(57)【要約】  トランスフェリンの三次元構造に基づいて、発明者らは、遊離チオール基を持った1又は複数個のシステイン残基を持つ変異ポリペプチド（突然変異タンパク質）を設計した（以降、チオトランスフェリンとも呼ばれる）。前記変異ポリペプチドは、システイン残基の硫黄原子を通じて生理活性化合物に結合されてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって：
鉄結合能を有し、
受容体に結合し、そして
配列番号1の第1〜679残基若しくは第339〜679残基、配列番号11の第1〜691残基、又は配列番号15の第1〜738残基と少なくとも60%同一であるアミノ酸配列を持ち、且つ、遊離チオール基を持つ少なくとも1つのシステイン残基を含んでなる前記ポリペプチド。
【請求項２】
特に脊椎動物、哺乳動物、又はヒトに由来する血清トランスフェリンと少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号1のV1〜T5、E13〜H25、M26〜S36、K42〜S44、Y85〜T93、K103〜Q108、L112〜K115、T120〜W128、L139〜P145、F154〜G156、A159〜F167、P168〜L170；P175〜C177、G178〜F186、G187〜K196、D197〜D201、I210〜N213、L214〜N216、K217〜R220、D221〜Q222、L226〜P234、S255〜K259、E260〜H273、F274〜H300、V305〜D310、Y317〜E328、G329〜P341、C402〜N417、C418〜D420、K434〜T440、W441〜N443、L444〜G446、Y468〜K470、I471〜R475、A485〜S501、G502〜N504、L505〜Y515、G516〜V526、T537〜Q540、N541〜D548、P549〜A551、K552〜N555、D558〜Y559、C563〜T567、R568〜P570、E572〜N576、E594〜F608、G609〜V636、L641〜T646、R663〜S668、又はS669〜R677のいずれかに相当する位置におけるアミノ酸のシステインによる置換、システインの挿入又は欠失を含んでなる、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号1のV1〜K4、M26〜P35、K42〜S44、Y85〜T93、K103〜Q108、L112〜K115、T120〜W128、L139〜P145、F154〜S155、A159〜F167、G178〜F186、D197〜D201、L214〜N216、D221〜Q222、L226〜P234、S255〜K259、F274〜H300、V305〜D310、G329〜P341、C402〜N417、K434〜T440、L444〜G446、I471〜R475、A485〜S501、L505〜Y515、N541〜D548、K552〜N555、D558、C563〜T567、G609〜V636、L641〜T646、R663〜S668のいずれかに相当する位置におけるアミノ酸のシステインによる置換、挿入、又は欠失を含んでなる、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号1のV1〜K4、K103〜Q108、L112〜K115、L139〜P145、A159〜F167、G178〜F186、F274〜H300、V305〜D310、G329〜P341、K434〜T440、L444〜G446、I471〜R475、A485〜S501、L505〜Y515、G609〜V636、L641〜T646のいずれかに相当する位置におけるアミノ酸のシステインによる置換、挿入、又は欠失を含んでなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号1のV1、P2、D3、K4、T5、H14、Q20、S21、D24、K27、S28、V29、P31、S32、D33、A43、E89、D104、G106、G114、L122、G123、P145、S155、D163、T165、D166、P168、P175、G176、G178、C179、S180、T181、L182、Q184、F187、S189、D197、G198、E212、A215、N216、A218、D221、D229、G257、N268、D277、K278、K280、E281、S287、P288、H289、K291、S298、P307、L326、T330、P335、T336、N413、S415、D416、D420、K434、S435、A436、S437、D438、D442、N443、G446、N469、N472、G487、K489、D491、S501、G502、L503、N510、T518、P539、Q540、G543、G544、K545、P547、D548、P549、K552、N553、N555、D558、D565、T567、P570、N576、A595、S610、N611、V612、T613、D614、S616、G617、T626、D634、D643、S666、T667、又はS669のいずれかに相当する位置においてアミノ酸のシステインによる置換、挿入、又は欠失を含んでなる、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
少なくとも1つのシステイン残基を、別のアミノ酸残基、特にSer、Thr、Val、又はAlaで置換した、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号1の第1〜679残基又は第339〜679残基と少なくとも95%の配列同一性を有し、且つ、前記の少なくとも1つのシステイン残基が、C19、C158、C161、C177、C179、C194、C227、C331、C339、C402、C418、C474、C495、C448、C506、C523、C563、C596、C615、C620、C665の中から選択される、請求項7に記載のポリペプチド。
【請求項９】
N-又はO-結合型グリコシル化を減少させる少なくとも1つの突然変異をさらに含んでなる、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号1と比較して、S32、N413、又はN611に相当する位置においてグリコシル化しないようにするアミノ酸への、S32、N413、S415、N611、又はT613に相当する位置におけるアミノ酸の置換を含んでなる、請求項9に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号1と少なくとも99%の配列同一性を有し、且つ、V1C、S28C、S32C、D104C、T165C、P175C、A215C、P288C、T336C、S415C、D146C、C171A、S415C＋D416の欠失、S415A＋D416の前にCの挿入、S501C、N553C、N611C、T613C、D643C、及びS28C＋S415Cの中から選択される1又は複数の突然変異を含んでなる、請求項1〜10のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号11と少なくとも95%の配列同一性を有し、且つ、突然変異S421Cを含んでなる、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項13に記載のポリヌクレオチドを含んでなるプラスミド。
【請求項１５】
請求項13に記載のポリヌクレオチド又は請求項14に記載のプラスミドを含んでなる宿主細胞。
【請求項１６】
酵母細胞である、請求項15に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
生理活性化合物と、請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドを含んでなる複合体であって、ここで、上記生理活性化合物が、上記ポリペプチドのシステイン残基の遊離チオール基を通じて連結される前記複合体。
【請求項１８】
請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドの製造方法であって、上記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項15又は16に記載の宿主細胞を培養し、そして上記ポリペプチドを回収することを含んでなる前記方法。
【請求項１９】
請求項1〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドと、上記ポリペプチド内のシステイン残基の硫黄原子を通じて連結される生理活性化合物とを連結することを含んでなる、請求項17に記載の複合体の製造方法。
【請求項２０】
請求項17に記載の複合体と、少なくとも1の医薬的に許容し得る担体又は希釈剤とを含んでなる組成物。
【請求項２１】
疾患、病気、及び診断の処置のための請求項17に記載の複合体の使用。
【請求項２２】
ポリペプチドの調製方法であって、以下のステップ：
トランスフェリン配列、鉄原子、及び受容体の例を少なくとも1つ含んでなる三次元モデルを提供し、
配列番号1のV1、P2、若しくはD3に相当するか、又はトランスフェリン配列のそれぞれの例の中で、以下の条件：
i）0.14を超えたRMFS
ii）100%を超える溶媒‐表面接近可能性
を満たすトランスフェリン配列内のアミノ酸残基を選択し、
上記の選択された残基をシステインで置換するか、又は上記の選択された残基のN側又はC側にシステインを挿入し、
任意に、上記トランスフェリン配列に対して追加の変更を加え、ここで、それぞれの変更は、アミノ酸の欠失、置換、又は挿入であり、そして
得られたアミノ酸配列を持つポリペプチドを調製する、
を含んでなる前記方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドのFe結合能、受容体結合能、及び／又は結合適性を測定し、そしてFe結合能、受容体結合能、及び／又は結合適性を有するポリペプチドを選択することをさらに含んでなる、請求項22に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
当該発明は、ポリペプチドと少なくとも1つの生理活性化合物の複合体（conjugates）、上記複合体を作るためのポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞間デリバリーを改善するために、受容体介在性エンドサイトーシス向けの生理活性化合物を伴ったトランスフェリンの複合体を使用することが知られている。例えば、N.J. KavimandamらのBioconjugate Chem., 2006, 17,1376-1384の題名は「Synthesis and Characterization of Insulin-Transferrin Conjugates」であり、D. ShahらのJournal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 85, No. 12, December 1996の題名は「Transcellular Delivery of an Insulin-Transferrin Conjugate in Enterocyte-like Caco-2 Cells」であり、及びFritzerらの(1996) Biochem. Pharm., 51, 489-493の題名は「Cytodoxic Effects of a Doxorubicin-Transferrin Conjugate in Multidrug-Resistant KB Cells」である。US 20030221201及び20040023334には、治療用タンパク質に融合されたトランスフェリン・タンパク質を含んでなる融合タンパク質が記載されている。
【０００３】
ヒト血清トランスフェリン（HST）は、2つの第二鉄イオンを結合する能力を有する19個のジスルフィド架橋で連結された38個のシステイン残基を含む679個のアミノ酸残基から成る一本鎖ポリペプチドであることが知られている。ヒト・トランスフェリンの三次元構造は、J. Wally et al., Journal of Biological Chemistry, 281 (34), 24934-24944 (2006)の中で公開された。Wallyらによるヒト・トランスフェリン結晶構造によると、HSTは第1〜331アミノ酸から成るNローブ（N-lobe）、第339〜679アミノ酸から成るCローブ（C-lobe）、及び第332〜338アミノ酸から成る中間ローブ（interlobe）リンカーを含んでなる。
【０００４】
鉄を取り込んだトランスフェリン・タンパク質が細胞表面上のトランスフェリン受容体（TfR）に遭遇すると、それは受容体に結合し、その結果、小胞に包まれて細胞内に運び込まれる。前記細胞は、その小胞を酸性化し、トランスフェリンにその鉄イオンを放出させる。前記受容体は、その後、エンドサイトーシス・サイクルを通して輸送されて細胞表面に戻され、別のラウンドの鉄の取り込みに備える。
【０００５】
Cheng, Y., Cell (Cambridge, Mass.) v116, pp. 565-576 (2004)には、ヒト・トランスフェリン受容体‐トランスフェリン複合体の構造に関するモデルが記載されている。その構造は、プロテイン・データ・バンク（Protein Data Bank）の中で1SUVとして見出される。
【０００６】
J. Wally et al., Journal of Biological Chemistry, 281 (34), 24934-24944 (2006)には、鉄不含ヒト・トランスフェリンの三次元構造が記載されている。その構造は、プロテイン・データ・バンクの中で2HAVとして見出される。
L. A. Lambert et al., Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 142 (2005)の題名は「Evolution of the transferrin family: Conservation of residues associated with iron and anion binding」である。
【０００７】
トランスフェリンは、ヒト血清トランスフェリン（HST）、ラクトフェリン、メラノトランスフェリン、及びオボトランスフェリンを含めた、高い配列相同性を有するタンパク質群を形成する。天然のHSTは、19個のジスルフィド架橋、S32のO-グリコシル化部位、及びN413とN611の2つのN-グリコシル化部位を伴う2つのローブ（N及びCローブ）を含むことが知られている。
【０００８】
Woodworth, R. C., et at. (1991), Biochemistry 30, 10824-9には、突然変異D63Cを含むヒト血清トランスフェリンのN末端半分子の突然変異体が開示されている。Muraiidhara, B. K. and Hirose, M. (2000), Protein Sci 9, 1567-1575には、オボトランスフェリンの単離されたCローブの選択的還元が開示されている。J. Williams et al., Biochem. J. (1985) 228, 661-665には、オボトランスフェリン又はC末端半分子におけるジスルフィド架橋の選択的還元が開示されている。US 5986067（Funkら）は、グリコシル化が起きないようにした組み換えHST突然変異体を開示している。
【発明の概要】
【０００９】
トランスフェリンの三次元構造に基づいて、発明者らは、遊離チオール基を持つ1又は複数個のシステイン残基を持っている変異ポリペプチド（突然変異タンパク質）（以降「チオトランスフェリン（thiotransferrin）」と呼ぶ）を設計した。その変異ポリペプチドは、上記ポリペプチドのシステイン残基の硫黄原子を通して生理活性化合物に結合させることもできる。
従って、本発明は、鉄結合能を有し、且つ、受容体に結合するポリペプチドを提供する。
【００１０】
それは、配列番号1の第1〜679残基又は第339〜679残基、配列番号11の第1〜691残基、又は配列番号15の第1〜738残基と少なくとも40%又は少なくとも60%同一であり、且つ、遊離チオール基を持つ1以上のシステイン残基を含んでなるアミノ酸配列を持つ。
【００１１】
用語チオトランスフェリンは、1又は複数個の不対システインを含んでなるトランスフェリン変異体を説明するために本明細書中に使用される。類似の用語チオラクトフェリン（thiolactoferrin）及びチオメラノトランスフェリン（thiomelanotransferrin）は、遊離チオ基を持つ1又は複数個の不対システイン残基を含んでなる、それぞれラクトフェリン及びメラノトランスフェリンの変異体を説明するために使用される。
【００１２】
それは、システイン残基の挿入（アミノ酸鎖長が延長される）、システインによる2以上の隣接残基の置換（アミノ酸鎖長が短縮される）若しくはシステインによるアミノ酸残基の置換（アミノ酸鎖長が変わらない）、システイン残基の欠失、又は上記の組み合わせによって作製されてもよい。
別の側面において、本発明は、少なくとも1つの生理活性化合物と本発明のポリペプチドを含んでなる複合体に関する。
【００１３】
発明の詳細な説明
トランスフェリン
本発明に使用されるトランスフェリンは、例えば、Lambert et al., Comparative Bio-chemistry and Physiology, Part B, 142 (2005), 129-141によって、及びTesta, Proteins of iron me-tabolism, CRC Press, 2002; Harris & Aisen, Iron carriers and iron proteins, Vol. 5, PhysicalBioinorganic Chemistry, VCH, 1991によって記載されるトランスフェリン・ファミリーに属する鉄結合能力を有するあらゆるタンパク質であってよい。
【００１４】
トランスフェリン・ファミリー・タンパク質の例は、血清トランスフェリン、オボトランスフェリン、メラノトランスフェリン、及びラクトフェリン、並びにその誘導体及び変異体であり、例えば、突然変異トランスフェリン（Mason et al., (1993) Biochemistry, 32, 5472; Mason et al., (1998), Biochem. J., 330,35）、切断型トランスフェリン、トランスフェリン・ローブ（Mason et al., (1996) Protein Expr. Purif., 8, 119; Mason et al., (1991) Protein Expr. Purif., 2, 214）、突然変異ラクトフェリン、切断型ラクトフェリン、ラクトフェリン・ローブ、突然変異オボトランスフェリン、切断型オボトランスフェリン、メラノトランスフェリン・ローブ、切断型メラノトランスフェリン、又は他のペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質と上記のいずれかの融合物（Shin et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2820; Ali et al., (1999) J. Biol. Chem.,274, 24066; Mason et al., (2002) Biochemistry, 41, 9448）などである。血清トランスフェリンは、特にC1変異体（受入番号NP 001054）とも呼ばれる、679個のアミノ酸を持つ配列番号1のアミノ酸配列を持ったヒト血清トランスフェリン（HST）が好まれる。ラクトフェリンは、特に691個のアミノ酸を持つ配列番号11のアミノ酸配列を持ったヒト・ラクトフェリンが好まれる。メラノトランスフェリンは、特に配列番号15の第20〜738アミノ酸配列残基をもったヒト・メラノトランスフェリンが好まれる。
【００１５】
トランスフェリンは、通常、配列番号1と少なくとも25%の同一性を持っているアミノ酸配列であり、特に少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、又は99.9%の同一性を持っているアミノ酸配列である。より特に、それは100%の同一性を持っていてもよい。
【００１６】
ラクトフェリンは、通常、配列番号11と少なくとも25%の同一性を持っているアミノ酸配列であり、特に少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、又は99.9%の同一性を持っているアミノ酸配列である。より特に、それは100%の同一性を持っていてもよい。
【００１７】
メラノトランスフェリンは、通常、配列番号15と少なくとも25%の同一性を持っているアミノ酸配列であり、特に少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、又は99.9%の同一性を持っているアミノ酸配列である。より特に、それは100%の同一性を持っていてもよい。
【００１８】
トランスフェリン・ファミリー・タンパク質のアミノ酸配列は、少なくとも167個のアミノ酸、特に少なくとも300個のアミノ酸、630個のアミノ酸、691個のアミノ酸、694個のアミノ酸、又は695個のアミノ酸の長さを有することもできる。その長さは、通常、長くても1274個のアミノ酸であり、特に長くても819個のアミノ酸、長くても722個のアミノ酸、長くても717個のアミノ酸、又は長くても706個のアミノ酸である。その長さは、特に679個のアミノ酸であってもよい。それは、脊椎動物からの691〜717個のアミノ酸を持ったトランスフェリンであるか、又は695〜706個のアミノ酸の長さを有する哺乳動物のトランスフェリンであってもよい。
【００１９】
トランスフェリン・ファミリー・タンパク質、特に694〜706個のアミノ酸の長さを有するものは、全体として、約7残基の中間ローブリンカーによって接続された、それぞれ約331〜341残基を持ち、且つ、それぞれ1つのFe（III）の原子及び1つの炭酸陰イオンを結合する、（N及びCローブと呼ばれる）2つのドメインを含む。通常、それぞれの鉄は、4つの保存されたアミノ酸残基：1つのAsp、2つのTyr、1つのHisに配位結合され、そして陰イオンはArg及びThrに結合される。
【００２０】
本発明に使用されるトランスフェリン・ファミリー・タンパク質は、完全長HST（配列番号1の第1〜679残基）又は、HSTのCローブ（配列番号1の第339〜679残基）と少なくとも40%又は少なくとも60%の同一性を持っている。TfRに対するHSTの一次受容体認識部位はCローブの中にあり、そしてタンパク分解によって分離されるHSTのCローブは第二鉄を細胞に供給できる。
【００２１】
ヒト血清トランスフェリンは、TfC1、TfC2、又はTfC3と称される変異体であってもよい。
多くのタンパク質がトランスフェリン・ファミリー内に存在することが知られているので、包括的な一覧を以下に示す。その一覧は、成熟タンパク質とリーダー配列を含めた完全長の配列を示す。
【００２２】
【表１】
2010535484.tif 000002
【００２３】
【表２】
2010535484.tif 000003
【００２４】
【表３】
2010535484.tif 000004
【００２５】
前記トランスフェリンは、別のタンパク質、特に以下で記載したものなどの生理活性タンパク質に任意に融合されてもよい。前記融合は、N末端であってもC末端であってもよく、又は挿入を含んでなることもできる。当業者はまた、オープン・リーディング・フレームは、それが（チモーゲンを含めた）天然タンパク質又は天然タンパク質の変異体若しくは断片（例えば、ドメインであってもよい）であるか；完全な合成のタンパク質であるか；（天然若しくは合成の）異なったタンパク質の一重又は多重融合物であるかにかかわらず、あらゆる配列を含んでなるタンパク質をコードし得ることを理解するだろう。トランスフェリン融合物の例は、米国特許出願US 2003/026778及びUS 2003/0221201、及びUS 2003/0226155、Shin, et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA, 92, 2820, Ali, et al., 1999, J Biol Chem, 274, 24066, Mason, et al., 2002, Biochemistry, 41, 9448に挙げられており、上記文献の内容を本明細書中に援用する。
【００２６】
三次元モデル
本発明に使用される三次元モデルは、少なくとも1分子のトランスフェリン及び少なくとも1つの受容体を含んでなる。図5は、2つのHSTの分子と2つのTfRの分子を用いたモデルについて座標を示す。このモデルの構築は、実施例4に記載されている。
【００２７】
トランスフェリン・ファミリー・タンパク質と受容体を含む他のモデルは、例えば1CB6、1B0L、1LFG、1DTZ、1AIV、1DOT、1OVT、1H76、1JNF、2HAV、及び1SUV（プロテインデータバンク）などの公表された三次元構造に基づいて同様に構築されることができる。
【００２８】
アミノ酸残基及び領域の選択‐ステップ1
三次元モデルにおけるそれぞれの残基のC-アルファ原子の位置に基づいて、以下の評価基準を満たす残基が選択される。
・RMSF＞0.14、＞0.16、＞0.18、＞0.20、＞0.22、＞0.24、＞0.26、＞0.28、又は＞0.30に相当する移動性（Mobility）。
・接近可能性（Accessibility）＞30%、＞40%、＞50%、＞60%、＞70%、＞80%、＞90%、＞100%、＞110%、＞120%、＞130%、又は＞140%。
【００２９】
以下に、図5に示したアミノ酸残基の特性に基づくこれらの基準によって選択した移動性と接近可能性とアミノ酸残基のいくつかの特定の組み合わせを列挙する。残基の番号の付け方は、三次元モデルにおける未定の配列番号1の最初の3つの残基を無視しているので、位置1として配列番号1のK4から始まる。
【００３０】
【化１】
2010535484.tif 000005
【００３１】
【化２】
2010535484.tif 000006
【００３２】
【化３】
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【００３３】
【化４】
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【００３４】
【化５】
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【００３５】
【化６】
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【００３６】
【化７】
2010535484.tif 000011
【００３７】
【化８】
2010535484.tif 000012
【００３８】
【化９】
2010535484.tif 000013
【００３９】
【化１０】
2010535484.tif 000014
【００４０】
【化１１】
2010535484.tif 000015
【００４１】
アミノ酸残基及び領域の選択‐ステップ2
次に、未定の3つのN末端アミノ酸（Wally et al., (2006) Journal of Biological Chemistry, 281 (34), 24934-24944）、V1、P2、及びD3が選択したアミノ酸の一覧表に追加され、そして先に示した選択したアミノ酸の割り当てられた位置番号が、未定の4つのN末端アミノ酸の追加に対して補正される。
【００４２】
さらに、残基及び領域を、三次元モデルの2次構造（αへリックスとβ鎖）とそれらの関係に基づいて選択することも可能である。J. Wally et al., Journal of Biological Chemistry, 281 (34), 24934-24944 (2006)の表2又は当該出願の図5に基づいた分析は、選択したアミノ酸が2次構造と関連して以下のとおり配置されることを示唆している：
【００４３】
【表４】
2010535484.tif 000016
【００４４】
実施例に記載のHSTの三次元構造、実施した接近可能性及びRMSF分析（図5）、並びに先に実施されたマッピング分析に基づいて、遊離チオール基を持った1又は複数個のCys残基の導入のために好ましい領域は、前記表中で特定されたすべてのループ、シート、及びヘリックス、すなわちV1-T5、E13-H25、M26-S36、K42-S44、Y85-T93、K103-Q108、L112-K115、T120-W128、L139-P145、F154-G156、A159-F167、P168-L170；P175-C177、G178-F186、G187-K196、D197-D201、I210-N213、L214-N216、K217-R220、D221-Q222、L226-P234、S255-K259、E260-H273、F274-H300、V305-D310、Y317-E328、G329-P341、C402-N417、C418-D420、K434-T440、W441-N443、L444-G446、Y468-K470、I471-R475、A485-S501、G502-N504、L505-Y515、G516-V526、T537-Q540、N541-D548、P549-A551、K552-N555、D558-Y559、C563-T567、R568-P570、E572-N576、E594-F608、G609-V636、L641-T646、R663-S668、S669-R677とみなすこともできる。特に好ましい範囲には、表1の中で特定されたすべてのループ、すなわちV1-K4、M26-P35、K42-S44、Y85-T93、K103-Q108、L112-K115、T120-W128、L139-P145、F154-S155、A159-F167、G178-F186、D197-D201、L214-N216、D221-Q222、L226-P234、S255-K259、F274-H300、V305-D310、G329-P341、C402-N417、K434-T440、L444-G446、I471-R475、A485-S501、L505-Y515、N541-D548、K552-N555、D558、C563-T567、G609-V636、L641-T646、R663-S668が含まれ、それでシートとヘリックスが除かれる。
【００４５】
2つのローブを持つトランスフェリン・ファミリー・タンパク質に関して、そのローブをJ. Wally et al,, Journal of Biological Chemistry, 281 (34), 24934-24944 (2006)に記載のとおり整列させてもよく、そして両ローブで基準を満たす残基を選択することもできる。ほとんどの好ましい範囲は、表1のNローブとCローブの両方で特定されたループ、すなわちV1-K4、K103-Q108、L112-K115、L139-P145、A159-F167、G178-F186、F274-H300、V305-D310、G329-P341、K434-T440、L444-G446、I471-R475、A485-S501、L505-Y515、G609-V636、L641-T646に及ぶ。
【００４６】
遊離チオール基を持った1又は複数個のCys残基の導入のために最も特に好ましい位置は、表1の中で特定されたアミノ酸、すなわちV1、P2、D3、K4 T5、H14、Q20、S21、D24、K27、S28、V29、P31、S32、D33、A43、E89、D104、G106、G114、L122、G123、P145、S155、D163、T165、D166、P168、P175、G176、G178、C179、S180、T181、L182、Q184、F187、S189、D197、G198、E212、A215、N216、A218、D221、D229、G257、N268、D277、K278、K280、E281、S287、P288、H289、K291、S298、P307、L326、T330、P335、T336、N413、S415、D416、D420、K434、S435、A436、S437、D438、D442、N443、G446、N469、N472、G487、K489、D491、S501、G502、L503、N510、T518、P539、Q540、G543、G544、K545、P547、D548、P549、K552、N553、N555、D558、D565、T567、P570、N576、A595、S610、N611、V612、T613、D614、S616、G617、T626、D634、D643、S666、T667、S669と規定される。
【００４７】
以下で、本発明は、特にトランスフェリンに関してさらに詳細に記載されているが、しかしながら、当業者は、その教示が、例えばラクトフェリンやメラノトランスフェリンなどの他のトランスフェリン・ファミリーのメンバーに同様に適用されることを理解するだろう。
【００４８】
トランスフェリンのアミノ酸配列の変更
先に記載したように、選択された位置での置換又は挿入によりアミノ酸配列を変更することによって、トランスフェリン分子内に遊離チオール基を導入することもできる。よって、選択された残基はCysで置換されてもよく（アミノ酸の長さは変わらない）、又は選択された残基のN又はC末端側にCysが挿入されてもよく（アミノ鎖の長さは延長される）、又は選択された残基を含めた1又は複数個の隣接残基がCysで置換されてもよい（アミノ酸鎖の長さは短縮される）。複数の変更が、そのポリペプチドに対して実施されてもよい。
【００４９】
あるいは、トランスフェリン分子内に存在しているCys残基（HSTの場合には38個）の中の1つを選択することもでき、そして選択したシステインを欠失させるか又は異なったアミノ酸、特にSer、Thr、Val、若しくはAlaで置換してもよい。先に選択された領域内のCys残基は、C19、C158、C161、C177、C179、C194、C227、C331、C339、C402、C418、C474、C495、C448、C506、C523、C563、C596、C615、C620、C665に相当する。選択したCys残基は、特にC227、C241、C474、C577、C563、又はC665に相当し得る。
【００５０】
チオトランスフェリンの製造
チオトランスフェリン、又は別の（単数若しくは複数の）タンパク質とチオトランスフェリンの融合物は、当該技術分野で知られている方法（Sanker, (2004), Genetic Eng. News, 24, 22-28, Schmidt, (2004), Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 363-372）によって調製されることができる。前記方法には、これに限定されるものではないが、形質転換又は一過性発現によるCHO（及びその変異株）、NS0、BHK、HEK293、Vero、若しくはPERC6細胞などの細胞株からの哺乳動物細胞培養（Mason et al., (2004), Protein Expr. Purif., 36, 318-326; Mason et al., (2002), Biochemistry, 41, 9448-9454）；昆虫細胞培養（Lim et al., (2004) Biotechnol. Prog., 20,1192-1197）；アオウキクサといった植物からの植物細胞培養；トランスジェニック動物（Dyck et al., (2003) Trends in Biotechnology, 21, 394-399）；トランスジェニック植物（Ma et al., (2003) Nature Reviews Genetics, 4, 794-805）；バチルス（Bacillus）やエシェリキア・コリ（Escherichia coli）などのグラム＋ve及びグラム−ve細菌（Steinlein, and Ikeda, (1993), Enzyme Microb. Technol., 15, 193-199）；これ制限されるものではないが、アスペルギルス属種（EP 238023、US 5,364,770、US 5,578,463、EP 184438、EP 284603、WO 2000/056900、WO 9614413）、トリコデルマ属種、及びフサリウム属種（Navalainen et al., (2005), Trends in Biotechnology, 23,468-473）を含めた糸状菌類における発現が挙げられる。
【００５１】
完全長HSTの変異体であるポリペプチドは、ベビーハムスター腎（BHK）細胞（Mason et al., (2004), Protein Expr. Purif., 36, 318-326, Mason et al., (2002), Biochemistry, 41, 9448-9454）、キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）S2細胞（Lim et al., (2004), Biotechnol Prog., 20, 1192-1197）から組み換えにより発現されても、BHK細胞（Mason et al., (2001), Protein Expr. Purif., 23, 142-150, Mason et a!., (1993), Biochemistry, 32, 5472-5479）及びS.セレビシエ（Sargent et al., (2006), Biometals 19, 513-519）から非N連結型のグリコシル化突然変異体として発現されてもよい。HSTのCローブの変異体であるポリペプチド（NTf/2C）は、BHK細胞から発現されてもよい（Mason et al., (1997), Biochem. J., 326 ( Pt 1), 77-85）。1つの態様において、宿主細胞は、酵母細胞、例えばサッカロミセス属、クルイベロマイセス属、又はピキア属のメンバーなど、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）（Mason et al., (1996), Protein Expr. Purif., 8,119-125, Steinlein etal., 1995 Protein Expr. Purif., 6, 619-624）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）（Mayson et al., (2003) Biotechnol. Bioeng., 81, 291-298）、及びピキア・メンブラナファシエンス（Pichia membranaefaciens）、又はチゴサッカロミセス・ルキシー（Zygosaccharomyces rouxii）（以前、チゴサッカロミセス・ビスポラス（Zygosaccharomyces bisporus）として分類された）、チゴサッカロミセス・バイリ（Zygosaccharomyces bailii）、チゴサッカロミセス・ファーメンタチ（Zygosaccharomyces fermentati）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（別名ピキア・アンガスタ（Pichia angusta）、あるいはクルイベロマイセス・ドロソフィラルム（Kluyveromyces drosophilarum）が好まれる。宿主細胞は、いずれの細胞型であってもよい。宿主細胞は、（哺乳動物、鳥、昆虫などの）動物、植物、真菌、又は細菌の細胞であってもそうでなくてもよい。細菌及び酵母などの真菌の宿主細胞が好まれることも、そうでないこともある。
