(57)【要約】  ヘモグロビンおよび少なくとも１つの病原性因子を含む生体液を第一のフィルターと接触させて、そして第一のろ液を生成し；第一のろ液をナノろ過デバイスと接触させて、そして第二のろ液を生成し；第二のろ液をクロマトグラフィー材料と接触させて、そして溶出した分画を単離し；溶出した分画を疎水性溶媒と接触させて、そして疎水性および親水性相を生成し；そして親水性相を単離する、ここで生体液は、約６５ｋＤａ以下の関心対象の構成要素を含む工程を含む、方法。高分子量構成要素および少なくとも１つの病原性因子を含む生体液を第一のフィルターと接触させて、そして第一のろ液を生成し；第一のろ液を親水性膜と接触させて、そして第二のろ液を生成し；第二のろ液をクロマトグラフィー材料と接触させて、そして溶出した分画を単離し；溶出した分画を疎水性溶媒と接触させて、そして疎水性および親水性相を生成し；そして親水性相を単離する、ここで高分子量構成要素は、約６５ｋＤａより大きい分子量を有する工程を含む、方法。ヘモグロビンおよび少なくとも１つの病原性因子を含む生体液を、少なくとも２つのろ過工程に供し、そしてそれによって、生体液に会合した病原性因子の量を減少させる工程を含む、方法。ヘモグロビン溶液を、複数のろ過工程を含む直交性分離方法論に供することによって、ヒトおよび／または動物起源のヘモグロビン溶液中の感染性海綿状脳症因子を除去する工程を含む、方法。【選択図】図１
2010515068.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビンおよび少なくとも１つの病原性因子を含む生体液を第一のフィルターと接触させて、そして第一のろ液を生成し；
第一のろ液をナノろ過デバイスと接触させて、そして第二のろ液を生成し；
第二のろ液をクロマトグラフィー材料と接触させて、そして溶出した分画を単離し；
溶出した分画を疎水性溶媒と接触させて、そして疎水性および親水性相を生成し；そして
親水性相を単離する、ここで生体液は、約６５ｋＤａ以下の関心対象の構成要素を含む
工程を含む方法。
【請求項２】
第一のフィルターと接触させる前に、ヘモグロビンを含む生体液を一酸化炭素で飽和させる工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
生体液がヒト由来ヘモグロビン、動物由来ヘモグロビン、またはその組み合わせを含む、請求項１の方法。
【請求項４】
病原性因子がタンパク質性プリオン、感染性海綿状脳症因子、またはその組み合わせを含む、請求項１の方法。
【請求項５】
第一のフィルターが大流量アフィニティープリオン減少フィルターを含む、請求項１の方法。
【請求項６】
フィルターが、約２５分間以下で約５００ｍｌ〜約１０００ｍｌの流速を有する、請求項５の方法。
【請求項７】
第一のろ液中の病原性因子の量が、生体液中の病原性因子の量に比較した際、約１対数以上減少している、請求項１の方法。
【請求項８】
ナノろ過デバイスが、中空繊維フィルターまたはディスクを含む、請求項１の方法。
【請求項９】
ナノろ過デバイスが、約６５ｋＤａの分子量カットオフを有する、請求項８の方法。
【請求項１０】
第二のろ液中の病原性因子の量が、第一のろ液中の病原性因子の量に比較した際、約１対数以上減少している、請求項１の方法。
【請求項１１】
クロマトグラフィー材料が強いアニオン交換体を含む、請求項１の方法。
【請求項１２】
溶出された分画中の病原性因子の量が、第二のろ液中の病原性因子の量に比較した際、約１対数以上減少している、請求項１の方法。
【請求項１３】
疎水性溶媒が、クロロホルム、トルエン、またはその組み合わせを含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
親水性相中の病原性因子の量が、生体液中の病原性因子の量に比較した際、約５対数以上減少している、請求項１の方法。
【請求項１５】
親水性相が感染性でない、請求項１の方法。
【請求項１６】
病原性因子の量を決定する工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１７】
組成物中の病原性因子の量の決定が、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、動物感染性アッセイ、またはその組み合わせによって実行される、請求項１６の方法。
【請求項１８】
高分子量構成要素および少なくとも１つの病原性因子を含む生体液を第一のフィルターと接触させて、そして第一のろ液を生成し；
第一のろ液を親水性膜と接触させて、そして第二のろ液を生成し；
第二のろ液をクロマトグラフィー材料と接触させて、そして溶出した分画を単離し；
溶出した分画を疎水性溶媒と接触させて、そして疎水性および親水性相を生成し；そして
親水性相を単離する、ここで高分子量構成要素は、約６５ｋＤａより大きい分子量を有する
工程を含む方法。
【請求項１９】
親水性膜がポリフッ化ビニリデンを含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
ヘモグロビンおよび少なくとも１つの病原性因子を含む生体液を、少なくとも２つのろ過工程に供し、そしてそれによって、生体液に会合した病原性因子の量を減少させる
工程を含む方法。
【請求項２１】
病原性因子が感染性海綿状脳症因子を含み、そして該因子の量の減少が約５対数以上である、請求項２０の方法。
【請求項２２】
ヘモグロビン溶液を、複数のろ過工程を含む直交性分離方法論に供することによって、ヒトおよび／または動物起源のヘモグロビン溶液中の感染性海綿状脳症因子を除去する
工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［０００１］本開示は、生体液および生体液を精製する方法に関する。より具体的には、本開示は、生体液から感染性海綿状脳症因子を直交性に除去するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
［０００２］感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）はプリオン病としても知られ、脳に「海綿状」の外見を与える小さい穴によって特徴付けられる、まれな変性性脳障害群である。クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）はヒトＴＳＥで最もよく知られるものである。該疾患は、毎年１００万人に約１人が罹患するまれなタイプの認知症である。他のヒトＴＳＥには、クールー、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、およびゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）が含まれる。クールーは、パプア、ニューギニアにおける孤立部族の人々で同定され、そして現在ほとんど消滅している。ＦＦＩおよびＧＳＳは、非常にまれな遺伝性疾患であり、世界中で数家族にしか見られない。変異型ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）と呼ばれる新たなタイプのＣＪＤが１９９６年に記載され、そして英国およびいくつかの他の欧州各国で発見されている。ｖＣＪＤの最初の症状は、古典的ＣＪＤのものとは異なり、そして該障害は、典型的にはより若い患者で発生する。ＴＳＥの症状は多様であるが、これらには一般的に、性格の変化、抑鬱などの精神医学的問題、協調性のなさ、および／または不安定歩行が含まれる。患者はまた、ミオクローヌスと呼ばれる不随意痙動、異常感覚、不眠症、精神錯乱、または記憶障害も経験しうる。疾患のより遅い段階では、患者は、重度の精神的欠陥を有し、そして運動能力また発話能力も失う。ＴＳＥは、迅速に進行する傾向があり、そして通常、数ヶ月から数年の経過に渡って、最終的に死に至る。研究によって、ｖＣＪＤは、「狂牛病」としても知られる、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）と呼ばれるＴＳＥ疾患に罹ったウシ由来の牛肉をヒトが消費することから生じた可能性があることが示唆されている。動物に見られる他のＴＳＥには、ヒツジおよびヤギが罹患するスクレーピー；エルクおよびシカが罹患する慢性消耗病；ならびに感染性ミンク脳症が含まれる。いくつかのまれな症例では、ＴＳＥは動物園の動物などの他の哺乳動物で発生している。ＴＳＥが輸血で感染しうることを示唆する証拠もあるが、感染および症状の出現の間の時間は長期に渡りうる。例えば、ヒトは症状が出現する前に、５〜２０年間感染している可能性もある。多くの国々で、ＴＳＥ突発を予防する異なる手段が実行されている。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、反芻動物に動物タンパク質を給餌することを禁じ、そして１９８０年以降、フランス、ポルトガルおよび／またはアイルランドで１０年より長く過ごした人々からの献血の禁止令を施行している。１９８０〜１９９６年に英国で６ヶ月より長く過ごした人々もまた、すでに、米国、カナダ、ニュージーランド、およびオーストラリアにおいて、献血を禁じられている。
