(57)【要約】  細胞融合の方法が提供され、この方法は、細胞を、液体およびナノ構造を有する液体組成物を含む培地において融合し、それにより、細胞を融合することを含み、ただし、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。モノクローナル抗体を作製するためおよび真核生物細胞を培養するための組成物および製造物もまた提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞融合の方法であって、前記方法は、細胞を、液体およびナノ構造を有する液体組成物を含む培地において融合し、それにより、細胞を融合することを含み、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある方法。
【請求項２】
前記細胞は同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は非同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は初代細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は不死化細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記非同一の細胞は腫瘍細胞および抗体産生細胞を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記非同一の細胞は幹細胞および体細胞を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞は胚性幹細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記体細胞は筋細胞または骨細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体産生細胞はＢリンパ球である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｂリンパ球はヒトＢリンパ球である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｂリンパ球は末梢血単核細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍細胞は、前記融合に先だって、ハイブリドーマ作製の増大を可能にする期間、前記液体組成物においてインキュベーションされる、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記期間は最低でも１日である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記流体分子の少なくとも一部が前記液体の分子と同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記流体分子の前記少なくとも一部がガス状状態である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ナノ構造の濃度は、ナノ構造が１リットルあたり１０２０個未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ナノ構造は前記ナノ構造のクラスターを形成することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ナノ構造はナノ構造間の長距離相互作用を維持することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記液体組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記液体組成物はヒドロキシアパタイトから作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記液体組成物は光の偏光を変化させることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
真核生物細胞を培養する方法であって、前記方法は、細胞を、液体およびナノ構造を有する液体組成物を含む培地においてインキュベーションし、それにより、真核生物細胞を培養することを含み、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある方法。
【請求項２４】
前記培地はさらに、増殖因子、血清および抗生物質からなる群から選択される少なくとも１つの作用因を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記真核生物細胞は単一の細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記単一の細胞はハイブリドーマである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
培養することがＨＣＦの非存在下で行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
真核生物細胞は間葉系幹細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記流体分子の少なくとも一部が前記液体の分子と同一である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記流体分子の前記少なくとも一部がガス状状態である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記ナノ構造の濃度は、ナノ構造が１リットルあたり１０２０個未満である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記ナノ構造は前記ナノ構造のクラスターを形成することができる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記ナノ構造はナノ構造間の長距離相互作用を維持することができる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記液体組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記液体組成物はヒドロキシアパタイトから作製される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記液体組成物は光の偏光を変化させることができる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
真核生物細胞培養培地と、液体およびナノ構造を有する液体組成物とを含む細胞培養培地であって、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある細胞培養培地。
【請求項３８】
前記真核生物細胞培養培地はさらに、増殖因子、血清および抗生物質からなる群から選択される少なくとも１つの作用因を含む、請求項３７に記載の細胞培養培地。
【請求項３９】
前記流体分子の少なくとも一部が前記液体の分子と同一である、請求項３７に記載の細胞培養培地。
【請求項４０】
前記流体分子の前記少なくとも一部がガス状状態である、請求項３７に記載の細胞培養培地。
【請求項４１】
前記ナノ構造の濃度は、ナノ構造が１リットルあたり１０２０個未満である、請求項３７に記載の細胞培養培地。
【請求項４２】
前記ナノ構造は前記ナノ構造のクラスターを形成することができる、請求項３７に記載の細胞培養培地。
【請求項４３】
前記ナノ構造はナノ構造間の長距離相互作用を維持することができる、請求項３７に記載の細胞培養培地。
【請求項４４】
前記液体組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項３７に記載の細胞培養培地。
【請求項４５】
前記液体組成物は細胞増殖速度を増大させることができる、請求項３７に記載の細胞培養培地。
【請求項４６】
前記液体組成物はヒドロキシアパタイトから作製される、請求項３７に記載の細胞培養培地。
【請求項４７】
前記液体組成物は光の偏光を変化させることができる、請求項３７に記載の細胞培養培地。
【請求項４８】
包装材と、前記包装材の中に含有される、真核生物細胞を培養することのために特定される液体組成物とを含む製造物であって、前記液体組成物は液体およびナノ構造を有し、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある製造物。
【請求項４９】
前記真核生物細胞は間葉系幹細胞である、請求項４８に記載の製造物。
【請求項５０】
前記流体分子の少なくとも一部が前記液体の分子と同一である、請求項４８に記載の製造物。
【請求項５１】
前記流体分子の前記少なくとも一部がガス状状態である、請求項４８に記載の製造物。
【請求項５２】
前記ナノ構造の濃度は、ナノ構造が１リットルあたり１０２０個未満である、請求項４８に記載の製造物。
【請求項５３】
前記ナノ構造は前記ナノ構造のクラスターを形成することができる、請求項４８に記載の製造物。
【請求項５４】
前記ナノ構造はナノ構造間の長距離相互作用を維持することができる、請求項４８に記載の製造物。
【請求項５５】
前記液体組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項４８に記載の製造物。
【請求項５６】
前記液体組成物は細胞増殖速度を増大させることができる、請求項４８に記載の製造物。
【請求項５７】
前記液体組成物はヒドロキシアパタイトから作製される、請求項４８に記載の製造物。
【請求項５８】
前記液体組成物は光の偏光を変化させることができる、請求項４８に記載の製造物。
【請求項５９】
包装材と、前記包装材の中に含有される、モノクローナル抗体を作製するために特定される液体組成物とを含む製造物であって、前記液体組成物は液体およびナノ構造を有し、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある製造物。
【請求項６０】
前記流体分子の少なくとも一部が前記液体の分子と同一である、請求項５９に記載の製造物。
【請求項６１】
前記流体分子の前記少なくとも一部がガス状状態である、請求項５９に記載の製造物。
【請求項６２】
前記ナノ構造の濃度は、ナノ構造が１リットルあたり１０２０個未満である、請求項５９に記載の製造物。
【請求項６３】
前記ナノ構造は前記ナノ構造のクラスターを形成することができる、請求項５９に記載の製造物。
【請求項６４】
前記ナノ構造はナノ構造間の長距離相互作用を維持することができる、請求項５９に記載の製造物。
【請求項６５】
前記液体組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項５９に記載の製造物。
【請求項６６】
前記液体組成物は細胞増殖速度を増大させることができる、請求項５９に記載の製造物。
【請求項６７】
前記液体組成物はヒドロキシアパタイトから作製される、請求項５９に記載の製造物。
【請求項６８】
前記液体組成物は光の偏光を変化させることができる、請求項５９に記載の製造物。
【請求項６９】
モノクローナル抗体を作製するための方法であって、前記方法は、不死化している細胞を、液体およびナノ構造を有する液体組成物を含む培地においてハイブリドーマを得るために抗体産生細胞と融合することを含み、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある方法。
【請求項７０】
前記ハイブリドーマをクローン化することをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記クローン化することが、前記ハイブリドーマを、前記液体組成物を含む培地においてインキュベーションすることによって行われる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記クローン化することがＨＣＦの非存在下で行われる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
モノクローナル抗体を前記クローン化の後で集めることを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記流体分子の少なくとも一部が前記液体の分子と同一である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
前記流体分子の前記少なくとも一部がガス状状態である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
前記ナノ構造の濃度は、ナノ構造が１リットルあたり１０２０個未満である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７７】
前記ナノ構造は前記ナノ構造のクラスターを形成することができる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７８】
前記ナノ構造はナノ構造間の長距離相互作用を維持することができる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７９】
前記液体組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項８０】
前記液体組成物はヒドロキシアパタイトから作製される、請求項６９に記載の方法。
【請求項８１】
前記液体組成物は光の偏光を変化させることができる、請求項６９に記載の方法。
【請求項８２】
セファロスポリンを、この物質を分散または溶解することを可能にする条件のもとでナノ構造および液体と接触させることを含む、セファロスポリンを溶解または分散する方法であって、前記ナノ構造は、前記液体の整列した流体分子によって包まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖および細胞融合を高めるための新規な組成物に関連する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の生体は、恒常性を生体において維持するために有害であり、また、病原性になり、これにより、様々な疾患を引き起こし得るか、または、様々な疾患の悪化を増大させ得る外因性抗原（例えば、ウイルス、細菌毒素および化学物質）、自己抗原（例えば、自己反応性リンパ球；ガン細胞および過度な内因性因子（例えば、サイトカイン、ホルモンまたは増殖因子））を特異的に捕捉し、これらを排除するための防御システムである体液性免疫を有する。この体液性免疫において、抗体が大きな役割を果たす。
【０００３】
抗体は、４つのポリペプチド鎖、すなわち、２つの長いポリペプチド鎖（免疫グロブリン重鎖；ＩｇＨ鎖）および２つの短いポリペプチド鎖（免疫グロブリン軽鎖；ＩｇＬ鎖）を含むＹ字型の基本構造を有する。このＹ字型構造は、ジスルフィド結合によって架橋される２つのＩｇＨ鎖が別のジスルフィド結合を介してＩｇＬ鎖のそれぞれにつなげられるときに作られる。
【０００４】
生体にとって有害である抗原を捕捉し、排除するこの機能のために、様々な抗体がこれまで長い間、薬物として使用されている。ポリクローナル抗体が抗体薬物の最も古い形態であり、この場合、特定の抗原に対する様々なタイプの抗体を含む抗血清が使用された。しかしながら、このような抗血清を得るための方法は、血清から集めることに限定され、したがって、その供給は必然的に制限された。そのうえ、抗原に対する特異性を含む単一タイプの抗体分子をこの抗血清から単離することは極めて困難であった。
【０００５】
ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによる１９７５年の、ハイブリドーマを使用するモノクローナル抗体の成功した調製（Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．２５６、ｐ．４９５〜４９７、１９７５）は、これにより、特定の抗原に対する抗体を要求に応じて作製することが可能になったので、これらの問題の解決をもたらし、また、モノクローナル抗体が薬物として使用されるための扉を開いた。
【０００６】
典型的には、ヒトモノクローナル抗体の作製では、ヒトのＢリンパ球を骨髄起原のパートナー細胞株との融合によって不死化することが必要である。これらの細胞融合の結果は、両方の親細胞株の特質、すなわち、絶え間なく増殖する能力、および、純粋な抗体を産生する能力を有する「ハイブリドーマ」と呼ばれる。
【０００７】
しかしながら、モノクローナル抗体作製のために利用可能である唯一のヒトＢ細胞は、末梢血において循環するＢ細胞であるので、モノクローナル抗体作製のための細胞の供給源は限定される。さらには、理論的には可能であるが、抗原が引き起こした免疫応答が最近または再発でなかったならば、ヒトモノクローナル抗体をその抗原に対して作製することが難しい。加えて、分泌されたモノクローナル抗体の量が典型的には多くないので、高レベルの単離されたモノクローナル抗体をハイブリドーマ細胞培養から作製することが困難であることが判明している。
【０００８】
モノクローナル抗体作製の理論的な成果および実際の成果を結びつけるためには、融合プロセスの効率が非常に高いことが必要であり、これは、末梢血から得られるＢ細胞が少ないことを克服するために、従って、末梢血から得られるＢ細胞の不死化の可能性をより高くするために必要である。
【０００９】
したがって、多量のモノクローナル抗体を費用効果的な様式で作製する方法が必要であることが広く認識されており、また、そのような方法を有することは非常に好都合であると考えられる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態からなる１つの局面によれば、細胞融合の方法が提供され、この場合、この方法は、細胞を、液体およびナノ構造を有する液体組成物を含む培地において融合し、それにより、細胞を融合することを含み、ただし、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態からなる１つの局面によれば、真核生物細胞を培養する方法が提供され、この場合、この方法は、細胞を、液体およびナノ構造を有する液体組成物を含む培地においてインキュベーションし、それにより、真核生物細胞を培養することを含み、ただし、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態からなる１つの局面によれば、真核生物細胞培養培地と、液体およびナノ構造を有する液体組成物とを含む細胞培養培地が提供され、ただし、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態からなる１つの局面によれば、包装材と、前記包装材の中に含有される、真核生物細胞を培養することのために特定される液体組成物とを含む製造物が提供され、ただし、前記液体組成物は液体およびナノ構造を有し、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態からなる１つの局面によれば、包装材と、前記包装材の中に含有される、モノクローナル抗体を作製するために特定される液体組成物とを含む製造物が提供され、ただし、前記液体組成物は液体およびナノ構造を有し、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態からなる１つの局面によれば、モノクローナル抗体を作製するための方法が提供され、この場合、この方法は、不死化している細胞を、液体およびナノ構造を有する液体組成物を含む培地においてハイブリドーマを得るために抗体産生細胞と融合することを含み、ただし、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態からなる１つの局面によれば、セファロスポリンを、この物質を分散または溶解することを可能にする条件のもとでナノ構造および液体と接触させることを含む、セファロスポリンを溶解または分散する方法が提供され、この場合、前記ナノ構造は、前記液体の整列した流体分子によって包まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は同一である。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は非同一である。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は初代細胞を含む。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は不死化細胞を含む。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、非同一の細胞は腫瘍細胞および抗体産生細胞を含む。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、非同一の細胞は幹細胞および体細胞を含む。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、幹細胞は胚性幹細胞である。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、体細胞は筋細胞または骨細胞である。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体産生細胞はＢリンパ球である。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｂリンパ球はヒトＢリンパ球である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｂリンパ球は末梢血単核細胞である。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞は、前記融合に先だって、ハイブリドーマ作製の増大を可能にする期間、前記液体組成物においてインキュベーションされる。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記期間は最低でも１日である。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記流体分子の少なくとも一部が前記液体の分子と同一である。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記流体分子の少なくとも一部がガス状状態である。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記ナノ構造の濃度は、ナノ構造が１リットルあたり１０２０個未満である。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造は前記ナノ構造のクラスターを形成することができる。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造はナノ構造間の長距離相互作用を維持することができる。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、液体組成物は、水の緩衝能力よりも大きい緩衝能力を含む。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、液体組成物はヒドロキシアパタイトから作製される。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、液体組成物は光の偏光を変化させることができる。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、培地はさらに、増殖因子、血清および抗生物質からなる群から選択される少なくとも１つの作用因を含む。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、真核生物細胞は単一の細胞である。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単一の細胞はハイブリドーマである。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養することがＨＣＦの非存在下で行われる。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、真核生物細胞は間葉系幹細胞である。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、真核生物細胞培養培地はさらに、増殖因子、血清および抗生物質からなる群から選択される少なくとも１つの作用因を含む。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、液体組成物は細胞増殖速度を増大させることができる。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、前記ハイブリドーマをクローン化することを含む。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、クローン化することが、前記ハイブリドーマを、前記液体組成物を含む培地においてインキュベーションすることによって行われる。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、クローン化することがＨＣＦの非存在下で行われる。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、モノクローナル抗体を前記クローン化の後で集めることを含む。
