(57)【要約】  本出願は、アミド結合によって疎水性部分に共有結合されたアミン部分を含むコンジュゲートを開示し、このコンジュゲートは、ＣＯＸ−２酵素の選択的阻害剤であり、種々の炎症性の疾患または障害、および癌の処置において有利に使用されることができる。このような炎症性の疾患または障害は、リウマチ様関節炎、大腸炎およびクローン病のような炎症性腸疾患、喘息、自己免疫疾患、慢性の炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、骨盤内炎症性疾患、再潅流傷害、移植拒絶反応、脈管炎、糖尿病、心臓血管疾患、病気によって誘発された炎症からなる群から選択される。癌は、結腸癌、食道癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、および前立腺癌からなる群から選択される。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミド結合によって疎水性部分（Ｍ２基）に共有結合されたアミン部分（Ｍ１基）を含むコンジュゲート。
【請求項２】
前記アミン部分は、プロリン部分、プロリンに由来する部分、それらの誘導体またはそれらのアナログである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記プロリン部分は、ヒドロキシプロリンを含む、請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記アミン部分はＲまたはＲ’残基を含み；前記Ｒは、水素、３０個までの炭素原子から構成されるアルキル、および３０個までの炭素原子から構成されるアシルからなる群から選択され；前記Ｒ’は、水素、および３０個までの炭素原子から構成されるアルキルからなる群から選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記疎水性部分は、飽和または不飽和の疎水性部分を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記疎水性部分（Ｍ２基）は、α−リポ酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記アミド結合を形成するアミンは、第１級アミンおよび第２級アミンからなる群から選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
一般式：
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を有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
ＣＯＸ−２の選択的阻害剤である、請求項１〜８のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
本明細書中に記載されるいずれかのコンジュゲート。
【請求項１１】
疼痛および／または炎症性の疾患または障害の処置における、請求項１〜１０のいずれかに記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１２】
疼痛および／または炎症性の疾患または障害を処置するための医薬の製造における、請求項１〜１０のいずれかに記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１３】
前記炎症性の疾患または障害は、リウマチ様関節炎、大腸炎およびクローン病のような炎症性腸疾患、喘息、自己免疫疾患、慢性の炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、骨盤内炎症性疾患、再潅流傷害、移植拒絶反応、脈管炎、糖尿病、心臓血管疾患、病気によって誘発された炎症からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１４】
疼痛および／または炎症性の疾患または障害を処置する方法であって、その処置を必要とする対象に、本明細書中に記載のコンジュゲートまたは化合物のいずれかの治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１５】
