(57)【要約】  近赤外線光エネルギー及び線量測定を適用して、すべての照射された細胞の生体エネルギー論的な定常状態の膜貫通及びミトコンドリアポテンシャル(ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ)を、光による脱分極効果によって変えるためのシステム及び方法をここに開示する。この脱分極は、照射されたミトコンドリア及び原形質膜の膜貫通ポテンシャルΔΨの絶対値の付随的な減少を引き起こす。多くの細胞の同化作用反応及び薬物耐性機構は、膜ポテンシャルΔΨの減少、プロトン起動力Δｐの密接に関連する弱化、及び関連する低下したリン酸化ポテンシャルΔＧｐによって一層機能的でなくされ且つ／又は弱められうる。照射露出領域内では、膜ポテンシャルΔΨの減少が、細菌、真菌及び哺乳動物細胞中で同時に起きる。この膜の脱分極は、標的とされた望ましくない細胞のみに対して、抗菌剤、抗真菌剤及び／又は抗新生物剤を強化する能力を与える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の適切な薬物；及び
ＮＩＭＥＬＳ照射λｎの出力をＮＩＭＥＬＳ線量測定Ｔｎにて発生して標的部位を照射するように構成されて配置されたＮＩＭＥＬＳ光発生レーザー、
を含む治療用システムであって、
該出力は、照射された細胞膜の膜双極子ポテンシャルΨｄを変え、それにより、ＮＩＭＥＬＳ効果を生じることができ、該ＮＩＭＥＬＳ効果は、該薬物の薬効を強化する当該治療用システム。
【請求項２】
前記のシステムが、前記の標的部位の生物学的部分に対する望ましくないダメージを回避するように構成されて配置されている、請求項１に記載の治療用システム。
【請求項３】
前記のＮＩＭＥＬＳ光発生レーザーが、波長８７０ｎｍ又は９３０ｎｍ又は両方の前記のＮＩＭＥＬＳ照射の出力を発生するように構成されて配置されている、請求項１に記載の治療用システム。
【請求項４】
前記のＮＩＭＥＬＳ光発生レーザーが、標的部位を５０〜１２００秒の時間(Ｔｎ)にわたって照射するように構成されて配置されている、請求項１に記載の治療用システム。
【請求項５】
前記のＮＩＭＥＬＳ線量測定が、前記の標的部位において、１００〜２０００Ｊ／ｃｍ2のエネルギー密度を与える、請求項１に記載の治療用システム。
【請求項６】
前記の出力を前記の標的部位において散乱させるように構成されて配置されている光分散用チップを更に含む、請求項１に記載の治療用システム。
【請求項７】
幾何学的に平坦な先端強度分布を有する出力を発生するように構成されて配置されている光送達用サブシステムを更に含む、請求項１に記載の治療用システム。
【請求項８】
前記の光送達用サブシステムが、平坦な先端のレンズを含む、請求項７に記載の治療用システム。
【請求項９】
光ファイバーを含む光送達用システムを更に含む、請求項１に記載の治療用システム。
【請求項１０】
前記のエネルギー出力を標的部位における全エネルギー又は出力のパワー若しくは時間の計算に基づいて調節して、定常状態の膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｓｔｅａｄｙを過渡的状態の膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｔｒａｎｓに変えることのできるＮｉｍｅｌｓ効果を造り出すように構成されて配置されている線量測定制御装置を更に含む、請求項１に記載の治療用システム。
【請求項１１】
前記の薬物が、抗菌（antibacterial）剤、抗真菌（antifungal）剤、抗新生物剤及びこれらの組合せよりなる群から選択される、請求項１に記載の治療用システム。
【請求項１２】
前記の抗菌剤が、β−ラクタム系抗生物質、糖ペプチド、環状ポリペプチド、マクロライド系抗生物質、ケトライド系抗生物質、アニリノウラシル、リンコサミド、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、アミノグリコシド、バシトラシン、セファゾリン、セファロスポリン、ムピロシン、ニトロイミダゾール、キノロン及びフルオロキノロン、ノボビオシン、ポリミキシン、カチオン性デタージェント抗生物質、オキサゾリジンオン又は他のヘテロ環状有機化合物、グリシルサイクリン、リポペプチド、環状リポペプチド、プレウロムチリン、及びグラミシジン、ダプトマイシン、リネゾリド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、モノバクタム、プラテンシマイシン、ストレプトグラミン、チニダゾール、並びにこれらの任意の塩を含むこれらの組合せよりなる群から選択される、請求項１１に記載の治療用システム。
【請求項１３】
前記の抗真菌剤が、ポリエン、アゾール、イミダゾール、トリアゾール、アリルアミン、エキノカンジン、シクロピロクス、フルシトシン、グリゼオフルビン、アモロロフィン、ソダリン、及びこれらの任意の塩を含むこれらの組合せよりなる群から選択される、請求項１１に記載の治療用システム。
【請求項１４】
抗新生物剤が、アクチノマイシン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、タキサン、エトポシド、テニポシド、及びこれらの組合せよりなる群から選択される、請求項１１に記載の治療用システム。
【請求項１５】
治療に有効な量の薬物；
脂質二重層の長鎖脂肪酸中のＣ−Ｈ共有結合を選択的に照射するために、ＮＩＭＥＬＳ照射λｎをＮＩＭＥＬＳ線量測定Ｔｎで発生して標的部位を照射するように構成されて配置されたＮＩＭＥＬＳ光発生レーザーであって、該共有結合の標的を定めた照射が、照射された細胞膜の膜双極子ポテンシャルΨｄを変えるのに有効であり、λｎとＴｎの組合せが、(ｉ)シトクロム鎖の照射、並びに(ii)膜の生体エネルギー状態を一つの熱力学的定常状態条件から一つの過渡的状態のエネルギーストレス及び／又はレドックスストレスの一つへの変更、に適している光発生レーザー；並びに
該ＮＩＭＥＬＳ照射λｎをＮＩＭＥＬＳ線量測定Ｔｎで標的部位に送達するのに適した光送達システムであって、該光送達システムが、該ＮＩＭＥＬＳ照射λｎを該ＮＩＭＥＬＳ線量測定Ｔｎで該標的部位に望ましい宿主細胞にダメージを与えずに送達するように構成されて配置されている光送達システム；
を含む治療用システム。
【請求項１６】
前記のＮＩＭＥＬＳ光発生レーザーが、５０〜１２００秒の時間(Ｔｎ)にわたって標的部位を照射するように構成されて配置されている、請求項１５に記載の治療用システム。
【請求項１７】
前記のＮＩＭＥＬＳ線量測定が、標的部位において、１００〜２０００Ｊ／ｃｍ2のエネルギー密度を与える、請求項１５に記載の治療用システム。
【請求項１８】
前記の薬物が、抗菌剤、抗真菌剤、抗新生物剤、及びこれらの組合せよりなる群から選択される、請求項１５に記載の治療用システム。
【請求項１９】
前記の抗新生物剤が、アクチノマイシン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、及びこれらの組合せよりなる群から選択される、請求項１８に記載の治療用システム。
【請求項２０】
前記の抗菌剤が、β−ラクタム系抗生物質、糖ペプチド、環状ポリペプチド、マクロライド系抗生物質、ケトライド系抗生物質、アニリノウラシル、リンコサミド、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、アミノグリコシド、バシトラシン、セファゾリン、セファロスポリン、ムピロシン、ニトロイミダゾール、キノロン及びフルオロキノロン、ノボビオシン、ポリミキシン、カチオン性デタージェント抗生物質、オキサゾリジンオン又は他のヘテロ環状有機化合物、グリシルサイクリン、リポペプチド、環状リポペプチド、プレウロムチリン、及びグラミシジン、ダプトマイシン、リネゾリド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、モノバクタム、プラテンシマイシン、ストレプトグラミン、チニダゾール、及びこれらの任意の塩を含むこれらの組合せよりなる群から選択される、請求項１８に記載の治療用システム。
【請求項２１】
前記の抗真菌剤が、ポリエン、アゾール、イミダゾール、トリアゾール、アリルアミン、エキノカンジン、シクロピロクス、フルシトシン、グリゼオフルビン、アモロロフィン、ソダリン、及びこれらの任意の塩を含むこれらの組合せよりなる群から選択される、請求項１８に記載の治療用システム。
【請求項２２】
前記のシステムが、プロトン起動力Δｐを変えるように構成されて配置されており、生物学的部分中の細胞又は生物学的夾雑物が、適切なＡＴＰを生成すること又は、該生物学的部分又は生物学的夾雑物におけるタンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、及び脂質の合成を含む、適切な成長及び繁殖に必要とされる必須栄養分を取ることを妨げられている、請求項１５に記載の治療用システム。
【請求項２３】
前記のシステムが、変化されたギブス自由エネルギー値、ΔＧｐにより利用可能なＡＴＰを、プロトン起動力Δｐと共役した前記の薬物のエネルギー依存性流出を損なうように低下させることにより、薬物を強化するように構成されて配置されている、請求項２２に記載の治療用システム。
【請求項２４】
２〜１０の値を有するＮＩＭＥＬＳ効果、Ｎｅを発生するように構成されて配置されている、請求項１５に記載の治療用システムであって、Ｎｅが、任意の組織、部分、又は溶液における微生物病原体に対する抗菌性強化のレベルを表す当該治療用システム。
【請求項２５】
前記の光送達システムが、平坦な先端レンズ、光ファイバー、又は分散用チップを含む、請求項１５に記載の治療用システム。
【請求項２６】
細胞同化経路を阻害して抗菌性分子に対する細胞耐性機構を弱化させるために、標的部位の細胞中のΔμＨ+又はΔμｘ+を減じる方法であって：
λｎ及びＴｎを組み合わせて標的部位を照射すること；
同時に、該標的部位のΔｐ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ、及び／又はΔｐ−ｐｌａｓ−Ｂａｃｔを減じること；及び
同時に又は順次的に、１の抗菌剤を該標的部位に投与すること
を含み、該標的部位における少なくとも一つの細胞同化経路の阻害を実現する当該方法。
【請求項２７】
前記の標的とされる同化経路が、ペプチドグリカン生合成であり、それは、細菌トランスペプチダーゼ酵素の活性部位に結合する前記の抗菌剤によって同時に標的とされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記の標的とされる細菌同化経路が、ペプチドグリカン生合成であり、それは、細胞壁中間体中のアシル−Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン基に結合する前記の抗菌剤によって同時に標的とされ、それにより、Ｎ−アセチルムラミン酸(ＮＡＭ)−及びＮ−アセチルグルコサミン(ＮＡＧ)−ペプチドサブユニットのペプチドグリカンマトリクスへの組込みが阻害され、それにより、グラム陽性細菌におけるペプチドグリカンの適切な形成が妨げられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記の標的とされる細菌同化経路が、ペプチドグリカン生合成であり、それは、前記の抗菌剤によって同時に標的とされ、該抗菌剤は、Ｃ55−イソプレニルピロホスフェートと結合し、それにより、ピロホスファターゼがＣ55−イソプレニルピロホスフェートと相互作用するのを防止し、それにより、ビルディングブロックペプチドグリカンを内膜の外側に運ぶのに利用することのできるＣ55−イソプレニルピロホスフェートの量を減少させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記の標的とされる同化経路が、細菌タンパク質の生合成であり、それは、細菌リボソームの５０Ｓサブユニット内の２３ＳｒＲＮＡ分子に結合し、それにより、ペプチジル−ｔＲＮＡを細胞内に蓄積させ、それにより、α−アミノ酸の活性化に必要な遊離のｔＲＮＡを涸渇させて、ペプチジルｔＲＮＡのリボソームからの早すぎる解離を引き起こすことによりトランスペプチデーションを阻害する、前記の抗菌剤によって同時に標的とされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記の抗菌剤が、５０Ｓの細菌リボソームサブユニットの２３ＳＲＮＡの２つのドメインに同時に結合し、それにより、細菌リボソームサブユニット５０Ｓ及び３０Ｓの形成を阻害する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記の抗菌剤が、その親油性を増大させるために塩素化されており、細菌リボソームの５０Ｓサブユニットの２３Ｓ部分に結合して、ペプチジル−ｔＲＮＡの活性部位(Ａ部位)からペプチジル部位(Ｐ部位)への移動を阻止し、それにより、トランスペプチダーゼ反応を阻害する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記の標的とされる同化経路が、細菌タンパク質の生合成であり、それは、３０Ｓ細菌リボソームサブユニットに結合し、それにより、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームのアクセプター部位(Ａ部位)への結合をブロックし、それにより、コドン−アンチコドン相互作用及びタンパク質合成の伸長期を阻害する、前記の抗菌剤により同時に標的とされる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記の抗菌剤が、前記の細菌リボソームに一層強力に、オクタヒドロテトラセン−２−カルボキサミド骨格を有する典型的サブクラスのポリケチド抗菌剤とは異なる向きで結合する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記の標的とされる同化経路が、細菌タンパク質の生合成であり、それは、特異的アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼに結合し、それにより、特異的アミノ酸又はその前駆体のその互換可能なｔＲＮＡの一つへのエステル化を防止し、そうして、アミノアシル−ｔＲＮＡの形成を防止する前記の抗菌剤によって同時に標的とされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記の標的とされる同化経路が、細菌タンパク質の生合成であり、それは、５０ＳｒＲＮＡに２３ＳｒＲＮＡのドメインＶを介して結合すると共に３０Ｓリボソームサブユニットの１６ＳｒＲＮＡと相互作用して、タンパク質合成のイニシエーターのホルミルメチオニン(ｆ−Ｍｅｔ−ｔＲＮＡ)と３０Ｓリボソームサブユニットとの結合を防止することにより、細菌タンパク質合成を開始期より前に阻害する前記の抗菌剤によって同時に標的とされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記の標的とされる同化経路が、細菌タンパク質の生合成であり、それは、細菌リボソームの５０Ｓサブユニットと、ペプチジルトランスフェラーゼセンター近くの２３ＳｒＲＮＡＰ部位の領域内でタンパク質Ｌ３にて相互作用し、それにより、ペプチジルトランスフェラーゼ活性及びペプチジルトランスファーを阻害し、Ｐ部位相互作用をブロックして、活性な５０Ｓリボソームサブユニットの正常な形成を防止する前記の抗菌剤によって同時に標的とされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
前記の標的とされる同化経路が、ＤＮＡの複製及び転写であり、それは、トポイソメラーゼＩＩ(ＤＮＡジャイレース)及び／又はトポイソメラーゼＩＶを阻害する前記の抗菌剤によって同時に標的とされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
前記の標的とされる同化経路が、ＤＮＡの複製及び翻訳であり、それは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩＣ(グラム陽性細菌における染色体ＤＮＡの複製に必要とされるが、グラム陰性細菌には存在しない酵素)を阻害する前記の抗菌剤によって同時に標的とされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
前記の標的とされる同化経路が、ＤＮＡの複製及び転写であり、それは、トポイソメラーゼＩＩ(ＤＮＡジャイレース)及び／又はトポイソメラーゼＩＶ及び／又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩＣを阻害する前記の抗菌剤によって同時に標的とされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項４１】
前記の標的とされる同化経路が、細菌リン脂質の生合成であり、それは、ホスファチジルエタノールアミンに富む細胞質膜に作用する前記の抗菌剤によって同時に標的とされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
前記の標的とされる同化経路が、細菌脂肪酸の生合成であり、それは、細菌の脂肪酸の生合成を、β−ケトアシル−(アシル−キャリアータンパク質(ＡＣＰ))シンターゼＩ／ＩＩ(ＦａｂＦ／Ｂ)(ＩＩ型脂肪酸の生合成に必須の酵素)の選択的ターゲティングによって阻害する前記の抗菌剤によって同時に標的とされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】
前記の標的とされる同化経路が、細菌原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔの維持であり、前記の抗菌剤が、細菌細胞膜機能を、グラム陽性細胞質膜への結合によって破壊し、それにより、脱分極及び膜ポテンシャルの喪失を引き起こし、それが、タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成の阻害へと導く、請求項２６に記載の方法。
【請求項４４】
前記の抗菌剤が、細菌細胞壁の透過性を増大させ、それにより、無機カチオンが該壁を自由に横切ることが可能となり、それにより、細胞質と細胞外環境との間のイオン勾配が消滅する、請求項２６に記載の方法。
【請求項４５】
前記の標的とされる同化経路が、細菌の膜の選択的透過性及び細菌の原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔの維持であり、前記の抗菌剤が、カチオン性抗菌性ペプチドであり、それは、該細菌の膜の負に帯電した表面に対して、真核細胞の中性の膜表面よりも選択的であり、その結果、細菌細胞膜の膜易透化並びに最終的な穿孔及び／又は崩壊を生じ、それにより、細菌細胞内容物の漏出及び膜貫通ポテンシャルの破壊を促進する、請求項２６に記載の方法。
【請求項４６】
前記の抗菌剤が、細菌プロテアーゼペプチドデホルミラーゼを阻害し、該デホルミラーゼが、新たに合成された細菌ポリペプチドのＮ末端からのホルミル基の除去を触媒する、請求項２６に記載の方法。
【請求項４７】
前記の抗菌剤が、細菌における２成分の調節システムを阻害し、該調節システムが、細菌原形質膜を横切るシグナル変換を介してそれらの環境に応答する能力を含み、これらのシグナル変換過程が、哺乳動物膜には存在しない、請求項２６に記載の方法。
【請求項４８】
前記の抗菌剤が、第二の分子と結合し又は該分子により送達され、該分子は、標的とされる細菌が該抗菌剤を弱め又は不活性化する耐性機構として産生する任意のタンパク質若しくは酵素に対して競争阻害剤として作用し、及び／又は、流出ポンプの阻害剤として作用し、その結果、該抗菌剤の効力の再生を補助する請求項２６に記載の方法。
【請求項４９】
細胞の同化経路を阻害して抗菌性分子に対する細胞耐性機構を弱化させるために、標的部位の細胞内のΔμＨ+又はΔμｘ+を減じる方法であって：
λｎとＴｎを組み合わせて標的部位を照射すること；
同時に、標的部位のΔｐ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ及び／又はΔｐ−ｐｌａｓ−Ｂａｃｔを減じること；及び
同時に又は順次的に、複数の抗菌剤を該標的部位に投与すること
を含み、該標的部位における少なくとも一つの細胞同化経路の阻害を実現する当該方法。
【請求項５０】
少なくとも一つの前記の抗菌剤を第二の分子と組み合わせ、該分子は、標的とされる細菌が該抗菌剤の一つを弱め又は不活性化するための耐性機構として産生する任意のタンパク質若しくは酵素に対する競争阻害剤として作用し、及び／又は、流出用ポンプの阻害剤として作用し、その結果、該抗菌剤の効力の再生が補助される請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
細胞の同化経路を阻害して抗真菌性分子に対する細胞耐性機構を弱化させるために、標的部位の細胞内のΔμＨ+又はΔμｘ+を減じる方法であって：
λｎとＴｎを組み合わせて標的部位を照射すること；
同時に、標的部位のΔｐ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ、Δｐ−ｍｉｔｏ−Ｆｕｎｇｉ、Δｐ−ｐｌａｓ−Ｆｕｎｇｉを減じること；及び
同時に又は順次的に、１の抗真菌剤を該標的部位に投与すること
を含み、該標的部位における少なくとも一つの細胞同化経路の阻害を実現する当該方法。
【請求項５２】
前記の標的とされる同化経路が、リン脂質の生合成であり、それは、真菌細胞膜中の既存のリン脂質の構造を破壊する前記抗真菌剤によって同時に標的とされる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記の標的とされる同化経路が、エルゴステロールの生合成であり、それは、エルゴステロールの生合成をＣ−１４脱メチル化段階で阻害する前記の抗真菌剤によって同時に標的とされ、該阻害は、エルゴステロールの涸渇及び、エルゴステロールの膜成分としての機能を原形質膜の構造の破壊によって邪魔するラノステロール及び他の１４メチル化ステロールの蓄積を生じる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記の標的とされる同化経路が、エルゴステロールの生合成であり、それは、スクアレンエポキシダーゼを阻害する前記の抗真菌剤によって同時に標的とされ、該阻害は次に、真菌細胞におけるエルゴステロールの生合成を阻害し、それは、真菌細胞膜に増大した透過性を持たせる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記の標的とされる同化経路が、エルゴステロールの生合成であり、それは、ｄ１４−レダクターゼ及びｄ７、ｄ８−イソメラーゼを阻害する前記の抗真菌剤によって同時に標的とされる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記の標的とされる同化経路が、真菌細胞壁の生合成であり、それは、(１，３)β−Ｄ−グルカン合成を阻害する前記の抗真菌剤によって同時に標的とされ、該阻害は次に、真菌細胞壁におけるβ−Ｄ−グルカン合成を阻害する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記の標的とされる同化経路が、真菌のステロールの生合成であり、それは、真菌細胞膜中のステロールと結合する前記の抗真菌剤によって同時に標的とされ、主たる前記ステロールは、エルゴステロールであり、効果的に、細胞膜の転移温度を変化させて該膜中に細孔を形成させ、真菌細胞膜に有害なイオンチャンネルの形成を生じる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
前記の抗真菌剤を、送達のために、脂質、リポソーム、脂質複合体及び／又はコロイド分散体中に配合して該剤の毒性を防止する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記の標的とされる同化経路が、タンパク質合成であり、前記の抗真菌剤が、シトシンパーミアーゼにより真菌細胞に取り込まれ、５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)に脱アミノ化され、ヌクレオシド三リン酸に変換されてＲＮＡに取り込まれて、ミスコーディングを生じる５−ＦＣである、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
前記の標的とされる同化経路が、真菌のタンパク質合成であり、それは、真菌の伸張因子ＥＦ−２を阻害する前記の抗真菌剤によって同時に標的とされる、請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
前記の標的とされる同化経路が、真菌のキチンの生合成であり、それは、少なくとも一つの酵素キチンシンターゼ２の作用を阻害することにより真菌のキチンの生合成を阻害する前記の抗真菌剤によって同時に標的とされる、請求項５１に記載の方法。
【請求項６２】
前記の抗真菌剤が、出芽及び成長、交配及び胞子形成中にキチンの合成に必要な酵素である酵素キチンシンターゼ３の作用を阻害する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記の抗真菌剤が、多価カチオン(Ｆｅ+3又はＡｌ+3)をキレートして、ミトコンドリアの電子伝達及び細胞エネルギー産生を受け持っている金属依存性酵素の阻害を生じ、それは又、真菌細胞内の過酸化物の正常な分解の阻害も導く、請求項５１に記載の方法。
【請求項６４】
前記の抗真菌剤が、真菌における２成分の調節システムを阻害し、該調節システムは、真菌原形質膜を横切るシグナル変換により環境に応答する、請求項５１に記載の方法。
【請求項６５】
前記の抗真菌剤を第二の分子と組み合わせ、該分子は、標的とされる真菌が該抗真菌剤を弱め又は不活性化するために耐性機構として産生任意のタンパク質又は酵素に対する競争阻害剤であり、流出用ポンプの阻害剤として作用し、その結果、該抗真菌剤の効力の再生を補助する第二の分子と組み合わせる、請求項５１に記載の方法。
【請求項６６】
細胞の同化経路を阻害して抗真菌性分子に対する細胞耐性機構を弱化させるために、
標的部位の細胞内のΔμＨ+又はΔμｘ+を減じる方法であって：
λｎとＴｎを組み合わせて該標的部位を照射すること；
同時に、標的部位で、細胞内のΔｐ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ及び／又はΔｐ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ及び／又はΔｐ−ｐｌａｓ−ｆｕｎｇｉを減じること；及び
同時に又は順次的に、複数の抗真菌剤を該標的部位に投与すること
を含み、標的部位における少なくとも一つの細胞同化経路の阻害を実現する当該方法。
【請求項６７】
少なくとも一つの前記の抗真菌剤を第二の分子と組み合わせ、該分子は、標的とされる真菌が該抗真菌剤の一つを弱め又は不活性化するための耐性機構として産生する任意のタンパク質若しくは酵素に対する競争阻害剤として作用し、及び流出用ポンプの阻害剤として作用し、その結果、該抗真菌剤の効力の再生が補助される請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
細胞の同化経路を阻害して抗新生物剤に対する細胞耐性機構を弱化させるために、
標的部位の細胞内のΔμＨ+又はΔμｘ+を減じる方法であって：
λｎとＴｎを組み合わせて標的部位を照射すること；
Δｐ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ及び／又は哺乳動物の原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｐｌａｓ−ｍａｍを減じること；及び
同時に又は順次的に、抗新生物剤を標的部位に投与すること
を含み、該標的部位における少なくとも一つの細胞同化経路の阻害を実現する当該方法。
【請求項６９】
前記の標的とされる同化経路が、ＤＮＡの複製であり、それは、ＤＮＡ中のグアニン核酸塩基を架橋させて、ＤＮＡ複製に必要な、らせんを解いて分離ができないＤＮＡ鎖を生じることによりＤＮＡの複製を阻害する前記の抗新生物剤によって同時に標的とされる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記の標的とされる同化経路が、ＤＮＡの複製であり、それは、ＤＮＡの同じ鎖内の、又はＤＮＡの異なる鎖内の２つの異なる７−Ｎ−グアニン残基と反応する前記の抗新生物剤によって同時に標的とされる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記の標的とされる同化経路が、ＤＮＡの複製であり、それは、ＤＮＡの複製及び細胞分裂を、代謝拮抗剤として作用することにより阻害する前記の抗新生物剤によって同時に標的とされる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記の標的とされる同化経路が、細胞分裂であり、それは、微小管の機能を妨げることにより細胞分裂を阻害する前記の抗新生物剤によって同時に標的とされる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記の標的とされる同化経路が、ＤＮＡの複製であり、それは、細胞がＧ１期及びＤＮＡの複製に入ることを妨げることによりＤＮＡの複製及び細胞分裂を阻害する前記の抗新生物剤によって同時に標的とされる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
前記の標的とされる同化経路が、細胞分裂であり、それは、微小管の安定性を増進して、後期における染色体の分離を妨げる前記の抗新生物剤によって同時に標的とされる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
前記の標的とされる同化経路が、ＤＮＡの複製であり、それは、Ｉ型又はＩＩ型トポイソメラーゼの阻害によってＤＮＡの複製及び細胞分裂を阻害する前記の抗新生物剤によって同時に標的とされ、該トポイソメラーゼの阻害は、適切なＤＮＡスーパーコイリングを破壊することによりＤＮＡの転写及び複製を邪魔する、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、選択したエネルギーでの赤外線放射の発生及び線量測定のための方法及びシステムであって、照射された細胞の生体エネルギー論的定常状態の膜貫通及びミトコンドリアのポテンシャルを、脱分極によって改変する当該方法及びシステムに関し、一層詳細には、抗細菌性及び抗真菌性化合物を、標的細菌及び／又は真菌及び／又は癌細胞において強化するための膜の脱分極のための方法及びシステムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗菌剤に耐性の細菌、真菌、及び他の微生物汚染の世界的増加は、人類社会に大きな脅威を与えている。サルファ剤(スルファニルアミド、１９３６年に初めて用いられた)及びペンシリン(１９４２年、Pfizer Pharmaceuticals)の出現以来、この惑星を横切るすべての種類の有意の量の抗菌性薬剤の開発が、耐性汚染菌及び病原体の出現及び拡大のための強力な環境を造った。ある種の耐性汚染菌は、病院及び一般的環境において優勢であるので、疫学的に並外れて重大なものである。抗生物質の広範な使用は、耐性細菌例えばメチシリン耐性の黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性の腸球菌(ＶＲＥ)の生成を促進するだけでなく、真菌性微生物例えばカンジダの感染(真菌症)に好都合な条件をも造っている。
【０００３】
殺微生物剤である強力な抗真菌剤(例えば、アンホテリシンＢ(ＡｍＢ))が存在しても、カンジダ血症の死亡率は、依然として、約３８％のままである。幾つかの症例では、薬物耐性の真菌を処置するためには、高投与量のＡｍＢを投与しなければならず、これは、しばしば、腎毒性及び他の有害な影響を生じる。その上、抗ミコバクテリア剤及び抗生物質の使いすぎは、生きている生物体における生体内蓄積を引き起こしえて、これは、哺乳動物細胞に対しても細胞傷害性でありうる。増大する世界人口及び薬物耐性の細菌及び真菌の普及を仮定すると、細菌又は真菌感染症の発病率の上昇は、予見できる未来について減っていないことが予想される。
【０００４】
最近、細菌及び真菌感染症に対して利用可能な治療は、抗細菌剤及び抗真菌剤の投与を含み、幾つかの症例では、感染領域の外科的な壊死組織切除法の適用を含む。特に、新たに出現した薬物耐性病原体及び高度に変形させる外科治療の極度の罹患率の故に、抗細菌性及び抗真菌性治療単独では、めったに効かないので、微生物感染を治療し又は予防する新しいストラテジーを開発することは避けられないものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
