(57)【要約】  本発明は、液体中に存在する特定細胞から細胞材料を収集するための方法に関し、区画(105)中の上部開口部(106)を介する該区画中への液体の挿入ステップ(210)（前記区画は下部開口部(107)を有し、さらに前記開口部の間に、前記特定細胞の直径と他の細胞の直径の間の直径を有する微小孔を伴うフィルター(115)を備える）；液体の大部分と前記他の細胞がフィルターを介して流れる間のろ過ステップ(215)；ＤＮＡ及び/またはＲＮＡの溶解、及び増幅ステップ(230)；及び増幅された遺伝物質の前記フィルター上での回収ステップ(250)を含んで成る。
2010538672.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体中に存在する特定細胞の細胞材料を収集するための方法であって：
−区画(105)の上部開口部(106)を介する前記液体の前記区画中への挿入ステップ(210)、ここで前記区画は下部開口部(107)を有し、フィルター(115)は前記２つの開口部の間に位置し、その微小孔は前記特定細胞の直径と他の細胞の直径の中間の直径を有するものである、
−前記液体の大部分と前記他の細胞が前記フィルターを通過する間のろ過ステップ(215)、
−前記フィルター上に保持される細胞の溶解ステップ(230)、そして
−前記フィルター上で溶解される細胞からの細胞材料の回収ステップ(245、250)、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記溶解ステップの後に、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡの増幅ステップを含み、且つ前記回収ステップの間に、増幅された遺伝物質が前記溶解された細胞から回収されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅ステップの間に、均質な増幅が、ＤＮＡまたはＲＮＡの量的観点の維持をもたらすことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅されたＤＮＡが、少なくとも１つの標的療法に対する感受性または抵抗性をコードする遺伝子の少なくとも１つの突然変異を検出するためのマトリクスとして使用される間に、検出ステップ(265、270)をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅されたＤＮＡが、前記標的療法に対する感受性または抵抗性をコードする遺伝子の発現レベルの変化を検出するためのマトリクスとして使用される間に、検出ステップ(265、270)をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＲＮＡがｃＤＮＡに変換され、そして前記ｃＤＮＡが前記標的療法に対する感受性または抵抗性をコードする遺伝子の発現レベルを検出するために使用される間に、検出ステップ(265、270)をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
検出ステップ(265、270)の間に、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、リアルタイムにおいて行われることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
検出ステップ(265、270)の間に、少なくとも１つの前方及び逆方プライマー対が、予め決められた注目の配列を増幅するために使用されることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
検出ステップ(265、270)の間に、少なくとも１対のプローブが使用されることを特徴とする、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１対のプローブの２つのプローブが、２つの異なる蛍光色素と結合し、そして一方が突然変異した配列を認識し、また他方が正常配列を認識するように規定されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１対のプライマー及び１対のプローブが、以下の突然変異：
−エルロチニブ及びゲフィチニブに対する抵抗性をコードするＫ-ras遺伝子のG12D突然変異、
−エルロチニブ及びゲフィチニブに対する抵抗性をコードするＫ-ras遺伝子のG12V突然変異、
−エルロチニブ及びゲフィチニブに対する抵抗性をコードするＫ-ras遺伝子のG13C突然変異、及び
−エルロチニブ及びゲフィチニブに対する増加した感受性をコードするEGFR遺伝子のL858R突然変異、
の１つを検出するために適応されることを特徴とする、請求項７または８、及び請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
以下の配列：
−AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT、
−TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT、
−TTGGAGCTGGTGGCGT、
−TGGAGCTGATGGCGT、
−AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT、
−TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT、
−TTGGAGCTGGTGGCGT、
−TTGGAGCTGTTGGCGT、
−AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT、
−TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT、
−TTGGAGCTGGTGGCGT、
−TTGGAGCTGGTTGCGT、
−GCAGCATGTCAAGATCACAGATTT、
−CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT、
