(57)【要約】  本発明は、移植のためにドナー組織から分離された膵島の生存性、回収性、及び機能を改善する方法に関し、さらに具体的には、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを使用して膵島の生存性及び機能性を向上することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離後において回収された膵島細胞の機能を保存する方法であって、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを、膵島の単離前に膵島細胞ドナーの膵島細胞に投与することを含み、ここで当該ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡが、膵島細胞においてｅＩＦ−５Ａ１の発現を抑制し、それにより膵島細胞におけるアポトーシスを阻害し、そして回収された膵島細胞の機能を保存する、前記方法。
【請求項２】
前記ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡが、ｅＩＦ−５Ａ１の以下のヌクレオチド配列：
５’−ＡＡＡＧＧＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡ−３'；
５'−ＡＡＧＡＴＣＧＴＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＡＣＴ−３'；
５'−ＡＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＴ−３'；又は
５'−ＡＡＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＡ−３'
を標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡが、以下のヌクレオチド配列：
５'−ＡＡＡＧＧＡＡＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＣＴＧＡｄＴｄＴ−３'
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡが、膵島細胞ドナーへの腹腔内注射を介して投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
膵島細胞がドナー回収プロセスの間にアポトーシスを引き起こすことを阻害する方法であって、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを、膵島単離前に膵島細胞ドナーへの腹腔内注射を介して膵島細胞ドナーにｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを投与することを含み、ここで当該ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡは、膵島細胞におけるｅＩＦ−５Ａ１ の発現を阻害し、それにより膵島細胞におけるアポトーシスを阻害する、前記方法。
【請求項６】
前記ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡが、ｅＩＦ−５Ａ１ の以下のヌクレオチド配列：
５'−ＡＡＡＧＧＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡ−３'；
５'−ＡＡＧＡＴＣＧＴＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＡＣＴ−３'；
５'−ＡＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＴ−３'；又は
５'−ＡＡＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＡ−３'
を標的とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡが、ヌクレオチド配列：５'−ＡＡＡＧＧＡＡＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＣＴＧＡｄＴｄＴ−３'を含む、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ランゲルハンスの膵島は、膵臓内でインスリンを生産する細胞を含む多細胞実体である。平均的なヒトで、約百万の膵島を有し、そして膵臓内の細胞の合計の約２〜３％を占める。膵臓はランゲルハンスの膵島を含み、これは、インスリンを生成するβ細胞を取り囲んでいる。β細胞は、血中のグルコースレベルをモニターしており、そして精密に計測された量のインスリンを放出して、グルコースピークに均衡させる。Ｉ型及びＩＩ型糖尿病は、９０％超のこれらのβ細胞が損傷を受けた場合に進行する。
【背景技術】
【０００２】
１型糖尿病は、米国において２１００万人の糖尿病患者の約１０％が罹患するグルコース恒常性についての障害である。１型糖尿病は、膵島β細胞の実質的に完全な自己免疫破壊から生じ、生命維持のためのインスリン投与に患者を依存状態にする。１型糖尿病の発症機序は、免疫系の細胞と、膵島β細胞上に存在する抗原との間の複雑な相互作用に関わっている。この相互作用は、Ｔｈ１細胞とマクロファージの活性化を導き、これは続いて他の因子のなかで特に、一酸化窒素産生を誘導するサイトカイン（ＩＬ１β、ＴＮＦα、及びＩＦＮγ）であって、アポトーシス性及び壊死性の膵島β細胞死を引き起こすサイトカインを放出する。膵臓又は膵島移植に関するβ細胞「置換」戦略は、１型糖尿病を回復させる点で一定ではないが成功を収めたが、限られた数のソース（死体ドナー）を必要とし、そしてさらに、内在の自己免疫プロセスにより破壊される。
【０００３】
結合マトリクス及び残りの外分泌組織からの膵島の分離又は単離は、研究室での実験及び移植目的の点で利点があり、そして有利である。膵島移植は、１型糖尿病の最も有望で、かつ生理的侵襲の少ない方法である。完全な膵臓組織ではなく膵島を移植することは、移植の容易さ、そして消化酵素の分泌に関わるドナー組織の膵臓外分泌機能が除去されるという確かな利点を有する。膵臓外分泌組織から膵島を遊離することは、膵島移植に影響する最初の及び重大な工程である。膵島単離における重要な目標は、十分な数の生存可能であり、機能を有しかつ強力な移植用の膵島を提供することである。
【０００４】
「エドモントンプロトコル」は、健常な膵島を糖尿病患者に移植する。エドモントンプロトコルを用いた膵島移植が、Shapiro, Ryan, and Lakey, Clinical Islet Transplantation--State of the Art, Transplantation Proceedings, 33, pp. 3502-3503 (2001); Ryan et al., Clinical Outcomes and Insulin Secretion After Islet Transplantation With the Edmonton Protocol, Diabetes, Vol. 50, April 2001, pp. 710-719; and Ryan et al., Continued Insulin Reserve Provides Long-Term Glycemic Control, Diabetes, Vol. 51, July 2002, pp. 2148-2157に記載される。肝臓に配置されると、当該細胞は、血液供給を発達させ、そしてインスリンを生成する。エドモントン・プロトコルは、使用される方法に応じて７〜１０の工程を含む。第一工程は、特定の酵素（リベラーゼ）を、ドナーの膵臓に導入することに関しており、当該酵素は膵臓組織を消化するが、膵島を消化しない。消化工程に続き、膵臓内の他の細胞から膵島を分離する幾つかの次なる工程が存在する。分離された膵島を、門脈として知られている肝臓の主な血管に移植する。肝臓は、損傷を受けた場合に、肝臓自体を再生することができ、新たな血管及び支持組織を構築できる。その結果、膵島を肝臓に移植した場合、新たな血管が形成して、膵島を支持すると信じられている。細胞が生成するインスリンは、周囲の血管を通して血流中に吸収され、そして体中に分布されて、血中のグルコースレベルを制御する。