【００５２】
代表的な原核生物ベクター・プラスミドは：Biorad Laboratories（Richmond, CA, USA）から入手可能なpUC18、pUC19、pBR322、及びpBR329；Pharmacia（Piscataway, NJ, USA）から入手可能なpTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、及びpRIT5；Stratagene Cloning Systems（La Jolla, CA92037, USA）から入手可能なpBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46Aである。
【００５３】
代表的な哺乳動物細胞ベクター・プラスミドは、Pharmacia（Piscataway, NJ, USA）から入手可能なpSVLである。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を駆動するのにSV40後期プロモータを使用し、最も高い発現レベルはCOS-1細胞などのT抗原産生細胞において見られる。誘導性哺乳動物発現ベクターの例は、同様にPharmacia（Piscataway, NJ, USA）から入手可能なpMSGである。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を駆動するのにマウス乳房腫瘍ウイルスの長い末端反復配列のグルココルチコイド誘導プロモータを使用する。
【００５４】
コード配列と、例えば好適な転写又は翻訳調節因子を含む発現ベクターを構築するのに、当業者にとって周知の方法が使用できる。こうした方法の1つには、粘着末端を介した連結がある。適合可能な粘着末端は、好適な制限酵素の作用によってDNA断片及びベクター上に作り出される。これらの末端は、相補的な塩基対合を通じて急速にアニーリングし、そして残った切れ目はDNAリガーゼの作用によって閉じられる。
【００５５】
さらなる方法では、合成二本鎖オリゴヌクレオチド・リンカー及びアダプターを使用する。平滑末端を持っているDNA断片は、突出3’末端を取り除き、且つ、陥凹3’末端を埋めるバクテリオファージT4 DNAポリメラーゼ又はE.コリDNAポリメラーゼIによって作り出される。規定した制限酵素の認識配列を含む平滑末端二本鎖DNAの合成のリンカー及びピースは、T4 DNAリガーゼによって粘着末端DNA断片に連結できる。それに続いて適切な制限酵素によってそれらが消化されて、粘着末端が作製され、そして適合可能な末端を持つ発現ベクターに連結される。アダプターはまた、連結に使用される1つの平滑末端を含むが、また1つの前もって形成された粘着末端も持っている化学的に合成されたDNA断片でもある。あるいは、（単数若しくは複数の）DNA断片が、任意に粘着末端を含む1以上の合成二本鎖オリゴヌクレオチドの存在又は不存在下、DNAリガーゼの作用によって連結されることができる。
【００５６】
さまざまな制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、Sigma-Genosys Ltd, London Road, Pampisford, Cambridge, United Kingdomを含めた多くの供給元から市販されている。
【００５７】
チオトランスフェリン、又はチオトランスフェリンと別の（単数若しくは複数の）タンパク質との融合物はヌクレオチド配列から発現されるが、それは1又は複数のイントロンを含んでいても含んでいなくてもよい。さらに、前記ヌクレオチド配列は、当該技術分野に知られている方法によって宿主に対して最適化されたコドンであってもそうでなくてもよい。
【００５８】
チオトランスフェリン、又はチオトランスフェリンと別の（単数若しくは複数の）タンパク質との融合物は、N結合型グリコシル化の減少を伴う変異体として発現されることができる。従って、ヒト血清トランスフェリン（HST）の場合に、N413はいずれかのアミノ酸、好ましくはQ、D、E又はAに変更されることができ；S415はS又はTを除いたいずれかのアミノ酸、好ましくはAに変更されることができ；T613はS又はTを除いたいずれかのアミノ酸、好ましくはAに変更されることができ；N611はいずれかのアミノ酸に変更されることができるか；又は上記のものの組み合わせである。トランスフェリンがHSTでない場合には、N-グリコシル化の減少は、タンパク質の一時構造に対する同様の修飾によって達成することができる。明確にするために、チオトランスフェリン、又はチオトランスフェリンと別の（単数若しくは複数の）タンパク質との融合物は、ともに本発明のトランスフェリン変異体であることができるので、N-結合型グリコシル化が減少している。
【００５９】
例えば遺伝子コード配列の破損によって、タンパク質のO-グリコシル化にかかわる1又は複数のタンパク質マンノシル・トランスフェラーゼを欠いた酵母を使用することは、特に有利であるかもしれない。組み換え技術によって発現されたタンパク質は、産生宿主細胞によって望ましくない翻訳後修飾を受けることがある。マンノシル化トランスフェリンは、レクチンであるコンカナバリンAに結合することができるだろう。酵母によって産生されるマンノシル化トランスフェリンの量は、1又は複数のPMT遺伝子を欠く酵母を使用することによって低減されることができる（WO 94/04687）。これを達成するのに最も簡便な方法は、Pmtタンパク質のうちの1つが低レベルでしか産生されないようなゲノム内の欠陥がある酵母を作出することである。例えば、Pmtタンパク質をわずかしか又は全く産生しないような、コード配列又は調節領域における（あるいはPMT遺伝子のうちの1つの発現を調節する別の遺伝子における）欠失、挿入又は転位があってもよいし、なくてもよい。あるいは、その酵母は、抗PMT抗体などの抗PMT作用物質を産生するように形質転換される可能性がある。あるいは、その酵母は、PMT遺伝子のうちの1つの活性を阻害する化合物の存在下で培養される可能性がある（Duffy et al, "Inhibition of protein mannosyltransferase 1 (PMT1) activ-ity in the pathogenic yeast Candida albicans", International Conference on Molecular Mecha-nisms of Fungal Cell Wall Biogenesis, 26-31 August 2001, Monte Verita, Switzerland, PosterAbstract P38；ポスター要約をhttp://www.micro.biol.ethz.ch/cellwall/で見ることができる）。S.セレビシエ以外の酵母が使用されているなら、例えば、ピキア・パストリス又はクルイベロマイセス・ラクチスにおける、S.セレビシエのPMT遺伝子に同等な1以上の遺伝子の破損もまた有益である。S.セレビシエから単離されたPMT1（又はその他のPMT遺伝子）の配列は、他の真菌種における同様の酵素活性をコードする遺伝子の同定又は破損に使用できる。クルイベロマイセス・ラクチスのPMT1相同体のクローニングがWO 94/04687に記載されている。
【００６０】
酵母にはまた、WO 95/33833及びWO 95/23857でそれぞれ教示されているとおり、HSP150及び／又はYAP3遺伝子の欠失があってもよいし、なくてもよい。
【００６１】
HST変異体は、組み換え発現と分泌によって産生されることができる。発現系（すなわち、宿主細胞）がサッカロミセス・セレビシエなどの酵母である場合には、S.セレビシエに好適なプロモーターとしては、PGK1遺伝子、GAL1若しくはGAL10遺伝子、TEF1、TEF2、PYK1、PMA1、CYC1、PHO5、TRP1、ADH1、ADH2、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ、グルコキナーゼ、α-接合因子フェロモン、a-接合因子フェロモン、PRB1プロモーター、PRA1プロモーター、GPD1プロモーターの遺伝子に関連するもの、及び5’調節領域の部分と、他のプロモーターの5’調節領域の部分又は上流活性化部位とのハイブリッドにかかわるハイブリッド・プロモーター（例えば、EP-A-258 067のプロモーター）が挙げられる。
【００６２】
好適な転写終結シグナルは当該技術分野で周知である。宿主細胞が真核生物である場合には、転写終結シグナルは真核細胞遺伝子の3’フランキング配列に由来することが好ましく、転写停止とポリアデニル化の適切なシグナルを含む。好適な3’フランキング配列は、例えば使用される発現制御配列に天然に連結されている、すなわち、プロモーターに相当し得る、遺伝子のそれであってもよい。あるいは、それらは異なっているかもしれない。その場合、且つ、宿主が酵母、好ましくはS.セレビシエである場合には、S.セレビシエのADH1、ADH2、CYC1、又はPGK1遺伝子の終結シグナルであることが好まれる。
【００６３】
2μm遺伝子などの隣接しているいずれかの遺伝子の中への転写の読み過ごし（read-through）を予防するために、その逆の場合のためにも、転写終止配列がプロモーター及びオープン・リーディング・フレームの上流と下流に位置するように転写終結配列が側面に位置することは、トランスフェリン突然変異体の配列を含んでなる組み換えタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター及びオープン・リーディング・フレームにとって有益であることもある。
【００６４】
1つの態様において、サッカロミセス・セレビシエなどの酵母における好まれる調節配列としては：EP 431 880で教示されている酵母プロモーター（例えば、サッカロミセス・セレビシエPRB1プロモーター）；及び転写ターミネータ、好ましくはEP 60 057で教示されているサッカロミセスADH1のターミネータが挙げられる。
【００６５】
翻訳の読み過ごしを最小とし、それによって延長された非天然型融合タンパク質の産生を回避するために、UAA、UAG又はUGAなどの翻訳終止コドンをコードする2以上のDNA配列を組み込むことが、非コード領域にとって有益であることもある。翻訳終止コドンのUAAが好まれる。
【００６６】
1つの好ましい態様において、トランスフェリン突然変異体の配列を含んでなる組み換えタンパク質が分泌される。その場合、分泌リーダー配列をコードする配列は、オープン・リーディング・フレーム内に含まれることができる。よって、当該発明によるポリヌクレオチドは、分泌リーダー配列をコードするポリヌクレオチド配列に作動できるように連結されたトランスフェリン突然変異体の配列を含んでなる組み換えタンパク質をコードする配列を含んでなることができる。リーダー配列は、必ずではないが、通常、ORFの一次翻訳産物のN末端に位置し、必ずではないが、一般的に分泌過程中にタンパク質から切り落とされて、「成熟」タンパク質をもたらす。よって、1つの態様において、リーダー配列との関連において用語「作動できるように連結された」には、トランスフェリン突然変異体の配列を含んでなる組み換えタンパク質をコードする配列が、その5’末端にて、且つ、インフレームにおいて、分泌リーダー配列をコードするポリヌクレオチド配列の3’末端に連結されるという意味を含んでいる。あるいは、分泌リーダー配列をコードするポリヌクレオチド配列は、インフレーム、トランスフェリン突然変異体の配列を含んでなる組み換えタンパク質のコード配列の中、又はトランスフェリン突然変異体の配列を含んでなる組み換えタンパク質のコード配列の3’末端に配置されることができる。
【００６７】
多数の天然の又は人工的なポリペプチド・リーダー配列（分泌プレ領域及びプレ／プロ領域とも呼ばれる）が宿主細胞からタンパク質を分泌するために使用又は開発された。リーダー配列は、細胞から周囲の媒質中に又は場合によっては細胞周辺腔内にタンパク質を運び出す細胞の機構の方へ新生タンパク質を向かわせる。
【００６８】
酵母のサッカロミセス・セレビシエ、チゴサッカロミセス種、クルイベロマイセス・ラクチスやピキア・パストリスなどの真核生物におけるタンパク質の産生のために、分泌リーダー配列が使用されてもよい。これは、シグナル（プロ）配列又はプレプロ・リーダー配列を含んでもよい。シグナル配列は、それらのアミノ酸配列が異種起源であることが知られている（Nothwehrand Gordon 1990, Bioessays 12, 479-484又はGierasch 1989, Biochemistry 28, p923-930）。本質的に、シグナル配列は、一般的にN末端に見られ、基本的なn-領域、疎水性のh-領域、及び極性のc-領域を持つ。この構造物が保持される限り、アミノ酸組成の如何にかかわらず、シグナル配列は機能するだろう。それらがどれくらいよく機能するか、すなわち、どれくらいの量の成熟タンパク質が分泌されるかは、アミノ酸配列に依存する。従って、用語「シグナル・ペプチド」は、本来は主に疎水性であり、及び酵母で発現された細胞外タンパク質の前駆体型のN末端配列として存在しているプレ配列を意味することが理解されている。前記シグナル・ペプチドの機能は、発現タンパク質が小胞体内に入るように分泌されることを可能にすることである。前記シグナル・ペプチドは、一般的にこの過程の経過中に切り落とされる。前記シグナル・ペプチドは、タンパク質を産生する酵母生物体にとって異種起源であっても、同属であってもよい。公知のリーダー配列としては、S.セレビシエの酸ホスファターゼ・タンパク質（Pho5p）（EP 366 400を参照のこと）、インベルターゼ・タンパク質（Suc2p）（Smith at al. (1985) Science, 229, 1219-1224を参照のこと）、及び熱ショック・タンパク質150（Hsp150p）（WO 95/33833を参照のこと）からのリーダー配列が挙げられる。さらに、S.セレビシエ接合因子α-1タンパク質（MFα-1）、及びヒト・リゾチームやヒト血清アルブミン（HSA）タンパク質からのリーダー配列が使用され、ヒト・アルブミンを分泌するために後者が特に使用されたが、排他的ではない。WO 90/01063は、MFα-1とHSAリーダー配列の融合を開示している。加えて、トランスフェリン突然変異体の配列を含んでなる組み換えタンパク質の分泌を指示するために、天然のトランスフェリン・リーダー配列を使用してもよく、使用しなくてもよい。
【００６９】
当業者は、セントロメア・プラスミドなどのあらゆる好適なプラスミドが使用され得ることを理解しているだろう。実施例は、当該発明の酵母宿主細胞を形質転換するのに使用するための好適なプラスミド（セントロメアYCplac33に基づくベクター）を提供する。あるいは、酵母適合性2μmに基づくプラスミドなどのその他の好適なプラスミドが使用されてもよい。
【００７０】
ある酵母タイプから得られたプラスミドは、別の酵母タイプ内で維持されることができる（Irie et al, 1991, Gene, 108(1), 139-144; Irie et al, 1991, Mol. Gen. Genet, 225(2), 257-265）。例えば、チゴサッカロミセス・ルキシーからのpSR1は、サッカロミセス・セレビシエ内で維持されることができる。1つの態様において、プラスミドが2μm-ファミリーのプラスミドであっても、そうでなくてもよいけれど、その宿主細胞は使用される2μm-ファミリー・プラスミドに適合できるだろう（以下のプラスミドのすべての解説について以下を参照のこと）。例えば、プラスミドがpSR1、pSB3又はpSB4に基づく場合には、好適な酵母細胞はチゴサッカロミセス・ルキシーであり；プラスミドがpSB1又はpSB2に基づく場合には、好適な酵母細胞はチゴサッカロミセス・バイリイ（Zygosaccharomyces bailli）であり；プラスミドがpSM1に基づく場合には、好適な酵母細胞はチゴサッカロミセス・ファーメンタチであり；プラスミドpKD1に基づく場合には、好適な酵母細胞はクルイベロマイセス・ドロソフィラルムであり；プラスミドがpPM1に基づく場合には、好適な酵母細胞はピキア・メンブランアエファシエンスであり；プラスミドが2μmプラスミドに基づく場合には、好適な酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエ又はサッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）である。よって、プラスミドは2μm-プラスミドに基づいていてもよく、且つ、酵母細胞はサッカロミセス・セレビシエであってもよい。2μm-ファミリー・プラスミドが、天然に存在するプラスミドのそれに由来する配列を持った遺伝子FLP、REP1及びREP2のうちの1つ、2つ又は好ましくは3つを含んでなる場合に、2μm-ファミリー・プラスミドが天然に存在するプラスミド「に基づく」と言われることができる。
【００７１】
有用な酵母エピソーム・プラスミド・ベクターは、pRS403-406及びpRS413-416（そしてStratagene Cloning Systems（La Jolla, CA 92037, USA）から一般に入手可能である）、YEp24（Botstein, D., et al. (1979) Gene 8, 17-24）、並びにYEplac122、YEplac195及びYEplac181（Gietz, R.D. and Sugino. A. (1988) Gene 74, 527-534）である。他の酵母プラスミドは、WO 90/01063及びEP 424 117に記載されており、並びにEP-A-286 424とWO 2005061719の「崩壊ベクター（disintegration vectors）」である。プラスミドpRS403、pRS404、pRS405、及びpRS406は、酵母組み込みプラスミド（YIps）であり、そしてYIplac204、YIplac211、及びYIplac128のように酵母選択マーカーHIS3、TRP1、LEU2、及びURA3を組み込む（Gietz, R.D. and Sugino. A. (1988) Gene 74, 527-534）。プラスミドpRS413-416は、YCplac22、YCplac33、及びYCplac11のように酵母セントロメア・プラスミド（YCps）である（Gietz, R.D. and Sugino. A. (1988) Gene 74, 527-534）。
【００７２】
ヘルパー・タンパク質の1又は複数、及び／又は最適なタンパク質産物（protein product of choice）がプラスミドが担持するポリヌクレオチド配列によってコードされている場合には、使用されるプラスミド・タイプとの適合性に関して、宿主細胞型が選択されることができる。こうしたプラスミドはWO 2005061719で開示されている。好ましいヘルパー・タンパク質としては、PDI1、AHA1、ATP11、CCT2、CCT3、CCT4、CCT5、CCT6、CCT7、CCT8、CNS1、CPR3、CPR6、DER1、DER3、DOA4、ERO1、EUG1、ERV2、EPS1、FKB2、FMO1、HCH1、HRD3、HSP10、HSP12、HSP104、HSP26、HSP30、HSP42、HSP60、HSP78、HSP82、KAR2、JEM1、MDJ1、MDJ2、MPD1、MPD2、PDI1、PFD1、ABC1、APJ1、ATP11、ATP12、BTT1、CDC37、CPR7、HSC82、KAR2、LHS1、MGE1、MRS11、NOB1、ECM10、SCJ1、SSA1、SSA2、SSA3、SSA4、SSB1、SSB2、SSC1、SSE2、SIL1、SLS1、ORM1、ORM2、PER1、PTC2、PSE1、UBC7、UBI4、及びHAC1又は切断されたイントロンを含まないHAC1が挙げられる（Valkonen et al. 2003, Applied Environ. Micro., 69, 2065）。こうしたヘルパー・タンパク質は、WO 2005/061718、WO 2006/067511、及びWO 2006/136831で開示されている。
【００７３】
先に規定されたプラスミドは、標準的な技術を通して宿主内に導入されることができる。原核生物の宿主細胞の形質転換に関して、例えば、Cohen et at (1972) Proc. Nail. Acad. Set. USA 69, 2110 and Sambrook et al (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと。酵母細胞の形質転換は、Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。Beggs (1978) Nature 275,104-109の方法もまた有用である。S.セレビシエの形質転換のための方法は、EP 251 744、EP 258 067、及びWO 90/01063で大まかに教示されている、上記文献の全体を本明細書中に援用する。脊椎動物細胞に関して、こうした細胞を形質移入するのに有用な試薬、例えば、リン酸カルシウムやDEAE-デキストラン又はリポソーム製剤は、Stratagene Cloning System又はLife Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USAから入手可能である。
【００７４】
エレクトロポレーションもまた、細胞を形質転換するのに有用であり、そして（酵母を含めた）真菌細胞、植物細胞、細菌細胞、及び（脊椎動物を含めた）動物細胞の形質転換に関して当該技術分野で周知である。エレクトロポレーションによる酵母の形質転換方法は、Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182で開示されている。
【００７５】
一般的に、プラスミドは宿主のすべてを形質転換するというわけではないので、そのため、形質転換した宿主細胞を選択することが必要であるだろう。よって、プラスミドは、これに限定されるものではないが、細菌選択マーカー及び／又は酵母選択マーカーが挙げられる、選択マーカーを含んでいてもよい。多くの他のものが当該技術分野で知られているが、代表的な細菌選択マーカーはβ-ラクタマーゼ遺伝子である。代表的な酵母選択マーカーとしては、LEU2、TRP1、HIS3、HIS4、URA3、URA5、SFA1、ADE2、MET15、LYS5、LYS2、ILV2、FBA1、PSE1、PDI1、及びPGK1が挙げられる。pgk1酵母株におけるPGK1について実証されたように、機能遺伝子がプラスミド上に提供される場合、その染色体欠失又は不活性化が生存できない宿主を生み出すいずれかの遺伝子、いわゆる必須遺伝子が選択遺伝子として使用できることを、当業者は理解しているだろう（Piper and Curran, 1990, Curr. Genet. 17, 119）。好適な必須遺伝子は、スタンフォード・ゲノム・データベース（SGD）、（http:://db.yeastgenome.org）の中で見つけることができる。細胞が特定の選択条件下で培養されることを必要とする不都合なしにプラスミドの安定性の増強を達成するために、欠失又は不活性化されたときに栄養要求性（生合成）要件を生じないあらゆる必須遺伝子生成物（例えば、PDI1、PSE1、PGK1、又はFBA1）が、プラスミドの不存在下、その遺伝子産物を産生できない宿主細胞におけるプラスミド上の選択マーカーとして使用できる。「栄養要求性（生合成）要件」に、我々は、増殖培地への添加又は修飾によって補足できる欠乏を含めている。そのため、本願との関連において好ましい「必須マーカー遺伝子」は、宿主細胞において欠失又は不活性化されたとき、増殖培地への添加又は修飾によって補足できない欠乏をもたらすものである。さらに、プラスミドは、2以上の選択マーカーを含んでいてもよい。
【００７６】
形質転換した宿主細胞を、十分な時間、そして当業者に知られている、且つ、ヘルパー・タンパク質及び最適なタンパク質産物の発現を許可するために、本明細書中に開示された教示を考慮した、適切な条件下で培養することができる。
培地は、非選択的であっても、又はプラスミドの維持に対する選択圧をかけてもよい。
【００７７】
E.コリなどの原核生物の宿主細胞、及び哺乳動物細胞などの真核生物の宿主細胞を培養する方法は、当該技術分野で周知である。酵母を培養する方法は、EP 330 451及びEP 361 991で大まかに教示されている。
このようにして製造された最適なタンパク質産物は、細胞内に存在し得るか、又は分泌されれば、培地及び／又は宿主細胞のペリプラズム空間の中に存在し得る。
【００７８】
従って、当該発明はまた、最適なタンパク質産物の製造方法を提供し、その方法は、以下のステップ：a）先に規定される最適なタンパク質産物をコードするポリヌクレオチドを含んでなる本発明の宿主細胞を準備し；そして、b）その宿主細胞を育てて（例えば、その宿主細胞を培地中で培養して）；その結果、1以上のヘルパー・タンパク質の過剰発現を引き起こすように遺伝子を組み換えられていない同じ細胞を、同じ条件下で育てる（例えば、培養する）ことによって達成される最適なタンパク質産物の産生レベルと比較して、高いレベルの最適なタンパク質産物を含んでなる細胞培養物又は組み換え生物体を作り出す、を含んでなる。
【００７９】
宿主細胞を育てるステップは、多細胞生物から得られた宿主細胞が、（植物又は動物などの）多細胞の組み換え生物体への再生を可能にすること、そして任意に、そこからの子孫の世代を1世代以上、作出することを伴っても、伴わなくてもよい。
【００８０】
前記方法は、培養された宿主細胞、組み換え生物体、又は培地から、このようにして発現された最適なタンパク質産物を精製するステップをさらに含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。
【００８１】
「培養された宿主細胞、組み換え生物体、又は培地から、このようにして発現された最適なタンパク質産物を精製する」ステップは、細胞固定、細胞分別、及び／又は細胞破砕を任意に含んでなるが、細胞固定、分離、及び／又は破壊の（単数若しくは複数の）ステップとは異なる少なくとも1つの他の精製ステップを常に含んでなる。
【００８２】
本発明のチオトランスフェリンは、こうしたタンパク質を精製するのに有用であることがわかっているいずれかの技術によって培地から精製されることができる。同様に、遠心分離、濾過などの細胞分別技術（例えば、直交流濾過、膨張層クロマトグラフィー等）が当該技術分野で周知である。同様に、ビードミル処理、超音波処理、酵素にさらすこと等を含めた細胞破砕の方法が、当該技術分野で周知である。
【００８３】
前記の「少なくとも1つの他の精製ステップ」は、当該技術分野で知られているタンパク質精製に好適なその他のステップであってもよい。例えば、組み換えにより発現されたアルブミンの回収のための精製技術は：WO 92/04367、マトリックス誘導色素の除去；EP 464 590、酵母誘導着色料の除去；EP 319 067、アルカリ性沈殿とそれに続く親油相へのアルブミンの適用；そしてWO 96/37515、US 5 728 553、及びWO 00/44772（それらは完全な精製過程を記載する）で開示された。前記文献の全てを本明細書中に援用する。適切な方法としては、硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿、酸若しくは溶媒抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロース・クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィー、レクチン・クロマトグラフィー、濃縮、希釈、pH調整、ダイアフィルトレーション、限外濾過、高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）、逆相HPLC、電導度調整等が挙げられる。
【００８４】
1つの態様において、前述の技術のいずれか1以上が、商業的又は工業的に許容されるレベルの純度までこのようにして単離されたタンパク質をさらに精製するために使用されてもよく、使用されなくてもよい。商業的又は工業的に許容されるのレベルの純度によって、我々は少なくとも10-4g.L-1、10-3g.L-1、0.01g.L-1、0.02g.L-1、0.03g.L-1、0.04g.L-1、0.05g.L-1、0.06g.L-1、0.07g.L-1、0.08g.L-1、0.09g.L-1、0.1g.L-1、0.2g.L-1、0.3g.L-1、0.4g.L-1、0.5g.L-1、0.6g.L-1、0.7g.L-1、0.8g.L-1、0.9g.L-1、1g.L-1、2g.L-1、3g.L-1、4g.L-1、5g.L-1、6g.L-1、7g.L-1、8g.L-1、9g.L-1、10g.L-1、15g.L-1、20g.L-1、25g.L-1、30g.L-1、40g.L-1、50g.L-1、60g.L-1、70g.L-1、80g.L-1、90g.L-1、100g.L-1、150g.L-1、200g,L-1、250g.L-1、300g.L-1、350g.L-1、400g.L-1、500g.L-1、600g.L-1、700g.L-1、800g.L-1、900g.L-1、1000g.L-1、又はそれ以上の濃度でのタンパク質の提供を含む。
【００８５】
商業的又は工業的に許容されるのレベルの純度は、最適なタンパク質産物がその本来の目的に好適な形態にされる比較的粗い精製方法によって得ることができる。商業的又は工業的に許容されるレベルの純度まで精製されたタンパク質調製物または、最適なタンパク質産物に加えて、例えば、宿主細胞又はそれから生じた破片などの細胞培養成分も含んでいてもよい。あるいは、最適なタンパク質産物、及び任意に、機能上許容されるレベルの、細胞培養過程に由来する低分子量共雑物を含んでなる組成物を得るために、（宿主細胞又はそこから生じた破片などの）高分子量成分が（例えば濾過又は遠心分離によって）取り除かれても、そうでなくてもよい。
前記タンパク質は、医薬的に許容し得るレベルの純度を達成するまで精製されても、されなくてもよい。それが実質的にパイロジェンを含んでおらず、且つ、その本来の目的のために使用できる、よって、そのタンパク質の活性に関連しない医学的効果を引き起こすことなく医薬的に効果を生じる量で投与されるのであれば、タンパク質は医薬的に許容し得るレベルの純度を有している。
【００８６】
当該発明の方法は、精製した最適なタンパク質産物を、担体又は希釈剤と一緒に製剤し、そして任意にこうして製剤したタンパク質を単位投与剤形で提供するステップをさらに含んでもよく、含まなくてもよい。
【００８７】
本発明の過程によって得られた治療的な有効なタンパク質にとって単独で投与されることは可能であるが、それが1又は複数の許容し得る担体又は希釈剤と一緒に医薬製剤として提供するのが望ましい。（単数若しくは複数の）担体又は（単数若しくは複数の）希釈剤は、所望のタンパク質に適合できるという意味合いで「許容し得る」でなくてはならない。一般的に、担体又は希釈剤は、無菌であるか若しくはパイロジェンを含まない水又は生理的食塩水である。
あるいは、当該発明の方法は、このようにして精製された最適なタンパク質産物を凍結乾燥するステップをさらに含んでもよく、含まなくてもよい。
【００８８】
チオトランスフェリン又は複合体の製剤
チオトランスフェリンは、Marcel Dekker Inc. New York 2000によって刊行された"Protein Formulation and Delivery", E. J. McNally (Ed.)及び"Rational Design of Satble Protein Formulations - Theory and Practice"; J. F. Carpenter and M. C. Manning (Ed.) Pharmaceutical Biotechnology Vol 13. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York 2002, Yazdi and Murphy, (1994) Cancer Research 54, 6387-6394, Widera et al., (2003) Pharmaceutical Research 20,1231-1238; Lee et al., (2005) Arch. Pharm. Res. 28, 722-729に示されているストラテジーによって製剤されることができる。製剤方法の例は以下のとおりである：
【００８９】
方法その1：精製に続いて、本発明の遊離チオール含有トランスフェリン突然変異タンパク質又は複合体は、0.01M〜0.2MのNaClを含む0.01M〜0.1Mのリン酸緩衝生理的食塩水（pH7.0〜8.0）中、4℃、−20℃、又は−80℃にて保存することができる。
【００９０】
方法その2：精製に続いて、本発明の遊離チオール含有トランスフェリン突然変異タンパク質又は複合体は、0.01M〜0.2MのNaClを含み、且つ、10〜20mg/Lのポリソルベート80を含む0.01M〜0.1Mのリン酸緩衝生理食塩水（pH7.0〜8.0）中、4℃、−20℃、又は−80℃にて保存することができる。
【００９１】
方法その3：精製に続いて、本発明の遊離チオール含有トランスフェリン突然変異タンパク質又は複合体は、0.01M〜0.2MのNaCl（pH7.0〜8.0）中、4℃、−20℃、又は−80℃にて保存することができる。
【００９２】
方法その4：精製に続いて、本発明の遊離チオール含有トランスフェリン突然変異タンパク質又は複合体は、10〜20mg/Lのポリソルベート80を含む0.01M〜0.2MのNaCl（pH7.0〜8.0）中、4℃、−20℃、又は−80℃にて保存することができる。
【００９３】
凍結乾燥製剤
方法その5：精製に続いて、本発明の遊離チオール含有トランスフェリン突然変異タンパク質又は複合体は、水に対して透析されて、凍結乾燥され、そして4℃、−20°、又は−80℃にて保存することができる。
【００９４】
方法その6：精製に続いて、本発明の遊離チオール含有トランスフェリン突然変異タンパク質又は複合体は、0.01M〜0.2MのNaCl（pH7.0〜8.0）に対して透析され、凍結乾燥され、そして4℃、−20℃、又は−80℃にて保存することができる。
【００９５】
ナノ粒子
方法その7：精製に続いて、本発明の遊離チオール含有トランスフェリン突然変異タンパク質又は複合体は、WO 2004/071536 A1及びWO 2008/007146 A1で開示されている手順などのナノ粒子を調製するための公知の手順に従って調製されるナノ粒子に製剤されることができる。前記両文献を本明細書中に援用する。
【００９６】
生理活性化合物
前記生理活性化合物は、治療用又は診断用化合物であってもよい。前記治療用化合物は、癌化学療法における使用のための化学療法剤であってもよい。それは細胞増殖抑制性のものであっても、細胞傷害性のものであってもよく；それは腫瘍抑制剤であってもよい。
【００９７】
前記生理活性化合物は、既に遊離チオール基を含んでいる、例えば、遊離チオール基を持つシステイン残基を含むポリペプチドであってもよい。あるいは、前記生理活性化合物は、遊離チオール基を含むように修飾されてもよい。よって、ポリペプチドのアミノ酸配列が遊離チオール基を持つシステイン残基を含むように変更されても、前記生理活性化合物が遊離チオール基を含むように化学的に誘導体化されてもよい。
【００９８】
前記生理活性化合物は、ポリペプチド（タンパク質）、特に組み換えタンパク質製剤であってもよい。それは、癌及び他の関連疾病を治療するために使用される化学療法剤又は放射線治療法剤であってもよい。
【００９９】
本発明の遊離チオール含有トランスフェリン突然変異タンパク質（チオトランスフェリン）は、本発明のトランスフェリン突然変異タンパク質が2以上の遊離チオールを含んでいる場合には、当該技術分野で知られている方法によって、少なくとも1つの生理活性化合物に（単数若しくは複数の）遊離チオール基を介して結合できる。前記生理活性化合物としては、これに限定されるものではないが、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質（天然のもの、組み換えのもの、若しくは合成のもの）（Debinski, (2002) Cancer Investigation 20, 801-809, O'Keefe and Draper et al., (1985) JBC 260, 932-937, Xia et al., (2000) J. Pharmacology Experimental Therapeutics 295, 594-600, Kavimandan et al., (2006) Bioconjugate Chem. 17, 1376-1384, Humphries, et al., (1994) J. Tissue Culture Methods 16, 239-242, Wenning et al., (1998) Biotech. Bioeng. 57, 484-496, Yazdi and Murphy, (1994) Cancer Research 54, 6387-6394, Weaver and Laske (2003) J. Neuro-Oncology 65, 3-13, Widera et al., (2003) Pharmaceutical Research 20, 1231-1238, Daniels, T.R. et al. (2006) Clinical Immunology 121, 159-176、及び本明細書中に含まれている参考文献）；治療用及び診断用の薬物又は化合物（Mishra et al., (2006) J. Drug Targeting 14,45-53, Lim and Shen, (2004) Pharmaceutical Research 21, 1985-1992, Fritzer et al., (1996) Biochemical Pharmacology 51, 489-493, Lubgan and Jozwiak (2002) Cell. Mol. Biol. Lett. 7, 98, Daniels, T.R. et al. (2006) Clinical Immunology 121, 159-176、及び本明細書中に含まれている参考文献）；これに限定されるものではないが、リポソーム、ウイルス、及びナノ粒子を含めた高分子量複合体（Mishra et al., (2006) J. Drug Targeting 14, 45-53, Daniels, T.R. et al. (2006) Clinical Immunology 121, 159-176、及び本明細書中に含まれている参考文献）；DNA、（siRNAを含めた）RNA、及びそれらの類似体を含めた核酸及び放射性核種（Lee et al., (2005) Arch, Pharm. Res. 28, 722-729, Huang et al., (2007) FASEB J. 21, 1117- 1125, Daniels, T.R. et al. (2006) Clinical Immunology 121, 159- 176、及び本明細書中に含まれている参考文献）、並びにデバイス（Humphries, et al., (1994) J. Tissue
