(57)【要約】  本発明は移植片拒絶において調整される遺伝子の分析および同定に関する。この遺伝子発現の改変は移植片拒絶を正確に検出するための分子署名を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）対象から移植後試料を入手すること；
（ｂ）表２で同定された遺伝子からなる群から選択される複数の遺伝子の組み合わせの移植後試料における遺伝子発現のレベルを決定すること；
（ｃ）移植後試料における少なくとも一つの遺伝子の遺伝子発現強度を対照試料における同一遺伝子の遺伝子発現強度と比較すること；および
（ｄ）少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが対照試料と相対して上方調節されているか、または下方調節されているかを決定することであって、ここで少なくとも一つの遺伝子の上方調節または下方調節は対象が移植片拒絶を経験する可能性があることを示し、それにより対象における移植器官の拒絶の発症を評価すること；
の工程を含む、対象において移植器官の拒絶の発症を評価するための方法。
【請求項２】
試料が対象から得られた細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が：グラフト生検サンプル；血液；血清；および尿からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
拒絶が慢性／硬化性同種移植腎症である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試料における発現強度が対照の発現強度と少なくとも約１.１倍異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
試料における発現強度が対照の発現強度と少なくとも約１.５倍異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）対象から移植後試料を入手すること；
（ｂ）表２で同定された遺伝子からなる群から選択される複数の遺伝子の組み合わせの移植後試料における遺伝子発現のレベルを決定すること；および
（ｃ）移植後試料における遺伝子の組み合わせの遺伝子発現パターンを対照試料における遺伝子の同一の組み合わせの遺伝子発現のパターン比較することであって、ここで対照試料発現プロフィールにおける遺伝子の同一の組み合わせの発現パターンと比較して移植後試料における遺伝子の組み合わせ組み合わせの遺伝子発現パターンの発現パターンにおける類似性は、対象が移植片拒絶を経験する可能性があることを示し、それにより対象における移植器官の拒絶の発症を評価すること；
の工程を含む、対象における移植器官の拒絶の発症を評価するための方法。
【請求項８】
試料が対象から得られた細胞を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試料が：グラフト生検；血液；血清；および尿からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
拒絶が慢性／硬化性同種移植腎症である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）対象から移植後試料を入手すること；
（ｂ）表２で同定された遺伝子からなる群から選択される複数の遺伝子の組み合わせの移植後試料における遺伝子発現のレベルを決定すること；および
（ｃ）移植後試料における遺伝子の組み合わせの遺伝子発現パターンを対照試料における遺伝子の同一の組み合わせの遺伝子発現のパターンと比較することであって、ここで対照試料発現プロフィールにおける遺伝子の同一の組み合わせの発現パターンと比較して、移植後試料における遺伝子の組み合わせの遺伝子発現パターンの発現パターンにおける類似性は移植片拒絶の等級を示し、それにより対象における移植器官の拒絶の進行を評価すること；
の工程を含む、対象における移植器官の拒絶の進行を評価するための方法。
【請求項１２】
試料が対象から得られた細胞を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
試料が：グラフト生検；血液；血清；および尿からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
拒絶が慢性／硬化性同種移植腎症である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
移植片拒絶の段階が：等級Ｉ；等級II；および等級IIIからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）拒絶を発達させることが分からない移植された対象から得られた試料における複数の遺伝子の組み合わせの遺伝子発現強度をベースライン値として取ること；
（ｂ）移植後の患者から得られた試料における複数の遺伝子の組み合わせに相当する遺伝子発現強度を検出すること；および
（ｃ）第１の値を第２の値と比較することであって、ここで第２の値よりも低いかまたは高い第１の値は移植された対象が拒絶を発達させる危険性を有することを予測し、ここで複数の遺伝子は表２で同定された遺伝子の群から選択される；
の工程を含む、対象における移植片拒絶をモニタリングする方法。
【請求項１７】
（ａ）移植の日にドナー対象から得られた試料からの複数の遺伝子の組み合わせに相当する遺伝子発現のパターンを検出すること；
（ｂ）移植後のレシピエント対象から得られた試料からの複数の遺伝子に相当する遺伝子発現のパターンを検出すること；および
（ｃ）第１の値を第２の値と比較することであって、ここで第２の値よりも低いかまたは高い第１の値はレシピエント対象が拒絶を発達させる危険性を有することを予測し；ここで複数の遺伝子は表２で同定された遺伝子からなる群から選択される；
の工程を含む、対象における移植片拒絶をモニタリングする方法。
【請求項１８】
（ａ）拒絶阻害薬の投与の前に移植された対象から投与前試料を入手すること；
（ｂ）投与前試料における複数の遺伝子の遺伝子発現のパターンを検出すること；
（ｃ）移植された対象から一つまたはそれより多い投与後試料を入手すること；
（ｄ）投与後試料または試料（複数も可）における複数の遺伝子の遺伝子発現のパターンを検出すること；
（ｅ）投与前試料における複数の遺伝子の遺伝子発現のパターンを投与後試料または試料（複数も可）における遺伝子発現のパターンと比較すること；および
（ｆ）それにしたがって薬剤を調整することであって、ここで複数の遺伝子は表２で同定された遺伝子の遺伝子からなる群から選択される；
の工程を含む、対象における移植片拒絶をモニタリングする方法。
【請求項１９】
表２で同定された遺伝子の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の一つもしくはそれより多い遺伝子またはコードされたそれの遺伝子生成物の合成、発現または活性を調整する化合物を対象に投与して少なくとも一つの拒絶の症状を軽減させることを含む、かかる処置を必要とする対象において移植片拒絶を防御、阻止、低減または処置するための方法。
【請求項２０】
表２で同定された遺伝子からなる群から選択される一つもしくはそれより多い遺伝子または遺伝子生成物の遺伝子発現のレベルをモニタリングすることを含む、移植片拒絶の防御、阻止、低減または処置において使用するための薬剤を同定するための方法。
【請求項２１】
移植された対象が腎臓移植された対象である、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子発現のパターンが遺伝子によりコードされるタンパク質の存在を検出することにより評価される、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質に特異的に結合する試薬を使用してタンパク質の存在を検出する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲおよびリアルタイム定量ＰＣＲからなる群から選択される技術により遺伝子発現のパターンが検出される、請求項１７から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
複数の遺伝子の遺伝子発現強度が検出される請求項１７から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
表２で列挙されるような複数の遺伝子の組み合わせまたはその発現産物の移植片拒絶のためのバイオマーカーとしての使用。
【請求項２７】
対象において移植片拒絶を防御または処置するための医薬品の調製のための表２で同定されたような一つもしくはそれより多い遺伝子またはその発現産物の合成、活性の発現、を調整する化合物の使用。
【請求項２８】
移植片拒絶が慢性／硬化性同種移植腎症であり、そして遺伝子は表２で同定された遺伝子からなる群から選択される、請求項１から２７のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項２９】
試料が血液、血清および尿からなる群から選択される、請求項１６から１８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般的にインビトロでの組織試料の分析試験に、そしてさらに特に慢性移植片機能障害、例えば慢性同種移植腎症の臨床診断に有用な遺伝子またはタンパク質ベースの試験に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
慢性移植片機能障害は移植後数ヶ月から数年に固形臓器移植片において、最終的にはグラフト不全を招くグラフト機能の徐々の劣化を表示する現象であり、そしてそれは特徴的な組織学的様相を伴う。臨床的には、腎臓グラフトにおけるにおける慢性移植片機能障害、例えば慢性／硬化性同種移植腎症（「ＣＡＮ」）は、通常タンパク質尿症および動脈性高血圧を併発する糸球体濾過率の緩徐な進行性の低下として現れる。強力な免疫調節薬および生物薬剤の臨床適用にもかかわらず、慢性拒絶は依然一般的で、そして重篤な移植後合併症である。慢性拒絶は執拗に進行する過程である。
【０００３】
特に移植後１か月以内の早期グラフト不全の唯一の最も一般的な原因は同種移植片の免疫学的拒絶である。拒絶の好ましくない影響力は：（ａ）維持免疫抑制時に併用される高用量抗拒絶治療の使用が移植に随伴される罹患率および死亡率の主要な原因である；（ｂ）拒絶グラフトの結果である「大衆」ＨＬＡ特異性に対する免疫はこの患者集団の再移植を困難にする；ならびに（ｃ）不全グラフトを有する免疫されたレシピエントが移植待ちの患者に戻ることにより永続的な器官不足の問題が深刻化する；という事実により拡大される。
【０００４】
生検組織の組織病理学的評価はＣＡＮの診断のための究極の判断基準であるが、ＣＡＮの発症の予測は現在のところ不可能である。現在のモニタリングおよび診断モダリティーは早期段階のＣＡＮの診断に適していない。したがって、さらに鋭敏であり、そして特にその早期および／または前臨床状態で拒絶の臨床診断に使用できる分子同定試験が必要とされている。
【発明の開示】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明はBANFF９７疾患分類（Racusen LC, et al., Kidney Int. ５５（２）：７１３−２３（１９９９））をさらに改良するための、遺伝子発現プロファイリングを使用する分子診断方法に関係する。本発明はまた、グラフト機能障害がその他のより便利な手段により未だ検出されない場合、移植後の早期の時点で適用された場合に予測または早期診断用バイオマーカーとしてバイオマーカーを使用するための方法をも提供する。
【０００６】
したがって本発明は：（ａ）対象から移植後試料を入手すること；（ｂ）表２で同定された遺伝子からなる群から選択される複数の遺伝子の組み合わせの移植後試料における遺伝子発現のレベルを決定すること；（ｃ）移植後試料における少なくとも一つの遺伝子の遺伝子発現強度を、対照試料における同一遺伝子の遺伝子発現強度と比較すること；および（ｄ）少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが対照試料と相対して上方調節されているか、または下方調節されているかを決定することであって、ここで少なくとも一つの遺伝子の上方調節または下方調節は、対象が移植片拒絶を経験する可能性があることを示し、それにより拒絶の発症を評価すること；の工程を含む、対象において移植器官の拒絶の発症を評価するための方法に関係する。
【０００７】
試料は対象から得られた細胞を含む。試料をグラフト生検；血液、血清；および尿からなる群から選択することができる。拒絶は慢性／硬化性同種移植腎症である。試料において上方または下方調節された発現の絶対的な強度は、対照の発現強度と少なくとも約１.１倍、または少なくとも約１.５倍異なる。
【０００８】
別の態様では、本発明は：（ａ）対象から移植後試料を入手すること；（ｂ）表２で同定された遺伝子からなる群から選択される複数の遺伝子の組み合わせの移植後試料における遺伝子発現のレベルを決定すること；および（ｃ）移植後試料における遺伝子の組み合わせの遺伝子発現パターンを、対照試料における遺伝子の同一の組み合わせの遺伝子発現のパターンと比較することであって、ここで対照試料発現プロフィールにおける遺伝子の同一の組み合わせの発現パターンと比較して、移植後試料における遺伝子の組み合わせの遺伝子発現パターンの発現パターンにおける類似性は、対象が移植片拒絶を経験する可能性があることを示し、それにより対象における移植器官の拒絶の発症を評価すること；の工程を含む、対象における移植器官の拒絶の発症を評価するための方法に関係する。
【０００９】
別の態様では、本発明は：（ａ）対象から移植後試料を入手すること；（ｂ）表２で同定された遺伝子からなる群から選択される複数の遺伝子の組み合わせの移植後試料における遺伝子発現のレベルを決定すること；および（ｃ）移植後試料における遺伝子の組み合わせの遺伝子発現パターンを、対照試料における遺伝子の同一の組み合わせの遺伝子発現のパターンと比較することであって、ここで対照試料発現プロフィールにおける遺伝子の同一の組み合わせの発現パターンと比較して、移植後試料における遺伝子の組み合わせの遺伝子発現パターンの発現パターンにおける類似性は移植片拒絶の等級を示し、それにより対象における移植器官の拒絶の進行を評価すること；の工程を含む、対象における移植器官の拒絶の進行を評価するための方法に関係する。移植片拒絶の段階を：等級Ｉ；等級II；および等級III；からなる群から選択することができる。
【００１０】
別の態様では、本発明は：（ａ）拒絶を発達させることが分からない移植された対象から得られた試料における複数の遺伝子の組み合わせの遺伝子発現強度をベースライン値として取ること；（ｂ）移植後の患者から得られた試料における複数の遺伝子の組み合わせに相当する遺伝子発現強度を検出すること；および（ｃ）第１の値を第２の値と比較することであって、ここで第２の値よりも低いかまたは高い第１の値は、移植された対象が拒絶を発達させる危険性を有することを予測し、ここで複数の遺伝子は表２で同定された遺伝子の群から選択される；の工程を含む、対象における移植片拒絶をモニタリングする方法に関係する。
【００１１】
別の態様では、本発明は：（ａ）移植の日にドナー対象から得られた試料からの複数の遺伝子の組み合わせに相当する遺伝子発現のパターンを検出すること；（ｂ）移植後のレシピエント対象から得られた試料からの複数の遺伝子に相当する遺伝子発現のパターンを検出すること；および（ｃ）第１の値を第２の値と比較することであって、ここで第２の値よりも低いかまたは高い第１の値は、レシピエント対象が拒絶を発達させる危険性を有することを予測し；ここで複数の遺伝子は表２で同定された遺伝子からなる群から選択される；の工程を含む、対象における移植片拒絶をモニタリングする方法に関係する。
【００１２】
別の態様では、本発明は：（ａ）拒絶阻害薬の投与の前に移植された対象から投与前試料を入手すること；（ｂ）投与前試料における複数の遺伝子の遺伝子発現のパターンを検出すること；（ｃ）移植された対象から一つまたはそれより多い投与後試料を入手すること；（ｄ）投与後試料または試料（複数も可）における複数の遺伝子の遺伝子発現のパターンを検出すること；（ｅ）投与前試料における複数の遺伝子の遺伝子発現のパターンを投与後試料または試料（複数も可）における遺伝子発現のパターンと比較すること；および（ｆ）それにしたがって薬剤を調整することであって、ここで複数の遺伝子は表２で同定された遺伝子の遺伝子からなる群から選択される；の工程を含む、対象における移植片拒絶をモニタリングする方法に関連する。
【００１３】
別の態様では、本発明は表２で同定された遺伝子の遺伝子からなる群から選択される遺伝子の一つもしくはそれより多い遺伝子またはコードされたそれの遺伝子生成物の合成、発現または活性を調整する化合物を対象に投与して、少なくとも一つの拒絶の症状を軽減させることを含む、かかる処置を必要とする対象において移植片拒絶を防御、阻止、低減または処置するための方法に関係する。
別の態様では、本発明は表２で同定された遺伝子からなる群から選択される一つもしくはそれより多い遺伝子または遺伝子生成物の遺伝子発現のレベルをモニタリングすることを含む、移植片拒絶の防御、阻止、低減または処置において使用するための薬剤を同定するための方法に関係する。
【００１４】
移植された対象は腎臓移植された対象である。遺伝子によりコードされるタンパク質の存在を検出することにより遺伝子発現のパターンを評価することができる。タンパク質に特異的に結合する試薬を使用してタンパク質の存在を検出することができる。ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲおよびリアルタイム定量ＰＣＲからなる群から選択される技術により遺伝子発現のパターンを検出することができる。逆転写ＰＣＲまたはマイクロアレイにより一つの遺伝子または複数の遺伝子の組み合わせの遺伝子発現強度を検出することができる。
【００１５】
別の態様では、本発明は表２で列挙されるような複数の遺伝子の組み合わせまたはその発現産物の使用に関係する。
別の態様では、本発明は対象において移植片拒絶を防御または処置するための医薬品の調製のための、表２で同定されたような一つもしくはそれより多い遺伝子またはその発現産物の合成、活性の発現、を調整する化合物の使用に関係する。
別の態様では、本発明はいずれかの先行の請求項に記載の方法または使用に関係し、ここで移植片拒絶は慢性／硬化性同種移植腎症であり、そして遺伝子は表２で同定された遺伝子からなる群から選択される。
【００１６】
（図面の簡単な説明）
図１は慢性拒絶の観察された等級対予測された等級を比較するＰＬＳのデータにより誘導されたグラフである。
図２は応答並べ替えを用いるＰＬＳにより誘導されたバイオマーカーの予測性能を示すグラフである。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
定義
本発明の理解を促すために、多くの用語および語句を以下に定義する：
「下方調節」または「下方調節された」なる用語は本明細書では互換的に用いられ、そして標的遺伝子または標的タンパク質の量の低下を指す。「下方調節」または「下方調節された」なる用語はまた、標的遺伝子または標的タンパク質を伴う過程またはシグナル伝達カスケードにおける低下をも指す。
【００１８】
「移植」なる用語は本明細書で使用される際には、一つの対象から「移植片」または「グラフト」と称される細胞、組織または器官を採取し、そしてそれまたはそれらを（通常）異なる対象に配する過程を指す。移植片を提供する対象は「ドナー」と称され、そして移植片を受け取る対象は「レシピエント」と称される。同一種の遺伝的に異なる二つの対象間で移植器官またはグラフトは「同種移植片」と称される。異なる種の対象間で移植されたグラフトは「異種移植片」と称される。
「移植片拒絶」なる用語は本明細書で使用される際には、レシピエントにより発現される活性免疫応答のために、そして器官機能障害の非免疫学的原因とは独立して、器官の機能的および構造的劣化として定義される。
【００１９】
「慢性同種移植腎症」「ＣＡＮ」なる用語は本明細書で使用される際には、患者の死亡に関連するもの以外の後期腎同種移植片喪失を指す。それは時間依存的免疫学的および非免疫学的原因からのネフロンへの漸進的な損傷を表す。それは慢性間質性線維症、尿細管萎縮、血管閉塞性変化および糸球体硬化症を伴う進行性の腎機能障害を特徴とする。
【００２０】
「慢性拒絶」なる用語は本明細書で使用される際には、移植後最初の３０−１２０日後に発達する移植器官（例えば腎臓）の拒絶を指す。腎臓では、腎血管の血管内膜の増殖および内膜線維症を伴い、血管の内腔の著明な低下を伴う腎硬化症（ 腎血管の硬化）の発達が発生する。その結果は最終的に腎不全を伴う腎虚血、高血圧、尿細管萎縮、間質性線維症および糸球体萎縮である。確立されたＨＬＡ不適合の影響に加えて、ドナー腎臓の年齢、ネフロン数、および虚血病歴が、移植された患者における究極的な進行性腎不全の原因となり得る。
【００２１】
