(57)【要約】  図９に示すアミノ酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の同一性を有し、栽培トマト植物体または選良種に遺伝子操作的に遺伝子移入されることを特徴とするタンパク質をコードするＡＦＴ遺伝子を提供する手段および方法を提供する。このＡＦＴ遺伝子は、栽培トマト植物体にＡＦＴ遺伝子を移入していない従来の栽培植物体と比較して高い濃度のフラボノイド類をもたらし、ＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型の遺伝子移入由来トマト植物体を提供する。トランスジェニック植物は、植物体、植物部位、または種子内にフラボノイド経路の代謝物、特にアントシアニンまたはフラボノール類を発現し、保有する特定のＤＮＡ配列が１以上の複数の形質転換、および／または植物の形質転換および／または発現に有益な発現ベクターに組み込まれることが開示される。同様にその生成方法が開示される。
2010517526.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質をコードするＡＦＴ遺伝子であって、図９に示すアミノ酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の同一性を有し、栽培植物体または選良種に遺伝子操作的に遺伝子移入され、前記栽培植物体に前記ＡＦＴ遺伝子を遺伝子移入していない従来の栽培植物体と比較して高い濃度のフラボノイド類をもたらすことを特徴とするタンパク質をコードするＡＦＴ遺伝子。
【請求項２】
栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体または選良種に遺伝子操作的に遺伝子移入され、前記栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体に前記ＡＦＴ遺伝子を遺伝子移入していない従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種植物体と比較して高い濃度のフラボノイド類をもたらすことを特徴とする請求項１に記載のＡＦＴ遺伝子。
【請求項３】
Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型に由来し、栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体または選良種に遺伝子操作的に遺伝子移入され、前記栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体に前記ＡＦＴ遺伝子を遺伝子移入していない従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種植物体と比較して高い濃度のフラボノイド類をもたらすことを特徴とする請求項１または請求項２に記載のＡＦＴ遺伝子。
【請求項４】
前記フラボノイド類の少なくとも一部がアントシアニン類および／またはフラボノール類であることを特徴とする請求項１に記載のＡＦＴ遺伝子。
【請求項５】
前記ＡＦＴ遺伝子がＳ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍに由来することを特徴とする請求項１に記載のＡＦＴ遺伝子。
【請求項６】
前記ＡＦＴ遺伝子が、Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ、Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｏｉｄｅｓ、Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉ  ｖ．ｐｕｂｅｒｅｌｕｍよりなる群から選択されたことを特徴とする請求項１に記載のＡＦＴ遺伝子。
【請求項７】
ＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型の遺伝子移入由来トマト植物体であって、前記ＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型を遺伝子移入していない従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体と比較して高い濃度のフラボノイド類によって特徴づけられる遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項８】
前記ＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型を遺伝子移入していない従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体と比較して高い濃度のアントシアニン類および／またはフラボノ−ル類によって特徴づけられる請求項７に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項９】
前記ＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型がＳ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍから遺伝子移入されたことを特徴とする請求項７に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項１０】
前記ＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型が、Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ、Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｉｏｄｅｓ、Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉ  ｖ．ｐｕｂｅｒｅｌｕｍよりなる群から遺伝子移入されたことを特徴とする請求項７に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項１１】
（ｉ）ｈｐ−１／ｈｐ−１系統トマトであるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマトと、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含むトマト間で交配し、
（ｉｉ）前記交配から得られたＦ１植物体を自家交配させ、
（ｉｉｉ）ｈｐ−１変異とＡＦＴ対立遺伝子の双方が分離しているＦ２群を作成し、
（ｉｖ）ｈｐ−１変異とＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子座が同型接合であるＦ２植物体を選択し、
（ｖ）従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体および／または初期親系統と比較して、相加的な手段以上の高濃度のフラボノイド類を有することで特徴づけられる純親系統を得るために、前記Ｆ２植物体を自家交配させてＦ３群および更なる個体群（Ｆ４、Ｆ５等）を作成し、
（ｖｉ）前記純親系統を他の同系統または異種の親系統と交配して用いて、商用のＦ１ハイブリッドを作り出す、
方法によって遺伝子移入的に得たことを特徴とする請求項７に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項１２】
前記フラボノイド類が、アントシアニン類およびフラボノール類であるデルフィニジン、ペツニジン、マルビジン、ケルセチン、ケンフェロール、ナリンゲニンを含むことを特徴とする請求項１１に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項１３】
少なくとも１つの親系統が高色素系統であるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍであって、高色素対立遺伝子が、ｈｐ−１、ｈｐ−１ｗ、ｈｐ−２、ｈｐ−２ｊ、ｈｐ−２ｄｇとして定義される１以上の同型対立遺伝子によって特徴づけられる群から選択され、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含む植物体と異種交配される方法によって遺伝子移入的に得たことを特徴とする請求項１１に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項１４】
少なくとも１つの親系統が高色素系統であるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍであって、高色素対立遺伝子が、紫外線損傷ＤＮＡ結合タンパク質１（ＤＤＢ１）または非黄化変異体１（ＤＥＴ１）遺伝子の１以上の同型接合対立遺伝子（ｈｐ−１、ｈｐ−１ｗ、ｈｐ−２、ｈｐ−２ｊ、ｈｐ−２ｄｇ）によって特徴づけられる群から選択され、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含む植物体と異種交配される方法によって遺伝子移入的に得たことを特徴とする請求項１１に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項１５】
少なくとも１つの親系統が高色素系統であるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍであって、高色素対立遺伝子が、紫外線損傷ＤＮＡ結合タンパク質１（ＤＤＢ１）または非黄化変異体１（ＤＥＴ１）遺伝子に欠損のあるｈｐ−１、ｈｐ−１ｗ、ｈｐ−２、ｈｐ−２ｊ、ｈｐ−２ｄｇ変異植物体と等表現型の光形態形成遺伝子の１以上の同型接合対立遺伝子によって特徴づけられる群から選択され、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含む植物体と異種交配される方法によって遺伝子移入的に得たことを特徴とする請求項１１に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項１６】
ＤＮＡマーカーを用いてＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子座において同型接合であるＦ２植物体を選択する付加的手段からなることを特徴とする請求項１１に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項１７】
ＡＦＴ遺伝子型がＳ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍに由来することを特徴とする請求項１１に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項１８】
ＡＦＴ遺伝子型がＳ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ、Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｉｏｄｅｓ、Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉ  ｖ．ｐｕｂｅｒｅｌｕｍよりなる群から選択されたことを特徴とする請求項１１に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項１９】
前記ＤＮＡマーカーがＳ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍに由来することを特徴とする請求項１６に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項２０】
前記ＤＮＡマーカーが、Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ、Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｉｏｄｅｓ、Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉ  ｖ．ｐｕｂｅｒｅｌｕｍよりなる群に由来することを特徴とする請求項１６に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項２１】
フラボノイドアグリコン、フラボノイド−Ｏ−グリコシド、フラボノイド−Ｃ−グリコシド、ヒドロキシル含有フラボノイドおよび／またはメトキシ置換、Ｃ−メチルフラボノイド、メチレンジオキシ・フラボノイド・カルコン、オーロン、ジヒドロカルコン、フラバノン、ジヒドロフラバノール、アンソクロ、プロアントシアニジン、濃縮プロアントシアニジン、ロイコアントシアニジン、フラバノール−３，４−ｏｌｓ、フラバノール−３−ｏｌｓ、グリコシルフラボノイド、ビフラボノイド、トリフラボノイド、イソフラボノイド、イソフラボン、イソフラバノン、ロテノノイド、プテロカルパン、イソフラバン、キノン誘導体、３−アリール−４−ヒドロキシクマリン、３−アリールクマリン、イソフラボノイ−３−エン、クメスタン、α−メチルデオキシベンゾイン、２−アリールベンゾフラン、イソフラバノール、クマロノクロモンよりなる群のうちのいずれかの成分から前記フラボノイドを選択したことを特徴とする請求項１１に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項２２】
デルフィジン、ペツニジン、マルビジンよりなる群から前記アントシアニンを選択したことを特徴とする請求項８に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項２３】
ケルセチン、ケンフェロールよりなる群から前記フラボノイドを選択したことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項２４】
４，２，４，６−テトラヒドロキシカルコン、ナリンゲニン、ケンフェロール、ジヒドロキシケンフェロール、ミリセチン、ケルセチン、ジヒドロケルセチン、ジヒドロミリセチン、ロイコペラルゴニジン、ロイコシアニジン、ロイコデルフィニジン、ペラルゴニジン−３−グルコシド、シアニジン−３−グルコシド、デルフィニジン−３−グルコシドよりなる群から前記フラボノイドを選択したことを特徴とする請求項１１に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項２５】
（ｉ）２−フェニルクロモン（２−フェニル−１，４−ベンゾピロン）構造由来の二次植物代謝物、（ｉｉ）前記代謝物が３−フェニルクロモン（３−フェニル−１，４−ベンゾピロン）構造由来であるイソフラボノイド類、（ｉｉｉ）前記代謝物が４−フェニルクマリン（４−フェニル−１，２−ベンゾピロン）構造由来であるネオフラボノイド類よりなる群から前記フラボノイドを選択したことを特徴とする請求項１１に記載の遺伝子移入由来トマト植物体。