−CAGTTTGGCCAGCCCA及び
−CAGTTTGGCCCGCCCA
から少なくとも２つのプライマー及び／または少なくとも２つのプローブがあることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
回収ステップ(245、250)の前に、内部にセントラルモバイルパンチ(141)を含むピストン(140)が、区画(105)の上部開口部(106)に位置することを特徴とする、請求項１〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
セントラルモバイルパンチ(141)が、星型を有する先のとがった下端(142)を有することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ろ過ステップ(215)の後、且つ回収ステップ(245、250)の前に、区画(105)の内容物が、それぞれの区画(105)の下部開口部(107)を取り囲んでいるストリップ(120)の下に位置する膜を伴う下部開口部(107)を塞ぐことによって単離されることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
フィルター(115)が、親水性表面処理されるポリカーボネートにおいて作り出されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
フィルター(115)が、7.5 μmを中心とする孔直径を有することを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
液体中に存在する特定細胞の遺伝物質を収集するための装置であって、
−上部開口部(106)及び下部開口部(107) 、前記２つの開口部の間に位置し、微小孔が前記特定細胞の直径と他の細胞の直径の中間の直径を有するフィルター(115)を含む区画(105)、
−前記上部開口部を介する前記区画中への前記液体の挿入手段、
−液体の大部分と前記他の細胞を前記フィルターに通過させるろ過手段(111、112)、
−前記フィルター上に保持された細胞の溶解手段、及び
−前記フィルター上で溶解された細胞の細胞材料の回収手段、
を含むことを特徴とする装置。
【請求項１９】
以下の配列：
−AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT、
−TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT、
−TTGGAGCTGGTGGCGT、
−TGGAGCTGATGGCGT、
−AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT、
−TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT、
−TTGGAGCTGGTGGCGT、
−TTGGAGCTGTTGGCGT、
−AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT、
−TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT、
−TTGGAGCTGGTGGCGT、
−TTGGAGCTGGTTGCGT、
−GCAGCATGTCAAGATCACAGATTT、
−CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT、
−CAGTTTGGCCAGCCCA、及び
−CAGTTTGGCCCGCCCA
から少なくとも２つのプライマー及び／または２つのプローブを含むことを特徴とする、請求項１８に記載の装置において使用するための分子生物学キット。
【請求項２０】
請求項１８に記載の装置をさらに含むことを特徴とする、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィルター上に単離された細胞から増幅された遺伝物質を抽出し、そして  標的療法に対する感受性及び抵抗性をコードする遺伝子の突然変異並びに発現レベルを検出するための方法、装置及び分子生物学キットに関する。
【０００２】
具体的には、液体、特に血液中に存在する特定細胞からＤＮＡまたはＲＮＡを収集すること、及び均質に増幅することに適用される。
【０００３】
血液のいくつかの特定細胞、例えば腫瘍細胞または栄養膜細胞は、非常に低い濃度で存在するので、細胞病理学的分析のためには濃縮されなければならない。しかしながら血液細胞と比較するならば、それらはより大きなサイズである。
【背景技術】
【０００４】
ホルムアルデヒドを基礎とする固定緩衝剤を血液サンプルに適用して、探索される細胞を固定し、そしてその後に多孔質フィルターを介して得られる液体を通過させることは、例えばPCT/FR2006/00052の文書から公知である。その後にそのフィルターは、その中にある細胞を探索するために研究室において顕微鏡下で分析される。以後それらは、例えば遺伝子解析による分析のためにフィルター上にサンプル化される。しかしながらこの手順は、それに伴う時間、設備及び正確な作業を理由として、大規模で手頃な費用で再現され得ない。
【０００５】
これは、腫瘍細胞上と栄養膜細胞上で同時に行われる分子生物学的分析を可能にするだろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、所定の研究室試験に適合する条件下で、注目の細胞の細胞材料、特にＲＮＡ及びＤＮＡ、の大部分の収集を良好な条件において可能にすることを通してこれらの欠点を改善し、そしてこの要求に対処することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的を達成するために、本発明の第１の観点は、液体中に存在する特定細胞の細胞材料を収集するための方法を提供し、当該方法は、
−区画の上部開口部を介する当該区画中への液体の挿入ステップ（前記区画は下部開口部を有し、フィルターは２つの開口部の間に位置し、その微小孔は前記特定細胞の直径と他の細胞の直径の中間の直径を有する）、
