(57)【要約】  本発明は、４−ＩＢＢＬ遮断薬、ならびに持続性炎症における新規の治療的介入としてのそのような遮断薬を含む医薬組成物および製品を提供する。したがって、本発明は、腫瘍壊死因子の持続的産生を減少させるための方法も提供する。
2010506921.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−１ＢＢＬ遮断薬および製薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物であって、前記４−１ＢＢＬ遮断薬が、（ａ）４−１ＢＢＬに対して特異的なアンタゴニスト抗体と、（ｂ）細胞中の４−１ＢＢＬ核酸からの発現を減少させるために有効なオリゴヌクレオチドと、（ｃ）可溶性４−１ＢＢとからなる群より選択される医薬組成物。
【請求項２】
前記アンタゴニスト抗体が、４−１ＢＢＬに対して特異的なキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記４−１ＢＢＬが、配列番号１または２に示される配列を有する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１０〜１５、２２〜３８、および４５〜５６からなる群より選択される配列を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記可溶性４−１ＢＢが、（ａ）ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸１８６、（ｂ）ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２３からアミノ酸１８６、（ｃ）マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸１８７、または（ｄ）マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２４からアミノ酸１８７に対応する配列を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記可溶性４−１ＢＢが、配列番号７、８、２０または２１に示される配列を有する、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
担体、請求項１に記載の４−１ＢＢＬ遮断薬、および抗炎症薬である第２薬剤を含む医薬配合物。
【請求項８】
前記抗炎症薬が、腫瘍壊死因子に対して特異的な抗体である、請求項７に記載の医薬配合物。
【請求項９】
前記アンタゴニスト抗体が、４−１ＢＢＬに対して特異的なキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項７または８に記載の医薬配合物。
【請求項１０】
前記４−１ＢＢＬが、配列番号１または２に示される配列を有する、請求項７または８に記載の医薬配合物。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１０〜１５、２２〜３８、および４５〜５６からなる群より選択される配列を有する、請求項７または８に記載の医薬配合物。
【請求項１２】
前記可溶性４−１ＢＢが、（ａ）ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２３からアミノ酸１８６、（ｂ）ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２３からアミノ酸１８６、（ｃ）マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸１８７、または（ｄ）マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２４からアミノ酸１８７に対応する配列を有する、請求項７または８に記載の医薬配合物。
【請求項１３】
前記可溶性４−１ＢＢが、配列番号７〜８、および２０〜２１からなる群より選択される配列を有する、請求項１２に記載の医薬配合物。
【請求項１４】
４−１ＢＢＬに対して特異的なキメラ抗体またはヒト化抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、配列番号１または２を含む４−１ＢＢＬポリペプチドに結合できる、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
配列番号１０〜１５、２２〜３８、および４５〜５６からなる群より選択される配列を有する４−１ＢＢＬ遮断薬。
【請求項１７】
（ａ）ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸１８６、（ｂ）ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２３からアミノ酸１８６、（ｃ）マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸１８７、または（ｄ）マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２４からアミノ酸１８７に対応する配列を有する可溶性４−１ＢＢ。
【請求項１８】
配列番号７、８、２０または２１の配列を有する請求項１７記載の可溶性４−１ＢＢ。
【請求項１９】
哺乳動物における炎症性サイトカインの産生を減少させるための方法であって、４−１ＢＢＬ遮断薬を前記哺乳動物に投与する工程を含み、前記４−１ＢＢＬ遮断薬が、（ａ）４−１ＢＢＬに対して特異的なアンタゴニスト抗体と、（ｂ）細胞中の４−１ＢＢＬ核酸からの発現を減少させるために有効なオリゴヌクレオチドと、（ｃ）可溶性４−１ＢＢとからなる群より選択される方法。
【請求項２０】
前記４−１ＢＢＬ遮断薬を投与する工程の前に、炎症状態にある哺乳動物、または炎症状態の危険性がある哺乳動物を同定する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記炎症性サイトカインが、腫瘍壊死因子またはＩＬ−６である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記アンタゴニスト抗体が、４−１ＢＢＬに対して特異的なキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記４−１ＢＢＬが、配列番号１または２の配列を有する、請求項１９、２０または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記４−１ＢＢＬ遮断薬が、配列番号１０〜１５、２２〜３８、および４５〜５６からなる群より選択される配列を有する、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記可溶性４−１ＢＢが、（ａ）ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸１８６、（ｂ）ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２３からアミノ酸１８６、（ｃ）マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸１８７、または（ｄ）マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２４からアミノ酸１８７に対応する配列を有する、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記可溶性４−１ＢＢが、配列番号７、８、２０または２１の配列を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物細胞による炎症性サイトカインの産生を減少させるための方法であって、前記細胞を４−１ＢＢＬ遮断薬と接触させる工程を含み、前記４−１ＢＢＬ遮断薬が、（ａ）４−１ＢＢＬに対して特異的なアンタゴニスト抗体と、（ｂ）細胞中の４−１ＢＢＬ核酸からの発現を減少させるために有効なオリゴヌクレオチドと、（ｃ）可溶性４−１ＢＢとからなる群より選択される方法。
【請求項２９】
前記炎症性サイトカインが、腫瘍壊死因子またはＩＬ−６である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アンタゴニスト抗体が、４−１ＢＢＬに対して特異的なキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項２８、２９、または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記４−１ＢＢＬが、配列番号１または２の配列を有する、請求項２８、２９または３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記４−１ＢＢＬ遮断薬が、配列番号１０〜１５、２２〜３８、および４５〜５６からなる群より選択される配列を有する、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記可溶性４−１ＢＢが、（ａ）ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸１８６、（ｂ）ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２３からアミノ酸１８６、（ｃ）マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸１８７、または（ｄ）マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２４からアミノ酸１８７に対応する配列を有する、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記可溶性４−１ＢＢが、配列番号７、８、２０または２１の配列を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳動物における炎症を緩和させるための方法であって、４−１ＢＢＬ遮断薬を前記哺乳動物に投与する工程を含み、前記４−１ＢＢＬ遮断薬が、（ａ）４−１ＢＢＬに対して特異的なアンタゴニスト抗体と、（ｂ）細胞中の４−１ＢＢＬ核酸からの発現を減少させるために有効なオリゴヌクレオチドと、（ｃ）可溶性４−１ＢＢとからなる群より選択される方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記炎症が、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬、強直性脊椎炎、クローン病、関節リウマチ、全身発症性若年性慢性関節炎、骨粗鬆症、または過敏性腸症候群に関連する、またはそれらに起因する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記４−１ＢＢＬが、配列番号１または２の配列を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記アンタゴニスト抗体が、４−１ＢＢＬに対して特異的なキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記４−１ＢＢＬ遮断薬が、配列番号１０〜１５、２２〜３８、および４５〜５６からなる群より選択される配列を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記可溶性４−１ＢＢが、（ａ）ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸１８６、（ｂ）ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２３からアミノ酸１８６、（ｃ）マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１〜アミノ酸１８７、または（ｄ）マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２４からアミノ酸１８７に対応する配列を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記可溶性４−１ＢＢが、配列番号７、８、２０または２１の配列を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
４−１ＢＢＬ遮断薬を含有する容器および炎症性サイトカインの産生を減少させるために４−１ＢＢＬ遮断薬を使用するための取扱説明書を含む製品であって、前記４−１ＢＢＬ遮断薬が、（ａ）４−１ＢＢＬに対して特異的なアンタゴニスト抗体と、（ｂ）細胞中の４−１ＢＢＬ核酸からの発現を減少させるために有効なオリゴヌクレオチドと、（ｃ）可溶性４−１ＢＢとからなる群より選択される製品。
【請求項４５】
前記４−１ＢＢＬ遮断薬を使用するための取扱説明書が、炎症状態の治療において４−１ＢＢＬ遮断薬を使用するための取扱説明書を含む、請求項４４に記載の製品。
【請求項４６】
前記炎症状態が、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬、強直性脊椎炎、クローン病、関節リウマチ、全身発症性若年性慢性関節炎、骨粗鬆症、または過敏性腸症候群である、請求項４５に記載の製品。
【請求項４７】
前記炎症性サイトカインが、腫瘍壊死因子またはＩＬ−６である、請求項４４、４５、または４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記４−１ＢＢＬが、配列番号１または２の配列を有する、請求項４４、４５または４６に記載の製品。
【請求項４９】
前記アンタゴニスト抗体が、４−１ＢＢＬに対して特異的なキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項４４、４５、または４６に記載の製品。
【請求項５０】
前記４−１ＢＢＬ遮断薬が、配列番号１０〜１５、２２〜３８、および４５〜５６からなる群より選択される配列を有する、請求項４４、４５、または４６に記載の製品。
【請求項５１】
前記可溶性４−１ＢＢが、（ａ）ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸１８６、（ｂ）ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２３からアミノ酸１８６、（ｃ）マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸１８７、または（ｄ）マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２４からアミノ酸１８７に対応する配列を有する、請求項４４、４５または４６に記載の製品。
【請求項５２】
前記可溶性４−１ＢＢが、配列番号７、８、２０または２１の配列を有する、請求項４４、４５、または４６に記載の製品。
【請求項５３】
４−１ＢＢＬ遮断薬についてスクリーニングを行う方法であって、
（ａ）４−１ＢＢＬを発現する細胞を候補薬剤と接触させる工程と、
（ｂ）前記候補薬剤が炎症性サイトカインの産生を減少させるかどうか、または前記候補薬剤が４−１オリゴマー化を防止するかどうかを判定する工程と
を含み、前記候補薬剤が、炎症性サイトカインの産生を減少させるか、４−１ＢＢＬオリゴマー化を防止する場合は、前記候補薬剤が４−１ＢＢＬ遮断薬である方法。
【請求項５４】
前記細胞がヒト細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞がマクロファージである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞がＲＡＷ２６４．７細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
４−１ＢＢＬ遮断薬についてスクリーニングを行う方法であって、
（ａ）哺乳動物に候補薬剤を投与する工程と、
（ｂ）前記候補薬剤が炎症を緩和させるかどうか、または炎症性サイトカインの産生を減少させるかどうかを判定する工程と
を含み、前記候補薬剤が、前記哺乳動物において炎症を緩和させるか、炎症性サイトカインの産生を減少させる場合は、前記候補薬剤が４−１ＢＢＬ遮断薬である方法。
【請求項５８】
前記炎症が、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬、強直性脊椎炎、クローン病、関節リウマチ、全身発症性若年性慢性関節炎、骨粗鬆症、または過敏性腸症候群に関連する、またはそれらに起因する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記炎症性サイトカインが、腫瘍壊死因子またはＩＬ−６である、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記炎症性サイトカインの産生が、２０％、２５％、３０％、または３０％以上減少する、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記４−１ＢＢＬが、配列番号１または２の配列を有する、請求項５３〜５８にのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２００６年１０月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／８５２，０２２号明細書、および２００７年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６０／９１７，５６１号明細書に対する優先権を主張するものであり、該出願はいずれも全体として参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０００２】
［連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載］
本願に関連する研究は、米国政府からの補助金（ＧＭ６７１０１、ＡＩ４１６３７、およびＡＩ５４６９６）による支援を受けている。米国政府は、本発明においてある一定の権利を有する場合がある。
【背景技術】
【０００３】
マクロファージ中の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などの前炎症性サイトカインの産生は、先天的免疫応答を開始するため、そして敗血症などの疾患に付随する全身性炎症状態を維持するために不可欠である（Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ４３０：２５７−６３（２００４）；Ｃｏｈｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：８８５−９１（２００２））。トール様受容体（ＴＬＲ）は、各々が微生物起源の特異的分子に応答する、主要な先天性免疫センサーである（Ｊａｎｅｗａｙ  ＆  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：１９７−２１６（２００２））。ＴＬＲ４は、リポ多糖（ＬＰＳ）エンドトキシンに対する受容体であり、例えば骨髄分化一次応答遺伝子８８（ＭｙＤ８８）およびＴｏｌｌ／インターロイキン−１受容体／耐性アダプタータンパク質（ＴＲＩＦ）（ＴＩＣＡＭ−１としても公知である）などのシグナリングアダプターを動員することによってＬＰＳに応答する。この動員は、ＩＲＡＫファミリーメンバーおよびＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）の相互作用および活性化を可能にさせ、これらは引き続いて炎症性サイトカイン産生を制御するＮＦ−κＢおよびＭＡＰキナーゼ経路を活性化する（Ａｋｉｒａ  ＆  Ｔａｋｅｄａ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：４９９−５１１（２００４））。
【０００４】
ＮＦ−κＢおよびＭＡＰキナーゼ経路は、リポ多糖（ＬＰＳ）処置から数時間以内にマクロファージ内で一時的に活性化されるが、ＴＮＦのような前炎症性サイトカインの産生は２４時間まで持続することができる。したがって、炎症性サイトカインの産生は、開始後に「持続」期が続くことを特徴とする炎症プロセスの一部である。持続期は、通常は炎症誘因の分解が生じると終了する。持続的なサイトカインの産生は、炎症状態を維持すること、および炎症性疾患の発生において極めて重要であるが、それは炎症の調節の崩壊を結果として生じさせる事象の多数が持続性炎症反応の終了時の近辺に発生するからである。このため、持続的なＴＮＦの産生は、多数の炎症性疾患の病態と関連している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、持続的ＴＮＦ産生に影響を及ぼせる薬剤は、炎症性疾患を治療するための治療薬を開発するために有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、マクロファージ活性化を媒介する際に重要な前炎症性サイトカインの産生において、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）が果たす役割の発見に関連する。特に、本発明は、４−１ＢＢＬが、炎症を生じさせる腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の持続的生成のために重要である後期シグナリング事象において作用するという発見に関連している。後期サイトカイン産生における４−１ＢＢＬの機能は、４−１ＢＢとは無関係である。したがって、本発明は、その公知の受容体である４−１ＢＢとは無関係である４−１ＢＢＬの新規機能に関連し、炎症性サイトカインの産生を減少させる方法を提供する。本発明は、４−１ＢＢＬアンタゴニストおよび遮断薬、ならびにそのようなアンタゴニストおよび遮断薬を含む医薬組成物および製品をさらに提供する。さらに、本発明は、４−１ＢＢＬ遮断薬およびアンタゴニストについてスクリーニングを行う方法を提供する。
【０００７】
本発明の１つの態様は、４−１ＢＢＬ遮断薬および製薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物であって、該４−１ＢＢＬ遮断薬が、（ａ）４−１ＢＢＬに対して特異的なアンタゴニスト抗体と、（ｂ）細胞中の４−１ＢＢＬ核酸からの発現を減少させるために有効なオリゴヌクレオチドと、（ｃ）可溶性４−１ＢＢとからなる群より選択される医薬組成物である。本組成物中では、治療有効量の遮断薬を使用できる。
【０００８】
本発明の１つの態様は、４−１ＢＢＬ遮断薬および抗炎症薬である第２薬剤を含む医薬配合物であって、該４−１ＢＢＬ遮断薬が、（ａ）４−１ＢＢＬに対して特異的なアンタゴニスト抗体と、（ｂ）細胞中の４−１ＢＢＬ核酸からの発現を減少させるために有効なオリゴヌクレオチドと、（ｃ）可溶性４−１ＢＢとからなる群より選択される医薬配合物である。本組成物中では、治療有効量の遮断薬および／または抗炎症薬を使用できる。抗炎症薬は、腫瘍壊死因子に対して特異的な抗体であり得る。
【０００９】
本発明の別の態様は、４−１ＢＢＬに対して特異的なキメラ抗体またはヒト化抗体である。
【００１０】
本発明の別の態様は、哺乳動物４−１ＢＢＬと特異的に結合する可溶性４−１ＢＢである。いくつかの実施形態では、哺乳動物４−１ＢＢＬは、ヒト、マウス、ウサギ、ブタまたはウマの４−１ＢＢＬである。いくつかの実施形態では、可溶性４−１ＢＢは、ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２３からアミノ酸１８６、マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２４からアミノ酸１８７、ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸１８６、マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸１８７、または別の哺乳動物４−１ＢＢにおける対応する領域に対応する配列を有する。いくつかの実施形態では、可溶性４−１ＢＢは、配列番号７、８、２０または２１の配列を有する。