「対象」なる用語は本明細書で使用される際には、免疫応答を惹起する任意の生存生物を指す。対象なる用語には、限定するものではないがヒト、チンパンジーならびにその他の類人猿およびサル種のような非ヒト霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマのような家畜；イヌおよびネコのような家庭用哺乳動物；マウス、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む実験用動物等が含まれる。用語は特定の年齢または性別を示さない。故に雄性であろうと雌性であろうと、成体および新生対象ならびに胎児にまで及ぶと意図される。
【００２２】
「遺伝子」には、転写および翻訳された後、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる少なくとも一つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドが含まれる。本明細書に記載されるいずれかのポリヌクレオチド配列を用いて、それらが随伴される遺伝子のより大きなフラグメントまたは全長コード化配列を同定することができる。より大きなフラグメント配列を単離する方法は当分野において公知であり、そのいくつかは本明細書に記載されている。
「遺伝子生成物」には遺伝子が転写および翻訳されたときに作成されるアミノ酸（例えばペプチドまたはポリペプチド）が含まれる。
【００２３】
「遺伝子発現強度」なる用語は本明細書で使用される際には、マーカー遺伝子転写物を定量し、そしてこの量を構成的に発現される遺伝子の転写物の量と比較することを指す。「遺伝子発現強度」なる用語は「正規化された、または標準化された遺伝子発現の量」を意味する。例えば細胞における全ての遺伝子の全発現は多様である（すなわち一定ではない）。増加したｍＲＮＡ転写物の検出が有意であるかどうかを正確に評価するために、試料間の発現のレベルを正確に比較するために遺伝子発現を「正規化する」ことが好ましい、すなわちそれは遺伝子発現が比較されるベースレベルである。マイクロアレイ分析を用いて遺伝子転写物の定量を達成し、そして遺伝子発現強度を正常な腎臓機能を有する試料に相対して計算した、すなわち正常からの相対偏差を測定した。
【００２４】
遺伝子に適用されるような「差次的に発現された」なる用語には、遺伝子から転写されたｍＲＮＡまたは遺伝子によりコードされるタンパク質生成物の差次的生成が含まれる。差次的に発現された遺伝子は正常または対照細胞の発現レベルと比較して過剰発現または過少発現され得る。一つの態様では、それには対照試料において検出される発現レベルよりも少なくとも１.１倍、１.２倍、１.３倍、１.４倍、１.５倍、１.６倍、１.７倍、１.８倍、１.９倍、２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍高いまたは低い差次的が含まれる。好ましい実施態様では、発現は対照試料よりも高い。「差次的に発現された」なる用語にはまた対照細胞でサイレントである場合に発現されるか、または対照細胞において発現される場合に発現されない細胞または組織におけるヌクレオチド配列もまた含まれる。とりわけ、この用語は所定の同種移植片の遺伝子発現レベルを指し、そしてベースライン発現レベルに相当する量よりも実質的に多いかまたは少ない量として定義される。本明細書ではベースラインは健常組織における発現のレベルであるとして定義される。健常組織には病理学的知見が含まれない移植器官が含まれる。
【００２５】
「試料」なる用語は本明細書で使用される際には生検から得られた細胞を指す。「試料」なる用語はまた限定するものではないが、気管支肺胞洗浄液の試料、胆汁の試料、胸膜腔内液もしくは腹水、または正常もしくは異常に機能する同種移植片により分泌もしくは排出された任意のその他の液体、または同種移植片を通して、もしくは同種移植片に対して解剖学的に近位の浸出もしくは漏出の結果である任意のその他の液体、または同種移植片と液体で連絡している任意の液体を含む液体試料から得られた細胞をも指す。また液体被験試料を：血液（末梢血を含む）、リンパ液、汗、腹水、胸膜腔内液、気管支肺胞洗浄液、心膜液、胃腸液、胆汁、尿、糞便、組織液もしくは膨化水、関節液、脳脊髄液、または同種移植片に近位の解剖学的部分から集められた、もしくは同種移植片と液体で連絡している流体管から集められた任意のその他の、命名されているかもしくは命名されていない液体；を含む本質的に任意の体液から入手することもできる。「移植後液体被験試料」は移植が実施された後に対象から入手された試料を指す。
【００２６】
逐次的試料を対象から入手することもでき、そして本明細書記載されるような免疫活性化遺伝子バイオマーカーの定量および拒絶の経過を一定期間追跡することができる。この場合、例えばバイオマーカー遺伝子（複数も可）の遺伝子発現のベースライン規模は移植後に採取された移植後試料における遺伝子発現強度である。例えば最初の試料または試料（複数も可）を例えば移植の１週間以内の非拒絶期間内で採取することができ、そしてこれらの試料中のバイオマーカー遺伝子の発現強度を１週間後に採取された試料中の遺伝子の発現強度と比較することができる。一つの実施態様では、試料を移植後２週、４週、８週、１２週、２４週および３６週、またはそれを任意に組み合わせて採取する。
【００２７】
「生検」なる用語は本明細書で使用される際には、診断試験用に生存患者から組織を除去することにより入手された標本を指す。その用語には吸引生検、ブラシ生検、絨毛膜絨毛生検、内視鏡的生検、切除生検、針生検（皮膚または器官の外部表面を貫通し、そして試験すべき下層組織にまで適切な針またはトロカールを通して吸引により除去することにより入手された標本）、開放生検、穿刺生検（穿孔器）、シェーブバイオプシ（shave biopsies）、擦過生検および楔状生検が含まれる。一つの実施態様では、細針吸引生検を用いる。別の実施態様では、ミニコア針生検を用いる。従来の経皮コア針生検を用いることもできる。
【００２８】
「上方調節」または「上方調節された」なる用語は本明細書では互換的に用いられ、そして標的遺伝子または標的タンパク質の増加または上昇を指す。「上方調節」または「上方調節された」なる用語はまた標的遺伝子または標的タンパク質を伴う過程またはシグナル伝達カスケードの増加または上昇をも指す。
【００２９】
「遺伝子クラスター」または「クラスター」なる用語は本明細書で使用される際には、発現パターンに関係する遺伝子の群を指す。換言すると、遺伝子のクラスターはグラフト非拒絶対グラフト拒絶のような異なる条件にわたって類似の調節を有する遺伝子の群である。クラスターにおける各遺伝子に関する発現プロフィールはそのクラスターにおける少なくとも一つのその他の遺伝子の発現プロフィールと相関するはずである。種々の統計的方法を用いて相関を評価することができる。いつもではないが、しばしば遺伝子クラスターのメンバーは類似の遺伝子発現パターンに加えて類似の生物学的機能を有する。
【００３０】
「プローブセット」は本明細書で使用される際には、二つまたはそれより多い遺伝子を検出するために用いることができる核酸の群を指す。検出は例えばＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲにおけるような増幅による、またはマイクロアレイにおけるようなハイブリダイゼーションによる、または一本鎖または二本鎖核酸の選択的酵素分解に基づくアッセイにおけるような選択的破壊および保護によるものでよい。プローブセットにおけるプローブを一つまたはそれより多い蛍光、放射活性またはその他の検出可能な部分（酵素を含む）で標識することができる。プローブは望ましい遺伝子を選択的に検出するために十分に大きければ、任意の大きさでよい。多重ＰＣＲに典型的であるようにプローブセットは溶液でよいか、またはプローブセットをアレイもしくはマイクロアレイにおけるように固体表面に付着させることができる。ＰＮＡのような化合物を核酸の代わりに使用して遺伝子にハイブリダイズさせることができることは周知である。加えてプローブはイノシンのような稀なまたは非天然の核酸を含有することができる。
【００３１】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」なる用語は互換的に用いられ、そして任意の長さのデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドいずれかのヌクレオチドの重合形態またはその類似体を含む。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することができ、そして公知のまたは未知の任意の機能を実施することができる。以下はポリヌクレオチドの非限定例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドはメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体のような修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾を重合体の組み立ての前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド構成成分により中断され得る。重合化の後に標識構成成分との抱合によるように、ポリヌクレオチドをさらに修飾することができる。その用語はまた二本鎖および一本鎖分子の双方をも含む。特記または要求されない場合、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施態様は、二本鎖形態および二本鎖形態を作り上げることが分かっているかまたは予測される２本の相補的一本鎖形態の各々の双方を包含する。
【００３２】
ポリヌクレオチドは四つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡである場合グアニンの代わりにウラシル（Ｕ）；の具体的な配列から構成される。この「ポリヌクレオチド配列」なる用語はポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示を、中央演算処理装置を有するコンピューターでデータベースにインプットし、そして機能的ゲノムおよび相同検索のようなバイオインフォーマティクス適用のために使用することができる。
【００３３】
「ｃＤＮＡ」なる用語には相補的ＤＮＡ、すなわち逆転写酵素のような酵素でｃＤＮＡに作られる細胞または生物に存在するｍＲＮＡ分子が含まれる。「ｃＤＮＡライブラリー」には細胞または生物に存在する、逆転写酵素でｃＤＮＡに変換され、次いで「ベクター」（外来ＤＮＡの添加の後に複製を持続できるその他のＤＮＡ分子）に挿入されるｍＲＮＡ分子の収集物が含まれる。ライブラリーのためのベクターの実例には、バクテリオファージ、細菌に感染するウイルス（例えばラムダファージ）が含まれる。次いでライブラリーを目的の特異的ｃＤＮＡ（およびしたがってｍＲＮＡ）に関してプロービングすることができる。
【００３４】
「プライマー」には、一般的には標的とハイブリダイズすることにより目的の試料に存在する標的または「鋳型」に結合し、その後標的に相補的なポリヌクレオチドの重合化を促進する遊離３’−ＯＨ基を有する短いポリヌクレオチドが含まれる。「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は「上流」および「下流」プライマーからなる「プライマーの対」または「プライマーのセット」、およびＤＮＡポリメラーゼのような重合化の触媒、および典型的には熱安定性ポリメラーゼ酵素を使用して標的ポリヌクレオチドの複製コピーが作成される反応である。ＰＣＲの方法は周知であり、そして例えばMacPherson et al., IRL Press at Oxford University Press（１９９１））にて教示される。ＰＣＲまたは遺伝子クローニングのようなポリヌクレオチドの複製コピーを生成する全ての方法は包括的に本明細書では「複製」と称される。プライマーをサザンまたはノーザンブロット分析のようなハイブリダイゼーション反応におけるプローブとして使用することもできる（例えばSambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning：A Laboratory Manual. ２nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., １９８９参照）。
【００３５】
「ポリペプチド」なる用語には二つまたはそれより多いサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド擬似物質の化合物が含まれる。サブユニットをペプチド結合により連結することができる。別の実施態様では、サブユニットをその他の結合、例えばエステル、エーテル等により連結することができる。本明細書で使用される際には、「アミノ酸」なる用語には天然および／もしくは非天然または合成のいずれかのアミノ酸が含まれ、グリシンおよびＤまたはＬ双方の光学異性体、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド擬似物質が含まれる。三つまたはそれより多いアミノ酸のペプチドは一般的にオリゴペプチドと称される。三つまたはそれより多いアミノ酸よりも大きなペプチド鎖はポリペプチドまたはタンパク質と称される。
【００３６】
「ハイブリダイゼーション」なる用語には、一つまたはそれより多いポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化されている複合体を形成する反応が含まれる。ワトソン−クリック塩基対形成、フーグスティーン結合により、または任意のその他の配列特異的様式で水素結合を生じ得る。複合体にはらせん構造を形成する二本鎖、多重鎖複合体を形成する三本またはそれより多い鎖、１本の自己ハイブリダイズ鎖、または任意のこれらの組み合わせを含まれ得る。ハイブリダイゼーション反応はＰＣＲ反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素切断のようなさらに広範な過程における一工程を構成し得る。
【００３７】
様々な「ストリンジェンシー」の条件下でハイブリダイゼーション反応を実施することができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーには任意の二つの核酸分子が互いにハイブリダイズする困難さが含まれる。ストリンジェント条件下では、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％互いに同一である核酸分子は互いにハイブリダイズし続けるが、一方低いパーセントの同一性を有する分子はハイブリダイズし続けることができない。高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで、５０℃で、好ましくは５５℃で、さらに好ましくは６０℃で、そしてなおさらに好ましくは６５℃で１回またはそれより多い洗浄である。
【００３８】
２本の一本鎖ポリヌクレオチド間で逆平行立体配置でハイブリダイゼーションを生じる場合、反応は「アニーリング」と称され、そしてこれらのポリヌクレオチドは「相補的」として記載される。第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの鎖の一つの間でハイブリダイゼーションを生じ得る場合、二本鎖ポリヌクレオチドは別のポリヌクレオチドに対して「相補的」または「相同的」であり得る。「相補性」および「相同性」（一つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）を、一般的に認められている塩基対形成の規則に従って、互いに水素結合すると予期される、対する鎖における塩基の比率に関して定量化できる。
【００３９】
本明細書で使用される際には、「マーカー」および「バイオマーカー」なる用語は互換的に用いられ、そして器官拒絶の危険性を有さない対象における量または活性に相対して、器官拒絶の危険性を有する対象における量または活性が存在するかまたは調整されている（すなわち増加または減少している）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。バイオマーカーの量または活性における相対変化は拒絶の出現または出現の危険性と相関する。
【００４０】
本明細書で使用される際には、「マーカーのパネル」なる用語はバイオマーカーの群を含み、その各メンバーの量または活性は器官拒絶の出現または出現の危険性と相関する。特定の実施態様では、バイオマーカーのパネルは、器官拒絶の危険性を有する対象における量または活性のいずれかで増加しているこれらのバイオマーカーのみを含み得る。その他の実施態様では、バイオマーカーのパネルは器官拒絶の危険性を有する対象における量または活性のいずれかで低下しているこれらのバイオマーカーのみを含み得る。
【００４１】
選択された用語の略語を以下の表１にまとめる。
【表１】
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【００４２】
移植片拒絶
本発明は拒絶の間、とりわけ慢性拒絶の間に差次的に調節される遺伝子の同定に関する。遺伝子の組み合わせの発現と慢性拒絶の間で高度に統計的に有意な相関性が見出されており、それにより移植片拒絶（例えば慢性腎拒絶）に関する「分子署名」が提供される。拒絶を被る可能性のあるこれらの遺伝子器官の同時発現のために、これらの遺伝子およびその発現産物を、移植片拒絶の危険性を有する患者の管理、予後診断および処置に使用できる。
【００４３】
したがって一つの態様では、本発明は移植片拒絶、とりわけ移植器官の慢性拒絶を示すために、表２で示される遺伝子の組み合わせを含む署名認識を用いることに関係する。
慢性拒絶はおそらく複数の因子：抗体およびリンパ球により引き起こされる。慢性拒絶の最も確実な診断は一般的に問題の器官の生検により成される。慢性拒絶を伴う腎臓は腎臓の実質において線維症（瘢痕化）およびの微細血管に対する損傷を有する。
【００４４】
拒絶の診断をグラフト機能障害のためのその他の病因から区別すること、および有効な治療の設立は：（ａ）拒絶を診断するために最も利用される現在の手段であるグラフトの経皮コア針生検は通常「事実」の後に実施される、すなわちグラフト機能障害およびグラフト損傷（場合によっては非可逆的である）が既に存在する；（ｂ）グラフトの形態学的分析が所定の拒絶エピソードの逆転の可能性に関してささやかな手掛かりおよび再発（「反跳」）の可能性に関してわずかな手掛かりしか提供しない；そして（ｃ）治療計画の設計のための必要条件である拒絶現象の基本メカニズムは拒絶の形態学的様相を含む現在の診断指針によりあまりよく定義されていない；のために困難になっている。
【００４５】
例えば腎同種移植片拒絶の診断は、通常グラフト機能障害の発達（例えば血清クレアチニンの濃度の上昇）および単核細胞浸潤もまた現れるグラフトの部分におけるグラフト傷害の形態学的証拠により行われる。しかしながら拒絶過程の指標としての腎機能異常の使用に対して二つの警告が適用される：第１に、死体腎グラフトの多くは収集およびエキソビボ保存手順からの傷害のために移植直後の期間に急性（可逆性）の腎不全を患うので、腎機能の悪化は拒絶を診断するための臨床上の手掛かりとしていつも利用できるとは限らない。第２に、即座に損なわれていない腎機能が存在する場合であっても、免疫抑制治療自体のような非免疫学的原因のためにグラフト機能障害は発達し得る。
【００４６】
例えばシクロスポリン（ＣｓＡ）腎毒性は一般的な合併症であり、単にＣｓＡの血漿／血液濃度に基づくだけでは容易に同定されない合併症である。ＣｓＡ腎毒性から拒絶を識別することの臨床上の重要性は、その治療計画が正反対であるので強調しすぎることはない：拒絶のための免疫抑制剤の増量および腎毒性のためのＣｓＡ投薬量の低下。
【００４７】
本発明はある程度、多くの異なる遺伝子の発現および／またはコードされるタンパク質の増加または減少が特定のグラフト拒絶状態に関連するという観察に基づく。本明細書に記載されるデータの結果として、同種移植片生検がほんの軽度な細胞浸潤を示す場合であっても、方法は今や迅速でそして信用できる慢性拒絶の診断に利用可能である。同時に差次的に調節される遺伝子の分析が本明細書で初めて記載され、そしてそれは移植片拒絶を正確に検出するための分子署名を提供する。
【００４８】
加えて本発明は部分的に、特定の環境下で実質的に関係した発現プロフィールを有する、しばしば機能的に関係した遺伝子の群である遺伝子クラスターとして遺伝子が発現されるという観察に基づく。したがって本発明はそのメンバーの発現がグラフト拒絶に相関する遺伝子のクラスターを提供する。本発明はさらに適当なマーカー遺伝子の発現を測定するための古典的分子方法および大規模な方法を提供する。
【００４９】
本明細書に記載される方法は特に慢性移植片拒絶を検出するために有用である。最も典型的には対象（すなわち移植片のレシピエント）はヒトのような哺乳動物である。移植器官には任意の移植可能な器官または組織、例えば腎臓、心臓、肺、肝臓、膵臓、骨、骨髄、腸、神経、幹細胞（または幹細胞由来の細胞）、組織構成成分および複合組織が含まれ得る。好ましい実施態様では移植片は腎臓移植片である。
【００５０】
