(57)【要約】  核酸の発現のための組成物及び方法がここに提供される。トランスポゾンベースの核酸コンストラクトを使用するトランスジェニック細胞及び動物中における核酸の誘導性発現のための組成物及び方法がまたここに提供される。内因性遺伝子発現の調節のための組成物及び方法がまたここに提供される。
2010512794.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）誘導プロモーターに作用可能に結合したポリヌクレオチドを含む第一転写ユニットであって、誘導プロモーターが一又は複数のＴｅｔＯ配列を含むものと；
（ｂ）ＴｅｔＲをコードするコード配列を含む第二転写ユニットと；
（ｃ）インバーテッドリピートの一方が（ａ）及び（ｂ）の５’であり、インバーテッドリピートの他方が（ａ）及び（ｂ）の３’である一対のインバーテッドリピート
を含む核酸コンストラクト。
【請求項２】
インバーテッドリピートの対がｐｉｇｇｙＢａｃインバーテッドリピートである請求項１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項３】
インバーテッドリピートの一方又は他方が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択されるポリヌクレオチド配列を含む請求項２に記載の核酸コンストラクト。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが調節ＲＮＡをコードする請求項１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項５】
調節ＲＮＡがｓｈＲＮＡである請求項４に記載の核酸コンストラクト。
【請求項６】
誘導プロモーターがＨ１又はＵ６プロモーターを更に含む請求項１から４の何れか一項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項７】
誘導プロモーターが少なくとも二のＴｅｔＯ配列を含む請求項６に記載の核酸コンストラクト。
【請求項８】
誘導プロモーターが配列番号１６の核酸配列を含む請求項７に記載の核酸コンストラクト。
【請求項９】
ポリヌクレオチドが第一ＲＮＡをコードし、核酸コンストラクトが第三転写ユニットを更に含み、第三転写ユニットが誘導プロモーターと作用可能に結合した第二ポリヌクレオチドを含み、第二ポリヌクレオチドが第二ＲＮＡをコードし、第一ＲＮＡ及び第二ＲＮＡが相補的である少なくとも１０の近接ヌクレオチドの配列を含む請求項１又は２に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１０】
選択マーカーを更に含む請求項１から４の何れか一項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１１】
選択マーカーが第二転写ユニットに配されている請求項１０に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１２】
ＩＲＥＳが、ＴｅｔＲをコードするコード配列と選択マーカーの間に配されている請求項１１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１３】
ＴｅｔＲをコードするコード配列がコドン最適化されている請求項１から４の何れか一項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１４】
ＴｅｔＲをコードするコード配列が配列番号１５のヌクレオチド１−５０７の核酸配列を含む請求項１３に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１５】
細胞においてポリヌクレオチドを発現させる方法において、
（ａ）細胞中に、
（ｉ）誘導プロモーターに作用可能に結合したポリヌクレオチドを含む第一転写ユニットであって、誘導プロモーターが一又は複数のＴｅｔＯ配列を含むものと；
（ｉｉ）ＴｅｔＲをコードするコード配列を含む第二転写ユニットと；
（ｉｉｉ）インバーテッドリピートの一方が（ｉ）及び（ｉｉ）の５’であり、インバーテッドリピートの他方が（ｉ）及び（ｉｉ）の３’である一対のインバーテッドリピート
を含む核酸コンストラクトを導入し、
（ｂ）該細胞を、誘導プロモーターからポリヌクレオチドの発現を誘導する誘導剤に暴露する
ことを含む方法。
【請求項１６】
インバーテッドリピートの対がｐｉｇｇｙＢａｃインバーテッドリピートである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
インバーテッドリピートの一方又は他方が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択されるポリヌクレオチド配列を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドが調節ＲＮＡをコードする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
調節ＲＮＡがｓｈＲＮＡである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
インバーテッドリピートに作用するトランスポサーゼをコードするポリヌクレオチドを細胞中に導入して核酸転位を媒介することを更に含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
トランスポサーゼがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
トランスポサーゼが、（ａ）配列番号１４に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）（ａ）の断片を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞における内因性遺伝子の発現を阻害する方法において、
（ａ）細胞中に、
（ｉ）誘導プロモーターに作用可能に結合したポリヌクレオチドを含む第一転写ユニットであって、ポリヌクレオチドが内因性遺伝子に特異的な調節ＲＮＡをコードするものと；
（ｉｉ）インバーテッドリピートの一方が（ｉ）の５’であり、インバーテッドリピートの他方が（ｉ）の３’である一対のインバーテッドリピート
を含む核酸コンストラクトを導入し、
（ｂ）該細胞を、誘導プロモーターからポリヌクレオチドの発現を誘導する誘導剤に暴露する
ことを含む方法。
【請求項２４】
調節ＲＮＡがｓｈＲＮＡである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
誘導プロモーターが一又は複数のＴｅｔＯ配列を含み、核酸コンストラクトが、ＴｅｔＲをコードするコード配列を含む第二転写ユニットを更に含み、インバーテッドリピートの一方が第二転写ユニットの５’のものであり、インバーテッドリピートの他方が第二転写ユニットの３’のものである請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
インバーテッドリピートがｐｉｇｇｙＢａｃインバーテッドリピートである請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
インバーテッドリピートの一方又は他方が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択されるポリヌクレオチド配列を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼをコードするポリヌクレオチドを細胞中に導入することを更に含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼが、（ａ）配列番号１４に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）（ａ）の断片を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ｓｈＲＮＡが、（ａ）リピンをコードする遺伝子、（ｂ）ＶＥＧＦをコードする遺伝子、又は（ｃ）癌遺伝子である遺伝子から選択される内因性遺伝子に対して特異的である請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
細胞が胚細胞である請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
第二転写ユニットが選択マーカーを更に含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
ＩＲＥＳが、ＴｅｔＲをコードするコード配列と選択マーカーの間に配されている請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＴｅｔＲをコードするコード配列がコドン最適化されている請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
ＴｅｔＲをコードするコード配列が配列番号１５のヌクレオチド１−５０７の核酸配列を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
誘導プロモーターがＨ１又はＵ６プロモーターを含む請求項２３から２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項３７】
誘導プロモーターが少なくとも二のＴｅｔＯ配列を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
誘導プロモーターが配列番号１６の核酸配列を含む請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
トランスジェニック哺乳動物においてポリヌクレオチドを発現させる方法において、
（ａ）哺乳類の非ヒト胚細胞中に、
（ｉ）誘導プロモーターに作用可能に結合したポリヌクレオチドを含む第一転写ユニットであって、ポリヌクレオチドが内因性遺伝子に特異的な調節ＲＮＡをコードするものと；
（ｉｉ）インバーテッドリピートの一方が（ｉ）の５’であり、インバーテッドリピートの他方が（ｉ）の３’である一対のインバーテッドリピート
を含む核酸コンストラクトを導入し；
（ｂ）該哺乳類の非ヒト胚細胞中に、インバーテッドリピートに作用するトランスポサーゼをコードするポリヌクレオチドを導入して核酸転位を媒介させ；
（ｃ）核酸コンストラクトとトランスポサーゼをコードするコード配列が導入された哺乳類の非ヒト胚細胞からトランスジェニック哺乳動物を生産し；
（ｄ）誘導プロモーターからポリヌクレオチドの発現を誘導する誘導剤をトランスジェニック哺乳動物に投与する
ことを更に含む方法。
【請求項４０】
調節ＲＮＡがｓｈＲＮＡである請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
誘導プロモーターが一又は複数のＴｅｔＯ配列を含み、核酸コンストラクトが、ＴｅｔＲをコードするコード配列を含む第二転写ユニットを更に含み、インバーテッドリピートの一方が第二転写ユニットの５’のものであり、インバーテッドリピートの他方が第二転写ユニットの３’のものである請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
インバーテッドリピートの対がｐｉｇｇｙＢａｃトランスポソンから誘導され、トランスポサーゼがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼである請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
インバーテッドリピートの一方又は他方が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択されるポリヌクレオチド配列を含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
トランスポサーゼが、（ａ）配列番号１４に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）（ａ）の断片を含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ｓｈＲＮＡが、（ａ）リピンをコードする遺伝子、（ｂ）ＶＥＧＦをコードする遺伝子、又は（ｃ）癌遺伝子である遺伝子から選択される内因性遺伝子に対して特異的である請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
哺乳類の非ヒト胚細胞がマウス細胞である請求項３９から４２の何れか一項に記載の方法。
【請求項４７】
哺乳類の非ヒト胚細胞が受精卵である請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
（ａ）誘導プロモーターに作用可能に結合したポリヌクレオチドを含む第一転写ユニットであって、ポリヌクレオチドが内因性遺伝子に特異的な調節ＲＮＡをコードするものと；
（ｂ）インバーテッドリピートの一方が（ａ）の５’であり、インバーテッドリピートの他方が（ｂ）の３’である一対のインバーテッドリピート
を含む核酸コンストラクト。
【請求項４９】
調節ＲＮＡがｓｈＲＮＡである請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
誘導プロモーターが一又は複数のＴｅｔＯ配列を含み、核酸コンストラクトが、ＴｅｔＲをコードするコード配列を含む第二転写ユニットを更に含む請求項４８に記載の核酸コンストラクト。
