(57)【要約】  本発明は、ウイルス、ポリオール及び双性イオン化合物を含む、組成物である。また、本発明は、サンプル中のウイルス粒子の大きさを分析することであって、ここで、粒子はポリオールとの混合状態にある、分析すること、サンプルが、許容可能な非凝集粒子のみを実質的に含有するか否かを大きさから判定することを含む、ウイルス凝集に対する分析方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス、ポリオール及び双性イオン化合物を含む組成物。
【請求項２】
前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アデノウイルスがチミジンキナーゼを発現する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリオールがグリセロールである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記双性イオン化合物がＨＥＰＥＳである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
非イオン性である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
凍結乾燥されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
サンプル中のウイルスの粒子の大きさを分析すること及び、
前記サンプルが、許容可能な非凝集粒子のみを実質的に含有するか否かを前記大きさから判定することを含む、ウイルス凝集に対する分析方法であって、
前記ウイルス粒子はポリオールとの混合状態にあることを特徴とする方法。
【請求項９】
前記粒子が、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物中に存在する、請求項８に記載の分析方法。
【請求項１０】
前記分析することが動的光散乱によるものである、請求項８又は９に記載の分析方法。
【請求項１１】
前記大きさが２００ｎｍ以下である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１２】
前記大きさが１００ｎｍ以下である、請求項１１に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝集が最小限に抑えられたウイルス製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、例えば遺伝子治療法における遺伝子の送達に用いることができる。かかるウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及び単純ヘルペスウイルスが挙げられる。例えば、特許文献１には、脳腫瘍の治療及びその再発の予防に関する治療法に用いる、機能性チミジンキナーゼを送達するアデノウイルスが開示されている。
【０００３】
当然のことながら、治療用途では、様々な規制要件が満たされる必要がある。遺伝子治療法に用いるウイルスの製造に関しては厳密な管理が要求され、ウイルス製剤の安定性及び有効性は、特に考慮されるべき事項である。
【０００４】
特許文献１及び特許文献２には、ウイルス製剤の安定剤としてのグリセロールが開示されている。特許文献３には、冷蔵温度及び冷蔵温度以上での長期安定性を目的とする、ウイルス製剤への添加剤としてのグリセロールが開示されている。他にも様々な添加剤が開示されており、例えば、種々の増量剤、凍結保護物質、凍結乾燥保護物質、緩衝液等が挙げられる。
【０００５】
特許文献２には、スクロース、グリセロール、塩化マグネシウム及びポリソルベート８０と共にウイルスを含む、組成物が開示されている。かかる界面活性剤を存在させることによって、ミセルを製造することができる。また、タンパク質を溶解させることもできる。緩衝液としてはＴｒｉｓを用いることができる。塩化マグネシウム等のイオン種の存在は、リン酸緩衝系の典型的なものである。
【０００６】
アデノウイルスベクターを製造、精製及び保存するプロセスは、場合によってはアデノウイルス凝集、及び生物学的活性の減少に繋がる可能性があるウイルスタンパク質修飾に関する多くの機会をもたらす可能性がある。精製アデノウイルスに関しては、凝集は、濃度、温度、ｐＨ及び貯蔵容器と相関関係にあることが報告されている。従来の分析学的方法では、天然のモノマーウイルスと、凝集化した粒子集団とを区別することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開公報  第００／２８０５９号
【特許文献２】米国特許      第６５４４７６９号
【特許文献３】米国特許      第７２３５３９１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、アデノウイルスがチミジンキナーゼを発現するという背景において、特に特許文献１に記載されているように、凝集は、問題となるおそれがあり、且つ有効性の低下に繋がる可能性があるが、防止することができるという発見に基づく。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様によれば、組成物は、ウイルス、ポリオール及び双性イオン化合物を含む。ウイルスは、好ましくはアデノウイルスである。典型的には、アデノウイルスはチミジンキナーゼを発現する。好ましくは、ポリオールはグリセロールである。双性イオン化合物は、好ましくはＨＥＰＥＳである。