【００４９】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００５０】
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施形態を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）およびＲＯ（逆浸透）水に基づくＭＥＭ培地における骨髄細胞の増殖を例示する棒グラフである。
【図２】図２は、５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの様々な水組成物の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
【図４】図４Ａ〜Ｃは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の水酸化ナトリウム滴定、および、ＲＯ水の水酸化ナトリウム滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示する、三連で行われた実験のグラフである。
【図６】図６は、ｐＨによって測定されたときの、ナノ構造を含む水の塩酸滴定、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示するグラフである。それぞれのグラフは３つの三連での実験をまとめる。
【図７】図７Ａ〜Ｃは、５５７ｎｍでの吸光度によって測定されたときの、ナノ構造を含む水、および、ＲＯ水の塩酸滴定（図７Ａ）および水酸化ナトリウム滴定（図７Ｂ〜図７Ｃ）を例示するグラフである。
【図８】図８Ａ〜Ｂは、ＲＯの塩酸滴定の後でのキュベットの写真（図８Ａ）、および、ナノ構造を含む水の塩酸滴定の後でのキュベットの写真（図８Ｂ）である。それぞれのキュベットは１μｌの塩酸の添加を例示する。
【図９】図９Ａ〜Ｃは、ＲＦ水の塩酸滴定を例示するグラフ（図９Ａ）、ＲＦ２水の塩酸滴定を例示するグラフ（図９Ｂ）、および、ＲＯ水の塩酸滴定を例示するグラフ（図９Ｃ）である。矢印は２回目の照射を示す。
【図１０】図１０は、ＲＯ水と比較したときの、ＦＲ２水の塩酸滴定を例示するグラフである。実験を３回繰り返した。３回の実験のすべてについての平均値がＲＯ水についてプロットされた。
【図１１Ａ．１１Ｂ．１１Ｆ．１１Ｇ】図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｆおよび図１１Ｇは、粉末の分散を３回試みた後、様々な時間間隔での、赤色粉末およびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液の写真である。図１１Ａ〜図１１Ｅは、実施例８のパートＡからの、右側：試験チューブＣ（５０％ＥｔＯＨ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、および、左側：試験チューブＢ（脱水されたＮｅｏｗａｔｅｒ（商標））を例示する。図１１Ｇ〜図１１Ｊは、赤色粉末の一晩の破砕、および、１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の滴定の後での溶液を例示する。
【図１１Ｃ．１１Ｄ．１１Ｈ．１１Ｉ】図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｈおよび図１１Ｉは、粉末の分散を３回試みた後、様々な時間間隔での、赤色粉末およびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液の写真である。図１１Ａ〜図１１Ｅは、実施例８のパートＡからの、右側：試験チューブＣ（５０％ＥｔＯＨ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、および、左側：試験チューブＢ（脱水されたＮｅｏｗａｔｅｒ（商標））を例示する。図１１Ｇ〜図１１Ｊは、赤色粉末の一晩の破砕、および、１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の滴定の後での溶液を例示する。
【図１１Ｅ．１１Ｊ】図１１Ｅおよび図１１Ｊは、粉末の分散を３回試みた後、様々な時間間隔での、赤色粉末およびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液の写真である。図１１Ａ〜図１１Ｅは、実施例８のパートＡからの、右側：試験チューブＣ（５０％ＥｔＯＨ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、および、左側：試験チューブＢ（脱水されたＮｅｏｗａｔｅｒ（商標））を例示する。図１１Ｇ〜図１１Ｊは、赤色粉末の一晩の破砕、および、１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の滴定の後での溶液を例示する。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ナノドロップで測定されたときの、３つの異なる溶液からの２μｌの吸光度の読み取りである。図１２Ａは、一晩の粉砕の後での赤色粉末＋１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒの溶液を表す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ナノドロップで測定されたときの、３つの異なる溶液からの２μｌの吸光度の読み取りである。図１２Ｂは、１００％の脱水されたＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加えた後での赤色粉末の溶液を表す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ナノドロップで測定されたときの、３つの異なる溶液からの２μｌの吸光度の読み取りである。図１２Ｃは、ＥｔＯＨ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％−５０％）を加えた後での赤色粉末の溶液を表す。
【図１３】図１３は、バイアル＃１（ＣＤ−Ｄａｕ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、バイアル＃４（ＣＤ−Ｄａｕ＋１０％ＰＥＧ／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））およびバイアル＃５（ＣＤ−Ｄａｕ＋５０％アセトン＋５０％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））の分光光度計測定のグラフである。
【図１４】図１４は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物（青色線）、および、微量の溶媒（アセトン）を伴う溶解物（ピンク色線）の分光光度計測定のグラフである。
【図１５】図１５は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物（青色線）および、アセトンにおける溶解物（ピンク色線）の分光光度計測定のグラフである。淡青色および黄色の線はアセトン蒸発の異なる割合を表し、紫色線はアセトン非含有溶液である。
【図１６】図１６は、ＣＤ−Ｄａｕの２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。青色線はＲＯにおける溶解物を表し、一方、ピンク色線はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物を表す。
【図１７】図１７は、ｔ−ｂｏｃの２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。青色線はＲＯにおける溶解物を表し、一方、ピンク色線はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶解物を表す。
【図１８】図１８Ａ〜Ｄは、２００ｎｍ〜８００ｎｍにおける分光光度計測定のグラフである。図１８Ａは、エタノールの存在下、および、エタノール蒸発直後のエタノール非存在下でのＡＧ−１４Ｂのグラフである。図１８Ｂは、エタノールの存在下、および、エタノール蒸発後２４時間のエタノール非存在下でのＡＧ−１４Ｂのグラフである。図１８Ｃは、エタノールの存在下、および、エタノール蒸発直後のエタノール非存在下でのＡＧ−１４Ａのグラフである。図１８Ｄは、エタノールの存在下、および、エタノール蒸発後２４時間のエタノール非存在下でのＡＧ−１４Ａのグラフである。
【図１９】図１９は、エタノール蒸発後２４時間でのＡＧ−１４ＡおよびＡＧ１４Ｂの懸濁物の写真である。
【図２０Ａ−Ｄ】図２０Ａ〜Ｄは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドの分光光度計測定のグラフである。図２０Ａは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドＸのグラフである。図２０Ｂは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＸ−５ＦＵのグラフである。図２０Ｃは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＮＬＳ−Ｅのグラフである。図２０Ｄは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＰａｌｍ−ＰＦＰＳＹＫ（ＣＭＦＵ）のグラフである。
【図２０Ｅ−Ｇ】図２０Ｅ〜Ｇは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドの分光光度計測定のグラフである。図２０Ｅは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＰＦＰＳＹＫＬＲＰＧ−ＮＨ２のグラフである。図２０Ｆは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＮＬＳ−ｐ２−ＬＨＲＨのグラフである。図２０Ｇは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＦ−ＬＨ−ＲＨ−ｐａｌｍ  ｋＧＦＰＳＫのグラフである。
【図２１Ａ−Ｄ】図２１Ａ〜Ｄは、クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。図２１Ａは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドＸの細胞傷害作用のグラフである。図２１Ｂは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＸ−５ＦＵの細胞傷害作用のグラフである。図２１Ｃは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＮＬＳ−Ｅの細胞傷害作用のグラフである。図２１Ｄは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＰａｌｍ−ＰＦＰＳＹＫ（ＣＭＦＵ）の細胞傷害作用のグラフである。
【図２１Ｅ−Ｇ】図２１Ｅ〜Ｇは、クリスタルバイオレットアッセイにより測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたペプチドの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。図２１Ｅは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＰＦＰＳＹＫＬＲＰＧ−ＮＨ２の細胞傷害作用のグラフである。図２１Ｆは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＮＬＳ−ｐ２−ＬＨＲＨの細胞傷害作用のグラフである。図２１Ｇは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたＦ−ＬＨ−ＲＨ−ｐａｌｍ  ｋＧＦＰＳＫの細胞傷害作用のグラフである。
【図２２】図２２は、エタノールおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるレチノールの吸光度のグラフである。
【図２３】図２３は、ろ過後の、エタノールおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるレチノールの吸光度のグラフである。
【図２４】図２４Ａ〜Ｂは、試験チューブ（左側はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）および物質「Ｘ」を含有し、右側はＤＭＳＯおよび物質「Ｘ」を含有する）の写真である。図２４Ａは、２４時間放置された試験チューブを例示し、図２４Ｂは、４８時間放置された試験チューブを例示する。
【図２５】図２５Ａ〜Ｃは、加熱および振とう処置を行った直後における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図２５Ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図２５Ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図２５Ｃ）の写真である。
【図２６】図２６Ａ〜Ｃは、加熱および振とう処置を行った後６０分における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図２６Ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図２６Ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図２６Ｃ）の写真である。
【図２７】図２７Ａ〜Ｃは、加熱および振とう処置を行った後１２０分における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図２７Ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図２７Ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図２７Ｃ）の写真である。
【図２８】図２８Ａ〜Ｃは、加熱および振とう処置を行った後２４時間における、物質「Ｘ」を溶媒１および溶媒２とともに含有する試験チューブ（図２８Ａ）、物質「Ｘ」を溶媒３および溶媒４とともに含有する試験チューブ（図２８Ｂ）、ならびに、物質「Ｘ」を溶媒５および溶媒６とともに含有する試験チューブ（図２８Ｃ）の写真である。
【図２９】図２９Ａ〜Ｄは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）および低下した濃度のＤＭＳＯを含む溶媒に物質「Ｘ」を含むガラス製ボトルの振とう直後の写真（図２９Ａ）、振とう後３０分の写真（図２９Ｂ）、振とう後６０分の写真（図２９Ｃ）および振とう後１２０分の写真（図２９Ｄ）である。
【図３０】図３０は、分光光度計によって測定されたときの、ボルテックス後６時間のＲＯ／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における物質「Ｘ」の吸収特徴を例示するグラフである。
【図３１】図３１Ａ〜Ｂは、分光光度計によって測定されたときの、エタノールにおけるＳＰＬ２１０１の吸収特徴を例示するグラフ（図３１Ａ）、および、アセトンにおけるＳＰＬ５２１７の吸収特徴を例示するグラフ（図３１Ｂ）である。
【図３２】図３２Ａ〜Ｂは、分光光度計によって測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＳＰＬ２１０１の吸収特徴を例示するグラフ（図３２Ａ）、および、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＳＰＬ５２１７の吸収特徴を例示するグラフ（図３２Ｂ）である。
【図３３】図３３Ａ〜Ｂは、分光光度計によって測定されたときの、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるタキソールの吸収特徴を例示するグラフ（図３３Ａ）、および、ＤＭＳＯにおけるタキソールの吸収特徴を例示するグラフ（図３３Ｂ）である。
【図３４】図３４は、２９３Ｔ細胞に対する異なる溶剤におけるタキソールの細胞傷害作用を例示する棒グラフである。コントロールＲＯ＝ＲＯ水により構成される培地；コントロールＮｅｏ＝Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）により構成される培地；コントロールＤＭＳＯ  ＲＯ＝ＲＯ水＋１０μｌのＤＭＳＯにより構成される培地；コントロールＮｅｏ  ＲＯ＝ＲＯ水＋１０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）により構成される培地；タキソールＤＭＳＯ  ＲＯ＝ＲＯ水と、ＤＭＳＯに溶解されたタキソールとにより構成される培地；タキソールＤＭＳＯ  Ｎｅｏ＝Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と、ＤＭＳＯに溶解されたタキソールとにより構成される培地；タキソールＮＷ  ＲＯ＝ＲＯ水と、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたタキソールとにより構成される培地；タキソールＮＷ  Ｎｅｏ＝Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたタキソールとにより構成される培地。
【図３５】図３５Ａ〜Ｂは、２つの異なるＴａｑポリメラーゼを使用する実施例１６に記載されるプロトコルに従って加熱した後、ナノ構造を含む液体組成物の存在下および非存在下で得られたＰＣＲ生成物を例示する、臭化エチジウムにより染色されたＤＮＡゲルの写真である。
【図３６】図３６は、２つの異なるＴａｑポリメラーゼを使用する実施例１７に記載されるプロトコルに従って加熱した後、ナノ構造を含む液体組成物の存在下および非存在下で得られたＰＣＲ生成物を例示する、臭化エチジウムにより染色されたＤＮＡゲルの写真である。
【図３７Ａ】図３７Ａは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）およびＤＭＳＯにおける０．５ｍＭタキソールの分光光度法による読み取りを例示するグラフである。
【図３７Ｂ−Ｃ】図３７Ｂ〜Ｃは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）およびＤＭＳＯにおけるタキソールのＨＰＬＣによる読み取りである。図３７Ｂは、タキソールの新たに調製された標準（ＤＭＳＯ）配合物のＨＰＬＣによる読み取りを例示する。図３７Ｃは、−２０℃での６ヶ月の貯蔵の後における、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に分散されたタキソールのＨＰＬＣによる読み取りを例示する。
【図３８】図３８は、ＤＭＳＯ配合物またはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）配合物における様々なタキソール濃度のＰＣ３細胞生存性を例示する棒グラフである。それぞれの点が８個の反復実験からの平均＋／−標準偏差を表す。
【図３９】図３９は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）による融合効率強化を例示する棒グラフである。融合が標準的プロトコルに従って行われ、この場合、培養培地およびＰＥＧが、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＮＰＤ）またはコントロールの水（ＤＩ）のいずれかを用いて粉末形態から再構成された。それぞれの融合について、１つの回分処理物からのＰＢＭＣを２つの等量物に分け、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）またはコントロールの水に基づく試薬での２つの並行実験物を調製するために使用した。図は、それぞれの融合実験におけるハイブリドーマ陽性ウエルの割合を示す。割合が、細胞が融合プロセス後に播種および増殖させられる９６ウエルプレートからのハイブリドーマ陽性ウエルの数として計算された。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）での融合結果のすべてと、コントロールの水での融合結果のすべてとの間における差は、χ二乗分析によって統計学的に有意であることが見出された（ｐ＜＜０．００１）。強化率を、［（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）での融合におけるハイブリドーマの数／コントロールの水での融合におけるハイブリドーマの数）ｘ１００％−１００％］の式によって計算した。
【図４０】図４０は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＮＰＤ）またはコントロールの水（ＤＩ）における準安定クローンのクローン化効率を例示する棒グラフである。抗体を産生する準安定なクローンから、２００個の細胞を計数し、９６ウエルプレートの全体に１０ｍＬの体積で播種した（平均して、１〜２細胞／１００μＬ／ウエル）。図は、クローン化実験あたりのハイブリドーマ陽性ウエルの平均割合を示す。誤差棒は平均の標準誤差を示す。
【図４１】図４１Ａ〜Ｂは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は安定なハイブリドーマクローンからの１０％ＦＣＳにおける抗体分泌を高めることができることを例示する棒グラフである。２つの並行培養物を安定なハイブリドーマクローンから反復物で調製した。一方をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）での培地（ＮＰＤ）において増殖させ、もう一方をコントロールの水（ＤＩ）での培地において増殖させ、両方を標準的な培養条件で保った。１週間増殖させた後、上清を集め、抗体濃度を標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。それぞれの棒が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＮＰＤ）での培養物およびコントロールの水（ＤＩ）での培養物において測定された平均抗体濃度を表す。誤差棒は平均の標準誤差を示す。図４１Ａは、培養上清において測定された総抗体濃度を例示する。図４１Ｂは、細胞あたりについて正規化された抗体濃度を例示する。
【図４２Ａ】図４２Ａは、安定なハイブリドーマクローンによる３％ＦＣＳにおけるＩＧＭ産生を例示する棒グラフである。安定なハイブリドーマクローンの同じ培養物に由来する２つの培養物を増殖させた。一方を、３％ＦＣＳが補充されたＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＮＰＤ）に基づく培地において増殖させ、もう一方を、３％ＦＣＳが補充されたコントロールの水（ＤＩ）に基づく培地において増殖させた。播種前に、細胞を無血清培地で洗浄して、残存血清が除かれたことを確認した。２週間の期間中、上清を示されたように集め、細胞を同じ日に計数した。培養物は４日目および１０日目に養分供給され、培地が６日目に培養物に入れられた。ＤＩでの培養における細胞はこれらの条件のもとで正常に増殖したが、測定可能な量の抗体を産生することができなかった。
【図４２Ｂ】図４２Ｂは、安定なハイブリドーマクローンによる３％ＦＣＳにおけるＩＧＭ産生を例示する棒グラフである。安定なハイブリドーマクローンの同じ培養物に由来する２つの培養物を増殖させた。一方を、３％ＦＣＳが補充されたＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＮＰＤ）に基づく培地において増殖させ、もう一方を、３％ＦＣＳが補充されたコントロールの水（ＤＩ）に基づく培地において増殖させた。播種前に、細胞を無血清培地で洗浄して、残存血清が除かれたことを確認した。２週間の期間中、上清を示されたように集め、細胞を同じ日に計数した。培養物は４日目および１０日目に養分供給され、培地が６日目に培養物に入れられた。ＤＩでの培養における細胞はこれらの条件のもとで正常に増殖したが、測定可能な量の抗体を産生することができなかった。