−液体の大部分と前記他の細胞がフィルターを通過する間のろ過ステップ、
−フィルター上に保持された細胞の溶解ステップ、そして
−フィルター上で溶解された細胞からの細胞材料の回収ステップ、
を含んで成ることを特徴とする。
【０００８】
本発明の方法は、細胞材料を迅速且つ効率的に収集することを可能にする。
【０００９】
原則として、本発明を用いて回収された細胞材料は、細胞の遺伝物質である。したがって本発明の方法は、フィルター上で直接に、且つ単一の単離細胞に至るまで、希少細胞の遺伝物質の実質的に損失がない回収を可能にする。したがって高比率の遺伝物質が、所定の研究室試験に適合する条件下で、良好な条件において注目の細胞から回収される。
【００１０】
特定の特徴によれば、上記において簡潔に述べられた本発明の方法は、溶解ステップの後にＤＮＡ及び／またはＲＮＡの増幅ステップを含み、そして回収ステップの間に、増幅された遺伝物質は、溶解された細胞から回収される。
【００１１】
特定の特徴によれば、増幅ステップの間に、均質な増幅は、ＤＮＡ及びＲＮＡの量的観点を維持することを達成する。
【００１２】
特定の特徴によれば、上記において簡潔に定義された本発明の方法は、増幅されたＤＮＡが少なくとも１つの標的療法に対する感受性または抵抗性をコードする遺伝子の少なくとも１つの突然変異を検出するためのマトリクスとして使用される間の検出ステップをさらに含む。
【００１３】
特定の特徴によれば、上記において簡潔に定義された本発明の方法は、増幅されたＤＮＡが標的療法に対する感受性または抵抗性をコードする遺伝子の発現レベルの変化を検出するためのマトリクスとして使用される間の検出ステップをさらに含む。
【００１４】
特定の特徴によれば、上記において簡潔に定義された本発明の方法は、ＲＮＡがｃＤＮＡに変換され、且つ前記ｃＤＮＡが標的療法に対する感受性または抵抗性をコードする遺伝子の発現レベルを検出するために使用される間の検出ステップをさらに含む。
【００１５】
特定の特徴によれば、検出ステップの間に、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、リアルタイムにおいて実行される。
【００１６】
特定の特徴によれば、検出ステップの間に、少なくとも１つの前方及び逆方のプライマー対が使用されて、予め決められた注目の配列が増幅される。
【００１７】
特定の特徴によれば、検出ステップの間に、少なくとも１対のプローブが使用される。
【００１８】
特定の特徴によれば、１対のプローブの少なくとも２つのプローブが、２つの異なる蛍光色素と対になり、そして一方が突然変異した配列を認識し、また他方が正常配列を認識するように定義される。
【００１９】
特定の特徴によれば、少なくとも１対のプライマーと１対のプローブが適応されて、エルロチニブ及びゲフィチニブに対する抵抗性をコードするＫ-ras遺伝子のG12D突然変異が検出される。
【００２０】
特定の特徴によれば、少なくとも１つのプライマーは、配列AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATの少なくとも８０％を含む。
【００２１】
特定の特徴によれば、少なくとも１つのプライマーは、配列TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTの少なくとも８０％を含む。
【００２２】
特定の特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列TTGGAGCTGGTGGCGTの少なくとも８０％を含む。
【００２３】
特定の特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列TGGAGCTGATGGCGTの少なくとも８０％を含む。
【００２４】
特定の特徴によれば、少なくとも１対のプライマーと１対のプローブが適応されて、エルロチニブ及びゲフィチニブに対する抵抗性をコードするＫ-ras遺伝子のG12V突然変異が検出される。
【００２５】
特定の特徴によれば、少なくとも１つのプライマーは、配列AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATの少なくとも８０％を含む。
【００２６】
特定の特徴によれば、少なくとも１つのプライマーは、配列TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTの少なくとも８０％を含む。
【００２７】
特定の特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列TTGGAGCTGGTGGCGTの少なくとも８０％を含む。
【００２８】
特定の特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列TTGGAGCTGTTGGCGTの少なくとも８０％を含む。
【００２９】
特定の特徴によれば、少なくとも１対のプライマーと１対のプローブが適応されて、エルロチニブ及びゲフィチニブに対する抵抗性をコードするＫ-ras遺伝子のG13C突然変異が検出される。
【００３０】
特定の特徴によれば、少なくとも１つのプライマーは、配列AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATの少なくとも８０％を含む。
【００３１】
特定の特徴によれば、少なくとも１つのプライマーは、配列TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTの少なくとも８０％を含む。
【００３２】
特定の特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列TTGGAGCTGGTGGCGTの少なくとも８０％を含む。
【００３３】
特定の特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列TTGGAGCTGGTTGCGTの少なくとも８０％を含む。
【００３４】
