(57)【要約】ジメチルフマレートを有効成分として含む血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物、ジメチルフマレートの血管平滑筋細胞増殖抑制用途およびこれを用いた血管平滑筋細胞の増殖抑制方法を提供する。本発明によれば、ジメチルフマレートがＡＭＰＫの活性を増大させることにより、血管平滑筋細胞の増殖を抑制することが可能になることが判明された。このため、ジメチルフマレートは、血管平滑筋細胞増殖抑制のための医薬の有効成分として有効に使用可能である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジメチルフマレートを有効成分として含む血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物。
【請求項２】
前記薬剤学的組成物は、動脈硬化症の予防または治療のためのものである請求項１に記載の血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物。
【請求項３】
前記薬剤学的組成物は、血管再狭窄の予防または治療のためのものである請求項１に記載の血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明はジメチルフマレートを有効成分として含む血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物、ジメチルフマレートの血管平滑筋細胞増殖抑制用途およびこれを用いた血管平滑筋細胞の増殖抑制方法に関する。
【０００２】
血管平滑筋細胞の増殖は、アテローム性動脈硬化症をはじめとする動脈硬化症症、血管再狭窄症などを含む心血管系疾患の重要な原因である (Hidde B., Restenosis: a challenge for pharmacology. Trends. Pharmacol. Sci. 2000;21(7):274-279; Nageswara RM, and Marschall SR, Circ. Res. 2007;100:460-473; Andres V, Castro C. Antiproliferative strategies for the treatment of vascular proliferative disease. Curr Vasc Pharmacol. 2003 Mar;1(1):85-98; Hao H, Gabbiani G, Bochaton-Piallat ML. Arterial smooth muscle cell heterogeneity: implications for atherosclerosis and restenosis development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003 Sep 1;23(9):1510-20)。
【０００３】
かような心血管系疾患を予防するための最良の方法は、高血圧、高脂血症、肥満、糖尿などの代謝症候群の要素を上手く管理することである。しかしながら、かような疾患が一回発病すると、薬物または手術的な方法を使用する治療が必要となる。スタチン系の薬品と抗高血圧薬剤を用いて血圧を調節するが、これは、心血管疾患の約１５−３０％しか減少できず、根本的な治療法になりえない。これまで知られている最良の治療法は、風船付きカテーテルを目詰まったり狭くなった血管中に入れた後に風船を拡張させて血管を通すことである(Hidde B., Restenosis: a challenge for pharmacology. Trends. Pharmacol. Sci. 2000;21(7):274-279; Andres V, Castro C. Antiproliferative strategies for the treatment of vascular proliferative disease. Curr Vasc Pharmacol. 2003 Mar;1(1):85-98); Hao H, Gabbiani G, Bochaton-Piallat ML. Arterial smooth muscle cell heterogeneity: implications for atherosclerosis and restenosis development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003 Sep 1;23(9):1510-20) 。しかしながら、血管平滑筋細胞の再増殖により風船拡張術施術後約１年以内に５０％程度の再狭窄率を示す問題が発生するため、血管平滑筋細胞の増殖を抑制することが必須的である。
【０００４】
