(57)【要約】  本開示は、レプチン融合ポリペプチド、上述のポリペプチドをコードする核酸分子、ならびに上述のポリペプチドを使用する治療の方法に関する。
2010535486.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レプチン受容体ポリペプチドの少なくとも１つのレプチン結合ドメインに直接または間接的に連結されるレプチンポリペプチドを含む、レプチンの活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項２】
レプチン受容体ポリペプチドの少なくとも１つのレプチン結合ドメインに直接または間接的に連結されるレプチンポリペプチドのアミノ酸配列またはその活性部分を含む融合ポリペプチド。
【請求項３】
２つのレプチン結合ドメインを含む、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
免疫グロブリン様ドメインを含む、請求項２または３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
少なくとも１つのサイトカイン様相同性ドメインを含む、請求項２から４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
２つのサイトカイン様相同性ドメインを含む、請求項２から４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ結合ドメインを含む、請求項２から６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
２つのフィブロネクチンＩＩＩ結合ドメインを含む、請求項２から６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号４１のアミノ酸残基４２５から５３５を含む、請求項２から８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号４１のアミノ酸残基５３６から６３５を含む、請求項２から９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号４１のアミノ酸残基３２６から４２７を含む、請求項２から１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号４１のアミノ酸残基６２から１７８を含む、請求項２から１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号４１のアミノ酸残基２３５から３２５を含む、請求項２から１２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号４１のアミノ酸残基６３６から７３３を含む、請求項２から１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号４１のアミノ酸残基７３４から８２９を含む、請求項２から１４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号４１のアミノ酸残基４２８から６３５を含む、請求項２から１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
前記レプチンポリペプチドは、レプチン受容体の少なくとも１つのレプチン結合ドメインに連結され、前記レプチンポリペプチドは、前記融合ポリペプチドにおいて前記レプチン結合ドメインのアミノ末端側に位置する、請求項２から１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
前記レプチンポリペプチドは、レプチン受容体の少なくとも１つのレプチン結合ドメインに連結され、前記レプチンポリペプチドは、前記融合ポリペプチドにおいて前記レプチン結合ドメインのカルボキシル末端側に位置する、請求項２から１６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
前記レプチンポリペプチドは、ペプチドリンカーによって、レプチン受容体ポリペプチドの少なくとも１つの結合ドメインに連結される、請求項２から１８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの少なくとも１コピーを含む、請求項１９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの２、３、４、５、６、７、８、９または１０コピーを含む、請求項２０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
前記ペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの６コピーから成る、請求項２１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
前記ペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの８コピーから成る、請求項２１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
レプチンポリペプチドおよびレプチン受容体ポリペプチドの少なくとも１つのレプチン結合ドメインの直接的な融合物である、請求項２から１８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
ｉ）配列番号３で表される核酸配列、
ｉｉ）配列番号５で表される核酸配列、
ｉｉｉ）配列番号７で表される核酸配列、
ｉｖ）配列番号９で表される核酸配列、
ｖ）配列番号１１で表される核酸配列、
ｖｉ）配列番号１３で表される核酸配列、
ｖｉｉ）配列番号１５で表される核酸配列、
ｖｉｉｉ）配列番号１７で表される核酸配列、
ｉｘ）配列番号１９で表される核酸配列、
ｘ）配列番号２１で表される核酸配列、
ｘｉ）配列番号２３で表される核酸配列、
ｘｉｉ）配列番号２５で表される核酸配列、
ｘｉｉｉ）配列番号２７で表される核酸配列
から選択される核酸配列を含む核酸分子、
配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、レプチン受容体調節活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項２６】
レプチンアゴニストをコードする、請求項２５に記載の核酸分子。
【請求項２７】
レプチンアンタゴニストをコードする、請求項２５に記載の核酸分子。
【請求項２８】
配列番号３で表される核酸配列を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２９】
配列番号５で表される核酸配列を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３０】
配列番号７で表される核酸配列を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３１】
配列番号９で表される核酸配列を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３２】
配列番号１１で表される核酸配列を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３３】
配列番号１３で表される核酸配列を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３４】
配列番号１５で表される核酸配列を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３５】
配列番号１７で表される核酸配列を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３６】
配列番号１９で表される核酸配列を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３７】
配列番号２１で表される核酸配列を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３８】
配列番号２３で表される核酸配列を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３９】
配列番号２５で表される核酸配列を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４０】
配列番号２７で表される核酸配列を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４１】
請求項１または２５から４０のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項４２】
配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項４３】
