(57)【要約】ガンのような疾患を処置するための組成物と方法。この組成物は、遺伝子発現のＲＮＡ干渉のプロセスを刺激することによって、確認された標的遺伝子の発現をサイレンシングさせるか、ダウンレギュレートするか、または抑制し、それにより腫瘍の増殖を阻害するために有効である。本発明によってはまた、腫瘍増殖を阻害するための、中和抗体または低分子薬物を使用する、確認された標的遺伝子産物の不活化により、ガンのような疾患を処置するための方法も提供される。より具体的には、この組成物と方法は、本明細書中で同定された特定の標的遺伝子の病理学的発現に関係する、哺乳動物のガンまたは前ガンの増殖に焦点があてられている。この組成物は、哺乳動物の組織内に導入されると標的遺伝子の発現を阻害する。この方法は、本発明の組成物を必要とする被験体に対して、ガン組織または臓器中での標的遺伝子の発現を阻害するために有効な量で投与する工程を含む。
2010512786.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その長さが２００ヌクレオチド以下であり、第１のヌクレオチド配列を含む単離された標的化ポリヌクレオチドであって、前記第１のヌクレオチド配列は、ＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子を標的化し、任意のＴ（チミジン）または任意のＵ（ウリジン）は、状況に応じて他方で置換することができ、そして前記第１のヌクレオチド配列は、
ａ）その長さが１５ヌクレオチドから３０ヌクレオチドまでの任意の数である配列、または
ｂ）ａ）に提供される配列の相補体
から構成される、単離された標的化ポリヌクレオチド。
【請求項２】
ループ配列によって前記第１のヌクレオチド配列とは間隔が隔てられている第２のヌクレオチド配列をさらに含み、前記第２のヌクレオチド配列が、
ａ）前記第１のヌクレオチド配列と実質的に同じ長さを有しており、そして
ｂ）前記第１のヌクレオチド配列に実質的に相補的である、
請求項１に記載にポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記第１のヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択される配列を標的化する配列；
ｂ）項目ａ）に提供される標的化配列よりも長く、項目ａ）に提供される標的化配列を含む伸張配列であって、前記伸張配列は、ＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子を標的化し、そして前記標的化配列は、配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択される配列を標的化する、伸張配列；
ｃ）配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択される配列を標的化する配列の断片であって、前記断片が、少なくとも１５ヌクレオチドの長さであり、最大で選択される配列よりも１塩基短い長さである、連続する塩基の配列からなる、断片；
ｄ）５個までのヌクレオチドが、配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択される配列を標的化する配列とは異なる、標的化配列；または
ｅ）ａ）〜ｄ）に提供される配列の相補体
からなる、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記第１のヌクレオチド配列の長さが、２１ヌクレオチドから２５ヌクレオチドまでの任意の数である、請求項１または請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
選択される配列の３’末端に結合した２ヌクレオチドの突出を状況に応じて含む、配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択される配列からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択される第１のヌクレオチド配列、ループ配列、および第２のヌクレオチド配列からなる、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記第１のヌクレオチド配列の３’末端にある２ヌクレオチド配列が、ＴＴ、ＴＵ、ＵＴ、またはＵＵであり、前記２ヌクレオチドがリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはそれらの両方を含む、請求項１または請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１または請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１または請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含む、請求項１または請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１に記載の第１の標的化ポリヌクレオチド鎖と、少なくとも前記第１のポリヌクレオチド鎖の第１のヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であり、それにハイブリダイズする第２のヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド鎖とを含む、二本鎖のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１、請求項２、または請求項１０のうち１項以上に記載された複数の標的化ポリヌクレオチドを含む組み合わせであって、個々のポリヌクレオチドは、ＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子の中の異なる配列、あるいはそれらの任意の２つ以上を標的化する、複数の標的化ポリヌクレオチドを含む組み合わせ。
【請求項１２】
個々の標的化ポリヌクレオチドの中の前記第１のヌクレオチド配列が以下：
ａ）配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択される配列を標的化する配列；
ｂ）項目ａ）に提供される標的化配列よりも長く、項目ａ）に提供される標的化配列を含む伸張配列であって、前記伸張配列は、ＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子を標的化し、そして前記標的化配列は、配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択される配列を標的化する、伸張配列；
ｃ）配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択される配列を標的化する配列の断片であって、前記断片が、少なくとも１５ヌクレオチドの長さであり、最大で選択される配列よりも１塩基短い長さである、連続する塩基の配列からなる、断片；
ｄ）５個までのヌクレオチドが、配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択される配列を標的化する配列とは異なる、標的化配列；または
ｅ）ａ）〜ｄ）に提供される配列の相補体
からなる、請求項１１に記載の組み合わせ。
【請求項１３】
請求項１、請求項２、または請求項１０に記載の標的化ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
前記ベクターが、プラスミド、コスミド、組み換え体ウイルス、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、トランスポゾン、またはミニ染色体である、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
前記制御エレメントが、その発現を促進するために有効な標的化ポリヌクレオチドと動作可能であるように連結されている、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１、請求項２、または請求項１０に記載の１つ以上のポリヌクレオチド、あるいはそれらの組み合わせでトランスフェクトされた細胞。
【請求項１７】
請求項１、請求項２、または請求項１０に記載の１つ以上のポリヌクレオチド、あるいはそれらの組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物であって、個々のポリヌクレオチドは、ＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子、あるいはこれらの任意の２つ以上の中の異なる配列を標的化する、薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１３に記載の１つ以上のベクターと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物であって、個々のベクターは、ＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子、あるいは、これらの任意の２つ以上の中の異なる配列を標的化するポリヌクレオチドを有している、薬学的組成物。
【請求項１９】
前記担体が合成ポリマー、リポソーム、デキストロース、界面活性剤、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせを含む、請求項１７または請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１または請求項２に記載のＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子を標的化する配列を有するポリヌクレオチドを合成する方法であって、以下の工程：
ａ）活性のある反応性末端を含み、前記配列の第１の末端にあるヌクレオチドに対応しているヌクレオチド試薬を提供する工程、
ｂ）先の工程による活性のある反応性末端と反応させて、増殖するポリヌクレオチド配列の長さを１ヌクレオチド伸ばすために、活性のある反応性末端を含み、標的化配列の連続している位置に対応しているさらなるヌクレオチドを付加させ、そして望ましくない生成物と過剰な試薬を除去する工程、および、
ｃ）工程ｂ）を、配列の第２の末端にあるヌクレオチドに対応するヌクレオチド試薬が付加されるまで繰り返す工程
を含み、それにより完全なポリヌクレオチドを提供する、方法。
【請求項２１】
ガン細胞の増殖を阻害する方法であって、細胞を、請求項１、請求項２、もしくは請求項１０に記載の１つ以上の標的化ポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む組成物と、細胞内への前記１つ以上のポリヌクレオチドの取り込みを促進する条件下で接触させる工程を含む、方法。
【請求項２２】
ガン細胞のアポトーシスを促進する方法であって、細胞を、請求項１、請求項２、もしくは請求項１０に記載の１つ以上の標的化ポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む組成物と、細胞内への前記１つ以上のポリヌクレオチドの取り込みを促進する条件下で接触させる工程を含む、方法。
【請求項２３】
請求項１、請求項２、もしくは請求項１０に記載のポリヌクレオチド、またはそれらの２つ以上の組み合わせの、被験体のガン、腫瘍、または前ガンの増殖を処置するために有効な薬学的組成物の製造における使用であって、個々のポリヌクレオチドは、ＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子を標的化する、使用。
【請求項２４】
前記ガン、腫瘍、または増殖が、乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、甲状腺組織、腎臓組織、子宮頸組織、肺組織、リンパ節組織、骨髄の造血組織、または卵巣組織から選択される組織の中で見られる、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
個々のポリヌクレオチドの中の前記第１のヌクレオチド配列が以下：
ａ）配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択される配列を標的化する配列；
ｂ）項目ａ）に提供される標的化配列よりも長く、項目ａ）に提供される標的化配列を含む伸張配列であって、前記伸張配列は、ＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子を標的化し、前記標的化配列は、配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択される配列を標的化する、伸張配列；
ｃ）配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択される配列を標的化する配列の断片であり、ここで、前記断片は、少なくとも１５ヌクレオチドの長さであり、最大で選択される配列よりも１塩基短い長さである連続する塩基の配列からなる、断片；
ｄ）５個までのヌクレオチドが、配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択される配列を標的化する配列とは異なる、標的化配列；または
ｅ）ａ）〜ｄ）に提供される配列の相補体
からなる、請求項２３に記載の使用。
【請求項２８】
前記被験体がヒトである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２９】
被験体のガン、腫瘍、または前ガンの増殖を処置するために有効な薬学的組成物の製造における、ＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子のポリペプチド産物に対して指向される１つ以上の抗体の使用。
【請求項３０】
前記ガン、腫瘍、または増殖が、乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、甲状腺組織、腎臓組織、子宮頸組織、肺組織、リンパ節組織、骨髄の造血組織、または卵巣組織から選択される組織の中で見られる、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記被験体がヒトである、請求項２９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、ガンの処置の１つの様式としてＲＮＡ干渉を誘導するために有用なポリヌクレオチドに関する。さらに具体的には、本発明は、前ガン細胞、ガン細胞、もしくは腫瘍細胞の増殖および／または転移に関与している特定の遺伝子に向けられた標的オリゴヌクレオチド配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンまたは前ガンの増殖は、一般的には、両性の腫瘍ではなく悪性腫瘍をいう。悪性腫瘍は両性腫瘍よりも早く増殖し、これらは局部組織に浸潤してこれを破壊する。いくつかの悪性腫瘍は血液系またはリンパ系を介する体中の至る所への転移により拡がる可能性がある。予測不可能であり、制御不可能な増殖は悪性ガンを危険なものとし、多くの場合には致命的となる。
【０００３】
悪性ガンの治療的処置は、ガンの発生の初期段階で最も有効である。したがって、初期の腫瘍形成の段階で治療標的を特定し、確認すること、そして、それと関係している強力な腫瘍増殖または遺伝子発現の抑制要素または物質を決定することが極めて重要である。
【０００４】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が配列特異的様式で遺伝子発現を阻害する転写後プロセスである。ＲＮＡｉプロセスは、少なくとも２工程で起こる：第１の工程においては、より長いｄｓＲＮＡが内因性のリボヌクレアーゼＤｉｃｅｒによって、「小さい干渉ＲＮＡ」と呼ばれるより短いｄｓＲＮＡに、または、通常は１００未満、５０、３０、２３、または２１ヌクレオチド未満の長さのｓｉＲＮＡに切断される。第２の工程においては、これらのｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ；Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０４，２９３−２９６）と呼ばれる多成分リボヌクレアーゼに組み込まれる。ｓｉＲＮＡの一方の鎖は、ＲＩＳＣに会合したままとなり、ＲＩＳＣの中のガイダー（ｇｕｉｄｅｒ）ｓｓ−ｓｉＲＮＡに相補的な配列を有している類似するＲＮＡｉ対してこの複合体を導く。このｓｉＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼがＲＮＡを消化し、これを不活化させる。このＲＮＡｉ作用は、細胞内の標的配列に対して、より長いｄｓＲＮＡまたはより短いｓｉＲＮＡのいずれかを導入することによって行われ得る。ＲＮＡｉ作用は、標的遺伝子に相補的はｄｓＲＮＡを生じるプラスミドを導入することによって行うことができることも明らかにされている。様々な生物体でのＲＮＡｉに関する開示については、特許文献１（Ｆｉｒｅら）；特許文献２（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら）；特許文献３（Ｈｅｉｆｅｔｚら）；Ｙａｎｇ，Ｄ．ら、非特許文献１、特許文献４（Ｌｉｍｍｅｒ）；および特許文献５（Ｋｒｅｕｔｚｅｒら）を参照のこと。
【０００５】
ＲＮＡｉは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）での（Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １８：８９６−８９８；Ｗｏｒｂｙら（２００１）Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２００１年８月１４日（９５）：ＰＬ１；Ｓｃｈｍｉｄら（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５（２）：７１−７４；Ｈａｍｍｏｎｄら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ，４０４：２９３−２９８）、シノラブディス・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）での（Ｔａｂａｒａら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：４３０−４３１）、Ｋａｍａｔｈら（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２．１−２．１０；Ｇｒｉｓｈｏｋら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：２４９４−２４９７））、そしてゼブラフィッシュ（Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）での（Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １８：８９６−８９８）遺伝子機能の決定にうまく使用されてきた。ヒト以外の哺乳動物およびヒトの細胞培養におけるＲＮＡｉ作用については多数の報告がある（Ｍａｎｃｈｅら（１９９２）。Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：５２３８−５２４８；Ｍｉｎｋｓら（１９７９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：１０１８０−１０１８３；Ｙａｎｇら（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１（２２）：７８０７−７８１６；Ｐａｄｄｉｓｏｎら（２００２）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９（３）：１４４３−１４４８；Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５（２）：１８８−２００；Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８；Ｃａｐｌｅｎら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９７４６−９７４７；Ｈｏｌｅｎら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０（８）：１７５７−１７６６；Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０：６８７７−６８８８；Ｊａｒｖｉｓら（２００１）ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ  ８（５）：３−５；Ｂｒｏｗｎら（２００２）ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ  ９（１）：３−５；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３；Ｌｅｅら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−５０５；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７−５００；Ｐａｄｄｉｓｏｎら（２００２）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８；Ｐａｕｌら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８；Ｓｕｉら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９（６）：５５１５−５５２０；Ｙｕら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９（９）：６０４７−６０５２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９９／３２６１９号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／５３０５０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９９／６１６３１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００／４４８９５号パンフレット
【特許文献５】独国特許発明第１０１００５８６．５号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００）１０：１１９１−１２００）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明により、ガンのような疾患を処置するための組成物と方法が提供される。これらの組成物は、遺伝子発現のＲＮＡ干渉のプロセスを刺激することにより、確認された標的遺伝子の発現をサイレンシングさせるか、ダウンレギュレートするか、または抑制するために有効である。それにより、これらの組成物と方法は、腫瘍増殖を阻害する。本発明によってはまた、腫瘍増殖を阻害するために、中和抗体または低分子薬物を使用する確認された標的遺伝子産物の不活化により、ガンのような疾患を処置するための方法も提供される。
【０００９】
さらに具体的には、これらの組成物および方法は、特に、ＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子から選択された標的遺伝子（本明細書中では「標的遺伝子（Ｔａｒｇｅｔ  Ｇｅｎｅ）」（単数または複数））の病理学的発現と関係している、哺乳動物でのガンの増殖または前ガンの増殖が焦点となっている。これらの組成物は、哺乳動物の組織に導入されると標的遺伝子の発現を阻害する。これらの方法には、本発明の組成物をそれが必要な被験体に対して、ガン性の組織または臓器の中での標的遺伝子の発現を阻害するために有効な量で投与する工程が含まれる。
【００１０】
第１の態様においては、本発明により、その長さが２００ヌクレオチド以下である、単離された標的化ポリヌクレオチドが提供される。このポリヌクレオチドには、標的遺伝子またはその相補体を標的化する第１のヌクレオチド配列が含まれる。第１のヌクレオチド配列またはその相補体は、１５から３０までの長さの任意の数のヌクレオチドであり、いくつかの実施形態においては、その長さは２１から２５ヌクレオチドである。
【００１１】
別の態様においては、先の段落に記載された本発明のポリヌクレオチドにはさらに、ループ配列によって第１のヌクレオチド配列とは離れて配置された第２のヌクレオチドが含まれる；第２のヌクレオチド配列は、
ａ）第１のヌクレオチド配列と実質的に同じ長さを有しており、そして、
ｂ）第１のヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であり、その結果、このポリヌクレオチドは、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに適している条件下でヘアピン構造を形成する。
【００１２】
先の段落に記載された直鎖のポリヌクレオチドとヘアピンポリヌクレオチドの多くの実施形態においては、第１のヌクレオチド配列は、以下から構成される：
ａ）配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択された配列を標的化する配列（本明細書中では「標的配列（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」）；
ｂ）項目ａ）に提供された標的化配列よりも長く、これを含む伸張配列であって、ここでは、伸張配列は標的遺伝子を標的化し、標的化配列は標的配列を標的化する、伸張配列；
ｃ）少なくとも１５ヌクレオチドの長さの標的配列を標的化する、選択された標的配列よりも短い配列の断片；
ｄ）５個までのヌクレオチドが選択された標的配列とは異なる、標的化配列；または
ｅ）ａ）〜ｄ）に提供された配列の相補体。
【００１３】
一般的な実施形態においては、本明細書中に記載される直鎖のポリヌクレオチドは、標的配列から構成され、これには状況に応じて、選択された配列の３’末端に結合させられた２ヌクレオチドの突出が含まれる。関連する一般的な実施形態においては、本明細書中に記載されるヘアピンポリヌクレオチドは、第１の選択されたヌクレオチド標的配列、ループ配列、および標的配列に実質的に相補的な第２のヌクレオチド配列から構成される。
【００１４】
さらなる実施形態においては、ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであるか、あるいは、ポリヌクレオチドには、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方が含まれる。
【００１５】
さらに別の態様においては、本発明により、本明細書中に記載される第１の直鎖の標的化ポリヌクレオチド鎖と、この第１のポリヌクレオチドの少なくとも最初のヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であり、それにハイブリダイズする第２のヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド鎖が含まれている、二本鎖のポリヌクレオチドが提供される。
【００１６】
なおさらなる態様においては、本発明により、本明細書中に記載される複数の直鎖の標的化ポリヌクレオチド、二本鎖のポリヌクレオチド、および／またはヘアピンポリヌクレオチドが含まれている、ポリヌクレオチドの組み合わせあるいは混合物が提供される。この場合、個々のポリヌクレオチドは、１つ以上の選択された標的遺伝子の中の別の選択された標的配列を標的化する。
【００１７】
なおさらなる態様においては、本発明により、本明細書中に記載される直鎖の標的化ポリヌクレオチドまたはヘアピン型の標的化ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。一般的な実施形態においては、ベクターは、プラスミド、コスミド、組み換え体ウイルス、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、トランスポゾン、またはミニ染色体である。
【００１８】
ベクターのさらに一般的な実施形態においては、制御エレメントは、その発現を促進するために有効な標的化ポリヌクレオチドと動作可能であるように連結させられる。さらに別の態様によっては、本明細書中に記載される１つ以上の直鎖のポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞、または本明細書中に記載される１つ以上のヘアピンポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞、または上記ポリヌクレオチドの組み合わせでトランスフェクトされた細胞が提供される。
【００１９】
