(57)【要約】本発明は、アルツハイマー病をはじめとしたＡβプラークの蓄積に関する疾患を、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドの末梢投与によって処置する方法に関する。本発明はまた、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドの末梢投与を介して、Ａβペプチドの血漿対脳の比を増加させる方法およびＡβペプチドクリアランスを増大させる方法も提供する。本発明はまた、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドの末梢投与を介して、記憶機能を改善する方法または記憶喪失を阻害する方法も提供する。本発明はまた、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドの末梢投与を介して、哺乳動物におけるＡβプラークのサイズおよび数を減少させる方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物においてＡβペプチドの血漿対脳の比を増加させる方法であって、該方法は、増加を必要とする哺乳動物に治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで、該投与は、中枢神経系に対して末梢である、方法。
【請求項２】
哺乳動物の脳からのＡβクリアランスを増大させる方法であって、該方法は、増大を必要とする哺乳動物に治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで、該投与は、中枢神経系に対して末梢である、方法。
【請求項３】
哺乳動物において記憶機能を改善するか、または記憶喪失を阻害する方法であって、該方法は、改善または阻害を必要とする哺乳動物に治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで、該投与は、中枢神経系に対して末梢である、方法。
【請求項４】
哺乳動物の脳におけるＡβプラークの数を減少させる方法であって、該方法は、減少を必要とする哺乳動物に治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで、該投与は、中枢神経系に対して末梢である、方法。
【請求項５】
哺乳動物の脳におけるＡβプラークのサイズを減少させる方法であって、該方法は、減少を必要とする哺乳動物に治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで、該投与は、中枢神経系に対して末梢である、方法。
【請求項６】
哺乳動物においてＡβプラーク蓄積に関連する疾患を処置する方法であって、該方法は、処置を必要とする哺乳動物に治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで、該投与は、中枢神経系に対して末梢である、方法。
【請求項７】
前記疾患が、アルツハイマー病、軽度の認知障害、軽度から中等度の認知障害、血管性痴呆、脳アミロイド血管症、遺伝性脳出血、老年痴呆、ダウン症候群、封入体筋炎、加齢性黄斑変性症、原発性アミロイドーシス、続発性アミロイドーシスおよびアルツハイマー病に関連する状態からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アルツハイマー病に関連する状態が、甲状腺機能低下、脳血管疾患、循環器疾患、記憶喪失、不安、行動機能障害、神経学的状態および精神学的状態からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記行動機能障害が、感情鈍麻、攻撃性および失調からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記神経学的状態が、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、後天性免疫不全、パーキンソン病、失語、失行、失認、ピック病、レビー小体を有する痴呆、筋緊張の変化、痙攣、感覚消失、視野欠損、協調不能、歩行障害、一過性の虚血発作または卒中、一過性の警戒、注意欠陥、頻繁な気分の落ち込み、失神、神経遮断薬過敏症、正常圧水頭症、硬膜下血腫、脳腫瘍、外傷後脳損傷および低酸素後損傷からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記精神学的状態が、うつ、妄想、錯覚、幻覚、性障害、体重減少、精神病、睡眠障害、不眠、行動抑制解除、病識欠如、希死念慮、抑うつ気分、被刺激性、快感消失、引きこもりおよび過度の罪悪感からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドが、皮下、非経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、吸入的または頬側に投与される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドが、参照アミノ酸配列と９０％同一であり、該参照アミノ酸配列は：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸２７から３１０；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２７から３４４；
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸２７から４４５；
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２７から３０９；
（ｖ）配列番号２のアミノ酸１から３１０；
（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸１から３４４；
（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸１から４４５；
（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１から３０９；
（ｉｘ）該参照アミノ酸配列のいずれかの改変体または誘導体および
（ｘ）該参照アミノ酸配列またはその改変体もしくは誘導体の１つ以上の組み合わせ
からなる群から選択される、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドが：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸２７から３１０；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２７から３４４；
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸２７から４４５；
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２７から３０９；
（ｖ）配列番号２のアミノ酸１から３１０；
（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸１から３４４；
（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸１から４４５；
（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１から３０９；
（ｉｘ）該ポリペプチドのいずれかの改変体または誘導体；および
（ｘ）該ポリペプチドまたはその改変体もしくは誘導体の１つ以上の組み合わせ
からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２７から３１０を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２７から３４４を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２７から４４５を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸２７から３０９を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１から３１０を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１から３４４を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１から４４５を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１から３０９を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドが、第１ポリペプチドフラグメントおよび第２ポリペプチドフラグメントを含み、ここで、該第１ポリペプチドフラグメントは、最大２０個の個別のアミノ酸置換を除いて第１参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含み、該第１参照アミノ酸配列は：
（ａ）配列番号２のアミノ酸ａから４４５、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２７からｂおよび
（ｃ）配列番号２のアミノ酸ａからｂ
からなる群から選択され、
ここで、ａは、２５から３５までの任意の整数であり、ｂは、３００から４５０までの任意の整数であり；そして、該第２ポリペプチドフラグメントは、最大２０個の個別のアミノ酸置換を除いて第２参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含み、該第２参照アミノ酸配列は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸ｃから４４５，
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２７からｄおよび
（ｃ）配列番号２のアミノ酸ｃからｄ
からなる群から選択され、
ここで、ｃは、２５から３５までの任意の整数であり、ｄは、３００から４５０までの任意の整数である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１ポリペプチドフラグメントが、前記第２ポリペプチドフラグメントの上流に位置する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１ポリペプチドフラグメントと前記第２ポリペプチドフラグメントとの間に位置するペプチドリンカーをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ペプチドリンカーが、配列番号１８（Ｇ４Ｓ）３を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基が、異なるアミノ酸で置換されている、請求項１４から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記異なるアミノ酸が：アラニン、セリンおよびトレオニンからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記異なるアミノ酸が、アラニンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドが、環状ポリペプチドである、請求項１４から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記環状ポリペプチドが、Ｎ末端に連結されている第１分子およびＣ末端に連結されている第２分子をさらに含み；該第１分子および該第２分子は、互いに連接されて該環状分子を形成している、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１分子および第２分子が：ビオチン分子、システイン残基およびアセチル化システイン残基からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１分子が、前記ポリペプチドのＮ末端に付着されているビオチン分子であり、前記第２分子が、該ポリペプチドのＣ末端に付着されているシステイン残基である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１分子が、前記ポリペプチドのＮ末端に付着されているアセチル化システイン残基であり、前記第２分子が、該ポリペプチドのＣ末端に付着されているシステイン残基である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｃ末端システインが、付着されるＮＨ２部分を有する、請求項３４または請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドが、非ＮｇＲ１部分をさらに含む、請求項１４から３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記非ＮｇＲ１部分が、前記可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドに縮合される異種ポリペプチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記異種ポリペプチドが：
（ａ）血清アルブミン、
（ｂ）Ｆｃ領域、
（ｃ）シグナルペプチド、
（ｄ）ポリペプチドタグおよび
（ｅ）該異種ポリペプチドの２つ以上の組み合わせ
からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｆｃ領域が：ＩｇＡ  Ｆｃ領域；ＩｇＤ  Ｆｃ領域；ＩｇＧ  Ｆｃ領域、ＩｇＥ  Ｆｃ領域；およびＩｇＭ  Ｆｃ領域からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ  Ｆｃ領域である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記アミノ酸配列と前記ＩｇＧ  Ｆｃ領域との間に位置するペプチドリンカーをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ペプチドリンカーが、配列番号１９（Ｇ４Ｓ）２を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリペプチドタグが：ＦＬＡＧタグ；Ｓｔｒｅｐタグ；ポリヒスチジンタグ；ＶＳＶ−Ｇタグ；インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タグ；およびｃ−Ｍｙｃタグからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドが、ポリマーと結合体化される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコール、糖ポリマーおよびポリペプチドからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコールである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドが、１、２、３または４個のポリマーと結合体化される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリマーの総分子量が、５，０００Ｄａから１００，０００Ｄａである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記治療有効量が、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドの０．００１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇである、請求項１から５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記治療有効量が、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドの０．０１ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記治療有効量が、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドの０．０５ｍｇ／ｋｇから０．５ｍｇ／ｋｇである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドが、血液脳関門を通過しない、請求項１から５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドが、１つ以上の抗Ａβ抗体と同時投与される、請求項１から５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドが、アドレナリン作用薬、抗アドレナリン作用薬、抗アンドロゲン剤、抗狭心症薬、抗不安剤、抗痙攣剤、抗うつ剤、抗てんかん薬、抗高脂血症薬、抗高リポタンパク血症薬、抗高血圧薬、抗炎症剤、抗強迫神経症薬、抗パーキンソン病薬、抗精神病薬、副腎皮質ステロイド；副腎皮質抑制剤；アルドステロンアンタゴニスト；アミノ酸；アナボリックステロイド；蘇生薬；アンドロゲン；血糖制御因子；心保護剤；心血管系薬剤；コリンアゴニストまたはコリンアンタゴニスト；コリンエステラーゼの不活性化剤またはインヒビター、認知補助剤または認知増強剤；ドーパミン作動薬；酵素インヒビター、エストロゲン、遊離酸素ラジカルスカベンジャー；ＧＡＢＡアゴニスト；グルタミン酸塩アンタゴニスト；ホルモン；コレステロール低下剤；抗高脂血症薬；降圧薬；免疫剤；免疫賦活剤；モノアミンオキシダーゼインヒビター、神経保護薬；ＮＭＤＡアンタゴニスト；ＡＭＰＡアンタゴニスト、競合性または非競合性のＮＭＤＡアンタゴニスト；オピオイドアンタゴニスト；カリウムチャネル開口薬；非ホルモンステロール誘導体；脳卒中後および頭部外傷後の処置；プロスタグランジン剤；向精神薬；弛緩剤；鎮静剤；催眠鎮静剤；選択的アデノシンアンタゴニスト；セロトニンアンタゴニスト；セロトニンインヒビター；選択的セロトニン取り込みインヒビター；セロトニンレセプターアンタゴニスト；ナトリウムチャネル遮断薬およびカルシウムチャネル遮断薬；ステロイド；刺激剤；および甲状腺ホルモンならびにインヒビター剤からなる群から選択される１つ以上のさらなる治療薬と同時投与される、請求項１から５５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、神経生物学、神経学および薬理学に関する。より詳細には、本発明は、アルツハイマー病をはじめとしたＡβプラーク蓄積に関与する疾患を、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドの末梢投与によって処置する方法に関する。本発明はまた、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドの末梢投与を介して、Ａβペプチドの血漿対脳の比を増加させる方法およびＡβペプチドクリアランスを増大させる方法も提供する。本発明はまた、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドの末梢投与を介して、記憶機能を改善する方法または記憶喪失を阻害する方法も提供する。本発明は、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドの末梢投与を介してＡβプラークサイズおよびＡβプラーク数を減少させる方法をさらに提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）における神経変性は、アミロイドプラークおよび神経原線維変化を伴う。Ｇｌｅｎｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：３５３−３５６（２００２）。アミロイドプラークは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク分解性切断から得られる４０〜４３ａａのアミロイドβ（Ａβ）ペプチドから主に構成されている。Ｌｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：１２１８０−１２１８４（１９９５）；Ｓｉｎｈａら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：５３７−５４０（１９９９）；Ｖａｓｓａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：７３５−７４１（１９９９）。有望な治療法としては、セクレターゼインヒビターを用いてＡβ生成を減少させること（Ｌａｎｚら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３０５：８６４−８７１（２００３））、亜鉛メタロエンドペプチダーゼ（例えば、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）（Ｑｉｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：３２７３０−３２７３８（１９９８）；Ｂｅｒｔｒａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：２３０２−２３０３（２０００）））またはネプリライシン（ＮＥＰ）（Ｙａｓｏｊｉｍａら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  ２９７：９７−１００（２００１）；Ｉｗａｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：１５５０−１５５２（２００１））を用いてＡβ分解を増大させること（Ｆｒａｕｔｓｃｈｙら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４０：１３８９−１３９９（１９９２））およびＡｂ特異的免疫を促進すること（Ｙｏｕｎｋｉｎ  ＳＧ，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：１８−１９（２００１）；Ｍｏｒｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：９８２−９８５（２０００）；Ｌｅｅ  ＶＭ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：８９３１−８９３２（２００１））が挙げられる。しかしながら、毒性および血液脳関門（ＢＢＢ）通過に関する問題が、ＡＤを処置する試みを妨害してきた。Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｋ．および  Ｆｒａｎｔｚ  Ｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８：１９９−２００（２００２）およびＯｒｇｏｇｏｚｏら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６１：４６−５４（２００３）。Ｎｏｇｏ−６６レセプター（ＮｇＲ１）は、成体の脳における損傷誘導型の軸索伸長の制限および経験依存的可塑性の制限に関与している。Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３４１−３４６（２００１）；ＭｃＧｅｅ  Ａ．Ｗ．および  Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ  Ｓ．Ｍ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６：１９３−１９８（２００３）；ＭｃＧｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：２２２２−２２２６（２００５）。特許文献１、特許文献２、特許文献３および特許文献４ならびに特許文献５および特許文献６（これらのすべての全体が本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと。
【０００３】
この役割において、ＮｇＲ１は、３つのミエリンインヒビタータンパク質、すなわち、Ｎｏｇｏ、ＭＡＧおよびＯＭｇｐに対するレセプターとして機能し、軸索においてＲｈｏ  ＧＴＰアーゼを活性化させるようにシグナル伝達する。Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３４１−３４６（２００１）；Ｌｉｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１１９０−１１９３（２００２）；Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：９４１−９４４（２００２）；Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２３：１４１６−１４２３（２００３）；ＭｃＧｅｅ  Ａ．Ｗ．および  Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ  Ｓ．Ｍ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６：１９３−１９８（２００３）。さらに、脳ＮｇＲ１は、そのＡβドメインを介してＡＰＰと相互作用する。Ｐａｒｋら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６：１３８６−１３９５（２００６）。また、高いレベルの脳ＮｇＲ１は、Ａβ負荷を減少させ、内因性ＮｇＲ１の喪失は、Ａβを増加させる。Ａβと、分泌されるＡＰＰα＋ＡＰＰβとの並行した変化は、Ａβレベルに対する脳ＮｇＲ１のインビボ効果の少なくとも一部が、α／βセクレターゼ活性の遮断によって媒介されることを示唆する。しかしながら、Ａβに対するＮｇＲ１の高い親和性およびプラーク中のＮｇＲ１の存在は、ＮｇＲ１がＡβのクリアランスも制御し得ることを示唆する。Ｐａｒｋら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６：１３８６−１３９５（２００６）。
【０００４】
Ｓｃｈｅｎｋによって概説されているように、免疫学的方法は、Ａβプラーク負荷の減少に成功している。Ｓｃｈｅｎｋ  Ｄ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３：８２４−８２８（２００２）。能動免疫と受動免疫の両方が、流出を促進するか、流入を阻害するか、またはミクログリア誘導性のＡｂ分解を活性化した。Ｗｅｉｎｅｒ  Ｈ．Ｌ．および  Ｓｅｌｋｏｅ  Ｄ．Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：８７９−８８４（２００２）；Ｍｏｒｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：９８２−９８５（２０００）；Ｓｃｈｅｎｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ４００：１７３−１７７（１９９９）。ＰＤ−ｍＡＰＰ中のＡβ１−４２＋アジュバントを用いた能動免疫によって、Ａβプラーク病理が低減した。Ｓｃｈｅｎｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ４００：１７３−１７７（１９９９）。Ｂａｒｄらは、体液性免疫が、血液脳関門を通過する抗体輸送を引き起こすことによってプラーク負荷を減少させるのに十分であることを証明した。Ｂａｒｄら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６：９１６−９１９（２０００）。対照的に、ＤｅＭａｔｔｏｓらは、Ａβ抗体が、ＢＢＢを通過せずにアルツハイマー病理を低減させると証明したことから、アルツハイマー病理における抗Ａβ減少に対する末梢シンク（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｓｉｎｋ）メカニズムが示唆された。ＤｅＭａｔｔｏｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：８８５０−８８５５（２００１）。
【０００５】
一連の研究では、アルツハイマーモデルトランスジェニックマウスにおいて、免疫学的手段によって脳におけるＡβ負荷を減少させることが、空間的な記憶成績の改善に関連した。しかしながら、いくつかの報告では、プラーク密度が任意の変化をする前に、敏感に行動上の改善が生じたことから、特定の可溶性Ａβ種と抗体との関連が、機能の改善に関与することが示唆された。２つの非免疫グロブリンタンパク質であるＲＡＧＥおよびゲルゾリンは、Ａβに結合することおよび末梢に投与されたとき脳Ａβ負荷を減少させることが示されている。非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３。末梢の非抗体Ａβ結合タンパク質によるＡβ減少が認知機能および記憶機能の改善と関連するか否かは、まだ試験されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０５／０１６９５５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０３１４６２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０４／０１４３１１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１／０５１５２０号パンフレット
【特許文献５】米国特許出願公開第２００２/００７７２９５号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００５/０２７１６５５号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄｅａｎｅら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ（２００３）９：９０７−９１３
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｏｋａら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００３）２３：２９−３３