２つのポリペプチドから成るホモ二量体であって、前記ポリペプチドはそれぞれ、
ｉ）レプチンまたはその受容体結合ドメインを含む第１の部分と、ペプチド連結分子によってそれと任意選択で連結される
ｉｉ）レプチン受容体の少なくとも１つのレプチン結合ドメインまたはその部分を含む第２の部分と
を含むホモ二量体。
【請求項４４】
前記ホモ二量体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０を含む２つのポリペプチドを含む、請求項４３に記載のホモ二量体。
【請求項４５】
請求項１または２５から４０のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４６】
請求項１、２５から４０または４５のいずれか一項に記載の核酸分子またはベクターを用いて形質移入または形質転換される細胞。
【請求項４７】
真核細胞である、請求項４６に記載の細胞。
【請求項４８】
原核細胞である、請求項４６に記載の細胞。
【請求項４９】
賦形剤または担体を含む、請求項２から２４または４１または４２のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項５０】
さらなる治療薬と組み合わせられる、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
レプチンアゴニストの投与が有効であろう状態に罹患しているヒト対象を治療するための方法であって、請求項２から２４または４１または４２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドの有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項５２】
前記状態は、肥満である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記状態は、肥満関連性の状態である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記肥満関連性の状態は、ＩＩ型糖尿病である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記肥満関連性の状態は、心疾患である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記状態は、免疫抑制である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
レプチンアンタゴニストの投与が有効であろう状態に罹患しているヒト対象を治療するための方法であって、請求項２から２４または４０または４１のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドの有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項５８】
前記状態は、食欲不振症である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記状態は、自己免疫疾患である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記自己免疫疾患は、多発性硬化症、１型糖尿病、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性肝炎、慢性関節リウマチ、自己免疫性大腸炎、クローン病、セリアック病、自己免疫性腎炎、自己免疫性ニューロパチー、脳障害、線維化肺胞炎から成る群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポリペプチドは、静脈内に投与される、請求項５１から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ポリペプチドは、皮下に投与される、請求項５１から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ポリペプチドは、２日間隔で投与される、請求項５１から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ポリペプチドは、１週間隔で投与される、請求項５１から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ポリペプチドは、２週間隔で投与される、請求項５１から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ポリペプチドは、１か月間隔で投与される、請求項５１から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
請求項２から２４または４０、４１または４３または４４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは二量体に結合するモノクローナル抗体。
【請求項６８】
ポリペプチドまたは二量体に結合するが、レプチンまたはレプチン受容体にそれぞれ特異的に結合しないモノクローナル抗体である、請求項６７に記載の抗体。
【請求項６９】
本発明によるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製するための方法であって、
ｉ）本発明による少なくとも１つのポリペプチドを含む免疫原を用いて免疫応答性哺乳動物を免疫するステップ、
ｉｉ）免疫された免疫応答性哺乳動物のリンパ球を骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成するステップ、
ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体を、（ｉ）のポリペプチドに対する結合活性についてスクリーニングするステップ、
ｉｖ）ハイブリドーマ細胞を培養して、前記モノクローナル抗体を量産および／または分泌するステップ、ならびに
ｖ）培養上清からモノクローナル抗体を回収するステップを含む方法。
【請求項７０】
前記免疫応答性哺乳動物は、マウスまたはラットである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
請求項６９または７０に記載の方法によって得られるまたは入手可能なハイブリドーマ細胞株。
【請求項７２】
生体試料において、本発明によるポリペプチドを検出するための診断試験であって、
ｉ）試験対象となる単離試料を提供するステップ、
ｉｉ）前記試料を、請求項２から２４または４０または４１または４３または４４のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは二量体に結合するリガンドと接触させるステップ、および
ｉｉｉ）前記試料において前記リガンドの結合を検出するステップを含む診断試験。
【請求項７３】
前記リガンドは、抗体である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項７３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レプチン融合ポリペプチドおよび二量体、上述のポリペプチドをコードする核酸分子、ならびに上述のポリペプチド／二量体を使用する治療の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカイン受容体は、３つの別個のグループに分類することができる。クラス１（ヘマトポエチンまたは成長ホルモンファミリーと呼ばれる）受容体は、それらの細胞外ドメインのアミノ末端部分における４つの保存システイン残基およびＣ末端部分における保存Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒモチーフの存在によって特徴づけられる。受容体は、２つのポリペプチド鎖から成る。クラスＩ受容体は、ＧＭ−ＣＳＦサブファミリー（ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＣＳＦを含む）ならびにＩＬ−６サブファミリー（ＩＬ−６、ＩＬ−１１、およびＩＬ−１２を含む）に細分することができる。ＩＬ−６サブファミリーにおいて、１つまたは２つの異なるサイトカインサブユニットと結合する、共通の伝達サブユニット（ｇｐ１３０）がある。ＩＬ−２サブファミリー（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、およびＩＬ−１５を含む）と呼ばれる、さらなるサブファミリーがある。繰り返しＣｙｓモチーフはまた、リガンドが、α、β、およびγインターフェロンであるが、保存Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒモチーフを欠くクラス２（インターフェロン受容体ファミリー）においても存在する。
【０００３】