【請求項２６】
図９に示すアミノ酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の相同性を有し、従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体と比較してトマト植物体中に高いフラボノイド濃度をもたらすことを特徴とするタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
【請求項２７】
図２下列に示す残基１から残基１００８の核酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の相同性を有し、従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体と比較してトマト植物体中に高いフラボノイド濃度をもたらすことを特徴とする請求項２６に記載のＤＮＡ配列。
【請求項２８】
前記ＤＮＡ配列は、植物体、植物部位または種子内において、フラボノイド経路の代謝物であるアントシアニンまたはフラボノール類の蓄積又は発現をもたらすことを特徴とする請求項２６または請求項２７に記載のＤＮＡ配列。
【請求項２９】
前記ＤＮＡ配列は、Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍのトマト植物体、トマト植物部位または種子内において、フラボノイド経路の代謝物であるアントシアニンまたはフラボノール類の蓄積又は発現をもたらすことを特徴とする請求項２６または請求項２７に記載のＤＮＡ配列。
【請求項３０】
前記ＤＮＡ配列は、図２下列に示す残基１から残基１００８の核酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の相同性を有し、栽培トマト系統におけるＡＦＴ遺伝子型の遺伝子移入のための遺伝資源、種子、苗木、発芽、植物体、植物部位のスクリーニングに有用であることを特徴とする請求項２６乃至請求項２９のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
【請求項３１】
トランスジェニック植物であって、植物体、植物部位または種子内にフラボノイド経路の代謝物であるアントシアニンまたはフラボノイド類を発現し、前記植物体は、図２下列に示す残基１から残基１００８の核酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡからなり、前記ＤＮＡは、１以上の複数の形質転換、および／または植物の形質転換および／または発現に有益な発現ベクターに組み込まれていることを特徴とする遺伝子移入植物体。
【請求項３２】
タンパク質をコードするＡＦＴ遺伝子を得る方法であって、図９に示すアミノ酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の同一性を有し、栽培植物体または選良種に遺伝子操作的に遺伝子移入され、前記栽培植物体に前記ＡＦＴ遺伝子を遺伝子移入していない従来の栽培植物体と比較して高い濃度のフラボノイド類をもたらすことを特徴とするタンパク質をコードするＡＦＴ遺伝子を得る方法。
【請求項３３】
従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体と比較して高濃度のアントシアニン類および／またはフラボノイド類を含むことを特徴とするＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型の遺伝子移入由来トマト植物体を作り出す方法であって、
（ｉ）ｈｐ−１／ｈｐ−１系統トマトであるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマトと、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含むトマト間で交配し、
（ｉｉ）前記交配から得られたＦ１植物体を自家交配させ、
（ｉｉｉ）ｈｐ−１変異とＡＦＴ対立遺伝子の双方が分離しているＦ２群を作成し、
（ｉｖ）ｈｐ−１変異とＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子座が同型接合であるＦ２植物体を選択し、
（ｖ）従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体および／または初期親系統と比較して、相加的な手段以上の高濃度のフラボノイド類を有することで特徴づけられる純親系統を得るために、前記Ｆ２植物体を自家交配させてＦ３群を生成し、
（ｖｉ）前記純親系統を他の同系統または異種の親系統と交配して用いて、商用のＦ１ハイブリッドを作り出す、
ことからなる方法。
【請求項３４】
従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体と比較して高濃度のアントシアニン類および／またはフラボノイド類を含むことを特徴とするＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型の遺伝子移入由来トマト植物体を作り出す方法であって、
（ｉ）ｈｐ−１／ｈｐ−１系統トマトであるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマトと、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含むトマト間で交配し、
（ｉｉ）前記交配から得られたＦ１植物体を自家交配させ、
（ｉｉｉ）ｈｐ−１変異とＡＦＴ対立遺伝子の双方が分離しているＦ２群を作成し、
（ｉｖ）ｈｐ−１変異とＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子座が同型接合であるＦ２植物体を選択し、
（ｖ）従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体および／または初期親系統と比較して、相加的な手段以上の高濃度のアントシアニン類とフラボノール類であるデルフィニジン、ペツニジン、マルビジン、ケルセチン、ケンフェロールを有することで特徴づけられた純親系統を得るために、前記Ｆ２植物体を自家交配させてＦ３群および更なる個体群（Ｆ４、Ｆ５等）を作成し、
（ｖｉ）前記純親系統を他の同系統または異種の親系統と交配して用いて、商用のＦ１ハイブリッドを作り出す、
ことからなる方法。
【請求項３５】
少なくとも１つの親系統が高色素系統であるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍであって、高色素対立遺伝子が、ｈｐ−１、ｈｐ−１ｗ、ｈｐ−２、ｈｐ−２ｊ、ｈｐ−２ｄｇとして定義される１以上の同型対立遺伝子によって特徴づけられる群から選択され、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含む植物体と異種交配することによって遺伝子移入植物体を作り出すことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１つの親系統が高色素系統であるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍであって、高色素対立遺伝子が、紫外線損傷ＤＮＡ結合タンパク質１（ＤＤＢ１）または非黄化変異体１（ＤＥＴ１）遺伝子における１以上の同型対立遺伝子（ｈｐ−１、ｈｐ−１ｗ、ｈｐ−２、ｈｐ−２ｊ、ｈｐ−２ｄｇ）によって特徴づけられる群から選択され、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含む植物体と異種交配することによって遺伝子移入植物体を作り出すことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの親系統が高色素系統であるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍであって、高色素対立遺伝子が、紫外線損傷ＤＮＡ結合タンパク質１（ＤＤＢ１）または非黄化変異体１（ＤＥＴ１）遺伝子に欠損のあるｈｐ−１、ｈｐ−１ｗ、ｈｐ−２、ｈｐ−２ｊ、ｈｐ−２ｄｇ変異植物体と等表現型の光形態形成遺伝子の１以上の同型接合対立遺伝子によって特徴づけられる群から選択され、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含む植物体と異種交配することによって遺伝子移入植物体を作り出すことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
ＨＰ−１とＡＦＴ遺伝子座が同型接合であるＦ２植物体を付加的にＤＮＡマーカーを用いて選択することを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
デルフィジン、ペツニジン、マルビジンよりなる群から前記アントシアニンを選択することを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
ケルセチン、ケンフェロール、ナリンゲニンよりなる群から前記フラボノイドを選択することを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
４，２，４，６−テトラヒドロキシカルコン、ナリンゲニン、ケンフェロール、ジヒドロキシケンフェロール、ミリセチン、ケルセチン、ジヒドロケルセチン、ジヒドロミリセチン、ロイコペラルゴニジン、ロイコシアニジン、ロイコデルフィニジン、ペラルゴニジン−３−グルコシド、シアニジン−３−グルコシド、デルフィニジン−３−グルコシドよりなる群から前記フラボノイドを選択したことを特徴とする請求項３４に記載の従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体と比較して高濃度のフラボノイド類を含むトマト植物体を作り出す方法。
【請求項４２】
（ｉ）２−フェニルクロモン（２−フェニル−１，４−ベンゾピロン）構造由来の二次植物代謝物、（ｉｉ）前記代謝物が３−フェニルクロモン（３−フェニル−１，４−ベンゾピロン）構造由来であるイソフラボノイド類、（ｉｉｉ）前記代謝物が４−フェニルクマリン（４−フェニル−１，２−ベンゾピロン）構造由来であるネオフラボノイド類よりなる群から前記フラボノイドを選択したことを特徴とする請求項３４に記載のトマト植物体を作り出す方法。
【請求項４３】
フラボノイドアグリコン、フラボノイド−Ｏ−グリコシド、フラボノイド−Ｃ−グリコシド、ヒドロキシル含有フラボノイドおよび／またはメトキシ置換、Ｃ−メチルフラボノイド、メチレンジオキシ・フラボノイド・カルコン、オーロン、ジヒドロカルコン、フラバノン、ジヒドロフラバノール、アンソクロ、プロアントシアニジン、濃縮プロアントシアニジン、ロイコアントシアニジン、フラバノール−３，４−ｏｌｓ、フラバノール−３−ｏｌｓ、グリコシルフラボノイド、ビフラボノイド、トリフラボノイド、イソフラボノイド、イソフラボン、イソフラバノン、ロテノノイド、プテロカルパン、イソフラバン、キノン誘導体、３−アリール−４−ヒドロキシクマリン、３−アリールクマリン、イソフラボノイ−３−エン、クメスタン、α−メチルデオキシベンゾイン、２−アリールベンゾフラン、イソフラバノール、クマロノクロモンよりなる群のいずれかの成分から前記フラボノイドを選択したことを特徴とする請求項３４に記載のトマト植物体を作り出す方法。
【請求項４４】
タンパク質をコードするＤＮＡを作り出す方法であって、図９に示すアミノ酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の同一性を有し、コードされたアミノ酸配列を識別して選択的に検証する処理を含み、前記配列がＡＦＴ表現型および増強したフラボノイド濃度に関連するＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ中に天然に存在するタンパク質の配列であることを特徴とする方法。
【請求項４５】
核酸を有用に得る方法であって、図２下列に示す残基１から残基１００８の核酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の相同性を有し、ＡＦＴ表現型に少なくとも部分的に関連するＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ中に天然に存在するタンパク質をコードする前記核酸配列を識別して選択的に検証することからなる方法。
【請求項４６】
従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体と比較して高い濃度のフラボノイド類を含むトマト植物体を作り出し、栽培トマト系統におけるＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型の遺伝子移入のために遺伝資源、種子、苗木、植物、発芽、植物体をスクリーニングして容易にした方法であって、
（ｉ）図２下列に示す残基１から残基１００８の核酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸を作り出し、
（ｉｉ）表１に定義されたＰＣＲプライマーを調製し、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）のＤＮＡを増幅し、
（ｉｖ）それを用いて標的組織を調べることからなる請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
植物体、植物部位、または種子内にフラボノイド経路の代謝物であるアントシアニンまたはフラボノイド類を蓄積または発現させるための遺伝子組み換え方法であって、
（ｉ）図２下列に示す残基１から残基１００８の核酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡを作り出し、
（ｉｉ）前記ＤＮＡを１以上の複数の形質転換、および／または植物の形質転換および／または発現に有益な発現ベクターに組み込むことからなる遺伝子組み換え方法。
【請求項４８】
トマト植物体、トマト部位または種子に有用なことを特徴とする請求項４７に記載の遺伝子組み換え方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にデルフィニジン、ペツニジン、マルビジンといった高濃度のアントシアニン類と特にケルセチン、ケンフェロールといった高フラボノール表現型を有する、トマト果実などの果物を生産する手段および方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