それ故、細菌及び真菌感染のリスクを、所定の標的部位で、標的細菌及び真菌(生物学的夾雑物)以外の生物学的部分(例えば、哺乳動物の組織、細胞又はある種の生化学的調製物例えばタンパク質調製物)に対する過度のリスク及び／又は有害な影響なしで、減じる方法及びシステムに対する要求がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、微生物及び／又は新生物関連の病状を減じ又は排除するのに必要とされる抗菌性分子(抗菌剤)及び／又は抗新生物性分子(抗新生物剤)の最少阻止濃度(ＭＩＣ)を減じるための方法及びシステムであって、それらなしでは、もはや安全なヒト投与量では機能的でない薬剤が補助的治療として再び有用になる方法及びシステムに向けられている。本発明の方法及びシステムによれば、近赤外線の選択したエネルギーでの照射及び線量測定(ここでは、「近赤外線による微生物排除システム」を表すＮＩＭＥＬＳとして知られる)が、照射された領域内のすべての膜の脱分極を引き起こすために利用され、それは、照射された細胞の膜電位ΔΨの絶対値を変えるであろう。
【０００７】
本発明の他の特徴及び利点は、後記の具体例の詳細な説明において示され、部分的には、その記載から明白であり、又はこの発明の実施により知ることができる。この発明のかかる特徴及び利点は、詳細な説明及び添付の請求の範囲において特に指摘されたシステム、方法及び装置により理解され、確認される。
この発明の局面は、下記の説明を添付の図面と一緒に読むことにより一層完全に理解することができるが、これらは、例証とみなすべきであり、決して制限するものではない。これらの図面は、必ずしも縮尺は揃っておらず、強調は、この発明の原理に基いてなされている。これらの図面において：
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】典型的なリン脂質二重層を示した図である。
【図２】リン脂質の化学構造を示した図である。
【図３】リン脂質二重層膜における双極子効果(Ψｄ)を示した図である。
【図４Ａ】ＮＩＭＥＬＳ照射前の定常状態の膜貫通ポテンシャルを有する細菌の原形質膜、哺乳動物のミトコンドリア膜、又は真菌のミトコンドリア膜におけるリン脂質二重層を示した図である。
【図４Ｂ】ＮＩＭＥＬＳ照射後の、細菌の原形質膜、哺乳動物のミトコンドリア膜、又は真菌のミトコンドリア膜における過渡的状態の原形質膜のポテンシャルを示した図である。
【図５】膜貫通タンパク質を内部に埋め込んで有するリン脂質二重層を示した図である。
【図６】電子伝達及びプロトンポンプの一般的描写を示した図である。
【図７】ΔΨ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ又はΔΨ−ｍｉｔｏ−ｍａｍに対応する真菌及び哺乳動物細胞のミトコンドリア膜の一般的概観を示した図である。
【図８】対照及びレーザーをあてた試料において緑色蛍光放射強度により測定したＭＲＳＡ膜貫通ポテンシャルにおけるＮＩＭＥＬＳ照射の効果(単一線量測定で)を、レーザー照射後の時間(分)の関数として示した図である。
【図９】レーザーをあてた試料における緑色蛍光放射強度の対照と比較した低下パーセントにより測定したＣ.アルビカンスの膜貫通ポテンシャルに対するＮＩＭＥＬＳ照射の効果を(様々な線量測定で)示した図である。
【図１０】対照及びレーザーをあてた試料において赤色蛍光放射強度により測定したＣ.アルビカンスのミトコンドリア膜ポテンシャルに対するＮＩＭＥＬＳ照射の効果(単一線量測定で)；及び対照及びレーザーをあてた試料において赤色蛍光対緑色蛍光の比として測定したＣ.アルビカンスのミトコンドリア膜ポテンシャルに対するＮＩＭＥＬＳ照射の効果(単一線量測定で)を示した図である。
【図１１】対照及びレーザーをあてた試料において赤色蛍光放射強度により測定したヒト胎児腎臓細胞のミトコンドリア膜ポテンシャルに対するＮＩＭＥＬＳ照射の効果(単一線量測定で)；及び対照及びレーザーをあてた試料において赤色蛍光対緑色蛍光の比として測定したヒト胎児腎臓細胞のミトコンドリア膜ポテンシャルに対するＮＩＭＥＬＳ照射の効果(単一線量測定で)を示した図である。
【図１２】ＭＲＳＡ中の全グルタチオン濃度の減少を、それがＮＩＭＥＬＳ照射の結果(幾つかの線量測定で)としてのこれらの細胞における反応性酸素種(ＲＯＳ)生成と相関するので示した図である(レーザーをあてた試料におけるグルタチオン濃度の減少を、対照に対するパーセンテージとして示してある)。
【図１３】Ｃ.アルビカンス中の全グルタチオン濃度の減少を、それがＮＩＭＥＬＳ照射の結果(幾つかの線量測定で)としてのこれらの細胞における反応性酸素種(ＲＯＳ)生成と相関するので示した図である(レーザーをあてた試料におけるグルタチオン濃度の減少を、対照に対するパーセンテージとして示してある)。
【図１４】ヒト胎児腎臓細胞中の全グルタチオン濃度の減少を、それがＮＩＭＥＬＳ照射の結果(幾つかの線量測定で)としてのこれらの細胞における反応性酸素種(ＲＯＳ)生成と相関するので示した図である(レーザーをあてた試料におけるグルタチオン濃度の減少を、対照に対するパーセンテージとして示してある)。
【図１５】ＮＩＭＥＬＳとメチシリンの、ＭＲＳＡコロニーの成長阻止における相乗効果を示した図である(データは、メチシリンが準致死的ＮＩＭＥＬＳ線量測定によって強化されていることを示している)。
【図１６】ＮＩＭＥＬＳとバシトラシンの、ＭＲＳＡコロニーの成長阻止における相乗効果を示した図である(矢印は、示した２つの試料におけるＭＲＳＡコロニーの成長又はその欠如を示している)(像は、バシトラシンが準致死的ＮＩＭＥＬＳ線量測定によって強化されていることを示している)。
【図１７】実験データにより示されるように、ＮＩＭＥＬＳの、ＭＲＳＡコロニーの成長阻止における、メチシリン、ペニシリン及びエリスロマイシンとの相乗効果を描いた棒グラフを示した図である。
【図１８】この発明の方法によって治療された典型的な爪甲真菌症患者の爪の外観の経時的改善を示している合成写真である。パネルＡは、基準としての、治療前の感染した足指の爪を示しており；パネルＢは、治療後６０日目の足指の爪を示しており；パネルＣは、治療後８０日目の足指の爪を示しており；そしてパネルＤは、治療後１００日目の足指の爪を示している。
【図１９】準致死的ＮＩＭＥＬＳ照射により大腸菌において減少した膜ポテンシャルの検出を例証した図である。
【図２０】準致死的ＮＩＭＥＬＳ照射により大腸菌において増大したグルタチオンの検出を例証した図である。
【０００９】
特定の具体例について図面に描いて説明したが、当業者は、描かれた具体例が説明のためのものであること及び示したものの変形物並びにここに記載の他のものも、構想して実施することができ、本発明の範囲内にあることを認めるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
この明細書で用いる場合、単数形は又、内容が明らかに別の意味を示す場合を除いて、その用語の複数形をも包含する。例えば、「ＮＩＭＥＬＳ波長」は、記載された複数のＮＩＭＥＬＳ波長並びにかかる複数の波長の組合せを包含することができる。
【００１１】
ここで用いる場合、特に別途示さない限り、「又は」なる語は、「及び／又は」の「非排他的な」意味で用いられ、「何れかの／又は」の「排他的な」意味ではない。
【００１２】
用語「約」は、ここでは、ほぼ、大体の範囲、又は近傍を意味するために用いられる。用語「約」が数値範囲と共に用いられる場合には、それは、その範囲を、示した数値の上限と下限を伸ばすことによって改変している。一般に、用語「約」は、ここでは、述べられた数値を上下に２０％の変動により改変するために用いられる。
【００１３】
本発明は、微生物及び／又は新生物関連病原体を減じ又は排除するのに必要な抗菌性分子(薬剤)及び／又は抗新生物性分子(薬剤)の最少阻止濃度(ＭＩＣ)を減じるための方法及びシステムであって、それらによらなければ、安全なヒト投与量ではもはや機能的でない抗菌剤が該方法及びシステムによって補助的治療として再び有用となる当該方法及びシステムに向けられている。本発明の方法及びシステムによれば、選択したエネルギーの近赤外線照射及び線量計測(ここでは、「近赤外線による微生物排除システム」を表すＮＩＭＥＬＳとして知られる)は、照射領域内の膜の脱分極を引き起こすために用いられ、それは、照射された細胞の膜電位ΔΨの絶対値を変えるであろう。
【００１４】
この変化されたΔΨは、プロトン起動力(motive force)Δｐの密接に関連した弱化、及びすべての影響された膜のバイオエナジェティックスを引き起こすであろう。従って、ＮＩＭＥＬＳ照射の効果(ＮＩＭＥＬＳ効果)は、ヒト宿主に感染して害悪を生じさせる微生物に対する既存の抗菌性分子を強化することができる。これらの効果は、多くの細胞の同化作用反応(例えば、細胞壁の形成)の機能及び薬物耐性機構(機能するために化学浸透圧的電気化学エネルギーを必要とする)を低下させるであろう。それ故、任意の膜に結合した細胞耐性機構又は同化作用反応(膜電位ΔΨ、プロトン起動力Δｐ、又はそれらの機能的エネルギー要求のためのリン酸化ポテンシャルΔＧｐを利用する)は、本発明の方法及びシステムによって影響を受けるであろう。
【００１５】
本発明の方法及びシステムは、光照射を利用して抗細菌性及び又は抗真菌性薬物を、望ましくない標的細胞(例えば、ＭＲＳＡ又は皮膚のカンジダ感染)に対してだけ強化し、哺乳動物細胞は一般に、細菌又は真菌細胞を傷害することを意図した(分子又は薬物による)処理に影響されないという事実によって可能にされる選択性を有する。
【００１６】
典型的具体例において、本発明の方法及びシステムに従って用いられる適用される光照射は、上記のように、ＮＩＭＥＬＳ線量測定にて約８５０〜９００ｎｍに及ぶ一種以上の波長を含む。一面において、約８６５〜８７５ｎｍの波長が、用いられる。他の面において、かかる適用される照射は、ＮＩＭＥＬＳ線量測定にて約９０５〜９４５ｎｍの波長を有する。一面において、かかる適用される光照射は、約９２５〜９３５ｎｍの波長を有する。特別の面において、９３０ｎｍの波長(又は、該波長を含む狭い波長範囲)を用いることができる。本発明の幾つかの面において、多数の波長範囲は、それぞれ、８７０ｎｍ及び９３０ｎｍを含む。
【００１７】
生体エネルギーシステムが本発明によるＮＩＭＥＬＳによって影響を受けうる微生物病原体には、微生物例えば細菌、真菌、糸状菌、マイコプラズマ、原生動物、及び寄生虫が含まれる。
【００１８】
一具体例において、本発明の方法及びシステムは、皮膚感染又は創傷感染を引き起こすことが知られている感染性存在物例えばブドウ球菌及び腸球菌を処理し、減じそして／又は排除する際に用いられる。ブドウ球菌及び腸球菌の感染は、身体の殆ど任意の皮膚表面を含みえて、皮膚病例えば、せつ、癰、水疱性膿痂疹、鱗状皮膚を引き起こすことが知られている。黄色ブドウ球菌は又、ブドウ球菌による食中毒、腸炎、骨髄炎、毒素性ショック症候群、心内膜炎、髄膜炎、肺炎、膀胱炎、敗血症及び手術の傷からの感染症の原因でもある。ブドウ球菌の感染は、患者が病院又は長期の介護施設にいても受けうる。閉じ込められた集団及び抗生物質の広範な使用は、抗生物質耐性の黄色ブドウ球菌株の発生へと導いた。これらの株は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(ＭＲＳＡ)と呼ばれている。ＭＲＳＡにより引き起こされる感染症は、しばしば、広範な抗生物質(特に、β−ラクタム系抗生物質)に耐性であって、非ＭＲＳＡ微生物により引き起こされた感染症より有意に高率の罹患率及び死亡率、一層高いコスト、及び一層長い病院滞在期間と関係している。病院におけるＭＲＳＡ感染のリスクファクターは、鼻腔のコロニー形成、外科手術、以前の抗菌剤治療、集中医療への入場、ＭＲＳＡコロニー形成した患者又は健康管理者にさらされること、４８時間より長時間病因にいること、及び留置カテーテル又は他の皮膚を通過する医用機器を有することを含む。
【００１９】
他の具体例において、本発明の方法及びシステムは、皮膚のカンジダ症として知られる感染性存在物を処置し、減じそして／又は排除する際に用いられる。これらのカンジダ感染は、皮膚を含み、そして身体の殆ど任意の皮膚表面を占めることができる。しかしながら、最もよく出現するのは、暖かく、湿った、又はしわになった領域(例えば、腋窩及び鼠径部)である。皮膚カンジダ症は、非常に一般的なものである。カンジダは、おむつかぶれの最も一般的な原因であり、おむつ内部の暖かく湿った条件がカンジダに有利になっている。これらの感染症を引き起こす最も一般的な真菌類は、カンジダ・アルビカンスである。カンジダ感染は又、糖尿病及び肥満の個人においても非常に一般的である。カンジダは又、爪甲真菌症と呼ばれる爪の感染、爪の周囲の皮膚の感染(爪甲周囲炎)及び口角周囲の感染(口角糜爛症と呼ばれる)をも引き起こしうる。
【００２０】
用語「ＮＩＭＥＬＳ線量測定」は、パワー密度(Ｗ／ｃｍ2)及びエネルギー密度(Ｊ／ｃｍ2)(ここに、１ワット＝１ジュール／秒)の値を示し、その値で、この発明の主題の波長が反応性酸素種(「ＲＯＳ」)を生成することができ、それにより、標的部位における生物学的夾雑物のレベルを低下させるものである。この用語は又、細胞を照射して、生物学的夾雑物の感受性を、抗菌剤及び抗新生物剤のＲＯＳの付随的生成を伴ってΔΨを低下させることにより、増大させること(ΔΨを低下させなければ、該夾雑物は、薬剤に耐性である)も包含する。この方法は、該生物学的夾雑物以外の宿主患者組織に許容できないリスク及び／又は副作用を伴わずに効果的でありうる。
【００２１】
抗真菌若しくは抗細菌剤又は抗新生物剤の「強化作用」とは、真菌、細菌、又は癌における耐性機構を、該剤が該真菌、細菌又は癌の成長及び／又は増殖を、この発明の方法及びシステムのない場合よりも一層低濃度で阻止するのに十分なだけ打ち消す、この発明の方法及びシステムを意味する。耐性が本質的に完全な場合即ち薬剤が細胞に対して全く効果を有しない場合には、強化作用は、薬剤が病原性細胞の成長及び／又は増殖を阻止し、それにより、病状を、治療上許容しうる投薬量で治療することを意味する。
【００２２】
ここで用いる場合、用語「微生物」は、顕微鏡的で、定義により、ヒトの眼で見るには小さすぎる生物体を指す。この発明の目的に関して、微生物は、細菌、真菌、古細菌、原生生物などであってよい。微生物学的なる語は、微生物に属するか又は関係するとして定義される。
【００２３】
ここで用いる場合、用語「細胞膜(又は、原形質膜又はミトコンドリア膜)」は、半透性の脂質二重層を指し、これは、すべての生細胞において共通構造を有している。それは、主として、無数の重要な細胞過程に関与するタンパク質及び脂質を含む。本発明の標的である細胞膜は、１より大きいタンパク質／脂質比を有している。別の言い方をするならば、夾雑物(又は部分、即ち、宿主組織)の標的膜の何れも、乾燥重量で、４９．９９％より多くの脂質を含まない。
【００２４】
ここで用いる場合、用語「ミトコンドリア」は、殆どの真核細胞(哺乳動物細胞及び真菌)において見出される膜で囲まれたオルガネラを指す。ミトコンドリアは、殆どの真核細胞の要求するＡＴＰ(細胞の化学エネルギー源として利用される)を生成しているので、「細胞内の発電所」である。ミトコンドリアは、リン脂質二重層及びタンパク質よりなる内膜及び外膜を含む。しかしながら、これら２種の膜は、異なる特性を有している。ミトコンドリア外膜は、オルガネラ全体を囲んでいて、真核生物の原形質膜に類似したタンパク質対リン脂質比を有しており、ミトコンドリア内膜は、クリスタとして知られる内部画分を形成し、原核生物の原形質膜と類似したタンパク質対リン脂質比を有している。これは、シトクロムなどのタンパク質に直接的に且つ効率的に機能するための一層大きいスペースを与えている。電子伝達系(「ＥＴＳ」)は、このミトコンドリア内膜上に配置されている。ミトコンドリア内膜内には、代謝産物をこの膜を超えて輸送する高度に制御されたトランスポートタンパク質もある。
【００２５】
ここで用いる場合、用語「流動モザイクモデル」は、広く支持されている、膜を横切る輸送を助成する多様な埋め込まれたタンパク質を有する、構造的及び機能的に非対称な脂質二重層としての生物学的膜の概念化を指す。この流動モザイクモデルは、リン脂質が膜内で殆どやすやすと位置を変えること(流動)と、膜内に存在するすべてのリン脂質、タンパク質及び糖タンパク質の組合せが細胞に外側からモザイクイメージを与えるので、そう呼ばれている。このモデルは、熱力学の注意深いバランスと機能的考察に基づいている。膜の熱力学の変化は、膜の機能に影響を与える。
【００２６】
ここで用いる場合、用語「膜双極子ポテンシャルΨｄ」は(膜貫通ポテンシャルΔΨに対して)、膜表面の高度に水和された脂質ヘッドと二重層の低極性の内部(疎水性)との間で形成されるポテンシャルを指す。脂質二重層は、本質的に、双極性の基及び分子の構造的機構(主として、リン脂質と水とのエステル結合)から生じるかなりの膜双極子ポテンシャルΨｄを有する。
【００２７】
Ψｄは、膜表面でイオンに依存せず、ここでは、下記の５つの異なる双極子ポテンシャルを記載するために用いられる：
１）哺乳動物の原形質膜の双極子ポテンシャルΨｄ−ｐｌａｓ−ｍａｍ；
２）哺乳動物のミトコンドリア膜の双極子ポテンシャルΨｄ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ；
３）真菌の原形質膜の双極子ポテンシャルΨｄ−ｐｌａｓ−ｆｕｎｇｉ；
４）真菌のミトコンドリア膜の双極子ポテンシャルΨｄ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ；及び
５）細菌の原形質膜の双極子ポテンシャルΨｄ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔ。
【００２８】
ここで用いる場合、用語「膜貫通ポテンシャル」は、膜によって分けられた水相の間の電気的ポテンシャルの差異(ｍＶ規模)を指し、記号(ΔΨ)により与えられる。ΔΨは、膜表面でイオンに依存せず、ここでは、下記の３つの異なる原形質膜貫通ポテンシャルを記載するために用いられる：
１）哺乳動物の原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｐｌａｓ−ｍａｍ
２）真菌の原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｐｌａｓ−ｆｕｎｇｉ
３）細菌の原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔ。
【００２９】
ここで用いる場合、用語「ミトコンドリア膜貫通ポテンシャル」は、ミトコンドリア内膜によって分けられた画分の間の電気的ポテンシャルの差異(ｍＶ規模)を指し、ここでは、下記の２つの異なるミトコンドリア膜貫通ポテンシャルを記載するために用いられる。
１）哺乳動物のミトコンドリア膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ
２）真菌のミトコンドリア膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ。
【００３０】
ミトコンドリアにおいて、栄養分(例えば、グルコース)からのポテンシャルエネルギーは、細胞の代謝過程に利用可能な活性エネルギーに変換される。連続的な酸化還元反応中に放出されたエネルギーは、プロトン(Ｈ+イオン)をミトコンドリアマトリクスから膜間スペースにポンプ輸送することを可能にする。結果として、ミトコンドリア膜には、該膜が分極するにつれて、化学浸透圧的電気的ポテンシャルの差異(ΔΨ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ又はΔΨ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ)が存在する。ΔΨ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ及びΔΨ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉは、ミトコンドリアの機能性の重要なパラメーターであり、細胞のエネルギー状態(レドックス状態)に対する直接的定量的値を与える。
【００３１】
ここで用いる場合、用語「哺乳動物原形質膜貫通ポテンシャル(ΔΨ−ｐｌａｓ−ｍａｍ)」は、哺乳動物細胞原形質膜における水相間の電気的ポテンシャルの差異を指す。哺乳動物原形質膜ポテンシャルは、主としてＨ+イオン(プロトン)により生じる細菌及び真菌のΔΨと異なる。哺乳動物の原形質膜においては、ΔΨの主たる推進役は、起電性Ｎａ+／Ｋ+−ＡＴＰアーゼポンプである。ΔΨ−ｐｌａｓ−ｍａｍは、膜貫通Ｋ+拡散(細胞内から細胞外へ)の追加的特質及び起電性Ｎａ+／Ｋ+−ＡＴＰアーゼポンプにより生成される。哺乳動物のＡＴＰは、ミトコンドリアにおいてプロトンポンプによって生成される。
【００３２】
ここで用いる場合、用語「真菌原形質膜貫通ポテンシャル(ΔΨ−ｐｌａｓ−ｆｕｎｇｉ)」は、真菌細胞原形質膜における電気的ポテンシャルの差異を指す。真菌原形質膜ポテンシャルは、膜に結合したＨ+−ＡＴＰアーゼ(機能するのにＡＴＰを必要とする高性能のプロトンポンプ)により生成される。このＨ+−ＡＴＰアーゼポンプは、真菌の成長並びに安定な細胞の代謝及び維持の両方に必要とされる。真菌のＡＴＰは、ミトコンドリアで生成される。
【００３３】
ここで用いる場合、用語「細菌原形質膜貫通ポテンシャル(ΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔ)」は、細菌細胞の原形質膜における電気的ポテンシャルの差異を指す。細菌原形質膜ポテンシャルは、電子及びプロトン(Ｈ+)の、細菌原形質膜を横切る定常状態の流れ(移動)であって、正常な電子伝達及び酸化的リン酸化を伴って細菌原形質膜内で起きる当該流れによって生成される。すべての電子伝達鎖の一般的特徴は、膜を貫通するプロトンの勾配を造るためのプロトンポンプの存在である。細菌はミトコンドリアを欠いていても、好気性細菌は、真核生物のミトコンドリアで起きるのと本質的に同じ過程によって酸化的リン酸化(ＡＴＰ産生)を行なう。ここで用いる場合、用語「Ｐクラスイオンポンプ」は、ＡＴＰ結合部位を含む(即ち、機能するのにＡＴＰを必要とする)膜貫通活性トランスポートタンパク質集合体を指す。輸送過程において、タンパク質サブユニットの一つは、リン酸化され、輸送されたイオンは、リン酸化されたサブユニットを通って移動すると考えられている。このクラスのイオンポンプには、Ｎａ+及びＫ+電気化学的ポテンシャル(ΔＮａ+／Ｋ+)及びｐＨ勾配(動物細胞によくある)を維持する、哺乳動物原形質膜内のＮａ+／Ｋ+−ＡＴＰアーゼポンプが含まれる。他の重要なＰクラスイオンポンプのメンバーは、プロトン(Ｈ+イオン)を細胞の外へ輸送してＫ+イオンを細胞の中へ輸送する。
【００３４】
ここで用いる場合、用語「Ｎａ+／Ｋ+ＡＴＰアーゼ」は、すべての動物細胞の原形質膜中に存在して、一つのＡＴＰ分子の加水分解と共役して３つのＮａ+イオンを輸出して２つのＫ+イオンを輸入する(これは、Ｎａ+及びＫ+電気化学的ポテンシャル及び動物細胞に典型的なｐＨ勾配を維持する)Ｐクラスイオンポンプを指す。真菌細胞(及び真核細胞)における内側が負の膜ポテンシャルは、異なるＡＴＰにより作動するプロトンポンプによるＨ+イオンの細胞の外への輸送によって生成される。
【００３５】
ここで用いる場合、用語「イオンエクスチェンジャー及びイオンチャンネル」は、ＡＴＰ非依存性システムであって、哺乳動物細胞における原形質膜ポテンシャルの確立を助成する膜貫通タンパク質を指す。
【００３６】
ここで用いる場合、用語「レドックス(還元／酸化反応の速記)」は、例えば電子の移動を含む非常に複雑な一連の過程による細胞における糖の酸化の複雑な過程を記載する。レドックス反応は、電子がドナー分子からアクセプター分子へ移動する化学反応である。用語レドックスは、還元と酸化の２つの概念から来ており、下記の簡単な用語にて説明されうる：
酸化は、分子、原子又はイオンによる電子の喪失を記載する。
還元は、分子、原子又はイオンによる電子の獲得を記載する。
【００３７】
ここで用いる場合、用語「レドックス状態」は、記載されている細胞のレドックス環境(又は、酸化ストレスのレベル)を記載する。
【００３８】
ここで用いる場合、用語「定常状態の膜貫通ポテンシャル(ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ)」は、本発明の方法及びシステムによる照射前の、哺乳動物、真菌又は細菌細胞の定量的な原形質膜ポテンシャルであって、将来的にもかかる照射のないままでいる当該ポテンシャルを指す。
【００３９】
例えば、正常な電子伝達及び酸化的リン酸化において起きる電子及びプロトンの細菌細胞膜を横切る定常状態的な流れは、膜を横切って起きる慣用のレドックス反応の一定の流量の故に、定常状態にある。逆に、このレドックス状態の任意の改変は、過渡的状態の膜ポテンシャルを引き起こすであろう。ΔΨ−ｓｔｅａｄｙは、ここでは、種に基く、３つの異なる定常状態の原形質膜貫通ポテンシャルを記載するために用いられる。
１）定常状態の哺乳動物の原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍａｍ
２）定常状態の真菌の原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｆｕｎｇｉ
３）定常状態の細菌の原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｂａｃｔ
【００４０】
ここで用いる場合、用語「過渡的状態の原形質膜ポテンシャル(ΔΨ−ｔｒａｎ)」は、本発明の方法及びシステムによる照射後の、哺乳動物、真菌又は細菌細胞の原形質膜ポテンシャルを指し、該照射は、原形質膜のバイオエナジェティックスを変化させた。細菌においては、ΔΨ−ｔｒａｎは、原形質膜にＥＴＳ及びシトクロムが存在するので、細胞のレドックス状態をも変化させるであろう。ΔΨ−ｔｒａｎは、本発明の方法を用いる照射なしでは起きない状態である。ΔΨ−ｔｒａｎは、ここでは、種に基く３つの異なる過渡的状態の原形質膜貫通ポテンシャルを記載するために用いられる。
１）過渡的状態の哺乳動物の原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｔｒａｎ−ｍａｍ
２）過渡的状態の真菌の原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｔｒａｎ−ｆｕｎｇｉ
３）過渡的状態の細菌の原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｂａｃｔ
【００４１】
ここで用いる場合、用語「定常状態のミトコンドリア膜ポテンシャル(ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ)」は、本発明の方法及びシステムによる照射前の哺乳動物又は真菌のミトコンドリアの定量的なミトコンドリア膜ポテンシャルであって、将来的にもかかる照射のないままでいる当該ポテンシャルを指す。
【００４２】
例えば、正常な電子伝達及び酸化的リン酸化において起きるミトコンドリアの内膜を横切る電子及びプロトンの定常状態の流れは、膜を横切って起きる慣用のレドックス反応の一定の流れの故に、定常状態にある。このレドックス状態の任意の改変は、過渡的状態のミトコンドリア膜ポテンシャルを引き起こすであろう。ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏは、種に基く２つの異なる定常状態のミトコンドリア膜ポテンシャルを記載するために用いられる。
１）定常状態の哺乳動物のミトコンドリアポテンシャルΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ
２）定常状態の真菌のミトコンドリアポテンシャルΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ
【００４３】
ここで用いる場合、用語「過渡的状態のミトコンドリア膜ポテンシャル(ΔΨ−ｔｒａｎ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ又はΔΨ−ｔｒａｎ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ)」は、本発明の方法及びシステムによる照射後の哺乳動物又は真菌細胞の膜ポテンシャルであって、それにより、該照射が該ミトコンドリア内膜のバイオエナジェティクスを変化させた当該膜ポテンシャルを指す。哺乳動物及び真菌細胞において、ΔΨ−ｔｒａｎ−ｍｉｔｏは又、ミトコンドリア内膜には電子伝達系(ＥＴＳ)及びシトクロムが存在するので、細胞のレドックス状態をも変化させるであろう。ΔΨ−ｔｒａｎ−ｍｉｔｏは又、(プロトン起動力)Δｐ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ及びΔｐ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉに激烈に影響を与えることができよう(何故なら、これらのミトコンドリアの(Ｈ+)勾配は、無数の細胞機能のための十分なＡＴＰを生成するために、ミトコンドリア内で生成されるので)。ΔΨ−ｔｒａｎ−ｍｉｔｏは、本発明の方法及びシステムによる照射なしでは起きない状態である。ΔΨ−ｔｒａｎ−ｍｉｔｏは、種に基く２つの異なる過渡的状態のミトコンドリア膜ポテンシャルを記載するために用いられよう。
１）  過渡的状態の哺乳動物ミトコンドリアポテンシャルΔΨ−ｔｒａｎ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ
２）  過渡的状態の真菌ミトコンドリアポテンシャルΔΨ−ｔｒａｎ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ
【００４４】
ここで用いる場合、用語「シトクロム」は、ヘム原子団を有して電子伝達を行う膜に結合したヘモタンパク質を指す。ここで用いる場合、用語「電子伝達系(ＥＴＳ)」は、細胞のエネルギー貨幣である(ＡＴＰ)を生成する生化学反応を媒介する一連の膜に結合した電子キャリアー（シトクロム）を記載する。原核細胞(細菌)においては、これは、原形質膜で起きる。真核細胞(真菌及び哺乳動物細胞)では、これは、ミトコンドリアで起きる。
【００４５】
ここで用いる場合、用語「ｐＨ勾配(ΔｐＨ)」は、膜の両側のバルク相の間のｐＨの差を指す。
【００４６】
ここで用いる場合、用語「プロトン電気化学的勾配(ΔμＨ+)(次元ｋＪモル−１)」は、膜を横切る電気的及び化学的特性、特にプロトン勾配を指し、細胞中で働くことのできる細胞ポテンシャルエネルギーの一種を表す。このプロトン電気化学的ポテンシャルの、プロトンポンプを含む能動輸送に従事する膜の両側の間での差は、ときには、化学浸透圧ポテンシャル又はプロトン起動力とも呼ばれる。ΔμＨ+が幾らかでも減少した場合には、影響を受けた細胞における細胞同化作用経路及び耐性機構が阻害されたと仮定される。これは、標的部位のみを照射するためにλｎとＴｎを組み合わせることにより達成することができ、又は標的部位への送達のために構成されて配置された薬物を同時に若しくは順次的に投与することによって更に増進することができる(即ち、同化経路の(ＡｎとＴｎ)＋(薬理学的分子)による同時ターゲティング)。
【００４７】
ここで用いる場合、用語「イオンの電気化学的勾配(Δμｘ＋)」は、イオン(Ｈ+以外)の濃度勾配により引き起こされる膜を横切る電気的及び化学的特性を指し、細胞中で働くことのできる細胞ポテンシャルエネルギーの一種を表す。哺乳動物細胞においては、Ｎａ+イオンの電気化学的勾配は、Ｎａ+の細胞の外への能動輸送によって原形質膜を横切って維持される。これは、プロトン電気化学的ポテンシャルとは異なる勾配であり、しかも、ＡＴＰと共役したポンプから生成され、酸化的リン酸化において生成される該ＡＴＰは、哺乳動物ミトコンドリアプロトン起動力(Δｐ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ)からのものである。Δμｘ+が幾らかでも減少した場合には、影響を受けた細胞における細胞同化作用経路及び耐性機構が阻害されたと仮定される。これは、標的部位のみを照射するためにＡｎとＴｎを合わせることにより達成することができ、又は標的部位への送達のために構成されて配置された薬物を同時に若しくは順次的に投与することによって更に増進することができる(即ち、同化経路の(λｎとＴｎ)＋(薬理学的分子)による同時ターゲティング)。
【００４８】
ここで用いる場合、用語「細菌の同化経路の同時ターゲティング」は、(同化経路に影響を及ぼす標的部位で細胞の(ΔμＨ+)及び／又は(Δμｘ+)を低下させるλｎ及びＴｎ)＋(同じ細菌の同化経路に影響を及ぼす薬理学的分子)を指し、薬理学的分子により阻止することのできる下記の細菌同化経路の何れをも指すことができる：