【非特許文献３】Ａｒａｎｃｉｏら、Ｅｍｂｏ  Ｊ（２００４）２３：４０９６−４１０５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、中枢神経系に対して末梢への可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドの投与が、脳からのＡβクリアランスを増大させ、記憶機能を改善したという発見に基づくものである。
【０００９】
ある特定の実施形態において、本発明は、哺乳動物においてＡβペプチドの血漿対脳の比を増加させるための方法を含み、その方法は、治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで、前記投与は、中枢神経系に対して末梢である。
【００１０】
ある特定の実施形態において、本発明は、哺乳動物の脳からのＡβクリアランスを増大させるための方法を含み、その方法は、治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで、前記投与は、中枢神経系に対して末梢である。
【００１１】
ある特定の実施形態において、本発明は、哺乳動物において記憶機能を改善するか、または記憶喪失を阻害するための方法を含み、その方法は、治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで、前記投与は、中枢神経系に対して末梢である。
【００１２】
ある特定の実施形態において、本発明は、哺乳動物の脳におけるＡβプラークの数を減少させる方法を提供し、その方法は、それを必要とする哺乳動物に治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを投与する工程を包含し、前記投与は、中枢神経系に対して末梢である。
【００１３】
ある特定の実施形態において、本発明は、哺乳動物の脳におけるＡβプラークのサイズを減少させる方法を提供し、その方法は、それを必要とする哺乳動物に治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで、前記投与は、中枢神経系に対して末梢である。
【００１４】
ある特定の実施形態において、本発明は、哺乳動物においてＡβプラーク蓄積に関連する疾患を処置する方法を提供し、その方法は、それを必要とする哺乳動物に治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで、前記投与は、中枢神経系に対して末梢である。いくつかの実施形態において、上記疾患は、アルツハイマー病、軽度の認知障害、軽度から中等度の認知障害、血管性痴呆、脳アミロイド血管症、遺伝性脳出血、老年痴呆、ダウン症候群、封入体筋炎、加齢性黄斑変性症、原発性アミロイドーシス、続発性アミロイドーシスおよびアルツハイマー病に関連する状態からなる（ｃｏｎｓｉｓｉｔｉｎｇ  ｏｆ）群から選択される。いくつかの実施形態において、アルツハイマー病に関連する状態は、甲状腺機能低下、脳血管疾患、循環器疾患、記憶喪失、不安、行動機能障害、神経学的状態および精神学的状態からなる群から選択される。いくつかの実施形態（ｅｍｂｄｏｉｍｅｎｔｓ）において、行動機能障害は、感情鈍麻、攻撃性および失調からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、神経学的状態は、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、後天性免疫不全、パーキンソン病、失語、失行、失認、ピック病、レビー小体を有する痴呆、筋緊張の変化、痙攣、感覚消失、視野欠損、協調不能、歩行障害、一過性の虚血発作または卒中、一過性の警戒（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ａｌｅｒｔｎｅｓｓ）、注意欠陥、頻繁な気分の落ち込み（ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｆａｌｌｓ）、失神、神経遮断薬過敏症、正常圧水頭症、硬膜下血腫、脳腫瘍、外傷後脳損傷および低酸素後損傷（ｐｏｓｔｈｙｐｏｘｉｃ  ｄａｍａｇｅ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、精神学的状態は、うつ、妄想、錯覚、幻覚、性障害、体重減少、精神病、睡眠障害、不眠、行動抑制解除（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｄｉｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）、病識欠如（ｐｏｏｒ  ｉｎｓｉｇｈｔ）、希死念慮、抑うつ気分、被刺激性、快感消失、引きこもりおよび過度の罪悪感からなる群から選択される。１つの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
【００１５】
いくつかの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、皮下、非経口的（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｙ）、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、吸入的または頬側に投与される。１つの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、皮下に投与される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、参照アミノ酸配列と９０％同一であり、その参照アミノ酸配列は：（ｉ）配列番号２のアミノ酸２７から３１０；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２７から３４４；（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸２７から４４５；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２７から３０９；（ｖ）配列番号２のアミノ酸１から３１０；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸１から３４４；（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸１から４４５；（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１から３０９；（ｉｘ）前記参照アミノ酸配列のいずれかの改変体または誘導体および（ｘ）前記参照アミノ酸配列またはその改変体もしくは誘導体の１つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドは：（ｉ）配列番号２のアミノ酸２７から３１０；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２７から３４４；（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸２７から４４５；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２７から３０９；（ｖ）配列番号２のアミノ酸１から３１０；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸１から３４４；（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸１から４４５；（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１から３０９；（ｉｘ）前記ポリペプチドのいずれかの改変体または誘導体；および（ｘ）前記ポリペプチドまたはその改変体もしくは誘導体の１つ以上の組み合わせからなる群から選択される。１つの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２７から３１０を含む。１つの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２７から３４４を含む。１つの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２７から４４５を含む。１つの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２７から３０９を含む。１つの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１から３１０を含む。１つの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１から３４４を含む。１つの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１から４４５を含む。１つの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１から３０９を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、第１ポリペプチドフラグメントおよび第２ポリペプチドフラグメントを含み、ここで、前記第１ポリペプチドフラグメントは、最大２０個の個別のアミノ酸置換を除いて第１参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含み、ここで、前記第１参照アミノ酸配列は：（ａ）配列番号２のアミノ酸ａから４４５、（ｂ）配列番号２のアミノ酸２７からｂおよび（ｃ）配列番号２のアミノ酸ａからｂからなる群から選択され、ここで、ａは、２５から３５までの任意の整数であり、ｂは、３００から４５０までの任意の整数であり；前記第２ポリペプチドフラグメントは、最大２０個の個別のアミノ酸置換を除いて第２参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含み、ここで、前記第２参照アミノ酸配列は、（ａ）配列番号２のアミノ酸ｃから４４５、（ｂ）配列番号２のアミノ酸２７からｄおよび（ｃ）配列番号２のアミノ酸ｃからｄからなる群から選択され、ここで、ｃは、２５から３５までの任意の整数であり、ｄは、３００から４５０までの任意の整数である。いくつかの実施形態において、第１ポリペプチドフラグメントは、前記第２ポリペプチドフラグメントの上流に位置する。さらなる実施形態において、ペプチドリンカーは、第１ポリペプチドフラグメントと第２ポリペプチドフラグメントとの間に位置する。１つの実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号１８（Ｇ４Ｓ）３を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基は、異なるアミノ酸で置換されている。いくつかの実施形態において、その異なるアミノ酸は：アラニン、セリンおよびトレオニンからなる群から選択される。１つの実施形態において、その異なるアミノ酸は、アラニンである。
【００２０】
いくつかの実施形態において、可溶性ＮｇＲポリペプチドは、環状である。いくつかの実施形態において、環状ポリペプチドは、Ｎ末端に連結されている第１分子およびＣ末端に連結されている第２分子をさらに含んでおり；第１分子および第２分子は、互いに連接されて前記環状分子を形成している。いくつかの実施形態において、第１分子および第２分子は：ビオチン分子、システイン残基およびアセチル化システイン残基からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１分子は、Ｎ末端に付着されているビオチン分子であり、第２分子は、本発明のポリペプチドのＣ末端に付着されているシステイン残基である。いくつかの実施形態において、第１分子は、本発明のポリペプチドのＮ末端に付着されているアセチル化システイン残基であり、第２分子は、本発明のポリペプチドのＣ末端に付着されているシステイン残基である。いくつかの実施形態において、第１分子は、本発明のポリペプチドのＮ末端に付着されているアセチル化システイン残基であり、第２分子は、本発明のポリペプチドのＣ末端に付着されているシステイン残基である。いくつかの実施形態において、Ｃ末端システインは、付着されているＮＨ２部分を有する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドは、非ＮｇＲ１部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、非ＮｇＲ１部分は、可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドに縮合される異種ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドが：（ａ）血清アルブミン、（ｂ）Ｆｃ領域、（ｃ）シグナルペプチド、（ｄ）ポリペプチドタグおよび（ｅ）前記異種ポリペプチドの２つ以上の組み合わせからなる群から選択されることをさらに提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域が：ＩｇＡ  Ｆｃ領域；ＩｇＤ  Ｆｃ領域；ＩｇＧ  Ｆｃ領域、ＩｇＥ  Ｆｃ領域；およびＩｇＭ  Ｆｃ領域からなる群から選択されることをさらに提供する。１つの実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態において、本発明は、ペプチドリンカーが上記アミノ酸配列とＩｇＧ  Ｆｃ領域との間に位置することをさらに提供する。１つの実施形態において、そのペプチドリンカーは、配列番号１９（Ｇ４Ｓ）２を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、ポリペプチドタグが：ＦＬＡＧタグ；Ｓｔｒｅｐタグ；ポリヒスチジンタグ；ＶＳＶ−Ｇタグ；インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タグ；およびｃ−Ｍｙｃタグからなる群から選択されることをさらに提供する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本発明は、１つ以上のポリアルキレングリコール部分に付着されている本発明のポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、１つ以上のポリアルキレングリコール部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分であることをさらに提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、１から５個のＰＥＧ部分に付着されている本発明のポリペプチドをさらに提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本発明は、治療有効量が、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドの０．００１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇであることを提供する。いくつかの実施形態において、治療有効量は、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドの０．０１ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、治療有効量は、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドの０．０５ｍｇ／ｋｇから０．５ｍｇ／ｋｇである。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明は、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドが、血液脳関門を通過しないことを提供する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、１つ以上の抗Ａβ抗体と同時投与される。いくつかの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、アドレナリン作用薬、抗アドレナリン作用薬、抗アンドロゲン剤、抗狭心症薬、抗不安剤、抗痙攣剤、抗うつ剤、抗てんかん薬、抗高脂血症薬、抗高リポタンパク血症薬、抗高血圧薬、抗炎症剤、抗強迫神経症薬（ａｎｔｉｏｂｅｓｓｉｏｎａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗パーキンソン病薬、抗精神病薬、副腎皮質ステロイド；副腎皮質抑制剤；アルドステロンアンタゴニスト；アミノ酸；アナボリックステロイド；蘇生薬；アンドロゲン；血糖制御因子；心保護剤；心血管系薬剤；コリンアゴニストまたはコリンアンタゴニスト；コリンエステラーゼの不活性化剤またはインヒビター、認知補助剤または認知増強剤；ドーパミン作動薬；酵素インヒビター、エストロゲン、遊離酸素ラジカルスカベンジャー；ＧＡＢＡアゴニスト；グルタミン酸塩アンタゴニスト；ホルモン；コレステロール低下剤；抗高脂血症薬；降圧薬；免疫剤；免疫賦活剤；モノアミンオキシダーゼインヒビター、神経保護薬；ＮＭＤＡアンタゴニスト；ＡＭＰＡアンタゴニスト、競合性または非競合性のＮＭＤＡアンタゴニスト；オピオイドアンタゴニスト；カリウムチャネル開口薬；非ホルモンステロール誘導体；脳卒中後および頭部外傷後の処置；プロスタグランジン剤；向精神薬；弛緩剤；鎮静剤；催眠鎮静剤；選択的アデノシンアンタゴニスト；セロトニンアンタゴニスト；セロトニンインヒビター；選択的セロトニン取り込みインヒビター；セロトニンレセプターアンタゴニスト；ナトリウムチャネル遮断薬およびカルシウムチャネル遮断薬；ステロイド；刺激剤（ｓｔｉｍｕｌａｎｔ）；および甲状腺ホルモンならびにインヒビター剤からなる群から選択される１つ以上のさらなる治療薬と同時投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは、野生型ＮｇＲ１を発現しているＣＯＳ−７細胞への結合に必要とされるＡＰ−Ａβ（１−２８）領域の欠失マッピングを示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＮｇＲ１を発現している細胞への結合を可能にする条件下において、ＡＰ−Ａβ（１−２８）が、ｐ７５−ＮＴＲまたはＲＡＧＥを発現しているＣＯＳ−７細胞に結合しないことを示している。
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ａβ（１−２８）によるＮｇＲ１からのＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６（１−３３）ではなくＡＰ−Ａβ（１−２８）の置換を示している。
【図２Ａ】図２Ａは、トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の表面における変異ＮｇＲ１タンパク質が、抗ウサギ−ＡＰによって認識されるウサギ抗ＮｇＲ１抗体を用いた免疫染色によって検出されたことを示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、特異な結合を示すＮｇＲ１変異体を発現しているＣＯＳ−７細胞へのＡＰまたはＡＰ融合型ＮｇＲ１リガンドの結合を示している。
【図２Ｃ】図２Ｃは、分子量および発現レベルを確かめるために抗ＮｇＲ１抗体で免疫ブロットされた、ＮｇＲ１および変異体を発現しているＣＯＳ−７細胞の細胞溶解産物を表している。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＮｇＲ１変異体に対するＮｇＲ１リガンドのＡＰ結合の定量化（野生型ＮｇＲ１に対するパーセンテージとして表される）を示している。
【図３Ａ】図３Ａは、ラットＩｇＧで皮下処置されたか、ＮｇＲ１（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃで皮下処置されたか、またはＮｇＲ１（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃでｉ．ｃ．ｖ．処置された、ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳＥＮ−１ΔＥ９トランスジェニックマウスの脳溶解産物中の、プロテインＡ／Ｇアフィニティークロマトグラフィによって濃縮されたタンパク質の抗ＮｇＲ１免疫ブロットを示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、１０月齢の末梢処置されたＡｐｐｓｗｅ／ＰＳＥＮ−１ΔＥ９トランスジェニックマウスにおける脳に対する血漿のＡβレベルの比を示しており、パーセンテージとしてプロットされている。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ラットＩｇＧで皮下処置されたか、またはＮｇＲ１（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃで皮下処置された、７〜１０月齢のＡＰＰｓｗｅ／ＰＳＥＮ−１ΔＥ９トランスジェニックマウスの脳溶解産物の抗ＡＰＰ（６Ｅ１０）免疫ブロットを示している。
【図３Ｄ】図３Ｄは、脳溶解産物における抗ＡＰＰ免疫反応性のレベルを示している。
【図４−１】図４Ａは、コントロールおよびＮｇＲ１（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃで処置されたトランスジェニックマウスの大脳皮質における抗Ａβ免疫反応性プラーク沈着の例を示している。図４Ｂは、海馬における抗シナプトフィジン免疫反応性プラーク沈着の例を示している。図４Ｃは、海馬における抗ＧＦＡＰ免疫反応性を示している。
【図４−２】図４Ｄは、図４Ａの像から定量化された、Ａβプラークで占められている面積のパーセンテージを示している。
【図４−３】図４Ｅは、ＥＬＩＳＡによって評価された、ＮｇＲ１（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃ群およびラットＩｇＧ群におけるＡβ（１−４０）レベルおよびＡβ（１−４２）レベルを示している。
【図４−４】図４Ｆは、図４Ｂからの抗シナプトフィジン免疫反応性のジストロフィの神経突起によって占められている面積を示している。
【図４−５】図４Ｇは、図４Ｃの像から測定された、抗ＧＦＡＰ免疫反応性によって占められている面積のパーセンテージを示している。
【図５Ａ】図５Ａは、４月齢のＡＰＰｓｗｅ／ＰＳＥＮ−１ΔＥ９および野生型同腹仔に対する６本の放射状の水迷路における平均エラー数を示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、１３月齢のＡＰＰｓｗｅ／ＰＳＥＮ−１ΔＥ９および野生型同腹仔に対する６本の放射状の水迷路における平均エラー数を示している。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＮｇＲ＋／−マウスおよびＮｇＲ−／−マウスに対する６本の放射状の水迷路における平均エラー数を示している。
【図５Ｄ】図５Ｄは、７〜１０月齢のＡＰＰｓｗｅ／ＰＳＥＮ−１ΔＥ９マウスにおけるＮｇＲ１（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃの皮下処置の結果を示している。
【図５Ｅ】図５Ｅは、プラーク密度と、各マウスの最後の１０回の試験に対する１回の遊泳あたりの平均エラーとの散布図を示している。
【図６】図６は、ＮｇＲ１（３１０）ｅｃｔｏ−ＦｃまたはＩｇＧによる皮下処置後の、７月齢から１０月齢までのＡＰＰｓｗｅ／ＰＳＥＮ−１ΔＥ９トランスジェニックマウスの可視プラットフォーム回避時間を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
定義および一般的な技術
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されている意味と同じ意味を有する。矛盾が生じる場合は、その定義を含んでいる本願が支配する。また、文脈によって別段必要とされない限り、単数形の用語は、複数を含み、複数形の用語は、単数を含むものとする。本明細書中に記述されるすべての刊行物、特許および他の参照文献は、それらの全体が全ての目的のために参考として援用される。
【００２８】
本明細書中に記載の記載される方法および材料と類似または等価である方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適当な方法および材料が、以下に記載される。材料、方法および例は、単なる例示であり、限定する意図ではない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および請求項から明らかである。
【００２９】
本明細書および請求項を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、述べられている整数または整数の群の包含を意味するが、他の任意の整数または整数の群の排除を意味しないことが理解される。
【００３０】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義が、本明細書中に提供される。
【００３１】
用語「ａ」または「ａｎ」実体は、その実体の１つ以上のことを指すことに注意されたい；例えば、「免疫グロブリン分子（ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、１つ以上の免疫グロブリン分子を表していると理解される。同様に、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上の」および「少なくとも１つ」は、本明細書中で交換可能に使用され得る。
【００３２】
本明細書中で使用されるとき、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」もしくは「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」などの変化形は、本明細書および請求項を通じて使用されるとき、列挙された任意の整数または整数の群の包含を示唆するが、さらなる整数または整数の群が、特定の方法、構造または組成物に加えられる場合がないことを示唆する。
【００３３】
本明細書中で使用されるとき、用語「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」もしくは「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの変化形は、本明細書および請求項を通じて使用されるとき、列挙された任意の整数または整数の群の包含、および、特定の方法、構造または組成物の基礎的な特性または新規の特性を実質的に変化させない、列挙された任意の整数または整数の群の任意の包含を示唆する。
【００３４】
本明細書中で使用されるとき、「抗体」は、インタクトな免疫グロブリンまたはその抗原結合フラグメントを意味する。本発明の抗体は、任意のアイソタイプまたはクラス（例えば、Ｍ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＡ）または任意のサブクラス（例えば、Ｇ１−４、Ａ１−２）であり得、カッパー（κ）軽鎖またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかを有し得る。
【００３５】
本明細書中で使用されるとき、「Ｆｃ」は、１つ以上の重鎖定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む免疫グロブリン重鎖の一部を意味する。例えば、パパイン消化によって入手可能な抗体の重鎖定常領域の一部。
【００３６】
本明細書中および米国特許出願６０／４０２，８６６で使用されるとき、「Ｎｏｇｏレセプター」、「ＮｏｇｏＲ」、「ＮｏｇｏＲ−１」、「ＮｇＲ」、「ＮｇＲ−１」、「ＮｇＲ１」および「ＮＧＲ１」の各々は、Ｎｏｇｏレセプター−１を意味する。
【００３７】
本明細書中で使用されるとき、「ＮｏｇｏＲ融合タンパク質」は、異種ポリペプチドに融合された可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１部分を含むタンパク質を意味する。
【００３８】
本明細書中で使用されるとき、「ヒト化抗体」は、非ヒト配列の少なくとも一部がヒト配列で置換されている抗体を意味する。ヒト化抗体を作製する方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号に見られる。
【００３９】
本明細書中で使用されるとき、「キメラ抗体」は、第１抗体からの１つ以上の領域および少なくとも１つの他の抗体からの１つ以上の領域を含む抗体を意味する。その第１抗体および追加抗体は、同じ種由来または異なる種由来であり得る。
【００４０】
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含すると意図され、この用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線状に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子のことを指す。用語「ポリペプチド」とは、２つ以上アミノ酸の任意の鎖のことを指し、特定の長さの生成物のことを指さない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２つ以上のアミノ酸の鎖のことを指すために使用される他の任意の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに使用され得るか、またはこれらの用語のいずれかと交換可能に使用され得る。用語「ポリペプチド」は、そのポリペプチドの発現後の改変（グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）による誘導体化、タンパク分解性切断または天然に存在しないアミノ酸による改変が挙げられるが、これらに限定されない）の生成物のことを指すとも意図される。ポリペプチドは、天然の生物学的起源から得られうるか、または組換え技術によって作製され得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。ポリペプチドは、化学合成による様式をはじめとした任意の様式で作製され得る。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上または２，０００以上のアミノ酸のサイズであり得る。ポリペプチドは、確定した３次元構造を有し得るが、必ずしもそのような構造を有するわけではない。確定された３次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれているといわれ、確定された３次元構造を有しないポリペプチドは、多数の異なる立体配座をとり得、折り畳まれていないといわれる。本明細書中で使用されるとき、糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基（例えば、セリン残基またはアスパラギン残基）の酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してタンパク質に付着している、少なくとも１つの炭水化物部分につながれたタンパク質のことを指す。
