(57)【要約】  樹状細胞を活性化させる非天然ＨＳＰ７０活性化領域に関する。ＨＳＰ７０活性化領域に結合するポリペプチドを使用し、ＨＳＰ７０に結合しかつＨＳＰ７０が樹状細胞を活性化することを妨げることによって自己免疫疾患、例えば白斑の治療が可能である。ＨＳＰ７０結合剤は、三量体複合体の形成のために会合しうる三量体化構造エレメントを有する融合タンパク質の形態で構築されうる。ＨＳＰ７０結合タンパク質、融合タンパク質および複合体を使用する白斑を治療するための医薬組成物および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ［配列番号１］を含むヒトＨＳＰ７０の単離非天然断片を含むポリペプチド。
【請求項２】
三量体化ドメインとＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ［配列番号１］に結合する少なくとも１つのポリペプチドとを含む融合タンパク質。
【請求項３】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、ＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ［配列番号１］に結合するポリペプチド配列を含むループ領域を有するＣ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）を含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ［配列番号１］に結合する第１のポリペプチドが前記三量体化ドメインのＮ末端およびＣ末端の一方に位置し、かつＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ［配列番号１］に結合する第２のポリペプチドが前記三量体化ドメインのＮ末端およびＣ末端の他方に位置する、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記第１および第２のポリペプチドの少なくとも１つが、ＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ［配列番号１］に結合する前記ポリペプチド配列を含むループ領域を有するＣ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記三量体化ドメインがテトラネクチン三量体化構造エレメントである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
請求項２〜５のいずれか一項に記載の３つの融合タンパク質を含む三量体複合体。
【請求項８】
前記三量体化ドメインがテトラネクチン三量体化構造エレメントである、請求項７に記載の三量体複合体。
【請求項９】
請求項８に記載の複合体および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項１０】
白斑を患う患者に請求項８に記載の複合体を投与する工程を含む、白斑を治療する方法。
【請求項１１】
白斑を患う患者に請求項９に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、白斑を治療する方法。
【請求項１２】
請求項２〜４に記載の融合タンパク質を含むポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
樹状細胞およびＨＳＰ７０を発現する細胞を含む組織を請求項６に記載の三量体複合体と接触させる工程を含む、ＨＳＰ７０によって樹状細胞の活性化を妨げる方法。
【請求項１６】
ストレスを患う患者に請求項９に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、ストレスに対するＨＳＰ７０に関連した自己免疫応答を予防する方法。
【請求項１７】
三量体化ドメインとＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ［配列番号１］を含むＨＳＰ７０ポリペプチドとを含む融合タンパク質。
【請求項１８】
ＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ［配列番号１］を含むループ領域を有するＣ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）をさらに含む、請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
樹状細胞を請求項１、１７または１８のいずれか１項に記載のポリペプチドと接触させる工程を含む、樹状細胞を活性化する方法。
【請求項２０】
メラノーマを患う患者に請求項１、１７または１８のいずれか１項に記載のポリペプチドを投与する工程を含む、メラノーマを治療する方法。
【請求項２１】
前記投与が局所である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記投与がメラノーマ腫瘍の注射によるものである、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年９月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／９６０，０２２号明細書および２００８年５月９日に出願された米国仮特許出願第６１／０５１，７２０号明細書の優先権を主張するものであり、その各々はその全体が参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、自己免疫疾患、例えば白斑の治療に関する。特に、本発明は、樹状細胞を活性化するヒトＨＳＰ７０タンパク質、ＨＳＰ７０タンパク質に結合するペプチド、およびペプチドを使用してＨＳＰ７０によって誘発される自己免疫疾患、例えば白斑を治療するための方法に関する。
【０００３】
関連分野の説明
白斑は、主な徴候が皮膚の進行性色素脱失である皮膚障害である。この疾患は、世界人口の１％または米国内だけで約３００万人を悩ませている。色素脱失の一般的原因は既存のメラノサイトによるメラニン形成の低下である。しかし、白斑においては、色素脱失は表皮の基底層からのメラノサイトの欠損によって誘発される。
【０００４】
白斑を発症する遺伝的傾向を有する個人はほんの一部である。これは拡張した小胞体のプロフィールおよび異常なメラノソームの区画化を含む白斑のメラノサイトにおける内因性異常の存在により反映されている。これらの異常により、白斑患者はいくつかの形態のストレスに感受性を示しうる。ストレスは白斑における増悪因子と考えられている。漂白性のフェノール、ＵＶ放射および機械的損傷を含む既知のストレス要因は、ケブナー現象（すなわち損傷を受けた領域に作用するいくつかの皮膚状態の傾向）を引き起こすことになる。患者自身は、ストレス（感情的なものまたは身体的なもののいずれか）がそれらの疾患の主因であると考えている。ストレスの役割は、一部の個人が職場における漂白性のフェノールへの暴露後に白斑を発症することになる場合での「職業性白斑」の存在によってさらに支持される。
【０００５】
Ｔ細胞浸潤物は、白斑症例の９０％超を占める最も一般的な形態である全身性白斑を有する患者に由来する拡大病変の病変部周辺（ｐｅｒｉｌｅｓｉｏｎａｌ）の皮膚において常に認められている。白斑皮膚から単離される腫瘍細胞は、自系メラノサイトに対して細胞毒性を示す。これらの所見は、白斑がストレス下で引き起こされるＴ細胞媒介性自己免疫疾患と見なされうることを示している。
【０００６】
ストレス下の細胞は、主流のタンパク質合成を停止させる一方、熱ショックタンパク質および／またはグルコースに調節されるタンパク質合成を誘発することになる（Ｗｅｌｃｈ、１９９３年；ＫｉａｎｇおよびＴｓｏｋｏｓ、１９９８年）。ストレスタンパク質は、既存の細胞性タンパク質に結合し、それらの分解を阻止し、それによって細胞アポトーシスを回避することになる。Ｔ細胞由来のストレスタンパク質画分が、それらが付き添う（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）タンパク質およびペプチド、それ故にそれらの由来である細胞に特異的な免疫応答を開始させうることは十分に確立されている。したがって、腫瘍由来のストレスタンパク質画分は抗腫瘍免疫反応性を惹起させうる。ＨＳＰ７０は、誘導ＨＳＰ７０が生細胞から分泌され、（シャペロンと同様にサイトカインとしても機能する）シャペロカイン（ｃｈａｐｅｒｏｋｉｎｅ）としての機能を果たすことから、これに関連するかなり特異なストレスタンパク質である（Ａｓｅａら、２０００年）。ＨＳＰ７０を有する小胞のエクソサイトーシスは、交感神経系の活性化に応答して生じ、最終的にいくつかの細胞種においてエクソサイトーシスにおけるシグナルとしての細胞内カルシウムの増加をもたらすと考えられる（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＦｌｅｓｈｎｅｒ、２００６年）。この状況にて、樹状細胞（ＤＣ）は、処理されて排出リンパ節内のＴ細胞に提示されうる生細胞由来の抗原ペプチドを備えると同時に、ＨＳＰ７０によって活性化され免疫応答を開始させる。これに関連し、ＨＳＰ７０はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖および細胞毒性を刺激し（Ｍｕｌｔｈｏｆら、１９９９年）、ＤＣにより成熟および１型分極（ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ）サイトカイン産生を誘発し（Ｗａｎｇら、２００２年）、ＤＣによってＴ細胞のクロスプライミングを刺激しうる（Ｋａｍｍｅｒｅｒら、２００２年）。最も重要なこととして、ＨＳＰ７０は、マウスにおいて、Ｔ細胞耐性を破壊し、自己免疫を誘発することが示されている（Ｍｉｌｌａｒら、２００３年）。興味深いことに、最近、循環リンパ球上でのＨＳＰ７０の表面発現の増大が白斑患者において報告された（Ｆｒｅｄｉａｎｉら、２００５年）。したがって、ストレスタンパク質の中でＨＳＰ７０がシャペロンタンパク質に対する免疫反応性の誘導への主要な寄与因子であるようである。
【０００７】
ＨＳＰ７０ファミリーは、部分的に構成的に発現されかつ部分的に誘導性のタンパク質をコードする、ヒトにおける染色体１、５、６、９、１１、１４および２１上の少なくとも１１の関連性の高い遺伝子からなる（Ｔａｖａｒｉａら、１９９６年）。ファミリーメンバー中での共通因子（ｄｅｎｏｍｉｎａｔｏｒ）は、遺伝子産物の発現が温度上昇によって誘発され（熱ショック）、かつタンパク質がおよそ７０ｋＤａ（６６〜７８ｋＤａ）の分子量を有する点である（Ｔａｖａｒｉａら、１９９６年）。大部分のファミリーメンバーは分子シャペロンとしての機能を果たす。この機能において、ＨＳＰ７０ファミリーメンバーは、発生期のタンパク質のフォールディングを促進し、ポリペプチドを結合させ、かつ成熟タンパク質を転位置させることになる（ＧｅｔｈｉｎｇおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、１９９２年）。ＨＳＰ７０ファミリーの個々のメンバーをコードする遺伝子座は、ＨＳＰＡ１からＨＳＰＡ９にかけての名称が付けられている（ＨＳＰＡ１およびＨＳＰＡ２の双方では、複数のメンバーに亜分類される）。個々の遺伝子産物の局在化は、核／細胞質（Ａ１はＨＳＰ７２またはＨｓｐ７０ｉとしても知られ、Ａ８はＨＳＰ７３またはＨＳＣ７０としても知られる）からＥＲ（５はＢｉＰまたはＧＲＰ７８としても知られる）およびミトコンドリア（９はＧＲＰ７５またはＰＢＰ７４としても知られる）まで、様々である（Ｔａｖａｒｉａら、１９９６年）。シャペロカインの機能は、主に誘導ＨＳＰＡ１Ａに与えられるように見える（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＦｌｅｓｈｎｅｒ、２００６年）。熱ショックの生理学的結果から細胞を保護する遺伝子の進化的保存により、タンパク質のこのファミリーの相同体が植物界および動物界を通して見出されうる。
【０００８】
構成的形態のＨＳＰ７０、ＨＳＰＡ８は、通常であればプロテアソーム分解を受けることになっている細胞質内タンパク質をリソソームに経路変更する。リソソーム分解に向けて経路変更されたタンパク質は、ＨＳＰ７０を含むリソソーム膜複合体によって線状化され、次いでリソソーム膜内に孔を形成するリソソーム関連膜タンパク質−２ａ（ＬＡＭＰ−２ａ）分子に移される。一旦、リソソーム内部でタンパク質がＨＳＰ７０（ｌｙＨＳＰ７０）に再び遭遇すると、進入する常在リソソームタンパク質が偶発的な分解から保護されうる。関節リウマチにおいては、自己免疫反応性が、ＨＳＰ７０がタンパク質（ＭＨＣクラスＩＩタンパク質を含む）をリソソームまで付き添うプロセスに部分的に与えられている。ＨＳＰ７０は、リソソームの完全性を保護し、酸化的ストレスの状態から保護する（Ｎｙｌａｎｄｓｔｅｄら、２００４年）。（細胞質に面する）リソソーム膜内に存在するＨＳＰ７０はまた、ドッキングタンパク質として、オートファジーと称されるプロセスでのリソソームと膜蓄積物（ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）および細胞質タンパク質との融合に（少なくとも部分的には）関与する。オートファジーは、余分な細胞内分子および構造を再生する機能を果たす。破壊されたオートファジーはまた、白斑メラノサイトにおいて認められる膜封入体（ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）によって支持されるものとして、白斑において生じうる（Ｌｅ  Ｐｏｏｌｅら、２０００年）。その結果、ＨＳＰ７０およびその共シャペロン（特にＣＨＩＰ）は、プロテアソーム分解を受け、抗原提示のＭＨＣクラスＩ経路に入るか、またはリソソーム分解を受けるタンパク質の割合を限定する門番のように見える。ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する細胞においては、リソソームは、かかるＭＨＣクラスＩＩ分子との関連で提示されるべきペプチド源である。したがって、ＨＳＰ７０は、クラスＩおよびクラスＩＩの行先の分離に関与する。
【０００９】
常在性組織細胞はまた、ＭＨＣクラスＩＩ分子を特別な環境下で発現しうる。メラノサイトにおいては、これらの環境はメラノーマおよび白斑において見出される（Ｌｅ  Ｐｏｏｌｅら、２００３年）。メラノサイト細胞は、他の細胞種におけるリソソームに対する等価物としてメラノソームを保有する。メラノソームは、メラノソーム−ファゴソーム融合体に組み込まれる（Ｌｅ  Ｐｏｏｌｅら、１９９３年；Ｌｅ  Ｐｏｏｌｅら、２００４年）。ＨＳＰ７０における変異は、エンドソーム／リソソーム区画の破壊に関与している。メラノソームタンパク質の輸送に潜在的に関与する、メラノソームの表面または内部でのＨＳＰ７０の存在については今日まで検討されていない。しかし、メラノソームの特別な免疫原性は、少なくとも部分的には、白斑メラノサイトによるＭＨＣクラスＩＩ分子との関連で免疫系に提示されるメラノサイトに特異的なメラノソームタンパク質に起因する可能性が高い（Ｗａｎｇら、１９９９年）。また、メラノソームに関連したＨＳＰ７０はメラノソームの移動の間に外在化され、それはＤＣによる抗原取り込み、プロセシングおよび提示に潜在的に作用しうる。
【００１０】
ＨＳＰ７０−ペプチド複合体に対するいくつかの表面受容体は免疫細胞上で同定されており、それにはＬＤＬ受容体関連タンパク質２／α２−マクログロブリンＣＤ９１（Ｂａｓｕら、２００１年）、スカベンジャー受容体ＬＯＸ−１（Ｄｅｌｎｅｓｔｅら、２００２年）、ＣＤ９４（Ｇｒｏｓｓら、２００３年）、ＳＲ−Ａ（Ｂｅｒｗｙｎら、２００３年）、ならびにＴｏｌｌ様受容体２および４（Ａｓｅａら、２００２年）およびＣＤ４０（Ｂｅｃｋｅｒら、２００２年）が含まれる。メラノーマ対白斑におけるメラノサイト細胞に対する抗腫瘍免疫と自己免疫との関係（Ｄａｓら、２００１年；Ｔｕｒｋら、２００２年；ＨｏｕｇｈｔｏｎおよびＧｕｅｖａｒａ−Ｐａｔｉｎｏ、２００４年；Ｅｎｇｅｌｈｏｒｎら、２００６年）によると、ＨＳＰが抗腫瘍免疫に関与した後での白斑における熱ショックタンパク質の関与が指摘されている（ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＵｄｏｎｏ、１９９４年；Ｃａｓｔｅｌｌｉら、２００４年）。したがって、ＨＳＰ７０をメラノサイトに対する免疫応答の存続から遮断することは、白斑を有する患者にとって有益でありうる。ストレスを受けたメラノサイトは、白斑における樹状細胞（ＤＣ）を、ストレスを受けたメラノサイトによるＨＳＰ７０の放出を介して活性化し、それによってアポトーシス誘発分子（例えばＴＲＡＩＬ）の発現を誘発しうる。さらに、活性化された樹状細胞は活性化後に細胞毒性活性を有し、メラノサイトを殺滅する可能性があり、それによって微小環境下でＨＳＰ７０のレベルが上昇する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Asea A, Kraeft SK, Kurt-Jones EA, Stevenson MA, Chen LB, Finberg RW, Koo GC, Calderwood SK HSP70 stimulates cytokine production through a CD14-dedendant pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine Nature Med 6: 435-442 (2000)
【非特許文献２】Basu S, Binder RJ, Ramalingam T, Srivastava PK CD91 is a common receptor for heat shock proteis gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin Immunity 14: 303-313 (2001)
