同様に約６０％より高くてもよく、同様に約７０％より高くてもよく、同様に約８０％より高くてもよく、同様に９０％より高くてもよく、しばしば、約９７％より高い。
【実施例】
【０２３４】
（７．実施例）
上記開示の種々の特徴および実施形態が、以下の代表的実施例において例示され、以下の代表的実施例は、例であって、限定することを意図しない。
【０２３５】
以下の説明において、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が使用される場合は必ず、それは、Ｊｕｌｉｃｈ  Ｃｈｉｒａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，  Ｊuｌｉｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙから得られるＧＤＨ  ＣＤＸ９０１である。
【０２３６】
（７．１  実施例１：野生型ケトレダクターゼ遺伝子獲得および発現ベクターの構築）
ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）コード遺伝子を、上記ケトレダクターゼの報告されたアミノ酸配列および米国仮特許出願第６０／８４８，９５０号（本明細書に参考として援用される）の実施例１に記載されるようなコドン最適化アルゴリズムに基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために設計した。遺伝子を、４２ヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドを用いて合成し、そして発現ベクターｐＣＫ１１０９００（米国特許出願公開第２００６０１９５９４７号の図３に示される）へと、ｌａｃプロモーターの制御下でクローニングした。上記発現ベクターはまた、Ｐ１５ａ  複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでいた。得られたプラスミドを、標準的方法を用いてＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０に形質転換した。コドン最適化した遺伝子および上記コードポリペプチドａｄｈ−ＬＢ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＧＩ：２８４００７８９）およびａｄｈ−ＬＫ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＡＰ９４０２９．１；ＧＩ：３３１１２０５６）は、配列番号１および３として見いだされ得る。上記野生型ケトレダクターゼの活性を、米国仮特許出願第６０／８４８，９５０号に記載されるように確認した。本明細書において使用される他のケトレダクターゼ（コドン最適化した遺伝子およびＹｄｌ１２４ｗｐ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０１０１５９．１；ＧＩ：６３２００７９）、ａｄｈ−ＬＢ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：１ＮＸＱ＿Ａ；ＧＩ：３０７４９７８２）、ａｄｈ−ＲＥ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＡＮ７３２７０．１；ＧＩ：３４７７６９５１）、Ｙｐｒ１ｐ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０１０６５６．１；ＧＩ：６３２０５７６）、Ｇｒｅ２ｐ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０１４４９０．１；ＧＩ：６３２４４２１）についてのコードポリペプチドを含む）はまた、米国仮特許出願第６０／８４８，９５０号（これは、本明細書に参考として援用される）に開示される。
【０２３７】
本開示の操作型ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０における発現のために、ベクターｐＣＫ１１０９００に同様にクローニングした。
【０２３８】
（７．２  実施例２：基質特異性および変換についてのＬＣ／ＭＳ／ＭＳアッセイ）
