(57)【要約】本発明はＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の１つ又は複数に対する二本鎖分子、又はかかる二本鎖分子を含有する組成物、ベクター、若しくは細胞を投与することにより肺癌を治療又は予防する方法に関する。本発明はまたＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの中から選択される１つ又は複数の過剰発現された遺伝子を用いて肺癌、特にＮＳＣＬＣ又はＳＣＬＣを診断する方法を特徴とする。また、肺癌におけるＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの１つ又は複数の過剰発現、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの１つ又は複数の細胞増殖機能、又はＣＤＫＮ３とＶＲＳ、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、及び／又はＥＦ−１δとの間の相互作用に対する化合物の効果を指標として用いて、肺癌を治療及び予防するための化合物を同定する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に導入した場合にＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲのｉｎ  ｖｉｖｏ発現、及び細胞増殖を阻害する単離二本鎖分子であって、互いにハイブリダイズすることで該二本鎖分子を形成するセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖とを含む、二本鎖分子。
【請求項２】
前記センス鎖が配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含む、請求項１に記載の二本鎖分子。
【請求項３】
前記二本鎖分子が、約１９ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の二本鎖分子。
【請求項４】
介在一本鎖によって連結したセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドから成る、請求項１に記載の二本鎖分子。
【請求項５】
一般式：
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有する二本鎖分子であって、式中、［Ａ］は配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ［Ａ'］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、請求項４に記載の二本鎖分子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の二本鎖分子を発現するベクター。
【請求項７】
ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現する癌を治療する方法であって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離二本鎖分子、又は請求項６に記載のベクターの少なくとも１つを投与する工程を含む方法。
【請求項８】
治療される前記癌が肺癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現する癌を治療するための組成物であって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離二本鎖分子又は請求項６に記載のベクターの少なくとも１つを含む、組成物。
【請求項１０】
治療される前記癌が肺癌である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
肺癌を診断する方法であって、
（ａ）被験体から得た生体試料において、
（ｉ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、及びＣＤＫＮ３の群から選択されるｍＲＮＡを検出すること、
（ｉｉ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、及びＣＤＫＮ３の群から選択されるタンパク質を検出すること、及び
（ｉｉｉ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、及びＣＤＫＮ３の群から選択されるタンパク質の生物活性を検出すること
から成る群から選択される方法のいずれか１つによって、遺伝子の発現レベルを求める工程、並びに
（ｂ）前記遺伝子の正常対照レベルと比較した場合の、工程（ａ）において求められる前記発現レベルの上昇を、肺癌の存在と関連付ける工程
を含む、方法。
【請求項１２】
工程（ａ）において求められる前記発現レベルが、前記正常対照レベルより少なくとも１０％高い、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）において求められる前記発現レベルをＥＢＩ３、ＤＬＸ５、及びＣＤＫＮ３の群から選択されるタンパク質に対する抗体の結合を検出することにより求める、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験体から得た生体試料が生検材料、痰、血液、胸水、又は尿を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
肺癌患者の予後を判定又は決定する方法であって、
（ａ）患者から得た生体試料において遺伝子の発現レベルを検出する工程、
（ｂ）検出される前記発現レベルを対照レベルと比較する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）の比較に基づいて前記患者の予後を決定する工程
を含み、前記遺伝子がＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３、又はＥＦ−１δから成る群から選択される、方法。
【請求項１６】
前記対照レベルが予後良好な対照レベルであり、該対照レベルと比較した場合の前記発現レベルの上昇が、予後不良であると決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記上昇が前記対照レベルより少なくとも１０％高い、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記発現レベルが、
（ａ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３、又はＥＦ−１δのｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δタンパク質を検出すること、及び
（ｃ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δタンパク質の生物活性を検出すること
から成る群から選択される方法のいずれか１つによって求められる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者から得た生体試料が生検材料、痰、又は血液、胸水、又は尿を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
肺癌を診断するか、又は肺癌患者の予後を判定若しくは決定するためのキットであって、
（ａ）遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬、
（ｂ）前記遺伝子によりコードされるタンパク質を検出するための試薬、及び
（ｃ）前記タンパク質の生物活性を検出するための試薬
から成る群から選択される試薬を含み、前記遺伝子がＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３、又はＥＦ−１δから成る群から選択される、キット。
【請求項２１】
前記試薬が前記遺伝子の遺伝子転写産物に対するプローブである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記試薬が前記遺伝子によりコードされる前記タンパク質に対する抗体である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
被験体において肺癌を診断する方法であって、
（ａ）診断される被験体に由来する血液試料を準備する工程、
（ｂ）前記血液試料におけるＥＢＩ３タンパク質のレベルを求める工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）において求められる前記ＥＢＩ３レベルを正常対照のＥＢＩ３レベルと比較する工程
を含み、前記血液試料におけるＥＢＩ３レベルが前記正常対照と比較して高いことにより、前記被験体が肺癌を患っていることが示唆される、方法。
【請求項２４】
前記血液試料が全血、血清、及び血漿から成る群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＥＢＩ３タンパク質をイムノアッセイにより検出する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記イムノアッセイがＥＬＩＳＡである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
（ｄ）前記血液試料におけるＣＥＡのレベルを求める工程、及び
（ｅ）工程（ｄ）において求められる前記ＣＥＡレベルを正常対照のＣＥＡレベルと比較する工程
をさらに含み、前記血液試料におけるＥＢＩ３レベル及びＣＥＡレベルのいずれか又は両方が前記正常対照と比較して高いことにより、前記被験体が肺癌を患っていることが示唆される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記肺癌がＮＳＣＬＣである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
（ｄ）前記血液試料におけるＣＹＦＲＡのレベルを求める工程、
（ｅ）工程（ｅ）において求められる前記ＣＹＦＲＡレベルを正常対照のＣＹＦＲＡレベルと比較する工程
をさらに含み、前記血液試料におけるＥＢＩ３レベル及びＣＹＦＲＡレベルのいずれか又は両方が前記正常対照と比較して高いことにより、前記被験体が肺癌を患っていることが示唆される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記肺癌がＳＣＣである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
（ｄ）前記血液試料におけるｐｒｏ−ＧＲＰのレベルを求める工程、
（ｅ）工程（ｅ）において求められる前記ｐｒｏ−ＧＲＰレベルを正常対照のｐｒｏ−ＧＲＰレベルと比較する工程
をさらに含み、前記血液試料におけるＥＢＩ３レベル及びｐｒｏ−ＧＲＰレベルのいずれか又は両方が前記正常対照と比較して高いことにより、前記被験体が肺癌を患っていることが示唆される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記肺癌がＳＣＬＣである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＥＢＩ３を発現する癌を検出するためのキットであって、
（ｉ）血液試料におけるＥＢＩ３のレベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
（ｉｉ）ＥＢＩ３に対する陽性対照試料
を含む、キット。
【請求項３４】
（ｉｉｉ）血液試料におけるＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰのレベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
（ｉｖ）ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰに対する陽性対照試料をさらに含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記陽性対照試料がＥＢＩ３、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰに対して陽性である、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
被験体における肺癌を診断する方法であって、
（ａ）診断を受ける被験体から血液試料を採取する工程、
（ｂ）前記血液試料におけるＮＰＴＸ１及びＣＹＦＲＡのレベルを求める工程、
（ｃ）工程（ｂ）において求められる前記ＮＰＴＸ１レベル及び前記ＣＹＦＲＡレベルを、正常対照のＮＰＴＸ１レベル及びＣＹＦＲＡレベルと比較する工程、及び
（ｄ）前記血液試料において、前記正常対照と比較して高いＮＰＴＸ１レベル及び高いＣＹＦＲＡレベルのいずれか又は両方が、前記被験体が肺癌を患っていることを示唆すると判断する工程
を含む、方法。
【請求項３７】
前記肺癌が扁平上皮癌（ＳＣＣ）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記血液試料が全血、血清、及び血漿から成る群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ＮＰＴＸ１及びＣＹＦＲＡタンパク質を発現する癌を検出するためのキットであって、
（ｉ）血液試料におけるＮＰＴＸ１及びＣＹＦＲＡタンパク質のレベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
（ｉｉ）ＮＰＴＸ１及びＣＹＦＲＡタンパク質に対する陽性対照試料
を含む、キット。
【請求項４０】
肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物をＥＢＩ３、ＤＬＸ５、又はＣＤＫＮ３のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程、
（ｂ）前記ポリペプチドと前記試験化合物との結合活性を検出する工程、及び
（ｃ）前記ポリペプチドに結合する化合物を選択する工程
を含む、方法。
【請求項４１】
肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物をＥＢＩ３、ＤＬＸ５、又はＣＤＫＮ３のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の前記ポリペプチドの生物活性を検出する工程、及び
（ｃ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、又はＣＤＫＮ３の前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドの生物活性を、前記試験化合物の非存在下で検出される該ポリペプチドの生物活性と比較して抑制する試験化合物を選択する工程
を含む、方法。
【請求項４２】
前記生物活性が細胞増殖、細胞浸潤、細胞外分泌、ホスファターゼ活性、及びＡｋｔリン酸化の促進の群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ホスファターゼ活性がＥＦ−１δを用いて検出されたものである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補化合物をＥＢＩ３、ＤＬＸ５、又はＣＤＫＮ３を発現する細胞と接触させる工程、及び
（ｂ）前記試験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、又はＣＤＫＮ３の発現レベルを低下させる候補化合物を選択する工程
を含む、方法。
【請求項４５】
肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補化合物をＥＢＩ３、ＤＬＸ５、又はＣＤＫＮ３の転写調節領域、及び該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる工程、
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、及び
（ｃ）対照と比較して、前記レポーター遺伝子の発現又は活性レベルを低下させる候補化合物を選択する工程
を含む、方法。
【請求項４６】
肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、ＣＤＫＮ３ポリペプチド又はその機能的等価物を、ＶＲＳポリペプチド、ＥＦ−１αポリペプチド、ＥＦ−１βポリペプチド、ＥＦ−１γポリペプチド、ＥＦ−１δポリペプチド、及びそれらの機能的等価物から成る群から選択される相互作用パートナーと接触させる工程、
（ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する工程、及び
（ｃ）これらのポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程
を含む、方法。
【請求項４７】
前記ＥＦ−１δポリペプチドの機能的等価物が、配列番号４８から成るポリペプチドを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＣＤＫＮ３ポリペプチドの機能的等価物がＶＲＳポリペプチド、ＥＦ−１αポリペプチド、ＥＦ−１βポリペプチド、ＥＦ−１γポリペプチド、又はＥＦ−１δ結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）候補化合物をＣＤＫＮ３を過剰発現する細胞と接触させる工程、
（ｂ）Ａｋｔ  Ｓｅｒ４７３のリン酸化を測定する工程、及び
（ｃ）対照と比較して、前記リン酸化を低下させる候補化合物を選択する工程
を含む、方法。
【請求項５０】
肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、ＮＰＴＸ１ポリペプチド又はその機能的等価物を、ＮＰＴＸＲポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる工程、
（ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する工程、及び
（ｃ）これらのポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程
を含む、方法。
【請求項５１】
前記ＮＰＴＸ１ポリペプチドの機能的等価物がＮＰＴＸＲ結合ドメインを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＮＰＴＸＲポリペプチドの機能的等価物がＮＰＴＸ１結合ドメインを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
配列番号８８又は配列番号８９を含むポリペプチドに結合する抗体。
【請求項５４】
ＮＰＴＸ１中和活性を有する、請求項５３に記載の抗体。
【請求項５５】
肺癌を治療又は予防するための組成物であって、薬学的に有効な量の抗ＮＰＴＸ１抗体又はその断片を含む、組成物。
【請求項５６】
前記ＮＰＴＸ１抗体が請求項５３及び５４に記載の抗体である、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
被験体において肺癌を治療又は予防する方法であって、該被験体に抗ＮＰＴＸ１抗体又はその断片を投与することを含む、方法。
【請求項５８】
前記ＮＰＴＸ１抗体が請求項５３及び５４に記載の抗体である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ＥＮＱＳＬＲＧＶＶＱＥＬＱＱＡＩＳＫＬ（配列番号６１）を含むポリペプチド又は該ポリペプチドに機能的に等価なポリペプチドのアミノ酸配列であって、配列番号８から成るペプチドの生物学的機能を欠く、ポリペプチド。
【請求項６０】
前記生物学的機能が細胞増殖活性である、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
前記ポリペプチドが８個〜３０個の残基から成る、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
前記ポリペプチドが細胞膜透過性物質で修飾される、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
一般式：
［Ｒ］−［Ｄ］
を有し、配列番号８から成るペプチドの生物学的機能を欠くポリペプチドであって、式中、［Ｒ］及び［Ｄ］はリンカーＧＧＧを介して直接的又は間接的に連結してもよく、［Ｒ］は細胞膜透過性物質を表し、［Ｄ］はＥＮＱＳＬＲＧＶＶＱＥＬＱＱＡＩＳＫＬ（配列番号６１）を含む断片配列のアミノ酸配列、又は該断片配列を含む該ポリペプチドに機能的に等価なポリペプチドのアミノ酸配列を表す、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
前記細胞膜透過性物質が：
ポリアルギニン、
Ｔａｔ／ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ／配列番号６３、
ペネトラチン／ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ／配列番号６４、
ブホリンＩＩ／ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ／配列番号６５、
トランスポータン／ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ／配列番号６６、
ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）／ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ／配列番号６７、
Ｋ−ＦＧＦ／ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ／配列番号６８、
Ｋｕ７０／ＶＰＭＬＫ／配列番号６９、
Ｋｕ７０／ＰＭＬＫＥ／配列番号７０、
プリオン／ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ／配列番号７１、
ｐＶＥＣ／ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ／配列番号７２、
Ｐｅｐ−１／ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ／配列番号７３、
ＳｙｎＢ１／ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ／配列番号７４、
Ｐｅｐ−７／ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ／配列番号７５、及び
ＨＮ−１／ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ／配列番号７６
から成る群から選択されるいずれか１つである、請求項６３に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
前記ポリアルギニンが１１個のＡｒｇ（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ／配列番号７７）である、請求項６４に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
活性成分として請求項５９〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、癌の治療及び予防のいずれか又は両方のための薬剤。
【請求項６７】
前記癌が肺癌である、請求項６６に記載の薬剤。
【請求項６８】
請求項５９〜６５のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与する工程を含む、癌を治療又は予防する方法。
【請求項６９】
前記癌が肺癌である、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物科学分野、より具体的には癌研究、癌診断及び癌治療の分野に関する。特に本発明は、肺癌を検出及び診断する方法と、肺癌を治療及び予防する方法とに関する。さらに本発明は、肺癌を治療及び／又は予防するための作用物質をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００７年８月２４日付で出願された米国仮特許出願第６０／９５７，９５６号、及び２００７年１０月３日付で出願された同第６０／９７７，３６０号（これらの内容全体が参照により本明細書中に援用される）の恩典を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
肺癌は世界的に見て癌死亡の最も一般的な原因の１つであり、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）がこれらの事例の８０％近くを占める（Greenlee, R.T., et al., CA. Cancer J. Clin. 51: 15-36 (2001)）。ＮＳＣＬＣの大多数はかなり進行した段階まで診断されないため、致命的な診断となる傾向があり、最近の集学的療法における進歩にもかかわらず１０年全生存率は１０％前後にとどまっている。最も画期的な治療レジメンでさえも転帰に対してごくわずかな効果しかなく、ＮＳＣＬＣに関する５年全生存率を１０％〜１５％しか増大させていない。肺癌の発症及び進行に関連する多くの遺伝子変化が報告されているが、正確な分子機構は不明なままである（Sozzi, G. Eur. J. Cancer 37: 63-73 (2001)）。したがって、有効な診断アプローチ及び分子標的療法を発展させるためには、肺癌の分子病態についてさらに理解を深めることが緊急の課題である。
【０００４】
過去１０年にわたって、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、及びビノレルビン等の新たに開発された細胞傷害性薬剤が出現し、進行性ＮＳＣＬＣの患者に複数の治療選択肢を提供している。しかしながら、この新たなレジメンのいずれも、シスプラチンに基づく療法と比較してごく限られた生存利益しかもたらすことができない（Kelly, K., et al., J. Clin. Oncol. 19: 3210-3218 (2001)）。近年、抗ＥＧＦＲ又は抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、又はベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）を含む分子標的薬剤、及びゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）及びエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）等のＥＧＦＲチロシンキナーゼの低分子阻害剤が臨床用途に関して検査及び／又は認可されている（Giaccone, G. J Clin Oncol. 23: 3235-3242 (2005)、Sridhar, S.S., Lancet Oncol. 4: 397-406 (2003)、Pal, S.K. and Pegram, M. Anticancer Drugs 16: 483-494 (2005)）。これらの薬剤は再発性ＮＳＣＬＣに対して或る程度の活性を示すが、生存利益を受けることのできた患者の数は依然として限られている。診断に関しては、ＮＳＥ、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ２１−１、及びＰｒｏＧＲＰを含む幾つかの肺癌腫瘍マーカーが臨床状況において現在使用されている（M. Seike, G.A. Chen, B.K. Shin）。しかしながら、主に低い感度及び／又は特異性のために、癌の早期検出及び臨床転帰の予測におけるそれらの有用性は依然として非常に限られている。したがって、疾患の診断及びモニタリングにおいて臨床医を助けることのできる、感度及び特異性の高い癌バイオマーカーの発見が緊急に必要とされる。このため、より選択的且つ有効な分子標的薬剤及びマーカーの開発等の新たな治療戦略が待ち望まれている。
【０００５】
幾つかの証拠によって、腫瘍細胞が分化の特定の段階で各々の組織型に特有の細胞表面マーカー及び／又は分泌マーカーを発現することが示唆される。細胞表面タンパク質及び分泌タンパク質は、免疫機構及び薬物送達システムにとってより利用可能であると考えられるため、これらのタイプのタンパク質の同定が、新規の診断戦略及び治療戦略の発展において重要な初期段階である。さらに、数千もの遺伝子の発現レベルをｃＤＮＡマイクロアレイ上で系統的に分析することは、発癌経路に関与する未知の分子を同定するのに有効なアプローチであり、それにより新規の抗癌薬及び腫瘍バイオマーカーの開発のための候補標的を明らかにすることができる（Kikuchi, T., et al., Oncogene 22: 2192-2205 (2003)、Kikuchi, T., et al., Int J Oncol. 28: 799-805 (2006)、Kakiuchi, S., et al., Mol Cancer Res. 1: 485-499 (2003)、Kakiuchi, S., et al., Hum Mol Genet. 13: 3029-3043 (2004)、Taniwaki M., et al., Int J Oncol. 29: 567-575 (2006)、Yamabuki. T., et al., Int J Oncol. 28: 1375-1384 (2006)）。本発明者らは、１０１種の肺癌組織からレーザーマイクロダイセクションにより調製した腫瘍細胞の純粋集団を用いて、様々なタイプの肺癌細胞の全ゲノム発現プロファイルを２７６４８個の遺伝子を含有するｃＤＮＡマイクロアレイ上で分析することにより、肺癌の診断、治療、及び予防のための新規の分子標的の単離を試みた（Kikuchi, T., et al., Oncogene 22: 2192-2205 (2003)、Kikuchi, T., et al., Int J Oncol. 28: 799-805 (2006)、Kakiuchi, S., et al., Hum Mol Genet. 13: 3029-3043 (2004)、Taniwaki M., et al., Int J Oncol. 29: 567-575 (2006)）。本発明者らは、個々の遺伝子産物の生物学的及び臨床病理的意義を確認するために、臨床肺癌材料の腫瘍組織マイクロアレイ分析とＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技法との組み合わせアッセイを行なった（Ishikawa, N., et al., Clin Cancer Res. 10: 8363-8370 (2004)、Ishikawa, N., et al., Cancer Res. 65: 9176-9184 (2005)、Ishikawa, N., et al., Cancer Sci. 97: 737-745 (2006)、Kato, T., et al., Cancer Res. 65: 5638-5646 (2005)、Kato T, et al., Clin. Cancer Res. 13: 434-442. (2007)、Furukawa, C., et al., Cancer Res. 65: 7102-7110 (2005)、Suzuki, C., Cancer Res. 63: 7038-7041 (2003)、Suzuki, C., Cancer Res. 65: 11314-11325 (2005)、Suzuki, C., et al., Mol Cancer Ther. 6: 542-551 (2007)、Takahashi K, et al., Cancer Res. 66: 9408-9419 (2006)、Hayama, S., et al., Cancer Res. 66: 10339-10348 (2006)、Hayama S, et al., Cancer Res. 67: 4113-4122 (2007)、Yamabuki T, et al., Cancer Res. 67: 2517-2525 (2007)）。
【０００６】
この系統的アプローチから、多数の遺伝子が或る特定の癌において過剰発現されるとして同定されている。例えば国際公開第２００４／３１４１３号パンフレット、国際公開第２００４／３１４０９号パンフレット、国際公開第２００７／１３６６５号パンフレット、及び国際公開第２００７／１３６７１号パンフレット（その内容が参照により本明細書中に援用される）を参照されたい。ここで、本発明者らはさらなる調査のために４つの遺伝子に着目した：エプスタイン・バーウイルス誘導遺伝子３（ＥＢＩ３）（配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００５７５５）、分泌性糖タンパク質である遠位欠失（distal-less）ホメオボックス５（ＤＬＸ５）（配列番号３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＢＣ００６２２６）、サイクリン依存性キナーゼ抑制因子３（ＣＤＫＮ３；別名ＫＡＰ１）（配列番号５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｌ２７７１１）、及び神経ペントラキシンＩ（ＮＰＴＸ１）（配列番号７８；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２５２２．２又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２５２２）。
【０００７】
ＥＢＩ３遺伝子の発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥＢＶにより形質転換されたＢ細胞株において初めて注目された（Devergne O, et al., J Virol 70: 1143-1153 (1996)）。ＥＢＩ３は、ＩＬ−１２のｐ３５関連サブユニットであるｐ２８とヘテロ二量化することにより形成される、ＩＬ−２７の構成要素である（Pflanz S, et al., Immunity 16: 779-90 (2002)）。ＩＬ−２７は、ＩＦＮ−γによって誘導される免疫反応に必要なＴｈ１免疫反応開始において重要な役割を果たすと考えられている。一方で、最近の報告では、ヒトの妊娠中にＥＢＩ３発現が胎盤の絨毛外細胞栄養芽層において見られ（Devergne O, et al., Am J Pathol 159: 1763-76 (2001)）、ＥＢＩ３が母体免疫寛容等の母体−胎盤免疫関係を調節し得ることが示唆されている。ヒト造血器腫瘍におけるＥＢＩ３の過剰発現が近年報告されているが（Larousserie, F., et al., Am J Pathol. 166: 1217-1228 (2005)、Niedobitek G, et al., J Pathol 198: 310-316 (2002)）、これらの腫瘍におけるその機能的役割、及びヒト固形腫瘍形成へのＥＢＩ３の関与は未だ報告されていない。
【０００８】
ホメオボックス遺伝子は、進化的に異なる種にわたって発生に関連する基本的に重要な転写因子である。Ｄｌｘ遺伝子の重複機能は、それらのほぼ同一のホメオドメインに由来すると推定されるが、それらの個々の特有の機能は、他のドメインにおけるそれらのアミノ酸配列の相違から生じると推定される（Liu JK, et al., Dev Dyn 210: 498-512 (1997)）。ホメオボックス遺伝子の不活性化は、多くの先天性奇形及び癌の発症に関係があるとされている（Downing JR, et al., Cancer Cell 2: 437-45 (2002)）。ＤＬＸ５は、Ｄｌｘ５及びＤｌｘ６の標的破壊又は除去が骨及び内耳の発生学的異常、並びに頭蓋顔面欠損をもたらすという証拠により実証されるように、骨芽細胞分化に関与するカスケードの開始に不可欠なマスター調節タンパク質（master regulatory protein）であり、哺乳類の四肢発生の調節において重要な役割を果たすと考えられている（Robledo RF, et al., Genes Dev 16: 1089-101 (2002)）。しかしながら、発癌におけるＤＬＸ５活性化の役割は解明されていない。
【０００９】
ＮＰＴＸ１は、新たに確認されたサブファミリーの「長いペントラキシン」の成員である（Goodman）。ＮＰＴＸ１遺伝子は、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端ペントラキシンドメインを有する４３０アミノ酸の分泌タンパク質をコードする。ＮＰＴＸ１は、シナプス物質及びシナプス前ヘビ毒毒素タイポキシンの取り込みを媒介し得るラットタンパク質として同定された。タンパク質の新たに確認されたサブファミリー「長いペントラキシン」は、興奮性シナプス形成及びシナプス再構築の促進において役割を果たし得る、幾つかの構造的及び機能的特性を有する（Schlimgen、Kirkpatrick）。このサブファミリーの成員はＮＰＴＸ１及びＮＰＴＸ２を含むが、その両方が神経ペントラキシン受容体（ＮＰＴＸＲ）と相互作用し（Schlimgen、Kirkpatrick、Goodman、Dodds）、超付加的（superadditive）シナプス形成活性を有する。さらに、本発明者らは、ＮＰＴＸ１が肺癌に対する血清学的マーカー又は予後マーカーに使用され得ることを明らかにした（国際公開第２００８／２３８４０号パンフレット）。しかしながら、発癌における「長いペントラキシン」の役割及び哺乳類細胞におけるその機能は、解明されていない。
【００１０】
ＣＤＫＮ３は、ｃｄｋ２及び／又はｃｄｃ２と関連し、細胞周期調節に関与するＧ１期及びＳ期の二重特異性タンパク質ホスファターゼとして初めて同定された（Gyuris, J., et al., Cell 75: 791-803 (1993)、Hannon, G.J., et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 91: 1731-1735 (1994)）。ｃｄｋ２の完全活性化には、Ｔｈｒ１６０のリン酸化並びにＴｈｒ１４及びＴｙｒ１５の脱リン酸化が必要とされる。サイクリンＡとｃｄｋ２との結合は、Ｔｈｒ１６０の脱リン酸化を阻害したが、ＣＤＫＮ３はサイクリンＡが分解又は解離された場合にのみｃｄｋ２を脱リン酸化することができる（Poon RY and Hunter T., Science 270: 90-93 (1995)）。以前の報告により、細胞周期制御におけるＣＤＫＮ３の機能的役割が示唆されるが、細胞増殖に対するその寄与は未だ報告されていない。ＣＤＫＮ３過剰発現は、胸癌及び前立腺癌においては以前に報告されているが（Lee, S.W., et al., Mol Cell Biol. 20: 1723-1732 (2000)）、ＣＤＫＮ３過剰発現が肺癌の進行を促進する機構については不明なままである。
【００１１】
一方、真核生物翻訳延長因子１δ（ＥＦ−１δ）（配列番号７；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＢＣ００９９０７）は、グアノシン５'−三リン酸（ＧＴＰ）及びアミノアシルｔＲＮＡと結合し、８０Ｓリボソーム上でのアミノアシルｔＲＮＡのコドン依存性配置（タンパク質合成のペプチド鎖延長を誘導する）をもたらし得る、ヌクレオチド交換タンパク質群を構成する延長因子−１複合体の構成要素である（Riis, B., et al., Trends Biochem Sci. 15: 420-424 (1990)、Proud, C.G. Mol Biol Rep.19: 161-170 (1994)）。ＥＦ−１δはまた、カドミウム応答性癌原遺伝子として同定及び特徴付けられている（Joseph P., et al., J Biol Chem. 277: 6131-6136 (2002)）。最近の報告によって、ＥＦ−１δのｍＲＮＡが食道癌組織において過剰発現され、リンパ節転移、病期の進行、及び予後不良と関連付けられることが示唆される（Ogawa, K., et al., Br J Cancer 91: 282-286 (2004)）。したがって、癌におけるＥＦ−１経路活性化の役割をより完全に理解することは、癌治療に対する新たなタイプの強力な阻害剤の開発につながる。
【００１２】
本発明は、新規の抗癌薬及び腫瘍バイオマーカーの開発のための候補標的として機能するか、又はそれを明らかにし得る発癌経路に関与する分子を発見することにより、当該技術分野における肺癌の診断及び治療のための改善された組成物及び方法の必要性に取り組む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述のように、本発明は４つの遺伝子ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３、及びＮＰＴＸ１、並びに肺癌の発癌においてそれらが果たす役割に関する。したがって、本発明は肺癌を検出、診断、治療、及び／又は予防するための新規の組成物及び方法、並びにそれに有用な薬剤をスクリーニングする方法に関する。
【００１４】
特に、本発明は、特異的な配列（特に配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５）から成る二本鎖分子が、肺癌細胞の細胞成長を阻害するのに有効であるという発見から生じるものである。具体的には、ＥＢＩ３、ＮＰＴＸＲ、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δ遺伝子を標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が本発明により提供される。これらの二本鎖分子は、単離した状態で利用されるか、又はベクターにコードされ、ベクターから発現される。したがって、かかる二本鎖分子、並びにそれらを発現するベクター及び宿主細胞を提供することが本発明の一目的である。
【００１５】
一態様では、本発明は、本発明の二本鎖分子又はベクターを、それを必要とする被験体に投与することにより細胞成長を阻害する方法及び肺癌を治療する方法を提供する。かかる方法は、１つ又は複数の二本鎖分子又はベクターから成る組成物を被験体に投与することを包含する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの本発明の二本鎖分子又はベクターを含有する、癌を治療するための組成物を提供する。
【００１７】
また別の態様では、本発明は、患者から得た生体試料におけるＥＢＩ３、ＤＬＸ５、及び／又はＣＤＫＮ３の発現レベルを求めることにより、被験体において肺癌に対する素因を診断又は決定する方法を提供する。遺伝子の正常対照レベルと比較した場合の１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの上昇は、被験体が肺癌を患っているか、又は肺癌を発症する危険性があることを示唆する。
【００１８】
さらに、本発明はＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの高い発現レベルは低い生存率と相関があるという発見に関する。したがって、本発明はＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３、及びＥＦ−１δの中から選択される１つ又は複数の遺伝子の発現レベルを検出する工程、それを所定の参照発現レベルと比較する工程、並びにそれらの間の差から患者の予後を決定する工程を含む、肺癌患者の予後を判定又は決定する方法を提供する。
【００１９】
ＥＢＩ３発現のレベルは、初期腫瘍の摘出後に低下することが示されている。したがって、本発明は、治療の前後でＥＢＩ３発現のレベルを求める工程を含む、治療をモニタリングする方法、又は肺癌であると診断された個体に対する治療の有効性を判定する方法を提供する。治療の後のＥＢＩ３発現のレベルの低下は、効果的な治療と相関がある。
【００２０】
肺癌患者の血液においてＥＢＩ３のレベルが上昇するという発見は、本発明にとって新しい。したがって、本発明は、被験体から得た血液試料におけるＥＢＩ３発現のレベルを求める工程、及びこのレベルを参照試料、典型的には正常対照において見られるレベルと比較する工程を含む、被験体において肺癌を診断する方法を提供する。試料においてＥＢＩ３発現のレベルが高いことは、被験体が肺癌を患っているか、又は肺癌を発症する危険性があることのいずれかを示唆する。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、肺癌を治療及び／又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。かかる化合物はＥＢＩ３、ＤＬＸ５及び／又はＣＤＫＮ３遺伝子と結合するか、又はＥＢＩ３、ＤＬＸ５及び／又はＣＤＫＮ３、遺伝子の生物活性を低下させるか、又はＥＢＩ３、ＤＬＸ５及び／又はＣＤＫＮ３、又はＥＢＩ３、ＤＬＸ５及び／又はＣＤＫＮ３遺伝子の代理となるレポーター遺伝子の発現を低下させる。さらに、ＣＤＫＮ３と、ＶＲＳ、ＥＦ−１α、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、又はＥＦ−１δとの間、又はＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの間の結合を阻害する化合物は、肺癌の症状を軽減することが期待される。特に、ＥＦ−１γのアミノ酸残基７２〜１６０を含有する断片とＣＤＫＮ３との間の結合を阻害する化合物を、本発明の方法により同定することができる。
【００２２】
またさらなる態様では、本発明は、優性阻害効果を有するＥＦ−１δ突然変異体、又はかかる突然変異体をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする被験体に投与することにより、被験体において肺癌を治療及び／又は予防する方法を提供する。かかるＥＦ−１δ突然変異体は好ましくは、ＣＤＫＮ３結合領域を含むアミノ酸配列、例えばＥＦ−１δのロイシンジッパーの全部又は一部を含むＥＦ−１δタンパク質の一部を含む（図２０Ａを参照）。好ましい実施の形態では、ＥＦ−１δ突然変異体は配列番号６１のアミノ酸配列を有する。ＥＦ−１δ突然変異体は代替的には、以下の一般式：［Ｒ］−［Ｄ］（式中、［Ｒ］は膜形質導入物質であり、［Ｄ］は配列番号６１のアミノ酸配列を有するポリペプチドである）を有し得る。細胞膜透過性物質は：
ポリアルギニン、
Ｔａｔ／ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ／配列番号６３、
ペネトラチン／ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ／配列番号６４、
ブホリンＩＩ／ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ／配列番号６５、
トランスポータン／ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ／配列番号６６、
ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）／ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ／配列番号６７、
Ｋ−ＦＧＦ／ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ／配列番号６８、
Ｋｕ７０／ＶＰＭＬＫ／配列番号６９、
Ｋｕ７０／ＰＭＬＫＥ／配列番号７０、
プリオン／ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ／配列番号７１、
ｐＶＥＣ／ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ／配列番号７２、
Ｐｅｐ−１／ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ／配列番号７３、
ＳｙｎＢ１／ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ／配列番号７４、
Ｐｅｐ−７／ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ／配列番号７５、及び
ＨＮ−１／ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ／配列番号７６から選択され得る。
【００２３】
さらなる態様では、本発明はＮＰＴＸ１断片に結合する抗体を提供する。この抗体は中和活性を有する。一態様では、本発明は、この抗体を投与することにより肺癌を治療又は予防する方法を提供する。
【００２４】
本発明の１つ又は複数の態様により或る特定の目的を達成することができ、一方で１つ又は複数の他の態様により或る特定の他の目的を達成することができることが当業者には理解される。各々の目的を本発明の全ての態様に、あらゆる点で等しく適用することはできない。このように、前述の目的は、本発明の任意の一態様に関して選択的に考えられ得る。本発明のこれら及び他の目的及び特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面及び実施例と併せて読むことでさらに十分に明らかとなる。しかしながら、上述の発明の概要及び以下の詳細な説明は共に好ましい実施の形態のものであり、本発明又は本発明の他の代替的な実施の形態を限定するものではないことを理解されたい。
【００２５】
本発明の様々な態様及び用途は、以下の図面の簡単な説明、及び本発明の詳細な説明、及びその好ましい実施形態を鑑みて当業者に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】腫瘍組織、細胞株、及び正常組織におけるＥＢＩ３発現の分析を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により検出された、１５組の臨床肺癌及び周囲正常肺組織の試料（上パネル）（肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、及び肺小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）；最上部）、並びに２３種の肺癌細胞株（下パネル）におけるＥＢＩ３の発現を示す。
【図１Ｂ】腫瘍組織、細胞株、及び正常組織におけるＥＢＩ３発現の分析を示す図である。癌細胞株及び気管支上皮細胞における内因性ＥＢＩ３タンパク質の発現及び細胞内局在化を示す。ＥＢＩ３は、ＮＣＩ−Ｈ１３７３細胞株及びＬＣ３１９細胞株においては粒状外観を呈した細胞の細胞質で染色されたが、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞株及び気管支上皮由来のＢＥＡＳ−２Ｂ細胞株においては染色されなかった。
【図１Ｃ】腫瘍組織、細胞株、及び正常組織におけるＥＢＩ３発現の分析を示す図である。培養培地における肺癌細胞株からのＥＬＩＳＡによる分泌ＥＢＩ３の検出を示す。分泌ＥＢＩ３は、ＥＢＩ３を発現する細胞株の培養培地において検出された。
【図１Ｄ】腫瘍組織、細胞株、及び正常組織におけるＥＢＩ３発現の分析を示す図である。１６種の正常成人ヒト組織におけるＥＢＩ３転写産物のノーザンブロット分析の結果である。強いシグナルが胎盤において観察された。
【図１Ｅ】腫瘍組織、細胞株、及び正常組織におけるＥＢＩ３発現の分析を示す図である。免疫組織化学による正常組織と腫瘍組織との間のＥＢＩ３タンパク質発現の比較を示す。
【図２Ａ】ＥＢＩ３過剰発現とＮＳＣＬＣ患者の予後不良との関連性を示す図である。肺癌組織及び正常組織におけるＥＢＩ３発現が強い例、弱い例、及び発現のない例を示す。原倍率：×１００（上レーン）、×２００（下レーン）。
【図２Ｂ】ＥＢＩ３過剰発現とＮＳＣＬＣ患者の予後不良との関連性を示す図である。ＥＢＩ３の発現に応じたＮＳＣＬＣ患者の生存率のカプラン・マイヤー分析の結果を示す（ログランク検定によるＰ＝０．００１１）。
【図３Ａ】ＥＬＩＳＡにより求めた、肺癌患者及び健常対照又はＣＯＰＤの非腫瘍性肺疾患患者におけるＥＢＩ３の血清中濃度を示す図である。肺ＡＤＣ、肺ＳＣＣ、又はＳＣＬＣの患者に由来する血清におけるＥＢＩ３の分布を示す。黒線：平均血清レベル。ＡＤＣ患者と健常個体／ＣＯＰＤ患者との間の差（それぞれＰ＜０．００１、マンホイットニーＵ検定）、ＳＣＣ患者と健常個体／ＣＯＰＤ患者との間の差（Ｐ＜０．００１）、及びＳＣＬＣ患者と健常／ＣＯＰＤ個体との間の差（Ｐ＜０．００１）は有意であったが、健常個体とＣＯＰＤ患者との間の差は有意ではなかった（Ｐ＝０．１６０）。
【図３Ｂ】ＥＬＩＳＡにより求めた、肺癌患者及び健常対照又はＣＯＰＤの非腫瘍性肺疾患患者におけるＥＢＩ３の血清中濃度を示す図である。肺ＡＤＣ、肺ＳＣＣ、又はＳＣＬＣの様々な臨床段階での患者に由来する血清におけるＥＢＩ３の分布を示す。ＬＤは限局性疾患を意味する。ＥＤは広範な疾患を意味する。
【図４Ａ】肺癌患者又は手術後の患者におけるＥＢＩ３の血清濃度、ＥＢＩのＲＯＣ曲線分析とＣＥＡ（ＮＳＣＬＣ）又はｐｒｏ−ＧＲＰ（ＳＣＬＣ）のＲＯＣ曲線分析との比較、及びＥＢＩ３に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の成長の阻害を示す図である。左パネルは、肺癌に対する血清マーカーとしてのＥＢＩ３のＲＯＣ曲線分析を示す。Ｘ軸：１−特異度。Ｙ軸：感度。カットオフレベルは、ＥＢＩ３に最適な診断精度及び尤度比（最小の偽陰性及び偽陽性結果）をもたらすように設定した（すなわち、１１．８単位／ｍＬ）。右パネルは、原発性ＮＳＣＬＣの切除前及び切除後のＥＢＩ３の血清レベルを示す。手術後の血清は、外科手術の２ヶ月後に得た。
【図４Ｂ】肺癌患者又は手術後の患者におけるＥＢＩ３の血清濃度、ＥＢＩのＲＯＣ曲線分析とＣＥＡ（ＮＳＣＬＣ）又はｐｒｏ−ＧＲＰ（ＳＣＬＣ）のＲＯＣ曲線分析との比較、及びＥＢＩ３に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の成長の阻害を示す図である。同じＮＳＣＬＣ患者の原発性腫瘍組織における血清ＥＢＩ３レベル（Ｕ／ｍＬ）及びＥＢＩ３の発現レベルを示す。
【図４Ｃ】肺癌患者又は手術後の患者におけるＥＢＩ３の血清濃度、ＥＢＩのＲＯＣ曲線分析とＣＥＡ（ＮＳＣＬＣ）又はｐｒｏ−ＧＲＰ（ＳＣＬＣ）のＲＯＣ曲線分析との比較、及びＥＢＩ３に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の成長の阻害を示す図である。上パネルは、ＥＢＩ３（青色）、及び肺癌の各々の組織型に対する血清マーカーである他の従来の腫瘍マーカー（ＣＥＡ：赤色、ＣＹＦＲＡ：緑色、ＰｒｏＧＲＰ：黄色）のＲＯＣ曲線分析を示す。Ｘ軸：１−特異度。Ｙ軸：感度。下パネルはＥＢＩ３と他の腫瘍マーカーとの組み合わせ分析を示す。感度及び偽陽性の両方における右のバーは、肺癌の各々の組織型におけるＥＢＩ３、並びに３つの腫瘍マーカー（ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、及びＰｒｏＧＲＰ）のいずれかを用いた組み合わせアッセイの感度又は偽陽性を示す。
【図４Ｄ】肺癌患者又は手術後の患者におけるＥＢＩ３の血清濃度、ＥＢＩのＲＯＣ曲線分析とＣＥＡ（ＮＳＣＬＣ）又はｐｒｏ−ＧＲＰ（ＳＣＬＣ）のＲＯＣ曲線分析との比較、及びＥＢＩ３に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の成長の阻害を示す図である。ＥＢＩ３に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の成長の阻害を示す。上パネルは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した、Ａ５４９細胞及びＬＣ３１９細胞におけるＥＢＩ３発現に対する、ｓｉ−ＥＢＩ３（＃１及び＃２）及び対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＣＮＴ／ＯＮ−ｔａｒｇｅｔ、ｓｉ−ＬＵＣ／ルシフェラーゼ）による遺伝子ノックダウン効果を示す。下パネルは、ｓｉ−ＥＢＩ３又は対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞及びＬＣ３１９細胞のコロニー形成アッセイ及びＭＴＴアッセイを示す。コラム：三連アッセイの相対吸光度。バー：標準偏差。
【図４Ｅ】肺癌患者又は手術後の患者におけるＥＢＩ３の血清濃度、ＥＢＩのＲＯＣ曲線分析とＣＥＡ（ＮＳＣＬＣ）又はｐｒｏ−ＧＲＰ（ＳＣＬＣ）のＲＯＣ曲線分析との比較、及びＥＢＩ３に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の成長の阻害を示す図である。高いレベルのＥＢＩ３を発現する２つの独立した形質転換体（ＣＯＳ−７−ＥＢＩ３−＃１及びＣＯＳ−７−ＥＢＩ３−＃２、上パネル）及び対照（ＣＯＳ−７−Ｍ１及びＣＯＳ−７−Ｍ２）を各々三連で培養した。１２０時間後、細胞生存率をＭＴＴアッセイ及びコロニー形成アッセイにより評価した（下パネル）。
【図５Ａ】肺腫瘍及び正常組織におけるＤＬＸ５の発現を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検査した、ＮＳＣＬＣ（腺癌及び扁平上皮癌）及び正常肺組織の臨床試料における遠位欠失ホメオボックス５（ＤＬＸ５）の発現を示す。
【図５Ｂ】肺腫瘍及び正常組織におけるＤＬＸ５の発現を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより明らかにした、肺癌細胞株におけるＤＬＸ５の発現を示す。βアクチン（ＡＣＴＢ）の発現を量的対照とした。
【図５Ｃ】肺腫瘍及び正常組織におけるＤＬＸ５の発現を示す図である。共焦点顕微鏡法により検査したＤＬＸ５タンパク質の細胞内分布（subcellulardistribution）を示す。
【図５Ｄ】肺腫瘍及び正常組織におけるＤＬＸ５の発現を示す図である。ノーザンブロット分析により検出した、正常ヒト組織におけるＤＬＸ５の発現を示す。
【図６Ａ】ＤＬＸ５タンパク質発現の免疫組織化学的評価（immunohistochemicalevaluation）、及びその過剰発現とＮＳＣＬＣ患者に関する予後不良との関連性、及びＳＢＣ−５癌細胞におけるＤＬＸ５に対するｓｉＲＮＡによる成長の阻害を示す図である。ウサギポリクローナル抗ＤＬＸ５抗体を用いた免疫組織化学的染色（対比染色にはヘマトキシリンを用いた）により検出した、５種の正常ヒト組織及び肺ＳＣＣにおけるＤＬＸ５の発現を示す（×２００）。ポジティブ染色は、胎盤（矢印）における合胞体栄養細胞層の細胞質及び／又は核、並びに肺癌細胞において見られた。
【図６Ｂ】ＤＬＸ５タンパク質発現の免疫組織化学的評価、及びその過剰発現とＮＳＣＬＣ患者に関する予後不良との関連性、及びＳＢＣ−５癌細胞におけるＤＬＸ５に対するｓｉＲＮＡによる成長の阻害を示す図である。肺癌（ＳＣＣ、×１００）及び正常肺（×１００）におけるＤＬＸ５の発現の代表的な例、並びにＳＣＣ陽性症例の拡大図（×２００）を示す。
【図６Ｃ】ＤＬＸ５タンパク質発現の免疫組織化学的評価、及びその過剰発現とＮＳＣＬＣ患者に関する予後不良との関連性、及びＳＢＣ−５癌細胞におけるＤＬＸ５に対するｓｉＲＮＡによる成長の阻害を示す図である。ＮＳＣＬＣ患者におけるＤＬＸ５発現レベルによる腫瘍特異的な生存のカプラン・マイヤー分析の結果を示す。
【図６Ｄ】ＤＬＸ５タンパク質発現の免疫組織化学的評価、及びその過剰発現とＮＳＣＬＣ患者に関する予後不良との関連性、及びＳＢＣ−５癌細胞におけるＤＬＸ５に対するｓｉＲＮＡによる成長の阻害を示す図である。ＳＢＣ−５細胞において半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出したＤＬＸ５発現のレベルを示す。対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＥＧＦＰ又はｓｉ−スクランブル／ＳＣＲ）又はｓｉ−ＤＬＸ５のいずれかによる治療の効果を、上部パネルに示す。ＭＴＴアッセイにより検出した、ＤＬＸ５に対するｓｉＲＮＡの細胞生存率に対する効果は、下部パネルに示す。
【図７Ａ】肺腫瘍におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。上部パネルは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検査した、１５種の肺癌臨床試料（１０種のＮＳＣＬＣ及び５種のＳＣＬＣ）（Ｔ）及びそれらに対応する正常肺組織（Ｎ）におけるＮＰＴＸ１の発現を示す。各々の一本鎖ｃＤＮＡの適当な希釈物は臨床肺癌試料のｍＲＮＡから調製し、βアクチン（ＡＣＴＢ）の発現レベルを量的対照とする。下部パネルは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検査した、２３種の肺癌細胞株におけるＮＰＴＸ１の発現を示す。
【図７Ｂ】肺腫瘍におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。ウエスタンブロット分析により検査した、４種の肺癌細胞株におけるＮＰＴＸ１タンパク質の発現を示す。
【図７Ｃ】肺腫瘍におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。４種の肺癌細胞株における内因性ＮＰＴＸ１タンパク質の細胞内局在化を示す。ＮＰＴＸ１は、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞、ＮＣＩ−Ｈ５２０細胞、及びＳＢＣ−５細胞においては粒状外観を呈した細胞の細胞質で染色されたが、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞では染色されなかった。
【図７Ｄ】肺腫瘍におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。ＮＰＴＸ１を発現するＮＣＩ−Ｈ２２６細胞、ＮＣＩ−Ｈ５２０細胞、及びＳＢＣ−５細胞、並びにＮＰＴＸ１を発現しないＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞からの馴化培地における、分泌ＮＰＴＸ１タンパク質のＥＬＩＳＡによる検出を示す。
【図７Ｅ】肺腫瘍におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検査した、９種の臨床肺癌（下部パネル）及び２３種の肺癌細胞株（上部パネル）におけるＮＰＴＸ１及びＮＰＴＸＲの発現を示す。
【図８Ａ】正常組織及び肺癌組織におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。ノーザンブロット分析により検出した、正常ヒト組織におけるＮＰＴＸ１の発現を示す。
【図８Ｂ】正常組織及び肺癌組織におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。代表的な肺腺癌（ＡＤＣ）組織及び５種の正常組織（心臓、肝臓、腎臓、副腎）におけるＮＰＴＸ１タンパク質の免疫組織化学的評価の結果を示す。
【図８Ｃ】正常組織及び肺癌組織におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。組織マイクロアレイ上の抗ＮＰＴＸ１抗体を用いた代表的な肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）におけるＮＰＴＸ１の免疫組織化学的染色の結果を示す（原倍率：×２００）。
【図８Ｄ】正常組織及び肺癌組織におけるＮＰＴＸ１の発現を示す図である。上部パネルは、肺ＡＤＣにおけるＮＰＴＸ１発現が強い例、弱い例、及び発現のない例を示す。下部パネルは、ＮＳＣＬＣ患者におけるＮＰＴＸ１発現による腫瘍特異的な生存のカプラン・マイヤー分析を示す（Ｐ＜０．０００１、ログランク検定）。
【図９Ａ】肺癌患者及び健常ドナー又はＣＯＰＤの非腫瘍性肺疾患患者における、ＥＬＩＳＡにより求められるＮＰＴＸ１の血清濃度を示す図である。肺ＡＤＣ、肺ＳＣＣ、又はＳＣＬＣの患者に由来する血清におけるＮＰＴＸ１の分布を示す。ＡＤＣ患者と健常／ＣＯＰＤ個体との間の差（Ｐ＜０．００１、マンホイットニーＵ検定）、ＳＣＣ患者と健常／ＣＯＰＤ個体との間の差（Ｐ＝０．００５）、及びＳＣＬＣ患者と健常／ＣＯＰＤ個体との間の差（Ｐ＝０．００５１）は有意であった。健常個体とＣＯＰＤ個体との間の差は有意ではなかった。
【図９Ｂ】肺癌患者及び健常ドナー又はＣＯＰＤの非腫瘍性肺疾患患者における、ＥＬＩＳＡにより求められるＮＰＴＸ１の血清濃度を示す図である。肺癌の様々な臨床段階での患者に由来する血清におけるＮＰＴＸ１の分布を示す。ＬＤは限局性疾患を意味する。ＥＤは広範な疾患を意味する。
【図９Ｃ】肺癌患者及び健常ドナー又はＣＯＰＤの非腫瘍性肺疾患患者における、ＥＬＩＳＡにより求められるＮＰＴＸ１の血清濃度を示す図である。ＮＳＣＬＣ患者における外科手術の前及び後（手術後２ヶ月）のＮＰＴＸ１の血清濃度を示す。
【図９Ｄ】肺癌患者及び健常ドナー又はＣＯＰＤの非腫瘍性肺疾患患者における、ＥＬＩＳＡにより求められるＮＰＴＸ１の血清濃度を示す図である。同じＮＳＣＬＣ患者の原発性腫瘍組織における血清ＮＰＴＸ１レベル及びＮＰＴＸ１の発現レベルを示す（原倍率：×１００）。
【図１０Ａ】ＮＰＴＸ１のオートクリン細胞成長効果を示す図である。ＮＰＴＸ１に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の成長阻害を示す。上部パネルは、ＲＴ−ＰＣＲ分析により分析した、Ａ５４９細胞及びＳＢＣ−５細胞における、ｓｉ−ＮＰＴＸ１（ｓｉ−１、ｓｉ−２）又は対照ｓｉＲＮＡ（ＬＵＣ又はＳＣＲ）に応じたＮＰＴＸ１の発現を示す。中央のパネルは、ＮＰＴＸ１に関して特異的なｓｉＲＮＡ又は対照プラスミドをトランスフェクトしたＡ５４９細胞及びＳＢＣ−５細胞のコロニー形成アッセイにより検査したコロニーの画像を示す。下パネルは、ｓｉ−ＮＰＴＸ１、ｓｉ−ＬＵＣ、又はｓｉ−ＳＣＲに応じた、ＭＴＴアッセイにより評価したＡ５４９細胞又はＳＢＣ−５細胞の生存率を示す。全てのアッセイは三連ウェルで３回実行した。
【図１０Ｂ】ＮＰＴＸ１のオートクリン細胞成長効果を示す図である。ＣＯＳ−７細胞において一過性に過剰発現されたＮＰＴＸ１の成長促進効果を示す。上パネルは、ウエスタンブロット分析により検出した、ＣＯＳ−７細胞におけるＮＰＴＸ１の一過性発現を示す。下パネルは、ＭＴＴアッセイ（左）及びコロニー形成アッセイ（右）により評価したＣＯＳ−７細胞の生存率を示す。
【図１０Ｃ】ＮＰＴＸ１のオートクリン細胞成長効果を示す図である。左パネルは、哺乳類細胞の成長に対するＮＰＴＸ１のオートクリン／パラクリン効果を示す。細胞生存率はＭＴＴアッセイにより計算した（ＣＯＳ−７細胞は最終濃度０ｎＭ、０．１ｎＭ、又は１ｎＭのＮＰＴＸ１で処理した）（ＰＢＳで示した右レーン）。ＭＴＴアッセイによって、ＣＯＳ−７細胞の培養培地におけるＮＰＴＸ１タンパク質（０ｎＭ、０．１ｎＭ、又は１ｎＭ）の活性に対する抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ−７５−１、５０ｎＭ）及び対照ＩｇＧ（正常マウス、５０ｎＭ）の競合的中和効果を評価する（抗ＮＰＴＸ１ｍＡｂ及びＩｇＧで示した左及び中央のレーン）。右パネルは、抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体（２５ｎＭ又は５０ｎＭ）による、ＮＰＴＸ１を過剰発現した肺癌Ａ５４９細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長の用量依存的な阻害を示す。各々の実験は三連で行なった。
【図１０Ｄ】ＮＰＴＸ１のオートクリン細胞成長効果を示す図である。抗ＮＰＴＸ１抗体による各種肺癌細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長の阻害を示す。ＭＴＴアッセイにより、抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ−７５−１、５０ｎＭ）の、ＮＰＴＸ１を過剰発現する肺癌細胞株ＳＢＣ−５（Ｐ＝０．０１２、各々両側ｔ検定）、並びにＮＰＴＸ１を発現しない肺癌細胞株ＳＢＣ−３及びＮＣＩ−Ｈ２１７０の成長に対する効果を評価する。各々の実験は三連で行なった。
【図１１】ＮＰＴＸ１発現プラスミドをトランスフェクトした哺乳類細胞の浸潤能亢進を示す図である。アッセイにより、ヒトＮＰＴＸ１に対する発現プラスミドをトランスフェクトした後のマトリゲルマトリクスにおけるＮＩＨ−３Ｔ３細胞の浸潤性を実証する。左上パネルは、ウエスタンブロット分析により検出したＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＮＰＴＸ１の一過性発現を示す。下パネルは、マトリゲル被覆フィルタを通って移動する細胞のギムザ染色（×２００）及び数を示す。アッセイは各々三連ウェルで３回実行した。
【図１２】ヌードマウスに移植したＡ５４９細胞に対する抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体の効果を示す図である。上パネルには、抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ−７５−１、３００μｇ／体重）又は正常マウスＩｇＧ（対照１、３００μｇ／体重）で週２回処理した３匹のマウス、及び処理しなかった３匹のマウス（対照２）の平均腫瘍容積をプロットした。値は腫瘍容積の平均±標準誤差として表される。動物に各々の抗体を腹腔内注射により３０日間週２回投与した。下パネルは、抗ＮＰＴＸ１抗体で処理した、ＨＥ染色した腫瘍（Ａ５４９）の組織病理学的検査を示す。ＮＰＴＸ１抗体による処理の３０日後、対照ＩｇＧで処理した腫瘍組織又は処理しなかった腫瘍組織と比較して、抗ＮＰＴＸ１抗体で処理した腫瘍組織においては、線維腫性（fibromatic）変化及び生癌細胞のより有意な減少が観察された。
【図１３Ａ】成長促進経路におけるＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの相互作用を示す図である。ＮＰＴＸ１又はＮＰＴＸＲを発現するＣＯＳ−７細胞を用いて共焦点顕微鏡法を行なった。緑色：ＮＰＴＸ１（ｍｙｃ）。赤色：ＮＰＴＸＲ。左パネルでは、ＣＯＳ−７細胞をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により透過処理し、ＮＰＴＸ１を検出する抗ｍｙｃ抗体により染色した。右パネルでは、ＣＯＳ−７細胞を、ＮＰＴＸ１に対する抗体（ｍｙｃ−ｔａｇ）及びＮＰＴＸＲ抗体を用いて細胞外表面染色について染色した。
【図１３Ｂ】成長促進経路におけるＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの相互作用を示す図である。ＮＰＴＸ１又はＮＰＴＸＲを発現するＣＯＳ−７細胞を用いて、共焦点顕微鏡法を行なった。左パネルでは、ＣＯＳ−７細胞をＮＰＴＸ１（ｍｙｃ）及びＮＰＴＸＲ抗体を用いて細胞外表面染色について染色した。右パネルでは、細胞表面上のＮＰＴＸ１を除去するためにグリシン治療を実行した。
【図１３Ｃ】成長促進経路におけるＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの相互作用を示す図である。ＮＰＴＸ１又はＮＰＴＸＲを発現するＳＢＣ−５細胞（Ｃ）を用いて、共焦点顕微鏡法を行なった。左パネルでは、ＳＢＣ−５細胞をＮＰＴＸ１（ｍｙｃ）及びＮＰＴＸＲ抗体を用いて細胞外表面染色について染色した。右パネルでは、細胞表面上のＮＰＴＸ１を除去するためにグリシン治療を実行した。
【図１３Ｄ】成長促進経路におけるＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの相互作用を示す図である。ＮＰＴＸＲに対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞成長の阻害を示す。上パネルは、ＲＴ−ＰＣＲ分析により分析した、Ａ５４９細胞及びＳＢＣ−５細胞におけるｓｉ−ＮＰＴＸ１（ｓｉ−１及びｓｉ−２）又は対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＬＵＣ及びｓｉ−ＳＣＲ）に応じたＮＰＴＸ１の発現を示す。下パネルは、ＮＰＴＸＲに対して特異的なｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞及びＳＢＣ−５細胞のコロニー形成アッセイにより検査したコロニーの画像を示す。中央のパネルは、ＭＴＴアッセイにより評価した、ｓｉ−ＮＰＴＸＲ、ｓｉ−ＬＵＣ、又はｓｉ−ＳＣＲに応じたＡ５４９細胞又はＳＢＣ−５細胞の生存率を示す。全てのアッセイは三連ウェルで３回実行した。
【図１４Ａ】ＮＰＴＸＲとの結合後のＮＰＴＸ１の内在化を示す図である。レシピエントＣＯＳ−７細胞を、ＮＰＴＸ１をトランスフェクトした（＋）ドナーＣＯＳ−７細胞からの馴化培地と共にインキュベートした。ｃ−ｍｙｃタグ付きＮＰＴＸ１が、レシピエント細胞をドナーの馴化培地で処理した３時間後に検出された。緑色：ＮＰＴＸ１。核はＤＡＰＩにより可視化した。（ａ）細胞を、ＮＰＴＸ１を検出するための抗ｍｙｃ抗体を用いて細胞外表面染色について染色した。（ｂ）細胞をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により透過処理し、ＮＰＴＸ１（ｍｙｃ）について染色した。（ｃ）ＰＢＳで３時間処理した。
【図１４Ｂ】ＮＰＴＸＲとの結合後のＮＰＴＸ１の内在化を示す図である。レシピエントＳＢＣ−５細胞を、ＮＰＴＸ１をトランスフェクトした（＋）ドナーＳＢＣ−５細胞からの馴化培地と共にインキュベートした。ｃ−ｍｙｃタグ付きＮＰＴＸ１が、レシピエント細胞をドナーの馴化培地で処理した３時間後に検出された。緑色：ＮＰＴＸ１。核はＤＡＰＩにより可視化した。（ａ）細胞を、ＮＰＴＸ１を検出するための抗ｍｙｃ抗体を用いて細胞外表面染色について染色した。（ｂ）細胞をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により透過処理し、ＮＰＴＸ１（ｍｙｃ）について染色した。（ｃ）ＰＢＳで３時間処理した。
【図１４Ｃ】ＮＰＴＸＲとの結合後のＮＰＴＸ１の内在化を示す図である。レシピエントＣＯＳ−７細胞は、ドナーＮＰＴＸ１をトランスフェクトした（＋）ＣＯＳ−７細胞からの馴化培地において、分泌されたＮＰＴＸ１を時間に依存して取り込むように見えた。ドナーＮＰＴＸ１をトランスフェクトした（＋）ＣＯＳ−７細胞からの馴化培地でレシピエントＣＯＳ−７細胞を処理した１時間後又は３時間後、内在化したＮＰＴＸ１を抗ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロット法により検出した。
【図１５Ａ】ＮＰＴＸ１を発現するＣＯＳ−７細胞からの馴化培地における、分泌された外因性ＮＰＴＸ１タンパク質のウエスタンブロット分析による検出を示す図である。
【図１５Ｂ】外因性ＮＰＴＸ１を発現するＣＯＳ−７細胞における、ＮＰＴＸ１のＮＰＴＸＲタンパク質への結合の免疫沈降分析による検出を示す図である。
【図１６Ａ】肺癌及び脳転移におけるＣＤＫＮ３の発現を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検査した、ＮＳＣＬＣの臨床試料（Ｔ）及び対応する正常肺組織（Ｎ）におけるＣＤＫＮ３の発現を示す。
