(57)【要約】  キク（Asteraceae）科、例えば、ヒマワリなどの植物種由来の種子材料のタンパク質分解物は、真核細胞、特に動物細胞の培養のための培地の構成成分として改善した性質を有する。当該種子材料は脱脂され、10〜50％の程度まで加水分解され、その後、不溶性物質から分離される。当該細胞は特に所望のタンパク質生成物を産生するために培養される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリアンサス（Helianthus）、カルサマス（Carthamus）又はベルノニア（Vernonia）属の植物種由来のタンパク質含有種子材料の加水分解物の真核細胞を培養するための培地における使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、当該植物種がヘリアンサス属、特にＨ．アンヌス（H. annuus）種由来である使用。
【請求項３】
請求項１または２に記載の使用であって、当該種子材料が加水分解の前に脱脂されている使用。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の使用であって、当該加水分解物が５〜５０％の加水分解率を有する使用。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の使用であって、動物細胞を培養するための使用。
【請求項６】
ヘリアンサス、カルサマス又はベルノニア属の植物種由来の脱脂された種子材料の加水分解物を乾燥重量基準で2〜80重量%含み、さらに少なくともサイトカイン及び／又は成長因子を含む、真核細胞を培養するための培地。
【請求項７】
請求項６に記載の培地であって、当該培地は液体であり、0.01〜4.0重量／体積%の加水分解物を含む培地。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の培地であって、さらに、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、ヌクレオチド、植物ホルモン、糖類、抗生物質、ヘリアンサス、カルサマス又はベルノニア属の植物種由来の脱脂された種子材料の加水分解物以外のタンパク質加水分解物から選択される他の慣習的な培地の構成成分を含む培地。
【請求項９】
0.05〜1.0重量／体積%、好ましくは0.1〜0.6重量／体積%のヘリアンサス、カルサマス又はベルノニア属の植物種由来の脱脂された種子材料の加水分解物を含む、真核細胞を培養するための液体培地。
【請求項１０】
ヘリアンサス、カルサマス又はベルノニア属の植物種由来の種子材料の加水分解物を含有する培地中で前記細胞を増殖させることを含む、インビトロで真核細胞を培養する方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、当該真核細胞が動物細胞、好ましくは哺乳類細胞及び／又は昆虫細胞を含む方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の方法であって、当該培地がさらに少なくとも小麦、大豆又はエンドウマメタンパク質の加水分解物を含む方法。
【請求項１３】
所望のタンパク質生成物を製造する方法であって、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法を使用して当該タンパク質生成物を産生する真核細胞を培養すること、及び当該培地から当該タンパク質生成物を回収することを含む方法。
【請求項１４】
ヘリアンサス、カルサマス又はベルノニア属の植物種のタンパク質含有種子材料の加水分解物を含有する組成物、並びにサイトカイン、成長因子、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、ヌクレオチド、植物ホルモン、糖類、及び抗生物質から選択される一つ又は一つ以上の培地の構成成分を含有する組成物を含む真核細胞培養において使用するためのキットであって、当該組成物が使用の前に混合されるキット。
【請求項１５】