標的とされる同化経路は、ペプチドグリカン生合成であり、これは、ペプチドグリカンを細菌細胞壁において架橋する細菌のトランスペプチダーゼ酵素(ペニシリン結合性タンパク質)の活性部位に結合する薬物により同時に標的とされ、これらの酵素の阻害は、最終的に、細胞の溶解及び細胞死を引き起こす；
標的とされる細菌の同化経路は、ペプチドグリカン生合成であり、これは、細胞壁中間体においてアシル−Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニル基に結合する薬物によって同時に標的とされ、それ故、Ｎ−アセチルムラミン酸(ＮＡＭ)−及びＮ−アセチルグルコサミン(ＮＡＧ)−ペプチドサブユニットのペプチドグリカンマトリクスへの取り込みを阻止し(ペプチドグリカン生合成を、トランスグリコシレーション及び／又はトランスペプチデーションに作用することによって有効に阻止する)、それによりグラム陽性細菌における適当なペプチドグリカンの形成を阻害する。
標的とされる細菌の同化経路は、ペプチドグリカン生合成であり、これは、Ｃ55−イソプレニルピロホスフェートと結合する薬物によって同時に標的とされ、ピロホスファターゼがＣ55−イソプレニルピロホスフェートと相互作用するのを阻止し、そうして、ビルディングブロックペプチドグリカンを内膜から外へ運ぶのに利用可能なＣ55−イソプレニルピロホスフェートの量を低下させる；
標的とされる同化経路は、細菌タンパク質の生合成であり、これは、細菌リボソームの５０Ｓサブユニット中の２３ＳｒＲＮＡ分子に結合する薬物により同時に標的とされ、これは、細胞中のペプチジルｔＲＮＡの蓄積を生じ、それ故、α−アミノ酸の活性化に必要な遊離のｔＲＮＡが涸渇して、ペプチジルｔＲＮＡのリボソームからの未成熟解離を引き起こすことによりペプチド転移を阻止する；
同時に標的とされる薬物は、５０Ｓの細菌リボソームサブユニットの２３ＳＲＮＡの２つのドメインに同時に結合し、それにより、細菌リボソームサブユニット５０Ｓ及び３０Ｓ(リボソームサブユニットアセンブリ)の形成を阻止することができ(ここに、同時に標的とされる薬物は、細菌細胞に透過するためにその親油性を増すために塩素化される)、そして細菌リボソームの５０Ｓサブユニットの２３Ｓ部分に結合して、ペプチジル−ｔＲＮＡのアミノアシル部位(Ａ部位)からペプチジル部位(Ｐ部位)への移動を阻止し、それにより、トランスペプチダーゼ反応を阻止し、これは、リボソームから放出されている不完全なペプチドを生じる；
標的とされる同化経路は、細菌タンパク質生合成であり、それは、３０Ｓの細菌リボソームサブユニットに結合する薬物によって同時に標的とされ、アミノ−アシルｔＲＮＡのリボソームのアクセプター部位(Ａ部位)への結合をブロックし、それにより、コドン−アンチコドン相互作用及びタンパク質合成の伸張期を阻止する；
同時に標的とされる薬物は、細菌リボソームに一層熱心に、オクタヒドロテトラセン−２−カルボキサミドスケルトンを有するポリケチド抗菌剤の古典的なサブクラスとは異なる向きで結合し、それで、それらは、ｔｅｔ(Ｍ)リボソーム及びｔｅｔ(Ｋ)外向きフラックス遺伝的決定子を有する黄色ブドウ球菌の株に対して活性である；
標的とされる同化経路は、細菌タンパク質の生合成であり、それは、特異的アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに結合して特異的アミノ酸又はその相溶性ｔＲＮＡの一つに対する前駆体のエステル化を阻止する薬物により同時に標的とされ、そうして、アミノアシル−ｔＲＮＡの形成を阻止し、それ故、必要なアミノ酸の細菌タンパク質への組込みを停止させる；
標的とされる同化経路は、細菌タンパク質の生合成であり、それは、開始期より前の細菌タンパク質合成を阻害する薬物により、５０ＳｒＲＮＡに２３ＳｒＲＮＡのドメインＶを介して結合し、同時に、３０Ｓリボソームサブユニットの１６ＳｒＲＮＡと相互作用することにより、同時に標的とされ、そうして、タンパク質合成のイニシエーターのホルミル−メチオニン(ｆ−Ｍｅｔ−ｔＲＮＡ)及び３０Ｓリボソームサブユニットの結合を阻止する
標的とされる同化経路は、細菌タンパク質の生合成であり、それは、細菌リボソームの５０Ｓサブユニットと２３ＳｒＲＮＡのＰ部位の領域中のタンパク質Ｌ２にてペプチジルトランスフェラーゼセンター近くで相互作用する薬物によって同時に標的とされ、それ故、ペプチジルトランスフェラーゼ活性及びペプチジルトランスファーを阻止し、Ｐ部位相互作用をブロックして、活性な５０Ｓリボソームサブユニットの正常な形成を妨げる；
標的とされる同化経路は、ＤＮＡ複製及び転写であり、それは、トポイソメラーゼＩＩ(ＤＮＡジャイレース)及び／又はトポイソメラーゼＩＶを阻害する薬物によって同時に標的とされる；
標的とされる同化経路は、ＤＮＡの複製及び翻訳であり、それは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩＣ(グラム陽性細菌において染色体ＤＮＡの複製に必要とされるが、グラム陰性細菌には存在しない酵素)を阻害する薬物によって同時に標的とされる；
標的とされる同化経路は、ＤＮＡ複製及び転写であり、それは、トポイソメラーゼＩＩ(ＤＮＡジャイレース)及び／又はトポイソメラーゼＩＶ及び／又はＤＮＡポリメラーゼＩＩＩＣを阻害する薬理学的雑種化合物によって同時に標的とされる；
標的とされる同化経路は、細菌のリン脂質の生合成であり、それは、ホスファチジルエタノールアミンに富む細胞質膜に作用して他の局所用相乗的薬物と組み合わせてよく作用する局所用薬物によって同時に標的とされる；
標的とされる同化経路は、細菌の脂肪酸の生合成であり、それは、細菌の脂肪酸の生合成を、β−ケトアシル−(アシル−キャリアー−タンパク質(ＡＣＰ))シンターゼＩ／ＩＩ(ＦａｂＦ／Ｂ)(ＩＩ型脂肪酸合成に必須の酵素)の選択的ターゲティングによって阻害する薬物によって同時に標的とされる；
標的とされる同化経路は、細菌原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔの維持であり、同時ターゲティング用薬物は、細菌細胞膜機能の多くの面を、主としてグラム陽性細胞質膜に結合することにより破壊し、細胞に浸透せず、脱分極及び膜ポテンシャルの喪失を引き起こし、これは、タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成の阻害へと導く；
同時ターゲティング用薬物は、細菌細胞壁の透過性を増大させ、それ故、無機カチオンが該壁を通って無制限な仕方で移動することを可能にし、それにより、細胞質と細胞外環境との間のイオン勾配を破壊する；
標的とされる同化経路は、細菌膜の選択的透過性の維持及び細菌原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔであり、同時ターゲティング用薬物は、カチオン性細菌性ペプチドであり、それは、真核細胞の中性の膜表面と比較して、細菌の膜の負に帯電した面に対して選択的であり、原核細胞膜の透過性及び細菌細胞膜の最終的な穿孔及び／又は崩壊へと導き、それにより、細菌細胞内容物の漏出及び膜貫通ポテンシャルの破壊を促進する；
同時ターゲティング用薬物は、細菌のプロテアーゼのペプチドデフォーミラーゼを阻害するものであり、この酵素は、新たに合成された細菌ポリペプチドのＮ−末端からホルミル基を除去することを触媒する；そして
同時ターゲティング用薬物は、細菌中の２つの成分の調節システム例えばそれらの、細菌原形質膜を横切るシグナル変換により環境に応答する能力を阻害するが、これらのシグナル変換過程は、哺乳動物膜には存在しないものである。
【００４９】
ここで用いる場合、用語「真菌の同化経路の同時ターゲティング」は、(同化経路に影響を及ぼすように標的部位の細胞の(ΔμＨ+)及び／又は(Δμｘ+)を低下させるλｎ及びＴｎ)＋(同じ真菌の同化経路に影響を及ぼす薬物)を指し、下記の真菌の同化経路の何れかを指すことができ、これらは、複数の薬物によって阻害されうる：
標的とされる同化経路は、リン脂質の生合成であり、それは、真菌細胞膜において既存のリン脂質の構造を破壊し、又他の局所用相乗効果剤と組み合わせてよく作用する局所用薬物によって同時に標的とされる；
標的とされる同化経路は、エルゴステロールの生合成であり、それは、エルゴステロールの生合成をＣ−１４脱メチル化段階、シトクロムＰ−４５０酵素１４−ａ−ステロールデメチラーゼにより触媒される３ステップの酸化的反応で阻害する薬物によって同時に標的とされ、その結果エルゴステロールの涸渇及びラノステロール及び他の１４−メチル化ステロールの蓄積を生じ、これは、エルゴステロールの膜成分としての「バルク」機能を、原形質膜の構造の破壊により邪魔する；
標的とされる同化経路は、エルゴステロールの生合成であり、それは、酵素スクアレンエポキシダーゼを阻害する薬物(それは、順番に、真菌細胞におけるエルゴステロールの生合成を阻害する)により同時に標的とされ、これは、真菌細胞膜に増大した透過性を持たせる；
標的とされる同化経路は、エルゴステロールの生合成であり、それは、エルゴステロール生合成経路において離れた別々の点において２つの酵素、ｄ１４−レダクターゼ及びｄ７，ｄ８−イソメラーゼを阻害する薬物により同時に標的とされる；
標的とされる同化経路は、真菌細胞壁の生合成であり、それは、酵素(１，３)β−Ｄ−グルカンシンターゼを阻害する薬物(それは、順番に、真菌細胞壁におけるβ−Ｄ−グルカン合成を阻害する)により同時に標的とされる；
標的とされる同化経路は、真菌のステロールの生合成であり、それは、真菌細胞壁中のステロールと結合する薬物により同時に標的とされ、同時ターゲティング用薬物が結合する主たるステロールは、エルゴステロールであり、これは、細胞膜の転移温度を効果的に変えて、膜に細孔を形成させ、真菌細胞膜に有害なイオンチャンネルの形成を生じる；
同時に標的とされる薬物は、送達のために、脂質、リポソーム、脂質複合体及び／又はコロイド分散体に、該薬物からの毒性を防止するために配合される；
標的とされる同化経路は、タンパク質合成であり、それは、５−ＦＣが真菌細胞にシトシンパーミアーゼにより取り込まれ、５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)に脱アミノ化され、ヌクレオシド三リン酸に変換され、そしてＲＮＡに組み込まれてミスコーディングを生じる薬物により同時に標的とされる；
標的とされる同化経路は、真菌タンパク質合成であり、それは、真菌の伸長因子ＥＦ−２(これは、その哺乳動物の類似物とは機能的に異なっている)及び／又は哺乳動物細胞には存在しない真菌の伸長因子３(ＥＦ−３)を阻害する薬物により同時に標的とされる；
標的とされる同化経路は、真菌のキチン生合成(β−(１，４)−結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのホモポリマー)であり、それは、真菌のキチンの生合成を、酵素キチンシンターゼ２、真菌の一次隔壁の形成及び細胞分裂に必要な酵素の少なくとも一つの作用を阻害することにより阻害する薬物により同時に標的とされる；
同時ターゲティング用薬物は、酵素キチンシンターゼ３、芽の出現及び成長、交配及び胞子形成中にキチンの合成に必要な酵素の作用を阻害する；
同時ターゲティング用薬物は、多価カチオン(Ｆｅ+3又はＡｌ+3)をキレートして、ミトコンドリアの電子伝達及び細胞エネルギー産生の責任を負った金属依存性酵素の阻害を生じ、それは又、真菌細胞内の過酸化物の正常な分解の阻害へも導く；そして
同時ターゲティング用薬物は、真菌における２成分の調節システム例えばそれらの真菌原形質膜を横切るシグナル変換により環境に応答する能力を阻害する。
【００５０】
ここで用いる場合、用語「癌同化経路の同時ターゲティング」は、(同化経路に影響を及ぼす標的部位における細胞の(ΔμＨ+)及び／又は(Δμｘ+)を低下させるλｎ及びＴｎ)＋(同じ癌同化経路に、非癌細胞を超える程度に影響を及ぼす薬物)を指し、下記の、薬物により阻止することのできる癌同化経路の何れかを指すこともできる：
標的とされる同化経路は、ＤＮＡ複製であり、それは、ＤＮＡ複製をＤＮＡ二重らせん鎖中のグアニン核酸塩基を架橋させて該鎖がらせんを解き分離すること(ＤＮＡ複製に必要)をできなくすることにより阻止する薬物により同時に標的とされる；
標的とされる同化経路は、ＤＮＡ複製であり、それは、ＤＮＡの同じ又は異なる鎖中の２つの異なる７−Ｎ−グアニン残基と反応しうる薬物により同時に標的とされる；
標的とされる同化経路は、ＤＮＡ複製であり、それは、ＤＮＡ複製及び細胞分裂を代謝拮抗物質として作用することにより阻害する薬物によって同時に標的とされる；
標的とされる同化経路は、細胞分裂であり、それは、細胞分裂を、微小管機能を妨げることにより阻害する薬物によって同時に標的とされる；
標的とされる同化経路は、ＤＮＡ複製であり、それは、ＤＮＡ複製及び細胞分裂を、細胞がＧ１期(ＤＮＡ複製の開始)に入ること及びＤＮＡの複製(Ｓ期)を妨げることにより阻害する薬物によって同時に標的とされる；
標的とされる同化経路が細胞分裂であり、それは、後期に染色体の分離を防止する微小管の安定性を増進する薬物によって同時に標的とされる；そして
標的とされる同化経路は、ＤＮＡ複製であり、それは、ＤＮＡ複製及び細胞分裂を、Ｉ型及びＩＩ型トポイソメラーゼを阻害することにより阻害する薬物によって同時に標的とされる(これは、適当なＤＮＡスーパーコイリングを破壊することによりＤＮＡの転写及び複製を邪魔するであろう)。
【００５１】
ここで用いる場合、用語「プロトン起動力(Δｐ)」は、エネルギーを、膜を横切るプロトンと電圧勾配の組合せとして、貯蔵する(一種の蓄電池のように作用する)ことを指す。２つの成分Δｐ及びΔΨ(膜貫通ポテンシャル)並びにΔｐＨ(Ｈ+の化学的勾配)。標準的な別の方法では、Δｐは、Ｈ＋膜貫通ポテンシャルΔΨ(外部が負(酸性))及び膜貫通ｐＨ勾配ΔｐＨ(内部がアルカリ性)よりなる。この電気化学的勾配の形態で貯蔵されたポテンシャルエネルギーは、水素イオンを、化学浸透圧中で、生物学的膜(ミトコンドリア内膜又は細菌及び真菌の原形質膜)を横切ってポンプ輸送することにより生成される。このΔｐは、細胞における、化学的、浸透圧的又は機械的仕事に利用することができる。プロトン勾配は、一般に、ＡＴＰ合成を駆動するために酸化的リン酸化に利用され、細菌、真菌又は哺乳動物細胞(癌細胞を含む)における流出用ポンプを駆動するために利用することができる。Δｐは、ここでは、種に基いて４つの異なる膜におけるプロトン起動力を記載するために用いられ、数学的に、(ΔＰ＝ΔΨ＋ΔｐＨ)として定義される。
１）哺乳動物のミトコンドリアのプロトン起動力(Δｐ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ)
２）真菌のミトコンドリアのプロトン起動力(Δｐ−ｍｉｔｏ−Ｆｕｎｇｉ)
３）真菌の原形質膜のプロトン起動力(Δｐ−ｐｌａｓ−Ｆｕｎｇｉ)
４）細菌の原形質膜のプロトン起動力(Δｐ−ｐｌａｓ−Ｂａｃｔ)
【００５２】
ここで用いる場合、「哺乳動物のミトコンドリアのプロトン起動力(Δｐ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ)」なる用語は、哺乳動物のミトコンドリア内膜を横切る(Ｈ+)の電気化学的勾配の形態で貯蔵されたポテンシャルエネルギーを指す。Δｐ−ｍｉｔｏ−ｍａｍは、酸化的リン酸化において、哺乳動物のミトコンドリアでＡＴＰ合成を駆動するために利用される。
【００５３】
ここで用いる場合、「真菌のミトコンドリアのプロトン起動力(Δｐ−ｍｉｔｏ−Ｆｕｎｇｉ」なる用語は、真菌のミトコンドリア内膜を横切る(Ｈ+)の電気化学的勾配の形態で貯蔵されたポテンシャルエネルギーを指す。Δｐ−ｍｉｔｏ−Ｆｕｎｇｉは、酸化的リン酸化において、真菌のミトコンドリアでＡＴＰ合成を駆動するために利用される。
【００５４】
ここで用いる場合、用語「真菌の原形質膜のプロトン起動力(Δｐ−ｐｌａｓ−Ｆｕｎｇｉ)」は、真菌の原形質膜を横切る(Ｈ+)の電気化学的勾配の形態で貯蔵され、水素イオンの原形質膜を横切る、膜に結合されたＨ+−ＡＴＰアーゼによるポンプ輸送により生成されるポテンシャルエネルギーを指す。この原形質膜に結合されたＨ+−ＡＴＰアーゼは、高性能のプロトンポンプであり、機能するのにＡＴＰを必要とする。このＨ+−ＡＴＰアーゼのためのＡＴＰは、Δｐ−ｍｉｔｏ−Ｆｕｎｇｉから生成される。Δｐ−ｐｌａｓ−Ｆｕｎｇｉは、真菌細胞において流出用ポンプを駆動するために利用することができる。
【００５５】
ここで用いる場合、用語「細菌の原形質膜のプロトン起動力(Δｐ−ｐｌａｓ−Ｂａｃｔ)」は、細菌の原形質膜を横切る電気化学的勾配(Ｈ+)の形態で貯蔵されたポテンシャルエネルギーを指し、水素イオンの、化学浸透圧下で原形質膜を横切るポンプ輸送により生成される。Δｐ−ｐｌａｓ−Ｂａｃｔは、細菌原形質膜におけるＡＴＰ合成を駆動するために酸化的リン酸化において用いられ、細菌細胞における流出用ポンプを駆動するために利用することができる。
【００５６】
ここで用いる場合、用語「同化経路」は、構造分子を一層小さいユニットから組み立てる細胞代謝経路を指す。これらの反応は、エネルギーを必要とする。多くの同化経路及び過程は、アデノシン三リン酸(ＡＴＰ)によって促進される。これらの過程は、アミノ酸などの単純な分子及び複雑な分子例えばペプチドグリカン、タンパク質、酵素、リボソーム、細胞オルガネラ、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、グルカン、キチン、単純脂肪酸、複合脂肪酸、コレステロール、ステロイド及びエルゴステロールの合成を包含することができる。
【００５７】
ここで用いる場合、用語「エネルギー変換」は、膜に埋め込まれた呼吸複合体を通る、プロトンを膜を横切ってポンプ輸送して電気化学的ポテンシャル(プロトン電気化学的勾配としても知られる)を造るための電子移動反応を利用する電子の移動を指す。
【００５８】
ここで用いる場合、細胞における用語「エネルギー型変換(transformation)」は、エネルギーの交換及び変換を可能にするために常に破壊されては造られる化学結合を指す。一般に、一層高濃度形態から一層低濃度形態へのエネルギーの型変換は、すべての生物学的又は化学的過程(細胞の呼吸に責任を負う)の駆動力であるといわれている。
【００５９】
ここで用いる場合、用語「アンカップラー」は、ＡＴＰの合成から膜のプロトンの電気化学的勾配(ΔμＨ+)に貯えられたエネルギーの分離を引き起こす分子又は装置を指す。
【００６０】
ここで用いる場合、用語「脱共役」は、アンカップラー(分子又は装置)を用いて、ＡＴＰの合成から膜のプロトン電気化学的勾配(ΔμＨ+)に貯えられたエネルギーの分離を引き起こすことを指す。
【００６１】
ここで用いる場合、用語「アデノシン５’−三リン酸(ＡＴＰ)」は、細胞内エネルギー移動の「分子通貨」として作用する多機能性ヌクレオチドを指す。ＡＴＰは、化学エネルギーを細胞内で、代謝のために輸送し、エネルギー源として、細胞呼吸の過程で生成される。ＡＴＰは、多くの酵素及び広範な細胞過程(生合成反応、流出ポンプ機能及び同化による細胞の成長及び分裂を含む)によって消費される。
【００６２】
ここで用いる場合、用語「アデノシン二リン酸(ＡＤＰ)」は、ＡＴＰのＡＴＰアーゼによる脱リン酸化の生成物である。ＡＤＰは、ＡＴＰ合成によりＡＴＰに戻される。有気呼吸する細胞においては、生理的条件下で、ＡＴＰシンターゼは、エネルギー源としてＴＥＳにより造られたプロトン起動力Δｐを利用してＡＴＰを造るということは理解される。この様式のすべてのエネルギーを造る過程は、酸化的リン酸化と呼ばれる。酸化的リン酸化の全反応シーケンスは、ＡＤＰ＋Ｐｉ→ＡＴＰである。生物学的反応を駆動する潜在力は、反応物と生成物のギブス自由エネルギーである。ギブス自由エネルギーは、仕事をするために利用可能な(「自由な」)エネルギーであり、用語ギブス自由エネルギーの変化(ΔＧ)は、膜において仕事をするために利用することのできる自由エネルギーの変化を指す。この自由エネルギーは、エンタルピー(ΔＨ)、エントロピー(ΔＳ)及び温度の関数である。(エンタルピー及びエントロピーは、以下で論じる。)
【００６３】
ここで用いる場合、用語「リン酸化ポテンシャル(ΔＧｐ)」は、ＡＴＰ、ＡＤＰ及びＰｉ濃度の任意所定のセットにおけるＡＴＰ合成のためのΔＧを指す(次元：ｋＪモル-1)。
【００６４】
ここで用いる場合、用語「ＣＣＣＰ」は、呼吸鎖の非常に毒性のイオノフォア及びアンカップラーであるカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾンを指す。ＣＣＣＰは、膜を通るプロトンの伝導性を増大させて、ＡＴＰ合成をΔμＨ+から脱共役させること及びΔΨとΔｐＨを消すことにより古典的なアンカップラーとして作用する。
【００６５】
ここで用いる場合、用語「脱分極」(脱エネルギゼーション(de-energization))は、細胞の原形質膜又はミトコンドリア膜ポテンシャルΔΨの絶対値の減少を指す。如何なる細菌の原形質膜の脱分極も、ＡＴＰの損失と増大した遊離基の形成へと導くということが仮定される。如何なる真核細胞のミトコンドリアの脱分極も、ＡＴＰの損失と増大した遊離基の形成へと導くということも仮定される。
【００６６】
ここで用いる場合、用語「エンタルピー変化(ΔＨ)」は、膜システムのエンタルピー又は熱含量の変化を指し、膜システムの熱力学的ポテンシャルの指数又は記述である。
【００６７】
ここで用いる場合、用語「エントロピー変化(ΔＳ)」は、膜システムのエントロピーの分子レベルで一層乱れた状態のエントロピーへの変化を指す。用語「レドックスストレス」は、細胞の標準酸化／還元ポテンシャル(「レドックス」)状態と異なる細胞状態を指す。レドックスストレスは、ＲＯＳの増大したレベル、グルタチオンの減少したレベル及び細胞のレドックスポテンシャルを変える任意の他の状況を包含する。
【００６８】
ここで用いる場合、用語「反応性酸素種」は、下記のカテゴリーの一つを指す：
ａ）スーパーオキシドイオンラジカル(Ｏ2-)
ｂ）過酸化水素(ラジカルではない)(Ｈ2Ｏ2)
ｃ）ヒドロキシルラジカル(*ＯＨ)
ｄ）ヒドロキシイオン(ＯＨ-)
これらのＲＯＳは、一般に、下記の反応鎖により生じる：
Ｏ2→Ｏ2-＋２Ｈ+→Ｈ2Ｏ2→ＯＨ-＋*ＯＨ→ＯＨ-
(ｅ-)         (ｅ-)   (ｅ-)         (ｅ-)
【００６９】
ここで用いる場合、用語「一重項酸素」は、(「１Ｏ2」)を指し、三重項励起分子との相互作用により形成される。一重項酸素は、逆平行スピンの電子を有する非ラジカル種である。一重項酸素１Ｏ2は、その電子のスピン制限を有しないので、それは、非常に高い酸化力を有して、容易に膜(例えば、ポリ不飽和脂肪酸、即ちＰＵＦＡにより)アミノ酸残基、タンパク質及びＤＮＡを攻撃することができる。
【００７０】
ここで用いる場合、用語「エネルギーストレス」は、細胞のＡＴＰレベルを変える状態を指す。これは、電子伝達における変化及び脱共役剤又はミトコンドリア及び／若しくは原形質膜におけるΔΨを変える照射への曝露でありうる。
【００７１】
ここで用いる場合、用語「ＮＩＭＥＬＳ効果」は、照射された細胞の、原形質膜及びミトコンドリアレベルでの、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙからΔΨ−ｔｒａｎｓへの、本発明による、生体エネルギー的「状態」の改変を指す。特に、ＮＩＭＥＬＳ効果は、細胞の同化経路又は抗菌及び／若しくは癌の耐性機構(プロトン起動力又は化学浸透圧ポテンシャルをエネルギー要求に対して利用する)を弱めることができる。
【００７２】
ここで用いる場合、用語「ペリプラズム空間又はペリプラズム」は、グラム陰性細菌の原形質膜と外膜との間の空間並びにグラム陽性細菌及び真菌例えばカンジダ及び白癬菌の原形質膜と細胞壁との間の空間を指す。このペリプラズム空間は、栄養獲得、ペプチドグリカンの合成、電子伝達及び細胞に有毒な物質の改変を含む様々な生化学経路に関与している。ＭＲＳＡのようなグラム陽性細菌においては、ペリプラズム空間は、β−ラクタマーゼ酵素がペニシリンベースの抗生物質を不活性化する場合、有意に臨床的に重要なものである。
【００７３】
ここで用いる場合、用語「流出用ポンプ」は、分子(抗生物質、抗真菌剤又は毒など)を、それらの細胞から外部環境へのエネルギー依存様式での排除のために、細胞の細胞質又はペリプラズムから輸出する能動輸送タンパク質アセンブリを指す。
【００７４】
ここで用いる場合、用語「流出用ポンプのインヒビター」は、流出用ポンプの分子を細胞から輸出する能力を邪魔する化合物又は電磁放射送達システム及び方法を指す。特に、この発明の流出用ポンプインヒビターは、電磁放射の形態であり、それは、治療用抗生物質、抗真菌剤、抗新生物剤及び毒物を細胞から放出するポンプの能力を、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍａｍ、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｆｕｎｇｉ又はΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｂａｃｔを改変することにより邪魔する。
【００７５】
細胞が「流出用ポンプ耐性機構を利用する」とは、細菌又は真菌又は癌細胞が、抗細菌剤及び／又は抗真菌剤及び／又は抗新生物剤を、細胞質又はペリプラズムから細胞の外部環境へ輸出し、それにより、これらの薬剤の細胞内濃度を低下させて、細胞の成長及び／又は増殖を阻害するのに必要な濃度より低い濃度にすることを意味する。
【００７６】
細胞成長のコンテキストにおいて、用語「阻害する」は、細胞集団の成長及び／又は増殖の速度を減少させ、可能であれば、停止させることを意味する。
【００７７】
タンパク質化学において、一次構造は、アミノ酸の直線的配列を指し；二次構造は、直線的アミノ酸構造が、らせん又はβ−シート構造の何れを形成するかを指し；タンパク質又は他の任意の巨大分子の三次構造は、その３次元構造であり、別の述べ方をするなら、一本鎖分子全体の空間的組織化(コンホメーションを含む)であり；四次構造は、三次構造を有する多数のタンパク質分子の、マルチサブユニット複合体における配置である。
【００７８】
ここで用いる場合、用語「タンパク質ストレス」は、膜輸送に関係する酵素及び他のタンパク質を含むタンパク質の三次及び四次構造の熱力学的改変を指す。この用語は、タンパク質の変性、タンパク質のミスフォールディング、タンパク質の架橋、鎖間及び鎖内結合(例えば、ジスルフィド結合)の酸素依存性及び非依存性酸化の両方、個々のアミノ酸の酸化などを含む(但し、制限はしない)。
【００７９】
用語「ｐＨストレス」は、細胞内ｐＨの改変を指す(即ち、約６．０未満の低下した細胞内ｐＨ又は約７．５を超える上昇した細胞内ｐＨ)。これは、例えば、細胞を、ここに記載したこの発明にさらして、細胞膜成分を変えること又は定常状態の膜ポテンシャルΔΨ−ｓｔｅａｄｙに変化を引き起こすことによって引き起こされうる。
【００８０】
ここで用いる場合、用語「抗真菌性分子」は、殺真菌性又は静真菌性の化学薬品又は化合物を指す。主たる効力は、抗真菌性分子を、耐性真菌株における有気性反応及び／又は流出用ポンプ活性を阻害することにより、又はエネルギーに関してプロトン起動力若しくは化学浸透圧ポテンシャルを必要とする他の耐性機構を阻害することによって強化する、本発明の能力である。
【００８１】
ここで用いる場合、用語「抗細菌性分子(又は、薬剤)」は、殺細菌性又は静細菌性の化学薬品又は化合物を指す。他の主たる効力は、本発明の、抗細菌性分子を、耐性細菌株における流出用ポンプ活性を阻害することにより、又はエネルギーに関してプロトン起動力若しくは化学浸透圧ポテンシャルを必要とする有気性反応及び／若しくは耐性機構を阻害するによって強化する能力にある。
【００８２】
ここで用いる場合、用語抗細菌性又は抗真菌性分子の「準阻害的濃度」は、標的細胞の集団中の大部分を阻害するのに必要とされる濃度より低い濃度を指す。(一面において、標的細胞は、治療のための標的とされる、細菌、真菌、及び癌細胞を含む細胞(但し、これらに限られない)である) 一般に、準阻害的濃度は、最少阻止濃度(ＭＩＣ)より低い濃度を指し、これは、別途特に述べられていない限り、標的細胞の成長又は増殖における少なくとも１０％の低下を生じるのに必要とされる濃度として定義される。
【００８３】
ここで用いる場合、用語「最少阻止濃度」又はＭＩＣは、有効又は治療上有効な最低濃度であって、微生物の成長の阻止を生じる濃度として定義される。
【００８４】
ここで用いる場合、用語薬物又は分子(例えば、抗細菌剤又は抗真菌剤)の「治療上有効な量」は、標的(病原性)細胞により引き起こされた症状の少なくとも一つを、ＮＩＭＥＬＳと一緒に、部分的に又は完全に除去させる薬剤の濃度を指す。特に、治療上有効な量は、(１)排除されなければ、身体内の標的細胞集団を減少させ、(２)身体内の標的細胞集団の増殖を阻害し(即ち、停止させるのでなければ、減速させる)、(３)感染の拡大を阻止し(即ち、停止させるのでなければ、減速させる)、(４)感染と関係する症状を軽減させる(排除するのでない場合)、ＮＩＭＥＬＳを伴う、薬剤の量を指す。
【００８５】
ここで用いる場合、用語「相互作用率」は、ＮＩＭＥＬＳレーザー及び／又は抗菌性分子間の、標的細胞についての、静細菌／殺細菌及び／又は静真菌／殺真菌相互作用の等級の数値表現として定義される。
【００８６】
生物学的膜におけるエネルギー変換の熱力学
本発明は、細胞膜の生物学的熱力学(生体エネルギー論)を混乱させること及びその結果の、照射された細胞の、標準的なエネルギー変換及びエネルギー型変換を適当に受けることに対する減少した許容力に向けられている。
【００８７】
本発明の方法及びシステムは、Ψｄ−ｐｌａｓ−ｍａｍ、Ψｄ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ、Ψｄ−ｐｌａｓ−ｆｕｎｇｉ、Ψｄ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ及びΨｄ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔを、光学的に、変化させ、改変して、同膜のΔΨ及びΔｐの更なる変化を推進する。これは、脂質二重層の長鎖脂肪酸中のＣ−Ｈ共有結合に標的を定めた近赤外線照射によって引き起こされ、双極子ポテンシャルΨｄの変化を引き起こす。
【００８８】
この生体エネルギー論的改変の過程を理解するのを助けるために、下記の、熱力学の、膜の生体エネルギー論及び生物学的膜におけるエネルギー変換への適用の記載を与える。先ず、膜(脂質二重層、図１参照)は、双極性の基及び分子の構造的結合、主として、リン脂質(図２)と水とのエステル結合から生じる有意の双極子ポテンシャルΨｄを有している。これらの双極性の基は、炭化水素相が外膜領域に関して陽性であるように方向付けられる(図３)。双極子ポテンシャルの程度は、通常、大きく、典型的には、数百ミリボルトである。第二の主要ポテンシャル、膜を横切る電荷の分離は、膜貫通ポテンシャルΔΨを生じさせる。この膜貫通ポテンシャルは、膜の両側のバルクの水相間での電気的ポテンシャルの差として定義され、帯電した分子の膜を横切る選択的輸送から生じる。原則として、細胞膜の細胞質側でのこのポテンシャルは、細胞外の生理学的溶液に対して負である(図４Ａ)。
【００８９】
双極子ポテンシャルΨｄは、すべての原形質膜及びミトコンドリア膜の静電ポテンシャルの大きく且つ機能的に重要な部分を構成する。Ψｄは、膜の内側の電場を改変して、非双極性二重層の中心に仮想正電荷を生じる。この「正電荷」の結果として、脂質膜は、正及び負に帯電した疎水性イオン間の透過率にかなりの(例えば、最大で６桁の)差を示す。Ψｄは又、親油性イオンに対する膜の透過性においても重要な役割を演じている。
【００９０】
多くの細胞過程例えば、タンパク質(酵素)の結合及び挿入、タンパク質の横方向拡散、リガンド−レセプター認識、並びに内部及び外部の分子への膜の融合のある段階は、膜の二重層の物理的特性であるΨｄに決定的に依存する。モデル膜システムにおける研究は、純粋脂質二おいて等温相転移、異なる相の分離、及び混合物中の個々の成分の明瞭なクラスタリングを引き起こす一価及び多価のイオンの能力を示した。膜においては、これらのような電荷は、膜に埋め込まれたタンパク質及びシトクロムのコンホメーション力学に物理的影響を及ぼすことができ(図４Ｂ)、一層特に、大きいコンホメーションの再配置をそれらの作動サイクル中に膜貫通ドメインで受けるタンパク質に物理的影響を及ぼすことができる(図５)。最も重要なことには、Ψｄにおける電荷は、膜の酵素活性を変調すると考えられている。
【００９１】
エネルギー変換
生物学的膜におけるエネルギー変換は、一般に、下記の３つの相互に関係する機構を含む：
１）レドックスエネルギーの、膜貫通イオン性電気化学的ポテンシャル(膜プロトン電気化学的勾配ΔμＨ+とも呼ばれる)に蓄えられる「自由エネルギー」への変換。このプロトン電気化学的ポテンシャルの、プロトンポンプを含む能動輸送に従事する膜の両側間での差は、ときには、化学浸透圧ポテンシャル又はプロトン起動力とも呼ばれる。