Culture Methods 16, 239-242、及び本明細書中に含まれている参考文献）が挙げられる。さらに、前記実体それ自体を、当該技術分野で知られている方法によって修飾することができる。
【０１００】
治療用化合物
4-1BBリガンド、5-ヘリックス、ヒトC-Cケモカイン、ヒトL105ケモカイン、huL105 3.と表されるヒトL105ケモカイン、ガンマ-インターフェロンによって誘発されるモノカイン（MIG）、部分的なCXCR4Bタンパク質、血小板塩基性タンパク質（PBP）、α1-アンチトリプシン、ACRP-30相同体；補体成分C1q C、アデノイド発現型ケモカイン（ADEC）、aFGF；FGF-1、AGF、AGFタンパク質、アルブミン、エトポシド、アンギオスタチン、炭疽菌ワクチン、コラプシンに特異的な抗体、アンチスタチン、抗TGFベータ・ファミリー抗体、アンチトロンビンIII、APM-1；ACRP-30；ファモキシン、アポ‐リポタンパク質種、アリールスルファターゼB、b57タンパク質、
【０１０１】
BCMA、ベータ・トロンボグロブリン・タンパク質（ベータ-TG）、bFGF；FGF2、血液凝固因子、BMPプロセッシング酵素フリン、BMP-10、BMP-12、BMP-15、BMP-17、BMP-18、BMP-2B、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-9、骨形成タンパク質-2、カルシトニン、カルパイン-10a、カルパイン-10b、カルパイン-10c、癌ワクチン、カルボキシペプチダーゼ、C-Cケモカイン、MCP2、CCR5変異体、CCR7、CCR7、CD11a Mab、CD137；4-1BB受容体タンパク質、CD20 Mab、CD27、CD27L、CD30、CD30リガンド、CD33免疫毒素、CD40、CD40L、CD52 Mab、Cerebusタンパク質、ケモカイン・エオタキシン、ケモカインhIL-8、ケモカインhMCP1、ケモカインhMCP1a、ケモカインhMCP1b、ケモカインhMCP2、ケモカインhMCP3、ケモカインhSDF1b、ケモカインMCP-4、ケモカインTECK及びTECK変異体、完全長及び成熟ケモカイン様タンパク質IL-8M1、完全長及び成熟ケモカイン様タンパク質IL-8M10、
【０１０２】
ケモカイン様タンパク質IL-8M3、完全長及び成熟ケモカイン様タンパク質IL-8M8、完全長及び成熟ケモカイン様タンパク質IL-8M9、完全長及び成熟ケモカイン様タンパク質PF4-414、完全長及び成熟ケモカイン様タンパク質PF4-426、完全長及び成熟ケモカイン様タンパク質PF4-M2、コレラ・ワクチン、コンドロモジュリン様タンパク質、c‐kitリガンド；SCF；マスト細胞成長因子；MGF；線維肉腫由来幹細胞因子、CNTF及びその断片（CNTFAx15’（Axokine（商標））など）、プレ形態と活性形態の両方の血液凝固因子、コラーゲン、補体C5 Mab、結合組織活性化タンパク質III、CTAA16.88 Mab、CTAP-III、CTLA4-Ig、CTLA-8、CXC3、CXC3、CXCR3；CXCケモカイン受容体3、シアノビリン-N、ダルベポエチン、エクソダスで表されるもの、huL105 7で表されるもの、DIL-40、Dnase、EDAR、EGF受容体 Mab、ENA-78、エンドスタチン、エオタキシン、上皮性好中球活性化タンパク質-78、EPO受容体；EPOR、エリスロポイエチン（EPO）及びEPO模倣体、ユウトロピン、エキソダス・タンパク質、第IX因子、第VII因子、第VIII因子、
【０１０３】
第X因子及び第XIII因子、FASリガンド阻害タンパク質（DcR3）、FasL、FasL、FasL、FGF、FGF-12；線維芽細胞成長因子相同因子-1、FGF-15、FGF-16、FGF-18、FGF-3；INT-2、FGF-4；ゲロニン、HST-1；HBGF-4、FGF-5、FGF-6；ヘパリン結合性分泌形質転換因子-2、FGF-8、FGF-9；グリア活性化因子、線維素原、flt-1、flt-3リガンド、卵胞刺激ホルモン・アルファ・サブユニット、卵胞刺激ホルモン・ベータ・サブユニット、ホリトロピン、フラクタルカイン、断片、筋線維タンパク質トロポニンI、FSH、ガラクトシダーゼ、ガレクチン-4、G-CSF、GDF-1、遺伝子治療、神経膠腫由来増殖因子、
【０１０４】
グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、グルコセレブロシダーゼ、グルコース・オキシダーゼ、グルコソダーゼ、グリコデリン-A；プロゲステロン関連子宮内膜タンパク質、GM-CSF、ゴナドトロピン、顆粒球走化タンパク質-2（GCP-2）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子、成長ホルモン、成長関連癌遺伝子-アルファ（GRO-アルファ）、成長関連癌遺伝子-ベータ（GRO-ベータ）、成長関連癌遺伝子-ガンマ（GRO-ガンマ）、hAPO-4；TROY、hCG、B型肝炎表面抗原、B型肝炎ワクチン、HER2受容体 Mab、ヒルジン、HIV gp120、HIV gp41、HIV阻害因子ペプチド、HIV阻害因子ペプチド、HIV阻害因子ペプチド、HIVプロテアーゼ阻害ペプチド、HIV1プロテアーゼ阻害剤、HPVワクチン、ヒト6CKineタンパク質、ヒトAct-2タンパク質、
【０１０５】
ヒト脂質生成抑制因子、ヒトB細胞刺激因子-2受容体、ヒト・ベータ-ケモカインH1305（MCP-2）、ヒトC-CケモカインDGWCC、ヒトCCケモカインELCタンパク質、ヒトCCタイプ・ケモカイン・インターロイキンC、ヒトCCC3タンパク質、ヒトCCF18ケモカイン、SLC（二次リンパ系ケモカイン）と表されるヒトCCタイプ・ケモカイン・タンパク質、ヒト・ケモカイン・ベータ-8短縮型、ヒト・ケモカインC10、ヒト・ケモカインCC-2、ヒト・ケモカインCC-3、ヒト・ケモカインCCR-2、ヒト・ケモカインCkベータ-7、ヒト・ケモカイン ENA-78、ヒト・ケモカイン・エオタキシン、ヒト・ケモカインGROアルファ、ヒト・ケモカインGROアルファ、ヒト・ケモカインGROベータ、ヒト・ケモカインHCC-1、ヒト・ケモカインHCC-1、ヒト・ケモカインI-309、ヒト・ケモカインIP-10、ヒト・ケモカインL105 3、
【０１０６】
ヒト・ケモカインL105 7、ヒト・ケモカインMIG、ヒト・ケモカインMIGベータ・タンパク質、ヒト・ケモカインMIP-1アルファ、ヒト・ケモカインMIP1ベータ、ヒト・ケモカインMlP-3アルファ、ヒト・ケモカインMIP-3ベータ、ヒト・ケモカインPF4、ヒト・ケモカイン・タンパク質331D5、ヒト・ケモカイン・タンパク質61164、ヒト・ケモカイン、受容体CXCR3、ヒト・ケモカインSDF1アルファ、ヒト・ケモカインSDF1ベータ、ヒト・ケモカインZSIG-35、ヒトChr19Kineタンパク質、ヒトCKベータ-9、ヒトCKベータ-9、ヒトCX3C111アミノ酸ケモカイン、ヒトDNAXインターロイキン-40、ヒトDVic-1C-Cケモカイン、ヒトEDIRF Iタンパク質配列、
【０１０７】
ヒトEDIRF IIタンパク質配列、ヒト好酸球CCタイプ・ケモカイン・エオタキシン、ヒト好酸球発現ケモカイン（EEC）、ヒト速筋線維骨格筋トロポニンC、ヒト速筋線維骨格筋トロポニンI、ヒト速筋線維骨格筋トロポニン・サブユニットC、ヒト速筋線維骨格筋トロポニン・サブユニットIタンパク質、ヒト速筋線維骨格筋トロポニン・サブユニットT、ヒト速筋線維骨格筋トロポニンT、ヒト胎児脾臓発現ケモカイン、FSEC、ヒトGM-CSF受容体、ヒトgro-アルファ・ケモカイン、ヒトgro-ベータ・ケモカイン、ヒトgro-ガンマ・ケモカイン、ヒトIL-16タンパク質、ヒトIL-1RD10タンパク質配列、ヒトIL-1RD9、ヒトIL-5受容体アルファ鎖、ヒトIL6受容体、ヒトIL-8受容体タンパク質hIL8RA、ヒトIL-8受容体タンパク質hIL8RB、ヒトIL-9受容体タンパク質、
【０１０８】
ヒトIL-9受容体タンパク質変異体3号、ヒトIL-9受容体タンパク質変異体断片、ヒトIL-9受容体タンパク質変異体断片3号、ヒト・インターロイキン1デルタ、ヒト・インターロイキン10、ヒトインターロイキン10、ヒト・インターロイキン18、ヒト・インターロイキン18誘導体、ヒト・インターロイキン-1ベータ前駆体、ヒト・インターロイキン-1ベータ前駆体、ヒト・インターロイキン-1受容体アクセサリー・タンパク質、ヒト・インターロイキン-1受容体アンタゴニスト・ベータ、ヒト・インターロイキン-1タイプ-3受容体、ヒト・インターロイキン-10（前駆体）、ヒト・インターロイキン-10（前駆体）、
【０１０９】
ヒト・インターロイキン-11受容体、ヒト・インターロイキン-12 40kDサブユニット、ヒト・インターロイキン-12ベータ-1受容体、ヒト・インターロイキン-12ベータ-2受容体、ヒト・インターロイキン-12 p35タンパク質、ヒト・インターロイキン-12 p40タンパク質、ヒト・インターロイキン-12受容体、ヒト・インターロイキン-13アルファ受容体、ヒト・インターロイキン-13ベータ受容体、ヒト・インターロイキン-15、クローンP1からのヒト・インターロイキン-15受容体、ヒト・インターロイキン-17受容体、ヒト・インターロイキン-18タンパク質（IL-18）、ヒト・インターロイキン-3、ヒト・インターロイキン-3受容体、ヒト・インターロイキン-3変異体、ヒト・インターロイキン-4受容体、ヒト・インターロイキン-5、ヒト・インターロイキン6、
【０１１０】
ヒト・インターロイキン-7、ヒト・インターロイキン-7、ヒト・インターロイキン8（IL-8）、ヒト細胞内IL-1受容体アンタゴニスト、ヒトIP-10とHIV-1 gp120 超可変領域の融合タンパク質、ヒトIP-10とヒトMuc-1コア・エピトープ（VNT）の融合タンパク質、ヒト肝臓及び活性化調節ケモカイン（LARC）、完全長及び成熟ヒトLkn-1タンパク質、完全長及び成熟ヒト乳房関連ケモカイン（MACK）タンパク質、ヒト成熟ケモカインCkベータ-7、ヒト成熟gro-アルファ、敗血症を治療するのに使用されるヒト成熟gro-ガンマ・ポリペプチド、ヒトMCP-3とヒトMuc-1コア・エピトープ（VNT）の融合タンパク質、ヒトMI10タンパク質、ヒトMI1Aタンパク質、ヒト単球走化性因子hMCP-1、ヒト単球走化性因子hMCP-3、ヒト単球走化作用プロタンパク質（MCPP）配列、ヒト・ニューロタクチン・ケモカイン様ドメイン、
【０１１１】
ヒト非ELR CXCケモカインH174、ヒト非ELR CXCケモカインIP10、ヒト非ELR CXCケモカインMig、ヒトPAI-1突然変異体、IL-16活性を有するヒト・タンパク質、IL-16活性を有するヒト・タンパク質、ヒト二次リンパ系ケモカイン（SLC）、ヒトSISDタンパク質、ヒトSTCP-1、ヒト間質細胞由来ケモカイン、SDF-1、ヒトT細胞混合リンパ球反応発現ケモカイン（TMEC）、ヒト胸腺と活性化調節サイトカイン（TARC）、ヒト胸腺発現、ヒトTNF-アルファ、ヒトTNF-アルファ、ヒトTNF-ベータ（LT-アルファ）、ヒトCC型ケモカイン・エオタキシン3タンパク質配列、ヒトII型インターロイキン-1受容体、ヒト野生型インターロイキン-4（hIL-4）タンパク質、ヒトZCHEMO-8タンパク質、ヒト化抗VEGF抗体及びそのフラグメント、ヒト化抗VEGF抗体及びそのフラグメント、ヒアルロニダーゼ、ICE 10kDサブユニット、ICE 20kDサブユニット、ICE 22kDサブユニット、イズロン酸-2-スルファターゼ、
【０１１２】
イズロニダーゼ、IL-1アルファ、IL-1ベータ、IL-1阻害剤（IL-1i）、成熟IL-1、IL-10受容体、IL-11、IL-11、IL-12 p40サブユニット、IL-13、IL-14、IL-15、IL-15受容体、IL-17、IL-17受容体、IL-17受容体、IL-17受容体、IL-19、IL-1i断片、IL1-受容体アンタゴニスト、IL-21（TIF）、IL-3含有融合タンパク質、IL-3突然変異タンパク質、IL-3変異体、IL-3変異体、IL-4、IL-4突然変異タンパク質、IL-4突然変異タンパク質Y124G、IL-4突然変異タンパク質Y124X、IL-4突然変異タンパク質、Il-5受容体、IL-6、Il-6受容体、IL-7受容体クローン、IL-8受容体、IL-9成熟タンパク質変異体（Met117バージョン）、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン・ベースの分子、又はそのいずれかのフラグメント（例えばSmall Modular ImmunoPharmaceutical（商標）（「SMIP」）、又はdAb、Fab’ フラグメント、F（ab’）2、scAb、
【０１１３】
scFv、若しくはscFvフラグメント）これだけに限定されることなくプラスミノーゲンを含む、インフルエンザワクチン、インヒビン・アルファ、インヒビン・ベータ、インスリン、インシュリン様成長因子、インテグリンMab、インター・アルファ・トリプシン阻害因子、インター・アルファ・トリプシン阻害因子、インターフェロン・ガンマ誘導タンパク質（IP-10）、インターフェロン（インターフェロンアルファ種や亜種、インターフェロン・ベータ種や亜種、インターフェロン・ガンマ種や亜種など）、インターフェロン（インターフェロンアルファ種や亜種、インターフェロン・ベータ種や亜種、インターフェロン・ガンマ種や亜種など）インターロイキン6、インターロイキン8（IL-8）受容体、インターロイキン8受容体B、インターロイキン1アルファ、インターロイキン-2受容体関連タンパク質p43、インターロイキン-3、インターロイキン-4突然変異タンパク質、インターロイキン-8（IL-8）タンパク質、
【０１１４】
インターロイキン-9、インターロイキン-9（IL-9）成熟タンパク質（Thr117バージョン）、インターロイキン（IL10、IL11、及びIL2など）、インターロイキン（IL10、IL11、及びIL2など）、日本脳炎ワクチン、Kalikrein阻害因子、ケラチン生成細胞増殖因子、Kunitzドメイン・タンパク質（アルブミン融合の有無にかかわらず、アプロチニン、アミロイド前駆タンパク質、WO 03/066824に記載のものなど）、Kunitzドメイン・タンパク質（アルブミン融合の有無にかかわらず、アプロチニン、アミロイド前駆タンパク質、WO 03/066824に記載のものなど）、LACI、ラクトフェリン、潜在的TGF-ベータ結合タンパク質II、レプチン、肝臓発現ケモカイン-1（LVEC-1）、肝臓発現ケモカイン-2（LVEC-2）、LT-アルファ、LT-ベータ、黄体形成ホルモン、Lymeワクチン、リンホタクチン、マクロファージ由来ケモカイン類似体MDC（n＋1）、マクロファージ由来ケモカイン類似体MDC-eyfy、マクロファージ由来ケモカイン類似体MDC-yl、マクロファージ由来ケモカイン、MDC、マクロファージ由来ケモカイン（MDC）、マスピン；プロテアーゼ阻害因子5、MCP-1受容体、MCP-1a、MCP-1b、MCP-3、MCP-4受容体、M-CSF、黒色腫阻害タンパク質、膜結合タンパク質、Met117ヒト・インターロイキン9、
【０１１５】
MIP-3アルファ、MIP-3ベータ、MIP-ガンマ、MIRAP、修飾ランテス、モノクローナル抗体、MP52、突然変異インターロイキン6 S176R、筋原繊維収縮性タンパク質トロポニンI、ナトリウム利尿性ペプチド、神経増殖因子-ベータ、神経増殖因子-ベータ2、ニューロピリン-1、ニューロピリン-2、ニューロタクチン、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、ニューロトロフィン-4a、ニューロトロフィン-4b、ニューロトロフィン-4c、ニューロトロフィン-4d、好中球活性化ペプチド-2（NAP-2）、NOGO-66受容体、NOGO-A、NOGO-B、NOGO-C、PTECと表される新規ベータ・ケモカイン、N-末端修飾ケモカインGroHEK/hSDF-1アルファ、N末端修飾ケモカインGroHEK/hSDF-1ベータ、
【０１１６】
N末端修飾ケモカインmet-hSDF-1アルファ、N末端修飾ケモカインmet-hSDF-1ベータ、OPGL、造骨性タンパク質-1；OP-1；BMP-7、造骨性タンパク質-2、OX40；ACT-4、OX40L、オキシトシン（ニューロフィシンI）、副甲状腺ホルモン、パッチド（Patched）、パッチド-2、PDGF-D、百日咳トキソイド、下垂体発現ケモカイン（PGEC）、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子-2、プラスミノーゲン・アクチベータ阻害因子-1；PAI-1、プラスミノーゲンアクチベータ阻害因子-2；PAI-2、プラスミノーゲンアクチベータ阻害因子-2；PAI-2、血小板由来増殖因子、血小板由来成長因子Bv-sis、血小板由来成長因子前駆体A、血小板由来成長因子前駆体B、血小板Mab、血小板由来内皮細胞成長因子（PD-ECGF）、血小板由来成長因子A鎖、血小板由来成長因子B鎖、
【０１１７】
敗血症の治療に使用されるポリペプチド、プレプロアポリポ・タンパク質「ミラノ」変異体、プレプロアポリポ・タンパク質「パリ」変異体、プレ-トロンビン、霊長類CCケモカイン「ILINCK」、霊長類CXCケモカイン「IBICK」、プロインスリン、プロラクチン、プロラクチン-2、プロサプチド、プロテアーゼ阻害因子ペプチド、プロテインC、プロテインS、プロトロンビン、プロウロキナーゼ、RANTES、RANTES8-68、RANTES9-68、RANTESペプチド、RANTES受容体、組み換えインターロイキン-16、レジスチン、レストリクトシン、レトロウイルス・プロテアーゼ阻害因子、リシン、ロタウイルス・ワクチン、RSV Mab、サポリン、サルシン、分泌及び膜貫通ポリペプチド、分泌及び膜貫通ポリペプチド、血清コリンエステラーゼ、血清タンパク質（血液凝固因子など）、可溶性BMP受容体キナーゼ・タンパク質-3、
【０１１８】
可溶性VEGF受容体、幹細胞抑制性因子、スタフィロコッカス・ワクチン、間質由来因子-1アルファ、間質由来因子-1ベータ、物質P（タヒキニン）、T1249ペプチド、T20ペプチド、T4エンドヌクレアーゼ、TACI、Tarc、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、Thr117ヒト・インターロイキン9、トロンビン、トロンボポエチン、トロンボポエチン誘導体1、トロンボポエチン誘導体2、トロンボポエチン誘導体3、トロンボポエチン誘導体4、トロンボポエチン誘導体5、トロンボポエチン誘導体6、トロンボポエチン誘導体7、胸腺発現ケモカイン（TECK）、甲状腺刺激ホルモン、チック抗凝固ペプチド、Tim-1タンパク質、TNF-アルファ前駆体、TNF-R、TNF-RII；TNF p75受容体；細胞死受容体、tPA、トランスフェリン、形質転換増殖因子ベータ、
【０１１９】
トロポニン・ペプチド、切断された単球走化作用タンパク質2（6-76）、切断された単球走化作用タンパク質2（6-76）、切断されたRANTESタンパク質（3-68）、腫瘍壊死因子、尿酸オキシダーゼ、ウロキナーゼ、バソプレッシン（ニューロフィシンII）、VEGF R-3；flt-4、VEGF受容体；KDR；flk-1、VEGF-110、VEGF-121、VEGF-138、VEGF-145、VEGF-162、VEGF-165、VEGF-182、VEGF-189、VEGF-206、VEGF-D、VEGF-E；VEGF-X、フォン・ヴィレブランド因子、野性型単球走化性タンパク質2、野性型単球走化性タンパク質2、ZTGF-ベータ9。
【０１２０】
化学療法剤
13-cis-レチノイン酸、2-CdA、2-クロロデオキシアデノシン、5-アザシチジン、5-フルオロウラシル、5-FU、6-メルカプトプリン、6-MP、6-TG、6-チオグアニンA、アブラキサン、Accutane（登録商標）、アクチノマイシンD、Adriamycin（登録商標）、Adrucil（登録商標）、Agrylin（登録商標）、Ala-Cort（登録商標）、アルデスロイキン、アレムツズマブ、ALIMTA、アリトレチノイン、Alkaban-AQ（登録商標）、Alkeran（登録商標）、全トランスレチノイン酸、アルファ-インターフェロン、アルトレタミン、アメソプテリン、アミフォスチン、アミノグルテチミド、アナグレリド、Anandron（登録商標）、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、Ara-C、Aranesp（登録商標）、Aredia（登録商標）、Arimidex（登録商標）、Aromasin（登録商標）、
【０１２１】
Arranon（登録商標）、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ATRA、Avastin（登録商標）、アザシチジン、BCG、BCNU、ベバシズマブ、ベキサロテン、BEXXAR（登録商標）、ビカルタミド、BiCNU、Blenoxane（登録商標）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、Busulfex（登録商標）、C225、カルシウム・ロイコボリン、Campath（登録商標）、Camptosar（登録商標）、カンプトテシン-11、カペシタビン、Carac（商標）、カルボプラチン、カルムスチン、カルムスチン・ウエハー、Casodex（登録商標）、CC-5013、CCNU、CDDP、CeeNU、Cerubidine（登録商標）、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、シトロボラム因子、クラドリビン、酢酸コルチゾン、Cosmegen（登録商標）、CPT-11、シクロホスファミド、Cytadren（登録商標）、シタラビン、シタラビン・リポソーマル、Cytosar-U（登録商標）、Cytoxan（登録商標）、ダカルバジン、ダコゲン、ダクチノマイシン、
【０１２２】
ダルベポエチン・アルファ、ダサチニブ、ダウノマイシン、ダウノルビシン、塩酸ダウノルビシン、ダウノルビシン・リポソーマル、DaunoXome（登録商標）、デカドロン、デシタビン、Delta-Cortef（登録商標）、Deltasone（登録商標）、デニロイキン・ディフティトックス、DepoCyt（商標）、デキサメサゾン、酢酸デキサメタゾン、デキサメサゾン・リン酸ナトリウム、デキサソン（Dexasone）、デクスラゾキサン、DHAD、DIC、ディオデックス（Diodex）、ドセタクセル、Doxil（登録商標）、ドキソルビシン、ドキソルビシン・リポソーマル、Droxia（商標）、DTIC、DTIC-Dome（登録商標）、Duralone（登録商標）、Efudex（登録商標）、Eligard（商標）、Ellence（商標）、Eloxatin（商標）、Elspar（登録商標）、Emcyt（登録商標）、
【０１２３】
エピルビシン、エポエチン・アルファ、Erbitux（商標）、エルロチニブ、エルウィニア・L-アスパラギナーゼ、エストラムスチン、エチヨル、Etopophos（登録商標）、エトポシド、リン酸エトポシド、Eulexin（登録商標）、Evista（登録商標）、エキセメスタン、Fareston（登録商標）、Faslodex（登録商標）、Femara（登録商標）、フィルグラスチム、フロクシウリジン、Fludara（登録商標）、フルダラビン、Fluoroplex（登録商標）、フルオロウラシル、フルオロウラシル（クリーム）、フルオキシメステロン、フルタミド
フォリン酸、FUDR（登録商標）、フルベストラント、G-CSF、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、Gemzar（登録商標）、
【０１２４】
Gleevec（商標）、Gliadel（登録商標）Wafer、GM-CSF、ゴセレリン、顆粒球-コロニー形成活性化因子、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子、Halotestin（登録商標）、Herceptin（登録商標）、ヘキサドロール（Hexadrol）、Hexalen（登録商標）、ヘキサメチルメラミン、HMM、Hycamtin（登録商標）、Hydrea（登録商標）、Hydrocort Acetate（登録商標）、ヒドロコーチゾン、ヒドロコルチゾン・リン酸ナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾン・ナトリウム、ハイドロコートン・ホスファート、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、Idamycin（登録商標）、イダルビシン、Ifex（登録商標）、IFN-アルファ、イホスファミド、IL-11、IL-2、メシル酸イマチニブ、イミダゾール・カルボキサミド、インターフェロン・アルファ、インターフェロン・アルファ-2b（PEG複合体）、
【０１２５】
インターロイキン-2、インターロイキン-11、Intron A（登録商標）（インターフェロン・アルファ-2b）、Iressa（登録商標）、イリノテカン、イソトレチノイン、Kidrolase（登録商標）、Lanacort（登録商標）、ラパチニブ、L-アスパラギナーゼ、LCR、レナリドマイド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイケラン、Leukine（商標）、ロイプロリド、ロイロクリスチン、Leustatin（商標）、リポソームAra-C、Liquid Pred（登録商標）、ロムスチン、L-PAM、L-サルコリシン、Lupron（登録商標）、Lupron Depot（登録商標）、M、Matulane（登録商標）、マキシデックス、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、Medralone（登録商標）、メドロール（登録商標）、Megace（登録商標）、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、Mesnex（商標）、メトトレキサート、メトトレキサート・ナトリウム、メチルプレドニソロン、Meticorten（登録商標）、マイトマイシン、
【０１２６】
マイトマイシン-C、ミトキサントロン、M-Prednisol（登録商標）、MTC、MTX、Mustargen（登録商標）、ムスチン、Mutamycin（登録商標）、Myleran（登録商標）、Mylocel（商標）、Mylotarg（登録商標）、Navelbine（登録商標）、ネララビン、Neosar（登録商標）、Neulasta（商標）、Neumega（登録商標）、Neupogen（登録商標）、Nexavar（登録商標）、Nilandron（登録商標）、ニルタミド、Nipent（登録商標）、ナイトロジェンマスタード、Novaldex（登録商標）、Novantrone（登録商標）、オクトレオチド、酢酸オクトレオチド、Oncospar（登録商標）、Oncovin（登録商標）、Ontak（登録商標）、Onxal（商標）、オプレベルキン、Orapred（登録商標）、Orasone（登録商標）、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセル、タンパク質に結合したもの、パミドロン酸、パニツムマブ、
【０１２７】
Panretin（登録商標）、Paraplatin（登録商標）、Pediapred（登録商標）、PEGインターフェロン、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、PEG-INTRON（商標）、PEG-L-アスパラギナーゼ、PEMETREXED、ペントスタチン、フェニルアラニンマスタード、Platinol（登録商標）、Platinol-AQ（登録商標）、プレドニゾロン、プレドニゾン、Prelone（登録商標）、プロカルバジン、PROCRIT（登録商標）、Proleukin（登録商標）、カルムスチン・インプラントを伴ったProlifeprospan 20、Purinethol（登録商標）、
【０１２８】
R、ラロキシフェン、Revlimid（登録商標）、Rheumatrex（登録商標）、Rituxan（登録商標）、リツキシマブ、Roferon-A（登録商標）（インターフェロン・アルファ-2a）、Rubex（登録商標）、塩酸ルビドマイシン、Sandostatin（登録商標）、Sandostatin LAR（登録商標）、サルグラモスチム、Solu-Cortef（登録商標）、Solu-Medrol（登録商標）、ソラフェニブ、SPRYCEL（商標）、STI-571、ストレプトゾシン、SU11248、スニチニブ、Sutent（登録商標）、タモキシフェン、Tarceva（登録商標）、Targretin（登録商標）、Taxol（登録商標）、Taxotere（登録商標）、Temodar（登録商標）、テモゾロミド、テニポシド、TESPA、サリドマイド、Thalomid（登録商標）、TheraCys（登録商標）、チオグアニン、Thioguanine Tabloid（登録商標）、チオホスホアミド、Thioplex（登録商標）、チオテパ、
【０１２９】
TICE（登録商標）、Toposar（登録商標）、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、Trexall（商標）、Trisenox（登録商標）、TSPA、TYKERB（登録商標）、VCR、Vectibix（商標）、Velban（登録商標）、Velcade（登録商標）、VePesid（登録商標）、Vesanoid（登録商標）、Viadur（商標）、Vidaza（登録商標）、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン、Vincasar Pfs（登録商標）、ビンクリスチン、ビノレルビン、酒石酸ビノレルビン、VLB、VM-26、Vorinostat、VP-16、Vumon（登録商標）、Xeloda（登録商標）、Zanosar（登録商標）、Zevalin（商標）、Zinecard（登録商標）、Zoladex（登録商標）、ゾレドロン酸、ゾリンザ、Zometa （登録商標）。
【０１３０】
放射性医薬品
炭素-11、炭素-14、クロム-51、コバルト-57、コバルト-58、エルビウム-169、フッ素-18、ガリウム-67、金-198、インジウム-111、インジウム-113m、ヨウ素-123、ヨウ素-125、ヨウ素-131、鉄-59、クリプトン-81m、窒素-13、酸素-15、リン-32、レニウム-186、ルビジウム-82、サマリウム-153、セレニウム-75、ストロンチウム-89、テクネチウム-99m、タリウム-201、トリチウム、キセノン-127、キセノン-133、イットリウム-90。
【０１３１】
造影剤
ガドリニウム、磁鉄鋼、マンガン、テクネチウム、I125、I131、P32、TI201、ロパミドール、PET-FDG。
【０１３２】
精製タグ
（Ala-Trp-Trp-Pro）n、アビジン／ストレプトアビジン／Strep-タグ、BCCP、B-タグ（ブルータングウイルスのVP7タンパク質領域）、カルモジュリン結合タンパク質（CBP）、セルロース結合ドメイン（CBD’s）、キチン結合ドメイン、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、c-myc、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、FLAG（商標）ペプチド（DYKDDDDK）、ガラクトース結合タンパク質、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、成長ホルモン、N-末端、血液凝集素インフルエンザ・ウイルス（HAI）、His-パッチ・チオレドキシン、His-タグ、HSB-タグ、KSI、lacZ（β-ガラクトシダーゼ）、マルトース結合タンパク質（MBP）、NusA、ompT/ompA/pelB/DsbA/DsbC、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン、S-タグ、ブドウ球菌タンパク質A、連鎖球菌タンパク質G、T4 gp55、T7遺伝子10、T7-タグ、チオレドキシン、trpE、ユビキチン。
【０１３３】
診断用化合物
診断薬又は生物学的「対照」医薬品の使用は当該技術分野で周知である。診断用薬は、（すなわち、検査結果を評価するのに必要とされる機器及び手順と一緒に）診断検査の一部として使用されるあらゆる医薬製品である。診断用薬は、生体内、生体外、又は試験管内で使用され得る。例えば、US 4,945,239は、透視画像装置を使用することによって乳癌細胞の存在を検出するために開発された手順を記載している。正常乳房細胞と良性乳房腫瘍細胞はトランスフェリン受容体の発現がないが、その一方で、乳癌はトランスフェリン受容体の非常に高い発現があることが知られている。ヒト・トランスフェリンは、ヒト・タンパク質、脂肪酸、及び他の体液の大部分が光を顕著に吸収しない電磁放射線の可視領域で強い吸収を示すような方法で化学的に修飾される。より特に、フルオレセインは、イソチオシアネート・カップリング法を使用してトランスフェリンに共有結合的にカップリングさせた。複合タンパク質（FITC-Tf）は、496nmに非常に強い吸収を有する。予備研究では、FITC-Tf複合体が癌細胞を検出するのに使用できることが実証された。EMT-6マウス乳房腫瘍細胞は、10%のウシ胎仔血清を含むRPMI1640培地中、二酸化炭素インキュベータ内で培養し、頻繁な分割によって対数期増殖が維持された。実験のために、細胞はトリプシン処理され、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.4で洗浄し、そしてPBS中、37℃にて30分間インキュベートして、細胞表面トランスフェリン受容体から結合したトランスフェリンを取り外した。その細胞は、次に、500gにて5分間、遠心分離され、そしてもう一度、PBSで洗浄された。2本の15mlコニカル遠沈管のそれぞれの中で、100万個の細胞が10mlのPBS、pH7.4中に懸濁され、そして1.0mlの2.0mg/ml FITC-Tf又はトランスフェリンが各試験管に加えられた。これらの試験管は、4℃にて45分間インキュベートされた。そして、その細胞はPBSで2度洗浄されて、結合していない物質を取り除いた。次に、洗浄されたペレットは0.2mlのPBS中に懸濁され、そして、画像化の目的のために、Dynatech社から入手可能な96ウェルの透明なプラスチック・タイタープレートに細胞が移された。
【０１３４】
配列比較と同一性
HST変異体は、配列番号1と少なくとも40%の同一性を有することができ、特に少なくとも45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の同一性を有することができる。
【０１３５】
ラクトフェリン変異体は、配列番号11と少なくとも40%の同一性を有することができ、特に少なくとも45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の同一性を有することができる。
【０１３６】
メラノトランスフェリン変異体は、配列番号15と少なくとも40%の同一性を有することができ、特に少なくとも45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の同一性を有することができる。
【０１３７】
図6〜9は、HST（配列番号1）との、多くのトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。HSTとヒト・ラクトフェリンの構造的配列比較は、J. Wally et al., Biometals (2007) 20:249-262によって記載されている。これらの配列比較は、先に記載したように選択されたHSTのそれらに相当する領域とアミノ酸残基を同定するのに使用できる。他のラクトフェリン・ファミリー・タンパク質に関しては、一次配列配列比較は当該技術分野に知られている多くの手順によって実施できる。
【０１３８】
そのような手順に関する例は、Hein, J.J. (1990). "Unified approach to alignment and phylogenies." In Methods in Enzymology, Vol. 183: pp. 626-645に基づくLasergene一式の一部のDNASTAR Inc.によって開発されたMegAiignプログラム（バージョン7）である。Jotun Hein Method、及び多重配列比較のためのGAP PENALTY＝11、GAP LENGTH PENALTY＝3と、対配列比較のためのKTUPLE＝2の設定を使用して、一連のパーセンテージ同一性値が計算できる。
【０１３９】
2つのアミノ酸配列の配列比較はまた、EMBOSSパッケージ（http：//emboss.org）バージョン2.8.0製のNeedleプログラムを使用することによって測定されてもよい。前記Needleプログラムは、Needleman, S. B, and Wunsch, C. D, (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453に記載の大域的な配列比較・アルゴリズムを実装する。使用される置換マトリクスはBLOSUM62であって、そしてギャップ開始ペナルティは10であり、ギャップ拡大ペナルティは0.5である。
【０１４０】