【０００５】
要するに、エドモントン・プロトコルの工程は、もろい三次元構造を有しかつ増殖及び生存には多量の酸素を必要とする膵島の生存性を損なわせる強制的プロセスを作り出す。当該プロセスの間に、膵島は、酸素デリバリーの非最適条件のため損傷を受けるか又は破壊されることがあり、所定のドナー膵臓から回収される健常な膵島の収率に影響する。さらに、ドナーの利用可能性により、膵島移植が極めて限定的なものになり；１人の患者においてインスリン独立性を得るためには、２つの膵臓が必要とされることが多い。
【０００６】
ステロイドフリーの非糖尿病誘発性免疫抑制治療と併せた膵島移植は、１型糖尿病を患う患者を治療するために用いられてきた。しかしながら、このような治療は、脂質異常症及び高血圧の高いリスクを導くことがあり、そして長期間の研究によると、膵島生存性が損なわれることが示される。
【０００７】
ヒトにおける膵島移植のエドモントンプロトコルにより、移植の１年後に、８０％の患者が、インスリン独立性を達成するという短期間の顕著な成功が示された。しかしながら、５年目ではこの割合は、たった約１０〜１５％に低下する。移植片機能の進行的消失の理由は明らかではないが、進行性のサイトカイン媒介性炎症の結果として膵島が失われるようである。しかしながら、膵島移植は、１型糖尿病を患う患者の実行可能な治療選択のままであり、長期間のインスリン独立性が得られない患者であっても、血糖不安定性の低下、低血糖症の発症低下、及びインスリン量の低下などの他の重要な恩恵を受けることが特に結果により示されている。
【０００８】
膵島移植後の初日は、移植された膵島について特に脆弱な期間である。最大で６０％の移植された膵島が、移植後の初日に非自己抗原特異的アポトーシスを受ける。この初期の破壊は、糖尿病を回復するために十分な膵島が生存することを保証するために、２〜３個の死体ドナーを使用することを必要とすることの主な根本的理由となっている。炎症性サイトカイン、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、及びＩＦＮγの局所的生産は、移植された膵島の初期アポトーシスに関わっている。こうして、初期移植期間におけるサイトカインを制限する戦略は、十分な膵島を得るために必要となるドナーの数を限られたものにし、膵島生存性を高め、そして長期間機能する能力を延長する。本発明は、これらの戦略を提供する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、単離後の回収された膵島細胞の機能を保持する方法であって、膵島単離の前に、膵島細胞ドナーの膵島細胞にｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを投与することを含み、ここで当該ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡは、膵島細胞においてｅＩＦ−５Ａ１ の発現を抑制し、それにより膵島細胞におけるアポトーシスを抑制し、そして回収された膵島細胞の機能を保存する、前記方法を提供する。好ましい実施態様では、ｓｉＲＮＡは、ｅＩＦ−５Ａ１ の以下のヌクレオチド配列を標的化する：
５'−ＡＡＡＧＧＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡ−３'；
５'−ＡＡＧＡＴＣＧＴＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＡＣＴ−３'；
５'−ＡＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＴ−３'；又は
５'−ＡＡＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＡ−３'
ある実施態様では、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列５'−ＡＡＡＧＧＡＡＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＣＴＧＡｄＴｄＴ−３'を含む。ｓｉＲＮＡは、任意の許容される手段を介してドナーに投与されてもよい。ある実施態様では、ｓｉＲＮＡは、腹腔内注射を介して膵島細胞ドナーへと投与される。
【００１０】
本発明の別の実施態様は、膵島細胞がドナー回収プロセスの間にアポトーシスを引き起こすことを阻害する方法であって、膵島単離の前に膵島細胞ドナーへの腹腔内投与を介して膵島細胞ドナーへとｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを投与することを含み、ここで当該ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡは、膵島細胞内におけるｅＩＦ−５Ａ１ の発現を阻害し、それにより膵島細胞におけるアポトーシスを阻害する、前記方法を提供する。
【００１１】
好ましい実施態様では、ｓｉＲＮＡは、ｅＩＦ−５Ａ１ の以下のヌクレオチド配列：
５'−ＡＡＡＧＧＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡ−３'；
５'−ＡＡＧＡＴＣＧＴＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＡＣＴ−３'；
５'−ＡＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＴ−３'；又は
５'−ＡＡＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＡ−３'
を標的とする。ある実施態様では、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列：５'−ＡＡＡＧＧＡＡＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＣＴＧＡｄＴｄＴ−３'を含む。
【００１２】
任意のｓｉＲＮＡ又はアンチセンスコンストラクトは、かかるコンストラクトが、膵島細胞においてｅＩＦ−５Ａ１ の発現を阻害する限り、使用することができる。ｓｉＲＮＡの投与は、任意の適切な経路であってもよい。代表的な投与方法は、膵島細胞ドナーの門脈を介したかん流、膵島細胞ドナーの門脈を介した流体力学的かん流、及び腹腔内注射を含む。
【００１３】
本発明は、アポトーシスを阻害し、そして膵島細胞の機能を保存するための組成物であって、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを含み、ここで当該ｓｉＲＮＡが、ｅＩＦ−５Ａ１の発現を阻害し、それにより膵島細胞におけるアポトーシスを阻害する組成物も提供する。好ましいｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡは上に論じられている。
【００１４】
本発明は、膵島β細胞における標的タンパク質の発現を阻害する方法であって、β細胞回収前にβ細胞ドナーに対して、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡに対して標的されたｓｉＲＮＡコンストラクトを投与することを含み、ここで当該ｓｉＲＮＡは、膵島β細胞中の標的タンパク質の発現を阻害する方法も提供する。
【００１５】
本発明は、ｅＩＦ−ＦＡの発現を低下させることにより、誘導性一酸化窒素合成（ｉＮＯＳ）経路を介して、一酸化窒素（ＮＯ）の産生を低下させる方法を提供する。
