(57)【要約】  骨形態発生タンパク質溶液を安定化させるための改善された組成物及び方法が提供される。この組成物はＧＤＦ−５の水溶液及び生体適合性酸（塩酸、酢酸、リン酸、又はトリフルオロ酢酸など）を含み、この溶液のｐＨは約３．０〜約３．６であり、これにより、取扱い時及び低温での長期保存中のＧＤＦ−５タンパク質の安定性改善がもたらされる。
2010535780.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨが約３．０〜約３．６である酸性水溶液中に、ＧＤＦ−５及び生体適合性酸を含む、組成物。
【請求項２】
前記ｐＨが約３．２〜約３．４である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記生体適合性酸が、塩酸、酢酸、リン酸、及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記生体適合性酸が、約１．０〜約１．３ｍＭの量で存在する塩酸である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記生体適合性酸が、約２０〜約５０ｍＭの量で存在する酢酸である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
ａ．ｐＨが約３．０〜約３．６である酸性水溶液中の、ＧＤＦ−５及び生体適合性酸の試料を提供する工程、並びに、
ｂ．ＧＤＦ−５の該溶液を約２℃〜約８℃の温度に冷却する工程、
を含む、ＧＤＦ−５タンパク質溶液を安定化する方法。
【請求項７】
前記溶液が約−２０℃まで更に冷却される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記溶液が約−８０℃まで更に冷却される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＤＦ−５がｒｈＧＤＦ−５である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＧＤＦ−５がｒｈＧＤＦ−５であり、前記生体適合性酸が１ｍＭ塩酸である、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、取扱い時及び低温での長期保存中の安定性改善のための、骨形態発生タンパク質の液体組成物に関連するものである。より具体的には、本発明は、取扱い時及び低温での長期保存中のタンパク質安定性が改善された、ｐＨが約３．０〜約３．６の酸性溶液中にＧＤＦ−５を含む生体適合性液体組成物に関するものである。
【０００２】
〔背景技術〕
ＧＤＦ−５は、タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーのサブクラスである、骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ）のメンバーである。ＧＤＦ−５は、リー（Lee）（米国特許第５，８０１，０１４号）により、最初にマウスから単離されたｍＧＤＦ−５を含む、数種の変異体及び突然変異体を含む。他の変異体としては、ｈＧＤＦ−５、及びＬＡＰ−４としても知られている（トリアントフィロー（Triantfilo）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２、３３８〜３４５（２００１年））、ＧＤＦ−５のヒト型の特許名（国際出願特許第９５／０４８１９号）であるＭＰ５２；また、ｈＧＤＦ−５の対立遺伝子タンパク質変異体である、ＣＤＭＰ−１（国際出願特許第９６／１４３３５号）；また、細菌で製造される組換えヒト型である、ｒｈＧＤＦ−５（欧州特許第０９５５３１３号）；また、ｒｈＧＤＦ−５の単量体変異体である、ｒｈＧＤＦ−５−Ａｌａ８３；ｈＧＤＦ−５／ＣＤＭＰ−１様タンパク質の総称である、ＢＭＰ−１４；また、世界保健機関により指定された国際非専売名であるラドテルミン（Radotermin）；また、ＭＰ５２の高分子量タンパク質変異体である、ＨＭＷ  ＭＰ５２；また、分子間架橋に関与するシステイン残基がアラニンで置換されている単量体バージョンである、Ｃ４６５Ａ；また、Ｎ４４５Ｔ、Ｌ４４１Ｐ、Ｒ４３８Ｌ、及びＲ４３８Ｋを含む、他の活性モノマー及び単一アミノ酸置換突然変異体が挙げられる。本出願の目的に関して、用語「ＧＤＦ−５」は、ＧＤＦ−５タンパク質の全ての変異体及び突然変異体を含むことを意味し、ｒｈＧＤＦ−５は、１１９個のアミノ酸を有するその例示的なメンバーである。
【０００３】
