(57)【要約】  一種の組換えアデノウイルスベクターであって、それがアデノウイルスベクター骨格において、真核細胞プロモータ、オペロン、コザック配列、外来遺伝子、PolyAシグナル配列を順次含有し、その中に、任意的にオペロンとコザック配列の間にイントロン及び外来遺伝子を挿入し、外来遺伝子はp53遺伝子である。当該組換えアデノウイルスベクターとアデノウイルス骨格とのコトランスフェクションにより得られた組換えアデノウイルスも本発明に含まれる。また、当該組換えアデノウイルスベクターと組換えアデノウイルスのそれぞれの調製方法及び用途が開示される。本発明は、さらに前記組換えアデノウイルスを含有する癌治療用薬物組成物を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えアデノウイルスシャトルベクターであって、図11の「A」に示されるアデノウイルスシャトルベクターpDC315(io)又は図11の「B」に示されるアデノウイルスシャトルベクターpDC316(io)のオペロンとPolyAシグナル配列との間にコザック（Kozak）配列と外来遺伝子とを挿入する、組換えアデノウイルスシャトルベクター。
【請求項２】
組換えアデノウイルスシャトルベクターであって、図11の「C」に示されるアデノウイルスシャトルベクターpDC515(io)又は図11の「D」に示されるアデノウイルスシャトルベクターpDC516(io)のオペロンとPolyAシグナル配列との間にコザック（Kozak）配列と外来遺伝子とを挿入する、組換えアデノウイルスシャトルベクター。
【請求項３】
前記コザック配列がCCACCATGGである、請求項1又は２に記載の組換えアデノウイルスシャトルベクター。
【請求項４】
前記外来遺伝子がヒトp53遺伝子であり、その配列がSEQ ID NO:3に示される、請求項１又は２に記載の組換えアデノウイルスシャトルベクター。
【請求項５】
真核遺伝子発現装置であって、それがSEQ ID NO:11の配列を有する、真核遺伝子発現装置。
【請求項６】
組換え体アデノウイルスであって、それが請求の範囲１〜４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスシャトルベクターとアデノウイルス骨格とを293IQ細胞にコトランスフェクションした後に得られ、その中で、前記アデノウイルスシャトルベクターがpDC315(io)又はpDC316(io)である場合には前記アデノウイルス骨格が図12(A)に示されるpBHGlox(delta)E1,3Creであり、前記アデノウイルスシャトルベクターがpDC515(io)又はpDC516(io)である場合には前記アデノウイルス骨格が図12(B)に示されるpBHGfrt(del)E1,3FLPである、組換え体アデノウイルス。
【請求項７】
その保存番号がCCTCC V200508である、請求項６に記載の組換え体アデノウイルス。
【請求項８】
請求項６〜７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス及び自由選択した薬用賦形剤を含む、癌治療用薬。
【請求項９】
請求項６〜７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスが、癌治療薬を調製する際の用途。
【請求項１０】
前記癌が肺癌、肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、卵巣癌及び子宮頚癌から選ばれる、請求項９に記載の用途。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の組換えアデノウイルスシャトルベクターが得られる方法であって、当該方法がコザック配列が連結される外来遺伝子をアデノウイルスシャトルベクターpDC315(io)、pDC316(io)、pDC515(io)又はpDC516(io)中のオペロンとPolyAシグナル配列との間にセンス方向で挿入することを含む、組換えアデノウイルスシャトルベクターが得られる方法。
【請求項１２】
請求項６又は７に記載の組換えアデノウイルスが得られる方法であって、当該方法が請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスシャトルベクターとアデノウイルス骨格とを293IQ細胞にコトランスフェクションした後、前記アデノウイルスシャトルベクターがpDC315(io)又はpDC316(io)である場合には前記アデノウイルス骨格が図12(A)に示されるpBHGlox(delta)E1,3Creであり、前記アデノウイルスシャトルベクターがpDC515(io)又はpDC516(io)である場合には前記アデノウイルス骨格が図12(B)に示されるpBHGfrt(del)E1,3FLPである、組換えアデノウイルスが得られる方法。
【請求項１３】
癌治療用方法であって、当該方法が患者に対して治療有効量を有する請求項６〜７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを施行することを含む、癌治療用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子工学技術分野に属する。具体的には、ヒト腫瘍抑制遺伝子の組換えウイルスベクターに関し、特に、コザック（Kozak）配列により誘導されたヒトp53ヒト腫瘍抑制遺伝子の組換えアデノウイルスベクターに関し、また、当該アデノウイルス組換えベクターを含有する薬物組成物に関する。本発明はまた、同時に当該組換えアデノウイルスベクターの調製方法及び用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．腫瘍遺伝子治療
遺伝子治療は、治療効果のある遺伝子又はDNA(RNA)断片を一定の方式を通じてヒトターゲット細胞に導入し、疾患を引き起こすそれぞれの分子病理変化に対し、相応的に分子レベルで遺伝子発現を調節し、治療効果を発揮して、根本的に疾患を治療する目的に達する分子医学治療方法である。
【０００３】
十数年来、腫瘍の遺伝子治療の発展は迅速である。アメリカでは、1995年前後から、10の大型遺伝子治療会社が設立され、1999年には遺伝子治療の専門会社が約30社あり、2000年まで100社近くに達し、2004年には全世界240以上の遺伝子治療会社の中で75社は腫瘍遺伝子治療の研究及び開発をしている。2004年7月末まで、全世界五大洲の23か国に認可された遺伝子治療臨床試験案が987件に達し、その中では腫瘍に対する遺伝子治療案が最も多く、全部で656件、全数の66.5％を占めている。投薬経路には、腫瘍組織内、静脈内、肝動脈内、皮下、筋肉、膀胱内、腹腔内などがある。世界中で最初に上場された遺伝子治療薬は腫瘍治療に用いられる薬である。
【０００４】
