(57)【要約】１又は複数のペプチダーゼを発現する組織及び器官をイメージングする複合体、方法及びキットを記載する。本発明の好ましい実施形態では、Ｍ（ＣＯ）３＋［Ｍ＝Ｔｃ又はＲｅ］を結合可能な一連のジ−（２−ピリジルメチル）アミン（Ｄ）配位子をリシノプリル（Ｌ）に結合させた。様々な数のメチレン基（３、４、５及び７、それぞれＤ（Ｃ４）Ｌ、Ｄ（Ｃ５）Ｌ、Ｄ（Ｃ６）Ｌ及びＤ（Ｃ８）Ｌ）の脂肪族テザーを用いた。インビトロ阻害活性は、メチレン基の数が増加するほど増大した。Ｄ（Ｃ８）Ｌ複合体は、Ｄ（Ｃ４）Ｌよりも有意に強力であることが観察された。ＡＣＥに対するインビボ特異性は、組織分布研究及びガンマイメージング研究の両研究で分析し、高ＡＣＥ含有組織内における局在性が示された。局在性は、リシノプリルによる前処理でブロックされた。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性医薬品部分又は光学イメージング部分に結合したペプチダーゼ結合部分を含んで構成される化合物。
【請求項２】
前記放射性医薬品部分は、放射線イメージング部分若しくは放射線治療部分又はその両方を含んで構成される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ペプチダーゼ結合部分は、エキソペプチダーゼ又はエンドペプチダーゼ阻害薬から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記ペプチダーゼ結合部分は、カルボキシペプチダーゼ結合部分を含んで構成され、
該カルボキシペプチダーゼ結合部分は、言い換えると、カルボキシペプチダーゼＡ１、カルボキシペプチダーゼＡ２、カルボキシペプチダーゼＢ、肥満細胞カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＥ、カルボキシペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＮ、又はカルボキシペプチダーゼＺ、の阻害薬からなる群より選択される、
請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記カルボキシペプチダーゼ結合部分は、ＡＣＥ結合部分を含んで構成される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記ＡＣＥ結合部分は、アラセプリル（alacepril）、ベナゼプリル（benazepril）、カプトプリル（captopril）、セロナプリル（ceronapril）、シラザプリル（cilazapril）、デラプリル（delapril）、エナラプリル（enalapril）、エナラプリラート（enalaprilat）、フォシノプリル（fosinopril）、イミダプリル（imidapril）、リシノプリル（lisinopril）、モエキシプリル（moexipril）、モベルチプリル（moveltipril）、ペントプリル（pentopril）、ペリンドプリル（perindopril）、キナプリル（quinapril）、ラミプリル（ramipril）、レンチアプリル（rentiapril）、スピラプリル（spirapril）、テモカプリル（temocapril）、トランドラプリル（trandolapril）又はゾフェノプリル（zofenopril）からなる群より選択される、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記放射線イメージング部分は、放射性核種キレート錯体を含んで構成される、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
前記放射性核種は、テクネチウム又はレニウムから選択される、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記放射性核種は、テクネチウム−９９ｍ、レニウム−１８６又はレニウム−１８８から選択される、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記放射線イメージング部分は、（テクネチウム−９９ｍ）Ｔｃ（ＣＯ）３又は（レニウム−１８６／１８８）Ｒｅ（ＣＯ）３キレート錯体を含んで構成される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
前記ＡＣＥ結合部分は、組織ＡＣＥを血清ＡＣＥよりも強く阻害する、請求項５に記載の化合物。
【請求項１２】
ＡＣＥのＩＣ５０阻害は、２０ｎＭ未満である、請求項５に記載の化合物。
【請求項１３】
前記ペプチダーゼ結合部分及び前記放射線イメージング部分は、アミド、エステル、アミン又はエーテル結合を介して結合される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
哺乳類の１又は複数の器官若しくは組織又はその両方のイメージング方法であって、
放射線イメージング部分又は光学イメージング部分に結合したペプチダーゼ結合部分を含んで構成される化合物の有効量を哺乳類に投与すること、及び
前記哺乳類の１又は複数の器官若しくは組織又はその両方の画像を取得すること、
を含んで構成される方法。
【請求項１５】
前記化合物は、静脈内投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物は、非放射性レニウム標識又はテクネチウム−９９ｍ標識Ｄ（Ｃ４）Ｌ（１）、Ｄ（Ｃ５）Ｌ（２）、Ｄ（Ｃ６）Ｌ（３）又はＤ（Ｃ８）Ｌ（４）からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記１又は複数の器官若しくは組織又はその両方は、肺組織を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記１又は複数の器官若しくは組織又はその両方は、腎臓組織を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記１又は複数の器官若しくは組織又はその両方は、心臓組織を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記１又は複数の器官若しくは組織又はその両方は、腫瘍組織を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記１又は複数の器官若しくは組織又はその両方は、不安定プラーク状態を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記１又は複数の器官若しくは組織又はその両方は、アテローム硬化状態を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記１又は複数の器官若しくは組織又はその両方は、炎症状態を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
（ｉ）金属キレート部分に結合したペプチダーゼ結合部分を含んで構成される化合物と、
（ｉｉ）放射性核種と、
を含んで構成されるキット。
【請求項２５】
前記放射性核種は、テクネチウム−９９ｍ、レニウム−１８６又はレニウム−１８８若しくはこれらの組み合わせから選択される、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
哺乳類の１又は複数の器官若しくは組織又はその両方に関連する病態を病期分類する方法であって、
（ｉ）放射線イメージング部分に結合したペプチダーゼ結合部分を含んで構成される化合物の有効量を哺乳類に投与すること、
（ｉｉ）前記哺乳類の前記１又は複数の器官若しくは組織又はその両方の画像を取得すること、
（ｉｉｉ）前記画像から、前記哺乳類の前記１又は複数の器官若しくは組織又はその両方に存在するペプチダーゼの量を測定すること、並びに
（ｉｖ）前記測定した量及び対照量を利用して、前記病態の分類に達すること、
を含んで構成される方法。
【請求項２７】
前記病態は、心不全、心筋症、肺疾患、腎臓機能障害、腎不全、炎症、アテローム硬化、不安定動脈プラーク又は新生物からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳類の１又は複数の器官若しくは組織又はその両方に関連する病態の治療に対する前記哺乳類の反応をモニタする方法であって、
（ｉ）放射線イメージング部分に結合したペプチダーゼ結合部分を含んで構成される化合物の有効量を哺乳類に投与すること、
（ｉｉ）前記哺乳類の前記１又は複数の器官若しくは組織又はその両方の画像を取得すること、
（ｉｉｉ）前記画像から、前記哺乳類の前記１又は複数の器官若しくは組織又はその両方に存在するペプチダーゼの量を測定すること、並びに
（ｉｖ）前記測定した量及び対照量を利用して、治療に対する前記哺乳類の反応を、もしあるならば、測定すること、
を含んで構成される方法。
【請求項２９】
前記対照量は、正常なグループに見られる量から求める、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記対照量は、前記哺乳類の前記１又は複数の器官に見られるベースライン量から求める、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記対照量は、正常なグループに見られる量から求める、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記対照量は、前記哺乳類の前記１又は複数の器官に見られるベースライン量から求める、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
哺乳類の１又は複数の器官若しくは組織又はその両方におけるペプチダーゼの発現を定量する方法であって、
放射線イメージング部分と結合したペプチダーゼ結合部分を含む化合物の有効量を哺乳類に投与すること、
前記哺乳類の前記１又は複数の器官若しくは組織又はその両方の画像を取得すること、並びに
前記画像及び一連の標準画像から、前記哺乳類の前記１又は複数の器官若しくは組織又はその両方における前記ペプチダーゼの発現量を定量すること、
を含んで構成される方法。
【請求項３４】
この方法を必要としている哺乳類に放射線治療を行う方法であって、
放射線治療部分に結合したペプチダーゼ結合部分を含んで構成される化合物の有効量を哺乳類に投与すること、
を含んで構成される方法。
【請求項３５】
前記化合物は、静脈内投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳類は、新生物状態を患っている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
下記の一般式で示される化合物。
（ＰＢＭ）ｎ−（ＬＩＮ）−（ＣＨＥ）ｍ
［式中、
ＰＢＭは、ペプチダーゼ結合部分を含んで構成され、
ｎは、１、２又は３であり、
ＬＩＮは、共有結合、−ＣＨ２−、−ＮＨ−、又は長さが炭素原子２−２０の直鎖若しくは分岐鎖であり、前記鎖に又は前記鎖内には、１−６の、アミノ基、酸素、硫黄、カルボニル基、尿素若しくはアミドを含むヘテロ原子、芳香環基、脂環（cyclic aliphatic ring）基、芳香族複素環基又は複素脂環（heterocyclic aliphatic ring）基、が任意に結合し、前記１又は複数のＰＢＭを前記１以上のＣＨＥに共有結合し、
ＣＨＥは、放射性核種を結合可能な単座、二座又は多座配位子であり得るキレート部分を含んで構成され、
ｍは、１、２又は３である。］
【請求項３８】
前記ペプチダーゼ結合部分は、カルボキシペプチダーゼＡ１、カルボキシペプチダーゼＡ２、カルボキシペプチダーゼＢ、肥満細胞カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＥ、カルボキシペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＮ、又はカルボキシペプチダーゼＺ、の阻害薬である、請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】
前記ペプチダーゼ結合部分は、アラセプリル、ベナゼプリル、カプトプリル、セロナプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、イミダプリル、リシノプリル、モエキシプリル、モベルチプリル、ペントプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、レンチアプリル、スピラプリル、テモカプリル、トランドラプリル又はゾフェノプリルである、請求項３７に記載の化合物。
【請求項４０】
前記リンカーは２−１５原子鎖であって、
前記鎖の１−６原子は、アミノ基、酸素、硫黄、カルボニル基、尿素又はアミドであり、前記鎖の残りの原子は炭素である、
請求項３７に記載の化合物。
【請求項４１】
前記リンカーは、リシン又はリシン類似体を含んで構成され、例えば、前記リシン類似体は、図６及び７に示されるものである、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４２】
前記放射性核種は、Ｔｃ又はＲｅである、請求項３７に記載の化合物。
【請求項４３】
前記ＣＨＥ部分は、ピリジルメチレンアミン、キノリンメチレンアミン、イソキノリンアミン、ピリジン−２−イルメチルアミノ酢酸、イソキノリン−３−イルメチルアミノ酢酸、チアゾール−２−イルメチルアミン及びチアゾール−２−イルメチルアミノ酢酸、又はＴｃと結合されて示される下記構造のキレート剤である、請求項３７に記載の化合物。
【化１】
2010502646.tif 000008
［式中、
Ｒ８は、Ｏ、Ｈ、ＯＨ、アルコキシ基又はＯ−アルキル基から選択され、
Ｒ９は、薬剤的に許容できる複素環基を表し、これは例えば、１−２の窒素、酸素又は硫黄原子を含む五又は六員環である。］
【化２】
2010502646.tif 000009
［式中、
Ｒ８は、Ｏ、Ｈ、ＯＨ、アルコキシ基又はＯ−アルキル基から選択され、
Ｒ９は、薬剤的に許容できる複素環基を表し、これは例えば、１−２の窒素、酸素又は硫黄原子を含む五又は六員環であり、
Ｒ１０及びＲ１１は、互いに独立して水素、アルキル基又は置換アルキル基を表し、
Ｒ１２は、アリール基、アルキル基又は複素環基から選択される。］
【化３】
2010502646.tif 000010
［式中、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０は、互いに独立して水素又はメチル基を表す。］
【化４】
2010502646.tif 000011
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連発明の相互参照）
本出願は、２００６年８月２９日に出願された米国仮出願第６０／８２３，８８４号の便益を主張し、そのすべての内容は、参照により本開示に含まれるものである。
【０００２】
（謝辞）
本研究は、米国国立保健研究所（ＮＩＨ）、米国保健社会福祉省からの助成金によるものである（１−Ｒ４３−ＨＬ０７５９１８−０１）。したがって、連邦政府は、本発明に関する一定の権利を有する。
【０００３】
（序文）
