(57)【要約】  本発明は、ａ）細菌コロニーを得るために、トリプトファン及び大多数の大腸菌によって発現される酵素Ａのための基質を含む検出培地上に大腸菌を含みやすい生物試料を接種をすること；ｂ）酵素Ａの活性を発現しているコロニーを検出し、大腸菌としてそれらを同定すること；およびｃ）酵素Ａの活性を発現しないコロニーを検出して、インドールテストを実施して、インドールテスト陽性を有するコロニーを大腸菌として同定することを含む、生物試料中の大腸菌（エシェリキア・コリ）を検出および／または同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）細菌コロニーを得るために、トリプトファン及び大多数の大腸菌によって発現される酵素Ａのための基質を含む検出培地上に大腸菌を含みやすい生物試料を接種をすること；
ｂ）酵素Ａの活性を発現しているコロニーを検出し、大腸菌としてそれらを同定すること；及び
ｃ）酵素Ａの活性を発現しないコロニーを検出して、インドールテストを実施して、インドールテスト陽性を有するコロニーを大腸菌として同定することを含む、生物試料中の大腸菌（エシェリキア・コリ）を検出および／または同定する方法。
【請求項２】
トリプトファン濃度が０．０２ｇ／ｌ以上、好ましくは０．４ｇ／ｌ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出培地が大多数の大腸菌によって発現されない酵素Ｂのための基質を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
検出培地が大多数の大腸菌によって発現される酵素Ｃのための基質を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
酵素Ａがβ−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−リボシダーゼ、ホスファターゼ、Ｌ−アラニンアミノペプチダーゼ、Ｌ−ロイシンアミノペプチダーゼ及びβ‐ガラクトシダーゼから選択される、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
酵素Ａがβ−グルクロニダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼである、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
酵素Ｂがβ−グルコシダーゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、エステラーゼ、スルファターゼ、β−キシロシダーゼ、フォスフォリパーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−セロビオシダーゼ、α−グルコシダーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、色素合成酵素、β−アラニンアミノペプチダーゼ及びエラスターゼから選択される、請求項３から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
酵素Ｂがβ−グルコシダーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
酵素Ｃがβ−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−リボシダーゼ、ホスファターゼ、Ｌ−アラニンアミノペプチダーゼ、Ｌ−ロイシンアミノペプチダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼから選択される、請求項４から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
酵素Ａがβ‐ガラクトシダーゼである場合に、酵素Ｂはβ−グルコシダーゼであり、酵素Ｃはα−ガラクトシダーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
酵素Ａがβ−ガラクトシダーゼである場合に、酵素Ｂはβ−グルコシダーゼであり、酵素Ｃはβ−グルクロニダーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
検出培地が酵素Ａの誘導物質、酵素Ｂの誘導物質および／または酵素Ｃの誘導物質を含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
酵素がβ−グルクロニダーゼであり、前記酵素Ａの誘導物質が好ましくはグルクロネートとメチル−β−グルクロニドから選択されるグルクロニドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