果実や野菜をカロチノイド、フラボノイド化合物、ビタミン類などの機能性代謝物で成分強化することが過去数年間で重要な育成の目標となっている。この傾向の好例としては、果実に高濃度のカロチノイド類、フラボノイド類、ビタミンＣおよびＥを含めるために商用のトマト品種への高色素（ｈｐ）変異体の遺伝子移入が行われることである。
【０００３】
Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅに由来する「アントシアニン果実（ＡＦＴ）」遺伝子型は、表皮および外果皮組織がフラボノイド化合物の分類に属する高濃度のアントシアニン類や代謝物によって紫色を呈する特徴を持っている。アントシアニン濃度の上昇は単一遺伝子によって決定されることが報告されている（ジョーンら著「ジャーナル・ヘレディティー」第９４号（２００３年）４４９〜４４６頁）。フラボノイド類は、多くの植物体で自然に存在するポリフェノール化合物である。フラボノイド類は果物、野菜、植物原料の飲料（茶、赤ワイン）に含まれ、多くの栄養補助食品や植物性生薬に用いられる。その中心的成分であるアグリコンに基づいて、カルコン類、フラバノン類、ジヒドロフラボノール類、フラボノール類、アントシアニン類などの異なった区分に分類できる。これまでに４０００以上の異なったフラボノイド類が判明しており、こうした膨大な多様性は、グリコシル化、メチル化、アシル化などのアグリコンの単一変異もしくは組み換え変異に起因する。一分類としてのフラボノイドは、植物体の育成、更には、病原菌抵抗性、色素産生、紫外線保護、花粉成長、種皮発達などの植物開発など多くの側面を担っている（ハルボーン著「フラボノイド」）。「１９８６年以来の研究の進歩（第一版）」（ボビーら著「植物細胞」第１４号（２００２年）、２５０９〜２５２６頁）。
【０００４】
アントシアニン類は、紫、赤、青色の植物色素を持つ最も一般的な種類である。植物体において３００を超える異なったアントシアニン化合物が確認されている。これらは、フラボノイド類特有のＣ６−Ｃ３−Ｃ６炭素構造を持つ平面分子を持っている。
【０００５】
特に、フラボノール類（ケンペロールやケルセチンなど）に属するフラボノイド類は、その高抗酸化能力によって人の食事における潜在的な健康保護機能（ライス・エバンスら著「植物化学の動向」第２号（１９９７年）１５２〜１５９頁、および、プロトジェンテら著「フリーラジカル研究」第３６号（２００２年）２１７〜２３３頁）、更に、ヒトの保護酵素システムを誘発するインビトロでの抗酸化能力（クック＆サマン著「栄養生化学ジャーナル」第７号（１９９６年）６６〜７６頁）を持っているという証拠が増えてきている。こうした知見から、フラボノイド類によって冠状動脈性心臓病や癌などの大病から防御できることが予測できる（ヘルトーク＆ホルマン著「欧州臨床栄養生化学ジャーナル」第５０号（１９９６）６３〜７１頁）。いくつかの疫学研究によれば、心臓保護とタマネギ、りんご、茶などの食品原料の摂取との間に深い関係があることが分かっている（ヘルトークら著「ランセット３４２号」（１９９３）１００７〜１０１１頁）。これに関して、アントシアニン類は、ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）の分析で測定できる強い抗酸化活性酸素によって特に注目されていた。ぶどう（ワンら著「農産食品化学ジャーナル」第４４号（１９９６）７０１〜７０５頁）、ブルーベリー、ブラックベリー、ラズベリー、サクランボ（ワンら著「農産食品化学ジャーナル」第４５号（１９９７）３０４〜３０９頁）が、他の果実や野菜に比べてアントシアニン類を多量に含み、抗酸化能を持つことが知られている。最も重要な食品のひとつであるトマトが世界中で広く収穫されており、ぶどう、ベリー類、サクランボなどより手軽に広く食せられているので、アントシアニン摂取のための食品として有望であると考えられる。ところが、市販されているトマトには高濃度のフラボノイド類（アントシアニン類を含む）が含まれておらず、高濃度のフラボノイド類を含有する市販トマト植物の実現は重要な目標である。
【０００６】
トマト果実のフラボノイド類含有量を増やし、多様化させる施策として以下の事柄に重点的に取り組んでいる。
１．フラボノイド化合物に係わる構造遺伝子の代謝工学
２．代謝経路に影響する転写因子の遺伝子組み換え
３．単一点突然変異（自然発生突然変異または誘発突然変異）および／または植物栄養素量に及ぼす顕著な効果を有する量的形質遺伝子座（レビンら著「イスラエル植物科学ジャーナル」（２００６年）近日刊行）
【０００７】
３５Ｓプロモーターの制御下におけるＰ．ｈｙｂｒｉｄａ由来の「カルコン異性化酵素（ＣＨＩ）」遺伝子によるトマトの形質転換は、果皮フラボノール濃度を劇的に増加させる。ところが、高フラボノール遺伝子組換え植物体による葉、葉野菜、およびｂｒｅａｋｅｒ（未熟果）や熟したトマト果肉中にはフラボノール量の増加は見られなかった（ミューアら著「ネーチャー・バイオテクノロジ」第１９号４７０〜４７４頁）。
【０００８】
トマト果肉中のフラボノール蓄積、および、それによるトマト果実中のフラボノール量の増加は、転写因子ＬＣ及びＣＩをコードするトウモロコシ遺伝子の同時過剰発現によって実現する（ボビーら著「植物細胞」第１４号（２００２年）、２５０９〜２５２６頁）。
【０００９】
代替的アプローチでは、フラボノール化を導く、Ｐ．ｈｙｂｒｉｄａ由来の４つの生合成酵素「カルコン合成酵素（ＣＨＳ）、カルコン合成酵素（ＣＨＩ）、フラバノン−３−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３Ｈ）、フラボノールシンターゼ（ＦＬＳ）」をコードする遺伝子を異所的かつ同時にトマト植物体に発現させた。４種のトランス遺伝子を含む約７５％の主形質転換体が極めて高濃度のケルセチン配糖体を果皮内や他の部分に蓄積するが、殻軸組織ではケンフェロールやナリンゲニン配糖体が顕著に増加する（ベルフォネンら著「実験的植物ジャーナル」第５３号２０９９〜２１０６頁）。
【００１０】
遺伝子組み換えによるトマト果実の果肉におけるフラボノイドの高濃度化に関しては大成功とはいかなかったことが記されており、加えて、高フラボノイド化植物体を得るにあたって非遺伝子組み換え的アプローチへの要求が高まっている。この要求は、遺伝子組み換え食品（ＧＭＯ）として知られているような遺伝子組み換え果実や野菜に対する消費者の抵抗感が契機となっている。
【００１１】
栽培もののトマト、つまり、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ、Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｉｄｅｓなどのいくつかのトマト種の果実はアントシアニンを著しく多量に含んでいる（リック著「カリフォルニア科学アカデミー・オケージョナル・ペーパー」１９６４年第４４、５９号；ジョージフ著「トマト遺伝子協同組合報告書」１９７２年第２２号１０頁；リックら著「トマト遺伝子協同組合報告書」１９９４年第４４号２９〜３０頁）。Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のアントシアニン果実（ＡＦＴ）、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｉｄｅｓ由来のナス（ＡＢＧ）、Ｌ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ由来のアトロビオラセウム（ａｔｖ）はトマト果実においてにアントシアニンの発現をひきおこす。野生種Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ  ｖ．ｐｕｂｅｒｕｌｕｍは機能性フラボノイド類でトマト果実を強化する源（ソース）と見られている（ウィリットら著「農業食品化学ジャーナル」第５３号１２３１〜１２３６頁）が、果皮濃縮は消極的な手法であり、産物は不安定である。
【００１２】
果物のフラボノイドを増やす別の試行としては、高色素（ｈｐ）変異の遺伝子移入である。トマトｈｐ変異体（ｈｐ−１、ｈｐ−１ｗ、ｈｐ−２、ｈｐ−２ｊ、ｈｐ−２ｄｇ）は、赤熟果物のカロチノイド（リコピンや、カロチン）濃度にプラスに働く効果があることはよく知られている（レビンら著「理論応用遺伝学」第１０６号（２００３年）４５４〜４６０頁）。ｈｐ−１変異を有する熟した植物果物も、トマト果実果皮のフラボノイド・ケルセチンを同質遺伝子系統の１３倍の増加を示すことが分かっている（イェンら著「理論応用遺伝学」第９５号（１９９７年）１０６９〜１０７９頁）。トマト変異体ｈｐ−２およびｈｐ−２ｊの果皮中およびトマト変異体ｈｐ−２ｄｇの果実中のケルセチンにおける同様の増加も明らかにされている（ビノら著「新植物学」第１６６号（２００５年）４２７〜４３８頁、および、レビンら著「イスラエル植物科学ジャーナル」（２００６年）近日刊行）。
【００１３】
ＡＦＴ遺伝子型のＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ種果実は、果実の表皮および外果皮組織に含まれるアントシアニンによって特徴づけられる。加工トマトとＡＦＴ植物体の交配のＦ２およびＢＣ１群におけるアントシアニン発現の分離比はアントシアニン発現のための単一優性遺伝子の仮説に一致することが分かっている。トマト果実におけるＴ−ＤＮＡ賦活標識実験で、アントシアニン生合成のＭＹＢ転写制御因子を識別して、ペチュニアＡｎ２と高い相同性を有するＡＮＴ１と呼ばれている（マシュースら著「植物細胞」第１５号（２００３年）１６８９〜１７０３頁）。
【００１４】
ＡＮＴ１変異トマトは、苗木栽培の芽形成のかなり早期から強烈な紫色素を顕わし、アントシアニン蓄積につながる生合成経路の活性化に反映させた。ＡＮＴ１植物体の植物性組織は強烈な紫色を呈したが、その果実を６６倍率で拡大観察したところ表皮にのみ紫色の斑点が視認できた。こうしたことから、表現型が更に強烈な紫を呈するような表皮および外果皮に更に高濃度のアントシアニンを高アントシアニンのトマトに含ませることが長い間の要望であった。
【００１５】
野生型Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅトマト株由来のＡＦＴは高いアントシアニン濃度をもたらすので、市販のｈｐ−１トマトは特定のフラボノイド濃度が若干増大するように見え、多く増加したフラボノイド濃度を持つ安定した品種改良増殖が長年の要望に実用的に応えることになる。
【００１６】
ＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子が、栽培トマト対応物より高いアントシアニン濃度の原因であることが知られている。よって、この遺伝子の特徴、分離、および、フラボノイド濃度を強化したトマトを含む商用植物への形質転換もまた、医薬成分や医薬合成品用のアントシアニンの調製などＧＭＯ利用が許容され得る効果が期待できる用途における長年の要求に応えることができる。
【００１７】
Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅに加えて、Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｉｄｅｓ、Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉ  ｖ．ｐｕｂｅｒｅｌｕｍなどの栽培トマトに関連するいくつかのトマト種果実は、栽培トマトに比較して相当に高いアントシアニン量を含有する。よって、夫々のＡＦＴ相同遺伝子の栽培トマトへの遺伝子移入および遺伝子発現が長い間待ち望まれていた新たな進展をもたらす。また、ＡＦＴ以外の遺伝子または対立遺伝子を強化するフラボノイドを含むトマト増殖へのＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅに由来するＡＦＴ遺伝子の遺伝子移入および遺伝子発現が更にフラボノイド含有量を増加させる。
【００１８】
上述したように、形質転換遺伝子組み換えによるトマト果実中のフラボノイド含有量のある種の増加は達成されたが、ＧＭＯ消費に対する消費者の抵抗感は周知のところであり、こうして、非遺伝子品種改良によって実現した高いフラボノイド栽培品種の市場での需要がある。したがって、こうした品種改良を促すためにＤＮＡマーカーのような遺伝子配列を用いるために植物種のＡＦＴ突然変異表現型をコード化する遺伝子（または、遺伝子群）の識別が有用、且つ、新規な技術手法であると見られている。
【００１９】
アントシアニン及びフラボノールのような食用の抗酸化物質の原料を得る際の関心の高さから見て、アントシアニン、特に、デルフィニジン、ペツニジン、マルビジンなどのアントシアニンと、特に、ケルセチン、ケンフェロールなどのフラボノイド表現型を高濃度に含むトマトを生産する手段および方法の実現が、長い間依然として要求されている。
【発明の概要】
【００２０】
本発明の目的は、タンパク質をコードするＡＦＴ遺伝子であって、図９に示すアミノ酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の同一性を有し、栽培植物体または選良種に遺伝子操作的に遺伝子移入され、前記栽培植物体に前記ＡＦＴ遺伝子を遺伝子移入していない従来の栽培植物体と比較して高い濃度のフラボノイド類をもたらすことを特徴とするタンパク質をコードするＡＦＴ遺伝子を提供することにある。
【００２１】
本発明の他の目的は、栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体または選良種に遺伝子操作的に遺伝子移入され、前記栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体に前記ＡＦＴ遺伝子を遺伝子移入していない従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種植物体と比較して高い濃度のフラボノイド類をもたらすことを特徴とするＡＦＴ遺伝子を提供することにある。
【００２２】
本発明の他の目的は、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型に由来し、栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体または選良種に遺伝子操作的に遺伝子移入され、前記栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体に前記ＡＦＴ遺伝子を遺伝子移入していない従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種植物体と比較して高い濃度のフラボノイド類をもたらすことを特徴とするＡＦＴ遺伝子を提供することにある。
【００２３】
本発明の他の目的は、前記フラボノイド類の少なくとも一部がアントシアニン類および／またはフラボノール類であることを特徴とするＡＦＴ遺伝子を提供することにある。
【００２４】
本発明の他の目的は、遺伝子がＳ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍに由来することを特徴とするＡＦＴ遺伝子を提供することにある。