【図４３】図４３Ａ〜Ｃは、血清低下培地におけるＣＨＯ細胞の増殖を例示する棒グラフである。図４３Ａ：細胞を、三連で、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＮＰＤ）に基づく培地およびコントロールの水（ＤＩ）に基づく培地において１０ｃｍペトリディッシュあたり１．５ｘ１０６個の初期密度で播種した。一晩増殖させた後、細胞をトリプシン処理によって剥がし、計数した。結果が生細胞の数として示される。それぞれの棒がそれぞれの処理における細胞の平均数を表す。誤差棒は平均の標準誤差を示す。処理間の差は３０％である。このグラフは、反復反応により行われ、３回繰り返された実験の代表的な結果を提供する。図４３Ｂ、図４３Ｃ：細胞を、５％または１％のＦＳＣが補充されたＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（ＮＰＤ）での培地またはコントロールの水（ＤＩ）での培地において複数の反復（処理あたり１８個のウエル）で９６ウエルプレートに播種した。結果をクリスタルバイオレット色素保持アッセイによって定量および分析した。それぞれの棒が所与の処理の後での平均細胞密度をＯ．Ｄ．の単位で表す。誤差棒は平均の標準誤差を示す。＊ＮＰＤ増殖細胞と、ＤＩ増殖細胞との間における有意差（ｐ＝０．０００６）、７％の全体的な差。＊＊ＮＰＤ増殖細胞と、ＤＩ増殖細胞との間における有意差（ｐ＝０．０００１）、１４％の全体的な差。
【図４４Ａ】図４４Ａは、初代ヒト線維芽細胞の増殖に対するＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の影響を例示する棒グラフである。初代ヒト線維芽細胞を反復して９６ウエルプレートに２つの初期細胞密度（ウエルあたり５０００個および１００００個の細胞）で播種した。一晩増殖させた後、細胞を固定処理し、クリスタルバイオレット色素保持法によってアッセイした。結果がＯ．Ｄ．値で示される。それぞれの棒が所与の増殖条件の平均Ｏ．Ｄ．を表す。誤差棒は平均の標準誤差を示す。＊５０００細胞／ウエルの細胞密度について、ＤＩ（コントロールの水）と、ＮＰＤ（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））との間における有意差（ｐ＜＜０．０００１）。＊＊１００００細胞／ウエルの細胞密度について、ＤＩと、ＮＰＤとの間における有意差（ｐ＜＜０．０００１）。
【図４４Ｂ】図４４Ｂは、初代ヒト線維芽細胞の増殖に対するＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の影響を例示する棒グラフである。２４ウエルプレートにおいて、初代ヒト線維芽細胞を、三連で、ＮＰＤに基づく培地およびＤＩに基づく培地に播種した。隣の三連組（ＮＰＤおよびＤＩの両方で）を、生細胞を剥がし、計数することによって２４時間毎に分析した。結果がウエルあたりの生細胞の数で示され、誤差棒は平均の標準誤差を示す。
【図４５】図４５は、細胞数を計数することによって測定されるような、間葉系幹細胞の増殖に対するＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の影響を例示する棒グラフである。
【図４６】図４６は、クリスタルバイオレット染色によって測定されるような、間葉系幹細胞の増殖に対するＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の影響を例示する棒グラフである。
【図４７】図４７は、１００％のアセトンに溶解されたセファロスポリンの分光光度計による読み取りである。
【図４８】図４８は、ろ過前およびろ過後における、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたセファロスポリンの分光光度計による読み取りである。
【図４９】図４９Ａ〜Ｂは、セファロスポリン濃度が異なるＬＢにおけるＤＨ５αの増殖曲線である。細菌を２回別々に３７℃および２２０ｒｐｍで増殖させた。
【図５０】図５０Ａ〜Ｂは、２回別々に接種した後７時間における、コントロールでの増殖（セファロスポリン非添加）に対する参照での２つの異なるセファロスポリン濃度によるＤＨ５αの生存性を例示する棒グラフである（コントロール群は１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含有する）。
【図５１】図５１は、ＤＤＷでのスペクトルに対するＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の光学活性を例示する棒グラフである。赤色および青色の曲線は、異なる日に測定された異なるＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）バッチ物の測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明は、細胞増殖および細胞融合を高めるための新規な組成物の発明である。
【００５３】
特に、本発明は、モノクローナル抗体の作製を高めるために使用されることができる。
【００５４】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の記載において示されるか、または、実施例において例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施することができ、または、様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定するものとして見なすべきでないことを理解しなければならない。
【００５５】
ヒトモノクローナル抗体の作製では、ヒトのＢリンパ球を骨髄起原のパートナー細胞株との融合によって不死化することが必要である。しかしながら、モノクローナル抗体作製のために利用可能である唯一のヒトＢ細胞は、末梢血において循環するＢ細胞であるので、モノクローナル抗体作製のための細胞の供給源は限定される。
【００５６】
加えて、分泌されたモノクローナル抗体の量は典型的には多くないので、高レベルの単離されたモノクローナル抗体をハイブリドーマ細胞培養から作製することが困難であることが判明している。
【００５７】
モノクローナル抗体作製の理論的な成果および実際の成果を結びつけるためには、融合プロセスの効率が非常に高いことが必要であり、これは、末梢血から得られるＢ細胞が少ないことを克服するために、したがって、末梢血から得られるＢ細胞の不死化の可能性をより高くするために必要である。加えて、ハイブリドーマの安定性と、ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の分泌との両方を高めるための方法を見つける必要がある。
【００５８】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、ナノ構造（例えば、米国特許出願第６０／５４５９５５号および同第１０／８６５９５５号、ならびに、国際特許出願公開番号ＷＯ２００５／０７９１５３に開示されるナノ構造など）を含む組成物が細胞融合および細胞安定性の両方を促進することを発見している。
【００５９】
本明細書中下記において、また、下記の実施例の節において例示されるように、本発明者らは、ナノ構造および液体がヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および融合パートナー（ＭＦＰ−２）細胞の融合を促進させ、また、それらから作製されるハイブリドーマの安定性をも促進させることを明らかにしている（本明細書中下記において実施例１の表１および表３、ならびに、実施例１９の図３９および表６を参照のこと）。加えて、本発明者らは、ナノ構造および液体がハイブリドーマからの抗体の分泌を増大させることを示している。したがって、本発明の液体およびナノ構造はモノクローナル抗体の単離および作製に役立ち得る。
【００６０】
本発明は、この発見を、モノクローナル抗体の作製を促進させるだけでなく、他の真核生物細胞との間での融合を高める新規な組成物を提供するために利用し、同様にまた、一般には細胞の増殖を高めるために、具体的には間葉系幹細胞の増殖を高めるために利用する（図４５〜図４６）。
【００６１】
したがって、本発明の１つの局面によれば、細胞融合の方法が提供され、この場合、この方法は、細胞を、液体およびナノ構造を有する液体組成物を含む培地において融合し、それにより、細胞融合を達成することを含み、ただし、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【００６２】
本明細書中で使用される表現「細胞融合」は、２つ以上の生細胞を（エクスビボまたはインビボのどちらであっても）合体させることを示す。
【００６３】
細胞融合を、細胞を融合誘導（ｆｕｓｅｏｇｅｎｉｃ）条件のもとで一緒にする任意の方法によって達成することができる。例えば、細胞を融合刺激剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはセンダイウイルスなど）の存在下で融合させることができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９８８）  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。代替として、細胞を適切な電気的条件のもとで融合させることができる。
【００６４】
本明細書中で使用される用語「ナノ構造（ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」は、一つ以上の粒子を含むサブマイクロメートルスケールの構造を指し、それらの粒子の各々はナノメートルまたはサブナノメートルスケールであり、一般に「ナノ粒子」と略される。構造の異なる要素（例えばナノ粒子、分子）の間の距離は、数十ピコメートルまたはそれ未満のオーダであることができ（その場合においてナノ構造は「連続ナノ構造」と称される）、または数百ピコメートルから数百ナノメートルのオーダであることができる（その場合においてナノ構造は「不連続ナノ構造」と称される）。従って、本実施形態のナノ構造は、ナノ粒子、ナノ粒子の配置、または一つ以上のナノ粒子および一つ以上の分子のいかなる配置も含むことができる。
【００６５】
上記組成物の液体は水性液体、例えば水であることが好ましい。
【００６６】
本発明のこの局面による一つの好ましい実施形態によれば、液体組成物のナノ構造は、整列した流体分子によって包囲されたナノメートルサイズのコア材料を含み、これらの流体分子はコア材料と、そして互いに定常的な物理的状態にある。このような液体組成物は、本発明者の米国特許出願第６０／５４５９５５号および第１０／８６５９５５号、並びに国際特許出願公開ＷＯ  ２００５／０７９１５３に記載されており、それらの内容は参考としてここに組み入れられる。
【００６７】
このようなコア材料の例は、限定されないが、強誘電性物質、強磁性物質および圧電性物質を含む。強誘電性物質は、電場を加えることによって逆転または再配向させることができる永続的な電気的分極をある温度範囲にわたって維持する物質である。強磁性物質は、磁場を加えることによって逆転できる永続的な磁化を維持する物質である。好ましくは、ナノ構造は、コア材料の強誘電性または強磁性を保持し、それによってマクロスケールの物理的特性がナノスケール環境にもたらされる特別な特徴を有する。
【００６８】
コア材料はまた、結晶構造を持ってもよい。
【００６９】
本明細書中で使用される用語「整列した流体分子」は、相互関係を有する、例えば流体分子間の相関を有する流体分子の組織化された配置を示す。例えば、一つの流体分子の即座の変位は、コア材料を包囲する一つ以上の他の流体分子の即座の変位と相互に関係されることができる。
【００７０】
本明細書中で使用される用語「定常的な物理状態」は、物体または分子が、少なくとも局所的な最小値を有する何らかのポテンシャルによって結びついている状況を示す。そのようなポテンシャルについての代表的な例には、限定されないが、ファンデルワールスポテンシャル、湯川ポテンシャル、およびレナード・ジョーンズポテンシャルなどが含まれる。他の形態のポテンシャルもまた、考えられる。
【００７１】
好ましくは、エンベロープの流体分子は液体組成物の液体分子と同一である。エンベロープの流体分子は、液体組成物の液体分子と同一でない追加の流体を含んでもよく、従ってエンベロープは不均一流体組成物を含んでもよい。
【００７２】
整列した流体分子のエンベロープの形成のため、本実施形態のナノ構造は、液体の比重より低いかまたはそれに等しい比重を有することが好ましい。
【００７３】
流体分子は液体状態またはガス状状態またはそれらの二つの混合状態のいずれかであってもよい。
【００７４】
ナノ構造の好ましい濃度は１リットルあたり１０２０個未満のナノ構造、より好ましくは１リットルあたり１０１５個未満のナノ構造である。好ましくは、液体中のナノ構造は、それらの間で引きつける静電力によって少なくとも一つの追加のナノ構造とクラスター形成することができる。好ましくは、ナノ構造間の距離がクラスター形成（約０．５〜１０μｍ）を防止するとき、ナノ構造は長距離の相互作用を維持することができる。
【００７５】
理論に拘束されないが、ナノ構造間の長距離相互作用は液体組成物に独自の特性を与えると考えられる。一つのこのような特徴は、後述する実施例の欄に示すように、本発明の液体組成物が２つの細胞タイプの間の融合プロセスを促進することができることである。さらに、後述する実施例の欄の実施例２に示すように、液体組成物は、細胞の安定性を増大することが示された。加えて、液体組成物は、ハイブリドーマからの抗体の分泌を促進することが示された（実施例１９）。
【００７６】
本発明のこの局面に従ったナノ構造の製造は、「トップダウン」プロセスを使用して行うことができる。このプロセスは、粉末（例えば、鉱物、セラミック粉末、ガラス粉末、金属粉末または合成ポリマー）が、十分に高い温度に、好ましくは約７００℃を越えて加熱される下記の方法工程を含む。意図される固体粉末の例には、ＢａＴｉＯ３、ＷＯ３およびＢａ２Ｆ９Ｏ１２が含まれるが、これらに限定されない。驚いたことに、本発明者は、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）もまた本発明の液体組成物を生成するために加熱されてもよいことを示した。ハイドロキシアパタイトは、それが非毒性によって特徴づけられ、一般に人の治療のためにＦＤＡ承認されているので、特に好ましい。
【００７７】
多くのハイドロキシアパタイト粉末がＳｉｇｍａ，ＡｌｄｒｉｃｈおよびＣｌａｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（例えばカタログＮｏ．１３０６−０６−５）のような多数の製造業者から入手可能であることが認識されるだろう。
【００７８】
表４に示されるように、ＨＡに基づく液体組成物は全て、水と比較すると高い緩衝能力を持つ。
【００７９】
加熱された粉末は次いで、冷たい液体（水）に、その密度異常温度以下で、例えば３℃または２℃で浸漬される。同時に、冷たい液体および粉末は、電磁ＲＦ放射線、好ましくは５００ＭＨｚ以上、７５０ＭＨｚより高いものによって照射され、それは連続波ＲＦ放射線または変調ＲＦ放射線のいずれであってもよい。
【００８０】
上記で記載される製造プロセスの期間中において、供給源粉末の大きな塊の一部が崩壊し、また、供給源粉末の個々の粒子の一部がその形状を変化させ、球状のナノ構造になることが本発明者らによって明らかにされている。製造プロセスの期間中において、ナノ気泡が高周波処理によって生じ、また、高温の粒子がこの異常性温度よりも低い水の中に注入されることのために、キャビテーションが生じることが仮定される［Ｋａｔｓｉｒ他、「電気化学的析出に対するｒｆ照射の影響およびナノ粒子ドーピングによるその安定化」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１５４（４）、Ｄ２４９〜Ｄ２５９、２００７］。水はこの異常性温度よりも低く保たれるので、高温の粒子は局所的加熱を引き起こし、このことが、結果として、加熱された場所の比体積の局所的な減少を引き起こし、これがやがては他の場所で加圧下で生じる。プロセスの期間中に、また、プロセス後の数時間以下の時間的合間の期間中に、水が、外気とのガスの交換および周囲の電磁放射線の選択的な吸収を含む自己組織化プロセスを受けることが仮定される。この自己組織化プロセスが、ナノ気泡およびナノ構造から構成される安定な構造化された分布の形成につながることがさらに仮定される。
【００８１】
下記の実施例の節において明らかにされるように、本発明の実施形態の液体組成物は、消滅しない円二色性シグナルによって特徴づけられる。円二色性は、物質が特定の波長で平面偏光の光と相互作用するときに生じる光学現象である。円二色性が、１つの偏光した光成分と物質との相互作用の特徴が、別の偏光した光成分と物質との相互作用の特徴と異なるときに生じる。例えば、吸収バンドが、物質に対する右円偏光成分および左円偏光成分の示差的吸収に依存して負または正のいずれかであり得る。
【００８２】
液体組成物の消滅しない円二色性シグナルは、液体組成物が光学活性な媒体であることを示していることが認識される。したがって、本発明の実施形態の液体組成物は光の偏光を変化させることができ、一方で、光と相互作用することができる。本発明者らは、本発明の実施形態の液体組成物の光学活性が、ナノ気泡およびナノ構造の安定な構造化された分布の上記で述べられた形成によって現れる長距離秩序の結果であると仮定する。
【００８３】
本明細書中上記で述べられたように、本発明の液体組成物は、細胞融合のプロセスに役立つことが示された。細胞の例には、初代細胞および不死化細胞、同一の細胞および非同一の細胞、ヒト細胞および非ヒト細胞が含まれる。
【００８４】
表現「不死化（された）細胞」は、数世代にわたって、または、無限に細胞培養において継代培養することができる細胞または細胞株を示す。不死化細胞の一例が腫瘍細胞である。
【００８５】
したがって、例えば、本発明の液体組成物は、ハイブリドーマを作製するための、腫瘍細胞と、抗体産生細胞（例えば、Ｂリンパ球）との間でのエクスビボ融合を助けるために使用することができる。
【００８６】
本明細書中で使用される用語「ハイブリドーマ」は、２つの細胞、すなわち、免疫系由来の分泌細胞（例えば、Ｂ細胞）および不死性細胞（例えば、ミエローマなど）を１つのメンブランの中で融合することによって作り出される細胞を示す。得られるハイブリッド細胞はクローン化することができ、これにより、同一の娘細胞を作製することができる。これらの娘クローンのそれぞれが免疫細胞の細胞生成物を数世代にわたって分泌することができる。
【００８７】
本発明のこの局面の好ましい実施形態によれば、Ｂリンパ球はヒトのＢリンパ球である。本発明のこの局面の別の好ましい実施形態によれば、Ｂリンパ球は、末梢血において循環するリンパ球であり、例えば、ＰＭＢＣである。
【００８８】
ハイブリドーマを本発明のこの局面に従って作製するために使用することができる腫瘍細胞の例には、マウスのミエローマ細胞およびミエローマ細胞株、ラットのミエローマ細胞株、および、ヒトのミエローマ細胞株が含まれる。
【００８９】
好ましくは、ミエローマ細胞株はマーカーを含み、したがって、選抜手法を確立することができる。例えば、ミエローマ細胞株はＨＧＰＲＴ陰性（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ陰性）である場合がある。その具体的な例には、Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１−Ａｇ４／１（ＮＳ−１）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．ＵＩ（Ｐ３ＵＩ）、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ．ＢＵ．１（これらはマウスに由来する）、２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１．２．３（Ｙ３）（これはラットに由来する）、ならびに、Ｕ２６６ＡＲ（ＳＫＯ−００７）、ＧＭ１５００ＧＴＧ−Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９−６、ＬＩＣＲ−ＬＯＷ−ＨＭｙ２（ＨＭｙ２）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４−１（ＮＰ４１）およびＭＦＰ−２（これらはヒトに由来する）が含まれる。
【００９０】
本発明のこの局面によれば、腫瘍細胞および／またはＢリンパ球が、本発明の液体組成物を含む培地（例えば、培養培地）においてインキュベーションされる。
【００９１】
本明細書中で使用される表現「培養培地」は、真核生物細胞が少なくとも１２時間にわたって生存性を保ち続けること、好ましくは、複製するために生存性を保ち続けることを可能にする培地を示す。
【００９２】
本発明の液体組成物におけるインキュベーションを、ハイブリドーマの数を増大させるために、融合手順の前から、融合手順の期間中および／または融合手順の後まで行うことができる。融合プロセスに先立つ本発明の液体組成物におけるインキュベーションを、ハイブリドーマの生成を高めるように任意の長さの時間にわたって行うことができる。好ましくは、インキュベーションは１日を超える。本明細書中下記の実施例１において例示されるように、ＭＦＰ−２細胞（ミエローマ細胞）が、融合前のおよそ２０日間、本発明の液体組成物を含む細胞培地で増殖させられた。融合手法自体もまた、本発明の液体組成物を含む培地において行うことができる。
【００９３】
本発明の局面のいずれかによれば、培養用培地の液体部分は、本明細書中下記においてさらに記載されるように、全体または一部を本発明の組成物の液体組成物に交換することができる。
【００９４】
培養培地は、本発明の局面のいずれかによれば、典型的には、経験に基づいて選択される。これは、それぞれの細胞が特定の様式で異なる培養培地に応答するからである。培養培地の様々な例が本明細書中下記においてさらに記載される。
【００９５】
本発明の液体組成物は、他の細胞（例えば、腫瘍細胞および樹状細胞など）の間でのエクスビボ融合を助けるために使用することができる。そのような融合された細胞は抗ガンワクチンとして効果的であり得ることが示されている［Ｚｈａｎｇ  Ｋ他、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２００６（Ｊｕｎ  ７）；１２（２１）：３４３８〜４１］。
【００９６】
本発明の液体組成物は、体細胞と、幹細胞との間でのインビボ融合を助けるために使用することができる。その強力な増殖能力および再生能力のために、幹細胞を、骨髄における損傷を修復するために、また、様々な器官（例えば、肝臓、脳および心臓など）を分化させるために使用することができる。幹細胞の修復特性の一部が、幹細胞が修復している器官に元々存在する細胞と融合するその能力に由来することが示されている［Ｗａｎｇ他、２００３、Ｎａｔｕｒｅ、４２２、８９７〜９０１］。それに従えば、本発明の液体組成物は、幹細胞と、体細胞（例えば、骨細胞および筋細胞など）との間での融合を高めるために使用することができる。したがって、幹細胞を本発明の液体組成物により処理し、その結果、幹細胞が、標的部位に対して、より迅速に、また、より効果的に融合し、それにより、幹細胞修復プロセスを行わせるようにすることができる。
【００９７】
本発明の液体組成物はまた、核酸を、細胞融合を介してインビボ移入するために使用することができる。例えば、Ｈｏｐｐｅ  ＵＣ、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．、１９９９（Ａｐｒ  ３０）；８４（８）：９６４〜７２を参照のこと。
【００９８】
本発明の組成物が役立ち得る別のエクスビボ融合プロセスが、胚性幹細胞と、ヒト細胞と間での融合である。そのような融合は、胚性幹細胞と類似する様式で挙動するハイブリッドを生じさせること、したがって、移植片のための遺伝子的に一致した幹細胞を生じさせることが示された。具体的には、ヒトの胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）がヒトの線維芽細胞と融合させられ、これにより、安定な四倍体ＤＮＡ含有量を維持し、かつ、ｈＥＳ細胞に特徴的な形態学、増殖速度および抗原発現パターンを有するハイブリッド細胞が得られた［Ｃｏｗａｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５（Ａｕｇ  ２６）；３０９（５７３９）：１３６９〜７３］。
【００９９】