【非特許文献３】Becker T, Hartl FU, Wieland F CD40, an extracellular receptor for binding and uptake of HSP70-peptide complexes J Cell Biol 158: 1277-1285 (2002)
【非特許文献４】Benhar, I, Azriel, R, Nahary, L, Shaky, S, Berdichevsky, Y, Tamarkin, A,, and Wels, W "Highlyefficient selection of phage antibodies mediated by display of antigen as Lpp-OmpA' fusions on live bacteria" J Mol Biol 301: 893-904 (2000)
【非特許文献５】Berwyn B, Hart JP, Rice S, Gass C, Pizzo SV, Post SR, Nicchitta CV Scavenger receptor-A mediates gp96/GRP94 and calreticulin internalization by antigen-presenting cells EMBO J 22: 6127-6136 (2003)
【非特許文献６】Boder, E T and Wittrup, K D "Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries" Nature Biotech 15: 553-557 (1997)
【非特許文献７】Castelli C, Rivoltini L, Rini F, Belli F, Testori A, Maio M, Mazzaferro V, Coppra J, Srivastava PK Heat shock proteins: biological functions and clinical application as personalized vaccines for human cancer Cancer Immunol Immunother 53:227-33 (2004)
【非特許文献８】Chen CH, Wang TL, Hung CF, Yang Y, Young RA, Pardoll DM, Wu, TC Enhancement of DNA vaccine potency by linkage of antigen gene to an HSP70 gene Cancer Res 60: 1035-1042 (2000)
【非特許文献９】Das PK, van den Wijngaard RMJGJ, Wankowicz-Kaoinska A, Le Poole IC A symbiotic concept of autoimmunity and tumor immunity: lessons from vitiligo Trends Immunol 22: 130-136 (2001)
【非特許文献１０】Delneste Y, Magistrelli G, Gauchat J, Haeuw J, Aubry J, Nakamura K, Kawakami-Honda N, Goetsch L, Sawamura T, Bonnefoy J, Jeannin P Involvement of LOX-1 in dendritic cell-mediated antigen cross-presentation Immunity 17: 353-362 (2002)
【非特許文献１１】Dunn, I S "Phage display of proteins" Cum Opinion Biotech 7: 547-553 (1996)
【非特許文献１２】Ernst, W J, Spenger, A,, Toellner, L, Katinger, H, Grabhen; R M "Expanding baculovirus surface display Modification of the native coat protein gp64 of Autographa calfornica NPV" Eur J Biochem 267:4033-4039 (2000)
【非特許文献１３】Engelhorn ME, Guevara-Patino JA, Noffz G, Hooper AT, Lou O, Gold JS, Kappel BJ, Houghton AN Autoimmunity and tumor imunity induced by immune responses to mutations in self Nat Med 12: 198-206 (2006)
【非特許文献１４】Frediani T, Lucarelli S, Frediani S, Frati C The role of heat shock proteins in vitiligo: deviation of cytotoxic response J Dermatol Sci 37: 114-117 (2005)
【非特許文献１５】Garbelli S, Mantovani S, Palermo B, Giachini C Melanocyte-specific, cytotoxic T cell responses in vitiligo: the effective variant of melanoma immunity Pigment Cell Res 18: 234-242 (2005)
【非特許文献１６】Gates, C M, Stemmer, W P C, Kaptein, R, and Schatz, P J "Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor "headpiece dimer" J Mol Biol 255: 373-386 (1996)
【非特許文献１７】Gething MJ, Sambrook J, Protein folding in the cell Nature 355: 33-45 (1992)
【非特許文献１８】Griffiths, A D and Duncan, A R "Strategies for selection of antibodies by phage display" Curr Opinion Biotech 9: 102-108 (1998)
【非特許文献１９】Gross C, Hansch D, Gastpar R, Multhoff G Interaction of heat shock protein 7 peptide with NK cells involves the NK receptor CD94 Biol Chem 384: 267-279 (2003)
【非特許文献２０】Houghton AN, Guevara-Patino JA Immune recognition of self in immunity against cancer J Clin Invest 114: 468-471 (2004)
【非特許文献２１】Johnson JD, Fleshner M Releasing signals, secretory pathways, and immune function of endogenous extracellular heat shock protein 72 J Leukoc Biol 79: 425-434 (2006)
【非特許文献２２】Kammerer R, Stober D, Riedl P, Oehninger C, Schirmbeck R, Reimann J Noncovalent assocation with stress protein facilitates cross-priming of CD8+ T cells to tumor cell antigens by dendritic cells J Immunol 168: 108-117 (2002)
【非特許文献２３】Kiang JG, Tsokos GC Heat shock protein 70 kDa: molecular biology, biochmeisty and physiology Pharmacol Ther 8: 183-21 (1998)
【非特許文献２４】Le Poole IC, Boissy RE, Sarangarajan R, Chen J, Forristal JJ, Sheth P, Westerhof W, Babcock G, Das PK, Saelinger CB PIG3V, an immortalized human vitiligo melanocyte cell line, expresses dilated endoplasmic reticulum In Vitro Cell Dev Biol Anim36 :309-319 (2000)
【非特許文献２５】Le Poole IC, van den Wijngaard RMJGJ, Westerhof W, Dutrieux RP, Das PK Presence or absence of melanocytes in vitiligo lesions: An immunohistochemical investigation J Invest Dermatol 100: 816-822 (1993)
【非特許文献２６】Le Poole IC, van den Wijngaard RMJGJ, Westerhof W, Verkruisen RP, Dutrieux RP, Dingemans KP, Das PK Phagocytosis by normal human melanocytes in vitro Exp Cell Res 205: 388-395 (1993b)
【非特許文献２７】Le Poole IC, Stennett LS, Bonsih BK, Robinson JK, Hernandez C, Hann SK, Nickoloff BJ Expansion of vitiligo lesions is associated with reduced epidermal CDw6 expression and increased expression of HLA-DR in perilesional skin Br J Dermatol 149: 739-748 (2003)
【非特許文献２８】Le Poole IC, Wankowicz-Kalinska A, van den Wijngaard RMJGJ, Nickoloff BJ, Das PK Autoimmune aspects of depigmentation in vitiligo J Investig Dermatol Symp Proc 2004 Jan;9(1):68-72 (2004)
【非特許文献２９】Lehner T, Wang Y, Whittal T, McGowan E, Kelly CG, Singh M Functional domains of HSP70 stimulate generation of cytokines and chemokines, maturation of dendritic cells and adjuvanticity Biochem Soc Trans 32: 629-632 (2004)
【非特許文献３０】MacAry PA, Javid B, Floto RA, Smith KGC, Oehlmann W, Singh M, Lehner PJ HSP70 peptide binding mutants separate antigen delivery from dendritic cell stimulation Immunity 20: 95-106 (2004)
【非特許文献３１】Marks, J D, Hoogenboom, H R, Griffiths, A D, and Winter, G "Molecular evolution of proteins on filamentous phage Mimicking the strategy of the immune system" J Biol Chem 267: 16007-16010 (1992)
【非特許文献３２】Mikawa, Y G, Maruyama, I N, and Brenner, S "Surface display of proteins on bacteriophage lambda heads" J Mol Biol 262: 21-30 (1996)
【非特許文献３３】Multhoff G, Mizzen L, Winchester CC, Milner CM, Wenk S, Eissner G, Kampinga HH, Laumbacher B, Johnson J Heat shock protein 70 (Hsp70) stimulates proliferation and cytolytic activity of natural killer cells Experimental hematology 27: 1627-1636 (1999)
【非特許文献３４】Nylandsted J, Gyrd-Hansen M, Danielewicz A, Fehrenbacher N, Lademann U, Hoyer Hansen M, Weber E, Multhoff G, Rohde M, Jaatela M Heat shock protein 7 promotes cell survival by inhibiting lysosomal membrane permeabilization J Exp Med 200: 425-435 (2004)
【非特許文献３５】Schaffitzel, C, Hanes, J, Jermutus, L, and Plucktun, A (1999) "Ribosome display: an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries" J Zmmunol Methods 23 1: 11 9-135 (1999)
【非特許文献３６】Srivastava PK, Udono H Heat shock protein-peptide complexes in cancer immunotherapy Curr Opin Immunol 6: 728-732 (1994)
【非特許文献３７】Tavaria M, Gabriele T, Kola I, Anderson RL A hitchhiker’s guide to the human Hsp70 family Cell Stress Chap 2: 23-28 (1996)
【非特許文献３８】Turk MJ, Wolchok JD, Guevara-Patino JA, Goldberg SM, Houghton AN Multiple pathways to tumor immunity and concomitant auroimmunity Immunol Rev 188: 122-135 (2002)
【非特許文献３９】Wang Y, Kelly CG, Singh M, McGowan EG, Carrara AS, Bergmeier LA, Lehner T Stimulation of Th1-polarizing cytokines, C-C chemokines, maturation of dendritic cells and adjuvant function by the peptide binding fragment of heat shock protein 70 J Immuno 169: 2422-2429 (2002)
【非特許文献４０】Wang Y, Whittal T, McGowan E, Younson J, Kelly C, Bergmeier LA, Singh M, Lehner T Identification of stimulating and inhibitory epitopes within the heat shock protein 70 molecule that modulate cytokine production and maturation of dendritic cells J Immunol 174: 3306-3316 (2005)
【非特許文献４１】Wang B, Chen YB, Ayalon O, Bender J, Garen A Human single-chain Fv immunoconjugates targeted to a melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan mediate specific lysis of human melanoma cells by natural killer cells and complement Proc Natl Acad Sci U S A Feb 16;96(4):1627-32 (1999)
【非特許文献４２】Welch WJ Heat shock proteins functioning as molecular chaperones: their roles in normal and stressed cells Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 339: 327-333 (1993)
