(57)【要約】  本発明の目的は、コリンアフィニティーを有するポリペプチドの使用に基づいて水溶液中で組換えタンパク質を分配、分離、及び精製する方法である。本発明は、所定の成分を含む２つの水溶液を混合し、最終的に密度の異なる二相に分割することができるという現象に基づく。コリンアフィニティーを有する上記ポリペプチドに融合したタンパク質は、相のうち一方に優先的に局在し、一方、細胞抽出物由来のタンパク質の大部分は逆相に移動する傾向がある。残った不要な材料を排除するための一連の洗浄操作の後、目的のタンパク質に結合したポリペプチドに対するアフィニティーを有する可溶性分子を添加することで、タンパク質の局在を逆転させることができる。本発明は、１又は別の相中における目的のタンパク質又はポリペプチドの存在を簡便に変更する方法を含み、それにより、高い収率及び純度グレードでのその精製を可能にする。本発明は、好ましくはコリン結合ドメインで標識された、組換えタンパク質を分離するための、経済的で、スケールの変更が可能な方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリンに対するアフィニティーを有するポリペプチド配列との融合タンパク質を分配又は分離する方法であって、
ａ）コリンに対するアフィニティーを有する配列との融合ポリペプチドを発現する細胞培養物又は細胞抽出物であって、前記配列が少なくともコリン結合性の構造的モチーフ（ＣＢＲ又は「コリン結合リピート」；ＰｆａｍコードＰＦ０１４７３）を含み、好ましくはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のアミダーゼＬｙｔＡのＣ末端ドメインの１つに由来するものである、細胞培養物又は細胞抽出物；
ｂ）前記抽出物又は培養物と、ポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）及び水中に５％超可溶の塩又はポリマーとの混合物であって、自然に２つの水相に分離する混合物；
ｃ）ポリエチレングリコール濃度のより高い相中への、コリンアフィニティーを有する前記配列との前記融合ポリペプチドの優先的濃縮
を特徴とする、方法。
【請求項２】
コリンの添加により、ＰＥＧが高濃度の相とは異なる相中に融合タンパク質が濃縮されていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記二成分系におけるＰＥＧの総濃度が３〜１５％であることを特徴とする、請求項１及び２に記載の方法。
【請求項４】
前記二成分系の前記第２の成分が、リン酸塩、クエン酸塩、硫酸塩、又はこれら３種類の塩の混合物を含むことを特徴とする、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
前記二成分系の前記第２の成分が、リン酸カリウムを濃度５〜１５％で含み、前記混合物のｐＨが６．０〜９．０の値であることを特徴とする、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項６】
前記二成分系の前記第２の成分が、デキストラン又は誘導体を５〜１０％の濃度で含み、混合物のｐＨが６．０〜９．０の値であることを特徴とする、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項７】
前記二成分系の前記第２の成分が、でんぷん又は誘導体を５〜１０％の濃度で含み、混合物のｐＨが６．０〜９．０の値であることを特徴とする請求項１〜３に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の方法であって、前記二成分系が、これらの請求項に記載の成分が添加された、請求項１に記載のコリンアフィニティーを有するポリペプチド配列との融合タンパク質を発現する細胞抽出物又は培養培地から構成されることを特徴とする、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞抽出物又は前記培養培地が、ハイブリドーマ、カビ、酵母、又は細菌の培養培地に由来することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記コリンアフィニティーペプチドとの前記融合タンパク質が、得られた二相系のＰＥＧを多く含む相に優先的に蓄積されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞抽出物又は培養培地に由来するもののＰＥＧを多く含む相に蓄積されないタンパク質を、ＰＥＧを多く含む相とは逆の相を除くことで除去することができることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、その後、除去されたのと同等の組成及び体積の溶液を添加し、次いで混合及び二相中へ分離し、その後請求項１１に従って混入タンパク質を新たに除去することを、混入タンパク質が定量的に排除されるまで繰り返すことのできるプロセスにおいて行うことを特徴とする、請求項１１に記載の方法
【請求項１３】
コリン結合ドメインを有する前記目的のポリペプチド又はタンパク質を精製された形態で得るために、前記目的のタンパク質を含むＰＥＧを多く含む相を直接使用することを特徴とする、請求項１０、１１、及び１２に記載の方法。
【請求項１４】
目的のタンパク質を含むＰＥＧを多く含む相を、水相中で目的の反応を触媒する機能を有する任意の種類の酵素リアクター中で用いて、前記ＰＥＧ濃度のより高い相とは異なる相中に産物を回収することができることを特徴とする、請求項１０、１１、及び１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記洗浄後に、添加される前記新鮮な溶液がコリンを５０ｍＭ超の濃度で含み、コリンアフィニティーを有するペプチドとの融合タンパク質のかなりの部分がＰＥＧを多く含まない相へと移動されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記目的のタンパク質を含むＰＥＧを多く含む相が、水相中で目的の反応を触媒する機能を有する任意の種類の酵素リアクター中で使用され、５０ｍＭを超えるコリンの添加によりＰＥＧを多く含まない相中に保持されているために前記生体触媒を回収することができることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記目的のタンパク質を含むＰＥＧを多く含まない相を、このタンパク質を精製された形態で得るために直接使用することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記目的のタンパク質を含むＰＥＧを多く含まない相が使用のために分取され、系中において、好ましくは除去されたものと組成及び体積が同様である、一定量の溶液により置換され、その後混合及び二相へ分離することを、ＰＥＧを多く含む相から前記目的のタンパク質が定量的に溶出されるまで繰り返すことのできるプロセスにおいて行うことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
以下の要素の少なくともいくつかを含む、請求項１〜１８のいくつかに記載のタンパク質精製法を実施するための産物：
ａ．塩濃度が５％を超える溶液
ｂ．ＰＥＧ濃度が５％を超える溶液
ｃ．濃度が５０ｍＭを超えるコリンの濃縮溶液。
【請求項２０】
タンパク質、ポリペプチド、又は任意のタンパク質誘導体を分離及び精製するための、請求項１〜１８に記載の方法の使用。
【請求項２１】
任意のコリン結合ドメインに融合した酵素が仲介する生化学的反応の産物を分離するための、請求項１〜１６に記載の方法及び前記請求項の産物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性ポリマーに対するさらなるアフィニティーを示し、一方が前記ポリマーを含む二相水性系中におけるポリペプチド又は融合タンパク質の非対称な分布を決定する、コリン結合性のポリペプチド配列を有するポリペプチド又は融合タンパク質の分離方法に関する。本方法を用いると、目的のポリペプチド又はタンパク質の精製に用いることができる簡便なプロセスで、細胞抽出物中に存在する複雑なタンパク質混合物から融合タンパク質を迅速に分離することができる。精製プロセスは、１又は複数の洗浄工程を含み、アフィニティーポリペプチドの天然リガンドを系に添加することで誘導される融合タンパク質分布の逆転により完了する。したがって、本発明を適用することができる分野は、工業的目的、農学的目的、治療的目的、又は生体臨床医学における診断目的や、生命科学分野における研究及び分析ツールとしてのみならず、生命工学的に関心のあるポリペプチド及びタンパク質の生成、分離、及び最終的な精製を含む。
【背景技術】
【０００２】
固体支持体中での酵素の固定化は、あらゆるタイプの生体内変換を行うための酵素リアクターの構築するように、クロマトグラフィー技術による精製を進めるための、通常の手法である（非特許文献１）。
【０００３】
そのために、多種多様な共有結合性及び非共有結合性の固定化システムが開発されてきた。確認された事例では、固体支持体との強力且つ特異的な相互作用を可能にするアフィニティーポリペプチド又は「タグ」と目的のタンパク質との融合物を利用することが有用である（非特許文献２及び３）。しかし、固体マトリックス中に酵素を固定化すると、しばしばタンパク質の特徴が構造レベル及び機能レベルで変化することが非常に多い。したがって、例えば支持体の物理化学的特性が、酵素相への基質の拡散又は移動相への生成物の拡散に影響を与え得る。これは酵素の速度定数を変化させ、多くの場合、プロセス効率を低下させ、いずれの場合にも、費用のかかる調整実験が必要となる。
【０００４】
一方、その工業的使用へとクロマトグラフィー法を拡張させるには、材料の圧縮性及びカラムに高圧をかける必要性から基本的に生じる一連の技術的困難が伴う。このため、近年、固体材料の使用に代わる溶液中での新規な方法が開発されている。この点で、水性二相系は、構造的に異なる２種類のポリマーの溶液の混合物又はポリマー（通常ポリエチレングリコール、すなわちＰＥＧ）と高濃度の塩の混合物により自然に形成される（非特許文献４〜６）。すぐ後に、どちらも水性である二相系が出現し、これらは平衡にあることが分かる。ポリマー−塩系では、一方の相がポリマーを多く含み、他方の相が塩を多く含むのに対し、２種類のポリマー混合物では、各相が２種類のポリマーの一方を多く含む。これらの混合物の化学物理的特性は広範に研究されており（非特許文献７）、相分離を引き起こす化合物の各々の濃度範囲を示すバイノーダルダイアグラムが作製されている。「タイライン（ｔｉｅ  ｌｉｎｅ）」と命名された線は、ひとたび分離した後の各相中の各ポリマーの最終濃度、および各相の相対体積を示す（非特許文献４）。水性二相系は生物学的材料の分離に非常に有用である（非特許文献８及び９）。これらは、生体適合性が高く、表面張力が低く（生体分子の分解を最小限にする）、充填及び産生の容量が大きいといった複数の利点を有し、これらは容易にスケールを変更することができる（非特許文献１０及び１１）。酵素触媒プロセスでは、酵素相と残部の間で物質（基質及び生成物）が移動し、これは酵素が固体表面上に吸着されている場合よりもはるかに促進される。
【０００５】