酵素Ａがβ−ガラクトシダーゼであり、前記酵素Ａの誘導物質が好ましくはラクトースとイソプロピル−β−チオガラクトシドから選択されるβ−ガラクトシドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
酵素Ｂがβ−グルコシダーゼであり、酵素Ｂの誘導物質が好ましくはメチル−β−グルコース、セロビオース、セロトリオース、トレハロース、セルロース及びデンプンから選択されるβ−グルコシドである、請求項１２から１４の何れか一項に記載の方法。  
【請求項１６】
酵素Ｂの誘導物質がセロビオースである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
トリプトファン、β−ガラクトシダーゼ酵素のための基質、β−グルコシダーゼ酵素のための基質及びセロビオースを含む検出培地。  
【請求項１８】
α−ガラクトシダーゼ酵素のための基質を含む、請求項１６に記載の検出培地。
【請求項１９】
大腸菌を検出するための、請求項１７または１８に定義の培地の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野は、生化学的な微生物分析、特に細菌の検出と同定である。
【０００２】
腸内細菌のような病原菌、特にグラム陰性細菌は毎年多くの疾患、流行病、その他の原因となる。
大腸菌（エシェリキア・コリ）という種は、消化管において最も優勢的な好気性の種である。しかしながら、水中の前記細菌の存在は糞便の混入の指示となり、特定の菌株は病原性であり、腹膜、胆管、虫垂、又は生殖器の化膿の原因となる。  
大腸菌の早期の特異的な検出は、治療に関して、汚染除去、その他の適切な解決法を提案することを可能にする。
この検出は、検出することが求められる細菌の酵素活性等の標的代謝活性とされる代謝に特異的な基質を含む検出培地の使用に特に基づくことができ、すなわち基質の選択を介して、反応があるか否かに応じて、微生物の性質を特徴づけることが可能である。  
【０００３】
CPS ID3培地（ビオメリュー）は、大腸菌の菌株を検出するために、β−グルコシダーゼ基質と組合わせて、場合によりトリプトファナーゼの検出と組合わせて、β−グルクロニダーゼ基質を使用する。
しかしながら、この培地が優れた特異性を有する一方で、大腸菌の検出のためのβ‐グルクロニダーゼ基質の使用は、この活性を発現しないごく一部の大腸菌の菌株（５−１０％）の存在のために不完全な感受性を呈する。さらにまた、特定のシトロバクター属の菌株も、大腸菌のコロニーと同じ色のβ−グルクロニダーゼ陽性コロニーを作ることができる。
【０００４】
本発明は、迅速且つ安価に、実施が容易な方法で病原性大腸菌を同定するために、特に適切な新規な培地を提供することによって従来技術の問題を解決することを提案する。  
驚くべきことに、発明者は、適切な追加テストは、大腸菌の迅速で簡単な検出を可能にすることを示した。
より具体的には、発明者は標的代謝活性を発現しない大腸菌に実施したインドールテストが、テストの感度を増大できることを示した。
【０００５】
本発明の開示を続ける前に、以下の定義を、本発明の理解を容易にするために提供する。
【０００６】
「生物試料」なる用語は、生体液に由来する臨床試料、又は任意の種類の食品に由来する食品試料、又は表面試料、水試料、空気試料のような環境試料を意味することを目的とする。従って、この試料は液体又は固体でもよく、血液、血漿、尿または糞便、鼻、のど、皮膚、傷又は脳脊髄液から採取された試料に由来する臨床試料、水又例えば牛乳または果汁等の飲料の試料；ヨーグルト、肉、卵、野菜、マヨネーズまたはチーズの試料；魚等の試料に由来する食品試料、あるいは、特に動物の餌のような動物飼料に由来する食品試料を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０００７】
「検出培地」なる用語は、微生物の生存および／または成長のために必要な全ての要素を含む培地を意味することを目的とする。この検出培地は、検出培地のみとして、又は培養且つ検出培地として、どちらにも提供される。第１の場合において、微生物の培養は播種の前に実施され、第２の場合において、検出培地は培養培地も構成する。例えば、本発明による培地は、他の考えられる添加物を含んでもよい：ペプトンまたは組織の抽出物、一つ以上の成長因子、炭水化物、一つ以上の選択剤、バッファー、一つ以上のゲル化剤等。
この培養培地は、チューブまたはフラスコまたはシャーレ上に播種の準備ができている、液体形態または使用準備済みのゲル形態であってもよい。  
本発明の目的において、検出は、液体培地、一片（a strip）または他の固体支持体で行われ得る。
【０００８】
「基質」なる用語は、微生物の酵素又は代謝活性による検出可能なシグナルを直接的に又は間接的に生じることができる何らかの分子を意味することを目的とする。  
基質は特に代謝基質、例えば炭素または窒素源であってもよく、代謝の生成物のうちの１つの存在下で呈色反応を生じる指示薬に結合されてもよい。  