【非特許文献４３】Whitehorn, EA, Tate, E, Yanofsky, S D, Kochersperger, L, Davis A, Mortensen, R B, Yonkovic, S, Bell, K, Dower, W J, and Barrett, R W "A generic method for expression and use of "tagged" soluble versions of cell surface receptors" Bio/Echnology 13: 1215-1219 (1995)
【非特許文献４４】Zhang H, Wang W, Li Q, Huang W Fusion protein of ATPase domain of Hsc70 with TRP2 acting as a tumor vaccine against B16 melanoma Immunol Lett Jun 15;105(2):167-73 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
白斑のためのケアの標準的方法は、免疫抑制治療としての局所ヒドロコルチゾンの処方、その後の免疫抑制およびメラニン形成刺激の双方をもたらすためのＰＵＶＡ療法を含み、いずれも成果は限定的である。既存のメラノサイト抗酸化剤の補充用に偽カタラーゼ（ｐｓｅｕｄｏｃａｔａｌａｓｅ）を使用した結果は不本意であった。効果的治療様式の開発における主な障害は、疾患として既存の病変を誤って認識することであった。したがって、患者、医師、および製薬会社は、色素脱失を妨げようとするのではなく再色素沈着（ｒｅｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を達成するための手段を探索している。白斑病変が傷が癒えた時に残る傷跡に酷似することから、これは行うべき重要な区別である。
【００１３】
したがって、発明者は、抗メラノサイト免疫の主な扇動因子（instigator）を除去することによって疾患の進行を停止するという当該技術分野における需要を特定している。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
一態様では、本発明は、ＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ［配列番号１］を含むヒトＨＳＰ７０活性化領域の非天然断片を有するポリペプチドに関する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、三量体化ドメインとＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧに結合する少なくとも１つのポリペプチドとを有する融合タンパク質に関する。ペプチドは、ＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧに結合するポリペプチド配列を含むループ領域を有するＣ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）でありうる。また、融合タンパク質は、三量体化ドメインのＮ末端およびＣ末端の一方に位置するＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧに結合する第１のポリペプチドおよび三量体化ドメインのＮ末端およびＣ末端の他方に位置するＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧに結合する第２のポリペプチドを有しうる。第１および第２のポリペプチドの一方または双方は、ＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧに結合するポリペプチド配列を含むループ領域を有するＣ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）でありうる。三量体化ドメインは、テトラネクチン三量体化構造エレメントでありうる。融合タンパク質は会合し、三量体複合体を形成しうる。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、ＨＳＰ７０活性化領域に結合するペプチドおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含有する医薬組成物に関する。組成物を使用し、白斑またはＨＳＰ７０によって引き起こされる他の自己免疫疾患を患う患者の治療が可能である。
【００１７】
本発明の様々なさらなる態様は、ＨＳＰ７０による樹状細胞の活性化を妨げる方法を含む。本方法は、樹状細胞およびＨＳＰ７０を発現する細胞を有する組織をＨＳＰ７０活性化領域を有するペプチドと接触させる工程を含む。ペプチドは、融合タンパク質および三量体複合体の形態でありうる。
【００１８】
本発明の別の態様は、三量体化ドメインとＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧを含むＨＳＰ７０ポリペプチドとの融合タンパク質を含む。３つの融合タンパク質は、三量体複合体の形態でありうる。タンパク質および複合体を使用し、樹状細胞の活性化およびメラノーマの治療が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＴＲＰ−２誘発性の白斑表現型を有するマウス（Ｖｉｔマウス）において、ヒトＨＳＰ７０およびＨＳＰ７０変異体１０がＨＳＰ７０変異体５、６および８とは対照的に色素脱失を媒介しうることを示す実験の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、形質移入の４８時間後におけるＣＯＳ細胞によるＨＳＰ７０ｉの発現のウエスタンブロット分析を示す。
【図３】図３は、Ｖｉｔマウスにおける色素脱失がＨＳＰ７０に応答して加速されることを示す。
【図４】図４は、最終の遺伝子銃ワクチン接種の６週間後におけるＶｉｔマウスの色素脱失を示す。
【図５】図５は、腹側への遺伝子銃ワクチン接種がＶｉｔマウスの背部への色素脱失の進行を誘発したことを示す。
【図６】図６は、既知の三次元構造の１０個のＣＴＬＤのアミノ酸配列のアラインメントを示す。主な二次構造エレメントの配列位置は、各配列上に示され、「αＮ」（αヘリックス数をＮで示す）および「βＭ」（β鎖数をＭで示す）として連続番号順で称される。ＣＴＬＤの２つの保存されたジスルフィド架橋の形成に関与する４つのシステイン残基は、図中にそれぞれ「ＣＩ」、「ＣＩＩ」、「ＣＩＩＩ」および「ＣＩＶ」として示され、列挙される。２つの保存されたジスルフィド架橋は、それぞれＣＩ−ＣＩＶおよびＣＩＩ−ＣＩＩＩである。１０個のＣ型レクチンは、ｈＴＮ：ヒトテトラネクチン、ＭＢＰ：マンノース結合タンパク質；ＳＰ−Ｄ：界面活性剤タンパク質Ｄ；ＬＹ４９Ａ：ＮＫ受容体ＬＹ４９Ａ；Ｈ１−ＡＳＲ：アシアログリコプロテイン受容体のＨ１サブユニット；ＭＭＲ−４：マクロファージマンノース受容体ドメイン４；ＩＸ−ＡおよびＩＸ−Ｂ：凝固因子ＩＸ／Ｘ−結合タンパク質ドメインＡおよびＢ（各々）；Ｌｉｔ：リソスタシン（ｌｉｔｈｏｓｔａｔｉｎｅ）；ＴＵ１４：被嚢類（ｔｕｎｉｃａｔｅ）Ｃ型レクチンである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
この詳細な説明の末尾にある参照文献一覧は、本明細書中で言及される文献の完全な参照のために提供される。参照文献一覧におけるまたは本明細書全体にわたって言及される参照文献の各々はそれら全体が参照により援用される。
【００２１】
一態様では、本発明は樹状細胞（ＤＣ）を活性化する非天然ＨＳＰ７０ポリペプチドに関する。ポリペプチドを使用し、免疫活性化が操作されうるように、ヒトＨＳＰ７０内のＤＣ活性化領域に結合する結合剤の生成が可能である。白斑のような自己免疫疾患においては、ＤＣ活性化領域の遮断が疾患の進行を遮断できる必要がある。したがって、一態様では、本発明は、ＨＳＰ７０誘発性の樹状細胞の活性化を低減または妨げることによる、白斑を治療するための方法に関する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、三量体化ドメインと樹状細胞を活性化するヒトＨＳＰ７０ドメイン（「ＨＳＰ活性化領域」）に結合するポリペプチドとの融合タンパク質に関する。三量体化ドメインは、白斑の治療に使用される安定な非免疫原性組成物を提供する他の類似の融合タンパク質に関連しうる。
【００２３】
本発明のこれらや他の態様をさらに詳細に規定する前に、多数の用語が定義される。本開示を通して使用される用語および語句は、用語に対する特定の定義が本明細書中に提供されない場合、当該技術分野で一般に理解されているような意味を有するものと解釈されるべきである。また、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明示しない場合、複数の言及を含む。
【００２４】
本明細書で使用される用語「結合メンバー」は、相互に結合特異性を有する分子対のメンバーを示す。結合対のメンバーは、天然由来でありうるかまたは全体的もしくは部分的に合成によって生成されうる。分子対の一方のメンバーはその表面上にある領域または空洞を有し、それは分子対の他方のメンバーの特定の空間的でかつ極性のある機構に対し、特異的に結合し、それ故に相補的である。したがって、対のメンバーは相互に特異的に結合する特性を有する。
【００２５】
本明細書で使用される用語「三量体化ドメイン」は、他の２つのアミノ酸配列と会合して「三量体」を形成するという機能性を含むアミノ酸配列を意味する。三量体化ドメインは、同一のアミノ酸配列の別の三量体化ドメイン（ホモ三量体）または異なるアミノ酸配列の三量体化ドメイン（ヘテロ三量体）と会合しうる。かかる相互作用は、三量体化ドメインの成分間の共有結合、ならびに水素結合力、疎水力、ファンデルワールス力および塩架橋によって引き起こされうる。
【００２６】
三量体化ドメインの特定の非限定例として、テトラネクチン三量体化構造エレメント（「ＴＴＳＥ」）、マンノース結合タンパク質三量体化ドメイン、およびコレクチンネック領域などが挙げられる。本明細書で使用される「テトラネクチン三量体化構造エレメント」または「ＴＴＳＥ」は、テトラネクチンタンパク質のアミノ酸２２〜４９、５０、５１または５２（配列番号３）を含む。
【００２７】
本発明の融合タンパク質の三量体化ドメインはテトラネクチンに由来する場合があり、より詳細には米国特許出願公開第２００７／０１５４９０１号明細書（参照により本明細書中に援用される）中に詳述されるＴＴＳＥを含む。ＴＴＳＥの三量体化効果は、他の２つのＴＴＳＥのコイルドコイル構造と相互作用し、比較的高温であっても非常に安定な三本鎖αヘリカルコイルドコイル三量体を形成するコイルドコイル構造によって引き起こされる。用語ＴＴＳＥはまた、タンパク質のテトラネクチンファミリーの天然メンバーのＴＴＳＥの変異体、悪影響を伴わないアミノ酸配列内で修飾されている変異体（いくらか実質的程度まで）、ＴＴＳＥのαヘリカルコイルドコイル三量体を形成する能力を包含するように意図されている。したがって、本発明に記載の三量体ポリペプチドはＴＴＳＥを三量体化ドメインとして含む可能性があり、それは配列番号２の配列と少なくとも６８％のアミノ酸配列同一性、より詳細には配列番号２と少なくとも７５％の同一性、少なくとも８７％の同一性または少なくとも９２％の同一性を有する配列を含む。これによると、ＴＴＳＥのシステイン残基５０番目（配列番号３）は、不要な鎖間ジスルフィド架橋の形成を回避するため、有利にはセリン、トレオニン、メチオニンまたは任意の他のアミノ酸残基に突然変異化される場合があり、それにより不要な多量体化が生じうる。特定の実施形態では、三量体化ドメインは、米国特許出願公開第２００７／００１５４９０１号明細書中により十分に記載の、テトラネクチンファミリーの三量体化構造エレメントのコンセンサス配列である配列番号２のポリペプチドである。
【００２８】
三量体化ドメインの別の例が、コレクチンネック領域を含むポリペプチドについて記載する国際公開第９５／３１５４０号パンフレット（その全体が本明細書中に援用される）において開示されている。次いで、三量体は、コレクチンネック領域のアミノ酸配列を含む３つのポリペプチドを伴う適切な条件下で作製されうる。
【００２９】
三量体化ドメインの別の例が、マンノース結合タンパク質Ｃ三量体化ドメイン（ＭＢＰ−Ｃ）である。この三量体化ドメインは、さらにオリゴマー化し、より高次の多量体複合体を生成しうる。
【００３０】
用語「Ｃ型レクチン様タンパク質」および「Ｃ型レクチン」は、任意の真核種内に存在するかまたはそのゲノム内にコードされる任意のタンパク質を示すように使用され、同タンパク質は、炭水化物リガンドに結合する、ＣＴＬＤの亜群、ＣＲＤに属する１つ以上のＣＴＬＤまたは１つ以上のドメインを有する。その定義は、詳細には、膜に付着したＣ型レクチン様タンパク質およびＣ型レクチン、機能的膜貫通ドメインが欠如した「可溶性」Ｃ型レクチン様タンパク質およびＣ型レクチンおよび１つ以上のアミノ酸残基がインビボでのグリコシル化または任意の他の合成後修飾によって改変されている変異体のＣ型レクチン様タンパク質およびＣ型レクチン、ならびにＣ型レクチン様タンパク質およびＣ型レクチンの化学修飾によって得られる任意の産物を含む。
【００３１】
ＣＴＬＤは約１２０のアミノ酸残基からなり、特徴として２つまたは３つの鎖間ジスルフィド架橋を有する。異なるタンパク質に由来するＣＴＬＤ間のアミノ酸配列レベルでの類似性は比較的低いが、多数のＣＴＬＤの三次元構造は、高度に保存されると共に、構造的変動性がいわゆるループ領域（最大で５つのループによって規定されることが多い）に本質的に限定されることが見出されている。いくつかのＣＴＬＤは、カルシウムに対する１つまたは２つのいずれかの結合部位を有し、カルシウムと相互作用する側鎖の大部分はループ領域内に位置する。
【００３２】
三次元構造情報が入手できるＣＴＬＤに基づくと、標準的なＣＴＬＤがβ１、α１、α２、β２、β３、β４、およびβ５の順序で連続的に出現する７つの主な二次構造エレメント（すなわち５つのβ鎖および２つのαヘリックス）によって構造的に特徴づけられることは推定されている。三次元構造が決定されている場合のすべてのＣＴＬＤにおいては、β鎖は、２つの逆平行のβシート（一方はβ１およびβ５で構成され、他方はβ２、β３およびβ４で構成される）で配列される。追加的なβ鎖である配列内でβ１に先行することが多いβ０は、存在する場合、β１、β５シートと統合する追加的な鎖を形成する。さらに、２つのジスルフィド架橋（α１およびβ５に結合するもの（ＣＩ−ＣＩＶ）とβ３に結合するもの）ならびにβ４およびβ５に結合するポリペプチドセグメント（ＣＩＩ−ＣＩＩＩ）は、これまでに特徴づけられたすべてのＣＴＬＤにおいて常に見出される。
【００３３】
ＣＴＬＤの三次元構造においては、これらの保存された二次構造エレメントは、多数のループに対するコンパクトな足場を形成し、これに関連して集合的に「ループ領域」と称され、コアから突出している。ＣＴＬＤの一次構造においては、これらのループは、２つのセグメント、すなわちループセグメントＡ（ＬＳＡ）およびループセグメントＢ（ＬＳＢ）内で組織化される。ＬＳＡは、規則的な二次構造が欠如することが多いβ２およびβ３に結合する長いポリペプチドセグメントを示し、最大で４つのループを有する。ＬＳＢは、β鎖のβ３およびβ４に結合するポリペプチドセグメントを示す。ＬＳＡ内の残基が、β４内の単一の残基と共に、いくつかのＣＴＬＤ（テトラネクチンのそれを含む）のＣａ２＋およびリガンド結合部位を特定することが示されている。例えば、１個もしくは数個の残基の置換を含む突然変異誘発試験では、結合特異性、Ｃａ２＋−感受性および／または親和性における変化がＣＴＬＤドメインによって行われうることが示されている（ＷｅｉｓおよびＤｒｉｃｋａｍｅｒ（１９９６年）、Ｃｈｉｂａら（１９９９年）、Ｇｒａｖｅｒｓｅｎら（２０００年））。
【００３４】
次の非限定例、すなわちテトラネクチン、リソスタチン（ｌｉｔｈｏｓｔａｔｉｎ）、マウスマクロファージガラクトースレクチン、クッパー細胞受容体、ニワトリニューロカン、パールシン（ｐｅｒｌｕｃｉｎ）、アシアログリコプロテイン受容体、軟骨プロテオグリカンコアタンパク質、ＩｇＥ  Ｆｃ受容体、膵炎関連タンパク質、マウスマクロファージ受容体、ナチュラルキラー基、幹細胞成長因子、因子ＩＸ／Ｘ結合タンパク質、マンノース結合タンパク質、ウシコングルチニン、ウシＣＬ４３、肝臓コレクチン１（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ  ｌｉｖｅｒ  １）、界面活性剤タンパク質Ａ、界面活性剤タンパク質Ｄ、ｅ−セレクチン、被嚢類ｃ型レクチン、ＣＤ９４  ＮＫ受容体ドメイン、ＬＹ４９Ａ  ＮＫ受容体ドメイン、ニワトリ肝レクチン、マスｃ型レクチン、ＨＩＶ  ｇｐ  １２０−結合ｃ型レクチン、および樹状細胞受容体ＤＣ−Ｓｉｇｎを含む多数のＣＬＴＤが知られている。
【００３５】
用語「アポトーシス」および「アポトーシス活性」は広義で使用され、典型的には細胞質の濃縮、血漿膜微絨毛の消失、核の分割、染色体ＤＮＡの分解またはミトコンドリアの機能の消失を含む１つ以上の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳類における規則正しいかまたは制御された形態の細胞死を示す。この活性は、周知の技術的方法、例えば細胞生存度アッセイ、ＦＡＣＳ分析またはＤＮＡ電気泳動、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、および／または膜小胞（アポトーシス体と称される）の形成を使用して決定され、測定されうる。
【００３６】
ここで本発明をより詳細に検討すると、一態様では本発明はＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ［配列番号１］を含むヒトＨＳＰ７０の非天然断片を含むポリペプチドに関する。このペプチドは、樹状細胞を活性化するためのヒトＨＳＰ７０内の活性化領域を示す。活性化された樹状細胞は、活性化後に細胞毒性およびＴ細胞刺激活性を有し、メラノサイトを殺滅可能であり、それにより環境内でのＨＳＰ７０のレベルが直接的または間接的に上昇する。