【請求項５１】
インバーテッドリピートがｐｉｇｇｙＢａｃインバーテッドリピートである請求項４８に記載の核酸コンストラクト。
【請求項５２】
インバーテッドリピートの一方又は他方が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択されるポリヌクレオチド配列を含む請求項５１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項５３】
ｓｈＲＮＡが、（ａ）リピンをコードする遺伝子、（ｂ）ＶＥＧＦをコードする遺伝子、又は（ｃ）癌遺伝子である遺伝子から選択される内因性遺伝子に対して特異的である請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
第二転写ユニットが選択マーカーを更に含む請求項５０に記載の核酸コンストラクト。
【請求項５５】
ＩＲＥＳが、ＴｅｔＲをコードするコード配列と選択マーカーの間に配されている請求項５４に記載の核酸コンストラクト。
【請求項５６】
ＴｅｔＲをコードするコード配列がコドン最適化されている請求項５０に記載の核酸コンストラクト。
【請求項５７】
ＴｅｔＲをコードするコード配列が配列番号１５のヌクレオチド１−５０７の核酸配列を含む請求項５６に記載の核酸コンストラクト。
【請求項５８】
誘導プロモーターがＨ１又はＵ６プロモーターを含む請求項４８から５１の何れか一項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項５９】
誘導プロモーターが少なくとも二のＴｅｔＯ配列を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
誘導プロモーターが配列番号１６の核酸配列を含む請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
請求項１から４又は請求項４８から５１の何れか一項に記載の核酸コンストラクトを含む細胞。
【請求項６２】
細胞が哺乳動物細胞である請求項６１に記載の細胞。
【請求項６３】
哺乳動物細胞が胚細胞である請求項６２に記載の細胞。
【請求項６４】
哺乳動物細胞がマウス細胞である請求項６２に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、その開示の全体を出典明示によりここに援用する２００６年１２月３１日出願の米国仮出願第６０／８７１３９０号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、トランスポゾンベースの核酸コンストラクトを使用するトランスジェニック細胞及び動物中における核酸の誘導発現に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞及び動物中における遺伝子発現を調節する能力は遺伝子機能の研究に有用である。例えば、ある遺伝子の機能は、その遺伝子を実質的に発現しない細胞において該遺伝子を発現させることによって、又はその細胞において通常観察される発現レベルを越えるレベルまでその遺伝子を発現させることによって、解明することができる。また、ある遺伝子の機能は、その遺伝子を発現する細胞中においてその遺伝子の発現を阻害するか又は「ノックダウン」することによって解明できる。
【０００４】
一般的なジーンターゲティング法はマウスのような哺乳動物において遺伝子機能を破壊するのに有用であることは分かっているが、かかる方法は遺伝子機能についてはしばしば限られた情報しかもたらさない。例えば、マウスにおける一般的なジーンターゲティング法による遺伝子の破壊は初期胚性致死を生じ、よってマウスの発育の後の段階及び成体マウスにおける遺伝子の機能についてのありうる情報は限られる。選択された発達段階での遺伝子機能を誘導的に又は条件的に破壊する能力は遺伝子機能についてかなり多くの情報を提供し、遺伝的欠陥を補償することを目的とした治療的介入の標的を更に同定しうる。
【０００５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は遺伝子発現を調節する方法である。しかしながら、ＲＮＡｉの使用は、ｓｉＲＮＡのようなＲＮＡ分子を細胞及び／又は動物へ効果的に送達し及び／又は誘導的に発現させるための信頼できる方法がないことによって妨害されている。細胞系へのＲＮＡ分子の効果的な送達及び／又は誘導的発現を達成する能力は、ＲＮＡｉを一般的な遺伝子機能のノックダウンに対する強力な機能的ゲノミクスツールにするであろう。更に、ターゲット遺伝子の発現を選択的に阻害する能力は、例えば動物にとって有害なタンパク質の生産を防止する、重要な治療的意味を有している。
よって、細胞及び動物において核酸を発現させ、遺伝子発現を調節するための信頼できる効果的な方法に対する必要性がある。本発明は上述の必要性を満たし、他の恩恵をもたらす。
【発明の概要】
【０００６】
核酸の発現のための組成物と方法がここに提供される。ある実施態様では、かかる組成物と方法によって、トランスポゾンベースのコンストラクトからの核酸の誘導的発現が可能になる。
一態様では、（１）誘導プロモーターに作用可能に結合したポリヌクレオチドと（２）該ポリヌクレオチドに隣接するトランスポゾン誘導インバーテッドリピートを含む核酸コンストラクトが提供される。一実施態様では、トランスポゾン誘導インバーテッドリピートはｐｉｇｇｙＢａｃインバーテッドリピートである。他の実施態様では、ポリヌクレオチドは調節ＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡをコードする。
【０００７】
他の態様では、（ａ）誘導プロモーターに作用可能に結合したポリヌクレオチドを含む第一転写ユニットであって、誘導プロモーターが一又は複数のＴｅｔＯ配列を含むものと；（ｂ）ＴｅｔＲをコードするコード配列を含む第二転写ユニットと；（ｃ）インバーテッドリピートの一方が（ａ）及び（ｂ）の５’であり、インバーテッドリピートの他方が（ａ）及び（ｂ）の３’である一対のインバーテッドリピートを含む核酸コンストラクトが提供される。一実施態様では、インバーテッドリピートの対はｐｉｇｇｙＢａｃインバーテッドリピートである。一実施態様では、インバーテッドリピートの一方又は他方が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
ある実施態様では、ポリヌクレオチドは調節ＲＮＡをコードする。かかる一実施態様では、調節ＲＮＡはｓｈＲＮＡである。
【０００８】
ある実施態様では、誘導プロモーターはＨ１又はＵ６プロモーターを更に含む。かかる一実施態様では、誘導プロモーターはＨ１プロモーターを更に含む。ある実施態様では、誘導プロモーターは少なくとも二のＴｅｔＯ配列を含む。かかる一実施態様では、誘導プロモーターは少なくとも二のＴｅｔＯ配列に作用可能に結合したＨ１プロモーターを含む。かかる一実施態様では、誘導プロモーターは配列番号１６の核酸配列を含む。
ある実施態様では、ポリヌクレオチドは第一ＲＮＡをコードし、核酸コンストラクトが第三転写ユニットを更に含み、第三転写ユニットが誘導プロモーターと作用可能に結合した第二ポリヌクレオチドを含み、第二ポリヌクレオチドが第二ＲＮＡをコードし、第一ＲＮＡ及び第二ＲＮＡが相補的である少なくとも１０の近接ヌクレオチドの配列を含む。
ある実施態様では、核酸コンストラクトは選択マーカーを更に含む。ある実施態様では、第二転写ユニットが選択マーカーを更に含む。かかる一実施態様では、選択マーカーはピューロマイシンに耐性を付与する。他のかかる実施態様では、ＩＲＥＳが、ＴｅｔＲをコードするコード配列と選択マーカーの間に配されている。
ある実施態様では、ＴｅｔＲをコードするコード配列はコドン最適化されている。かかる一実施態様では、ＴｅｔＲをコードするコード配列は配列番号１５のヌクレオチド１−５０７の核酸配列を含む。
【０００９】
更に他の態様では、細胞においてポリヌクレオチドを発現させる方法において、（ａ）細胞中に、（ｉ）誘導プロモーターに作用可能に結合したポリヌクレオチドを含む第一転写ユニットであって、誘導プロモーターが一又は複数のＴｅｔＯ配列を含むものと；（ｉｉ）ＴｅｔＲをコードするコード配列を含む第二転写ユニットと；（ｉｉｉ）インバーテッドリピートの一方が（ｉ）及び（ｉｉ）の５’であり、インバーテッドリピートの他方が（ｉ）及び（ｉｉ）の３’である一対のインバーテッドリピートを含む核酸コンストラクトを導入し；（ｂ）該細胞を、誘導プロモーターからポリヌクレオチドの発現を誘導する誘導剤に暴露することを含む方法が提供される。ある実施態様では、インバーテッドリピートの対はｐｉｇｇｙＢａｃインバーテッドリピートである。かかる一実施態様では、インバーテッドリピートの一方又は他方が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
ある実施態様では、ポリヌクレオチドは調節ＲＮＡをコードする。かかる一実施態様では、調節ＲＮＡはｓｈＲＮＡである。
【００１０】
ある実施態様では、該方法は、インバーテッドリピートに作用するトランスポサーゼをコードするポリヌクレオチドを細胞中に導入して核酸転位を媒介することを更に含む。かかる一実施態様では、トランスポサーゼはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼである。かかる一実施態様では、トランスポサーゼは、（ａ）配列番号１４に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）（ａ）の断片を含む。
【００１１】
更に他の態様では、細胞における内因性遺伝子の発現を阻害する方法において、（ａ）細胞中に、（ｉ）誘導プロモーターに作用可能に結合したポリヌクレオチドを含む第一転写ユニットであって、ポリヌクレオチドが内因性遺伝子に特異的な調節ＲＮＡをコードするものと；（ｉｉ）インバーテッドリピートの一方が（ｉ）の５’であり、インバーテッドリピートの他方が（ｉ）の３’である一対のインバーテッドリピートを含む核酸コンストラクトを導入し；（ｂ）該細胞を、誘導プロモーターからポリヌクレオチドの発現を誘導する誘導剤に暴露することを含む方法が提供される。ある実施態様では、細胞は胚細胞である。
ある実施態様では、調節ＲＮＡはｓｈＲＮＡである。かかる一実施態様では、ｓｈＲＮＡは、（ａ）リピンをコードする遺伝子、（ｂ）ＶＥＧＦをコードする遺伝子、又は（ｃ）癌遺伝子である遺伝子から選択される内因性遺伝子に対して特異的である。
【００１２】
ある実施態様では、誘導プロモーターは一又は複数のＴｅｔＯ配列を含み、核酸コンストラクトが、ＴｅｔＲをコードするコード配列を含む第二転写ユニットを更に含み、インバーテッドリピートの一方が第二転写ユニットの５’のものであり、インバーテッドリピートの他方が第二転写ユニットの３’のものである。
ある実施態様では、インバーテッドリピートはｐｉｇｇｙＢａｃインバーテッドリピートである。かかる一実施態様では、インバーテッドリピートの一方又は他方が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。ある一実施態様では、該方法は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼをコードするポリヌクレオチドを細胞中に導入することを更に含む。かかる一実施態様では、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼは、（ａ）配列番号１４に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）（ａ）の断片を含む。
【００１３】
ある実施態様では、第二転写ユニットは選択マーカーを更に含む。かかる一実施態様では、ＩＲＥＳは、ＴｅｔＲをコードするコード配列と選択マーカーの間に配されている。ある実施態様では、ＴｅｔＲをコードするコード配列がコドン最適化されている。かかる一実施態様では、ＴｅｔＲをコードするコード配列は配列番号１５のヌクレオチド１−５０７の核酸配列を含む。
ある実施態様では、誘導プロモーターはＨ１又はＵ６プロモーターを含む。ある実施態様では、誘導プロモーターは少なくとも二のＴｅｔＯ配列を含む。かかる一実施態様では、誘導プロモーターは配列番号１６の核酸配列を含む。
【００１４】
更に他の態様では、トランスジェニック哺乳動物においてポリヌクレオチドを発現させる方法において、（ａ）哺乳類の非ヒト胚細胞中に、（ｉ）誘導プロモーターに作用可能に結合したポリヌクレオチドを含む第一転写ユニットであって、ポリヌクレオチドが内因性遺伝子に特異的な調節ＲＮＡをコードするものと；（ｉｉ）インバーテッドリピートの一方が（ｉ）の５’であり、インバーテッドリピートの他方が（ｉ）の３’である一対のインバーテッドリピートを含む核酸コンストラクトを導入し；（ｂ）該哺乳類の非ヒト胚細胞中に、インバーテッドリピートに作用するトランスポサーゼをコードするポリヌクレオチドを導入して核酸転位を媒介させ；（ｃ）核酸コンストラクトとトランスポサーゼをコードするコード配列が導入された哺乳類の非ヒト胚細胞からトランスジェニック哺乳動物を生産し；（ｄ）誘導プロモーターからポリヌクレオチドの発現を誘導する誘導剤をトランスジェニック哺乳動物に投与することを含む方法が提供される。
【００１５】
ある実施態様では、調節ＲＮＡはｓｈＲＮＡである。かかる一実施態様では、ｓｈＲＮＡは、（ａ）リピンをコードする遺伝子、（ｂ）ＶＥＧＦをコードする遺伝子、又は（ｃ）癌遺伝子である遺伝子から選択される内因性遺伝子に対して特異的である。