様々な組織（血液を含む。）及び器官が、ペプチダーゼ（プロテアーゼ、プロテイナーゼ及びタンパク質分解酵素とも称される。）を様々なレベルで発現する。発現レベルは、その組織又は器官に関連する病態（又はその欠如）によって変化し得る。例えば、高レベルのアンジオテンシン変換酵素（angiotensin-converting enzyme、ＡＣＥ）が、心不全患者の心筋で観察されている。
【０００４】
ＭＥＲＯＰＳデータベース(http://merops.sanger.ac.uk/)は、ペプチダーゼ及びこれを阻害するタンパク質の情報源である。またＭＥＲＯＰＳデータベースは、特定のペプチダーゼの小分子阻害物質の長大なリストも含んでいる。Rawlings, N.D., Morton, F.R. & Barrett, A.J. (2006) MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res 34, D270-D272を参照のこと。このデータベース（特に７．５０版）の内容は、参照により本明細書に含まれるものとする。
【０００５】
ペプチダーゼの阻害薬として、これらの分子（タンパク質のような高分子、又はペプチド及び既存の薬物若しくは薬物候補を含む小分子）もまたペプチダーゼと結合し特定の親和性を阻害する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＡＣＥ（代表的なペプチダーゼ）
虚血性心疾患及び発作に起因しうる死亡率が減少傾向にあるにもかかわらず、米国におけるうっ血性心不全の有病率とその死亡率は、この３０年で略３倍となっている。（S.Y. Chai, F.A.O. Mendelsohn, G. Paxinos, Neuroscience, 20: 615-627 (1987)を参照のこと。）次の２０年では、冠動脈心疾患による心不全が、全感染症を凌いで世界の主な死亡原因になるであろうと推定されている。（M.R. Cowie, D.A. Wood, A.J.S Coats, S.G. Thompson, P.A. Poole-Wilson, V. Suresh, G.C. Sutton, Eur. Heart J., 20: 421-428 (1999)を参照のこと。）
【０００７】
したがって、心不全等の特定の病気の進行を診断、治療及びモニタするための新規のそしてより良い方法に対するニーズが存在する。
【０００８】
リシノプリル（代表的なペプチダーゼ結合部分）
高血圧及びうっ血性心不全の治療に臨床的に用いられるＡＣＥ阻害薬であるリシノプリル（Lisinopril）は、ＡＣＥを直接的に阻害することが示されてきた。うっ血性心不全患者の心臓切片におけるオートラジオグラフィーの予備結果に基づいて（V. Dilsizian, J. Shirani, Y.H-C. Lee, D. Kiesewetter, E.M. Jagoda, M.L. Loredo, W.C. Eckelman, Circulation, 104:17, 3276 (2001)を参照のこと。）、本発明の発明者は、ＡＣＥは、診断及び心不全の病期分類、更には治療に対する反応の確認、において魅力的な分子標的となりうると考えている。同様に、発明者は、特定の組織及び器官における他のペプチダーゼの過剰発現は、幅広い様々な病態の進行の診断、治療及びモニタに利用可能であると考えている。このような様々な病態には、限定を意図するものではないが、心不全、心筋症、肺疾患、腎臓機能障害、腎不全、炎症、アテローム性硬化、不安定性動脈プラーク又は新生物（例えば、乳癌、前立腺癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌等）が含まれる。更に他の病態には、種々の循環器疾患が含まれ、これには一般的に、糖尿病性腎症、過剰組織ＡＣＥ活性、インスリン非依存性糖尿病又は高血圧による慢性腎不全、高血圧性末梢血管疾患、気腫、（又は慢性閉塞性肺疾患、ＣＯＰＤ）、等が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ペプチダーゼ結合部分（例えば、ペプチダーゼを阻害する物質）を、放射性医薬品部分（放射線療法及び放射性イメージング部分を含む。）又は光学イメージング部分と結合する一連の複合体に関する。ペプチダーゼには、限定を意図するものではないが、エキソペプチダーゼ、例えば、カルボキシペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼ、並びにエンドペプチダーゼ、例えば、セリン−、システイン−、アスパラギン酸−及びメタロエンドペプチダーゼ、が含まれる。「部分（moiety）」は、他の部分とは独立して存在しうる分子である。したがって、ヒドロキシルやハロゲン化物等のようなだたの置換基（即ち、官能基）は、本発明で用いられる意味における「部分」にはあたらない。
【００１０】
本発明の特定の態様では、金属キレート錯体と、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ（アンギオテンシン変換酵としても知られる。）の阻害薬であるリシノプリルと、の結合に基づく一連の複合体が記載されている。したがって、金属種（例えば、Ｍ（ＣＯ）３＋［Ｍ＝Ｔｃ又はＲｅ、特にその非放射性及びラジオアイソトープ］コア）を結合可能な一連のリシノプリルベース配位子（詳細は後述）を合成し評価する。適切な配位子の例には、限定を意図するものではないが、ジ−（２−ピリジルメチレン）アミン、ジ−（２−キノリンメチレン）アミン、ジ−（２−イソキノリン）アミン、等が含まれ、これらは、リシノプリル又は他のペプチダーゼ結合部分に、例えば脂肪族テザー（aliphatic tether）を介して結合する。インビトロ分析により、脂肪族テザーに含まれるメチレン基の数が増加すると、阻害能が増大することが示されている。ＡＣＥのインビボ特異性についても、正常ラットを使用して遊離リシノプリル存在下又は非存在下で研究した。これらのインビボ研究は、高ＡＣＥ含有組織中での放射性トレーサの局在性を示しており、この局在性は、遊離リシノプリルでの前処理によりブロックされることを示している。
【００１１】
本発明の他の態様では、新規の一連の９９ｍＴｃ標識ＡＣＥ阻害薬の調製が記載されている。これらの複合体は、インビボでのＡＣＥ発現をモニタ可能であり、例えば循環器疾患、特にうっ血性心不全、の病期分類に有用となりえる。驚いたことに、一連の化合物の中で最も強力な化合物である９９ｍＴｃ−Ｄ（Ｃ８）Ｌは、最も長いテザーを有している。この複合体は、例えば心不全に対するその診断能力及び病態分類能力を評価することを目的に、（例えば、心筋中でのＡＣＥ発現を定量することにより）ＡＣＥ過剰発現の動物モデルにおいて評価される。したがって、ＡＣＥを発現する組織又は器官のイメージング方法は、本発明の態様のひとつである。ＡＣＥ発現の特定の場合では、肺組織、腎臓組織、心臓組織若しくは腫瘍組織又はこれらの組み合わせが開示されている。
【００１２】
本発明はまた、ペプチダーゼ結合部分に結合した光学（例えば、蛍光、化学発光又はリン光）イメージング部分に関し、これは例えば、ジ−（２−キノリンメチレン）アミン又はジ−（２−イソキノリン）アミンを、ペプチダーゼ結合部分に繋留（tethered）されたキレート配位子として用いる非放射性（即ち、「ｃｏｌｄ」）のレニウムキレート錯体である。光学イメージングの適用例は、Wei L, Babich JW, Ouellette W, Zubieta J.のDeveloping the {M(CO)3}+ core for fluorescence applications: Rhenium tricarbonyl core complexes with benzimidazole, quinoline, and tryptophan derivatives. Inorg Chem. 2006 Apr 3;45(7): 3057-66 及びJames S, Maresca KP, Babich JW, Valliant JF, Doering L, Zubieta J.のIsostructural Re and 99mTc complexes of biotin derivatives for fluorescence and radioimaging studies. Bioconjug Chem. 2006 May-Jun; 17(3): 590-6に開示されている。本発明はまた、ペプチダーゼ結合部分との結合パートナーとして放射線治療部分を含む。ここで、用語「放射線治療部分（radiotherapeutic moiety）」は、放射線イメージング部分若しくは放射線治療部分又はその両方を含むものである。放射線治療部分の例としては、レニウム-１８６又はレニウム-１８８トリ（カルボニル）ジ-（２-ピリジルメチレン）アミンキレート錯体としてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】リシノプリル（Ｌ）に結合したジ−（２−ピリジルメチル）アミン（Ｄ）キレートを調製するための合成スキームを示す。
【図２】インビトロ生化学分析におけるリシノプリル及びＤ（Ｃｘ）Ｌ化合物の用量曲線を示す。
【図３】正常及びリシノプリル前処理（１ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ．）スプラーグドーリーラットの１５分後における９９ｍＴｃ−Ｄ（Ｃ５）Ｌの組織分布を示す。
【図４】スプラーグドーリーラット中の９９ｍＴｃ−Ｄ（Ｃ５）ＬのＸ線画像（左図：リシノプリル前処理なし、右図：リシノプリル前処理あり）を示す。
【図５】配位子及びこれに対応する配位子−金属錯体を示す。配位子及び配位子−金属錯体は、ペプチド配列のＣ末端又はＮ末端のいずれかに結合可能である。
【図６】アミノ官能基に付着する配位子及びこれに対応する配位子−金属錯体を示す。
【図７】カルボキシ官能基に付着する配位子及びこれに対応する配位子−金属錯体を示す。
【図８】キレート化ステップを含む、本発明の化合物の合成スキームを示す。
【図９】９９ｍＴｃ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃ８）Ｌ（ＭＩＰ−１０３７）の投与後１０分における対照ラット（Ａ）及びリシノプリル前処理ラット（Ｂ）におけるインビボ分布を示す全身平面画像の腹側像を示す。
【図１０】リシノプリルで前処理したラット（Ｂ）では存在しない９９ｍＴｃ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃ８）Ｌ（ＭＩＰ−１０３７）投与後の対照ラット（Ａ）における肺での活性を示す小動物用ＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像を示す。
【図１１】表ＩＩの結果を示す棒グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の好ましい実施形態では、ＡＣＥ発現をイメージングするプローブを調製する。ＡＣＥ阻害薬であるリシノプリル（「Ｌ」）を、開始薬理学的モチーフ（starting pharmacological motif）として用いた。Ｍ（ＣＯ）３＋［Ｍ＝Ｔｃ又はＲｅ］に結合可能な配位子であるジ−（２−ピリジルメチル）アミン（「Ｄ」）は、リシノプリルのリシン残基のε−アミンにおけるアミド結合形成によりシリノプリル内に組み込まれる。配位子は、種々の数のメチレンスペーサー基（３、４、５及び７であり、それぞれＤ（Ｃ４）Ｌ、Ｄ（Ｃ５）Ｌ、Ｄ（Ｃ６）Ｌ及びＤ（Ｃ８）Ｌとする。）を含む脂肪族テザーを備えた。図１を参照されたい。
【００１５】
ＡＣＥ阻害は、比色分析を用いウサギ肺ＡＣＥについてインビトロで評価した。正常オススプラーグドーリーラットを用い、投与後１５、６０及び１２０分において、リシノプリル（１ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ．）の存在下（ｎ＝６／時点）又は非存在下（ｎ＝４／時点）における組織分布及びクリアランスを研究することにより、９９ｍＴｃ−Ｄ（Ｃ５）ＬについてＡＣＥのインビボ特異性を測定した。
【実施例】
【００１６】
尚、本明細書において引用される文献の内容は、本開示に含まれることとする。
【００１７】
[複合体の調製]
リシノプリルは、LKT Laboratories（セントポール、ミネソタ）から入手した。すべての配位子は、既刊文献による方法に若干の変更を加えた方法に従って合成した。M.K. Levadala, S.R. Banerjee, K.P. Maresca, J.W. Babich, J. Zubieta, Synthesis, 11: 1759-1766 (2004); L. Wei, J. Babich, W.C. Eckelman, J. Zubieta, Inorg. Chem., 44: 2198-2209 (2005)を参照のこと。元素分析は、Desert Analytics（ツーソン、アリゾナ）により、エレクトロスプレー質量分析は、HT Laboratories（サンディエゴ、カリフォルニア）により、行った。
D(C4)L (1): 収率 = 40% (0.68 g). 1H NMR (CDCl3, ppm): 8.50 (m, 2H), 7.62 (m 2H), 7.43 (m, 2H), 7.13 (m, 8H), 3.85 (m, 4H), 3.69-2.60 (mm, 11H), 2.26-1.41 (mm, 16H). MS(ESI): m/z 674 (M+ +1), m/z 672 (M- -1). C37H48N6O6・1.5H2Oの分析計算値: C, 63.50; H, 7.35; N, 12.01; O, 17.15. 実測値: C, 63.44; H, 7.11; N, 12.24, O, 17.17. (MIP-1039)
D(C5)L (2): 収率 = 34% (0.61 g). 1H NMR (CDCl3, ppm): 8.51 (m, 2H), 7.65 (m 2H), 7.51 (m, 2H), 7.13 (m, 8H), 3.92 (d, 4H), 3.69-2.65 (mm, 11H), 2.27-1.46 (mm, 18H). MS(ESI): m/z 688 (M+ +1), m/z 686 (M- -1). C38H50N6O6・H2Oの分析計算値: C, 64.75; H, 7.44; N, 11.92; O, 15.89. 実測値: C, 64.77; H, 7.35; N, 11.92; O, 16.07. (MIP-1003)
D(C6)L (3): 収率 = 13% (0.23 g). 1H NMR (CDCl3, ppm): 8.50 (m, 2H), 7.64 (m 2H), 7.49 (m, 2H), 7.15 (m, 8H), 3.86 (d, 4H), 3.68-2.60 (mm, 11H), 2.26-1.41 (mm, 20H). MS(ESI): m/z 702 (M++1), m/z 700 (M- -1). C39H52N6O6・2.5H2Oの分析計算値: C, 62.80; H, 7.70; N, 11.27; O, 18.23. 実測値: C, 62.82; H, 7.47; N, 11.40; O, 17.91.