所定のアミノ酸配列と配列番号1の間の同一性の度合いは、その2つの配列のうちのより短いものの長さによって除算される、その2つの配列の配列比較における完全な一致の数として計算される。結果はパーセント同一性の形で表される。前記の2つの配列が重複している同じ位置において同一のアミノ酸残基を持っているとき、完全な一致が起こる。配列の長さは、その配列のアミノ酸残基の数である。
【０１４１】
三次元モデルにおける残基の移動性（RMSF）
シミュレーションの最後のナノ秒間のC-アルファ炭素原子の二乗平均揺らぎは、D. van der Spoel, E. Lindahl, B. Hess, G. Groenhof, A. E. Mark and H. J. C. Berendsen: GROMACS: Fast, Flexible及びFree, J. Comp. Chem. 26 pp. 1701-1718 (2005)に基づく、Gromacsツール「g rmsf」、バージョン3.3を使用することで計算された。
【０１４２】
三次元モデルにおける残基の溶媒接近可能性
溶媒接近可能表面積が、DSSPソフトウェアを使用することで各残基について計算される（W.Kabsch and C.Sander, Biopolymers 22 (1983) 2577-2637）。それぞれの溶媒接近可能表面積は、その位置に見られる特定のアミノ酸の基準値によって割られ、そして100が掛けられ、その結果、各残基についての基準値のパーセンテージが得られる。
【０１４３】
20個の異なったアミノ酸についての標準溶媒接近可能表面積は（アミノ酸のための一文字コードを使用して）以下のとおり規定される：A＝62、C＝92、D＝69、E＝156、F＝123、G＝50、H＝130、I＝84、K＝174、L＝97、M＝103、N＝85、P＝67、Q＝127、R＝211、S＝64、T＝80、V＝81、W＝126、Y＝104。
【０１４４】
リガンド結合性
前記ポリペプチドは、保存性又は非保存性のいずれかの、挿入、欠失、及び置換を、こうした変化がトランスフェリンの有用なリガンド結合性、免疫学的、又は受容体結合特性を実質的に低減しない所に含んでもよい。前記ポリペプチドは、、ヒト・トランスフェリンの受容体結合活性（モル対モル）の少なくとも5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、少なくとも80%、90%、95%、100%、105%、又はそれを超える活性を有する場合がある。前記ポリペプチドは、受容体に対する増強された親和性又は低減された鉄の放出を有する場合がある（Adams et al., 2003 J Biol Chem, 278 (8), 6027-33; Baker et al., 2007 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 63 (Pt 3), 408-14; He and Mason, 2002 Molecular and Cellular Iron Transport, 5-123; Mason et al., 2005 Biochemistry, 44 (22), 8013-21）。
【０１４５】
前記ポリペプチドは、修飾された（例えば、低減された）グリコシル化、例えばこれだけに限定されることなく、低減されたN-結合型グリコシル化又は低減されたO-結合型グリコシル化などを示す場合がある。トランスフェリン分子のN-結合型グリコシル化パターンは、いずれか又はすべてのN、X、又はS/T位置において、N-X-S/Tなどのアミノ酸グリコシル化コンセンサス配列を付加／欠失することによって修飾されることができる。トランスフェリン突然変異体は、生理活性担体としての突然変異体の有効性が改善されるように、鉄を放出する能力が変わる、及び／又は再循環時間が変わる場合がある（Lao et al., 2007 J Control Release, 117 (3), 403-12）。トランスフェリン突然変異体は、金属イオン、及び／又はトランスフェリン受容体などの他のタンパク質に対するそれらの天然の結合が変更されてもよい。このように修飾されたトランスフェリン突然変異体の例は以下で例示される。
【０１４６】
我々はまた、ヒト・トランスフェリン又はヒト・トランスフェリン類似体の天然に存在する多型変異体も含む。一般的に、ヒト・トランスフェリンの変異体又は断片は、モル対モルで、ヒト・トランスフェリンのリガンド結合活性（例えば、鉄結合）の少なくとも5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%の、（好ましくは少なくとも80%、90%、95%、100%、105%、又はそれを超える）活性を有する。
【０１４７】
鉄結合アッセイ
鉄結合容量は、トランスフェリン突然変異体の配列を含んでなる組み換えタンパク質の、可逆的に鉄に結合するための能力を指す。鉄を欠いているトランスフェリンは無色であるが、鉄が結合されると、それらは独特のサーモンピンク色である。そのため、鉄結合容量は、それらの鉄を含まない及び完全な鉄を負荷した状態にあるタンパク質についての470nm：280nm吸光度比によって分光光度測定により測定されることが可能である。チオトランスフェリンは、それがシステインの挿入なしに対応するポリペプチドの鉄結合能の少なくとも5%を有するならば、鉄結合容量を有すると見なされる。
【０１４８】
別段の記述がない限り、試薬は鉄を含まないものであるべきである。0.1Mのクエン酸、0.1Mの酢酸、10mMのEDTA pH4.5に対する透析によってトランスフェリン又は試験サンプルから鉄を取り除くことが可能である。前記タンパク質は、100mMのHEPES、10mMのNaHCO3 pH8.0中に約20mg/mLにて存在すべきである。280nmの吸光度を分光光度測定により正確に測定できるように、水中に希釈されたアポトランスフェリン（すなわち、鉄不含対照トランスフェリン）（Calbiochem, CN Biosciences, Nottingham, UK）の470nm：280nm吸光度比を計測すること（0%の鉄結合）。2mLの1M NaOH中、191mgのニトロ三酢酸（nitrotriacetic acid）を溶解させ、次に2mLの0.5M塩化鉄を加えることによって20mMの鉄‐ニトリロトリアセタート（FeNTA）溶液を調製すること。脱イオン水で50mLに希釈すること。十分に過剰の新たに調製した20mMのFeNTAを加えることによって、鉄をアポ‐（対照）トランスフェリンに完全に負荷すること（100%の鉄結合）、次に、ホロ‐トランスフェリン調製物を、100mMのHEPES、10mMのNaHCO3 pH8.0に対して完全に透析して、470nm：280nmにて吸光度比を計測する前に残っているFeNTAを取り除くこと。初めは鉄を含んでいるはずがないので、試験サンプル（すなわち、問題のトランスフェリン突然変異体の配列を含んでなる組み換えタンパク質）を使用して前記手順を反復し、そして対照に対する最終的な比を比較する。
【０１４９】
トランスフェリン総鉄結合能（TIBC）の定量のための手順
総鉄結合能（TIBC）は、すべての利用可能なトランスフェリン鉄結合部位を飽和するのに必要な鉄の最大量を示す。TIBC、血清鉄、及び血清鉄対TIBC（トランスフェリン飽和）の比の測定は、臨床診断及び観察に日常的に使用されている（Huebers, H. A. et al. (1987), Clin Chem 33, 273-7）。rTfの総鉄結合能は、Caraway, 1963 Clinical Chem 9(2), 188によって記載されている血清鉄及び鉄結合能の測定のための変法を使用することで測定されることが可能である。rTfは、1mLの総鉄結合バッファー（0.5MのTris pH8、0.5MのNaHCO3）の添加前に、5mg.mL-1に希釈された。各試験管に、0.220g±0.005gの炭酸マグネシウムが加えられて（余分な鉄が取り除かれ）、そしてロック‐ロール・ミキサーを使用して45分間混合された。サンプルは17℃、5000rpmにて25分間、遠心分離された。鉄を結合したトランスフェリンを含む上清（650μl）は、ultrafree（登録商標）-MC 0.45μの微量遠心スピンフィルターの受入容器に移されて、8000rpmにて10分間遠心分離された。前記受入容器は取り出され、そしてボルテックスにかけて混合された。サンプルは2つのアリコートに分割され、100μLの各サンプルが鉄分析のためにミクロチューブに移され、そして残っている150μlのそれぞれのサンプルが、rTF濃度が（精製の項に記載の）RP-HPLCによって計測されるように200μlの圧着トップHPLCバイアル（02-CTV、Chromacol Ltd）内に移された。
【０１５０】
タンパク質サンプル中の鉄の総量は、鉄に関する比色試薬であるferene-Sを使用し、そして595nmにて吸光度の変化を観察することによって計測されることが可能になる。
【０１５１】
10mg.L-1の鉄の通常在庫標準は、4.95mlの水に50μlの鉄の原子分光法標準の添加によって調製された。鉄標準は、検量線を作製できるように、100μlの終量中、1、2、3、4、5、及び10mg.L-1に調製された。それぞれ標準に50μlの1.3Mアスコルビン酸が加えられ、サンプルが混合されて、そして室温にてインキュベートされた。10分後に、すべてのサンプルに50μlの20%（w/v）三塩化酢酸が添加された。100μlの標準が10×4×45mmのプラスチック・キュベットに移され、そして100μlの酢酸アンモニウムが加えられ、続いて100μlの22.2nmol.L-1 ferene-S溶液及び700μlの水が加えられた。前記標準は室温にて10分間インキュベートされ、その後、（Shimadzu UV2501分光光度計又は同等物を使用して）595nmにて吸光度が計測された。検量線が、鉄濃度mg.L-1に対する595nmの吸光度から構成された。
【０１５２】
同時に、50μlの1.3Mアスコルビン酸がrTfサンプル（100μl）に加えられ、サンプルは混合され、そして室温にてインキュベートされた。10分後に、タンパク質を含むサンプルに、50μlの20%（w/v）三塩化酢酸が加えられ、そして50μlのクロロホルムが加えられた。すべてのサンプルが、ボルテックスにかけることによって混合され、そして14,000rpmにて3分間遠心分離された。上清（100μl）が10×4×45mmのプラスチック・キュベットに移され、そして100μlの40%（w/v）酢酸アンモニウムが加えられ、続いて100μlの22.2nmol.L-1 ferene-S溶液及び700μlの水が加えられた。前記標準は室温にて10分間インキュベートされ、その後、（Shimadzu UV2501分光光度計又は同等物を使用して）595nmにて吸光度が計測された。鉄濃度mg.L-1は検量線を使用することで計算され、そして鉄濃度（mg.gタンパク質-1）はタンパク質濃度（g.L-1）によって鉄濃度を割ることによって計算された。
【０１５３】
結合（Conjugation）
本発明のトランスフェリン突然変異タンパク質（チオトランスフェリン）は、当該技術分野で知られている方法によって生理活性化合物に共有結合的に連結できる（http://www.piercenet.com/files/1601361Crosslink.pdf ）。これらとしては、これに限定されるものではないが、例えば、前記生理活性化合物上に存在する別の遊離チオールを組み込むか若しくは操作することによって；又は前記生理活性化合物上にピリジル・ジスルフィド基を組み込むか若しくは操作することによって；又は前記生理活性化合物上にヨードアセチル基を組み込むか若しくは操作することによって；あるいは前記生理活性化合物上にマレイミド基を組み込むか若しくは操作することによって、前記生理活性化合物の中若しくはその上にチオール反応性基を組み込むか若しくは操作することが挙げられる。例えば、N-エチルマレイミド（NEM、Pierce）、2-アミノ-2’-アミノエタンチオールスルホナート（Pierce）、N-ベータ-マレイミドプロピオン酸（BMPA Pierce）、メチル・メタン・チオスルホナート（MMTS、Pierce）、フルオレセイン-5-マレイミド（Pierce）、5-ヨードアセトアミド-フルオレセイン（5-IAF、Pierce）又はN-［6-7-アミノ-4-メチルクマリン-3-アセトアミド）ヘキシル］-3’-［2’-ピリジルジチオ］プロピオンアミド（AMCA-HPDP、Pierce）。
【０１５４】
前記生理活性化合物が少なくとも1つのチオール基を含む場合には、その生理活性化合物が、これだけに限定されることなく、酸化などの当該技術分野に知られている方法、又はこれだけに限定されることなく、4-Bis-マレイミドブタン（BMB、Pierce）；1,4-ビス-マレイミジル-2,3-ジヒドロキシブタン（BMDB、Pierce）；ビス-マレイミドヘキサン（BMH、Pierce）、ビス-マレイミドエタン（BMOE、Pierce）；1,8-ビス-マレイミドトリエチレングリコール（BM［PEO］3、Pierce）；1,11-ビス-マレイミドテトラエチレングリコール（BM［PEO］4、Pierce）；1,4-ジ-［3’-（2’-ピリジルジチオ）-プロピオンアミド］ブタン（DPDPB、Pierce）；ジチオ-ビス-マレイミドエタン（DTME Pierce）；1,6-ヘキサン-ビス-ビニルスルホン（HBVS、Pierce）、及びトリス-［2-マレイミドエチル］アミン（TMEA、Pierce）などの架橋剤の使用によって本発明のトランスフェリン突然変異タンパク質に架橋処理できる。
【０１５５】
前記生理活性化合物がチオール反応性基を含まない場合には、それに、当該技術分野で知られている方法によって化学的な修飾又は遺伝子工学のどちらかによって1又は複数のこうした基を組み込むように修飾できる（Chapman, A.P. (2002) Adv. Drug Deliv. Rev., 54 531-545: Humphreys, DiP. et al. Protein Engineering, Design & Selection vol. 20 no. 5 pp. 227-234, 2007）。これらの2つの参考文献が抗体又は抗体フラグメント内の操作された遊離チオールに対する架橋PEGのための方法論を記載しているが、その技術は、本発明のトランスフェリン突然変異タンパク質内の操作された遊離チオールに生理活性化合物を架橋するのに使用されることが可能である。あるいは、ConjuChem Inc.（Montreal, Quebec, Canada, H2X 3Y8）によって開発されたDrug Affinity Complex（DAC（商標））技術が、例えば、WO 200069902に記載のとおり使用できる。それぞれのDAC（商標）構築物の中には、以下の3つの部分が存在する：1）薬物成分（生物学的活性に関与する部分）；2）薬物成分に取り付けられたリンカー、及び3）リンカーの反対端の反応化学基、一般にチオールに選択なソフト求電子剤；マレイミドは最も有用な態様である。
【０１５６】
前記生理活性化合物がチオール反応性基を含んでいないが、1以上のアミノ基を含んでいる場合には、それに、架橋剤の使用などの当該技術分野で知られている方法による化学的な修飾によって1以上のチオール反応性基を組み込むように修飾できる。前記架橋剤は、これだけに限定されることなく、N-5-アザイド-2-ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（AMAS、Pierce）、N［ベータ-マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミド・エステル（BMPS、Pierce）、N-エタ-マレイミドカプロン酸（EMCA、Pierce）、N-［エタ-マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミド・エステル（EMCS、Pierce）、
【０１５７】
N-［エタ-マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミド・エステル（スルホ-EMCS、Pierce）、N-［ガンマ-マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミド・エステル（GMBS、Pierce）、N-［ガンマ-マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミド・エステル（スルホ-GMBS、Pierce）、N-カッパ-マレイミドウンデカン酸（KMUA、Pierce）、N-［カッパ-マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド（KMUH、Pierce）、N-［カッパ-マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミド・エステル（スルホ-KMUS、Pierce）、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミド（MBS、Pierce）、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミド・エステル（スルホ-MBS、Pierce）、N-スクシンイミジルS-アセチルチオアセタート（SATA、Pierce）、N-スクシンイミジルS-アセチルチオプロピオナート（SATP、Pierce）、スクシンイミジル3-［ブロモアセトアミド］プロピオンナート（SBAP、Pierce）、N-スクシンイミジル・ヨードアセタート（SIA、Pierce）、
【０１５８】
N-スクシンイミジル［4-ヨードアセチル］アミノベンゾアート（SIAB、Pierce）、スルホスクシンイミジル［4-ヨードアセチル］アミノベンゾアート（スルホ-SIAB、Pierce）、スクシンイミジル［4-［N-マレイミドメチル］シクロヘキサン-1-カルボキシラート（SMCC、Pierce）、スルホスクシンイミジル［4-［N-マレイミドメチル］シクロヘキサン-1-カルボキシラート（スルホ-SMCC、Pierce）、スクシンイミジル-［4-［N-マレイミドメチル］シクロヘキサン-1-カルボキシ-［6-アミドカプロアート（LC-SMCC、Pierce）、
【０１５９】
4-スクシンイミジルオキシカルボニル-メチル-アルファ［2-ピリジルジチオ］トルエン（SMPT、Pierce）、スルホスクシンイミジル-6-［アルファ-メチル-アルファ2-ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノアート（スルホ-LC-SMPT、Pierce）、スクシンイミジル4-［p-マレイミドフェニル］-ブチラート（SMPB、Pierce）、スルホスクシンイミジル4-［p-マレイミドフェニル］-ブチラート（スルホ-SMPB、Pierce）、スクシンイミジル-6-［（ベータ-マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノアート］（SMPH、Pierce）、N-スクシンイミジル3-［2-ピリジルジチオ］プロピオナート（SPDP、Pierce）、
【０１６０】
スクシンイミジル［3-（2-ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノアート（LC-SPDP、Pierce）、スルホスクシンイミジル［3’-（2-ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノアート（スルホ-LC-SPDP、Pierce）、及びN-スクシンイミジル-［4-ビニルスルホニル］ベンゾアート（SVSB、Pierce）などである。Kavimandan et al., (2006) Bioconjugate Chem. 17,1376-1384に記載されているように、特定のアミン残基をブロックすることが有益なこともある。
【０１６１】
前記生理活性化合物がチオール反応性基を含んでいないが、1又は複数個のカルボニル（酸化された炭水化物）基を含んでいる場合には、それに、架橋剤の使用などの当該技術分野で知られている方法による化学的な修飾によって1又は複数のチオール反応性基を組み込むように修飾できる。前記架橋剤は、これだけに限定されることなく、N-［エタ-マレイミドカプロン酸］ヒドラジド（EMCH、Pierce）、4-［N-マレイミドメチル］シクロヘキサン-1カルボキシルヒドラジド・HCl・1/2ジオキサン（M2C2H、Pierce）、3-マレイミドフェニル・ボロン酸（MPBH、Pierce）、及び3-［2-ピリジルジチオ］プロピオニル・ヒドラジド（PDPH、Pierce）などである。
【０１６２】
前記生理活性化合物がチオール反応性基を含んでいないが、1以上のヒドロキシル基を含んでいる場合には、それに、架橋剤、例えばこれだけに限定されることなく、N-［p-マレイミドフェニル］イソシアナート（PMPl、Pierce）などの使用などの当該技術分野で知られている方法による化学的な修飾によって1又は複数のチオール反応性基を組み込むように修飾できる。
【０１６３】
トランスフェリン変異体の結合能力
本発明のポリペプチドの結合能力は、McGraw et al., (1987), The Journal of Cell Biology, 105, 207-214 and Presley et al., (1993), The Journal of Cell Biology, 122,1231-1241に記載されているとおり、蛍光標識、そして細胞内取り込みによって試験されることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】プラスミドpDB2241の構造を示す。
【図２】プラスミドpDB3237の構造を示す。
【図３】プラスミドpDB3191の構造を示す。
【図４】三次元のトランスフェリン・モデルの構築を示す。
【図５−１】三次元モデル中の2つのTf鎖内の残基についてのデータを示す。詳細は実施例の中で述べられる。
【図５−２】三次元モデル中の2つのTf鎖内の残基についてのデータを示す。詳細は実施例の中で述べられる。
【図５−３】三次元モデル中の2つのTf鎖内の残基についてのデータを示す。詳細は実施例の中で述べられる。
【図５−４】三次元モデル中の2つのTf鎖内の残基についてのデータを示す。詳細は実施例の中で述べられる。
【図５−５】三次元モデル中の2つのTf鎖内の残基についてのデータを示す。詳細は実施例の中で述べられる。
【図５−６】三次元モデル中の2つのTf鎖内の残基についてのデータを示す。詳細は実施例の中で述べられる。
【図５−７】三次元モデル中の2つのTf鎖内の残基についてのデータを示す。詳細は実施例の中で述べられる。
【図５−８】三次元モデル中の2つのTf鎖内の残基についてのデータを示す。詳細は実施例の中で述べられる。
【図５−９】三次元モデル中の2つのTf鎖内の残基についてのデータを示す。詳細は実施例の中で述べられる。
【図５−１０】三次元モデル中の2つのTf鎖内の残基についてのデータを示す。詳細は実施例の中で述べられる。
【図５−１１】三次元モデル中の2つのTf鎖内の残基についてのデータを示す。詳細は実施例の中で述べられる。
【図５−１２】三次元モデル中の2つのTf鎖内の残基についてのデータを示す。詳細は実施例の中で述べられる。
【図５−１３】三次元モデル中の2つのTf鎖内の残基についてのデータを示す。詳細は実施例の中で述べられる。
【図６−１】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図６−２】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図６−３】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図６−４】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図６−５】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図６−６】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図６−７】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図６−８】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図６−９】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図６−１０】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図７−１】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図７−２】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図７−３】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図７−４】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図７−５】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図７−６】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図７−７】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図７−８】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図７−９】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図８−１】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図８−２】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図８−３】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図９−１】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図９−２】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図９−３】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図９−４】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図９−５】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図９−６】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図９−７】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図９−８】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図９−９】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図９−１０】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図９−１１】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図９−１２】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図９−１３】NP 001054として同定されたHST（配列番号1）と、様々なトランスフェリン・ファミリー・タンパク質の配列比較を示す。
【図１０】修飾のために選択された残基とクローニングを容易にする制限エンドヌクレアーゼ部位の位置を標識した、pDB3191からの3.259kbのNotI発現カセットのマップを示す。
【図１１】プラスミドpDB3806の構造を示す。
【図１２】プラスミドpDB3809の構造を示す。
【図１３】ラクトフェリン・サブクローニング・プラスミドpDB3815及びpDB3816の構造を示す。
【図１４】チオラクトフェリン・サブクローニング・プラスミドpDB3817の構造を示す。
【図１５】ラクトフェリン発現プラスミドpDB3818及びPDB3819の構造を示す。
【図１６】チオラクトフェリン発現プラスミドpDB3820の構造を示す。
【図１７】組み換えトランスフェリン（S415A、T613A）発現プラスミドpDB3237又は適切な組み換えチオトランスフェリン発現プラスミドを保持しているS.セレビシエ（S.cerevisiae）株の菌株1からの分泌組み換え「チオトランスフェリン」と比較した組み換えトランスフェリン（S415A、T613A）のSDS-PAGE分析を示す。10mL BMMD振盪フラスコに、100μLの冷凍保存酵母ストックを植菌し、そして、30℃にて5日間インキュベートした。ゲル1は、GelCode（登録商標）Blue試薬（Pierce）を用いた非還元SDS-PAGE（4-12% NuPAGE（登録商標）、MOPSバッファー、Invitrogen）により分析した20μLの上清に該当する。ゲル2は、GelCode（登録商標）Blue試薬（Pierce）を用いて還元SDS-PAGE（4-12% NuPAGE（登録商標）、MOPSバッファー、Invitrogen）により分析した20μLの上清に該当する。  図17のゲル1及び2において、そのレーンは以下のサンプルに対応している：1＝10μLのSeeBlue Plus Marker（Invitrogen）、2＝20μLの菌株1［pDB3237］、3＝20μLの菌株1［pDB3766］、4＝20μLの菌株1［pDB3767］、5＝20μLの菌株1［pDB3778］、6＝20μLの菌株1［pDB3769］、7＝20μLの菌株1［pDB3789］、8＝20μLの菌株1［pDB3770］、9＝20μLの菌株1［pDB3771］、10＝20μLの菌株1［pDB3779］、11＝20μLの菌株1［pDB3757］、12＝20μLの菌株1［pDB3761］、13＝10μLのSeeBlue Plus Marker（Invitrogen）、14＝20μLの菌株1［pDB3773］、15＝20μLの菌株1［pDB3763］、16＝20μLの菌株1［pDB3760］、17＝20μLの菌株1［pDB3745］、18＝20μLの菌株1［pDB3775］、19＝20μLの菌株1［pDB3758］、20＝20μLの菌株1［pDB3777］、21＝20μLの菌株1［pDB3765］、22＝20μLの菌株1［pDB3759］、23＝20μLの菌株1［pDB3237］、24＝10μLのSeeBlue Plus Marker（Invitrogen）。
【図１８】トランスフェリン（S415A、T613A）発現プラスミドpDB3237を保持しているS.セレビシエ菌株1からのトランスフェリン（S415A、T613A）分泌物と比較した、チオトランスフェリン変異体発現プラスミドを保持している独自のS.セレビシエ菌株からのチオトランスフェリン変異体分泌物のロケット免疫電気泳動分析を示す。10mL BMMD振盪フラスコに、100μLの冷凍保存酵母ストックを植菌し、30℃にて5日間インキュベートした。二重反復試験で、ロケット免疫電気泳動ゲル（30μLのヤギ抗Tf／50mLのアガロース）の1ウェルあたり4μLの培養上清を添加した。組み換えヒト・トランスフェリン（S415A、T613A）（Deltaferrin（商標））の基準濃度を、20〜100μg/mLで添加した。プレシピン（Precipin）をクマシーブルーで染色した。ゲル1は、組み換えヒト・トランスフェリン（S415A、T613A）を発現している菌株1［pDB3237］からの発現と比較した、トランスフェリン変異体のNローブ及び中間ローブの発現レベルに該当する。ゲル2は、組み換えヒト・トランスフェリン（S415A、T613A）を発現している菌株1［pDB3237］からの発現と比較した、トランスフェリン変異体のCローブの発現レベルに該当する。
【図１９】S.セレビシエ菌株1［pDB3767］、菌株1［pDB3773］、菌株1［pDB3237］からの組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、組み換えチオトランスフェリン（S415C、T613A）、及びトランスフェリン（S415A、T613A）組み換えチオトランスフェリンの分泌物と比較した、S.セレビシエ菌株1［pDB3809］からの組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415C、T613A）のSDS-PAGE分析を示す。10mL BMMD振盪フラスコに、100μLの冷凍保存酵母ストックを植菌し、そして30℃にて5日間インキュベートした。ゲル1は、GelCode（登録商標）Blue試薬（Pierce）を用いた非還元SDS-PAGE（4-12% NuPAGE（登録商標）、MOPSバッファー、Invitrogen）により分析された20μLの上清に該当する。図19のゲル1において、そのレーンは以下のサンプルに相当する：1＝10μLのSeeBlue Plus Marker（Invitrogen）、2＝20μLの菌株1［pDB3237］、3＝20μLの菌株1［pDB3237］、4＝20μLの菌株1［pDB3767］、5＝20μLの菌株1［pDB3773］、6＝20μLの菌株1［pDB3809］、7＝20μLの菌株1［pDB3809］。図19のゲル2において、そのレーンは以下のサンプルに相当する：1＝10μLのSeeBlue Plus Markers（Invitrogen）、2＝サンプルなし、3＝20μLの菌株1［pDB3237］4＝20μLの菌株1［pDB3237］、5＝20μLの菌株1［pDB3767］、6＝20μLの菌株1［pDB3773］、7＝20μLの菌株1［pDB3809］、8＝20μLの菌株1［pDB3809］。
【図２０】独自のS.セレビシエ菌株1［pDB3767］、菌株1［pDB3773］、菌株1［pDB3237］からの組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、組み換えチオトランスフェリン（S415C、T613A）、及びトランスフェリン（S415A、T613A）組み換えチオトランスフェリンの分泌物と比較した、独自のS.セレビシエ菌株1［pDB3809］からの組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415C、T613A）のロケット免疫電気泳動分析を示す。10mL BMMD振盪フラスコに、100μLの冷凍保存酵母ストックを植菌し、そして30℃にて5日間インキュベートした。二重反復試験で、ロケット免疫電気泳動ゲル（30μLのヤギ抗Tf／50mLのアガロース）の1ウェルあたり4μLの培養上清を添加した。組み換えヒト・トランスフェリン（S415A、T613A）（Deltaferrin（商標））の基準濃度を、20〜100μg.mL-1で添加した。プレシピンをクマシーブルーで染色した。
【図２１】S.セレビシエ菌株1［pDB3237］からの組み換えトランスフェリン（S415A、T613A）及びS.セレビシエ菌株1［pDB3773］からの組み換えチオトランスフェリン（S415C）と比較した、S.セレビシエ菌株1［pDB3818］からの組み換えラクトフェリン（T139A、T480A、S625A）、S.セレビシエ菌株1［pDB3819］からの組み換えラクトフェリン（T139A、T480A、S625A）、及びS.セレビシエ株1［pDB3820］からの組み換えチオラクトフェリン（T139A、S421C、T480A、S625A）のSDS-PAGE分析を示す。10mL BMMD振盪フラスコに、100μLの冷凍保存酵母ストックを植菌し、そして30℃にて5日間インキュベートした。ゲル1は、GelCode（登録商標）Blue試薬（Pierce）を用いた非還元SDS-PAGE（4-12% NuPAGE（登録商標）、MOPSバッファー、invitrogen）により分析した、20μLの上清に該当する。図21の両ゲルにおいて、そのレーンは以下のサンプルに相当する：1＝10μLのSeeBlue Plus Markers（Invitrogen）、2＝20μLの菌株1［pDB3237］、3＝20μLの菌株1［pDB3773］、4＝20μLの菌株1［pDB3818］、5＝20μLの菌株1［pDB3818］、6＝20μLの菌株1［pDB3819］、7＝20μLの菌株1［pDB3819］、8＝20μLの菌株1［pDB3820］、及び9＝20μLの菌株1［pDB3820］。
【図２２】精製組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、精製チオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）、精製チオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）、精製チオトランスフェリン（S415C、T613A）、及び精製チオトランスフェリン（S4125A、N553C、T613A）と比較した、精製組み換えトランスフェリン（S415A、T613A）の分析的TBE-尿素ゲル分析を示す。サンプルを、以下の実施例に記載のプロトコールに従って調製した。5μgのサンプルを、6%のTBE尿素PAGE（Invitrogen）で分離し、クマシーG250（Pierce）で染色した。  レーン1〜2は菌株1［pDB3237］のサンプルを示し、レーン3は菌株1［pDB3767］を示し、レーン4は菌株1［pDB3779］を示し、レーン5は菌株1［pDB3758］を示し、レーン6は菌株1［pDB3773］を示し、そしてレーン7は菌株1［pDB3778］を示す。  レーン1は、組み換えトランスフェリン（S415A、T613A）突然変異体の鉄不含調製物を示し、レーン2は、組み換えトランスフェリン（S415A、T613A）突然変異体の鉄添加調製物を示し、レーン3は、組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）突然変異体の鉄添加調製物を示し、レーン3は、組み換えチオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）突然変異体の鉄添加調製物を示し、レーン3は、組み換えチオトランスフェリン（S415C、T613A）突然変異体の鉄添加調製物を示し、レーン3は、組み換えチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）突然変異体の鉄添加調製物を示す。