【０００３】
［０００３］米国において、ＦＤＡはこの主題を扱うＴＳＥ諮問委員会を作った。さらに、ＦＤＡは、すでに、医薬品においてＴＳＥ因子の存在を規制する多くの文書を発行している。
【０００４】
［０００４］ＴＳＥなどのプリオン病には、プロテアーゼ耐性の病原性プリオンタンパク質であるアイソフォーム（ＰｒＰＳｃ）への正常細胞性ＰｒＰｃの変換が付随する。ＰｒＰＳｃは、ＴＳＥに関与すると考えられる因子である。ＴＳＥに罹患するリスクは、ＴＳＥ因子への被験体の有効な曝露に基づく。有効な曝露は、３つの主な変数の関数である：汚染した物質中の感染性因子の量；曝露経路；および特定のバリア効果。例えば、曝露の非経口経路は、消化管を通じた曝露よりも、感染を確立するのにより効率的である。したがって、ＴＳＥ因子除去としても知られるＰｒＰＳｃ除去のための現在のプロセスは、動物に由来し、そしてヒトで用いられる非経口薬剤に関して、より厳格である。ヒト組織に由来する薬剤に関してもまた、類似の評価基準が提唱されている。
【０００５】
［０００５］ヘモグロビンを含む血液製剤からのＴＳＥ因子除去に関する１つの課題は、ヘモグロビンが分解しやすいことである。ヘモグロビンは、精製プロセス中に損傷を受けやすい、ユニークでそして非常に不安定な分子である。この四量体ヘムタンパク質は、容易に解離して不安定な二量体になり、そして酸化され；したがって代用血液の主な目的である酸素輸送能を失う。無細胞ヘモグロビンの自発的自己酸化は、スーパーオキシドアニオンを生じる。この酸化の速度は、水素イオン（低いｐＨ）によって増大する。スーパーオキシドアニオンは、触媒として作用し、そしてさらなるヘモグロビン自己酸化を促進し、そして自発的にまたは酵素的に不均化（ｄｉｓｍｕｔａｔｅ）して、過酸化水素を形成する。過酸化水素は、第一鉄−または第二鉄−ヘモグロビンと反応して、フェリル−ヘモグロビンを生じる。フェリル−ヘモグロビンはラジカルとして作用し、そしてヒドロキシルラジカルと同じ度合いまで脂質過酸化を開始する。赤血球外部の環境は、機能する還元された第一鉄型でヘムを維持するのに必要な酵素的および非酵素的酸化防止系を含有しないため、赤血球外部のヘモグロビン酸化反応の制御は困難である。したがって、不可逆的ヘム酸化は、ヘモグロビンに基づく代用血液開発者には問題である。
【０００６】
［０００６］ウシおよびヒト起源のヘモグロビン溶液が有効な酸素運搬血漿増量剤であるためには、いくつかの必要条件を満たさなければならない。非毒性、非免疫原性、および非発熱性であり、長期の保存期限、満足できる酸素運搬能ならびにコロイド浸透圧および血漿と類似の粘性を有することに加えて；これらの製品は、ＴＳＥなどの病原体を含んではならない。ヘモグロビン溶液からの他の病原体（例えば微生物）の除去は、滅菌／限外ろ過後の示差培養などの技術を用いて有効に達成可能であるが、製造プロセスのＴＳＥクリアランス能が検証されなければならない。
【０００７】
［０００７］プリオンタンパク質（例えばＰｒＰＳｃ）は、一般的な脱活性化法に非常に抵抗性である。これらは調理およびオートクレーブでさえも、ならびに高濃度の酸または塩基への曝露の後でも存続可能であり；これらの条件は、ヘモグロビンを含む流体の精製には攻撃的すぎる。例えば、ヘモグロビン含有溶液中のＴＳＥ因子を除去するための唯一の薬学的産業法は、カラムクロマトグラフィー技術に基づく。
【０００８】
［０００８］ＦＤＡによれば、血液製剤、特にヘモグロビン溶液から、５対数のＴＳＥ因子を除去可能であるプロセスが容認可能であるようである。しかし、こうしたプロセスにおいて、異なる工程による対数除去は、クリアランス工程が直交性である（すなわち独立機構によって因子を除去する）場合にのみ、付加的であると見なされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、ヘモグロビン含有溶液から病原性プリオンタンパク質を減少させる直交性方法に関する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
［０００９］本明細書に開示するのは、ヘモグロビンおよび少なくとも１つの病原性因子を含む生体液を第一のフィルターと接触させて、そして第一のろ液を生成し；第一のろ液をナノろ過デバイスと接触させて、そして第二のろ液を生成し；第二のろ液をクロマトグラフィー材料と接触させて、そして溶出した分画を単離し；溶出した分画を疎水性溶媒と接触させて、そして疎水性および親水性相を生成し；そして親水性相を単離する、ここで生体液は、約６５ｋＤａ以下の関心対象の構成要素を含む工程を含む、方法である。やはり本明細書に開示するのは、高分子量構成要素および少なくとも１つの病原性因子を含む生体液を第一のフィルターと接触させて、そして第一のろ液を生成し；第一のろ液を親水性膜と接触させて、そして第二のろ液を生成し；第二のろ液をクロマトグラフィー材料と接触させて、そして溶出した分画を単離し；溶出した分画を疎水性溶媒と接触させて、そして疎水性および親水性相を生成し；そして親水性相を単離する、ここで高分子量構成要素は、約６５ｋＤａより大きい分子量を有する工程を含む、方法である。やはり本明細書に開示するのは、ヘモグロビンおよび少なくとも１つの病原性因子を含む生体液を、少なくとも２つのろ過工程に供し、そしてそれによって、生体液に会合した病原性因子の量を減少させる工程を含む、方法である。さらに本明細書に開示するのは、ヘモグロビン溶液を、複数のろ過工程を含む直交性分離方法論に供することによって、ヒトおよび／または動物起源のヘモグロビン溶液中の感染性海綿状脳症因子を除去する工程を含む方法である。
【００１１】
［００１０］本開示の態様を詳細に説明するため、ここで、付随する図に言及する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】［００１１］図１は、生体液中のＴＳＥ因子のレベルを減少させるための方法のフローチャートである。
【図２】［００１２］図２は、ヘモグロビン溶液中のＴＳＥ因子の減少において、ナノろ過デバイス、イオン交換膜クロマトグラフィーおよび疎水性溶媒を含む、直交性多工程法の有効性のグラフ表示である。個々の精製法に関するＬｏｇ１０減少として、そして全多工程プロセスに関する累積Ｌｏｇ１０減少として、結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［００１３］本明細書に開示するのは、生体液からの病原性因子の直交性除去、例えば以後、ＴＳＥ因子と呼ばれる感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の原因であると考えられる因子の除去のための方法である。本明細書において、生体液は、障害を治療するために生物に投与可能な、天然供給源、合成的に調製された構成要素、またはその組み合わせに由来する構成要素を有する任意の流体を指す。１つの態様において、生体液は、ヘモグロビンを含む組成物または溶液ともまた称されうる、ヘモグロビン含有溶液である。１つの態様において、ＴＳＥ因子は、プリオン、あるいは病原性プリオン（ＰｒＰＳｃ）である。プリオンは、タンパク質性感染性粒子の略であり、そして体の細胞で見られる無害なタンパク質である正常型、および疾患を引き起こす感染型の両方で存在しうる。１つの態様において、本明細書に開示する直交性方法論を用いて、ヘモグロビン含有溶液からＴＳＥ因子を除去可能であり、そして本明細書において、直交性という用語は、各工程が独立機構によって、構成要素（例えばＴＳＥ因子）の除去および／または脱活性化を生じる、２より多い工程を含む方法論を指す。例えば、本明細書記載の直交性方法論は、構成要素（例えばＴＳＥ因子）の異なる物理化学的特性を利用して、前記構成要素の除去または排除を達成する工程を含んでもよい。