【００２５】
本発明の他の目的は、遺伝子が、Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ、Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｏｉｄｅｓ、Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉ  ｖ．ｐｕｂｅｒｅｌｕｍよりなる群から選択されたことを特徴とするＡＦＴ遺伝子を提供することにある。
【００２６】
本発明の他の目的は、ＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型の遺伝子移入由来トマト植物体であって、前記ＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型を遺伝子移入していない従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体と比較して高い濃度のフラボノイド類によって特徴づけられる遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００２７】
本発明の更に他の目的は、前記ＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型を遺伝子移入していない従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体と比較して高い濃度のアントシアニン類および／またはフラボノ−ル類によって特徴づけられる遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００２８】
本発明の更に他の目的は、前記ＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型がＳ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍから遺伝子移入されたことを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００２９】
本発明の更なる目的は、前記ＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型が、Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ、Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｉｏｄｅｓ、Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉ  ｖ．ｐｕｂｅｒｅｌｕｍよりなる群から遺伝子移入されたことを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００３０】
本発明の更に他の目的は、
（ｉ）ｈｐ−１／ｈｐ−１系統トマトであるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマトと、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含むトマト間で交配し、
（ｉｉ）前記交配から得られたＦ１植物体を自家交配させ、
（ｉｉｉ）ｈｐ−１変異とＡＦＴ対立遺伝子の双方が分離しているＦ２群を作成し、
（ｉｖ）ｈｐ−１変異とＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子座が同型接合であるＦ２植物体を選択し、
（ｖ）従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体および／または初期親系統と比較して、相加的な手段以上の高濃度のフラボノイド類を有することで特徴づけられる純親系統を得るために、前記Ｆ２植物体を自家交配させてＦ３群および更なる個体群（Ｆ４、Ｆ５等）を作成し、
（ｖｉ）前記純親系統を他の同系統または異種の親系統と交配して用いて、商用のＦ１ハイブリッドを作り出す、
方法によって遺伝子移入的に得たことを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００３１】
本発明の更にその他の目的は、前記フラボノイド類が、アントシアニン類およびフラボノール類であるデルフィニジン、ペツニジン、マルビジン、ケルセチン、ケンフェロール、ナリンゲニンを含むことを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００３２】
本発明の他の目的は、少なくとも１つの親系統が高色素系統であるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍであって、高色素対立遺伝子が、ｈｐ−１、ｈｐ−１ｗ、ｈｐ−２、ｈｐ−２ｊ、ｈｐ−２ｄｇとして定義される１以上の同型対立遺伝子によって特徴づけられる群から選択され、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含む植物体と異種交配される方法によって遺伝子移入的に得たことを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００３３】
本発明の他の目的は、少なくとも１つの親系統が高色素系統であるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍであって、高色素対立遺伝子が、紫外線損傷ＤＮＡ結合タンパク質１（ＤＤＢ１）または非黄化変異体１（ＤＥＴ１）遺伝子の１以上の同型接合対立遺伝子（ｈｐ−１、ｈｐ−１ｗ、ｈｐ−２、ｈｐ−２ｊ、ｈｐ−２ｄｇ）によって特徴づけられる群から選択され、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含む植物体と異種交配される方法によって遺伝子移入的に得たことを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００３４】
本発明の他の目的は、少なくとも１つの親系統が高色素系統であるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍであって、高色素対立遺伝子が、紫外線損傷ＤＮＡ結合タンパク質１（ＤＤＢ１）または非黄化変異体１（ＤＥＴ１）遺伝子に欠損のあるｈｐ−１、ｈｐ−１ｗ、ｈｐ−２、ｈｐ−２ｊ、ｈｐ−２ｄｇ変異植物体と等表現型の光形態形成遺伝子の１以上の同型接合対立遺伝子によって特徴づけられる群から選択され、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含む植物体と異種交配される方法によって遺伝子移入的に得たことを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００３５】
本発明の他の目的は、ＤＮＡマーカーを用いてＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子座において同型接合であるＦ２植物体を選択する付加的手段からなることを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００３６】
本発明の他の目的は、ＡＦＴ遺伝子型がＳ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍに由来することを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００３７】
本発明の他の目的は、ＡＦＴ遺伝子型がＳ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ、Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｉｏｄｅｓ、Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉ  ｖ．ｐｕｂｅｒｅｌｕｍよりなる群から選択されたことを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００３８】
本発明の更なる目的は、前記ＤＮＡマーカーがＳ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍに由来することを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００３９】
本発明の更なる目的は、前記ＤＮＡマーカーが、Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ、Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｉｏｄｅｓ、Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉ  ｖ．ｐｕｂｅｒｅｌｕｍよりなる群に由来することを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００４０】
本発明の更なる目的は、フラボノイドアグリコン、フラボノイド−Ｏ−グリコシド、フラボノイド−Ｃ−グリコシド、ヒドロキシル含有フラボノイドおよび／またはメトキシ置換、Ｃ−メチルフラボノイド、メチレンジオキシ・フラボノイド・カルコン、オーロン、ジヒドロカルコン、フラバノン、ジヒドロフラバノール、アンソクロ、プロアントシアニジン、濃縮プロアントシアニジン、ロイコアントシアニジン、フラバノール−３，４−ｏｌｓ、フラバノール−３−ｏｌｓ、グリコシルフラボノイド、ビフラボノイド、トリフラボノイド、イソフラボノイド、イソフラボン、イソフラバノン、ロテノノイド、プテロカルパン、イソフラバン、キノン誘導体、３−アリール−４−ヒドロキシクマリン、３−アリールクマリン、イソフラボノイ−３−エン、クメスタン、α−メチルデオキシベンゾイン、２−アリールベンゾフラン、イソフラバノール、クマロノクロモンよりなる群のうちのいずれかの成分から前記フラボノイドを選択したことを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００４１】
本発明の更なる目的は、デルフィジン、ペツニジン、マルビジンよりなる群から前記アントシアニンを選択したことを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００４２】
本発明の更なる目的は、ケルセチン、ケンフェロールよりなる群から前記フラボノイドを選択したことを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００４３】
本発明の更なる目的は、４，２，４，６−テトラヒドロキシカルコン、ナリンゲニン、ケンフェロール、ジヒドロキシケンフェロール、ミリセチン、ケルセチン、ジヒドロケルセチン、ジヒドロミリセチン、ロイコペラルゴニジン、ロイコシアニジン、ロイコデルフィニジン、ペラルゴニジン−３−グルコシド、シアニジン−３−グルコシド、デルフィニジン−３−グルコシドよりなる群から前記フラボノイドを選択したことを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００４４】
本発明の更なる目的は、（ｉ）２−フェニルクロモン（２−フェニル−１，４−ベンゾピロン）構造由来の二次植物代謝物、（ｉｉ）前記代謝物が３−フェニルクロモン（３−フェニル−１，４−ベンゾピロン）構造由来であるイソフラボノイド類、（ｉｉｉ）前記代謝物が４−フェニルクマリン（４−フェニル−１，２−ベンゾピロン）構造由来であるネオフラボノイド類よりなる群から前記フラボノイドを選択したことを特徴とする遺伝子移入由来トマト植物体を提供することにある。
【００４５】
本発明の更なる目的は、図９に示すアミノ酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の相同性を有し、従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体と比較してトマト植物体中に高いフラボノイド濃度をもたらすことを特徴とするタンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供することにある。
【００４６】
本発明の更なる目的は、図２下列に示す残基１から残基１００８の核酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の相同性を有し、従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体と比較してトマト植物体中に高いフラボノイド濃度をもたらすことを特徴とするＤＮＡ配列を提供することにある。
【００４７】
本発明の更なる目的は、前記ＤＮＡ配列は、植物体、植物部位または種子内において、フラボノイド経路の代謝物であるアントシアニンまたはフラボノール類の蓄積又は発現をもたらすことを特徴とするＤＮＡ配列を提供することにある。
【００４８】
本発明の更なる目的は、前記ＤＮＡ配列は、Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍのトマト植物体、トマト植物部位または種子内において、フラボノイド経路の代謝物であるアントシアニンまたはフラボノール類の蓄積又は発現をもたらすことを特徴とするＤＮＡ配列を提供することにある。
【００４９】
本発明の更なる目的は、前記ＤＮＡ配列は、図２下列に示す残基１から残基１００８の核酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の相同性を有し、栽培トマト系統におけるＡＦＴ遺伝子型の遺伝子移入のための遺伝資源、種子、苗木、発芽、植物体、植物部位のスクリーニングに有用であることを特徴とするＤＮＡ配列を提供することにある。
【００５０】
本発明の更なる目的は、トランスジェニック植物であって、植物体、植物部位または種子内にフラボノイド経路の代謝物であるアントシアニンまたはフラボノイド類を発現し、前記植物体は、図２下列に示す残基１から残基１００８の核酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡからなり、前記ＤＮＡは、１以上の複数の形質転換、および／または植物の形質転換および／または発現に有益な発現ベクターに組み込まれていることを特徴とする遺伝子移入植物体を提供することにある。
【００５１】
本発明の範疇には、タンパク質をコードするＡＦＴ遺伝子を得る方法であって、図９に示すアミノ酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の同一性を有し、栽培植物体または選良種に遺伝子操作的に遺伝子移入され、前記栽培植物体に前記ＡＦＴ遺伝子を遺伝子移入していない従来の栽培植物体と比較して高い濃度のフラボノイド類をもたらすことを特徴とするタンパク質をコードするＡＦＴ遺伝子を得る方法を提供することも含まれる。