【図２３−１】ESI-TOF質量分析法を使用した、トランスフェリン（S415C、T613A）と比較した、チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、チオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）、チオトランスフェリン（S415A、T613A）、チオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）、及びチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体の分析からの逆畳み込み積分した（deconvolved）質量スペクトルを示す。スペクトルAは、YBX7［pDB3237］高細胞密度発酵から精製したトランスフェリン（S415A、T613A）の質量スペクトルを示す。ピークの同定A）天然分子（理論上の質量75098Da）、B）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75259Da）。スペクトルBは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製した、菌株1［pDB3767］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定C）天然分子（理論上の質量75114Da）、D）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75274Da）。スペクトルCは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製した、菌株1［pDB3779］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定E）天然分子（理論上の質量75130Da）、F）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75292Da）。スペクトルDは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製した、菌株1［pDB3773］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S415C、1613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定G）天然分子（理論上の質量75130Da）、H）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75292Da）。スペクトルEは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製した、菌株1［pDB3758］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定I）天然分子（理論上の質量75087Da）、J）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75249Da）。スペクトルFは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製した、菌株1［pDB3778］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定K）天然分子（理論上の質量75114Da）。
【図２３−２】ESI-TOF質量分析法を使用した、トランスフェリン（S415C、T613A）と比較した、チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、チオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）、チオトランスフェリン（S415A、T613A）、チオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）、及びチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体の分析からの逆畳み込み積分した（deconvolved）質量スペクトルを示す。スペクトルAは、YBX7［pDB3237］高細胞密度発酵から精製したトランスフェリン（S415A、T613A）の質量スペクトルを示す。ピークの同定A）天然分子（理論上の質量75098Da）、B）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75259Da）。スペクトルBは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製した、菌株1［pDB3767］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定C）天然分子（理論上の質量75114Da）、D）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75274Da）。スペクトルCは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製した、菌株1［pDB3779］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定E）天然分子（理論上の質量75130Da）、F）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75292Da）。スペクトルDは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製した、菌株1［pDB3773］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S415C、1613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定G）天然分子（理論上の質量75130Da）、H）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75292Da）。スペクトルEは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製した、菌株1［pDB3758］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定I）天然分子（理論上の質量75087Da）、J）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75249Da）。スペクトルFは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製した、菌株1［pDB3778］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定K）天然分子（理論上の質量75114Da）。
【図２３−３】ESI-TOF質量分析法を使用した、トランスフェリン（S415C、T613A）と比較した、チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、チオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）、チオトランスフェリン（S415A、T613A）、チオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）、及びチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体の分析からの逆畳み込み積分した（deconvolved）質量スペクトルを示す。スペクトルAは、YBX7［pDB3237］高細胞密度発酵から精製したトランスフェリン（S415A、T613A）の質量スペクトルを示す。ピークの同定A）天然分子（理論上の質量75098Da）、B）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75259Da）。スペクトルBは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製した、菌株1［pDB3767］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定C）天然分子（理論上の質量75114Da）、D）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75274Da）。スペクトルCは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製した、菌株1［pDB3779］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定E）天然分子（理論上の質量75130Da）、F）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75292Da）。スペクトルDは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製した、菌株1［pDB3773］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S415C、1613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定G）天然分子（理論上の質量75130Da）、H）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75292Da）。スペクトルEは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製した、菌株1［pDB3758］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定I）天然分子（理論上の質量75087Da）、J）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75249Da）。スペクトルFは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製した、菌株1［pDB3778］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定K）天然分子（理論上の質量75114Da）。
【図２４−１】ESI-TOF質量分析法を使用した、DTNBで処理したトランスフェリン（S415A、T613A）と比較した、DTNBで処理したチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、チオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）、チオトランスフェリン（S415C、T613A）、チオトランスフェリン（N553C、S415A、T613A）、及びチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体の分析からの逆畳み込み積分した質量スペクトルを示す。スペクトルAは、YBX7［pDB3237］の高細胞密度発酵から精製したトランスフェリン（S415A、T613A）の質量スペクトルを示す。ピークの同定A）天然分子（理論上の質量75098Da）、B）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75259Da）。スペクトルBは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製し、そしてDTNBで処理した、菌株1［pDB3767］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定C）天然分子＋NTB（理論上の質量75311Da）、D）天然分子＋1つのヘキソース＋NTB（理論上の質量75473Da）。スペクトルCは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製し、そしてDTNBで処理した、菌株1［pDB3779］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定E）天然分子＋NTB（理論上の質量75327Da）、F）天然分子＋1つのヘキソース＋NTB（理論上の質量75489Da）。スペクトルDは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製し、そしてDTNBで処理した、菌株1［pDB3773］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定G）天然分子＋NTB（理論上の質量75327Da）、H）天然分子＋1つのヘキソース＋NTB（理論上の質量75489Da）。スペクトルEは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製し、そしてDTNBで処理した、菌株1［pDB3758］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（N553C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定I）天然分子＋NTB（理論上の質量75284Da）、J）天然分子＋1つのヘキソース＋NTB（理論上の質量75446Da）。スペクトルFは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製し、そしてDTNBで処理した、菌株1［pDB3778］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定K）天然分子＋NTB（理論上の質量75311Da）。
【図２４−２】ESI-TOF質量分析法を使用した、DTNBで処理したトランスフェリン（S415A、T613A）と比較した、DTNBで処理したチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、チオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）、チオトランスフェリン（S415C、T613A）、チオトランスフェリン（N553C、S415A、T613A）、及びチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体の分析からの逆畳み込み積分した質量スペクトルを示す。スペクトルAは、YBX7［pDB3237］の高細胞密度発酵から精製したトランスフェリン（S415A、T613A）の質量スペクトルを示す。ピークの同定A）天然分子（理論上の質量75098Da）、B）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75259Da）。スペクトルBは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製し、そしてDTNBで処理した、菌株1［pDB3767］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定C）天然分子＋NTB（理論上の質量75311Da）、D）天然分子＋1つのヘキソース＋NTB（理論上の質量75473Da）。スペクトルCは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製し、そしてDTNBで処理した、菌株1［pDB3779］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定E）天然分子＋NTB（理論上の質量75327Da）、F）天然分子＋1つのヘキソース＋NTB（理論上の質量75489Da）。スペクトルDは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製し、そしてDTNBで処理した、菌株1［pDB3773］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定G）天然分子＋NTB（理論上の質量75327Da）、H）天然分子＋1つのヘキソース＋NTB（理論上の質量75489Da）。スペクトルEは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製し、そしてDTNBで処理した、菌株1［pDB3758］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（N553C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定I）天然分子＋NTB（理論上の質量75284Da）、J）天然分子＋1つのヘキソース＋NTB（理論上の質量75446Da）。スペクトルFは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製し、そしてDTNBで処理した、菌株1［pDB3778］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定K）天然分子＋NTB（理論上の質量75311Da）。
【図２４−３】ESI-TOF質量分析法を使用した、DTNBで処理したトランスフェリン（S415A、T613A）と比較した、DTNBで処理したチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、チオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）、チオトランスフェリン（S415C、T613A）、チオトランスフェリン（N553C、S415A、T613A）、及びチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体の分析からの逆畳み込み積分した質量スペクトルを示す。スペクトルAは、YBX7［pDB3237］の高細胞密度発酵から精製したトランスフェリン（S415A、T613A）の質量スペクトルを示す。ピークの同定A）天然分子（理論上の質量75098Da）、B）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75259Da）。スペクトルBは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製し、そしてDTNBで処理した、菌株1［pDB3767］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定C）天然分子＋NTB（理論上の質量75311Da）、D）天然分子＋1つのヘキソース＋NTB（理論上の質量75473Da）。スペクトルCは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製し、そしてDTNBで処理した、菌株1［pDB3779］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定E）天然分子＋NTB（理論上の質量75327Da）、F）天然分子＋1つのヘキソース＋NTB（理論上の質量75489Da）。スペクトルDは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製し、そしてDTNBで処理した、菌株1［pDB3773］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定G）天然分子＋NTB（理論上の質量75327Da）、H）天然分子＋1つのヘキソース＋NTB（理論上の質量75489Da）。スペクトルEは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製し、そしてDTNBで処理した、菌株1［pDB3758］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（N553C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定I）天然分子＋NTB（理論上の質量75284Da）、J）天然分子＋1つのヘキソース＋NTB（理論上の質量75446Da）。スペクトルFは、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製し、そしてDTNBで処理した、菌株1［pDB3778］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定K）天然分子＋NTB（理論上の質量75311Da）。
【図２５】セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼと結合させたチオトランスフェリン変異体と比較した、チオトランスフェリン変異体のSDS-PAGE分析を示す。最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製したタンパク質を、4倍モル過剰のEZ-Link Maleimide Activated Horseradish Peroxidase（Pierce）で処理した。ゲル1は、GelCode（登録商標）Blue試薬（Pierce）を用いた非還元SDS-PAGE（4-12% NuPAGE（登録商標）、MOPSバッファー、Invitrogen）により分析した、20μLのサンプルに該当する。ゲル2は、GelCode（登録商標）Blue試薬（Pierce）を用いた還元SDS-PAGE（4-12% NuPAGE（登録商標）、MOPSバッファー、Invitrogen）により分析した、20μLの上清に該当する。レーン1＝10μLのSeeBlue Plus Marker（Invitrogen）、2＝トランスフェリン（S415A、T613A）、3＝トランスフェリン（S415A、T613A）＋EZ-Link Maleimide Activated Horseradish Peroxidase、4＝チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、5＝チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）＋EZ-Link Maleimide Activated Horseradish Peroxidase、6＝チオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）、7＝チオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）＋EZ-Link Maleimide Activated Horseradish Peroxidase、8＝10μLのSeeBlue Plus Markers（Invitrogen）、9＝チオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）、10＝チオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）＋EZ-Link Maleimide Activated Horseradish Peroxidase、11＝チオトランスフェリン（S415C、T613A）、12＝チオトランスフェリン（S415C、T613A）＋EZ-Link Maleimide Activated Horseradish Peroxidase、13＝チオトランスフェリン（N553C、S415A、T613A）、14＝チオトランスフェリン（N553C、S415A、T613A）＋EZ-Link Maleimide Activated Horseradish Peroxidase。
【図２６】ESI-TOF質量分析法を使用した、フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）と比較した、チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）の分析からの逆畳み込み積分した質量スペクトルを示す。スペクトルAは、チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定A）天然分子（理論上の質量75114Da）、B）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75272Da）。スペクトルBは、フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定C）天然分子＋フルオレセイン（理論上の質量75541Da）、D）天然分子＋フルオレセイン＋1つのヘキソース（理論上の質量75701Da）。
【図２７】ESI-TOF質量分析法を使用した、フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）と比較した、チオトランスフェリン（S415C、T613A）の分析からの逆畳み込み積分した質量スペクトルを示す。スペクトルAは、チオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定A）天然分子（理論上の質量75130Da）、B）天然分子＋1つのヘキソース（理論上の質量75292Da）。スペクトルBは、フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定C）天然分子＋フルオレセイン（理論上の質量75553Da）、D）天然分子＋フルオレセイン＋1つのヘキソース（理論上の質量75716Da）。
【図２８】ESI-TOF質量分析法を使用した、DTNBで処理したフルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）と比較した、DTNBで処理したチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）の分析からの逆畳み込み積分した質量スペクトルを示す。スペクトルAは、DTNBで処理されたチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定A）天然分子＋NTB（理論上の質量75311Da）、B）天然分子＋1つのヘキソース＋NTB（理論上の質量75473Da）。スペクトルBは、DTNBで処理したフルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定C）天然分子＋フルオレセイン（理論上の質量75541Da）、D）天然分子＋フルオレセイン＋1つのヘキソース（理論上の質量75701Da）。
【図２９】ESI-TOF質量分析法を使用した、DTNBで処理したフルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）と比較した、DTNBで処理したチオトランスフェリン（S415C、T613A）の分析からの逆畳み込み積分した質量スペクトルを示す。スペクトルAは、DTNBで処理したチオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定A）天然分子＋NTB（理論上の質量75327Da）、B）天然分子＋1つのヘキソース＋NTB（理論上の質量75489Da）。スペクトルBは、DTNBで処理したフルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。ピークの同定C）天然分子＋フルオレセイン（理論上の質量75553Da）、D）天然分子＋フルオレセイン＋1つのヘキソース（理論上の質量75716Da）。
【実施例】
【０１６５】
材料と方法
特に明記しない限り、以下の実施例で使用される化学物質は商品から提供される。
【０１６６】
尿素ゲル電気泳動
尿素ゲル電気泳動を、市販のミニゲル（6%の均一のTBE尿素、Invitrogen）を用いて、Makey及びSeal（Monthony et al, 1978, Clin. Chem., 24, 1825-1827; Harris & Aisen, 1989, Physical biochemistry of the transferrins, VCH; Makey & Seal, 1976, Biochim. Biophys. Acta., 453, 250-256; Evans & Williams, 1980, Biochem. J., 189, 541-546）の手順を改良したものを使用して実施する。約10μgのタンパク質を含んでいるサンプルを、TBE尿素サンプル・バッファー（Invitrogen）中に1：1に希釈し、180Vにて550〜600Vhの間分離し、そしてGelCode（登録商標）Blue試薬（Pierce）で染色する。アポ‐トランスフェリンを、0.1Mのクエン酸、0.1Mの酢酸、10mMのEDTA、pH4.5に対する透析によって調製する。溶液を、濾過（0.22μm）し、Vivaspin polyethersulphone 10,000 NMWCO遠心濃縮器を使用して10mg/mlに濃縮し、そして10倍量の水、続いて10倍量の0.1MのHEPES、0.1MのNaHCO3 pH8.0に対してダイアフィルター処理する。サンプルを、すすぎを用いて濃縮器から回収し、そして5mg/mlの終濃度に調整する。電気泳動法の前に、再構成されたホロ‐トランスフェリンを、この溶液からの50μlのアリコートへの10μlの1mM FeNTA（ニトリロ三酢酸二ナトリウム中、塩化鉄の等モル溶液として新たに調製される）の添加と、それに続く、鉄結合の完了のためのCO2溶解を許可するための10分間の静置によって調製する。この技術は、異なった鉄負荷を有する4つの分子形態、すなわち（高い移動度の順に）アポ‐トランスフェリン、CローブとNローブが結合した一鉄（monoferric）トランスフェリン、及びホロ‐トランスフェリン、に分離する。トランスフェリンの4つの形態の分離は4〜6Mの尿素中での部分的な変性に起因すると考えられる；ここで、いずれかのローブにおける鉄結合が、変性に対する抵抗性の増大をもたらす立体構造の変化を引き起こす。よってローブ内の鉄の存在が、より高い電気泳動移動度を有するよりコンパクトな構造をもたらす。NローブはCローブより少ないジスルフィド結合しか持たないので（それぞれ8個対11個）、Nローブ、鉄の不存在下でさらに折り畳まれず、Cローブへの鉄結合を伴った一鉄形態を最低の移動度にする。
【０１６７】
遊離チオール・アッセイ
タンパク質上の遊離チオールの数を、エルマン試薬を使用することで分光光度測定により測定する。エルマン試薬（5’5’-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB））は、チオール基と反応して、タンパク質の混合ジスルフィドと、（タンパク質のスルフィジル（sulphidyl）基の1molあたり）1molの2-ニトロ-5-チオ-ベンゾアート（NTB）を形成する芳香族ジスルフィドである。NTBの形成は412nmにおける吸光度を測定することによって観察できる。モル吸光係数は、13,600M-1cm-1である。
【０１６８】
エルマン試薬を使用した遊離チオール・アッセイは、タンパク質の遊離チオール基の数を測定するのに使用できる。遊離チオール基の数を測定するために、サンプル・タンパク質を、1mlの終量として7.4mMのリン酸バッファーpH7.4中、既知濃度（例えば、10mg/mL）に希釈した。前記タンパク質溶液（600mL）を、37mMのリン酸バッファー（pH8.3）中、新たに調製した5,5’-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB）で処理した。EDTAの存在下、室温にて45分間後に、前記溶液の吸光度を、試薬ブランクに対して412nmにて計測し、そしてE 412＝13600M-1cm-1を使用することで反応したスルフヒドリルの数を計算した。
【０１６９】
微生物
以下の実施例で使用した宿主菌株を、S. M. Kerry-Williams et al. (1998) Yeast 14:161-169で開示されたDXY1のhsp150-欠損バージョンである菌株1と同定した。WO 95/33833は、hsp150-欠損酵母を調製する方法を当業者に教示している。
【０１７０】
実施例1：トランスフェリン突然変異タンパク質発現プラスミドの構築
本願発明のトランスフェリン変異体の発現プラスミドは、Tf変異体S415A、T613Aに関する以下の説明と同じように構築できる。
トランスフェリン突然変異タンパク質を、部位特異的突然変異誘発によってpDB3237（図2）と呼ばれるプラスミドの修飾によって作製する。（StratageneのQuikchange Kitなどの）市販キットに示された手順を用いることでシステイン残基（TGT若しくはTGC）をコードするいずれかのDNA配列へと、選択された（単数若しくは複数の）残基のコドンを修飾するために、重複変異原性オリゴヌクレオチド配列を使用するだろう。
【０１７１】
トランスフェリン（S415A、T613A）発現プラスミド、pDB3237の構築
S.セレビシエにおける発現に最適化されたコドンである、ヒト・トランスフェリン（S415A、T613A）に作動できるように連結されたインベルターゼ・リーダー配列をコードする合成DNAを作製するために、重複オリゴヌクレオチド・プライマーを使用した。
【０１７２】
配列番号2は、それぞれアスパラギン413及びアスパラギン611におけるN-結合型グリコシル化を防ぐためにセリン415とトレオニン613においてアラニン・コドンへと修飾された成熟ヒト・トランスフェリンC1変異体タンパク質配列に基づくDNA配列である。前記配列は、クローニングを容易にするために、SphI及びAflII制限エンドヌクレアーゼ部位が側面に配置されている。配列番号2は、アスパラギン413及びアスパラギン611部位におけるN-結合型グリコシル化を防ぐためにセリン415位トレオニン613においてアラニン・コドンへと修飾された成熟ヒト・トランスフェリンC1変異タンパク質をコードする配列（ヌクレオチド124〜2160）；2つの翻訳終止コドン（ヌクレオチド2161〜2166）；インベルターゼ・リーダ（シグナル）タンパク質をコードする配列（ヌクレオチド67〜123）；3’UTR及びSphIクローニング部位までのADH1遺伝子ターミネータの一部（ヌクレオチド2167-2359）；5’UTR及びAflIIクローニング部位までのPRB1遺伝子プロモーターの一部（ヌクレオチド1〜66）を含んでなる。
【０１７３】
インベルターゼ・リーダ（シグナル）タンパク質をコードする配列（ヌクレオチド67〜123）は、シグナル・ペプチドMLLQAFLFLLAGFAAKISA（配列番号3の−1〜−19）をコードする。配列番号3の1〜679は、アスパラギン413及びアスパラギン611におけるN-結合型グリコシル化を防ぐためにセリン415及びトレオニン613においてアラニン・コドンへと修飾された成熟ヒト・トランスフェリンC1変異タンパク質をコードする配列を含んでなる。
【０１７４】
ヒト・トランスフェリン（S415A、T613A）（配列番号2）に作動できるように連結されたインベルターゼ・リーダー配列をコードする合成DNA配列を、SphIとAflIIを用いて完全に消化して、2.357kbの断片を作製した。WO 00/44772に記載のプラスミドpDB2241（4.383kb）を、制限エンドヌクレアーゼSphIとAflIIを使用して完全に消化して、4.113kbの断片を作製し、続いて、仔ウシ腸由来アルカリ・ホスファターゼを使用してそれを脱リン酸した。2.537kbのインベルターゼ・リーダ・ヒト・トランスフェリン配列（S415A、T613A）DNA断片を、pDB2241由来の4.113kbのSphI／AflII断片に連結して、プラスミドpDB3191（図3）を作製した。プラスミドpDB3191を、NotI制限エンドヌクレアーゼを用いて完全に消化して、3.259kbのインベルターゼ・リーダー配列ヒト・トランスフェリン（S415A、T613A）発現カセットを切り離す。
【０１７５】
プラスミドpDB2690の構築は、WO/2005061719 A1に記載されている。プラスミドpDB2690（13.018kb）を、制限エンドヌクレアーゼNotIを用いて完全に消化し、そして仔ウシ腸由来アルカリ・ホスファターゼを使用して脱リン酸し、そして3.259kbのNotIトランスフェリン（S415A、T613A）発現カセットと連結させて、（LEU2遺伝子に対して逆方向にトランスフェリン（S415A、T613A）発現カセットを持つ16.306kbのpDB3237（図2）を作製した。
【０１７６】
チオトランスフェリン突然変異体発現プラスミドの構築
あるいは、本願発明のチオトランスフェリン変異体の発現プラスミドは、pDB2690内へのNotIトランスフェリン変異体発現カセットのサブクローニングの前に、プラスミドpDB3191（図3）内に合成したDNA断片をサブクローニングすることによって作製できる。
【０１７７】
pDB3191（図3）のトランスフェリンDNA配列は、独特なAflII、XcmI、NcoI、及びAccI制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいる。提案された突然変異の位置を、pDB3191のトランスフェリン発現カセット配列上にマッピングした（図10）。配列番号4、5、6、及び7は、アスパラギン413部位におけるN-結合型グリコシル化を防ぐためにセリン415においてアラニン・コドンへと修飾された成熟ヒト・トランスフェリンC1変異体タンパク質配列の一部に基づくDNA配列である。前記配列は、クローニングを容易にするためにAflII及びXcmI制限エンドヌクレアーゼ部位が側面に配置されている。AflIIとXcmI制限部位の間のDNA配列の修飾によって、14種類のチオトランスフェリン変異体を作製した（表2）。配列番号4は、XcmIクローニング部位までの、アスパラギン413部位におけるN-結合型グリコシル化を防ぐためにセリン415においてアラニンへと修飾された成熟ヒト・トランスフェリンC1変異タンパク質をコードする配列の一部（ヌクレオチド124〜1487）；インベルターゼ・リーダ（シグナル）タンパク質をコードする配列（ヌクレオチド67〜123）及びAflIIクローニング部位までのPRB1遺伝子プロモーターの一部（ヌクレオチド1〜66）を含んでなる。トランスフェリン・タンパク質コード配列が選択されたコドンにおいてシステイン・コドンへと修飾されている、11種類の配列番号4の変異体を合成した。
【０１７８】