D(C8)L (4): 収率 = 35% (0.57 g). 1H NMR (CDCl3, ppm): 8.50 (d, 2H), 7.63 (m 2H), 7.50 (m, 2H), 7.13 (m, 8H), 3.85 (d, 4H), 3.69-2.53 (mm, 11H), 2.23-1.22 (mm, 24H). MS(ESI): m/z 730 (M++1), m/z 728 (M- -1). C41H56N6O6・H2Oの分析計算値: C, 65.93; H, 7.83; N, 11.25; O, 14.99. 実測値: C, 65.64; H, 8.21; N, 11.20; O, 14.48. (MIP-1037)
【００１８】
[インビトロ分析]
各化合物の濃度範囲について、ｐ−ヒドロキシベンゾイル-グリシンＬ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシンのＡＣＥ切断を阻害する能力を、市販されているインビトロ生化学分析を製造元（富士レビオ）の説明書通りに行って試験した。本分析用に選択したＡＣＥ酵素源として、精製ウサギ肺ＡＣＥ（Sigma）を１試料あたり３．３ｍＵ用いた。各実験では、リシノプリルをポジティブコントロールとして使用した。この分析により得られたデータの例を図２に示す。ウサギ肺ＡＣＥを用いたところ、リシノプリル、Ｄ（Ｃ４）Ｌ、Ｄ（Ｃ５）Ｌ、Ｄ（Ｃ６）Ｌ及びＤ（Ｃ８）ＬのＩＣ５０値は、それぞれ２．５ｎＭ、８３．３ｎＭ、４２．８ｎＭ、４２．５ｎＭ及び１９．５ｎＭとなった。ＩＣ５０値は、Ｄ（Ｃ８）Ｌ（組織：１９．５ｎＭ）はリシノプリル（組織：２．５ｎＭ）程能力がないが、Ｄ（Ｃ４）Ｌ（組織：８３．３ｎＭ）と比較すればより能力があることを示した。要約すれば、インビトロ分析により、ジピリジルとコアリシノプリル部分との間のメチレン基の数の増加に伴って活性が増大することが示された。
【００１９】
同様に、任意のペプチダーゼの小分子阻害薬に結合したキレート部分に基づく複合体の能力を評価することができる。表１は、代表的なペプチダーゼをその基質と共に示している。表２は、選択されたペプチダーゼに対する代表的な小分子阻害薬を示している。特にＡＣＥに関連する病状及び小分子阻害薬についての更なる議論として、Moskowitz, D. W. Diabetes Technology & Therapeutics (2002) 4(4): 519-532を参照のこと。
【００２０】
[インビボ分析]
９９ｍＴｃ−Ｄ（Ｃ５）Ｌの組織分布及びクリアランスの定量分析を正常オススプラーグドーリーラットの複数のグループで行った。動物に、試験化合物の投与５分前にリシノプリル１ｍｇ／ｋｇを与えて、標的器官の特異的な取り込みをブロックし、これにより推定される作用機構をインビボで示した。９９ｍＴｃ-Ｄ（Ｃ５）Ｌは、試験したすべての組織において検出され、試験時間の経過に伴って着実に減少した。取り込みは肺において観察され、投与後１５分で０．７５±０．１４％ＩＤ／ｇに近づいた（図３）。９９ｍＴｃ−Ｄ（Ｃ５）Ｌは、腎臓、肝臓及び腸内の化合物レベルからも明らかなように、腎臓及び肝胆道の両方においてクリアランスを示した。放射性標識化合物の投与５分前のリシノプリル１ｍｇ／ｋｇによる前処理により、肺における化合物の取り込み及び保持が減少した（０．１１±０．０２％ＩＤ／ｇ）。これは、９９ｍＴｃ−Ｄ（Ｃ５）ＬがインビボでＡＣＥと特異的に結合することを示唆している。
【００２１】
画像研究として、動物をガンマカメラに配置し、ベースライン平面腹側画像（baseline planar anterior image）を１分間の５連続画像で得た。この化合物について肝臓及び胃腸管において強い信号が検出されたが、９９ｍＴｃ−Ｄ（Ｃ５）Ｌは、リシノプリルでの前処理によりブロックされた肺取り込みを示し（図４）、組織分布研究における結果を支持した。
【００２２】
[ACE比色分析プロトコル]
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）活性を、ＡＣＥカラーキット（富士レビオ）を製造元の説明書通りに用いて測定した。ＡＣＥは、ｐ−ヒドロキシベンゾイル−グリシル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシンに作用し、ｐ−ヒドロキシベンゾイル−グリシンを生成する。このｐ−ヒドロキシベンゾイル−グリシンは、ヒプリカーゼによりｐ−ヒドロキシ安息香酸に変換される。ｐ−ヒドロキシ安息香酸及び４−アミノアンチピリンを過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化及び縮合により、キノンイミン染料（quinoneimine dye）を生成した。キノンイミン染料の濃度は、５０５ｎｍの最大吸光度において定量的に測定される。このアッセイは、ＡＣＥ比色分析においてレニウム標識ＡＣＥ阻害薬に特異的な組織及び血漿を比較するように設計されている。
【００２３】
ラット血清の調製：
正常ラットの血液を、心臓穿刺により注射器及び１６ゲージ針を用いて抗凝固剤を用いずに採取し、１５ｍＬ円錐管に移した。この管は、氷上で３０分間冷却し、血液を凝固させた。凝固した血液を取り除き、残った血清を５０００×ｇで１０分間室温で遠心分離した。上澄みを回収し、０．２２μｍフィルターで濾過した。
【００２４】
試薬の調製：
ＡＣＥカラーキットは、富士レビオから購入し、本アッセイは、製造元の説明書通りに行った。即ち、基質を緩衝液５．６ｍＬで再構成し、ブランクとしてブランクをバッファ５．６ｍＬで再構成し、停止溶液（stopper solution）１５．５ｍＬで展開液を再構成した。ウサギ肺ＡＣＥ（Sigma A6778）を１ｕｎｉｔ／ｍＬ水の濃度に再構成した。
【００２５】
試験法：
血清及び組織ＡＣＥの最適濃度を、試料チューブ又はブランクチューブに添加する濃度をそれぞれ次表のように変化させて測定した。
【００２６】
０  ２．５    ５    １０    １５    ２０  μＬ血清
５  １０    ２５    ５０          μＬ組織ＡＣＥ
【００２７】
その後、基質又はブランク溶液（１２５μＬ）を添加して、３７℃で２０分間インキュベートした。展開液を添加して、３７℃で３分間インキュベートした。試験化合物の活性は、５０５ｎＭにおける吸光度を分光光度計で測定することで測定した。血清ＡＣＥ（２５μＬ）及び組織ＡＣＥ（３．３ｍＵｎｉｔ）の最適量を用いて、レニウム標識ＡＣＥ阻害薬の特異性を測定した。リシノプリル及びカプトプリルを含有する試験化合物を調製し（５０μＭｓｔｏｃｋ）、最終的な濃度が１μＭ〜０．１ｎＭ（１０μＬ／アッセイチューブ）の範囲となるように連続的に１０倍希釈を行った。本アッセイは、上述のように行った。
【００２８】
表１．選択されたペプチダーゼ及びその基質
カルボキシペプチダーゼＡ１
基質：
Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
Ｄｎｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
Ｄｎｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
Ｄｎｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
Ｄｎｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ
カルボキシペプチダーゼＡ２
基質：
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
カルボキシペプチダーゼＢ
基質：
Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ  Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
フリルアクリロイル−Ａｌａ−Ａｒｇ
肥満細胞カルボキシペプチダーゼＡ
カルボキシペプチダーゼＤ
基質：
ダンシル−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ
カルボキシペプチダーゼＥ
カルボキシペプチダーゼＧ、カルボキシペプチダーゼＧ１、カルボキシペプチダーゼＧ２
基質：
葉酸
カルボキシペプチダーゼＭ
カルボキシペプチダーゼＮ
カルボキシペプチダーゼＹ
基質：
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
カルボキシペプチダーゼＺ
カルボキシペプチダーゼＴ
セリンカルボキシペプチダーゼＡ
基質：
Ｂｚ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ
ダンシル−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−ＮＨ２
フリルアクリロイル−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ
Ｚ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ
Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｌａ
Ｚ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ
Ｚ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ
【００２９】
表２．選択されたペプチダーゼの小分子阻害薬
１４１Ｗ９４
４-ヒドロキシ-５，６-ジヒドロ-２-ピロン誘導体（4-hydroxy-5,6-dihydro-2-pyrone derivative）
ＡＢＴ−３７８
ＡＢＴ−５３８
Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｈ
Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ
Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈ
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈ
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｈ
Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｈ
Ａｃ−ＰＲＬＮｖｓ
Ａｃ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＡｓｎＶＳ
Ａｃ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｈ
Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈ
Ａｃ−ＷＥＨＤ−ＣＨＯ
Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ
アセトルファン（acetorphan）（プロドラッグ）
Ｎ−アセチル−アスパルチル−グルタミル−バリル−アスパルトアルデヒド（N-acetyl-aspartyl-glutamyl-valyl-aspartaldehyde）
Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｄ，Ｌ−アルギニンアルデヒド（N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-D,L-argininaldehyde）
Ｎ−アセチル−トリプトファニル−グルタミル−ヒスチジニル−アスパルトアルデヒド（N-acetyl-tryptophanyl-glutamyl-histidinyl-aspartaldehyde）
アクチノニン（actinonin）
活性代謝物Ｍ８
Ａｄａ−Ａｈｘ３−Ｌ３ＶＳ
ＡｄａＡｈｘ（３）Ｌ（３）ＶＳ
ＡＥＢＳＦ
ＡＧ−１３４３
ＡＧ７０８８
アジェネラーゼ（Agenerase）
ＡＧＭ−１４７０
アリスキレン（aliskiren）
ＡＬＬＭ
ＡＬＬＮ
アロフェニルノルスタチン（allophenylnorstatine）含有阻害薬
アマスタチン（amastatin）
［（２Ｓ，  ３Ｒ）］−３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−メチルヘキサノイル］−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（[(2S, 3R)]-3-amino-2-hydroxy-5-methylhexanoyl]-Val-Val-Asp）
２−（５−アミノ−６−オキソ−２−フェニル−ピリミジン−１−イル）−Ｎ−［１−ヒドロキシ−３−メチル−１−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）ブタン−２−イル］アセトアミド（2-(5-amino-6-oxo-2-phenyl-pyrimidin-1-yl)-N-[1-hydroxy-3-methyl-1-(5-tert-butyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)butan-2-yl]acetamide）
２−アミノ−Ｎ−［５−（６−ジメチルアミノプリン−９−イル）−４−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）オキソラン−３−イル］−３−（４−メトキシフェニル）プロパンアミド（2-amino-N-[5-(6-dimethylaminopurin-9-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]-3-(4-methoxyphenyl)propanamide）
アンプレナビル（amprenavir）
アンチパイン（antipain）
アプスタチン（apstatin）
アプティバス（Aptivus）
アルガトロバン（argatroban）
アルファメニンＡ（arphamenine A）
アルファメニンＢ（arphamenine B）
アタザナビル（atazanavir）
アジドベスタチン（azidobestatin）
バシトラシンＡ（bacitracin A）
バチマスタット（batimastat）
ＢＢ−２５１６
ＢＢ−９４
ベンズアミジン（benzamidine）
｛１Ｓ−ベンジル−４Ｒ−［１−（１Ｓ−カルバモイル−２−フェニルエチルカルバモイル）−１Ｓ−３−  メチルブチルカルバモイル］−２Ｒ−ヒドロキシ−  ５−フェニルペンチル｝カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチルエステル（{1S-benzyl-4R-[1-(1S-carbamoyl-2-phenylethylcarbamoyl)-1S-3-methylbutylcarbamoyl]-2R-hydroxy- 5-phenylpentyl}carbamic acid tert-butyl ester）
ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニルアルギニルジアゾメタン（benzyloxycarbonylphenylalanylarginyldiazomethane）
ベンジルスルホニルフルオリド（benzylsulfonyl fluoride）
ベスタチン（bestatin）
ベスタチン類似体ＳＬ-３８７
ベスタチン、硫黄含有類似体
ＢＩＬＮ２０６１
ＢＭＳ−２３２６３２
ＢＭＳ１８６７１６
Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈ
ボルテゾミブ（bortezomib）
ブレカナビル（Brecanavir）
ブタビンダイド（butabindide）
Ｎ−［２−［５−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル］−（ＩＲＳ）−１−（メチルエチル）−２−オキソエチル］−２−（５−アミノ−６−オキソ−２−フェニル−６Ｈ−ピリミジン−１−イル）アセトアミド（N-[2-[5-(tert-butyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-(IRS)-1-(methylethyl)-2-oxoethyl]-2-(5-amino-6-oxo-2-phenyl-6H-pyrimidin-1-ly)acetamide）
（２Ｓ）−Ｎ−［（２Ｓ，３Ｒ）−４−［（３Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル）−３，４，４ａ，５，６，７，８，８ａ−オクタヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−２−イル］−３−ヒドロキシ−１−フェニル−ブタン−２−イル］−２−（キノリン−２−カルボニルアミノ）ブタンジアミド（(2S)-N-[(2S,3R)-4-[(3S,4aS,8aS)-3-(tert-butylcarbamoyl)-3,4,4a,5,6,7,8,8a-octahydro-1H-isoquinolin-2-yl]-3-hydroxy-1- phenyl-butan-2-yl]-2-(quinoline-2-carbonylamino)butanediamide）
Ｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣＯＣＨＯ
ＢｚＬＬＬＣＯＣＨＯ
ＣＡ０７４
カルパイン阻害剤Ｉ
カルパイン阻害剤ＩＩ
カルパイン阻害剤ＩＩＩ
カンドキサトリル（candoxatril）
カンドキサトリラート（candoxatrilat）
カプトプリル（captopril）
Ｎ−［（Ｓ）−１−カルボキシ−３−フェニルプロピル］−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ（N-[(S)-1-carboxy-3-phenylpropyl]-L-Ala-L-Pro）
カテプシンＬ阻害薬カツヌマ（cathepsin L inhibitor Katunuma）
ＣＧＰ−６０５３６
p‐クロロ第二水銀安息香酸塩（p-chloromercuribenzoate）
キモスタチン（chymostatin）
シラスタチン（cilastatin）
ＣＫＤ−７３１
クラストラクタシスチン  ベータラクトン
ＣＬＩＫ１４８
ＣＲＡ−０１３７８３
クリキシバン（Crixivan）
（１Ｓ，４Ｒ，６Ｓ，７Ｚ，１４Ｓ，１８Ｒ）−１４−シクロペンチオキシカルボニルアミノ−１８−［２−（２−イソプロピルアミノ−チアゾール−４−イル）−７−メトキシキノリン−４−イルオキシ］−２，１５−ジオキソ−３，１６−ジアザトリシクロ［１４．３．０．０４．６］ノナデク−７−エン−４−カルボン酸（(1S, 4R, 6S, 7Z, 14S, 18R)-14-cyclopentyloxycarbonylamino-18-[2-(2-isopropylamino-thiazol-4-yl)-7-methoxyquinolin-4-yloxy]-2,15-dioxo- 3,16-diazatricyclo[14.3.0.04.6 ]nonadec-7-ene-4-carboxylic acid）
Ｄ−２−メチル−３−メルカプトプロパノイル−Ｌ−Ｐｒｏ（D-2-methyl-3-mercaptopropanoyl-L-Pro）
Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ（２）Ｃｌ
ＤＡＮＬＭＥ
ＤＡＰＴ
ダルナビル（darunavir）
ＤＣＩ
ＤＦＰ
１，３−ジ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル）アミノアセトン（1, 3-di-(N-benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucyl)aminoacetone）
ジアゾアセチル-Ｄ，Ｌ-ノルロイシンメチルエステル（diazoacetyl-D,L-norleucine methyl ester）
３，４−ジクロロイソクマリン（3,4-dichloroisocoumarin、DCI）
Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル（N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-l-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester）
ジイソプロピルフルオロフォスフェート（diisopropyl fluorophosphate、DFP）
ジイソプロピルホスホノフルオリダート（diisopropyl phosphonofluoridate）
（２Ｓ）−Ｎ−［（２Ｓ，４Ｓ，５Ｓ）−５−［［２−（２，６−ジメチルフェノキシ）アセチル］アミノ］−４−ヒドロキシ−１，６−ジフェニル−ヘキサン−２−イル］−３−メチル−２−（２−オキソ−１，３−ジアジナン−１−イル）ブタンアミド（(2S)-N-[(2S,4S,5S)-5-[[2-(2,6-dimethylphenoxy)acetyl]amino]-4-hydroxy-1,6- diphenyl-hexan-2- yl]-3-methyl-2-(2-oxo-1,3-diazinan-1-yl)butanamide）
Ｎ−［２−［４−（２，２−ジメチルプロピオニルオキシ）フェニルスルホニルアミノ］アミノ酢酸（N-[2-[4-(2,2-dimethylpropionyloxy)phenylsulfonylamino] aminoacetic acid）
４，６−ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタ−８−イル［４−［（４−アミノフェニル）スルホニル−（２−メチルプロピル）アミノ］−３−ヒドロキシ−１−フェニル−ブタン−２−イル］アミノホルマート（4,6-dioxabicyclo[3.3.0]oct-8-yl [4-[(4-aminophenyl)sulfonyl-(2-methylpropyl)amino]-3-hydroxy-1-phenyl-butan-2-yl]aminoformate）
ＤＰＣ４２３
ＤＸ−９０６５ａ
Ｅ−６４
Ｅ６４
Ｅ６４ｃ
Ｅ６４ｄ
ＥＤＴＡ
エラスポール（Elaspol）
エラスタチナル（elastatinal）
エナラプリル（enalapril）
エナラプリラート（enalaprilat）
Ｅｐ４７５
ＥＰＮＰ
１，２−エポキシ−３（ｐ−ニトロフェノキシ）プロパン（1,2-epoxy-3(p-nitrophenoxy)propane）
ＥＳＴ
Ｎ−（２−エトキシ−５−オキソ−オキソラン−３−イル）−５−イソキノリン−１−イルカルボニルアミノ−２，６−ジオキソ−１，７−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカン−８−カルボキサミド（N-(2-ethoxy-5-oxo-oxolan-3-yl)-5-isoquinolin-1-ylcarbonylamino-2,6-dioxo-1,7-diazabicyclo[5.4.0]undecane-8-carboxamide）
１−［２−（１−エトキシカルボニル−３−フェニル−プロピル）アミノプロパノイル］ピロリジン−２−カルボン酸（1-[2-(1-ethoxycarbonyl-3-phenyl-propyl)aminopropanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid）
エチル（＋）−（２Ｓ，３Ｓ）−３−［（Ｓ）−３−メチル−１−（３−メチルブチルカルバモイル）ブチルカルバモイル］−２−オキシランカルボキシレート（ethyl(+)-(2S,3S)-3-[(S)-3-methyl-1-(3-methylbutylcarbamoyl)butylcarbomoyl]-2-oxiranecarboxylate）
Ｎ‐エチルマレイミド（N-ethylmaleimide）
１−メチルピロール−２，５−ジオン（1-ethylpyrrole-2,5-dione）
３−（５−フルオロ−３−インドリル）−２−メルカプト−（Ｚ）−２−プロペン酸（3-(5-fluoro-3-indolyl)-2-mercapto-(Z)-2-propenoic acid）
４−［２−［（４−フルオロフェニル）メチル］−６−メチル−５−（５−メチルオキサゾール−３−イル）カルボニルアミノ−４−オキソ−ヘプタノイル］アミノ−５−（２−オキソピロリジン−３−イル）−ペンタ−２−エノアート（4-[2-[(4-fluorophenyl)methyl]-6-methyl-5-(5-methyloxazol-3-yl)carbonylamino-4-oxo-heptanoyl]amino-5-(2-oxopyrrolidin-3-yl)-pent-2-enoate）
Ｎ−ｆｏｒｍｙｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｉｐ−Ｌｅｕ−Ｐｉｐ
Ｎ−ｆｏｒｍｙｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｉｐ−Ｌｅｕ−Ｐｉｐ
２−［２−（ホルミル−｛アロ｝−イソロイシル−スレオニル−ロイシル−バリル）−（ヘキサヒドロピラダジン−３−カルボニル）−ロイシル］−ヘキサヒドロピリダジン−３−カルボン酸（2-[2-(formyl-{allo}-isoleucyl-threonyl-leucyl-valyl)-(hexahydropyradazine-3-carbonyl)-leucyl]-hexahydropyridazine-3-carboxylic acid）
フォートベイス（Fortovase）
ホスアンプレナビル（Fosamprenavir）（プロドラッグ）
ＦＰＲＣＨ２Ｃｌ
フマガロン（fumagalone）
フマギリン（fumagillin）
γ-セクレターゼ阻害剤ＩＩ（gamma-secretase inhibitor II）
グロボマイシン（globomycin）
ＧＷ０３８５
ＧＷ４３３９０８
ＧＷ４３３９０８（プロドラッグ）
ＨＭＢＡ
ＨＭＢＳＡ
１Ｒ−［１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ］−１−（１−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−４−プロピル−６−オキサ−２−アザビシクロ［３．２．１．］ヘプタン−３，７−ジオン（1R-[1S,4R,5S]-1-(1-hydroxy-2-methylpropyl)-4-propyl-6-oxa-2-azabicyclo[3.2.1.]heptane-3,7-dione）
（３Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）−２−［（２Ｒ，３Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−［（３−ヒドロキシ−２−メチル−ベンゾイル）アミノ］−４−フェニルスルファニル−ブチル］−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−３，４，４ａ，５，６，７，８，８ａ−オクタヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボキサミド（(3S,4aS,8aS)-2-[(2R,3R)-2-hydroxy-3-[(3-hydroxy-2-methyl-benzoyl)amino]-4-phenylsulfanyl-butyl]-N-tert- butyl-3,4,4a,5,6,7,8,8a-octahydro-1H-isoquinoline-3-carboxamide）
（４Ｒ）−３−［（２Ｓ，３Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−［［（２Ｒ）−２−［（２−イソキノリン−５−イルオキシアセチル）アミノ］−３−メチルスルファニル−プロパノイル］アミノ］−４−フェニル−ブタノイル］−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−チアゾリジン−４−カルボキサミド（(4R)-3-[(2S,3S)-2-hydroxy-3-[[(2R)-2-[(2-isoquinolin-5-yloxyacetyl)amino]-3-methylsulfanyl-propanoyl]amino]-4-phenyl-butanoyl]-N-tert-butyl-thiazolidine-4-carboxamide）
［１−［［３−ヒドロキシ−４−［（２−メトキシカルボニルアミノ−３，３−ジメチル−ブタノイル）アミノ−［（４−ピリジン−２−イルフェニル）メチル］アミノ］−１−フェニル−ブタン−２−イル］カルバモイル］−２，２−ジメチル−プロピル］アミノホルマート（[1-[[3-hydroxy-4-[(2-methoxycarbonylamino-3,3-dimethyl-butanoyl)amino-[(4-pyridin-2-ylphenyl)methyl]amino]-1-phenyl-butan-2-yl]carbamoyl]-2,2-dimethyl-propyl]aminoformate）