また、基質は酵素基質であってもよく、すなわち基質は微生物の直接的または間接的な検出を可能にする生成物を与えるために酵素によって加水分解され得る基質であってもよい。この基質は、明らかにされる酵素活性に特異的な第１の部分及び標識として作用する第２の部分（以下では標識部分とする）を含んでもよい。この標識部分は色素生産性、蛍光発生性、発光性等でもよい。
固体支持体（フィルター、寒天、電気泳動ゲル）に適している色素生産性基質として、オキシダーゼ（osidase）とエステラーゼ活性の検出を可能にする、インドキシルとその誘導体を主成分とした基質、及びヒドロキシキノリン又はエスクレチンとそれらの誘導体を主成分とした基質を挙げることが出来る。また、ニトロフェノール及びニトロアニリン及びその誘導体を主成分とする基質を挙げることができ、ニトロフェノールに基づく基質の場合はオキシダーゼとエステラーゼ活性を検出するためであり、ニトロアニリンに基づく基質の場合はペプチダーゼ活性を検出するためである。最後に、ナフトールとナフチルアミンとそれらの誘導体を主成分とする基質を挙げることができ、ナフトールによってオキシダーゼとエステラーゼ活性を検出することが可能であり、ナフチルアミンによってペプチダーゼ活性を検出することが可能である。この基質は、オキシダーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ等の活性のような酵素活性の検出を特に可能にすることができるが、これに制限されるものではない。
また、酵素基質は、その加水分解の生成物が直接的または間接的に検出される天然の基質であってもよい。天然の基質としては、特に、トリプトファナーゼまたはデアミナーゼ活性を検出するためのトリプトファン、デアミナーゼ活性を検出するための環状アミノ酸（トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン）、ホスホリパーゼ活性を検出するためのホスファチジルイノシトール等を挙げることができる。
【０００９】
本発明によれば、基質は、好ましくは、インドキシル（３−インドキシル、５−ブロモ−３−インドキシル、５−ヨード−３−インドキシル、４−クロロ−３−インドキシル、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル、６−ブロモ−３−インドキシル、６−フルオロ−３−インドキシル、５−ブロモ−４−クロロ−ｎ−メチル−３−インドキシル、ｎ−メチル−３−インドキシル等）を主成分とする基質；ウンベリフェロン（４−メチルウンベリフェロン、シクロヘキセノエスクレチン等）を主成分とする基質；アリザリンを主成分とする基質；ｐ−ナフトールベンゼインを主成分とする基質；ニトロフェノール（オルト−ニトロフェノール、パラ−ニトロフェノール等）を主成分とする基質；アミノフェノール（パラ‐アミノフェノール、ジクロロアミノフェノール等）を主成分とする基質；ヒドロキシキノリン；カテコール（カテコール、ジヒドロキシフラボン、ヒドロキシフラボン等）；レゾルフィン；クロロフェノール・レッド；フルオレセイン；ナフトール（α−ナフトール、２−ナフトール、ナフトール−ＡＳＢＩ等）；アミノクマリン（７−アミノ−４−メチルクマリン等）；ナフチルアミド；アクリジン（アミノフェニルアクリジン等）；またはアミノフェノキサジン（アミノベンゾフェノキサジノン、アミノペンチルレソルフィン等）を主成分とする基質から選択される。  
指示作用により、β−グルクロニダーゼ活性を検出するために使用する基質は、特に４−メチルウンベリフェリル−β−グルクロニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド、６−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド、アリザリン−β−グルクロニドまたはシクロヘキセノエスクレチン−β−グルクロニド、またはその塩類であってもよい。  
【００１０】
β‐ガラクトシダーゼ活性を検出するために使用する基質は、特に４−メチルウンベリフェリル−β−ガラクトシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド、６−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド、アリザリン−β−ガラクトシドまたはシクロヘキセノエスクレチン−β−ガラクトシドまたはその塩類であってもよい。
β−グルコシダーゼ活性を検出するために使用する基質は、特に４−メチルウンベリフェリル−β−グルコシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルコシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−グルコシド、６−クロロ−３−インドリル−β−グルコシド、アリザリン−β−グルコシド、シクロヘキセノエスクレチン−β−グルコシド、ニトロフェニル−β−グルコシドまたはジクロロアミノフェニルグルコシドまたはその塩類であってもよい。