【００１４】
［００１４］１つの態様において、方法論は、生体液からのＴＳＥ因子除去を達成するために、クロマトグラフィー技術、化学的処理、およびナノろ過を含む。例えば、直交性多工程法には、高アフィニティープリオン除去フィルター、ナノろ過デバイス、親水性膜、イオン交換膜クロマトグラフィーおよび疎水性溶媒が含まれてもよい。１つの態様において、ＴＳＥ因子除去のための方法論は、使用者が所望する任意の順序で実行可能であり、あるいはＴＳＥ因子除去のための方法論は、本明細書に開示する順列で実行可能である。ＴＳＥ因子除去（すなわちＰｒＰＳｃ除去）に供されて生じた生体液は、ヘモグロビン含有溶液などの生体液の投与が必要な哺乳動物障害の治療で使用するのに適している可能性もある。
【００１５】
［００１５］試料からのＴＳＥ因子除去のための方法の態様２００を図１に示す。１つの態様において、試料は、ヘモグロビン含有溶液などの生体液を含む。ヘモグロビン含有溶液は、ヒトおよび動物（例えばウシなどの反芻動物）起源のヘモグロビンを含んでもよい。１つの態様において、ヘモグロビン含有溶液は、全血由来であり、そして無細胞ヘモグロビン含有溶液である。本明細書において以後用いるような無細胞ヘモグロビン含有溶液は、およそヘモグロビンのｐＩ（等電点）であるｐＨ、あるいは別に示さない限り、約６．６〜約７．２、あるいは約７．８〜約８．２であってもよい。本明細書に開示する方法論に供する前に、遊離ヘモグロビンを炭素一酸素型に変換するために、溶液を一酸化炭素と接触させてもよい。炭素一酸素型は、一酸化炭素に結合したヘモグロビンを指す。試料が一酸化炭素で飽和されるのに十分な期間、一酸化炭素と試料を接触させてもよい。一般の当業者に理解されるであろうように、一酸化炭素の飽和量を達成するのに必要な時間は、試料溶液の構成要素および一酸化炭素供給源などの多様な要因に応じるであろうし、そして使用者が所望する結果を達成するように調整してもよい。理論によって限定されることを望むのではないが、ヘモグロビンの炭素一酸素型は、デオキシヘモグロビン（すなわち酸素に結合していないヘモグロビン）またはオキシヘモグロビン（すなわち酸素に結合したヘモグロビン）に比較してより安定でありうる。１つの態様において、試料は、炭素一酸素ヘモグロビンを含む生体液である。こうした試料を、ブロック１０、２０、４０および５０に記載するような方法論に供してもよい。１つの態様において、開示する方法論に供した後に得られる最終組成物は、約６５ｋＤａ未満の分子量を有する、関心対象の構成要素（すなわち使用者が所望する構成要素）を有する。
【００１６】
［００１６］図１を参照すると、方法２００は、試料を高流量アフィニティープリオン減少フィルターに接触させる工程、ブロック１０で始まりうる。こうした高流量アフィニティープリオン減少フィルターは、例えばポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のポリマー材料で構成される不活性膜にカップリングされた、１以上の血小板減少性および／または白血球減少性剤で構成されてもよい。フィルターは、約２５分間以下で、あるいは約２０分間以下で、約５００〜約１０００ｍｌの流体速度の、例えばそして限定なしに生体液などの、流体の迅速な流動（すなわち高流量）を可能にしうる。こうしたフィルターは、その全体が本明細書に援用される米国特許第６，９４５，４１１号に記載される。適切な高流量アフィニティープリオン減少フィルターの例は、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  ＭＩ  ４８１０３−９０１９，  米国）から商業的に入手可能な全血収集、ろ過および保存系である、ＰＡＬＬ  ＬＥＵＫＯＴＲＡＰアフィニティープリオン減少ろ過系である。
【００１７】
［００１７］理論によって限定されることを望むのではないが、高流量アフィニティープリオン減少フィルターは、ＰｒＰＳｃ含有白血球を選択的に除去するよう機能しうる。したがって、ブロック１０は、白血球と会合するＴＳＥ因子の減少を提供し、そしてフィルターは、こうした感染白血球を捕捉するよう適切にサイズ設定されてもよい。こうしたろ過は、ロイコフィルトレーション（ｌｅｕｋｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）と称されうる。
【００１８】
［００１８］無細胞ヘモグロビンである出発物質を得るための、赤血球からのヘモグロビンの抽出は、典型的には、細胞構成要素を損傷する技術を用いて実行される。例えば、低浸透圧溶解によって、赤血球懸濁物からのヘモグロビンの抽出を行ってもよい。低浸透圧溶解は、ＰｒＰＳｃを含有する白血球を破裂させ、そしてこうしてＴＳＥ因子（すなわちＰｒＰＳｃ）をヘモグロビン含有溶液内に放出することも可能である。ロイコフィルトレーション、またはろ過によって白血球を除去するプロセス（例えば高流量プリオンアフィニティーフィルターを用いる）は、白血球から遊離ヘモグロビン溶液にＰｒＰＳｃが移動する可能性を減少させる。
【００１９】
［００１９］試料を高流量アフィニティープリオン減少フィルターと接触させると、バイオアッセイおよびウェスタンブロットアッセイによって決定した際、試料（例えばヘモグロビン含有溶液）からＴＳＥ因子の約１対数以上の、あるいは約４０〜約６０％（０．４〜０．６対数減少）、あるいは約０．７〜約１．９対数、あるいは約２〜約３．７対数の除去が生じうる。高流量プリオンアフィニティー減少フィルターに供された後の試料（例えばヘモグロビン含有溶液）を、以後、ろ過試料と呼ぶ。ろ過試料は、ろ液、または高流量プリオンアフィニティー減少フィルターによって保持されなかった試料部分を含む。
【００２０】
［００２０］図１を再び参照すると、次いで、方法２００は、ブロック２０に進行してもよく、そしてろ過試料を第二のろ過デバイスと接触させてもよい。ＴＳＥ除去の手段としてのろ過の潜在的有効性は、ＴＳＥ因子（すなわちＰｒＰＳｃ）が、約１０００ｋＤａまでの分子量の異常な線維状形態の形で存在しうるという事実に基づく。第二のろ過デバイスは、多孔サイズ選択性膜を含む例えば中空繊維フィルターまたはディスクなどのナノろ過デバイスを含んでもよい。こうしたナノろ過デバイスは、酢酸セルロース、二酢酸セルロース、三酢酸セルロース、ポリスルホン等のポリマー材料で構成されてもよい。フィルターは、１分間あたり約１００ｍｌ〜約５００ｍｌの流体速度の、例えばそして限定なしに生体液などの、流体の迅速な流動を可能にしてもよい。１つの態様において、第二のろ過デバイスは、約６４．５ｋＤａ、あるいは約６５ｋＤａ、あるいは約７５ｋＤａの分子量カットオフ（明記する量以上の分子量を有する分子がフィルターによって捕捉され、そしてより小さい分子量を有する分子がフィルターによって保持されないことを意味する）を有する。１つの態様において、ヘモグロビンがフィルターによって保持されないが、ＴＳＥ因子（例えば病原性プリオン）などのより大きい分子がフィルターによって捕捉されるように、フィルターは、ヘモグロビン分子よりわずかに大きいサイズカットオフ（例えば６４．５ｋＤａ）を有する。適切なナノろ過デバイスの例には、限定なしに、Ｍｉｎｎｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ  ５５４４７，  米国から商業的に入手可能なＨＥＭＯＣＯＲ高性能血液濃縮装置ＨＰＨ  ４００、ＨＰＨ  ７００、ＨＰＨ  １０００またはＨＰＨ  １４００が含まれ；こうしたデバイスは、単一のろ過装置として、またはろ過面積を増加させるため、カップリング方式で、使用可能である。１つの態様において、これらのナノろ過デバイスは、約６５ｋＤａ以上、あるいは約７５ｋＤａ以上の分子量を持つＴＳＥ因子のさらなる減少を生じる。第二のろ過デバイスに供されたろ過試料は、ろ過試料に比較した際、ＴＳＥ因子の量が約１対数以上、あるいは約１〜約３．２対数、あるいは約３．３〜約３．７対数、あるいは約３．８〜約４．５対数減少していてもよく、そしてサイズ設定されたろ過試料と呼ばれるかまたは称される。サイズ設定されたろ過試料は、ろ過デバイスによって保持されなかった、ろ過試料由来のろ液または物質を含む。