請求項１３に記載のキットであって、当該組成物の少なくとも一つが液体であって、この液体は任意で殺菌されるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞、特に動物細胞の培地用のタンパク源の製造、並びにそのようにして製造される細胞培地及び、真核細胞、特に動物細胞のインビトロの培養のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
価値ある生物化学物質、生物医薬品、例えば、抗体及び抗生物質の製造、これは哺乳類、植物、または昆虫細胞を培養することによるが、適切な培地を必要とする。細胞培養液の処方は、一連の添加剤、これは定義されていない成分、例えば、ウシ胎仔血清 (FCS)、いくつかの動物由来のタンパク質及び／又はウシ由来のタンパク質加水分解物を含むが、これらにより補充されてきた。
【０００３】
血清又は血清由来の物質、これらは例えば、アルブミン、トランスフェリン、又はインスリンであり、動物細胞の培養で使用されるが、培養物及びこれらから得られるバイオ医薬品生成物を汚染する(contaminate)可能性のある望ましくない作用物質を含んでもよい。さらに、ウシ由来のタンパク質生成物、例えば、加水分解された乳タンパク質、又はウシの肉若しくはコラーゲン加水分解物はBSE汚染の危険性を有する。さらに、ヒト血清由来の添加物は、既知のすべてのウイルス、これは血清によって感染する可能性のある肝炎およびHIVを含む、について検査されなければならない。
【０００４】
結論として、あらゆる血清由来生成物が未知の作用物質により汚染される可能性がある。細胞培養物中のヒトまたは他の動物源に由来する血清又はタンパク質添加物の場合、数多くの問題（例えば、変動する品質及び異なるバッチの組成、並びにウイルス、マイコプラズマ又はBSEによるコンタミネーションのリスク）を生じる可能性がある。したがって、植物性タンパク質加水分解物又は植物性ペプトンは一般に、動物性成分を含むべきではない培地中で使用される。
【０００５】
しかしながら、動物由来の細胞培養添加剤を含まない培地中での動物細胞の増殖は、必ずしも満足できるものであるとは限らない。インビトロで培養される動物細胞は塊になって増殖することが頻繁に観察される。これは、当該塊の中心の細胞から栄養物が奪われ死ぬため、最適以下の条件であると考えられる。さらに、後続の処理の間にチューブまたはフィルターが詰まるリスクもある。当該細胞の低下した生存能力もまた、それらの外観によって評価されてもよい。低下した生存能力を有する細胞は、不規則な形状、すなわち非円形の形状であり、さらに「粒状の」細胞含有物を有し、これは完全に明るく透明な細胞含有物を有する健康な細胞とは対象的である。
【０００６】
US 2004/0185561、内容は参照によりここに組み込まれるが、様々な植物の種子、これはピーナッツ、アーモンド、ヘーゼルナッツ、トウモロコシ、大豆、ヒマワリ等を含む、の非加水分解抽出物の細胞培地中のサプリメントとしての使用について記載する。その中で、ピーナッツ抽出物、特にピーナッツ抽出物とジャガイモ抽出物との組み合わせが、動物細胞の増殖に最も効果的であると結論付けられる。また、US2004/185561において、高分子量の画分（100,000 Daよりも大きい）が植物の種子の抽出物の増殖活性に関与するとも結論付けられる。
【０００７】
Ikram-Ul-Haq et al. (Proceedings of Pakistan Congress of Zoology 24 (2004) 67-75)、内容は参照によりここに組み込まれるが、これは非加水分解ヒマワリ粉を使用するバシルス・スブチリス（Bacillus subtilis）による中性プロテアーゼの製造のための液内発酵パラメータの最適化について記載する。
【０００８】
Postemsky et al. (Micologia Aplicada Int. 18 (2006) 7〜12)、内容は参照によりここに組み込まれるが、これは特定のキノコを増殖させるために、温度、pH並びにキビ及びヒマワリ種子の外皮の寒天培地に対する影響と、温度及びヒマワリ種子の培地の液体培地に対する影響について調べる。当該ヒマワリ種子は、脱脂も加水分解もされていない。
【０００９】