目的のケトレダクターゼ遺伝子を有するプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉの単一の微生物コロニーを、３０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールおよび１％  グルコースを含む、５０ｍｌのＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉブロスへと接種した。細胞を、一晩（少なくとも１６時間）、２５０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃のインキュベーター中で増殖させた。上記培養を、１リットルフラスコの中の２５０ｍｌ  Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス（１２ｇ／Ｌ  バクト−トリプトン、２４ｇ／Ｌ  酵母抽出物、４ｍｌ／Ｌ  グリセロール、６５ｍＭ  リン酸カリウム，ｐＨ  ７．０、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、３０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール）に、６００ｎｍ（ＯＤ６００）において０．２の光学密度になるまで希釈し、３０℃で増殖させた。上記ケトレダクターゼ遺伝子の発現を、上記培養物のＯＤ６００が、０．６〜０．８であるときに、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、一晩（少なくとも１６時間）インキュベートした。細胞を遠心分離（５０００ｒｐｍ，１５分，４℃）によって回収し、その上清を廃棄した。上記細胞ペレットを、等容積の冷（４℃）１００ｍＭ  トリエタノールアミン（塩化物）緩衝液，ｐＨ７．０（ＡＤＨ−ＬＫおよびＡＤＨ−ＬＢ、ならびにこれらに由来する操作型ケトレダクターゼの場合には、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む）で再懸濁し、上記のように遠心分離によって回収した。上記洗浄した細胞を、２容積の上記冷トリエタノールアミン（塩化物）緩衝液中に再懸濁し、４℃で維持しながら１２０００ｐｓｉでフレンチプレスに２回通した。細胞細片を遠心分離（９０００ｒｐｍ，４５分，４℃）により除去した。その清透な溶解物上清を回収し、−２０℃で保存した。凍結した清透な溶解物の凍結乾燥により、粗製ケトレダクターゼ酵素の乾燥粉末を提供した。
【０２３９】
上記野生型ケトレダクターゼの活性を、米国仮特許出願第６０／８４８，９５０号に記載されるように確認した。１ｍＬの１００ｍＭ（ナトリウム）リン酸緩衝液，ｐＨ７．５の溶液に、１０ｍｇ  ケトレダクターゼ粉末、５０ｍｇ  ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、１００μＬ  イソプロパノールおよび１０ｍｇ  ４’−クロロアセトフェノンもしくは非置換のアセトフェノンを添加した。上記反応混合物を、室温で１６時間にわたって攪拌し、次いで、１ｍＬ  ＭＴＢＥで抽出した。上記ＭＴＢＥ相のサンプルを、上記４’−クロロアセトフェノンの変換およびその生成物である１−（４’−クロロフェニル）エタノールの鏡像異性組成について、キラルＨＰＬＣによって分析した。
【０２４０】
（７．３  実施例３：ケトレダクターゼの生成；発酵手順）
曝気攪拌１５Ｌ発酵槽において、６．０Ｌの増殖培地（０．８８ｇ／Ｌ  硫酸アンモニウム、０．９８ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム；１２．５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム三水和物、６．２５ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、６．２ｇ／ＬのＴａｓｔｏｎｅ−１５４酵母抽出物、０．０８３ｇ／Ｌ  クエン酸鉄アンモニウム、および８．３ｍｌ／Ｌの微量元素溶液（２ｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物、２．２ｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水和物、０．５ｇ／Ｌ  硫酸マンガン一水和物、１ｇ／Ｌ  硫酸銅（Ｉ）七水和物、０．１ｇ／Ｌ  モリブデン酸アンモニウム四水和物および０．０２ｇ／Ｌの  四ホウ酸ナトリウム十水和物を含む）を含む）を、３０℃の温度にした。上記発酵槽に、対数増殖期後期の、目的のケトレダクターゼ遺伝子を有するプラスミドを含むＥ．  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０を接種し、実施例３に記載されるように振盪フラスコ中、０．