(57)【要約】  本発明はポリペプチドおよび蛋白質の化学合成のための方法および中間体、さらにとりわけ、Ｎ−末端β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含むペプチドフラグメントをＣ−末端チオエステルを有する別のペプチドフラグメントと化学的に連結して、自発的に再配列してアミド結合を形成するβ（ベータ）−アミノ−チオエステル中間体を生み出すための方法および中間体に関する。また、本発明はβ（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびその保護された型を合成する方法に冠する。そのうえ、本発明はポリペプチドおよび蛋白質のβ（ベータ）−メチル−チアゾリジン残基をβ（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）残基に変換することに関する。  【選択図】図１
2010538063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオエステル部分を有する第１分子と酸化されていないスルフヒドリル部分を有するβ（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）残基を有する第２分子間にアミド結合を形成するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）第１分子のチオエステル部分を第２分子のβ（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）残基の酸化されていないスルフヒドリル部分と反応させて第１分子および第２分子をβ（ベータ）−アミノ−チオエステルリンケージによりつなぐ中間体を生み出すこと；および
（ｂ）中間体のβ（ベータ）−アミノ−チオエステルリンケージを分子内で再配列させ、第１分子および第２分子をつなぐアミド結合を形成させることを含む、前記方法。
【請求項２】
前記の第１分子および第２分子がペプチドフラグメント、ポリペプチド、ペプチドミメティックおよび蛋白質を含む群から独立して選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の反応ステップおよび再配列ステップが液相または固相中で起こる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記反応ステップが少なくとも１つのチオール触媒の存在下で起こる、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記チオール触媒がチオフェノール、１−チオ−２−ニトロフェノール、２−チオ−安息香酸、２−チオ−ピリジン、４−チオ−２−ピリジンカルボン酸、４−チオ−２−ニトロピリジン、４−メルカプトフェニル酢酸、２−メルカプトエタンスルホン酸、３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸、および２，３−ジメルカプトプロパンスルホン酸からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）チオエステルを有する第１分子部分；
（ｂ）β（ベータ）−メチル−システイン残基（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有する第２分子部分；および
（ｃ）チオエステルとβ（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）をつなぐβ（ベータ）−アミノ−チオエステルリンケージを含む、分子中間体。
【請求項７】
前記β（ベータ）−アミノ−チオエステルリンケージが自発的に分子内で再配列し、前記第１分子部分および第２分子部分をつなぐアミド結合を形成する、請求項６に記載の分子中間体。
【請求項８】
２つのペプチドフラグメントの連結によってポリペプチドまたは蛋白質を合成するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）Ｎ−末端β（ベータ）−メチル−チアゾリジンを含む第１ペプチドフラグメントのＣ−末端チオエステルと第２ペプチドフラグメントのＮ−末端β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の連結によりアミド結合を形成すること；および
（ｂ）酸性条件下で求核試薬により連結生成物を処理し、Ｎ−末端β（ベータ）−メチル−チアゾリジン残基をＮ−末端β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）残基に変換することを含む、前記方法。
【請求項９】
前記求核試薬がＯ−アルキルヒドロキシルアミンである、請求項８に挙げた方法。
【請求項１０】
前記Ｏ−アルキルヒドロキシルアミンがＯ−メチルヒドロキシルアミンである、請求項９に挙げた方法。
【請求項１１】
前記酸性条件がｐＨ２．０〜ｐＨ６．０の範囲にある、請求項８、９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
所望するポリペプチドまたは蛋白質が形成されるまで前記ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）が反復されうる、請求項８、９、１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