【００１０】
本発明の組成物は、非イオン性である、及び／又は塩を含まない可能性がある。本発明の組成物は、血清を含まない可能性がある。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、ウイルス凝集に対する分析方法は、ウイルス粒子の大きさを判定することを含み、例えば、ここで、粒子はポリオールとの混合状態であるか、又は本発明の組成物中に存在する。分析方法は、好ましくは光子相関分光法（ＰＣＳ）としても既知である動的光散乱（ＤＬＳ）によって行われ、製造プロセス及び精製プロセスにおいて、天然の形態でウイルス粒子を分析することができるため、考えられる粒子凝集体の形成をモニタリングすることが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
概括的に言えば、本発明に係る組成物は、上記で参照した従来技術（これらの刊行物のそれぞれの内容は、参照により本明細書中に援用される）に記載されている種類の様な又はかかる種類の構成成分を含み得る。
【００１３】
ウイルスは、野生型ウイルス又は組換えウイルスであり得る。本発明は、広範なウイルスと共に利用することができる。これらのウイルスとしては、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスが挙げられる。好ましくは、ウイルスは、異種遺伝子産物を発現することができる種類のアデノウイルスベクターである。遺伝子産物は、例えば、脳腫瘍の切除後の治療法での使用に好適であり得る。
【００１４】
当業者には既知であるように、ウイルス調製品は、例えば、塩勾配を用いた密度分画によって得ることができる。ウイルスは、接線フロー濾過（ＴＦＦ）と組み合わせたクロマトグラフィ精製法（例えば、陰イオン交換及びサイズ排除）で精製及び製剤化することができる。
【００１５】
ポリオールはこの段階又はこの段階以前に添加することができる。多くのポリオールが既知であるが、グリセロールが好ましい。製剤中のグリセロールの濃度は、好ましくは少なくとも２（重量又は体積）％、より好ましくは少なくとも５（重量又は体積）％、例えば、最大３０（重量又は体積）％である。
【００１６】
組成物は、好ましくは非イオン性である。塩は添加されない可能性がある。
【００１７】
本発明では、スクロース等の糖を用いることができるが、その存在は必須ではない。スクロースは凍結保護物質として既知であるが、凍結による局所的なｐＨ効果を回避することが重要である。このことが重要であるのは、本発明の組成物が、典型的には凍結乾燥され、低温、例えば−７０℃で保存されるためである。
【００１８】
ポリオールの他、新規製剤の別の構成成分は双性イオンである。多くのかかる化合物が既知であり、治療用途を意図した組成物での使用に好適である。ＨＥＰＥＳ、すなわち、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸が好ましいが、他の内用の有機アミン／酸も好適であり得る。この構成成分の濃度は、典型的には例えば、少なくとも１ｍＭ、最大で１０ｍＭ又は２０ｍＭである。
【００１９】
以下の実施例によって、本発明を説明する。
【実施例】
【００２０】
実施例１
特許文献１に記載の使用のために調製したウイルスサンプルを、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０％グリセロール、ｐＨ７．８を含む、緩衝液を用いた場合の凝集体の存在に関して分析した。
【００２１】
サンプルは、粒径分析後に凍結し、一度凍結解凍した後に再分析した。精製物を、２０％グリセロールを含有する最終製剤緩衝液中に製剤化した場合には、サンプルの粒径プロファイルの変化は検出されなかった。しかしながら、凝集ウイルスを含有するサンプルを一度凍結及び解凍した後に再評価すると、粒径プロファイルの明らかな変化が検出された。他のすべての被検サンプルに関して、同様の結果が得られた。
【００２２】
精製バッチの粒径プロファイルに対する凍結／解凍の反復の効果を評価した。精製サンプルの５回連続の凍結及び解凍のサイクルの後であっても凝集体を検出することはできなかった。
【００２３】
実施例２
本実施例では、Ｎｉｃｏｍｐ  ３８０  ＺＬＳ粒径分布測定システム（Particle Sizing System）を用いて粒径分布を得た。この装置は、粒径分析においてＤＬＳを用いる（http://www.pssnicomp.com/nicomptheory.htm）：レーザー光線を被分析サンプルに当て、散乱光の強度を９０度の角度から測定する。光の散乱は、レーザー光線がサンプル緩衝液中に存在する固体粒子と衝突した場合に起こる。特定方向の散乱光の強度は、分散した粒子が液体中で動き回るため、時間の経過と共に周期的に変化する。粒径が小さいほど、周囲液体中での粒子の動きが速くなり、且つ散乱光の強度変化が速くなる。粒子径は、光強度対時間のプロファイルの変動から得られるデータに基づいて算出することができる。現在、ウイルス粒径の判定には、Malvern Instruments製のＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ
Ｓ粒径分布測定装置を使用している。この装置も、粒径分析のためにＤＬＳ法を利用する。装置の製造業者によれば、ＤＬＳは、１ｎｍに至るまでの粒子を粒径分布測定する（size）ことができる一方、レーザー回折に基づく方法は、約１００ｎｍに至るまでの粒子を確実に粒径分布測定することができる。
