(57)【要約】  本発明は、リシンデカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドが増強される組み換え微生物に関し、この使用下ではカダベリン（１，５−ジアミノペンタン）が発酵により製造され、その際、Ｃ供給源として有利には再生する原料、例えばグルコース、サッカロース、糖蜜その他が使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リシンデカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドが、この酵素に関して変更されていない微生物に比較して増強されて存在する、高いリシン力価を有するカダベリンを形成する組み換え微生物。
【請求項２】
リシン／カダベリンアンチポーターと呼ばれるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、このタンパク質に関して変更されていない微生物に比較して増強されて存在する、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
リシンデカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドが、以下からなる群：
大腸菌（Escherichia coli）、バチルス・ハロデユランス（Bacillus halodurans）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringensis）、バークホルデリア・アムビファリア（Burkholderia ambifaria）、バークホルデリア・ベトナミエンシス（Burkholderia vietnamensia）、バークホルデリア・セノセパチア（Burkholderia cenocepatia）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）、セレノモナス・ルミナンティウム（Selenomonas ruminantium）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）, 腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）, ストレプトマイセス・ピロサス（Streptomyces pilosus）、エイケネラ・コルロデンス（Eikenalla corrodens）、ユウバクテリウム・アシダミノフィルム（Eubacterium acidaminophilum）、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tulariensis）、ジオバチルス・コーストフィラス（Geobacillus kaustophilus）、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）, キネオコッカス・ラジオトレランス（Kineococcus radiotolerans）、オーシャノバチルス・イヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis）、パイロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）、プロクロロコッカス・マリナス（Porochlorococcus marinus）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、ロドフェラックス・フェリレデューセンス（Rhodoferax ferrireducens）、サッカロファガス・デグラダンス（Saccharophagus degradans）、肺炎連鎖菌（Streptococcus pneumoniae）, シネココッカス種（Synechococcus sp）
から選択されている微生物に由来する、請求項１又は２記載の微生物。
【請求項４】
リシン／カダベリンアンチポーターと呼ばれるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、以下からなる群：
大腸菌（Escherichia coli）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）又はビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）
から選択されている微生物に由来する、請求項１から３までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項５】
エシェリキア又はバチルス又はコリネフォルメ属の細菌の組み換え株、特にコリネバクテリウム属の細菌の組み換え株である、請求項１から４までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項６】
リシンデカルボキシラーゼ及びリシン／カダベリンアンチポーターと呼ばれるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、大腸菌（Escherichia coli）種の微生物に由来する、請求項１から５までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項７】
過剰発現が、少なくとも１だけ形質転換されていない微生物に比較して前記ポリヌクレオチドのコピー数が高められることにより、又は、前記ポリヌクレオチドが出発株に比較してより強力なプロモーターと組み合わせられることにより、行われる、請求項１から６までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項８】
コリネフォルメ微生物であり、かつ、以下の群：
ａ）ジヒドロジピコリナート−合成酵素をコードする遺伝子ｄａｐＡ、
ｂ）グリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｇａｐ、
ｃ）グルコース−６−ホスファートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｚｗｆ及びそのアレル、
ｄ）ピルバートカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｐｙｃ及びそのアレル、
ｅ）マラート−キノン−オキシドレダクターゼをコードする遺伝子ｍｑｏ、
ｆ）フィードバック耐性アスパルタートキナーゼをコードする遺伝子ｌｙｓＣ及びそのアレル
ｇ）Ｚｗａｌタンパク質をコードするｚｗａｌ遺伝子
から選択されるコリネバクテリウムからの遺伝子１つ以上を同時に増強又は過剰発現する、請求項１から７までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項９】
Ｌ−リシンエキスポートのタンパク質をコードするｌｙｓＥ−遺伝子が減弱又は遮断される請求項１から８までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項１０】
以下の群
ａ）フィードバック耐性アスパルトキナーゼ遺伝子又はアレル、
ｂ）ジヒドロジピコリナート−合成酵素をコードする遺伝子、
ｃ）ジヒドロピコリナートレダクターゼをコードする遺伝子、
ｄ）スクシニルジアミノピメラートトランスアミナーゼをコードする遺伝子、
ｅ）スクシニルジアミノピメラートデアシラーゼをコードする遺伝子
から選択される大腸菌（E.coli）からの遺伝子１種以上を同時に増強又は過剰発現する、エシェリキア属の微生物である、請求項１から７までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項１１】
リシンデカルボキシラーゼ遺伝子で形質転換される前にＬ−リシンを産生する能力を有する、請求項１から１０までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項１２】
リシンデカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド及び／又はリシン／カダベリンアンチポーターと呼ばれるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、ベクター又はプラスミド。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドが大腸菌（Escherichia coli）由来である、請求項１２記載のベクター又はプラスミド。