【００５２】
本発明の範疇には、従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体と比較して高濃度のアントシアニン類および／またはフラボノイド類を含むことを特徴とするＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型の遺伝子移入由来トマト植物体を作り出す方法であって、
（ｉ）ｈｐ−１／ｈｐ−１系統トマトであるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマトと、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含むトマト間で交配し、
（ｉｉ）前記交配から得られたＦ１植物体を自家交配させ、
（ｉｉｉ）ｈｐ−１変異とＡＦＴ対立遺伝子の双方が分離しているＦ２群を作成し、
（ｉｖ）ｈｐ−１変異とＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子座が同型接合であるＦ２植物体を選択し、
（ｖ）従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体および／または初期親系統と比較して、相加的な手段以上の高濃度のフラボノイド類を有することで特徴づけられる純親系統を得るために、前記Ｆ２植物体を自家交配させてＦ３群を生成し、
（ｖｉ）前記純親系統を他の同系統または異種の親系統と交配して用いて、商用のＦ１ハイブリッドを作り出す、
ことからなる方法を提供することも含まれる。
【００５３】
本発明の範疇には、従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体と比較して高濃度のアントシアニン類および／またはフラボノイド類を含むことを特徴とするＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型の遺伝子移入由来トマト植物体を作り出す方法であって、
（ｉ）ｈｐ−１／ｈｐ−１系統トマトであるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマトと、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含むトマト間で交配し、
（ｉｉ）前記交配から得られたＦ１植物体を自家交配させ、
（ｉｉｉ）ｈｐ−１変異とＡＦＴ対立遺伝子の双方が分離しているＦ２群を作成し、
（ｉｖ）ｈｐ−１変異とＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子座が同型接合であるＦ２植物体を選択し、
（ｖ）従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体および／または初期親系統と比較して、相加的な手段以上の高濃度のアントシアニン類とフラボノール類であるデルフィニジン、ペツニジン、マルビジン、ケルセチン、ケンフェロールを有することで特徴づけられた純親系統を得るために、前記Ｆ２植物体を自家交配させてＦ３群および更なる個体群（Ｆ４、Ｆ５等）を作成し、
（ｖｉ）前記純親系統を他の同系統または異種の親系統と交配して用いて、商用のＦ１ハイブリッドを作り出す、
ことからなる方法を提供することも含まれる。
【００５４】
本発明の範疇には、少なくとも１つの親系統が高色素系統であるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍであって、高色素対立遺伝子が、ｈｐ−１、ｈｐ−１ｗ、ｈｐ−２、ｈｐ−２ｊ、ｈｐ−２ｄｇとして定義される１以上の同型対立遺伝子によって特徴づけられる群から選択され、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含む植物体と異種交配することによって遺伝子移入植物体を作り出すことを特徴とする方法を提供することも含まれる。
【００５５】
本発明の範疇には、少なくとも１つの親系統が高色素系統であるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍであって、高色素対立遺伝子が、紫外線損傷ＤＮＡ結合タンパク質１（ＤＤＢ１）または非黄化変異体１（ＤＥＴ１）遺伝子における１以上の同型対立遺伝子（ｈｐ−１、ｈｐ−１ｗ、ｈｐ−２、ｈｐ−２ｊ、ｈｐ−２ｄｇ）によって特徴づけられる群から選択され、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含む植物体と異種交配することによって遺伝子移入植物体を作り出すことを特徴とする方法を提供することも含まれる。
【００５６】
本発明の範疇には、少なくとも１つの親系統が高色素系統であるＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍであって、高色素対立遺伝子が、紫外線損傷ＤＮＡ結合タンパク質１（ＤＤＢ１）または非黄化変異体１（ＤＥＴ１）遺伝子に欠損のあるｈｐ−１、ｈｐ−１ｗ、ｈｐ−２、ｈｐ−２ｊ、ｈｐ−２ｄｇ変異植物体と等表現型の光形態形成遺伝子の１以上の同型接合対立遺伝子によって特徴づけられる群から選択され、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子を含む植物体と異種交配することによって遺伝子移入植物体を作り出すことを特徴とする方法を提供することも含まれる。
【００５７】
更に、本発明の範疇には、ＨＰ−１とＡＦＴ遺伝子座が同型接合であるＦ２植物体を付加的にＤＮＡマーカーを用いて選択することを特徴とする方法を提供することも含まれる。
【００５８】
更に、本発明の範疇には、デルフィジン、ペツニジン、マルビジンよりなる群から前記アントシアニンを選択することを特徴とする方法を提供することも含まれる。
【００５９】
更に、本発明の範疇には、ケルセチン、ケンフェロール、ナリンゲニンよりなる群から前記フラボノイドを選択することを特徴とする方法を提供することも含まれる。
【００６０】
更に、本発明の範疇には、４，２，４，６−テトラヒドロキシカルコン、ナリンゲニン、ケンフェロール、ジヒドロキシケンフェロール、ミリセチン、ケルセチン、ジヒドロケルセチン、ジヒドロミリセチン、ロイコペラルゴニジン、ロイコシアニジン、ロイコデルフィニジン、ペラルゴニジン−３−グルコシド、シアニジン−３−グルコシド、デルフィニジン−３−グルコシドよりなる群から前記フラボノイドを選択したことを特徴とする従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体と比較して高濃度のフラボノイド類を含むトマト植物体を作り出す方法を提供することも含まれる。
【００６１】
更に、本発明の範疇には、（ｉ）２−フェニルクロモン（２−フェニル−１，４−ベンゾピロン）構造由来の二次植物代謝物、（ｉｉ）前記代謝物が３−フェニルクロモン（３−フェニル−１，４−ベンゾピロン）構造由来であるイソフラボノイド類、（ｉｉｉ）前記代謝物が４−フェニルクマリン（４−フェニル−１，２−ベンゾピロン）構造由来であるネオフラボノイド類よりなる群から前記フラボノイドを選択したことを特徴とするトマト植物体を作り出す方法を提供することも含まれる。
【００６２】
更に、本発明の範疇には、フラボノイドアグリコン、フラボノイド−Ｏ−グリコシド、フラボノイド−Ｃ−グリコシド、ヒドロキシル含有フラボノイドおよび／またはメトキシ置換、Ｃ−メチルフラボノイド、メチレンジオキシ・フラボノイド・カルコン、オーロン、ジヒドロカルコン、フラバノン、ジヒドロフラバノール、アンソクロ、プロアントシアニジン、濃縮プロアントシアニジン、ロイコアントシアニジン、フラバノール−３，４−ｏｌｓ、フラバノール−３−ｏｌｓ、グリコシルフラボノイド、ビフラボノイド、トリフラボノイド、イソフラボノイド、イソフラボン、イソフラバノン、ロテノノイド、プテロカルパン、イソフラバン、キノン誘導体、３−アリール−４−ヒドロキシクマリン、３−アリールクマリン、イソフラボノイ−３−エン、クメスタン、α−メチルデオキシベンゾイン、２−アリールベンゾフラン、イソフラバノール、クマロノクロモンよりなる群のいずれかの成分から前記フラボノイドを選択したことを特徴とするトマト植物体を作り出す方法を提供することも含まれる。
【００６３】
更に、本発明の範疇には、タンパク質をコードするＤＮＡを作り出す方法であって、図９に示すアミノ酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の同一性を有し、コードされたアミノ酸配列を識別して選択的に検証する処理を含み、前記配列がＡＦＴ表現型および増強したフラボノイド濃度に関連するＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ中に天然に存在するタンパク質の配列であることを特徴とする方法を提供することも含まれる。
【００６４】
更に、本発明の範疇には、核酸を有用に得る方法であって、図２下列に示す残基１から残基１００８の核酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の相同性を有し、ＡＦＴ表現型に少なくとも部分的に関連するＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ中に天然に存在するタンパク質をコードする前記核酸配列を識別して選択的に検証することからなる方法を提供することも含まれる。
【００６５】
更に、本発明の範疇には、従来の栽培Ｓ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種トマト植物体と比較して高い濃度のフラボノイド類を含むトマト植物体を作り出し、栽培トマト系統におけるＡＦＴ−Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ遺伝子型の遺伝子移入のために遺伝資源、種子、苗木、植物、発芽、植物体をスクリーニングして容易にした方法であって、
（ｉ）図２下列に示す残基１から残基１００８の核酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸を作り出し、
（ｉｉ）表１に定義されたＰＣＲプライマーを調製し、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）のＤＮＡを増幅し、
（ｉｖ）それを用いて標的組織を調べることからなる方法を提供することも含まれる。
【００６６】
更に、本発明の範疇には、植物体、植物部位、または種子内にフラボノイド経路の代謝物であるアントシアニンまたはフラボノイド類を蓄積または発現させるための遺伝子組み換え方法であって、
（ｉ）図２下列に示す残基１から残基１００８の核酸配列（ＬＡ１９９６配列）に対して少なくとも８０％の相同性を有するＤＮＡを作り出し、
（ｉｉ）前記ＤＮＡを１以上の複数の形質転換、および／または植物の形質転換および／または発現に有益な発現ベクターに組み込むことからなる遺伝子組み換え方法を提供することも含まれる。
【００６７】
最後に、本発明の範疇には、トマト植物体、トマト部位または種子に有用なことを特徴とする遺伝子組み換え方法を提供することも含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本発明を当分野の技術者が実施可能なように本発明の発明者が考える最良の実施形態に基づいて以下の各章に沿って順に説明するが、トマトや、特に、デルフィニジン、ペツニジン、マルビジンなどの高アントシアニン、および、ケルセチン、ケンフェロールなどの高フラボノイド表現型を含む他の果実を生産するための手段および方法を提供することが本発明の基本概念であり、各種改変が可能なことは当該分野の技術者には自明のことである。
【００６９】
用語「ｈｐ−１」とは、トマト品種に移入して果物を高濃度のカロチノイド、フラベノイド、ビタミンＣおよびＥで強化する高色素−１遺伝子変異を意味する。ｈｐ−１変異は、トマト紫外線損傷ＤＮＡ結合タンパク質１（ＤＤＢ１）および非黄化変異体１（ＤＥＴ１）遺伝子に位置するｈｐ−１ｗ、ｈｐ−２、ｈｐ−２ｊ、ｈｐ−２ｄｇを含む変異表現型のグループに属する。
【００７０】
ここでの用語「アントシアニン果実（ＡＦＴ）」とは、特定単一遺伝子を意味し、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅから遺伝子移入すると、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍなどの栽培トマトの高濃度のアントシアニンおよび他のフラボノイド代謝産物をもたらす。
【００７１】
用語「ＡＮＴ１−Ｌ」とは、アントシアニンおよびフラボノイド蓄積に関連するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの特定単一遺伝子を意味する。
【００７２】
用語「ＡＮＴ１−Ｃ」とは、アントシアニンおよびフラボノイド蓄積に関連するＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅの特定単一遺伝子を意味する。ＡＮＴ１−Ｃでコードされているポリペプチドは、８つのアミノ酸が変化している点でＡＮＴ１−Ｌとは異なる（図３）。
【００７３】
ここでの用語「遺伝子移入」または「遺伝子移入由来」とは、交雑や戻し交雑によって遺伝子がある種から他の種または登録種の遺伝子集団への移動を起こす植物体の育種方法を意味し、所望の遺伝子型や表現型を選択することによって実施できる。ＤＮＡマーカーによって、所望の遺伝子型の選択が容易になり、育種を促進する。
【００７４】
ここでの「形質転換」とは、異種の植物ＤＮＡ配列を導入する任意の方法を意味し、異種の植物ＤＮＡ配列がある種のＤＮＡベクターシステムか構築物に組み込まれ、持続的に標的宿主植物ゲノムまたは細胞質に導入される方法であり、前記植物ＤＮＡの構築物の導入は従来から知られている様々な方法で実施できる。
【００７５】
ここでの用語「植物体」または「植物部位」とは、限定的ではないが、果実、種子、胚芽、分裂組織、カルス組織、花、枝葉、根、芽、植物配偶体、胞子体花粉、小胞子を含む任意の植物体、植物器官および組織を意味する。植物細胞は、任意の植物器官または組織から取り出し、それらから培養調製ができる。本発明による方法に適用できる植物類は、一般に、形質転換技術を受容できるモノコテリデノス植物体とジコテリデノス植物体の双方を含む高等植物類と同じ程度に広い解釈での植物体である。
【００７６】