遺伝子治療の研究及び用途は、遺伝病に対する治療に起源したが、近年来、腫瘍遺伝子治療の発展は、遺伝病をはるかに超え、原因として、主に腫瘍の発症率及び患者人数が遺伝病をはるかに超えたためである。世界衛生組織の報告によると、2000年に全世界で新たに発症した悪性腫瘍病人は1010万人、死亡人数は620万人、現在悪性腫瘍の病例は2240万人に達する。過去の10年間、全世界の悪性腫瘍発症率は22％増加し、すでに日常病、且つ人々の命及び生活品質にひどく関わる主な疾患の一つになり、人類の健康に対する脅威が巨大で、患者の身心に対して酷い傷害をもたらしている。第二は、治療遺伝子の選択種類が多く、範囲も広く、遺伝病のように欠陥のある又は変異のある遺伝子に局限されることがなく、腫瘍を治療する目的に達することができ、正常な人体細胞に対する損傷が弱い遺伝子であれば、すべて採用することができることである。例えば、腫瘍抑制遺伝子、免疫増強遺伝子、自殺遺伝子、血管新生抑制遺伝子等がある。第三は、腫瘍の遺伝子治療は、外来遺伝子の持続的発現を要求しなく、段階的発現さらに一過性発現も腫瘍細胞を殺す目的に達することができる。第四は、多数の腫瘍遺伝子治療案は、治療遺伝子を腫瘍細胞に直接導入し、治療遺伝子の発現調節に対する要求が遺伝病治療のように厳しくないことである。
【０００５】
２．ヒトp53遺伝子の研究発展
1979 年レーン（Lane）とクローフォード（Crawford ）ら(Lane D P,Crawford L V.T antigene is bound to a host protein in SV40 transformation cells[J].Nature, 1979/278/570 P 261-263)は、SV40ラージＴ抗原遺伝子によりトランスフェクションされた細胞において、p53遺伝子を発見し、それが癌遺伝子と考えられている。その後、フィンレー（Finlay）ら(Levine AJ,Momand J,Finlay CA.The p53 tumor suppressor gene [J].Nature, 1991, 351(3):453) は、研究により、myc又はras癌遺伝子のトランスフェクションされた細胞において、野生型p53遺伝子が存在すれば、生長が抑制されることが見られる。したがって、p53遺伝子は癌抑制遺伝子に属することが提案された。
【０００６】
ヒトp53遺伝子は、第17番染色体17p13.1領域に局在し、ゲノムDNAに20303bpの長さがあり、11個のエクソンと10個のイントロンを含み、393アミノ酸残基のタンパク質、すなわちｐ53タンパクをコードする。
【０００７】
ｐ53タンパクは、機能から五つの部分に分けられ、
Ｎ末端の転写活性化領域(1-42 aa)は一連のタンパク構造(例えば、MDM2 TBP TAFs)に結合して、p53の転写機能を調節することができる、
シグナル領域(64-92 aa)は、プロリンを多く含有し、五つのプロリン-X-X-プロリン反復順序があり、この領域は転写活性化に必要なものではないが、アポトーシス誘導に対して必要である、
DNA結合領域(102-292 aa)は、順序特異的DNA配列を認識する、
四量体化領域(324-355 aa)は、この領域で癌細胞の生長を抑制することができる、
C−末端の非特異的DNA結合領域 (370-393 aa)は、非特異的DNA配列と結合することができる。
【０００８】
p53の基本的機能は、核転写因子であり、その抗腫瘍の生物学活性が主に腫瘍細胞の周期を停止することに表され、G1/S期及びG2/M期に作用することができる、
腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する、
腫瘍血管の形成を抑制する、
腫瘍細胞の免疫原性を増強させる、
腫瘍細胞の浸潤及び転移を抑制する、
腫瘍細胞の放射化学療法及び熱療法に対する敏感性を増加させることなどである。
【０００９】
p53遺伝子変異は、多くの腫瘍発生の重要な原因の一つである。遺伝子変異は、主に点突然変異、対立遺伝子の欠失、遺伝子再構成、腫瘍ウイルス性癌タンパク質と結合して不活性化されることなどを含む。報告によると、約200種以上の不同な腫瘍の中で、50％の腫瘍にはp53遺伝子変異がある。p53遺伝子の中に、四つがエクソン5〜8の突然変異のホットスポットに位置することが発見され、不同な組織器官に発生された腫瘍の中で、p53遺伝子変異プロファイルに差異が示されたが、約90％の変異は、この部分の領域に集中された。それらがそれぞれ132-143、174-179、236-248及び272-281番のアミノ酸をコードする。
【００１０】
多種類の人類腫瘍の中、例えば食道癌、肺癌、胃癌、肝癌、結腸及び直腸癌、膵臓癌、乳腺癌、卵巣癌、甲状腺癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、並びに神経芽細胞腫の中で、p53遺伝子の変異率は50％以上になる。メラノーマ（悪性黒色腫）（原発）では、p53遺伝子変異率が97％と高くなる。肺癌では、各型の肺癌でp53遺伝子変異が存在し、約52％の非小細胞肺癌や90％の小細胞肺癌では、p53遺伝子変異が存在する。また、一部分の白血病、脳腫瘍、多発性ミエローマ、星細胞腫にもp53遺伝子の改変が存在する。研究により、治療しにくい腫瘍p53遺伝子変異率が比較的高く、相対的に治療し易い腫瘍においてp53遺伝子変異の発生が比較的少ないことが発見されている。また、p53遺伝子の変異と病状の進展、腫瘍の転移及び放射化学療法に対する敏感性、治癒後との関係も密接である。
【００１１】
３．アデノウイルスベクター研究の進展
アデノウイルスの形態は特徴的な20面体カプシドであり、エンベロープを持たず、直径は70〜90nmで、252個のカプソメアがあり、その中に、20面体頂点に突起構造を持ったカプソメアには12個のペントン（penton）があり、ペントンごとに２本のファイバーがある。ペントンの他、240個頂点に突起構造を持たないカプソメアがあり、ヘキソン(Hexon)と呼ばれている。アデノウイルスゲノムは、直線の２本鎖DNAであり、長さは約36kb、その5’側と一種の末端タンパク（TP）とは共有結合され、また5’側には逆方向末端反復配列（ITRs）がある。ウイルスDNAが、核心タンパクVII と一つの「mu」と呼ばれる小ペプチドと緊密に結合される。もう一つのタンパクVが、DNA-タンパク複合体に被覆され、且つタンパクVIを介して、DNA-タンパク複合体とウイルスカプシドとの間に構造上の連絡を提供する。遺伝子治療ベクターとするアデノウイルスゲノムは、通常そのE1領域及び/又はE3領域を削除し、外来遺伝子カセットをE1領域の部位に挿入し、このように構築された組換えアデノウイルスは、複製欠損型のものであり、一般的な細胞内に複製されることができなく、特定の細胞（例えば、293細胞）のみに複製し生産される。
【００１２】
アデノウイルスベクターの特徴は、ベクターの容量が比較的大きく（＞7.5 kb）、トランスフェクション効率が極めて高く（インビトロでヒト腫瘍細胞をトランスフェクションすることが100％に達することができる）、生産効率が高く（ウイルスが生産細胞に何百倍に増幅されることができる）、非組込み性に細胞を感染し、遺伝毒性が無く、感染能力が強く（分裂、非分裂細胞が全部感染されることができる）、外来遺伝子の発現量が高いことである。これらの特徴がアデノウイルスを腫瘍の遺伝子治療及びその製品の工業化生産に特に適合させている。
【００１３】
組換えアデノウイルスベクターのシードウイルスの調製法の進展：
早期のダブルプラスミドコトランスフェクション法の利用は、即ち、目的遺伝子を持つシャトルベクター小プラスミドとアデノウイルゲノムを持つ大プラスミドをパッケージング細胞-293細胞にコトランスフェクションし、これら２種類のプラスミドが293細胞にランダムの相同組換えにより組換えアデノウイルスベクターゲノムを形成し、293細胞内でウイルス顆粒になるようにパッケージングする、この方法の効率は比較的低い、