遊離Ｎ−末端β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含むポリペプチドを合成するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）固相または液相中でＮ−末端β（ベータ）−メチル−チアゾリジン残基を含むポリペプチドを合成すること；および
（ｂ）酸性条件下で求核試薬によりポリペプチドを処理し、Ｎ−末端β（ベータ）−メチル−チアゾリジン残基を遊離Ｎ−末端β（ベータ）−メチル−システイン残基（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に変換することを含む、前記方法。
【請求項１４】
前記求核試薬がＯ−アルキルヒドロキシルアミンである、請求項１３に挙げた方法。
【請求項１５】
前記Ｏ−アルキルヒドロキシルアミンがＯ−メチルヒドロキシルアミンである、請求項１４に挙げた方法。
【請求項１６】
以下のステップ：
（ａ）Ｎ−Ｂｏｃ−トレオニン−ｔ−ブチルエステル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）をＮ−Ｂｏｃ−Ｏ−メタンスルホニル−トレオニン−ｔ−ブチルエステル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）に変換すること；
（ｂ）Ｎ−Ｂｏｃ−Ｏ−メタンスルホニル−トレオニン−ブチルエステル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）をアロ−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｓ−アセチル−β（ベータ）−メチル−システイン−ｔ−ブチルエステル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）に変換すること；
（ｃ） アロ−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｓ−アセチル−β（ベータ）−メチル−システイン−ｔ−ブチルエステル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）をアロ−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）に変換すること；
（ｄ）アロ−β（ベータ）−メチルシステイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）およびトリフェニルメタノールをアロ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）に変換すること；および
（ｅ）アロ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）をアロ−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）に変換することを含む、アロ−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を合成するための方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法によって合成される、アロ−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）。
【請求項１８】
式  アロ−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の化合物、または薬剤的に受容可能なその塩。
【請求項１９】
以下のステップ：
（ａ）Ｎ−Ｂｏｃ−トレオニン−ｔ−ブチルエステル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）をＮ−Ｂｏｃ−Ｏ−メタンスルホニル−トレオニン−ｔ−ブチルエステル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）に変換すること；
（ｂ）Ｎ−Ｂｏｃ−Ｏ−メタンスルホニル−トレオニン−ブチルエステル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）をアロ−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｓ−アセチル−β（ベータ）−メチル−システイン−ｔ−ブチルエステル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）に変換すること；
（ｃ） アロ−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｓ−アセチル−β（ベータ）−メチル−システイン−ｔ−ブチルエステル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）をアロ−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）に変換すること；
（ｄ）アロ−β（ベータ）−メチルシステイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）およびトリフェニルメタノールをアロ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）に変換すること；および
（ｅ）アロ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）をアロ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）に変換することを含む、アロ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を合成するための方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法によって合成される、アロ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）。