ヒトレプチンは、ヒトにおけるｌｅｐ遺伝子およびマウスにおけるｏｂ遺伝子によってコードされる１６ｋＤタンパク質ホルモンである。レプチンは、サイトカインファミリーの単一膜貫通受容体であるレプチン受容体を通して作用する。３つのエクソンおよび２つのイントロンを含み、約１８ｋｂのゲノムＤＮＡにわたる、ヒトにおけるレプチンをコードする単一遺伝子がある。レプチンは、とりわけ食欲および免疫機能をコントロールするために栄養状態および免疫系と関連する。レプチンまたはレプチン受容体のいずれかにおける突然変異の存在は、肥満と関連する付随する二次的症状（たとえば心疾患、ＩＩ型糖尿病）を伴う肥満表現型をもたらし得る。レプチンは、肥満度指数（ＢＭＩ）に比例して脂肪組織によって主に産生され、より低度なレベルで、胃および胎盤などのような器官によって産生される。レプチンは、食物摂取の阻害およびエネルギー消費の刺激を通して体重を調節する。さらに、レプチンは、自然および適応免疫の両方に影響を与える。自然免疫に関して、レプチンは、好中球の活性を調節し、単球／マクロファージの食作用を増加させ、急性期応答の炎症性メディエーターの分泌を増強する。適応免疫に関して、レプチンは、ナイーブＴ細胞による増殖およびインターロイキン２（ＩＬ−２）分泌を促進するのに対して、メモリーＴ細胞に関して、それは、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α分泌）を増加させることによって、ヘルパーＴ１（Ｔｈ１）免疫応答への切り換えを促進する。
レプチンの発現および／または産生が混乱すると、疾患の病理学的発現は、エネルギー代謝および免疫状態に対する影響により複雑になる。肥満に対する確立された関連とは別に、レプチンの低下は、不妊症、骨粗鬆症、および免疫抑制と関連する。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、薬物動態（ＰＫ）および活性が改善されたレプチン組換え形態の同定に関する。新しいレプチン分子は、生物学的活性を有し、二量体を形成し、安定性が改善されている。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】ａは細菌発現レプチンの核酸配列を示す図であり、ｂはアミノ酸配列を示す図である。
【図２】ａはＬＲ  ２Ａ１の核酸配列を示す図であり、ｂはＬＲ  ２Ａ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】ａはＬＲ  ２Ａ１の核酸配列を示す図であり、ｂは細菌発現に適したＬＲ  ２Ａ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図４ａ】ＬＲ  ２Ｂ１の核酸配列を示す図である。
【図４ｂ】ＬＲ  ２Ｂ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図５ａ】ＬＲ  ２Ｄ１の核酸配列を示す図である。
【図５ｂ】ＬＲ  ２Ｄ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図６】ａはＬＲ  ２Ｅ１の核酸配列を示す図であり、ｂはＬＲ  ２Ｅ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図７】ａはＬＲ  ２Ｆ１の核酸配列を示す図であり、ｂはＬＲ  ２Ｆ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図８】ａはＬＲ  ２Ｇ１の核酸配列を示す図であり、ｂはＬＲ  ２Ｇ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図９ａ】ＬＲ  ２Ｈ１の核酸配列を示す図である。
【図９ｂ】ＬＲ  ２Ｈ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図１０ａ】ＬＲ  ２Ｉ１の核酸配列を示す図である。
【図１０ｂ】ＬＲ  ２Ｉ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図１１】ａはＬＲ  ２Ｊ１の核酸配列を示す図であり、ｂはＬＲ  ２Ｊ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図１２】ａはＬＲ  ２Ｋ１の核酸配列を示す図であり、ｂはＬＲ  ２Ｋ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図１３ａ】ＬＲ  ２Ｌ１の核酸配列を示す図である。
【図１３ｂ】ＬＲ  ２Ｌ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図１４ａ】ＬＲ  ２Ｍ１の核酸配列を示す図である。
【図１４ｂ】ＬＲ  ２Ｍ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図１５】ａ）レプチン結合ドメイン（ＬＢＤ）は、発現ベクターｐＳｅｃＴａｇの中にライゲーションされて、ｐＳｅｃＴａｇｌｉｎｋＳＳＬＢＤを生成する。ｂ）レプチンは、ｐＳｅｃＴａｇｌｉｎｋＳＳＬＢＤの中にライゲーションされて、ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ１（ｌｍ）を生成する。ｃ）ＤＮＡは、合成され、ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ１（ｌｍ）の中にライゲーションされて、（Ｇ４Ｓ）５を導入する。
【図１６】レプチンＬＲ融合物を発現するＣＨＯ細胞からの培地のウェスタンブロットを示す図である。レーンの内容物は、１、２Ａ１発現；２、２Ｂ１発現；３、２Ｄ１発現；４、マーカー（２０、２５、３７、５０、７５、１００、１５０、２００ｋＤａ）とする。ウェスタンブロットは、レプチンに対する抗体を用いてプローブした。
【図１７】ａ）レプチン受容体細胞外ドメイン（ＯｂＲｅｘ）は、発現ベクターｐＳｅｃＴａｇの中にライゲーションされて、ｐＳｅｃＴａｇｌｉｎｋＳＳＯｂＲｅｘを生成する。ｂ）レプチンは、ｐＳｅｃＴａｇｌｉｎｋＳＳＯｂＲｅｘの中にライゲーションされて、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ１（ｌｍ）を生成する。ｃ）ＤＮＡは、合成され、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ１（ｌｍ）の中にライゲーションされて、（Ｇ４Ｓ）５を導入する。
【図１８】ａ）ＰＣＲは、適した制限部位（プライマーＲ１〜４内に含有される）が側面に位置する、興味のある遺伝子から成るＤＮＡを生成するために使用した。ｂ）ＰＣＲ産物は、リンカー領域の両側に、適したベクターの中にライゲーションした。ｃ）構築物は、その後、適切なリンカーを導入するために修飾した。リンカーは、いかなる不要な配列（つまり非天然制限部位）も含有しなかった。
【図１９】ａ）オリゴヌクレオチドは、特有のオーバーラップを有する部分的に二本鎖の領域を形成するように設計し、アニールし、処理した場合、リガンドおよび受容体にアニールするであろう隣接領域を有するリンカーをコードするであろう。ｂ）ＰＣＲは、ＬＲ融合遺伝子を産生するために「メガプライマー」ならびに末端プライマー（Ｒ１およびＲ２）を使用して行った。Ｒ１およびＲ２プライマーは、標的ベクターの中へのライゲーションに有用な隣接制限部位を導入するように設計した。
【図２０】完全長レプチン受容体のアミノ酸配列を示す図である。
【図２１】レプチンＬＲ融合構築物の模式図を示す図である。
【図２２】２Ａ１、２Ｂ１、および２Ｄ１構築物を発現するＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ安定細胞株の免疫ブロット分析を示す図である。レーンＭ＝マーカー（２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、および２０ｋＤａ）；レーン１＝ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎコントロール細胞、レーン２＝２Ａ１発現培地、レーン３＝２Ｂ１発現培地、レーン４＝２Ｄ１発現培地。
【図２３】２Ａ１Ｅｃｏｐｔの発現を示す図である。Ａ）２Ａ１Ｅｃｏｐｔ発現を示すクーマシー染色ゲル。レーンＭ＝マーカー（２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、２０、および１５ｋＤａ）；レーン１＝誘発時の発現、レーン２＝誘発４時間後の発現、レーン３＝誘発後、一晩のインキュベーションの後の発現、レーン４＝２Ａ１Ｅｃｏｐｔ発現細胞の不溶性画分、レーン５＝２Ａ１Ｅｃｏｐｔ発現細胞の可溶性画分。Ｂ）２Ａ１Ｅｃｏｐｔ発現の免疫ブロット。レーンＭ＝マーカー（２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、２０、および１５ｋＤａ）；レーン１＝誘発時の発現、レーン２＝誘発４時間後の発現、レーン３＝誘発後、一晩のインキュベーションの後の発現。