なおさらなる態様においては、本発明により、本明細書中に記載される１つ以上の直鎖のポリヌクレオチドまたはヘアピンポリヌクレオチドまたはそれらの混合物と、薬学的に許容される担体が含まれている薬学的組成物が提供される。この場合、個々のポリヌクレオチドは、標的遺伝子の中の別の標的配列、またはそれらの任意の２つ以上を標的化する。
【００２０】
なお別の態様においては、本発明により、本明細書中に記載される標的遺伝子を標的化する配列を有しているポリヌクレオチドを合成する方法が提供される。これらの方法には以下の工程が含まれ、それにより、完全なポリヌクレオチドが提供される：
ａ）活性のある反応性末端を含み、その配列の第１の末端にあるヌクレオチドに対応しているヌクレオチド試薬を提供する工程、
ｂ）先の工程による活性のある反応性末端と反応させて、ポリヌクレオチド配列の長さを１ヌクレオチド伸ばすために、活性のある反応性末端を含み、標的化配列の連続している位置に対応しているさらなるヌクレオチドを付加させ、そして望ましくない生成物と過剰な試薬を除去する工程、および、
ｃ）工程ｂ）を、配列の第２の末端にあるヌクレオチドに対応するヌクレオチド試薬が付加されるまで繰り返す工程。
【００２１】
なおさらなる態様においては、本発明により、ガン細胞の増殖を阻害する方法が提供される。この方法には、細胞と、本明細書中に記載される１つ以上の直鎖の標的化ポリヌクレオチドまたはヘアピン型の標的化ポリヌクレオチドまたはそれらの混合物が含まれている組成物とを、細胞内への１つ以上のポリヌクレオチドの取り込みを促進する条件下で接触させる工程が含まれる。
【００２２】
さらに別の態様においては、本発明により、ガン細胞においてアポトーシスを促進する方法が提供される。この方法には、細胞と、本明細書中に記載される１つ以上の直鎖の標的化ポリヌクレオチドまたはヘアピン型の標的化ポリヌクレオチドまたはそれらの混合物が含まれている組成物とを、細胞内への１つ以上のポリヌクレオチドの取り込みを促進する条件下で接触させる工程が含まれる。
【００２３】
なお別の態様においては、本発明により、哺乳動物組織の中でのガンまたは前ガンの増殖を阻害するための方法が提供される。ここでは、この方法には、組織と、１つ以上の標的遺伝子を含むＤＮＡまたはＲＮＡと相互作用する本発明の阻害性の標的化ポリヌクレオチドとを接触させる工程が含まれる。標的化ポリヌクレオチドは、組織の細胞の中での１つ以上の標的遺伝子の発現を阻害する。この方法のいくつかの実施形態においては、組織は、乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、腎臓組織、子宮頸組織、リンパ節組織、または卵巣組織である。さらには、阻害性の標的化ポリヌクレオチドは、核酸分子、デコイ分子、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合体化ＤＮＡ、カプセル化されたＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、裸のＲＮＡ、カプセル化されたＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ，二本鎖ＲＮＡ、分子、またはそれらの組み合わせである。
【００２４】
なおさらなる態様においては、本発明により、本明細書中に記載される直鎖の標的化ポリヌクレオチドまたはヘアピン型の標的化ポリヌクレオチド、またはそれらの２つ以上の混合物の使用が提供される。この場合、個々のポリヌクレオチドは、被験体の中でのガンまたは前ガンの増殖を処置するために有効な薬学的組成物の製造において、標的遺伝子を標的化する。この使用のいくつかの実施形態においては、ガンまたは増殖は、乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、甲状腺組織、腎臓組織、子宮頸組織、肺組織、リンパ節組織、骨髄の造血組織、または卵巣組織から選択される組織の中で見られる。この使用のさらに別の一般的な実施形態においては、それぞれのポリヌクレオチドの第１のヌクレオチド配列は、以下から構成される：
ａ）配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択された配列を標的化する配列（本明細書中では「標的配列」）；
ｂ）項目ａ）に提供された標的化配列よりも長く、これを含む伸張配列であって、ここでは、伸張配列は標的遺伝子を標的化し、標的化配列は標的配列を標的化する、伸張配列；
ｃ）少なくとも１５ヌクレオチドの長さの標的配列を標的化し、選択された標的配列よりも短い配列の断片；
ｄ）５個までのヌクレオチドが選択された標的配列とは異なる、標的化配列；または
ｅ）ａ）〜ｄ）に提供された配列の相補体。
この使用のなおさらなる実施形態においては、被験体はヒトである。
【００２５】
なおさらなる態様においては、本発明により、被験体の中でのガン、腫瘍、または前ガンの増殖を処置するために有効な薬学的組成物の製造における、標的遺伝子のポリペプチドの生産に対して向けられた１つ以上の抗体の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明のポリヌクレオチドの様々な実施形態の模式図。パネルＡ、直鎖のポリヌクレオチドの実施形態。長さは２００ヌクレオチド以下であり、１５ヌクレオチド以上である。ｂ）においては、特異的な標的化配列がより大きな標的化配列の中に含まれる。ｄ）においては、黒っぽい垂直の棒状の部分は、置換されたヌクレオチドを模式的に示す。パネルＢ、２００ヌクレオチド以下の全長のヘアピンポリヌクレオチドの１つの実施形態。
【図２】ＩＣＴ−１０５３（ＰＣＤＰ）ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションに反応する時間に対する、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の腫瘍の大きさの変化の提示。データは、平均＋／−ＳＥとして示される。
【図３】ＩＣＴ−１０５２（ｃＭｅｔ）ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションに反応する時間に対する、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の腫瘍の大きさの変化の提示。データは、平均＋／−ＳＥとして示される。
【図４】ＩＣＴ−１０５２（ｃＭｅｔ）ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションに反応する時間に対する、Ａ５４９異種移植片の腫瘍の大きさの提示。データは、平均＋／−ＳＥとして示される。
【図５】ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡもしくはＩＣＴ−１０５３  ｓｉＲＮＡ、または対照ｓｉＲＮＡで処理した場合の、培養物中のＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の増殖の阻害の提示。データは、平均値として示される。
【図６】ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡもしくはＩＣＴ−１０５３  ｓｉＲＮＡ、または対照ｓｉＲＮＡで処理した場合の、培養物中のＨＣＴ１１６ヒト結腸ガン細胞の増殖の阻害の提示。データは、平均＋／−ＳＥとして示される。
【図７】ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡで処理した場合の、培養物中のＡ５４９ヒト肺ガン細胞の増殖の阻害の提示。データは、平均＋／−ＳＥとして示される。
【図８】ＩＣＴ−１０２７（ＧＲＢ２  ＢＰ）ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションに反応する時間に対する、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の腫瘍の大きさの変化の提示。データは、平均＋／−ＳＥとして示される。
【図９】ＩＣＴ−１０２７  ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでの処理に反応したＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の中でのアポトーシスの誘導の提示。データは、平均＋／−ＳＥとして示される。
【図１０】ＩＣＴ−１０５１（Ａ−Ｒａｆ）ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションに反応する時間に対する、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の腫瘍の大きさの変化の提示。データは、平均＋／−ＳＥとして示される。
【図１１】ＩＣＴ−１０５４（ＰＣＤＰ６）ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションに反応する時間に対する、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の腫瘍の大きさの変化の提示。データは、平均＋／−ＳＥとして示される。
【図１２】ＩＣＴ−１０２０（Ｄｉｃｅｒ）ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションに反応する時間に対する、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の腫瘍の大きさの変化の提示。データは、平均＋／−ＳＥとして示される。
【図１３】ＩＣＴ−１０２１（ＭＤ２タンパク質）ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションに反応する時間に対する、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の腫瘍の大きさの変化の提示。データは、平均＋／−ＳＥとして示される。
【図１４】ＩＣＴ−１０２２（ＧＡＧＥ−２）ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションに反応する時間に対する、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の腫瘍の大きさの変化の提示。データは、平均＋／−ＳＥとして示される。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書中で特定された全ての特許、特許出願公開、および特許出願は、それらが一語一句本明細書中に示されているかのように、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。本明細書中で特定された全ての技術的な刊行物もまた、引用により本明細書中に組み入れられる。
【００２８】
本明細書中では、冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、単数形として、または複数形としての意味を同等に記述する。これらの冠詞の特定の意味は、それらが使用される状況から明らかである。
【００２９】
本明細書中で使用される場合は、用語「腫瘍」は、悪性であるか良性であるかにかかかわらず、全ての新生物細胞の成長と増殖を、そして全ての前ガンおよびガンの細胞ならびに組織をいう。
【００３０】
本明細書中で使用される場合は、用語「前ガン」は、悪性腫瘍またはガンに至る可能性がある変化に関係している特徴を有している細胞あるいは組織をいう。
【００３１】
本明細書中で使用される場合は、用語「ガン」は、制御されていない増殖、特定の機能の喪失、不死性、高い転移の可能性、抗アポトーシス活性の有意な増大、迅速な成長および増殖速度、ならびに、特定の特徴的な形態学的および細胞性マーカーのような特徴を有している細胞あるいは組織をいう。いくつかの状況においては、ガン細胞は腫瘍の形態であろう。そのような細胞は、動物の中に局所に存在する場合があり、他の状況においては、これらは、独立した細胞（例えば、白血球）として血流の中を循環している場合もある。
【００３２】
本明細書中で使用される場合は、用語「標的」配列と、類似する用語および表現は、本発明のポリヌクレオチドがそれに対して向けられるガン細胞の核酸の中に存在するヌクレオチド配列に関する。「標的遺伝子」は、遺伝子の発現のレベルまたは遺伝子産物の活性の調節により、疾患の進行が妨げられるおよび／または緩和される、発現させられた遺伝子をいう。具体的には、本発明においては、標的遺伝子には、本明細書中に記載されるような、内因性の遺伝子およびそれらの変異体が含まれる。
【００３３】
標的化ポリヌクレオチドは、ａ）その構成成分が病原体のゲノムに含まれる特定のサブ配列（標的配列と呼ばれる）に相同であるかまたは同一である配列を含むことによるか、あるいは、ｂ）それ自体が標的配列と相同であるかまたは同一である配列を含むことによるかのいずれかにより、ガン細胞の核酸配列を標的化する。細胞内で有効である標的化ポリヌクレオチドは、ａ）およびｂ）で特定されたそれぞれの鎖のうちの一方から構成される二本鎖の分子である。そのようにガン細胞の核酸配列を標的化する任意の二本鎖の標的化ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉の表現形に従って標的配列とハイブリダイズし、それによりＲＮＡ干渉を開始する能力を有すると考えられる。
【００３４】
被験体の中の標的遺伝子は、例えば、様々なＧｅｎＢａｎｋ登録された物質、および類似するデータベースの中の物質において特定された野生型配列と同じ配列を有している場合がある。通常は、そのようなデータベースは公に利用することができる。しかし、標的遺伝子の発現を抑制するために使用される干渉ＲＮＡは、その標的に対して完全には相補的ではない場合があり、また、標的は、既存のＧｅｎＢａｎｋ登録番号が割り当てられた野生型配列であると考えられる配列とは異なっている場合もある。例えば、標的遺伝子には、１つ以上の単一のポリヌクレオチド多形が含まれる場合があり、それにより、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号の中の配列とはわずかに異なる場合がある。加えて、標的遺伝子は、エキソンの別な方法でのスプライシングの産物であるｍＲＮＡを生じる場合があり、これによっては、染色体遺伝子よりも含まれているエキソンが少ない成熟ｍＲＮＡが生じ得る。このような別な方法でスプライシングされたｍＲＮＡもまた、野生型遺伝子に対して向けられたＲＮＡｉ種の標的であり得る。本発明の開示においては、全てのそのような偶然性が、標的遺伝子の概念に含まれ、そして野生型配列を標的化するように開発された任意のＲＮＡｉ種が、そのような変化したかまたは修飾された転写物をおそらく標的化し、そして標的化配列の概念に含まれる。
【００３５】
一般的には、「遺伝子」は、調節機能、触媒機能のいずれかを有しており、そして／またはタンパク質をコードするＲＮＡに転写される能力があるゲノムの中の領域である。真核生物遺伝子は、通常は、イントロンとエキソンを有しており、これは、成熟タンパク質の別のバージョンをコードする様々なＲＮＡスプライシング変異体を生じるように組織され得る。当業者は、本発明に、スプライシング変異体、対立遺伝子変異体、および別のプロモーター部位または別のポリアデニル化部位が原因で生じる転写物を含む、見られ得る全ての内因性遺伝子が含まれることを理解するであろう。内因性の遺伝子は、本明細書中に記載される場合は、変異した内因性の遺伝子である場合もある。この場合、変異は、コード領域の中にある場合も、また、調節領域の中にある場合もある。
【００３６】
「アンチセンスＲＮＡ」：真核生物においては、ＲＮＡポリメラーゼは、構造遺伝子の転写を触媒してｍＲＮＡを生じさせる。ＤＮＡ分子はＲＮＡポリメラーゼの鋳型を含むように設計することができる。この場合、ＲＮＡ転写物は好ましいｍＲＮＡの配列に相補的な配列を有する。ＲＮＡ転写物は「アンチセンスＲＮＡ」と呼ばれる。アンチセンスＲＮＡ分子はｍＲＮＡの発現を阻害することができる（例えば、Ｒｙｌｏｖａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６２（３）：８０１−８，２００２；Ｓｈｉｍら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９４（１）：６−１５，２００１）。
【００３７】
「アンチセンスＤＮＡ」または「ＤＮＡデコイ」または「デコイ分子」：第１の核酸分子に関して、第２のＤＮＡ分子または、第１の分子もしくはその一部の相補配列であるかまたは相補配列に相同である配列を用いて作製された第２のＤＮＡ分子または第２のキメラ核酸分子は、第１の分子のアンチセンスＤＮＡまたはＤＮＡデコイまたはデコイ分子と呼ばれる。用語「デコイ分子」にはまた、一本鎖または二本鎖であり得、ＤＮＡまたはＰＮＡ（ペプチド核酸）を含み（Ｍｉｓｃｈｉａｔｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，９（６）：６３３−９，２００２）、そしてタンパク質結合部位（好ましくは、調節タンパク質の結合部位、より好ましくは、転写因子の結合部位）の配列を含む核酸分子も含まれる。アンチセンス核酸分子（アンチセンスＤＮＡおよびデコイＤＮＡ分子を含む）の利用は当該で分野で公知である（例えば、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４７：２９４−３０１，２００１；Ａｎｄｒａｔｓｃｈｋｅら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２１：（５）３５４１−３５５０，２００１）。
【００３８】
「安定化させられたＲＮＡ」：安定化させられたＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡは、本明細書中に記載される場合は、エキソヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅを含む）による消化に対して、例えば、リボース糖の３’位置で修飾された（例えば、上記で定義された置換されたか未置換のアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アルキニル、またはアルキニルオキシ基を含めることによる）か、または保護を得るためにその構造の中の別の場所で修飾されたヌクレオチドアナログを使用して保護される。ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡはまた、３’−３’−連結２ヌクレオチド構造（Ｏｒｔｉｇａｏら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｌｉ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２：１２９−１４６（１９９２））および／または２つの修飾されたリン結合（例えば、２つのホスホロチオエート結合）を含めることによって、エキソヌクレアーゼによる３’末端での消化に対して安定化させることもできる。
【００３９】
「カプセル化された核酸」（カプセル化されたＤＮＡまたはカプセル化されたＲＮＡを含む）は、マイクロスフェアまたはマイクロ粒子の中にある、比較的非免疫原性の材料でコーティングされた、選択的酵素消化に供される複数の材料でコーティングされた核酸分子をいい、例えば、複数の材料（例えば、ゼラチンと硫酸コンドロイチン）の複合コアセルベーションによって合成されたマイクロスフェアまたはマイクロ粒子をいう（例えば、米国特許第６，４１０，５１７号を参照のこと）。マイクロスフェアまたはマイクロ粒子の中のカプセル化された核酸は、そのコード配列の発現を誘導するその能力を保つ方法でカプセル化される（例えば、米国特許第６，４０６，７１９号を参照のこと）。
【００４０】
「阻害剤」は、特定の機能を阻害および／またはブロックする分子をいう。特定の機能を阻害および／またはブロックする能力を有している任意の分子は、本明細書中で記載される場合には、「試験分子」であり得る。例えば、標的遺伝子の腫瘍形成機能または抗アポトーシス活性について言及される場合には、そのような分子は、特定の標的遺伝子のインビトロおよびインビボアッセイを使用して同定することができる。阻害剤は、標的遺伝子の活性を部分的または完全にブロックする、それらの活性を低下させる、妨害する、または遅らせる、あるいは、その細胞性応答を脱感作させる化合物である。これは、標的遺伝子産物（すなわち、タンパク質）に対する、直接または他の中間体分子を介する結合によって行われ得る。標的遺伝子の遺伝子産物の活性をブロックする（標的遺伝子の腫瘍形成機能または抗アポトーシス活性の阻害を含む）アンタゴニストまたは抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）は、そのような阻害剤と考えられる。本発明の阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、デコイ分子、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合体化ＤＮＡ、カプセル化されたＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、裸のＲＮＡ、カプセル化されたＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉を生じることができる分子、またはそれらの組み合わせである。本発明の阻害剤のグループにはまた、標的遺伝子の遺伝子修飾されたバージョン（例えば、活性が変化したバージョン）も含まれる。したがって、このグループには、自然界に存在しているタンパク質、さらには、合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、小さい化学的分子などが含まれる。
【００４１】
「阻害剤についてのアッセイ」は、例えば、インビトロで、細胞内で、標的遺伝子を発現させる工程、推定される阻害剤化合物を加える工程、その後、標的遺伝子の活性または転写に対する機能的効果を決定する工程を含む実験手順をいう。標的遺伝子を含むかまたは標的遺伝子を含むと予想される試料は、可能性のある阻害剤で処理される。これらの阻害剤には、核酸をベースとする分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、二本鎖ＲＮＡ、およびＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ、リボザイム、およびトリプレックスなど）；およびタンパク質をベースとする分子（例えば、ペプチド、合成のリガンド、短縮型の部分的なタンパク質、可溶性受容体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、イントラボデイー、および単鎖抗体など）；ならびに、様々な形態の小さい化学的分子が含まれる。阻害または変化の程度は、対照試料に対して目的の試料による活性の測定値を比較することによって試験される。閾値は阻害を評価するために確立される。例えば、標的遺伝子産物であるポリペプチドの阻害は、適切な対照と比較した標的遺伝子活性の値が８０％以下である場合に、得られたと考えられる。
【００４２】
本明細書中で使用される場合には、第１の配列またはサブ配列がその配列またはサブ配列のそれぞれの位置で第２の配列またはサブ配列と同じ塩基を有している場合に、第１の配列またはサブ配列は、第２の配列またはサブ配列に対して「同一である」、または「１００％の同一性」を有する、または、１００％同一の概念を含む用語もしくは表現によって記載される。同一性の決定においては、任意のＴ（チミジン）またはその任意の誘導体、あるいはＵ（ウリジン）またはその任意の誘導体は互いに等価であり、したがって、同一である。同一である第１の配列と第２の配列については、ギャップは認められない。
【００４３】
標的化ポリヌクレオチドまたはその相補体の配列は、標的配列と完全に同じである場合があり、また、配列の特定の部位に適合していない塩基が含まれる場合もある。不適合の取り込みは本明細書中に十分に記載される。理論に束縛されることは望ましくないが、不適合の取り込みにより、問題の特定の標的配列についてのＲＮＡ干渉の表現形を最適化させるための生理学的条件下での意図される程度のハイブリダイゼーションの安定性が提供されると考えられる。同一性の程度により、その塩基が互いに同じである２つの配列の中の位置の割合が決定される。「配列同一性の割合」は以下に示されるように計算される：
【００４４】
【化１】
2010512786.tif 000003
互いに１００％未満の同一性である配列は、互いに「類似」しているかまたは「相同」である。相同性の程度または類似性の割合（％）は、２つの配列またはサブ配列の間での同一性の割合（％）に関する同義語である。例えば、互いに少なくとも６０％の同一性、または好ましくは少なくとも６５％の同一性、または好ましくは少なくとも７０％の同一性、または好ましくは少なくとも７５％の同一性、または好ましくは少なくとも８０％の同一性、またはより好ましくは少なくとも８５％の同一性、またはより好ましくは少なくとも９０％の同一性、またはなおさらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を示す２つの配列は、互いに「類似」しているか、または「相同」である。あるいは、ｓｉＲＮＡ分子のオリゴヌクレオチド配列に関しては、５個以下の塩基、または４個以下の塩基、または３個以下の塩基、または２個以下の塩基、または１個の塩基が異なる２つの配列は、互いに「類似」しているかまたは「相同」であると言われる。
【００４５】
加えて、「同一性」および「類似性」は、以下に記載される方法を含むがこれらに限定されない公知の方法によって容易に計算することができる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；および、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）。比較のための配列のアラインメントの方法は当該分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２，１９８１の局所相同性アルゴリズムによって；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の相同性整列アルゴリズムによって；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８：２４４４、１９８８の類似性の検索の方法によって；これらのアルゴリズムのコンピューター処理によって（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａによるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），７  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡを含むがこれらに限定されない；ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３；２３７−２４４，１９８８；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６：８８１−９０，１９８８；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，８：１−６，１９９２；およびＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４：７−３３１，１９９４に詳細に記載されている）を含むがこれらに限定されない）行うことができる。データベースの類似性の検索のために使用することができるプログラムのＢＬＡＳＴファミリーとしては、以下が挙げられる：ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド質問配列に��いてのＢＬＡＳＴＮ；タンパク質データベース配列に対するタンパク質質問配列についてのＢＬＡＳＴＸ；タンパク質データベース配列に対するタンパク質質問配列についてのＢＬＡＳＴＰ；ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質質問配列についてのＴＢＬＡＳＴＮ；およびヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド質問配列についてのＴＢＬＡＳＴＸ。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１９章，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５を参照のこと。
【００４６】
他の場所に明記されない限りは、本明細書中で提供される配列同一性／類似性の値は、プログラムのＢＬＡＳＴ  ２．０  ｓｕｉｔｅまたはそれらの後継機を使用して、デフォルトパラメーターを使用して得られた値をいう。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２；３３８９−３４０２，１９９７。これらのパラメーターのデフォルト設定を将来の必要性に応じて容易に変更することができることが理解される。