ある実施態様では、誘導プロモーターは一又は複数のＴｅｔＯ配列を含み、核酸コンストラクトが、ＴｅｔＲをコードするコード配列を含む第二転写ユニットを更に含み、インバーテッドリピートの一方が第二転写ユニットの５’のものであり、インバーテッドリピートの他方が第二転写ユニットの３’のものである。
ある実施態様では、インバーテッドリピートの対はｐｉｇｇｙＢａｃトランスポソンから誘導され、トランスポサーゼはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼである。かかる一実施態様では、インバーテッドリピートの一方又は他方が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。他の実施態様では、トランスポサーゼは、（ａ）配列番号１４に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）（ａ）の断片を含む。
ある実施態様では、哺乳類の非ヒト胚細胞はマウス細胞である。かかる一実施態様では、哺乳類の非ヒト胚細胞は受精卵である。
【００１６】
更に他の態様では、（ａ）誘導プロモーターに作用可能に結合したポリヌクレオチドを含む第一転写ユニットであって、ポリヌクレオチドが内因性遺伝子に特異的な調節ＲＮＡをコードするものと；（ｂ）インバーテッドリピートの一方が（ａ）の５’であり、インバーテッドリピートの他方が（ｂ）の３’である一対のインバーテッドリピートを含む核酸コンストラクトが提供される。
ある実施態様では、調節ＲＮＡはｓｈＲＮＡである。かかる一実施態様では、ｓｈＲＮＡは、（ａ）リピンをコードする遺伝子、（ｂ）ＶＥＧＦをコードする遺伝子、又は（ｃ）癌遺伝子である遺伝子から選択される遺伝子に対して特異的である。
ある実施態様では、誘導プロモーターは一又は複数のＴｅｔＯ配列を含み、核酸コンストラクトが、ＴｅｔＲをコードするコード配列を含む第二転写ユニットを更に含む。
【００１７】
ある実施態様では、インバーテッドリピートはｐｉｇｇｙＢａｃインバーテッドリピートである。ある実施態様では、インバーテッドリピートの一方又は他方は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
ある実施態様では、第二転写ユニットは選択マーカーを更に含む。かかる一実施態様では、ＩＲＥＳは、ＴｅｔＲをコードするコード配列と選択マーカーの間に配されている。ある実施態様では、ＴｅｔＲをコードするコード配列はコドン最適化されている。かかる一実施態様では、ＴｅｔＲをコードするコード配列は配列番号１５のヌクレオチド１−５０７の核酸配列を含む。
【００１８】
ある実施態様では、誘導プロモーターはＨ１又はＵ６プロモーターを含む。ある実施態様では、誘導プロモーターは少なくとも二のＴｅｔＯ配列を含む。かかる一実施態様では、誘導プロモーターは配列番号１６の核酸配列を含む。
更に他の態様では、上記の核酸コンストラクトを含む細胞が提供される。かかる一実施態様では、細胞は哺乳動物細胞である。かかる一実施態様では、哺乳動物細胞は胚細胞である。かかる他の実施態様では、哺乳動物細胞はマウス細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例Ａに記載されたような、ルシフェラーゼに特異的なｓｈＲＮＡの誘導性発現のためのｐｉｇｇｙＢａｃベースのベクター「ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）」を示す。
【図２】実施例Ａに記載されたような機能的エレメントの注釈を付した、図１のベクターのヌクレオチド配列（配列番号１７）を示す。コドン最適化ＴｅｔＲのアミノ酸配列（配列番号２１）もまた示す。ピューロマイシン選択マーカーのアミノ酸配列（配列番号２２）もまた示す。
【図３】実施例Ｂに記載されたような、ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）を形質移入した胚性幹（ＥＳ）細胞におけるルシフェラーゼに特異的なｓｈＲＮＡのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性発現及びルシフェラーゼ活性のノックダウンを示す。
【図４】実施例Ｂに記載されたような、ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）を形質移入したＥＳ細胞から単離されたクローンにおけるルシフェラーゼに特異的なｓｈＲＮＡのＤｏｘ誘導性発現及びルシフェラーゼ活性のノックダウンを示す。
【図５】図４のＥＳ細胞からのバイオルミネセンスの定量化を示す。
【図６】実施例Ｂに記載されたような、ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）を形質移入しＤｏｘで処理したＥＳ細胞から誘導された胚様体からのバイオルミネセンスの定量化を示す。
【図７】実施例Ｃに記載されたような、ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）を注射した単細胞胚から誘導されたルシフェラーゼ発現トランスジェニックマウスに対する３日間のＤｏｘ投与の効果を示す。
【図８】実施例Ｃに記載されたような、図７のトランスジェニックマウスのバイオルミネセンスの定量化を示す。
【図９】実施例Ｃに記載されたような、ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）を注射した単細胞胚から誘導されたルシフェラーゼ発現トランスジェニックマウスに対する７日間のＤｏｘ投与の効果を示す。
【図１０】実施例Ｄに記載されたような、リピンに特異的なｓｈＲＮＡの誘導的発現のためにｐｉｇｇｙＢａｃベースのベクターを構築するための方策を示す。
【図１１】実施例Ｃに記載されたような、ｐＣＡＧ−ＰＢａｓｅのヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
実施態様の詳細な説明
核酸の発現のための組成物と方法が提供される。ある実施態様では、かかる組成物と方法により、トランスジェニック細胞及び動物においてトランスポゾンベースの核酸コンストラクトからの核酸の誘導性発現が可能になる。更なる実施態様では、かかる組成物と方法は、誘導的な形で、核酸配列、例えば内因性遺伝子の発現を阻害又は「ノックダウン」するために使用することができ、これにより、例えば一般的なジーンターゲティング技術による破壊が初期段階の致死を引き起こしうる遺伝子のような遺伝子の「条件付きノックダウン」を作り出すことが可能になる。
【００２１】
１．定義
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」なる用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの構築の前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されうる。ポリヌクレオチドは重合後に、例えば標識成分との結合により、更に修飾されうる。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤を含むもの(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチドの未修飾形態が含まれる。更に、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへの更なる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体又は半固体支持体に結合されてもよい。５'及び３'末端ＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有するアミン又は有機キャップ基部分で置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されうる。またポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態を含み得、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ-又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖類似体、α-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えうる。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ又はＲ'は独立してＨ、又はエーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同���である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００２２】
細胞又は生物学的分子、例えば核酸、ポリペプチド、又は抗体に対する「単離された」なる用語は、その自然環境の少なくとも一の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。
ハイブリダイゼーションに関しての「ストリンジェントな条件」なる用語は、核酸のハイブリダイゼーションが６５℃の５×ＳＳＣ、５×デンハート液、１％ＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中で起こり、ハイブリダイゼーションの後に次の洗浄（第二回目の洗浄は高ストリンジェントな洗浄である）が続くことを意味する：室温で０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで１０分；及び６５℃で０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＤＤＣで３０分。更なる詳細については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology (1995), Wiley Interscience Publishersを参照のこと。
【００２３】
「核酸コンストラクト」なる用語は、自然では通常互いに伴わないポリヌクレオチドセグメントを含む組換え核酸分子を意味する。核酸コンストラクトは染色体外であるか、宿主細胞の染色体中に組み込まれうる。
「対象のポリヌクレオチド」なる用語は非限定的で、任意のポリヌクレオチドを意味する。
「隣接」なる用語は、与えられた核酸配列が特定の参照配列の５’及び３’に現れることを意味する。介在配列が、与えられた核酸配列と参照配列の間に生じうる。
「転写ユニット」なる用語は、転写される少なくとも一のポリヌクレオチド配列を含み、配列が特定のプロモーターに作用可能に結合している核酸コンストラクト内の領域を意味する。
【００２４】
「ｓｉＲＮＡ」又は「低分子干渉ＲＮＡ」なる用語は、ｓｉＲＮＡが標的ポリヌクレオチドと同じ細胞中で発現される場合に標的ポリヌクレオチドの発現を減少させ又は阻害する能力を有している二本鎖ＲＮＡを意味する。二本鎖ＲＮＡを形成するｓｉＲＮＡの相補鎖は典型的には実質的な又は完全な同一性を有している。一実施態様では、ｓｉＲＮＡは二本鎖ＲＮＡであって、その一方の鎖（「アンチセンス」鎖とも呼ぶ）が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的な又は完全な同一性を有している。ある実施態様では、ｓｉＲＮＡは、約１５−５０ヌクレオチド長、約２０−３０ヌクレオチド長、約２０−２５ヌクレオチド長、又は２４−２９ヌクレオチド長であり、上述の範囲内の整数である任意の長さを含む。その全体が出典明示によりここに援用されるＷＯ０３０７６５９２として公開されたＰＣＴ／ＵＳ０３／０７２３７もまた参照のこと。ｓｉＲＮＡ分子は、もしそれが、（ａ）標的ポリヌクレオチド（又は標的ポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡ）に選択的に結合し、及び／又は（ｂ）標的ポリヌクレオチドを発現する細胞においてｓｉＲＮＡが発現される場合、標的ポリヌクレオチドの発現を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％だけ低減させるならば、標的ポリヌクレオチドに対して「特異的」である。
【００２５】
「ｓｉＲＮＡ」なる用語は、例えばミクロＲＮＡ前躯体（プレ-ｍｉＲＮＡ）及び低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のようなヘアピン構造を形成可能なＲＮＡを包含する。例えば、Brummelkamp等 (2002) Science 550-553を参照のこと。プレ−ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、センス領域、アンチセンス領域、及びループ領域を有し、ヘアピン構造を形成可能である自己相補的なＲＮＡ分子である。ある実施態様では、センス及びアンチセンス領域はそれぞれ約１５−５０ヌクレオチド長、約２０−３０ヌクレオチド長、約２０−２５ヌクレオチド長、又は２４−２９ヌクレオチド長であり、前記範囲内の整数である任意の長さを含む；またループ部分は約２−１５ヌクレオチド長又は約６−９ヌクレオチド長であり、前記範囲内の整数である任意の長さを含む。
「ＲＮＡｉ」又は「ＲＮＡ干渉」は、例えば二本鎖ＲＮＡ媒介メカニズムによるＲＮＡ媒介メカニズムによる遺伝子発現の部分的な又は完全な阻害を意味する。
【００２６】