２）哺乳動物細胞において、(Ｎａ+)イオン電気化学的勾配Δμｘ+は、(Ｎａ+)の細胞外への能動輸送によって、原形質膜を横切って維持されている。これは、プロトン電気化学的ポテンシャルとは異なる勾配であり、酸化的リン酸化において哺乳動物ミトコンドリアプロトン起動力Δｐ−ｍｉｔｏ−ｍａｍから生成されたＡＴＰによる(ポンプ)により生成される。
３）この「自由エネルギー」の、膜を横切る能動輸送を推進するためのＡＴＰを造る(エネルギー変換)ための利用(細胞において必要とされる溶質及び代謝産物の付随的集積を伴う)は、リン酸化ポテンシャルΔＧｐと呼ばれる。換言すれば、ΔＧｐは、任意所定のＡＴＰ、ＡＤＰ及びＰｉ濃度のセットにおけるＡＴＰ合成のためのΔＧである。
【００９２】
定常状態の膜貫通タンパク質(ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ)
膜「システム」の状態は、その化学ポテンシャル勾配ΔμＨ+とＥ(エネルギー)が一時的に非依存的であり、システムの縁を横切るエネルギーの流れがない場合には、平衡である。もし膜システム変数のΔμＨ+とＥが一定であるが、システムを横切るエネルギー移動の正味の流れがあるならば、この膜システムは、定常状態にあり、一時的に依存的である。
【００９３】
焦点は、細胞(呼吸し、成長し、分裂している細胞)の、この一時的に依存的な定常状態膜貫通及び／又はミトコンドリアポテンシャル(ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ)である。この電子及びプロトンの、又はＮａ+／Ｋ+イオンの、ミトコンドリア又は原形質膜を、正常な電子伝達及び酸化的リン酸化中に横切る流れの「定常状態」は、内因性又は外因性の事象によって妨げられなければ、未来に継続することは最もありそうなことである。膜の熱力学の如何なる外因性の改変も、過渡的状態の膜貫通及び／又はミトコンドリアポテンシャルΔΨ−ｔｒａｎｓをもたらし、このΔΨ−ｓｔｅａｄｙからΔΨ−ｔｒａｎｓへの変化は、本発明の目的である。
【００９４】
状態変数ΔΨ−ｓｔｅａｄｙとΔΨ−ｔｒａｎｓの間の数学的関係は、状態方程式と呼ばれる。熱力学においては、状態関数(状態量)は、システムの現在の状態にのみ依存する特性又はシステムである。それは、システムがその固有の状態に達した経路に依らない。本発明は、膜貫通及び／又はミトコンドリアポテンシャルΔΨにおける状態の変化を促進して、一時的に依存する様式で、膜の生体エネルギー論を、熱力学的定常状態ΔΨ−ｓｔｅａｄｙから過渡的状態ΔΨ−ｔｒａｎｓにおけるエネルギーストレス及び／又はレドックスストレスの一つに動かす。
【００９５】
これは、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍａｍ、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−Ｂａｃｔ−ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ及びΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉにおいて起こりうる。理論に拘束されることは望まないが、この変化は、脂質二重層の長鎖脂肪酸中のＣ−Ｈ共有結合に標的を定めた近赤外線(波長９３０ｎｍ)の照射(双極子ポテンシャルΨｄの変化を引き起こす)、及びシトクロム鎖に標的を定めた近赤外線(波長８７０ｎｍ)照射(膜のΔΨ−ｓｔｅａｄｙ及びレドックスポテンシャルを同時に変える)により引き起こされるということが考えられる。
【００９６】
熱力学の第一法則と膜
熱力学の第一法則(膜システムについて正しい)の本質的な面は、孤立システムのエネルギーは、保存され、熱及び仕事の両者は、エネルギーの同等の形態して考えられるということである。それ故、膜システムのエネルギーレベル(Ψｄ及びΔΨ)は、所定の距離にわたり又は体積要素内で、力又は圧力作用により、それぞれ、為される機械的仕事の増加又は減少により；及び／又は膜内で温度勾配により伝達される非破壊的熱によって変化しうる。
【００９７】
この法則(エネルギー保存の法則)は、周囲から孤立したシステムの全エネルギーは変化しないと断定する。従って、任意の量の熱及び仕事(エネルギー)のシステムへの追加は、そのシステムのエネルギーの変化に反映されなければならない。
【００９８】
赤外線照射の吸収
赤外線照射の個々の光子は、紫外線の光子で見られるような電気的変化を(分子内で)誘導するのに十分なエネルギー(例えば、電子ボルトで測定)を含んでいない。この故に、赤外線照射の吸収は、分子結合の可能な振動及び回転において小さいエネルギー変化を有する化合物に限られる。
【００９９】
定義により、膜二重層について、赤外線照射を吸収するためには、赤外線の光子を吸収する脂質二重層の分子結合内の振動及び回転は、膜の双極子ポテンシャルの正味の変化を引き起こさなければならない。もし赤外線照射の振動数(波長)が吸収分子(即ち、長鎖脂肪酸中のＣ−Ｈ共有結合)の振動数と一致すれば、照射は吸収されて、Ψｄの変化を引き起こす。これは、Ψｄ−ｐｌａｓ−ｍａｍ、Ψｄ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ、Ψｄ−ｐｌａｓ−ｆｕｎｇｉ、Ψｄ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ及びΨｄ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔにおいて起こりうる。換言すれば、ここに記載した方法及びシステムを利用すれば、すべての細胞の脂質二重層のエンタルピー及びエントロピーの直接的且つ標的を定めた変化(ΔＨ及びΔＳ)がありうる。
【０１００】
本発明は、上で導入され、部分的に経験的データから得られた洞察の組合せに基づいており、それは、下記を含む：
【０１０１】
固有の、単一波長(８７０ｎｍ及び９３０ｎｍ)が、細菌細胞(原核生物)例えば大腸菌及び(真核生物)例えばＨｅｌａチャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)を、ＲＯＳ及び毒性一重項酸素反応の生成及び相互作用の結果、殺すことができるということは認められてきた。例えば、２００３年８月２６日出願の米国特許出願第１０／６４９９１０号及び２００４年２月１１日出願の米国特許出願第１０／７７６１０６号を参照されたい(これらの全教示を参考として本明細書中に援用する)。かかるＮＩＭＥＬＳシステムを用いて、個々の８７０ｎｍ及び９３０ｎｍの波長を回避する代わりに、本発明のレーザーシステム及び方法(ＮＩＭＥＬＳシステム)は、共焦点レーザー顕微鏡で典型的に見出されるもの例えば光学的トラップで用いられるもの(約５００，０００ｗ／ｃｍ2少ないパワー)より５ｌｏｇ低いパワー密度の波長を組み合わせて、かかる波長の治療用レーザーシステムの使用を有利に利用することが確立された。
【０１０２】
これは、照射域内のすべての細胞のΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍａｍ、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｆｕｎｇｉ、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−Ｂａｃｔ，ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ及びΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉの変化、操作及び脱分極の表示された目的のために行われる。これは、本発明において、脂質二重層の長鎖脂肪酸中のＣ−Ｈ共有結合に標的を定めた赤外線照射(９３０ｎｍエネルギー)により達成され、照射域内のすべての生物学的膜の双極子ポテンシャルΨｄ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ、Ψｄ−ｐｌａｓ−ｆｕｎｇｉ、Ψｄ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ及びΨｄ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔの変化を生じる。第二に、シトクロム鎖の近赤外線照射(８７０ｎｍ)は、シトクロムを有する膜(即ち、細菌の原形質膜、並びに真菌及び哺乳動物のミトコンドリア)のΔΨ−ｓｔｅａｄｙ及びレドックスポテンシャルを更に変化させる。
【０１０３】
直接的発色団(シトクロム及び長鎖脂肪酸中のＣ−Ｈ結合)として役立って、本発明の照射光路内のすべての細胞の脂質二重層について、膜脂質及びシトクロムの分子力学における直接的エンタルピー及びエントロピーの変化がある。これは、照射された細胞内の各膜の双極子ポテンシャルΨｄを変え、同時に、すべての膜の膜ポテンシャルΔΨの絶対値を変える。
【０１０４】
これらの変化は、ＮＩＭＥＬＳシステムから直線的一光子過程にてエネルギーを吸収したときに、脂質及びシトクロムの金属タンパク質反応中心の有意に増大した分子運動(即ち、ΔＳ)によって起きる。脂質二重層及び／又はシトクロムにおける小さい熱力学的変化でも双極子ポテンシャルΨｄを変えるのに十分であるので、付着した電子伝達タンパク質、又は膜貫通タンパク質の分子形状(及び、それ故、酵素活性)は、一層機能的でなくなる。これは、照射された細胞中のすべての膜において、直接、ΔΨに影響を与えて改変する。
【０１０５】
ＮＩＭＥＬＳ効果は、ここに記載した方法及びシステムによって、細胞膜に熱的又は剥離的機械的ダメージを与えることなく起きる。この組み合わせた標的を定めた低線量のアプローチは、エネルギーのビーム光路内のすべての膜に現実の機械的ダメージを生じる既存の方法からの明瞭な変化及び改良である。
【０１０６】
膜のエントロピー及び熱力学の第二法則
熱の他の形態のエネルギーへの変換は、決して完全ではなく、(熱力学の第二法則により)常に、エントロピーの増加を伴わなければならない。エントロピー(膜内の)は、状態関数であり、反応におけるその変化は、(エネルギー)熱の入出力及び関連する分子の再配置の変化による、反応の向きを記載する。
【０１０７】
たとえ熱及び機械的エネルギーがそれらの基本的性質(エネルギーの形態として)において同等であっても、熱エネルギーを仕事に変換する能力には限界がある。即ち、過剰な熱は、膜構造に永久的にダメージを与えて、仕事又は両方向の有益なエネルギー変化を妨げうる。
【０１０８】
このＮＩＭＥＬＳ効果は、照射された細胞のエントロピーの「状態」を、一時的に依存的な様式で、脂質二重層のレベルで改変する。このエントロピーの増加は、すべての照射された膜(ミトコンドリア及び原形質)のΨｄを変え、それ故、熱力学的に「定常状態」の電子及びプロトンの細胞膜を横切る流れを変える(図６及び７)。これは、順番に、定常状態の膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｓｔｅａｄｙを過渡的状態の膜ポテンシャル(ΔΨ−ｔｒａｎ)へと変化させる。この現象は、下記にて起きる：
１）  哺乳動物原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｐｌａｓ−ｍａｍ；
２）  真菌原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｐｌａｓ−ｆｕｎｇｉ；
３）  細菌原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔ；
４）  哺乳動物ミトコンドリア膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ；及び
５）  真菌ミトコンドリア膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ。
【０１０９】
これは、流動モザイク膜中の長鎖脂肪酸のＣ−Ｈ結合のレベルでの標的を定めたエンタルピー変化の直接的結果であり、膜の物質的特性を変えうる動的な混乱(膜内で)を生じる。この流動モザイクは、エントロピーが増加して、電子伝達タンパク質の三次及び四次特性を破壊し、レドックスストレス、エネルギーストレス及びその後のＲＯＳの生成を生じえて、これは、更に、膜にダメージを与え、更に、生体エネルギー論を変えるであろう。
【０１１０】
呼吸する細胞の電子伝達系の主たる機能は、定常状態でエネルギーを変換することであるので、本発明の技術は、一時的に、機械光学的に、変換過程における関連する多くの熱力学的相互作用を脱共役させるために利用される。これは、膜のプロトン電気化学的勾配ΔμＨ+及びプロトン起動力及びΔｐの絶対定量値を変えるという明確な意図を持って行うことができる。この現象は、とりわけ、下記において起こりうる：
１）  哺乳動物ミトコンドリアプロトン起動力(Δｐ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ)；
２）  真菌ミトコンドリアプロトン起動力(Δｐ−ｍｉｔｏ−Ｆｕｎｇｉ)；
３）  真菌原形質膜プロトン起動力(Δｐ−ｐｌａｓ−Ｆｕｎｇｉ)；及び
４）  細菌原形質膜プロトン起動力(Δｐ−ｐｌａｓ−Ｂａｃｔ)。
【０１１１】
かかる現象は、順番に、リン酸化及びＡＴＰ合成のための利用可能なギブス自由エネルギー値ΔＧ(ΔＧｐ)を減少させる。本発明は、必要なエネルギー依存的有気反応を阻害するために、これらの現象を実施して、薬物療法剤を強化し及び／又は細胞の抵抗機構(抗細菌性、抗真菌性及び抗新生物性分子に対する)を低下させる(これらの耐性機構の多くは、これらの分子に抵抗し及び／又はそれらを流出させるためのそれらのエネルギー要求に対してプロトン起動力又は化学浸透圧を利用するので)。
【０１１２】
ΔΨ−ｓｔｅａｄｙの改変の結果としての遊離基生成
酸化的リン酸化及び他の生体エネルギー論的仕事に対する化学的アンカップラーの作用は、膜(原形質及びミトコンドリア)のエネルギーを与えられた状態に依存すると考えられる。更に、細菌の膜又は真核生物のミトコンドリア内膜のエネルギーを与えられた状態は、細胞呼吸及び電子伝達中に起きる一次プロトン移動事象により確立された電気化学的プロトン勾配ΔμＨ+と考えられている。
【０１１３】
ΔμＨ+を(例えば、カップリング膜を、プロトン又は補償性イオンの移動のために透過性にすることにより)直接消し(脱分極させる)、生体エネルギー論的仕事を膜ポテンシャルΔΨ−ｓｔｅａｄｙの低下を誘導することにより阻害する薬剤。これは、呼吸(一次プロトン移動)が速やかに継続しつつ生じる。
【０１１４】
例えば、酸化的リン酸化の古典的なアンカップラーであるカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン(ＣＣＣＰ)は、膜ポテンシャルΔΨ−ｓｔｅａｄｙの低下を誘導し、呼吸を継続しつつ、ＲＯＳの付随的生成を誘導する。これらの薬剤(アンカップラー)は、一般に、すべての細菌、真菌及び哺乳動物細胞に対して、相応じて毒性であるので、抗細菌剤、抗真菌剤、又は抗新生物剤として用いることができない。
【０１１５】
しかしながら、抗細菌剤、抗真菌剤又は抗新生物剤に耐性の多くの標的細胞において、Δｐアンカップラー(ＣＣＣＰのような)は、流出用ポンプに必要とされるエネルギー勾配を崩壊させ、それ故、これらの薬物の細胞内蓄積の強力な増加を誘導するということが示されている。これらの結果は、幾つかの耐性機構(例えば、薬物流出用ポンプ)は、プロトン起動力によって駆動されることを明確に示している。もしこの効果を、「標的細胞」だけのダメージをユニークに達成するために利用する方法があれば、この選択性は、アンカップラーの一般的なダメージを与える性質に対して、明らかに重要であろう。
【０１１６】
本発明のこの特別の発見及び実験データは、膜が光学的に脱分極されるときに、ＲＯＳの生成が、影響を受けた細胞の脱分極を更によく強化することができ、本発明の抗細菌性効果を更に強化することができることを示している(実施例ＶＩＩＩ参照)。
【０１１７】
ＮＩＭＥＬＳレーザー照射による遊離基及びＲＯＳの生成
多くの関連する膜のエネルギー変換過程の熱力学的相互作用を機械的光学的に改変し、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙをも変えることにより、本発明は、下記の照射された膜のΔμＨ+及びΔｐを低下させることによって光学的アンカップラーとして作用することができる：
１）  哺乳動物ミトコンドリアプロトン起動力(Δｐ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ)
２）  真菌ミトコンドリアプロトン起動力(Δｐ−ｍｉｔｏ−Ｆｕｎｇｉ)
３）  真菌原形質膜プロトン起動力(Δｐ−ｐｌａｓ−Ｆｕｎｇｉ)
４）  細菌原形質膜プロトン起動力(Δｐ−ｐｌａｓ−Ｂａｃｔ)。
【０１１８】
この低下したΔｐは、変化されたレドックス状態の故に、一連の遊離基及びラジカル酸素種を生じさせる。この遊離基及び負の酸素種の生成は、実験的に証明されており、ここに、下記のΔΨ−ｓｔｅａｄｙのΔΨ−ｔｒａｎｓへの変化と共に記載されている(実施例ＶＩＩＩ参照)：
１）  ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍａｍ ＋ (ＮＩＭＥＬＳ処理)→→ΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｍａｍ
２）  ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｆｕｎｇｉ＋(ＮＩＭＥＬＳ処理)→→ΔΨ-trans-fungi
３）  ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｂａｃｔ ＋ (ＮＩＭＥＬＳ処理)→→ΔΨ-trans-bact
４）  ΔΨ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ＋(ＮＩＭＥＬＳ処理)→→ΔΨ-trans-mito-fungi
５）  ΔΨ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ ＋ (ＮＩＭＥＬＳ処理)→→ΔΨ-trans-mito-mam
【０１１９】
ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ＋(ＮＩＭＥＬＳ処理)→→ΔΨ−ｔｒａｎｓ現象の故に、変化したレドックス状態並びに遊離基及びＲＯＳの生成は、生物学的膜に重大な更なるダメージ例えば脂質の過酸化を引き起こしうる。
【０１２０】
脂質の過酸化
脂質の過酸化は、微生物界及び哺乳動物界における生物学的細胞傷害及び細胞死の一般的な原因である。この過程において、強い酸化体が、ポリ不飽和脂肪酸(ＰＵＦＡ)を含む膜のリン脂質の崩壊を引き起こす。膜のダメージの重さは、膜の流動性の局所的低下及び二重層の完全性の完全な崩壊を引き起こすことができる。
【０１２１】
ミトコンドリア膜(哺乳動物細胞及び真菌)の過酸化は、呼吸鎖に対する有害な結果を有し、ＡＴＰの不十分な生成及び細胞のエネルギーサイクルの崩壊を生じるであろう。原形質膜(細菌)の過酸化は、膜の透過性、膜タンパク質例えばポーリン及び流出用ポンプ、シグナル変換の阻害及び不適当な細胞呼吸及びＡＴＰ生成に影響を及ぼしうる(即ち、原核生物の呼吸鎖は、原核生物はミトコンドリアを有しないので、原形質膜に収容されている)。
【０１２２】
遊離基
遊離基は、不対電子を有する原子又は分子として定義される。遊離基が生物学的環境でなしうるダメージの例は、ポリ不飽和脂肪酸(ＰＵＦＡ)のビス−アリル性Ｃ−Ｈ結合からの一電子除去(既存の又は生成された遊離基による)であり、炭素中心化(carbon centered)遊離基を生じる。
Ｒ*＋(ＰＵＦＡ)−ＣＨ(ビス−アリル性Ｃ−Ｈ結合) → (ＰＵＦＡ)−Ｃ*＋ＲＨ
【０１２３】
この反応は、脂質の過酸化による、生物学的膜のダメージを開始することができる。遊離基は又、非ラジカル分子に加えて、遊離基生成物を生成することもできる。
(Ａ*＋Ｂ → Ａ−Ｂ*)又は非ラジカル生成物(Ａ*＋Ｂ → Ａ−Ｂ)
この例は、芳香族化合物の*ＯＨによるヒドロキシル化である。
【０１２４】
反応性酸素種(ＲＯＳ)
酸素ガスは、実際は、遊離基種である。しかしながら、それは、２つの不対電子を基底状態で平行スピンを有する異なるπ−反結合性オービタルに含んでいるので、(スピン制限)規則は、一般に、Ｏ2が平行スピンを有する電子対を触媒なしで受けることを妨げている。従って、Ｏ2は、一度に一個の電子を受けなければならない。
【０１２５】
酸素の一電子減少を刺激することのできる細胞(原核細胞及び真核細胞)内には、多くの有意のドナーがあり、これは、更なるラジカル種を造る。
これらは、一般に、次のように分類される：
スーパーオキシドイオンラジカル  (Ｏ2-)
過酸化水素(非ラジカル)  (Ｈ2Ｏ2)
ヒドロキシルラジカル  (*ＯＨ)
ヒドロキシイオン  (ＯＨ-)
反応鎖は：
Ｏ2→Ｏ2-＋２Ｈ+→Ｈ2Ｏ2→ＯＨ-＋*ＯＨ→ＯＨ-
(ｅ-)         (ｅ-)   (ｅ-)         (ｅ-)
【０１２６】
スーパーオキシド
これらの分子の細胞に対する危険性は、文献によく分類されている。例えば、スーパーオキシドは、酸化剤又は還元剤として作用することができる。
ＮＡＤＨ → ＮＡＤ+
【０１２７】
生物体の代謝に一層重要なことには、スーパーオキシドは、シトクロムＣを還元することができる。一般に、スーパーオキシド(Ｏ2-)の脂質(即ち、膜)タンパク質、及びＤＮＡとの反応速度は、生物学的意味を有するには余りに遅いと考えられている。スーパーオキシドヒドロペルオキシルラジカル(ＨＯＯ*)のプロトン化形態は、(Ｏ2-)より一層低い還元ポテンシャルを有するが、水素原子をＰＵＦＡから除去することができる。やはり注意すべきことには、(ＨＯＯ*)のｐＫａ値は、４．８であり、この生物学的膜の近くの(酸)微小環境は、ヒドロペルオキシルラジカルの形成に適している。その上、スーパーオキシド(Ｏ2-)の任意の遊離のＦｅ+3との反応は、「ペリフェリル」中間体を生成し、これも、ＰＵＦＡと反応することができ、脂質(膜)の過酸化を誘導しうる。
【０１２８】
過酸化水素
過酸化水素(Ｈ2Ｏ2)は、良い酸化剤ではなく、ＰＵＦＡから水素を除去することができない。しかしながら、それは、生物学的膜を(むしろ容易に)横切ることができ、細胞の他の領域に危険で有害な効果を発揮しうる。例えば、(Ｈ2Ｏ2)は、微小細胞環境内で、遷移金属(例えば、Ｆｅ+2及びＣｕ+)と高度に反応性であり、これは、次いで、ヒドロキシルラジカル(*ＯＨ)を造ることができる(フェントン反応として公知)。ヒドロキシルラジカルは、生物学において知られる最も反応性の種の一つである。
【０１２９】
ヒドロキシルラジカル
ヒドロキシルラジカル(*ＯＨ)は、殆どすべての種類の生物学的分子と反応する。それは、非常に早い反応速度を有し、本質的に、ヒドロキシルラジカル(*ＯＨ)拡散速度及び(*ＯＨ)創生部位の近くで反応する分子の存在(又は、非存在)により制御される。実際、ヒドロキシルラジカル(*ＯＨ)の標準的還元ポテンシャル(Ｅ０')は、(＋２．３１Ｖ)であり、これは、(Ｈ2Ｏ2)より７倍大きい値であり、生物学的に関係する遊離基の中で最も反応性であるとして分類される。ヒドロキシルラジカルは、タンパク質及びＤＮＡにダメージを与える以外に、生物学的膜において脂質の過酸化を開始する。
【０１３０】
ＰＵＦＡの過酸化から造られる反応性酸素種
その上、脂質の過酸化(任意の起源から)の発生は、３つの他の反応性酸素中間体分子のＰＵＦＡからの生成を生じる。
(ａ)アルキルヒドロペルオキシド(ＲＯＯＨ)；
Ｈ2Ｏ2のように、アルキルヒドロペルオキシドは、技術的に、ラジカル種ではないが、遷移金属例えばＦｅ+2及びＣｕ+の存在下で不安定である。
(ｂ)アルキルペルオキシルラジカル(ＲＯＯ*)；及び
(ｃ)アルコキシルラジカル(ＲＯ*)。
【０１３１】
アルキルペルオキシルラジカル及びアルコキシルラジカルは、極めて反応性の酸素種であり、更なる脂質の過酸化の伝播にも寄与している。照射された細胞の変化したレドックス状態並びに遊離基及びＲＯＳの生成(ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ＋(ＮＩＭＥＬＳ処理)→→ΔΨ−ｔｒａｎｓ現象のため)は、本発明の他の目的である。これは、細胞の生体エネルギー論を更に変える追加的効果であり、必要なエネルギー依存性の有気反応を阻害し、薬物治療剤を強化し、及び／又は細胞の、抗細菌性、抗真菌性及び抗新生物性分子に対する耐性機構を低下させる。
【０１３２】
ＲＯＳの過剰産生は、細胞の巨大分子、とりわけ脂質にダメージを与えうる。脂質の酸化は、細胞膜の小規模な構造力学並びにそれらの一層巨視的な横方向の構成及び変化した双極子モーメントΨｄの成分の再方向付けに依存する充填密度の両方を改変することが示されている。アシル鎖(脂質中)の酸化によるダメージは、二重結合の喪失、鎖の短縮、及びヒドロペルオキシ基の導入を生じる。それ故、これらの変化は、脂質二重層の構造的特長及び力学並びに双極子ポテンシャルΨｄに影響すると考えられる。
【０１３３】
抗菌剤耐性
抗菌剤耐性は、微生物の、抗菌性の薬物又は分子の影響にもかかわらず生存する能力として定義される。抗菌剤耐性は、自然に、自然選択により、ランダムな突然変異によって又は遺伝子工学により進化しうる。やはり、微生物は、耐性遺伝子を、プラスミド交換などの機構によって、互いに伝達することができる。もし微生物が、幾つかの耐性遺伝子を有するならば、多剤耐性と呼ばれ、又は非公式には「スーパーバグ」と呼ばれている。
【０１３４】
病原性の細菌及び真菌における多剤耐性は、かかる微生物に感染した患者の治療において重大な問題である。現在、ヒトでの使用に関して安全である新規な抗菌性薬物を造り又は発見することは、恐ろしく高価であって困難なことである。やはり、すべての公知の抗菌剤クラス及び機構に挑戦する進化した耐性変異微生物も又、存在する。それ故、僅かの抗菌剤しか長期間の効力を維持することができない。抗菌性薬物への耐性の殆どの機構は、公知である。
【０１３５】
微生物が抗菌剤に対する耐性を示す４つの主たる機構は：
ａ）薬物を不活性し又は改変すること；
ｂ）標的部位を変えること；
ｃ）代謝経路を変えること；及び
ｄ）薬物の透過性を下げ及び／又は細胞表面の活性な流出用ポンプを増加させることにより、薬物の蓄積を減らすこと。
【０１３６】
耐性微生物の例
黄色ブドウ球菌(S. aureus)は、現在、人類を悩ませている主たる耐性病原性細菌の一つである。このグラム陽性細菌は、主として、世界の成人の半分近くの粘膜及び皮膚において見出される。S. aureusは、すべての公知の抗生物質のクラスからの圧力に対して、極めて適応性である。S. aureusは、ペニシリンに対する耐性が１９４７年に見出された最初の細菌である。その後、メチシリン及びオキサシリンに対する殆ど完全な耐性が見出された。「スーパーバグ」ＭＲＳＡ(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌)は、最初、１９６１年に検出され、今や、世界的に病院及び一般社会に広布している。今日、米国におけるS. aureus感染の過半数が、ペニシリン、メチシリン、テトラサイクリン及びエリスロマイシンに耐性である。最近、抗生物質の新たなクラス(最後の頼みの抗菌剤)糖ペプチド及びオキサゾリジンオンにおいて、有意の耐性が報告された(Vancomycin １９９６年以後、及びZyvox ２００３年以後)。
【０１３７】
新規な変異体ＣＡ−ＭＲＳＡ(community acquired ＭＲＳＡ)も、最近、現れて流行しており、急速に進行する、致死的疾患群(壊死性肺炎、重い敗血症及び壊死性筋膜炎を含む)の原因である。community associated (ＣＡ)−ＭＲＳＡ感染症の大発生は、矯正施設、アスレチックチーム、軍の補充兵、新生児育児室、及び同性愛の男性において、日々報告されている。ＣＡ−ＭＲＳＡ感染は、今や、多くの都市部で最も流行しているようであり、殆どのＣＡ−S. aureus感染を引き起こしている。
【０１３８】
科学界及び医学界は、既存の抗菌性薬物の増強因子並びに細菌及び真菌における薬物耐性システムの阻害剤を見出すことを試みてきた。かかる増強因子及び／又は阻害剤は、ヒトに毒性でないならば、病原性の薬物耐性微生物に感染した患者の治療に対して非常に価値があるであろう。米国においては、個人の８０％もの多くが、S. aureusのコロニーを何処かに有している。殆どは、断続的にコロニーを有するだけであり；２０〜３０％は、持続的にコロニーを有している。ヘルスケアワーカー、糖尿病の人、及び透析患者は、すべて、高率でコロニーを有する。外鼻腔は、成人における優勢なコロニー形成部位であり；他のコロニー形成の潜在的部位には、腋窩、直腸及び会陰が含まれる。
【０１３９】
細菌のΔΨ−ｓｔｅａｄｙの選択的な薬理学的改変
リポペプチドと呼ばれる殺細菌性抗生物質の比較的新しいクラスがあり、ダプトマイシンは、その最初にＦＤＡが承認したメンバーである。この抗生物質は、事実上すべての臨床関連グラム陽性細菌(例えばＭＲＳＡ)を、現在市場に出ている他の抗生物質と異なる作用機構により、迅速に殺すことができることを示した(イン・ビトロ及びイン・ビボで)。
【０１４０】
ダプトマイシンの作用機構は、リポペプチド化合物の、カルシウム依存性の、細菌の細胞質膜中への取り込みを含んでいる。分子レベルで、正味の負電荷を減少させ、それが、グラム陽性細菌の細胞質膜中に典型的に見出される負に帯電したリン脂質によりよく作用することを可能にするのは、２つのアスパラギン酸残基(ダプトマイシン分子中)間のカルシウム結合である。一般に、治療レベルにおいて真菌又は哺乳動物細胞との相互作用はなく、それ故、それは、非常に選択的分子である。
【０１４１】
ダプトマイシンの効果は、このカルシウム依存性の細菌細胞質膜への作用から生じ、それは、膜貫通膜電気的ポテンシャル勾配ΔμＨ+を消すということが提案されてきた。これは、細菌の膜のみの有効な選択的化学的脱分極にある。脱分極(この様式で)は、細菌に致死的作用ではないが、正しくエネルギーを与えられた細胞質膜の維持は、細菌細胞の生存及び成長に必須であるということは周知である。例えば、抗生物質バリノマイシンは、カリウムイオンの存在下で脱分極を引き起こし、静菌作用があるが、ＣＣＣＰの場合のように、殺細菌作用はない。
【０１４２】
逆に、プロトン起動力Δｐ(その主たる要素は、膜貫通電気的ポテンシャル勾配ΔμＨ+である)の非存在下では、細胞は、ＡＴＰを作ることができず、又は成長及び生殖に必要とされる栄養分を取り込むことができない。ΔμＨ+の崩壊は、ダプトマイシンにより生じる異なる(有害な)効果(例えば、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、及び脂質の生合成)を説明する。
【０１４３】
薬物ダプトマイシンに関する従来技術の更なる研究は、ゲンタマイシン又はミノサイクリンの添加は、ＭＲＳＡに対する殺細菌活性の増進を生じることを示唆する。ゲンタマイシン及びミノサイクリンの両者は、ＭＲＳＡ細胞から、エネルギー依存性ポンプによって流出されえて、３０Ｓの細菌リボソームのレベルでのタンパク質合成(同化機能)の阻害剤であるので。これは、膜貫通電気的ポテンシャル勾配ΔμＨ+のダプトマイシンによる消失がある種の抗菌性薬物を強化しうることを示している。これは、膜ポテンシャルΔΨの減少及びＡＴＰがたんぱく質合成の同化機能に利用可能でない(即ち、付随する低下されたΔＧｐ)という事実により有用性の低下された耐性機構の結果として生じる。
【０１４４】
上記に基いて、標的細胞における薬物流出用ポンプの活性及び／又は同化反応を、所定の標的領域内の細胞の膜ポテンシャルΔΨを安全に減少させる(ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ＋(ＮＩＭＥＬＳ処理)→→ΔΨ−ｔｒａｎｓ)ことにより、光学的に阻害することができることは、明らかに望ましい。本発明の方法は、これ及び他の仕事を、選択した赤外線波長例えば８７０ｎｍ及び９３０ｎｍの利用により達成する(ダプトマイシンなどの如何なる外因性の薬剤から独立して)。これは、同じ仕事を達成するのに全身への薬物を必要とする既存の従来技術の方法を超える明らかな改良である。
【０１４５】
多剤耐性の流出用ポンプ
多剤耐性の流出用ポンプは、今や、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌、及び癌細胞に存在することが知られている。流出用ポンプは、一般に、耐性機構の広いスペクトルを与えるトランスポーターの多特異性を有する。これらは、抗菌剤耐性の他の機構例えば抗菌剤の標的の突然変異又は抗菌性分子の酵素的改変の効果を強化する。抗菌剤の活性な流出は、臨床的には、β−ラクタム系抗菌剤、マルコライド、フルオロキノロン、テトラサイクリン及び他の重要な抗生物質に関連している(イトラコナゾール及びテルビナフィンを含む殆どの抗真菌性化合物を伴う)。
【０１４６】