３−ヒドロキシ−４−［２−［３−ヒドロキシ−６−メチル−４−［３−メチル−２−［３−メチル−２−（３−メチルブタノイルアミノ）ブタノイル］アミノ−ブタノイル］アミノ−ヘプタノイル］アミノプロパノイルアミノ］−６−メチル−ヘプタン酸（3-hydroxy-4-[2-[3-hydroxy-6-methyl-4-[3-methyl-2-[3-methyl-2-(3-methylbutanoylamino)butanoyl]amino-butanoyl]amino- heptanoyl]aminopropanoylamino]-6-methyl-heptanoic acid）
（２Ｓ）−１−［（２Ｓ，４Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−［［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］カルバモイル］−５−フェニル−ペンチル］−４−（ピリジン−３−イルメチル）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−ピペラジン−２−カルボキサミド（(2S)-1-[(2S,4R)-2-hydroxy-4-[[(1S,2R)-2-hydroxy-2,3-dihydro-1H-inden-1-yl]carbamoyl]-5-phenyl-pentyl]-4-(pyridin-3-ylmethyl)-N-tert-butyl-piperazine-2-carboxamide）
Ｎ−［３−［（１Ｒ）−１−［（６Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−オキソ−６−フェネチル−６−プロピル−５Ｈ−ピラン−３−イル］プロピル］フェニル］−５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−スルホンアミド（N-[3-[(1R)-1-[(6R)-2-hydroxy-4-oxo-6-phenethyl-6-propyl-5H-pyran-3-yl]propyl]phenyl]-5-(trifluoromethyl)pyridine-2-sulfonamide）
ｐ−ヒドロキシメルクリベンゼンスルホナート（p-hydroxymercuribenzenesulfonate）
ｐ−ヒドロキシメルクリベンゾアート（p-hydroxymercuribenzoate）
ＩＤＮ−６５５６
インジナビル（indinavir）
インビラーゼ（invirase）
ヨードアセトアミド（iodoacetamide）
ヨードアセタート（iodoacetate）
２−ヨードアセタート（2-iodoacetate）
ヨードチロスタチン（iodotyrostatin）
イソバレリル−Ｌ−チロシル−Ｌ−バリル−ＤＬ−チロシナール（isovaleryl-L-tyrosyl-L-valyl-DL-tyrosinal）
Ｎ−イソバレリル−チロシル−ロイシル−チロシナール（N-isovaleryl-tyrosyl-leucyl-tyrosinal）
ＫＮＩ−２７２
キノスタチン−２７2（kynostatin-272）
Ｌ−００６２３５
Ｌ−７０９０４９
Ｌ−７３５，５２４
Ｌ６８５４５８
ラクタシスチン（lactacystin）
ＬＡＦ２３７
ロイペプチン（leupeptin）
ロピナビル（lopinavir）
ロキスタチン（loxistatin）
ＬＹ−５７０３１０
マリマスタット（marimastat）
ＭＤ８０５
ＭＤＬ２８１７０
［３−メチル−１−（３−フェニル−２−ピラジン−２−イルカルボニルアミノ−プロパノイル）アミノ−ブチル］ボロン酸（[3-methyl-1-(3-phenyl-2-pyrazin-2-ylcarbonylamino-propanoyl)amino-butyl]boronic acid）
４−メチルウンベリフェリルｐ−（ＮＮＮ−トリメチルアンモニウム）シンナマート（4-methylumbelliferyl p-(NNN-trimethylammonium)cinnamate）
４−メチルウンベリフェリルｐ−グアニジノベンゾアート（4-methylumbelliferyl p-guanidinobenzoate）
ＭＧ−１０１
ＭＧ−２６２
ＭＧ１３２
ＭＫ−４２１
ＭＫ−４２２
ＭＫ−６３９
ＭＫ０７９１
ＭＬＮ−３４１
ＭＬＮ５１９
ＭＱＰＡ
ＭＵＧＢ
ＭＵＴＭＡＣ
ＭＷ１６７
Ｎ−［（Ｓ）−２−ベンジル−３［（Ｓ）（２−アミノ−４−メチルチオ）ブチルジチオ］−１−オキソプロピル］−Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステル（N-[(S)-2-benzyl-3[(S)(2-amino-4- methylthio)butyl dithio]-1-oxopropyl]-L-phenylalanine benzyl ester）
ネルフィナビル（nelfinavir）
ＮＥＭ
Ｎｉｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＬｅｕＶＳ−Ｍｅ
ニトロベスタチン（nitrobestatin）
ＮＬＶＳ
ノービア（Norvir）
ＮＰＧＢ
ＮＰＩ−００５２
ＮＶＰ−ＬＡＦ２３７
オマパトリラト（omapatrilat）
オムラリド（omuralide）
ＯＮＯ−５０４６
ＯＮＯ−６８１８
ＯＰ
オバリシン（ovalicin）
６−オキソ−５−（３−フェニル−２−スルファニル−プロパノイル）アミノ−２−チア−７−アザビシクロ［５．４．０］ウンデカン−８−カルボン酸（6-oxo-5-(3-phenyl-2-sulfanyl-propanoyl)amino-2-thia-7-azabicyclo[5.4.0]undecane-8-carboxylic acid）
６−オキソ−６−デオキシフマギロール（6-oxo-6-deoxyfumagillol）
オキソラン−３−イル［４−［（４−アミノフェニル）スルホニル−（２−メチルプロピル）アミノ］−３−ヒドロキシ−１−フェニル−ブタン−２−イル］アミノホルマート（oxolan-3-yl [4-[(4-aminophenyl)sulfonyl-(2-methylpropyl)amino]-3- hydroxy-1-phenyl-butan-2-yl]aminoformate）
ｐ−ニトロフェニル-p'-グアニジノベンゾアート（p-nitrophenyl-p'-guanidinobenzoate）
ＰＣＭＢ
ＰＤ１５０６０６
ＰＤ１５１７４６
ペファブロック（Pefabloc）
ペプスタチン（pepstatin）
ペプスタチンＡ（pepstatin A）
１，１０−フェナントロリン（1,10-phenanthroline）
ｏ−フェナントロリン（o-phenanthroline）
フェニルメタンスルホニルフルオリド（phenylmethane sulfonylfluoride）
２−（ホスホノメチル)ペンタン二酸（2-(phosphonomethyl)pentanedioic acid）
ホスホラミドン（phosphoramidon）
ピペラスタチン（piperastatin）
ピペラスタチンA（piperastatin A）
ＰＭＰＡ
ＰＭＳＦ
ＰＮＵ−１４０６９０
ポストスタチン（poststatin）
ＰＰＡＣＫ
プラルナカサン（pralnacasan）
Ｎ−（Ｌ−３−ｔｒａｎｓ−プロピルカルバモイルオキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−プロリン（N-(L-3-trans-propylcarbamoyloxirane-2-carbonyl)-L-isoleucyl-L-proline）
プロテアソーム阻害剤３（proteasome inhibitor 3）
プロテアソーム阻害剤III（proteasome inhibitor III）
ＰＳ−５１９
ＰＳ３４１
プソイドヨードチロスタチン（pseudo-iodotyrostatin）
プソイドチロスタチン（pseudo-tyrostatin）
ＰＳＩ−３
ＰＳＩ−ＩＩＩ
プロマイシン（puromycin）
ＲＢ１０１（Ｓ）
ｒｅｔｒｏ−チオルファン［［［（Ｒ）−１−（メルカプトメチル）−２−フェニルエチル］アミノ］−３−オキソプロパン酸］［ＨＳＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）ＮＨＣＯＣＨ２ＣＯＯＨ］（retro-thiorphan [[[(R)-1-(mercaptomethyl)-2-phenylethyl] amino]-3-oxopropanoic acid] [HSCH2CH(CH2C6H5)NHCOCH2COOH]）
リトナビル（ritonavir）
ＲＫ−８０５
Ｒｏ３１−８９５９
ルピントリビル（rupintrivir）
ルプリントリビル（ruprintrivir）
Ｓ−ＰＩ
Ｓ１７０９２
サリノスポラミドＡ（salinosporamide A）
サキナビル（saquinavir）
ＳＣＨ５０３０３４
ＳＣＨ４４６２１１
ＳＣＨ６
シベレスタット（sivelestat）
ＳＰＰ１００
ＳＱ１４２２５
ＳＳＲ６９０７１
スタチン（statine）
ＴＢＬ（４）Ｋ
１，３−チアゾール−５−イルメチル［［３−ヒドロキシ−５−［［３−メチル−２−［［メチル−［（２−プロパン−２−イル−１，３−チアゾール−４−イル）メチル］カルバモイル］アミノ］−ブタノイル］アミノ］−１，６−ジフェニル−ヘキサン−２−イル］アミノ］ホルマート（1,3-thiazol-5-ylmethyl [[3-hydroxy-5-[[3-methyl-2-[[methyl-[(2-propan-2-yl-1,3-thiazol-4-yl)methyl]carbamoyl]amino]- butanoyl]amino]-1,6-diphenyl-hexan-2-yl]amino]formate）
チオルファン（thiorphan）
チオルファン［Ｎ−［（Ｓ）−２−（メルカプトメチル）−１−オキソ−３−フェニルプロピル］グリシン］［ＨＳＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）ＣＯＮＨＣ−Ｈ２ＣＯＯＨ］（thiorphan [N-[(S)-2-(mercaptomethyl)-1-oxo-3-phenylpropyl]glycine] [HSCH2CH(CH2C6H5)CONHC-H2COOH]）
チプラナビル（tipranavir）
ＴＬＣＫ
ＴＭＣ−９５
ＴＭＣ−９５Ａ
ＴＭＣ−９５Ｂ
ＴＭＣ−９５Ｃ
ＴＭＣ−９５Ｄ
ＴＭＣ１１４
ＴＮＰ−４７０
Ｔｏｓ−ＬｙｓＣＨ（２）Ｃｌ（ＴＬＣＫ）
Ｔｏｓ−ＰｈｅＣＨ（２）Ｃｌ（ＴＰＣＫ）
ＴＰＣＫ
Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニル−ロイシルアミド（３−メチル）ブタン（L-trans-epoxysuccinyl-leucylamido(3-methyl)butane）
Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニル−ロイシルアミド（４−グアニジノ）ブタン（L-trans-epoxysuccinyl-leucylamido(4-guanidino)butane）
チロペプチンＡ（tyropeptin A）
チロペプチンＢ（tyropeptin B）
チロスタチン（tyrostatin）
チロスタチン（tyrostatin）
ウベニメクス（Ubenimex）
ＵＩＣ−９４０１７
ＵＫ−６９，５７８
ＵＫ−７３，９６７
ＵＫ−７９，３００
ベルケイド（Velcade）
ビルダグリプチン（vildagliptin）
ビラセプト（Viracept、メシル酸ネルフィナビル（nelfinavir mesylate））
ＶＸ−７４０
ＶＸ４７８
ＶＸ９５０
Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ｌｅｕｃｉｎａｌ
Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＬｅｕＶＳ
（Ｚ−ＬＬ）（２）ケトン（(Z-LL)(2) ketone）
Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ジアゾメタン（Z-Phe-Arg-diazomethane）
Ｚ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｈ
ＺＤ−８３２１(好中球エラスターゼ阻害薬、neutrophil elastase inhibitor)
ＺＬ（３）ＶＳ
ＺＬ３ＶＳ
【００３０】
尚、興味の対象となる任意のペプチダーゼに対する利用可能な他の阻害薬について、種々の方法を用いて評価してもよい。典型的なプロトコルのいくつかを以下に示す。
【００３１】
［カルボキシペプチダーゼＡ１及びＡ２］
カルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ）は、ポリペプチド鎖のＣ末端に隣接するペプチド結合を加水分解する膵メタロペプチダーゼである。カルボキシペプチダーゼＡ１（ＣＰＡ１）及びカルボキシペプチダーゼＡ２（ＣＰＡ２）は、ペプチド基質に対する特異性において異なる。前者（従来のＡ型に割り当て可能）は、脂肪族及び芳香族残基を広く選択するのに対し、後者は、芳香族残基に対してより限定的である。芳香族の又は分岐した側鎖を有するＣ末端Ｌアミノ酸は、ペプチド鎖を優先的に切断する。反応速度の測定は、Folk及びSchirmer（1963）の方法に基づいて行う。Folk, J.及びSchirmer, E. J. Biol. Chem. (1963) 238:3884-94を参照のこと。ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−フェニルアラニン（Sigma H6875）の加水分解速度は、２５４ｎｍにおける吸光度の増加を測定することにより測定した。１ユニットは、特定条件下、ｐＨ７．５、２５℃で１分間あたりｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−フェニルアラニン１マイクロモルを加水分解する。
【００３２】
基質
１ｍＭ  ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−フェニルアラニン溶解２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５Ｍ塩化ナトリウム含む。
【００３３】
酵素
ＣＰＡ１は、Sigmaを通じて購入可能である（C5358）。或いは、ｈＣＰＡ１は、Laethem等、Arch Biochem Biophys (1996) 332(1): 8-18に記載の手順で精製可能である。ｈＣＰＡ２は、Reverter等、J. Biol. Chem. (1998) 273(6): 3535-41に記載の手順で精製可能である。
【００３４】
手順
