(57)【要約】  オストレオコッカス種の核ゲノムから少なくとも１つのポリペプチドを生産する方法。該方法は、オストレオコッカス種の核ゲノムに少なくとも１つの組換え核酸分子を導入することを含み、組換え核酸分子は第２のポリヌクレオチドと連結されて作用する第１のポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つのポリペプチドをコードし、第１のポリヌクレオチドはオストレオコッカス種での該少なくとも１つのポリペプチドの発現を許容するプロモータ配列を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オストレオコッカス種の核ゲノムから少なくとも１つのポリペプチドを生産する方法であって、
（ｉ）  オストレオコッカス種の核ゲノムに、第２のポリヌクレオチドに連結されて作用する第１のポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの組換え核酸分子を導入する工程を含み、
第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つのポリペプチドをコードし、第１のポリヌクレオチドはオストレオコッカス種での該少なくとも１つのポリペプチドの発現を許容するプロモータ配列を含む、方法。
【請求項２】
前記オストレオコッカス種は、
フランス国ロスコフ（Ｒｏｓｃｏｆｆ）所在の海洋プランクトンのロスコフカルチャーコレクション（ＲＣＣ）にて、参照番号ＲＣＣ１４１、ＲＣＣ１４３、ＲＣＣ３４３、ＲＣＣ３４４、ＲＣＣ３５６、ＲＣＣ３７１、ＲＣＣ３７１、ＲＣＣ３９３、ＲＣＣ４１０、ＲＣＣ４２０およびＲＣＣ５０１で入手可能なオストレオコッカス種、および
イギリス国の藻類および原虫類カルチャーコレクション（スコットランド、ＰＡ３７  ＩＱＡ、アーガイル（Ａｒｇｙｌｌ）、オーバン（Ｏｂａｎ）、ＳＡＭＳ研究サービス社（ＳＡＭＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．））（ＣＣＡＰ）にて、国際寄託機関ＣＣＡＰから与えられた受託番号が１５７／１で入手可能なオストレオコッカス  タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ）
からなるグループから選択された少なくとも１つであり、
好ましくはオストレオコッカス  タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ）である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オストレオコッカス種は、イギリス国の藻類および原虫類カルチャーコレクション（スコットランド、ＰＡ３７  ＩＱＡ、アーガイル（Ａｒｇｙｌｌ）、オーバン（Ｏｂａｎ）、ＳＡＭＳ研究サービス社（ＳＡＭＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．））（ＣＣＡＰ）にて、国際寄託機関ＣＣＡＰから与えられた受託番号が１５７／１で入手可能なオストレオコッカス  タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ）である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プロモータ配列は、
オストレオコッカス  タウリ  ヒストンＨ４プロモータ配列（配列番号１）、
オストレオコッカス  タウリ  ｃｐｘプロモータ配列（配列番号５）、
オストレオコッカス  タウリ  ｃｒｄ１プロモータ配列（配列番号４）、
オストレオコッカス  タウリ  高親和性リン酸トランスポーター（ＨＡＰＴ）プロモータ（配列番号３）
からなるグループから選択された少なくとも１つである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
プロモータ配列は配列番号３を有する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列が、
Ｇ４１８またはノーセオスリシンアセチルトランスフェラーゼなどの抗生物質への耐性を引き起こす遺伝子、および
ルシフェラーゼ遺伝子などのレポータ遺伝子
からなるグループから選択されたマーカー遺伝子である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列が、治療に関連する配列である請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記第２のポリヌクレオチドが、第１のポリペプチドと、少なくとも第２のポリペプチドとをコードする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のポリペプチドと前記少なくとも第２のポリペプチドとが融合タンパク質である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第１のポリペプチドは免疫グロブリンのＨ鎖またはその可変領域を含み、第２のポリペプチドは免疫グロブリンの軽鎖またはその可変領域を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２のポリヌクレオチドは、０．５〜１０ｋｂ、好ましくは０．５〜５ｋｂ、より好ましくは０．５〜３ｋｂからなる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２のポリヌクレオチドは、オストレオコッカス種での前記少なくとも１つのポリペプチドの分泌を許容する分泌シグナルを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記分泌シグナルは、オストレオコッカス  タウリの予測アクアリシン／ズブチリシン分泌プロテアーゼ配列ペプチド（配列番号１７）からなる群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記（ｉ）の導入する工程は、エレクトロポレーションからなるグループから選択された方法によって実行される請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉｉ）前記オストレオコッカス種中で発現された前記少なくとも１つのポリペプチドを採収する工程、をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記オストレオコッカス種をバイオリアクターにて成長させる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記オストレオコッカス種をオストレオコッカス種の成長を刺激する硝酸塩、アンモニウム塩、リン酸塩、および二酸化炭素からなるグループから選択された少なくとも１つである少なくとも１つの化合物を含む培地において成長させる請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
オストレオコッカス種において少なくとも１つのポリペプチドを発現させるための発現カセットであって、
（ａ）少なくとも１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入するためのクローニング部位に連結されて作用し、かつ該クローニング部位よりも上流に配置されたプロモータ配列