特定の特徴によれば、少なくとも１対のプライマーと１対のプローブが適応されて、エルロチニブ及びゲフィチニブに対して増加した感受性をコードするEGFR遺伝子のL858R突然変異が検出される。
【００３５】
特定の特徴によれば、少なくとも１つのプライマーは、配列GCAGCATGTCAAGATCACAGATTTの少なくとも８０％を含む。
【００３６】
特定の特徴によれば、少なくとも１つのプライマーは、配列CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTの少なくとも８０％を含む。
【００３７】
特定の特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列CAGTTTGGCCAGCCCAの少なくとも８０％を含む。
【００３８】
特定の特徴によれば、少なくとも１つのプローブは、配列CAGTTTGGCCCGCCCAの少なくとも８０％を含む。
【００３９】
特定の特徴によれば、上記において簡潔に述べられた本発明の方法は、ろ過ステップの前に、ホルムアルデヒドが存在しない固定緩衝剤を、特定細胞を含む液体に適用するステップを含む。
【００４０】
これは、遺伝物質を分解させずに、探索される特定細胞を明確に硬化させる。
【００４１】
特定の特徴によれば、挿入ステップの間に、区画は、一般的なシリンジの形を有し、ここでのフィルターは、２つの開口部の間に位置する。
【００４２】
これらの特徴のおかげで、ピストンは、フィルターの位置を変更させずに上部開口部の中に適用され得る。
【００４３】
特定の特徴によれば、ろ過ステップの間に、吸引は、フィルターの下からの減圧によって適用される。これらの特徴のおかげで、ろ過は、吸引がない場合よりもより効果的、且つ迅速である。
【００４４】
特定の特徴によれば、ろ過ステップの後、且つ回収ステップの前に、区画は、エッペンドルフ管に覆いかぶせられる。これは、フィルターからエッペンドルフ管への直接的な経路を達成する。
【００４５】
特定の特徴によれば、回収ステップの前に、内側にセントラルパンチモバイルを含むピストンは、区画の上部開口部の中に位置する。
【００４６】
特定の特徴によれば、セントラルモバイルパンチは、星型を有する先のとがった下端を有する。
【００４７】
特定の特徴によれば、回収ステップの間に、圧力は、パンチの上部に適応されて、パンチの先端部によりフィルターに穴が空けられる。
【００４８】
特定の特徴によれば、ピストンは、パンチを縦方向に固定するための手段を含み、回収ステップの間に、パンチは、その上部に圧力がかけられる前に、ピストンの内側を旋回し、前記固定手段から離される。
【００４９】
特定の特徴によれば、回収ステップの間に、垂直下方への圧力がピストンにかけられ、区画の内容物を区画の下に位置する菅の中に移行させる。
【００５０】
これらのそれぞれの特徴のおかげで、特定細胞の細胞材料は、フィルター中の穿孔を通り抜けて損傷なく、抽出され得る。
【００５１】
特定の特徴によれば、ろ過ステップの後、且つ回収ステップの前に、区画の内容物は、膜を有する下部開口部を塞ぐことによって単離される。
【００５２】
特定の特徴によれば、前記膜は、それぞれの区画の下部開口部を取り囲んでいるストリップの下に位置する。これは、フィルター上方への溶解液の封じ込め及び保持を提供する。
【００５３】
特定の特徴によれば、前記膜は、接着性の膜である。
【００５４】
それぞれのこれらの特徴のおかげで、区画の内容物は、特定細胞の細胞材料のろ過と回収の間の環境から単離される。
【００５５】
特定の特徴によれば、回収ステップの間に、パンチの上部に圧力がかけられ、区画の内容物を単離する膜に穴を開ける。
【００５６】
特定の特徴によれば、フィルターは、親水性表面処理されるポリカーボネートにおいて作り出される。かかるフィルターを用いることは、特定細胞の保持を改良し、且つ回収される細胞材料の接着を減少させる。
【００５７】
特定の特徴によれば、フィルターは、7.5 μmを中心とする孔直径を有する。したがって直径のばらつきのために、実質的に8 μmを超える直径を有する孔はない。
【００５８】
細胞学的解析フィルターに慣用的に使用される孔の直径未満である、この孔直径を用いることは、さらに離れた孔間隔を可能にし、隣接する孔の数を減らし、且つ特定細胞の損失を阻む。
【００５９】
本発明の第２の観点は、液体中に存在する特定細胞の遺伝物質を収集するための装置を提供し、当該装置は、
−上部開口部及び下部開口部 、２つの開口部の間に位置し、微小孔が前記特定細胞の直径と他の細胞の直径の中間の直径を有するフィルターを含む区画、
−上記開口部を介する液体の前記区画中への挿入手段、
−液体の大部分と前記他の細胞をフィルターに通過させるろ過手段、
−フィルター上に保持された細胞の溶解手段、及び
−フィルター上で溶解された細胞の細胞材料の回収手段
を含んで成ることを特徴とする。
【００６０】
本発明の第３の観点は、以下の配列：
−AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT、
−TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT、
−TTGGAGCTGGTGGCGT、
−TGGAGCTGATGGCGT、
−AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT、
−TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT、
−TTGGAGCTGGTGGCGT、
−TTGGAGCTGTTGGCGT、
−AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT、
−TCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT、
−TTGGAGCTGGTGGCGT、
−TTGGAGCTGGTTGCGT、
−GCAGCATGTCAAGATCACAGATTT、
−CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT、
−CAGTTTGGCCAGCCCA及び
−CAGTTTGGCCCGCCCA.