ＣＰＡストック溶液は、１０％塩化リチウムに溶解し、最終濃度を１−３ｕｎｉｔ／ｍＬとする。ＣＰＡの濃度は、２７８ｎｍにおける吸光度の測定により算出可能である（ｍｇ／ｍＬ＝Ａ２７８ｘ０．５１５）。基質は、ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−フェニルアラニン（１ｍＭ）溶解アッセイバッファ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）である。基質２．０ｍＬを各キュベットにピペットで分取して、分光光度計内２５℃３〜４分間インキュベートし、温度平衡とし、あればブランク速度を確立する。希釈した酵素０．１ｍＬを添加し、３〜５分間におけるＡ２５４の増加を記録する。ΔＡ２５４／分を、得られた曲線の初期直線部分から測定する。試験化合物の阻害活性を、１μＭ〜０．１ｎＭの範囲の濃度での存在下の反応速度の測定により分析する。
【００３５】
計算
【００３６】
【数１】
2010502646.tif 000002
【００３７】
アッセイの出典はWorthington Biochemである。詳細については、http://www.worthington-biochem.com/COA/default.htmLを参照のこと。
【００３８】
［カルボキシペプチダーゼＢ］
カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）は、塩基性アミノ酸であるリシン、アルギニン及びオルニチンのポリペプチドのＣ末端からの加水分解を触媒する。活性は、Folk及びSchirmer(1963)の分光光度法により測定し、即ち、反応速度は、ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−アルギニンの加水分解による２５４ｎｍにおける吸光度の増加により測定される。１ユニットは、特定条件下、ｐＨ７．６５、２５℃で１分間あたりｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−フェニルアラニン１マイクロモルの加水分解を引き起こす。
【００３９】
基質
１ｍＭ  ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−アルギニン溶解２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６５、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む。
【００４０】
酵素
ＣＰＢは、Sigmaを通じて購入可能である（C9584)。ストック溶液は、試薬用水で希釈して１−５ｕｎｉｔ／ｍＬの濃度とする。
【００４１】
手順
基質２．９ｍＬをキュベットにピペットで分取して、分光光度計内２５℃３〜４分間インキュベートし、温度平衡とし、あればブランク速度を確立する。希釈した酵素０．１ｍＬを添加し、３〜４分間におけるＡ２５４の増加を記録する。ΔＡ２５４／分を、得られた曲線の初期直線部分から測定する。試験化合物の阻害活性を、１μＭ〜０．１ｎＭの範囲の濃度での存在下の反応速度の測定により分析する。
【００４２】
計算
【００４３】
【数２】
2010502646.tif 000003
【００４４】
アッセイの出典はWorthington Biochemである。詳細については、http://www.worthington-biochem.com/COB/default.htmLを参照のこと。
【００４５】
或いは、Sigma-Aldrichによるプロトコル、http://www.sigmaaldrich.com/img/assets/18160/Carboxypeptidase_B.pdf#search=%22carboxypeptidase%20b%20assay%22を用いる。
【００４６】
［カルボキシペプチダーゼＤ］
カルボキシペプチダーゼＤ（ＣＰＤ）は、３つの相同カルボキシペプチダーゼ活性部位ドメイン及びカルボキシル末端の疎水性膜貫通アンカーを有する１８０−ｋＤａの一本鎖糖タンパク質である。単一アミノ酸をペプチド及びタンパク質のＣ末端から切断し、Ｃ末端アルギニン又はリシンに対して厳密な特異性を示す。ＣＰＤ活性は、エンドポイント蛍光測定を用いて測定する。
【００４７】
基質
ＣＰＤ基質のダンシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニンは、塩化ダンシルを、ジペプチド、アラニン−アルギニンと上述のように反応させて合成する。Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1982) 79:3886-3890; Life Sci. (1982) 31:1841-1844; Methods Enzymol. (1995) 248:663-675を参照のこと。
【００４８】
酵素
ＣＰＤ活性は、ＭＣＦ−７細胞可溶化物中で測定する。ＭＣＦ−７細胞［（１０−２０）×１０６］は、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．６）中で２１ゲージ針でホモジナイズする。全細胞可溶化物又は細胞成分画分を得、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を各画分に添加して、最終濃度を０．１％（ｖ／ｖ）とする。試料は、その後の分析まで−２０℃で保管する。
【００４９】
手順
氷冷酵素試料（全量５０μＬ中に１μＬあたり６０−８０ｎｇのタンパク質）を、１５０μＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．６）と共に３７℃で５分間プレインキュベートする。このアッセイは、予め平衡化（３７℃）した（５０μＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ５．６、中の）ダンシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニン基質の添加により開始される。３７℃でのインキュベート（ＣＰＤ−Ｎについては６分間、ＣＰＤについては１０分間）の後、本反応を１５０μＬの１Ｍクエン酸の添加により終了させ、試料を氷上に配置する。生成したダンシル−Ｌ−アラニンを、クロロホルムで抽出することで、より親水性の基質であるダンシル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アルギニンから分離する。クロロホルム層の蛍光を、クロロホルムブランクと比較して、３４０ｎｍ励起波長及び４９５ｎｍ蛍光を測定する。ダンシル−Ｌ−アラニン（Tokyo Chemical Industry America、ポートランド、オレゴン、米国）を様々な濃度で用いて、各アッセイについて検量線を作成し、抽出効率の変動を補正する。阻害薬には、ＭＧＴＡ（ＤＬ−２−メルカプトメチル−３−グアニジノエチルチオプロパン酸、Calbiochem、ラ・ホーヤ、カリフォルニア、米国）及びＯＰ（１，１０−フェナントロリン、Sigma）を用いる。ＣＰ活性は、１０μＭ  ＭＧＴＡの存在下又は非存在下での活性の違いとして測定する。特異的な活性SAは、タンパク質１ｍｇあたりのＶｍａｘ（μｍｏｌ／ｍｉｎ＝ｕｎｉｔ）として算出する（即ち、ＳＡ＝ｕｎｉｔ／ｍｇタンパク質）。Ｋｍは６３ｕＭとなり、Ｖｍａｘ＝２７ｕｍｏｌ／ｍｉｎである。試験化合物の阻害活性を、１μＭ〜０．１ｎＭの範囲の濃度で分析する。
出典は、Biochem J. (2005) 390(Pt 3): 665-73 http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=15918796である。
【００５０】
［カルボキシペプチダーゼＥ］
カルボキシペプチダーゼＥ（ＣＰＥ）は、細胞内タンパク質分解により切断されたペプチドホルモンの塩基性残基を、Ｃ末端から切断するプロセシング酵素である。この酵素は、神経及び内分泌細胞のゴルジ及び分泌顆粒に専ら存在する。
【００５１】
基質
Ｄｎｓ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｒｇは、Fricker Methods Neurosci. (1995) 23:237-250による方法で調製可能である。
【００５２】
酵素
カルボキシペプチダーゼＥは、これまでに確立された手順で精製及び単離が可能である。J. Biol. Chem. (1996) 271(8): 30619-30624を参照のこと。
【００５３】
手順
カルボキシペプチダーゼアッセイとして、２５μＬの酵素を、５０ｍＭ  ＮａＡｃ（ｐＨ５．５）及び２００μＭダンシル−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ基質と合わせて最終的な体積を２５０μＬとする。加えて、１ｍＭのＣｏＣｌ２又は１μＭのグアニジノエチルメルカプトコハク酸（ＧＥＭＳＡ）のいずれかをチューブに含んだ。試料を阻害薬と共に１５分間４℃でプレインキュベートし、その後、基質を添加し、チューブを１時間３７℃でインキュベートする。６０分間のインキュベートに続き、１００μＬの０．５Ｍ  ＨＣｌ及び２ｍＬのクロロホルムを添加し、チューブを混合し、その後、５００×ｇで２分間遠心分離する。クロロホルム層における蛍光（励起３５０ｎｍ、蛍光５００ｎｍ）の測定から、生成物の量を測定する。メタロカルボキシペプチダーゼ活性を、Ｃｏ２＋（ＣＰＥの活性化剤）の存在下及びＧＥＭＳＡ（ＣＰＥの阻害薬）の存在下で測定した活性の差として定義する。これらの実験では、カルボキシペプチダーゼ活性は、酵素を含むチューブとバッファ及び基質のみを含むチューブとの蛍光の差として定義し、酵素、バッファ及び基質を含み２価イオン又は阻害薬を含まない対照チューブの％として表す。試験化合物の阻害活性を、１μＭ〜０．１ｎＭの範囲の濃度で分析する。
出典は、J. Biol. Chem. (1996) 271(8): 30619-24 http://www.jbc.org/cgi/content/full/271/48/30619?ijkey=9114ecbb2b0629a51b4b2c5782deeec9ed63a931である。
【００５４】
［カルボキシペプチダーゼＧ］
カルボキシペプチダーゼＧは、リソソームのチオール依存性プロテアーゼであり、これは、ｇ−グルタミルプテロイルポリ−ｇ−グルタミン酸を徐々に切断して、プテロイル−ａ−グルタミン酸（葉酸）及び遊離グルタミン酸を生成する。ｇ−グルタミル結合に対して特に特異的であるが、Ｃ末端アミノ酸に対しては特異的ではないと考えられている。J. Biol. Chem. (1967) 242:2933を参照のこと。
【００５５】
基質
(+)アメトプテリンは、Sigma-Aldrichから購入可能である（A7019)。
【００５６】
酵素
カルボキシペプチダーゼＧは、Sigma-Aldrichから購入可能である（C9658）。１ユニットは、１分間あたり、ｐＨ７．３、３０℃で１．０ｕモルのグルタミン酸を（＋）アメトプテリンから加水分解する。
【００５７】
手順
２．８ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファに、０．１ｍＭ塩化亜鉛と共に、ｐＨ７．３、３０℃で０．１ｍＬの１．８ｍＭ（＋）アメトプテリンを添加する。反転させて混合し、３０℃に平衡化する。適切に温度調節された分光光度計を用いて、Ａ３２０ｎｍを一定となるまでモニタする。その後、０．３−０．６ｕｎｉｔ／ｍＬ水含有０．１ｍＬ酵素を添加する。その直後に、反転させて混合し、試験試料及びブランク両方の最大線形速度を用いてΔ３２０ｎｍ／分における減少を記録する。試験化合物の阻害活性を、１μＭ〜０．１ｎＭの範囲の濃度で分析する。
【００５８】
計算
【００５９】
【数３】
2010502646.tif 000004
【００６０】
３＝アッセイの体積（ミリリットル）
ｄｆ＝希釈ファクター
８．３＝３２０ｎｍにおける基質及び生成物間のミリモル吸光係数の差
１０．１＝使用した酵素の体積（ミリリットル）
出典は、Sigma-Aldrich酵素アッセイhttp://www.sigmaaldrich.com/sigma/enzyme%20assay/c9658enz.pdfである。
【００６１】
［カルボキシペプチダーゼＭ］
カルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）は、細胞外グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型膜糖タンパク質である。このタンパク質は、亜鉛メタロカルボキシペプチダーゼのＣＰＮ／Ｅサブファミリーのメンバーである。これは、例えばリシン及びアルギニンなどのＣ末端塩基性残基を、最後から２番目にアラニンを含有するペプチドから特異的に除去する。細胞表面上のペプチドホルモン及び成長因子の活性の制御において、並びに細胞外タンパク質の膜局在型分解において、重要な役割を演じていると考えられる（Braz J Med Biol Res 2006 39:211-217）。
【００６２】
基質
ダンシル−Ａｌａ−Ａｒｇは、ジペプチドＡｌａ−Ａｒｇをダンシル化することで合成可能である（Methods in Neurosciences: Peptide Technology" (P. M. Conn, ed.), Vol. 6, p. 373. Academic Press, Orlando, Florida, 1991.）
【００６３】
酵素
カルボキシペプチダーゼＭは、Tan等(Methods Enzymol 1995 248:663-675)により記載された方法に従って、単離精製される。
【００６４】
手順
１２５μＬのバッファ（０．２Ｍ  ＨＥＰＥＳ［４−（２−ヒドロキシエチル）−ｌ−ピペラジンエタンスルホン酸]，ｐＨ７．０，０．２％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）５〜５０／ｕＬの酵素、０又は２５μＬの１００ｍＭ  ＭＧＴＡ及び０〜７０μＬの水を添加して最終的な体積を２００μＬとする。反応の各セットについて、１酵素ブランク（基質を含まず）及び１基質ブランク（酵素を含まず）を用意する。反応の特異性を確実にするために、試料を２−メルカプトメチル−３−グアニジノエチルチオプロパン酸（2-mercaptomethyl-3-guanidinoethylthiopropanoic、ＭＧＴＡ）阻害薬の有り無しでプレインキュベートすることもできる。試料は、氷上で５〜１０分間プレインキュベートし、その後、５０μＬの１．０ｍＭダンシル−Ａｌａ−Ａｒｇ（４．６４ｍｇ／１０ｍＬ水又は希釈１０ｍＭストック溶液１：１０）を添加して反応を開始する。試料は、３７℃で活性に応じて１５分間〜３時間インキュベートし、１５０μＬの停止液（ＮａＯＨでｐＨ３．１に調整した１．０Ｍクエン酸）を添加して反応を停止させる。クロロホルム（１．０ｍＬ）を各チューブに添加し、１５秒間勢いよく混合して、ダンシル−Ａｌａ生成物を抽出し、その後８００ｇで１０分間遠心分離して層を分離させる。クロロホルム層（下層）における蛍光を、３４０ｎｍ励起波長及び４９５ｎｍ蛍光においてクロロホルムブランクと比較して測定する。試験化合物の阻害活性を、１μＭ〜０．１ｎＭの範囲の濃度で分析する。