５〜２．０の出発ＯＤ６００まで増殖させた。上記発酵槽を５００〜１５００ｒｐｍで攪拌し、３０％飽和以上の溶存酸素レベルを維持するために、１．０〜１５．０Ｌ／分で発酵容器に空気を供給した。上記培養物のｐＨを、２０％  ｖ／ｖ  水酸化アンモニウムの添加によって、７．０に維持した。上記培養物の増殖を、供給溶液（５００ｇ／Ｌ  セルロース（ｃｅｒｅｌｏｓｅ）、１２ｇ／Ｌ  塩化アンモニウムおよび１０．４ｇ／Ｌ  硫酸マグネシウム七水和物を含む）の添加によって、維持した。上記培養物が５０のＯＤ６００に達した後、ケトレダクターゼの発現を、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度まで添加することによって誘導した。上記培養物をさらに１４時間増殖させた。次いで、上記培養物を４℃の冷却し、回収するまで４℃に維持した。細胞を、ＲＣ１２ＢＰ遠心分離機において４℃で、５０００Ｇで４０分間の遠心分離によって回収した。回収した細胞を、以下の下流の回収プロセスにおいて直接使用したか、またはこのような使用までに、４℃で保存した。
【０２４１】
上記細胞ペレットを、４℃の２容積の１００ｍＭ  トリエタノールアミン（塩化物）緩衝液，ｐＨ６．８中で、湿潤な細胞ペーストの各容積にまで再懸濁した。細胞内ケトレダクターゼを、１２０００ｐｓｉｇの圧力を使用して、２段階均質化バルブアセンブリを装着させたホモジナイザーに上記懸濁物を通過させることによって、上記細胞から放出させた。上記細胞ホモジネートを、破壊の直後に４℃に冷却した。１０％  ｗ／ｖ  ポリエチレンイミン，ｐＨ７．２の溶液を、０．５％  ｗ／ｖの最終濃度にまで、上記溶解物に転換し、３０分間攪拌した。得られた懸濁物を、３０分間にわたって、標準的実験用遠心分離機において、５０００Ｇの遠心分離によって清透にした。上記清透な上清をデカントし、３０Ｋｄの分子量カットオフを有するセルロース限外濾過膜を使用して、１０倍濃縮した。上記最終濃縮物を、浅い容器に分与し、−２０℃で凍結し、凍結乾燥させて粉末にした。上記ケトレダクターゼ粉末を、−８０℃で保存した。
【０２４２】
（７．４  実施例４：変換および鏡像異性過剰の化合物（ＩＩ）を測定するための分析法）
変換についての逆相ＨＰＬＣアッセイ。以下のＨＰＬＣ法を使用して、ハイスループットでの、式（Ｉ）の化合物の、式（ＩＩ）の化合物への還元を分析した：
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  シリーズＨＰ
方法名：１５４９−ＩＳＯ
カラムタイプ：Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ  Ｃ１８
カラムサイズ：２．１×５０ｍｍ
充填サイズ：３．５μｍ  Ｃ１８  Ｚｏｒｂａｘ  ＸＤＢ
運転時間：３分間
移動相：５０％  アセチルにトリル  ５０％  ０．２５％  酢酸
流速：０．６ｍｌ／分、温度：周囲
検出：ＵＶ２５０ｎｍ
溶出時間：アルコール：０．９分
ケトン：１．２分。
【０２４３】
鏡像異性過剰の測定のためのキラルＨＰＬＣ。以下のＨＰＬＣ法を使用して、式（ＩＩ）の化合物の（Ｓ）鏡像異性体および（Ｒ）鏡像異性体を分離および分析した：
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  シリーズＨＰ
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ，２５０×４．６ｍｍ
溶媒：均一濃度（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）、８０％  Ａ（ヘプタン）および２０％  Ｂ（ヘプタン−イソプロパノール  ５０：５０）
流速：１ｍｌ／分、温度：周囲
検出：ＵＶ２２０ｎｍ
運転時間：４５分。
【０２４４】
保持時間は、以下の通りであった：（Ｉ）については、２９．１分、Ｒ−（ＩＩ）については３５．４分、およびＳ−（ＩＩ）については３８．７分。上記Ｒ−アルコールおよびＳ−アルコールは、１：１面積比でベースライン分離を示した。
【０２４５】
（７．５  実施例５：補因子再生についてグルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼを使用して、化合物（Ｉ）を還元する活性についての野生型ケトレダクターゼの評価）