【００１６】
本発明は、ｉＮＯＳ経路を介して一酸化窒素の産生を低下させる医薬の製造のための、ｅＩＦ−５Ａ ｓｉＲＮＡの使用をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、門脈を介してｅＩＦ−５Ａ ｓｉＲＮＡをかん流した後における、β−アクチン、ｍＡＡＴ、及びｅＩＦ−５Ａ１について行われたＲＴ−ＰＣＲの結果を提供する。この図は、ｅＩＦ−５Ａ１ の発現が計測可能であり、そうして膵島に取り込まれたことを示す。
【図２】図２は、低速逆行性門脈かん流（slows regrograde portal vein perfusion）を示す。胆管（透明）及び門脈（赤）は、調製的ノット（preparatory knot)（暗色縫合）の準備ができている。針をノットの下に差し込み（矢印により方向を示す）、ノットの下を横断させ、そしてｓｉＲＮＡを血管に放出して、これらは膵臓、脾臓、腸、及び遠位結腸の三分の一に到達する。
【図３】図３は、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを膵島にかん流することにより、ｅＩＦ−５Ａ１ の発現の低下が誘導される（図には、ｅＩＦ−５Ａ１ のｍＲＮＡレベルの低下が示される）ことを示す。
【図４】図４には、対照及び生理食塩水で処理された膵島に比べて、ｅＩＦ−５Ａ１ で処理された膵島細胞のアポトーシスを低下することが示される（ここで１群あたりｎ＝２）。
【図５】図５には、対照及び生理食塩水で処理された膵島に比較した場合に、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡで処理された膵島細胞のアポトーシスが低下することが示される（ここで１群辺りｎ＝３）。
【図６】図６は、ｅＩＦ−５Ａ２に対して整列されたヒトｅＩＦ−５Ａ１のヌクレオチド配列を提供する。
【図７】図７は、ｅＩＦ−５Ａ２に対して整列されたヒトｅＩＦ−５Ａ１のアミノ酸配列を提供する。
【図８】図８は、代表的なアンチセンスオリゴヌクレオチドと供にヒトｅＩＦ−５Ａ１のヌクレオチド配列を提供する。
【図９】図９は、代表的なアンチセンスオリゴヌクレオチドと供にヒトｅＩＦ−５Ａ１のヌクレオチド配列を提供する。
【図１０Ａ】図１０Ａ及び図１０Ｂは、代表的なｓｉＲＮＡと供にヒトｅＩＦ−５Ａ１のヌクレオチド配列を提供する。
【図１０Ｂ】図１０Ａ及び図１０Ｂは、代表的なｓｉＲＮＡと供にヒトｅＩＦ−５Ａ１のヌクレオチド配列を提供する。
【図１１】図１１は、代表的なｓｉＲＮＡと供にヒトｅＩＦ−５Ａ１のヌクレオチド配列を提供する。
【図１２】図１２は、ｓｉＲＮＡ ｅＩＦ−５Ａ１が、膵島細胞において発現をノックダウン（減少）させることができるということを示す実験の模式図を示す。
【図１３】図１３Ａは、２．８から１１ｍＭのグルコース刺激の後の５０個の膵島についてのインスリン分泌パターンを示し、そして図１３Ｂは、２．８から１１ｍＭのグルコース刺激の後の単一膵島からの[Ｃａ2+]iパターンを示す。この相は、０、１、２による。この図により、通常機能の膵島が、インスリン分泌の二相性のパターンでのグルコース刺激に応答することが示され、これは膵島細胞内カルシウム（[Ｃａ2+]i）における同様の変化に近似する。
【図１４】図１４は、カルシウム振動研究の結果を提供する。これらの図により、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡで処理され（そうしてｅＩＦ−５Ａ１の発現が低下した）膵島細胞が、有意に強いグルコース応答及び全体の振動を示すということが示される。図１４は、これらの処理された細胞が、長期間生存するばかりでなく、機能も保持するということを示す。
【図１５】図１５は、サイトカイン処理された染色済みの膵島細胞の異なる写真を示す。この写真により、対照又はビヒクル（生理食塩水のみ）で処理された膵島細胞よりも、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡで処理された膵島細胞の生存性が高く、そして死細胞が少ないということが示される。
【図１６Ａ】図１６Ａ及び１６Ｂは、ＩＰ注射を介して膵島細胞ドナーに投与された場合にｓｉＲＮＡが、膵島細胞に侵入することを４種の画像化技術を用いて示す。共焦点イメージングを用いて、単離膵島の３Ｄ再構成図を作成した。図１６Ａにより、０．９％の生理食塩水を１日１回、３日間腹腔内投与されたマウスから単離された膵島が、ＦＩＴＣ自己蛍光を示すが、ＴＲＩＴＣチャンネル（図ではＣｙ３標識）において最低の蛍光しか示さないということが示される。
【図１６Ｂ】図１６Ａ及び１６Ｂは、ＩＰ注射を介して膵島細胞ドナーに投与された場合にｓｉＲＮＡが、膵島細胞に侵入することを４種の画像化技術を用いて示す。共焦点イメージングを用いて、単離膵島の３Ｄ再構成図を作成した。図１６Ｂにより、Ｃｙ−３標識された安定化ｓｉＲＮＡを１日１回、３日間腹腔内投与されたＣ５７Ｂｌ／６から単離された膵島が、Ｃｙ３標識の浸透を示すということが示される。
【図１７Ａ】図１７（Ａ）は、βＴＣ３細胞が、２の異なるｓｉＲＮＡコンストラクト（コンストラクトＡ及びＢ）、又は対照でトランスフェクトされ、そして指定のタンパク質について免疫ブロットに供された場合の結果を示す。
【図１７Ｂ】図１７（Ｂ）は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに同じｓｉＲＮＡを１日１回、３日間腹腔内注射し、そして膵島を単離し、そしてコラゲナーゼ消化及び分画勾配遠心分離を介して精製した場合の結果を示す。膵島を２％ＳＤＳ中で溶解し、そして免疫ブロットに供する。
【図１７Ｃ−Ｄ】図１７（Ｃ）は、単離された膵島にＦｕｒａ２を３０分間充填し、次に３ｍＭ Ｄ−グルコース中でイメージングした場合の結果を示す。膵島を１１ｍＭ Ｄ−グルコースで３００秒刺激し、そしてＦｕｒａ２比を、蛍光顕微鏡により連続してモニタリングした場合の結果を示す。図１７（Ｄ）は、グルコース刺激されたインスリン分泌（ＧＳＩＳ）を、各処理群から得た５０の膵島を用いて実行した結果を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａ−Ｉは、ｅＩＦ−５Ａのノックダウンが、膵島機能及びex-vivoでの生存性を改善するということを示す。
【図１８Ｂ】図１８Ａ−Ｉは、ｅＩＦ−５Ａのノックダウンが、膵島機能及びex-vivoでの生存性を改善するということを示す。
【図１８Ｃ】図１８Ａ−Ｉは、ｅＩＦ−５Ａのノックダウンが、膵島機能及びex-vivoでの生存性を改善するということを示す。
【図１８Ｄ−Ｉ】図１８Ａ−Ｉは、ｅＩＦ−５Ａのノックダウンが、膵島機能及びex-vivoでの生存性を改善するということを示す。
【図１９Ａ】図１９Ａ−Ｄは、サイトカイン誘導性のｉＮＯＳタンパク質の生産が、ｅＩＦ−５Ａ欠損細胞では見られないことを示す。
【図１９Ｂ】図１９Ａ−Ｄは、サイトカイン誘導性のｉＮＯＳタンパク質の生産が、ｅＩＦ−５Ａ欠損細胞では見られないことを示す。
【図１９Ｃ】図１９Ａ−Ｄは、サイトカイン誘導性のｉＮＯＳタンパク質の生産が、ｅＩＦ−５Ａ欠損細胞では見られないことを示す。
【図１９Ｄ】図１９Ａ−Ｄは、サイトカイン誘導性のｉＮＯＳタンパク質の生産が、ｅＩＦ−５Ａ欠損細胞では見られないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