【００１１】
本発明の別の態様は、４−１ＢＢＬ遮断薬を含有する容器および炎症を緩和させるためおよび／または炎症性サイトカインの産生を減少させるために４−１ＢＢＬ遮断薬を使用するための取扱説明書を含む製品である。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢＬ遮断薬を使用するための取扱説明書は、炎症状態の治療において４−１ＢＢＬ遮断薬を使用するための取扱説明書を含む。容器内には、治療有効量の遮断薬を用意できる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、炎症状態は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬、強直性脊椎炎、クローン病、関節リウマチ、全身発症性若年性慢性関節炎、骨粗鬆症、または過敏性腸症候群である。
【００１３】
本発明の別の態様は、哺乳動物における炎症性サイトカインの産生を減少させるための方法であって、該哺乳動物に４−１ＢＢＬ遮断薬を投与する工程を含む方法である。治療有効量の遮断薬を投与できる。いくつかの実施形態では、本方法は、炎症状態にある哺乳動物、または炎症状態の危険性がある哺乳動物を同定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒト、マウス、ウサギ、ブタまたはウマである。
【００１４】
本発明の別の態様は、哺乳動物における炎症を緩和させるための方法であって、４−１ＢＢＬ遮断薬を該哺乳動物に投与する工程を含む方法である。治療有効量の遮断薬を投与できる。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒト、マウス、ウサギ、ブタまたはウマである。
【００１５】
本発明の別の態様は、４−１ＢＢＬ遮断薬についてスクリーニングを行う方法であって、（ａ）４−１ＢＢＬを発現する細胞を候補薬剤と接触させる工程と、（ｂ）該候補薬剤が炎症性サイトカインの産生を減少させるかどうか、または該候補薬剤が４−１ＢＢＬオリゴマー化を防止するかどうかを判定する工程とを含み、該候補薬剤が、炎症性サイトカインの産生を減少させるか、４−１ＢＢＬオリゴマー化を防止する場合は、該候補薬剤が４−１ＢＢＬ遮断薬である方法である。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインは、腫瘍壊死因子もしくはＩＬ−６である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞、マクロファージ、および／またはＲＡＷ２６４．７細胞である。
【００１６】
本発明の別の態様は、４−１ＢＢＬ遮断薬についてスクリーニングを行う方法であって、（ａ）候補薬剤を哺乳動物に投与する工程と、（ｂ）該候補薬剤が、該哺乳動物において、炎症を緩和させるかどうか、または炎症性サイトカインの産生を減少させるかどうかを判定する工程とを含み、該候補薬剤が、該哺乳動物において、炎症を緩和させるか、炎症性サイトカインの産生を減少させる場合は、該候補薬剤が４−１ＢＢＬ遮断薬である方法である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、炎症状態を有する。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインは、腫瘍壊死因子もしくはＩＬ−６である。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインの産生は、２０％、２５％、３０％もしくは３０％以上減少する。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、またはブタである。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態では、４−１ＢＢＬは、哺乳動物４−１ＢＢＬである。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢＬは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタまたはウマの４−１ＢＢＬである。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢＬは、配列番号１または２に示される配列を有する。いくつかの実施形態では、遮断薬は、４−１ＢＢＬに対して特異的なキメラ抗体またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、遮断薬は配列番号１０〜１５、２２〜３８、および４５〜５６からなる群より選択される配列を有するオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、遮断薬は、ヒト４−１ＢＢＬに結合する可溶性４−１ＢＢである。いくつかの実施形態では、可溶性４−１ＢＢは、ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２３からアミノ酸１８６、マウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸２４からアミノ酸１８７、ヒト４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸１８６、またはマウス４−１ＢＢポリペプチドのアミノ酸１からアミノ酸１８７に対応する配列を有する。いくつかの実施形態では、遮断薬は、配列番号７、８、２０または２１の配列を有する可溶性４−１ＢＢである。いくつかの実施形態では、炎症性サイトカインは、腫瘍壊死因子もしくはＩＬ−６である。
【００１８】
別段の規定がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者であれば一般に理解する意味と同一の意味を有する。本発明を実践するためには本明細書に記載したものと類似もしくは同等の方法および材料を使用できるが、以下では、適切な方法および材料について記載する。本明細書に言及したすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、全体として参照することにより本明細書の一部をなすものとする。アミノ酸の名称は、本発明が属する分野の当業者であれば一般に理解する正式名称、３文字、もしくは１文字名称を含むことができる。不一致がある場合は、用語の定義を含む本明細書が優先されることになる。さらに、材料、方法、および実施例は、例示することのみを目的とし、限定することは意図されていない。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａ−Ｄは、４−１ＢＢＬがＴＬＲ４−相互作用タンパク質であることを示す結果を表す図である。（Ａ）ヒスチジンが欠如する培地上での、ＴＬＲ４のアミノ酸６５３〜８３９および４−１ＢＢＬのアミノ酸５〜２５４（クローン１）、４−１ＢＢＬのアミノ酸３〜２５４（クローン２）、ドミナントネガティブｐ３８α（ＡＦ）、ｐ５３またはＬａｍｉｎをコードする発現プラスミドでトランスフェクトした酵母細胞の増殖。４−１ＢＢＬは、ＴＬＲ４細胞内ドメインと相互作用するが、非関連タンパク質は相互作用しない。（Ｂ）トランスフェクションの２４時間後に溶解した、空のプラスミド（対照）または赤血球凝集素タグ付き４−１ＢＢＬ（ＨＡ−４−１ＢＢＬ）およびＦｌａｇタグ付きＴＬＲ４またはＩＬ−３Ｒを発現するプラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のイムノアッセイを示す。溶解物の３分の２は、抗赤血球凝集素（ＨＡ）を用いて免疫沈降（ＩＰ）させられた。ＴＬＲ４は、４−１ＢＢＬによって沈降したが、ＩＬ−３Ｒは沈降しなかった。（Ｃ）ＧＦＰタグ付き４−１ＢＢＬおよびＦｌａｇタグ付きＴＬＲ４、細胞質ドメインが欠損しているＴＬＲ４（ＴＬＲ４−ΔＣｙｔ）、細胞外ドメイン（ＴＬＲ４−ΔＥｘｔ）が欠損しているＴＬＲ４またはＩＬ−３Ｒ（左側）またはＭｙｃタグ付きＴＬＲ４もしくはＰ７１２Ｈ置換を伴うＴＬＲ４（ＴＬＲ４−Ｐ７１２Ｈ、右側）を発現するプラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のイムノアッセイを示す。溶解物は、抗Ｆｌａｇもしくは抗Ｍｙｃを用いて免疫沈降させた。ＴＬＲ４細胞内ドメインは４−１ＢＢＬとの相互作用に関係し、ＴＬＲ４  ＴｏＩｌ−ＩＬ−ＩＲドメインの別個の部分が４−１ＢＢＬおよびＭｙＤ８８と相互作用する。（Ｄ）Ｆｌａｇタグ付きＴＬＲ４およびＧＦＰ単独もしくはＧＦＰタグ付き４−１ＢＢＬ、細胞質ドメインが欠損している４−１ＢＢＬ（４−１ＢＢＬ−ΔＣｙｔ）、細胞外ドメインが欠損する４−１ＢＢＬ（４−１ＢＢＬ−ΔＥｘｔ）または細胞質ドメインのみを含有する４−１ＢＢＬ（４−１ＢＢＬ−Ｃｙｔ）を発現するプラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のイムノアッセイを示す。４−１ＢＢＬがＴＬＲ４と相互作用するためには、４−１ＢＢＬの細胞質ドメインおよび細胞膜との会合が必要とされる。ＩＰは免疫沈降法であり、ＩＢは免疫ブロット法である。結果は、２〜３回の独立した実験を表している。
【図２】図２Ａ−Ｄは、４−１ＢＢＬのインビボでの阻害作用を示す結果を表す図である。（Ａ）０．５ｍｇ／２５ｇ（体重）のＬＰＳを腹腔内注射した野生型マウスおよび４−１ＢＢＬ欠損マウスの生存率を示す。４−１ＢＢＬ  ＫＯ（ノックアウト）マウスは、ＬＰＳの致死作用に対して耐性であった。アイソタイプ対照であるＩｇＧ２ａもしくは抗４−１ＢＢＬ（２５０μｇ／２５ｇ（体重））と一緒に３００μｇ／２５ｇ（体重）のＬＰＳ（Ｂ）もしくは５００μｇ／２５ｇ（体重）のＬＰＳ（Ｃ）を腹腔内注射した野生型マウスの生存率を示す。ＬＰＳが野生型マウスに及ぼす致死作用は、抗４−１ＢＢＬの投与によって軽減された。（Ｄ）ＬＰＳを注射した野生型マウスもしくは４−１ＢＢＬ欠損マウス由来の血清中のＴＮＦについてのＥＬＩＳＡを示す。ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ産生は、野生型マウスと比較して４−１ＢＢＬ  ＫＯマウスでははるかに低かった。（Ａ）および（Ｂ）では対数順位検定を使用した。（Ａ）ではＰ＝０．００１７であり、（Ｂ）の左側パネルではＰ＝０．０１８であり、（Ｂ）の右側パネルではＰ＝０．０４８である。（Ｃ）におけるデータは、平均値±ｓ．ｄ．として表示した。＊はＰ＜０．００５であり、＊＊はＰ＜０．００１である（スチューデントｔ−検定）。
【図３】図３Ａ−Ｈは、ＬＰＳ刺激マクロファージ中の持続的ＴＮＦ産生のために４−１ＢＢＬが必要とされることを示す結果を表す図である。（Ａ）未処置で放置した（なし）野生型（ＷＴ）腹腔マクロファージもしくは４−１ＢＢＬ欠損（４−１ＢＢＬ  ＫＯ）腹腔マクロファージ、または２４時間かけてＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ、ＬＰＳ）で処置した野生型腹腔マクロファージもしくは４−１ＢＢＬ欠損腹腔マクロファージの培養培地中のＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１２のｐ４０鎖（ＩＬ−１２ｐ４０）のＥＬＩＳＡを示す。右下、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ、対照）によって誘導されたＩＬ−６の産生。４−１ＢＢＬ欠損マクロファージは、野生型マクロファージより少ないＴＮＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−１２を産生した。（ＢおよびＣ）野生型マクロファージおよび４−１ＢＢＬ欠損マクロファージ（Ｂ）またはＬＰＳで処置した４−１ＢＢＬ欠損マクロファージ（４−１ＢＢ  ＫＯ、Ｃ）の培養培地中でのＴＮＦについてのＥＬＩＳＡ（時間、横軸）を示す。４−１ＢＢＬはＬＰＳ刺激後の後期にＴＮＦ産生のために必須であったが、４−１ＢＢは持続的ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ産生を促進するために必要とされなかった。（Ｄ）ＬＰＳで処置した野生型および４−１ＢＢＬ欠損マクロファージによるＴＮＦのｍＲＮＡの定量的ＰＣＲを示す。ＡＵは任意単位を示す。ＴＮＦのｍＲＮＡは、ＬＰＳ刺激の２時間後に４−１ＢＢＬ欠損マクロファージおよび野生型マクロファージと同様の量でピークに達したが、ＬＰＳ刺激後の後期には４−１ＢＢＬ欠損細胞では野生型マクロファージにおけるＴＮＦのｍＲＮＡの量がはるかに少なかった。（Ｅ）ＬＰＳで刺激した野生型マクロファージおよび４−１ＢＢＬ欠損マクロファージ中のＴＮＦおよびグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ、対照）の転写速度についての核ランオン分析のＲＮＡドットブロット（１００ｎｇ／ｍＬ、時間は上方のレーン）を示す。ＬＰＳは、４−１ＢＢＬ欠損および野生型のマクロファージ両方におけるＬＰＳ刺激１時間後にＴｎｆ転写を誘発したが、Ｔｎｆ転写はＬＰＳ処置後の後期には４−１ＢＢＬ欠損マクロファージ中では減少した。（Ｆ）ＬＰＳ刺激の３時間後の野生型マクロファージおよび４−１ＢＢＬ欠損マクロファージにおけるＴＮＦのｍＲＮＡの安定性についてのリアルタイムＰＣＲ解析を示す。転写を阻害するためにアクチノマイシンＤ（１０μｇ／ｍＬ）を使用した。数値は、０時間（１００％に設定）での数値に対する残留率である。４−１ＢＢＬの欠損は、ＴＮＦのｍＲＮＡの安定性に相当に大きな影響を及ぼした。（Ｇ）放射性標識プローブ（左端）を用いて評価した、ＬＰＳで刺激した野生型マクロファージおよび４−１ＢＢＬ欠損マクロファージからの核抽出物のＥＬＩＳＡ（時間、上方レーン）を示す。４−１ＢＢＬ欠損は、ＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化または転写因子ＡＰ−１のＬＰＳ誘導性活性化に影響を及ぼさなかった。（Ｈ）野生型またはＬＰＳで処置した４−１ＢＢＬ欠損マクロファージの溶解物のイムノブロット（時間、上方のレーン）を示す。ＮＦ−κＢおよびＭＡＰキナーゼ経路は、４−１ＢＢＬ欠損によって有意な影響を受けなかった。ｐ−はリン酸化を���す。対照と対比して、＊はＰ＜０．０１であり、＊＊はＰ＜０．００５である（スチューデントｔ−検定）。データは３回の平均値±ｓ．ｄ．（Ａ〜Ｄ）であり、２〜３回の実験（Ａ〜Ｈ）を表している。
【図４】図４Ａ−Ｄは、４−１ＢＢＬがＲＡＷ２６４．７マクロファージにおける持続的ＴＮＦ産生のために必要とされることを示す結果を表す図である。（Ａ）ＲＡＷ２６４．７細胞は、対照ｓｉＲＮＡ、または４−１ＢＢＬ−ｓｉＲＮＡ＃１もしくは４−１ＢＢＬ−ｓｉＲＮＡ＃２を含むｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒを用いて安定的にトランスフェクトした。４−１ＢＢＬのタンパク質レベルは、免疫ブロット法によって測定した。（Ｂ）ＴＮＦ産生を指定の時間において、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で処置した対照細胞および４−１ＢＢＬノックダウン細胞中で測定した。（Ｃ）ＴＮＦ産生を、ペプチドグリカン（ＰＧ、１０μｇ／ｍＬ）、ポリＩ：Ｃ（２５μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣｐＧ（５μｇ／ｍＬ）、もしくは培養培地で２４時間かけて処置した対照細胞および４−１ＢＢＬノックダウン細胞中で測定した。いずれのｓｉＲＮＡもＲＡＷ２６４．７細胞中での４−１ＢＢＬ発現を効果的にノックダウンし（Ａ）、ＬＰＳおよび他のＴＬＲリガンド誘導性ＴＮＦ産生を阻害した（ＢおよびＣ）。４−１ＢＢＬは、Ｉ−κＢ−α分解に反映されるようにＲＡＷ２６４．７細胞におけるＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化に何の役割も果たさなかった（Ｄ）。データは、２回ずつ実施した３例の独立した実験の平均値±ｓ．ｄ．として表示した。対照と対比して、＊はＰ＜０．０５であり、＊＊はＰ＜０．０１である。（ａ）における結果は、３例の実験を表している。
【図５】図５Ａ−Ｂは、４−１ＢＢがＲＡＷ２６４．７マクロファージ中のＬＰＳ誘導性ＴＮＦ産生に関係していないことを示す結果を表す図である。（Ａ）ＲＡＷ２６４．７細胞は、対照ｓｉＲＮＡ、４−１ＢＢ−ｓｉＲＮＡ＃１もしくは４−１ＢＢ−ｓｉＲＮＡ＃２を含むｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒを用いて安定的にトランスフェクトした。４−１ＢＢのｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲによって試験した。（Ｂ）ＴＮＦ産生を２４時間にわたるＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）処置後に対照および４−１ＢＢノックダウン細胞中で測定した。低分子干渉ＲＮＡはＲＡＷ２６４．７細胞における４−１ＢＢ産生を効果的にノックダウンしたが（Ａ）、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ産生に及ぼす作用は観察されなかった（Ｂ）。データは、２回ずつ実施した３例の独立した実験の平均値±ｓ．ｄ．として表示した。
【図６】図６Ａ−Ｄは、４−１ＢＢＬがマクロファージ中のＴＬＲリガンド誘導性ＴＮＦ産生に関係していることを示す結果を表す図である。（Ａ）２９３Ｔ細胞は、Ｆｌａｇ−ＴＬＲ２、Ｆｌａｇ−ＴＬＲ３、Ｆｌａｇ−ＴＬＲ４、もしくはＦｌａｇ−ＴＬＲ９と一緒に、空の発現ベクター（対照）またはＨＡ−４−１ＢＢＬ発現ベクターを用いてトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクションの２４時間後に溶解した。細胞溶解物は抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫ブロットするか、抗ＨＡを用いて免疫沈降させて抗ＨＡおよび抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫ブロットした。試験した全ＴＬＲは、共免疫沈降アッセイにおいて４−１ＢＢＬによって沈降した。（Ｂ）野生型マクロファージおよび４−１ＢＢＬ欠損マクロファージは、Ｐａｍ３（１μｇ／ｍＬ）、ポリＩ：Ｃ（２５μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、Ｒ８４８（１００ｎＭ）、ＣｐＧ（５μｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）、または培養培地（なし）を用いて処置した。ＴＮＦ産生は、処置２４時間後に測定した。ＴＮＦのＰａｍ３（ＴＬＲ２リガンド）、ポリＩ：Ｃ（ＴＬＲ３リガンド）、Ｒ８４８（ＴＬＲ７＆８リガンド）、ＣｐＧ（ＴＬＲ９リガンド）誘導性産生は、４−１ＢＢＬ  ＫＯ細胞中では減少した。（Ｃ）野生型マクロファージおよびＴＬＲ４欠損マクロファージは０、１、２．５もしくは５μｇ／ｍＬのＣｐＧ  ＤＮＡで処置し、２４時間かけてインキュベートするか、（Ｄ）１μｇ／ｍＬのＣｐＧのＤＮＡで処置し、培養上清を指定の時点で採取してＴＮＦ産生を測定した。低用量のＣｐＧ（１μｇ／ｍＬ）を使用した場合は、ＴＬＲ４欠損マクロファージ中のＴＬＲ９誘導性ＴＮＦ産生における小規模ではあるが統計学的に有意な減少が見られた。データは、３回行った実験の平均値±ｓ．ｄ．として表示した。＊はＰ＜０．０５であり、＊＊はＰ＜０．０１であり、＊＊＊はＰ＜０．００５である。結果は、２〜４回の実験を表している。
【図７】図７Ａ−Ｆは、４−１ＢＢＬ誘導および細胞表面局在がＬＰＳ処置マクロファージ中での持続的ＴＮＦ産生のために必要とされることを示す結果を表す図である。（Ａ）ＬＰＳで処置した、野生型マクロファージおよびＴＬＲ４（ＴＬＲ４  ＫＯ）、ＭｙＤ８８（ＭｙＤ８８  ＫＯ）またはＴＲＩＦ（ＴＲＩＦ  ＫＯ）が欠損するマクロファージからの溶解物中の４−１ＢＢＬの免疫ブロット（時間、上方のレーン）を示す。ＬＰＳは、ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、およびＴＲＩＦに依存的にマクロファージ中の４−１ＢＢＬの迅速な発現を誘導する。（Ｂ）前処理を行わずに放置（なし）、または１時間かけてＮＦ−κＢ（２０μＭのスルファサラジン）、ｐ３８（１０μＭのＳＢ２０３５８０）、Ｊｎｋ（５μＭのＳＰ６００１２５）もしくはＭＥＫ（１０μＭのＰＤ９８０５９）の阻害剤を用いて前処置して、次にＬＰＳを用いて処置した野生型マクロファージ中の４−１ＢＢＬ  ｍＲＮＡの半定量ＰＣＲ（時間、上方のレーン）を示す。ＬＰＳ誘導性４−１ＢＢＬ  ｍＲＮＡは、ＮＦ−κＢ阻害剤であるスルファサラジンおよびプロテアソーム阻害剤ＭＧ−１３２（データは示していない）によって効果的に阻害された。さらに、ｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０、Ｊｎｋ阻害剤ＳＰ６００１２５、およびＭｅｋ阻害剤ＰＤ９８０５９もまた４−１ＢＢＬ発現に対しある程度の阻害作用を示していた。（Ｃ）４−１ＢＢＬをコードする組換えアデノウイルス（Ａｄｖ）による感染１８時間後のＬＰＳ誘導性４−１ＢＢＬ  ｍＲＮＡ（処置１時間、ＬＰＳ）もしくは異所的に発現した４−１ＢＢＬ  ｍＲＮＡの安定性についてのリアルタイムＰＣＲ解析を示す。転写を阻害するためにアクチノマイシンＤを使用した。数値は、０時間（１００％に設定）での数値に対する残留率である。ｍＲＮＡの安定性におけるＬＰＳ誘導性の変化もまたＬＰＳ誘導性４−１ＢＢＬ発現に関係していた。（Ｄ）ＬＰＳを用いて処置した野生型腹腔マクロファージによる４−１ＢＢＬ発現のフローサイトメトリー（時間、キー）を示す。右は表面での発現を示し、左は０．１％サポニンで透過性にされた細胞中の全発現を示す。ＬＰＳ誘導性４−１ＢＢＬは、細胞表面上に局在する。（Ｅ）１時間かけてブレフェルジンＡ（３μｇ／ｍＬ）を用いて（＋）または用いずに（−）プレインキュベートし、次にＬＰＳで処置し（時間、左端）、抗４−１ＢＢＬで免疫染色した野生型腹腔マクロファージの免疫蛍光顕微鏡検査を示す。原倍率は１００倍である。ブレフェルジンＡは、小胞体からゴルジ（Ｇｏｌｇｉ）装置への転位を阻害することによって細胞表面へのタンパク質転位を遮断する。（Ｆ）Ｅにおいて記載した方法で処置した細胞の溶解物中の４−１ＢＢＬおよびＴＮＦのｍＲＮＡの半定量ＰＣＲを示す。ブレフェルジンＡは、１時間後における４−１ＢＢＬ  ｍＲＮＡのＬＰＳ誘導性増加にもＬＰＳ誘導性ＴＮＦ  ｍＲＮＡにも影響を及ぼさなかったが、２、４および６時間後にはＴＮＦ  ｍＲＮＡを減少させた。ＧＡＰＤＨ（Ａ、Ｂ、Ｆ）はグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ローディング対照）である。データは、３例の独立した実験を表している。
【図８】図８Ａ−Ｆは、ＴＬＲリガンドはマクロファージ中の４−１ＢＢＬ発現を誘導するが、ＩＬ−１βは誘導しないことを示している結果を表す図である。野生型マクロファージは、指定の時間にわたって、ＬＰＳ、ＩＬ−１β、ポリＩ：Ｃ、ペプチドグリカン、ＣｐＧ  ＤＮＡ、またはＲ８４８で処置した。何も処置していない細胞（なし）、またはＬＰＳ、もしくはＩＬ−１βで処置した細胞の培養上清を採取し、ＩＬ−６レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。（Ｂ）におけるデータは、３回の実験の平均値±ｓ．ｄ．として表示した。４−１ＢＢＬの発現は、抗４−１ＢＢＬ抗体を用いたウエスタンブロット法によって分析した。ＧＡＰＤＨを対照として使用した。結果は、２〜３回の実験を表している。