【００２１】
［００２１］１つの態様において、ろ過デバイスに供されている、本明細書に記載するものなどの試料を、元来の生体液に対して希釈してもよい。希釈試料は、多量の液体を含みうるため、取り扱いに好都合でない可能性もある。さらに、多くの生物学的構成要素（例えばヘモグロビン、タンパク質など）は、希釈溶液中で低濃度で維持した際、安定性の減少を示しうる。１つの態様において、本明細書に開示する方法論によって生成される溶液を、特定の技術にしたがって濃縮して、より濃縮された試料を生成してもよい。これらの試料を濃縮するのに適した技術が知られる。例えば、ろ過試料を濃縮するために、ナノろ過デバイスと接触させた後に、約１０ｋＤａ、あるいは約４０ｋＤａ、あるいは約５０ｋＤａの分子カットオフを有する透析装置に試料を導入して、試料を濃縮してもよい。あるいは開示する方法論の各工程後に生体液を濃縮してもよい。試料の出発濃度および最終濃度は、利用するデバイスのタイプに応じるであろう。その結果、当該技術分野の一般的な技術の１つによって、試料の最終濃度を使用者が所望する値に調整してもよい。
【００２２】
［００２２］図１を再び参照すると、試料中のＴＳＥ因子を減少させるための方法は、次いで、ブロック４０に進行してもよく、そしてサイズ設定されたろ過試料を、クロマトグラフィー材料または膜、例えばイオン交換膜と接触させてもよい。１つの態様において、クロマトグラフィー膜は、試料中のＴＳＥ因子（例えばＰｒＰＳｃ）のレベルをさらに減少させるように機能する。１つの態様において、クロマトグラフィー膜は、強いアニオン交換体を含む。別の態様において、クロマトグラフィー材料は、アニオン交換ディスク、あるいはアニオン交換カプセル、あるいはアニオン交換モジュールを含む。本開示で使用するのに適したクロマトグラフィー材料の例には、限定なしに、ＡＳＴＲＯＤＩＳＣクロマトグラフィー装置、ＭＵＳＴＡＮＧ  Ｑ使い捨てカプセル、およびＭＵＳＴＡＮＧ  Ｑモジュールの形のＭＵＳＴＡＮＧ  Ｑ強アニオン交換膜が含まれ；多孔性は約０．８μｍであり、そして膜総容積は約０．１８ｍｌ〜約１０００ｍｌであるか、あるいは約１０００ｍｌより大きい。ＭＵＳＴＡＮＧ  Ｑ膜は、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  ＭＩ  ４８１０３−９０１９，  米国）より商業的に入手可能である。ＭＵＳＴＡＮＧ  Ｑ強アニオン交換体を含む膜の使用は、望ましい低タンパク質結合特性、広い化学薬品および温度抵抗性、ならびに高流速の利点を提供可能である。例えば、修飾ＭＵＳＴＡＮＧ  Ｑ膜は、ＴＳＥ因子レベルを減少させつつ、高い割合のタンパク質、例えばヘモグロビンの透過を可能にすることも可能である。クロマトグラフィー膜と接触させたサイズ設定ろ過試料は、ろ過試料と比較した際、ＴＳＥ因子量が、約１対数以上、あるいは約３．８〜約４．３対数、あるいは約１〜約３．７対数、あるいは約４．３〜約５対数減少している可能性もあり、そして以後、クロマトグラフィーされたサイズ設定ろ過試料と称される。クロマトグラフィーされたサイズ設定ろ過試料は、組成物の溶出された分画を含み、したがって試料はアニオン交換体に接着しない物質を含む。
【００２３】
［００２３］再び図１を参照すると、次いで、方法はブロック５０に進行してもよく、そしてクロマトグラフィーされたサイズ設定ろ過試料を疎水性溶媒と接触させてもよい。疎水性溶媒と接触させる前に、試料のｐＨを約８．０、あるいは約７．８、あるいは約８．２に増加させてもよい。理論によって限定されることを望むのではないが、クロマトグラフィーされたサイズ設定ろ過試料（すなわちヘモグロビンを含む）のｐＨを増加させると、ヘモグロビン分子が脱プロトン化されて、負に荷電された分子が生じ、そして親水性相内へのヘモグロビンの分配が促進されるであろう。１つの態様において、クロマトグラフィーされたサイズ設定ろ過試料を疎水性溶媒と接触させ、攪拌し、そして続いて少なくとも２つの相（例えば疎水性および親水性相）の形成を可能にして、試料の少なくとも１つの構成要素が疎水性相と会合するようにし、そして試料の少なくとも１つの構成要素が親水性相と会合したままになるようにする。疎水性溶媒は、クロマトグラフィーされたプロセシング試料の構成要素と適合する任意の疎水性溶媒であってもよいし；あるいは、疎水性溶媒は、クロロホルム、トルエン、またはその組み合わせを含む。理論によって限定されることを望むのではないが、ＴＳＥ因子（例えばＰｒＰＳｃ）の凝集型は、疎水性溶媒中の溶解度が増加し、そしてしたがって、優先的に疎水性溶媒内に分配されて、試料中に存在する量がさらに減少しうる。さらに、疎水性溶媒内へのＴＳＥ因子の分配は、ＴＳＥ因子の分解を生じうる。したがって、生体液を疎水性溶媒と接触させると、ＴＳＥ因子の存在および感染性が減少する。１つの態様において、ブロック５０は、疎水性溶媒と接触させた、クロマトグラフィーされたプロセシング試料を、遠心分離、あるいは高速超遠心に供する工程をさらに含んでもよい。クロマトグラフィーされたプロセシング試料の疎水性および親水性相内への分配を促進するため、遠心分離を使用してもよい。遠心分離などの技術を用いて試料を分離するための方法および装置は、一般の当業者に知られる。１つの態様において、本明細書に開示する方法の続く工程で、次いで使用可能な、クロマトグラフィーされたサイズ設定ろ過試料の親水性相は、クロマトグラフィーされたプロセシング試料に比較した際、ＴＳＥ因子の量が、約１対数以上、あるいは約０．８〜約１．２対数、あるいは約０．１〜約０．７対数、あるいは約１．３〜約３．５対数の減少を有することも可能であり、そして該試料は、プロセシングされた試料と呼ばれるかまたは称される。
【００２４】
［００２４］１つの態様において、次いで、方法は、プロセシングされた試料をさらにプロセシングして、該試料を生物への導入、例えば患者への投与などに適した条件に置くことを可能にしてもよい。あるいは、遊離ヘモグロビンに基づく代用血液製造において、試料（例えばヒトまたは動物起源のヘモグロビン）をさらにプロセシングして用いてもよい。
【００２５】
［００２５］別の態様において、生体液は血漿または血清を含む。血漿試料は、アルブミン、凝固因子、免疫グロブリンまたはその組み合わせなどの分画を含んでもよい。こうした試料をブロック１０、３０、４０および５０に記載するような方法論に供してもよい。１つの態様において、開示する方法論に血漿または血清を供した後に得られるはずの最終組成物は、約６５ｋＤａより大きく、そして約１５０ｋＤａ以下の分子量を有する関心対象の構成要素（すなわち使用者が所望する構成要素）を有する。
【００２６】
［００２６］図１を参照すると、試料中のＴＳＥ因子レベルを減少させる方法は、ブロック１０で始まり、そして免疫グロブリン（１５０ｋＤａ）などの高分子量構成要素を有する生体液で使用するのに適した高流量アフィニティープリオン減少系を含んでもよい。本明細書において、高分子量は、約６５ｋＤａより大きい分子量を指し、そして前記高分子量構成要素を含むこうした生体液は、高分子量試料（ＨＭＷＳ）と称される。ＨＭＷＳからのＴＳＥ因子の除去において使用するのに適した高流量プリオン減少フィルターの例には、限定なしに、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商業的に入手可能なＬＥＵＫＯＴＲＡＰ  ＳＣ  ＲＣろ過系が含まれる。これらのＨＭＷＳからの赤血球、血小板および白血球の単離は、ＰｒＰＳｃ含有白血球に損傷を与える可能性もあり、そして試料内にＴＳＥ因子（すなわちＰｒＰＳｃ）を導入する可能性もある、遠心力などの侵襲性技術を必要としうる。ＨＭＷＳは、本明細書に記載するタイプの高流量プリオン減少フィルターと接触させた際、溶液中に関心対象の構成要素を残すことも可能であり（例えばＩｇＧ）、一方、ＴＳＥ因子はフィルターによって捕捉される。フィルターから除去される溶液は、関心対象の構成要素を含有し、これを続いてプロセシングしてもよく、そして該試料を以後、ろ過ＨＭＷＳと称する。ろ過ＨＭＷＳは、ＨＭＳＷと比較した際、ＴＳＥ因子量が、約１対数以上、あるいは約０．７〜約１．９対数、あるいは約２〜約３．７対数減少している可能性もある。図１を参照すると、方法は、次いで、ブロック３０に進行してもよく、そしてろ過されたＨＭＷＳを親水性膜と接触させてもよい。