真核生物翻訳開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）は、ストレス誘導性の遺伝子の転写後調節において決定的な因子であることが明らかとなり、そして哺乳動物細胞においてサイトカイン媒介性のアポトーシスを促進することが明らかとなっている。ｅＩＦ−５Ａは、真核生物を通して極めて高度に保存されている小さな酸性タンパク質であり、そして固有のポリアミン由来のアミノ酸であるヒプシンを含むことが知られている唯一のタンパク質である。ｅＩＦ−５Ａは、ｍＲＮＡプロセッシング、輸送、及び翻訳において役割を果たすことが提案されていた。しかしながら、どんなものであれ膵島における炎症カスケードにおけるその役割は、従前、特徴決定されていなかった。膵島は、グルコース及び脂質毒性、酸化ストレス、及び炎症性サイトカインに対して感受性が高い。膵島の細胞ストレスへの応答を媒介する点に関わる因子の役割を研究するため、本発明者は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いてin vivoにおいて膵島の特定タンパク質を枯渇させるプロトコルを開発した。研究において、発明者らは、ＲＮＡ干渉を用いてｅＩＦ−５Ａタンパク質を膵島から枯渇させることにより、膵島におけるｅＩＦ−５Ａの役割を決定することを試みた。
【００１９】
しかしながら、おもに齧歯類膵島におけるＲＮＡ干渉研究における主要な試みでは、トランスフェクション効率が比較的低かった。従来の研究が、短いヘアピンＲＮＡのウイルス媒介性のデリバリーを利用することを示した一方で、この技術は、適切なウイルスを作成するには時間がかかるものであり、そしてウイルス毒性を被るものであった。本発明者らは、安定化された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を繰り返し腹腔内注射することにより、マウス膵島から選択したタンパク質をin vivoで枯渇させる新たなプロトコルを発見した。このプロトコルは、膵島内へのｓｉＲＮＡの顕著な浸透をもたらす。この技術は、よく特徴決定された膵臓転写因子Ｐｄｘ１などの任意の所望の標的タンパク質を、膵島からうまく枯渇させるために使用することができる。この技術を用いて、発明者は、ｅＩＦ−５Ａタンパク質を膵島からうまく枯渇させ、そして誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）をコードするｍＲＮＡの翻訳を促進することにより、ｅＩＦ−５Ａが、サイトカイン媒介性の膵島機能不全に寄与するということを示した。このデータは、ｉＮＯＳのｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ（おそらく、サイトカイン媒介性のストレス応答に関与するｍＲＮＡ）のサブセットの安定化及び／又は核輸送のために、ｅＩＦ−５Ａが膵島において必要であるというモデルを示唆する。
【００２０】
本発明者らは、in vivoでのｓｉＲＮＡ注射を使用して、サイトカイン媒介性ストレスにおける真核生物翻訳開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）の役割を研究した。ｅＩＦ−５Ａは、ストレス誘導性遺伝子の翻訳において、決定的なレギュレーターとして他のシステムにおいて特徴決定されていた。ｅＩＦ−５Ａに対するｓｉＲＮＡがマウスに注射された場合、単離された膵島においてｅＩＦ−５Ａタンパク質レベルの５０〜７０％の低下が観察された。この低下に伴い、対照処理に比べて、グルコース刺激性のインスリン分泌及びＣａ2+可動化が３０〜４０％の増加すること観察された。単離された膵島を炎症性サイトカイン（ＩＬ１β、ＴＮＦα、ＩＦＮγ）のカクテルに暴露した場合に、膵島機能の相対的向上が、ｓｉ−ｅＩＦ−５Ａで処理された動物において持続した。ｅＩＦ−５Ａノックダウンの後の膵島保護は、その生成物がグルコース応答性又はインスリン転写に関与する遺伝子（Ｓｌｃ２ａ２、Ｇｃｋ、Ｉｒｓ１、Ｎｋｘ６−１、ＭａｆＡ、Ｐｄｘ１、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＳｅｔｄ７）の発現変化を伴うことはない。図１８Ｃを参照のこと。大事なことは、誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）をコードするｍＲＮＡが、対照で処理された膵島及びｓｉ−ｅＩＦ−５Ａ−処理された膵島の両方において、サイトカインに応答して、４０倍超も上方制御されるが（図１９Ａを参照のこと）、ｉＮＯＳタンパク質レベルが、ｓｉ−ｅＩＦ−５Ａ処理された膵島において３〜５倍低いということである（図１９Ｂを参照のこと）。これらのデータにより、ｓｉ−ｅＩＦ−５Ａ処理された膵島における機能の向上が、二次的に一酸化窒素の生産を低下しうるということが示唆される。これにより、ストレスシグナルに応答した膵島β細胞において、ｅＩＦ−５ＡがｉＮＯＳ翻訳の制御を介して不可欠な役割を果たし、そして膵島細胞の生存性の保存並びに回収後及び移植後において機能する膵島細胞の能力の保存を狙った治療戦略について、ｅＩＦ−５Ａが実行可能な標的として役立ちうるという証拠を提供する。
【００２１】
本発明者らは、（ＧＣ−７（ＤＨＳの阻害剤）を投与することによる）ヒプシン化の阻害を介したｅＩＦ−５Ａ機能の遮断が、効果的にｉＮＯＳレベルを低下するということをさらに示した。図１９Ｄを参照のこと。
【００２２】
膵島へのｓｉＲＮＡの取り込みが、逆行性の門脈閉塞を介した膵臓かん流により達成することができるということが以前に示されていた。Ｂｒａｄｌｅｙら、Transplantation Proceedings, 37, 233-236, 2005を参照のこと。簡潔に説明すると、Ｃｙ−３標識されたルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）ｓｉＲＮＡ ＧＬ２ 二本鎖を、リポフェクタミン２０００でパッケージして、又はパッケージせずに用いて、そして尻尾静脈を通して（in vivo、マウス１匹あたり５０μｇ）注射するか、又は逆行性門脈静脈閉塞（in situ, マウス１頭あたり２μｇ）により膵臓に直接注射した。膵臓を取得し、そしてIn situデリバリー後に２４時間４℃で貯蔵するか、又はin vivoデリバリー後に４時間貯蔵し、そして膵島を単離し、そしてさらに試験前に１６時間培養した。ｓｉＲＮＡの分布を可視化するために、膵臓をインスリンについて染色し、そして蛍光顕微鏡の下で試験した。単離された膵島を直接蛍光顕微鏡で試験した。パッケージされていないｓｉＲＮＡは、リポソームにパッケージされたｓｉＲＮＡを用いて観察されるのと同程度に膵島に到達し、いわゆる「裸」のｓｉＲＮＡデリバリーの報告に一致した。Lewis et al., Nat. Genet. 32: 107-108, Epub 2002 Jul 2029, 2002 and McCaffrey AP, et al., Nature 418: 38 - 39, 2002)。図１は、膵島細胞へのかん流が、膵島細胞への適切なデリバリーメカニズムを提供するということを示す。
【００２３】
従って、本発明は、膵島細胞において標的タンパク質の発現を抑制する方法であって、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを、膵島細胞に投与することを含み、ここで当該ｓｉＲＮＡが、膵島細胞において標的タンパク質の発現を阻害する、前記方法を提供する。任意の手段を介して、好ましくは膵島β細胞の単離の前に、膵島β細胞ドナーに腹腔内投与することを介して投与されてもよい。
【００２４】
１の実施態様では、本発明者らは、安定化されたＣｙ３−標識された二本鎖ＲＮＡをＣ５７Ｂｌ／６マウスに三日間腹腔内注射することにより、共焦点顕微鏡で測定した場合に当該ＲＮＡが単離された膵島へと顕著に浸透することが明らかにされた。タンパク質ノックダウンについてこの技術を試験するために、Ｐｄｘ１を標的とした安定化ｓｉＲＮＡを用いた。Ｐｄｘ１ｍＲＮＡに対する２つの異なるｓｉＲＮＡは、（免疫ブロット分析により評価した場合に）膵島においてＰｄｘ１タンパク質の５０％及び９０％ノックダウンをもたらした。図１７Ａ−Ｄを参照のこと。
【００２５】