【００６５】
計算
カルボキシペプチダーゼ活性を、無抑制試料及び１０ｍＭ  ＭＧＴＡで阻害した試料間の蛍光の差として定義する。蛍光単位（ＦＵ）を、ＦＵ対ダンシル−Ａｌａ（Sigma D0125)濃度について検量線を作成することで、基質（ナノモル）に変換する。
出典は、Methods Enzymol (1995) 248:663-675である。
【００６６】
［カルボキシペプチダーゼＮ］
カルボキシペプチダーゼＮ（ＣＰＮ）は、タンパク質を分解から保護する２つの酵素的に活性なサブユニット（ＣＰＮ１）及び２つの大きなサブユニット（ＣＰＮ２）からなる血漿亜鉛メタロプロテアーゼである。ＣＰＮは、カルボキシル末端アルギニン及びリシンを、例えば、補体アナフィラトキシン、キニン及びクレアチンキナーゼＭＭ（ＣＫ−ＭＭ）など、血流に含まれる最後から２番目にアラニンを含有するペプチドから切断する。アミノ酸を１つのみ除去することで、ＣＰＮは、ペプチド活性及びレセプター結合を変化させる能力を有する（Mol Immunol (2004) 40:785-93）。
【００６７】
基質
フリルアクリロイル（ＦＡ）−Ａｌａ−Ｌｙｓは、Sigmaから購入可能である（F5882）。
【００６８】
酵素
カルボキシペプチダーゼＮは、Skidgel Methods Enzymol (1995) 248:653-63に記載された方法に従って精製可能である。
【００６９】
手順
０．５Ｍ  ＮａＣ１バッファを含有する０．５ｍＬの０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７５）、０．１ｍＬの５ｍＭ  ＦＡ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（１８．２３ｍｇ／１０ｍＬ水）及び十分な水を添加し、最終的な体積を１．０ｍＬとする。混合物を水浴で３７℃に加温し、酵素試料を添加して短時間混合し、その後、その溶液を、記録分光光度計の温度調節された（３７℃）チャンバー内で予め温めたキュベットに迅速に移す。３３６ｎｍにおける吸光度の変化は、約２〜３分にわたり連続的に記録される。試験化合物の阻害活性を、１μＭ〜０．１ｎＭの範囲の濃度で分析する。
出典は、Methods Enzymol (1995) 248:653-63である。
【００７０】
［カルボキシペプチダーゼＴ］
カルボキシペプチダーゼＴ（ＣＰＴ）は、サーモアクチノマイセス・ブルガリス（Thermoactinomyces vulgaris）により分泌されることが発見されている。ペプチド基質に対するＣＰＴ特異性は、カルボキシペプチダーゼＡ及びＢの特徴の組み合わせであり、したがって、この酵素は、カルボキシペプチダーゼＡのように、Ｃ末端中性、好ましくは疎水性、アミノ酸、更には陽性基を側鎖に有するアルギニン及びリシン残基を切断する。
【００７１】
酵素
カルボキシペプチダーゼＴは、Stepanov Methods Enzymol (1995) 248:675-83に記載された方法によって精製可能である。
【００７２】
基質
Ｄｎｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＯＨの合成は、上述の手順を通じて成される。Biokhimiya (1973) 38:790を参照のこと。
【００７３】
手順
１ｍＬの０．５ｍＭ基質溶液溶解０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ１バッファ（ｐＨ７．５）に、１０〜１００μＬの酵素溶液を添加する。この混合物を１０〜６０分間３７℃でインキュベートし、その後０．２ｍＬの５０％ＣＨ３ＣＯＯＨを添加して反応を停止させる。この混合物を、１Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＨで予め平衡化された２ｍＬのＳＰＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５を含むマイクロカラム（綿で栓をしたＥｐｐｅｎｄｏｆｆ自動ピペットからプラスチックコーン）に定量的に移す。カラムを１Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＨ（２回、１ｍＬ）で洗浄する。洗液をまとめ、溶液のＡ３６０を測定する。Ｄｎｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ濃度を測定するために、１５０００のモル吸光値（extinction value）（ｅ３６０）を用いる。１活性ユニットは、特定の条件下で１分間あたり１〜ｍｏｌの基質を加水分解する酵素の量に等しい。試験化合物の阻害活性を、１μＭ〜０．１ｎＭの範囲の濃度で分析する。
出典は、Methods Enzymol (1995) 248:675-683である。
【００７４】
［カルボキシペプチダーゼＹ］
カルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＤＹ）は、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）から単離され、極めて幅広い脱離基（例えば、アミノ酸、ｐ−ニトロアニリン、及び種々のアルコール）との加水分解を触媒することが発見されている、６４ｋＤａセリンカルボキシペプチダーゼである。本アッセイでは、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシンの酵素加水分解の間に遊離したロイシンの速度を測定する。
【００７５】
基質
ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシンは、Sigmaから購入可能である（C1141)。備考：ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシンは、バッファとの混合前に、０．５ｍＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を用いて溶解する。
【００７６】
酵素
カルボキシペプチダーゼＹはSigmaより入手可能である（C3888）。酵素の１ｍｇ／ｍＬ溶液を試薬用水を用いて準備する。
【００７７】
手順
１．０ｍＬの１ｍＭベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシン溶解５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５基質溶液を添加する。１０分間２５℃でプレインキュベートする。５０μＬの酵素を添加して酵素反応を開始する。２５℃で１０分間反応させる。１．０ｍＬのニンヒドリン試薬（各５０ｍＬの４％ニンヒドリン溶解メチル・セロソルブ及び０．２Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）−７．１ｍＭ塩化第一スズを混合して調製する。）を添加する。１０テストチューブのそれぞれを１５分間撹拌する。すべてのチューブを熱湯の湯浴に１５分間配置する。チューブを湯浴から取り出し、３０℃未満に冷却する。５．０ｍＬの５０％プロパノール溶液を各テストチューブに添加してよく混合する。すべてのチューブについて５７０ｎｍにおける光学濃度を読む。ロイシンを様々な濃度で用いて、各アッセイについて検量線を作成する。試験化合物の阻害活性を、１μＭ〜０．１ｎＭの範囲の濃度で分析する。
【００７８】
計算
【００７９】
【数４】
2010502646.tif 000005
【００８０】
出典は、Worthington Biochemである。http://www.worthington-biochem.com/COY/default.htmLを参照のこと。
【００８１】
［カルボキシペプチダーゼＺ］
カルボキシペプチダーゼＺ（ＣＰＺ）は、メタロカルボキシペプチダーゼのカルボキシペプチダーゼＥサブファミリーのメンバーである。これらのＺｎ−依存性酵素は、一般的にタンパク質の細胞内外の処理と関係するが、ＣＰＺの特異的な基質はあまりよく知られておらず、しかしながら、Ｃ末端アルギニンを切断することは示されており、Ｗｎｔシグナル伝達経路に関係している。Development (2003) 130(21): 5103-11を参照のこと。
【００８２】
基質
ダンシル−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｒｇは、Fricker Methods Neurosci. (1995) 23:237-250の方法により準備可能である。
【００８３】
酵素
カルボキシペプチダーゼＺｃＤＮＡは、ＡＴ−２０細胞及び上述のようにアフィニティークロマトグラフィーで精製されたタンパク質に、安定的に形質移入可能である。Biochem Biophys Res Comm. (1999) 256:256-8を参照のこと。
【００８４】
手順
ＣＰＺ活性は、最終的なバッファ体積を２５０μＬとした１００ｍＭ、ｐＨ７．４  Ｔｒｉｓ−Ｃｌバッファに溶解した０．２ｍＭダンシル−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｒｇを用いてアッセイする。３７℃で３時間の後、１００μＬの０．５Ｍ  ＨＣｌで反応を停止させ、その後２ｍLのクロロホルムを添加する。混合及び３００×ｇで２分間の遠心分離の後、生成物の量をクロロホルム層の蛍光を測定することで測定する。阻害薬の効果を試験するために、精製したＣＰＺを、バッファ、基質及び阻害薬の混合物に添加し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、１００ｕＭダンシル−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ及び指示された濃度の阻害薬とした最終濃度を得る。反応を、３７℃で１時間インキュベートする。インキュベーションの後、１００μＬの０．５Ｍ  ＨＣｌ及び２ｍＬのクロロホルムを添加し、チューブを混合して、その後５００×ｇで２分間遠心分離する。生成物の量を、クロロホルム層の蛍光（励起３５０ｎｍ、蛍光５００ｎｍ）を測定することで測定する。酵素を含まない対照反応も行う。大量のＣＰＥを使用して反応を行い、基質の生成物への完全な変換に対応する蛍光を測定する。Ｋｍ値を、ダンシル−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ及びダンシル−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｒｇで０．０２５〜１．６ｍＭの濃度範囲を用いて、測定する。
出典は、Biochemical and Biophysical Research Communications (1999) 256:564-568である。
【００８５】
［セリンカルボキシペプチダーゼＡ］
セリンカルボキシペプチダーゼＡは、哺乳類カテプシンＡ（mammalian cathepsin A）、リソソームカルボキシペプチダーゼＡ及びリソソーム防御タンパク質とも呼ばれ、元来は酸性ｐＨでＺ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒを加水分解する酵素と定義される。また、この酵素は、中性ｐＨでエステラーゼ及びデアミダーゼ活性を示す。カテプシンＡはインビトロで例えばＺ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、アンギオテンシンＩＩ、サブスタンスＰ及びエンドセリンＩ等の合成及び生物活性双方のペプチドホルモンを幅広く加水分解できるので、カテプシンＡの生理学的な基質は未だ明らかとなっていないが、カテプシンＡは、ペプチドホルモンのインビボ代謝に関係することが示唆されている。カテプシンＡ活性のアッセイの原理は、ＨＰＬＣで分離した後に行う基質Ｎ−ＤＮＳ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕからの酵素標識Ｎ−ＤＮＳ−Ｐｈｅの蛍光分析測定に基づく。
【００８６】
酵素
０．２５Ｍスクロースに溶解したネズミ腎臓ホモジネートを１０００００×ｇで８０分間遠心分離したものを酵素の源として使用した。
【００８７】
基質
Ｎ−ＤＮＳ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕを、Wiedmeier J. Chromatogr. (1982) 231:410により発表された方法に従って合成した。
【００８８】
手順
反応混合物は、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ４．６）、４０μＭ  Ｎ−ＤＮＳ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ及び酵素並びに水を含み、反応物の全体積は２５０μＬとする。３７℃でインキュベートし、沸騰水中で５分間９５℃に加熱して反応を停止させる。遠心分離の後、内部標準としてＮ−ＤＮＳ−ＮＬｅｕを透明な上澄みに添加し、得られた混合物の一定分量を、Chikuma等のJ Chrom B: Biomed Sci and Apps (1999) 728(1): 59-65に従ってＨＰＬＣで分析する。Ｎ−ＤＮＳ−Ｐｈｅのピーク高を測定し、内部標準として添加したＮ−ＤＮＳ−ＮＬｅｕのピーク高からピコモルに変換する。酵素活性の１ユニットは、１分間３７℃で１ｐｍｏｌの基質を対応する生成物に変換するために必要な酵素の量として定義される。試験化合物の阻害活性を、１μＭ〜０．１ｎＭの範囲の濃度で分析する。
出典は、J. Chrom. B: Biomed. Sci. and Apps. (1999) 728(1): 59-65である。
【００８９】
メタノール（ｘｘｍＬ）に溶解したＤ（Ｃｘ）Ｌ（１ｅｑ）を含む丸底フラスコに、［Ｒｅ（ＣＯ）３（Ｈ２Ｏ）３］Ｂｒ（１ｅｑ）を添加した。反応を、８０℃に加熱し、４時間撹拌した。冷却時に、溶媒を除去し試料をＨＰＬＣで精製した。試料を、１Ｈ  ＮＭＲ及び質量分析法で分析した。
Re(CO)3D(C4)L (5): 収率= 23% (0.4 g). 1H NMR (CDCl3, ppm): 8.77 (m, 2H), 7.91 (m 2H), 7.61 (m, 2H), 7.35 (m, 2H), 7.13 (m, 5H), 5.00 (m, 4H), 4.12-2.60 (mm, 11H), 2.26-1.41 (mm, 16H). MS(ESI): m/z 944 (M+H)+, m/z 942 (M-H)+.