を備え、該プロモータ配列はオストレオコッカス種での前記少なくとも１つのポリペプチドの発現を許容する、発現カセット。
【請求項２０】
前記プロモータ配列は、
オストレオコッカス  タウリ  ヒストンＨ４プロモータ配列（配列番号１）、
オストレオコッカス  タウリ  ｃｐｘプロモータ配列（配列番号５）、
オストレオコッカス  タウリ  ｃｒｄ１プロモータ配列（配列番号４）、
オストレオコッカス  タウリ  高親和性リン酸トランスポーター（ＨＡＰＴ）プロモータ（配列番号３）
からなるグループから選択された少なくとも１つであり、
特に、前記プロモータ配列は配列番号３を有する請求項１９に記載の発現カセット。
【請求項２１】
プロモータ配列は配列番号３を有する請求項１９に記載の発現カセット。
【請求項２２】
前記クローニング部位は、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位および少なくとも１つのレコンビナーゼ認識部位からなるグループから選択される請求項１９に記載の発現カセット。
【請求項２３】
請求項１９に記載の少なくとも１つの発現カセットを備えたベクター。
【請求項２４】
原核生物の複製起点を含む請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
前記複製起点はＥ．Ｃｏｌｉの複製起点である請求項２３に記載のベクター。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法によって得られた細胞。
【請求項２７】
前記細胞は、
イギリス国の藻類および原虫類カルチャーコレクション（スコットランド、ＰＡ３７  ＩＱＡ、アーガイル（Ａｒｇｙｌｌ）、オーバン（Ｏｂａｎ）、ＳＡＭＳ研究サービス社（ＳＡＭＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．））（ＣＣＡＰ）にて、国際寄託機関ＣＣＡＰから与えられた受託番号が１５７／１で入手可能なオストレオコッカス  タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ）、
オストレオコッカス  オセアニカ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｃｅａｎｉｃａ）、および
フランス国ロスコフ（Ｒｏｓｃｏｆｆ）所在の海洋プランクトンのロスコフカルチャーコレクション（ＲＣＣ）にて、参照番号ＲＣＣ１４１、ＲＣＣ１４３、ＲＣＣ３４３、ＲＣＣ３４４、ＲＣＣ３５６、ＲＣＣ３７１、ＲＣＣ３７１、ＲＣＣ３９３、ＲＣＣ４１０、ＲＣＣ４２０およびＲＣＣ５０１で入手可能なオストレオコッカス種
からなるグループから選択されたオストレオコッカス種の細胞であり、
好ましくはオストレオコッカス  タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ）である請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
イギリス国の藻類および原虫類カルチャーコレクション（スコットランド、ＰＡ３７  ＩＱＡ、アーガイル（Ａｒｇｙｌｌ）、オーバン（Ｏｂａｎ）、ＳＡＭＳ研究サービス社（ＳＡＭＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．））（ＣＣＡＰ）にて、国際寄託機関ＣＣＡＰから与えられた受託番号が１５７／１で入手可能なオストレオコッカス
タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ）の細胞である請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
請求項１に記載の方法によって得ることが可能なポリペプチドであって、Ｎ−グリコシル化炭水化物鎖を有するポリペプチド。
【請求項３０】
一本鎖抗体である請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
請求項２９に記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項３２】
治療組成物の調製のための請求項２９に記載の少なくとも１つのポリペプチドの使用方法。
【請求項３３】
治療組成物は、癌、感染症、心血管疾患、アルツハイマー病またはパーキンソン病などの
神経変性疾患、および単一遺伝子遺伝病などの遺伝子疾患からなるグループから選択された少なくとも１つの疾患の治療用の治療組成物である請求項３２に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示の技術は、包括的には、緑藻類、特にオストレオコッカス種における核ゲノムからのポリペプチドの発現方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質、特にモノクローナル抗体の生産は、重要なマーケットを示し、十分に拡大しており、２００４年には１兆円（１００億ドル）と評価され、２０１０年には３兆円（３００億ドル）を超えるとされている。これらの組換えタンパク質は、健常人のための栄養補助食品として、または病気、特に癌腫および感染症の治療用治療薬として、その用途が見出されている。
【０００３】
治療薬の生産のために遺伝子工学技術を使用する主な利点は、かかる方法によって大量の所望のタンパク質が生成されることである。種々の細胞の種類を使用した種々の方法がこれまでに開発された。細菌細胞に基づく技術が改良された場合でも、抗体のような複雑なタンパク質を生産するためにはかかる方法は制約を示す。真核細胞、特に昆虫細胞や哺乳動物細胞を使用する方法は、ヒトの複雑なタンパク質の生産を可能にするが、これらの系はコストが高く、これがかかる系の開発の主な制約になっていた。
【０００４】
遺伝子組換え植物でのタンパク質の生産は、現在十分に台頭している代替方法となっている。これらの発現系は、ウイルスやプリオンなどの病原体を運搬せずに複雑なタンパク質を生産することを可能にする。遺伝子組換え植物の使用に関する主な問題は、特にヒト遺伝子またはアレルゲンを使用した場合の、花粉の伝播に関する汚染の危険性である。実際に、欧州の法律は、そのような危険のため、遺伝子組換え植物の使用を規制している。さらに、そのような生産が安価なものであると、植物からのタンパク質の精製は複雑で拡張的になるだろう。
【０００５】
最近、緑藻類、すなわちクラミドモナス  ラインハーティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）が、そのプラスチド（色素体）ゲノムからヘルペスウィルス向けのモノクローナル抗体を生産するために使用されている。この藻類は、単細胞であるため、遺伝子組換え植物と比較して組換えタンパク質の精製を促進するという主な利点を与える。しかしながら、クラミドモナス  ラインハーティの遺伝子コードには偏りがあるため、この発現系の主な欠点となっている。実際、遺伝子によってコードされた組換えタンパク質の正確な発現を得るためには、第３位にＡまたはＴを含むかかる遺伝子の各コドンを遺伝子修飾する必要がある。タンパク質の生産のためのこの必要なステップには、クラミドモナス  ラインハーティにおけるこの発現系の高い生産コストを伴う。さらに、色素体での発現は、抗体などの糖タンパク質の生物活性または安定化のために必要とされることが多い該糖タンパク質のグリコシル化を行わない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、低コストで大量のタンパク質を好都合に生産および精製する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