ＢＭＰファミリーの全てのメンバーは、カルボキシ末端活性ドメインを含む共通構造特性を共有し、３つの分子内ジスルフィド結合及び１つの分子間ジスルフィド結合を作製するシステイン残基の高度に保存されたパターンを共有する。活性型は、単一ファミリーメンバーがジスルフィド結合したホモ二量体、又は２種の異なるメンバーのヘテロ二量体のいずれであってもよい（マサック（Massague）ら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：９５７  （１９９０年）；サンパス（Sampath）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６５：１３１９８（１９９０年）；セレステ（Celeste）ら、ＰＮＡＳ  ８７：９８４３〜４７（１９９０年）；米国特許第５，０１１，６９１号、及び米国特許第５，２６６，６８３号を参照のこと）。ＧＤＦ−５タンパク質の適切な折り畳み、及びこれらのジスルフィド結合の形成は、生物学的機能に必須であり、誤った折り畳みがあると、不活性な凝集体、及び開裂された断片が生じる。
【０００４】
遺伝子組換え細菌からのＢＭＰの生成、特にＧＤＦ−５の生成は、プラスミドベクターを利用して大腸菌を形質転換し、高収量でモノマーＧＤＦ−５タンパク質を産生させる（例えばホッテン（Hotten）米国特許第６，７６４，９９４号及びマキシマ（Makishima）米国特許第７，２３５，５２７号を参照）。このモノマーは、封入体から得られ、これを精製、及び再折り畳みすることによりＧＤＦ−５のホモ二量体として、生物学的活性を有するＧＤＦ−５タンパク質の二量体を生成する。二量体に至るこの工程では、ＧＤＦ−５タンパク質の分離及び精製を可能にするために、製薬上受容されないさまざまな材料を利用して溶解度特性を改変する。
【０００５】
一般にタンパク質の分解については数多くの文献に記述されているが、骨形態発生タンパク質、特にＧＤＦ−５の保存性及び溶解度についてはあまり記述されていない。ＢＭＰ−２はｐＨが６未満のとき１ｍｇ／ｍＬを上回る濃度で容易に可溶であり、ｐＨが６を上回る場合は１Ｍ  ＮａＣｌ、３０％イソプロパノール、又は０．１ｍＭヘパリンを加えることによって溶解度を高めることができる（ルパート（Ruppert）ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３７、２９５〜３０２（１９９６年））。ＧＤＦ−５は生理学的ｐＨ範囲及び緩衝液中ではほぼ不溶性であり、極度のｐＨでのみ水に可溶性である（ホンダ（Honda）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８９（６）、５８２〜５８９（２０００年））。ＧＤＦ−５は約９．５〜１２．０のアルカリ性ｐＨで可溶性であるが、この条件下ではタンパク質が急速に分解するため、ＧＤＦ−５タンパク質の調製には酸性条件が使用される。
【０００６】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
ＧＤＦ−５タンパク質の生体適合性組成物は、タンパク質の妥当な溶解度と同時に安定性を得るのに大きな困難を抱えている。ＧＤＦ−５タンパク質の現行の保存方法は、長期間保存には１０ｍＭ  ＨＣｌをｐＨ２及び−８０℃で利用されているが、これらの条件であっても、特に凍結−解凍サイクルを繰り返した場合、いくらかのタンパク質の分解が起こる。我々はＧＤＦ−５タンパク質の遅い溶出群にトリプシン消化を実施し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱着イオン化−飛行時間型質量分析法）分析を用いて非トリプシンのペプチド断片を見出した。これは、保存及びその後の断片凝集中に、酸触媒によるタンパク質の開裂が起きていることを示す。また別個に、ＧＤＦ−５タンパク質溶液に凍結−解凍サイクルと長時間の高温曝露を連続して実施した。これらの試験結果両方から、現行の１０ｍＭ  ＨＣｌ保存溶媒中ではタンパク質の分解があることが示された。よって、ＧＤＦ−５タンパク質溶液の取扱い及び保存のための、組成物の改善の必要性が存在する。
【０００７】
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、改善された安定性のＧＤＦ−５タンパク質を提供する、ＧＤＦ−５溶液の取扱い及び低温での長期保存のための組成物を提供する。保存溶液のｐＨを２から約３へと上昇させることにより、ＧＤＦ−５タンパク質の溶解度に悪影響を与えることなく、このタンパク質の安定性が顕著に改善される。適切な溶媒系としては、約３．０〜約３．６のｐＨを提供する量での塩酸（ＨＣｌ）、酢酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、及びリン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】還元性及び非還元性のさまざまなＧＤＦ−５組成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。
【図２】さまざまなＧＤＦ−５組成物の円二色性解析。
【図３】ストック１０ｍＭ  ＨＣｌ  ＧＤＦ−５溶液を更に水で希釈したものの円二色性解析。
【図４ａ】１０ｍＭ  ＨＣｌ中のＧＤＦ−５溶液のＤＳＣスペクトル。
【図４ｂ】１ｍＭ  ＨＣｌ中のＧＤＦ−５溶液のＤＳＣスペクトル。
【図４ｃ】０．０１％（体積比）ＴＦＡ中のＧＤＦ−５溶液のＤＳＣスペクトル。