【図９】図９Ａ−Ｇは、４−１ＢＢＬの発現および架橋結合がＴＮＦ産生を誘発することを示す結果を表す図である。様々な用量（上方レーンおよび横軸）のなし（対照）もしくは４−１ＢＢＬを発現するアデノウイルスで感染させた野生型マクロファージ（Ａ）、野生型および４−１ＢＢ欠損マクロファージ（Ｂ）、野生型およびＴＬＲ４欠損マクロファージ（Ｃ）、野生型およびＴＬＲ２欠損マクロファージ（Ｄ）または野生型およびＴＲＩＦ欠損マクロファージ（Ｅ）による４−１ＢＢＬの免疫ブロット（上方）、ならびにＴＮＦ産生のＥＬＩＳＡ（下方）を示す。ＰＦＵはプラーク形成単位である。４−１ＢＢＬ発現は、用量依存的にＴＮＦ産生を誘導し（Ａ）、４−１ＢＢを必要としなかった（Ｂ）。ＴＮＦ誘導はＴＬＲ４−／−マウスから単離したマクロファージ中では部分的に低下し（Ｃ）、ＴＬＲ２欠損マクロファージ中では低かった（Ｄ）。ＴＲＩＦ欠損症が４−１ＢＢＬ誘導性ＴＮＦ産生に影響を及ぼさなかったので（Ｅ）、ＴＮＦ誘導はＴＲＩＦとは無関係であった。（Ｆ）野生型マクロファージ、またはヤギ抗ヒト（抗Ｆｃ、１．５μｇ／ｍＬ）、４−１ＢＢ−Ｆｃ（５μｇ／ｍＬ）を培養培地と一緒にもしくは培養培地を単独（なし）で用いて２４時間かけて処置し、４−１ＢＢＬ、ＭｙＤ８８、ＴＲＩＦ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、またはＭｙＤ８８とＴＲＩＦとの両方が欠損するマクロファージによるＴＮＦについてのＥＬＩＳＡを示す。ＴＮＦ産生を誘発するためには、２つより多い４−１ＢＢＬ分子の架橋結合が必要とされる。（Ｇ）培養培地（なし）、あるいはＬＰＳ単独またはＬＰＳと、Ｆｃ、４−１ＢＢ−Ｆｃもしくは抗４−１ＢＢＬ（α−４−１ＢＢＬ、０、２もしくは５μｇ／ｍＬ、各々計５μｇ／ｍＬに加えたアイソタイプ抗体ＩｇＧ２ａとともに）との組み合わせと、２４時間インキュベートした野生型マクロファージによるＴＮＦ産生についてのＥＬＩＳＡを示す。４−１ＢＢ−Ｆｃおよび抗４−１ＢＢＬ抗体は、ＬＰＳ誘導性のＴＮＦ産生を阻害した。対照と対比して、＊はＰ＜０．０５であり、＊＊はＰ＜０．０１であり、＊＊＊はＰ＜０．００５である（スチューデントｔ−検定）。データは３例ずつのサンプルの平均値±ｓ．ｄ．であり、２〜４例の実験を表している。
【図１０】図１０Ａ−Ｉは、２つの連続するＴＬＲ４複合体が存在することを示す図である。（Ａ）ＬＰＳで処置した野生型マクロファージのイムノアッセイ（時間、上方のレーン）を示す。全細胞溶解物（溶解物、上）または抗ＴＬＲ４、抗ＭｙＤ８８もしくは抗４−１ＢＢＬを用いて免疫沈降させた溶解物は、抗４−１ＢＢＬ、抗ＴＬＲ４および／または抗ＭｙＤ８８を用いた免疫ブロット法によって分析した。破線はアイソタイプ抗体（免疫沈降法における陰性対照）であり、実線は４−１ＢＢＬもしくはＭｙＤ８８の免疫ブロットにおける陽性対照である。ＬＰＳ処置マクロファージでは、ＭｙＤ８８−ＴＬＲ４複合体は初期細胞応答の原因であり、４−１ＢＢＬ−ＴＬＲ４複合体は持続的ＴＮＦ産生に関係している。（Ｂ）Ｆｌａｇ−ＴＬＲ４は、ＭｙＤ８８によって沈降したがＦｌａｇ−４−１ＢＢＬによっては沈降しないので、これはＭｙＤ８８が４−１ＢＢＬとは相互作用できないことを示している。（Ｃ）４−１ＢＢＬは、ＴＲＡＦ６とは相互作用するが、ＴＲＡＦ２とは相互作用しない。（Ｄ）ＴＲＡＦ６のノックダウンは、ＬＰＳ、ポリＩ：Ｃ、およびＩＬ−１β誘導性サイトカイン産生を低下させたが、ＴＮＦ誘導性ＩＬ−６産生には影響を及ぼさない。（Ｅ）放射性標識プローブ（左端）を用いて分析した、ＧＦＰ（Ａｄｖ−ＧＦＰ）もしくは４−１ＢＢＬ（Ａｄｖ−４−１ＢＢＬ）を発現するアデノウイルスで感染させた野生型マクロファージからの核抽出物のＥＭＳＡ（時間、上方のレーン）を示す。ＬＰＳ（右下）は、ＬＰＳ処置サンプル（ＮＦ−κＢに対する陽性対照）である。４−１ＢＢＬの発現はＣＲＥＢおよびＣ／ＥＢＰを活性化させたが、ＮＦ−κＢは活性化させなかった。（Ｆ）Ｅに記載した方法で処置した細胞の全溶解物中の様々なタンパク質（左端）の免疫ブロットを示す。（Ｇ）４−１ＢＢＬを発現するアデノウイルスで感染させた野生型マクロファージによるＴＮＦ産生についてのＥＬＩＳＡを示す。野生型マクロファージは感染６時間後にＮＦ−κＢ（２０μＭスルファサラジン）、ｐ３８（１０μＭのＳＢ２０３５８０）、Ｊｎｋ（５μＭのＳＰ６００１２５）もしくはＭＥＫ（１０μＭのＰＤ９８０５９）の阻害剤で処置し、感染２４時間後に分析した。対照と対比して、＊はＰ＜０．０１であり、＊＊はＰ＜０．００５である（スチューデントｔ−検定）。（Ｈ）上は、４−１ＢＢＬを発現するアデノウイルスで感染させた野生型マクロファージ中のＴＮＦ  ｍＲＮＡの半定量ＰＣＲ（時間、上方のレーン）を示す。下は、アデノウイルスを用いて１８時間かけて感染させた野生型マクロファージ、またはＬＰＳを用いて１時間かけて処置した野生型マクロファージ中のＴＮＦ  ｍＲＮＡの安定性を示す。転写を阻害するためにアクチノマイシンＤを使用した。数値は、０時間（１００％に設定）での数値に対する残留率である。データは、３回行った平均値±ｓ．ｄ．を表し（Ｇ）、２例（Ａ、Ｇ、Ｈ）、３例（Ｅ）または４例（Ｆ）の実験を表している。ＩκＢαの分解は、４−１ＢＢＬを過剰発現する細胞中では観察されなかった（Ｆ）。４−１ＢＢＬの発現はｐ３８、ＪｎｋおよびＥｒｋのある程度のリン酸化を誘発し（Ｆ）、そしてｐ３８、ＪｎｋおよびＥｒｋの阻���は４−１ＢＢＬ媒介性ＴＮＦ産生を減少させた（しかしＮＦ−κＢは減少させなかった）（Ｇ）。４−１ＢＢＬの欠損は後期において低いＬＰＳ誘導性ＴＮＦ  ｍＲＮＡ転写を生じさせたが、４−１ＢＢＬ過剰発現はより多くのＴＮＦ  ｍＲＮＡを生じさせた（Ｈ）。ＴＮＦ転写産物は４−１ＢＢＬを過剰発現する細胞およびＬＰＳ処置細胞中で類似の半減期を有していた（Ｈ）。（Ｉ）ＬＰＳ処置マクロファージ中の連続シグナリングのモデルを示す。ＴＬＲ４−ＬＰＳの連結反応は、数時間以内にＴＮＦを含む炎症遺伝子のＭｙＤ８８およびＴＲＩＦに依存性の発現を導く。４−１ＢＢＬはこの早期応答によって誘導され、細胞表面へ転位し、そこでＴＬＲと相互作用して、ＴＮＦなどの炎症遺伝子の持続発現についてのシグナリングを開始する。
【図１１Ａ−Ｆ】ＩＬ−６の誘導における４−１ＢＢＬの関与を例示するデータを要約している図である。４−１ＢＢＬ−／−マウスは、ＬＰＳに応答して野生型マウスより有意に少ないＩＬ−６を産生する（Ａ）。野生型マウスからのマクロファージは、４−１ＢＢＬ−／−マウスからのマクロファージより有意に多いＩＬ−６を産生した（Ｂ）。Ｐａｍ３、ポリＩ：Ｃ、ＬＰＳ、Ｒ８４８、およびＣｐＧで処置した野生型マクロファージは、同一の誘導因子で処置した４−１ＢＢＬ−／−マクロファージより有意に多いＩＬ−６を産生した（Ｃ）。ＬＰＳおよび４−１ＢＢ−Ｆｃとともにインキュベートしたマクロファージは、ＬＰＳ単独とともにインキュベートしたマクロファージより有意に少ないＩＬ−６を産生し、ＬＰＳおよび増加する濃度の抗４−１ＢＢＬ抗体とともにインキュベートしたマクロファージは、減少するレベルのＩＬ−６産生を示した（Ｄ）。４−１ＢＢＬ発現が４−１ＢＢＬ−特異的ｓｉＲＮＡによって減少するＲＡＷ２６４．７細胞は、対照ｓｉＲＮＡを用いて処置したＲＡＷ２６４．７細胞より有意に少ないＩＬ−６を産生する（Ｅ）。４−１ＢＢＬの発現が４−１ＢＢＬ−特異的ｓｉＲＮＡによって減少する細胞であって、ペプチドグリカン（ＰＧ、１０μｇ／ｍＬ）、ポリＩ：Ｃ（２５μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣｐＧ（５μｇ／ｍＬ）で処置した細胞は、対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞であって、ペプチドグリカン（ＰＧ、１０μｇ／ｍＬ）、ポリＩ：Ｃ（２５μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣｐＧ（５μｇ／ｍＬ）で処置した細胞より有意に少ないＩＬ−６を産生する（図１１Ｆ）。
【図１２】マウス４−１ＢＢＬ（Ａ）およびヒト４−１ＢＢＬ（Ｂ）の構造ドメインを示す概略図である。「Ｃｙｔ」は細胞質ドメインを示し、「ＴＭ」は膜貫通ドメインを示し、「Ｅｘｔ」は細胞外ドメインを示し、そして「Ｓｉｇ」はシグナルペプチドを示している。
【図１３】マウス４−１ＢＢ（Ａ）、ヒト４−１ＢＢ（Ｂ）、および可溶性マウス４−１ＢＢ−ヒトＩｇ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｃ）の構造ドメインを示す概略図である。「Ｃｙｔ」は細胞質ドメインを示し、「ＴＭ」は膜貫通ドメインを示し、「Ｅｘｔ」は細胞外ドメインを示し、そして「Ｓｉｇ」はシグナルペプチドを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、マクロファージ活性化における前炎症性サイトカインの産生において４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）が果たす役割の発見に関連している。詳細には、本発明は、４−１ＢＢＬが後期シグナリング事象において作用し、過剰持続性炎症を導くＴＮＦなどの炎症性サイトカインの持続的産生を生じさせるという発見に関連している。後期サイトカイン産生における４−１ＢＢＬの機能は、４−１ＢＢとは無関係である。したがって、本発明は、４−１ＢＢに非依存的にＴＮＦおよびＩＬ−６などの炎症性サイトカインの産生を減少させるための方法において使用可能な４−１ＢＢＬ遮断薬、ならびにそのような遮断薬を含む医薬組成物および製品を提供する。本発明は、炎症を緩和させるための方法、炎症性サイトカインの産生を減少させるための方法、ならびに４−１ＢＢＬ遮断薬についてスクリーニングを行うための方法を提供する。
【００２２】
［４−１ＢＢポリペプチドおよび核酸］
本明細書に記載した試験は、マクロファージ中でのＴＮＦ発現の初期誘導および持続的ＴＮＦ産生が早期および後期のシグナリング事象によって調節されることを示している。マクロファージ中でのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）４−媒介性ＴＮＦ産生は一般には数時間以内に発生し、ほぼ１日間にわたり持続する（例えばＧａｌａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ７６：５９３９−４３（１９７９）を参照されたい）。持続的ＴＮＦ産生は、細胞表面４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）によって制御される後期ＴＬＲシグナリングを含む。４−１ＢＢＬは骨髄分化一次応答遺伝子８８（ＭｙＤ８８）およびＴｏｌｌ／インターロイキン−１受容体／耐性アダプタータンパク質（ＴＲＩＦ）とは無関係に機能するが、ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）には依存する。したがって、シグナルソームＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＴＲＩＦは炎症遺伝子の開始および早期発現の原因であり、４−１ＢＢＬは後期の持続的ＴＮＦ産生の原因である。４−１ＢＢＬは、炎症性刺激に応答するマクロファージ中の早期誘導性タンパク質の１つであり、マクロファージ活性化の早期においてのみ誘導される。新規に合成した４−１ＢＢＬは細胞表面上に転位して後期持続的ＴＮＦ産生のための新規のシグナリング期を引き起こす。そこで、例えば、ＴＮＦもしくはＩＬ−６などの炎症性サイトカインの過剰産生に関連する疾患、または、持続的炎症反応の調節におけるその他の機能停止に関連する疾患は、４−１ＢＢＬポリペプチドの活性もしくは４−１ＢＢＬ核酸からの発現を阻害もしくは減少させることができる薬剤で治療することができる。
【００２３】
４−１ＢＢＬ（４−１ＢＢリガンド）は、例えば活性化Ｂ細胞およびマクロファージなどの活性化した抗原提示細胞上で発現するＩＩ型細胞表面糖タンパク質のＴＮＦファミリーのメンバーである。４−１ＢＢＬポリペプチドは当分野において公知であり、例えば、マウス、ウサギ、ブタ、イヌ、ウシ、サル、またはヒト由来のような、任意の起源由来であってもよい。マウス４−１ＢＢＬポリペプチドの１つの例は、以下である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０３３４３０）。
【化１】
2010506921.tif 000003
【００２４】
ヒト４−１ＢＢＬポリペプチドの１つの例は、以下（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４１２７３）である。
【化２】
2010506921.tif 000004
【００２５】
４−１ＢＢＬは、機能もしくは配列に基づいて同定できる。例えば、本発明は、一部には、マクロファージ中において、４−１ＢＢＬが４−１ＢＢとは無関係にＴＮＦ産生を媒介するという発見に基づいているが、４−１ＢＢＬは、Ｔ細胞受容体の活性化時に共刺激シグナルを生成するために活性化ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞上で発現した膜貫通タンパク質のＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４−１ＢＢと相互作用することも公知である。Ｗａｔｔｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２３−６８（２００５）。さらに、ヒトおよびマウスの４−１ＢＢＬの機能的ドメインを、図１２に示している。
【００２６】
本明細書で使用する「４−１ＢＢＬ」もしくは「４−１ＢＢＬポリペプチド」は、全長ポリペプチドの任意の生物活性フラグメント、ならびに生物活性４−１ＢＢＬに対する抗体を生ぜしめるための免疫原として使用するために適切な任意のフラグメントを含む。したがって、４−１ＢＢＬポリペプチドは、配列番号１または２に示す配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有していてもよい。一般に、用語「実質的に同一」は、アミノ酸配列が参照配列とは保存的アミノ酸置換のみが、例えば１つのアミノ酸と他の同一クラスのアミノ酸（例、バリンとグリシン、アルギンとリシン）との置換のみが、もしくはそのタンパク質の機能を破壊しないアミノ酸配列の位置に局在する１つ以上の非保存的置換、欠損もしくは挿入のみが相違することを意味する。ポリペプチド（もしくは核酸）配列は、それが参照配列と約５０％の相同性、例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９５％以上の相同性を示す場合は、その参照配列と実質的に同一である。４−１ＢＢＬポリペプチドは、例えば、配列番号１および２と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９０％以上同一である場合がある。
【００２７】
４−１ＢＢＬ核酸は、４−１ＢＢＬポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡのポリマーである。４−１ＢＢＬ核酸は、ゲノムＤＮＡならびにメッセンジャーＲＮＡであってもよい。４−１ＢＢＬ核酸は、プラスミドベクターもしくはウイルスＤＮＡ内に組み込むことができる。４−１ＢＢＬ核酸は、一本鎖もしくは二本鎖、環状もしくは直鎖状であってもよい。４−１ＢＢＬ核酸の例には、制限なく、配列番号１および２に規定したマウスおよびヒトの４−１ＢＢＬポリペプチド配列をコードするものが含まれる。マウス４−１ＢＢＬポリペプチド（配列番号１）をコードする４−１ＢＢＬ核酸の例は、アクセッション番号ＮＭ＿００９４０４を付与してＧｅｎＢａｎｋにおいて見いだすことができる以下の配列である。
【化３】
2010506921.tif 000005
【００２８】
ヒト４−１ＢＢＬポリペプチド（配列番号２）をコードする４−１ＢＢＬ核酸の例は、アクセッション番号Ｕ０３３９８を付与してＧｅｎＢａｎｋにおいて見いだすことができる以下の配列である。
【化４】
2010506921.tif 000006
【００２９】
４−１ＢＢＬ核酸はさらにまた、その核酸が上記で考察したように４−１ＢＢＬに特異的な抗体を生ぜしめるための免疫原として使用するために適切な生物活性ポリペプチドもしくはフラグメントをコードすることを前提に、配列番号１および２に規定したポリペプチド配列のフラグメントをコードしてもよい。
【００３０】
［一般的な４−１ＢＢＬ遮断薬］
４−１ＢＢＬ遮断薬は、４−１ＢＢＬの発現および／または活性を阻害および／または減少させる高分子または低分子であってもよい。４−１ＢＢＬ遮断薬は、４−１ＢＢＬの活性を阻害または減少させることができる。そのような４−１ＢＢＬ遮断薬の例には、４−１ＢＢＬ特異的抗体、４−１ＢＢの可溶形態、および例えばブレフェルジンＡなどの細胞表面へのタンパク質転位を妨害する薬剤もしくは低分子が含まれるが、これらに限定されない。これらの４−１ＢＢＬ遮断薬は、４−１ＢＢＬのオリゴマー化を遮断すること、および／またはＴＮＦ産生に関係する後期シグナリング事象において例えばＴＬＲおよびＴＲＡＦ６などの適切なシグナリング分子との相互作用を妨害するとによって作用する。本明細書で使用する用語「４−１ＢＢＬオリゴマー化」は、例えばＴＮＦもしくはＩＬ−６などの炎症性サイトカインの４−１ＢＢＬ媒介性産生のために必要とされる４−１ＢＢＬ分子の凝集体の形成を意味する。４−１オリゴマー化は、２つより多い４−１ＢＢＬ分子の凝集体、例えば３つもしくは４つの４−１ＢＢＬ分子の凝集体の形成を意味する。４−１ＢＢＬ遮断薬もまた細胞表面へのタンパク質転位を妨害する場合があるが、これは後期シグナリング期中に適正に機能するためには４−１ＢＢＬの細胞表面局在が必要であるためである。
【００３１】
４−１ＢＢＬ遮断薬は、さらに４−１ＢＢＬ核酸からの発現を阻害または減少させることによって機能することもできる。４−１ＢＢＬ遮断薬は、細胞が生成する４−１ＢＢＬの量が変化するように、転写レベルもしくは翻訳レベルで作用することができる。４−１ＢＢＬ遮断薬は、４−１ＢＢＬのｍＲＮＡ転写産物の産生を減少させるか、ｍＲＮＡ転写産物の安定性を減少させることができる。これらの遮断薬には、例えばアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムなどのオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。そのようなオリゴヌクレオチドをベースとする４−１ＢＢＬ遮断薬は、生理学的条件下（例、３７℃、ｐＨ７〜７．８、および生理的濃度の電解質）またはストリンジェントもしくは高度にストリンジェントな条件下で４−１ＢＢＬ核酸にハイブリダイズすることができ、そして４−１ＢＢＬ核酸からの発現を阻害もしくは減少させることができる。これらの遮断薬は、４−１ＢＢＬの発現または活性に関係する他の分子の阻害剤をもまた含むことができる。
【００３２】
オリゴヌクレオチドは、３ヌクレオチドより長い長さを有するリボースヌクレオチドもしくはデオキシリボースヌクレオチドのポリマーである。オリゴヌクレオチドは天然型ヌクレオチド、合成、修飾、もしくは疑似ヌクレオチド、例えばホスホロチオレート、ならびに例えばＰ３２、ビオチンもしくはジゴキシゲニンなどの検出可能な標識を有するヌクレオチドを含むことができる。
【００３３】
本発明のオリゴヌクレオチドである、４−１ＢＢＬ核酸の発現を減少させることができるオリゴヌクレオチドは、４−１ＢＢＬ核酸と完全に相補的であってもよい。代替的には、配列間のある程度の変動性は許容できる。例えば生理的温度および塩濃度の生理的条件下、またはストリンジェントもしくは高度にストリンジェントな条件下で４−１ＢＢＬ核酸にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドは、４−１ＢＢＬ核酸の発現を阻害するために十分に相補的である。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、規定のイオン強度およびｐＨでの特異的配列に対する熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。しかし、ストリンジェントな条件は、本明細書の他の場所で適格とする所望のストリンジェンシー度に依存して、選択した配列の熱融解点より約１℃〜約２０℃低い範囲内の温度を含む。例えば、４−１ＢＢＬコーディング配列と正確に相補的である２、３、４、もしくは５ストレッチ以上の連続ヌクレオチドを含み、各々が近接するコーディング配列に対して相補的ではない１ストレッチの連続ヌクレオチドによって分離されている阻害性オリゴヌクレオチドは、４−１ＢＢＬ核酸の機能を阻害できる。一般に、各ストレッチの連続ヌクレオチドは、長さが少なくとも４、５、６、７、もしくは８ヌクレオチド以上である。非相補的な介入配列は、長さが１、２、３、もしくは４ヌクレオチドであってもよい。当業者であれば、センス核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの計算された融点を使用して、特定の標的核酸の発現を阻害するために許容されるミスマッチ度を容易に推定できる。本発明のオリゴヌクレオチドをベースとする４−１ＢＢＬ遮断薬には、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンス核酸またはリボザイムが含まれる。
【００３４】
４−１ＢＢＬ遮断薬は、４−１ＢＢＬの発現および／または活性を、例えば、２％、５％、１０％、２０％、４０％、６０％、８０％、９５％または１００％などの任意の量阻害または減少させる。４−１ＢＢＬの活性は、例えば、持続的ＴＮＦ産生についてアッセイする方法、４−１ＢＢＬがＴＬＲもしくはＴＲＡＦ６と相互作用するかどうかを判定する方法、および４−１ＢＢＬが細胞表面に局在するかどうかを判定する方法などの本明細書に記載した方法を含む当分野において公知の方法を使用して判定できるが、これらに限定されない。４−１ＢＢＬの発現は、さらにまた、４−１ＢＢＬ転写産物のレベルを測定するためのノーザンハイブリダイゼーションまたは４−１ＢＢＬポリペプチドのレベルを測定するためのウエスタンハイブリダイゼーションを含む当分野において公知の方法を用いて測定することもできるが、これらに限定されない。
【００３５】
様々なタイプの４−１ＢＢＬ遮断薬の例については、以下で詳細に考察する。
【００３６】
［４−１ＢＢＬ特異的抗体］
４−１ＢＢＬ遮断薬は、４−１ＢＢＬポリペプチドに対するアンタゴニスト抗体であり得る。用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、例えばモノクローナル抗体、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分を意味する。モノクローナル抗体は、特定の抗原エピトープと特異的に結合する抗体分子の集団である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分は、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）の２フラグメントを含む。抗４−１ＢＢＬ抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および／または完全ヒト抗体であり得るが、これらに限定されない。マウス抗体は、完全にマウス起源に由来する抗体、例えばマウス骨髄細胞およびマウスＢリンパ球の融合から生成したマウスハイブリドーマに由来する抗体である。キメラ抗体は、非ヒト起源、例えばマウスもしくは霊長類由来の可変領域、およびヒト起源由来の定常領域を有する抗体である。ヒト化抗体は、抗原結合領域、例えばマウス起源由来の相補性決定領域、およびヒト起源由来の残りの可変領域および定常領域を有する。完全ヒト抗体は、ヒト細胞に由来する、またはヒト抗体遺伝子を有するトランスジェニックマウスに由来する抗体である。