本明細書に記載される方法は抗拒絶治療の有効性を評価するために有用である。かかる方法はマーカー遺伝子の転写物の投与前規模を、同一遺伝子の転写物の投与後規模と比較することを伴い、ここで遺伝子の転写物の投与前規模よりも少ない同一遺伝子の転写物の投与後規模は、抗拒絶治療の有効性を示す。移植片拒絶の防御および／または処置のための任意の候補（例えば薬物、抗体または拒絶もしくは防御のその他の形態）を、候補に暴露する前および後にマーカー発現強度を比較することによりスクリーニングすることができる。加えてこの様式で価値のある情報を集めて、その生物学的材料で評価が実施される対象の将来の臨床管理の決定を補助することができる。マーカー遺伝子の遺伝子発現強度を決定するための本明細書に記載される方法を用いて、対象からの試料を使用して評価を実施することができる。分析はさらに感染病原体の検出を含み得る。
【００５１】
慢性拒絶のバイオマーカー
本発明はある程度、選択された遺伝子が慢性移植片機能障害、例えばＣＡＮにおいて調整されるという発見に基づく。慢性拒絶（ＣＲ）は低悪性度であるが、通常非可逆的であり、そして最終的には最も血管新生化された固形臓器同種移植片の不全を招く同種移植片傷害の進行性形態である。それは罹患することなく長期間生存するための唯一の最も重要な障害である。移植後５年までに、３０−５０％もの心臓、肺、膵臓および腎臓同種移植片レシピエントがそれに罹患する。
【００５２】
増大しつつあるヒト遺伝子配列情報と組み合わされた、高度に平行して自動化されたＤＮＡハイブリダイゼーション技術における進歩により、数千の遺伝子に関する発現レベルを同時に分析することが実現可能になってきている（例えばSchena et al., Science ２７０：４６７−４７０（１９９５）；Lockhart et al., Nature Biotechnology １４：１６７５−１６８０（１９９６）；Blanchard et al., Nature Biotechnology １４：１６４９（１９９６）；Ashbyら、１９９６年１０月２９日発行の米国特許第５５６９５８８号；Perou et al., Nature ４０６：７４７−７５２（２０００）を参照のこと）。遺伝子ごとの定量的ＲＴ−ＰＣＲのような方法は非常に正確であるが、相対的に労働集約的である。定量的ＰＣＲを用いて数千の遺伝子の発現を分析することが可能であるが、尽力および経費は莫大である。代わって大規模分析の実例として、ｍＲＮＡの全集団をｃＤＮＡに変換し、そして１０から１００００またはそれより多い遺伝子のいずれかを示すプローブの規則配列にハイブリダイズさせることができる。これらのプローブの各々にハイブリダイズするｃＤＮＡの相対量は対応する遺伝子の発現レベルの測定値である。次いでデータを統計的に分析して遺伝子発現の情報パターンを表すことができる。実際に、腎同種移植片拒絶の早期診断および新しい予後診断バイオマーカーは免疫抑制を最小化し、そして個別化するために重要である。組織病理学的差次的診断に加えて、遺伝子発現プロファイリングは、「分子署名」を定義することにより疾病分類を有意に改善する。
【００５３】
いくつかの以前の研究は腎臓移植の様々なクラスを識別するためにトランスクリプトーム研究法を適用するのに成功している。しかしながらマイクロアレイプラットフォームの異種性および種々のデータ分析法により、着実なＣＡＮの署名の同定が困難になっている。
【００５４】
この問題に取り組むために、管理された学習アルゴリズム（例えばＰＬＳ）を、安定したグラフト機能を有する患者および種々の等級のＣＡＮを有すると診断された患者からの腎プロトコール生検の遺伝子発現プロフィールに適用した。実施例Ｉに示されるように、この研究によりモデル、例えば様々な等級のＣＡＮを有する組織を正確に予測できるＰＬＳモデルに有用な記述子（すなわち遺伝子マーカー；バイオマーカー）を誘導するために様々なマイクロアレイデータセットから複数の遺伝子発現署名の共通部分が同定された。すなわち、本発明は拒絶の間、とりわけＣＡＮ進行の間に調整される（すなわち上方調節または下方調節される）遺伝子の同定に関する。一つまたはそれより多いバイオマーカー遺伝子の発現とＣＡＮとの間に高度に統計的に有意な相関が見出され、それにより移植片拒絶（例えばＣＡＮ）のための「分子署名」が提供される。これらのバイオマーカー遺伝子およびその発現産物は拒絶を被る可能性のある器官を同定するため、および／または疾患（例えばＣＡＮ）進行の等級を決定するために有用であるので、これらを移植片拒絶の危険性を有する患者の管理、予後診断および処置に使用することができる。
【００５５】
本明細書に開示されたデータにより、実際の臨床状況で、および遺伝子発現の分子操作なしで遺伝子の組み合わせがＣＡＮの指標であることが実証された、一つの実施態様では、組織移植後の分子署名を形成するバイオマーカー遺伝子の組み合わせは表２に示されるものである。表２の第１列はアフィメトリクスプローブセット識別番号を示し、そして第２列は関連遺伝子のUNIGENE識別番号を示す。第３および第４列は遺伝子記号および遺伝子名を表示する。第５列は正常腎機能全体で平均化された遺伝子の未処理発現強度を示し、そして第６−９列は正常、ＣＲ１、ＣＲ２およびＣＲ３条件下の正規化された値を示す。遺伝子をその予測力によるのではなく、アルファベット順に列挙する。
【００５６】
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【００５７】
したがって一つの態様では、本発明は表２で示された一つまたはそれより多い遺伝子を含む署名認識を使用して移植片拒絶、とりわけ移植器官のＣＡＮ拒絶を示すことに関係する。一つの実施態様では、本発明は表２で示された複数の遺伝子の組み合わせを含む署名認識を使用して移植片拒絶、とりわけ移植器官のＣＡＮ拒絶を示すことに関係する。
【００５８】
ＣＡＮの臨床様相
慢性移植片機能障害は移植後数ヶ月から数年に固形臓器移植片において、最終的にはグラフト不全を招くグラフト機能の徐々の劣化を表示する現象であり、そしてそれは特徴的な組織学的様相を伴う。臨床的には、腎臓グラフトにおける慢性同種移植片腎症（すなわちＣＡＮ）は、通常タンパク質尿症および動脈性高血圧を併発する糸球体濾過率の緩徐な進行性の低下として現れる。
【００５９】
全ての実質性同種移植片におけるＣＡＮの主要な組織形態学的様相は線維増殖性動脈内膜炎である。血管病変は動脈全長を斑模様に侵す。線維性の肥厚および小動脈の内膜の特徴的な「タマネギ状」外観に至る同心性筋内膜（myointimal）増殖がある。その他の知見には、内皮膨化、泡沫細胞蓄積、内弾性板の崩壊、硝子変性および内側肥厚、ならびに内皮細胞下Ｔリンパ球およびマクロファージの存在が含まれる（Hruban RH, et al., Am J Pathol １３７（４）：８７１−８２（１９９０））。加えて持続性の限局的血管周囲炎症がしばしば認められる。
【００６０】
血管変化に加えて、ＣＡＮを被る腎臓はまた間質性線維症、尿細管萎縮および糸球体症を示す。毛細管壁の重複および糸球体間質マトリックスの増加である慢性移植片糸球体症はＣＡＮを有する腎臓の高度に特異的な様相として同定されている（Solez K, Clin Transplant.；８（３ Pt ２）：３４５−５０（１９９４））。あまり特異的でない病変は糸球体虚血性虚脱、尿細管萎縮、および間質性線維症である。さらに傍尿細管毛細血管基底膜開裂および積層がグラフト機能の後期低下に関連する（Monga M, et al., Ultrastruct Pathol. １４（３）：２０１−９（１９９０））。腎臓同種移植片におけるＣＡＮの組織学的診断のための基準は腎同種移植片病理学に関するBanff９７スキームにおいて国際標準化されている（Racusen LC, et al., Kidney Int. ５５（２）：７１３−２３（１９９９））；（Kouwenhoven et al., Transpl Int. ２０００；１３（６）：３８５−４０１（２０００）から借用）。表３はＣＡＮに関するBanff９７基準をまとめている（Racusen LC, et al., Kidney Int. ５５（２）：７１３−２３（１９９９））。
【００６１】
表３：慢性同種移植片腎症（ＣＡＮ）の組織病理学的知見の等級
【表１２】
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【００６２】
Banff９７に関して「適切な」標本が１０個またはそれより多い糸球体および少なくとも２個の動脈での生検により定義される。ＣＡＮの過程を理解するために、二つの作業仮説が提示される（Kouwenhoven et al., Transpl Int. ２０００；１３（６）：３８５−４０１（２０００））。第１の、そして恐らく最も重要な一連の危険因子は「同種抗原依存的」、免疫学的または拒絶関連因子の指定の下にひとまとめにされている。これらの中で後期発症および急性拒絶エピソードの数の増加；若年のレシピエント；雄対雌性別不一致；自己免疫性肝炎または胆管疾患の一次診断；免疫抑制ベースラインおよび非コーカサス人種レシピエントは全て慢性拒絶を発達させる危険性の増加に関連している。さらに具体的には（ａ）組織適合性：長期間グラフト生存は、ドナーとレシピエントの間の組織適合性一致のその程度に強く相関すると思われる；（ｂ）急性拒絶：急性拒絶エピソードの発症、頻度および重篤度はＣＡＮの非依存性危険因子である。急性拒絶は最も一貫して同定される、ＣＡＮ発生のための危険因子である；（ｃ）シクロスポリンの維持用量が少なすぎるか非適応性であるために次善的な免疫抑制；および（ｄ）抗ドナー特異的抗体：多くの研究により、移植に続いて大部分の患者が抗体を生成することが示されている。
【００６３】
第２の一連の危険因子は「非同種抗原依存的」または「非免疫学的」危険因子と称され、それは慢性拒絶の発達にも寄与し、高齢のドナー、ドナー器官に既存のアテローム性動脈硬化症、および長い冷阻血時間を含む。虚血のような疾患および傷害に対する非同種免疫応答はＣＡＮを引き起こすかまたは悪化させ得る。さらに具体的には（ａ）糸球体性腎炎のような元来の疾患の再発；（ｂ）移植の外科的傷害の結果；（ｃ）虚血の期間：内膜過形成は虚血の期間と相関する；（ｄ）屍体からの腎臓グラフト対生存血縁および非血縁ドナーからのもの；（ｅ）ウイルス感染：ＣＭＶ感染はＩＣＡＭ−１のような細胞内付着分子に直接的に影響する；（ｆ）高脂質血症；（ｇ）高血圧；（ｈ）年齢；（ｉ）性別：移植片アテローム性動脈硬化症の発症は女性よりも男性において早期であった；（ｊ）人種；ならびに（ｋ）機能的組織の量であるネフロン数の低下および過剰濾過。
【００６４】
ＣＡＮは移植器官の破壊の形態学的証拠を特徴とする。全ての実質器官の一般的な共通因子は内膜過形成の発達である。Ｔ細胞およびマクロファージはＣＤ８＋よりもＣＤ４＋Ｔ細胞が過剰な、主にグラフト侵入細胞型である。付着分子（ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１）およびＭＨＣ抗原の発現増加はＣＡＮを有する同種移植片において認められ、そしてＴＧＦ−βの増加がしばしば見出される。グラフトがＣＡＮを発達させ得る経路の簡潔な記載は以下のとおりである：
【００６５】
虚血、外科的操作および再灌流傷害による内皮細胞活性化
結果的に内皮細胞は酸素フリーラジカルを生成し、そしてそれらは増加した量のサイトカインＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびケモカインＩＬ−８、マクロファージ化学遊走性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質１αおよび１β（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β）、コロニー刺激因子、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）のような複数の成長因子、ならびに組織因子およびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤（ＰＡＩ）のようなプロトロンビン分子を放出する。これらのサイトカインはＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｐ−およびＥ−セレクチンを含む付着分子により、それらが内皮細胞と相互作用する傷害の部位への好中球、単球／マクロファージおよびＴリンパ球の遊走を活性化する。これらの付着分子の発現増加はサイトカインＩＬ−１β、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αにより誘起される。白血球の血管外遊走は、内皮細胞間の透過性を上昇させる、活性化された補体および酸素フリーラジカルにより促進される。
【００６６】
ＣＡＮ診断のための現在の臨床研究法に対する制限
拒絶、例えばＣＡＮの診断をグラフト機能障害のためのその他の病因から区別すること、および有効な治療の設立は：（ａ）拒絶を診断するために最も利用される現在の手段であるグラフトの経皮コア針生検は通常「事実」の後に実施される、すなわちグラフト機能障害およびグラフト損傷（場合によっては非可逆的である）が既に存在する；（ｂ）グラフトの形態学的分析が所定の拒絶エピソードの逆転の可能性に関してささやかな手掛かりおよび再発（「反跳」）の可能性に関してわずかな手掛かりしか提供しない；そして（ｃ）治療計画の設計のための必要条件である拒絶現象の基本メカニズムは拒絶の形態学的様相を含む現在の診断指針によりあまりよく定義されていない；のために複雑な過程である。
【００６７】
例えば腎同種移植片拒絶の診断は、通常グラフト機能障害の発達（例えば血清クレアチニンの濃度の上昇）および単核細胞浸潤もまた現れるグラフトの部分におけるグラフト傷害の形態学的証拠により行われる。しかしながら拒絶過程の指標としての腎機能異常の使用に対して二つの警告が適用される：第１に、死体腎グラフトの多くは収集およびエキソビボ保存手順からの傷害のために移植直後の期間に急性（可逆性）の腎不全を患うので、腎機能の悪化は拒絶を診断するための臨床上の手掛かりとしていつも利用できるとは限らない。第２に、即座に損なわれていない腎機能が存在する場合であっても、免疫抑制治療自体のような非免疫学的原因のためにグラフト機能障害は発達し得る。
【００６８】
例えばシクロスポリン（ＣｓＡ）腎毒性は一般的な合併症であり、単にＣｓＡの血漿／血液濃度に基づくだけでは容易に同定されない合併症である。ＣｓＡ腎毒性から拒絶を識別することの臨床上の重要性は、その治療計画が正反対であるので強調しすぎることはない：拒絶のための免疫抑制剤の増加および腎毒性のためのＣｓＡ投薬量の低下。
【００６９】
本発明はある程度、一つまたはそれより多い遺伝子の発現および／またはコードされるタンパク質の増加または減少が特定のグラフト拒絶状態に関連するという観察に基づく。本明細書に記載されるデータの結果として、同種移植片生検がほんの軽度な細胞浸潤を示す場合であっても、方法は今や迅速でそして信用できる急性および慢性拒絶の診断に利用可能である。同時に調整される（例えば上方調節または下方調節される）遺伝子の分析が本明細書で記載され、そしてそれは移植片拒絶を正確に検出するための分子署名を提供し、そして／または移植片拒絶の重篤度もしくは進行を等級分けする。
【００７０】
本発明はさらに適当なバイオマーカー遺伝子の発現を測定するための古典的分子方法および大規模方法を提供する。本明細書に記載される方法は特に慢性移植片拒絶および好ましくは早期の慢性移植片拒絶を検出するために有用である。一つの実施態様では、慢性移植片拒絶はＣＡＮの結果である。最も典型的には対象（すなわち移植片のレシピエント）はヒトのような哺乳動物である。移植器官には任意の移植可能な器官または組織、例えば腎臓、心臓、肺、肝臓、膵臓、骨、骨髄、腸、神経、幹細胞（または幹細胞由来の細胞）、組織構成成分および複合組織が含まれ得る。好ましい実施態様では移植片は腎臓移植片である。
【００７１】
本明細書に記載される方法は抗拒絶治療の有効性を評価するために有用である。かかる方法はバイオマーカー遺伝子の転写物の投与前規模を、同一遺伝子の転写物の投与後規模と比較することを伴い、ここで遺伝子の転写物の投与前規模よりも少ない同一遺伝子の転写物の投与後規模は、抗拒絶治療の有効性を示す。移植片拒絶の防御および／または処置のための任意の候補（例えば薬物、抗体または拒絶もしくは防御のその他の形態）を、候補に暴露する前および後にバイオマーカー発現強度を比較することによりスクリーニングすることができる。加えてこの様式で価値のある情報を集めて、その生物学的材料で評価が実施される対象の将来の臨床管理の決定を補助することができる。バイオマーカー遺伝子の遺伝子発現強度を決定するための本明細書に記載される方法を用いて、対象からの試料を使用して評価を実施することができる。分析はさらに感染病原体の検出を含み得る。
【００７２】
本発明のバイオマーカーに関連する生物学的経路
本発明のバイオマーカーはＣＡＮにより影響を受ける選択された生物学的経路を同定し、そしてこれらの生物学的経路は固形臓器同種移植片腎症に関連性がある。実際にこの分析により遺伝子クラスターを示し得る選択された生物学的経路のための着実なバイオマーカー署名が表された。かかる生物学的経路には、限定するものではないが例えば「選択された本発明のＣＡＮ関連遺伝子」と題されたセクションにて実施例Ｉで示された生物学的経路が含まれる。
【００７３】
大規模遺伝子発現分析の出現により、遺伝子の群がしばしば協調された様式で一緒に発現されることが表されている。例えば出芽酵母における全ゲノム発現分析により、ジオーキシーシフト（diauxic shift）としても公知の成長条件の変化の間の代謝遺伝子の協調的調節が示された（DiRisi et al., Science ２７８：６８０−６８６（１９９７）；Eisen et al., PNAS ９５：１４８６３−１４８６８（１９９８））。ジオーキシーシフトは、グルコースをエタノールに発酵する酵母細胞が培地中のグルコースを使い果たし、そしてエタノールを代謝し始めるときに生じる。グルコースの存在下では解糖系の遺伝子が発現され、そしてグルコースのエタノールへの発酵を実施する。グルコースが使い果たされたときに、酵母細胞はエタノールを代謝しなければならず、クレブスサイクルおよび呼吸に大いに依存する過程である。
【００７４】
したがって解糖系遺伝子の発現は低下し、そしてクレブスサイクルおよび呼吸遺伝子の発現は協調された様式で増加する。類似の協調的遺伝子調節が種々の癌細胞において見出されている。細胞周期進行およびＤＮＡ合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子はしばしば癌性細胞において協調的に過剰発現される（Ross et al., Nature Genet. ２４：２２７−２３５（２０００）；Perou et al., PNAS ９６：９２１２−９２１７（１９９９）；Perou et al., Nature ４０６：７４７−７５２（２０００））。
【００７５】
遺伝子の協調的調節は機能的な観点から論理的である。たいていの細胞過程は複数の遺伝子を必要とし、例えば：解糖、クレブスサイクル、および細胞周期進行は全て多重遺伝子過程である。したがって機能的に関係する遺伝子の協調的発現は、細胞に種々の細胞活性を実施させるのに必須である。遺伝子のかかる群分けを「遺伝子クラスター」と称することができる（Eisen et al., PNAS ９５：１４８６３−６８（１９９８））。同様にＣＡＮおよび特に慢性拒絶において機能的に関係する遺伝子の協調的発現もまた本発明の範囲内である。
【００７６】
遺伝子発現のクラスター化は機能的な必要性のみならず、転写制御のメカニズムの自然な結果でもある。調節エレメントとも称される、シス作用性ＤＮＡ配列に結合する転写レギュレーターにより遺伝子発現が一次的に調節される。特定の遺伝子に関する発現のパターンはその遺伝子に作用する種々の転写レギュレーターの活性の合計の結果である。したがって類似の一連の調節エレメントを有する遺伝子もまた類似の発現パターンを有し、そして一緒にクラスター化する傾向があろう。もちろん遺伝子が特定の環境下で協調的に発現される異なる調節エレメントを有することも可能であり、そして全く一般的である。
【００７７】
一を超える遺伝子クラスターの分析が移植片拒絶の診断のためのみならず、適切な医学的介入を決定するためにも有用であろうと予想される。例えば慢性同種移植片腎症は多くのバリエーションおよび多くの様々な最適処置計画を有する障害に関する一般的な記載である。一つの実施態様では、本発明は同時にグラフト拒絶を同定し、そして適切な処置を決定するための方法を提供する。一般に本発明は遺伝子クラスターを示し得る、様々な、情報提供するバイオマーカー遺伝子の代表的なものを測定することを含む方法を提供し、それは適切な処置プロトコールを示す。
【００７８】
遺伝子発現の検出
本発明の特定の態様では、対象から入手された一つまたはそれより多いバイオマーカー遺伝子に関して発現強度を決定する。試料はグラフト生検からのような対象から入手された細胞を含み得る。その他の試料には、限定するものではないが血液、血漿、血清、リンパ液、ＣＳＦ、嚢胞液、腹水、尿、糞便および胆汁が含まれる。試料を気管支肺胞洗浄液、胸膜腔内液もしくは腹水、または正常もしくは異常に機能する同種移植片により分泌もしくは排出された任意のその他の液体、または同種移植片を通してもしくは同種移植片に対して解剖学的に近位の浸出もしくは漏出の結果である任意のその他の液体、または同種移植片と液体で連絡している任意の液体から入手することもできる。