【図２４】２Ａ１Ｅｃｏｐｔの封入体調製物のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。レーンＭ＝マーカー（２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、２５、および２０ｋＤａ）；レーン１＝大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）：２Ａ１Ｅｃｏｐｔ全細胞、レーン２＝細胞溶解物−可溶性画分、レーン３＝細胞溶解物−不溶性画分、レーン４〜７＝２％デオキシコール酸ナトリウム洗浄１〜４、レーン８〜９＝水洗浄１〜２、レーン１０＝封入体調製物。
【図２５】２Ａ１を発現するＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞からの粗製培地のインビトロバイオアッセイを示す図である。２Ａ１を発現するＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞からの粗製培地（１０×濃縮物）を、レプチンインビトロバイオアッセイにおいて細胞を刺激するために使用した。培地はアゴニスト活性を与えたが、２Ａ１を発現しない細胞からの培地は活性を与えなかった（黒色のカラム）。
【図２６】精製２Ａ１Ｅｃｏｐｔのインビトロバイオアッセイを示す図である。免疫ブロットにおいて２Ａ１Ｅｃｏｐｔの適切なサイズで単一のバンドを示したリフォールディングした２Ａ１Ｅｃｏｐｔ試料を、レプチンインビトロバイオアッセイにおいて細胞を刺激するために使用した。試料はアゴニスト活性を示した。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明の一態様によれば、レプチン受容体ポリペプチドの少なくとも１つのレプチン結合ドメインに直接または間接的に連結されるレプチンポリペプチドを含む、レプチンの活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子が提供される。
【０００７】
本発明の一態様によれば、レプチン受容体ポリペプチドの少なくとも１つのレプチン結合ドメインに直接または間接的に連結されるレプチンポリペプチドのアミノ酸配列またはその活性部分を含む融合ポリペプチドが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述の融合ポリペプチドは、２つのレプチン結合ドメインを含む。
本発明のさらなる好ましい実施形態において、上述の融合ポリペプチドは、免疫グロブリン様ドメインを含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述の融合ポリペプチドは、少なくとも１つのサイトカイン様相同性ドメイン、好ましくは２つのサイトカイン様相同性ドメインを含む。
【０００８】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、上述の融合ポリペプチドは、少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ結合ドメイン、好ましくは２つのフィブロネクチンＩＩＩ結合ドメインを含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述の融合ポリペプチドは、配列番号４１のアミノ酸残基４２８〜５３５を含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述の融合ポリペプチドは、配列番号４１のアミノ酸残基５３６〜６３５を含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述の融合ポリペプチドは、配列番号４１のアミノ酸残基３２６〜４３７を含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述の融合ポリペプチドは、配列番号４１のアミノ酸残基６２〜１７８を含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述の融合ポリペプチドは、配列番号４１のアミノ酸残基２３５〜３２５を含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述の融合ポリペプチドは、配列番号４１のアミノ酸残基６３９〜７３２を含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述の融合ポリペプチドは、配列番号４１のアミノ酸残基７３４〜８２９を含む。
本発明のさらなる好ましい実施形態において、上述の融合ポリペプチドは、配列番号４１のアミノ酸残基４２８〜６３５を含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述のレプチンポリペプチドは、レプチン受容体の少なくとも１つのレプチン結合ドメインに連結され、上述のレプチンポリペプチドは、上述の融合ポリペプチドにおいて上述のレプチン結合ドメインのアミノ末端側に位置する。
本発明の好ましい実施形態において、上述のレプチンポリペプチドは、レプチン受容体の少なくとも１つのレプチン結合ドメインに連結され、上述のレプチンポリペプチドは、上述の融合ポリペプチドにおいて上述のレプチン結合ドメインのカルボキシル末端側に位置する。
本発明の好ましい実施形態において、上述のレプチンポリペプチドは、ペプチドリンカー、好ましくは柔軟なペプチドリンカーによって、レプチン受容体ポリペプチドの少なくとも１つの結合ドメインに連結される。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態において、上述のペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの少なくとも１コピーを含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述のペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの２、３、４、５、６、７、８、９または１０コピーを含む。
好ましくは、上述のペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの６コピーから成る。
好ましくは、上述のペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの８コピーから成る。
本発明の代替の実施形態において、上述のポリペプチドは、ペプチド連結分子を含まず、レプチンポリペプチドおよびレプチン受容体ポリペプチドの少なくとも１つのレプチン結合ドメインの直接的な融合物である。
本発明の一態様によれば、
ｉ）配列番号３で表される核酸配列、
ｉｉ）配列番号５で表される核酸配列、
ｉｉｉ）配列番号７で表される核酸配列、
ｉｖ）配列番号９で表される核酸配列、
ｖ）配列番号１１で表される核酸配列、
ｖｉ）配列番号１３で表される核酸配列、
ｖｉｉ）配列番号１５で表される核酸配列、
ｖｉｉｉ）配列番号１７で表される核酸配列、
ｉｘ）配列番号１９で表される核酸配列、
ｘ）配列番号２１で表される核酸配列、
ｘｉ）配列番号２３で表される核酸配列、
ｘｉｉ）配列番号２５で表される核酸配列、
ｘｉｉｉ）配列番号２７で表される核酸配列
から選択される核酸配列を含む核酸分子、
配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５または２７とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、レプチン受容体調節活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子が提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、レプチンアゴニストをコードする。
本発明の代替の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、レプチンアンタゴニストをコードする。
核酸分子のハイブリダイゼーションは、２つの相補的な核酸分子が、互いに、かなりの量の水素結合を起こす場合に起こる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、核酸を取り囲む環境条件、ハイブリダイゼーション方法の性質、ならびに使用される核酸分子の組成および長さによって変動し得る。特定の程度のストリンジェンシーを達成するのに必要とされるハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２００１）およびＴｉｊｓｓｅｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  第Ｉ部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３）において説明される。Ｔｍは、核酸分子の所与の鎖の５０％が、その相補鎖にハイブリダイズする温度である。以下は、ハイブリダイゼーション条件の例示的なセットであり、限定的なものではない。