から、少なくとも２つのプライマー及び／または２つのプローブを含む分子生物学キットを提供する。
【００６１】
特定の特徴によれば、上に簡潔に述べられた本発明のキットは、上記において簡潔に定義された本発明の装置をさらに含む。
【００６２】
上記において簡潔に述べられた本発明の方法のものと類似する本装置及び本キットの利点、目的及び特徴は、ここでは取り上げない。
【００６３】
本発明の他の利点、目的及び特徴は、添付の図面を参照して、限定のない説明の方法によって供される以下の説明から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、本発明の方法の第１段階において使用される本発明の装置の２つの特定の態様の部分を遠近法において図式的に表し、
【図２】図２は、本発明の方法の第１段階において使用される本発明の装置の２つの特定の態様の部分を断面図において図式的に表し、
【図３】図３は、本発明の装置の第１の特定の態様の部分を遠近法において図式的に表し、
【図４】図４は、本発明の装置の第１の特定の態様の部分を正面図において図式的に表し、
【図５】図５は、本発明の装置の第１の特定の態様の部分を断面図において図式的に表し、
【図６】図６は、本発明の装置の第２の特定の態様の部分を遠近法において図式的に表し、
【図７】図７は、本発明の装置の第２の特定の態様の部分を断面図において図式的に表し、
【図８】図８は、本発明の方法の第２段階において使用される本発明の装置の２つの特定の態様の部分を遠近法において図式的に表し、及び
【図９】図９は、本発明の方法の１つの特定の態様において実行されるステップをフローチャート形式において表す。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
図１及び２において見られるように、これらの図中に示される２つの態様において、細胞材料、ここでは遺伝物質を収集するための装置は、それぞれ上部開口部106と下部開口部107を有するシリンジの形態にある複数（ここでは４つ）の区画105を含む。下部開口部107の中に設置された座金またはリング118は、フィルター115を保持する。フィルター115は極小の穴が開けられ、そして座金またはリング118につけられ、そしてその後にシリンジの形態にある４つの区画105の遠位末端に、すなわち底に差し込まれる。例えばフィルター115は、親水性表面処理によりポリカーボネートにおいて作り出される。かかるフィルターの使用は、特定細胞の保持率を改善させ、且つ回収される細胞材料の接着を減少させる。フィルター115は、例えば7.5 μmを中心とする孔直径を有する。直径のばらつきのせいで、実質的には8 μmを超える直径を有する孔はない。
【００６６】
それぞれの区画105の小さな開口部、または下部開口部に、封鎖方法においてチップ117が置かれ、容器112からのしぶきによる区画105の末端の汚染可能性を防ぐ。これらの区画105は、プラスチック材料ストリップ116によって一緒に集められて、単一の部分を構成する。本方法において作り出される４つの区画105、上部ストリップ116、４つのピストン140及びプラグストリップ120（後述）の組み合わせは、使い捨てできる。
【００６７】
細胞材料を収集するための方法の第１段階では、区画105は、プレート110の下面の下で容器112に連結された区画を含む支持体111の中に挿入されたプレート110によって支持され、それを介して吸引がもたらされ得る。O-リング113は、チップ117とプレート110の間の連結を封鎖する。O-リング114は、プレート110と支持体111の間の連結を封鎖する。O-リング113及び114によって提供される封鎖は、区画の内容物の吸引を可能にする。
【００６８】
容器112を介する吸引の間に、区画105の中に存在する液体のいくつかの特定細胞のうち、より直径の大きいものは、フィルター115によって保持されるのに対して、液体の大部分及び小さい細胞は、フィルター115を介して区画105の外に吸引される。
【００６９】
細胞材料を回収するための方法の第１段階の終わりに、区画105は、図１及び２において示される装置の部分から取り除かれ、そしてチップ117は、区画105の下部開口部から取り除かれる。その後にプラグストリップ120は、シリンジの形態にある区画105のチップの中に挿入される。このストリップは、区画の下端でチップを受ける４つの穿孔を有する。プラスチックフィルムは、プラグストリップ120の下面に貼られ、そして流体密封、好適には接着性の膜を構成する。
【００７０】
このようにして区画105の内容物は、特定細胞の細胞材料が回収されるまで環境から単離される。
【００７１】