流出用ポンプによる耐性の場合、微生物は、抗菌剤又は毒性化合物を捕まえて細胞の外(環境)へ排出する能力を有し、それにより、該薬剤の細胞内の蓄積を低減させている。一般に、これらの流出用ポンプの少なくとも一つの過剰発現は、該薬剤の細胞内蓄積を、その阻害活性に必要な閾値まで達するのを妨げると考えられている。一般に、微生物においては、薬物の流出は、電気化学的ポテンシャル及び／又はこれらのタンパク質ポンプの要求に対して必要なエネルギー(ＡＴＰ)を造るプロトン起動力と共役している。これは、下記を含む：
１）哺乳動物ミトコンドリアプロトン起動力(Δｐ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ)；
２）真菌ミトコンドリアプロトン起動力(Δｐ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ)；
３）真菌原形質膜プロトンプロトン起動力(Δｐ−ｐｌａｓ−ｆｕｎｇｉ)；及び
４）細菌原形質膜プロトン起動力(Δｐ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔ)。
【０１４７】
系統発生的に、細菌の抗生物質排出用ポンプは、下記の５つのスーパーファミリーに属する：
(ｉ)ＡＢＣ(ＡＴＰ結合性カセット)、これは、ＡＴＰの加水分解によりエネルギーを与えられる主たる活性なトランスポーターである；
(ii)ＳＭＲ[ＤＭＴ(薬物／代謝産物トランスポーター)の小型多剤耐性サブファミリー]；
(iii)ＭＡＴＥ[ＭＯＰ(多剤／オリゴ糖脂質／多糖類フリッパーゼ)スーパーファミリーの多数の抗菌剤の排出サブファミリー]；
(iv)ＭＦＳ(主要促進剤スーパーファミリー)；及び
(ｖ)ＲＮＤ(耐性／小結節形成／分裂スーパーファミリー)、これらは、すべて、イオン勾配により駆動される二次的な活性トランスポーターである。
【０１４８】
本発明の、流出用ポンプを阻害するためのアプローチは、照射領域内の膜ΔΨの一般的改変(光学的脱分極)であり、これは、一層低い電気化学的勾配へと導き、それは、リン酸化ポテンシャルΔＧｐ及びポンプ機能用エネルギー要求に対する利用可能なエネルギーを低下させる。標的細胞の多くの異なる同化及びエネルギーに駆動される機構(正常な成長のための栄養分の吸収を含む)を阻害する同じ光生物学的機構を有することも又、本発明の目的である。
【０１４９】
流出用ポンプのエネルギーの低下：機構の駆動力を標的とする
今日、臨床用に流出用ポンプ阻害剤として開発された分子の「エネルギーブロッカー」ファミリーに属する薬物はない。流出用ポンプの「一般的」阻害剤であることが見出された少数の分子はある。２つのかかる分子は、レセルピン及びベラパミルである。これらの分子は、元々、血管モノアミントランスポーターの阻害剤及び膜を貫通するカルシウムの流入のブロッカー(又は、カルシウムイオンアンタゴニスト)として、それぞれ、認識された。ベラパミルは、癌細胞及びある種の寄生虫におけるＭＤＲポンプの阻害剤として知られており、トブラマイシンの活性を改善もする。
【０１５０】
レセルピンは、Ｂｍｒ及びＮｏｒＡ(２つのグラム陽性細菌の流出用ポンプ)の活性を、ＭＤＲ流出用ポンプの機能に必要とされる膜プロトン起動力Δｐの生成を変えることにより阻害する。たとえこれらの分子が、抗生物質(即ち、テトラサイクリン)の排出に関与するＡＢＣトランスポーターを阻害することができても、細菌の流出をブロックするのに必要な濃度は、ヒトにおいて神経毒性である。今日まで、文献において、ダプトマイシンを用いた類似の実験は言及されていない。真菌用薬物の流出は、主として、２つの群の膜に結合した輸送タンパク質：ＡＴＰ結合性カセット(ＡＢＣ)トランスポーター及び主要促進剤スーパーファミリー(ＭＦＳ)ポンプにより媒介される。
【０１５１】
細菌の原形質膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔ及び細胞壁の合成
正常細胞代謝中に、タンパク質は、細胞質膜から排出されて、ΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔを形成する。この機能は又、細菌の原形質膜近くの狭い領域を酸性化(低ｐＨ化)もする。グラム陽性細菌の枯草菌においては、ペプチドグリカン自己分解の活性が、電子伝達系がプロトンコンダクターの添加によりブロックされたときに、増大される(即ち、もはや阻害されない)ことが示されている。これは、ΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔ及びΔμＨ＋()が、潜在的に、細胞壁同化機能及び生理学に深淵且つ利用可能な影響を有することを示唆している。
【０１５２】
加えて、ΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔのアンカップラーは、ペプチドグリカンの形成を、ペプチドグリカン合成に関与するヌクレオチド前駆体の蓄積、及びペプチドグリカン中の主要生体高分子の一つであるＮ−アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)の輸送の阻害を伴って阻害するということが示されている。
【０１５３】
やはり、グラム陽性及びグラム陰性細菌においてΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔを低下させるタキプレシンと呼ばれる抗菌性化合物への言及がある。(Antimicrobial compositions and pharmaceutical preparations thereof 米国特許第５，６１０，１３９号、その全教示を参考として本明細書中に援用する。) この化合物は、準致死的濃度で、細胞壁合成の阻害剤のβ−ラクタム系抗生物質であるアンピシリンを、ＭＲＳＡにおいて強化する能力を有することが示された。光学的に低下されたΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔの多数の影響(即ち、増大された細胞壁の自己分解、阻害された細胞壁合成、及び細胞壁の抗菌剤強化)を、細菌細胞壁を標的とする任意の他の関連抗菌性治療に共役させることは望ましい。これは、特に、細胞壁を阻害する抗菌性化合物に対する耐性機構として流出用ポンプを有しないグラム陽性細菌例えばＭＲＳＡにおいて適切である。
【０１５４】
細胞壁阻害性化合物は、グラム陽性細菌においては、細胞壁に対する効果を示すために、膜を通って入る必要がない(グラム陰性細菌では必要である)。実験的証拠は、ＮＩＭＥＬＳレーザー及びその付随的な光学的ΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔ低下現象がＭＲＳＡにおける細胞壁阻害性抗菌剤と相乗的であることを証明した(実施例ＸＩＩ参照)。これは、ＭＲＳＡは、ペプチドグリカン阻害性抗菌剤は効果的であるために細胞に入る必要がないので、それらに対して機能する流出用ポンプを有しないので、同化的(ペリプラズムの)ＡＴＰと共役した機能の阻害によって機能するに違いない。
【０１５５】
ΔΨ−ｐｌａｓ−ｆｕｎｇｉ及びΔΨ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ：正しい細胞機能及び抗菌剤耐性に必要なもの
正常な細胞代謝において、ΔΨ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉは、ミトコンドリアにおいて、電子伝達系により生成され、それは、次いで、ミトコンドリアのＡＴＰシンターゼ酵素系によってＡＴＰを生成する。次に原形質膜に結合したＨ+−ＡＴＰアーゼにパワーを与えてΔΨ−ｐｌａｓ−ｆｕｎｇｉを生成するのはＡＴＰである。真菌のミトコンドリアのＡＴＰシンターゼは、化学薬品ポリゴディアルによって、投与量依存様式で阻害されるということは、以前に示されている(Lunde 及び Kubo, Antimicrob Agents Chemother. 2000 ７月；44(7): 1943-1953、その全教示を参考として本明細書中に援用する)。このサイトゾルのＡＴＰ濃度の誘導された低下は、ΔΨ−ｐｌａｓ−ｆｕｎｇｉを生成する原形質膜に結合したＨ+−ＡＴＰアーゼの抑制へと導くということ、及びこの減損が更に他の細胞活性を弱化させることが更に見出された。加えて、ΔΨ−ｐｌａｓ−ｆｕｎｇｉの低下は、原形質膜の生体エネルギー論的及び熱力学的崩壊を引き起こし、これは、プロトンの流入へと導き、それは、プロトン起動力を崩壊させ、それ故、栄養分の取込みを阻害する。
【０１５６】
更に重要なことには、ＡＴＰは、真菌の原形質膜脂質のエルゴステロールの生合成に必要である。エルゴステロールは、今日医薬として用いられている大多数の市販の関連抗真菌性化合物により標的とされる構造的脂質である(即ち、アゾール、テルビナフィン及びイトラコナゾール)。
【０１５７】
研究は、２つの抗菌性ペプチド(Ｐｅｐ２及びＨｓｔ５)が、ＡＴＰを真菌細胞から流出させる能力を有すること(即ち、細胞内ＡＴＰ濃度を涸渇させる)及びこの低下したサイトゾルのＡＴＰは、ＡＴＰ依存性の抗真菌剤の流出用ポンプであるＡＢＣトランスポーターＣＤＲ１及びＣＤＲ２の不活性化を生じることを示した。
【０１５８】
光学的方法を利用することには、膜を脱分極させて、流出用ポンプの阻害及び同化反応の増強剤としての、真菌内の細胞ＡＴＰを涸渇させるという利点がある。それ故、ΔΨ−ｐｌａｓ−ｆｕｎｇｉ及び／又はΔΨ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉを光学的に変えて、必要な細胞機能、ＡＴＰ生成を阻害すること、及び抗真菌性化合物を強化することは望ましいであろう。
【０１５９】
それ故、薬物耐性(流出用ポンプによるもの)を防止するためのストラテジーの一つは、細胞内ＡＴＰのレベルを低下させることであり、これは、ＡＴＰ−依存性の流出用ポンプの不活性化を誘導する。真菌性病原体においては、この仕事を達成するための許容しうる化学的薬剤がなかった。しかしながら、ＮＩＭＥＬＳ効果は、このゴールを光学的に達成する能力を有し、実験的証拠が、ＮＩＭＥＬＳレーザー及び真菌における現象が、抗真菌性化合物と相乗的であることを示している。(実施例ＸＩＩＩ参照)。
【０１６０】
このＮＩＭＥＬＳ効果は、ここに開示した方法及びシステムによって、細胞膜に熱的又は剥離的機械的ダメージを生じることなく生じる。この組み合わせた、標的を定めた低線量のアプローチは、実際にすべてのエネルギービーム光路内の膜に対して機械的ダメージを引き起こすすべての既存の方法とは明瞭に変化して改良されたものである。
【０１６１】
第一の面において、この発明は、ＮＩＭＥＬＳビームの光路内のすべての膜の双極子ポテンシャルΨｄ(Ψｄ−ｐｌａｓ−ｍａｍ、Ψｄ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ、Ψｄ−ｐｌａｓ−ｆｕｎｇｉ、Ψｄ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ、及びΨｄ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔ)を改変して、同じ膜のΔΨ及びΔｐの更なる変化のカスケードを推進する方法を提供する。
【０１６２】
すべての照射された膜の生体エネルギー論的な定常状態の膜ポテンシャルΔΨ−ｓｔｅａｄｙ(ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍａｍ、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｆｕｎｇｉ、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−Ｂａｃｔ、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ及びΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ)は、ΔΨ−ｔｒａｎｓ値(ΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｍａｍ、ΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｆｕｎｇｉ、ΔΨ−ｔｒａｎｓ−Ｂａｃｔ、ΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ及びΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉ)に変化される。これは、すべての照射された細胞について同時の脱分極及びΔｐの絶対値の計量可能な変化(Δｐ−ｍｉｔｏ−ｍａｍ、Δｐ−ｍｉｔｏ−Ｆｕｎｇｉ、Δｐ−ｐｌａｓ−Ｆｕｎｇｉ及びΔｐ−ｐｌａｓ−Ｂａｃｔ)を生じる。
【０１６３】
これらの現象は、生物学的主体(例えば、哺乳動物の組織、細胞又はある種の生化学的調製物例えばタンパク質調製物)に、許容しえないリスク及び／又は許容しえない悪影響なしで、標的とされた生物学的夾雑物(細菌及び真菌)以外の所定の標的部位で、標的部位を、所望の波長、パワー密度レベル、及び／又はエネルギー密度レベルの光学的照射を用いて照射することによって生じる。
【０１６４】
ある具体例においては、かかる応用光学的照射は、ここに記載のように、ＮＩＭＥＬＳ線量測定において約８５０〜９００ｎｍの波長を有しうる。典型的具体例においては、約８６５〜８７５ｎｍの波長が利用される。更なる具体例においては、かかる応用的照射は、ＮＩＭＥＬＳ線量測定において約９０５〜９４５ｎｍの波長を有しうる。ある具体例においては、かかる応用光学的照射は、約９２５〜９３５ｎｍの波長を有しうる。以下に例示する代表的な非制限的具体例においては、用いた波長は、９３０ｎｍである。
【０１６５】
生体エネルギー論的定常状態の膜ポテンシャルは、典型的具体例において、下記するように、改変することができ、８７０及び９３０ｎｍをそれぞれ限界として含む多数の波長範囲を採用することができる。
【０１６６】
ＮＩＭＥＬＳ強化等級規模(ＮＰＭＳ)
以前に一層詳細に論じたように、ＮＩＭＥＬＳパラメーターは、レーザー双極子の平均の単一又は追加的出力パワー及びそれらの双極子の波長(８７０ｎｍ及び９３０ｎｍ)を含む。この情報に、標的部位でのレーザービームの面積(ｃｍ2)、レーザーシステムのパワー出力及び照射時間を加えた情報は、この発明の有効且つ安全な照射プロトコールを計算するために利用することのできる情報のセットを提供する。
【０１６７】
ＮＩＭＥＬＳレーザーで利用可能なこれらの新規な耐性逆転及び抗菌性強化相互作用に基づいて、各固有の抗菌剤及びレーザー線量測定に当てはまる「強化効果」についての定量的値が必要である。
【０１６８】
パラメーターの新たなセットが規定され、それは、ＮＩＭＥＬＳレーザーの任意の異なる線量測定値及び所定の試験される抗菌剤についての任意のＭＩＣ値の具現を考慮するであろう。これは、ＮＩＭＥＬＳレーザーシステム及び方法に対して、ＮＩＭＥＬＳシステムを用いる任意所定の実験又は治療用パラメーター内で病原性微生物のＣＦＵを定量する変数のセットのみを造ることによって、簡単に調整することができる。
【０１６９】
これらのパラメーターは、ＮＩＭＥＬＳ強化等級規模(ＮＰＭＳ)と呼ばれる規模を造り、ＮＩＭＥＬＳレーザー固有の、抗菌性薬物の耐性の逆転及び／又はＭＩＣの強化の現象を利用すると同時に、パワー及び／又は処理時間による隣接組織の火傷及び傷害に対する安全性の測定も行なう。このＮＰＭＳ規模は、１〜１０のＮＩＭＥＬＳ効果数(Ｎｅ)を測定するが、ゴールは、任意の安全な抗菌剤濃度とＮＩＭＥＬＳ線量測定との組合せにおいて、病原体のＣＦＵ計数の減少において、４以上のＮｅを得ることである。たとえ、ここで、病原性微生物の定量にＣＦＵ計数を用いても、他の定量手段例えば染色検出法又はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法も又、Ａ、Ｂ及びＮｐパラメーターについて、値を得るために利用することができる。
【０１７０】
このＮＩＭＥＬＳ効果数Ｎｅは、抗菌性薬物の組み合わせた阻害的／静菌的効果が、病原性標的に対するＮＩＭＥＬＳレーザーと、健康な組織に損傷を与えずに、相乗的である程度を示す相互作用係数である。
【０１７１】
ＮＩＭＥＬＳ強化数(Ｎｐ)は、所定濃度の抗菌剤が、健康な組織に傷害を与えずに、病原性の標的に対して、相乗的であるか、又は拮抗性であるかどうかを示す値である。それ故、標準的な任意所定のセットにおいて、実験用又は治療用のパラメーターは、下記の通りである：
・ Ａ＝ＮＩＭＥＬＳを単独で用いた場合の病原体のＣＦＵ計数；
・ Ｂ＝抗菌剤を単独で用いた場合の病原体のＣＦＵ計数；
・ Ｎｐ＝(ＮＩＭＥＬＳ＋抗菌剤)を用いた場合の病原体のＣＦＵ計数；及び
・ Ｎｅ＝(Ａ＋Ｂ)／２Ｎｐ；
ＮＩＭＥＬＳ効果数Ｎｅの解釈：
２Ｎｐ＜Ａ＋Ｂであるならば、(所定の)抗菌剤は、ＮＩＭＥＬＳレーザーによって、用いた濃度及び線量測定にて、上首尾に強化された。
次に：
もしＮｅ＝１であるならば、強化効果はない。もしＮｅ＞１ならば、強化効果はある。
もしＮｅ ≧２であるならば、少なくとも５０％の強化効果が、抗菌剤に対してある。もしＮｅ≧４であるならば、少なくとも７５％の強化効果が、抗菌剤に対してある。もしＮｅ≧１０であるならば、少なくとも９０％の強化効果が、抗菌剤に対してある。
見本計算１：
・ Ａ＝１１０ＣＦＵ
・ Ｂ＝１２０ＣＦＵ
・ Ｎｐ＝７５ＣＦＵ
・ Ｎｅ＝(１１０ＣＦＵ＋１２０ＣＦＵ)／２(７５)＝１．５
見本計算２：
・ Ａ＝１５０ＣＦＵ
・ Ｂ＝９０ＣＦＵ
・ Ｎｐ＝３０ＣＦＵ
・ Ｎｅ＝(１５０ＣＦＵ＋９０ＣＦＵ)／２(３０)＝４
【０１７２】
一般に、微生物感染症を治療する場合、抗菌剤は高価であり、概して、望ましくない副作用(全身的な腎臓及び／肝臓の障害を含みうる)を伴うので、一層低投与量の抗菌剤を用いることは有利でありうる。それ故、抗菌剤のＭＩＣを低下させ且つ／又は強化するために方法を工夫することは望ましい。本発明は、治療を受ける領域が同時にＮＩＭＥＬＳレーザーシステムによる治療を受ける場合に、抗菌剤分子のＭＩＣを減じるためのシステム及び方法を提供する。
【０１７３】
もし抗菌剤のＭＩＣが局所的で耐性の焦点感染(例えば、皮膚、糖尿病患者の足、床擦れ)であるならば、これらの感染症を治療するための多くの一層古くて、安くて安全な抗菌剤の治療的効力は、回復されるであろう。それ故、抗菌剤のＭＩＣを、ＮＩＭＥＬＳレーザーを加えることにより減少させる(例えば、一面で１より大きい、他の面で４以上の、そして更に別の面で１０以上のＮｅの値を生成する)ことは、抗生物質の一度失われた治療的効力の回復に向けた積極的なステップを表している。
【０１７４】
それ故、一面において、この発明は、微生物病原体を根絶するか又は少なくとも減衰させるのに必要な抗菌性分子のＭＩＣを、照射された細胞の膜ポテンシャルΔΨを減少させる照射域内の膜の脱分極によって、減じる方法及びシステムを提供する。この弱化されたΔΨは、プロトン起動力Δｐの密接に関連した弱化、及びすべての影響を受けた膜の関連する生体エネルギー論を引き起こす。この「ＮＩＭＥＬＳ効果」が既存の抗菌性分子を、ヒト宿主に感染して傷害を引き起こす微生物に対して強化することは、本発明の更なる目的である。
【０１７５】
ある具体例において、かかる適用される光照射は、ここに記載のように、約８５０〜９００ｎｍの波長を、ＮＩＭＥＬＳ線量測定にて有する。典型的具体例において、約８６５〜８７５ｎｍの波長が利用される。更なる具体例においては、かかる適用される照射は、約９０５〜９４５ｎｍの波長をＮＩＭＥＬＳ線量測定にて有する。ある具体例において、かかる適用される光照射は、約９２５〜９３５ｎｍの波長を有する。一面において、用いられる波長は、９３０ｎｍである。
【０１７６】
本発明によりＮＩＭＥＬＳレーザーシステムにより影響される生体エネルギー論的システムを有する微生物病原体には、例えば、細菌、真菌、糸状菌、マイコプラズマ、原生動物などの微生物、及び寄生虫が含まれる。下記するように、典型的具体例は、８７０ｎｍ及び９３０ｎｍをそれぞれ限界として含む範囲を含む複数の波長範囲を利用することができる。
【０１７７】
この発明の一つの面による方法において、これらの企図された波長範囲による照射は、独立して、順番に、ブレンドした比で、又は本質的に同時に実施することができる(そのすべては、パルス波及び／又は連続波、ＣＷ、操作を利用することができる)。
【０１７８】
ＮＩＭＥＬＳエネルギーを用いるＮＩＭＥＬＳ線量照射での夾雑菌に対する照射は、抗菌剤の投与の前、後、又は該投与と同時に行なわれる。しかしながら、該ＮＩＭＥＬＳ線量測定でのＮＩＭＥＬＳエネルギーは、抗菌剤が感染した個人又は他の哺乳動物において「ピークの原形質レベル」に達した後で施与することができる。同時投与される抗菌剤は、標的の耐性夾雑菌の任意の自然に感受性の変異体に対して抗菌活性を有するべきであるということは注意すべきである。
【０１７９】
本発明の方法及びシステムにより照射される波長は、夾雑菌の感受性を、約０．０１Ｍ以下の又は約０．００１Ｍ以下の、又は約０．０００５Ｍ以下の抗菌剤濃度における類似の非耐性夾雑菌株のレベルにまで増大させる。
【０１８０】
この発明の方法は、微生物夾雑物の進行を、標的部位で、遅くし又は排除して、少なくとも幾つかの夾雑菌と関連する症状又は無症候性の病状を改善し、及び／又は夾雑菌の抗菌剤に対する感受性を増大させる。例えば、この発明の方法は、微生物夾雑物のレベルの標的部位における低下及び／又は抗菌性化合物の活性の、生物学的夾雑物の、それらが進化し又は獲得した耐性を有する抗菌剤に対する感受性の、生物学的患者への悪影響なしでの増加による強化を生じる。微生物夾雑物のレベルの低下は、予備処理レベルと比較して、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、７０％以上であってよい。生物学的夾雑物の、抗菌剤に対する感受性に関して、該感受性は、少なくとも１０％強化される。
【０１８１】
他の面において、この発明は、この発明の他の面による方法を実行するシステムを提供する。かかるシステムは、放射を発生するためのレーザー発振器、放射の線量を計算して制御するための制御装置、及び該放射を、適用領域を通して治療部位に伝えるための送達用アセンブリ(システム)を含む。適当な送達用アセンブリ／システムには、中空の導波管、ファイバーオプティックス、及び／又は自由空間／ビーム光伝達要素が含まれる。適当な自由空間／ビーム光伝達かご物には、コリメーティングレンズ及び／又は開口絞りが含まれる。
【０１８２】
一形態において、このシステムは、二重波長近赤外線の光源として、一以上の固体状態双極子レーザーを利用する。二以上の双極子レーザーを、単一のハウジング内に配置して、統一的に制御する。二つの波長は、約８５０〜９００ｎｍ及び約９０５〜９４５ｎｍの二つの範囲内での放出を含むことができる。本発明の発振器は、ここに開示し他範囲の一つにおいて、単一波長(又は、ピーク値、例えば、中央波長)を放射するために利用される。ある具体例において、かかるレーザーは、実質的に約８６５〜８７５ｎｍ及び約９２５〜９３５ｎｍの範囲の照射をするために用いられる。
【０１８３】
本発明によるシステムは、生成することが望まれる個々の波長範囲について、適当な光源を含むことができる。例えば、適当な固体状態のレーザー双極子、様々な超短期パルスレーザー双極子、又はイオンドープト(例えば、適当な希土類元素)光ファイバー又はファイバーレーザーが用いられる。一形態において、適当な近赤外線レーザーは、チタンドープトサファイアを含む。他の種類の固体状態、液体、又はガス増進(活性)媒質によるものを含む他の適当なレーザー源を、本発明の範囲内で使用することができる。
【０１８４】
本発明の一具体例によれば、治療用システムは、光学的放射を本質的に第一の波長範囲(約８５０〜９００ｎｍ)で発生するのに適合された光学的放射発生システム、適用範囲を通して伝達されるべき光学的放射を生じるための送達用アセンブリ、及び光学的放射発し装置に操作可能に接続された、適用範囲を通して伝達される放射の線量を制御するための制御装置を含み、それで、単位領域当たり伝達される照射のパワー密度とエネルギー密度の時間積分は、予め決められた閾値より低い。やはり、この具体例内において、治療用システムは、光学的放射を実質的に第一の波長範囲(約８６５〜８７５ｎｍ)内で発生するように特に適合されている。
【０１８５】
更なる具体例によれば、治療用システムは、第二の波長範囲(約９０５〜９４５ｎｍ)において光学的放射を相当に発生するように配列された光学的放射発生装置を含み；ある具体例では、記した第一の波長範囲は、同時に又は同時／順次的に、光学的放射発生装置により生成される。やはり、この具体例の範囲内において、治療用システムは、光学的放射を、実質的に第一の波長範囲(約９２５〜９３５ｎｍ)内で、発生するように特に適合される。
【０１８６】
この治療用システムは、更に、適用領域を通る第二の波長範囲(及び、適用可能であれば、第一の波長範囲)内の光学的放射の伝達のための送達用アセンブリ(システム)、及び光学的放射発生装置を、選択的に放射を、実質的に第一の波長範囲にて又は実質的に第二の波長範囲で又はこれらの任意の組合せにて発生させるために操作可能に制御するための制御装置を含むことができる。
【０１８７】
一具体例によれば、この送達用アセンブリは、少なくとも一つの、この医療用デバイスの光伝達範囲内に位置する患者の組織に挿入するために構成して配置された末端を有する光ファイバーを含み、ここに、この放射は、ＮＩＭＥＬＳ線量測定にて、医療用デバイスの周囲の組織へ送達される。この送達用デバイスは、更に、自由ビームの光学的システムをも包含することができる。
【０１８８】
更なる具体例により、この治療システムの制御装置は、放射の線量を制御するための電力制限器を含む。この制御装置は、更に、患者のプロフィルを記憶しておくためのメモリー及びオペレーターにより入力された情報に基いて特定の標的部位に必要とされる線量を計算するための線量測定計算機を含むことができる。一面において、このメモリーは又、異なる種類の病気及びその治療のプロフィル例えば特定の適用に関しての放射のパターン及び放射線量についての情報を記憶するために利用することもできる。この光照射は、この治療システムから、異なるパターンで、適用部位に送達することができる。この照射は、連続波(ＷＣ)として、又はパルス化して、又は各々の組合せとして生成して送達することができる。例えば、単一波長パターンで、又は複数の波長(例えば、二重波長)のパターンで。例えば、２つの波長の照射を、多重化し(光学的に合わせる)又は同じ治療部位に同時に伝達することができる。偏光ビームスプリッター(コンバイナー)及び／又は適当な鏡から焦点に集めた出力の重ね合わせ及び／又は、他の適当な多重化／結合技術の利用を含む(但し、これらに限られない)適当な光学的結合技術を利用することができる。或は、この照射を、２つの波長を二者択一的に同じ治療部位に送達する別のパターンで送達することができる。２以上のパルスの間隔を、本発明のＮＩＭＥＬＳ技術によって、所望通りに選択することができる。各治療は、任意の様式の伝達と組み合わせることができる。送達された光照射の強度分布は、所望の通りに選択することができる。
【０１８９】
典型的な具体例は、最上層又は実質的に最上層(例えば、台形など)の強度分布を含む。他の強度分布例えばガウス分布を利用することもできる。
【０１９０】
ここで用いる場合、用語「生物学的夾雑物」は、標的部位との直接又は間接的接触により、標的部位(例えば、感染した患者の組織又は器官)に又は哺乳動物の場合には標的部位の近くに(例えば、レシピエントに移植された細胞、組織又は器官の場合、又は患者において使用されるデバイスの場合)、望ましくなく且つ／又は有害な影響を与えうる夾雑物を意味することを意図している。この発明の生物学的夾雑物は、一般に、標的部位で見出されることが当業者に公知の微生物例えば細菌、真菌、糸状菌、マイコプラズマ、原生動物、寄生虫である。
【０１９１】
当業者は、本発明の方法及びシステムを、当業者に一般的に公知の様々な生物学的夾雑物と一緒に使用することができるということを認めるであろう。下記のリストは、単に、本発明の方法及びデバイスにより標的とされうる広範な微生物を説明するためのものであり、この発明の範囲を制限することは意図していない。
【０１９２】
従って、生物学的夾雑物(病原体)の説明用の非制限的例は、例えば、エシェリキア属、エンテロバクター属、バチルス属、カンピロバクター属、コリネバクテリウム属、クレブシエラ属、トレポネーマ属、ビブリオ属、連鎖球菌属及びブドウ球菌属を含むが、これらに限られない。
【０１９３】
更に説明すると、生物学的夾雑物は、制限はしないが、任意の真菌例えば白癬菌属、小胞子菌属、表皮糸状菌属、カンジダ属、スコプラリオプシス・ブレビカウリス、フザリウム種、アスペルギルス種、アルテルナリア属、アクレモニウム、シタリディナム・ディミディアツム、及びシタリディナム・ヒアリナム。トリパノゾーマ及びマラリア原虫などの寄生虫も又、標的となりうる生物学的夾雑物である(プラスモディウム種、並びに糸状菌；マイコプラズマ及びプリオンを含む)。ウイルスは、例えば、ヒト免疫不全ウイルス及び他のレトロウイルス、ヘルペスウイルス、パルボウイルス、フィロウイルス、シルコウイルス、パラミクソウイルス、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス(Ｂ型及びＣ型肝炎を含む)、ポックスウイルス、トガウイルス、エプスタイン‐バーウイルス及びパルボウイルスも標的とされうる。
【０１９４】
照射すべき標的部位は、既に、生物学的夾雑物に感染している必要はないということは理解されよう。実際、本発明の方法は、感染前に「予防的に」用いることができる。更なる具体例は、医療用デバイス例えばカテーテル(例えば、ＩＶカテーテル、中心静脈ライン、動脈カテーテル、末梢カテーテル、透析用カテーテル、腹腔透析用カテーテル、硬膜外カテーテル)、人工的接合点、ステント、外部固定用ピン、胸腔チューブ、食道薬供給チューブなどに対する利用を含む。
【０１９５】
ある例においては、照射は、緩和的であり並びに予防的であってよい。それ故、この発明の方法は、組織を、感染の症状を治療し又は緩和するために治療上有効な時間にわたって照射するために用いられる。表現「治療し又は緩和する」は、この発明により治療された個人の症状の、かかる治療を受けてない個人の症状と比較しての、軽減、防止、及び／又は逆転を意味する。
【０１９６】
当業者は、この発明が、任意の微生物、真菌、及びウイルス感染により引き起こされ又はそれらに関係する様々な病気に関して有用であることを認めるであろう(Harrison's Principles of Internal Medicine, 第１３版、McGraw Hill, New York (1994)参照、その全教示を参考として本明細書中に援用する)。ある具体例において、この発明による方法及びシステムは、感染症を公知の抗菌剤組成物の投与により治療するための当分野で利用可能な伝統的な治療的アプローチに付随して利用される(例えば、Goodman及びGilman's，The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第８版、1990, Pergmon Press参照、その全教示を、参考として本明細書中に援用する)。用語「抗菌性組成物」、「抗菌剤」は、ヒトを含む動物に投与されて微生物感染の増殖を阻止する化合物(例えば、抗細菌剤、抗真菌剤、及び抗ウイルス剤)及びそれらの組合せを指す。
【０１９７】
企図した広範な適用には、例えば、様々な皮膚科用、足治療用及び一般用薬剤が含まれる。治療される部位と与えられるエネルギーの間の相互作用は、波長；標的部位の化学的及び物理的特性；ビームのパワー密度又は放射束密度；連続波(ＣＷ)かパルス化照射かの何れを用いるか；レーザービームスポットサイズ；露出時間、エネルギー密度、及び標的部位の、これらのパラメーターの何れかを用いたレーザー照射の結果としての物理的特性の何らかの変化を含む幾つかのパラメーターによって規定される。加えて、標的部位の物理的特性(例えば、吸収及び散乱係数、散乱異方性、熱伝導性、熱容量、及び機械的強度)も又、全体的効果及び結果に影響する。
【０１９８】
ＮＩＭＥＬＳ線量測定は、パワー密度(Ｗ／ｃｍ2)及びエネルギー密度(Ｊ／ｃｍ2；１ワット＝１ジュール／秒)のを示し、それで、主題の波長は、ＲＯＳを生成することができ、それにより、標的部位における生物学的夾雑物のレベルを低下させることができ且つ／又は夾雑物を照射してその生物学的夾雑物が耐性の抗菌剤に対する感受性を、ＲＯＳの付随的生成を伴ってΔΨを低下させることによって、許容しえないリスク及び／又は許容しえない副作用を生物学的夾雑物以外の生物学的部分(例えば、哺乳動物細胞、組織又は期間)に伴わずに増大させることができる。
【０１９９】