チオトランスフェリン変異体（V1C）において、そのトランスフェリン・タンパク質コード配列は、第1位にてバリン・コドンがシステイン・コドン（TGT）に置換されるように修飾されている。
チオトランスフェリン変異体（S28C）において、そのトランスフェリン・タンパク質コード配列は、第28位にてセリン・コドンがシステイン・コドン（TGT）に置換されるように修飾されている。
チオトランスフェリン変異体（S32C）において、そのトランスフェリン・タンパク質コード配列は、第32位にてセリン・コドンがシステイン・コドン（TGT）に置換されるように修飾されている。
【０１７９】
チオトランスフェリン変異体（D104C）において、そのトランスフェリン・タンパク質コード配列は、第104位にてアスパラギン酸コドンがシステイン・コドン（TGT）に置換されるように修飾されている。
チオトランスフェリン変異体（T165C）において、そのトランスフェリン・タンパク質コード配列は、第165位にてトレオニン・コドンがシステイン・コドン（TGT）に置換されるように修飾されている。
チオトランスフェリン変異体（P175C）において、そのトランスフェリン・タンパク質コード配列は、第175位にてプロリン・コドンがシステイン・コドン（TGT）に置換されるように修飾されている。
【０１８０】
チオトランスフェリン変異体（A215C）において、そのトランスフェリン・タンパク質コード配列は、第215位にてアラニン・コドンがシステイン・コドン（TGT）に置換されるように修飾されている。
チオトランスフェリン変異体（P288C）において、そのトランスフェリン・タンパク質コード配列は、第288位にてプロリン・コドンがシステイン・コドン（TGT）に置換されるように修飾されている。
チオトランスフェリン変異体（T336C）において、そのトランスフェリン・タンパク質コード配列は、第336位にてトレオニン・コドンがシステイン・コドン（TGT）に置換されるように修飾されている。
【０１８１】
チオトランスフェリン変異体（S415C）において、そのトランスフェリン・タンパク質コード配列は、第415位にてセリン・コドンがシステイン・コドン（TGT）に置換されるように修飾されている。
チオトランスフェリン変異体（D416C）において、そのトランスフェリン・タンパク質コード配列は、第416位にてアスパラギン酸コドンがシステイン・コドン（TGT）に置換されるように修飾されている。
【０１８２】
配列番号5は、XcmIクローニング部位までの、アスパラギン413の部位におけるN結合型グリコシル化を防ぐためにセリン415においてアラニンへと修飾され、且つ、システイン179部位に不対システインを作り出すためにシステイン171においてアラニン・コドンへと修飾された成熟ヒト・トランスフェリンC1変異タンパク質をコードする配列の一部（ヌクレオチド124〜1487）；インベルターゼ・リーダ（シグナル）タンパク質コード配列（ヌクレオチド67〜123）及びAflIIクローニング部位までのPRB1遺伝子プロモーターの一部（ヌクレオチド1〜66）を含んでなる。
【０１８３】
適切な配列番号4変異体又は配列番号5DNA配列を、AflII及びXcmIで完全に消化して、1.479kbのDNA断片を作製した。プラスミドpDB3191（6.47kb）を、制限エンドヌクレアーゼAflII及びXcmIを使用して完全に消化して、4.991kbの断片を作製し、続いてエビ由来アルカリ・ホスファターゼを使用してそれを脱リン酸した。適切な1.479kbのチオトランスフェリン変異体DNA断片を、pDB3191由来の4.991kbのAflII／XcmI断片内にサブクローニングして、プラスミドpDB3714、pDB3715、pDB3752、pDB3716、pDB3717、pDB3754、pDB3740、pDB3741、pDB3742、pDB3755、pDB3744、又はpDB3756（表2）を作製した。
【０１８４】
配列番号6は、（アミノ酸鎖長が短縮されるように）セリン415及びアスパラギン酸416コドンのシステイン・コドンへの置換によって修飾された成熟ヒト・トランスフェリンC1変異体タンパク質配列に基づくDNA配列である。前記配列は、クローニングを容易にするために、AflII及びXcmI制限エンドヌクレアーゼ部位が側面に配置されている。配列番号6は、XcmIクローニング部位までの、（アミノ酸鎖長が短縮される）2つの残基、セリン415及びアスパラギン酸416、のシステイン・コドンへの置換によって修飾された成熟ヒト・トランスフェリンC1変異タンパク質をコードする配列の一部（ヌクレオチド124〜1484）；インベルターゼ・リーダ（シグナル）タンパク質をコードする配列（ヌクレオチド67〜123）及びAflIIクローニング部位までのPRB1遺伝子プロモーターの一部（ヌクレオチド1〜66）を含んでなる
【０１８５】
【表５】
2010535484.tif 000017
【０１８６】
配列番号6のDNA配列を、AflII及びXcmIで完全に消化して、1.476kbの断片を作製した。プラスミドpDB3191（6.47kb）を、制限エンドヌクレアーゼAflII及びXcmIを使用して完全に消化して、4.991kbの断片を作製し、続いてエビ・アルカリ・ホスファターゼを使用してそれを脱リン酸した。1.476kbのチオトランスフェリン変異体（欠失416C）DNA断片を、pDB3191由来の4.991kbのAflII／XcmI断片内にサブクローニングして、6.467kbのプラスミドpDB3743（表2）を作製した。
【０１８７】
配列番号7は、アスパラギン413部位におけるN-結合型グリコシル化を防ぐためにセリン415においてアラニン・コドンへと修飾され、且つ、（アミノ鎖長が延長されるように）システイン・コドンがアスパラギン酸416残基のN末端側に挿入されるように修飾された成熟ヒト・トランスフェリンC1変異体タンパク質配列に基づくDNA配列である。前記配列は、クローニングを容易にするために、AflII及びXcmI制限エンドヌクレアーゼ部位が側面に配置されている。配列番号7は、XcmIクローニング部位までの、アスパラギン413におけるN-結合型グリコシル化を防ぐためにセリン415においてアラニン残基へと修飾され、且つ、システイン・コドンがアスパラギン酸416のN末端側に挿入されるアスパラギン酸416において修飾された成熟ヒト・トランスフェリンC1変異タンパク質をコードする配列の一部（ヌクレオチド124〜1490）；インベルターゼ・リーダ（シグナル）タンパク質をコードする配列（ヌクレオチド67〜123）及びAflIIクローニング部位までのPRB1遺伝子プロモーターの一部（ヌクレオチド1〜66）を含んでなる。
【０１８８】
配列番号7のDNA配列を、AflII及びXcmIで完全に消化して、1.482kbの断片を作製した。プラスミドpDB3191（6.47kb）を、制限エンドヌクレアーゼのAfftlとXcmIを使用して完全に消化して、4.991kbの断片を作製し、それに続いてエビ・アルカリ・ホスファターゼを使用してそれを脱リン酸した。1.482kbのチオトランスフェリン変異体（挿入415C416）DNA断片を、pDB3191由来の4.991kbのAflII／XcmI断片内にサブクローニングして、6.473kbのプラスミドpDB3712（表2）を作製した。
【０１８９】
配列番号8は、成熟ヒト・トランスフェリンC1変異体タンパク質配列の一部に基づくDNA配列である。前記配列は、クローニングを容易にするために、XcmI及びNcoI制限エンドヌクレアーゼ部位が側面に配置されている。配列番号8は、セリン501においてシステイン・コドン（TGT）へと修飾された成熟ヒト・トランスフェリンC1変異タンパク質をコードする配列の一部（ヌクレオチド1〜301）を含んでなる。
【０１９０】
配列番号8のDNA配列を、XcmI及びNcoIで完全に消化して、0.288kbの断片を作製した。プラスミドpDB3191（6.47kb）を、制限エンドヌクレアーゼXcmI及びNcoIを使用して完全に消化して、6.182kbの断片を作製し、続いてエビ・アルカリ・ホスファターゼを使用してそれを脱リン酸した。0.288kbのチオトランスフェリン（S415A、S501C、T613A）変異体DNA断片を、pDB3191由来の6.182kbのXcmI／NcoI断片内にサブクローニングして、6.47kbのプラスミドpDB3713（表2）を作製した。
【０１９１】
配列番号9のDNA配列は、アスパラギン611部位におけるN-結合型グリコシル化を防ぐためにトレオニン613においてアラニン・コドンへと修飾された成熟ヒト・トランスフェリンC1変異体タンパク質配列の一部に基づいている。前記配列は、クローニングを容易にするために、NcoI及びAccI制限エンドヌクレアーゼ部位が側面に配置されている。
4種類のチオトランスフェリン変異体を、NcoIとAccI制限部位の間のDNA配列の修飾によって作製した。
【０１９２】
配列番号9は、NcoIクローニング部位からの、アスパラギン611部位におけるN-結合型グリコシル化を防ぐためにトレオニン613においてアラニン・コドンへと修飾された成熟ヒト・トランスフェリンC1変異タンパク質をコードする配列の一部（ヌクレオチド1〜393）；2つの翻訳終止コドン（ヌクレオチド394-399）；3’UTRとAccIクローニング部位までのADH1遺伝子ターミネータの一部（ヌクレオチド1〜462）を含んでなる。
【０１９３】
トランスフェリン・タンパク質をコードする配列が、選択された残基においてシステイン・コドン（TGT）へと修飾されている、4種類の配列番号9の変異体を合成した。
チオトランスフェリン変異体（N553C）において、そのアミノ酸配列は、第553位にてアスパラギン・コドンがシステイン・コドン（TGT）に置換されるように修飾されている。
チオトランスフェリン変異体（N611C）において、そのアミノ酸配列は、第611位にてアスパラギン・コドンがシステイン・コドン（TGT）に置換されるように修飾されている。
【０１９４】
チオトランスフェリン変異体（T613C）において、そのアミノ酸配列は、第613位にてトレオニン・コドンがシステイン・コドン（TGT）に置換されるように修飾されている。
チオトランスフェリン変異体（D643C）において、そのアミノ酸配列は、第643位にてアスパラギン酸コドンがシステイン・コドン（TGT）に置換されるように修飾されている。
【０１９５】
適切な配列番号9のチオトランスフェリン変異体DNA配列を、NcoI及びAccIで完全に消化して、0.457kbのDNA断片を作製した。プラスミドpDB3191（6.47kb）を、制限エンドヌクレアーゼNcoI及びAccIを使用して完全に消化して、6.013kbの断片を作製し、続いてエビ・アルカリ・ホスファターゼを使用してそれを脱リン酸した。適切な0.457kbのチオトランスフェリン変異体DNA断片を、pDB3191由来の6.013kbのNcoI／AccI断片内にサブクローニングして、6.47kbのプラスミドpDB3748、pDB3749、PDB3750、pDB3751（表2）を作製した。
【０１９６】
適切なチオトランスフェリン変異体サブクローニング・プラスミドpDB3714、pDB3715、pDB3752、pDB3716、pDB3717、pDB3754、pDB3740、pDB3741、pDB3742、pDB3755、pDB3744、pDB3756、pDB3713、pDB3748、pDB3749、pDB3750、又はpDB3751を、NotI制限エンドヌクレアーゼによって完全に消化して、適切な3.259kbのチオトランスフェリン変異体発現カセットを取り出した。
【０１９７】
プラスミドpDB2690の構築をWO/2005061719 A1に記載した。プラスミドpDB2690（13.018kb）を、制限エンドヌクレアーゼNotIで完全に消化し、エビ・アルカリ・ホスファターゼを使用して脱リン酸し、そして3.259kbのNotIチオトランスフェリン変異体発現カセットと連結して、16.306kbのプラスミドである、LEU2遺伝子に対して同方向にチオトランスフェリン変異体発現カセットを持っているpDB3778、pDB3770、pDB3779、pDB3757、pDB3761、pDB3773、pDB3763、pDB3771、pDB3775、pDB3777、又はLEU2遺伝子に対して逆方向にチオトランスフェリン変異体発現カセットを持っているpDB3766、pDB3767、pDB3769、pDB3789、pDB3758、pDB3765、pDB3759を作製した。これらの実施例は、本願発明の一部として、前記発現カセットが発現ベクター内にいずれの方向でクローニングされてもよいことを示唆している。
【０１９８】
システイン・コドンの挿入によって遊離チオールが導入される（アミノ鎖長が延長される）一例を説明する。プラスミドpDB3712を、制限エンドヌクレアーゼNotIで完全に消化して、3.262kbのチオトランスフェリン（挿入415C416）変異体発現カセットを取り出した。プラスミドpDB2690（13.018kb）を、制限エンドヌクレアーゼNotIで完全に消化し、エビ・アルカリ・ホスファターゼを使用して脱リン酸し、そして3.262kbのNotIチオトランスフェリン変異体発現カセットと連結して、LEU2遺伝子に対して同方向にチオトランスフェリン変異体発現カセットを持っている16.309kbのプラスミドpDB3745を作製した。
【０１９９】
1つのシステイン・コドンを2つのコドンで置換することによって遊離チオールが導入される（アミノ鎖長は短縮される）一例を説明する。プラスミドpDB3743を、制限エンドヌクレアーゼNotIで完全に消化して、3.256kbのチオトランスフェリン（欠失416C）変異体発現カセットを取り出した。プラスミドpDB2690（13,018kb）を、制限エンドヌクレアーゼNotIで完全に消化し、エビ・アルカリ・ホスファターゼを使用して脱リン酸し、そして3.256kbのNotIトランスフェリン変異体発現カセットと連結して、LEU2遺伝子に対して同方向でトランスフェリン変異体発現カセットを持っている16.303kbのプラスミドpDB3760を作製した。
【０２００】
チオトランスフェリン（S28C、S415C）突然変異体発現プラスミドの構築
セリン28コドンのシステイン・コドンへの、及びセリン415コドンのシステイン・コドンへの置換によって2つの遊離チオール基が導入される一例を説明する。
【０２０１】
配列番号10は、アスパラギン611部位におけるN-結合型グリコシル化を防ぐためにトレオニン613においてアラニン・コドンへと修飾され、アスパラギン413部位におけるN-結合型グリコシル化を防ぐためにセリン415においてシステイン・コドン（TGT）へと修飾され、及び1つを超える（2つの）遊離チオール基が作り出されるようにセリン28においてシステイン・コドン（TGT）へと修飾された成熟ヒト・トランスフェリンC1変異タンパク質をコードする配列（ヌクレオチド124〜2160）；2つの翻訳終止コドン（ヌクレオチド2161〜2166）；インベルターゼ・リーダ（シグナル）タンパク質をコードする配列（ヌクレオチド67〜123）；3’UTRとSphIクローニング部位までのADH1遺伝子ターミネータの一部（ヌクレオチド2167〜2359）；5’UTRとAflIIクローニング部位までのPRB1遺伝子プロモーターの一部（ヌクレオチド1〜66）に基づくDNA配列である。
【０２０２】
発現プラスミドは、pDB3744の1.737kbのBsaBI DNA断片上に存在するS415C、T613A突然変異体をプラスミドpDB3715内にサブクローニングすることによって構築された。プラスミドpDB3744を、制限エンドヌクレアーゼBsaBIで完全に消化して、1.737kbのチオトランスフェリン（S415C）変異体発現カセットの一部を取り出した。プラスミドpDB3715を、制限エンドヌクレアーゼBsaBIで完全に消化して、4.733kbの断片をゲル抽出によって回収し、そしてエビ・アルカリ・ホスファターゼを使用して脱リン酸した。プラスミドpDB3715からの4.733kbの断片を、プラスミドpDB3744からの1.737kbのBsaBIチオトランスフェリン変異体断片と連結して、6.470kbのプラスミドpDB3806（図11）を作製した。チオトランスフェリン（S28C、S415C、T613A）変異体サブクローニング・プラスミドpDB3806を、NotI制限エンドヌクレアーゼで完全に消化して、3.259kbのチオトランスフェリン（S28C、S415C、T613A）変異体発現カセットを取り出した。プラスミドpDB2690（13.018kb）を、制限エンドヌクレアーゼNotIで完全に消化し、エビ・アルカリ・ホスファターゼを使用して脱リン酸し、そして3.259kbのNotIチオトランスフェリン（S28C、S415C、T613A）変異体発現カセットと連結して、LEU2遺伝子に対して逆方向にチオトランスフェリン（S28C、S415C、T613A）変異体発現カセットを持っている16.306kbのプラスミドpDB3809（図12）を製造した。
【０２０３】
S.セレビシエ菌株（菌株1）を、トランスフェリン発現プラスミドpDB3237及びチオトランスフェリン発現プラスミドpDB3766、pDB3767、PDB3778、pDB3769、pDB3789、pDB3770、pDB3771、pDB3779、pDB3757、pDB3761、pDB3773、pDB3763、pDB3760、pDB3745、pDB3775、pDB3758、pDB3777、pDB3765、pDB3809を用いてロイシン原栄養性に形質転換した。酵母を、改良された酢酸リチウム法（Sigma yeast transformation kit, YEAST-1, protocol 2; Ito et al, 1983, J. BacterioL, 153, 16; Elble, 1992, Biotechniques, 13, 18）を使用して形質転換した。形質転換体を、BMMD-寒天平板上で選択し、続いてBMMD-寒天平板上でパッチアウトした。BMMDの組成は、Sleep et al., 2002, Yeast, 18,403によって記載されている。冷凍保存ストックを、10mLのBMMD振盪フラスコ培養（24時間、30℃、200rpm）から20%（w/v）のトレハロース中で調製した。
【０２０４】
ラクトフェリン突然変異タンパク質発現プラスミドの構築
トランスフェリンは、これに限定されるものではないが、ヒト血清トランスフェリン（HST）、ラクトフェリン、メラノトランスフェリン、及びオボトランスフェリンが挙げられる、高い配列相同性を有するタンパク質群を形成する。
【０２０５】
S.セレビシエにおける発現のために最適化されたコドンであってもよく、そうでなくてもよい、ヒト・ラクトフェリン（T139A、T480A、S625A）に作動できるように連結されたインベルターゼ・リーダー配列をコードする合成のDNAを作製するために、重複オリゴヌクレオチド・プライマーを使用した。配列番号11は、アスパラギン137、アスパラギン478、及びアスパラギン623部位のそれぞれにおけるN-結合型グリコシル化を防ぐためにトレオニン139、トレオニン480、及びセリン625においてアラニン・コドンへと修飾された成熟ヒト・ラクトフェリン変異体タンパク質配列（受入番号NP 002334）に基づいている。
【０２０６】
配列番号12は、アスパラギン137、アスパラギン478、及びアスパラギン623部位のそれぞれにおけるN-結合型グリコシル化を防ぐためにトレオニン139、トレオニン480、及びセリン625においてアラニン・コドンへと修飾されたヒト・ラクトフェリン（T139A、T480A、S625A）変異タンパク質をコードするヒト天然DNA配列（受入番号NM 002343）に作動できるように連結されたインベルターゼ・リーダ・タンパク質配列をコードするS.セレビシエの天然DNA配列（ヌクレオチド124〜2196）；2つの翻訳終止コドン（ヌクレオチド2197〜2202）；天然のS.セレビシエ・インベルターゼ・リーダ（シグナル）タンパク質をコードする配列（ヌクレオチド67〜123）；3’UTRとSphIクローニング部位までのADH1遺伝子ターミネータの一部（ヌクレオチド2203〜2395）；5’UTRとAflIIクローニング部位までのPRB1遺伝子プロモーターの一部（ヌクレオチド1〜66）である。前記配列は、クローニングを容易にするために、SphI及びAflII制限エンドヌクレアーゼ部位が側面に配置されている。
【０２０７】
配列番号13は、アスパラギン137、アスパラギン478とアスパラギン623部位のそれぞれにおけるN-結合型グリコシル化を防ぐために、トレオニン139、トレオニン480、及びセリン625においてアラニン・コドンへと修飾された成熟ヒト・ラクトフェリン（T139A、T480A、S625A）変異タンパク質配列をコードするDNA配列に作動できるように連結された、S.セレビシエにおける発現に最適化したインベルターゼ・リーダー・タンパク質配列コドンであって、S.セレビシエにおける発現に最適化したコドン（ヌクレオチド124〜2196）；2つの翻訳終止コドン（ヌクレオチド2197〜2202）；S.セレビシエにおける発現に最適化されたインベルターゼ・リーダ（シグナル）タンパク質をコードする配列コドン（ヌクレオチド67〜123）；3’UTRとSphIクローニング部位までのADH1遺伝子ターミネータの一部（ヌクレオチド2203〜2395）；5’UTRとAflIIクローニング部位までのPRB1遺伝子プロモーターの一部（ヌクレオチド1〜66）をコードするDNA配列である。前記配列は、クローニングを容易にするために、SphI及びAflII制限エンドヌクレアーゼ部位が側面に配置されている。
【０２０８】
ヒト・トランスフェリン・タンパク質とヒト・ラクトフェリン・タンパク質の配列配列比較を、遊離チオール基が作り出されるようなシステイン残基への修飾に好適なラクトフェリン・タンパク質配列中のアミノ酸残基を特定するために使用した。表2に記載のシステイン残基への修飾のために選択されたヒト・トランスフェリン・タンパク質配列のアミノ酸残基を、ヒト・トランスフェリンとヒト・ラクトフェリン・タンパク質配列の配列比較上にマッピングした。トランスフェリン・タンパク質配列上の第415位のセリン残基に相当するラクトフェリン・タンパク質配列上の第421位のセリン残基、要するにセリン421をシステイン残基の修飾のために選択した。
【０２０９】
配列番号14は、アスパラギン137、アスパラギン478、及びアスパラギン623部位のそれぞれにおけるN-結合型グリコシル化を防ぐためにトレオニン139、トレオニン480、及びセリン625においてアラニン・コドンへと修飾され、且つ、セリン421においてシステイン・コドン（TGT）へと修飾された成熟ヒト・ラクトフェリン（T139A、S421C、T480A、S625A）変異タンパク質をコードする配列をコードするDNA配列に作動できるように連結されたS.セレビシエにおける発現のために最適化したインベルターゼ・リーダー・タンパク質配列コドンであって、S.セレビシエにおける発現のために最適化したコドン（ヌクレオチド124〜2196）；2つの翻訳終止コドン（ヌクレオチド2197〜2202）；S.セレビシエにおける発現のために最適化したインベルターゼ・リーダ（シグナル）タンパク質をコードする配列コドン（ヌクレオチド67〜123）；3’UTRとSphIクローニング部位までのADH1遺伝子ターミネータの一部（ヌクレオチド2203〜2395）；5’UTRとAflIIクローニング部位までのPRB1遺伝子プロモーターの一部（ヌクレオチド1〜66）をコードするDNA配列である。前記配列は、クローニングを容易にするために、SphI及びAflII制限エンドヌクレアーゼ部位が側面に配置されている。
【０２１０】
ヒト・ラクトフェリン（T139A、T480A、S625A）に作動できるように連結されたインベルターゼ・リーダー配列をコードする合成DNA配列（配列番号12）を、SphI及びAflIIで完全に消化して、2.393kbの断片を作製した。プラスミドpDB3191（6.470kb）（図3）を、制限エンドヌクレアーゼSph及びAflIIを使用して完全に消化して、4.113kbの断片を作製し、続いてエビ腸由来アルカリ・ホスファターゼを使用してそれを脱リン酸した。2.393kbのインベルターゼ・リーダー配列‐ヒト・ラクトフェリン（T139A、T480A、S625A）DNA断片を、pDB3191由来の4.113kbのSphI／AflII断片に連結して、プラスミドpDB3815（図13）を作製した。
【０２１１】
ヒト・ラクトフェリン（T139A、T480A、S625A）に作動できるように連結されたインベルターゼ・リーダー配列をコードする、S.セレビシエにおける発現のために最適化された合成DNA配列コドン（配列番号13）を、SphI及びAflIIで完全に消化して、2.393kbの断片を作製した。プラスミドpDB3191（6.470kb）（図3）を、制限エンドヌクレアーゼSphI及びAflIIを使用して完全に消化して、4.113kbの断片を作製し、続いてエビ腸由来のアルカリ・ホスファターゼを使用してそれを脱リン酸した。2.393kbのインベルターゼ・リーダー配列‐ヒト・ラクトフェリン（T139A、T480A、S625A）DNA断片を、pDB3191由来の4.113kbのSphI／AflII断片内に連結して、プラスミドpDB3816（図13）を作製した。
【０２１２】
ヒト・ラクトフェリン（T139A、S421C、T480A、S625A）に作動できるように連結されたインベルターゼ・リーダー配列をコードする、S.セレビシエにおける発現のために最適化した合成DNA配列コドン（配列番号14）を、SphI及びAflIIで完全に消化して、2.393kbの断片を作製した。プラスミドpDB3191（6.470kb）（図3）を、制限エンドヌクレアーゼSphIとAflIIを使用して完全に消化して、4.113kbの断片を作製し、続いてエビ腸由来のアルカリ・ホスファターゼを使用してそれを脱リン酸した。2.393kbのインベルターゼ・リーダー配列‐ヒト・ラクトフェリン（T139A、T480A、S625A）DNA断片を、pDB3191由来の4.113kbのSphI／AflII断片内に連結して、プラスミドpDB3817（図14）を作製した。
【０２１３】
プラスミドpDB3815及びpDB3816を、NotI制限エンドヌクレアーゼで完全に消化して、インベルターゼ・リーダー配列ヒト・ラクトフェリン（T139A、T480A、S625A）発現カセットをコードする3.259kbのDNA配列を取り出した。プラスミドpDB3817を、NotI制限エンドヌクレアーゼで完全に消化して、3.259kbのインベルターゼ・リーダー配列ヒト・ラクトフェリン（T139A、T480A、S421C、S625A）発現カセットを取り出した。
【０２１４】
プラスミドpDB2690の構築をWO/2005061719 A1に記載した。プラスミドpDB2690（13.018kb）を、制限エンドヌクレアーゼNotIで完全に消化し、エビ・アルカリ・ホスファターゼを使用して脱リン酸し、そしてpDB3815、pDB3816、及びpDB3817由来の適当な3.259kbのNotIラクトフェリン変異体発現カセットと連結して、LEU2遺伝子に対して同方向でラクトフェリン変異体発現カセットを持っている16.342kbのプラスミドpDB3818、pDB3819（図15）、及びpDB3820（図16）のそれぞれを作製した。
【０２１５】
S.セレビシエ菌株（菌株1）を、ラクトフェリン発現プラスミドpDB3818、pDB3819、及びpDB3820を用いてロイシン原栄養性に形質転換した。酵母を、改良された酢酸リチウム法（Sigma yeast transformation kit, YEAST-1, protocol 2; Ito et al, 1983, J. BacterioL, 153, 16; Elble, 1992, Biotechniques, 13, 18）を使用して形質転換した。形質転換体を、BMMD-寒天平板上で選択し、続いてBMMD-寒天平板上でパッチアウトした。BMMDの組成は、Sleep et al., 2002, Yeast, 18,403によって記載されている。冷凍保存ストックを、10mLのBMMD振盪フラスコ培養（24時間、30℃、200rpm）から20%（w/v）のトレハロース中で調製した。
【０２１６】
実施例では、所定のコドンTGTをシステイン・コドンに使用したが、しかし本願発明において、コドンTGCを使用することもできた。
【０２１７】
実施例2：トランスフェリン及びチオトランスフェリン突然変異タンパク質の精製
実施例1からの形質転換体を以下のとおり培養した：
50mlコニカルフラスコ中に10mlの培地を入れた振盪フラスコ培養物を、YEPD培地（1%（w/v）の酵母抽出物、2%（w/v）のBactopeptone、2%（w/v）のグルコース）又はBMMD（緩衝化した最少培地、0.67%（w/v）のアミノ酸不含Bacto Yeast Nitrogen Base、36mMのクエン酸／126mMの水素オルトリン酸二ナトリウム、pH6.5、2%（w/v）のグルコース）を用いて30℃、200rpmにて培養した。
【０２１８】
酵母形質転換体を、10mLのBMMD振盪フラスコ中で5日間培養した。細胞の遠心分離後に、上清中に分泌されたチオトランスフェリン変異タンパク質を、4-12%グラジエントSDS非還元ゲル（SDS-PAGE）と4-12%グラジエントSDS還元ゲル（SDS-PAGE）によって、菌株1［pDB3237］から発現された組み換えヒト・トランスフェリン（S415A、T613A）と比較した（図17）。全菌株が、菌株1［pDB3237］からの組み換えヒト・トランスフェリン（S415A、T613A）バンドと等しく移動するタンパク質バンドを分泌した。
【０２１９】
10mLのBMMD振盪フラスコ中に5日間で発現された組み換えトランスフェリン変異体の力価を、菌株1［pDB3237］のものとロケット免疫電気泳動によって比較した（図18）。チオトランスフェリン変異体から分泌されたトランスフェリンの力価は、菌株：菌株1［pDB3766］、菌株1［pDB3767］、菌株1［pDB3778］、菌株1［pDB3769］、菌株1［pDB3789］、菌株1［pDB3770］、菌株1［pDB3779］、菌株1［pDB3757］、菌株1［pDB3761］、菌株1［pDB3773］、菌株1［pDB3775］、菌株1［pDB3758］、菌株1［pDB3777］、及び菌株1［pDB3765］の中でも菌株1［pDB3237］と類似しているように見えた。菌株1［pDB3237］のものとロケット免疫電気泳動によって比較したとき、低い発現を、菌株1［pDB3771］、菌株1［pDB3763］、菌株1［pDB3760］、菌株1［pDB3745］、及び菌株1［pDB3759］から検出した。
【０２２０】
本願発明に記載したとおり、システイン残基の挿入（そのアミノ酸鎖長は延長される）、システインでの2個以上の隣接残基の置換（そのアミノ酸鎖長は短縮される）若しくはシステインでのアミノ酸残基の置換（アミノ酸鎖長は変わらない）、システイン残基の欠失、又は上記の組み合わせによって作製されたチオトランスフェリン突然変異タンパク質は、（ロケット免疫電気泳動によって計測される）組み換えトランスフェリン（S415A、T613A）と同じ分子量、及びトランスフェリン抗体と同じ反応性を有する完全長の単量体タンパク質として発現され、システイン残基へのアミノ酸修飾がタンパク質発現に悪影響を与えないことを実証した。
【０２２１】
流加発酵を、30℃にて10L Braun Biostat E発酵槽中で行った；pHを観察し、そしてアンモニア又は硫酸の添加によって適宜調整した。アンモニアはまた、培養物のための窒素源も提供した。溶存酸素のレベルを観察し、そして＞20%飽和のレベルを維持するようにスターラー・スピードと連動させた。種菌を、振盪フラスコ内の緩衝化した最少培地中で培養した。バッチ相では、培養物を、2%（w/v）のショ糖を含む発酵槽培地（発酵槽体積の約50%）中に植え付けた。溶存酸素のレベルを急激に上げることによって、給餌段階を自動的に始動させる。規定の名目上の成長速度に給餌速度を制御することによって、ショ糖を成長限界濃度に維持した。給餌は、すべて基本的にCoilins, S.H,, (1990)によって記載されているとおり、50%（w/v）のショ糖を含む発酵培地から構成された（S.H. Collins, Production of secreted proteins in yeast, in: T.J.R. Harris (Ed.) Protein production by biotechnology, Elsevier, London, 1990, pp. 61-77）。
【０２２２】
培養上清を遠心分離によって採集した。二段階イオン交換クロマトグラフィ手順を使用して、突然変異トランスフェリン（チオトランスフェリン）を調製した。培養上清を水で希釈して、例えばSP-FFなどの最初のカラムへの結合に好適な電導度を与えた。SP-FFの場合では、培養上清を、氷酢酸を用いてpH5.0に調整した後に、3.0±0.3mS/cmに希釈する。
【０２２３】
最初のクロマトグラフィー・ステップには、50mMの酢酸ナトリウムpH5.0で平衡化したSP-Sepharose Fast Flow（GE Healthcare）カラム（層の容積約400ml、層の高さ11cm）を使用する。添加は、10〜25mg突然変異トランスフェリン／mlマトリックスであった。カラムを、カラム体積の3倍量の平衡化バッファーで洗浄し、そしてカラム体積の約2倍量の50mMのリン酸ナトリウム、25mMの塩化ナトリウムpH7.0でタンパク質を溶出した。線流速は、添加及び洗浄中には330cm/hであり、そして溶出中には165cm/hであった。
【０２２４】
第2ステップのために、前記溶出液を、水酸化ナトリウムによるpH9.0〜9.3への調整後に、約3倍に希釈して、＜3.0±0.3mS/cmの電導度を与えた。これを、15.7mMの四ホウ酸カリウムpH9.2で平衡化したDEAE-Sepharose Fast Flow（GE Healthcare）カラム（層の容積約800ml、層の高さ11cm）に添加した。添加は、5〜10mg突然変異トランスフェリン／mlマトリックスであった。前記カラムを、カラム体積の5倍量の平衡化バッファーで洗浄し、そしてカラム体積の4〜5倍量の60mM四ホウ酸カリウムpH9.35で溶出した。線流速は、添加及び洗浄中には286cm/hであり、溶出中には264cm/hであった。前記溶出液を、Pall Centramate Omeqa（登録商標）10,000 NMWCO膜を使用して10mMのHEPESバッファーに対して濃縮及びダイアフィルター処理して、約20mg/mlの終濃度を得、そして−80℃にて保存した。
【０２２５】
組み換えチオトランスフェリン突然変異体タンパク質濃度を、Shimadzu VP7.3クライアントサーバ・ソフトウェア制御の下でUV検出器を備えたAgilent 1100バイナリグラジエント・システムを使用した逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）によって測定した。最大100μLの注入を、0〜3分で30%のB、3〜13分で30から55%のBへ（リニアグラジエント）、13〜14分で55%のB、14〜15分で55から30%のBへ（リニアグラジエント）、15〜20分で30%のB（均一濃度）のグラジエント時間プログラムを使用して、移動相A（水中、0.1%のTFA、5%のアセトニトリル）、移動相B（水中、0.1%のTFA、95%のアセトニトリル）を含んでなる1ml/分の流速で45℃にてPhenomenex Jupiter C4 300Å（50×4.6mm、5μm）に対しておこなった。ピーク検出を、214nmの吸光度にて実施し、そして0.1〜10μgのヒト・トランスフェリン（Calbiochem）検量線に対して定量化する。
【０２２６】
チオトランスフェリン（S32C、S415A（T613A）変異体を発現する菌株1［pDB3778］、チオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）変異体を発現する菌株1［pDB3779］、及びチオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）変異体を発現する菌株1［pDB3758］の高細胞密度流加発酵は、それぞれ1.95、1.75、及び0.61mg.mL-1（n＝1）の収量をもたらした。チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）を発現する菌株1［pDB3767］の高細胞密度流加発酵は、〜1.67mg.mL-1（n＝2）の収量をもたらし、そしてチオトランスフェリンは（S415C、T613A）を発現する菌株1［pDB3773］は〜1.06mg.mL-1（n＝2）の収量をもたらした。
【０２２７】
ホロ化（holoisation）手順を使用して、鉄を負荷した組み換えチオトランスフェリン変異体タンパク質を調製した。重炭酸ナトリウムを精製したチオトランスフェリンのサンプルに加えて、20mMの終濃度を得た。2mol Fe3+.mol-1トランスフェリンを目標とした（10mg.mL-1のクエン酸鉄アンモニウムの形態（16.5〜18.5%Fe）での）鉄の量を計算し、組み換えトランスフェリン／20mMの重炭酸ナトリウム調製物に加え、そして周囲温度（21〜25℃）にて最低60分間混合し、それに続いて145mMのNaCl中に限外濾過した。
【０２２８】
実施例3：トランスフェリン受容体の結合性
トランスフェリン受容体の結合性を、以下のとおり測定した。
赤白血病K562細胞における55Fe取り込み競合
10mMのリン酸バッファー、pH7.4から凍結乾燥された状態でヒト血漿由来アポトランスフェリン（Calbiochem 616419、組織培養グレード、パイロジェン不含）が供給される。トランスフェリン突然変異タンパク質を、先に記載したように、発現させ、精製し、そして定量する。
【０２２９】