Ad-Easy法は、即ち、外来遺伝子がクローンされたアデノウイルスシャトルプラスミドをアデノウイルスの大部分のゲノムプラスミドを持つ細菌を形質転換し、細菌Cre組換え酵素の作用下で、組換えして組換えアデノウイルスベクターゲノムのプラスミドが得られ、耐性スクリーニングを行った後、増幅してプラスミドを抽出し、消化して精製した後、293細胞にトランスフェクションし、その中で組換えウイルス顆粒になるようにパッケージングする、この方法の効率は比較的高い、
AdMax法は、即ち、外来遺伝子がクローンされたアデノウイルスシャトルプラスミド及びアデノウイルスの大部分のゲノムを持つパッケージングプラスミドを293細胞にコトランスフェクションし、組換え酵素の作用下で、組換えアデノウイルスを組換えして産生する、これは、現在でのパッケージング効率が最も高い方法である(Ng P,Parks RJ,Cummings DT, et al.An enhanced system for construction of adenoviral vectors by the two-plasmid rescue method[J].Hum Gene Ther.2000,11(5):693-699.)。
【００１４】
アデノウイルスベクターに有する外来遺伝子の発現が、往々に一定の細胞毒性を持ち、また、ある時は、細胞毒性の無い遺伝子の中レベルの発現もアデノウイルスベクターの複製及び増幅を明らかに停止させ、引き起こされた結果は、感染活性のある組換えアデノウイルス顆粒を産生し難くし、又は高力価まで増幅し難くする。この状況が出た場合、ウイルスモノクローナルのスクリーニング方法を利用しても、高発現目的のタンパクのウイルスを得ることができない。例えば、糖タンパク質を発現するアデノウイルスは、往々に毒性が出難く、類似する状況はまた、あるDNA結合タンパク質又は酵素を発現するアデノウイルスベクターを有する。したがって、存在するアデノウイルスベクターの力価及び生産量を事前に予想することが非常に難しい。
【００１５】
AdMax（登録商標）Hi-IQアデノウイルスベクターシステムにより、以上の状況下でアデノウイルスベクターの調製を達成することができる。これは、AdMax（登録商標）に基づいて、ラクトースオペロン(lac operator)を利用して目的遺伝子の転写を制御し、ラクトースリプレッサー（lac repressor)の293細胞を発現させる場合にアデノウイルスベクターをパッケージングし、目的遺伝子の発現が抑制され、他の細胞においては目的遺伝子の発現が特に限定されない。
【００１６】
「Hi-IQ」システムが、所有又は潜在的な細胞毒性を持つ目的遺伝子のアデノウイルスベクターを高生産量で産生するために用いられ、AdMax（登録商標）システムと異なるところは、前者が一つのラクトースリプレッサー（lac repressor）を発現させる293細胞（293-IQ細胞）、及びMCMVプロモータ、イントロン、ラクトースオペロンを含有するシャトル（Shuttle）プラスミド、アデノウイルスゲノムを含有する補助大プラスミドを含む。得られた組換えウイルスはE1/E3欠失された複製欠損型アデノウイルスである。
【００１７】
組換えヒトp53アデノウイルスは、悪性腫瘍の臨床治療に応用されたのはすでに十年の歴史がある。いくつの喜ばれる効果が取得されたが、総合的には、効果がまだ不十分である。その原因は、主にp53腫瘍抑制遺伝子の真核発現装置において、通常RSV、SV40又はCMV等の比較的弱いプロモータが利用され、p53タンパクが腫瘍細胞における発現量を相対的に不足させることにより引き起こされた。研究により明らかになるように、一人の正常細胞が体内外の様々な要因によりその遺伝子を変化させ、最後に腫瘍細胞を形成させる場合、すでに10000以上の遺伝子レベルの変化（例えば、癌を抑制する遺伝子の欠失、点突然変異、メチル化、癌原遺伝子の再構成、増幅、突然変異など）が蓄積され、腫瘍抑制遺伝子p53の作用メカニズムは細胞周期に対する停止、腫瘍細胞のアポトーシスを促進、 細胞分化、老化の誘導及び腫瘍血管の形成を抑制することなどにより腫瘍の生長を抑制する。それゆえ、それらのもっとも著しい作用の特徴が、マルチターゲットであり、単独な部位作用ではなく、例えば、p53タンパクが転写因子として、特異的なDNA配列と直接作用し、下流の多種類遺伝子の発現を調節することができる。遺伝子チップの研究により発見され、p53転写により活性化され、発現を上達させたのには107種の遺伝子があり、転写抑制され発現を降下させたのには54種の遺伝子がある。同時に、p53タンパク自身も、多数の細胞内タンパク質と作用することができ、例えば、癌遺伝子mdm2の遺伝子発現産物は、p53タンパクと特異的に結合してp53の機能を抑制することができる。従って、腫瘍細胞中の多くの遺伝子の変化に対して、遺伝子代替療法の組換えヒトp53アデノウイルス遺伝子薬物製剤として、腫瘍細胞を感染して発現させた後、そのp53タンパクの発現量が極めて少なく、確実且つ有効に腫瘍の生長を制御することは難しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかし、高発現のヒトp53組換えアデノウイルスシャトルベクターを構築した後では、293細胞において組換えアデノウイルスにパッケージングすることができなく、ヒトp53遺伝子を腫瘍細胞にも形質導入することができなく、遺伝子治療の目的に達することができない。その原因は、高発現ヒトp53遺伝子の真核発現装置がパッケージング細胞においても同様に効率的に発現され、パッケージング細胞内のタンパク質合成するための資源（組換えアデノウイルスのパッケージング過程も大量タンパク質合成の過程であり、両方が直接の競争関係を形成する）を大量に消耗し、また、大量のp53タンパクが293細胞周期を停止させ、アポトーシスまで達する可能性があり、従って、遺伝子の効率的な発現以外、組換えアデノウイルスの効率的なパッケージングが必要なことにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の目的は一種の組換えアデノウイルスを提供し、その挿入された真核発現装置において、多数の遺伝子発現を増強させる調節エレメントを総合的に使用し、例えば、ＭＣＭＶ(Murine Cytomegalovirus,マウスサイトメガロウイルス) プロモータ、イントロン、コザック（Kozak）規則配列など、遺伝子発現の不同なレベル、不同な段階に、ヒトp53 腫瘍抑制遺伝子を組換えアデノウイルスベクターにより腫瘍細胞に入らせた後、直接腫瘍細胞において大量発現させることができ、腫瘍細胞の生長を抑制し、最終的にそれらのアポトーシスに導かれることにある。同時に、その真核発現装置のＭＣＭＶの下流にオペロンを挿入し、例えば、大腸菌ラクトースオペロン(lac operator)、293パッケージング細胞内に大腸菌ラクトースオペロンDNA配列と特異的結合することができるラクトースリプレッサー遺伝子を形質転換して、安定に発現させ、このように、組換えアデノウイルスのパッケージング過程においては、293細胞発現のラクトースリプレッサータンパクがMCMVプロモータとヒトp53 腫瘍抑制遺伝子との間に設置され、p53遺伝子の転写を正常に行わせることができなく、外来遺伝子の293細胞における発現が明らかに抑制され、組換えアデノウイルスのパッケージング過程に影響させることができない。以上の二つの方法を通して、ヒトp53 腫瘍抑制遺伝子を腫瘍細胞において効率的に発現させることができ、遺伝子形質転換により改変された293細胞（即ち293IQ細胞）において効率的にパッケージングすることができる。