更に、これらは経済的な系であり、目的の分子の分配を向上させるための多くの要因を管理することができる。二相間のタンパク質の分配は、問題になっているタンパク質の電荷、サイズ、疎水性等の要因に依存し、一般的に予測の困難な問題である。実際、これらの系の市場への大々的な導入はタンパク質の分配の予測性が低いことで制限されている。しかし、目的のタンパク質と融合させたアフィニティーポリペプチド又は「タグ」を使用することで、１つの相又は別の相中へのそれらの位置をよりよく制御して誘導することができ、水性二相系中でのアフィニティーによる分配が実証されている。
【０００６】
公知のヘキサヒスチジン「タグ」を用いた有望な結果が示されている（非特許文献１２及び１３）。この系では、あらかじめ金属イオンを用いた共有結合により誘導された、ヒスチジン末端に融合されたタンパク質は主にＰＥＧ含有量の多い相へ向かう。同様に、アフィニティーによるそのような分配法におけるチロシン配列（非特許文献１４）又はトリプトファン配列（非特許文献１５）も研究されてきた。
【０００７】
コリン結合モジュール（ＣＢＭ、「Ｃｈｏｌｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅｓ」）は、種々の微生物中に存在するコリン結合タンパク質（ＣＢＰ）と名付けられたものの一部を形成するポリペプチドファミリーを構成する（非特許文献１６）。ＣＢＭはＣＢＭで、ループ−フォールドβ型の構造を形成する高度に保存された約２０アミノ酸の反復配列からなる（ＣＢＲつまり「コリン結合リピート」；Ｐｆａｍコード  ＰＦ０１４７３：非特許文献１７）、（非特許文献１８〜２０）。２つの連続するＣＢＲがコリン結合部位を形成する。ＣＢＭのコリン及びその構造的アナログへのアフィニティーにより（非特許文献２１）、これらのＣＢＭのうちいくつかを用いた効率的な融合タンパク質精製系の設計が可能になった（非特許文献２２）。
【０００８】
基本的に、この方法は、融合タンパク質を含む細胞抽出物を、ジエチルアミノエタノール（ＤＥＡＥ）のような第三級又は第四級のアミンで誘導体化した支持体に適用することからなる。このようにして固定化されたタンパク質は、その機能性を維持しており、コリンのような競合リガンドを添加することで容易に溶出することができる。したがって、ここで記載した方法は、ＬＹＴＡＧと命名されたアミダーゼＬｙｔＡのＣ末端ドメインを用いた以前の２つの特許（特許文献１及び２）の基礎となるものである。
【０００９】
この方法の利点のうち、特筆すべきは、系の特異性が高く、既に市販されている非常に多様な支持体（樹脂、紙、マルチウェルプレート等）を使用することができ、不適合性をほとんど示さず、また経済的な構成要素（支持体、コリン等）の使用、非毒性、及び関連する環境的不利益がない等の、工業レベルでバイオリアクター中において使用するための効率向上の点から考えて必要な特質を全て有することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】スペイン特許第２  ０３２  ７１７号明細書
【特許文献２】スペイン特許出願公開第２００７００２８１号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍｏｓｂａｃｈ，  Ｋ．，  ｅｄ．  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐａｒｔ  Ｂ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌ．  １３５．  １９８７
【非特許文献２】Ｕｈｌｅｎ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １９９２．  ３（４）：  ｐ．３６３−９
【非特許文献３】Ｗａｕｇｈ，  Ｄ．Ｓ．，  Ｍａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２００５．  ２３（６）：  ｐ．３１６−２０
【非特許文献４】Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｈ．Ｗ．ａ．Ｇ．，  ｅｄ．  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌ．  ２２８．  １９９４
【非特許文献５】Ｇｕａｎ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ：  Ｔｈｅｏｒｙ，  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．  Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９５．  ６７（６）：  ｐ．９５５−９６２
【非特許文献６】Ａｎｄｒｅｗｓ，  Ｂ．Ａ．，  Ａ．Ｓ．  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．  ａｑｕｅｏｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，  ２００５．  ９０（３）：  ｐ．３８０−９０
【非特許文献７】Ｃａｂｅｚａｓ，  Ｈ．，  Ｊｒ．，  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｐｈａｓｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｐｐｌ，  １９９６．  ６８０（１−２）：  ｐ．３−３０
【非特許文献８】Ｈｕｓｔｅｄｔ，  Ｈ．，  Ｋ．Ｈ．  Ｋｒｏｎｅｒ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｒ．  Ｋｕｌａ，  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｈａｓｅ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，  ｉｎ  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ：  ｔｈｅｏｒｙ，  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｕｓｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｈ．  Ｗａｌｔｅｒ，  Ｄ．Ｅ．  Ｂｒｏｏｋｓ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｅｄｉｔｏｒｓ．  １９８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｏｒｌａｎｄｏ，  ＦＬ，．  ｐ．５２９−５８７
【非特許文献９】Ｐｅｒｓｓｏｎ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−１  ｕｓｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ：  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，  １９９９．  ６５（４）：  ｐ．３７１−８１
【非特許文献１０】Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎ，  Ｐ．Ａ．，  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  １９８６，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｗｉｌｅｙ
【非特許文献１１】Ｗａｌｔｅｒ，  Ｈ．，  Ｇ．  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｅ．  Ｂｒｏｏｋｓ，  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ：  ｒｅｃｅｎｔ  ｒｅｓｕｌｔｓ．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  １９９１．  １９７（１）：  ｐ．１−１８
【非特許文献１２】Ｃｈｕｎｇ，  Ｂ．Ｈ．，  Ｄ．Ｂａｉｌｅｙ，  ａｎｄ  Ｆ．Ｈ．  Ａｒｎｏｌｄ，  Ｍｅｔａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ，  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｈ．Ｗ．ａ．Ｇ．  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｅｄｉｔｏｒ，  １９９４，  ｐ．１６７−２７７
【非特許文献１３】Ｂｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ，  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｍｅｔａｌ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ，  １９９１．  ５３９（２）：  ｐ．２６７−７７
【非特許文献１４】Ｆｅｘｂｙ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｔａｇｇｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ，  ２００４．  ２０（３）：  ｐ．７９３−８
【非特許文献１５】Ｃｏｌｌｅｎ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ｉ  （Ｃｅｌ７Ｂ）  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅｒｍｏｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ−ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２００１．  ８７（２）：  ｐ．１７９−９１
【非特許文献１６】Ｓｗｉａｔｌｏ，  Ｅ．  ａｎｄ  ｅ．ａｌ，  ｃｈｏｌｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．，  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ，  Ｅ．Ｉ．  Ｔｕｏｍａｎｅｎ，  Ｔ．Ｊ．  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｅｄｉｔｏｒｓ，  ２００４，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ．  ｐ．４９−６０
【非特許文献１７】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／／ｃｇｉ−ｂｉｎ／Ｐｆａｍ／ｇｅｔａｃｃ？ＰＦ０１４７３
【非特許文献１８】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｔｏｒｎｅｒｏ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｏｌｅｎｏｉｄ  ｆｏｌｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＬｙｔＡ．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ，  ２００１．  ８（１２）：  ｐ．  １０２０−４