【００２７】
［００２７］親水性膜は、ＨＭＷＳ中のＴＳＥ因子（例えばＰｒＰＳｃ）レベルをさらに減少させるよう機能しうる。１つの態様において、膜は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、あるいは修飾ＰＶＤＦを含む。ＰＶＤＦを含む膜の使用は、望ましい低タンパク質結合特性、広い化学薬品および温度抵抗性、ならびに高流速の利点を提供可能である。例えば、修飾ＰＶＤＦ膜は、ＴＳＥ因子レベルを減少させつつ、高い割合のタンパク質、例えばヘモグロビンの透過を可能にすることも可能である。本開示で使用するのに適した親水性ＰＶＤＦ膜の例には、限定なしに、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商業的に入手可能なＵＬＴＩＰＯＲ  ＤＶ５０等級膜フィルターが含まれる。適切なＰＶＤＦ膜の例は、本明細書にその全体が援用される、米国特許第５，７３６，０５１号に開示される。親水性膜と接触させた、ろ過ＨＭＷＳ試料は、以後、プロセシングされたＨＭＷＳと称され、該試料は、ろ過ＨＭＷＳと比較した際、ＴＳＥ因子量が、約１対数以上、あるいは約３．３〜約３．７対数、あるいは約１〜約３．２対数、あるいは約３．８〜約４．５対数減少している可能性もある。次いで、親水性膜由来のろ液を、本明細書に開示する方法の続く工程に使用してもよい（例えばブロック４０および／または５０）。
【００２８】
［００２８］１つの態様において、次いで、ヘモグロビン含有溶液に関して本明細書において先に記載するように、プロセシングされたＨＭＳＷをアニオン交換体と接触させ（例えばブロック４０）、そして続いて疎水性溶媒と接触させる（例えばブロック５０）。アニオン交換体とＨＭＳＷを接触させた（例えばブロック４０）後、試料は、アニオン交換体に供されていないＨＭＳＷと比較した際、ＴＳＥ因子量が、約１対数以上、あるいは約３．８〜約４．３対数、あるいは約１〜約３．７対数、あるいは約４．３〜約５対数減少している可能性もある。ＨＭＳＷを疎水性溶媒と接触させた（例えばブロック５０）後、試料は、疎水性溶媒に供されていないＨＭＳＷと比較した際、ＴＳＥ因子量が、約１対数以上、あるいは約０．８〜約１．２対数、あるいは約０．１〜約０．７対数、あるいは約１．３〜約３．５対数減少している可能性もある。先に記載するように、該方法は、次いで、プロセシングされた試料をさらにプロセシングして、該試料を生物への導入、例えば患者への投与に適した条件に置くことを可能にしてもよい。あるいは、さらなるプロセシングを伴わずに、試料を用いてもよい。
【００２９】
［００２９］１つの態様において、方法は、開示する方法論に試料を供する前に、供する間に、または供した後に、試料中のＴＳＥ因子レベルを決定する工程をさらに含む。例えば、図１ブロック２０でナノろ過デバイスと試料を接触させる前に、ＴＳＥ因子（例えばＰｒＰＳｃ）の存在に関して、試料の少なくとも一部を分析してもよい。あるいは、図１ブロック４０でアニオン交換膜と試料を接触させた後、ＴＳＥ因子の存在に関して試料の少なくとも一部を分析してもよい。あるいは、図１ブロック５０で疎水性溶媒と試料を接触させた後、ＴＳＥ因子の存在に関して試料の少なくとも一部を分析してもよい。いくつかの態様において、方法は、開示する方法論において、各工程後にＴＳＥ因子の存在に関して試料の少なくとも一部を分析する工程をさらに含む。ＴＳＥ因子の存在に関する分析は、定性的、定量的または両方であってもよい。こうした分析は、一般の当業者に知られ、そしてこれには例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、動物感染性アッセイまたはその組み合わせが含まれうる。１つの態様において、本明細書に開示するＴＳＥ因子除去プロセスに供された試料（例えば分配されクロマトグラフィーされたプロセシング試料）は、試料中に存在するＴＳＥ因子の約５対数以上、あるいは約６対数以上、あるいは約７対数以上の除去を有しうる。１つの態様において、本明細書に開示する方法論に供された試料は、検出不能なレベルのＴＳＥ因子を有することも可能であり、ここで検出法はＥＬＩＳＡ、動物感染性アッセイまたはその組み合わせを含む。１以上のＴＳＥ因子の感染性の量を含む試料は、本明細書に開示する方法論に供された際、存在するＴＳＥ因子量の十分な減少を有し、試料の感染性の喪失を生じることも可能である。
【００３０】
［００３０］本明細書に記載する方法は手動で実行可能であり、自動化可能であり、または手動および自動化プロセスの組み合わせであってもよい。１つの態様において、本明細書記載の方法論を実行するためのデバイスを手動で制御可能であり、自動化可能であり、またはその組み合わせであってもよい。１つの態様において、本明細書に開示するプロセスを実行可能なコンピュータ化装置によって方法を実行し、ここで本明細書記載の方法は、プロセッサ、ユーザ・インターフェース、マイクロプロセッサ、記憶装置、ならびに他の関連ハードウェアおよびオペレーティング・ソフトウェアを有する汎用コンピュータ上のソフトウェアまたは他のコンピュータ化構成要素において実行される。該方法を実行するソフトウェアは、有形的表現媒体中に保存されてもよいし、そして／または例えばコンピュータ上の記憶装置中に常駐していてもよい。同様に、入力および／またはソフトウェアからの出力、例えば構成要素量、比較、および結果は、有形的表現媒体、コンピュータ記憶装置、紙のプリントアウトなどのハードコピー、または他の保存デバイス中に保存されてもよい。
【００３１】
［００３１］本明細書に開示する方法論は、異なる物理的原理に依存し、そしてＰｒＰＳｃの典型的な特性に取り組む、個々の排除工程を含む、ＰｒＰＳｃクリアランス・プラットホームである。本明細書に開示する方法論は、白血球の除去によるＰｒＰＳｃ減少；ナノフィルターでのＰｒＰＳｃろ過、アニオン膜吸収剤でのＰｒＰＳｃ吸収および疎水性溶媒でのＰｒＰＳｃ不活性化を含む。
【実施例】
【００３２】
［００３２］本態様は、一般的に記載されており、以下の実施例は、特定の態様として、そしてその実施および利点を示すために提供される。実施例は例示のために提供され、そしていかなる方式でも請求項の指定を限定するよう意図されないことが理解されるものとする。
【００３３】
実施例１
ナノろ過によるウシ・ヘモグロビン溶液の精製、ならびにＰｒＰＳｃ抗原捕捉酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）およびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによるプリオン除去法の検証
［００３３］本実施例で用いるスクレーピー因子は、ＴＳＥ感染性に関する代理マーカーとしてよく特徴付けられ、そして広く認められているハムスター２６３Ｋ系統であった。用いたスクレーピー調製物は、以下の希釈：１００、１０−１、１０−２、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６および１０−７で行ったスパイク処理実験前に、超音波処理され、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、そして０．４５および０．２２μｍの多孔性を持つフィルターのカスケードを通じてろ過された、１０％ハムスター脳ホモジネートであった。
【００３４】