最近、各種の代謝性疾患とミトコンドリアとの連携研究が盛んになされている。血管合併症の発病機序中に血管細胞において酸化ストレスが増大することが観察されたが、この酸化ストレスの増加はミトコンドリアの機能障害に起因するという意見が支配的である(Nageswara RM and Marschall SR, Circ. Res. 2007;100:460-473)。ミトコンドリアは血管細胞内の種々の酸化ストレス発生システムのうち葡萄糖代謝および脂肪代謝と関連して活性酸素種を生成する機関であり、且つ、高血糖、脂肪酸、サイトカイン、成長因子などにより発生する酸化ストレスに共通して作用して血管合併症の発生を一層加速化させる恐れがあるためである。最近の研究において、ＵＣＰ−２、ＡＭＰＫ、ＰＧＣ−１などの遺伝子の過発現が高血圧誘発因子によるミトコンドリアの機能を改善させ、血管平滑筋細胞の増殖および移動を抑制することが観察されている(Lee W.J., et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25:2488-2494; Park J.Y., et al., Diabetologia 2005;48:1022-1028; Lee IK, et al., Effects of Recombinant Adenovirus-Mediated Uncoupling Protein 2 Overexpression on Endothelial Function and Apoptosis. Circ Res. 2005 Jun 10;96(11):1200-7; Kim HJ, et al., Effects of PGC-1α on TNF-α Induced MCP-1 and VCAM-1 Expression and NF-κB Activation in Human Aortic Smooth Muscle and Endothelial Cells. ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING. 2007;9(3): 301-307)。
【０００５】
血管平滑筋細胞の増殖がＡＭＰＫの活性により支配される恐れがあることが再度報告されている(Nagata D, et al., AMP-activated protein kinase inhibits Angiotensin II-stimulated vascular smooth muscle cell proliferation. Circulation. 2004;110:444-451)。ＡＭＰＫが活性化された血管平滑筋細胞は増殖が抑制されることが観察され、且つ、この平滑筋細胞においては細胞増殖抑制因子であるｐ５３とｐ２１の発現が増大され、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ：cyclin-dependent kinase）の活性が減少された(Igata M, et al., Adenosine monophosphate-activated protein kinase suppresses vascular smooth muscle cell proliferation through the inhibition of cell cycle progression. Circ Res. 2005;97(8):837-844)。ＡＭＰＫは食餌制限や運動によりＡＭＰの相対的な比率がＡＴＰよりも高いときに活性化される一種のリン酸化酵素であって、細胞の複製を中断してそれ以上のＡＴＰの消耗を抑制する機能を持つ代謝関連の重要なタンパク質である(Hardie DG. AMP-activated protein kinase as a drug target. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2007;47:185-210)。活性化されたＡＭＰＫは糖代謝と脂質酸化を促進させ、糖新生成と脂質の合成を抑制することが知られている。なお、ＡＭＰＫは代謝過程とは無関係に活性化されたりもするが、糖尿病治療剤として知られているメトホルミンによっても活性化され、α−リポ酸により活性されたりもする (Lee W.J., et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25:2488-2494; Lee KM, et al., Alpha-lipoic acid inhibits fractalkine expression and prevents neointimal hyperplasia after balloon injury in rat carotid artery. Atherosclerosis. 2006 Nov;189(1): 104-14)。
【０００６】