WO 2006/123926、内容は参照によりここに組み込まれるが、これは少なくとも一つの植物性タンパク源に基づく、好ましくは、菜種、小麦、またはキャラウェー由来の、微生物及び／又は細胞を増殖及び／又は培養するためのペプチド組成物に関する。小麦の加水分解物の効果については、実施例において扱われる。
【００１０】
WO 2006/128764、内容は参照によりここに組み込まれるが、これは複合体タンパク質を産生する哺乳類細胞の培養方法であって、一つまたは一つ以上の植物由来のペプトンが細胞培養物に供給される方法について開示する。植物源である大豆、綿実、及びエンドウマメが例示される。大豆加水分解物のCHO細胞の培養に対する影響は、添付の実施例において示される。
【００１１】
WO 98/08934、内容はここにおいて参照により組み込まれるが、これは無血清細胞培地、これは例えば硫酸デキストランなどのポリアニオン系化合物、及び任意で特定のペプチド、例えば米ペプチドまたは大豆ペプチドなどを含む、について開示する。
【００１２】
Parrado et al. (Process Biochemistry 28 (1993) 109-113)、内容は参照によりここに組み込まれるが、これはストレプトキナーゼを産生するストレプトコッカス・イクイシミリス（Streptococcus equisimilis）の増殖のための窒素源としてのヒマワリ粉の加水分解物の使用について記載する。当該加水分解物は、Kerase処理により得られ、18.8％の加水分解率を有していた。それは、高レベルのポリフェノールを含んでいた。発酵培地中の窒素源としてのヒマワリ粉ペプトンの有用性は非常に制限されており、ポリフェノールの除去が必須であることが結論付けられた。
【発明の概要】
【００１３】
キク（Asteraceae）科の種子、特にヒマワリの種子の脱脂粉からの加水分解物は、インビトロで真核細胞、特に哺乳類細胞を培養することに非常に適していることがわかった。したがって、本発明は、（脱脂された）ヒマワリ原料の加水分解物を含む細胞培地、及び（脱脂された）ヒマワリ原料の加水分解物の加水分解物を培地成分として使用するインビトロの動物細胞の培養方法を提供する。本発明に従う加水分解物を培地成分として使用する場合、培養の間、当該細胞は塊とならず、明るく透明な外観を有することもわかった。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
本発明は、真核細胞、特に動物細胞の培養のための培地における、キク科の植物種由来のタンパク質含有種子材料の加水分解物の使用に関連する。本発明はまた真核細胞、特に動物細胞の培養のための培地、これは乾燥重量基準で2〜80重量%のキク科の植物種由来の種子材料の加水分解物を含む、にも関係する。
【００１５】
本発明に従って使用される当該種子材料は、好ましくは脱脂される。脱脂前、そのタンパク質含有量は、乾燥物質で少なくとも5重量%、好ましくは乾燥物質で少なくとも10重量%である。脱脂後、当該タンパク質含有量は乾燥物質基準で少なくとも10重量%、好ましくは少なくとも20重量%である。当該種子材料は、キク科の種の植物材料に由来する。特に、当該植物材料は、油の生産に使用される植物、例えば、以下の属：ヘリアンサス（Helianthus）（ヒマワリ）、特にＨ．アンヌス（H. annuus）、カーサマス（Carthamus）（紅花）、特にＣ．ティンクトリアス（C. tinctorius）、ベルノニア（Vernonia）（鉄樹）、特にＶ．ガラメンシス（V. galamensis）、シナラ（Cynara）（カルドン、チョウセンアザミ）、グイゾチア（Guizotia）（ニガー）、クレピス（Crepis）（オニタビラコ）などに由来する。好ましくは、当該植物は、ヘリアンサス（Helianthus）属、例えばＨ.アンヌス（H. annuus）、Ｈ．アルゴフィラス（H. argophilus）などの種である。キク科の種を参照すると、ヘリアンサス（Helianthus）、カーサマス（Carthamus）及びベルノニア（Vernonia）属が好ましく、特により好ましくは上に挙げた種である。
【００１６】