［００３４］米国ＦＤＡ指針のもとで飼育された多数の健康なドナーからまたは個々の動物からウシ血液を得た。無菌条件下で、外頸静脈の穿孔によって血液を抜き取った。１頭の動物からおよそ２リットルの血液を得て、そして７５ｍｌのＡＣＤ抗凝血剤（Ｔｈｅ  Ｍｅｔｒｉｘ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｄｕｂｕｑｕｅ，  ＩＡ  ５２００２，  米国）を含有する５００ｍｌの真空滅菌発熱物質不含ビン内に収集した。異なる動物由来の血液は混合しなかった。代用血液製造施設に輸送する際、ビンをゲル氷上に維持した。次いで、ＬＥＵＫＯＴＲＡＰによる白血球からの赤血球の分離に、そして遠心分離による血小板および血漿からの赤血球の分離に、血液を供した。この工程は、非ヘムタンパク質、およびヘモグロビンが最終的に精製される必要がある他の物質の負荷量を減少させた。すべての白血球を除去するとまた、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルスおよびその他のものなどの、これらの細胞と会合するいかなるウイルスも除去された。さらに白血球の完全な除去は、これらの細胞に存在する傾向があるＴＳＥ因子も排除した。
【００３５】
［００３５］ＰＡＬＬ  ＬＥＵＫＯＴＲＡＰアフィニティープリオン減少フィルター系（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，  ＮＹ  １１５４８，  米国）を用いて、ウイルスおよびＴＳＥ因子を所持しうる白血球の除去を行った。製造者によると、ＰｒＰＳｃに関するプリオン減少性能は２．９±０．７対数である。製造者の使用説明書にしたがって、供与８時間以内に全血に対して、あるいは４℃で一晩保持した血液に対して、フィルターあたり４５０ｍｌの体積で、４〜２２℃の範囲の血液温度で、精製を行った。
【００３６】
［００３６］次いで、無菌条件下で、標準的血液貯蔵法を用いて、無菌発熱物質不含プラスチック容器（Ｆｅｎｗａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，  ＩＬ  ６００１５，  米国）中、約１７０ｘｇ、１５℃で２０分間、そして等張生理食塩水溶液（赤血球：生理食塩水、１：４ｖｏｌ／ｖｏｌ；７６０ｘｇ、４℃で１０分間周期）を用いて、一連の５回の洗浄および５回の遠心分離によって、血小板および血漿から赤血球を精製した。
【００３７】
［００３７］白血球および血小板の非存在を確認するため、コールター細胞カウンターを用いることによって、細胞カウントを行い、そして分光光度法などのルーチンの化学的方法によって、懸濁物中のタンパク質の非存在を検証した。
【００３８】
［００３８］０．４５μｍの多孔性の高流量ろ過モジュールを用いた低浸透圧透析−限外ろ過によって、赤血球からのヘモグロビンの抽出を行った。ヘモグロビン単離中のタンパク質分解を最小限にするため、わずかに低張な培地（２４０〜２６０ｍＯｓｍ  ｋｇ）および１０ｐ．ｓ．ｉ．未満の膜間圧を用いて、方法を４℃で行った。Ｐａｌｌ  ＳＳＵＰＯＲ  ＤＣＦカプセルフィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などの０．２μｍフィルターを通じて、抽出したヘモグロビンをろ過し、一酸化炭素での飽和によって、炭素−一酸素型に変化させ、そしてＦＥＮＷＡＬ輸送パック中に４℃で保存した。
【００３９】
［００３９］本実施例において、１０％ハムスター脳ホモジネートでスパイク処理したＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ６．８±０．２中、１リットルあたり６０±１０グラムの濃度のウシ・ヘモグロビンおよそ５００ｍｌを、場合による管セットを含む、商業的に入手可能な高性能血液濃縮装置、ＨＥＭＯＣＯＲ  ＨＰＨ  １４００（Ｍｉｎｎｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いたナノろ過に供した。このポリスルホンに基づく中空繊維透析膜は、２０．９ｃｍの有効繊維長、１．３１ｍ２の膜ろ過面積、８６ｍｌのプライミング体積および６５ｋＤａの平均分子量カットオフを有する。流速３００ｍｌ／分、３０ｋＰａの膜間圧でろ過を行い、そして２時間で完了した。
【００４０】
［００４０］場合による管セットを含む、商業的に入手可能なポリスルホンに基づく低流動透析装置、ＯＰＴＩＦＬＵＸ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ，  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ  ０２４２０，  米国）を用いて、透析液を収集し、そしてほぼ元来のレベルである１リットルあたり５５±８グラムのＨｂまで濃縮した。このデバイスは、１．５ｍ２の表面積、８３ｍｌのプライム体積および１０ｋＤａの平均分子量カットオフを有した。
【００４１】
［００４１］およそ１時間で方法は完了し、そして濃縮された産物を透析前試料と一緒に、製造者にしたがって、ＰｒＰＳｃを認識するＢＳＥ−スクレーピー抗原試験ＥＩＡキット（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，  Ｍａｉｎｅ  ０４０９２，  米国）によるプリオンタンパク質レベルの測定に供した。あるいは、プロテアーゼでの処理後、製造者の使用説明書にしたがって、感染ハムスター脳由来の変性スクレーピー関連原線維因子（ＳＡＦ）の調製物に対して作製された２つの抗体を使用する、ＳＰＩ−ＢＩＯ  ＥＩＡキット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  ＭＩ  ４８１０８，  米国）を用いて試料を実験した。
【００４２】
［００４２］すべての実験を３つ組で行い、そして式：ＲＴ＝ｌｏｇ  １０（試料出発体積ｘ最初のＰｒＰＳｃ濃度）／（ろ過後の試料体積ｘ最終ＰｒＰＳｃ濃度）を用いた、対数減少係数（ＲＦ）の計算によって、ＰｒＰＳｃのクリアランスを表した。結果は、ＨＥＭＯＣＯＲ  ＨＰＨ  １４００が、１ｍ２あたり４００ｍｌの中空繊維表面積に対するヘモグロビンの比で、そして表１に示すように、２時間後にヘモグロビンの９０％より多くをろ過したことを示し、ナノろ過は、ＰｒＰＳｃレベルを平均３．４７±０．１４対数減少させることが可能であった。
表１
【００４３】
【表１】
2010515068.tif 000003
［００４３］ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによってもまた評価したろ液は：（１）スクレーピー因子でスパイク処理し、そしてナノろ過プロセスに供していないウシ・ヘモグロビン溶液、および（２）ＰｒＰＳｃでスパイク処理し、そしてナノろ過に供したウシ・ヘモグロビン溶液であり、両方の試料を以下の希釈で評価した：１００、１０−１、１０−２、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６および１０−７。
【００４４】
［００４４］スクレーピー感染性に関するｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、関心対象の溶液のアリコットでのハムスター（離乳したばかりの仔、およそ６〜８週齢）の脳内（ｉ．ｃ．）接種を伴った。５匹のハムスターを、スパイク処理した非精製およびスパイク処理した精製ヘモグロビン溶液の各希釈群に割り当てた（希釈あたり５匹の動物および力価決定あたり７つの希釈）。対照ハムスターにはヘモグロビンのみを接種した。動物を２００日間毎日観察し、そしてスクレーピー感染の典型的な臨床徴候（運動失調、慢性疲労および円状徘徊などの神経学的特徴）および生存率に関して監視した。トランスジェニックマウスをウシ・プリオンに感染させると、およそ２００日間のインキュベーション時間を示すという指摘に基づいて、２００日の観察期間を選択した。したがって、２００日後、麻酔過剰摂取によってすべての生存動物を屠殺し、そしてスクレーピー感染の特徴的な細管、スクレーピー関連原線維因子に関して、電子顕微鏡によって脳を調べた。死亡した動物およびスクレーピー感染の臨床的徴候のために殺した動物の脳もまた、ＳＡＦに関して電子顕微鏡によって調べた。生存およびＳＡＦ陽性率を表２に示す。
【００４５】
［００４５］結果は、スパイク処理した非精製ウシ・ヘモグロビン調製物がおよそ１０５／ｍｌのスクレーピー感染力価を有することを示唆する。ナノろ過後、およそ１０３．５のスクレーピー感染性減少が達成された。これらの結果は、ＥＬＩＳＡ研究によって得た結果と一致する。したがって、ナノろ過は、単独では、ＰｒＰＳｃ感染性を完全に排除することは不能であり、そして１００および１０−１の希釈では、何匹かの動物は生存できなかった。さらに、結果は、約６５ｋＤａの孔サイズの中空繊維を通じてさえ、スクレーピー感染性力価が約１０５／ｍｌである場合、ナノろ過は、ヘモグロビン溶液からの完全なＰｒＰＳｃクリアランスのための独立な方法としては働きえないことを示す。