【００４２】
「単離された」ポリペプチドまたはそのフラグメント、改変体もしくは誘導体とは、その天然環境に存在しないポリペプチドのことを意図している。特定のレベルの精製を必要としない。例えば、単離されたポリペプチドは、その特有の環境または天然の環境から取り出された状態であり得る。組換えで作製されたポリペプチドおよび宿主細胞において発現されたタンパク質は、任意の適当な手法によって、分離されているか、分画されているか、または部分的もしくは実質的に精製されている、天然ポリペプチドまたは組換えポリペプチドと同様に本発明の目的において単離されていると考えられる。
【００４３】
本発明において、「ポリペプチドフラグメント」とは、大きいポリペプチドの短いアミノ酸配列のことを指す。タンパク質フラグメントは、「独立した」ものであり得るか、またはそのフラグメントが一部の領域を形成する大きなポリペプチドの内部に含まれ得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、約５アミノ酸長、約１０アミノ酸長、約１５アミノ酸長、約２０アミノ酸長、約３０アミノ酸長、約４０アミノ酸長、約５０アミノ酸長、約６０アミノ酸長、約７０アミノ酸長、約８０アミノ酸長、約９０アミノ酸長および約１００アミノ酸長以上を含むフラグメントが挙げられる。
【００４４】
用語「フラグメント」、「改変体」、「誘導体」および「アナログ」は、本発明のポリペプチドについて言及するとき、少なくともいくつかの生物学的活性を保持する任意のポリペプチドを包含する。本明細書中に記載されるようなポリペプチドとしては、そのポリペプチドが、その機能を果たす限り、そのフラグメント、改変体または誘導体分子が挙げられ得るが、これらに限定されない。本発明のＮｇＲ１ポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントとしては、タンパク分解性フラグメント、欠失フラグメントおよび特に動物に送達されたときに作用部位に容易に到達するフラグメントが挙げられ得る。ポリペプチドフラグメントとしては、天然ポリペプチドの抗原性または免疫原性のエピトープ（線状ならびに３次元のエピトープを含む）を含むポリペプチドの任意の部分がさらに挙げられる。本発明のＮｇＲ１ポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントは、上に記載されたようなフラグメントを含む改変体領域およびアミノ酸置換、欠失または挿入によってアミノ酸配列が変更されたポリペプチドも含み得る。改変体は、対立遺伝子改変体のように、天然に存在し得る。「対立遺伝子改変体」とは、生物体の染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子の代替型のことを意図する。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の突然変異誘発技術を使用して作製され得る。本発明のＮｇＲ１ポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントは、保存型または非保存型のアミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。本発明のＮｇＲ１ポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントはまた、誘導体分子を含み得る。改変体ポリペプチドはまた、本明細書中で「ポリペプチドアナログ」とも呼ばれ得る。本明細書中で使用されるとき、ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの「誘導体」とは、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する対象ポリペプチドのことを指す。２０個の標準的なアミノ酸の１つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドもまた、「誘導体」として含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンに置き換えられ得；５−ヒドロキシリシンは、リシンに置き換えられ得；３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンに置き換えられ得；ホモセリンは、セリンに置き換えられ得；そしてオルニチンは、リシンに置き換えられ得る。
【００４５】
本明細書中で使用されるとき、用語「ジスルフィド結合」は、２つの硫黄原子間に形成される共有結合を包含する。アミノ酸システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。
【００４６】
本明細書中で使用されるとき、「融合タンパク質」は、第２ポリペプチドにペプチド結合を介して線状に接続されている第１ポリペプチドを含むタンパク質のことを意味する。その第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、同一であってもよいし、異なっていてもよく、それらは、直接接続していてもよいし、ペプチドリンカー（以下を参照のこと）を介して接続していてもよい。
【００４７】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数の核酸ならびに複数の核酸を包含すると意図され、単離された核酸分子または核酸構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）のことを指す。ポリヌクレオチドは、非翻訳５’配列および非翻訳３’配列、コード配列を含む全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を含み得る。ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合または通常の結合でない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られる結合のようなアミド結合）を含み得る。ポリヌクレオチドは、改変されていないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより代表的には二本鎖または一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の改変された塩基あるいは安定性もしくは他の理由のために改変されたＤＮＡ骨格またはＲＮＡ骨格を含み得る。「改変された」塩基としては、例えば、トリチル化（ｔｒｉｔｙｌａｔｅｄ）塩基およびイノシンなどの稀な塩基が挙げられる。種々の改変は、ＤＮＡおよびＲＮＡに対してなされ得る；従って、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的または代謝的に改変された形態を含む。
【００４８】
用語「核酸」とは、任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチド中に存在するＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡフラグメントのことを指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その天然の環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡのことを意図する。例えば、ベクター内に含まれている、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的において単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞内で維持されている組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の精製された（部分的または実質的に）ポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロにおけるＲＮＡ転写物を包含する。本発明の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成で作製されたそのような分子をさらに包含する。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節エレメント（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーター）であり得るか、または調節エレメントを含み得る。
【００４９】
本明細書中で使用されるとき、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないにもかかわらず、コード領域の一部であると考えられ得るが、任意のフランキング配列（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなど）は、コード領域の一部ではない。本発明の２つ以上コード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物中（例えば、単一ベクター上）に存在し得るし、別個のポリヌクレオチド構築物中（例えば、別個の（異なる）ベクター上）に存在し得る。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでもよいし、２つ以上のコード領域を含んでもよく、例えば、単一のベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードし得る。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントをコードする核酸に融合されているかまたは融合されていない異種コード領域をコードし得る。異種コード領域としては、特殊なエレメントまたはモチーフ（例えば、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメイン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つ以上のコード領域と作動可能に会合されたプロモーターおよび／または他の転写調節領域もしくは翻訳調節領域を含み得る。作動可能な会合は、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）に対するコード領域が、１つ以上の制御配列の影響下または支配下で遺伝子産物の発現が行われるような方法でその制御配列と会合されるときのことである。２つのＤＮＡフラグメント（例えば、ポリペプチドコード領域およびそれに関連するプロモーター）は、プロモーター機能の誘導によって、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写がもたらされる場合、および２つのＤＮＡフラグメント間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現制御配列の能力を妨害しない場合、もしくは転写されるＤＮＡ鋳型の能力を妨害しない場合に、「作動可能に会合している」。従って、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写をもたらすことができる場合、そのプロモーター領域は、その核酸と作動可能に会合され得る。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写調節エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルは、細胞特異的転写を指示するポリヌクレオチドと作動可能に会合され得る。適当なプロモーターおよび他の転写調節領域は、本明細書中に開示される。
【００５１】
種々の転写調節領域が、当業者に公知である。これらとしては、脊椎動物細胞において機能する転写調節領域（例えば、サイトメガロウイルス（イントロン−Ａに連結された最初期プロモーター）、サルウイルス４０（初期プロモーター）およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターセグメントおよびエンハンサーセグメントであるがこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない。他の転写調節領域としては、脊椎動物遺伝子（例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ−グロビン）から得られるものならびに真核細胞において遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。さらなる適当な転写調節領域としては、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびにリンフォカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。
【００５２】
同様に、種々の翻訳調節エレメントが、当業者に公知である。これらとしては、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび翻訳終結コドンならびにピコルナウイルス由来のエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する、分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と会合され得る。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、成長中のタンパク質鎖の、粗面小胞体を通過する輸送が開始されると成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは、一般に、そのポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有し、そのシグナルペプチドは、完全なポリペプチドまたは「全長」ポリペプチドから切断されて、分泌型または「成熟」型のポリペプチドを産生することが認識されている。ある特定の実施形態において、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドまたは免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、またはそれと作動可能に会合されている、ポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的な誘導体が、使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能的な誘導体が、使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノゲンアクチベーター（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換され得る。
【００５５】
本明細書中で使用されるとき、用語「操作された」は、合成手段による（例えば、組換え技術、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素的もしくは化学的な結合またはこれらの技術のいくつかの組み合わせによる）核酸分子またはポリペプチド分子の操作を含む。
【００５６】
本明細書中で使用されるとき、用語「連結された」、「融合された」および「融合」は、交換可能に使用される。これらの用語は、手段（化学的な結合体化または組換え手段を含む）に関係なく２つ以上のエレメントまたは構成要素を共に連接することを指す。「インフレーム融合」とは、元のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の正確な翻訳の読み枠を維持する様式で、連続した長いＯＲＦを形成する２つ以上のポリヌクレオチドＯＲＦの連接のことを指す。従って、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する、２つ以上の（ｔｗｏ  ｏｒｅ  ｍｏｒｅ）セグメントを含む単一のタンパク質である（そのセグメントは、天然においては通常そのように連接されていない）。従って、読み枠は、融合されたセグメント全体にわたって連続的になるが、そのセグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的または空間的に分断され得る。
【００５７】
「リンカー」配列は、融合タンパク質において２つのポリペプチドコード領域を分断している１続きの１つ以上のアミノ酸である。代表的なリンカーは、少なくとも５アミノ酸を含む。さらなるリンカーは、少なくとも１０アミノ酸または少なくとも１５アミノ酸を含む。ある特定の実施形態において、ペプチドリンカーのアミノ酸は、そのリンカーが親水性であるように選択される。リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１８）は、十分な可撓性を提供するので、多くの抗体に幅広く適応可能な好ましいリンカーである。他のリンカーとしては、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１９）、ＧｌｕＳｅｒＧｌｙＡｒｇＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号２０）、ＧｌｕＧｌｙＬｙｓＳｅｒＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｕＳｅｒＬｙｓＳｅｒＴｈｒ（配列番号２１）、ＧｌｕＧｌｙＬｙｓＳｅｒＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｕＳｅｒＬｙｓＳｅｒＴｈｒＧｌｎ（配列番号２２）、ＧｌｕＧｌｙＬｙｓＳｅｒＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｕＳｅｒＬｙｓＶａｌＡｓｐ（配列番号２３）、ＧｌｙＳｅｒＴｈｒＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙＬｙｓＳｅｒＳｅｒＧｌｕＧｌｙＬｙｓＧｌｙ（配列番号２４）、ＬｙｓＧｌｕＳｅｒＧｌｙＳｅｒＶａｌＳｅｒＳｅｒＧｌｕＧｌｎＬｅｕＡｌａＧｌｎＰｈｅＡｒｇＳｅｒＬｅｕＡｓｐ（配列番号２５）およびＧｌｕＳｅｒＧｌｙＳｅｒＶａｌＳｅｒＳｅｒＧｌｕＧｌｕＬｅｕＡｌａＰｈｅＡｒｇＳｅｒＬｅｕＡｓｐ（配列番号２６）が挙げられる。より短いリンカーの例としては、上記のリンカーのフラグメントが挙げられ、より長いリンカーの例としては、上記のリンカーの組み合わせ、上記のリンカーフラグメントの組み合わせおよび上記リンカーと上記リンカーフラグメントとの組み合わせが挙げられる。
【００５８】
ポリペプチドの場合、「線状配列」または「配列」は、アミノ末端からカルボキシル末端方向へのポリペプチドにおけるアミノ酸の順序であり、ここで、配列中で互いに隣接する残基は、ポリペプチドの１次構造において近接する。
【００５９】
用語「発現」とは、本明細書中で使用されるとき、遺伝子が、生化学物質、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを生成するプロセスのことを指す。そのプロセスは、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の顕在化（遺伝子ノックダウンならびに一過性発現と安定発現の両方が挙げられるがこれらに限定されない）を含む。そのプロセスとしては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）または他の任意のＲＮＡ産物への遺伝子の転写、およびポリペプチドへのそのようなｍＲＮＡの翻訳ならびに転写または翻訳を制御する任意のプロセスが挙げられるがこれらに限定されない。所望の最終産物が生化学物質である場合、発現は、その生化学的物質および任意の前駆体の生成を含む。遺伝子の発現によって、「遺伝子産物」が生成される。本明細書中で使用されるとき、遺伝子産物は、核酸（例えば、遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ）または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書中に記載される遺伝子産物は、転写後修飾（例えば、ポリアデニル化）された核酸または翻訳後修飾（例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク分解性切断など）されたポリペプチドをさらに含む。
【００６０】
本明細書中で使用されるとき、用語「処置する」または「処置」とは、治療的な処置と予防的または防止的な措置（ここで、その目的は、望まれない生理学的な変化または障害（例えば、多発性硬化症の進行）を予防するか、または遅延させる（減じる）ことである）の両方のことを指す。有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、検出可能か検出不可能かに関係なく、症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の回復または寛解、および緩解（部分的か全体的かに関係なく）が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けない場合に予想される生存時間と比べたときの生存時間の延長も意味し得る。処置の必要のある者としては、その状態もしくは障害をすでに有している者、ならびにその状態もしくは障害を有する傾向にある者またはその状態もしくは障害が予防されるべき者が挙げられる。
【００６１】
「被験体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後診断または治療が望まれる、任意の被験体、特に哺乳動物の被験体を意味する。哺乳動物の被験体としては、ヒト、家畜動物、農場動物、動物園動物、競技用動物、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛）；霊長類（例えば、類人猿、サル、オランウータンおよびチンパンジー）；イヌ科動物（例えば、イヌおよびオオカミ）；ネコ科動物（例えば、ネコ、ライオンおよびトラ）；ウマ科動物（例えば、ウマ、ロバおよびシマウマ）；食用動物（例えば、ウシ、ブタおよびヒツジ）；有蹄動物（例えば、シカおよびキリン）；げっ歯類動物（例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット）；などが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、哺乳動物は、ヒト被験体である。
【００６２】
本明細書中で使用されるとき、「治療有効量」とは、投薬時および必要な時間にわたって、所望の治療結果を達成するのに有効な量のことを指す。治療結果は、例えば、症状の軽減、生存時間の延長、運動性の改善などであり得る。治療結果は、「治癒」である必要はない。
【００６３】
本明細書中で使用されるとき、「予防的に有効な量」とは、投薬時および必要な時間にわたって、所望の予防的な結果を達成するのに有効な量のことを指す。代表的には、予防的用量は、疾患の前または疾患の初期に被験体において使用されるので、予防的に有効な量は、治療有効量より少ない。
【００６４】
本明細書中で使用されるとき、「Ａβクリアランス」とは、脳から血漿へのＡβペプチドの移動のことを指す。
【００６５】
Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチド
ヒトＮｇＲ１ポリペプチドを配列番号２として以下に示す。
【００６６】
全長ヒトＮｇＲ１（配列番号２）：
【００６７】
【化１】
2010502623.tif 000002
ラットＮｇＲ１ポリペプチドを配列番号４として以下に示す。
【００６８】
全長ラットＮｇＲ１（配列番号４）：
【００６９】
【化２】
2010502623.tif 000003
マウスＮｇＲ１ポリペプチドを配列番号６として以下に示す。
【００７０】
全長マウスＮｇＲ１（配列番号６）：
【００７１】
【化３】
2010502623.tif 000004
全長Ｎｏｇｏレセプター−１は、シグナル配列、Ｎ末端領域（ＮＴ）、８個のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、ＬＲＲＣＴ領域（８個のロイシンリッチリピートのＣ末端のロイシンリッチリピートドメイン）、Ｃ末端領域（ＣＴ）およびＧＰＩアンカーからなる。
【００７２】
本明細書中で使用されるＮｇＲ１ドメインの名称は、以下のとおり定義される：
【００７３】
【表１】
2010502623.tif 000005
可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチド
本発明のいくつかの実施形態は、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドを提供する。本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドは、ＮＴドメイン；８つのＬＲＲおよびＬＲＲＣＴドメインを含み、シグナル配列および機能的ＧＰＩアンカーを有しない（すなわち、ＧＰＩアンカーがないか、または細胞膜と効率的に会合する能力を有しないＧＰＩアンカー）。
【００７４】
いくつかの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドは、異種ＬＲＲを含む。いくつかの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドは、２、３、４、５、６、７または８個の異種ＬＲＲを含む。異種ＬＲＲは、Ｎｏｇｏレセプター−１以外のタンパク質から得られるＬＲＲを意味する。異種ＬＲＲを得ることができる例示的なタンパク質は、ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ１．２）；Ｔ細胞活性化ロイシンリピートリッチタンパク質；デコリン（ｄｅｃｅｏｒｉｎ）；ＯＭ−ｇｐ；インスリン様成長因子結合タンパク質酸性不安定（ａｃｉｄｉｃ  ｌａｂｉｌｅ）サブユニットｓｌｉｔおよびｒｏｂｏ；ならびにｔｏｌｌ様レセプター４である。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、３１９アミノ酸の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチド（可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１  ３４４、ｓＮｏｇｏＲ１−３４４またはｓＮｏｇｏＲ３４４）（配列番号７および９の残基２６−３４４または配列番号９の残基２７−３４４）を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、２８５アミノ酸の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチド（可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１  ３１０、ｓＮｏｇｏＲ１−３１０またはｓＮｏｇｏＲ３１０）（配列番号８および１０の残基２６−３１０または配列番号１０の残基２７−３１０）を提供する。
【００７６】
【表２−１】
2010502623.tif 000006
【００７７】
【表２−２】
2010502623.tif 000007
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドの末梢投与によって、哺乳動物におけるＡβペプチドの血漿対脳の比が増大するか、または哺乳動物の脳からのＡβクリアランスが増強される。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドの末梢投与によって、哺乳動物において記憶機能が改善されるか、または記憶喪失が阻害される。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
【００７８】
本発明のいくつかの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドは、参照アミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であり、その参照アミノ酸配列は：（ｉ）配列番号２のアミノ酸２７から３１０；（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸２７から３４４；（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸２７から４４５；（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸２７から３０９；（ｖ）配列番号２のアミノ酸１から３１０；（ｖｉ）配列番号２のアミノ酸１から３４４；（ｖｉｉ）配列番号２のアミノ酸１から４４５；（ｖｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１から３０９；（ｉｘ）前記参照アミノ酸配列のいずれかの改変体または誘導体、および（ｘ）前記参照アミノ酸配列またはその改変体もしくは誘導体の１つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【００７９】
「ＮｇＲ１参照アミノ酸配列」または「参照アミノ酸配列」は、いかなるアミノ酸置換も導入されていない特定の配列を意味する。当業者が理解するように、置換が存在しない場合、本発明の「単離されたポリペプチド」は、参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