当該種子材料は、従来の方法、例えばヘキサンなどの有機溶媒を使用して、外皮を取り除いた種子を圧搾すること及び／又は抽出することなどによって脱脂されてもよい。脂質抽出の前に当該種子は、外皮を取り除き、及び／又は押しつぶされてもよいが、これは必須ではない。好ましくは、当該脱脂された種子材料はタンパク質を含有する。より好ましくは、当該脱脂された種子材料は、少なくとも10重量%、より好ましくは少なくとも20重量%のタンパク質を含む。当該脱脂された種子材料は、好ましくは10重量%より少ない脂肪含有率を有する。
【００１７】
ここで使用される加水分解物は、酵素的タンパク質分解の結果生じる加水分解物を意味し、タンパク質加水分解物と呼ばれてもよい。当該（脱脂された）種子材料、これは任意で粉砕されるが、これを細菌、菌類、野菜若しくは動物起源のエンドプロテアーゼ及び／又はエキソプロテアーゼ若しくはそれらの混合物を使用して加水分解に供する；しかしながら、当該酵素は動物由来ではないことが好ましい。当該酵素は、組み換えDNA技術を使用して産生されてもよい。当該好ましい酵素は、エンドプロテアーゼである。より好ましくは、当該酵素には、アルカリ性のプロテアーゼが含まれる。最も好ましくは、当該プロテアーゼは、セリンエンドプロテアーゼであるズブチリシン(アルカラーゼ)である。特に適切な酵素には、Novozymesのアルカラーゼ及び／又はMerckのパパインが含まれる。他の適切な酵素には、例えば、ニュートラーゼが含まれる。
【００１８】
加水分解の条件には３０分〜８時間；好ましくは１〜６時間、最も好ましくは２〜４時間の反応時間が含まれ；温度は、２０〜６５℃、好ましくは４０〜６０℃である。当該ｐＨは６．０〜８．５、好ましくは６．６〜８．０、最も好ましくは７．０〜８．０に調整されてもよい。溶液中で加水分解されるタンパク質の濃度は１〜１０％タンパク質、好ましくは２〜８、最も好ましくは３〜６重量%である。使用される酵素の量は基質に基づいており、０．５〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％、最も好ましくは１．５〜３．５重量％である。
【００１９】
当該加水分解物は、好ましくは、加水分解率５〜５０％、好ましくは１０〜４０％、最も好ましくは１０〜３０％に達するまで行われる。当該加水分解反応は、熱処理を用いて終了させる。好ましくは、当該熱処理は、８０〜１００℃で１５〜９０分（バッチ熱処理）、又は１００〜１２０℃で１〜５分（高温短時間処理、HTST）の加熱時間を包含する。加水分解率は、実施例に示される通り、従来のホルモル滴定を使用して決定されても良い。加水分解反応の終了後、当該反応混合物は任意で洗練され、不溶性の部分を、例えば遠心分離又は当該分野で既知のろ過補助器具、例えば珪藻土（例えば、Celite（登録商標）、Dicalite（登録商標）、Hyflo（登録商標））などを使用して除去しても良い。好ましくは、当該加水分解物は、乾燥物質基準で10重量%より少ない、より好ましくは5重量%より少ない、最も好ましくは2重量%より少ない水不溶性物質を含む。当該加水分解物は噴霧乾燥または凍結乾燥によって乾燥されてもよい。当該加水分解物は、そのようなものとして使用されてもよく、またはさらに精留されてもよい。
【００２０】
当該加水分解は好ましくは、全タンパク質基準で２０〜８０重量％、特に分子量１００〜５００Ｄａを有するペプチドを２０〜６０重量％及び／又は分子量５００〜１０００Ｄａを有するペプチドを１０〜３０重量％含む。ペプチド長の観点からは、当該加水分解物は好ましくは、全タンパク質基準で少なくとも１５重量％、より好ましくは少なくとも２５重量％、最も好ましくは３５重量％、例えば、８５重量％まで、より好ましくは６５重量％まで、最も好ましくは５５重量％までのジペプチドからペンタペプチド、８〜３０重量％のヘキサペプチドからノナペプチド、少なくとも８重量％、特に１５〜６０重量％の高級ペプチド、及び０．１〜３０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％の遊離アミノ酸を含む。好ましい実施形態において、当該加水分解物は限外ろ過されてもよく、これは好ましくは５または１０ｋＤの分子量カットオフ（molecular weight cut-off）を使用する。当該加水分解物は、さらなる構成成分、例えば、炭水化物、可溶繊維、多価の金属塩などを含んでもよい。好ましくは、当該タンパク質含有率（遊離アミノ酸を含むすべてのタンパク質性の物質）は、３０〜９０重量％、より好ましくは４５〜８５重量％である。これらの量は、乾燥重量基準である。