【図４ｄ】０．０１％（体積比）リン酸中のＧＤＦ−５溶液のＤＳＣスペクトル。
【図４ｅ】０．０１％（体積比）酢酸中のＧＤＦ−５溶液のＤＳＣスペクトル。
【図５ａ】１０ｍＭ  ＨＣｌ中のＧＤＦ−５参照基準のｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図５ｂ】５回の凍結−解凍サイクル後の１０ｍＭ  ＨＣｌ中のＧＤＦ−５の、ｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図５ｃ】５回の凍結−解凍サイクル後の５０ｍＭ酢酸中のＧＤＦ−５の、ｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図５ｄ】５回の凍結−解凍サイクル後の０．０１％（体積比）ＴＦＡ中のＧＤＦ−５の、ｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図５ｅ】５回の凍結−解凍サイクル後の１ｍＭ  ＨＣｌ中のＧＤＦ−５の、ｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図６】図５ｂ〜ｅに示されているさまざまな試料のピーク１の変化率。
【図７】室温に６日間置いた後の１２ｍＭ  ＨＣｌ中のＧＤＦ−５の、ｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図８】室温におけるさまざまな溶媒中にあるＧＤＦ−５の分解傾向。
【図９】２〜８℃におけるさまざまな溶媒中にあるＧＤＦ−５の分解傾向。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
我々は、取扱い時及び保存中のＧＤＦ−５タンパク質溶液の安定性を改善するため、数多くの異なる溶媒系の使用を調べ、ここに、このタンパク質を取り扱うための有用な組成物を記載する。ＧＤＦ−５の発見及びそれ以降の組換えヒト型の開発以来、ＧＤＦ−５は、そのタンパク質構造を保存するため、−８０℃において１０ｍＭ  ＨＣｌ溶媒系中に保存されてきた。ＧＤＦ−５は、グリコシル化を行わないという理由もあって、ＢＭＰ−２などの他のＢＭＰよりも溶解度が低い（ＢＭＰ−２については数多くの科学文献によって対象とされている）。ＧＤＦ−５の溶解度及び安定性について入手できる報告は、たとえあるとしてもほとんどない。ＧＤＦ−５単量体をプラスミド形質転換細菌から調製及び単離し、次に再折り畳みにより二量体にすることは、生理活性を有する二量体の取扱い及び保存とは異なる、一連の課題及び問題を提示する。一方、生体適合性組成物において成熟した二量体ＧＤＦ−５タンパク質を取扱う際は、別の一連の問題が生じ、文献ではそのＧＤＦ−５タンパク質の溶解度及び安定性に関する生理化学的情報はほとんど明らかにされていない。
【００１０】
本発明の目的は、取扱い時及び保存中のタンパク質安定性を改善するような溶媒系におけるＧＤＦ−５タンパク質の組成を提供することである。本発明の別の目的は、低温における長期保存中に安定なＧＤＦ−５タンパク質の生体適合性溶液を提供することである。本発明のまた別の目的は、室温における取扱い時に安定なＧＤＦ−５タンパク質の生体適合性溶液を提供することである。本発明のまた別の目的は、ＧＤＦ−５タンパク質が安定化され、酸触媒開裂に対する脆弱性が低下し、しかも有用な溶解度が維持されるような、ｐＨが約３．０〜約３．６の溶媒系を提供することにより、ＧＤＦ−５タンパク質溶液を保存する方法を提供することである。
【００１１】
この出願の目的に関して、下記の用語の定義が有用となろう。用語「ＧＤＦ−５」は、ＧＤＦ−５タンパク質分子のすべての類似物、変異体及び突然変異体を含むことが意図されており、例えばＧＤＦ−５、ｍＧＤＦ−５、ｈＧＤＦ−５、ＭＰ−５２、ＬＡＰ−４、ラドテルミン、ＣＤＭＰ−１、Ｃ４６５Ａ、及びｒｈＧＤＦ−５が挙げられるが（これらに限定されない）、ｒｈＧＤＦ−５がこの群の例示的なメンバーである。用語「ＧＤＦ−５」はまた、生物学的活性を同様に示すことが分かっている単量体ＧＤＦ−５タンパク質を含むと理解される。用語「室温」は本明細書において「ＲＴ」又は「Ｒ．Ｔ．」と略され、普通のオフィス又は実験室の周囲温度を意味するものと理解され、約１８〜約２５℃である。用語「バルク」は本明細書において「バルクタンパク質」又は「バルク溶液」として記述されるとき、１０ｍＭ  ＨＣｌ中のＧＤＦ−５溶液で、その生成過程で単離及び精製された後−８０℃で保存されたものを意味するものと理解され、用語「ストック」、「ストックタンパク質」、及び「ストック溶液」と同義である。
【００１２】
我々は、バルクＧＤＦ−５溶液についていくつかの研究を行い、タンパク質分解の度合、及びＧＤＦ−５タンパク質の取扱い及び保存のための溶媒系及び条件の改善の必要性について究明した。我々は、ＨＥＡＬＯＳ（商標）鉱化コラーゲンスポンジにＧＤＦ−５タンパク質１０ｍＭ  ＨＣｌ溶液を染み込ませ次に凍結乾燥したものから単離されたＧＤＦ−５タンパク質の抽出物から得られた遅い溶出ピーク（凝集体）にトリプシン消化を実施した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析を実施した。非トリプシン断片が観察され、これはＧＤＦ−５タンパク質の酸触媒開裂を示唆するものであった。