組換えタンパク質は、オストレオコッカス種の緑藻類核ゲノムから発現させることが可能である。従って、本願発明者らは、オストレオコッカス種において少なくとも１つのポ
リペプチドを生産する方法を提供する。かかる方法は、オストレオコッカス種の核ゲノムに、第２のポリヌクレオチドに連結されて作用する第１のポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの組換え核酸分子を導入する工程を含み、第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つのポリペプチドをコードし、第１のポリヌクレオチドはオストレオコッカス種での該少なくとも１つのポリペプチドの発現を許容するプロモータ配列を含む。
【０００８】
本願発明者らはさらに、オストレオコッカス種において少なくとも１つのポリペプチドを発現させるための発現カセットを提供する。該カセットは、少なくとも１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入するためのクローニング部位に連結されて作用し、かつ該クローニング部位よりも上流に配置されたプロモータ配列を備え、該プロモータ配列はオストレオコッカス種での前記少なくとも１つのポリペプチドの発現を許容する。
【０００９】
本願発明者らは、以下に説明するような本発明の少なくとも１つの発現カセットを備えたベクターを提供する。
【００１０】
本願発明者らはさらに、以下に説明するような本発明の方法によって得ることができる細胞を提供する。
【００１１】
本願発明者らはさらに、以下に説明するような本発明の方法によって得ることができ、Ｎ−グリコシル化炭水化物鎖を有するポリペプチドを提供する。
【００１２】
本願発明者らはまた、治療組成物の調製のための少なくとも１つのポリペプチドの使用方法を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】関連する制限部位と、オストレオコッカス  タウリのヒストンＨ４プロモータの制御下にあるＧ４１８耐性遺伝子（ＫａｎＭｘ）と、それに続くＴＥＦターミネータおよびルシフェラーゼ＋遺伝子とを示す、ＰｏｔＬｕｃベクターのマップ。
【図２Ａ】ＰｏｔＬｕｃ−ＰＲＲ１ベクターを生成すべくＰｏｔＬｕｃ中のルシフェラーゼ遺伝子にオストレオコッカス  タウリのＰＲＲ１遺伝子を融合するスキーム。二重線はサザンブロット分析で使用されたプローブに対応する領域を示す。
【図２Ｂ】ＰｏｔＬｕｃ−ＨＡＰＴベクターを生成すべくＰｏｔＬｕｃ中のルシフェラーゼ遺伝子にオストレオコッカス  タウリのＨＡＰＴ（高親和性リン酸トランスポーター）プロモータを融合するスキーム。
【図３】３４個の異なるオストレオコッカス  タウリ形質転換体から得られたタンパク質抽出物に対するルシフェラーゼルミネセンスの測定値を示す。（灰色と白色のボックス）を示す。これらの細胞は、オストレオコッカス  タウリのＰＰＰ１全遺伝子に融合させたＧ４１８耐性ＤＮＡおよびルシフェラーゼ＋遺伝子で形質転換した。黒色ボックス−陰性対照（ＤＮＡなし）、灰色ボックス−ルミネセンス（冷光）が陰性対照よりも２倍高かった、白色ボックス−ルミネセンスが陰性対照より２倍低かった。
【図４Ａ】３つの異なるオストレオコッカス  タウリの安定した形質転換体（ＰＲＲ１−５、ＰＲＲ１−７およびＰＲＲ１−１５）のルシフェラーゼ活性。これらの細胞は、オストレオコッカス  タウリのＰＰＰ１全遺伝子に融合させたＧ４１８耐性ＤＮＡおよびルシフェラーゼ＋遺伝子で形質転換した。これらの形質転換体は、昼／夜（白色ボックス／黒色ボックス）を交互にして培養した。
【図４Ｂ】ＥＦ１α対照細胞に関して定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定したＰＲＲ１  ｍＲＮＡの発現。
【図５】Ｇ４１８耐性でルシフェラーゼ活性を示す１０個の異なる形質転換体におけるサザンブロットによる遺伝子ＰＲＲ１挿入の検出。ライン１、５および７は形質転換体ＰＲＲ１−５、ＰＲＲ１−７およびＰＲＲ１−１５に相当する。ラインＣは、形質転換されていない陰性対照に相当する。使用されたプローブは図２に記載されたＰＲＲ１遺伝子（６００ｂｐ）の３’領域に相当する。
【図６Ａ】種々の条件の試験によるエレクトロポレーションによるオストレオコッカス  タウリ細胞の形質転換の最適化。浸透圧の影響を示す。
【図６Ｂ】種々の条件の試験によるエレクトロポレーションによるオストレオコッカス  タウリ細胞の形質転換の最適化。パルス時間の影響を示す。
【図６Ｃ】種々の条件の試験によるエレクトロポレーションによるオストレオコッカス  タウリ細胞の形質転換の最適化。電界強度の影響を示す。
【図６Ｄ】種々の条件の試験によるエレクトロポレーションによるオストレオコッカス  タウリ細胞の形質転換の最適化。ＤＮＡ量の影響を示す。
【図７】関連する制限部位と、オストレオコッカス  タウリのヒストンＨ４プロモータの制御下にあるノーセオスリシンアセチルトランスフェラーゼ耐性遺伝子（Ｎａｔ１）と、それに続くＴＥＦターミネータ、６×ヒスチジンタグ、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）およびリン酸トランスポータープロモータを示す、Ｐｏｔｏｘベクターのマップ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
オストレオコッカス種の核ゲノムから少なくとも１つのポリペプチドを生産する方法を開示する。該方法は、
（ｉ）オストレオコッカス種の核ゲノムに、第２のポリヌクレオチドに連結されて作用する第１のポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの組換え核酸分子を導入する工程を含み、
第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つのポリペプチドをコードし、第１のポリヌクレオチドはオストレオコッカス種での該少なくとも１つのポリペプチドの発現を許容するプロモータ配列を含む。
【００１５】
本願発明者らの方法によるポリペプチドまたはタンパク質複合体を発現するためのオストレオコッカス種の使用は、ポリペプチドまたはタンパク質複合が核ゲノムから発現でき、そのため、クラミドモナス  ラインハーティの色素体発現系とは異なり、遺伝子の各コドンを修飾しなくても所望の産物を正確に発現できるという利点を有する。
【００１６】
用語「ポリペプチド」は、本明細書に使用する場合、隣接するアミノ酸残基のαアミノ基とカルボキシ基の間のペプチド結合によって互いに接続された一連の直線状のアミノ酸残基を指す。
【００１７】
用語「オストレオコッカス種」は、本明細書に使用する場合、プラシノ藻科の単細胞緑藻種を指す。本発明によれば、オストレオコッカス種は、