【請求項２１】
式  アロ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）の化合物、または薬剤的に受容可能なその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリペプチドおよび蛋白質の化学合成のための方法および中間体、さらにとりわけ、Ｎ−末端ベータ−メチル−システイン（“β（ベータ）−メチル−システイン”；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含むペプチドフラグメントをＣ−末端チオエステルを有する別のペプチドフラグメントと化学的に連結して、自発的に再配列してアミド結合を形成するベータ−アミノ−チオエステル（“β（ベータ）−アミノ−チオエステル”）中間体を生み出すための方法および中間体に関する。その上、本発明はβ（ベータ）−メチル−システインおよびベータ−メチル−チアゾリジン（“β（ベータ）−メチル−チアゾリジン”；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１））を合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質を化学的に合成するためのいくつかの技術が開発されている。たとえば、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，２版，１９８４）およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．ら，Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９８４）を参照されたい。それらの中で、ネイティブな化学的連結がネイティブな蛋白質を化学的に生み出すための最も有用な方法の１つであることが証明されている。しかし、ネイティブな化学的連結は、システイン残基を有するポリペプチドおよび蛋白質の合成に適しているだけであり、かかるシステイン残基は最終標的ポリペプチドおよび蛋白質を形成するためにペプチドフラグメントを連結するための接続点として使用することができる。
【０００３】
改善された化学的および生物学的特性を有するポリペプチドならびに蛋白質類似体および誘導性を作り出すために、ポリペプチドおよび蛋白質の内側の特定の部位への非天然アミノ酸残基の組み込みが時には必要である。そのような類似体および誘導体は改善された化学的安定性、改善された酵素的安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏでの作用期間延長、および亢進した生物学的活性を有することができる。そのような非天然アミノ酸の１クラスはβ（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）である。β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）はジスルフィドブリッジおよびペプチド骨格に構造的束縛を負わせ、そしてペプチド結合を酵素的開裂から潜在的に保護することができる（たとえば、Ｈａｖｉｖ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６：３６３−３６９；Ｆａｉｌｉｅ，Ｄ．Ｐ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２：６５４−６８６；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｍ．，ら，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，１９９５，３５：２０−３２；およびＳｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．，ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，１９９５，４６：４７−５５を参照されたい）。生物学的にいっそう活性で、酵素的にいっそう安定な蛋白質類似体および誘導体を生み出すために、蛋白質の内側のいずれか所望する位置にβ（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）残基を組み込むための新規な化学的方法を開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は２つの分子間にアミド結合を形成する方法に関し、そのような分子は蛋白質、ポリペプチド、ペプチドミメティック、ポリマー、またはそのいずれかの組み合わせでありうる。これらの２つの分子間で、一方の−“第１”−分子は末端β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）残基を含み、他方の−“第２”−分子はチオエステル官能基を含む。図１に示すように、反応中、２つの分子は初めにチオエステルリンケージを介してつながり、その後β（ベータ）−アミノ−チオエステルリンケージは分子内再配列により自発的に最終アミド結合に変換する。生じた最終生成物は新規に形成されたアミド結合を介してつながる２つの分子の部分を含む。
【０００５】