【００２１】
当該加水分解物は、他の慣習的な培地の構成成分、例えば植物性または動物性サイトカイン及び／又は成長因子（仮に、これらが動物起源でないなら）、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、ヌクレオチド、植物ホルモン、グルコースを含む糖類、抗生物質などと組み合わされてもよい。植物ホルモンは、オーキシン、ジベレリン、アブシジン酸、及びこれらの混合物を含む。
【００２２】
商業的に入手可能な基礎培地もまた、本発明の加水分解物と組み合わせて使用されてもよい。CHO-1としての動物細胞株については、LonzaのPower CHO-1 CD、Irvine ScientificのIS CHO-CD、またはSAFCのExcell 325 PF CHOが使用されてもよい。植物性細胞については、SAFCから入手可能なMurashige及びSkoog基礎培地が使用されてもよい。当該加水分解物は、他のタンパク源、例えば小麦、大豆、エンドウマメからの加水分解物などと、例えば、キク科の種子タンパク質対他のタンパク質が、タンパク質基準で９：１から１：４、好ましくは４：１から１：２の重量比で組み合わされてもよい。
【００２３】
本発明に従う細胞培地及び培養方法の両者は、真核細胞、特に動物細胞の培養を補助する能力があり、この能力は、それが少なくともインビトロでの当該細胞の生存、増殖及び／又は分化を可能にすること、好ましくは、その上、インビトロでの当該細胞による生成物の発現をも可能にすることを意味する。回分培養、流加培養、連続反応器中の培養又は灌流反応器中の培養はいずれも想定される。
【００２４】
細胞増殖曲線は、細胞が増殖及び成長する真の増殖期と、当該細胞が多かれ少なかれ定常状態にあるが、興味の対象となる代謝産物、例えば抗体などを産生し始める産生期とに分けられてもよい。本発明の加水分解物は、動物細胞又は他の真核細胞の増殖期及び産生期を補助することに適している。
【００２５】
当該細胞培地は、液体として又は粉末、乾燥形態で提供されてもよい。当該液体培地中の（本質的に水溶性の）加水分解物の量は、当業者によって決定されてもよいが、好ましくは0.01〜4.0重量／体積%、より好ましくは0.05〜2.0重量／体積%、または0.05〜1.0重量／体積%、さらにより好ましくは0.1〜1.0重量／体積%、及び最も好ましくは0.2〜0.6重量／体積%を含有する。
【００２６】
水で戻すことのできる乾燥培地中の加水分解物の量は、培地成分に依存するが、典型的には2〜80重量%、好ましくは5〜50重量%の範囲である。当該細胞培地はまた、好ましくは糖類、特にグルコースを、加水分解物に対するグルコースの乾燥重量比で好ましくは10から0.1、より好ましくは2.5から0.4で含み、さらに上述の構成要素も含有する。
【００２７】
さらに本願発明は、真核細胞を培養するための細胞培地の使用に関する。真核生物は、菌類（酵母を含む）、原生生物界、クロミスタ（Chromista）、植物界、及び後生動物界（動物）を含む。当該発明は特に、植物細胞、例えば、コメ、タバコ、及びトウモロコシなど、並びに特に動物細胞の培養、好ましくはインビトロの培養のための使用に関する。培養される細胞は天然の供給源からのものでもよく、又は遺伝子組み換えが行われていてもよい。動物細胞は特に、脊椎動物細胞及び無脊椎動物細胞、これは、例えばヒト細胞などの哺乳類細胞、例えばPER C6細胞（登録商標）、げっ歯類細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、鳥類、魚類、爬虫類、両生類又は昆虫細胞を含む。
【００２８】