標識した二鉄（diferric）トランスフェリンからの鉄55取り込みについて、標準的な条件下（重炭酸塩緩衝化、5%（v/v）のCO2、抗生物質、10%（v/v）のウシ胎仔血清）、RPMI細胞培地中で培養したK562赤白血病細胞を、HEPES-バッファー及び1mg/mlのウシ血清アルブミンを含む無血清培地で洗浄し、そしてこの培地中、1000万細胞/mlの濃度にて使用する。試験されるサンプルを、アポトランスフェリン突然変異タンパク質の等モル濃度に調製する。アポトランスフェリン突然変異タンパク質を、0.1Mのクエン酸、0.1Mの酢酸、10mMのEDTA pH4.5に対する透析によって調製する。溶液を、濾過（0.22μm）し、Vivaspin polyethersulphone 10,000 NMWCO遠心濃縮器を使用して10mg/mlに濃縮し、そして10倍量の水、続いて10倍量の0.1M HEPES、0.1M NaHCO3 pH8.0に対してダイアフィルター処理する。サンプルを、すすぎを用いて濃縮器から回収し、そして5mg/mlの終濃度に調整する。トランスフェリン突然変異タンパク質を、鉄源として鉄ニトリロ三酢酸を使用した標準的な手順（Bates and Schlabach, J Biol Chem, 248, 3228-3232, 1973）に従って鉄を添加する。通常は、50μlの1M NaClO4を、450μlのトランスフェリン突然変異タンパク質原液に加える（pHはアルカリ性〜中性）。55Fe-NTA-添加バッファーを、0.5NのHCI（NEN products）中、8.5μlの50mM NTA（pH8.25）、18.9μlの0.1M Tris、98.8μlのMillipore-精製水、及び7.5μlの55FeCl3を混合することによって調製する。500μlのトランスフェリン突然変異タンパク質を、55Fe-NTA-添加液と（滴下により）慎重に混合し、次に310μlの5mM Hepes. NaOH／0.1MのNaClO4を加える。その混合物を、4℃にて60分間インキュベートし、それに続いてそれを（セファデックスG‐25含有した）PD-10カラムによりデスレート（deslated）し、そして透析する。PD-10カラムを、5mlの平衡化バッファー（5mMのHepes/NaOH、0.1Mの NaClO4、0.1gのBSA（Amresco））で平衡化し、次に5mlの洗浄バッファー（5mMのHepes/NaOH、0.1MのNaClO4）で3回洗浄した。鉄（55Fe）負荷トランスフェリン突然変異タンパク質を、カラムに添加し、そして溶出バッファー（5mMのHepes/NaOH、0.1MのNaClO4）で溶出する。溶出された鉄（55Fe）負荷トランスフェリン突然変異タンパク質を、5mMのHepes、0.15mMのNaCl、pH7.4に対して4℃にて透析する。
【０２３０】
高濃度の55Feで標識したヒト血漿トランスフェリン又はトランスフェリン突然変異タンパク質サンプル（0、25、100、200、400、800、1600nM）を、25μlの培地と混合する。その反応を、300μlの細胞懸濁液の添加によって開始する。並列実験の2連目を、百倍過剰の未標識二鉄トランスフェリンの存在下で実施して、非特異的結合を明らかにする。37℃にて25分後に、氷浴中への浸漬によって反応を止め、細胞懸濁液の60μlの3つのアリコートを新しい試験管に移し、細胞を冷たい状態で遠心分離し、そしてジエチルフタラート／ジブチルフタレートの油層の添加後に再び遠心分離する。上清を取り除き、細胞ペレットを、カウンターバイアル中に移し、そして0.5MのKOH＋1%（v/v）のTriton X-100を用いて溶解させた。溶解物を、一晩の溶解後に1MのHClで中和し、Readysolvシンチレーション・カクテルと混合し、そしてPackard液体シンチレーション・カウンタでカウントする。結果はfmol55Fe/100万個の細胞として一般的に提供される。
【０２３１】
トランスフェリン突然変異タンパク質と放射性標識血漿トランスフェリンによるヒトK562細胞内への鉄取り込みの競合
さらに、定濃度の55Fe-標識血漿トランスフェリン（100nM）を0〜1600nM（0、25、100、200、400、800、1600nM）の範囲の濃度の非放射性標識ホロトランスフェリン突然変異タンパク質と一緒に使用して、競合アッセイを実施する。鉄（55Fe）負荷血漿トランスフェリンを、先に記載した方法によって調製する。K562細胞をインキュベーション混合物に加えて、106細胞／mlの細胞密度を得る。0.1%（w/v）のウシ血清アルブミン及び10mMのHepesを含むRPMI-培地を、トランスフェリンと細胞の希釈に使用する。37℃にて25分後に、氷浴中への浸漬によって反応を止め、細胞懸濁液の60μlの3つのアリコートを新しい試験管に移し、細胞を冷たい状態で遠心分離し、そしてジエチルフタラート／ジブチルフタレートの油層の添加後に再び遠心分離する。上清を取り除き、細胞ペレットを、カウンターバイアル中に移し、そして0.5MのKOH＋1%（v/v）のTriton X-100を用いて溶解させた。溶解物を、一晩の溶解後に1MのHClで中和し、Readysolvシンチレーション・カクテルと混合し、そしてPackard液体シンチレーション・カウンタでカウントする。結果は、fmol55Fe/100万個の細胞として一般的に提供される。
【０２３２】
チオトランスフェリンはトランスフェリン受容体に結合すると見なされ、それはCys挿入のない対応するポリペプチドの受容体結合能の少なくとも5%を有する。
【０２３３】
実施例4：三次元モデルの構築
鉄と受容体の両方の結合領域、並びに表面露出領域を特定できるトランスフェリンの合理的なモデルを入手するために、以下のアプローチを使用した：
Pymol（Warren L. DeLano "The PyMOL Molecular Graphics System.", DeLano Scientific LLC, San Carlos, CA, USA. http://www.pymoi.org）で初期モデル構築をおこなった。2つの構造を鋳型として使用した：
1．アポ‐ヒト血清トランスフェリンの鎖A、PDB登録2HAV
2．ヒト・トランスフェリン受容体‐トランスフェリン複合体、PDB登録1SUV
【０２３４】
モデル構築において、以下のステップを使用した：
1．1SUVの鎖A及びBを新しいモデルに直接コピーし、それぞれ鎖R及びSと表した。
2．Pymolの「整列」コマンドを使用して、2HAVの鎖Aのコピーを、1SUVのD及びF鎖と整列させた。C-アルファ炭素原子だけを配列比較に使用した。この位置で、1SUVの鎖A及びBとの顕著な衝突が観察されたので、衝突を減らすように構造物を手動で動かした。結果を、新しいモデルの鎖Aとしてコピーした。
3．Pymolの「整列」コマンドを使用して、2HAVの鎖Aの別のコピーを、1SUVの鎖Cと整列させた。2HAVの鎖Aの第332番までの残基だけ考慮され、そしてC-アルファ炭素原子だけを配列比較に使用した。結果を、新しいモデルの鎖Bとしてコピーした。
【０２３５】
前記モデルを、Gromacs 3.3ソフトウェア（D. van der Spoel, E. Lindahl, B. Hess, G. Groenhof, A. E. Mark and H. J. C. Berendsen: GROMACS: Fast, Flexible and Free, J. Comp. Chem. 26 pp. 1701-1718 (2005)）を使用して分子力学シミュレーションにかけた。分子動力学カスケードを利用した：
1．100ステップの最急降下最小化。
2．周期境界条件を使用した、16×16×16nmの溶媒水ボックス内に埋め込む。
3．100ステップの最急降下最小化。
4．300Kにて2nsのNVT分子動力学。
【０２３６】
構造物のスナップショットを、分子動力学シミュレーションの400ps後に記録した。3セットのデータを前記モデルの各残基について得た：
1．2nsの分子動力学シミュレーションの軌跡を加工し、そしてシミュレーションの最後のナノ秒間のC-アルファ炭素原子の二乗平均揺らぎを、Gromacsツール「g rmsf」を使用して計算した。
2．溶媒接近可能表面積を、DSSPソフトウェア（W.Kabsch and C.Sander, Biopolymers 22 (1983) 2577-2637）を使用して、400psスナップショット構造物の中の各残基について計算した。それぞれの溶媒接近可能表面積を、その位置で見られる特定アミノ酸の基準値で除算し、そして100を乗算することによって、各残基について基準値に対するパーセンテージを得た。
【０２３７】
20個の異なったアミノ酸についての標準溶媒接近可能表面積は（アミノ酸のための一文字コードを使用して）以下のとおり規定される：A＝62、C＝92、D＝69、E＝156、F＝123、G＝50、H＝130、I＝84、K＝174、L＝97、M＝103、N＝85、P＝67、Q＝127、R＝211、S＝64、T＝80、V＝81、W＝126、Y＝104。
【０２３８】
3．二次構造を、DSSPソフトウェア（W.Kabsch and C.Sander, Biopolymers 22 (1983) 2577-2637）を使用して、400psスナップショット構造物の中の各残基について測定した。二次構造がH（ヘリックス）、B（単離されたベータ・ブリッジ）、又はE（広がったシート）と規定される場合には、残基に「1」と印を付け、そうでなければ「0」と印を付ける。
前記モデルの鎖R及びSについてのデータを破棄した。3つのデータセットのそれぞれに関する鎖A及び鎖Bについてのデータを収集した。
【０２３９】
実施例5：1以上の遊離チオール基を持つチオトランスフェリン突然変異タンパク質の発現
この実施例では、セリン-28のシステイン残基への置換、及びセリン-415のシステイン残基への置換によって、2つの遊離チオール基を導入する。チオトランスフェリン（S28C、S415C、T613A）変異体の分泌を、チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体、チオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体、及びトランスフェリン（S415A、T613A）の分泌と比較した。チオトランスフェリン（S28C、S415C、T613A）変異体発現プラスミドpDB3809の構造を、実施例1に記載する。
【０２４０】
菌株1［pDB3809］、菌株1［pDB3767］、菌株1［pDB3773］、及び菌株1［pDB3237］を、10mL BMMD振盪フラスコ中で5日間培養した。細胞の遠心分離後に、菌株1［pDB3809］、菌株1［pDB3767］、菌株1［pDB3773］から上清中に分泌されたチオトランスフェリン（S28C、S415C、T613A）変異体、チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体、及びチオトランスフェリン（S415C、T613A）変異タンパク質を、4-12%グラジエントSDS非還元ゲル（SDS-PAGE）と4-12%グラジエントSDS還元ゲル（SDS-PAGE）によって、菌株1［pDB3237］からの組み換えヒト・トランスフェリン（S415A、T613A）分泌と比較した（図19）。それぞれ、菌株1［pDB3767］、菌株1［pDB3773］、及び菌株1［pDB3237］から分泌された組み換えヒト・トランスフェリン（S415A、T613A）、チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、チオトランスフェリン（S415C、T613A）のバンドと等しく移動する、菌株1［pDB3709］から分泌されたチオトランスフェリン（S28C、S415C、T613A）タンパク質に相当するタンパク質バンドが検出され、菌株1［pDB3709］から分泌されたチオトランスフェリン（S28C、S415C、T613A）タンパク質が単量体タンパク質として分泌されたことを実証した。
【０２４１】
10mL BMMD振盪フラスコ中に5日間で菌株1［pDB3709］から分泌された組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415C、T613A）の力価を、ロケット免疫電気泳動によって、菌株1［pDB3767］から分泌された組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、菌株1［pDB3773］から分泌された組み換えチオトランスフェリン（S415C、T613A）、及び菌株1［pDB3237］から分泌された組み換えトランスフェリン（S415A、T613A）の力価と比較した（図20）。菌株1［pDB3709］から分泌された組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415C、T613A）のロケット免疫電気泳動及びSDS-PAGE分析は、トランスフェリン・タンパク質の2つ以上の選択されたアミノ酸残基のシステイン残基への修飾が、完全長の単量体タンパク質のタンパク質発現に悪影響を与えないことを実証している。
【０２４２】
実施例6：ラクトフェリン及びチオラクトフェリン突然変異タンパク質の発現
ラクトフェリン（T139A、T480A、S625A）及びチオラクトフェリン、（T139A、S421C、T480A、S625A）発現プラスミドpDB3818-20の構造を、実施例1に記載する。
【０２４３】
菌株1［pDB3818］、菌株1［pDB3719］、菌株1［pDB3720］、菌株1［pDB3773］、及び菌株1［pDB3237］を、10mL BMMD振盪フラスコ中で5日間培養した。細胞の遠心分離後に、菌株1［pDB3818］、菌株1［pDB3719］、及び菌株1［pDB3720］から上清中に分泌されたラクトフェリン（T139A、T480A、S625A）及びチオラクトフェリン（T139A、S421C、T480、S625）変異タンパク質を、4-12%グラジエントSDS非還元ゲル（SDS-PAGE）及び4-12%グラジエントSDS還元ゲル（SDS-PAGE）によって、菌株1［pDB3237］からの組み換えヒト・トランスフェリン（S415A、T613A）分泌、及び菌株1［pDB3773］からのチオトランスフェリン（S415C、T613A）発現と比較した（図21）。
【０２４４】
約80kDaに移動する、菌株1［pDB3818］と菌株1［pDB3819］の両方から分泌されたラクトフェリン（T139A、T480A、S625A）タンパク質に相当するタンパク質バンドが検出され、ラクトフェリン（T139A、T480A、S625A）が微生物宿主から発現されことが可能であることを示唆している；発現プラスミドが微生物宿主における発現のために最適化されたコドンであってもそうでなくてもよい。ラクトフェリン・タンパク質配列上の第421位のセリン残基は、トランスフェリン・タンパク質配列上の第415位のセリン残基に対応する（実施例1を参照のこと）、よって、菌株1［pDB3820］からのチオラクトフェリン（T139A、S421C、T480A、S625A）発現を、菌株1［pDB3773］からのチオトランスフェリン（S415C、T613A）発現と比較した（図16）。ラクトフェリン（T139A、T480A、S625A）と等しく移動する、菌株1［pDB3820］から分泌されたラクトフェリン（T139A、S421C、T480A、S625A）タンパク質に相当するタンパク質バンドもまた検出され、選択されたアミノ酸残基のシステイン残基への修飾がタンパク質発現に悪影響を与えないこと、及び他のトランスフェリン・ファミリー・タンパク質もまた本願発明に使用することもできることを実証している。
【０２４５】
実施例7：チオトランスフェリン突然変異タンパク質の鉄結合性
本願発明に記載のチオトランスフェリン突然変異タンパク質の鉄を結合する能力を、2つの実験手順、尿素ゲル分析及び総鉄結合能に関する分光光度分析を使用して測定し、そして組み換えヒト・トランスフェリン（S415A、T613A）標準のそれと比較した。
【０２４６】
組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、組み換えチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）、組み換えチオトランスフェリン、（A215C、S415A、T613A）、組み換えチオトランスフェリン（S415C、T613A）、及び組み換えチオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）の鉄結合能を、精製した組み換えヒト・トランスフェリン（S415A、T613A）標準のそれと比較した。組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、組み換えチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）、組み換えチオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）、組み換えチオトランスフェリン（S415C、T613A）、及び組み換えはチオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）に、実施例2に記載のとおり鉄負荷した。
【０２４７】
5μgのサンプルを、6%のTBE尿素PAGE（Invitrogen）により分離し、そしてCoomassie G250（Pierce）で染色した（図22）。この技術は、異なった鉄負荷を有する4つの分子形態、すなわち（移動度の高い順に）アポ‐トランスフェリン、CローブとNローブを結合した一鉄トランスフェリン、及びホロ‐トランスフェリンを分離する。トランスフェリンの4つの形態の分離は4〜6Mの尿素中での部分的な変性に起因すると考えられる；ここで、いずれかのローブにおける鉄結合が、変性に対する抵抗性の増大をもたらす立体構造の変化を引き起こす。よってローブ内の鉄の存在が、より高い電気泳動移動度を有するよりコンパクトな構造をもたらす。NローブはCローブより少ないジスルフィド結合しか持たないので（それぞれ8個対11個）、Nローブは、鉄の不存在下でさらに折り畳まれず、Cローブへの鉄結合を伴った一鉄形態を最低の移動度にする。
【０２４８】
前記チオトランスフェリン変異体は鉄を結合する能力はあったが、しかし、実験条件下で精製された組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、組み換えチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）、組み換えチオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）、組み換えチオトランスフェリン（S415C、T613A）、及び組み換えチオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）（図22のレーン3〜7）は、鉄で完全に飽和されているように見えず、組み換えトランスフェリン（S415A、T613A）に比べてよりゆっくり分析用TBE尿素ゲルを通り抜けて移動するバンドを示し（図22のレーン2）、且つ、不均一性が観察された。タンパク性バンドの1つが、二鉄トランスフェリンに相当する組み換えヒト・トランスフェリン（S415A、T613A）のホロ‐トランスフェリン形態と等しく移動した。チオトランスフェリン変異体はまた、一鉄トランスフェリンの一部分を含むようにも見えた。これらの結果の解釈には多少の注意が必要である。一鉄（チオ）トランスフェリン変異体に相当するバンドの存在は、鉄負荷が飽和二鉄トランスフェリンに特有のより高い電気泳動移動度をもたらさなかったことを示した。しかしながら、前記技術が鉄結合の安定化に依存するので、前記突然変異が鉄結合を妨げるというのは無難な結論でない；尿素変性に対するローブの不安定化が同じ結果をもたらすだろう。
【０２４９】
本願発明に記載の組み換えチオトランスフェリンと、組み換えヒトトランスフェリン（S415A、T613A）（Deltaferrin（商標））標準の総鉄結合能（TIBC）を、当該出願に記載のとおり、Caraway, 1963 Clinical Chem 9 (2), 188によって記載された血清鉄及び鉄結合能の測定のための改良法を使用して測定した。
【０２５０】
組み換えヒト・トランスフェリン（S415A、T613A）の総鉄結合能（TIBC）を2.14と計測した。組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体の総鉄結合能を1.91と計測し、組み換えはチオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）変異体を2.23と計測し、組み換えチオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）変異体を2.00と計測し、組み換えチオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体を2.18と計測し、そして組み換えチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体を2.42と計測し（表3）、選択された残基のシステインへの修飾が、トランスフェリン突然変異タンパク質の全体の構造を変更しない、又はチオトランスフェリン突然変異タンパク質が鉄に結合できることを妨げないことを示唆している。
【０２５１】
実施例8：組み換えトランスフェリン（S415A、T613A）と比較した組み換えチオトランスフェリン変異体のトランスフェリン受容体結合能
組み換えトランスフェリン変異体の受容体結合能を、表面プラズモン共鳴法（SPR）分析によって評価した。トランスフェリン受容体へのトランスフェリン・サンプルの結合活性は、非侵襲性の光学技術である表面プラズモン共鳴法（SPR）を使用して計測できる。ここで、前記SPR応答が、分子が結合するか又は解離する際の検出装置の表面における質量濃度の変化の評価基準である。サンプルを、一定の流速にてマイクロ・フロー・システムを介してセンサーチップ表面に送る。この分析では、トランスフェリン・サンプルにTfRに結合する能力があれば、表面センサ・チップ上の質量がTfRとTf分子の間の結合のために増加して、表面プラズモン波を生じるので、結合量に比例したSPRシグナルのシフトを共鳴単位（RU）の変化として検出できる。1RUの応答は、約1pg.mm-2の表面濃度の変化に相当する。
【０２５２】
トランスフェリンとそのトランスフェリン受容体の間の相互作用分析のためのBiacoreセンサーチップを、トランスフェリンの添加前に、まずトランスフェリン受容体抗体を固定することによって調製した。具体的には、抗トランスフェリン受容体（抗TfR）抗体を、25℃にてアミン結合化学反応を使用してCM5センサーチップ表面（GE Healthcareカタログ番号BR-1000-14）に固定した。CM5センサーチップ・フローセル上のカルボキシメチル化デキストラン表面を、N-ヒドロキシスクシンイミド：N-エチル-N’-（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（NHS：EDC）の付加によって活性なスクシンアミド・エステルに変換した。
【０２５３】
【表６】
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【０２５４】
トランスフェリン受容体以外の固定化タンパク質を持つセンサーチップを同時に準備し、そして溶媒などによるいわゆるバルク効果を排除するためにこのチップ上にサンプル標本を流すことが許されるとき、共鳴単位の変化を差し引くことによって、（トランスフェリン）受容体特異結合を確認できる。抗TfR抗体（AbD Serotecカタログ番号MCA1148）を、10mMの酢酸ナトリウムpH5.0（GE Healthcareカタログ番号BR-1003-50）中、10μg.mL-1に希釈し、フローセル2の上にだけ注入した。一方で、50μLの前記トランスフェリン受容体（TfR）（AbD Serotecカタログ番号9110-300）（HBS-EP（10mMのHEPES、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.005%の界面活性剤P-20、pH7.4）中、10〜20μg.mL-1希釈した）を両フローセルの上に注入した。センサーチップ表面上の余分なエステル基を、エタノールアミン・ハイドロクロライド（1M pH8.5）を使用して失活させた。
【０２５５】
HBS-EPを、相互作用分析のランニング・バッファー及び希釈バッファーとして使用した。精製し鉄負荷した組み換えトランスフェリン（S415A、T613A）又は組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、最初のクロマトグラフィー・ステップで精製された組み換えチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）、組み換えチオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）、組み換えチオトランスフェリン（S415C、T613A）、及び組み換えはチオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）を、20μg.mL-1に希釈し、そして50μLを両フローセルの上に注入した。反復試験を、再現性を確保するために実施した。準備したBiacoreセンサーチップ表面を、サンプル注入の間の10mMの酢酸ナトリウムpH4.5（GE Healthcareカタログ番号BR-1003-50）の6〜12秒間の注入によって、精製した組み換えトランスフェリン変異体の添加の間に再生した。ベースラインが復元されるまで、最大3回の注入を必要に応じておこなった。
【０２５６】
最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製されたは、組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、組み換えチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）、組み換えチオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）、組み換えチオトランスフェリン（S415C、T613A）、及び組み換えチオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）のサンプルを、前記トランスフェリン受容体に結合するそれらの能力について、精製し鉄負荷した組み換えトランスフェリン（S415A、T613A）と比較した。
【０２５７】
チオトランスフェリンはトランスフェリン受容体に結合すると見なされ、それはシステイン挿入のない対応するポリペプチドの受容体結合能の少なくとも5%を有する。質的なSPR分析によると、すべてのチオトランスフェリン突然変異タンパク質にはトランスフェリン受容体に結合する能力があった。
【０２５８】
実施例9：組み換えチオトランスフェリン変異体の質量分析
この実施例のために、精製した組み換えチオトランスフェリン変異体のサンプルを、最初のクロマトグラフィー・ステップによって精製された実施例2のように準備し、ESITOF質量分析法によって分析し、そして精製したトランスフェリン（S415A、T613A）のそれと比較した。
【０２５９】
サンプルを、通常20〜100nmol/mLの濃度にて回収したタンパク質を用いて逆相（RP-）HPLCを使用して脱塩／濃縮された試験タンパク質の水溶液として質量分析のために準備した。RP-HPLC脱塩を、Browniee Aquapore BU-300（C4）7mm、100×2.1mmカラムにより実施し、その方法は、溶媒Aとしての0.1%（v/v）のトリフルオロ酢酸（TFA）及び溶媒Bとしての70%（v/v）のアセトニトリル、0.1%（v/v）のTFAのバイナリ・グラジエントを利用し、280nmのUV吸光度によって検出される溶出成分の回収を伴った。飛行時間型質量分析のために、サンプルを、陽イオン・モードの供給源であるlonSprayTMを搭載したハイブリッド四重極飛行時間型質量分析計（QqOaTOF、Applied Biosystems、QSTAR-XL（登録商標））内に導入して、フローインジェクション分析（FIA）を使用した。能動的に調整された唯一の装置パラメータがDecoupling Potential（DP）であり、これは通常250Vに設定した。通常、2分間のサンプル・スキャンを平均した。タンパク質分析のために、TOF分析装置を、ウマ・ミオグロビン（Sigma）のプロトン化分子イオンに対して較正され、そして分解能は通常12,000であった。装置制御、データ取得、及びプロセシングを、AnalystTM QS v1.1ソフトウェア（Applied Biosystems）を使用して実施した。
【０２６０】
図23は、トランスフェリン（S415A、T613A）と比較した、チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体、チオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）変異体、チオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体、チオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）変異体、及びチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。トランスフェリン（S415A、T613A）の質量分光分析は、2つのピークを示す。この場合、一方のピーク（図23に「A」と印を付けた）は、75097の整数質量（理論上の質量75098Da）を有する修飾されていないトランスフェリン（S415A、T613A）分子に対応するピークである（図23）。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きいピークも存在する（図23における「B」と印を付けた）。これは、多分O-結合型グリコシル化を表す。
【０２６１】
スペクトルBは、最初のクロマトグラフィー・ステップで精製した、菌株1［pDB3767］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。第28位のセリン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、1個の遊離チオールが存在するようにその分子が折り畳まれるとき、75114の質量が予想される。この場合、最も大きい単一ピーク（図23に「C」と印を付けた）は、75116の整数質量（理論上の質量75114Da）を有する修飾されていない分子に対応するピークである。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きなピーク（図23に「D」と印を付けた）が存在する。これは多分O-結合型グリコシル化を表す。
【０２６２】
スペクトルCは、最初のクロマトグラフィー・ステップで精製した、菌株1［pDB3779］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。第215位のアラニン残基がシステインへと修飾され、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、1個の遊離チオールが存在するようにその分子が折り畳まれるとき、75130の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図23に「E」と印を付けた）は、75130の整数質量（理論上の質量75130Da）を有する修飾されていない分子に対応するピークである。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きなピーク（図23に「F」と印を付けた）が存在する。これは多分O-結合型グリコシル化を表す。
【０２６３】
スペクトルDは、最初のクロマトグラフィー・ステップで精製した、菌株1［pDB3773］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。第415位のセリン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、1個の遊離チオールが存在するようにその分子が折り畳まれるとき、75130の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図23に「G」と印を付けた）は、75127の整数質量（理論上の質量75130Da）を有する修飾されていない分子に対応するピークである。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを有する大きなピーク（図23に「H」と印を付けた）が存在する。これは多分O-結合型グリコシル化を表す。
【０２６４】
スペクトルEは、最初のクロマトグラフィー・ステップで精製した、菌株1［pDB3758］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。第553位のアスパラギン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、1個の遊離チオールが存在するようにその分子が折り畳まれるとき、75087の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図23に「I」と印を付けた）は、75032の整数質量（理論上の質量75087Da）を有する修飾されていない分子に対応するピークである。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きなピーク（図23に「J」と印を付けた）が存在する。これは多分O-結合型グリコシル化を表す。
【０２６５】
スペクトルFは、最初のクロマトグラフィー・ステップで精製した、菌株1［pDB3778］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。チオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）の質量分光分析は、たった1つの主要ピークだけを示す。第32位のセリン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、1個の遊離チオールが存在するようにその分子が折り畳まれるとき、75114の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図23に「K」と印を付けた）は、75110の整数質量（理論上の質量75114Da）を有する修飾されていない分子に対応するピークである。他のトランスフェリン／チオトランスフェリン質量分析と対照的に、単回ヘキソース添加についての162ダルトンのインクリメントに相当する追加的なピークは検出されず、セリン-32のシステインへの突然変異がこの位置におけるO-結合型グリコシル化を防ぐことを示唆している。
【０２６６】
実施例10：エルマン試薬（5’5’-ジチオ-ビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB）で処理した組み換えチオトランスフェリン変異体の質量分析
タンパク質上の遊離チオールの数を、エルマン試薬を使用することで分光光度測定により測定できる。エルマン試薬（5’5’-ジチオ-ビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB））は、チオール基と反応して、タンパク質の混合ジスルフィドと（タンパク質のスルフィジル基1molあたり）1molの2-ニトロ-5-チオ-ベンゾアート（TNB）を形成する芳香族ジスルフィドである。あるいは、タンパク質上の遊離チオールの数は、DTNB試薬で処理したタンパク質サンプルの質量分析を使用することで測定できる。5-チオ-2-ニトロ安息香酸（TNB）は199Daの分子量があるので、よって（TNBから、試験タンパク質上の遊離チオール基によるジスルフィド架橋形成中のH2喪失を差し引いた）197Daの質量の増加が、タンパク質サンプル上の1個の遊離チオール基の存在を示す。
【０２６７】
100μlの試験タンパク質サンプル（20mg.mL-1）を、100μlのバッファー2（4mg.mL-1のDTNBと500mMのリン酸ナトリウム、pH7.0）及び900μlのバッファー1（0.1MのTRIS-HCl、100mMのEDTA、pH8.0）に加えた。その調製物を、周囲温度（21〜25℃）にて25分間混合し、続いて低分子質量排除フィルタ（Vivaspin2-10000 MWCO Sartorius Stedim Germany）を通して濾過した。そのフイルターを、2倍量の0.1% トリフルオロ酢酸（TFA）で洗浄し、そしてサンプルを、300μlの0.1% TFA中に再懸濁した。TNB標識サンプルを、逆相（RP-）HPLCを使用して脱塩／濃縮することによって質量分析のために準備した。RP-HPLC脱塩を、Browniee Aquapore BU-300（C4）7mm、100×2.1mmカラムにより実施し、その方法は、溶媒Aとしての0.1%（v/v）のトリフルオロ酢酸（TFA）及び溶媒Bとしての70%（v/v）のアセトニトリル、0.1%（v/v）のTFAのバイナリ・グラジエントを利用し、280nmのUV吸光度によって検出される溶出成分の回収を伴った。
【０２６８】
飛行時間型質量分析のために、実施例9に記載のとおり、サンプルを、陽イオン・モードの供給源であるlonSprayTMを搭載したハイブリッド四重極飛行時間型質量分析計（QqOaTOF、Applied Biosystems、QSTAR-XL（登録商標））内に導入して、フローインジェクション分析（FIA）を使用した。
【０２６９】
図24は、DTNBで処理したトランスフェリン（S415A、T613A）と比較した、DTNBで処理したチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体、チオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）変異体、チオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体、チオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）変異体、及びチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。DTNBで処理したトランスフェリン（S415A、T613A）の質量分光分析は、2つのピークを示した。この場合、1つのピーク（図24に「A」と印を付けた）は、75097の整数質量（理論上の質量75098Da）を有する修飾されていないトランスフェリン（S415A、T613A）分子に対応するピークである（図24）。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きなピーク（図24に「B」と印を付けた）もまた存在する。これは多分O-結合型グリコシル化を表す。195Daの質量シフトが質量スペクトルにおいて検出されず、トランスフェリン（S415A、T613A）（Deltaferrin（商標）標準）の中の38個のシステイン残基のすべてがジスルフィド結合し、且つ、遊離チオール基が存在していないことを確認した。
【０２７０】