【００７９】
遺伝子発現を測定するための多くの様々な方法が当分野において公知である。古典的な方法には、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットおよびリボヌクレアーゼ保護アッセイが含まれる。本明細書に記載される特定の実例ではバイオマーカー遺伝子の発現強度を測定するために競合的逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲが使用される。かかる方法を用いて対象遺伝子および全遺伝子クラスターの発現を試験することができる。しかしながら試験される遺伝子の数が増加するので、時間および経費が重荷になり得る。
【００８０】
大規模検出方法により、より迅速で安い経費の、多くの遺伝子の発現レベルの同時分析が可能になる。かかる方法は典型的には固体基質に取り付けられたプローブの規則配列を伴う。各プローブは異なる一連の核酸にハイブリダイズできる。一つの方法では、目的の種々遺伝子のコード化領域の実質的な部分を増幅または合成することによりプローブを作成する。次いでこれらの遺伝子を固体支持体にスポットする。次いでｍＲＮＡ試料が得られ、ｃＤＮＡに変換され、増幅され、そして（通常蛍光標識で）標識される。次いで標識されたｃＤＮＡをアレイに適用し、そしてｃＤＮＡはその濃度に直線的に関係する様式でその各々のプローブにハイブリダイズする。標識の検出によりアレイに付着した各ｃＤＮＡの量の測定が可能になる。
【００８１】
かかるＤＮＡアレイ実験を実施するための多くの方法が当分野において周知である。方法の実例を以下に記載するが、限定されることを意図するものではない。
マイクロアレイは当分野において公知であり、そして順々に遺伝子生成物（例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド）に対応するプローブが公知の位置で結合する表面からなる。一つの実施態様ではマイクロアレイは、その中での各位置が遺伝子によりコードされる生成物（例えばタンパク質またはＲＮＡ）に関して別個の結合部位を示し、そしてその中での結合部位が生物のゲノムにおける遺伝子のほとんどまたはほぼ全ての生成物に関して存在するアレイ（すなわちマトリックス）である。好ましい実施態様では「結合部位」（本明細書では以後「部位」）は、特定の同族ｃＤＮＡが特異的にハイブリダイズできる核酸または核酸誘導体である。結合部位の核酸または誘導体は例えば合成オリゴマー、全長ｃＤＮＡ、全長未満のｃＤＮＡ、または遺伝子フラグメントでよい。
【００８２】
通常マイクロアレイは少なくとも１００個およびさらに好ましくは５００個、１０００個、４０００個またはそれを超える遺伝子に相当する結合部位を有するであろう。特定の実施態様では、最も好ましいアレイは示された特定の生物の約９８−１００％の遺伝子を有するであろう。その他の実施態様では、より少ない、具体的に選択された遺伝子に相当する結合部位を有する特化されたマイクロアレイを使用することができる。特定の実施態様では、特化されたマイクロアレイは４０００個より少ない、１０００個より少ない、２００個より少ない、または５０個より少ない遺伝子に関する結合部位を含み、そして表２のいずれかのバイオマーカーの少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、４個、５個、またはそれより多い遺伝子に関する結合部位を含む。好ましくは、マイクロアレイは目的の生物学的ネットワークモデルの試験および確認に関連性のある遺伝子に関する結合部位を有する。
【００８３】
マイクロアレイに接触させる核酸を種々の方式で調製することができる。全およびポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製するための方法が周知であり、そして一般的にはSambrook et al., supraに記載されている。標識ｃＤＮＡはオリゴｄＴ−プライミングまたはランダムプライミング逆転写によりｍＲＮＡから調製され、その双方は当分野において周知である（例えばKlug and Berger, Methods Enzymol. １５２：３１６−３２５（１９８７）参照）。検出可能な標識に抱合されたｄＮＴＰ、最も好ましくは蛍光標識ｄＮＴＰの存在下で逆転写を実施することができる。これに代えて単離されたｍＲＮＡを、標識ｄＮＴＰの存在下で二本鎖ｃＤＮＡのインビトロ転写により合成される標識アンチセンスＲＮＡに変換することができる（Lockhart et al., Nature Biotech. １４：１６７５（１９９６））。ｃＤＮＡまたはＲＮＡを検出可能な標識の不在下で合成することができ、そして続いて例えばビオチン化ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰの組み込み、またはいくつかの類似の手段により標識し（例えばビオチンのソラレン誘導体をＲＮＡに対して光架橋する）、続いて標識ストレプトアビジン（例えばフィコエリトリン抱合ストレプトアビジン）またはその均等物を添加することができる。
【００８４】
蛍光標識を使用する場合、フルオレセイン、リサミン、フィコエリスリン、ローダミン（Perkin Elmer Cetus）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３.５、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、Ｃｙ７、FluorX（Amersham）およびその他（例えばKricka, Academic Press San Diego, Calif.（１９９２）参照）を含む多くの適当なフルオロフォアが公知である。
別の実施態様では、蛍光標識以外の標識が使用される。例えば放射性標識、または区別される発光スペクトルを有する放射性標識の対を使用することができる（Zhao et al., Gene １５６：２０７（１９９５）；Pietu et al., Genome Res. ６：４９２（１９９６）を参照のこと）。しかしながら放射性同位元素はあまり好ましくない実施態様である。
【００８５】
標識核酸の集団がマトリックスに取り付けられた適切な相補的核酸に特異的にハイブリダイズするように核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を選ぶ。本明細書使用される際には、より短いポリヌクレオチドが２５塩基以下である場合に、標準的な塩基対形成規則を用いて誤対合がないとき、またはより短いポリヌクレオチドが２５塩基よりも長い場合に、５％しか誤対合がないとき、一つのポリヌクレオチド配列は別のものに相補的であると考えられる。
【００８６】
最適なハイブリダイゼーション条件は長さ（例えばオリゴマー対２００塩基より大きいポリヌクレオチド）および標識核酸の型（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ）および固定化ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに依存するであろう。核酸に関する特異的（すなわちストリンジェント）ハイブリダイゼーション条件に関する一般的なパラメーターはSambrook et al., supra、およびAusubel et al., １９８７, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley−Interscience, New York（その全てを全目的に関して出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。標識核酸のアレイに対する非特異的結合を、大量の非特異的ＤＮＡでアレイを処理する、いわゆる「遮断」工程により低下させることができる。
【００８７】
蛍光標識プローブを使用する場合、転写物アレイの各部位での蛍光発光を、好ましくは走査型共焦点レーザー顕微鏡により検出することができる。二つのフルオロフォアを使用する場合、使用した二つのフルオロフォアの各々に関して適切な励起ラインを用いる別個のスキャンを実施する。これに代えて、二つのフルオロフォアに特異的な波長で標本の同時照明を可能にするレーザーを使用でき、そして二つのフルオロフォアからの発光を同時に分析できる（Shalon et al., Genome Research ６：６３９−６４５（１９９６）を参照のこと）。好ましい実施態様では、コンピューター制御Ｘ−Ｙステージおよび顕微鏡対物を有するレーザー蛍光スキャナでアレイをスキャンする。マルチライン混合ガスレーザーで二つのフルオロフォアの逐次的励起が達成され、そして発光された光を波長により分割し、そして二つの光電子増倍管で検出する。蛍光レーザー走査装置はSchena et al., Genome Res. ６：６３９−６４５（１９９６）および本明細書に引用されたその他の文献に記載されている。これに代えてFerguson et al., Nature Biotech. １４：１６８１−１６８４（１９９６）に記載される光ファイバー束を使用して、多くの部位で同時にｍＲＮＡ存在量レベルをモニタリングすることができる。蛍光マイクロアレイスキャナはAffymetrix、Packard BioChip Technologies、BioRobotics および多くのその他の供給者から市販により入手可能である。
【００８８】
種々のコンピューターソフトウェアを使用してシグナルを記録、定量化および分析する。一つの実施態様では、グラフィックプログラム（例えばHijaak Graphics Suite）を用いてスキャンされた画像をスペックル除去し、そして次に各部位で各波長での平均ハイブリダイゼーションのスプレッドシートを創成する画像グリッド化プログラムを用いて分析する。必要により、二つの蛍光に関するチャンネル間の「クロストーク」（またはオーバーラップ）に関して実験的に決定された補正を行うことができる。転写物アレイ上の任意のハイブリダイゼーション部位に関して二つのフルオロフォアの発光の比率を計算するのが好ましい。比率は同族遺伝子の絶対的な発現レベルに非依存的であるが、その発現が薬物投与、遺伝子欠失または任意のその他の試験される事象により有意に調整される遺伝子に関して有用である。
【００８９】
一つの実施態様では、二つの異なって標識されたｃＤＮＡのセットの混合物をマイクロアレイにハイブリダイズさせることにより、目的の細胞の転写状態を反映する転写物アレイを作成する。一つの細胞は目的の細胞であるが、他方の細胞は標準化対照として使用される。次いで各細胞のｃＤＮＡのマイクロアレイへの相対的ハイブリダイゼーションは二つの細胞における各遺伝子の相対的発現を反映する。
【００９０】
様々な試料および条件におけるバイオマーカーの発現レベルを種々の統計的方法を用いて比較することができる。様々な遺伝子の発現パターンにおける関連性の程度を評価するために種々の統計的方法が利用可能である。統計的方法を関係する二つの部分に分けることができる：一つまたはそれより多い遺伝子の発現パターンの関係性を決定するための数的指標、および適当な数的指標に基づいた発現データを体系化し、そして分類するためのクラスタリング方法（Sherlock, Curr. Opin. Immunol. １２：２０１−２０５（２０００）；Butte et al., Pacific Symposium on Biocomputing, Hawaii, World Scientific, p.４１８−２９（２０００））。
【００９１】
一つの実施態様では、ＰＬＳのような管理された学習方法を用い、そして予測モデリングの手段としてニューラルネットワーク（ＮＮ）、サポートベクトルマシン（ＳＶＰ、またはｋ−最近傍（ＫＮＮ）のようなその他の管理された学習アルゴリズムを用いることができる。実施例Ｉに詳記されるように、本発明のバイオマーカーはＣＡＮ（例えば選択された等級のＣＡＮ）を有する組織を分類するためにＰＬＳモデルにおける記述子として有用である。
別の実施態様では、ピアソン相関、ユークリッド距離測定、エントロピー計算（Butte et al. ２０００, supra）、凝集型クラスタリング法、分割型クラスタリング法および自己組織化マップ（ＳＯＭ）のような管理されていない方法を用いる。
【００９２】
別の態様では、本発明はプローブセットを提供する。好ましいプローブセットは一つまたはそれより多い遺伝子の発現を検出し、そしてグラフトの状態についての情報を提供するように設計されている。本発明の好ましいプローブセットは表２のいずれかのバイオマーカー遺伝子に属する少なくとも二つの遺伝子を検出するために有用であるプローブを含む。本発明のプローブセットは１００００個だけの遺伝子転写物の検出のために有用なプローブを含み、そして好ましいプローブセットは４０００個より少ない、１０００個より少ない、２００個より少ない、１００個より少ない、９０個より少ない、８０個より少ない、７０個より少ない、６０個より少ない、５０個より少ない、４０個より少ない、３０個より少ない、２０個より少ない、１０個より少ない遺伝子転写物の検出のために有用なプローブを含むであろう。本発明のプローブセットは移植片状態についての情報を有する遺伝子転写物の検出に標的化されている。本発明のプローブセットはまた移植片状態についての情報を有さない遺伝子転写物を検出する多数または少数のプローブをも含み得る。好ましい実施態様では、本発明のプローブセットを固体基質に取り付けてプローブのアレイを形成する。プローブセットは多重ＰＣＲにも有用であり得ると予想される。プローブセットのプローブは核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的に修飾された形態）もしくはＰＮＡ、または望ましい核酸配列と特異的に相互作用することができる任意のその他の重合性化合物でよい。
【００９３】
本発明のバイオマーカー（複数も可）を含むコンピューター可読媒体もまた提供される。本明細書で使用される際には「コンピューター可読媒体」にはコンピューターにより直接読み取られ、そしてアクセスされ得る媒体が含まれる。かかる媒体には、限定するものではないが；フロッピーディスクのような磁気記憶媒体、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ；ＣＤ−ＲＯＭのような光学式記憶媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭのような電気的記憶媒体；ならびに磁気／光学式記憶媒体のようなこれらのカテゴリーのハイブリッドが含まれる。いずれかの現在公知のコンピューター可読媒体をどのように使用して、本発明のバイオマーカーがそこに記録されているコンピューター可読媒体を含む製品を創成することができるかは、当業者には容易に理解されよう。
【００９４】
本明細書で使用される際には「記録された」には、コンピューター可読媒体に情報を保存するための過程が含まれる。本発明のバイオマーカーを含む製品を作成するためにコンピューター可読媒体の情報を記録するために、当業者はいずれかの現在公知の方法を容易に採用することができる。
【００９５】
種々のデータ処理プログラムおよびフォーマットを用いて本発明のバイオマーカー情報をコンピューター可読媒体に保存することができる。例えばバイオマーカーに相当する核酸配列をWordPerfectおよびMicroSoft Wordのような市販により入手可能なソフトウェアでフォーマットされた文書処理テキストファイルで表すか、またはＤＢ２、Sybase、Oracle等のようなデータベースアプリケーションに保存されたＡＳＣIIファイルの形態で表すことができる。本発明のバイオマーカーがそこに記録されているコンピューター可読媒体を得るために、かなり多数のデータ処理構成フォーマット（例えばテキストファイルまたはデータベース）を適合させることができる。
【００９６】
コンピューター可読形態で本発明のバイオマーカーを提供することにより、種々の目的のためにバイオマーカー配列情報に日常的にアクセスすることができる。例えば当業者は、標的配列または標的構造モチーフをデータ記憶手段に保存された配列情報と比較するために、コンピューター可読形態の本発明のヌクレオチドまたは核酸配列を使用することができる。検索手段を用いて特定の標的配列または標的モチーフと一致する本発明の配列のフラグメントまたは領域を同定する。
【００９７】
本発明にはまた本発明のバイオマーカー（複数も可）を含むアレイも含まれる。アレイを用いてアレイの一つまたはそれより多い遺伝子の発現を検定することができる。一つの実施態様では、アレイを用いて、アレイの遺伝子の組織特異性を解明するために、組織における遺伝子発現を検定することができる。この様式で約８６００個までの遺伝子を発現に関して同時に検定することができる。これにより一つまたはそれより多い組織において特異的に発現される一連の遺伝子を示すプロフィールを開発することが可能になる。
【００９８】
かかる定性的決定に加えて、本発明により遺伝子発現の定量化が可能になる。故に組織特異性のみならず、組織における一連の遺伝子の発現のレベルもまた解明可能である。故にその組織発現そのものおよびその組織における発現のレベルに基づいて遺伝子を群分けすることができる。これは例えば組織間または内で遺伝子発現の関係性を解明するのに有用である。故に一つの組織を混乱させることができ、そして第２の組織における遺伝子発現に及ぼす影響を決定することができる。この局面では、生物学的刺激に応答して一つの細胞型が別の細胞型に及ぼす影響を決定することができる。かかる決定は例えば遺伝子発現のレベルで細胞−細胞相互作用の影響を知るために有用である。薬剤が治療的に投与されて一つの細胞型を処置するが、別の細胞型に望ましくない影響を有する場合、本発明は望ましくない影響の分子基盤を決定するためのアッセイを提供し、そして故に反対に作用する薬剤を同時投与するか、またはそうでなければ望ましくない影響を処置する機会を提供する。同様に単一の細胞型内でさえ、分子レベルで望ましくない生物学的影響を決定することができる。故に標的遺伝子以外の発現に及ぼす薬剤の影響を解明し、そして反対に作用させることができる。
【００９９】
別の実施態様では、アレイを用いてアレイにおける一つまたはそれより多い遺伝子の発現の時間経過をモニタリングすることができる。これは本明細書に開示されるように、種々の生物学的局面において、例えば発達および分化、疾患進行、細胞形質転換および老化のようなインビトロ過程、例えば痛みおよび食欲のような自律神経のおよび神経学的過程、ならびに学習または記憶のような認知機能で起こり得る。
【０１００】
アレイはまた同一の細胞または異なる細胞において、遺伝子の発現の別の遺伝子の発現に及ぼす影響を解明するためにも有用である。例えばこれは究極のまたは下流の標的を調節できない場合の治療的介入のための代替え分子標的の選択を提供する。
アレイはまた正常および疾患細胞において一つまたはそれより多い遺伝子の差次的発現パターンを解明するためにも有用である。これは診断または治療的介入のための分子標的として供され得る一連の遺伝子を提供する。
【０１０１】
タンパク質
特定のタンパク質のレベル増加により移植片についての診断情報もまた提供され得るということがさらに予想される。特定の実施態様では、表２の遺伝子によりコードされる一つまたはそれより多いタンパク質を検出することができ、そしてタンパク質レベルの上昇または低下を用いてグラフト拒絶を診断することができる。好ましい実施態様では、移植後液体試料中のタンパク質レベルを検出し、そして特に好ましい実施態様では、液体試料は末梢血または尿である。別の好ましい実施態様では、タンパク質レベルはグラフト生検において検出される。
本明細書を鑑みて、タンパク質を検出するための方法は当分野において周知である。かかる方法の実例にはウェスタンブロッティング、酵素結合検疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、一次元および二次元電気泳動、質量分析および酵素活性の検出が挙げられる。適当な抗体にはポリクローナル、モノクローナル、フラグメント（例えばＦａｂフラグメント）、一本鎖抗体および特異的結合分子のその他の形態が含まれ得る。
【０１０２】
予見医学
本発明は診断アッセイ、予後診断アッセイ、遺伝薬理学および臨床試験のモニタリングが予後診断（予測）目的で用いられ、それにより対象を予防的に診断および処置する予見医学の分野に関係する。したがって本発明の一つの態様は試料（例えば血液、血清、細胞、組織）からバイオマーカータンパク質および／または核酸発現を決定し、それにより対象が移植片を拒絶する可能性があるかどうかを決定するための診断アッセイに関する。
【０１０３】
本発明の別の態様は、以下のセクションでさらに詳記されるような臨床試験でバイオマーカーの発現または活性に及ぼす薬剤（例えば薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関係する。