【図１６Ｂ】肺癌及び脳転移におけるＣＤＫＮ３の発現を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検査した、早期原発性ＮＳＣＬＣ（Ｉ期〜ＩＩＩａ期）、進行性原発性ＮＳＣＬＣ（ＩＩＩｂ期〜ＩＶ期）、及びＡＤＣに由来する転移性脳腫瘍の臨床試料（Ｔ）、並びに正常肺組織（Ｎ）におけるＣＤＫＮ３の発現を示す（上パネル）。ＰＣＲ産物のデンシトメトリー強度（Densitometric intensity）を、画像分析ソフトウェアにより定量化した（下パネル）。
【図１６Ｃ】肺癌及び脳転移におけるＣＤＫＮ３の発現を示す図である。ノーザンブロット分析により検出した、正常ヒト組織におけるＣＤＫＮ３の発現を示す。
【図１７Ａ】肺癌におけるＣＤＫＮ３の発現、及びＮＳＣＬＣ患者に関する臨床転帰不良とのその関連性を示す図である。マウスモノクローナル抗ＣＤＫＮ３抗体を用いた免疫組織化学的染色（対比染色にはヘマトキシリンを用いた）により検出した、６種の正常ヒト組織及びＮＳＣＬＣ症例におけるＣＤＫＮ３の発現を示す（×２００）。
【図１７Ｂ】肺癌におけるＣＤＫＮ３の発現、及びＮＳＣＬＣ患者に関する臨床転帰不良とのその関連性を示す図である。組織マイクロアレイ上での抗ＣＤＫＮ３抗体を用いた、代表的な手術で摘出したＮＳＣＬＣ（肺ＳＣＣ）及び正常肺の免疫組織化学的染色の結果を示す（×１００）。
【図１７Ｃ】肺癌におけるＣＤＫＮ３の発現、及びＮＳＣＬＣ患者に関する臨床転帰不良とのその関連性を示す図である。ＮＳＣＬＣ患者におけるＣＤＫＮ３発現による腫瘍特異的な生存のカプラン・マイヤー分析を示す（ログランク検定によるＰ＜０．０００１）。
【図１８Ａ】ＣＤＫＮ３と相互作用する新規の分子としてのＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、ＥＦ−１δ／ＶａｌＲＳの同定を示す図である。ＣＤＫＮ３と相互作用するタンパク質のスクリーニングを示す。銀染色によって示される１４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、３１ｋＤａ、及び２５ｋＤａのバンドが抽出された。これらは抗ＣＤＫＮ３モノクローナル抗体を用いて免疫沈降させたＬＣ３１９細胞に由来する細胞可溶化物において見られたが、正常マウスＩｇＧを用いたものにおいては見られなかった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析配列決定によるそれらのペプチド配列によって、個々のバンドがそれぞれＶＡＲＳ、ＥＦ−１γ、ＥＦ−１δ、ＥＦ−１βであると規定された。ＣＤＫＮ３タンパク質のバンドの位置は星印で示す。分子量マーカー（ｋＤａ）の位置は左側に示す。
【図１８Ｂ】ＣＤＫＮ３と相互作用する新規の分子としてのＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、ＥＦ−１δ／ＶａｌＲＳの同定を示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により検出した、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＣＤＫＮ３、ＶａｌＲＳ、ＥＦ−１γ、ＥＦ−１δ、ＥＦ−１β、及びそれらの関連分子ＣＤＫ１の発現を示す。
【図１９Ａ】肺癌におけるＥＦ−１δの発現、及びＮＳＣＬＣ患者に関する臨床転帰不良とのその関連性を示す図である。ウエスタンブロット分析により検出した、肺癌細胞株におけるＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δタンパク質の発現を示す。
【図１９Ｂ】肺癌におけるＥＦ−１δの発現、及びＮＳＣＬＣ患者に関する臨床転帰不良とのその関連性を示す図である。組織マイクロアレイ上の抗ＥＦ−１δ抗体を用いた、ＮＳＣＬＣ（肺ＳＣＣ）及び正常肺を含む代表的な手術で摘出した試料の免疫組織化学的染色の結果を示す（×１００）。
【図１９Ｃ】肺癌におけるＥＦ−１δの発現、及びＮＳＣＬＣ患者に関する臨床転帰不良とのその関連性を示す図である。ＥＦ−１δ発現と、ＮＳＣＬＣ患者における臨床転帰不良との関連性を示す。ＮＳＣＬＣ患者におけるＥＦ−１δ発現による腫瘍特異的な生存のカプラン・マイヤー分析を示した（ログランク検定によるＰ＝０．０００６）。
【図２０Ａ】ＣＤＫＮ３によるＥＦ−１δの脱リン酸化を示す図である。ＬＣ３１９細胞の抽出物に由来する内因性ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δの免疫沈降により確認した、肺癌細胞におけるＣＤＫＮ３とＥＦ−１δとの関連性を示す。ＩＰ：免疫沈降、ＩＢ：免疫ブロット。
【図２０Ｂ】ＣＤＫＮ３によるＥＦ−１δの脱リン酸化を示す図である。様々な細胞周期でのＬＣ３１９細胞における内因性ＣＤＫＮ３（緑色）、及び内因性ＥＦ−１δ（赤色）の共局在化を示す。
【図２０Ｃ】ＣＤＫＮ３によるＥＦ−１δの脱リン酸化を示す図である。外因性及び内因性のＥＦ−１δのリン酸化を示す。外因性ＥＦ−１δを過剰発現するＣＯＳ−７細胞からの細胞抽出物（左パネル）、及びＬＣ３１９細胞からの細胞抽出物（右パネル）をλタンパク質ホスファターゼ（λ−ＰＰａｓｅ）で処理した。λ−ＰＰａｓｅで処理した細胞抽出物においてバンドシフトが検出された。白矢印及び黒矢印は、それぞれリン酸化ＥＦ−１δ及び脱リン酸化ＥＦ−１δを示す。
【図２０Ｄ】ＣＤＫＮ３によるＥＦ−１δの脱リン酸化を示す図である。ＬＣ３１９細胞において外因的に過剰発現されたＣＤＫＮ３による、内因性ＥＦ−１δの脱リン酸化を示す。ＣＤＫＮ３発現ベクターをＬＣ３１９細胞にトランスフェクトした。
【図２１Ａ】ＥＦ−１δのＣＤＫＮ３結合領域の同定を示す図である。ＣＤＫＮ３を一過性に過剰発現したＣＯＳ−７細胞における、外因性ＥＦ−１δの脱リン酸化を示す。内因性ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δを弱く発現するＣＯＳ−７細胞に、Ｆｌａｇ−ＨＡタグ付きＣＤＫＮ３発現ベクター、Ｆｌａｇ−ＨＡタグ付きＥＦ−１δ−発現ベクター、又は２つの発現ベクターの両方をトランスフェクトした。これらの細胞からの全細胞抽出物を、抗ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロット分析に使用した（左パネル）。斜線矢印、白矢印、及び黒矢印は、それぞれＣＤＫＮ３、リン酸化ＥＦ−１δ、及び脱リン酸化ＥＦ−１δを示す。抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降させたこれらの細胞抽出物を、抗ホスホセリン抗体を用いて免疫ブロットした（右パネル）。白矢印はリン酸化ＥＦ−１δを示す。ＩＰ：免疫沈降。ＩＢ：免疫ブロット。
【図２１Ｂ】ＥＦ−１δのＣＤＫＮ３結合領域の同定を示す図である。ＥＦ−１δの配列スキームを示す。ＥＦ−１δの１つの完全長構築物及び４つの欠失構築物を示す。
【図２１Ｃ】ＥＦ−１δのＣＤＫＮ３結合領域の同定を示す図である。ＥＦ−１δにおけるＣＤＫＮ３と結合する領域の免疫沈降実験による同定を示す。ＥＦ−１δにおけるＮ末端１６０アミノ酸ポリペプチドを欠いた、ＥＦ−１δのｌ６１〜２８１構築物は、ＬＣ３１９細胞において内因性ＣＤＫＮ３と相互作用するいかなる能力も保持しなかったが、これはＥＦ−１δにおいてロイシンジッパーモチーフを含有する８９アミノ酸ポリペプチド（コドン７２〜１６０）が、ＣＤＫＮ３との相互作用において重要な役割を果たし得ることを示唆する。ＩＰ：免疫沈降。ＩＢ：免疫ブロット。
【図２２Ａ】ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δの肺癌細胞の成長に対する効果を示す図である。左上パネルは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した、ＬＣ３１９細胞におけるｓｉ−ＣＤＫＮ３（ｓｉ−Ａ及びｓｉ−Ｂ）又は対照ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、又はスクランブル（ＳＣＲ））に応じたＣＤＫＮ３の発現を示す。右上パネルは、ＭＴＴアッセイにより評価した、ｓｉ−ＣＤＫＮ３、ｓｉ−ＥＧＦＲ、ｓｉ−ＬＵＣ、又はｓｉ−ＳＣＲに応じたＬＣ３１９細胞の生存率を示す。下パネルは、特異的なｓｉＲＮＡ又は対照プラスミドをトランスフェクトしたＬＣ３１９細胞のコロニー形成アッセイを示す。
【図２２Ｂ】ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δの肺癌細胞の成長に対する効果を示す図である。左上パネルは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した、ＬＣ３１９細胞におけるｓｉ−ＥＦ−１δ（ｓｉ−１及びｓｉ−２）又は対照ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、又はスクランブル（ＳＣＲ））に応じたＥＦ−１δの発現を示す。右上パネルは、ＭＴＴアッセイにより評価した、ｓｉ−ＥＦ−１δ又は対照ｓｉＲＮＡに応じたＬＣ３１９細胞の生存率を示す。下パネルは、ｓｉ−ＥＦ−１δ又は対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＬＣ３１９細胞のコロニー形成アッセイの結果を示す。
【図２３Ａ】細胞浸潤活性を増大し、Ａｋｔを活性化するＣＤＫＮ３の能力を実証する図である。モックベクター又はＣＤＫＮ３発現ベクターをトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の浸潤能の増大を実証する、マトリゲル浸潤アッセイの結果を示す。マトリゲル被覆フィルタを通って浸潤する細胞の数を示す。
【図２３Ｂ】細胞浸潤活性を増大し、Ａｋｔを活性化するＣＤＫＮ３の能力を実証する図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により検出した、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＥＦ−１α１及びＥＦ−１α２の発現を示す。
【図２３Ｃ】細胞浸潤活性を増大し、Ａｋｔを活性化するＣＤＫＮ３の能力を実証する図である。ＬＣ３１９細胞の抽出物を用いた免疫沈降により確認した、肺癌細胞におけるＣＤＫＮ３とＥＦ−１αとの関連性を示す。ＩＰ：免疫沈降。ＩＢ：免疫ブロット（左パネル）。
【図２３Ｄ】細胞浸潤活性を増大し、Ａｋｔを活性化するＣＤＫＮ３の能力を実証する図である。ＣＤＫＮ３発現ベクターをトランスフェクトしたＬＣ３１９細胞におけるＡｋｔ−リン酸化を示す。ＣＤＫＮ３を発現する細胞からの総タンパク質抽出物を、抗Ａｋｔ抗体、抗ホスホ−Ａｋｔ抗体（Ｓｅｒ４７３）、抗Ｆｌａｇ抗体、又は抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロット分析により検出した。モックベクターをトランスフェクトした細胞からのタンパク質抽出物を対照として使用し、βアクチンをローディング対照として使用した。
【図２３Ｅ】細胞浸潤活性を増大し、Ａｋｔを活性化するＣＤＫＮ３の能力を実証する図である。モックベクター又はＣＤＫＮ３発現ベクターをトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、ＬＹ２９４００２又はＤＭＳＯ（ビヒクル）と共にプレインキュベートし、浸潤能の増大を実証するマトリゲル浸潤アッセイを行なった。マトリゲル被覆フィルタを通って浸潤する細胞の数を示した。
【図２４Ａ】ＥＦ−１δにおけるＣＤＫＮ３結合領域の同定を示す図である。そのＮＨ２末端で膜形質導入１１ポリアルギニン配列に共有結合した、５種の細胞透過性ペプチドの概略図を示す。ＥＦ−１δにおけるロイシンジッパーモチーフの配列、及びＥＦ−１δに由来する５種の細胞透過性ペプチドを示す。
【図２４Ｂ】ＥＦ−１δにおけるＣＤＫＮ３結合領域の同定を示す図である。ＭＴＴアッセイにより評価した、５種の細胞透過性ペプチドに応じたＬＣ３１９細胞の生存率を示す（上パネル）。免疫沈降により検出した、１１Ｒ−ＥＦ−１δ９０〜１０８ペプチドで処理したＬＣ３１９細胞における内因性ＣＤＫＮ３とＥＦ−１δタンパク質との間の複合体形成の減少を示す（下パネル）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の開示
本発明の実施形態の実施又は試験に際しては、本明細書中に記載されるものと同様又は等価の方法及び材料を使用することができるが、好ましい方法及び材料をここで記載する。しかしながら、本発明は本明細書中に記載される特定の分子、組成物、方法論、又はプロトコルに限定されず、日常実験及び最適化に従って変わり得ることを理解されたい。また、本明細書において使用される専門用語は、単に特定の実施形態（versions or embodiments）の説明を目的とするものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するよう意図されないことを理解されたい。
【００２８】
他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術を有する者（当業者）により一般に理解されるものと同じ意味を有する。しかしながら、矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される。したがって、本発明に関しては以下の定義が適用される：
【００２９】
定義
単語「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、本明細書中で使用される場合、特に指定のない限り、「少なくとも１つの」を意味する。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「生体試料」という用語は生物体全体又はその組織、細胞又は構成部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血（amniotic cord blood）、尿、膣液、及び精液を含む（これらに限定されない）体液）のサブセットを指す。「生体試料」という用語はさらに、生物体全体又はその細胞、組織又は構成部分のサブセット、又はその画分若しくは一部分から調製されるホモジネート、可溶化物、抽出物、細胞培養物、又は組織培養物を指す。最後に、「生体試料」は、タンパク質又はポリヌクレオチド等の細胞成分を含有する、生物を繁殖させたニュートリエントブロス又はゲル等の培地を指す。
【００３１】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、及び「核酸分子」という用語は本明細書中で核酸残基の重合体を指すのに互換可能に使用され、特に指定のない限りは、それらの一般に認められた１文字のコードにより称される。該用語は、1つ又は複数の核酸がエステル結合によって結合された核酸（ヌクレオチド）重合体に適用される。核酸重合体はＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの組合せから成り得、天然及び非天然の核酸ポリマーの両方を包含する。
【００３２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は本明細書中でアミノ酸残基の重合体を指すのに互換可能に使用される。該用語は天然アミノ酸重合体に加えて、１つ又は複数のアミノ酸残基が修飾残基であるか、又は対応する天然アミノ酸の人工の化学的模倣体（chemical mimetic）のように天然に存在しない残基であるアミノ酸重合体にも適用される。
【００３３】
遺伝子又はタンパク質
本発明における遺伝子の核酸配列及びポリペプチド配列を以下の番号で示すが、これらに限定されない：
ＥＢＩ３：配列番号１及び配列番号２、
ＤＬＸ５：配列番号３及び配列番号４、
ＣＤＫＮ３：配列番号５及び配列番号６、
ＥＦ−１δ：配列番号７及び配列番号８、
ＶａｌＲＳ：配列番号２６又は配列番号２８、及び配列番号２７又は配列番号２９、
ＥＦ−１β：配列番号３０及び配列番号３１、
ＥＦ−１γ：配列番号３２及び配列番号３３、
ＥＦ−１α：配列番号５７又は配列番号９０、及び配列番号５８又は配列番号９１、
Ａｋｔ：配列番号５９及び６０、
ＮＰＴＸ１：配列番号７８及び配列番号７９、並びに
ＮＰＴＸＲ：配列番号８６及び配列番号８７。
【００３４】
さらに、配列データは以下のアクセッション番号によっても利用可能である。
ＥＢＩ３：ＮＭ＿００５７５５、
ＤＬＸ５：ＢＣ００６２２６、
ＣＤＫＮ３：Ｌ２７７１１、
ＥＦ−１δ：ＢＣ００９９０７、
ＶａｌＲＳ：ＮＭ＿００６２９５又はＢＣ０１２８０８、
ＥＦ−１β：ＮＭ＿００１９５９、
ＥＦ−１γ：ＢＣ００９８６５、
ＥＦ−１α：ＮＭ＿００１４０２又はＮＭ＿００１９５８、
ＮＰＴＸ１：配列番号ＮＭ＿００２５２２又はＮＭ＿００２５２２．２、並びに
ＮＰＴＸＲ：配列番号ＮＭ＿０１４２９３。
【００３５】
本発明の一態様によれば、機能的等価物は上記「ポリペプチド」であるとも考えられる。ここで、タンパク質の「機能的等価物」とは、該タンパク質と同等の生物活性を有するポリペプチドである。すなわち、この生物学的能力を保持する任意のポリペプチドを、かかる機能的等価物として本発明において使用することができる。かかる機能的等価物は、１つ又は複数のアミノ酸がタンパク質の天然のアミノ酸配列に置換、欠失、付加、又は挿入されたものを含む。代替的には、ポリペプチドは、個々のタンパク質の配列と少なくとも約８０％の相同性（配列同一性とも称される）、より好ましくは少なくとも約９０％〜９５％の相同性を有するアミノ酸配列から成るものであり得る。他の実施形態では、ポリペプチドは、ストリンジェントな条件下で遺伝子の天然のヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ得る。
【００３６】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、又は形状は、それを作製するために使用される細胞若しくは宿主、又は利用される精製方法に応じて変化し得る。しかしながら、ポリペプチドが本発明のヒトタンパク質の機能と同等の機能を有する限り、そのポリペプチドは本発明の範囲に含まれる。
【００３７】
「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、核酸分子が、典型的に核酸の複合混合物において、その標的配列とハイブリダイズするが他の配列とは検出可能なハイブリダイズはしない条件を表す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、様々な状況下で異なる。配列が長くなれば、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"（1993）に見られる。概して、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度、ｐＨで特定の配列のために、熱融解点（Ｔｍ）より約５℃〜１０℃低く選択される。Ｔｍは、（規定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度で）標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍで、プローブの５０％が平衡状態で占められる）。ストリンジェントな条件は、不安定化剤、例えばホルムアミドの添加によっても達成することができる。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションのために、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２倍、例えばバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。
例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下を含む：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳにおいて４２℃でインキュベートする、又は５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳにおいて６５℃でインキュベートし、０．２×ＳＳＣ、及び０．１％ＳＤＳにおいて５０℃で洗浄する。
【００３８】
本発明に関しては、上記ヒトタンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーション条件は、当業者により日常的に選択され得る。例えば、ハイブリダイゼーションは、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂバッファー」（Amersham LIFE SCIENCE）を用いて、６８℃で、３０分以上、前ハイブリダイゼーションを行ない、標識プローブを添加して、６８℃で１時間以上温めることによって実施することができる。以下の洗浄工程は、例えば低いストリンジェント条件で実施することができる。低いストリンジェント条件は例えば、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、例えば５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳである。幾つかの実施形態では、高いストリンジェント条件を用いる。好ましくはストリンジェンシーの高い条件が使用されることが多い。高いストリンジェント条件は例えば、室温で２０分間、２×ＳＳＣ、０．０１％  ＳＤＳにおける３回の洗浄、その後の３７℃で２０分間、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳにおける３回の洗浄、及び５０℃で２０分間、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳにおける２回の洗浄である。しかしながら、幾つかの因子、例えば温度及び塩濃度は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える可能性があり、当業者は、必要なストリンジェンシーを達成するために因子を好適に選択することができる。
【００３９】
一般に、タンパク質における１つ又は複数のアミノ酸の修飾は、タンパク質の機能に影響を与えないことが知られている。実際に、変異したか又は修飾されたタンパク質、或る特定のアミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入、及び／又は付加することにより修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984)、Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10: 6487-500 (1982)、Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。したがって、単一のアミノ酸若しくは少数のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、若しくは置換、又はタンパク質の変更が同様の機能を有するタンパク質をもたらす「保存的修飾」と見なされる修飾は、本発明に関しては許容可能であることを当業者は認識するであろう。
【００４０】
タンパク質の活性が維持される限り、アミノ酸変異の数は特に限定されない。しかしながら、一般にアミノ酸配列の５％以下を変更するのが好ましい。したがって、好ましい実施形態では、かかる突然変異体において変異させるアミノ酸の数は、一般に３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは１０アミノ酸以下、より好ましくは６アミノ酸以下、さらにより好ましくは３アミノ酸以下である。
【００４１】
変異させるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の性質が保存された異なるアミノ酸に変異させるのが好ましい（保存的アミノ酸置換として知られるプロセス）。アミノ酸側鎖の性質の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、及び以下の官能基又は共通の特性を有する側鎖である：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、ヒドロキシル基を含有する側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子を含有する側鎖（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミドを含有する側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基を含有する側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、並びに芳香族を含有する側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。機能的に同様のアミノ酸を与える保存的置換表は当該技術分野で既知である。例えば、以下の８つの基はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。このように保存的に修飾されたポリペプチドが本発明のタンパク質に含まれる。しかしながら、本発明は、これらに限定されず、タンパク質は、タンパク質の少なくとも１つの生物活性を保持していれば非保存的修飾を含む。さらに、修飾タンパク質には、多型変異体、種間相同体、これらのタンパク質の対立遺伝子でコードされるものは除外されない。
【００４２】
さらに、本発明の遺伝子は、かかるタンパク質の機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを包含する。上記配列情報に基づいて合成したプライマーを用いて、タンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するために、ハイブリダイゼーションに加えて、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用することができる。ヒトの遺伝子及びタンパク質とそれぞれ機能的に等価なポリヌクレオチド及びポリペプチドは通常、元のヌクレオチド又はアミノ酸配列と高い相同性を有する。「高い相同性」とは、典型的には４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％〜９５％以上の相同性を指す。特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性は、"Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)"におけるアルゴリズムに従って決定することができる。
【００４３】
抗体
「抗体」という用語は本明細書中で使用される場合、指定のタンパク質又はそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリン及びその断片を含むことが意図される。抗体はヒト抗体、霊長類化（primatized）抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質、又は放射性標識と融合させた抗体、及び抗体断片を含み得る。さらに、本明細書において「抗体」は広義で使用され、具体的には無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成される多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）包含し、また所望の生物活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は全てのクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）を示す。
【００４４】
主題発明では、ＣＤＫＮ３とＥＦ−１δとの間の結合又は相互作用を妨害するために、ＥＦ−１δのＣＤＫＮ３結合領域（７２ａａ〜１６０ａａの位置）に対する抗体を利用する。この２つの遺伝子の両方が肺癌において上方制御されるため（図１６、図１７、図１８Ｂ、及び図１９）、肺癌細胞における相互作用が求められる（図１８及び図２０）。さらに、ＮＰＴＸ１に対する抗体は、分泌されたＮＰＴＸ１タンパク質を中和し、癌細胞増殖を阻害するのに有用であった（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。したがって、本発明の抗体は肺癌を治療するのに有用であり得る。これらの抗体は既知の方法により提供される。本発明に従って使用される抗体を作製する例示的な技法は記載されている。
【００４５】
（ｉ）ポリクローナル抗体：
ポリクローナル抗体は、動物において関連抗原及びアジュバントの頻回皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射により生じさせるのが好ましい。本発明では、抗原は、配列番号８８若しくは配列番号８９、又は配列番号６１等のＥＦ−１δのＣＤＫＮ３結合領域を含むポリペプチドであるがこれに限定されない。二官能性物質又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する共役）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣ１２、又はＲ'Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲは異なるアルキル基である）を用いて、免疫化される種において免疫原性のあるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害因子と、関連抗原とを共役させることが有用であり得る。
【００４６】
例えば１００μｇ又は５μｇのタンパク質又は複合体（それぞれウサギ又はマウスの場合）を３倍量の完全フロインドアジュバントと合わせ、この溶液を複数の部位で皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性のある複合体、又は誘導体に対して免疫化する。１ヵ月後、ペプチド又は複合体の初期量の１／５〜１／１０量を完全フロインドアジュバントに加え、複数の部位で皮下注射することにより動物を追加免疫する。７日〜１４日後、動物から採血し、血清を抗体力価について検定する。力価が平衡に達するまで動物を追加免疫する。同じ抗原の異なるタンパク質を共役させた複合体及び／又は異なる架橋試薬による複合体で動物を追加免疫するのが好ましい。
【００４７】
複合体は、融合タンパク質（protein fusions）として、組み換え細胞培養物においても作製することができる。また、ミョウバン等の凝集剤が、免疫反応を増強するのに適切に使用される。
【００４８】
（ｉｉ）モノクローナル抗体：
モノクローナル抗体は実質的に均質な抗体集団、すなわち、集団内に含有される個々の抗体が起こり得る自然発生突然変異（若干存在し得る）以外は同一である集団から得ることができる。したがって、「モノクローナル」という修飾詞は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を意味する。
【００４９】
例えば、モノクローナル抗体は、Kohler G & Milstein C. Nature. 1975 Aug 7; 256 (5517):495-7に初めて記載されたハイブリドーマ法を用いて作製され得るか、又は組み換えＤＮＡ法により作製され得る（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。
【００５０】
ハイブリドーマ法においては、マウス又は他の適当な宿主動物（ハムスター等）を以上に記載されるように免疫化して、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を生成するか、又は生成することが可能なリンパ球を誘導する。代替的には、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化してもよい。リンパ球を次に、ポリエチレングリコール等の適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。
【００５１】
このように調製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは非融合親骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する１つ又は複数の物質を含有する、適切な培養培地に播種して成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。
【００５２】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル産生を支持し、また培地、例えばＨＡＴ培地に対して感受性がある。
これらの中で、好ましい骨髄腫細胞株としては、マウス骨髄腫細胞株、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Manassas, Virginia, USA）から入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞由来のものが挙げられる。ヒト骨髄腫細胞株及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Kozbor D, et al., J Immunol. 1984 Dec;133(6):3001-5、Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【００５３】
ハイブリドーマ細胞が成長している細胞培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関して検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって求められる。
【００５４】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson PJ & Rodbard D. Anal Biochem. 1980 Sep 1;107(1):220-39のスキャッチャード解析によって決定することができる。
【００５５】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、そのクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）によって成長させてもよい。この目的に適した培養培地には、例えばＤ−ＭＥＭ培地又はＲＰＭＬ−１６４０培地が含まれる。また、ハイブリドーマ細胞を動物において腹水腫瘍として、ｉｎ  ｖｉｖｏで成長させてもよい。
【００５６】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィー等によって培養培地、腹水、又は血清から適切に分離することができる。
【００５７】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて）容易に単離及び配列決定され得る。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源となる。ＤＮＡを単離した後、発現ベクターに入れ、それを次に宿主細胞（免疫グロブリンタンパク質を本来産生しない、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞等）にトランスフェクトすることにより、組み換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組み換え発現に関する総説としては、Skerra A. Curr Opin Immunol. 1993 Apr; 5 (2):256-62 及びand Pl?ckthun A. Immunol Rev. 1992 Dec;130:151-88が挙げられる。
【００５８】
ＥＦ−１δのＣＤＫＮ３結合領域（７２ａａ〜１６０ａａの位置）に対して反応性を有する特異的抗体又は抗体断片を作り出す別の方法は、ＥＦ−１δのＣＤＫＮ３結合領域（７２ａａ〜１６０ａａの位置）によって細菌において発現される、免疫グロブリン遺伝子又はその一部分をコードする発現ライブラリをスクリーニングすることである。例えば、完全Ｆａｂ断片、ＶＨ領域、及びＦｖ領域を、細菌においてファージ発現ライブラリを用いて発現させることができる。例えば、Ward ES et al., Nature. 1989 Oct 12; 341(6242): 544-546、Huse WD, et al., Science. 1989 Dec 8; 246(4935): 1275-1281、及びMcCafferty J, et al., Nature. 1990 Dec 6; 348(6301): 552-554を参照されたい。かかるライブラリをＥＦ−１δのＣＤＫＮ３結合領域（７２ａａ〜１６０ａａの位置）を用いてスクリーニングすることにより、ＥＦ−１δのＣＤＫＮ３結合領域（７２ａａ〜１６０ａａの位置）と反応する免疫グロブリン断片を同定することができる。代替的には、抗体又はその断片を生成するためにＳＣＩＤ−ｈｕマウス（Genpharmから入手可能）を使用することができる。
【００５９】
さらなる実施形態においては、抗体又は抗体断片を、McCafferty J, et al., Nature. 1990 Dec 6;348(6301):552-4に記載されている技法を用いて作り出される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson T, et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8;及びMarks JD, et al., J MoL BioL, 222: 581-597 (1991) J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97はそれぞれ、ファージライブラリを用いたマウス抗体及びヒト抗体の単離について記載している。その後の刊行物には、鎖シャッフリング（chain shuffling）による高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の生成(Marks JD, et al., Biotechnology (N Y). 1992 Jul;10(7):779-83)、並びに非常に大きいファージライブラリを構築する戦略として、組合せ感染（combinatorial infection）及びｉｎ  ｖｉｖｏ組換え(Waterhouse P, et al., Nucleic Acids Res. 1993 May 11;21(9):2265-6)が記載されている。したがって、これらの技法は、モノクローナル抗体の単離のための、伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替手段である。
【００６０】
また、例えば、コード配列を相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインで置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号明細書、Morrison SL, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Nov;81(21):6851-5)）、又は非免疫グロブリンポリペプチドに関するコード配列の全部又は一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって、ＤＮＡを修飾してもよい。
【００６１】
典型的には、かかる非免疫グロブリンポリペプチドで、抗体の定常ドメインを置換するか、又は抗体の一抗原結合部位の可変ドメインを置換することによって、第１の抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作成する。
【００６２】
（ｉｉｉ）ヒト化抗体：
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において記載されている。好ましくは、ヒト化抗体には、ヒト以外の供給源に由来する１つ又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入（import）」残基と称されることが多く、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は基本的に、Winter及び共同研究者らの方法((Jones PT, et al., Nature. 1986 May 29-Jun 4;321(6069):522-5; Riechmann L, et al., Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-7; Verhoeyen M, et al., Science. 1988 Mar 25;239(4847):1534-6))に従って、超可変領域配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行なうことができる。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、無傷ヒト可変ドメインよりかなり小さな部分が、ヒト以外の種の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）である。実際には、ヒト化抗体は典型的に、幾つかの超可変領域残基、及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が、齧歯動物抗体中の類似部位に由来する残基で置換されているヒト抗体である。
【００６３】
抗原性を低下させるためには、ヒト化抗体の作製に使用するヒト可変ドメイン（軽鎖及び重鎖の両方）の選択が非常に重要である。いわゆる「最良適合（best-fit）」法によれば、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。次に、齧歯動物の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体に関するヒトフレームワーク領域（ＦＲ）とする（Sims MJ, et al., J Immunol. 1993 Aug 15;151(4):2296-308; Chothia C & Lesk AM. J Mol Biol. 1987 Aug 20;196(4):901-17)。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体の共通配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。幾つかの異なるヒト化抗体に同じフレームワークを使用してもよい（Carter P, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 May 15;89(10):4285-9; Presta LG, et al., J Immunol. 1993 Sep 1;151(5):2623-32)。
【００６４】
ヒト化される抗体は、抗原に対する高い親和性、及び他の好適な生物学的特性を保持していることがさらに重要である。この目標を達成するには、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親配列及び様々な概念的ヒト化生成物を、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いて分析するプロセスによって調製され得る。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の、考え得る三次元立体配座構造を図解及び表示するコンピュータープログラムが入手可能である。これらの表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する増大した親和性等の所望の抗体特徴が達成されるように、受容（recipient）配列及び移入配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は抗原結合の影響に直接的且つ最も実質的に関与する。
【００６５】
（ｉｖ）ヒト抗体：
ヒト化の代替手段として、ヒト抗体を作り出すことができる。例えば、免疫化の際に内因性免疫グロブリンを産生することなく、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製することが可能である。例えば、キメラマウス及び生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。かかる生殖系列突然変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移動は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を引き起こす。例えば、Jakobovits A, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Mar 15;90(6):2551-5、 Nature. 1993 Mar 18;362(6417):255-8、 Br?ggemann M, et al., Year Immunol. 1993;7:33-40;並びに米国特許第５,５９１，６６９号明細書、同第５，５８９，３６９号明細書、及び同第５，５４５，８０７号明細書を参照されたい。
【００６６】
代替的には、ファージディスプレイ法（McCafferty J, et al., Nature. 1990 Dec 6;348(6301):552-4）を使用して、非免疫化ドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト抗体及び抗体断片を生成することができる。この技法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３又はｆｄ等の糸状バクテリオファージの主要又は微量コートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として提示される。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能的特性に基づく選択は、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択ももたらす。したがって、ファージはＢ細胞の特性の幾つかを模倣する。ファージディスプレイは多様な形式で行なうことができるが、それらの概説については、例えば、Johnson KS & Chiswell DJ. Curr Opin Struct Biol. 1993 ;3:564-71を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントの幾つかの供給源をファージディスプレイに使用することができる。
【００６７】
Clackson T, et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8は、免疫化したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小ランダムコンビナトリアルライブラリから抗オキサゾロン抗体の種々のアレイを単離した。Marks JD, et al., J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97、又はGriffiths AD, et al., EMBO J. 1993 Feb;12(2):725-34.によって記載される技法に基本的に従って、非免疫化ヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築し、抗原（自己抗原を含む）の種々のアレイに対する抗体を単離することができる。また、米国特許第５，５６５，３３２号明細書及び同第５，５７３，９０５号明細書を参照されたい。
【００６８】
ヒト抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって作り出してもよい（米国特許第２０５，５６７，６１０号明細書及び同第５，２２９，２７５号明細書を参照）。ＳＣＩＤマウスを用いてヒト抗体を作り出す好ましい手段は、共有の（commonly-owned）同時係属中の出願に開示されている。
【００６９】
（ｖ）抗体断片：
抗体断片の生成について、様々な技法が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷抗体のタンパク分解によって誘導されていた（例えば、Morimoto K & Inouye K.J Biochem Biophys Methods. 1992 Mar; 24（1-2）: 107-17、Brennan M et al., Science. 1985 Jul 5; 229（4708） 81-3を参照されたい）。しかしながら、現在では、これらの断片は組換え宿主細胞によって直接生成することができる。例えば、上述の抗体ファージライブラリから抗体断片を単離することができる。代替的には、Ｆａｂ'−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的カップリングを行なってＦ（ａｂ'）２断片を形成することもできる（Carter P et al., Biotechnology（NY）. 1992 Feb; 10（2）: 163-7）。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ'）２断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片を生成するための他の技法は、当業者には明らかである。他の実施形態において、好適な抗体は一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号パンフレット、米国特許第５，５７１，８９４号明細書、及び米国特許第５，５８７，４５８号明細書を参照されたい。抗体断片はまた、例えば米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されるような「線状抗体」であってもよい。かかる線状抗体断片は単一特異的であっても、又は二重特異的であってもよい。
【００７０】
（ｖｉ）非抗体結合タンパク質：
「非抗体結合タンパク質」又は「非抗体リガンド」又は「抗原結合タンパク質」という用語は下記でより詳細に論じられる、アドネクチン、アビマー、一本鎖ポリペプチド結合分子、及び抗体様結合ペプチド模倣薬を含む非免疫グロブリンタンパク質足場を使用する抗体模倣体を互換可能に指す。
【００７１】
抗体と同様に標的化し、標的に結合する他の化合物も開発されている。これらの「抗体模倣体」の一部は、非免疫グロブリンタンパク質骨格をタンパク質フレームワークの代替として抗体の可変領域に使用する。
【００７２】
例えば、Ladner et al.（米国特許第５，２６０，２０３号明細書）には、凝集しているが分子的には分離した、抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域と同様の結合特異性を有する一本鎖ポリペプチド結合分子が記載されている。該一本鎖結合分子は、ペプチドリンカーにより連結した抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方の抗原結合部位を含有し、２つのペプチド抗体と同様の構造に折り畳まれる。一本鎖結合分子は、サイズがより小さい、安定性がより大きい、及びより容易に修飾される等、従来の抗体に優る幾つかの利点を示す。
【００７３】
Ku et al. (Proc Natl Acad Sci USA 92(14):6552-6556 (1995))は、シトクロムｂ５６２に基づく抗体の代替手段を記載している。Ku et al. (1995)は、シトクロムｂ５６２のループの２つを無作為化し、ウシ血清アルブミンに対する結合に関して選択したライブラリを作り出した。個々の突然変異体は、抗ＢＳＡ抗体と同様に選択的にＢＳＡに結合することが見出された。
【００７４】
Lipovsek et al.（米国特許第６，８１８，４１８号明細書及び同第７，１１５，３９６号明細書）は、フィブロネクチン又はフィブロネクチン様タンパク質骨格、及び少なくとも１つの可変ループを特徴とする抗体模倣体を記載している。アドネクチンとして知られるこれらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、任意の標的リガンドに関する高い親和性及び特異性を含む、自然抗体又は改変抗体と同じ特徴の多くを示す。新たな又は改善された結合タンパク質を発展させる任意の技法を、これらの抗体模倣体と共に使用することができる。
【００７５】
これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造は、ＩｇＧ重鎖の可変領域の構造と同様である。したがって、これらの模倣体は、天然抗体と本質的に同様の抗原結合特性及び親和性を示す。さらに、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、抗体及び抗体断片に優る或る特定の利点を示す。例えば、これらの抗体模倣体は固有の折り畳み安定性に関してジスルフィド結合に依存せず、したがって、通常は抗体を分解する可能性のある条件下で安定である。また、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造は、ＩｇＧ重鎖の構造と同様であるため、ループの無作為化及びシャフリングのプロセスは、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ親和性成熟のプロセスと同様、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで採用することができる。
【００７６】
Beste et al.（Proc Natl Acad Sci USA 96(5): 1898-1903 (1999)）は、リポカリン骨格（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標））に基づく抗体模倣体を記載している。リポカリンは、タンパク質末端に４つの超可変ループを有するβバレルから成る。Beste（1999）は、該ループにランダム突然変異誘発を行ない、例えばフルオレセインとの結合に関して選択した。３つの変異体がフルオレセインと特異的な結合を示し、１つの変異体が抗フルオレセイン抗体と同様の結合を示した。さらなる分析によって、無作為化位置が全て可変であることが明らかとなったが、これはＡｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）が抗体の代替手段としての使用に適切であり得ることを意味する。
【００７７】
Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）は、典型的には１６０残基〜１８０残基の小さな一本鎖ペプチドであり、生産コストの減少、貯蔵安定性の増大、及び免疫反応の減少を含む、抗体に優る幾つかの利点を提供する。
【００７８】
Hamilton et al.（米国特許第５，７７０，３８０号明細書）は、結合部位として使用される複数の可変ペプチドループが付着した、カリックスアレーンの強固な非ペプチド有機骨格を使用した合成抗体模倣体を記載している。ペプチドループは全て、互いにカリックスアレーンの幾何学的に同じ側から突出する。この幾何学的構造のために、全てのループが結合に利用可能であり、リガンドに対する結合親和性が増加する。しかしながら、他の抗体模倣体と比較して、カリックスアレーンベースの抗体模倣体はペプチドのみから成るものではなく、したがってプロテアーゼ酵素による攻撃を受けにくい。上記骨格も純粋にペプチド、ＤＮＡ、又はＲＮＡから成るものではなく、これはこの抗体模倣体が厳しい環境条件において比較的安定であり、寿命が長いことを意味する。さらに、カリックスアレーンベースの抗体模倣体は比較的小さいため、免疫原性反応をもたらす可能性は低い。
【００７９】
Murali et al.（Cell Mol Biol. 49(2): 209-216 (2003)）は、抗体をより小さいペプチド模倣体にする方法論を記載している。該ペプチド模倣体は「抗体様結合ペプチド模倣体」（ＡＢｉＰ）と称され、これも抗体に対する代替手段として有用であり得る。
【００８０】
Silverman et al.（Nat Biotechnol. (2005), 23: 1556-1561）は、「アビマー」と称される複数のドメインを含む一本鎖ポリペプチドである融合タンパク質を記載している。アビマーは、ヒト細胞外受容体ドメインからｉｎ  ｖｉｔｒｏエキソンシャフリング及びファージディスプレイにより開発されたため、様々な標的分子に対する親和性及び特異性において抗体と幾らか類似した結合タンパク質群である。得られた多ドメインタンパク質は、単一エピトープ結合タンパク質と比較して改善された親和性（場合によってはｎＭ以下の）及び特異性を示し得る、複数の独立した結合ドメインを含み得る。アビマーを構築及び使用する方法に関するさらなる詳細は、例えば米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号明細書、同第２００５００４８５１２号明細書、同第２００５００５３９７３号明細書、同第２００５００８９９３２号明細書、及び同第２００５０２２１３８４号明細書に開示されている。
【００８１】
非免疫グロブリンタンパク質フレームワークに加えて、抗体特性はまた、ＲＮＡ分子及び非天然オリゴマー（例えばプロテアーゼ阻害剤、ベンゾジアゼピン、プリン誘導体、及びβターン模倣体）（全て本発明による使用に適切である）を含むがこれらに限定されない化合物において模倣されてきた。
【００８２】
（ｖｉｉ）ＮＰＴＸ１活性を中和する抗体
本発明の抗ＮＰＴＸ１抗体に関する「中和」という用語、又は「ＮＰＴＸ１活性を中和する抗体」という表現は、ＮＰＴＸ１と結合又は接触することによって、ＮＰＴＸ１による細胞増殖活性の阻害をもたらす抗体を指すように意図される。ＮＰＴＸ１は細胞外へ分泌され、肺癌細胞の増殖に不可欠な因子として機能するため、幾つかの抗ＮＰＴＸ１抗体はこの活性を中和し得る。
【００８３】
（ｖｉｉｉ）抗体又は抗体断片の選択
上述の方法により調製される抗体又は抗体断片は、癌細胞のようなＥＦ−１δのＣＤＫＮ３結合領域（７２ａａ〜１６０ａａの位置）を発現する細胞の親和性を検出することにより選択され得る。これらの細胞への非特異的な結合を、３％ＢＳＡを含有するＰＢＳで、室温で３０分間処理することによりブロッキングする。細胞を候補抗体又は抗体断片と共に室温で６０分間インキュベートする。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＦＩＴＣ標識二次抗体により６０分間室温で染色し、蛍光光度計を用いることにより検出する。代替的には、本発明では、表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサーを、抗体又は抗体断片を検出又は定量化する手段として使用してもよい。細胞表面上のＥＦ−１δのＣＤＫＮ３結合領域（７２ａａ〜１６０ａａの位置）を検出することのできる抗体又は抗体断片が、本発明において選択される。
【００８４】
ＮＰＴＸ１に特異的なウサギポリクローナル抗体（ｐＡｂ）（ＢＢ０１７）を、ウサギをＧＳＴ融合ヒトＮＰＴＸ１タンパク質（コドン２０〜１４５：配列番号８８及びコドン２９７〜４３０：配列番号８９）で免疫化することにより産生させ、標準プロトコルを用いて精製した。また、ヒトＮＰＴＸ１に特異的なマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ｍＡｂ−７５−１）を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（Chowdhury）を遺伝子銃を用いてヒトＮＰＴＸ１タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡで皮内免疫化することにより作出した。ＮＰＴＸ１のｍＡｂを、細胞培養上清からアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。ＮＰＴＸ１のｍＡｂは、ＮＰＴＸ１を内因的に発現するか、又は発現しない肺癌細胞株の可溶化物を用いたウエスタンブロット分析により、ヒトＮＰＴＸ１に特異的であることが証明された。
【００８５】
（iｘ）医薬製剤
本発明に従って使用される抗体の治療製剤は、貯蔵のために、所望の純度を有する抗体を任意で薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製され得る。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、採用する用量及び濃度でレシピエントに対して毒性がなく、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール、若しくはベンジルアルコール；メチルパラベン若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００８６】
皮下投与に適した凍結乾燥製剤は、国際公開第９７／０４８０１号パンフレットに記載される。かかる凍結乾燥製剤を適切な希釈剤で高タンパク質濃度に再構成し、再構成した製剤を本明細書において治療される哺乳類に皮下投与してもよい。
【００８７】
本明細書における製剤はまた、処理される特定の兆候に対し必要に応じて２つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない、相補的活性を有する活性化合物を含有し得る。例えば、化学療法剤、サイトカイン、又は免疫抑制剤をさらに提供するのが望ましいこともある。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患又は障害又は治療のタイプ、及び上述の他の因子に依存する。これらは一般に、以上で使用したものと同じ用量及び投与経路、又はこれまで採用されてきた用量の約１％〜９９％で使用される。
【００８８】
活性成分はまた、コロイド状薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）又はマクロエマルション中の、例えばコアセルベーション技法又は界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンのマイクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入してもよい。かかる技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【００８９】
持続放出調製品を調製してもよい。適切な持続放出調製品の例としては、薬剤を含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリクス（このマトリクスは造形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である）が挙げられる。持続放出マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸エチルとの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル共重合体、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドから成る注射可能なミクロスフェア）等の分解性乳酸−グリコール酸共重合体、及びポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用する製剤は滅菌されてなくてはならない。これは滅菌ろ過膜を介したろ過により容易に達成される。
【００９０】
（ｘ）抗体を用いた治療
本発明の抗体を含む組成物は、適正な医療行為に沿った形で調合、投薬、及び投与され得る。好ましくは、本発明の抗体はヒト、キメラ若しくはヒト化抗体ｓｃＦｖ、又は抗体断片である。これに関して検討される因子には、治療される特定の肺癌、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、疾患又は障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリング、及び医師に既知の他の因子が含まれる。投与される抗体の治療的に有効な量は、かかる検討に左右される。
【００９１】
一般的な提案として、非経口的に投与される抗体の治療的に有効な量は、１回の投与につき、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ（患者体重）の範囲であり、使用される抗体の典型的な初期範囲は約２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【００９２】
しかしながら、上述したように、これらの提案された抗体量は治療に大いに委ねられる。適当な投与量及びスケジューリングの選択において主要な因子は、前述したように、得られた結果である。
【００９３】
例えば、進行中及び急性の疾患の治療に関しては、初期に比較的高い投与量が必要とされ得る。最も効果的な結果を得るために、抗体は疾患又は障害に応じて、疾患又は障害の最初の兆候、診断、出現、又は発生に可能な限り近く、又は疾患又は障害の寛解の間に投与され得る。
【００９４】
抗体は非経口的投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、及び鼻腔内投与、並びに局所免疫抑制治療が所望される場合には、病巣内投与を含む任意の適切な手段により投与され得る。非経口注入には筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。
【００９５】
また、抗体はパルス注入により、例えば抗体の投与量を減少させて適切に投与され得る。好ましくは、投薬は、投与が短期であるか又は長期であるかに一部依存するが、注射、最も好ましくは静脈内又は皮下注射により行なわれる。
【００９６】
さらに、細胞毒性物質、化学療法剤、免疫抑制剤、及び／又はサイトカイン等の他の化合物を、本明細書における抗体とともに投与してもよい。併用投与には、別個の製剤又は単一の医薬製剤を用いた同時投与、及びいずれかの順序での連続投与が含まれるが、この場合、両方の（又は全ての）活性薬剤が同時にそれらの生物活性を発揮する期間があるのが好ましい。
【００９７】
患者への抗体の投与とは別に、本発明は遺伝子治療による抗体の投与を考慮する。かかる抗体をコードする核酸の投与は、「治療的に有効な量の抗体を投与する」という表現に包含される。例えば、細胞内抗体を作出する遺伝子治療の使用に関する、１９９６年３月１４日付で公開された国際公開第９６／０７３２１号パンフレットを参照されたい。
【００９８】
核酸（任意でベクター中に含有される）を患者の細胞に入れるには、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏでの２つの主要なアプローチがある。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達については、核酸は患者に、通常は抗体が必要とされる部位に直接注射する。ｅｘ  ｖｉｖｏ治療については、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離細胞に導入し、その修飾細胞を患者に直接、又は例えば患者に移植される多孔質膜に封入して投与する（例えば米国特許第４，８９２，５３８号明細書及び同第５，２８３，１８７号明細書を参照）。核酸を生細胞に導入するには、利用可能な多様な技法がある。技法は、核酸を目的とする宿主の細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれで培養細胞に移動させるかに応じて異なる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの哺乳類細胞への核酸の移動に適切な技法には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、顕微注射、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法等が含まれる。遺伝子のｅｘ  ｖｉｖｏ送達に関して一般に使用されるベクターは、レトロウイルスである。
【００９９】
現在のところ好ましいｉｎ  ｖｉｖｏ核酸移動技法としては、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、又はアデノ随伴ウイルス等）を用いたトランスフェクション、及び脂質ベースのシステム（遺伝子の脂質媒介移動に有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌである）が挙げられる。場合によっては、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上の受容体に対するリガンド等の標的細胞を標的とする薬剤により、核酸供給源を提供するのが望ましい。リポソームを採用する場合、エンドサイトーシスと関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、例えば特定の細胞型に指向性のあるカプシドタンパク質又はその断片、循環中にインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、及び細胞内局在化を標的とし、細胞内半減期を増強するタンパク質の標的化及び／又は取り込みを容易にするために使用され得る。受容体媒介エンドサイトーシス技法は、例えば、Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)及びWagner et al, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990)により記載されている。現在知られている遺伝子マーキング及び遺伝子治療のプロトコルの概説に関しては、Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992)を参照されたい。また、国際公開第９３／２５６７３号パンフレット、及びその中に引用される参考文献も参照されたい。
【０１００】
二本鎖分子
本明細書で使用されるように、「単離二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子（例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、例えば二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））及び低分子干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ、例えばＤＮＡとＲＮＡとの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）又はＤＮＡとＲＮＡとの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む）の発現を阻害する核酸分子を表す。
【０１０１】
本明細書で使用されるように、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぐ二本鎖ＲＮＡ分子を表す。ｓｉＲＮＡを細胞に導入する標準的な技法（ＤＮＡが、ＲＮＡが転写される鋳型であるものを含む）を用いる。ｓｉＲＮＡとしては、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、もしくはＥＦ−１δ遺伝子のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、もしくはＥＦ−１δ遺伝子のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）、又はその両方が挙げられる。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＲＮＡを構築することができる。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡ又はｓｈＲＮＡのいずれかであり得る。
【０１０２】
本明細書で使用されるように、「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに相補配列を含み、且つ二本鎖ＲＮＡ分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、２つのＲＮＡ分子の構築物を表す。２つの鎖の配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」又は「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子も含み得る。
【０１０３】
本明細書で使用されるように、「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに相補的である、第１の領域及び第２の領域、即ちセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む、ステム−ループ構造を有するｓｉＲＮＡを表す。領域の相補性及び配向性の程度は、塩基の対合が領域間で起こるのに十分であり、第１の領域及び第２の領域がループ領域によって連結し、そのループは、ループ領域内のヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠失によって生じる。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間にある一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【０１０４】
本明細書で使用されるように、「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡとＤＮＡとから成る二本鎖ポリヌクレオチド分子を表し、ＲＮＡ及びＤＮＡのハイブリッド及びキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぐ。本明細書中で、ハイブリッドは、ＤＮＡから成るポリヌクレオチドとＲＮＡから成るポリヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する分子を示し、キメラは、二本鎖分子を含む鎖の一方又は両方がＲＮＡ及びＤＮＡを含有し得ることを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技法が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡとしては、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、もしくはＥＦ−１δ遺伝子のセンス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、もしくはＥＦ−１δ遺伝子のアンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）又はその両方が挙げられる。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを構築することができる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ又はｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれかであり得る。