本発明の液体組成物によって促進され得るさらに別のエクスビボ融合プロセスが、体細胞核移入である。これは、体細胞が除核卵母細胞と融合させられるプロセスである。体細胞の核が遺伝情報を提供し、一方、卵母細胞は、胚が発達するために必要である栄養分および他のエネルギー産生物質を提供する。この手法は胚性幹細胞のクローン化および作製のために使用される。
【０１００】
さらに本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、本発明の液体組成物が、融合プロセス、融合プロセスによって作製されたハイブリドーマのクローン化、および、ハイブリドーマからの抗体の分泌を含めて、モノクローナル抗体作製の全プロセスを高めることを示している。本発明者らは、本発明の液体組成物の存在下で作製されたクローン化されているハイブリドーマが、本発明の液体組成物の非存在下で作製されたクローン化されているハイブリドーマよりも安定であることを示している。
【０１０１】
したがって、本発明の別の局面によれば、モノクローナル抗体を作製する方法が提供され、この場合、この方法は、不死化している細胞を、液体およびナノ構造を有する液体組成物を含む培地においてハイブリドーマを得るために抗体産生細胞と融合することを含み、ただし、前記ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、前記コア物質と、前記整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【０１０２】
本明細書中で使用される表現「モノクローナル抗体」は、免疫分子が免疫反応するいずれかの抗原に対する単一の結合親和性を含む免疫分子を示す。
【０１０３】
本発明のこの局面によれば、モノクローナル抗体が、不死化している細胞を、本明細書中上記で記載されるような本発明の液体組成物においてハイブリドーマを作製するために抗体産生細胞と融合することによって作製される。その後、作製されたハイブリドーマはクローン化することができる。本発明のこの局面の好ましい実施形態によれば、クローン化が、単一のハイブリドーマを、本発明の液体組成物を含む培地においてインキュベーションすることによって行われる。
【０１０４】
本発明の液体組成物の存在下で作製されたクローン化されているハイブリドーマは、その非存在下で作製されたクローン化されているハイブリドーマよりも安定であるので、クローン化手法は典型的には、安定化因子（例えば、ＨＣＦなど）の添加を必要としない。
【０１０５】
ハイブリドーマの作製、および、必要な場合に行われるそのクローン化の後で、モノクローナル抗体をスクリーニングすることができ、様々なモノクローナル抗体を集めることができる。多くのスクリーニング方法がこの技術分野では知られており、これらには、機能的アッセイおよび構造的アッセイが含まれる。ハイブリドーマをスクリーニングするための１つの例示的な方法が、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用する本明細書中下記の実施例２において記載される。
【０１０６】
モノクローナル抗体を集めるための技術もまた、この技術分野では広く知られており、そのような技術には、典型的には、標準的なタンパク質精製方法が含まれる。
【０１０７】
本発明のさらにさらなる局面によれば、包装材に包装され、本明細書中に記載されるような、モノクローナル抗体の作製における使用のために包装材の中または表面において印刷で特定される、本明細書中上記で記載されるような本発明の組成物を含む製造物が提供される。
【０１０８】
本発明の組成物は、真核生物細胞物（例えば、本明細書中上記で記載されるハイブリドーマなど）の安定化を高めることが示されているので、本発明者らは、本発明の組成物が、他の真核生物細胞物の安定化を高めるために利用され得ることを認識している。
【０１０９】
したがって、本発明のさらに別の局面によれば、真核生物細胞を培養する方法が提供される。この方法は、細胞を、液体およびナノ構造を有する液体組成物を含む培地においてインキュベーションすることを含み、ただし、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【０１１０】
理論にとらわれることはないが、本発明者らは、本発明の液体組成物が、いくつかの理由で、培養培地における使用のために特に適していると考える。
【０１１１】
第１に、本発明者らは、本発明の液体組成物により、この液体組成物において培養される細胞の増殖速度が増大し得ることを示している（図１、実施例３、および、図４３Ａ〜図４３Ｃ、実施例１９）。
【０１１２】
第２に、本発明者らは、本発明の液体組成物により、様々な作用因の溶解性が高まることを示している（実施例８〜実施例１５、図１１〜図３４、ならびに、実施例１８および実施例２１）。このことは、培養培地に添加される必要がある水不溶性作用因の溶解性を高めるために特に関連し得る。
【０１１３】
第３に、本発明者らは、本発明の液体組成物が、高まった緩衝能力を含むこと、すなわち、水よりも大きい緩衝能力を含むことを示している（実施例４〜実施例７、図２〜図１０）。このことは、特にｐＨ感受性である細胞のために関連し得る。
【０１１４】
本明細書中で使用される表現「緩衝能力」は、酸または塩基が添加されたとき、安定なｐＨを維持する組成物の能力を示す。
【０１１５】
最後に、本発明者らは、本発明の液体組成物により、タンパク質が安定化され得ることを示している（実施例１６〜１７、図３５〜図３６）。このことは、安定でないペプチド作用因が培養培地に添加される必要があるならば、特に関連し得るか、または、細胞から分泌されたペプチド作用因を安定化するために特に関連し得る。
【０１１６】
本発明のこの局面によれば、細胞は、どのような目的のためにも、例えば、増殖、維持および／またはクローン化（これらに限定されない）などのために培養され得ることを理解しなければならない。加えて、インキュベーション時間は決して制限されず、細胞は、必要とされる限り、長期にわたって本発明の組成物において培養され得ることを理解しなければならない。
【０１１７】
本発明の組成物は、低い濃度で典型的には存在する因子のオートクリン分泌を必要とする細胞を培養するために特に有用であり得る。例えば、間葉系幹細胞は、増殖を高めるＤＫＫ１を分泌することが示された。本発明の組成物の整列した構造は、ＤＫＫ１の濃度を効果的に増大させ、それにより、その増殖を高めるために役立ち得る。
【０１１８】
本発明の組成物はまた、非安定である傾向を有する細胞を培養するために特に有用であり得る。そのような細胞の例には、ハイブリドーマ、凍結後に再培養されている細胞、および、低い濃度で存在する細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
本発明者らは、いずれかの真核生物細胞培養培地の水分含有量のすべてまたは一部を本発明の液体組成物で交換することを意図する。培地の水分含有量の除去を、凍結乾燥、風乾およびオーブン乾燥などの技術を使用して行うことができる。したがって、培養用培地の液体部分は５％（より好ましくは１０％、より好ましくは２０％、より好ましくは４０％、より好ましくは６０％、より好ましくは８０％、一層より好ましくは１００％）の本発明の液体組成物を含むことができる。
【０１２０】
多くの培地がまた、乾燥された成分として市販されている。そのようなものとして、本発明の液体組成物は、培地の水成分を除くことを事前に必要とすることなく加えることができる。
【０１２１】
真核生物細胞培養培地の例には、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ａｍｅｓ  Ｍｅｄｉａ、ＣＨＯ細胞培地、ＨａｍのＦ−１０培地、ＨａｍのＦ−１２培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔａ  Ｌ−１５培地、ＭｃＣｏｙ培地、ＭＥＭ  Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍが含まれる。そのような培地が、様々な会社から、例えば、Ｓｉｇｍａ  ＡｌｄｒｉｃｈおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどから広範囲に入手可能である。
【０１２２】
培地は、様々な他の成分、例えば、増殖因子、血清および抗生物質などを含み得ることが理解される。そのような成分が、例えば、Ｓｉｇｍａ  ＡｌｄｒｉｃｈおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。
【０１２３】
好ましくは、本発明の液体組成物は、細胞を本発明の液体組成物においてインキュベーションする前に（例えば、ろ過滅菌によって）滅菌される。
【０１２４】
本発明のさらにさらなる局面によれば、包装材に包装され、本明細書中に記載されるように真核生物細胞を培養することのために包装材の中または表面において印刷で特定される、本明細書中上記で記載されるような本発明の組成物を含む製造物が提供される。
【０１２５】
本明細書中上記で述べられたように、本発明の組成物は調製済みの培養培地として製造することができる。それに従えば、真核生物細胞培養培地と、本明細書中上記で記載されるような液体組成物とを含む細胞培養培地が提供される。
【０１２６】
本発明の別の局面によれば、セファロスポリンを、この物質を分散または溶解することを可能にする条件のもとでナノ構造および液体と接触させることを含む、セファロスポリンを溶解または分散する方法が提供され、この場合、ナノ構造は、流体の整列した流体分子によって包まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【０１２７】
セファロスポリンは、可溶化プロセスを助けるために本発明の液体組成物を加える前の溶媒、または、加えた後の溶媒に溶解することができる。本発明では、この物質の溶解性をさらに増大させるために、極性、非極性、有機（例えば、エタノールまたはアセトンなど）または非有機を含む任意の溶媒の使用が意図されることが理解される。
【０１２８】
溶媒は、物質が本発明の液体組成物に溶解／分散されたままであるように可溶化プロセスの期間中の任意のときに（完全または部分的に）除くことができる。溶媒を除く様々な方法がこの技術分野では知られている（例えば、蒸発（すなわち、加熱、または、圧力を加えることによる蒸発）、または、任意の他の方法など）。
【０１２９】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を意味する。
【０１３０】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例を検討したとき、当業者には明らかになる。加えて、本明細書中上記に描かれるような、また、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１３１】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１３２】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ他著「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ他、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎ他編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ他編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている：米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９８４）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（１９８５）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（１９８４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ他、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；なお、これらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１３３】
実施例１
ヒトハイブリドーマの単離に対する、ナノ構造を含む水の影響
下記の実験を、ナノ構造を含む水が、モノクローナル抗体作製の最初の段階、すなわち、ハイブリドーマの単離に影響を及ぼすかどうかを確認するために行った。
【０１３４】
材料および方法
細胞増殖のための試薬：ＲＰＭＩ１６４０をＢｅｉｔ−ＨａＥｍｅｋ（イスラエル）から粉末で購入し、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（Ｄｅｃｏｏｐ、イスラエル）またはコントロールの水（逆浸透による精製水）のいずれかにおいて再構成した。再構成後、重炭酸ナトリウムを製造者の勧めに従って培地に加え、ｐＨを７．４に調節した。培養培地には、１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ＭＥＭ−ビタミン（０．１ｍＭ）、非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）およびピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）が補充された（すべてをＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した）。ＨＣＦをＯｒｉＧｅｎから購入した。上記補充物のすべてを、水に基づく液体形態で購入し、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地またはコントロールの培地に希釈した。８−アザグアニン、ＨＴおよびＨＡＴをＳｉｇｍａから購入し、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づくＲＰＭＩまたはコントロールのＲＰＭＩのいずれかを用いて粉末形態から再構成した。
【０１３５】
化学試薬：粉末化ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）またはコントロールの水を用いて再構成した。フレーク状ＰＥＧ−１５００（Ｓｉｇｍａ）を、無菌ＰＢＳの両方の形態を用いて再構成した（５０％ｗ／ｖ）。液体ＰＥＧのｐＨを約７に調節し、液体ＰＥＧをろ過滅菌した。ハンクス平衡塩溶液をＢｅｉｔ−ＨａＥｍｅｋから購入した。ＥＬＩＳＡプレートをコーティングするための炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ＝９．６）、ＯＰＤ（０．４ｍｇ／ｍＬで使用）およびリン酸塩−クエン酸塩緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ＝５．０）をＳｉｇｍａから購入した。
【０１３６】
抗体：ヤギ抗ヒトＩｇＭおよびＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＭをＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入した。標準ヒトＩｇＭをＳｉｇｍａから購入した。
【０１３７】
融合：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および融合パートナー（ＭＦＰ−２）細胞を混合およびペレット化の前に血清非含有の培養培地で４回洗浄した。３７℃に予熱された３００μｌのＰＥＧ−１５００を細胞混合物（１０〜２００ｘ１０６細胞）に加え、絶えず振とうしながら３分間インキュベーションした。その後、ＰＥＧをハンクス平衡塩溶液および完全ＲＰＭＩにより細胞混合物から希釈した。ウシ胎児血清（１０％）およびＨＴ（ｘ２）を得られた細胞懸濁物に加えた。このプロセスの期間中に生じたハイブリドーマをＨＡＴ選抜とともに完全ＲＰＭＩにおいて９６ウエルプレートで培養した。抗体についての上清のスクリーニングを、ハイブリドーマ細胞がウエルのおよそ１／４を占めたときに始めた。
【０１３８】
サンドイッチＥＬＩＳＡ：サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ハイブリドーマの上清をＩｇＭについてスクリーニングした。簡単に記載すると、捕獲抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＭ）を炭酸塩／重炭酸塩緩衝液において調製し、１００ｎｇ／１００μｌ／ウエルの濃度で９６ウエルプレートに加えた。その後、プレートを４℃で一晩インキュベーションした。下記の工程のすべてを室温で行った。ＰＢＳにおける０．３％乾燥乳による１時間のブロッキング処理の後、ハイブリドーマからの上清をさらに１．５時間加えた。ＰＢＳにおいて１：５００で希釈されたヒト血清を陽性コントロールとして使用した。ハイブリドーマ増殖培地を陰性コントロールとして使用した。二次抗体（ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＭ）を１：５０００の濃度でブロッキング溶液において調製し、１時間インキュベーションした。比色反応を生じさせるために、プレートを、０．０３％のＨ２Ｏ２を含有するリン酸塩−クエン酸塩緩衝液においてＯＰＤとインキュベーションした。発色反応を１５分後に１０％塩酸により停止させた。反応の読み取りおよび記録を、４９２ｎｍの波長フィルターを使用してＭｕｌｔｉｓｃａｎ−Ａｓｃｅｎｔで行った。
【０１３９】
結果
２組の同一の実験を行った。最初の実験では、すべてが、（液体補充物の添加を除いて）ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく試薬であり、第２の実験では、試薬が標準的な逆浸透水（本明細書中では、コントロールの水）で作製された。記載された実験におけるｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の使用を細胞増殖の時点で開始した。すなわち、ＭＦＰ−２細胞の２つの集団を等しい密度で置床した：一方をｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく完全ＲＰＭＩにおいて置床し、もう一方をコントロールの水に基づく完全ＲＰＭＩにおいて置床した。この段階で、ＭＦＰ−２を、ＨＡＴ耐性細胞を選抜するために８−アザグアニンの存在下で増殖させた。１週間の増殖の後、２つの融合実験を、等しい数のリンパ球およびＭＦＰ−２細胞を用いて行った。それぞれの融合物を９６ウエルの８枚のプレートに置床した。およそ２０日後、両方の融合に由来するハイブリドーマをそれらのＩｇＭ産生能について試験した。それぞれのプレートにおいて見出されるＩｇＭ陽性クローンの数が下記の表１に示される。
2010515432.tif 000002
【０１４０】
統計学的有意差が、コントロールでのＩｇＭ陽性ウエルの平均数と、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）でのＩｇＭ陽性ウエルの平均数との間に見出された（コントロール対ｎｅｏｗａｔｅｒについてのアンペアード両側ｔ検定：ｐ＜０．００１）。加えて、上記の表において認められるように、プレートあたりのハイブリドーマの数が比較的一定している。このことは、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）が、おそらくはその安定化作用の結果である、ハイブリドーマの作製でのより大きな一貫性を可能にすることを示している。したがって、ヒトのモノクローナル抗体を分泌する安定なハイブリドーマクローンを作出し、単離するプロセス全体がｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）では大きく高められる。
【０１４１】
コントロールおよびｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＩｇＭ陽性ウエルの量（この場合、測定された濃度は希釈血清よりも大きかった）もまた測定された。表１に例示されるように、統計学的有意差が、χ２検定を使用したとき、検出されなかった。このことは、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）がハイブリドーマの形成および安定化に影響を及ぼしているが、同様に大きな役割を分泌のレベルにおいて果たしていないことを強く示唆する。
【０１４２】
ハイブリドーマ形成後の、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地における抗体の分泌の速度論を分析した。ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は分泌を実際に増大させることが示されており、だが、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は、細胞の分泌装置に影響を及ぼすことによってではなく、むしろ、ハイブリドーマを安定化し、それにより、より大きな全体的な分泌速度を可能にすることによって分泌を増大させているかもしれない。
【０１４３】
コントロールと、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）との間での、ＩｇＭ産生ハイブリドーマの数における違いは、ＥＬＩＳＡによる測定がｎｅｏｗａｔｅｒの環境ではより精密であることに起因すると考えられ得るので、下記の実験を行った。３つの検量線を作製した。標準のヒトＩｇＭを下記において希釈した：１）Ｔｒｉｓ緩衝液、２）コントロールの増殖培地（完全ＲＰＭＩ）、３）ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）での増殖培地（完全ＲＰＭＩ）。この実験の結果が本明細書中下記の表２に示される。
2010515432.tif 000003
【０１４４】
表２が示すように、コントロール培地およびｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）培地はともに、光学濃度の値が、Ｔｒｉｓ緩衝液と比較して、やや歪んでいる（製造者の勧めに従って、標準ＩｇＭは校正されなければならない）。しかしながら、統計学的有意差が、試験された範囲において、光学濃度のコントロールでの値と、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）での値との間に見出されなかった。
【０１４５】
実施例２
ヒトハイブリドーマのクローン化に対する、ナノ構造を含む水の影響
関係のあるハイブリドーマを単離した後でのモノクローナル抗体作製における次の工程は、ハイブリドーマをクローン化によって安定化することである。ナノ構造を含む水がハイブリドーマのクローン形成能を妨げ得るかどうかを試験するために、下記の実験を行った。
【０１４６】
材料および方法
クローン化：ハイブリドーマのクローン化を標準的なプロトコルに従って行った。簡単に記載すると、限られた数（およそ１０４個）の細胞を９６ウエルディッシュの上段横列にわたって連続希釈し、その後、その第１横列の内容物を、残る８個の横列において下に向かって連続希釈した。このようにして、プレートの右下に向かうウエルは、ただ１個の細胞を有する傾向を有した。
【０１４７】
ＩｇＭ含有量についてのスクリーニング：サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ハイブリドーマの上清をＩｇＭについてスクリーニングした。簡単に記載すると、捕獲抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＭ）を炭酸塩／重炭酸塩緩衝液において調製し、１００ｎｇ／１００μＬ／ウエルの濃度で９６ウエルプレートに加えた。その後、プレートを＋４℃で一晩インキュベーションした。下記の工程のすべてを室温で行った。ＰＢＳにおける０．３％乾燥乳による１時間のブロッキング処理の後、ハイブリドーマからの上清を１．５時間加えた。ＰＢＳにおいて１：５００で希釈されたヒト血清を陽性コントロールとして使用した。バックグラウンドについて、また、陰性コントロールとして、ハイブリドーマ増殖培地を使用した。二次抗体（ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＭ）を１：５０００の濃度でブロッキング溶液において調製し、１時間インキュベーションした。比色反応を生じさせるために、プレートを、０．０３％のＨ２Ｏ２を含有するリン酸塩−クエン酸塩緩衝液においてＯＰＤとインキュベーションした。発色反応を１５分後に１０％塩酸により停止させた。反応の読み取りおよび記録を、４９２ｎｍの波長フィルターを使用してＭｕｌｔｉｓｃａｎ−Ａｓｃｅｎｔで行った。
【０１４８】
結果