【００３７】
４−１ＢＢＬポリペプチドに対する抗体は、４−１ＢＢＬ特異的抗体であり、したがってそれは４−１ＢＢＬではないポリペプチドには結合せずに４−１ＢＢＬポリペプチドに結合することになる。４−１ＢＢＬ特異的抗体は、適正な４−１ＢＢＬの機能を妨害または遮断する点で、アンタゴニスト抗体である。例えば、図２Ａ〜Ｄを参照されたい。アンタゴニスト抗体は、例えば、２つより多い４−１ＢＢＬのオリゴマー化を妨害してもよく、炎症性サイトカインの産生が減少するように、持続的ＴＮＦ産生に関係する下流シグナリング分子、例えばＴＬＲもしくはＴＲＡＦ６への結合を遮断してもよい。例えば、そのようなアンタゴニスト抗体は、２つの４−１ＢＢＬと結合することができ、そしてサイトカイン産生を媒介するために必要とされる２つより多い４−１ＢＢＬの凝集体の形成を防止する。そのようなアンタゴニスト抗体は、さらにまた例えば、サイトカイン産生を媒介するために必要とされるＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９およびＴＲＡＦ６などの下流シグナリング分子への結合を妨害する部位で４−１ＢＢＬに結合することもできる。
【００３８】
抗４−１ＢＢＬ抗体がアンタゴニスト抗体であるかどうかは、本明細書に記載した方法を用いて判定することができる。例えば、ＴＮＦなどの炎症性サイトカインの産生は、抗体の存在下または非存在下で測定できる。抗体は、その存在が炎症性サイトカインの産生のレベルもしくは持続時間の減少を生じさせる場合にはアンタゴニスト抗体である。
【００３９】
抗体を生成する方法は、当分野において周知である。例えば、４−１ＢＢＬポリクローナル抗体は、適切な哺乳動物を単離４−１ＢＢＬポリペプチドもしくは４−１ＢＢＬポリペプチドの抗原性フラグメントを用いて免疫する工程によって調製できる。哺乳動物は、例えば、ウサギ、ヤギ、もしくはマウスであり得る。４−１ＢＢＬポリペプチドもしくは抗原性フラグメントは、組換えＤＮＡ技術を用いて発現させるか、化学合成によって調製するか、標準的なタンパク質精製技術を用いて精製することができる。免疫から適切な時間後に、抗体分子は哺乳動物から、例えば哺乳動物の血液もしくは他の液体から単離することができ、そしてさらに、硫酸アンモニウムを用いる沈降法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはプロテインＡを用いる親和性クロマトグラフィーを含む標準的手法を用いて精製することができるが、これらに限定されない。さらに、哺乳動物の抗体産生細胞を単離し、これを使用して４−１ＢＢＬモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を調製することができる。抗体分泌ハイブリドーマ細胞を調製するための手法は、当分野において公知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７（１９７５）およびＫｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）を参照されたい。４−１ＢＢＬモノクローナル抗体は、例えば、組換えＤＮＡ分子からの発現、または４−１ＢＢＬポリペプチドを使用する組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーのスクリーニングなどの当分野において公知の他の方法を用いて調製することもできる。
【００４０】
キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体を生成する方法もまた当分野において周知であり、例えば、組換えＤＮＡ技術に関係する方法が含まれる。キメラ抗体は、抗体分子の非ヒト可変領域およびヒト定常領域をコードする核酸からの発現によって生成できる。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６８５１（１９８４）を参照されたい。ヒト化抗体は、非ヒト抗原結合領域（相補性決定領域）ならびにヒト可変量域（抗原結合領域を含まない）およびヒト定常領域をコードする核酸からの発現によって生成できる。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−２４（１９８６）；およびＶｅｒｈｏｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−３６（１９８８）を参照されたい。完全ヒト抗体は、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子のみを発現する遺伝子組換えトランスジェニックマウスを免疫する工程によって生成できる。この場合、治療上有用なモノクローナル抗体は、さらに従来のハイブリドーマ技術を用いて入手できる。例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ＆  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたい。抗体の設計および産生に関係する核酸および手法は、当分野において周知である。例えば、Ｂａｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３：８７−９７（１９９４）；Ｂｅｒｄｏｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．４：２５６−６４（１９９５）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３−４６（１９８４）；Ｃａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：２７４−３１１（１９８６）；Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：３６０−６６（１９８９）；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１０９−２０（１９８４）；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１  ：５２２−２５（１９８６）；Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６０：１２５０−５６（１９８９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２３９−６５（１９９２）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ  ’Ｉ  Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ８１：６８５１−５５（１９８４）；Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：３８３３−３７（１９８９）；Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：４３７−６２（１９９２）；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  ＆  Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１２８−３２（２０００）；Ｈｕｓｔｏｎ  ＆  Ｇｅｏｒｇｅ，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．１０：１２７−４２（２００１）；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＆  Ｌｅ  Ｇａｌｌ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：３９−６０（２００４）を参照されたい。
【００４１】
［可溶性４−１ＢＢ］
４−１ＢＢＬ遮断薬はまた、可溶性４−１ＢＢ分子でもあり得る。４−１ＢＢは、活性化Ｔ細胞上に発現したＩ型膜貫通タンパク質のＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである。例えば、Ｗａｔｔｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２３−６８（２００５）を参照されたい。マウス４−１ＢＢの例は、アクセッション番号ＮＰ＿０３５７４２を付与してＧｅｎＢａｎｋで見いだすことができる以下の配列である。
【化５】
2010506921.tif 000007
【００４２】
ヒト４−１ＢＢの例は、アクセッション番号ＮＰ＿００１５５２を付与してＧｅｎＢａｎｋで見いだすことができる以下の配列である。
【化６】
2010506921.tif 000008
【００４３】
４−１ＢＢポリペプチドは、典型的には、マウスポリペプチドおよびヒトポリペプチドについて図１３に示したように、シグナル配列、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む。
【００４４】
可溶性４−１ＢＢは、これを生成する細胞に膜貫通タンパク質として付着しておらず、４−１ＢＢＬの活性を阻害および／または減少させることができる４−１ＢＢポリペプチドを意味する。例えば、可溶性４−１ＢＢは、全長４−１ＢＢの細胞外ドメインからなる単一ポリペプチドであってもよい。本明細書で使用するように、「全長４−１ＢＢ」は、それをコードする内因性の核酸を有する細胞によって発現したポリペプチドである。全長４−１ＢＢは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有することになる。全長４−１ＢＢは、シグナルペプチドを有していても有していなくてもよい。これとは対照的に、可溶性４−１ＢＢは、それが膜貫通タンパク質として細胞に付着していない限り、全長以外の任意の形態での４−１ＢＢである。可溶性４−１ＢＢポリペプチドの例は、全長ポリペプチドまたはそのＣ末端で例えば免疫グロブリン分子のＦｃフラグメント、例えばＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントなどの非関連ポリペプチドセグメント、または例えばＧＦＰ、ＨＡ、およびＦＬＡＧならびにＧＳＴなどの任意の従来のタンパク質タグもしくは融合成分と融合した４−１ＢＢの細胞外ドメインからなる融合ポリペプチドの細胞外ドメインに対応するポリペプチドである。可溶性４−１ＢＢは、実施例で考察したマウス４−１ＢＢ／Ｆｃなどの単一ポリペプチドもしくは二量体であり得る。二量体でもある可溶性４−１ＢＢの例は、実施例のセクションで考察したマウス４−１ＢＢ／ヒトＩｇ−Ｆｃポリペプチドである。
【００４５】
可溶性４−１ＢＢポリペプチドの例は、以下の配列を有するマウス４−１ＢＢの細胞外ドメインである。
【化７】
2010506921.tif 000009
【００４６】
可溶性４−１ＢＢポリペプチドの別の例は、以下の配列を有するヒト４−１ＢＢの細胞外ドメインである。
【化８】
2010506921.tif 000010
【００４７】
可溶性４−１ＢＢポリペプチドの他の例には、各々配列番号２０および２１に示した、マウス４−１ＢＢの最初の１８６アミノ酸またはヒト４−１ＢＢの最初の１８５アミノ酸が含まれる。
【化９】
2010506921.tif 000011
【化１０】
2010506921.tif 000012
【００４８】
可溶性４−１ＢＢポリペプチドは、ポリペプチドが４−１ＢＢＬの活性を阻害または減少させることができる限り、配列番号７、８、２０もしくは２１のＮ末端もしくはＣ末端でさらに１つ以上の追加のアミノ酸を有することができ、ポリペプチドが細胞によって生成される場合は、それは膜貫通タンパク質として細胞の膜内へは組み込まれない。例えば、可溶性４−１ＢＢポリペプチドは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒトＩｇＧのＦｃ部分、ヒスチジンタグ、または上記で考察したような任意の非関連アミノ酸配列に融合した配列番号７、８、２０もしくは２１からなる融合タンパク質であり得る。フラグメントが生物活性であり得る限り、即ちフラグメントが４−１ＢＢＬ活性を阻害または減少させることができる限りにおいて、可溶性４−１ＢＢポリペプチドは細胞外ドメインのフラグメント、例えば配列番号７、８、２０および２１のフラグメントでもあり得る。フラグメントが生物活性を有するかどうか、即ち、フラグメントが４−１ＢＢＬ活性を阻害または減少させることができるかどうかを判定する方法には、本明細書で考察かつ例示した方法、例えばＬＰＳに反応するマクロファージなどの細胞による炎症性サイトカイン産生を測定する方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
４−１ＢＢ、可溶性４−１ＢＢ、およびそれらの生物活性フラグメントは、任意の起源由来であり得る。例えば、これらは、マウス、ウサギ、ブタ、イヌ、ウシ、サル、またはヒトから単離することができる。それらは、例えば、ＣＨＯ、Ｓ２および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主細胞、または例えばブタもしくはサルもしくはウサギなどの宿主動物中の組換え核酸から発現させ、その後当業者には公知のタンパク質精製技術を用いて単離することができる。代替的には、それらはペプチド合成の従来の方法によって合成することができる。可溶性４−１ＢＢは、ペプチダーゼ消化による全長ポリペプチドの調製から入手できる。例えばマウス４−１ＢＢ−ヒトＩｇ−Ｆｃポリペプチドなどの融合タンパク質を調製する方法は、当分野において周知であり、例えば組換えＤＮＡ技術に関係する方法が含まれる。より詳細には、関連４−１ＢＢドメインをコードする核酸配列は、Ｆｃフラグメントをコードする核酸にライゲートさせ、次に適切な宿主細胞中で発現させることができる。４−１ＢＢをコードする核酸またはそれらの生物活性フラグメントをクローニングできる融合成分をコードする多数の発現ベクターは、市販品として入手できる。本発明者らが使用した可溶性４−１ＢＢは、１つの会社から購入した。
【００５０】
［４−１ＢＢＬ特異的アンチセンスＲＮＡ］
アンチセンスＲＮＡは、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって、４−１ＢＢＬの発現を特異的に減少させるために使用できる。アンチセンスＲＮＡは、４−１ＢＢＬをコードするセンス核酸に相補的である。例えば、アンチセンスＲＮＡは、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的であってもよく、ｍＲＮＡ配列に相補的であってもよい。アンチセンスＲＮＡは、全コーディング鎖に、またはその一部分のみに相補的であってもよい。アンチセンスＲＮＡは、４−１ＢＢＬをコードする核酸の非コーディング領域のすべてまたは一部に相補的であってもよい。非コーディング領域は、コーディング領域をフランキングする５’領域および３’領域、例えば５’非翻訳配列および３’非翻訳配列を含む。アンチセンスＲＮＡは、一般に長さが少なくとも６ヌクレオチドであるが、約８、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ヌクレオチド長であってもよい。もっと長いオリゴヌクレオチドもまた使用できる。アンチセンスＲＮＡは、当分野において公知の方法を用いて、例えば、アンチセンスＲＮＡをコードする発現ベクターからの発現、もしくは発現カセットからの発現によって調製できる。代替的には、アンチセンスＲＮＡは、天然型ヌクレオチドまたはＲＮＡの生物学的安定性を高める、もしくはアンチセンスＲＮＡとセンス核酸との間に形成された二本鎖の生理学的安定性を高めるように設計した修飾ヌクレオチドを用いる化学合成によって調製できる。修飾ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５オキシ酢酸、ウィブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−ｏｘａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄメチルエステル、ウラシル−５−ｏｘａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが含まれる。したがって、本発明のアンチセンスＲＮＡは、修飾ヌクレオチドならびに天然ヌクレオチドを含んでもよく、アンチセンスＲＮＡは、配列番号３および４に提供した配列に相補的である、上記で考察した任意の長さであってもよい。
【００５１】
［４−１ＢＢＬ特異的抗体］
低分子干渉ＲＮＡを使用すると、４−１ＢＢＬポリペプチドのレベルが減少するように４−１ＢＢＬの翻訳を特異的に減少させることができる。ｓｉＲＮＡは、配列特異的に転写後遺伝子サイレンシングを媒介する。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｈｏｔｔｏｐｉｃｓ／ｒｎａｉ／ｒｎａｉ＿ｍａｙ２００２＿ｐｒｉｎｔ．ｈｔｍｌ（最新検索、２００６年５月１０日）を参照されたい。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体に組み込まれると、ｓｉＲＮＡは、その複合体を相同性があるｍＲＮＡ転写産物に誘導し、これは次に複合体によって開裂されることによって、相同性がある内因性ｍＲＮＡ転写産物の開裂を媒介する。ｓｉＲＮＡは、Ｇタンパク質のｍＲＮＡ転写産物の任意の領域に対して同種であってもよい。相同性の領域は、長さが３０ヌクレオチド以下、好ましくは２５ヌクレオチド以下、およびより好ましくは長さが約２１〜２３ヌクレオチドであってもよい。ｓｉＲＮＡは、典型的には二本鎖であり、２つのヌクレオチド３’オーバーハング、例えば３’オーバーハンギングＵＵジヌクレオチドを有していてもよい。ｓｉＲＮＡを設計するための方法は、当業者には公知である。例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８（２００１）；Ｈａｒｂｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１３：８３−１０６（２００３）を参照されたい。典型的には、ＡＡから始まり、センスおよびアンチセンスのｓｉＲＮＡ鎖の両方について３’ＵＵオーバーハングを有し、およそ５０％のＧ／Ｃ含量を有する標的部位が選択される。ｓｉＲＮＡは、化学合成でき、またはインビトロでの転写によって作成でき、またはｓｉＲＮＡ発現ベクターもしくはＰＣＲ発現カセットから発現させることができる。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｂ／ｔｂ＿５０６ｈｔｍｌ（最新検索、２００６年５月１０日）を参照されたい。ｓｉＲＮＡが発現ベクターもしくはＰＣＲ発現カセットから発現させられる場合は、ｓｉＲＮＡをコードするインサートはｓｉＲＮＡヘアピン内へ折り畳まれるＲＮＡ転写産物として発現させることができる。したがって、ＲＮＡ転写産物は、３’末端でヘアピンのループならびにＵのストリングを形成するスペーサー配列によってその逆相補的アンチセンスＲＮＡ配列に結合しているセンスｓｉＲＮＡ配列を含むことができる。ヘアピンのループは、任意の適切な長さ、例えば長さが３〜３０ヌクレオチド、好ましくは長さが３〜２３ヌクレオチドのループであってもよく、そしてＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣおよびＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号９）を含む様々なヌクレオチド配列のループであってもよい。ｓｉＲＮＡは、さらにまた直接に、または導入遺伝子もしくはウイルスを介して導入した二本鎖ＲＮＡの開裂によって、インビボで生成することもできる。いくつかの生体内では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる増幅が起こる場合がある。
【００５２】
４−１ＢＢＬのｍＲＮＡ転写産物にハイブリダイズできるｓｉＲＮＡ配列の例には、以下の配列およびそれらの相補的配列が含まれる。
【化１１】
2010506921.tif 000013
【００５３】
それらの相補的配列は、以下のとおりである。
【化１２】
2010506921.tif 000014
【００５４】
マウス４−１ＢＢＬを標的とする低分子干渉ＲＮＡもまた含まれる。
５’−ＧＣＴＣＴＡＴＧＧＣＣＴＡＧＴＣＧＣＴ−３’（配列番号１４）
５’−ＧＣＡＡＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１５）
５’−ＧＣＵＣＵＡＵＧＧＣＣＵＡＧＵＣＧＣＵ−３’（配列番号３３）
５’−ＧＣＡＡＡＧＣＣＵＣＡＧＧＵＡＧＡＵＧ−３’（配列番号３４）
【００５５】
それらの相補的配列は、以下である。
ＡＧＣＧＡＣＴＡＧＧＣＣＡＴＡＧＡＧＣ（配列番号３５）
ＣＡＴＣＴＡＣＣＴＧＡＧＧＣＴＴＴＧＣ（配列番号３６）
ＡＧＣＧＡＣＵＡＧＧＣＣＡＵＡＧＡＧＣ（配列番号３７）
ＣＡＵＣＵＡＣＣＵＧＡＧＧＣＵＵＵＧＣ（配列番号３８）
【００５６】
本発明の追加のｓｉＲＮＡ配列には、配列番号１８および１９ならびにそれらの相補的配列、さらに以下が含まれる。
ＡＡＧＡＣＧＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＴＴ（配列番号４５）
ＡＡＧＡＧＧＣＣＧＧＣＧＧＧＡＵＣＧＵＣＧＴＴ（配列番号４６）
ＡＵＡＧＵＡＧＡＣＵＣＣＡＧＣＣＵＵＧＧＣＴＴ（配列番号４７）
ＡＵＵＣＣＧＡＣＣＵＣＧＧＵＧＡＡＧＧＧＴＴ（配列番号４８）
ＣＧＣＵＧＣＣＧＣＣＵＧＣＧＣＣＧＵＣＵＵＴＴ（配列番号４９）
ＣＧＡＣＧＡＵＣＣＣＧＣＣＧＧＣＣＵＣＵＵＴＴ（配列番号５０）
ＧＣＣＡＡＧＧＣＵＧＧＡＧＵＣＵＡＣＵＡＵＴＴ（配列番号５１）
ＣＣＣＵＵＣＡＣＣＧＡＧＧＵＣＧＧＡＡＵＴＴ（配列番号５２）
ＧＣＵＣＵＡＵＧＧＣＣＵＡＧＵＣＧＣＵＴＴ（配列番号５３）
ＧＣＡＡＡＧＣＣＵＣＡＧＧＵＡＧＡＵＧＴＴ（配列番号５４）
ＡＧＣＧＡＣＵＡＧＧＣＣＡＵＡＧＡＧＣＴＴ（配列番号５５）
ＣＡＵＣＵＡＣＣＵＧＡＧＧＣＵＵＵＧＣＴＴ（配列番号５６）
【００５７】
本発明のｓｉＲＮＡは、例えば血清中、血液循環中、または哺乳動物細胞中などの生理的条件下でその安定性を高めるように化学修飾することができる。本発明の化学修飾ｓｉＲＮＡは、コレステロールに共役したｓｉＲＮＡ、脂質に被包化されたｓｉＲＮＡ、および抗体に結合したｓｉＲＮＡであるｓｉＲＮＡが含まれる。本発明の低分子干渉ＲＮＡもまた親油性コンジュゲートを形成するために例えば高比重リポタンパク質などの他の疎水性脂質分子に共役させることができ、またはそれらはセンスもしくはアンチセンス鎖状で部分的ホスホロチオエート骨格および２’−Ｏ−メチル糖修飾を有していてもよい。ｓｉＲＮＡの親油性コンジュゲートには、例えばステアロイル（Ｃ１８）およびドコサニル（Ｃ２２）などの飽和アルキル鎖に共役したコンジュゲートならびにリトコール酸およびオレイルアミン（リトコール酸オレイル、Ｃ４３）のハイブリッドに共役したコンジュゲートが含まれる。
【００５８】
［４−１ＢＢＬ特異的リボザイム］