【０１０５】
本明細書で使用されるように、「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補配列を含み、且つ二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、２つの分子の構築物を表す。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」又は「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の１つ又は両方が、ＲＮＡとＤＮＡとの両方から成るか（キメラ分子）、又は代替的に分子の１つがＲＮＡから成り、もう一方がＤＮＡから成る（ハイブリッド二本鎖）。
【０１０６】
本明細書で使用されるように、「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的である、第１の領域及び第２の領域、即ちセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む、ステム−ループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを表す。領域の相補性及び配向性の程度は、塩基の対合が領域間で起こるのに十分であり、第１の領域及び第２の領域がループ領域によって連結し、そのループは、ループ領域内のヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）間の塩基対合の欠失によって生じる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間にある一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
【０１０７】
本明細書中で使用される場合、「単離核酸」は、その元の環境（例えば、天然の場合は自然環境）から取り出した核酸、したがって、その自然状態から合成的に変化させた核酸である。本発明においては、単離核酸の例としてはＤＮＡ、ＲＮＡ、及びその誘導体が挙げられる。
【０１０８】
標的ｍＲＮＡとハイブリダイズするＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲに対する二本鎖分子は、遺伝子の通常は一本鎖のｍＲＮＡ転写産物と結合し、それにより翻訳を妨げ、したがってタンパク質の発現を阻害することによりＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子によりコードされるＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲタンパク質の産生を低減又は阻害する。本明細書中で実証されるように、肺癌細胞株におけるＥＢＩ３の発現がｄｓＲＮＡにより阻害され（図４Ｄ）、肺癌細胞株におけるＣＤＫＮ３の発現がｄｓＲＮＡにより阻害され（図２２Ａ）、肺癌細胞株におけるＮＰＴＸＲの発現がｄｓＲＮＡにより阻害され（図１３Ｄ）、肺癌細胞株におけるＥＦ−１δの発現がｄｓＲＮＡにより阻害された（図２２Ｂ）。
【０１０９】
したがって、本発明はＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δ遺伝子を発現する細胞に導入した場合に、該遺伝子の発現を阻害することが可能な単離二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、下記で述べるようなｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムにより設計され得る。
例えば、
配列番号１８（配列番号１の６７９ｎｔ〜６９７ｎｔの位置）、
配列番号２０（配列番号１の２８０ｎｔ〜２９８ｎｔの位置）のヌクレオチドを含むＥＢＩ３標的配列、
例えば、
配列番号４９（配列番号５の３１０ｎｔ〜３２８ｎｔの位置）のヌクレオチドを含むＣＤＫＮ３標的配列、
例えば、
配列番号５１（配列番号７の２２５ｎｔ〜２４３ｎｔの位置）のヌクレオチドを含むＥＦ−１δ標的配列、
例えば、
配列番号８４（配列番号８６の１２８０ｎｔ〜１２９８ｎｔの位置）
配列番号８５（配列番号８６の１３９３ｎｔ〜１４１１ｎｔの位置）のヌクレオチドを含むＮＰＴＸＲ標的配列。
【０１１０】
具体的には、本発明は以下の二本鎖分子［１］〜［２０］を提供する：
［１］細胞に導入した場合にＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲのｉｎ  ｖｉｖｏ発現、及び細胞増殖を阻害する、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖から成る単離二本鎖分子。
［２］配列番号１８（配列番号１の６７９ｎｔ〜６９７ｎｔの位置）、配列番号２０（配列番号１の２８０ｎｔ〜２９８ｎｔの位置）、配列番号４９（配列番号５の３１０ｎｔ〜３２８ｎｔの位置）、配列番号５１（配列番号７の２２５ｎｔ〜２４３ｎｔの位置）、配列番号８４（配列番号８６の１２８０ｎｔ〜１２９８ｎｔの位置）、及び配列番号８５（配列番号８６の１３９３ｎｔ〜１４１１ｎｔの位置）の中から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡに作用する、［１］に記載の二本鎖分子、
［３］センス鎖が配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有する、［２］に記載の二本鎖分子
［４］約１００ヌクレオチド未満の長さを有する、［３］に記載の二本鎖分子。
［５］約７５ヌクレオチド未満の長さを有する、［４］に記載の二本鎖分子。
［６］約５０ヌクレオチド未満の長さを有する、［５］に記載の二本鎖分子。
［７］約２５ヌクレオチド未満の長さを有する、［６］に記載の二本鎖分子。
［８］約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの間の長さを有する、［７］に記載の二本鎖分子。
［９］介在一本鎖によって連結したセンス鎖とアンチセンス鎖との両方を有する単一ポリヌクレオチドから成る、［３］に記載の二本鎖分子。
［１０］一般式：５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'（式中、［Ａ］は配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有するセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、［Ａ'］は［Ａ］と相補的な配列を含有するアンチセンス鎖である）を有する、［９］に記載の二本鎖分子、
［１１］ＲＮＡから成る、［１］に記載の二本鎖分子。
［１２］ＤＮＡとＲＮＡとの両方から成る、［１］に記載の二本鎖分子。
［１３］ＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１２］に記載の二本鎖分子。
［１４］センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれＤＮＡ及びＲＮＡから成る、［１３］に記載の二本鎖分子。
［１５］ＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１２］に記載の二本鎖分子。
［１６］アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、又はセンス鎖の５'末端に隣接する領域及びアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域の両方がＲＮＡである、［１５］に記載の二本鎖分子、
［１７］隣接領域が９個〜１３個のヌクレオチドから成る、［１６］に記載の二本鎖分子、
［１８］３'オーバーハングを含有する、［２］に記載の二本鎖分子、
［１９］［２］に記載の二本鎖分子を発現するベクター、
［２０］一般式：５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'（式中、［Ａ］は配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、［Ａ'］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である）を有する、［１９］に記載のベクター。
【０１１１】
本発明の二本鎖分子は以下でより詳細に説明される。
【０１１２】
細胞において標的遺伝子発現を阻害する能力がある二本鎖分子を設計する方法が知られている（例えば米国特許第６，５０６，５５９号明細書（その全体が本明細書中で参照により援用される）を参照されたい）。例えば、ｓｉＲＮＡを設計するコンピュータプログラムは、Ambionのウェブサイトから入手可能である（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）。
【０１１３】
コンピュータプログラムは、以下のプロトコルに基づき、二本鎖分子に対する標的ヌクレオチド配列を選択する。
【０１１４】
標的部位の選択
１．  転写産物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として、それぞれのＡＡの存在と、その３'側に隣接した１９個のヌクレオチドとを記録する。Tuschl et al.は、５'非翻訳領域及び３'非翻訳領域（ＵＴＲ）と開始コドン近くの領域（７５塩基以内）に対してｓｉＲＮＡを設計することを避けることを推奨している。これらの領域は調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、ＵＴＲ結合タンパク質及び／又は翻訳開始複合体が、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
２．  潜在的な標的部位と、適当なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）とを比較し、他のコード配列との相同性が大きい任意の標的配列を考慮から外す。基本的に、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/でのＮＣＢＩサーバーにあるＢＬＡＳＴを用いる（Altschul SF, et al., Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25（17）:3389-402）。
３．  合成のために条件を満たす標的配列を選択する。遺伝子の長さに従って評価する標的配列を幾つか選択するのが一般的である。
【０１１５】
上記のプロトコルによって、本発明の単離二本鎖分子の標的配列は、以下のように設計された。
ＥＢＩ３遺伝子に対する配列番号１８及び配列番号２０、
ＣＤＫＮ３遺伝子に対する配列番号４９及び配列番号５０、
ＥＦ−１δ遺伝子に対する配列番号５１及び配列番号５２、又は
ＮＰＴＸＲ遺伝子に対する配列番号８４及び配列番号８５。
【０１１６】
上述の標的配列を標的とする二本鎖分子をそれぞれ、標的遺伝子を発現する細胞の成長を抑制する能力について検査した。したがって、本発明は以下の群から選択される配列のいずれかを標的とする二本鎖分子を提供する：
ＥＢＩ３遺伝子に対する配列番号１８（配列番号１の６７９ｎｔ〜６９７ｎｔの位置）又は配列番号２０（配列番号１の２８０ｎｔ〜２９８ｎｔの位置）、
ＣＤＫＮ３遺伝子に対する配列番号４９（配列番号５の３１０ｎｔ〜３２８ｎｔの位置）、
ＥＦ−１δ遺伝子に対する配列番号５１（配列番号７の２２５ｎｔ〜２４３ｎｔの位置）、及び
配列番号８４（配列番号８６の１２８０ｎｔ〜１２９８ｎｔの位置）又は配列番号８５（配列番号８６の１３９３ｎｔ〜１４１１ｎｔの位置）。
【０１１７】
本発明の二本鎖分子は単一の標的ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ若しくはＮＰＴＸＲ遺伝子配列を対象としてもよく、又は複数の標的ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ及び／又はＮＰＴＸＲ遺伝子配列を対象としてもよい。
【０１１８】
上述のＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ及び／又はＮＰＴＸＲ遺伝子の標的配列を標的とする本発明の二本鎖分子は、標的配列の核酸配列及び／又は標的配列に相補的な配列のいずれかを含有する単離ポリヌクレオチドを含む。ＥＢＩ３遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例としては、配列番号１８若しくは配列番号２０の配列、及び／又はこれらのヌクレオチドに相補的な配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられ、ＣＤＫＮ３遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例としては、配列番号４９の配列、及び／又はこれらのヌクレオチドに相補的な配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられ、ＥＦ−１δ遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例としては、配列番号５１の配列、及び／又はこれらのヌクレオチドに相補的な配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられ、ＮＰＴＸＲ遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例としては、配列番号８４若しくは配列番号８５の配列、及び／又はこれらのヌクレオチドに相補的な配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。しかしながら、本発明はこれらの例に限定されず、上述の核酸配列における小さな修飾は、修飾された分子がＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子の発現を抑制する能力を保持する限りは許容可能である。ここで、「小さな修飾」という表現は、核酸配列と関連して使用される場合、配列への核酸の１つ、２つ又は幾つかの置換、欠失、付加、又は挿入を示す。
【０１１９】
本発明に関して、「幾つか」という用語は、核酸の置換、欠失、付加、及び／又は挿入に適用する場合、平均３個〜７個、好ましくは３個〜５個、より好ましくは３個〜４個、さらにより好ましくは３個の核酸残基を意味し得る。
【０１２０】
本発明によると、本発明の二本鎖分子は、実施例において利用される方法を用いて、その能力について試験することができる。以下の実施例においては、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子のｍＲＮＡの様々な部分のセンス鎖、又はそれに相補的なアンチセンス鎖から成る二本鎖分子が、標準方法に従って（例えば、ＥＢＩ３に対してＡ５４９、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δに対してＬＣ３１９を用いて）、肺癌細胞株におけるＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子産物の産生を低減するそれらの能力についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験される。さらに、例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞と比較した場合の、候補二本鎖分子と接触させた細胞におけるＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子産物の減少は、例えば実施例１、実施例１１、及び実施例１８の「半定量的ＲＴ−ＰＣＲ」という項目で述べるＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲのｍＲＮＡに対するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより検出することができる。次に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏセルベースアッセイ（cell-based assays）においてＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子産物の産生を低減する配列を、細胞成長に対するそれらの阻害効果について試験することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏセルベースアッセイにおいて細胞成長を阻害する配列を次に、癌の動物、例えばヌードマウス異種移植モデルを用いて、それらのｉｎ  ｖｉｖｏ能力について試験し、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ産物の産生の低下、及び癌細胞成長の低下を確認することができる。
【０１２１】
単離ポリヌクレオチドがＲＮＡ又はそれらの誘導体である場合、ヌクレオチド配列において塩基「ｔ」は「ｕ」に置き換えるものとする。本明細書で使用されるように、「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチドユニット間のワトソンクリック型又はフーグスティーン型の塩基対合を表し、「結合」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の物理的な又は化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが修飾ヌクレオチド及び／又は非ホスホジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドは同じように互いに結合することもできる。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件化でハイブリダイズして、ほとんど又は全くミスマッチを含有しない安定二本鎖を形成する。さらに、本発明の単離ポリヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子又はヘアピンループ構造を形成することができる。一実施形態において、このような二本鎖は１０個のマッチ毎にわずか１個のマッチしか含有していない。幾つかの実施形態では、二本鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二本鎖はミスマッチを含有しない。
【０１２２】
ポリヌクレオチドはＥＢI３では１１４９ヌクレオチド長未満、ＣＤＫＮ３では８４４ヌクレオチド長未満、ＥＦ−１δでは１０３１ヌクレオチド長未満、及びＮＰＴＸＲでは５８１５ヌクレオチド長未満が好ましい。例えば、ポリヌクレオチドは、全ての遺伝子では５００ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、又は２５ヌクレオチド長未満である。本発明の単離ポリヌクレオチドは、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子に対する二本鎖分子を形成するのに、或いは二本鎖分子をコードする鋳型ＤＮＡを調製するのに有用である。ポリヌクレオチドが二本鎖分子を形成するのに使用される場合、ポリヌクレオチドは１９ヌクレオチドより長く、例えば２１ヌクレオチドより長く、例えば約１９ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドであり得る。
【０１２３】
本発明の二本鎖分子は、１つ又は複数の修飾ヌクレオチド及び／又は非ホスホジエステル結合を含有し得る。当該技術分野に既知の化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性及び／又は細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に取り込むことができる他の種類の化学修飾にも気づくであろう（国際公開第０３／０７０７４４号パンフレット、国際公開第２００５／０４５０３７号パンフレット）。一実施形態では、分解耐性の改善又は取り込みの改善を与えるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例としては、ホスホロチオエート結合、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上で）、２'−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２'−デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基（universal base）」ヌクレオチド、５'−Ｃ−メチルヌクレオチド、及び逆デオキシ塩基残基取り込み（米国特許出願第２００６０１２２１３７号明細書）が挙げられる。
【０１２４】
別の実施形態では、二本鎖分子の安定性を向上させるために、又は標的化の効率を増大させるために修飾を用いることができる。修飾としては、二本鎖分子の２つの相補鎖間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の３'末端又は５'末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾及び／又は骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチド及び２'−デオキシリボヌクレオチドが挙げられる（国際公開第２００４／０２９２１２号パンフレット）。別の実施形態において、標的ｍＲＮＡにおける、及び／又は相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性の増減に修飾を用いることができる（国際公開第２００５／０４４９７６号パンフレット）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、又は５−プロピルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを７−デザプリン、７−アルキルプリン、又は７−アルケニルプリンに置換することができる。別の実施形態では、二本鎖分子が３'オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３'末端のヌクレオチドが突き出た（overhanging）ヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに置き換えることができる（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15（2）: 188-200）。さらに詳細には、公開文献、例えば米国特許出願第２００６０２３４９７０号明細書が利用可能である。本発明は、これらの例には限定されず、得られた分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持していれば、任意の既知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に利用することができる。
【０１２５】
さらに、本発明の二本鎖分子はＤＮＡとＲＮＡとの両方、例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ又はｓｈＤ／Ｒ−ＮＡを含み得る。特に、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドポリヌクレオチド又はＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは安定性の増大を示す。ＤＮＡとＲＮＡとの混合物、即ちＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とから成るハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖（ポリヌクレオチド）の一方又は両方上でＤＮＡとＲＮＡとの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成することができる。
【０１２６】
ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドは、遺伝子を発現する細胞に導入する際、標的遺伝子の発現を阻害する活性があれば、センス鎖がＤＮＡであり、アンチセンス鎖がＲＮＡであるか、又はその反対のいずれかであってもよい。好ましくは、センス鎖ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドがＲＮＡである。また、キメラ型二本鎖分子は、遺伝子を発現する細胞に導入した場合に分子が標的遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方がＤＮＡ及びＲＮＡから成っていても、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖のいずれか１つがＤＮＡ及びＲＮＡから成っていてもよい。二本鎖分子の安定性を高めるために、分子は可能な限り多くのＤＮＡを含有するのが好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するために、分子は発現の十分な阻害を誘導する範囲のＲＮＡである必要がある。
【０１２７】
キメラ型二本鎖分子の好ましい例としては、二本鎖分子の上流部分領域（すなわち、センス鎖又はアンチセンス鎖内の標的配列又はその相補的な配列に隣接する領域）がＲＮＡである。好ましくは、上流部分領域とはセンス鎖の５'側（５'末端）及びアンチセンス鎖の３'側（３'末端）を指す。代替的には、センス鎖の５'末端及び／又はアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域が上流部分領域と称される。すなわち、好ましい実施形態では、アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、又はセンス鎖の５'末端に隣接する領域及びアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域の両方がＲＮＡから成る。例えば、本発明のキメラ型又はハイブリッド型二本鎖分子は、以下の組み合わせを含む：
センス鎖：５'−［ＤＮＡ］−３'
３'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ]−５'：アンチセンス鎖、
センス鎖：５'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３'
３'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５'：アンチセンス鎖、及び
センス鎖：５'−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３'
３'−（ＲＮＡ）−５'：アンチセンス鎖。
【０１２８】
上流部分領域は、二本鎖分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖内に、標的配列又はこれに対する相補配列の末端から数えて約９個〜１３個のヌクレオチドのドメインであり得る。さらに、かかるキメラ型二本鎖分子の例としては、少なくともポリヌクレオチドの上流半分の領域（センス鎖では５'側領域及びアンチセンス鎖では３'側領域）がＲＮＡであり、もう半分がＤＮＡである１９個〜２１個のヌクレオチド鎖長を有するものが挙げられる。かかるキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合、標的遺伝子の発現阻害効果がかなり高くなる（米国特許出願第２００５０００４０６４号明細書）。
【０１２９】
本発明において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えばショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及びＤＮＡとＲＮＡとから成るショートヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成することができる。ｓｈＲＮＡ又はｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができる急ヘアピンカーブ（tight hairpin turn）を作製する、ＲＮＡの配列又はＲＮＡとＤＮＡとの混合物である。ｓｈＲＮＡ又はｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、一本鎖上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分けられる。一般的に、ヘアピン構造は、細胞機構によってｄｓＲＮＡ又はｄｓＤ／Ｒ−ＮＡに切断され、それからＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列に一致するｍＲＮＡと結合すると共に、これを切断する。
【０１３０】
任意のヌクレオチド配列から成るループ配列は、ヘアピンループ構造を形成するためにセンス配列とアンチセンス配列との間に位置付けることができる。したがって、本発明はまた、一般式：５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'（式中、［Ａ］は標的配列に対応する配列を含有するセンス鎖であり、［Ｂ］は介在一本鎖であり、［Ａ'］は［Ａ］に相補的な配列を含有するアンチセンス鎖である）を有する二本鎖分子を提供する。標的配列は例えば、ＥＢＩ３に対する配列番号１８及び配列番号２０のヌクレオチド、ＣＤＫＮ３に対する配列番号４９のヌクレオチド、ＥＦ−１δに対する配列番号５１のヌクレオチド、又はＮＰＴＸＲに対する配列番号８４及び配列番号８５のヌクレオチドの中から選択され得る。
【０１３１】
本発明はこれらの例には限定されず、［Ａ］における標的配列は、二本鎖分子が標的となるＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子の発現を抑制する能力を保持していれば、これらの例から修飾された配列であってもよい。［Ａ］領域は［Ａ'］領域とハイブリダイズし、［Ｂ］領域から成るループを形成する。介在一本鎖部分［Ｂ］、すなわちループ配列は好ましくは３ヌクレオチド長〜２３ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列から成る群から選択することができる（http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html）。さらに、２３個のヌクレオチドから成るループ配列は活性ｓｉＲＮＡも提供する（Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435-8, Epub 2002 Jun 26）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、又はＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435- 8, Epub 2002 Jun 26；
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100（4）: 1639-44, Epub 2003 Feb 10；及び
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4（6）: 457-67。
【０１３２】
本発明のヘアピンループ構造を有する例示的な二本鎖分子は以下に示される。以下の構造では、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣ及びＵＵＣＡＡＧＡＧＡから成る群から選択することができるが、本発明はこれらに限定されない：
ＣＡＡＵＧＡＧＣＣＵＧＧＧＣＡＡＧＵＡ−［Ｂ］−ＵＡＣＵＵＧＣＣＣＡＧＧＣＵＣＡＵＵＧ（標的配列番号１８）；
ＵＣＡＣＧＧＡＵＧＵＣＣＡＧＣＵＧＵＵ−［Ｂ］−ＡＡＣＡＧＣＵＧＧＡＣＡＵＣＣＧＵＧＡ（標的配列番号２０）；
ＵＡＵＡＧＡＧＵＣＣＣＡＡＡＣＣＵＵＣ−［Ｂ］−ＧＡＡＧＧＵＵＵＧＧＧＡＣＵＣＵＡＵＡ（標的配列番号４９）；
ＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＵＣＵＧＣ−［Ｂ］−ＧＣＡＧＡＣＵＣＵＧＧＵＵＣＵＣＣＡＣ（標的配列番号５１）；
ＧＡＣＡＡＵＧＧＣＵＧＧＣＡＣＣＡＣＡ−［Ｂ］−ＵＧＵＧＧＵＧＣＣＡＧＣＣＡＵＵＧＵＣ（標的配列番号８４）；及び
ＣＡＵＣＡＡＧＣＣＵＣＡＵＧＧＧＡＵＣ−［Ｂ］−ＧＡＵＣＣＣＡＵＧＡＧＧＣＵＵＧＡＵＧ（標的配列番号８５）。
【０１３３】
さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、ヌクレオチド「ｕ」を３'オーバーハングとして標的配列のアンチセンス鎖の３'末端に付加することができる。付加される「ｕ」の数は少なくとも２、概して２〜１０、例えば２〜５である。付加される「ｕ」は二本鎖分子のアンチセンス鎖の３'末端で一本鎖を形成する。
【０１３４】
二本鎖分子を調製する方法は、当該技術分野で既知の化学合成方法のいずれかを利用することができる。化学合成方法に従って、センス鎖及びアンチセンス鎖の一本鎖ポリヌクレオチドを別々に合成した後、二本鎖分子を得るのに適当な方法によって共にアニーリングする。アニーリングに関する一実施形態では、合成一本鎖ポリヌクレオチドは少なくとも約３：７、例えば約４：６、例えば実質的に等モル量（即ち約５：５のモル比）のモル比で混合される。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリング二本鎖ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の通常利用される方法によって精製することができる。精製方法の例としては、アガロースゲル電気泳動を利用するか、又は残存一本鎖ポリヌクレオチドが、例えば適当な酵素による分解によって取り除かれる方法が挙げられる。
【０１３５】
ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲ配列に隣接する調節配列は同一であっても又は異なっていてもよく、このためこれらの発現は別々に又は一時的に又は空間的に調整することができる。二本鎖分子は、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲ遺伝子鋳型を、例えば低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリＩＩＩ転写ユニット又はヒトＨ１  ＲＮＡプロモーターを含有するベクターにクローニングすることによって細胞内で転写することができる。
【０１３６】
本発明の二本鎖分子を含有するベクター
本明細書に記載の二本鎖分子を１つ又は複数含有するベクター、及びかかるベクターを含有する細胞も本発明に包含される。本発明のベクターは好ましくは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする。本明細書中で、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入される場合、ベクターが分子を発現するであろうことを示す。好ましい一実施形態では、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な調節要素を含む。かかる本発明のベクターは、本発明の二本鎖分子を生成するのに、又は癌を治療する活性成分として直接使用することができる。
【０１３７】
本発明のベクターは、例えば調節配列が、両方の鎖を（ＤＮＡ分子の転写によって）発現させる方法でＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲ配列と操作可能に連結するように、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲ配列を発現ベクターにクローニングすることによって生成することができる（Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5）。例えば、ｍＲＮＡに対するアンチセンス鎖であるＲＮＡ分子が第１のプロモーター（例えばクローニングしたＤＮＡの３'末端と隣接するプロモーター配列）によって転写され、ｍＲＮＡに対するセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えばクローニングしたＤＮＡの５'末端に隣接するプロモーター配列）によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがｉｎ  ｖｉｖｏでハイブリダイズし、遺伝子をサイレンシングするために二本鎖分子構築物を生成する。代替的に、二本鎖分子のセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれコードする２つのベクター構築物は、センス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ発現した後で二本鎖分子構築物を形成するために利用する。さらに、クローニング配列は二次構造（例えばヘアピン）を有する構築物、すなわち標的遺伝子のセンス配列と相補的なアンチセンス配列との両方を含有するベクターの単一転写産物をコードすることができる。
【０１３８】
本発明のベクターは、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するためにそのようなものを具備することもできる（例えば相同的な組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第５，５８０，８５９号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書、同第５，８０４，５６６号明細書、同第５，７３９，１１８号明細書、同第５，７３６，５２４号明細書、同第５，６７９，６４７号明細書、及び国際公開第９８／０４７２０号パンフレットを参照されたい。ＤＮＡベースの送達技法の例としては、「ネイキッド（naked：裸）ＤＮＡ」、促進性（ブピバカイン（bupivicaine）、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、及び粒子媒介性（「遺伝子銃」）又は圧力媒介性の送達が挙げられる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号明細書を参照されたい）。
【０１３９】
本発明のベクターは例えば、ウイルス又は細菌ベクターであり得る。発現ベクターの例としては、弱毒化ウイルス宿主、例えば牛痘又は鶏痘が挙げられる（例えば米国特許第４，７２２，８４８号明細書を参照されたい）。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしての牛痘ウイルスの使用を含む。標的遺伝子を発現する細胞に導入する際、組換え牛痘ウイルスが分子を発現し、それにより細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例としてはカルメット・ゲラン桿菌（Bacille Calmette Guerin）（ＢＣＧ）が挙げられる。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載される。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与及び生成に有用である。例としては、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクター等が挙げられる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shcdlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、及びHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【０１４０】
癌細胞の成長を阻害又は低減する方法、及び本発明の二本鎖分子を用いて癌を治療する方法
或る特定のｓｉＲＮＡのＮＳＣＬＣを阻害する能力は、以前に国際公開第２００５／８９７３５号パンフレット（参照により本明細書中に援用される）に記載されている。本発明において、ＥＢＩ３に対する２つの異なるｄｓＲＮＡ、ＣＤＫＮ３に対する２つの異なるｄｓＲＮＡ、及びＥＦ−１δに対する２つの異なるｄｓＲＮＡを、細胞成長を阻害するそれらの能力について試験した。ＥＢＩ３に対する２つのｄｓＲＮＡ（図４Ｄ）、ＣＤＫＮ３に対する１つのｄｓＲＮＡ（図２２Ａ）、ＥＦ−１δに対する１つのｄｓＲＮＡ（図２２Ｂ）、又はＮＰＴＸＲに対する２つのｄｓＲＮＡ（図１３Ｄ）は、肺癌細胞株において細胞増殖の抑制と同時に、遺伝子の発現を効果的にノックダウンした。
【０１４１】
したがって、本発明は、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、又はＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲの発現を阻害することでＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子の機能不全を誘導することにより細胞成長、すなわち肺癌細胞の成長を阻害する方法を提供する。ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、又はＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲ遺伝子の発現は、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ若しくはＮＰＴＸＲ遺伝子を特異的に標的とする本発明の上述の二本鎖分子、又は該二本鎖分子のいずれかを発現することのできる本発明のベクターのいずれかにより阻害することができる。
【０１４２】
癌細胞の細胞成長を阻害する、本発明の二本鎖分子及びベクターのかかる能力は、それらを癌を治療する方法に使用することができることを示唆する。したがって、本発明はＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ若しくはＮＰＴＸＲ遺伝子に対する二本鎖分子、又は該分子を発現するベクターを副作用なく投与することにより肺癌患者を治療する方法を提供するが、これは該遺伝子が正常器官においてほとんど検出されなかったためである（図１、図７Ｅ、図１６、図１７、図１８Ｂ、及び図１９）。
【０１４３】
具体的には、本発明は、以下の方法［１］〜［２５］を提供する：
［１］ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、及び／又はＮＰＴＸＲを過剰発現する細胞における該遺伝子の発現、並びに細胞増殖を阻害する少なくとも１つの単離二本鎖分子を投与する工程（該分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖から成る）を含む、癌細胞の成長を阻害し、癌を治療する方法（該癌細胞又は癌はＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子の中から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現する）、
［２］二本鎖分子が、配列番号１８（配列番号１の６７９ｎｔ〜６９７ｎｔの位置）、配列番号２０（配列番号１の２８０ｎｔ〜２９８ｎｔの位置）、配列番号４９（配列番号５の３１０ｎｔ〜３２８ｎｔの位置）、配列番号５１（配列番号７の２２５ｎｔ〜２４３ｎｔの位置）、配列番号８４（配列番号８６の１２８０ｎｔ〜１２９８ｎｔの位置）、及び配列番号８５（配列番号８６の１３９３ｎｔ〜１４１１ｎｔの位置）の中から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡで作用する、［１］に記載の方法、
［３］センス鎖が配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有する、［２］に記載の二本鎖分子、
［４］治療される癌が肺癌である、［１］に記載の方法、
［５］肺癌がＮＳＣＬＣ又はＳＣＬＣである、［１］に記載の方法、
［６］複数種の二本鎖分子を投与する、［１］に記載の方法、
［７］複数種の二本鎖分子が同じ遺伝子を標的とする、［６］に記載の方法。
［８］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［３］に記載の方法。
［９］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［８］に記載の方法。
［１０］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［９］に記載の方法。
［１１］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［１０］に記載の方法。
［１２］二本鎖分子が約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド長の間である、［１１］に記載の方法。
［１３］二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結される、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む単一ポリヌクレオチドから成る、［１］に記載の方法。
［１４］二本鎖分子が一般式：５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'（式中、［Ａ］は配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有するセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、［Ａ'］は［Ａ］に相補的な配列を含有するアンチセンス鎖である）を有する、［１３］に記載の方法、
［１５］二本鎖分子がＲＮＡである、［１］に記載の方法。
［１６］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡとの両方を含む、［１］に記載の方法。
［１７］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１６］に記載の方法。
［１８］センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドとがそれぞれ、ＤＮＡとＲＮＡとから成る、［１７］に記載の方法。
［１９］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１６］に記載の方法。
［２０］アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、又はセンス鎖の５'末端に隣接する領域及びアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域の両方がＲＮＡから成る、［１９］に記載の方法、
［２１］隣接領域が９個〜１３個のヌクレオチドから成る、［２０］に記載の方法、
［２２］二本鎖分子が３'オーバーハングを含有する、［１］に記載の方法、
［２３］二本鎖分子がベクターによりコードされる、［１］に記載の方法、
［２４］ベクターによりコードされる二本鎖分子が、一般式：５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'（式中、［Ａ］は配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有するセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、［Ａ'］は［Ａ］に相補的な配列を含有するアンチセンス鎖である）を有する、［２３］に記載の方法、並びに
［２５］二本鎖分子が、分子に加えてトランスフェクション促進剤、及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物中に含有される、［１］に記載の方法。
【０１４４】
本発明の方法は以下でより詳細に説明される。
【０１４５】
ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子を発現する細胞の成長は、細胞を、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子に対する二本鎖分子、分子を発現するベクター、又はこれを含む組成物に接触させることによって阻害され得る。さらに細胞を、トランスフェクション剤に接触させることができる。好適なトランスフェクション剤は当該技術分野で既知である。「細胞成長の阻害」という語句は、細胞が、分子に曝露されない細胞に比べて、より遅い速度で増殖するか、又は生存率が低減する。細胞成長は、例えばＭＴＴ細胞増殖アッセイを用いた当該技術分野で既知の方法によって測定することができる。
【０１４６】
任意の種類の細胞の成長は、細胞が本発明の二本鎖分子の標的遺伝子を発現又は過剰発現していれば、本発明の方法に従って抑制することができる。例示的な細胞としては、ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣを含め、肺癌細胞が挙げられる。
【０１４７】
したがって、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲに関連する疾患を患っている又は発症する危険性がある患者は、少なくとも１つの本発明の二本鎖分子、少なくとも１つの分子を発現する少なくとも１つのベクター、又は少なくとも１つの分子を含む少なくとも１つの組成物を投与することによって治療することができる。例えば、肺癌患者を本方法に従って治療することができる。癌の種類は、診断される特定種類の腫瘍に従って、標準的な方法によって同定することができる。肺癌は例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＹＦＲＡ、ｐｒｏ−ＧＲＰ等を肺癌マーカーとして用いて、又は胸部Ｘ線検査及び／又は喀痰細胞診により診断され得る。より好ましくは、本発明の方法により治療される患者は、患者からの生検材料におけるＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲの発現をＲＴ−ＰＣＲ又はイムノアッセイにより検出することにより選択される。好ましくは、本発明の治療の前に、被験体からの生検材料をＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子の過剰発現について当該技術分野で既知の方法、例えば免疫組織化学的分析又はＲＴ−ＰＣＲにより確認する。
【０１４８】
細胞成長を阻害し、それにより癌を治療する本発明の方法によると、複数種の二本鎖分子（又はそれを発現するベクター若しくはそれを含有する組成物）を投与する場合、各々の分子は異なる構造を有し得るが、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、及び／又はＮＰＴＸＲの同じ標的配列と一致するｍＲＮＡで作用する。代替的には、複数種の二本鎖分子は、同じ遺伝子の異なる標的配列と一致するｍＲＮＡで作用しても、又は異なる遺伝子の異なる標的配列と一致するｍＲＮＡで作用してもよい。例えば、方法はＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲを対象とする二本鎖分子を利用し得る。代替的には、例えば、方法はＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、及びＮＰＴＸＲから選択される１つ、２つ以上の標的配列を対象とする二本鎖分子を利用し得る。
【０１４９】
細胞成長を阻害するために、本発明の二本鎖分子は、分子と対応するｍＲＮＡ転写産物との結合を達成する形態で、細胞に直接導入することができる。代替的に、上記のように、二本鎖分子をコードするＤＮＡは、ベクターとして細胞に導入することができる。二本鎖分子及びベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション増強剤、例えばＦｕＧＥＮＥ（Roche diagnostics）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Invitrogen）及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（和光純薬工業株式会社）を利用することができる。
【０１５０】
治療は、臨床的利点、例えばＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子の発現の低減、又は被験体における癌のサイズ、有病率若しくは転移能の減少をもたらすかどうかで「有効」であるとみなされる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、治療が癌の形成を遅らせる若しくは防ぐか、又は癌の臨床症状を防ぐ又は緩和するという意味である。有効性（Efficaciousness）は、特定の腫瘍型を診断又は治療する任意の既知の方法に関連して求められる。
【０１５１】
本発明の二本鎖分子は、半化学量論的な量で標的ｍＲＮＡ（ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ）を分解することが理解される。理論に束縛されないが、本発明の二本鎖分子によって、触媒的に標的ｍＲＮＡの分解が起こると考えられている。したがって、治療効果を発揮するために、癌部位に又はその近くに、標準的な癌治療に比べて有意に少ない二本鎖分子を送達させる必要がある。
【０１５２】
当業者は、因子、例えば被験体の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状及び他の状態；投与経路；並びに投与が局所的又は全身的のいずれであるかを考慮して、所定の被験体に投与する、本発明の二本鎖分子の有効量を容易に求めることができる。概して、有効量の本発明の二本鎖分子は、癌部位に又はその近くに、細胞内濃度が約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭの二本鎖分子である。より多くの又はより少ない量の二本鎖分子を投与することができることが考慮される。特定の状況に必要とされる正確な用量は、当業者により容易且つ日常的に決定され得る。
【０１５３】
本発明の方法は、少なくとも１つのＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲを発現する癌、例えば肺癌、特にＮＳＣＬＣ又はＳＣＬＣの成長又は転移を阻害するために使用することができる。特に、ＥＢＩ３（すなわち、配列番号１８若しくは配列番号２０）、ＣＤＫＮ３（すなわち、配列番号４９）、ＥＦ−１δ（すなわち、配列番号５１）、又はＮＰＴＸＲ（すなわち、配列番号８４若しくは配列番号８５）の標的配列を含有する二本鎖分子が、肺癌の治療に特に好ましい。
【０１５４】
癌を治療するために、本発明の二本鎖分子は、二本鎖分子とは異なる医薬品と併用して被験体に投与することもできる。代替的に、本発明の二本鎖分子は、癌を治療するために設計される別の治療法と併用して被験体に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、癌を治療する又は癌転移を予防するのに現在利用されている治療法（例えば放射線療法、外科的手術及び化学療法剤（例えばシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン又はタモキシフェン）を用いた治療）と併用して投与することができる。
【０１５５】
本方法において、二本鎖分子は、送達試薬と併用してネイキッド二本鎖分子、又は二本鎖分子を発現する組換えプラスミド若しくはウイルスベクターのいずれかとして被験体に送達することができる。
【０１５６】
本発明の二本鎖分子と併用して投与するのに好適な送達試薬としては、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、又はポリカチオン（例えばポリリシン）又はリポソームが挙げられる。好ましい送達試薬はリポソームである。
【０１５７】
リポソームは、特定の組織、例えば網膜組織又は腫瘍組織への二本鎖分子の送達に役立ち、二本鎖分子の血液半減期も増大させ得る。本発明での使用に好適なリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、概してこれには、中性又は負に帯電したリン脂質とステロール、例えばコレステロールとが含まれる。概して、因子、例えば血流中の所望のリポソームのサイズ及び半減期を考慮して、脂質の選択が導かれる。リポソームを調製するのに、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、及び米国特許第４，２３５，８７１号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、同第４，８３７，０２８号明細書、及び同第５，０１９，３６９号明細書（その開示全体が参照により本明細書に引用される）で記載されるような様々な方法が知られている。
【０１５８】
好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、リポソームを癌部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍又は小胞内皮細胞に広まった受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原又は内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体が好ましい。
【０１５９】
特に好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えば構造の表面と結合するオプソニン阻害部分を有することによって、単核マクロファージ及び網内系によるクリアランスを避けるように変性される。一実施形態では、本発明のリポソームは、オプソニン阻害部分とリガンドとの両方を含み得る。
【０１６０】
本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用されるように、オプソニン阻害部分は、例えば脂質−可溶性アンカーと膜自体とのインターカレーション、又は膜脂質の活性基への直接結合によって、膜と化学的に又は物理的に接着する場合に、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン阻害親水性ポリマーは、例えば米国特許第４，９２０，０１６号明細書（その開示全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）及び網内系（「ＲＥＳ」）によってリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。このようにして、オプソニン阻害部分で変性されたリポソームは非変性リポソームよりもかなり長く循環血液中に留まる。このため、かかるリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
【０１６１】
ステルスリポソームは、多孔性又は「漏出性（leaky）」微小血管系によって与えられる組織中で集積することが知られている。したがって、かかる微小血管系の欠点を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍は効率的にこれらのリポソームを集積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの低減が、肝臓及び脾臓における有意な集積を防ぐことによって、ステルスリポソームの毒性を低下させる。このようにして、オプソニン阻害部分で変性された本発明のリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。
【０１６２】
リポソームを変性するのに好適なオプソニン阻害部分は、分子量が約５００ダルトン〜約４００００ダルトン、例えば約２０００ダルトン〜約２００００ダルトンの水溶性ポリマーであり得る。かかるポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧ又はＰＰＧ、及びＰＥＧ又はＰＰＧステアレート；合成ポリマー、例えばポリアクリルアミド又はポリＮ−ビニルピロリドン；直鎖、分岐又は樹状のポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えばポリビニルアルコール及びポリキシリトール（これらにカルボン酸基又はアミノ基が化学結合する）、並びにガングリオシド、例えばガングリオシドＧＭ１が挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ若しくはメトキシＰＰＧのコポリマー、又はそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン阻害ポリマーは、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、又はポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン阻害ポリマーは、アミノ酸又はカルボン酸、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナンを含有する天然多糖；アミノ化多糖又はオリゴ糖（直鎖又は分岐）；又は例えばカルボン酸基の連結を有するカルボン酸の誘導体によって反応したカルボキシル化多糖又はオリゴ糖でもあり得る。
【０１６３】
好ましくは、オプソニン阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ又はその誘導体である。ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体によって変性したリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。
【０１６４】
オプソニン阻害部分は、多くの既知の技法のいずれか１つによってリポソーム膜と結合することができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、それから膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、６０℃でＮａ（ＣＮ）ＢＨ３及び溶媒混合物（例えばテトラヒドロフランと水とを３０：１２の比で）を用いて還元アミノ化によってステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０１６５】
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で検討される。少なくとも１つの本発明の二本鎖分子を発現するかかるベクターは、直接又は好適な送達試薬と併用して投与することもでき、これには、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、又はポリカチオン（例えばポリリシン）又はリポソームが含まれる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者の癌領域に送達する方法は当該技術分野内である。
【０１６６】
本発明の二本鎖分子は、二本鎖分子を癌部位に送達するのに好適な任意の手段によって、被験体に投与することができる。例えば、二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、又は他の好適な非経口投与経路若しくは腸内投与経路によって投与することができる。
【０１６７】
好適な腸内投与経路としては、経口、直腸又は鼻腔送達が挙げられる。
【０１６８】
好適な非経口投与経路としては、静脈内投与（例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入及び血管系へのカテーテル点滴）；傍組織及び組織内注射（例えば傍腫瘍及び腫瘍内注射、網膜内注射、又は網膜下注射）；皮下注入を含む皮下注射又は皮下沈着（例えば浸透圧ポンプによって）；例えばカテーテル若しくは他の留置装置（placement device）（例えば、多孔性、非孔性又はゼラチン様材料を含む、網膜ペレット又は坐剤又はインプラント）による癌部位の領域又はその近くの領域への直接適用；並びに吸入が挙げられる。幾つかの実施形態では、二本鎖分子又はベクターの注射又は注入は、癌の部位で又はその近くで行われる。
【０１６９】
本発明の二本鎖分子は、単回投与又は複数回の投与で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入によるものである場合、注入は、単回の持続投与で行うか、又は複数回の注入によって送達することができる。作用物質の注射は、癌部位の組織、又は癌部位の近くに直接行うことが好ましい。癌部位の組織に又は癌部位の近くに作用物質を複数回注射することが、特に好ましい。
【０１７０】
当業者は容易に、本発明の二本鎖分子を所定の被験体に投与するのに適当な投薬計画（dosage regimen）を決定することもできる。例えば、二本鎖分子は１回、例えば癌部位での又はその近くでの単回注射又は沈着として被験体に投与することができる。代替的に、二本鎖分子は、約３日〜約２８日、例えば約７日〜約１０日の間、１日１回又は２回、被験体に投与することができる。例示的な一投与計画では、二本鎖分子は７日間、１日１回、癌部位に又はその近くに注射される。投与計画に複数回の投与が含まれる場合、被験体に投与される二本鎖分子の有効量は、投与計画全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことが理解される。
【０１７１】
本発明の二本鎖分子を含有する組成物
上記の他に、本発明はまた、分子をコードする、本発明の二本鎖分子又はベクターの少なくとも１つを含む医薬組成物を提供する。特に本発明は、以下の組成物［１］〜［２５］を提供する：
［１］互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖から成る、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲの発現及び細胞増殖を阻害する少なくとも１つの単離二本鎖分子を含む、癌細胞の成長を阻害し、癌を治療するための組成物（該癌細胞及び癌はＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲ遺伝子の中から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現する）、
［２］二本鎖分子が配列番号１８（配列番号１の６７９ｎｔ〜６９７ｎｔの位置）、配列番号２０（配列番号１の２８０ｎｔ〜２９８ｎｔの位置）、配列番号４９（配列番号５の３１０ｎｔ〜３２８ｎｔの位置）、配列番号５１（配列番号７の２２５ｎｔ〜２４３ｎｔの位置）、配列番号８４（配列番号８６の１２８０ｎｔ〜１２９８ｎｔの位置）、及び配列番号８５（配列番号８６の１３９３ｎｔ〜１４１１ｎｔの位置）の中から選択される標的配列と一致するｍＲＮＡで作用する、［１］に記載の組成物、
［３］二本鎖分子において、センス鎖が配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有する、［２］に記載の組成物、
［４］治療される癌が肺癌である、［１］に記載の方法、
［５］肺癌がＮＳＣＬＣ又はＳＣＬＣである、［４］に記載の方法、
［６］組成物が複数種の二本鎖分子を含有する、［１］に記載の組成物、
［７］複数種の二本鎖分子が同じ遺伝子を標的とする、［６］に記載の組成物。
［８］二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［３］に記載の組成物。
［９］二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［８］に記載の組成物。
［１０］二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［９］に記載の組成物。
［１１］二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［１０］に記載の組成物。
［１２］二本鎖分子が約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド長の間である、［１１］に記載の組成物。
［１３］二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結される、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む単一ポリヌクレオチドから成る、［１］に記載の組成物。
［１４］二本鎖分子が一般式：５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'（式中、［Ａ］は配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有するセンス鎖配列であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、［Ａ'］は［Ａ］に相補的な配列を含有するアンチセンス鎖である）を有する、［１３］に記載の組成物、
［１５］二本鎖分子がＲＮＡである、［１］に記載の組成物。
［１６］二本鎖分子がＤＮＡ及び／又はＲＮＡである、［１］に記載の組成物。
［１７］二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１６］に記載の組成物。
［１８］センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドとがそれぞれ、ＤＮＡとＲＮＡとから成る、［１７］に記載の組成物。
［１９］二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１６］に記載の組成物。
［２０］アンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域、又はセンス鎖の５'末端に隣接する領域及びアンチセンス鎖の３'末端に隣接する領域の両方がＲＮＡから成る、［１９］に記載の組成物、
［２１］隣接領域が９個〜１３個のヌクレオチドから成る、［２０］に記載の組成物。
［２２］二本鎖分子が３'オーバーハングを含有する、［１］に記載の組成物。
［２３］二本鎖分子がベクターによってコードされ、組成物に含有される、［１］に記載の組成物。
［２４］二本鎖分子が一般式：５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'（式中、［Ａ］は配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５の中から選択される標的配列に対応する配列を含有するセンス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、［Ａ'］は［Ａ］に相補的な配列を含有するアンチセンス鎖である）を有する、［２３］に記載の組成物、並びに
［２５］トランスフェクション増強剤と薬学的に許容可能な担体とを含む、［１］に記載の組成物。
【０１７２】
本方法の好適な組成物は以下でより詳細に説明される。
【０１７３】
本発明の二本鎖分子は、当該技術分野で既知の技法に従って、被験体に投与する前に医薬組成物として配合することが好ましい。本発明の医薬組成物は、少なくとも滅菌性であり且つパイロジェン無含有であることを特徴とする。本明細書で使用されるように、「薬学的製剤（pharmaceutical formulations）」は、ヒト及び獣医学的使用のための製剤を含む。本発明の医薬組成物を調製する方法は、例えばRemington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.（1985）（その開示全体が参照により本明細書に援用される）に記載のように当該技術分野内である。
【０１７４】
本発明の薬学的製剤は、生理学的に許容可能な担体培地と混合して、本発明の二本鎖分子又はこれをコードするベクターの少なくとも１つ（例えば０．１重量％〜９０重量％）、又は分子の生理学的に許容可能な塩を含む。好ましい生理学的に許容可能な担体培地としては、水、緩衝水、生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等が挙げられる。
【０１７５】
本発明によれば、組成物は、複数種の二本鎖分子を含有することができ、その分子のそれぞれが、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、及び／又はＮＰＴＸＲの同じ標的配列又は異なる標的配列に指向性を有し得る。例えば、組成物は、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲに指向性を有する二本鎖分子を含有することができる。代替的に、例えば組成物は、ＰＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ及びＮＰＴＸＲから選択される、１つ、２つ又はそれ以上の標的配列に指向性を有する二本鎖分子を含有することができる。
【０１７６】
さらに本発明の組成物は、１つ又は複数の二本鎖分子をコードするベクターを含有することができる。例えばベクターは、１つ、２つ又は幾つかの種類の本発明の二本鎖分子をコードすることができる。代替的に本発明の組成物は、複数種類のベクターを含有することができ、そのベクターのそれぞれが異なる二本鎖分子をコードする。
【０１７７】
その上、本発明の二本鎖分子は、本発明の組成物中にリポソームとして含有され得る。リポソームの詳細に関しては、「二本鎖分子を使用した癌を治療する方法」の項を参照されたい。
【０１７８】
本発明の医薬組成物は、従来の薬学的賦形剤及び／又は添加剤も含み得る。好適な薬学的賦形剤としては、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、バッファー及びｐＨ調整剤が挙げられる。好適な添加剤としては、生理学的に生体適合性があるバッファー（例えば塩酸トロメタミン）、キレート剤（chelants）の添加物（例えばＤＴＰＡ又はＤＴＰＡ−ビスアミド）又はカルシウム錯体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）、又は任意でカルシウムキレート塩若しくはナトリウム塩の添加物（例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム又は乳酸カルシウム）。本発明の医薬組成物は、液体形態での使用のために包装されていても、又は凍結乾燥されていてもよい。