【００２０】
従って、本発明の一つの場面は、組換えアデノウイルスベクターに関し、それがアデノウイルスシャトルベクターpDC315(io) 又はpDC316(io)のオペロンとPolyＡシグナル配列との間にコザック配列と外来遺伝子とを挿入している。
【００２１】
本発明のもう一つ場面は、組換えアデノウイルスベクターに関し、それがアデノウイルスシャトルベクターpDC515(io)又はPdc516(io)のオペロンとPolyＡシグナル配列との間にコザック配列と外来遺伝子とを挿入することである。
【００２２】
好ましくは、前記コザック配列がCCACCATGGであり、前記外来遺伝子がヒトp53遺伝子であり、その配列はSEQ ID NO:3で示されるのがよい。
【００２３】
本発明のもう一つの場面は、真核遺伝子発現装置に関し、それがSEQ ID NO:11配列を有する。好ましくは、その配列は「SEQ ID NO:11」で示されるのがよい。
【００２４】
また、本発明のもう一つの場面は、組換えアデノウイルスベクターに関し、それが、前記組換えアデノウイルスシャトルベクターとアデノウイルス骨格とを293IQ細胞にコトランスフェクションした後に得られ、その中で、前記アデノウイルスシャトルベクターが pDC315(io)又はpDC316(io)である場合には前記アデノウイルス骨格が「pBHGlox(delta)E1,3Cre」であり、前記アデノウイルスシャトルベクターがpDC515(io)又はpDC516(io)である場合には前記アデノウイルス骨格が「pBHGfrt(del) E1,3FLP」であることにある。
【００２５】
好ましくは、前記組換えアデノウイルスは、2005年6月20日に中国典型培養物寄託中心に寄託された寄託番号が「CCTCC V200508」のアデノウイルスであることがよい。
【００２６】
本発明のもう一つ場面は癌治療用薬に関し、それが本発明の組換えアデノウイルスと任意の薬用賦形剤を含む。
【００２７】
また、本発明のもう一つの場面は、前記組換えアデノウイルスが癌治療用薬の調製するための応用に関し、その中で、前記癌が肺癌、肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、卵巣癌及び子宮頚癌から選ばれる。
【００２８】
また、本発明は前記組換えアデノウイルスベクターが得られる方法に関し、それは、コザック配列が連結される外来遺伝子をアデノウイルスシャトルベクターpDC315(io) pDC316(io) 又はpDC516(io)中のオペロンとPolyＡシグナル配列との間にセンス挿入することを含む。
【００２９】
また、本発明は前記組換えアデノウイルスが得られる方法に関し、それは、前記組換えアデノウイルスベクターとアデノウイルス骨格とを293IQ細胞にコトランスフェクションした後、その中で、前記アデノウイルスシャトルベクターがpDC315(io)又はpDC316(io)である場合には、前記アデノウイルス骨格は「pBHGlox(delta)E1,3Cre」であり、前記アデノウイルスシャトルベクターがpDC515(io)又はpDC516(io)である場合には、前記アデノウイルス骨格は 「pBHGfrt(del) E1,3FLP」であることを含む。
【００３０】
一方、癌治療用方法に関し、それは、患者に対して治療有効量の本発明の組換えアデノウイルスを使用することを含む。その中で、前記有効量は、当業者又は医師が具体的な状況によって容易に確定することができる。具体的には、本発明が、上流プライマー「5’-ATA GGATCC ACCATGG AGG AGC CGC AGT C 3’」(SEQ ID NO:1)、下流プライマー「5’-ATA GGATCC ATG TCA GTC TGA GTC AG 3’」(SEQ ID NO:2) を使用し、ＰＣＲ（polymerase chain reaction、ポリメラーゼ連鎖反応）によりヒトp53腫瘍抑制遺伝子コード領域を増幅し、PCR産物がＴベクターにクローニングされ、サンガー法で配列決定し、制限酵素BamHIでアデノウイルスシャトルプラスミド(pDC315(io) pDC316(io) pDC515(io)又はpDC516(io))にサブクローニングされ、ＰＣＲでスクリーニングしてクローンをセンス挿入し、アデノウイルスゲノム骨格プラスミドDNA（pBHGlox(delta)E1,3Cre又はpBHGfrt(del) E1,3FLP）と共に293IQ細胞にコトランスフェクションし、真核細胞において、部位特異的な相同組換えにより、組換えアデノウイルスrAdMH-khp53までパッケージングでき、ポジティブ組換えアデノウイルスのシードウイルスがクローン化され、感染293IQ細胞が増幅、精製され、遺伝子治療薬に調製される。
【００３１】
この組換えアデノウイルスは、以下の特徴を有する。
【００３２】
１．独特な真核遺伝子発現装置構造は、まず、現在世界中に真核遺伝子発現効率が最高なマウスサイトメガロウイルスを起動させるプロモータMCMVを利用し、転写レベルに外来遺伝子の発現を向上させ、プロモータと外来遺伝子の間にイントロンを挿入し、遺伝子転写後の「mRNA」の安定性をさらに向上させる。次に、ヒトp53腫瘍抑制遺伝子コード領域の前に一つのコザック配列が上手に設計され、タンパク質の翻訳レベルにおいて遺伝子の発現量をさらに向上させる。最後に、ＭＣＭＶの下流に大腸菌ラクトースオペロンを挿入し、293IQ細胞と配合して利用し、前記真核遺伝子高発現装置を有効にアデノウイルスベクターに組換えさせる。したがって、効率的にパッケージングすることができる。
【００３３】
２．アデノウイルスベクターは、トランスフェクション率が高く、操作可能性がよく、比較的大きい遺伝子を持つことができ、高力価のウイルス顆粒を調製することができる。したがって、宿主の範囲が広く、安全性がよく、病原性が低い利点を有する。
【００３４】
３．ヒトp53腫瘍抑制遺伝子の抗癌作用のマルチターゲット特性には、腫瘍細胞周期を停止し、腫瘍生長を抑制し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導すること以外、細胞分化、老化を誘導することができ、腫瘍血管の形成を抑制し、腫瘍細胞の免疫原性を増強させ、腫瘍細胞の浸潤及び転移を抑制し、腫瘍細胞の放射化学療法及び熱療に対する敏感性を増加させることなどがある。
【００３５】
４．アデノウイルスベクターによりヒトp53腫瘍抑制遺伝子をヒト腫瘍ターゲット組織細胞に導入して直接発現させ、p53タンパクの不安定によって遺伝子工学の方法でインビトロにおいて遺伝子工学組換えタンパク質製品を調製することができない問題を解決できる。また、タンパク質分子の修飾工程において、例えば、タンパク質リン酸化、フォールディング及びポリ化などの面で内因性p53タンパクと如何なる差別も無く、完全な生物活性を有し、直接に腫瘍局部においてその抗癌作用を十分発揮することができる。