１ｍｌ  反応容積中、３０ｍｇ／Ｌ  ＫＲＥＤ、１２ｍｇ／ｍｌ  １−［４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチル−ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ］プロパン−２−オン（Ｉ）（ＷＯ０６１３０６５７（本明細書に参考として援用される）のスキーム１および実施例１に従って得られ得る）、１．５ｍｇ／ｍＬ  ＧＤＨ  ＣＤＸ９０１（Ｊｕｌｉｃｈ  Ｃｈｉｒａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｊuｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、６６ｍｇ／ｍＬ  グルコース、２００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７）、１００ｍＭ  トリエタノールアミン／塩化物緩衝液，ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む反応混合物を、室温で２０時間にわたって攪拌しながらインキュベートし、次いで、３ｍＬ  酢酸エチルで抽出し、実施例４に記載される方法によって、またはＷＯ０６１３０６５７の実施例２に従って、分析した。その結果を、表３に示す。
【０２４６】
【表３】
2010517574.tif 000016
＋は、活性が認められたことを示す。
【０２４７】
上記野生型ケトレダクターゼであるＡＤＨ−ＬＫは、＞９９．９％の鏡像異性選択性（＞９９．９％  ｅ．ｅ．）でＲ−（ＩＩ）を提供する。
【０２４８】
上記実施例は、補因子再生系（グルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼ）と組み合わせて使用した場合、活性および鏡像異性選択性について野生型ケトレダクターゼの評価を示す。野生型ケトレダクターゼであるＡＤＨ−ＬＫは、所望の（Ｒ）−鏡像異性体を提供する。
【０２４９】
（７．６  実施例６：補因子再生のためにイソプロピルアルコールを使用する、化合物（Ｉ）を還元する活性についての野生型ケトレダクターゼの評価）
１ｍｌの反応容積において、反応混合物（１５ｍｇ／ｍｌ  ＫＲＥＤ；ＤＭＦ中もしくはＴＨＦ中２ｍｇ／ｍｌの（Ｉ）（２０ｍｇ／ｍｌ  ストック溶液から１０×希釈まで添加される）、２ｍｇ／ｍＬ  ＮＡＤＰ＋、０．４〜０．５ｍｌ  ＩＰＡ、０．４ｍｌ  １００ｍＭ  トリエタノールアミン／塩化物緩衝液，ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む）を、室温で、８時間（ＤＭＦが使用される場合）または１６時間（ＴＨＦが使用される場合）にわたって攪拌しながらインキュベートした。サンプルを、実施例４および５の方法によって分析した。
【０２５０】
これら反応条件下で、Ｌ．ｋｅｆｉｒｉ由来のＡＤＨ−ＬＫは、ＤＭＦ中で２１％変換およびＴＨＦ中で６１％変換を提供した一方で、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ由来のＡＤＨ−ＬＢは、ＤＭＦ中で７０％変換およびＴＨＦ中で２６％変換を提供した。
【０２５１】
上記実施例は、補因子再生のためにＩＰＡと組み合わせて使用した場合の活性および鏡像異性選択性について、野生型Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓケトレダクターゼの評価を示す。野生型ケトレダクターゼであるＡＤＨ−ＬＫは、１０％  ＴＨＦの存在下で高いｅ．ｅ．において所望の（Ｒ）−鏡像異性体を提供する。
【０２５２】
（７．７  実施例７：補因子再循環のためにグルコース／グルコースデヒドロゲナーゼを使用する、化合物（Ｉ）に対するケトレダクターゼ活性についての高スループットＨＰＬＣアッセイ）
ライブラリーコロニーを、Ｑ−ｂｏｔ（登録商標）ロボットコロニーピッカー（Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，ＯＲ）を使用して、１８０μＬ  Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉブロス（ＬＢ）、１％  グルコースおよび３０μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含む浅いウェルの９６ウェルマイクロタイタープレートに拾い上げた。細胞を、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。