【００８０】
本発明のいくつかの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドは、（ｉ）配列番号２のアミノ酸ａから２８４、（ｉｉ）配列番号２の２１０からｂおよび（ｉｉｉ）配列番号２のａからｂからなる群から選択され、ここで、ａは、２００から２１０までの任意の整数であり、ｂは、２８４から２９５までの任意の整数である。
【００８１】
本発明の方法において使用するための可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸アミノ酸２７から３１０；配列番号２のアミノ酸２７から３４４、配列番号２のアミノ酸２７から４４５、配列番号２のアミノ酸２７から３０９、配列番号２のアミノ酸１から３１０、配列番号２のアミノ酸１から３４４、配列番号２のアミノ酸１から４４５；および配列番号２のアミノ酸１から３０９が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８２】
任意の様々なアミノ酸は、本発明のポリペプチドにおいてアミノ酸で置換され得る。ヒトＮｇＲ１において置換され得るアミノ酸としては、６１位；９２位；１０８位；１２２位；１２７位；１３１位；１３８位；１３９位；１５１位；１７６位；１７９位；２２７位；２３７位；２５０位；２５９位；１０８および１３１位；１１４および１１７位；１２７および１５１位；１２７および１７６位；１４３および１４４位；１８９および１９１位；１９６および１９９位；２０２および２０５位  ２５６および２５９位；２６７および２６９位；２７７および２７９位；１１４、１１７および１３９位；１８９、１９１および２３７位；１８９、１９１および２８４位；２０２、２０５および２２７位；２０２、２０５および２５０位；２２０、２２３および２２４位；２３７、２５６および２５９位；２９６、２９７および３００位；１７１、１７２、１７５および１７６位；２９２、２９６、２９７および３００位；１９６、１９９、２２０、２２３および２２４位；１７１、１７２、１７５、１７６、１９６および１９９位；１９６、１９９、２２０、２２３、２２４および２５０位；１０８、１３１および６１位；３６および３８位；３６、３８および６１位；６１、１３１、３６および３８位；ならびに６３および６５位のアミノ酸が挙げられるがこれらに限定されない。どの異なるアミノ酸が使用されるかは、多くの基準、例えば、ポリペプチドフラグメントの立体配座に対する置換の影響、ポリペプチドフラグメントの電荷またはポリペプチドフラグメントの親水性に左右される。本発明のポリペプチドのアミノ酸および参照アミノ酸配列に対するアミノ酸置換は、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられ得る。参照アミノ酸配列におけるアミノ酸に対して置換される代表的なアミノ酸としては、アラニン、セリン、トレオニン、特に、アラニンが挙げられる。ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドの操作を介してそのような置換を行うことは、十分に当業者の日常的な専門技術の範囲内である。
【００８３】
可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドは、配列番号２の少なくとも６個、例えば、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、１００個またはそれ以上のアミノ酸のフラグメントを含み得る。本明細書中に記載される配列番号２の参照ＮｇＲ１ポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドの対応フラグメントもまた、企図される。
【００８４】
当該分野で公知のように、２つのポリペプチド間の「配列同一性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。本明細書中に記述されるとき、任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるかは、当該分野で公知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェア（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）であるがこれらに限定されない）を使用して決定され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを使用することにより、２つの配列間の相同性の最良のセグメントを探索する。特定の配列が、例えば、本発明の参照配列と９５％同一であると判定するために、ＢＥＳＴＦＩＴまたは他の任意の配列アラインメントプログラムを使用するとき、パラメータは、当然のことながら、同一性のパーセンテージが、参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算されるように、そして、参照配列中のアミノ酸の総数の最高５％の相同性におけるギャップが許容されるように、設定される。
【００８５】
以下で詳細に記述するように、本発明の方法において使用するための可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドは、２つ以上の可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドの任意の組み合わせを含み得る。従って、可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドの二量体（ホモ二量体またはヘテロ二量体）が、企図される。本明細書中に記載されるような２つ以上の可溶性ＮｇＲ１ポリペプチドは、直接接続されていてもよいし、適当なペプチドリンカーを介して接続されていてもよい。そのようなペプチドリンカーは、本明細書中の別の箇所に記載されている。
【００８６】
本明細書中に開示される方法において使用するためのＮｇＲ１ポリペプチドは、ペプチド結合または改変ペプチド結合によって互いに連接されたアミノ酸から構成され得（すなわち、ペプチド同配体）、遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のアミノ酸（例えば、天然に存在しないアミノ酸）を含み得る。ＮｇＲ１ポリペプチドは、天然のプロセス（例えば、翻訳後プロセシング）または当該分野で周知の化学修飾技術によって、改変され得る。そのような改変は、基礎的な教科書およびより詳細なモノグラフならびに大部の研究文献に十分に記載されている。改変は、ＮｇＲ１ポリペプチドのいずれの位置（ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端もしくはカルボキシル末端または炭水化物などの部分を含む）でも生じ得る。同じタイプの改変が、所与のＮｇＲ１ポリペプチド中のいくつかの部位において同程度または様々な程度で存在し得ることが認識されるだろう。また、所与のＮｇＲ１ポリペプチドは、多くのタイプの改変を含み得る。ＮｇＲ１ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として、分枝型であってもよいし、分枝を含むかまたは含まない環状であってもよい。環状ＮｇＲ１ポリペプチド、分枝型ＮｇＲ１ポリペプチドおよび環状分枝ＮｇＲ１ポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合性の付着、ヘム部分の共有結合性の付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合性の付着、脂質または脂質誘導体の共有結合性の付着、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合性の付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化、タンパク分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介性付加（例えば、アルギニン化）およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  第２版，（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第１〜１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【００８７】
本明細書中に記載されるポリペプチドは、環状であり得る。ポリペプチドの環化は、線状ペプチドの立体配座の自由を低減し、より構造的に束縛された分子をもたらす。ペプチド環化の多くの方法は、当該分野で公知である。例えば、ペプチドのＮ末端のアミノ酸残基とＣ末端のアミノ酸残基との間のアミド結合の形成による「骨格と骨格」との環化。その「骨格と骨格」との環化の方法は、２つのα−チオアミノ酸残基（例えば、システイン、ホモシステイン）間のジスルフィド架橋の形成を含む。本発明のある特定のペプチドは、環状ポリペプチドを形成するためにペプチドのＮ末端上およびＣ末端上に改変を含む。そのような改変としては、システイン残基、アセチル化システイン残基、ＮＨ２部分を有するシステイン残基およびビオチンが挙げられるがこれらに限定されない。ペプチド環化の他の方法は、Ｌｉ  ＆  Ｒｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：３２５−３４１（２００２）および米国特許公開番号Ｕ．Ｓ．２００５−０２６０６２６  Ａ１（これらの全体は本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００８８】
本発明の方法において、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントは、予め形成されたポリペプチドとして直接投与され得るか、または核酸ベクターを介して間接的に投与され得る。本発明のいくつかの実施形態において、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントは、（１）本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを発現する核酸（例えば、ベクター）を用いて、移植可能な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程；および（２）疾患、障害または損傷の部位において哺乳動物に、形質転換された宿主細胞を移植する工程を包含する処置方法において投与される。本発明のいくつかの実施形態において、上記移植可能な宿主細胞は、哺乳動物から取り出され、一時的に培養され、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントをコードする単離された核酸を用いて形質転換またはトランスフェクトされ、そして、その細胞を取り出した同じ哺乳動物に移植して戻される。その細胞は、それが移植される部位と同じ部位から取り出され得るが、そうである必要はない。時折エキソビボ遺伝子治療としても知られるそのような実施形態は、制限された時間にわたって作用部位に局在する、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの持続的な供給を提供することができる。
【００８９】
本発明のさらなる例示的なＮｇＲポリペプチドならびに本発明を実施するためにこれらの分子を得るための方法および材料は、以下に記載される。
【００９０】
融合タンパク質および結合体化ポリペプチド
本発明のいくつかの実施形態は、融合タンパク質を形成するために、異種ポリペプチド部分に融合された、全長ＮｇＲ１タンパク質ではないＮｇＲ１ポリペプチド、例えば、ＮｇＲ１のポリペプチドフラグメントを使用することに関する。そのような融合タンパク質は、様々な目的、例えば、血清半減期の延長、バイオアベイラビリティの改善、特定の器官または組織型へのインビボにおける標的化、組換え発現効率の改善、宿主細胞分泌の改善、容易な精製および高いアビディティを達成するために使用され得る。達成されるべき目的に応じて、異種部分は、不活性であり得るか、または生物学的に活性であり得る。また、その異種部分は、本発明のＮｇＲ１ポリペプチド部分に安定に融合されるためか、またはインビトロもしくはインビボにおいて切断可能であるために、選択され得る。これらの他の目的を達成する異種部分は、当該分野で公知である。
【００９１】
いくつかの実施形態において、本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドは、異種ポリペプチドをさらに含む融合タンパク質の構成要素である。いくつかの実施形態において、その異種ポリペプチドは、免疫グロブリン定常ドメインである。いくつかの実施形態において、その免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖定常ドメインである。いくつかの実施形態において、上記異種ポリペプチドは、Ｆｃフラグメントである。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプター−１ポリペプチドのＣ末端に連接される。いくつかの実施形態において、融合Ｎｏｇｏレセプター−１タンパク質は、二量体である。本発明は、上に記載されたようなポリペプチドフラグメントの改変体、アナログまたは誘導体をさらに包含する。
【００９２】
本発明のいくつかの実施形態において、ＮｇＲ１ポリペプチドフラグメントは、１つ以上のさらなるＮｇＲポリペプチドフラグメント、例えば、ＮｇＲ１、ＮｇＲ２またはＮｇＲ３ポリペプチドフラグメントに、Ｆｃとともに融合され得る。
【００９３】
ヒトＮｇＲ２ポリペプチドを、配列番号１４として以下に示す。
【００９４】
全長ヒトＮｇＲ２（配列番号１４）：
【００９５】
【化４】
2010502623.tif 000008
マウスＮｇＲ２ポリペプチドを配列番号１５として以下に示す。
【００９６】
全長マウスＮｇＲ２（配列番号１５）：
【００９７】
【化５】
2010502623.tif 000009
ヒトＮｇＲ３ポリペプチドを配列番号１６として以下に示す。
【００９８】
全長ヒトＮｇＲ３（配列番号１６）：
【００９９】
【化６】
2010502623.tif 000010
マウスＮｇＲ３ポリペプチドを配列番号１７として以下に示す。
【０１００】
全長マウスＮｇＲ３（配列番号１７）：
【０１０１】
【化７】
2010502623.tif 000011
本発明の方法のいくつかの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドは、第１ポリペプチドフラグメントおよび第２ポリペプチドフラグメントを含み、ここで、前記第１ポリペプチドフラグメントは、最大２０個の個別のアミノ酸置換を除いて、第１参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含み、ここで、前記第１参照アミノ酸配列は：（ａ）配列番号２のアミノ酸ａから４４５、（ｂ）配列番号２のアミノ酸２７からｂおよび（ｃ）配列番号２のアミノ酸ａからｂからなる群から選択され、ここで、ａは、２５から３５までの任意の整数であり、ｂは、３００から４５０までの任意の整数であり；前記第２ポリペプチドフラグメントは、最大２０個の個別のアミノ酸置換を除いて、第２参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含み、ここで、前記第２参照アミノ酸配列は、（ａ）配列番号２のアミノ酸ｃから４４５、（ｂ）配列番号２のアミノ酸２７からｄおよび（ｃ）配列番号２のアミノ酸ｃからｄからなる群から選択され、ここで、ｃは、２５から３５までの任意の整数であり、ｄは、３００から４５０までの任意の整数である。
【０１０２】
ＮｇＲ融合ポリペプチドの発現の代替法として、選択された異種部分を予め形成し、上記ポリペプチドに化学的に結合体化することができる。ほとんどの場合において、選択された異種部分は、ＮｇＲ１ポリペプチドに縮合されるか、結合体化されるかに関係なく、同様に機能する。ゆえに、異種アミノ酸配列に関する以下の記述において、別段述べられない限り、異種配列が、融合タンパク質の形態で、または化学結合体として、ＮｇＲポリペプチドに連接され得ることが理解されるべきである。
【０１０３】
本明細書中に開示される処置方法において使用するためのＮｇＲポリペプチドは、ＮｇＲポリペプチドが、求められる機能を発揮するのを妨害しないような、任意のタイプの分子の共有結合性の付着によって改変されている誘導体を含む。例えば、限定するわけではないが、本発明のＮｇＲポリペプチドは、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、ホスフィル化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク分解性切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって改変され得る。数多くの化学修飾のいずれかは、公知の技術（特定の化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが挙げられるがこれらに限定されない）によって行われ得る。さらに、その誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０１０４】
ＮｇＲポリペプチドが融合されている異種ポリペプチドは、治療的に有用であるか、またはＮｇＲポリペプチドを標的化するために有用である。ＮｇＲ融合タンパク質は、様々な目的、例えば、血清半減期の延長、バイオアベイラビリティの改善、特定の器官または組織型へのインビボにおける標的化、組換え発現効率の改善、宿主細胞分泌の改善、容易な精製および高いアビディティを達成するために使用され得る。達成されるべき目的に応じて、異種部分は、不活性であり得るか、または生物学的に活性であり得る。また、その異種部分は、ＮｇＲポリペプチドに安定に融合されるためか、またはインビトロもしくはインビボにおいて切断可能であるために、選択され得る。これらの他の目的を達成する異種部分は、当該分野で公知である。
【０１０５】
本発明の方法において使用するための、ＮｇＲポリペプチドなどの薬理学的に活性なポリペプチドは、迅速なインビボクリアランスを示し得ることから、体内において治療的に有効な濃度を達成するために大用量を必要とする。さらに、約６０ｋＤａより小さいポリペプチドは、時折腎毒性に導く糸球体濾過を潜在的に受ける。比較的小さいポリペプチド（例えば、ＮｇＲシグナル伝達ドメインのポリペプチドフラグメント）の融合または結合体化は、そのような腎毒性のリスクを低下させるためまたは回避するために使用され得る。治療的なポリペプチドのインビボ安定性、すなわち、血清半減期を増大させるための、様々な異種アミノ酸配列、すなわち、ポリペプチド部分または「キャリア」が、知られている。例としては、血清アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））が挙げられる。
【０１０６】
その長い半減期、広範なインビボ分布および酵素的または免疫学的な機能の欠損に起因して、本質的には全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＨＳＡフラグメントが、異種部分として通常使用される。Ｙｅｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１９０４−０８（１９９２）およびＳｙｅｄら、Ｂｌｏｏｄ  ８９：３２４３−５２（１９９７）に教示されている方法および材料のような方法および材料の適用を介して、ＨＳＡを使用することにより、有意なインビボ安定性の増大、例えば、１０倍から１００倍高いインビボ安定性を示しつつ、ＮｇＲポリペプチド部分のおかげで薬理学的活性を示す融合タンパク質またはポリペプチド結合体を形成することができる。ＨＳＡのＣ末端は、ＮｇＲポリペプチド部分のＮ末端に融合され得る。ＨＳＡは、天然の分泌タンパク質であるので、融合タンパク質が、真核生物発現系、例えば、哺乳動物発現系において産生されるとき、ＨＳＡシグナル配列は、細胞培養液への融合タンパク質の分泌をもたらすために利用され得る。
【０１０７】
ある特定の実施形態において、本発明の方法において使用するためのＮｇＲポリペプチドは、標的部分をさらに含む。標的部分としては、身体のある特定の部分への局在化を指示するタンパク質またはペプチドが挙げられる。
【０１０８】
本発明のいくつかの実施形態は、ヒンジ領域およびＦｃ領域、すなわち、Ｉｇ重鎖定常領域のＣ末端部分に融合されたＮｇＲポリペプチド部分を使用する。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域に存在するアミノ酸は、異なるアミノ酸で置換され得る。これらの実施形態のヒンジ領域に対する例示的なアミノ酸置換としては、ヒンジ領域に存在する個別のシステイン残基の、異なるアミノ酸による置換が挙げられる。任意の異なるアミノ酸は、ヒンジ領域においてシステインで置換され得る。本発明のポリペプチドのアミノ酸および参照アミノ酸配列に対するアミノ酸置換は、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられ得る。参照アミノ酸におけるシステインに対して置換される代表的なアミノ酸としては、アラニン、セリン、トレオニン、特に、セリンおよびアラニンが挙げられる。ポリペプチフラグメントをコードするポリヌクレオチドの操作を介してそのような置換を行うことは、十分に当業者の日常的な専門技術の範囲内である。
【０１０９】
ＮｇＲ−ポリペプチド−Ｆｃ融合の潜在的な利点としては、溶解性、インビボ安定性および多価性（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｃｙ）、例えば、二量体化が挙げられる。使用されるＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＧのＦｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）であり得る。あるいは、使用されるＦｃ領域は、ＩｇＥまたはＩｇＭのＦｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）であり得る。ＩｇＧ  Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域が、通常使用される。Ｆｃ融合物をコードするＤＮＡを構築および発現するための材料および方法は、当該分野で公知であり、過度の実験を行うことなく、融合物を得るために適用され得る。本発明のいくつかの実施形態は、Ｃａｐｏｎら、米国特許第５，４２８，１３０号および同第５，５６５，３３５号に記載されている融合タンパク質のような融合タンパク質を使用する。
【０１１０】
シグナル配列は、小胞体膜を通過するタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。免疫融合物（ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｎ）を構築するために有用なシグナル配列としては、抗体軽鎖シグナル配列、例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１２５：１９１−２０２（１９８９））、抗体重鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８６：５７７４（１９８０））が挙げられる。あるいは、他のシグナル配列を使用することができる。例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：５１４５（１９８４）を参照のこと。シグナルペプチドは、通常、シグナルペプチダーゼによって小胞体の内腔において切断される。これによって、Ｆｃ領域およびＮｇＲ１ポリペプチド部分を含んでいる免疫融合タンパク質が分泌される。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ配列は、分泌カセットとＮｇＲ１ポリペプチド部分との間においてタンパク分解性切断部位をコードし得る。そのような切断部位は、例えば、コードされた融合タンパク質のタンパク分解性切断を提供するので、標的タンパク質からＦｃドメインが分離され得る。有用なタンパク分解性切断部位としては、タンパク分解性酵素（例えば、トリプシン、プラスミン、トロンビン、Ｘａ因子またはエンテロキナーゼＫ）によって認識されるアミノ酸配列が挙げられる。
【０１１２】
分泌カセットは、複製可能な発現ベクター内に組み込まれ得る。有用なベクターとしては、線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなどが挙げられる。例示的な発現ベクターは、免疫融合ＤＮＡの転写がヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーおよびプロモーターの支配下に配置されるｐｄＣである。例えば、Ｌｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：７１２（１９９１）；およびＬｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５−５００（１９９８）を参照のこと。適切な宿主細胞は、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントをコードするＤＮＡを用いて形質転換され得るか、またはトランスフェクトされ得、そして、そのポリペプチドの発現および分泌のために使用され得る。代表的に使用される宿主細胞としては、不死のハイブリドーマ細胞、ミエローマ細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。
【０１１３】
完全にインタクトな野生型Ｆｃ領域は、通常、本発明の方法において使用されるＦｃ融合タンパク質において不必要かつ望まれないエフェクター機能を示す。ゆえに、代表的には、ある特定の結合部位が、分泌カセットの構築中にＦｃ領域から欠失される。例えば、軽鎖との共発現が不必要であるので、重鎖結合タンパク質に対する結合部位であるＢｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ８：１１１−１４（１９８７））は、免疫融合物の有効な分泌を妨害しないように、ＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから欠失される。ＩｇＭに存在するような膜貫通ドメイン配列もまた、通常欠失される。
【０１１４】
ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を使用することが最も多い。あるいは、免疫グロブリンガンマの他のサブクラス（ガンマ−２、ガンマ−３およびガンマ−４）のＦｃ領域を、分泌カセットにおいて使用することができる。免疫グロブリンガンマ−１のＩｇＧ１  Ｆｃ領域が、通常、分泌カセットにおいて使用され、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域のうちの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンガンマ−１のＦｃ領域は、ヒンジ領域およびＣＨ３領域の一部を含んでいるが、ＣＨ２領域を含んでいない、ＣＨ２欠失Ｆｃである。ＣＨ２欠失Ｆｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  １：４７（１９９０）によって報告されている。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭのうちの１つのＦｃ領域が使用される。
【０１１５】
ＮｇＲ−ポリペプチド−部分−Ｆｃ融合タンパク質は、いくつかの異なる配置で構築され得る。１つの配置において、ＮｇＲポリペプチド部分のＣ末端は、Ｆｃヒンジ部分のＮ末端に直接融合される。わずかに異なる配置では、短いポリペプチド、例えば、２〜１０アミノ酸が、ＮｇＲポリペプチド部分のＮ末端とＦｃ部分のＣ末端との融合物に組み込まれる。代替の配置では、短いポリペプチドは、ＮｇＲポリペプチド部分のＣ末端とＦｃ部分のＮ末端との融合物に組み込まれる。この配置の例示的な実施形態は、Ｆｃに連結されている（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２（配列番号１９）に連結された配列番号２のアミノ酸２６−３１０であるＮｇＲ１（３１０）−２ＸＧ４Ｓ−Ｆｃである。そのようなリンカーは、いくつかの状況において生物学的活性を改善し得る配座的可撓性を提供する。ヒンジ領域の十分な部分が、Ｆｃ部分内に保持されている場合、ＮｇＲ−ポリペプチド−部分−Ｆｃ融合物は、二量体化するので、二価の分子が形成される。単量体のＦｃ融合物の均一な集団は、単一特異的な二価の二量体をもたらす。各々が異なる特異性を有する２つの単量体のＦｃ融合物の混合物は、二重特異的な二価の二量体をもたらす。
【０１１６】
対応するアミノ反応基およびチオール反応基を含む多くの架橋剤のいずれかを使用することにより、本発明のＮｇＲポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを血清アルブミンに連結することができる。適当なリンカーの例としては、チオール反応性マレイミド、例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳおよびＧＭＢＳを挿入するアミン反応性架橋剤が挙げられる。他の適当なリンカーは、チオール反応性ハロアセテート基、例えば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢを挿入する。還元可能な連結をもたらす、スルフヒドリル基との反応用の保護チオールまたは非保護チオールを提供するリンカーとしては、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡおよびＳＡＴＰが挙げられる。そのような試薬は、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。
【０１１７】
結合体化は、本発明のＮｇＲポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントのＮ末端または血清アルブミン上のチオール部分を含むものでなくてもよい。例えば、ＮｇＲ−ポリペプチド−アルブミン融合物は、遺伝子操作技術を使用して得ることができ、ここで、そのＮｇＲポリペプチド部分は、そのＮ末端、Ｃ末端または両方において血清アルブミン遺伝子に融合される。