試料中の本発明のバイオマーカータンパク質または遺伝子の存在または不在を検出するための方法の実例は、被験対象から試料を入手すること、および試料中のバイオマーカータンパク質または核酸の存在が検出されるように、タンパク質またはバイオマーカータンパク質をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出できる化合物または薬剤と試料を接触させることを伴う。本発明のバイオマーカー遺伝子またはタンパク質に相当するｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための好ましい薬剤は、本発明のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズできる標識された核酸プローブである。本発明の診断アッセイにおける使用に適当なプローブは本明細書に記載される。
【０１０４】
バイオマーカータンパク質を検出するための好ましい薬剤はバイオマーカータンパク質に結合できる抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体はポリクローナルまたはさらに好ましくはモノクローナルである。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を使用することができる。プローブまたは抗体に関して「標識された」なる用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリング（すなわち物理的連結）させることによるプローブまたは抗体の直接標識、および直接標識された別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含することが意図される。間接標識の実例には、蛍光標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出できるような、ＤＮＡプローブのビオチンでの末端標識が挙げられる。「試料」なる用語には、対象ならびに対象内に存在する組織、細胞および液体から単離された組織、細胞および生物学的液体が含まれると意図される。すなわち本発明の検出方法を使用して、試料中のバイオマーカーｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡをインビトロおよびインビボで検出することができる。例えばバイオマーカーｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術には、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが含まれる。バイオマーカータンパク質の検出のためのインビトロ技術には、酵素結合検疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈殿および免疫蛍光が含まれる。バイオマーカーゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術にはサザンハイブリダイゼーションが含まれる。さらに、バイオマーカータンパク質の検出のためのインビボ技術には、対象に標識された抗バイオマーカー抗体を導入することが含まれる。例えば対象におけるその存在および位置を標準的な撮像技術により検出することができる放射性バイオマーカーで抗体を標識することができる。
【０１０５】
一つの実施態様では、試料は被験対象からのタンパク質分子を含有する。これに代えて、試料は被験対象からのｍＲＮＡ分子または被験対象からのゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。好ましい試料は対象から従来の手段により単離された血清試料である。
方法はさらに対照対象から対照試料（例えば移植されていない健常腎臓から、または拒絶の徴候を示さない移植された健常腎臓からの生検）を入手すること、バイオマーカータンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が試料中で検出されるように、バイオマーカータンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出できる化合物または薬剤と対照試料を接触させること、および対照試料中のバイオマーカータンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、被験試料中のバイオマーカータンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較することを伴う。
【０１０６】
本発明はまた試料中のバイオマーカーの存在を検出するためのキットをも包含する。例えばキットは試料中のバイオマーカータンパク質またはｍＲＮＡを検出できる標識された化合物または薬剤；試料中のバイオマーカーの量を決定するための手段；および試料中のバイオマーカーの量を標準と比較するための手段を含むことができる。化合物または薬剤を適当な容器に包装することができる。キットはさらに、キットを使用してバイオマーカータンパク質または核酸を検出するための説明書を含むことができる。
【０１０７】
さらに本明細書に記載される診断方法を利用してバイオマーカー発現または活性異常に関連する疾患または障害を有するか、またはそれを発達される危険性を有する対象を同定することができる。本明細書で使用される際には、「異常」なる用語には野生型バイオマーカー発現または活性から逸脱するバイオマーカー発現または活性が含まれる。発現または活性異常には、発現または活性の増加または減少、および野生型発達の発現のパターンまたは細胞内の発現のパターンに追随しない発現または活性が含まれる。例えばバイオマーカー発現または活性異常には、バイオマーカー遺伝子における変異がバイオマーカー遺伝子の過少発現または過剰発現を引き起こす場合、およびかかる変異が非機能的バイオマーカータンパク質または野生型の様式では機能しないタンパク質、例えばバイオマーカーリガンドと相互作用しないタンパク質または非バイオマーカータンパク質リガンドと相互作用するタンパク質を導く状況が含まれると意図される。
【０１０８】
さらに本明細書で記載される予後診断アッセイを用いて、対象に薬剤（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド擬似物質、タンパク質、ペプチド、核酸、小型分子、またはその他の薬物候補）を投与して拒絶の危険性、例えばシクロスポリンを低減させることができるかどうかを決定することができる。故に本発明は、表２の遺伝子の組み合わせの遺伝子発現または活性の増加に関連する障害のための薬剤で対象を有効に処置できるかどうかを決定するための方法を提供する。
【０１０９】
遺伝子の発現または活性に及ぼす薬剤（例えば薬物）の影響のモニタリングを基本的な薬物スクリーニングのみならず臨床試験にも適用できる。例えば本明細書に記載されるようなスクリーニングアッセイにより遺伝子発現、タンパク質レベルを増加させるかまたは活性を上方調節すると決定された薬剤の有効性を、分子署名および薬剤での処置の間の分子署名の任意の変化を試験することにより提示する対象の臨床試験においてモニタリングすることができる。
【０１１０】
例えば、そして限定するものではないが、遺伝子活性を調整する薬剤（例えば化合物、薬物または小型分子）での処置により細胞内で調整される遺伝子およびそのコードされるタンパク質を同定することができる。臨床試験では、細胞を単離し、そしてｍＲＮＡを調製し、そして拒絶に関連する意味づけられた遺伝子の発現のレベルに関して分析することができる。本明細書に記載されるようなノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲにより、またはこれに代えて本明細書に記載されるような方法の一つにより、生成されたタンパク質の量を測定することにより遺伝子発現のレベル（例えば遺伝子発現パターン）を定量することができる。この方式では遺伝子発現パターンを、細胞の薬剤に対する生理学的応答の指標である分子署名として供することができる。したがって対象の薬剤での処置の前およびその間の種々の時点でこの応答状態を決定することができる。
【０１１１】
好ましい実施態様では、本発明は（ｉ）薬剤の投与の前に対象から投与前試料を入手すること；（ｉｉ）投与前試料中の遺伝子または遺伝子の組み合わせの発現、遺伝子、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡによりコードされるタンパク質のレベルを検出すること；（ｉｉｉ）対象から一つまたはそれより多い投与後試料を入手すること；（ｉｖ）投与後試料中のバイオマーカータンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出すること；（ｖ）投与前試料中のバイオマーカータンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、投与後試料または試料（複数も可）中の遺伝子または遺伝子の組み合わせ、遺伝子、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡによりコードされるタンパク質と比較すること；および（ｖｉ）したがって対象に対する薬剤の投与を改変すること；の工程を含む薬剤（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド擬似物質、タンパク質、ペプチド、核酸、小型分子、または本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにより同定されるその他の薬物候補）での対象の処置の有効性をモニタリングするための方法を提供する。例えば遺伝子の発現または活性をより低いレベルまで低下させるために、すなわち移植片拒絶に対して保護するために薬剤の有効性を増大させるためには、薬剤の投与の増加が望ましいかもしれない。これに代えて、バイオマーカーの発現または活性を検出されたものよりも低いレベルまで低下させる、すなわち、例えば毒性を回避するために、薬剤の有効性を低下させるためには、薬剤の投与の減少が望ましいかもしれない。かかる実施態様にしたがって、たとえ観察可能な表現型の応答がない場合でも、遺伝子発現または活性を薬剤の有効性の指標として使用することができる。
【０１１２】
本発明は移植片拒絶を防御するための予防的および治療的双方の方法を提供する。処置の予防的および治療的の双方の方法に関して、薬理ゲノミクスの分野から得られた知識に基づいてかかる処置を具体的にあつらえるか、または修飾することができる。本明細書で使用される際には、「薬理ゲノミクス」には遺伝子シークエンシング、統計遺伝学、および遺伝子発現分析のようなゲノミクステクノロジーの、臨床開発中および市販されている薬物への適用が含まれる。さらに具体的には、その用語は対象の遺伝子がそのヒトの薬物に対する応答性（例えば対象の「薬物応答性表現型」または「薬物応答性遺伝子型」）をどのように決定するかの研究を指す。故に本発明の別の態様はその対象の薬物応答性遺伝子型にしたがって、本発明のバイオマーカー分子またはバイオマーカーモジュレーターのいずれかでの対象の予防的または治療的処置をあつらえるための方法を提供する。薬理ゲノミクスにより臨床医または医師が、処置から最も利益を被るであろう対象に予防的または治療的処置を標的化し、そして毒性の薬物関連副作用を経験するであろう対象の処置を回避することが可能になる。
【０１１３】
一つの態様では本発明は、対象にバイオマーカー発現を調整する化合物または薬剤を投与することによりバイオマーカー発現または活性の増加に関連する対象における移植片拒絶を防御するための方法を提供する。かかる化合物または薬剤の実例は、例えば移植に使用されるもののような、免疫抑制特性を有する化合物または薬剤（例えばカルシニューリン阻害剤、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えばラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３、バイオリムス−７またはバイオリムス−９）；免疫抑制特性を有するアスコマイシン（例えばＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１等）；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプレン；メトトレキサート；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸または塩；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスペルグアリンまたはその免疫抑制性相同体、類似体または誘導体；ＰＫＣ阻害剤（例えば第ＷＯ０２／３８５６１号または第ＷＯ０３／８２８５９号に開示されるようなもの、実施例５６または７０の化合物）；ＪＡＫ３キナーゼ阻害剤（例えばＮ−ベンジル−３,４−ジヒドロキシ−ベンジリデン−シアノアセトアミドａ−シアノ−（３,４−ジヒドロキシ）−］Ｎ−ベンジルシンナムアミド（チルホスチンＡＧ４９０）、プロジギオシン２５−Ｃ（ＰＮＵ１５６８０４）、［４−（４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６,７−ジメトキシキナゾリン］（ＷＨＩ−Ｐ１３１）、［４−（３’−ブロモ−４’−ヒドロキシルフェニル）−アミノ−６,７−ジメトキシキナゾリン］（ＷＨＩ−Ｐ１５４）、［４−（３’,５’−ジブロモ−４’−ヒドロキシルフェニル）−アミノ−６,７−ジメトキシキナゾリン］ＷＨＩ−Ｐ９７、ＫＲＸ−２１１、遊離形態または薬学的に許容される塩形態、例えば一クエン酸塩（ＣＰ−６９０５５０とも称される）の３−｛（３Ｒ,４Ｒ）−４−メチル−３−［メチル−（７Ｈ−ピロロ［２,３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−アミノ］−ピペリジン−１−イル｝−３−オキソ−プロピオニトリル、または第ＷＯ０４／０５２３５９号もしくは第ＷＯ０５／０６６１５６号にて開示されるような化合物）；Ｓ１Ｐ受容体アゴニストまたはモジュレーター（例えばＦＴＹ７２０、場合によってはリン酸化されているか、またはそれの類似体、例えば２−アミノ−２−［４−（３−ベンジルオキシフェニルチオ）−２−クロロフェニル］エチル−１,３−プロパンジオール、場合によってはリン酸化されているかまたは１−｛４−［１−（４−シクロヘキシル−３−トリフルオロメチル−ベンジルオキシイミノ）−エチル］−２−エチル−ベンジル｝−アゼチジン−３−カルボン酸またはその薬学的に許容される塩）；免疫抑制性モノクローナル抗体（例えば白血球受容体に対するモノクローナル抗体、例えばＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはそのリガンド）；その他の免疫調整化合物（例えばＣＴＬＡ４またはその変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部を有する組換え結合分子、例えば非ＣＴＬＡ４タンパク質配列に結合したＣＴＬＡ４またはその変異体の少なくとも細胞外部分、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ（例えばＡＴＣＣ６８６２９と指定されたもの）またはその変異体、例えばＬＥＡ２９Ｙ）；付着分子阻害剤（例えばＬＦＡ−１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ−１または−３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４アンタゴニストまたはＶＬＡ−４アンタゴニスト）である。これらの化合物または薬剤を組み合わせて使用することもできる。
【０１１４】
本発明の別の態様は治療目的のためにバイオマーカータンパク質発現または活性を調整する方法に関係する。したがって実例的な実施態様では、本発明の調整方法は、細胞を細胞に関連するバイオマーカータンパク質活性の一つまたはそれより多い活性を調整するバイオマーカータンパク質または薬剤と接触させることを伴う。バイオマーカータンパク質活性を調整する薬剤は、核酸もしくはタンパク質のような本明細書に記載されるような薬剤、バイオマーカータンパク質の天然発生標的分子（例えばバイオマーカータンパク質基質）、バイオマーカータンパク質抗体、バイオマーカータンパク質アゴニストもしくはアンタゴニスト、バイオマーカータンパク質アゴニストもしくはアンタゴニストのペプチド擬似物質、またはその他の小型分子でよい。一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれより多いバイオマーカータンパク質活性を刺激する。かかる刺激剤の実例には活性バイオマーカータンパク質および細胞に導入されているバイオマーカータンパク質をコードする核酸分子が挙げられる。別の実施態様では、薬剤は一つまたはそれより多いバイオマーカータンパク質活性を阻止する。かかる阻害剤の実例にはアンチセンスバイオマーカータンパク質核酸分子、抗バイオマーカータンパク質抗体およびバイオマーカータンパク質阻害剤が挙げられる。これらの調整方法をインビトロで（例えば細胞を薬剤と共に培養することにより）またはこれに代えてインビボで（例えば薬剤を対象に投与することにより）実施することができる。このように本発明は、バイオマーカータンパク質または核酸分子の発現または活性異常を特徴とする疾患または障害に苦しむ対象を処置する方法を提供する。一つの実施態様では、方法は薬剤（例えば本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにより同定された薬剤）またはバイオマーカータンパク質発現もしくは活性を調整する（例えば上方調節または下方調節する）薬剤の組み合わせを投与することを伴う。別の実施態様では、方法は、バイオマーカータンパク質または核酸分子を治療として投与して、バイオマーカータンパク質発現または活性の低下または異常を補うことを伴う。バイオマーカータンパク質が異常に下方調節され、そして／またはバイオマーカータンパク質活性の増大が有利な効果を有する可能性がある状況では、バイオマーカータンパク質活性の刺激が望ましい。例えばバイオマーカーが下方調節され、そして／またはバイオマーカータンパク質活性の増大が有利な効果を有する可能性がある状況では、バイオマーカータンパク質活性の刺激が望ましい。同様にバイオマーカータンパク質が異常に上方調節され、そして／またはバイオマーカータンパク質活性の低下が有利な効果を有する可能性がある状況では、バイオマーカータンパク質活性の阻止が望ましい。
【０１１５】
本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにより同定されるような、本発明のバイオマーカータンパク質および核酸分子、ならびにバイオマーカータンパク質活性（例えばバイオマーカー遺伝子発現）に刺激または阻止効果を有する薬剤またはモジュレーターを対象に投与して、バイオマーカータンパク質活性異常に関連するバイオマーカー関連障害（例えば前立腺癌）を処置（予防的または治療的）することができる。かかる処置に併せて薬理ゲノミクス（すなわち対象の遺伝子型と外来性化合物または薬物に対するその対象の応答との間の関係の研究）を考慮することができる。治療薬の代謝における差異は、用量と薬理学的に活性な薬物の血中濃度との間の関係を改変することにより重篤な毒性または治療の失敗を招き得る。故に医師または臨床医は、バイオマーカー分子またはバイオマーカーモジュレーターを投与するかどうかを決定すること、ならびにバイオマーカー分子またはバイオマーカーモジュレーターでの投薬量および／または処置の治療計画をあつらえることにおいて、適切な薬理ゲノミクス研究で得られた知識を適用することを考慮できる。
【０１１６】
「ゲノムワイド関連解析」として公知の薬物応答を予測する遺伝子の同定に対する一つの薬理ゲノミクス研究法は、既知の遺伝子関連バイオマーカー（例えばその各々が２個のバリアントを有する、ヒトゲノム上の６００００−１０００００個の多型性または可変部位からなる「２対立遺伝子の」遺伝子バイオマーカー地図）からなるヒトゲノムの高分解能地図に一次的に依存する。かかる高分解能遺伝子地図を、特定の観察された薬物応答または副作用に関連するバイオマーカーを同定するための第II／III相薬物試験に参加している統計的に有意な数の対象の各々のゲノムの地図と比較することができる。これに代えて、ヒトゲノムにおけるおよそ１０００万個の公知の単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）の組み合わせからかかる高分解能地図を作成することができる。本明細書で使用される際には「ＳＮＰ」は、一続きのＤＮＡにおける単一のヌクレオチド塩基において生じる共通の改変である。例えばＳＮＰはＤＮＡ１０００塩基毎に１回生じ得る。ＳＮＰは疾患過程に関与し得るが、大部分は疾患関連ではないかもしれない。かかるＳＮＰの発生に基づいた遺伝子地図が得られると、その対象ゲノムの特定のＳＮＰパターンに依存して、対象を遺伝子カテゴリーに群分けすることができる。かかる様式では、遺伝的に類似する対象間で共通し得る形質を考慮して、処置計画をかかる遺伝的に類似する対象の群にあつらえることができる。
【０１１７】
これに代えて「候補遺伝子研究法」と称される方法を利用して、薬物応答を予測する遺伝子を同定することができる。この方法にしたがって、薬物標的をコードする遺伝子が公知である場合（例えば本発明のバイオマーカータンパク質）、集団においてその遺伝子の全ての共通するバリアントをかなり容易に同定することができ、そして別のものに対比してその遺伝子の一つのバージョンを有することが特定の薬物応答に関連するかどうかを決定することができる。