【０１７９】
固体組成物には、従来の非毒性固体担体、例えば医薬品品質のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用することができる。
【０１８０】
例えば、経口投与するための固体医薬組成物は、上記で列挙された担体及び賦形剤のいずれかと、１０％〜９５％、例えば２５％〜７５％の１つ又は複数の本発明の二本鎖分子とを含み得る。エアロゾル（吸入）投与のための医薬組成物は、上記のようにリポソームに封入される０．０１重量％〜２０重量％、例えば１重量％〜１０重量％の１つ又は複数の本発明の二本鎖分子と、噴霧剤とを含み得る。所望に応じて、担体、例えば鼻内送達ではレシチンが含まれ得る。
【０１８１】
上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のｉｎ  ｖｉｖｏ機能を阻害しなければ、他の薬学的に活性のある成分を含有することができる。例えば組成物は、癌を治療するのに従来使用される化学療法剤を含有することができる。
【０１８２】
別の実施形態では、本発明はまた、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲの発現により特徴付けられる肺癌を治療するための医薬組成物の製造における、本発明の二本鎖核酸分子の使用を提供する。例えば、本発明は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５の中から選択される配列を標的とする、細胞におけるＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、及びＮＰＴＸＲの中から選択される遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子の、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲを発現する肺癌を治療するための医薬組成物の製造のための使用に関する。
【０１８３】
代替的には、本発明はさらに、薬学的又は生理学的に許容可能な担体に、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５の中から選択される配列を標的とする、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲの発現を該遺伝子を過剰発現する細胞において阻害する二本鎖核酸分子を活性成分として配合する工程を含む、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲの発現により特徴付けられる肺癌を治療するための医薬組成物を製造する方法又はプロセスを提供する。
【０１８４】
別の実施形態では、本発明はまた、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、配列番号１８、配列番号２０、配列番号４９、配列番号５１、配列番号８４、及び配列番号８５の中から選択される配列を標的とする、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲの発現を該遺伝子を過剰発現する細胞において阻害する二本鎖核酸分子である活性成分を、薬学的又は生理学的に許容可能な担体と混和させる工程を含む、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＮＰＴＸＲの発現により特徴付けられる肺癌を治療するための医薬組成物を製造する方法又はプロセスを提供する。
【０１８５】
肺癌を診断する方法
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、又はＥＦ−１δの発現が、肺癌細胞において特異的に上昇することが見出された（図１、図５、図７、図８、及び図１６）。したがって、本発明において同定された遺伝子、並びにそれらの転写産物及び翻訳産物には、肺癌に対するマーカーとしての診断的有用性が見られ、細胞試料におけるＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、又はＥＦ−１δの発現を測定することにより、肺癌を診断することができる。具体的には、本発明は、被験体におけるＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、又はＥＦ−１δの発現レベルを測定することにより肺癌を診断する方法を提供する。本発明の方法によって診断することのできる肺癌には、ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣが含まれる。さらに、肺腺癌及び肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）を含むＮＳＣＬＣも、本発明により診断又は検出される。
【０１８６】
本発明に従って、被験体の状態を試験する中間結果が与えられ得る。かかる中間結果は、医者、看護師又は他の療法士（practitioner）が、被験体が疾患を患っていると診断するのを補助する付加的情報と組み合わせることができる。代替的に、本発明は、被験体から得た組織において癌性細胞を検出するため、及び被験体が疾患を患っていることを診断するのに有用な情報を医者に与えるために使用することができる。
【０１８７】
特に本発明は、以下の方法［１］〜［１０］を提供する：
［１］
（ａ）生体試料においてＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３、又はＥＦ−１δのアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現レベルを検出する工程、及び
（ｂ）遺伝子の正常対照レベルと比較して、検出される発現レベルの上昇を疾患の存在と相関させる工程を含む、肺癌を診断する方法。
［２］発現レベルが正常対照レベルより少なくとも１０％高い、［１］に記載の方法、
［３］発現レベルが、
（ａ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、又はＥＦ−１δの配列を含むｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、又はＥＦ−１δのアミノ酸配列を含むタンパク質を検出すること、及び
（ｃ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、又はＥＦ−１δのアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出することの中から選択される方法により検出される、［１］に記載の方法、
［４］肺癌がＮＳＣＬＣ又はＳＣＬＣである、［１］に記載の方法、
［５］発現レベルを、プローブと遺伝子の遺伝子転写産物とのハイブリダイゼーションを検出することにより求める、［３］に記載の方法、
［６］発現レベルを、遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体の結合を遺伝子の発現レベルとして検出することにより求める、［３］に記載の方法、
［７］生体試料が生検材料、痰、又は血液を含む、［１］に記載の方法、
［８］被験体から得られる生体試料が上皮細胞を含む、［１］に記載の方法、
［９］被験体から得られる生体試料が癌細胞を含む、［１］に記載の方法、
［１０］被験体から得た生体試料が癌性上皮細胞を含む、［１］に記載の方法。
【０１８８】
肺癌を診断する方法が以下でより詳細に説明される。
【０１８９】
本方法によって診断される被験体は好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物としては例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ及びウシが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
生体試料を、診断する被験体から採取し、診断を実施することが好ましい。任意の生体材料は、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δの目的となる転写産物又は翻訳産物を含んでいれば、測定のための生体試料として使用することができる。生体試料としては、身体組織及び体液、例えば血液、痰及び尿が挙げられる。好ましくは、生体試料は、上皮細胞、より好ましくは癌性上皮細胞又は癌性である疑いがある組織に由来する上皮細胞を含む細胞集団を含有する。さらに、必要であれば、細胞を、得られた身体組織及び体液から精製した後、生体試料として使用することができる。
【０１９１】
本発明に従って、被験体から得た生体試料におけるＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δの発現レベルが求められる。発現レベルは、当該技術分野で既知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで求めることができる。例えば、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δのｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション法（例えばノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを用いて定量することができる。検出は、チップ又はアレイで実施することができる。アレイの使用は好ましくは、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δを含む複数の遺伝子（例えば様々な癌特異的遺伝子）の発現レベルを検出するためのものである。当業者は、ＥＢＩ３（配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５７５５）、又はＤＬＸ５（配列番号３、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ００６２２６）又はＮＰＴＸ１（配列番号７８、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２５２２）又はＣＤＫＮ３（配列番号５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２７７１１）又はＥＦ−１δ（配列番号７、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ００９９０７）の配列情報を利用して、かかるプローブを調製することができる。例えば、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δのｃＤＮＡはプローブとして使用することができる。必要であれば、プローブは、好適な標識、例えば染料、蛍光色素及びアイソトープで標識することができ、遺伝子の発現レベルは、ハイブリダイズされた標識の強度として検出することができる。
【０１９２】
さらに、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δの転写産物は、増幅ベースの検出法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）でプライマーを用いて定量することができる。かかるプライマーは、利用可能な遺伝子の配列情報に基づき調製することもできる。例えば、実施例で使用されるプライマー（配列番号９及び配列番号１０、配列番号２１及び配列番号２２、配列番号３４及び配列番号３５、又は配列番号３６、配列番号３７、配列番号８０及び配列番号８１）は、ＲＴ−ＰＣＲ又はノーザンブロット分析による検出に利用することができるが、本発明はそれらに限定されない。
【０１９３】
特に、本発明の方法で使用されるプローブ又はプライマーは、ストリンジェント、中程度ストリンジェント、又は低ストリンジェントの条件下でＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δのｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用されるように、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブ又はプライマーがその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を表す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、様々な状況下で異なる。長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般的に、ストリンジェント条件の温度は、規定のイオン強度及びｐＨで特定の配列のために、熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、（規定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度で）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度である。一般的にＴｍでは標的配列が過剰に存在するので、プローブの５０％が平衡状態で占められる。典型的に、ストリンジェント条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的に約０．０１Ｍ〜１．０Ｍのナトリウムイオン（又はその塩）であり、温度が、短いプローブ又はプライマー（例えば１０個〜５０個のヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であり、長いプローブ又はプライマーでは少なくとも約６０℃である。ストリンジェント条件は、脱安定化剤、例えばホルムアミドの添加によっても達成することができる。
【０１９４】
代替的に翻訳産物は、本発明の診断のために検出することができる。例えば、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δタンパク質の量を求めることができる。翻訳産物としてタンパク質の量を求める方法としては、上記タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が挙げられる。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。さらに、抗体の任意の断片又は修飾断片（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）は、断片がＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δタンパク質との結合能を保持していれば、検出に使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当該技術分野で既知であり、かかる抗体及びそれらの等価物を調製するために、任意の方法を本発明で利用することができる。
【０１９５】
その翻訳産物に基づきＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルを検出する別の方法として、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δタンパク質に対する抗体を用いて、免疫組織化学分析によって染色の強度を観察することができる。すなわち、強い染色の観察は、上記タンパク質の存在の増大と同時に、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δ遺伝子の高い発現レベルを示す。
【０１９６】
さらに、診断の正確性を改善するために、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルに加えて、他の癌関連遺伝子、例えば肺癌によって異なる発現をすることが知られる遺伝子の発現レベルも求めることができる。
【０１９７】
生体試料においてＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δ遺伝子を含む癌マーカー遺伝子の発現レベルは、対応する癌マーカー遺伝子の対照レベルから、例えば１０％、２５％若しくは５０％増大していれば、又は１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超若しくはそれ以上に増大していれば、増大していると考えることができる。
【０１９８】
疾患状態（癌性又は非癌性）が既知の被験体（複数可）からこれまでに採取し、保管した試料（複数可）を使用することによって、対照レベルを試験生体試料と同時に求めることができる。代替的に、疾患状態が既知の被験体の試料において、これまでに求められたＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベル（複数可）を分析することによって得られたデータに基づき、統計的方法によって対照レベルを求めることができる。さらに、対照レベルは、これまでに試験された細胞由来の発現パターンのデータベースであり得る。その上、本発明の一態様によれば、生体試料におけるＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルは、複数の参照試料から求められる複数の対照レベルと比較することができる。患者から得た生体試料のものと同程度の組織型に由来する参照試料から求められる対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が既知である集団におけるＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルの標準値を用いることが好ましい。標準値は、当該技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±２Ｓ．Ｄ．又は平均±３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用することができる。
【０１９９】
本発明に関して、癌性でないことが既知の生体試料から求められる対照レベルは「正常対照レベル」と呼ばれる。他方で、対照レベルが癌性生体試料から求められる場合、これは「癌性対照レベル」と呼ばれる。
【０２００】
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルが正常対照レベルに比べて増大しているか、又は癌性対照レベルと同程度である場合、被験体は、癌を患っているか又は発症する危険性があると診断され得る。さらに、複数の癌関連遺伝子の発現レベルを比較する場合、試料と癌性である参照との間の遺伝子発現パターンの類似は、被験体が、癌を患っているか又は発症する危険性があることを示す。
【０２０１】
試験生体試料の発現レベルと対照レベルとの間の相違は、発現レベルが細胞の癌性状態又は非癌性状態に応じて異ならないことが知られている対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子としては、βアクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ及びリボソームタンパク質Ｐ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０２】
癌の予後を判定する方法
本発明は、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δの発現は、患者の予後が悪くなることに有意に関連があるという新規の発見に関係している。したがって本発明は、患者の生体試料においてＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルを検出すること、検出された発現レベルを対照レベルと比較すること、及び予後不良（poor prognosis）（低い生存率）の指標として、対照レベルに対する発現レベルの増大を求めることによって、癌、特に肺癌の患者の予後を求める又は判定する方法を提供する。
【０２０３】
本明細書中で、「予後」という用語は、疾患の見込み転帰、並びに症例の性質及び症状によって示されるような、疾患からの回復の可能性（prospect）に関する予測（forecast）を表す。したがって、良好ではない、陰性又は不良である予後は、治療後の生存期間又は生存率の低下によって規定される。反対に、陽性、良好な（favorable, or good）予後は、治療後の生存期間又は生存率の上昇によって規定される。
【０２０４】
「予後を判定する」という用語は、患者の癌の今後の転帰（例えば悪性度、癌の治癒見込み、生存時間等）によって、所定の検出又は測定を予測する（predicting, forecasting）又は相互に関連付ける能力を表す。例えば、経時的にＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの発現レベルを求めることで、患者に対する転帰（例えば悪性度の増減、癌の進行度（grade）の増減、癌の治癒見込み、生存率等）の予測が可能となる。
【０２０５】
本発明に関して、「予後を判定する（又は決定する）」という語句は、癌の進行、特に癌の再発、転移拡散及び疾患再発の予測及び見込み分析を包含することが意図される。本発明の予後を判定する方法は、治療的介入、診断基準、例えば疾患の病期分類、並びに腫瘍性疾患の転移又は再発に関する疾患モニタリング及び監視を含む、治療法について結論を出す際に臨床的に使用されることが意図される。
【０２０６】
本方法に使用される患者から得た生体試料は、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子を試料で検出することができれば、判定される被験体由来の任意の試料であってもよい。好ましくは、生体試料は、肺細胞（肺から得られる細胞）である。さらに、生体試料としては、体液、例えば痰、血液、血清又は血漿が挙げられ得る。その上、試料は組織から精製される細胞であってもよい。生体試料は、治療前、治療中、及び／又は治療後を含む様々な時点で、患者から得ることができる。
【０２０７】
本発明に従って、患者から得た生体試料において測定されるＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルが高ければ、治療後の寛解、回復、及び／又は生存に関する予後が不良になり且つ不良な臨床転帰の見込みが高くなることが示された。したがって、本方法によれば、比較に使用される「対照レベル」は例えば、治療後に癌の良好な又は陽性の予後を示した個体又は個体集団において、任意の種類の治療の前に検出されたＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルであり、本明細書で「良好な予後対照レベル」とも称される。代替的に、「対照レベル」は、治療後に癌の不良な又は陰性の予後を示した個体又は個体集団において、任意の種類の治療の前に検出されたＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルであり、本明細書で「不良な予後対照レベル」とも称される。「対照レベル」は、単一の参照集団に由来する単一発現パターン又は複数の発現パターンである。したがって、対照レベルは、癌の患者、又は疾患状態（良好又は不良な予後）が既知の患者の集団における任意の種類の治療の前に検出されたＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルに基づき求めることができる。好ましくは、癌は肺癌である。疾患状態が既知の患者群においてＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルの標準値を用いることが好ましい。標準値は、当該技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±２Ｓ．Ｄ．又は平均±３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用することができる。
【０２０８】
対照レベルは、任意の種類の治療の前に、疾患状態（良好な予後又は不良な予後）が既知の癌患者（複数可）（対照又は対照群）からこれまでに採取及び保存された試料（複数可）を使用することによって、試験生体試料と同時に求めることができる。
【０２０９】
代替的に、対照レベルは、対照群からこれまでに採取及び保存された試料におけるＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルを分析することによって得られた結果に基づいて統計的方法によって求めることができる。さらに、対照レベルは、これまでに試験された細胞由来の発現パターンのデータベースであり得る。
【０２１０】
その上、本発明の一態様によれば、生体試料におけるＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルは、複数の参照試料から求められる複数の対照レベルと比較することができる。患者から得た生体試料のものと同程度の組織型に由来する参照試料から求められる対照レベルを用いることが好ましい。
【０２１１】
本発明によれば、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルと良好な予後対照レベルとの類似が患者のより良好な予後を示し、良好な予後対照レベルに対する発現レベルの増大が、治療後の寛解、回復、生存、及び／又は臨床転帰に対する、より良好ではない不良な予後を示す。他方で、不良な予後対照レベルに対するＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルの低減が、患者のより良好な予後を示し、発現レベルと不良な予後対照レベルとの類似が治療後の寛解、回復、生存、及び／又は臨床転帰に対する、より良好ではない不良な予後を示す。
【０２１２】
生体試料におけるＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルは、対照レベルと１．０倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、又はそれ以上異なる場合に変化していると考えられ得る。
【０２１３】
試験生体試料レベルと対照レベルとの間の発現レベルの相違は、対照、例えばハウスキーピング遺伝子に正規化することができる。例えば、発現レベルが癌性細胞と非癌生細胞との間で異ならないことが知られるポリヌクレオチド（βアクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ及びリボソームタンパク質Ｐ１をコードするものを含む）を、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルを正規化するのに使用することができる。
【０２１４】
発現レベルは、当該技術分野で既知の技法を用いて患者から得た生体試料において遺伝子転写産物を検出することによって求めることができる。本発明の方法によって検出される遺伝子転写産物には、転写産物及び翻訳産物、例えばｍＲＮＡ及びタンパク質の両方が含まれる。
【０２１５】
例えば、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の転写産物は、遺伝子転写産物に対するＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子プローブを使用するハイブリダイゼーション、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション分析によって検出することができる。検出はクリップ又はアレイ上で行うことができる。ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子を含む複数の遺伝子の発現レベルを検出するために、アレイを使用することが好ましい。別の例として、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子に特異的なプライマーを使用する増幅ベースの検出法、例えば逆転写ベースのポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を検出に利用することができる（実施例を参照されたい）。ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子に特異的なプローブ又はプライマーは、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δ（それぞれ配列番号１、３、５及び７）の配列全体を参照することにより従来の技法を用いて設計及び調製することができる。例えば、実施例で使用されるプライマー（配列番号９及び配列番号１０（ＥＢＩ３）、配列番号２１及び配列番号２２（ＤＬＸ５）、配列番号８２及び配列番号８３（ＮＰＴＸ１）、配列番号３４及び配列番号３５（ＣＤＫＮ３）、配列番号３６及び配列番号３７（ＥＦ−１δ））は、ＲＴ−ＰＣＲによる検出に利用することができるが、本発明はそれらに限定されない。
【０２１６】
特に、本発明の方法で使用されるプローブ又はプライマーは、ストリンジェント、中程度ストリンジェント、又は低ストリンジェントの条件下でＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用されるように、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブ又はプライマーがその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を表す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、様々な状況下で異なる。長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般的に、ストリンジェント条件の温度は、規定のイオン強度及びｐＨで特定の配列のために、熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、（規定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度で）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度である。一般的にＴｍでは標的配列が過剰に存在するので、プローブの５０％が平衡状態で占められる。典型的に、ストリンジェント条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的に約０．０１Ｍ〜１．０Ｍのナトリウムイオン（又はその塩）であり、温度が、短いプローブ又はプライマー（例えば１０個〜５０個のヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であり、長いプローブ又はプライマーでは少なくとも約６０℃である。ストリンジェント条件は、脱安定化剤、例えばホルムアミドの添加によっても達成することができる。
【０２１７】
代替的に翻訳産物は、本発明の判定のために検出することができる。例えば、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質の量を求めることができる。翻訳産物としてタンパク質の量を求める方法としては、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が挙げられる。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。さらに、抗体の任意の断片又は修飾断片（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）は、断片がＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質との結合能を保持していれば、検出に使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当該技術分野で既知であり、かかる抗体及びそれらの等価物を調製するために、任意の方法を本発明で利用することができる。
【０２１８】
その翻訳産物に基づきＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルを検出する別の方法として、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質に対する抗体を用いて、免疫組織化学分析によって染色の強度を観察することができる。すなわち、強い染色の観察は、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質の存在の増大と同時に、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の高い発現レベルを示す。
【０２１９】
さらに、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質は細胞増殖活性を有することが知られている。したがって、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルは、指標としてかかる細胞増殖活性を用いて求めることができる。例えば、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δを発現する細胞は、生体試料の存在下で調製及び培養し、それから増殖速度を検出すること又は細胞周期若しくはコロニー形成能を測定することによって、生体試料の細胞増殖活性を求めることができる。
【０２２０】
その上、判定の正確性を改善するために、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の発現レベルに加えて、他の肺癌関連遺伝子、例えば肺癌で異なる発現をすることが知られる遺伝子の発現レベルも求めることができる。かかる他の肺細胞関連遺伝子としては、国際公開第２００４／０３１４１３号パンフレット及び国際公開第２００５／０９０６０３号パンフレット（これらの内容は参照により本明細書に援用される）に記載されるものが挙げられる。
【０２２１】
代替的に、本発明に従って、被験体の予後を判定する他の試験結果に加えて、中間結果も与えられ得る。かかる中間結果は、医者、看護師又は他の療法士が被験体の予後を判定、判断又は推測するのを補助することができる。予後を判定するために、本発明によって得られる中間結果と組み合わせて考慮することができる付加的情報としては、被験体の臨床症状及び身体状態が挙げられる。
【０２２２】
本方法に従って癌の予後を判定される患者は好ましくは哺乳動物であり、これにはヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ及びウシが挙げられる。
【０２２３】
癌を診断する又は癌の予後を判定するキット
本発明は、癌を診断する又は癌の予後を判定するキットを提供する。好ましくは、癌は肺癌である。特にキットは、患者から得た生体試料においてＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子の発現を検出する試薬を少なくとも１つ含み、この試薬は、
（ａ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子のｍＲＮＡを検出する試薬、
（ｂ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質を検出する試薬、及び
（ｃ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質の生物活性を検出する試薬から成る群から選択され得る。
【０２２４】
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに好適な試薬としては、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δのｍＲＮＡと特異的に結合する又は同定する核酸、例えばＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δのｍＲＮＡの一部に対する相補配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δのｍＲＮＡに特異的なプライマー及びプローブによって例示される。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で既知の方法に基づき調製することができる。必要であれば、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δのｍＲＮＡを検出する試薬は固体マトリクス上に固定することができる。その上、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δのｍＲＮＡを検出する試薬を２つ以上キットに包含させることができる。
【０２２５】
他方で、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質を検出するのに好適な試薬としては、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質に対する抗体が挙げられる。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。さらに、抗体の任意の断片又は修飾断片（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）は、断片がＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質との結合能を保持していれば、試薬として使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当該技術分野で既知であり、かかる抗体及びそれらの等価物を調製するために、任意の方法を本発明で利用することができる。さらに抗体は、直接連結又は間接的な標識法によってシグナル生成分子で標識することができる。抗体を標識し、抗体とそれらの標的との結合を検出するための標識及び方法が当該技術分野で既知であり、任意の標識及び方法を本発明に利用することができる。その上、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質を検出する試薬を２つ以上キットに包含させることができる。
【０２２６】
さらに生物活性は、例えば生体試料で発現したＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質によって細胞増殖活性を測定することによって求めることができる。例えば、細胞を患者から得た生体試料の存在下で培養し、それから増殖速度を検出すること又は細胞周期若しくはコロニー形成能を測定することによって、生体試料の細胞増殖活性を求めることができる。必要であれば、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δのｍＲＮＡを検出する試薬は固体マトリクス上に固定することができる。その上、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質の生物活性を検出する試薬を２つ以上キットに包含させることができる。
【０２２７】
キットは、上述の試薬を２つ以上含み得る。さらに、キットは、固体マトリクスと、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子に対するプローブと結合する試薬又はＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質に対する抗体と、細胞を培養するための培地及び容器と、陽性及び陰性の対照試薬と、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体とを含み得る。例えば、予後が良好な又は予後不良の患者から得られた組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットはさらに、商業的視点及び使用者視点から望まれる他の材料（バッファー、希釈剤、フィルタ、ニードル、シリンジ、及び使用者用取扱説明書に同封された添付文書（例えば、書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む）を含み得る。これらの試薬等が、標識を備える容器内に含まれ得る。好適な容器としては、ボトル、バイアル及び試験管が挙げられる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックで構成され得る。
【０２２８】
本発明の一実施形態として、試薬がＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δのｍＲＮＡに対するプローブである場合、試薬は、固体マトリクス、例えば多孔性ストリップ上で固定し、少なくとも１つの検出部位を形成することができる。多孔性ストリップの測定領域又は検出領域は、それぞれが核酸（プローブ）を含有する複数の部位を含み得る。試験ストリップは、陰性及び／又は陽性の対照に関する部位も含有し得る。代替的に、対照部位は、試験ストリップから分けられたストリップ上に位置し得る。任意で、異なる検出部位は、異なる量の固定化核酸、すなわち第１の検出部位ではより多量に及びその後の部位ではより少量に含有することができる。試験試料の添加の際、検出可能なシグナルを提示する部位の数は、試料中に存在するＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δのｍＲＮＡ量の定量的指標を与える。検出部位は、任意の好適に検出可能な形状で構成されていてもよく、典型的に試験ストリップ幅に広がるバー又はドットの形状である。
【０２２９】
本発明のキットはさらに、陽性対照試料又はＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ標準試料を含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ陽性血液試料を採取することによって調製することができ、それからそのＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δレベルを分析する。代替的に、精製ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δタンパク質又はポリヌクレオチドを、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ無含有血清に添加し、陽性試料又はＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ標準を形成することができる。本発明では、精製ＫＤＤ１は組換えタンパク質であり得る。陽性対照試料のＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δレベルは例えば、カットオフ値を超える。
【０２３０】
肺癌の血清学的診断
被験体から得た血液試料におけるＥＢＩ３のレベルを測定することにより、被験体においてＥＢＩ３を発現する癌の発生、又は癌を発症する素因を判定することができる。癌は肺癌、例えばＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣであり得る。さらに、ＳＣＬＣは肺腺癌及び肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）を含む。したがって、本発明は、血液試料におけるＥＢＩ３のレベルを求めること（例えば測定すること）を包含する。本発明において、肺癌を診断する方法はまた、肺癌を試験又は検出する方法を含む。代替的には、本発明においては、肺癌の診断とは、被験体における肺癌の疑い、危険性、又は可能性を示すことも指す。
【０２３１】
代替的には、被験体から得た血液試料におけるＮＰＴＸ１のレベルを測定することにより、被験体においてＮＰＴＸ１を発現するＳＣＣの発生、又はＳＣＣを発症する素因を判定することができる。したがって、本発明は、血液試料におけるＮＰＴＸ１のレベルを求めること（例えば測定すること）を包含する。本発明において、ＳＣＣを診断する方法はまた、ＳＣＣを試験又は検出する方法を含む。代替的には、本発明においては、ＳＣＣの診断とは、被験体におけるＳＣＣの疑い、危険性、又は可能性を示すことも指す。
【０２３２】
ＥＢＩ３又はＮＰＴＸ１の遺伝子又はタンパク質のいずれかを試料中で検出することができる限り、任意の血液試料をＥＢＩ３又はＮＰＴＸ１のレベルを求めるために使用することができる。好ましくは、血液試料は全血、血清、及び血漿を含む。
【０２３３】
本発明において、「血液試料におけるＮＰＴＸ１のＥＢＩ３のレベル」とは、全血における赤血球容積を補正した後、血中に存在するＥＢＩ３又はＮＰＴＸ１の濃度を指す。当業者は、血中の赤血球容積率が個体間で大きく異なることを認識するであろう。例えば、全血における赤血球の割合は男性と女性との間で非常に異なる。さらに、個体間の差は無視することはできない。したがって、血球成分を含む全血中の物質の見かけの濃度は、赤血球容積率に応じて大きく異なる。例えば、血清中の濃度が同じであっても、大量の血球成分を有する試料に対する測定値は、少量の血球成分を有する試料に対する値より低くなる。したがって、血中の成分の測定値を比較するために、赤血球容積を補正した値が通常使用される。
【０２３４】
例えば、血球を全血から分離することにより得られた血清又は血漿を試料として用いて、血中の成分を測定することにより、赤血球容積の影響を除外した測定値を得ることができる。したがって、本発明におけるＥＢＩ３又はＮＰＴＸ１のレベルは通常、血清又は血漿中の濃度として求めることができる。代替的には、該レベルを初めに全血中の濃度として測定し、次に赤血球容積の影響を補正してもよい。全血試料中の赤血球容積を測定する方法は既知である。
【０２３５】
本発明の方法により肺癌又はＳＣＣに関して診断される被験体は、哺乳類が好ましく、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシが含まれる。本発明の好ましい被験体はヒトである。
【０２３６】
本発明において、被験体は肺癌の疑いがある患者であっても、又は健常個体であってもよい。患者は臨床意思決定を円滑にするために本発明により診断されてもよい。別の実施形態では、本発明はまた、肺癌又はＳＣＣをスクリーニングするために健常個体に適用され得る。
【０２３７】
さらに、被験体の状態を検査した中間結果も提供され得る。かかる中間結果を、医師、看護師、又は他の施術者が、被験体が疾患を患っていることを診断する助けとなるさらなる情報と組み合わせてもよい。代替的には、本発明は、被験体から得た組織において癌細胞を検出し、被験体が疾患を患っていることを診断するのに有用な情報を医師に提供するために使用され得る。
【０２３８】
本発明の一実施形態では、ＥＢＩ３のレベルは、血液試料におけるＥＢＩ３タンパク質の量又は濃度を測定することにより求められる。血液試料におけるＥＢＩ３タンパク質の量を求める方法には、イムノアッセイ法が含まれる。
【０２３９】
本発明の診断方法では、ＥＢＩ３の血中濃度に加えて、ＣＥＡ又はｐｒｏ−ＧＲＰの血中濃度を肺癌を検出するために求めてもよい。したがって、本発明は、ＥＢＩ３の血中濃度又はＣＥＡ若しくはｐｒｏ−ＧＲＰの血中濃度のいずれか、又はそれらの血中濃度の両方が健常個体と比較して高い場合に肺癌が検出される、肺癌を診断する方法を提供する。
【０２４０】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、肺癌を含む癌の腫瘍マーカーとしてよく研究されている。
【０２４１】
ガストリン放出ペプチド前駆体（ｐｒｏ−ＧＲＰ）は、小細胞肺癌において有用なマーカーである。上記のように、ＣＥＡ又はｐｒｏ−ＧＲＰは、肺癌を診断又は検出するための血清学的マーカーとして既に使用されている。しかしながら、肺癌に対するマーカーとしてのＣＥＡ又はｐｒｏ−ＧＲＰの感度は、肺癌を完全に検出するには幾らか不十分である。したがって、肺癌の診断感度を改善することが必要とされる。
【０２４２】
本発明において、肺癌に対する新規の血清学的マーカーであるＥＢＩ３が提供される。肺癌に関する診断又は検出の方法の感度の改善が、本発明により達成され得る。すなわち、本発明は、
（ａ）血液試料を診断を受ける被験体から採取する工程、
（ｂ）血液試料におけるＥＢＩ３のレベルを求める工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）において求められるＥＢＩ３レベルを、正常対照のＥＢＩ３レベルと比較する工程を含む、被験体において肺癌を診断する方法を提供するが、ここで血液試料におけるＥＢＩ３レベルが正常対照と比較して高いことにより、被験体が肺癌を患っていることが示唆される。代替的には、本発明は、
（ａ）診断を受ける被験体から採取した血液試料におけるＥＢＩ３のレベルを求める工程、及び
（ｂ）工程（ａ）において求められるＥＢＩ３レベルを、正常対照のＥＢＩ３レベルと比較する工程を含む、被験体においてＳＣＣを診断する方法を提供するが、ここで血液試料におけるＥＢＩ３レベルが正常対照と比較して高いことにより、被験体が肺癌を患っていることが示唆される。
【０２４３】
好ましい実施形態では、ＮＳＣＬＣの場合、本発明の診断又は検出の方法は、
（ｄ）血液試料におけるＣＥＡのレベルを求める工程、
（ｅ）工程（ｄ）において求められるＣＥＡレベルを、正常対照のＣＥＡレベルと比較する工程、及び
（ｆ）血液試料において、正常対照と比較して高いＥＢＩ３レベル及び高いＣＥＡレベルのいずれか又は両方が、被験体が肺癌、特にＮＳＣＬＣを患っていることを示唆すると判断する工程をさらに含み得る。
【０２４４】
ＥＢＩ３とＣＥＡとの組み合わせにより、肺癌、特にＮＳＣＬＣの検出に関する感度が有意に改善され得る。例えば、下記で論じられる実施例において分析される群では、肺癌に関するＣＥＡの陽性率は約４０．０％である。それに対し、ＣＥＡとＥＢＩ３との組み合わせの陽性率は６４．９％まで上昇する（図４Ｃの左パネル）。本発明において、「ＣＥＡとＥＢＩ３との組み合わせ」とは、マーカーとして使用されるＣＥＡレベル及びＥＢＩ３レベルのいずれか又は両方を指す。好ましい実施形態では、ＣＥＡ及びＥＢＩ３のいずれかに陽性の患者は、肺癌の高い危険性を有すると判断され得る。肺癌に対する血清学的マーカーとしてのＥＢＩ３とＣＥＡとの組み合わせの使用は新しい。
【０２４５】
ＳＣＣの患者に対するＲＯＣ分析により、感度が４８．６％（３７人中１８人）、特異度が２．３％（１３０人中３人、図４Ｃの中央上パネル）で、ＣＹＦＲＡのカットオフ値が２．０ｎｇ／ｍｌと決定される。血清ＥＢＩ３とＣＹＦＲＡとの間の相関係数は、有意ではなく（スピアマンの順位相関係数：ρ（ｒｈｏ）＝−０．１１７、Ｐ＝０．４８１７）、血清において両方のマーカーを測定することで、ＳＣＣ検出の総合感度を７８．５％まで改善することができることが示唆される（ＳＣＣの診断について、ＣＹＦＲＡ単独の感度は４８．６％（３７人中１８人）、ＥＢＩ３単独の感度は５４．１％（３７人中２０人）である）。正常ボランティア（対照群）における２つの腫瘍マーカーのいずれかに対する偽陽性率は４．６％（１３０人中６人）であったが、同じ対照群におけるＣＹＦＲＡ及びＥＢＩ３各々に対する偽陽性率は、２．３％（１３０人中３人）及び２．３％（１３０人中３人、図４Ｃの中央下パネル）。
【０２４６】
ＳＣＣの場合、本発明の診断又は検出の方法は、
（ｄ）血液試料におけるＣＹＦＲＡのレベルを求める工程、
（ｅ）工程（ｄ）において求められるＣＹＦＲＡレベルを、正常対照のＣＹＦＲＡレベルと比較する工程、及び
（ｆ）血液試料において、正常対照と比較して高いＥＢＩ３及び高いＣＹＦＲＡレベルのいずれか又は両方が、被験体が肺癌、特にＳＣＣを患っていることを示唆すると判断する工程をさらに含み得る。
【０２４７】
代替的には、ＳＣＬＣの場合、本発明の診断又は検出の方法は、
（ｄ）血液試料においてｐｒｏ−ＧＲＰのレベルを求める工程、
（ｅ）工程（ｄ）において求められるｐｒｏ−ＧＲＰレベルを、正常対照のｐｒｏ−ＧＲＰレベルと比較する工程、及び
（ｆ）血液試料において、正常対照と比較して高いＥＢＩ３及び高いｐｒｏ−ＧＲＰレベルのいずれか又は両方が、被験体が肺癌、特にＳＣＬＣを患っていることを示唆すると判断する工程をさらに含み得る。
【０２４８】
ＥＢＩ３とｐｒｏ−ＧＲＰとを組み合わせることで、肺癌、特にＳＣＬＣの検出に対する感度は有意に改善され得る。例えば、下記で論じられる実施例において分析される群では、肺癌に関するｐｒｏ−ＧＲＰの陽性率は約６７．５％である。それに対し、ｐｒｏ−ＧＲＰとＥＢＩ３との組み合わせの陽性率は７６．３％まで上昇する（図４Ｃの右パネル）。本発明おいて、「ｐｒｏ−ＧＲＰとＥＢＩ３との組み合わせ」とは、マーカーとして使用されるｐｒｏ−ＧＲＰレベル及びＥＢＩ３レベルのいずれか又は両方を指す。好ましい実施形態では、ｐｒｏ−ＧＲＰ及びＥＢＩ３のいずれかに陽性の患者は、肺癌の高い危険性を有すると判断され得る。肺癌に対する血清学的マーカーとしてのＥＢＩ３とｐｒｏ−ＧＲＰとの組み合わせの使用は本発明の新たな発見である。
【０２４９】
したがって、本発明は、ＣＥＡ又はｐｒｏ−ＧＲＰ単独を測定した結果に基づく決定と比較して、肺癌患者の検出に対する感度を大いに改善することができる。この改善の背景には、ＣＥＡ陽性患者又はｐｒｏ−ＧＲＰ陽性患者の群と、ＥＢＩ３陽性患者の群とは完全に一致しないという事実がある。
【０２５０】
例えば、ＣＥＡ又はｐｒｏ−ＧＲＰの測定の結果、標準値より低い値を有する（すなわち肺癌を有しない）ことが決定された患者のうち、実際には、或る特定の割合で肺癌を有する患者が存在する。かかる患者はＣＥＡ偽陰性患者又はｐｒｏ−ＧＲＰ偽陰性患者と称される。ＣＥＡ又はｐｒｏ−ＧＲＰに基づく決定と、ＥＢＩ３に基づく決定とを組み合わせることにより、ＣＥＡ偽陰性患者又はｐｒｏ−ＧＲＰ偽陰性患者の中から、ＥＢＩ３値が標準値を超える患者を見つけ出すことができる。すなわち、本発明は、ＣＥＡ又はｐｒｏ−ＧＲＰの血中濃度が低いために「陰性」であると誤って決定された患者の中から、実際に肺癌を有する患者を同定する手段を提供する。肺癌患者の検出に対する感度は、本発明によってこのようにして改善される。一般に、複数のマーカーを用いた決定による結果を単に組み合わせることで検出感度を高めることができるが、一方で、それにより特異度が低下することが多い。しかしながら、本発明においては、感度と特異度との間の最良のバランスを求めることにより、特異度を損なうことなく検出感度を高めることのできる特性の組み合わせを求めた。
【０２５１】
本発明において、ＣＥＡ又はｐｒｏ−ＧＲＰの測定の結果を同時に検討するために、例えばＣＥＡ又はｐｒｏ−ＧＲＰの血中濃度を測定し、ＥＢＩ３の測定値と標準値との間の上述の比較と同様にして標準値と比較してもよい。例えば、ＣＥＡ又はｐｒｏ−ＧＲＰの血中濃度を測定し、それを標準値と比較する方法は既に知られている。さらに、ＣＥＡ又はｐｒｏ−ＧＲＰ用のＥＬＩＳＡキットも市販されている。既知の報告に記載されるこれらの方法を、肺癌を診断又は検出する本発明の方法において使用することができる。
【０２５２】
同様に、本発明のさらなる実施形態では、ＮＰＴＸ１のレベルは、血液試料におけるＮＰＴＸ１タンパク質の量又は濃度を測定することにより求められる。血液試料におけるＮＰＴＸ１タンパク質の量を求める方法には、イムノアッセイ法が含まれる。
【０２５３】
本発明の診断方法においては、ＳＣＣを検出するために、ＮＰＴＸの血中濃度に加えて、ＣＹＦＲＡの血中濃度を測定してもよい。したがって、本発明は、ＮＰＴＸ１の血中濃度若しくはＣＹＦＲＡの血中濃度のいずれか、又はそれらの両方が健常個体と比較して高い場合にＳＣＣが検出される、ＳＣＣを診断する方法を提供する。
【０２５４】
サイトケラチン１９フラグメント（ＣＹＦＲＡ、又はＣＹＦＲＡ２１−１）は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）と同様、癌の腫瘍マーカーとしてよく研究されている。ＣＹＦＲＡは非小細胞肺癌において有用なマーカーである。上記のように、ＣＹＦＲＡは、ＮＳＣＬＣを診断又は検出するための血清学的マーカーとして既に使用されている。しかしながら、ＳＣＣに対するマーカーとしてのＣＹＦＲＡの感度は、ＳＣＣを特に初期段階で完全に検出するには幾らか不十分である。したがって、ＳＣＣの診断感度を改善することが必要とされる。
【０２５５】
本発明において、ＳＣＣに対する新規の血清学的マーカーであるＮＰＴＸが提供される。ＳＣＣに関する診断又は検出の方法の感度の改善が、本発明により達成され得る。すなわち、本発明は、
（ａ）診断を受ける被験体から血液試料を採取する工程、
（ｂ）血液試料におけるＮＰＴＸ１のレベルを求める工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）において求められるＮＰＴＸ１レベルを、正常対照のＮＰＴＸ１レベルと比較する工程を含む、被験体においてＳＣＣを診断する方法を提供するが、ここで血液試料におけるＮＰＴＸ１レベルが正常対照と比較して高いことにより、被験体が肺癌を患っていることが示唆される。代替的には、本発明は、
（ａ）診断を受ける被験体から採取した血液試料におけるＮＰＴＸ１のレベルを求める工程、及び
（ｂ）工程（ａ）において求められるＮＰＴＸ１レベルを、正常対照のＮＰＴＸ１レベルと比較する工程を含む、被験体においてＳＣＣを診断する方法を提供するが、ここで血液試料におけるＮＰＴＸ１レベルが正常対照と比較して高いことにより、被験体が肺癌を患っていることが示唆される。
【０２５６】
好ましい実施形態では、ＳＣＣの場合、本発明の診断又は検出の方法は、
（ｄ）血液試料におけるＣＹＦＲＡのレベルを求める工程、
（ｅ）工程（ｄ）において求められるＣＹＦＲＡレベルを、正常対照のＣＹＦＲＡレベルと比較する工程、及び
（ｆ）血液試料において、正常対照と比較して高いＮＰＴＸ１レベル及び高いＣＹＦＲＡレベルのいずれか又は両方が、被験体がＳＣＣを患っていることを示唆すると判断する工程をさらに含み得る。
【０２５７】
ＮＰＴＸ１とＣＹＦＲＡとの組み合わせにより、ＳＣＣの検出に関する感度が有意に改善され得る。例えば、下記で論じられる実施例において分析される群では、ＳＣＣに関するＣＹＦＲＡの陽性率は約２９．４％である。それに対し、ＣＹＦＲＡとＮＰＴＸ１との組み合わせの陽性率は６２．３％まで上昇する。本発明において、「ＣＹＦＲＡとＮＰＴＸ１との組み合わせ」とは、マーカーとして使用されるＣＹＦＲＡレベル及びＮＰＴＸ１レベルのいずれか又は両方を指す。好ましい実施形態では、ＣＹＦＲＡ及びＮＰＴＸ１のいずれかに陽性の患者は、ＳＣＣの高い危険性を有すると判断され得る。ＳＣＣに対する血清学的マーカーとしてのＮＰＴＸ１とＣＹＦＲＡとの組み合わせの使用は新しい。
【０２５８】
したがって本発明は、単独でＣＹＦＲＡを測定する結果に基づいた測定に比べて、ＳＣＣの患者を検出する感度を大きく改善させることができる。ＣＹＦＲＡ陽性患者の群と、ＮＰＴＸ陽性患者の群とが完全には適合していないことが、この改善の基になっている（Behind）。
【０２５９】
例えば、ＣＹＦＲＡ測定の結果として、標準値よりも低い値を有する（すなわちＳＣＣではない）と判定された患者の中に、ＳＣＣを有する患者が実際に或る特定の割合で存在する。かかる患者は、ＣＹＦＲＡ偽陰性患者と称される。ＣＹＦＲＡに基づく測定をＮＰＴＸに基づく測定と組み合わせることによって、ＮＰＴＸ１値が標準値を超える患者をＣＹＦＲＡ偽陰性患者の中に見出すことができる。すなわち、ＣＹＦＲＡの血中濃度が低いために「陰性」であると誤って判断された患者の中から、本発明は、実際にＳＣＣである患者を見つける手段を提供する。したがって、ＳＣＣ患者を検出する感度が本発明によって改善された。概して、複数のマーカーを用いた測定結果を単純に組み合わせることで検出感度を増大させることができるが、他方で特異度の低減が引き起こされることが多い。しかしながら、感度と特異度との間の最良のバランスを求めることによって、本発明は、特異度を落とすことなく検出感度を増大させることができる特徴的な組合せを求めている。
【０２６０】
本発明において、同時にＣＹＦＲＡ測定の結果を考慮して、例えばＣＹＦＲＡの血液濃度を測定し、ＮＰＴＸの測定値と標準値との上述の比較と同じように、標準値と比較することができる。例えば、どのようにＣＹＦＲＡの血液濃度を測定し、どのようにそれを標準値と比較するかは既に知られている。さらに、ＣＹＦＲＡに対するＥＬＩＳＡキットも市販されている。既知のレポートに記載のこれらの方法は、ＳＣＣを診断又は検出するために本発明の方法に用いることができる。
【０２６１】
本発明においては、ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１の血中濃度の標準値は統計的に求めることができる。例えば、健常個体におけるＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１の血中濃度を測定して、標準的なＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１の血中濃度を統計的に決定することができる。統計的に十分な集団を集めた場合、平均値から標準偏差（Ｓ．Ｄ．）の２倍又は３倍の範囲にある値が大抵の場合、標準値として使用される。したがって、平均値＋２×Ｓ．Ｄ．又は平均値＋３×Ｓ．Ｄ．に対応する値が標準値として使用され得る。記載のように設定した標準値には、理論的には健常個体のそれぞれ９０％及び９９．７％が含まれる。
【０２６２】
代替的には、標準値はまた、肺癌又はＳＣＣ患者それぞれにおける実際のＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１の血中濃度に基づいて設定され得る。通常、このように設定される標準値は偽陽性率を最小限に抑え、検出感度を最大にすることのできる条件を満たす値の範囲から選択される。本明細書においては、偽陽性率とは、健常個体におけるＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１の血中濃度が標準値より高いと判断される患者の割合を指す。これに対し、健常個体におけるＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１の血中濃度が標準値より低いと判断される患者の割合は、特異度を示す。すなわち、偽陽性率と特異度との和は常に１となる。検出感度とは、肺癌の存在が断定された個体集団のうち全ての肺癌患者における、ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１の血中濃度が標準値より高いと判断される患者の割合を指す。
【０２６３】
さらに、本発明に関しては、ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１の濃度が標準値より高いと判断される患者における肺癌又はＳＣＣ患者の割合は、陽性予測値を表す。一方、ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１の濃度が標準値より低いと判断される患者における健常個体の割合は、陰性予測値を表す。これらの値の間の関係を表１にまとめる。下記に示す関係により示唆されるように、肺癌又はＳＣＣの診断精度を評価するための指標である感度、特異度、陽性予測値、及び陰性予測値に関する値は各々、ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸの血中濃度のレベルを判断するための標準値に応じて変化する。
【０２６４】
（表１）
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【０２６５】
既に述べたように、標準値は通常、偽陽性率が低く、感度が高いように設定される。しかしながら、上記に示す関係からまた明らかなように、偽陽性率と感度との間にはトレードオフがある。すなわち、標準値を下げると、検出感度は増大する。しかしながら、偽陽性率も増大するため、「低い偽陽性率」を有するという条件を満たすのは困難である。この状況を鑑みて、本発明においては、例えば以下の予測結果をもたらす値が代表的な標準値として選択され得る。
【０２６６】
偽陽性率が５０％以下である標準値（すなわち、特異度が５０％以上である標準値）。
【０２６７】
感度が２０％以上である標準値。
【０２６８】
本発明では、標準値は受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて設定することができる。ＲＯＣ曲線は、縦軸に検出感度、及び横軸に偽陽性率（すなわち、「１−特異度」）を示すグラフである。本発明においては、ＲＯＣ曲線は、高度／低度のＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ血中濃度を求めるための標準値を連続的に変化させて得られた、感度及び偽陽性率における変化をプロットすることにより得ることができる。
【０２６９】
ＲＯＣ曲線を得るための「標準値」は、統計的分析のために一時的に使用される値である。ＲＯＣ曲線を得るための「標準値」は一般に、全ての選択可能な標準値を包含可能な範囲内で、連続的に変化させることができる。例えば、標準値は、分析集団における最小及び最大のＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１測定値の間で変化させることができる。
【０２７０】
本発明において使用するのに好ましい標準値は、得られたＲＯＣ曲線に基づいて、上述の条件を満たす範囲から選択することができる。代替的には、標準値は、標準値を変化させることで作成したＲＯＣ曲線に基づいて、大部分のＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１測定値を含む範囲から選択することができる。
【０２７１】
血中のＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１は、タンパク質を定量化することのできる任意の方法により測定され得る。例えば、イムノアッセイ、液体クロマトグラフィー、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、質量分析等を本発明において使用することができる。質量分析においては、タンパク質は適切な内部標準を用いて定量化され得る。例えば、同位体標識ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１を内部標準として使用することができる。ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１の血中濃度は、血中のＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１のピーク強度及び内部標準のピーク強度から求めることができる。一般に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法がタンパク質の質量分析のために使用される。また、質量分析又は液体クロマトグラフィーを使用する分析法を用いて、他の腫瘍マーカー（例えばＣＥＡ又はｐｒｏ−ＧＲＰ）と同時にＥＢＩ３を分析することができる。代替的には、質量分析又は液体クロマトグラフィーを使用する分析方法を用いても、ＮＰＴＸ１を他の腫瘍マーカー（例えばＣＹＦＲＡ）と同時に分析することができる。
【０２７２】
本発明においては、ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１を測定するのに好ましい方法はイムノアッセイである。ＥＢＩ３のアミノ酸配列は既知である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００５７５５）。ＥＢＩ３のアミノ酸配列を配列番号２に示し、それをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。同様に、ＮＰＴＸ１のアミノ酸配列は既知である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００２５１３）。ＮＰＴＸ１のアミノ酸配列を配列番号７９に示し、それをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号７８に示す（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２５２２）。したがって、当業者は、抗体を、ＥＢＩ３又はＮＰＴＸ１のアミノ酸配列に基づいて必要な免疫原を合成することにより調製することができる。免疫原として使用されるペプチドは、ペプチドシンセサイザーを用いて容易に合成され得る。合成ペプチドは、担体タンパク質に結合させることにより免疫原として使用することができる。
【０２７３】
キーホールリンペットヘモシアニン、ミオグロビン、アルブミン等を担体タンパク質として使用することができる。例示的な担体タンパク質はＫＬＨ、ウシ血清アルブミン等である。合成ペプチドを担体タンパク質に結合させるために、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル法（以下、ＭＢＳ法と略記する）等が一般に使用される。
【０２７４】
具体的には、システインを合成ペプチドに導入し、ペプチドをシステインのＳＨ基を用いてＭＢＳによりＫＬＨと架橋させる。システイン残基は、合成ペプチドのＮ末端に導入しても、又はＣ末端に導入してもよい。
【０２７５】
代替的には、ＥＢＩ３及びＮＰＴＸ１は、それぞれＥＢＩ３のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００５７５５）及びＮＰＴＸ１のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２５２２）、又はその一部分を用いて調製することができる。必要なヌクレオチド配列を含むＤＮＡは、ＥＢＩ３又はＮＰＴＸ１発現組織から調製されるｍＲＮＡを用いてクローニングされ得る。代替的には、市販のｃＤＮＡライブラリをクローニング供給源として使用することができる。得られたＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１の遺伝子組み換え体、又はその断片も免疫原として使用することができる。このように発現されるＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１組み換え体は、本発明において使用される抗体を得るための免疫原として好ましい。
【０２７６】
このようにして得られた免疫原を適切なアジュバントと混合し、使用することで動物を免疫化する。既知のアジュバントには、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）及び不完全アジュバントが含まれる。免疫化の手順を抗体力価の上昇が確認されるまで適当な間隔で繰り返す。本発明において免疫化される動物については特に限定されない。具体的には、マウス、ラット、又はウサギ等の免疫化に一般に使用される動物を使用することができる。
【０２７７】
抗体をモノクローナル抗体として得る場合、それらの作製に有利な動物が使用され得る。例えばマウスにおいては、細胞融合のための多くの骨髄腫細胞株が知られており、ハイブリドーマを高い確率で樹立する技法は既によく知られている。したがって、マウスはモノクローナル抗体を得るために免疫化される動物として望ましい。
【０２７８】
さらに、免疫化処理はｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理に限定されない。培養免疫担当細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫感作する方法も採用され得る。これらの方法により得られる抗体産生細胞を形質転換及びクローニングする。抗体産生細胞を形質転換してモノクローナル抗体を得る方法は、細胞融合に限定されない。例えば、クローニング可能な形質転換体をウイルス感染により得る方法が知られている。
【０２７９】
本発明において使用されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１に対するそれらの反応性に基づいてスクリーニングすることができる。具体的には、抗体産生細胞をＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１、又はそのドメインペプチドに対する結合活性を指標として用いて初めに選択し、これを免疫原として使用した。このスクリーニングにより選択される陽性クローンを、必要に応じてサブクローニングする。
【０２８０】
本発明において使用されるモノクローナル抗体は、樹立したハイブリドーマを適切な条件下で培養し、産生された抗体を採取することにより得ることができる。ハイブリドーマがホモハイブリドーマである場合、ハイブリドーマは同系動物に腹腔内接種することによりｉｎ  ｖｉｖｏで培養することができる。この場合、モノクローナル抗体は腹水として採取される。ヘテロハイブリドーマを使用する場合、ハイブリドーマはヌードマウスを宿主として用いてｉｎ  ｖｉｖｏで培養することができる。
【０２８１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ培養に加えて、ハイブリドーマは一般に、適切な培養環境においてｅｘ  ｖｉｖｏでも培養される。例えば、ＲＰＭＩ  １６４０及びＤＭＥＭ等の基本培地が、ハイブリドーマ用の培地として一般に使用される。抗体産生能力を高いレベルに維持するために、動物血清等の添加物をこれらの培地に添加してもよい。ハイブリドーマをｅｘ  ｖｉｖｏで培養する場合、モノクローナル抗体を培養上清として採取することができる。培養上清は培養後に細胞から分離するか、又は中空糸を使用する培養装置を用いて培養しながら連続採取することにより採取することができる。
【０２８２】
本発明において使用されるモノクローナル抗体は、腹水又は培養上清として採取されるモノクローナル抗体から、免疫グロブリン画分を飽和硫安塩析によって分離することにより調製し、さらにゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー等により精製する。また、モノクローナル抗体がＩｇＧである場合、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーに基づく精製法が効果的である。
【０２８３】
一方、本発明において使用される抗体をポリクローナル抗体として得るために、抗体力価が免疫化後に増大される動物から採血し、血清を分離して抗血清を得る。免疫グロブリンを既知の方法により抗血清から精製し、本発明において使用される抗体を調製する。ＥＢＩ３特異的抗体は、ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１をリガンドとして使用するイムノアフィニティクロマトグラフィーを、免疫グロブリン精製と組み合わせることにより調製することができる。
【０２８４】
ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１に対する抗体がＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１に接触すると、抗体は、抗原−抗体反応を介して抗体により認識される抗原決定基（エピトープ）と結合する。抗体と抗原との結合は、様々なイムノアッセイ原理により検出することができる。イムノアッセイは、異種分析法と同種分析法とに大きく分類され得る。イムノアッセイの感度及び特異度を高レベルに維持するためには、モノクローナル抗体の使用が望ましい。ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１を様々なイムノアッセイ方式により測定する本発明の方法を、本明細書中でさらに具体的に説明する。
【０２８５】
最初に、物質（ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１）を異種イムノアッセイを用いて測定する方法を記載する。異種イムノアッセイにおいては、上記物質に結合する抗体を、該物質と結合しない抗体と分離した後で検出するための機構が必要とされる。
【０２８６】
分離を容易にするために、固定化試薬が一般に使用される。例えば、上記物質を認識する抗体が固定化された固相を初めに調製する（固定化抗体）。上記物質をこれらに結合させ、第２の抗体をさらにそれらに反応させる。
【０２８７】
固相を液相から分離し、必要に応じてさらに洗浄した後、固相上に残留する第２の抗体は上記物質の濃度に比例する。第２の抗体を標識すると、上記物質は標識に由来するシグナルを測定することにより定量化することができる。
【０２８８】
抗体を固相に結合させるために、任意の方法が使用され得る。例えば、抗体はポリスチレン等の疎水性材料に物理的に吸着させることができる。代替的には、抗体は表面上に官能基を有する多様な材料に化学的に結合させることができる。さらに、結合リガンドで標識した抗体を、リガンドの結合パートナーを用いて捕捉させることにより、固相に結合させることもできる。結合リガンドとその結合パートナーとの組み合わせには、アビジン−ビオチン等が含まれる。固相と抗体とは一次抗体と上記物質との反応と同時に、又はその前に共役させることができる。
【０２８９】
同様に、第２の抗体を直接標識する必要はない。すなわち、第２の抗体は抗体に対して抗体を用いて、又はアビジン−ビオチン反応等の結合反応を用いて間接的に標識することができる。
【０２９０】
試料中の上記物質の濃度は、該物質の濃度が既知の標準的な試料を用いて得られるシグナル強度に基づいて求められる。
【０２９１】
上述した異種イムノアッセイのための固定化抗体及び第２の抗体として、それが抗体であるか、又は上記物質を認識するその抗原結合部位を含む断片である限り、任意の抗体を使用することができる。したがって、抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は両方の混合物若しくは組み合わせであり得る。例えば、抗体とポリクローナル抗体との組み合わせが本発明において好ましい組み合わせである。代替的には、両方の抗体がモノクローナル抗体である場合、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体を組み合わせるのが好ましい。
【０２９２】
測定される抗原が抗体の間に挟まれるため、かかる異種イムノアッセイはサンドイッチ法と呼ばれる。サンドイッチ法は測定感度及び再現性に優れるため、本発明において好ましい測定原理である。
【０２９３】
競合的阻害反応の原理も異種イムノアッセイに適用され得る。具体的には、異種イムノアッセイは、試料中の上記物質が既知濃度の該物質と抗体との結合を競合的に阻害する現象に基づくイムノアッセイである。試料中の上記物質の濃度は、既知濃度の上記物質を標識して、抗体と反応した（又は反応しなかった）上記物質の量を測定することにより求めることができる。
【０２９４】
既知濃度の抗原及び試料中の抗原が、同時に抗体と反応すると競合的反応系が確立される。さらに、抗体を試料中の抗原と反応させ、その後既知濃度の抗原を反応させると阻害反応系による分析が可能である。どちらのタイプの反応系においても、操作性に優れる反応系は、試薬成分として使用される既知濃度の抗原、又は抗体のいずれか一方を標識成分として、他方を固定化試薬として設定することにより構築することができる。
【０２９５】
放射性同位体、蛍光物質、発光物質、酵素活性を有する物質、肉眼で観察可能な物質、磁気的に観察可能な物質等がこれらの異種イムノアッセイにおいて使用される。これらの標識物質の具体的な例を下記に示す。
【０２９６】
酵素活性を有する物質としては、
ペルオキシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、
ウレアーゼ、
カタラーゼ、
グルコースオキシダーゼ、
乳酸脱水素酵素、又は
アミラーゼ等が挙げられる。
【０２９７】
蛍光物質としては、
フルオレセインイソチオシアネート、
テトラメチルローダミンイソチオシアネート、
置換ローダミンイソチオシアネート、又は
ジクロロトリアジンイソチオシアネート等が挙げられる。
【０２９８】
放射性同位体としては、
トリチウム、
１２５Ｉ、又は
１３１Ｉ等が挙げられる。
【０２９９】
これらのうち、酵素等の非放射活性標識が安全性、操作性、感度等の観点から有利な標識である。酵素標識は抗体又はＥＢＩ３に、過ヨウ素酸法又はマレイミド法等の既知の方法により結合させることができる。
【０３００】
固相として、ビーズ、容器の内壁、微粒子、多孔質担体、磁性粒子等が使用される。例えばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、ガラス、金属、セラミック等の材料を用いて形成される固相を使用することができる。抗体等を化学的に結合する官能基を表面に導入した固体材料も知られている。例えばポリ−Ｌ−リシン処理又はグルタルアルデヒド処理の化学的結合、及び物理吸着を含む既知の結合法を、固相及び抗体（又は抗原）に適用することができる。
【０３０１】
本明細書中に例示される全ての異種イムノアッセイにおいて、固相を液相から分離する工程及び洗浄する工程が必要とされるが、これらの工程はサンドイッチ法の変形である免疫クロマトグラフィー法を用いて容易に行なうことができる。
【０３０２】
具体的には、固定化される抗体を、試料溶液を毛管現象により輸送することが可能な多孔質担体に固定化し、次に物質（ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１）及び標識抗体を含有する試料の混合物をこの毛管現象よりその中に展開する。展開の間、上記物質は標識抗体と反応し、固定化抗体とさらに接触すると、その配置に捕捉される。上記物質と反応しない標識抗体は、固定化抗体により捕捉されることなく通過する。
【０３０３】
結果として、固定化抗体の上記配置に残留する標識抗体のシグナルを指標として用いて、上記物質の存在を検出することができる。標識抗体を予め多孔質担体において上流に維持する場合、単に試料溶液中に滴下することで全ての反応を開始及び完了することができ、極めて単純な反応系を構築することができる。免疫クロマトグラフィー法においては、着色粒子等の肉眼で区別することのできる標識成分を組み合わせて、特別な読取装置さえも必要としない分析装置を構成することができる。
【０３０４】
さらに、免疫クロマトグラフィー法では、上記物質に対する検出感度を調節することができる。例えば、検出感度を下記に記載されるカットオフ値近くに調節することにより、カットオフ値を超えた場合にも上述の標識成分を検出することができる。かかる装置を用いることにより、被験体が陽性であるか、又は陰性であるかを非常に単純に判断することができる。肉眼による標識の区別を可能にする構成を採用することによって、単に血液試料を免疫クロマトグラフィー用の装置に適用することで必要な検査結果が得られ得る。
【０３０５】
免疫クロマトグラフィー法の検出感度を調節する様々な方法が当該技術分野では知られている。例えば、検出感度を調節するための第２の固定化抗体を、試料が適用される位置と固定化抗体との間に位置付けることができる（特開平６−３４１９８９号公報（未審査公開特許公報））。試料中の上記物質は、試料を適用した位置から、標識検出のための第１の固定化抗体の位置へと展開される間に第２の固定化抗体により捕捉される。第２の固定化抗体が飽和した後、上記物質は下流に位置する第１の固定化抗体の位置に到達し得る。結果として、試料中に含まれる上記物質の濃度が予め定められている濃度を超える場合、標識抗体に結合した上記物質が第１の固定化抗体の位置で検出される。
【０３０６】
次に、同種イムノアッセイを説明する。上記で記載されるように反応溶液の分離を必要とする異種イムノアッセイ法とは対照的に、物質（ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１）は同種分析法を用いても測定することができる。同種分析法は、抗原−抗体反応の生成物の検出を、それらを反応溶液から分離することなく可能にする。
【０３０７】
代表的な同種分析法は、免疫沈降反応であるが、この場合抗原性物質は、抗原−抗体反応の後に生成される沈降物を検査することにより定量的に分析される。免疫沈降反応にはポリクローナル抗体が一般に使用される。モノクローナル抗体を適用する場合、上記物質の異なるエピトープに結合する、複数のタイプのモノクローナル抗体を使用するのが好ましい。免疫反応に続く沈降反応の生成物は肉眼で観察されるか、又は光学的に測定して数量データに変換することができる。
【０３０８】
抗原による抗体感作した微粒子の凝集を指標として使用する、免疫学的粒子凝集反応は一般的な同種分析法である。上述の免疫沈降反応と同様に、ポリクローナル抗体又は複数のタイプのモノクローナル抗体の組み合わせを、この方法においても使用することができる。微粒子は、抗体の混合物で感作することにより抗体で感作するか、又は各々の抗体で別個に感作した粒子を混合することにより調製することができる。このようにして得られる微粒子は、上記物質と接触するとマトリクス様反応生成物を生じる。該反応生成物は、粒子の凝集として検出することができる。粒子の凝集は肉眼で観察され得るか、又は光学的に測定して数量データに変換することができる。
【０３０９】
エネルギー移動及び酵素チャネリングに基づく免疫学的分析法は、同種イムノアッセイとして知られる。エネルギー移動を利用する方法において、ドナー／アクセプタ関係を有する異なる光学標識が、抗原上の隣接エピトープを認識する複数の抗体に結合する。免疫反応が起こると、この２つの部分が接近してエネルギー移動現象が起こり、例えば消光又は蛍光波長における変化等のシグナルが生じる。一方、酵素チャネリングは隣接エピトープに結合する複数の抗体の標識を利用するが、この場合標識は、一方の酵素の反応生成物が他方の酵素の基質であるような関係を有する酵素の組み合わせである。この２つの部分が免疫反応により接近すると、酵素反応が促進され、したがって、それらの結合は酵素反応速度における変化として検出することができる。
【０３１０】
本発明においては、ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１の測定のための血液は、患者から採血した血液から調製することができる。好ましい血液試料は血清又は血漿である。血清又は血漿の試料は測定の前に希釈することができる。代替的には、全血を試料として測定することができ、得られた測定値を補正して血清中濃度を求めることができる。例えば、全血における濃度は、同じ血液試料中の血球体積百分率を求めることにより血清中濃度に補正され得る。
【０３１１】
好ましい実施形態では、イムノアッセイはＥＬＩＳＡである。本発明者らは、肺癌患者における血清ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１を検出するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを確立した。
【０３１２】
次に、血液試料中のＥＢＩ３レベル及び／又はＮＰＴＸ１レベルを、正常対照試料等の参照試料に関するＥＢＩ３レベル及び／又はＮＰＴＸ１レベルと比較した。「正常対照レベル」という表現は、典型的には肺癌又はＳＣＣをそれぞれ患っていない集団の血液試料において見られるＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１レベルを指す。参照試料は好ましくは試験試料と同様の性質を有する。例えば、試験試料が患者の血清を含む場合、参照試料も血清でなくてはならない。対照被験体及び試験被験体に由来する血液試料におけるＥＢＩ３レベル及び／又はＮＰＴＸ１レベルは、同時に求めてもよく、又は代替的には、対照群から予め採取した試料におけるＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１レベルを分析することにより得られる結果に基づく統計的方法によって、正常対照レベルを求めてもよい。
【０３１３】
ＥＢＩ３レベル及び／又はＮＰＴＸ１レベルはまた、肺癌又はＳＣＣの治療過程をモニタリングするために使用してもよい。この方法において、試験血液試料は肺癌又はＳＣＣに対する治療を受けている被験体から提供される。好ましくは、複数の試験血液試料を治療前、治療中、又は治療後の様々な時点で被験体から得る。次に、治療後の試料におけるＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１レベルを治療前の試料におけるＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１レベル、又は代替的には参照試料におけるＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１レベル（例えば正常対照レベル）と比較してもよい。例えば、治療後のＥＢＩ３レベル又はＮＰＴＸ１レベルが治療前のＥＢＩ３レベル及び／又はＮＰＴＸ１レベルより低い場合、その治療は効果的であったと結論付けることができる。同様に、治療後のＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１レベルが正常対照ＥＢＩ３レベル及び／又はＮＰＴＸ１レベルと同様である場合にも、その治療は効果的であったと結論付けることができる。
【０３１４】
「効果的な」治療は、ＥＢＩ３及び／又はＮＰＴＸ１レベルを低下させるか、又は被験体における肺癌のサイズ、有病率、又は転移能を減少させる治療である。治療を予防的に適用する場合、「効果的な」とは、治療が肺癌（又はＳＣＣ）の発生を遅らせる若しくは予防するか、又は肺癌（又はＳＣＣ）の臨床症状を緩和することを意味する。肺癌（又はＳＣＣ）の判定は標準的な臨床プロトコルを用いて行なうことができる。さらに、治療の有効性は、肺癌（又はＳＣＣ）を診断又は治療する任意の既知の方法に関して求められ得る。例えば、肺癌は病理組織学的に、又は症状の異常を同定することにより日常的に診断される。
【０３１５】
肺癌の血清学的診断のためのキット
本発明による肺癌の診断を実行するために使用される成分を予め組み合わせて、試験キットとして供給することができる。したがって、本発明は、
（ｉ）血液試料におけるＥＢＩ３レベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
（ｉｉ）ＥＢＩ３に対する陽性対照試料を含有する、肺癌を検出するためのキットを提供する。
【０３１６】
好ましい実施形態では、本発明のキットは、
（ｉｉｉ）血液試料におけるＣＥＡ又はｐｒｏ−ＧＲＰレベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
（ｉｖ）ＣＥＡ及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰに対する陽性対照試料をさらに含有し得る。
【０３１７】
代替的には、本発明によるＳＣＣの診断を実行するために使用される成分を予め組み合わせて、試験キットとして供給することができる。したがって、本発明は、
（ｉ）血液試料におけるＮＰＴＸ１レベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
（ｉｉ）ＮＰＴＸ１に対する陽性対照試料を含有する、肺癌を検出するためのキットを提供する。
【０３１８】
好ましい実施形態では、本発明のキットは、
（ｉｉｉ）血液試料におけるＣＹＦＲＡレベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
（ｉｖ）ＣＹＦＲＡに対する陽性対照試料をさらに含有し得る。
【０３１９】
本発明のキットを構成するイムノアッセイ用の試薬は、上記に記載される様々なイムノアッセイに必要な試薬を含み得る。具体的には、イムノアッセイ用の試薬には、測定される物質を認識する抗体が含まれる。抗体はイムノアッセイのアッセイ形式に応じて修飾することができる。本発明の好ましいアッセイ形式としてＥＬＩＳＡを使用することができる。ＥＬＩＳＡにおいては、例えば固相上に固定化される第１の抗体、及び標識を有する第２の抗体が一般に使用される。
【０３２０】
したがって、ＥＬＩＳＡ用のイムノアッセイ試薬は、固相担体上に固定化される第１の抗体を含み得る。微粒子又は反応容器の内壁を固相担体として使用することができる。微粒子として磁性粒子を使用することができる。代替的には、例えば９６ウェルマイクロプレートのマルチウェルプレートが、反応容器として使用されることが多い。９６ウェルマイクロプレートよりも体積の小さいウェルを高密度で備える、多数の試料を処理するための容器も知られている。本発明においては、これらの反応容器の内壁を固相担体として使用することができる。
【０３２１】
ＥＬＩＳＡ用のイムノアッセイ試薬は、標識を有する第２の抗体をさらに含み得る。ＥＬＩＳＡ用の第２の抗体は、酵素が直接又は間接的に結合した抗体であり得る。酵素を抗体に化学的に結合させる方法は既知である。例えば、免疫グロブリンを酵素的に切断して、可変領域を含む断片を得ることができる。これらの断片に含まれる−ＳＳ−結合を−ＳＨ基に還元することにより、二官能性リンカーを付着させることができる。酵素を二官能性リンカーに予め結合させることにより、酵素を抗体断片に結合させることができる。
【０３２２】
代替的には、酵素を間接的に結合させるために、例えばアビジン−ビオチン結合を使用することができる。すなわち、ビオチン化した抗体をアビジンが付着した酵素と接触させることにより、酵素を抗体に間接的に結合させることができる。また、第２の抗体を認識する酵素で標識した抗体である第３の抗体を用いて、酵素を第２の抗体に間接的に結合させることができる。例えば、酵素（例えば上記で例示される酵素）を、抗体を標識するための酵素として使用することができる。
【０３２３】
本発明のキットは、ＥＢＩ３に対する陽性対照を含む。ＥＢＩ３に対する陽性対照は、濃度を予め求めたＥＢＩ３を含む。好ましい濃度は、例えば本発明の試験方法における標準値として設定された濃度を含む。代替的には、より濃度の高い陽性対照も組み合わせることができる。本発明のＥＢＩ３に対する陽性対照は、濃度が予め求められているＣＥＡ及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰをさらに含むことができる。ＥＢＩ３、ＣＥＡ、及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰを含む陽性対照は本発明の陽性対照として好ましい。
【０３２４】
したがって、本発明はＥＢＩ３及びＣＥＡ及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰを正常値より高い濃度で含む、肺癌を検出するための陽性対照を提供する。代替的には、本発明は、肺癌の検出のための陽性対照の生成における、ＥＢＩ３及びＣＥＡ及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰを正常値より高い濃度で含有する血液試料の使用に関する。ＣＥＡ及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰは、肺癌に関する指標としての役割を果たすことができることが知られている。しかしながら、ＥＢＩ３が肺癌に関する指標としての役割を果たすことができることが本発明により得られる新規の発見である。したがって、ＣＥＡ及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰの他にＥＢＩ３を含む陽性対照は、新規である。本発明の陽性対照は、ＣＥＡ及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰ並びにＥＢＩ３を標準値よりも高い濃度で血液試料に添加することによって調製されることができる。例えば、標準値よりも高い濃度でＣＥＡ及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰ並びにＥＢＩ３を含む血清が本発明の陽性対照として好ましい。
【０３２５】
代替的には、本発明のキットはＮＰＴＸ１に対する陽性対照を含み得る。ＮＰＴＸ１に対する陽性対照は、濃度を予め求めたＮＰＴＸ１を含む。好ましい濃度は、例えば本発明の試験方法における標準値として設定された濃度である。代替的には、より濃度の高い陽性対照も組み合わせることができる。本発明におけるＮＰＴＸ１に対する陽性対照は、濃度を予め求めたＣＹＦＲＡをさらに含み得る。ＮＰＴＸ１及び／又はＣＹＦＲＡを含む陽性対照は、本発明のＳＣＣを検出するための陽性対照として好ましい。
【０３２６】
したがって、本発明はＮＰＴＸ１及びＣＹＦＲＡを正常値より高い濃度で含む、ＳＣＣを検出するための陽性対照を提供する。代替的には、本発明は、ＳＣＣの検出のための陽性対照の作製における、ＮＰＴＸ１及びＣＹＦＲＡを正常値より高い濃度で含有する血液試料の使用に関する。ＣＹＦＲＡがＮＳＣＬＣに対する指標として機能し得ることは知られている。しかしながら、ＮＰＴＸ１がＳＣＣに対する指標として機能し得ることは、本発明によって得られた新たな発見である。したがって、ＣＹＦＲＡに加えてＮＰＴＸ１を含む陽性対照は新しい。本発明の陽性対照は、ＣＹＦＲＡ及びＮＰＴＸ１を標準値より高い濃度で血液試料に添加することにより調製することができる。例えば、ＣＹＦＲＡ及びＮＰＴＸ１を標準値より高い濃度で含む血清が、本発明の陽性対照として好ましい。
【０３２７】
本発明における陽性対照は好ましくは液体形態である。本発明においては、血液試料が試料として使用される。したがって、対照として使用される試料も液体形態である必要がある。代替的には、乾燥陽性対照を使用時に所定の量の液体で溶解することにより、試験濃度を与える対照を調製することができる。乾燥陽性対照と共に、それを溶解するのに必要な量の液体を梱包することにより、使用者はそれらを単に混合するだけで必要な陽性対照を得ることができる。陽性対照として使用されるＥＢＩ３又はＮＰＴＸ１は天然由来のタンパク質であっても、又は組み換えタンパク質であってもよい。陽性対照だけでなく、陰性対照を本発明のキットにおいて組み合わせることもできる。陽性対照又は陰性対照は、イムノアッセイにより示される結果が正確であることを確認するために使用される。
【０３２８】
抗肺癌化合物のためのスクリーニング
本発明に関して、本スクリーニング法により同定される薬剤は任意の化合物であっても、又は幾つかの化合物を含む組成物であってもよい。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞又はタンパク質に曝露される試験薬剤は、単一の化合物であっても、又は化合物の組み合わせであってもよい。化合物の組み合わせを方法に使用する場合、化合物は順次又は同時に接触させることができる。
【０３２９】
本発明のスクリーニング法においては、任意の試験薬剤、例えば細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵産物、海洋生物の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質又は粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微低分子化合物（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアプタマー等の核酸構築物等を含む）、及び天然化合物を使用することができる。本発明の試験薬剤はまた、（１）生物学的ライブラリ法、（２）空間的にアドレス可能なパラレル固相又は溶液相ライブラリ法、（３）デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、（４）「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、及び（５）アフィニティクロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む、当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができる。アフィニティクロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチは化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、又は低分子ライブラリにも適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67）。分子ライブラリを合成する方法の例は、当該技術分野において見つけることができる（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13、Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6、Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994、Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061、Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51）。化合物のライブラリは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照）、又はビーズ（Lam, Nature 1991, 354: 82-4）、チップ（Fodor, Nature 1993, 364: 555-6）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号明細書、同第５，４０３，４８４号明細書、及び同第５，２２３，４０９号明細書）、プラスミド（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9）、若しくはファージ（Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90、Devlin, Science 1990, 249: 404-6、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10、米国特許出願第２００２−１０３３６０号明細書）上に提供され得る。
【０３３０】
本スクリーニング法のいずれかによってスクリーニングした化合物の構造の一部を付加、欠失、及び／又は置換により変換した化合物は、本発明のスクリーニング法により得られる薬剤に含まれる。
【０３３１】
さらに、スクリーニングした試験作用物質がタンパク質である場合、タンパク質をコードするＤＮＡを得るために、タンパク質の全アミノ酸配列を求めて、タンパク質をコードする核酸配列を推測するか、又は得られるタンパク質の部分アミノ酸配列を分析して、該配列に基づいてオリゴＤＮＡをプローブとして調製し、該プローブを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。得られるＤＮＡは、癌を治療又は予防するための候補である試験作用物質を調製する上での使用が見出される。
【０３３２】
本明細書中に記載されるスクリーニングに有用な試験薬剤はまた、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δタンパク質、又はｉｎ  ｖｉｖｏで元のタンパク質の生物活性を欠くその部分ペプチドに特異的に結合する抗体であり得る。
【０３３３】
試験薬剤ライブラリの構築は当該技術分野においてよく知られているが、以下に、本スクリーニング方法のための試験薬剤の同定及びかかる薬剤のライブラリの構築に関するさらなる指針を与える。
【０３３４】
（ｉ）分子モデリング：
試験薬剤ライブラリの構築は、求められる特性を有することが知られる化合物の分子構造、及び／又は阻害される標的分子、すなわちＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δの分子構造の情報により容易になる。さらなる評価に適切な試験薬剤を予備スクリーニングする一アプローチは、試験薬剤とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングである。
【０３３５】
コンピュータモデリング技術により、選択した分子の三次元原子構造の可視化、及び該分子と相互作用する新たな化合物の合理的設計が可能になる。三次元構成は典型的には選択した分子のｘ線結晶学的分析又はＮＭＲイメージングのデータに依存する。分子ダイナミクスは力場データを必要とする。コンピュータグラフィックスシステムは、新たな化合物が標的分子にどのように結合するかを予測可能にし、結合特異性を完全なものにする化合物及び標的分子の構造の実験的操作を可能にする。分子−化合物相互作用が、小さい変化が一方又は両方に加えられる場合に何であるか予測するには、通常は分子設計プログラム及び使用者との間のユーザーフレンドリーなメニュー形式のインターフェースを備えた、分子力学ソフトウェア及び計算主体の（computationally intensive）コンピュータが必要とされる。
【０３３６】
上記に概説される分子モデリングシステムの例には、ＣＨＡＲＭｍプログラム及びＱＵＡＮＴＡプログラム（Polygen Corporation，Waltham，Mass）が含まれる。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化及び分子ダイナミクスの機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング、及び分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子の互いの相互作用的構築、修飾、可視化、及び挙動分析を可能にする。
【０３３７】
Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66、Ripka, New Scientist 1988, 54-8、McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22、Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93、Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62、及び核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90等の多数の論文が、特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングを概説している。
【０３３８】
化学物質をスクリーニング及び図式化する他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc.（Pasadena，Calif.）、Allelix, Inc.（Mississauga，Ontario，Canada）、及びHypercube, Inc.（Cambridge，Ontario）等の会社から入手可能である。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9、Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24、Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78、Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
【０３３９】
推定阻害剤を同定した後、下記に詳述するように、コンビナトリアル化学技法を採用し、同定した推定阻害剤の化学的構造に基づいて、任意の数の変異体を構成することができる。得られた推定阻害剤又は「試験薬剤」のライブラリを本発明の方法を用いてスクリーニングし、肺癌を治療又は予防する試験薬剤を同定してもよい。
【０３４０】
（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成（Combinatorial chemical synthesis）：
試験薬剤のコンビナトリアルライブラリは、既知の阻害剤中に存在するコア構造の情報を含む、合理的薬物設計プログラムの一部として作製され得る。このアプローチにより、ハイスループットスクリーニングを促す適度なサイズにライブラリを維持することが可能になる。代替的には、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより、単純な、特に短い重合体分子ライブラリが構築され得る。この後者のアプローチの一例は、６アミノ酸長の全ペプチドのライブラリである。かかるペプチドライブラリは６アミノ酸おきの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
【０３４１】
コンビナトリアル化学ライブラリの調製は当業者に既知であり、化学合成又は生物学的合成のいずれかにより作り出すことができる。コンビナトリアル化学ライブラリとしては、ペプチドライブラリ（例えば米国特許第５，０１０，１７５号明細書、Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93、Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。化学的多様性ライブラリを作り出すための他の化学を使用することもできる。かかる化学としては、ペプチド（例えば国際公開第９１／１９７３５号パンフレット）、コード化ペプチド（例えば国際公開第９３／２０２４２号パンフレット）、ランダムバイオオリゴマー（random bio-oligomers）（例えば国際公開第９２／０００９１号パンフレット）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第５，２８８，５１４号明細書）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、及びジペプチド等のダイバーソマー（diversomers）（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13）、ビニル性ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568）、グルコース骨格を有する非ペプチド性（nonpeptidal）ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8）、低分子化合物ライブラリの類似有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661）、オリゴカルバメート（oligocarbamates）（Cho et al., Science 1993, 261: 1303）、及び／又はペプチジルホスホネート（peptidylphosphonates）（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658）、核酸ライブラリ（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば米国特許第５，５３９，０８３号明細書を参照）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号明細書を参照）、炭水化物ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22、米国特許第５，５９３，８５３号明細書を参照）、並びに有機低分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン（Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.）、イソプレノイド（米国特許第５，５６９，５８８号明細書）、チアゾリジノン及びメタチアゾノン（metathiazanones）（米国特許第５，５４９，９７４号明細書）、ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号明細書及び同第５，５１９，１３４号明細書）、モルホリノ化合物（米国特許第５，５０６，３３７号明細書）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号明細書）等を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４２】
（ｉｉｉ）ファージディスプレイ：
別のアプローチは、ライブラリを作成するために組み換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」（Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6）を用いて、非常に大きいライブラリを構築することができる（例えば１０６個〜１０８個の化学物質）。第２のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74）、及びFodor et al.の方法（Science 1991, 251: 767-73）がその例である。Furka et al.（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93）、Houghten（米国特許第４，６３１，２１１号明細書）、及びRutter et al.（米国特許第５，０１０，１７５号明細書）は、アゴニスト又はアンタゴニストとして試験することのできるペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
【０３４３】
コンビナトリアルライブラリを調製するための装置は市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ（Advanced Chem Tech，Louisville KY）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Rainin，Woburn，MA）、４３３Ａ（Applied Biosystems，Foster City，CA）、９０５０  Ｐｌｕｓ（Millipore，Bedford，MA）を参照）。また、多数のコンビナトリアルライブラリ自体も市販されている（例えば、ComGenex（Princeton，N.J.）、Tripos, Inc.（St. Louis，MO）、3D Pharmaceuticals（Exton，PA）、Martek Biosciences（Columbia，MD）等を参照）。
【０３４４】
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ結合化合物のスクリーニング
本発明では、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及びＥＦ−１δの過剰発現が、正常器官における発現はなかったにもかかわらず、肺癌において検出された（図１、図５、図７、図１６、及び図１９）。したがって、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子、該遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて、本発明はＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δに結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。肺癌におけるＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及びＥＦ−１δの発現により、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δに結合する化合物は、肺癌細胞の増殖を抑制し、したがって肺癌の治療又は予防に有用であることが期待される。したがって、本発明はまた、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドを用いて、肺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、並びに肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。特に、このスクリーニング法の一実施形態は、
（ａ）試験化合物を、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程、
（ｂ）ポリペプチドと試験化合物との間の結合活性を検出する工程、及び
（ｃ）ポリペプチドに結合する試験化合物を選択する工程、
を含む。
【０３４５】
本発明の方法を下記により詳細に記載する。
【０３４６】
スクリーニングに使用されるＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドは、組み換えポリペプチド、又は天然に由来するタンパク質、又はその部分ペプチドであり得る。試験化合物に接触させるポリペプチドは、例えば精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体に結合した形態、又は他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
【０３４７】
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドを用いて、例えばＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、当業者に既知の多くの方法を使用することができる。かかるスクリーニングは、例えば免疫沈降法により、具体的には以下のように行なうことができる。ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドをコードする遺伝子を、遺伝子をｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ及びｐＣＤ８等の外来遺伝子用の発現ベクターにインサートすることにより、宿主（例えば動物）細胞等において発現させる。
【０３４８】
発現に使用するプロモーターは一般に使用され得る任意のプロモーターであり、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson (ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141 (1982)）、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91: 217-23 (1990)）、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108: 193 (1991)）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987)）、ＳＲａｌｐｈａプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466 (1988)）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9 (1987)）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94 (1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946 (1989)）、ＨＳＶ  ＴＫプロモーター等を含み得る。
【０３４９】
外来遺伝子を発現するための宿主細胞への遺伝子の導入は、任意の方法、例えばエレクトロポレーション法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26 (1987)）、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52 (1987)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17 (1984)、Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3 (1984)）、リポフェクチン法（Derijard B., Cell 76: 1025-37 (1994)、Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30 (1993)、Rabindran et al., Science 259: 230-4 (1993)）等によって行なうことができる。
【０３５０】
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子によりコードされるポリペプチドは、該ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に対する特異性が明らかとなっているモノクローナル抗体のエピトープを導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を含有する融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ−抗体系を使用することができる（Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)）。その複数のクローニング部位を使用して、例えばβガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光（florescence）タンパク質（ＧＦＰ）等との融合タンパク質を発現することのできるベクターは市販されている。また、融合によりＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドの特性が変化しないように、数個〜十数個のアミノ酸の中からわずかなエピトープのみを導入することにより調製される融合タンパク質も報告されている。ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザウイルスの血球凝集素（influenza aggregate）ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ（monoclonal phage）上のエピトープ）等のエピトープ、及びこれらを認識するモノクローナル抗体をエピトープ−抗体系として、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドに結合するタンパク質のスクリーニングに使用することができる（Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)）。
【０３５１】
免疫沈降においては、これらの抗体を適当な界面活性剤を用いて調製される細胞可溶化物に添加することにより免疫複合体を形成する。免疫複合体はＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチド、該ポリペプチドと結合する能力を有するポリペプチド、及び抗体から成る。免疫沈降は、上記エピトープに対する抗体を使用する以外に、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドに対する抗体を用いて行なうこともでき、この抗体は上記で記載されるように調製することができる。抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、免疫複合体は、例えばプロテインＡセファロース又はプロテインＧセファロースにより沈降し得る。ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子によりコードされるポリペプチドをＧＳＴ等のエピトープを有する融合タンパク質として調製する場合、免疫複合体は、グルタチオン−セファロース４Ｂ等のこれらのエピトープと特異的に結合する物質を用いて、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドに対する抗体を使用する場合と同じようにして形成することができる。
【０３５２】
免疫沈降は、例えば文献（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988)）における方法に従って又は準じて行なうことができる。
【０３５３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、免疫沈降タンパク質の分析に一般に使用され、結合したタンパク質は、適当な濃度のゲルを用いてタンパク質の分子量により分析される。ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドに結合したタンパク質は、クマシー染色又は銀染色等の一般の染色法によって検出することが困難であるため、タンパク質に対する検出感度は、細胞中のタンパク質を標識する放射性同位体３５Ｓ−メチオニン又は３５Ｓ−システインを含有する培養培地中で細胞を培養し、タンパク質を検出することにより改善され得る。タンパク質の分子量が明らかである場合、標的タンパク質はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、その配列を決定することができる。
【０３５４】
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドに結合するタンパク質を、該ポリペプチドを用いてスクリーニングする方法として、例えばウエストウエスタンブロット分析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90 (1991)）を使用することができる。具体的には、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドに結合するタンパク質は、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドに結合するタンパク質を発現することが期待される培養細胞（例えばＬＣ１７６、ＬＣ３１９、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＰＣ３、ＰＣ９、ＰＣ１４、ＳＫ−ＬＵ−１、ＥＢＣ−１、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＳＷ９００、及びＳＷ１５７３）からｃＤＮＡライブラリを、ファージベクター（例えばＺＡＰ）を用いて調製し、ＬＢ−アガロース上でタンパク質を発現させ、発現されたタンパク質をフィルタ上に固定し、精製及び標識したＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドを上記フィルタと反応させ、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドに結合したタンパク質を発現するプラークを標識によって検出することにより得ることができる。本発明のポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの間の結合を利用するか、又はＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドと特異的に結合する抗体、又はＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドに融合させたペプチド若しくはポリペプチド（例えばＧＳＴ）を利用することにより標識してもよい。放射性同位体又は蛍光等を用いる方法も使用することができる。
【０３５５】
代替的には、本発明のスクリーニング法の別の実施形態では、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Clontech）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Stratagene）；参考文献は"Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)"、"Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)"）。
【０３５６】
ツーハイブリッドシステムにおいては、本発明のポリペプチドをＳＲＦ−結合領域又はＧＡＬ４−結合領域に融合させ、酵母細胞において発現させる。ｃＤＮＡライブラリを、本発明のポリペプチドに結合するタンパク質を発現することが期待される細胞から、ライブラリが発現される場合に、ＶＰ１６転写活性化領域又はＧＡＬ４転写活性化領域に融合するように調製する。次に、ｃＤＮＡライブラリを上記酵母細胞に導入し、ライブラリに由来するｃＤＮＡを検出される陽性クローンから単離する（本発明のポリペプチドに結合するタンパク質が酵母細胞において発現される場合、その２つの結合がレポーター遺伝子を活性化するため、陽性クローンが検出可能となる）。ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質は、上記で単離されるｃＤＮＡを大腸菌に導入し、タンパク質を発現させることにより調製することができる。レポーター遺伝子として、ＨＩＳ３遺伝子に加えて、例えばＡｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等も使用することができる。
【０３５７】
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合する化合物は、アフィニティクロマトグラフィーを用いてもスクリーニングすることができる。例えば、本発明のポリペプチドをアフィニティカラムの担体上に固定化させ、本発明のポリペプチドに結合することが可能なタンパク質を含有する試験化合物をカラムに適用してもよい。本明細書における試験化合物は、例えば細胞抽出物、細胞可溶化物等であり得る。試験化合物を投入した後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドに結合した化合物を調製することができる。試験化合物がタンパク質である場合、得られるタンパク質のアミノ酸配列を分析して、該配列に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、オリゴＤＮＡをプローブとして用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、タンパク質をコードするＤＮＡを得る。
【０３５８】
本発明においては、表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサーを、結合した化合物を検出又は定量化する手段として使用してもよい。かかるバイオセンサーを使用する場合、本発明のポリペプチドと試験化合物との間の相互作用は、わずかな量のポリペプチドを用いて、標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとして即時に観察することができる（例えばＢＩＡｃｏｒｅ（Pharmacia））。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いて、本発明のポリペプチドと試験化合物との間の結合を評価することが可能である。
【０３５９】
タンパク質だけでなくＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質に結合する化学物質（アゴニスト及びアンタゴニストを含む）をも単離するために、固定化したＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドを合成化学物質、又は天然物質バンク、又はランダムファージペプチド提示ライブラリに曝露する場合に結合する分子をスクリーニングする方法、及びコンビナトリアル化学技法に基づくハイスループット技法を用いてスクリーニングする方法（Wrighton et al., Science 273: 458-64 (1996)、Verdine, Nature 384: 11-13 (1996)、Hogan, Nature 384: 17-9 (1996)）が当業者に既知である。
【０３６０】
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの生物活性を抑制する化合物のスクリーニング
本発明において、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δタンパク質は、肺癌細胞の細胞増殖（図４Ｄ、図６Ｄ、図１０Ａ、図１０Ｂ、図２２Ａ、及び図２２Ｂ）、細胞浸潤活性（図２３Ａ）、細胞外分泌（図１Ｃ及び図７Ｄ）、ホスファターゼ活性（図２１Ａ）、及びＡｋｔリン酸化（図２３Ｄ）を促進する活性を有する。これらの生物活性を用いて、本発明は、肺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、及び肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。したがって、本発明は、
（ａ）試験化合物をＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程
（ｂ）工程（ａ）のポリペプチドの生物活性を検出する工程、及び
（ｃ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの生物活性を、試験化合物の非存在下で検出される該ポリペプチドの生物活性と比較して抑制する試験化合物を選択する工程を含む、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子によりコードされるポリペプチドを用いて、肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【０３６１】
本発明の方法を下記により詳細に記載する。
【０３６２】
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質の生物活性を保持する限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに使用することができる。かかる生物活性には、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質の細胞増殖活性が含まれる。例えば、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質を使用することができるが、これらのタンパク質に機能的に等価なポリペプチドもまた使用することができる。かかるポリペプチドは、細胞により内因的又は外因的に発現され得る。
【０３６３】
このスクリーニングにより単離される化合物は、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子によりコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドの機能を、それに結合することにより阻害する分子を指す。該用語はまた、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δをコードする遺伝子の発現を低下させるか又は阻害する分子を指す。さらに、このスクリーニングにより単離される化合物は、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドの分子（ＤＮＡ及びタンパク質を含む）とのｉｎ  ｖｉｖｏ相互作用を阻害する化合物の候補である。
【０３６４】
本発明の方法において検出される生物活性が細胞増殖である場合、該活性は例えば、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドを発現する細胞を準備すること、細胞を試験化合物の存在下で培養すること、並びに細胞周期の測定等により、及び例えば図４Ｄ、図６Ｄ、図１０Ａ、図１０Ｂ、図２２Ａ、及び図２２Ｂに示すようなコロニー形成活性の測定により、細胞増殖の速度を求めることによって検出することができる。ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δポリペプチドを発現した細胞の増殖速度を、化合物で処理していない細胞の増殖速度と比較して低下させる化合物、及びこれらのポリペプチドを全く又はほとんど発現しない細胞と比較して増殖速度を維持する化合物が、肺癌を治療又は予防するための候補化合物として選択される。
【０３６５】
本発明の方法において検出される生物活性が細胞浸潤活性である場合、該活性は例えば、ＣＤＫＮ３ポリペプチドを発現する細胞を準備すること、及び例えば図２３Ａに示すマトリゲル浸潤アッセイを用いた測定により、浸潤細胞の量を求めることによって検出することができる。ＣＤＫＮ３ポリペプチドを発現した浸潤細胞の量を、化合物で処理していない浸潤細胞の量と比較して低下させる化合物、及びＣＤＫＮ３ポリペプチドを全く又はほとんど発現しない細胞と比較して浸潤量を維持する化合物が、肺癌を治療又は予防するための候補化合物として選択される。
【０３６６】
本発明の方法において検出される生物活性が細胞外分泌である場合、該活性は例えば、ＥＢＩ３ポリペプチド又はＮＰＴＸ１ポリペプチドを発現する細胞を準備すること、細胞を試験化合物の存在下で培養すること、及び例えば図１Ｃ及び図７Ｄに示すＥＬＩＳＡを用いた測定により、培養培地におけるこれらのポリペプチドの分泌タンパク質の量を求めることによって検出することができる。ＥＢＩ３ポリペプチド又はＮＰＴＸ１ポリペプチドを発現した細胞からの分泌タンパク質の量を、化合物で処理していない細胞又はＥＢＩ３からの分泌タンパク質量と比較して低下させる化合物、及びＮＰＴＸ１ポリペプチドを全く又はほとんど発現しない細胞と比較して分泌タンパク質量を維持する化合物が、肺癌を治療又は予防するための候補化合物として選択される。
【０３６７】
本発明の方法において検出される生物活性がホスファターゼ活性である場合、該活性は例えば、試験化合物の存在下で、ＣＤＫＮ３ポリペプチド又はその機能的等価物をＥＦ−１δポリペプチド又はその機能的等価物と接触させること、及び例えば図２１Ａに示すウエスタンブロット法を用いた測定により、ＥＦ−１δポリペプチドのリン酸化レベルを求めることによって検出することができる。細胞のＥＦ−１δポリペプチドのリン酸化レベルを、化合物で処理していない細胞のリン酸化レベルと比較して低下させる化合物が、肺癌を治療又は予防するための候補化合物として選択される。好ましい方法では、ＥＦ−１δポリペプチドのリン酸化レベルの検出は、ホスホセリンにより測定される。
【０３６８】
本発明の方法において検出される生物活性がＡｋｔリン酸化である場合、該活性は例えば、ＣＤＫＮ３ポリペプチドを発現する細胞を準備すること、及び例えば図２３Ｄに示すウエスタンブロット法を用いた測定により、Ａｋｔリン酸化のレベルを求めることによって検出することができる。ＣＤＫＮ３ポリペプチドを発現した細胞におけるＡｋｔリン酸化のレベルを、化合物で処理していない細胞のリン酸化レベルと比較して低下させる化合物、及びＣＤＫＮ３ポリペプチドを全く又はほとんど発現しない細胞と比較して該レベルを維持する化合物が、肺癌を治療又は予防するための候補化合物として選択される。
【０３６９】
例えば、ＥＦ−１δは肺癌細胞においてＣＤＫＮ３と共発現され、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤＫＮ３ホスファターゼの生理的基質である可能性があることが確認されたが、これはＣＤＫＮ３が、肺腫瘍においてＥＦ−１δの脱リン酸化を介した成長促進機能を有し得ることを示唆する（図２０及び図２１）。したがって、ＣＤＫＮ３機能を阻害することによりＥＦ−１δの脱リン酸化を阻害する化合物は、肺癌細胞の増殖を抑制し、したがってＮＳＣＬＣ又はＳＣＬＣを含む肺癌を治療又は予防するのに有用であることが期待される。したがって、本発明はまた、肺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、並びにＮＳＣＬＣ及び／又はＳＣＬＣを含む肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【０３７０】
より具体的には、該方法は、
（ａ）候補化合物を、ＣＤＫＮ３を過剰発現する細胞と接触させる工程、
（ｂ）ＥＦ−１δのリン酸化レベルを測定する工程、及び
（ｃ）対照と比較して脱リン酸化を低減する候補化合物を選択する工程を含む。
【０３７１】
好ましくは、ＥＦ−１δのリン酸化及び脱リン酸化は、ＥＦ−１δの分子量を求めることにより検出され得る。タンパク質の分子量を求める方法はよく知られている。例えば、以下の実施例の項に記載されるウエスタンブロット分析を用いることにより、リン酸化及び脱リン酸化をそれぞれ、分子量の増加及び減少として検出することができる。代替的には、ＥＦ−１δのリン酸化レベルは、リン酸化ＥＦ−１δを認識する抗体を用いた免疫学的技法によっても評価することができる。例えば、ＥＦ−１δ上のリン酸化セリンを認識する抗体、又は汎リン酸化型特異的抗体をかかる目的のために使用することができる。好ましい実施形態では、比較される対照レベルは、試験条件（候補化合物の存在下）と同じ条件下で、候補化合物の非存在下で検出されるＥＦ−１δのリン酸化レベルであり得る。
【０３７２】
代替的には、本発明において、Ａｋｔリン酸化（Ｓｅｒ４７３）がＣＤＫＮ３過剰発現により増進する（図２３）ことが明らかにとなった。したがって、ＣＤＫＮ３機能を阻害することによりＡｋｔリン酸化を減少させる化合物も、肺癌細胞の増殖を抑制し、したがってＮＳＣＬＣ及び／又はＳＣＬＣを含む肺癌を治療又は予防するのに有用であることが期待される。したがって、本発明はまた、肺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、並びにＮＳＣＬＣ及び／又はＳＣＬＣを含む肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【０３７３】
より具体的には、該方法は、
（ａ）候補化合物を、ＣＤＫＮ３を過剰発現する細胞と接触させる工程、
（ｂ）Ａｋｔ  Ｓｅｒ４７３のリン酸化を測定する工程、及び
（ｃ）対照と比較してリン酸化を低減する候補化合物を選択する工程を含む。
【０３７４】
好ましい実施形態では、本発明の方法により選択される試験化合物は、その治療効果を評価するためのさらなるスクリーニングの候補となり得る。
【０３７５】
好ましくは、Ａｋｔのリン酸化レベルは、配列番号５９のヌクレオチド配列（ＮＰ＿００１０１４４３１）によりコードされる配列番号６０のアミノ酸配列の４７３セリン残基で検出され得る。当業者によく知られているＡｋｔリン酸化の検出方法を使用することができる。例えば、以下の実施例の項に記載されるウエスタンブロット分析を用いることができる。
【０３７６】
本発明に関しては、ＣＤＫＮ３によるＡｋｔのリン酸化に適切な条件は、リン酸供与体、例えばＡＴＰの存在下でＡｋｔ及びＣＤＫＮ３をインキュベートすることにより提供され得る。ＣＤＫＮ３によるＡｋｔリン酸化に適切な条件はまた、ＣＤＫＮ３及びＡｋｔを発現する細胞を培養することを含む。例えば、細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有する形質転換細胞であり得る。インキュベート後、Ａｋｔのリン酸化レベルは、リン酸化Ａｋｔを認識する抗体を用いて検出することができる。好ましい実施形態では、比較される対照レベルは、試験条件（候補化合物の存在下）と同じ条件下で、候補化合物の非存在下で検出されるＡｋｔのリン酸化レベルであり得る。
【０３７７】
リン酸化Ａｋｔの検出の前に、Ａｋｔを他の要素、すなわちＡｋｔ発現細胞の細胞可溶化物から分離してもよい。例えば、ゲル電気泳動がＡｋｔを残りの構成要素から分離するために使用され得る。代替的には、Ａｋｔを抗Ａｋｔ抗体を有する担体と接触させることにより、Ａｋｔを捕捉してもよい。標識リン酸供与体を使用する場合、Ａｋｔのリン酸化レベルは標識を追跡することによって検出することができる。例えば、放射標識ＡＴＰ（例えば３２Ｐ−ＡＴＰ）をリン酸化供与体として使用する場合、分離したＡｋｔの放射能はＡｋｔのリン酸化レベルと相関する。代替的には、非リン酸化Ａｋｔからリン酸化Ａｋｔを特異的に認識する抗体を、リン酸化Ａｋｔの検出に使用してもよい。好ましくは、抗体はＳｅｒ−４７３残基でリン酸化Ａｋｔを認識する。
【０３７８】
所与のタンパク質に機能的に等価なポリペプチドを調製する方法は、当業者によく知られており、タンパク質に変異を導入する既知の方法を含む。一般に、タンパク質における１つ又は複数のアミノ酸の修飾は、タンパク質の機能に影響を与えないことが知られている（Mark DF et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6、Zoller MJ & Smith M, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500、Wang A et al., Science 1984, 224: 1431-3、Dalbadie-McFarland G et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。実際に、変異したか又は修飾されたタンパク質、或る特定のアミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入、及び／又は付加することにより修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984)、Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10: 6487-500 (1982)、Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。したがって、単一のアミノ酸若しくは少数のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、若しくは置換、又はタンパク質の変更が同様の機能を有するタンパク質をもたらす「保存的修飾」と見なされる修飾は、本発明に関しては意図されることを当業者は認識するであろう。
【０３７９】
例えば、当業者はＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ及び／又はＡｋｔタンパク質に機能的に等価なポリペプチドを、これらのタンパク質のいずれかのアミノ酸配列に、例えば部位特異的突然変異誘発を用いて、適当な変異を導入することにより調製することができる（Hashimoto-Gotoh et al., Gene 152: 271-5 (1995)、Zoller and Smith, Methods Enzymol 100: 468-500 (1983)、Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12: 9441-56 (1984)、Kramer and Fritz, Methods Enzymol 154: 350-67 (1987)、Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-92 (1985)、Kunkel TA, et al., Methods Enzymol. 1991; 204: 125-39.）。本発明のポリペプチドは、得られる変異ポリペプチドがそれぞれＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、及び／又はＡｋｔに機能的に等価であるという条件で、１つ又は複数のアミノ酸が変異したＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、及び／又はＡｋｔのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。タンパク質の活性が維持される限り、アミノ酸変異の数は特に限定されない。しかしながら、一般にアミノ酸配列の５％以下を変更するのが好ましい。したがって、好ましい実施形態では、かかる突然変異体において変異させるアミノ酸の数は、一般に３０アミノ酸以下、典型的には２０アミノ酸以下、より典型的には１０アミノ酸以下、好ましくは５アミノ酸〜６アミノ酸以下、より好ましくは１アミノ酸〜３アミノ酸以下である。
【０３８０】
変異させるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の性質が保存された異なるアミノ酸に変異させるのが好ましい（保存的アミノ酸置換として知られるプロセス）。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、及び共通して以下の官能基又は特徴を有する側鎖：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）を含有するヒドロキシル基；側鎖（Ｃ、Ｍ）を含有する硫黄原子；側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）を含有するカルボン酸及びアミド；側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）を含有する塩基；及び側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を含有する芳香族基である。なお、括弧内の文字はアミノ酸の１文字コードを示す。さらに、機能的に同様のアミノ酸を与える保存的置換表は当該技術分野で既知である。例えば、以下の８つの基はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
（１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び
（８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
【０３８１】
かかる保存的に修飾されたポリペプチドは、本発明のＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＡｋｔタンパク質に含まれる。しかしながら、本発明はそれらに限定されず、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＡｋｔタンパク質は、元のタンパク質の結合活性が保持される限り、非保存的修飾を含む。さらに、修飾タンパク質は多型変異体、種間相同体、及びこれらのタンパク質の対立遺伝子によりコードされるタンパク質を除外するものではない。