【００３６】
本発明は下記の点で貢献できる。
【００３７】
構築された独特な構造と特性を有する組換えアデノウイルス、例えば「rAdMH-khp53」が、ヒトp53腫瘍抑制遺伝子のヒト腫瘍パーゲット組織細胞に直接効率的に発現させることを実現しただけでなく、また、特定的な293IQ細胞において効率的にパッケージングできる。従って、その抗癌作用が低発現系より明らかに良く、多くの低発現p53遺伝子治療に対して敏感ではない腫瘍細胞も同様に有効に抑制され、治療効果がさらに確実となり有効である。本発明のヒトp53腫瘍抑制遺伝子とアデノウイルスとを連結して、直接、真核細胞に発現することができる。すなわち、直接固形腫瘍部位に導入して発現させることができ、治療を受けるヒト自身を、p53腫瘍抑制タンパクを生産する「工場」へ変えることができる。このような方法は、タンパクの不安定、半減期が短く、活性が低く、コストが高いなどの欠点を克服することができ、この療法を大部分の患者に受け入れることができ、且つ支払う力がある治療経路になる。
【００３８】
その中で、実験に使われている293IQ細胞が、293細胞に基づいて大腸菌ラクトースリプレッサー遺伝子に形質転換された後に得られた。詳細資料としては、マシューズ（Matthews D A）、カミングス（Cummings D）、イーヴリー（Evelegh C）、その他による「Development and use of a 293 cell line expressing lac repressor for the rescue of recombinant adenoviruses expressing high levels of rabies virus glycoprotein Journal of General Virology(1999),80,345-353」が参照できる。
【００３９】
本文に記載された参考文献は、その全文が参考にされ本発明と結合する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】組換えkhp53腫瘍抑制遺伝子アデノウイルスの研究技術経路の手順を示す図である。
【図２】コザック（Kozak）規則配列を持つヒトp53遺伝子のコード断片のアガロースゲル電気泳動分析の結果を示す図であり、その中で、「Ｍ」はDL2000 DNA Marker、「１」は1206bp目的断片、「２」は陽性対照である。
【図３】pDC515(io)-khp53 組換えプラスミドの消化、電気泳動の同定結果を示す図であり、その中で、「Ｍ」は「Lamda/EcoT14I DNA Marker」、「１」はpDC515(io)-khp53組換えプラスミド、「２」は 「pDC515(io)-khp53/BamHI」、「３」は「pDC515(io)-khp53/EcoRI」である。
【図４】組換えアデノウイルスrAdMH-khp53シードウイルスの産生を示す図であり、「Ａ」は 陽性対照、「Ｂ」は ＣＰＥ（cytopathic effect、細胞変性効果）を形成する293IQ細胞、「Ｃ」は完全なＣＰＥの293IQ細胞である。
【図５】組換えアデノウイルスrAdMH-khp53 のＰＣＲ、電気泳動の同定結果を示す図であり、その中で、「Ｍ」はDL2000 DNA Marker、「１」は 陽性対照、「８」は 陰性対照、「２〜７」は同定されるクローンである。
【図６】組換えアデノウイルスrAdMH-khp53のゲノム構造を示す図であり、その中で、丸１はイントロン、丸２はＭＣＭＶプロモータ、丸３はオペロン、丸４はhp53コード配列、丸５はコザック配列、丸６は「SV40PolyA」である。
【図７】RT-PCR（逆転PCR）で電気泳動分析によりSaos-2細胞でrAdMH-khp53を感染した後p53 mRNAの発現の結果を示す図であり、その中で、「１」はA549細胞の総RNA RT産物を鋳型とするp53遺伝子コード領域内の特異的プライマー（「２〜４」の全部がこのプライマーを使用する）のPCR増幅結果（陰性対照）を示し、「２」はSaos-2細胞の総RNA RT産物を鋳型とするＰＣＲの増幅結果（陰性対照）を示し、「３」はSaos-2細胞でrAdMH-khp53が感染した後の総RNA RT産物を鋳型とするＰＣＲの増幅結果を示し、「４」は 如何なる鋳型を加えないＰＣＲの増幅結果を示し、「Ｍ」はDL2000 DNA Marker、「５」は如何なる鋳型をも加えることなく、GAPDH遺伝子特異的プライマー（「６」〜「８」の全部がこのプライマーを使用する）のＰＣＲで増幅した結果を示し、「６」はSaos-2細胞でrAdMH-khp53を感染した後の総RNA RT産物を鋳型とするＰＣＲの増幅結果を示し、「７」は Saos-2細胞の総RNA RT産物を鋳型とするＰＣＲの増幅結果を示し、「８」はA549細胞の総RNA RT産物を鋳型とするＰＣＲの増幅結果を示す。
【図８】組換えアデノウイルスrAdMH-khp53でSaos-2細胞を感染した後10時間のウェスタンブロット（Western blot）法を適用する分析結果であり、その中で、「１」は Saos-2細胞の総タンパク質、「２」は Saos-2細胞に「rAdMH-khp53」が感染された後の総タンパク質、「３」は A549細胞の総タンパク質である。
【図９】組換えアデノウイルスrAdMH-khp53の体外癌抑制活性を示す図である。
【図１０】組換えアデノウイルスrAdMH-khp53の体内癌抑制活性を示す図である。
【図１１】アデノウイルスシャトルベクターのプロファイルを示し、その中で、「Ａ」はpDC315(io)、「Ｂ」はpDC316(io)、「Ｃ」はpDC515(io)、「Ｄ」はpDC516(io)である。
【図１２（Ａ）】アデノウイルス骨格ＤＮＡが 「pBHGlox(delta)E1,3Cre」である場合を示す図である。
【図１２（Ｂ）】アデノウイルス骨格ＤＮＡが「pBHGfrt(del) E1、3FLP」である場合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下の実施例は、本発明に対する更なる解釈及び説明であり、本発明に対して如何なる制限をも有しない。
【００４２】
本発明において使用されたアデノウイルスベクターpDC315(io)，pDC316(io)及びその対応するアデノウイルス骨格 pBHGlox E1,3Creは、本元正陽遺伝子技術有限公司より購入された「AdMax（登録商標）HI-IQ Kit H」であり、製品インデックス番号は「PD-01-68」で、その中に、pFG140,293IQ細胞を含む。
【００４３】
アデノウイルスベクターpDC515(io), pDC516(io)及びその対応するアデノウイルス骨格pBHGfrt E1,3FLPは、本元正陽遺伝子技術有限公司より購入された「AdMax（登録商標）Hi-IQ Kit J」であり、製品インデックス番号は「PD-01-69」で、その中に、pFG 140,293IQ細胞を含む。
【実施例１】
【００４４】
組換えkhp53腫瘍抑制遺伝子のアデノウイルス組換え体の構築
１）khp53規則配列を持つヒトp53腫瘍抑制遺伝子コード配列（khp53 に略称する）の取得；