本発明の別の側面は液相または固相中で実行される連結反応に関する。反応媒体はチオール触媒を含んでいてもよい。そのようなチオール触媒には、チオフェノール、１−チオ−２−ニトロフェノール、２−チオ−安息香酸、２−チオ−ピリジン、４−チオ−２−ピリジンカルボン酸、４−チオ−２−ニトロピリジン、４−メルカプトフェニル酢酸、２−メルカプトエタンスルホン酸、３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸、および２，３−ジメルカプトプロパンスルホン酸が挙げられるがそれらに限定されない。
【０００６】
本発明の別の側面はβ（ベータ）−メチル−チアゾリジンからβ（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）への変換に関する。この段階的な連結では、Ｎ−末端β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）とＣ−末端チオエステルを持つペプチドフラグメントが必要である。しかし、Ｂｏｃ−化学のためのベンジルならびにＦｍｏｃ−化学のためのトリチルおよびｔ−ブチルのような慣用のチオ−保護基を使用して、Ｎ−末端β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のスルフヒドリル基を保護することはできない。これは、最終開裂ステップ中、そのような慣用の保護基が除去され、遊離スルフヒドリル基が生み出されて、それがＣ−末端チオエステルと反応して所望しない生成物を形成することになるという事実のためである。
【０００７】
この問題を検討するために、本発明は、図２に示すように、ポリペプチドおよび蛋白質の化学合成中にβ（ベータ）−メチル−チアゾリジン型におけるＮ−末端β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を保護するための方法を提供する。β（ベータ）−メチル−チアゾリジンは開裂ステップ中、元のままの状態であり、Ｎ−末端β（ベータ）−メチル−チアゾリジンおよびＣ−末端チオエステルを含むペプチド中間体が生み出されることになる。この中間体はＣ−末端チオエステルを含む別のペプチドフラグメントとの連結反応において使用されることになる。連結反応の後にだけ、生成物中の遊離β（ベータ）−メチル−チアゾリジンは酸性条件下で、求核試薬を使用することによって遊離β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に変換されることになり、ここで該求核試薬はＯ−アルキルヒドロキシルアミンであり、さらに具体的には該Ｏ−アルキルヒドロキシルアミンはＯ−メチルヒドロキシルアミンであり、そして酸性条件はｐＨ２．０〜ｐＨ６．０の範囲にある。生じたＮ−末端β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）残基を有するより大きなペプチドフラグメントをその後の連結ステップに使用して、さらにより大きなポリペプチドまたは蛋白質を生み出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は本発明の一側面に従ってアミド結合を形成するための合成スキームを示す図である。
【図２】図２は本発明の一側面に従ってポリペプチドおよび蛋白質の化学的合成中にβ（ベータ）−メチル−チアゾリジン型でＮ−末端β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を保護するための合成スキームを示す図である。
【図３】図３はＮ−Ｂｏｃ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）およびＮ−Ｆｍｏｃ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を合成するための合成スキームを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の化合物中に存在するある種のアミノ酸は以下のように表すことができ、以下のように本明細書に表される：
ＡｌａまたはＡはアラニンであり、
ＡｒｇまたはＲはアルギニンであり、
ＡｓｎまたはＮはアスパラギンであり、
ＡｓｐまたはＤはアスパラギン酸であり、
ＣｙｓまたはＣはシステインであり、
ＧｌｎまたはＱはグルタミンであり、
ＧｌｕまたはＥはグルタミン酸であり、
ＧｌｙまたはＧはグリシンであり、
ＨｉｓまたはＨはヒスチジンであり、
ＩｌｅまたはＩはイソロイシンであり、
ＬｅｕまたはＬはロイシンであり、
ＬｙｓまたはＫはリシンであり、
ＭｅｔまたはＭはメチオニンであり、
Ｎｌｅはノルロイシンであり、
ＰｈｅまたはＦはフェニルアラニンであり、
ＰｒｏまたはＰはプロリンであり、
ＳｅｒまたはＳはセリンであり、
ＴｈｒまたはＴはトレオニンであり、
ＴｒｐまたはＷはトリプトファンであり、
ＴｙｒまたはＹはチロシンであり、そして
ＶａｌまたはＶはバリンである。
【００１０】
本明細書で使用されるある種の他の略語は以下のように定義される：
Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルであり、
Ｂｚｌはベンジルであり、
ＤＣＭはジクロロメタンであり、
ＤＩＣはＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミドであり、
ＤＩＥＡはジイソプロピルエチルアミンであり、
Ｄｍａｂは４−｛Ｎ−（１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロへキシリデン）−３−メチルブチル）−アミノ｝ベンジルであり、
ＤＭＡＰは４−（ジメチルアミノ）ピリジンであり、
ＤＭＦはジメチルホルムアミドであり、