本方法の第２段階の間に、プラグストリップ120に付随する区画105を担持するストリップ116は、プラスチック材料のラック133の上に置かれる。その後に区画105の中に存在する細胞は、オーブンの中で溶解される。この目的を達成するために、探索される細胞の細胞膜を溶解するための、及びＤＮＡまたはＲＮＡを均質に増幅するための試薬の添加後に、区画105を垂直に保つラック133は、オーブンの中に運ばれる。オーブンから離れ、冷却後、エッペンドルフ管がホルダー130の下部支持体131の上に置かれる。プラグストリップ120に付随する区画105を担持するストリップ116は、ホルダー130の上に置かれ、そしてホルダー130は、下部支持体131の上に置かれる。
【００７２】
その後にポイント142で終結する中心軸パンチ141を備えるピストン140は、それぞれの区画105の上部開口部106を介して挿入される。セクションにおけるこのポイント142は、好適には、例えば４つの枝を伴う星型を有し、その場合には十字型になる。
【００７３】
ホルダー130の棚のような部分付近の位置で保持されるエッペンドルフ菅125は、それぞれの区画105の下方に置かれる。
【００７４】
図３及び４は、本方法の第２段階の間のピストン140及びパンチ141のそれぞれの連続する位置を示す。これら図３及び４のそれぞれ左側のピストン140及びパンチ141は、区画106の実質的に完全に外側にあり、且つパンチ141の上部は、ピストン140の垂直上に突き出る。
【００７５】
その後に回転の適用によって、パンチは、安全な位置に動かされる。ここでのパンチ141は、当該パンチがピストン140の内側に縦方向に滑ることができる駆動位置に対する力学的な隣接のために、ピストン140の内側に縦方向に滑ることができない。その後に下方垂直力がパンチ141の先端にかけられ、このパンチ141のポイント142をフィルター115に向かって、区画106の本体の中に降下させる。この降下が継続すると、ポイント142は、管125の中にわずかに突き抜けるまで、最初にフィルター115を貫通し、そしてその後に膜120を貫通する。その後にパンチ141は、区画105の下部開口部との接触によって、適所に保持される。最終的に図３及び４の右側に示されるように、区画105の内容物を管125に向かって押し込むために、パンチ142のポイントによってフィルター115の中、及び膜120の中に形成された穴を介して、適所に保持されたパンチ141によって下方への力がピストン140にかけられる。
【００７６】
その後にエッペンドルフ管は、これらの管125の中に収集され増幅された遺伝物質、特に注目の細胞のＤＮＡまたはＲＮＡの分析のために、ホルダー130の最上部、区画105及び膜120に向かって引き寄せられることによって、下部支持体131から取り除かれる。
【００７７】
プレート110、ラック133、ホルダー130及び支持体131は、再利用できることに留意すべきである。
【００７８】
第２の態様では、図１、２、６及び７において示されるホルダー130の支持体131は、４つの開口部の代わりに８つの開口部を有する支持体132に置き換えられる。４つのエッペンドルフ管125は、より少ない限度容量の、典型的に1.5 mlの代わりに0.25 mlの８つのエッペンドルフ管126のストリップによって置き換えられる。これらのエッペンドルフ管は、細胞材料を回収する他の方法にも適合し、増幅された遺伝物質をフィルター上で直接的だが少容量で抽出することを可能にする。ひいてはかかる容量は、リアルタイムの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)に適しているエッペンドルフ管の中に直接含ませることができる。８つのエッペンドルフ管が使用される場合は、４つの管は増幅された遺伝物質を収集するために使用され、そして４つの管はポジティブまたはネガティブコントロールを生み出すために使用されることに留意すべきである。
【００７９】
図９において見られるように、本発明の方法は、第１に当業界において公知の方法において、適宜希釈またはろ過され、分析される液体、例えば血液をサンプリングするステップ200を含む。
【００８０】
ステップ205の間に、特に探索される特定細胞を、それらの遺伝物質を分解させずに、固定、すなわち固めるために、ホルムアルデヒドが存在しない固定緩衝剤が適用される。
【００８１】
この固定緩衝剤は、例えば“PBS”、リン酸緩衝剤、カルシウムキレート剤ETDAの細胞の形態を保つためのウシ血清アルブミン(BSA)の赤血球を溶解するためのサポニン、pHを7.2に調節するための水酸化ナトリウム(NaOH)、及びRCL2、それらの遺伝物質を分解しない細胞固定剤から成る。ホルムアルデヒドは、遺伝物質の破壊を導くので使用されないことに留意すべきである。
【００８２】