α−ガラクトシダーゼ基質として、４−メチルウンベリフェリル−α−ガラクトシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−ガラクトシド、５−ブロモ−６クロロ−３−インドリル−α−ガラクトシド、６−クロロ−３−インドリル−α−ガラクトシド、アリザリン−α−ガラクトシドまたはニトロフェニル−α−ガラクトシドまたはその塩類であってもよい。  
【００１１】
「大多数の大腸菌によって発現される酵素ＡまたはＣ」なる表現は、所与の条件下で、８０％より多くの大腸菌によって発現される酵素を意味することを目的とする。    
当業者は、大多数の大腸菌の菌株によって発現される多数の活性を承知している。いくつかは、特に、the Manual of Clinical Microbiology、第７版(P. R. Murray 等、1999)、更に、ビオメリュー同定生成物データベース（api 20E, ID 32E, rapid ID 32等）に記載されている。
大多数の大腸菌によって発現される酵素のために、特にβ−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−リボシダーゼ、ホスファターゼ、Ｌ−アラニンアミノペプチダーゼ、Ｌ−ロイシンアミノペプチダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ラクトース酸性化酵素またはトリプトファナーゼを挙げることが出来る。  
【００１２】
「大多数の大腸菌によって発現されない酵素Ｂ」なる表現は、所与の条件下で、２０％未満の大腸菌によって発現される酵素を意味することを目的とする。  
また、これらの活性は当業者に知られており、それらの一部は前述の資料に記載されている。特に、β−グルコシダーゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、エステラーゼ、スルファターゼ、β−セロビオシダーゼ、α−グルコシダーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、色素合成酵素、β−アラニン・アミノペプチダーゼまたはエラスターゼを挙げることが出来る。
【００１３】
「インドールテスト」なる表現は、微生物によるインドールの生産を検出することを可能にするテストを意味することを目的とする。一般に、反応培地中に生産されるインドールは、試薬、例えばコバック試薬、ジメチルアミノシンナムアルデヒド（ＤＭＡＣＡ）またはジェームズ試薬によって検出される。インドールが存在する場合には、赤色の呈色反応がコバック試薬とジェームズ試薬によって得られ、青色の呈色反応はＤＭＡＣＡによって得られる。  
【００１４】
「誘導物質」なる用語は、標的代謝活性の発現の増加を誘発する化合物を意味することを目的とする；全ての実験条件が別の面で等しくて、誘導物質が適切な濃度である場合は、それが不在の場合または不適当な濃度である場合よりも、代謝活性はより大きい。  
・β−グルクロニダーゼの場合は、好ましくはグルクロネート及びメチル−β−グルクロニドから選択されるグルクロニドを挙げることができる；
・β−ガラクトシダーゼの場合は、好ましくはラクトースとイソプロピル−β−チオガラクトシドから選択されるβ‐ガラクトシドを挙げることができる；
・β−グルコシダーゼの場合は、グルコースにβ位において結合する炭水化物で構成される炭水化物、またはβグルコシドサブユニットを有する炭水化物、特にセロビオース、セルロース、デンプン、セロトリオースまたはトレハロースを挙げることができる。また、メチル−β−グルコシド、イソプロピル−β−チオグルコシド、インドキシル−β−グルコシドまたはメチル−β−チオグルコシドを挙げてもよく、
・α−ガラクトシダーゼの場合は、好ましくはメリビオースとメチル−α−ガラクトシドから選ばれるα−ガラクトシドを挙げることができる。  
【００１５】
この点に関して、本発明は生物試料中の大腸菌（E.coli）を検出および／または同定する方法であって、  
ａ）細菌コロニーを得るために、大腸菌を含みやすい生物試料を、トリプトファンと大多数の大腸菌によって発現される酵素Ａのための基質を含む検出培地上に接種をすること；
ｂ）酵素Ａの活性を発現する大腸菌を検出し、大腸菌として、それらを同定すること；及び
ｃ）酵素Ａの活性を発現しないコロニーを検出して、インドールテストを実施して、インドールテスト陽性を有するコロニーを大腸菌として同定することを含む方法に関する。
【００１６】
微生物の接種は、当業者に公知である任意の接種技術によって実施され得る。インキュベーション工程は検出が要求される酵素活性にとって最適である温度で実施されてもよく、当業者は検出される酵素活性に従って直ちに前記温度を選択することができる。検出／同定は、比色法または蛍光定量法によって、目視検査によって実施され得る。  
【００１７】