イギリス国の藻類および原虫類カルチャーコレクション（スコットランド、ＰＡ３７  ＩＱＡ、アーガイル（Ａｒｇｙｌｌ）、オーバン（Ｏｂａｎ）、ＳＡＭＳ研究サービス社（ＳＡＭＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．））（ＣＣＡＰ）にて、国際寄託機関ＣＣＡＰから与えられた受託番号が１５７／１で入手可能なオストレオコッカス  タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ）、
オストレオコッカス  オセアニカ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｃｅａｎｉｃａ）、および
フランス国ロスコフ（Ｒｏｓｃｏｆｆ）所在の海洋プランクトンのロスコフカルチャーコレクション（ＲＣＣ）にて、参照番号ＲＣＣ１４１、ＲＣＣ１４３、ＲＣＣ３４３、ＲＣＣ３４４、ＲＣＣ３５６、ＲＣＣ３７１、ＲＣＣ３７１、ＲＣＣ３９３、ＲＣＣ４１０、ＲＣＣ４２０およびＲＣＣ５０１で入手可能なオストレオコッカス種
からなるグループから選択可能であり、好ましくはオストレオコッカス  タウリである。
【００１８】
例えば、オストレオコッカス  タウリの野生型菌株０ＴＴＨ０５９５は、フランス国ロスコフ（Ｒｏｓｃｏｆｆ）所在の海洋プランクトンのロスコフカルチャーコレクション（ＲＣＣ）にて参照番号ＲＣＣ６１４で、またはイギリス国の藻類および原虫類カルチャーコレクション（スコットランド、ＰＡ３７  ＩＱＡ、アーガイル（Ａｒｇｙｌｌ）、オーバン（Ｏｂａｎ）、ＳＡＭＳ研究サービス社（ＳＡＭＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．））（ＣＣＡＰ）にて国際寄託機関ＣＣＡＰから与えられた受託番号１５７／１で入手可能である。そのゲノム全体が、以下のＥＭＢＬアクセッション番号で利用可能である：ＣＲ９５４２０１（Ｃｈｒｏｍ１）；ＣＲ９５４２０２（Ｃｈｒｏｍ２）；ＣＲ９５４２０３（Ｃｈｒｏｍ３）；ＣＲ９５４２０４（Ｃｈｒｏｍ４）；ＣＲ９５４２０５（Ｃｈｒｏｍ５）；ＣＲ９５４２０６（Ｃｈｒｏｍ６）；ＣＲ９５４２０７（Ｃｈｒｏｍ７）；ＣＲ９５４２０８（Ｃｈｒｏｍ８）；ＣＲ９５４２０９（Ｃｈｒｏｍ９）；ＣＲ９５４２１０（ＣｈｒｏｍｉＯ）；ＣＲ９５４２１１（Ｃｈｒｏｍ１１）；ＣＲ９５４２１２（Ｃｈｒｏｍ１２）；ＣＲ９５４２１３（Ｃｈｒｏｍ１３）；ＣＲ９５４２１４（Ｃｈｒｏｍ１４）；ＣＲ９５４２１５（Ｃｈｒｏｍ１５）；ＣＲ９５４２１６（Ｃｈｒｏｍ１６）；ＣＲ９５４２１７（Ｃｈｒｏｍ１７）；ＣＲ９５４２１８（Ｃｈｒｏｍ１８）；ＣＲ９５４２１９（Ｃｈｒｏｍ１９）；ＣＲ９５４２２０（Ｃｈｒｏｍ２０）。本発明の本願発明者らの方法によりポリペプチドを発現するためのオストレオコッカス種の使用は、その遺伝子コードに偏りがなく、すべてのコドンが存在し、したがってポリペプチドの発現および生産が促進されるという利点を提供する。
【００１９】
オストレオコッカス種に少なくとも１つの組換え核酸分子を導入する方法は、当業者により、一般的知識については容易に識別される。例えば、（ｉ）の導入工程は、エレクトロポレーションによって行なうことが可能である。
【００２０】
用語「組換え核酸分子」は、本明細書に使用する場合、実験的組換えから得ることが可能なポリヌクレオチドを指す。
【００２１】
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書に使用する場合、リン酸ジエステル結合により互いに結合された２つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を指す。そのようなものとして、用語「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、好ましくは遺伝子またはその一部であり得るＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ポリデオキシリボ核酸配列等を含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよい。さらに、本明細書に使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」は、細胞から分離可能な天然核酸分子と、例えば化学合成法によりまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の酵素法により調製可能な合成ポリヌクレオチドとの両方を含む。
【００２２】
用語「連結されて作用する」は、本明細書に使用する場合、２つ以上の分子が、一つの単位として機能し、かつ一方又は両方の分子もしくはその組み合わせに起因する機能をもたらすように、互いに対して配置され得ることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、転写または翻訳調節要素に連結されて作用し、この場合、かかる調節要素は、ポリヌクレオチドにその調節効果を与える。これは、調節要素が、細胞中で通常関連するポリヌクレオチド配列に効果を及ぼすのと同様である。
【００２３】
用語「プロモータ配列」は、本明細書に使用する場合、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位と、転写調節タンパク質の少なくとも結合部位とを有するＤＮＡ領域を指す。当業者は、本発明に有用なプロモータ配列を、自身の一般的知識を用いて容易に識別できる。例えば、本発明に有用なプロモータ配列は、オストレオコッカス  タウリ  ヒストンＨ４プロモータ配列（配列番号１）、オストレオコッカス  タウリ  ｃｐｘプロモータ配列（配列番号５）、オストレオコッカス  タウリ  ｃｒｄ１プロモータ配列（配列番号４）、およびオストレオコッカス  タウリ高親和性リン酸トランスポーター（ＨＡＰＴ）プロモータ（
配列番号３）からなるグループから選択することが可能である。特に、本発明のプロモータ配列は、配列番号３を有し得る。
【００２４】
第２のポリヌクレオチドが少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含む、上記方法を行うことが可能である。用語「外因性ヌクレオチド配列」は、本明細書に使用する場合、オストレオコッカス種ゲノムでは天然に見出されないヌクレオチド配列を指す。さらに、用語「外因性ヌクレオチド配列」は、本明細書に使用する場合、天然ヌクレオチド配列、合成ヌクレオチド配列、ゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、およびＲＮＡ配列を含み、好ましくはＤＮＡ配列を含む。例えば、かかる方法では、少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列はマーカー遺伝子であってよい。用語「マーカー遺伝子」は、本明細書に使用する場合、検出可能な発現型を与えるポリヌクレオチドを指す。当業者は自身の一般的知識に関してマーカー遺伝子を容易に識別可能である。特に、マーカー遺伝子は、Ｇ４１８（例えば配列番号６により識別されるＫａｎＭｘ）またはノーセオスリシンアセチルトランスフェラーゼ（例えば配列番号９により識別されるＮａｔｌ）などの抗生物質への耐性を引き起こす遺伝子、および、ホタルルシフェラーゼや自身の基質であるルシフェリンおよびコエンテラジンの加水分解でルミネセンスを生じるｒｅｌｌｉｌａ遺伝子等のレポータ遺伝子から選択され得る。特に、本発明による少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列は、治療に関連する配列であり得る。当業者は自身の一般的知識により、治療に関連する配列を容易に識別可能である。例えば、治療に関連する配列は野生型遺伝子であってよく、それは特定の病気の非機能的遺伝子、遺伝子のネガティブ変異型、遺伝子の機能的阻害剤をコードする配列であってよい。特に治療に関連する配列は、ダニアレルゲンなどのアレルゲンのような糖タンパク質をコードする遺伝子であってよい。