Boulnois 1986, (Lasers Med. Sci. 1:47-66 (1986)、その全教示を参考として本明細書中に援用する)において論じられたように、低いパワー密度(放射束密度とも呼ばれる)及び／又はエネルギーでは、レーザー−組織相互作用を、純粋光学的(光化学的)に記述できるが、一層高いパワー密度では、光−熱相互作用が確実となる。ある具体例において、以下に例示するように、ＮＩＭＥＬＳ線量パラメーターは、公知の光化学と光力学的治療に、外来薬物、染料及び／又は発色団と共に伝統的に用いられている領域の光熱パラメーターとの間にあるが、光力学療法の範囲で、外来薬物、染料及び／又は発色団を必要とせずに機能することができる。
【０２００】
当分野での医用レーザー適用のためのエネルギー密度(流束量として、又は粒子若しくは放射束と時間の積(又は、積分)としても表現できる)は、典型的には、約１〜１０，０００Ｊ／ｃｍ2で変化するが(５桁の等級)、パワー密度(放射束密度)は、約１×１０-3〜１０12Ｗ／ｃｍ2で変化する(１５桁の等級)。パワー密度と照射露出時間との間の相反関係を考慮して、如何なる意図した特定のレーザー−組織相互作用についても大体同じエネルギー密度が必要とされるということが認められる。結果として、レーザー露出持続時間(照射時間)は、レーザー−組織相互作用の性質及び安全性を決める第一次パラメーターである。例えば、イン・ビボでの組織の熱的蒸発(剥離ではない)を数学的に捜すならば(Boulnois 1986に基づいて)、１０００Ｊ／ｃｍ2のエネルギー密度を生成すれば(表１参照)、下記の線量測定パラメーターの何れでも使用できるということが理解できる：
【０２０１】
【表１】
2010512232.tif 000002
【０２０２】
この工程は、組織中の生物学的夾雑物に対するＮＩＭＥＬＳ相互作用に利用することのできる適当な方法又は基礎的アルゴリズムを記載している。換言すれば、この数学的関係は、レーザー−組織相互作用現象を達成する相反関係である。この原理は、エネルギー密度及び時間及びパワーパラメーターのＮＩＭＥＬＳ実験データの挿入を伴う、ＮＩＭＥＬＳエネルギーにより与えられる、観測される抗菌性現象についての線量測定計算の基礎として利用することができる。
【０２０３】
照射される標的部位における特定の相互作用(例えば、標的部位の化学的及び物理的特性；連続波(ＣＷ)又はパルス化照射の何れを用いるか；レーザービームスポットサイズ；及び標的部位の物理的特性例えば吸収及び散乱係数、散乱異方性、熱伝導性、熱容量、及び機械的強度の、これらのパラメーターの何れかを用いたレーザー照射の結果としての、任意の変化)に基づいて、実務家は、パワー密度及び時間を調節して、所望のエネルギー密度を得ることができる。
【０２０４】
ここに与えた例は、イン・ビトロ及びイン・ビボの治療の両方のコンテキストにおけるかかる関係を示している。それ故、例えば、爪甲真菌症又は直径１〜４ｃｍの大きさの感染した傷の治療のコンテキストにおいて、パワー密度の値は、安全で傷害的でなく／傷害が最少となる熱レーザー−組織相互作用にとどまり、「変性」及び「組織過熱」のレベルより十分低くなるように、約０．５〜５Ｗ／ｃｍ2で変化された。他の適当なスポットサイズも用いることができる。この相反関係を用いて、これらの波長を用いたＮＩＭＥＬＳ相互作用に必要とされる閾値エネルギー密度を、所望のエネルギーが送達される限り、スポットサイズに関係なく維持することができる。典型的具体例において、光エネルギーは、均一な幾何学的分布(例えば、平坦な先端、又は最上層の工程)で組織に送達される。かかる技術を用いて、ＲＯＳを生成するのに十分な適当なＮＩＭＥＬＳ線量測定(ＮＩＭＥＬＳ効果)を計算して、生物学的夾雑物のレベルを下げ且つ／又は生物学的夾雑物の、該夾雑物が耐性である抗菌剤に対する感受性を上げるのに必要とされる閾値エネルギー密度(但し、それは、「変性」及び「組織過熱」のレベルより低い)に達することができる。
【０２０５】
ここに例示するイン・ビボで微生物を標的とするＮＩＭＥＬＳ線量測定(例えば、爪甲真菌症)は、約２００〜７００Ｊ／ｃｍ2で、ほぼ１００〜７００秒にわたった。これらのパワー値は、光剥離又は光熱的(レーザー／組織)相互作用に関係するパワー値に接近しない。
【０２０６】
平行レーザービームの強度分布は、ビームのパワー密度により与えられ、レーザー出力の、円の面積(ｃｍ2)に対する比及びエネルギーの空間的分布パターンとして定義される。それ故、面積１．７７ｃｍ2の入射ガウスビームパターンを有する１．５ｃｍの照射スポットの照明パターンは、少なくとも６つの異なるパワー密度値を１．７７ｃｍ2の照射領域内に生成しうる。これらの変化するパワー密度の強度(又は、パワー濃度)は、中心点で、１(外縁で)から６までスポットの表面積を超えて増大する。この発明のある具体例において、ビームパターンが与えられ、それは、伝統的レーザービーム放射に関係するこの固有のエラーを克服する。ＮＩＭＥＬＳパラメーターは、下記のように、処置時間(Ｔｎ)の関数として計算することができる：
Ｔｎ＝エネルギー密度／パワー密度。
【０２０７】
ある具体例において(例えば、以下のイン・ビトロ実験を参照されたい)、Ｔｎは、約５０〜３００秒であり；他の具体例においては、Ｔｎは、約７５〜２００秒であり；更に別の具体例においては、Ｔｎは、約１００〜１５０秒である。イン・ビボの具体例においては、Ｔｎは、約１００〜１２００秒である。
【０２０８】
上記の関係及び所望の光強度分布例えばここに記載したような平坦な先端の照明の外形を利用して、一連のイン・ビボのエネルギーパラメーターが、ＮＩＭＥＬＳ微生物汚染除去治療にイン・ビトロで有効として実験的に証明されている。そうして、所定の標的部位に対するキーパラメーターは、様々な異なるスポットサイズ及びパワー密度でのＮＩＭＥＬＳ療法に必要とされるエネルギー密度であることが示されている。
【０２０９】
「ＮＩＭＥＬＳ線量測定」は、パワー密度及び／又はエネルギー密度の、この発明の主題の波長が、光学的に、標的部位におけるΔΨを低下させることができる第一の閾値点から、第二の終点までの範囲及び／又は、生物学的夾雑物の、該夾雑物が耐性である抗菌剤に対する感受性をＲＯＳの発生により増大させるために、生物学的部位で許容しえない有害なリスク又は影響(例えば、熱的ダメージ例えばタンパク質)が検出される値の直前までの範囲を包含する。当業者は、ある環境においては、標的部位(例えば、哺乳動物の細胞、組織又は器官)における悪影響及び／又はリスクは、この発明の方法により得られる固有の利益の故に、許容しうることを認めるであろう。従って、企図される停止点は、有害な影響が無視できず、それ故、望まれない点である(例えば、細胞死、タンパク質の変性、ＤＮＡの損傷、罹患率、又は死亡率)。
【０２１０】
ある具体例(例えば、イン・ビボ適用)においては、ここで企図されるパワー密度範囲は、約０．２５〜４０Ｗ／ｃｍ2である。他の具体例においては、パワー密度範囲は、約０．５〜２５Ｗ／ｃｍ2である。
【０２１１】
更なる具体例において、パワー密度範囲は、約０．５〜１０Ｗ／ｃｍ2の値を包含しうる。ここに例示したパワー密度は、約０．５〜５Ｗ／ｃｍ2である。イン・ビボで、約１．５〜２．５Ｗ／ｃｍ2のパワー密度は、様々な微生物に効果的であることが示されている。
【０２１２】
経験的データは、一層高いエネルギー密度値は、一般に、イン・ビボ(例えば、足指爪)よりもイン・ビトロセッティング(例えば、プレート)において生物学的夾雑物を標的とする場合に用いられることを示しているようである。
【０２１３】
ある具体例(下記のイン・ビトロの実施例を参照されたい)においては、ここで企図されるエネルギー密度範囲は、５０Ｊ／ｃｍ2より大きいが、約２５，０００Ｊ／ｃｍ2未満である。他の具体例においては、エネルギー密度範囲は、約７５０〜７，０００Ｊ／ｃｍ2である。更に別の具体例においては、エネルギー密度範囲は、約１，５００〜６，０００Ｊ／ｃｍ2であり、これは、生物学的夾雑物が、イン・ビトロセッティング(例えば、プレート)で標的とされるべきかイン・ビボ(例えば、足指爪又は医用デバイス周囲)で標的とされるべきかに依存している。ある具体例(下記のイン・ビボでの実施例を参照されたい)においては、エネルギー密度は、約１００〜５００Ｊ／ｃｍ2である。更に別のイン・ビボでの具体例においては、エネルギー密度は、約１７５〜３００Ｊ／ｃｍ2である。更に別の具体例においては、エネルギー密度は、約２００〜２５０Ｊ／ｃｍ2である。幾つかの具体例においては、エネルギー密度は、約３００〜７００Ｊ／ｃｍ2である。幾つかの他の具体例においては、エネルギー密度は、約３００〜５００Ｊ／ｃｍ2である。更に別の場合には、エネルギー密度は、約３００〜４５０Ｊ／ｃｍ2である。
【０２１４】
微生物種の様々なイン・ビトロ処理のために経験的に調べられたパワー密度は、約１〜１０Ｗ／ｃｍ2である。
【０２１５】
当業者は、所定に環境に対して、ここで企図されるパワー密度及びエネルギー密度範囲内の特に適したＮＩＭＥＬＳ線量測定値の同定は、日常的実験により経験的になされうるということを認めるであろう。近赤外線エネルギーを歯周囲治療と共に使用する実務家(例えば、歯科医)は、日常的に、パワー密度及びエネルギー密度を、各所定の患者に関係する緊急性に基づいて調節する(例えば、組織の色、組織の構造、及び病原体侵入の深さの関数としてパラメーターを調節する)。例えば、明るい色の組織(例えば、メラニン欠乏患者)における歯周囲の感染症のレーザー治療は、一層暗い組織は近赤外線エネルギーを一層効率的に吸収し、それ故それらの近赤外線エネルギーを組織において一層早く熱に変換するので、一層暗い組織よりも大きい熱安全性パラメーターを有するであろう。それ故、実務家の能力で明らかに必要なものは、複数の異なるＮＩＭＥＬＳ線量測定値を種々の治療プロトコールについて同定することである。
【０２１６】
以下に説明するように、抗生物質耐性細菌は、本発明の方法によって効果的に治療できるということが見出されている。加えて、この発明の方法を用いて、伝統的アプローチを増加させることができ、伝統的治療と共に、その代わりに用いるために、又は有効な治療的アプローチとして連続的にさえ用いられうるということが見出されている。従って、この発明は、抗生物質治療剤と組み合わせることができる。用語「抗生物質」は、β−ラクタム系抗生物質、ペニシリン、及びセファロスポリン、バンコマイシン、バシトラシン、マクロライド系抗生物質(エリスロマイシン)、ケトライド系抗生物質(テリスロマイシン)、リンコサミド系抗生物質(クリンダマイシン)、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、アミノグリコシド(ゲンタマイシン)、アンホテリシン、アニリノウラシル、セファゾリン、クリンダマイシン、ムピロシン、スルホンアミド及びトリメトプリム、リファンピシン、メトロニダゾール、キノロン、ノボビオシン、ポリミキシン、オキサゾリジンクラス(例えば、リネゾリド)、グリシルサイクリン(例えば、チゲサイクリン)、環状リポペプチド(例えば、ダプトマイシン)、プレウロムチリン(例えば、レタパムリン)及びグラミシジンなど並びにこれらの任意の塩又は変異体を含むが、これらに限られない。テトラサイクリンは、イムノサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン及びミノサイクリンなどを含むがこれらに限られないことが本発明の範囲内にあるということも又、理解される。アミノグリコシド系抗生物質が、ゲンタマイシン、アミカシン及びネオマイシンなどを含むが、これらに限られないということも又、更に理解される。
【０２１７】
下記に説明するように、抗真菌剤耐性の真菌は、この発明の方法によって効果的に治療することができるということが見出されている。加えて、本発明の方法は、伝統的アプローチを増加させるために利用することができ、伝統的治療と共に、その代わりに用いるために、又は有効な治療アプローチとして連続的にさえ利用することができるということが見出されている。従って、この発明は、抗真菌性治療剤と組み合わせることができる。用語「抗真菌剤」は、ポリエン、アゾール、トリアゾール、アリルアミン、エキノカンジン、シクロピロクス、フルシトシン、グリゼオフルビン、アモロロフィン、ソダリン及びこれらの組合せ(これらの塩を含む)を含むが、これらに限られない。
【０２１８】
下記に説明するように、抗新生物剤耐性の癌は、本発明の方法によって効果的に治療されうるということが仮定されている。加えて、本発明の方法を利用して、伝統的アプローチを増加させることができ、伝統的治療と共に、それの代わりに用いることができ、又は有効な治療的アプローチとして連続的にさえ利用することができるということが見出されている。従って、この発明は、抗新生物剤治療と組合せることができる。用語「抗新生物剤」は、アクチノマイシン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、タキサン、エトポシド、テニポシド及びこれらの組合せ(これらの塩を含む)を含むが、これらに限られない。
【０２１９】
細菌及び真菌における薬物耐性システムの阻害剤、又は抗菌剤の強化剤を見出すことを試みる従来技術の共通の教義は、常に、かかる薬剤は、何らかの固有の価値を有するためには、感染した哺乳動物組織に対して非毒性でなければならないということを有してきた。その上、抗菌剤は、哺乳動物宿主に一般的でない細菌又は真菌細胞過程に影響を与え、それ故、一般に、性質及びデザインにおいて、安全で治療活性があるという事実が常にあった。従来技術においては、もし、抗菌剤、強化剤、及び／又は耐性逆転実在物が、哺乳動物細胞にも病原体を傷害するのと同じ様式で影響を与えるならば、それらは、治療として安全には用いえなかった。
【０２２０】
本発明においては、実験データ(例えば、実施例Ｉ〜Ｘ参照)は、全細胞型間でのΔΨ及びΔｐの全般的変化を支持しており、それ故、全細胞膜の電気的機構のみならず電気力学的面が、適当に分離されうる異なる特性を有しないという考えに導く。これは、病原性細胞(望ましくない細胞)のみならず、ビームの光路中のすべての細胞が脱分極により影響を受けることを示している。
【０２２１】
このＮＩＭＥＬＳシステムの光生物学及び細胞エネルギー論的データが既に示したもの(即ち、すべての膜エネルギー論は、原核生物及び真核生物種を横切る同じ仕方で影響されるということ)を再確認すると、本発明による技術は、この全般的光脱分極の効果を、抗菌性分子を治療養生法に加えてかかる分子を望ましくない細胞において(のみ)強化することにより、望ましくない細胞において独立的に利用する。かかる標的を定めた治療の結果は、ＮＩＭＥＬＳレーザーの全般的脱分極の効果を利用することができ、それは、治療用ビームの光路内の哺乳動物細胞に対して、細菌及び真菌に対するより一層よく評価され且つ一過性である。それ故、実験データが示唆するように、哺乳動物細胞の一過性のエネルギー論的強さの測定は、光脱分極及びＲＯＳの発生にもかかわらず、細菌又は真菌細胞において見られるものより大きいに違いない。
【０２２２】
下記の実施例は、我々の現在の光生物学及び細胞エネルギー論並びに細胞過程に適用した場合の熱力学の保存の理解に結びつく全般的光膜脱分極の概念を証明する実験的証拠を与える。
【実施例】
【０２２３】
下記の実施例は、本発明の典型的具体例を示すために含まれるものであり、この発明の範囲を制限することを意図するものではない。当業者は、特定の具体例において多くの変化がなされうること及びそれらが、本発明の精神及び範囲から離れることなく、やはり類似の結果を得ることを認めるであろう。
【０２２４】
実施例Ｉ
【表２】
2010512232.tif 000003
【０２２５】
実施例ＩＩ
細菌の方法：イン・ビトロでのＭＲＳＡに対するＭＩＮＥＬＳ処理パラメーター
下記のパラメーターは、イン・ビトロでの実験Ｖ及びＶＩＩＩ〜ＸＩＩについてのＭＲＳＡに適用する場合の、この発明による一般的な細菌の方法を示している。
【０２２６】
Ａ．ＭＲＳＡに対する実験の材料及び方法：
【表３】
2010512232.tif 000004
【０２２７】
類似の細胞培養及び速度論的プロトコールを、すべてのＮＩＭＥＬＳ照射について、大腸菌及びＣ．アルビカンスを用いて、イン・ビトロ試験で実施した。それ故、例えば、Ｃ．アルビカンスＡＴＣＣ１４０５３液体培養物を、ＹＭ培地(２１ｇ／Ｌ、Difco)中で、３７℃で成長させた。標準化懸濁液からアリコートを、２４ウェル組織培養プレート中の選択したウェルに採った。レーザー処理の後に、１００μＬを各ウェルから取って、連続的に１：１０００で希釈し、その結果、最初の培養物の１：５×１０6の最終希釈物を得た。各最終的希釈物のアリコートを別々のプレート上に広げた。次いで、これらのプレートを、３７℃で、約１６〜２０時間インキュベートした。手作業によるコロニー計数を行って記録した。
【０２２８】
【表４】
2010512232.tif 000005
【０２２９】
再び、類似の細胞培養及び速度論的プロトコールを、すべてのＮＩＭＥＬＳ照射について、大腸菌及びＣ．アルビカンスを用いてイン・ビトロアッセイ試験にて行った。それ故、例えば、Ｃ．ＡＴＣＣ１４０５３液体培養物を、ＹＭ培地(２１ｇ／Ｌ、Difco)中で、３７℃で成長させた。標準化懸濁液からアリコートを、２４ウェル組織培養プレート中の選択したウェル中に採った。レーザー処理の後に、各レーザーを受けた試料及び対照用試料を、個々のアッセイの指示によって処理した。
【０２３０】
実施例ＩＩＩ
哺乳動物細胞の方法：イン・ビトロＨＥＫ２９３(ヒト胎児腎臓細胞)実験についてのＮＩＭＥＬＳ処理パラメーター
下記のパラメーターは、この発明による一般的な細菌についての方法を、イン・ビトロ実験用にＨＥＫ２９３細胞に適用した場合について説明している。
【０２３１】
Ａ．ＨＥＫ２９３細胞についての実験材料及び方法
ＨＥＫ２９３細胞を、２４ウェルプレートの適当なウェルに、１×１０5細胞／ｍｌ(全量０．７ｍｌ)の密度で、フリースタイル培地(Invitrogen)中に播種した。細胞を、実験前に、加湿したインキュベーター中で、３７℃で、８％ＣＯ2中で、約４８時間インキュベートした。細胞は、実験時に約９０％集密であったが、これは、凡そ３×１０5の全細胞に匹敵する。処理の直前に、細胞を、予め暖めたリン酸緩衝塩溶液(ＰＢＳ)にて洗い、処理中に２ｍｌのＰＢＳを重層した。
【０２３２】
レーザー処理後、細胞を、ウェルから機械的に取り出して、１．５ｍｌの遠心分離用チューブに移した。ミトコンドリア膜ポテンシャル及び全グルタチオンを、キット製造業者の指示に従って測定した。
【０２３３】
実施例ＩＶ
ＣＲＴ＋(黄色)及びＣＲＴ−(白色)の黄色ブドウ球菌実験についてのＮＩＭＥＬＳイン・ビトロ試験
我々は、ｃｒｔ遺伝子(黄色カロテノイド色素)を遺伝子工学的に処理して除いた黄色ブドウ球菌のｃｒｔ−(白色)変異体を用いて実験を行い、これらの変異体を、野生型(黄色)の黄色ブドウ球菌に対して、予め決めた非致死的線量のＮＩＭＥＬＳレーザーにかけた。この実験の目的は、ＮＩＭＥＬＳレーザーによる遊離基酸素種(ＲＯＳ)発生現象及び／又は一重項酸素の発生について試験することである。科学文献で、Liu等は、以前に類似のモデルを利用して、黄色の黄色ブドウ球菌のカロテノイド色素の好中球に対する酸化防止的防護活性を試験した。(Liu等、Staphylococcus aureus golden pigment impairs neutrophil killing and promotes virulence through its antioxidant activity, Vol. 202, No. 2, 2005年、7月18日、209-215頁、その全教示を、参考として本明細書中に援用する。)
【０２３４】
黄色ブドウ球菌における金色は、生物を一重項酸素から防護することのできるカロテノイド(抗酸化剤)色素により与えられ、かかるカロテノイド色素を産生しない変異体(ｃｒｔ-)が単離された場合には、その変異体のコロニーは、外観が「白色」であり、酸化剤の殺菌作用を一層受けやすく、好中球の生存を損なうということは、以前に測定されている。
【０２３５】
ＮＩＭＥＬＳレーザーの非致死的線量測定が、(野生型黄色ブドウ球菌に対して)一貫して、変異体の「白色」細胞の９０％以下を殺し、正常な黄色ブドウ球菌を殺さないということが見出された。これら２種類の黄色ブドウ球菌株における唯一の遺伝的差異は、変異体における抗酸化剤色素の欠如である。
【０２３６】
【表５】
2010512232.tif 000006
【０２３７】
【表６】
2010512232.tif 000007
【０２３８】
実施例Ｖ
ＭＲＳＡ、Ｃ．アルビカンス及び大腸菌におけるΔΨの変化についてのＮＩＭＥＬＳイン・ビトロ試験
無傷の細胞に取り込まれて、それらの無傷の細胞に１５〜３０分以内で蓄積され、他の細胞質成分に感知できる染色を伴わない選択された蛍光染料がある。これらの膜ポテンシャルの染料インジケーターは、多年にわたって利用可能であり、細胞生理学を研究するために用いられてきた。これらの染料の蛍光強度は、それらの蛍光スペクトル特性が膜貫通ポテンシャルΔΨ−ｓｔｅａｄｙの値の変化の原因であるので、容易にモニターすることができる。
【０２３９】
これらの染料は、一般に、ポテンシャルに依存して、細胞外培地と膜又は膜の細胞質との間で分配されることによって作動する。これは、染料上での電圧ポテンシャルのイオン電荷との相互作用による、染料の再分配によって起きる。この蛍光は、プロトノフォアのカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン(ＣＣＣＰ)によって約５分で除去されうる。これは、染料濃度の維持が、機能的ＥＴＳ及びΔｐにより維持される内側が負の膜貫通ポテンシャルに依存することを示している。
【０２４０】
仮説試験：
帰無仮説は、μ1−μ2＝０
μ1は、カルボシアニン染料にさらされた対照用細胞培養物(レーザーなし)における蛍光強度であり
μ2は、ＮＩＭＥＬＳレーザーから準致死的線量測定で予備照射された同じ細胞培養物における蛍光強度である
【０２４１】
このデータは、ＮＩＭＥＬＳレーザーシステムによる(細胞の)予備処理によって、細胞の蛍光が(未照射の対照即ち「レーザーを受けてない」細胞よりも一層少なく)消されることを示しており、これは、ＮＩＭＥＬＳレーザーが、原形質膜を介して、細胞の呼吸過程及び酸化的リン酸化と相互作用したことを示している。
μ1−μ2＝０
は、この細胞培養物に対する追加の準致死的ＮＩＭＥＬ照射がΔΨ−ｓｔｅａｄｙに何の効果も有しないことを支持する。
μ1−μ2＞０
は、この細胞培養物に対する追加の準致死的ＮＩＭＥＬ照射がΔΨ−ｓｔｅａｄｙに対して消散又は脱分極効果を有することを支持する。
【０２４２】
材料及び方法：
BacLight(商標)細菌膜ポテンシャルキット(B34950, Invitrogen U S)。このBacLight(商標)細菌膜ポテンシャルキットは、カルボシアニン染料ＤｉＯＣ２(３)(３，３’−ジエチルオキサカルボシアニンヨージド、成分Ａ)及びＣＣＣＰ(カルボニルシアニド３−クロロフェニルヒドラゾン、成分Ｂ)(両方ともＤＭＳＯ中)、及び１×ＰＢＳ溶液(成分Ｃ)を提供する。
ＤｉＯＣ２(３)は、すべての細菌細胞で緑色蛍光を示すが、この蛍光は、一層大きい膜ポテンシャルにより引き起こされる一層高いサイトゾル濃度において染料分子が自己会合するにつれて、赤色放射の方へ変化する。プロトンイオノフォア例えばＣＣＣＰは、膜ポテンシャルを、プロトン勾配を排除することによって破壊し、一層高度の緑色蛍光を引き起こす。
【０２４３】
ＭＲＳＡにおける膜ポテンシャルΔΨの検出
緑色蛍光放射は、対照と準致死的線量測定でレーザー照射された試料についての集団平均蛍光強度を利用して計算された：
【０２４４】
【表７】
2010512232.tif 000008
【０２４５】
このデータは、μ1−μ2＞０(レーザー照射された細胞)が、図８に示したように、一層少ない「緑色蛍光」を有したことを示している。これらのＭＲＳＡ試料は、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｂａｃｔの、準致死的ＮＩＭＥＬＳ線量測定によるΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｂａｃｔの一つへの変化及び低下を明確に示した。
【０２４６】
Ｃ．アルビカンスにおける膜ポテンシャルΔΨの検出
緑色蛍光放射は、対照及び下記の表に列記された準致死的線量測定でレーザー照射された試料についての集団平均蛍光強度を利用して計算された：
【０２４７】
【表８】
2010512232.tif 000009
【０２４８】
このデータは、μ1−μ2＞０(レーザー照射されたＣ．アルビカンス細胞)が、図９に示したように、一層少ない「緑色蛍光」を有したことを示している。これらのＣ．アルビカンス試料は、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｆｕｎｇｉの、準致死的ＮＩＭＥＬＳ線量測定及び増大する(準致死的)ＮＩＭＥＬＳ線量測定によるΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｆｕｎｇｉの一つへの変化及び低下を明確に示した。
【０２４９】
大腸菌における膜ポテンシャルΔΨの検出
赤色／緑色比を、対照及び準致死的線量測定でレーザー照射した試料についての集団平均蛍光強度を利用して計算した：
【０２５０】
このデータは、μ1−μ2＞０(レーザー照射された細胞)が、図１９に示したように、一層少ない「緑色蛍光」を有したことを示している。これらの大腸菌試料は、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｂａｃｔの、準致死的ＮＩＭＥＬＳ線量測定によるΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｂａｃｔの一つへの変化及び低下を明確に示した。
【０２５１】
実施例ＶＩ
Ｃ．アルビカンスにおける、準致死的レーザー線量測定によるΔΨ−ｍｉｔｏについてのＮＩＭＥＬＳイン・ビトロ試験
仮説試験：
帰無仮説は、μ1−μ2＝０
ａ）μ1は、ミトコンドリア膜ポテンシャル検出キットにさらされた対照細胞培養物のミトコンドリアにおける蛍光強度である。
ｂ）μ2は、ＮＩＭＥＬＳレーザーから準致死的線量測定で予備照射されてミトコンドリア膜ポテンシャル検出キットにさらされた同じ細胞培養物における蛍光強度である。
【０２５２】
このデータは、ミトコンドリアの蛍光が、ＮＩＭＥＬＳレーザーシステムによる(細胞の)予備処理によって、(対照のレーザー照射されてない細胞よりも少なく)消されることを示しており、これらの結果は、ＮＩＭＥＬＳレーザーが、細胞の呼吸過程及び酸化的リン酸化と、真菌及び哺乳動物細胞のミトコンドリアにおいて相互作用したことを示している。
μ1−μ2＝０
は、この細胞培養物のミトコンドリアに対する追加の準致死的ＮＩＭＥＬ照射がΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏに何の効果も有しないことを支持する。
μ1−μ2＞０
は、この細胞培養物に対する追加の準致死的ＮＩＭＥＬ照射がΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏに対して消散又は脱分極効果を有することを支持する。
【０２５３】
材料及び方法：
ミトコンドリア膜ポテンシャル検出キット(APO LOGIX JC-1)(Cell Technology Inc., 950 Rengstorff Ave, Sute D; Mountain View CA 94043)。
【０２５４】
ミトコンドリア膜ポテンシャル(ΔΨ)の喪失は、アポトーシスの顕著な特徴である。この APO LOGIX JC-1 アッセイキットは、細胞中のミトコンドリア膜ポテンシャルを測定する。
【０２５５】
アポトーシスを起こしていない細胞では、ＪＣ−１(５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンズ−イミダゾリルカルボシアニンヨージド)は、モノマーとしてサイトゾル中に存在し(緑色)、凝集物としてミトコンドリアにも蓄積する(赤色になる)。ところが、アポトーシス及びネクローシスを起こした細胞では、ＪＣ−１は、モノマー形態で存在して、サイトゾルを緑色に染める。
【０２５６】
【表９】
2010512232.tif 000010
【０２５７】
この(APO LOGIX JC-1)キットは、膜ポテンシャルを、緑色蛍光の赤色蛍光への会話によって測定する。図１０Ａにおいて、赤色の出現は測定されてプロットされており、これは、無傷の膜を有する細胞においてのみ起き、緑色の赤色に対する比は、図１０Ｂに示されている(対照及びレーザー照射された試料の両方について)。明らかに、この試験においては、レーザーを受けた試料において、赤色蛍光が減少しているが、緑色の赤色に対する比は増大しており、これは、脱分極を示している。これらの結果は、膜貫通ΔΨ試験と同じである(即ち、両方のデータは、脱分極を示している)。
【０２５８】
これらの結果は又、μ1−μ2＞０及び細胞ミトコンドリアに対する準致死的ＮＩＭＥＬ照射がΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏに対して消散又は脱分極効果を有することをも示し、カンジダ・アルビカンスのΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉのΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉへの明らかな低下を示している。
【０２５９】
実施例ＶＩＩ
準致死的レーザー線量測定によるヒト胎児腎臓細胞のΔΨ−ｍｉｔｏについてのＮＩＭＥＬＳイン・ビトロ試験
仮説試験：
帰無仮説は、μ1−μ2＝０
ａ）μ1は、ミトコンドリア膜ポテンシャル検出キットにさらされた哺乳動物対照細胞培養物のミトコンドリア(レーザー照射なし)における蛍光強度である。
ｂ）μ2は、ＮＩＭＥＬＳレーザーから準致死的線量測定で予備照射されてミトコンドリア膜ポテンシャル検出キットにさらされた同じ哺乳動物細胞培養物における蛍光強度である。
【０２６０】
膜ポテンシャル検出キット
このデータは、ミトコンドリアの蛍光が、ＮＩＭＥＬＳレーザーシステムによる(細胞の)予備処理によって、(対照のレーザー照射されてない細胞よりも少なく)消されることを示しており、これらの結果は、ＮＩＭＥＬＳレーザーが、細胞の呼吸過程及び酸化的リン酸化と、哺乳動物細胞のミトコンドリアにおいて相互作用したことを示している。
μ1−μ2＝０
は、この哺乳動物細胞培養物のミトコンドリアに対する追加の準致死的ＮＩＭＥＬ照射がΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｍａｍに何の効果も有しないことを支持する。
μ1−μ2＞０
は、この哺乳動物細胞培養物に対する追加の準致死的ＮＩＭＥＬ照射がΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｍａｍに対して消散又は脱分極効果を有することを支持する。
【０２６１】
材料及び方法：
ミトコンドリア膜ポテンシャル検出キット(APO LOGIX JC-1)(Cell Technology Inc., 950 Rengstorff Ave, Sute D; Mountain View CA 94043)。
ミトコンドリア膜ポテンシャル(ΔΨ)の喪失は、アポトーシスの顕著な特徴である。この APO LOGIX JC-1 アッセイキットは、細胞中のミトコンドリア膜ポテンシャルを測定する。アポトーシスを起こしていない細胞では、ＪＣ−１(５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンズ−イミダゾリルカルボシアニンヨージド)は、モノマーとしてサイトゾル中に存在し(緑色)、凝集物としてミトコンドリアにも蓄積する(赤色になる)。ところが、アポトーシス及びネクローシスを起こした細胞では、ＪＣ−１は、モノマー形態で存在して、サイトゾルを緑色に染める。
【０２６２】
【表１０】
2010512232.tif 000011
【０２６３】
ＨＥＫ−２９３(ヒト胎児腎臓細胞)のΔΨ−ｍｉｔｏ試験：
この(APO LOGIX JC-1)キットは、膜ポテンシャルを、緑色蛍光の赤色蛍光への会話によって測定する。図１１Ａにおいて、赤色の出現は測定されてプロットされており、これは、無傷の膜を有する細胞においてのみ起き、緑色の赤色に対する比は、図１１Ｂに示されている(対照及びレーザー照射された試料の両方について)。
【０２６４】
明らかに、この試験においては、レーザーを受けた試料において、赤色蛍光が減少しているが、緑色の赤色に対する比は増大しており、これは、脱分極を示している。これらの結果は、μ1−μ2＞０及び哺乳動物細胞ミトコンドリアに対する準致死的ＮＩＭＥＬ照射がΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｍａｍに対して消散又は脱分極効果を有することを示しており、哺乳動物におけるΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｍａｍのΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｍｉｔｏ−ｍａｍへの明らかな低下を示している。
【０２６５】
実施例ＶＩＩＩ