【請求項１４】
ａ）請求項１から１１までのいずれか１項記載の微生物を培地中でカダベリンが形成される条件下で発酵させ、
ｂ）このカダベリンを微生物の細胞中で又は発酵培地中で蓄積させる、カダベリンの製造方法。
【請求項１５】
ａ）カダベリンを単離し、その際、場合により、
ｂ）この発酵ブイヨンの溶解した更なる成分及び／又はバイオマスがその全体において又は≧０〜１００％）の割合において単離した生成物中に残存する、
請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
コリネフォルメ細菌を使用する、請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
エシェリキア属の微生物を使用する、請求項１４又は１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、リシンデカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドが増強される組み換え微生物であり、この使用下ではカダベリン（１，５−ジアミノペンタン）が発酵により製造され、その際、Ｃ供給源として有利には再生する原料、例えばグルコース、サッカロース、糖蜜その他が使用される。
【０００２】
先行技術
ポリアミド（ＰＡ）は、ポリマーの重要な群であり、ここから、自動車−、スポーツ−及びライフスタイル産業のための特殊なプラスチックの系列が獲得される。この際、ジアミンは、このポリアミドの重要なモノマー成分である。ジカルボン酸と一緒にこれは縮合して、様々なポリマーを生じ、その際、このジアミン及びジカルボン酸の鎖長がこのプラスチックの特性を決定する。
【０００３】
これまでには、ジアミンは化学的に、石油ベースの原料からのジカルボン酸の中間生成物を経て（Albrecht, Klaus et al . ; Plastics; Winnacker-Kuechler : Chemische Technik (第5版) (2005), 5 465-819）、又は、アミノ酸の化学的脱カルボキシル化を用いて製造される（Suyama, Kaneo. The Decarboxylation of Amino Acids (4), Yakugaku Zasshi, (1965), Vol. 85(6), 513 533）。この上昇性のオイルコストを考慮すると、バイオテクノロジー手法、例えば発酵を用いた再生する原料からのジアミンの合成に対する迅速な乗り換えが所望される。
【０００４】
この問題提起の範囲内において、リシン産生微生物から出発して、カダベリン生産が、リシンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子にとって場合により異種であるものの導入により製造されることができることが見出された。
【０００５】
カダベリンを形成できる生物は、既に、記載されている（Tabor, Herbert; Hafner, Edmund W.; Tabor, Celia White. Construction of an Escherichia coli strain unable to synthesize putrescine, spermidine, or cadaverine: characterization of two genes controlling lysine decarboxylase . Journal of Bacteriology (1980), 144(3), 952-6, Takatsuka Yumiko; Kamio Yoshiyuki Molecular dissection of the Selenomonas ruminantium cell envelope and lysine decarboxylase involved in the biosynthesis of a polyamine covalently linked to the cell wall peptidoglycan layer. Bioscience, biotechnology, and biochemistry (2004), 68(1), 1-19）。カダベリン合成を高めるための試みでは、大腸菌（Escherichia coli）株が、宿主固有のリシンデカルボキシラーゼ（ｃａｄＡ）の過剰発現のためのプラスミドを有する。この大腸菌株は、この固有のｃａｄＡ遺伝子の過剰発現後に、カダベリンを高められた量で形成する（JP 2002-223770）。更なる追試において、大腸菌中でのｃａｄＡの成長及び発現後に、この生物は、外部に供給されたリシンの変換のための完全細胞触媒として使用され（JP 2002-223771, JP 2004-000114, EP 1482055）、その際、このデカルボキシラーゼは、大腸菌の細胞表面にも提示されることができる（JP 2004-208646）。更なる方法は、単離したｃａｄＡ酵素を用いたカダベリンへのリシン−ＨＣＬの変換である(JP 2005-060447)。
【０００６】
上記した生物触媒作用されたプロセスの発酵的手法（ここでは、生成物が直接的に獲得される）による交代は、この製造方法の経済学また同様に環境学の決定的な改善を提示する。
【０００７】
本発明の課題
本発明者らは、再生可能な原料からのカダベリンの発酵による新規製造方法を提供するとの課題を課した。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明の主題は、リシンデカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドが、この酵素に関して変更されていない微生物に比較して増強されて存在する、高いＬ−リシン力価を有するカダベリンを形成する組み換え微生物であり、これは、親株として機能する。
【０００９】
「高いリシン力価を有する」との呼称は、この親株が有利には、出発株、例えば野生株とは、増加した範囲においてＬ−リシンを産生し、かつ、この細胞又はこの取り囲む発酵培地中に蓄積することにおいて相違するＬ−リシン産生者であることを意味する。この力価は質量／容積（ｇ／ｌ）において測定される。
【００１０】
野生型株においては、厳密な制御機構が、固有の要求を超える、代謝生成物、例えばＬ−アミノ酸の製造及び培地中へのその放出を妨げる。製造者観点からはアミノ酸産生者と呼ばれる株の構築は従って、この代謝制御を克服することが要求される。
【００１１】
このコントロール機構の除去及びこの微生物の出力特性の改善の保証のために、突然変異、選択及び突然変異体選択の方法が適用される。このようにして、代謝拮抗物質、例えばリシン−類似体Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、又はバリン類似体２チアゾールアラニンに対して抵抗性であり、化学的化合物、例えば、Ｌ−アミノ酸、例えばＬ−リシン又はＬ−バリンを産生する株を得る。
【００１２】
ここ数年来、同様に、例えばコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）及び大腸菌（Escherichia coli）によるＬアミノ酸産生株の目的とされる株改善化のための組み換えＤＮＡ技術の方法が、個々のアミノ酸−生合成遺伝子を増強又は減弱化し、そして、この化学的化合物の産生に対する結果を検査することにより、使用される。
【００１３】
コリネバクテリウム・グルタミクムの生物学、遺伝学及びバイオテクノロジーのための要約となるような説明は、"Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Eds.: L. Eggeling und M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis, 2005), Journal of Biotechnolgyの特別号 (Chief Editor: A. Puehler) タイトル"A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology" (Journal of Biotechnolgy 104/1-3, (2003)) 及び T. Scheper (Managing Editor) による本"Microbial Production of L-Amino Acids" (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 79, Springer Verlag, Berlin, Deutschland, 2003)中に、見出すことができる。