本発明は、膵島細胞においてｅＩＦ−５Ａ１の発現を阻害する方法であって、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを膵島細胞に投与することを含み、ここで当該ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡが、膵島細胞においてｅＩＦ−５Ａ１の発現を阻害する、方法を提供する。図１６Ａ及び図１６Ｂは、ＩＰ注射を介した膵島細胞ドナーへの投与が、膵島細胞に対する適切なデリバリーメカニズムを提供するということを示した。図１６Ｂは、安定化されたＣｙ−３標識二本差ＲＮＡをＣ５７Ｂｌ／６マウスに３日間の腹腔内注射することにより、共焦点顕微鏡で測定した場合に、当該ＲＮＡが単離膵島に顕著に浸透することを明らかにした。図１２Ｂ及び１８Ｂは、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡで処理された膵島細胞が、より少ないｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡしか発現しないことを示す。
【００２６】
ｅＩＦ−５Ａ１発現を抑制することにより、アポトーシスが阻害される。図４及び５は、単離前にｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡで膵島細胞を処理することが、これらの細胞のアポトーシスを阻害するメカニズムを提供した（ｓｕｂＧ１期の細胞数の低下により示される）。したがって、本発明は、回収された膵島細胞において、アポトーシスを阻害する方法であって、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを膵島β細胞ドナーに投与することを含み、ここで当該ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡは、膵島細胞内におけるｅＩＦ−５Ａ１の発現を阻害し、そしてここでｅＩＦ−５Ａ１発現の抑制がアポトーシスを阻害する、方法を提供する。回収プロセスの前に、膵島細胞をｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡで処理することが好ましい。
【００２７】
本発明は、単離された後に回収された膵島細胞の機能を保存する方法であって、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを膵島単離の前に膵島細胞ドナーの膵島細胞に投与することを含み、これが膵島細胞におけるｅＩＦ−５Ａ１発現の抑制又は低下をもたらし、次に膵島細胞におけるアポトーシスを抑制し、さらにその機能を保存する方法をさらに提供する。膵島細胞の機能の保存は、膵島細胞が回収プロセスを生き残るということだけではなく、回収プロセス後においてその機能を維持する（細胞の機能は、長期間残存し、及び／又はそれらはｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡ処理されていない膵島細胞よりも優れたグルコース応答性を維持する）ということを意味する。
【００２８】
１の実施態様では、膵島機能及び全身の健康におけるｅＩＦ−５Ａ１ ノックダウンの結果を調査するために、Ｃ５７Ｂｌ／６雄マウスに、ビヒクル（０．９％生理食塩水）[群Ｉ]、対照ｓｉＲＮＡ（１６．６ｍｇ／ｋｇ）[群ＩＩ]、又はｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡ（１６．６ｍｇ／ｋｇ[群ＩＩＩ]のいずれかを腹腔内（ＩＰ）注射した。指定された処理の注射を、膵島回収（０日目）の前３日間（−３、−２、−１日目）毎日投与した。単離された膵島をコラゲナーゼ処理により精製し、そして試験の開始前１６〜１８時間静置した。回収後１日目に機能のベースラインを確立した後に、半分の膵島を、サイトカインカクテル（５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ１β、１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ−α、１００ｎｇ／ｍｌ ＩＮＦ−γ）に晒して、１型糖尿病において膵島が直面する条件を模倣した。実験設計の模式図及び膵島の配分を図１２Ａに示す。
【００２９】
ウエスタンブロットにより、タンパク質ノックダウンについて膵島の各群から得たタンパク質ライセートを分析した。図１２Ｂは、群IIIの処理を受けたマウス膵島におけるｅＩＦ−５Ａ１の相対的ノックダウンを示し、これは図１２Ｃにおいて定量化される。これらのデータにより、膵島内におけるｅＩＦ−５Ａ１の発現のノックダウンをもたらすＩＰ注射の効力が示される。
【００３０】
回収された膵島における保存された機能の証拠は、カルシウム振動アッセイにより示される。本発明者らは、細胞内カルシウムが刺激及びストレスの指標であるということを決定した。ヒト及び齧歯類の両方において、通常通り機能する膵島は、図１３Ａに示されるようにインスリン分泌の２相性のパターンでグルコース刺激に応答する。一次近似として、この二相性パターンは、膵島の細胞内カルシウム[Ｃａ2+]iにおける変化によく似ており、この変化は、第二相のプラトーに落ち着く第一相ピークからなる（図１３Ｂ）。３４０及び３８０ｎｍ励起から放射される光の比として報告される[Ｃａ2+]iの計測は、膵島機能のさらなる特徴を検出する優れた感度を提供する。グルコースに対する[Ｃａ2+]i応答は、３つの相からなり（図１３を参照のこと）、β細胞刺激と分泌との関係における「コンセンサスモデル」により記載されるプロセスを大まかに反映している。[Ｃａ2+]iの初期の落ち込みは、グルコースがβ細胞に移動した後に、小胞体が[Ｃａ2+]iを動員し、隔離するにつれ生じる（第０相）。次にグルコースは、解糖をとおして代謝され、そしてさらにトリカルボン酸（ＴＣＡ）回路においてさらに代謝され、ＡＴＰ生産をもたらす。ＡＴＰ／ＡＤＰの十分な増加が生じて、ＫATP−イオンチャネルが閉じた場合、第一相インスリン分泌に関連するＬ型カルシウムチャネルが開くために、[Ｃａ2+]iの急激な増加が生じる。この最初の第一相ピークの後に、[Ｃａ2+]iは、プラトーに落ち着くが、プラトーは[Ｃａ2+]i振動によりしばしば中断される。プラトーの高さは、グルコース濃度及び第二相インスリン分泌の割合に直接関連している。概して、イメージングに基づく[Ｃａ2+]i計測は、個々の膵島のレベルで、動的なインスリン分泌の優れた一次近似となる。
【００３１】
多くの因子は、グルコース刺激に対する通常の[Ｃａ2+]i応答にマイナスの影響を与えることがある。グルコース代謝、ミトコンドリア及びＡＴＰ産生、小胞体、イオンチャネルの機能、及び多種多様の他の問題の破綻は、グルコース刺激に関するカルシウム処理のダイナミクスに影響を与えることがある。[Ｃａ2+]iの変化を頻繁にモニタリングすることにより、これらの活性態様における不具合は、静的インスリン分泌の標準計測により観察されるよりも頻繁に観察される。例えば、低いグルコースレベルにおけるベース[Ｃａ2+]iの増加、及びグルコース刺激の間における[Ｃａ2+]iの第０相の落ち込みの低下は、ＥＲ−ストレス又はおそらくイオンチャネル機能不全を指している可能性がある。このような不具合は、静的又は動的インスリン分泌を計測することによって容易に検出することはできないが、本明細書に記載される画像化技術は、これらの問題を指摘するために使用することができる。
【００３２】
カルシウム振動及びグルコース刺激されたインスリン分泌研究においてサイトカインが存在する場合、及び存在しない場合の両方において、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡ（１６．６ｍｇ／ｋｇ）で処理された膵島［第３群（ｅＩＦ−５Ａ１ノックダウン膵島）］は、グルコースに対する高い応答性、並びに長期間の機能の維持（長期間の生存を示す）を示した。図１４を参照のこと。従って、これらの膵島は、インスリンの高い生産を示すことが予期される（データー取得中）。生存／死亡染色した後に撮られた画像から得た元データーは、ｅＩＦ−５Ａ１ ノックダウンが膵島細胞の生存を延長するという概念を定性的に裏付ける（図１５）。赤色膵島（死亡した膵島細胞の各にインターカレットするＥｔＨＤ−１の結果）の数を、カルセイン−ＡＭを蛍光カルセインへと能動的に切断する緑色膵島の数と比較することにより、膵島生存の定性的画像が確かめられる（図１５）。