「調節ＲＮＡ」又は「調節ＲＮＡ分子」なる用語は、例えば対応するｍＲＮＡの発現を調節することにより、遺伝子の発現を調節することができるＲＮＡを意味する。かかる調節ＲＮＡには、限定するものではないが、ＲＮＡｉ可能なＲＮＡが含まれる。調節ＲＮＡは、もしそれが、（ａ）標的ポリヌクレオチド（又は標的ポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡ）に選択的に結合し、及び／又は（ｂ）標的ポリヌクレオチドを発現する細胞において調節ＲＮＡが発現される場合、標的ポリヌクレオチドの発現を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％だけ低減させるならば、標的ポリヌクレオチドに対して「特異的」である。
「調節エレメント」なる用語は、ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を調節する一又は複数のヌクレオチド配列を意味する。転写調節エレメントには、限定されるものではないが、作用可能に結合したポリヌクレオチドの発現を駆動可能なプロモーター；プロモーターの転写促進活性に影響を及ぼすプロモーター内のオペレーター配列；転写終結配列；及びポリアデニル化シグナル配列が含まれる。
【００２７】
「作用可能に結合」なる用語は、成分がその意図された形で機能することを可能にする関係にある二以上の成分の近位を意味する。例えば、プロモーターは、それがシスでポリヌクレオチド配列の転写を制御するように作用するならば、ポリヌクレオチドに「作用可能に結合」している。「作用可能に結合」している核酸配列は近接していても近接していなくともよい。
ここで使用される「発現」なる用語は、細胞内で生じる与えられた核酸の転写又は翻訳を意味する。発現レベルは、核酸から転写されるＲＮＡの量か、もしＲＮＡが翻訳される場合は、コードされるタンパク質の量の何れかに基づいて決定することができる。例えば、与えられた核酸から転写されたｍＲＮＡはＰＣＲ又はノーザンハイブリダイゼーションにより定量できる（Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)を参照)。与えられた核酸によりコードされるタンパク質は、様々な方法、例えばＥＬＩＳＡにより、タンパク質の生物活性をアッセイすることにより、又はそのような活性とは独立したアッセイ、例えばウェスタンブロット法又はラジオイムノアッセイを用いて、タンパク質を認識しそれに結合する抗体を用いて、定量することができる。上掲のSambrook等, 1989。
【００２８】
「阻害する」なる用語は、特定のプロセス又は結果を部分的に又は完全に減少させ又はブロックすることを意味する。
「プロモーター」なる用語は、それが作用可能に結合した核酸の転写を制御するポリヌクレオチド配列を意味する。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合及び転写開始のシグナルを含む。ある実施態様では、プロモーターは更なる調節エレメント、例えばオペレーター配列を含む。様々な異なった供給源からの構成的、誘導性及び抑制性プロモーターを含む多数のプロモーターが当該分野においてよく知られており（またＧｅｎＢａｎｋのようなデータベースにおいて同定され）、クローン化ポリヌクレオチドとして（例えばＡＴＣＣのような寄託期間並びに他の商業的又は個人の供給源から）入手できる。誘導プロモーターでは、プロモーターの活性は、例えば誘導剤のようなシグナルに応答して増加又は減少する。強力なプロモーターとして同定されているプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、及びヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）である。
【００２９】
「誘導プロモーター」なる用語は、その活性が一又は複数の特異的シグナルを加え又は取り除くことにより調節されうるプロモーターを意味する。例えば、誘導プロモーターは、特定の条件セットの下、例えばプロモーターを活性化し、及び／又はプロモーターの抑制を軽減する誘導剤の存在下で、作用可能に結合したポリヌクレオチドの転写を活性化しうる。
「誘導剤」なる用語は、誘導プロモーターの活性を調節することができる任意の薬剤を意味する。誘導剤には、限定されるものではないが、化学的化合物、生物学的巨大分子、又はそれらの任意の組合せが含まれる。
【００３０】
「インバーテッドリピート」又は「ＩＲ」なる用語は、核酸配列の２つのコピーが、転位性核酸分子中に存在する場合に反対の配向にある、トランスポゾンから誘導され、トランスポサーゼによって作用させられた核酸配列を意味する。インバーテッドリピートは、不完全であり得、これは、インバーテッドリピートがインバーテッドリピート間に位置するポリヌクレオチドの転位を媒介可能である限り、核酸配列が互いの完全なコピーではないことを意味する。
「ｐｉｇｇｙＢａｃ」なる用語は、鱗翅目（Lepidopteran）のイラクサギンウワバ（Trichopulsia ni）において最初に同定されたトランスポゾンのファミリーを意味し、該トランスポゾンはクラスＩＩのＤＮＡ転位性エレメントに関連している。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは過去に「ＩＦＰ２」として記載されている。Cary等 (1989) Virology 172:156-169を参照のこと。
「クラスＩＩ ＩＲ」又は「クラスＩＩインバーテッドリピート」は、クラスＩＩ ＤＮＡ転位性エレメントから誘導され、クラスＩＩトランスポサーゼによって作用させられたインバーテッドリピートを意味する。
【００３１】
「ｐｉｇｇｙＢａｃインバーテッドリピート」又は「ｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＲ」は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンから誘導され、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼによって作用させられたインバーテッドリピートを意味する。
「配列内リボソーム進入部位 」又は「ＩＲＥＳ」は、翻訳開始を促進し、動物細胞中において２つのシストロン（オープンリーディングフレーム）が単一転写物から翻訳されるようにするポリヌクレオチド配列を記述する。ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳに作用可能に結合したオープンリーディングフレームの翻訳のためのリボソーム侵入部位を提供する。ポリシストロニックでありうる（つまり、単一のｍＲＮＡから幾つかの異なったポリペプチドをコードし得る）細菌ｍＲＮＡとは異なり、動物細胞の殆どのｍＲＮＡは、モノシストロニックであり、タンパク質一つのみの合成をコードする。ポリシストロニックな転写物が真核細胞中に存在している場合、翻訳は一般に５’に最も近い転写開始部位から開始し、第一の停止コドンで終結する。ついで、転写物がリボソームから放出され、ポリシストロニックな転写物において最初のコードされたポリペプチドのみの翻訳が生じる。真核細胞では、転写物中の第二又は次のオープンリーディングフレームに作用可能に結合したＩＲＥＳを有するポリシストロニックな転写物により、オープンリーディングフレームの翻訳が可能になり、同じ転写物によってコードされる二以上のポリペプチドが生産される。ベクター構築におけるＩＲＥＳエレメントの使用は過去に記載されている。例えば、Pelletier等, Nature 334: 320-325 (1988)；Jang等, J. Virol. 63: 1651-1660 (1989)；Davies等, J. Virol. 66: 1924-1932 (1992)；Adam等 J. Virol. 65: 4985-4990 (1991)；Morgan等 Nucl. Acids Res. 20: 1293-1299 (1992)；Sugimoto等 Biotechnology 12: 694-698 (1994)；Ramesh等 Nucl. Acids Res. 24: 2697-2700 (1996)を参照のこと。
【００３２】
「選択マーカー」なる用語は、ポリヌクレオチド担持する細胞を、対応する選択剤の存在下で、そのために又はそれに対して特異的に選択されるようにするポリヌクレオチドを意味する。例を挙げると、抗生物質耐性遺伝子は、遺伝子で形質転換された宿主細胞を、対応する抗生物質の存在下で陽性に選択されるようにする陽性選択マーカーとして使用することができる；非形質転換宿主細胞は選択条件下で増殖又は生存を維持できないであろう。選択マーカーは陽性、陰性又は二機能性でありうる。陽性選択マーカーによりマーカーを担持する細胞の選択が可能になる一方、陰性選択マーカーによりマーカーを担持する細胞を選択的に除去することが可能になる。ある実施態様では、選択マーカーは、薬剤に耐性を付与し、又は宿主細胞における代謝又は異化欠陥を補償する。選択マーカーには増幅可能な選択可能遺伝子が含まれ、コード化された産物が選択性を保持している限り、天然の選択マーカーの変異体、断片、機能的均等物、誘導体、ホモログ及び融合体が含まれる。有用な誘導体は、選択可能な性質に関連する選択マーカーの領域又はドメインにおいて実質的な配列類似性（アミノ酸レベルで）を一般に有している。様々な選択マーカーが開示されており、二機能性（つまり、陽性／陰性）マーカー(例えば１９９２年５月２９日に公開されたＷＯ９２／０８７９６、及び１９９４年１２月８日に公開されたＷＯ９４／２８１４３を参照)（ここに出典明示より援用される）が含まれる。例えば、一般に真核細胞で使用される選択マーカーには、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｇｙ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、グルタミンシンテターゼ、アスパラギンシンテターゼ、及びネオマイシン（Ｇ４１８）、ピューロマイシン、ヒスチジノールＤ、ブレオマイシン及びフレオマイシン耐性のコード遺伝子が含まれる。
【００３３】
核酸の移動に関して、「導入する」、「導入された」なる用語及びその文法的変形語は細胞中への核酸の導入を直接的又は間接的に生じるヒトの介入（処置）を意味する。例えば、核酸は細胞中に、例えば形質移入によって直接導入することができ、その核酸はまたそれを含む細胞の子孫の何れかに「導入された」と考えられる。
ここで交換可能に使用される「ポリペプチド」又は「タンパク質」なる用語は、任意の長さのアミノ酸の多量体を意味する。該用語はまたグリコシル化、アセチル化及びリン酸化を含む反応を通して翻訳後に修飾されるタンパク質を含む。「ペプチド」なる用語は一般に約３０アミノ酸長未満である短いポリペプチドを意味する。
「コドン最適化」なる用語は、与えられた脊椎動物の細胞において、一又は複数のコドンを、その脊椎動物において核酸の翻訳により頻繁に使用される一又は複数のコドンで置き換えることにより発現に適応させた核酸コード配列を意味する。
【００３４】
「ＴｅｔＯ」又は「ＴｅｔＯ配列」なる用語は、ＴｅｔＲに結合可能なＴｅｔオペレーター配列を意味する。
「ＴｅｔＲ」なる用語は、一又は複数のＴｅｔＯ配列に結合可能な野生型Ｔｅｔリプレッサー又はその変異体を意味する。
ここで使用される「実質的に同様」又は「実質的に同じ」なる用語は、二つの数値間（例えばＴｅｔＲの発現レベル）において、該値によって測定される生物学的特性の内容において二つの数値間に少しの、又は生物学的な、及び／又は統計的な有意差がないと当業者が考える程、十分に高程度の類似性を示す。
「哺乳動物」なる用語は、哺乳動物として分類される任意の動物を意味し、家畜（例えばウシ）、スポーツ動物、ペット（ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（ヒト、非ヒト霊長類）、及び齧歯類（例えばマウス及びラット）を含む、ある実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【００３５】
「トランスジェニック」なる用語は、ここでは導入遺伝子を内部に持つ性質を記述するために使用される。例えば、「トランスジェニック生物」は、動物の細胞の一又は複数が、例えばここに記載された方法による、ヒト介入によって導入された核酸を含む、哺乳動物、魚、鳥及び両生類を含む任意の動物である。例えば興味あるポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むトランスジェニック動物では、導入遺伝子は典型的にはトランスジェニック動物の細胞にポリペプチドを発現又は過剰発現するように仕向ける。しかしながら、本発明のある実施態様によれば、調節ＲＮＡの発現を使用して、アンチセンス又はＲＮＡ干渉機構を通して特定の内因性遺伝子を下方制御することができる。
【００３６】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」なる用語は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある様々な方法で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用して、達成することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのために適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用して得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって著作され、ソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類と共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、あるいはソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され、変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対するある程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて直ぐ上の段落に記載されるようにして得られる。