本発明の好ましい一実施形態によれば、酵素Ａは、β−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−リボシダーゼ、ホスファターゼ、Ｌ−アラニンアミノペプチダーゼ、Ｌ−ロイシン・アミノペプチダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼから選択される。  
【００１８】
本発明の好ましい一実施形態によれば、酵素Ａは、β−グルクロニダーゼである。好ましくは、β‐グルクロニダーゼ活性のための基質は、好ましくは２０と１０００ｍｇ／ｌとの間の濃度の、４−メチルウンベリフェリル−β−グルクロニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド、６−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド、アリザリン−β−グルクロニドまたはシクロヘキセノエスクレチン−β−グルクロニドまたはそれらの塩類から選択される。  
【００１９】
本発明の好ましい他の実施形態によれば、酵素Ａは、β−ガラクトシダーゼである。好ましくは、β‐ガラクトシダーゼ活性のための基質は、好ましくは１０と１０００ｍｇ／ｌとの間、好ましくは２０と５００ｍｇ／ｌとの間の濃度の、４−メチルウンベリフェリル−β−ガラクトシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド、６−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド、アリザリン−β−ガラクトシドまたはシクロヘキセノエスクレチン−β−ガラクトシド、またはそれらの塩類から選択される。  
好ましくは、上記酵素Ａのための基質は、１０と１０００ｍｇ／ｌとの間、好ましくは２０と５００ｍｇ／ｌとの間の濃度である。  
【００２０】
本発明の好ましい一実施形態によれば、トリプトファン濃度は、０．０２ｇ／ｌ以上、好ましくは０．４ｇ／ｌ以上である。
本発明の好ましい一実施形態によれば、検出培地は、また、大多数の大腸菌によって発現されない酵素Ｂのための基質を含む。
本発明の好ましい一実施形態によれば、酵素Ｂは、β−グルコシダーゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、エステラーゼ、スルファターゼ、β−セロビオシダーゼ、α−グルコシダーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、色素合成酵素、β−アラニン・アミノペプチダーゼとエラスターゼから選択される。
好ましくは、酵素Ｂはβ−グルコシダーゼである。  
好ましくは、β−グルコシダーゼ活性のための基質は、好ましくは１０と１０００ｍｇ／ｌとの間、好ましくは２０と５００ｍｇ／ｌとの間の濃度の、４−メチルウンベリフェリル−β−グルコシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルコシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−グルコシド、６−クロロ−３−インドリル−β−グルコシド、アリザリン−β−グルコシド、シクロヘキセノエスクレチン−β−グルコシド、ニトロフェニル−β−グルコシドまたはジクロロアミノフェニルグルコシドまたはそれらの塩類から選択される。
好ましくは、前記酵素Ｂのための基質は、１０と１０００ｍｇ／ｌとの間、好ましくは２０と５００ｍｇ／ｌとの間の濃度である。  
【００２１】
本発明の好ましい一実施形態によれば、検出培地も、大多数の大腸菌によって発現される酵素Ｃのための基質を含む。
従って、２つの実施態様が可能である：  
・酵素Ｃが酵素Ａと同一である；この場合、基質は異なるべきである。酵素ＡとＣとして、β‐ガラクトシダーゼを挙げることが出来る；この場合、培地は、例えば、酵素Ａのための基質としての４−メチルウンベリフェリル−βグルクロニドを、酵素Ｃのための基質としての５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−βグルクロニドを含む；  
・または、酵素Ｃは酵素Ａとは異なる；例えば、酵素Ａとしてβ‐ガラクトシダーゼを、酵素Ｃとしてのα−ガラクトシダーゼと組合わせて、挙げることが出来る。また、酵素Ａとしてβ‐ガラクトシダーゼを、酵素Ｃとしてのβ‐グルクロニダーゼと組合わせて、挙げることが出来る。
好ましくは、酵素Ｃは、β‐グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−リボシダーゼ、ホスファターゼ、Ｌ−アラニンアミノペプチダーゼ、Ｌ−ロイシン・アミノペプチダーゼ、β‐ガラクトシダーゼから選択される。  