前記炎症性の疾患または障害は、リウマチ様関節炎、大腸炎およびクローン病のような炎症性腸疾患、喘息、自己免疫疾患、慢性の炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、骨盤内炎症性疾患、再潅流傷害、移植拒絶反応、脈管炎、糖尿病、心臓血管疾患、病気によって誘発された炎症からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれかに記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物、化粧品組成物、または薬用化粧品組成物。
【請求項１７】
癌の処置および／または予防における、請求項１〜１０のいずれかに記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１８】
癌を処置および／または予防するための医薬の製造における、請求項１〜１０のいずれかに記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１９】
前記癌は、結腸癌、食道癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、および前立腺癌からなる群から選択される、請求項１７または１８に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項２０】
癌を処置および／または予防する方法であって、その処置および／または予防を必要とする対象に、本明細書中に記載のコンジュゲートまたは化合物のいずれかの治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２１】
前記癌は、結腸癌、食道癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、および前立腺癌からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、「ＰＯＬＹＵＮＳＡＴＵＲＡＴＥＤ  ＦＡＴＴＹ  ＡＣＩＤ−ＨＹＤＲＯＸＹＰＲＯＬＩＮＥ  ＡＭＩＤＥＳ  ＡＳ  ＮＯＮＳＴＥＲＯＩＤＡＬ  ＡＮＴＩ−ＩＮＦＬＡＭＭＡＴＯＲＹ  ＤＲＵＧＳ」という名称の米国仮特許出願第６０／８７５８３２号（２００６年１２月２０日出願）からの優先権を主張する。上述の出願は、参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般的には医薬物質および医薬組成物に関し、より具体的には、特にシクロオキシゲナーゼ酵素の阻害、ならびに炎症、リウマチ様関節炎、大腸炎およびクローン病のような炎症性腸疾患、喘息、自己免疫疾患、慢性の炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、骨盤内炎症性疾患、再潅流傷害、移植拒絶反応、脈管炎、糖尿病、心臓血管疾患、病気によって誘発された炎症、および癌の処置に有用な医薬物質および医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
炎症は、病原体、損傷された細胞、または刺激物のような有害な刺激に対する脈管組織の複雑な生物学的応答である。炎症は、有害な刺激を除去するためのおよび組織の治癒プロセスを開始するための生物による防御の試みである。炎症は感染の同義語ではない。炎症が感染によって引き起こされる場合でも、これらの用語を同義語として使用することは正しくない：感染は外因性の病原体によって引き起こされ、一方、炎症は病原体に対する生物の応答である。
【０００４】
炎症が無い場合、創傷および感染は決して治癒することがなく、組織の漸進的な破壊は生物の生存を危うくするだろう。しかしながら、抑制されずに進行する炎症もまた、高熱、アテローム性動脈硬化症、およびリウマチ様関節炎のような多くの疾患をもたらしうる。炎症が通常は身体によってしっかりと調節されているのは、この理由のためである。
【０００５】
炎症は、急性または慢性のいずれかとして分類されることができる。急性の炎症は、有害な刺激に対する身体の初期応答であり、血液から損傷組織への血漿および白血球の増大された移動によって達成される。生化学的事象のカスケードは、局所脈管系、免疫系、および損傷組織内の種々の細胞が関与する炎症性応答を伝達および発達させる。慢性の炎症として知られる長期の炎症は、炎症部位に存在する細胞のタイプの漸進的な移行をもたらし、炎症プロセスからの組織の同時に起こる破壊および治癒によって特徴付けられる。
【０００６】
炎症性疾患は、炎症に関連する異常であり、種々のヒトがかかる病気の根底にある疾患の大きな関連しない群を含む。免疫系は、しばしば炎症性疾患と関連し、アレルギー反応と一部の筋疾患の両方において異常な炎症をもたらす多くの免疫系疾患で示される。炎症プロセスにおける病因的起源を持つ非免疫疾患は、癌、アテローム性動脈硬化症、および虚血性心疾患を含むと考えられる。