ＤＮＰは２，４−ジニトロフェニルであり、
Ｆｍｏｃはフルオレニルメチルオキシカルボニルであり、
ＨＢＴＵは２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、
ｃＨｅｘはシクロヘキシルであり、
ＨＯＡｔはＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、
ＨＯＢｔは１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールであり、
Ｍｍｔは４−メトキシトリチルであり、
ＮＭはＮ−メチルピロリドンであり、
Ｐｂｆは２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニルであり、
Ｐｈはフェニルであり、
ｔＢｕまたはｔ−ブチルはｔｅｒｔ−ブチルであり、
ＴＩＳはトリイソプロピルシランであり、
ＴＯＳはトシルであり、
Ｔｒｔはトリチルであり、
ＴＦＡはトリフルオロ酢酸であり、
ＴＦＦＨはテトラメチルフルオロホルアミジニウムヘキサフルオロホスフェートであり、そして
Ｚはベンジルオキシカルボニルである。
【００１１】
本開示におけるアミノ酸のすべての略語（たとえば、Ａｌａ）は−ＮＨ−Ｃ（Ｒ）（Ｒ′）−ＣＯ−の構造を表し、式中ＲおよびＲ′はそれぞれ独立して水素またはアミノ酸の側鎖（たとえば、Ａｌａの場合Ｒ＝ＣＨ３およびＲ′＝Ｈ）であり、あるいはＲとＲ′が一緒になって環系を形成してもよい。
【００１２】
お互いに等価である用語、“ベータ−メチル−システイン”、“β（ベータ）−Ｍｅ−Ｃｙｓ”、または“β（ベータ）−ＭｅＣｙｓ”（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）によって意味するものは：
【００１３】
【化１】
2010538063.tif 000003
【００１４】
であり、そしてそれはＬ−またはＤ−コンフィギュレーションでありうる。
お互いに等価である用語“β（ベータ）−メチル−チアゾリジン”、“β（ベータ）Ｍｅ−Ｔｈｚ”、“β（ベータ）−ＭｅＴｈｚ”または“β（ベータ）ＭｅＴｈｚ”によって意味するものは：
【００１５】
【化２】
2010538063.tif 000004
【００１６】
であり、そしてそれはＬ−またはＤ−コンフィギュレーションでありうる。
お互いに等価である用語“β（ベータ）−アミノ−チオエステル”、または“β（ベータ）−（アミノ）−チオエステル”によって意味するものは：
【００１７】
【化３】
2010538063.tif 000005
【００１８】
である。
【実施例】
【００１９】
本発明の異なる特徴をさらに説明するために実施例が以下に提供される。実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法論を説明する。これらの実施例は主張された本発明を限定しない。
【００２０】
本発明で使用されるペプチドフラグメントは標準固相ペプチド合成によって調製することができる（たとえば、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，２版．１９８４）を参照されたい）。
【００２１】
実施例１：Ｎ−Ｂｏｃ−トレオニン−ｔ−ブチルエステル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
３０ｍｌのジクロロメタン中のトレオニン−ｔ−ブチルエステル・ＨＣｌ（２．２ｇ、１０ｍｍｏｌｅｓ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５））の氷冷懸濁液に、４．２ｍｌのトリエチルアミン（３当量）、続いて２ｍｌのジクロロメタン中のジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカルボネート（（Ｂｏｃ）２Ｏ、２．８ｇ、１．２当量）の溶液を添加し、混合物はゆっくり室温に戻した。２時間攪拌後、混合物は２０ｍｌのクロロホルムで希釈し、それを水で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させた。揮発性物質は真空下で除去し、乾固させた。粘性オイル（２．８ｇ）が得られた。生成物は、それ以上精製せずに次の反応に直接使用した。
【００２２】
実施例２：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｏ−メタンスルホニル−トレオニン−ｔ−ブチルエステル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
−２０℃に冷やしたピリジン４０ｍｌ中のＮ−Ｂｏｃ−トレオニン−ｔ−ブチルエステル（２．８ｇ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４））の攪拌溶液にメタンスルホニルクロリド２ｍｌ（２．５当量）を滴下して加え、混合物は室温に戻した。一晩攪拌後、反応混合物は氷水（３００ｍｌ）に注ぎ、それをエーテル（２ｘ２５０ｍｌ）で抽出した。エーテル抽出物は、洗浄液が酸性（ｐＨ４）になるまで０．４Ｎ  ＨＣｌで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させた。溶媒は真空下で除去し、乾固させた。青白い固体（３．３ｇ）が得られた。ＴＬＣ（シリカゲル、クロロホルム／アセトン＝９：１、Ｒｆ＝０．５６、ニンヒドリンスプレー）。
【００２３】
実施例３：アロ−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｓ−アセチル−β（ベータ）−メチル−システイン−ｔ−ブチルエステル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