３つのサブクローンプレートを下記の様式で同じ陽性親のウエルから調製した：プレートＩを、ＨＣＦの添加がないｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）での培地においてサブクローン化した；プレートＩＩを、ＨＣＦの添加を有するコントロールの水での培地においてサブクローン化した；プレートＩＩＩを、ＨＣＦを伴うｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）での培地においてサブクローン化した。これらのプレートを２週間にわたって顕微鏡で追跡し、２週間後、ウエルにおける細胞密度は、測定可能な量の抗体を産生するために十分に高かった。その後、これら３つのプレートの上清をそれらのＩｇＭ含有量について試験した。この実験をまとめる結果が本明細書中下記の表３に示される。
2010515432.tif 000004
【０１４９】
統計学的有意差が、ＩｇＭ産生クローンの頻度の間に、または、それぞれのプレートにおいて産生される抗体量の分布の間に見られなかった。このことは、ハイブリドーマが、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地では、ＨＣＦを伴うコントロールの培地の場合と同じくらい良好にクローン化することを示している。コントロールの培地では、ＨＣＦの添加がない場合、ハイブリドーマはクローン化しない。このことは、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地が、不安定なハイブリドーマのクローン形成能を高める環境をもたらすことを示唆する。この考えはまた、ハイブリドーマ回収の頻度が、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく試薬での融合、および、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地での増殖の後では高まることによっても支持される。
【０１５０】
考察および結論
本実施例に記載される実験の結果は、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は、物理的な細胞融合の効率を上げることによってであるか、または、融合の過程において生じるハイブリドーマを安定化させることによってであるかにかかわらず、融合プロセスを改善することを示している。どちらにしても、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）において調製される融合体の収率はコントロールの場合よりも有意に高かった（ｐ＜０．００１、表１）。また、高収率ハイブリドーマの割合および抗体濃度の分布が、コントロールでの試験と、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）での試験との間で有意に異なっていないので（表１）、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）はおそらくは抗体産生または抗体分泌の機構に干渉していない。
【０１５１】
しかしながら、このクローン化実験では、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）が、新しいクローンに対する安定化作用を有するかもしれないという仮説を裏付ける重要な証拠が明らかにされた。ＨＣＦを伴わないクローン化では、ほとんどの場合において、成功した安定なクローンがもたらされない。この試薬（これは実際にはマクロファージ馴化培地である）の役割は、細胞１個の増殖を支えることである。ＨＣＦからハイブリドーマによって受け取られる因子がない場合、ハイブリドーマは、大抵の場合、死に至るか、または、かろうじて増殖し、しかし、抗体を産生するその能力を失っている。生育可能な抗体分泌ハイブリドーマが、ＨＣＦを伴わないｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるクローン化の間に得られたという事実は、それ自体が有益な知見である。そのうえ、これらのクローンは、ＨＣＦ−クローン化で確立されたクローンと統計学的に比較されたとき、それらの産生能および頻度において等しい。
【０１５２】
他の観測結果もまた、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の安定化作用の仮説を裏付けている。例えば、コントロールの培地への解凍の後で回復しなかった細胞集団が、ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地ではゆっくり回復した。ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の環境において生じ、増殖した、産生能を有するクローンは、培地が１日間、コントロールに変えられたとき、抗体を分泌することを停止した。
【０１５３】
実施例３
増殖に対する、ナノ構造を含む液体組成物の影響
下記の実験を、ナノ構造を含む液体組成物が細胞増殖に影響を及ぼすかを確認するためにヒト間葉系細胞に対して行った。
【０１５４】
材料および方法
ヒト間葉系幹細胞の増殖をＲＯ水またはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地において調べた。
【０１５５】
培地の調製：２５０ｍｌのＭＥＭα培地を、２．５ｇのＭＥＭおよび０．５５ｇのＮａＨＣＯ３をＲＯ水またはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のいずれかに加えることによって調製した。
【０１５６】
細胞培養：細胞を、２０％のウシ胎児血清、１００ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補充されたＭＥＭαにおいて維持した（Ｃｏｌｔｅｒ他、２００１、ＰＮＡＳ、９８：７８４１〜７８４５）。細胞を計数し、２つのタイプのＭＥＭα培地において５００細胞／ｍｌの濃度に希釈した：一方のＭＥＭα培地がＲＯ水に基づき、もう一方のＭＥＭα培地がＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づいた。細胞を、９６ウエルプレートで、すなわち、５０個の細胞をそれぞれのウエルに有する１００μｌの培地において増殖させた。８日後、細胞増殖をクリスタルバイオレット生存性アッセイによって推定した。このアッセイにおける色素はＤＮＡを染色する。可溶化したとき、単層物によって取り込まれた色素の量を５９０ｎｍにおいてプレートリーダーで定量することができる。
【０１５７】
結果
クリスタルバイオレット生存性アッセイの結果が本明細書中下記において表４および図１にまとめられる。
2010515432.tif 000005
【０１５８】
結論
本発明の液体組成物は細胞の増殖を増大させる。
【０１５９】
実施例４
ナノ構造を含む組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む組成物の影響を調べた。
【０１６０】
材料および方法
フェノールレッド溶液（２０ｍｇ／２５ｍｌ）を調製した。２９０μｌを、１３ｍｌのＲＯ水、または、ナノ構造を含む水（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）の様々なバッチに加えた。それぞれの水が、フェノールレッド溶液が加えられた後でのそれらの黄色または明るいオレンジ色により、それらのすべてが酸性であったが、異なる開始ｐＨを有したことが認められた。２．５ｍｌのそれぞれの水＋フェノールレッド溶液をキュベットに加えた。水酸化ナトリウムの増大する体積をそれぞれのキュベットに加え、吸収スペクトルを分光光度計で読み取った。酸性溶液はピークを４３０ｎｍにおいて与え、アルカリ性溶液はピークを５５７ｎｍにおいて与える。波長の範囲は２００ｎｍ〜８００ｎｍであり、しかし、０．０２Ｍ水酸化ナトリウムの添加に関連しては、グラフは５５７ｎｍの波長だけを示す。
【０１６１】
結果
表５には、水酸化ナトリウム滴定の後でのそれぞれの水の溶液の５５７ｎｍにおける吸光度がまとめられる。
2010515432.tif 000006
【０１６２】
図２および表５に例示されるように、ＲＯ水は、水酸化ナトリウムを加えたとき、ｐＨにおけるより大きい変化を示す。ＲＯ水はわずかな緩衝作用を有するが、吸光度が０．０９Ａに達したとき、緩衝作用が「破れ」、ｐＨ変化が、より多くの水酸化ナトリウムを加えた後ではより大きくなる。ＨＡ−９９水はＲＯと類似している。ＮＭ（＃１５０９０５−１０６）（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））、ＡＢ水Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（ＡＢ１−２２−１  ＨＡ  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）は若干の緩衝作用を有する。ＨＡＰおよびＨＡ−１８はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）よりも一層大きい緩衝作用を示す。
【０１６３】
まとめると、この実験から、ＨＡ−９９−Ｘを除いて、試験されたナノ構造を含むすべての新しい水タイプ（ＨＡＰ、ＡＢ１−２−３、ＨＡ−１８、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と類似した特性を示す。
【０１６４】
実施例５
ナノ構造を含む液体組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む液体組成物の影響を調べた。
【０１６５】
材料および方法
水酸化ナトリウムおよび塩酸を、５０ｍｌのＲＯ水、または、ナノ構造を含む水（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）に加え、ｐＨを測定した。実験を三連で行った。すべてにおいて、３回の実験を行った。
【０１６６】
水酸化ナトリウム滴定：１μｌ〜１５μｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを加えた。
【０１６７】
塩酸滴定：１μｌ〜１５μｌの１Ｍ塩酸を加えた。
【０１６８】
結果
水酸化ナトリウム滴定についての結果を図３Ａ〜Ｃおよび図４Ａ〜Ｃに示す。塩酸滴定についての結果を図５Ａ〜Ｃおよび図６に示す。
【０１６９】
ナノ構造を含む水は、ＲＯ水について必要とされる同じｐＨレベルに到達するためにより多量の水酸化ナトリウムを要求するので、ナノ構造を含む水は緩衝能力を有する。この特徴は７．６〜１０．５のｐＨ範囲においてより著しい。加えて、ナノ構造を含む水は、ＲＯ水について必要とされる同じｐＨレベルに到達するためにより多量の塩酸を必要とする。この作用は、アルカリ範囲よりも、酸性ｐＨ範囲での方が大きい。例えば、１０μｌの水酸化ナトリウム（１Ｍ）を（総和で）加えたとき、ＲＯのｐＨが７．５６から１０．３に増大した。ナノ構造を含む水のｐＨは７．６２から９．３３に増大した。１０μｌの塩酸（０．５Ｍ）を（総和で）加えたとき、ＲＯのｐＨが７．５２から４．３１に低下した。ナノ構造を含む水のｐＨは７．７１から６．６５に低下した。この特徴は７．７〜３のｐＨ範囲においてより著しい。
【０１７０】
実施例６
ナノ構造を含む液体組成物の緩衝能力
緩衝能力に対する、ナノ構造を含む液体組成物の影響を調べた。
【０１７１】
材料および方法
フェノールレッド溶液（２０ｍｇ／２５ｍｌ）を調製した。１ｍｌを、４５ｍｌのＲＯ水、または、ナノ構造を含む水（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）に加えた。ｐＨを測定し、必要ならば、滴定した。３ｍｌのそれぞれの水＋フェノールレッド溶液をキュベットに加えた。水酸化ナトリウムまたは塩酸の増大する体積をそれぞれのキュベットに加え、吸収スペクトルを分光光度計で読み取った。酸性溶液はピークを４３０ｎｍにおいて与え、アルカリ性溶液はピークを５５７ｎｍにおいて与える。波長の範囲は２００ｎｍ〜８００ｎｍであり、しかし、０．０２Ｍ水酸化ナトリウムの添加に関連しては、グラフは５５７ｎｍの波長だけを示す。
【０１７２】
塩酸滴定：
ＲＯ：４５ｍｌ  ｐＨ５．８
１ｍｌのフェノールレッドおよび５μｌの水酸化ナトリウム（１Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝７．８５
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（＃１５０９０５−１０６）：４５ｍｌ  ｐＨ６．３
１ｍｌのフェノールレッドおよび４μｌの水酸化ナトリウム（１Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝７．１９
【０１７３】
水酸化ナトリウム滴定：
Ｉ．ＲＯ：４５ｍｌ  ｐＨ５．７８
１ｍｌのフェノールレッド、６μｌの塩酸（０．２５Ｍ）および４μｌの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝４．４３
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（＃１５０６０４−１０９）：４５ｍｌ  ｐＨ８．８
１ｍｌのフェノールレッドおよび４５μｌの塩酸（０．２５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝４．４３
ＩＩ．ＲＯ：４５ｍｌ  ｐＨ５．７８
１ｍｌのフェノールレッドおよび５μｌの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝６．４６
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（＃１２０１０４−１０７）：４５ｍｌ  ｐＨ８．６８
１ｍｌのフェノールレッドおよび５μｌの塩酸（０．５Ｍ）を加えた。新しいｐＨ＝６．９１
【０１７４】
結果
図７Ａ〜Ｃおよび図８Ａ〜Ｂに例示されるように、ナノ構造を含む水の緩衝能力はＲＯ水の緩衝能力よりも大きかった。
【０１７５】
実施例７
ＲＦ水の緩衝能力
緩衝能力に対するＲＦ水の影響を調べた。
【０１７６】
材料および方法
水酸化ナトリウム（１Ｍ）の数μｌの液滴を加えて、１５０ｍｌのＲＯ水のｐＨ（ｐＨ＝５．８）を上げた。この水の５０ｍｌを３つのボトルに等分した。３つの処理を行った：
ボトル１：非処理（ＲＯ水）
ボトル２：３０Ｗにより３０分間照射されたＲＯ水。このボトルは、滴定を開始する前に実験台に１０分間放置された（ＲＦ水）。
ボトル３：ｐＨが５に達したとき、２回目の照射に供されたＲＦ水。照射後、このボトルは、滴定を開始する前に実験台に１０分間放置された。
【０１７７】
１μｌの０．５Ｍ塩酸を５０ｍｌの水に加えることによって滴定を行った。ｐＨ値が４．２未満に達したときに滴定を終えた。
【０１７８】
実験を三連で行った。
【０１７９】
結果
図９Ａ〜Ｃおよび図１０から理解され得るように、ＲＦ水およびＲＦ２水は、ナノ構造を含む担体組成物の緩衝特性と類似する緩衝特性を含む。
【０１８０】
実施例８
ナノ構造を含む液体組成物の溶媒能力
下記の実験を、ナノ構造を含む液体組成物が、１ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解しないことがともに知られている２つの材料を溶解することができたかどうかを確認するために行った。
【０１８１】
Ａ．エタノール／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（Ｄｏ−Ｃｏｏｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）型溶液における溶解
材料および方法
５回の試みを、粉末を様々な組成で溶解することを目指して行った。
組成は下記の通りであった：
Ａ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋９９０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）。
Ｂ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋９９０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（９０分間脱水されたもの）。
Ｃ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋４９５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋４９５μｌのＥｔＯＨ（５０％−５０％）。
Ｄ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋９００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋９０μｌのＥｔＯＨ（９０％−１０％）。
Ｅ．１０ｍｇの粉末（赤色／白色）＋８２０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋１７０μｌのＥｔＯＨ（８０％−２０％）。
【０１８２】
これらのチューブをボルテックスし、６０℃に１時間加熱した。
【０１８３】
結果
１．白色粉末は５個すべての試験チューブにおいて溶解しなかった。
２．赤色粉末は溶解したが、しばらくして沈降した。
色がわずかに黄色に変化したので、試験チューブＣは粉末をより良好に溶解したかのようであった。
【０１８４】
Ｂ．粉砕後の、エタノール／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（Ｄｏ−Ｃｏｏｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）型溶液における溶解
材料および方法
粉砕後、赤色粉末を４つの組成で溶解した：
Ａ．１／２ｍｇの赤色粉末＋４９．５μｌのＲＯ。
Ｂ．１／２ｍｇの赤色粉末＋４９．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）。
Ｃ．１／２ｍｇの赤色粉末＋９．９μｌのＥｔＯＨ→３９．６５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（２０％−８０％）。
Ｄ．１／２ｍｇの赤色粉末＋２４．７５μｌのＥｔＯＨ→２４．７５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％−５０％）。
総反応体積：５０μｌ。
【０１８５】
これらのチューブをボルテックスし、６０℃に１時間加熱した。
【０１８６】
結果
粉砕後、赤色粉末を溶解するために、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）との組合せにおいて、わずかに２０％のエタノールだけが必要であった。
【０１８７】
Ｃ．徹底的な粉砕の後における、エタノール／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）（Ｄｏ−Ｃｏｏｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）型溶液における溶解
材料および方法
２つの粉砕プロトコルを行った。第１は粉末単独に対してであり（バイアル１）、第２は、１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（１％）に分散された粉末に対してあった（バイアル２）。
【０１８８】
これら２つの組成物を２つのバイアルに入れ、攪拌機上に置いて、材料を一晩粉砕した。
【０１８９】
１５時間後、１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を数分毎に１０μｌの滴定によって１ｍｇの赤色粉末（バイアル１）に加えた。
【０１９０】
変化を、試験チューブの写真を０時間〜２４時間の間で撮影することによってモニタリングした（図１４Ｆ〜Ｊ）。
【０１９１】
比較として、２つのチューブを観察した。２つのうちの一方が、９９０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（９０分間脱水されたもの）に分散された赤色粉末（１％溶液）を含み、他方が、５０％エタノール／５０％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液に分散された赤色粉末（１％溶液）を含んだ。チューブを６０℃で１時間加熱した。これらのチューブが図１４Ａ〜Ｅに例示される。２４時間の期間の後、それぞれの溶液からの２μｌを採取し、その吸光度をｎａｎｏｄｒｏｐで測定した（図１５Ａ〜Ｃ）。
【０１９２】
結果
図１１Ａ〜Ｊは、徹底的な粉砕の後では、赤色材料が２４時間にわたって安定であり続け、沈下しないように、赤色材料を溶解することが可能であることを例示する。しかしながら、図１１Ａ〜Ｅは、時間が経過するとき、該材料は色が変化すること（安定でないこと）を示す。
【０１９３】
バイアル１はほとんど吸収しなかった（図１２Ａ）；溶液Ｂの吸光度ピークは、左側（２２０ｎｍ）への変化を伴って２２０ｎｍ〜２７０ｎｍの間にあり（図１２Ｂ）、溶液Ｃの吸光度ピークは２５０ｎｍ〜３３０ｎｍの間にあった（図１２Ｃ）。
【０１９４】
結論
赤色材料を粉砕することにより、該材料をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に分散させることがもたらされた。この分散物は２４時間にわたって持続した。該材料をガラス製バイアルにおいて維持することにより、溶液は、１００％の脱水Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）およびＥｔＯＨ−Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の両方において、その後７２時間安定に保たれた。
【０１９５】
実施例９
ダイゼイン、ダウノルビシンおよびｔ−ｂｏｃ誘導体を溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が３つの材料（ダイゼイン−ダウノマイシンコンジュゲート（ＣＤ−Ｄａｕ）；ダウノルビシン（セルビジン塩酸塩）；ダイゼインのｔ−ｂｏｃ誘導体（ｔｂｏｃ−Ｄａｉｄ）、これらのすべてが、水に溶解しないことが知られている）を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０１９６】
材料および方法
Ａ．ＣＤ−Ｄａｕの可溶化−パート１：
要求濃度：３ｍｇ／ｍｌ（Ｎｅｏｗａｔｅｒ）
属性：この材料を、ＤＭＳＯ、アセトン、アセトニトリルに溶解した。
属性：この材料をＥｔＯＨに溶解した。
【０１９７】
５個の異なるガラス製バイアルを調製した：
１．５ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋１．２ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）。
２．１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋６００μｌのアセトン。
３．１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋１５０μｌのアセトン＋４５０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（２５％アセトン）。
４．１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋６００μｌの１０％＊ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）。
５．１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋６００μｌのアセトン＋６００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）。
【０１９８】
これらのサンプルをボルテックスし、分光光度計での測定を、バイアル＃１、バイアル＃４およびバイアル＃５に対して行った。
【０１９９】
バイアルを、アセトンを蒸発させるために開けたままにした（バイアル＃２、バイアル＃３およびバイアル＃５）。
【０２００】
結果
バイアル＃１（１００％のＮｅｏｗａｔｅｒ）：ＣＤ−Ｄａｕが数時間後に沈降した。
バイアル＃２（１００％のアセトン）：ＣＤ−Ｄａｕがアセトン内に懸濁されたが、４８時間後には、アセトンが材料を溶解したので、材料が部分的に沈降した。
バイアル＃３（２５％のアセトン）：ＣＤ−Ｄａｕがあまり良好に溶解せず、材料が溶液内部に漂った（溶液は濁っているようであった）。
バイアル＃４（１０％ＰＥＧ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ）：ＣＤ−Ｄａｕが、バイアル＃１におけるＣＤ−Ｄａｕよりも良好に溶解したが、ＣＤ−Ｄａｕは、１００％アセトンとの混合物の場合ほど良好に溶解しなかった。