【０００７】
多くの種類のタンパク質が炎症に関連し、それらのうちのいずれか１種はそのタンパク質の正常な機能および発現を損なうか、さもなければ調節を不可能にする遺伝的変異を受けやすい。
【０００８】
炎症に関連する疾患の例は、リウマチ様関節炎、大腸炎およびクローン病のような炎症性腸疾患、喘息、自己免疫疾患、慢性の炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、骨盤内炎症性疾患、再潅流傷害、移植拒絶反応、脈管炎、糖尿病、心臓血管疾患、および病気によって誘発された炎症を含む。
【０００９】
アスピリンのような非ステロイド系抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）は、アラキドン酸代謝の第１の工程を触媒するシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）を阻害することによって、それらの抗炎症効果を示す。１９８０年代の後期に、アイソザイムＣＯＸ−１が恒常的に形成され、プロスタグランジンの生理学的生成を担い、一方、ＣＯＸ−２が誘導性であり、炎症時のプロスタグランジンの亢進された生成を担うことが理解された。ＣＯＸの別のアイソザイムであるＣＯＸ−３もまた、最近報告された。疼痛および炎症を処置するためのＮＳＡＩＤの慢性的な使用は、しばしば、胃潰瘍の形成、出血、および腎機能の抑制のような副作用を伴う。これは、改良された胃腸の許容性を有する新しい種類の抗炎症剤および鎮痛薬としてのＣＯＸ−２酵素の選択的阻害剤の開発に対する基本的な理論的根拠であった。しかしながら、それらの使用を支持する理論的根拠が正しそうであっても、この新しい種類の薬物の可能性は理解されていない。
【００１０】
ＣＯＸ−２は、１９９０年代の初期に発見され、それ以降、ＣＯＸ−２阻害剤の研究において製薬産業による多大な努力が費やされている。ＣＯＸ−２の過剰発現が悪性腫瘍サンプルにおいて見出されていたので、２０００年に、ＣＯＸ−２阻害剤は結腸および直腸の癌の処置のための臨床試験において使用された。
【００１１】
しかしながら、この時点で心臓麻痺および心臓発作の危険性が明らかにされた。これはおそらく、ＣＯＸ−２が、糸球体および皮質において生理的に発現され、そしてＣＯＸ−２もまた、抗炎症役割を有しうるためである。最近、ＣＯＸ−２阻害剤に関する多くの事象が、メディアの注目をひきつけている。心臓に対して深刻な危険が存在するという、結腸および直腸の癌についてのＶｉｏｘｘ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＶＩＧＯＲ）の試験からの知見を受けて、ロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ）は２００４年９月にＭｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏによって販売が中止された。ＣＯＸ−２阻害剤がセレコキシブ（ＡＰＣ）試験で腺腫の予防において使用されたときに同様の主張がなされ、独立したＤａｔａ  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｂｏａｒｄによる分析が、致命的な心臓血管疾患（ＣＶＤ）および致命的でない重要な心臓血管疾患（ＣＶＤ）の危険が存在することを示したので、それは結局２００４年１２月に販売が停止された。
【００１２】
２００５年２月２０日に、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）審議会は、全ての種類のＣＯＸ−２阻害剤がヒトの心臓麻痺および心臓発作の危険性を増大させることを全会一致で結論付け、そしてその危険性にもかかわらず、Ｖｉｏｘｘを含む薬物が、強い警告を伴ってではあるが、市場に残るべきであると推奨した。ＦＤＡの決定を受けて、欧州連合およびＣＯＸ−２阻害剤が使用されていた国々は、同様の制限を課した。それらの薬物は現在「汚点を付けられている」ので、医師はそれらを処方したがらず、患者は疼痛を和らげるために自分の心臓の健康を危険にさらすことを望まず、セレブレックス、バルドコキシブ、およびロフェコキシブの販売量は劇的に下落している。ＣＯＸ−２阻害剤が論議の的になっているので、多くの製薬会社は、関節炎および他の炎症性疾患を処置するために、新しい効果的な抗炎症薬物の研究における研究努力を再開しなければならない。
【００１３】