【００４７】
用語「実質的に同一」または「相同」は、それらの様々な文法上の形態で、ポリヌクレオチドに、記載されるアラインメントプログラムのうちの１つを使用して参照配列と比較して所望される同一性（例えば、少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、なおより好ましくは少なくとも９０％の同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９５％）を有している配列が含まれることを意味する。
【００４８】
本明細書中で使用される場合は、用語「単離された」および類似の用語は、核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを記載するために使用される場合には、その天然の状態または本来の状態から取り出されている組成物をいう。したがって、自然界にそれが存在する場合には、これは、その本来の環境から取り出されている。これが合成によって調製されている場合には、これは、合成によって得られた最初の生成物の混合物からこれが取り出されている。例えば、その自然な状態において生存している生物体の中に本来存在する自然界に存在しているポリヌクレオチドは、「単離され」ていないが、その自然な状態においてそれと一緒に存在している少なくとも１つの材料とは分離された同じポリヌクレオチドは、この用語が本明細書中で使用される場合には、「単離されている」。一般的には、少なくとも１つの一緒に存在している物質の除去は、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの「単離」を構成する。多くの場合においては、いくつかの、多くの、またはほとんどの一緒に存在している物質が、核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを単離するために除去され得る。インビトロでの合成のプロセスまたは化学合成のプロセスの産物である、核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドは、合成プロセスの結果として、原則的に単離されている。重要な実施形態においては、そのような合成の産物は、使用された試薬および前駆体物質、そしてプロセスによって生じた副産物を除去するために処理される。
【００４９】
組成物（例えば、処方物、トランスフェクション組成物、薬学的組成物、または化学反応もしくは酵素反応のための組成物もしくは溶液であり、これらは、自然界には存在しない組成物である）の中に取り込まれたポリヌクレオチドは、これが本明細書中で使用される場合は、その用語の意味において、依然、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。
【００５０】
本明細書中で使用される場合は、「核酸」または「ポリヌクレオチド」、ならびに類似する用語および表現は、自然界に存在しているヌクレオチドからなるポリマー、ならびに、合成のまたは修飾されたヌクレオチドからなるポリマーに関する。したがって、本明細書中で使用される場合は、ＲＮＡであるポリヌクレオチド、またはＤＮＡであるポリヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含むポリヌクレオチドには、自然界に存在している部分（例えば、自然界に存在している塩基と、リボースもしくはデオキシリボース環）が含まれる場合があり、また、これらは、以下に記載される部分のような合成の部分または修飾された部分から構成される場合もある。本発明において使用されるポリヌクレオチドは一本鎖である場合があり、また、塩基対合した二本鎖の構造である場合も、またさらに、３本の鎖が塩基対合した構造である場合もある。
【００５１】
核酸およびポリヌクレオチドは、２０ヌクレオチド以上の長さ、または３０ヌクレオチド以上の長さ、または５０ヌクレオチド以上の長さ、または１００ヌクレオチド以上の長さ、または１０００ヌクレオチド以上の長さ、または何万もしくはそれ以上、または何十万もしくはそれ以上の長さである場合もある。ｓｉＲＮＡは本明細書中で定義されるポリヌクレオチドであり得る。本明細書中で使用される場合は、「オリゴヌクレオチド」およびこれをベースとする類似する用語は、自然界に存在しているヌクレオチドからなる短いポリマー、さらには、すぐ前の段落に記載されたような、合成のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドからなるポリマーをいう。オリゴヌクレオチドは、１０ヌクレオチド以上の長さ、または１５、または１６、または１７、または１８、または１９、または２０ヌクレオチド以上の長さ、または２１、または２２、または２３、または２４ヌクレオチド以上の長さ、または２５、または２６、または２７、または２８、または２９、または３０ヌクレオチド以上の長さ、３５以上、４０以上、４５以上、約５０ヌクレオチドまでの長さであり得る。ｓｉＲＮＡの中で標的化配列として使用されるオリゴヌクレオチド配列は、１５から３０ヌクレオチドの間のヌクレオチドの任意の数を有し得る。多くの実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、２１から２５ヌクレオチドの間の任意の数のヌクレオチドを有し得る。オリゴヌクレオチドは化学合成される場合があり、そして、ｓｉＲＮＡ、ＰＣＲプライマー、もしくはプローブとして使用される場合がある。
【００５２】
先の段落で提供された大きさの範囲の重複が原因で、用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」は、本発明のｓｉＲＮＡについて言及される場合には、本明細書中では同義的に使用される場合があることが理解される。
【００５３】
本明細書中で使用される場合は、「ヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド配列」、または「ポリヌクレオチド配列」、および類似する用語は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが有している塩基の配列と、さらには、その配列を持つオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構造の両方を互換的にいう。ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列はさらに、塩基の配列が、当該分野で通常使用されているような塩基を指定する文字の特定の並びの記載または記述によって定義される、任意の天然のもしくは合成のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをいう。
【００５４】
「ヌクレオシド」は、通常、生化学、分子生物学、遺伝学のような分野、および本発明の技術分野に関係がある類似する分野の当業者によって、プリンまたはピリミジン塩基に対してグリコシド結合によって連結させられた単糖を含むと理解されている。そして「ヌクレオチド」には、糖の３’または５’位置（ペントースについて）に通常結合しているが、糖の他の位置に存在する場合もある、少なくとも１つのリン酸基を有しているヌクレオシドが含まれる。ヌクレオチド残基は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの中の連続する位置を占める。ヌクレオチドの修飾または誘導は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの中の任意の連続する位置で行われ得る。全ての修飾されたかまたは誘導されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが本発明に含まれ、特許請求の範囲の範囲内にある。修飾または誘導は、リン酸基、単糖、または塩基の中で行われる場合もある。
【００５５】
限定ではない例として、以下の記載により、特定の修飾されたかまたは誘導されたヌクレオチドが提供される。これらは全て、本発明のポリヌクレオチドの範囲内にある。単糖は、例えば、リボースまたはデオキシリボース以外のペントースまたはヘキソースであることによって修飾される場合がある。単糖はまた、ヒドロキシル基をヒドロ基もしくはアミノ基で置換することによって、さらには、別のヒドロキシル基をアルキル化するかまたはエステル化することによって、などにより修飾される場合もある。２’位置での置換（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−アリール、２’−Ｏ−アミノアルキル、または２’−デオキシ−２’−フルオロ基）により、オリゴヌクレオチドに対する高いハイブリダイゼーション特性が提供される。
【００５６】
オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの中の塩基は、「未修飾の」塩基である場合も、また「天然の」塩基である場合もあり、これには、プリン塩基であるアデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）、そしてピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。加えて、これらは、修飾または置換を有している塩基であり得る。修飾された塩基の限定ではない例としては、以下のような他の合成の塩基および天然の塩基が挙げられる：ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトシキウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、ウェイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピルウラシル、５−プロピニル−シトシン、およびピリミジン塩基の他のアルキル誘導体、６−アゾ−ウラシル、６−アゾ−シトシン、６−アゾ−チミン、５−ウラシル（シュ−ドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ−、８−チオール−、８−チオアルキル−、８−ヒドロキシル−、およびその他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよびその他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−フルオロ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン。さらなる修飾された塩基としては、以下が挙げられる：三環式ピリミジン（例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−��ランプ（例えば、置換されたフェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン））、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）。修飾された塩基にはまた、プリンまたはピリミジンが他の複素環（例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドン）で置換されたものも含まれ得る。さらなる塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されている塩基、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５８−８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されている塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されている塩基、ならびに、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，第１５章，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２８９−３０２頁，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されている塩基が挙げられる。これらの塩基のうちの特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む）が含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２℃高めることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．編，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，２７６−２７８頁）、そしてこれが現在のところ好ましい塩基置換であり、特に、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせられた場合にさらに好ましい。引用により本明細書中に組み入れられる米国特許第６，５０３，７５４号および同第６，５０６，７３５号、ならびにそれらの中で引用されている参考文献を参照のこと。修飾にはさらに、以下が含まれる：ポリアミン結合オリゴヌクレオチドが記載されている、米国特許第５，１３８，０４５号および同第５，２１８，１０５号に開示されている修飾；ホスホロチオエートを含むキラルリン結合が取り込まれているオリゴヌクレオチドが記載されている、米国特許第５，２１２，２９５号、同第５，５２１，３０２号、同第５，５８７，３６１号、および同第５，５９９，７９７号に開示されている修飾；修飾された骨格を有しているオリゴヌクレオチドが記載されている、米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，５４１，３０７号、および同第５，３８６，０２３号；修飾されたヌクレオ塩基が記載されている、米国特許第５，４５７，１９１号および同第５，４５９，２５５号；ペプチド核酸が記載されている米国特許第５，５３９，０８２号；β−ラクタム骨格を有しているオリゴヌクレオチドが記載されている米国特許第５，５５４，７４６号；オリゴヌクレオチドの合成が開示されている米国特許第５，５７１，９０２号；アルキルチオヌクレオシドが開示されている米国特許第５，５７８，７１８号；２’−Ｏ−アルキルグアノシン、２，６−ジアミノプリン、および関連する化合物が記載されている米国特許第５，５０６，３５１号；Ｎ−２置換プリンを有しているオリゴヌクレオチドが記載されている米国特許第５，５８７，４６９号；３−デアザプリンを有しているオリゴヌクレオチドが記載されている米国特許第５，５８７，４７０号；結合させられた４’−デスメチルヌクレオシドアナログが記載されている、米国特許第５，２２３，１６８号および同第５，６０８，０４６号；骨格が修飾されたオリゴヌクレオチドアナログが記載されている、米国特許第５，６０２，２４０号および同第５，６１０，２８９号；特に、２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドの合成方法が記載されている、米国特許第６，２６２，２４１号および同第５，４５９，２５５号。
【００５７】
ヌクレオチド間の結合は、一般的には、３’−５’リン酸結合であり、これは、自然なホスホジエステル結合、ホスホチオエステル結合、およびなお他の合成の結合であり得る。ホスホロチオエート骨格を含むオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ安定性を高める。修飾された骨格の例としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル、および他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、およびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’−アミノホスホルアミデート、およびアミノアルキルホスホルアミデートを含む）、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、およびボラノホスフェートが挙げられる。さらに別の結合としては、ホスホトリエステル、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋されたホスホルアミデート、架橋されたメチレンホスホネート、架橋されたホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオチド間結合が挙げられる。他のポリマー架橋としては、これらの２’−５’結合アナログが挙げられる。引用により本明細書中に組み入れられる米国特許第６，５０３，７５４号および同第６，５０６，７３５号、ならびにそれらの中で引用されている参考文献を参照のこと。
【００５８】
上記において説明された修飾を含む任意の修飾を、本発明の標的化ポリヌクレオチドに容易に取り込むことができ、これらは、本発明の標的化ポリヌクレオチドの範囲に含まれる。任意の修飾されたヌクレオチドの使用は、当業者に理解されるように、同じ塩基対合特性を有している自然界に存在しているヌクレオチドの使用と同等である。全ての等価な修飾されたヌクレオチドが、本明細書中に開示され、特許請求の範囲において請求される本発明の範囲に含まれる。
【００５９】
本明細書中および特許請求の範囲の中で使用される場合は、用語「相補体」、「相補的」、「相補性」、および類似する用語と表現は、生化学、分子生物学、遺伝学のような分野、および本発明の分野に関係がある類似する分野の当業者によって通常理解されるように、それらの塩基が１対１で相補的な塩基対合を形成する２つの配列をいう。相補的な配列を有している２つの一本鎖（ｓｓ）ポリヌクレオチドは、二本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチドを形成させるための適切な緩衝液および温度条件下で、互いにハイブリダイズすることができる。限定ではない例として、自然界に存在している塩基が考えられる場合には、Ａと（ＴまたはＵ）は互いに相互作用し、そしてＧとＣが互いに相互作用する。他の場所に明記されていない限りは、「相補的」は、「完全な相補性」を現すように意図され、これはすなわち、２つのポリヌクレオチド鎖が互いにアラインメントされた場合に、一方の鎖の中の連続する塩基の配列の中のそれぞれの塩基が、向かい合う鎖上の同じ長さの連続する塩基の配列の中の相互作用する塩基に対して相補的である部分が、鎖の中に少なくとも一部存在するであろうことを意図する。
【００６０】
本明細書中で使用される場合は、「ハイブリダイズする」、「ハイブリダイゼーション」、および類似する用語と表現は、相補的な配列を有している鎖が互いに相互作用を生じることによる、核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド二本鎖を形成するプロセスをいう。この相互作用は、１つの対を形成するために特異的に相互作用するそれぞれの鎖の上の相補的な塩基によって起こる。互いにハイブリダイズする鎖の能力は、以下に記載されるように様々な条件に依存する。核酸の鎖は、それぞれの鎖の中の十分な数の対応する位置が、互いに相互作用できるヌクレオチドによって占められている場合に、互いにハイブリダイズする。互いにハイブリダイズするポリヌクレオチド鎖は、完全に相補的である場合がある。あるいは、２つのハイブリダイズしたポリヌクレオチドは、互いに「実質的に相補的」である場合もあり、これは、これらが適合していない塩基を少数有していることを示している。自然界に存在している塩基と、本明細書中に記載されたもののような修飾された塩基はいずれも、相補的な塩基対を形成することに関与している。例として生化学および分子生物学を含むがこれらに限定されない本発明の分野の当業者によっては、二本鎖を形成する鎖の配列は、特異的にハイブリダイズできるためには互いに必ずしも１００％の相補性を有している必要はないことが理解される。
【００６１】
本明細書中で使用される場合は、「ヌクレオチド突出」および類似する用語および表現は、二本鎖の一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸びているか、または変更すべきところが変更されている場合に、二本鎖のポリヌクレオチドの二本鎖構造を超えて伸びている対合していないヌクレオチド（単数または複数）をいう。逆に、「平滑」または「平滑末端」、および類似する用語と表現は、二本鎖の末端に対合していないヌクレオチドがない、すなわち、ヌクレオチドの突出がない二本鎖をいう。
【００６２】
本明細書中で使用される場合は、「アンチセンス鎖」および類似する用語と表現は、標的配列に対して実質的に相補的である領域を含む、ポリヌクレオチド二本鎖の１つの鎖をいう。本明細書中で使用される場合は、用語「相補性領域」は、配列（例えば、本明細書中で定義されるような標的配列）に対して実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域をいう。相補性領域が標的配列に対して完全には相補的でない場合には、不適合は、末端領域においては一般的に寛容され、そして存在する場合には、通常、５’および／または３’末端の６、５、４、３、または２ヌクレオチド以内である。
【００６３】
用語「センス鎖」および類似する用語と表現は、本明細書中で使用される場合は、標的配列のアンチセンス鎖の１つの領域に対して相補的である領域を含むポリヌクレオチド二本鎖の１つの鎖をいう。したがって、センス鎖は、標的配列と同じであるかまたは実質的に類似する領域を有する。
【００６４】
本明細書中で使用される場合は、「断片」および類似する用語と表現は、参照の全長配列よりも短い、核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの部分をいう。断片の塩基配列は、参照の対応する部分の配列から変化していない；参照の対応する部分と比較して、断片の中には挿入または欠失はない場合がある。本明細書中で意図されるように、核酸またはポリヌクレオチドの断片（例えば、オリゴヌクレオチド）は、１５塩基以上の長さ、または１６以上、１７以上、１８以上、または１９以上、または２０以上、または２１以上、または２２以上、または２３以上、または２４以上、または２５以上、または２６以上、または２７以上、または２８以上、または２９以上、または３０以上、または５０以上、または７５以上、または１００塩基以上の長さであり、全長の配列よりも１塩基短い長さまでの長さである。
【００６５】
本明細書中で使用される場合は、用語「病理学的発現」および「病原性発現」、ならびに類似する表現は、いずれも「病理学的発現」と言われ、そして病理学的状態または病理学的症状と関係がある遺伝子のディファレンシャルな発現をいう。したがって、病理学的発現は、疾患ではない症状または非病理学的症状において見られる発現レベルとは異なる遺伝子の発現をいう。本開示においては、病理学的発現は、特に、標的遺伝子（すなわち、ＲＮＡｉ治療の標的である遺伝子）として同定された遺伝子をいう。したがって、病理学的発現は、一般的には、遺伝子の過剰発現と遺伝子の低発現の両方をいうが、ＲＮＡｉ治療によって標的化される遺伝子の病理学的発現は、通常、過剰発現であり、ＲＮＡｉ治療は、過剰発現を阻害するかまたは低下させることを目的として行われる。
【００６６】
全長の遺伝子またはＲＮＡにはさらに、任意の自然界に存在しているスプライシング変異体、対立遺伝子変異体、他のオルタナティブ転写物、自然界に存在している全長の遺伝子と同じもしくは類似する機能を示すスプライシング変異体、ならびに、得られるＲＮＡ分子が含まれる。遺伝子の断片は遺伝子に由来する任意の部分であり得、これは、機能的ドメイン（例えば、触媒ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインなど）を提示する場合も、また提示しない場合もある。
【００６７】
「相補的ＤＮＡ」（ｃＤＮＡ）は、ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を生じる逆転写酵素によりｍＲＮＡ鋳型からコピーされた一本鎖のＤＮＡ分子である。当業者はまた、この用語「ｃＤＮＡ」を、そのような一本鎖のＤＮＡ分子とその相補的ＤＮＡ鎖を含む二本鎖のＤＮＡ分子をいうためにも使用する。
【００６８】
用語「動作可能であるように連結された」および類似する用語と表現は、調節エレメントと遺伝子またはそのコード領域との間の連結部分を記載するために使用される。すなわち、遺伝子発現は、通常、構成的もしくは誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサーを含む、特定の転写調節エレメントによって支配される。したがって、そのような遺伝子またはコード領域は、調節エレメント「に対して動作可能であるように連結させられた（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ）」、または調節エレメント「に対して動作可能であるように連結させられた（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ）」、または調節エレメント「と動作可能であるように結合させられた」といわれ、この遺伝子またはコード領域が調節エレメントによって制御されるかまたは調節エレメントによる影響を受けることを意味する。
【００６９】
本明細書中で使用される場合は、用語「干渉する」、「サイレンシングさせる」、および「〜の発現を阻害する」、ならびに類似する用語および表現は、これらが標的遺伝子について言及する限りにおいては、部分的、または原則として完全のいずれかである、標的の発現の抑制あるいは阻害をいう。多くの場合、このような干渉は、抑制された表現形として現れる。様々な場合において、標的遺伝子の発現は、本発明の標的化ポリヌクレオチドの投与によって、少なくとも約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％抑制される。好ましい実施形態においては、標的遺伝子は、標的化ポリヌクレオチドを投与することにより、少なくとも約８５％、または約９０％、または約９５％、または実質的には完全に抑制される。そのような干渉は、細胞培養物中の細胞の中、または組織外植片の中、あるいは被験体の中でインビボで現れ得る。
【００７０】
本明細書中で使用される場合は、用語「処置」および類似する用語と表現は、疾患もしくは症状、疾患の兆候、または疾患に進行する素因を有している被験体に対する治療薬の適用または投与、あるいは、被験体から単離された組織もしくは細胞株に対する治療薬の適用または投与をいう。処置は、その回復もしくは治癒を促すため、または疾患、疾患の兆候、もしくは疾患に進行する素因を寛解させる、緩和する、変化させる、矯正する、改善する、好転させる、もしくは影響を与えることを目的として行われる。
【００７１】
本明細書中で使用される場合は、表現「治療有効量」および「予防有効量」は、それぞれ、疾患の処置において治療的利点を、または、疾患の予防を提供するかもしくは疾患の重篤度を下げる効果を提供する量をいう。治療上有効である特定の量は、処置された被験体における反応の評価を使用して、かかりつけの医師によって容易に決定され得、疾患の性質、被験体の病歴と年齢、疾患の病期、および他の治療薬の投与のような当該分野で公知の要因に応じて異なり得る。
【００７２】
本明細書中で使用される場合は、「薬学的組成物」は、薬学的有効量の標的化ポリヌクレオチドと薬学的に許容される担体を含む組成物をいう。本明細書中で使用される場合は、「薬学的有効量」、「治療有効量」、または単に「有効量」は、意図される薬理学的、治療的、または予防的結果を得るために有効な阻害性ポリヌクレオチドの量をいう。例えば、所定の臨床的処置が、疾患または障害と関係している臨床的パラメーターの少なくとも最小の測定可能な変化が存在する場合に有効であると考えられる時は、その疾患または障害の処置のための薬剤の治療有効量は、少なくともパラメーターの変化の程度に影響を与えるために必要な量である。
【００７３】
用語「薬学的に許容される担体」は、少なくとも、生理学的に許容され、かつ、監督官庁によって承認された治療薬の投与のための組成物をいう。
【００７４】
ヌクレオチドはまた、標識を持つように修飾される場合もある。例えば、蛍光標識またはビオチン標識を有しているヌクレオチドを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手することができる。
【００７５】
ＲＮＡ干渉
本発明によれば、増殖および／または転移を促進するガン細胞中の標的の遺伝子発現が、ＲＮＡ干渉によって弱められる。具体的には、本発明において標的化される遺伝子としては、ＩＣＴ−１０５２、ＩＣＴ−１０５３、ＩＣＴ−１０２７、ＩＣＴ−１０５１、ＩＣＴ−１０５４、ＩＣＴ−１０２０、ＩＣＴ−１０２１、およびＩＣＴ−１０２２と指定された遺伝子が挙げられる。標的遺伝子の転写産物は、１５から３０ヌクレオチドの間の任意の数のヌクレオチドを含み、または多くの場合には、２１から２５ヌクレオチドの間の任意の数のヌクレオチドを含む標的の少なくとも１つのセグメントに相補的な特異的な二本鎖ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列によって細胞内に標的化させられる。標的は、５’非翻訳（ＵＴ）領域の中に存在する場合があり、コード配列の中に存在する場合があり、また、３’ＵＴ領域の中に存在する場合もある。例えば、ＰＣＴ国際公開第００／４４８９５号、同第９９／３２６１９号、同第０１／７５１６４号、同第０１／９２５１３号、同第０１／２９０５８号、同第０１／８９３０４号、同第０２／１６６２０号、および同第０２／２９８５８号（これらはそれぞれ、本明細書中でそれらの全体が引用により組み入れられる）を参照のこと。