【非特許文献１９】Ｈｅｒｍｏｓｏ，  Ｊ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｔｅｉｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｐｃｅ．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ２００５．  １２（６）：  ｐ．  ５３３−８
【非特許文献２０】Ｈｅｒｍｏｓｏ，  Ｊ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ  Ｃｐ−ｌ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ２００３．  １１（１０）：  ｐ．  １２３９−４９
【非特許文献２１】Ｓａｎｚ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｒ．  Ｌｏｐｅｚ，  ａｎｄ  Ｊ．Ｌ．  Ｇａｒｃｉａ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｃｈｏｌｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ’ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ’  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ａｍｉｄａｓｅ．  Ａ  ｎｅｗ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｉｓ  ａｕｔｏｌｙｓｉｎ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｆｔ，  １９８８．  ２３２（２）：  ｐ．  ３０８−１２
【非特許文献２２】Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｕｅｌｌｅｓ，  Ｊ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  １９９２．  ２０３（１−２）：  ｐ．  １５３−９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、水性二相系においてＬＹＴＡＧドメインとの融合タンパク質を分配するためのプロトコールを含み、分配はコリンの添加を介して自在に調節することができる。これにより融合タンパク質の精製の可能性が開け、用途が拡大し、この点で、現行の形態でのＬＹＴＡＧモジュールを、固相でのアフィニティークロマトグラフィー法におけるアフィニティー「タグ」として提供する。更に、この方法は、ＬＹＴＡＧと同じ構造ファミリーの任意のコリン結合モジュールに拡張することができる。
【００１３】
本発明の目的は、コリン結合性のポリペプチドモジュールと融合したタンパク質の溶液中での分配及び精製方法であって、この方法は、主要な化合物が自然に二相に分配される水性二成分系の使用に基づき、一方の相にはコリン結合ドメイン（ＣＢＤ）に対するアフィニティーを有する可溶性ポリマーが多く含まれ、他方の相には異なるポリマー又は塩が多く含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本方法は、図１に示すスキームに従い、基本的に、目的のタンパク質と少なくともコリン結合ドメインとの融合物を過剰発現した細胞培養から得た水性抽出物を、２つに分かれた相中に混合物を分離するのに好ましい適切な濃度及び割合の二成分系の要素と共にインキュベートすることからなる。ＣＢＤは溶解ポリマーを含む相にアフィニティーを示すため、相の分離後、融合タンパク質はこのポリマーを多く含む相に優先的に存在し、逆の相およびそれと共に該逆の相に優先的に分配された抽出物からのタンパク質及びその他の不純物を除去することができる。その後、この系に、除去した相と同じ組成の溶液をある体積分添加し、ＣＢＤにアフィニティーを有するポリマーを多く含む相と撹拌して混合し、新たに２つの相に分離させる。この洗浄手順を、除去した相中の混入タンパク質が最低限の量になるまで必要な回数繰り返す。この時点で、最後に、除去した相に対応する溶液を、今度は特定ポリマーへのコリン結合ドメインの結合を逆転させる効果を有する最終濃度のコリンを含有する溶液で代え、タンパク質への結合についてポリマーと競合させ、このタンパク質の多い相から逆の相へと特異的な方法で移動させ、その結果、最後の混合及び相分離後、塩又は別のポリマーを含む相に、ＣＢＤとの融合タンパク質が高純度グレードで含有される。
【００１５】
本発明の方法は、好ましくは、ＰＥＧ（３〜１５％）及びリン酸カリウム（５〜１５％）、例えばそれぞれ１５％及び１２．５％、の使用を含む。別の好ましい形態では、リン酸カリウムの代わりに他のリン酸塩、硫酸塩、又はクエン酸塩を用いてもよく、これらも、水への溶解性が高く、二相の分離が可能である。成功することが示されているＰＥＧの分子量範囲としては、ＰＥＧ−６０００〜ＰＥＧ−２００００が含まれ、ＰＥＧ−８０００を用いる形態が好ましい形態である（以後、単にＰＥＧという）。
【００１６】
別の好ましい形態は、ＰＥＧ（３〜１５％）溶液及びデキストラン（５〜１０％、例えば６％）溶液を使用することで適合された二相を含み、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で相分離することができる。別の好ましい形態では、デキストランを、デキストランの置換誘導体、又はでんぷん及びその誘導体等の同様な構造の多糖で置き換えることができる。
【００１７】
選択した系に応じて、微生物培養物由来の細胞を遠心して回収し、精製をＰＥＧ／リン酸塩系中で実施する場合は好ましくは２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に、ＰＥＧ／デキストラン系中の場合は好ましくは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁する。超音波処理で細胞を溶解した後、細胞残渣を除去するために得られた粗抽出物を遠心し、得られた上清に、各系について記載されている濃度及び割合に達するまで、必要な量のＰＥＧ及びリン酸二カリウム又はＰＥＧ及びデキストランを添加する。このようにして得られた溶液を穏やかに短時間振盪し、その後二相に分かれる。この分離は混合物を遠心することで促進することができる。
【００１８】
次の工程を実施する前に、例えばポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、又はコリン結合ドメインを認識する抗体を用いる免疫学的方法により、記載したどちらの系においてもＰＥＧを多く含む相に対応する上相にＣＢＤとの融合タンパク質が存在することを確認することができる。次に、用いる系に応じてリン酸塩又はデキストランを多く含む下相をピペット又はデカンテーション用の漏斗を用いて除去する。その後、相の分離及びその相対体積の維持のために、この混合物に、除去した相と同じ体積分を添加し、その濃度は、問題の系のバイノーダルダイアグラム（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｈ．Ｗ．ａ．Ｇ．，  ｅｄ．  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌ．  ２２８．  １９９４）及び使用される試薬の初期濃度に応じた濃度である。
【００１９】
この洗浄プロセスを何回か繰り返した後、目的のタンパク質を多く含む上相の使用を選択することもでき、又はコリンを含有すること以外は同じ組成の溶液で下相を置換する最後の工程を含めてもよい。溶液を混合して、系の２つの特徴的な相が新たに形成された後、ＣＢＤとの融合タンパク質は下相に優先的に高純度グレードで存在する。記載した本発明は、組換え発現により産生されたタンパク質を精製するためのクロマトグラフィー用固体支持体の使用の代替法となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】アフィニティーで分配することによる、ＬＹＴＡＧに融合されたタンパク質の精製。
【図２】２０℃におけるＬＹＴＡＧ構造へのｐＨの影響についての遠紫外線中でのＣＤ分析。（Ａ）ｐＨ７．０（黒塗りの印）及びｐＨ５（白抜きの印）で記録した波長スペクトル。添加物なし（丸）、１０％ＰＥＧ存在下（三角）、又は１４０ｍＭコリン存在下。（Ｂ）ｐＨ滴定後の２２３ｎｍにおけるＣＤシグナル。添加物なし（黒丸）、１４０ｍＭコリン存在下（四角）、及び１０％ＰＥＧ存在下（白丸）。
【図３】円偏光二色性で追跡したＬＹＴＡＧの熱安定性。添加物なし（○）、１０％ＰＥＧ存在下（●）、及び１５０ｍＭコリン存在下（ｘ）。
【図４】二水性相中での精製系及びアフィニティークロマトグラフィーによる精製系の比較ダイアグラム。
【図５】それぞれＷａｓｈＤ＋コリン緩衝液及びＷａｓｈＰ＋コリン緩衝液で溶出する前（Ａ）及び後（Ｂ）の、ＰＥＧ／デキストラン二相系（左のチューブ）及びＰＥＧ／リン酸塩二相系（右のチューブ）中でのタンパク質ＧＦＰ−ＬＹＴＡＧの分配。Ｃ）ＰＥＧ／リン酸塩中での精製で生じた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１、ＲＥＧ−１［ｐＡＬＥＸ２−Ｃａ−ＧＦＰ］の粗抽出物；レーン２、分子量マーカー；レーン３、アフィニティークロマトグラフィーで得た純粋なタンパク質コントロール；レーン４、ＰＥＧを多く含む溶出前の上相；レーン５、リン酸塩を多く含む溶出前の下相；レーン６、溶出後の上相；レーン７、溶出後の下相。
【図６】ＰＥＧ／デキストラン中でのＬＹＴＡＧ−プロテインＡの精製で生じた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。（Ａ）レーン１、分子量マーカー；レーン２、ＲＥＧ−１［ｐＸ］の粗抽出物；レーン３、ＰＥＧを多く含む洗浄前の上相；レーン４、デキストランを多く含む洗浄前の下相；レーン５、第１の洗浄後の上相；レーン６、第１の洗浄後の下相；レーン７、第２の洗浄後の上相：レーン８、第２の洗浄後の下相。（Ｂ）レーン１、分子量マーカー；レーン２、第１の溶出後の上相；レーン３、第１の溶出後の下相；レーン４、第２の溶出後の上相；レーン５、第２の溶出後の下相。（Ｃ）ＰＥＧ／リン酸塩中での精製で生じた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１、分子量マーカー；レーン２、ＲＥＧ−１［ｐＸ］の粗抽出物；レーン３、ＰＥＧを多く含む溶出前の上相；レーン４、リン酸塩を多く含む溶出前の下相；レーン５、溶出後の上相；レーン６、溶出後の下相。
【図７】ＰＥＧ／デキストラン中でのＬＹＴＡＧ−Ｌｉｐ３６の精製で生じた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。（Ａ）レーン１、分子量マーカー；レーン２、ＲＥＧ−１［ｐＡＬＥＸｂ−Ｌｉｐ３６］の粗抽出物；レーン３、ＰＥＧを多く含む洗浄前の上相；レーン４、デキストランを多く含む洗浄前の下相；レーン５、第１の洗浄後の上相；レーン６、第一の洗浄後の下相；レーン７、第２の洗浄後の上相；レーン８、第２の洗浄後の下相。（Ｂ）レーン１、分子量マーカー；レーン２、第１の溶出後の上相；レーン３、第１の溶出後の下相；レーン４、第２の溶出後の上相；レーン５、第２の溶出後の下相。