【００１４】
コリネバクテリウム・グルタミクムのゲノムのヌクレオチド配列は、Ikeda und Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003)) 、EP 1 108 790及びKalinowski et al . (Journal of Biotechnolgy 104/1-3, (2003))で記載されている。
【００１５】
リシンデカルボキシラーゼをコードすることができる適したポリヌクレオチドは、例えば、大腸菌（Escherichia coli）, バチルス・ハロデユランス（Bacillus halodurans）, バチルス・セレウス（Bacillus cereus）, バチルス ズブチリス（Bacillus subtilis）, バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringensis）, バークホルデリア・アムビファリア（Burkholderia ambifaria）, バークホルデリア・ベトナミエンシス（Burkholderia vietnamensia）, バークホルデリア・セノセパチア（Burkholderia cenocepatia）, クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）, セレノモナス・ルミナンティウム（Selenomonas ruminantium）, ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）, 腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）, ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）, ストレプトマイセス・ピロサス（Streptomyces pilosus）, エイケネラ・コルロデンス（Eikenalla corrodens）, ユウバクテリウム・アシダミノフィルム（Eubacterium acidaminophilum）, フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tulariensis）, ジオバチルス・コーストフィラス（Geobacillus kaustophilus）, サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）, サルモネラ・  チフィムリウム（Salmonella typhimurium）, ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）, ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）, テルモプラズマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）, 熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）, キネオコッカス・ラジオトレランス（Kineococcus radiotolerans）, オーシャノバチルス・イヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis）, パイロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）, プロクロロコッカス・マリナス（Porochlorococcus marinus）, プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）, ロドフェラックス・フェリレデューセンス（Rhodoferax ferrireducens）, サッカロファガス・デグラダンス（Saccharophagus degradans）, 肺炎連鎖菌（Streptococcus pneumoniae）, シネココッカス種（Synechococcus sp）の株に由来する。
【００１６】
適したリシンデカルボキシラーゼとは、これは、本発明による方法において使用できるものであるが、リシンを脱カルボキシル化することができる酵素及びそのアレル又は突然変異体が理解される。
【００１７】
本発明により使用される、酵素リシンデカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドは、有利には、配列番号１の大腸菌（Escherichia coli）に由来する。これは、国際的にアクセス可能なデータバンク、例えばアメリカ国のNational Library of Medicine and the National Institute of Health (NIH) からアクセス番号 NC 007946で自由に入手可能である。この同じ配列は同様に、colibri web ServerでInstitut Pasteur (フランス国)番号b4131で又は遺伝子名cadAで自由に入手可能でもある。この同じ配列は、やはり、Swiss Institute of Bioinformatics が維持するウェブサーバーExPasy で番号P0A9H4又は遺伝子名cadAで自由に入手可能でもある。
【００１８】
高められた規模においてＬ−リシンを産生する本発明による微生物を使用する処置は、公知技術からは導くことができない。
【００１９】
US 5,827,698においては、対照的に、リシンデカルボキシラーゼ活性が減少する場合に、Ｌ−リシン生産者を大腸菌中で改善させることが記載されている。
【００２０】
カダベリンの生産は、このカダベリンを産生する組み換え細胞中で更に、カダベリン／リシンアンチポーターと呼ばれるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、有利には、大腸菌由来のポリヌクレオチド（配列番号３、TC 2. A.3.2.2）を発現させることにより支持され、これは、この前述の化合物の細胞から培地中への搬出を容易にする。更なる適したカダベリン／リシンアンチポーターは、例えば大腸菌（Escherichia coli）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）又はビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）の株に由来する。
【００２１】
カダベリン又は関連するジアミンを天然に搬出するか又は突然変異後にカダベリン又は関連するジアミンを搬出することができる能力を獲得するトランスポーターも利用されることができる。
【００２２】
本発明は、カダベリンの搬出を触媒作用するタンパク質をコードする、Ｃ．グルタミクムによる内因性トランスポーター遺伝子の過剰発現も含む。同様に、本発明は、カダベリン産生株中で有利には、競合性のリシン−又はアルギニン搬出が生じる、即ち、この相応する搬出遺伝子又は搬出機能が減弱されて存在するか又は遮断されていることを含む。
【００２３】
本発明の主題は、組み換え微生物、特に前述のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを増強して含有するコリネフォルメ細菌である。有利には、リシンデカルボキシラーゼ及び／又はリシン／カダベリンアンチポーターをコードするヌクレオチド配列が増強され、特に過剰発現される。
【００２４】
有利な微生物は、腸内細菌の科、特にエシェリキア、バシラスの属、特に大腸菌（E. coli ）及び枯草菌（B. subtilis）の種由来であり、その際、カダベリン産生を促進するリシンデカルボキシラーゼは内因的又は外因的な由来であることができる。
【００２５】
本発明による組み換え微生物中でリシンデカルボキシラーゼ及び／又はリシン／カダベリンアンチポーターをコードする過剰発現されたポリヌクレオチドは、様々な科又は属由来の微生物であることができる。
【００２６】
前述の遺伝子の過剰発現のために、個々で又は一緒に、これらの微生物は、遺伝子が過剰発現されていない微生物に比較して高められた範囲においてカダベリンを産生する。
【００２７】
本発明による組み換え微生物は、組み換え遺伝子技術方法により形成され、これは当業者に公知である。
【００２８】
一般的には、この前述の遺伝子を有するベクターは、細胞中へと、慣用の形質転換−又はトランスフェクション技術により導入される。適した方法は、Sambrook et al . (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory, 1989)で見出されることができる。