本発明者らは、血管平滑筋細胞においてＡＭＰＫの活性を促進させる物質を研究した結果、ジメチルフマレート（dimethyl fumarate：ＤＭＦ）が血管平滑筋細胞においてＡＭＰＫの活性を促進させて血管平滑筋細胞の増殖を抑制することを見出すことにより、本発明を完成するに至った。
【０００７】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
従って、本発明の目的は、ジメチルフマレートを有効成分として含む血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物、ジメチルフマレートの血管平滑筋細胞増殖抑制用途およびこれを用いた血管平滑筋細胞の増殖抑制方法を提供するところにある。
【０００８】
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、ジメチルフマレートを有効成分として含む血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物を提供する。
【０００９】
ジメチルフマレートは、下記の一般式１に示す構造を有する。
【００１０】
【化１】
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【００１１】
本発明の実施例によれば、ジメチルフマレートは、血管平滑筋細胞の増殖を抑制させ、風船拡張術後に生成可能な新生内膜の形成も減少させる。下記の実施例から明らかなように、ジメチルフマレートはＡＭＰＫを活性化させて血管平滑筋細胞の増殖を抑制し、さらに、細胞増殖を抑制するのに関与するｐ５３、ｐ２１タンパク質の発現を増加させ、細胞増殖を誘導するＣＤＫの発現を抑制する。
【００１２】
細胞増殖において分列期への誘導および転写活性に重要な役割を果たすタンパク質がＥ２Ｆである。Ｅ２Ｆは網膜芽細胞腫（Ｒｂ）と結合した形で存在していて、成長因子やＣＤＫの刺激によりＲｂがリン酸化されると分離されて細胞を複製期に誘導する。下記の実施例によれば、ジメチルフマレートと反応した血管平滑筋細胞においてはＲｂのリン酸化が抑制される。このため、本発明によれば、ジメチルフマレートは細胞周期を調節する機能があることを確認することができる。
【００１３】
本発明のジメチルフマレートを有効成分として含有する組成物は、前記有効成分の他に、薬剤学的に適しており、且つ、生理学的に許容される補助剤を用いて製造可能であり、前記補助剤としては、賦形剤、崩壊剤、甘味剤、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤または香味剤などの可溶化剤を使用することができる。
【００１４】
本発明のジメチルフマレートを有効成分として含有する組成物は、投与のために上述した有効成分の他にさらに薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで薬剤学的組成物として好適に製剤化可能である。
【００１５】
本発明のジメチルフマレートを有効成分として含有する組成物の剤形としては、顆粒剤、散剤、錠剤、被覆錠、カプセル剤、座剤、灌腸剤、シロップ、汁、懸濁剤、乳剤または注射可能な液剤などが挙げられる。
【００１６】
例えば、錠剤またはカプセル剤への製剤化のために、有効成分は、エタノール、グリセロール、水などの経口、無毒性の薬剤学的に許容可能な不活性担体と結合可能である。また、必要に応じて、好適な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および発色剤もまた混合物に含有可能である。好適な結合剤は、これらに制限されることはないが、澱粉、ゼラチン、グルコースまたはβ−ラクトースなどの天然糖、トウモロコシ甘味剤、アカシア、トラガカントまたはソジウムオレートなどの天然および合成ガム、ソジウムステアレート、マグネシウムステアレート、ソジウムベンゾエート、ソジウムアセテート、ソジウムクロライドなどを含む。崩壊剤は、これらに制限されることはないが、澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどを含む。
【００１７】
液状溶液として製剤化される組成物において許容可能な薬剤学的担体としては、滅菌 および生体に適したものであって、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、靜菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。さらに、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸剤、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当該分野における適切な方法によりRemington’s Pharmaceutical Science、Mack Publishing Company、Easton PAに開示されている方法を用いて各疾患によってまたは成分によって好適に製剤化することができる。