【００３７】
参照ポリヌクレオチド配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、参照ポリヌクレオチド配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある様々な方法で、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用して、達成することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのために適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって著作され、ソースコードは米国著作権庁,ワシントン D.C.，20559に使用者用書類と共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウスサンフランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、あるいはソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され、変動しない。
核酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。
【００３８】
ＩＩ．発明の実施態様
核酸の発現のための組成物と方法がここに提供される。ある実施態様では、かかる組成物と方法により、トランスジェニック細胞及び動物における核酸の誘導性発現が可能になる。ある実施態様では、かかる組成物はトランスポゾンベースの核酸コンストラクトを含む。ある実施態様では、かかる組成物と方法は、内因性遺伝子発現を調節するために使用できる。更なる実施態様では、かかる組成物と方法は、誘導的な形で、核酸配列、例えば内因性遺伝子の発現を阻害又は「ノックダウン」するために使用することができ、これにより、例えば一般的なジーンターゲティング技術による破壊が初期段階の致死を引き起こしうる遺伝子のような遺伝子の「条件付きノックダウン」を作り出すことが可能になる。
【００３９】
Ａ．組成物
一態様では、核酸の発現のための核酸コンストラクトが提供される。ある実施態様では、核酸コンストラクトは、（１）誘導プロモーターに作用可能に結合した少なくとも一種の対象のポリヌクレオチドを含む転写ユニットと（２）対象のポリヌクレオチドに隣接するトランスポゾン誘導インバーテッドリピートを含む。かかる核酸コンストラクトの成分は以下の実施態様に更に記載される：
【００４０】
１．成分
ａ）誘導プロモーター系
一態様では、誘導プロモーター系を用いて対象のポリヌクレオチドの発現を調節する。誘導プロモーター系の様々な実施態様では、対象のポリヌクレオチドが誘導プロモーターに作用可能に結合される。誘導プロモーターからの対象のポリヌクレオチドの転写は、例えば誘導剤によって、活性化されうる。かかる一実施態様では、誘導プロモーターは不活性であるか又は誘導剤の存在下で低い基礎活性を有しており、誘導剤の存在下で活性である。誘導剤の存在下での転写は、誘導剤のない場合の転写よりも５、１０、５０、１００、又は５００倍大きい。
【００４１】
誘導剤は、例えばプロモーターに結合しプロモーターから転写を活性化することによってプロモーターに直接作用しうる。かかる誘導剤の例には、限定されるものではないが、以下の表１に記載されるように、重金属イオン、インターフェロン、及びグルココルチコイドが含まれる。あるいは、誘導剤は、例えば、プロモーター活性に影響を与えるポリペプチドを通して作用することによって、プロモーターに間接的に作用しうる。例えば、一実施態様では、誘導剤は（例えばそれに結合することによって）レセプターのようなポリペプチドを活性化し、活性化されたポリペプチドがついでプロモーターからの転写を活性化する。かかる誘導剤の例には、限定されるものではないが、以下の表１に記載されるように、エクジソン、ＲＵ４８６、及びエストロゲンが含まれる。他の誘導剤には、特定の増殖条件、例えば「熱ショック」が含まれる。他の実施態様では、誘導剤は、プロモーターを阻止するポリペプチドを不活性化し、抑制を軽減することによって転写を活性化させる。かかる誘導剤の例には、限定されるものではないが、ＩＰＴＧ（Ｌａｃ発現系で使用）及びテトラサイクリン及びその類似体（Ｔｅｔ発現系で使用）含まれる。
【００４２】
真核細胞において使用される誘導プロモーター系の例には、限定されるものではないが、ホルモン調節エレメント(例えば、Mader, S.及びWhite, J. H. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607を参照)、合成リガンド調節エレメント(例えば、Spencer, D. M.等 1993) Science 262:1019-1024を参照)及び電離放射線調節エレメント(例えばManome, Y.等 (1993) Biochemistry 32:10607-10613；Datta, R.等 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1014-10153を参照)が含まれる。インビトロ又はインビボでの哺乳動物系において使用される更なる例示的な誘導プロモーターは、Gingrich等 (1998) Annual Rev. Neurosci. 21:377-405に概説され、以下の表１にまとめる。
【００４３】
2010512794.tif 000003
【００４４】
本発明において使用される例示的な誘導プロモーター系はＴｅｔ系である。かかる系は、Gossen等(1993)によって記載されたＴｅｔ系に基づいている。例示的な実施態様では、対象のポリヌクレオチドは一又は複数のＴｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）を含むプロモーターの制御下にある。不活性状態では、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）がＴｅｔＯ部位に結合し、プロモーターからの転写を抑制する。活性状態、例えばテトラサイクリン（Ｔｃ）、無水テトラサイクリン、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）、又はその活性な類似体のような誘導剤の存在下で、誘導剤はＴｅｔＯからＴｅｔＲの放出を引き起こし、それによって転写が起こるようにする。ドキシサイクリンは、１−ジメチルアミノ−２，４ａ，５，７，１２−ペンタヒロロキシ−１１−メチル−４，６−ジオキソ−１，４ａ，１１，１１ａ，１２，１２ａ−ヘキサヒドロテトラセン−３−カルボキサミドの化学名を有する抗生物質のテトラサイクリンファミリーのメンバーである。
【００４５】
一実施態様では、ＴｅｔＲは、哺乳動物細胞、例えばマウス又はヒト細胞における発現に対してコドン最適化されている。殆どのアミノ酸は、遺伝コードの縮重のため一を越えるコドンによってコードされ、核酸によってコードされたアミノ酸配列の如何なる変更もなく与えられた核酸のヌクレオチド配列において実質的な変異を可能にする。しかしながら、多くの生物は、「コドンバイアス」（つまり、与えられたアミノ酸に対しての特定のコドンの使用へのバイアス）としても知られているコドン使用において差異を示す。コドンバイアスは、特定のコドンに対するｔＲＮＡの支配的な種の存在としばしば相関しており、これはひいてはｍＲＮＡ翻訳の効率を増加させる。従って、特定の生物（例えば原核生物）から誘導されたコード化配列を、コドン最適化を通して異なった生物（例えば真核生物）中での発現の改善の目的に合わせることができる。
コドン使用表は直ぐに入手できる。Nakamura, Y.等 Nucl. Acids Res. (2000) 28:292を参照のこと。これらの表又は類似の表を使用して、当業者は、ポリペプチドをコードするコドン最適化核酸を設計するために、任意の与えられたポリペプチドにコドン使用頻度を適用できる。コドン最適化コード化領域は当該分野で知られている様々な異なった方法によって設計することができ、その幾つかがここに又米国特許出願公開第２００４０２０９２４１号に記載されている。
【００４６】
一態様では、コドン最適化ＴｅｔＲの使用により、例えば（１）ＴｅｔＲ発現を増加させ、（２）低レベルの誘導剤を使用する発現の誘導を可能にし、及び／又は（３）誘導剤の不存在下での対象ポリヌクレオチドの「リーキーな(leaky)」発現を最小にすることによる、誘導性ポリヌクレオチド発現のより緻密な制御が可能になる。コドン最適化ＴｅｔＲは、その全体が出典明示によりここに明示的に援用される２００６年７月２７日出願の同時係属米国出願第１１／４６０６０６号に記載されている。野生型Ｔｅｔリプレッサータンパク質の配列は従来から知られている（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｊ０１８３０号参照)。ＴｅｔＯ配列に結合するＴｅｔＲタンパク質を試験するアッセイ法は、Lederer 等(1995) Anal. Biochemistry 232:190-196に記載されている。
Ｔｅｔ系の他の特定の変異体は次の「Ｔｅｔ−Ｏｆｆ」及び「Ｔｅｔ−Ｏｎ」系を含む。Ｔｅｔ−Ｏｆｆ系では、転写はＴｃ又はＤｏｘの存在下で不活性である。その系では、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６の強いトランス活性化ドメインに融合したＴｅｔＲからなるテトラサイクリン制御トランス活性化因子（ｔＴＡ）が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥ）の転写制御下にある標的核酸の発現を調節する。ＴＲＥは、プロモーター(一般的にはヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）最初期プロモーターから誘導された最小プロモーター配列）に融合したＴｅｔＯ配列コンカテマーから構成される。Ｔｃ又はＤｏｘの不在下で、ｔＴＡはＴＲＥに結合し、標的遺伝子の転写を活性化させる。Ｔｃ又はＤｏｘの存在下では、ｔＴＡはＴＲＥに結合できず、標的遺伝子からの発現は不活性のままである。
【００４７】
逆に、Ｔｅｔ−Ｏｎ系では、転写はＴｃ又はＤｏｘの存在下で活性である。Ｔｅｔ−Ｏｎ系は逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子ｒｔＴＡに基づく。ｔＴＡと同様に、ｒｔＴＡは、ＴｅｔＲリプレッサーとＶＰ１６トランス活性化ドメインからなる融合タンパク質である。しかしながら、ＴｅｔＲ ＤＮＡ結合部分における４個のアミノ酸変化により、ｒｔＴＡの結合特性が、Ｄｏｘの存在下で標的導入遺伝子のＴＲＥ中のｔｅｔＯ配列だけをそれが認識できるように改変される。よって、Ｔｅｔ−Ｏｎ系では、ＴＲＥ調節標的遺伝子の転写は、Ｄｏｘの存在下でのみｒｔＴＡによって刺激される。
他の誘導プロモーター系は大腸菌由来のｌａｃリプレッサー系(Brown等, Cell 49:603-612 (1987)を参照)である。ｌａｃリプレッサー系は、ｌａｃオペレーター(ｌａｃＯ)を含むプロモーターに作用可能に結合した対象ポリヌクレオチドの転写を調節することにより機能する。ｌａｃリプレッサー（ｌａｃＲ）はLacOに結合し、よって対象ポリヌクレオチドの転写を防止する。対象ポリヌクレオチドの発現は、適切な誘導剤、例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導される。
【００４８】
合成プロモーター及び原核生物又は真核生物由来の天然プロモーターを含む様々なプロモーターを本発明の核酸コンストラクトに使用することができる。ある実施態様では、ヒト又はマウスのような任意の哺乳動物から由来したｐｏｌ ＩＩＩプロモーターのような、様々なＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターを使用することができる。かかるｐｏｌ ＩＩＩプロモーターには、限定するものではないが、Ｈ１ ＲＮＡ又はＵ６ ｓｎＲＮＡ遺伝子から誘導された、それぞれ「Ｈ１プロモーター」又は「Ｕ６」プロモーターとここで称されるプロモーターが含まれる。他のｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、例えばその全体が出典明示によりここに援用されるPaule及びWhite, Nuc. Acids Res. (2000) 28:1283-1298に見出すことができる。ある実施態様では、例えばＣＭＶプロモーターを含む様々なＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）プロモーターを使用することができる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターは多くの組織において発現を駆動可能な遍在性プロモーターであり得、例えばユビキチン−Ｃプロモーター、ＣＭＶプロモーター、β−アクチンプロモーター又はＰＧＫプロモーターである。他の実施態様では、ｐｏｌ ＩＩプロモーターは組織又は細胞型特異的プロモーター又は発生段階特異的プロモーターである。