表２
【００４６】
【表２】
2010515068.tif 000004
実施例２
アニオン交換膜クロマトグラフィーによるウシ・ヘモグロビン溶液の精製、およびＰｒＰＳｃ抗原捕捉酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）によるプリオン除去法の検証
［００４６］本実施例で用いたスクレーピー因子もまた、ハムスター２６３Ｋ系統であった。用いたスクレーピー調製物は、以下の希釈：１００、１０−１、１０−２、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６および１０−７で行ったスパイク処理実験前に、超音波処理され、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、そして０．４５および０．２２μｍの多孔性を持つフィルターのカスケードを通じてろ過された、１０％ハムスター脳ホモジネートであった。
【００４７】
［００４７］本実施例では、１０％ハムスター脳ホモジネートでスパイク処理したＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ６．８±２中、１リットルあたり６０±１０グラムの濃度のウシ・ヘモグロビン溶液１００ｍｌを、ＭＵＳＴＡＮＧ  Ｑ膜を備えた商業的に入手可能なＰａｌｌ  ＡＣＲＯＤＩＳＣ装置（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  ＭＩ  ４８１０３−９０１９，  米国）を用いたアニオン交換膜クロマトグラフィーに供した。
【００４８】
［００４８］０．８μｍ多孔性を持つＭＵＳＴＡＮＧ  Ｑポリエーテルスルホン膜は、プラスミドＤＮＡ、負荷電タンパク質、およびウイルス粒子に有効に結合する強アニオン交換体である。ヘモグロビン２０ｍｌあたり１つの使い捨てＰａｌｌ  ＡＣＲＯＤＩＳＣ装置を用いて、クロマトグラフィーを行った。クロマトグラフィー前に、ＡＣＲＯＤＩＳＣ装置を４ｍｌの１Ｍ  ＮａＯＨで、その後、４ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌでプレコンディショニングし、そして２０ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ６．８±０．２で平衡化した。スパイク処理した炭素−一酸素型のヘモグロビン溶液（ｐＨ６．８±０．２）を、４ｍｌ／分の流速で、クロマトグラフィー分離に供した。ｐＨ６．８ではヘモグロビンは電荷を持たない。ヘモグロビンの電荷除去はｐＨ６．８±０．２の２０ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液で平衡化されたこの強アニオン交換膜への結合を防止するよう意図される。このクロマトグラフィー法はまた、膜へのＤＮＡおよびウイルス粒子の結合に影響を及ぼさないことも意図される。別個のＡＣＲＯＤＩＳＣ装置を用いてクロマトグラフィーを５回実行した後、収集した分画を一緒にプールし、そして最終体積を決定した。
【００４９】
［００４９］以下の希釈：１００、１０−１、１０−２、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６および１０−７のクロマトグラフィー前および後の試料を、製造者の使用説明書にしたがって、ＰｒＰＳｃを認識するＢＳＥ−スクレーピー抗原試験ＥＩＡキット（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，  Ｍａｉｎｅ  ０４０９２，  米国）によるプリオンタンパク質レベルの測定に供した。さらに、プロテアーゼでの処理後、製造者の使用説明書にしたがって、感染ハムスター脳由来の変性ＳＡＦの調製物に対して作製された２つの抗体を使用する、ＳＰＩ−ＢＩＯ  ＥＩＡキット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  ＭＩ  ４８１０８，  米国）によって試料を実験した。
【００５０】
［００５０］すべての実験を３つ組で行った。式：ＲＴ＝ｌｏｇ  １０（試料出発体積ｘ最初のＰｒＰＳｃ濃度）／（ろ過後の試料体積ｘ最終ＰｒＰＳｃ濃度）を用いた、対数減少係数（ＲＦ）の計算によって、ＰｒＰＳｃのクリアランスを表した。結果は、交換体膜表面積に対するヘモグロビンの比が１ｃｍ２あたりおよそ５ｍｌである場合、ＭＵＳＴＡＮＧ  Ｑ膜アニオン交換体と接触させた試料が、ヘモグロビンレベルの減少を示さないことを示した。しかし、表３に示すように、ＭＵＳＴＡＮＧ  Ｑを用いたアニオン交換膜クロマトグラフィーは、ＰｒＰＳｃレベルを４．０１±０．２４対数減少させることが可能であった。
表３
【００５１】
【表３】
2010515068.tif 000005
実施例３
疎水性溶媒によるウシ・ヘモグロビン溶液の精製、およびＰｒＰＳｃ抗原捕捉酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）によるプリオン除去法の検証
［００５１］本実施例で用いたスクレーピー因子もまた、ハムスター２６３Ｋ系統であった。用いたスクレーピー調製物は、以下の希釈：１００、１０−１、１０−２、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６および１０−７で行ったスパイク処理実験前に、超音波処理され、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、そして０．４５および０．２２μｍの多孔性を持つフィルターのカスケードを通じてろ過された、１０％ハムスター脳ホモジネートであった。
【００５２】
［００５２］本実施例では、実施例１におけるように調製した、１０％ハムスター脳ホモジネートでスパイク処理したＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．０±２中、１リットルあたり６０±１０グラムの濃度の炭素−一酸素型のウシ・ヘモグロビン溶液２００ｍｌを、クロロホルム（ＨＰＬＣ等級、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での疎水性溶媒処理に供した。
【００５３】
［００５３］Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分離装置（ＳＳ−３４ローターを備えたモデルＲＣ５Ｃ）を用いて、以下の方式で、クロロホルム後、遠心分離工程を用いる、一連の３回の処理を行った：（１）１５対１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比でクロロホルムと混合したヘモグロビンを１５分間ボルテックスし、そして７６０ｘｇおよび４℃で３０分間遠心分離し；（２）上清を一連の第二の試験管に移し、１６対１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比でクロロホルムと混合し、１０分間ボルテックスし、そして１，６００ｘｇおよび４℃で１５分間、そして３，８００ｘｇで１５分間遠心分離し；（３）上清を一連の第三の試験管に移し、そしてクロロホルムを含まずに、４８，４００ｘｇおよび４℃で９０分間遠心分離した。第三の遠心分離後、窒素ガスをフラッシュすることによって、残った微量のクロロホルムの除去にヘモグロビン溶液を供して、その後、一酸化炭素をフラッシュして炭素−一酸素型への完全な変換を確実にした。
【００５４】