４−１ＢＢＬ遮断薬は、さらにまたリボザイムであってもよい。リボザイムは、例えば相同性領域を有するｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を開裂させることができる触媒活性を備えるＲＮＡ分子である。例えば、Ｃｅｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１５３２−１５３９（１９８７）；Ｃｅｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：５４３−５６８（１９９０）；Ｃｅｃｈ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：６０５−６０９（１９９２）；Ｃｏｕｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：５１０−５１５（１９９６）を参照されたい。リボザイムを使用すると、４−１ＢＢＬ  ｍＲＮＡ転写産物を触媒作用により開裂し、それによってｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆらの米国特許第５，６４１，６７３号明細書を参照されたい。４−１ＢＢＬ核酸に対する特異性を有するリボザイムは、配列番号３および４のヌクレオチド配列に基づいて設計できる。高度に配列特異的にＲＮＡ分子をトランスで開裂することができるリボザイムを設計および構築する方法は、当分野において開発され、報告されている。例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１（１９８８）を参照されたい。リボザイムは、リボザイム内に別個の「ハイブリダイゼーション」領域を作り上げることによって、特異的ＲＮＡに標的化することができる。ハイブリダイゼーション領域は、リボザイムが標的と特異的にハイブリダイズすることを可能にする標的ＲＮＡに相補的な配列を含有する。例えば、Ｇｅｒｌａｃｈらの欧州特許第３２１，２０１号明細書を参照されたい。標的配列は、配列番号３および４のヌクレオチド配列から選択した約１０、１２、１５、２０、もしくは５０連続ヌクレオチドのセグメントであってもよい。より長い相補的配列を使用すると、標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を高めることができる。リボザイムのハイブリダイゼーションおよび開裂領域は一体的に関連している場合がある；したがって、相補的領域を通して標的ＲＮＡにハイブリダイズすると、リボザイムの触媒領域は標的を開裂させることができる。代替的には、４−１ＢＢＬをコードするｍＲＮＡを使用すると、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択することができる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ  ＆  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８（１９９３）を参照されたい。
【００５９】
［他の４−１ＢＢＬ遮断薬］
４−１ＢＢＬ遮断薬にはまた、４−１ＢＢＬ発現もしくは活性に関係する他の分子の阻害剤が含まれ、それらにはこれらの分子の発現を減少させるオリゴヌクレオチドまたは分子自体の活性の阻害剤が含まれる。４−１ＢＢＬの発現もしくは活性に関係する分子には、例えば、ＮＦ−κＢ；ＣＲＥＢ；Ｃ／ＥＢＰ；ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９等のＴＬＲ；ＭｙＤ８８；ＴＲＩＦ；ｐ３８；Ｊｎｋ；Ｍｅｋ；およびＴＲＡＦ６が含まれる。これらの分子の発現を減少させるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドをベースとする４−１ＢＢＬ遮断薬について上述したものなどのオリゴヌクレオチドに類似する。これらは、ｓｉＲＮＡ（例、配列番号１８および１９）、アンチセンス核酸、または４−１ＢＢＬ発現もしくは活性に関係する選択した分子に対して向けられたリボザイムを含む。活性阻害剤には、例えば、ＮＦ−κＢ阻害剤であるスルファサラジン、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ−１３２、ｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０、Ｊｎｋ阻害剤であるＳＰ６００１２５、およびＭｅｋ阻害剤であるＰＤ９８０５９が含まれる。
【００６０】
［炎症を緩和させる］
４−１ＢＢＬ遮断薬を使用すると、炎症性疾患状態を防止または治療することができる。４−１ＢＢＬ遮断薬は、例えば、ＴＮＦもしくはＩＬ−６などの炎症性サイトカインの過剰産生を減少させることによって炎症を緩和させる。したがって、１つの実施形態では、本発明は、哺乳動物における炎症性サイトカインの産生を減少させるための方法を提供する。哺乳動物は、炎症状態にある哺乳動物、またはそのような状態になる危険性が高い哺乳動物であり得る。
【００６１】
炎症状態には、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、乾癬、強直性脊椎炎、クローン病、過敏性腸症候群、全身発症性若年性慢性関節炎、および骨粗鬆症が含まれる。炎症状態にある哺乳動物は、その状態の公知の症状に基づいて同定できるが、これらには限定されない。例えば、クローン病もしくは関節リウマチに罹患している哺乳動物は、同一種の非罹患哺乳動物に比較して、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１およびＴＮＦなどの前炎症性サイトカインの産生のレベルもしくは持続時間における増加を示すことがある。その増加は、例えば、５％、１０％、１５％、２０％、または２０％以上などの任意の量であってもよい。炎症状態の他の症状には、病理的炎症および関節破壊が含まれるが、これらには限定されない。炎症状態に対して危険な状態にある哺乳動物は、例えば、Ｖｙｓｅ  ＆  Ｔｏｄｄ，Ｃｅｌｌ  ８５：３１１−１８（１９９６）、Ｋｉｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：３１９−３３０（２００１）およびＲｉｏｕｘ  ＆  Ａｂｂａｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：５８４−９（２００５））において考察された遺伝子異常に基づいて同定できる。
【００６２】
４−１ＢＢＬ遮断薬は、数多くの方法で投与できる。投与経路の例には、非経口、静脈内、皮内、皮下、経口、吸入、経皮（局所）、経粘膜、および経直腸投与が含まれる。全身投与は、経粘膜または経皮手段によって行ってもよい。ポリペプチドをベースとする遮断薬は、例えば、必要に応じて、または医師の判断にしたがって、皮下注射によって投与できる。これらは、数時間にわたる静脈内注射によって注射することもできる。例えばアンチセンスもしくはｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドをベースとする４−１ＢＢＬ遮断薬は、ベクター内に挿入し、遺伝子療法ベクターとして使用できる。遺伝子療法ベクターは、静脈内注射、局所投与または定位注射によって被験者に送達できる。例えば、米国特許第５，３２８，４７０号明細書およびＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９１：３０５４（１９９４）を参照されたい。したがって、４−１ＢＢＬ遮断薬は、組織部位への直接注射によって被験者に投与することができ、またはインサイチューで生成することができる。代替的には、４−１ＢＢＬ遮断薬は、選択した細胞に標的化するために修飾し、その後全身投与することができる。例えば、アンチセンス分子は、選択された細胞表面上で発現する受容体もしくは抗原に結合するように修飾することができる。他の低分子タイプの遮断薬は、経口投与することができる。
【００６３】
４−１ＢＢＬ遮断薬は、単独で使用でき、または第２薬剤、例えば公知の抗炎症薬、例えばアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、エファリズマブ（Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標））、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、メトトレキセート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ）、およびオマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））と併用できる。
【００６４】
哺乳動物に投与すべき用量は、４−１ＢＢＬの発現もしくは活性を減少させるために適切な任意の量であってもよい。用量は、有効量またはその適切な画分であってもよい。これは、年齢、身体状態、サイズ、体重、治療される症状、症状の重症度、および任意の併用療法を含む個々の患者のパラメーターに左右される。適切な用量を決定する因子は当業者には周知であり、ルーチンの実験により対応することができる。例えば、物理化学的特性、毒性学的特性および薬物動態的特性は、標準の化学的アッセイおよび生物学的アッセイを用いて、さらに化学、薬理学および毒性学の分野において公知の数学モデリング技術を使用することによって決定することができる。治療有用性および投与方法は、そのような技術の結果から、そして適切な薬物動態モデルおよび／または薬力学的モデルを使用することによって外挿することができる。患者に投与すべき正確な量は、担当医師に委ねることになる。しかし、４−１ＢＢＬ遮断薬は、約０．０５〜約２，０００ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）、好ましくは約１〜約２００ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）の用量で経口または注射によって投与できる。オリゴヌクレオチドをベースとする遮断薬は、約０．０５〜約５００ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）、好ましくは約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）の用量で（例えば、経口または注射によって）投与できる。ヒト成人における用量範囲は、一般には４〜４０，０００ｍｇ／日、および好ましくは４０〜４，０００ｍｇ／日である。本発明の所定の薬剤は長時間作用型であるため、初日には８０〜４，０００ｍｇの開始用量で、そしてその後は２０〜１，０００ｍｇの低用量で投与するのが有利な場合がある。患者はさらに、医学的理由、心理的理由または実質的に任意の他の理由から低用量または耐用量を主張することがある。併用薬の成分として調製される第２薬剤の有効量は、第２薬剤の製造業者の推奨、担当医師の判断に従うことになるが、さらにＰＨＹＳＩＣＩＡＮ’Ｓ  ＤＥＳＫ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥに記載される量および投与法についてのプロトコールおよび管理要因によって誘導される。
【００６５】
治療方法の有効性は、障害の公知の徴候もしくは症状における改善について患者を監視することによって評価できる。例えば、炎症の改善は、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦもしくはＭＣＰ−１の産生などの前炎症性サイトカインの産生のレベルおよび持続時間を監視することによって検出できる。前炎症性サイトカインの産生のレベルもしくは持続時間の任意の減少、例えば５％、１０％、１５％、２０％または２０％以上の減少は、患者における改善を示している。
【００６６】
［４−１遮断薬の医薬組成物］
４−１ＢＢＬ遮断薬は、哺乳動物に投与するために適切な医薬組成物（本明細書では、本発明の医薬組成物）中に組み込むことができる。本発明の医薬組成物は、典型的には、活性な薬剤および医薬的に許容される担体を含む。本明細書で使用する語句「医薬的に許容される担体」は、当分野において哺乳動物への医薬的投与と適合することが公知である、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを意味している。任意の従来の媒質もしくは薬剤は、それらが活性化合物と不適合である場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用は企図されている。さらに、補助的活性化合物もまた、本医薬組成物中に含めることができる。例えば、本発明の医薬組成物は、上述したような第２の抗炎症薬をさらに含むことができる。
【００６７】
本発明の組成物および方法においては、治療有効量の遮断薬を使用できる。そのような治療有効量の遮断薬は、一般に、対象とする細胞もしくは組織、または哺乳動物中での４−１ＢＢＬ発現もしくは活性を減少させるために十分である。いくつかの実施形態では、遮断薬の治療有効量は、炎症を緩和させるために十分な量である。遮断薬の治療有効量の例は、上述のセクションに記載した用量である。したがって、４−１ＢＢＬ遮断薬は、約０．０５〜約２，０００ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）、好ましくは約１〜約２００ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）の用量で投与できる。オリゴヌクレオチドをベースとする遮断薬は、０．０５〜約５００ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）、好ましくは約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）の用量、例えば１、３、５ｍｇ／ｋｇで経口または注射によって投与できる。ヒト成人における用量範囲は、一般には４〜４０，０００ｍｇ／日、および好ましくは４０〜４，０００ｍｇ／日である。本発明のある特定の薬剤は長時間作用型であるため、初日には８０〜４，０００ｍｇの開始用量で、そしてその後は２０〜１，０００ｍｇの低用量で投与することが有利な場合がある。
【００６８】
本発明の医薬組成物は、ある特定の投与経路と適合するように調製される。非経口、皮内または皮下投与に使用される液剤もしくは懸濁剤は、（１）例えば注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくは他の合成溶媒などの無菌希釈剤、（２）例えばベンジルアルコールもしくはメチルパラベンなどの抗菌剤、（３）アスコルビン酸もしくは亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤、（４）エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、（５）酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩などのバッファおよび例えば塩化ナトリウムもしくはデキストロースなどの等張性を調整するための薬剤を含むことができる。ｐＨは、例えば塩酸もしくは水酸化ナトリウムなどの酸もしくは塩基を用いて調整できる。非経口製剤は、アンプル、ディスポーザブルシリンジもしくは複数回投与バイアル内に封入できる。
【００６９】
医薬組成物は、さらにまた４−１ＢＢＬ遮断薬の性質に基づいて調製および投与することができる。例えばｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドタイプの４−１ＢＢＬ遮断薬は、例えばＬｉ  ＆  Ｒｏｓｓｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：２６１−７２（２００５）に記載されているようなベクターをベースとする送達系を使用して、ｓｉＲＮＡならびにＳｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：３４７−５１（２００３）、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−１７８（２００４）、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１００２−１００７（２００５）、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：７０９−７１７（２００５）、およびＷｏｌｆｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：１１４９−１１５７（２００７）に記載されるようなコレステロールに結合した、脂質に被包化された、そして抗体に結合したものを含む化学修飾ｓｉＲＮＡの高圧静脈内注射を使用して送達できる。ｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドタイプの４−１ＢＢＬ遮断薬およびリボザイムもまた、例えば、Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｓｉＲＮＡ  ＣｏｍｐｌｅｘによってＮＯＮ−ＶＩＲＡＬ  ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｔｏｋｙｏ，２００５において記載されるようなカチオン性リポソームを用いて送達することができる。
【００７０】
注射のために適切な医薬組成物には、無菌注射液剤もしくは分散剤の即時の調製のための無菌水溶液もしくは分散液および無菌粉末が含まれる。静脈内投与には、適切な担体には、生理的食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝食塩水が含まれる。組成物は、無菌である上に製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、例えば細菌および真菌などの微生物による汚染に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）、および適切なそれらの混合物を含有する溶媒もしくは分散媒であってもよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、および分散剤の場合には必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって達成できる。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなどの様々な抗菌剤および抗真菌剤を使用して達成できる。例えば等張剤または吸収を遅延させる薬剤などの他の成分（例、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含むことができる。
【００７１】
無菌注射用液は、必要に応じて上述した成分の１つもしくは成分の組み合わせとともに、適切な溶媒中に所要量の活性な薬剤を組み込むことによって調製できる。分散液は、塩基性分散媒および上記で考察した他の必要な成分を含有する無菌ビヒクル中に活性化合物を組み込み、その後ろ過滅菌することによって調製できる。注射溶液を調製するための無菌散剤の場合には、好ましい調製方法には、有効成分および事前に無菌濾過した溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥法が含まれる。
【００７２】
経口組成物は、不活性希釈剤または食用担体を含むことができる。それらは、ゼラチンカプセル内に封入できる、または錠剤に圧縮できる。経口治療投与のためには、活性化合物は賦形剤とともに組み込まれてもよく、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用できる。経口組成物は、流体担体を用いて調製することもできる。医薬的に適合する結合剤および／またはアジュバント材料は、本組成物の一部として含むことができる。錠剤、ピル剤、カプセル剤、トローチ剤などは、同様の性質を備える以下の成分もしくは化合物のいずれかを含有することができる。結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガントガムもしくはゼラチン。賦形剤、例えばデンプンもしくはラクトース。錠剤崩壊剤、例えばアルギン酸もしくはコーンスターチ。潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム。流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素。甘味料、例えばスクロースもしくはサッカリン。または、香料添加剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジフレーバー。
【００７３】
吸入による投与において、本組成物は、加圧容器もしくは適切な噴射剤、例えば二酸化炭素などの気体を含有するディスペンサーからのエアロゾルスプレーまたはネブライザーの形態で送達することができる。
【００７４】
経粘膜もしくは経皮投与には、バリアへの浸透に適していることが当分野において公知である浸透剤を使用できる。これらには、例えば、鼻スプレーを用いて遂行できる、経粘膜投与のための洗浄剤、胆汁塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経皮投与には、活性化合物は、当分野において一般に公知である軟膏、膏薬、ゲル剤もしくはクリーム剤に調製される。
【００７５】
１つの実施形態では、本発明の薬剤は、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系などの制御放出製剤などの、薬剤を身体からの迅速な消失から保護する担体を用いて調製できる。生分解性生体適合性ポリマーを使用できる。これらには、エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸が含まれる。そのような製剤を調製する方法は、当業者には明らかである。ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染した細胞に標的化したリポソーム懸濁液を含むリポソーム懸濁液もまた、製薬学的に許容可能な担体として使用できる。これらは、当分野において公知の方法を用いて調製できる。
【００７６】
経口組成物または非経口組成物は、投与の容易さおよび用量の一様性のために用量単位形で調製できる。語句「用量単位形」は、治療される被験者における単位用量として適切な物理的に別個の単位を意味し、各単位は必要な医薬担体と会合させて所望の治療作用を生成するために計算された活性化合物の所定量を含有する。単位用量形における仕様は、活性化合物の固有の特性および達成すべき特定の治療作用に依存する。
【００７７】
遺伝子療法ベクターの医薬製剤は、許容できる希釈剤中に遺伝子療法ベクターを含むことができる、または遺伝子送達ビヒクルが中に包埋される徐放性マトリックスを含んでいてもよい。
【００７８】
本発明の医薬組成物は、投与についての説明書と一緒に、容器、パックもしくはディスペンサー内に含めることができる。そのような製品は、持続性炎症を治療するための４−１ＢＢＬ遮断薬を使用するための説明書を含む。さらに、そのような製品は、炎症を治療するための第２薬剤を使用するための説明書を含んでいてもよい。
【００７９】
［スクリーニングアッセイ］
本発明は、新規な４−１ＢＢＬ遮断薬についてスクリーニングを行う方法も含む。新規な４−１ＢＢＬ遮断薬は、４−１ＢＢＬオリゴマー化、４−１ＢＢＬと他のシグナリング分子、例えばＴＲＡＦ６もしくはＴＬＲと４−１ＢＢＬとの相互作用、または細胞膜への４−１ＢＢＬ転位を妨害する能力に基づいて同定できる。
【００８０】