バイアル＃５：ＣＤ−Ｄａｕが最初、アセトン内に懸濁され、ＣＤ−Ｄａｕが完全に溶解した後で、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を、アセトンを交換するために加えた。最初、アセトンは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在にもかかわらず、この材料を溶解した。しかしながら、アセトンが蒸発するにつれ、材料は一部がバイアルの底に沈降した。しかしながら、材料は懸濁されたままであった。
【０２０１】
分光光度計での測定（図１３）は、アセトンの存在下および非存在下の両方における材料の挙動を例示する。アセトンがある場合、水または１０％ＰＥＧにより懸濁される材料（両方の場合に、これらは１つだけのピークを示すだけである）との比較において、２つのピークが存在する。
【０２０２】
Ｂ．ＣＤ−Ｄａｕの可溶化−パート２：
アセトンが、溶液＃２、溶液＃４および溶液＃５から蒸発するとすぐに、材料はわずかに沈降した。さらなる量のアセトンをこれらのバイアルに加えた。このプロトコルは、材料をアセトンおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の存在下で溶解することを可能にし、一方で、同時に、その後の、溶液からのアセトンの蒸発を可能にする（この処置を２回行った）。２回目のサイクルの後で、液相をバイアルから取り出し、さらなる量のアセトンを沈降した材料に加えた。沈降した材料が溶解すると、それを以前に取り出された液相と一緒にした。一緒にした溶液を再び蒸発させた。材料が全く溶解しなかったので、バイアル＃１からの溶液を取り出し、代わりに、１．２ｍｌのアセトンを沈降物に加えて、材料を溶解した。その後、１．２ｍｌの１０％ＰＥＧ＋Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）もまた加え、しばらくした後で、アセトンを溶液から蒸発させた。これらの処置を終了したとき、これらのバイアルを一緒にして１つのバイアルにした（３ｍｌの総体積）。この最終的な体積の上に、３ｍｌのアセトンを、材料を溶解し且つ透明な液化溶液を収容するために加え、その後、この溶液を５０℃で再び蒸発させた。溶液は平衡に達しなかった。これは、そのような状態に一旦達すると、溶液は分離してしまうであろうという事実のためである。平衡を避けることによって、材料の水和状態が維持され、液体として保たれた。溶媒を蒸発させた後、材料を清浄なバイアルに移し、真空条件下で閉じた。
【０２０３】
Ｃ．ＣＤ−Ｄａｕの可溶化−パート３：
別の３ｍｌの材料（６ｍｌの総体積）を、２ｍｌのアセトン溶解材料と、以前の実験から残った１ｍｌの残留材料とを加えることにより作製した。
【０２０４】
１．９ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を、アセトンを含有するバイアルに加えた。
【０２０５】
１００μｌのアセトン＋１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を残留材料に加えた。
【０２０６】
蒸発を、５０℃に調節されたホットプレート上で行った。
【０２０７】
この処置を、溶液が安定になるまで３回繰り返した（アセトンの添加およびその蒸発）。
【０２０８】
これら２つのバイアルをまとめて一緒にした。
【０２０９】
これら２つの溶液を一緒にした後、材料がわずかに沈降した。アセトンを加え、溶媒の蒸発を繰り返した。
【０２１０】
バイアル（３ｍｌ＋２ｍｌ）を混合する前に、本明細書中上記のパート２に記載されるような実験で調製された第１の溶液を９℃で一晩インキュベーションして、その結果、溶液が平衡に達し、平衡を維持することを確実にした。そうすることによって、既に溶解している材料は沈降しないはずである。翌朝、溶液の吸収を明らかにし、差グラフを得た（図１４）。これら２つのバイアルを一緒にした後、材料がわずかに沈降するので、吸収測定を再び行った。一部の沈降の結果として、溶液をアセトン（５ｍｌ）の添加によって１：１で希釈し、続いて、溶液の蒸発をホットプレートにて５０℃で行った。蒸発処置を行いながらでの溶液の分光光度計での読み取りはアセトンの存在のために変化した（図１５）。これらの実験から、微量のアセトンが存在するとき、アセトンは、もたらされる吸収読み取りに影響を及ぼし得ることが暗示される。
【０２１１】
Ｂ．ダウノルビシン（セルビジン塩酸塩）の可溶化
要求濃度：２ｍｇ／ｍｌ
【０２１２】
材料および方法
２ｍｇのダウノルビシン＋１ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を１つのバイアルにおいて調製し、２ｍｇのダウノルビシン＋１ｍｌのＲＯを第２のバイアルにおいて調製した。
【０２１３】
結果
この材料は、分光光度計での測定（図１６）によって例示されるように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）および水の両方において容易に溶解した。
【０２１４】
結論
ダウノルビシンは難なくＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）および水に溶解する。
【０２１５】
Ｃ．ｔ−ｂｏｃの可溶化
要求濃度：４ｍｇ／ｍｌ
【０２１６】
材料および方法
１．１４ｍｌのＥｔＯＨを、１８．５ｍｇのｔ−ｂｏｃ（油状材料）を含有する１つのガラス製バイアルに加えた。その後、これを２つのバイアルに分け、１．７４ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）またはＲＯ水を、溶液が２５％のＥｔＯＨを含むようにバイアルに加えた。分光光度計での測定の後、溶媒を溶液から蒸発させ、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を両方のバイアルに加えてそれぞれのバイアルにおいて２．３１ｍｌの最終体積にした。これら２つのバイアルにおける溶液を１つの清浄なバイアルに一緒にし、真空条件下での輸送のためにパッケージングした。
【０２１７】
結果
分光光度計での測定が図１７に例示される。この材料はエタノールに溶解した。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加え、その後、溶媒を熱（５０℃）により蒸発させた後、この材料はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解することができた。
【０２１８】
結論
材料を溶解するための最適な方法は、最初、材料を溶媒（アセトン、酢酸またはエタノール）とともに溶解し、その後、親水性流体（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））を加え、続いて、その溶媒を、溶液を加熱し、溶媒を蒸発させることによって除くことである。
【０２１９】
実施例１０
ＡＧ−１４ａおよびＡＧ−１４ｂを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が２つの薬草材料（ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂ、これらはともに、２５ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解しないことが知られている）を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２２０】
パート１
材料および方法
２．５ｍｇのそれぞれの材料（ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂ）を、４つのチューブのそれぞれにおける粉末の最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌであるように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）単独、または、７５％のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）および２５％のエタノールを含む溶液のいずれかで希釈した。これらのチューブをボルテックスし、５０℃に加熱して、エタノールを蒸発させるようにした。
【０２２１】
結果
エタノールの存在下および非存在下でのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における２つの薬草材料の分光光学的測定を図１８Ａ〜Ｄに示す。
【０２２２】
結論
ＲＯにおける懸濁はＡＧ−１４Ｂを溶解しなかった。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）におけるＡＧ−１４Ｂの懸濁は凝集せず、これに対して、ＲＯでは、ＡＧ−１４Ｂが凝集した。
【０２２３】
ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４ＢはＮｅｏｗａｔｅｒ／ＲＯに溶解しなかった。
【０２２４】
パート２
材料および方法
５ｍｇのＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂを６２．５μｌのＥｔＯＨ＋１８７．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）で希釈した。さらに６２．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加えた。これらのチューブをボルテックスし、５０℃に加熱して、エタノールを蒸発させるようにした。
【０２２５】
結果
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を加える前でのＥｔＯＨにおける溶解、その後、ＥｔＯＨの蒸発により、ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂが溶解した。
【０２２６】
図１９に示されるように、ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂは、４８時間を超えて懸濁状態で安定なままであった。
【０２２７】
実施例１１
ペプチドを溶解する、ナノ構造を含む担体の能力
ナノ構造を含む担体組成物が７つの細胞傷害性ペプチド（これらのすべてが、水に溶解しないことが知られている）を溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。加えて、Ｓｋｏｖ−３細胞に対するこれらのペプチドの影響を、ナノ構造を含む担体組成物がペプチドの細胞傷害活性に影響を及ぼしたかどうかを確認するために測定した。
【０２２８】
材料および方法
可溶化：７個すべてのペプチド（ペプチドＸ、Ｘ−５ＦＵ、ＮＬＳ−Ｅ、Ｐａｌｍ−ＰＦＰＳＹＫ（ＣＭＦＵ）、ＰＦＰＳＹＫＬＲＰＧ−ＮＨ２、ＮＬＳ−ｐ２−ＬＨＲＨおよびＦ−ＬＨ−ＲＨ−ｐａｌｍ  ｋＧＦＰＳＫ）を０．５ｍＭでＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解した。分光光学的測定を行った。
【０２２９】
インビトロ実験：Ｓｋｏｖ−３細胞を９６ウエルプレートにおいてマッコイ５Ａ培地で増殖させ、１５００細胞／ウエルの濃度に希釈した。２４時間後、２μｌ（０．５ｍＭ、０．０５ｍＭおよび０．００５ｍＭ）のペプチド溶液を、１０−６Ｍ、１０−７Ｍおよび１０−８Ｍの最終濃度のために１ｍｌのマッコイ５Ａ培地でそれぞれ希釈した。９個の反復物をそれぞれの処理のために作製した。それぞれのプレートは、３つの濃度での２つのペプチド、および、コントロール処理の６つのウエルを含有した。９０μｌのマッコイ５Ａ培地＋ペプチドを細胞に加えた。１時間後、１０μｌのＦＢＳを（競合を防止するために）加えた。細胞を、クリスタルバイオレットに基づく生存性アッセイで２４時間後および４８時間後に定量した。このアッセイにおける色素はＤＮＡを染色する。可溶化したとき、単層により取り込まれた色素の量をプレート読取り機で定量した。
【０２３０】
結果
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）で希釈された７個のペプチドの分光光学的測定を図２０Ａ〜Ｇに示す。図２１Ａ〜Ｇに示されるように、溶解されたペプチドのすべてが細胞傷害活性を含んでいた。
【０２３１】
実施例１２
レチノールを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物がレチノールを溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２３２】
材料および方法
レチノール（ビタミンＡ）をＳｉｇｍａ（Ｆｌｕｋａ、９９％ＨＰＬＣ）から購入した。レチノールを下記の条件下でＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）において可溶化した。
ＥｔＯＨおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における１％レチノール（１ｍｌに０．０１ｇｒ）。
ＥｔＯＨおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．５％レチノール（１ｍｌに０．００５ｇｒ）。
ＥｔＯＨおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．５％レチノール（２５ｍｌに０．１２５ｇｒ）。
ＥｔＯＨおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．２５％レチノール（２５ｍｌに０．０６２５ｇｒ）。最終的なＥｔＯＨ濃度：１．５％
【０２３３】
ＥｔＯＨにおけるレチノールの吸光度スペクトル：レチノール溶液を、校正用グラフを作製するために、種々のレチノール濃度とともに無水ＥｔＯＨにおいて作製した。吸光度スペクトルを分光光度計で検出した。
【０２３４】
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．２５％および０．５％のレチノールを有し、ＥｔＯＨの濃度が不明である２つの溶液を分光光度計で検出した。数滴の油滴が水に溶解されないので、レチノールの実際の濃度もまた不明である。
【０２３５】
ろ過：Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における０．２５％のレチノールを有し、ＥｔＯＨの最終濃度が１．５％である２つの溶液を調製した。これらの溶液を０．４４μｌおよび０．２μｌのフィルターでろ過した。
【０２３６】
結果
レチノールは、アルカリ性のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）において、酸性のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）よりも容易に可溶化した。溶液の色は黄色であり、この色は時間とともに退色した。吸光度実験において、０．５％のレチノールは、０．１２５％のレチノールと類似するパターンを示し、０．２５％のレチノールは、０．０３１２５％のレチノールと類似するパターンを示した（図２２を参照のこと）。レチノールは熱において不安定であるので、（その融点は６３℃であり）、レチノールはオートクレーブ処理することができない。ろ過は、レチノールが（ＥｔＯＨに）完全に溶解されたときに可能であった。図２３に示されるように、ろ過後の溶液におけるレチノールは０．０３１２５％未満である。両方のろ液は、類似した結果を与えた。
【０２３７】
実施例１３
材料Ｘを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が材料Ｘを４０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２３８】
パート１−水およびＤＭＳＯにおける溶解性
材料および方法
第１の試験チューブにおいて、２５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）を１ｍｇの材料「Ｘ」に加えた。第２の試験チューブにおいて、２５μｌのＤＭＳＯを１ｍｇの材料「Ｘ」に加えた。両方の試験チューブをボルテックスし、６０℃に加熱し、振とう機で１時間振とうした。
【０２３９】
結果
この材料はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に全く溶解しなかった（試験チューブ１）。この材料はＤＭＳＯに溶解し、黄褐色の色を与えた。これらの溶液を２４時間〜４８時間放置し、それらの安定性を経時的に分析した（図２４Ａ〜Ｂ）。
【０２４０】
結論
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は材料「Ｘ」を溶解せず、材料が沈降し、これに対して、ＤＭＳＯは材料「Ｘ」をほぼ完全に溶解した。
【０２４１】
パート２−ＤＭＳＯの削減および異なる溶媒における材料の安定性／速度論の経時的な試験
材料および方法
それぞれが２５μｌの総反応体積を含有する６個の異なる試験チューブを分析した：
１．１ｍｇの「Ｘ」＋２５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（１００％）。
２．１ｍｇの「Ｘ」＋１２．５μｌのＤＭＳＯ→１２．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％）。
３．１ｍｇの「Ｘ」＋１２．５μｌのＤＭＳＯ＋１２．５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（５０％）。
４．１ｍｇの「Ｘ」＋６．２５μｌのＤＭＳＯ＋１８．７５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（２５％）。
５．１ｍｇの「Ｘ」＋２５μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋スクロース＊（１０％）。
６．１ｍｇの「Ｘ」＋１２．５μｌのＤＭＳＯ＋１２．５μｌの脱水Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）＊＊（５０％）。
＊０．１ｇのスクロース＋１ｍｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）＝１０％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）＋スクロース
＊＊脱水Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を６０℃で９０分間脱水することによって得た。
【０２４２】
すべての試験チューブをボルテックスし、６０℃に加熱し、１時間振とうした。
【０２４３】
結果
６つの溶媒および材料Ｘを含む、時間０での試験チューブを図２５Ａ〜Ｃに示す。６つの溶媒および材料Ｘを含む、可溶化後６０分での試験チューブを図２６Ａ〜Ｃに示す。６つの溶媒および材料Ｘを含む、可溶化後１２０分での試験チューブを図２７Ａ〜Ｃに示す。６つの溶媒および材料Ｘを含む、可溶化後２４時間での試験チューブを図２８Ａ〜Ｃに示す。
【０２４４】
結論
すべての試験チューブにおいて、材料が２４時間後に沈降したので、材料「Ｘ」は期間中を通して安定なままではなかった。
【０２４５】
試験チューブ２の溶媒と、試験チューブ６の溶媒との間には、同じ割合の溶媒を含有するにもかかわらず、違いが認められる。これは、試験チューブ６が、非脱水のＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）より疎水性である脱水Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含有するためである。
【０２４６】
パート３  ＤＭＳＯのさらなる削減および異なる溶媒における材料の安定性／速度論の経時的な試験
材料および方法
１ｍｇの材料「Ｘ」＋５０μｌのＤＭＳＯをガラス製チューブに入れた。５０μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）をチューブに少しずつ加え（数秒毎に、５μｌ）、その後、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の溶液（９％ＤＭＳＯ＋９１％Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標））５００μｌを加えた。
【０２４７】
第２のガラス製チューブにおいて、１ｍｇの材料「Ｘ」＋５０μｌのＤＭＳＯを加えた。５０μｌのＲＯをチューブに少しずつ加え（数秒毎に、５μｌ）、その後、ＲＯの溶液（９％ＤＭＳＯ＋９１％ＲＯ）５００μｌを加えた。
【０２４８】
結果
図２９Ａ〜Ｄに例示されるように、材料「Ｘ」は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を含む溶液に分散されたままであったが、ＲＯ水を含む溶液では、チューブの底に沈降した。図３０は、ボルテックス後６時間での、ＲＯ／Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）およびアセトンに分散された材料の吸収特徴を示す。
【０２４９】
結論
材料「Ｘ」が、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）と比較したとき、ＲＯに異なって溶解すること、および、材料「Ｘ」は、ＲＯと比較したとき、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）においてより安定であることが明らかである。分光光度計での測定（図３０）からは、グラフ下面積がＲＯの場合よりも大きいので、材料「Ｘ」が、５時間後でさえ、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）にはより良好に溶解していたことが明らかである。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は材料「Ｘ」を水和することが明らかである。ＤＭＳＯの量を２０％〜８０％減らすことができ、また、材料「Ｘ」を水和し、材料「Ｘ」をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に分散する、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく溶液を得ることができる。
【０２５０】
実施例１４
ＳＰＬ２１０１およびＳＰＬ５２１７を溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が材料ＳＰＬ２１０１およびＳＰＬ５２１７を３０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２５１】
材料および方法
ＳＰＬ２１０１をその最適な溶媒（エタノール）に溶解し（図３１Ａ）、ＳＰＬ５２１７をその最適な溶媒（アセトン）に溶解した（図３１Ｂ）。これら２つの化合物をガラス製バイアルに入れ、冷暗所環境で保った。微量の溶媒が全く認められなくなるまで、溶媒の蒸発をデシケータにおいて長時間行い、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を溶液に加えた。
【０２５２】
結果
ＳＰＬ２１０１およびＳＰＬ５２１７は、図３２Ａ〜Ｂにおける分光光度計データによって示されるように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解した。
【０２５３】
実施例１５
タキソールを溶解する、ナノ構造を含む液体組成物の能力
ナノ構造を含む液体組成物が材料タキソール（パクリタキセル）を０．５ｍＭの最終濃度で溶解することができたかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２５４】
材料および方法
可溶化：０．５ｍＭのタキソール溶液を、ＤＭＳＯ、または、１７％のＥｔＯＨを伴うＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）のいずれかで調製した（４ｍｌにおいて０．００１７ｇｒ）。吸光度を分光光度計により検出した。
細胞生存性アッセイ：１５００００個の２９３Ｔ細胞を３ｍｌのＤＭＥＭ培地とともに６ウエルプレートに播種した。それぞれの処理物を、ＲＯまたはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づくＤＭＥＭ培地で増殖させた。タキソール（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）またはＤＭＳＯに溶解されたもの）を１．６６６μＭの最終濃度に加えた（３ｍｌの培地中１０μｌの０．５ｍＭタキソール）。細胞をタキソールによる２４時間処理の後で集め、死細胞を検出するためのトリパンブルー溶液を使用して計数した。