本発明の方法によって培養される細胞は特に、タンパク質生成物、これはバイオ医薬品産業においてさらに精製されてもよい、の発現に使用される。本発明の培地中で有利に産生されてもよいタンパク質生成物の非限定的な例は、エリスロポエチン（血液疾患を治療するための）、エタネルセプト（リウマチ性疾患及び通風を治療するためのＴＮＦ−α阻害剤）、アルファドルナーゼ（嚢胞性線維症の治療のためのデオキシリボヌクレアーゼ）、ベータインターフェロン（多発性硬化症を治療するための）及び広範囲の治療的モノクローナル抗体を含む。所望のタンパク質生成物は、当該分野で既知の方法、例えば細胞を培地から分離すること、及び当該タンパク質生成物を無細胞の液体（上清）から単離すること、例えば、精留、アフィニティークロマトグラフィー（吸着−脱離）等、又はこれらの組み合わせによって回収されてもよい。
【００２９】
さらに本発明は、キク科の植物種のタンパク質含有種子材料の加水分解物、並びに植物または動物サイトカイン及び／又は成長因子、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、植物ホルモン、ヌクレオチド、糖類、及び抗生物質から選択される一つまたは一つ以上の培地の構成成分を含有するキットに関する。当該構成成分は、一つまたは一つ以上の組み合わせとして当該キット中に存在してもよい。例えば、当該タンパク質含有加水分解物は別々に乾燥又は溶解形態で存在してもよく、培地の更なる構成成分、例えば、植物又は動物サイトカイン及び／又は成長因子、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、緩衝塩、微量元素、ヌクレオシド、ヌクレオチド、植物ホルモン、糖類及び抗生物質などの一部またはすべてが別の組み合わせとして存在してもよい。代わりに、当該加水分解物は、例えば、（追加の、すなわち、キク科由来ではない）アミノ酸及び／又は糖類とあらかじめ混合されてもよく、いかなる残存構成成分が別々に、又は一つ若しくは一つ以上の組み合わせで存在してもよい。組成物の少なくとも一つが液体、この液体は有利に滅菌されていてもよい、であることが好ましい。当該キットの組成物は、培地の使用前に混合される。
【００３０】
従って、本発明に従う加水分解物及びその使用には、いくつかの重要な利点があることがわかった。第一に、インビトロで培養される動物細胞は、塊又はクラスターでは増殖しないが、個々の細胞として存在する。第二に、それらの完全な円形及び明るく透明な細胞含有物によって判断される通り、当該細胞の生存能力は良好である。第三に、技術水準の細胞培地、例えば非血清タンパク質、特に大豆タンパク質に基づく培地などに比べて非常に高い細胞密度を得ることができ、これは所望の細胞生成物の発現レベルを損なうことがない。四番目に、当該加水分解物は動物細胞のインビトロの培養のためのいかなる基礎培地と組み合わされてもよく、これは上述の利点を有する様々な細胞培地の製造を可能にする。当該培養はまた、長期間に亘って延長することができ、これによってより高い生成物収量を得る。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、0.4重量／体積%の加水分解物を含むIS CHO-CD培地中でのＣＨＯ細胞（CRL 11397）の増殖能力を示す。
【図２】図２：0.4 %ヒマワリ加水分解物を含む、及び含まない様々な培地中でのＣＨＯ細胞（CRL 11397）の増殖能力。実線は、ヒマワリ加水分解物S1を含む標準培地を表し、破線はヒマワリ加水分解物を含まない標準培地を表す。
【００３２】
例：
例1a
ヒマワリタンパク質の種子加水分解物の調製
ADMの脱脂ヒマワリ粉200 g（35%重量タンパク質）を60℃で1.8 kgの水に分散させ、10%溶液を作成した。当該溶液のpHを50 %水酸化ナトリウムで7.5±0.1に調製した。この溶液に、5.05 g（固形で2.5%）のアルカラーゼ2.4 L（NOVOZYMES, USA）を添加した。pHは当該加水分解の間、ドリフト（drift）させておいた。60℃、４時間の加水分解の後、当該溶液のpHを50%水酸化ナトリウムで6.7±0.1に調整し、当該溶液は95℃で30分間不活性化したバッチであった。当該溶液を60℃まで冷却し、約100 gのHyflo珪藻土（ＤＥ）を添加し、Buchi真空ろ過漏斗及びろ紙を使用して当該溶液をろ過した。ろ過後、当該溶液を凍結乾燥した。この加水分解物をS1とする。
【００３３】
S1の分析