次いで、１０μＬのこの培養物を、３９０μＬ  Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）および３０μｇ／ｍＬ  ＣＡＭを含む深い９６ウェルのプレートに移した。２５０ｒｐｍで、２．５〜３時間にわたって振盪しながら、３０℃で深いウェルプレートのインキュベーションの後（ＯＤ６００  ０．６〜０．８）、上記細胞培養物による組換え遺伝子発現を、最終濃度１ｍＭになるまで、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導した。次いで、上記プレートを、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートしながら、３０℃でインキュベートした。
【０２５３】
細胞を、遠心分離によってペレット化し、３００μＬ  溶解緩衝液中で再懸濁し、室温で少なくとも２時間にわたって振盪することによって溶解した。上記溶解緩衝液は、１００ｍＭ  トリエタノールアミン（塩化物）緩衝液，ｐＨ７．０〜７．２、１ｍｇ／ｍＬ  リゾチームおよび７５０μｇ／ｍＬ  ポリミキシンＢスルフェートを含んでいた。
【０２５４】
ケトレダクターゼ活性を、２０５μＬ  アッセイ混合物（１．７ｍｇ／ｍＬ  ＧＤＨ  ＣＤＸ９０１、０．７ｍｇ／ｍｌ  ＮＡＤＰ＋、６６．７ｍｇ／ｍＬ  グルコース、２００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７）、１００ｍＭ  トリエタノールアミン／塩化物緩衝液，ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む）を含むマイクロタイタープレートのウェルに、測定した量の溶解混合物を移すことによって測定した。反応を、ＤＭＦ中の２ｍｇ／ｍｌ  （Ｉ）を２５μＬ添加することによって開始し（（Ｉ）の最終濃度は、０．２ｍｇ／ｍｌである）、１時間にわたって２５℃でインキュベートした。５００μＬ  アセトニトリルを１ウェルあたりに添加し、ウェルを混合し、その後、２００μＬを、Ｓｏｌｖｉｎｅｒｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）フィルタープレートに移した。２００ｒｐｍで１分間にわたるｓｏｌｖｅｎｅｒｔフィルタープレート（ｓｏｌｖｅｎｅｒｔ  ｆｉｌｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）の遠心分離によって、Ｎｕｎｃ丸底プレート中にその濾液を回収した。上記サンプルプレートを密封して、上記溶媒の蒸発を妨げ、そして実施例４に従ってＨＰＬＣによって分析した。
【０２５５】
（７．８  実施例８：補因子再循環のためにＩＰＡを使用する、化合物（Ｉ）に対するケトレダクターゼ活性についての高スループットＨＰＬＣアッセイ）
細胞ペレットを、実施例８に従って調製し、１５０μＬの２００ｍＭ  トリエタノールアミン／塩化物緩衝液，ｐＨ７．０（１ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含有する）中で再懸濁した。１５０μＬ  イソプロピルアルコールを、上記懸濁した細胞に添加し、上記プレートを密封した後、上記細胞を、少なくとも１２０分間にわたって軌道振盪機上で、室温で振盪することによって溶解した。
【０２５６】
アッセイ混合物（１００ｍＭ  トリエタノールアミン／塩化物緩衝液，ｐＨ７．０、２５％  イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、２％  アセトン、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４および０．７ｍｇ／ｍｌ  ＮＡＤＰ＋、ならびに５０％ＴＨＦ／５０％ＩＰＡ中の５ｍｇ／ｍｌ  （Ｉ）を５０μＬからなる）１７５μＬを含む深いウェル（２ｍｌ）のマイクロタイタープレートのウェルに、測定された量の溶解混合物を移すことによって、ケトレダクターゼ活性を測定した。
【０２５７】
反応を、２５μＬ  溶解物（必要であれば、等容積のＩＰＡで希釈した）の添加によって開始し、熱シールし、そして２５〜５０ｏＣで１８時間にわたって、振盪インキュベーター中でインキュベートした。上記反応の終了時に、５００μＬ  酢酸エチルを各ウェルに添加し、上記プレートを再度密封し、軌道振盪機上で少なくとも５分間にわたって激しく振盪した。プレートを、２０〜３０秒間にわたって４０００ｒｐｍで遠心分離した。１４０μＬ  アセトニトリルおよび７０μＬの酢酸エチル反応混合物を、Ｓｏｌｖｉｎｅｒｔフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）に移し、２００ｒｐｍで３分間にわたって上記ｓｏｌｖｅｎｅｒｔフィルタープレートを遠心分離することによって、Ｎｕｎｃ丸底プレート中にその濾液を回収した。上記サンプルプレートを密封して、上記溶媒の蒸発を防ぎ、実施例４に従って、ＨＰＬＣによって分析した。