【００７６】
本発明の方法によれば、ガン細胞遺伝子の発現、およびそれによるガン細胞の複製は、ｓｉＲＮＡを使用して抑制される。本発明の標的化ポリヌクレオチドにはｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドが含まれる。ｓｉＲＮＡは、ガン細胞標的配列と同じであるかまたは類似するヌクレオチド配列の化学合成によって調製することができる。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｚａｍｏｒｅ，Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｂａｒｔｅｌ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９９９），Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１３：３１９１−３１９７（その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。あるいは、標的化ｓｉＲＮＡは、標的化ポリヌクレオチド配列を使用して、例えば、細胞を含まないシステム（例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）抽出物であるがこれに限定されない）の中でガン細胞のリボポリヌクレオチド配列を消化することによるか、または、組み換え体である二本鎖のガン細胞ｃＲＮＡの転写によって得ることができる。
【００７７】
有効なサイレンシングは、通常、選択された標的配列に相補的な１５〜３０ｎｔの鎖（すなわち、アンチセンス）と１５〜３０ｎｔの同じ長さのセンス鎖からなるｓｉＲＮＡ二本鎖を用いて観察される。多くの実施形態においては、ｓｉＲＮＡ対合二本鎖のそれぞれの鎖はさらに、３’末端に１個、２個、３個、または４個の対合していないヌクレオチドの突出を有する。一般的な実施形態においては、突出の大きさは２ｎｔである。３’突出の配列は、ｓｉＲＮＡ標的の認識についての特異性に、さらに小さな貢献をする。１つの実施形態においては、３’突出の中のヌクレオチドはリボヌクレオチドである。別の実施形態においては、３’突出の中のヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。３’突出において３’デオキシヌクレオチドを使用することにより、高い細胞内安定性が提供される。
【００７８】
標的化配列を含む本発明の組み換え体発現ベクターは、細胞内に導入されると、細胞増殖および／または転移に関係しているガン細胞中の遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡ配列を含むＲＮＡを提供するように処理される。そのようなベクターは、標的化配列の発現を可能にする様式でガン細胞の標的化配列に隣接している動作可能であるように連結された調節配列を含む発現ベクターの中にクローニングされたＤＮＡ分子である。ベクターからは、ガン細胞のＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子が最初のプロモーター（例えば、クローニングされたＤＮＡの３’プロモーター配列）によって転写させられ、そしてガン細胞のＲＮＡ標的のセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えば、クローニングされたＤＮＡの５’プロモーター配列）によって転写させられる。その後、センス鎖とアンチセンス鎖がインビボでハイブリダイズして、遺伝子のサイレンシングのためのガン細胞ＲＮＡ分子を標的化するｓｉＲＮＡ構築物が生じる。あるいは、２つの別の構築物を利用して、ｓｉＲＮＡ構築物のセンス鎖とアンチセンス鎖をつくることができる。さらに、クローニングされたＤＮＡは、ヘアピン型の二次構造を有している転写物をコードすることができ、この場合、１つの転写物は標的遺伝子（単数または複数）に由来するセンス配列と相補的なアンチセンス配列の両方を有する。この実施形態の一例においては、ヘアピン型のＲＮＡｉ転写産物には、標的遺伝子全体またはその一部に類似している第１の配列と、第１の配列に相補的な第２の配列が含まれ、これらはヘアピン型の二本鎖を形成するように配置される。別の例においては、ヘアピン型のＲＮＡｉ産物はｓｉＲＮＡである。ベクター中のガン細胞の配列に隣接している調節配列は同じである場合があり、また、それらの発現を別々に、または時間的にもしくは空間的様式で調節することができるように異なる場合もある。
【００７９】
特定の実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、例えば、小さい核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６に由来するＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ転写単位またはヒトＲＮａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡ  Ｈ１を含むベクターの中にガン細胞の標的遺伝子の鋳型をクローニングすることによって細胞内で転写される。ベクターシステムの１つの例は、ＧｅｎｅＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＴＭ  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅキットである（Ｉｍｇｅｎｅｘから市販されている）。Ｕ６およびＨ１プロモーターは、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターのタイプＩＩＩのクラスのメンバーである。Ｕ６様プロモーターの＋１ヌクレオチドは常にグアノシンであるが、Ｈ１プロモーターの＋１はアデノシンである。これらのプロモーターの終結シグナルは、５個の連続するチミジンによって定義される。転写物は、通常、２つ目のアデニンの後ろで切断される。この位置での切断によって、発現されたｓｉＲＮＡの中に３’ＵＵ突出が生じる。これは、合成のｓｉＲＮＡの３’突出と類似している。４００ヌクレオチド未満の長さの任意の配列をこれらのプロモーターによって転写させることができ、したがって、これらは、例えば、およそ５０ヌクレオチドのＲＮＡヘアピン−ループ転写物の中の、およそ２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡの発現に理想的に適している。選択されたｓｉＲＮＡ配列についての最初のＢＬＡＳＴ相同検索は、ガン細胞の中で優先的に発現される標的だけが同定され、標的とされていない宿主遺伝子が同定されないことを確実にするために、市販されているヌクレオチド配列ライブラリーに対して行われる。Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１  ＥＭＢＯ  Ｊ．２０（２３）：６８７７−８８を参照のこと。
【００８０】
ポリヌクレオチドの合成
標的化ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドと、標的化配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を使用して、標準的な合成技術によって調製することができる。オリゴヌクレオチドを合成するための方法には周知の化学的プロセスが含まれ、これには、Ｔ．Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｄｏｒｃａｓ  Ｊ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１−２４頁（１９９１）に記載されており、引用により本明細書中に組み入れられる、表面が誘導された粒子上へのヌクレオチドホスホルアミダイトの連続的付加が含まれるがこれに限定されない。
【００８１】
合成手順の一例では、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ＲＮＡホスホルアミダイトとチミジンホスホルアミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が使用される。合成のオリゴヌクレオチドは脱保護され、ゲル精製され（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、（２００１）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１５，１８８−２００）、その後、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）精製される（Ｔｕｓｃｈｌら、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：１１６５８−１１６６８）。相補的なｓｓＲＮＡが、アニーリング緩衝液（１００ｍＭの酢酸カリウム、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭの酢酸マグネシウム）の中で、９０℃で１分間インキュベートされ、その後、３７℃で１時間インキュベートされて、対応するｄｓ−ｓｉＲＮＡにハイブリダイズさせられる。
【００８２】
他のオリゴヌクレオチドの合成方法としては、ホスホトリエステルおよびホスホジエステル法（Ｎａｒａｎｇら、（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０）にしたがう固相オリゴヌクレオチド合成、そしてＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇ，Ｐ．Ｊ．ら、（１９８５）「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ  ｂｏｎｄｓ  ｖｉａ  ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ」，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｒｉｐｔａ  ２５，２８０−２８２；およびＦｒｏｅｈｌｅｒ，Ｂ．Ｃ．ら（１９８６ａ）「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖｉａ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｈ−ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１４，５３９９−５４０７など）、および支持体上での合成（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９−１８６２）にしたがう固相オリゴヌクレオチド合成、さらには、ホスホルアミダイト技術（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」，第１５４巻，２８７−３１４頁（１９８８）、米国特許第５，１５３，３１９号、同第５，１３２，４１８号、同第４，５００，７０７号、同第４，４５８，０６６号、同第４，９７３，６７９号、同第４，６６８，７７７号、および同第４，４１５，７３２号）、ならびに、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ」，Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７、およびその中に含まれている参考文献に記載されている他の方法、ならびに非ホスホルアミダイト技術が挙げられるが、これらに限定されない。固相合成は、不純物および過剰な試薬からのオリゴヌクレオチドの単離を手助けする。一旦、固体支持体から切断されると、オリゴヌクレオチドは公知の技術によってさらに単離することができる。
【００８３】
本発明の阻害性ポリヌクレオチド
本発明の標的化ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、混合ＤＮＡ−ＲＮＡポリヌクレオチド鎖、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。後者の一例は、デオキシ２ヌクレオチド配列（例えば、ｄ（ＴＴ）、ｄ（ＵＵ）、ｄ（ＴＵ）、ｄ（ＵＴ））ならびに他の可能な２ヌクレオチドを有している３’末端で終結しているＲＮＡ配列である。さらなる実施形態においては、３’突出は、上記で特定された塩基、または他の塩基を有しているリボヌクレオチドから構成される場合がある。さらに、オリゴヌクレオチド医薬品は、一本鎖である場合も、また二本鎖である場合もある。本発明の治療用オリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態は、オリゴリボヌクレオチドまたは３’ｄ（ＴＴ）末端を有しているオリゴリボヌクレオチドであると考えられる。一本鎖の標的化ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞に投与されると、細胞内に残っている内因性の酵素活性によって、侵入時に二本鎖の分子へと容易に変換させられる。得られる二本鎖のオリゴヌクレオチドはＲＮＡ干渉を引き起こす。
【００８４】
標的化ポリヌクレオチドは、一本鎖のポリヌクレオチドである場合も、また二本鎖のポリヌクレオチドである場合もある。ポリヌクレオチドの中に含まれる標的化ヌクレオチド配列は、全体が自然界に存在しているヌクレオチドから構成されている場合があり、また、ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つのヌクレオチドが、修飾されたヌクレオチドであるかもしくは誘導されたヌクレオチドである場合もある。修飾または誘導は、ポリヌクレオチドの安定化、相補体との鎖のハイブリダイゼーションの最適化、またはＲＮＡｉプロセスの誘導の促進のような目的を達成できる場合がある。標的化配列を含めるための、分子生物学、細胞生物学、腫瘍学、および関連する医薬品の分野、ならびに本発明に関係している他の分野の当業者によって理解される全ての等価なポリヌクレオチドは本発明の範囲内にある。
【００８５】
本発明のポリヌクレオチドには標的化配列が含まれ、疾患または病状の特徴である細胞の増殖または複製を阻害するために有効である。本発明の重要な実施形態においては、第１のヌクレオチド配列または標的化配列は、少なくとも１５ヌクレオチド（ｎｔ）の長さであり、最大１００ｎｔであり得る。特定の重要な実施形態においては、長さは最大７０ｎｔであり得る。なおさらに重要な実施形態においては、第１のヌクレオチド配列は、１５ｎｔ、または１６ｎｔ、または１７ｎｔ、または１８ｎｔ、または１９ｎｔ、または２０ｎｔ、または２１ｎｔ、または２２ｎｔ、または２３ｎｔ、または２４ｎｔ、または２５ｎｔ、または２６ｎｔ、または２７ｎｔ、または２８ｎｔ、または２９ｎｔ、または３０ｎｔの長さであり得る。
【００８６】
第１の標的化ヌクレオチド配列またはその相補体は、通常、標的遺伝子の中を標的化する配列に対して少なくとも８０％相補的である。したがって、標的配列が１５から３０ｎｔの間の長さの範囲である先の段落において同定されたそれらの実施形態においては、３個以下、または４個以下、または５個以下のヌクレオチドが標的配列との相補性とは異なる。有意な実施形態においては、第１のヌクレオチド配列またはその相補体は、標的配列に対して少なくとも８５％相補的であるか、または少なくとも９０％相補的であるか、または少なくとも９５％相補的であるか、または少なくとも９７％相補的である。
【００８７】
第１のヌクレオチド配列またはその相補体は、それがＲＮＡ干渉の表現形を誘導するその標的配列に対して十分に相補的であり、それによりＲＮａｓｅ活性による標的核酸の切断を促進する。病原性の核酸の切断を促進する任意の等価な第１のヌクレオチド配列は本発明の範囲に含まれる。
【００８８】
短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、本発明の第１のポリヌクレオチドに含まれることが想定される。ｓｈＲＮＡには、第１の標的化ヌクレオチド配列、間に存在しているループを形成するヌクレオチド配列、そして第１の標的化配列に相補的な第２の標的化ヌクレオチド配列が含まれる。理論に束縛されることは望ましくないが、第１の標的配列、ループ、そして第１のループに相補的な第２の標的配列を含むポリヌクレオチドは、第２の相補的配列が第１の標的配列とハイブリダイズする分子内二本鎖「ヘアピン」構造を形成するように周囲に存在する（ａｒｏｕｎｄ）と考えられる。重ねて、理論に束縛されることは好ましくないが、ＲＮＡｉの表現形は、その標的配列とともに複合体を形成する二本鎖のＲＮＡ配列によって誘導されると考えられる。ｓｈＲＮＡの使用により、標的化された遺伝子をサイレンシングさせるために有効な二本鎖の標的化ポリヌクレオチドを提供するための最適な手段が提供される。
【００８９】
重要な実施形態においては、標的化ポリヌクレオチドにはさらに、第１のヌクレオチド配列と動作可能な関係にあるか、またはｓｈＲＮＡの場合には、第１のヌクレオチド配列、ループ、および相補的なヌクレオチド配列を含む完全なｓｈＲＮＡ構築物と動作可能な関係にある、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列が含まれる。
【００９０】
ベクター。本発明により、本発明の１つ以上の第１のポリヌクレオチドを含む様々なベクターが提供される。１つ以上の第１のポリヌクレオチドを含めることにより、ベクターは１つ以上の病原性の標的配列に特異的な標的化配列を持つことになる。病原性の標的配列は同じ遺伝子に向けられる場合も、また、その病状に罹患している被験体の細胞の中の別の遺伝子に対して向けられる場合もある。本発明の有利な任意のベクターとしては、第１のヌクレオチド配列に対して、またはｓｈＲＮＡ配列に対して動作可能であるように連結させられたプロモーター、エンハンサー、またはそれらの両方が挙げられる。
【００９１】
本発明のベクターを調製するための方法は、分子生物学、細胞生物学、腫瘍学の分野、および関連する医薬品の分野、および本発明に関係がある他の分野で広く知られている。ベクターを調製するために有用な方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）およびＳｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（第５版）（Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら（２００２）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ）に記載されているが、これらに限定されない。
【００９２】
抗体
用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性のある部分（すなわち、抗原に特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）をいう。そのような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない。一般的には、ヒトから得られた抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤの任意のクラスをいい、これらは、分子の中に存在する重鎖の性質によって互いに異なる。特定のクラスには、さらにサブクラスが含まれ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２などが含まれる。さらに、ヒトにおいては、軽鎖はκ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書中での抗体との言及には、ヒト抗体種の全てのそのようなクラス、サブクラス、およびタイプについての言及が含まれる。
【００９３】
抗原またはその一部もしくは断片となるように意図される本発明の単離されたタンパク質は、抗原に対して免疫特異的に結合する抗体を生じさせるために、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製のための標準的な技術を使用して免疫原として使用することができる。全長のタンパク質を使用することができ、また代わりに、本発明によっては、免疫原として使用される抗原のペプチド断片が提供される場合もある。抗原性ペプチド断片には、全長のタンパク質のアミノ酸配列のうちの少なくとも６個のアミノ酸残基が含まれ、そしてそのエピトープが含まれ、結果として、そのペプチドに対して惹起させられた抗体は、全長のタンパク質と、またはそのエピトープを含むあらゆる断片と特異的な免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドには、少なくとも１０個のアミノ酸残基、または少なくとも１５個のアミノ酸残基、または少なくとも２０個のアミノ酸残基、または少なくとも３０個のアミノ酸残基が含まれる。抗原性ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、その表面上にあるタンパク質の複数の領域であり；通常、これらは親水性領域である。
【００９４】
本発明の特定の実施形態においては、抗原性ペプチドに含まれる標的遺伝子ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープは、タンパク質の表面上に位置するポリペプチドの１つの領域（例えば、親水性領域）である。ヒトのタンパク質配列の疎水性分析は、ポリペプチドのどの領域が特に親水性であるか、したがって、標的化抗体の生産に有用な表面残基をコードすると思われるかを示すであろう。標的化抗体の生産のための手段として、親水性と疎水性の領域を示しているヒドロパシープロット（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｐｌｏｔ）を当該分野で周知の任意の方法によって作製することができる。これらの方法としては、例えば、フーリエ変換を用いるかまたは用いないかのいずれかの、Ｋｙｔｅ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法またはＨｏｐｐ  Ｗｏｏｄ法が、挙げられる。ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ  １９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと（これらはそれぞれ、本明細書中でその全体が参考として援用される）。抗原性タンパク質内の１つ以上のドメイン、またはその誘導体、その断片、そのアナログもしくはそのホモログに特異的な抗原もまた、本明細書中で提供される。
【００９５】
当該分野で公知の様々な手順を、本発明のタンパク質に特異的であるか、またはそれらの誘導体、断片、アナログ、ホモログ、もしくはオルトに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の生産のために使用することができる。（例えば、引用により本明細書中に組み入れられる、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ，ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｄ，１９８８、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと）。これらの抗体のうちのいくつかは以下で議論される。
【００９６】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類）が、ネイティブタンパク質、その合成改変体、またはこれらの誘導体の１回以上の注射により、免疫され得る。適切な免疫原調製物には、例えば、自然界に存在している免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を提示する化学合成されたポリペプチド、または、組換えにより発現される免疫原性タンパク質が含まれ得る。さらに、このタンパク質は、免疫化される哺乳類において免疫原性であることが公知の第２のタンパク質に結合させられる場合がある。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシのサイログロブリン、および大豆トリプシン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。この調製物には、アジュバントをさらに含めることができる。免疫応答を大きくするために使用される様々なアジュバントとしては、フロイントの（完全または不完全）アジュバント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｏｌ）、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、ジニトロフェノールなど）、カルメット−ゲラン杆菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）および挫瘡プロピオンバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）のような、ヒトにおいて使用することができるアジュバント、または同様の免疫賦活剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができるアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。
【００９７】
モノクローナル抗体
用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書中で使用される場合は、特有の軽鎖遺伝子産物と特有の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の１つの分子種のみを含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、この集団内の全ての分子において同じである。従って、ＭＡｂは、抗原に対する特有の結合親和性を特徴とする、抗原の特定のエピトープと免疫応答できる抗原結合部位を含む。
【００９８】
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））によって記載されるハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法においては、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物が、通常は、免疫化剤で免疫化されて、免疫化剤に特異的に結合するであろう抗体が産生されるか、またはそのような抗体を産生することができるリンパ球が誘導される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫することもできる。
【００９９】
免疫剤としては、通常、タンパク質抗原、その断片、またはその融合タンパク質が挙げられるであろう。一般には、末梢血リンパ球が、ヒト起源の細胞が望ましい場合には使用され、また、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が、非ヒト哺乳類供給原が望ましい場合に使用される。リンパ球は、その後、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、不死化細胞株と融合させられ、ハイブリドーマ細胞が形成させられる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３）。不死化細胞株は、通常、哺乳類細胞（特に、齧歯類、ウシ、ヒトを起源とする骨髄腫細胞）に移入される。通常は、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、融合させられていない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含むことが好ましい、適切な培養培地の中で培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合は、ハイブリドーマのための培養培地には、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンが含まれるであろう（「ＨＡＴ培地」）。これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻害する。
【０１００】