非常に高度なストリンジェンシー（少なくとも９０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：１６時間、６５℃で５×ＳＳＣ
２度洗浄：それぞれ１５分間、室温（ＲＴ）で２×ＳＳＣ
２度洗浄：それぞれ２０分間、６５℃で０．５×ＳＳＣ
高度なストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：１６〜２０時間、６５℃〜７０℃で５×〜６×ＳＳＣ
２度洗浄：それぞれ５〜２０分間、ＲＴで２×ＳＳＣ
２度洗浄：それぞれ３０分間、５５℃〜７０℃で１×ＳＳＣ
低度なストリンジェンシー（少なくとも５０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：１６〜２０時間、ＲＴ〜５５℃で６×ＳＳＣ
少なくとも２度洗浄：それぞれ２０〜３０分間、ＲＴ〜５５℃で２×〜３×ＳＳＣ。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号３で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号５で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号７で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号９で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号１１で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号１３で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号１７で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号１９で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号２１で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号２３で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号２５で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号２７で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の一態様によれば、本発明による核酸によってコードされるポリペプチドが提供される。
本発明のさらなる態様によれば、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０で表されるアミノ酸配列を含むまたはそれから成るポリペプチドが提供される。
本発明の一態様によれば、２つのポリペプチドから成るホモ二量体であって、上述のポリペプチドはそれぞれ、
ｉ）レプチンまたはその受容体結合ドメインを含む第１の部分と、ペプチド連結分子によってそれと任意選択で連結される
ｉｉ）レプチン受容体の少なくとも１つのレプチン結合ドメインまたはその部分を含む第２の部分と
を含むホモ二量体が提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述のホモ二量体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０を含むまたはそれから成る２つのポリペプチドを含む。
本発明のさらなる態様によれば、本発明による核酸分子を含むベクターが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述のベクターは、本発明による核酸分子を発現するように適合された発現ベクターである。
本発明による（１つまたは複数の）核酸を含むベクターは、特に、ベクターが、安定した形質移入のための、ゲノムの中への組換えのために細胞の中に核酸を導入するために使用されることになっている場合、プロモーターまたは他の調節配列を含む必要はない。好ましくは、ベクターにおける核酸は、適切なプロモーターまたは宿主細胞における転写のための他の調節エレメントに作動可能に連結される。ベクターは、複数の宿主において機能する二機能性発現ベクターであってもよい。「プロモーター」によって、転写開始部位から上流の、転写に必要とされる調節領域をすべて含有するヌクレオチド配列が意味される。適したプロモーターは、真核細胞または原核細胞における発現のための構成的、組織特異的、誘発性、発生的、または他のプロモーターを含む。「作動可能に連結される」は、転写がプロモーターから開始されるように適切に位置し、配向する同じ核酸分子の一部としてつながれていることを意味する。プロモーターに作動可能に連結されるＤＮＡは、プロモーターの「転写開始調節下に」ある。
好ましい実施形態において、プロモーターは、構成的、誘発性、または調節可能プロモーターである。
本発明のさらなる態様によれば、本発明による核酸分子またはベクターを用いて形質移入または形質転換される細胞が提供される。
好ましくは、上述の細胞は、真核細胞である。その代わりに、上述の細胞は、原核細胞である。
本発明の好ましい実施形態において、上述の細胞は、真菌細胞（たとえばピキア種、サッカロミセス種、アカパンカビ種）、昆虫細胞（たとえばスポドプテラ種）、哺乳動物細胞（たとえばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞）、植物細胞から成る群から選択される。
本発明のさらなる態様によれば、賦形剤または担体を含む、本発明によるポリペプチドを含む医薬組成物が提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述の医薬組成物は、さらなる治療薬と組み合わせられる。
投与される場合、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる調製物で投与される。そのような調製物は、薬学的に許容できる濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性の担体、および任意選択で他の治療薬を規定どおりに含有していてもよい。
本発明の医薬組成物は、注射を含む、任意の通常の経路によって投与することができる。投与および適用は、たとえば経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、関節内、皮下、局所（目）、皮膚（たとえば皮膚または粘膜へのクリーム状の脂質可溶性挿入物）、経皮、鼻腔内であってもよい。
本発明の医薬組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、単独でまたはさらなる薬もしくは共力性の薬剤と共に所望の応答をもたらす医薬品／組成物の量である。これは、一時的に疾患の進行を単に遅らせることを伴ってもよいが、より好ましくは、それは、持続的に疾患の進行を食い止めることを伴う。これは、ルーチン的な方法によってモニターすることができるまたは診断方法に従ってモニターすることができる。
対象に投与される医薬組成物の用量は、異なるパラメーターに従って、特に、使用される投与のモードおよび対象の状態（つまり年齢、性別）に従って選ぶことができる。投与される場合、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる量および薬学的に許容できる組成物で適用される。医薬で使用される場合、塩は、薬学的に許容できるはずであるが、薬学的に許容できない塩は、その薬学的に許容できる塩を調製するために好都合に使用されてもよく、本発明の範囲から除外されない。そのような薬理学的におよび薬学的に許容できる塩は、以下の酸から調製されるものを含むが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、およびその他同種のもの。さらに、薬学的に許容できる塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、またはカルシウム塩などのようなアルカリ金属塩またはアルカリ土類塩として調製することができる。
医薬組成物は、所望される場合、薬学的に許容できる担体と組み合わせられてもよい。本明細書において使用されるような用語「薬学的に許容できる担体」は、ヒトへの投与に適した１つまたは複数の適合性の固体または液体の増量剤、希釈剤、またはカプセル化する物質を意味する。用語「担体」は、適用を容易にするために有効成分が組み合わせられる天然または合成の有機または無機成分を示す。医薬組成物の構成成分はまた、所望の医薬品効力を実質的に損なうであろう相互作用がない方法で本発明の分子とおよび互いに混合することもできる。
医薬組成物は、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、および塩中のリン酸を含む適した緩衝剤を含有していてもよい。