【０２５８】
（７．９  実施例９：イソプロパノールに対するケトレダクターゼ活性についての高スループット蛍光プレスクリーン）
細胞を増殖させ、回収し、実施例８に従って溶解した。
【０２５９】
９６ウェル黒色マイクロタイタープレート中に、２０μＬのサンプル（１００ｍＭ  トリエタノールアミン／塩化物緩衝液，ｐＨ  ７．０、（必要であれば）１ｍＭ  ＭｇＳＯ４中で希釈）を、１８０μＬのアッセイ混合物（１００ｍＭ  トリエタノールアミン／塩化物緩衝液，ｐＨ７．０、２％  イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４からなる）に添加し、反応進行を、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）において３３０ｎｍでの励起後に、４４５ｎｍにおいてＮＡＤＰＨへ変換した際にＮＡＤＰの蛍光の減少を追跡することによって測定した。
【０２６０】
（７．１０  実施例１０：アセトン安定性ケトレダクターゼについての高スループットスクリーン）
細胞ペレットを実施例８に従って調製し、１５０μＬの２００ｍＭ  トリエタノールアミン／塩化物緩衝液，ｐＨ７．０（１ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含有する）中で再懸濁した。１５０μＬの混合物（７６％  ＩＰＡ、２０％  ＴＨＦおよび４％  アセトンを含む）を、上記懸濁した細胞に添加し、上記プレートを密封した後に、上記細胞を、室温において、軌道振盪機上で１８時間にわたって振盪することによって、溶解した。
【０２６１】
ケトレダクターゼ活性を、１７５μＬ  アッセイ混合物（８０ｍＭ  トリエタノールアミン／塩化物緩衝液，ｐＨ７．０、２６．２〜３７．１％  イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、１．８％  アセトン、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４および０．７ｍｇ／ｍｌ  ＮＡＤＰ＋、ならびに５０％ＴＨＦ／５０％ＩＰＡ中の５ｍｇ／ｍｌ  （Ｉ）を５０μＬからなる）を含む、深いウェル（２ｍｌ）のマイクロタイタープレートのウェルに測定された量の溶解混合物を移すことによって測定した。
【０２６２】
反応を、２５μＬ  溶解物（必要であれば、等容積のＩＰＡで希釈）を添加することによって開始し、熱シールし、そして２５〜５０ｏＣで１８時間にわたって、振盪インキュベーター中でインキュベートした。上記反応の終了時に、５００μＬ  酢酸エチルを各ウェルに添加し、上記プレートを再度密封し、軌道振盪機上で少なくとも５分間にわたって激しく振盪した。プレートを、２０〜３０秒間にわたって４０００ｒｐｍ（３２２０×ｇ）で遠心分離した。１４０μＬ  アセトニトリルおよび７０μＬの酢酸エチル反応混合物を、Ｓｏｌｖｉｎｅｒｔフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）に移し、２００ｒｐｍで３分間にわたって上記ｓｏｌｖｅｎｅｒｔフィルタープレートを遠心分離することによって、Ｎｕｎｃ丸底プレート中にその濾液を回収した。上記サンプルプレートを密封して、上記溶媒の蒸発を防ぎ、実施例４に従って、ＨＰＬＣによって分析した。
【０２６３】
（７．１１  実施例１１：補因子再生のためにイソプロピルアルコールを使用する、化合物（Ｉ）を（Ｒ）−２へ還元するための、野生型ＡＤＨ−ＬＫに由来する操作型ケトレダクターゼの改善された活性）
１ｍｌ反応容積において、反応混合物（１５ｍｇ／ｍｌ  ＫＲＥＤ；ＴＨＦ中の２ｍｇ／ｍｌ  （Ｉ）、２ｍｇ／ｍＬ  ＮＡＤＰ＋、０．４ｍｌ  ＩＰＡ、０．５ｍｌ  １００ｍＭ  トリエタノールアミン／塩化物緩衝液，ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む）を、室温において１６時間にわたって攪拌しながらインキュベートした。サンプルを、実施例４および実施例５の方法によって分析した。
【０２６４】