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような組換えＤＮＡ法によっても作製することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離することができ、配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターの中に配置され得、この発現ベクターは、その後、宿主細胞（例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別の方法では免疫グロブリンタンパク質を生産しない骨髄腫細胞）にトランスフェクトされて、組換え体である宿主細胞の中でモノクローナル抗体の合成が得られる。
【０１０１】
（ヒト化抗体）
本発明のタンパク質抗原に対して惹起させられた抗体にはさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体が含まれ得る。これらの抗体はヒトへの投与に適しており、投与された免疫グロブリンに対してヒトによって免疫応答が引き起こされることはない。抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはこれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合サブ配列）であり、これらは主に、ヒト免疫グロブリンの配列から構成されており、そして非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列が含まれる。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換することによって行うことができる。（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと。）ヒト化抗体にはまた、好ましくは、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常は、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部が含まれるであろう（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０１０２】
（ヒト抗体）
完全なヒト抗体は、原則として、軽鎖および重鎖の両方の配列全体（ＣＤＲを含む）がヒト遺伝子から得られたものである抗体分子をいう。このような抗体は、本明細書中では、「ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」と呼ばれる。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照のこと）、およびＥＢＶハイブリドーマ技術により調製することができ、ヒトモノクローナル抗体を得ることができる（Ｃｏｌｅら（１９８５）ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において利用することができ、ヒトハイブリドーマを使用することによって（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０を参照のこと）、またはインビトロでヒトＢ細胞をエプスタイン・バーウイルスで形質転換することによって（Ｃｏｌｅら、１９８５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁を参照のこと）産生することができる。
【０１０３】
加えて、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））を含むさらに別の技術を使用して産生することもできる。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、その中の内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化させられているトランスジェニック動物（例えば、マウス）に導入することにより作製することができる。チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）において、ヒト抗体の生産が観察され、これは、ヒトにおいて見られる抗体産生とあらゆる点（遺伝子の配置、アセンブリ、および抗体のレパートリーを含む）で酷似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、ならびにＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２））；Ｌｏｎｇｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６））ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５）において記載されている。
【０１０４】
ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答して動物の内因性抗体ではなく完全なヒト抗体を産生するように改変されるヒト以外のトランスジェニック動物を使用して、さらに産生させることができる（ＰＣＴ国際公開第９４／０２６０２号を参照のこと）。ヒト以外の宿主の中の重鎖および軽鎖の免疫グロブリンをコードする内在性遺伝子は、無能化されており、そしてヒトの重鎖および軽鎖の免疫グロブリンをコードする活性な遺伝子座が、宿主のゲノムに挿入される。このヒト遺伝子は、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を使用して組み込まれる。全ての望ましい改変を提供する動物が、その後、全量より少ない改変の相補体を含む中間のトランスジェニック動物を交配させることにより、子孫として得られる。好ましい実施形態においては、このようなヒト以外の動物はマウスであり、そして、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）と呼ばれる（ＰＣＴ国際公開第９６／３３７３５号および同第９６／３４０９６号に開示されている）。
【０１０５】
Ｆａｂ断片および単鎖抗体
本発明に従って、複数の技術を、本発明の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生に、適合させることができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。加えて、複数の方法を、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築（例えば、Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）に適合させて、タンパク質またはその誘導体、その断片、そのアナログ、もしくはそのホモログに対して望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を、迅速かつ効率的に同定することができる。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体断片は、当該分野で公知の技術によって生産することができる。この技術としては以下が挙げられるが、これらに限定はされない：（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって得られるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生じるＦａｂ断片；（ｉｉｉ）パパインと還元剤での抗体分子の処理によって生じるＦａｂ断片、および（ｉｖ）Ｆｖ断片。
【０１０６】
抗体療法
本発明の抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、および完全なヒト抗体を含む）は治療薬として使用される場合がある。このような薬剤は、一般的には、被験体の疾患または病状を処置するかあるいは予防するために使用されるであろう。抗体調製物（好ましくは、その標的抗原に対して高い特異性と高い親和性を有しているもの）が被験体に投与され、これは一般的には、その標的とのその結合が原因で効果があるであろう。そのような効果は、投与された抗体分子と問題の標的抗原との間での相互作用の特異的な性質に応じて、２種類のうちの１つであり得る。第１の例においては、抗体の投与により、それが自然界において結合する内因性のリガンドを有している標的の結合をできなくするかまたは阻害することができる。この場合、抗体は、標的に結合して、自然界に存在しているリガンドの結合部位をマスクする。ここでは、リガンドはエフェクター分子としての役割を担う。したがって、受容体はリガンドが反応することができるシグナル伝達経路を媒介する。
【０１０７】
あるいは、効果は、標的分子上のエフェクター結合部位に対する結合により、抗体が生理学的結果を誘発するものであり得る。この場合、疾患または病状においては存在しないかまたは欠損している可能性がある内因性のリガンドを有している受容体が代理のエフェクターリガンドとして抗体に結合して、受容体の基礎（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂａｓｅ）を開始させる。
【０１０８】
抗体の薬学的組成物
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、ならびに、本明細書中に開示されるスクリーニングアッセイによって同定された他の分子は、様々な障害の処置のために薬学的組成物の形態で投与することができる。そのような組成物の調製に関する原則と考慮事項、ならびに、組成物の選択における指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏら編）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：１９９５：Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ  Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，１９９４；およびＰｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第４巻），１９９１、Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに提供されている。
【０１０９】
本発明には、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、および他の哺乳動物によって生産させることができる、標的遺伝子のタンパク質産物に結合する抗体が含まれる。ＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子のポリペプチド産物に対して惹起させられた治療用抗体としては、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化形態、およびヒトモノクローナル抗体が挙げられる。標的遺伝子のポリペプチド産物に対して惹起させられた特異的なモノクローナル抗体は、これらが抗体で処理された場合に、ガン細胞のアポトーシス活性を高めることができる。そのような特異的なモノクローナル抗体はさらに、それらが抗体で処理された場合に、ガン細胞の増殖を低下させることができる。標的遺伝子に特異的なモノクローナル抗体は、異種腫瘍移植モデルおよび同系腫瘍移植モデルのいずれを用いた場合にも、インビボで腫瘍の増殖を阻害する能力を有している。
【０１１０】
本発明のガン細胞を標的とするポリヌクレオチド
いくつかの標的遺伝子を、本発明のリード標的遺伝子として同定した。これらの標的遺伝子は、腫瘍増殖、疾患の進行の阻害について、ならびに、哺乳動物において（特に、ヒトにおいて）腫瘍およびガンの阻害および処置のための方法と組成物について確認された標的と考えられる。確認は、標的遺伝子が腫瘍増殖の阻害またはアポトーシスの促進のための標的であり、したがって、治療の標的として使用することができること、そしてこれらはまた、腫瘍およびガンの診断、予防、および治療に有用な化合物を同定するためにも使用できることの以下の実施例に示されている提示に一部基づく。標的遺伝子は表１にまとめられる。
【０１１１】
【表１】
2010512786.tif 000004
ＩＣＴ−１０５２：標的ＩＣＴ−１０５２は、Ｃ−ＭＥＴプロトオンコジーン）として同定されている（肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体；Ｂｏｔｔａｒｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：８０２−８０４；Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，６：５０１−５０４；Ｐａｒｋら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，８４：６３７９−８３；国際公開第９２／１３０９７号；同第９３／１５７５４号；同第９２／２０７９２；Ｐｒａｔら、１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：５９５４−６２を参照のこと）。ｃ−Ｍｅｔの発現は、様々なヒトの充実性腫瘍の中で検出されており（Ｐｒａｔら、１９９１，Ｉｎｔ．Ｊ．ｃａｎｃｅｒ，４９：３２３−３２８）、そして、濾胞上皮に由来する甲状腺腫瘍に関与している（ＤｉＲｅｎｚｏら、１９９２、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，７：２５４９−５３）。ｃ−Ｍｅｔとそのスプライシング変異体は、ｓｉＲＮＡによって媒介されたＩＣＴ−１０５２のノックダウンによって腫瘍増殖の阻害が生じるので、腫瘍を促進する標的（ｔｕｍｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔ）のように作用する。標的ＩＣＴ−１０５２は腫瘍刺激因子であり、したがって、抗体、低分子、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、および他のアンタゴニスト試薬を使用して哺乳動物組織の中の腫瘍、ガン、および前ガン状態を処置するための標的である。
【０１１２】
ＤＬ−２１、ＤＮ−３０、ＤＮ−３１、およびＤＯ−２４と呼ばれるｃ−Ｍｅｔに対するいくつかの抗体（モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む）は、ｃ−Ｍｅｔの１４５ｋＤａのβ鎖の細胞外ドメイン（国際公開第９２／２０７９２号；Ｐｒａｔら、１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１：５９５４−６２）または細胞内ドメイン（Ｂｏｔｔａｒｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：８０２−８０４）に特異的である。そのような抗体は、診断用途および治療用途において使用されている（Ｐｒａｔら、１９９１、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４９：３２３−３２８；Ｙａｍａｄａら、１９９４、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６３７：３０８−３１２；Ｃｒｅｐａｌｄｉら、１９９４、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２５：３１３−２０；米国特許第５，６８６，２９２号；同第６，２０７，１５２号；Ｍａｒｋ  Ｋａｙの特許出願；米国特許出願公開番号２００３０１１８５８７；国際公開第２００４／０７８７７号および同第２００４／０７２１１７号）。
【０１１３】
標的ＩＣＴ−１０５２には、表１に記載されているＧｅｎＢａｎｋ登録番号に開示された配列のヌクレオチド配列と、またはそのコードされるポリペプチドに対して、（ｉ）実質的なヌクレオチド配列相同性（例えば、少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも８０％、なおさらに好ましくは少なくとも９０％、そしてなおさらに好ましくは少なくとも９５％）を有する、多形変異体、対立遺伝子、突然変異体、および種間オルトログが含まれる。ＩＣＴ−１０５２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、通常、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、およびヒツジを含むがこれらに限定されない哺乳動物に由来する。
【０１１４】
ＩＣＴ−１０５２のヌクレオチド配列には、６６４１塩基対が含まれ（本明細書に添付されている配列表の配列番号１を参照のこと；先行技術文献ＵＳ６０／６４２，０６７に開示されている）、これは、１３９０アミノ酸のタンパク質をコードする（本明細書に添付されている配列表の配列番号２を参照のこと；先行技術文献ＵＳ６０／６４２，０６７に開示されている）。
【０１１５】
ＩＣＴ−１０５３：ＩＣＴ−１０５３と指定された標的はＰＤＣＤ１０（プログラムされた細胞死（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）１０（ＰＤＣＤ１０））である。この遺伝子は、アポトーシスに関与しているタンパク質に対する類似性によって前骨髄細胞株において最初に同定されたタンパク質をコードする。ＰＤＣＤ１０タンパク質は、培養物中の２９３細胞のアポトーシスを阻害することができた（Ｍａら、１９９８）。ＩＣＴ−１０５３は、早い速度で増殖している腫瘍の中でアップレギュレートされる。この標的の阻害は、様々なガンのタイプ、腫瘍、および前ガン状態の治療において重要な役割を果たすことができる。したがって、ｓｉＲＮＡ、モノクローナル抗体、およびこの標的の低分子阻害剤は、抗体、低分子、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、および他のアンタゴニスト物質を使用するガンの処置に有用であり得る。
【０１１６】
標的ＩＣＴ−１０５３には、表１に記載されているＧｅｎＢａｎｋ登録番号に開示された配列のヌクレオチド配列と、またはそのコードされるポリペプチドに対して、（ｉ）実質的なヌクレオチド配列相同性（例えば、少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも８０％、なおさらに好ましくは少なくとも９０％、そしてなおさらに好ましくは少なくとも９５％）を有する、多形変異体、対立遺伝子、突然変異体、および種間オルトログが含まれる。ＩＣＴ−１０５３ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、通常、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、およびヒツジを含むがこれらに限定されない哺乳動物に由来する。
【０１１７】
ＩＣＴ−１０５３のヌクレオチド配列には、１４６６塩基対が含まれ（本明細書に添付されている配列表の配列番号３を参照のこと；先行技術文献ＵＳ６０／６４２，０６７に開示されている）、これは、２１２アミノ酸のタンパク質をコードする（本明細書に添付されている配列表の配列番号４を参照のこと；先行技術文献ＵＳ６０／６４２，０６７に開示されている）。
【０１１８】
ＩＣＴ−１０２７：標的ＩＣＴ−１０２７は、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する能力を有している、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）の成長因子受容体結合タンパク質２（ＧＲＢ２）である（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎら、（１９９２））。ＧＲＢ２遺伝子は、ＳＲＣ腫瘍遺伝子産物の非触媒領域に対して相同性を有しているタンパク質をコードし、陰門（ｖｕｌｖａ）形成の誘導を導くシグナル伝達経路に関係しているシノラブディス・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＳｅｍ５遺伝子のホモログである。Ｄｒｋ（ＧＲＢ２のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ホモログ）は、光受容体の発生において不可欠な役割を担っている。様々な実験により、ＳＨ２／ＳＨ３ドメイン相互作用によって媒介される哺乳動物のＧＲＢ２−Ｒａｓシグナル伝達経路についての証拠が提供されている。これは、胚発生およびガンにおいて複数の機能を有している。ＩＣＴ−１０２７は、早い速度で増殖している腫瘍の中でアップレギュレートされる。標的ＩＣＴ−１０２７は、抗体、低分子、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、および他のアンタゴニスト試薬を使用して哺乳動物組織の中の腫瘍、ガン、および前ガン状態を処置するための新規の標的であると考えられる。
【０１１９】
標的ＩＣＴ−１０２７には、表１に記載されているＧｅｎＢａｎｋ登録番号に開示された配列のヌクレオチド配列と、またはそのコードされるポリペプチドに対して、（ｉ）実質的なヌクレオチド配列相同性（例えば、少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも８０％、なおさらに好ましくは少なくとも９０％、そしてなおさらに好ましくは少なくとも９５％）を有する、多形変異体、対立遺伝子、突然変異体、および種間オルトログが含まれる。ＩＣＴ−１０５２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、通常、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、およびヒツジを含むがこれらに限定されない哺乳動物に由来する。
【０１２０】
ＩＣＴ−１０２７のヌクレオチド配列には、３３１７塩基対が含まれ（本明細書に添付されている配列表の配列番号５を参照のこと；先行技術文献ＵＳ６０／６４２，０６７に開示されている）、これは、２１７アミノ酸のタンパク質をコードする（本明細書に添付されている配列表の配列番号６を参照のこと；先行技術文献ＵＳ６０／６４２，０６７に開示されている）。
【０１２１】
標的ＩＣＴ−１０５１。限られたＡｐａｆ−１活性は、病理学的なタンパク質の凝集と、ＨＤにおける神経細胞死の両方を緩和することができる。特異的なホスホイノシチドに結合するＡ−Ｒａｆ残基が、おそらく、これらのリン脂質の中に多く含まれる特定の膜マイクロドメインに対して酵素を局在化させる１つの機構として同定される。ヒトの結腸直腸腺ガンにおけるＡＲＡＦ遺伝子の中の保存されている領域の変異分析により腫瘍形成におけるその薬剤がまとめられている。ヒト胎児の肝臓ｃＤＮＡライブラリーのツーハイブリッドスクリーニングにおいては、ＴＨ１がＡ−Ｒａｆの新規の相互作用パートナーとして検出された。この特異的相互作用は、Ａ−Ｒａｆの活性化において重要な役割を担っている可能性がある。Ａ−Ｒａｆキナーゼは、ＭＥＫ１とのトリヒドロホビン１およびＡ−Ｒａｆ相互作用によってネガティブに調節され、リン酸化によりＭＥＫ１を活性化させる。
【０１２２】
標的ＩＣＴ−１０５４。Ｒａｆ−１は、ＡＬＧ−２（ＰＣＤＰ６）のＡＳＫ−１依存性リン酸化を中断させることによってその抗アポトーシス機能を媒介することができる。それらの先祖細胞である正常なメラニン形成細胞と比較したヒトのブドウ膜メラノーマ細胞の中でのＡＬＧ−２のダウンレギュレーションにより、Ｃａ＋によって媒介されるアポトーシスシグナルの妨害、それによる細胞の生存性の増強による選択的利点を有しているメラノーマ細胞が提供され得る。データは、ＡＬＧ−２が肝臓および肺の新生物の中で過剰発現されており、肺の上皮細胞の中で主に見られることを示している。ＡＬＧ−２は、細胞増殖と細胞死の両方において役割を担っている。ＡＬＧ−２のペンタ−ＥＦ−ハンドドメインは、Ｃａ２＋依存性様式でアネキシンＶＩＩおよびアネキシンＸＩの両方のアミノ末端ドメインと相互作用する。アネキシンＸＩのＰｒｏ／Ｇｌｙ／Ｔｒｙ／Ａｌａを多く含む疎水性領域は、ＡＬＧ−２のＣａ（２＋）に依存して露出させられる疎水性表面をマスクする。ＡＬＧ−２は、その５番目のＥＦ−ハンド領域全体を通じた二量体化によって安定化させられる。アポトーシス関連遺伝子２は、Ｆａｓの死ドメインに結合し、Ｊｕｒｋａｔ細胞の中でのＦａｓ媒介性アポトーシスの間にＦａｓから解離する。
【０１２３】
標的ＩＣＴ−１０２０。突出の長さと配列組成を含む３’末端構造の様々な性質が、ｄｓＲＮＡと単分子である短いヘアピンＲＮＡの両方において、Ｄｉｃｅｒ切断の位置を決定することに重要な役割を担っている。Ｄｉｃｅｒは、脊椎動物細胞のヘテロクロマチン構造の形成に不可欠である。Ｄｉｃｅｒは、ＲＮＡ転写後プロセシングの中心を１つ有する。脆弱性Ｘ症候群のＣＧＧリピートは、ＲＮＡヘアピンを容易に形成し、ヒトＤｉｃｅｒ酵素により消化される。これは、遺伝子発現に影響を与えるＲＮＡ干渉の中心的な工程である。
【０１２４】
標的ＩＣＴ−１０２１。Ｔｏｌｌ様受容体４シグナル伝達複合体での、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＬＰＳのリポ多糖（ＬＰＳ）依存性アンタゴニストの主要な分子部位としてのＭＤ−２の機能を説明する証拠が存在している。これらの結果は、Ｇｌｕ（２４）−Ｐｒｏ（３４）のアミノ末端ＴＬＲ４領域が、ＭＤ−２の結合とＬＰＳのシグナル伝達に重要であることを明白に示している。ＭＤ−２は、敗血症の際の臓器の炎症の重要な媒介因子である。Ｔｈｒ３５からＡｌａへの変異をコードしている１０３位での珍しいＡからＧへの置換により、リポ多糖によって誘導されるシグナル伝達の低下が生じる。結果は、トル様受容体４のＮ末端領域がＭＤ−２との会合に不可欠であることを示しておいる。これは、細胞表面での発現に、しいては、リポ多糖への反応性に必要である。細胞外トル様受容体４（ＴＬＲ４）ドメイン−ＭＤ−２複合体は、リポ多糖（ＬＰＳ）に結合することができ、野生型ＴＬＲ４を発現している細胞の中でのＬＰＳによって誘導されるＮＦ−κＢの活性化とＩＬ−８の分泌を弱めることができる。気道上皮および肺のマクロファージの中でのＭＤ−２発現の調節は、気道での内毒素反応性を変更するための手段となり得る。ＭＤ−２の塩基性アミノ酸のクラスターは、細胞性リポ多糖の認識に関与している。ＴＬＲ４は、ＭＤ−２を伴わずに複数のグリコシル化を受けることができるが、細胞表面発現に不可欠な特異的なグリコシル化がＭＤ−２の存在には必要である。ＭＤの中には２つの機能的ドメインが存在している。一方は、Ｔｏｌｌ様受容体４の結合を担っており、そして他方はアゴニスト（リポ多糖）との相互作用を媒介する。ＭＤ−２はリポ多糖に結合して、Ｔｏｌｌ様受容体４の凝集とシグナル伝達を導く。いくつかのデータにより、リポ多糖結合タンパク質が、膜ＣＤ１４からＴｏｌｌ様受容体４−ＭＤ−２シグナル伝達受容体へのＬＰＳの移動を阻害することにより、リポ多糖（ＬＰＳ）に対する細胞の応答を阻害できるとの仮説がサポートされている。ＬＢＰ、ＣＤ１４、およびＴＬＲ−２を介するＬＴＡの先天性免疫認識は、グラム陽性病原体によってもたらされる感染性疾患の経過の間の全身的な合併症の病因において重要な機構を示すが、ＴＬＲ−４およびＭＤ−２は関与していない。ジスルフィド結合が、このタンパク質のアセンブリと機能に関与している。リポ多糖は、ｔｏｌｌ様受容体４−ＭＤ−２−ＣＤ１４複合体により、ゴルジ体へと、そしてゴルジ体から迅速に輸送される。発現は、腸上皮細胞の中の免疫によって媒介されるシグナルによって調節される。ＭＤ−２は、マウスＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）に対して、リピッドＡに対する反応性を付与することができるが、リピッドＩＶａに対する反応性は付与することはできない。したがって、ＴＬＲ４の細かい特異性に影響を与える。アクセサリー分子ＭＤ−２の発現は、細菌のリポ多糖に反応して脱調節された免疫シグナル伝達とプロ炎症性遺伝子の活性化を制限する機構によって、腸上皮細胞の中でダウンレギュレートされる。ＭＤ−２が腫瘍形成に関与していることを示す報告はこれまでにはない。
【０１２５】
標的ＩＣＴ−１０２２。この遺伝子は、精巣を除いて、様々な腫瘍の中で発現されているが、正常な組織の中では発現されていない遺伝子のファミリーに属する。このファミリーのメンバーの配列は関係性が深いが、散在しているヌクレオチド置換によって異なる。抗原性ペプチドＹＲＰＲＰＲＲＹ（これもまた、いくつかの他のファミリーのメンバーによってコードされる）は、自己の細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される。このタンパク質の機能については、現在のところ何も明らかになっていない。
【０１２６】
標的ＩＣＴ−１０５２、ＩＣＴ−１０５３、ＩＣＴ−１０２７、ＩＣＴ−１０５１、ＩＣＴ−１０５４、ＩＣＴ−１０２０、ＩＣＴ−１０２１、およびＩＣＴ−１０２２が、２つの特異的ｓｉＲＮＡ分子によってダウンレギュレートされれば、腫瘍増殖速度が遅くなることが以下の実施例において報告される。
【０１２７】