【図８】ＰＥＧ／デキストラン中でのＬＹＴＡＧ−β−ガラクトシダーゼの精製で生じた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１、分子量マーカー；レーン２、ＲＥＧ−１［ｐＡＬＥＸ２ｃ−ＬａｃＺ］の粗抽出物；レーン３、ＰＥＧを多く含む洗浄前の上相；レーン４、デキストランを多く含む洗浄前の下相；レーン５、第１の溶出後の上相；レーン６、第１の溶出後の下相。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の方法の開発の出発点は、水性二相系で一般的に使用されるポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、アセチルコリンエステラーゼ等のコリン結合タンパク質と相互作用し、コリンの認識部位に特異的にインターカレートされ、それによって高濃度では酵素の阻害剤として作用することが観察されたことである（Ｋｏｅｌｌｎｅｒ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ａ  ｃａｔｉｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ：  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ＰＥＧ−ＳＨ  ｔｏ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｔｏｒｐｅｄｏ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ２００２．  ３２０（４）：  ｐ．７２１−５）。Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のタンパク質ＬｙｔＡのカルボキシル末端（Ｃ−ＬｙｔＡ）、バクテリオファージＣｐ−１由来のリゾチーム（ｌｉｓｏｚｙｍｅ）ＣＰＬ１等のコリン結合ドメイン、又は、一般的に、種々の微生物に由来するＣＢＭファミリーの任意のコリン結合ドメイン（スペイン特許第２０３２７１７号；Ｓｗｉａｔｌｏ，  Ｅ．  ａｎｄ  ｅ．ａｌ，  Ｃｈｏｌｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．，  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ，  Ｅ．Ｉ．  Ｔｕｏｍａｎｅｎ，  Ｔ．Ｊ．  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｅｄｉｔｏｒｓ，  ２００４，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ．  ｐ．  ４９−６０）は、コリンへの天然のアフィニティーを有する構造的及び機能的反復を有する配列を含む。
【００２２】
本発明は、この結合ドメインと相互作用する能力についてのＰＥＧとコリンの間の類似性を考慮したものである。このＰＥＧとコリンの等価性の検証は、最初に、このポリマーの存在下でＬＹＴＡＧドメイン（Ｃ−ＬｙｔＡに由来）の円偏光二色性（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｎｉｓｕｍ）分析により行うことができる。コリン非存在下及びｐＨ７の水溶液中ではタンパク質ＬＹＴＡＧは一部変性することが分かる（Ｍａｅｓｔｒｏ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．  Ｓａｎｚ，  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒｔｌｙ  ｆｏｌｄｅｄ  ｓｔａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ  Ｃ−ＬｙｔＡ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ２００５．  ３８７（Ｐｔ  ２）：  ｐ．  ４７９−８８）。その結果、タンパク質ＬＹＴＡＧの円偏光二色性スペクトルは再現性が悪く、サンプルの保存期間及びサンプルが受けた凍結・解凍サイクルの数に依存する。
【００２３】
しかし、コリンを添加するとタンパク質が安定化し、その楕円度が増す（図２Ａ）。コリンに結合するＬＹＴＡＧ構造（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｔｏｒｎｅｒｏ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｏｌｅｎｏｉｄ  ｆｏｌｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＬｙｔＡ．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ，  ２００１．  ８（１２）：  ｐ．  １０２０−４）によれば、このアミノアルコールは、コリン結合部位に存在する疎水性領域の保護及び最後のフォークを介した二量体化の誘導に必須であり、これによりタンパク質が非常に安定化すると考えられる（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｔｏｒｎｅｒｏ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｏｌｅｎｏｉｄ  ｆｏｌｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＬｙｔＡ．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ，  ２００１．  ８（１２）：  ｐ．  １０２０−４；  Ｕｓｏｂｉａｇａ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ａｕｔｏｌｙｓｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９６．  ２７１（１２）：  ｐ．  ６８３２−８）。
【００２４】
ＰＥＧを１０％で添加すると、高濃度のコリンと同様な円偏光二色性（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｒｏｉｓｍ）スペクトルの安定化効果が生まれる（図２Ａ）。このことは、このリガンドの結合部位との同様な相互作用を示している。一般的に、タンパク質の溶解性はその等電点に対応するｐＨ付近で最小となる。これは、正味の電荷が存在しないと疎水性相互作用を介した分子間凝集が起こりやすいからである。この意味で、タンパク質へのリガンドの結合は、タンパク質表面に存在する疎水性領域を隠すのに寄与し得るため、等電点付近のｐＨ値におけるタンパク質の溶解性を上昇させる。
【００２５】
図２Ｂに示すように、ＬＹＴＡＧタンパク質標品の２２３ｎｍにおける円偏光二色性シグナルは、６．５〜８．０のｐＨ範囲内では変化せず、ｐＨ６．０より下では低下し、ｐＨ４．５〜５．５で最小となる。ｐＨ５．０のスペクトルは、全ての波長でシグナルの全体的な減少を示す（図２Ａ）と同時にサンプルの吸収の低下を示している（データ示さず）。このことは、ＬＹＴＡＧの溶解性がこのｐＨ範囲で最小であり、タンパク質を凝集させ、可溶性分子群を減少させ、円偏光二色性シグナルが生じやすくなっていることを示唆している。これらの結果は、情報科学的応用を用いて算出されるこのタンパク質の理論的等電点が約５．３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ｃｇｉ／ｐｉ−ｗｒａｐｐｅｒ．ｐｌ）であることに従った予想と一致している。
【００２６】
飽和濃度のコリン（１４０ｍＭ）を添加すると、楕円度が全体的に増加し、２．４〜８．０を含む全てのｐＨ範囲でＬＹＴＡＧタンパク質が安定化する（図２Ａ及び２Ｂ）。このことは、リガンドがなければ露出されているであろう疎水性部位がリガンドの結合で隠されることで凝集が回避されているという仮説を指示している。この仮説の更なる裏付けとして、２％ＣＨＡＰＳ又は１４０ｍＭの２，２−ジメチルプロパノール（ＤＭＰ）等の低極性添加物でも、ｐＨ５．０における円偏光二色性スペクトルが回復することを指摘しておく（データ示さず）。これらの同じアッセイを１０％ＰＥＧ存在下で行って得られる結果もコリンの場合について記載したのと同様であり（図２Ａ及び２Ｂ）、このことは、このポリマーがＬＹＴＡＧタンパク質と相互作用するという仮説を裏付けており、更にその天然リガンドと同様な効果を発揮しており、このことは両方の分子が同じタンパク質領域に結合され得ることを示している。また、このことは、ＬＹＴＡＧタンパク質がＤＥＡＥ−セルロースカラム中に保持される能力をＰＥＧ存在下で失うことからも示され（データ示さず）、このことは、ＰＥＧがコリン結合部位中にインターカレートされることでコリンの結合又はＤＥＡＥ等のアナログの結合が阻害されていることを示している。
【００２７】
最後に、温度の関数として２２３ｎｍの円偏光二色性シグナルで追跡されるタンパク質の熱安定性を解析し、ＰＥＧがＬＹＴＡＧ構造に対してコリンの効果をまね（ｅｍｕｌａｔｅ）かを確認した（図３）。リガンド非存在下では、ＬＹＴＡＧは、中間状態物の蓄積に由来する二相性の移行（ｂｉｐｈａｓｉｃ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を示す（Ｍａｅｓｔｒｏ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．  Ｓａｎｚ，  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒｔｌｙ  ｆｏｌｄｅｄ  ｓｔａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ  Ｃ−ＬｙｔＡ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ２００５．  ３８７（Ｐｔ  ２）：  ｐ．  ４７９−８８）。１５０ｍＭのコリン存在下では、そのような中間状態物の蓄積が避けられ、唯一つのシグモイド型の曲線及び熱安定性が得られ、これは以前に報告されている通りである（Ｍａｅｓｔｒｏ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．  Ｓａｎｚ，  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒｔｌｙ  ｆｏｌｄｅｄ  ｓｔａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ  Ｃ−ＬｙｔＡ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ２００５．  ３８７（Ｐｔ  ２）：  ｐ．  ４７９−８８）。
【００２８】
ＰＥＧ存在下での同様なアッセイの実施において、この化合物の添加が中間体効果を引き起こすかを確認した結果、中間状態物は消えたが、変性温度に変化は無かった（図３）。したがって、ＰＥＧはコリンの役割をまね（ｅｍｕｌａｔｅ）している。記載の実験は、ＰＥＧがコリンと同じコンフォメーション変化を誘導できないことを示しているが、本発明の基礎の１つであるＣＢＤのＰＥＧに対するアフィニティーを証明している。