【００３３】
本発明は、一酸化窒素の産生増加と関連する炎症性疾患に関与する細胞においてアポトーシスを阻害する方法をさらに提供する。例えば、リューマチ様関節炎（ＲＡ）などの炎症性疾患は、誘導性一酸化窒素合成（ｉＮＯＳ）経路の活性化のため、一酸化窒素（ＮＯ）の生産増加と関連する。動物モデルにおける研究により、ＮＯが、関節炎症及び組織損傷の病原進行において通常の役割を果たすということが示唆される。なぜなら、関節炎の重篤度が、ＮＯＳ阻害剤の投与により低下するからである。関節内に存在する幾つかの細胞（例えば滑膜線維芽細胞、内皮細胞、及び軟骨細胞）は、炎症性サイトカインにより誘導されて、インビトロでＮＯを産生することができる。さらに、局在化研究により、ＲＡを煩う患者から得られた関節組織の滑膜表層細胞、軟骨細胞及び血管におけるｉＮＯＳ発現が上方制御されることが示される。滑膜表層及び軟骨へのｉＮＯＳの局在化は、アポトーシスがＲＡ、特に滑膜表層及び軟骨において特に増加することを示した他の研究の点でも関心が高い。リューマチ様関節におけるアポトーシスの原因となるメカニズムは、不明のままであるが、Ｆａｓ抗原の発現が、ＲＡ滑膜細胞において増加し、そしてＦａｓ抗体が、インビトロにおける滑膜細胞のアポトーシス性の死亡を刺激することができるということが以前の研究者により示された。ｉＮＯＳ経路の活性化が、リューマチ性関節においてアポトーシスの刺激に関与するという仮説が検討された。なぜなら高レベルのＮＯが、インビトロにおいて多くの細胞型においてアポトーシスを刺激することが知られているからであり、そしてＮＯが、ＲＡにおけるアポトーシスのメディエーターとして作用すると結論づけられた（R. J. van't Hof et al., Rheumatology 200, 39: 1004-1008を参照のこと)。
【００３４】
このようなものとして、本発明はＲＡに関わる細胞（例えば、滑膜細胞及び軟骨細胞）においてアポトーシスを阻害する方法であって、ｅＩＦ−５Ａ１の発現を阻害し、それによりｉＮＯＳ経路を介した一酸化窒素の産生を阻害又は低下させて、細胞のアポトーシスを阻害する方法を提供する。
【００３５】
本発明は、さらに、細胞又は宿主におけるＮＯ産生を阻害する方法であって、当該細胞又は宿主にｅＩＦ−５Ａ１に対するｓｉＲＮＡを投与することによる方法を提供する。ｓｉＲＮＡは、ｅＩＦ−５Ａ１の発現を低下させ、そして次にｉＮＯＳ経路の活性化を抑制することによりＮＯの産生を低下させる。
【００３６】
本発明は、ｉＮＯＳ経路を介して一酸化窒素の産生を低下させる医薬の製造のための、ｅＩＦ−５Ａ ｓｉＲＮＡの使用を提供する。
【００３７】
ｅＩＦ−５Ａ１ の発現を抑制する任意のｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡが使用されてもよい。「阻害」という語句は、対照細胞、つまりｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡで処理されていない細胞において生じるレベルに比べて低下することを意味する。１の代表的、そして特に好ましいｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡは、以下の配列：５'−ＡＡＡＧＧＡＡＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＣＴＧＡｄＴｄＴ−３'を含む。２００５年１１月２８日に出願された同時係属米国出願１１／２９３，３９１号（当該出願はその全てを本明細書に援用する）は、追加の代表的ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを提供し、そして他の細胞型においてｅＩＦ−５Ａ１の発現を阻害するために使用され、そしてアポトーシスを阻害することが示された他のアンチセンスコンストラクトを提供する。当業者は、ｅＩＦ−５Ａ１ 配列が与えられれば、他のｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを設計することができ、そして過度の実験を行うことなく、発現を阻害する能力について当該ｓｉＲＮＡを容易に試験することができる。図６〜１１は、ｅＩＦ−５Ａ１ の配列、代表的なｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスコンストラクトを提供する。本発明の別の実施態様では、ｅＩＦ−５Ａ１ のアンチセンスコンストラクトを使用して、ｅＩＦ−５Ａ１ の発現を阻害し、そうして膵島細胞のアポトーシスを阻害し、並びにその機能を維持又は保存することもできる。
【００３８】
好ましい実施態様では、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡは、ｅＩＦ−５Ａ１の以下のヌクレオチド配列：
５’−ＡＡＡＧＧＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡ−３'；
５'−ＡＡＧＡＴＣＧＴＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＡＣＴ−３'；
５'−ＡＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＴ−３'；及び
５'−ＡＡＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＡ−３'
を標的とする（図１０を参照のこと）。特に好ましい実施態様では、ｓｉＲＮＡは、ｅＩＦ−５Ａ１の以下の配列：５’−ＡＡＡＧＧＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡ−３'を標的とする。
【００３９】
本発明は、ドナー回収プロセスの間に、膵島細胞がアポトーシスを引き起こすことを阻害するための方法を提供する。上に記載されるように、多くの膵島細胞は、回収された場合にアポトーシスを引き起こす。本発明者らは、回収する前に膵島細胞にｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを提供することが、アポトーシスに対する保護的利点を提供することを示した。ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡは、膵島単離の前に、膵島細胞ドナーの膵島細胞に投与される。ドナー（及び膵島細胞）は、例えばヒト膵島細胞を含む任意の動物であっても良い。任意の投与方法が使用されてもよい。例えば、ｓｉＲＮＡは、膵島細胞ドナーの門脈を通したかん流を介して投与されることもあるし、又は膵島細胞ドナーの門脈を介した流体力学的かん流を介して投与されることもある。実施例１を参照のこと。別の投与形態として腹腔内投与が挙げられる。実施例２、及び実施例３〜５を参照のこと。
【００４０】
門脈を介したかん流は、胆管への挿管に類似しているが、針は反対の方向に向いている。門脈は、肝臓を引き出し、そしてマウスの左側へと内臓を移動させることにより露出する。調製的ノット（preperative knot）を門脈の周囲に作り、そして胆管を含める。血管に穿刺した後に、尖っていない針を膵臓にまで進め、そしてその周囲でノットを絞める。マウスモデルでは、１ｍｌの生理食塩水又はｓｉＲＮＡ（５μｇ）をゆっくり放出し、針を取り出し、そしてノットを針の手前で閉じて、液体の漏出を妨げる。この時点で、マウスをひっくり返し、そして胆管を膵臓消化にアクセスさせた。膵臓にｓｉＲＮＡを長時間適用してもよい。或いは、膵臓を取り出し、冷却状態を維持して、コラゲナーゼで処理することもできる。通常の膵島単離方法を行い、そして膵島（５０）を１６時間インキュベートしてもよい。