【０３８２】
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＡｋｔのアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸残基が付加されたポリペプチドの例は、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＡｋｔをそれぞれ含有する融合タンパク質である。したがって、融合タンパク質、すなわちＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＡｋｔと、他のペプチド又はタンパク質との融合体は、本発明に含まれる。融合タンパク質は当業者によく知られた技法、例えばＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＡｋｔをコードするＤＮＡを、他のペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡとフレームが一致するように連結し、融合ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、それを宿主において発現させることにより作製され得る。本発明のタンパク質と融合されるペプチド又はタンパク質に関する限定はない。
【０３８３】
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＡｋｔタンパク質に融合するペプチドとして使用することができる既知のペプチドとしては例えば、ＦＬＡＧ（Hopp TP, et al., Biotechnology 1988 6: 1204-10）、６つのＨｉｓ（ヒスチジン）残基を含有する６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザアグルチニン（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃ断片、ＶＳＰ−ＧＰ断片、ｐ１８ＨＩＶ断片、Ｔ７−タグ、ＨＳＶ−タグ、Ｅ−タグ、ＳＶ４０Ｔ抗原断片、ｌｃｋタグ、αチューブリン断片、Ｂ−タグ、プロテインＣ断片等が挙げられる。本発明のタンパク質に融合することができるタンパク質の例としては、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、インフルエンザアグルチニン（ＨＡ）、免疫グロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。
【０３８４】
融合タンパク質は、上記で論じられる融合ペプチド又はタンパク質をコードする市販のＤＮＡを、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＡｋｔタンパク質をコードするＤＮＡと融合させ、調製される融合ＤＮＡを発現させることにより調製することができる。
【０３８５】
機能的に等価なポリペプチドを単離するための当該技術分野で既知の代替的方法は、例えばハイブリダイゼーション技法（Sambrook et al., Molecular Cloning 2nd ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)）を包含する。当業者はＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＡｋｔと高い相同性を有するＤＮＡを容易に単離することができ、単離したＤＮＡからＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＡｋｔと機能的に等価なポリペプチドを単離することができる。本発明のタンパク質はＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＡｋｔをコードするＤＮＡ配列の全部又は一部とハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＡｋｔと機能的に等価であるタンパク質を含む。これらのポリペプチドは、ヒトに由来するタンパク質に対応する哺乳類相同体（例えばサル、ラット、ウサギ、及びウシの遺伝子によりコードされるポリペプチド）を含む。ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＡｋｔをコードするＤＮＡと高度の相同性を示すｃＤＮＡを動物から単離する際には、前立腺癌組織を使用するのが特に好ましい。
【０３８６】
ヒトＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＡｋｔタンパク質に機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者により日常的に選択され得る。「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という表現は、典型的には核酸の複合混合物において、核酸分子がその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列と検出可能にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況下で違ってくる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)に見られる。本発明に関しては、適切なハイブリダイゼーション条件は、当業者により日常的に選択され得る。
【０３８７】
概して、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度、ｐＨで特定の配列のために、熱融解点（Ｔｍ）より約５℃〜１０℃低く選択される。Ｔｍは、（規定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度で）標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍで、プローブの５０％が平衡状態で占められる）。ストリンジェントな条件は、不安定化剤、例えばホルムアミドの添加によっても達成することができる。選択的又は特異的なハイブリダイゼーションのために、陽性シグナルは好ましくは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２倍、より好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。
【０３８８】
例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下を含む：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳにおいて４２℃でインキュベートする、又は５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳにおいて６５℃でインキュベートし、０．２×ＳＳＣ、及び０．１％ＳＤＳにおいて５０℃で洗浄する。適切なハイブリダイゼーション条件は、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ  緩衝液」（Amersham LIFE SCIENCE）を用いた６８℃で３０分間以上のプレハイブリダイゼーション、標識プローブの添加、及び６８℃で１時間以上の加温も含み得る。
【０３８９】
洗浄工程は、例えば、ストリンジェンシーの低い条件下で行うことができる。したがって例示的なストリンジェンシーの低い条件は、例えば４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含み得る。代替的には、例示的なストリンジェンシーの高い条件は、例えば室温で２０分間、２×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳにおいて３回洗浄すること、その後３７℃で２０分間、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて３回洗浄すること、及び５０℃で２０分間、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて２回洗浄することを含み得る。しかしながら、温度及び塩濃度等の幾つかの因子が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与えることがあり、当業者は必要なストリンジェンシーを達成するために該因子を適切に選択することができる。
【０３９０】
好ましくは、機能的に等価なポリペプチドは、本明細書中で開示される天然のＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＡｋｔの配列と少なくとも約８０％の相同性（配列同一性とも称される）、より好ましくは少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する。ポリペプチドの相同性は、"Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30（1983）"におけるアルゴリズムに従って求めることができる。他の実施形態では、機能的に等価なポリペプチドは、ストリンジェントな条件（下記で規定）下で、かかる機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ得る。
【０３９１】
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＡｋｔに関する配列情報に基づいて合成されるプライマーを用いてＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＡｋｔと機能的に等価なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するために、ハイブリダイゼーションの代わりに遺伝子増幅法（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法）を利用することができる。
【０３９２】
本発明に関して有用なＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ、又はＡｋｔの機能的等価物のアミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、又は形状は、それを作製するために使用される細胞若しくは宿主、又は利用される精製方法に応じて変化し得る。しかしながら、それがＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１δ又はＡｋｔポリペプチドのいずれか１つの機能的等価物である限り、そのポリペプチドは本発明の範囲に含まれる。
【０３９３】
本明細書中に規定する「生物活性を抑制する」とは、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの生物活性を、化合物の非存在下での生物活性と比較して、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、又は７５％、最も好ましくは９０％抑制することである。
【０３９４】
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの発現を変化させる化合物のスクリーニング
本発明において、ｓｉＲＮＡによるＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの発現の減少は、癌細胞増殖の阻害を引き起こす（図４Ｄ、図６Ｄ、図１０Ａ、図１０Ｂ、図２２Ａ、及び図２２Ｂ）。したがって、本発明はＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの発現を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの発現を阻害する化合物は、肺癌細胞の増殖を抑制し、したがって肺癌を治療又は予防するのに有用であることが期待される。したがって、本発明はまた、肺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、及び肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明に関しては、かかるスクリーニングは例えば、
（ａ）候補化合物をＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δを発現する細胞と接触させる工程、並びに
（ｂ）ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの発現レベルを対照と比較して低下させる候補化合物を選択する工程を含み得る。
【０３９５】
本発明の方法を下記により詳細に記載する。
【０３９６】
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δを発現する細胞は、例えば肺癌から樹立した細胞株を含むが、かかる細胞を本発明の上記スクリーニングに使用することができる（例えばＡ４２７、ＬＣ１７６、ＬＣ３１９、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ１３１７、ＮＣＩ−Ｈ１６６６、ＮＣＩ−Ｈ１７８１、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＰＣ３、ＰＣ９、ＰＣ１４、ＥＢＣ０１、ＬＵ６１、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＮＣＩ−Ｈ６４７、ＬＸ１、ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、ＳＫ−ＬＵ−１、ＥＢＣ−１、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＳＫ−ＭＥＳ−Ｉ、ＳＷ９００、及びＳＷ１５７３）。発現レベルは当業者によく知られている方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫染色、及びフローサイトメトリー分析により予想することができる。本明細書中に規定する「発現レベルを低下させる」とは、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの発現レベルを、化合物の非存在での発現レベルと比較して、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、又は７５％、最も好ましくは９５％低下させることである。本明細書における化合物は化学物質、二本鎖ヌクレオチド等を含む。二本鎖ヌクレオチドの調製については上述している。スクリーニング法においては、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの発現レベルを低下させる化合物を肺癌の治療又は予防に使用される候補化合物として選択することができる。
【０３９７】
代替的には、本発明のスクリーニング法には、
（ａ）候補化合物を、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの転写調節領域及び転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子から成るベクターを導入した細胞と接触させる工程、
（ｂ）上記レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、及び
（ｃ）上記レポーター遺伝子の発現又は活性を低下させる候補化合物を選択する工程が含まれ得る。
【０３９８】
適切なレポーター遺伝子及び宿主細胞は当該技術分野で既知である。例えば、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イソギンチャクモドキ（Discosoma sp.）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、及びβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）であり、宿主細胞はＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列とＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの転写調節領域とを連結することにより調製することができる。本明細書におけるＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの転写調節領域は、開始コドンから少なくとも５００ｂｐ上流、好ましくは１０００ｂｐ、より好ましくは５０００ｂｐ又は１００００ｂｐ上流までの領域である。転写調節領域を含有するヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリから単離することができ、又はＰＣＲによって増幅させる（propagated）ことができる。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をこれらの遺伝子のいずれか１つの転写調節領域に連結することにより調整することができる。転写調節領域を同定する方法、さらにアッセイプロトコルは既知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
【０３９９】
上記レポーター構築物を含有するベクターを、宿主細胞に感染させ、レポーター遺伝子の発現又は活性を当該技術分野で既知の方法により（例えばルミノメーター、吸光度計、フローサイトメーター等を用いて）検出する。本明細書中に規定する「発現又は活性を低下させる」とは、レポーター遺伝子の発現又は活性を、化合物の非存在での発現又は活性と比較して、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、又は７５％、最も好ましくは９５％低下させることである。
【０４００】
ＣＤＫＮ３とＶＲＳ、ＥＦ−１α、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、又はＥＦ−１δとの間、又はＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの間の結合を減少させる化合物のスクリーニング
本発明において、ＣＤＫＮ３（配列番号５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｌ２７７１１）と、バリル−ｔＲＮＡ合成酵素（ＶＲＳ）（配列番号２６若しくは配列番号２８；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００６２９５若しくはＢＣ０１２８０８）又はＥＦ−１β（配列番号３０；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１９５９）又はＥＦ−１γ（配列番号７；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＢＣ００９９０７）又はＥＦ−１δ（配列番号３２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＢＣ００９８６５）との間の相互作用を免疫沈降（図１８Ａ）により示すか、又はＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの間の相互作用を図１５Ｂに示す。さらに、ＣＤＫＮ３は、ＥＦ−１γの７２〜１６０アミノ酸（配列番号４８）に対応する領域に結合する（図２１Ｂ及び図２１Ｃ）。さらに、ＣＤＫＮ３はＥＦ−１δを脱リン酸化する（図２０Ｄ及び図２１Ａ）。したがって、本発明は、ＣＤＫＮ３と、ＶＲＳ、ＥＦ−１α、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、及びＥＦ−１δの中から選択される相互作用パートナーとの間の結合、又はＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの間の結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。ＣＤＫＮ３とこれらの相互作用パートナーとの間、又はＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの間の結合を阻害する化合物は、肺癌細胞の増殖を抑制し、したがって肺癌を治療又は予防するのに有用であることが期待される。したがって、本発明はまた、肺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、及び肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【０４０１】
より具体的には、該方法は
（ａ）ＣＤＫＮ３ポリペプチド又はその機能的等価物を、試験化合物の存在下で、ＶＲＳポリペプチド、ＥＦ−１αポリペプチド、ＥＦ−１βポリペプチド、ＥＦ−１γポリペプチド、ＥＦ−１δポリペプチド、及びその機能的等価物の中から選択される相互作用パートナーと接触させる工程、
（ｂ）ポリペプチド間の結合を検出する工程、並びに
（ｃ）ポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程、又は
（ａ）ＮＰＴＸ１ポリペプチド又はその機能的等価物を、試験化合物の存在下で、相互作用ＮＰＴＸＲポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる工程、
（ｂ）ポリペプチド間の結合を検出する工程、及び
（ｃ）ポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程を含む。
【０４０２】
本発明において、「相互作用パートナー」は、ＣＤＫＮ３の生物活性に関与する物質又は化合物を指す。したがって、例えばＣＤＫＮ３がその機能を発現するためのポリペプチドを必要とする場合、該ポリペプチドは「相互作用パートナー」であり得る。一般に、ＣＤＫＮ３と相互作用パートナーとは互いに結合することで機能を維持する。好ましい実施形態では、相互作用パートナーはポリペプチドである。ＣＤＫＮ３がＶＲＳポリペプチド、ＥＦ−１αポリペプチド、ＥＦ−１βポリペプチド、ＥＦ−１γポリペプチド、ＥＦ−１δポリペプチドと相互作用することが本明細書中で明らかにされる。したがって、これらの分子及び機能的等価物が好ましい相互作用パートナーである。ここで、相互作用パートナーの「機能的等価物」は例えば、相互作用パートナーと同等の生物活性を有するポリペプチドを含む。
【０４０３】
すなわち、本発明においては、かかる相互作用パートナーの少なくとも１つの生物活性を保持する任意のポリペプチドを、かかる機能的等価物として使用することができる。例えば、相互作用パートナーの機能的等価物は細胞増殖の促進活性を保持する。また、相互作用パートナーの生物活性はＣＤＫＮ３に対する結合活性、及び／又はＣＤＫＮ３に媒介される細胞移動又は細胞増殖を含む。相互作用パートナーの機能的等価物には、これらの相互作用パートナータンパク質の天然のアミノ酸配列に、１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入された機能的等価物が含まれる。
【０４０４】
「ＥＦ−１γポリペプチドの機能的等価物」という表現は、本明細書中で使用される場合、ＣＤＫＮ３結合ドメインのアミノ酸配列（配列番号４８）を含むポリペプチドを指す。同様に、「ＣＤＫＮ３ポリペプチドの機能的等価物」という用語は、ＶＲＳ又はＥＦ−１β又はＥＦ−１γ又はＥＦ−１δ結合ドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドを指し、「ＶＲＳポリペプチド又はＥＦ−１βポリペプチド又はＥＦ−１γポリペプチドの機能的等価物」という用語は、ＣＤＫＮ３結合ドメインのアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。
【０４０５】
本発明の方法を下記にさらに詳細に記載する。
【０４０６】
ＣＤＫＮ３と、ＶＲＳ、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、若しくはＥＦ−１δとの間、又はＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの間の結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当業者によく知られている多くの方法を使用することができる。かかるスクリーニングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイシステムとして行うことができる。より具体的には、初めにＣＤＫＮ３ポリペプチド又はＮＰＴＸ１ポリペプチドを支持体に結合させ、それにＶＲＳポリペプチド、ＥＦ−１βポリペプチド、ＥＦ−１γポリペプチド、ＥＦ−１δポリペプチド、又はＮＰＴＸＲを試験化合物と共に添加する。次に、この混合物をインキュベートし、洗浄して、支持体に結合したＶＲＳポリペプチド、ＥＦ−１βポリペプチド、ＥＦ−１γポリペプチド、ＥＦ−１δポリペプチド、又はＮＰＴＸＲを検出及び／又は測定する。有望な候補化合物はＶＲＳポリペプチド、ＥＦ−１βポリペプチド、ＥＦ−１γポリペプチド、ＥＦ−１δポリペプチド、又はＮＰＴＸＲの検出量を低下させることができる。これに対し、ＶＲＳポリペプチド、ＥＦ−１βポリペプチド、ＥＦ−１γポリペプチド、ＥＦ−１δポリペプチド、又はＮＰＴＸＲを支持体に結合させてから、ＣＤＫＮ３ポリペプチド又はＮＰＴＸ１を添加してもよい。ここで、ＣＤＫＮ３又はＮＰＴＸ１、及びＶＲＳ、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲポリペプチドは、天然タンパク質としてだけでなく、遺伝子組み換え技法により調製される組み換えタンパク質としても調製することができる。天然タンパク質は、例えばアフィニティクロマトグラフィーにより調製することができる。一方、組み換えタンパク質は、ＣＤＫＮ３、ＶＲＳ、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、ＥＦ−１δ、ＮＰＴＸ１、又はＮＰＴＸＲをコードするＤＮＡを用いて形質転換した細胞を培養し、その細胞においてタンパク質を発現させた後、そのタンパク質を回収することにより調製してもよい。
【０４０７】
タンパク質を結合するのに使用され得る支持体の例は、アガロース、セルロース、及びデキストラン等の不溶性多糖、並びにポリアクリルアミド、ポリスチレン、及びシリコン等の合成樹脂を含み、好ましくは上記材料から調製される市販のビーズ及びプレート（例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップ等）が使用され得る。ビーズを使用する場合、ビーズをカラムに充填してもよい。代替的には、磁気ビーズの使用も当該技術分野で既知であり、磁力によりビーズに結合したタンパク質を容易に単離することを可能とする。
【０４０８】
タンパク質の支持体への結合は、化学的結合及び物理的吸着等の常法に従って行われ得る。代替的には、タンパク質を、該タンパク質を特異的に認識する抗体を介して支持体に結合させてもよい。さらに、タンパク質の支持体への結合は、アビジン及びビオチンによっても行うことができる。タンパク質間の結合は、緩衝液がタンパク質間の結合を阻害しない限り、バッファー（例えばリン酸バッファー及びＴｒｉｓバッファーを含むが、これらに限定されない）中で行なわれる。
【０４０９】
本発明において、表面プラズモン共鳴現象を用いたバイオセンサーが、結合タンパク質を検出又は定量する手段として使用され得る。かかるバイオセンサーが使用される場合、タンパク質間の相互作用は、微量のポリペプチドだけを用いて、標識を用いずに、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することができる（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Pharmacia）。したがって、バイオセンサー、例えばＢＩＡｃｏｒｅを用いて、ＣＤＫＮ３と、ＶＲＳ、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、又はＥＦ−１δとの間、又はＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの間の結合を評価することが可能である。
【０４１０】
代替的には、ＣＤＫＮ３、ＶＲＳ、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、若しくはＥＦ−１δ、ＮＰＴＸ１、又はＮＰＴＸＲは標識されていてもよく、このポリペプチドの標識は、結合活性を検出又は測定するために使用され得る。具体的には、ポリペプチドの１つを前標識した後、標識したポリペプチドを試験化合物の存在下で他のポリペプチドと接触させ、次に結合したポリペプチドを洗浄した後、標識により検出又は測定する。放射性同位体（例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素（例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ）、蛍光物質（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン）、及びビオチン／アビジン等の標識物質が、本発明の方法においてタンパク質を標識するために使用され得る。タンパク質を放射性同位体で標識する場合、検出又は測定は、液体シンチレーションにより行なうことができる。代替的には、酵素で標識したタンパク質を、該酵素の基質を添加し、発色等の基質の酵素的変化を吸光光度計を用いて検出することにより検出又は測定することができる。さらに、蛍光物質を標識として使用する場合、結合したタンパク質は、蛍光光度計を使用して検出又は測定され得る。
【０４１１】
さらに、ＣＤＫＮ３と、ＶＲＳ、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、若しくはＥＦ−１δとの間の結合、又はＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの間の結合は、ＣＤＫＮ３、ＶＲＳ、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、ＥＦ−１δ、ＮＰＴＸ１、又はＮＰＴＸＲに対する抗体を用いて検出又は測定することもできる。例えば、支持体上に固定化したＣＤＫＮ３ポリペプチド又はＮＰＴＸ１ポリペプチドを、試験化合物及びＶＲＳ、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ若しくはＥＦ−１δポリペプチド、又はＮＰＴＸＲポリペプチドと接触させた後、混合物をインキュベートし、洗浄し、ＶＲＳ、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ若しくはＥＦ−１δポリペプチド、又はＮＰＴＸＲポリペプチドに対する抗体を用いて検出又は測定を行うことができる。
【０４１２】
代替的には、ＶＲＳ、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、ＥＦ−１δ又はＮＰＴＸＲポリペプチドを支持体上に固定化してもよく、ＣＤＫＮ３又はＮＰＴＸ１に対する抗体を抗体として使用してもよい。本発明のスクリーニングにおいて抗体を用いる場合、抗体は好ましくは上記で述べた標識物質のうち１つで標識され、標識物質を基に検出又は測定される。代替的には、ＣＤＫＮ３、ＶＲＳ、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、ＥＦ−１δ、ＮＰＴＸ１又はＮＰＴＸＲポリペプチドに対する抗体を、標識物質で標識した二次抗体で検出される一次抗体として使用してもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいてタンパク質と結合した抗体は、プロテインＧカラム又はプロテインＡカラムを使用して検出又は測定してもよい。
【０４１３】
代替的に、本発明のスクリーニング方法の別の実施形態において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用することができる（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ」（Clontech）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Stratagene）、「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612（1992）」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92（1994）」を参照されたい）。
【０４１４】
ツーハイブリッドシステムにおいては、例えばＣＤＫＮ３ポリペプチド又はＮＰＴＸ１ポリペプチドをＳＲＦ結合領域又はＧＡＬ４結合領域に融合させ、酵母細胞において発現させる。ＮＰＴＸ１ポリペプチドに結合するＣＤＫＮ３ポリペプチド又はＮＰＴＸＲポリペプチドに結合するＶＲＳ、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ又はＥＦ−１δポリペプチドは、ＶＰ１６転写活性化領域又はＧＡＬ４転写活性化領域と融合され、同様に試験化合物の存在下で酵母細胞において発現される。代替的には、ＣＤＫＮ３ポリペプチド又はＮＰＴＸ１ポリペプチドをＳＲＦ結合領域又はＧＡＬ４結合領域と融合させてもよく、ＶＲＳ、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、ＥＦ−１δポリペプチド、又はＮＰＴＸＲポリペプチドをＶＰ１６転写活性化領域又はＧＡＬ４転写活性化領域と融合させてもよい。この２つの結合はレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンを検出可能とする。レポーター遺伝子として、ＨＩＳ３遺伝子に加えて、例えば、Ａｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を、使用することができる。
【０４１５】
さらに、ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１γを用いる場合、本発明のスクリーニング方法は、抗ホスホセリン抗体を用いることによりＥＦ−１γのリン酸化レベルを検出するものである。
【０４１６】
肺癌を治療又は予防するための化合物のさらなるスクリーニング
本発明においては、以下の事象の１つ又は複数を抑制することにより、ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣを含む肺癌の細胞増殖が低減することが明らかになる：
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの発現、
ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３、及び／又はＥＦ−１δの生物活性、並びに
ＣＤＫＮ３と、ＥＦ−１α、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、及び／又はＥＦ−１δとの間の相互作用。
【０４１７】
したがって、これらのうち少なくとも１つの事象を阻害する試験化合物をスクリーニングすることにより、肺癌を治療又は予防する可能性のある候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物が肺癌を治療又は予防する可能性は、癌に対する治療薬を同定する第２のスクリーニング及び／又はさらなるスクリーニングにより評価することができる。
【０４１８】
ＥＦ−１δ突然変異体
本明細書中で開示されるタンパク質のドミナントネガティブ（dominant negative）突然変異体を、肺癌を治療又は予防するために使用することができる。例えば、本発明は、優性阻害効果を有するＥＦ−１δ突然変異体、又はかかる突然変異体をコードするポリヌクレオチドを投与することにより、被験体において肺癌を治療又は予防する方法を提供する。ＥＦ−１δ突然変異体は、ＣＤＫＮ３結合領域を含むアミノ酸配列、例えばＥＦ−１δのロイシンジッパーの一部を含むＥＦ−１δタンパク質の一部を含み得る（図２０Ａを参照）。ＥＦ−１δ突然変異体は、配列番号８の９０ａａ〜１０８ａａの位置に対応する配列番号６１のアミノ酸配列を有し得る。
【０４１９】
本発明はまた、配列：ＥＮＱＳＬＲＧＶＶＱＥＬＱＱＡＩＳＫＬ（配列番号６１）を含むポリペプチド、又は該ポリペプチドに機能的に等価なポリペプチドのアミノ酸配列を提供するが、ここで該ポリペプチドは配列番号８から成るペプチドの生物学的機能を欠いている。好ましい実施形態では、失われる生物学的機能は肺癌細胞の細胞増殖を促進する活性である。本発明のポリペプチドの長さは完全長ＥＦ−１δ（配列番号８；２８１個の残基）未満であり得る。一般に、本発明のポリペプチドは２００個未満のアミノ酸残基、好ましくは１００個未満のアミノ酸残基、より好ましくは１０個〜５０個、代替的には８個〜３０個のアミノ酸残基を有し得る。
【０４２０】
本発明のポリペプチドは修飾されたポリペプチドを含む。本発明において、「修飾された」という用語は、例えば他の物質と結合することを指す。したがって、本発明においては、本発明のポリペプチドは細胞膜透過性物質等の他の物質をさらに含み得る。他の物質にはペプチド、脂質、糖、及び様々な天然ポリマー又は合成ポリマー等の有機化合物が含まれる。本発明のポリペプチドは、ポリペプチドがＥＦ−１δとＣＤＫＮ３との結合を阻害する所望の活性を保持する限り、任意の修飾を有し得る。幾つかの実施形態では、抑制性ポリペプチドは、ＣＤＫＮ３へのＥＦ−１δの結合と直接競合し得る。修飾はまた、本発明のポリペプチドに付加的な機能を与え得る。付加的な機能の例としては、指向性（targetability）、送達性（deliverability）、及び安定化が挙げられる。
【０４２１】
幾つかの好ましい実施形態では、ＥＦ−１δ突然変異体は、膜形質導入物質に結合し得る。多数のペプチド配列が、生細胞内に移行する能力に関して特徴付けられており、本発明においてこの目的のために使用することができる。かかる膜形質導入物質（典型的にはペプチド）は、内在化の後に生細胞中の細胞質コンパートメント及び／又は核コンパートメントに到達する能力によって定義される。形質導入物質が由来し得るタンパク質の例としては、ＨＩＶ  Ｔａｔトランス活性化因子１、ＨＩＶ  Ｔａｔトランス活性化因子２、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）転写因子アンテナペディア３が挙げられ得る。また、形質導入活性を有する非天然ペプチドも使用されている。これらのペプチドは典型的には、移行について試験される膜相互作用性で知られる小ペプチドである。Ｋ−線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の分泌シグナル配列内の疎水性領域、スズメバチ毒（venom）毒素マストパラン（トランスポータン）１３、及びブホリンＩ１４（両生類の抗微生物ペプチド）が、形質導入物質として有用であることが示されている。本発明において有用な形質導入物質の概要については、Joliot et al. Nature Cell Biology 6: 189-96 (2004)を参照されたい。
【０４２２】
ＥＦ−１δ突然変異体は一般式：
［Ｒ］−［Ｄ］
（式中、［Ｒ］は膜形質導入物質であり、［Ｄ］は配列番号６１のアミノ酸配列を有するポリペプチドである）を有し得る。該一般式において、［Ｒ］は［Ｄ］と直接連結しても、又はリンカーを介して［Ｄ］と間接的に連結してもよい。複数の官能基を有するペプチド又は化合物をリンカーとして使用することができる。具体的には、アミノ酸配列：−ＧＧＧ−がリンカーとして使用され得る。代替的には、膜形質導入物質及び配列番号６１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを微粒子の表面に結合させることができる。本発明においては、［Ｒ］は［Ｄ］の任意の（arbitral）領域に連結し得る。例えば、［Ｒ］を［Ｄ］のＮ末端又はＣ末端に連結しても、又は［Ｄ］を構成するアミノ酸残基の側鎖に連結してもよい。さらに、［Ｒ］の複数の分子を［Ｄ］の１つの分子に連結することもできる。幾つかの実施形態では、［Ｒ］の複数の分子を［Ｄ］の異なる部位に連結してもよい。別の実施形態では、［Ｄ］は共に連結した幾つかの［Ｒ］で修飾され得る。
【０４２３】
膜形質導入物質は、下記に挙げる群から選択することができる：
［ポリアルギニン］；Matsushita, M. et al, J Neurosci. 21, 6000-7 (2003)、
［Ｔａｔ／ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ］（配列番号６３）；Frankel, A. et al, Cell 55, 1189-93 (1988)、Green, M. & Loewenstein, P. M. Cell 55, 1179-88 (1988)、
［ペネトラチン／ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ］（配列番号６４）；Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994)、
［ブホリンＩＩ／ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ］（配列番号６５）；Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000)、
［トランスポータン／ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ］（配列番号６６）；Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998)、
［ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）／ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ］（配列番号６７）；Oehlke, J. et al. Biochem. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998)、
［Ｋ−ＦＧＦ／ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ］（配列番号６８）；Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995)、
［Ｋｕ７０／ＶＰＭＬＫ］（配列番号６９）；Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003)、
［Ｋｕ７０／ＰＭＬＫＥ］（配列番号７０）；Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003)、
［プリオン／ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ］（配列番号７１）；Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002)、
［ｐＶＥＣ／ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ］（配列番号７２）；Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001)、
［Ｐｅｐ−１／ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ］（配列番号７３）；Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001)、
［ＳｙｎＢ１／ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ］（配列番号７４）；Rousselle, C. et al. Mol. Pharmacol. 57, 679-86 (2000)、
［Ｐｅｐ−７／ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ］（配列番号７５）；Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002)、
［ＨＮ−１／ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ］（配列番号７６）；Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000)。
【０４２４】
本発明において、ポリアルギニンを構成するアルギニン残基の数は限定されない。幾つかの好ましい実施形態では、５個〜２０個の連続したアルギニン残基が例示され得る。好ましい実施形態では、ポリアルギニンのアルギニン残基の数は１１個である（配列番号７７）。
【０４２５】
本明細書中で使用される場合、「ＥＦ−１δのドミナントネガティブ断片」という表現は、ＣＤＫＮ３と、複合体形成（complexing）可能なＥＦ−１δの突然変異型を指す。したがって、ドミナントネガティブ断片は、完全長ＥＦ−１δポリペプチドと機能的に等価でない断片である。好ましいドミナントネガティブ断片は、ＣＤＫＮ３結合領域を含む断片、例えばＥＦ−１δのロイシンジッパーの一部を含むＥＦ−１δタンパク質の一部である。
【０４２６】
別の実施形態では、本発明は、肺癌を治療又は予防するための医薬組成物の製造における、配列：ＥＮＱＳＬＲＧＶＶＱＥＬＱＱＡＩＳＫＬを有するポリペプチド（配列番号６１）、該ポリペプチドと機能的に等価なポリペプチド、又はこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を提供するが、ここで該ポリペプチドは配列番号８から成るペプチドの生物学的機能を欠いている。さらに、別の実施形態では、本発明はまた、配列：ＥＮＱＳＬＲＧＶＶＱＥＬＱＱＡＩＳＫＬを含むポリペプチド（配列番号６１）、該ポリペプチドに機能的に等価なポリペプチド、又はこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを活性成分として含む、肺癌の治療及び予防のいずれか又は両方のための薬剤を提供するが、ここで該ポリペプチドは配列番号８から成るペプチドの生物学的機能を欠いている。代替的には、本発明はまた、配列：ＥＮＱＳＬＲＧＶＶＱＥＬＱＱＡＩＳＫＬから成るポリペプチド（配列番号６１）、又は該ポリペプチドに機能的に等価なポリペプチド、及び薬学的に許容可能な担体を含む、肺癌を治療又は予防するための医薬組成物を提供するが、ここで該ポリペプチドは配列番号８から成るペプチドの生物学的機能を欠いている。
【０４２７】
当業者は、被験体の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状、及び他の状態等の因子、投与経路、並びに投与が局所投与又は全身投与のいずれであるかを考慮することで、所与の被験体に投与される本発明のポリペプチドの有効量を容易に決定することができる。
【０４２８】
用量は症状によって異なり得るが、ＮＳＣＬＣを治療又は予防するための抗体又はその断片の例示的な投与量は、正常成人（体重６０ｋｇ）に経口投与する場合、１日当たり約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは１日当たり約１．０ｍｇ〜約５０ｍｇ、より好ましくは１日当たり約１．０ｍｇ〜約２０ｍｇである。
【０４２９】
正常成人（体重６０ｋｇ）に注射の形で非経口的に投与する場合、患者の状態、疾患の症状、及び投与方法によって幾らかの違いはあるが、１日当たり約０．０１ｍｇ〜約３０ｍｇ、好ましくは１日当たり約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ、より好ましくは１日当たり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの投与量を静脈注射するのが簡便である。また、他の動物の場合にも、６０ｋｇの体重に換算した量を投与することが可能である。
【０４３０】
より多い量又はより少ない量のペプチドを投与することを検討することができる。特定の状況に対して必要とされる正確な用量は、当業者により容易且つ日常的に決定される。
【０４３１】
本発明は、活性成分を薬学的又は生理学的に許容可能な担体に混和させる工程を含む、ＥＦ−１δを発現する肺癌を治療するための医薬組成物を製造する方法又はプロセスをさらに提供するが、ここで活性成分は配列：ＥＮＱＳＬＲＧＶＶＱＥＬＱＱＡＩＳＫＬ（配列番号６１）を含むポリペプチド、又は該ポリペプチドに機能的に等価なポリペプチドである。
【０４３２】
本発明の態様を以下の実施例で説明するが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定する意図はない。
【０４３３】
他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術を有する者（当業者）により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載のものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料を以下で説明する。
【０４３４】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０４３５】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【０４３６】
パートＩ：ＥＢＩ３関連実験
実施例１  一般的方法
１．細胞株及び組織試料
この試験で使用される２３種のヒト肺癌細胞株としては、９種の腺癌（ＡＤＣ；Ａ４２７、Ａ５４９、ＬＣ３１９、ＰＣ−３、ＰＣ−９、ＰＣ−１４、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、ＮＣＩ−Ｈ１６６６及びＮＣＩ−Ｈ１７８１）と、２種の腺扁平上皮癌（ＡＳＣ；ＮＣＩ−Ｈ２６６及びＮＣＩ−Ｈ６４７）と、７種のＳＣＣ（ＥＢＣ−１、ＬＵ６１、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、及びＳＫ−ＭＥＳ−１）と、１種の大細胞癌（ＬＸ１）と、４種の小細胞肺癌（ＳＣＬＣ；ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＳＢＣ−３及びＳＢＣ−５）とが挙げられる。全ての細胞を、１０％ＦＣＳを添加した適当な培地中で単層で成長させ、５％ＣＯ２で加湿空気雰囲気下で３７℃に維持した。対照として用いたヒト末梢気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）をCambrex Bioscience, Inc.（East Rutherford, NJ）からの最適化培地（末梢気道成長培地）中で成長させた。初代の肺癌試料は、インフォームドコンセントにより早期に取得した（Yamabuki T, et al., Int J Oncol 28: 1375-84(2006)、Kikuchi T, et al., Oncogene 22: 2192-205(2003)、Taniwaki M, et al., Int J Oncol 29: 567-75(2006)）。国際対癌連合のＴＮＭ分類に従って臨床病期を求めた（Sobin L et al., 6th ed. New York: Wiley-Liss; (2002)）。２７１種のＡＤＣ、１１０種のＳＣＣ、２８種のＬＣＣ、１４種のＡＳＣ、及び隣接正常肺組織を含む、合計で４２３種の原発性ＮＳＣＬＣ（Ｉ期〜ＩＩＩＡ期）のホルマリン固定試料は、埼玉県立がんセンター（埼玉県、日本）において外科手術を受ける患者から臨床病理的データと共に早期に得た。この研究及び言及した全ての臨床材料の使用は、個々の倫理審査委員会によって認可されたものであった。
【０４３７】
２．血清試料
血清試料は、インフォームドコンセントに署名して、１２０人の健常な対照個人（９６人の男性及び２４人の女性、２７歳〜６０歳の範囲で年齢の中央値が５１．６歳）、及び６３人の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である非腫瘍性肺疾患患者（５３人の男性及び１０人の女性、５４歳〜７３歳の範囲で年齢の中央値が６７．０歳）から得た。これらのＣＯＰＤ患者は全て、現在及び／又は以前に喫煙者であった（生涯喫煙量（pack-year index）（ＰＹＩ）の平均［±１ＳＤ］が７０．０±４２．７であった。ＰＹＩは、１日で消費したタバコ箱数［１パック２０本］に喫煙年数を乗算した数として規定された）。血清試料は、インフォームドコンセントに署名して、９５人の肺癌患者（４９人の男性及び４６人の女性、３８歳〜８３歳の範囲で年齢の中央値が６４．４歳）、並びに１９４人の肺癌患者（１４２人の男性及び５２人の女性、３８歳〜８９歳の範囲で年齢の中央値が６８．０歳）からも得た。これらの２８９肺癌症例には、１７０のＡＤＣ、３７のＳＣＣ及び８２のＳＣＬＣが含まれていた。合計で２８９人の肺癌患者から得たこれらの血清試料を、以下の基準に基づいて研究のために選択した：（ａ）患者は新たに診断され、未治療であった、及び（ｂ）患者の腫瘍が病理学的に肺癌であると診断された（Ｉ期〜ＩＶ期）。診断時に血清を得て、−１５０℃で保管した。
【０４３８】
３．半定量的逆転写−ＰＣＲ
各々の試料から得た合計で３μｇアリコートのｍＲＮＡを、ランダムプライマー（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Invitrogen，Carlsbad，CA）を用いて一本鎖ｃＤＮＡに逆転写させた。以下のＥＢＩ３に特異的な合成プライマーセット、又は内部対照としてβアクチン（ＡＣＴＢ）に特異的なプライマーを用いて半定量的逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）実験を行なった：
ＥＢＩ３、５'−ＴＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＣＴＡＣ−３'（配列番号９）及び
５'−ＡＧＣＴＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＴＧＴＡＡＣ−３'（配列番号１０）、
ＡＣＴＢ、５'−ＧＡＧＧＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＧ−３'（配列番号１１）及び
５'−ＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣ−３'（配列番号１２）。
【０４３９】
ＰＣＲは、生成物強度が増幅の直線位相（linear phase）内に確実に収まるように、サイクル数に関して最適化した。
【０４４０】
４．ノーザンブロット分析
１６種の組織を対象とするヒト多組織ブロット（BD Biosciences，Palo Alto，CA）を、以下のプライマーを用いてプローブとして調製した、［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰで標識したＥＢＩ３のＰＣＲ産物（４０４ｂｐ）とハイブリダイズさせた：
５'−ＴＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＣＴＡＣ−３'（配列番号１３）、及び
５'−ＣＴＡＣＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＡＴＴＧ−３'（配列番号１４）。
【０４４１】
プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及び洗浄を製造業者の仕様書に従って行なった。ブロットを、−８０℃、７日間の増感スクリーンでのオートラジオグラフィーに供した。
【０４４２】
５．免疫細胞化学的分析
細胞をカバーガラス（Becton Dickinson Labware，Franklin Lakes，NJ）上に置き、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて室温で３分間透過処理した。非特異的な結合を、室温で１０分間、Ｃａｓｂｌｏｃｋ（ZYMED，San Francisco，CA）でブロッキングした。次に細胞を、室温で６０分間、３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で希釈した一次抗体とインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を室温で６０分間、Ａｌｅｘａ  ４８８結合二次抗体（Invitrogen）で染色した。ＰＢＳによるさらなる洗浄の後、各々の検体を、４'、６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Vector Laboratories, Inc，Burlingame，CA）に載せ、Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＴＳＣ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ：Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）で可視化した。
【０４４３】
６．免疫組織化学及び組織マイクロアレイ
パラフィンブロック中に埋包された臨床試料におけるＥＢＩ３タンパク質の存在を研究するために、切片を以下の様に染色した。要約すると、内因性ペルオキシダーゼ及びタンパク質をブロッキングした後、３．３ｍｇ／ｍＬのヤギポリクローナル抗ヒトＥＢＩ３抗体（Santa Cruz Biotechnnology，Santa Cruz，CA）を各スライドに添加し、切片を、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ［Histofine Simple Stain MAX PO (G)，Nichirei，Tokyo，Japan］とインキュベートした。基質−色原体を添加し、検体をヘマトキシリンで対比染色した。腫瘍組織マイクロアレイは、他で記載したように（Chin SF, et al., Mol Pathol 56: 275-9 (2003）、Callagy G, et al., Diagn Mol Pathol 12: 27-34 (2003)、Callagy G, et al., J Pathol 205: 388-96 (2005)）、４２３のホルマリン固定原発性肺癌を用いて構築した。サンプリングのための組織領域を、スライド上の対応するＨ＆Ｅ染色切片との視覚化アラインメントに基づき選択した。ドナー腫瘍ブロックから採取された３つ、４つ又は５つの組織芯（直径０．６ｍｍ、深さ３ｍｍ〜４ｍｍ）を、組織マイクロアレイ（Beecher Instruments，Sun Prairie，WI）を用いてレシピエントのパラフィンブロックに入れた。それぞれの症例由来の正常な組織芯に穴を開けて、得られたマイクロアレイブロックの５μｍ切片を免疫組織化学分析に使用した。３人の別々の研究者が、臨床病理学的データの予備知識なく、以前レポートしたように（Suzuki C, et al., Cancer Res 65: 11314-25 (2005)、Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 10: 8363-70 (2004)、Kato T, et al., Cancer Res 65: 5638-46 (2005)、Hayama S, et al., Cancer Res 67: 4113-22 (2007)、ＥＢＩ３陽性度を半定量的に判定した。ＥＢＩ３染色の強度は、以下の基準を用いて評価した：強陽性（２＋とスコア付け）、５０％を超える腫瘍細胞が暗褐色に染色され、完全に細胞質を見えなくする；弱陽性（１＋）、腫瘍細胞の細胞質で検知できるより程度の低い任意の褐色染色；欠損（０とスコア付け）、腫瘍細胞において検出できる染色なし。評価人（reviewers）が別々に症例を強陽性と規定する場合のみ、症例は強陽性であると認められた。
【０４４４】
７．統計的分析
ＳｔａｔＶｉｅｗ統計プログラム（SAS，Cary，NC）を用いて統計的分析を行なった。外科手術の日からＮＳＣＬＣに関連する死亡の時点、又は最後の追跡観察までの腫瘍特異的な生存曲線を算出した。カプラン・マイヤー曲線を各関係変数及びＥＢＩ３発現について算出した。患者サブグループ間の生存期間における差異を、ログランク検定を用いて分析した。Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを用いて単変量分析及び多変量分析を行なって、臨床病理学的変数と癌関連死亡率との間の関連性を判定した。第１に、年齢、性別、病理学的腫瘍分類、及び病理学的結節分類を含む考え得る予後因子（一度に１つの因子を考慮に入れる）と死との間の関連性を分析した。第２に、多変量Ｃｏｘ分析を、Ｐ値＜０．０５の取り込み（entry）レベルを満たした任意及び全ての変数と共に、強いＥＢＩ３発現を常にモデルに入れる変数減少（backward）（ステップワイズ）手順に適用した。モデルに因子を加え続けたが、独立因子はＰ＜０．０５の追い出し（exit）レベルを超えなかった。
【０４４５】
８．ＥＬＩＳＡ
独自に構築したＥＬＩＳＡシステムでＥＢＩ３の血清レベルを測定した。まず初めに、ＥＢＩ３に特異的なヤギポリクローナル抗体を捕捉抗体として９６ウェルマイクロプレート（Nunc Roskilde，Denmark）に加え、室温で２時間インキュベートした。いかなる非結合抗体も洗い流した後、５％  ＢＳＡをウェルに加え、ブロッキングのために４℃で１６時間インキュベートした。１回の洗浄後、３倍希釈血清をウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。いかなる非結合物質も洗い流した後、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学研究所、熊本県、日本）を使用してＥＢＩ３に特異的なビオチニル化したポリクローナル抗体を検出抗体としてウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。１回洗浄して、いかなる非結合抗体−酵素試薬も取り除いた後、ＨＲＰ−ストレプトアビジンをウェルに加え、２０分間インキュベートした。１回洗浄後、基質溶液（R&D Systems, Inc.，Minneapolis，MN）をウェルに加え、３０分間反応させた。２Ｎの硫酸１００μＬを添加することによって反応を停止させた。着色強度を、４５０ｎｍの波長、５７０ｎｍの参照波長で光度計によって求めた。血清中のＣＥＡのレベルは、供給業者の推奨に従って、市販の酵素試験キット（Hope Laboratories，Belmont，CA）を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。血清中のＰｒｏＧＲＰのレベルは、供給業者のプロトコルに従って、市販の酵素試験キット（株式会社テイエフビー、東京都、日本）を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。腫瘍群と健常な対照群との間のＥＢＩ３、ＣＥＡ、及びＰｒｏＧＲＰレベルの差異はマンホイットニーＵ検定によって分析した。最適な診断精度及び尤度比を有するカットオフレベルを求めるために、ＥＢＩ３、ＣＥＡ、及びＰｒｏＧＲＰのレベルを受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析によって評価した。ＥＢＩ３とＣＥＡ／ＰｒｏＧＲＰとの間の相関係数をスピアマンの順位相関係数を用いて算出した。有意差は、Ｐ＜０．０５として規定した。
【０４４６】
９．ＲＮＡ干渉アッセイ
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖（Dharmacon, Inc.，Lafayette，CO）（６００ｐＭ）を、３０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen、Carlsbad、CA）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、ＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９及びＬＣ３１９にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を７日間培養し、細胞の生存率を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（セルカウンティングキット−８溶液；同仁化学研究所、熊本県、日本）により評価した。ＥＢＩ３発現の抑制を確認するために、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを上記のＥＢＩ３に特異的な合成プライマーを用いて行なった。ＲＮＡｉに関する合成オリゴヌクレオチドの配列は、以下のようであった：
対照１（Ｏｎ−Ｔａｒｇｅｔ  ｐｌｕｓ；Dharmacon, Inc.；
５'−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＣＧＡＣＵＡＡ−３'（配列番号５３に対応するＲＮＡ）、
５'−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＵＵＣＵＧＡ−３'（配列番号５４に対応するＲＮＡ）、
５'−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＵＵＣＣＵＡ−３'（配列番号５５に対応するＲＮＡ）、
５'−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＵＧＵＧＵＧＡ−３'（配列番号５６に対応するＲＮＡ）のプール）、
対照２（ルシフェラーゼ／ＬＵＣ：フォチヌス・ピラリス（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ遺伝子）；
５'−ＮＮＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡ−３'（配列番号１６に対応するＲＮＡ）、
ＥＢＩ３−１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＥＢＩ３−＃１）；
５'−ＵＡＣＵＵＧＣＣＣＡＧＧＣＵＣＡＵＵＧＵＵ−３'（配列番号１７）、
ｓｉ−ＥＢＩ３−＃１の標的配列；
５'−ＣＡＡＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧＴＡ−３'（配列番号１８）、
ｓｉ−ＥＢＩ３−＃２；
５'−ＡＡＣＡＧＣＵＧＧＡＣＡＵＣＣＧＵＧＡＵＵ−３'（配列番号１９）、
ｓｉ−ＥＢＩ３−＃１の標的配列；
５'−ＴＣＡＣＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＴ−３'（標的配列２０）。
【０４４７】
１０．ＥＢＩ３を発現するＣＯＳ−７形質転換体
ＥＢＩ３を安定発現する形質転換体を標準プロトコルに従って樹立した。ＥＢＩ３の全コード領域を、プライマーセット（５'−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＣＡＴＧＡＣＣＣＣＧＣＡＧＣＴＴ−３'及び５'−ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＡＴＴＧＴＧＧＣ−３'）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。産物をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩを用いて消化し、ＥＢＩ３タンパク質のＣＯＯＨ末端のｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓエピトープ配列（ＬＤＥＥＳＩＬＫＱＥＨＨＨＨＨＨ）を含有するｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／ＨｉｓＡ（＋）ベクター（Invitrogen）の適当な部位にクローニングした。ＦｕＧＥＮＥ  ６トランスフェクション試薬（Roche Diagnostics，Basel，Switherland）を製造業者のプロトコルに従って用いて、内因性ＥＢＩ３を発現しないＣＯＳ−７細胞に、ＥＢＩ３を発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＢＩ３−ｍｙｃ／Ｈｉｓ）、又はモックプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ）のいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、１０％ＦＢＳ及びジェネテシン（０．４ｍｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ中で１４日間培養した。次に、５０個の別個のコロニーをトリプシン処理し、限界希釈アッセイにより安定な形質転換体についてスクリーニングした。各々のクローンにおいてＥＢＩ３の発現を、ウエスタンブロット法及び免疫染色により求めた。
【０４４８】
１１．ＭＴＴアッセイ及びコロニー形成アッセイ
ＥＢＩ３を安定発現することのできるＣＯＳ−７形質転換体を、６ウェルプレートに播種し（１×１０４細胞／ウェル）、１０％ＦＣＳ及び０．４ｍｇ／ｍｌのジェネテシンを含有する培地において維持した。１２０時間後、細胞増殖をセルカウンティングキット（和光純薬工業株式会社、大阪府、日本）を用いたＭＴＴアッセイにより評価した。コロニーを染色し、同時に計数した。全ての実験は三連で行なった。
【０４４９】
実施例２  肺癌及び正常組織におけるＥＢＩ３発現
初期段階での癌の存在の検出に適用可能であり得る新規の分子を同定するため、且つ癌細胞の生物学的特性に基づく新規の治療を発展させるために、１０１種の肺癌の全ゲノム発現プロファイル分析を、ｃＤＮＡマイクロアレイ（Kikuchi T, et al., Oncogene 22: 2192-205 (2003)、Taniwaki M, et al., Int J Oncol 29: 567-75 (2006)、Kikuchi T, et al., Int J Oncol 28: 799-805 (2006)、Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 1: 485-99 (2003)、Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 13: 3029-43 (2004)）を用いて実行した。スクリーニングした３２２５６種の遺伝子のうち、ＥＢＩ３転写産物の発現の上昇（３倍以上）が、検査した肺癌試料の大半の癌細胞において同定された。１５種の肺癌組織のうち１１種、２３種の肺癌細胞株のうち１２種において、過剰発現が半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験により確認された（図１Ａ）。肺癌細胞における内因性ＥＢＩ３の細胞内局在化を検査するために、免疫蛍光分析を実行した。ＥＢＩ３転写産物を半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験により検出したところ、ＬＣ３１９細胞及びＮＣＩ−Ｈ１３７３細胞において、高レベルのＥＢＩ３が粒状外観を呈した腫瘍細胞の細胞質で検出されたが（図１Ａ）、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞及び気管支上皮由来のＢＥＡＳ−２Ｂ細胞は共に、ＥＢＩ３の発現を示さなかった。結果は、抗体がＥＢＩ３に特異的に結合することを示唆するものでもあった（図１Ｂ）。また、ＥＢＩ３は分泌タンパク質をコードするため、ＥＢＩ３の培養上清レベルをＥＬＩＳＡによって評価し、ＥＢＩ３はＬＣ３１９及びＰＣ１４により分泌されるが、一方でＮＣＩ−Ｈ２１７０又はＢＥＡＳ−２Ｂによる分泌ＥＢＩ３は検出されないことを確認した（図１Ｃ）。
【０４５０】
ＥＢＩ３のｃＤＮＡ断片をプローブとして用いたノーザンブロット分析により、胎盤においてのみ高度に発現する１．３ｋｂの転写産物を同定し、その転写産物は他のどの正常組織においてもほとんど検出不可能であった（図１Ｄ）。また、ＥＢＩ３タンパク質の発現をＥＢＩ３に特異的なポリクローナル抗体を用いて、５種の正常組織（肝臓、心臓、腎臓、肺、及び胎盤）及び肺癌組織上で検査した。ＥＢＩ３の染色は、腫瘍細胞の細胞質、並びに胎盤の合胞体栄養細胞層及び細胞栄養芽層で主に観察されたが、他の４つの正常組織においては検出されなかった（図１Ｅ）。肺癌におけるＥＢＩ３タンパク質の発現レベルは、胎盤における発現レベルより高かった。
【０４５１】
実施例３  ＥＢＩ３発現とＮＳＣＬＣ患者に関する予後不良との関連性
肺癌形成におけるＥＢＩ３の生物学的意義及び臨床病理的意義を調査するために、根治的切除を受けた４２３件のＮＳＣＬＣ症例からの組織切片を含有する組織マイクロアレイ上で、免疫組織化学的染色を行なった。ＥＢＩ３に特異的なポリクローナル抗体を用いて検出されるＥＢＩ３染色は、腫瘍細胞の細胞質で主に観察されるが、正常肺細胞においては観察されなかった（図２Ａ）。ＥＢＩ３発現のパターンを、組織アレイ上で、なし（０としてスコア付け）から弱い／強い陽性（１＋〜２＋としてスコア付け）までの範囲で分類した。ＥＢＩ３は、４２３種のＮＳＣＬＣのうち、２１０件（４９．６％）の症例で強く染色され（スコア：２＋）、１５９件（３７．６％）の症例で弱く染色され（スコア１＋）、５４件（１２．８％）の症例で染色されなかった（スコア０）（表２Ａ）。次に、ＥＢＩ３発現（強い陽性対弱い陽性／なし）と、性別（男性でより高い；フィッシャーの直接確率検定によるＰ＜０．０００１）、組織型（非ＡＤＣでより高い；フィッシャーの直接確率検定によるＰ＝０．０００４）、腫瘍サイズ（ｐＴ２−４でより高い；フィッシャーの直接確率検定によるＰ＝０．０００９）、及びリンパ節転移（ｐＮ１−２でより高い；フィッシャーの直接確率検定によるＰ＝０．００３９）との有意な相関が見出された（表２Ａ）。ＮＳＣＬＣ患者の生存期間中央値は、ＥＢＩ３の発現レベルが高くなるに従って有意に短くなる（Ｐ＝０．００１１、ログランク検定；図２Ｂ）。また、患者の予後と、年齢、性別、病理学的腫瘍段階（腫瘍サイズ；Ｔ１対Ｔ２−４）、病理学的結節段階（結節状態；Ｎ０対Ｎ１、Ｎ２）、組織構造（ＡＤＣ対他の組織型（histology types））、及びＥＢＩ３状態（スコア０、１＋対スコア２＋）を含む幾つかの因子との間の関連性を評価するために、単変量分析を適用した。これらの変数は全て、予後不良と有意に関連する。Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いた多変量分析により、ＥＢＩ３（Ｐ＝０．０４３５）並びに他の３つの因子（年齢、病理学的腫瘍段階、及び病理学的結節段階）が、外科的治療を行ったＮＳＣＬＣ患者に関して独立した予後因子であることが決定された（表２Ｂ）。
【０４５２】