スペクトルBは、最初のクロマトグラフィー・ステップで精製した、菌株1［pDB3767］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体（DTNBで処理した）の質量スペクトルを示す。第28位のセリン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、1molのNTBがチオール基に結合するようにその分子が折り畳まれるとき、75311の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図24に「C」と印を付けた）は、75311の整数質量（理論上の質量75311Da）を有するチオトランスフェリン分子に結合する1molのNTBに相当するピークである。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きなピーク（図24に「D」と印を付けた）が存在する。これは多分O-結合型グリコシル化を表す。
【０２７１】
スペクトルCは、最初のクロマトグラフィー・ステップで精製した、菌株1［pDB3779］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（A215C、S415A、T613A）変異体（DTNBで処理した）の質量スペクトルを示す。第215位のアラニン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、1molのNTBがチオール基に結合するようにその分子が折り畳まれるとき、75327の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図24に「E」と印を付けた）は、75325の整数質量（理論上の質量75327Da）を有するチオトランスフェリン分子に結合する1molのNTBに相当するピークである。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きなピーク（図24に「F」と印を付けた）が存在する。これは多分O-結合型グリコシル化を表す。
【０２７２】
スペクトルDは、最初のクロマトグラフィー・ステップで精製した、菌株1［pDB3773］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体（DTNBで処理した）の質量スペクトルを示す。第415位のセリン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、1molのNTBがチオール基に結合するようにその分子が折り畳まれるとき、75327の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図24に「G」と印を付けた）は、75324の整数質量（理論上の質量75327Da）を有するチオトランスフェリン分子に結合する1molのNTBに相当するピークである。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きなピーク（図24に「H」と印を付けた）が存在する。これは多分0-結合型グリコシル化を表す。
【０２７３】
スペクトルEは、最初のクロマトグラフィー・ステップで精製した、菌株1［pDB3758］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S415A、N553C、T613A）変異体（DTNBで処理した）の質量スペクトルを示す。第553位のアスパラギン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、1molのNTBがチオール基に結合するようにその分子が折り畳まれるとき、75284の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図24に「I」と印を付けた）は、75281の整数質量（理論上の質量75284Da）を有するチオトランスフェリン分子に結合する1molのNTBに相当するピークである。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きなピーク（図24に「J」と印を付けた）が存在する。これは多分O-結合型グリコシル化を表す。
【０２７４】
スペクトルFは、最初のクロマトグラフィー・ステップで精製した、菌株1［pDB3778］の高細胞密度発酵からのチオトランスフェリン（S32C、S415A、T613A）変異体（DTNBで処理した）の質量スペクトルを示す。チオトランスフェリン（S32C）の質量分析は、たった1つの主要なピークを示す。第32位のセリン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、1molのNTBがチオール基に結合するようにその分子が折り畳まれるとき、75311の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図24に「K」と印を付けた）は、75307の整数質量（理論上の質量75311Da）を有するチオトランスフェリン分子に結合する1molのNTBに相当するピークである。この結果は、セリン-32の突然変異がこの位置でのO-結合型グリコシル化を防ぐことを示唆した。
【０２７５】
DTNBで処理したチオトランスフェリン変異体の質量分析は、それぞれチオトランスフェリン突然変異タンパク質が1つの遊離チオールを持つことを裏付け、その一方で、同じ実験条件下でDTNBを使用してもトランスフェリン（S415A、T613A）標準を標識できない。
【０２７６】
実施例11：セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ・タンパク質のチオトランスフェリン変異体との結合
本発明のチオトランスフェリンを、当該技術分野に知られている方法によって生理活性化合物に共有結合で連結されるそれらの能力についてアッセイした。マレイミド基は、pH6.5〜7.5にて主にスルフヒドリル基と反応し、安定したチオエーテル結合を形成する。マレイミド標識試薬は、例えばタンパク質、薬物、及び造影剤などの生理活性分子を持っている遊離チオール基を含むタンパク質分子を標識するために使用できる。pH7では、マレイミド基は、アミン基（Pierce）に比べて、チオール基に対して〜1000倍高い反応性がある。精製した組み換えヒト・トランスフェリン（Deltaferrin（商標））及び最初のクロマトグラフィー・ステップで精製したチオトランスフェリン変異体を、リン酸緩衝生理的食塩水（PBS）中、50μg.mLに希釈し、4倍モル過剰のEZ-Link（登録商標）Maleimide Activated Horseradish Peroxidase（Pierce）と一緒に4℃にて一晩、混合した。タンパク質を、非還元4-12% SDS-PAGEによって分離し、GelCode（登録商標）Blue試薬（Pierce）を使用して染色した（図25）。組み換えヒト・トランスフェリン（Deltaferrin（商標））（図25のレーン2にAと印を付けた）と等しく移動するタンパク質バンドを、EZ Link（登録商標）Maleimide Activated Horseradish Peroxidase（Pierce）と反応しなかったそれぞれのチオトランスフェリン変異タンパク質について検出した（図25のレーン4、6、9、11、及び13にAと印を付けた）。非反応EZ-Link（登録商標）Maleimide Activated Horseradish Peroxidase（Pierce）に相当するバンドを、EZ-Link（登録商標）Maleimide Activated Horseradish Peroxidaseで処理したサンプルのレーンで検出した（Pierce）（図25のレーン3、5、7、10、12、及び14にBと印を付けた）。一級アミンにおけるマレイミドのトランスフェリン（S415A、T613A）への非特異的結合に相当すると思われる、Cと印を付けたフェイント・バンドもまた図25のレーン2に検出した。セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼに結合したチオトランスフェリン変異体に相当するより大きなバンドを、EZLink（登録商標）Maleimide Activated Horseradish Peroxidaseで処理したサンプルのレーンにおいて検出した（Pierce）（図25のレーン3、5、7、10、12、及び14にCと印を付けた）。この実施例は、本願発明に記載の遊離チオール基を導入するなどのための、1以上の不対システイン残基を含むチオトランスフェリン突然変異タンパク質タンパク質が、マレイミド活性化タンパク質などの生理活性分子に共有結合により連結できることを実証している。
【０２７７】
実施例12：フルオレセインのチオトランスフェリン変異体との結合
チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）及びチオトランスフェリン（S415C、T613A）を、当該技術分野に知られている方法によって、フルオレセイン-5-マレイミドに共有結合で連結するそれらの能力についてアッセイした。マレイミド基はpH6.5〜7.5にて主にスルフヒドリル基と反応し、安定したチオエーテル結合を形成する。pH7では、マレイミド基は、アミン基（Pierce）に比べて、チオール基に対して〜1000倍高い反応性がある。
【０２７８】
実施例2に記載のとおり準備したチオトランスフェリン変異体を、フルオレセイン-5-マレイミドとの結合の前に、サイズ排除クロマトグラフィーにかけた。実施例2に記載のチオトランスフェリンの準備において、そのチオトランスフェリン二量体が存在している可能性がある。そのため、本明細書中に記載した方法を使用して達成できる高い純度にもかかわらず、仕上げステップとしてサイズ排除クロマトグラフィーを含むことは有利である。前記仕上げステップで、低レベル又は痕跡レベルのこれらの共雑物を取り除く。
【０２７９】
カラム（26×920mm、488mL）に、Superdex 200 Prep Grade媒体（GE Healthcare）を詰めた。そのカラムを、タンパク質サンプルの添加前に、0.5MのNaOHで浄化した。実施例2に記載のプロトコールによって準備したチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）又はチオトランスフェリン（S415C、T613A）を、前記カラムに添加した。
【０２８０】
サンプル添加の規模は、カラム体積の2%であった。流量は、3.5mL.min-1であった。ランニング・バッファーは、Dunbecco’sリン酸緩衝生理食塩水（DPBS、Sigma）又はその中でタンパク質が安定しているその他のバッファーであり、そして画分を、ピークの全域で1分毎に（3.5mLの画分）回収した。各画分を、GP.HPLC法を使用して、単量体の含有量についてアッセイした。GP-HPLC法は、25μLの注入物を用いて1ml.min-1にて、25mMのリン酸ナトリウム、0.1Mの硫酸ナトリウム、0.05%のアジ化ナトリウム、pH7.0で慣らし運転したTosoh TSK3000GWxLカラムで構成された。
【０２８１】
サイズ排除クロマトグラフィー・ステップで精製したチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）及びチオトランスフェリン（S415C、T613A）調製物を2つに分割した。一方のサンプルを、フルオレセイン-5-マレイミドを使用してフルオレセインと結合させ、もう片方のサンプルを、「非結合」チオトランスフェリン・サンプルとして保存した。
【０２８２】
フルオレセイン結合型チオトランスフェリン・サンプル（S28C、S415A、T613A）を、チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）に約15倍モル過剰のフルオレセイン-5-マレイミドを加え、それを、周囲温度（21〜25℃）にて75分間混合することによって準備した。
【０２８３】
フルオレセイン結合型チオトランスフェリン・サンプル（S415A、T613A）を、チオトランスフェリン（S415A、T613A）に約15倍モル過剰のフルオレセイン-5-マレイミドを加え、それを、周囲温度（21〜25℃）にて110分間混合することによって準備した。
【０２８４】
フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）及び非結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）、フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）調製物を、それぞれ2つのサンプルに分割した。一方のサンプルを、鉄負荷ステップにかけたが、もう片方のサンプルを鉄を取り除くステップにかけた。
【０２８５】
サイズ排除クロマトグラフィー・ステップでさらに精製された、鉄不含組み換えフルオレセイン結合型チオトランスフェリン・タンパク質又は組み換え非結合型チオトランスフェリン・タンパク質を調製するために、前記サンプルを、0.1Mのクエン酸ナトリウム、0.1Mの酢酸ナトリウム、10mMのEDTA pH4.5中で周囲温度にて最低180分間インキュベートし、続いて、外れた鉄を除去するために、まず水に対して、次に100mMのHEPES、10mMの炭酸ナトリウム・バッファー pH8.0に対して限外濾過した。
【０２８６】
鉄不含チオトランスフェリン突然変異タンパク質サンプルを準備した：鉄不含フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、鉄不含非結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、鉄不含フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）、及び鉄不含非結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）。これらのサンプルを、実施例13、14、及び16でさらに分析した。
【０２８７】
実施例3に記載の鉄負荷（ホロ化）手順を、サイズ排除クロマトグラフィー・ステップでさらに精製された、鉄負荷した組み換えフルオレセイン結合型チオトランスフェリン・タンパク質又は組み換え非結合型チオトランスフェリン・タンパク質を準備するのに使用した。重炭酸ナトリウムを、精製したフルオレセイン・チオトランスフェリン・サンプルに加えて、20mMの終濃度にした。2mol Fe3+.mol-1トランスフェリンを目標とした（10mg.mL-1のクエン酸鉄アンモニウムの形態（16.5〜18.5%Fe）での）鉄の量を計算し、組み換えトランスフェリン／20mMの重炭酸ナトリウム調製物に加え、そして周囲温度（21〜25℃）にて最低60分間混合し、続いて145mMのNaClに対して限外濾過した。
【０２８８】
こうして、4種類の鉄負荷チオトランスフェリン突然変異タンパク質サンプルを準備した：鉄負荷したフルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、鉄負荷した非結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、鉄負荷したフルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）、及び鉄負荷した非結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）。これらのサンプルを、実施例13、14、及び15でさらに分析した。
【０２８９】
実施例13：フルオレセイン結合型チオトランスフェリン変異体の質量分析
フルオレセイン結合型組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）及びフルオレセイン結合型組み換えチオトランスフェリン（S415C、T613A）を、ESITOF質量分析法によって分析し、そして組み換えチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）及び組み換えチオトランスフェリン（S415C、T613A）のそれと比較した。鉄負荷（ホロ）チオトランスフェリンと鉄不含（アポ）チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）の両方、及びチオトランスフェリン（S415C、T613A）調製物を分析した。鉄不含チオトランスフェリン・サンプル（データ未掲載）は、鉄負荷（ホロ）サンプルと同等な結果を示した。
【０２９０】
実施例12で調製したフルオレセイン結合型と非結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）及びチオトランスフェリン（S415C、T613A）のサンプルを、実施例9に記載のプロトコールを使用した質量分析法のために準備した。
【０２９１】
図26は、非結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体、及びフルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。スペクトルAは、チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A））の質量スペクトルを示す。チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）の質量分光分析は2つのピークを示す。第28の位セリン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、1個の遊離チオールが存在するようにその分子が折り畳まれるとき、75114の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図26に「A」と印を付けた）は、75111の整数質量（理論上の質量75114Da）を有する修飾されていない分子に対応するピークである。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きなピーク（図26に「B」と印を付けた）が存在する。これは多分O-結合型グリコシル化を表す。スペクトルBは、フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）の質量スペクトルを示す。フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S145A、T613A）の質量分析は、2つのピークを示す。第28位のセリン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、遊離チオール基に結合したフルオレセイン分子が存在するように分子が折り畳まれるとき、75541の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図26に「A」と印を付けた）は、75555の整数質量（理論上の質量75541Da）を有するフルオレセイン結合型分子に対応するピークである。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きなピーク（図26に「B」と印を付けた）が存在する。これは多分O-結合型グリコシル化を表す。
【０２９２】
図27は、非結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体及びフルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。スペクトルAは、チオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。第415位のセリン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、遊離チオール基に結合したフルオレセイン分子が存在するように分子が折り畳まれるとき、75130の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図27に「A」と印を付けた）は、75126の整数質量（理論上の質量75130Da）を有する修飾されていない分子に対応するピークである。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きなピーク（図27に「B」と印を付けた）が存在する。これは多分O-結合型グリコシル化を表す。スペクトルBは、フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。第415位のセリン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、1個の遊離チオールが存在するようにその分子が折り畳まれるとき、75557の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図27に「A」と印を付けた）は、75574の整数質量（理論上の質量75557Da）を有するフルオレセイン結合型分子に対応するピークである。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きなピーク（図27に「B」と印を付けた）が存在する。これは多分0-結合型グリコシル化を表す。
【０２９３】
実施例14：エルマン試薬（5’5’-ジチオ-ビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB）で処理したフルオレセイン結合型チオトランスフェリン変異体の質量分析
フルオレセイン-5-マレイミド試薬が、フルオレセイン結合型チオトランスフェリンを作り出すためのチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体及びチオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体上の遊離チオール基と反応したことを確認するために、そのフルオレセイン結合型チオトランスフェリン変異体サンプルを、実施例10に記載の遊離チオール・アッセイを使用してアッセイし、そして「非結合型」チオトランスフェリン・サンプルの質量スペクトルと比較した。
実施例10に記載のとおり、サンプルをDTNBで処理し、そして質量分析のために準備した。
【０２９４】
図28は、DTNBで処理した、非結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体及びフルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。スペクトルAは、DTNBで処理したチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）の質量スペクトルを示す。チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）の質量分光分析は、2つのピークを示す。第28位のセリン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、1molのNTBがチオール基に結合するようにその分子が折り畳まれるとき、75311の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図28に「A」と印を付けた）は、75307の整数質量（理論上の質量75311Da）を有する修飾されていない分子に対応するピークである。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きなピーク（図28に「B」と印を付けた）が存在する。これは多分0-結合型グリコシル化を表す。
【０２９５】
スペクトルBは、DTNBで処理したフルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）の質量スペクトルを示す。フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）の質量分析は、2つのピークを示す。第28位のセリン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、遊離チオール基に結合したフルオレセイン分子が存在するようにその分子が折り畳まれるとき、75541の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図28に「C」と印を付けた）は、75561の整数質量（理論上の質量75541Da）を有するフルオレセイン結合型分子に対応するピークである。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きなピーク（図28に「D」と印を付けた）が存在する。これは多分O-結合型グリコシル化を表す。このスペクトルは、DTNBの不存在下で見られたものと同等であり（図26）、DTNBの添加が197Daのさらなる質量シフトをもたらさないので、フルオレセインがセリン-28の遊離チオール基を通して結合されることを示唆している。
【０２９６】
図29は、DTNBで処理した、非結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体及びフルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）変異体の質量スペクトルを示す。
【０２９７】
スペクトルAは、DTNBで処理したチオトランスフェリン（S415C、T613A）の質量スペクトルを示す。チオトランスフェリン（S415C、T613A）の質量分光分析は、2つのピークを示す。第28位のセリン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、1molのNTBがチオール基に結合するようにその分子が折り畳まれるとき、75327の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図29に「A」と印を付けた）は、75328の整数質量（理論上の質量75327Da）を有する修飾されていない分子に対応するピークである。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きなピーク（図29に「B」と印を付けた）が存在する。これは多分O-結合型グリコシル化を表す。
【０２９８】
スペクトルBは、DTNBで処理したフルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）の質量スペクトルを示す。フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）の質量分析は、2つのピークを示す。第415位のセリン残基がシステインへと修飾されていて、且つ、38個のシステイン残基がジスルフィド結合し、遊離チオール基に結合したフルオレセイン分子が存在するようにその分子が折り畳まれるとき、75557の質量が予想される。この場合、最も大きな単一ピーク（図29に「C」と印を付けた）は、75573の整数質量（理論上の質量75557Da）を有するフルオレセイン結合型分子に対応するピークである。単回ヘキソース添加に関して予想される162ダルトンのインクリメントを持つ大きなピーク（図29に「D」と印を付けた）が存在する。これは多分O-結合型グリコシル化を表す。このスペクトルは、DTNBの不存在下で見られたものと同等であり（図27）、DTNBの添加が197Daのさらなる質量シフトをもたらさないので、フルオレセインがセリン-415の遊離チオール基を通して結合されることを示唆している。
【０２９９】
DTNB処理した、チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）及びチオトランスフェリン（S415C、T613A）の質量分光分析は、チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）及びチオトランスフェリン（S415C、T613A）が1つの遊離チオールを持つことを裏付けたが、その一方で、フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）及びフルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）は、同じ実験条件下でDTNBを使用しても標識されず、フルオレセイン-5マレイミドが遊離チオールを通してチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）及びチオトランスフェリン（S415C、T613A）を標識することを実証している。
【０３００】
実施例15：（SPRによって計測される）トランスフェリン受容体結合性
実施例12に記載のとおり発現させ、精製し、そして定量化したチオトランスフェリン突然変異タンパク質及びフルオレセイン結合型チオトランスフェリン突然変異タンパク質を、実施例8に記載のものと同じプロトコールを使用した表面プラズモン共鳴法（SPR）によって計測されるトランスフェリン受容体結合能に関して比較した。
【０３０１】
フルオレセインと結合させたチオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）サンプルには、（SPRによって計測される）トランスフェリン受容体に結合する能力があった。実施例8のSPR分析によるトランスフェリン受容体結合性の計測は、セリン28などの選択された残基のシステイン残基への修飾がトランスフェリンの全体構造を変更しないし、トランスフェリンのその受容体への結合も妨げないことを示した。
【０３０２】
同様に、フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）サンプルには、SPR分析によると、非結合型サンプルと同じ様式でトランスフェリン受容体に結合する能力があった。実施例8のSPR分析によるトランスフェリン受容体結合性の計測は、セリン415などの選択された残基のシステイン残基への修飾がトランスフェリンの全体構造を変更しないし、トランスフェリンのその受容体への結合も妨げないことを示した。
【０３０３】
この実施例は、生理活性分子がシステイン残基の硫黄原子を通してチオトランスフェリン突然変異タンパク質に結合されるとき、そのチオトランスフェリン突然変異タンパク質がトランスフェリン受容体に結合する能力を維持していることを実証している。
【０３０４】
実施例16：トランスフェリン受容体結合性
トランスフェリン受容体結合性は、赤白血病K562細胞における55Fe取り込み競合を測定することよって計測することができる。チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、チオトランスフェリン（S415C、T613A）、フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）のトランスフェリン受容体結合性を、トランスフェリン（S415A、T613A）及びヒト血漿由来アポ‐トランスフェリンのそれと比較した。
【０３０５】
チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）、チオトランスフェリン（S415C、T613A）、フルオレセイン結合型チオトランスフェリン（S415C、T613A）の鉄不含サンプルを、実施例11に記載のとおり等モル濃度（〜5mg/mL）にて準備し、そして実施例3に記載のプロトコールによって赤白血病K562細胞に55Feを供給するそれらの能力についてアッセイした。
【０３０６】
チオトランスフェリンはトランスフェリン受容体に結合すると見なされ、それはシステイン挿入のない対応するポリペプチドの受容体結合能の少なくとも5%を有する。
【０３０７】
トランスフェリン媒介性鉄取り込みについてアッセイするために、鉄を必要としている細胞モデルを選ばなければならない。すべての増殖性細胞が必須増殖因子として鉄を必要としているので、あらゆる成長の速い培養細胞株を使用できる。この種のアッセイのための古典的モデルは、ヒト赤白血病K562細胞株であり、それは、急性転化の状態にある慢性骨髄球性白血病に罹患している患者に由来する。この細胞型を用いた実験は、受容体を介したエンドサイトーシスの機構の解明に不可欠であった（Klausner et al., 1983）。［Klausner, R. D., Van Renswoude, J., Ashwell, G., Kempf, C., Schechter, A. N., Dean, A. & Bridges, K. R, (1983) Receptor-mediated endocytosis of transferrin in K562 cells. J Biol Chem 258,4715-4724］。
【０３０８】
受容体媒介性エンドサイトーシスを介した鉄取り込みは、トランスフェリンを放射性鉄（55Fe）で標識し、そして適切な細胞を異なった濃度の標識トランスフェリンと一緒にインキュベーションした後に、適切な時間間隔で細胞の放射能を計測することによって容易にアッセイできる。鉄取り込みは、厳密にエンドサイトーシス‐放出システムの作業が提供される時間とともに直線的に進行し、それは、計算データから容易に見ることができる。
【０３０９】
取り込みの過程の非特異的成分は、大過剰の未標識二鉄トランスフェリンの添加によってアッセイできる。これらの条件下で計測された残留放射能は、非特異的取り込みによると説明できるので、それが合計から割り引かれる。組み換えトランスフェリン又はチオトランスフェリンからの非特異的結合とその結果生じた鉄取り込みが、天然トランスフェリンに比べて有意に高くてはいけない、さもなければ、それらは、制御されていない方法で鉄を細胞に供給し、細胞損傷の可能性につながる。
【０３１０】
受容体数が取り込み過程の制限因子であるので、計測された親和性と極大容量は、トランスフェリン受容体の結合親和性との結合部位の最大数を表すだろう。
【０３１１】
標識二鉄トランスフェリンからの鉄取り込みを、以下のとおり実施した。
標準的な条件下のRPMI細胞培地中で培養した（重炭酸塩緩衝化、5%のCO2、抗生物質、10%のウシ胎仔血清）、K562赤白血病細胞を、HEPESバッファー及び1mg/mlのウシ血清アルブミンを含む無血清培地で洗浄し、そしてこの培地中、1000万個の細胞／mlの濃度にて使用した。
【０３１２】
55Feで標識した、高まる濃度の血漿トランスフェリン又はそれぞれの組み換えトランスフェリンのサンプル（12.5、25、100、200、300、500、600、800、1200、1600、2000nM）を100μlの培地と混合した。50μlの細胞懸濁液の添加によって反応を開始させた。
【０３１３】
並行する同一実験の2連目を、百倍過剰の未標識二鉄トランスフェリンの存在下で実施して、非特異的結合を明らかにする。37℃にて25分後に、氷浴中への浸漬によって反応を止め、細胞懸濁液の30μLの3つのアリコートを新しい試験管に移し、細胞を冷たい状態で遠心分離し、そしてジエチルフタラート／ジブチルフタレートの油層の添加後に再び遠心分離した。上清を取り除き、細胞ペレットをカウンターバイアル中に移し、そして0.5MのKOH＋1%（v/v）のTriton X-100を用いて溶解させた。溶解物を、一晩の溶解後に1MのHClで中和し、Readysolvシンチレーション・カクテルと混合し、そしてPackard液体シンチレーション・カウンタでカウントした。
【０３１４】
鉄源として鉄ニトリロ三酢酸を使用して標準的な手順に従って、トランスフェリンに鉄を負荷した（Bates and Schlabach, 1973）。［Bates, G. W. and M. R. Schlabach (1973). 'The reaction of ferric salts with transferrin." J Biol Chem 248(9): 3228-32.］。
【０３１５】
結果をfmol55Fe/100万個の細胞として提供する。すべてのデータが、3つの実験の平均値±S.E.Mである。結果を表4で提供する。これらの結果から、すべてのトランスフェリン・サンプルが、トランスフェリン（S415A、T613A）対照のレベルの5%を超える、受容体媒介エンドサイトーシス（特異的な鉄取り込み）によって鉄をK562細胞に供給できる能力があることがわかった。Kd値が、トランスフェリン（S415A、T613A）が少なくとも血漿由来トランスフェリン対照と同様に受容体に結合することを示しているが、その一方、チオトランスフェリン（S28C、S415A、T613A）及びチオトランスフェリン（S415C、T613A）は、わずかに低い受容体結合性（すなわち、より高いKd値）しか有していないように見える。驚いたことに、フルオレセインのチオトランスフェリン変異体への結合は、この実験においてトランスフェリン受容体への結合するの減少を引き起こさなかった。
【０３１６】
【表７】
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【配列表フリーテキスト】
【０３１７】
配列表に対する言及
当該出願はコンピュータで読み込み可能な形態の配列表を含んでいる。前記のコンピュータで読み込み可能な形態のものを本明細書中に援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図５−１０】
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【図５−１１】
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【図５−１２】
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【図５−１３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図９−９】
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【図９−１０】
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【図９−１１】
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【図９−１２】
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【図９−１３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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