ここでの用語「フラボノイド」とは、（ｉ）特に、２−フェニルクロモン（２−フェニル−１，４−ベンゾピラン）構造に由来するフラボノイド、（ｉｉ）３−フェニルクロモン（３−フェニル−１，４−ベンゾピラン）構造に由来するイソフラボノイド、（ｉｉｉ）４−フェニルクマリン（４−フェニル−１，２−ベンゾピラン）構造に由来するネオフラボノイドなど、ＩＵＰＡＣ命名法に従って定めた任意の植物体二次代謝産物を意味する。同様に、この用語には、フラボノイドアグリコン、フラボノイド−Ｏ−グリコシド、フラボノイド−Ｃ−グリコシド、ヒドロキシル置換および／またはメトキシ置換フラボノイド、Ｃ−メチルフラボノイド、メチレンジオキシフラボノイド、カルコン、オーロン、ジヒドロカルコン、フラバノン、ジヒドロフラバノール、アンソクロ、プロアントシアニジン、濃縮プロアントシアニジン、ロイコアントシアニジン、フラバノール−３，４−ｏｌｓ、フラバノール−３−ｏｌｓ、グリコシルフラボノイド、ビフラボノイド、トリビフラボノイド、イソフラボノイド、イソフラボン、イソフラバノン、ロテノノイド、プテロカルパン、イソフラバン、キノン誘導体、３−アリール−４−ヒドロキシクマリン、３−アリールクマリン、イソフラボノイ−３−エン、クメスタン、α−メチルデオキシベンゾイン、２−アリールベンゾフラン、イソフラバノール、クマロノクロモンなどの意味も含まれる。
【００７７】
ここでの用語「フラボノール」とは、ＩＵＰＡＣが定めた３−ヒドロキシル−２−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン骨格を有する任意のフラボノイドを意味する。これらの多様性は、ケルセチン（３，５，７，３’，４’−ペンタヒドロキシル−２−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、ケンペロール（３，５，７，４’−テトラヒドロキシル−２−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）、ミリセチン（３，５，７，３’，４’，５’−ヘキサヒドロキシル−２−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）を用いた非限定的方法で典型的に示されるフェノール性（−ＯＨ）基の異なった部分に由来する。
【００７８】
ここでの用語「アントシアニジン」とは、ベンゼン環に融合した酸素含有ヘテロ環ピランを有する任意のフラベノイドを意味し、ここでのピラン環は２位でフェニル基に結合し、異なる置換基を有することができる。
【００７９】
用語「アントシアニン」とは、ある種の糖成分を有するアントシアニジンを意味する。
【００８０】
用語「ｃｖ．」とは、商用および非商用の品種を意味する。
【００８１】
用語「選良種」とは、特にトマトの一般的な商用の交配植物種を意味する。
【００８２】
〔植物体材料、交配、生育条件〕
次の植物体材料を準備した：  Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ−ＡＦＴを含むＬＡ１９９６種、マネーメーカー種（赤色果実・放任受粉型の青果物市場向けトマト）、アイルサ・クレイグ種（赤色果実・放任受粉型トマト・遺伝的にほぼ同質であり、ｈｐ−１変異について同型接合）、ＶＦ３６種（ＬＡ０４９０）（赤色果実・放任受粉型品種）、ラトガーズ種（ＬＡ１０９０）（赤色果実・放任受粉型品種）、ＬＡ１５８９種（赤色果実Ｓ．Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ種）、ＰＩ１２８６５０紫果実Ｓ．Ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ種。
【００８３】
母系として、マネーメーカー種とアイルサ・クレイグ種ｈｐ−１／ｈｐ−１と、父系ＬＡ１９９６とで異種交配を行った。この異種交配で得られたＦ１植物体を自家受粉させて、ｈｐ−１変異とＡＦＴ対立遺伝子が分離するＦ２群を作成した。ここでのＤＮＡマーカーに基づいてｈｐ−１変異が同型接合でＡＦＴ遺伝子座が異型接合する植物体を上記Ｆ２群から選別し、ｈｐ−１／ｈｐ−１の遺伝的背景においてＡＦＴが分離するＦ３群を生成した。
【００８４】
植物体をイスラエル中部の２箇所、ゼライム・ゲデラ・シード社（イスラエル）のバルカニセンターで作付けした。夏季には植物を路地栽培乃至遮光栽培し、冬季には最低摂氏１５℃の気温に温度調節したハウス内で栽培した。夏季には、５月の第一週に移植を行い、冬季は１１月の第１週に移植を行った。
【００８５】
〔ゲノムＤＮＡ抽出〕
ゲノムＤＮＡを、フルトンら著「植物分子生物学報告」第１３号（１９９５年）２０７〜２０９頁に開示の手法によって個別の植物体から抽出した。
【００８６】
〔ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーの設計〕
配列分析および遺伝子座特異プライマーの設計をＤＮＡＭＡＮ配列分析ソフトウェアＶ４．１（リンノン・バイオソフト社（米国ケベック）製）を用いて行った。
【００８７】
〔パイロシークエンス遺伝子型決定法〕
ｈｐ−１変異の遺伝子型を判定するためにパイロシークエンス方式を用いた。このパイロシークエンス遺伝子型決定方式は、ｈｐ−１／ｈｐ−１変異植物体とその準遺伝子同質体の相互間のｈｐ−１変異遺伝子型をコードする遺伝子中に見つけられる一塩基多型に基づいている。遺伝子型決定手法として、リーバーマンら著「理論応用遺伝学」第１０８号（２００４年）１５７４〜１５８１頁に開示された方法を採用した。
【００８８】
〔フラボノイド生合成経路のＡＮＴ１および他の構造遺伝子の遺伝子型決定法〕
遺伝子型決定は、連鎖解析および／またはＰＣＲの後に制限酵素分解を用いる多型決定を目的として行われた。ＰＣＲ増幅に用いるプライマーを表１に示す。ＰＣＲ増幅産物を臭化エチジウムで染色した１．０％アガロースゲル中で電気泳動法によって視覚化した。
【表１】
2010517526.tif 000003
【００８９】
〔リアルタイムＰＣＲ分析〕
緑熟トマト果実の果皮からＲＮＡを抽出した。各実験で、各遺伝子型からの３つの１平方ミリ角（ＬＡ１９９６、正常赤色果実遺伝子型マネーメーカー種、ＶＦ３６、ラトガーズ、ＬＡ１９９６とマネーメーカー種のＦ１交配種）を分析した。ＴＲＩｚｏｌ試薬システム（インビトロジェン社（米国カリフォルニア州カールズバッド）製）を用いてＲＮＡ抽出を行った。混入する可能性のあるゲノムＤＮＡは「ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ」キットを用いて分解させ、「ｉＳｃｒｉｐｔ−ｃＤＮＡ」合成キット（バイオ−ラッド研究所（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）製）を使用してｃＤＮＡ合成のテンプレートとして全ＲＮＡを用いた。全ＲＮＡの純度および合成ｃＤＮＡの品質は以下のいずれかのプライマーを用いたＰＣＲによって検証した。
【００９０】
「サイバー・グリーンＰＣＲ  マスター・ミックス」（アプライド・バイオシステム社（米国カリフォルニア州フォスターシティ）製）を用いてリアルタイムＰＣＲ分析を行った。ＰＣＲ反応は初期インキュベーション温度９５℃で１０分間、続いて、９５℃で１５秒間の変性、更に６１℃で３０秒間のアニーリングと、７２℃で３０秒間の重合化処理を４０サイクル行った。
【００９１】
この実験調査中、１８ＳリボソームＲＮＡを参照遺伝子として用いて、そのためのプライマーが設計され、同様にその他の遺伝子も分析された。観察対象であるカルコン合成酵素-１（ＣＨＳ１）、カルコン合成酵素-２（ＣＨＳ２）、カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）、 ジヒドロフラボノール還元酵素（ＤＦＲ）、フラバノン−３−ヒドロキシラーゼ（ＦＳＨ）、アントシアニン１（ＡＮＴ１）を表２に示す。サンプルを、「ＧｅｎｅＡｍｐ５７００配列検出システム」を用いて通常重複して分析し、「ＧｅｎｅＡｍｐ５７００ＳＤＳソフト（アプライド・バイオシステム社製）」でデータを収集して解析した。検査遺伝子転写物の相対存在量を式［２（ＣＴ検査遺伝子-ＣＴ参照遺伝子）］で計算した。式において、ＣＴは、蛍光発光が一定の閾値を越える分別サイクル数（通常は０．１に設定）。
【表２】
2010517526.tif 000004
【００９２】
〔アントシアニン、フラボノール抽出、および、定量化〕
新鮮なトマト果皮のサンプル（０．１〜０．３ｇ）を液体窒素中で粉砕し、暗所で冷メタノール、水、酢酸の混合液２ｍｌ（１１：５：１）を用いて色素を抽出した（マーカム＆Ｋ．Ｒ．オフマン著「植物化学」第３４号（１９９３）６７９〜６８５頁）。
【００９３】
抽出物２０，８００ｇ（１４，０００ｒｐｍ）で１０分間遠心し、上清中にアントシアニン脱離させた。更に、精製物をヘキサン容積２／３とした。サンプルを０．５ｍｌに濃縮し、１時間２Ｎ・ＨＣｌ中で等量のメタノールと共に沸騰させて加水分解し、０．４５μm−ポリビニリデンジフロライドフィルター（米国ナルジェ社製）でろ過した。
【００９４】
ＬＣ−１０ＡＴポンプ、SCL-10Aコントローラ、ＳＰＤ−ＭｌＯＡＶＰフォトダイオードアレイ検出器を備えたΗＰＬＣ（島津製作所製）を用いてフラボノイドの組成を測定した。抽出物をＲＰ１８カラム（Ｖｙｄａｃ−２０１ＴＰ５４）に充填し、次の溶液を用いて２７℃で分離した（溶液：（Ａ）Ｈ２Ｏ、ｐＨ２．３、（Ｂ）Ｈ２Ｏ：ＭｅＣＮ：ＨＯＡｃ（１０７：５０：４０）、ｐＨ２．３）。溶液ＡとＢとの比率が４：１から３：７のリニアに勾配をつくるように４５分かけて供給し、流速毎分０．５ｍｌで比率が３：７の状態で更に１０分間保持し、保持時間と２５０〜６５０ｎｍにおける吸収スペクトルを標準精製フラボノイド（アピン・ケミカルズ、ポリフェノールズ、シグマ）と比較してフラボノイドを識別した。
【００９５】
〔トマトゲノムに対するＡＮＴ１およびＡＦＴ遺伝子のマッピング〕
以前発表された資料文献（レビンら著「イスラエル植物科学ジャーナル」第１００号（２０００年）２５６〜２６２頁）のように、ＡＮＴ１遺伝子と強い関連性を持つこの実験調査で見つかったＡＦＴ遺伝子はＳ．Ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ遺伝子移入系統を用いてトマトゲノムにマッピングされた（エシェドら著「理論応用遺伝学」第８３号（１９９２年）１０２７〜１０３４頁）。
【００９６】
元の親種Ｍ８２とＳ．Ｐｅｎｎｅｌｌｉｉを含む遺伝子移入系統の個々の植物体から抽出したＤＮＡをＰＣＲ反応の際のテンプレートとして用いた。自動サーモサイクラー（ＭＪリサーチ社（米国マサチューセッツ州ウォルサム）製）で反応を行った。
【００９７】
次のＤＮＡプライマーをこれらの反応に用いた（マシュースら著「植物細胞」第１５号（２００３年）１６８９〜１７０３頁）。
Ｆ：５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＴＧ−３’
Ｒ：５’−ＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＣＡＡＧＴＡＧＡＴＴＣＣＡＴＡＡＧＴＣＡ−３’
【００９８】
ＰＣＲ反応は初期インキュベーションに９４℃３分間、引き続いて９４℃３０秒の変性、６０℃３０秒間アニーリングし、７２℃６０秒間の重合化処理を３５サイクル行った。７２℃の最終伸長反応を７分間行い、上記サイクル処理を完了した。臭化エチジウムで染色した１．０％アガロースゲルを１ｍｌ用いた電気泳動法によって得られたＰＣＲ産物を視覚化した。親種Ｍ−８２（ＬＡ３４７５）およびＳ．Ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ（ＬＡ０７１６）の間の多型性を得るための制限酵素は必要なかった。
【００９９】
〔ＡＮＴ１遺伝子のクローニング〕
個々のＡＦＴ変異（ＬＡ１９９６）植物体および野生遺伝子型（アイルサ・クレイグ）の葉組織１００ｍｇから全ＲＮＡを抽出した。ＴＲＩｚｏｌ試薬システム（インビトロジェン社（米国カリフォルニア州カールズバッド）製）を用いてＲＮＡ抽出を行った。混入の可能性のあるゲノムＤＮＡは「ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ」キットを用いて分解させ、「ｉＳｃｒｉｐｔ−ｃＤＮＡ」合成キット（バイオ−ラッド研究所（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）製）を使用したｃＤＮＡ合成のテンプレートとして全ＲＮＡを用いた。ＡＮＴ１遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＹ３４８８７０）を変異体種と正常遺伝種の双方で増幅させるためにＰＣＲ反応のテンプレートとしてｃＤＮＡを用いた。下記遺伝子５’末端および３’末端の特異的プライマーを用いたプルーフリーディングＴａｑポリメラーゼ（ロッシュ・ダイアゴノスティック社（米国インディアナ州インディアナポリス）製）のＰｗｏ-ＤＮＡポリメラーゼ）でＰＣＲを実行した。
Ｆ：  ５’−ＡＴＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＴＧＴＣＴＴＣＡＴＴＧＧ−３’
Ｒ：  ５’−ＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＣＡＡＧＴＡＧＡＴＴＣＣＡＴＡＡＧＴＣ−３’
【０１００】
ＴＡクローニングの後、結果的に得られた産物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社（米国カリフォルニア州カールズバッド）製）に結合し、配列分析で検証した。
【０１０１】
〔植物形質転換のバイナリーベクター構造〕
カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ構成プロモーターの制御下に変異および正常ＡＮＴ１を有する植物形質転換のための構築物を調製した。全ての構築物は、３５Ｓプロモーターの下でＮＰＴＩＩ選択マーカー遺伝子を有する。
【０１０２】
これらの構築物を調製するために、ｐＭＯＮ１００９８プラスミドをＥｃｏＲＩで分解させた後にエビのアルカリフォスファターゼ（ロッシュ・ダイアゴノスティック社（米国インディアナ州インディアナポリス）製）を用いて処理し、（ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターからの）ＥｃｏＲＩ分解ＡＮＴ１と結合した。ｐＭＯＮ−３５Ｓ−ＡＮＴ１を並んで含むクローンを単離し、変異および正常ＡＮＴ１のクローンについて配列を検証した。
【０１０３】
〔形質転換プロトコル〕
上記構築物の形質転換のためにＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｂａｃｕｍ ＳＲＩの葉切除片、および、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種マネーメーカーの子葉切除片を用いた。
【０１０４】