２０ｍｌのメタノール中のチオール酢酸（３０ｍｍｏｌｅｓ）２．５ｍｌの溶液に、窒素雰囲気下でメタノール中の１．０Ｎ  ＫＯＨ２４ｍｌを添加し、１時間攪拌後、揮発性物質を真空下で除去し、淡黄色の固体であるチオール酢酸カリウムを得た。それを３０ｍｌのジメチルホルミドに溶かし、氷浴で冷やし、窒素雰囲気下で２０ｍｌのジメチルホルミド中のＮ−Ｂｏｃ−Ｏ−メタンスルホニル−トレオニン−ｔ−ブチルエステル（未精製物３．３ｇ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６））の溶液を滴下して加えた。反応混合物は窒素雰囲気下で室温に戻し、一晩攪拌した（ゲル形成）。溶媒は真空下で除去し、乾固させた。残渣はエチルアセテートと水に分配した。エチルアセテート層は水で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させた。溶媒の留去後、残渣は、溶離液としてクロロホルム／アセトン＝１９５：５を使用するシリカゲル（６０ｇ）のクロマトグラフィーにかけた。適切な画分はプールし、溶媒は真空下で除去し、乾固させた。茶色の粘性物質（２．３ｇ）が得られた。ＴＬＣ（シリカゲル、クロロホルム／エチルアセテート＝９：１、Ｒｆ＝０．８２）。
【００２４】
実施例４：アロ−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
アロ−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｓ−アセチル−β（ベータ）−メチル−システイン−ｔ−ブチルエステル（６８０ｍｇ、２ｍｍｏｌｅｓ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７））は１０ｍｌのトリフルオロ酢酸で１時間処理した。揮発性物質を真空下で除去し、乾固させた後、残渣は１０ｍｌの６Ｎ  ＨＣｌで溶かし、窒素雰囲気下で一晩８０〜８５℃（油浴）で加熱した。過剰なＨＣｌと水は真空下で除去し、乾固させ、残渣は凍結乾燥させた。エレクトロスプレイイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）は１３６．５および他のピークを示した。生成物は、それ以上精製せずに次の反応に直接使用した。アルゴンによる窒素の置換および６Ｎ  ＨＣｌによる脱ガスが収率を改善できることが認められた。
【００２５】
実施例５：アロ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
未精製のアロ−β（ベータ）−メチルシステイン（２ｍｍｏｌｅスケール；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０））およびトリフェニルメタノール（５２０ｍｇ、１当量）の混合物は１０ｍｌのトリフルオロ酢酸で３０分間処理し、揮発性物質は真空下で除去して乾固させた。淡黄色の固体が得られた。ＥＳＩ−ＭＳは３７７．７を示した。
【００２６】
実施例６：アロ−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
未精製のアロ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）は２０ｍｌのアセトニトリルに溶かし、水性ＮａＨＣＯ３で処理し、溶液をｐＨ８にし、５ｍｌアセトニトリル中のｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（５２０ｍｇ）の溶液を添加した。２時間後、反応混合物は冷やし、５％ＫＨＳＯ４で酸性化し、それをエチルアセテート（５０ｍｌ）で抽出し、乾燥（ＭｇＳＯ４）させた。溶媒の留去後、残渣は、溶離液としてクロロホルム／メタノール＝１９５：５を使用するシリカゲル（５０ｇ）のクロマトグラフィーにかけた。適切な画分をプールし、溶媒は真空下で除去し、乾固させた。白色泡状物（１６０ｍｇ）が得られた。ＴＬＣ（シリカゲル、クロロホルム／メタノール＝４：１、Ｒｆ＝０．５１）。ＥＳＩ−ＭＳは５００．２および２４３．３のピークを示した。
【００２７】
実施例７：アロ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチルシステイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
以下はアロ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）の調製の説明である。該化合物はアロ−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｓ−トリチル−β（ベータ）−メチル−システイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）に類似した方法で調製された。ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートの代わりにＦｍｏｃ−ｏｓｕが使用された。ＴＬＣ（シリカゲル、クロロホルム／メタノール＝９：１、Ｒｆ＝０．２７）。ＥＳＩ−ＭＳは６２２．０を示した。
【００２８】
実施例８：モデルペプチドβ（ベータ）−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）の調製
【００２９】
【化４】
2010538063.tif 000006
【００３０】