【００２９】
水相二相系中でＬＹＴＡＧとの融合物をアフィニティーにより精製する一般的プロトコール
【００３０】
本発明は、ＬＹＴＡＧとＰＥＧの間の相互作用を示す前述の結果に基づき、２つの水相を用いたタンパク質分離系中でこのポリマーを使用した具体的な実施例を提供し、コリン結合ドメインを有するポリペプチドの分離プロトコールの開発を可能にする。
【００３１】
好ましいプロトコールは、分離法を開発するためのＰＥＧ／リン酸塩及びＰＥＧ／デキストランの組合せを考慮したものである。ＰＥＧ／リン酸塩系は、ｐＨ８．０で、ＰＥＧ（３〜１５％）及びリン酸カリウム（５〜１５％）という異なる濃度範囲での自発的な二相への分離を可能にする。相の一方（上相）はＰＥＧを多く含み、別の相（下相）はリン酸塩を多く含む。ＰＥＧ１５％＋リン酸塩１２．５％の系（ｐＨ８．０）（いわゆるＥｘｔＰ緩衝液）は二相間で体積の差が少ないため、最もよく機能する。その一部として、ＰＥＧ／デキストラン系では、方法は、３〜１０％のＰＥＧ及び５〜１０％のデキストランの使用濃度範囲を含む。前述の系同様、これらの濃度範囲は二相への分割を可能にし、ＰＥＧを多く含む相は上相に、デキストランを多く含む相は下相になる。
【００３２】
好ましい濃度は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中にＰＥＧ６％及びデキストラン６％（いわゆるＥｘｔＤ緩衝液）であり、また、この二相も二相間の体積差がより少ない。一般的なプロトコールは図１に要約されており、第１に、コリン結合ドメインの少なくとも１つのモジュール、好ましいケースではＬＹＴＡＧ、を含む融合タンパク質を過剰発現する細胞抽出物を得ることからなる。そのような抽出物は、二相の形成に必要な化合物の存在下で遠心することで又は重力により得られ、その最後の場合には、遠心の代わりにデカント用の漏斗を用いてもよい。前述したＰＥＧへのＬＹＴＡＧのアフィニティーが、このポリマーを含有する上相中へのＬＹＴＡＧ融合物の定量的局在を決定する（以下の詳細な例を参照されたい）。これが過剰であることを確認した後、一連の洗浄を行うが、この洗浄は、下相の除去及び除去された相と常に同じ組成を維持した同体積の新鮮な溶液の添加からなるため、相は依然として分離されている。
【００３３】
文献（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｈ．Ｗ．ａ．Ｇ．，  ｅｄ．  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌ．  ２２８．  １９９４）に公開されているバイノーダルダイアグラムからのデータに基づき、前述の好ましい形態の場合には、この新鮮な相の組成は、ｐＨ８．０で、１％のＰＥＧ及び１６％のリン酸カリウムを含む（いわゆるＷａｓｈＰ緩衝液）か、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に０．５％のＰＥＧ及び１６％のデキストランを含む（いわゆるＷａｓｈＤ緩衝液）。新たに混合して相分離した後、下相をＷａｓｈＰ又はＷａｓｈＤ緩衝液で置換し、このプロセスを洗浄が終わるまで繰り返す（通常２〜３工程）。この時点で、ＰＥＧ相中のタンパク質純度は既にかなり高くなり得る。しかし、１５０ｍのコリンをＷａｓｈＰ又はＷａｓｈＤ緩衝液に含めると、リガンド結合部位のＰＥＧを置換する効果を現し、融合タンパク質を特異的に下相に移動させるので、これを電気泳動的な均一性に向けた精製に用いることができる。
【００３４】
記載した発明は、存在するタンパク質のその他の精製系に対するいくつかの利点を提供し、とりわけ、簡便、迅速、且つ経済的な方法であり、穏やかな条件下での精製を可能にする。第１に、この系の多様性が、使用できる幅広い反応物質及び濃度に反映されており、具体的な各場合毎の特定の必要性に合わせることを可能にしている。更に、充填が必要、過剰な充填による圧力の問題等のカラムクロマトグラフィーの典型的な問題が最小限に抑えられ、本方法はいずれの場合にも、固体支持体を用いた方法よりもはるかに迅速且つ簡便である（図４）。一方、毒性要素（ヘキサヒスチジン「タグ」の特定の場合における重金属等）が存在しないため、この二相系は環境に優しいものであるとみなせる。
【００３５】
より技術的な観点からは、アフィニティー化合物へのタンパク質の吸収はより効率的な方法で起こり、樹脂等の表面に基づくアフィニティー支持体と異なり、溶液中のこの１つのポリマーの周囲で起こる。更に、ＣＢＤ  ＬＹＴＡＧとＰＥＧとの相互作用は、広いｐＨ範囲におけるタンパク質の全般的な安定化を誘導し、これらの精製系を中性から離れたｐＨ値で用いる可能性を広げ、この方法で溶出することで、酸性のｐＨで生じるタンパク質とクロマトグラフィー支持体との間の静電反発力の存在が回避される。したがって、融合タンパク質の生物物理学的特性に関する主要な基準とみられるＣＢＤがＰＥＧ及びコリンに示す二重のアフィニティーのおかげで、系中にコリンが存在するかしないかに応じて所望の相での決定された融合物の局在を導くことが可能となる。
【００３６】
一般的規則として、ＰＥＧ／リン酸塩及びＰＥＧ／デキストラン系が、ＬＹＴＡＧ等のＣＢＤとの融合物をアフィニティーにより分配するのに先験的に適していると考えられるが、どれを選択するかは、具体的な個々のケースの特徴（全体的な電荷、サイズ、及び疎水性）に大きく依存する。この意味で、個々の具体的な融合タンパク質に系を適合させるため及び収率の向上のために作用し得る種々のパラメータ、すなわち、イオン力、温度、ｐＨ、界面活性剤の使用等があるため（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｈ．Ｗ．ａ．Ｇ．，  ｅｄ．  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌ．  ２２８．  １９９４）、
【００３７】
本発明は非常に多様である。更に、本発明は、前述したように、ＰＥＧ／クエン酸塩、ＰＥＧ／硫酸塩、ＰＥＧ／でんぷん等の潜在的に有用な代替的二相系も想定しており、それらも使用することができる。可溶性の低いタンパク質の場合、抽出を大容量で実施してサンプルを希釈し、タンパク質の凝集及び沈殿を最小限に抑えることができる。最後に、本方法は、生物学的変換の酵素プロセスに組み込むことができ、その中では、１又は別の相中に酵素を自在に封じ込め（コリン添加の有無で調節）、生成物を逆の相に蓄積させることができ、精製が促進され、生成物による酵素的阻害の可能性が最小限に抑えられる。
【実施例１】
【００３８】
ＬＹＴＡＧ−ＧＦＰ融合物の精製
【００３９】
本実施例は、蛍光タンパク質とＣＢＤドメイン、具体的にはＬＹＴＡＧ、との融合物をどのように精製することができるかを示す。本発明のこの具体的実施例のために、バイオメダル社（Ｂｉｏｍｅｄａｌ）のＬＹＴＡＧ「キット」の推奨に従い、ｐＡＬＥＸ２−Ｃａベクター（バイオメダル社製）から作製した発現プラスミドｐＡＬＥＸ２−Ｃａ−ＧＦＰで形質転換した大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＲＥＧ−１株（イスパニアのバイオメダル社製、ｗｗｗ．ｂｉｏｍｅｄａｌ．ｃｏｍ）の培養液４００ｍｌを、培地へのサリチル酸塩添加によりＧＦＰ−ＬＹＴＡＧタンパク質の発現が誘導されるまで前記培養液を３７℃でインキュベートし、緑色蛍光ＧＦＰ−ＬＹＴＡＧタンパク質との融合物を発現させる。
【００４０】
遠心して細胞を回収し、精製がＰＥＧ−リン酸塩系中で実施される場合は２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍｌに、ＰＥＧ／デキストラン系の場合は２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁する。超音波処理による細胞の溶解及び遠心による細胞残渣の除去の後、各アリコートに、必要な量を計量したＰＥＧ、リン酸カリウム、又はデキストランを添加して前述のＥｘｔＰ緩衝液及びＥｘｔＤ緩衝液を再構成する。この溶液をビーカー中で両方の化合物が完全に再懸濁されるまで穏やかに撹拌し（ＤＮＡの断片化を減少させ、最終タンパク質標品中で不純物として存在するのを減少させるため）、室温にて１２，０００ｒｐｍで５分間遠心する（温度に対して感受性がより高いタンパク質の場合は４℃で遠心してもよい）。
【００４１】
ＬＹＴＡＧ「タグ」のＰＥＧに対する証明された特異的アフィニティーにより、２つの試験例において、ＰＥＧを多く含む相（上相）中に融合タンパク質が蓄積される（図５Ａ）ことを決定する。ＧＦＰ−ＬＹＴＡＧタンパク質の見られる上相が緑色をしていることから、それが完全にフォールディングされており、機能的であることが確認される。リン酸塩及びデキストランを多く含む下相には、細胞タンパク質の大部分が残っており、上相中のＧＦＰ−ＬＹＴＡＧ融合物の純度グレードは既にかなり高いものであり得る（図５Ｃ）。いずれの場合も、Ｗａｓｈ緩衝液にコリンを添加するとＧＦＰ−ＬＹＴＡＧタンパク質は下相に溶出する（図５Ｂ及び５Ｃ）。指摘すべき点として、第１にこれらの図中に示す電気泳動ゲルは、使用した高塩濃度及びポリマーの干渉によるタンパク質の異常な移動性を示している。
【００４２】
タンパク質の溶出は、一回目の抽出では完全ではない（図５Ｃ、レーン６）が、コリンを含む新たな新鮮な下相の添加によって引き続き抽出することにより、系中に存在するＧＦＰ−ＬＹＴＡＧ融合物の大部分を回収することができる（データ示さず）。この特定のタンパク質について、ＰＥＧ／リン酸塩系がＰＥＧ／デキストラン系で達成されるよりもわずかに高い収率（培養液１リットル当たり約５ｍｇ）及び純度グレードを提供することを確認することができる。
【実施例２】
【００４３】
ＬＹＴＡＧ−プロテインＡ融合物の精製
【００４４】
本実施例は、免疫グロブリンに結合したスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡの断片と融合させたＣ−ＬｙｔＡコリン結合ドメインの融合物を本発明によってどのように精製することができるかを示す。本具体的実施例は、前述の実施例のＬＹＴＡＧ−ＧＦＰ融合物で記載したのと同じ方法を用いるが、ｐＡＬＥＸｂベクター（バイオメダル社製）から構築したｐＡＬＥＸｂ−ＰｒｏｔＡプラスミドで形質転換したＲＥＧ−１株の培養液を用い、ＰＥＧ／デキストラン（図６Ａ及び６Ｂ）及びＰＥＧ／リン酸塩（図６Ｃ）のような二相系のいずれかを用いて良好な精製を達成する。
【００４５】
前回の場合同様、リン酸塩の代わりにデキストランを用いると洗浄工程の数が増える（この場合は２回）。更に、洗浄後、ＬＹＴＡＧ−プロテインＡタンパク質はＰＥＧ相中でも実質的に純粋なままである。同様に、コリンを含む新鮮な下相を添加すると、デキストラン相中にポリペプチド融合物を局在させることが可能になり、複数回の溶出工程後に基本的に全てのタンパク質が回収される。
【実施例３】
【００４６】
ＬＹＴＡＧ−Ｌｉｐ３６融合物の精製
【００４７】
ｐＡＬＥＸｂベクター（バイオメダル社製）から構築したｐＡＬＥＸｂ−Ｌｉｐ３６プラスミドで形質転換したＲＥＧ−１株の培養液を用いること以外は前述の実施例と同様に実施する。この場合、精製はＰＥＧ／デキストラン系中でのみ効率的である。図７はまた、このポリマー対を用いる場合に複数回の洗浄が必要であることを示している。収率は培養液１リットル当たり５〜１０ｍｇの間で変動する。