（表２Ａ）ＮＳＣＬＣ組織におけるＥＢＩ３陽性と患者特性との間の関連性（ｎ＝４２３）
2010536366.tif 000003
【０４５３】
（表２Ｂ）ＮＳＣＬＣの患者における予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル解析
2010536366.tif 000004
【０４５４】
実施例４  肺癌患者におけるＥＢＩ３の血清レベル
ＥＢＩ３は分泌タンパク質をコードするため、ＥＢＩ３タンパク質が肺癌患者の血清中に分泌されるか否かを調査した。ＥＬＩＳＡ実験により、３０１人の肺癌患者から得た血清試料の大半においてＥＢＩ３タンパク質が検出された。肺癌患者におけるＥＢＩ３の血清レベルの平均（±１ＳＤ）は、１８．０±１６．４単位／ｍＬであった。対照的に、１３４人の健常個体の平均（±１ＳＤ）ＥＢＩ３血清レベルは、４．４±４．７単位／ｍＬであり、喫煙者及び／又は喫煙経験者である６３人のＣＯＰＤ患者における平均（±１ＳＤ）ＥＢＩ３血清レベルは、５．８±８．０単位／ｍＬであった。血清ＥＢＩ３タンパク質のレベルは、健常ドナー又はＣＯＰＤ患者におけるより肺癌患者において有意に高かったが（Ｐ＜０．０００１、マンホイットニーＵ検定）、健常個体とＣＯＰＤ患者との間の差は有意ではなかった（Ｐ＝０．１６０）。肺癌の組織型によれば、ＥＢＩ３の血清レベルは、１７８人の腺癌患者では１７．８±１５．４単位／ｍＬであり、４１人のＳＣＣ患者では１９．９±１６．９単位／ｍＬであり、８２人のＳＣＬＣ患者では１７．６±１８．１単位／ｍＬであったが（図３Ａ）、この３つの組織型間の差は有意ではなかった。本発明者らは次に、ＥＢＩ３のレベルと、情報が利用可能な肺癌患者の臨床段階との間の関係を評価した。初期段階の腫瘍を有する患者においても、高レベルの血清ＥＢＩ３が検出された（図３Ｂ）。これら３０１人の癌患者及び１３４人の健常対照のデータを用いて作成したＲＯＣ曲線を使用して（図４Ａ、左パネル）、ＥＢＩ３に対する最適な診断精度及び尤度比（最小の偽陰性及び偽陽性結果）を提供するために、このアッセイにおけるカットオフレベルを設定した（すなわち、４５．２％（３０１人中１３６人）の感度且つ９７．８％（１３４人中１３１人）の特異度で１５．４単位／ｍＬ）。腫瘍組織構造によれば、血清ＥＢＩ３の陽性症例の割合は、ＮＳＣＬＣに関しては４７．９％（２１９人中１０５人）、ＳＣＬＣに関しては３７．８％（８２人中３１人）であった。ＣＯＰＤに関しては、血清ＥＢＩ３の陽性症例の割合は３．２％（６３人中２人）であった。同じ患者における血清ＥＢＩ３のレベルをモニタリングするために、ＮＳＣＬＣ患者から得た手術前及び手術後（外科手術の２ヶ月後）の血清試料のセット（paired）を用いて、ＥＬＩＳＡ実験を実行した。血清ＥＢＩ３の濃度は、原発性腫瘍の外科的切除の後、劇的に低下した（図４Ａ、右パネル）。本発明者らはさらに、血清を外科手術の前に採取した、同じセットの６件のＮＳＣＬＣ症例（ＥＢＩ３陽性腫瘍を有する３人の患者及びＥＢＩ３陰性腫瘍を有する３人の患者）において、血清ＥＢＩ３値を原発性腫瘍におけるＥＢＩ３の発現レベルと比較した。血清ＥＢＩ３のレベルは、原発性腫瘍におけるＥＢＩ３の発現レベルと良い相関を示した（図４Ｂ）。結果は、初期段階での癌の検出及び疾患の再発のモニタリングのためのバイオマーカーとしての、血清ＥＢＩ３の高い特異性及び大きな可能性を独立して支持するものである。
【０４５５】
実施例５  腫瘍マーカーとしてのＥＢＩ３及びＣＥＡ／ＣＹＦＲＡ／ＰｒｏＧＲＰの組み合わせアッセイ
腫瘍検出バイオマーカーとしての血清ＥＢＩ３レベルの臨床有用性を評価するために、２つの従来の腫瘍マーカー（ＡＤＣ患者に対するＣＥＡ、ＳＣＣ患者に対するＣＹＦＲＡ、及びＳＣＬＣ患者に対するＰｒｏＧＲＰ）の血清レベルを、癌患者及び対照個体から得た同じ血清試料セットにおいて、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＲＯＣ分析によって、ＮＳＣＬＣ検出に関するＣＥＡのカットオフ値が、２．２ｎｇ／ｍＬであると求められた（３６．０％（１７８人中６４人）の感度且つ９７．５％（１１８人中１１５人）の特異度；図４Ｃ、左上パネル）。血清ＥＢＩ３とＣＥＡ値との間の相関係数は有意ではなく（スピアマンの順位相関係数：ρ（ｒｈｏ）＝０．０６３；Ｐ＝０．４０１６）、血清中の両方のマーカーを測定することで、ＡＤＣの検出に対する総合感度が６５．７％（１７８人中１１７人）に改善され得ることが示唆された（ＡＤＣの診断に関して、ＣＥＡ単独の感度は３６．０％（１７８人中６４人）であり、ＥＢＩ３単独の感度は４６．１％（２０５人中８２人）であった）。正常ボランティア（対照群）でのこの２つの腫瘍マーカーのいずれかに関する偽陽性率は５．１％（１１８人中６人）であったが、同じ対照群におけるＣＥＡ及びＥＢＩ３各々の偽陽性率は、それぞれ２．５％（１１８人中３人）及び２．５％（１１８人中３人）であった（図４Ｃ、左下パネル）。ＳＣＣ患者に対するＲＯＣ分析により、ＣＹＦＲＡのカットオフ値は、４８．６％（３７人中１８人）の感度且つ２．３％（１３０人中３人）の特異度で（図４Ｃ、中央上パネル）、２．０ｎｇ／ｍｌであると求められた。血清ＥＢＩ３とＣＹＦＲＡとの間の相関係数は有意ではなく（スピアマンの順位相関係数：ρ（ｒｈｏ）＝−０．１１７；Ｐ＝０．４８１７）、血清中の両方のマーカーを測定することで、ＳＣＣの検出に対する総合感度が７８．５％に改善され得ることが示唆された（ＳＣＣの診断に関して、ＣＹＦＲＡ単独の感度は４８．６％（３７人中１８人）であり、ＥＢＩ３単独の感度は５４．１％（３７人中２０人）であった）。正常ボランティア（対照群）でのこの２つの腫瘍マーカーのいずれかに関する偽陽性率は４．６％（１３０人中６人）であったが、同じ対照群におけるＣＹＦＲＡ及びＥＢＩ３各々の偽陽性率は、それぞれ２．３％（１３０人中３人）及び２．３％（１３０人中３人）であった（図４Ｃ、中央下パネル）。ＳＣＬＣ患者に対するＲＯＣ分析により、ＰｒｏＧＲＰのカットオフ値は、６４．６％（８２人中５３人）の感度且つ９７．４％（１１６人中３人）の特異度で（図４Ｃ、右上パネル）、３９．５ｐｇ／ｍＬであると求められた。血清ＥＢＩ３とＰｒｏＧＲＰ値との間の相関係数は有意ではなく（スピアマンの順位相関係数：ρ（ｒｈｏ）＝０．０７４；Ｐ＝０．５０７５）、同様に両方のマーカーの血清レベルを測定することで、ＳＣＬＣの検出に対する総合感度が７４．４％（８２人中６１人）に改善され得ることが示唆された（ＳＣＬＣの診断に関して、ＰｒｏＧＲＰ単独の感度は６４．６％（８２人中５３人）であり、ＥＢＩ３単独の感度は３７．８％（８２人中３１人）であった）。正常ボランティア（対照群）でのこの２つの腫瘍マーカーのいずれかに関する偽陽性症例は５．２％（１１６人中６人）であったが、同じ対照群におけるＰｒｏＧＲＰ及びＥＢＩ３各々の偽陽性率は、それぞれ２．６％（１１６人中３人）及び２．６％（１１６人中３人）であった（図４Ｃ、右下パネル）。
【０４５６】
実施例６  ＥＢＩ３に対するｓｉＲＮＡによる肺癌細胞の成長の阻害
ＥＢＩ３の上方制御が肺癌細胞の成長又は生存において役割を果たすか否かを判定するために、２つの異なる対照ｓｉＲＮＡ（ＯＮ−Ｔａｒｇｅｔ及びＬＵＣに関するｓｉＲＮＡ）と共に、ｓｉＲＮＡによる内因性ＥＢＩ３発現の阻害を評価した。有効なｓｉＲＮＡによる２つの異なるＮＳＣＬＣ細胞Ａ５４９又はＬＣ３１９の処理は、ＥＢＩ３の発現を低下させ（図４Ｄ）、ＭＴＴアッセイ及びコロニー形成アッセイにより測定される細胞生存率及びコロニー数の有意な阻害をもたらした（図４Ｄ）。結果はＥＢＩ３の上方制御が癌細胞の成長又は生存と関連することを示唆する。
【０４５７】
実施例７  ＥＢＩ３の成長促進効果
腫瘍形成におけるＥＢＩ３の潜在的な役割を明らかにするために、ＥＢＩ３を発現するように設計したプラスミドを調製した（ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＢＩ３−ｍｙｃ／Ｈｉｓ）。このプラスミド又はモックプラスミドをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、ＥＢＩ３を発現する安定なクローンを樹立した。抗ＥＢＩ３抗体を用いた免疫細胞化学的染色により、細胞質においてＥＢＩ３タンパク質の発現が確認された（データは示さない）。哺乳類細胞の成長に対するＥＢＩ３の影響を求めるために、本発明者らは、ＥＢＩ３を安定発現するＣＯＳ−７由来形質転換体のコロニー形成アッセイを行なった。本発明者らは、外因性ＥＢＩ３を発現する２つの独立したＣＯＳ−７細胞株（ＣＯＳ−７−ＥＢＩ３−＃１及びＣＯＳ−７−ＥＢＩ３−＃２；図４Ｅ、上パネル）を樹立し、それらの成長をモックベクターをトランスフェクトした対照細胞（ＣＯＳ−７−ＭＯＣＫ−Ｍ１及びＣＯＳ−７−ＭＯＣＫ−Ｍ２）の成長と比較した。２つのＣＯＳ−７−ＥＢＩ３細胞のどちらの成長も、ＥＢＩ３の発現レベルに応じて有意に促進された（図４Ｅ、下パネル）。また、ＣＯＳ７−ＥＢＩ３細胞においては、対照細胞より大きなコロニーを形成する顕著な傾向が見られた（図４Ｅ、下パネル）。ｓｉＲＮＡアッセイの結果によると、これらのデータによりＥＢＩ３は腫瘍成長及び／又は生存において重要な役割を果たすことが強く示唆される。
【０４５８】
分析及び考察
腫瘍の画像診断、併用化学療法、及び放射線療法における最近の進歩に関わらず、肺癌患者に関する予後及び生活の質という観点では、過去１０年間にわずかな改善しか達成されていない。したがって、癌の早期検出のための、及び個々の患者に対する補助治療法のより良い選択のための新規の診断バイオマーカーを開発することが現在緊急に必要とされている。１０１種の肺癌の全ゲノム発現プロファイル分析を、レーザーマイクロダイセクションによる癌細胞の濃縮の後、３２２５６個を超える遺伝子を含有するｃＤＮＡマイクロアレイを用いて実行した（Kikuchi T, et al., Oncogene 22: 2192-205 (2003)、Taniwaki M, et al., Int J Oncol 29: 567-75 (2006)、Kikuchi T, et al., Int J Oncol 28: 799-805 (2006)、Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 1: 485-99 (2003)、Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 13: 3029-43 (2004)）。この分析により、幾つかの遺伝子が新規の診断マーカー、治療薬、及び／又は免疫療法の開発のための候補としての可能性を有することが明らかにとなった（Suzuki C, et al., Cancer Res 65: 11314-25 (2005)、Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 10: 8363-70 (2004)、Kato T, et al., Cancer Res 65: 5638-46 (2005)、Hayama S, et al., Cancer Res 67: 4113-22 (2007)）。
【０４５９】
これらのうち、想定される腫瘍特異的な膜貫通タンパク質又は分泌タンパク質をコードする遺伝子は、細胞表面上又は細胞外空間内、及び／又は血清中に存在し、分子マーカー及び治療標的として容易に利用可能であるため、大きな利点を有すると考えられる。本発明に関しては、かかる遺伝子の１つである、分泌タンパク質をコードするＥＢＩ３を、肺癌に関する診断バイオマーカー及び予後バイオマーカー（複数可）としてのその有用性を評価するために、組織マイクロアレイ及びＥＬＩＳＡによりタンパク質発現状態において検査した。
【０４６０】
ＥＢＩ３は、エプスタイン・バーウイルス感染によって、Ｂリンパ球においてその発現を誘導することにより同定された（Devergne O, et al., J Virol 70: 1143-1153 (1996)）。この３４ｋＤａの糖タンパク質は、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットに関連するヘマトポイエチン受容体ファミリーの成員であり、細胞媒介性免疫反応の調節において役割を果たすことが示唆される。
【０４６１】
ＥＢＩ３は、ＥＢＶにより不死化したリンパ芽球様細胞株において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで強く発現することが初めに記載された３４ｋＤａの糖タンパク質である（Devergne O, et al., J Virol 70: 1143-1153 (1996)）。最近の研究により、ＥＢＩ３は新たなＩＬ−１２  ｐ３５関連サブユニットであるｐ２８とヘテロ二量化することにより、ＩＬ−２７と呼ばれる新規のサイトカインを形成し、Ｔｈ１免疫反応の開始に関して重要な役割を果たすことが明らかにされている（Pflanz S, et al., Immunity 16: 779-90 (2002)）。これに対し、ＥＢＩ３がＩＬ−１２αと共にＩＬ−３５を形成し、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞と反応することにより、免疫反応を免疫抑制へと調節し得ることを示唆する最近の報告もある（Niedbala W, et al., Eur J Immunol 37: 1-9 (2007)、Collison LW, et al., Nature 450: 566-9 (2007)）。さらに、ＥＢＩ３の発現は、ヒトの妊娠中に胎盤絨毛において見ることができることも報告されており、ＥＢＩ３が母体免疫寛容等の母体と胎盤との間の免疫反応を調節し得ることが示唆される（Devergne O, et al., Am J Pathol 159: 1763-76 (2001)）。
【０４６２】
本発明に関しては、高レベルのＥＢＩ３タンパク質発現が、肺癌患者から得た組織試料において見られた。これに従って、ｓｉＲＮＡによる内因性ＥＢＩ３の発現の阻害が肺癌細胞の生存率の著しい低下をもたらす一方で、外因性ＥＢＩ３を発現する哺乳類細胞が有意な成長促進を示すことも実証された。ＥＢＩ３の肺癌発生における詳細な機能は不明であるが、本発明の結果はＥＢＩ３発現が癌細胞増殖／生存を促進し得ることをほのめかすものであった。
【０４６３】
高レベルのＥＢＩ３タンパク質は、肺癌患者から得た血清試料においても見られた。この研究に使用される血清試料の半分は早期癌の患者に由来するものであったため、ＥＢＩ３は早期癌の診断にも有用であり得る。ＥＢＩ３を診断ツールとして適用することの実現可能性を検査するために、ＥＢＩ３の血清レベルを、ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣに対する３つの従来の診断マーカーであるＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、又はＰｒｏＧＲＰの血清レベルと、診断に対するその感度及び特異度の観点から比較した。両方のマーカーを組み合わせたアッセイ（ＥＢＩ３＋ＣＥＡ、ＥＢＩ３＋ＣＹＦＲＡ、又はＥＢＩ３＋ＰｒｏＧＲＰ）により、肺癌（ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣ）に対する感度が約６５％〜７５％まで増大されたが（ＣＥＡ又はＰｒｏＧＲＰ単独よりも有意に高い）、一方で健常ボランティアの５％〜７％が陽性であると誤って診断された。様々な臨床段階を対象とする、より大きな血清試料セットを用いたさらなる検証が必要とされているが、本明細書中に提示した本発明のデータは、肺癌に対する血清学的／組織化学的バイオマーカーとしてのＥＢＩ３自体の潜在的な臨床有用性を十分に示すものである。
【０４６４】
結論として、ＥＢＩ３は本明細書において、肺癌患者に対する予後の血清診断及び免疫組織化学的予測のための潜在的バイオマーカーとして同定された。この分子はまた、抗体療法、低分子化合物、及び癌ワクチン等の治療的アプローチの開発のための有力な候補である。
【０４６５】
ＩＩ部：ＤＬＸ５関連実験
実施例７  一般的方法
１．肺癌細胞株及び組織試料
この研究において使用されるヒト肺癌細胞株は以下のようであった：肺腺癌（ＡＤＣ）、Ａ４２７、Ａ５４９、ＬＣ３１９、ＰＣ３、ＰＣ９、及びＮＣＩ−Ｈ１３７３；細気管支肺胞上皮癌（ＢＡＣ）、ＮＣＩ−Ｈ１７８１；肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＥＢＣ−Ｉ、ＬＵ６１、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、及びＮＣＩ−Ｈ２１７０；肺腺扁平上皮癌（ＡＳＣ）、ＮＣＩ−Ｈ２２６及びＮＣＩ−Ｈ６４７；肺大細胞癌（ＬＣＣ）、ＬＸ１；並びに小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＳＢＣ−３、及びＳＢＣ−５。全ての細胞を１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充した適当な培地において単層で成長させ、５％ＣＯ２の加湿空気の雰囲気で３７℃に維持した。ヒト末梢気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）は、Cambrex Bio Science Inc.（Walkersville，MD）から購入した最適化培地（ＳＡＧＭ）において成長させた。１４種の原発性ＮＳＣＬＣ（７種のＡＤＣ及び７種のＳＣＣ）を、以前に記載されているように（Kato T, et al., Cancer Res 65: 5638-46 (2005)）、書面によるインフォームドコンセントを行なった上で患者から得た。合計で３６９種のＮＳＣＬＣ及び隣接正常肺組織の組織マイクロアレイ上での免疫染色用の試料は、埼玉県立がんセンター（埼玉県、日本）において根治的外科手術を受ける患者から得た。この研究及び全ての臨床材料の使用は、企業研究倫理委員会によって認可されたものであった
【０４６６】
２．半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Life Technologies, Inc.，Gaithersburg，MD）を用い、製造業者のプロトコルに従って培養細胞及び臨床組織から抽出した。抽出したＲＮＡ及び正常ヒト組織ポリ（Ａ）ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（株式会社ニッポンジーン、東京都、日本）で処理し、オリゴ（ｄＴ）プライマー及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Invitrogen，Carlsbad，CA）を用いて逆転写した。以下のＤＬＸ５特異的プライマー又は内部対照としてＡＣＴＢ特異的プライマーを用いて、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を行なった：
ＤＬＸ５：５'−ＣＴＣＧＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＣＡＴ−３'（配列番号２１）、及び
５'−ＡＧＴＴＧＡＧＧＴＣＡＴＡＧＡＴＴＴＣＡＡＧＧＣＡＣ−３'（配列番号２２）；
ＡＣＴＢ：５'−ＧＡＧＧＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＧ−３'（配列番号１１）及び
５'−ＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣ−３'（配列番号１２）。
【０４６７】
生成物強度が増幅の対数期内に確実に収まるように、ＰＣＲ反応をサイクル数に関して最適化した。
【０４６８】
３．ノーザンブロット分析
ヒト多組織ブロット（BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA）を、３２Ｐで標識したＤＬＸ５のＰＣＲ産物とハイブリダイズさせた。ＤＬＸ５のｃＤＮＡプローブを、上記のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより調製した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及び洗浄を供給業者の勧告に従って実行した。ブロットを室温で３０時間、増感ＢＡＳスクリーン（BIO−RAD，Hercules，CA）でのオートラジオグラフィーに供した。
【０４６９】
４．抗ＤＬＸ５抗体
ＮＨ２末端にＨｉｓタグ付きエピトープを含有する、ＤＬＸ５の完全長断片を発現するプラスミドを、ｐＥＴ２８ベクター（Novagen，Madison，WI）を用いて調製した。この組み換えペプチドを、大腸菌ＢＬ２１コドンプラス株（Stratagene，LaJolla，CA）において発現させ、ＴＡＬＯＮ樹脂（BD Bioscience）を用いて、供給業者のプロトコルに従って精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で抽出したタンパク質をウサギに接種し、免疫血清を標準方法に従ってアフィニティカラム上で精製した。アフィニティ精製した抗ＤＬＸ５抗体を、免疫組織化学的研究に使用した。ＤＬＸ５発現ベクターをトランスフェクトした細胞株から得た可溶化物を用いたウエスタンブロット上で、及び細胞株の免疫細胞化学的染色によって（細胞株は各々ＤＬＸ５を内因的に発現するか又は発現しない）、抗体がＤＬＸ５に特異的であることが確認された。
【０４７０】
５．免疫細胞化学
ＳＢＣ−５細胞をカバースリップ上に播種し、細胞を４％ホルムアミド中で固定し、冷メタノール／アセトン（５０：５０）を用いて室温で５分間透過処理した。ＰＢＳで一回洗浄した後、細胞を抗ＤＬＸ５抗体と室温で１時間インキュベートした後、Ａｌｅｘａ４８８結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）（１：１０００希釈）と暗所で１時間インキュベートした。共焦点顕微鏡（ＴＣＳ  ＳＰ２−ＡＯＢＳ、Leica Microsystems）上で画像を捉えた。
【０４７１】
６．免疫組織化学及び組織マイクロアレイ分析
臨床材料におけるＤＬＸ５タンパク質の存在を調査するために、組織切片をＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（DakoCytomation，Glostrup，Denmark）によって染色した。内因性ペルオキシダーゼ及びタンパク質をブロッキングした後、アフィニティ精製した抗ＤＬＸ５抗体を添加し、各々の切片を二次抗体であるＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧとインキュベートした。基質色原体を添加し、検体をヘマトキシリンで対比染色した。腫瘍組織マイクロアレイを、他に掲載されているように、ホルマリン固定ＮＳＣＬＣを用いて構築した（Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 10: 8363-70 (2004)）。サンプリングのための組織領域は、スライド上での対応するＨＥ染色切片とのビジュアルアラインメント（visual alignment）に基づいて選択した。ドナー腫瘍ブロックから採取した３つ、４つ、又は５つの組織芯（直径０．６ｍｍ；高さ３ｍｍ〜４ｍｍ）を、組織マイクロアレイヤー（Beecher Instruments，Sun Prairie，WI）を用いてレシピエントパラフィンブロックに入れた。各々のケースから正常組織の芯を抜いた。得られたマイクロアレイブロックの５μｍの切片を免疫組織化学的分析に使用した。ＤＬＸ５に関する陽性は、臨床追跡データの予備知識を持たない３人の別の調査員により半定量的に判定され、調査員は各々、染色強度をなし（０としてスコア付け）、弱い陽性（１＋）、又は強い陽性（２＋）として記録した。肺癌は、全ての調査員（reviewers）が強い陽性（２＋）であると判断した場合にのみ、そのようにスコア付けした。
【０４７２】
７．統計的分析
全ての分析は、統計的分析ソフトウェア（ＳｔａｔＶｉｅｗ、バージョン５．０；SAS Institute, Inc.，Cary，NC，USA）を用いて実行した。その発現レベルと年齢、性別、病理学的ＴＮＭ段階、及び組織型等の臨床病理的変数との間の相関を次に検査した。強いＤＬＸ５免疫反応性を、フィッシャーの直接確率検定を用いて臨床病理学的変数との関連性について判定した。Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを用いて単変量分析及び多変量分析を行なって、臨床病理学的変数と癌関連死亡率との間の関連性を判定した。第１に、年齢、性別、組織型、ｐＴ分類、及びｐＮ分類を含む考え得る予後因子（一度に１つの因子を考慮に入れる）と死との間の関連性を分析した。第２に、多変量Ｃｏｘ分析を、０．０５未満のＰ値の取り込み（entry）レベルを満たした任意及び全ての変数と共に、ＤＬＸ５発現を常にモデルに入れる変数減少（ステップワイズ）手順に適用した。モデルに因子を加え続けたが、独立因子はＰ＜０．０５の追い出し（exit）レベルを超えなかった。
【０４７３】
８．ＲＮＡ干渉アッセイ
哺乳類細胞においてｓｉＲＮＡを生成するように設計されたベクターベースのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）システム、ｐｓｉＨ１ＢＸ３．０がこれまでに確立されている（Suzuki C, et al., Cancer Res 63: 7038-41(2003)）。ＤＬＸ５特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクター１０μｇを、３０μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen）を用いて、ＤＬＸ５を内因性過剰発現した、ＳＢＣ−５及びＮＣＩ−Ｈ１７８１細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を適当な濃度のジェネテシン（Ｇ４１８）の存在下で７日間培養し、コロニー数及び生細胞をギムザ染色及び三連ＭＴＴアッセイによって計数した。ＲＮＡｉに対する合成オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の通りであった：
対照１（ＥＧＦＰ：高感度緑色蛍光タンパク質遺伝子、オワンクラゲ（Aequorea victoria）ＧＦＰの突然変異体）、５'−ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣ−３'（配列番号２３）；
対照２（スクランブル：５Ｓ及び１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする葉緑体ミドリムシ（Euglena gracilis）遺伝子）、５'−ＧＣＧＣＧＣＴＴＴＧＴＡＧＧＡＴＴＣＧ−３'（配列番号１６）；
ｓｉＲＮＡ−ＤＬＸ５−♯１、５'−ＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＴＧ−３'；
ｓｉＲＮＡ−ＤＬＸ５−♯２、５'−ＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＴＣＡＡ−３'。
【０４７４】
本発明のＲＮＡｉシステムを実証するために、対照又は効力のないｓｉＲＮＡではなく、機能的ｓｉＲＮＡによるＤＬＸ５発現の下方制御を、このアッセイに使用される細胞株において確認した。
【０４７５】
実施例８  肺癌及び正常組織におけるＤＬＸ５遺伝子の発現
肺癌に対する新規の治療剤及び／又はバイオマーカーの開発のための標的分子を同定するために、初めに、分析した８６種のＮＳＣＬＣ又は１５種のＳＣＬＣの５０％より多くにおいて、５倍以上の発現を示す遺伝子についてｃＤＮＡマイクロアレイによるスクリーニングを実行した（Kikuchi T, et al. Oncogene. 2003 Apr 10;22 (14): 2192-205、Taniwaki M, et al, Int J Oncol. 2006 Sep; 29(3): 567-75、Kakiuchi S, et al. Mol Cancer Res. 2003 May; 1(7): 485-99）。スクリーニングした２７６４８種の遺伝子のうち、ＤＬＸ５遺伝子が肺癌の大部分において過剰発現されることが同定され、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験によって１４種のさらなるＮＳＣＬＣ症例のうち９種（７種のＡＤＣのうち２種及び７種のＳＣＣの全て）（図５Ａ）並びに２３種の肺癌細胞株のうち１０種においてその過剰発現が確認されたが、一方で正常気管支上皮に由来するＳＡＥＣ細胞においては、その発現はほとんど検出不可能であった（図５Ｂ）。肺癌細胞における内因性ＤＬＸ５の細胞内局在化を求めるために、続いてヒトＤＬＸ５に特異的なウサギポリクローナル抗体を作出し、ＳＢＣ−５細胞の核において強く染色され、細胞質において弱く染色されることを見出した（図５Ｃ）。ＤＬＸ５のｃＤＮＡをプローブとして用いたノーザンブロット分析により、検査した２３種の組織のうち胎盤においてのみ１．８ｋｂの転写産物に対応する強いシグナルを同定した（図５Ｄ）。さらに、５種の正常組織（心臓、肝臓、腎臓、肺、及び胎盤）におけるＤＬＸ５タンパク質の発現を、抗ＤＬＸ５ポリクローナル抗体を用いて免疫組織化学的分析により肺癌における発現と比較した。ノーザン分析の結果と一致して、胎盤及び肺癌においてはＤＬＸ５の発現が観察されたが、他の４種の正常組織においてはほとんど検出不可能であった（図６Ａ）。
【０４７６】
実施例９  ＮＳＣＬＣ患者でのＤＬＸ５発現と予後不良との関連性
ＤＬＸ５の臨床病理的意義を確認するために、ＤＬＸ５タンパク質の発現を、根治性の外科的切除を受けた３６９人の患者由来の肺癌組織を含有する組織マイクロアレイによりさらに検査した。ＤＬＸ５発現パターンを欠損／弱（０〜１＋にスコア付け）〜強（２＋）の範囲で組織アレイ上で分類した（図６Ｂ）。ポジティブ染色が、２３４種中１９１種（８１．６％）のＡＤＣ腫瘍、９５種中８０種（８４．２％）のＳＣＣ腫瘍、２７種中２４種（８８．９％）のＬＣＣ腫瘍、及び１３種中１０種（７６．９％）のＡＳＣ腫瘍で見出された。次にＤＬＸ５発現（強陽性対弱陽性／欠損）と様々な臨床病理的パラメータとの相関関係を検査し、ｐＴ分類との有意な相関関係が見出された（大きい腫瘍でより高い、Ｐ＝０．００５３、フィッシャーの直接確率検定)（表３Ａ）。
【０４７７】
検査した３６９件のＮＳＣＬＣ症例の中で、ＤＬＸ５が１６０症例で強く染色され（４３．４％、スコア２＋)、１４５症例で弱く染色され（３９．３％、スコア１＋）、及び６４症例で染色されなかった（１７．３％、スコア０）（詳細を表３Ａに示す）。腫瘍が強いＤＬＸ５発現を示したＮＳＣＬＣ患者は、欠損／弱いＤＬＸ５発現のものに比べて腫瘍特異的な生存期間が短いことを明らかにした（Ｐ＝０．００４５、ログランク検定、図６Ｃ）。また単変量分析は、患者の予後と、年齢（６５歳未満対６５歳以下）、性別（女性対男性）、組織型（ＡＤＣ対非ＡＤＣ)、ｐＴ分類（Ｔ１対Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４）、ｐＮ分類（Ｎ０対Ｎ１、Ｎ２）、及びＤＬＸ５状態（０、１＋対２＋）を含む他の因子との関連性を評価するのに適用した。
【０４７８】
これらのパラメータの中で、ＤＬＸ５状態（Ｐ＝０．００４８）、高齢者（Ｐ＝０．００２８）、男性（Ｐ＝０．００１）、非ＡＤＣ組織学的分類（Ｐ＝０．００１）、進行性ｐＴ段階（Ｐ＜０．０００１）、及び進行性ｐＮ段階（Ｐ＜０．０００１）が、有意に予後不良に関連していた（表３Ｂ）。予後因子の多変量分析では、強いＤＬＸ５発現、高齢者、より高いｐＴ段階及びより高いｐＮ段階が独立した予後因子であることを示した（それぞれＰ＝０．０４１５、０．０００７、０．０００４及びＰ＜０．０００１；表３Ｂ）。
【０４７９】
（表３Ａ）ＮＳＣＬＣ組織におけるＤＬＸ５陽性度と患者の特性との間の関連性（ｎ＝３６９）
2010536366.tif 000005
【０４８０】
（表３Ｂ）ＮＳＣＬＣの患者における予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル分析
2010536366.tif 000006
【０４８１】
実施例１０  ＤＬＸ５に対する特定のｓｉＲＮＡによるＮＳＣＬＣ細胞の成長阻害
ＤＬＸ５が肺癌細胞の成長又は生存に不可欠であるか否かを判定するために、ＤＬＸ５に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＤＬＸ５−＃１及びｓｉ−ＤＬＸ５−＃２）を発現するプラスミド及び２つの対照プラスミド（ＥＧＦＰ及びスクランブルに対するｓｉＲＮＡ）を構築し、肺癌細胞株、ＳＢＣ−５及びＮＣＩ−Ｈ１７８１にトランスフェクトした。ｓｉ−ＤＬＸ５−＃２をトランスフェクトした細胞におけるｍＲＮＡレベルは、これらの２つの対照ｓｉＲＮＡ又はｓｉ−ＤＬＸ５−＃１のいずれかをトランスフェクトしたものに比べて有意に低下した。コロニー数及びＭＴＴアッセイによって測定された生細胞の数で有意な低下が観察され、このことによりＤＬＸ５の上方制御が、癌細胞の成長又は生存に関連することが示唆された（ＳＢＣ−５の代表的なデータを図６Ｄに示す）。
【０４８２】
考察：
癌治療のための分子標的薬物の開発は進歩したが、利用可能な治療に対して良好な応答を示す患者の割合は依然として非常に限定されている（Imai K, et al., Nat Rev Cancer 6:714-27（2006））。このため、有害反応が最小であるか又は全くなく、悪性細胞に対する特異性が高い新規の抗癌剤を開発することが急務である。このために、本発明者らは、以下のように薬物開発に良好な分子標的を同定する戦略を推進している；１）ｃＤＮＡマイクロアレイ分析に基づく癌細胞における上方制御遺伝子のスクリーニング；２）ＲＮＡｉシステムを用いた機能喪失表現型の研究及びタンパク質の生物学的機能の規定；並びに３）組織マイクロアレイ上の数百もの臨床試料間のタンパク質発現の系統的分析。このアプローチをとると、遠位欠失ホメオボックスタンパク質ファミリーの成員であるＤＬＸ５が臨床肺癌試料及び細胞株の大部分で頻繁に過剰発現されること、及びこの遺伝子産物が肺癌細胞の生存／成長に必要であることが本明細書で実証される。
【０４８３】
ショウジョウバエ遠位欠失（Ｄｌｌ）遺伝子産物に対する配列に関連したホメオボックス含有転写因子のファミリーをコードする、脊椎動物のＤｌｘ遺伝子は、パラログの機能的多様性の一例を構成する。以前に研究された全ての脊椎動物は、一般に３つの二遺伝子（bigene）クラスターとして配置される少なくとも６つのＤｌｘ遺伝子を有する：Ｄｌｘ１／Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ５／Ｄｌｘ６、及びＤｌｘ３／Ｄｌｘ４（Ｄｌｘ７）（２４、２８〜３０）。Ｄｌｘ５タンパク質は、初期胚発生中のマウス胚の前部に初めに発現される（Simeone A, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 91:2250-4（1994））。ホモ接合Ｄｌｘ５／Ｄｌｘ６ダブルノックアウトマウスが、中指の喪失及びかぎ爪状の四肢末端を特徴とする異種四肢障害である裂手／裂足奇形（ＳＨＦＭ）表現型を示すことが報告されており、これによりＤＬＸ５遺伝子が哺乳類の四肢発生に重要な調節因子の１つであることが示唆される（Merlo GR, et al., Genesis 33:97-101（2002））。実際、ＤＬＸ５は、哺乳類での骨芽細胞分化に関与するカスケードを開始するのに不可欠なマスター転写調節因子であることが示された（Lee JY, et al., Mol Cells 22:182-8（2006）, Ryoo HM, et al., Mol Endocrinol 11:1681-94（1997））。
【０４８４】
本研究では、ＤＬＸ５遺伝子が肺癌で頻繁に過剰発現され、また肺癌の発症／進行に重要な役割を果たし得ることが実証された。この研究では、肺癌細胞におけるｓｉＲＮＡによるＤＬＸ５発現のノックダウンにより、細胞成長が抑制された。さらに、本発明の組織マイクロアレイ実験によって得られた臨床病理的証拠により、ＤＬＸ５強陽性腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者が、ＤＬＸ５弱陽性／陰性腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者よりも癌特異的な生存期間が短かったことが示された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにより得られた結果により、ＤＬＸ５が肺癌細胞の重要な成長因子であり、より悪性の表現型に関連すると考えられることが強く示唆された。ＤＬＸ５タンパク質は、主に核に存在し、ホメオドメインを含むので、転写調節に重要な役割を果たし、肺癌細胞で様々な下流遺伝子を直接的又は間接的に転写活性化するはずである。ＤＬＸ５経路のさらなる調査により、肺癌形成における癌遺伝子（oncogenes：オンコジーン）の活性化機構についてさらに理解を深めることができる。ＤＬＸ５が胎盤を除くいずれの正常な成人組織でも発現されないので、ＤＬＸ５活性の選択的阻害は、有害事象の最小の危険性で癌に対して強力な生物活性を有することが期待される有望な治療戦略であり得る。
【０４８５】
要するに、ＤＬＸ５遺伝子は、肺癌の成長／進行に重要な役割を果たすと考えられる。切除検体におけるＤＬＸ５過剰発現は、予後不良であると思われる患者に対するアジュバント療法の適用に有用な指標となり得る。さらに、本明細書中のデータにより、ヒト癌治療のために特異的にＤＬＸ５を標的とする新たな抗癌剤及び癌ワクチンの設計の可能性が強く示唆される。
【０４８６】
パートＩＩＩ：ＮＰＴＸ１関連実験
実施例１１  一般的方法
１．細胞株及び組織試料
この試験で使用される２３種のヒト肺癌細胞株としては、９種の腺癌（ＡＤＣ；Ａ４２７、Ａ５４９、ＬＣ３１９、ＰＣ−３、ＰＣ−９、ＰＣ−１４、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、ＮＣＩ−Ｈ１６６６及びＮＣＩ−Ｈ１７８１）と、９種の扁平上皮癌（ＳＣＣ；ＥＢＣ−１、ＬＵ６１、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ６４７、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、及びＳＫ−ＭＥＳ−１）と、１種の大細胞癌（ＬＣＣ；ＬＸ１）と、４種の小細胞肺癌（ＳＣＬＣ；ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＳＢＣ−３及びＳＢＣ−５）とが挙げられる。全ての細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加した適当な培地中で単層で成長させ、５％ＣＯ２で加湿空気雰囲気下で３７℃に維持した。ヒト末梢気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）をCambrex Bio Science Inc.（Walkersville, MD）から購入した最適化培地（ＳＡＧＭ）中で成長させた。初代の肺癌組織試料は、以前に記載されたように（Kikuchi 2003、Taniwaki 2006）、書面によるインフォームドコンセントにより取得した。２３８種のＡＤＣ、９５種のＳＣＣ、２８種のＬＣＣ、及び１３種のＡＳＣ、及び隣接正常肺組織を含む、合計で３７４種の原発性ＮＳＣＬＣのホルマリン固定試料は、埼玉県立がんセンター（埼玉県、日本）において外科手術を受けた患者から臨床病理的データと共に早期に得た。１３種のＳＣＬＣを、広島大学（広島県、日本）で剖検を受けた個体から得た。腫瘍検体の組織学的分類は、ＷＨＯ基準に基づいていた（Travis WD）。ＮＳＣＬＣ検体及び死後材料（ＡＤＣを有する２個体）由来の５種の組織（心臓、肝臓、肺、腎臓、及び副腎）も広島大学から入手した。この研究及び言及した全ての臨床材料の使用は、個々の倫理審査委員会によって認可されたものであった。
【０４８７】
２．血清試料
血清試料は、インフォームドコンセントに署名した、対照として１０２人の健常な個人（８４人の男性及び１８人の女性、３１歳〜６０歳の範囲で年齢の中央値が４９．０±７．４６ＳＤ）、及び日本のオーダーメイド医療実現化プロジェクト（BioBank Japan）の一部として登録された又は広島大学病院に入院した、８０人の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である非腫瘍性肺疾患患者（６８人の男性及び１２人の女性、５４歳〜７３歳の範囲で年齢の中央値が６６．４±５．９２ＳＤ）から得た。これらの患者は全て、現在及び／又は以前に喫煙者であった（生涯喫煙量（pack-year index）（ＰＹＩ）の平均［±１ＳＤ］が６４．２±４１．６であった。ＰＹＩは、１日で消費したタバコ箱数［１パック２０本］に喫煙年数を乗算した数として規定された）。健常個体は、全血球計算値、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、赤血球沈降速度、肝機能検査、腎機能検査、尿検査、便検査、胸部Ｘ線検査、又は心電図では異常を示さなかった。血清試料は、インフォームドコンセントに署名した、広島大学病院及び神奈川県立がんセンター病院に入院した２２３人の肺癌患者、並びに日本のオーダーメイド医療実現化プロジェクト（BioBank Japan）の一部として登録された１０６人の肺癌患者（２２７人の男性及び１０２人の女性、３０歳〜８６歳の範囲で年齢の中央値が６６．６±１１．２ＳＤ）からも得た。以下の基準に基づき、試験のために試料を選択した：（１）患者は、新たに診断され、これまでに治療しておらず、（２）患者の腫瘍を肺癌として病理的に診断した（Ｉ期〜ＩＶ期）。これらの３２９症例には、１８５のＡＤＣ、５１のＳＣＣ、及び９３のＳＣＬＣが含まれていた。臨床病理的記録を完全に文書で行った。診断時に血清を得て、−８０℃で保存した。
【０４８８】
３．半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
総ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD）を使用して培養細胞及び臨床組織から抽出した。抽出ＲＮＡ及び正常なヒト組織のポリＡ  ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）で処理した後、オリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマーとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Life Technologies, Inc.）とを用いて逆転写した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を、合成ＮＰＴＸ１遺伝子特異的プライマー（５'−ＧＴＴＧＧＧＧＡＣＣＧＧＡＧＧＴＡＡＡ−３'及び５'−ＡＡＡＣＣＡＣＧＡＣＴＴＣＧＴＣＡＡＧＣ−３'）、合成ＮＰＴＸＲ遺伝子特異的プライマー（５'−ＴＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＣＡＴＣＴ−３'及び５'−ＧＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＴＧ−３'）、又は内部対照としてβアクチン（ＡＣＴＢ）特異的プライマー（５'−ＡＴＣＡＡＧＡＴＣＡＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴ−３'及び５'−ＣＴＧＣＧＣＡＡＧＴＴＡＧＧＴＴＴＴＧＴ−３'）を用いて行った。全てのＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００（Applied Biosystems, Foster City, CA）で、９４℃、２分間の初期変性、その後の２２サイクル（ＡＣＴＢでは）又は３５サイクル（ＮＰＴＸ１では）の９４℃、３０秒、５４℃又は６０℃、３０秒、及び７２℃、６０秒を包含した。
【０４８９】
４．ノーザンブロット分析
ヒト多重組織ブロット（BD Biosciences, Palo Alto, CA）を、３２Ｐ標識ＰＣＲ産物とハイブリダイズさせた。ＮＰＴＸ１のＰＣＲ産物を、上記と同じプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによってプローブとして調製した。供給業者の推奨に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗浄を実行した。−８０℃で１週間、増感スクリーンを用いて、ブロットをオートラジオグラフィーに供した。
【０４９０】
５．抗ＮＰＴＸ１抗体の調製
ＮＰＴＸ１（ＢＢ０１７）に特異的なウサギポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を、ウサギにＧＳＴ融合ヒトＮＰＴＸ１タンパク質（コドン２０〜１４５及び２９７〜４３０）で免疫付与することにより産生し、標準プロトコルを用いて精製した。またヒトＮＰＴＸ１（ｍＡｂ−７５−１）に特異的なマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、遺伝子銃を用いてヒトＮＰＴＸ１タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡをＢＡＬＢ／ｃマウス（Chowdhury）の皮内に免疫付与することにより産生した。ＮＰＴＸ１のｍＡｂをアフィニティクロマトグラフィによって細胞培養上清から精製した。ＮＰＴＸ１のｍＡｂが、内因的にＮＰＴＸ１を発現した又は発現しなかった肺癌細胞株の可溶化物を用いたウエスタンブロット分析によってヒトＮＰＴＸ１に特異的であることが証明された。
【０４９１】
６．ウエスタンブロット分析
細胞を、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｓｅｔ  ＩＩＩ（Calbiochem, Darmstadt, Germany）を含有するラジオイムノ沈降アッセイバッファー［５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸Ｎａ、０．１％ＳＤＳ］で溶解した。タンパク質試料を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによって分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬニトロセルロース膜（GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ）上に電気ブロットした。ブロットを、マウスモノクローナル抗ＮＰＴＸ１抗体（ｍＡｂ−７５−１）とインキュベートした。抗原−抗体複合体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（GE Healthcare Bio-sciences）と結合した二次抗体を用いて検出した。タンパク質バンドを増強化学発光ウエスタンブロット法検出試薬（GE Healthcare Bio-Sciences）によって可視化した。
【０４９２】
７．免疫蛍光分析
細胞をカバーガラス（Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ）上に置き、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて室温で３分間透過処理した。非特異的な結合を、室温で１０分間、ＣＡＳＢＬＯＣＫ（ZYMED, South San Francisco, California）でブロッキングした。次に細胞を、室温で６０分間、３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で希釈したヒトＮＰＴＸ１抗体（ｍＡｂ−７５−１）に対する一次抗体とインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を室温で６０分間、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。ＰＢＳによるさらなる洗浄の後、各々の検体を、４'，６'−ジアミジン−２'−フェニルインドレンジヒドロクロライド（ＤＡＰＩ）を含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA）に載せ、Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＴＳＣ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ：Leica Microsystems, Wetzlar, Germany）で可視化した。
【０４９３】
８．免疫組織化学及び組織マイクロアレイ
パラフィンブロック中に埋包された臨床試料におけるＮＰＴＸ１タンパク質の存在を研究するために、切片を以下の様に染色した。要約すると、内因性ペルオキシダーゼ及びタンパク質をブロッキングした後、１００ｍｇ／ｍｌのマウスモノクローナル抗ヒトＮＰＴＸ１抗体（ｍＡｂ−７５−１）を添加した。切片を、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧとインキュベートした。基質−色原体を添加し、生検試料をヘマトキシリンで対比染色した。
【０４９４】
腫瘍組織マイクロアレイは、他で記載されているように（Callagy, 2003, 2005; Chin）、３８７のホルマリン固定原発性肺癌（３７４のＮＳＣＬＣ及び１３のＳＣＬＣ）を用いて構築した。サンプリングのための組織領域を、スライド上の対応するＨＥ染色切片との視覚化アラインメントに基づき選択した。ドナー腫瘍ブロックから採取された３つ、４つ又は５つの組織芯（直径０．６ｍｍ、高さ３ｍｍ〜４ｍｍ）を、組織マイクロアレイヤー（Beecher Instruments, Sun Prairie, WI）を用いてレシピエントのパラフィンブロックに入れた。それぞれの症例由来の正常な組織芯に穴を開けて、得られたマイクロアレイブロックの５μｍ切片を免疫組織化学分析に使用した。３人の別々の研究者が、臨床病理学的データの予備知識なく、ＮＰＴＸ１陽性度を半定量的に判定した。ＮＰＴＸ１染色の強度は、以下の基準を用いて評価した：強陽性（２＋とスコア付け）、５０％を超える腫瘍細胞が暗褐色に染色され、完全に細胞質を見えなくする；弱陽性（１＋）、腫瘍細胞の細胞質で検知できるより程度の低い任意の褐色染色；欠損（０とスコア付け）、腫瘍細胞において検出できる染色なし。評価人（reviewers）が別々に症例を強陽性と規定する場合のみ、症例は強陽性であると認められた。
【０４９５】
９．統計的分析
統計分析をＳｔａｔ  Ｖｉｅｗ統計プログラム（SaS, Cary, NC）を用いて実行した。臨床病理的変数とＮＰＴＸ１に対する陽性度との関連性を、フィッシャーの直接確率検定によって比較した。腫瘍特異的な生存率をカプラン・マイヤー法によって評価し、２つの群間の差異をログランク検定で評価した。変数減少法によるＣｏｘ比例ハザード回帰モデルを用いて予後に関連する危険因子を評価した。比例ハザード仮定を確認し、これを満たし、単変量分析において統計的に有意な結果を有する変数のみを多変量分析に含めた。このモデルから変数を取り除くための基準は尤度比統計値であり、これは最尤部分推定値に基づいていた（除去のためのデフォルトＰ値  ０．０５）。
【０４９６】
１０．ＥＬＩＳＡ
独自に構築したＥＬＩＳＡシステムでＮＰＴＸ１の血清レベルを測定した。まず初めに、ＮＰＴＸ１に特異的なマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ−７５−１；４ｍｇ／ｍｌ）を１ウェル当たり１００ｍｌ、捕捉抗体として９６ウェルマイクロプレート（Nunc Maxisorp Bioscience, Inc., Naperville, IL）に加え、室温で２時間インキュベートした。室温で、ＰＢＳＴ（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳ）を用いて、いかなる非結合抗体も洗い流した後、５％  ＢＳＡを１ウェル当たり２００ｍｌウェルに加え、ブロッキングのために室温で２時間インキュベートした。３回の洗浄後、１％ＢＳＡを有するＰＢＳ中の３倍希釈血清を１ウェル当たり１００ｍｌウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。いかなる非結合物質も洗い流した後、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（株式会社同仁化学研究所、熊本県、日本）を使用してビオチニル化した、ＮＰＴＸ１に特異的なウサギポリクローナル抗体（ＢＢ０１７；０．０１ｍｇ／ｍｌ）を、検出抗体として１ウェル当たり１００ｍｌウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。３回洗浄して、いかなる非結合抗体−酵素試薬も取り除いた後、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡｖ−ＨＲＰ）をウェルに加え、２０分間インキュベートした。３回の洗浄後、基質溶液（R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN）を１ウェル当たり１００ｍｌウェルに加え、３０分間反応させた。２Ｎの硫酸５０ｍｌを添加することによって反応を停止させた。着色強度を、４５０ｎｍの波長、５７０ｎｍの参照波長で光度計によって求めた。血清中のＣＥＡのレベルは、供給業者の推奨に従って、市販の酵素試験キット（HOPE Laboratories, Belmont, CA）を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。血清中のＣＹＦＲＡのレベルは、供給業者の推奨に従って、市販の酵素試験キット（DRG International Inc USA, Mountainside, NJ）を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。血清中のＰｒｏＧＲＰのレベルは、供給業者の推奨に従って、市販の酵素試験キット（株式会社テイエフビー、東京都、日本）を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。腫瘍群と健常な対照群との間のＮＰＴＸ１、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ及びＰｒｏＧＲＰレベルの差異はマンホイットニーＵ検定によって分析した。最適な診断精度及び尤度比を有するカットオフレベルを求めるために、ＮＰＴＸ１、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ及びＰｒｏＧＲＰのレベルを受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析によって評価した。ＮＰＴＸ１とＣＥＡとの間の相関係数をスピアマンの順位相関係数を用いて算出した。有意差は、Ｐ＜０．０５として規定した。
【０４９７】
１１．ＲＮＡ干渉アッセイ
上述のように、哺乳類細胞におけるｓｉＲＮＡの合成に関するベクターベースのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）システム、ｐｓｉＨ１ＢＸ３．０がこれまでに確立されている（Suzuki, 2003）。本明細書中では、ｓｉＲＮＡ発現ベクター１０μｇを、３０μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen）を用いて、ＮＰＴＸ１を過剰発現した、ＮＳＣＬＣ細胞株、Ａ５４９及びＳＣＬＣ細胞株、ＳＢＣ−５にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を適当な濃度のジェネテシン（Ｇ４１８）の存在下で５日間培養し、その後細胞数及び生存率をギムザ染色及び三連ＭＴＴアッセイによって測定した。要するに、細胞計測キット８溶液（株式会社同仁化学研究所）を１／１０量の濃度で各々のディッシュに添加し、プレートを３７℃でさらに２時間インキュベートした。次に吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ５５０（BIO−RAD, Hercules, CA）を用いて４５０ｎｍで測定した。ＮＰＴＸ１のｍＲＮＡ発現の抑制を確認するために、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を、合成ＮＰＴＸ１特異的なプライマーを用いて行なった。ＲＮＡｉに対する合成オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の通りであった：対照１（ルシフェラーゼ、ＬＵＣ：フォチヌス・ピラリス（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ遺伝子）、５'−ＣＧＴＡＣＧＣＧＧＡＡＴＡＣＴＴＣＧＡ−３'；対照２（スクランブル、ＳＣＲ：５Ｓ及び１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする葉緑体ミドリムシ（Euglena gracilis）遺伝子）、５'−ＧＣＧＣＧＣＴＴＴＧＴＡＧＧＡＴＴＣＧ−３'；ＮＰＴＸ１  ｓｉＲＮＡ−１（ｓｉ−ＮＰＴＸ１−１）、５'−ＣＴＣＧＧＧＣＡＡＡＣＴＴＴＧＣＡＡＴ−３'；ＮＰＴＸ１  ｓｉＲＮＡ−２（ｓｉ−ＮＰＴＸ１−２）、５'−ＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＣＣＡ−３'。
【０４９８】
１２．細胞成長アッセイ
ＮＰＴＸ１の全コード配列を、ｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃ−Ｈｉｓプラスミドベクター（Invitrogen, Carlsbad, California）の適当な部位にクローニングした。ｍｙｃ−Ｈｉｓタグ付きＮＰＴＸ１を発現するプラスミド又はモックプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を、適当な濃度のジェネテシン（Ｇ４１８）の存在下で１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で８日間成長させた。細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより評価した。要するに、細胞計測キット８溶液（株式会社同仁化学研究所）を１／１０量の濃度で各々のディッシュに添加し、プレートを３７℃でさらに２時間インキュベートした。次に吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ５５０（BIO−RAD, Hercules, CA）を用いて参照として４５０ｎｍで測定した。
【０４９９】
１３．マトリゲル浸潤アッセイ
ヒトＮＰＴＸ１を発現するｐｃＤＮＡ３.１−ｍｙｃ／Ｈｉｓプラスミド、又はモックプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中でコンフルエント近くまで成長させた。細胞をトリプシン処理により採取し、血清又はプロテイナーゼ阻害剤を添加せずにＤＭＥＭ中で洗浄し、１×１０５細胞／ｍｌの濃度でＤＭＥＭ中に懸濁した。細胞懸濁液を調製する前に、マトリゲルマトリクス（Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ）の乾燥層を室温で２時間、ＤＭＥＭを用いて再水和した。１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ（０．７５ｍｌ）を、２４ウェルマトリゲル浸潤チャンバにおける各々の下部チャンバ（lower chamber）に添加し、０．５ｍｌ（５×１０４細胞）の細胞懸濁液を上部チャンバの各々のインサートに添加した。インサートのプレートを３７℃で２２時間インキュベートした。インキュベート後、チャンバを処理した；供給業者（Becton Dickinson Labware）の指示通りに、マトリゲルを介して浸潤した細胞を固定し、ギムザ染色した。
【０５００】
実施例１２  肺腫瘍及び正常組織におけるＮＰＴＸ１発現
治療剤の開発のための新規の標的分子及び／又は肺癌に対する診断上のバイオマーカーを求めるために、初めにｃＤＮＡマイクロアレイ（Kikuchi, 2003, 2006, Kakiuchi, 2004, Taniwaki）によって分析された１０１種の肺癌試料の半分以上において、正常な細胞よりも癌細胞で３倍を超える高い発現レベルを示した遺伝子をスクリーニングした。スクリーニングした２７６４８個の遺伝子の中で、ＮＰＴＸ１の過剰発現が、検査した肺癌の大部分で同定され、１５種の内１０種のさらなる肺癌組織及び２３種の内１７種の肺癌細胞株において半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験によってその転写活性化を確認した（図７Ａ、上パネル及び下パネル）。その後ヒトＮＰＴＸ１に特異的なマウスモノクローナル抗体を生成し、４つの肺癌細胞株（３つのＮＰＴＸ１陽性細胞株：ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２０、及びＳＢＣ−５対１つのＮＰＴＸ１陰性細胞株、ＮＣＩ−Ｈ２１７０）及び末梢気道上皮由来細胞（ＳＡＥＣ）における内因性ＮＰＴＸ１タンパク質の発現として、ウエスタンブロット分析により確認した（図７Ｂ）。
【０５０１】
これらの４つの肺癌細胞株における内因性ＮＰＴＸ１の細胞内局在化を検査するために、免疫蛍光分析を実行した。ＮＰＴＸ１は、粒状外観を呈した腫瘍細胞の細胞質でＮＣＩ−Ｈ２２６細胞においては高いレベル、ＮＣＩ−Ｈ５２０細胞及びＳＢＣ−５細胞においては低いレベルで検出されたが、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞では検出されず、このことはウェスタンブロット法の結果と一致していた（図７Ｃ）。ＮＰＴＸ１は分泌タンパク質（Schlimgen）であったので、これらの肺癌細胞株の培養培地においてその存在を検査するために、ＥＬＩＳＡ法を適用した。ＮＰＴＸ１タンパク質は、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞、ＮＣＩ−Ｈ５２０細胞及びＳＢＣ−５細胞の培地では検出されたが、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞の培地では検出されなかった（図７Ｄ）。ウエスタンブロットによって細胞可溶化物で及びＥＬＩＳＡによって培養培地で検出可能なＮＰＴＸ１量は、ＲＴ−ＰＣＲにより検出したＮＰＴＸ１の量との良好な相関関係を示し、これによりこの抗体がＮＰＴＸ１タンパク質と特異的に結合することが示された。
【０５０２】
プローブとしてヒトＮＰＴＸ１のｃＤＮＡを用いたノーザンブロット分析は、脳及び副腎のみで非常に弱い６．５ｋｂバンドを検出したが、任意の他の組織では発現が観察されなかった（図８Ａ）。また、ＮＰＴＸ１タンパク質の発現を、５種の正常組織（肝臓、心臓、腎臓、肺、副腎）と肺ＡＤＣ組織とでＮＰＴＸ１に特異的なモノクローナル抗体を用いて検査した。ＮＰＴＸ１染色は主に、腫瘍細胞及び副腎における細胞（皮質）の細胞質で観察されたが、正常細胞では検出されなかった（図８Ｂ）。肺癌におけるＮＰＴＸ１タンパク質の発現レベルは副腎のものより有意に高かった。
【０５０３】
実施例１３  ＮＰＴＸ１発現と予後不良との関連性
ＮＰＴＸ１の生物学的及び臨床病理的な意義を確認するために、ＮＰＴＸ１タンパク質の発現を、３７４人のＮＳＣＬＣ患者由来の原発性ＮＳＣＬＣ組織と、１３人の患者由来のＳＣＬＣ組織とを含有する組織マイクロアレイにより検査した。ＮＰＴＸ１に関する陽性細胞質染色が、手術で切除したＮＳＣＬＣの５６．１％（２１０／３７４）及びＳＣＬＣの６９．２％（９／１３）で観察され、検査した正常肺組織のいずれにおいても染色は観察されなかった（図８Ｃ）。次にそのポジティブ染色と、３７４人のＮＳＣＬＣ患者における様々な臨床病理的パラメータとの相関を検査した。組織アレイ上で、ＮＰＴＸ１発現パターンを、欠損（０でスコア付け）から弱／強陽性（１＋〜２＋とスコア付け）の範囲で分類した（図８Ｄ、上パネル、方法を参照されたい）。
【０５０４】
検査した３７４件のＮＳＣＬＣ症例の中で、ＮＰＴＸ１は、１３９症例で強く染色され（３７．１％、スコア２＋）、７１症例で弱く染色され（１９．０％、スコア１＋）、１６４症例では染色されなかった（４３．９％、スコア０）（表１Ａ）。この研究では、腫瘍サイズ（ｐＴ２〜４対ｐＴ１、Ｐ＜０．０００１、フィッシャーの直接確率検定）及びリンパ節転移（ｐＮ１〜２対ｐＮ０、Ｐ＝０．００４４、フィッシャーの直接確率検定）がＮＰＴＸ１状況に有意に関連している（表１Ｂ）。カプラン・マイヤー分析によって、強いＮＰＴＸ１染色を有する患者（２＋とスコア付け）の生存期間の中央値が、欠損／弱いＮＰＴＸ１染色を有するＮＳＣＬＣ患者（０、１＋とスコア付け）のものよりも有意に短いことが示された（Ｐ＜０．０００１、ログランク検定、図８Ｄ、下パネル）。予後因子の多変量分析において、ｐＴ段階、ｐＮ段階、及び強いＮＰＴＸ１陽性度が独立した予後因子になることを示していた（表１Ｂ）。
【０５０５】
（表１Ａ）ＮＳＣＬＣ組織におけるＮＰＴＸ１陽性度と患者の特性との間の関連性（ｎ＝３７４）
2010536366.tif 000007
【０５０６】
（表１Ｂ）ＮＳＣＬＣの患者における予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル分析
2010536366.tif 000008
【０５０７】
実施例１４  肺癌患者におけるＮＰＴＸ１の血清レベル
ＮＰＴＸ１が分泌タンパク質をコードするので、ＮＰＴＸ１タンパク質が肺癌患者の血清に分泌されたか否かを研究した。ＥＬＩＳＡ実験によって、３２９人の肺癌患者由来の血清学的試料の大部分でＮＰＴＸ１が検出され、肺癌患者におけるＮＰＴＸ１の血清レベルは、１．３６±１．６０ｎｇ／ｍｌ（平均±１ＳＤ）であり、健常個体におけるＮＰＴＸ１の血清レベルは０．５９±０．４４ｎｇ／ｍｌであった（差異は、マンホイットニーＵ検定ではＰ値が０．００１未満で有意であった；図９Ａ）。肺癌の組織型に従って、ＮＰＴＸ１の血清レベルは、ＡＤＣ患者で１．４１±１．２７ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＣ患者で１．０９±０．９５ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＬＣ患者で１．４２±２．３３ｎｇ／ｍｌであり、３つの組織型間の差異は有意なものではなかった。ＮＰＴＸ１の血清レベルは、良性肺疾患のＣＯＰＤ患者で０．６７±０．４８ｎｇ／ｍｌであった。肺癌患者でのＮＰＴＸ１の血清レベルは、正常ボランティア及びＣＯＰＤ患者のものより有意に高かった（Ｐ＜０．０００１）。初期段階の腫瘍を有する患者であっても高レベルの血清ＮＰＴＸ１が検出された。有意には、初期段階疾患（Ｉ期〜ＩＩＩＡ期又はＬＤ期）の患者由来の血清よりも局所進行性肺癌（ＩＩＩＢ期）又は遠隔器官転移（ＩＶ期又はＥＤ期）の患者由来の血清で、さらなるレベルのＮＰＴＸ１がより一般的であった（図９Ｂ）。これらの３２９人の癌患者及び１０２人の健常な対照のデータによって作成した受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて、このアッセイにおけるカットオフレベルは、ＮＰＴＸ１に最適な診断精度と尤度比とを与えるように、即ちＮＰＴＸ１で１．２８ｎｇ／ｍｌ（ＮＳＣＬＣで４１．５％、ＡＤＣで４４．３％、ＳＣＣで２９．４％、及びＳＣＬＣで３１．２％の感度で）及びＮＳＣＬＣで９６．１％の特異度で）に設定された。８０人のＣＯＰＤ患者の中で、７人（８．８％）が陽性ＮＰＴＸ１レベルを有していた。次に同じ患者で血清ＮＰＴＸ１レベルをモニタリングするために、対となる術前及び術後の（手術後２ヶ月の）４人のＮＳＣＬＣ患者由来の血清試料を使用してＥＬＩＳＡ実験を実施した。原発腫瘍の外科的切除後、血清ＮＰＴＸ１濃度が劇的に低減した（図９Ｃ）。本発明者らはさらに、手術前に血清を採取した１２人のＮＳＣＬＣ症例（６人のＮＰＴＸ１陽性の腫瘍を有する患者及び６人のＮＰＴＸ１陰性の腫瘍を有する患者）の同じ組において、原発性腫瘍で血清ＮＰＴＸ１値をＮＰＴＸ１の発現レベルと比較した。血清ＮＰＴＸ１のレベルは、原発性腫瘍でＮＰＴＸ１の発現レベルと良好な相関関係を示した（図９Ｄ）。その結果により独立して、初期段階での癌の検出、並びに腫瘍の切除及び疾患の再発のモニタリングのためのバイオマーカーとしての血清ＮＰＴＸ１の高い特異性及び大きな可能性が支持される。
【０５０８】
実施例１５  腫瘍マーカーとしてのＮＰＴＸ１、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ及びＰｒｏＧＲＰの組み合わせアッセイ
また、診療所において腫瘍検出バイオマーカーとして血清ＮＰＴＸ１レベルの臨床的有用性を評価するために、癌患者及び対照個体由来の同じ組の血清試料において２つの従来の腫瘍マーカー（ＡＤＣ患者ではＣＥＡ、ＳＣＣ患者ではＣＹＦＲＡ、及びＳＣＬＣ患者ではｐｒｏＧＲＰ）の血清レベルもＥＬＩＳＡによって測定した。ＲＯＣ分析によって求められるこのアッセイにおけるカットオフレベルは、最適な診断精度及び尤度比をもたらすように、ＣＥＡではすなわち２．５ｎｇ／ｍｌ（ＡＤＣでは３８．４％の感度で及び９８．０％の特異度で）、ＣＹＦＲＡではすなわち２．０ｎｇ／ｍｌ（ＳＣＣでは２９．４％の感度で及び９８．０％の特異度で）及びｐｒｏＧＲＰではすなわち、４６．０ｐｇ／ｍｌ（ＳＣＬＣでは６２．４％の感度で及び９９．０％の特異度で）に設定された。血清ＮＰＴＸ１とＣＥＡ値との間の相関係数は有意ではなかった（スピアマンの順位相関係数：ｐ＝０．１０９、Ｐ＝０．１４７４）。
【０５０９】
血清中でＮＰＴＸ１及びＣＥＡの両方を測定することで、肺ＡＤＣ患者の検出感度全体を６４．９％に改善することができる。正常ボランティア（対照群）間の２つの腫瘍マーカーのいずれかに対する偽陽性率は、４．９％に達した。血清ＮＰＴＸ１とＣＹＦＲＡ値との間の相関係数は有意ではなかった（スピアマンの順位相関係数：ｐ＝０．０１３、Ｐ＝０．９２４２）。血清中でＮＰＴＸ１及びＣＹＦＲＡの両方を測定することで、肺ＳＣＣ患者の検出感度全体を６２．３％に改善することができる。正常ボランティア（対照群）間の２つの腫瘍マーカーのいずれかに対する偽陽性率は、５．９％に達した。血清ＮＰＴＸ１値とｐｒｏＧＲＰ値との間の相関係数は有意ではなかった（スピアマンの順位相関係数：ｐ＝０．１６１、Ｐ＝０．１２３２）。血清中でＮＰＴＸ１及びｐｒｏＧＲＰの両方を測定することで、肺ＳＣＬＣ患者の検出感度全体を７２．０％に改善することができる。正常ボランティア（対照群）間の２つの腫瘍マーカーのいずれかに対する偽陽性率は、４．９％に達した。
【０５１０】
実施例１６  肺癌細胞に対するＮＰＴＸ１のオートクリン成長促進効果
ＮＰＴＸ１の上方制御が肺癌細胞の成長又は生存に関与するか否かを判定するために、２つの異なる対照プラスミド（ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、及びスクランブル（ＳＣＲ）に対するｓｉＲＮＡ）と共に、ＮＰＴＸ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＮＰＴＸ１−１、ｓｉ−ＮＰＴＸ１−２）を発現するようにプラスミドを設計及び構築し、それらをＡ５４９細胞及びＳＢＣ−５細胞にトランスフェクトし、内因性ＮＰＴＸ１の発現を抑制した。ｓｉ−ＮＰＴＸ１−２をトランスフェクトした細胞におけるＮＰＴＸ１の量は、２つの対照ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした細胞に比べて有意に低減した（図１０Ａ、上パネル）。ｓｉ−ＮＰＴＸ１−１は、ＮＰＴＸ１発現に対する抑制効果をほとんど示さなかった。遺伝子発現レベルに対する抑制効果と一致して、トランスフェクトしたｓｉ−ＮＰＴＸ１−２は、コロニー形成アッセイ及びＭＴＴアッセイによって測定されたコロニー数及び細胞生存率の有意な低減をもたらすが、かかる効果は、２つの対照ｓｉＲＮＡ又はｓｉ−ＮＰＴＸ１−１では観察されなかった（図１０Ａ、中央及び下パネル）。
【０５１１】
腫瘍形成におけるＮＰＴＸ１の潜在的役割をさらに開示するために、本発明者らは、ＮＰＴＸ１（pｃＤＮＡ３．１−ＮＰＴＸ１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ）又はモックベクターのいずれかを発現するように設計されたプラスミドを調製した。これらのプラスミドＤＮＡを、ＮＰＴＸ１発現を検出可能なＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、コロニー形成アッセイ及びＭＴＴアッセイを行った。細胞生存率は、モックベクターをトランスフェクトした細胞に比べて、ＮＰＴＸ１のｃＤＮＡのセンス鎖をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を含有するディッシュで有意に増大した（図１０Ｂ）。
【０５１２】
次に、親和性精製した抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ−７５−１）が、ＮＰＴＸ１を含有する培地中で培養したＣＯＳ−７細胞の成長を阻害することができるか否かを研究した。期待通り、ＮＰＴＸ１の添加によって引き起こされる成長増大は、５０ｎＭ濃度の抗ＮＰＴＸ１抗体によって中和され、ＣＯＳ−７細胞の生存率は、ＮＰＴＸ１なしで培養した細胞とほとんど同等になった（図１０Ｂ）。その後、組換えＮＰＴＸ１タンパク質を用いてオートクリンアッセイを行なった。ＮＰＴＸ１の分泌が細胞成長に影響を与えるか否かを研究するために、ＣＯＳ−７細胞を、培養培地中で０．１ｎＭ〜１ｎＭの最終濃度でＮＰＴＸ１とインキュベートした。ＮＰＴＸ１とインキュベートしたＣＯＳ−７細胞が、対照と比較して、用量依存的なＭＴＴアッセイによる細胞成長の増大を示した（図１０Ｃ）。
【０５１３】
これらの結果により、ＮＰＴＸ１の成長促進効果は、ＣＯＳ−７の細胞表面上でのＮＰＴＸ１と受容体（複数可）との結合を介して媒介されると考えられることが示唆された。次に、抗ＮＰＴＸ１抗体（５０ｎＭ）が、ＮＰＴＸ１を含有する培地中で培養したＣＯＳ−７細胞の成長を阻害することができるか否かを研究した。期待通り、ＮＰＴＸ１の添加によって引き起こされる成長増大は、５０ｎＭ濃度の抗ＮＰＴＸ１抗体によって中和され、ＣＯＳ−７細胞の生存率は、ＮＰＴＸ１なしで培養した細胞とほとんど同等になった（図１０Ｃ）。これらの結果により、ＮＰＴＸ１の成長促進効果は、ＣＯＳ−７の細胞表面上でのＮＰＴＸ１と受容体（複数可）との結合を介して媒介されると考えられることが示唆された。
【０５１４】
次に、ＮＰＴＸ１陽性肺癌細胞株、ＳＢＣ−５及びＡ５４９、並びにＮＰＴＸ１陰性ＳＢＣ−３細胞及びＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞の成長に対する抗ＮＰＴＸ１抗体の効果を研究した。ＳＢＣ−５及びＡ５４９の両方の成長は、抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体（２５ｎＭ又は５０ｎＭ；ｍＡｂ−７５−１）の培養培地（ＳＢＣ−５：Ｐ＝０．０１２；Ａ５４９：２５ｎＭ又は５０ｎＭ、それぞれＰ＝０．０２７及びＰ＝０．０００３；各々両側ｔ検定）への添加によって用量依存的に抑制されたが、ＮＰＴＸ１を発現しないＳＢＣ−３細胞の成長は影響されなかった（図１０Ｄ）。これらのデータにより、ＮＰＴＸ１が、肺癌細胞の増殖のためのオートクリン／パラクリン成長因子として機能し、また抗体ベースの療法に対する潜在的な免疫療法標的になり得ることが示された。