医薬組成物はまた、任意選択で、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、およびチメロサールなどのような適した防腐剤を含有していてもよい。
医薬組成物は、単位剤形で好都合に与えられてもよく、薬学の技術分野においてよく知られている方法のいずれかによって調製されてもよい。方法はすべて、活性作用物質を、１つまたは複数の補助成分を構成する担体と結合させるステップを含む。一般に、組成物は、活性化合物を、液体の担体、微粉化した固体の担体、またはその両方と均一におよび完全に結合させることならびにその後、必要であれば、産物を成形することによって調製される。
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤、ロゼンジなどのように、別々の単位として与えられてもよく、それぞれが、所定の量の活性化合物を含有する。他の組成物は、シロップ剤、エリキシル剤、または乳剤などのような、水性の液体または非水系の液体中の懸濁剤を含む。
非経口投与に適した組成物は、好ましくは、レシピエントの血液と等張である滅菌した水性または非水系の調製物を好都合に含む。この調製物は、適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、知られている方法に従って製剤されてもよい。滅菌注射調製物はまた、たとえば１，３−ブタンジオール中の液剤のように、無毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶剤中の滅菌注射液剤または懸濁剤であってもよい。用いられてもよい許容できる溶剤の中には、水、リンガー溶液、および等張食塩水がある。さらに、滅菌した不揮発性油は、溶剤または懸濁化剤として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含む任意の無刺激の不揮発性油が用いられてもよい。さらに、オレイン酸などのような脂肪酸は、注射剤の調製物において使用されてもよい。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に適した担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて見つけることができる。
本発明のさらなる態様によれば、レプチンアゴニストの投与が有効であろう状態に罹患しているヒト対象を治療するための方法であって、本発明による少なくとも１つのポリペプチドの有効量を投与するステップを含む方法が提供される。
本発明の好ましい方法において、上述の状態は、肥満である。
本発明のさらなる好ましい方法において、上述の状態は、肥満関連性の状態である。
本発明の好ましい方法において、上述の肥満関連性の状態は、ＩＩ型糖尿病である。
本発明の好ましい方法において、上述の肥満関連性の状態は、心疾患である。
本発明の代替の好ましい方法において、上述の状態は、免疫抑制である。
本発明のさらなる態様によれば、レプチンアンタゴニストの投与が有効であろう状態に罹患しているヒト対象を治療するための方法であって、本発明による少なくとも１つのポリペプチドの有効量を投与するステップを含む方法が提供される。
本発明の好ましい方法において、上述の状態は、食欲不振症である。
本発明のさらなる好ましい方法において、上述の状態は、自己免疫疾患である。  本発明の好ましい方法において、上述の自己免疫疾患は、多発性硬化症、１型糖尿病、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性肝炎、慢性関節リウマチ、自己免疫性大腸炎、クローン病、セリアック病、自己免疫性腎炎、自己免疫性ニューロパチー（ギランバレー）、脳障害（ラスムッセン）、線維化肺胞炎から成る群から選択される。
本発明の好ましい方法において、上述のポリペプチドは、静脈内に投与される。
本発明の代替の好ましい方法において、上述のポリペプチドは、皮下に投与される。
本発明のさらなる好ましい方法において、上述のポリペプチドは、２日間隔で投与され、好ましくは、上述のポリペプチドは、１週、２週、または１か月間隔で投与される。
本発明のさらなる態様によれば、本発明によるポリペプチドまたは二量体に結合するモノクローナル抗体が提供される。
好ましくは、上述のモノクローナル抗体は、ポリペプチドまたは二量体に結合するが、レプチンまたはレプチン受容体にそれぞれ特異的に結合しない抗体である。
モノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドを含む二量体のいずれかによって提示される立体構造抗原（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）に結合する。
本発明のさらなる態様において、本発明によるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製するための方法であって、
ｉ）本発明による少なくとも１つのポリペプチドを含む免疫原を用いて免疫応答性哺乳動物を免疫するステップ、ｉｉ）免疫された免疫応答性哺乳動物のリンパ球を骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成するステップ、
ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体を、（ｉ）のポリペプチドに対する結合活性についてスクリーニングするステップ、
ｉｖ）ハイブリドーマ細胞を培養して、上述のモノクローナル抗体を量産および／または分泌するステップ、ならびに
ｖ）培養上清からモノクローナル抗体を回収するステップを含む方法が提供される。
好ましくは、上述の免疫応答性哺乳動物は、マウスである。その代わりに、上述の免疫応答性哺乳動物は、ラットである。
ハイブリドーマ細胞を使用するモノクローナル抗体の産生は、当技術分野においてよく知られている。モノクローナル抗体を産生するために使用される方法は、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６、４９５〜４９７ページ（１９７５）におけるＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎならびにＤｏｎｉｌｌａｒｄおよびＨｏｆｆｍａｎ、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖ．ＩＩ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ編、１９８１における「Ｂａｓｉｃ  Ｆａｃｔｓ  ａｂｏｕｔ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」によって開示され、これらは、参照によって組み込まれる。
本発明のさらなる態様によれば、本発明による方法によって得られるまたは入手可能なハイブリドーマ細胞株が提供される。
本明細書の説明および請求項の全体にわたって、その用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」および用語の変化形、たとえば「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「〜を含むが、これらに限定されない」を意味し、他の部分、添加剤、構成成分、整数、またはステップを除外することを意図しない（および除外しない）。
本明細書の説明および請求項の全体にわたって、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、明細書は、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、複数および単数を企図するものとして理解されたい。
本発明の特定の態様、実施形態、または実施例に関連して記載される特色、整数、特徴、化合物、化学的部分、または化学基は、矛盾しない限り、本明細書において記載される他の態様、実施形態、または実施例に適用可能であることが理解されたい。
本発明の実施形態は、ここで、ほんの一例として、以下の図に関連して記載することとする。
表１は、ＬＲ融合物名称を示す表である。
表２は、レプチン受容体に対する抗体を使用して、ＥＬＩＳＡによって決定されるようなレプチンＬＲ融合物の発現レベルを示す表である（ｎｄ＝検出できず）。
材料および方法
インビトロ試験  レプチンの活性を検出し、評価するためのインビトロの方法は、当技術分野において知られている。たとえばＬｉｕら（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９７）１３８、８：３５４８〜３５５４ページ）、Ｗｈｉｔｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９７）２７２（７）：４０６５〜４０７１ページ）、およびＭａａｍｒａら（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２００７）１４２（１０）：４３８９〜４３９３ページ）を参照されたい。これらは、それぞれ、とりわけ、細胞ベースのアッセイにおけるレプチン受容体の発現を記載する。