これは、改良された胃腸の許容性を有する新しい種類の抗炎症剤および鎮痛薬としての、ＣＯＸ−２酵素の新しい、安全で、非毒性の選択的阻害剤の開発に対する基本的な理論的根拠である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、プロリンおよびその構造的アナログおよび誘導体（例えば、タウリンおよび他の小さな有機分子）のような特定の有機分子と、任意選択的に置換された、飽和脂肪酸および／または不飽和脂肪酸、および／あるいは高級アルキル（例えば、鎖内に少なくとも６個の炭素原子を有するアルキル）のような疎水性部分とのコンジュゲートが、ＣＯＸ−２の効果的な選択的阻害剤であり、従って、（鎮痛薬として）疼痛の処置に、そして炎症、リウマチ様関節炎、大腸炎およびクローン病のような炎症性腸疾患、喘息、自己免疫疾患、慢性の炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、骨盤内炎症性疾患、再潅流傷害、移植拒絶反応、脈管炎、糖尿病、心臓血管疾患および病気によって誘発された炎症の処置に有益に利用されることができるという知見に基づく。
【００１５】
さらに、結腸癌、食道癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、および前立腺癌の処置および予防におけるＮＳＡＩＤ、特にＣＯＸ−２阻害剤の有効性、従ってそれらの処置に対して使用されうることを示す最近の知見は；ＣＯＸ−２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ａ  ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，２００２年２月；１３（２）：１２７〜３７．；Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００４年２月；３１（１  補遺３）：６４．；Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２，Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，２００３年１０月；７６（４）：１３２７〜３５．およびＨＥＲ２  ａｎｄ  ＣＯＸ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，２００４年１月；４０（１）：５０〜５である。
【００１６】
本発明は、以下の詳細な説明を添付の図面と併せて、より完全に理解および認識されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ−Ｈ】図１Ａ〜Ｈは、本発明のコンジュゲートのアミン部分の図である。
【図１Ｉ−Ｏ】図１Ｉ〜Ｏは、本発明のコンジュゲートのアミン部分の図である。
【図２】図２Ａ〜Ｆは、本発明のコンジュゲートの疎水性部分の図である。
【図３】図３Ａ〜Ｄは、いくつかの例示的なコンジュゲートの図である。
【図４】図４Ａ〜Ｆは、本明細書中に開示される方法によって合成された、例示的なコンジュゲートの図である。
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａ〜Ｃは、生体外研究および生体内研究に供された、例示的なコンジュゲートの図である。
【図５Ｄ−Ｆ】図５Ｄ〜Ｆは、生体外研究および生体内研究に供された、例示的なコンジュゲートの図である。
【図６】図６ＡおよびＢは、ＣＩＡマウスにおけるＰＧＥ２生成およびＴＮＦαレベルに対する、ＲＮＸ００３化合物の効果の生体内研究の実験データの棒グラフである。
【図７】図７は、５−ＡＳＡの効果と比較した、ラットにおいて実験的に誘発された潰瘍性大腸炎に対する、ＲＮＸ００６化合物の効果の生体内研究の実験データの棒グラフである。
【図８】図８は、ＭＴＴ試験のＲＮＸ００３化合物の増加する濃度に対してプロットされた細胞生存率のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、種々の変更および代替の形態が可能であるが、本発明の特定の実施形態が図面において例として示され、かつ本明細書において詳細に説明されている。しかしながら、特定の実施形態の本明細書中の記載は、開示される特定の形態に本発明を限定することを意図せず、逆に、本発明は本発明の精神および範囲内の全ての変更物、等価物および代替物の範囲を包含することが理解されるべきである。
【００１９】