【００１３】
ＧＤＦ−５の取扱い及び保存のために改善された組成物を発見する努力として、我々は、１０ｍＭ  ＨＣｌ（バルクタンパク質の現行の溶媒系）、１ｍＭ  ＨＣｌ、０．０１％（体積比）酢酸、０．０１％（体積比）ＴＦＡ、及び０．０１％（体積比）リン酸の５種類の異なる溶媒環境において、このタンパク質の生理化学的特性を調べた。ＧＤＦ−５タンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析は、マサチューセッツ州ボストンにあるダナ・ファーバー癌研究所（Dana-Farber Cancer Institute）の質量分析計コア施設（Mass Spectrometry Core Facility）で実施された。試料をシナピン酸と混合し、ステンレススチール製プレート上にスポット状に置いて乾燥させ、ボヤージャー（Voyager）ＤＥ−ＳＴＲ質量分析計（製造はアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社、マサチューセッツ州フラミンガム）のリニアモードで解析を行った。ピーク高さ解析によって見積もられた凝集体パーセンテージは、１０ｍＭ  ＨＣｌ中では約２３．５％であり、一方他の４種の溶媒中では８〜１２％であった。この見積りにおいて、２７ｋＤａを上回る質量は凝集体であると仮定された。ＭＡＬＤＩは定量的技法ではないため、各溶媒中の凝集体の絶対的なパーセンテージは近似値でしかないことに注意すべきである。にもかかわらず、このデータは、他の４種の溶媒に比べ１０ｍＭ  ＨＣｌにおける凝集体の割合が大きいことを明らかに示していた。
【００１４】
我々は同じ溶媒系群においてＧＤＦ−５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を実施した。図１は、５種類の異なる溶媒環境（１０ｍＭ  ＨＣｌ、１ｍＭ  ＨＣｌ、０．０１％（体積比）ＴＦＡ、０．０１％（体積比）酢酸、及び０．０１％（体積比）リン酸）における、還元性及び非還元性のＧＤＦ−５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。非還元性ゲルにおいて、少量の凝集体が観察され、一方還元性ゲルでは、おそらく酸開裂によるものと思われる低分子量種の存在が明らかに示唆された。５種類の異なる溶媒環境において再構成されたＧＤＦ−５のマイグレーションプロファイル間には、有意な差は見られなかった。
【００１５】
また、同じ５種類の溶媒環境（１０ｍＭ  ＨＣｌ、１ｍＭ  ＨＣｌ、０．０１％（体積比）ＴＦＡ、０．０１％（体積比）酢酸、及び０．０１％（体積比）リン酸）において、ＧＤＦ−５タンパク質の遠紫外線円二色性（ＣＤ）解析を実施した。その結果を、重ね合わせたプロットとして図２に示す。１０ｍＭ  ＨＣｌ中のＧＤＦ−５の固有ＣＤスペクトルが、明らかに他の溶媒中のスペクトルとは異なることが示されている。他の４種類の溶媒環境を互いに比較したところ、ＧＤＦ−５の二次的構造分布に有意な差は見られなかった。別の実験において、バルクＧＤＦ−５溶液（１０ｍＭ  ＨＣｌ中で３．８ｍｇ／ｍＬ）を水で希釈して、望ましいタンパク質濃度０．２ｍｇ／ｍＬとし、同時にｐＨを（希釈により）高めて、次に、水をブランクとして用いてＣＤ解析を実施した。図３にそのスペクトルが示されており、ＧＤＦ−５の微妙なｐＨ依存構造変化が明らかに示されている。ｐＨ３では、それより低いｐＨのスペクトルに比べて、ＧＤＦ−５タンパク質は比較的構造化されており、ランダムさが低く、ベータ寄与が大きい。
【００１６】
我々は、同じ５種類の溶媒環境（１０ｍＭ  ＨＣｌ、１ｍＭ  ＨＣｌ、０．０１％（体積比）酢酸、０．０１％（体積比）ＴＦＡ、及び０．０１％（体積比）リン酸）において、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）解析を実施した。図４ａ〜４ｅには、装置基準並びに溶媒の減算及び濃度正規化を行った後の、試料のＤＳＣ温度データを示す。１０ｍＭ  ＨＣｌ中のバルクＧＤＦ−５（図４ａ）は、Ｔｍ＜３０℃で弱い熱遷移を示し、また６５℃近くで広く弱い遷移を示している。熱遷移は著しく乏しかった。これに対し、１ｍＭ  ＨＣｌ（図４ｂ）、０．０１％（体積比）ＴＦＡ（図４ｃ）、及び０．０１％（体積比）リン酸（図４ｄ）に対して透析されたＧＤＦ−５タンパク質では、４０℃近くで大きな遷移が、及び８５℃近くで小さな吸熱的遷移が示された。０．０１％（体積比）酢酸（図４ｅ）の結果では、Ｔｍ１〜６０℃、及びＴｍ２〜９４℃と、両方の遷移において顕著な上昇が示された。熱力学的パラメーター、即ちΔＨ値及びΔＳ値も、０．０１％（体積比）酢酸において顕著に高かった。この結果から、ＧＤＦ−５タンパク質の熱安定性は、酢酸環境中、又はより高いｐＨにおいて大きくなることが示唆される。過去の研究において、分子間ジスルフィド架橋を形成することのできないＣ４６５Ａ単量体では、４０℃付近での最初の吸熱が示されていないため、この遷移は２つの単量体単位間のジスルフィド相互作用を表わしていることが示唆される。