【００３７】
ヒトＨＳＰ７０の非天然断片は、完全長ＨＳＰ７０に満たないヒトＨＳＰ７０の一部を含む。特に、ＨＳＰ７０の非天然断片は、限定はされないが、１１、１３、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、および１５０アミノ酸長のポリペプチド配列を含む。非天然断片はまた、ＮもしくはＣ末端で切断されているかまたは末端間に１つ以上のアミノ酸の欠失を有する天然ＨＳＰ７０を含む。本発明の非天然断片は、配列番号１のＨＳＰ７０活性化領域を含む。かかる断片は、切断された野生型配列として任意の種によって天然に発現されることはなく、当該技術分野で容易に理解されるように単離され、精製されうる。
【００３８】
別の態様では、本発明は、ＨＳＰ７０活性化ドメインに結合するポリペプチドに関する。本態様では、本発明は、三量体化ドメインとＨＳＰ７０活性化領域に結合する少なくとも１つのポリペプチド結合メンバーとを含むペプチド、タンパク質または融合タンパク質に関する。本発明によると、結合メンバーは、三量体化ドメインのＮもしくはＣ末端アミノ酸残基のいずれかに結合されうる。また、特定の実施形態では、結合メンバーを三量体化ドメインのＮ末端およびＣ末端の双方に結合させることは有利でありうる。
【００３９】
別の態様では、ポリペプチド結合メンバーはＣＴＬＤのループ領域内に含まれる。ポリペプチドは、天然または非天然の配列でありうる。本態様では、配列はＣＬＴＤのループ領域内に含まれ、ＣＴＬＤはドメインのＮ末端またはＣ末端で直接かまたは適切なリンカーを介するかのいずれかで三量体化ドメインに融合される。また、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端およびＣ末端の他方で融合された第２のＣＬＴＤドメインを含みうる。本態様の変形では、融合タンパク質は、三量体化ドメインの末端の一方で結合メンバーおよび他方の末端でＣＬＴＤを含む。融合タンパク質の第１、第２または第３は、ＨＳＰ７０活性化領域における最大で６つの特定の結合メンバーを有する三量体複合体の一部でありうる。
【００４０】
別の実施形態では、結合メンバーは抗体または抗体断片を含む。これに関連して、用語「抗体」は、天然であってもまたは部分的もしくは全体的に合成によって生成されるにしても免疫グロブリンを記述するために使用される。抗体が多くの方法で修飾されうることから、用語「抗体」は、任意の特異的な結合メンバーまたはＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ［配列番号１］に対して特異的な結合ドメインを有する物質を網羅するものとして解釈されるべきである。したがって、この用語は、天然であってもまたは全体的もしくは部分的な合成であっても、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体の抗体断片、誘導体、機能的等価物および相同体を網羅する。したがって、別のポリペプチドに融合される、免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子または等価物が含まれる。同用語はまた、抗体結合ドメイン、例えば抗体模倣体であるかまたはそれに相同性がある結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質を網羅する。これらは天然の供給源に由来しうるか、またはそれらは部分的もしくは全体的に合成によって生成されうる。抗体の例として、免疫グロブリンアイソタイプおよびそのアイソタイプサブクラス；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの抗原結合ドメインを含む断片；ならびに二重特異性抗体が挙げられる。
【００４１】
別の態様では、本発明は、３つの融合タンパク質の三量体複合体に関し、ここで３つの融合タンパク質の各々は三量体化ドメインとＨＳＰ７０活性化領域に結合する少なくとも１つのポリペプチドとを含む。一実施形態では、三量体複合体は、テトラネクチン三量体化構造エレメント、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）三量体化ドメイン、コレクチンネック領域およびその他から選択される三量体化ドメインを有する融合タンパク質を含む。三量体複合体は、本発明の融合タンパク質のいずれかからなり得、ここで三量体複合体の融合タンパク質は三量体を形成するための互いに会合可能な三量体化ドメインを含む。したがって、一部の実施形態では、三量体複合体は同じアミノ酸配列を有する融合タンパク質からなるホモ三量体複合体である。他の実施形態では、三量体複合体は、例えば異なる三量体化ドメインおよび／またはＨＳＰ７０活性化領域に結合する異なるポリペプチドなどの異なるアミノ酸配列を有する融合タンパク質からなるヘテロ三量体複合体である。
【００４２】
マイコバクテリアＨＳＰ７０配列ＱＰＳＶＱＩＱＶＹＱＧＥＲＥＩＡＡＨＮＫ［配列番号１７］（アミノ酸４０７〜４２６）が樹状細胞を活性化することが可能であることは過去に決定された（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７４（６）：３３０６頁（２００５年））。次いで、これらの結果を用い、樹状細胞の活性化に関与するヒトＨＳＰ７０の領域が同定された。分析のため、ヒトＨＳＰ７０のＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧＥＲ［配列番号１８］配列が選択された。この配列は、上記のマイコバクテリア配列の一部（ＱＰＳＶＱＩＱＶＹＱＧＥＲ［配列番号１９］；アミノ酸４０７〜４１９）に対して相同性があり、それは免疫刺激性領域であることが報告された２０−ｍｅｒペプチドの一部である（同文献）。報告のように、このペプチドの最初から４つのアミノ末端アミノ酸のアラニン置換により、免疫刺激が有意に阻害された（同文献）。
【００４３】
下記の実施例に記載のように、多数の変異が、種間相同性に基づく１３−ｍｅｒヒト配列内に導入された。４つの変異体が生成され、これらの配列を有するベクターは白斑マウスモデルにおいて試験された。最後の２つのアミノ酸の突然変異（すなわち変異体１０）が色素脱失に対して全く効果を有しないことから、これらのアミノ酸が白斑における色素脱失の媒介に必要でなかったことが明らかである。したがって、本発明のポリペプチドＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ［配列番号１］が、白斑における色素脱失の媒介を担うＨＳＰ７０活性化領域として同定される。
【００４４】
本発明の他の態様は、ｈｓｐ７０ペプチドに対する拮抗性ペプチドの競合的結合を介し、ｈｓｐ７０の刺激部分と細胞との相互作用を阻害することによって樹状細胞の活性化を妨げることに関する。
【００４５】
別の態様は、ＨＳＰ７０によって誘発されるストレス関連自己免疫疾患、例えば白斑を、かかる疾患を患う患者にＨＳＰ７０活性化領域に結合する有効量のポリペプチドを投与することによって治療することに関する。ポリペプチドは三量体化ドメインを伴う融合タンパク質の一部であり、また記載のような三量体複合体の一部でありうる。白斑の治療においては、投与の好ましい経路は薬学的に許容可能な送達賦形剤中で局所である。
【００４６】
本発明の別の態様では、ＨＳＰ７０活性化領域を使用し、樹状細胞が活性化されうる。本態様では、ドメインは三量体化ドメインに融合され、融合タンパク質が生成される。上記のように、融合タンパク質は三量体複合体の一部であり得、かつそれはＨＳＰ７０活性化領域が移殖されているＣＴＬＤループ領域を含みうる。
【００４７】
白斑皮膚に浸潤するＴ細胞によって認識される抗原は、メラノーマ腫瘍に浸潤するＴ細胞に対する主な標的抗原として先行的に同定された（Ｄａｓら、２００１年）。これらの抗原は、他の細胞種内のリソソームに対して機能的類似性を担持するメラノソーム内で発現される（Ｌｅ  Ｐｏｏｌｅら、１９９３年）。局在化は、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１およびチロシナーゼなどのメラノソームタンパク質の免疫原性に寄与する可能性が高い。白斑における免疫反応性とメラノーマの間の類似性は、その腫瘍に対して検出可能な免疫応答を有するメラノーマ患者において認められる白斑によって支持される。実際、色素脱失はメラノーマ患者における陽性予後因子と考えられる（Ｎｏｒｄｌｕｎｄら、１９８３年）。不運にも免疫応答はメラノーマ腫瘍をほとんど除去できない一方、有効な免疫は進行性白斑の特質である。したがって、白斑患者は、メラノサイト細胞に対し、メラノーマ患者の場合より活発な免疫応答を生じさせるように見える（Ｇａｒｂｅｌｌｉら、２００５年）。
【００４８】
ＤＣによる抗原の取り込みおよびプロセシングを援助するＨＳＰ７０のシャペロンの機能は、分子を、抗腫瘍ワクチンにおけるアジュバントとして機能する理想的な候補にする。ＨＳＰ７０−抗原融合タンパク質をコードするＤＮＡがメラノーマに対するワクチン内に封入されている（Ｚｈａｎｇら、２００６年）。かかる応用では、マイコバクテリアＨＳＰ７０が用いられることが多い（Ｃｈｅｎら、２０００年）。抗癌ワクチンにおいては、異種ストレスタンパク質の使用は、得られるタンパク質の免疫原性をヌクレオチド変異が高めるというさらなる利点を有する（マイコバクテリアおよびマウスＨＳＰ７０は約５０％の相同性がある）一方で、いずれかの変異がペプチドとタンパク質とを結合しうる。異なる種内での分子の保存は、マウス細胞系がヒトＨＳＰ７０に結合し、その逆もいえるという観察によってさらに支持される（ＭａｃＡｒｙら、２００４年）。３つの機能ドメインが、ＨＳＰ７０分子内部で割り当てられている。すなわち、シャペロン共同因子への結合に明らかに関与する、約４４ｋＤ（約３５０アミノ酸）のＮ末端ＡＴＰａｓｅドメイン、約１８ｋＤのペプチド結合ドメイン（約１５０アミノ酸）および１０ｋＤのＣ末端ドメイン（約１００アミノ酸）である（Ｌｅｈｎｅｒら、２００４年）。ＨＳＰ７０−ペプチド複合体におけるいくつかの表面受容体が免疫細胞上で同定されており、ＬＤＬ受容体関連タンパク質２／α２−マクログロブリンＣＤ９１（Ｂａｓｕら、２００１年）、スカベンジャー受容体ＬＯＸ−１（Ｄｅｌｎｅｓｔｅら、２００２年）、ＣＤ９４（Ｇｒｏｓｓら、２００３年）およびＳＲ−Ａ（Ｂｅｒｗｙｎら、２００３年）、Ｔｏｌｌ様受容体２および４（Ａｓｅａら、２００２年）、ならびにＣＤ４０（Ｂｅｃｋｅｒら、２００２年）が含まれる。
【００４９】
メラノーマ対白斑におけるメラノサイト細胞に対する抗腫瘍免疫と自己免疫との関係について報告がなされている（Ｄａｓら、２００１年；Ｔｕｒｋら、２００２年；ＨｏｕｇｈｔｏｎおよびＧｕｅｖａｒａ−Ｐａｔｉｎｏ、２００４年；Ｅｎｇｅｌｈｏｒｎら、２００６年）（ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＵｄｏｎｏ、１９９４年；Ｃａｓｔｅｌｌｉら、２００４年）。抗腫瘍免疫におけるＨＳＰ７０の役割を援助するワクチンがメラノーマ患者にとって利益になる一方、ＨＳＰ７０がメラノサイトに対する免疫応答を持続しないよう遮断することが、白斑を有する患者にとって利益になりうる。
【００５０】
メラノーマにおける抗腫瘍免疫を高めるため、ＨＳＰ７０融合タンパク質に基づくワクチンを含むいくつかのワクチンが開発中である（Ｈｕａｎｇら、２００３年）。ＨＳＰ７０または熱ショックタンパク質７０が、それ自体で免疫原性を示しかつＤＣ活性化およびＴ細胞反応性を刺激するためのアジュバントとして機能するシャペロンタンパク質としてワクチン内に含まれる。
【００５１】
したがって、本発明の別の態様は、樹状細胞を活性化することによりメラノーマを治療する方法を含む。本方法は、樹状細胞を融合タンパク質または三量体複合体と接触させる工程を含む。本発明の様々な態様では、分子は、皮膚癌（メラノーマ）もしくは他のタイプの癌のためのワクチンとして、またはウイルスワクチンまたはワクチンにおけるアジュバントとして、単独でまたは免疫応答が生じる必要がある抗原にライゲートして使用されうる。
【００５２】
本発明の他の態様は、米国特許出願公開第２００７／０１５４９０１号明細書にさらに記載のように、本発明の融合タンパク質を発現するためのヌクレオチド配列、ベクターおよび宿主細胞に関する。
【００５３】
ＨＳＰ７０活性化領域に対する結合メンバーの同定方法
一態様では、ＨＳＰ７０活性化領域に対する結合メンバーは、ポリペプチドのランダムライブラリからの、ＨＳＰ活性化領域に特異的に結合するライブラリのメンバーの選択によって得ることができる。推定リガンド結合部位を有する表現型を提示するための多数のシステムが知られている。これらは、ファージディスプレイ（例えば線状ファージｆｄ［Ｄｕｎｎ（１９９６年）、ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤｕｎｃａｎ（１９９８年）、Ｍａｒｋｓら（１９９２年）］、ファージλ［Ｍｉｋａｗａら（１９９６年）］）、真核ウイルス上のディスプレイ（例えばバキュロウイルス［Ｅｒｎｓｔら（２０００年）］）、細胞ディスプレイ（例えば、細菌細胞［Ｂｅｎｈａｒら（２０００年）］、酵母細胞［ＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ（１９９７年）］、および哺乳類細胞［Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎら（１９９５年）］上のディスプレイ）、リボソーム結合ディスプレイ［Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌら（１９９９年）］、ならびにプラスミド結合ディスプレイ［Ｇａｔｅｓら（１９９６年）］を含む。
【００５４】
また、米国特許出願公開第２００７／０２７５３９３号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）は、ＣＬＴＤライブラリの作成を目的としてディスプレイシステムを完成させるための手順について詳述している。一般的手順は、（１）選択されるＣＴＬＤの三次元構造の参照（かかる情報が入手可能な場合）によるループ領域の位置の同定、または入手不能な場合での、図６に示される配列との配列アラインメントによるβ２、β３およびβ４鎖の配列位置の同定（これは、上でさらに開示される、β２およびβ３コンセンサス配列要素に対応する配列要素およびβ４鎖特性の同定によるさらなる実証によって補助される）；（２）β２、β３およびβ４をコードする配列に近接したエンドヌクレアーゼ制限部位の挿入を予め行う場合または行わない場合での、タンパク質ディスプレイベクター系における選択されるＣＴＬＤをコードする核酸断片のサブクローン化；ならびに（３）選択されるＣＴＬＤのループ領域の一部または全部をコードする核酸断片と、多数の核酸断片からなるアンサンブルの無作為に選択されたメンバーとの置換を含む。多数の核酸断片は、受け取るフレームワークをコードする核酸コンテキストへの挿入後、元のループ領域ポリペプチド断片をコードする核酸断片を、無作為に選択された核酸断片と置換することになる。元のループセグメントまたはループ領域全体を置換する新しいポリペプチドをコードするクローン化核酸断片の各々は、その新しい配列コンテキスト内部で決定されたリーディングフレームにおいて解読されることになる。
【００５５】
ホモ三量体タンパク質として機能する複合体が形成されうる。ヒトテトラネクチンタンパク質の三量体構造は、ＨＳＰ７０活性化領域に結合可能なメンバーを有するライブラリを作成するための独自の理想的な足場を提示する。しかし、ＨＳＰ７０結合活性を有するペプチドがまず同定されなければならない。これを行うため、既知の結合活性を有するペプチドが使用されうるか、またはさらなる新しいペプチドがディスプレイライブラリからのスクリーニングによって同定されうる。多数の異なるディスプレイシステム、例えば限定はされないが、ファージ、リボソームおよび酵母ディスプレイが利用可能である。
【００５６】
結合活性を有する新しいペプチドを選択するため、ライブラリが作成され、単量体成分として、単一の単量体ＣＴＬＤドメインまたはファージの表面上に提示される個々のペプチドのいずれかとしてのＨＳＰ７０活性化領域への結合について最初にスクリーニングされうる。一旦、ＨＳＰ７０結合活性を有する配列が同定されると、それに続いてこれらの配列をヒトテトラネクチンの三量体化ドメイン上に移殖することで、ヒトＨＳＰ７０活性化領域に結合可能な有望なタンパク質療法が得られることになる。
【００５７】
４つの方法が、これらのファージディスプレイライブラリおよび三量体化ドメインコンストラクトの作成において用いられうる。第１の方法では、ランダムペプチドファージディスプレイライブラリが作成および／または使用されることになる。ジスルフィド制限ループとして作成されるランダム線状ペプチドおよび／またはランダムペプチドは、ファージ粒子の表面上に個別に提示され、ファージディスプレイの「パニング」を介したＨＳＰ７０活性化領域への結合性に対して選択されることになる。ＨＳＰ７０結合活性を有するペプチドクローンを得た後、これらのペプチドは、ヒトテトラネクチンの三量体化ドメイン上に移殖されるか、またはＣＴＬＤドメインのループ内に移殖されてから三量体化ドメイン上に移植され、ＨＳＰ７０結合活性についてスクリーニングされることになる。
【００５８】