【０５１５】
実施例１７  ＮＰＴＸ１による細胞浸潤の活性化
組織マイクロアレイ上での免疫組織化学的分析によって、ＮＰＴＸ１強陽性腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者が、ＮＰＴＸ１弱陽性又はＮＰＴＸ１陰性腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者よりも短い癌特異的な生存期間を示すことが示唆されたので、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を使用してマトリゲルアッセイを用いて、細胞浸潤におけるＮＰＴＸ１の考え得る役割を検査した。ＮＰＴＸ１のｃＤＮＡのＮＩＨ−３Ｔ３細胞へのトランスフェクションは、モックベクターをトランスフェクトした細胞に比べて、マトリゲルによるその浸潤活性を有意に高めた（図１１）。
【０５１６】
実施例１８  ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体による肺癌細胞の成長の阻害
本発明はさらに、マウスモデルにおける治療的薬剤としての抗ＮＰＴＸ１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍抑制効果を研究した。本発明者らは、Ａ５４９細胞を７週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）の皮下に移植し、３０日間、１週間に２回、３００μｇ／体の親和性精製した抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ−７５−１）、又は正常マウスＩｇＧ（対照）を腫瘍に投与した。抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ−７５−１）により、Ａ５４９肺癌の成長が有意に抑制されたが、同じ用量の正常マウスＩｇＧは腫瘍成長に影響を与えなかった（Ｐ＝０．０１６、それぞれ両側ｔ検定；図１２、上パネル）。切除腫瘍の凍結切片を用いたＨＥ染色により、抗ＮＰＴＸ１抗体で処理した腫瘍組織において生癌細胞の有意な繊維腫変化及び減少が検出された（図１２、下パネル）。まとめると、これらの結果により、抗ＮＰＴＸ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ−７５−１）がｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの癌細胞に対する成長抑制効果を有することが明らかになった。
【０５１７】
実施例１９  成長促進経路におけるＮＰＴＸ１に対する受容体としてのＮＰＴＸＲ
既知のＮＰＴＸ１受容体、ＮＰＴＸＲは、シナプス前ヘビ毒毒素タイポキシンのシナプスへの輸送に関与することが示唆され、これはシナプス残屑の除去に関与する新規のニューロンへの取り込み経路を表し得る（Kirkpatrick LL, et al., J Biol Chem 278:17786-92（2000）, Dodds DC, et al., J Biol Chem 272（34）:21488-94（1997））。ＮＰＴＸＲ遺伝子が、肺癌で発現されたか否か、及び成長促進効果に関与していたか否かを研究するために、本発明者らは、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験によって肺癌細胞株及び臨床組織におけるＮＰＴＸＲの発現を分析した。ＮＰＴＸＲは、肺癌試料で比較的高いレベルで発現されたが、正常肺では発現されなかった（図７Ｅ）。ＮＰＴＸＲの発現パターンは、これらの腫瘍におけるＮＰＴＸ１発現との良好な一致を示した。上記のように、ＮＰＴＸ１のオートクリン成長促進効果に関して検査したＣＯＳ−７細胞は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析及び免疫組織化学分析により、内因的にＮＰＴＸＲを発現することを確認した（データ図示せず）。このデータによって、ＮＰＴＸ１が肺癌細胞におけるＮＰＴＸＲとの相互作用によって、その成長促進効果を媒介すると考えられることが示唆された。
【０５１８】
ＣＯＳ−７細胞及び肺癌細胞でのＮＰＴＸ１と、内因性ＮＰＴＸＲとの結合を研究するために、ＮＰＴＸＲが内因的に発現されると共に、ＮＰＴＸ１発現するベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞及び肺癌ＳＢＣ−５細胞を用い、受容体−リガンド結合アッセイを実行した。これらの細胞の培養培地中の外因性ＮＰＴＸ１の分泌が確認され、フローサイトメトリー分析によってＮＰＴＸ１と細胞表面との結合を検出した（ＣＯＳ−７の代表的なデータを図１５Ａに示す）。これらの２つの細胞株（ＣＯＳ−７細胞及びＳＢＣ−５細胞）の表面上での分泌ＮＰＴＸ１と内因性ＮＰＴＸＲとの共局在化も観察された（図１３Ａ）。ＮＰＴＸ１とＣＯＳ−７及びＳＢＣ−５細胞との特異的な相互作用を確認するために、本発明者らは、それらの培地中にストリッピングバッファー（１００ｍＭのグリシン、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．５）を添加し、細胞表面に結合する一次抗体としての抗ＮＰＴＸ１抗体及び抗ＮＰＴＸＲ抗体を除去した。グリシン処理の後、ＮＰＴＸ１及びＮＰＴＸＲは細胞の細胞表面上には検出されず、このことにより細胞表面上でのＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの相互作用が示唆された（図１３Ｂ及び図１３Ｃ）。ＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの間の直接的な関連性を検査するために、本発明者らは、ＣＯＳ−７細胞又はＳＢＣ−５細胞でｍｙｃ／Ｈｉｓタグ付きＮＰＴＸ１を一時的に発現させた。細胞可溶化物は、抗ｍｙｃ又は抗ＮＰＴＸＲ抗体によって免疫沈降され、抗ＮＰＴＸＲ又は抗ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロット分析に有用であった。ＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの共沈降が見出された（図１５Ｂ）。これらの結果により、ＮＰＴＸ１とＮＰＴＸＲとの間の相互作用が確認され、ＮＰＴＸ１／ＮＰＴＸＲ複合体の存在が示唆された。
【０５１９】
ＮＰＴＸＲに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＮＰＴＸＲ−１及びｓｉ−ＮＰＴＸＲ−２）を発現するように設計されたプラスミドを用いて、肺癌形成におけるＮＰＴＸ１受容体相互作用の生物学的意義を検査した。これらのプラスミドのいずれかのＡ５４９細胞又はＳＢＣ−５細胞へのトランスフェクションが、２つの対照ｓｉＲＮＡのいずれかを含有する細胞に比べて、内因性受容体の発現を抑制した（図１３Ｄ、上パネル）。受容体の発現低減に従って、Ａ５４９細胞及びＳＢＣ−５細胞は、細胞生存率及びコロニー数の有意な減少を示した（図１３Ｄ、中央及び下パネル）。これらの結果により、ＮＰＴＸＲとの相互作用によって、ＮＰＴＸ１が肺癌の発症／進行に非常に重要な役割を果たし得る可能性が強く支持された。
【０５２０】
実施例２０  ＮＰＴＸＲとの結合後のＮＰＴＸ１の内在化
ＮＰＴＸ１／ＮＰＴＸＲシグナル伝達の調節に関与する機構を求めるために、本発明者らは、ＮＰＴＸ１及びＮＰＴＸＲの細胞内分布の共焦点顕微鏡観察によって、ＮＰＴＸ１／ＮＰＴＸＲは、細胞が分泌ＮＰＴＸ１に曝されると内在化し得るか否かを検査した。レシピエントＣＯＳ−７細胞又はＳＢＣ−５細胞は、培地においてカバースリップ上で３７℃で一晩成長させた。また、ＮＰＴＸ１ベクターをトランスフェクトしたドナーＣＯＳ−７細胞又はＳＢＣ−５細胞の上清を採取した。それから、レシピエントＣＯＳ−７細胞又はＳＢＣ−５細胞を、ドナー細胞の上清と３時間インキュベートした。本発明者らは、免疫組織化学法によってＮＰＴＸ１とこれらの細胞の表面との結合を検出した（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。また、これらの２つの細胞株の表面上で外因性ＮＰＴＸ１と内因性ＮＰＴＸＲとの共局在化が観察された（データ図示されず）。それから、膜透過条件下で免疫組織化学法を行ない、本発明者らは内在化した外因性ＮＰＴＸ１を検出した（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。レシピエントＣＯＳ−７細胞のドナーＮＰＴＸ１トランスフェクト（＋）ＣＯＳ−７細胞由来の馴化培地による処理の１時間又は３時間後、内在化したＮＰＴＸ１が、抗ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロット法によって検出された。レシピエントＣＯＳ−７細胞は、ドナーＮＰＴＸ１トランスフェクト（＋）ＣＯＳ−７細胞由来の馴化培地において時間に依存的に分泌ＮＰＴＸ１を取り込むと考えられた（図１４Ｃ）。全ての分析は、実験者の処理条件の知識なしの盲検で実行した。
【０５２１】
考察
過去１０年で、腫瘍の診断画像化、併用化学療法、最新の手術法及び放射線療法における多くの進歩にもかかわらず、ほとんどの肺癌患者の予後及び生活の質（quality of life）に関して改善はほとんど達成されていない。実際、患者の３分の２が、根治性の外科治療が不可能である進行性段階と診断される。進行性ＮＳＣＬＣに対する新たな化学治療計画の有効性は向上したが、従来の化学療法による進行性ＮＳＣＬＣに対する生存率の中央値は依然として約７ヶ月〜８ヶ月である（Breathnach 2001, Hanna 2004）。
【０５２２】
したがって、癌の早期検出のために実用性のある診断用バイオマーカーと、悪性の癌細胞に重要な特定の細胞シグナルを標的とする新たな種類の薬剤を開発することが現在緊急に必要とされる。上述のように、２７６４８個の遺伝子を含有するｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、レーザーマイクロダイセクションによる癌細胞の濃縮後に１０１種の肺癌の全ゲノム発現プロファイル分析を実行した。この分析により、新規の診断上のマーカー、治療的薬物、及び／又は免疫療法の開発のための潜在的に良好な候補になり得る幾つか遺伝子が同定された。これらの中で、推定腫瘍特異的膜貫通／分泌タンパク質をコードする遺伝子は、細胞表面上又は細胞外空間内、及び／又は血清中に存在するので重要な利点があると考えられ、これにより分子マーカー及び治療的標的として容易に接近可能となる。
【０５２３】
本発明に関しては、分泌タンパク質をコードするＮＰＴＸ１が、肺癌の診断及び治療のための新規のツールの開発に対する潜在的な標的として同定される。ＮＰＴＸ１は、「長ペントラキシン」の新たに確認されたサブファミリー成員である（Goodman）。ＮＰＴＸ１は、シナプス巨大分子の取り込みを媒介し、成人脳の発達（developing and adult brain）におけるシナプス形成及びシナプス可塑性の両方に関与する（Breathnach, O. S, et al., J Clin Oncol. 19:1734-1742（2001））。しかしながら、ＮＰＴＸ１と発癌との関連性はこれまでに説明されていない。   
【０５２４】
本明細書で、ＮＰＴＸ１タンパク質は、肺癌検体の大部分で発現されることが示されたが、正常組織ではほとんど発現されなかった。さらに、より高いＮＰＴＸ１発現レベルが、より短い癌特異的生存期間に関連していた。一貫して、外因性ＮＰＴＸ１の発現の誘導が、ＣＯＳ−７細胞及びＮＩＨ−３Ｔ３細胞の成長／浸潤活性を高めた。分泌されたＮＰＴＸ１は、オートクリン／パラクリン細胞成長／浸潤因子として機能し得る。ＮＰＴＸ１は、神経ペントラキシン受容体（ＮＰＴＸＲ）と結合するものとして以前に同定された（Goodman, AR, et al., Cytokine Grouwth Factor Rev. Aug; 7（2）:192-202（1996））。しかしながら、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、肺癌細胞株及び癌組織でＮＰＴＸＲのｍＲＮＡ発現を分析した場合、ＮＰＴＸＲの発現パターンは、ＮＰＴＸ１のものとは完全には一致しなかった（データ図示せず）。本明細書での観察の基となる正確な分子機構は、癌細胞におけるＮＰＴＸ１受容体の同定によっては依然として解明されていないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにより得られた結果により、過剰発現されたＮＰＴＸ１が、癌細胞成長及び浸潤に関連するオートクリン／パラクリン成長因子であると考えられ、悪性の強い表現型の肺癌細胞を誘導することがはっきりと示唆される。さらにこのデータによって、肺癌治療のための分子標的としてのＮＰＴＸ１の可能性が実証された。
【０５２５】
興味深いことに、低酸素症が、肺癌細胞におけるＮＰＴＸ１発現の有意な増大を誘導した（データ図示せず）。臨床研究により、腫瘍性病変内の低ｐＯ２圧は、不良転帰の独立した予後指標であり、治療的処理とは独立に遠隔転移を進行させる危険性の増大との相関があることが示された（４６〜４８）。低酸素症は、腫瘍細胞生存、浸潤及び転移における重要な役割を果たす。低酸素条件下で腫瘍細胞の生存率を増大し得る一連の遺伝子及びタンパク質（血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子、誘導型一酸化窒素合成酵素、血小板由来内皮成長因子、グルコース輸送体１、エリスロポイエチン及び一酸化窒素合成酵素遺伝子を含む）は、低酸素誘導性因子−１ａによって調節される（４９〜５２）。他の臨床研究により、固形腫瘍での低酸素症の軽減が放射線療法の転帰に悪影響を及ぼすことが示されている。したがって、本明細書でのデータにより、ＮＰＴＸ１の標的化が、浸潤性、転移性及び放射線耐性の低酸素肺癌の治療に有望な治療戦略として機能し得ることが示唆される。
【０５２６】
また一方で、高いレベルのＮＰＴＸ１タンパク質が肺癌患者由来の血清学的試料に存在することが発見された。血清マーカーは、様々な診断、癌の早期検出、予後予測、治療有効性のモニタリング及び疾患再発の追跡調査に適用することができる。本明細書での研究により、高いレベルの血清ＮＰＴＸ１が初期段階の腫瘍を有する患者であっても検出されることが明らかになる。さらに血清学的濃度のＮＰＴＸ１は原発性腫瘍の外科的切除後に劇的に低下した。さらに血清ＮＰＴＸ１のレベルは、同じ患者における原発性腫瘍組織でのＮＰＴＸ１の発現レベルとの良好な相関関係を示した。
【０５２７】
診断上のツールとしてＮＰＴＸ１を適用することの容易性を確認するために、診断の感度及び特異度に関して、ＮＰＴＸ１の血清レベルを、ＡＤＣ、ＳＣＣ及びＳＣＬＣに対する従来の診断上のマーカーであるＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ及びｐｒｏＧＲＰのものと比較した。両方のマーカー（ＮＰＴＸ１＋ＣＥＡ、ＮＰＴＸ１＋ＣＹＦＲＡ又はＮＰＴＸ１＋ｐｒｏＧＲＰ）を組み合わせたアッセイが、肺癌（ＡＤＣ、ＳＣＣ又はＳＣＬＣ）に対してＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ又はｐｒｏＧＲＰ単独の感度よりも高い、約６４％〜７２％まで感度を増大させた一方で、健常ボランティアの５％〜６％が陽性であると誤って診断された。様々な臨床段階を含むより大きな組の血清試料によるさらなる確認が必要ではあるが、本明細書で示されたデータは、血清学的バイオマーカーとしてのＮＰＴＸ１が、初期段階であっても肺癌の診断に、治療有効性のモニタリングに、及び疾患再発の追跡調査に有用であることを十分実証している。
【０５２８】
結論として、ＮＰＴＸ１は、肺癌の大部分で過剰発現し、その血清レベルは患者のかなり多くの血清で上昇した。他の腫瘍マーカー（複数可）と組合せたＮＰＴＸ１は、癌診断の感度を有意に向上することができ、またそれを早期全身治療の恩恵を受け得る患者を同定するための免疫組織化学的マーカーとして初期診断で使用することができる。ＮＰＴＸ１の上方制御は肺癌形成の頻繁に起こる、且つ重要な特徴であるので、ＮＰＴＸ１の標的化は、肺癌に特異的な抗癌薬を設計するための新たな戦略になり得る。
【０５２９】
パートＩＶ：ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δ関連実験
実施例１８  一般的方法
１．細胞株及び臨床組織試料
この試験で使用される１５種のヒト肺癌細胞株は以下のようであった：１５種のＮＳＣＬＣ；ＬＣ１７６、ＬＣ３１９、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５５２、ＰＣ３、ＰＣ９、ＰＣ１４、ＳＫ−ＬＵ−１、ＥＢＣ−１、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＳＷ９００、及びＳＷ１５７３。全ての細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加した適当な培地中で単層で成長させ、５％ＣＯ２で加湿空気雰囲気下で３７℃に維持した。ヒト末梢気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）をCambrex Bio Science Inc.（Walkersville, MD）から購入した最適化培地（ＳＡＧＭ）中で成長させた。７種のＡＤＣ及び７種のＳＣＣを含む原発性ＮＳＣＬＣは、他で記載したように（Kikuchi et al., 2003）取得した。２４３種のＡＤＣ、１０２種のＳＣＣ、２８種のＬＣＣ、及び１２種の腺扁平上皮癌（ＡＳＣ）、及び隣接正常肺組織を含む、合計で３８５種の原発性ＮＳＣＬＣのホルマリン固定試料は、埼玉県立がんセンター（埼玉県、日本）において根治的外科手術を受ける患者から臨床病理的データと共に早期に得た。ＮＳＣＬＣ検体及び死後材料（ＳＣＣを有する２個体）由来の５種の組織（心臓、肝臓、肺、腎臓、及び胃）も広島大学から入手した。この研究及び全ての臨床材料の使用は、個々の研究倫理審査委員会によって認可されたものであった。
【０５３０】
２．半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
製造業者のプロトコルに従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Life Technologies, Inc.）を使用して、総ＲＮＡを培養細胞及び臨床組織から抽出した。抽出したＲＮＡ及び正常ヒト組織ポリ（Ａ）ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（株式会社ニッポンジーン）で処理し、オリゴ（ｄＴ）２０プライマーとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Invitrogen）とを用いて逆転写した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験は、以下の合成した遺伝子特異的なプライマー又は内部対照としてβアクチン（ＡＣＴＢ）特異的プライマーを用いて行なった：
ＣＤＫＮ３、５'−ＧＴＧＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＧＧ−３'（配列番号３４）及び
５'−ＴＣＴＣＴＴＧＡＴＧＡＴＡＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣ−３'（配列番号３５）；
ＥＦ−１δ、５'−ＴＧＧＣＴＡＣＡＡＡＣＴＴＣＣＴＡＧＣＡＣＡＴ−３'（配列番号３６）及び
５'−ＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＣＡＣＴＧＡＡＴＣＴＧＴＡ−３'（配列番号３７）；
ＶａｌＲＳ、５'−ＴＡＡＧＣＡＴＣＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＴＧ−３'（配列番号３８）及び
５'−ＧＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＴＣＡＧＡＡ−３'（配列番号３９）；
ＥＦ−１α１、５'−ＡＧＡＣＴＧＧＴＴＡＡＴＧＡＴＡＡＣＡＡＴＧＣ−３'（配列番号４０）及び
５'−ＧＧＴＣＴＣＡＡＡＡＴＴＣＴＧＴＧＡＣＡＡＡＴ−３'（配列番号４１）；
ＥＦ−１β、５'−ＣＡＧＡＡＧＣＡＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＧ−３'（配列番号４２）及び
５'−ＡＴＧＣＣＡＴＧＡＴＣＣＡＧＧＡＴＧＧＡ−３'（配列番号４３）；
ＥＦ−１γ、５'−ＧＧＴＧＧＡＣＴＡＣＧＡＧＴＣＡＴＡＣＡＣＡＴ−３'（配列番号４４）及び
５'−ＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＡＡＴＧＡＣＣＣＣＣ−３'（配列番号４５）；
ＣＤＫ１、５'−ＡＧＣＣＴＡＧＣＡＴＣＣＣＡＴＧＴＣＡＡ−３'（配列番号４６）及び
５'−ＧＡＡＧＡＣＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＡＡＧ−３'（配列番号４７）；
ＡＣＴＢ、５'−ＧＡＧＧＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＧ−３'（配列番号１１）及び
５'−ＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣ−３'（配列番号１２）。
【０５３１】
ＰＣＲ反応は、増幅の対数増殖期内での産物強度を確実にするために、サイクル数で最適化させた。
【０５３２】
３．ノーザンブロット分析
ヒト多重組織ブロット（BD Biosciences Clontech）を、ＣＤＫＮ３の３２Ｐ標識ＰＣＲ産物とハイブリダイズさせた。供給業者の推奨に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗浄を実行した。−８０℃で７日間、増感スクリーンを用いて、ブロットをオートラジオグラフィーに供した。
【０５３３】
４．ウエスタンブロット分析
細胞を、プロテアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｓｅｔ  ＩＩＩ；CALBIOCHEM）を含有するＲＩＰＡバッファー［５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸Ｎａ、０．１％ＳＤＳ］で溶解した。タンパク質試料を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによって分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬニトロセルロース膜（GE Healthcare Biosciences）上に電気ブロットした。ブロットを、マウスモノクローナル抗ＣＤＫＮ３（ＫＡＰ）抗体（BD Bioscience Pharmingen）、ウサギポリクローナル抗ＥＦ−１δ抗体（NOVUS Biologicals）、マウスモノクローナル抗ＥＦ−１α抗体（Upstate）、ウサギポリクローナル抗Ａｋｔ抗体（Cell Signaling Technology, Inc.）、ウサギポリクローナル抗ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）、マウスモノクローナル抗βアクチン抗体（SIGMA）、マウスモノクローナル抗Ｆｌａｇ抗体（SIGMA）、ウサギポリクローナル抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）又はラットモノクローナル抗ＨＡ抗体（Roche Diagnostics Corporation）とインキュベートした。抗原−抗体複合体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（GE Healthcare Bio-sciences）と結合した二次抗体を用いて検出した。以前に記載されたように（Kato et al., 2005；Suzuki et al., 2005）、タンパク質バンドをＥＣＬウエスタンブロット法検出試薬（GE Healthcare Bio-sciences）によって可視化した。マウスモノクローナル抗ＣＤＫＮ３（ＫＡＰ）抗体（BD Bioscience Pharmingen）及びウサギポリクローナル抗ＥＦ−１δ抗体（NOVUS Biologicals）は、内因性タンパク質のいずれかを発現した又は発現しないＮＳＣＬＣ細胞可溶化物を用いて、ウエスタンブロット分析によって個々にヒトＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δに特異的であることが証明された（図１９Ａを参照されたい）。
【０５３４】
５．免疫組織化学及び組織マイクロアレイ
臨床試料におけるＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δタンパク質の存在を研究するために、切片をＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（DakoCytomation）を用いて染色した。要するに、内因性ペルオキシダーゼ及びタンパク質をブロッキングした後に、抗ＣＤＫＮ３抗体（BD Bioscience Pharmingen）又は抗ＥＦ−１δ抗体（NOVUS Biologicals）を添加し、切片を二次抗体としてＨＲＰで標識した抗マウスＩｇＧ又はウサギＩｇＧとインキュベートした。基質−色原体を添加し、検体をヘマトキシリンで対比染色した。
【０５３５】
腫瘍組織マイクロアレイは、以前に記載されたように（Chin, S.F., et al., Mol. Pathol. 56: 275-279 (2003); Callagy, G., et al., Mol. Pathol. 12: 27-34 (2003): Callagy, G., et al., J. Pathol. 205: 388-396 (2005)）構築した。サンプリングのための組織領域を、スライド上の対応するＨＥ染色切片との視覚化アラインメントに基づき選択した。ドナー腫瘍ブロックから採取された３つ、４つ又は５つの組織芯（直径０．６ｍｍ、高さ３ｍｍ〜４ｍｍ）を、組織マイクロアレイヤー（Beecher Instruments）を用いてレシピエントのパラフィンブロックに入れた。それぞれの症例由来の正常な組織芯に穴を開けた。得られたマイクロアレイブロックの５μｍ切片を免疫組織化学分析に使用した。ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δタンパク質の陽性度は、臨床追跡調査データの予備知識なく、３人の独立した研究者らによって欠損又は陽性として染色強度に従って判定された。評価人が別々に症例を強陽性と規定する場合のみ、症例は強陽性であると認められた。
【０５３６】
６．統計的分析
分割表を用いて、年齢、性別、腫瘍サイズ（ｐＴ）及びリンパ節転移（ｐＮ）等の臨床病理的変数と、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δの陽性度との関連を組織マイクロアレイ分析によって求めた。腫瘍特異的な生存曲線を、手術日からＮＳＣＬＣに関連する死の時点又は最後の追跡調査観察まで算出した。カプラン・マイヤー曲線をそれぞれの関連変数及びＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δの発現に関して算出し、患者亜群間の生存時間の違いを、ログランク検定を用いて分析した。予後に関連する危険因子を、変数減少法によるＣｏｘ比例ハザード回帰モデルを用いて評価した。比例ハザード仮定を確認し、これを満たし、単変量分析において統計的に有意な結果を有する変数のみを多変量分析に含めた。変数を除去する基準は尤度統計値であり、これは最尤部分推定値に基づいていた（モデルからの除去のためのデフォルトＰ値  ０．０５）。
【０５３７】
７．ＲＮＡ干渉アッセイ
上述のように、哺乳類細胞におけるｓｉＲＮＡの合成に関するベクターベースのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）システム、ｐｓｉＨ１ＢＸ３．０がこれまでに確立されている（Suzuki, C., Cancer Res. 63:7038-7041（2003））。１０μｇのｓｉＲＮＡ発現ベクターを、３０μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen）を用いてＮＳＣＬＣ細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を適当な濃度のジェネテシン（Ｇ４１８）の存在下で５日間培養し、その後細胞数及び生存率をギムザ染色及び三連ＭＴＴアッセイによって測定した。ＲＮＡｉに対する合成オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の通りであった：
対照１（ＥＧＦＰ：遺伝子、オワンクラゲＧＦＰの突然変異体）、
５'−ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣ−３'（配列番号２３）；
対照２（ルシフェラーゼ：フォチヌス・ピラリス（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ遺伝子）、
５'−ＣＧＴＡＣＧＣＧＧＡＡＴＡＣＴＴＣＧＡ−３'（配列番号１５）；
対照３（スクランブル：５Ｓ及び１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする葉緑体ミドリムシ遺伝子）、
５'−ＧＣＧＣＧＣＴＴＴＧＴＡＧＧＡＴＴＣＧ−３'（配列番号１６）；
ｓｉＲＮＡ−ＣＤＫＮ３−Ａ（ｓｉ−Ａ）、５'−ＴＡＴＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＡＣＣＴＴＣ−３'（配列番号４９）；
ｓｉＲＮＡ−ＣＤＫＮ３−Ｂ（ｓｉ−Ｂ）、５'−ＴＡＣＡＣＴＧＣＴＡＴＧＧＡＧＧＡＣＴ−３'（配列番号５０）；
ｓｉＲＮＡ−ＥＦ−１δ−１（ｓｉ−１）、５'−ＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＴＣＴＧＣ−３'（配列番号５１）；
ｓｉＲＮＡ−ＥＦ−１δ−２（ｓｉ−２）、５'−ＣＡＴＣＣＡＧＡＡＡＴＣＣＣＴＧＧＣＴ−３'（配列番号５２）。
【０５３８】
即席のＲＮＡｉシステムを確認するために、初めに半定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、個々の対照ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ、ルシフェラーゼ及びスクランブル）が、ＣＯＳ−７細胞に一時的にトランスフェクトした対応する標的遺伝子の発現を低減することを確認した。ｓｉ−ＣＤＫＮ３及びｓｉ−ＥＦ−１δによるＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δの発現の下方制御（対照では下方制御しない）を、このアッセイで使用した細胞株において半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって確認した。
【０５３９】
８．免疫組織化学及び組織マイクロアレイ
臨床試料におけるＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δタンパク質の存在を研究するために、切片をＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（DakoCytomation）を用いて染色した。要するに、内因性ペルオキシダーゼ及びタンパク質をブロッキングした後に、抗ＣＤＫＮ３抗体（BD Bioscience Pharmingen）又は抗ＥＦ−１δ抗体（NOVUS Biologicals）を添加し、切片を二次抗体としてＨＲＰで標識した抗マウスＩｇＧ又はウサギＩｇＧとインキュベートした。基質−色原体を添加し、検体をヘマトキシリンで対比染色した。
【０５４０】
腫瘍組織マイクロアレイをこれまでに公開されたように構築した（Chin et al., 2003；Callagy et al., 2003, 2005）。サンプリングのための組織領域は、スライド上の対応するＨＥ染色切片との視覚化アラインメントに基づき選択した。ドナー腫瘍ブロックから採取された３つ、４つ又は５つの組織芯（直径０．６ｍｍ、高さ３ｍｍ〜４ｍｍ）を、組織マイクロアレイヤー（Beecher Instruments）を用いてレシピエントのパラフィンブロックに入れた。それぞれの症例由来の正常な組織芯に穴を開けた。得られたマイクロアレイブロックの５μｍ切片を免疫組織化学分析に使用した。ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δタンパク質の陽性度は、臨床追跡調査データの予備知識なく、３人の独立した研究者らによって欠損又は陽性として染色強度に従って判定された。ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δ染色の強度は、以下の基準を用いて評価した：強陽性（２＋）、５０％を超える腫瘍細胞が暗褐色に染色され、完全に細胞質を見えなくする；弱陽性（１＋）、腫瘍細胞の細胞質で検知できるより程度の低い任意の褐色染色；欠損（０とスコア付け）、腫瘍細胞において検出できる染色なし。評価人が別々に症例を陽性と規定する場合のみ、症例は陽性であると認められた。
【０５４１】
９．統計的分析
分割表を用いて、年齢、性別、腫瘍サイズ（ｐＴ）及びリンパ節転移（ｐＮ）等の臨床病理的変数と、組織マイクロアレイ分析によって求められるＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δの陽性度とを関連付ける試みがなされた。腫瘍特異的な生存曲線を、手術日からＮＳＣＬＣに関連する死の時点又は最後の追跡調査観察まで算出した。カプラン・マイヤー曲線をそれぞれの関連変数及びＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δの発現に関して算出し、患者亜群間の生存時間の違いを、ログランク検定を用いて分析した。予後に関連する危険因子を、変数減少法によるＣｏｘ比例ハザード回帰モデルを用いて評価した。比例ハザード仮定を確認し、これを満たし、単変量分析において統計的に有意な結果を有する変数のみを多変量分析に含めた。変数を除去する基準は尤度統計値であり、これは最尤部分推定値に基づいていた（モデルからの除去のためのデフォルトＰ値  ０．０５）。
【０５４２】
１０．マトリゲル浸潤アッセイ
製造業者の取扱説明書に従ってＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Roche Diagnostics）を用いて、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞にＣＤＫＮ３を発現するプラスミド又はモックプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を採取し、ＦＣＳなしでＤＭＥＭ中に懸濁した。細胞懸濁液を調製する前に、マトリゲル基質（Becton Dickinson Labware）の乾燥層を室温で２時間ＤＭＥＭによって再水和した。それから、１０％  ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを２４ウェルマトリゲル浸潤チャンバのそれぞれの下部チャンバに加え、細胞懸濁液を上部チャンバのそれぞれの挿入部（inserts）に加えた。挿入部のプレートを３７℃で２２時間インキュベートした。インキュベート後、マトリゲルでコーティングした挿入部を通って侵入する細胞を固定し、ギムザで染色した。
【０５４３】
１１．合成細胞透過性ペプチド
ＣＤＫＮ３の考え得る結合部位を含有したＥＦ−１δタンパク質の一部に対応する１９アミノ酸ペプチド配列は、そのＮＨ２末端で膜伝達１１ポリアルギニン配列と共有結合した（１１Ｒ；Futaki et al., Hayama et al., 2006, 2007を参照されたい）。５種の細胞透過性ペプチドが合成された：１１Ｒ−ＥＦ−１δ７３−９１、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＴＳＧＤＨＧＥＬＶＶＲＩＡＳＬＥＶＥＮ；１１Ｒ−ＥＦ−１δ９０−１０８、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＥＮＱＳＬＲＧＶＶＱＥＬＱＱＡＩＳＫＬ；１１Ｒ−ＥＦ−１δ１０８−１２６、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＬＥＡＲＬＮＶＬＥＫＳＳＰＧＨＲＡＴＡ；１１Ｒ−ＥＦ−１δ１２５−１４３、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＴＡＰＱＴＱＨＶＳＰＭＲＱＶＥＰＰＡＫ；１１Ｒ−ＥＦ−１δ１４２−１６０、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧＧ−ＡＫＫＰＡＴＰＡＥＤＤＥＤＤＤＩＤＬＦ。ペプチドを調製逆相高圧液体クロマトグラフィで精製した。ＬＣ３１９細胞を、５日間、２．５μＭ、５．０μＭ及び７．５μＭの濃度で１１Ｒペプチドとインキュベートした。培地を適当な濃度の各々のペプチドで４８時間毎に交換し、処理後５日目に、細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより評価した。
【０５４４】
１２．ＣＤＫＮ３関連タンパク質の免疫沈降及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳマッピング
肺癌細胞株ＬＣ３１９由来の細胞抽出物を、プロテアーゼ阻害剤の存在下で最終容量２ｍｌの免疫沈降バッファー［０．５％  ＮＰ−４０、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ］中で４℃で１時間、１００μＬのプロテインＧ−アガロースビーズとのインキュベーションによって予め精製した。１０００ｒｐｍで４℃で５分間の遠心分離の後、上清を４℃で２時間、抗ＣＤＫＮ３モノクローナル抗体又は正常マウスＩｇＧとインキュベートした。それから５０００ｒｐｍで２分間の遠心分離によって、ビーズを回収し、それぞれ１ｍＬの免疫沈降バッファーで６回洗浄した。洗浄したビーズを５０μＬのＬａｅｍｍｌｉ試料バッファー中で再懸濁し、５分間煮沸して、タンパク質を５％〜１０％のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル（BIO RAD）で分離した。電気泳動後、ゲルを銀で染色した。抗ＣＤＫＮ３モノクローナル抗体で免疫沈降した抽出物で特異的に見出されたタンパク質バンドを切り出し、かつマトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）分析法（ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲプラス、株式会社島津製作所）に利用した。
【０５４５】
１３．ホスファターゼアッセイ
ホスファターゼ処理のために、細胞抽出物をホスファターゼバッファー中のλ−ホスファターゼ（New England Biolabs）又はバッファー単独と３７℃で１時間インキュベートした後、免疫ブロット法に使用した。
【０５４６】
実施例１９  肺腫瘍及び正常組織におけるＣＤＫＮ３発現
治療剤及び／又は診断上のバイオマーカーの開発のための新規の標的分子を検索するために、初めにｃＤＮＡマイクロアレイにより分析した１０１種の肺癌の５０％より多くで３倍を超える発現を示す遺伝子をスクリーニングした。スクリーニングした２７６４８個の遺伝子の中で、サイクリン依存性キナーゼ抑制因子３（ＣＤＫＮ３）をコードする遺伝子が、肺癌で頻繁に過剰発現され、ＣＤＫＮ３発現の増大が１４件中１２件のさらなるＮＳＣＬＣ症例（７件中６件の腺癌（ＡＤＣ）及び７件中６件の扁平上皮癌（ＳＣＣ））で確認されたことが同定された（図１６Ａ）。興味深いことに、初期段階の原発性肺腫瘍のものと比べて、ＣＤＫＮ３のより高い発現パターンが、脳転移及び進行性原発性肺腫瘍（腺癌、ＡＤＣ）で観察された（図１６Ｂ）。プローブとしてのＣＤＫＮ３のｃＤＮＡによるノーザンブロット法により、２３種の検査した正常ヒト組織の中において睾丸で０．９ｋｂ転写産物に対応する強い強いシグナルが同定され、胸腺、結腸、胃及び骨髄で非常に弱いシグナルが同定された（図１６Ｃ）。また、ＣＤＫＮ３タンパク質の発現を６つの正常組織（心臓、肝臓、腎臓、肺、結腸及び睾丸）で抗ＣＤＫＮ３抗体によって検査し、ＣＤＫＮ３が睾丸（主に一次精母細胞の細胞質）及び肺癌で豊富に発現されたが、その発現は、残りの５つの正常組織ではほとんど検出することができなかったことを見出した（図１７Ａ）。
【０５４７】
実施例２０  ＣＤＫＮ３過剰発現と予後不良との関連性
ＣＤＫＮ３の生物学的及び臨床病理的意義を確認するために、臨床ＮＳＣＬＣにおけるＣＤＫＮ３タンパク質発現を、３８５人の患者由来のＮＳＣＬＣ組織及び１５人の患者由来のＳＣＬＣ組織を含有する組織マイクロアレイにより検査した。ＣＤＫＮ３に対するポジティブ染色（細胞質及び核）が、手術で切除したＮＳＣＬＣの６５．７％（２５３／３８５）及びＳＣＬＣの８０．０％（１２／１５）で観察されたが、検査した正常肺組織のいずれでも染色は観察されなかった（図１７Ｂ）。それから、ポジティブ染色と様々な臨床病理的パラメータとの間の相関関係を３８５人のＮＳＣＬＣ患者で検査した。ＳＣＬＣの試料サイズはさらに評価するには小さすぎた。性別（男性でより高い、Ｐ＝０．００５４、フィッシャーの直接確率検定）、組織学的分類（非ＡＤＣでより高い、Ｐ＜０．０００１、フィッシャーの直接確率検定）、及びｐＮ段階（Ｎ１、Ｎ２でより高い、Ｐ＝０．００５７、フィッシャーの直接確率検定）が有意にＣＤＫＮ３陽性度に関連していた（表４Ａ）。腫瘍がＣＤＫＮ３のポジティブ染色を示したＮＳＣＬＣ患者は、ＣＤＫＮ３発現が欠損したものと比べて腫瘍特異的な生存期間が短いことを明らかにした（Ｐ＜０．０００１、ログランク検定）（図１７Ｃ）。単変量分析によって、高齢（６５歳以上）、男性、非ＡＤＣ組織学的分類、進行性ｐＴ段階、進行性ｐＮ段階及びＣＤＫＮ３陽性度は全て、ＮＳＣＬＣ患者では腫瘍特異的な生存率が低いことと有意に関連していた（表４Ｂ）。予後因子の多変量分析では、高齢、進行性ｐＴ段階、進行性ｐＮ段階及びＣＤＫＮ３陽性度が独立した予後因子であることを示していた（表４Ｂ）。
【０５４８】
（表４Ａ）ＮＳＣＬＣ組織におけるＣＤＫＮ３陽性度と患者の特性との間の関連性
2010536366.tif 000009
【０５４９】
（表４Ｂ）ＮＳＣＬＣにおける予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル分析
2010536366.tif 000010
【０５５０】
実施例２１  ＣＤＫＮ３と相互作用する新規の分子としてのＥＦ−１β−γ−δ／ＶａｌＲＳの同定
発癌におけるＣＤＫＮ３の機能を解明するために、肺癌細胞においてＣＤＫＮ３と相互作用するタンパク質を求めた。ＬＣ３１９細胞由来の細胞抽出物を抗ＣＤＫＮ３モノクローナル抗体又はマウスＩｇＧ（陰性対照）で免疫沈降させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離の後に、タンパク質複合体を銀染色した。抗ＣＤＫＮ３抗体による免疫沈降体で見られたが、マウスＩｇＧによる免疫沈降体では見られなかった、１４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、３１ｋＤａ及び２５ｋＤａのタンパク質バンドを、切り出し、トリプシン消化して、質量分析にかけた。１４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、３１ｋＤａ及び２５ｋＤａバンド由来のペプチドがそれぞれ、バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ、ＶａｌＲＳ；１４０ｋＤａ）、真核性翻訳延長因子１γ（ＥＦ−１γ；５０ｋＤａ）、真核性翻訳延長因子１δ（ＥＦ−１δ；３１ｋＤａ）、真核性翻訳延長因子１β（ＥＦ−１β；２５ｋＤａ）の配列に一致した（図１８Ａ）。
【０５５１】
これらの４つのタンパク質は、タンパク質合成に関与する延長因子−１のグアニン−ヌクレオチド交換複合体を含む。ＮＳＣＬＣ細胞において延長因子−１のグアニン−ヌクレオチド交換複合体及びその関連分子の構成要素の発現パターンを研究するために、ＶａｌＲＳ、ＥＦ−１δ、ＥＦ−１α１、ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ及びＣＤＫ１のｍＲＮＡ発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験により分析した。肺癌におけるＣＤＫＮ３の発現パターンはＥＦ−１δのものと非常に類似していた（図１８Ｂ）。ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δタンパク質は、ウエスタンブロット分析により検査した肺癌細胞株で同時に活性化したことがさらに確認された（図１９Ａ）。以前の報告により、哺乳類細胞におけるＥＦ−１δの発癌性が実証された（Joseph, P., et al., J Biol Chem. 277:6131-6136（2002））。
【０５５２】
これらの発見から、癌細胞におけるＣＤＫＮ３とＥＦ−１δとの機能的関連性を研究した。内因性ＣＤＫＮ３とＥＦ−１δとの間の類似の相互作用をＬＣ３１９細胞での免疫沈降実験により検査し、この細胞ではこれらの２つの遺伝子が豊富に発現された（図２０Ａ）。それらの細胞内局在化を、マウスモノクローナル抗ＣＤＫＮ３抗体とウサギポリクローナル抗ＥＦ−１δ抗体とを用いて免疫細胞化学分析によってアフィジコリンで同期したＬＣ３１９細胞において研究した。タンパク質の共局在化は、細胞周期を通して細胞質及び核で主に検出された（代表的な画像を図２０Ｂに示す）。
【０５５３】
実施例２２  ＮＳＣＬＣの成長及び進行に対するＥＦ−１δの効果
ＥＦ−１δの臨床病理的意義を明らかにするために、３８５人の患者由来の肺癌組織を含有する組織マイクロアレイによって、臨床ＮＳＣＬＣにおいてＥＦ−１δタンパク質発現を検査した。ＥＦ−１δに対するポジティブ染色（細胞質及び核）が手術で切除したＮＳＣＬＣの６７．５％で観察された（２６０／３８５）（図１９Ｂ）。ＥＦ−１δに対する染色は、検査した正常肺組織のいずれでもほとんど観察されなかった。ＣＤＫＮ３タンパク質の発現は、これらの腫瘍においてＥＦ−１δ発現と有意に一致していた（Ｐ＜０．０００１、フィッシャーの直接確率検定）。ＮＳＣＬＣにおけるＥＦ−１δのポジティブ染色は、性別（男性でより高い；Ｐ＝０．０００４、フィッシャーの直接確率検定）、組織型（非ＡＤＣでより高い；Ｐ＜０．０００１、フィッシャーの直接確率検定）、及び進行性ｐＮ段階（Ｎ１、Ｎ２でより高い；Ｐ＝０．０１４１、フィッシャーの直接確率検定）及び５年生存率（Ｐ＝０．０００６、ログランク検定）に有意に関連していた（図１９Ｃ；表５Ａ）。予後因子の多変量分析では、年齢、ｐＴ段階、ｐＮ段階及びＥＦ−１δ陽性度が独立した予後因子であることを示していた（表５Ｂ）。
【０５５４】
ＥＦ−１δが肺癌細胞の成長又は生存に生物学的に不可欠であるか否かをさらに判定するために、本発明者らは、ＥＦ−１δに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＥＦ−１δ−１及びｓｉ−ＥＦ−１δ−２）を発現するプラスミド、及び３つの異なる対照プラスミド（ＥＧＦＰ、ＬＵＣ、又はＳＣＲに対するｓｉＲＮＡ）を設計及び構築し、それらを肺癌細胞にトランスフェクトして、内因性ＥＦ−１δの発現を抑制した。ｓｉ−１をトランスフェクトした細胞でのＥＦ−１δ転写産物の量は、３つの対照ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした細胞に比べて有意に低下し（図２２Ｂ）、ｓｉ−２はＣＤＫＮ３発現に対して抑制効果をほとんど示さなかった。またｓｉ−１のトランスフェクションにより、ＭＴＴ及びコロニー形成アッセイによって測定された細胞生存率及びコロニー数の有意な低下が起こった（図２２Ｂ）。これらの結果により、ＣＤＫＮ３が、ＥＦ−１δとの相互作用及び／又はＥＦ−１δの活性化によってＮＳＣＬＣの成長及び／又は進行を促進することができることが示唆された。
【０５５５】
（表５Ａ）ＮＳＣＬＣ組織におけるＥＦ−１δ陽性度と患者の特性との間の関連性
2010536366.tif 000011
【０５５６】
（表５Ｂ）ＮＳＣＬＣにおける予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル分析
2010536366.tif 000012
【０５５７】
実施例２３  ＥＦ−１δのＣＤＫＮ３媒介性脱リン酸化反応
ウエスタンブロット分析により、肺癌細胞で２つの異なるサイズのＥＦ−１δタンパク質が検出された一方で（図２０Ａ）、報告によるとＥＦ−１δはｉｎ  ｖｉｔｒｏでそのセリン残基及びスレオニン残基でリン酸化された（Minella O, et al., Biosci Rep. 3:119-27（1998））。ｉｎ  ｖｉｖｏでＥＦ−１δリン酸化反応の可能性を検査するために、本発明者らは、タンパク質ホスファターゼの存在又は非存在下でＦｌａｇ−ＨＡタグ付きＥＦ−１δを過剰発現したＣＯＳ−７細胞由来の抽出物をインキュベートし、ウエスタンブロット分析によってＥＦ−１δタンパク質の分子量を分析した。ホスファターゼで処理した抽出物中の大部分のＥＦ−１δタンパク質の測定量は、非処理細胞のものより少なかった（図２０Ｃ、左パネル）。一方、Ｆｌａｇ−ＨＡタグ付きＥＦ−１βタンパク質及びＦｌａｇ−ＨＡタグ付きＥＦ−１γタンパク質の分子量は、ホスファターゼで処理後も変化しなかった（図２０Ｃ、中央の右パネル）。
【０５５８】
さらに本発明者らは、リン酸化形態のＥＦ−１δが肺癌ＬＣ３１９細胞に存在することを確認した（図２０Ｄ、左パネル）。ＣＤＫＮ３が二重特異性タンパク質ホスファターゼをコードするため、本発明者らは次に、肺癌細胞におけるＥＦ−１δのＣＤＫＮ３誘導性の脱リン酸化反応を検査した。本発明者らは、Ｆｌａｇ−ＨＡタグ付きＣＤＫＮ３発現ベクターをＬＣ３１９細胞にトランスフェクトした。抗ＥＦ−１δ抗体を用いたウエスタンブロット分析により、内因性ＥＦ−１δがＣＤＫＮ３用量依存的に脱リン酸化されることが示された（図２０Ｄ、右パネル）。
【０５５９】
ＣＤＫＮ３によるＥＦ−１δの特異的な脱リン酸化反応を確認するために、Ｆｌａｇ−ＨＡタグ付きＣＤＫＮ３発現ベクター及びＦｌａｇ−ＨＡタグ付きＥＦ−１δ発現ベクターをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、ＣＤＫＮ３の過剰発現によってリン酸化ＥＦ−１δタンパク質の低減を検出した（図２１Ａ、左パネル）。ＥＦ−１δ及びＣＤＫＮ３の抗Ｆｌａｇ抗体による免疫沈降、その後のパン−ホスホ特異的な抗体による免疫ブロット法（ホスホセリン、ホスホスレオニン、又はホスホチロシン）が、そのセリン残基でのＥＦ−１δの脱リン酸化反応を示した（図２１Ａ、右パネル）。ＣＤＫＮ３の過剰発現によるスレオニン残基及びチロシン残基に対する効果は観察されなかった（データ図示せず）。
【０５６０】
実施例２４  ＥＦ−１δにおけるＣＤＫＮ３結合領域の同定
その後、これら２つのタンパク質と、肺癌に対する治療標的としてのその潜在性との関連性の生物学的重要性を研究した。ＣＤＫＮ３との相互作用に必要とされるＥＦ−１δにおけるドメインを求めるために、そのＮ末端及びＣ末端にＦＬＡＧ−ＨＡ配列を有するＥＦ−１δの各々の構築物をＬＣ３１９細胞にトランスフェクトした（ＥＦ−１δ７２〜１６０、ＥＦ−１δ１６１〜２８１、ＥＦ−１δ１〜１６０、ＥＦ−１δ７２〜２８１、及び全長ＥＦ−１δ１〜２８１；図２１Ｂ）。モノクローナル抗Ｆｌａｇ抗体による免疫沈降により、ＥＦ−１δ７２〜１６０、ＥＦ−１δ１〜１６０、ＥＦ−１δ７２〜２８１及びＥＦ−１δ１〜２８１がＣＤＫＮ３と相互作用することが可能であったが、ＥＦ−１δ１６１〜２８１は可能ではなかったことが示された（図２１Ｂ）。これらの実験により、ＥＦ−１δにロイシンジッパーモチーフを含有する８９アミノ酸ポリペプチド（コドン７２〜１６０；配列番号４８）がＣＤＫＮ３との相互作用に重要な役割を果たすことが示唆された。
【０５６１】
実施例２５  ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δに対するｓｉＲＮＡによるＮＳＣＬＣ細胞の成長抑制
ＣＤＫＮ３が肺癌細胞の成長又は生存に不可欠であるか否かを判定するために、ＣＤＫＮ３に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−Ａ及びｓｉ−Ｂ）を発現するプラスミド、及び３つの異なる対照プラスミド（ＥＧＦＰ、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）又はスクランブル（ＳＣＲ）に対するｓｉＲＮＡ）を設計及び構築し、それらをＬＣ３１９細胞（図２２Ａ）及びＡ５４９細胞（データ図示せず）にトランスフェクトした。ｓｉ−Ａをトランスフェクトした細胞でのＣＤＫＮ３転写産物の量は、３つの対照ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした細胞に比べて最も有意に低下し、ｓｉ−ＢはＣＤＫＮ３発現に対して抑制効果をほとんど示さなかった（図２２Ａ：上部左パネル）。遺伝子発現に対するその抑制効果と一致して、トランスフェクトしたｓｉ−Ａにより、ＭＴＴ及びコロニー形成アッセイによって測定された細胞生存率及びコロニー数の減少が起こったが、かかる効果は３つの対照又はｓｉ−Ｂでは観察されなかった（図２２Ａ：上部右及び下パネル）。
【０５６２】
ＥＦ−１δが肺癌細胞の成長又は生存にとって生物学的に不可欠であるか否かをさらに判定するために、ＥＦ−１δに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＥＦ−１δ−１及びｓｉ−ＥＦ−１δ−２）を発現するプラスミド、及び３つの異なる対照プラスミド（ＥＧＦＰ、ＬＵＣ又はＳＣＲに対するｓｉＲＮＡ）を設計及び構築し、それらをＬＣ３１９細胞にトランスフェクトして、内因性ＥＦ−１δの発現を抑制した。ｓｉ−１をトランスフェクトした細胞におけるＥＦ−１δ転写産物の量は、３つの対照ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした細胞に比べて最も有意に低下し（図２２Ｂ：上部左パネル）、ｓｉ−２はＥＦ−１δ発現に対する抑制効果をほとんど示さなかった。またｓｉ−１のトランスフェクションにより、ＭＴＴ及びコロニー形成アッセイによって測定された細胞生存率及びコロニー数の有意な減少が起こった（図２２Ｂ右側上及び下パネル）。これらの結果により、ＣＤＫＮ３がＥＦ−１δとの相互作用及び／又はＥＦ−１δの活性化によって、ＮＳＣＬＣの成長及び／又は進行を促進し得ることが示唆された。
【０５６３】
実施例２６  ＣＤＫＮ３の過剰発現は、細胞浸潤を増大し、Ａｋｔを活性化するのに十分である。
組織マイクロアレイ上の免疫組織化学的分析により、ＣＤＫＮ３強陽性腫瘍を有する肺癌患者が、腫瘍がＣＤＫＮ３に対して陰性であった患者よりも短い癌特異的な生存期間を示したことが示されたので（図１９Ｂ及び図１９Ｃ）、ＣＤＫＮ３が細胞浸潤能に関与し得るか否かを求めるのに、マトリゲル浸潤アッセイを実行した。マトリゲルによるＣＤＫＮ３発現ベクターをトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の浸潤は、モックベクターをトランスフェクトした対照細胞に比べて有意に高まり（図１９Ｃ）、これによりＣＤＫＮ３がまた、悪性の高い表現型の肺癌細胞に寄与し得ることが示唆された。一方、ＥＦ−１β、γ、δ、及びＶａｌＲＳと関連することが知られたＥＦ−１αは、複数の機能に関与するとされる。
【０５６４】
そのため、ＮＳＣＬＣ細胞におけるＣＤＫＮ３及びＥＦ−１α（ＥＦ−１α１及びＥＦ−１α２）の発現パターンを研究するために、ＣＤＫＮ３、ＥＦ−１α１及びＥＦ−１α２のｍＲＮＡ発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験により分析した。肺癌におけるＥＦ−１α２の発現パターンは、ＥＦ−１δのものと同程度であった（図２３）。ＥＦ−１α２は、重要なヒト癌遺伝子であると考えられ、ＥＦ−１α２の発現が齧歯類の線維芽細胞を形質転換し、ヌードマウスにおけるそれらの腫瘍原性を増大させる（Lee, 2003；Anand et al., 2002）。一方、ＥＦ−１αはＥＦ−１β−γ−δ／ＶａｌＲＳによって調節されると考えられるが、ＥＦ−１αが複合機能的タンパク質としてどのように調節されるかはほとんど知られていない（Minella et al., 1998）。また最近の報告により、ＥＦ−１α２がＡｋｔの活性因子であり、Ａｋｔ及びＰＩ３Ｋ依存的に細胞浸潤及び細胞移動を高めることが示された。ＣＤＫＮ３がＡｋｔ活性化に関与し得るか否かを求めるために、ＣＤＫＮ３はＬＣ３１９細胞で一次的に過剰発現され、Ａｋｔのリン酸化状態を求めるためにウエスタンブロット分析で使用された。次にＡｋｔ活性化の代理マーカーとして機能するＳｅｒ４７３のリン酸化反応を研究した。図１９Ｄで示されるように、ＣＤＫＮ３を一次的に過剰発現したＬＣ３１９細胞は、モックベクターをトランスフェクトした対照細胞に比べてＳｅｒ４７３のリン酸化レベルが増大した。ＰＩ３Ｋ活性が細胞浸潤におけるＣＤＫＮ３依存性の増大に必要とされるか否かを求めるために、本発明者らはＬＹ２９４００２の存在下で浸潤アッセイを実行した。これらのアッセイにより、ＰＩ３Ｋ阻害がＬＹ２９４００２用量依存的にＣＤＫＮ３過剰発現細胞で有意に浸潤の程度を低下させることが示された（図２３、上パネル）。一方、ＬＹ２９４００は、モックベクターをトランスフェクトした対照細胞における浸潤に対する阻害効果をほとんど有していなかった（図２３、下パネル）。
【０５６５】
実施例２７  ＣＤＫＮ３のドミナントネガティブペプチドによるＮＳＣＬＣ細胞の成長阻害
それから、肺癌細胞の成長又は生存に対するＣＤＫＮ３とＥＦ−１δとの間の相互作用の機能的意義を研究するために、これらの２つのタンパク質の結合を阻害することが期待される生体活性細胞透過性ペプチドが、開発された。次に、ＥＦ−１δのコドン７３〜１６０に含まれた１９アミノ酸配列の５つの異なるペプチドを合成した（図２４Ａ）。これらのペプチドをＮＨ２末端で１１個のアルギニン残基（１１Ｒ）を伝達する膜に共有結合させた。５つの１１Ｒ−ＥＦ−１δペプチドの、ＬＣ３１９細胞の培養培地への添加による成長に対する効果を評価し、ここで１１Ｒ−ＥＦ−１δ９０−１０８ペプチドによる処理が、ＭＴＴアッセイによって測定されるように細胞生存率を有意に低下させた（図２４Ｂ、上パネル）。１１Ｒ−ＥＦ−１δ９０−１０８の、ＬＣ３１９細胞の培養培地への添加が、免疫沈降実験による内因性ＣＤＫＮ３とＥＦ−１δとの間の複合体形成を低減した（図２４Ｂ、下パネル）。これらのデータにより、１１Ｒ−ＥＦ−１δ９０−１０８がＣＤＫＮ３とＥＦ−１δとの間の相互作用を特異的に阻害することができることが示された。
【０５６６】
考察
癌治療に対する新規の分子標的の同定及び特性化における最近の加速によって、かなりの関心と共に新たな種類の抗癌剤の開発に焦点が当てられている（Kelly, K., et al., J. Clin. Oncol. 19 :3210-3218（2001））。今までのところ、多くの標的化療法が肺癌で研究中であるが、応答性のある腫瘍型の範囲及び治療の有効性は依然として非常に限定される。分子標的化薬物は、作用機構が明確であるため、最小の有害作用で悪性細胞に対する特異性が高いことが期待される。この目的へのアプローチとして有望な戦略は、癌細胞で過剰発現する遺伝子を効果的に同定するために全ゲノム発現分析の力を利用することである。また、組織マイクロアレイを、ＲＮＡｉ技法による機能喪失効果のハイスループットスクリーニングと組み合わせて、潜在的な標的タンパク質のバリデーションのために数百ものアーカイブ臨床試料を分析するのに使用した。このアプローチを用いて、本明細書でＣＤＫＮ３が臨床肺癌試料及び肺癌細胞株で頻繁に過剰発現され、遺伝子産物が肺癌細胞の成長及び進行において欠かすことのできない役割を果たすことが示される。
【０５６７】
ＣＤＫＮ３（ＫＡＰとも呼ばれる）は、二重特異性のタンパク質ホスファターゼのファミリーに属し、初めにｃｄｋ２又はｃｄｃ２と相互作用するタンパク質として同定され、これによりＣＤＫＮ３が細胞周期調節に関与し得ることが示唆された（Gyuris et al., 1993；Hannon et al., 1994；Brown et al., 1999）。ＣＤＫＮ３の過剰発現が非浸潤性（in situ）及び浸潤性管癌で報告されたが（Lee, S. W., et al., Mol Cell Biol. 20:1723-1732（2000））、その発癌機能は不明なままである。
【０５６８】
グアニンヌクレオチド交換因子として機能することが知られ、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素的送達に関与する、延長因子−１複合体のサブユニットであるＥＦ−１δが、新規のＣＤＫＮ３細胞内標的分子として発見された。アミノアシルｔＲＮＡは、リボソームタンパク質合成におけるアミノ酸供与体である。ｔＲＮＡ分子は、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによって、対応するアミノ酸でアミノアシル化される。アミノアシルｔＲＮＡは、延長因子−１α（ＥＦ−１α）との三重複合体に変換され、タンパク質合成のためにアミノ酸の直接前駆体を与える。アミノアシルｔ−ＲＮＡとリボソームとの結合に関与するＧタンパク質である延長因子−１（ＥＦ−１）は、４つの異なるサブユニット（ＥＦ−１β、ＥＦ−１γ、ＥＦ−１δ及びＶａｌＲＳ）とＥＦ−１αとのグアニン−ヌクレオチド交換複合体から成る（Brandsma et al.,1995；Riis et al., 1990；Nygard et al., 1990；Motorin et al., 1988；Motorin et al., 1991）。ＥＦ−１β−γ−δ／ＶａｌＲＳは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ２）及びサイクリン依存性キナーゼ１（ＣＤＫ１）によってリン酸化される。ＥＦ−１複合体の構成要素としてＥＦ−１δは少なくとも哺乳類でＰＫＣによってリン酸化されることが知られている（Venema, R. C., et al, J Biol Chem. 266, 11993-11998.（1991）；Venema R. C., et al, J Biol Chem. 266, 12574-12580.（1991））。一方、ＥＦ−１δの過剰発現が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換し、それらをヌードマウスにおいて腫瘍原性にする可能性があり、さらにそのアンチセンスｍＲＮＡによるＥＦ−１δのブロッキングによって、その発癌性の有意な反転が起こった（Joseph, P., et al., J Biol Chem. 277:6131-6136（2002）；Lei, Y. X., et al., Teratog Carcinog Mutagen. 22:377-383（2002））。一方、ＥＦ−１δの過剰発現が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換し、それらをヌードマウスにおいて腫瘍原性にする可能性があり、さらにそのアンチセンスｍＲＮＡによるＥＦ−１δのブロッキングによって、その発癌性の有意な反転が起こった（Joseph, P., et al., J Biol Chem. 277：6131-6136（2002）；Lei, Y. X., et al., Teratog Carcinog Mutagen. 22：377-383（2002））。
【０５６９】
一方、ＥＦ−１αは、複数の細胞機能に関与し、ＥＦ−１β−γ−δ／ＶａｌＲＳによって調節される（Minella O, et al., Biosci Rep. 3:119-27（1998））。最近の報告により、ＥＦ−１αの２つのアイソフォームの１つであるＥＦ−１α２が、乳癌細胞における細胞移動及び細胞浸潤を刺激することができることが示された一方で（Amiri A, et al., Oncogene 26:3027-40（2007））、このＥＦ−１α２は非転移性対照に比べて、転移性ラット乳腺癌細胞株で過剰発現した（Pencil SD、Breast Cancer Res Treat. 25:165-74（1993）；Edmonds BT, et al., J Cell Sci. 109：2705-14（1996））。一方、ＥＦ−１αは、複数の細胞機能に関与し、ＥＦ−１β−γ−δ／ＶａｌＲＳにより調節される（Minella O, et al., Biosci Rep. 3：119-27（1998））。最近の報告によって、ＥＦ−１αの２つのアイソフォームの１つであるＥＦ−１α２が、乳癌細胞における細胞移動及び細胞浸潤を刺激することができることが示された一方で（Amiri A, et al., Oncogene 26:3027-40（2007））、このＥＦ−１α２は非転移性対照に比べて、転移性ラット乳腺癌細胞株で過剰発現した（Pencil SD, Breast Cancer Res Treat. 25:165-74（1993）；Edmonds BT, et al., J Cell Sci. 109：2705-14（1996））。
【０５７０】
以前の報告により、ＥＦ−１β−γ−δ／ＶａｌＲＳ活性の増大は、ＣＤＫ１によるＥＦ−１γのリン酸化反応に関連し、これに並行して、ＥＦ−１δのリン酸化反応がＶａｌＲＳの阻害、及びしたがってポリ（バリン）合成の特異的な阻害につながることが示されている（Monnier et al., 2001）。一方、ＥＦ−１δの過剰発現が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換し、それらをヌードマウスにおいて腫瘍原性にし得る。さらにそのアンチセンスｍＲＮＡによるＥＦ−１δのブロッキングによって、その発癌性の有意な反転が起こった（Joseph et al., 2002；Lei et al., 2002）。また、ＥＦ−１αは、複数の細胞機能に関与し、ＥＦ−１β−γ−δ／ＶａｌＲＳによって調節される（Minella et al., 1998）。最近の報告により、ＥＦ−１αの２つのアイソフォームの１つであるＥＦ−１α２が、乳癌細胞における細胞移動及び細胞浸潤を刺激することが示された（Amiri et al., 2006）。さらに、ＥＦ−１α２は転移の進行に関与し得ると共に、このＥＦ−１α２は非転移性対照に比べて、転移性ラット乳腺癌細胞株で過剰発現する（Pencil et al., 1993；Edmonds et al., 1996）。
【０５７１】
ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δの発現を低減させる特定のｓｉＲＮＡによる、本明細書でのＮＳＣＬＣ細胞の処理により成長抑制が起こった。ＥＦ−１δが肺癌細胞でＣＤＫＮ３と同時に発現し、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤＫＮ３ホスファターゼの生理学的基質であることが確認され、これによりＣＤＫＮ３がＥＦ−１δの脱リン酸化反応による肺腫瘍での成長促進機能を有し得ることが示唆された。本発明者らの組織マイクロアレイ実験によって得られた臨床病理学的証拠により、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ強陽性腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者が、ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δに対する陰性又は弱い染色を有する患者よりも短い生存期間を示すことが示され、これによりＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δの過剰発現が悪性の強い表現型の肺癌細胞を促し得る可能性が高まった。さらに、形質導入性１１Ｒ−ＥＦ−１δ９０−１０８ペプチドがＣＤＫＮ３とＥＦ−１δとの機能的な複合体形成を阻害し得ることが示され、これにより癌細胞成長の抑制が起こった。
【０５７２】
ＣＤＫＮ３又はＥＦ−１δの発現を低減させる特定のｓｉＲＮＡによりＮＳＣＬＣ細胞の成長抑制が起こった。ＥＦ−１δが肺癌細胞でＣＤＫＮ３と同時に発現し、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤＫＮ３ホスファターゼの生理学的基質である可能性があることが確認され、これによりＣＤＫＮ３がＥＦ−１δの脱リン酸化反応による肺腫瘍での成長促進機能を有し得ることが示唆された。さらに、本発明の組織マイクロアレイ実験によって得られた臨床病理学的証拠により、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ陽性腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者が、ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δに対するネガティブ染色を有する患者よりも短い生存期間を示すことが示され、これによりＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δの過剰発現が悪性の強い表現型の肺癌細胞を促し得る可能性が高まった。本発明のデータを組み合わせると、ＣＤＫＮ３とＥＦ−１β−γ−δ／ＶａｌＲＳとの関連性がＥＦ−１δの脱リン酸化反応につながり得ることが示唆され、腫瘍細胞の細胞機能を活性化することにより、腫瘍成長及び／又は進行が起こる。
【０５７３】
要するに、二重特異性タンパク質ホスファターゼであるＣＤＫＮ３は、その新たに明らかになった相互作用分子、ＥＦ−１δの脱リン酸化反応によって、肺癌の成長促進経路に不可欠な役割を果たすと考えられる。ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δは、診療所における予後バイオマーカーとして有用であり、ＣＤＫＮ３の酵素活性又はＣＤＫＮ３とＥＦ−１δとの相互作用を標的とすることは、新たなタイプの抗癌薬を開発するのに有望な治療的アプローチになり得る。
【０５７４】
産業上の利用可能性
本明細書中で実証されるように、細胞成長は、ＥＢＩ３、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δ遺伝子を特異的に標的とする二本鎖分子によって抑制される。したがって、これらの新規の二本鎖分子は、抗癌薬の開発に有用な候補物質である。例えば、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及び／又はＥＦ−１δタンパク質の発現を阻止する及び／又はその活性を抑える薬剤は、抗癌剤、特に肺癌の治療、より具体的にはＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣの治療用の抗癌剤としての治療上の有用性を見出し得る。
【０５７５】
ヒト遺伝子ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３及びＥＦ−１δの発現が、正常器官に比べて肺癌で顕著に上昇する。したがって、これらの遺伝子は、肺癌診断上のマーカーとして便利に使用することができ、これによりコードされたタンパク質は肺癌の診断上のアッセイにおける有用性を見出している。
【０５７６】
さらに、本明細書で記載される方法は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む肺癌の診断、並びにこれらの疾患の患者の予後不良の予測にも有用である。さらに本発明は、肺癌を含む癌に対する治療的アプローチの展開の有力候補物質を提供する。
【０５７７】
一態様では、本発明は、ＥＢＩ３レベルが、正常対照のものに比べて肺癌患者の血清中で上昇するという発見に関する。したがって、ＥＢＩ３タンパク質は、肺癌に対する診断上のマーカー、特に血清学的マーカーとして有用性がある。指標としてＥＢＩ３の血清レベルを用いて、本発明は、癌患者において癌を診断する方法、及び癌患者において癌治療の進行をモニタリングする方法を提供する。従来技術では、肺癌に好適な血清学的マーカーを提供することはできない。本発明の新規の血清学的マーカーＥＢＩ３は、肺癌の検出に対する感度を向上し得る。また、ＥＢＩ３とＣＥＡ又はｐｒｏ−ＧＲＰとの組み合わせは、膵臓癌の検出に対する感度の上昇に寄与する。
【０５７８】
さらに、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＣＤＫＮ３、ＮＰＴＸ１又はＥＦ−１δポリペプチドは、抗癌薬の開発に有用な標的である。例えば、ＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３若しくはＥＦ−１δと結合する薬剤、又はＥＢＩ３、ＤＬＸ５、ＮＰＴＸ１、ＣＤＫＮ３若しくはＥＦ−１δの発現を阻止する薬剤、又はその活性を抑える薬剤、又はＣＤＫＮ３とＥＦ−１δとの間の結合を阻害する薬剤は、抗癌剤、特に肺癌治療のための抗癌剤としての治療的有用性を見出し得る。
【０５７９】
本明細書中に引用される全ての刊行物、データベース、配列、特許、及び特許出願は、参照により本明細書中に援用される。
【０５８０】
本発明をその具体的な実施形態を参照して詳細に記載したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正をその実施形態に加えることができることは当業者には明らかであり、その境界及び限界は添付の特許請求の範囲により設けられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2010536366.tif 000014
【図１Ｃ】
2010536366.tif 000015
【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
2010536366.tif 000017
【図２】
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【図３】
2010536366.tif 000019
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2010536366.tif 000023
【図４Ｅ】
2010536366.tif 000024
【図５】
2010536366.tif 000025
【図６】
2010536366.tif 000026
【図７Ａ】
2010536366.tif 000027
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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