表題ペプチドは手動ペプチドシンセサイザーで合成した。Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡレジン（１０６ｍｇ、７６マイクロモル、０．７２ｍｍｏｌｅ／ｇ）（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）が使用された。Ｆｍｏｃアミノ酸は以下の側鎖保護と一緒に使用された：Ｂｏｃ−β（ベータ）−ＭｅＣｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５））およびＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６））。Ｆｍｏｃ基はＤＭＦ中２５％ピペリジンによる１０分間、および再度２０分間の処理により除去された。それぞれのカップリングステップでは、ＮＭＰ中のＦｍｏｃアミノ酸（４当量）、ＨＯＢｔ（４当量）およびＤＩＣ（４当量）が使用された。以下の反応サイクルが使用された：（１）ＤＭＦによる洗浄；（２）ＤＭＦ中２５％ピペリジン、３０分間によるＦｍｏｃ保護基の除去；（３）ＤＭＦによる洗浄；および（４）予め活性化されたＦｍｏｃアミノ酸との９０分間のカップリング。Ｂｏｃ−ベータ−ＭｅＣｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（５０．３ｍｇ  ０．１０５ｍｍｏｌｅ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４））はＮＭＰ中のＴＦＦＨ（２７．８ｍｇ、０．１０５ｍｍｏｌｅ）、およびＤＩＥＡ（２７ｍｇ、０．２１１ｍｍｏｌｅ）を使用して１２時間カップリングさせた。このカップリングはその後、ＮＭＰ中のＢｏｃ−β（ベータ）−ＭｅＣｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（５０．３ｍｇ、０．１０５ｍｍｏｌｅ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４））、ＨＯＢｔ（１６．１ｍｇ、０．１０５ｍｍｏｌｅ）およびＤＩＣ（１３．２ｍｇ、０．１０５ｍｍｏｌｅ）を使用して反復した。生じたレジンはＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。
【００３１】
生じた、保護されたペプチド−レジンは脱保護し、８％  ＴＩＳ／ＴＦＡ（１ｍｌ）で２時間開裂させた。レジンは濾過し、ＴＦＡ（１ｍｌ）と２回のＤＣＭ（１ｍｌ）により洗浄した。濾液は窒素流下で１ｍｌ未満にまで濃縮し、それを冷エーテル（５ｍｌ）に注いだ。形成された沈殿物は遠心分離し、集めた。ペレットは水に溶かし、凍結乾燥させた。
【００３２】
この粗生成物は水に溶かし、Ｌｕｎａ  ５μＣ８（２）カラム（１００ｘ２０ｍｍ）を使用して逆相プレパラティブＨＰＬＣで精製した。カラムは１００％Ａおよび０％Ｂから７０％Ａおよび３０％Ｂまでの直線グラジエントで３５分間溶出し、ここでＡは水中０．１％ＴＦＡであり、Ｂはアセトニトリル中０．１％ＴＦＡであった。画分はアナリティカルＨＰＬＣによりチェックした。純粋な生成物を含むものを合わせ、凍結乾燥により乾固させた。化合物の純度は約９９％であった。最終生成物１３．９ｍｇが得られた。ＥＳＩ−ＭＳ分析は分子量４０９．４を示した（計算した分子量４０９．５５と一致）。
【００３３】
実施例９：Ｈ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓ−Ｐｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）の調製
【００３４】
【化５】
2010538063.tif 000007
【００３５】
クロロトリチルクロリドレジン（１．０ｇ、１．４９ｍｍｏｌｅ）（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）はＤＣＭ（１０ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（４８７ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌｅ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８））（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＤＩＥＡ（７７０ｍｇ、５．９６ｍｍｏｌｅ）の溶液で１時間処理した。レジンは濾過し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＥＡ  １７：２：１（１０ｍｌ）で２回、ＤＣＭで３回、そしてＤＭＦで３回洗浄した。
【００３６】
Ｆｍｏｃ保護基は、２５％ピペリジン／ＤＭＦ（１０ｍｌ）と共に１０分間および３０分間レジンを振盪することによって除去した。その後レジンはＤＭＦ（１０ｍｌ）で３回洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（２．７９ｇ、５．９５ｍｍｏｌｅ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５））（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）はＮＭＰ（１０ｍｌ）中のＨＯＢｔ（５．９５ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（５．９５ｍｍｏｌｅ）と共に１時間振盪することによって、生じたペプチドレジンにカップリングさせた。
【００３７】