これら反応条件下で、ＡＤＨ−ＬＫは６１％変換を与え、ＡＤＨ−ＬＢは、ＴＨＦ中で２６％変換を与え、配列番号１１４を有するＡＤＨ−ＬＫ改変体は１００％変換を与え、配列番号１８を有するＡＤＨ−ＬＫ改変体は、９３％変換を与えた。
【０２６５】
３ｍｇ／ｍｌ  ＫＲＥＤおよびＴＨＦ中の１ｍｇ／ｍｌ  （Ｉ）を用いることを除いて類似の反応条件下で試験した場合、２時間の反応時間後のＡＤＨ−ＬＫ、配列番号１１４および配列番号１８での変換は、それぞれ、１１％、１００％および２３％であった。配列番号１１４からＡＤＨ−ＬＢへの変異Ａ９４Ｇの導入は、配列番号１１６を与えた。配列番号１１４および配列番号１１６を有するケトレダクターゼは、１０％  ＤＭＦ中において類似の活性を有する。
【０２６６】
この実施例は、ケトレダクターゼ量、反応時間、および変換の比較によって、上記野生型ケトレダクターゼＡＤＨ−ＬＫに由来する操作型ケトレダクターゼが、ケトレダクターゼＡＤＨ−ＬＫと比較して、改善された活性を提供することを示す。
【０２６７】
（７．１２  実施例１２：ＡＤＨ−ＬＫに由来する操作型ケトレダクターゼによる、化合物（Ｉ）の改善された変換）
操作型ＡＤＨ−ＬＫポリペプチドによる変換を、１ｇ／Ｌの種々のＫＲＥＤを、実施例７に記載されるような条件下でインキュベートすることによって、測定した。
【０２６８】
表４は、上記ケトレダクターゼ粉末に対応する配列番号、上記野生型ＡＤＨ−ＬＫからのアミノ酸変異数および２０分間の反応における化合物（Ｉ）から（Ｒ）−２への変換を与える。
【０２６９】
【表４】
2010517574.tif 000017
＋：＜２０％の変換；＋＋：２５〜７５％の変換；＋＋＋：＞７５％の変換。
【０２７０】
（７．１３  実施例１３：ＡＤＨ−ＬＫに由来する操作型ケトレダクターゼの改善された変換およびアセトンに対する耐性）
操作型ＡＤＨ−ＬＫ改変体の変換およびアセトンに対する耐性を、１０％  ＴＨＦ、４０％  ＩＰＡ、５０％  １００ｍＭ  トリエタノールアミン−塩化物、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ｐＨ８．０、０．７ｍｇ／ｍｌ  ＮＡＤＰ＋の混合物中、２％  アセトンの非存在下および存在下で、１ｇ／Ｌの種々のＫＲＥＤを、０．５ｇ／Ｌ  （Ｉ）とともに、２０分間にわたって室温でインキュベートすることによって測定し、続いて、実施例４に従って変換を測定した。
【０２７１】
表５は、上記ケトレダクターゼ粉末に対応する配列番号、上記野生型ＡＤＨ−ＬＫからのアミノ酸変異数および２０分間の反応における（Ｉ）から（Ｒ）−２への変換を与える。
【０２７２】
【表５−１】
2010517574.tif 000018
【０２７３】
【表５−２】
2010517574.tif 000019
（７．１４  実施例１４：化合物（ＩＩ）のＲ−異性体の調製）
磁性攪拌棒（４×１２ｍｍ）を含む２０ｍｌ  サンプルバイアル（２１ｍｍ  ＯＤ）に、３．５ｍｇのＮＡＤＰ＋（Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｙｅａｓｔ，Ｊａｐａｎの一ナトリウム塩）、２５ｍｇの配列番号７８を有するＫＲＥＤおよび５００ｍｇの（Ｉ）を添加した。１．５ｍｌ  ２−メチルＴＨＦ（Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、１．０ｍｌ  イソプロピルアルコール、および２．５ｍｌの１００ｍＭ  トリエタノールアミン／塩化物（ｐＨ８）の混合物に、固体になるまで１ｍＭ  ＭｇＳＯ４を添加し、その得られた３相混合物を攪拌し、４０°Ｃで２４時間にわたって加熱した（オイルバス）。サンプルを、実施例４に従う分析、またはＷＯ０６１３０６５７の実施例２に従う分析のために、上記攪拌混合物から取り出した（その時点で、（Ｉ）は、＞９９．９％  ｅ．ｅのＲ−（ＩＩ）に完全に変換していた）。
【０２７４】
（７．１５  実施例１５：補因子再循環のためにＩＰＡを使用する、アセトフェノン還元についての高スループットキラルＧＣアッセイ）
キラルＧＣ分析：
機器：Ａｓｔｅｃ  Ｃｈｉｒａｌｄｅｘ  Ｂ−ＤＰカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ）
温度：１１０℃
入り口温度：２５０℃
分割（Ｓｐｌｉｔ）：  １：１００
圧力：１５ｐｓｉ  ヘリウム
検出器：ＦＩＤ，２５０℃
保持時間：  ケトン：６．６分
（Ｒ）−アルコール：９．１分
（Ｓ）−アルコール：９．５分
（７．１６  実施例１６：補因子再生のためにイソプロピルアルコールを使用する、アセトフェノンを（Ｒ）−１−フェニルエタノールへの還元についての、野生型Ｋｅｆｉｒ由来の操作型ケトレダクターゼの改善された活性）