４−１ＢＢＬのオリゴマー化を防止できる４−１ＢＢＬ遮断薬は、候補薬剤の存在下および非存在下において細胞をベースとするアッセイにおいて同定できる。その存在が２つの４−１ＢＢＬの結合を媒介する候補薬剤は、４−１ＢＢＬのオリゴマー化、即ち３つ以上の４−１ＢＢＬの凝集体の形成を防止する点で、４−１ＢＢＬ遮断薬である。一般に、２つの４−１ＢＢＬの結合は、酵母ツーハイブリッド系（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ  ＆  Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−４６（１９８９）を参照されたい）および例えばβ−ラクタマーゼ相補性アッセイなどのタンパク質フラグメント相補性アッセイ（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｒｆ．ｏｒｇ／ＪＢＴ／Ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＪＢＴ００１２／ｊｂｔ００１２．ｈｔｍｌ（最新アクセス、２００６年９月８日）を参照されたい）を含む標準方法を用いて検出できるが、これらに限定されない。酵母ツーハイブリッド系では、２つの４−１ＢＢＬ融合タンパク質は酵母細胞内で発現させることができる。１つの融合タンパク質は、ＤＮＡ−結合ドメインに融合した４−１ＢＢＬからなり、そして第２融合タンパク質は転写活性化ドメインに融合した４−１ＢＢＬからなる。４−１ＢＢＬの結合は、レポーター遺伝子の活性化を導き、酵母が規定培地上で増殖することを許容する。β−ラクタマーゼ相補性アッセイでは、２つのβ−ラクタマーゼ酵素フラグメントである、各々アミノ酸２６〜１９６および１９８〜２９０からなるＢｌａ（ａ）およびＢｌａ（ｂ）は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーによって４−１ＢＢＬと融合させることができる。１対の４−１ＢＢＬ−Ｂｌａ（ａ）および４−１ＢＢＬ−Ｂｌａ（ｂ）でトランスフェクトした細胞にはＣＣＦ２／ＡＭを装填する。ＣＣＦ２／ＡＭは細胞膜を通過して拡散し、細胞質エステラーゼはそのエステル官能基を加水分解し、β−ラクタマーゼ基質ＣＣＦ２を遊離させる。４０９ｎｍでのＣＣＦ２中のクマリン供与体の励起は、フルオレセイン受容体へのＦＲＥＴを導き、５２０ｎｍでの緑色蛍光の発光を発生させる。２つの４−１ＢＢＬの結合は、２つのβ−ラクタマーゼフラグメントを近接させ、結果として完全形のβ−ラクタマーゼを生じさせる。このβ−ラクタマーゼは、ＣＣＦ２をさらに加水分解し、供与体および受容体を分離させ、ＦＲＥＴ崩壊をもたらす。結果として、単離クマリン供与体は、４４７ｎｍで青色蛍光を発光する。これは、顕微鏡下で観察できる、またはフローサイトメーターで測定できる。
【００８１】
４−１ＢＢＬとシグナリング分子との相互作用を阻害または減少させることができる４−１ＢＢＬ遮断薬は、細胞をベースとする方法を用いて同定できる。そのようなアッセイの例は、本明細書に記載されている。４−１ＢＢＬとシグナリング分子、例えばＴＬＲもしくはＴＲＡＦ６との相互作用を阻害または減少させることができる４−１ＢＢＬ遮断薬を、（ｂ）候補薬剤を用いて同定し、そして次に４−１ＢＢＬがシグナリング分子と相互作用するかどうかを判定するための細胞をベースとする方法、代替的には、４−１ＢＢＬとＴＬＲもしくはＴＲＡＦ６との相互作用を阻害する薬剤は、４−１ＢＢＬ凝集について上述したものに類似する細胞をベースとするスクリーンを用いて同定できる。例えば、４−１ＢＢＬ−酵母ＤＮＡ結合タンパク質およびＴＲＡＦ６−酵母転写活性化因子ドメイン、またはＴＲＡＦ６−酵母ＤＮＡ結合タンパク質および４−１ＢＢＬ−酵母転写活性化因子ドメインを使用すると、上述したように酵母ツーハイブリッド系において使用できる。同様に、４−１ＢＢＬ−Ｂｌａ（ａ）およびＴＲＡＦ６−Ｂｌａ（ｂ）またはＴＲＡＦ  ６−Ｂｌａ（ａ）および４−１ＢＢＬ−Ｂｌａ（ｂ）からなる融合タンパク質を使用すると、上述した４−１ＢＢＬおよびＴＲＡＦ６の相互作用をアッセイすることができる。
【００８２】
細胞表面への４−１ＢＢＬ転位を阻害または減少させることができる４−１ＢＢＬ遮断薬は、４−１ＢＢＬを発現する細胞を選択した薬剤と接触させる工程と、４−１ＢＢＬが細胞膜に局在するかどうかを判定する工程とによって同定できる。そのような細胞は、例えば、ＲＡＷ２６４．７細胞株などの哺乳動物細胞であってもよい。
【００８３】
４−１ＢＢＬ遮断薬は、さらにまた細胞をベースとする炎症のモデル、または炎症の動物モデルを用いて同定することもできる。細胞をベースとするアッセイの例は、本明細書に記載されている。例えば、適切な刺激、例えばＬＰＳへの曝露に応答してＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１もしくはＭＣＰ−１などの炎症性サイトカインを発現する細胞が候補薬剤と接触させられる。候補薬剤と接触させられている細胞による炎症性サイトカインの産生は、候補薬剤と接触させられていない細胞内での産生と比較される。細胞をベースとするアッセイについては、例えば炎症を誘発するＬＰＳなどの刺激に応答して炎症性サイトカインを産生できる任意の細胞を使用できる。これらの細胞には、例えば、ＲＡＷ２６４．７細胞、一次マウスマクロファージ、および一次ヒト単球が含まれる。同様に、４−１ＢＢＬ遮断薬は、炎症の動物モデルを用いて同定できる。例えば、哺乳動物に候補薬剤を投与し、例えばＴＮＦもしくはＩＬ−６などの炎症性サイトカイン、または体温の上昇もしくは関節腫脹などの過剰持続性炎症と関連する他の観察可能な表現型の産生を測定し、候補薬剤が投与されていない類似動物の産生と比較することができる。
【００８４】
以下では、実施例において本発明をより詳細に説明するが、これらは特許請求項に記載した本発明の範囲を限定しない。
［実施例］
【実施例１】
【００８５】
［材料および方法］
マウスおよび試薬。ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、ＴＲＩＦ（ＬＰＳ２）ならびにＴＲＩＦおよびＭｙＤ８８の両方の欠損マウスは、Ｈｏｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２４：７４３−４８（２００３）、よびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１４４１−５２（２００３）に記載のとおりであった。４−１ＢＢＬ欠損マウスは、ＤｅＢｅｎｅｄｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：４８３３−４１（１９９９）に記載されるように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに戻し交配を８回行った。４−１ＢＢ欠損マウスは、Ｖｉｎａｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４２１８−２９（２００４）に記載されるように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに少なくとも戻し交配を７回行った。同一実験では性および年齢が適合するマウスを使用した。
【００８６】
腹腔マクロファージであるＲＡＷ２６４．７および２９３Ｔ細胞の調製および培養は、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１４４１−５２（２００３）によって記載されている。性別および年齢が一致する４−１ＢＢＬ欠損および野生型（ＷＴ）のマウスにＬＰＳを腹腔内注射した。血清サンプルを採取し、生存を観察した。動物の使用についてのプロトコールは、Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（スクリップス研究所）の施設内動物飼育使用委員会によって承認された。
【００８７】
以下の試薬を使用した。Ｐａｍ３ＣｙｓＳｅｒ（Ｌｙｓ）４（ＥＭＣ  ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ社）、大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４由来のＬＰＳ（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ホスホロチオエート安定化ＣｐＧ  ＤＮＡおよびＲ−８４８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）、ポリＩ：Ｃ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ペプチドグリカン（Ｆｌｕｋａ社）、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）、組換えマウス４−１ＢＢ−Ｆｃおよび抗４−１ＢＢＬ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）、４−１ＢＢＬに対するモノクローナル抗体（クローンＴＫＳ−１、ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、抗Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ社）、抗ＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＭｙＤ８８、ＴＬＲ４、およびＴＲＡＦ６に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４共役ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）、抗ＡＵ−１（Ｃｏｖａｎｃｅ社）、抗ＧＡＰＤＨ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、ブレフェルジンＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、およびスルファサラジン、ＳＢ２０３５８０、ＳＰ６００１２５、およびＰＤ９８０５９（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）。
【００８８】
プラスミド、組換えアデノウイルスおよびＰＣＲ。哺乳動物発現ベクターは、全長の細胞外ドメイン欠損（ΔＥｘｔ）、もしくは細胞質ドメイン欠損（ΔＣｙｔ）のヒト４−１ＢＢＬ  ｃＤＮＡを用いて構築した、またはそれらは全長のｐｒｏ７１２ｈｉｓ突然変異体の細胞外ドメイン欠損（ΔＥｘｔ）、もしくは細胞質ドメイン欠損（ΔＣｙｔ）のヒトＴＬＲ４  ｃＤＮＡを用いて構築した。これらのｃＤＮＡは、ＧＦＰ（ｐＥＧＦＰ−Ｃｌ中で）、Ｆｌａｇ（ｐｃＤＮＡ３中で）、またはＨＡ（ｐｃＤＮＡ３中で）のいずれかと融合させた。マウス４−１ＢＢＬを過剰発現する複製欠損アデノウイルス５（Ａｄｖ−４−１ＢＢＬ）、または対照として導入遺伝子を含まないアデノウイルス（Ａｄｖ−対照）は、Ｂｕｋｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１  ：１２９１−１２９６（２００４）においてヒト４−１ＢＢＬについて記載した「ツープラスミドレスキュー」法を用いて生成した。
【００８９】
半定量ＰＣＲは、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１４４１−５２（２００３）に記載されるように実施した。リアルタイムＰＣＲのために０．５μｇの全ＲＮＡを使用して、プライマーとしてｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２を用いてｃＤＮＡを調製した。リアルタイムＰＣＲ解析では、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。
【００９０】
全長の細胞質ドメイン、細胞外ドメイン欠損（ΔＥｘｔ）、もしくは細胞質ドメイン欠損（ΔＣｙｔ）のヒト４−１ＢＢＬ  ｃＤＮＡはＧＦＰ（ｐＥＧＦＰ−Ｃ１）、Ｆｌａｇ（ｐｃＤＮＡ３中で）、もしくはＨＡ（ｐｃＤＮＡ３中で）と融合させた哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。マウス４−１ＢＢＬを発現する複製欠損アデノウイルス−５−（Ａｄｖ−４−１ＢＢＬ）、または対照として導入遺伝子を含まないアデノウイルス（Ａｄｖ−対照）は、Ｂｕｋｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１２９１−１２９６（２００４）によって以前に記載の方法と同一の方法を用いて生成した。オリゴヌクレオチドは、マウス４−１ＢＢＬ（＃１、５’−ＧＣＴＣＴＡＴＧＧＣＣＴＡＧＴＣＧＣＴ−３’（配列番号１４）、＃２、５’−ＧＣＡＡＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１５））、マウス４−１ＢＢ（＃１、５’−ＡＣＣＴＧＴＡＧＣＴＴＧＧＧＡＡＣＡＴＴＴ−３’（配列番号１６）、＃２、５’−ＡＡＴＡＣＡＡＴＣＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＧＡ−３’（配列番号１７））、またはなし（対照）を標的とするｓｉＲＮＡ鎖を発現させるためにｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ内にクローニングした。ヒトＩＬ３Ｒ、ＴＬＲ２、３、４もしくは９  ｃＤＮＡ鎖は、ｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ発現ベクター内へクローニングした。
【００９１】
トランスフェクション。２９３Ｔ細胞は、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のプロトコールにしたがってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いた発現ベクターを用いてトランスフェクトし、細胞溶解物を２４時間後に調製した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションのためには、マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７は、ＴＲＡＦ６（＃１、’−ＧＧＡＵＣＡＵＣＡＡＧＵＡＣＡＵＵＧＵＴＴ−３’（配列番号１８）、＃２、５’−ＧＧＧＣＵＡＣＧＡＵＧＵＧＧＡＧＵＵＵＴＴ−３’（配列番号１９）、前設計したｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社）もしくはＰｏｌｙＡｍｉｎｅを用いる対照としてのＧＦＰ（Ａｍｂｉｏｎ社）を標的とするｓｉＲＮＡを用いて一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞は刺激因子を用いてインキュベートした。細胞溶解物および培養上清は２４時間後に調製し、ウエスタンブロット法によってＴＲＡＦ６のノックダウンおよびＥＬＩＳＡによるＴＮＦ−αの産生について分析した。
【００９２】
電気泳動移動度シフト、核ランオン、および酵母ツーハイブリッドアッセイ。核抽出物は、以前に記載されたプロトコールにしたがって調製した。［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよびＥＭＳＡを用いた特異的オリゴヌクレオチドの放射性標識は、Ｐｒｏｍｅｇａ社のプロトコールによって推奨されるように実施した。ＴＮＦ転写速度は、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０９０：２２−２８（１９９１）に記載されるように、ランオン分析によって測定した。ツーハイブリッドスクリーニングは、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：２９６−２９９（１９９７）に記載されるように、混合ヒト胎児脳および脾臓ｃＤＮＡライブラリーを用いて記載されるように実施した。細胞内タンパク質ドメイン（アミノ酸６５３〜８３９）の範囲に及ぶヒトＴｌｒ４の部分をｐＡＳ２ベクター内にサブクローニングし、ベイトとして使用した。５×１０の形質転換体についてスクリーニングを行った。
【００９３】
４−１ＢＢＬもしくは４−１ＢＢノックダウン安定性細胞株の生成。ＲＡＷ２６４．７細胞は、ｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ−４−１ＢＢＬ、４−１ＢＢ、または空ベクターを用いて安定的にトランスフェクトした。細胞を選択するために、細胞は、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有する培養培地中で２週間かけてインキュベートし、その後プールした。細胞は、Ｇ４１８を含有する培地中で維持した。
【００９４】
フローサイトメトリー。腹腔マクロファージは、氷上のＰＢＳ、５％  ＦＣＳ、０．０１％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳバッファ）中に懸濁させた。表面４−１ＢＢＬ発現は、フィコエリトリンと共役した４−１ＢＢＬ特異的抗体（クローンＴＫＳ−１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて評価した。全４−１ＢＢＬ発現は、細胞を固定し、固定−透過化バッファ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）中で固定かつ透過化した後に評価した。細胞を透過化バッファ中のフィコエリトリン共役４−１ＢＢＬ抗体で染色し、次にＦＡＣＳバッファを用いて洗浄した。アイソタイプ対照として、フィコエリトリン共役ラットＩｇＧ２ａ、κを使用した。
【００９５】
免疫組織化学的検査およびイムノアッセイ。腹腔マクロファージをカバーガラス上に播種し、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、次に０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中でインキュベートすることによって透過化した。２％  ＢＳＡを用いて遮断した後、細胞は抗マウス４−１ＢＢＬを用いてインキュベートし、次にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４−共役ロバ抗ヤギＩｇＧ中でのインキュベーションを行った。蛍光画像は、Ａｘｉｏのバージョン３．１ソフトウエア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社）を用いて可視化した。マクロファージ培養もしくはマウス血清由来の上清を採取し、ＴＮＦもしくはＩＬ−６の濃度を酵素結合性免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）によって製造業者のプロトコールにしたがって測定した。免疫沈降法および免疫ブロット法において使用した抗体は、図の説明文に記載した。実験手順は、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２６：３８２４−３４（２００６）に記載のとおりであった。
【００９６】
サイトカインの測定。マクロファージ培養もしくはマウス血清由来の上清を採取し、ＴＮＦ−αもしくはＩＬ−６の濃度を酵素結合性免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）によって製造業者のプロトコールにしたがって測定した。
【００９７】
統計解析。カプランマイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）プロットを構築し、対数順位検定を使用してマウスの生存率における差を測定した。血清ＴＮＦにおける統計学的有意差は、Ｓｔｕｄｅｎｔｔ検定によって測定した。
【実施例２】
【００９８】
［４−１ＢＢＬはＴＬＲ４相互作用タンパク質である］
酵母ツーハイブリッドスクリーンを使用して、ＴＬＲ４の細胞内ドメインと相互作用するタンパク質を同定した。酵母細胞は、ｐＡＳ２−ＴＬＲ４（６５３〜８３９ａａ）をｐＧＡＤ１０ベクター中の４−１ＢＢＬ（５〜２５４ａａ）（クローン１）、４−１ＢＢＬ（３〜２５４ａａ）（クローン２）、ｐ３８（（ＡＦ）、ｐ５３、もしくはラミンとともに用いてトランスフェクトした。「ベイトアンドプレイ（ｂａｉｔ  ａｎｄ  ｐｒｅｙ）」相互作用は、ヒスチジンが欠如する培地上での酵母増殖によって証明された。７つの陽性クローン中２つは細胞表面ＩＩ型膜貫通タンパク質である４−１ＢＢＬであることがわかった（Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２６３１−２６４１（１９９３）およびＡｌｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２２１９−２２２７（１９９４）を参照されたい）。４−１ＢＢＬは、ベイトベクター内でコードされたＴＬＲ４細胞内ドメインを含有する酵母細胞およびプレイベクター内でコードされた４−１ＢＢＬがＨｉｓ３レポーター遺伝子の相互作用媒介性発現に起因してヒスチジンが欠如する培地中で増殖できたという観察によって示されるように、ＴＬＲ４細胞内ドメインと相互作用するが、非関連タンパク質とは相互作用しない。（図１Ａ）。
【００９９】
この相互作用を確認するために、ＨＡ−４−１ＢＢＬを２９３細胞中でＦｌａｇ−ＴＬＲ４もしくはＦｌａｇ−ＩＬ−３受容体（ＩＬ−３Ｒ）を用いて、あるいは用いずに共発現させ、それらの関連を共免疫沈降法によって判定した。２９３Ｔ細胞を空ｐｃＤＮＡ３ベクター（対照）、または空ｐｃＤＮＡ３ベクター、Ｆｌａｇ−ＴＬＲ４もしくはＦｌａｇ−ＩＬ−３Ｒ発現ベクターと組み合わせた４−１ＢＢＬ発現ベクターを用いてトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクションの２４時間後に溶解した。細胞溶解物の２／３は抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降した。溶解物および免疫沈降物を抗Ｆｌａｇおよび抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロットすると、結果は、ＴＬＲ４は４−１ＢＢＬによって沈降するがＩＬ−３Ｒは沈降しないことを示している（図１Ｂ）。
【０１００】
４−１ＢＢＬとＴＬＲ４との相互作用を特性付けるために、以下の実験を実施した。
【０１０１】
イムノアッセイをＧＦＰ−４−１ＢＢＬ、およびＦｌａｇ−ＴＬＲ４、細胞質ドメインを含まないＦｌａｇ−ＴＬＲ４（ΔＣｙｔ）、細胞外ドメインを含まないＦｌａｇ−ＴＬＲ４（ΔＥｘｔ）、Ｆｌａｇ−ＩＬ−３Ｒ、Ｍｙｃ−ＴＬＲ４、もしくはＭｙｃ−ＴＬＲ４−Ｐ７１２Ｈ（Ｌｐｓｄ）のいずれかを発現するプラスミドを用いてトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を用いて実施した。細胞溶解物を抗Ｆｌａｇもしくは抗Ｍｙｃを用いて免疫沈降させ、細胞溶解物および免疫沈降物を指定の抗体を用いて免疫ブロットした。結果は、ＴＬＲ４細胞内ドメインはそれと４−１ＢＢＬとの相互作用に関係しているが、ＴＬＲ４  ＴＩＲドメイン内の突然変異（Ｌｐｓｄ、Ｐｒｏ７１２Ｈ）はＴＬＲ４と４−１ＢＢＬとの相互作用に実質的な作用を及ぼさなかったことを示している（図１Ｃ）。Ｌｐｓｄ突然変異はＴＩＲドメイン間の相互作用を崩壊させるが、ＭｙＤ８８はＴＩＲドメインの構造を妨害しないために（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：１１１−１５（２０００）を参照されたい）、ＴＬＲ４  ＴＩＲドメインの別個の部分が４−１ＢＢＬおよびＭｙＤ８８と相互作用する場合がある。
【０１０２】
さらに、イムノアッセイは、Ｆｌａｇ−ＴＬＲ４発現ベクターを、ＧＦＰ、ＧＦＰ−４−１ＢＢＬ、細胞質ドメインを含まないＧＦＰ−４−１ＢＢＬ（ΔＣｙｔ）、細胞外ドメインを含まないＧＦＰ−４−１ＢＢＬ（ΔＥｘｔ）、または細胞質ドメインのみを含むＧＦＰ−４−１ＢＢＬ（Ｃｙｔ）を発現するベクターと併用してトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を用いて実施した。細胞溶解物は、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降させ、抗Ｆｌａｇおよび抗ＧＦＰ抗体を用いて免疫ブロットした。結果は、４−１ＢＢＬがＴＬＲ４と相互作用するためには細胞質ドメインを含有していなければならず、そして細胞膜と関連していなければならないことを示したが、それは細胞質ドメインを含まない４−１ＢＢＬも細胞質ドメイン単独の４−１ＢＢＬもＴＬＲ４と共免疫沈降しなかったためである（図１Ｄ）。