【００２５】
第２のポリヌクレオチドが第１のポリペプチドと少なくとも１つの第２のポリペプチドとをコードする、上記方法を行うことが可能である。コードされたポリペプチドは、いずれもまたはすべて、同じであってもよいし、異なっていてもよい。そのようなものとして、方法は、例えば二量体、三量体および四量体を含む機能性タンパク質複合体を生産する手段を提供し、複合体のサブユニットは同じであってもよいし異なっていてもよい。特に、第１のポリペプチドと少なくとも第２のポリペプチドは融合タンパク質であってよい。
用語「融合タンパク質」は、本明細書に使用する場合、単一の「融合された」ポリペプチドを発現すべく単一のオープンリーディングフレームの発現により生産されたペプチド結合により第１のポリペプチドドメインが第２のポリペプチドドメインに連結されて作用する、組換ＤＮＡ方法により生産されたポリペプチドを指す。特に、融合タンパク質は、Ｈｉｓ−６タグ、「ＦＬＡＧエピトープ」、ビオチン、またはその同等物等の、細胞での融合タンパク質の識別または発現を促進し得るペプチドタグを含んでも良い。例えば、精製タンパク質を得ることが望ましい場合、そのようなタグは、融合タンパク質の単離を促進できるという利点を提供し得る。
【００２６】
特に、第１のポリペプチドは免疫グロブリンＨ鎖（Ｈ）またはその可変領域（ＶＨ）を含んでもよく、第２のポリペプチドは免疫グロブリン軽鎖（Ｌ）またはその可変領域（ＶＬ）を含んでもよい。免疫グロブリン重鎖は免疫グロブリン軽鎖と結合してオストレオコッカス種において一価抗体を形成し、２つの一価抗体がさらに結合して二価抗体を生産し得る。そのため、本方法は、抗体などの機能性タンパク質複合体を生産するための手段を提供する。
【００２７】
第２のポリヌクレオチドが０．５〜１０ｋｂ、好ましくは０．５〜５ｋｂ、より好ましくは０．５〜３ｋｂからなる、上記方法を行うことが可能である。
【００２８】
詳細には、第２のポリヌクレオチドは「標的シグナル」を含んでもよい。用語「標的シ
グナル」は、本明細書に使用する場合、ポリペプチドを細胞の特定の位置、例えば細胞質ゾル、核、原形質膜、小胞体、細胞外培地（つまり分泌）へ標的として向けるヌクレオチド配列を指す。詳細には、第２のポリヌクレオチドは、オストレオコッカス種での少なくとも１つのポリペプチドの分泌を許容する分泌シグナルを含む。当業者は分泌シグナルを容易に識別可能である。例えば、分泌シグナルは、オストレオコッカス  タウリの予測アクアリシン／ズブチリシン分泌プロテアーゼ配列ペプチド（配列番号１７に対応するＭＲＲＦＬＴＴＷＬＴＡＣＶＳＲＡＮＡＦ）からなるグループから選択される。本方法によりポリペプチドまたはタンパク質複合体を発現するためのオストレオコッカス種の使用は、オストレオコッカス種が細胞壁を備えず、したがって分泌タンパク質の生産を可能にすると共にタンパク質の精製を促進するという利点を提供する。
【００２９】
上記方法は、
（ｉｉ）前記オストレオコッカス種中で発現された前記少なくとも１つのポリペプチドを採収する工程、
をさらに含んでもよい。
【００３０】
用語「採収」は、本明細書に使用する場合、オストレオコッカス種からポリペプチドが分離されることを意味する。特に、少なくとも１つのポリペプチドを実質的に精製可能であるということは、それがタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、または天然で関連している他の物質が比較的存在しないこと意味する。一般に、実質的に精製されたポリペプチドは、試料の少なくとも約５０パーセント、特に約約８０パーセントを構成する。
【００３１】
オストレオコッカス種は、バイオリアクターにて成長させることが可能である。当業者は自身の一般的知識に関してバイオリアクターを、例えばＬａｂｆｏｒｓｌｕｘ（Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ社）のようにして、容易に識別可能である。
【００３２】
特に、オストレオコッカス種を、オストレオコッカス種の成長を刺激する少なくとも１つの化合物を含む培地において成長させることが可能である。オストレオコッカス種の成長を刺激する化合物は、当業者には自身の一般的知識に関して容易に識別することができる。例えば、オストレオコッカス種の成長を刺激する少なくとも１つの化合物は、硝酸塩、アンモニア塩基、リン酸塩および二酸化炭素からなるグループから選択することができる。上記方法によりポリペプチドまたはタンパク質複合体を発現するためのオストレオコッカス種の使用は、大集団のオストレオコッカス種を成長させることができ、そのため大量の所望の産物の生産と、望ましい場合には分離とを可能にするという利点を提供する。
【００３３】
オストレオコッカス種は、少なくとも１つのβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを含む培地で成長させることが可能である。上記方法によりポリペプチドまたはタンパク質を発現するためのオストレオコッカス種の使用は、核ゲノムからポリペプチドまたはタンパク質複合体を発現させることができ、従ってクラミドモナス  ラインハーティの色素体発現計とは異なり所望の産物のグリコシル化を可能にするという利点を提供する。
【００３４】
さらに、いくつかのインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）および免疫化学データは、オストレオコッカス種におけるタンパク質のグリコシル化が、特にβ−１，２−キシロースおよびα−１，３−フコース等の免疫原性およびアレルゲン性の残基がないという点で、高等植物におけるそれと異なることを示唆している。したがって、本発明の方法によりポリペプチドまたはタンパク質複合体を発現するためのオストレオコッカス種の使用は、グリコシル化がβ−１，２−キシロースやα−１，３−フコース等の免疫原性およびアレルゲン性の残基を提供せず、したがってアレルゲン性の残基なしで所望の産物をグリコシル化できるという利点を提供する。
【００３５】
本願発明者らはさらに、オストレオコッカス種において少なくとも１つのポリペプチドを発現させるための発現カセットを提供する。カセットは、
（ａ）少なくとも１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入するためのクローニング部位に連結されて作用し、かつ該クローニング部位よりも上流に配置されたプロモータ配列
を備え、プロモータ配列はオストレオコッカス種での該少なくとも１つのポリペプチドの発現を許容する。
【００３６】
用語「上流」とは、本明細書に使用する場合、ＤＮＡ転写の方向とは反対方向を指し、そのため非コード鎖を５’から３’へ、またはＲＮＡ転写物上を３’から５’へ進む。
【００３７】