【００１８】
また、本発明は、血管平滑筋細胞増殖抑制用医薬の製造のためのジメチルフマレートの用途を提供する。
【００１９】
前記血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物は、このような医薬の製造のために使用可能である。
【００２０】
さらに、本発明は、哺乳動物に治療上有効量のジメチルフマレートを有効成分として含む薬剤学的組成物を投与することを含む血管平滑筋細胞の増殖抑制方法を提供する。
【００２１】
本発明において、前記血管平滑筋細胞増殖抑制は、血管平滑筋細胞の増殖の減少および予防を含む。
【００２２】
本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制用薬剤学的組成物は、血管平滑筋細胞の増殖により誘発される疾患であるアテローム性動脈硬化症をはじめとする動脈硬化症症(Hidde B., Restenosis: a challenge for pharmacology. Trends. Pharmacol. Sci. 2000;21(7):274-279; Nageswara RM, and Marschall SR, Circ. Res. 2007;100:460-473; Andres V, Castro C. Antiproliferative strategies for the treatment of vascular proliferative disease. Curr Vasc Pharmacol. 2003 Mar;1(1):85-98; Hidde B., Restenosis: a challenge for pharmacology. Trends. Pharmacol. Sci. 2000;21(7):274-279; Hao H, Gabbiani G, Bochaton-Piallat ML. Arterial smooth muscle cell heterogeneity: implications for atherosclerosis and restenosis development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003 Sep 1;23(9):1510-20)などを含む心血管系疾患の予防または治療のために使用可能である。
【００２３】
このため、本発明の血管平滑筋細胞増殖抑制用薬学的組成物は、１種またはそれ以上の心血管系疾患の治療剤も含むことができる。例えば、ジメチルフマレートは当業界における周知の高脂血症治療剤または血圧降下剤などと併用可能である。
【００２４】
本発明のジメチルフマレートを有効成分として含有する組成物は、靜脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、腹腔内、胸骨内、けい皮、鼻側内、吸入、局所、直腸、経口、眼球内または皮内経路を通じて通常の方式により投与可能である。
【００２５】
本発明のジメチルフマレートを有効成分として含有する組成物の治療上有効量とは、血管平滑筋細胞の増殖を抑制する効果を奏するのに求められる量を意味する。このため、疾患の種類、疾患の軽重度、組成物に含有されている有効成分および他の成分の種類および含量、剤形の種類および患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、同時に使用される薬物をはじめとする様々な因子によって調節可能である。成人にジメチルフマレートを１日につき１回ないし数回投与時、例えば、１００ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇの容量にて投与することが好ましい。
【００２６】
〔発明の効果〕
本発明により、ジメチルフマレートがＡＭＰＫの活性を増大させることにより、血管平滑筋細胞の増殖を抑制することが可能になることが判明された。このため、ジメチルフマレートは血管平滑筋細胞増殖抑制のための医薬の有効成分として有効に使用可能である。
【００２７】
〔図面の簡単な説明〕
（図１）ＰＤＧＦの存在または不存在下にジメチルフマレートを濃度別に処理した場合、血管平滑筋細胞の増殖がジメチルフマレートの濃度に依存的に有意に減少することを示すグラフである。
（図２）風船拡張術実施２週後のラットの頚動脈の切断面を示す顕微鏡写真（×１００）である。
（図３）ジメチルフマレートがＡＭＰＫとＡｃｃのリン酸化に及ぼす影響を示すウェスタンブロット写真である。
（図４）ジメチルフマレートが細胞増殖と関連するタンパク質であるｐ５３、ｐ２１のタンパク質の発現に及ぼす影響を示すウェスタンブロット写真である。
（図５）ジメチルフマレートがｐＲｂとＣＤＫの発現に及ぼす影響を示すウェスタンブロット写真である。
（図６）ジメチルフマレートが細胞周期に及ぼす影響を示すＦＡＣＳを用いた細胞周期分析結果である。