表１は、Superdexペプチドカラム（Amersham Biosciences）によって分析した分子量分布を示す。当該カラムは、既知の分子量を有するタンパク質マーカーによって較正した。
【００３４】
窒素含有率及び加水分解率を、ホルモル滴定を用いて決定した。当該加水分解物の全窒素（TN）含有率は9.4%と測定され、これから窒素変換因子5.7を使用して全タンパク質含有率53.6 %を得た。
【００３５】
アミノ窒素（AN）含有率は1.5 %であった。
【００３６】
加水分解率を、式：
DH = {(AN/TN)*130}−5.9
を使用して14%と決定した。
【表１】
2010535499.tif 000002
【００３７】
例1b
10%固形物の溶液を、高タンパク質ヒマワリ粉（Glencore Internationalの高タンパク質ヒマワリペレット、37%全タンパク質）により60℃の水浴で調製した。スラリーを、80℃で10分間熱処理した。次に、60℃まで冷却し、pHを測定した。水酸化ナトリウムを使用し、pHを7.5±0.1に調整した。アルカラーゼ酵素を固形基準4%濃度で当該混合物に添加し、加水分解を60℃で6時間行った。6時間後、当該スラリーを95℃で30分、加熱不活性化した。当該加水分解された混合物を真空ろ過し、粗不純物を除去した。次に10,000 Daのカットオフを有するKoch HFK-131らせん巻膜装置を使用して当該スラリーを真空ろ過し、噴霧乾燥して粉末の加水分解物を得た。本実施例で得た加水分解率は36%であった。この加水分解物をS2とする。
【００３８】
例1c
Merckから得た酵素パパインを固体基準で2%の濃度で使用した以外は、例1bと同様の手順が行われた。当該混合物を3時間加水分解し、次に95℃で30分間、加熱不活性化した。本実施例で得た加水分解率は25％であった。この加水分解物をS3とする。
【００３９】
例1d
低タンパク質ヒマワリ粉（Glencore Int.の32%の全タンパク質を有するヒマワリペレット）を固体基準で2%のアルカラーゼを使用して3時間加水分解した以外は、例1bと同様の手順を行った。本実施例で得られた加水分解率は42%であった。当該加水分解物をS4とした。
【００４０】
S2〜S4の分子量分布を例１aの方法に従って決定し、表１にまとめた。
【００４１】
例2a
CHO細胞のインビトロの培養
培地の調製
商業的に入手可能な種々の培地に、濃度0.4（重量／体積）%のヒマワリ加水分解物(S1)を添加した。
【００４２】
以下の培地について試験した：Power CHO-1 CD培地(Lonza, Cat. No. 12-770 Q), IS CHO-CD 培地 (Irvine Scientific, Cat. No. 91119)及びEx-cell 325 PF CHO 培地 (SAFC, Cat No. 14340C)。もしまだ培地中に存在しなければ、L-グルタミン (2 mM)、ヒポキサンチン (100 μM) 及びチミジン (15 μM)を添加した。ペニシリン及びストレプトマイシンを添加し、細菌の増殖を防止した。
【００４３】
細胞株
２つの異なるIgG発現CHO細胞株を使用した(CHO-2,: ATCC CRL 11397, これはIgG4を産生する)及びCHO-3, ATCC CRL 12445, これはIgG1を産生する)。使用前に当該細胞株を、動物質を含まない培地条件に適合させた。
【００４４】
増殖及び産生曲線
増殖及び産生曲線を測定するために、CHO細胞を６ウェルプレートで増殖させた。1 mlの細胞懸濁液に3 mlの培地を添加した。添加された加水分解物を含む、及び含まない化学的に定義された培地を試験した。大豆からの加水分解物(SE50MAF-UF; DMV International, 約50%のタンパク質含有率)及びグルテン起源の加水分解物 (WGE80M-UF; DMV International, 約80%のタンパク質含有率)をヒマワリ加水分解物と同じ培地中、同じ濃度で試験した。週に3回、2 mlの培地を新鮮な培地に交換した。
【００４５】