【０１１８】
一を超える前記の薬理ゲノミクス研究法から作成された情報を用いて、対象の予防的または治療的処置に適切な投薬量および処置計画を決定することができる。この知識は、投与または薬物選択に適用される場合、逆反応または治療の失敗を回避させ、そして故に本明細書に記載されるスクリーニングアッセイの実例の一つにより同定されるモジュレーターのようなバイオマーカー分子またはバイオマーカーモジュレーターで対象を処置する場合に治療的または予防的有効性を強化することができる。
【０１１９】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、それは限定として解釈されるべきではない。本明細書全体にわたって引用された全ての参照文献、特許および公開された特許出願の内容は出典明示により本明細書の一部とする。
【実施例】
【０１２０】
実施例
実施例１：  慢性／硬化性同種移植片腎症の指標であるバイオマーカーの同定
本発明の研究の序文および目的
生検組織の組織病理学的評価は慢性腎同種移植片腎症（ＣＡＮ）の診断の究極の判断基準であるが、ＣＡＮの発症の予測は現在不可能である。遺伝子発現プロファイリングのような分子診断法はBANFF９７疾患分類（Racusen LC, et al., Kidney Int. ５５（２）：７１３−２３（１９９９））のさらなる改良を補助でき、そしてまた移植後の早い時点に適用された場合、その他の手段によりグラフト機能障害が依然検出できない場合に、予測または早期診断バイオマーカーとして用いられ得る。本研究では遺伝子発現プロファイリングを腎移植患者からの腎プロトコール生検から抽出された生検ＲＮＡに適用した。具体的には、腎移植患者の腎臓生検から誘導されたｍＲＮＡ発現レベルに基づいて、慢性／硬化性同種移植片腎症のゲノムバイオマーカーを同定することによりＣＡＮの検出／診断が可能になる。
【０１２１】
患者の層別化
２カ所の臨床センターの腎移植患者からの腎臓生検試料を使用した；このバイオマーカー分析のためにセンター「Ａ」は全部で７１個の試料を提供し、そしてセンター「Ｂ」は全部で３２個の試料を提供した。慢性／硬化性同種移植片腎症（ＣＡＮ）の様々な等級にわたる試料分布を以下の表４に示す。
【０１２２】
表４：２カ所の臨床センターから採用された様々な等級のＣＡＮを有する試料の数
【表１３】
2010524427.tif 000014
【０１２３】
全部で１０３個の試料を用いることができ、そのうち６５個の試料はＣＡＮの徴候を呈さず、以下では「正常」と称され、そして３８個の試料は様々な等級のＣＡＮのものであった。センターＡでは等級IIを有する試料は１個のみであり、そして等級IIIを有する試料はなかったことに留意することは重要である。
【０１２４】
１.２  試料の加工
この研究で使用された腎臓生検試料は、急性および慢性同種移植片拒絶の症状を有する患者からの腎臓生検ならびに調査の時点で正常な腎機能を有する、すなわち急性または慢性拒絶の徴候のない移植患者からの腎臓生検試料を提供するいくつかの臨床センターから収集した。
【０１２５】
腎臓生検試料はBanff９７診断基準にしたがって臨床センターの病理学者により試験され、そして判断される。腎臓生検の病理学的知見のコピーおよび個体群統計データ、病歴ならびにその他の臨床パラメーターをデータベースに保存した。
以下の詳記されるように臨床センターでｍＲＮＡを抽出した。Affymetrix Ｕ１３３ Plus ２マイクロアレイでのハイブリダイゼーションにより遺伝子発現パターンに関して抽出されたｍＲＮＡ試料を分析した。１カ所のセンターからの全試料を一つのバッチで分析した。ＭＡＳ５正規化転写レベルを臨床データと一緒にデータベースに保存する。
【０１２６】
１.３  ＲＮＡ抽出および精製
チオシアン酸グアニジンフェノール−クロロホルム抽出（Trizol、Invitrogen Life Technologies）により各凍結組織切片から全ＲＮＡを入手し、そして次にアフィニティー樹脂（RNeasy, Qiagen）で製造者の説明書にしたがって全ＲＮＡを精製し、そして定量した。吸光度λ＝２６０ｎｍ（Ａ２６０ｎｍ）での吸光度により全ＲＮＡを定量し、そしてＡ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ比率により純度を推定した。非変性アガロースゲル電気泳動によりＲＮＡ分子の完全性を確認した。およそ−８０℃でＲＮＡを分析まで保存した。
【０１２７】
１.４  GeneChip実験
全てのＤＮＡマイクロアレイ実験をGenomics Factory EU（Basel, Switzerland）でGeneChip システム（Affymetrix, Inc., San Diego, CA, USA）の製造者の説明書にしたがって、および以前に記載されたように（Lockhart DJ, et al., Nat Biotechnol. １４（１３）：１６７５−８０（１９９６））行った。
【０１２８】
Trizol（Invitrogen Life Technologies, San Diego, CA, USA）を使用してイソチオシアン酸グアニジンフェノール−クロロホルム抽出により（Chomczynski P, et al., Anal Biochem １６２（１）：１５６−９（１９８７））全ＲＮＡをスナップ凍結した腎臓生検試料から入手し、そしてアフィニティー樹脂カラム（RNeasy；Qiagen, Hilden, Germany）で製造者の説明書にしたがって精製した。全ＲＮＡをＴ７基盤のポリメラーゼプロトコール（Affymetrix, GeneChip（登録商標）Expression ３’−Amplification Reagents Two−CycleｃＤＮＡSynthesis Kit）で増幅した。５４０００個を超えるプローブセットを含み、３５０００個を超える転写物および２８０００個を超える十分に立証されたヒト遺伝子からのバリアントを分析するヒトＨＧ  １３３  plus２標的アレイ［Affymetrix］を使用した。腎臓生検あたり１個のGeneChipを使用した。得られた画像ファイル（．ｄａｔファイル）をMicroarray Analysis Suite ５（ＭＡＳ５）ソフトウェア（Affymetrix）を使用して処理した。シグナル強度（Signal）およびカテゴリー発現レベル測定値（Absolute Call）に関するデータを含有するタブ区切りファイルが得られた。１５０の「標的強度」を使用して未処理データを発現レベルに変換した。電子データベースにアップロードする前に品質に関してデータを検査した。
【０１２９】
１.４.１  データ分析
Silicon GeneticsソフトウェアパッケージGeneSpringバージョン８.１を用いて、ＳＩＭＣＡ−Ｐ＋（バージョン１１.０）でUmetrics AB（Sweden）によりデータ分析を実施した。ＭＡＳ５変換されたトランスクリプトームデータを各センターの正常試料の中央値に関して別個に正規化した。（GeneSpringバージョン８.１）。全試料の２５％を超えて存在または限界のフラグを示すプローブセットが分析に含められ、そして１８’１４９プローブセットのスタートセットを生じた。
【０１３０】
数的変化および生物学的情報の組み合わせであるこれらのデータの情報内容を、種々のデータベースおよび科学的文献と比較することにより評価した。いくつかのデータベース、例えばPubMed（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）、NIH David（http：／／david.niaid.nih.gov）、Affymetrix（https：／／www.affymetrix.com）および内部データベースを用いてデータセットの生物学的妥当性を調べた。
【０１３１】
１.４.２  予測モデリングおよびバリデーション技術
正規化された発現の値を対数変換し、そしてパレート基準化した（Pareto scaled）。部分最小二乗法を管理された学習アルゴリズムとして用いた。
課題が慢性拒絶の等級のような変数の予測であり、そして予測因子の遺伝子セットのような非常に多くの相関する予測因子が存在する場合、部分最小二乗法（ＰＬＳ）は最適な方法の一つである。恐らくそれは多重共線性および実測よりも非常に多くの数の変数が存在する場合、予測のための最良の統計研究法の一つである。
【０１３２】
ＰＬＳ回帰の目標は、応答変数Ｙのセットを予測因子変数Ｘのセットに関連付けしたい状況で次元縮小法を提供することである。ＰＬＳはｔｈとｕｈとの間の共分散を最大にする直交Ｘ成分ｔｈ＝Ｘｗｈ＊およびＹ成分ｕｈ＝Ｙｃｈを同定する。それはＸおよびＹの主成分分析とＸおよびＹの正準相関分析との間の妥協である。実測よりも多くのさらなる予測因子（ｃＤＮＡクローン）が存在するために、正準相関分析または多変数回帰を直接適用できないということに留意されたい。加えてマイクロアレイデータで実測された高度な多重共線性により、たとえ発現レベルのサブセットが選択されたとしても、多変数回帰および正準分析の性能不良が引き起こされる。対照的に、マイクロアレイデータの場合と同様に、実測よりも多くのさらなる予測因子変数が存在する場合でさえ、ＰＬＳ方法論を適用することができる（Perez−Enciso１ M, et al., Human Genetics １１２（５−６）：５８１−９２（２００３））。ＰＬＳ−ＤＡの特定の事例が、ＹがＸのカテゴリー変数のカテゴリーを記載する２値変数のセットであるＰＬＳ回帰である；すなわち数値従属性、または応答、変数がカテゴリーの数と一致する。代替えの識別法がNguyenb and Rocke（Nguyen DV, et al., Bioinformatics １８：３９−５０（２００２））に見出される。各応答変数ｙｋに関して、Ｘ成分に関する回帰モデルを記す：
【数１】
2010524427.tif 000015
式中、ｗｈ＊はｋ番目の成分の各々の元来の変数に与えられた重みを含有するｐ次元ベクトルであり、そしてｃｈはｈ番目のＸ成分変数におけるｙｋの回帰係数である。Wold et al.（Wold et al., 「ＰＬＳ法により解決される化学における多変量検量法問題」Ruhe A, Kagstrom B（eds）Proc Conf Matrix Pencils. Springer, Heidelberg, pp ２８６−２９３（１９８３））により開発された、欠測値を考慮に入れるアルゴリズムを使用した。意味のある解を生じるためのＰＬＳに関する基本的要件は、特徴抽出とも称されるいくつかの予備的な変数選択である。これは各変数に関するＶＩＰ（変数重要度パラメーター）に基づいて変数を選択することにより達成された。ＶＩＰはＰＬＳ文献においてよく用いられる測定であり、そして変数ｊに関して：
【数２】
2010524427.tif 000016
（（Eriksson L, et al., Umetrics, Umea（１９９９）；（Tenenhaus M, La regression ＰＬＳ. ０Editions Technip, Paris（１９９８））各ｊ番目に関して予測因子変数ｊ＝１、ｐ、ここでＲ２（ａ，ｂ）はベクトルａおよびｂにおける項目間の相関の２乗を表し、そしてｔｈ＝Ｘｈ−１ｗｈ、ここでＸｈ−１は成分ｔ１，．．．ｔｈ−１におけるＸの回帰の残差行列であり、そしてｗｈはノルム１のベクトルである（ＰＬＳ回帰アルゴリズムではｔｈはこの正規化制約を受けて構築される））として定義される。
【数３】
2010524427.tif 000017
は各変数ｊのｈ番目のＰＬＳ成分に対する貢献を測定することに留意されたい。故にＶＩＰｊはモデルの２乗総和に相対して、全成分およびカテゴリー応答（Ｙで２を超えるカテゴリーに関して）にわたって合計された各変数の応答に及ぼす影響を定量化し；これによりＶＩＰが各ｃＤＮＡクローンの全体的な効果の測定を直感的に喚起することには留意されたい。ＶＩＰはまた：
【数４】
2010524427.tif 000018
の特性をも有する。
【０１３３】
この作業では、１８’１４９個全ての変数（ｃＤＮＡレベル）で第１の分析を実施し、そして各変数に関してＶＩＰを評価した。続いて、ＶＩＰ＞１.８を有する変数のみを選択し、そして第２の最終分析に含めた。最初に利用可能な多数の変数（ｃＤＮＡクローン）のためにこの厳密な基準を設定した。新しい成分がＱ２基準を満足した場合、ＰＬＳ成分の数を選択した；すなわち
【数５】
2010524427.tif 000019
ここで、ＰＲＥＳＳｈはｈ成分を含有するモデルの予測２乗和であり、そしてＲＥＳＳｈ−１はｈ−１成分を含有するモデルの残差２乗和である。ＰＲＥＳＳはクロスバリデーションによりコンピューター計算され；
【数６】
2010524427.tif 000020
ｙｈ−１，ｉはｈ−１成分が適合する場合、実測ｉの残差であり、そして
【数７】
2010524427.tif 000021
はｉ番目の実測が除かれる場合に得られる予測ｙｉである。新しい実測の予測は
【数８】
2010524427.tif 000022
（ここでｘｉは新しい実測ｉに関する変数レコードを含有するベクトルである）として簡単に得られる。モデルバリデーションを応答並べ替えにより実施した。並べ替え検定はその柔軟性および増大しつつあるコンピューター力により、ここ数年非常によく用いられるようになってきたコンピューター利用手順の一部である（Good PI,  Permutation tests：a practical guide to resampling methods for testing hypotheses. Springer, New York,（２０００））。その原理は非常に簡単で、所定の試料の統計値Ｔの有意性を検定したいとしよう。応答ベクトル（Ｙ）はＮ回並べ替えられ、そして並べ替えセットの各々に関するＴｉ、ｉ＝１、Ｎを計算する。ヌル仮説の下でＴの分布はＴｉ値のセットで近似される；例えば５％有意性閾値は０.０５×Ｎ全Ｔｉの最大値になろう。ここで応答ベクトル（Ｙ）を２００回並べ替え、そして分析をやり直して、Ｑ２およびＲ２をプロットし、ここで
【数９】
2010524427.tif 000023
そしてＲ２はモデルにより説明される２乗総和の部分である。Ｑ２はモデルの予測能力の測定値であるが、Ｒ２はモデルの適合の良好性に関係する。ＳＩＭＣＡ−Ｐソフトウェアバージョン１１.０（Eriksson L, et al., Umetrics, Umea（１９９９））で分析を行った。
【０１３４】
結果
特徴抽出により、前記した基準のＶＩＰ＞１.８を通過した１６４個のプローブセットを生じた。これらの１６４個のプローブセットにより構築された予測モデルの結果を図１に表示し、ここではモデル予測を臨床で観察された疾患状態、すなわち正常およびＣＲ１−ＣＲ３に対してプロットする。
【０１３５】
図１はモデルにより予測されるような慢性拒絶の等級対、病理学者により評価されるような慢性拒絶の実際の等級を示す。２カ所の異なるセンター（ＡおよびＢ）から得られたデータは異なる記号により暗号化されている。実線は回帰直線を示し、点線は９６％信頼限界に相当し、そして破線は９５％予測区間を示す。慢性拒絶の予測等級と実際の等級の間には良好な相関性が存在する。
【０１３６】
【表１４】
2010524427.tif 000024
【０１３７】
モデルは三つの有意な成分からなる（表４参照）。モデルの予測力はクロスバリデーションに基づいてＱ２（ｃｕｍ）＝０.６５９である。
図２は応答並べ替えによるバリデーションの結果を表示する。水平軸は無作為に並べ替えられた応答と比較した真の応答の類似の測定値（すなわち相関係数）を示す。垂直軸はそれぞれの並べ替えられた応答で得られた計算されたＲ２−およびＱ２−値を示す。Ｒ２はモデルにより説明される２乗総和の部分であり（モデルの適合の良好性）、そしてＱ２はモデルの予測能力の測定値である。モデルの適合の良好性は最適というわけではない；切片はＲ２＝０.３９であり、そして基準値０.４をわずかに下回る。しかしながら、Ｑ２−切片が−０.０１であることに示されるようにモデルの予測能力は優れている。
分子署名を形成し、そして慢性同種移植片拒絶の予測を可能にする予測因子遺伝子の組み合わせを表２に示す。
【０１３８】
【表１５】
2010524427.tif 000025
【表１６】
2010524427.tif 000026
【表１７】
2010524427.tif 000027
【表１８】
2010524427.tif 000028
【表１９】
2010524427.tif 000029
【表２０】
2010524427.tif 000030
【表２１】
2010524427.tif 000031
【表２２】
2010524427.tif 000032
【表２３】
2010524427.tif 000033
【表２４】
2010524427.tif 000034
【０１３９】
ＣＡＮ関連遺伝子の選択
１６４個の遺伝子プローブおよび関連遺伝子の大多数は同種移植片拒絶において観察される進行中の免疫および炎症性応答の間に生じる主要な生物学的事象を反映する。遺伝子の実例には、限定するものではないがプラスミノーゲン、ジアミンオキシダーゼ、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９、セリンプロテアーゼ阻害剤、およびｋｕｎｔｚ２型からなる群から選択される遺伝子の組み合わせが挙げられる。遺伝子の別のセットには、限定するものではないがＨ１９、ＳＡＬ様１、Ｊｕｎ  Ｄ癌原遺伝子、線維芽細胞成長因子受容体２、プロラクチン受容体、アポリポタンパク質Ｍ（ＡＰＯＭ）およびペルオキシソーム増殖活性化受容体、ガンマ、コアクチベーター１、アルファ（ＰＰＡＲＧＣ1Ａ）からなる群から選択される遺伝子の組み合わせが含まれる。遺伝子の別のセットには、限定するものではないがキナーゼアンカータンパク質１２（ＡＫＡＰ１２）、コラーゲンＶＩ型（Ｃｏｌ６Ａ１）、６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２,６−ビホスファターゼ３（ＰＦＫＦＢ３）、ＴＧＦ−ベータ１、インスリン様成長因子２、網膜芽細胞腫結合タンパク質８、ホメオボックスＤ１３、アグマチンウレオヒドロラーゼ、アルブミン、ペプチダーゼＤ、微小管関連タンパク質タウ、チオレドキシンドメイン含有４（ＴＸＮＤＣ４）、デルタ−ノッチ様ＥＧＦ反復含有膜貫通（ＤＮＥＲ）、コネクション（connexion）３１.９、ジカルボニル／Ｌ−キシルロースリダクターゼ、コンドロイチンベータ、４Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＣｈＧｎ）、Ｍａｌ  Ｔ細胞分化タンパク質２（ＭＡＬ２）、アシル−ＣｏＡシンテターゼ長鎖ファミリーメンバー４（ＡＳＣＬ４）、ＡＤＡＭ１７、スプライシング因子プロリン／グルタミンリッチ（ポリピリミジントラクト結合タンパク質関連（ＳＦＰＱ）、フィラミンＣ、ガンマ（アクチン結合タンパク質２８０（ＦＬＮＣ）、プロミニン１（ＰＲＯＭ１）、ＰＬＳＣＲ１、トリオースリン酸イソメラーゼ１（ＴＰＩ１）、ＳＣＣＯ4Ｃ１、ＨＴＡＴＩＰ２、ＰＲＫＣ、アポトーシス、ＷＴ１、レギュレーター（ＰＡＷＲ）からなる群から選択される遺伝子の組み合わせが含まれる。遺伝子の別のセットには、限定するものではないがアタキシン７、アルファ−アミノ−ベータ−カルボキシムコナート−イプシロン−セミアルデヒドデカルボキシラーゼ（ＡＣＭＳＤ）、ＡＣＯＸ２、ＡＤＡＭ１７、ＡＧＸＴ２、ＡＬＡＤ、ＡＬＡＳ２、ＡＬＤＨ７Ａ１、ＡＳＢＦ１、ＢＨＭＴ２、ＣＣＬ２８、ＣＨＤＨ、ＣＫＡＰ２、ＣＰＶＬ、ＤＣＸＲ、ＤＰＰ４、ＥＣＨＤＣ３、ＥＨＦ、ＥＰＨＸ２、ＦＫＢＰ１１、ＦＭ０４、ＦＫＢＰ１、ＦＵＴ３、ＧＡＳ５、ＨＡＧＨ、ＨＣＣＲ１、ＨＰＮヘプシン、ＩＮＳＬ３、ＩＱＧＡＰ１、ＫＣＮＪ１５、ＫＩＦ１３Ｂ、ＬＲＰ２、ＰＤＺＫ１、ＰＬＤ１、ＰＮＰＮ、ＲＴＫＮ、ＳＬＣ７Ａ９、ＳＬＰＪ、ＴＨＥＭ２からなる群から選択される遺伝子の組み合わせが含まれる。前記の列挙された遺伝子の任意の組み合わせもまた本発明の範囲内である。
【０１４０】
ＰＬＧ：プラスミノーゲン−プラスミン経路
プラスミノーゲン−プラスミン系は動脈新生内膜形成およびアテローム硬化性動脈瘤形成の間の細胞遊走およびマトリックス分解に意味づけられる。プラスミンタンパク質分解はエラスチン分解、マクロファージ浸潤、中膜リモデリング、平滑筋細胞遊走および新生内膜の形成を媒介することにより同種移植片動脈硬化症において主要な役割を果たす。プラスミノーゲン−プラスミン系は腎線維症の局面で有利なまたは有害な潜在的影響を有する。プラスミノーゲン−プラスミン系における重要な酵素前駆体であるプラスミノーゲンは実験的間質性線維症からマウスを保護せず、そして有意な病原的影響を有し得る。腎線維症の生物学における最近の研究は、腎線維症に及ぼすプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１（ＰＡＩ−１）、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）およびウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）のようなタンパク質の影響はプラスミンの作成から別個に生じるということを意味している。
【０１４１】
ＤＡＯ：ジアミンオキシダーゼ−ＯＤＣ経路