本発明により、前ガンまたはガン細胞に侵入すると、ＲＮＡ干渉の表現形を引き起こすことが目的で使用されるオリゴヌクレオチドが広く提供される。本発明は、ガン細胞標的遺伝子の性質に制限されることはないが、本発明の標的遺伝子を標的化するオリゴヌクレオチドを強調する。ＲＮＡ干渉は、適切な二本鎖ＲＮＡによって細胞内に生じさせられる。この二本鎖のうちの一方は、ガン細胞の標的ポリヌクレオチドの中の配列と同じであるか、類似性の高い相補体を有する。一般的には、標的遺伝子を標的化するオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである場合があり、また、これには、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの混合物が含まれる場合もある。最も一般的には、本発明により、１５ヌクレオチドから、長くても２００ヌクレオチドまでの任意の長さの範囲であるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドには、ＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子を標的とする第１のヌクレオチド配列が含まれる。第１のヌクレオチド配列は、ａ）その長さが１５ヌクレオチドから３０ヌクレオチドまでの任意の数である標的化配列、またはｂ）その相補体のいずれかから構成される。そのようなポリヌクレオチドは、本明細書中では直鎖のポリヌクレオチドと呼ばれる。
【０１２８】
図１により、本発明のポリヌクレオチドの特定の実施形態の模式図が提供される。本発明では、ＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子、あるいは、特定の場合には、そのような標的配列とはわずかに一致しないｓｉＲＮＡ配列を標的化する配列が開示される。これらは全て、配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２に提供されており、これらは実施例１に開示される。本明細書中で開示される配列は、１９ヌクレオチドから２５ヌクレオチドまでの長さの範囲である。標的化配列は、図１の中の薄い影がつけられた四角によって模式的に示される。図１、パネルＡ、ａ）は、「ＳＥＱ」として示される開示された配列が、状況に応じて、それらの全体の長さが２００ヌクレオチドまでの範囲であり得るより長いポリヌクレオチドの中に含まれ得る実施形態を説明している。
【０１２９】
本発明により、さらに、標的化ポリヌクレオチドにおいては、配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２から選択された配列が、標的化ポリヌクレオチドがＳＥＱによって示される第１のヌクレオチド配列よりも長い標的遺伝子の中の配列を標的化するように、より長い標的化配列の一部として存在する場合があることが提供される。これは、図１、パネルＡ、ｂ）に示される。ここでは、完全な標的化配列が、ポリヌクレオチドの上の水平方向の線によって、そしてＳＥＱブロックを取り囲むより濃い色の影によって示される。ポリヌクレオチドの全ての実施形態においてそうであるように、このより長い配列は、状況に応じて、２００塩基またはそれ未満の長さのさらに長いポリヌクレオチドの中に含められる場合もある（図１、パネルＡ、ｂ）。
【０１３０】
本発明によってはさらに、上記標的化配列のうちの任意のものの断片である標的化配列（結果として、この断片は、少なくとも１５ヌクレオチドの長さである（そして、図１、パネルＡ、ｃに示される、最長で参照の配列番号のものよりも１塩基短い長さ）配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２の中に提供される配列を標的化する）、さらには、標的化配列（ここでは、５個までのヌクレオチドが配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２（図１、パネルＡ、ｄに示される）に提供される標的配列に対する相補体とは異なっていてもよい（この実施例においては、３つの濃い色の縦方向の棒によって示される３つの変異体塩基を示している））が提供される。
【０１３１】
なおさらに、本発明により、上記の配列（図１、パネルＡ、ｅに示される）のうちの任意のものに対して相補的であり、「ＣＯＭＰＬ」と命名された配列が提供される。これらの配列のうちの任意のものが、本発明のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに含められる。本発明の任意の直鎖のポリヌクレオチドは、上記のａ）〜ｅ）に記載された配列だけによって構成される場合があり、また状況によっては、２００ヌクレオチドの限界までのさらに別の塩基が含まれる場合もある。ＲＮＡ干渉には二本鎖ＲＮＡが必要であるので、標的化ポリヌクレオチド自体が二本鎖（少なくとも配列番号７〜７６、８１〜８４、および８９〜２４２によって提供される配列に対して相補的である二本鎖を含む）であり、それらにハイブリダイズする場合があり、また、相補鎖を生じさせるために細胞内プロセスに頼る場合もある。
【０１３２】
したがって、本発明のポリヌクレオチドは、最も一般的には、一本鎖であり得、また、二本鎖である場合もある。なおさらなる実施形態においては、ポリヌクレオチドには、デオキシリボヌクレオチドだけが含まれるか、またはリボヌクレオチドだけが含まれるか、あるいは、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方が含まれる。本明細書中に記載されるポリヌクレオチドの重要な実施形態においては、標的配列は、１５ヌクレオチド（ｎｔ）、または１６ｎｔ、または１７ｎｔ、または１８ｎｔ、または１９ｎｔ、または２０ｎｔ、または２１ｎｔ、または２２ｎｔ、または２３ｎｔ、または２４ｎｔ、または２５ｎｔ、または２６ｎｔ、または２７ｎｔ、または２８ｎｔ、または２９ｎｔ、または３０ｎｔのいずれかの長さであり得る配列からなる。なおさらに有利な実施形態においては、標的化配列は、ウイルス病原体ゲノムの中の標的配列に対する相補体とは５個までの塩基が異なる場合がある。
【０１３３】
本発明のいくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチドは、１ｎｔ、または２ｎｔ、または３ｎｔ、または４ｎｔの長さであり得る本明細書中に記載される３’突出を必要に応じて含む標的化配列から構成されているｓｉＲＮＡである。多くの実施形態においては、３’突出は２ヌクレオチドである。
【０１３４】
あるいは、ＲＮＡ干渉における二本鎖ＲＮＡの必要性の認識において、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、分子内ヘアピンループ二本鎖分子を形成するように調製される場合がある。そのような分子は、その後ろに短いループ配列が続く先の段落の複数の実施形態のうちのいずれかに記載された第１の配列の形状であり、これにはその後ろに、第１の配列に相補的な第２の配列が続く。そのような構造は、所望される分子内ヘアピンを形成する。さらに、このポリヌクレオチドは、最大２００ヌクレオチドの長さもまた有しているとして開示される。結果として、列挙された３つの必要な構造が、２００ヌクレオチドまでの任意の全長を有している任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを構成し得る。ヘアピンループポリヌクレオチドは、図１、パネルＢに説明される。
【０１３５】
用語「複合体化ＤＮＡ」には、別の分子（例えば、炭水化物、例えば、糖（糖−ＤＮＡ複合体が形成させられる））と複合体を形成したかまたは別の分子と結合したＤＮＡ分子が含まれる。そのような複合体（例えば、糖と複合体化したＤＮＡ）は、受容体を介する効率的な遺伝子送達を促進するかまたはサポートすることができ、例えば、グルコースはＤＮＡと複合体化させることができ、マンノース受容体のような受容体を介して細胞に送達され得る。
【０１３６】
「カプセル化された核酸」（カプセル化されたＤＮＡまたはカプセル化されたＲＮＡを含む）は、比較的非免疫原性であり、選択的に酵素消化に供される材料でコーティングされたマイクロスフェアまたはマイクロ粒子の中の核酸分子、例えば、複数の材料（例えば、ゼラチンと硫酸コンドロイチン）の複合コアセルベーションによって合成されたマイクロスフェアまたはマイクロ粒子をいう（例えば、米国特許第６，４１０，５１７号を参照のこと）。マイクロスフェアまたはマイクロ粒子の中のカプセル化された核酸は、そのコード配列の発現を誘導するその能力を保つ方法でカプセル化される（例えば、米国特許第６，４０６，７１９号を参照のこと）。
【０１３７】
標的化ポリヌクレオチドを含む薬学的組成物
治療用途のための薬学的組成物には、１つ以上の標的化ポリヌクレオチドと担体が含まれる。１つ以上の標的化ポリヌクレオチドを含む薬学的組成物は、標的遺伝子の発現または活性と関係がある疾患あるいは障害を処置するために有用である。担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。経口投与される薬物については、薬学的に許容される担体としては、薬学的に許容される賦形剤、例えば、不活性な希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤、および保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
多くの実施形態においては、本発明は、様々な標的遺伝子を標的化するように設計された少なくとも２つの標的化ポリヌクレオチドと薬学的に許容される担体が含まれている薬学的組成物に関する。１つ以上の標的遺伝子のｍＲＮＡを標的化することが原因で、複数の標的化ポリヌクレオチドを含む薬学的組成物は、少なくとも、これらの複数の遺伝子を発現している腫瘍細胞の中では、１つの標的化ポリヌクレオチドを含む組成物と比較して、改善された処置効率を提供し得る。この実施形態においては、個々の標的化ポリヌクレオチドが先のセクションに記載されたように調製される。これは引用により本明細書中に組み入れられる。１つの標的化ポリヌクレオチドは、１つの標的遺伝子の少なくとも一部に実質的に相補的なヌクレオチド配列を有し得る。さらに別の標的化ポリヌクレオチドが調製され、そのそれぞれは、様々な標的遺伝子の一部に実質的に相補的であるヌクレオチド配列を有する。複数の標的化ポリヌクレオチドを同じ薬学的組成物の中で組み合わせることができ、また、別々に処方することもできる。個別に処方される場合は、別の標的化ポリヌクレオチドを含む複数の組成物に、同じ担体または異なる担体を含めることができ、そして、同じ投与経路を使用して投与することも、また、異なる投与経路を使用して投与することもできる。さらに、個々の標的化ポリヌクレオチドを含む複数の薬学的組成物は、実質的に同時に投与される場合も、連続して投与される場合も、また、１日または処置期間を通じて予め設定された間隔で投与される場合もある。
【０１３９】
本発明の薬学的組成物は、標的遺伝子の発現を阻害するために十分な投与量で投与される。標的化ポリヌクレオチドは、ＲＩＳＣ複合体の一部としてこれらが触媒様式で作用することが理解されているので、阻害作用を生じることにおいて極めて有効である。したがって、本発明の１つ以上の標的化ポリヌクレオチドを含む組成物を、驚くほどの低用量で投与することができる。
【０１４０】
１日あたりレシピエントの体重１キログラムあたり５ｍｇの標的化ポリヌクレオチド最大用量が、標的遺伝子の発現を阻害するかまたは完全に抑制するためには十分である。一般的には、標的化ポリヌクレオチドの適切な用量は、１日あたりレシピエントの体重１キログラムあたり０．０１から５．０ミリグラムの範囲、好ましくは、１日あたり体重１キログラムあたり０．１から２００マイクログラム（ｍｃｇ／ｋｇ）の範囲、より好ましくは、１日あたり０．１から１００ｍｃｇ／ｋｇの範囲、なおさらに好ましくは、１日あたり１．０から５０ｍｃｇ／ｋｇの範囲、最も好ましくは、１日あたり１．０から２５ｍｃｇ／ｋｇの範囲であろう。薬学的組成物は１日に１回投与される場合があり、また、標的化ポリヌクレオチドは、１日を通じて適切な間隔で２回、３回、４回、５回、６回、またはそれ以上に分けられた用量で投与される場合もある。その場合、個々の分けられた用量に含まれる標的化ポリヌクレオチドは、一日量の合計が得られるように対応させられたより少ない量でなければならない。投薬単位はまた、数日間かけて投与するための徐放処方物として、例えば、数日の期間にわたり標的化ポリヌクレオチドの徐放を提供する従来の処方物を使用して、調合することもできる。徐放処方物は当該分野で周知である。この実施形態においては、投薬単位には、一日量の対応する倍数が含まれる。
【０１４１】
特定の要因が、被験体を効率的に処置するために必要な投与量とタイミングに影響を与える場合があり、これには、必ずしもこれらに限定されないが、疾患または障害の重篤度、これまでの処置、被験体の全体的な健康状態および／または年齢、ならびに存在している他の疾患が含まれることを当業者なら理解するであろう。さらに、治療有効量の組成物での被験体の処置には、１回の処置または一連の処置が含まれ得る。本発明に含まれる個々の標的化ポリヌクレオチドについての有効用量とインビボでの半減期の予測は、従来の方法論を使用して、または適切な動物モデルを使用するインビボでの試験に基づいて行うことができ、適切な用量応答特性を決定するための確立されている基準に従って処置の間に調整することができる。
【０１４２】
マウスの遺伝学の進歩により、様々なヒトの疾患の実験のための多数のマウスモデルが作製されている。例えば、マウスモデルは、造血器悪性腫瘍、例えば、白血病、リンパ腫、および急性骨髄性白血病に利用することができる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって支援されているＭＭＨＣＣ（ヒトのガンのマウスモデル・コンソーシアム（Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒｓ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）ウェブページ（ｅｍｉｃｅ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）により、公知のガンモデルの疾患部位特異的統計が提供され、検索することができるＣａｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｃａｎｃｅｒｍｏｄｅｌｓ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、さらには、ＮＣＩ−ＭＭＨＣＣマウスについての蓄積データ（ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）にリンクする。マウスにおいて白血病およびリンパ腫をモデル化するために現在利用することができ、そして本発明の実施において有用な遺伝的ツールの例は、以下の参考文献に記載されている：Ｍａｒｕ，Ｙ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（２００１）７３：３０８−３２２；Ｐａｎｄｏｌｆｉ，Ｐ．Ｐ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００１）２０：５７２６−５７３５；Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（２００１）．ｄｅｌｔａ．：２０６−２１１；Ｒｅｇｏ，Ｅ．Ｍ．ら、Ｓｅｍｉｎ．ｉｎ  Ｈｅｍａｔ．（２００１）３８：４−７０；Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｋ．Ｍ．ら（２００１）Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｔｕｍｏｒｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１１，１９１−２００；Ｖａｎ  Ｅｔｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８，２２４−２３０；Ｗｏｎｇ，Ｓ．ら（２００１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０，５６４４−５６５９；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＪＡ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２０００）５２（２）：４３７−４３；Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８）１６７（２）：３５３−７１；Ｚｅｎｇ  Ｘ  Ｘら、Ｂｌｏｏｄ．（１９８８）９２（１０）：３５２９−３６；Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｂ．ら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９９９）２７（４）：６８２−８；およびＫｏｖａｌｃｈｕｋ，Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２０００）１９２（８）：１１８３−９０。マウスについての蓄積データはまた、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｈａｒｌａｎ，Ｍｕｔａｎｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒｓ（ＭＭＲＲＣ）Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋでも、また、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｕｔａｎｔ  Ａｒｃｈｉｖｅでも見ることができる。そのようなモデルは、標的化ポリヌクレオチドのインビボでの試験のために、さらには、治療有効量の決定のために使用することができる。さらに、標的遺伝子の効果について、様々なノックアウトトランスジェニック動物モデルまたはノックイントランスジェニック動物モデルを調製することができ、標的化ポリヌクレオチド��投与を評価するために実験することができる。
【０１４３】
本発明に含まれる薬学的組成物は、経口経路または非経口経路を含むがこれらに限定されない当該分野で公知の任意の手段によって投与することができ、これには、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、経皮投与、気道（エアゾール）投与、直腸投与、膣投与、および局所（口腔および舌下）投与が含まれる。特定の実施形態においては、薬学的組成物は、静脈内または非経口による注入または注射によって投与され、さらに別の一般的な実施形態においては、標的化ポリヌクレオチドを含む薬学的組成物は、腹腔鏡による手順、および同様の顕微鏡を使う手順を使用して、腫瘍、ガン、または前ガンの増殖に対してインサイチュで直接送達することができる。
【０１４４】
筋肉内、腹腔内、皮下、および静脈内での使用については、本発明の薬学的組成物は、一般的には、適切なｐＨと等張性になるように緩衝化させられた、滅菌の水溶液もしくは懸濁液の中に提供されるであろう。適切な水性ビヒクルとしては、Ｒｉｎｇｅｒ溶液および等張性の塩化ナトリウムが挙げられる。好ましい実施形態においては、担体は、水性緩衝液だけから構成される。この状況においては、「だけ」は、標的遺伝子を発現する細胞の中への標的化ポリヌクレオチドの取り込みに影響を及ぼすかまたはそれを媒介する可能性がある補助剤またはカプセル化物質が存在しないことを意味する。そのような物質としては、例えば、ミセル構造、例えば、以下に記載されるようなリポソームまたはキャプシドが挙げられる。驚くべきことに、本発明者らは、裸の標的化ポリヌクレオチドと生理学的に許容される溶媒だけが含まれている組成物が細胞に取り込まれ、ここで、標的化ポリヌクレオチドは標的遺伝子の発現を効率よく阻害することを発見した。マイクロインジェクション、リポフェクション、ウイルス、ウイロイド、キャプシド、キャプソイド、または他の補助剤が細胞培養物に標的化ポリヌクレオチドを導入するために必要であるが、驚くべきことに、これらの方法および薬剤は、インビボでの標的化ポリヌクレオチドの取り込みには必要ない。本発明の水性懸濁液には、懸濁剤（例えば、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、およびトラガカントガム）、ならびに湿潤剤（例えば、レシチン）が含まれ得る。水性懸濁剤についての適切な保存剤としては、エチルおよびｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸が挙げられる。
【０１４５】
本発明に有用な薬学的組成物にはまた、標的化ポリヌクレオチドを体からの迅速な排除から保護するためのカプセル化された処方物（例えば、徐放処方物（インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む））も含まれる。生体分解性の生体適合性ポリマー（たとえば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）を使用することができる。そのような処方物の調製のための方法は、当業者には明らかであろう。材料はまた、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染させられた細胞に対して標的化させられたリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；ＰＣＴ国際公開第９１／０６３０９号；および欧州特許公開公報ＥＰ−Ａ−４３０７５（これらは引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されているように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０１４６】
特定の実施形態においては、カプセル化された処方物にはウイルス外被タンパク質が含まれる。この実施形態においては、標的化ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのウイルス外被タンパク質に結合させられるか、または少なくとも１つのウイルス外被タンパク質と会合させられるか、または少なくとも１つのウイルス外被タンパク質に取り囲まれ得る。ウイルス外被タンパク質は、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス）に由来する場合もウイルスと会合している場合もあり、また、一部が人工的である場合も、完全に人工的なものである場合もある。例えば、外被タンパク質は、ポリオーマウイルスのＶｉｒｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １および／またはＶｉｒｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２、あるいはそれらの誘導体であり得る。
【０１４７】
そのような化合物の毒性と治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団のうちの５０％に対して致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効である用量）を決定するために、細胞培養物または実験用動物の中で標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果との間での用量比は治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
【０１４８】
細胞培養物でのアッセイおよび動物実験によって得られたデータは、ヒトで使用される投与量の範囲を決定することにおいて使用することができる。本発明の組成物の投与量は、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましく、これには、わずかに毒性が伴うか、または毒性は伴わない。投与量は、使用される投薬形態、利用される投与軽度に応じてこの範囲内で変化し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療有効量は、細胞培養アッセイおよび動物モデルから、細胞培養物中で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を得ることができる試験化合物の濃度）を含む、化合物の循環血漿濃度範囲が得られるように、最初に概算することができる。そのような情報は、ヒトに有効な用量をさらに正確に決定するために使用することができる。
【０１４９】
上記で議論されたように、それらの個々の投与、または集団としての（ａｓ  ａ  ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）投与に加えて、本発明に有用な標的化ポリヌクレオチドは、疾患の処置に有効な他の公知の薬剤と組み合わせて投与することができる。いずれにしても、投与を行う医師は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載される標準的な効力の測定を使用して観察された結果に基づいて、標的化ポリヌクレオチドの投与量とタイミングを調整することができる。
【０１５０】
動物モデルへの高スループットの送達のためにＩｎｔｒａｄｉｇｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの商標である遺伝子送達技術を使用することがさらに想定される。Ｉｎｔｒａｄｉｇｍ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＰｏｌｙＴｒａｎＴＭ技術（国際特許公開第０１４７４９６号を参照のこと）により、腫瘍へのプラスミドの直接の投与が可能であり、これにより、ゴールドスタンダード（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）ヌクレオチド送達試薬よりも７倍大きな効率が得られる。これは、腫瘍の中での候補の標的タンパク質の強い腫瘍発現と活性を提供する。
【０１５１】
標的遺伝子の発現によって引き起こされる疾患を処置するための方法
特定の実施形態においては、本発明は、標的遺伝子の発現によって引き起こされる疾患を有しているか、またはそのような疾患を発症するリスクがある被験体を処置するための方法に関する。１つ以上の標的化ポリヌクレオチドは、腫瘍、ガン、または前ガンの増殖を含む、１つ以上の細胞増殖および／または分化の障害を制御するための新規の治療薬となり得る。この方法には、患者（例えば、ヒト）に対して標的化ポリヌクレオチドの薬学的組成物を投与する工程が含まれる。その結果、標的遺伝子の発現はサイレンシングさせられる。それらの高い特異性が原因で、本発明の標的化ポリヌクレオチドは、以下に記載されるように、そして驚くべき低用量で、異常細胞および異常組織の標的遺伝子のｍＲＮＡを特異的に標的化する。
【０１５２】
疾患の予防においては、標的遺伝子は、疾患の開始または維持に必要な遺伝子である場合も、また、疾患に罹患する高いリスクと関係があるとして同定されている遺伝子である場合もある。疾患の処置においては、標的化ポリヌクレオチドは、疾患を呈している細胞または組織と接触させることができる。例えば、ガンと関係があるか、または腫瘍細胞の中で高レベルで発現されている、変異した遺伝子の転写において形成されたｍＲＮＡ全体またはその一部に実質的に相補的な配列を含む標的化ポリヌクレオチドは、ガン細胞または腫瘍と接触させられる場合も、またはそれらの中に導入される場合もある。
【０１５３】
細胞増殖性障害および／または分化障害の例としては、ガン（例えば、ガン腫、肉腫）、転移性障害、または造血性新生物障害（例えば、白血病）が挙げられる。転移性腫瘍は、多数の原発性の腫瘍のタイプ（膵臓、前立腺、結腸、肺、乳房、および肝臓を起源とするものを含むがこれらに限定されない）から生じ得る。本明細書中で使用される場合は、用語「ガン」、「過増殖」、および「新生物」は、自律的に増殖する能力（すなわち、迅速に増殖している細胞増殖を特徴とする異常な状態）を有している細胞をいう。これらの用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲性の程度にはかかわらず、ガンの増殖または腫瘍形成性のプロセス、転移組織または悪性に転換した細胞、組織、もしくは臓器のあらゆるタイプを含むように意味される。増殖性障害にはまた、造血系を起源とする（例えば、骨髄、リンパ系、または赤血球の系統、あるいはそれらの前駆細胞から生じる）過形成／新生物細胞が関与している疾患を含む、造血系の新生物障害も含まれる。
【０１５４】
ｓｉＲＮＡの組み合わせ