ファージディスプレイライブラリおよび三量体化ドメインコンストラクトを作成するための第２の方法では、ＣＴＬＤ由来の結合剤を得ることを含むことになる。ライブラリは、ファージの表面上に提示されるヒトテトラネクチンのＣＴＬＤ足場内部の５つの異なるループの中の１つ以上のループ内でアミノ酸をランダム化することによって作成されうる。ＨＳＰ７０活性化領域への結合については、ファージディスプレイパニングを介して選択されうる。ＨＳＰ７０結合活性を示すペプチドループを有するＣＴＬＤクローンを得た後、これらのＣＴＬＤクローンはヒトテトラネクチンの三量体化ドメイン上に移植され、ＨＳＰ７０結合活性についてスクリーニングされうる。
【００５９】
ファージディスプレイライブラリおよび三量体化ドメインコンストラクトを作成するための第３の方法では、ＨＳＰ７０活性化領域に対する結合能を有する既知の配列を取得することを含み、これらをヒトテトラネクチンの三量体化ドメイン上に直接移殖し、ＨＳＰ７０結合活性についてスクリーニングすることになる。
【００６０】
第４の方法は、ＨＳＰ７０活性化領域に対する既知の結合能を有するペプチド配列を使用し、最初にそれらの結合性を、ペプチドに隣接するランダム化アミノ酸または／およびペプチド内部の選択されたランダム化内部アミノ酸で新しいライブラリを作成することによって改善し、次いでファージディスプレイを介して改善された結合性に対して選択することを含む。改善された親和性を有する結合剤を得た後、これらのペプチドの結合剤は、ヒトテトラネクチンの三量体化ドメイン上に移殖され、ＨＳＰ７０結合活性についてスクリーニングされうる。この方法では、初期ライブラリは、第１の方法（上記）におけるようなファージ粒子の表面上に提示される遊離ペプチドまたは第２の方法（これも上で考察）におけるようなＣＴＬＤ足場内部の制限ループのいずれかとして作成されうる。改善された親和性を有する結合剤を得た後、これらのペプチドのヒトテトラネクチンの三量体化ドメイン上への移植およびＨＳＰ７０結合活性についてのスクリーニングが行われることになる。
【００６１】
Ｎ末端（Ｖ１７）で最大で１６の残基が除去されるかまたはＣ末端が改変された三量体化ドメインの切断バージョンが使用されうる。ＴｒｉｐＶ、ＴｒｉｐＴ、ＴｒｉｐＱおよびＴｒｉｐＫと称されるＣ末端の変異は、三量体化ドメイン上でのＣＴＬＤドメインに特有の提示を可能にする。ＴｒｉｐＫ変異体は最長のコンストラクトであり、ＣＴＬＤと三量体化ドメインとの間での最長でかつ最も柔軟なリンカーを有する。ＴｒｉｐＶ、ＴｒｉｐＴ、ＴｒｉｐＱは、構造的柔軟性が全く伴わない、ＣＴＬＤ分子の三量体化モジュール上への直接的な融合を示すが、ＣＴＬＤ分子の３分の１が、ＴｒｉｐＶからＴｒｉｐＴへ、またＴｒｉｐＴからＴｒｉｐＱへとしている。これは、これらのアミノ酸の各々がαヘリカルターン（α−ｈｅｌｉｃａｌ  ｔｕｒｎ）になっており、フルターン（ｆｕｌｌ  ｔｕｒｎ）には３．２アミノ酸が必要とされるという事実に基づく。第１、第３および第４の方法において結合性に対して選択される遊離ペプチドは、三量体化ドメインの上記バージョンのいずれかの上に移殖されうる。次いで、得られる融合体をスクリーニングすることで、ペプチドの組み合わせおよび方向のいずれが最高の活性をもたらすかが判明しうる。テトラネクチンのＣＴＬＤのループ内部に制限された、結合性に対して選択されるペプチドは完全長三量体化ドメイン上に移殖されうる。
【００６２】
より詳細には、４つの方法は以下に説明される。これらの方法ではファージディスプレイが着目されているが、ポリペプチドを同定する他の等価な方法が使用可能である。
【００６３】
方法１
限定はされないがＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｐｈ．Ｄ．ファージディスプレイペプチドライブラリキットなどのペプチドディスプレイライブラリキットが市販されており、ＨＳＰ７０結合活性を有する新しい新規のペプチドの選択における使用を目的に購入されうる。Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓキットの３つの形態、すなわち、（２．８×１０９の独立クローンのライブラリサイズを有する）７アミノ酸長の線状ランダムペプチドを有するＰｈ．Ｄ．−７ペプチドライブラリキット、（７アミノ酸長のランダムペプチドおよび１．２×１０９独立クローンのライブラリサイズを有する）ジスルフィド制限ループとして作成されたペプチドを有するＰｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃジスルフィド制限ペプチドライブラリキット、および（２．８×１０９の独立クローンのライブラリサイズを有する）１２アミノ酸長の線状ランダムペプチドを有するＰｈ．Ｄ．−１２ペプチドライブラリキットが使用可能である。
【００６４】
あるいは、類似のライブラリが、これらのキットに類似するランダムアミノ酸を有するペプチドでデノボに作成されうる。作成においては、ランダムヌクレオチドがＮＮＫまたはＮＮＳ方法のいずれかを使用して生成され、ここではＮは４つの核酸塩基Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの均等な混合物を表す。ＫはＧまたはＴのいずれかの均等な混合物を表し、ＳはＧまたはＣのいずれかの均等な混合物を表す。これらのランダム化された位置は、ファージまたはファージミドディスプレイベクター系のいずれかにおいてＧｅｎｅ  ＩＩＩタンパク質上へクローン化されうる。ＮＮＫおよびＮＮＳ方法の双方は全部で２０の有望なアミノ酸および１つの停止コドンを網羅し、ここでコードされたアミノ酸における頻度はやや異なる。細菌の形質転換効率に限界があることから、ファージディスプレイにおいて作成されるライブラリサイズは上掲のサイズの程度であり、それ故に最大で７つのランダム化アミノ酸位置（ＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫ）［配列番号２０］を有するペプチドが生成可能であり、さらに理論上の組み合わせ（２０７＝１．２８×１０９）のレパートリー全体を網羅する。より長いペプチドライブラリはＮＮＫまたはＮＮＳ方法のいずれかを使用して作成可能であるが、実際のファージディスプレイのライブラリサイズは、細菌の形質転換における要件に起因して、かかる長さに関連しうるすべての理論上のアミノ酸の組み合わせを網羅しないであろう。
【００６５】
方法２
図６に示されるヒトテトラネクチンＣＴＬＤは５つのループを有し、それは改変され、ＣＴＬＤの異なるタンパク質標的に対する結合性が付与されうる。ランダムアミノ酸配列をこれらのループの中の１つ以上のループ内に配置することでライブラリの作成が可能であり、それから所望される結合特性を有するＣＴＬＤドメインが選択されうる。ヒトテトラネクチンＣＴＬＤの５つのループの全部または一部の内部に制限されたランダムペプチドを有するこれらのライブラリの作成は、（限定はされないが）上の方法１に記載のＮＮＫまたはＮＮＳのいずれかを使用してなされうる。７つのランダムペプチドがＴＮ  ＣＴＬＤのループ１に挿入されうるという方法の一例は次の通りである。
【００６６】
断片ＡのＰＣＲは、ＣＴＬＤのＮ末端に結合するフォワードオリゴＦ１（５’−ＧＣＣＣＴＣＣＡＧＡＣＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＧＧＧ−３’；配列番号４）；ループ１の直ぐ５’側のＤＮＡ配列に結合するリバースオリゴＲ１（５’−ＧＴＴＧＡＧＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴＣＧＧＣＣＴＣ−３’；配列番号５）を使用して実施されうる。断片Ｂは、フォワードオリゴＦ２（５’−ＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＴＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣＣＴＣＡＡＣＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＧＧＧＴＧＧＡＣＡＴＧＡＣＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＡＴＣ−３’；配列番号６）およびリバースプライマーＲ２（５’−ＣＡＣＧＡＴＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＴＧＴＡＧＧＧ−３’；配列番号７）を使用して作成されうる。フォワードプライマーＦ２は、プライマーＲ１に対して相補的な５’末端を有し、ループ１の最初から７個のアミノ酸をランダムアミノ酸と置換し、ループ１の最後のアミノ酸およびその３’側配列に結合する３’末端を有する一方、リバースプライマーＲ２は、ＣＴＬＤ配列の末端に対して相補的であり、それに結合する。ＰＣＲは、高性能ポリメラーゼまたはｔａｑブレンドおよび標準のＰＣＲ熱サイクル条件を使用して実施されうる。次いで、断片ＡおよびＢはゲル単離され、次いで上記のようにプライマーＦ１およびＲ２を使用する重複伸長（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ＰＣＲのために結合されうる。制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩによる消化は、ＴＮ  ＣＴＬＤのループを有する断片の単離と、それに続く（クローン化のためにＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩで同様に消化される）Ｇｅｎｅ  ＩＩＩに融合された下記に示される制限修飾ＣＴＬＤを有するファージディスプレイベクター（ＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅなど）へのライゲーションを可能にしうる。
【００６７】
ランダム化アミノ酸との置換による他のループの修飾は、上で示される場合と同様に行われうる。ループ内部の制限されたアミノ酸とランダム化アミノ酸との置換は、任意の特定のループに限定されないばかりか、元のサイズのループに限定されない。同様に、ループの全置換は必要とされず、部分置換はループのいずれかにおいて生じうる。いくつかの場合、ループ内部での元のアミノ酸の一部（例えばカルシウムを調整するアミノ酸（ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ））の保持が望ましい場合がある。これらの場合、ランダム化アミノ酸との置換がループ内部の少ない方のアミノ酸のいずれかにおいて生じ、カルシウムを調整するアミノ酸が保持されうるか、あるいはさらなるランダム化アミノ酸をループに付加することで、ループの全体サイズが拡大し、さらにこれらのカルシウムを調整するアミノ酸が保持されうる。極めて大きいペプチドが、ループ１および２またはループ３および４などのループ領域を１つのより大きい置換ループに組み合わせることによって適合され、試験されうる。さらに、他のＣＴＬＤ、例えば限定はされないがＭＢＬ  ＣＴＬＤが、テトラネクチンのＣＴＬＤの代わりに使用されうる。ペプチドのこれらＣＴＬＤへの移植が、上記の場合と同様の方法を用いて行われうる。
【００６８】
方法３
いくつかの場合、結合活性を有するペプチドの直接クローン化が十分でない場合があり、さらに最適化および選択が必要でありうる。例として、ＨＳＰに対して既知の結合性を有するペプチド、例えば限定はされないが上記のものは、ヒトテトラネクチンのＣＴＬＤに移殖されうる。結合のためのこれらのペプチドの最適な提示に対して選択するため、隣接アミノ酸の中の１つ以上がランダム化された後、結合についてのファージディスプレイ選択がなされうる。さらに、単独で限定的または弱い結合を示すペプチドはまた、別の追加的ループのランダム化を有するＣＴＬＤライブラリのループの１つに移殖された後、再び結合性および／または特異性の増大についてのファージディスプレイを介した選択がなされうる。さらに、アミノ酸への特異的な相互作用／結合が既知である場合に結晶構造によって同定されるペプチドにおいては、非結合アミノ酸のランダム化が検討された後、結合性および受容体特異性の増大についてのファージディスプレイを介した選択がなされうる。
【００６９】
方法４：
一旦ＨＳＰ７０に対する結合活性を有する多数のペプチドが同定されると、これらのペプチドは、遊離線状ペプチドとしてかまたはシステインを使用するジスルフィド制限ループとして、ＮまたはＣ末端の三量体化ドメインのいずれかの上に直接クローン化されうる。ＨＳＰに結合可能な一本鎖抗体またはドメイン抗体はまた、三量体化ドメインのいずれかの末端上にクローン化されうる。さらに、既知の結合特性を有するペプチドは、ＴＮ  ＣＴＬＤのループ領域のいずれか１つに直接クローン化されうる。ジスルフィド制限ループまたは抗体の相補性決定領域として選択されるペプチドであれば、ヒトテトラネクチンのＣＴＬＤのループ領域への再配置に対してかなり従順でありうる。次いで、これらすべてのコンストラクトにおいては、単量体としての結合、ならびに三量体化ドメインと融合される場合には三量体としての結合が試験されうる。
【００７０】
医薬組成物
さらに別の態様では、本発明は、治療有効量の本発明の融合タンパク質を薬学的に許容可能な担体または賦形剤と共に含有する医薬組成物に関する。本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体」または「薬学的に許容可能な賦形剤」は、生理学的に適合性のあるありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張性剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容可能な担体または賦形剤の例として、水、生理食塩水、リン酸塩緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなどの１つ以上と共にそれらの組み合わせが挙げられる。多くの場合、組成物中に、等張性剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを含むことは好ましいものになる。湿潤剤などの薬学的に許容可能な物質あるいは湿潤剤または乳化剤などの少量の補助剤、保護剤または緩衝液は、抗体または抗体部分の貯蔵寿命または有効性を高めるものであり、それらもまた含められうる。場合により、崩壊剤、例えば架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどが含まれ得る。賦形剤に加え、医薬組成物は、次のもの、すなわち血清アルブミンなどの担体タンパク質、緩衝液、結合剤、甘味料および他の香味料；着色剤およびポリエチレングリコールの中の１つ以上を含みうる。
【００７１】
組成物は、例えば、液体、半固体および固体剤形、例えば溶液（例えば注射可能および注入可能溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、ピル、粉末、リポソームおよび坐剤を含む種々の形態でありうる。好ましい形態は、意図される投与経路および治療用途に依存することになる。一実施形態では、ペプチド、複合体または組成物は、局所クリームまたは軟膏において投与される。一実施形態では、組成物は注射可能または注入可能溶液の形態であり、例えば抗体でのヒトの受動免疫用に使用される場合に類似の組成物が挙げられる。一実施形態では、投与の形式は非経口的である（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）。一実施形態では、融合タンパク質（または三量体複合体）は静脈内注入または注射によって投与される。別の実施形態では、融合タンパク質または三量体複合体は筋肉内または皮下注射によって投与される。
【００７２】
医薬組成物における投与の他の適切な経路は、限定はされないが、直腸、経皮、膣、経粘膜または腸内投与を含む。
【００７３】
治療的組成物は、典型的には製造および保存の条件下で無菌でありかつ安定である。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散剤、リポソーム、または高い薬剤濃度に適する他の規則正しい構造として処方されうる。無菌の注射可能溶液は、必要量の活性化合物（すなわち融合タンパク質または三量体複合体）を、必要に応じて上に列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に取り込むことによって調製され、その後に滅菌濾過されうる。一般に、分散剤は、活性化合物を塩基性分散媒および上に列挙される成分からの必要とされる他の成分を含有する無菌媒体中に取り込むことによって調製される。無菌の注射可能溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥と、活性成分プラス任意の追加的な所望される成分の粉末を予め無菌濾過されたその溶液から生成する凍結乾燥である。溶液の適切な液性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散剤の場合に必要とされる粒子サイズの維持および界面活性剤の使用によって維持されうる。注射可能組成物の長期間の吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含むことによってもたらされうる。
【００７４】
ＨＳＰ７０ポリペプチド結合剤および本明細書中に記載の障害の治療において有用な治療剤を有するキットなどの製品（ａｒｔｉｃｌｅ  ｏｆ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ）は、少なくとも容器およびラベルを含む。適切な容器として、例えば、ボトル、バイアル、注射器、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成されうる。容器の表面かまたはそれに付随するラベルは、製剤が選択される条件を扱うために使用されることを示す。製品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えばリン酸塩緩衝化生理食塩水、リンガー液、およびデキストロース溶液を含む容器をさらに含みうる。それは、使用説明書と共に、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、注射器、および添付文書を含む、商業およびユーザの観点からして望ましい他の構成要素をさらに含みうる。製品はまた、上記の別の活性剤を有する容器を含みうる。