【００１７】
別の実験群において、我々は、１０ｍＭ  ＨＣｌ中のＧＤＦ−５に対し凍結−解凍サイクルをわずか２回行っただけで、ｒｐ−ＨＰＬＣにより示されるように、断片及び分解生成物が実質的に増加し得ることを示した。図５ａは、バルクＧＤＦ−５の参照基準のｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラムであり、良好な純度及び非常にわずかな別ピークが示されている。図５ｂは、凍結−解凍サイクルを５回行った後のバルクＧＤＦ−５のｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラムであり、断片の増加が別のピーク（ピーク１＆ピーク２）として現われていることが示されている。図５ｃは、凍結−解凍サイクルを５回行った後の５０ｍＭ酢酸中ＧＤＦ−５のｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラムであり、別のピーク（ピーク１＆ピーク２）として現われている断片増加が、たとえあるとしてもほとんどないことが示されている。図５ｄは、凍結−解凍サイクルを５回行った後の０．０１％（体積比）ＴＦＡ中ＧＤＦ−５のｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラムであり、別のピーク（ピーク１＆ピーク２）として現われている断片増加が、たとえあるとしてもほとんどないことが示されている。図５ｅは、凍結−解凍サイクルを５回行った後の１ｍＭ  ＨＣｌ中ＧＤＦ−５のｒｐ−ＨＰＬＣクロマトグラムであり、別のピーク（ピーク１＆ピーク２）として現われている断片増加が、たとえあるとしてもほとんどないことが示されている。
【００１８】
図６はピーク１の変化だけを直接比較したプロットであり、１０ｍＭ  ＨＣｌ試料中のＧＤＦ−５タンパク質のピーク１は、凍結−解凍サイクルをわずか２回行った後に約３０％の増加を示しており、一方、他の溶媒系では、凍結−解凍サイクルを５回行った後にもピーク１は最小限の変化が示されている。凍結−解凍サイクルを５回行った後、バルク１０ｍＭ  ＨＣｌ溶液のピーク１の変化率は約７５％であり、他の溶媒系ではピーク１の変化はごくわずかであることが示された。
【００１９】
別の実験群において、我々は、２〜８℃及び室温（ＲＴ、約２５℃）の温度で液体ＧＤＦ−５タンパク質溶液に安定性改善を提供するための、さまざまな溶媒系の可能性を調べた。これらの実験において、ＧＤＦ−５タンパク質の安定性は、１．３ｍＭ  ＨＣｌ、５ｍＭ  ＨＣｌ、１２ｍＭ  ＨＣｌ、０．０１％（体積比）ＴＦＡ、及び５０ｍＭ酢酸の各溶媒について、ｒｐ−ＨＰＬＣによって評価された。ＧＤＦ−５タンパク質溶液試料は、選択した溶媒とともに２〜８℃に一晩置いて透析することによって調製され、これを小さいバイアルに約１ｍＬ／バイアルの量で等分に分けて移し、これらを適宜に２〜８℃又は室温に置いた。各指定の時刻ポイントにおいて、各セットのバイアルを１つ取り出し、解析の実施まで−８０℃で保管した。その結果、ＧＤＦ−５は、５０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．３）溶液及び０．０１％（体積比）ＴＦＡ（ｐＨ３．３）溶液の両方とも、室温に３日間置いたものにおいて安定であり、１．３ｍＭ  ＨＣｌ（ｐＨ３．３）に２日間置いたものにおいて安定であったが、５ｍＭ  ＨＣｌ（ｐＨ２．５）又は１２ｍＭ  ＨＣｌ（ｐＨ２．１）で室温に置いて２日後のものは安定ではなかった（図７及び８を参照）。
【００２０】
２〜８℃において、ＧＤＦ−５タンパク質は５０ｍＭ酢酸又は０．０１％（体積比）ＴＦＡ溶液中で少なくとも３０日間安定であり、１．３ｍＭ  ＨＣｌ中では少なくとも６日間安定であった。これに対して、ＧＤＦ−５タンパク質は５ｍＭ  ＨＣｌ溶液及び１２ｍＭ  ＨＣｌ溶液中において２〜８℃で分解され、２日後に分解種を形成していることがｒｐ−ＨＰＬＣによって証明された（図９を参照）。
【００２１】
下記の実施例は、本発明の性質を説明するための例に過ぎず、範囲を制限するものではない。当業者であれば、本発明の範囲内と見なされ得る他の実施形態が容易に想起されるであろう。
【実施例】
【００２２】
（実施例１）