反応性酸素種(ＲＯＳ)についてのＮＩＭＥＬＳイン・ビトロ試験
これらの反応性酸素種(ＲＯＳ)の発生についてのイン・ビトロ試験を、細菌の膜貫通ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｂａｃｔのΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｂａｃｔへの、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉのΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉへの、及びΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｍａｍのΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｍｉｔｏ−ｍａｍへの、上記の実施例においてΔΨ試験で用いたものに匹敵する準致死的レーザー線量測定による、レーザーによる変化後に行った。
【０２６６】
材料及び方法：
全グルタチオン定量用キット(Dojindo Laboratories; Kumamoto Techno Research Park, 2025-5 Tabaru, Mashiki-machi, Kamimashiki-gun; Kumamoto 861-2202, 日本国)
【０２６７】
グルタチオン(ＧＳＨ)は、動物組織、植物組織、細菌及び酵母中に最も豊富にあるチオール(ＳＨ)化合物である。ＧＳＨは、反応性酸素種に対する防護及びタンパク質のＳＨ基の維持などの多くの異なる役割を演じている。これらの反応において、ＧＳＨは、グルタチオンジスルフィド(ＧＳＳＧ：ＧＳＨの酸化型)に変換される。ＧＳＳＧは、グルタチオンレダクターゼによって酵素的に還元されるので、ＧＳＨは、生物体における優勢な形態である。エルマン試薬として知られるＤＴＮＢ(５，５’−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸))が、チオール化合物の検出のために開発された。１９８５年に、ＤＴＮＢ及びグルタチオンレダクターゼによるグルタチオンリサイクリングシステムが、高度に敏感なグルタチオン検出方法を造るということが示唆された。ＤＴＮＢとグルタチオン(ＧＳＨ)は反応して、２−ニトロ−５−チオ安息香酸及びグルタチオンジスルフィド(ＧＳＳＧ)を生成する。２−ニトロ−５−チオ安息香酸は、黄色の生成物であるので、試料用液中のＧＳＨ濃度は、４１２ｎｍでの吸光度の測定により測定することができる。ＧＳＨは、ＧＳＳＧから、グルタチオンレダクターゼによって生成され、ＤＴＮＢと反応して再び２−ニトロ−５−チオ安息香酸を生成する。それ故、このリサイクリング反応は、全グルタチオン検出の感度を改良する。
【０２６８】
有意の濃度では、ＲＯＳは、急速且つ特異的に、グルタチオン抗酸化システムの成分(カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、ＧＳＨ)によるその還元速度を超える速度で、標的と反応する。
【０２６９】
ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｂａｃｔをΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｂａｃｔの一つに変える準致死的ＮＩＭＥＬＳ線量測定におけるＭＲＳＡ中のグルタチオンの検出
図１２に示したように、これらの結果は、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｂａｃｔをΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｂａｃｔの一つに変える準致死的ＮＩＭＥＬＳ線量測定におけるＭＲＳＡ中の全グルタチオンの減少を明確に示しており、これは、膜貫通ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｂａｃｔのΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｂａｃｔの一つへの準致死的変化によるＲＯＳの発生の証拠である。
【０２７０】
ΔΨ−ｓｔｅａｄｙをΔΨ−ｔｒａｎｓの一つに変える準致死的ＮＩＭＥＬＳ線量測定における大腸菌中のグルタチオンの検出
図２０に示したように、これらの結果は、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｂａｃｔをΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｂａｃｔの一つに変える準致死的ＮＩＭＥＬＳ線量測定における大腸菌中の全グルタチオンの減少を明確に示しており、これは、膜貫通ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｂａｃｔのΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｂａｃｔの一つへの準致死的変化によるＲＯＳの発生の証拠である。
【０２７１】
ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉをΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉに変え、その後、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｆｕｎｇｉをΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｆｕｎｇｉの一つに変える準致死的ＮＩＭＥＬＳにおけるＣ．アルビカンス中のグルタチオンの検出
【０２７２】
ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉをΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉに変え、その後、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｆｕｎｇｉをΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｆｕｎｇｉの一つに変える準致死的ＮＩＭＥＬＳ線量測定におけるＣ．アルビカンス中のグルタチオンの検出
図１３に示したように、これらの結果は、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉをΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉに変え、その後、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｆｕｎｇｉをΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｆｕｎｇｉの一つに変える準致死的ＮＩＭＥＬＳ線量測定におけるＣ．アルビカンス中の全グルタチオンの減少を明確に示しており、これは、膜貫通ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉのΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉへの、その後の、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｆｕｎｇｉのΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｆｕｎｇｉの一つへの準致死的変化によるＲＯＳの発生の証拠である。
【０２７３】
ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｍａｍをΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｍａｍに変える準致死的ＮＩＭＥＬＳ線量測定におけるＨＥＫ−２９３(ヒト胎児腎臓細胞)中でのグルタチオンの検出
図１４に示したように、これらの結果は、ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｍａｍをΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｍｉｔｏ−ｍａｍに変える準致死的ＮＩＭＥＬＳ線量測定におけるＨＥＫ−２９３(ヒト胎児腎臓細胞)中での全グルタチオンの減少を明確に示しており、これは、ＮＩＭＥＬＳ媒介の膜貫通ΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｍｉｔｏ−ｍａｍのΔΨ−ｔｒａｎｓ−ｍｉｔｏ−ｍａｍへの準致死的変化によるＲＯＳの発生の証拠である。
【０２７４】
実施例ＩＸ
準致死的線量のＮＩＭＥＬＳレーザーの、エリスロマイシン及びトリメトプリムを伴うＭＲＳＡへの影響の評価
この実施例では、ＮＩＭＥＬＳレーザーの準致死的線量が、ＭＲＳＡにおいて、抗生物質エリスロマイシンの効果を抗生物質トリメトプリムより一層強化するかどうかを測定した。エリスロマイシン耐性においては、流出用ポンプが、主要な因子を演じている。トリメトプリムの流出用ポンプによる耐性機構は、グラム陽性の黄色ブドウ球菌においては、報告されていない。
【０２７５】
背景：エリスロマイシンは、β−ラクタム系のペニシリンに非常に類似した抗菌スペクトルを有するマルコライド系抗生物質である。過去において、それは、広範なグラム陽性細菌の皮膚及び気道感染の治療に有効であり、最も安全に使える抗生物質の一つと考えられてきた。過去においては、エリスロマイシンは、ペニシリンに対するアレルギーを有する人々のために用いられてきた。エリスロマイシンの作用機構は、細菌の成長及び複製を、細菌のタンパク質合成を妨害することにより防止することである。これは、エリスロマイシンが、５０Ｓの細菌リボソーム中の２３ＳｒＲＮＡ分子に結合し、それにより、成長中のペプチド鎖が出るのをブロックし、そうして、ペプチドの移動を阻害するので達成される。エリスロマイシン耐性(他のマルコライドも)は、手に負えず、広範であり、２つの有意の耐性システムによって達成される：
Ａ）５０Ｓリボソームサブユニット中の２３ＳｒＲＮＡを無反応にする改変
Ｂ）薬物の細胞外への流出
【０２７６】
トリメトプリムは、歴史的に尿管感染症の治療に用いられてきた抗生物質である。それは、ジヒドロフォレートレダクターゼの阻害剤として知られる抗菌剤のクラスのメンバーである。トリメトプリムの作用機構は、それがジヒドロ葉酸の類似体であるので、細菌のジヒドロフォレートレダクターゼ(ＤＨＦＲ)のシステムを邪魔することである。これは、この酵素に対する天然の基質よりも１０００倍高い親和性のために、ＤＨＦＲの競争阻害を引き起こす。
【０２７７】
従って、トリメトプリムは、テトラヒドロ葉酸分子の合成を阻害する。テトラヒドロ葉酸は、ＤＮＡヌクレオチドチミジレートのデノボ合成において必須の前駆体である。細菌は、環境(即ち、感染宿主)から葉酸を取り込むことができず、それ故、それら自身のテトラヒドロ葉酸のデノボ合成に依存している。この酵素の阻害は、最終的に、ＤＮＡ複製を妨害する。
【０２７８】
トリメトプリム耐性は、一般に、正常染色体のＤＨＦＲの過剰生産、又は薬物耐性ＤＨＦＲ酵素から生じる。トリメトプリム耐性の黄色ブドウ球菌の報告は、その耐性は、染色体的に媒介された型のものか又は大型プラスミドにコードされていることを示してきた。幾つかの株は、染色体性とプラスミド媒介によるトリメトプリム耐性の両方を示すと報告されてきた。グラム陽性の病原体である黄色ブドウ球菌においては、トリメトプリムに対する耐性は、遺伝子変異のためであり、トリメトプリムが能動的に細胞外へ流出されたという報告はされてない。
【０２７９】
細菌における流出用ポンプ
細菌及び真菌における薬物耐性の主たる経路は、細胞の細胞質において治療的濃度が得られないようにする、抗生物質の細胞外への能動輸送(流出)である。
【０２８０】
抗生物質(及び他の有害な分子)の能動的流出は、グラム陽性細菌の細胞質膜及びグラム陰性細菌の外膜中の一連の膜貫通タンパク質によって媒介される。
【０２８１】
臨床的には、流出用ポンプにより媒介される抗生物質耐性が、グラム陽性細菌においてマルコライド系抗生物質、テトラサイクリン及びフルオロキノロンに対して最も関連している。グラム陰性細菌においては、β−ラクタム流出媒介の耐性も又、臨床的に関連性が高い。
【０２８２】
仮説試験
帰無仮説は、μ1−μ2＝０ 及びμ1−μ3＝０であり、ここに：
ａ）μ1は、ＮＩＭＥＬＳレーザーシステムからの、対照としてのＭＲＳＡへの準致死的線量測定であり、そして；
ｂ）μ2は、同じＮＩＭＥＬＳレーザーシステムからの、ＭＲＳＡへの、トリメトプリムの有効レベルの直ぐ下の耐性ＭＩＣでの添加を伴う準致死的線量測定であり、そして；
ｃ）μ3は、同じＮＩＭＥＬＳレーザーシステムからの、ＭＲＳＡへの、エリスロマイシンの有効レベルの直ぐ下の耐性ＭＩＣでの添加を伴う準致死的線量測定である。
【０２８３】
このデータは、抗生物質トリメトプリム又はエリスロマイシンの添加が、準致死的照射を変えて、下記のように、これらのＭＲＳＡコロニーの成長の減少を生じることを示している：
μ1−μ2＝０
トリメトプリムの添加が、正常に成長したＭＲＳＡコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じないことを支持する。
μ1−μ2＞０
は、トリメトプリムの添加が、正常に成長したＭＲＳＡコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じることを支持する。
μ1−μ3＝０
は、エリスロマイシンの添加が、正常に成長したＭＲＳＡコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じないことを支持する。
μ1−μ3＞０
は、エリスロマイシンの添加が、正常に成長したＭＲＳＡコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じることを支持する。
【０２８４】
【表１１】
2010512232.tif 000012
【０２８５】
結果：
この実験は、明らかに、ＮＩＭＥＬＳシステムによる準致死的レーザーパラメーター下で、μ1−μ2＝０且つμ1−μ3＞＝０であることを示した。これは、流出用ポンプが、阻害されていること、及びエリスロマイシン耐性が、ＭＲＳＡのΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｂａｃｔに対するＮＩＭＥＬＳ効果によって逆転されていることを示している。
【０２８６】
実施例Ｘ
ＮＩＭＥＬＳレーザーの準致死的線量の、テトラサイクリン及びリファンピンを伴うＭＲＳＡに対する影響の評価
この実験の目的は、準致死的線量のＮＩＭＥＬレーザーが、ＭＲＳＡにおいて、抗生物質テトラサイクリンの効果を抗生物質リファンピンよりも強化するかどうかを観察することであった。流出用ポンプは、よく調べられており、テトラサイクリン耐性において主要な因子を演じている。しかしながら、リファンピンの流出用ポンプによる耐性機構は、グラム陽性の黄色ブドウ球菌では、報告されていない。
【０２８７】
この実験は、以前にも、エリスロマイシン及びトリメトプリムを用いて行われ、データは、ＮＩＭＥＬＳ効果は、エリスロマイシンにおいて流出用ポンプによる耐性機構にダメージを与えることができることを示した。
【０２８８】
テトラサイクリン：
テトラサイクリンは、静菌性抗生物質であり、これは、それが、細菌の成長を、タンパク質合成を阻害することにより妨げることを意味する。テトラサイクリンは、これを、細菌の３０Ｓリボソームの作用を、酵素アミノアシル−ｔＲＮＡの結合により阻害することによって達成する。テトラサイクリン耐性は、しばしば、エネルギー依存性のテトラサイクリンの流出をコードする新たな遺伝子の獲得、又は細菌リボソームをテトラサイクリンの作用から防護するタンパク質をコードする新たな遺伝子の獲得のためである。
【０２８９】
リファンピン：
リファンピンは、細菌ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤であり、ＲＮＡの伸張を直接ブロックすることにより機能する。リファンピシンは、典型的には、ミコバクテリア感染を処理するために用いられるが、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(ＭＲＳＡ)の治療においてもフシジン酸(静菌性タンパク質合成阻害剤)と共に役割をも演じる。リファンピン耐性がＭＲＳＡにおいて流出用ポンプによるという報告はない。
【０２９０】
仮説：
帰無仮説は、μ1−μ2＝０ 及びμ1−μ3＝０であり、ここに：
ａ）μ1は、ＮＩＭＥＬＳレーザーシステムからの、対照としてのＭＲＳＡへの準致死的線量測定であり、そして；
ｂ）μ2は、同じＮＩＭＥＬＳレーザーシステムからの、ＭＲＳＡへの、テトラサイクリンの有効レベルの直ぐ下の耐性ＭＩＣでの添加を伴う準致死的線量測定であり、そして；
ｃ）μ3は、同じＮＩＭＥＬＳレーザーシステムからの、ＭＲＳＡへの、リファンピンの有効レベルの直ぐ下の耐性ＭＩＣでの添加を伴う準致死的線量測定である。
【０２９１】
このデータは、抗生物質テトラサイクリン又はリファンピンの添加が、準致死的照射後に、下記のように、これらのＭＲＳＡコロニーの成長の減少を生じることを示している：
μ1−μ2＝０
は、テトラサイクリンの添加が、正常に成長したＭＲＳＡコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じないことを支持する。
μ1−μ2＞０
は、テトラサイクリンの添加が、正常に成長したＭＲＳＡコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じることを支持する。
μ1−μ3＝０
は、リファンピンの添加が、正常に成長したＭＲＳＡコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じないことを支持する。
μ1−μ3＞０
は、リファンピンの添加が、正常に成長したＭＲＳＡコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じることを支持する。
【０２９２】
【表１２】
2010512232.tif 000013
【０２９３】
結果：
この実験は、明らかに、ＮＩＭＥＬＳシステムによる準致死的レーザーパラメーター下で、μ1−μ2＝０且つμ1−μ3＞＝０であることを示した。これは、流出用ポンプが、阻害されていること、及びテトラサイクリン耐性が、ＭＲＳＡのΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｂａｃｔに対するＮＩＭＥＬＳ効果によって逆転されていることを示している。
【０２９４】
実施例ＸＩ
ＮＩＭＥＬＳレーザーの準致死的線量の、メチシリン及び細胞壁合成のΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔ阻害を伴うＭＲＳＡに対する影響の評価
メチシリン：
メチシリンは、以前、グラム陽性細菌特にβ−ラクタマーゼ産生微生物例えば黄色ブドウ球菌(殆どのペニシリンに耐性)により引き起こされた感染症を治療するために用いられたが、もはや臨床的には用いられていないβ−ラクタム系抗生物質である。用語メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(ＭＲＳＡ)は、すべてのペニシリンに耐性の黄色ブドウ球菌を記述するために用いられ続ける。
【０２９５】
作用機構
他のβ−ラクタム系抗生物質と同様に、メチシリンは、ペプチドグリカン(細菌の細胞壁)の合成を阻害することにより作用する。
【０２９６】
グラム陽性細菌の枯草菌には、ＥＴＳをプロトンコンダクターを加えることによりブロックしたときにペプチドグリカンの自己分解活性が増大する(即ち、もはや阻害されない)ことが示されている。これは、ΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔ及びΔμＨ+(細胞の酵素機能のためのエネルギー貯蔵と無関係)が、潜在的に、深淵で利用可能な影響を細胞壁の同化機能及び生理に対して有することを示唆している。
【０２９７】
加えて、ΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔアンカップラーがペプチドグリカン形成を、ペプチドグリカン合成に関与するヌクレオチド前駆体の蓄積により、及びペプチドグリカン中の主要な生体高分子の一つであるＮ−アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)の輸送の阻害により阻害するということが報告されている。
【０２９８】
仮説試験：
バシトラシンは、光学的に低下されたΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔの、成長しつつある細胞壁に対する複数の影響(即ち、増大された細胞壁自己分解、阻害された細胞壁合成)を強化するであろう。これは、特に、細胞壁阻害性抗菌性化合物のための耐性機構として流出用ポンプを有しないグラム陽性細菌例えばＭＲＳＡにおいて関連する。
帰無仮説は、μ1−μ2＝０ 及びμ1−μ3＝０であり、ここに：
ａ）μ1は、ＮＩＭＥＬＳレーザーシステムからの、対照としてのＭＲＳＡへの準致死的線量測定であり、そして；
ｂ）μ2は、同じＮＩＭＥＬＳレーザーシステムからの、ＭＲＳＡへの、メチシリンの有効レベルの直ぐ下の耐性ＭＩＣでの添加を伴う準致死的線量測定であり、そして；
μ1−μ2＝０
は、メチシリンの添加が、正常に成長したＭＲＳＡコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じないことを支持する。
μ1−μ2＞０
は、メチシリンの添加が、正常に成長したＭＲＳＡコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じることを支持する。
【０２９９】
結果：
図１５に示したように、この実験は、明らかに、ＮＩＭＥＬＳシステムによる準致死的レーザーパラメーター下で、μ1−μ2＞＝０であることを示し、これは、メチシリンの添加が、ＣＦＵ計数により示されるように正常に成長したＭＲＳＡコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じることを意味している。これは、メチシリン(流出用ポンプと無関係)がＭＲＳＡのΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｂａｃｔに対するＮＩＭＥＬＳ効果によって強化されたことを示唆する。
【０３００】
それ故、ＮＩＭＥＬＳレーザー及びその付随する光学的ΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔ低下現象は、ＭＲＳＡにおける細胞壁阻害的抗菌剤と相乗的である。理論に拘束されることは望まないが、これは、ＭＲＳＡはメチシリンに対する流出用ポンプを有しないので、同化的(ペリプラズムの)ＡＴＰ共役機能の阻害によって機能するに違いない。
【０３０１】
実施例ＸＩＩ
ＮＩＭＥＬＳレーザーの準致死的線量の、バシトラシン及び細胞壁合成のΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔ阻害を伴うＭＲＳＡに対する影響の評価
バシトラシンは、枯草菌によって産生される環状ポリペプチドの混合物である。毒性で使いにくい抗生物質であるため、バシトラシンは、一般に、経口では使えないが、局所的に用いられる。
【０３０２】
作用機構：
バシトラシンは、Ｃ55−イソプレニルピロホスフェートの脱リン酸化を邪魔し、該ピロホスフェートは、グラム陰性微生物の内膜及びグラム陽性微生物の原形質膜の外側のペプチドグリカン細菌細胞壁のビルディングブロックを運ぶ分子である。
【０３０３】
グラム陽性細菌の枯草菌では、ＥＴＳがプロトンコンダクターの添加によりブロックされたときに、ペプチドグリカンの自己分解活性が増大する(即ち、もはや阻害されない)ということが示されている。これは、ΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔ及びΔμＨ+(細胞の酵素機能のためのエネルギー貯蔵と無関係)が、潜在的に、深淵で利用可能な影響を細胞壁の同化機能及び生理に対して有することを示している。
【０３０４】
加えて、ΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔアンカップラーがペプチドグリカン形成を、ペプチドグリカン合成に関与するヌクレオチド前駆体の蓄積により、及びペプチドグリカン中の主要な生体高分子の一つであるＮ−アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)の輸送の阻害により阻害するということが報告されている。
【０３０５】
仮説試験：
バシトラシンは、光学的に低下されたΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔの、成長しつつある細胞壁に対する複数の影響(即ち、増大された細胞壁自己分解、阻害された細胞壁合成)を強化する。これは、特に、細胞壁阻害性抗菌性化合物のための耐性機構として流出用ポンプを有しないグラム陽性細菌例えばＭＲＳＡにおいて関連する。
帰無仮説は、μ1−μ2＝０ 及びμ1−μ3＝０であり、ここに：
ａ）μ1は、ＮＩＭＥＬＳレーザーシステムからの、対照としてのＭＲＳＡへの準致死的線量測定であり、そして；
ｂ）μ2は、同じＮＩＭＥＬＳレーザーシステムからの、ＭＲＳＡへの、バシトラシンの有効レベルの直ぐ下の耐性ＭＩＣでの添加を伴う準致死的線量測定であり、そして；
μ1−μ2＝０
は、バシトラシンの添加が、正常に成長したＭＲＳＡコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じないことを支持する。
μ1−μ2＞０
は、バシトラシンの添加が、正常に成長したＭＲＳＡコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じることを支持する。
【０３０６】
結果：
図１６に示したように、この実験は、明らかに、ＮＩＭＥＬＳシステムによる準致死的レーザーパラメーター下で、μ1−μ2＞＝０であることを示し、これは、バシトラシンの添加が、正常に成長したＭＲＳＡコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じることを意味している。図１６において、矢印は、示した２つの試料におけるＭＲＳＡの成長又はその欠如を示している。これは、バシトラシン(流出用ポンプと無関係)がＭＲＳＡのΔΨ−ｓｔｅａｄｙ−ｂａｃｔに対するＮＩＭＥＬＳ効果によって強化されたことを示している。それ故、ＮＩＭＥＬＳレーザー及びその付随する光学的ΔΨ−ｐｌａｓ−ｂａｃｔ低下現象は、ＭＲＳＡにおける細胞壁阻害的抗菌剤と相乗的である。理論に拘束されることは望まないが、これは、ＭＲＳＡはバシトラシンに対する流出用ポンプを有しないので、同化的(ペリプラズムの)ＡＴＰ共役機能の阻害によって機能するに違いない。
【０３０７】
実施例ＸＩＩＩ
ＮＩＭＥＬＳレーザーの準致死的線量の、ラミシル及びスポラノクスを伴うＣ．アルビカンスに対する影響の評価
この実験の目的は、準致死的線量のＮＩＭＥＬレーザーが、抗真菌性化合物ラミシル及び／又はスポラノクスのＣ．アルビカンスにおける効果を強化するかどうかを観察することであった。
【０３０８】
導入：
真菌細胞のサイトゾルのＡＴＰ濃度の低下は、ΔΨｐ−ｆｕｎｇｉを生成する原形質膜に結合したＨ+−ＡＴＰアーゼの抑制へと導くということ及びこの減損は他の細胞活性を弱化させることが見出されている。加えて、ΔΨｐ−ｆｕｎｇｉの低下は、原形質膜の生体エネルギー論的、熱力学的崩壊を引き起こし、これは、プロトンの流入へと導き、それは、プロトン起動力を崩壊させ、それ故、栄養分を取り込むのを阻害する。更に注意すべきことには、ＡＴＰは、真菌の原形質膜の脂質のエルゴステロールの生合成に必要である。エルゴステロールは、今日、医薬において使用される、ラミシル及びスポラノクス(及び、商標登録されてない、カウンターパート)を含む大多数の市販の関連抗真菌性化合物(即ち、アゾール、テルビナフィン及びイトラコナゾール)により標的とされる構造脂質である。
【０３０９】
やはり最近、２つの新規な抗菌性ペプチド(Ｐｅｐ２及びＨｓｔ５)が、ＡＴＰを真菌細胞から流出させる能力を有すること(即ち、細胞内ＡＴＰ濃度を涸渇させる)及びこの低下したサイトゾルのＡＴＰは、ＡＴＰ依存性の抗真菌剤の流出用ポンプであるＡＢＣトランスポーターＣＤＲ１及びＣＤＲ２の不活性化を生じるこということが示された。
【０３１０】
ラミシル：
ラミシルは、(他のアリルアミンと同様に)、エルゴステロー合成を、スクアレンエポキシダーゼ(部分的に、真菌細胞壁合成経路の部分である酵素)を阻害することにより阻害する。
【０３１１】
スポラノクス：
イトラコナゾール(スポラノクス)の作用機構は、他のアゾール系抗真菌剤と同じであり；それは、真菌のシトクロムＰ４５０オキシダーゼ媒介のエルゴステロオルの合成を阻害する。
【０３１２】
仮説：
Ｃ．アルビカンスへの準致死的線量測定でのＮＩＭＥＬＳレーザーは、ラミシル及びスポラノクスを、真菌の膜の脱分極及び細胞内ＡＴＰの涸渇によって光学的に低下されたΔΨ−ｐｌａｓ−ｆｕｎｇｉ及び／又はΔΨ−ｍｉｔｏ−ｆｕｎｇｉのために強化する。
帰無仮説は、μ1−μ2＝０ 及びμ1−μ3＝０であり、ここに：
ａ）μ1は、ＮＩＭＥＬＳレーザーシステムからの、対照としてのＣ．アルビカンスへの準致死的線量測定であり、そして；
ｂ）μ2は、同じＮＩＭＥＬＳレーザーシステムからの、Ｃ．アルビカンスへの、スポラノクスの有効レベルの直ぐ下の耐性ＭＩＣでの添加を伴う準致死的線量測定であり、そして；
ｃ）μ3は、同じＮＩＭＥＬＳレーザーシステムからの、ＭＲＳＡへの、ラミシルの有効レベルの直ぐ下の耐性ＭＩＣでの添加を伴う準致死的線量測定である。
【０３１３】
このデータは、抗生物質ラミシル及び／又はスポラノクスの添加が、準致死的照射後に、下記のように、これらのＣ．アルビカンスコロニーの成長の減少を生じることを示している：
μ1−μ2＝０
は、スポラノクスの添加が、正常に成長したＣ．アルビカンスコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じないことを支持する。
μ1−μ2＞０
は、スポラノクスの添加が、正常に成長したＣ．アルビカンスコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じることを支持する。
μ1−μ3＝０
は、ラミシルの添加が、正常に成長したＣ．アルビカンスコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じないことを支持する。
μ1−μ3＞０
は、ラミシルの添加が、正常に成長したＣ．アルビカンスコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じることを支持する。
【０３１４】
【表１３】
2010512232.tif 000014
【０３１５】
【表１４】
2010512232.tif 000015
【０３１６】
結果：
この実験は、明らかに、ＮＩＭＥＬＳシステムによる準致死的レーザーパラメーター下で、μ1−μ2＝０且つμ1−μ3＞＝０であることを示した。これは、ラミシルの添加が、正常に成長したＣ．アルビカンスコロニーに対して、準致死的ＮＩＭＥＬ照射後に、有害な効果を生じることを意味している。これは、エゴステロール生合成阻害剤(ラミシル及びスポラノクス)が、ＮＩＭＥＬＳレーザーシステムの準致死的線量測定照射によって強化されたことを示唆している。
【０３１７】
実施例ＸＩＶ
ＮＩＭＥＬＳ線量測定の計算
下記の実施例は、様々な普通に見出される微生物の生存力に、ここに記載の波長で、影響を与えるＮＩＭＥＬＳアプローチの能力を描写した選択された実験を記載している。これらの例示された微生物には、大腸菌Ｋ−１２、多剤耐性大腸菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、カンジダ・アルビカンス、及び紅色白癬菌が含まれる。
【０３１８】
以前に一層詳細に論じたように、ＮＩＭＥＬＳパラメーターは、レーザーダイオードの平均単一又は相加的出力、及び該ダイオードの波長(８７０ｎｍ及び９３０ｎｍ)を含む。この情報は、レーザービームの面積(ｃｍ2)と共に、この発明による有効且つ安全な照射プロトコールを計算するために用いることのできる情報の最初のセットを与える。所定のレーザーのパワー密度は、標的部位におけるＮＩＭＥＬＳの潜在的効果を測定する。パワー密度は、任意所定のレーザー出力及びビーム面積の関数であり、下記の方程式により計算することができる：
単一波長について：