用語「クローニング部位」は、本明細書に使用する場合、第２のポリヌクレオチドへの第１のポリヌクレオチドの結合を促進するすべてのヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列を指すよう広く使用される。例えば、クローニング部位は、マルチクローニング部位のような少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位およびｌｏｘＰ部位のような少なくとも１つのレコンビナーゼ認識部位からなるグループから選択することが可能である。
【００３８】
当業者は自身の一般的知識で、プロモータ配列を、容易に識別可能である。例えば、プロモータ配列は、オストレオコッカス  タウリ  ヒストンＨ４プロモータ配列（配列番号１）、オストレオコッカス  タウリ  ｃｐｘプロモータ配列（配列番号５）、オストレオコッカス  タウリ  ｃｒｄ１プロモータ配列（配列番号４）、およびオストレオコッカス
タウリ高親和性リン酸トランスポーター（ＨＡＰＴ）プロモータ（配列番号３）からなるグループから選択することが可能である。特に、プロモータ配列は配列番号３を有し得る。
【００３９】
本願発明者らはさらに、本発明の少なくとも１つの発現カセットを備えたベクターを提供する。ベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターを含む、原核細胞または真核細胞へポリヌクレオチドを導入するのに有用なベクターであればいかなるベクターであってもよい。１実施形態では、ベクターは原核生物の複製起点をさらに含んでもよい。特に、複製起点はＥ．Ｃｏｌｉの複製起点であってよい。そのため、ベクターは、オストレオコッカス種と同様に原核生物の宿主細胞中でも継代培養し、操作することができる。ベクターは、少なくとも１つのクローニング部位、１つの調節要素、少なくとも１つのマーカー遺伝子、および少なくとも１つの標的シグナルのうちの少なくとも一つをさらに含んでもよい。
【００４０】
用語「調節要素」は、本明細書に使用する場合、該調節要素に連結されて作用するポリヌクレオチドの転写または翻訳を調節するヌクレオチド配列を指す。
【００４１】
本願発明者らはまた、上記方法によって得ることが可能な細胞を提供する。特には、細胞はオストレオコッカス種であってよい。細胞は、
イギリス国の藻類および原虫類カルチャーコレクション（スコットランド、ＰＡ３７  ＩＱＡ、アーガイル（Ａｒｇｙｌｌ）、オーバン（Ｏｂａｎ）、ＳＡＭＳ研究サービス社（ＳＡＭＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．））（ＣＣＡＰ）にて、国際寄託機関ＣＣＡＰから与えられた受託番号が１５７／１で入手可能なオストレオコッカス  タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ）、
オストレオコッカス  オセアニカ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｃｅａｎｉｃａ）、および
フランス国ロスコフ（Ｒｏｓｃｏｆｆ）所在の海洋プランクトンのロスコフカルチャーコレクション（ＲＣＣ）にて、参照番号ＲＣＣ１４１、ＲＣＣ１４３、ＲＣＣ３４３、Ｒ
ＣＣ３４４、ＲＣＣ３５６、ＲＣＣ３７１、ＲＣＣ３７１、ＲＣＣ３９３、ＲＣＣ４１０、ＲＣＣ４２０およびＲＣＣ５０１で入手可能なオストレオコッカス種
からなるグループから選択されたオストレオコッカス種の細胞であり、
好ましくはオストレオコッカス  タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ）である。
特には、本発明の細胞は、ＲＣＣに参照番号ＲＣＣ６１４で登録され、またはイギリス国の藻類および原虫類カルチャーコレクション（スコットランド、ＰＡ３７  ＩＱＡ、アーガイル（Ａｒｇｙｌｌ）、オーバン（Ｏｂａｎ）、ＳＡＭＳ研究サービス社（ＳＡＭＳ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．））（ＣＣＡＰ）にて国際寄託機関ＣＣＡＰから与えられた受託番号１５７／１で入手可能なオストレオコッカス  タウリであってよい。
【００４２】
本願発明者らはまた、上記方法によって得ることが可能なポリペプチドであって、Ｎ−グリコシル化炭水化物鎖を有するポリペプチドを提供する。１実施形態では、ポリペプチドは一本鎖抗体である。そのようなものとして、方法は、Ｎ−グリコシル化抗体された抗体などの機能性タンパク質複合体を生産するための手段を提供する。
【００４３】
本願発明者らはまた、少なくとも１つのポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００４４】
本願発明者らはさらに、治療組成物の調製のための少なくとも１つのポリペプチドの使用方法を提供する。特に、治療組成物は、癌、感染症、心血管疾患、アルツハイマー病またはパーキンソン病などの神経変性疾患、および単一遺伝子遺伝病などの遺伝子疾患からなるグループから選択された疾患の治療用の治療組成物であり得る。
【００４５】
本開示の選択的な代表的態様をここで以下の非限定的な実施例により例証する。
【実施例】
【００４６】
実施例１：オストレオコッカス  タウリにおけるルシフェラーゼ融合タンパク質の発現
本実施例は、オストレオコッカス  タウリでのルシフェラーゼ融合タンパク質の発現を実証する。
方法
オストレオコッカス  タウリ  コンピテント細胞の調製
【００４７】
コンピテント細胞を調製するために、オストレオコッカス  タウリの野生型菌株０ＴＴＨ０５９５を使用した。かかる細胞は、フランス国ロスコフ（Ｒｏｓｃｏｆｆ）所在の海洋プランクトンのロスコフカルチャーコレクション（ＲＣＣＭＰ）にて参照番号ＲＣＣ６１４で、およびイギリス国の藻類および原虫類カルチャーコレクション（スコットランド、ＰＡ３７  ＩＱＡ、アーガイル（Ａｒｇｙｌｌ）、オーバン（Ｏｂａｎ）、ＳＡＭＳ研究サービス社（ＳＡＭＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．））（ＣＣＡＰ）にて国際寄託機関ＣＣＡＰから与えられた受託番号１５７／１で入手可能である。オストレオコッカス  タウリ  コンピテント細胞の調製全体は、滅菌状態で行なった。オストレオコッカス  タウリ（野生型菌株０ＴＴＨ０５９５）の細胞を、３０００万個／ｍｌの細胞密度に達するまで、２０℃にて青色光（３０ｍｍｏｌ量子／ｃｍ2秒）で成長させ
た。海水にＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（参照番号：Ｋ１６３０）のＫｅｌｌｅｒ培地を加えた培養培地を、０．２２μｍでろ過し、オートクレーブした。最終０．１％ｗ／ｖになるようプルロン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、参照番号：Ｐ７０６１）を添加後に、細胞を８０００×ｇ、８分、４℃で遠心分離し、５０ｍｌ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社）の円錐形チューブ中に採収した。その後、プロトコルは氷上で実行した。１ｍｌの１Ｍソルビトールで２回洗浄して（１００００ｇ、５分、４℃）塩を除去し、細胞を２〜３×１０10個／ｍｌの最終細胞濃度になるよう５０μｌの１Ｍスクロース中に再懸濁した。
プラスミドの構築
【００４８】
以下の３種類の融合物を調製した：