本発明の例示的実施形態が以下に記載される。このような実際の実施形態のいずれの開発においても、実施ごとに異なるシステム関連およびビジネス関連の制約の遵守のような開発者の特定の目的を達成するために、多数の実施固有の決定がなされなければならないことは理解されるだろう。さらに、このような開発努力は複雑かつ時間がかかることであるが、それでもなお本開示の利益を有する当業者にとって通常の仕事であることは理解されるだろう。
【００２０】
本発明によるコンジュゲートは、ここで参照される図１Ａ〜Ｏおよび図２Ａ〜Ｆに示される２つのそれぞれの群から選択される、２つの部分Ｍ１およびＭ２の任意の組合せを含むことができる。図１Ａ〜Ｏに示されるＭ１基のアミン部分は、末端アミンによって特徴付けられ、それは、図２Ａ〜Ｆに示されるＭ２基の疎水性部分の（受容的な矢印によって示される）末端カルボニルと共に、第２級アミドまたは第３級アミドのいずれかの（矢印によって示される）アミド結合を形成し、それによって本発明のコンジュゲートを形成する。図１Ｃおよび図１Ｄに示されるＭ１基のアミン部分は、それぞれＲおよびＲ’残基を含む；ここで、Ｒは、水素、３０個までの炭素原子から構成されるアルキル、または３０個までの炭素原子から構成されるアシルであり、Ｒ’は、水素、または３０個までの炭素原子から構成されるアルキルである。Ｍ２基の疎水性部分は、α−リポ酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である。
【００２１】
次に図３Ａ〜Ｄを参照すると、本発明による例示的なコンジュゲートの化学構造が示される。
【００２２】
次に参照される図４〜Ｆにおける例示的コンジュゲートは、下記に詳述される手順に従って合成された。無水ジクロロメタン中の、脂肪酸（ＦＡ）（１．５ｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１．６ｍｍｏｌ）の溶液は、氷水浴中で冷却され、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．６ｍｏｌ）が攪拌されながら添加される。混合物は、冷蔵庫（０℃〜＋５℃）で一晩保存される。分離されたＮ，Ｎ’−ジシクロヘキヘキシルウレアは濾過によって除去され、溶媒は真空下で蒸発される。粗生成物は、イソプロパノールから２回再結晶化される。
【００２３】
次に参照される図５Ａ〜Ｅに示される例示的なコンジュゲートは、生体外活性に対するＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の阻害について試験された。ヒツジＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２を阻害する、表１に列挙された試験化合物の能力（ＩＣ５０値、ｍＭ）は、製造者の説明書に従って酵素免疫アッセイ（ＥＩＫ）キット（カタログ番号５６０１０１、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｌ，米国）を使用して決定された。
【００２４】
シクロオキシゲナーゼは、アラキドン酸（ＡＡ）〜ＰＧＨ２の生合成の第一工程を触媒する。塩化第一スズでの還元によってＰＧＨ２から生成されるＰＧＦ２αは、酵素免疫アッセイ（ＡＣＥＴＭ競合的ＥＩＡ）によって測定された。
【００２５】
試験化合物のストック溶液は、ＤＭＳＯの最小容積に溶解された。簡単に言うと、ヘム（１０μＬ）の存在下でＣＯＸ−１またはＣＯＸ−２（１０μＬ）酵素のいずれかと共に、一連の供給された反応緩衝溶液（５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２ｍＭフェノールを含有する９６０μＬ、０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）に対して、１０μＬの種々の濃度の試験薬物溶液（１ｍＬの最終容量中で０．０１、０．１、１、１０、５０、および１００μＭ）を添加した。これらの溶液は、３７℃で５分間インキュベートされ、その後、１０μＬのＡＡ（１００μＭ）溶液が添加され、２分後に５０μＬの１Ｍ  ＨＣｌを添加することによって、ＣＯＸ反応が停止された。塩化第一スズでの還元によってＰＧＨ２から生成されるＰＧＦ２αは、酵素免疫アッセイによって測定された。
【００２６】
このアッセイは、限られた量のＰＧ抗血清に対する、ＰＧとＰＧ−アセチルコリンエステラーゼコンジュゲート（ＰＧトレーサー）の間の競合に基づく。ＰＧトレーサーの濃度は一定に保たれるが、ＰＧの濃度は変化するので、ＰＧ抗血清に結合することができるＰＧトレーサーの量は、ウェル中のＰＧの濃度に反比例する。５０％の阻害（ＩＣ５０、μＭ）を生じる試験化合物の濃度は、濃度−阻害応答曲線から計算された（二重測定）。