【００２９】
本発明の主題は、同様に、ベクター、特にプラスミドであって、本発明により使用されるポリヌクレオチドを含有し、かつ場合により細菌中で複製するものである。本発明の主題は、同様に、前述のベクターで形質転換された組み換え微生物である。
【００３０】
その際、この両者のポリヌクレオチドは、唯一の又は２つのプロモーターの作用下にあることができる。
【００３１】
「増強化」との概念は、この関連において、例えば、遺伝子１種以上、ＯＲＦｓ１種以上のコピー数のコピー数を少なくとも（１）コピー高め、強力なプロモーターを機能的にこの遺伝子と連結させ、又は、相応する酵素又はタンパク質を高い活性でコードする遺伝子又はアレル又はＯＲＦを使用し、場合によりこれらの処置を組み合わせることによる、相応するＤＮＡによりコードされる１種以上のこの酵素又はタンパク質のこの微生物中での細胞内活性又は濃度の向上を説明する。大腸菌においては、強力なプロモーターとしてｌａｃ、ｔａｃ及びｔｒｐが挙げられる。
【００３２】
オープンリーディングフレーム（ORF, open reading frame）として、ヌクレオチド配列の断片を指し、これは、タンパク質又はポリペプチド又はリボ核酸をコードするか又はコードすることができ、これには公知技術によれば機能が割り当てられることができない。このヌクレオチド配列の問題となる断片へ機能を割り当てた後には、一般的には、遺伝子のことをいう。アレルとは、一般的には、所定の遺伝子の代替的な形態が理解される。この形態は、ヌクレオチド配列中での相違により特徴付けられる。
【００３３】
一般的に、ヌクレオチド配列、即ち、ＯＲＦ、遺伝子又はアレルによりコードされるタンパク質又はこのコードされるリボ核酸を、遺伝子産物と言う。
【００３４】
増強化、特に過剰発現の処置により、この相応するタンパク質の活性又は濃度は、一般的には、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％又は５００％、最大で１０００％まで又は２０００％、この野生型タンパク質の活性又は濃度に対して、又は相応する酵素又はタンパク質について組み換えられていない微生物又は親株中のタンパク質の活性又は濃度について、高められる。組み換えられていない微生物又は親株（parent strain）としては、本発明による増強化又は過剰発現が実施された微生物が理解される。
【００３５】
前記遺伝子又は遺伝子構築物は、様々なコピー数を有するプラスミド中に存在するか又は染色体に組み込まれそして増幅されてよい。又は、更に、この遺伝子の過剰発現は、この培地組成及び培養操作の変更により達成されてよい。
【００３６】
ｃａｄＡアレルのコピー数の向上のためには、コリネフォルメ細菌中で複製されるプラスミドが適する。数々の公知のプラスミドベクター、例えば、pZ1 (Menkel et al . , Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al . , Gene 102:93-98 (1991))又はpHS2-1 (Sonnen et al . , Gene 107:69-74 (1991)) は、潜在的なプラスミドpHM1519, pBL1又は pGA1に基づく。他のプラスミドベクター、例えば、pCG4 (US-A 4,489,160)又はpNG2 (Serwold-Davis et al . , FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990))又はpAG1 (US-A 5,158,891)に基づくプラスミドベクターは、同じように使用できる。コリネバクテリウム・グルタミクムのプラスミドベクターに関する要約となる説明は、Tauch et al . (Journal of Biotechnology 104(1-3), 27-40 (2003)で見出される。
【００３７】
更に、このコピー数の向上のためには、染色体遺伝子増幅の方法を適用でき、これは、例えば、Reinscheid et al . (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))により、hom-thrB-オペロンの複製又は増幅のため記載されている。この方法では、この完全な遺伝子又はアレルはプラスミドベクター中へとクローニングされ、これは、宿主（典型的には大腸菌）中では複製できるが、Ｃ．グルタミクム中では複製できない。ベクターとして例えば、pSUP301 (Simon et al . , Bio/Technology 1, 784-791 (1983))、pK18mob又はpK19mob (Schaefer et al . , Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman, Journal of Biological Chemistry 269:32678-84 (1994); US-A 5,487,993)、pCR(R)Blunt (Invitrogen社, Groningen, Niederlande; Bernard et al . , Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al . , Journal of Bacteriology 173:4510-4516 (1991))又はpBGS8 (Spratt et al . , Gene 41: 337-342 (1986))が考慮される。増幅すべき遺伝子又はアレルを含有するプラスミドベクターは、引き続き、所望されるＣ．グルタミクムの株中へとコンジュゲーション又は形質転換により移行される。このコンジュゲーションの方法は、例えば、Schaefer et al . (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994))で記載されている。形質転換のための方法は、例えば、Thierbach et al . (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) 及び Tauch et al . (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) で記載されている。「クロスオーバー」事件を用いた相同組み換え後には、この生じる株は、当該遺伝子又はアレルの少なくとも２個のコピーを含有する。特に、タンデム増幅の方法（これは例えばWO 03/014330中に記載されている）も又は所望の箇所での組み込みによる増幅の方法（これは例えばWO 03/040373中に記載されている）も、少なくとも１、２又は３の分だけのコピー数の向上のために使用される。
【００３８】
「減弱化」又は「減弱する」との概念は、例えば弱いプロモーターを使用するか又は低い活性を有する相応する酵素をコードする遺伝子又はアレルを使用するか、又は、相応する遺伝子又は酵素若しくはタンパク質を不活性化し場合によりこの処置を組み合わせることにより、相応するＤＮＡによりコードされる微生物中の１種以上の酵素又はタンパク質のこの細胞内活性の減少又は遮断を説明する。
【００３９】
この減弱化の処置により、この相応するタンパク質の活性又は濃度は一般的には、この野生型タンパク質の活性又は濃度又は出発微生物中のタンパク質の活性又は濃度の０〜７５％、０〜５０％、０〜２５％、０〜１０％、又は０〜５％に減少される。「出発微生物」とは、この相応する遺伝子の減弱化が実施される微生物が理解される。
【００４０】
請求されるのは、特に、前述した、酵素リシンデカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドが増強されて、有利には過剰発現して存在するコリネフォルメ細菌である。
【００４１】
コリネフォルメ細菌は無論、この酵素をコードするポリヌクレオチドを含有しないので、外来生物に由来するリシンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子からのコピーの存在は既に過剰発現と呼ばれる。
【００４２】
本発明の主題は、微生物、特にコリネフォルメ細菌を前述のポリヌクレオチドの１つで形質転換し、この得られる組み換え細菌を適した培地中で、このポリヌクレオチドをコードするリシンデカルボキシラーゼの発現に適した条件下で発酵させ、この形成されるカダベリンを蓄積及び単離し、場合により、この発酵ブイヨン及び／又はこのバイオマスからの更なる溶解した成分（≧０〜１００％）をも用いた、カダベリンの製造方法でもある。