【０２５５】
結果
タキソールは、図３３Ａ〜Ｂに示されるように、ＤＭＳＯおよびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の両方に溶解した。タキソールの様々な溶液の後での２９３Ｔ細胞の生存性を図３４に示す。
【０２５６】
結論
タキソールは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における溶液の後で細胞傷害作用を含んでいた。
【０２５７】
実施例１６
ナノ構造を含む液体組成物の安定化作用
ナノ構造を含む液体組成物がタンパク質の安定性をもたらしたかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２５８】
材料および方法
２つの市販のＴａｑポリメラーゼ酵素（Ｐｅｑ−ｌａｂおよびＢｉｏ−ｌａｂ）を、ｄｄＨ２Ｏ（ＲＯ）におけるそれらの活性、および、ナノ構造を含む担体（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）におけるそれらの活性を求めるために、ＰＣＲ反応において調べた。酵素を１時間〜２．５時間までの種々の期間にわたって９５℃に加熱した。２つのタイプの反応液を作製した：
水のみ−酵素および水のみを煮沸した。
中味すべて−反応成分のすべてを煮沸した（酵素、水、緩衝液、ｄＮＴＰ類、ゲノムＤＮＡおよびプライマー）。
【０２５９】
煮沸後、必要とされる任意のさらなる反応成分をＰＣＲチューブに加え、通常のＰＣＲプログラムを３０サイクルに設定した。
【０２６０】
結果
図３５Ａ〜Ｂに示されるように、ナノ構造を含む液体組成物は、成分のすべてが熱ストレスに供された条件、および、酵素のみが熱ストレスに供された条件の両方の下で、酵素を加熱から保護した。対照的に、ＲＯ水は、成分のすべてが熱ストレスに供された条件下で、酵素を加熱から保護しただけであった。
【０２６１】
実施例１７
ナノ構造を含む液体組成物の安定化作用のさらなる例示
ナノ構造を含む液体組成物が２つの市販のＴａｑポリメラーゼ酵素（Ｐｅｑ−ｌａｂおよびＢｉｏ−ｌａｂ）の安定性をもたらしたかを確認するために、下記の実験を行った。
【０２６２】
材料および方法
ＰＣＲ反応を下記のように設定した：
Ｐｅｑ−ｌａｂサンプル：ナノ構造を含む液体組成物（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）、または、蒸留水（逆浸透＝ＲＯ）のいずれか２０．４μｌ。
０．１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｑ−ｌａｂ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、５Ｕ／μｌ）
【０２６３】
３つのサンプルを設定し、９５℃の一定温度でのＰＣＲ装置に入れた。インキュベーション時間は、６０分、７５分および９０分であった。
【０２６４】
Ｔａｑ酵素の煮沸の後、下記の成分を加えた：
２．５μｌの１０Ｘ反応緩衝液Ｙ（Ｐｅｑ−ｌａｂ）
０．５μｌのｄＮＴＰ類（１０ｍＭ）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１μｌのプライマー  ＧＡＰＤＨミックス  １０ｐｍｏｌ／μｌ
０．５μｌのゲノムＤＮＡ  ３５μｇ／μｌ
【０２６５】
Ｂｉｏｌａｂサンプル
ナノ構造を含む液体組成物（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）、Ｄｏ−Ｃｏｏｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、イスラエル）、または、蒸留水（逆浸透＝ＲＯ）のいずれか１８．９μｌ。
０．１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏ−ｌａｂ、Ｔａｑポリメラーゼ、５Ｕ／μｌ）
【０２６６】
５つのサンプルを設定し、９５℃の一定温度でのＰＣＲ装置に入れた。インキュベーション時間は、６０分、７５分、９０分、１２０分および１５０分であった。
【０２６７】
Ｔａｑ酵素の煮沸の後、下記の成分を加えた：
２．５μｌのＴＡＱ  １０Ｘ緩衝液（Ｍｇ非含有）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１．５μｌのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
０．５μｌのｄＮＴＰ類（１０ｍＭ）（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１μｌのプライマー  ＧＡＰＤＨミックス（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
０．５μｌのゲノムＤＮＡ（３５μｇ／μｌ）
【０２６８】
それぞれの処理（ＮｅｏｗａｔｅｒまたはＲＯ）のために、陽性コントロールおよび陰性コントロールを作製した。陽性コントロールは、酵素を煮沸することを伴わないものであった。陰性コントロールは、酵素を煮沸することを伴わず、かつ、ＤＮＡを反応において伴わないものであった。ＰＣＲミックスを、煮沸ｔａｑアッセイ、ならびに、コントロール反応のために作製した。
【０２６９】
サンプルをＰＣＲ装置に入れ、下記のように操作した：
ＰＣＲプログラム：
１．９４℃で２分間の変性
２．９４℃で３０秒間の変性
３．６０℃で３０秒間のアニーリング
４．７２℃で３０秒間の伸長
工程２〜４を３０回繰り返す
５．７２℃で１０分間の伸長
【０２７０】
結果
図３６に示されるように、ナノ構造を含む液体組成物は、１．５時間までの期間、両方の酵素を熱ストレスから保護した。
【０２７１】
実施例１８
ナノ構造を含む液体組成物はタキソールを溶解することができることのさらなる証拠
下記の実験を、ナノ構造を含む液体組成物が０．０８％のエタノールの存在下において０．５ｍＭの最終濃度で物質タキソール（パクリタキセル）を溶解することができたかどうかを確認するために行った。
【０２７２】
材料および方法
可溶化：０．５ｍＭのタキソール溶液を調製した（４ｍｌにおいて０．００１７ｇｒ）。タキソールをエタノールに溶解し、２０日間に及ぶＲＴ緩速溶媒交換手法を使用してＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に交換した。この手法が終了したとき、４０％未満のエタノールが溶液中に残存し、最終的な投与濃度において０．０８％のエタノールをもたらした。溶液を、０．２μｍのフィルターを使用して滅菌した。別途、タキソールをＤＭＳＯにおいて調製した（０．５ｍＭ）。両方の溶液を−２０℃で保った。吸光度を分光光度計により検出した。
【０２７３】
細胞生存性アッセイ：２０００個のＰＣ３細胞を、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩに基づく培地の１００μｌとともに９６ウエルプレートの各ウエルに播種した。播種後２４時間で、０．５ｍＭタキソールの２μｌ、１μｌおよび０．５μｌを１ｍｌのＲＰＭＩ培地で希釈し、これにより、１μＭ、０．５μＭおよび０．２５μＭの最終濃度をそれぞれ得た。少なくとも８個の反復する反応を処理あたり行った。細胞増殖を、タキソール添加後２４時間で、クリスタルバイオレット比色アッセイを使用して細胞密度を定量することによって評価した。
【０２７４】
処理後２４時間で、細胞をＰＢＳにより洗浄し、４％パラホルムアルデヒドにより固定処理した。クリスタルバイオレットを加え、室温で１０分間インキュベーションした。細胞を３回洗浄した後、５０％エタノールにおいて１００ｍＭクエン酸ナトリウムを含む溶液を使用して、色を細胞から溶出した。光学濃度の変化を、分光光度法によるプレートリーダーを使用して５７０ｎｍで読み取った。細胞生存性を、ブランクを引いた後、コントロールでの光学濃度（これは１００％であると見なされる）の百分率として表した。
【０２７５】
結果
ＤＭＳＯまたはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解された０．５ｍＭタキソールの分光光度法による吸光度が図３７Ａに例示される。図３７Ｂ〜図３７Ｃは両方の配合物についてのＨＰＬＣによる読み取りである。測定結果は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に分散されたタキソールの配合物における構造的な変化が６ヶ月の貯蔵期間の後で何ら生じないことを示した。
【０２７６】
細胞生存性のタキソール誘導による喪失の結果が、ＤＭＳＯまたはＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解した後において図３８に例示される。
【０２７７】
結論
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたタキソール（０．０８％のエタノールを最終的な作業濃度において有する）は、ＤＭＳＯに溶解されたタキソールと類似する、ヒト前立腺ガン細胞株に対するインビトロ細胞生存性／細胞毒性を示した。
【０２７８】
実施例１９
ヒトハイブリドーマの単離に対する、ナノ構造を含む水の影響を例示するさらなる実験
下記の実験を、ナノ構造を含む水が、モノクローナル抗体作製の最初の段階、すなわち、ハイブリドーマの単離に影響を及ぼすかどうかを確認するために行った。
【０２７９】
細胞増殖のための試薬：細胞増殖のための培地および補充物のすべてをＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＲＰＭＩ１６４０およびＤＭＥＭを粉末形態で購入し、ＮＰＤまたはＤＩ水のいずれかにおいて再構成した。再構成後、重炭酸ナトリウムを製造者の勧めに従って培地に加え、ｐＨのさらなる調節は行わなかった。使用前に、培地のすべてを０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過滅菌した。ハイブリドーマ細胞の増殖のために、ＲＰＭＩには、１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ＭＥＭ−ビタミン（０．１ｍＭ）、非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）およびピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）が補充された。上記補充物のすべてを液体形態で購入し、製造者から得られたそのままで使用した（このことは、それらがＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）またはコントロールの水（ＤＩに基づく培地−１８．２メガオームの超純粋な脱イオン水（ＤＩ水、ＵＨＱ  ＰＳ、ＥＬＧＡ  Ｌａｂｗａｔｅｒ））に希釈されたことを意味する）。８−アザグアニン、ＨＴおよびＨＡＴをＳｉｇｍａから購入し、ＮＰＤまたはＤＩでのＲＰＭＩを用いて粉末形態から再構成した。ヒト初代線維芽細胞およびＣＨＯ細胞の増殖のために使用されたＤＭＥＭには、１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）が補充された。ハイブリドーマクローン化因子をＢｉｏＶｅｒｉｓから購入した。
【０２８０】
化学試薬：粉末化ＰＢＳをＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。ＰＥＧ−１５００（Ｐ５４０２、Ｓｉｇｍａ）をＳｉｇｍａから購入し、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）またはコントロールの水に基づく無菌ＰＢＳを用いて再構成した（５０％ｗ／ｖ）。調製物をｐＨ７．２に調節し、ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ）を１０％に加え、その後、ＰＥＧ溶液を０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過滅菌した。ハンクス平衡塩溶液をＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｂｅｉｔ−ＨａＥｍｅｋ  ＬＴＤ（イスラエル）から購入し、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく実験およびコントロールに基づく実験のためにそのまま使用した。ＥＬＩＳＡプレートをコーティングするための炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ＝９．６）、ＯＰＤ（０．４ｍｇ／ｍＬで使用）およびリン酸塩−クエン酸塩緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ＝５．０）をＳｉｇｍａから購入した。
【０２８１】
抗体：ヤギ抗ヒトＩｇＭ／ＩｇＧおよびＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＭ／ＩｇＧをＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入した。標準ヒトＩｇＭ／ＩｇＧをＳｉｇｍａから購入した。
【０２８２】
細胞：これらの実験で使用されたすべての細胞（ＭＦＰ−２、ＣＨＯおよび初代ヒト線維芽細胞）をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地およびコントロールに基づく培地のいずれかにおいて１週間維持し、細胞を実験前に培地になじませるようにした。加えて、融合パートナー細胞株ＭＦＰ−２を、ウシ胎児血清および添加物が、ＨＧＰＲＴ陰性の表現型を維持するための８−アザグアニンとともに添加されたＲＰＭＩ１６４０において維持した。初代ヒト線維芽細胞をＡＴＣＣから得て、ＤＭＥＭにおいて維持した。ＣＨＯ細胞株をＤＭＥＭにおいて維持した。すべての細胞培養を、ウシ胎児血清、グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンが添加された培養培地からなる完全培地において行った。ＭＦＰ−２細胞株については、ビタミン、非必須アミノ酸およびピルビン酸塩もまた、完全培地において添加された。
【０２８３】
方法
細胞融合：ＰＥＧ１４５０を用いた化学的融合技術［Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７］を用いた。この場合、ＰＥＧ１４５０は、ヒト末梢血リンパ球とのハイブリドーマを作出するために融合剤として作用する。ＰＥＧ１４５０は典型的には、１０％のＤＭＳＯが添加されるＰＢＳにおいて調製される。これらの実験のために、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）を使用して、ＰＢＳを調製し、その後、このＰＢＳを使用して、ＰＥＧ／ＤＭＳＯ溶液を作製した；コントロール調製物として、コントロールの水に基づくＰＢＳにおいて調製されたＰＥＧを使用した。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）をコントロールの水に対して比較するすべての融合実験のために、すべての試薬を、ウシ胎児血清および高濃度の補充物を除いて、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）またはコントロールの水のいずれかにおいて調製した。加えて、ＰＥＧ−１４５０を用いた融合の後でのハンクス平衡塩（ＨＢＳＳ）における細胞の希釈（下記参照）を、ＨＢＳＳの購入された液体形態物（Ｂｅｉｔ  ＨａＥｍｅｋ、イスラエル）を製造者から得られたそのままで使用して行った。
【０２８４】
ハイブリドーマの作製のために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を４０ｍＬの新たに採血された全血から単離し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７（Ｓｉｇｍａ）により精製し、コントロールの水に基づく血清非含有の培養培地で４回洗浄した。ＭＦＰ−２融合パートナー細胞をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地またはコントロールの水に基づく培地のいずれかにおいて増殖させ、その後、血清非含有のそれぞれの培地により４回洗浄した。それぞれの実験のために、ＰＢＭＣの１つの回分処理物を２つの等量物に分け、それらの一方をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）での融合のために使用し、もう一方をコントロールの水での融合のために使用した。次に、ＭＦＰ−２およびＰＢＭＣをＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく血清非含有培地またはコントロールの水に基づく血清非含有培地のいずれかにおいて混合し、ペレット化した。その後、３７℃に予熱されたＰＥＧ−１４５０を、混合された細胞の１０〜２００ｘ１０６個について３００μＬで加えた。細胞混合物を、絶えず振とうしながらＰＥＧとともに３分間インキュベーションした。その後、ＰＥＧをハンクス平衡塩溶液および完全ＲＰＭＩ（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）またはコントロールの水のいずれかにおいて調製されたもの）により細胞混合物から希釈した。得られた細胞懸濁物に、ウシ胎児血清（１０％）およびＨＴ（ｘ２）を加えた。このプロセスで作製されたハイブリドーマを、ＨＡＴ選抜とともに完全ＲＰＭＩにおいて９６ウエルプレートで培養した（約２ｘ１０６リンパ球／ウエルの細胞密度）。免疫グロブリン産生についての上清のスクリーニングを、ハイブリドーマ細胞がウエルのおよそ１／４を占めた後で行った。
【０２８５】
サンドイッチＥＬＩＳＡ：サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ハイブリドーマの上清をＩｇＭ／ＩｇＧについてスクリーニングした。簡単に記載すると、捕獲抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＭ／ＩｇＧ）を炭酸塩／重炭酸塩緩衝液において調製し、１００ｎｇ／１００μＬ／ウエルの濃度で９６ウエルプレートに加えた。その後、プレートを４℃で一晩インキュベーションした。下記の工程のすべてを室温で行った。ＰＢＳにおける０．３％乾燥乳による１時間のブロッキング処理の後、ハイブリドーマからの上清を１．５時間加えた。ＰＢＳにおいて１：５００で希釈されたヒト血清を陽性コントロールとして使用した。バックグラウンドのために、また、陰性コントロールとして、ハイブリドーマ増殖培地を使用した。二次抗体（ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＭ／ＩｇＧ）を１：５０００の濃度でブロッキング溶液において調製し、１時間インキュベーションした。比色反応を生じさせるために、プレートを、０．０３％のＨ２Ｏ２を含有するリン酸塩−クエン酸塩緩衝液においてＯＰＤとインキュベーションした。発色反応を１５分後に１０％ＨＣｌにより停止させた。反応の読み取りおよび記録を、４９２ｎｍの波長フィルターを使用してＭｕｌｔｉｓｃａｎ−Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ＥＬＩＳＡリーダーにより行った。使用されたすべての試薬は、ＮＰＤまたはＤＩに基づくハイブリドーマ上清からなったサンドイッチ層を除いて標準物であった。
【０２８６】
クローン化：選ばれたクローンの２００個の細胞を１０ｍＬの培地の体積で希釈し、平均して各ウエルが１個〜２個の細胞を含有するように９６ウエルプレートに播種した（１００μＬ／ウエル）。細胞をインキュベーションし、定期的に養分補給し、クローンの増殖について顕微鏡でモニターした。クローンがウエルの１／４〜１／２を占めたとき、その上清を分析した。クローン化の効率をプレートあたりの生育可能なクローンの数で表した。１０パーセントのＨＣＦ（ハイブリドーマクローン化因子）を実験設計に従って加えた。
【０２８７】
細胞増殖アッセイ：初代細胞株および不死化細胞株の増殖をクリスタルバイオレット色素保持アッセイによりモニターした。一定数の細胞を多数の反復で９６ウエルプレートに播種した。細胞の増殖を４％ホルムアルデヒドにおける固定処理によって停止させた。その後、固定処理された細胞を０．５％クリスタルバイオレットにより染色し、その後、水による洗浄を何回も行った。保持された色素を５０％エタノール（ｖ／ｖ）における０．１Ｍクエン酸ナトリウムの１００μＬ／ウエルにおいて抽出した。その後、ウエルの吸光度をＭｕｌｔｉｓｃａｎ−Ａｓｃｅｎｔマイクロプレートリーダーおよび適切なフィルターにより５５０ｎｍで読み取った。
【０２８８】
初代ヒト線維芽細胞：２０代目の継代培養から出発して、ヒト線維芽細胞を培養し、細胞が線維芽細胞の典型的な形態学を示し、その数が、最初に播種された量よりも少なく低下しない限り、毎週、継代培養した。継代数および計算された集団倍加を記録した。細胞の形態学および生存性を顕微鏡でモニターした。これらの実験で使用されたヒト線維芽細胞は、一般には、集団倍加が２５であった。
【０２８９】
データ分析：Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく実験と、コントロールに基づく実験との間での、融合およびクローン化の効率における差の統計学的有意性を、χ二乗検定によって求めた。初代ヒト線維芽細胞を用いた増殖試験の結果をアンペアードスチューデントｔ検定によって分析した。０．０５未満の統計学的ｐ値を有意であると見なした。
【０２９０】
結果
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）は、ヒトモノクローナル抗体を作製するためのハイブリドーマ形成の効率を高める
化学的融合実験の結果が図３９に示される。これらの実験のために、１人の個体に由来するＰＢＭＣを、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく環境またはコントロールに基づく環境のいずれかにおける融合のために、精製後、２つの群に分けた。ＮＰＤの環境と、ＤＩの環境との間での、ハイブリドーマの収率における統計学的有意差が見られた。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく融合実験におけるハイブリドーマの収率が、コントロールに基づく培地における並行した融合と比較してより大きいことについての明白な傾向が認められた。強化の割合が、［（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）での融合におけるハイブリドーマの数／コントロールの水での融合におけるハイブリドーマの数）ｘ１００％−１００％］の式によって計算された。これらの結果が図３９に示される。強化の程度は一定でなく、一連の８個の融合実験の中では、２２パーセントから２２７パーセントまで変動した。ＮＰＤにおける増大した融合効率は一定していないが、このことは、それぞれの融合が、異なるドナーに由来するリンパ球を用いて行われたので、予想外のことではない。そのようなものとして、ハイブリドーマの形成に対するＮＰＤ水性環境の影響の大きさは、ある程度は遺伝的背景の関数である。
【０２９１】
ＮＰＤ水におけるハイブリドーマサブクローンの増大した収率
モノクローナル抗体作製のプロセスにおける極めて重要な工程の１つが、安定なサブクローンを、特異的なモノクローナル抗体の分泌について陽性であることが見出された最初のハイブリドーマ集団から単離することである。これは、典型的には、特異的な最初のハイブリドーマクローンの連続したサブクローン化によって達成される。ウエルあたり１個〜２個の細胞を播種することを伴うサブクローン化の目的は、遺伝的に安定しており、ただ１つのモノクローナル抗体を産生する単一起原のクローンを作製することである。このプロセスの期間中に、ハイブリドーマ細胞は、遺伝的不安定性のために死に至る可能性があるか、または、増殖し得るが、抗体を産生するその能力を失う可能性がある。これらの困難を克服するために、クローンの増殖および安定化を容易にする様々な因子を含有するマクロファージ馴化培地からなるハイブリドーマクローン化因子（ＨＣＦ）が使用される。しかしながら、使用される融合パートナー細胞株はミエローマ起原であるので、そのような融合パートナー細胞株により作製されるハイブリドーマは、ハイブリドーマ自身のクローン拡大を促進させるオートクリン因子を分泌すると考えられる。しかしながら、これらの因子のオートクリン作用は、それらの濃度が比較的低いために標準的なインビトロ培養では明らかではない。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地が生物学的利用能を高めることができるか、したがって、これらの分泌された因子のオートクリン活性を、細胞局在化濃度における増大によって調べた。これは、最初のハイブリドーマ細胞をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地に対してコントロールの水に基づく培地においてサブクローン化し、また、ＨＣＦを両方のクローン化培地に加えることの影響をも観察することによって最も良く達成された。