脱ブロッキンングおよび洗浄手順は上記のように反復した。Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（１．５８ｇ、５．９５ｍｍｏｌｅ；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９））（Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）はＮＭＰ（１０ｍｌ）中のＨＯＢｔ（５．９５ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ（５．９５ｍｍｏｌｅ）と共に１時間振盪することによって、ペプチド−レジンにカップリングさせた。
【００３８】
レジンはＤＭＦで３回、ＤＣＭで３回、その後ＭｅＯＨで３回洗浄した。レジンは真空下で乾燥させた。
保護されたペプチドはＤＣＭ中の１０ｍｌの１．０％  ＴＦＡと共にレジンを２分間振盪することによりレジンから開裂させた。レジンは濾過し、濾液はＭｅＯＨ中１０％ピリジン２ｍｌに注いだ。溶媒を真空下で除去後、残渣をＤＣＭに溶かし、飽和ＮａＣｌで２回、そして１Ｍ  硫酸水素ナトリウムで３回洗浄した。ＤＣＭ溶液は硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒は真空下で除去し、白色固体１２０ｍｇを得た。
【００３９】
この保護されたペプチド（１２０ｍｇ、２１８マイクロモル）はＤＣＭ（５ｍｌ）中のＴＦＦＨ（２１８マイクロモル）およびＤＩＥＡ（４３６マイクロモル）で処理した。生じた酸フルオリドはチオフェノール（２１８マイクロモル）で処理し、チオエステルを形成させた。２時間後、９：１  ＤＣＭ／ＭｅＯＨで溶出する薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は反応が完了したことを示唆した。反応混合物はＤＣＭ（１０ｍｌ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（５ｍｌ）で３回洗浄した。この溶液は硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒は真空下で除去した。生じた白色固体は１３０ｍｇの重さであった。
【００４０】
このＤＣＭ２ｍｌ中の保護されたペプチドはＴＦＡ２ｍｌの添加により脱保護された。２時間後、溶媒は１ｍｌに濃縮し、ペプチドは１４ｍｌの冷ジエチルエーテルの添加により沈殿させた。生じた懸濁液は遠心分離し，デカンテーションした。ペレットは水に溶かし、Ｌｕｎａ  ５μＣ８（２）カラム（１００ｘ２０ｍｍ）を使用して逆相プレパラティブＨＰＬＣで精製した。カラムは１００％Ａおよび０％Ｂから６０％Ａおよび４０％Ｂまでの直線グラジエントで３０分間溶出し、ここでＡは水中０．１％ＴＦＡであり、Ｂはアセトニトリル中０．１％ＴＦＡであった。画分はアナリティカルＨＰＬＣによりチェックした。純粋な生成物を含むものを合わせ、凍結乾燥し、乾固させた。最終生成物７６．６ｍｇが得られた。ＥＳＩ−ＭＳ分析は分子量４４２．３を示した（計算した分子量４４２．５８と一致）。
【００４１】
実施例１０：Ｈ−β（ベータ）−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）とＨ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓ−Ｐｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を使用したモデル連結
【００４２】
【化６】
2010538063.tif 000008
【００４３】
β（ベータ）−ＭｅＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（実施例９、１．０ｍｇ、２．４４マイクロモル；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３））は２００ｍＭ  ｐＨ８．５ホスフェート／６Ｍグアニジンバッファー（０．１ｍｌ）に溶かし、ｔｒｉｓ（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（０．０３５ｍｌの４０ｍｇ／ｍｌ溶液、ｐＨは７に調整）を添加した。Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓ−Ｐｈ（実施例２、１．０８ｍｇ、２．４４マイクロモル；（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７））は２００ｍＭ  ｐＨ８．５ホスフェート／６Ｍグアニジンバッファー（０．１ｍｌ）に溶かした。２つの溶液は合わせ、反応はＬＣ−ＭＳでモニターした。連結は２５時間で完了した。
【００４４】
生じた溶液は、２２０ｎｍでモニターしながら９５％バッファーＡ（水中０．１％ＴＦＡ）および５％バッファーＢ（アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）から２０％バッファーＡおよび８０％バッファーＢまで３０分かけて溶出する逆相ＨＰＬＣ（Ｌｕｎａ  ５μＣ８（２）１００ｘ４．６ｍｍカラム）で精製した。ＥＳＩ−ＭＳ分析は分子量７４１．５を示した（計算した分子量７４１．９６と一致）。
【図１】
2010538063.tif 000009
【図２】
2010538063.tif 000010
【図３】
2010538063.tif 000011
【配列表】
2010538063000001.xml
【国際調査報告】
2010538063.tif 000018
2010538063.tif 000019
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