細胞を手作業で数え上げ、各培地交換の前にELISAによってIgGの産生を測定した。当該細胞を、位相差顕微鏡(Zeiss Axiovert 25, 400 x倍率)を使用して視覚的に検査した。ヒマワリ加水分解物が培地中に存在した時、外観は劇的に改善した。個々の細胞だけが観察され、細胞の凝集は見られなかった。このことは、標準培地又は他の加水分解物を使用する培地中で増殖するCHO細胞培養物には多くの細胞凝集物が存在するという観察とは対照的であった。その上、当該細胞形状は、プラスの影響を受けた。細胞は、ヒマワリ加水分解物を含有する培地中で培養された時、さらに一層円形で明るい外観を有していた。
【００４６】
表２並びに図１及び２は、様々な植物タンパク質加水分解物を含む、及び含まない様々な培地の存在下でのCHO細胞の増殖能力を示す。
【表２】
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【００４７】
例2b
細胞増殖実験は、ヒマワリ種子加水分解物S2-S4を使用し、かつ原則的に例2aに従うCHO-2細胞（ATCC CRL 11397）を使用して行った。使用した基礎増殖培地はPower CHOであった。培地に添加した加水分解物の量は0.2重量%であった。コントロールとして、加水分解物を含まないPower CHOを用いた。対照として、大豆加水分解物（0.4重量% SE50MAF-UF, DMV International）を含むPower CHOを使用した。
【００４８】
本実験において、細胞計数はCedex HiRes機器（Innovatis, Germany）を使用して行った。Cedex HiResはTrypan Blue除去法を使用し、細胞培養工程中の細胞濃度及び生存能力を決定した。それは、Trypan Blueによってサンプルを染色し、スキャナー技術によって作成された画像を解析し、最終的に２、３分で細胞計数を表示する。以下のプロトコールを使用した：
６ウェルプレート中のCHO細胞懸濁液を再懸濁し、均質化を確実にした。続いて、代表的なサンプル150 μLをサンプルカップに移動した。150 μLのDulbeccoリン酸緩衝食塩水（Invitrogen, Cat. No. 14190-094）をサンプルカップに添加し、希釈係数1:1を得た。当該サンプルカップをマルチサンプルトレイに設置した。所望のサンプルデータ及びパラメータを各サンプルに定義した。コメントを入力し、すべてのサンプルの状態を活性化し、測定を始めた。得られた結果を印刷し、さらなる計算のためエクセルにエクスポートした。細胞計数の結果を表３に示す。
【表３】
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【００４９】
細胞の生存能力の決定
同じCedex HiRes機器を使用して、培養細胞の生存能力も決定した。表４は、細胞増殖の様々な段階にある生存細胞の百分率を示す。
【表４】
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【００５０】
当該得られた増殖曲線は、当該細胞をヒマワリ加水分解物を使用して培養することができることを示す。細胞密度は他の試験された培地を使用して得られた密度よりも高い。
【００５１】
様々な培地に添加された時、ヒマワリ加水分解物は、良好な増殖及び産生を示す。CHO-2細胞が、ヒマワリ加水分解物S2、S3、及びS4を補充した培地中で増殖した時、非常に良好なIgG4の産生が起こったことが観察された。これは、ヒマワリ加水分解物が別の方法においても使用可能であることを示す。
【００５２】
最も顕著な観察は、ヒマワリ加水分解物を含む培地中で増殖する時、非常に良好な形状をしているということである。当該細胞は、完璧に円形であり、明るい外観を有し、これは細胞の生存を示すと考えられる。培養物中には、個々の細胞のみがあり、クラスターは全くなかった。懸濁培養物において、クラスター／詰まりは非常に一般的であるが、望ましくない。大きなクラスターの中心の細胞は死に、後続の処理の間、チューブ材またはフィルターの詰まりの危険がある。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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