【００４１】
本発明は、膵島細胞内でアポトーシスを阻害するための組成物であって、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを含み、ここでｓｉＲＮＡがｅＩＦ−５Ａ１の発現を阻害し、それによりアポトーシスを阻害し、そして膵島細胞の機能を維持する。組成物は、他の又は追加のｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡを上記のように含むこともある。好ましいｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列：５'−ＡＡＡＧＧＡＡＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＣＴＧＡｄＴｄＴ−３’を含む。
【実施例】
【００４２】
実施例１：門脈かん流
マウス膵島は、ｅＩＦ−５Ａ１を発現する。全量ＲＮＡを、単離されたマウス膵島から抽出し、そしてＲＴ−ＰＣＲを、β−アクチンとｅＩＦ−５Ａについて行った（図１）。安静にして刺激を受けていない膵島は、ｅＩＦ−５Ａ１−ｍＲＮＡの陽性レベルを示した。
【００４３】
ｅＩＦ−５Ａ１−ｍＲＮＡレベルは、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡデリバリー（門脈低速かん流）後に減少した。マウスに１ｍｌのｓｉＲＮＡ（ＣＴ（対照）配列又はｅＩＦ−５Ａ１、５ｍｇ）又は生理食塩水を、それぞれの群についてｎ＝２で低速逆行性門脈かん流（図２））により導入した。膵管にコラゲナーゼを潅注することにより、膵臓を消化し、そして膵島を、Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 12153-12158 Epub 12005 Aug. 12110, 2005に記載される通りに単離した。膵島（１マウスあたり５０個）を１６時間インキュベートした。全量ＲＮＡを抽出し、そしてβ−アクチン及びｅＩＦ−５Ａ１についてＲＴ−ＰＣＲを行った（図３）。ｅＩＦ−５Ａ１／β−アクチンのｍＲＮＡの比は、５．２４（ＣＴ−ｓｉＲＮＡ）及び３．０１（ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡ）であった。図３は、ｓｉＲＮＡで処理された細胞においてｅＩＦ−５Ａ１のｍＲＮＡレベルが低下したことを示す。この実験をｎ＝３のマウスで繰り返し、そして膵島をＲＮＡ抽出のために３回インキュベートを行った；結果は、最初の観察と一致した。
【００４４】
ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡデリバリー（門脈流体力学的かん流）後におけるｅＩＦ−５Ａ１ｍＲＮＡレベルの低下及び膵島アポトーシス割合の低下
マウスに、１ｍｌのｓｉＲＮＡ（ＣＴ又はｅＩＦ−５Ａ１ ５μｇ）又は生理食塩水を、流体力学的逆行性門脈かん流により導入した（１群あたりｎ＝２）。当該かん流は５秒以内に完了した。膵管にコラゲナーゼを潅注することにより膵臓を消化し、そして膵島を単離した。膵島を１６時間インキュベートし、次に分配した：１の群を、アポトーシスの評価のため、プロピジウムヨージドで染色し（１マウスあたり５０の膵島）、そしてもう一方の群をＲＴ−ＰＣＲで処理した（１マウスあたり２５の膵島）。ｅＩＦ−５Ａ１／β−アクチンについてのｍＲＮＡのレベルは、ＣＴ−ｓｉＲＮＡ群において、ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡ群よりも高かった。アポトーシス率は、２８．１％低下した（図４）。この実験を繰り返したところ（ｎ＝３）、アポトーシス率は、再び減少した（図５）。
【００４５】
ビオチン化ｓｉＲＮＡを用いた膵島かん流
ビオチン化ｓｉＲＮＡ（５０μｇ）を、上に記載されるように膵島に還流した（低速かん流、ｎ＝１）。膵臓を染色用にホルマリン中で固定した。
【００４６】
ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ分子は、Dharmacon, Lafayette, Co.により合成された。ｅＩＦ−５Ａ１ 及び対照ｓｉＲＮＡの配列はそれぞれ、５’ＣＧＧＡＡＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＣＵＧＡｄＴｄＴ  ３’及び５'ＡＧＵＣＧＡＣＣＵＵＣＡＧＵＡＡＧＧＣｄＴｄＴ３'であった。
【００４７】
ＲＴ−ＰＣＲ
Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキットを用いて細胞から全量ＲＮＡを抽出した。ｅＩＦ−５Ａ１プライマーは次の通りである：
フォワード  ５'−ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＧＡＧ  ＧＴＡ  ＣＧＡ  ＧＡ−３'；
リバース    ５'−ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＡＴ−３’。
【００４８】
プロピジウムヨージド（ＰＩ）アポトーシス染色
温和なトリプシン処理により膵島の単一細胞懸濁液を得た。ＰＢＳで細胞を洗浄し、そして０．３％サポニン、ＥＤＴＡ１ｍＭ、Ｒｎａｓｅ、１％アジド、１％ＦＣＳ及び５０μｇ／ｍｌのＰＩをＰＢＳに含むサポニン−ＰＩ混合液を加えた。細胞を完全にボルテックスし、そして暗所にて４℃でインキュベートした後にＦＡＣＳによりｓｕｂ−Ｇ１集合について分析した。
【００４９】
実施例２：腹腔内注射
抗体及びｓｉＲＮＡ：
ｅＩＦ−５Ａ１ に対するマウスモノクローナル抗体を作成した。抗アクチンモノクローナル抗体（クローンＣ４、＃６９１００）をＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓから購入した。ウエスタンブロットにおいて、Ｌｉ−ｃｏｒ社から購入した近赤外フルオロフォア標識された二次抗体を用いた（ＩＲＤｙｅ８００及びＩＲＤｙｅ７００）。ｅＩＦ−５Ａ１  特異的ｓｉＲＮＡは、ｅＩＦ−５Ａ１の以下の配列：５'−ＡＡＡＧＧＡＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡ−３’に対するものである。コントロールｓｉＲＮＡは転写配列：５'−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＡＧＧＡ−３'であり、そしていずれの既知のタンパク質についてもノックダウンを誘導しないことが前に示された。同時係属米国出願第１１／７２５，４７０号及びＰＣＴ／ＵＳ０７／６４４２４を参照のこと。これらの文献をその全てを本明細書に援用する。
【００５０】
マウスへのｓｉＲＮＡのＩＰ（腹腔内）注射：
１２匹の８〜１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６雄マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社から購入した。雌の発情サイクルに伴う代謝変化を避けるために、雄マウスを選択した。マウスをランダムに３つの処理群に割り当てた：第１群−ビヒクル処理（０．９％生理食塩水）、第２群−対照ｓｉＲＮＡ処理、第３群−ｅＩＦ−５Ａ１ ｓｉＲＮＡ処理。各マウスを、１６．６ｍｇ／ｋｇ、又は（第一群の場合）同等の体積をＩＰ注射を介して選択した処理に供した。膵島回収（０日目）の前に３日間（−３、−２、−１日目）毎日（午前１１：００ころに）マウスに注射した。
【００５１】
膵島単離とサイトカイン処理：