好ましくは、酵素Ｃはβ‐グルクロニダーゼである。好ましくは、β−グルクロニダーゼ活性のための基質は、１０と１０００ｍｇとの間の濃度の４−メチルウンベリフェリル−β−グルクロニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド、６−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド、アリザリン−β−グルクロニドまたはシクロヘキセノエスクレチン−β−グルクロニドまたはそれらの塩類から選択される。
好ましくは、酵素Ｃはα−ガラクトシダーゼである。好ましくは、α−ガラクトシダーゼ活性のための基質は、１０と１０００ｍｇ／ｌとの間、好ましくは２０と５００ｍｇ／ｌとの間の濃度の、４−メチルウンベリフェリル−α−ガラクトシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−ガラクトシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−α−ガラクトシド、６−クロロ−３−インドリル−α−ガラクトシド、アリザリン−α−ガラクトシドまたはニトロフェニル−α−ガラクトシドから選択される。  
好ましくは、前記酵素Ｃのための基質は、１０と１０００ｍｇ／ｌとの間、好ましくは２０と５００ｍｇ／ｌとの間の濃度である。  
【００２２】
酵素Ａがβ‐ガラクトシダーゼである本発明の好ましい一実施形態によれば；酵素Ｂはβ−グルコシダーゼであり、酵素Ｃはα−ガラクトシダーゼである。
本発明のこの特定の実施形態において、
・酵素Ａのための基質は、好ましくは、１０と１０００ｍｇ／ｌとの間の濃度の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド、６−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドまたはアリザリン−β−ガラクトシドであり、
・酵素Ｂのための基質は、好ましくは、１０と１０００ｍｇ／ｌとの間の濃度の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルコシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−グルコシド、６−クロロ３−インドリル−β−グルコシドまたはアリザリン−β−グルコシドであり、
・酵素Ｃのための基質は、好ましくは、１０と１０００ｍｇ／ｌとの間の濃度の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−ガラクトシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−α−ガラクトシド、６−クロロ−３−インドリル−α−ガラクトシドまたはアリザリン−α−ガラクトシドである。
【００２３】
他の本発明の好ましい実施例によれば、酵素Ａは、β‐ガラクトシダーゼである；酵素Ｂはβ−グルコシダーゼであり、酵素Ｃはβ‐グルクロニダーゼである。本発明のこの特定の実施形態において、
・酵素Ａのための基質は、好ましくは、１０と１０００ｍｇ／ｌとの間の濃度の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−βガラクトシド、６−クロロ−３−インドリル−βガラクトシドまたはアリザリン−β−ガラクトシドであり、
・酵素Ｂのための基質は、好ましくは、１０と１０００ｍｇ／ｌとの間の濃度の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルコシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−グルコシド、６−クロロ−３−インドリル−β−グルコシドまたはアリザリン−β−グルコシドであり、
・酵素Ｃのための基質は、好ましくは、１０と１０００ｍｇ／ｌとの間の濃度の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−βグルクロニド、６−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニドまたはアリザリン−β−グルクロニドである。
【００２４】
本発明の特定の一実施形態によれば、検出培地は、酵素Ａの誘導物質、酵素Ｂの誘導物質および／または酵素Ｃの誘導物質をも含む。
本発明の好ましい一実施形態によれば、酵素Ａ、ＢまたはＣの誘導物質は、１００ｎｇ／ｌと１０ｇ／ｌとの間、好ましくは１０ｍｇ／ｌと３ｇ／ｌとの間の濃度である。
酵素ＡまたはＣがβ‐グルクロニダーゼである場合、上記酵素ＡまたはＣの誘導物質は好ましくはグルクロニドであり、好ましくはグルクロネートとメチル−β−グルクロニドから選択される。
酵素ＡまたはＣがβ‐ガラクトシダーゼである場合、上記酵素ＡまたはＣの誘導物質は好ましくはβ−ガラクトシドであり、好ましくはラクトースとイソプロピル−βチオガラクトシドから選択される。
酵素Ｂがβ−グルコシダーゼである場合、酵素Ｂの誘導物質は好ましくはβ−グルコシドであり、好ましくはメチル−β−グルコース、セロビオース、セロトリオース、トレハロース、セルロース及びデンプンから選択される。好ましくは、酵素Ｂの誘導物質は、好ましくは１０ｍｇ／ｌと１０ｇ／との間の濃度のセロビオースである。