本発明のいくつかの実施形態によっては、２つ以上のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む薬学的組成物が提供される。これらのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにはそれぞれ、呼吸器系ウイルスのゲノムの中の配列を標的化する遺伝子が含まれる。関連する実施形態により、組み合わせを使用することによる、細胞を処置する方法、および呼吸器系ウイルスによる感染を処置する方法、ならびに、呼吸器系ウイルスによる感染を処置することを目的とする薬学的組成物の製造におけるそのような組み合わせ組成物の使用が提供される。組み合わせの個々のポリヌクレオチド成分は、ウイルス病原体のゲノムの中の同じ遺伝子の異なる部分、または異なる遺伝子、または１つの遺伝子のいくつかの部分、さらには、１つ以上の遺伝子を標的化することができる。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせを使用することの利点は、所定の遺伝子の発現を阻害することの利点が組み合わせにおいて増幅されることである。より大きな効力は、複数の標的化配列の使用により、遺伝子をノックダウンさせること、またはウイルスゲノムをサイレンシングさせることにおいて得られる。ウイルスの複製を阻害することにおける大きな効力は、ウイルスゲノムの中の１つ以上の遺伝子を標的化することによって得られる。
【０１５５】
薬学的組成物
本発明の標的化ポリヌクレオチドは、本明細書中では、「活性のある化合物」または「治療薬」と呼ばれる。これらの治療薬は、被験体への投与に適している薬学的組成物の中に取り込ませることができる。
【０１５６】
本明細書中で使用される場合は、「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与と適合する、任意の、そして全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗生物質および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むように意図される。適切な担体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ（編）第２０版（２０００）Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，ＵＳＡ、およびＷｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  ＧｉｓｖｏｌｄのＴｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｄｅｌｇａｄｏ  ａｎｄ  Ｒｅｍｅｒｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ（これらは引用により本明細書中に組み入れられる）のようなテキストに記載されている。そのような担体または希釈剤の中で使用することができる成分の好ましい例としては、水、生理食塩水、リン酸塩、炭酸塩、アミノ酸溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、デキストロース（グルコースと同義）溶液、および５％のヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。限定ではない例として、デキストロースは、５％または１０％の水溶液として使用することができる。リポソームおよび非水性の担体（例えば、不揮発性油）もまた使用される場合がある。薬学的活性のある物質についてのそのようなビヒクルおよび試薬の使用は当該分野で周知である。補助活性化合物もまた、組成物の中に取り込ませることができる。
【０１５７】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合するように処方される。投与経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与、鼻腔投与、吸入、経皮（局所）投与、経粘膜投与、および直腸投与）が挙げられる。非経口投与、静脈内投与、皮内投与、または皮下投与に使用される溶液または懸濁液には、以下の成分を含めることができる：滅菌の希釈剤（例えば、注射用滅菌水、生理食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成の溶媒）；抗生物質（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩）、ならびに弾力性の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。
【０１５８】
吸入による投与のためには、複数の化合物が、適切な推進剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む加圧された容器またはディスペンサー、あるいはネブライザーからエアゾールスプレーの形態で送達される。
【０１５９】
１つの実施形態においては、活性のある化合物は、体内からの迅速な排除から化合物を保護するであろう担体とともに、例えば、徐放処方物（インプラントおよびマイクロカプセル化された送達システムを含む）として調製される。徐放調製物の適切な例としては、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成型された製品（例えば、膜、またはマイクロカプセル）の形態である。徐放マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）、ならびに、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸）が挙げられる。ポリマー（例えば、エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸）は、１００日以上もの間分子を放出することが可能であるが、特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたり薬学的活性のある物質を放出する。有利なポリマーは生体分解性であるか、または生体適合性である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染させられた細胞に対して標的化させられたリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。有利な形態（例えば、マイクロスフェア）を有している徐放調製物は、上記に記載されたような材料から調製することができる。
【０１６０】
本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドはベクターに挿入することができ、遺伝子治療用ベクターとして使用することができる。遺伝子治療用ベクターは、例えば、米国特許第５，７０３，０５５号に記載されているように、任意の多数の経路によって被験体に送達することができる。したがって、送達にはまた、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号）、または定位固定注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３０５４−３０５７を参照のこと）も含まれ得る。遺伝子治療用ベクターの薬学的調製物には、許容される希釈剤の中に遺伝子治療用ベクターを含めることができ、また、その中に遺伝子送達ビヒクルが組み込まれている遅延放出マトリックスを含めることもできる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを組み換え体細胞（例えば、レトロウイルスベクター）から完全な状態で生じさせることができる場合には、薬学的調製物には、遺伝子送達システムを生じる１つ以上の細胞を含めることができる。
【０１６１】
薬学的組成物は、キットの中に、例えば、容器、パック、またはディスペンサーの中に、投与についての説明書とともに含めることができる。
【０１６２】
本発明にはまた、被験体の呼吸器系ウイルスによる感染を処置するための薬学的組成物または医薬品の製造における治療薬の使用も含まれる。
【０１６３】
送達
いくつかの実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、リポソームによって媒介されるトランスフェクションによって、例えば、市販されている試薬または技術（例えば、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（商標）試薬、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ  ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用することによって、さらには、エレクトロポレーション、および同様の技術によって送達される。加えて、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、動物モデル（例えば、齧歯類またはヒト以外の霊長類）に、呼吸管への吸入または点滴によって送達される。動物モデルで使用されるさらに別の経路としては、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、および関連する投与経路が挙げられる。ｓｉＲＮＡを含む薬学的組成物には、ｓｉＲＮＡの安定性を保護する、ｓｉＲＮＡの存続期間を長くする、ｓｉＲＮＡ機能を強化する、または特異的組織／細胞に対してｓｉＲＮＡを標的化させるさらに別の複数の成分が含まれる。これらには、様々な生体分解性ポリマー、陽イオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン）陽イオン性コポリペプチド（例えば、ヒスチジン−リジン（ＨＫ）ポリペプチド）（例えば、ＭｉｘｓｏｎらのＰＣＴ国際公開第０１／４７４９６号、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘの同第０２／０９６９４１号、およびＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの同第９９／４２０９１号を参照のこと）、ＰＥＧ化された陽イオン性ポリペプチド、およびリガンドが取り込まれているポリマーなど、正電荷を有しているポリペプチド、ＰｏｌｙＴｒａｎポリマー（天然の多糖類、スクレログルカンとしても知られている）、標的化リガンドと結合したポリマーからなるナノ粒子（ＴａｒｇｅＴｒａｎ変異体）、界面活性剤（Ｉｎｆａｓｕｒｆ；Ｆｏｒｅｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；ＯＮＹ  Ｉｎｃ．）、および陽イオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン）が含まれる。Ｉｎｆａｓｕｒｆ（登録商標）（カルファクタント）は、気道内注入に使用されるウシの肺から単離された天然の肺界面活性剤であり；これには、リン脂質、中性脂質、および疎水性の界面活性剤が結合したタンパク質ＢおよびＢが含まれる。ポリマーは、一次元また多次元のいずれかであり得、２０ミクロン未満、２０から１００ミクロンの間、または１００ミクロンを越える直径を有しているマイクロ粒子またはナノ粒子でもあり得る。上記ポリマーは、特定の組織または細胞の受容体もしくは分子に特異的なリガンド分子を持つことができ、したがって、ｓｉＲＮＡの標的化させられた送達のために使用することができる。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドはまた、陽イオン性リポソームをベースとする担体（例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ／コレステロール（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）、および他のタイプの脂質水溶液によっても送達される。加えて、小さい割合（５〜１０％）のグルコース水溶液、およびＩｎｆａｓｕｒｆが、ｓｉＲＮＡの気道への投与のための有効な担体である３０。
【０１６４】
蛍光顕微鏡によって試験された５％のグルコースとＩｎｆａｓｕｒｆの経口−気管送達溶液の中に懸濁させられた蛍光標識されたｓｉＲＮＡを使用することにより、鼻腔経路によって、または経口−気管経路によってマウスにｓｉＲＮＡが送達され、そして肺組織が洗浄された後に、ｓｉＲＮＡが肺の中で広い範囲に分配されていたことが示されている（その全体が引用により本明細書中に組み入れられる共有にかかる国際公開第２００５／０１９４０号を参照のこと）。マウスの鼻腔経路および肺（上部および深部呼吸器）へのｓｉＲＮＡの送達は、指標遺伝子とｓｉＲＮＡ標的の融合物を有しているプラスミドの中でｓｉＲＮＡと同時に送達された指標遺伝子（ＧＦＰまたはルシフェラーゼ）をうまくサイレンシングさせることが示された（共有にかかる国際公開第２００５／０１９４０号を参照のこと）。加えて、他者との共同実験によって本発明者らによって報告された実験では、ＳＡＲＳに感染したアカゲザルにおいて、ｓｉＲＮＡ種がＳＡＲＳコロナウイルスの複製を阻害し、それにより、肺の病理を緩和することが明らかになった３０。
【０１６５】
ｓｉＲＮＡ組み換え体ベクター
本発明の別の態様は、本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを含むベクター（好ましくは、発現ベクター）に関する。本明細書中で使用される場合は、用語「ベクター」は、それが連結させられている別の核酸を運搬することができる核酸分子いう。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらに別のＤＮＡセグメントをその中に連結させることができる、環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここでは、さらに別のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムの中に連結させることができる。特定のベクターは、それらが動作可能であるように連結させられた遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは本明細書中では「発現ベクター」と呼ばれる。一般的には、組み換えＤＮＡ技術において利用される発現ベクターは、多くの場合はプラスミドの形態である。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書中では、「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用することができる。しかし、本発明は、同等の機能を担うそのような他の形態の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含むように意図される。
【０１６６】
本発明の組み換え体発現ベクターには、本発明の核酸が宿主細胞の中での核酸の発現に適している形態で含まれる。これは、組み換え体発現ベクターに、発現させられる核酸配列に対して動作可能であるように連結させられた、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列が含まれることを意味する。組み換え体発現ベクターの中では、「動作可能であるように連結させられた」は、目的のヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能にする様式（例えば、インビトロの転写／翻訳システムにおいて、あるいは、ベクターが宿主細胞の中に導入される場合には宿主細胞の中で）で調節配列（単数または複数）に対して連結させられていることを意味するように意図される。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むように意図される。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞の中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、および特定の宿主細胞の中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。なお別の実施形態においては、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞の中で発現させられる。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞の中で使用される場合は、発現ベクターの制御機能は、多くの場合は、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。さらに別のベクターとしては、ミニ染色体（例えば、細菌人工染色体、酵母人工染色体、または哺乳動物人工染色体）が挙げられる。原核細胞および真核細胞の両方についての他の適切な発現システムについては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章と第１７章を参照のこと。
【０１６７】
別の実施形態においては、組み換え体である哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプ（例えば、呼吸器の細胞）の中で核酸の発現を優先的に指示することができる。組織特異的調節エレメントは当該分野で公知である。本発明によってはさらに、発現ベクターの中にクローニングされた本発明のＤＮＡ分子が含まれている組み換え体発現ベクターが提供される。ＤＮＡ分子は、ウイルスＲＮＡを標的化するｓｉＲＮＡを含むＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にする様式で調節配列に動作可能であるように連結させられる。様々な細胞のタイプの中でのＲＮＡ分子の継続的な発現を指示する、核酸に動作可能であるように連結させられる調節配列を選択することができ、例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的、または細胞型特異的発現を指示するウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー、または調節配列を選択することができる。
【０１６８】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって、原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書中で使用される場合は、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、宿主細胞に外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入するための様々な当該分野で理解されている技術を示すように意図され、これには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２）、および他の実験室マニュアルに見ることができる。
【０１６９】
処置方法
本発明は、ＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子の病理学的発現と関係がある哺乳動物の疾患を処置するための方法に関する。この方法には、ＤＮＡあるいはＲＮＡレベルで、標的であるＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子のうちの少なくとも１つと相互作用する阻害性核酸組成物を哺乳動物に投与する工程が含まれる。核酸組成物は、哺乳動物の組織に導入されると、標的であるＩＣＴ−１０５３遺伝子、またはＩＣＴ−１０５２遺伝子、またはＩＣＴ−１０２７遺伝子、またはＩＣＴ−１０５１遺伝子、またはＩＣＴ−１０５４遺伝子、またはＩＣＴ−１０２０遺伝子、またはＩＣＴ−１０２１遺伝子、またはＩＣＴ−１０２２遺伝子のうちの１つ以上の発現を抑制することができる。この処置方法は、特に、哺乳動物の組織の中での、ガンまたは前ガンの増殖のような疾患に向けられる。多くの場合、組織は、乳房組織、結腸組織、前立腺組織、皮膚組織、骨組織、耳下腺組織、膵臓組織、腎臓組織、子宮頸部組織、リンパ節組織、または卵巣組織である。よくあるケースにおいては、阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、デコイ分子、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合体化ＤＮＡ、カプセル化されたＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、裸のＲＮＡ、カプセル化されたＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ，二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉を生じることができる分子、またはそれらの組み合わせである。
【０１７０】
以下の実施例は本発明の特定の実施形態を説明する。これらは、明細書全体に、および特許請求の範囲に示されている本発明の範囲を限定するようには見なされるべきではない。
【実施例】
【０１７１】
ガンの処置のためのＲＮＡ干渉に適用される新規の標的遺伝子を同定し、これらの標的に特異的なｓｉＲＮＡの腫瘍阻害特性を評価するための実験を行った。具体的には、ＩＣＴ−１０５３、ＩＣＴ−１０５２、ＩＣＴ−１０２７、ＩＣＴ−１０５１、ＩＣＴ−１０５４、ＩＣＴ−１０２０、ＩＣＴ−１０２１、ＩＣＴ−１０２２、およびＩＣＴ−１０２２を標的化することによって実験を行った。
【０１７２】
２つのｓｉＲＮＡ標的配列をそれぞれの遺伝子の中で選択し、ＢＬＡＳＴによって確認し、そして配列をＱｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）によって合成した。これらの実施例で報告される実験においては、それぞれの遺伝子についての２つの特異的ｓｉＲＮＡ配列の混合物を、異種移植片モデルに、または培養物中の細胞に繰り返し送達した。ヒトＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡを、選択したｓｉＲＮＡの効果を評価するためにそれに対するポジティブ対照として使用した。
【０１７３】
（実施例１）
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）
ｓｉＲＮＡ二本鎖を、標的であるＩＣＴ−１０５２、ＩＣＴ−１０５３、またはＩＣＴ−１０２７（配列番号１、３、および５）、あるいは、ＩＣＴ−１０５１、ＩＣＴ−１０５４、ＩＣＴ−１０２０、ＩＣＴ−１０２１、ＩＣＴ−１０２２、またはＩＣＴ−１０２２のＤＮＡ配列の選択した標的化領域に基づいて作製した。特定の実施形態においては、設計した配列は、ＡＡ−（Ｎ）ｍ−ＴＴ（ここでは、１５≦ｍ≦２１）を含み、約３０％から７０％のＧ−Ｃ含有量を有する。適切な配列が見つからない場合は、断片の大きさを２９ヌクレオチドまでの配列に伸張する。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドの３’末端は、ＴＴまたはＵＵによって表される突出を持つ（すなわち、対合していない塩基を有している）。理論に束縛されることは望ましくないが、ｓｉＲＮＡ二本鎖上の対称３’突出は、低分子干渉リボヌクレオタンパク質粒子（ｓｉＲＮＰ）が、センスとアンチセンスである標的ＲＮＡを切断するｓｉＲＮＰの適切な等しい割合で形成されることを確実にすることを手助けすると考えられる（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１５：１８８−２００，２００１）。
【０１７４】
ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡ：２１ｂｐのセンスまたはアンチセンスｓｉＲＮＡを配列番号１の標的化された領域に基づいて同定した。これらを表２に示す。
【０１７５】
【表２】
2010512786.tif 000005
ＩＣＴ−１０５３  ｓｉＲＮＡ：２１ｂｐのセンスまたはアンチセンスｓｉＲＮＡを配列番号３の標的化された領域に基づいて同定した。これらを表３に示す。
【０１７６】
【表３】
2010512786.tif 000006
ＩＣＴ−１０２７  ｓｉＲＮＡ：２１ｂｐのセンスまたはアンチセンスｓｉＲＮＡを配列番号５の標的化された領域に基づいて同定した。これらを表４に示す。
【０１７７】
【表４】
2010512786.tif 000007
さらに別の標的化された配列を表５〜１８において特定する。
【０１７８】
【表５】
2010512786.tif 000008
【０１７９】
【表６】
2010512786.tif 000009
【０１８０】
【表７】
2010512786.tif 000010
【０１８１】
【表８】
2010512786.tif 000011
【０１８２】
【表９】
2010512786.tif 000012
【０１８３】
【表１０】
2010512786.tif 000013
【０１８４】
【表１１】
2010512786.tif 000014
【０１８５】
【表１２】
2010512786.tif 000015
【０１８６】
【表１３】
2010512786.tif 000016
【０１８７】
【表１４】
2010512786.tif 000017
【０１８８】
【表１５】
2010512786.tif 000018
【０１８９】
【表１６】
2010512786.tif 000019
【０１９０】
【表１７】
2010512786.tif 000020
【０１９１】
【表１８】
2010512786.tif 000021
。
【０１９２】
（実施例２）
ＩＣＴ−１０５３  ｓｉＲＮＡによる腫瘍増殖の阻害
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳ガン細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（１つのＴ−７５フラスコに対して２０ｍｌ）の中で、３７℃、５％のＣＯ２で維持した。５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中の４×１０５個のＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を、腫瘍を誘導するために、０日目にマウスの乳頭下の脂肪体に注射した。
【０１９３】
１１日目と１８日目に、マウスを、２０μｌのＰＢＳの中の、１０μｇのＩＣＴ−１０５３  ｓｉＲＮＡ（５μｇのＩＣＴ−１０５３−ｓｉＲＮＡ−ｂと混合した５μｇのＩＣＴ−１０５３−ｓｉＲＮＡ−ｂ）または１０μｇの非特異的ｓｉＲＮＡ（ＮＣ）のネガティブ対照のいずれかで処置した。
【０１９４】
ＩＣＴ−１０５３  ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチド鎖からなる：
【０１９５】
【化２】
2010512786.tif 000022
ＩＣＴ−１０５３  ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチド鎖からなる：
【０１９６】
【化３】
2010512786.tif 000023
ポジティブ対照として、腫瘍を２つのＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ阻害剤で処置した。ＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチドからなる：
【０１９７】
【化４】
2010512786.tif 000024
ＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチドからなる：
【０１９８】
【化５】
2010512786.tif 000025
ネガティブ対照（ＮＣ−ｓｉＲＮＡ）として、腫瘍に、いずれのヒトまたはマウスの遺伝子配列とも相同性を有していない２つの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−ｓｉＲＮＡ二本鎖を注射した。ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖とＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖配列を、実施例５の中で以下に示す（配列番号８５〜８８）。
【０１９９】
ｓｉＲＮＡ二本鎖を、エレクトロポレーションを使用して腫瘍異種移植片に直接トランスフェクトした。腫瘍の大きさを、それぞれのｓｉＲＮＡ送達の前と、実験の終了時まで最後のｓｉＲＮＡ送達後は１週間に２回、外部キャリパーを使用して長さと幅を測定することによってモニタした。腫瘍の容積は以下のように計算した：
容積＝幅２×長さ×０．５２
結果を図２に示す。ＩＣＴ−１０５３  ｓｉＲＮＡで処置した場合に得られた腫瘍の大きさは、非特異的ｓｉＲＮＡを用いた場合に見られた大きさよりもはるかに小さく、ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡポジティブ対照を用いた場合に得られた腫瘍の大きさと本質的に区別することができた。これは、ＰＤＣＤ１０発現をノックダウンさせるＩＣＴ−１０５３を標的化するｓｉＲＮＡが、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片によって生じた腫瘍の増殖を強く制限することを示している。