ジアミンオキシダーゼ（ＤＡＯ）はペルオキシソーム酵素Ｄ−アミノ酸オキシダーゼをコードする。酵素はその補欠分子族としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を使用するフラボタンパク質である。かつてはヒスタミナーゼと称されたＤＡＯは種々の組織で見出されるが、特に腸粘膜において活性である。その機能は細胞増殖に必須の物質であるいくつかのポリアミンの酸化的脱アミノ化である。故にＤＡＯは骨髄および腸粘膜のような急速に増殖する組織おける調節酵素である。基礎およびヘパリン処理ＤＡＯレベルの測定は小腸移植後の潜在的関連性を有する。小腸グラフトの拒絶は粘膜損傷に至り、それは考え得るところではＤＡＯ活性の変化に至り得る。
【０１４２】
ＣＸＣＬ９：ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド９、ＭＩＧに関与する経路
ケモカインは移植器官への白血球補充において、ならびに組織内の白血球局在化および特定のケモカインまたはケモカイン受容体の拮抗作用において重要な役割を果たすことが示されており、同種移植片拒絶の間に上方調節されるとして同定されており、白血球のグラフトへの浸潤を遅延させ、そしてグラフト生存を延長させることが示されている。ＣＸＣＬ５およびＣＣＬ２の発現はＴ細胞浸潤とは独立することが見出されたが、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＸＣＬ１およびＣＣＬ１のグラフト内発現は明らかにＴ細胞依存性であり、そして移植後経時的に有意に増加した。
【０１４３】
ＩＦＮ−ガンマ（ＭＩＧ）（ＣＸＣＬ９）およびＩＦＮ−ガンマ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）（ＣＸＣＬ１０）により誘起されるケモカインモノカインは腎移植における急性拒絶の早期マーカーである。ＭＩＧは併発感染または腎機能の機能不全に関するその他の原因には関係しなかった。結論としては、尿ＭＩＧは急性拒絶に対する非常に鋭敏で、そして特異的な予測因子として提供され、抗拒絶治療に対する応答を映し出し、そして故に改善された長期間の腎同種移植片生存に寄与し得る。
【０１４４】
ＭＩＧは閉塞性細気管支炎症候群（ＢＯＳ）に意味づけられており、最終的には気道線維症／閉塞に移行する持続性の細気管支周囲炎症を特徴とする。急性の拒絶はＢＯＳの発達の主な危険因子であり、そして血管周囲／気管支白血球浸潤を特徴とする。これらの白血球が補充される具体的なメカニズムは明らかにされていない。ＣＸＣケモカイン（ＩＦＮ−ガンマ誘起モノカイン（ＭＩＧ）／ＣＸＣケモカインリガンド（ＣＸＣＬ）９、ＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０およびＩＦＮ誘導Ｔ細胞アルファ化学遊走物質（ＩＴＡＣ）／ＣＸＣＬ１１）はその共有する受容体ＣＸＣＲ３を通して作用する。それらは強力な白血球化学遊走物質であり、そしてその他の炎症／線維増殖性疾患に関与するので、同種免疫応答の間のこれらのケモカインの発現は単核細胞の持続性の補充を促進して慢性肺拒絶を導き得る。ヒト気管支肺胞洗浄液中のＭＩＧ／ＣＸＣＬ９、ＩＦＮ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）／ＣＸＣＬ１０およびＩＴＡＣ／ＣＸＣＬ１１のレベル上昇は急性から慢性拒絶への連続に関連した。
【０１４５】
ＳＰＩＮＴ２：セリンプロテアーゼ阻害剤、クニッツ型、２（ＨＡＩ２）、ビクニン
ビクニンは、シュウ酸カルシウム結晶化の阻止、増殖の調節および発癌の調整を含む種々の過程において役割を果たすことが示されているプロテアーゼ阻害剤である。ビクニンは尿路結石、増殖および発癌において役割を有すると考えられる。ビクニンの二つの形態、ＨＡＩ−１およびＨＡＩ−２は正常な腎臓およびＲＣＣ細胞に現れる。ＨＡＩ−１およびＨＡＩ−２は腎尿細管上皮細胞において発現された。二つのＨＡＩの発現はＲＣＣにおいて有意に下方調節されたが、ＨＧＦＡ発現は疾患腎臓において増強され、これはＨＡＩとＨＧＦＡを含むその標的プロテイナーゼとの間の不均衡を示唆しており、ＲＣＣではプロテイナーゼ活性が優位である。
【０１４６】
Ｈ１９、刷り込み母性発現された未翻訳ｍＲＮＡ
Ｈ１９は癌、例えば乳癌、上咽頭癌、慢性骨髄増殖性障害、肝芽腫、膀胱癌、腎臓癌および副腎皮質腫瘍の病変形成および成長調節機能障害において重要な役割を果たす。
【０１４７】
ＳＡＬＬ１：ＳＡＬ様１
ＳＡＬＬ１は異質染色質への局在により基準のＷｎｔシグナリングを増強する。Ｓａｌｌ１は腎臓発達において必須の役割を有する。ＳＡＬＬ１はショウジョウバエ領域特異的ホメオティック遺伝子ｓｐａｌｔ（ｓａｌ）の哺乳動物相同体であり、そしてヒトのＳＡＬＬ１におけるヘテロ接合性変異はタウンズ−ブロックス（Townes−Brocks）症候群に至る。腎臓発達において必須のジンクフィンガー核因子であるＳａｌｌ１を強く発現する細胞（Ｓａｌｌ１−ＧＦＰ（高）細胞）はコロニーを形成し、そしてその上それらは器官培養設定で三次元腎臓構造を再構成する。
【０１４８】
ＪｕｎＤ：Ｊｕｎ  Ｄ癌原遺伝子
ＪｕｎＤはパラ分泌マイトジェンを調節することにより慢性腎臓疾患に対して保護する。ＡＰ−１転写因子はＪｕｎおよびＦｏｓタンパク質から構成され、細胞増殖の微調整において重大な役割を果たす。ＡＰ−１複合体はネフロン減少後の腎病変の発達と平行する増殖性応答の間に活性化されることが示されているが、悪化の過程における個々のＪｕｎ／Ｆｏｓ構成成分の具体的な役割についてはほとんど知られていない。
【０１４９】
ＦＧＦＲ２：線維芽細胞成長因子受容体２
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は後腎の発達に意味づけられている成長および分化因子のファミリーである。ＦＧＦはチロシンキナーゼ受容体ＦＧＦＲを介してその作用を発揮し、それは四つのＦＧＦＲ遺伝子（ＦＧＦＲ１からＦＧＦＲ４）によりコードされる。ラット後腎Ｅ１４からＥ２１においてＦＧＦ１からＦＧＦ５、ＦＧＦ７からＦＧＦ１０、およびＦＧＦＲ１からＦＧＦＲ４（IIIｂおよびIIIｃスプライシングバリアント）に関するｍＲＮＡの発現が検出された。インサイチュハイブリダイゼーションにより、腎性ゾーン、尿管上皮および発達中のネフロンエレメントにおいてＦＧＦ１  ｍＲＮＡが検出された。成熟化で改変された区別されるパターンでＦＧＦＲタンパク質が局在した。ＦＧＦＲ１は発達中の後腎上皮および間葉において広く分布したが、発達中の間質では分布しなかった。ＦＧＦＲ２はまたネフロン上皮において、特に近位尿細管において広く分布したが、後腎間葉、間葉凝集物または発達中の間質では検出されなかった。ＦＧＦＲ３は間葉凝集物、ネフロンエレメントおよび髄質間質に局在したが、近位尿細管では局在しなかった。ＦＧＦＲ４はほとんどの成熟ネフロン構造に局在し、そして腎性間葉、間葉凝集物または発達中の間質では局在しなかった。
【０１５０】
ＰＲＬＲ：プロラクチン受容体
シクロフィリンＡとＰＲＬＲの間の相互作用は、ＰＲＬＲから通じる種々のシグナリング経路で様々な調節的な役割を果たす。急性期応答のプロラクチン受容体の組織特異的遺伝子発現はリポ多糖類により誘起される。急性炎症は、宿主において恒常性を回復するために重大である急性期応答（ＡＰＲ）として公知の防御反応を惹起することができる。ストレス条件下で恒常性を維持する免疫調整因子としてのプロラクチン（ＰＲＬ）に関する役割が提示されている；しかしながらＡＰＲの間のその機能は依然明らかになっていない。ＡＰＲに特徴的な炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ベータおよびＩＦＮガンマ）はインビトロで肺線維芽細胞によるＰＲＬ受容体（ＰＲＬＲ）の発現を誘起したことが示されている。リポ多糖類（ＬＰＳ）誘起ＡＰＲの間のＰＲＬＲのインビボ発現もまたマウスの種々の組織において調査されている。ＰＲＬＲ  ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルは腹腔内ＬＰＳ注射の後、肝組織において下方調節された。ｍＲＮＡ発現に及ぼす抑制効果はまた前立腺、精嚢、腎臓、心臓および肺組織においても観察された。これらの知見により、ＡＰＲの局面でのＰＲＬＲ発現の複合的な組織特的調節が示唆される。
【０１５１】
ＡＰＯＭ：アポリポタンパク質Ｍ
アポリポタンパク質Ｍ（ａｐｏＭ）は主にヒト血漿中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に随伴される２６ｋＤａタンパク質であり、トリグリセリドリッチリポタンパク質（ＴＧＲＬＰ）および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）では少ない割合で存在する。それはリポカリンタンパク質スーパーファミリーに属する。ヒト組織発現アレイ研究により、ａｐｏＭは肝臓および腎臓においてのみ発現され、そして少量は胎児肝臓および腎臓において見出されることが示される。インサイチュａｐｏＭ  ｍＲＮＡハイブリダイゼーションにより、ａｐｏＭは肝細胞および腎臓の尿細管上皮細胞において独占的に発現されることが実証される。ａｐｏＭの発現はインビボおよび／またはインビトロで血小板活性化因子（ＰＡＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）およびレプチンにより調節され得る。
【０１５２】
ペルオキシソーム増殖活性化受容体、ガンマ、コアクチベーター１、アルファ（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ）
この遺伝子によりコードされるタンパク質はエネルギー代謝に関与する遺伝子を調節する転写コアクチベーターである。このタンパク質は、このタンパク質と複数の転写因子との相互作用を可能にするＰＰＡＲガンマと相互作用する。このタンパク質はｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）および核呼吸因子（ＮＲＦ）と相互作用し、そしてその活性を調節することができる。それは外的生理学的刺激とミトコンドリア発生の調節との間の直接的な連関を提供し、そして筋線維型決定を調節する主要な因子である。このタンパク質はまた血圧の制御、細胞性コレステロール恒常性の調節および肥満の発達に関与し得る。
【０１５３】
ＡＫＡＰ１２：Ａキナーゼアンカータンパク質（グラビン）１２
Ａキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）は構造的に多様なタンパク質の群であり、それはタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の調節サブユニットに結合し、そして細胞内の別個の位置にホロ酵素を閉じ込める共通の機能を有する。この遺伝子はＡＫＡＰファミリーのメンバーをコードする。コードされたタンパク質は内皮細胞、培養線維芽細胞および骨肉腫細胞において発現される。それはタンパク質キナーゼＡおよびＣならびにホスファターゼに随伴され、そしてシグナル伝達におけるスカッフォルドタンパク質として供される。このタンパク質およびＲII  ＰＫＡは細胞周囲で共局在化する。このタンパク質は細胞成長関連タンパク質である。
【０１５４】
Ｃｏｌ６Ａ１：コラーゲン、ＶＩ型、アルファ１
コラーゲンは種々の組織の完全性の維持において役割を果たすタンパク質のスーパーファミリーである。コラーゲンは細胞外マトリックスタンパク質であり、そしてその共通の構造エレメントとして三重らせんドメインを有する。コラーゲンＶＩはミクロフィブリルの主要な構造構成成分である。コラーゲンＶＩの基本的な構造単位はアルファ１（ＶＩ）、アルファ２（ＶＩ）およびアルファ３（ＶＩ）鎖のヘテロ三量体である。アルファ２（ＶＩ）およびアルファ３（ＶＩ）鎖は各々ＣＯＬ６Ａ２およびＣＯＬ６Ａ３遺伝子によりコードされる。この遺伝子によりコードされるタンパク質はＶＩ型コラーゲンのアルファ１サブユニット（アルファ１（ＶＩ）鎖）である。コラーゲンＶＩサブユニットをコードする遺伝子における変異は常染色体優性障害であるベスレムミオパチー（Bethlem myopathy）を招く。
【０１５５】
ＰＦＫＦＢ３：６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２,６−ビホスファターゼ３
酸素が制限されるようになる場合、細胞はエネルギー生成のために一次的に解糖様式にシフトする。解糖流量の重要なレギュレーターはフルクトース−２,６−ビスリン酸（Ｆ−２,６−ＢＰ）であり、６−ホスホフルクト−１−キナーゼ（ＰＦＫ−１）強力なアロステリックレギュレーターである。Ｆ−２,６−ＢＰのレベルは二機能性酵素のファミリーである６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２,６−ビスホスファターゼ（ＰＦＫＦＢまたはＰＦＫ−２）により維持され、それはキナーゼおよびホスファターゼ活性の双方を有する。酵素ファミリーの各メンバーはそのホスファターゼ：キナーゼ活性比率（Ｋ：Ｂ）およびその組織特異的発現を特徴とする。以前の研究により、ＰＦＫ−２アイソザイム遺伝子の一つであるＰＦＫＦＢ−３は低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）経路を介して低酸素により誘起されることが実証された。マウスの様々な器官におけるこのファミリーの三つのメンバーの基礎および低酸素発現もまた研究された。その知見により、四つ全てのアイソザイム（ＰＦＫＦＢ−１−４）はインビボで低酸素に応答することが示される。しかしながら、その発現および低酸素応答性の基礎レベルは研究された様々な器官で異なる。特にＰＦＫＦＢ−１は肝臓、心臓および骨格筋において高度に発現され、精巣においては低酸素に対する最も高い応答性が見出される。ＰＦＫＦＢ−２は主に肺、脳および心臓において発現される。しかしながら、最も高い低酸素応答性は肝臓および精巣においてのみ見出される。ＰＦＫＦＢ−３は高度に発現される骨格筋を除く全ての器官において可変的に低い基礎レベルで発現する。最も重要なことは、三つ全ての遺伝子のその低酸素応答性が最も十分であり、肺、肝臓、腎臓、脳、心臓および精巣において強く誘起される。さらなる研究により、ＰＦＫＦＢ−１およびＰＦＫＦＢ−２が遷移金属、鉄キレート剤およびＨＩＦヒドロキシラーゼの阻害剤のような低酸素擬似物質に対して高度に応答することが示されたが、これはこれらの遺伝子の低酸素応答性がＨＩＦタンパク質によっても調節されることを示唆している。データにより、ＰＦＫ−２遺伝子がインビボで低酸素に応答することが実証され、それは生物の環境的または局所的低酸素／虚血に対する適応における生理学的役割を示している。
【０１５６】
ＴＧＦ−ベータ１：トランスフォーミング成長因子−ベータ１
多機能性成長サイトカインであるトランスフォーミング成長因子−ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１は慢性同種移植片腎症の病原形成に意味づけられている。慢性腎グラフト拒絶では、ＴＧＦ−ベータ１の尿分泌が増加し；ＴＧＦ−ベータ１の尿分泌は動脈性高血圧、間質組織線維症の程度、およびグラフト不全の進行に関連し；ＨＤＬレベルとＴＧＦ−ベータ１の尿分泌との間の逆相関（慢性拒絶を有する患者および安定したグラフト機能を有するレシピエントの双方で）はこの成長因子の分泌に及ぼす異常脂質血症の影響を示唆している（１０８５０５８７）。
【０１５７】
ＩＧＦ２：インスリン様成長因子２（ソマトメジンＡ）
インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）遺伝子バリアントは栄養過剰誘起の代謝変化に関連する。ＩＧＦ−２のゲノム刷り込みの喪失は正常な造血細胞における細胞増殖に強く関連する。線維芽細胞増殖、筋線維芽細胞への分化およびコラーゲン合成の増加はＥＧＦまたはＩＧＦ−２のいずれかと連携したＣＴＧＦ依存性経路を介して調節される。
【０１５８】
ＡＬＢ：アルブミン
アルブミンはタンパク質キナーゼＣアルファ媒介メカニズムを介してインスリン誘起インスリン受容体基質（ＩＲＳ）シグナリングを損なうことによりグルコース代謝に影響を及ぼす。アルブミンは特異的分子吸着剤として作用する。ビリルビン、胆汁酸、芳香族アミノ酸および銅のようなアルブミン結合分子の除去は臨床的に肝臓、心血管系および腎機能ならびに肝性脳症の改善を伴う。
【０１５９】
ＭＡＰＴ：微小管随伴タンパク質タウ
ＭＡＰ２ＣおよびＴＡＵは、もしかするとチューブリン界面を架橋することにより、個々の原線維に沿って結合することにより微小管を安定化する。アルファシヌクレインおよびタウはその線維化を促進し、そしてヒト神経変性疾患における病理学的封入体の形成を推進することができる。
【０１６０】
ＭＡＬ２：Ｍａｌ、Ｔ細胞分化タンパク質２
データによりＭＡＬ２がＨＥＰＧ２細胞における経細胞輸送に必須であることが示される。ＭＡＬ２タンパク質ｍＲＮＡ種は甲状腺において検出され、そして甲状腺濾胞の免疫組織化学的分析により、ＭＡＬ２が頂端膜に分布することが示された。
【０１６１】
ＬＯＣ２８５１４８（ＡＤＡＭ１７）
ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７はジスインテグリンおよびメタロプロテアーゼファミリーのメンバーであり、アルファ分泌型切断を触媒し、そしてしたがってＡ１７２細胞においてアルファセクレターゼとして作用する。ＡＤＡＭ−１７はコレラ菌プロサイトリシンの強力なアクチベーターである。ＡＤＡＭ−１７／ＴＡＣＥおよびＴＩＭＰ−３はまた前立腺癌の病原形成において重要な役割を果たし得る。
【０１６２】
ＦＬＮＣ：フィラミンＣ、ガンマ（アクチン結合タンパク質２８０）
カルパイン３の基質であり得て、サルコグリカンとのタンパク質−タンパク質相互作用を調節する。蓄積は、筋肉ミオパチーにおけるコア形成の強力であるが、非特異的な免疫組織化学的マーカーである。
【０１６３】
ＰＡＷＲ：ＰＲＫＣ、アポトーシス、ＷＴ１、レギュレーター
ＰＡＲ−４は細胞表面のＣＤ９５受容体を上方調節することによりアポトーシスを増加させ、そしてイニシエーターカスパーゼ８および１０の切断を促進することにより、同時にＦＬＩＣＥ様阻害タンパク質（ＦＬＩＰ）を減少させる。ＰＡＲ−４はＣＨＴ１と相互作用することにより、および細胞表面でのその組み込みを低下させることにより、コリンの取り込みの調節に直接的に関与する。
【０１６４】
ＳＣＡ７：アタキシン７
中枢神経系で富化された新規アタキシン７タンパク質の同定により、複数のポリグルタミン含有タンパク質の発現がＳＣＡ７に特徴的な神経変性パターンにおいて役割を果たし得ることが示唆される。
【０１６５】
ＡＣＭＳＤ：アルファ−アミノ−ベータ−カルボキシムコナート−イプシロン−セミアルデヒドデカルボキシラーゼ
Ｌ−トリプトファン−キヌレニン経路の代謝体、Ｌ−キヌレニンおよびキノリン酸（Ｑｕｉｎ）の著明な増加が腎不全を有するラットおよびヒトの双方の血清および脳脊髄液（ＣＳＦ）で観察された。腎不全後のその蓄積の原因となるメカニズムが調査された。慢性腎不全を有する患者では、血清Ｌ−キヌレニンおよびＱｕｉｎのレベル上昇が血液透析により低下した。腎不全ラットでは血清、脳およびＣＳＦにおけるＱｕｉｎおよびＬ−キヌレニンレベルもまた腎不全の重篤度に平行して上昇した。Ｑｕｉｎ（３.５倍）およびＬ−キヌレニン（２.８倍）の尿分泌もまた増加した。キヌレニン経路の律速酵素である肝臓Ｌ−トリプトファン２,３−ジオキシゲナーゼ活性（ＴＤＯ）は血中尿素窒素およびクレアチニレベルに比例して増加した。キヌレニン３−ヒドロキシラーゼおよびキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは未変化であったが、キヌレイナーゼ、３−ヒドロキシアントラニラートジオキシゲナーゼおよびアミノカルボキシムコナート−セミアルデヒドデカルボキシラーゼ（ＡＣＭＳＤａｓｅ）の活性はわずかに低下した。ピラジナミド（ＡＣＭＳＤａｓｅ阻害剤）の全身投与により対照ラットにおける血清Ｑｕｉｎ濃度が上昇し、それは腎不全に応答した身体ＡＣＭＳＤａｓｅ活性における変化が血清Ｑｕｉｎ濃度の決定のための重要な因子であることを実証している。血清Ｌ−キヌレニン濃度の上昇は主に肝臓におけるＴＤＯ増加およびキヌレイナーゼ活性の低下のためであり、そして血清Ｑｕｉｎ濃度の上昇は腎不全後の身体におけるＡＣＭＳＤａｓｅ活性の低下のためである。ＣＳＦ  Ｌ−キヌレニンの蓄積は血清Ｌ−キヌレニンの増加の開始により引き起こされ、そしてＣＳＦ  Ｑｕｉｎの蓄積は血漿からのＱｕｉｎおよび／または脳へのＱｕｉｎ前駆体に対して二次的である。
【０１６６】
ＡＣＯＸ２