【００２７】
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【００２８】
図５Ａ〜Ｅに示される例示的コンジュゲートがＣＯＸ−１と比べてＣＯＸ−２の生体外活性を選択的に阻害する能力は、上に示される生体外研究の結果によって確認された。
【００２９】
図５Ａ〜Ｃに示される例示的コンジュゲートは、かくして、ラットにおける足の浮腫測定の生体内研究に供された。Ｓｐｒａｇｕｅ  ｄａｗｌｅｙラット（１５０ｇ〜２００ｇ）が使用された。浮腫は、軽いエーテル麻酔下でのラットの左後肢中へのカラゲーニン（１ｍｇ／足）の単回の足底下注射によって誘発された。注射された総容量は、常に０．１ｍｌであった。足の容積は、水中足容積測定装置（ｈｙｄｒｏｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ）（モデル７１５０、Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、イタリア）を使用して、注射の直前と、注射後の１時間間隔で測定された。結果は、各群について、基礎の容積を引くことによって計算された足容積（ｍｌ）の増加、または時間経過曲線（ＡＵＧ；ｍｌ  ｈ）下での面積を計算することによって計算された足容積（ｍｌ）の増加のいずれかとして表された。
【００３０】
参考として、表２に示されるような異なる時間間隔でのカラゲーニン誘発浮腫について、化合物の抗炎症活性がイブプロフェンと対比して試験された。１時間後、試験されたヒドロキシプロリン−ＦＡ  アミド化合物の全てが、化合物ＯＬ−ＨＰＲに対する３１％〜化合物ＬＮ−ＨＰＲに対する４３．４％の範囲で浮腫サイズの適度な減少を示した。この減少は、表２に示されるようなコントロールの減少と比べて非常に有意であるとみなされ、ＬＹＮ−ＨＰＲ誘導体は、イブプロフェンと比べて４時間後に最も強力な抗炎症化合物であった。４時間後、炎症は最も大きなサイズ（３．１）に到達し、試験された化合物の全てが足の浮腫を減少することができた。化合物ＬＹＮ−ＨＰＲは、炎症の大きさを小さくする最も強力な化合物であった（４時間後、５２％）。
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【００３１】
図５Ａ〜Ｃに示される例示的コンジュゲートによるＣＯＸ−２対ＣＯＸ−１の選択的活性阻害の生体外研究の結果と、ラットにおける後肢のカラゲーニン誘発浮腫に対するそれらの生体内阻害効果の結果との相関は、それらの鎮痛／解熱／抗炎症活性が、プロスタグランジン合成の阻害を介するシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の阻害によって達成されることを肯定する。
【００３２】
図５Ｃに示されるＲＮＸ０００３化合物は、マウスのコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）におけるＰＧＥ２生成およびＴＮＦαレベルのさらなる生体内研究に供された。雄性のｂｌａｃｋ／５７マウス（８〜１０週齢）は、ＣＩＡの研究のために使用された。ウシＣＩＩ（タイプＩＩコラーゲン  ＣＩＩ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）は、４℃で一晩、０．１Ｍ酢酸中に溶解された。これは、等量の完全フロイントのアジュバント（Ｓｉｇｍａ）中で乳化された。マウスは、１００μｇのＣＩＩを含有する１００μｌのエマルジョンで、尾の付け根において皮内に免疫された。２１日目に、マウスは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解された１００μｇのＣＩＩで腹膜内に追加抗原刺激された。このモデルは、ＲＡに対する疾患の機構および可能性のある治療を研究するために広く使用されている。実際、ＣＩＡモデルは、関節軟骨および骨の腐食、パンヌスの形成、滑膜炎のパターンを含むヒトＲＡの形態的特徴と類似の多くの形態的特徴を有する。さらに、ＣＩＡは、滑膜および軟骨におけるサイトカインおよび生物学的因子の多くでＲＡと共通する。
【００３３】