標準的単離技術及び動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認されたプロトコルを用いてＣ５７Ｂｌ／６マウスからの膵島の単離を行った。コラゲナーゼ消化まで膵臓を４．２ｍＭ炭酸水素ナトリウム及び１％ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＨＢＳＳ中に貯蔵した。分画遠心法により精製を行った。１０％ＦＢＳ及び５％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したフェノールレッドフリーＤＭＥＭ溶液中に全ての膵島を維持した。培養液を３７℃＋５％ＣＯ2で５．５ｍＭグルコース中においてインキュベートした。代謝試験（カルシウム振動）前に１６〜１８時間精製された膵島を回復させた。
【００５２】
１日目の代謝試験の終わりに、生理的に関連のあるサイトカインの規定のカクテル（５ｍｇ／ｍｌ ＩＬ１β、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＴ−α、１００ｎｇ／ｍｌのＩＮＦ−γ）を用いて、サイトカイン処理を適用した。サイトカイン処理された膵島を、次の試験まで２４時間休ませ、そしてタンパク質分析を行った（２日目及び３日目）。
【００５３】
免疫ブロットアッセイ：
（２００ｍＭのＤＴＴ及びベンゾナーゼを含むＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で調製された）１０μｇの膵島細胞抽出物を、４〜２０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で電気泳動することにより分離し、抗−ｅＩＦ−５Ａ１ マウスモノクローナル一次抗体（１：１５０００希釈）を用いて、免疫ブロット分析を行った。Ｏｄｙｓｓｅｙシステム（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の近赤外技術を用いて画像化及び定量した。
【００５４】
カルシウム振動アッセイ：
（上に記載されるように）コラゲナーゼ消化された８〜１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウス膵臓から膵島を手で拾いあげた。Ｆｕｒａ−２低グルコース溶液（３ｍＭ）中で２０分間処理し、次に温度制御されたフローチャンバー中に配置した。低グルコース溶液（Ｆｕｒａを伴わない）を膵島上に流して、ベースカルシウム計測値（５分）を調べた。ＩＰ Ｌａｂ４．０ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてカルシウムの計測値を取得し、そして３４０〜３８０ｎｍの放出光の比として報告する。ベースカルシウムレベルに達した後に、チャンバーを通して高グルコース（１１ｍＭ）溶液を流して（１５分間）、膵島の細胞内カルシウム応答を誘導する。カルシウム応答を、５秒間の間隔で、２０分間の観察のあいだに測定した。試験を終える際、膵島を５％ブリーチ溶液中に配置する。
【００５５】
実施例３：in vitro及びin vivoにおけるＰｄｘ−１に対するｓｉＲＮＡの適用
βＴＣ３細胞に、２種のＰｄｘ−１ｓｉＲＮＡコンストラクト（コンストラクトＡ及びＢ）又は対照をトランスフェクトし、そしてタンパク質Ｐｄｘ−１、ＧＡＰＤＨ及びβ−アクチンについての免疫ブロットに供する。図１７Ａを参照のこと。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、同じｓｉＲＮＡを１日１回３日間腹腔内注射し、そして膵島をコラゲナーゼ消化及び分画勾配遠心を介して単離及び精製した。膵島を２％ＳＤＳ中に溶解し、そして免疫ブロットに供した。図１７Ｂを参照のこと。３０分間Ｆｕｒａ２を単離膵島に充填し、次に３ｍＭ Ｄ−グルコース中で画像化した。〜３００秒で１１ｍＭ Ｄ−グルコースで膵島を刺激し、そしてＦｕｒａ２比を、連続して、蛍光顕微鏡によりモニタリングした。図１７Ｃを参照のこと。グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）を、各処理群から５０の膵島を用いて行った。図１７Ｄを参照のこと。
【００５６】
実施例４：ｅＩＦ−５Ａ１のノックダウンは、ex vivoでの膵島機能及び生存を改善する
ｅＩＦ−５Ａに対するｓｉＲＮＡのin vitro投与が、Ex vivoでの膵島機能を改善することをこの実施例は示す。図１８Ａは、実験設計の模式図を提供する。膵島を処理後に単離し、そして抽出物を免疫ブロット分析に供した。図１８Ｂを参照のこと。単離膵島をグルコース感知及びインスリン転写に必須である遺伝子についてＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。遺伝子転写はサイトカイン処理（ＩＦＮｇ、ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦａと４時間）により抑制されるが、群間の差異は観察されなかった。図１８Ｃを参照のこと。単離後２４時間のｓｉ−ｅＩＦ−５Ａ処理された膵島（図１８Ｄを参照のこと）及び単離後４８時間のｓｉ−ｅＩＦ−５Ａ処理された膵島（図１８Ｆを参照のこと）は、単離後２４時間の対照処理された膵島（図１８Ｄを参照のこと）及び単離後４８時間の対照処理（図１８Ｆを参照のこと）に比較して、グルコース刺激カルシウム（ＧＳＣａ）応答の改善を示した。ｓｉｅＩＦ−５Ａ処理された膵島は、単離後２４時間のサイトカイン（図１８Ｅを参照のこと）及び単離後４８時間のサイトカイン（図１８Ｇを参照のこと）の存在下で高いＧＳＣａを示す。ｅＩＦ−５Ａ処理されたマウスから単離された膵島は、ＧＳＩＳにより評価された場合に、４時間のサイトカインインキュベーションがない場合（図１８Ｈを参照のこと）とある場合（図１８Ｈを参照のこと）の両方において、対照に比較して、グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）の改善を示した。
【００５７】
実施例５：ｅＩＦ−５Ａのノックダウンが、サイトカイン誘導性ｉＮＯＳ生産を無効にする
サイトカイン誘導性のｉＮＯＳタンパク質産生は、ｅＩＦ−５Ａ欠損細胞において生じない。サイトカインで処理された膵島を、ｉＮＯＳｍＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲに供した。全ての処理群は、サイトカイン暴露の際にｉＮＯＳｍＲＮＡの劇的な上方制御を示した。図１９Ａを参照のこと。サイトカイン処理された膵島を免疫ブロット分析に供した。注目すべきは、ｉＮＯＳタンパク質は、サイトカイン暴露された際に対照膵島中において誘導されるが、ｓｉ ｅＩＦ−５Ａ処理された膵島においては誘導されないという点である。図１９Ｂを参照のこと。ＩＮＳ−１（８３２／１３）β細胞を、サイトカインカクテルで４時間処理し、そして免疫ブロットに供した。細胞はｉＮＯＳタンパク質の同様の増加を示す。図１９Ｃを参照のこと。ＩＮＳ−１細胞を、様々な濃度のＧＣ−７で処理し、デオキシハイプシン合成酵素の阻害剤で一晩処理し、次にサイトカインの存在下で４時間インキュベートした。ＩＮＳ−１細胞は、ｉＮＯＳ生産及びＣＧ−７濃度の逆相関を示し、活性ｅＩＦ−５Ａ産生を抑制が、ｉＮＯＳ翻訳を示唆する。図１９Ｄを参照のこと。
【表１】
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【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ−Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ−Ｉ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【国際調査報告】
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