【０１１８】
本発明のＮｇＲポリペプチドは、ポリペプチドタグに融合され得る。用語「ポリペプチドタグ」は、本明細書中で使用されるとき、ＮｇＲポリペプチドに付着され得るか、接続され得るか、または連結され得、かつ、ＮｇＲポリペプチドを同定するためか、精製するためか、濃縮するためか、または単離するために使用され得るアミノ酸の任意の配列を意味すると意図される。ＮｇＲポリペプチドへのポリペプチドタグの付着は、例えば、（ａ）ポリペプチドタグをコードする核酸配列および（ｂ）ＮｇＲポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を構築することによって生じ得る。例示的なポリペプチドタグとしては、例えば、翻訳後修飾を受けることができるアミノ酸配列、例えば、ビオチン化されるアミノ酸配列が挙げられる。他の例示的なポリペプチドタグとしては、例えば、抗体（またはそのフラグメント）または他の特異的に結合する試薬によって、認識され得るアミノ酸配列および／または結合され得るアミノ酸配列が挙げられる。抗体（またはそのフラグメント）または他の特異的に結合する試薬によって認識され得るポリペプチドタグとしては、例えば、「エピトープタグ」として当該分野で公知のポリペプチドタグが挙げられる。エピトープタグは、天然または人工のエピトープタグであり得る。天然および人工のエピトープタグは、当該分野で公知であり、例えば、人工エピトープ（例えば、ＦＬＡＧ、Ｓｔｒｅｐまたはポリヒスチジンペプチド）が挙げられる。ＦＬＡＧペプチドは、配列Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号２７）またはＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号２８）を含む（Ｅｉｎｈａｕｅｒ，Ａ．および  Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ，Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４９：１−３：４５５−４６５（２００１））。Ｓｔｒｅｐエピトープは、配列Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号２９）を有する。ＶＳＶ−Ｇエピトープもまた使用され得、配列Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（配列番号３０）を有する。別の人工エピトープは、６つのヒスチジン残基（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号３１）を有するポリＨｉｓ配列である。天然に存在するエピトープとしては、モノクローナル抗体１２ＣＡ５によって認識されるインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号３２）（Ｍｕｒｒａｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９：１７０−１７９（１９９５））およびモノクローナル抗体９Ｅ１０によって認識されるヒトｃ−ｍｙｃ（Ｍｙｃ）由来の１１アミノ酸配列（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号３３）（Ｍａｎｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ  １６２：１２９−１３４（１９９５））が挙げられる。別の有用なエピトープは、モノクローナル抗体ＹＬ１／２によって認識されるトリペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅである（Ｓｔａｍｍｅｒｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８３：２９８−３０２（１９９１））。
【０１１９】
ある特定の実施形態において、ＮｇＲポリペプチドおよびポリペプチドタグは、連結アミノ酸配列を介して接続され得る。本明細書中で使用されるとき、「連結アミノ酸配列」は、１つ以上のプロテアーゼによって認識され得、かつ／または切断され得るアミノ酸配列であり得る。１つ以上のプロテアーゼによって認識され得、かつ／または切断され得るアミノ酸配列は、当該分野で公知である。例示的なアミノ酸配列は、以下のプロテアーゼ：ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、Ｘａ因子、ＡＰＣ、ｔ−ＰＡ、ｕ−ＰＡ、トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ、ペプシン、カテプシンＢ、Ｈ、Ｌ、Ｓ、Ｄ、カテプシンＧ、レニン、アンギオテンシン変換酵素、マトリクスメタロプロテアーゼ（コラゲナーゼ、ストロメライシン、ゼラチナーゼ）、マクロファージエラスターゼ、ＣｉｒおよびＣｉｓによって認識されるアミノ酸配列である。上述のプロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列は、当該分野で公知である。ある特定のプロテアーゼによって認識される例示的な配列は、例えば、米国特許第５，８１１，２５２号に見られる。
【０１２０】
ポリペプチドタグは、市販のクロマトグラフィ媒体を使用する精製を容易にし得る。
【０１２１】
本発明のいくつかの実施形態において、ＮｇＲポリペプチド融合構築物は、細菌におけるＮｇＲポリペプチド部分の産生を増大させるために使用される。そのような構築物において、高いレベルで通常発現かつ／または分泌される細菌のタンパク質は、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントのＮ末端の融合パートナーとして使用される。例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ  ６７：３１（１９８８）；Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８）；Ｌａ  Ｖａｌｌｉｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１８７（１９９３）を参照のこと。
【０１２２】
適当な融合パートナーのアミノ末端およびカルボキシ末端においてＮｇＲポリペプチド部分を融合することによって、本発明のＮｇＲポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの二価型または四価型を得ることができる。例えば、ＮｇＲポリペプチド部分をＩｇ部分のアミノ末端およびカルボキシ末端に融合することにより、２つのＮｇＲポリペプチド部分を含む二価の単量体ポリペプチドが生成され得る。Ｉｇ部分によってこれらのモノマーの２つを二量体化すると、ＮｇＲポリペプチドの四価型が得られる。そのような多価型を使用することにより、標的に対する高い結合親和性が達成され得る。本発明のＮｇＲポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの多価型は、ＮｇＲポリペプチド部分をタンデムで配置させてコンカテマーを形成することによっても得ることができ、それは、単独で使用され得るか、またはＩｇもしくはＨＳＡなどの融合パートナーに融合され得る。
【０１２３】
結合体化されるポリマー（ポリペプチド以外）
本発明のいくつかの実施形態は、本発明のＮｇＲポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを含み、ここで、１つ以上のポリマーが、そのＮｇＲポリペプチドに結合体化（共有結合的に連結）されている。そのような結合体化に適したポリマーの例としては、ポリペプチド（上に記載した）、糖ポリマーおよびポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。代表的には、必ずしもそうであるわけではないが、ポリマーは、以下：溶解性、安定性またはバイオアベイラビリティの１つ以上を改善する目的で、本発明のＮｇＲポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントに結合体化されている。
【０１２４】
本発明のＮｇＲポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントへの結合体化に通常使用されるポリマーのクラスは、ポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、最も頻繁に使用される。ＰＥＧ部分、例えば、１、２、３、４または５個のＰＥＧポリマーは、各ＮｇＲポリペプチドに結合体化されることにより、ＮｇＲポリペプチド単独と比べて血清半減期が増大し得る。ＰＥＧ部分は、非抗原性であり、かつ、本質的に生物学的に不活性である。本発明の実施において使用されるＰＥＧ部分は、分枝状であっても非分枝状であってもよい。
【０１２５】
ＮｇＲポリペプチドに付着されるＰＥＧ部分の数および個別のＰＥＧ鎖の分子量は、変化し得る。通常、ポリマーの分子量が高いほど、ポリペプチドに付着されるポリマー鎖は、少ない。通常、ＮｇＲポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントに付着されるポリマー質量全体は、２０ｋＤａから４０ｋＤａである。従って、１つのポリマー鎖が付着される場合、その鎖の分子量は、一般に、２０〜４０ｋＤａである。２本の鎖が付着される場合、各鎖の分子量は、一般に１０〜２０ｋＤａである。３本の鎖が付着される場合、その分子量は、一般に７〜１４ｋＤａである。
【０１２６】
ポリマー、例えば、ＰＥＧは、ポリペプチド上の任意の適当な、露出されている反応基を介してＮｇＲポリペプチドに連結され得る。その露出されている反応基は、例えば、Ｎ末端のアミノ基もしくは内部のリシン残基のイプシロンアミノ基またはその両方であり得る。活性化されたポリマーは、ＮｇＲポリペプチド上の任意の遊離アミノ基において反応し得、そして共有結合的に連結され得る。ＮｇＲポリペプチドの（利用可能な場合）、遊離カルボキシル基、適当に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化された炭水化物部分およびメルカプト基もまた、ポリマー付着のための反応基として使用され得る。
【０１２７】
結合体化反応では、ポリペプチド濃度に応じて、ポリペプチド１モルあたり約１．０〜約１０モルの活性化ポリマーが、本質的に使用される。通常、選択される比は、ＮｇＲポリペプチド部分の所望の薬理学的活性を損ないうる副反応（非特異的なことが多い）を最小限にしつつ、その結合体化反応を最大にするバランスを表している。好ましくは、ＮｇＲポリペプチドの生物学的活性の少なくとも５０％（例えば、本明細書中に記載されるか、または当該分野で公知のアッセイのいずれかにおいて証明される）が保持され、最も好ましくは、ほぼ１００％が保持される。
【０１２８】
上記ポリマーは、従来の化学を使用してＮｇＲポリペプチドに結合体化され得る。例えば、ポリアルキレングリコール部分は、ＮｇＲポリペプチドのリシンイプシロンアミノ基につながれ得る。リシン側鎖の連結は、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル（例えば、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）およびプロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＡ−ＰＥＧ））を用いて行われ得る。適当なポリアルキレングリコール部分としては、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳおよびノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣが挙げられる。これらの試薬は、市販されている。さらなるアミン反応性ＰＥＧリンカーは、スクシンイミジル部分で置換され得る。これらとしては、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカーボネート（ＰＮＰ）、エポキシド、ベンゾトリアゾールカーボネート、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾールおよびＰＮＰカーボネートが挙げられる。通常、条件は、選択性および反応の程度を最大にするように最適化される。反応条件のそのような最適化は、当該分野の通常の技術範囲内である。
【０１２９】
ＰＥＧ化は、当該分野で公知のＰＥＧ化反応のいずれかによって行われ得る。例えば、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０，１９９２および欧州特許出願ＥＰ０１５４３１６およびＥＰ０４０１３８４を参照のこと。ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）を用いるアシル化反応またはアルキル化反応を使用して行われ得る。
【０１３０】
アシル化によるＰＥＧ化は、通常、ポリエチレングリコールの活性なエステル誘導体の反応を含む。任意の反応性のＰＥＧ分子が、ＰＥＧ化において使用され得る。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化されたＰＥＧが、頻繁に使用される活性化されたＰＥＧエステルである。本明細書中で使用されるとき、「アシル化」としては、治療的なタンパク質と水溶性ポリマーとの以下のタイプの連結（例えば、ＰＥＧ：アミド、カルバメート、ウレタンなど）が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４を参照のこと。反応パラメータは、通常、ＮｇＲポリペプチドに損傷を与え得るか、またはＮｇＲポリペプチドを不活性化させ得る温度、溶媒およびｐＨの条件を回避するように選択される。
【０１３１】
一般に、接続する連結は、アミドであり、代表的には、生じる生成物の少なくとも９５％は、モノ−、ジ−またはトリ−ＰＥＧ化される。しかしながら、ＰＥＧ化の程度が高いいくつかの種は、使用される特定の反応条件に応じた量で形成され得る。必要に応じて、精製されたＰＥＧ化種が、混合物、特に、未反応種から、従来の精製方法（例えば、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、疎水性交換クロマトグラフィおよび電気泳動が挙げられる）によって分離される。
【０１３２】
アルキル化によるＰＥＧ化は、一般に、還元剤の存在下における、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体と、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントとの反応を含む。さらに、実質的にＮｇＲポリペプチドのＮ末端のアミノ基においてのみＰＥＧ化を促進する（すなわち、モノ−ＰＥＧ化タンパク質）ように反応条件を操作することができる。モノＰＥＧ化またはポリＰＥＧ化のいずれかの場合において、ＰＥＧ基は、代表的には、−ＣＨ２−ＮＨ−基を介してタンパク質に付着される。−ＣＨ２−基に特に関連して、このタイプの連結は、「アルキル」連結として知られる。
【０１３３】
Ｎ末端に標的化され、モノＰＥＧ化された生成物を生成するための還元アルキル化を介する誘導体化は、誘導体化に利用可能な異なるタイプの１級アミノ基（Ｎ末端に対するリシン）の特異な反応性を利用する。その反応は、そのタンパク質のリシン残基のイプシロン−アミノ基とＮ末端のアミノ基のイプシロン−アミノ基との間のｐＫａの差を利用することができるｐＨにおいて行われる。そのような選択的な誘導体化によって、反応基（例えば、アルデヒド）を含む水溶性ポリマーの、タンパク質への付着が制御される：上記ポリマーを用いた結合体化は、主にタンパク質のＮ末端において生じ、他の反応基（例えば、リシン側鎖アミノ基）の重大な改変は、生じない。
【０１３４】
アシル化とアルキル化の両方のアプローチにおいて使用されるポリマー分子は、水溶性ポリマーから選択される。選択されるポリマーは、代表的には、単一の反応基（例えば、アシル化に対しては活性なエステルまたはアルキル化に対してはアルデヒド）を有するように改変され、本方法において提供される重合の程度が制御され得る。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（水安定性である）もしくはモノＣ１−Ｃ１０アルコキシまたはそれらのアリールオキシ誘導体である（例えば、Ｈａｒｒｉｓら、米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。そのポリマーは、分枝状であっても、非分枝状であってもよい。アシル化反応のために選択されるポリマーは、代表的には単一の反応性エステル基を有する。還元アルキル化のために、選択されるポリマーは、代表的には単一の反応性アルデヒド基を有する。一般に、水溶性ポリマーは、天然に存在するグリコシル残基から選択されない。なぜなら、これらは、通常、哺乳動物の組換え発現系によって、便利に作製されるからである。
【０１３５】
本発明のＰＥＧ化されたＮｇＲポリペプチドを調製するための方法は、一般に、（ａ）分子が１つ以上のＰＥＧ基に付着するようになる条件下で、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントと、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性のエステル誘導体またはアルデヒド誘導体）とを反応させる工程および（ｂ）反応産物を得る工程を包含する。一般に、アシル化反応のための最適な反応条件は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて個別的に決定される。例えば、タンパク質に対してＰＥＧの比が大きいほど、通常は、ポリＰＥＧ化された生成物のパーセンテージが高くなる。
【０１３６】
モノポリマー／ＮｇＲポリペプチドの実質的に均一な集団を生成する還元アルキル化は、一般に：（ａ）還元アルキル化条件下で、ＮｇＲのＮ末端のアミノ基の選択的な改変を可能にするのに適したｐＨにおいて、本発明のＮｇＲ１ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントと、反応性ＰＥＧ分子とを反応させる工程；および（ｂ）反応産物を得る工程を包含する。
【０１３７】
モノポリマー／ＮｇＲポリペプチドの実質的に均一な集団に対する還元アルキル化反応条件は、本発明のＮｇＲポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントのＮ末端への水溶性ポリマー部分の選択的な付着を可能にする条件である。そのような反応条件は、一般に、リシン側鎖アミノ基とＮ末端のアミノ基との間にｐＫａの差をもたらすものである。本発明の目的では、ｐＨは、通常、３〜９の範囲、代表的には３〜６の範囲である。
【０１３８】
本発明のＮｇＲポリペプチドは、タグ、例えば、タンパク質分解によって後で放出され得る部分を含み得る。従って、リシンとＮ末端の両方と反応する低分子量のリンカー（例えば、トラウト（Ｔｒａｕｔ’ｓ）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））で改変されたＨｉｓ−タグを最初に反応させ、次いでそのＨｉｓタグを放出させることによって、リシン部分を選択的に改変することができる。その結果、そのポリペプチドは、チオール反応性頭部基（例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基または遊離ＳＨもしくは保護ＳＨ）を含むＰＥＧを用いて選択的に改変され得る遊離ＳＨ基を含むことになる。
【０１３９】
トラウト試薬を、ＰＥＧ付着に対する特定の部位を設ける任意のリンカーと置き換えることができる。例えば、トラウト試薬を、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡまたはＳＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に置き換えることができる。同様に、そのタンパク質を、マレイミドを挿入するアミン反応性リンカー（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳまたはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基を挿入するアミン反応性リンカー（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）またはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーと反応させることができ、そして、得られた生成物を、遊離ＳＨを含むＰＥＧと反応させることができる。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、ポリアルキレングリコール部分は、ＮｇＲポリペプチドのシステイン基に結合される。結合は、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基またはチオール基を使用して達成され得る。
【０１４１】
必要に応じて、ＮｇＲポリペプチドは、不安定な結合を介してポリエチレン−グリコール部分に結合体化される。この不安定な結合は、例えば、生化学的な加水分解、タンパク質分解またはスルフヒドリル切断において、切断され得る。例えば、この結合は、インビボ（生理学的）条件下で切断され得る。
【０１４２】
反応基が、Ｎ末端のアルファアミノ基上に存在する場合、上記反応は、一般に、生物学的に活性な材料と不活性なポリマーとを反応させるために使用される任意の適当な方法によって、約ｐＨ５−８、例えば、ｐＨ５、６、７，または８において、生じ得る。一般に、そのプロセスは、活性化されたポリマーを調製する工程、およびその後、タンパク質をその活性化されたポリマーと反応させることによって、製剤に適した可溶性タンパク質を生成する工程を含む。
【０１４３】
本発明の核酸分子
ヒトＮｏｇｏレセプター−１ポリヌクレオチドを配列番号１として以下に示す。
【０１４４】
全長ヒトＮｏｇｏレセプター−１は、配列番号１のヌクレオチド１６６からヌクレオチド１５８７によってコードされる：
【０１４５】
【化８】
2010502623.tif 000012
ラットＮｏｇｏレセプター−１ポリヌクレオチドを配列番号３として以下に示す。
【０１４６】
【化９】
2010502623.tif 000013
マウスＮｏｇｏレセプター−１ポリヌクレオチドを配列番号５として以下に示す。
【０１４７】
全長マウスＮｏｇｏレセプター−１は、配列番号５のヌクレオチド１７８からヌクレオチド１５９９によってコードされる：
【０１４８】
【化１０】
2010502623.tif 000014
本発明は、本発明の列挙されたポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、その核酸は、配列番号７および９に示されるようなＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸残基２６−３４４または配列番号９に示されるようなＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸残基２７−３４４からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、その核酸分子は、配列番号８および１０に示されるようなＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸残基２６−３１０または配列番号１０に示されるようなＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸残基２７−３１０からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。本明細書中で使用されるとき、「核酸」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびアンチセンス分子、ならびに、天然の起源に由来するものであるか合成されたものであるかに関係なく、代替の骨格に基づくか、または代替の塩基を含む核酸を意味する。いくつかの実施形態において、その核酸は、転写プロモーターおよび必要に応じてシグナル配列をさらに含み、それらの各々は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号７および９に示されるようなＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸残基２６−３４４または配列番号９のアミノ酸残基２７−３４４ならびに配列番号８および１０に示されるようなＮｏｇｏレセプター−１のアミノ酸残基２６−３１０または配列番号１０のアミノ酸残基２７−３１０からなる群から選択されるポリペプチドを含む融合タンパク質を含む本発明のＮｏｇｏレセプター−１融合タンパク質をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態において、Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質をコードする核酸は、転写プロモーターおよび必要に応じてシグナル配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのヌクレオチド配列は、免疫グロブリン定常領域をさらにコードする。いくつかの実施形態において、その免疫グロブリン定常領域は、重鎖定常領域である。いくつかの実施形態において、そのヌクレオチド配列は、ヒンジ領域に連接された免疫グロブリン重鎖定常領域をさらにコードする。いくつかの実施形態において、その核酸は、Ｆｃをさらにコードする。いくつかの実施形態において、Ｎｏｇｏレセプター−１融合タンパク質は、Ｆｃフラグメントを含む。
【０１５１】
本発明のコード核酸は、診断目的および探索目的のために検出可能な標識を含むようにさらに改変され得る。種々のそのような標識は、当該分野で公知であり、本明細書中に記載されるコード分子とともに容易に使用され得る。適当な標識としては、ビオチン、放射標識されたヌクレオチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、当該分野で公知の標識のいずれかを使用して、標識されたコード核酸分子を得ることができる。
【０１５２】
本発明はまた、適度にストリンジェントな条件下または高ストリンジェンシー条件下において、本発明のポリペプチドのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドの非コーディング鎖または相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドを包含する。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする。ストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見られる。
【０１５３】
組成物
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドまたは融合タンパク質を含んでいる組成物を提供する。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでいる組成物を提供する。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、本発明は、作用部位への送達のために薬学的に使用され得る調製物中に、活性な化合物のプロセシングを促進する賦形剤および補助剤を含んでいる適当な薬学的に許容可能なキャリアを含み得る。非経口投与に適した製剤としては、水溶性型、例えば、水溶性の塩での活性な化合物の水溶液が挙げられる。さらに、適切な油性注射懸濁液として活性な化合物の懸濁液が、投与され得る。適当な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えば、ゴマ油または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を上げる物質（例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストラン）を含み得る。必要に応じて、その懸濁液は、安定剤も含み得る。リポソームもまた、細胞に送達するための本発明の分子を封入するために使用され得る。例示的な「薬学的に許容可能なキャリア」は、任意およびすべての、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤など（生理的に適合可能な水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである）ならびにそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、本組成物は、等張剤、例えば、糖、多価アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）または塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、本組成物は、湿潤剤などの薬学的に許容可能な物質または微量の補助剤（例えば、湿潤剤または乳化剤）、保存剤または緩衝液を含み、それらは、本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプターまたは融合タンパク質の有効期間または有効性を増大する。
【０１５６】
本発明の組成物は、例えば、液体、半固体および固体の剤形（例えば、液体の溶液（例えば、注射可能な溶液および注入可能な溶液）、分散液（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）または懸濁液）をはじめとした種々の形態であり得る。好ましい形態は、意図される投与様式および治療的な適用に左右される。１つの実施形態において、組成物は、注射可能または注入可能な溶液（例えば、他の抗体を用いてヒトを受動免疫するために使用される組成物に類似の組成物）の形態である。
【０１５７】