【００４３】
本発明の主題はとりわけ、一般的に以下の工程を実施するカダベリンの製造方法である：
ａ）リシンデカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列及び有利にはリシン／カダベリンアンチポーターと呼ばれるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが増強して、特に過剰発現して存在する組み換え微生物、特にコリネフォルメ細菌の、酵素及びカダベリンの形成のために適している条件下での発酵、及び
ｂ）発酵ブイヨン中での及び／又は前述の細胞中でのこのカダベリンの濃縮。
【００４４】
これには、この発酵ブイヨン及び／又は前述の細菌の細胞からのカダベリンの単離が引き続くことができ、その際、場合により、この発酵ブイヨン及び／又はバイオマスからの成分は部分的に又は完全に除去又は完全に生成物中に残存する。
【００４５】
大腸菌からのｃａｄＡ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１に示してある。
【００４６】
コリネバクテリウム属では特にこの専門分野で公知の種であるコリネバクテリウム・グルタミクムを挙げることができる。本発明による微生物のための出発の基礎としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミクムの種の公知の野生株が使用され、例えば次のものが適する：
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032
コリネバクテリウム・アセトグルタミクムATCC15806
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムATCC13870
コリネバクテリウム・メラッセコラATCC17965
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスFERM BP-1539
ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムATCC13869、及び
ブレビバクテリウム・ジバリカチムATCC14020。
【００４７】
本発明により使用される株の適した前駆物質は、公知のコリネフォルメ細菌株であり、これは、Ｌ−リシンを産生できる能力を有し、これは例えば、次の株である：
EP 0 358 940中に記載されたコリネバクテリウム・グルタミクムDM58-1/pDM6 (= DSM4697)、
EP 0 435 132中に記載されたコリネバクテリウム・グルタミクムMH20 (= DSM5714)
EP 1 108 790中に記載されたコリネバクテリウム・グルタミクムAHP-3 (= FermBP-7382)、及び
US 5,250,423中に記載されたコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスAJ12521 (= FERM BP-3304)
コリネバクテリウム・グルタミクムDM1800 (Georgi T, Rittmann D, Wendisch VF (2005) Metabolie Engeneering 7:291-301)。
【００４８】
「ＡＴＣＣ」との呼称を有する株は、 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)に関連されることができる。「ＤＳＭ」との呼称を有する株はDeutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ,Braunschweig, ドイツ国)に関連されることができる。「ＦＥＲＭ」との呼称を有する株はNational Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan)に関連されることができる。
【００４９】
この群の細菌の株の分類学的分類のための記載は、特に、Kaempfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996))及びUS-A-5, 250, 434で見出される。数年前から（Liebl et al ., International Journal of Systematic Bacteriology 41(2), 255-260 (1991)）、種の呼称「ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）」、「ブレビバクテリウム・ラクトフェルメ（Brevibacterium lactofermentum）」及び「ブレビバクテリウム・ジバリカチム（Brevibacterium divaricatum）」を有するコリネフォルメ細菌がコリネバクテリウム・グルタミクムの種に分類される。「コリネバクテリウム・メラッセコラ（Corynebacterium melassecola）」との種の呼称を有するコリネフォルメ細菌は、コリネバクテリウム・グルタミクムの種に同様に属する。
【００５０】
本発明による処置のために適している微生物は、有利には、Ｌ−リシンを産生する、細胞中で濃縮するか又はこれを取り囲む栄養培地中へ放出し、ここで蓄積させる能力を有する。特に、この使用される株は、この株がリシンデカルボキシラーゼ遺伝子で形質転換される前に、＞（少なくとも）１ｇ／ｌ、≧１５ｇ／ｌ、≧２０ｇ／ｌ、又は≧３０ｇ／ｌ  Ｌ−リシンを、≦（最大で）１２０時間、≦９６時間、≦４８時間、≦３６時間、≦２４時間又は≦１２時間で産生する能力を有する。この際、この株は、突然変異作成及び選択により、組み換えＤＮＡ技術により又はこの両方の手法の組み合わせにより製造された株であることができる。
【００５１】
突然変異作成のためには、典型的なｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異作成方法が、突然変異原物質、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン又は紫外光を使用しながら使用されることができる。
【００５２】
更に、突然変異作成ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法のためには、例えばヒドロキシルアミンを用いた処理（Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, 1992）又は突然変異原オリゴヌクレオチド（T. A. Brown: Gentechnologie fuer Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993）又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、 Newton und Grahamによるハンドブック (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994中に記載されている）が使用されることができる。。
【００５３】
突然変異の作成のための更なるマニュアルは、公知技術及び遺伝学及び分子生物学の公知の教科書、例えば、Knippers ("Molekulare Genetik", 第6版, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995)、Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) 、又は、Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986)による教科書から取り出すことができる。
【００５４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を使用すると、技術水準中で記載されたｃａｄＡ遺伝子は、野生型株の単離された全ＤＮＡから出発して、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅され、場合により適したプラスミドベクター中でクローニングされ、かつ、このＤＮＡは引き続き突然変異作成方法に付される。
【００５５】
ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた増幅のためのマニュアルは、当業者は特に、Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984)及びNewton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994)による教科書に見出す。同様にして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異作成の方法もまた使用されることができ、これは例えば、公知の教科書Sambrook et al . (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York, USA, 1989)に記載されている。相応する方法はまた、いわゆる「キット」の形で、例えば、Papworth et al. (Strategies 9(3), 3-4 (1996))により記載された「QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit」の形でStratagene (La Jolla, USA)社から市販されている。適したｃａｄＡアレルは、引き続きこの上記された方法を用いて選別及び検査される。
【００５６】
本発明の主題は、少なくとも１つの非相同性に発現されたリシンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子、有利には大腸菌からのｃａｄＡを含有する、カダベリンの発酵による獲得のための株、有利にはコリネフォルメ細菌、特にコリネフォルメバクテリウム・グルタミクムの株である。
【００５７】
適しているのは、エシェリキア属の相応する株でもある。
【００５８】
この有利に使用されるリシンデカルボキシラーゼアレル又は遺伝子は、この遺伝子交換（「gene replacement」）の方法（これは、Schwarzer und Puehler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) 又はPeters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998))が記載している）により適した株中に移行されることができる。この相応するリシンデカルボキシラーゼアレルはこの際、Ｃ．グルタミクム中で非複製性のベクター、例えばpK18mobsacB又はpK19mobsacB(Jaeger et al ., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992))又はpCR(R)Blunt (Invitrogen社, Groningen, Niederlande; Bernard et al . , Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993))中へクローニングされ、かつ、これは引き続き形質転換又はコンジュゲーションにより所望されるＣ．グルタミクムの宿主に移行される。第１の、組み込みを引き起こす「クロスオーバー」事件及び適した第２の、切除を引き起こす「クロスオーバー」事件を用いた相同組み換え後には、目的遺伝子又は目的配列中で突然変異の組み入れが達成される。最終的には、WO 03/014330及びWO 03/040373に記載された増幅方法が使用できる。
【００５９】
付加的に、カダベリンの製造のためには、本発明により使用されるリシン−デカルボキシラーゼ遺伝子又はアレルの発現に付加的に、同時に、リシン−生合成の１種以上の酵素を増強すること、特に過剰発現することが有利であることができる。内因性遺伝子の使用は一般的に有利である。
【００６０】
「内因性遺伝子」又は「内因性ヌクレオチド配列」とは、１つの種類の集団又は種中に存在する遺伝子又はヌクレオチド及びアレルが理解される。
【００６１】
概念「増強」とは、この関連においては、微生物中で相応のＤＮＡによってコードされる１種以上の酵素又はタンパク質の細胞内活性又は濃度を、例えば１種以上の遺伝子のコピー数を高めるか、強力なプロモーターを使用するか、又は高い活性を有する相応の酵素又はタンパク質をコードする遺伝子又はアレルを使用し、そして場合によりこれらの処置を組み合わせて高めることを説明している。
【００６２】
更に、カダベリンの改善された生産のためには、この記載されたようにして製造されたコリネフォルメ細菌に対してそれぞれの生合成経路、糖分解、補充、ペントースリン酸回路、アミノ酸搬出の１種以上の酵素及び場合により調節性のタンパク質を、請求された生物中でのリシン形成を向上させるために過剰発現することが有利であることができる。内因性遺伝子の使用はこの記載された処置では一般的に有利である。
【００６３】
従って、コリネフォルメ微生物中での高められたＬ−リシン形成のためには、以下の群から選択される１種以上の遺伝子が過剰発現されることが有利である：
ジヒドロジピコリナート−合成酵素をコードする遺伝子ｄａｐＡ、例えば、コリネバクテリウム・グルタミクムの野生型のEP 0 197 335中に記載されたｄａｐＡ遺伝子。
【００６４】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｚｗｆ、例えばJP-A-09224661及びEP-A-1108790中に記載されたコリネバクテリウム・グルタミクムの野生型のｚｗｆ遺伝子。
【００６５】
US-2003-0175911-A1中に記載されたコリネバクテリウム・グルタミクムのｚｗｆアレル、これは例えばこのアミノ酸配列の２４３位置でのＬ−アラニンはＬ−トレオニンにより置き換えられているか又は２４５位でのＬ−アスパルギン酸はＬ−リシンにより置き換えられているタンパク質をコードする。
【００６６】
WO 2005/058945中に記載されたコリネバクテリウム・グルタミクムのｚｗｆアレル、これは例えばこのアミノ酸配列の８位のＬ−セリンがＬ−トレオニンにより置き換えられているか又は３２１位のＬ−グリシンがＬ−セリンにより置き換えられているタンパク質をコードする。
【００６７】
ピルビン酸−カルボキシラートをコードする遺伝子ｐｙｃ、これは例えばDE-A-198 31 609及びEP 1108790中に記載されたコリネバクテリウム・グルタミクムの野生型のｐｙｃ遺伝子である。
【００６８】
EP 1 108 790中に記載されたコリネバクテリウム・グルタミクムのｐｙｃアレル、これはこのアミノ酸配列の４５８位のＬ−プロリンがＬ−セリンにより置き換えられているタンパク質をコードする。
【００６９】
WO 02/31158及び特にEP1325135B1に記載されたコリネバクテリウム・グルタミクムのｐｙｃアレル、これは、１位でのＬ−バリンのＬ−メチオニンによる置き換え、１５３位でのＬ−グルタミン酸のＬ−アスパラギン酸による置き換え、１８２位でのＬ−アラニンのＬ−セリンによる置き換え、２０６位でのＬ−アラニンのＬ−セリンによる置き換え、２２７位でのＬ−ヒスチジンのＬ−アルギニンによる置き換え、４５５位でのＬ−アラニンのグリシンによる置き換え及び１１２０位でのＬ−アスパラギン酸のＬ−グルタミン酸による置き換えの群から選択されたアミノ酸交換１種以上を有するタンパク質をコードする。
【００７０】
アスパルタートキナーゼをコードするｌｙｓＣ遺伝子、例えば、EP-A-1108790中で配列番号１（アクセス番号AX120085及び120365も参照のこと）として、及び、WO 01/00843中で配列番号２５（アクセス番号AX063743参照のこと）として記載されているコリネバクテリウム・グルタミクムの野生型のｌｙｓＣ遺伝子。
【００７１】
フィードバック耐性アスパルタートキナーゼ変異体をコードするｌｙｓＣFRBアレル。
【００７２】
「フィードバック」耐性アスパルタートキナーゼとは、リシン及びトレオニンの混合物又はＡＥＣ（アミノエチルシステイン）及びトレオニンの混合物又はリシン単独又はＡＥＣ単独による抑制に対する野生型と比較してより少ない感受性を有するアスパルタートキナーゼが理解される。この感度抑制されたアスパルタートをコードする遺伝子又はアレルは、ｌｙｓＣFBR−アレルと呼ばれる。技術水準においては、数々のｌｙｓＣFBR−アレルが記載され、これは、野生型タンパク質と比較したアミノ酸交換を有するアスパルタートキナーゼ変異体をコードする。コリネバクテリウム・グルタミクムの野生型のｌｙｓＣ−遺伝子のコーディングは、NCBIデータバンクのアクセス番号AX756575に相当する。
【００７３】