【００４９】
本発明の核酸コンストラクトにおいて有用な他のプロモーターは、ウイルスプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列プロモーター（ｐＲＳＶ）；ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ２２１１５０４）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２又は５）、単純ヘルペスウイルス（チミジンキナーゼプロモーター）、ウシパピローマウイルス、トル肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス（例えばＭｏＭＬＶ、又はＲＳＶ ＬＴＲ）、Ｂ型肝炎ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、ＶＩＳＮＡ、及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター；及びＳＰ６、Ｔ３及びＴ７プロモーター); 免疫グロブリンプロモーター；熱ショックプロモーター；又はメタロチオネインプロモーターを含む。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点をまた含む制限断片として簡便に得ることができる。Fiers等, Nature, 273:113 (1978)；Mulligan及びBerg, Science, 209:1422-1427 (1980)；Pavlakis等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981)。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得ることができる。Greenaway 等, Gene, 18:355-360 (1982)。
【００５０】
誘導性発現系は、例えば、バクテリオファージＰｉのＣｒｅ／ｌｏｘ系、酵母２ｕＭプラスミドのＦＬＰ／ＦＲＴ系、酵母プラスミドｐＳＲｌの１／ＲＳ系、又はバクテリオファージＭｕの改変Ｇｉｎ／ｇｉｘ系を導入することができると更に考えられる。特定の実施態様では、誘導性発現系はＣｒｅ／ｌｏｘＰ組換え系を取り込む。簡単に述べると、Ｃｒｅは、出典明示によりここに援用されるSauer (1993) Methods Enzymol. 225:890-900によって記載されているように、ｌｏｘＰ部位間での分子内（切除又は逆転）及び分子間（組込み）部位特異的組換えを媒介するバクテリオファージＰｉ由来の３８ｋＤａのリコンビナーゼタンパク質である。ｌｏｘＰ部位（「交差座」部位）は８ｂｐの非対称スペーサー領域によって分離した２つの１３ｂｐのインバーテッドリピートからなる。Ｃｒｅの一分子がインバーテッドリピート当たり結合し、又は２つのＣｒｅ分子が与えられたｌｏｘＰ部位に並ぶ。組換えは８塩基対の非対称スペーサー領域で生じ、これがまた部位の方向性の原因となる。 互いに反対の配向の２つのｌｏｘＰ部位がＤＮＡの介在片を逆にする；同じ配向の２つの部位が、一つのｌｏｘＰ部位を背後に残す部位間の介在ＤＮＡの切除を指示する。
【００５１】
特定の時間に核酸配列を切除する能力は、切除が望まれるときに一対のｌｏｘＰ部位に核酸配列を隣接させ、リコンビナーゼを導入することによって利用されうる。望まれる場合、Ｃｒｅ発現導入遺伝子が誘導性及び／又は組織特異的プロモーターの制御下に配されて、選択された細胞において選択された時間での核酸配列の切除が可能になる。誘導性発現系の一実施態様では、「スタッファー(stuffer)断片」(以下に更に記載)を含むポリヌクレオチドが、プロモーター内又はプロモーターと誘導性発現が望まれる核酸配列（「誘導性配列」）間に位置させられる。スタッファー断片にはloxP部位が隣接し、Cre媒介組換え事象が、誘導性配列とプロモーターが作用可能に結合するように、スタッファー断片の切除と誘導性配列とプロモーターの並置を導く。
「スタッファー断片」は、プロモーター中に又はプロモーターと誘導性配列の間に挿入され、プロモーターに特異的な転写停止シグナルを含むポリヌクレオチドを意味する。よって、スタッファー断片の存在は、プロモーターからの誘導性配列の転写を防止し、プロモーター-誘導性配列転写ユニットを不活性な状態に維持する。（上述のように）リコンビナーゼ酵素を添加すると、プロモーター特異的転写停止シグナルを含むスタッファー断片の部位特異的切除がプロモーターと誘導性配列の並置を生じ、ついでこれにより誘導性配列の転写が生じる。
【００５２】
スタッファー断片は任意のヌクレオチド配列であり得、好ましくは立体構造変化を起こしやすいものではない配列である。例えば、スタッファー断片は、ｌａｃＺ遺伝子のセグメント又はそれが転写防止において機能性である転写停止シグナルを含む限り任意の他の所望の核酸セグメントでありうる。所望ならば、スタッファー断片は更なる特徴、例えば転写状態を誘導対非誘導として簡単に検出し決定することを可能にする選択マーカーを含みうる。
スタッファー断片のサイズは、それが（ａ）転写を阻害でき、及び／又は（ｂ）酵素媒介組換え事象において切除されうる限り、５００塩基対以上、６００塩基対以上、７００塩基対以上、８００塩基対以上、１０００塩基対以上、１２００塩基対以上、又は１４００塩基対以上でありうる。スタッファー断片の一例は、マウスＵ６プロモーター特異的転写停止シグナルに対応する５つの隣接チミンからなる配列を含むｋａｃＺの１ｋｂセグメントである。
【００５３】
ｂ）トランスポゾンベース系
適切なトランスポゾンベース系を使用して、対象ポリヌクレオチドを発現するトランスジェニック細胞をつくり出す。一実施態様では、適切なトランスポゾンベース系は、（１）核酸の切除及び転位を許容するインバーテッドリピートが隣接する対象のポリヌクレオチドを含む核酸と、（２）インバーテッドリピートに作用して核酸の転位を媒介するトランスポサーゼを含む。一実施態様では、インバーテッドリピート及びそれらに作用するトランスポサーゼは、限定するものではないが、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ｔａｇａｌｏｎｇ、ｈｏｂｏ、ｈｅｒｍｅｓ、Ａｃ、及びＴａｍ３転位因子を含むクラスＩＩ転位因子から誘導される。
一実施態様では、対象ポリヌクレオチドを含む核酸にはトランスポゾンインバーテッドリピートが隣接する。かかる一実施態様では、インバーテッドリピートは対象ポリヌクレオチドを含む核酸の５’及び３’末端にある。
一実施態様では、インバーテッドリピートは、例えば哺乳動物ゲノムのような脊椎動物ゲノムへの対象ポリヌクレオチドの転位を許容する。かかるインバーテッドリピートには、限定するものではないが、ｐｉｇｇｙＢａｃインバーテッドリピート又はＴｃ１／マリナー・トランスポゾンスーパーファミリーのトランスポゾンからのインバーテッドリピートが含まれる。そのスーパーファミリーには、限定するものではないが、「Sleeping Beauty」及び「Frog Prince」トランスポゾンが含まれる。
【００５４】
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは最初は鱗翅目（Lepidopteran）のイラクサギンウワバ（Trichopulsia ni）において最初に同定された。Cary等 (1989) Virology 172:156-169を参照。イラクサギンウワバにおいて、ｐｉｇｇｙＢａｃは機能的トランスポサーゼをコードする２．１ｋｂのオープンリーディングフレームを有する２４７５ｂｐの低分子インバーテッドリピートエレメントである。ｐｉｇｇｙＢａｃは切り貼り機構を介して転位し、挿入時に複製される５’ＴＴＡＡ３’標的部位を挿入し、正確に切除し、フットプリントを残さない。ｐｉｇｇｙＢａｃのインバーテッドリピートと転位を駆動するその能力は特徴付けられている。例えば、出典明示によりここに明示的に援用される米国特許第６２１８１８５号及び同第６９６２８１０号を参照のこと。
【００５５】
一実施態様では、インバーテッドリピートｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンから誘導される。かかる一実施態様では、インバーテッドリピートは５’ＣＣＣＴＡＧＡＡＡＧＡＴＡ３’（配列番号１）の核酸配列を含む。かかる他の実施態様では、インバーテッドリピートは、５’ＣＣＣＴＡＧＡＡＡＧＡＴＡＧＴＣＴＧＣＧＴＡＡＡＡＴＴＧＡＣＧＣＡＴＧ３’（配列番号２）の核酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する核酸配列、又は配列番号２の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含み、かかるインバーテッドリピートは作用可能に結合した核酸の転位を媒介することができる。かかる実施態様の他のものでは、インバーテッドリピートは、５’ＣＣＣＴＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＴＡＴＴＧＴＧＡＣＧＴＡＣＧＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＴＧＣＧＴＡＡＡＡＴＴＧＡＣＧＣＡＴＧ３’（配列番号３）の核酸配列、又はこれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する核酸配列、あるいは配列番号３の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含み、かかるインバーテッドリピートは作用可能に結合した核酸の転位を媒介することができる。
【００５６】
特定の実施態様では、転位可能な核酸は、（１）配列番号２又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する核酸配列、又は配列番号２の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含む第一インバーテッドリピート；及び（２）配列番号３の逆相補鎖（つまり配列番号４）、又は配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する核酸配列、又は配列番号４の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含む第二インバーテッドリピートが隣接する対象ポリヌクレオチドを含む。
特定の実施態様では、転位可能な核酸は、（１）配列番号３又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する核酸配列、又は配列番号３の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含む第一インバーテッドリピート；及び（２）配列番号２の逆相補鎖（つまり配列番号５）、又は配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する核酸配列、又は配列番号５の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含む第二インバーテッドリピートが隣接する対象ポリヌクレオチドを含む。
【００５７】
第一及び第二インバーテッドリピートはそれぞれ対象ポリヌクレオチドの５’及び３’末端にあってもよい。あるいは、第一及び第二インバーテッドリピートはそれぞれ対象ポリヌクレオチドの３’及び５’末端にあってもよい。例示的な立体配置（それぞれ単一の核酸分子を示す）は次の通りである：
立体配置１
5’ CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG(配列番号2)--対象ポリヌクレオチド--CATGCGTCAATTTTACGCATGATTATCTTTAACGTACGTCACAATATG
ATTATCTTTCTAGGG(配列番号4) 3’、又は
立体配置２
5’ CCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGCGTAAAATTGACGCATG(配列番号3)--対象ポリヌクレオチド--CATGCGTCAATTTTACGC
AGACTATCTTTCTAGGG(配列番号5) 3’ 
【００５８】
ある実施態様では、インバーテッドリピートはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンから誘導される。かかるインバーテッドリピートは、例えば米国特許第６６１３７５２号及び同第６４８９４５８号に記載されており、これらは出典明示によりここに明示的に援用される。かかる一実施態様では、インバーテッドリピートは、次のものから選択される核酸配列を含む：
5’ GTTCAAGTCG GAAGTTTACA TACACTTAG 3’(配列番号6)
5’ CAGTGGGTCA GAAGTTTACA TACACTAAGG 3’(配列番号7)
5’ CAGTGGGTCA GAAGTTAACA TACACTCAAT T 3’(配列番号8)
5’ AGTTGAATCG GAAGTTTACA TACACCTTAG 3’(配列番号9)
【００５９】
他のかかる実施態様では、インバーテッドリピートは、