【００７５】
典型的には、適量の薬学的に許容可能な塩が製剤中で使用され、製剤に等張性が付与される。薬学的に許容可能な担体の例として、生理食塩水、リンガー液およびデキストロース溶液が挙げられる。製剤のｐＨは、好ましくは約６〜約９、およびより好ましくは約７〜約７．５である。特定の担体が、例えばＨＳＰポリペプチド結合剤の投与経路および濃度に応じてより好ましい場合があることは、当業者にとって明らかであろう。
【００７６】
治療的組成物は、適切な純度を有する所望される分子を、凍結乾燥剤形、水溶液または水性懸濁液の形態で、任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤と混合することによって調製されうる（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．編（１９８０年））。許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して好ましくは非毒性であり、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／あるいはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００７７】
かかる担体のさらなる例として、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、グリシンなどの緩衝物質、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウムなどの電解液、ポリビニルピロリドン、およびセルロースに基づく物質が挙げられる。局所またはゲルベース形態の担体には、多糖類、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウムまたはメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、およびウッドワックスアルコールが含まれる。すべての投与においては、従来のデポー形態が好適に使用される。かかる形態には、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、プラスター、吸入形態、鼻腔スプレー、舌下錠、および持続放出製剤が含まれる。
【００７８】
インビボ投与に使用される製剤であれば無菌である必要がある。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に無菌濾過膜を通る濾過によって行われる。製剤は、全身投与される場合、凍結乾燥形態かまたは溶液中で保存されうる。凍結乾燥形態の場合、それは典型的には、使用される時点で、適切な希釈剤との再構成のため、他の成分と併せて処方される。液体製剤の例として、皮下注射用に１回分用量バイアル内に満たされた無菌、透明、無色の保存料未添加の（ｕｎｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）溶液が挙げられる。
【００７９】
治療製剤は、一般に無菌のアクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって貫通可能なストッパを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル内に入れられる。製剤は、好ましくは、局所、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）反復注射または注入として、あるいは鼻腔内または肺内送達に適するエアロゾル製剤として投与される。
【００８０】
本明細書で開示される分子はまた、持続放出製剤の形態で投与されうる。持続放出製剤の適切な例として、タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、ここでマトリックスは造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例として、ポリエステル、Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、１５：１６７−２７７頁（１９８１年）およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．、１２：９８−１０５頁（１９８２年）に記載のヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許第５８，４８１号明細書）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２２：５４７−５５６頁（１９８３年））、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、上記）、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔなどの分解性乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号明細書）が挙げられる。
【００８１】
補助活性化合物はまた組成物中に取り込まれうる。特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質または三量体複合体は、１つ以上の追加的治療剤との同時処方および／または同時投与がなされる。例えば、本発明の融合タンパク質または三量体複合体は、他の標的に結合する１つ以上の抗体（例えば他のサイトカインに結合するかまたは細胞表面分子に結合する抗体）または１つ以上のサイトカインとの同時処方および／または同時投与がなされうる。
【００８２】
本明細書で使用される用語「治療有効量」は、投与される目的である効果をもたらす融合タンパク質または三量体複合体の量を意味する。正確な用量は当業者によって確認可能になる。当該技術分野で既知のように、年齢、体重、性別、食事、投与の時間、薬剤相互作用および症状の重症度に基づく調整が必要な場合があり、それは当業者による定期実験で確認可能となる。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が融合タンパク質または三量体複合体の任意の毒性または有害な影響を上回る場合のものでもある。「予防的有効量」は、所望される予防的結果を得るのに必要な用量および期間での有効量を示す。典型的には、予防的用量が疾患前かまたは疾患のより早期の段階で対象に対して使用されることから、予防的有効量は治療有効量より少ないことになる。
【００８３】
投与計画を調整することで、最適な所望される応答（例えば治療的または予防的応答）を得ることができる。例えば、単回ボーラスが投与されうるか、数回に分けた用量が長期的に投与されうるか、または用量は治療的状況の要件が示すように比例的に低減または増加されうる。投与のしやすさおよび用量の均一性から非経口組成物を用量単位形態で処方することが特に有利である。本明細書で用いられる用量単位形態は、試験される哺乳類対象について１回分の用量として適する物理的に独立した単位を示し、各単位は必要とされる薬剤担体に関連して所望される治療効果をもたらすように計算された規定量の活性化合物を含有する。本発明の用量単位形態における仕様は、（ａ）活性化合物に固有の特性および達成されるべき特定の治療または予防効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療においてかかる活性化合物を化合する場合の当該技術分野に特有の制限によって決定づけられ、かつそれらに直接依存している。
【００８４】
治療の方法
本発明の別の態様は、ＨＳＰ７０媒介性のＤＣの活性化を妨げる方法に関する。本方法は、可溶性ＨＳＰ７０を、三量体化ドメインとＨＳＰ７０活性化領域に結合する少なくとも１つのポリペプチドとを含む本発明のＨＳＰ７０樹状細胞活性化領域における結合メンバーと接触させる工程を含む。本態様の一実施形態では、本方法は、ＨＳＰ７０を発現する細胞を有する組織を本発明の三量体複合体と接触させる工程を含む。
【００８５】
ＨＳＰポリペプチド結合剤は、既知の方法、例えばボーラスとしての静脈内投与に従って、あるいは筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、または吸入経路による長期間の連続注入によって投与されうる。場合により、投与は、様々な市販のデバイスを使用し、ミニポンプ注入を介して行われうる。
【００８６】
本発明はまた、本発明のポリペプチド、融合タンパク質または複合体を、メラノーマを患う患者に投与する工程を含む、メラノーマを治療する方法に関する。
【００８７】
本発明のＨＳＰポリペプチドおよびポリペプチド結合剤を投与するのに有効な用量および計画は経験に基づいて決定可能であり、かかる決定を行うことは当業者の範囲内にある。１回または複数回の用量が使用されうる。ＨＳＰポリペプチドおよびポリペプチド結合剤のインビボ投与が用いられる場合、常用量は、投与の経路に依存し、１日あたり哺乳動物の体重の約１０ｎｇ／ｋｇ〜最大で１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日で変化しうる。送達の特定の用量および方法に関する指針は、文献において提供されている。例えば、米国特許第４，６５７，７６０号明細書；米国特許第５，２０６，３４４号明細書；または米国特許第５，２２５，２１２号明細書を参照のこと。当業者は、投与すべき用量が、例えば、ポリペプチドを受けることになる動物、投与の経路、および哺乳動物に投与されている他の薬剤または治療法に依存して変化することを理解するであろう。用量の種間スケーリングは、当該技術分野で既知の方法で、例えばＭｏｒｄｅｎｔｉら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．、８：１３５１頁（１９９１年）に開示されるように行われうる。
【００８８】
融合タンパク質の生成
本発明の融合タンパク質は、任意の適切な標準タンパク質発現系において、融合タンパク質をコードするベクターで形質転換された宿主を融合タンパク質が発現されるような条件下で培養することによって発現されうる。好ましくは、発現系は、所望されるタンパク質が容易にインビトロで単離され、再フォールディングされうる系である。一般的事柄として、原核生物の発現系が、高収量のタンパク質が得られる可能性があり、効率的精製および再フォールディング方法が利用可能であることから好ましい。したがって、（ベクターおよび細胞種を含む）適切な発現系の選択は当業者の理解の範囲内にある。同様に、一旦、本発明の融合タンパク質における主なアミノ酸配列が選択されると、当業者は所望されるアミノ酸配列をコードすることになる適切な組換えＤＮＡコンストラクトを容易に設計し、選択される宿主内でのコドンバイアス、宿主内で分泌されるシグナル配列に対する必要性、シグナル配列内部でのプロテイナーゼ切断部位の導入などの要素を考慮することができる。
【００８９】
一実施形態では、単離ポリヌクレオチドはＨＳＰポリペプチドまたはＨＳＰ７０活性化領域に結合するポリペプチドをコードする。一実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、ＨＳＰ７０ポリペプチドに結合する第１のポリペプチド、ＨＳＰ７０ポリペプチドに結合する第２のポリペプチド、および三量体化ドメインをコードする。特定の実施形態では、ＨＳＰ７０ポリペプチドに結合するポリペプチド（または第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド）および三量体化ドメインは単一の隣接ポリヌクレオチド配列（遺伝子融合体）においてコードされる。他の実施形態では、ＨＳＰ７０ポリペプチドに結合するポリペプチド（または第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド）および三量体化ドメインは非隣接ポリヌクレオチド配列によってコードされる。したがって、一部の実施形態では、ＨＳＰ７０ポリペプチドに結合する少なくとも１つのポリペプチド（またはＨＳＰ７０ポリペプチドに特異的に結合する第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド）および三量体化ドメインは、別々のポリペプチドとして発現され、単離され、精製され、また共に融合されて本発明の融合タンパク質が形成される。
【００９０】
標準的技術が、組換えＤＮＡ分子、タンパク質、および融合タンパク質の生成、ならびに組織培養および細胞形質転換において用いられうる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（下記）または「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４年）を参照のこと。精製技術は、典型的には、製造業者の仕様に従うかまたはＳａｍｂｒｏｏｋら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ）（１９８９年）に示されるような従来の方法を用いて当該技術分野で一般に行われたように、または本明細書中に記載のように実施される。特別な定義が提供されない場合、実験手法に関連して用いられる命名法、ならびに本明細書中に記載の分子生物学、生化学、分析化学、および薬化学／製剤化学に関する技術は、当該技術分野で周知であり一般に用いられるものである。標準的技術は、生化学合成、生化学分析、薬学的調製、処方、および送達、ならびに患者の治療において用いられうる。
【００９１】
これらの組換えＤＮＡコンストラクトは、選択される宿主に適する多数の発現ベクターのいずれかにインフレームで挿入されうる。特定の実施形態では、発現ベクターは組換え融合タンパク質コンストラクトの発現を制御する強力なプロモーターを含む。組換え発現方法を用いて本発明の融合タンパク質を生成する場合、得られる融合タンパク質は当該技術分野で周知の適切な標準的方法を用いて単離され、精製され、場合により例えば凍結乾燥などのさらなる処理を受けうる。
【００９２】
柔軟な分子リンカーが場合によって特定の結合メンバーおよび三量体化ドメインの間に挿入され、それらに共有結合しうることは理解されるであろう。特定の実施形態では、リンカーは約１〜２０個のアミノ酸残基のポリペプチド配列である。リンカーは、１０個未満、最も好ましくは５、４、３、２、もしくは１個のアミノ酸でありうる。特定の場合、９、８、７もしくは６個のアミノ酸が適切でありうる。有用な実施形態では、リンカーは本質的に非免疫原性であり、タンパク質分解切断を受けにくく、他の残基（例えばシステイン残基）と相互作用することで知られるアミノ酸残基を含まない。
【００９３】
下記の説明はまた、１つ以上の化学基に共有結合される（以下、「抱合される」）融合タンパク質および三量体複合体を生成する方法に関する。かかる抱合体における使用に適する化学基は、好ましくは有意に毒性または免疫原性でない。化学基は、場合により、保存に適する条件下で保存され、使用されうる抱合体を生成するように選択される。ポリペプチドに抱合されうる種々の典型的な化学基は当該技術分野で既知であり、例えば炭水化物、例えば糖タンパク質、ポリグルタミン酸塩、および非タンパク質性ポリマー、例えばポリオール上で天然に生じる炭水化物を含む（例えば米国特許第６，２４５，９０１号明細書を参照）。
【００９４】
本明細書で使用される用語「ポリオール」は広くは多価アルコール化合物を示す。ポリオールは任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであり得、例えば直鎖または分岐鎖を有しうる。好ましいポリオールは、１つ以上のヒドロキシル位置で化学基、例えば１〜４の炭素を有するアルキル基と置換されるものを含む。典型的には、ポリオールはポリ（アルキレングリコール）、好ましくはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。しかし、当業者は、例えばポリ（プロピレングリコール）およびポリエチレン−ポリプロピレングリコール共重合体などの他のポリオールがＰＥＧにおける本明細書中に記載した抱合のための技術を用いて利用されうることを理解している。本発明のポリオールは、当該技術分野で周知のものや、例えば市販のものを含む。
【００９５】
例えば、ポリオールは、国際公開第９３／００１０９号パンフレット（上記）に開示のように、リジン残基を含む１つ以上のアミノ酸残基で本発明の融合タンパク質に抱合されうる。使用されるポリオールは任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであり得、直鎖または分岐鎖を有しうる。適切なポリオールは、１つ以上のヒドロキシル位置で化学基、例えば１〜４の炭素を有するアルキル基と置換されるものを含む。典型的には、ポリオールはポリ（アルキレングリコール）、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）であることから、説明を簡単にするため、考察の残りは、使用されるポリオールがＰＥＧであり、ポリオールをポリペプチドに抱合させるプロセスが「ペグ化（ペグ化ｉｏｎ）」と称される場合の典型的な実施形態に関する。しかし、当業者は、例えばポリ（プロピレングリコール）およびポリエチレン−ポリプロピレングリコール共重合体などの他のポリオールがＰＥＧにおける本明細書中に記載の抱合のための技術を用いて利用されうることを理解している。
【００９６】