オストレオコッカス  タウリ  ヒストンＨ４プロモータへの抗生物質耐性遺伝子の融合（Ｇ４１８耐性遺伝子：ＰｏｔＬｕｃベクターおよびｃｌｏｎａｔ耐性遺伝子：ｐＨ４Ｎａｔ１ベクター）；
ホタルルシフェラーゼ遺伝子へのＨＡＰＴプロモータの融合（ＰｏｔＬｕｃ−ＨＡＰＴベクター）；
ホタルルシフェラーゼ遺伝子へのオストレオコッカス  タウリのＰＰＲ１（Ｐｓｅｕｄｏ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  １、偽応答レギュレーター）遺伝子の融合（ＰｏｔＬｕｃ−ＰＰＲ１ベクター）。
【００４９】
ＤＮＡ操作はすべて、ほぼＳａｍｂｒｏｏｋら（Molecular cloning. A laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）によって記載されたように実行した。オストレオコッカス  タウリ  ヒストンＨ４プロモータは２つのプライマーｏｔ−Ｈ４
Ｆｏｒおよびｏｔ−Ｈ４  Ｒｅｖの使用によりＰＣＲにより増幅されたオストレオコッカス  タウリのＤＮＡ断片に相当するｏｔ−Ｈ４  Ｆｏｒの配列は５’−ＧＣＧ  ＧＡＴ
ＣＣＣ  ＡＣＧ  ＧＡＧ  ＣＧＣ  ＡＡＣ  ＧＧＴ  ＡＣＣ−３’（配列番号１３）であり、ｏｔ−Ｈ４  Ｒｅｖの配列は５’−ＣＣ  ＡＧＣ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ−３’（配列番号１４）である。
【００５０】
ノーセオスリシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｌｏｎａｔ）耐性遺伝子（Ｎａｔｌ）をコードするＰＡＧ２５ベクターのＴＥＦプロモータ（配列番号１１）を、ＢａｍＨ１部位とＮｃｏｌ部位を使用してオストレオコッカス  タウリのヒストンＨ４プロモータと置換した。
【００５１】
オストレオコッカス  タウリ  ヒストンＨ４プロモータを、（ＴＥＦプロモータと置換するために）ＰＵＧ６５からのＢａｍＨＩ部位とＮｃｏｌ部位の間でＫａｎＭｘモジュールのＧ４１８抗生物質耐性遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｓ７８１７５）に融合した。得られたプラスミドをＰｏｔＨ４ＫａｎＭｘと命名した。Ｐｒｏｍｅｇａ社のｐＳＰ−ｌｕｃ＋ＮＦ由来のルシフェラーゼ＋遺伝子を、Ｘｂａｌ部位とＮｈｅｌ部位を使用して、ＰｏｔＨ４ＫａｎＭｘに挿入した。得られたプラスミドは、Ｐｏｔｌｕｃと命名したが、ルシフェラーゼ＋遺伝子に遺伝子を融合させることが可能である。ＰｏｔｌｕｃプラスミドはＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）の複製起点と、ｐＵＣ１９に既に存在するアンピシリン耐性遺伝子とを有する。Ｐｏｔｌｕｃプラスミドは、ホタルルシフェラーゼ（配列番号１０）をコードする遺伝子、オストレオコッカス  タウリ  ヒストンＨ４（配列番号１）の強力なプロモータの制御下でオストレオコッカス  タウリにおける選択マーカーとして使用されるＧ４１８耐性遺伝子（配列番号６）、およびそれに続くＴＥＦターミネータ（配列番号７）とをさらに有している（図１）。
【００５２】
プロモータ領域の２００個のヌクレオチドを含むオストレオコッカス  タウリ遺伝子ＰＲＲ  １の全体（配列番号２）を、特異的プライマーＴＯＣ１ｆｕｌｌｆｕＲＮｃｏ１およびＴＯＣ１ｆｕｌｌＦＮｈｅ１を使用して増幅し、ＰｏｔＬｕｃのＮｈｅｌ部位とＮｃｏｌ部位の間でクローニングし、プラスミドＰｏｔＬｕｃＰＲＲ１を生成した（図２Ａ）。ＴＯＣ１ｆｕｌｌｆｕＲＮｃｏ１の配列はＴＴＴＣＣＡＴＧＧＡＣＴＴＧＧＡＧＣＣＧＴＣＧＣＧＡＧＡ（配列番号１５）であり、ＴＯＣ１ｆｕｌｌＦＮｈｅ１の配列はＴＴＴＧＣＴＡＧＣＡＣＣＴＣＧＡＧＣＣＧＧＧＡＣＣＡＡＡＡＡ（配列番号１６）である。
【００５３】
ＡＴＧの上流で１００ｂｐから成るＨＡＰＴプロモータ（配列番号３）を、ＢｇＩＩＩ部位とＮｃｏｌ部位の間でＰｏｔｌｕｃにてクローニングし、プラスミドＰｏｔＬｕｃ−
ＨＡＰＴを生成した（図２Ｂ）。
オストレオコッカス  タウリ形質転換のためのＤＮＡの調製
【００５４】
４つのＤＮＡ構築物を、異なる対象遺伝子の発現を駆動するプロモータの上流を切断する正確な制限酵素を使用して線形化した：
Ｃｌｏｎａｔ耐性遺伝子に融合されたオストレオコッカス  タウリ  ヒストンＨ４プロモータ；
Ｇ４１８耐性遺伝子に融合されたオストレオコッカス  タウリ  ヒストンＨ４プロモータ；
Ｇ４１８耐性遺伝子に融合されたオストレオコッカス  タウリ  ヒストンＨ４プロモータと、それに続くルシフェラーゼ遺伝子に融合されたオストレオコッカス  タウリ  ＰＲＲ１遺伝子またはＨＡＰＴプロモータ。
線形化プラスミドを、ｔＲＮＡ添加（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｒ５６３６）後にエタノール沈降させ、水に再懸濁して、１μｇ／μｌの最終ＤＮＡ濃度を得た。
【００５５】
図６に示されるように、エレクトロポレーションによりオストレオコッカス  タウリの形質転換を最適化した。ルシフェラーゼ（約６ｋｂ）に融合されたＨＡＰＴプロモータ（強いプロモータ）を含むＰｏｔＬｕｃ−ＨＡＰＴプラスミド（Ｘｍｎｌによる）から生じた線形化ＤＮＡ構築物を、ルシフェラーゼ活性をモニタすることによりエレクトロポレーション条件を最適化するために使用した。以下に示した実験条件は、最も高い形質転換効率と、最も高い生存率を備えた条件である（ソルビトールバッファ、電界強度６００Ｖ／ｃｍ、抵抗器４００Ω）。ある形質転換の場合、上記のように調製された５０ｍｌのコンピテントセル（２×１０10個の細胞）を、氷上で少なくとも１０分間５μｌ  ＤＮＡとインキュベートし、１ｍｍのエレクトロポレーションキュベットに移し、約２分室温に暖める（Ｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）。エレクトロポレーションは、以下の電気的パラメータを用いてＧｅｎｅパルサー装置（Ｂｉｏｒａｄ社）にて行った：電界強度６００Ｖ／ｃｍ、抵抗器４００Ω、コンデンサ２５μＦ）。時定数は８〜９ミリ秒であった。エレクトロポレートされた細胞を、上記の段落００５５に記載したような４０ｍｌの培地で２日間再懸濁した（発現フェーズ）。４８時間後に、形質転換体を、固体培地（０．２％アガロースと適切な選択抗生物質を含むＫｅｌｌｅｒ培地（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、参照番号Ｋ１６３０））中で選択した。固体培地は以下のように調製した：オートクレーブした低融点アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を２．１％ｗ／ｖで９０度にて維持し、体積９の培養培地に対し体積１１の割合で混合した。５００μｌ〜１ｍｌの形質転換体を１０ｍｌのこの培地と混合し、混合物をペトリ皿上に注いだ。ペトリ皿は湿式チャンバ内で先に述べたのと同じ照明条件下に配置した。
エレクトロポレーションによるオストレオコッカス細胞の形質転換の最適化
【００５６】
ルシフェラーゼ＋（約６ｋｂ）に融合された高親和性リン酸トランスポーター（ＨＡＰＴ）プロモータを含む線形化ＤＮＡ構築物（Ｘｍｎｌによる）を種々の条件でエレクトロポレートした。ＨＡＰＴの強力な同族プロモータ下でのルシフェラーゼ遺伝子の一過性発現を、エレクトロポレートした細胞にて１日後にチェックした。１０6個の生存細胞当た