ＲＮＸ０００３（純度＞９６．９１％）は、上に詳述される手順と同様の手順に従って薬物処置のために合成された。イブプロフェンは、Ｓｉｇｍａ（Ｒｅｈｅｖｏｔ，イスラエル）から購入された。ＲＮＸ０００３およびイブプロフェンは、８０％  Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：生理食塩水（８０％：２０％）中にそれぞれ溶解された。確立されたＣＩＡに対するＲＮＸ００３の効果を評価するために、処置は、紅斑および／または浮腫の最初の目に見える徴候がいずれかの足で観察された日であるとみなされる、関節炎の臨床的症状の開始１日目から始められた。マウスは無作為に選択され、以下の群のいずれか１つに割り当てられた：ＲＮＸ００３（２５０ｍｇ／（ｋｇ／日）；ｎ＝４）、イブプロフェン（５００ｍｇ／（ｋｇ／日）；ｎ＝４）、またはビヒクル（ｎ＝４）。ＲＮＸ００３送達およびイブプロフェン送達の経路は、経口投与であった。処置は、２１日間にわたって毎日施された。
【００３４】
ＰＧＥ２およびＴＮＦαの生成についてのアッセイは、下記に詳述されるように行われた。関節組織は、ＰＧＥ２およびサイトカインの生成を測定するために、既に記載されたように調製された。簡単に記載すると、各マウスからの左前足（足、足首、および膝を含む）が取り除かれ、１ｍｌの溶解媒質（ＰＧＥ２については、ＨＣｌでｐＨ３に調節された０．１Ｍ酢酸ナトリウム中７５％のエタノール、サイトカインについては、２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニルおよび１ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチン、およびペプスタチンＡを含有するＲＰＭＩ  １６４０）あたり１００ｍｇの組織でホモジナイズされた。ホモジネートは、次いで、４℃で１５分間、３５００×ｇで遠心分離された。血清は、関節炎の２２日目のマウスから上記に記載されるように得られた。上清および血清は、使用まで−２０℃で保存された。ＰＧＥ２濃度は、製造者の説明書に従って市販のラジオ免疫アッセイ（ＲＩＡ）キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，英国）を用いて測定された。市販の酵素結合免疫吸着アッセイキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，フランス）は、製造者の説明書に従って、血清中のＴＮＦαの濃度を測定するために使用された。結果は、次に参照される図６Ａおよび６Ｂに示されるように、関節ホモジネートからの血清または上清１ｍｌあたりのｐｇとして表された。
【００３５】
次に参照される図５Ｆに示される例示的なＲＮＸ００６化合物は、以下のように、ラットにおける炎症性腸疾患ＩＢＤ（潰瘍性大腸炎）に対する効果について試験された。雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  ｄａｗｌｅｙラットが、この研究において使用された。簡単に記載すると、潰瘍性大腸炎は、文献に記載されるように硫酸トリニトロベンゼンによって誘発された。ラットは、（−）シャム（健康）、（＋）コントロール潰瘍性大腸炎（ＵＣ、非処置）、ＲＮＸ００６（２５ｍｇ／ｋｇ）で処置されたＵＣ、および５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ  ２５ｍｇ／ｋｇ）で処置されたＵＣの４つの群に分けられた。ＲＮＸ００６および５−ＡＳＡは、実験の全ての期間の間、直腸に投与された。実験の終了時に、動物は犠牲にされ、炎症の重篤度を試験するために結腸が単離された。炎症の重篤度は、結腸の炎症領域中のミエロペルオキシダーゼ活性（ＭＰＯ活性）の測定によって試験された。
【００３６】
次に図７を参照すると、図７はラットにおける炎症性腸疾患ＩＢＤ（潰瘍性大腸炎）に対するＲＮＸ００６化合物の効果の結果を示している。ＲＮＸ００６化合物で処置されたＩＢＤラットは、非処置ＩＢＤラットの（＋）コントロールと比べて有意に低いＭＰＯ活性を示し、そして５−ＡＳＡで処置されたＩＢＤラットと比べてでさえ低いＭＰＯ活性を示した。これらの結果は、ＲＮＸ００６化合物が、ＩＢＤの処置において５−ＡＳＡよりも強力な治療薬剤であることを示す。なぜなら、ＲＮＸ００６化合物は、ＭＰＯ活性のレベルをシャム（−）コントロールのＭＰＯ活性のレベル付近まで低減させることができるからである。
【００３７】