【実施例４】
【００４８】
ＬＹＴＡＧ−βガラクトシダーゼ融合物の精製
【００４９】
本実施例は、ｐＡＬＥＸ２ｃベクター（バイオメダル社製）から構築したｐＡＬＥＸ２ｃ−ＬａｃＺプラスミドで形質転換したＲＥＧ−１株の培養液から発現させた融合ＬＹＴＡＧ−β−ガラクトシダーゼを用いること以外は前述と同様の方法で実施する。ベータ−ガラクトシダーゼのような高分子量タンパク質及びオリゴマータンパク質を精製するための二相中の分配系の能力が証明される。この場合、どの相にタンパク質が位置するかという傾向について、ＬＹＴＡＧと融合した部分の生物物理学的特性がコリン結合モジュールよりも支配的である可能性があり得る。
【００５０】
この意味で、おそらくは融合物のサイズが大きいために起こり得る、中間相中に失われる特定のタンパク質が確認され得る。それにも関わらず、図８に示すように、ＰＥＧデキストラン系中でハイブリッドタンパク質を許容可能な純度グレードで精製することができる。このようにして精製したタンパク質は、ｏ−１  ２  ３  ４  ５  ６ニトロフェニルガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）等の合成基質に対してその活性を保持しており（データ示さず）、実施例１に記載したＧＦＰ−ＬＹＴＡＧ融合物の場合のような構造的安定性及び適切なフォールディングを示している。
【実施例５】
【００５１】
培養培地に分泌された、ＬＹＴＡＧに融合されたタンパク質の精製
【００５２】
この場合、酵母等の細菌及びその他の微生物により培養培地中に分泌される組換えタンパク質の精製に本発明を用いることができる。酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、効果的な分泌機構を有し、この性質を、例えばｐＰＩＣ９ベクター（Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、インビトロジェン社製）を用いて細胞外培地へと輸送を方向付けるリーダーペプチドに融合させた目的のタンパク質の産生に利用する。ｐＰＩＣ９−ＣＬＹＴベクター（Ｃａｕｂｉｎ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｏｌｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，  ２００１．  ７４（２）：  ｐ．  １６４−７１）と同様にこのタンパク質をコリン結合ドメインＬＹＴＡＧに更に融合すれば、記載した水性二相系の１つを用いて細胞外培地から精製することができる。
【００５３】
そのために、ｐＰＩＣ９−ＣＬＹＴプラスミドに由来しＬＹＴＡＧと目的のタンパク質との分泌可能な融合物を発現するコンストラクトで形質転換したＰ．パストリスのＧＳ１１５株を、ＢＭＧＹ緩衝培地中にて３０℃でＯＤ６００が２〜６に達するまで培養してよく、その時点で、炭素源をグリセロール１％（ＢＭＧＹ培地）からメタノール０．５％（ＢＭＭＹ培地）に変更することでＬＹＴＡＧ融合物の発現を誘導する。誘導から１５〜２４時間後、培養液を遠心し、上清を回収する。この上清は、分泌型のＬＹＴＡＧ融合タンパク質を含むため、前述の実施例で記載した精製系の１つに直接まわすことができ、目的のタンパク質の精製へとプロセスが進められる。
【００５４】
同様に、コリン結合ドメインと融合したタンパク質の培養培地からの精製も、細胞膜周辺腔又は細胞外培地へと融合物を輸送するリーダーペプチドとＬＹＴＡＧ−タンパク質又はタンパク質−ＬＹＴＡＧとの融合物を発現する大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の細菌培養から行うことができる。
【実施例６】
【００５５】
ＬＹＴＡＧ−プロテインＡを用いた二相中での抗体の精製
【００５６】
プロテインＡは、免疫グロブリンへのアフィニティーを示し、この特性は、実施例２に記載した二相系による抗体精製に利用することができる。本実施例では、二相の成分は、精製して２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）（ＰＥＧ／デキストラン系を用いる場合）に透析したＬＹＴＡＧ−プロテインＡ（５〜１０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ及び目的の抗体を発現するハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍｅ）培養液の上清１９ｍｌの混合物に溶解され得る。上清は２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）（ＰＥＧ／リン酸塩系を用いる場合）又は２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）（ＰＥＧ／デキストラン系を用いる場合）に透析する必要がある。
【００５７】
２つの化合物を溶解した後、前述の実施例に記載した条件下での分離、洗浄、及び溶出に進み、最終的に、下相中にプロテインＡ−抗体複合体を高純度グレードで得ることができる。あるいは、最後の工程で、ＬＹＴＡＧ−プロテインＡ融合物の分離に有利なｐＨ条件及びイオン力を用いて抗体を回収・精製することができ、ＬＹＴＡＧ−プロテインＡ融合物はＰＥＧを多く含む相に保持され、再利用することができる。
【図１】
2010539142.tif 000002
【図２】
2010539142.tif 000003
【図３】
2010539142.tif 000004
【図４】
2010539142.tif 000005
【図５Ａ】
2010539142.tif 000006
【図５Ｂ】
2010539142.tif 000007
【図５Ｃ】
2010539142.tif 000008
【図６Ａ】
2010539142.tif 000009
【図６Ｂ】
2010539142.tif 000010
【図６Ｃ】
2010539142.tif 000011
【図７Ａ】
2010539142.tif 000012
【図７Ｂ】
2010539142.tif 000013
【図８】
2010539142.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成21年9月3日(2009.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の目的は、水性二相系中においてＬＹＴＡＧモジュールに融合したポリペプチド及びタンパク質を分配するプロトコールを含み、前記分配は、コリンの添加によって調節される。本発明は、ＬＹＴＡＧモジュールの用途を、固相アフィニティークロマトグラフィーにおけるアフィニティータグとしての現行の形態から水性二相系中でのアフィニティー分配における使用に拡大する。更に、本方法は、ＬＹＴＡＧと同じ構造ファミリーの任意のコリン結合モジュールを用いてもよい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明の目的は、コリン結合性のポリペプチドモジュールと融合したポリペプチド及びタンパク質の溶液での分配及び精製方法であって、この方法は、主要な化合物が自然に二相に分配される水性二成分系の使用に基づき、一方の相にはコリン結合モジュール（ＣＢＭ）に対するアフィニティーを有する可溶性ポリマーが多く含まれ、他方の相には異なるポリマー又は塩が多く含まれる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本方法は、図３に示すスキームに従い、基本的に、目的のタンパク質と少なくとも１つのコリン結合リピート（ＣＢＲ）を含むコリン結合モジュール（ＣＢＭ）との融合物を発現する細胞培養から得た水性抽出物を、２つに分かれた相中に混合物を分離するのに好ましい適切な濃度及び割合の二成分系の要素と共にインキュベートすることからなる。前述のポリマーに対するＣＢＭのアフィニティーの結果、相分離後に、融合タンパク質はこのポリマーを多く含む相に優先的に位置し、その結果、逆の相と同時にそこに分配された抽出物由来のその他のタンパク質及び細胞成分を除去することが可能となる。次いで、捨てられた相を、元の組成と同じ同体積の新鮮な溶液で置換し、系を混合し、相の分離のために静置され、その後、前の工程と同様に同相を捨てる。除去した相の混入タンパク質が最小限の量になるまで、この洗浄手順を必要な回数繰り返す。この時点で、捨てられた相を、元の同じ組成の同体積の溶液に、今度はＣＢＭタグタンパク質のポリマーへの結合を逆転する効果を有する濃度のコリンを含ませたもので置換し、このポリマーとタンパク質への結合について競合させ、タンパク質を特異的に逆相に移動させ、この逆相から最後にタンパク質を高純度グレードで回収することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の方法は、好ましくは、ＰＥＧ（３〜１５％）及びリン酸カリウム（５〜１５％）、例えばそれぞれ１５％及び１２．５％、の使用を含む。別の好ましい形態では、リン酸カリウムの代わりに他の可溶性の高いリン酸塩、硫酸塩、又はクエン酸塩を用いてもよく、これらは二相系の形成に適合する。この系に有用なＰＥＧ分子量は、ＰＥＧ−６０００〜ＰＥＧ−２００００であり、ＰＥＧ−８０００を使用する形態が好ましい形態である（以後、ＰＥＧ）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
【図１】２０℃におけるＬＹＴＡＧ構造へのｐＨの影響についての遠紫外線中でのＣＤ分析を示す図である。（Ａ）ｐＨ７．０（黒塗りの印）及びｐＨ５（白抜きの印）で記録した波長スペクトル。添加物なし（白丸）、１０％ＰＥＧ存在下（三角）、又は１４０ｍＭコリン存在下（四角）。（Ｂ）ｐＨ滴定後の２２３ｎｍにおけるＣＤシグナル。添加物なし（黒丸）、１４０ｍＭコリン存在下（四角）、及び１０％ＰＥＧ存在下（白丸）。
【図２】円偏光二色性で表されるＬＹＴＡＧの熱安定性を示す図である。添加物なし（○）、１０％ＰＥＧ存在下（●）、及び１５０ｍＭコリン存在下（ｘ）。
【図３】アフィニティーで分配することによる、ＬＹＴＡＧ融合タンパク質の精製を示す図である。
【図４】二相水性系中でのアフィニティー分配による精製及び固体支持体中でのアフィニティークロマトグラフィーによる精製の比較ダイアグラムである。
【図５】それぞれＷａｓｈＤ＋コリン緩衝液及びＷａｓｈＰ＋コリン緩衝液で溶出する前（Ａ）及び（Ｂ）の、ＰＥＧ／デキストラン（左のチューブ）及びＰＥＧ／リン酸塩（右のチューブ）の二相水性系中でのＧＦＰ−ＬＹＴＡＧタンパク質の分配を示す図である。Ｃ）ＰＥＧ／リン酸塩中での精製で生じた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１、ＲＥＧ−１［ｐＡＬＥＸ２−Ｃａ−ＧＦＰ］の粗抽出物；レーン２、分子量マーカー；レーン３、アフィニティークロマトグラフィーで得た純粋なタンパク質コントロール；レーン４、ＰＥＧを多く含む溶出前の上相；レーン５、リン酸塩を多く含む溶出前の下相；レーン６、溶出後の上相；レーン７、溶出後の下相。