［００５４］以下の希釈：１００、１０−１、１０−２、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６および１０−７のクロマトグラフィー処理前および後の試料を、製造者の使用説明書にしたがって、ＰｒＰＳｃを認識するＢＳＥ−スクレーピー抗原試験ＥＩＡキット（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，  Ｍａｉｎｅ  ０４０９２，  米国）によるプリオンタンパク質レベルの測定に供した。さらに、プロテアーゼでの処理後、製造者の使用説明書にしたがって、感染ハムスター脳由来の変性ＳＡＦの調製物に対して作製された２つの抗体を使用する、ＳＰＩ−ＢＩＯ  ＥＩＡキット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  ＭＩ  ４８１０８，  米国）によって試料を実験した。
【００５５】
［００５５］すべての実験を３つ組で行った。式：ＲＴ＝ｌｏｇ  １０（試料出発体積ｘ最初のＰｒＰＳｃ濃度）／（ろ過後の試料体積ｘ最終ＰｒＰＳｃ濃度）を用いた、対数減少係数（ＲＦ）の計算によって、ＰｒＰＳｃのクリアランスを表した。表４に示すように、クロロホルムでの処理は、ＰｒＰＳｃレベルを１．１５±０．１４対数減少させた。このデータは、クロロホルム処理が、ＰｒＰＳｃからのヘモグロビン溶液精製に関して、不活性化工程と見なされうることを示唆する。
表４
【００５６】
【表４】
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実施例４
ナノろ過、アニオン交換膜クロマトグラフィーおよび疎水性溶媒によるウシ・ヘモグロビン溶液の精製、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによるプリオン除去法の検証
［００５６］本実施例で用いたスクレーピー因子もまた、ハムスター２６３Ｋ系統であった。用いたスクレーピー調製物は、以下の希釈：１００、１０−１、１０−２、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６および１０−７で行ったスパイク処理実験前に、超音波処理され、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、そして０．４５および０．２２μｍの多孔性を持つフィルターのカスケードを通じてろ過された、１０％ハムスター脳ホモジネートであった。
【００５７】
［００５７］ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによって評価した溶液は：（１）スクレーピー因子でスパイク処理し、そしてプリオン精製プロセスに供していない、以下の希釈：１００、１０−１、１０−２、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６および１０−７のウシ・ヘモグロビン溶液、ならびに（２）スクレーピー因子でスパイク処理し、そしてナノろ過、アニオン交換膜クロマトグラフィーおよび疎水性処理に基づくカスケードプリオン精製プロセスに供した、以下の希釈：１００、１０−１、１０−２、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６および１０−７のウシ・ヘモグロビン溶液であった。本実施例の出発物質は、炭素−一酸素型のウシ・ヘモグロビン溶液であり、そして実施例１におけるように調製され、そして先に記載するようにスパイク処理された。
【００５８】
［００５８］ＴＳＥ精製プロセスは、それぞれ実施例１、２および３に記載されるような：（１）ナノろ過、（２）アニオン交換膜クロマトグラフィーおよび（３）クロロホルムでの疎水性溶媒処理を組み合わせた。ヘモグロビンのナノろ過およびアニオン膜交換デバイスへの低い吸収を維持するために、ヘモグロビンの電荷、そしてしたがってその静電相互作用を排除する緩衝系にヘモグロビンを溶解した。こうした緩衝系は実施例１および２に記載される。さらに、ヘムを酸化に対して保護するため、ヘム酸素を完全に一酸化炭素で置換して、酸化攻撃に対して非常に抵抗性である炭素−一酸素ヘモグロビンを形成した。ヘモグロビン濃度を概算することによって、試料体積中のいかなる変化も希釈に関して補正した。精製前の試料中の平均ヘモグロビン濃度は１リットルあたりおよそ６０±１０グラムであり、そして精製後は１リットルあたりおよそ５５±８グラムであった。
【００５９】
［００５９］スクレーピー感染性に関するｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、関心対象の溶液のアリコットでのハムスター（離乳したばかりの仔、およそ６〜８週齢）の脳内（ｉ．ｃ．）接種を伴った。５匹のハムスターを、スパイク処理した非精製およびスパイク処理した精製ヘモグロビン溶液の各希釈群に割り当てた（希釈あたり５匹の動物および力価決定あたり７つの希釈）。対照ハムスターにはヘモグロビンのみを接種した。動物を２００日間毎日観察し、そしてスクレーピー感染の典型的な臨床徴候（運動失調、慢性疲労および円状徘徊などの神経学的特徴）および生存率に関して監視した。２００日後、麻酔過剰摂取によってすべての生存動物を屠殺し、そしてスクレーピー感染の特徴的な細管（スクレーピー関連原線維因子−ＳＡＦ）に関して、電子顕微鏡によって脳を調べた。死亡した動物およびスクレーピー感染の臨床的徴候のために殺した動物の脳もまた、ＳＡＦに関して電子顕微鏡によって調べた。生存およびＳＡＦ陽性率を表５に示す。
【００６０】
［００６０］結果は、スパイク処理した非精製ウシ・ヘモグロビン調製物がおよそ１０５／ｍｌのスクレーピー感染力価を有することを示唆する。スクレーピーでスパイク処理したウシ・ヘモグロビン試料のこの多工程精製法後、スクレーピー感染性はまったく検出されなかった。動物にヘモグロビンのみを接種すると、いかなる臨床的および形態学的変化の観察も生じなかった。
【００６１】
［００６１］これらのデータは、ナノろ過、アニオン交換膜クロマトグラフィーおよび疎水性溶媒処理の連続段階的使用によって、ＴＳＥ因子からのウシ・ヘモグロビン溶液の精製が、スクレーピー感染性を有効に排除可能であることを示唆する。
【００６２】
［００６２］ＰｒＰＳｃからのウシ・ヘモグロビンのこの多工程精製法は、ＴＳＥ因子の除去（ナノろ過およびアニオン交換膜クロマトグラフィー）ならびに不活性化（疎水性溶媒）の要素を含有するため、直交性と見なされうる。
表５
【００６３】
【表５】
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［００６３］態様が示され、そして記載されているが、本発明の精神および解説から逸脱することなく、当業者がその修飾を行ってもよい。本明細書記載の態様は、例のみであり、そして限定するよう意図されない。多くの変動および修飾が可能であり、そして開示の範囲内である。数値範囲または制限が明確に述べられている場合、こうした表現範囲または制限は、明確に述べられている範囲または制限内に属する同様の大きさの反復範囲または制限を含むと理解されなければならない（例えば約１〜約１０には、２、３、４などが含まれ；０．１０より大きいには、０．１１、０．１２、０．１３などが含まれる）。用語「場合による」の使用は、請求項の任意の要素に関して、対象の要素が必要であるかまたは必要でないことを意味するよう意図される。どちらの選択肢も請求項の範囲内であると意図される。含む、含まれる、有するなどの、より広い用語の使用は、からなる、から本質的になる、から実質的に構成されるなどの、より狭い用語の使用に対する補助を提供すると理解されるべきである。
【００６４】
［００６４］したがって、保護範囲は、上記説明によっては限定されず、続く請求項によってのみ限定され、範囲には、請求項の主題のすべての同等物が含まれる。あらゆる請求項が、本発明の態様として明細書に援用される。したがって、請求項はさらなる説明であり、そして本発明の態様への付加物である。本明細書の参考文献、特に本出願の優先日以後の公開日を有しうるいかなる参考文献の考察も、該文献が本発明に対する先行技術であることの容認ではない。本明細書に引用するすべての特許、特許出願、および刊行物の開示は、本明細書に示すものを補助する例示的、手技的または他の詳細を提供する度合いまで、本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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