【０２００】
（実施例３）
ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡによる腫瘍増殖の阻害
概ね、実施例２に記載された手順と同様の実験手順を使用した。本実施例では、対照動物を１×ＰＢＳだけで処置した（図３のビヒクル対照）。１１日目と１８日目に、マウスを、２０μｌのＰＢＳの中の、１０μｇのＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡ（５μｇのＩＣＴ−１０５２−ｓｉＲＮＡ−ｂと混合した５μｇのＩＣＴ−１０５２−ｓｉＲＮＡ−ａ）または１０μｇの非特異的ｓｉＲＮＡ（ＮＣ）のいずれかで処置した。
【０２０１】
ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチド鎖からなる：
【０２０２】
【化６】
2010512786.tif 000026
ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチド鎖からなる：
【０２０３】
【化７】
2010512786.tif 000027
ポジティブ対照として使用したＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ−ａおよびＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖は、実施例２で使用したものと同じである（配列番号７７〜８０）。
【０２０４】
結果を図３に示す。本実施例で使用したＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡが、ネガティブ対照であるＰＢＳビヒクルおよび非特異的ｓｉＲＮＡ（ＮＣ−ｓｉＲＮＡ）と比較して腫瘍の大きさを小さくしたことが明らかである。ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡの有効な効果は、ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡと同じ程度に有効ではなかった。これらの結果は、ｃ−Ｍｅｔ発現をノックダウンさせる本実施例で使用したＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡが、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の腫瘍増殖を阻害するために有効であることを示している。
【０２０５】
（実施例４）
ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡによる腫瘍増殖の阻害
Ａ５４９ヒト肺ガン細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＤＭＥＭ培地の中で、３７℃、５％のＣＯ２で維持した。０日目に、１００μｌの無血清ＤＭＥＭ培地中の１×１０７個のＡ５４９細胞を、麻酔したヌードマウスの脇腹にｓ．ｃ．接種した。６日目に腫瘍の大きさを測定し、動物を処置群に無作為に割り当てた。
【０２０６】
７日目に、それぞれの腫瘍に、エレクトロポレーションで強化したトランスフェクション手順を使用して、２０μｌのＰＢＳの中の、１０μｇのＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡ（５μｇのＩＣＴ−１０５２−ｓｉＲＮＡ−ｂと混合した５μｇのＩＣＴ−１０５２−ｓｉＲＮＡ−ａ（配列番号８１〜８４）；実施例３を参照のこと）または１０μｇの非特異的ｓｉＲＮＡ（ＮＣ）のいずれかを腫瘍内にトランスフェクトした。４回のさらなるｓｉＲＮＡの送達を、１２日目、１６日目、２０日目、および２７日目に行った。腫瘍の大きさを、それぞれのｓｉＲＮＡの送達前と、最後のｓｉＲＮＡ送達後は１週間に２回測定した。
【０２０７】
結果を図４に示す。本実施例においては、ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡでのＡ５４９腫瘍の処置により、非特異的ｓｉＲＮＡで処置した腫瘍と比較して、Ａ５４９異種移植片の増殖速度が有意に阻害されたことが観察された。これらの結果は、腫瘍の中でｃ−Ｍｅｔ発現をノックダウンさせる本実施例で使用したＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９肺腫瘍の増殖を効率よく阻害することを示している。
【０２０８】
（実施例５）
ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡとＩＣＴ−１０５３  ｓｉＲＮＡによる腫瘍増殖の阻害
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳ガン細胞を、１０％のＦＢＳを加えたＲＰＭＩ  １６４０培地の中で、３７℃、５％のＣＯ２で維持した。細胞を、実施例２で使用したものと同じＩＣＴ−１０５３  ｓｉＲＮＡ（配列番号７３〜７６）で、または実施例３で使用したＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡ（配列番号８１〜８４）で、２μｇのｓｉＲＮＡ／２×１０６細胞／２００μｌのＤＭＥＭ培地、または５μｇのｓｉＲＮＡ／２×１０６細胞／２００μｌのＤＭＥＭ培地の濃度で、エレクトロポレーション媒介トランスフェクション法を使用してトランスフェクトした。対照群においては、細胞を、エレクトロポレーション媒介トランスフェクション法を使用して、同じ濃度でｓｉＲＮＡ標的化緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子（ＧＦＰ）でトランスフェクトした。ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡは、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖とＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖の等量の混合物である。
【０２０９】
ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチドからなる：
【０２１０】
【化８】
2010512786.tif 000028
ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチド鎖からなる：
【０２１１】
【化９】
2010512786.tif 000029
トランスフェクションの４８時間後に、細胞増殖活性を、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ（ＭＴＴに基づく、ここでは、ＭＴＴは、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−臭化ジフェニルテトラゾリウム、またはチアゾリルブルーである）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して測定した。それぞれウェルの中の培地を吸引し、その後、２ｍｌの無血清ＤＭＥＭをそれぞれのウェルに添加した。２００μＬのＭＴＴストック溶液（ＭＴＴストック溶液：１０ｍＬのＰＢＳ中の５０ｍｇのＭＴＴ）をそれぞれのウェルに添加した。プレートを、３７℃のＣＯ２インキュベーターの中で３時間インキュベートした。このインキュベーション時間の間に、生存可能な細胞は、ＭＴＴを水不溶性のホルマザン色素へと変換させる。それぞれのウェルの中の培地が除去されるが、ホルマザンの結晶は除去されない。２ｍＬの酸性イソプロピルアルコール（５００ｍＬのイソプロピルアルコール＋３．５ｍＬの６Ｎ  ＨＣｌ）をそれぞれのウェルに添加し、結晶を約１０分かけて完全に溶解させた。それぞれのウェルから１００μｌを９６ウェルプレートに移し、５７０ｎｍでの吸光度を、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  ６８０，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して６５０ｎｍでのバックグラウンドを減算して読み取った。
【０２１２】
結果を図５に示す。ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡとＩＣＴ−１０５３−ｓｉＲＮＡにより、適用されたいずれの用量でも、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の２５〜３０％の増殖の阻害が提供されたが、対照試料によっては、わずかに５％またはそれ未満の増殖の阻害しか生じなかったことが明らかとなった。これらのデータは、この実験で使用した標的化ｓｉＲＮＡが、培養物中のヒト乳ガン細胞の増殖を阻害するために有効であることを示している。
【０２１３】
（実施例６）
ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡとＩＣＴ−１０５３  ｓｉＲＮＡによるガン細胞の増殖の阻害
ＨＣＴ１１６ヒト結腸直腸ガン細胞を、２．５％のＦＢＳを加えてＤＭＥＭ培地の中で、３７℃および５％のＣＯ２で維持した。ＨＣＴ１１６細胞を、実施例２で使用したものと同じＩＣＴ−１０５３  ｓｉＲＮＡ（配列番号７３〜７６）で、または実施例３で使用したＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡ（配列番号８１〜８４）で、５μｇのｓｉＲＮＡ／２×１０６細胞／２００μｌのＤＭＥＭ培地の濃度で、エレクトロポレーション媒介トランスフェクション法を使用してトランスフェクトした。対照群においては、細胞を、ＮＣ−ｓｉＲＮＡで、同じ濃度でトランスフェクトした。
【０２１４】
トランスフェクション後７２時間で、トランスフェクトされたＨＣＴ１１６細胞の中での細胞増殖活性を、実施例５に記載したＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して測定した。
【０２１５】
結果を図６に示す。ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡまたはＩＣＴ−１０５３  ｓｉＲＮＡでの処理によっては、ＨＣＴ１１６細胞の増殖の２５〜３０％の阻害が生じ、一方、ＮＣ−ｓｉＲＮＡでの処理によっては、模擬処置を行った対照細胞と比較して、わずかに８％しか細胞増殖阻害が生じなかったことが観察された。これらのデータは、ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡとＩＣＴ−１０５３  ｓｉＲＮＡが、培養物中のヒト結腸ガン細胞の細胞増殖の有効な阻害因子であることを示している。
【０２１６】
（実施例７）
ＩＣＴ−１０５２による肺ガン細胞の増殖の阻害
Ａ５４９ヒト肺ガン細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＤＭＥＭ培地の中で、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。Ａ５４９細胞を、実施例３で使用したものと同じＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡ（配列番号８１〜８４）で、５μｇのｓｉＲＮＡ／２×１０６細胞／２００μｌのＤＭＥＭ培地の濃度で、エレクトロポレーション媒介トランスフェクション法を使用してトランスフェクトした。対照群においては、Ａ５４９細胞を、ＮＣ−ｓｉＲＮＡで、実施例２に記載したように（配列番号８５〜８８）トランスフェクトした。トランスフェクション後７２時間で、トランスフェクトされた細胞の中での細胞増殖活性を、実施例５に記載したようにＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して測定した。
【０２１７】
結果を図７に示す。ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡでの処理によっては、Ａ５４９細胞の約２５の細胞増殖阻害が生じ、一方、ＮＣ−ｓｉＲＮＡでの処理によっては、模擬処置を行った対照細胞と比較して、わずかに５％またはそれ未満しか細胞増殖阻害が生じなかったことが観察された。これらのデータは、ＩＣＴ−１０５２  ｓｉＲＮＡが、培養物中のヒト肺ガン細胞の細胞増殖を効果的に阻害できることを示している。
【０２１８】
（実施例８）
ＩＣＴ−１０２７  ｓｉＲＮＡによる腫瘍増殖の阻害
ｓｉＲＮＡを９日目、１４日目、および２０日目に投与した（図８に矢印で示した）改良を加えて、実施例２および３と同様の実験手順を使用した。マウスを、２０μｌのＰＢＳ中の、１０μｇのＩＣＴ−１０２７  ｓｉＲＮＡ（５μｇのＩＣＴ−１０２７−ｓｉＲＮＡ−ｂと混合した５μｇのＩＣＴ−１０２７−ｓｉＲＮＡ−ａ）または１０μｇのＧＦＰ−ｓｉＲＮＡのいずれかで処置した。
【０２１９】
ＩＣＴ−１０２７  ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチド鎖からなる：
【０２２０】
【化１０】
2010512786.tif 000030
ＩＣＴ−１０２７  ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチド鎖からなる：
【０２２１】
【化１１】
2010512786.tif 000031
ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡをネガティブ対照とし、これは、実施例２４に記載したように、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖とＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖（配列番号８５〜８８）の等量の混合物である。ｓｉＲＮＡ二本鎖を、腫瘍異種移植片の中に腫瘍内注射した。
【０２２２】
結果を図８に示す。Ｇｒｂ２発現をノックダウンさせるＩＣＴ−１０２７  ｓｉＲＮＡ混合物が、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ対照と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の充実性腫瘍の増殖を有意に阻害することが明らかである。
【０２２３】
（実施例９）
ＩＣＴ−１０２７  ｓｉＲＮＡによる腫瘍細胞のアポトーシスの促進
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳ガン細胞を、１０％のＦＢＳを加えたＲＰＭＩ  １６４０培地の中で、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。細胞を、実施例８に記載した配列を使用してＩＣＴ−１０５７  ｓｉＲＮＡ（配列番号８９〜９２）で、２μｇのｓｉＲＮＡ／２×１０６細胞／２００μｌのＤＭＥＭ培地または５μｇのｓｉＲＮＡ／２×１０６細胞／２００μｌのＤＭＥＭ培地の濃度で、エレクトロポレーション媒介トランスフェクション法を使用してトランスフェクトした。対照群においては、細胞にはいずれの処置も行わなかった。模擬群においては、細胞を、同じエレクトロポレーション手順を用いて、しかし培地の中にｓｉＲＮＡを含めずに処理した。トランスフェクション後４８時間で、細胞の中でのアポトーシス活性を、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、細胞質ヒストン−ＤＮＡ断片（これはアポトーシスの指標である）の定量的決定により測定した。このアッセイは、ＤＮＡおよびヒストンに対してそれぞれ特異的であるマウスモノクローナル抗体を使用する定量的サンドイッチ−酵素−免疫アッセイの原理に基づく。これにより、細胞溶解物の細胞質画分の中のモノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームの特異的決定が可能である。それぞれのウェルの中の細胞を、キットとともに提供される溶解緩衝液で溶解させた。それぞれのウェルから２０μｌの細胞溶解物を、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレートに移し、マウスモノクローナル抗ヒストン−ビオチン抗体とマウスモノクローナル抗ＤＮＡ−ペルオキシダーゼとともにインキュベートした。結合していない抗体を洗い流した。ヌクレオソームの量を、基質として２，２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸；ＡＢＴＳ）を用いてペルオキシダーゼ活性を測光分析により測定することによって定量的に決定した。その後、プレートをプレートリーダーの上に置き、５９０ｎｍでの吸光度を、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  ６８０，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して測定した。
【０２２４】
結果を図９に示す。対照試料および模擬試料と比較して、Ｇｒｂ２遺伝子発現をノックダウンさせるＩＣＴ−１０２７  ｓｉＲＮＡが、用量依存性の様式で有意なアポトーシスを誘導することが明らかである。結果は、ＩＣＴ−１０２７に特異的な阻害性ＲＮＡが、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することによってＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の腫瘍増殖を阻害することを示唆している（実施例８）。
【０２２５】
（実施例１０）
ＩＣＴ−１０５１  ｓｉＲＮＡによる乳ガン異種移植片の増殖の阻害
実施例２に記載したものと同様の実験手順を、標的としてのＩＣＴ−１０５１（Ａ−Ｒａｆ）を確認するための本実施例において使用した。
【０２２６】
１１日目と１８日目に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍を、１０μｇのＩＣＴ−１０５１  ｓｉＲＮＡ（５μｇのＩＣＴ−１０５１−ｓｉＲＮＡ−ｂと混合した５μｇのＩＣＴ−１０５３−ｓｉＲＮＡ−ａ）または１０μｇのＮＣ−ｓｉＲＮＡのいずれかで処置した。
【０２２７】
ＩＣＴ−１０５１  ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチドからなる：
【０２２８】
【化１２】
2010512786.tif 000032
ＩＣＴ−１０５１  ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチドからなる：
【０２２９】
【化１３】
2010512786.tif 000033
ＮＣ−ｓｉＲＮＡをネガティブ対照とし、これは、実施例２に記載したように、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖とＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖の等量の混合物である。
【０２３０】
結果を図１０に示す。Ａ−Ｒａｆ発現をノックダウンさせるＩＣＴ−１０５１  ｓｉＲＮＡ混合物は、ＮＣ−ｓｉＲＮＡで処置した異種移植片と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の増殖速度を低下させた。
【０２３１】
（実施例１１）
ＩＣＴ−１０５４  ｓｉＲＮＡによる乳ガン異種移植片の増殖の阻害
実施例２に記載したものと同様の実験手順を、ガン治療の標的としてのＩＣＴ−１０５４（ＰＣＤＰ６）を確認するための本実施例において使用した。
【０２３２】
１１日目と１８日目に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍を、１０μｇのＩＣＴ−１０５４  ｓｉＲＮＡ（５μｇのＩＣＴ−１０５４−ｓｉＲＮＡ−ｂと混合した５μｇのＩＣＴ−１０５４−ｓｉＲＮＡ−ａ）または１０μｇのＮＣ−ｓｉＲＮＡのいずれかで処置した。
【０２３３】
ＩＣＴ−１０５４  ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチドからなる：
【０２３４】
【化１４】
2010512786.tif 000034
ＩＣＴ−１０５４  ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチドからなる：
【０２３５】
【化１５】
2010512786.tif 000035
ＮＣ−ｓｉＲＮＡをネガティブ対照とし、これは、実施例２に記載したように、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖とＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖の等量の混合物である。
【０２３６】
結果を図１１に示す。ＰＣＤＰ６発現をノックダウンさせるＩＣＴ−１０５４  ｓｉＲＮＡ混合物は、ＮＣ−ｓｉＲＮＡで処置した異種移植片と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の増殖速度を低下させた。
【０２３７】
（実施例１２）
ＩＣＴ−１０２０による乳ガン異種移植片の増殖の阻害
実施例２に記載したものと同様の実験手順を、改良したｓｉＲＮＡ投与スケジュールを用いて、ガン治療の標的としてのＩＣＴ−１０２０（Ｄｉｃｅｒ）を確認するための本実施例において使用した。
【０２３８】
本実施例では、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍異種移植片を、９日目と１４日目に、１０μｇのＩＣＴ−１０２０  ｓｉＲＮＡ（５μｇのＩＣＴ−１０２０−ｓｉＲＮＡ−ｂと混合した５μｇのＩＣＴ−１０２０−ｓｉＲＮＡ−ａ）または１０μｇのＮＣ−ｓｉＲＮＡのいずれかで処置した。
【０２３９】
ＩＣＴ−１０２０  ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチドからなる：
【０２４０】
【化１６】
2010512786.tif 000036
ＩＣＴ−１０２０  ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチドからなる：
【０２４１】
【化１７】
2010512786.tif 000037
ＮＣ−ｓｉＲＮＡをネガティブ対照とし、これは、実施例２に記載したように、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖とＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖の等量の混合物である。
【０２４２】
結果を図１２に示す。腫瘍細胞内でのＤｉｃｅｒ発現を特異的にノックダウンさせるＩＣＴ−１０２０  ｓｉＲＮＡでの処置により、ネガティブ対照であるＮＣ−ｓｉＲＮＡで処置した異種移植片と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の増殖速度が有意に低下した。
【０２４３】
（実施例１３）
ＩＣＴ−１０２１  ｓｉＲＮＡによる乳ガンの異種移植片の増殖の阻害
実施例２に記載したものと同様の実験手順を、ガン治療の標的としてのＩＣＴ−１０２１（ＭＤ２タンパク質）を確認するための本実施例において使用した。１１日目と１８日目に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍を、１０μｇのＩＣＴ−１０２１  ｓｉＲＮＡ（５μｇのＩＣＴ−１０２１−ｓｉＲＮＡ−ｂと混合した５μｇのＩＣＴ−１０２１−ｓｉＲＮＡ−ａ）または１０μｇのＮＣ−ｓｉＲＮＡのいずれかで処置した。
【０２４４】
ＩＣＴ−１０２１  ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチドからなる：
【０２４５】
【化１８】
2010512786.tif 000038
ＩＣＴ−１０２１  ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチドからなる：
【０２４６】
【化１９】
2010512786.tif 000039
ＮＣ−ｓｉＲＮＡをネガティブ対照とし、これは、実施例２に記載したように、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖とＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖の等量の混合物である。
【０２４７】
結果を図１３に示す。腫瘍細胞内でのＭＤ２タンパク質発現を特異的にノックダウンさせるＩＣＴ−１０２１  ｓｉＲＮＡでの処置により、ＮＣ−ｓｉＲＮＡで処置した異種移植片と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の増殖速度が低下した。
【０２４８】
（実施例１４）
ＩＣＴ−１０２２  ｓｉＲＮＡによる乳ガンの異種移植片の増殖の阻害
実施例２に記載したものと同様の実験手順を、ガン治療の標的としてのＩＣＴ−１０２２（ＧＡＧＥ−２）を確認するための本実施例において使用した。本実施例では、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片腫瘍を、１０日目と１５日目に、１０μｇのＩＣＴ−１０２２  ｓｉＲＮＡ（５μｇのＩＣＴ−１０２２−ｓｉＲＮＡ−ｂと混合した５μｇのＩＣＴ−１０２２−ｓｉＲＮＡ−ａ）または１０μｇのＮＣ−ｓｉＲＮＡのいずれかで処置した。
【０２４９】
ＩＣＴ−１０２２  ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチドからなる：
【０２５０】
【化２０】
2010512786.tif 000040
ＩＣＴ−１０２２  ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖は、以下の配列を有している２つの相補的なポリヌクレオチドからなる：
【０２５１】
【化２１】
2010512786.tif 000041
ＮＣ−ｓｉＲＮＡをネガティブ対照とし、これは、実施例２に記載したように、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ａ二本鎖とＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ｂ二本鎖の等量の混合物である。
【０２５２】
ｓｉＲＮＡで処置したＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の増殖曲線を図１４に示す。腫瘍細胞内でのＧＡＧＥ−２発現を特異的にノックダウンさせるＩＣＴ−１０２２  ｓｉＲＮＡでの処置により、ＮＣ−ｓｉＲＮＡで処置した異種移植片と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片の増殖速度が有意に低下した。
【０２５３】
本発明の他の実施形態および使用は、本明細書中に開示される発明の詳細および実施を考慮して当業者に明らかであろう。米国および外国の特許ならびに特許出願を含む、本明細書中で引用された全ての参考文献および材料は、具体的に、そして全体が引用により本明細書中に組み入れられる。明細書および実施例は例として考慮されるにすぎず、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【０２５４】
参考文献
【０２５５】
【数１】
2010512786.tif 000042
【０２５６】
【数２】
2010512786.tif 000043
【０２５７】
【数３】
2010512786.tif 000044
【図１】
2010512786.tif 000045
【図２】
2010512786.tif 000046
【図３】
2010512786.tif 000047
【図４】
2010512786.tif 000048
【図５】
2010512786.tif 000049
【図６】
2010512786.tif 000050
【図７】
2010512786.tif 000051
【図８】
2010512786.tif 000052
【図９】
2010512786.tif 000053
【図１０】
2010512786.tif 000054
【図１１】
2010512786.tif 000055
【図１２】
2010512786.tif 000056
【図１３】
2010512786.tif 000057
【図１４】
2010512786.tif 000058
【配列表】
2010512786000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月25日(2009.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010512786000001.app
【国際調査報告】
2010512786.tif 000108
2010512786.tif 000109
2010512786.tif 000110
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