細胞溶解物を、Ｑ−ｂｏｔ（登録商標）ロボットコロニーピッカー（Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，ＯＲ）を使用して、１８０μＬ  Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉブロス（ＬＢ）、１％  グルコースおよび３０μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含む、浅いウェルの９６ウェルマイクロタイタープレートにコロニーを拾い上げることによって調製した。細胞を、２５０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で一晩増殖させた。次いで、この培養物の１０μＬを、３９０μＬ  Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）および３０μｇ／ｍＬ  ＣＡＭを含む、深い９６ウェルプレートに移した。２５０ｒｐｍで２．５〜３時間にわたって振盪しながら、３０℃で深いウェルプレートをインキュベーションした後（ＯＤ６００  ０．６〜０．８）、細胞培養物による組換え遺伝子発現を、最終濃度１ｍＭになるまで、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導した。次いで、上記プレートを、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートしながら、３０℃でインキュベートした。
【０２７５】
細胞を、遠心分離によってペレット化し、３００μＬ  溶解緩衝液中で再懸濁し、室温で少なくとも２時間にわたって振盪することによって溶解した。上記溶解緩衝液は、１００ｍＭ  トリエタノールアミン（塩化物）緩衝液，ｐＨ７．０〜７．２、１ｍｇ／ｍＬ  リゾチームおよび７５０μｇ／ｍＬ  ポリミキシンＢスルフェートを含んでいた。１００μＬ  細胞溶解物に、５０μＬの１００ｍＭ  トリエタノールアミン−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７．０（０．５ｍＭ  ＮＡＤＰ  ナトリウム塩、３００μＬ  イソプロパノール、および５０μＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の５０ｇ／Ｌ  アセトフェノンを含む）中に添加し、そして上記プレートを密封した後、上記細胞を、軌道振盪機上で４時間にわたって、室温において８５０ｒｐｍで振盪することによってインキュベートした。
【０２７６】
上記反応の生成物（１−フェニルエタノール）を、１ｍＬの酢酸エチルを各サンプルに添加し、そして上記マイクロタイタープレートを密封し、８５０ｒｐｍにおいて室温で１０分間にわたって振盪することによって抽出した。プレートを、プレート遠心分離器（３２２０×ｇ）において４ｏＣで２分間にわたって、４，０００ｒｐｍで遠心分離し、そして各ウェルからの２００μＬの有機相を、浅いウェルのプレートに移し、上記プレートをキラルＧＣ分析の前に密封した。
【０２７７】
表６は、上記ケトレダクターゼに対応する配列番号、上記野生型ＫＥＦｃ（ＡＤＨ−ＬＫ）からのアミノ酸変異数、およびアセトフェノンの、（Ｒ）−１−フェニルエタノールへの変換を与える。
【０２７８】
【表６】
2010517574.tif 000020
＋：＜７０％の変換；＋＋：７０〜９０％の変換；＋＋＋：＞９０％の変換。
【０２７９】
本願において引用されるすべての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、各個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が、すべての目的のために、参考として援用されることが個々に示されるかのように同程度にまで、すべての目的でそれら全体が本明細書に参考として援用される。
【０２８０】
種々の具体的実施形態を例示しかつ記載してきたが、種々の改変は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行われ得ることが認識される。
【図１】
2010517574.tif 000021
【図２】
2010517574.tif 000022
【国際調査報告】
2010517574.tif 000023
2010517574.tif 000024
2010517574.tif 000025