さらに、レプチンＬＲ融合物は、デュアルルシフェラーゼバイオアッセイを使用して、インビトロ活性について試験した。手短かに言えば、ＭＣＦ−７哺乳動物細胞を、ＳＩＥ、レプチン受容体（ＯｂＲ）、ＳＴＡＴ３によって誘発されるホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼを発現するプラスミドを用いて形質移入した（後者の３つのタンパク質は恒常的に発現される）。２４時間後に、細胞は、レプチンＬＲ融合物を用いて６時間刺激する。細胞を溶解し、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。これは、ＬＲ融合物によるレプチン受容体の刺激に比例する。恒常的に発現されるウミシイタケルシフェラーゼの活性でこの値を割ることによって、実験誤差について補正した活性を得る。
インビボ試験
インビボ動物モデルは、当技術分野において知られている。ｏｂ／ｏｂマウスモデル（Ｚｈａｎｇら  Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７２：４２５〜４３２ページ）は、レプチン突然変異についてホモ接合性であり、レプチンのアゴニストおよびアンタゴニストの活性を評価するために使用されてきた。Ｃｈｅｈａｂら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９６）１２：３１８〜３２０ページ）、Ｌｏｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９４：８９７〜９０１ページ）、およびＰｅｌｌｙｍｏｕｎｔｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２６９：５４０〜５４２ページ）を参照されたい。
免疫試験
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体へのリガンドまたは受容体の結合を測定するイムノアッセイは、当技術分野において知られている。市販で入手可能な抗体は、試料におけるリガンドまたは受容体を検出するためにおよびまた競合的阻害研究における使用のためにも入手可能である。たとえばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、Ａｂｃａｍ  ＰＬＣを参照されたい。
融合タンパク質の組換え産生
融合タンパク質の構成成分は、リガンドまたは受容体にアニールし、標的ベクターの中にクローニングするための適した制限部位を導入するように設計したプライマーを使用して、ＰＣＲによって生成した（図Ｘ１ａ）。ＰＣＲのための鋳型は、標的遺伝子を含み、ＩＭＡＧＥクローン、ｃＤＮＡライブラリー、または特注合成遺伝子から得た。適切な隣接制限部位を有するリガンドおよび受容体の遺伝子を合成したら、これらは、その後、標的ベクターにおけるリンカー領域の両側にライゲーションした（図Ｘ１ｂ）。構築物は、その後、リンカー領域の両側の２つの特有の制限部位の間への特注合成長のＤＮＡの挿入によって、ｓｓＤＮＡ修飾技術によるリンカー領域の変更によって、適した制限部位の間へのプライマーデュプレックス／マルチプレックスの挿入によって、またはＰＣＲ修飾によって、隣接制限部位を有していない適切なリンカーを含有するように修飾した（図Ｘ１ｃ）。
その代わりに、最適なリガンドまたは受容体のドメインにアニールするように設計した隣接配列を有するリンカーを、オリゴヌクレオチドデュプレックスを作製することによって、最初に合成し、これを、二本鎖のＤＮＡを生成するように処理した（図Ｘ２ａ）。その後、「メガプライマー」としてのリンカー配列、「メガプライマー」がアニールするリガンドおよび受容体の反対側の末端に対して設計したプライマーを使用し、鋳型としてのリガンドおよび受容体を用いてＰＣＲを行った。末端プライマーは、最適な発現ベクターへのライゲーションに適した制限部位を用いて設計した（図Ｘ２ｂ）。
融合タンパク質の発現および精製
発現は、適した系（たとえば哺乳動物ＣＨＯ細胞および大腸菌など）において実行し、これは、ＬＲ融合遺伝子を生成したベクターに依存した。発現は、その後、１つまたは複数のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、未変性ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡを含むことができる多種多様の方法を使用して分析した。
適したレベルの発現が達成されたら、ＬＲ融合物は、精製および後の分析のための十分なタンパク質を産生するためにより大規模で発現させた。
精製は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、サイズ排除、および／またはアフィニティークロマトグラフィーなどのような１つまたは複数のクロマトグラフィー手順の適した組み合わせを使用して実行した（ニッケル／コバルト樹脂、抗体固定化樹脂、および／またはリガンド／受容体固定化樹脂を使用）。
精製タンパク質は、１つまたは複数のブラッドフォードアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、未変性ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡを含むことができる、多種多様の方法を使用して分析した。
ＬＲ融合物の特徴づけ
変性ＰＡＧＥ、未変性ＰＡＧＥゲル、およびウェスタンブロッティングは、融合ポリペプチドを分析するために使用し、ウェスタンブロッティングは、ＬＲ融合物に対して非立体構造感受性の抗体を用いて行った。未変性溶液状態の分子量情報は、ＳｕｐｅｒｏｓｅＧ２００分析カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーおよび分析超遠心法などのような技術から得ることができる。
ＬＲ融合物の構築
２Ａ１、２Ｂ１および２Ｄ１遺伝子は、Ｏｂ、ＬＢＤ、ＯｂＲＥｃ、および両端に特有の適合性の制限部位を有するリンカー構成成分を生成することによって合成し、それらを相互にライゲーションして、完全な遺伝子を形成した。２Ｂ１および２Ｄ１における外来配列（つまり制限部位）は、Ｏｂ、ＬＢＤ、およびＯｂＲＥｃ遺伝子の内の特有の制限部位の間に特注合成ＤＮＡ断片（Ｇｅｎｅｃｕｓｔ、Ｆｒａｎｃｅ）をライゲーションすることによって続いて除去し、これにより２Ｂ２および２Ｄ２を生成した。２Ａ１Ｅｃｏｐｔ遺伝子は、特注ＤＮＡ合成（Ｇｅｎｅｃｕｓｔ、Ｆｒａｎｃｅ）によって生成し、ｐＥＴ２１ａ＋の中にライゲーションした。２Ａ１Ｅｃｏｐｔ配列は、大腸菌における発現のためにコドン最適化されており、Ｃ末端Ｈｉｓタグを有する。
ＬＲ融合物の発現
哺乳動物発現：
安定細胞株は、形質移入試薬としてＦｕｇｅｎｅ−６を使用して、６ウェルプレートにおいて改良ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎベクターｐＳｅｃＴａｇ−Ｖ５／ＦＲＴ−Ｈｉｓｔを使用して生成した。ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞は、発現ベクターおよび細胞染色体の「ホット−スポット」へのＬＲ融合物遺伝子の組換えを引き起こす酵素であるｆｌｐリコンビナーゼを発現するプラスミドであるｐＯＧ４４を用いて同時形質移入した。ハイグロマイシンＢは、陽性組換え体を有する細胞を選択するために使用した。
安定細胞株が確立されたら、それらを、５０〜７０％の培養密度で７５ｃｍ２培養プレート上で成長させ、培地を無血清培地に交換した。培養物を、さらに２〜４日間、インキュベートし、その後、培地試料を採取した。これらを、１３％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で流し、免疫ブロッティングのためにＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＢＳ＋０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０中の５％（ｗ／ｖ）牛乳タンパク質中でブロックした後に、試料検出は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合二次抗体と共に特異的抗レプチン抗体を使用して実行した。視覚化は、ＨＲＰ検出キットを使用する、写真用フィルム上での化学発光によるものとした。
哺乳動物系からのＬＲ融合物の発現を示す免疫ブロットを図２２に示す。
大腸菌発現：
ｐＥＴ２１ａ＋：２Ａ１Ｅｃｏｐｔを、化学的コンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。その後、２Ａ１Ｅｃｏｐｔを発現するクローンは、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補足したＬＢ培地において成長させ、室温で、平台型の振盪機上で成長させた。誘発は、０．４のＯＤ６００で１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて行い、培養物を一晩成長させた。その後、細胞を摘出し、溶解し、その後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で流し、クーマシー染色したまたは免疫ブロットした。