Re(CO)3D(C5)L (6): 収率= 34% (0.61 g). 1H NMR (CDCl3, ppm): 8.77 (m, 2H), 7.91 (m 2H), 7.61 (m, 2H), 7.35 (m, 2H), 7.13 (m, 5H), 3.92 (d, 4H), 3.69-2.65 (mm, 11H), 2.27-1.46 (mm, 18H). MS(ESI): m/z 688 (M+H) +, m/z 686 (M-H)+.
Re(CO)3D(C8)L (7): 収率= 55% (0.40 g). 1H NMR (CDCl3, ppm): 8.50 (d, 2H), 7.63 (m 2H), 7.50 (m, 2H), 7.13 (m, 8H), 3.85 (d, 4H), 3.69-2.53 (mm, 11H), 2.23-1.22 (mm, 24H). MS(ESI): m/z 730 (M+ +H)+. m/z 728 (M-H)+.
【００９０】
９９ｍＴｃ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃｘ）Ｌの基本手順
【００９１】
［９９ｍＴｃ（ＣＯ）３（Ｈ２Ｏ）３］＋を、既刊文献［６］に記載の手順を用いてＩｓｏｌｉｎｋキットによって調製した。金属錯体のラット血漿安定性を試験するために、単離した９９ｍＴｃ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃｘ）Ｌを１ｍＬのラット血漿中において３７℃で５分、６０分、２４時間インキュベートした。所望の時点で、インキュベートした混合物の一定分量（４００μＬ）を採取した。アセトニトリル（８００μＬ）の添加により、沈殿物を得て、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄みを回収し、窒素蒸気下で濃縮した。残った残渣を１０％エタノール／生理食塩水に溶解し、ＨＰＬＣにより分析して化合物の安定性を測定した（図４）。
【００９２】
インビトロＡＣＥ活性アッセイ
試験化合物のＡＣＥ活性阻害能力を、富士レビオ社のＡＣＥカラーキットを製造元の説明書通りに用いて測定した。精製したウサギ肺ＡＣＥ（３．３ｍＵｎｉｔ、Sigma Chemicals）を、基質の溶液中において２０分間３７℃で、１μＭ〜０．１ｎＭの濃度の試験化合物と共にインキュベートした。展開液を添加し、分光光度計で５０５ｎｍを読む前に試料を更に５分間３７℃でインキュベートした。
【００９３】
ラット組織分布
９９ｍＴｃ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃ８）Ｌ（ＭＩＰ−１０３７）の組織分布研究を、オススプラーグドーリーラットの複数グループで行った（ｎ＝５／時点）。ＭＩＰ−１０３７は、０．１ｍＬの一定体積で５０μＣｉ／ｋｇのボーラス投与（約１０μＣｉ／匹）として、尾静脈から投与した。実験動物は、投与後１０分、３０分、１時間及び２時間に、二酸化炭素で窒息させて安楽死させた。組織（血液、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、大腸及び小腸（内容物を含む。）、精巣、骨格筋並びに脂肪）を解剖し、切除し、湿重量を計量し、プラスチックチューブに移し、自動γ−カウンター（LKB Model 1282, Wallac Oy, フィンランド）で測定した。％ＩＤ／ｇとして示される組織の時間−９９ｍＴｃ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃ８）Ｌ（ＭＩＰ−１０３７）放射能濃度は、１分間あたりの減衰補正測定値を投与量％に変換し、組織又は器官試料の重量で除算して求めた。更に、投与量の一定分量を測定し、各組織試料中の１分間あたりの測定値を、器官あたりの投与量％に変換した。
【００９４】
イメージング
６スプラーグドーリーラットをペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ）で麻酔し、９９ｍＴｃ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃ８）Ｌ（ＭＩＰ−１０３７）単体処理グループ又はリシノプリル／９９ｍＴｃ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃ８）Ｌ（ＭＩＰ−１０３７）処理グループに無作為に割り当てた（ｎ＝３／ｇｒｏｕｐ）。全６実験動物をガンマカメラに配置し、低エネルギー汎用コリメータ付きＤＳＸ−ＬＩデュアルヘッド型γカメラ（SMV America）及びミニガンマカメラＭＧＣ５００（TeraRecon Inc.）を各実験動物に用いてベースライン平面腹側画像を１分間の５連続画像で得た。リシノプリル（０．５ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ．）は、実験動物（ｎ＝３）に対して、９９ｍＴｃ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃ８）Ｌ（ＭＩＰ−１０３７）投与の５分前に投与した。５分後、５ｍＣｉ／ｋｇ  ９９ｍＴｃ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃ８）Ｌ（ＭＩＰ−１０３７）を全実験動物（ｎ＝６）に静脈投与し、投与後１０、３０、６０分に１分間の５平面腹側画像を得た。
【００９５】
更に、小動物用ＳＰＥＣＴ／ＣＴを利用した９９ｍＴｃ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃ８）Ｌ（ＭＩＰ−１０３７）取り込みの解剖学的局在性には、ピンホールコリメータ付きＸ−ＳＰＥＣＴ小動物用スキャナー（Gamma Medica, Inc.、ノースリッジ、カリフォルニア）を用いた。ラットに９９ｍＴｃ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃ８）Ｌ（ＭＩＰ−１０３７）単体又はリシノプリルと共に（９９ｍＴｃ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃ８）Ｌ（ＭＩＰ−１０３７）の投与５分前に）投与し、処理グループ（ｎ＝２／ｇｒｏｕｐ）ラットは、イソフルオラン／酸素混合物で麻酔した。後の画像融合時に必要となる全体的な不動性を保証するために、麻酔した実験動物を、特別な装置に固定した。呼吸ベルトを用いて呼吸数を測定することで麻酔深度をモニタした。直腸プローブで体温を制御し、熱伝対（thermocoupler）及び温エアスチームで３７℃に維持した。ＳＰＥＣＴデータを取得し製造元のソフトウェアを用いて再構成した。ＳＰＥＣＴ及びＣＴデータの融合は標準的な方法で行った。
【００９６】
表Ｉに示すように、精製ウサギ肺ＡＣＥについてインビトロで評価した各Ｒｅ−錯体の阻害活性は、テザーの長さ（メチレンスペーサーユニットの数）にともなって直接的に変化し、リシノプリルＩＣ５０＝４ｎＭと比較して、Ｒｅ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃ８）Ｌ（ＭＩＰ−１０３７）；ＩＣ５０＝３ｎＭ、Ｒｅ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃ５）Ｌ（ＭＩＰ−１００３）；ＩＣ５０＝１４４ｎＭ）、及びＲｅ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃ４）Ｌ（ＭＩＰ−１０３９）；ＩＣ５０＝１，１４６ｎＭ）であった。７炭素メチレンスペーサーテザーの類似体であるＭＩＰ−１０３７は、親分子であるリシノプリルに相当する活性を示す。
【００９７】
【表１】
2010502646.tif 000006
【００９８】
表ＩＩは、９９ｍＴｃ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃ８）Ｌ（ＭＩＰ−１０３７）のラット組織分布を示す。全試験組織において様々な濃度で放射性トレーサが検出され、時間経過後直ぐに減少した。取り込みは、高ＡＣＥ発現組織である肺で最も多く、投与後１０分に１５．２％ＩＤ／ｇに達し、２時間経過後も３．９３％ＩＤ／ｇ残った。クリアランスは、腸における放射性標識の増加により示されるように肝胆道経路を介したものが主であると考えられた。ＭＩＰ−１０３７の取り込みは、０．６ｍｇ／ｋｇ非放射性標識リシノプリルとの混注により肺及び他の組織において劇的に減少し、特異的な結合を証明するものとなった。ラット血漿のＨＰＬＣ分析は、錯体は、有意な分解を伴わず２４時間にわたり安定することを示した。
【００９９】
【表２】
2010502646.tif 000007
【０１００】
全身イメージングを用いて、ＭＩＰ−１０３７がインビボでの非侵襲的なＡＣＥ活性モニタに使用可能であるか否かを測定した。上述のように、リシノプリルでの前処理の有無のラットをインビボイメージングプロトコルに用いた。各実験動物について各イメージング時点で肺、肝臓、小腸及びバックグラウンド（軟部組織）に関心領域（Regions of interest、ＲＯＩ）を設定した。各ＲＯＩは、カウントで示し、また、ＲＯＩは同時点におけるバックグラウンドでノーマライズした。図９は、ＭＩＰ−１０３７投与後１０分に取得したインビボ腹側全身平面画像を示している。投与後１０分における初期対照画像は、肺、肝臓、小腸及び膀胱において、リシノプリルで前処理することによりブロックされる放射性トレーサの取り込みが高いことを示した。
【０１０１】
加えて、小動物用ＳＰＥＣＴ／ＣＴ（Gamma Medica, Inc.、ノースリッジ、カリフォルニア）イメージング研究を、放射性トレーサの解剖学的局在性を明らかにするためにおこなった。全身平面イメージングプロトコルと同様に、リシノプリルによる前処理を行ったラットと行わなかったラットとにＭＩＰ−１０３７を与えた。図１０に示されるように、リシノプリルによる前処理によりブロックされる肺活性が顕著に認められ、これは、ＭＩＰ−１０３７が組織（肺）ＡＣＥにインビボで特異的に結合することを示している。前処理グループ及び対照グループの画像を比較すると、肺におけるＭＩＰ−１０３７の取り込みは、ＲＯＩにおけるカウントにより示されたように６０分の観察時間にわたって有意に減少した。肺における放射性トレーサの取り込みは、投与６０分後に略見られなくなった。加えて、ＭＩＰ−１０３７の取り込みの有意な減少が、膀胱で１０、３０及び６０分において、並びに小腸で３０及び６０分において、確認された。肝臓の取り込みは、一過性のもので、この器官からの洗い流しは極めて速く多量であり、ほとんどすべての放射能が、投与後６０分に小腸に完全に排出された。
【０１０２】
メチレン基が変化するＤ（Ｃｘ）Ｌ型の配位子を用いてＭ（ＣＯ）３＋錯体を生成した。最も能力の在る化合物であるＭ（ＣＯ）３Ｄ（Ｃ８）Ｌを、９９ｍ−Ｔｃを用いてインビボで試験した。組織分布研究からは、例えば肺のような高ＡＣＥ発現の器官は、高取り込みであることが示された。リシノプリルで前処理を行った研究からは、この化合物は実際にＡＣＥ特異的であることが示された。平面カメラ画像及びμＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングは、インビボにおける結果が確認された。結論として、リシノプリルと同様の効力を有する高親和性Ｔｃ−９９ｍ標識ＡＣＥ阻害薬が設計された。体内分布、薬理学的ブロッキング研究及び画像分析は、インビボにおいてＡＣＥとの特異的な相互作用を示した。この物質は、関連病態におけるＡＣＥ調節のモニタリングに有用であると考えられる。
【０１０３】
以上、本発明は、好ましい複数の実施形態の詳細な説明により記載及び例示を行った。しかしながら、当業者であれば本発明の範囲内の他の実施形態に関しても明らかであり、本発明は上述の好ましい複数の実施形態に限定されるものではなく、本発明は、特許請求の範囲に相当する範囲と一致するものである。
【図１】
2010502646.tif 000012
【図２】
2010502646.tif 000013
【図３】
2010502646.tif 000014
【図４】
2010502646.tif 000015
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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