４種類の異なる溶媒系、１ｍＭ  ＨＣｌ、０．０１％（体積比）酢酸、０．０１％（体積比）ＴＦＡ、及び０．０１％（体積比）リン酸を、現在使用されている標準の１０ｍＭ  ＨＣｌ溶媒系と比較して、ＧＤＦ−５タンパク質の安定性改善をもたらす能力に関して試験した。１０ｍＭ  ＨＣｌ中の約１〜２ｍＬのバルクＧＤＦ−５タンパク質（３．８ｍｇ／ｍＬ）を、解凍したばかりの試料から採取し、２〜８℃で２４時間透析し、試験溶液１リットルごとに３つの変化で、４種類の異なる溶媒系それぞれにＧＤＦ−５タンパク質溶液を生成した。透析の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ溶液に対して吸光係数１．１６、通路長さ１ｃｍを用いて、２８０ｎｍでの吸光度値から決定された。このＧＤＦ−５タンパク質溶液は次にＳＤＳ−ＰＡＧＥ、円二色法（ＣＤ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって解析された。
【００２３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＧＤＦ−５タンパク質試料は、バイオラッド（Bio-Rad）８〜１６％濃度勾配ゲルの適切な試料緩衝液（メーカー提供）で、５０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）含有のもの（還元性）又は非含有のもの（非還元性）のいずれかで希釈された。試料は９０℃で５分間加熱することにより変性され、次に５０００ｒｐｍで遠心機に短時間かけた。８〜１６％バイオラッド標準ゲルに１×トリスグリシンＳＤＳ泳動用緩衝液を加え、２００ボルト一定で１時間、電気泳動を実施した。ゲルを、１００ｍＬの１０％メタノール、７％酢酸（ルビー（Ruby）固定／除染溶液）中で、４５ｒｐｍの軌道振盪器に１時間かけて培養した。この固定溶液を別の容器に静かに移し、８０ｍＬのシプロルビー（Sypro-Ruby）（バイオラッド（Bio-Rad））を加えた。ゲルを４５ｒｐｍの軌道振盪器上にて、暗所で一晩培養した。このシプロルビーを別の容器に静かに移し、１００ｍＬ除染溶液を加えた。ゲルを、４５ｒｐｍの軌道振盪器上にて３時間培養した。最後に、ゲルを、バイオラッド・ゲル・ドック・イメージャー（Bio-Rad Gel Doc imager）で撮像した。
【００２４】
非還元性ゲル中において、少量の凝集体が観察され、一方還元性ゲル中では、おそらく酸開裂によるものと思われる低分子量種の存在が明らかに示唆された。５種類の異なる溶媒環境において再構成されたＧＤＦ−５のマイグレーションプロファイル間には、有意な差は見られなかった。
【００２５】
円二色性
円二色性解析は、ＡＶＩＶモデル６０ＤＳ円二色性光分散計（Circular Dichroism Spectropolarimeter）を用いて実施された。各試料について、１９０〜２５０ｎｍの間でスキャンが行われた。各スキャンについて、１ｎｍ間隔で、各間隔について２秒間、データが採取された。スキャン温度は２３℃であった。最終タンパク質濃度は０．２ｍｇ／ｍＬであった。データは、３回のスキャンの平均を表わした。緩衝液ブランクについても同一の条件下で記録が行われ、緩衝液ブランクのＣＤスペクトルを、各試料のＣＤスペクトルから差し引いた。測定はすべて、０．０１％ＴＦＡをブランクとして使用して行われた。キュベットの通路長さは１ｍｍであった。スキャンは、平均残基重量（値１１５）を使用し、これを次の式に挿入することにより正規化された：
［θ］＝［０．１×Ｒ残基］／［濃度（ｍｇ／ｍｏｌ）×光路］
［θ］の値が、各波長について計算されて、平均残基楕円率となった。最後に、プログラムＰＲＯＳＥＣ  ｖ．２．１（著作権１９８７年、アビブアソシエーツ（AVIV Associates））を使用して、二次構造の見積りを行った。
【００２６】
示差走査熱量測定
図４ａ〜４ｅには、装置基準並びに溶媒の減算及び濃度正規化を行った後の、５種類の異なる溶媒環境におけるＧＤＦ−５タンパク質のＤＳＣ温度データを示す。試料は−８０℃で保存されており、これを解凍して、室温で８分間攪拌しながら減圧下で脱気してから、ＤＳＣセルに入れ、マイクロカル（MicroCal）ＶＰ−ＤＳＣで、６０℃／時で５〜１００℃の範囲を二重にスキャンした。タンパク質濃度はすべての試料について０．５１ｍｇ／ｍＬであった。１０ｍＭ  ＨＣｌ中のバルクＧＤＦ−５は、Ｔｍ＜３０℃で弱い熱遷移を示し、６５℃近くで広く弱い遷移を示した。熱遷移は著しく乏しかった。これに対し、１ｍＭ  ＨＣｌ、０．０１％ＴＦＡ及び０．０１％リン酸に対して透析されたタンパク質では、４０℃近くで大きな遷移、及び８５℃近くで小さな吸熱的遷移が示された。０．０１％酢酸の結果では、Ｔｍ１〜６０℃、及びＴｍ２〜９４℃と、両方の遷移において顕著な上昇が示された。熱力学的パラメーター、すなわちΔＨ値及びΔＳ値も、０．０１％酢酸試料において顕著に高かった。この結果から、このタンパク質の熱安定性は、酢酸環境中、又はより高いｐＨにおいて、大きくなることが示唆される。過去の研究において、分子間ジスルフィド架橋を形成することのできないＣ４６５Ａ単量体では、４０℃付近での最初の吸熱が示されていないため、この遷移は２つの単量体単位間のジスルフィド相互作用を表わしていることが示唆される。
【００２７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：