5’ AGTTGAAGTC GGAAGTTTAC ATACACTTAA GTTGGAGTCA TTAAAACTCG TTTTTCAACT ACACCACAAA TTTCTTGTTA ACAAACAATA GTTTTGGCAA GTCAGTTAGG ACATCTACTT TGTGCATGAC ACAAGTCATT TTTCCAACAA TTGTTTACAG ACAGATTATT TCACTTATAA TTCACTGTAT CACAATTCCA GTGGGTCAGA AGTTTACATA CACTAA 3’(配列番号10)の核酸配列、
又はこれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する核酸配列、又は配列番号１０の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含み、ここで、かかるインバーテッドリピートは作用可能に結合した核酸の転位を媒介可能である。他のかかる実施態様では、インバーテッドリピートは、
5’TTGAGTGTAT GTTAACTTCT GACCCACTGG GAATGTGATG AAAGAAATAA AAGCTGAAAT GAATCATTCT CTCTACTATT ATTCTGATAT TTCACATTCT TAAAATAAAG TGGTGATCCT AACTGACCTT AAGACAGGGA ATCTTTACTC GGATTAAATG TCAGGAATTG TGAAAAAGTG AGTTTAATG TATTTGGCTA AGGTGTATGT AAACTTCCGA CTTCAACTG 3’ (配列番号11)の核酸配列、
又はこれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する核酸配列、又は配列番号１１の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含み、ここで、かかるインバーテッドリピートは作用可能に結合した核酸の転位を媒介可能である。
【００６０】
ある実施態様では、インバーテッドリピートはＦｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅトランスポゾンから誘導される。かかるインバーテッドリピートは、例えば、出典明示によりここに明示的に援用される米国特許出願公開第２００５／０２４１００７Ａ１に記載されている。かかる一実施態様では、インバーテッドリピートは、
5’ TGTG AAAAAGTGTT TGCCCCC 3’(配列番号12)の核酸配列を含む。
他のかかる実施態様では、インバーテッドリピートは、
5’CAGTGGTGTG AAAAAGTGTT TGCCCCCTTC CTCATTTCCT GTTCCTTTGC ATGTTTGTCA CACTTAAGTG TTTCGGAACA TCAAACCAAT TTAAACAATA GTCAAGGACA ACACAAGTAA ACACAAAATG CAATTTGTAA ATGAAGGTGT TTATTATTAA AGGTGAAAAA AAATCCAAAC CATCATGGCC CTGTGTGAAA AAGTGATTGC CCCCCTTGTT AAAACATACT ATAACTGTGG TTGTCCACAC 3’ (配列番号13) の核酸配列
又はこれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する核酸配列、又は配列番号１３の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を含み、ここで、かかるインバーテッドリピートは作用可能に結合した核酸の転位を媒介可能である。
【００６１】
上述のインバーテッドリピートの何れかに作用するトランスポサーゼがここに提供される。一実施態様では、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、又はＦｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅトランスポサーゼが提供される。かかるトランスポサーゼは、例えば上で引用した刊行物に記載されている。トランスポサーゼは天然に生じるトランスポサーゼ又はその活性な断片又は変異体、例えば天然に生じるトランスポサーゼに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸同一性を有する変異体でありうる。トランスポサーゼはまた遺伝子操作されたトランスポサーゼでありうる。トランスポサーゼは、それが活性である限り、つまりインバーテッドリピートに作用して核酸転位を媒介する限り、任意の供給源から誘導されうる。トランスポサーゼ又はトランスポサーゼをコードする核酸は、インバーテッドリピートに隣接して対象ポリヌクレオチドを含む核酸の導入の前、後、又はそれと同時に細胞中に導入されうる。トランスポサーゼをコードする核酸とインバーテッドリピートが隣接する対象ポリヌクレオチドは同じ又は別個の核酸コンストラクトに存在しうる。トランスポサーゼをコードする核酸の転写はここで検討したプロモーター（例えば構成的、誘導的、又は二機能的）の何れかによって駆動されうる。
【００６２】
特定の実施態様では、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼ（つまり、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンから誘導されたトランスポサーゼ）が提供される。かかる一実施態様では、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼは、鱗翅目（Lepidopteran）のイラクサギンウワバ（Trichopulsia ni）のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン由来の次のアミノ酸を含む：
1 mgsslddehi lsallqsdde lvgedsdsei sdhvseddvq sdteeafide vhevqptssg
61 seildeqnvi eqpgsslasn kiltlpqrti rgknkhcwst skstrrsrvs alnivrsqrg
121 ptrmcrniyd pllcfklfft deiiseivkw tnaeislkrr esmtgatfrd tnedeiyaff
181 gilvmtavrk dnhmstddlf drslsmvyvs vmsrdrfdfl irclrmddks irptlrendv
241 ftpvrkiwdl fihqciqnyt pgahltideq llgfrgrcpf rmyipnkpsk ygikilmmcd
301 sgtkymingm pylgrgtqtn gvplgeyyvk elskpvrgsc rnitcdnwft siplaknllq
361 epykltivgt vrsnkreipe vlknsrsrpv gtsmfcfdgp ltlvsykpkp akmvyllssc
421 dedasinest gkpqmvmyyn qtkggvdtld qmcsvmtcsr ktnrwpmall ygminiacin
481 sfiiyshnvs skgekvqsre kfmrnlymsl tssfmrkrle aptlkrylrd nisnilpnev
541 pgtsddstee pvtkkrtyct ycpskirrka nasckkckkv icrehnidmc qscf
(配列番号14)、
又はその活性な断片又は変異体。かかる断片及び変異体には、限定されるものではないが、出典明示によりここに援用されるZimowska等(2006) Insect Biochem. Mol. Biol. 36(5):421-428、及びＮＣＢＩ受託番号ＡＢＣ８８６８０．１、ＡＢＣ８８６７８．１、ＡＢＣ８８６７７．１、ＡＢＣ８８６７５．１、ＡＢＣ８８６７１．１、及びＡＡＥ６８０９８．１に記載されたものが含まれる。
【００６３】
ｃ）対象ポリヌクレオチド
本発明の核酸コンストラクトにおいて、発現が誘導プロモーターの制御下にある対象ポリヌクレオチドは限定されるものではない。例えば、対象ポリヌクレオチドはポリペプチドをコードしてもコードしなくともよい。
一実施態様では、対象ポリヌクレオチドは、例えばトランスジェニック発現の表現型の影響を観察するために、及び／又はポリペプチド又は機能的均等物の内因性発現がないか又は低減される「レスキュー」実験のために、そのトランスジェニック発現が望まれるポリペプチドをコードする。例えば、ポリヌクレオチドのトランスジェニック発現は、例えば癌性状態のような異常状態に至らしめ、ポリヌクレオチドを発現するトランスジェニック動物は疾患の有用なモデルでありうる。
【００６４】
他の実施態様では、対象ポリヌクレオチドは調節ＲＮＡ分子（例えばタンパク質に実質的に翻訳されないＲＮＡ分子）をコードする。かかる調節ＲＮＡ分子には、限定するものではないが、アンチセンスＲＮＡ及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）をなすＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡを含む）及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。ＲＮＡｉは一般に一方の鎖が標的遺伝子のコード領域に実質的に又は完全に相補的である二本鎖ＲＮＡ分子により遺伝子発現を部分的に又は完全に停止させることを含む。Fire等 (1998) Nature 391:806-811を参照。ＲＮＡｉの更なる概説には、Novina及びSharp, Nature (2004) 430:161-164を参照のこと。
ｓｉＲＮＡｓは、例えば低分子や抗体のような伝統的なアンタゴニストが失敗であったり又は実用的ではない等の場合、遺伝子発現を調節するためのツールとして有用であることが証明されている。(Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003))。インビトロで合成された２１から２３ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡは干渉ＲＮＡｓ（ｉＲＮＡｓ）として作用することが示されており、遺伝子発現を特異的に阻害しうる(Fire A., Trends in Genetics 391; 806-810 (1999))。これらのｉＲＮＡｓは、典型的には、その標的ｍＲＮＡｓの分解を媒介することによって作用する。ｉＲＮＡｓは一般に（必ずしも常にではないが）３０ヌクレオチド長以下であるので、それらは、例えばインターフェロン生産、及び／又はタンパク質合成の活動停止のような細胞の抗ウイルス防御機構を惹起させない。
【００６５】
実際には、ｓｉＲＮＡｓを合成し、ついでここで記載したもののような核酸コンストラクト中にクローニングできる。かかるコンストラクトは、例えばマイクロインジェクション又は形質移入によって哺乳動物細胞に導入することができ、及び／又は例えばここに更に記載されるように、トランスジェニック動物をつくるために使用することができる。ｓｉＲＮＡは構成的又は誘導的な形で発現されうる。ｓｉＲＮＡは、例えばｓｉＲＮＡを組織特異的プロモーターに作用可能に結合させることにより、組織特異的な形で発現されうる。ｓｉＲＮＡの発現は、対応するｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の量を「ノックダウン」又は有意に低減させるために使用されうる。従って、ｓｉＲＮＡは対象遺伝子の機能のノックダウンの表現型の影響を評価し、及び／又は過剰発現が例えば癌又は炎症のような疾患に関連していると思われる遺伝子をノックアウトするために有用である。よって、本発明は、遺伝子発現を調節するｓｉＲＮＡベースの方法を提供する。
ｓｉＲＮＡは上述の誘導発現系の何れかを使用して発現させうる。ｓｉＲＮＡの発現のための好適なプロモーターには、限定するものではないが、上述のものの任意のもの、特にｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えばＨ１又はＵ６が含まれる。特定の対象遺伝子の発現を停止させるために好適なｓｉＲＮＡは当該分野で知られており、及び／又は当業者に知られた方法によって常套的に同定され、又は設計されうる。例えば、ＵＳ２００５／００７１８９３；Vickers等 (2003) J. Biol. Chem. 278:7108-7118；Hill等 (1999) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 21:728-737；Sandy等 (2005) Biotechniques 39:215-224を参照のこと。
【００６６】
ｄ）他の成分
場合によっては、他の配列が本発明の核酸コンストラクト中に含められうる。かかる配列には、限定するものではないが、核酸コンストラクト中においてプロモーターに作用可能に結合している一又は複数のエンハンサー配列；核酸コンストラクトから転写されるポリヌクレオチドの３’に位置している一又は複数の転写終結配列；コンストラクトの増殖を容易にする配列；及び／又はクローニング部位が含まれる。