本組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソームまたは高い薬物濃度に適した他の秩序構造として製剤化され得る。一般に、分散液は、塩基性分散媒および上に列挙されたものから必要な他の成分を含む活性な化合物を滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌された注射可能溶液の調製用の滅菌された粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分および予め濾過滅菌された溶液由来の任意のさらなる所望の成分の粉末をもたらす真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、必要な粒径を維持することによって（分散の場合）、そして、界面活性剤を使用することによって、維持され得る。注射可能な組成物の長時間にわたる吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、活性な化合物は、迅速な放出から化合物を保護するキャリア（例えば、埋没物、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系をはじめとした制御放出型の製剤）を用いて調製され得る。生分解性で生体適合性のポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸）が使用され得る。そのような製剤を調製するための多くの方法に特許が与えられているか、または一般に当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７８）を参照のこと。
【０１５９】
本発明の薬学的組成物は、「治療有効量」または「予防的に有効な量」の本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質を含み得る。「治療有効量」とは、投薬時および必要な時間にわたって、所望の治療結果を達成するために有効な量のことを指す。可溶性ＮｏｇｏレセプターポリペプチドまたはＮｏｇｏレセプター融合タンパク質の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重などの因子に応じて変化し得る。治療有効量は、可溶性ＮｏｇｏレセプターポリペプチドまたはＮｏｇｏレセプター融合タンパク質の任意の有毒作用または有害作用を治療的に有益な効果が上回る量でもある。「予防的に有効な量」とは、投薬時および必要な時間にわたって、所望の予防的な結果を達成するために有効な量のことを指す。代表的には、予防的な用量は、疾患の前または初期に被験体において使用されるので、予防的に有効な量は、治療有効量よりも少ない。
【０１６０】
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的な応答）を提供するように調整され得る。例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、時間をかけていくつかの分割量を投与してもよいし、治療状況の危急が示されるのに合わせてその用量を比例的に減少または増加させてもよい。投与を簡便にするために単位剤形で非経口組成物を製剤化することが特に有益であり、均一な単位剤形とは、本明細書中で使用されるとき、処置される哺乳動物被験体に対する単位投薬量として適した物理的に別々の単位のことを指し、各単位は、必要な薬学的キャリアと併せて所望の治療的な効果をもたらすように計算された所定の量の活性な化合物を含んでいる。本発明の単位剤形に対する規格は、（ａ）可溶性レセプターポリペプチドまたはＮｏｇｏレセプター融合タンパク質の特有の特徴および達成されるべき特定の治療的または予防的な効果、ならびに（ｂ）個体における感度を処置するためにそのような可溶性レセプターポリペプチドまたはＮｏｇｏレセプター融合タンパク質を調合する技術において固有の制限によって規定され、そして、それらに直接左右される。いくつかの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドに対する治療的に有効な用量範囲は、０．００１〜１０ｍｇ／Ｋｇ／日である。いくつかの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドに対する治療的に有効な用量範囲は、０．０１〜１ｍｇ／Ｋｇ／日である。いくつかの実施形態において、可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドに対する治療的に有効な用量範囲は、０．０５〜０．５ｍｇ／Ｋｇ／日である。
【０１６１】
本発明の可溶性ＮｇＲ１レセプターポリペプチドを用いた処置に対して、投薬量は、例えば、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲、およびより通常は０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）であり得る。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得るか、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記の範囲の用量の中間値もまた、本発明の範囲内であると意図される。被験体は、そのような用量を毎日、１日おきに（ｏｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｄａｙｓ）、毎週投与され得るか、または経験的な分析によって決定された他の任意のスケジュールに従って投与され得る。例示的な処置は、長期間、例えば、少なくとも６ヶ月にわたる複数回投与量での投与を必要とする。さらなる例示的な処置レジメンは、２週間に１回または１ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の投与を必要とする。例示的な投薬スケジュールとしては、連続した日程での１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきの３０ｍｇ／ｋｇまたは毎週の６０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。
【０１６２】
いくつかの方法では、２つ以上の可溶性ＮｇＲ１レセプターポリペプチドまたは融合タンパク質が同時に投与され、この場合、投与されるポリペプチドまたは融合タンパク質の各々の投薬量は、示された範囲内に入る。補充的な活性な化合物もまた、本発明の方法において使用される組成物に組み込まれ得る。例えば、ＮｇＲポリペプチドまたは融合タンパク質は、１つ以上のさらなる治療薬（例えば、アドレナリン作用薬；抗アドレナリン作用薬、抗アンドロゲン剤、抗狭心症薬、抗不安剤、抗痙攣剤、抗うつ剤、抗てんかん薬、抗高脂血症薬、抗高リポタンパク血症薬、抗高血圧薬、抗炎症剤、抗強迫神経症薬、抗パーキンソン病薬、抗精神病薬、副腎皮質ステロイド；副腎皮質抑制剤；アルドステロンアンタゴニスト；アミノ酸；アナボリックステロイド；蘇生薬；アンドロゲン；血糖制御因子；心保護剤；心臓血管系薬剤；コリンアゴニストまたはコリンアンタゴニスト；コリンエステラーゼの不活性化剤またはインヒビター、認知補助剤または認知増強剤；ドーパミン作動性；酵素インヒビター、エストロゲン、遊離酸素ラジカルスカベンジャー；ＧＡＢＡアゴニスト；グルタミン酸塩アンタゴニスト；ホルモン；コレステロール低下剤；抗高脂血症薬；降圧薬；免疫剤；免疫賦活薬；モノアミンオキシダーゼインヒビター、神経保護薬；ＮＭＤＡアンタゴニスト；ＡＭＰＡアンタゴニスト、競合性または非競合性のＮＭＤＡアンタゴニスト；オピオイドアンタゴニスト；カリウムチャネル開口薬；非ホルモンステロール誘導体；脳卒中後および頭部外傷後の処置；プロスタグランジン；向精神薬；弛緩剤；鎮静剤；催眠鎮静剤；選択的アデノシンアンタゴニスト；セロトニンアンタゴニスト；セロトニンインヒビター；選択的セロトニン取り込みインヒビター；セロトニンレセプターアンタゴニスト；ナトリウムチャネル遮断薬およびカルシウムチャネル遮断薬；ステロイド；刺激剤；および甲状腺ホルモンならびにインヒビター剤）と共製剤化および／または同時投与され得る。
【０１６３】
本発明の実施形態において、ＮｇＲポリペプチドまたは融合タンパク質は、中枢神経系に対して末梢に送達される。「中枢神経系に対して末梢」は、ＮｇＲポリペプチドが中枢神経系に直接、例えば脳室内またはクモ膜下に投与される投与経路以外の、任意の投与経路を包含する。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、ＮｇＲポリペプチドまたは融合タンパク質は、経口投与；経鼻投与；非経口投与；経皮的投与；局所的投与；眼内投与；気管支内投与；腹腔内投与；静脈内投与；皮下投与；筋肉内投与；およびこれらの投与経路の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される経路によって投与される。１つの実施形態において、ＮｇＲポリペプチドまたは融合タンパク質は、皮下に投与される。
【０１６５】
非経口注射可能投与は、一般に、皮下、筋肉内または静脈内の注射および注入のために使用される。さらに、非経口投与に対する１つのアプローチは、持続放出または徐放の系の埋没物を使用し、この埋没物は、米国特許第３，７１０，７９５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）によれば確実に一定レベルの投薬量を維持する。
【０１６６】
本発明は、水溶液のボーラス注射または制御放出系の埋没をはじめとした、選択された標的組織へのＮｇＲポリペプチドまたは融合タンパク質に適した任意の送達方法を包含する。制御放出型埋没物の使用によって、反復注射の必要が減少する。
【０１６７】
本組成物はまた、本化合物に適した送達系または支援システムとして機能する生体適合性のキャリア材料中に分散された本発明のＮｇＲポリペプチドまたは融合タンパク質を含み得る。徐放キャリアの適当な例としては、成形品（例えば、坐剤またはカプセル）の形態での半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。埋没可能な、またはマイクロカプセル徐放型のマトリックスとしては、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，３１９号；ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２１１（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【０１６８】
本発明のベクター
可溶性ＮｇＲポリペプチドをコードする核酸を含んでいるベクターは、本発明の方法において使用するための可溶性ポリペプチドを生成するために使用され得る。そのような核酸が作動可能に連結されているベクターおよび発現調節配列の選択は、所望の機能的な特性、例えば、タンパク質発現および形質転換される宿主細胞に左右される。代表的な実施形態において、本明細書中に記載される方法において有用な可溶性ＮｇＲポリペプチドは、そのタンパク質をコードする外来性核酸を有する細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）によって産生される組換えタンパク質である。他の実施形態において、組換えポリペプチドは、遺伝子活性化として通常知られているプロセスによって産生され、ここで、プロモーターまたはエンハンサーを含む外来性核酸を有する細胞は、そのポリペプチドをコードする内在性の核酸に作動可能に連結される。
【０１６９】
組換えポリペプチド（例えば、組換え可溶性ＮｇＲポリペプチド）を作製するための通例の技術は、適切な転写／翻訳の制御シグナルおよびタンパク質コード配列を使用して目的のポリペプチドをコードする発現ベクターを構築するために使用され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ２００１）を参照のこと）。これらの方法は、インビトロにおける組換えＤＮＡおよび合成技術ならびにインビボにおける組換え、例えば、インビボ相同組換えを包含し得る。ポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、ポリペプチドコード配列に作動可能に連結されている第２の核酸配列によって制御され得、そのポリペプチドは、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主内で発現される。
【０１７０】
作動可能に連結されたコード配列の発現の制御に有用な発現調節エレメントは、当該分野で公知である。例としては、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナルおよび他の調節エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。誘導性プロモーターが使用されるとき、例えば、宿主細胞の培地中の養分状態の変化または温度の変化によって、そのプロモーターは、制御され得る。
【０１７１】
ポリペプチドをコードする核酸を含んでいる細菌宿主または真核生物宿主において複製されることができる発現ベクターを使用して宿主をトランスフェクトし、それにより、そのような核酸の発現が指示されることによって、ポリペプチドが生成され、次いで、そのポリペプチドが単離され得る。好ましい哺乳動物の発現ベクターは、細菌内でのベクターの増殖を促進する原核生物配列と、真核細胞において発現される１つ以上の真核生物転写単位の両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適した哺乳動物発現ベクターの例である。外来性ＤＮＡ配列で細胞をトランスフェクトするための通常の技術が、本発明において使用され得る。トランスフェクション方法としては、化学的手段、例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランもしくはリポソーム；または物理的手段、例えば、マイクロインジェクションもしくはエレクトロポレーションが挙げられ得る。そのトランスフェクトされた細胞は、通常の技術によって生育される。例えば、Ｋｕｃｈｌｅｒら（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙを参照のこと。その発現産物は、そのタンパク質が宿主細胞または細胞懸濁液から分泌される系において、例えば、通例の力学的、化学的または酵素的な手段によって、宿主細胞系を破壊した後に、細胞培地から単離される。これらの方法はまた、遺伝子ターゲティングおよび遺伝子活性化をはじめとした他の手順によって遺伝的に改変された細胞を使用しても行われ得る（Ｔｒｅｃｏら、ＷＯ９５／３１５６０（本明細書中で参考として援用される）；Ｓｅｌｄｅｎら、ＷＯ９３／０９２２２もまた参照のこと）。
【０１７２】
そのベクターは、原核生物のレプリコン、すなわち、細菌の宿主細胞内における自己複製および染色体外での組換えＤＮＡ分子の維持を指示する能力を有するＤＮＡ配列、を含み得る。そのようなレプリコンは、当該分野で周知である。さらに、原核生物のレプリコンを含むベクターはまた、その発現によって検出可能マーカー（例えば、薬物耐性）が付与される遺伝子も含み得る。細菌の薬物耐性遺伝子の例は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する抵抗性を付与するものである。
【０１７３】
原核生物のレプリコンを含んでいるベクターはまた、細菌宿主細胞において遺伝子コード配列の発現を指示するための、原核生物またはバクテリオファージのプロモーターを含み得る。細菌宿主に適合したプロモーター配列は、代表的には、発現されるＤＮＡセグメントの挿入用の好都合な制限酵素認識部位を含んでいるプラスミドベクター内に提供される。そのようなプラスミドベクターの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の適当な原核生物の宿主は、本発明の方法において使用されるタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を発現するために使用され得る。
【０１７４】
本発明の目的のために、数多くの発現ベクター系が、使用され得る。例えば、ベクターの１つのクラスは、動物ウイルス（例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルス）から得られるＤＮＡエレメントを利用する。そのようなベクターの例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０６００８９およびＷＯ２００２／０５６９１８（これらは、その全体が本明細書中で参考として援用される）に見られる。他のものは、内部のリボソーム結合部位を含むポリシストロニック系の使用を含む。さらに、ＤＮＡを染色体に組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択され得る。そのマーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）、殺生物剤（例えば、抗生物質）耐性または重金属（例えば、銅）に対する抵抗性を提供し得る。その選択可能マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結され得るか、または同時形質転換によって同じ細胞内に導入され得る。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子は、選択可能マーカー遺伝子の例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））。さらなるエレメントがまた、ｍＲＮＡの最適な合成に必要とされ得る。これらのエレメントとしては、シグナル配列、スプライスシグナルならびに転写プロモーター、エンハンサーおよび終結シグナルが挙げられ得る。
【０１７５】
１つの実施形態において、ＮＥＯＳＰＬＡと呼ばれるＢｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の専売の発現ベクター（米国特許第６，１５９，７３０号）が、使用され得る。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン１およびエキソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子ならびにリーダー配列を含む。このベクターは、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションされた後、Ｇ４１８含有培地中で選択され、そして、メトトレキサートで増幅されると、非常に高いレベルの発現をもたらすことが見出されている。当然のことながら、真核細胞において発現を誘発することができる任意の発現ベクターが、本発明において使用され得る。適当なベクターの例としては、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）ならびにプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる真核細胞発現ベクターが、当該分野で公知であり、市販されている。代表的には、そのようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントを挿入するための好都合な制限酵素認識部位を含む。例示的なベクターとしては、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ３１２５５）、レトロウイルス発現ベクターｐＭＩＧおよびｐＬＬ３．７、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５、ならびにＡＡＶベクターが挙げられる。他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
【０１７６】
一般に、適当に高いレベルのアンタゴニストを発現する細胞に対して多数の形質転換された細胞をスクリーニングすることは、例えば、ロボットシステムによって行われ得る通例の実験法である。
【０１７７】
上記組換え発現ベクターは、宿主細胞においてベクターの複製を制御する配列（例えば、複製開始点）および選択可能なマーカー遺伝子を有し得る。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に左右され得ることは、当業者によって認識される。哺乳動物の宿主細胞発現に対して頻繁に使用される制御配列としては、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント（例えば、レトロウイルスのＬＴＲ由来のプロモーターおよびエンハンサー）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄｍｌＰ））、ポリオーマおよび強力な哺乳動物プロモーター（例えば、天然の免疫グロブリンプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。ウイルスの調節エレメントおよびその配列に関するさらなる説明については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉ，米国特許第５，１６８，０６２号；Ｂｅｌｌ，米国特許第４，５１０，２４５号；およびＳｃｈａｆｆｎｅｒ，米国特許第４，９６８，６１５号を参照のこと。
【０１７８】
選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、Ａｘｅｌ，米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、代表的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に対して薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサート）に対する抵抗性を付与する。頻繁に使用される選択可能マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞において使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。
【０１７９】
可溶性ＮｇＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいるベクターは、適当な宿主細胞の形質転換に使用され得る。形質転換は、任意の適当な方法によるものであり得る。哺乳動物細胞内に外来性ＤＮＡを導入するための方法は、当該分野で周知であり、その方法としては、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入および核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入され得る。
【０１８０】
宿主細胞の形質転換は、使用されるベクターおよび宿主細胞に適した従来の方法によって達成され得る。原核生物の宿主細胞の形質転換に対しては、エレクトロポレーションおよび塩処理方法が、使用され得る（Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２１１０−１４（１９７２））。脊椎動物細胞の形質転換に対しては、エレクトロポレーション、陽イオン性脂質または塩処理方法が使用され得る。例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１３７３−７６（１９７９）を参照のこと。
【０１８１】
タンパク質発現に使用される宿主細胞株は、哺乳動物起源が最も好ましい；当業者は、宿主細胞中で発現される所望の遺伝子産物に最も適している特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力を備えていると認められている。例示的な宿主細胞株としては、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸部癌腫）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウスミエローマ）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞株は、代表的には、商業サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたは公開されている文献から入手可能である。
【０１８２】
産生細胞株からのポリペプチドの発現は、公知技術を使用して増大され得る。例えば、グルタミン合成酵素（ＧＳ）系は、ある特定の条件下で発現を増大させるために通常使用される。例えば、欧州特許番号０２１６８４６、０２５６０５５および０３２３９９７および欧州特許出願番号８９３０３９６４．４を参照のこと。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、本発明は、コード配列を含んでいる組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を提供する。本明細書中で使用されるとき、ｒＤＮＡ分子は、分子操作に供されたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を作製するための方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと。いくつかのｒＤＮＡ分子において、コードＤＮＡ配列は、発現調節配列およびベクター配列に作動可能に連結されている。本発明のベクターは、少なくとも、複製または宿主染色体への挿入、および好ましくは、そのｒＤＮＡ分子内に含まれている構造遺伝子の発現も指示することができる場合がある。
【０１８４】
真核細胞に適合可能な発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞と適合可能な発現ベクターもまた、コード配列を含むｒＤＮＡ分子を形成するために使用され得る。真核細胞発現ベクターは、当該分野で周知であり、いくつかの商業的供給源から入手可能である。代表的には、所望のＤＮＡセグメントの挿入に対して好都合な制限酵素認識部位を含んでいるベクターが、提供される。そのようなベクターの例は、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ（登録商標）３１２５５）および他の真核生物発現ベクターである。
【０１８５】
本発明のｒＤＮＡ分子を構築するために使用される真核細胞発現ベクターは、真核細胞において有効な選択可能マーカー、好ましくは、薬物耐性選択マーカーをさらに含み得る。好ましい薬物耐性マーカーは、その発現がネオマイシン抵抗性をもたらす遺伝子、すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））。あるいは、選択可能マーカーは、別個のプラスミド上に存在し得、その２つのベクターは、宿主細胞を同時にトランスフェクションすることによって導入され、そしてトランスフェクタントを、その選択可能マーカーに対して適切な薬物中で培養することによって選択される。
【０１８６】
本発明の抗体または抗体部分を発現するために、軽鎖および重鎖の一部または全長をコードする遺伝子が転写および翻訳の調節配列に作動可能に連結されるようにその遺伝子のＤＮＡを発現ベクター内に挿入する。発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来のエピソームなどが挙げられる。上記抗体遺伝子は、ベクター内の転写および翻訳の調節配列が、その抗体遺伝子の転写および翻訳を制御する意図された機能を発揮するように、ベクター内にライゲーションされる。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用される発現宿主細胞と適合可能であるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別個のベクター内に挿入され得る。いくつかの実施形態において、両方の遺伝子は、同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的な制限酵素認識部位のライゲーションまたは制限酵素認識部位が存在しない場合は平滑末端のライゲーション）によって発現ベクター内に挿入される。
【０１８７】
好都合なベクターは、任意のＶＨ配列またはＶＬ配列が、上に記載されたように容易に挿入され得、そして発現され得るように操作された、適切な制限酵素認識部位を有する、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬの免疫グロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターにおいて、スプライシングは、挿入されたＪ領域におけるスプライス供与部位とヒトＣ領域の前に存在するスプライス受容部位との間、およびヒトＣＨエキソン内に存在するスプライス領域において、通常生じる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流の天然の染色体部位において生じる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。その抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるようにベクター内にクローニングされ得る。そのシグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【０１８８】
本発明の他の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを発現するためにレンチウイルスベクターを使用する。レンチウイルスは、非周期（ｎｏｎｃｙｃｌｉｎｇ）細胞および分裂終了細胞に感染し得、発生中にサイレンシングされないという利点も提供することから、胚性幹細胞の感染を介してトランスジェニック動物の作製が可能となる。Ｍｉｌｈａｖｅｔら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．５５：６２９−６４８（２００３）。他のポリヌクレオチド発現ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアルファウイルスに基づいて構築され得るがこれらに限定されない。
【０１８９】