【実施例３】
【０１０３】
［４−１ＢＢＬが欠損するマウスはＬＰＳ誘導性の死に対してより耐性である］
４−１ＢＢＬのインビボでの作用を測定するために、４−１ＢＢＬ欠損マウスを分析したが、結果は以下のとおりである。４−１ＢＢＬが欠損するマウスは、生存可能で繁殖性があり、健常である。これらのマウスは正常リンパ系器官を有していたが、ウイルスに対するＣＤ８＋  Ｔ細胞記憶の欠損を示す。野生型および４−１ＢＢＬ欠損のマウスにおける腹腔マクロファージの数は匹敵している（データは示していない）。４−１ＢＢＬ欠損マウスおよび野生型マウスへのＬＰＳの腹腔内注射は、４−１ＢＢＬ欠損マウスが野生型マウスに比較してＬＰＳの致死作用に対してより耐性であることを明らかにした（図２Ａ）。注目すべきことに、ＬＰＳが野生型マウスに及ぼす致死作用は、抗４−１ＢＢＬの投与によって軽減された（図２Ｂ、Ｃ）。４−１ＢＢＬ欠損のインビボでの作用は、マクロファージ中の４−１ＢＢＬ媒介性ＴＮＦ産生の欠損、および／または他の系統の細胞中での４−１ＢＢＬによる４−１ＢＢの活性化が欠如している結果であり得る。興味深いことに、それらはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＮＫＴ細胞をほとんど有していないため、４−１ＢＢが欠損するマウスもまたＬＰＳおよびガラクトサミンの注射によって誘発される死亡に対して耐性である。しかし、４−１ＢＢＬ欠損および４−１ＢＢ欠損マウスにおけるＬＰＳ耐性は、相違する原因の結果として生じるに違いないが、それは４−１ＢＢＬ欠損マウスが正常数のＮＫおよびＮＫＴ細胞を含有するためである（データは示していない）。
【実施例４】
【０１０４】
［４−１ＢＢＬは、持続的ＴＮＦ産生に関係している。］
Ａ．インビボ試験
４−１ＢＢＬがＴＬＲ４媒介性宿主反応に関係しているのかどうかを判定するために、４−１ＢＢＬ  ＫＯ（ノックアウト）および野生型マウスへ、以下のように用量０．５ｍｇの大腸菌ＬＰＳを惹起投与した。４−１ＢＢＬ−／−および野生型マウスに０．５ｍｇのＬＰＳを腹腔内注射し、２および６時間後に採取した血清中のＴＮＦレベルを測定した。
【０１０５】
結果は、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ産生が、野生型マウスと比較して４−１ＢＢＬ  ＫＯマウスにおいてはるかに低かったことを示している（図２Ｄ）。詳細には、ＬＰＳは血清中ＴＮＦ濃度の迅速な増加を誘導し、これはＬＰＳ注射１時間後にピークに達した。４−１ＢＢＬ欠損マウス中の血清ＴＮＦ濃度はＬＰＳ注射１時間後には野生型マウスにおける血清ＴＮＦ濃度とほぼ同一であったが、それより後の時点では野生型マウスにおける方が低かった（図２Ｄ）。これらのデータは以下で考察する、４−１ＢＢＬ欠損のみがＬＰＳ処置後の後期にＴＮＦ産生に影響を及ぼした点でインビトロデータ（図３Ａ）と一致している；しかし、ＬＰＳによるインビボＴＮＦ誘導は、インビトロにおける場合より急速であるように思われた。
【０１０６】
Ｂ．一次マクロファージを使用する試験
マクロファージはＬＰＳ惹起投与マウスにおけるＴＮＦの一次起源であるので（Ｂｅｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：５５２−５５４（１９８５））、４−１ＢＢＬ  ＫＯおよび野生型マウス由来の腹腔マクロファージを単離し、ＬＰＳ刺激後のＴＮＦ産生を測定した。
【０１０７】
最初に、４−１ＢＢＬがマクロファージ中でのＬＰＳ誘導性サイトカイン産生に及ぼす作用を、ＬＰＳ刺激２４時間後に４−１ＢＢＬ欠損マウスおよび野生型マクロファージの培地中でサイトカインを測定することによって判定した。４−１ＢＢＬ欠損マクロファージは、野生型マクロファージより少ないＴＮＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−１２を産生した（図３Ａ）。ＩＬ−１βの発現は、４−１ＢＢＬの欠損によって影響を受けなかった、またはほんの僅かにしか影響を受けなかった（図３Ａ）。４−１ＢＢＬ欠損マクロファージはＩＬ−１βを用いた刺激後に野生型量のＩＬ−６を産生したが、これは４−１ＢＢＬがＬＰＳ誘導性細胞サイトカイン応答に選択的に関係していることを示唆している（図３Ａ）。
【０１０８】
さらに、ＬＰＳ誘導の６、１２および１８時間後のＴＮＦ産生についてもまた測定した。４−１ＢＢＬ−／−および野生型マウス由来の腹腔マクロファージを６ウエル培養皿中で１ウエルに付き２×１０６の密度でプレーティングし、次にＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で処置した。培地中のＴＮＦレベルは、６、１２および１８時間後に測定した。興味深いことに、ＴＮＦ産生はＬＰＳ刺激の初期３時間中には４−１ＢＢＬ  ＫＯマクロファージ中で正常であったが、この時点後にはほぼ完全に消失し（図３Ｂ）、これはＴＮＦ産生におけるそれ以上の、即ちＬＰＳ刺激後のそれ以降の時間中に増加を刺激するためには４−１ＢＢＬが必須であることを示している。
【０１０９】
４−１ＢＢＬは、最初に共刺激機能を有するＴ細胞表面受容体である４−１ＢＢのリガンドとしてクローニングした（Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：２６３１−２６４１（１９９３）を参照されたい）。４−１ＢＢはマクロファージ中でも発現するので、４−１ＢＢがＬＰＳ処置細胞中での４−１ＢＢＬ媒介性ＴＮＦ発現に関係するかどうかについて試験した。以下の実験は、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ産生に４−１ＢＢが関係していることを判定するために実施した。
【０１１０】
予想外にも、４−１ＢＢＬが持続的なＬＰＳ誘導性のＴＮＦ産生を促進するために４−１ＢＢの存在は必要とされなかったが、それはＬＰＳ誘導性ＴＮＦの量が野生型および４−１ＢＢ欠損のマクロファージにおいて類似していたためである（図３Ｃ）。このため、４−１ＢＢＬ−４−１ＢＢ相互作用はマクロファージ中で発生しない、またはそれらは単純にマクロファージのＴＮＦ産生を維持することに役割を果たさない。
【０１１１】
Ｃ．ＲＡＷ２６４．７マクロファージを使用する試験
マクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７における４−１ＢＢＬの機能が一次マクロファージ細胞における機能に類似するかどうかを判定するために、ｓｉＲＮＡを使用して以下のように４−１ＢＢＬ発現をノックダウンさせた。簡潔に述べると、ＲＡＷ２６４．７細胞は、対照ｓｉＲＮＡ、または４−１ＢＢＬ−ｓｉＲＮＡ＃１もしくは＃２を含有するｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒを用いて安定的にトランスフェクトした。４−１ＢＢＬのタンパク質レベルは、免疫ブロット法によって測定した。ＴＮＦ産生は、（１）ＬＰＳを用いて３、９および２４時間にわたって処置した対照および４−１ＢＢＬノックダウン細胞中で、ならびに（２）ペプチドグリカン（ＰＧ、１０μｇ／ｍＬ）、ポリＩ：Ｃ（２５μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣｐＧ（５μｇ／ｍＬ）、もしくは未処置培養培地（なし）を用いて２４時間かけて処置した対照細胞および４−１ＢＢＬノックダウン細胞中で測定した。結果は、いずれのｓｉＲＮＡもＲＡＷ２６４．７細胞中での４−１ＢＢＬ発現を効果的にノックダウンし（図４Ａ）、ＬＰＳおよび他のＴＬＲリガンド誘導性ＴＮＦ産生を阻害した（図４ＢおよびＣ）ことを示し、したがって４−１ＢＢＬの役割はＲＡＷ２６４．７細胞中および一次マクロファージ細胞中において同一であることを示している。４−１ＢＢＬはＲＡＷ２６４．７細胞中でのＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化には何の役割も及ぼさないが、それはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）を用いて１５、３０、４０、５０、６０および９０分間かけて処置した４−１ＢＢＬノックダウンＲＡＷ細胞が同等のＩ−κＢ−α分解を示したためである（図４Ｄ）。
【０１１２】
次に、ＲＡＷ２６４．７細胞中での４−１ＢＢ発現を以下のとおりにｓｉＲＮＡを用いてノックダウンさせた。ＲＡＷ２６４．７細胞は、対照ｓｉＲＮＡ、４−１ＢＢＬ−ｓｉＲＮＡ＃１もしくは＃２を含有するｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒを用いて安定的にトランスフェクトした。４−１ＢＢ  ｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲによって試験した。ＴＮＦ産生は、２４時間にわたるＬＰＳ処置後に対照および４−１ＢＢＬノックダウン細胞中で測定した。ｓｉＲＮＡはＲＡＷ２６４．７細胞中では４−１ＢＢを極めて効果的にノックダウンさせたが、このノックダウンはＬＰＳ誘導性ＴＮＦ産生には影響を及ぼさなかった（図５Ａ〜Ｂ）。４−１ＢＢはマクロファージ中でのＬＰＳ誘導性ＴＮＦ産生には関係していないに違いないので、４−１ＢＢは持続的ＴＮＦ産生の調節において４−１ＢＢＬとの関連を有していない。まとめると、ＬＰＳ処置マクロファージ中でのＴＮＦ産生を持続させることにおける４−１ＢＢ非依存性機能は、ｓｉＲＮＡを用いて４−１ＢＢＬおよび４−１ＢＢをノックダウンさせることによってＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞株においても観察された（図４Ａ〜Ｃおよび図５  Ａ〜Ｂ）。
【０１１３】
Ｄ．転写試験
４−１ＢＢＬが転写および／または翻訳後段階でのＴＮＦ発現に影響を及ぼすかどうかを判定するために、４−１ＢＢＬ欠損マウスおよび野生型マクロファージ中でのＴｎｆ  ＲＮＡをＬＰＳ処置の様々な期間の後に測定した（図３Ｄ）。ＴＮＦ  ｍＲＮＡの発現は、ＬＰＳ刺激の２時間後に４−１ＢＢＬ欠損マウスおよび野生型マクロファージにおいて類似量でピークに達した。しかしＬＰＳ刺激後の後期には４−１ＢＢＬ欠損マウスにおけるＴＮＦ  ｍＲＮＡは野生型マクロファージ中よりはるかに少なかった（図３Ｄ）。これらのデータはＴＮＦタンパク質データ（図３Ｂ）と一致し、４−１ＢＢＬがＴｎｆ  ｍＲＮＡ転写産物の発現に影響を及ぼすことを示している。
【０１１４】
４−１ＢＢＬがＴｎｆの転写に影響を及ぼすかどうかを判定するために、核ランオン分析を実施した。ＬＰＳは、野生型および４−１ＢＢＬ欠損のマクロファージ両方においてＬＰＳ刺激１時間後にＴｎｆ転写を誘発した。しかしＴｎｆ転写はＬＰＳ処置後の後期には４−１ＢＢＬ欠損マクロファージ中では減少した（図３Ｅ）。
【０１１５】
４−１ＢＢＬ欠損マクロファージ中のＬＰＳ刺激後の後期において見いだされた低いＴｎｆ  ｍＲＮＡ量もまたｍＲＮＡ安定性の変化の結果として生じたのかどうかを判定するために、本発明者らは、ＬＰＳ刺激３時間後の４−１ＢＢＬ欠損マウスおよび野生型マクロファージ中でのＴｎｆ  ｍＲＮＡの半減期を測定した。４−１ＢＢＬ欠損は、Ｔｎｆ  ｍＲＮＡの安定性に実質的な影響を及ぼした（図３Ｆ）。このため、４−１ＢＢＬは、ＴＮＦ産生の転写および翻訳後調節の両方に影響を及ぼす。
【０１１６】
４−１ＢＢＬ欠損がＮＦ−κＢおよび他の転写因子のＬＰＳ誘導性活性化に影響を及ぼすかどうかについては、以下のように電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって判定した。４−１ＢＢＬ−／−および野生型マクロファージをＬＰＳにより１、２、４、８および１２時間かけて刺激し、次に核抽出物調製のために採取した。ＥＭＳＡは、放射性標識プローブを用いて実施した。結果は、４−１ＢＢＬ欠損が２時間後にピークに達する早期応答であるＬＰＳ誘導性ＮＦ−ｋＢ活性化に影響を及ぼさないことを示している（図３Ｇ）。これは、初期３時間中には４−１ＢＢＬ欠損によってＬＰＳ誘導性ＴＮＦ産生が影響を受けなかったことを示す図３Ｂのデータと一致している。４−１ＢＢＬ欠損はさらにまたＬＰＳ誘導性ＡＰ−Ｉ活性にも大半、または全く影響を及ぼさなかった（図３Ｇ）。これとは対照的に、ＬＰＳ刺激の８時間後に発生したＬＰＳ誘導性ＣＲＥＢおよびＣ／ＥＢＰ活性化は、４−１ＢＢＬ欠損によって有意に阻害された（図３Ｇ）。低下したＣＲＥＢおよびＣ／ＥＢＰ活性化は、４−１ＢＢＬ欠損マクロファージ中での持続的ＴＮＦ産生における欠損に帰すことができる。
【０１１７】
ＬＰＳ誘導性シグナリング経路、ＮＦ−κＢおよびＭＡＰキナーゼ経路を試験するために、野生型および４−１ＢＢＬ  ＫＯマウス由来の腹腔マクロファージをＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で０．５、１、２、４および６時間かけて処置し、細胞溶解物を抗ＩκＢ−α、抗ホスホ−ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）、抗ホスホ−ＪＮＫ（ｐ−ＪＮＫ）、抗ホスホ−ｐ３８（ｐ−ｐ３８）、抗４−１ＢＢＬ、もしくは抗ＧＡＰＤＨ抗体で免疫ブロットした。結果は、ＮＦ−ｋＢの阻害剤（ＩκＢ−α）の分解速度は４−１ＢＢＬ  ＫＯおよび野生型の細胞中で同一であったが（図３Ｈ）、４−１ＢＢＬ  ＫＯ細胞中のＥＲＫ１／２、ＪＮＫ１／２、およびｐ３８  ＭＡＰキナーゼ活性化（リン酸化）のレベルは野生型細胞におけると同等であるか僅かに低かったことを示している（図３Ｈ）。
【０１１８】
したがって、ＴＬＲ４の下流の早期シグナルは４−１ＢＢＬ欠損による影響を受けないと思われ、シグナリング経路（図３Ｈ）および転写因子（図３Ｇ）の活性化の分析から得られたデータは、ＴＮＦ産生の分析（図３Ｂ）から得られたデータと一致している。さらに、これはＴＬＲ４の早期シグナリングが４−１ＢＢＬノックアウトマクロファージ中では無傷であるという見解を支持している。
【実施例５】
【０１１９】
［４−１ＢＢＬはＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４およびＴＬＲ９と相互作用し、マクロファージ中でのＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４およびＴＬＲ９媒介性ＴＮＦ産生に関係している］
４−１ＢＢＬがＴＬＲ４媒介性細胞応答に選択的に関係しているかどうかを判定するために、以下のようにＨＡ−４−１ＢＢＬをＦｌａｇ−ＴＬＲ２、Ｆｌａｇ−ＴＬＲ３、Ｆｌａｇ−ＴＬＲ４、もしくはＦｌａｇ−ＴＬＲ９と共発現させた。２９３Ｔ細胞は、Ｆｌａｇ−ＴＬＲ２、Ｆｌａｇ−ＴＬＲ３、Ｆｌａｇ−ＴＬＲ４、もしくはＦｌａｇ−ＴＬＲ９と一緒に、空（対照）またはＨＡ−４−１ＢＢＬの発現ベクターを用いてトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクションの２４時間後に溶解させた。細胞溶解物は抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫ブロットした、または抗ＨＡを用いて免疫沈降させ、次に抗ＨＡおよび抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫ブロットした。結果は、試験した全ＴＬＲが、共免疫沈降アッセイにおいて４−１ＢＢＬによって沈降したことを示している（図６Ａ）。この共免疫沈降は特異性を有するが、それはＦｌａｇ−ＩＬ−３Ｒが４−１ＢＢＬと共免疫沈降しなかったためである（図６Ａ）。
【０１２０】
４−１ＢＢＬがＴＬＲ２、３、４、もしくは９媒介性細胞応答に関係しているかどうかを判定するために、以下の実験を実施した。野生型および４−１ＢＢＬ−／−マクロファージは、Ｐａｍ３（１μｇ／ｍＬ）、ポリＩ：Ｃ（２５μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、Ｒ８４８（１００ｎＭ）、ＣｐＧ（５μｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）、または未処置培養培地（なし）を用いて処置した。ＴＮＦ産生は、処置２４時間後に測定した。結果は、ＴＮＦのＰａｍ３（ＴＬＲ２リガンド）、ポリＩ：Ｃ（ＴＬＲ３リガンド）、Ｒ８４８（ＴＬＲ７＆８リガンド）、ＣｐＧ（ＴＬＲ９リガンド）誘導性産生が４−１ＢＢＬ  ＫＯ細胞中では減少したことを示している（図６Ｂ）。この作用はＴＬＲ特異的であったが、それはＩＬ−１β誘導性ＴＮＦ産生が４−１ＢＢＬ  ＫＯ細胞中では正常であったためである（図６Ｂ）。このため、４−１ＢＢＬは、すべてではなくても多数の異なるＴＬＲのシグナリングに関係している。
【実施例６】
【０１２１】
［ＬＰＳ処置マクロファージ中での持続的ＴＮＦ産生のためには４−１ＢＢＬの誘導および細胞表面局在が必要とされる］
４−１ＢＢＬは大半の組織中では検出不能であり、マクロファージ中および樹状細胞中でのみ低レベルが発現する（Ｆｕｔａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：２７５−２８６（２００２）を参照されたい）。ＬＰＳ処置マクロファージ中での持続的ＴＮＦ産生において４−１ＢＢＬが果たす役割を分析するために、野生型、ＴＬＲ４−／−、ＭｙＤ８８−／−、およびＴＲＩＦ−／−マウスから単離したマクロファージをＬＰＳで０．５、１、２、４、および８時間かけて処置した。４−１ＢＢＬタンパク質は、抗４−１ＢＢＬ抗体を用いた免疫ブロット法によって分析した。ＧＡＰＤＨをローディング対照として使用した。結果は、ＬＰＳがマクロファージ中での４−１ＢＢＬの迅速な発現を誘導し、４時間後にピークに達することを示している（図７Ａ、左側の１〜５レーン、または全パネルの１〜６レーン）。４−１ＢＢＬ誘導のタイミングは、４−１ＢＢＬノックアウトマクロファージ中で低下した持続的ＴＮＦ産生と明確に相関している（図３Ｂ）。ＬＰＳ誘導性４−１ＢＢＬ発現は、ＴＬＲ４−／−、ＭｙＤ８８−／−、およびＴＲＩＦ−／−マクロファージ中では低下しているために、ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、およびＴＲＩＦ依存性である（図７Ａ）。４−１ＢＢＬ発現は、試験した全ＴＬＲリガンドによって誘導されたが、ＩＬ−１βによっては誘導されなかった（図８Ａ〜Ｆ）。４−１ＢＢＬはその合成後に（おそらくはグリコシル化によって）翻訳後修飾されると思われるが、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でシフトしたタンパク質バンドが観察されたためであった（図７Ａ）。
【０１２２】
４−１ＢＢＬをコードする遺伝子のプロモーターは多数のＮＦ−κＢ結合部位を含有し、そしてＬＰＳ誘導性４−１ＢＢＬ  ｍＲＮＡはＮＦ−κＢ阻害剤であるスルファサラジン（図７Ｂ）またはプロテアソーム阻害剤であるＭＧ−１３２（データは示していない）によって効果的に阻害された。ｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０、Ｊｎｋ阻害剤ＳＰ６００１２５、およびＭｅｋ阻害剤ＰＤ９８０５９もまた４−１ＢＢＬ発現し対しある程度の阻害作用を示していた（図７Ｂ）。ＬＰＳ誘導性の４−１ＢＢＬ  ｍＲＮＡ（Ｔ１／２＝６７分間）は非刺激マクロファージ中でアデノウイルスベクターによって発現した４−１ＢＢＬ  ｍＲＮＡ（Ｔ１／２＝３３分間）よりはるかに安定していたが、これはｍＲＮＡ安定性におけるＬＰＳ誘導性変化もまたＬＰＳ誘導性４−１ＢＢＬ発現に関係していた（図７Ｃ）。
【０１２３】
野生型マウス由来のＬＰＳ処置腹腔マクロファージ中での４−１ＢＢＬ発現は、抗４−１ＢＢＬ抗体を用いるフローサイトメトリーによって分析した。アイソタイプ抗体を対照として使用した。全４−１ＢＢＬを測定するためには０．１％サポニンを用いる透過化を使用した。結果は、ＬＰＳ誘導性４−１ＢＢＬの大半が細胞表面上に局在することを示している（図７Ｄ）。
【０１２４】
ＴＮＦの発現を調節するためには細胞表面上に新規に合成した４−１ＢＢＬが局在する必要があるかどうかを判定するために、腹腔マクロファージを１時間かけてブレフェルジンＡ（３μｇ／ｍＬ）を用いて、あるいは用いずにプレインキュベートし、次に指定の時間かけてＬＰＳで処置した。免疫染色は抗４−１ＢＢＬ抗体を用いて実施した。４−１ＢＢＬおよびＴＮＦ  ｍＲＮＡは、半定量ＰＣＲによって分析した。ＧＡＰＤＨを対照として使用した。ブレフェルジンＡは、小胞体からゴルジ装置へのその転位を阻害することによって細胞表面へのタンパク質転位を遮断する特異的阻害剤である（Ｋｌａｕｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１６：１０７１−１０８０（１９９２）を参照されたい）（図７Ｅ）。新規に合成した４−１ＢＢＬの細胞表面への転位の遮断は、４−１ＢＢＬ  ｍＲＮＡにおけるＬＰＳ誘導性増加に影響を及ぼさなかった（図７Ｆ）。ブレフェルジンＡ処置は１時間後のＬＰＳ誘導性ＴＮＦ  ｍＲＮＡに影響を及ぼさなかったが、２、４および６時間後のＴＮＦ  ｍＲＮＡを減少させたので（図７Ｆ）、これは４−１ＢＢＬの誘導のみではなく細胞表面局在もまた持続的ＴＮＦ産生のために必要とされることを示唆している。
【実施例７】
【０１２５】
［４−１ＢＢＬの発現および架橋結合はＴＮＦ産生を誘発する］
ＬＰＳ処置マクロファージ中での持続的ＴＮＦ産生のためには４−１ＢＢＬの誘導が必要とされるので、４−１ＢＢＬの過剰発現がＴＮＦ産生を誘発できるかどうかを試験した。４−１ＢＢＬは、Ｂｕｋｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１２９１−１２９６（２００４）に記載されるように、アデノウイルス媒介性遺伝子送達によってマクロファージ中で発現させた。簡潔に述べると、マクロファージは、なし（対照）もしくは４−１ＢＢＬをコードする様々な用量のアデノウイルスで感染させ、４−１ＢＢＬの発現を抗４−１ＢＢＬ抗体を用いて免疫ブロット法によって測定した。ウイルス感染２４時間後の培地中のＴＮＦレベルを測定した。結果は、４−１ＢＢＬ発現が用量依存的にＴＮＦ産生を誘導したことを示している（図９Ａ）。ＴＮＦ誘導は、対照ウイルスで感染させた細胞の培地では検出可能なＴＮＦが存在しなかったので、４−１ＢＢＬ特異的であった。４−１ＢＢＬ発現によるＴＮＦの誘導は、ＴＮＦ産生が４−１ＢＢＬをコードするアデノウイルスで感染させた４−１ＢＢ欠損マウスおよび野生型マクロファージにおいて類似していたため、４−１ＢＢを必要としなかった。
【０１２６】
４−１ＢＢＬ過剰発現によって媒介されたＴＮＦ産生がＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、およびＴＲＩＦ依存性であるかどうかを試験するために、ＴＬＲ４−／−およびＴＲＩＦ−／−マクロファージを対照もしくは４−１ＢＢＬを発現するウイルスで感染させ、細胞中の４−１ＢＢＬレベルおよび培地中のＴＮＦレベルを測定した。結果は、４−１ＢＢＬ発現によるＴＮＦ産生の誘導が部分的にはＴＲＬ４−／−マウスから単離したマクロファージ中では低下していることを示し（図９Ｃ）、これはＴＬＲ４に加えて、４−１ＢＢＬと相互作用できる他のＴＬＲもまた４−１ＢＢＬ媒介性ＴＮＦ産生に関係する場合があることを示唆している。実際に、４−１ＢＢＬは、ＴＬＲ２および他のＴＬＲとそれらが２９３Ｔ細胞中で共発現した場合には相互作用し（図６Ａ）、４−１ＢＢＬ過剰発現によって誘導されたＴＮＦ産生はＴＬＲ２欠損マクロファージ中では減少した（図９Ｄ）。これらの結果は、４−１ＢＢＬ媒介性のＴＮＦ産生に複数のＴＬＲが関係しているという解釈を支持している。ＴＬＲが関係しているにもかかわらず、ＴＲＩＦの欠損は４−１ＢＢＬ誘導性ＴＮＦ産生には何の影響も及ぼさなかった（図９Ｅ）。ＭｙＤ８８マウスから単離したマクロファージはアデノウイルスによって効果的に感染させることができないため、４−１ＢＢＬ誘導性ＴＮＦ産生におけるＭｙＤ８８の必要性に関しては別の方法によって対処しなければならない（以下を参照されたい）。