すでに発表されたヒト野生型p53 cDNA全配列（SEQ ID NO:3）に基づいて、二本のプライマーが設計され合成される。二本のプライマーには、上流プライマー「5’-ATA GGATCC A CCATGG AGG AGC CGC AGT C 3’」(SEQ ID NO:1)、下流プライマー「5’-ATA GGATCC ATG TCA GTC TGA GTC AG 3’」(SEQ ID NO:2)、上下流プライマーの間には全部BamHI切断部位GGATCCと切断保護性塩基ATAとを挿入し、上流プライマーのBamHI切断部位GGATCCの後にＡ塩基を付加し、最後に、ヒトp53 cDNAの中で開始コドンATGの前に二つの塩基CC後の配列、即ち、CCATGG AGG AGC CGC AGT Cとし、このように、BamHI切断部位GGATCC中のCC塩基、付加されたＡ塩基及びヒトp53 cDNA中の自有の「CCATGG」により、khp53規則配列CCACCATGG(SEQ ID NO:4)を構成し、前記ヒト野生型p53 cDNAを鋳型として、TaKaRa LA Taq （登録商標）DNAポリメラーゼ（宝生物工程（大連）有限公司）を利用し、ＰＣＲ（polymerase chain reaction、ポリメラーゼ連鎖反応）によりヒトp53腫瘍抑制遺伝子コード領域を増幅する。その中での反応条件は、ステップ１で変性94℃、２分間、ステップ２で変性94℃、30秒、ステップ３でアニーリング45℃、40秒、ステップ４で伸長72℃、60秒、ステップ５でステップ２に戻し、30サイクル、ステップ６で伸長72℃、５分間、そして、ステップ７で４℃保存する。これにより得られた大量の1206bpヒトp53遺伝子コード断片(SEQ ID NO:5)は、コザック（Kozak）規則配列を持ち、アガロースゲル電気泳動分析の結果が図2に示される。
【００４５】
２）khp53腫瘍抑制遺伝子コード配列のクローニングとシーケンシング：
前記コザック規則配列を持つヒトp53遺伝子PCR産物(SEQ ID NO:5)を直接Tベクター（上海生工生物工程技術服務有限公司）と連結させ、JM109宿主菌（北京軍事医学科学院基礎医学研究所）を形質転換し、X-gal，IPTG， Ampを含有するLB寒天プレートにプレーティングして、多くのブルー及びホワイトコロニーが出る。そこで、ブルー、ホワイトクローンを六つずつ選び、2ml増幅させ、菌液を熱溶解してPCR鋳型を調製し、上流プライマー「5’-AGCACTGTCCAACAACACCA 3’」(SEQ ID NO:6)、下流プライマー「5’-ATA GGATCC ATG TCA GTC TGA GTC AG 3’」(SEQ ID NO:2)、ＰＣＲ（反応条件は、ステップ１で変性94℃、2分間、ステップ２で変性94℃、30秒、ステップ３でアニーリング50℃、30秒、ステップ４で伸長72℃、30秒、ステップ５でステップ２に戻し、30サイクル、ステップ６で伸長72℃、5分間、ステップ７で4℃保存）でヒトp53腫瘍抑制遺伝子コード配列内277bpの特異的断片を増幅して、クローン中にヒトp53腫瘍抑制遺伝子が挿入されたかどうかを同定する。結果としては、ブルークローンには277 bp断片PCR産物が無く、空ベクターであり、ホワイトクローンには全部277 bp断片PCR産物がある。その後、ＰＣＲでポジティブクローンに同定されたプラスミドをミニプレップで取り出し、制限酵素BamHIで消化して電気泳動し、直線Ｔベクターバンドの前に約1200bpのバンドを産生し、Ｔベクターには両端にBamHI切断部位を持つヒトp53腫瘍抑制遺伝子コード配列断片を挿入したことが証明され、当該プラスミドをpUCm-khp53に命じてサンガーの方法で配列を決定し、そして、ヒトp53腫瘍抑制遺伝子コード領域の断片配列が予想結果と一致する。
【００４６】
３）組換えアデノウイルスシャトルベクターpDC515(io)-khp53の構築：
プラスミドpUCm-khp53及びアデノウイルスシャトルベクターpDC515(io)を増幅して抽出し、全部制限酵素BamHIで消化して、アガロースゲル電気泳動で必要な遺伝子断片と直線ベクターを分離し、ゲルをカットして目的断片を回収、精製し、紫外線で定量し、挿入断片とベクターとをモル比3:1の割合で混合して、T4 DNAリカーゼで16℃一晩連結させ、コンピテント大腸菌を形質転換し、上記２）項の方法で、先にポジティブクローンをスクリーングし、また、上流プライマー「5’-ACA TCC ACT TTG CCT TTC TC 3’」(SEQ ID NO:7)、下流プライマー「5’-GG GAC AGC ATC AAA TCA TCC 3’」(SEQ ID NO:8)、ＰＣＲで遺伝子の挿入方向を同定し、その反応条件は、ステップ１で、変性94℃、2分間、ステップ２で変性94℃、30秒、ステップ３でアニーリング50℃、30秒、ステップ４で伸長72℃、30秒、ステップ５でステップ２に戻し、30サイクル、ステップ６で伸長72℃、５分間、そして、ステップ７で４℃保存する。その後、ＰＣＲで同定されたポジティブクローンプラスミドをミニプレップ法で取り出し（即ち、センスで断片のクローンを挿入）し、制限酵素BamHIで消化、電気泳動して、直線シャトルベクターバンドの前に約1200bpのバンドを産生し、図3に示されるように、ベクターには両端にBamHI切断部位を持つヒトp53腫瘍抑制遺伝子コード領域断片が挿入されたことが証明され、最後に、−20℃下で、センスで遺伝子を挿入したポジティブクローンを保存し、当該クローンがpDC515(io) -khp53に命名される。
【００４７】
４）組換えkhp53腫瘍抑制遺伝子のアデノウイルスシードウイルスの調製：
pDC515(io)-khp53、アデノウイルスゲノム骨格DNA、即ちpBHGfrt(del)E1,3FLPなどのプラスミドの大量的な増幅、抽出、精製及び定量（方法は、『分子クローニング』J. サムブルック（Sambrook）など、2002を参照する）；293IQ細胞の回復、増幅及びプレーティング、Lipofectamine2000トランスフェクション試薬（広州展晨生物科技有限公司）でpDC515(io) -khp53を媒介し、アデノウイルスゲノム骨格DNA（DNAの総量は800ngで、モル比は1：1）と共に293IQ細胞にコトランスフェクションし、同時に、陰性対照を設置し、８日後ウェル293IQ細胞をコトランスフェクションして細胞変性効果 (CPE) が発生したが、陰性対照のウェル293IQ細胞の生長が正常、初歩的に、組換えアデノウイルスの産生を断定することができ、10日目までに、コトランスフェクションしたウェル293IQ細胞は完全に変性され、図4に示しされる変性細胞及び上清を収集し、−20℃〜37℃の間に繰り返して3回凍結融解し、−20℃に保存して準備する。
【実施例２】
【００４８】
組換えkhp53腫瘍抑制遺伝子のアデノウイルスの同定、クローン化、大量増幅、精製及び臨床レベルの遺伝子薬の製剤の調製
１）組換えkhp53腫瘍抑制遺伝子のアデノウイルスの同定：