酵素Ｃがα−ガラクトシダーゼである場合、酵素Ｃの誘導物質は、好ましくはメリビオースまたはメチル−α−ガラクトシドである。
【００２５】
また、本発明は、トリプトファン、β‐ガラクトシダーゼ酵素のための基質、β−グルコシダーゼ酵素のための基質及びセロビオースを含んでなる検出培地にも関する。
本発明の好ましい一実施形態によれば、トリプトファン濃度は、０．０２ｇ／ｌ以上、好ましくは０．４ｇ／ｌ以上である。
好ましくは、β−グルコシダーゼ活性のための基質は、好ましくは１０と１０００ｍｇ／ｌとの間、好ましくは２０と５００ｍｇ／ｌとの間の濃度の４−メチルウンベリフェリル−β−グルコシド、５−ブロモ−４−クロロ３−インドリル−β−グルコシド、５−ブロモ−６−クロロ３−インドリル−β−グルコシド、６−クロロ３−インドリル−β−グルコシド、アリザリン−β−グルコシド、シクロヘキセノエスクレチン−β−グルコシド、ニトロフェニル−β−グルコシドまたはジクロロアミノフェニルグルコシドまたはそれらの塩類から選択される。
好ましくは、β−ガラクトシダーゼ活性のための基質は、好ましくは１０と１０００ｍｇ／ｌとの間、好ましくは２０と５００ｍｇ／ｌとの間の濃度の４−メチルウンベリフェリル−β−ガラクトシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−βガラクトシド、６−クロロ−３−インドリル−βガラクトシド、アリザリン−β−ガラクトシドまたはシクロヘキセノエスクレチン−βガラクトシドまたはそれらの塩類から選択される。  
好ましくは、セロビオースは、１０ｍｇ／ｌと１０ｇ／ｌとの間の濃度である。
【００２６】
本発明の好ましい一実施形態によれば、検出培地も、α−ガラクトシダーゼ酵素のための基質を含む。
α−ガラクトシダーゼのための基質として、２０と１０００ｍｇ／ｌとの間の濃度の４−メチルウンベリフェリル−α−ガラクトシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−ガラクトシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−α−ガラクトシド、６−クロロ−３−インドリル−α−ガラクトシド、アリザリン−α−ガラクトシドまたはニトロフェニル−α−ガラクトシドを特に挙げることが出来る。
また、本発明は、大腸菌を検出するための上記の培地の使用にも関する。
【００２７】
下記の実施例は、説明として提供されるものであって、事実上限定するものではない。本発明を、より明らかに理解することを可能にするものである。
【実施例】
【００２８】
実施例１：大腸菌を検出するための、無色のコロニーにおけるインドールテストの貢献
三千（３０００）の尿サンプルは、市販のCPS ID 3培地（ビオメリュー）に接種をされた。培地は、インキュベートされて、供給元の推奨に従って分析された：大腸菌の菌株を検出して同定するために、ピンクから赤色のコロニーは、種の大腸菌（E.coli）に属するとして前同定された。インドールテストは、この同定を確認するために実施された。平行して、本発明に従って、培地が使用されて、分析された：ピンクから赤色のコロニーは、種の大腸菌に属するとして同定された；インドールテストは、無色のコロニーにおいて実施された；反応が陽性の場合、菌株は大腸菌と同定された。全ての同定は、医学的検査研究所によって一般に使われる適切な生化学検査を使用して確認された。    
表１：CPS ID3培地上の大腸菌の菌株を同定するための無色コロニーにおけるインドールテストの貢献
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供給元の提案に従って、インドールテストがCPS ID 3培地上のピンクから赤色のコロニーにだけ実施された場合、大腸菌の菌株の同定感度の減少に結果としてなることは、表１から非常に明白である。一方で、この試験が無色コロニーに実施される場合、非常に高い同定感度を得ることができる。
【００２９】
実施例２：セロビオース、６−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルコシドを組合せてなる培地におけるインドールテストの貢献
トリプトファン、６−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルコシドを、それぞれ０．９ｇ／ｌ、０．１５ｇ／ｌ、０．０５ｇ／ｌ及び０．１ｇ／ｌ、トリプチケースソイ寒天培地（ビオメリュー）に加えた。この培地は、０．５ｇ／ｌのセロビオースを補充されるか、または補充されない。これらの２つの培地は、１シャーレにつき２０ｍｌの割合で分配される。尿試料から単離された一般に微生物及び出願人のコレクションに由来する微生物は、０．５のマクファーランドを１／２０に希釈した１０μｌの懸濁液の半定量的単離によってこれらの培地上に接種される。シャーレは３７°Ｃで２４時間インキュベートされ、次に形成されたコロニーは視覚的に調べられる。これらのコロニーの呈色反応は記録される。インドールテストは、ジェームズ試薬（ビオメリュー）を使用して無色のコロニーに実施された。結果を、下記の表２に示す：  