本発明のポリヌクレオチドの転写は、真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）に対するプロモーターから駆動され得る。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからの転写物は、すべての細胞において高レベルで発現される；所与の細胞型における所与のｐｏｌ  ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に左右される。原核生物のＲＮＡポリメラーゼ酵素が、適切な細胞において発現されるとき、原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターも使用される（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６７４３−７（１９９０）；Ｇａｏ  および  Ｈｕａｎｇ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２８６７−７２（１９９３）；Ｌｉｅｂｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：４７−６６（１９９３）；Ｚｈｏｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４５２９−３７（１９９０））。一部の研究者は、そのようなプロモーターから発現されるポリヌクレオチドが、哺乳動物細胞において機能し得ることを証明した（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．２：３−１５（１９９２）；Ｏｊｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８０２−６（１９９２）；Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：４５８１−９（１９９２）；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６３４０−４（１９９３）；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４４１１−８（１９９２）；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９０：８０００−４（１９９３）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２２５９（１９９５）；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ＆  Ｃｅｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１５６６（１９９３））。
【０１９０】
本発明のタンパク質を組換え的に生成する宿主細胞および方法
本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチド、可溶性Ｎｏｇｏレセプター融合タンパク質をコードする核酸分子およびこれらの核酸分子を含んでいるベクターは、適当な宿主細胞を形質転換するために使用され得る。形質転換は、宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するための任意の公知の方法によるものであり得る。哺乳動物細胞内に異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は、当該分野で周知であり、その方法としては、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入および核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞内に導入され得る。
【０１９１】
本発明のｒＤＮＡ分子を用いた適切な細胞宿主の形質転換は、代表的には、使用されるベクターのタイプおよび使用される宿主系に左右される周知の方法によって達成される。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーションおよび塩処理方法が使用され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２１１０−２１１４（１９７２）を参照のこと）。ｒＤＮＡを含んでいるベクターを用いた脊椎動物細胞の形質転換に関しては、エレクトロポレーション、陽イオン性脂質または塩処理方法が使用され得る（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１３７３−１３７６（１９７９）を参照のこと）。
【０１９２】
首尾よく形質転換された細胞、すなわち、本発明のｒＤＮＡ分子を含んでいる細胞は、選択可能マーカーに対する選択をはじめとした周知の技術によって同定され得る。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入からもたらされる細胞をクローン化することにより、シングルコロニーが生成され得る。それらのコロニー由来の細胞を、回収し、溶解し、そして、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７（１９７５）によって報告されているような方法を使用して、ｒＤＮＡの存在についてそのＤＮＡ含有量を調べることができるか、またはその細胞から産生されるタンパク質を免疫学的方法によってアッセイすることができる。
【０１９３】
本発明の方法において使用するための本発明のポリペプチドまたは抗体を発現するための宿主細胞は、原核生物であってもよいし、真核生物であってもよい。発現のために宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で周知であり、そのような細胞株としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））から入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられる。これらとしては、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞および多くの他の細胞株が挙げられる。特定の好ましい細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有するかを決定することによって選択される。他の有用な真核生物宿主細胞としては、植物細胞が挙げられる。使用され得る他の細胞株は、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞株である。例示的な原核生物の宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓである。
【０１９４】
本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドおよび可溶性Ｎｏｇｏレセプター融合タンパク質をコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞に導入されるとき、
それらは、宿主細胞内での抗体、ポリペプチドおよび融合ポリペプチドの発現、またはより好ましくは、宿主細胞が生育している培養液への本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドおよび可溶性Ｎｏｇｏレセプター融合タンパク質の分泌を可能にするのに十分な時間にわたって宿主細胞を培養することによって産生される。本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドおよび可溶性Ｎｏｇｏレセプター融合タンパク質は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養液から回収され得る。
【０１９５】
さらに、産生細胞株からの本発明の本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドおよび可溶性Ｎｏｇｏレセプター融合タンパク質（またはそれらに由来する他の部分）の発現は、多くの公知技術を使用して増大され得る。例えば、グルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）は、ある特定の条件下において発現を増大させるための通常のアプローチである。ＧＳ系は、欧州特許番号０２１６８４６、０２５６０５５および０３２３９９７ならびに欧州特許出願番号８９３０３９６４．４の全体または一部に記載されている。
【０１９６】
本明細書中に記載されるような培養細胞によって産生されるポリペプチドは、分泌ポリペプチドとして培養液から回収され得るか、または、細胞によって分泌されない場合は、宿主細胞溶解産物から回収され得る。ポリペプチドを単離する際の第１工程として、一般に、培養液または溶解産物を遠心分離することにより、粒子状の細胞残屑を除去する。その後、ポリペプチドが単離され、そして好ましくは、可溶性タンパク質および他の細胞成分の混入物から精製され、以下の手順が、適当な精製手順の例示である：イムノアフィニティカラムまたはイオン交換カラムにおける分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ＤＥＡＥ）におけるクロマトグラフィ；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ  ＰＡＧＥ；硫安塩析；およびゲル濾過、例えば、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。精製中にタンパク分解性の分解を阻害するためにプロテアーゼインヒビターが使用され得る。当業者は、組換え細胞培養における発現時のポリペプチドの特性の変更の責任を負うために、目的のポリペプチドに適した精製方法が改変を必要とし得ることを認識する。
【０１９７】
ポリペプチドの精製には、例えば、アフィニティークロマトグラフィ、従来のイオン交換クロマトグラフィ、サイジングクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、ゲル濾過または他の従来のタンパク質精製技術の使用が必要とされ得る。例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２中の“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”を参照のこと。
【０１９８】
細胞治療
本発明のいくつかの実施形態において、可溶性ＮｇＲポリペプチドは：（１）可溶性ＮｇＲポリペプチドを発現する核酸（例えば、ベクター）を用いて、移植可能な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程；および（２）その形質転換された宿主細胞を、哺乳動物の疾患、障害または損傷の部位に移植する工程を包含する処置方法において投与される。例えば、形質転換された宿主細胞は、脊髄損傷の部位に移植され得る。本発明のいくつかの実施形態において、移植可能な宿主細胞は、哺乳動物から取り出され、一時的に培養され、可溶性ＮｇＲポリペプチドをコードする単離された核酸で形質転換またはトランスフェクトされ、そして、その細胞が取り出された同じ哺乳動物に移植して戻される。その細胞は、移植される同じ部位から取り出され得るが、そうである必要はない。時折エキソビボ遺伝子治療として知られるそのような実施形態は、ある限られた時間にわたって作用部位の部位に局在化される可溶性ＮｇＲポリペプチドの持続的な供給を提供し得る。
【０１９９】
遺伝子治療
可溶性ＮｇＲポリペプチドは、Ａβ蓄積の減少が治療的に有益であり得る疾患、障害または損傷を処置するための遺伝子治療アプローチを使用して、哺乳動物、例えば、ヒト患者において、インビボで産生され得る。これは、適当な発現調節配列に作動可能に連結された適当な可溶性ＮｇＲポリペプチドをコードする核酸の投与を含む。一般に、これらの配列は、ウイルスベクターに組み込まれる。そのような遺伝子治療適したウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、複製欠損ウイルスベクターであり得る。代表的には、Ｅ１遺伝子またはＥ３遺伝子内に欠失を有するアデノウイルスベクターが使用される。アデノウイルスベクターが使用されるとき、このベクターは、通常、選択マーカー遺伝子を有しない。そのようなベクターの例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０６００８９およびＷＯ２００２／０５６９１８に見られ、これらは、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０２００】
可溶性ＮｇＲポリペプチドの発現構築物は、インビボにおいて可溶性ＮｇＲポリペプチド遺伝子を細胞に効率的に送達することができる任意の生物学的に有効なキャリア、例えば、任意の製剤または組成物として投与され得る。アプローチは、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルス−１をはじめとしたウイルスベクターまたは組換え細菌プラスミドもしくは組換え真核生物プラスミド内への対象遺伝子の挿入を含む。ウイルスベクターは、細胞を直接トランスフェクトする；プラスミドＤＮＡは、例えば、陽イオン性リポソーム（リポフェクチン）または誘導体化（例えば、抗体結合体化）されたポリリジン結合体、グラマシジン（ｇｒａｍａｃｉｄｉｎ）Ｓ、人工的なウイルスエンベロープもしくは他のそのような細胞内キャリア、ならびに、遺伝子構築物の直接的な注射またはインビボにおいて行われるＣａＰＯ４沈殿の助けを用いて送達され得る。
【０２０１】
インビボにおいて細胞内に核酸を導入するための好ましいアプローチは、可溶性ＮｇＲポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）または可溶性ＮｇＲポリペプチドアンチセンス核酸を含んでいるウイルスベクターの使用によるものである。ウイルスベクターによる細胞の感染は、標的化された細胞の大部分がその核酸を受け取ることができるという利点を有する。さらに、ウイルスベクター内にコードされる分子、例えば、ウイルスベクター内に含まれているｃＤＮＡによってコードされる分子は、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞内で効率的に発現される。
【０２０２】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、インビボにおいて、特に、ヒトの中に、外来性遺伝子を移入するための組換え遺伝子送達系として使用され得る。これらのベクターは、遺伝子を細胞内に効率的に送達し、移入された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡ内に安定に組み込まれる。複製欠損レトロウイルスのみを産生する、特殊化された細胞株（「パッケージング細胞」と呼ばれる）の開発によって、遺伝子治療に対するレトロウイルスの有用性が高まり、また、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療目的のために遺伝子導入における用途に対して特徴付けられる。標準的な技術によるヘルパーウイルスの使用を介して標的細胞を感染させるために使用され得る複製欠損レトロウイルスは、ビリオン内にパッケージングされ得る。組換えレトロウイルスを作製するためおよびインビトロまたはインビボにおいてそのようなウイルスに細胞を感染させるためのプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ９．１０−９．１４および他の標準的な研究室のマニュアルに見られる。適当なレトロウイルスの例としては、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられ、これらは、当業者に公知である。エコトロピックレトロウイルス系とアンホトロピックレトロウイルス系の両方を調製するのに適したパッケージングウイルス株の例としては、．ｐｓｉ．Ｃｒｉｐ、．ｐｓｉ．Ｃｒｅ、．ｐｓｉ．２および．ｐｓｉ．Ａｍが挙げられる。レトロウイルスは、インビトロおよび／またはインビボにおいて上皮細胞をはじめとした多くの様々な細胞型に種々の遺伝子を導入するために使用されてきた（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３９５−１３９８；Ｄａｎｏｓ  および  Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙら（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１−６４７；Ｄａｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願ＷＯ９２���０７５７３を参照のこと）。
【０２０３】
本発明において有用な別のウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来のベクターを利用する。アデノウイルスのゲノムは、目的の遺伝子産物をコードし、発現するが、正常な溶菌ウイルスの生活環において複製する能力に関して不活性であるように操作され得る。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５を参照のこと。アデノウイルス株Ａｄ型５  ｄ１３２４または他のアデノウイルスの株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適当なアデノウイルスベクターは、当業者に公知である。組換えアデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができない点および上皮細胞をはじめとした多岐にわたる細胞型に感染するために使用され得る点においてある特定の状況において有益であり得る（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）前出）。さらに、そのウイルス粒子は、比較的安定であり、精製および濃縮に適しており、そして上記のとおり、感染性の範囲に影響を及ぼすように改変され得る。さらに、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含まれている外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれないが、エピソームとして残存することにより、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）内に組み込まれる、もとの位置における挿入突然変異誘発の結果として生じ得る潜在的な問題が回避される。さらに、外来ＤＮＡに対するアデノウイルスゲノムの運搬能力は、他の遺伝子送達ベクターと比べて大きい（最大８キロベース）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、前出；Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ  および  Ｇｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。
【０２０４】
対象遺伝子の送達に有用なさらに別のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。Ａｌｉ，２００４，Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ．２５５：１６５−７８；およびＬｕ，２００４，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．１３（１）：１３３−４５に概説されている。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および増殖性の生活環のためにヘルパーウイルスとして別のウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を必要とする天然に存在する欠陥ウイルスである（概説としてＭｕｚｙｃｚｋａら（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９を参照のこと）。アデノ随伴ウイルスは、そのＤＮＡを非分裂細胞内に組み込み得、そして高頻度の安定な組み込みを示す数少ないウイルスのうちの１つでもある（例えば、Ｆｌｏｔｔｅら（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６２：１９６３−１９７３を参照のこと）。ＡＡＶのわずか３００塩基対を含むベクターがパッケージングされ得、そして組み込み得る。外来性ＤＮＡのためのスペースは、約４．５ｋｂに限られている。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０に記載されているようなＡＡＶベクターを使用することにより、ＤＮＡを細胞に導入することができる。ＡＡＶベクターを使用して、種々の核酸が様々な細胞型に導入されてきた（例えばＨｅｒｍｏｎａｔら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９；およびＦｌｏｔｔｅら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０を参照のこと）。
【０２０５】
上で説明した方法などのウイルス移入方法に加えて、非ウイルス性の方法もまた、動物の組織において可溶性ＮｇＲポリペプチド、フラグメントまたはアナログの発現を引き起こすために使用され得る。遺伝子導入のほとんどの非ウイルス性の方法が、高分子の取り込みおよび細胞内輸送のために哺乳動物細胞によって使用される正常なメカニズムに依存している。好ましい実施形態において、本発明の非ウイルス遺伝子送達系は、標的化された細胞による対象ＮｇＲ遺伝子の取り込みに対して、エンドサイトーシスの経路に依存している。このタイプの例示的な遺伝子送達系としては、リポソームに由来する系、ポリリジン結合体および人工的なウイルスエンベロープが挙げられる。他の実施形態としては、Ｍｅｕｌｉら（２００１）Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１６（１）：１３１−１３５；Ｃｏｈｅｎら（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７（２２）：１８９６−９０５；またはＴａｍら（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７（２１）：１８６７−７４において記載されているようなプラスミド注入系が挙げられる。
【０２０６】
代表的な実施形態において、可溶性ＮｇＲポリペプチド、活性なフラグメントまたはアナログをコードする遺伝子は、表面上に正電荷を有し（例えば、リポフェクチン）、標的組織の細胞表面抗原に対する抗体を用いてタグ化されている（必要に応じて）、リポソーム内に封入され得る（Ｍｉｚｕｎｏら（１９９２）Ｎｏ  Ｓｈｉｎｋｅｉ  Ｇｅｋａ  ２０：５４７−５５１；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６３０９；日本国特許出願１０４７３８１；および欧州特許公開ＥＰ−Ａ−４３０７５）。
【０２０７】
臨床の状況では、治療的なＮｇＲ遺伝子に対する遺伝子送達系は、多くの方法のうちのいずれか（各々が当該分野で公知である）によって患者に導入され得る。例えば、遺伝子送達系の薬学的調製物は、全身性に、例えば、静脈内注射によって導入され得、標的細胞におけるタンパク質の特定の形質導入は、遺伝子送達ビヒクル、レセプター遺伝子の発現を制御する転写制御配列に起因する細胞型もしくは組織型の発現またはそれらの組み合わせによって提供されるトランスフェクションの特異性によって主に生じる。他の実施形態において、組換え遺伝子の最初の送達は限定され、動物への導入はかなり局在化されたものである。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、カテーテルによって（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位注射によって（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｓ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７）導入され得る。
【０２０８】
遺伝子治療構築物の薬学的調製物は、許容可能な希釈剤中の遺伝子送達系から本質的になり得るか、または遺伝子送達ビヒクルを吸収している緩効性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達系が、組換え細胞からインタクトでもたらされ得る場合（例えば、レトロウイルスベクター）、その薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。
【０２０９】
遺伝子治療、特に、本明細書中に記載されるようなＣＮＳの状態または障害を処置するための遺伝子治療に関する指導は、例えば、米国特許出願番号２００２／０，１９３，３３５（遺伝子治療ベクターまたは形質転換された細胞を神経組織に送達する方法を提供）；米国特許出願番号２００２／０，１８７，９５１（哺乳動物の脳または神経系における標的細胞に対するレンチウイルスベクターを使用して神経変性疾患を処置するための方法を提供）；米国特許出願番号２００２／０，１０７，２１３（遺伝子治療ビヒクルおよび神経変性疾患の処置および予防においてそれを使用するための方法を開示）；米国特許出願番号２００３／０，０９９，６７１（遺伝子をＣＮＳに送達するために適した変異型狂犬病ウイルスを開示）；および米国特許第６，４３６，７０８号（脳全体において長期間の発現をもたらす遺伝子送達系を開示）；米国特許第６，１４０，１１１号（種々の疾患の処置におけるヒト遺伝子治療に適したレトロウイルスベクターを開示）；ならびにＫａｓｐａｒら（２００２）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．５：５０−６；Ｓｕｈｒら（１９９９）Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．５６：２８７−９２；およびＷｏｎｇら（２００２）Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ５，６３３−６３９）に見られる。
【０２１０】
ｒＤＮＡ分子を使用した組換えタンパク質の産生
本発明は、本明細書中に記載される核酸分子を使用して、本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドおよび／または可溶性Ｎｏｇｏレセプター融合タンパク質を生成するための方法をさらに提供する。一般的には、タンパク質の組換え型の生成は、代表的には以下の工程を包含する：第１に、本発明のタンパク質をコードする核酸分子を得る。コード配列が、イントロンによって中断されていない場合、そのコード配列は、任意の宿主における発現に直接適している。そして、その核酸分子は、必要に応じて、上に記載されたような適当な調節配列と作動可能な連結に置かれることにより、タンパク質オープンリーディングフレームを含む発現単位を形成する。その発現単位を使用して、適当な宿主を形質転換し、そして、その形質転換された宿主を、組換えタンパク質の産生を可能にする条件下で培養する。必要に応じて、その組換えタンパク質は、培地または細胞から単離される；そのタンパク質の回収および精製は、いくらかの不純物が許容され得るいくつかの場合では必ずしも必要ではないかもしれない。
【０２１１】
前述の工程の各々は、種々の方法において行われ得る。例えば、所望のコード配列は、ゲノムフラグメントから得られ得、適切な宿主において直接使用され得る。種々の宿主において作動可能な発現ベクターの構築は、上に示したような適切なレプリコンおよび調節配列を使用して達成される。調節配列、発現ベクターおよび形質転換方法は、遺伝子を発現するために使用される宿主細胞のタイプに依存し、それらについては先に詳細に記述した。通常では利用可能でない場合、これらのベクターに挿入する切除可能な遺伝子を提供するように、適当な制限酵素認識部位がコード配列の末端に付加され得る。当業者は、本発明の核酸分子とともに使用するために当該分野で公知の任意の宿主／発現系を容易に適合させることにより、組換えタンパク質を産生することができる。
【０２１２】
可溶性ＮｇＲポリペプチド、融合タンパク質、ポリヌクレオチドおよび組成物を使用する方法
本発明の１つの実施形態は、哺乳動物においてＡβペプチドの血漿対脳の比を増大させるための方法を提供し、その方法は、治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを中枢神経系に対して末梢に投与する工程を包含する。
【０２１３】
本発明の別の実施形態は、哺乳動物の脳からＡβクリアランスを増大させるための方法を提供し、その方法は、治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを中枢神経系に対して末梢に投与する工程を包含する。
【０２１４】
本発明のさらなる実施形態は、哺乳動物において記憶機能を改善するか、または記憶喪失を阻害するための方法を提供し、その方法は、治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを中枢神経系に対して末梢に投与する工程を包含する。
【０２１５】
本発明の別の実施形態は、哺乳動物の脳においてＡβプラークの数を減少させる方法を提供し、その方法は、それを必要とする哺乳動物に治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで、前記投与は、中枢神経系に対して末梢である。
【０２１６】
本発明の別の実施形態は、哺乳動物の脳においてＡβプラークのサイズを減少させる方法を提供し、その方法は、それを必要とする哺乳動物に治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで、前記投与は、中枢神経系に対して末梢である。
【０２１７】
本発明の別の実施形態は、哺乳動物においてＡβプラーク蓄積に関連する疾患を処置する方法を提供し、その方法は、それを必要とする哺乳動物に治療有効量の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで、前記投与は、中枢神経系に対して末梢である。
【０２１８】