【００２４】
実施例１に記載の最終製剤緩衝液中に、（Ａ）国際公開第９８／２００２７号パンフレットに記載されている物、及び（Ｂ）特許文献１に記載されている物を含む、アデノウイルスのバッチを作製した。バッチ（Ｂ）は、接線フロー濾過（ＴＦＦ）前後のサンプルを含んだ。これは、プロセス時のウイルス粒子安定性及び凝集に対するＣｓＣｌの効果を検討するために行った。通常、ＴＦＦプロセス後に採取したサンプルのＣｓＣｌ含有量は無視できるものである。
【００２５】
アデノウイルス粒径測定結果に対するグリセロールの効果を評価するために、バッチをアデノウイルス凝集体の存在に関して分析した。サンプルは塩化セシウム（ＣｓＣｌ）を含有した。超遠心管から回収したアデノウイルスを含有するバンドをプールして、５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ中に５倍希釈した後にこれらのサンプルを得た。
【００２６】
陽性の凝集サンプルを得るために、精製プロセス時に採取したサンプルを、＋３７℃で異なる時間：０日間、２日間及び７日間、グリセロールを添加せずにインキュベートした。
【００２７】
最終濃度が２０％となるように、グリセロールを選択したサンプルに添加した。等容量の５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを、他の組のＨＥＰＥＳ前処理サンプルに添加した。
【００２８】
最終製剤緩衝液（２０％グリセロール、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８）中に製剤化した、ウイルスを含有するサンプルを、＋３７℃でインキュベートし、いかなる前処理も行わずに分析した。
【００２９】
ウイルス凝集体は、ポリクローナルアデノウイルス抗体（Abcam、英国ケンブリッジ；１：１００希釈）を用いた免疫沈降によって調製した。粒径分析後、すべてのサンプルを凍結し、−７０℃で保存した。＋３７℃で７日間インキュベートし、ポリクローナル抗体を用いて免疫沈降させたサンプルを一旦解凍して、サンプル粒径分布に対する製剤緩衝液の効果を判定した。
【００３０】
なお、サンプル緩衝液組成は、得られるウイルス粒径に影響を及ぼす可能性がある。サンプル緩衝液が２０％グリセロールを含有する場合、測定されるウイルス粒径は約２００ｎｍである一方、（グリセロールを含まない）ＴＦＦ前に採取したサンプルでは、ウイルス粒径は約１１０ｎｍである。文献によれば、１つの無傷のアデノウイルス粒子の直径は約８０ｎｍ〜９０ｎｍである。実測のウイルス粒径と、報告されているウイルス粒径との相違は、とりわけ、グリセロール含有サンプルの場合では、サンプル緩衝液組成の効果として説明することができる。グリセロールはサンプル緩衝液をより粘稠なものにするため、周囲緩衝液中での粒子の動きが緩徐になる結果、不正確な粒径分布測定となる。Ｎｉｃｏｍｐ粒径分布測定装置は、被分析サンプルを、或る特定の事前に設定される性質を有する水性緩衝液中に製剤化するという仮定に基づいて設定することができる。これらの事前に設定される測定パラメータを、グリセロール含有緩衝液のパラメータに対応するように変化させた場合に得られる結果を再計算することにより、正確な粒径測定値（readings）を得ることができる。
【００３１】
グリセロールは、実測の粒径に対する効果を有するように思われるだけでなく、アデノウイルスを凝集から保護するようにも見えることが分かった。＋３７℃で０日間及び２日間インキュベートした、いずれの被分析サンプルにおいても、凝集ウイルスは検出されなかった。＋３７℃で７日間インキュベーションした後、粒径分析の直前に前処理したサンプルでは凝集粒子が出現した。しかしながら、７日の時点で、最終製剤緩衝液中に製剤化したウイルスサンプルは、依然として検出可能な粒子凝集体を含まないように見えた。また、＋３７℃でのインキュベーションの間、グリセロールをサンプル緩衝液中でインキュベートした場合には、検出可能なウイルス凝集は存在しなかった。各分析時点後、サンプルを凍結させた。７日の時点から凍結サンプルを解凍し、再分析すると、ＴＦＦ前に採取した前処理サンプルの粒径が影響を受けているように見えた一方で、最終製剤緩衝液中のウイルスは無傷であるように思われた。
【００３２】
ポリクローナルアデノウイルス抗体の添加により、ウイルス粒子が凝集した。抗体処理サンプル中のアデノウイルス凝集体の存在を透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって確認した。未処理の対照サンプルには凝集体が存在しなかった。しかしながら、抗体処理サンプルにおいては、凝集したアデノウイルスの大きなクラスターが検出された。
【００３３】
最終製剤緩衝液中に製剤化した、いずれの被検精製サンプルにおいても、凝集体は存在しなかった。予備実験時に、Ｎｉｃｏｍｐ  ３８０  ＺＬＳ粒径分布測定システムの検出限界は、１ｍｌ当たり１×１０11個の非凝集ウイルス粒子であることが分かった。現在、粒径分析にはＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓ粒径分布測定装置を使用している。この装置の検出限界も、１ｍｌ当たり１×１０11個のウイルス粒子であることが確認されている。ウイルス粒子の凝集により、シグナル強度は減少する。
【国際調査報告】
2010535854.tif 000002
2010535854.tif 000003
2010535854.tif 000004