【００２８】
〔発明を実施するための形態〕
＜血管平滑筋細胞の分離および培養＞
血管平滑筋細胞を培養するためにSprague-Dawley白鼠の大動脈から血管平滑筋細胞を分離し、一次培養して実験した。血管平滑筋細胞は２０％牛胎血清を含有する培養液において細胞が生長するまで３７℃、５％の二酸化炭素の条件を備えた培養器において培養した。この過程において得られた細胞を新たな培養皿に移して培養し、４−７回まで継代培養した初期細胞を実験に供した。
【００２９】
＜実施例１：ジメチルフマレートによる血管平滑筋細胞の増殖抑制確認＞
一次培養された血管平滑筋細胞を９６−ウェル培養皿に培養し、７０％生長したときに０．５％牛胎血清含有培地に交換し、２４時間かけて培養して細胞を休止期状態に放置した。一次培養した血管平滑筋細胞にそれぞれ異なる容量（１、２、５、１０μＭ）のジメチルフマレートと細胞の増殖を増加させる血小板由来成長因子（platelet derived growth factor：ＰＤＧＦ）（２０ｎｇ／ｍｌ）を処理し、３７℃において４８時間かけて反応させた。生存した細胞の数はＷＳＴ細胞計数キット（ＷＡＫＯ、日本）を用いて測定した。細胞増殖確認用試薬を処理し、４時間さらに反応させた後にＥＬＩＳＡリーダーにより４５０ｎｍにおける吸光度を測定して細胞の増殖力を調査した。実験結果は、３回以上独立した実験において測定して平均を求めて示す。図１から明らかなように、血小板由来成長因子により増大された細胞増殖がジメチルフマレート濃度が高くなるにつれて抑制された。
【００３０】
＜実施例２：白鼠における血管平滑筋細胞の増殖抑制効果確認＞
ジメチルフマレートが風船拡張術施行後に新生内膜の形成を抑制するかどうかを確認するために、ジメチルフマレート含有食餌を供給したSprague-Dawley白鼠により実験した。
【００３１】
飼育室の温度を２２±２℃に維持し、明暗は１２時間周期に自動調節した条件を維持しながら飼育した。白鼠を正常対照群、高脂肪食（２０％脂肪、０．０５％コレステロール）のみをする陰性対照群、高脂肪食餌に０．５％または１％ジメチルフマレートを含む食餌を供給した実験群の３群（各群当たりに４匹）に分け、１ケージにつき１匹ずつ独立したケージにおいて４週間飼育しながら実験を行った。風船拡張術実施前２週間飼育して風船拡張術を実施し、一般食餌とジメチルフマレート食餌を続けながら２週間さらに飼育した後、大動脈を分離してヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色方法により新生内膜の形成を確認した。
【００３２】
その結果、高脂肪食餌だけを供給した群においては正常対照群（図２のａ）に比べて新生内膜の形成が確認された（図２のｂ）。これに対し、ジメチルフマレートがそれぞれ０．５％と１％含有されている食餌を供給した群においては風船拡張術施行後に新生内膜の生成が格段に減っていることが観察された（図２のｃ、図２のｄ）。
【００３３】
＜実験例１：ジメチルフマレートがＡＭＰＫ、ＡＣＣのリン酸化に及ぼす影響確認＞
一次培養した血管平滑筋細胞を６０ｍｍ組織培養皿に８０−９０％程度満たした後、０．５％ＦＢＳを含む培地において２４時間放置して細胞を休止期状態にした。ジメチルフマレートを処理しなかった群を対照群とし、実験群は５μＭのジメチルフマレートをそれぞれ１、２、３、６、１２時間かけて処理した５群に分けた。ＲＩＰＡ緩衝溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌタンパク質分解酵素抑制剤）を用いて各群の血管平滑筋細胞から全体タンパク質を分離した。分離した各試料のタンパク質を定量し、２５ｍｇのタンパク質を試料緩衝溶液と混ぜて５分間沸騰した後に冷却させてソジウムドデシルスルファートポリアクリアミドゲルにおいて電気泳動してサイズ別に分離した後、ＰＶＤＦメンブレインに移し、ｐＡＭＰＫ、ｐＡＣＣ抗体と反応させてリン酸化を確認した。なお、一定量のタンパク質が使用されたかどうかを確認するために、抗アクチン抗体と反応させて確認した。
【００３４】
図３から明らかなように、ＡＭＰＫの活性は半分は初期に増大され、ＡＭＰＫの標的遺伝子であるＡＣＣのリン酸化は増大し続けることが確認された。
【００３５】
＜実験例２：ジメチルフマレートが細胞増殖と関連するタンパク質の発現に及ぼす影響確認＞
一次培養した血管平滑筋細胞を６０ｍｍ組織培養皿に８０−９０％程度満たした後、０．５％ＦＢＳを含む培地において２４時間放置して細胞を休止期状態にした。ジメチルフマレートを処理しなかった群を対照群とし、実験群は５μＭのジメチルフマレートをそれぞれ１、２、３、６、１２時間かけて処理した５群に分けた。ＲＩＰＡ緩衝溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１μｇ／ｍｌタンパク質分解酵素抑制剤）を用いて各群の血管平滑筋細胞から全体タンパク質を分離した。分離した各試料のタンパク質を定量し、２５μｇのタンパク質を試料緩衝溶液と混ぜて５分間沸騰した後に冷却させてソジウムドデシルスルファートポリアクリアミドゲルにおいて電気泳動してサイズ別に分離した後、ＰＶＤＦメンブレインに移し、ｐ５３、ｐ２１抗体と反応させて発現を確認した。なお、一定量のタンパク質が使用されたかどうかを確認するために、抗アクチン抗体と反応させて確認した。