【０１２７】
４−１ＢＢＬは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーである（Ｗａｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２３−６８（２００５）を参照されたい）。４−１ＢＢＬは、それが機能するためには三量体が必要とされる点でこのスーパーファミリーの他のメンバーと類似していてもよい（Ｒａｂｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４１４７２−４１４８１（２００５）を参照されたい）。この可能性を試験するために、野生型マクロファージを４−１ＢＢ−Ｆｃキメラ（４−１ＢＢのジスルフィド結合ホモ二量体）、抗Ｆｃ抗体、または４−１ＢＢ−Ｆｃおよび抗Ｆｃを併用して処置し、次に培地中のＴＮＦレベルを測定した。より詳細には、マクロファージをヤギ抗ヒトＦｃ抗体（抗Ｆｃ、１．５μｇ／ｍＬ）、マウス４−１ＢＢ−ヒトＩｇ−Ｆｃドメイン融合タンパク質（４−１ＢＢ−Ｆｃ、５μｇ／ｍＬ）、４−１ＢＢ−Ｆｃおよび抗Ｆｃを併用して、または未処置培養培地を用いて処置した。培地中のＴＮＦレベルは２４時間後に測定した。結果は、４−１ＢＢ−Ｆｃは２つの４−１ＢＢＬ分子を架橋結合させることはできるが、ＴＮＦ産生を誘導しなかったことを示している（図９Ｆ）。その後の４−１ＢＢ−Ｆｃと抗Ｆｃ抗体との架橋結合はＴＮＦ産生を誘導したが、抗Ｆｃ抗体単独では何の作用も及ぼさなかった（図９Ｆ）。ＴＮＦ産生を誘発するためには、２つより多い４−１ＢＢＬ分子の架橋結合が必要とされると思われる。架橋結合誘導性ＴＮＦ産生における４−１ＢＢＬの必要性は、４−１ＢＢＬ  ＫＯ細胞を用いることによって確認された（図９Ｆ）。
【０１２８】
４−１ＢＢＬシグナリングがＭｙＤ８８およびＴＲＩＦを必要とするかどうかを判定するために、ＭｙＤ８８−／−およびＴＲＩＦ−／−マクロファージを４−１ＢＢ−Ｆｃ、抗Ｆｃ抗体、ならびに４−１ＢＢ−Ｆｃおよび抗Ｆｃ抗体の両方で処置し、培地中のＴＮＦレベルを測定した。結果は、４−１ＢＢＬ架橋結合媒介性ＴＮＦ産生がＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存性であることを示している（図９Ｆ）。これとは対照的に、４−１ＢＢＬ架橋結合によって誘発されたＴＮＦ産生は、野生型マクロファージ中と比較して、ＴＬＲ２欠損およびＴＬＲ４欠損マクロファージ中では統計学的に有意な境界まで減少した（図９Ｆ）。
【０１２９】
これらのデータの１つの解釈は、細胞表面上での４−１ＢＢＬの発現およびその後のオリゴマー化がＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存性ＴＮＦ産生を誘発することである。ＴＬＲ４および他のＴＬＲは４−１ＢＢＬと相互作用するので（図１Ａ、１Ｂ、１Ｄおよび６Ａ）、そしてＴＬＲは二量体を形成するので（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：３９４−３９７（１９９７）を参照されたい）、４−１ＢＢＬ過剰発現によって媒介されるＴＮＦ産生におけるＴＬＲ４の部分的依存性（図９Ｃ）は、４−１ＢＢＬの架橋結合に寄与する４−１ＢＢＬ−ＴＬＲ４相互作用に起因すると考えられる。これは、４−１ＢＢＬ過剰発現媒介性ＴＮＦ産生がＴＬＲ４もしくはＴＬＲ２いずれかの欠損によって部分的に阻害されるという観察所見によって支持されている（図９Ｃ〜Ｆ）。
【０１３０】
４−１ＢＢ−Ｆｃおよび抗４−１ＢＢＬは２つの４−１ＢＢＬ分子にしか結合せず、それらと４−１ＢＢＬとの結合は４−１ＢＢＬオリゴマー化を阻害する、または４−１ＢＢＬが例えばＴＬＲなどの他の分子と相互作用することを防止するはずであるため、それらを使用してこの仮説を試験した。マクロファージは、以下のように４−１ＢＢ−Ｆｃもしくは抗４−１ＢＢＬ抗体の存在下でＬＰＳを用いて刺激した。マクロファージをＬＰＳ、４−１ＢＢ−Ｆｃを含むＬＰＳ、０、２、もしくは５μｇ／ｍＬの抗４−１ＢＢＬを含むＬＰＳ、または未処置培養培地とともに２４時間かけてインキュベートした。結果は、４−１ＢＢ−Ｆｃおよび抗４−１ＢＢＬ抗体がいずれもＬＰＳ誘導性ＴＮＦ産生を阻害したことを示している（図９Ｇ）。
【０１３１】
４−１ＢＢＬは多数のＴＬＲリガンドによって誘導されたので（図８Ａ〜Ｆ）、ＴＬＲ２リガンド（Ｐａｍ３）、ＴＬＲ３リガンド（ポリＩ：Ｃ）、ＴＬＲ４リガンド（ＬＰＳ）、ＴＬＲ７、８リガンド（Ｒ８４８）およびＴＬＲ９リガンド（ＣｐＧ）を用いて刺激した４−１ＢＢＬ欠損マクロファージによるＴＮＦ産生について試験した。ＴＮＦ産生の減少が観察された（図６Ｂ）。これらのデータは、様々なＴＬＲによって媒介されたＴＮＦ産生に４−１ＢＢＬが関係していることを示している。エンドソームもしくは例えばＴＬＲ９などの小胞体（ＥＲ）中に局在するＴＬＲは血漿膜中に局在する４−１ＢＢＬとはおそらく相互作用し難いと思われるので、ＴＬＲ９誘導性の４−１ＢＢＬのシグナリングは、細胞表面上での４−１ＢＢＬと他のＴＬＲとの相互作用に依存する場合がある。これに一致しているのは、低用量のＣｐＧ（１μｇ／ｍＬ）を使用した場合のＴＬＲ４欠損マクロファージ中のＴＬＲ９誘導性ＴＮＦ産生における小規模ではあるが統計学的に有意な減少の検出である（図６Ｃ〜Ｄ）。しかし、４−１ＢＢＬと細胞表面ＴＬＲとの相互作用以外の機序が４−１ＢＢＬシグナリングに関係している場合もあるが、それは細胞が高用量のＣｐＧを用いて刺激した場合にＴＬＲ４欠損によるこの減少が有意ではなかったためである。
【実施例８】
【０１３２】
［２つの連続するＴＬＲ４複合体］
４−１ＢＢＬ誘導はＴＬＲ／ＭｙＤ８８／ＴＲＩＦ経路に左右され、そして４−１ＢＢＬ媒介性シグナリングはＭｙＤ８８およびＴＲＩＦには非依存性であるが、それとＴＬＲとの相互作用には関連しているので、以下のようにＬＰＳ処置マクロファージ中に連続ＴＬＲ４シグナリング複合体が存在するのかどうかを試験した。マクロファージをＬＰＳで０．５、１、２、４、８および１２時間かけて処置した。全細胞溶解物は、（１）抗４−１ＢＢＬ、抗ＴＬＲ４、および抗ＭｙＤ８８を用いて免疫ブロットした、（２）抗ＴＬＲ４抗体を用いて免疫沈降させて、次に抗ＴＬＲ４、抗４−１ＢＢＬ、および抗ＭｙＤ８８を用いて免疫ブロットした、（３）抗ＭｙＤ８８抗体を用いて免疫沈降させ、次に抗ＭｙＤ８８、抗ＴＬＲ４、および抗４−１ＢＢＬを用いて免疫ブロットした、または（４）抗４−１ＢＢＬを用いて免疫沈降させ、次に抗４−１ＢＢＬ、抗ＴＬＲ４、および抗ＭｙＤ８８を用いて免疫ブロットした。全免疫沈降法のために陰性対照としてアイソタイプ抗体を使用した。４−１ＢＢＬもしくはＭｙＤ８８に対する免疫ブロット法における陽性対照は、指定の箱の中に示した。結果は、２〜８時間の曝露時間にＬＰＳが４−１ＢＢＬ発現を誘導したが、ＴＬＲ４もしくはＭｙＤ８８のタンパク質レベルには影響を及ぼさなかったことを示している（図１０Ａ、細胞溶解物）。ＴＬＲ４は、０．５〜１時間のＬＰＳ曝露時間中にＭｙＤ８８と会合して、その後解離したが、他方ＴＬＲ４−４−１ＢＢＬ複合体は２〜１２時間のＬＰＳ曝露時間中に出現した（図１０Ａ、ＩＰ：ＴＬＲ４）。ＴＬＲ４−ＭｙＤ８８複合体は、ＭｙＤ８８の免疫沈降によって確認された（図１０Ａ、ＩＰ：ＭｙＤ８８）。ＭｙＤ８８は４−１ＢＢＬを沈降させることはできなかったが、これはＭｙＤ８８および４−１ＢＢＬが同一ＴＬＲ４複合体には存在しないことを示している。４−１ＢＢＬの免疫沈降は２〜１２時間かけてＬＰＳ処置した細胞中でＴＬＲ４を沈降させたが、ＭｙＤ８８を沈降させることはできなかったことから、ＭｙＤ８８および４−１ＢＢＬが同一複合体中には存在しないことが確認された（図１０Ａ、ＩＰ：４−１ＢＢＬ）。このため、ＬＰＳ処置マクロファージ中には２つのＴＬＲ４複合体が存在し、１つは初期細胞応答の原因であるＭｙＤ８８複合体であり、そして第２は持続的ＴＮＦ産生に関係している４−１ＢＢＬ−ＴＬＲ４複合体である。
【０１３３】
ＭｙＤ８８は４−１ＢＢＬと相互作用できないことを確認するために、ＡＵ１タグ付ＭｙＤ８８を以下のようにＦｌａｇ−４−１ＢＢＬもしくはＦｌａｇ−ＴＬＲ４を用いて過剰発現させた。２９３Ｔ細胞は、Ｆｌａｇ−４−１ＢＢＬもしくはＦｌａｇ−ＴＬＲ４発現ベクターと一緒にＭｙＤ８８−ＡＵ１発現ベクターを用いてトランスフェクトした。細胞はトランスフェクションの２４時間後に溶解させ、細胞溶解物はＡＵ１抗体を用いた免疫沈降供し、その後に抗Ｆｌａｇおよび抗ＡＵ１抗体を用いた免疫ブロットに供した。結果は、Ｆｌａｇ−ＴＬＲ４はＭｙＤ８８によって沈降したがＦｌａｇ−４−１ＢＢｌは沈降しなかったことを示している（図１０Ｂ）。
【０１３４】
４−１ＢＢＬと相互作用するタンパク質を探索するために、４−１ＢＢＬとＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ６との相互作用について以下のように試験した。２９３Ｔ細胞は、ＴＲＡＦ２−ｍｙｃもしくはＴＲＡＦ６−ｍｙｃ発現ベクターと一緒にＨＡ−４−１ＢＢＬ発現ベクターを用いてトランスフェクトした。細胞溶解物は、抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降させ、抗ｍｙｃおよび抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロットした。結果は、４−１ＢＢＬがＴＲＡＦ６とは相互作用するが、ＴＲＡＦ２とは相互作用しないことを示している（図１０Ｃ）。
【０１３５】
４−１ＢＢＬおよびＴＲＡＦ６は相互作用するために、４−１ＢＢＬ媒介性ＴＮＦ産生のためにＴＲＡＦ６が必要とされるかどうかを試験した。ＳｉＲＮＡを使用して、以下のようにＲＡＷ２６４．７マクロファージ中でＴＲＡＦ６をノックダウンさせた。マクロファージをＴＲＡＦ６−ｓｉＲＮＡ＃１もしくは＃２、または対照ｓｉＲＮＡ（Ｃ）を用いてトランスフェクトし、ＴＲＡＦ６タンパク質レベルをＴＲＡＦ６に対して免疫ブロットすることによって分析した。対照ｓｉＲＮＡ、ＴＲＡＦ６−ｓｉＲＮＡ＃１もしくはＴＲＡＦ６−ｓｉＲＮＡ＃２トランスフェクト細胞中のＴＮＦ産生レベルを、抗Ｆｃ、４−１ＢＢ−Ｆｃ、４−１ＢＢ−Ｆｃおよび抗Ｆｃと一緒に、ＬＰＳ、ポリＩ：Ｃ（２５μｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）、または未処置培養培地を用いてインキュベートした２４時間後に測定した。ＩＬ−６レベルは、細胞を培地、ＬＰＳ、もしくはＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）で処置した場合に測定した。ｓｉＲＮＡはいずれもＲＡＷ２６４．７細胞中のＴＲＡＦ６タンパク質レベルを効果的に減少させた（図１０Ｄ）。ＴＲＡＦ６ノックダウン細胞および対照細胞は、４−１ＢＢ−Ｆｃ、抗Ｆｃ抗体、または４−１ＢＢ−Ｆｃおよび抗Ｆｃ抗体の両方で処置し、そして培地中のＴＮＦレベルを測定した。ＴＲＡＦ６のノックダウンは、４−１ＢＢＬ架橋結合媒介性ＴＮＦ産生を遮断した（図１０Ｄ）。予想されるように、ＴＲＡＦ６のノックダウンは、ＬＰＳ、ポリＩ：Ｃ、およびＩＬ−１β誘導性サイトカイン産生を低下させたが、ＴＮＦ誘導性ＩＬ−６産生には影響を及ぼさない（図１０Ｄ）。
【０１３６】
４−１ＢＢＬによって誘発される下流事象を解明するために、転写因子活性化について試験した。４−１ＢＢＬの発現はＣＲＥＢおよびＣ／ＥＢＰを活性化させたがＮＦ−κＢは活性させなかった（図１０Ｅ）。これは４−１ＢＢＬ欠損がＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化には何の影響も及ぼさないが、ＣＲＥＢおよびＣ／ＥＢＰ活性化を低下させた（図３Ｆ）という観察所見と一致している。同様に、ＩκＢαの分解は、４−１ＢＢＬを過剰発現する細胞中で観察されなかった（図１０Ｆ）。４−１ＢＢＬの発現はｐ３８、ＪｎｋおよびＥｒｋのある程度のリン酸化を誘発し（図１０Ｆ）、そしてｐ３８、ＪｎｋおよびＥｒｋの阻害は４−１ＢＢＬ媒介性ＴＮＦ産生を減少させた（しかしＮＦ−κＢは減少させなかった）（図１０Ｇ）ことは、４−１ＢＢＬ媒介性ＴＮＦ産生にはＭＡＰキナーゼ経路が関係していることを示唆している。４−１ＢＢＬシグナリング経路は、４−１ＢＢＬの欠損が後期におけるＬＰＳ誘導性ＴＮＦ  ｍＲＮＡ転写の減少（図３Ｅ）を生じさせ、４−１ＢＢＬ過剰発現はＴｎｆ  ｍＲＮＡ量を増加させた（図１０Ｈ）ので、Ｔｎｆ  ｍＲＮＡに影響を及ぼすと思われた。４−１ＢＢＬを過剰発現する細胞中およびＬＰＳ細胞で処置した細胞中のＴｎｆ  ｍＲＮＡの半減期を比較した。Ｔｎｆ転写産物は類似の半減期を示した（図１０Ｈ）。ＬＰＳはＴｎｆ  ｍＲＮＡを安定化させ、４−１ＢＢＬの欠損はＬＰＳ誘導性Ｔｎｆ  ｍＲＮＡの安定性を低下させる（図３Ｆ）ことは公知であるので、４−１ＢＢＬはＬＰＳ誘導性Ｔｎｆ  ｍＲＮＡ安定化の媒介因子であると思われる。集約すると、本明細書に記載したデータは、マクロファージ中でのＴＮＦ発現の初期活性化およびＴＮＦの持続的産生が早期および後期シグナリング経路によって調節されることを示している（図１０Ｉ）。
【０１３７】
前炎症性サイトカインの発現は、遺伝子の活性化および不活性化機序によって厳密に制御される。本明細書に記載した試験は、マクロファージ中でのＴＮＦ発現の初期活性化およびＴＮＦの持続的産生が早期および後期シグナリング経路によって調節されることを示している（図１０Ｉ）。周知のシグナル経路であるＴＬＲ４／ＭｙＤ８８／ＴＲＩＦは、炎症性遺伝子の開始および早期発現の責任を担っている。４−１ＢＢＬは、早期誘導性タンパク質の１つであり、細胞活性化の早期においてのみ誘導される。新規に合成した４−１ＢＢＬは細胞表面上に転位して持続的ＴＮＦ産生のための新規のシグナリング期を生成する。４−１ＢＢＬおよびＴＬＲの相互作用は第２期シグナリングの生成に関係していると思われ、連続シグナリング複合体においてＴＬＲが果たす役割は、４−１ＢＢＬのオリゴマー化を支援する可能性が最も高い。４−１ＢＢＬ複合体のシグナリング機序は初期ＴＬＲ４シグナリングの機序とは異なるが、それは後者がＭｙＤ８８およびＴＲＩＦには依存していないためである。しかし、いずれのシグナリング期もＴＲＡＦ６を必要とする。
【０１３８】
炎症性サイトカインの産生は、通常は炎症性誘発因子の分解が存在すると終了する初期およびその後の持続期を特徴とする炎症プロセスの一部である（Ｔｒｉａｎｔａｆｉｌｏｕ  ａｎｄ  Ｔｒｉａｎｔａｆｉｌｏｕ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：３０１−３０４（２００２）を参照されたい）。しばしば、持続的炎症性応答の終了時には炎症調節の崩壊が発生し、ＴＮＦ産生の長期間の持続には多数の炎症性疾患の病態が関連することが多い（Ｖａｓｓａｌｌｉ，Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４１１−４５２（１９９２）を参照されたい）。このために、持続的ＴＮＦ産生における重要な調節因子としての４−１ＢＢＬの同定は、炎症性疾患における新規な介入術を開発するための新規な治療標的を提供する。
【実施例９】
【０１３９】
［４−１ＢＢＬはＩＬ−６誘導において役割を果たす］
ＩＬ−６は、炎症に関係するサイトカインである。ＩＬ−６発現の増加は、関節リウマチ（ＲＡ）、全身発症性若年性慢性関節炎（ＪＣＡ）、骨粗鬆症、および乾癬等の数種の疾患プロセスの病態に関係している。ＩＬ−６誘導における４−１ＢＢＬの関与を示すために、以下の実験を実施した。第１に、４−１ＢＢＬ−／−および野生型マウスに０．５ｍｇのＬＰＳを腹腔内注射した。次に血清を０、２および６時間後に採取し、ＩＬ−６レベルを測定した。結果は、４−１ＢＢＬ−／−マウスがＬＰＳに応答して野生型マウスより有意に少ないＩＬ−６を産生することを示した（図１１Ａ）。４−１ＢＢＬ−／−および野生型マウス由来の腹腔マクロファージをＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で処置し、培養培地中のＩＬ−６のレベルを３、９および１８時間後に試験した。結果から、野生型マウス由来のマクロファージが４−１ＢＢＬ−／−マウス由来のマクロファージより有意に多いＩＬ−６を生成することを確認した（図１１Ｂ）。これらの結果は、野生型および４−１ＢＢＬ−／−マクロファージをＰａｍ３（１μｇ／ｍＬ）、ポリＩ：Ｃ（２５μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、Ｒ８４８（１００ｎＭ）、ＣｐＧ（５μｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）、または未処置培養培地（なし）を用いて処置した２４時間後のＩＬ−６産生レベルと比較した。Ｐａｍ３、ポリＩ：Ｃ、ＬＰＳ、Ｒ８４８、およびＣｐＧで処置した野生型マクロファージは、４−１ＢＢＬ−／−マクロファージより有意に多いＩＬ−６を生成した（図１１Ｃ）。これとは対照的に、野生型および４−１ＢＢＬ−／−マクロファージによるＩＬ−６産生レベルは匹敵していた。
【０１４０】
マクロファージをＬＰＳ、４−１ＢＢ−Ｆｃを含むＬＰＳ、０、２、もしくは５μｇ／ｍＬの抗４−１ＢＢＬ抗体を含むＬＰＳ、または未処置培養培地とともに２４時間かけてインキュベートし、次に培地中のＩＬ−６レベルを測定すると、結果は、ＬＰＳおよび４−１ＢＢ−Ｆｃを用いてインキュベートしたマクロファージがＬＰＳ単独とインキュベートしたマクロファージより有意に少ないＩＬ−６を生成することを示した（図１１Ｄ）。ＬＰＳおよび濃度を上昇させながら抗４−１ＢＢＬ抗体を用いてインキュベートしたマクロファージもまた、レベルが減少するＩＬ−６産生を示した（図１１Ｄ）。
【０１４１】
ＩＬ−６産生において４−１ＢＢＬが果たす役割を確認するために、ＲＡＷ２６４．７細胞は、対照ｓｉＲＮＡ、または４−１ＢＢＬ−ｓｉＲＮＡ＃１もしくは＃２を含有するｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒを用いて安定性にトランスフェクトした。ＬＰＳを用いて３、９および２４時間かけて処置した４−１ＢＢＬノックダウン細胞中でのＩＬ−６産生を測定し、対照細胞のＩＬ−６産生と比較した。結果は、４−１ＢＢＬ発現がノックダウンされているＲＡＷ２６４．７細胞が対照ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトしたＲＡＷ２６４．７細胞より有意に少ないＩＬ−６を生成することを示した（図１１Ｅ）。これらの結果は、対照、およびペプチドグリカン（ＰＧ、１０μｇ／ｍＬ）、ポリＩ：Ｃ（２５μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＣｐＧ（５μｇ／ｍＬ）、または未処置培養培地中で２４時間かけて処置した４−１ＢＢＬノックダウン細胞についての所見と一致していた（図１１Ｆ）。
【０１４２】
［参考文献］
【表１Ａ】
2010506921.tif 000015
【表１Ｂ】
2010506921.tif 000016
【０１４３】
［他の実施形態］
本明細書で参照もしくは言及したすべての特許および刊行物は、本発明が関与する分野の当業者の技術レベルの指標であり、そのように参照した特許もしくは刊行物各々は、それが全体として個別に参照することにより本明細書の一部をなすものとし、または本明細書に全体として記載される場合と同程度に参照することにより本明細書の一部をなすものとする。本出願人らは、本明細書にそのような言及した任意の特許もしくは刊行物からの任意またはすべての材料および情報を物理的に組み入れる権利を保有する。
【０１４４】
本明細書に記載した特定の方法および組成物は、好ましい実施形態を表し、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するとことは意図していない。他の目的、態様、および実施形態は、本明細書を考察すれば当業者であれば考え付くであろうし、特許請求の範囲に規定された本発明の精神の中に含まれている。当業者には、本明細書に開示した本発明には、本発明の範囲および精神から逸脱せずに、様々な置き換えおよび変更を加えられることは容易に明白になろう。本明細書に例示的に記載した本発明は、本明細書において必須であると特別に開示されていない任意の要素、または制限の非存在下で適切に実施することができる。本明細書に例示的に記載した方法およびプロセスは、異なる工程順序で適切に実施することができ、そしてそれらは本明細書または特許請求項に指定の工程の順序に必ずしも限定されない。本明細書および添付の特許請求項において使用するように、単数形の「１つの」および「その」には、その状況が明白に他のことを指すものでない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「（１つの）抗体」は複数（例えば、抗体の溶液または一連の抗体調製物）のそのような抗体などを含む。いかなる状況下においても、本特許は、本明細書に詳細開示した特定の実施例もしくは実施形態もしくは方法に限定されると解釈されてはならない。いかなる状況下においても、特許用語は、そのような記述が詳細であり、かつ出願人らによる応答文書において明示的に認められた認定もしくは留保を伴わない限り、特許商標局の任意の審査官もしくは任意の他の役員もしくは職員によって作成された任意の記述によって制限されないと解釈できる。
【０１４５】
使用してきた用語および表現は説明のためであって限定するために使用されたものではなく、本明細書に図示かつ記載した特徴もしくはその部分の任意の同等物を排除するためにそのような用語および表現を使用することは意図したものではなく、様々な変更が請求されている本発明の範囲内において可能であると認識されている。したがって、本発明を好ましい実施形態および任意の特徴によって詳細に開示してきたが、本明細書に開示した概念の変更および変形は当業者であれば使用できること、そしてそのような変更および変形は添付の特許請求項によって規定された本発明の範囲内に含まれると見なされることは理解される。
【０１４６】
本明細書では、本発明を広汎かつ遺伝学的に記載してきた。一般的開示内に含まれるより狭い種および亜属のグループの各々もまた本発明の一部を形成している。これには除かれた材料が本明細書で詳細に言及されたか否かとは無関係に、属からの任意の対象を取り出すという前提または消極的な限定を伴って、本発明の一般的記述を含む。
【０１４７】
他の実施形態は、以下の特許請求項に含まれる。さらに、本発明の特徴もしくは態様がマーカッシュグループによって記載される場合は、当業者であれば、本発明がマーカッシュグループの任意の個別メンバーもしくはメンバーのサブグループによって記載されることもまた理解される。
【図１】
2010506921.tif 000017
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ−３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2010506921.tif 000027
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2010506921.tif 000031
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９Ａ−９Ｃ】
2010506921.tif 000037
【図９Ｄ−９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ．１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ−１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１１Ａ．１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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