培養調整は次の通りである：植物体種子を石鹸（市販洗剤「パルムオリーブ」）と水で洗って水中に置き、その後、流水で１．５時間洗浄した。続いて、種子を９６％ｖ／ｖのエタノール中で１分間、振り混ぜて、３％ｖ／ｖ（＋０．０１％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０）の次亜塩素酸ソーダ中に１５分間放置し、更に、１．５％ｖ／ｖ（＋０．０１％ｖ／ｖツイン２０）の次亜塩素酸ソーダ中で３０分間激しく撹拌した。最後に種子を滅菌蒸留水で３回洗浄した。処理した葉切除片、および、子葉切除片を上記種子から得られた苗木茎の基部から取り外し、植物成長調整剤成分含有において異なる下記のＭＳ培地に接種した。
【０１０５】
上記移植片を、本出願人の研究所において標準的な培地でＭＳ無機塩を含む塩基培地（ムラシゲ＆スクーグ著「生理学植物」第１５（３）号（１９６２年）４７３〜４９７頁）に蔗糖またはグルコース３０ｇと寒天８ｇ／Ｌを添加した培地に接種した。成長調節剤補充（単位ｍｇ／Ｌ）：  タバコ…ＩＡＡ０．８、キネチン２、ゼアチン１；  トマト…ＩＡＡ０．１、ゼアチン１
【０１０６】
培地を培養室に２３℃で１６時間照明（照明状況：５０ｍｍｏｌ；ｍ−２；ｓ−１の白色蛍光ランプ）の下で保管した。全ての外植片を前記培地に植え、発芽能力を評価した。
【０１０７】
この実験調査全般で用いた全てのベクターをアグロバクテリウム・ツメフアシェンス菌ＥＨＡ１０５に挿入した。葉切除片、および、子葉切除片を滅菌状態でアグロバクテリウム菌と共に、アセトシリンゴン２００μＭを添加したＭＳ培地で２０分間、培養した。細菌ろ紙で組織を吸い取り処理した後、アセトシリンゴン１００μＭを添加した暗所ＭＳ培地において２２℃でカルス組織片を共培養した。その後、切除片を洗浄し、選別用にカナマイシン５０ｍｇ／Ｌとセフォタキシム２００ｍｇ／Ｌを含む固形再生培地に移し、培養容器内で育成した。
【０１０８】
〔統計分析〕
ＪＭＰ統計判定ソフト（ＳＡＳインスティテュート（米国ノースカロライナ州カリー）製）を用いて分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。更に、<http://workbench.sdsc.ede/>に開示された「生物学ワークベンチ」を用いたＣＬＵＳＲＡＬ  Ｗ方法（トンプソンら著「核酸研究」第２２号（１９９４）４６７３〜４６８０頁）によってヌクレオチドおよびアミノ酸配列を整列させた。
【０１０９】
図１に、従来技術によるアントシアニンおよびフラボノールの生合成経路の概略図を示している。
【０１１０】
図２に、アイルサ・クレイグ品種（上図）とＬＡ１９９６（下図）とのＡＮＴ１遺伝子のヌクレオチド配列の比較を概略的に示している（開始コドンおよび終止コドンは両配列に下線をつけており、イントロン領域は黄色で彩色している）。
【０１１１】
図３に、アイルサ・クレイグ品種（上図）とＬＡ１９９６（下図）とのＡＮＴ１タンパク質のアミノ酸比較を概略的に示している（２線間で異なるアミノ酸を黄色で彩色している）。
【０１１２】
図４に、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（ＡＮＴｌ−Ｌ）由来のＡＮＴ１対立遺伝子とＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ（ＡＮＴｌ−Ｃ）由来のＡＮＴ１対立遺伝子間の共優性遺伝子多型の写真画像を示している。
【０１１３】
図５に、ＡＮＴ１遺伝子と、ＡＮＴ１とｈｐ−１に分離するＦ２群中のアントシアニン蓄積の形質の視覚的表示を示している（各果実は夫々の遺伝子型の個別植物体から得られたものである）。
【０１１４】
図６に、染色体１０のトマトゲノムに対するＡＮＴ１の制限酵素遺伝子解析の写真および配置図を示している。
【０１１５】
図７に、カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓ構成プロモーターの制御下のＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ（ＡＮＴｌ−Ｃ）由来のＡＮＴ１遺伝子で形質転換されたタバコ再生体およびＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（ＡＮＴｌ−Ｌ）由来のＡＮＴ１遺伝子で形質転換されたタバコ再生体との比較写真を示している。
【０１１６】
図８に、カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓ構成プロモーターの制御下におけるＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ（ＡＮＴｌ−Ｃ）由来のＡＮＴ１遺伝子で形質転換されたトマトおよびＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（ＡＮＴｌ−Ｌ）由来のＡＮＴ１遺伝子で形質転換されたトマト（マネーメーカー品種）再生体の比較写真を示している。
【０１１７】
図９に、トマト登録種およびコショウからクローンが作られたＡＮＴ１遺伝子のアミノ酸配列の概略図を示している（果実アントシアニンを蓄積していない登録種：ＬＡ１５８９はＳ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ、ＬＡ２８３８ＡはＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍである。果実アントシアニンを蓄積している登録種：ＰＩ１２８６５０はＳ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、ｈｐ−７９９は未知のＳ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍとＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍとの交配から生まれた選択系統、ＬＡ１９９６はＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子型、ＣＡＥ７５７４５はアントシアニンを蓄積するコショウである）。
【０１１８】
図１０に、ｈｐ−１変異およびＡＮＴ１−Ｃ対立遺伝子（ＡＮＴ１−Ｃ／ＡＮＴ１−Ｃ  ｈｐ−１／ｈｐ−１）が同型接合したＦ３植物体とＬＡ１９９６植物体（ＡＮＴ１−Ｃ／ＡＮＴ１−Ｃ  ＋／＋）から得られたトマト果実を示している。
【０１１９】
図１１に、本発明の別の態様によるＳ．Ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ（ＡＮＴ１−Ｐ／ＡＮＴ１−Ｐ  ｈｐ−１／ｈｐ−１）由来のＡＮＴ１対立遺伝子とｈｐ−１変異が同型接合した登録品種のトマト植物体および果実を示している。
【実施例１】
【０１２０】
ＡＦＴ遺伝子座での同型接合果実は、アントシアニンに加えて高濃度のフラボノール・ケルセチンとケンフェロールを含有している。
【０１２１】
ＡＦＴ遺伝子型ＬＡ１９９６種の植物体、赤色果実マネーメーカー種の植物体、および、マネーメーカー種とＬＡ１９９６種との交配種であるＦ１植物体を乱塊法計画の開放耕地で育成した。各遺伝子型の５種子を３ブロックに各々に作付けし、赤熟段階で果実をサンプルとして高性能液体クロマトグラフィー分析を行い果皮のフラボノール量とアントシアニン量を測定した。赤熟果実で識別された主要なアントシアニンとその平均濃度を遺伝子型に従って図３に示す。また、同遺伝子型の赤熟果実に含まれる主要なフラボノールとその平均濃度を遺伝子型に従って図４に示す。
【０１２２】
図３に示す結果から、赤熟果実のマネーメーカー種植物体に較べてＡＦＴ／ＡＦＴ植物体から得られた熟果の果皮に含まれるアントシアニン、デルフィニジン、ペツニジン、マルビジンが統計的に有意な蓄積を見せたことが分かる。これらのことから、同じＡＦＴ／ＡＦＴ植物体と赤熟化トマト植物体ＵＣ８２Ｂの果実に含まれるアントシアニン濃度を比較した以前の結果を確認できる（ジョーンら著「ジャーナル・ヘレディティー」第９４号（２００３年）４４９〜４５６頁）。加えて、図４に示す結果によって、ＡＦＴ／ＡＦＴ変異植物体の果実が、機能的フラボノール、特に、ケルセチンおよびケンフェロールを統計的に有意に蓄積するという特徴を持っていることが分かる。ケルセチン濃度は、ＡＦＴ／ＡＦＴ遺伝型の熟果において、果皮重量（ｇＦＷ）に基づく赤熟マネーメーカー種植物体の濃度に較べて〜３．６倍高く、果皮部分（ｃｍ２）では〜４．３倍高かった。ケンペロール濃度は、ＡＦＴ／ＡＦＴ遺伝型の熟果において、果皮重量（ｇＦＷ）に基づく赤熟マネーメーカー種植物体の濃度に較べて〜２．７倍高く、果皮部分（ｃｍ２）では〜３．３倍高かった。
【０１２３】
【表３】
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【０１２４】
【表４】
2010517526.tif 000006
【０１２５】
表３および表４に示す結果から、異型接合のＦ１植物体の果皮におけるアントシアニンおよびフラボノール濃度は、通常、赤熟遺伝子型のものと較べて高いが、ＬＡ１９９６遺伝子型（ＡＦＴ／ＡＦＴ）よりかなり低いことが明らかになった。これらの結果は、ＡＦＴ遺伝子（または複数ＡＦＴ遺伝子）の部分的優性効果を示している。
【０１２６】
しかしながら、こうした統計分析では、対応する赤熟マネーメーカー種植物体と比較した場合において、Ｆ１植物体から得られる果実における平均アントシアニン濃度と平均フラボノール濃度との統計的に有意な差を明らかにできなかった。
【実施例２】
【０１２７】
フラボノイド生合成経路の重要な酵素の転写のアップレギュレーションがＡＦＴ植物体の特徴である。
【０１２８】
上記の予備試験の枠組みの中に作付けしたＬＡ１９９６種植物体、および、ＶＦ３６種およびラトガーズ種の２種の赤熟遺伝型から得られた緑熟果からリアルタイムＰＣＲに用いるＲＮＡサンプルを抽出した。ｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲ分析に続いて、フランボノイド生合成経路ＣＨｌ、ＣＨ２、Ｆ３Ｈ、ＤＦＲ（プラマーは表３に示す）の４種の構造的な酵素の転写プロフィールに関する３種の遺伝子型を比較した。この結果は、２種の赤熟遺伝型（データは示していない）に比較した時のＣＨＳ１、ＣＨＳ２、ＤＦＲの極端な発現上昇、および、ＬＡ１９９６のＦ３Ｈの適度な発現減少を示している。特注に値することは、フラボノイド生合成の初期段階で機能する２つのＣＨＳ１遺伝子と生合成の後段での酵素活性をコードするＤＦＲ遺伝子について極端な発現上昇が見られたことである（図１）。分析は乱塊法計画の開放耕地での実験で得られたサンプルを用いて繰り返し行われた（実施例１参照）。上記３箇所からのＬＡ１９９６種植物体、赤熟マネーメーカー種植物体、これら２種間の異種交配によるＦ１植物体からリアルタイムＰＣＲで用いるサンプルを採取した。フラボノイド生合成経路の重要な遺伝子の転写における倍増を示す結果を表５に示す。
【０１２９】
【表５】
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【０１３０】
これらの結果から、対応する赤熟果実に較べて同型接合および異型接合のＡＦＴ植物体の果皮にＣＨＳ１、ＣＨＳ２、ＤＦＲをコードする遺伝子が実質的に発現上昇することが確認できた。
【実施例３】
【０１３１】
ＣＨＳ１、ＣＨＳ２、ＤＦＲをコードする遺伝子はＡＦＴ植物体において多型でない。
【０１３２】
ＣＨＳはフラボノイド生合成経路における第一関与段階で機能する酵素をコードする遺伝子である。上記したような有意の転写発現増加のために、ＣＨＳ１またはＣＨＳ２がＡＦＴ表現型をもたらす遺伝子になり得ると仮定できる。この仮説を検証するために、２つの遺伝子（表１）の夫々に遺伝子座特異プライマーを設計し、ＰＣＲにＶＦ３６種（ＬＡ０４９０）およびラトガーズ種（ＬＡ１０９０）の２つの赤熟品種から対応するゲノム領域を増幅させ、３１（ＣＨＳ１）および３５（ＣＨＳ２）制限酵素でそれらを分解させた。
【０１３３】
これら２遺伝子について、ＬＡ１９９６種と上記の赤熟品種との間に多型性はなかった。同様に、アントシアニン生合成の後段で働くＤＦＲ（制限酵素２７）、および、Ｆ３Ｈ（制限酵素２２）にも多型性はなく、前記の実験において転写的に誤った制御であったことが判明した。これらの結果は、制御遺伝子がＡＦＴ表現型をコードする遺伝子であるという理論に一致する。
【実施例４】
【０１３４】
トマトＡＮＴ１遺伝子は、ＡＦＴ表現型をコードする有望な遺伝子候補である。
【０１３５】
トマト果実におけるＴ−ＤＮＡ賦活標識実験で、アントシアニン生合成のＭＹＢ転写制御因子を識別して、ペチュニアＡｎ２と高い相同性を有することからＡＮＴ１と呼ばれている（マシュースら著「植物細胞」第１５号（２００３年）１６８９〜１７０３頁）。
【０１３６】
ａｎｔ１変異トマト植物体は、栽培の芽形成のかなり早期から強烈な紫色素を顕わし、アントシアニン蓄積につながる生合成経路の活性化に反映させた。ａｎｔ１植物体の植物性組織は強烈な紫色を呈し、果実は表皮および果皮に紫色の斑点があった。果実の転写結果（実施例２）と同様に、ａｎｔ１変異実生は、アントシアニン生合成の初期（ＣＨＳ）および後期（ＤＦＲ）で機能するタンパク質をコードする遺伝子が発現上昇を示した（マシュースら著「植物細胞」第１５号（２００３年）１６８９〜１７０３頁）。
【０１３７】
ＡＮＴ１遺伝子配列は後になってＲＦＬＰプローブとして用いられ、２９５−Ｆ２個体を用いて、ＡＮＴ１遺伝子とコショウＡ遺伝子、枝葉、花、未熟果実にアントシアニン色素を蓄積する優性遺伝子の間の完全同時分離を示した（ボロフスキーら著「Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ」第１０９号（２００４年）２３〜２９頁）。Ａ遺伝子はコショウ染色体１０にマッピングされ、染色体はＬＡ１９９６種において初期の段階では多型は認められなかった（ジョーンら著「ジャーナル・ヘレディティー」第９４号（２００３年）４４９〜４４６頁）。それにも拘わらず、ＬＡ１９９６種および赤熟アイルサ・クレイグ種植物体由来のＡＮＴ１遺伝子を配列で特徴付け、ＡＦＴ表現型の有望な候補遺伝子としてのＡＮＴ１遺伝子を強調できる可能性のあるヌクレオチド多型を検出することを決定した。配列分析によって、ＡＮＴ１遺伝子コード領域と非コード領域における２つの遺伝子型には複数のヌクレオチドに差があることを明らかにした（図２）。特筆すべきは、アイルサ・クレイグ品種の読み取り枠のヌクレオチド配列とミクロトーム種（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＹ３４８８７０<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/>で検索））との間で完全な配列同一性が見られたことである。
【０１３８】