同種移植片拒絶の間に、サイトカインおよび脂質メディエーターは細胞傷害および臓器不全の原因となる。ペルオキシソームはペルオキシソームベータ酸化による脂質メディエーターの分解を含む脂質代謝において重大な役割を果たす。ラット肝臓同種移植の後の肝臓ペルオキシソームの改変が調査された。ＭＨＣ不適合性Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＲＴ１ａ）ドナーラットおよびＬｅｗｉｓ（ＲＴ１（１））レシピエントラットを同種移植に使用した。免疫抑制のために、これらの動物の群はシクロスポリン（ＣｓＡ）を腹腔内投与された（１ｍｇ／ｋｇ体重／日）。Ｌｅｗｉｓラットを同系移植の組み合わせに使用した。移植後１０日にペルオキシソーム直径および体積密度の決定のために形態計測学的方法を用いて肝臓を調査した。ペルオキシソームカタラーゼ（ＣＡＴ）およびアシル補酵素Ａオキシダーゼ（ＡＯＸ）の活性を決定し、そして対応するタンパク質を定量的免疫細胞化学および免疫ブロッティングにより評価した。ＣＡＴおよびＡＯＸをコードするｍＲＮＡの発現をノーザンブロッティングにより調査した。同種移植された肝臓ではペルオキシソームの体積密度および直径が有意に減少したが、ＣｓＡ処置動物では未変化であった。ＣＡＴおよびＡＯＸの活性ならびにそのタンパク質レベルの双方は肝臓同種移植片で有意に低下した。さらにＣＡＴおよびＡＯＸの対応するｍＲＮＡレベルは肝臓同種移植片で有意に減少したが、一方ＣｓＡ処置によりこれらのｍＲＮＡの増加に至った。同系移植された肝臓により、対応する酵素値のわずかな低下のみが示された。結論：ペルオキシソームは肝臓同種移植後に形態学的および機能的の双方で重篤な影響を受ける。これらの結果により、ペルオキシソーム脂質酸化の機能障害は、炎症性応答の調節に関与する脂質メディエーターの異化反応の低下による拒絶過程の病原形成の原因となり得ることが示唆される。その免疫抑制効果に加えて、ＣｓＡはこれらの重要なペルオキシソーム機能の維持により同種移植片生存に寄与し得る（Steinmetz et al.,. Transplantation. Jul ２７；６６（２）：１８６−９４（１９９８））。
【０１６７】
ＡＤＡＭ１７
慢性腎同種移植片拒絶は細胞外マトリックス区画および種々の細胞型の増殖における改変を特徴とする。これらの様相はマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を含むメタロエンドペプチダーゼのメトジンシンスーパーファミリー、ジスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）ならびにメプリンによりある程度制御される。したがって確立されたＦｉｓｈｅｒからＬｅｗｉｓラットへの腎臓移植モデルにおけるメトジンシンの調節を調査した。ラット腎臓の凍結ホモジネートおよびパラフィン切片を使用して０日（健常対照）および移植後＋６０日および＋１００日の慢性拒絶の期間に研究を実施した。Affymetrix Rat Expression Array ２３０Ａ GeneChipおよびリアルタイムTaqmanポリメラーゼ連鎖反応分析によりメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現を試験した。酵素電気泳動、ウェスタンブロット分析および免疫組織学によりタンパク質発現を研究した。ＭＭＰ（ＭＭＰ−２／−１１／−１２／−１４）、その阻害剤（メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）−１／−２）の、ＡＤＡＭ−１７およびトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−ベータ１のｍＲＮＡレベルは慢性腎同種移植片拒絶の間に有意に増加した。したがってＭＭＰ−２活性および免疫組織学的染色は増強された。ＭＭＰ−１２の場合に最も重要なｍＲＮＡ上昇が観察された。予測されたとおり、ウェスタンブロット分析によってもまたＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１４およびＴＩＭＰ−２（後者の２例では個々のタンパク質として、および複合体として）の生成の増加が実証された。対照的にＭＭＰ−９／−２４およびメプリンアルファ／ベータのｍＲＮＡレベルは低下した。したがってＭＭＰ−９タンパク質レベルならびにメプリンアルファ／ベータ合成および活性は有意に下方調節された。メトジンシンファミリー（ＭＭＰ、ＡＤＡＭおよびメプリン）およびＴＩＭＰのメンバーは慢性腎同種移植片拒絶において差次的に調節される。故にメトジンシンの改変されたパターンは新規診断マーカーを示し得て、そしてもしかすると将来的な治療的介入のための新規標的を提供し得る。（Berthier et al., Kidney Int. ６９（２）：３５８−６８（２００６ Feb））
【０１６８】
ＡＧＸＴ２
アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）２は、ラットでは腎臓で高レベルで発現されるピリドキサール５’−リン酸依存性、ミトコンドリア酵素である。（Lee IS et al., Nephron. ８３（２）：１８４−５（１９９９））
【０１６９】
ＡＬＡＤ
腎同種移植片移植後の障害を受けた腎機能はしばしばレシピエントにおいて貧血を招く。急性拒絶の間に貧血に至る分子メカニズムは十分には理解されておらず；不十分なエリトロポイエチン生成および鉄欠乏が主な原因であると報告されている。急性拒絶における貧血に潜む分子事象の理解を深めるために、９０００個のヒトｃＤＮＡクローンを含有するＤＮＡマイクロアレイ（７４６９個の独特な遺伝子を示す）を用いて急性拒絶および貧血の併発を有する４人の小児腎同種移植片レシピエントからの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の遺伝子発現プロフィールを試験した。これらの貧血の拒絶患者では、ヘモグロビン転写および合成、鉄および葉酸結合および輸送に関与する１１個の下方調節された遺伝子の「赤血形成クラスター」が同定された。加えていくつかの同種免疫応答遺伝子が同時に下方調節された、いくつかは急性拒絶を有し、そしていくつかは急性拒絶および貧血の併発を有する３６個のＰＢＬ試料の別個のデータを分析して、急性拒絶と貧血との間の可能な関連性を支持した。結論としては、ＤＮＡマイクロアレイを使用する分析により、正常腎臓と比較して腎同種移植片拒絶を有する腎臓において改変されたヘモグロビン合成および／または赤血球形成に関係する遺伝子のクラスターが同定された。このクラスターの発現における改変の間の可能な関係性、腎機能の低下、同種免疫過程自体および腎移植に及ぼすその他の影響についてはさらなる分析が待たれる。（Chua et al., Am J Transplant. ３（１）：１７−２２（２００３ Jan））
【０１７０】
ＡＬＡＳ２
鉄調節タンパク質（ＩＲＰ）１および２は転写後にトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）フェリチンおよびその他の鉄代謝タンパク質の発現を調節する。ＩＲＰ２の除去により鉄制限された赤血球形成を招く。ＩＲＰ２−／−マウスの赤血球前駆体におけるＴｆＲ発現は低下し、そして骨髄鉄貯蔵はないが、トランスフェリン飽和レベルは正常である。５−アミノレブリン酸シンターゼ２（ＡＬＡＳ２）の著明な過剰発現はＩＲＰ依存性翻訳抑制の喪失の結果であり、そして遊離プロトポルフィリンＩＸおよび亜鉛プロトポルフィリンのレベルの著明な増加はＩＲＰ２−／−赤血球系細胞において作成される。ＩＲＰ２−／−マウスは遺伝的小赤血球性貧血の新しいパラダイムを示す。ＩＲＰ２変異または欠失は、正常トランスフェリン飽和、血清フェリチンの上昇、赤血球プロトポルフィリンＩＸレベルの上昇および成人発症性神経変性を有する患者における不応性小赤血球性貧血および骨髄鉄欠乏の原因であり得る（Cooperman SS et al..Blood. １０６（３）：１０８４−９１（２００５ Aug １）、Epub ２００５ Apr １４）。
【０１７１】
ＡＬＤＨ７Ａ１
ベタインは種々腎細胞の浸透圧調節において重要な役割を果たす。腎臓ではベタイン合成は皮質において最も高くなるようであるが、一方浸透圧で調節された蓄積は髄質内部で重大な役割を果たすようだ。ベタイン合成の改変はおそらくベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの浸透圧調節により引き起こされる。この酵素の活性は等張対照条件と比較して、低浸透圧条件下で有意に高かった。これらの結果により、長期間適応の間、ウサギ腎臓の髄質外部のＴＡＬＨ細胞におけるベタイン合成が細胞外浸透圧により調節され得ることが実証される。（Furuyama K et al., Blood. １０１（１１）：４６２３−４（２００３ Jun １）. Epub ２００３ Jan １６）。
【０１７２】
ＢＨＭＴ２
グリシンベタイン補充は、ベタイン−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＢＨＭＴ）により触媒されるメチル化を介してホモシスチン尿症および慢性腎不全患者におけるホモシステインレベルを低下させる。低ベタイン食を与えたラットにグリシンベタイン、プロリンベタイン、トリゴネリン、ジメチルスルホニオプロピオン酸（ＤＭＳＰ）またはジメチルテチン（dimethylthetin）（１.５ミリモル）を皮下投与した。各ベタインの全血漿ホモシステインならびに尿および血漿ベタイン濃度に及ぼす効果をモニタリングした。グリシンベタイン、ＤＭＳＰおよびジメチルテチンの循環ホモシステイン濃度に及ぼす効果はインビボでＢＨＭＴにより媒介された。循環グリシンベタイン濃度はＤＭＳＰおよびジメチルテチン処置に続いて上昇した。全てのベタインでの処置に続いてグリシンベタインの尿分泌が増加し、それは腎臓におけるグリシンベタインの再吸収が阻止されたことを示唆している。その研究により、グリシンベタイン類似体はホモシステイン代謝に複数の影響を及ぼすことが示された（Slow S. et al., Int J Biochem Cell Biol. ３６（５）：８７０−８０.０（２００４ May））。
【０１７３】
ＣＣＬ２８
ケモカインＣＣＬ２８はいくつかの粘膜部位で上皮細胞により構成的に発現され、ならびにＴ細胞およびＩｇＡ  Ｂ細胞の亜集団の恒常性化学遊走物質として機能し、そして抗微生物活性を媒介すると考えられている。インビボでは、ＣＣＬ２８は正常ヒト結腸と比較して病理学的に炎症を起こした上皮において著明に増加した。ヒト結腸および小腸異種移植片を使用してインビボヒト腸上皮をモデル化した。炎症誘発性刺激により上方調節されたその発現と合致して、ＣＣＬ２８  ｍＲＮＡ発現はＮＦカッパＢ活性化の薬理学的阻害剤により減弱された。これらの知見により、ＣＣＬ２８はヒト結腸上皮において「炎症性」ケモカインとして機能することが示され、そしてＣＣＬ２８が結腸炎症を対抗制御するために作用し得るという概念が示唆される（Ogawa et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. ２８７（５）：G１０６２−９（２００４ Nov）. Epub ２００４ Jul ８）。
【０１７４】
ＤＣＸＲ
血流中のカルボニル化合物は糖尿病または末期腎不全対象の腎臓に蓄積する傾向がある。以前にジカルボニル／Ｌ−キシルロースリダクターゼ（ＤＣＸＲ）をコードするｃＤＮＡがマウス腎臓ｃＤＮＡライブラリーから単離された。腎臓におけるＤＣＸＲの機能的役割がＴｇマウスで試験された。腎臓におけるＤＣＸＲタンパク質発現レベルが６倍増加したが、ホモ接合性Ｔｇマウスでは顕著な組織学的異常は何ら示されなかった。全身にわたってＤＣＸＲ発現の上昇が観察されたが、その腎分布は内因性ＤＣＸＲタンパク質のものに類似した、すなわち主要な発現部位は集合尿細管であり、その他の尿細管およびボーマン嚢では中度の発現を伴ったが、間質部分および糸球体では存在しなかった。糖尿病性腎症の進行におけるＤＣＸＲの役割を試験するために、ＴｇマウスをＫＫ−Ａ（ｙ）糖尿病モデルマウスと交配させた。得られた子孫Ｔｇ／Ａ（ｙ）はその＋／Ａ（ｙ）同腹仔と比較して、軽体重、低レベルの血中グルコース、水摂取およびクレアチニンクリアランスを示した。顕微鏡レベルで、およびカルボキシメチルリジンの腎蓄積において著明な病理学的差異は観察されなかったが、データはＤＣＸＲがグルコースまたはカルボニル化合物の代謝において機能し、そして高血糖圧下である腎臓において保護的な役割を果たし得ることを意味する。したがってＤＣＸＲ  ＴｇマウスおよびＴｇ×ＫＫ−Ａ（ｙ）ハイブリッドマウスは糖尿病のバックグラウンドを有する腎臓におけるカルボニル代謝に関する具体的なモデルとして供される。（Sudo et al., Transgenic Exp Anim. ５４（５）：３８５−９４（２００５ Oct））
【０１７５】
ＥＨＦ
ｅｔｓファミリーは保存されたＤＮＡ結合「ＥＴＳ」ドメインを共有し、そして過剰発現された場合に腫瘍形成を誘起するいくつかの腫瘍性タンパク質を含む転写因子の大きな多重遺伝子族である。マウス下垂体成長ホルモン分泌細胞腫瘍からｃＤＮＡがクローン化され、シークエンシングされ、そして特徴付けされて、新規ｅｔｓファミリー遺伝子、「Ｅｈｆ」（「ｅｔｓ相同因子」）が示された。推定３００個のアミノ酸Ｅｈｆタンパク質が高度に多岐にわたるｅｔｓファミリーメンバーであるが、最近同定された腫瘍性タンパク質ＥＳＸに対して最も関連性が高い（全体の３６％および８４％のＥＴＳドメインアミノ酸同一性）。故にＥｈｆおよびＥＳＸは新しいｅｔｓサブファミリーを含む。Ｅｈｆは単一のコピー遺伝子であるが、４つの異なるｍＲＮＡ転写体を生成する。Ｅｈｆ転写体はマウス腎臓および肺に豊富であり、筋肉および肝臓ではそれほど多くなく、そして脳、脾臓または精巣では検出されない。成長ホルモン分泌細胞腫瘍におけるその存在およびＥＳＸに対するその関連性のために、Ｅｈｆは新しい腫瘍性タンパク質を示し得る（Bochert MA et al., Biochem Biophys Res Commun. ２４６（１）：１７６−８１（１９９８ May ８））。
【０１７６】
適当であるその他の好ましい遺伝子には、限定するものではないがＥＰＨＸ２（Imig JD et al.,  Hypertension. ４６（４）：９７５−８１（２００５ Oct）、 Epub ２００５ Sep １２）、ＦＫＢＰ１１（Han IS et al., J Korean Med Sci. １７（１）：４１−８（２００２ Feb））；Sheppard KE, J Neuroendocrinol. ７（１１）：８３３−４０（１９９５ Nov））、ＦＭＯ４（Zhang J et al., Drug Metab Dispos. ３４（１）：１９−２６（２００６ Jan）. Epub ２００５ Sep ２３；Krause RJ et al., J Pharmacol Exp Ther. ３０４（１）：１８５−９１（２００３ Jan））、ＦＮＢＰ２（Chan DC et al., EMBO J. １５（５）：１０４５−５４（１９９６ Mar １））、ＦＵＢＰ１（Scholz H et al., J Biol Chem. ２７２（５２）：３２８３６−４６（１９９７ Dec ２６））、ＦＵＴ３（Xia L et al., Blood. １０４（１０）：３０９１−６（２００４ Nov １５）. Epub ２００４ Jul ２７；Yan JL et al., Acta Pharmacol Sin. ２４（９）：８７８−８４（２００３ Sep）；Rhim AD et al., Glycoconj J. １８（９）：６４９−５９（２００１ Sep）；Lacha J et al., J Leukoc Biol. ７１（２）：３１１−８（２００２ Feb）；Poland DC et al., Glycoconj J. １８（３）：２６１−８（２００１ Mar）；Artrip JH et al., Erratum in：J Biol Chem ；２７４（２１）：１５２９２（１９９９ May ２１）；Cooper DK, Xenotransplantation. ５（１）：６−１７（１９９８ Feb）；Cowan PJ et al., Transplantation. ６５（１２）：１５９９−６０４（１９９８ Jun ２７）； Chen CG et al., Transplantation. ６５（６）：８３２−７（１９９８ Mar ２７）；Osman N et al., Proc Natl Acad Sci U S A. ９４（２６）：１４６７７−８２（１９９７ Dec ２３））、ＧＡＳ５（Bek MF et al., Am J Pathol. １６８（１）：２０−３２（２００６ Jan）；Lake AC et al., Cell Commun Signal. １（１）：５（２００３ Nov ２４））、ＨＡＧＨ（Mulley JC et al., Hum Genet. ７４（４）：４２３−４（１９８６ Dec））、ＨＣＣＲ１（Chung YJ et al., Histol Histopathol. ２０（３）：９９９−１００３（２００５ Jul））；Ko J et al., Oncogene. ２２（３０）：４６７９−８９（２００３ Jul ２４））、ＨＰＮ：ヘプシン（Li Y et al., Biochim Biophys Acta. １６８１（２−３）：１５７−６５（２００５ Jan １１）. Epub ２００４ Dec １５；Roemer A et al.,  J Urol. １７２（６ Pt １）：２１６２−６（２００４ Dec））、ＩＮＳＬ３（Fu P et al., Ann N Y Acad Sci. １０４１：５１６−９（２００５ May））、ＩＱＧＡＰ１（Lehtonen S et al., Proc Natl Acad Sci U S A. １０２（２８）：９８１４−９（２００５ Jul １２）. Epub ２００５；Jia Z et al., J Biol Chem. ２８０（３４）：３０５６４−７３（２００５ Aug ２６）. Epub ２００５ Jun ２８）、ＫＣＮＪ１５（Derst C et al., J Biol Chem. ２７３（３７）：２３８８４−９１（１９９８ Sep １１）；Shuck ME et al., J Biol Chem. ２７２（１）：５８６−９３（１９９７ Jan ３））、ＫＣＮＮ２（Kusaka M et al., Transplant Proc. ３７（１）：３６４−６（２００５ Jan−Feb））、ＫＩＦ１３Ｂ（Venkateswarlu K et al., J Cell Sci. １１８（Pt １１）：２４７１−８４（２００５ Jun １））、ＬＲＰ２（de Jong M et al., J Nucl Med. ４６（１０）：１６９６−７００（２００５ Oct））、Oleinikov AV et al., J Pathol. １９２（２）：２５１−６（２０００ Oct））、ＰＤＺＫ１（Miyazaki H et al., J Am Soc Nephrol. １６（１２）：３４９８−５０６（２００５ Dec）. Epub ２００５ Oct １９）、ＰＬＤ１（Zhao Y et al., Biochem Biophys Res Commun. ２７８（１）：１４０−３（２０００ Nov １１）；Slaaby R et al., Biochem J. ３５１ Pt ３：６１３−９（２０００ Nov １））、ＰＮＰＮ（Okuda T et al., Biochem Biophys Res Commun. ３１３（３）：６４７−５３（２００４ Jan １６）、ＲＴＫＮ（Liu CA et al., J Biomed Sci. １１（５）：６６１−７０（２００４ Sep−Oct））、ＳＬＣ３４Ａ１（Baum M et al., Kidney Int. ６８（３）：１１４８−５３（２００５ Sep）；Nashiki K et al., Kidney Int. ６８（３）：１１３７−４７（２００５ Sep））、ＳＬＣ７Ａ９（Yuen YP et al., Kidney Int. ６９（１）：１２３−８（２００６ Jan））、ＳＬＰＩ（He Z et al., J Mol Med. ８１（１０）：６００−１２（２００３ Oct）. Epub ２００３ Aug １９）、ＴＨＥＭ２（Lucas et al., Oncogene. ２４（４２）：６４１８−３１（２００５ Sep ２２））が含まれる。
【０１７７】
考察
ＣＡＮの予測／早期診断のためのゲノムバイオマーカーを同定する目的でいくつかの腎同種移植片プロトコール生検の遺伝子発現プロファイリングを実施した。バイオマーカーはＣＡＮが組織学的パラメーターにより明らかになる前にＣＡＮを診断するための分子手段として有用である。
【０１７８】
均等物
本発明は本出願において記載された特定の実施態様に関して限定されるべきではなく、それは本発明の個々の態様の単なる説明として意図される。当業者に明らかであろうように、本発明の多くの修飾および変更をその精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。本発明の範囲内である機能的に均等な方法および装置は、本明細書に列挙されるものに加えて、前記の記載から当業者に明白であろう。かかる修飾および変更は添付の特許請求の範囲内に入ると意図される。本発明は添付の特許請求の範囲が権利を付与する均等物の全範囲を伴うかかる特許請求の範囲の表現によってのみ限定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】慢性拒絶の観察された等級対予測された等級を比較するＰＬＳのデータにより誘導されたグラフである。
【図２】応答並べ替えを用いるＰＬＳにより誘導されたバイオマーカーの予測性能を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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