【００３６】
その結果、図４から明らかなように、ジメチルフマレートにより細胞増殖と関連するタンパク質であるｐ５３とｐ２１の発現が増大されることを確認した。
【００３７】
＜実験例３：ジメチルフマレートが細胞増殖と関連するタンパク質の発現に及ぼす影響確認＞
一次培養した血管平滑筋細胞を６０ｍｍ組織培養皿に８０−９０％程度満たした後、０．５％ＦＢＳを含む培地において２４時間放置して細胞を休止期状態にした。ジメチルフマレートを処理しなかった群を対照群とし、実験群はＰＤＧＦの存在または不存在に５μＭのジメチルフマレートをそれぞれ６、１２、２４時間かけて処理した群に分けた。ＲＩＰＡ緩衝溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１μｇ／ｍｌタンパク質分解酵素抑制剤）を用いて各群の血管平滑筋細胞から全体タンパク質を分離した。分離した各試料のタンパク質を定量し、２５μｇのタンパク質を試料緩衝溶液と混ぜて５分間沸騰して冷却させてソジウムドデシルスルファートポリアクリアミドゲルにおいて電気泳動してサイズ別に分離した後にＰＶＤＦメンブレインに移し、ｐＲｂ、サイクリンＥに対する抗体と反応させて発現を確認した。なお、一定量のタンパク質が使用されたかどうかを確認するために抗アクチン抗体と反応させて確認した。
【００３８】
その結果、図５から明らかなように、ジメチルフマレートが成長因子とＣＤＫにより促進されるＲｂのリン酸化を抑制させることを確認することができた（図５）。
【００３９】
ジメチルフマレートがＣＤＫの発現を抑制させるかどうかを確認するために、ウェスタンブロットを行った。一次培養した血管平滑筋細胞に５μＭのジメチルフマレートを２時間かけて前処理し、増殖因子であるＰＤＧＦを処理した。所定時間反応させた後に細胞を回収し、ウェスタンブロット方法によりＣＤＫ発現を調査した。その結果、ジメチルフマレートを前処理した実験群においてジメチルフマレートを処理しなかった対照群よりもＣＤＫの発現が抑制されることを確認した（図５）。
【００４０】
＜実験例４：ジメチルフマレートが細胞周期に及ぼす影響確認＞
ジメチルフマレートが細胞周期に及ぼす影響を調べるためにＦＡＣＳを用いて分析した。２４時間かけて０．５％牛胎血清含有培地において生長させた血管平滑筋細胞に５μＭのジメチルフマレートを２時間かけて前処理した。細胞を複製期に誘導するために成長因子とインシュリンを処理し、２４時間かけて反応させた。その後、細胞を回収し、固定過程を経た後、プロピジウムヨージド（propidium iodide：ＰＩ）により核を染色し、ＦＡＣＳを用いて細胞周期を分析した。各試料当たりに１０、０００個の細胞を測定して細胞周期は％にて示す。
【００４１】
その結果、成長因子とインシュリンの刺激を受けた血管平滑筋細胞は刺激を受けなかった対照群（図６のａ）と比較して複製期状態にある細胞が増大した（８．７％）（図６のｂ）。これに対し、ジメチルフマレートと同時に反応した細胞は複製期状態の細胞が３．４％まで減っていることを確認した（図６のｃ）。
【００４２】
本発明により、ジメチルフマレートがＡＭＰＫの活性を増大させることにより、血管平滑筋細胞の増殖を抑制することが可能になることが判明された。このため、ジメチルフマレートは血管平滑筋細胞増殖抑制のための医薬の有効成分として有効に使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＰＤＧＦの存在または不存在下にジメチルフマレートを濃度別に処理した場合、血管平滑筋細胞の増殖がジメチルフマレートの濃度に依存的に有意に減少することを示すグラフである。
【図２】風船拡張術実施２週後のラットの頚動脈の切断面を示す顕微鏡写真（×１００）である。
【図３】ジメチルフマレートがＡＭＰＫとＡｃｃのリン酸化に及ぼす影響を示すウェスタンブロット写真である。
【図４】ジメチルフマレートが細胞増殖と関連するタンパク質であるｐ５３、ｐ２１のタンパク質の発現に及ぼす影響を示すウェスタンブロット写真である。
【図５】ジメチルフマレートがｐＲｂとＣＤＫの発現に及ぼす影響を示すウェスタンブロット写真である。
【図６】ジメチルフマレートが細胞周期に及ぼす影響を示すＦＡＣＳを用いた細胞周期分析結果である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【国際調査報告】
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2010539078.tif 000016