５種類の異なる溶媒環境における、完全な形のタンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析が、マサチューセッツ州ボストンにあるダナ・ファーバー癌研究所（Dana-Farber Cancer Institute）の質量分析計コア施設（Mass Spectrometry Core Facility）で実施された。試料をシナピン酸と混合し、ステンレススチール製プレート上にスポット状に置いて乾燥させ、ボヤージャー（Voyager）ＤＥ−ＳＴＲ質量分析計（製造はアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社、マサチューセッツ州フラミンガム）のリニアモードで解析を行った。いずれの溶媒においても、主な二量体並びに他のより大きなオリゴマー種の重量平均分子量に、有意な差は観察されなかった。５つのスペクトルはすべて、１００％相対強度に正規化された状態で２７ｋＤａピークを有していた。ピーク高さ解析によって見積もられた凝集体パーセンテージは、１０ｍＭ  ＨＣｌ中では約２３．５％であり、一方他の４種の溶媒中では８〜１２％であった。この見積りにおいて、２７ｋＤａを上回る質量は凝集体であると仮定された。ＭＡＬＤＩは定量的技法ではないため、各溶媒中の凝集体の絶対的なパーセンテージは近似値でしかないことに注意すべきである。にもかかわらず、このデータは、他の４種の溶媒に比べ１０ｍＭ  ＨＣｌにおける凝集体の割合が大きいことを明らかに示している。
【００２８】
全体的に、これらの結果を組み合わせると、試験されたＧＤＦ−５タンパク質は、４つの異なる溶媒系それぞれにおいて、連続希釈において良好な線形性を有し、１０ｍＭ  ＨＣｌ組成物を超えて改善された安定性が示された。
【００２９】
（実施例２）
２０ｍＭ酢酸におけるＧＤＦ−５の溶解度を評価する試みが実施された。１０ｍＭ  ＨＣｌ（３．８ｍｇ／ｍＬ）中のストックＧＤＦ−５を、３，５００ＭＷのカットオフ膜を用いて２０ｍＭ酢酸に対して透析し、次に凍結乾燥した後、その乾燥質量を２０ｍＭ酢酸中に再構成した。２８０ｎｍでのＯＤが測定された。２０ｍＭ酢酸中の〜６．５ｍｇ／ｍＬのＧＤＦ−５で透明な溶液が容易に得られることが示された。別の試みにおいて、２０ｍＭ酢酸中のＧＤＦ−５タンパク質を凍結乾燥し、１ｍＭ  ＨＣｌ中に再構成した。ここでも２８０ｎｍでのＯＤが測定され、その結果、ＧＤＦ−５タンパク質濃度が〜６．５ｍｇ／ｍＬの透明な溶液が容易に得られることが示された。
【００３０】
（実施例３）
さまざまな保存溶媒（１ｍＭ  ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＨＣｌ、０．０１％（体積比）ＴＦＡ、及び５０ｍＭ酢酸）において、５回の凍結／解凍サイクルを経たＧＤＦ−５タンパク質の安定性が評価された。１０ｍＭ  ＨＣｌ中のバルクＧＤＦ−５を−８０℃から取り出し、２〜８℃で解凍した。次にこのＧＤＦ−５タンパク質溶液を、選択した溶媒で２〜８℃において一晩透析した（透析カセット：ピアス（Pierce）、カタログ番号６６３８０、１００００ＭＷＣＯ）。透析した試料を小さいバイアルに約１ｍＬ／バイアルの量を移し、これらを−８０℃に置いた。凍結／解凍のサイクルごとに、試験試料を−８０℃で最低１９時間凍結させ、室温で最低５時間解凍した。各サイクルの終了時に各溶媒試料のバイアルを１つ取り出し、解析まで−８０℃に保存した。これによって、全ての試料が、外観評価、ｒｐ−ＨＰＬＣ、紫外線分光法、及びｐＨにより、同時に解析された。
【００３１】
ガラス製バイアルに入った試験試料の透明度及び粒子を調べた。試料バイアルを、黒色の背景に対し、垂直方向の光を使用して検査した。試験試料の透明度は、純水試料と比較された。すべての試料が澄んで透明であった。ＧＤＦ−５タンパク質は、５回の凍結／解凍サイクルを経た後も、３．６ｍｇ／ｍＬの濃度で依然として可溶性であった。
【００３２】
非還元性ｒｐ−ＨＰＬＣ法を使用して、ＧＤＦ−５タンパク質の含有量及び分解種の監視が行われた。簡単に説明すると、試験試料を１ｍＭ  ＨＣｌで希釈して０．１ｍｇ  ＧＤＦ−５／ｍＬとし、この希釈試料（５０μＬ）をＨＰＬＣカラム（バイダック（Vydac）２１８ＴＰ５２、Ｃ１８カラム）に直接注入し、これを０．１５％（体積比）ＴＦＡの水溶液及び０．１５％（体積比）ＴＦＡのアセトニトリル溶液で移動相として溶出させた。溶出ピークは、２１４ｎｍで観測された。ピーク面積を参照基準面積と比較して、ＧＤＦ−５タンパク質の含有量を調べた。各ピーク面積のパーセンテージを計算して、主ピーク及び小ピーク（分解ピーク）の変化を観測した。
【００３３】
代表的なクロマトグラムを図５ａ〜ｅに示す。ＧＤＦ−５の主ピーク及び他の分解ピークがこれらの図中に示されている。すべての保存条件における試料において、タンパク質濃度には有意な変化は観察されなかった。ＧＤＦ−５タンパク質は、１ｍＭ  ＨＣｌ、５０ｍＭ酢酸、及び０．０１％（体積比）ＴＦＡ溶液中では、５回の凍結／解凍サイクルを経た後も、主ピークが１００％再生され、安定であった。しかしながら、ＧＤＦ−５タンパク質の１０ｍＭ  ＨＣｌ溶液では安定性が低くなり、２回目の凍結／解凍サイクル後にピーク１が劇的に増大した（図６を参照）。