Ａｐｏ−２Ｌのペグ化において使用されるＰＥＧの平均分子量は変動する可能性があり、典型的には約５００〜約３０，０００ダルトン（Ｄ）の範囲でありうる。好ましくは、ＰＥＧの平均分子量は約１、０００〜約２５，０００Ｄ、およびより好ましくは約１、０００〜約５，０００Ｄである。一実施形態では、ペグ化は約１，０００Ｄの平均分子量を有するＰＥＧの場合になされる。場合により、ＰＥＧホモポリマーは未置換であるが、１末端でアルキル基と置換されうる。好ましくは、アルキル基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基、および最も好ましくはメチル基である。ＰＥＧ製剤は市販されており、典型的には、本発明における使用に適するＰＥＧ製剤は、平均分子量に基づいて販売される非均一製剤である。例えば、市販のＰＥＧ（５０００）製剤は、典型的には分子量がやや変動する（通常±５００Ｄ）分子を含有する。本発明の融合タンパク質は、例えば小分子化合物（例えば化学療法剤）に抱合される；シグナル分子（例えばフルオロフォア）に抱合される；特異的結合対の分子（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン、抗体／抗原）に抱合される；またはグリコシル化、ペグ化、または安定化ドメイン（例えばＦｃドメイン）に対するさらなる融合によって安定化される当該技術分野で既知の技術を用いてさらに修飾されうる。
【００９７】
タンパク質をペグ化するための種々の方法は当該技術分野で既知である。ＰＥＧに抱合されたタンパク質を生成する特定の方法は、米国特許第４，１７９，３３７号明細書、米国特許第４，９３５，４６５号明細書および米国特許第５，８４９，５３５号明細書に記載の方法を含む。典型的には、タンパク質は、主に反応条件、ポリマーの分子量などに依存し、タンパク質の１つ以上のアミノ酸残基を介してポリマー上の末端反応基に共有結合される。反応基を有するポリマーは本明細書中で活性化ポリマーと称される。反応基は、選択的にタンパク質上の遊離アミノ基または他の反応基と反応する。ＰＥＧポリマーは、ランダムまたは部位特異的様式のいずれかでタンパク質上のアミノ基または他の反応基に共役されうる。しかし、最適な結果を得るため、選択される反応基のタイプおよび量ならびに使用されるポリマーのタイプが、反応基をタンパク質上の多すぎる特に活性の高い基と反応させることを回避するために使用される特定のタンパク質またはタンパク質変異体に依存することになることは理解されるであろう。これが完全に回避する見込みがない可能性があることから、一般に、タンパク質濃度に依存し、タンパク質１モルあたり、約０．１〜１０００モル、好ましくは２〜２００モルの活性化ポリマーが使用されることが推奨される。タンパク質１モルあたりの最終量の活性化ポリマーは、最適な活性を維持する一方、それと同時に可能であればタンパク質の循環半減期を最適化する上でのバランスである。
【００９８】
セクション見出しがあくまで整理上の目的で本明細書中で用いられ、記述される主題を限定する任意の方法などとして解釈されるべきでないことは着目すべきである。本明細書中で引用されるすべての参考文献は、あらゆる目的でそれら全体が参照により援用される。
【００９９】
以下は、あくまで例示目的で提供され、上で広義の用語で記述される本発明の範囲を限定するようには意図されない。本開示において引用されるすべての参考文献は参照により本明細書中に援用される。
【実施例】
【０１００】
実施例１
突然変異をヒトＨＳＰ７０発現ベクターに導入し、ヒトＨＳＰ７０におけるＤＣ活性化領域についてよりよく理解し、ＤＣの活性化に関与する最小の考え得る領域を同定した。ヒトＨＳＰ７０のアミノ酸配列を下記に示す［配列番号１６］。
【表１】
2010538655.tif 000002
【０１０１】
ＨＳＰ−７０の１３−ｍｅｒ（太字）を、白斑での色素脱失におけるその重要性をさらに検討するために選択した。４つの変異体を生成し、これらの配列を有するベクターを、Ｄｅｎｍａｎら、「Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ」、１２８；２０４１−２０４８頁、２００８年３月（参照により本明細書中に援用される）に記載のように白斑マウスモデルにおいて試験した。同モデルでは、樹状細胞によって認識されるメラノサイト関連抗原ペプチドを提供し、それによってＴ細胞媒介性免疫応答を誘発するタンパク質の翻訳を誘導するヒトＴＲＰ−２  ＤＮＡを使用する。突然変異を、ＨＳＰ７０をコードするプラスミドに部位特異的突然変異誘発によって導入した。下記の表１は、この部位特異的突然変異誘発の結果を示す。突然変異を導入し、１３−ｍｅｒ内部のアミノ酸の１または２を改変した。修飾アミノ酸を太字で示す。
【０１０２】
【表２】
2010538655.tif 000003
【０１０３】
ｈＴＲＰ−２およびｈＨＳＰ７０およびｈＨＳＰ７０変異体のクローン化および配列決定は次のように実施可能である。ｈＴＲＰ−２発現クローン化においては、ＲＮＡをＭ１４ヒトメラノーマ細胞から単離した。ＴＲＰ−２転写産物は、次のプライマー、すなわち５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＣＣＴＴＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＴＣ−３’（フォワード）［配列番号１２］および５’−ＣＴＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＴＡＴＣＴＣＴＴＧ−３’（リバース）［配列番号１３］の存在下で増幅可能である。上流プライマーにおけるＣＡＣＣ配列は、ＰＣＲ産物のｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））へのディレクショナルＴＯＰＯクローン化を可能にした。ヒトＨＳＰ７０ｉは、プライマー５’−ＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＡＴＣＧ−３’（フォワード）［配列番号１４］および５’−ＣＴＡＡＴＣＴＡＣＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧ−３’（リバース）［配列番号１５］の存在下でヒト一次ケラチノサイトＲＮＡから増幅可能である。ＨＳＰ７０をコードする遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。
【０１０４】
すべての増幅における逆転写ＰＣＲ条件は次のようにして得ることができる。すなわち、５ｍｇのＲＮＡが、１ｍＭずつのｄＮＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、３．３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｎｇ／ｍｌのオリゴｄＴプライマーおよび２００Ｕ  Ｓｕｐｅｒｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素の存在下、４２℃で、第１の鎖の逆転写緩衝液と結合し、７０℃への加熱によって反応が終了しうる。１０％の逆転写反応物のＰＣＲ増幅が可能である（ＰＣＲ緩衝液：２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４００ｍＭずつのｄＮＴＰ、０．８ｍｇ／ｍｌのプライマーおよび５Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ）。ｈＴＲＰ−２の場合、Ｔａｑポリメラーゼを２．５Ｕ  ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ酵素（Ｉｎｖｉｒｔｒｏｇｅｎ）によって置換した上で、添加剤は１＃ＡｃｃｕＰｒｉｍｅミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって置換可能である。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、および７２℃で１００秒間、それに続いて７２℃で１０分間、４０サイクルで実行可能である。ＰＣＲ産物は、製造業者の使用説明書に従って適切なベクターにクローン化可能である。
【０１０５】
各クローン化手順から得られる細菌コロニーに対して制限分析可能であり、正確な方向に遺伝子を有するクローンをＭｅｇａＰｒｅｐエンドトキシンフリーな単離手順（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））において使用し、配列決定によって検証可能である。ｈＨＳＰ７０、ｍＨＳＰ７０、およびＴＲＰ−２を含むワクチン内に含まれる真核発現ベクターによってコードされるすべてのタンパク質の発現の奏功については、形質移入ＣＯＳ細胞由来の全タンパク質のウエスタンブロッティング、それに続く間接アルカリホスファターゼ免疫染色によって確認可能である。
【０１０６】
実施例２
単一または二重の置換ペプチド配列を１３−ｍｅｒ内部に導入し、未変性タンパク質および突然変異タンパク質の発現を形質移入ＣＯＳ細胞のウエスタンブロッティングによって確認した。タンパク質の発現をもたらさなかった変異体は示していない。
【０１０７】
図２は、形質転換の４８時間後におけるＣＯＳ細胞による誘導ＨＳＰ７０（ＨＳＰ７０ｉ）の発現を示す。ＣＯＳ細胞にはタンパク質回収の４８時間前にリポフェクタミンの存在下で形質移入した。ブロットを、ＨＳＰ７０に対する抗体（ＳＰＡ−８１０（モノクローナル）およびＳＰＡ−８１１（ポリクローナル）の双方）でプローブした。ＭｏＡｂによる変異体５および６の認識は、ポリクローナル抗体（ＰｏＡｂ）による認識よりも低下している。抗体はＡｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  Ｉｎｃ．（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）から購入した。
【０１０８】
実施例３
Ｃ５７ＢＬ／６マウス１０匹／群に、４週間にわたり４．８μｇの全ＤＮＡを毎週ワクチン接種した。使用したプラスミドＤＮＡは、（メラノサイトに対する免疫原性応答を誘導するのに使用される）ＴＲＰ２と野生型または変異体ＨＳＰ７０発現ベクターとの組み合わせ、ならびに空の（ｅｍｐｔｙ）ベクター対照群を含んだ。マウスに、Ｏｖｅｒｗｉｊｋら、ＰＮＡＳ、９６：２９８２−７頁、１９９９年に記載のように遺伝子銃によってワクチン接種した。遺伝子銃で使用される「銃弾（ｂｕｌｌｅｔｓ）」を調製するため、所望される組み合わせでのエンドトキシンフリーなプラスミドＤＮＡを、２００ｍＭ  ＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））および１０容量のエタノール（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、スペルミジンでコートした金ビーズ（Ｆｌｕｋａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）上に沈殿させた。洗浄したビーズを、ＢｉｏＲａｄ  Ｔｕｂｉｎｇ  Ｐｒｅｐ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）内のシリコーンチューブ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に沈殿させた。銃弾を調製の１０日以内に使用した。Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子銃システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用する遺伝子銃ワクチン接種によるマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒから得たＣ５７ＢＬ／６Ｊ）の２つの株。目的のＤＮＡでコートした金粒子を、最大３００ｐ．ｓ．ｉ．（ポンド／平方インチ）でのヘリウム圧力下でシリコーンチューブカートリッジから放出し、それによりＤＮＡが皮膚に直接進入し、ＤＣなどの関連細胞種内部に収まる（ｎｅｓｔｌｅ）ことが可能になり、ここではＤＮＡが排出リンパ節への泳動の前および後に発現され、ワクチンによってコードされる抗原に対する免疫応答が誘発されうる。
【０１０９】
アッセイでは、実験条件ごとにマウス１０匹の群サイズを用いた。マウスを麻酔し、ワクチン接種前にそれらの毛をＮＡＩＲ（登録商標）クリームで除去した。色素脱失を、毛が回復後、毎週、フラットベッドスキャナー上のイメージから測定した。色素脱失を、週に１度、麻酔したマウスの両側に対し、フラットベッドスキャナーを使用して走査し、ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ（登録商標）ソフトウェアを使用してグレースケールで定量することによって評価した。マウスは９週間監視され、順応に１週間、ワクチン接種にさらに３週間および毛の再生後の追跡調査に８週間を費やした。マウスを６〜１０週齢で実験に導入した。
【０１１０】
図３および４は実験の結果を示す。図４Ａは、最後の遺伝子銃ワクチン接種の６週間後におけるマウスの色素脱失を示す。図４Ｂは、対照プラスミドのみでワクチン接種されているマウスを示す。毛が回復してから、色素脱失は全く認められなかった。図４Ｂは、等量のＴＲＰ２およびヒトＨＳＰ７０をコードするプラスミドの組み合わせでワクチン接種したマウスにおける有意な色素脱失を示す。図４Ｃに示されるように、マウスは、等量のＴＲＰ２およびヒトＨＳＰ７０変異体６をコードするプラスミドの組み合わせでのワクチン接種後に色素脱失を示さなかった。これらの結果は、同じく処理されたマウス間での色素脱失の浸透度における変動を示す。
【０１１１】
図５は、腹側への遺伝子銃ワクチン接種がマウスの背部への色素脱失の進行を誘発したことを示す。対照ベクター（図５、左側）対ＴＲＰ−２およびヒトＨＳＰ７０変異体１０個の組み合わせ（図５、中央）またはＴＲＰ−２＋マウスＨＳＰ７０（図６、右側）で処理された代表的マウスの非ワクチン接種領域を示す背側イメージ。それらの色素脱失の進行性は、ヒト白斑において認められるものに類似する。背側色素脱失はまた、ＨＳＰ７０変異体１０で処理されたマウスにおいて認められた。
【０１１２】
したがって、アミノ酸配列ＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧ［配列番号１］がＤＣ活性化およびそれによる免疫活性化に関与するものと決定されうる。図１は、本発明のペプチドが自己免疫色素脱失のプロセスを媒介することを示す。変異体５、６、８、および１０に対する野生型ペプチドの活性の比較によると、変異体１０のみが色素脱失を野生型ペプチドに類似のレベルまで促進することが示される。
【０１１３】
本発明の様々な特定の実施形態が本明細書中に記載されているが、本発明が明確な実施形態に限定されず、かつ様々な変化または改良が本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者によって本明細書中でなされうることは理解されるべきである。
【０１１４】
参照文献一覧
Asea A, Kraeft SK, Kurt-Jones EA, Stevenson MA, Chen LB, Finberg RW, Koo GC, Calderwood SK HSP70 stimulates cytokine production through a CD14-dedendant pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine Nature Med 6: 435-442 (2000)
Basu S, Binder RJ, Ramalingam T, Srivastava PK CD91 is a common receptor for heat shock proteis gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin Immunity 14: 303-313 (2001)
Becker T, Hartl FU, Wieland F CD40, an extracellular receptor for binding and uptake of HSP70-peptide complexes J Cell Biol 158: 1277-1285 (2002)
Benhar, I, Azriel, R, Nahary, L, Shaky, S, Berdichevsky, Y, Tamarkin, A,, and Wels, W "Highlyefficient selection of phage antibodies mediated by display of antigen as Lpp-OmpA' fusions on live bacteria" J Mol Biol 301: 893-904 (2000)
Berwyn B, Hart JP, Rice S, Gass C, Pizzo SV, Post SR, Nicchitta CV Scavenger receptor-A mediates gp96/GRP94 and calreticulin internalization by antigen-presenting cells EMBO J 22: 6127-6136 (2003)
Boder, E T and Wittrup, K D "Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries" Nature Biotech 15: 553-557 (1997)