大腸菌系からのＬＲ融合物の発現を示す免疫ブロットを図２３に示す。
ＬＲ融合物の精製
大腸菌が発現したＬＲ融合物の精製（２Ａ１Ｅｃｏｐｔ）
２Ａ１Ｅｃｏｐｔは、プラスミドｐＥＴ２１ａ＋：２Ａ１Ｅｃｏｐｔから大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において発現された。
２Ａ１Ｅｃｏｐｔは、Ｎｉ−Ｐｒｏｂｏｎｄ樹脂カラムを使用して精製した。溶解した細胞の不溶性画分は、２％デオキシコール酸ナトリウムを用いて４回および蒸留水を用いて２回洗浄して、封入体調製物を得た。このステップにより、ほとんどの混入タンパク質を除去し、２Ａ１Ｅｃｏｐｔについて＞８０％の純度を得た；図２４。
統計
２つのグループは、それらの分散が正常に分布した場合、スチューデント検定を用いてまたは正常に分布しなかった場合、スチューデント−サタースウェイト検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔｅ’ｓ  ｔｅｓｔ）によって比較した。分布は、Ｆ検定を用いて試験した。一元配置ＡＮＯＶＡは、３つ以上のグループの平均値を比較するために使用し、有意水準がｐ＜０．０５であった場合、個々の比較はダネット検定を用いて行った。統計的検定はすべて、５％の有意水準で両側とし、欠測値に対するインピュテーションは行わなかった。
実施例１：２Ａ１
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩが側面に位置する、レプチン受容体（ＯｂＲ）のレプチン結合ドメイン（ＬＢＤ）ドメインをコードするＤＮＡをＰＣＲによって産生した。その後、これを、改良ｐＳｅｃＴａｇ−ＦＲＴ−Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯベクターの中にライゲーションして、ｐＳｅｃＴａｇＬｉｎｋＳＳＬＢＤを産生した（図１５ａ）。ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩが側面に位置する、レプチンをコードするＤＮＡを、プライマー；ＮｈｅＯｂｓｓＦ（５’−ｇｇｇａａａｇｃｔａｇｃｃａｃｃａｔｇｃａｔｔｇｇｇｇａａｃｃｃｔｇｔｇｃｇ−３’）およびＯｂＢａｍＲ（５’−ｇｇｇａａａｇｇａｔｃｃｇｃａｃｃｃａｇｇｇｃｔｇａｇｇｔｃｃ−３’）を使用してＰＣＲによって産生した。これを、ｐＳｅｃＴａｇＬｉｎｋＳＳＬＢＤの中にライゲーションして、ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ１（ｌｍ）を産生した（図１５ｂ）。リンカー領域は、ＡｌｅＩおよびＮｓｉＩの制限部位の間に特注合成し、これをｐＳｅｃＴａｇ２Ａ１（ｌｍ）に挿入して、ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ１ｓｔｏｐを得た（図１５ｃ）。ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ１ｓｔｏｐをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の中に形質移入し、一時的なおよび安定した発現細胞株を作製した。しかしながら、レプチンに対する抗体を使用する発現培地のウェスタンブロットは、２Ａ１が発現したことを示した（図１６）。２Ａ１はまた、大腸菌細胞においても発現した。２Ａ１のアミノ酸配列は、大腸菌コドン使用頻度について最適化して翻訳し戻した。コドン最適化遺伝子（２Ａ１Ｅｃｏｐｔ）を特注で遺伝子合成し、その後、ｐＥＴ２１ａ＋発現ベクターの中に挿入し、タンパク質を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞から発現した。
実施例２：２Ｂ１
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩが側面に位置する、レプチン受容体細胞外ドメイン（ＯｂＲｅｘ）をコードするＤＮＡをＰＣＲによって産生した。その後、これを、改良ｐＳｅｃＴａｇ−ＦＲＴ−Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯベクターの中にライゲーションして、ｐＳｅｃＴａｇＬｉｎｋＳＳＯｂＲｅｘを産生した（図１７ａ）。ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩが側面に位置する、レプチンをコードするＤＮＡを、プライマー；ＮｈｅＯｂｓｓＦ（５’−ｇｇｇａａａｇｃｔａｇｃｃａｃｃａｔｇｃａｔｔｇｇｇｇａａｃｃｃｔｇｔｇｃｇ−３’）およびＯｂＢａｍＲ（５’−ｇｇｇａａａｇｇａｔｃｃｇｃａｃｃｃａｇｇｇｃｔｇａｇｇｔｃｃ−３’）を使用してＰＣＲによって産生した。これを、ｐＳｅｃＴａｇＬｉｎｋＳＳＯｂＲｅｘの中にライゲーションして、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ１（ｌｍ）を産生した（図１７ｂ）。リンカー領域は、ＡｌｅＩおよびＢｓｔＢＩの制限部位の間に特注合成し、これをｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ１（ｌｍ）に挿入して、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ１ｓｔｏｐを得た（図１７ｃ）。ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ１ｓｔｏｐをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の中に形質移入し、一時的なおよび安定した発現細胞株を作製した。発現レベルは、ＯｂＲに対する抗体を使用するＥＬＩＳＡによって測定されるように、低度なｎｇ／ｍｌレベルであることが分かった（表２）。しかしながら、発現培地のウェスタンブロットが、より高度なレベルの発現が達成されたことを示唆するので（図１６）、これらの発現レベルは、ＥＬＩＳＡによって過小評価された可能性がある。
実施例３：２Ｄ１
ｐＳｅｃＴａｇ２Ｄ１ｓｔｏｐを、上記のｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ１ｓｔｏｐに類似する方法において合成した。ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ１ｓｔｏｐをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の中に形質移入し、一時的なおよび安定した発現細胞株を作製した。発現レベルは、ＯｂＲに対する抗体を使用するＥＬＩＳＡによって測定されるように、低度なｎｇ／ｍｌレベルであることが分かった（表２）。しかしながら、発現培地のウェスタンブロットが、より高度なレベルの発現が達成されたことを示唆するので（図１６）、これらの発現レベルは、ＥＬＩＳＡによって過小評価された可能性がある。
実施例４  インビトロバイオアッセイ結果
インビトロバイオアッセイは、刺激したＭＣＦ−７細胞の活性を測定するためにデュアルルシフェラーゼレポーター系を利用する。
ＭＣＦ−７細胞は、ＯｂＲ、ＳＴＡＴ５、ＳＩＥ、およびウミシイタケルシフェラーゼを発現するプラスミドを用いて形質移入した。ＯｂＲの活性化は、ＳＴＡＴ３およびＳＩＥを介して、ホタルルシフェラーゼの誘発性で、比例した発現を引き起こした。ウミシイタケルシフェラーゼは、恒常的に発現し、ホタルルシフェラーゼ活性測定を標準化するためのコントロールとして作用した。ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの両方は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびルミノメーターを使用して測定した。ウミシイタケルシフェラーゼ測定値でホタルルシフェラーゼ測定値を割ることにより補正された活性を得た（つまり、細胞密度および形質移入効率などのような試料の間の差異について補正）。その後、補正した活性を、非刺激細胞の活性で割り、「誘発倍数」値を得た。
２Ａ１（１０×濃縮物）および２Ａ１Ｅｃｏｐｔ（精製）の生物活性を、図２５および２６にそれぞれ示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９ａ）】
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【図１９ｂ）】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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