アイルサ・クレイグ品種とＬＡ１９９６種間のアミノ酸配列を比較すると、２つの遺伝子型間で８つのアミノ酸が異なることが明らかになった（図３）。アイルサ・クレイグ品種のアミノ酸配列と、ミクロトーム種（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＱ５５１８１<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/>で検索））からクローニングされた元来のＡＮＴ１のアミノ酸配列との間に完全な同一性が明確に顕れた。７つのアミノ酸の差異がＬＡ１９９６種と２つの赤熟遺伝子型（アイルサ・クレイグ種とミクロトーム種）との間の大きな違いであると見なせる（表６）。
【０１３９】
【表６】
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【０１４０】
ＡＮＴ１遺伝子のＬＡ１９９６種と赤熟遺伝子型間のヌクレオチド配列差に基づいて、ＰＣＲプライマー（表１）を設計し、ＰＣＲ増幅反応でうまく利用できた。増幅産物をＮｃｏＩ制限酵素で分解させ、図４に示すように、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（ＡＮＴ１−Ｌ）とＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ（ＡＮＴ１−Ｃ）由来のＡＮＴ１対立遺伝子間の共優性多型を示すようにした。
【０１４１】
上記で詳細に示されたヌクレオチド配列およびタンパク質配列の多型に加えて、ＡＮＴ１遺伝子は、ＬＡ１９９６から得られたトマトの果皮において、対応する赤熟マネーメーカー種と比較して統計的に有意な４．９倍（Ｓ．Ｅ．は１．４）の転写のダウンレギュレーションを示した。また、マネーメーカー種とＬＡ１９９６種との異種交配から得られたＦ１植物体より採取した果実にも統計的に有意な転写のダウンレギュレーションが見られたが、転写の減少倍率は半分（２．５±０．２）であった。
【実施例５】
【０１４２】
トマトのＡＮＴ１遺伝子はトマト果実内のアントシアニン蓄積の形質と綿密に関連する。
【０１４３】
連鎖解析を行って、ＡＮＴ１とアントシアニン蓄積量との間の関連性について調べた。そのために、ＬＡ１９９６種とアイルサ・クレイグ品種との異種交配により得られるＦ２群であって、ｈｐ−１変異体のホモ接合体を作成した。ｈｐ−１／ｈｐ−１変異植物体は、赤熟ホモ接合型ｈｐ変異植物体中においても、増強したアントシアニン蓄積がみられることから（イェンら著「理論応用遺伝学」第９５号（１９９７年）１０６９〜１０７９頁、ビノら著「新植物学」第１６６号（２００５年）４２７〜４３８頁、および、レビンら著「イスラエル植物科学ジャーナル」（２００６年）近日刊行）、ＡＦＴ遺伝子を有するｈｐ−１／ｈｐ−１変異植物体中でもアントシアニン蓄積の凝集が見られると仮定した。先に設計されているパイロシークエンス・プライマー（リーバーマンら著「理論応用遺伝学」第１０８号（２００４年）１５７４〜１５８１頁）、および、表１に示すＰＣＲプライマーをそれぞれ用いて、合計２４７のＦ２植物体のＨＰ−１およびＡＮＴ１遺伝子についての遺伝子型が特定された。アントシアニン蓄積の形質は緑熟果および赤熟果の目視検査により記録された。
【０１４４】
【表７】
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【０１４５】
表７および図５に示した結果は、ＡＮＴ１−Ｃとアントシアニン蓄積量の形質との間に強い関連性があることを明らかにし、ホモ接合体ｈｐ−１／ｈｐ−１遺伝子型のホモ接合体との顕著、且つ、完全な関連性を示した。ＡＮＴ１−ＣがＡＮＴ１−Ｌより優位であると期待した通り、４つの異型接合のＡＮＴ１−Ｃ／ＡＮＴ１−Ｌ植物体は、緑熟果または赤熟果においてアントシアニン蓄積の表現型を示さなかった。遺伝子組み換え体であることを考えると、これらの植物は、ＡＮＴ１とＡＦＴ遺伝子との間隔が〜．８センチモルガンであることを示唆している（Ｆ２を基準に算出）。しかしながら、この見識に異論がある。つまり、施行した増殖条件では、ＬＡ１９９６種とアイルサ・クレイグ品種を含む数種の赤熟の開放受粉した栽培品種との交配から得られた異型接合のＡＮＴ１−Ｃ／ＡＮＴ１−Ｌ植物体において如何なる可視表現型も観察できなかったからである。表３および表４に示した本発明に基づく代謝データでは、異型接合植物体が表現型を示す能力がないことも如実に顕しており、ＡＮＴ１−Ｃ／ＡＮＴ１−ＬのＦ１植物体から採取した果実に含まれるアントシアニンおよびフラボノールの平均含有量は、同型接合体ＡＮＴ１−Ｃ／ＡＮＴ１−Cより同型接合体ＡＮＴ１−L／ＡＮＴ１−Ｌにかなり似ていることを明らかにしている。ＡＮＴ１とＡＦＴの完全連鎖の可能性に関する見解を更に立証するために、ＡＦＴ表現型に特徴的な表現型を示さない２つの非ｈｐ−１異型接合体ＡＮＴ１−Ｃ／ＡＮＴ１−ＬのＦ２植物体を自家受粉させた。結果的に得られたＦ３群の夫々の６０の植物体を作付けして、熟成果を外観検査したところ、異型接合植物体で推測されたように、ＡＦＴ形質はこれら２つの群で実際に分離することが明らかとなった。加えて、ｈｐ−１変異体が同型接合であり、ＡＮＴ１遺伝子（ｈｐ−１／ｈｐ−１、ＡＮＴ１−Ｃ／ＡＮＴ１−Ｌ）が異型接合である植物体を自家受粉させた結果、得られたＦ３植物体はＡＮＴ１遺伝子の遺伝子型が特定された。結果的に得られた遺伝子型の夫々を顕す１８つの植物体を作付けした。果実成熟した上で、これらの植物体を外観検査したところ、ＡＮＴ１遺伝子型とＡＦＴ表現型との間に完全な関連性が見られ、ここでも、ＡＮＴ１とＡＦＴ遺伝子との間に強い関連性と完全連鎖の可能性が示された。
【実施例６】
【０１４６】
トマトＡＦＴ遺伝子を染色体１０にマッピングする。
【０１４７】
ＬＡ１９９６種から遺伝子移入されたＡＦＴ遺伝子とＡＮＴ１遺伝子配列との強い関連性によって初めてＡＦＴ遺伝子の染色体位置がトマトゲノムにおいてマッピングできた。その目的のために、Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉの遺伝子移入種が用いられた（エシェドら著「理論応用遺伝学」第８３号（１９９２年）１０２７〜１０３４頁）。図６で要約した結果では、遺伝子移入種１０−３に対してのみＡＮＴ１がトマト染色体１０の長腕にマッピングされている。ここでの実験研究で得られたＡＮＴ１とＡＦＴ形質との強い関連性は、ＡＦＴ表現型をもたらす遺伝子もまたトマト染色体１０の長腕に位置することを表している。
【実施例７】
【０１４８】
ｈｐ−１変異体は、ＡＮＴ１−Ｃ対立遺伝子におけるアントシアニンおよびフラボノール発現を相加的な方法より増強できる。
【０１４９】
図１に視覚表示したように、ｈｐ−１変異体は、ＡＮＴ１−Ｃ対立遺伝子に起因して赤熟果実のアントシアニン発現を増強する。このｈｐ−１の積極的な貢献は、ＡＮＴ１−Ｃ／ＡＮＴ１−Ｃ同型接合植物体およびＡＮＴ１−Ｃ／ＡＮＴ１−Ｌ異型接合植物体で見られた。果実アントシアニン濃度および可能性としてフラボノール濃度にも及ぼすこの相乗作用を定量化するために、赤熟果実を次のＦ３遺伝子型の夫々の植物体１８種から採取した：ＡＦＴ／ＡＦＴ  ｈｐ−１／ｈｐ−１、ＡＦＴ／＋  ｈｐ−１／ｈｐ−１、および、＋＋  ｈｐ−１／ｈｐ−１。同様に初期親種は、ＡＦＴ／ＡＦＴ  ＋＋（ＬＡ１９９６種）、および、＋＋  ｈｐ−１／ｈｐ−１（ｈｐ−１変異体に対して同型接合であるアイルサ・クレイグ種）である。
【０１５０】
【表８】
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【０１５１】
表８に示した結果は、複合遺伝子型ＡＦＴ／ＡＦＴ  ｈｐ−１／ｈｐ−１が初期親種に比較して相加的効果以上の有意な効果をアントシアニン、デルフィニジン、ペツニジン、マルビジンに及ぼすことが明らかにした。
【０１５２】
この遺伝子型は、表９に示すように、フラボノール類のケセルチン、ケンフェロールの濃度を同様に高める傾向を示した。
【０１５３】
【表９】
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【実施例８】
【０１５４】
タバコおよびトマト植物体の形質転換は、ＡＮＴ１−Ｃアントシアニン蓄積の非常に大きな効果を示す。
【０１５５】
カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓ構成プロモーターの制御下でのＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ  （ＡＮＴ１−Ｃ）およびＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（ＡＮＴ１−Ｌ）を由来とするＡＮＴ１遺伝子の形質転換は、トマトおよびタバコの再生体において相当多量かつ早期のアントシアニン産生を示した。これらの結果より、ＡＮＴ１はおそらく大部分がＡＦＴ表現型をコードする遺伝子であり、ＡＮＴ１−Ｃ対立遺伝子は、栽培トマト由来のＡＮＴ１−Ｌ対立遺伝子と比較して、アントシアニン産生に相当大きな効果をもたらすことを明確に示している。
【実施例９】
【０１５６】
ＡＮＴ１遺伝子における１８７位プロリンのグルタミンへの置換  −  ＡＦＴ遺伝子型におけるアントシアニン蓄積の決定因子。
【０１５７】
コショウと同様に高果実アントシアニンのトマト種からクローニングされたＡＮＴ１遺伝子のアミノ酸配列を低果実アントシアニンのトマト種およびコショウと比較した。これらの比較の検討のいくつかを図９に示しており、高濃度で果実アントシアニンを蓄積する種と蓄積しない種間での明瞭な差異である、たった一つのアミノ酸としてＡＮＴ１遺伝子の１８７位プロリンのグルタミンへの置換を表している。この結果は、この単一アミノ酸置換のみがＡＦＴ表現型に見られる果実アントシアニン蓄積の増加の要因になり得ることを明らかにしている。しかし、ＡＮＴ１遺伝子における他のアミノ酸変化が同程度またはそれ以上の果実アントシアニン蓄積表現型を産生する可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
本発明を理解し、本発明の実施方法が分かるように、非限定例であるが添付の図面を参照して好ましい実施例をここに開示する。
【０１５９】
【図１】図１は、アントシアニンおよびフラボノールの生合成経路の概略図である（ホルトンとコーニシュ著「植物細胞」第７号（１９９５年）１０７１〜１０８３頁援用）。
【図２】図２は、アイルサ・クレイグ品種（上図）とＬＡ１９９６（下図）とのＡＮＴ１遺伝子のヌクレオチド配列の比較を概略的に示している（開始コドンおよび終止コドンは両配列に下線をつけており、イントロン領域は黄色で彩色している）。
【図３】図３は、アイルサ・クレイグ品種（上図）とＬＡ１９９６（下図）とのＡＮＴ１タンパク質のアミノ酸比較を概略的に示している（２線間で異なるアミノ酸を黄色で彩色している）。
【図４】図４は、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（ＡＮＴｌ−Ｌ）由来のＡＮＴ１対立遺伝子とＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ（ＡＮＴｌ−Ｃ）由来のＡＮＴ１対立遺伝子間の共優性遺伝子多型を示す写真画像である。
【図５】図５は、ＡＮＴ１遺伝子と、ＡＮＴ１とｈｐ−１に分離するＦ２群中のアントシアニン蓄積の形質の関連性を視覚表示している（各果実は夫々の遺伝子型の個々の植物体から得られたものである）。
【図６】図６は、トマトゲノムに対するＡＮＴ１の制限酵素遺伝子解析を表した写真および配置図である（トマト染色体１０のマップはネット資料<http://tgrc.ucdavis.edu/pennellii-ILs.pdf>から援用）。
【図７】図７は、カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓ構成プロモーターの制御下において、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ（ＡＮＴｌ−Ｃ）由来のＡＮＴ１遺伝子で形質転換されたタバコ再生体およびＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（ＡＮＴｌ−Ｌ）由来のＡＮＴ１遺伝子で形質転換されたタバコ再生体との比較写真である。
【図８】図８は、カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓ構成プロモーターの制御下におけるＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ（ＡＮＴｌ−Ｃ）由来のＡＮＴ１遺伝子で形質転換されたトマトおよびＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（ＡＮＴｌ−Ｌ）由来のＡＮＴ１遺伝子で形質転換されたトマト（マネーメーカー品種）再生体の比較写真である。
【図９】図９は、トマト登録品種およびコショウからクローンが作られたＡＮＴ１遺伝子のアミノ酸配列の概略図である（果実アントシアニンを蓄積していない登録品種：ＬＡ１５８９はＳ．Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ、ＬＡ２８３８ＡはＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍである。／果実アントシアニンを蓄積している登録品種：ＰＩ１２８６５０はＳ．Ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ、ｈｐ−７９９は未知のＳ．ＰｅｒｕｖｉａｎｕｍとＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍとの交配から生まれた選択系統、ＬＡ１９９６はＳ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ由来のＡＦＴ遺伝子型、ＣＡＥ７５７４５はアントシアニンを蓄積するコショウである）。
【図１０】図１０は、本発明の一態様によるｈｐ−１変異およびＡＮＴ１−Ｃ対立遺伝子（ＡＮＴ１−Ｃ／ＡＮＴ１−Ｃ  ｈｐ−１／ｈｐ−１）が同型接合したＦ３植物体とＬＡ１９９６植物体（ＡＮＴ１−Ｃ／ＡＮＴ１−Ｃ  ＋／＋）から得られたトマト果実を示している。
【図１１】図１１は、本発明の別の態様によるＳ．Ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ（ＡＮＴ１−Ｐ／ＡＮＴ１−Ｐ  ｈｐ−１／ｈｐ−１）由来のＡＮＴ１対立遺伝子とｈｐ−１変異が同型接合した登録品種のトマト植物および果実を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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2010517526.tif 000024
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