上流プライマー「5’-TCG TTT CTC AGC AGC TGT TG 3’」(SEQ ID NO:9)、下流プライマー「5’-CAT CTG AAC TCA AAG CGT GG 3’」(SEQ ID NO:10)で、ＰＣＲにより組換えアデノウイルスの熱溶解により調製された鋳型を増幅させる。その反応条件は、ステップ１で変性94℃、2分間、ステップ２で変性94℃、30秒、ステップ３でアニーリング55℃、30秒、ステップ４で伸長72℃、40秒、ステップ５でステップ２に戻し、30サイクル、ステップ６で伸長72℃、５分間、そして、ステップ７で4℃保存し、Ad5ゲノム特異的断片(11-13.4mu、860bp)を増幅したら、前記形成されたウイルスが5型アデノウイルスに同定される。上流プライマー「5’-AGCACTGTCC  AACAACACCA 3’」(SEQ ID NO:6)、下流プライマー「5’-ATA GGATCC ATG TCA GTC TGA GTC AG 3’」(SEQ ID NO:2)で、以上のように、ＰＣＲによりヒトp53腫瘍抑制遺伝子コード領域内277bpの特異的断片を増幅して、当該5型アデノウイルス中にヒトp53腫瘍抑制遺伝子が挿入されたかどうかを同定し、結果は図5に示されるように、六つのクローンを有し、全部5型アデノウイルスであり、全部ヒトp53腫瘍抑制遺伝子を持っている。
【００４９】
２）組換えkhp53腫瘍抑制遺伝子のアデノウイルスシードウイルスのクローン化；
293IQ細胞はMEM培養液で、濃度が1×105細胞 /mlである懸濁液を調製し、100μl/ウェルで96ウェルプレートに植菌した。同時に、10倍系希釈で、前記組換えアデノウイルスの希釈液を調製してそれぞれ293IQ細胞を感染し、37℃下で、CO2インキュベーターの中で10日培養し、逆さにして顕微鏡で調べ、最高希釈度でＣＰＥの状況を判断且つ記録して、一つのプラークしか形成しない単一細胞及び上清を収集し、-20℃〜37℃の間で繰り返して３回凍結融解し、293IQ細胞に基づいてさらに増幅させ、クローン化された組換えアデノウイルスのシードとして、その構造が図6に示される。当該組換えアデノウイルスを「E1、E3欠失された5型組換えアデノウイルスrAdMH-khp53」に命名し、「rAdMH-khp53」の略称で、2005年06月20日に中国典型培養物寄託中心、中国、武漢に寄託される。その寄託番号はCCTCC-V200508である。
【００５０】
３）組換えアデノウイルスの大量増幅及び保存：
37℃、5％CO2の条件下で、φ15cm細胞プレートで293IQ細胞（培地：MEM+10%FBS）を培養し、全部100プレートがあり、細胞が80-90%コンフルエント状態に生長した場合、20μlの前記種のウイルス液を添加し、細胞を37℃、5％CO2条件下に置いて、引き続き培養して調べ、すべての細胞が変性した後、懸濁細胞をピペッティングして、細胞懸濁液を遠心管に収集し、800-1000rpmで5min遠心して細胞を収集して、300cm2ごと収集された細胞沈殿を2mlのアデノウイルス保存液  (1×PBS2+10%グリセリン)に懸濁させ、-20℃〜37℃の間で繰り返して3回凍結融解し、4℃、2000rpmで10min遠心、上清を収集して、0.45/0.2μm膜を透過してろ過し、-20℃で保存して用意する。
【００５１】
４)イオン交換クロマトグラフィー精製及び臨床レベル組換えアデノウイルス遺伝子薬の製剤の調製
AKTA（登録商標）explorer 100 全自動クロマトグラフィーシステム（アマシャムファルマシアバイオテク（中国）社（Amersham Pharmacia Biotech (China)Ltd.））で、条件が20ml Q Sepharose XLカラム、溶出液が1M NaCl、50mM Tris/HCL ,pH8.0、5％ グリセリン、リニアグラジエントが0〜100% 、400ml（20個カラム容量）、クロマトグラフィーのチャートに基づいて組換えアデノウイルスの画分を収集し、最後に0.1M NaOHで洗浄する。精製した後の組換えアデノウイルスが脱塩によりpH（pH8.0）を調整し、0.2μmフィルタでろ過除菌し、サブパッケージングした後、最後に-80℃の冷蔵庫に保存した。
【実施例３】
【００５２】
組換えkhp53腫瘍抑制遺伝子のアデノウイルスの力価の測定、アデノウイルスの顆粒数の測定及びヒト悪性腫瘍細胞中の遺伝子発現解析
１）TCID50方法で組換えアデノウイルスの力価を測定する：
293IQ細胞はMEM培養液で濃度が1×105細胞/mlである懸濁液を調製し、100μl/ウェルで96ウェルプレートに植菌した。同時に、10倍系希釈でウイルス希釈液を調製し、それぞれ293IQ細胞を感染し、一列ごとの前10個ウェルにそれぞれ100μlの同じ濃度のウイルス希釈液を入れて、11、12目のウェルに同じ容量の2％BCSのMEM培養液を入れて陰性対照とした。37℃、CO2インキュベーターで10日培養し、逆さにして顕微鏡で調べ、ＣＰＥの状況を判断して記録し、最後に、下記の式で組換えアデノウイルスの力価を計算し、 T=101+d(S-0.5)IU/ml、その中で、d=Log10（希釈倍数）=1、S=1回目の希釈からの陽性比率の和がウェルごとの値であり、陽性は0.1、陰性は0、２回の平行テストにより得られた力価値の差が「≦100.7＝5」、これらの数値から当該式はT=10S＋0.5IU/mlになることにした。結果としては、二つ96ウェルプレートのS値がそれぞれ「8.8」と「8.6」とになり、力価はそれぞれ2.00×1010IU/mlと1.26×1010IU/mlとで、平均値は1.63×1010IU/mlである。
【００５３】
２）紫外吸収法でアデノウイルス顆粒数の測定：
実施例２のステップ４で精製された組換えアデノウイルス250μlを取り、同容量0.2％SDS溶液を加えて溶解させ、均一に振動混合し、56℃水浴に10分間放置した。温度が室温まで下がる時、瞬間遠心した。ウイルス保存液を0.2％SDS溶液の同容量混合液とブランク対照として、波長260nmと280nmの吸光値を測定し、平行テストを２回行い、式でウイルス顆粒数を計算「A260×希釈倍数×1.1×1012」した。測定結果により、これらの「rAdMH-khp53」のウイルス顆粒数が4.6×1011VP/mlであることを表した。
【００５４】
３）RT-PCRでp53遺伝子発現の検出：
ヒト骨肉腫Saos-2細胞（p53遺伝子を発現しない）とヒト肺癌A549細胞（野生型p53遺伝子を発現する）（広州中山大学実験動物中心）を回復させて培養し、6cmの細胞プレート（Saos-2細胞が２個、A549細胞が１個）にそれぞれプレーティングして、rAdMH-khp53組換えアデノウイルスが10MOIで一皿のSaos-2細胞を感染し、10時間後、トリゾル試薬（Trizol（登録商標）reagent）（商品名）（invitrogen社）のキットに提供された方法に基づいて、Saos-2、Saos-2+rAdMH-khp53、A549細胞の総RNAを抽出した、
「Fermentas Rebert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit」（上海生工生物工程技術服務有限公司）におけるキットに提供された方法に基づいて、Saos-2、Saos-2+rAdMH-khp53、A549細胞のcDNA 一本目の鎖を合成した、
各細胞のcDNA一本目の鎖を鋳型としてＰＣＲで（増幅方法は、実施例２の１）項におけるp53遺伝子の同定と同じ）p53特異的断片を増幅し、同時に、ＰＣＲにより増幅したハウスキーピング遺伝子GAPDHの特異的断片を内対照として、ブランク対照を設置した、
アガロースゲル電気泳動でPCR産物を調べ、紫外線光下で写真を取り、結果が図7に示される。
【００５５】
第１のバンドが、A549細胞総RNA RT-PCRの結果であり、p53 mRNAの発現がある、