ステップ210の間に、ステップ205から得られる液体は、探索される細胞の直径と液体サンプルの他の細胞の直径の間の直径を有する微小孔を伴うフィルターの中で終わる区画105の中に置かれる。或いは、ステップ205の固定は、ステップ210の後に、区画105の内側にもたらされる。
【００８３】
ステップ215の間に、吸引は、フィルター下での減圧によって適用される。その後に液体の大部分及びフィルター115の孔よりも小さい直径の細胞は、フィルター115を通過する。一方、フィルター115の孔の直径に満たない直径の探索される細胞は、区画105の中のフィルター115の上に保持される。
【００８４】
ステップ220の間に、区画は、プレート110から取り除かれ、チップ117は、区画105から取り除かれ、そして区画105の中に残存する内容物は、接着性の膜120によって下の部分が覆われたプラグストリップによって下部開口部を塞ぐことによって単離される。
【００８５】
ステップ225の間に、プラグストリップ120及びストリップ116に付随する区画105は、ラック133に挿入され、ストリップ116は、このラック133によって保たれている。
【００８６】
ステップ230の間に、フィルター上に保持された細胞は、公知の技術によって溶解される。この目的を達成するために、探索される細胞の細胞膜を溶解し、且つ遺伝物質を均質に増幅して量的観点を維持するための試薬が添加された後に、区画105を垂直に保持するラック133は、公知の期間オーブンの中に保たれる。
【００８７】
オーブンから取り出された後に、ステップ232の間に、ストリップ116、区画105及びプラグストリップ120は、ラック133から取り除かれ、そしてホルダー130の上に置かれる。
【００８８】
ステップ235の間に、それぞれの区画105は、下部支持体131または132の上に各々設置されるエッペンドルフ管125または126に覆いかぶさり、その後にストリップ116を伴うホルダー130、区画105及びプラグストリップ120は、各々下部131または132の上に置かれる。
【００８９】
ステップ240の間に、ピストン140に対して可動性である中心軸パンチ141及び区画105の内側のポイント142で終端を備えるピストン140は、それぞれの区画105の上部開口部106を介して挿入される。交差セクションでは、このポイント142は、好適には、例えば４つの枝を伴う星型を有し、その場合にはポイントは十字型になる。
【００９０】
ステップ245の間に、パンチは、その安全な位置から解除される。その後にパンチ141の上部に圧力がかけられて、ピストン140に導かれて区画105の縦軸に沿って降ろされる。この縦運動の間に、パンチ141のポイント142は、フィルター115及びプラグまたは接着性の膜120に連続的に穴を開ける。
【００９１】
ステップ250の間に、区画105の残存内容物が、パンチ141のポイント142を囲む開口部を介して、フィルター115及びプラグまたは膜120を通過し、そしてエッペンドルフ管に到達するように、ピストン140の残りの部分に圧力がかけられる。
【００９２】
このようにして特定細胞の遺伝物質は、フィルター中の貫通を介する損傷を受けずに抽出される。
【００９３】
ステップ255の間に、支持体131または132及びエッペンドルフ管125または126は、区画105及び膜120を取り除いた後に、ホルダー130の最上部を介して取り除かれる。
【００９４】
ステップ265及び270の間に、探索され、これらの管125または126の中に収集される細胞の遺伝物質、特にＤＮＡまたはＲＮＡの分析が達成される。増幅されたＤＮＡは、標的治療に対する感受性または抵抗性における突然変異を検出するためのマトリクスとして使用される。さらに、或いは、ＲＮＡからＲＴ変換によって生み出され、そしてその後に増幅される相補ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)は、標的療法に対する感受性または抵抗性をコードする遺伝子の発現レベルを検出するためのマトリクスとしても使用される。
【００９５】
規定容量の増幅された遺伝物質、特にＤＮＡはサンプル化されて、リアルタイムの定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の間に、前方及び逆方のプライマー対及びプローブ対を用いて、標的療法に対する感受性または抵抗性における突然変異が検出される。
【００９６】