表２：６−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルコシドを組合わせてなり、場合によりセロビオースで補充される培地における、大腸菌の同定に関するインドールテストの貢献  
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トリプトファン、６−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルコシドを組合せてなる培地で、セロビオースがシトロバクター００９菌株と大腸菌の菌株とをより明らかに区別できることは、上の表２から明白である。さらに、トリプトファンがある場合には、無色のコロニーによるインドールの生産を調べることによって、更に特異性に損害を与えることで不利にならずに大腸菌を検出するための感度を増やすことができる。  
【００３０】
実施例３：トリプトファン濃度の大腸菌の無色コロニーの検出への影響
さまざまな濃度のトリプトファン（０、０．３、０．６、０．９ｇ／ｌ）及び１００ｍｇ／ｌのセロビオースは、CPS ID 3培地（ビオメリュー）に加えられる。これらの培地は、２５０ｍｇ／ｌの６−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド及び５０ｍｇ／ｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルコシドを含むこれらの培地は、１つのシャーレにつき２０ｍｌの割合で分配される。出願人のコレクションに由来する微生物は、０．５のマクファーランドを１／２０に希釈した１０μｌの懸濁液の半定量的単離によってこれらの培地上に接種される。シャーレは３７℃で２４時間インキュベートされた。２４時間のインキュベートの後、形成されたコロニーは視覚的に調べられる。これらのコロニーの呈色反応は、記録される。インドールテストは、ジェームズ試薬（ビオメリュー）を使用して無色のコロニーに実施される。結果を、下記の表３に示す：  
表３：トリプトファン濃度の大腸菌の無色のコロニーの検出への影響
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０．３ｇ／ｌのトリプトファン濃度によってさえ、大腸菌の菌株によるインドールの生産を検出できることは、上の表３から明白である；にもかかわらず、反応は、より高い濃度でより記録される。
【００３１】
実施例４：セロビオース、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−α−ガラクトシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルコシドを組合せてなる培地におけるインドールテストの貢献
５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−α−ガラクトシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルコシド及びイソプロピル−チオ−β−ガラクトシドは、それぞれ７５ｍｇ／ｌ、５０ｍｇ／ｌ、５０ｍｇ／ｌ及び１０ｍｇ／ｌで、合成酵素基質を除かれたCPS ID 3培地（ビオメリュー）に加えられる。これらの培地は、１つのシャーレにつき２０ｍｌの割合で分配される。一般に尿サンプルから単離された微生物及び出願人のコレクションに由来する微生物は、０．５のマクファーランドを１／２０に希釈した１０μｌの懸濁液の半定量的単離によってこれらの培地上に接種される。シャーレは３７℃で２４時間インキュベートされた。
２４時間のインキュベートの後、形成されたコロニーは視覚的に調べられる。これらのコロニーの呈色反応は、記録される。インドールテストは、ジェームズ試薬（ビオメリュー）を使用して無色のコロニーに実施される。結果は、下記の表４に示される：  
表４：トリプトファン濃度の大腸菌の無色コロニーの検出への影響
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５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−α−ガラクトシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルコシドを組合せてなる培地で、無色コロニーによるインドールの生産が大腸菌を検出するための感度を増大できることは、上の表４から明白である。
【国際調査報告】
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