有利には以下のｌｙｓＣFBR−アレルである：ｌｙｓＣ A279T （コードされたアスパルタートキナーゼタンパク質の２７９位のアラニンのトレオニンに対する置き換え）、ｌｙｓＣ  A279V （コードされたアスパルタートキナーゼタンパク質の２７９位のアラニンのバリンに対する置き換え）、ｌｙｓＣ  S301F （コードされたアスパルタートキナーゼタンパク質の３０１位のセリンのフェニルアラニンに対する置き換え）、ｌｙｓＣ  T308I （コードされたアスパルタートキナーゼタンパク質の３０８位のトレオニンのイソロイシンに対する置き換え）、ｌｙｓＣ  S301Y （コードされたアスパルタートキナーゼタンパク質の３０８位のセリンのチロシンに対する置き換え）、ｌｙｓＣ  G345D （コードされたアスパルタートキナーゼタンパク質の３４５位のグリシンのアスパルギン酸に対する置き換え）、ｌｙｓＣ  R320G （アスパルタートキナーゼタンパク質の３２０位のアルギニンのグリシンに対する置き換え）、ｌｙｓＣ  T311I （コードされたアスパルタートキナーゼタンパク質の３１１位のトレオニンのイソロイシンに対する置き換え）、ｌｙｓＣ  S381F （コードされたアスパルタートキナーゼタンパク質の３８１位のセリンのフェニルアラニンに対する置き換え）、ｌｙｓＣ  S317A （コードされたアスパルタートキナーゼタンパク質の３１７位のセリンのアラニンに対する置き換え）及び ｌｙｓＣ  T380I （コードされたアスパルタートキナーゼタンパク質の３８０位のトレオニンのイソロイシンに対する置き換え）。
【００７４】
特に有利には、ｌｙｓＣFBR−アレルｌｙｓＣ  Ｔ３１１Ｉ（コードされたアスパルタートキナーゼタンパク質の３１１位のトレオニンのイソロイシンに対する置き換え）及びＡ２７９Ｔ（コードされたアスパルタートキナーゼタンパク質の２７９位のアラニンのトレオニンに対する置き換え）及びＳ３１７Ａ（コードされたアスパルタートキナーゼタンパク質の３１７位のセリンのアラニンに対する置き換え）の群から選択された少なくとも１つの置き換えを有するｌｙｓＣFBRアレルである。
【００７５】
リシン−搬出−タンパク質をコードする遺伝子ｌｙｓＥ、例えばDE-A-195 48 222中に記載される野生型コリネバクテリウム・グルタミクムのｌｙｓ−Ｅ遺伝子はこれに対して減弱又は遮断される。
【００７６】
ジアミノピメラート−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｄｄｈ、例えば、コリネバクテリウム・グルタミクムの野生型のEP 1 108 790中に記載されたｄｄｈ遺伝子。
【００７７】
コリネバクテリウム・グルタミクムの野生型のＺｗａｌタンパク質をコードする遺伝子ｚｗａｌ（US 6,632,644）
同様にして、以下の群
ａ）US 5,827,698によるフィードバック耐性アスパルトキナーゼをコードする遺伝子又はそのアレル、
ｂ）ジヒドロジピコリナート−合成酵素をコードする遺伝子、
ｃ）ジヒドロピコリナートレダクターゼをコードする遺伝子、
ｄ）スクシニルジアミノピメラートトランスアミナーゼをコードする遺伝子、
ｅ）スクシニルジアミノピメラートデアシラーゼをコードする遺伝子
から選択された大腸菌からの遺伝子１種以上を同時に増強又は過剰発現する、エシェリキア属のカダベリン産生微生物も請求される。
【００７８】
本発明による微生物は、連続的に又は非連続的に、バッチ式方法（バッチ培養）において又は流加バッチ（供給方法）又は繰り返された流加バッチ（反復性供給方法）において、カダベリン産生の目的のために培養される。公知の培養方法に関する概要は、Chmielによる教科書(Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))又はStorhasによる教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))に記載されている。
【００７９】
使用すべき培養培地は適したように、前記のそれぞれの株の要求を満足しなくてはならない。様々な微生物の培養培地の記載は、American Society for Bacteriologyの教本「Manual of Methods for General Bacteriology」(Washington D.C., USA, 1981)に含まれている。
【００８０】
炭素供給源として、糖及び炭水化物、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン及びセルロース、油脂、例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、ヤシ脂、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノール、及び有機酸、例えば酢酸が使用されてよい。これらの物質は単独で又は混合物として使用されてよい。
【００８１】
窒素供給源として、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母ブイヨン、肉ブイヨン、麦芽ブイヨン、コーンスティープリカー、大豆粉、及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウムが使用されてよい。前記窒素供給源は、単独で又は混合物として使用されてよい。
【００８２】
リン供給源として、リン酸、リン酸水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又はこの相応するナトリウム含有塩が使用されてよい。前記培養培地は更に、金属塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有することが必要であり、これらは成長に必要である。
【００８３】
最後に、必須栄養成長物質、例えばアミノ酸及びビタミンを上述の物質に加えて使用してよい。培養培地にはその上適した前駆物質が添加されることができる。上述の使用物質は、１回のバッチの形で培養物に添加するか、適した方法で、この培養の間に供給されてよい。
【００８４】
前記培養物のｐＨ調節のために、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、又はアンモニア水、又は酸性化合物、例えばリン酸、又は硫酸を適した方法で使用する。泡の発生の調節のために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルが使用されてよい。プラスミドの安定性の維持のために前記溶媒に、適した選択的に作用する物質、例えば抗生物質を添加してよい。好気的条件を維持するために、酸素又は酸素含有混合物、例えば空気を前記培養物に導入する。この培養温度は、通常は、２０〜４５℃、有利には２５〜４０℃であるこの培養は、カダベリンの最大量が形成されるまで進行されるか又はこの収率又は生成率がこの所望される最適値に達するまで進行される。この目標は通常は、１０〜１６０時間の間に達成される。
【００８５】
このようにして製造されたカダベリンは引き続き収集され、次いで有利には単離され場合により精製される。
【００８６】
カダベリン及びＬ−アミノ酸、例えばＬ−リシンの測定のための方法は技術水準から公知である。この分析は例えば、Spackman et al . (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)で記載されたようにアニオン交換クロマトグラフィー、引き続きニンヒドリン−誘導体化を実施することにより行われ、又は、これは逆相ＨＰＬＣにより実施されることができ、例えばLindroth et al . (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174)に記載されている。
【００８７】
本発明による方法は、リシン−デカルボキシラーゼ遺伝子及び／又はリシン／カダベリンアンチポーターと呼ばれるタンパク質が過剰発現される高いリシン力価を有する微生物を使用してカダベリンの改善された発酵による製造のために使用される。
【００８８】
実施例
一般技術
ＤＮＡ操作のためには、標準技術が利用され、例えばこれはSambrook, J. et al . (1989), Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New Yorkに記載されているとおりである。ＤＮＡ増幅は、SAWADY Pwo-DNAポリメラーゼ（Peqlab Biotechnologie, Erlangen, Germany）又はPlatinum Pfx-DNAポリメラーゼ（Invitrogen, Karlsruhe, Germany）により行われた。他に記載がなけれたこのポリメラーゼは製造者の指示に従い利用した。ＰＣＲ増幅及び制限切断部位の導入のためのオリゴヌクレオチドはMWG-Biotech (Ebersberg, Germany)から得た。構築された株の検出をTaqポリメラーゼREADYMIX (Sigma, Taufkirchen, Germany)並びにプラスミド調製物を用いたコロニーＰＣＲにより行った。ＤＮＡ断片は、MinElute Gel Extraction Kit (Quiagen, Hilden, Germany)を用いて製造者の指示に応じて精製及び獲得した。プラスミドＤＮＡをQiaprep spin Miniprep Kits (Quiagen, Hilden, Germany)を用いて単離した。全ての構築されたプラスミドを、制限分析により引き続くシークエンシングを用いて確認した。