示された態様において使用される標的療法に対する感受性または抵抗性における突然変異の探索の原理は、以下の通りである。遺伝子レベルでの局所的な突然変異の有無に関する情報は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）遺伝子型分析によって提供される。ＳＮＰ遺伝子型分析の第１ステップ265は、２つのプライマーを用いて、注目の配列と２つのプローブ、例えばＴａｑＭａｎ(商標)タイプを増幅するリアルタイムの定量ＰＣＲである。一方のプローブは、突然変異した配列を認識し、そして他方のプローブは、正常配列を認識する。２つのプローブには、異なる蛍光色素、例えば正常配列とハイブリダイズするプローブにはＶＩＣ、そして突然変異した配列とハイブリダイズするプローブにはＦＡＭが結合している。第２のステップ270は、ＦＡＭ及び／またはＶＩＣ蛍光色素によって放射される最初の蛍光と最後の蛍光を測定するＳＮＰ遺伝子型分析プログラムを用いる。本プログラムは、それぞれのサンプル中に存在する多様な配列間に差異を作ることを可能にする：
−ＶＩＣのみの蛍光の増加は、正常配列のホモ接合体プロファイルを示し、
−ＦＡＭのみの蛍光の増加は、突然変異した配列のホモ接合体プロファイルを示し、
−ＶＩＣ及びＦＡＭの両方の蛍光の増加は、ヘテロ接合体プロファイルを示す。
【００９７】
プライマー及びプローブ（前方及び逆方、5’から3’）の以下の配列は、例えば以下の突然変異を検出するために使用される。
【００９８】
エルロチニブ及びゲフィチニブに対する抵抗性をコードするＫ-ras遺伝子のG12D突然変異については：
−前方プライマーAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT、
−逆方プライマーTCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT、
−”天然”プローブ、色”ＶＩＣ”TTGGAGCTGGTGGCGT、
−”突然変異”プローブ、色”ＦＡＭ”TGGAGCTGATGGCGT。
【００９９】
エルロチニブ及びゲフィチニブに対する抵抗性をコードするＫ-ras遺伝子のG12V突然変異（”12”をコードする）については：
−前方プライマーAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT、
−逆方プライマーTCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT、
−”天然”プローブ、色”ＶＩＣ”TTGGAGCTGGTGGCGT、
−”突然変異”プローブ、色”ＦＡＭ”TTGGAGCTGTTGGCGT。
【０１００】
エルロチニブ及びゲフィチニブに対する抵抗性をコードするＫ-ras遺伝子のG13C突然変異については：
−前方プライマーAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT、
−逆方プライマーTCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCT、
−”天然”プローブ、色”ＶＩＣ”TTGGAGCTGGTGGCGT、
−”突然変異”プローブ、色”ＦＡＭ”TTGGAGCTGGTTGCGT。
【０１０１】
エルロチニブ及びゲフィチニブに対する増加した感受性をコードするEGFR遺伝子のL858R突然変異については：
−前方プライマーGCAGCATGTCAAGATCACAGATTT、
−逆方プライマーCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT、
−”天然”プローブ、色”ＶＩＣ”CAGTTTGGCCAGCCCA、
−”突然変異”プローブ、色”ＦＡＭ”CAGTTTGGCCCGCCCA。
【０１０２】
“前方”、”逆方”、及び”5”から”3”の意味は、当業者に周知である。プローブは、２つのプライマー間で適合し、そしてそれらの関連した蛍光色の効力によって突然変異の有無を明らかにする。色ＦＡＭは、青色の範囲にあり、そして色ＶＩＣは、緑色の範囲にある。ＰＣＲ装置によるそれぞれのこれらの色における蛍光強度の測定は、正常遺伝子、突然変異ホモ接合体遺伝子、及び突然変異ヘテロ接合体遺伝子を識別する。例えば50回の増幅サイクルで達成される。
【０１０３】
他の態様では、規定容量の遺伝物質、特にＲＴ（逆転写）によってｃＤＮＡに変換され、そして増幅されたＲＮＡはサンプル化されて、前方及び逆方プライマー対及びプローブを用いて、且つリアルタイム、例えば50サイクルの定量ＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応)の間に、標的療法に対する感受性または抵抗性をコードする遺伝子の発現レベルが検出される。
【０１０４】
上記を読んだ後に明確になるように、本発明の方法、装置及びキットは、サンプルが探索される細胞を１つのみ含む場合であっても、所定の研究室試験に適合する条件下で、注目の細胞の遺伝物質の大部分の収集及び増幅を、良好な条件において可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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