【０２９２】
ＰＢＭＣをＭＦＰ−２と融合させ、最初のハイブリドーマクローンを増殖させた後、抗体産生ハイブリドーマを特定し、補充物を含むＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地またはコントロールの水に基づく培地においてサブクローン化した。これらの実験の結果が表６に示される。全体的には、試験されたそれぞれの最初のハイブリドーマについて、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地でのより大きなクローン増殖が、コントロールの水に基づく培地と比較して観測された。ＨＣＦがＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地およびコントロールの水に基づく培地の両方に加えられたとき、両方の配合物におけるクローンの数における類似した割合の増加が認められた。最後に、図４０に示されるように、準安定なクローンからの細胞のクローン形成能もまた、ＮＰＤに基づく培地では高まる。
2010515432.tif 000007
表６：１つの最初の抗体産生ハイブリドーマクローンから、２００個の細胞を計数し、１０ｍＬの体積に加え、９６ウエルプレート全体に播種した（平均して１〜２細胞／１００μＬ／ウエル）。表は、それぞれの処理において顕微鏡で計数された生育可能なサブクローンの数（および括弧内に百分率）を示す。
【０２９３】
χ二乗分析：
ＤＩ−ＲＰＭＩ＋ＨＣＦ対ＤＩ−ＲＰＭＩ  ｐ＝０．００８；ＤＩ−ＲＰＭＩ＋ＨＣＦ対ＮＰＤ−ＲＰＭＩ  ｐ＝有意でない；ＤＩ−ＲＰＭＩ＋ＨＣＦ対ＮＰＤ−ＲＰＭＩ＋ＨＣＦ  ｐ＝０．００８；ＮＰＤ−ＲＰＭＩ＋ＨＣＦ対ＤＩ−ＲＰＭＩ  ｐ＜０．００００１；ＮＰＤ−ＲＰＭＩ＋ＨＣＦ対ＮＰＤ−ＲＰＭＩ  ｐ＝０．００２；ＮＰＤ−ＲＰＭＩ対ＤＩ−ＲＰＭＩ  ｐ＝０．０３。
【０２９４】
ＮＰＤ水において増殖させたハイブリドーマからのモノクローナル抗体の増大した分泌。モノクローナル抗体の分泌に対するＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の水性環境の影響を研究するために、いくつかの安定化されたハイブリドーマクローンからのヒトモノクローナル抗体の産生を研究した。抗体を５年以上にわたって安定に産生し続けているハイブリドーマクローンをコントロールの水に基づく培地において増殖させ、その後、２つの並行培養物をそれから調製した。一方をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地において調製し、もう一方をコントロールの水に基づく培地において調製した。数日間なじませた後、細胞を反復して等しい密度で播種し、５日間の増殖の後、上清を集め、抗体濃度を標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。これらの実験のうちの１つの結果を図４１Ａに示したが、すべては、類似する結果を示した。グラフから明白であるように、反復するＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培養からの収量はやや一定していなかった（Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培養での濃度は１０１μｇ／ｍＬから４０μｇ／ｍＬまで変動し、これに対して、コントロールの水では、その範囲ははるかにより狭く、３０μｇ／ｍＬ〜３２μｇ／ｍＬであった）が、全体的に、モノクローナル抗体の収量は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地の方が多かった。しかしながら、一部の細胞はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地においてより速く増殖する（下記参照）。したがって、この結果は、細胞あたりのより大きい分泌ではなく、むしろ、類似する分泌を有する細胞のより大きい増殖を反映しているかもしれない。このバイアスを除くために、抗体濃度をそれぞれの培養における細胞数に対して正規化した（図４１Ｂ）。正規化の後では、結果は回分処理物の濃度に類似しており、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地におけるモノクローナル抗体の分泌が、コントロールの水に基づく培地において得られる分泌のほぼ２倍であることを示している。
【０２９５】
分泌に対するＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）培地の影響をさらに研究するために、モノクローナル抗体の分泌を、低下させた血清で増殖させた培養物において調べた。この実験は、あまり活発でなく（１０％のウシ胎児血清を有する完全培地と比較して相対的に休止しており）、しかし、依然として代謝的に活発であり、それにより、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地の増殖バイアスの一部を排除する培養物における分泌を調べることを可能にした。図４２はこれらの実験の結果を示す。実験では、３％ＦＣＳにおいて反復して増殖させた安定なハイブリドーマクローンの毎日の抗体濃度および生細胞カウント数の両方が定量された。Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）での培養において、抗体濃度は、培養における生細胞の量とともに変化した。細胞増殖および数における変動はまた、抗体の濃度にもまた影響を与えた培地交換および養分補給の関数でもあった（４日目および１０日目に、培地が、細胞に養分補給するために培養物に添加され、６日目に、培地が完全に取り替えられた）。対照的に、コントロールの水での培養における細胞は増殖を保ち、しかし、何らかの測定可能な量の抗体を産生することができなかった。図４２におけるグラフは、ハイブリドーマ細胞増殖と、培養物の抗体含有量との間における典型的な関係を示す。一般に、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地では、抗体の量が、養分供給後の増殖バーストの後で生じる細胞数における増大の後で増大する。グラフのパターンは、培地交換からの抗体濃度に対する希釈効果を反映し、また、（培地交換後６日目の）細胞増殖における付随する急な増大もまた反映する。
【０２９６】
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく水性環境における細胞増殖
ハイブリドーマクローンを用いた前回の実験の結果は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地がヒトハイブリドーマ細胞のクローン拡大およびクローン生存性に影響を及ぼしたことを示唆した。この仮説をさらに調べるために、不死性ＣＨＯ細胞株および初代ヒト線維芽細胞の増殖をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地およびコントロールの水に基づく培地において研究した。
【０２９７】
不死性細胞株はＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）においてより速く増殖する
ＣＨＯ細胞を、並行するＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく完全ＤＭＥＭでの培養およびコントロールの水に基づく完全ＤＭＥＭでの培養において増殖させた。細胞を、反復する培養において１．５ｘ１０６個／１０ｃｍペトリディッシュの初期密度で播種した。一晩増殖させた後、細胞をトリプシン処理によって剥がし、計数した。結果が図４３Ａ〜図４３Ｃに示され、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）培地では、細胞が平均してほぼ３０％速く増殖したことが明らかにされる。ＣＨＯ細胞の増殖に対する血清枯渇の影響を調べるために、細胞を、５％または１％のＦＣＳを有する並行するＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培養およびコントロールの水に基づく培養において反復して播種した。これらの実験において、細胞量をクリスタルバイオレット色素保持アッセイによって定量した。この実験の結果は、結果が図４３Ａ〜図４３Ｃに例示されるが、血清を低下させた条件のもとでは、細胞は、コントロールの水に基づく培地と比較して、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地においてより速く増殖することを示している。
【０２９８】
初代ヒト線維芽細胞はＮＰＤ水においてより遅く増殖する
比較的少ない継代培養（２０回の集団倍加）での初代ヒト線維芽細胞を最初に、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地およびコントロールの水に基づく培地において培養して、細胞をそれらのそれぞれの増殖培地になじませた。初代線維芽細胞は細胞密度に対して敏感であるので、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地対コントロールの水に基づく培地の影響を、異なる初期播種密度を用いて細胞増殖に対して調べた。９６ウエルプレートにおいて、２つの細胞密度を、反復したウエルで、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地およびコントロールの水に基づく培地の両方において播種した（ウエルあたり５０００個および１００００個の細胞）。一晩増殖させた後、プレートをクリスタルバイオレット色素保持アッセイにより分析した。このアッセイの結果が図４４Ａに示される。両方の細胞密度で、コントロールの水に基づく培地において増殖させた線維芽細胞は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地での場合よりも速く増殖した。この違いは、非常に統計学的に有意であることが見出された（ｐ＜０．０００１）。差の百分率を計算すると、密度が大きい場合、処理間の差は、密度が低い場合（４４％）よりも顕著であった（５６％）ことが示された。
【０２９９】
初代ヒト線維芽細胞の増殖に対するＮＰＤに基づく培地の影響をさらに研究するために、反復した培養での８日間にわたるコントロールの水に基づく培地およびＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地における線維芽細胞の増殖を調べた。前回の実験では、線維芽細胞が、ＤＩに基づく培地においてこの密度で十分に増殖したので、細胞を、反復する並行培養においてウエルあたり１００００個の細胞で播種した。この実験からの増殖曲線が図４４Ｂに示される。曲線から明白であるように、初代ヒト線維芽細胞は、コントロールの水に基づく培地と比較して、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に基づく培地では増殖が不良であった。このことは、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）における環境が初代線維芽細胞の増殖のためにそれほど有利でないことを示しており、また、線維芽細胞の増殖は細胞密度の関数であるので、細胞−細胞の探知がやや損なわれることを示唆する。
【０３００】
実施例２０
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖に対する、ナノ構造を含む水の影響
ＭＳＣは、自身およびその周りの細胞に影響を与える様々な因子を分泌することが知られているオートクリン／パラクリン細胞である（ＣａｐｌａｎおよびＤｅｎｎｉｓ、２００６、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、９８（５）：１０７６〜８４）。Ｇｒｅｇｏｒｙ他（Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｓｉｎｇｈ他、２００３、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００３（Ｊｕｌ  ２５）；２７８（３０）：２８０６７〜７８、Ｅｐｕｂ、２００３年５月９日）は、１ｃｍ２あたり５個の細胞での培養ＭＳＣが、その増殖を高めるＷｎｔシグナル伝達経路のｄｉｃｋｋｐｏｆ１（ＤＫＫ１）を分泌することを示している。類似する効果を、非常に低い密度で播種された増殖性の高い細胞に由来する２０％の培地を添加することによって達成することができる。
【０３０１】
下記の実験を、ＭＳＣの増殖に対するＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）の影響を明らかにするために行った。
【０３０２】
材料および方法
細胞培養：ヒト骨髄（ＢＭ）細胞を、承認されたプロトコルのもと、Ｌａｎｉａｄｏ  ＨｏｓｐｉｔａｌおよびＴｅｌ  Ａｖｉｖ大学において成人ドナーから得た。ヒト骨髄細胞を本質的には記載されるように培養した。簡単に記載すると、１０ｍｌのＢＭ吸引物を１９歳〜７０歳の男性ドナーおよび女性ドナーの腸骨稜から採取した。単核細胞を、密度勾配（ｆｉｃｏｌｌ／ｐａｑｕｅ、Ｓｉｇｍａ）を使用して単離し、２５ｍＭグルコースを含有し、１６％のＦＢＳ（ロット番号：ＣＰＢ０１８３、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたαＭＥＭ培地に再懸濁した（すべての培養培地成分を、別途示されない限り、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｔｈ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）から得た）。細胞を１０ｃｍの培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に置床し、５％の加湿ＣＯ２とともに３７℃でインキュベーションした。２４時間後、非接着性の細胞を捨て、接着性の細胞をＰＢＳにより２回徹底的に洗浄した。細胞を５日間〜７日間インキュベーションし、０．２５％トリプシンおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡによる３７℃での５分間の処理によって集め、１ｃｍ２あたり５０個〜１００個の細胞で播種し、コンフルエンスにまで培養した。これを継代培養１と名付けた。継代培養１に由来する細胞を５０細胞／ｃｍ２〜１００細胞／ｃｍ２の密度で２４ウエルプレートに播種し、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）またはＲＯ水に基づく培地（これは粉末化培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）、０１−０５５−１Ａ）から調製された）において培養した。細胞の生存性を、５日毎に１回、合計で２０日間、クリスタルバイオレットアッセイによってアッセイした。加えて、ドナーの１人に由来する細胞を６ウエルプレートに上記密度で播種し（三連）、細胞を、血球計を使用して計数した。
【０３０３】
結果
継代培養２〜継代培養４に由来する３名の骨髄ドナー（１名の女性および２名の男性）を５０細胞／ｃｍ２〜１００細胞／ｃｍ２の密度で増殖させ、細胞カウント（図４５）およびクリスタルバイオレット（図４６）を使用してアッセイした。
【０３０４】
結論
本実施例において示されるデータに基づけば、Ｎｅｏｗａｔｅｒに基づく培地における幹細胞（ＭＳＣ）の増殖速度が、低い細胞密度では高まる。細胞が高コンフルエンスに到達したとき、速度は低下し、２０日以内に、両方の条件における細胞の量が一列に並ぶ。Ｇｒｅｇｏｒｙ他（Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｓｉｎｇｈ他、２００３、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００３（Ｊｕｌ  ２５）；２７８（３０）：２８０６７〜７８、Ｅｐｕｂ、２００３年５月９日）は、ＭＳＣにおける増殖速度がＤＫＫ１のオートクリン分泌により影響を受けることを示唆した。ＭＳＣの増殖速度における最初の４日〜５日で見られる遅延期は、ＤＫＫ１の濃度が低いことに起因する。増殖培地における高い濃度のＤＫＫ１に達すると、細胞は１回の倍加あたり２４時間〜４８時間までの大きい速度で増殖する。上記データは増殖期間における変化を示し、このことは、より高い濃度のＤＫＫ１がより初期には培地に存在することを暗示する。この現象は、高まった増殖を引き起こす細胞近傍におけるＤＫＫ１の局所的濃度によって説明することができる。
【０３０５】
実施例２１
セファロスポリンの可溶化
下記実験の目的は、不溶性のセファロスポリンを、緩速溶媒交換手法を使用して３．６ｍｇ／ｍｌの濃度でＮｅｏｗａｔｅｒ（ＮＷ）に溶解すること、および、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性を保有するｐＵＣ１９プラスミドにより形質転換された大腸菌ＤＨ５α菌株に対するその生物活性を評価することであった。
【０３０６】
材料および方法
緩速溶媒交換：２５ｍｇのセファロスポリンを５ｍｌの有機溶媒（アセトン）に溶解した（５ｍｇ／ｍｌ）。ＮＷを添加する前に、この物質をＨｅλｉｏｓα分光光度計により分析した（図４７）。この物質はかろうじてアセトンに溶解した。この物質は最初、砂様の外見を伴って沈降した。有機溶媒をＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）で交換する手順を、（３０℃で設定された）マルチブロックヒーターにおいて、また、デシケータおよびフードの中で行った。有機溶媒の濃度を、表７に示される式に従って計算した。
2010515432.tif 000008
屈折計：ＲＩ：１．３３３９、式による計算に従って：１．８３３％。
分析天秤：平均：０．９９６２、式に従って：１．９４１％。
【０３０７】
溶液を、０．４５μｍのフィルターを使用して首尾良くろ過した。溶液の分光光度計による読み取りをろ過手順の前後で行った。
【０３０８】
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたセファロスポリンの生物活性の分析
ｐＵＣ１９プラスミド（アンピシリン耐性）を保有するＤＨ５α大腸菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが補充された液体ＬＢ培地において３７℃および２２０ｒｐｍ（回転／分）で一晩増殖させた。
【０３０９】
一晩（ＯＮ）のスターター培養物の１００μＬを下記のように新鮮な液体ＬＢに再接種した：
ａ．１００μｌのＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）（２回目の実験のみ）および抗生物質非添加（両方の実験）を有する３つのチューブ。
ｂ．セファロスポリンストック溶液（５０ｕｇ／ｍｌ）の１０μｌを有する３つのチューブ。
ｃ．セファロスポリンストック溶液（５ｕｇ／ｍｌ）の１００μｌを有する３つのチューブ。
【０３１０】
細菌を３７℃および２２０ｒｐｍでインキュベーションした。連続したＯＤ読み取りを、ＴＥＣＡＮ  ＳＰＥＣＴＲＡＦｌｏｕｒ  Ｐｌｕｓを使用して、５９０ｎｍのフィルターとともに９６ウエルの透明プレートを使用して１時間毎に行った。
【０３１１】
結果
図４８は、ろ過前およびろ過後における、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたセファロスポリンの分光光度計による読み取りである。
【０３１２】
図４９Ａ〜図４９Ｂおよび図５０Ａ〜図５０Ｂに例示されるように、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に溶解されたとき、セファロスポリンは、大きく希釈されたときでさえ、細菌増殖阻害剤としての生物学的利用能および生物活性を有する。注目すべきことに、本実施例は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）自身は細菌の増殖阻害において何ら役割を有しないことを教示する。
【０３１３】
実施例２２
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の光学活性
Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）に対する旋光分析法による測定を、誘導された長距離秩序の形跡を検証するために考案した。ＮＰＤ溶液の光学活性（円偏光した光および楕円偏光した光に関して）を、円二色性（ＣＤ）法を使用して測定した。
【０３１４】
円二色性（ＣＤ）実験手順：ＣＤ分光法は、水溶液を通過した左回りおよび右回り（ＬおよびＲ）の偏光した光の間における吸収差を検出することを目的とする。そのような差は、水に沈められた光学活性（キラル）な分子、あるいは、水または溶液における分子またはナノ粒子または何らかの他の誘導された整列構造の分布から生じ得る。本実施例において報告される測定は、Ｊａｓｃｏ  Ｋ８５１  ＣＤ旋光計を室温（２９８Ｋ）で使用して行われた。スペクトルが、１ｎｍおよび１０秒の増分を使用して１９０ｎｍ〜２８０ｎｍの間で走査された。感度および分解能を増大させるために、非常に長い光路を、（通常の操作モードでの１ｍｍ以下と比較して）１０ｃｍの石英キュベットを使用することによって確保した。
【０３１５】
結果
結果は、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）が円二色性を示すことを示している。（ベースラインとして使用された）ＤＤＷのＣＤスペクトルに対する、Ｎｅｏｗａｔｅｒ（商標）の異なる回分処理物で行われた２つの典型的なＣＤスペクトルが図５１に示される。約０．５ミリ度の光学活性の検出された大きさが１０−５ｍｏｌｅ〜１０−６ｍｏｌｅの通常のペプチド溶液の効果と類似することは特筆される。したがって、その大きさは、無視できるレベルではない。右回り偏光の光に対する左回り偏光の光の吸収におけるＣＤ測定された差は、構造の非対称性に起因して生じる。すなわち、規則的な構造が存在しない場合には、消滅するＣＤ強度が生じ、一方、整列した構造では、正のシグナルおよび／または負のシグナルを含有し得るスペクトルが生じる。したがって、本発明者らは、ＮＰＤ溶液のＣＤスペクトルにおける消滅しないシグナルの存在は、ナノ粒子およびナノ気泡の網目組織によって形成されるＮｅｏｗａｔｅｒ（商標）における長距離の配向秩序の形成に関連するかもしれないことを提案する。
【０３１６】
明確にするため別個の実施形態で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０３１７】
本発明はその特定の実施形態によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本明細書中で言及した刊行物、特許および特許願ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はすべて、個々の刊行物、特許もしくは特許願またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図３７Ｂ−Ｃ】
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【図４３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ．１１Ｂ．１１Ｆ．１１Ｇ】
2010515432.tif 000021
【図１１Ｃ．１１Ｄ．１１Ｈ．１１Ｉ】
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【図１１Ｅ．１１Ｊ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ−Ｄ】
2010515432.tif 000034
【図２０Ｅ−Ｇ】
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【図２１Ａ−Ｄ】
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【図２１Ｅ−Ｇ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【国際調査報告】
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