【００８９】
実施例１：pEKEx2cadAの構築
pEKEx2cadAの構築のためにベクターpEKEx2（Kleinertz et al . , 1991 Gene 102:93）を使用し、クローニングされた遺伝子のこの転写はイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導可能なｔａｃプロモーター及びｌａｃリプレッサー系（lacIq）の制御下で可能になった。
【００９０】
このｃａｄＡ遺伝子をコードする２．２ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を、以下のオリゴヌクレオチド及び大腸菌ＤＨ５のＤＮＡをテンプレートとして用いて増幅した。
【００９１】
配列番号５；
pcadAFr 5 ' - ttgtcgacaaggagatatagatATGAACGTTATTGCAATATTGAATC-3' (SalI)
配列番号６：
pcadARe 5' - aaggatccTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTCAATACC -3' (Bam HI)
（大文字でゲノム配列に相補的な配列が記載される。増幅物中へと更にSalI又はBamHIのための制限切断部位及びリボソーム結合部位（aaggag）の他に８個のヌクレオチドが開始コドン前に導入された）。
【００９２】
ＰＣＲ増幅物をポリヌクレオチドキナーゼ（Roche, Basel, Switzerland）を用いてリン酸化し、平滑末端をベクターpUC18のSmaI切断部位中へとクローニングした（YanischPerron et al . , 1985, Gene 33:103-19）。この挿入物の同一性及び正確性をシークエンシングにより確認した。引き続きpUC18誘導体から２．２ｋｂの断片をSall-BamHI-フラグメントとして単離し、Sall-BamHIで切断したベクターpEKEx2とライゲーションした。制限消化に基づき所望されるプラスミドを選択し、このうちの１つをpEKEx2cadAと呼ぶ。
【００９３】
実施例２：pEKEx2cadBAの構築
pEKEx2cadBAの構築のためにベクターpEKEx2（Kleinertz et al . , 1991 Gene 102:93）を使用し、クローニングされた遺伝子のこの転写はイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導可能なｔａｃプロモーター及びｌａｃリプレッサー系（laclq）の制御下で可能になった。このｃａｄＢ遺伝子及びｃａｄＡ遺伝子をコードする３．６ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を、以下のオリゴヌクレオチド及び大腸菌ＤＨ５のＤＮＡをテンプレートとして用いて増幅した。
【００９４】
配列番号７：
pcadBAFr 5' - ttggatccaaggagatatagatATGAGTTCTGCCAAGAAGATCG - 3' Bam HI)
配列番号８：
pcadBARe 5 ' -aaggatccTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTCAATACC-3 ' (Bam HI) '
（大文字でゲノム配列に相補的な配列が記載される。増幅物中へと更にBamHIのための制限切断部位及びリボソーム結合部位（aaggag）の他に８個のヌクレオチドが開始コドン前に導入された）。
【００９５】
ＰＣＲ増幅物をポリヌクレオチドキナーゼ（Roche, Basel, Switzerland）を用いてリン酸化し、平滑末端をベクターpUC18のSmal切断部位中へとクローニングした（YanischPerron et al . , 1985, Gene 33:103-19）。この挿入物の同一性及び正確性をシークエンシングにより確認した。引き続きpUC18誘導体から３．６ｋｂの断片をBamHI-フラグメントとして単離し、BamHIで切断したベクターpEKEx2とライゲーションした。制限消化に基づき所望されるプラスミドを選択し、このうちの１つをpEKEx2cadBAと呼ぶ。
【００９６】
実施例３：組み換え細胞の獲得
コリネバクテリウム・グルタミクムDM1800のコンピテント細胞(Georgi et al . , Metab Eng. 7 (2005) 291301)の製造をTauch et alが記載したように行った（Curr Microbiol. (2002) 45:362-367）。pEKEx2, pEKEx2cadA及びpEKEx2cadBAのＤＮＡを電気穿孔を用いて導入し、Merck社（Darmstadt, Deutschland）のブレインハート寒天（カナマイシン５０ｍｇ／ｌで補給されている）上で形質転換体を選択した（FEMS Microbiol Lett., 1989, 53:299-303）。形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、これを制限消化を用いて特性決定した。このようにしてＣ．グルタミクムpEKEx2、Ｃ．グルタミクムpEKEx2cadA及びＣ．グルタミクムpEKEx2cadBAを得た。
【００９７】
このＣ．グルタミクムＤＭ１８００の株は、次の特性により特徴付けられる（野生型Ｃ．グルタミクムATCC 13032と比較して）：アレルpyc P458S（ピルバートデカルボキシラーゼ）及びlysC T311I（アスパルタートキナーゼ）中での突然変異、これは高められたリシン形成を生じる（Georgi T, Rittmann D, Wendisch VF Metab Eng. 2005; 7 (4) : 291-301, Lysine and glutamate production by Corynebacterium glutamicum on glucose, fructose and sucrose: roles of malic enzyme and fructose-1, 6-bisphosphatase . Metab Eng. 2005 JuI; 7 (4) .291-301）。
【００９８】
実施例４：細菌を用いたカダベリン形成
組み換えＣ．グルタミクムＤＭ１８０００株を、カナマイシン２５ｍｇ／ｌを含有する複合培地ＣＧＩＩＩ（Eggeling and Bott, Eds, Handbook of Corynebacterium glutamicum., CRC Press, Taylor Francis Group）上で一晩３０℃で生育させる。引き続きこの細胞をそのつど５分間の６０００ｒｐｍでの遠心分離により収集し、再懸濁し、０．９ＮａＣｌ中に取り込み、再度遠心分離し、最後に０．９ＮａＣｌ中に取り込んだ。この細胞懸濁液を用いて最小培地ＣＧＸＩＩ  ４％グルコース  ２５ｍｇ／ｌカナマイシン（Eggeling and Bott, Eds, Handbook of Corynebacterium glutamicum., CRC Press, Taylor Francis Group）に接種した。引き続きこの細胞を３０℃でインキュベーションした。少なくとも２個の独立した発酵を実施した。４７時間後に、アミノ酸−及びカダベリン測定のための試料を取り出した。この測定を、ハイスループット液体クロマトグラフィー（J Chromat (1983) 266:471-482）を用いて実施した。この発酵の結果を第１表中に示した。従って、この構築されかつ記載された株の利用は、糖からの微生物のカダベリン形成を可能にするための方法を提示する。
【００９９】
第１表：コリネバクテリウム・グルタミクムＤＭ１８００の組み換え株の培地上清中のカダベリン蓄積
【表１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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