【図６】ＰＥＧ／デキストラン中でのＬＹＴＡＧ−プロテインＡの精製で生じた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。（Ａ）レーン１、分子量マーカー；レーン２、ＲＥＧ−１［ｐＸ］の粗抽出物；レーン３、ＰＥＧを多く含む洗浄前の上相；レーン４、デキストランを多く含む洗浄前の下相；レーン５、第１の洗浄後の上相；レーン６、第１の洗浄後の下相；レーン７、第２の洗浄後の上相：レーン８、第２の洗浄後の下相。（Ｂ）レーン１、分子量マーカー；レーン２、第１の溶出後の上相；レーン３、第１の溶出後の下相；レーン４、第２の溶出後の上相；レーン５、第２の溶出後の下相。（Ｃ）ＰＥＧ／リン酸塩中での精製で生じた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１、分子量マーカー；レーン２、ＲＥＧ−１［ｐＸ］の粗抽出物；レーン３、ＰＥＧを多く含む溶出前の上相；レーン４、リン酸塩を多く含む溶出前の下相；レーン５、溶出後の上相；レーン６、溶出後の下相。
【図７】ＰＥＧ／デキストラン中でのＬＹＴＡＧ−Ｌｉｐ３６の精製で生じた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。（Ａ）レーン１、分子量マーカー；レーン２、ＲＥＧ−１［ｐＡＬＥＸｂ−Ｌｉｐ３６］の粗抽出物；レーン３、ＰＥＧを多く含む洗浄前の上相；レーン４、デキストランを多く含む洗浄前の下相；レーン５、第１の洗浄後の上相；レーン６、第一の洗浄後の下相；レーン７、第２の洗浄後の上相；レーン８、第２の洗浄後の下相。（Ｂ）レーン１、分子量マーカー；レーン２、第１の溶出後の上相；レーン３、第１の溶出後の下相；レーン４、第２の溶出後の上相；レーン５、第２の溶出後の下相。
【図８】ＰＥＧ／デキストラン中でのＬＹＴＡＧ−β−ガラクトシダーゼの精製で生じた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン１、分子量マーカー；レーン２、ＲＥＧ−１［ｐＡＬＥＸ２ｃ−ＬａｃＺ］の粗抽出物；レーン３、ＰＥＧを多く含む洗浄前の上相；レーン４、デキストランを多く含む洗浄前の下相；レーン５、第１の溶出後の上相；レーン６、第１の溶出後の下相。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明は、ＰＥＧとこれらのＣＢＭの間のこの特異的な相互作用を利用する。この相互作用は、ポリマー存在下でのＬＹＴＡＧモジュール（Ｃ−ＬｙｔＡ誘導体）の円偏光二色性分析により明らかにすることができる。ｐＨ７の水溶液中及びコリンの非存在下では、ＬＹＴＡＧタンパク質は一部変性していることが分かる（Ｍａｅｓｔｒｏ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．  Ｓａｎｚ，  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒｔｌｙ  ｆｏｌｄｅｄ  ｓｔａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ  Ｃ−ＬｙｔＡ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ２００５．  ３８７（Ｐｔ  ２）：  ｐ．  ４７９−８８）。その結果、その円偏光二色性スペクトルは再現性が悪く、アッセイ中に受ける凍結−解凍サイクル等のサンプルの保存条件に大きく影響を受ける。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
しかし、コリンを添加するとＬＹＴＡＧタンパク質が安定化し、その楕円性が増す（図１Ａ）。ＬＹＴＡＧのコリン結合構造（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｔｏｒｎｅｒｏ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｏｌｅｎｏｉｄ  ｆｏｌｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＬｙｔＡ．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ，  ２００１．  ８（１２）：  ｐ．  １０２０−４）によれば、このアミノアルコールは、コリン結合部位に存在する疎水性領域の保護及び最後のフォークを介した二量体化の誘導に重要な役割を果たしており、これによりタンパク質の安定性が大きく上昇すると考えられる（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｔｏｒｎｅｒｏ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｏｌｅｎｏｉｄ  ｆｏｌｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＬｙｔＡ．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ，  ２００１．  ８（１２）：  ｐ．  １０２０−４；  Ｕｓｏｂｉａｇａ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ａｕｔｏｌｙｓｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｎｍ，  １９９６．  ２７１（１２）：  ｐ．  ６８３２−８）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
１０％ＰＥＧを添加すると、高濃度のコリンで誘導されるのと同様な円偏光二色性スペクトルの安定化効果が生まれ（図１Ａ）、ＰＥＧ及びコリンの両方が、ＬＹＴＡＧ中の相互作用部位を共有していることを示している。一方、所与のタンパク質の溶解性は、その等電点に対応するｐＨ値付近で最小となる。これは、正味の電荷がないと疎水性相互作用により分子間凝集が起こりやすくなるためである。この意味で、同系のタンパク質へのリガンドの結合は、タンパク質中に存在する疎水性領域を隠すのに寄与し得るため、等電点に近いｐＨ値での溶解性を上昇させる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
図１Ｂに示すように、ＬＹＴＡＧタンパク質標品の２２３ｎｍにおける円偏光二色性シグナルは、ｐＨ６．５〜８．０の範囲内では変化せず、ｐＨ６．０より下では低下し、ｐＨ４．５〜ｐＨ５．５で最小となる。ｐＨ５．０では、スペクトルは全ての波長でシグナルの低下を示し（図１Ａ）、サンプル吸収の一般的な低下が検出される（データ示さず）。このことは、ＬＹＴＡＧの溶解性がこのｐＨ範囲で最小であり、その結果、タンパク質が凝集し、このようにして、円偏光二色性シグナルを発しやすい可溶性分子の数が減少することを示唆している。これらの結果は、ソフトウェアアプリケーション（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ｃｇｉ／ｐｉ−ｗｒａｐｐｅｒ．ｐｌ）を用いて得られるこのタンパク質の理論的等電点が５．３であることからの予想と一致する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
コリンを飽和濃度（１４０ｍＭ）で添加すると、楕円度の一般的増加を誘導し、２．４〜８．０のｐＨ値でＬＹＴＡＧタンパク質が安定化する（図１Ａ及び１Ｂ）。このことは、このリガンドの結合が、そうでなければ露出されている疎水性部位を隠し、それによりタンパク質凝集が防止されるという仮説を支持している。この仮説の更なる裏付けとして、２％ＣＨＡＰＳ又は１４０ｍＭの２，２−ジメチルプロパノール（ＤＭＰ）等の低極性添加物を添加しても、ｐＨ５．０における円偏光二色性スペクトルは回復する（データ示さず）。これらのアッセイを１０％ＰＥＧ存在下で実施すると、結果はコリンで得られる結果と同様であり（図１Ａ及び１Ｂ）、このポリマーがＬＹＴＡＧタンパク質を相互作用するという仮説を裏付けており、これにより、その天然リガンドの結合で生じるのと同様な効果が生じ、このことはＰＥＧとコリンの両方が同じタンパク質領域と相互作用することを示している。このことはまた、ＬＹＴＡＧタンパク質がＤＥＡＥ−セルロースカラム中に保持される能力をＰＥＧ存在下で失うことからも示され（データ示さず）、このことは、ＰＥＧがコリン結合部位中にインターカレートしてＣＢＭのＤＥＡＥへの更なる結合が阻害されていることを示している。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
最後に、タンパク質の熱安定性を２２３ｎｍにおける円偏光二色性分析により調べることで（図２）、ＰＥＧがＬＹＴＡＧ構造に対するコリンの安定化効果をまね（ｅｍｕｌａｔｅ）できていることも示された。リガンド非存在下では、ＬＹＴＡＧは、中間状態物の蓄積に由来する二相性の移行（Ｍａｅｓｔｒｏ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．  Ｓａｎｚ，  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒｔｌｙ  ｆｏｌｄｅｄ  ｓｔａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ  Ｃ−ＬｙｔＡ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ２００５．  ３８７（Ｐｔ  ２）：  ｐ．  ４７９−８８）を示す。１５０ｍＭのコリンが存在すると、そのような中間状態物の蓄積が防止され、唯一つのシグモイド型の曲線及び熱安定性が得られ、これは以前に報告されている通りである（Ｍａｅｓｔｒｏ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．  Ｓａｎｚ，  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒｔｌｙ  ｆｏｌｄｅｄ  ｓｔａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ  Ｃ−ＬｙｔＡ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ２００５．  ３８７（Ｐｔ  ２）：  ｐ．  ４７９−８８）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
同様なアッセイをＰＥＧ存在下で実施すると、結果は、この化合物の添加が中間体効果を生じ、変性温度に影響を与えることなく中間体状態物の蓄積を防ぐことを示した（図２）。記載した研究を合わせると、本発明の基礎の１つであるＣＢＭのＰＥＧへのアフィニティーが証明される。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
本発明は、ＬＹＴＡＧとＰＥＧの間の相互作用を示す前述の結果に基づき、二相水性系を用いたタンパク質分離にこのポリマーを使用した具体的実施例を提供し、コリン結合モジュールに融合したポリペプチド及びタンパク質分離プロトコールの開発を可能にする。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