図５Ｃに示されるように、ＲＮＸ００３化合物の細胞毒性効果が、次いで、ヒトケラチノサイト細胞株Ｈａｃａｔを使用する細胞培養系におけるＭＴＴ試験を使用して評価された。Ｈａｃａｔ細胞株は、分化したケラチノサイト表現型を保持し、無限に増殖されることができ、従って、長期間の研究が行われることを可能にする。細胞は、１０％容積／容積の不活性化されたウシ胎仔血清、１％の非必須アミノ酸、１％のグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンで補充された高グルコース含有量（４．５ｇ／Ｌ）を有するＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖された。細胞は、３７℃で、９５％  Ｏ２−５％  ＣＯ２の加湿雰囲気下で維持された。培地のｐＨは７．４で監視された。両方の細胞株からの細胞の培地は、週に２回取り替えられた。７０％〜８０％のコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で、細胞はトリプシン処理され、９６ウェルのマイクロタイタープレートに播種された。細胞播種の２４時間後に、細胞は種々の濃度のＲＮＸ００３に曝露された。
【００３８】
ＭＴＴアッセイは以下のように行われた。テトラゾリウム色素であるＭＴＴは、細胞の生存率および／または代謝状態を評価するために広く使用される。この比色アッセイは、生存細胞中のミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼによる、黄色の臭化テトラゾリウム（ＭＴＴ）から赤色のホルマザン誘導体への変換に基づく。９６ウェルプレートの各ウェル中に、１００μＬあたり２×１０４個の細胞が播種された。細胞播種から２４時間後に、細胞は３７℃で２４時間、異なる濃度の物質と共にインキュベートされた。各ウェルからの物質の除去後に、細胞はリン酸緩衝生理食塩水中で洗浄された。細胞は次いで、ＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍＬ）が各ウェル（１００μＬ）に添加された血清不含ＤＭＥＭ中でさらに４時間インキュベートされた。次いで培地が除去され、細胞は、ホルマザン結晶を溶解するために１００μＬの酸性イソプロパノール（０．０８Ｎ  ＨＣｌ）で１５分間インキュベートされる。ＭＴＴホルマザンの吸光度は、Ｅｌｉｓａ読み取り機において５７０ｎｍで決定される。生存率は、非処置細胞に対する処置細胞の吸光度の比率（百分率として表される）と定義される。
【００３９】
ＲＮＸ００３化合物の細胞毒性効果を評価するために、細胞は、２４時間、異なる濃度のＲＮＸ００３化合物と共にインキュベートされた。各ウェルからのＲＮＸ００３の除去の後に、細胞はリン酸緩衝生理食塩水中で洗浄され、ＭＴＴアッセイが記載されるように実行された。
【００４０】
次に図８を参照すると、図８は、細胞の生存率がＲＮＸ００３化合物の増加する濃度に対してプロットされるグラフを示す。１．２５ｍｇ／ｍｌまでの濃度での処置後に、考慮すべき細胞毒性効果は見られなかった。細胞毒性効果（生存細胞数の減少）は、１．２５ｍｇ／ｍｌより高い濃度で観察された。非処置細胞と比較して細胞数の５０％の減少をもたらす細胞毒性濃度であるＣＤ５０は、約２ｍｇ／ｍＬのＲＮＸ００３化合物の濃度で見出された。
【００４１】
上に詳述される生体外および生体内研究の実験データから認識されるように、本発明による例示的コンジュゲートは、ＣＯＸ−２の活性を選択的に阻害し、その結果、ラットの後肢においてカラゲーニン誘発浮腫の影響を減少させ、そしてマウスにおいてコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）におけるＰＧＥ２生成およびＴＮＦαレベルを低減させる能力によって特徴付けられる。さらに、選択された化合物は所望の治療効果を誘導するのに適切な濃度で細胞毒性ではないことが見出され、従って、医薬用途に好適である。
【００４２】
本発明が、上記に詳細に説明されかつ示されていることによって限定されないこと、および全て本発明の範囲内に含まれる多くの変更が存在することは理解されるだろう。むしろ本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。
【図１Ａ−Ｈ】
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【図１Ｉ−Ｏ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｃ】
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【図５Ｄ−Ｆ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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