Castelli C, Rivoltini L, Rini F, Belli F, Testori A, Maio M, Mazzaferro V, Coppra J, Srivastava PK Heat shock proteins: biological functions and clinical application as personalized vaccines for human cancer Cancer Immunol Immunother 53:227-33 (2004)
Chen CH, Wang TL, Hung CF, Yang Y, Young RA, Pardoll DM, Wu, TC Enhancement of DNA vaccine potency by linkage of antigen gene to an HSP70 gene Cancer Res 60: 1035-1042 (2000)
Das PK, van den Wijngaard RMJGJ, Wankowicz-Kaoinska A, Le Poole IC A symbiotic concept of autoimmunity and tumor immunity: lessons from vitiligo Trends Immunol 22: 130-136 (2001)
Delneste Y, Magistrelli G, Gauchat J, Haeuw J, Aubry J, Nakamura K, Kawakami-Honda N, Goetsch L, Sawamura T, Bonnefoy J, Jeannin P Involvement of LOX-1 in dendritic cell-mediated antigen cross-presentation Immunity 17: 353-362 (2002)
Dunn, I S "Phage display of proteins" Cum Opinion Biotech 7: 547-553 (1996)
Ernst, W J, Spenger, A,, Toellner, L, Katinger, H, Grabhen; R M "Expanding baculovirus surface display Modification of the native coat protein gp64 of Autographa calfornica NPV" Eur J Biochem 267:4033-4039 (2000)
Engelhorn ME, Guevara-Patino JA, Noffz G, Hooper AT, Lou O, Gold JS, Kappel BJ, Houghton AN Autoimmunity and tumor imunity induced by immune responses to mutations in self Nat Med 12: 198-206 (2006)
Frediani T, Lucarelli S, Frediani S, Frati C The role of heat shock proteins in vitiligo: deviation of cytotoxic response J Dermatol Sci 37: 114-117 (2005)
Garbelli S, Mantovani S, Palermo B, Giachini C Melanocyte-specific, cytotoxic T cell responses in vitiligo: the effective variant of melanoma immunity Pigment Cell Res 18: 234-242 (2005)
Gates, C M, Stemmer, W P C, Kaptein, R, and Schatz, P J "Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor "headpiece dimer" J Mol Biol 255: 373-386 (1996)
Gething MJ, Sambrook J, Protein folding in the cell Nature 355: 33-45 (1992)
Griffiths, A D and Duncan, A R "Strategies for selection of antibodies by phage display" Curr Opinion Biotech 9: 102-108 (1998)
Gross C, Hansch D, Gastpar R, Multhoff G Interaction of heat shock protein 7 peptide with NK cells involves the NK receptor CD94 Biol Chem 384: 267-279 (2003)
Houghton AN, Guevara-Patino JA Immune recognition of self in immunity against cancer J Clin Invest 114: 468-471 (2004)
Johnson JD, Fleshner M Releasing signals, secretory pathways, and immune function of endogenous extracellular heat shock protein 72 J Leukoc Biol 79: 425-434 (2006)
Kammerer R, Stober D, Riedl P, Oehninger C, Schirmbeck R, Reimann J Noncovalent assocation with stress protein facilitates cross-priming of CD8+ T cells to tumor cell antigens by dendritic cells J Immunol 168: 108-117 (2002)
Kiang JG, Tsokos GC Heat shock protein 70 kDa: molecular biology, biochmeisty and physiology Pharmacol Ther 8: 183-21 (1998)
Le Poole IC, Boissy RE, Sarangarajan R, Chen J, Forristal JJ, Sheth P, Westerhof W, Babcock G, Das PK, Saelinger CB PIG3V, an immortalized human vitiligo melanocyte cell line, expresses dilated endoplasmic reticulum In Vitro Cell Dev Biol Anim36 :309-319 (2000)
Le Poole IC, van den Wijngaard RMJGJ, Westerhof W, Dutrieux RP, Das PK Presence or absence of melanocytes in vitiligo lesions: An immunohistochemical investigation J Invest Dermatol 100: 816-822 (1993)
Le Poole IC, van den Wijngaard RMJGJ, Westerhof W, Verkruisen RP, Dutrieux RP, Dingemans KP, Das PK Phagocytosis by normal human melanocytes in vitro Exp Cell Res 205: 388-395 (1993b)
Le Poole IC, Stennett LS, Bonsih BK, Robinson JK, Hernandez C, Hann SK, Nickoloff BJ Expansion of vitiligo lesions is associated with reduced epidermal CDw6 expression and increased expression of HLA-DR in perilesional skin Br J Dermatol 149: 739-748 (2003)
Le Poole IC, Wankowicz-Kalinska A, van den Wijngaard RMJGJ, Nickoloff BJ, Das PK Autoimmune aspects of depigmentation in vitiligo J Investig Dermatol Symp Proc 2004 Jan;9(1):68-72 (2004)
Lehner T, Wang Y, Whittal T, McGowan E, Kelly CG, Singh M Functional domains of HSP70 stimulate generation of cytokines and chemokines, maturation of dendritic cells and adjuvanticity Biochem Soc Trans 32: 629-632 (2004)
MacAry PA, Javid B, Floto RA, Smith KGC, Oehlmann W, Singh M, Lehner PJ HSP70 peptide binding mutants separate antigen delivery from dendritic cell stimulation Immunity 20: 95-106 (2004)
Marks, J D, Hoogenboom, H R, Griffiths, A D, and Winter, G "Molecular evolution of proteins on filamentous phage Mimicking the strategy of the immune system" J Biol Chem 267: 16007-16010 (1992)
Mikawa, Y G, Maruyama, I N, and Brenner, S "Surface display of proteins on bacteriophage lambda heads" J Mol Biol 262: 21-30 (1996)
Multhoff G, Mizzen L, Winchester CC, Milner CM, Wenk S, Eissner G, Kampinga HH, Laumbacher B, Johnson J Heat shock protein 70 (Hsp70) stimulates proliferation and cytolytic activity of natural killer cells Experimental hematology 27: 1627-1636 (1999)
Nylandsted J, Gyrd-Hansen M, Danielewicz A, Fehrenbacher N, Lademann U, Hoyer Hansen M, Weber E, Multhoff G, Rohde M, Jaatela M Heat shock protein 7 promotes cell survival by inhibiting lysosomal membrane permeabilization J Exp Med 200: 425-435 (2004)
Schaffitzel, C, Hanes, J, Jermutus, L, and Plucktun, A (1999) "Ribosome display: an in vitro method for
selection and evolution of antibodies from libraries" J Zmmunol Methods 23 1: 11 9-135 (1999)
Srivastava PK, Udono H Heat shock protein-peptide complexes in cancer immunotherapy Curr Opin Immunol 6: 728-732 (1994)
Tavaria M, Gabriele T, Kola I, Anderson RL A hitchhiker’s guide to the human Hsp70 family Cell Stress Chap 2: 23-28 (1996)
Turk MJ, Wolchok JD, Guevara-Patino JA, Goldberg SM, Houghton AN Multiple pathways to tumor immunity and concomitant auroimmunity Immunol Rev 188: 122-135 (2002)
Wang Y, Kelly CG, Singh M, McGowan EG, Carrara AS, Bergmeier LA, Lehner T Stimulation of Th1-polarizing cytokines, C-C chemokines, maturation of dendritic cells and adjuvant function by the peptide binding fragment of heat shock protein 70 J Immuno 169: 2422-2429 (2002)
Wang Y, Whittal T, McGowan E, Younson J, Kelly C, Bergmeier LA, Singh M, Lehner T Identification of stimulating and inhibitory epitopes within the heat shock protein 70 molecule that modulate cytokine production and maturation of dendritic cells J Immunol 174: 3306-3316 (2005)
Wang B, Chen YB, Ayalon O, Bender J, Garen A Human single-chain Fv immunoconjugates targeted to a melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan mediate specific lysis of human melanoma cells by natural killer cells and complement Proc Natl Acad Sci U S A Feb 16;96(4):1627-32 (1999)
Welch WJ Heat shock proteins functioning as molecular chaperones: their roles in normal and stressed cells Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 339: 327-333 (1993)
Whitehorn, EA, Tate, E, Yanofsky, S D, Kochersperger, L, Davis A, Mortensen, R B, Yonkovic, S, Bell, K, Dower, W J, and Barrett, R W "A generic method for expression and use of "tagged" soluble versions of cell surface receptors" Bio/Echnology 13: 1215-1219 (1995)
Zhang H, Wang W, Li Q, Huang W Fusion protein of ATPase domain of Hsc70 with TRP2 acting as a tumor vaccine against B16 melanoma Immunol Lett Jun 15;105(2):167-73 (2006)
【図１】
2010538655.tif 000004
【図２】
2010538655.tif 000005
【図３】
2010538655.tif 000006
【図４】
2010538655.tif 000007
【図５】
2010538655.tif 000008
【図６】
2010538655.tif 000009
【配列表】
2010538655000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月11日(2010.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010538655000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月27日(2010.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
三量体化ドメインの特定の非限定例として、テトラネクチン三量体化構造エレメント（「ＴＴＳＥ」）、マンノース結合タンパク質三量体化ドメイン、およびコレクチンネック領域などが挙げられる。本明細書で使用される「テトラネクチン三量体化構造エレメント」または「ＴＴＳＥ」は、テトラネクチンタンパク質のアミノ酸１７〜４９、５０、５１または５２（配列番号３）を含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2010538655000001.app
【国際調査報告】
2010538655.tif 000017
2010538655.tif 000018
2010538655.tif 000019
2010538655.tif 000020
2010538655.tif 000021
2010538655.tif 000022