１）
【数１】
2010512232.tif 000016
二重波長処理について：
２）
【数２】
2010512232.tif 000017
ビーム面積は、下記の何れかにより計算することができる：
３）
【数３】
2010512232.tif 000018
特定の出力パワーである期間にわたって作動する一のＮＩＭＥＬＳレーザーダイオードシステムにより組織に送達される全光エネルギーは、ジュールで測定されて、下記のように計算される：
４）
【数４】
2010512232.tif 000019
特定の出力パワーである期間にわたって両ＮＩＭＥＬＳレーザーダイオードシステムにより同時に組織に送達される全光エネルギー(両波長)は、ジュールで測定されて、下記のように計算される：
５）
【数５】
2010512232.tif 000020
実際には、全エネルギーの、照射治療領域にわたる分布及び分配を知ることは、最大ＮＩＭＥＬＳ利益のある応答のための線量を正確に測定するために有用である(但し、必須ではない)。全エネルギー分布は、エネルギー密度(ジュール／ｃｍ2)として測定することができる。以下に記載のように、所定の波長の光について、エネルギー密度は、組織反応の測定において最も重要な因子である。一のＮＩＭＥＬＳ波長についてのエネルギー密度は、下記のように得られる：
６）
【数６】
2010512232.tif 000021
７）
【数７】
2010512232.tif 000022
２つのＮＩＭＥＬＳ波長が用いられる場合には、エネルギー密度は、下記のように得られる：
８）
【数８】
2010512232.tif 000023
９）
【数９】
2010512232.tif 000024
特定の線量についての治療時間を計算するためには、実務家は、エネルギー密度(Ｊ／ｃｍ2)又はエネルギー(Ｊ)、並びに出力パワー(Ｗ)、及びビーム面積(ｃｍ2)を利用することができる(下記の方程式の何れか一つを利用)：
１０）
【数１０】
2010512232.tif 000025
１１）
【数１１】
2010512232.tif 000026
【０３１９】
この実施例に例示したような線量測定の計算は、煩わしいものとなりうるので、この治療システムは、すべての研究された治療可能性及び線量測定を記憶したコンピューターデータベースをも含むことができる。この制御装置中のコンピューター(線量測定及びパラメーター計算機)は、上記の式に基くアルゴリズムを用いて予めプログラムされており、それで、オペレーターは、容易に、データ及びパラメーターをスクリーン上で検索することができ、必要な追加データ(例えば、スポットサイズ、所望の全エネルギー、各波長の時間及びパルス幅、照射される組織、照射される細菌)を他の任意の必要な情報と共に入力することができ、それで、好適な治療結果のために必要な任意のすべてのアルゴリズム及び計算を、線量測定及びパラメーター計算によって生成することができ、それ故、レーザーを実施することができる。
【０３２０】
まとめると、下記の実施例において、細菌培養物を、ＮＩＭＥＬＳレーザーにさらした場合、殺菌率(処理後培養プレートにおけるコロニー形成単位即ちＣＦＵの計数により測定)は、９３．７(多剤耐性大腸菌)から１００％(すべての他の細菌及び真菌)に及んだ。
【０３２１】
実施例ＸＶ
細菌における方法：イン・ビトロでの大腸菌ターゲティングのためのＮＩＭＥＬＳ処理パラメーター
下記のパラメーターは、大腸菌に、文献により、熱的ダメージに関係するものよりも十分に低い最終温度で適用する場合の、この発明による方法を説明する。
【０３２２】
Ａ．大腸菌Ｋ−１２についての実験材料及び方法：
大腸菌Ｋ−１２液体培養物を、ルリア−ベルターニ(ＬＢ)培地(２５ｇ／Ｌ)にて成長させた。プレートは、３５ｍＬのＬＢプレート培地(２５ｇ／Ｌ ＬＢ、１５ｇ／Ｌ 細菌用寒天)を含んだ。培養物の希釈を、ＰＢＳを用いて行なった。すべてのプロトコール及び操作は、無菌技術を利用して行なわれた。
【０３２３】
Ｂ．成長速度論
種培養物から取り出して、多くの５０ｍＬのＬＢ培地に接種して、３７℃で一晩培養した。翌朝、ヘルシエスト(healthiest)培養物を選んで、５０ｍＬ ＬＢへの３７℃での５％接種に用い、Ｏ.Ｄ.600を経時的に、培養物が定常期になるまで３０〜４５分ごとに測定することによりモニターした。
【０３２４】
Ｃ．マスターストック集団
対数期の培養物(約０．７５のＯ.Ｄ.600)から出発して、１０ｍＬを４℃に置いて、１０ｍＬの５０％グリセロールを加えて、アリコートを２０の低温バイアルに採り、液体窒素中で急速凍結した。これらの低温バイアルを、その後、−８０℃に貯蔵した。
【０３２５】
Ｄ．液体培養物
大腸菌Ｋ１２の液体培養物を、前記のように調整した。１００μＬのアリコートをサブ培養物から取り出し、ＰＢＳで、１：１２００に連続的に希釈した。この希釈物を、これらの細胞がＰＢＳ懸濁液中で定常状態(成長)に達して有意の分裂がなく、比較的一定数の細胞をアリコートとして更なる試験用に採れることを確実にするために、室温で約２時間又はＯ.Ｄ.600の更なる増加が認められなくなるまでインキュベートした。
【０３２６】
一度、このＫ１２希釈物が定常状態になったことが測定されたならば、この懸濁液の２ｍＬをアリコートとして、２４ウェル組織培養プレートの選択したウェルに、所定の線量測定パラメーターでの選択したＮＩＭＥＬＳ実験用に採った。これらのプレートを、室温で、使用準備ができるまで(約２時間)インキュベートした。
【０３２７】
レーザー処理後に、１００μｌを、各ウェルから取り出して、連続的に、１：１０００に希釈して、最終的に、最初のＫ１２培養物の１：１２×１０5の希釈物を生成した。各最終希釈物の３×２００Ｌのアリコートを、３重に、別々のプレート上に広げた。次に、これらのプレートを３７℃で約１６時間にわたってインキュベートした。手作業によるコロニー計数を行なって記録した。各プレートのデジタル写真も撮った。類似の細胞培養及び速度論的プロトコールを、黄色ブドウ球菌及びＣ．アルビカンスを用いるすべてのＮＩＭＥＬＳ照射試験についてイン・ビトロで行なった。例えば、Ｃ．アルビカンスＡＴＣＣ１４０５３液体培養物を、ＹＭ培地(２１ｇ／Ｌ、Difco)中で３７℃で成長させた。標準化懸濁液から、アリコートを、２４ウェルの組織培養プレート中の選択したウェルに採った。レーザー処理後、１００μＬを各ウェルから取り出して、連続的に、１：１０００に希釈して、最初の培養物の１：５×１０5の最終的希釈物を生じた。各最終希釈物の３×１００μＬを別々のプレート上に広げた。次いで、これらのプレートを、３７℃で、約１６〜２０時間にわたってインキュベートした。手作業でのコロニー計数を行なって、記録した。各プレートのデジタル写真も撮った。
【０３２８】
紅色白癬菌ＡＴＣＣ５２０２２液体培養物を、ペプトン−デキストロース(ＰＤ)培地で３７℃で成長させた。標準化懸濁液から、アリコートを、２４ウェル組織培養プレート中の選択したウェルに採った。レーザー処理後に、アリコートを、３７℃で、約９１時間にわたってインキュベートした。インキュベーションの６６時間後及び９１時間後に、手作業のコロニー計数を行なって、記録した。対照用ウェルではすべての微生物が成長したが、ここに記載したレーザー処理したウェルの１００％において、成長がなかった。各プレートのデジタル写真も撮った。
【０３２９】
熱試験を、室温から出発して、ＰＢＳ溶液にて実施した。１０ワットのＮＩＭＥＬＳレーザーエネルギーは、システムの温度が臨界的閾値の４４℃近くまで上昇する前に、１２分レーザーサイクルでの使用のために利用可能であった。
【０３３０】
【表１５】
2010512232.tif 000027
【０３３１】
実施例ＸＶＩ
大腸菌に対するイン・ビトロターゲティングのためのＮＩＭＥＬＳレーザー(波長９３０ｎｍ)についての線量測定値
本実験は、ＮＩＭＥＬＳ単一波長λ＝９３０ｎｍが、哺乳動物組織に対する安全熱パラメーター内で、大腸菌に対する定量可能な抗菌性効力と関連することをイン・ビトロで示す。
【０３３２】
実験データは、イン・ビトロで、もし、システム内へ９３０ｎｍ単独で５４００Ｊの全エネルギー及び３０５６Ｊ／ｃｍ2のエネルギー密度の閾値が２５％少ない時間で達成されれば、１００％の抗菌性効力がやはり達成されうることを示している。
【０３３３】
【表１６】
2010512232.tif 000028
【０３３４】
イン・ビトロ実験データは又、λ＝９３０ｎｍの単一エネルギーを用いる処理が、イン・ビトロで、細菌種黄色ブドウ球菌に対する抗菌効力を、哺乳動物組織に対して安全な熱パラメーター内で有することをも示している。
【０３３５】
もし、システム内へ５４００Ｊの全エネルギー及び３０５６Ｊ／ｃｍ2のエネルギー密度の閾値が黄色ブドウ球菌及び他の細菌種に関して２５％少ない時間で達成されれば、１００％の抗菌性効力がやはり達成されるであろうということも考えられている。
【０３３６】
【表１７】
2010512232.tif 000029
【０３３７】
イン・ビトロ実験データは又、λ＝９３０ｎｍのＮＩＭＥＬＳ単一波長は、イン・ビトロで、Ｃ．アルビカンスに対して、抗真菌効力を、哺乳動物組織に対する安全熱パラメーターの範囲内で有することをも示した。
【０３３８】
システム内へ５４００Ｊの全エネルギー及び３０５６Ｊ／ｃｍ2のエネルギー密度の閾値が２５％少ない時間で達成されれば、１００％の抗菌性効力がやはり達成されるであろうということも考えられている。
【０３３９】
【表１８】
2010512232.tif 000030
【０３４０】
実施例ＸＶＩＩ
イン・ビトロでのＮＩＭＥＬＳレーザー(波長８７０ｎｍ)についての線量測定値
イン・ビトロ実験データは又、大腸菌に対しては、７２００Ｊ以下の全エネルギー、及び４０７４Ｊ／ｃｍ2以下のエネルギー密度及び５．６６０Ｗ／ｃｍ2以下のパワー密度、及び８７０ｎｍの波長単独では有意の殺菌が達成されないことをも示している。
【０３４１】
【表１９】
2010512232.tif 000031
【０３４２】
実施例ＸＶＩＩＩ
ＮＩＭＥＬＳ独特の、８７０ｎｍと９３０ｎｍの光エネルギーの間の交互の相乗効果
イン・ビトロ実験データは又、２つのＮＩＭＥＬＳ波長(λ＝８７０ｎｍ及び９３０ｎｍ)の間で、それらを交互に(９３０ｎｍの前に８７０ｎｍ)使用した場合、相加的効果があることをも示している。８７０ｎｍのＮＩＭＥＬＳ波長の第一の照射としての存在は、第二の９３０ｎｍのＮＩＭＥＬＳ波長の照射の抗菌性効力の効果を増進させることが見出されている。
【０３４３】
イン・ビトロ実験データは、この相乗効果(８７０ｎｍの波長を、９３０ｎｍの波長と組み合わせること)は、９３０ｎｍの光エネルギーを減じることを可能にすることを示している。ここに示すように、光エネルギーは、(９３０ｎｍの前に８７０ｎｍ)の波長を交互的仕方で組み合わせたとき、ＮＩＭＥＬＳ１００％大腸菌抗菌性効力に必要とされる全エネルギー及びエネルギー密度の約１／３に減少する。
【０３４４】
イン・ビトロ実験データは又、この相乗的機構が、もし、８７０ｎｍの光エネルギーの等量を、９３０ｎｍエネルギー(２０％増しのパワー密度)の前にこのシステムに加えたならば、９３０ｎｍの光エネルギーをＮＩＭＥＬＳ１００％大腸菌抗菌性効力に必要な全エネルギー密度の約１／２に減らすことを可能にしうることをも示している。
【０３４５】
【表２０】
2010512232.tif 000032
【０３４６】
この相乗的能力は、９３０ｎｍの光エネルギーは、システムを８７０ｎｍの光エネルギーよりも一層高率で加熱するので、ヒト組織の安全性に重要であり、処理中に可能な最少量の熱を生成することは、哺乳動物システムに有益である。
【０３４７】
ＮＩＭＥＬＳ光エネルギー(８７０ｎｍ及び９３０ｎｍ)は、上記の仕方で、他の細菌種においても、交互に使われ、その１００％抗菌性効果は、本質的に同じであるということも又、考えられる。
【０３４８】
イン・ビトロ実験データは又、真菌を照射する場合、２つのＮＩＭＥＬＳ波長(８７０ｎｍ及び９３０ｎｍ)を交互に使う(８７０ｎｍを９３０ｎｍの前に)ならば、それらの間には相加効果もあることをも示している。８７０ｎｍＮＩＭＥＬＳ波長の第一の照射としての存在は、数学的に、第二の９３０ｎｍＮＩＭＥＬＳ波長での照射の抗真菌性効力の効果を増進させる。
【０３４９】
イン・ビトロ実験データ(下記の表を参照されたい)は、この合成機構は、もし等量の８７０ｎｍの光エネルギーをこのシステムに９３０ｎｍのエネルギーより前に細菌種の抗菌性効力に必要とされるよりも２０％高いパワー密度で加えるならば、９３０ｎｍの光エネルギー(全エネルギー及びエネルギー密度)を、ＮＩＭＥＬＳ１００％抗真菌性効力に必要な全エネルギー密度の約１／２に減じることをこと可能にしうることを示している。
【０３５０】
【表２１】
2010512232.tif 000033
【０３５１】
この相乗的効果は、９３０ｎｍの光エネルギーは、８７０ｎｍの光エネルギーよりも一層大きい速度でシステムを加熱するので、ヒトの組織の安全性にとって重要であり、それは、処理中できるだけ最少量の熱を生成する哺乳動物システムに有益である。
【０３５２】
もしＮＩＭＥＬＳ光エネルギー(８７０ｎｍ及び９３０ｎｍ)が上記の仕方で他の真菌種に交互に用するならば、１００％の抗真菌性効果が本質的に同じであろうということも又、考えられる。
【０３５３】
実施例ＸＩＸ
ＮＩＭＥＬＳ独特の、λ＝８７０ｎｍとλ＝９３０ｎｍの光エネルギー間での同時の相乗効果
イン・ビトロ実験データは又、２つのＮＩＭＥＬＳ波長(９３０ｎｍと組み合わされた８７０ｎｍ)が同時に使われるならば、それら(８７０ｎｍ及び９３０ｎｍ)の間に相加効果があることをも示している。８７０ｎｍのＮＩＭＥＬＳ波長と９３０ｎｍのＮＩＭＥＬＳ波長の同時照射としての存在は、絶対的に、ＮＩＭＥＬＳシステムの抗菌性効力の効果を増進させる。
【０３５４】
イン・ビトロ実験データ(例えば、下記の表ＩＸ及びＸを参照されたい)は、λ＝８７０ｎｍとλ＝９３０ｎｍの光のエネルギー及び密度を合わせることが、この発明による単一の処理を利用する場合に必要とされる全エネルギー及びエネルギー密度の約半分だけ、９３０ｎｍの光のエネルギー及び密度を、効果的に減じることを示した。
【０３５５】
【表２２】
2010512232.tif 000034
【０３５６】
【表２３】
2010512232.tif 000035
【０３５７】
この同時の相乗的能力は、９３０ｎｍの光エネルギーは、８７０の光エネルギーよりも一層早くシステムを加熱するので、ヒトの組織の安全性にとって重要であり、哺乳動物システムにとって、処理中にできるだけ最少量の熱を生成することは有益である。
【０３５８】
もしＮＩＭＥＬＳ光エネルギー(８７０ｎｍ及び９３０ｎｍ)を上記の仕方で、他の細菌種で同時に使用するならば、１００％抗菌効果は、本質的に同じであるということも考えられる。(図１７、１８及び１９参照) イン・ビトロ実験データは又、２つのＮＩＭＥＬＳ波長(８７０ｎｍ及び９３０ｎｍ)を、真菌に対して同時に試用した場合には、それらの間で相加効果があることをも示している。８７０ｎｍのＮＩＭＥＬＳ波長と９３０ｎｍのＮＩＭＥＬＳ波長の、同時の照射としての存在は、ＮＩＭＥＬＳシステムの抗真菌効力の効果を増進させることが見出されている。
【０３５９】
イン・ビトロ実験データは、この相乗効果(同時の照射のために、８７０ｎｍの波長を９３０ｎｍの波長と結合させる)が、(８７０ｎｍ及び９３０ｎｍ)の波長を同時の仕方で合わせたときに、９３０ｎｍの光エネルギーを、ＮＩＭＥＬＳ１００％Ｃ．アルビカンス抗真菌性効力に必要とされる全エネルギー及びエネルギー密度の約１／２に減じることを可能にすることを示している。
【０３６０】
【表２４】
2010512232.tif 000036
【０３６１】
それ故、ＮＩＭＥＬＳ波長(λ＝８７０ｎｍ及び９３０ｎｍ)を利用して、抗菌性及び抗真菌性効力を、交互的仕方で若しくは同時に又はそのような仕方の任意の組合せにて達成することができ、それにより、最少化された温度増加と結合されたλ＝９３０での露出が減少する。
【０３６２】
イン・ビトロ実験は又、大腸菌を、次のパラメーターにて(対照用)波長λ＝８３０ｎｍ単独で照射した場合には(１２分間の照射サイクル、λ＝９３０ｎｍの照射による１００％抗菌性及び抗真菌性効力と結合した最少ＮＩＭＥＬＳ線量測定に対して同じパラメーターで)、この対照用の８３０ｎｍのレーザーは、全く抗菌性効力を生じなかったことをも示している。
【０３６３】
【表２５】
2010512232.tif 000037
【０３６４】
イン・ビトロ実験データは、安全な温度線量測定で適用した場合に、λ＝９３０ｎｍと共にλ＝８３０の発光を用いるならば殆ど相加効果がないことも示している。第一発光としての８３０ｎｍの対照用波長の存在は、第二の９３０ｎｍＮＩＭＥＬＳ波長にとの相乗的抗菌性効力の生成において、８７０ｎｍのＮＩＭＥＬＳ波長の増進効果より遥かに優れている。
【０３６５】
【表２６】
2010512232.tif 000038
【０３６６】
イン・ビトロ実験データは、安全な熱線量測定で適用した場合、８３０ｎｍの波長とＮＩＭＥＬＳ９３０ｎｍ波長による相加効果が、それらを同時に用いる場合一層すくないことをも示している。事実、イン・ビトロ実験データは、８７０ｎｍを、９３０ｎｍと同時に合わせた場合に、１００％の大腸菌抗菌性効力を達成するのに、市販の８３０ｎｍに対して、１７％少ないエネルギー、１７％少ないエネルギー密度、及び１７％少ないパワー密度が必要とされることを示している。これは、やはり、ＮＩＭＥＬＳ波長により処理されるイン・ビボシステムに対する熱及び害をかなり減じるものである。
【０３６７】
【表２７】
2010512232.tif 000039
【０３６８】
殺菌量：
イン・ビトロデータは、ＮＩＭＥＬＳレーザーシステムが(熱許容性の範囲内で)、イン・ビトロで、２，０００，０００(２×１０6)コロニー形成単位(ＣＦＵ)の大腸菌及び黄色ブドウ球菌を含む細菌溶液に対して有効であることをも示した。これは、感染したヒトの潰瘍組織の試料１ｇ当たりに典型的に見られるものより２倍多い。Brown等は、調べた糖尿病患者の７５％において、微生物細胞が、すべて、少なくとも１００，０００ＣＦＵ／ｇであること、及びそれらの患者のうちの３７．５％で、微生物の量は、１，０００，０００(１×１０6)ＣＦＵより多いことを報告した(Brown等、Ostomy Wound Management, 40147, ２００１年１０月発行、その全教示を参考として本明細書中に援用する)。
【０３６９】
熱的パラメーター
イン・ビトロ実験データは又、ＮＩＭＥＬＳレーザーシステムが、１００％の抗菌性及び抗真菌性効力を、ヒトの組織にとって安全な熱的許容範囲内で達成しうることをも示している。
【０３７０】
実施例ＸＸ
ＮＩＭＥＬＳにおける一層低温の効果
細菌種の冷却
イン・ビトロ実験データは又、細菌試料を、ＰＢＳ中で、２時間にわたって、実質的に４℃まで出発温度を下げることによって、光学的抗菌性効力が、如何なる現在の再現可能な抗菌性エネルギー及びＮＩＭＥＬＳレーザーシステムによっても達成されないことをも示した。
【０３７１】
実施例ＸＸＩ
紅色白癬菌に対するＮＩＭＥＬＳ効果
この実施例は、ＮＩＭＥＬＳ波長(８７０ｎｍ及び９３０ｎｍ)効果を、交互又は同時の仕方で用いた場合に示している。
【０３７２】
【表２８】
2010512232.tif 000040
【０３７３】
【表２９】
2010512232.tif 000041
【０３７４】
【表３０】
2010512232.tif 000042
【０３７５】
【表３１】
2010512232.tif 000043
【０３７６】
【表３２】
2010512232.tif 000044
【０３７７】
実施例ＸＸＩＩ
ＭＲＳＡ／抗菌剤強化
この実施例は、メチシリンに対する抗菌剤感受性を増大させるための、イン・ビトロでの、ＭＲＳＡを標的としたＮＩＭＥＬＳ波長(λ＝８３０ｎｍ及び９３０ｎｍ)の利用を示している。４つの別々の実験を行なった。これらの４つの実験についてのデータセットは、下記の表に与えた。図１７も参照されたい。それは、(ａ)ＮＩＭＥＬＳの、ＭＲＳＡコロニーの成長阻害における、メチシリン、ペニシリン及びエリスロマイシンとの相乗効(データは、ペニシリン及びメチシリンが、準致死的ＮＩＭＥＬＳ線量測定により、細菌原形質膜のプロトン起動力(Δｐ−ｐｌａｓ−Ｂａｃｔ)を阻害し、それによりペプチドグリカン合成の同化過程(これは、薬物によっても同時に標的とされる)を阻害することにより、強化されていることを示している)、及び(ｂ)エリスロマイシンが、一層大きい程度に強化されることを示している(何故なら、Ｎｉｍｅｌｓ効果は、タンパク質合成の同化過程及びエリスロマイシン耐性のための流出用ポンプのためのエネルギーを供給する細菌原形質膜のプロトン起動力(Δｐ−ｐｌａｓ−Ｂａｃｔ)を阻害しているから)。
【０３７８】
材料：
【表３３】
2010512232.tif 000045
【０３７９】
ＣＦＵ計数のための一般的方法：
【表３４】
2010512232.tif 000046
【０３８０】
【表３５】
2010512232.tif 000047
【０３８１】
２００６年１１月７日におけるＭＲＳＡ研究の独立した報告
(MRSA Data Progression 11-07-06 Experiment #1)
実験１ − デザイン：
８つの異なるレーザー線量を用いて、Ａ１〜Ｈ１の標識を付した対数増殖中のＭＲＳＡの塩溶液懸濁液を処理した。
【０３８２】
処理した及び対照用の未処理の懸濁液を希釈してトリプシン処理した大豆入り寒天上に、３０μｇ／ｍｌのメチシリンを伴って又は伴わずに、三連でプレートした。
２４時間３７℃で成長させた後に、コロニーを計数した。
【０３８３】
ＣＦＵ(コロニー形成単位)を、これらのメチシリンを含むプレートと含まないプレートの間で、対照(未処理)と処理したＭＲＳＡの両方について比較した。
【０３８４】
実験１ − 結果：
条件Ｄ１〜Ｈ１は、メチシリンプレート上で、処理した試料及び未処理の試料において、類似のＣＦＵの減少を示した。
【０３８５】
条件Ａ１、Ｂ１及びＣ１は、レーザー処理した試料において、未処理の対照と比較して、それぞれ、３０％、３３％、又は６７％少ないＣＦＵを示した。
【０３８６】
これは、試料Ａ１、Ｂ１及びＣ１に対して行なわれた処理が、ＭＲＳＡをメチシリンの効果に対して感受性にしたことを示している。
【０３８７】
【表３６−１】
2010512232.tif 000048
【０３８８】
【表３６−２】
2010512232.tif 000049
【０３８９】
【表３６−３】
2010512232.tif 000050
【０３９０】
【表３７】
2010512232.tif 000051
【０３９１】
２００６年１１月８日におけるＭＲＳＡ研究の独立した報告
(MRSA Data Progression 11-08-06 Experiment #2)
実験２ − デザイン：
実験１で及び以前に確立された有効線量に基いて、８つの異なるレーザー線量を用いて、Ａ２〜Ｈ２の標識を付した対数増殖中のＭＲＳＡの塩溶液懸濁液を処理した。
【０３９２】
処理した及び対照用の未処理の懸濁液を希釈してトリプシン処理した大豆入り寒天上に、３０μｇ／ｍｌのメチシリンを伴って又は伴わずに、三連でプレートした。
２４時間３７℃で成長させた後に、コロニーを計数した。
【０３９３】
実験２ − 結果：
ＣＦＵの、メチシリンを含むプレートと含まないプレート上での比較は、すべてのレーザー処理した試料におけるメチシリンの効力における有意の増加を、Ａ２及びＢ２を除いて示した。このデータを、以下に、表にまとめる。
【０３９４】
【表３８】
2010512232.tif 000052
【０３９５】
【表３９−１】
2010512232.tif 000053
【０３９６】
【表３９−２】
2010512232.tif 000054
【０３９７】
【表４０】
2010512232.tif 000055
【０３９８】
【表４１】
2010512232.tif 000056
【０３９９】
２００６年１１月９〜１０日の、ＭＲＳＡ研究についての独立した報告
(MRSA Data Progression 11-10-06 Experiment #3)
実験３ − デザイン：
実験１及び２並びに以前に確立された有効線量に基く８つの異なるレーザー線量を用いて、標識Ａ３〜Ｈ３を付した対数増殖中のＭＲＳＡの塩溶液懸濁液を処理した。
【０４００】
処理した及び未処理の対照用懸濁液を、希釈して、トリプシン処理した大豆を含む寒天上に、３０μｇ／ｍｌのメチシリンを伴って、又は伴わずに、５連でプレートした。
３７℃で２４時間成長させた後に、コロニーを計数した。
【０４０１】
実験３ − 結果：
メチシリンを含むプレート上と含まないプレート上での、ＣＦＵの比較は、すべてのレーザー処理した試料におけるメチシリンの効力の有意の増加を示した。このデータを、以下に、表にまとめる。
【０４０２】
【表４２】
2010512232.tif 000057
【０４０３】
【表４３−１】
2010512232.tif 000058
【０４０４】
【表４３−２】
2010512232.tif 000059
【０４０５】
【表４３−３】
2010512232.tif 000060
【０４０６】
【表４３−４】
2010512232.tif 000061
【０４０７】
【表４４】
2010512232.tif 000062
【０４０８】
【表４５】
2010512232.tif 000063
【０４０９】
２００６年１１月１０〜１１日の、ＭＲＳＡについての独立した報告
(MRSA Data Progression 11-10-06 Experiment #4)
実験４ − デザイン：
以前の実験で確立された有効線量に基く２つの異なるレーザー線量を用いて、標識Ａ４〜Ｆ４を付した対数増殖中のＭＲＳＡの塩溶液懸濁液を処理した。
【０４１０】
処理した懸濁液及び対照用の未処理の懸濁液を希釈して、３０μｇ／ｍｌのメチシリン(グループＡ４及びＢ４)、０．５μｇ／ｍｌペニシリンＧ(グループＣ４及びＤ４)又は４μｇ／ｍｌエリスロマイシン(グループＥ４及びＦ４)を含むか又は含まない、トリプシン処理した大豆を含む寒天上に、５連で、プレートした。
【０４１１】
３７℃で２４時間成長させた後に、コロニーを計数した。
【０４１２】
実験４ − 結果：
レーザー処理は、ＭＲＳＡの、試験した各抗生物質に対する感受性を数倍増大させる。このデータを以下にまとめる。
2010512232.tif 000064
【０４１３】
【表４６】
2010512232.tif 000065
【０４１４】
【表４７−１】
2010512232.tif 000066
【０４１５】
【表４７−２】
2010512232.tif 000067
【０４１６】
実施例ＸＸＩＩＩ
イン・ビボでの安全性試験 − ヒト患者
イン・ビトロでの繊維芽細胞での研究の後に、発明者は、自身に対して線量測定滴定を行なって、安全な、最大エネルギーレベル及び露出時間を確認した(それは、ヒトの皮膚組織に火傷を生じることなく或は照射組織にダメージを与えない)。
【０４１７】
発明者が用いた方法論は、彼の足の親指を、時間を変え、ＮＩＭＥＬＳレーザーのパワー設定を変えて照射することであった。この自己照射実験の結果を、以下に記す。
【０４１８】
【表４８】
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【０４１９】
【表４９】
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【０４２０】
時間／温度の評価を、これらのレーザーエネルギーのヒトの皮膚組織に対する熱的安全性を確実にするために図に作った(データは示してない)。一のレーザー手順において、彼は、彼の足の親指を、８７０ｎｍと９３０ｎｍの両方に、最大で２３３秒間さらすと同時に、足の親指の表面面積をレーザー赤外線温度計によって測定した。彼は、上記の線量測定を、表面温度３７．５℃で、８７０ｎｍ及び９３０ｎｍで、合わせたパワー密度１．７０Ｗ／ｃｍ2と共に用いると、痛みを生じることを見出して、レーザーを切った。
【０４２１】
第二のレーザー手順において、彼は、彼の足の親指を、９３０ｎｍに最大で１４２秒間さらすと同時に、やはり、足親指の表面温度をレーザー赤外線温度計によって測定した。彼は、表面温度３６℃で、９３０ｎｍ単独で、１．７０Ｗ／ｃｍ2のパワー密度では、痛みを生じることを見出して、レーザーを切った。
【０４２２】
実施例ＸＸＩＶ
イン・ビボでの安全性の試験 − 制限された臨床での予備的研究
上記の実験後に、足の爪甲真菌症の更なる患者をを治療した。これらの患者は、すべて、無料の、志願者であり、インフォームドコンセントの署名をした。この限られた予備的研究の本質的ゴールは、ＮＩＭＥＬＳレーザー装置を用いてイン・ビトロで得られたものと同レベルの真菌汚染除去をイン・ビボで達成することである。我々は又、発明者により自己曝露実験において許容された適用最大露出時間及び温度限界をも決定した。高度に制御されてモニターされた環境においては、３〜５のレーザー曝露手順が、各患者に対して行なわれた。４人の患者が補充されて、治療を受けた。インフォームドコンセントの署名をした患者は、報酬を受けず、手順中であっても、何時でも、止めることができることを知らされた。
【０４２３】
第一の患者の治療のために用いられた線量測定は、発明者自身の暴露(上記)中に用いられたものと同じであった。爪の表面温度も又、発明者により自身の暴露において見出された温度と同等のものであった。
【０４２４】
治療された足指は、有意に、軽減された足白癬及び爪床周囲の鱗片化を示し、これは、真菌の貯蔵器として作用していた爪甲の汚染菌除去を示した。対照用の爪は、横切り組織バーで削られて、削りくずは、菌学的媒質にプレートするために保存された。処理された爪は、削られて、正確な同じ仕方でプレートされた。
【０４２５】
爪の削りくずを培養するために、サブローデキストラン寒天(２％デキストロース)培地を、次の添加物を加えて調製した：クロラムフェニコール(０．０４ｍｇ／ｍｌ)(一般的な真菌試験用)；クロラムフェニコール(０．０４ｍｇ／ｍｌ)及びシクロヘキシミド(０．４ｇ／ｍｌ)(皮膚糸状菌に選択的)；クロラムフェニコール(０．０４ｍｇ／ｍｌ)及びグリゼオフルビン(２０μｇ／ｍｌ)(真菌成長についての負の対照として役立つ)。
治療＃１と治療＃２(治療＃１の３日後に実施)の９日の菌学的結果は、同じであった(対照用足指爪甲には皮膚糸状菌成長があり、処理した足指爪甲にはなかった)。処理した爪甲は、如何なる成長も示さなかったが、未処理の対照用培養プレートは、有意の成長を示した。第一の患者は、１２０日間、追跡を受けて、同じプロトコール下で４回の治療を受けた。図１８は、治療前(Ａ)、治療の６０日後(Ｂ)、治療の８０日後(Ｃ)、及び治療の１２０日後(Ｄ)の足指爪の比較を示している。特に、健康で未感染の爪甲は、爪領域の５０％をカバーしており、１２０日後には、健康な表皮から成長していた。
【０４２６】
ある具体例を、ここでは、記載してきたが、当業者は、本発明の方法、システム、及び装置は、その精神から離れることなく、他の特定の形態で具体化することができることを理解するであろう。それ故、本願の具体例は、すべての点で、本発明の説明と考えるべきであって、本発明を制限するものではない。ヒトの爪は、難治性のレンズとして作用し、ＮＩＭＥＬＳ赤外線エネルギーの部分を分散及び／又は反射するということは理解される。それ故、ブタの皮膚への線量／耐性の研究が、火傷／損傷を伴わない最大ＮＩＭＥＬＳ線量測定を滴定するために行われた。ブタの皮膚は、ヒトの皮膚のモデルとして利用された。これらの研究は、ＮＩＨの実験室動物の世話と使用の指針(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)による動物保護作用(Animal Protection Act)に従って行われた。これらの試験を以下に示した。
ブタの皮膚の線量／耐性の研究
【０４２７】
【表５０−１】
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【０４２８】
【表５０−２】
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【０４２９】
【表５０−３】
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【０４３０】
実施例ＸＸＶ
非熱的ＮＩＭＥＬＳ相互作用
非熱的ＮＩＭＥＬＳ相互作用の証拠：
実験(イン・ビトロの水浴での研究)により、イン・ビトロＮＩＭＥＬＳ実験で達成される温度は、病原体を中和するのに十分高くはないことが示された。
【０４３１】
下記の図表において、大腸菌が単独で、水浴中の試験管内で８分間連続的に４７．５℃で刺激された(challenged)場合には、それらは、９１％のコロニー成長を達成したということが明確に理解できる。それ故、ＮＩＭＥＬＳ反応は、全く光化学的性質のものであり、外因性の薬物及び／又は染料の非存在下で起きるということが本質的に示された。
【０４３２】
【表５１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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