第２のバンドが、Saos-2細胞総RNA RT-PCRの結果であり、p53 mRNAの発現がない、
第３のバンドが、rAdMH-khp53でSaos-2細胞を感染して10時間後の総RNA RT-PCRの結果であり、p53 mRNAの発現があり、外来遺伝子発現の結果である、
第４のバンドが陽性対照であり、RT-PCRシステムには如何なる鋳型も加えてなく、バンドが出なかった、
ＭバンドはDNA分子量標準である、
第５〜第７のバンドが、A549、Saos-2、Saos-2+rAdMH-khp53細胞の総RNAを鋳型として、ハウスキーピング遺伝子GAPDHの特異的プライマーをRT-PCR増幅した結果では、全部バンドがある、
第８のバンドは陰性対照であり、RT-PCRシステムでは如何なる鋳型も加えてなく、バンドが出なかった。
【００５６】
４）SDS-PAGE,ウェスタンブロット（Western blot）でP53タンパク質発現の検出：
通常方法で抽出して、上記３）項において処理された細胞の総タンパクで定量を行った、
15％ポリアクリルアミドゲルを調製してタンパク電気泳動した、
NC膜と２枚のワットマン（Whatman）ろ紙をカットし、２枚海綿と一緒に転移バッファーで５分間含浸した、
電子移動装置を設置した後、50mA電流下で一晩ブロットした、
ブロットした後、ＰＢＳ（phosphate buffered saline、リン酸緩衝食塩水）で２分間洗浄し、5％BSAのＰＢＳにおいて30分間ブロッキングした、
5mlマウス抗ヒトp53の一次抗体（尚柏生物医学技術（北京）有限公司）（5％BSAを含有するＰＢＳを1:500まで希釈する）を添加し、振動器で１時間インキュベートした、
ＰＢＳで５回洗浄し、５分間/回である、
HRP-ヒトP53の二次抗体（尚柏生物医学技術（北京）有限公司）を添加し、1:1000まで希釈して（5%BSAを含有するPBS 希釈）、振動器で 30分間インキュベートした、
ＰＢＳで５回洗浄し、５分間/回である、
メンブレンをDAB顕色剤に入れて、室温において軽く揺らし、顕色反応を観察し、バンドが必要な濃度に達した場合（１〜3分間）、直ちに水で洗浄し、最後にメンブレンをPBS溶液に入れて、取り出して写真を撮り、結果が図８に示される。
【００５７】
第1のバンドが、Saos-2細胞総タンパク質のウェスタンブロットの結果であり、p53タンパクのブロットがなく、Actinタンパクのブロットがある、
第２のバンドは、rAdMH-khp53でSaos-2細胞を感染した10時間後の総タンパクウェスタンブロットの結果であり、p53タンパクのブロットが非常に大きく、その発現量が非常に高いことを説明でき、Actinタンパクのブロットのサイズが第1のバンドと相似する、
第３のバンドは、A549細胞総タンパクウェスタンブロットの結果であり、P53タンパクのブロットがあり、Actinタンパクのブロットもある。
【実施例４】
【００５８】
組換えkhp53腫瘍抑制遺伝子のアデノウイルスがインビトロとインビボでヒト悪性腫瘍細胞の生長に対する抑制
１）ＭＴＴ（テトラゾリウム塩の一種）で細胞生存率の測定実験：
96ウェルプレートにおいて、5000個細胞/ウェルで悪性腫瘍細胞（ヒト肺癌A549細胞、ヒト肝癌HepG2細胞、ヒト乳腺癌MCF-7細胞、ヒト鼻咽癌HNE-1細胞、ヒト卵巣癌SK-OV-3、ヒト子宮頚癌Hela細胞等）（すべて広州中山大学実験動物中心から取得された）を植菌し、完全に接着した後、不同なＭＯＩ（multiplicity of infection、ウイルス粒子数と細胞数の比率）(0,2.5,5,10,25,50,100,250)のrAdMH（外来遺伝子がない）（前記rAdMH-khp53の生産過程を参照し、外来遺伝子のないシャトルプラスミドpDC515(io)とアデノウイルスゲノム骨格 pBHGfrt(del)E1,3FLPにより、293IQ細胞の中で組換えて産生された）、rAdMH-LacZ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子を持っている（前記rAdMH-khp53の生産過程を参照し、センスでβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に挿入したシャトルプラスミドpDC515(io)−LacZとアデノウイルスゲノム骨格pBHGfrt(del)E1,3FLPにより、293IQ細胞で組換えして産生され、その中で、pDC515(io)−LacZ組換えプラスミドは、LacZ遺伝子(SEQ ID NO:12)をHindIII制限酵素で切断し、Klenow酵素で末端を平滑化し、pDC515(io)をEcoRI制限酵素で切断し、Klenowで末端を平滑化した後、全部BanHI制限酵素で切断し、電気泳動で二つのDNA断片を分離して精製した後、連結、形質転換及びスクリーングにより得られた）及びrAdMH-khp53でそれぞれ細胞を感染した。４日後、培養液を除去して150μL/ウェル(0.5mg/mL)のMTT溶液を加えて、37℃、4時間作用してから除去した。再び150μL/ウェルDMSO を添加し、水平振動器で10min振動し、570nm波長下でＡ値を測定し、結果としては、rAdMH-khp53が各悪性腫瘍細胞に対して明らかなキラー作用を有し、ヒト肺癌A549細胞を例として、遺伝子治療組の生存細胞が明らかに減少し、その結果を図9に示す。
【００５９】
２)  rAdMH-khp53遺伝子薬物でヌードマウス移植腫瘍に対する治療実験：
ヌードマウスの９匹を選択し、それぞれ前背部、右後背部と左後背部の不同な部位に5×106ヒト肺癌A549細胞を含有するPBS懸濁液0.1mlを皮下注射した。腫瘍接種して６日後、不同な部位の腫瘍小結節（又は腫瘍接種部位）内で、それぞれ1×109IUのrAdMH-khp53（右後背部）、rAdMH-LacZ（前背部）及びブランク対照液PBS（左後背部）0.1 mlを注射した。
【００６０】
２日を隔て1回注射し、全部で６回注射をし、毎回注射前に、腫瘍体積を測定し、24日観察した。結果として、遺伝子治療組の腫瘍が明らかに縮小され、その結果を図10に示す。実験完成した後、実験動物を死亡させ、腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、脳などの組織を切り取り、固定、パラフィンで包埋し、組織を切片し、動物体内の組換えアデノウイルスのターゲット組織及び非ターゲット組織に導入される分布状況を免疫組織化学法で分析し、結果として、マウスの心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓、脳などの組織構造が完全で明らかな損傷がなく、腫瘍組織で組み込みアデノウイルスの存在が見られ、非腫瘍組織にアデノウイルスがない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２（Ａ）】
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【図１２（Ｂ）】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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