好ましいプロトコールでは、分離法中で用いる二相水性系中にＰＥＧ／リン酸塩及びＰＥＧ／デキストランの組合せを用いる。ＰＥＧ／リン酸塩系は、ｐＨ８．０で、ＰＥＧ（３〜１５％）及びリン酸カリウム（５〜１５％）という異なる濃度範囲で形成され、ｐＨ８．０の１５％ＰＥＧ／１２．５％リン酸塩の組合せ（以後、ＥｘｔＰ緩衝液）が好ましく、これはＰＥＧの多い（上）相とリン酸塩の多い（下）相の間の体積の差が最小である。一方、ＰＥＧ／デキストラン系は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で、ＰＥＧ（３〜１０％）及びデキストラン（５〜１０％）という異なる濃度範囲で形成され、６％ＰＥＧ系／６％デキストランの組合せが好ましく（以後、ＥｘｔＤ緩衝液）、これもＰＥＧの多い（上）相とデキストランの多い（下）相の間の体積の差が最小である。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
一般的なプロトコールは図３に要約されており、目的のポリペプチド又はタンパク質を少なくとも１のＣＢＲを含むＣＢＭ（好ましくはＬＹＴＡＧ）との融合物として発現する細胞抽出物を得ることから始まる。前記抽出物を、二相系の形成に必要な化合物と混合し、遠心して、又は重力により、相を分離する。前述のＰＥＧに対するＬＹＴＡＧのアフィニティーにより、このポリマーを含む上相へのＬＹＴＡＧ融合物の定量的分配が決定される（以下の詳細な例を参照されたい）。上相にＬＹＴＡＧ融合物が蓄積していることを確認した後、一連の洗浄工程を適用することができ、この洗浄工程は、下相の除去並びに捨てられたのと同じ体積及び組成での下相の置換からなる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
文献（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｈ．Ｗ．ａ．Ｇ．，  ｅｄ．  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌ．  ２２８．  １９９４）に公開されているバイノーダルダイアグラムからのデータに基づき、前述の好ましい形態の場合、この新鮮な相の組成は１％ＰＥＧ及び１６％リン酸カリウム、ｐＨ８．０（以後、ＷａｓｈＰ緩衝液）又は２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の０．５％ＰＥＧ及び１６％デキストラン（以後、ＷａｓｈＤ緩衝液）からなる。新たな混合及び相分離プロセスの後、下相をＷａｓｈＰ緩衝液又はＷａｓｈＤ緩衝液で置換し、プロセスを２〜３回繰り返す。この時点で、ＰＥＧ相中の目的のタンパク質の純度は既に十分高くなり得る。しかし、ＷａｓｈＰ緩衝液又はＷａｓｈＤ緩衝液に１５０ｍＭのコリンを含めると、融合タンパク質のリガンド結合部位からＰＥＧを移動させてポリマーとの相互作用を破壊する効果を現し、それにより、融合タンパク質を下相に回収することが可能になり、したがって、これを電気泳動的均一性に精製することができる。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
記載した発明は、他の、既存のタンパク質精製系に対して複数の利点を有し、例えば、簡便、迅速、経済的な方法であり、穏やかな条件下での精製を可能にする。この系の多様性は、使用できる試薬及び試薬濃度が多様であることに基づき、個々の特定の事例の具体的必要性に合わせることが可能である。更に、この系はカラムクロマトグラフィーに関連する技術的問題、例えば充填の必要性、圧力及び詰まりの問題等を有さず、固体支持体を用いるものよりも迅速であり、スケール変更が容易である（図４）。更に、毒性要素（ヘキサヒスチジン「タグ」に基づく系の場合における重金属等）が存在しないため、ＬＹＴＡＧ二相系は環境に優しい方法である。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
記載した系において、アフィニティー化合物へのタンパク質の吸収は溶液中で起こり、したがって、クロマトグラフィー樹脂等の表面に基づくアフィニティー支持体よりも効率的な方法である。更に、ＣＢＭ  ＬＹＴＡＧとＰＥＧの相互作用は、広いｐＨ範囲でタンパク質の安定化を誘導し、中性から離れたｐＨ値でこれらの精製系を用いる可能性を広げ、したがって、酸性のｐＨ値で生じるタンパク質とクロマトグラフィー支持体の間の静電反発力の存在を克服する。調べた実施例中、ＰＥＧ及びコリンに対するＣＢＭの二重アフィニティーはＬＹＴＡＧ融合タンパク質の分配に関して支配的な基準であると考えられ、単に系にコリンを添加する又は添加しないことで、所与の融合タンパク質を所望の相に局在させる。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
一般的に、ＬＹＴＡＧ等のＣＢＭと融合したタンパク質のアフィニティー分配にはＰＥＧ／リン酸塩及びＰＥＧ／デキストリン系が先験的に適しているようであるが、全体的な電荷、サイズ、疎水性等の目的のタンパク質の種々の特性が各系のパフォーマンスに影響を与え、したがって、どの系を選択するかにも影響を与える。この点で、本発明は、分配を向上させるために個々の特定の融合タンパク質に系を適合させるために作用する種々のパラメータ、すなわち、とりわけ、イオン力、温度、ｐＨ、及び界面活性剤の使用があるため、非常に多様である（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｈ．Ｗ．ａ．Ｇ．，  ｅｄ．  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌ．  ２２８．  １９９４）。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
更に、本発明はＰＥＧ／クエン酸塩、ＰＥＧ／硫酸塩／及びＰＥＧ／でんぷん等の代替的二相系を使用する可能性も想定する。可溶性の低いタンパク質の場合、抽出を大きなバッファー容量で行ってサンプルを希釈してタンパク質の凝集及び沈殿を最小限に抑えることができる。最後に、本方法は、生物学的内変換の酵素プロセスに組み込むことができ、その中では、（コリンの添加あり又はなしにより）酵素を１つの相又は別の相に自在に封じ込めることができ、一方、生成物は逆の相に蓄積し、それによって生成物の精製が促進され、生成物による酵素阻害の発生が最小限に抑えられ、触媒が再利用される。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリン結合ポリペプチドに結合されたタンパク質又はポリペプチドを分配又は分離するための方法であって、
ａ）
ｉ）少なくとも１つのコリン結合構造モチーフを有する配列の少なくとも１つのタンパク質若しくはポリペプチドを含む、細胞培養物の粗抽出物若しくは部分精製抽出物、又は細胞培養物の細胞外培地、又は異なる化学物質の混合物を、
ｉｉ）水と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、水中での溶解度が５％より高い塩又はその他のポリマーとの混合物に接触させ、
得られた混合物が自発的に２つの水相Ａ及びＢを有する二成分系を構成し、相Ａが相ＢよりもＰＥＧを多く含み、前記コリン結合モチーフを有するタンパク質又はポリペプチドが相Ａに優先的に分配され、
ｂ）必要に応じて、コリンを含む溶液を添加することで、前記コリン結合モチーフを含む前記タンパク質又はポリペプチドの相Ａへの優先的分配を抑制する
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記二成分系中の総ＰＥＧ濃度が３〜１５％であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記二成分系の前記相Ｂ中に存在する前記塩が、リン酸塩、クエン酸塩、硫酸塩、又はその混合物から選択されることを特徴とする、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記二成分系の前記相Ｂ中に存在する前記塩が、リン酸カリウムを濃度５〜１５％で含み、前記混合物のｐＨが６．０〜９．０の値であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記二成分系の前記相Ｂ中に存在する前記ポリマーが、濃度５〜１０％のデキストラン又はデキストラン誘導体であり、前記混合物のｐＨが６．０〜９．０の値であることを特徴とする、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記二成分系の前記相Ｂ中に存在する前記ポリマーが、濃度５〜１０％のでんぷん又はでんぷん誘導体であり、前記混合物のｐＨが６．０〜９．０の値であることを特徴とする、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項７】
コリンへのアフィニティーを有する前記ポリペプチド配列が、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＬｙｔＡアミダーゼのＣ末端ドメインに由来することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞培養の前記細胞抽出物又は前記細胞外培地が、ハイブリドーマ、カビ、酵母、又は細菌に由来することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
相Ｂを捨てることで、相Ａに優先的に分配されないタンパク質を前記細胞抽出物又は前記細胞外培養培地から部分的に除去することからなる更なる工程を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
相Ａに優先的に分配されない前記タンパク質が以下の工程により定量的に排除されることを特徴とする、請求項９に記載の方法：
ｉ）捨てられた相Ｂと組成及び体積が同等な量の溶液を添加する工程、
ｉｉ）混合及び二相Ａ及びＢへ分離する工程、
ｉｉｉ）新たに形成された相Ｂを捨てる工程、及び
ｉｖ）必要に応じて前記工程を繰り返す工程。
【請求項１１】
融合タンパク質又は融合ポリペプチドを含むＰＥＧを多く含む相Ａを、前記融合タンパク質又は融合ポリペプチドを精製された形態で得るために直接使用することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０に記載のＰＥＧを多く含む相Ａに保持されている融合タンパク質又は融合ポリペプチドの、水相中で目的の反応を触媒するための酵素リアクター中での生体触媒としての使用であって、逆側の相であるＰＥＧの少ない相Ｂ中に前記反応の産物を回収することが可能な、使用。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は融合ポリペプチドの分配又は分離のためのコリンへのアフィニティーを有する配列としての、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＬｙｔＡアミダーゼのＣ末端ドメインの使用。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は融合ポリペプチドを分配又は分離するための方法を実施するためのキットであって、以下の要素を含むキット：
ｉ）ＰＥＧ濃度が３〜１５％である水溶液；
ｉｉ）水溶液であって、リン酸塩、クエン酸塩、若しくは硫酸塩、又はその混合物、又はデキストラン若しくはデキストラン誘導体、又はでんぷん若しくはでんぷん誘導体を含む水溶液；及び
ｉｉｉ）固体の塩としてのコリン又は水溶液中のコリン。
【国際調査報告】
2010539142.tif 000015
2010539142.tif 000016
2010539142.tif 000017
2010539142.tif 000018