りのルミネセンスシグナルを、種々の実験を通じて、最大シグナルのパーセンテージとして正規化する（黒色）。死亡率を、１日後にフローサイトメトリーにより評価した低い赤色蛍光を有する細胞のパーセンテージにより定義した（白色）。結果を図６Ａ〜Ｄに示す。
【００５７】
図６Ａは浸透圧の影響を示す。細胞を１Ｍスクロースまたは１Ｍソルビトールのいずれかに再懸濁し、８００Ｖ／ｃｍ、２００Ωおよび４００Ω（２５μＦ）でエレクトロポレートし、時定数を増加させた。生存率はいずれの浸透圧でも等しかったが、形質転換効率
はその時定数が特に高いためにソルビトールの方が高く、したがって、これをさらなる最適化のために使用した。
【００５８】
図６Ｂはパルス時間の影響を示す。細胞を８００Ｖ／ｃｍでエレクトロポレートし、抵抗をパルス時間（時定数）を増加させるよう調節した。形質転換効率は、５ミリ秒より大きい一定時の間に非常に改善されたが、生存率はこの実験では約８０％であった。
【００５９】
図６Ｃは電界強度の影響を示す。エレクトロポレーションは５００Ｖではほとんど非効率であったが、６００Ｖで最大となり、８００Ｖまでは効率的ではあるが効率が約５０％だけ減少した。上記の電圧は細胞の生存率に非常に影響を及ぼしたため、おそらく効率が減少したと考えられる。
【００６０】
図６Ｄは、ＤＮＡ量（１ｍｇ／ｍｌ濃度）の影響を示す。ＤＮＡの最適量は５μｇであった。
結果：
抗生物質耐性の安定なオストレオコッカス  タウリ形質転換体
【００６１】
オストレオコッカス  タウリ細胞を、オストレオコッカス  タウリ  ヒストンＨ４プロモータの制御下、Ｇ４１８耐性を有する線形化ＰｏｔＬｕｃプラスミド（Ｘｍｎｌによる）により形質転換した。４つの独立した形質転換を行なった。陽性クローンを１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８に基づいて選択した。ＤＮＡ１μｇ当たり５０〜１０００個の形質転換体が得られた。ＤＮＡがない同じ条件下でエレクトロポレートした陰性対照では形質転換体が得られなかった。
【００６２】
オストレオコッカス  タウリ細胞を、オストレオコッカス  タウリ  ヒストンＨ４プロモータの制御下、Ｃｌｏｎａｔ耐性を有する線形化ｐＨ４Ｎａｔ１プラスミド（Ｘｍｎｌによる）により形質転換した。２つの独立した形質転換を行なった。陽性クローンを７００ｍｇ／ｍｌのＣｌｏｎａｔに基づいて選択した。ＤＮＡ１μｇ当たり５００個以下の形質転換体が得られた。
【００６３】
この実施例は、オストレオコッカス  タウリにおいてコドン使用に偏りなく、外因性選択遺伝子を使用することが可能であることを示している。
【００６４】
オストレオコッカス  タウリにおけるルシフェラーゼ組換えタンパク質の発現
オストレオコッカス  タウリ細胞を、オストレオコッカス  タウリのＰＲＲ１全遺伝子に融合させたＧ４１８耐性およびルシフェラーゼ＋遺伝子を有する線形化ＰｏｔＬｕｃ  ＰＲＲ１プラスミド（Ｎｈｅｌによる）により形質転換した（図２Ａ）。ＤＮＡ１μｇ当たり１０００個の形質転換体が、野生型オストレオコッカス  タウリの致死量である１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８選択に基づいて得られた。ルミネセンスをマイクロプラークに入れた培養物に対して直接またはタンパク質抽出物に対してルシフェリンの存在下で照度計Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＬＢ  ３６０を使用して測定した（図３）。
【００６５】
結果は、試験したクローンの９０％よりも多くが、ＤＮＡなしで形質転換した形質転換陰性対照よりも高いルシフェラーゼレベルを有していたことを示す（２から１００，０００倍超）。種々の形質転換体のルシフェラーゼ活性を、細胞３×１０7個／ｍｌで２００
μＭのルシフェリンの存在下で昼／夜を交互にインキュベートして２００μｌの培養細胞に対して試験した（図４Ａ）。ルシフェラーゼの周期的発現の同様なプロフィールがこれらの種々のクローンで観察された。これらのプロフィールは、定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定したＰＲＲ１  ｍＲＮＡの発現を反映している（図４Ｂ）が、これはＰＲＲ１遺伝子が完全に挿入されていることを示唆している。１０個の形質転換対のＤＮＡを抽出し（Ｑｉａ
ｇｅｎ社のＫｉｔ  Ｄｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）、制限酵素Ｎｃｏｌにより消化し、サザンブロットに使用した。ＰＲＲ１の３’コード領域の６００ｂｐに対応するプローブを使用して、オストレオコッカス  タウリのゲノム構築物中の挿入物を検出した（図５）。
【００６６】
結果は、野生型菌株０ＴＴＨ０５９５（Ｃ）での内因性遺伝子ＰＲＲ１の存在が４ｋｂのハイブリダイゼーションシグナルにより検出されたことを示している。このバンドはすべての形質転換体で見出された。それより過剰のバンドは複数の挿入物に相当する（１〜３）。平均で、形質転換体による２つの組み込み事象が観察された。
【００６７】
種々の形質転換体が種々のレベルの発現でルシフェラーゼを蓄積していた。形質転換体の分析は、ゲノムへの複数の組み込み事象を示し、Ｇ４１８耐性の細胞の９０％超がＰＲＲ１遺伝子の発現を反映するルシフェラーゼの発現を示したため、導入された断片が切断されなかったことを示唆した。
【００６８】
この実施例は、オストレオコッカス  タウリでのルシフェラーゼ＋組換えタンパク質の発現が効率的であることを示している。
実施例２：Ｐｏｔｏｘベクターの構築
【００６９】
ＰＡＧ２５ベクターのＮａｔｌコード配列の上流のＴＥＦプロモータを、ＢａｍＨ１とＮｃｏｌクローニング部位間でオストレオコッカス由来のヒストンＨ４プロモータと置換した。合成マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）と、それに続く６×ヒスチジンタグをコードする配列と相補的配列（配列番号１７および配列番号１８）とを、続けてオストレオコッカス  タウリ  ＨＡＰＴプロモータと共に導入し、Ｐｏｔｏｘベクターを生成した。このベクターは強力なＨＡＰＴプロモータの制御下で対象のコード配列をクローニングおよび発現することを可能にする。形質転換体は７５０μｇ／ｍｌのＣＬＯＮＡＴ耐性に基づいて選択可能である。対象タンパク質は６×ヒスチジンＴＡＧを使用して精製可能である。必要な場合、Ｘｈｏ  Ｉ制限ヌクレアーゼを使用して、このＴＡＧを削除することが可能である。
【００７０】
上記に列挙したものを含む本願で参照したすべての文書は、その全体が本願に援用される。上述の実施形態に対する様々な改変は、本明細書で提供した開示から当業者には明らかである。したがって、本開示中の技術は、本開示の趣旨または実質的属性から逸脱しない他の特定の形式で具現化され得る。
【図３】
2010517558.tif 000002
【図５】
2010517558.tif 000003
【図６Ａ】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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