【００３４】
タンパク質含有量はまた、紫外線分光法によって測定された。試験試料を適切な溶媒で希釈してから解析を行った。ＧＤＦ−５の濃度は、２８０ｎｍにおいて吸光係数１．１６ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍを使用して計算された。紫外線による結果から、この研究の過程においてすべての試料においてタンパク質濃度には有意な変化がないことが示された。紫外線分光法によって測定されたタンパク質濃度とＨＰＬＣによって測定されたタンパク質濃度は、同様であった。試料のｐＨは、較正されたｐＨ計を使用して、希釈せずに直接測定された。すべての試料において、ｐＨは安定であり、保存条件によってｐＨがシフトすることはなかった。
【００３５】
この結果、ＧＤＦ−５タンパク質は、１ｍＭ  ＨＣｌ、５０ｍＭ酢酸、及び０．０１％（体積比）ＴＦＡ溶液中では、５回の凍結／解凍サイクルを経た後も安定であることが示された。これに対して、１０ｍＭ  ＨＣｌ溶液中ではＧＤＦ−５は安定性が低くなり、２回目の凍結／解凍サイクルを経た後に分解種が形成され始めていた。
【００３６】
（実施例４）
この実施例では、さまざまな酸性溶媒（１．３ｍＭ  ＨＣｌ、５ｍＭ  ＨＣｌ、１２ｍＭ  ＨＣｌ、０．０１％（体積比）ＴＦＡ、及び５０ｍＭ酢酸）において、２〜８℃、また室温（約２５℃）に、長期間曝露した場合の、ＧＤＦ−５タンパク質の安定性が評価された。１０ｍＭ  ＨＣｌ中のバルクＧＤＦ−５を−８０℃から取り出し、２〜８℃で解凍した。次にこのＧＤＦ−５タンパク質溶液を、選択した溶媒で２〜８℃において一晩透析した（透析カセット：ピアス（Pierce）、カタログ番号６６３８０、１００００ＭＷＣＯ）。この透析された試料を小さいバイアルに約１ｍＬ／バイアルの量で等分に分けて移し、これらを適宜に２〜８℃又は室温に置いた。各指定の時刻ポイントにおいて、各セットのバイアルを１つ取り出し、ｒｐ−ＨＰＬＣ、紫外線分光法、及びｐＨ計を使用した解析の実施まで−８０℃で保管した。
【００３７】
その結果、ＧＤＦ−５は、５０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．３）溶液及び０．０１％（体積比）ＴＦＡ（ｐＨ３．３）溶液の両方とも、室温に３日間置いたものにおいて安定であり、１．３ｍＭ  ＨＣｌ（ｐＨ３．３）に２日間置いたものにおいて安定であったが、５ｍＭ  ＨＣｌ（ｐＨ２．５）又は１２ｍＭ  ＨＣｌ（ｐＨ２．１）で室温に置いたものは安定ではなかった。２〜８℃において、ＧＤＦ−５タンパク質は５０ｍＭ酢酸又は０．０１％（体積比）ＴＦＡ溶液中で少なくとも３０日間安定であり、１．３ｍＭ  ＨＣｌ中では少なくとも６日間安定であった。これに対して、５ｍＭ  ＨＣｌ並びに１２ｍＭ  ＨＣｌ溶液で２〜８℃に置いた場合、ＧＤＦ−５は急速に分解し、６日以内に分解種を形成していることがＨＰＬＣによって証明された（図９を参照）。ＨＣｌを使用した研究は、６日間で停止された。
【００３８】
本発明は具体的な実施形態を参照して記述されているが、ＧＤＦ−５タンパク質溶液のｐＨを上昇させる方法及び手段の変更及び修正は、当業者に容易に明らかとなろう。そのような変更及び修正は、添付する特許請求の範囲内にあることを意図している。
【００３９】
〔実施態様〕
（１）  ｐＨが約３．０〜約３．６である酸性水溶液中に、ＧＤＦ−５及び生体適合性酸を含む、組成物。
（２）  前記ｐＨが約３．２〜約３．４である、実施態様１に記載の組成物。
（３）  前記生体適合性酸が、塩酸、酢酸、リン酸、及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択される、実施態様１に記載の組成物。
（４）  前記生体適合性酸が、約１．０〜約１．３ｍＭの量で存在する塩酸である、実施態様３に記載の組成物。
（５）  前記生体適合性酸が、約２０〜約５０ｍＭの量で存在する酢酸である、実施態様３に記載の組成物。
（６）  ａ．ｐＨが約３．０〜約３．６である酸性水溶液中の、ＧＤＦ−５及び生体適合性酸の試料を提供する工程、並びに、
ｂ．ＧＤＦ−５の該溶液を約２℃〜約８℃の温度に冷却する工程、
を含む、ＧＤＦ−５タンパク質溶液を安定化する方法。
（７）  前記溶液が約−２０℃まで更に冷却される、実施態様６に記載の方法。
（８）  前記溶液が約−８０℃まで更に冷却される、実施態様６に記載の方法。
（９）  前記ＧＤＦ−５がｒｈＧＤＦ−５である、実施態様１に記載の組成物。
（１０）  前記ＧＤＦ−５がｒｈＧＤＦ−５であり、前記生体適合性酸が１ｍＭ塩酸である、実施態様１に記載の組成物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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