本発明の方法を使用して処置され得る疾患としては、アルツハイマー病、軽度の認知障害、軽度から中等度の認知障害、血管性痴呆、脳アミロイド血管症、遺伝性脳出血、老年痴呆、ダウン症候群、封入体筋炎、加齢性黄斑変性症、原発性アミロイドーシス、続発性アミロイドーシスまたはアルツハイマー病に関連する状態が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の方法を使用して処置され得るアルツハイマー病に関連する状態としては、甲状腺機能低下、脳血管疾患、循環器疾患、記憶喪失、不安、行動機能障害、神経学的状態または精神学的状態が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の方法を使用して処置され得る行動機能障害としては、感情鈍麻、攻撃性または失調が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法を使用して処置され得る神経学的状態としては、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、後天性免疫不全、パーキンソン病、失語、失行、失認、ピック病、レビー小体を有する痴呆、筋緊張の変化、痙攣、感覚消失、視野欠損、協調不能、歩行障害、一過性の虚血発作または卒中、一過性の警戒、注意欠陥、頻繁な気分の落ち込み、失神、神経遮断薬過敏症、正常圧水頭症、硬膜下血腫、脳腫瘍、外傷後脳損傷または低酸素後損傷が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の方法を使用して処置され得る精神学的状態としては、うつ、妄想、錯覚、幻覚、性障害、体重減少、精神病、睡眠障害、不眠、行動抑制解除、病識欠如、希死念慮、抑うつ気分、被刺激性、快感消失、引きこもりまたは過度の罪悪感が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１９】
軽度の認知障害（ＭＣＩ）は、思考技能の軽度であるが測定可能な障害の状態を特徴とするが、痴呆の存在と必ずしも関連しない状態である。ＭＣＩは、アルツハイマー病に先行することが多いが、必ずしもそうであるわけではない。ＭＣＩは、軽度な記憶問題に関連することが最も多い診断であるが、他の思考技能（例えば、言語または計画技能）における軽度の障害を特徴とすることもあり得る。しかしながら、一般に、ＭＣＩを有する個体は、その年齢または教育的なバックグラウンドの者に対して予想される記憶力よりも重大な記憶力の衰えを有する。その状態が進行するにつれて、当該分野で十分に理解されているように、医師は、軽度から中程度の認知障害に診断を変化させ得る。
【０２２０】
本発明の方法において、可溶性ＮｇＲポリペプチドは、中枢神経系に対して末梢に投与される。「中枢神経系に対して末梢」は、ＮｇＲポリペプチドが中枢神経系に直接、例えば脳室内またはクモ膜下に投与される投与経路以外の、任意の投与経路を包含する。本発明の可溶性ＮｏｇｏレセプターポリペプチドまたはＮｏｇｏレセプター融合タンパク質は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、吸入的または頬側の経路を介して投与され得る。例えば、ある薬剤は、微量注入（ｍｉｃｒｏｉｎｆｕｓｉｏｎ）を介して損傷部位に局所的に投与され得る。１つの実施形態において、可溶性ＮｇＲポリペプチドは、皮下に投与される。本発明のいくつかの実施形態において、可溶性ＮｇＲポリペプチドは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過しない。
【０２２１】
本発明の可溶性Ｎｏｇｏレセプターポリペプチドまたは融合タンパク質は、単独で、または、特定の病理学的プロセスを調節する他の薬剤との併用もしくは連続的な併用で提供され得る。本明細書中で使用されるとき、可溶性ＮｏｇｏレセプターおよびＮｏｇｏレセプター融合タンパク質が、同時か、継続的か、または独立して投与されるとき、それら２つは、１つ以上のさらなる治療薬と併用されると言われる。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、ＮｇＲレセプターポリペプチドまたは融合タンパク質は、本発明の方法において使用するための１つ以上の抗Ａβ抗体と共製剤化および／または同時投与され得る。本発明の方法において使用するための抗Ａβの例は、例えば、米国特許公開番号２００６０１６５６８２  Ａ１、２００６００３９９０６  Ａ１および２００４００４３４１８  Ａ１に見られる。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、ＮｇＲ１ポリペプチドまたは融合タンパク質は、１つ以上のさらなる治療薬（例えば、アドレナリン作用薬、抗アドレナリン作用薬、抗アンドロゲン剤、抗狭心症薬、抗不安剤、抗痙攣剤、抗うつ剤、抗てんかん薬、抗高脂血症薬、抗高リポタンパク血症薬、抗高血圧薬、抗炎症剤、抗強迫神経症薬、抗パーキンソン病薬、抗精神病薬、副腎皮質ステロイド；副腎皮質抑制剤；アルドステロンアンタゴニスト；アミノ酸；アナボリックステロイド；蘇生薬；アンドロゲン；血糖制御因子；心保護剤；心血管系薬剤；コリンアゴニストまたはコリンアンタゴニスト；コリンエステラーゼの不活性化剤またはインヒビター、認知補助剤または認知増強剤；ドーパミン作動薬；酵素インヒビター、エストロゲン、遊離酸素ラジカルスカベンジャー；ＧＡＢＡアゴニスト；グルタミン酸塩アンタゴニスト；ホルモン；コレステロール低下剤；抗高脂血症薬；降圧薬；免疫剤；免疫賦活剤；モノアミンオキシダーゼインヒビター、神経保護薬；ＮＭＤＡアンタゴニスト；ＡＭＰＡアンタゴニスト、競合性または非競合性のＮＭＤＡアンタゴニスト；オピオイドアンタゴニスト；カリウムチャネル開口薬；非ホルモンステロール誘導体；脳卒中後および頭部外傷後の処置；プロスタグランジン剤；向精神薬；弛緩剤；鎮静剤；催眠鎮静剤；選択的アデノシンアンタゴニスト；セロトニンアンタゴニスト；セロトニンインヒビター；選択的セロトニン取り込みインヒビター；セロトニンレセプターアンタゴニスト；ナトリウムチャネル遮断薬およびカルシウムチャネル遮断薬；ステロイド；刺激剤；および甲状腺ホルモンならびに本発明の方法において使用するためのインヒビター剤）と共製剤化および／または同時投与され得る。
【０２２４】
投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、同時処置の種類（もしあれば）、処置の頻度ならびに望まれる効果の性質に左右される。本発明の化合物は、インビボ、通常哺乳動物（例えば、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウス）またはインビトロにおいて、利用され得る。
【０２２５】
本明細書中に記載されるような疾患および障害の処置の方法は、代表的には、ヒトにおいて使用する前に、所望の治療的または予防的な活性について、インビトロにおいて試験され、次いで、許容可能な動物モデルにおいてインビボで試験される。トランスジェニック動物を含む適当な動物モデルは、当業者に周知である。Ａβペプチドの血漿対脳の比の増加、および脳からのＡβクリアランスの増大、およびＡβプラークの数の減少に対する、ＮｇＲ１ポリペプチド、融合タンパク質および組成物の効果は、実施例に記載されるようにインビトロにおいて試験され得る。最終的に、適切な表現型を示すトランスジェニックマウスを作製し、そして、本明細書中に記載されるようなモデルにおいてＮｇＲ１ポリペプチドをマウスまたはラットに投与することによって、インビボ試験が行われ得る。
【０２２６】
本明細書中に記載される方法および適用に対する他の適当な改変および適応が、明白であり、かつ、本発明またはその任意の実施形態の範囲から逸脱することなく行われ得ることは、関連分野の当業者には直ちに明らかであろう。本発明がよりよく理解され得るために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示目的のみであり、いかなる様式でも本発明の範囲を制限すると解釈されるべきでない。
【実施例】
【０２２７】
（実施例１）
Ａβ（１−２８）中の残基１５〜２８はＮｇＲへの結合に不可欠である
Ａβ（１−２８）の線状のサブセグメントが、細胞結合アッセイにおいて全長ヒトＮｇＲと相互作用するか否かを判定するために、ＡＰに融合されたＡβ外部ドメインの様々な部分を含む欠失構築物を作製した。ＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６と同じ方法によって、ＡＰ−Ａβ（１−２８）タンパク質を作製した。ＡＰ−Ａβ変異構築物を作製するために、Ａβフラグメントを増幅し、ｐＡＰ５タグベクター（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）内にライゲーションし、そして、配列決定した。組換えタンパク質を免疫ブロット法により確認した。トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞へのＡＰ融合タンパク質の結合は、以前に報告されている。Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３４１−３４６（２００１）。全長ヒトＮｇＲへの相互作用に関与するＡβの領域は、Ａβ１−４０の中央の残基である残基１５〜２８に局在する（図１ａ）。
【０２２８】
ＮｇＲへのＡＰ−Ａβ（１−２８）の結合と、他に報告されているパートナーであるｐ７５およびＲＡＧＥへのＡＰ−Ａβ（１−２８）の結合とを比較した。Ｄｅａｎｅら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９：９０７−９１３（２００３）；Ｙａａｒら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １００：２３３３−２３４０（１９９７）。ＣＯＳ−７細胞を、Ａβに結合すると報告されている膜タンパク質であるｐ７５−ＮＴＲおよびＲＡＧＥでトランスフェクトした。Ｄｅａｎｅら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９：９０７−９１３（２００３）；Ｙａａｒら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １００：２３３３−２３４０（１９９７）。ＮｇＲへのＡＰ−Ａβ（１−２８）結合が容易に検出可能な条件下において、ｐ７５およびＲＡＧＥは、Ａβ融合タンパク質と有意な相互作用を示さない（図１ｂ）。
【０２２９】
ＮｇＲは、Ｎｏｇｏ−６６に対する親和性によって同定されたので、本発明者らは、ＡβとＮｏｇｏ−６６とが、ＮｇＲへの結合について競合すると考えた。固定化され、精製されたＮｇＲタンパク質に対するＡＰ−Ａβ（１−２８）またはＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（１−３３）の結合アッセイにおいて競合を評価した。合成Ａβ１−２８を使用して、固定化されたヒトＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−ＦｃからのＡＰ−Ａβ（１−２８）置換およびＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６（１−３３）置換を、ＥＬＩＳＡ形式において評価した。２５０ｎＭの可溶性ＡＰ−Ａβ（１−２８）またはＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６（１−３３）は、示された濃度の遊離Ａβ（１−２８）の存在下において、精製ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃでコーティングされたウェルへの結合が可能であった。この無細胞アッセイにおいて、ＮｇＲに対するアビディティは、細胞ベースの結合システムと比べて低く、Ａβ（１−２８）に対する測定されたＫｉは、７００ｎＭである。データは、４回の実験からの平均値＋／−ＳＥＭである。合成Ａβ（１−２８）は、Ａβリガンドと相互作用するＮｇＲの能力を妨害するが、Ｎｏｇｏ−６６リガンドと相互作用する能力を妨害しない（図１ｃ）。従って、この２つのリガンドのＮｇＲの結合部位は、このアッセイによって区別される。
【０２３０】
（実施例２）
ＮｇＲ中の特定の残基がＡｐ−Ａβ（１−２８）への結合を支援する
ＡβおよびＮｏｇｏ−６６と相互作用するＮｇＲドメインを探索するために、ＮｇＲの結晶構造に基づいたストラテジーを使用した。多くのヒトＮｇＲ表面の接近可能な残基を、個別に、または隣接残基の群として、Ａｌａに変異させ（表３）、生じたリガンド結合特性を評価した。リガンド濃度は、ＡＰが３０ｎＭ、ＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６が５ｎＭ、ＡＰ−Ａβ（１−２８）が５０ｎＭであった。ＮｇＲ突然変異誘発は、以前に報告されている。Ｈｕら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５：５２９８−５３０４（２００５）；Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２３：１４１６−１４２３（２００３）。各変異ＮｇＲタンパク質の発現を、発現ベクターでトランスフェクトされた細胞表面において免疫組織化学的検出によって確かめた（図２ａ）。結合しているＡＰを染色し、そしてＮＩＨイメージソフトウェアを使用して測定した。トランスフェクトされたＣＯＳ−７の表面上においてヒトＮｇＲの変異体を免疫蛍光的に検出した。結合特性が変化した変異体の各々に対して、野生型と類似の電気泳動移動度を有する免疫反応性ＮｇＲタンパク質の発現もまた、免疫ブロットにより確認した（図２ｃ）。ＮｇＲ変異体を発現している全ＣＯＳ−７細胞溶解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして抗ＮｇＲ抗体を用いてブロットした。各変異体の移動度は、Ｎ連結型グリコシル化部位における変異（Ｎ８２およびＮ１７９）以外は、野生型ＮｇＲと区別不能であった。ＮｇＲ変異タンパク質のこの収集物を発現している細胞へのＡＰ−Ａβ（１−２８）リガンドとＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６リガンドの両方の結合を、リガンドの所定のＫｄと等しい濃度において評価した（図２ｂ、ｄ）。
【０２３１】
ＡＰ−Ａβ（１−２８）およびＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６への結合について、Ａｌａ置換ヒトＮｇＲ変異体を試験した。３つのカテゴリーがある：（ａ）両方のリガンドに結合しないＮｇＲ変異体、（ｂ）すべてのＮｇＲリガンドへの結合を維持する変異体、および（ｃ）ＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６と結合するが、ＡＰ−Ａβ（１−２８）と結合しない特異な結合変異体。ほとんどのアミノ酸は、いずれかのリガンドの結合に必要ない（表３）。これは、ＮｇＲ  ＬＲＲドメインの凸側から調べられた残基のすべてを含む。別のアミノ酸サブセットが、Ａβ（１−２８）とＮｏｇｏ−６６の両方の結合に不可欠である（表３）。これらのアミノ酸が、ＮｇＲタンパク質の局在性または分子サイズを変化させず、そして凹面上において近接してクラスター化されるので、本発明者らは、それらがコアリガンド結合部位を形成すると仮定した。これは、卵胞刺激ホルモンレセプターなどの他のＬＲＲタンパク質に対して、リガンド結合が主に凹側上で起きるという観察結果と一致する。Ｆａｎ  Ｑ．Ｒ．および  Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  Ｗ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：２６９−２７７（２００５）。構造的な研究なしに、これらの変異が天然のＮｇＲタンパク質の折り畳みを妨害する可能性を排除することはできない。Ａｌａ置換がＮｏｇｏ−６６のＮｇＲ結合をもたらすがＡβ（１−２８）のＮｇＲ結合をもたらさない第３のアミノ酸群が、最も興味深い（表３）。ＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６結合は、野生型ＮｇＲと区別不能であるので、異常なタンパク質の折り畳みが、低いＡβ結合に対する根拠である可能性はない。代わりに、ＮｇＲアミノ酸２１０、２５６、２５９および２８４は、Ａβ相互作用に対して選択的に寄与する可能性があるが、Ｎｏｇｏ−６６相互作用に対して選択的に寄与する可能性はない。
【０２３２】
【表３】
2010502623.tif 000015
（実施例３）
ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃ処置は血漿／脳Ａβ比を変化させるように末梢に作用する
内因性ＮｇＲは、Ａβの生成および沈着を制限する際に役割を果たすが、Ａβの中央のドメインに対するＮｇＲの親和性は、ＮｇＲがＣＮＳの外側に送達される場合、末梢のクリアランスを促進し得ることを示唆する。皮下に投与されたラットＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃがマウスの脳に入るか否かを調べるために、脳溶解産物中のＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃの存在をアッセイした。ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃ融合タンパク質またはコントロールラットＩＧを、プロテインＡ／Ｇアフィニティークロマトグラフィによって濃縮した。ラットＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃタンパク質を投与するために、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）製のＡＰＰｓｗｅ／プレセニリン−１（Ｐｓｅｎ−１）ΔＥ９マウス（Ｐａｒｋら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６：１３８６−１３９５（２００６））（Ｓｔｏｃｋ  ＃０４４６２）を、イソフルランおよび酸素を用いて麻酔し、ＡＬＺＥＴ浸透圧ポンプ２００４を、肩甲骨上の皮下に挿入し、筋膜間に留置させた。そのポンプは、ＰＢＳ中の、１．２μｇ／μｌのラットＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃ溶液またはラットＩｇＧ溶液を０．２５μｌ／ｈｒで２８日間送達した。総処置期間である１２週間に向けて、ポンプを２８日後に交換した。抗Ａβ（６Ｅ１０）抗体は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製であった。ＤＡＢ染色試薬は、Ｖｅｃｔｏｒ製であった。各タンパク質の用量は、０．２７ｍｇ／ｋｇ／ｄであった。
【０２３３】
皮下処置されたＡＰＰｓｗｅ／Ｐｓｅｎ−１ΔＥ９トランスジェニックマウス由来の脳をＰＢＳ＋プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）中でホモジナイズした。その粒状の分画を、２０分間の１００，０００ｘｇにおける遠心分離によって回収した。膜をＰＢＳ（１ｇの脳湿重量／ｍｌ）に再懸濁し、そして１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に可溶化した。洗浄剤抽出物をプロテインＡ／Ｇ＋セファロース（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）免疫沈降に供し、そしてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製の抗ＮｇＲポリクローナル抗体（ＡＦ１４４０）によって解析した。脳室内投与は、容易に検出されるＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃレベルを脳組織においてもたらすが、皮下処置後に、ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃは中枢に検出されない（図３ａ）。これは、ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃが、ＡＰＰｓｗｅ／Ｐｓｅｎ−１ΔＥ９マウスにおいてかなりの程度でＢＢＢを通過することができないという仮説と一致する。
【０２３４】
抗Ａβ処置に対して示されたように、ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃが、Ａβに対する末梢のシンクとして機能する程度に、血漿対脳の比は、上昇するはずである。末梢処置されたマウス由来の脳サンプルおよび血漿サンプルにおける酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、Ａβ４０およびＡβ４２のレベルを評価した（図３ｂ）。皮下処置の３ヵ月後に、血漿：脳Ａβ（１−４２）比は、有意に上昇する。＊，ｐ＜０．０５，ＡＮＯＶＡ。製造者のプロトコル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ）に従って、ＡβＥＬＩＳＡアッセイを行った。ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃを用いた皮下処置によって、Ａβに対する血漿：脳比が２倍以上上昇した。以前に、本発明者らは、中枢へのｉ．ｃ．ｖ．投与ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃが、脳内のｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβタンパク質のレベルを低下させることに注目していた。Ｐａｒｋら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２６：１３８６−１３９５（２００６）。しかしながら、脳ＡＰＰレベルは、皮下ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃ処置によっては変化しない（図３ｃ、ｄ）。ｎ＝４〜５匹のマウスからの平均値±ｓｅｍ。
【０２３５】
（実施例４）
Ｎｇｒ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃで処置されたＡＰＰｓｗｅ／ＰＳＥＮ−１ΔＥ９マウスにおけるＡβプラーク負荷、神経突起ジストロフィ（Ｎｅｕｒｉｔｉｃ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）および星状細胞増加の減少
皮下ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃの末梢への限定によって、中枢のＡβ負荷に対する、「シンク」としてのその効果を評価することができる。症候性となった（脳におけるＡβ沈着および空間的な記憶機能の低下によって判断される）７月齢においてＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ−１ΔＥ９トランスジェニックマウスの処置を開始した（以下を参照のこと）。ＩｇＧ（０．６ｍｇの全タンパク質）に対して、皮下ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃの０．２７ｍｇ／ｋｇ／日による処置の３ヶ月後、脳を免疫組織化学およびＥＬＩＳＡによって調べた。傍矢状切片内のＡβプラークをパラホルムアルデヒドによって固定し、そして０．１Ｍギ酸処理後に抗Ａβ−（１−１７）６Ｅ１０抗体で標識した。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを使用して、各動物からの２つの切片について大脳皮質の総面積に対するパーセンテージとしてプラーク面積を定量した。傍矢状のパラフィン包埋切片において、モノクローナル抗シナプトフィジンＧＡ−５（Ｓｉｇｍａ）およびモノクローナル抗ＧＦＡＰ  ＳＹ３８（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で染色することにより、神経突起ジストロフィおよび反応性星状細胞増加を可視化した。ジストロフィの神経突起および反応性の星状細胞のクラスターによって占められている大脳皮質および海馬の面積を、Ａβプラーク負荷と同じ方法によって総面積に対するパーセンテージとして測定した。データは、ラットＩｇＧ処置群内の９匹のマウスおよびＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃ処置群内の７匹のマウスからの±ＳＥＭである。
【０２３６】
総Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）レベルならびにＡβプラークは、ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃによってコントロールレベルの約５０％に有意に減少する（図４ａ、ｄ、ｅ）。同時に、抗シナプトフィジン染色によって検出されるジストロフィの神経突起は、末梢のＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃ処置によって減少する（図４ｂ、ｆ）。抗ＧＦＡＰ染色強度によって検出されるアストログリオーシス（Ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）もまた、末梢のＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃによる治療によって有意に減少した（図４ｃ、ｇ）。従って、ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃの遅延型の皮下投与は、トランスジェニックマウスにおいてＡβ関連疾患の組織学的証拠を抑制する。
【０２３７】
（実施例５）
ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃの皮下処置は、ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳＥＮ−１ΔＥ９トランスジェニックマウスにおける放射状水迷路の成績を改善する
皮下ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃ治療がＡβプラークを減少させる能力は有望であるが、認識能力は、臨床上のＡＤにおいて関連する症状である。空間的な記憶におけるＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ−１ΔＥ９導入遺伝子関連機能障害を評価するために、改変された放射状水迷路パラダイム（ＲＡＷＭ）を使用した。Ｍｏｒｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：９８２−９８５（２０００）。改変された放射状水迷路試験プロトコルは、Ｄ．Ｍｏｒｇａｎとの私信に基づくものであった（Ｍｏｒｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：９８２−９８５（２０００））。その迷路は、４０ｃｍの開放された中央の領域から放射状に伸びる１９ｃｍ幅の６本の泳路を備えた直径１メートルの円形のプールからなるものであり、１本の路の端に水没回避プラットフォームを配置した。壁および各路の端に、空間的な手がかりを提示した。行動主義者を処置に対して盲検化した。視力、意欲および遊泳について管理するために、開放された水の可視プラットフォームパラダイムにおいてマウスを最大１分間試験し、待ち時間を記録した。次に、Ｅｘｃｅｌ関数＝ＭＯＤ（＄Ｃｅｌｌ＋ＲＡＮＤＢＥＴＷＥＥＮ（１，５），６）（ここで、＄ＣＥＬＬは、隠されているプラットフォームの位置である）に従って、マウスをランダムな路に置いた。各マウスを最大１分間泳がせて、回避プラットフォームを見つけさせた。誤った路に入っている（４本のすべての足がその泳路内に入っている）か、または２０秒後に路を選択できていないときは、そのマウスを最初の路に戻し、誤りをつけた。すべてのマウスが、各試験の後、次の試験が始まる前にプラットフォーム上で３０秒間過ごした。その後、学習ブロック（ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）を構成する４回以上の試験をマウスに対して行った。学習ブロックの間に３０分間マウスを休ませた。全体において、１日目に３学習ブロックにわたってマウスを試験し、翌日にさらに３学習ブロックを繰り返した。
【０２３８】
野生型同腹仔マウスに対してＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ−１ΔＥ９において、短期間の空間的記憶の欠陥が４ヶ月まで明らかである（図５ａ）。１３月齢では、野生型マウスは、この課題において若いマウスよりもそれほど良い成績ではないが、ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ−１ΔＥ９トランスジェニックマウスは、本発明者らのトレーニングパラダイムにおいて課題を学習することが完全にできないことから、疾患進行が実証される（図５ｂ）。コントロールとして、ＮｇＲ発現の喪失（ｎｇｒ−／−マウスにおいて）は、ＲＡＷＭ成績を有意に変化させない（図５ｃ）。
【０２３９】
２５〜２９回のトレーニング試験後のＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ−１ΔＥ９マウスによる誤った泳ぎの数は、マウスが１、２または３ヶ月間コントロールＩｇＧ治療を皮下に受けるとき、８、９および１０ヶ月において着実に増加する。対照的に、皮下ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃで処置されたマウスは、疾患進行の停止を示し、そして、３ヵ月後の成績の改善の傾向を１０月齢まで示す（図５ｄ）。ＲＡＷＭエラーは、ｒＩｇＧ処置マウスと比べて、皮下ＮｇＲ（３１０）ｅｃｔｏ−Ｆｃ処置の２ヵ月後および３ヵ月後に有意に減少する（ＡＮＯＶＡ，それぞれＰ＜０．０５および０．０２）。これらの群間において可視のプラットフォーム回避待ち時間において有意差が観察されなかったので、これらの差は、視力、意欲または運動能力の変化ではなく、記憶機能の改善に関係する（図６）。ｎ＝７〜９匹のマウス／群からの平均値±ｓｅｍ。この２群にわたって、平均ＲＡＷＭエラーとＡβ免疫反応性沈着物の密度との間に、正の相関がある（図５ｅ）。
【０２４０】
当業者が認識するように、本発明の精神から逸脱することなく本発明の好ましい実施形態に対して数多くの変更および改変がなされ得る。そのようなバリエーションのすべてが、本発明の範囲内であると意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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