例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン遺伝子のような哺乳動物遺伝子からの多くのエンハンサー配列が知られている。好適なエンハンサーは真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーである。例として、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス最初期プロモーターのエンハンサー(Boshart等 Cell 41:521 (1985))、複製起点後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントの検討についてはまたYaniv, Nature, 297:17-18 (1982)を参照のこと。エンハンサー配列はプロモーターの５’又は３’でありうる。ある実施態様では、エンハンサーはプロモーターの５’部位又はプロモーターとそれが作用可能に結合しているポリヌクレオチドの間に位置される。
【００６７】
核酸コンストラクトは場合によってはＩＲＥＳを含んでいてもよい。ＩＲＥＳは可変長さであり、例えば 脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）又はピコルナウイルスゲノムのような様々な供給源由来でありうる。様々なＩＲＥＳ配列とその構築は例えばPelletier等, Nature 334: 320-325 (1988)；Jang等, J. Virol. 63:1651-1660 (1989)；Davies等, J. Virol. 66: 1924-1932 (1992)；Adam等 J. Virol. 65: 4985-4990 (1991)；Morgan等 Nucl. Acids Res. 20: 1293-1299 (1992)；Sugimoto等 Biotechnology 12: 694-698 (1994)；及びRamesh等 Nucl. Acids Res. 24: 2697-2700 (1996)に記載されている。一実施態様では、ＥＣＭＶのＩＲＥＳが本発明の核酸コンストラクトにおいて使用される。ＩＲＥＳに作用可能に結合したコード配列は、例えばＩＲＥＳの３’末端の約８塩基又はより下流か又はコード配列の翻訳が起こる任意の距離にある。ＩＲＥＳと下流のコード配列の開始の間の最適な又は許容可能な距離は、距離を変化させ、距離の関数として発現を測定することにより容易に決定することができる。
【００６８】
核酸コンストラクトは場合によっては細菌中でのコンストラクトの増殖を容易にする原核生物配列を含んでいてもよい。従って、コンストラクトは、複製起点（つまり、一又は複数の選択された宿主細胞におけるコンストラクトの複製を可能にする核酸配列）及び細菌中での選択のための抗生物質耐性遺伝子のような成分を含みうる。複製起点は例えば細菌中のＣｏｌＥ１複製起点を含む。様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）が、染色体外（エピソーム）複製が望まれる哺乳動物細胞において有用である。更なる真核生物選択マーカー遺伝子を導入することができる。
核酸コンストラクトは、例えば発現が誘導プロモーターから望まれるポリヌクレオチドのような与えられた配列の挿入又は除去のために少なくとも一のクローニング部位を含みうる。一実施態様では、クローニング部位は複数クローニング部位、つまり複数の制限部位を含む。ラムダ媒介組換えを使用して配列の挿入を許容するゲートウェイ部位もまた使用されうる。
【００６９】
２．核酸コンストラクトの特定の実施態様
上述の実施態様に加えて、次の特定の実施態様が更に提供される：
一態様では、（１）一又は複数のＴｅｔＯ配列を含む誘導プロモーターに作用可能に結合した少なくとも一の対象ポリヌクレオチドを含む第一転写ユニットと；（２）ＴｅｔＲをコードするコード配列を含む第二転写ユニットと；（３）一対のインバーテッドリピートであって、インバーテッドリピートの一方が（１）及び（２）の５’であり、他方のインバーテッドリピートが（１）及び（２）の３’であるものを含む核酸コンストラクトが提供される。一実施態様では、ＴｅｔＲは第二転写ユニットから発現され、誘導剤の不存在下で第一転写ユニット中の誘導プロモーターを抑制する。しかしながら、誘導剤（例えばテトラサイクリン又はドキシサイクリンのようなテトラサイクリンアナログ）の存在下では、ＴｅｔＲによる抑制は軽減され、第一転写ユニット中の対象ポリヌクレオチドがよって発現される。かかる一実施態様では、対象ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉ（例えばｓｈＲＮＡ）をなすことができる調節ＲＮＡ分子を、調節ＲＮＡ分子が標的とする核酸配列の発現が誘導剤の存在下で「ノックダウン」されるように、コードしている。よって、ここに記載された核酸コンストラクトは、調節された遺伝子発現、特に標的核酸配列の条件付きノックダウンに対するメカニズムを提供する。
一実施態様では、第一転写ユニットは第二転写ユニットの５’に配されている。他の実施態様では、第一転写ユニットは第二転写ユニットの３’に配されている。更に他の実施態様では、（第一及び第二転写ユニットに加えて）一又は複数の転写ユニットが、かかる更なる転写ユニットがインバーテッドリピート内に含まれていることを条件として、以下に更に検討するように、核酸コンストラクト中に存在していてもよい。
【００７０】
ａ）インバーテッドリピート
一実施態様では、インバーテッドリピートは、上で更に詳細に記載したように、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、又はＦｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅから選択される。かかる一実施態様では、インバーテッドリピートは、ｐｉｇｇｙＢａｃインバーテッドリピートから選択される。かかる一実施態様では、インバーテッドリピートの少なくとも一つは、配列番号１、２、３、４、又は５から選択される核酸配列を含む。
ｂ）ＴｅｔＲ
一実施態様では、ＴｅｔＲをコードするコード化配列は哺乳動物細胞における発現のために最適化されている。かかる一実施態様では、コード化配列は、マウス又はヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。かかる一実施態様では、コドン最適化コード化配列は、（ａ）以下のポリヌクレオチド（開始及び停止コドンに下線）：
ATGTCCAGACTGGATAAGTCCAAGGTGATTAATTCCGCTCTGGAACTCCTGAACGAGGTCGGCATCGAGGGACTGACCACACGGAAGCTGGCTCAGAAACTCGGCGTCGAACAGCCTACCCTCTACTGGCATGTCAAAAATAAGAGAGCCCTCCTGGACGCCCTGGCTATCGAGATGCTGGACAGACACCACACCCACTTCTGCCCCCTGGAAGGCGAATCCTGGCAGGATTTCCTCCGGAACAACGCTAAAAGCTTTAGATGCGCCCTCCTCAGCCATAGAGACGGAGCTAAAGTGCACCTGGGAACCCGGCCTACAGAAAAACAGTACGAGACACTGGAAAACCAGCTCGCTTTCCTCTGCCAACAAGGCTTTAGCCTGGAAAACGCCCTCTACGCTCTCAGCGCTGTCGGCCATTTTACACTGGGCTGCGTGCTCGAGGACCAGGAGCACCAAGTGGCTAAAGAGAGCGGGAAACCCCTACCACCGATAGCATGCCCCCCCTGCTGAGACAAGCCATTGAGCTCTTTGATCATCAGGGAGCTGAACCCGCCTTCCTCTTTGGACTCGAACTCATTATTTGCGGACTCGAGAAGCAACTGAAATGCGAAAGCGGAAGCGCCTACTCCGGCTCCAGAGAATTTCGGTCCTACTAG (配列番号１５)；又は
（ｂ）配列番号１５と同じポリペプチドをコードし、配列番号１５と実質的に同様のレベルで哺乳動物細胞中で発現され得る配列番号１５の変異体を含む。他の実施態様では、配列番号１５のヌクレオチド１−５０７によってコードされるＴｅｔＲのアミノ酸配列が明示的に提供される。他の実施態様では、ＴｅｔＲのアミノ酸配列が配列番号２１に示される。
【００７１】
ｃ）誘導プロモーター
一実施態様では、誘導プロモーターは一又は複数のＴｅｔＯ配列を含む。一実施態様では、誘導プロモーターは、一又は複数のＴｅｔＯ配列に作用可能に結合したｐｏｌ ＩＩＩ  プロモーターを含む。かかる一実施態様では、誘導プロモーターは、一又は複数のＴｅｔＯ配列に作用可能に結合したＨ１プロモーター又はＵ６プロモーターを含む。一実施態様では、誘導プロモーターは、少なくとも２のＴｅｔＯ配列に作用可能に結合したＨ１  プロモーターを含む。かかるプロモーターは胚性幹細胞及び胚様体細胞において有用であることが示されており、ＴｅｔＲ媒介抑制は、２つのＴｅｔＯ配列に作用可能に結合したＨ１プロモーターを含むプロモーターが使用された場合に特にストリンジェントであった。全体が出典明示によりここに援用される２００６年７月２７日出願の同時係属の米国出願代１１／４６０６０６号を参照のこと。一実施態様では、２つのＴｅｔＯ配列を含む誘導プロモーターは、（ａ）「Ｈ１−ｔｅｔＯ２−２Ｘプロモーターセグメント」（５’から３，ＴｅｔＯ配列に下線）のポリヌクレオチド配列：
CGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATCCCTATCAGTGATAGAGACTTATAAGTTCCCTATCAGTGATAGAGATCCCC(配列番号１６); 
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；又は（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドと少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド を含み、ここで（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリヌクレオチドにはＴｅｔＲが結合し得る。
【００７２】
ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターが使用される一実施態様では、ｐｏｌ ＩＩＩ転写終結配列が対象ポリヌクレオチドの３’に配される。一実施態様では、ｐｏｌ ＩＩＩ転写終結配列は４又はそれ以上の連続Ｔ残基を含む。かかる一実施態様では、ｐｏｌ ＩＩＩ転写終結配列は、５の連続Ｔ残基を含む。かかる実施態様では、ｐｏｌ ＩＩＩ転写が第二又は第三のＴで終結し、従って２から３のＵ残基だけが、合成されるＲＮＡの３’末端に付加される。
ｐｏｌ ＩＩプロモーターが使用される一実施態様では、対象ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡをコードする。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターが使用される一実施態様では、対象ポリヌクレオチドが調節ＲＮＡをコードする。
【００７３】
ｄ）転写ユニット
一実施態様では、転写ユニットは第一ＲＮＡをコードする第一コード領域と、第二ＲＮＡをコードする第二コード領域を含み、双方のコード領域が共通のプロモーター（例えばｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）の制御下にある。かかる一実施態様では、第一ＲＮＡ及び第二ＲＮＡは実質的に又は完全に相補的である配列を含み、従って二本鎖領域を有するＲＮＡ分子を形成可能である。かかる二本鎖領域はついでｓｉＲＮＡとして機能しうる。例えば、第一及び第二ＲＮＡｓは、相補的である少なくとも１０−３０の近接ヌクレオチド（その範囲内の全ての整数を含む）の配列を含みうる。
一実施態様では、核酸コンストラクトは、調節ＲＮＡの一又は複数の成分をコードする複数の転写ユニットを含む。例えば、一実施態様では、核酸コンストラクトは、（１）第一プロモーター（例えばｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）に作用可能に結合した第一ポリヌクレオチドを含む第一転写ユニットであって、第一ポリヌクレオチドが第一ＲＮＡをコードするもの；及び（２）第二プロモーター（例えば第二ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）に作用可能に結合した第二ポリヌクレオチドを含む更なる転写ユニットであって、第二ポリヌクレオチドが第二ＲＮＡをコードするものを含む。かかる一実施態様では、第二ＲＮＡは、２つのＲＮＡが発現されるときに二本鎖構造を形成できるように、第一ＲＮＡに実質的に又は完全に相補的である。例えば、かかる一実施態様では、第一及び第二ＲＮＡは、相補的である少なくとも１０−３０の近接ヌクレオチド（その範囲内の全ての整数を含む）の配列を含みうる。
【００７４】
様々な実施態様では、核酸コンストラクトは、異なった標的核酸配列を標的とする複数の調節ＲＮＡをコードする複数の転写ユニットを含む。かかる実施態様では、複数の内因性遺伝子の調節が達成されうる。
他の実施態様では、核酸コンストラクトは、ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作用可能に結合した第一プロモーター(例えば、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター)と、同じポリヌクレオチドに反対の配向で作用可能に結合した第二プロモーターを、第一プロモーターからのポリヌクレオチドの発現が第一ＲＮＡの合成を生じせしめ、第二プロモーターからのポリヌクレオチドの発現が、第一ＲＮＡに実質的に又は完全に相補的である第二ＲＮＡの合成を生じせしめるように、含んでいる。例えば、第一及び第二ＲＮＡは、相補的である少なくとも１０−３０の近接ヌクレオチド（その範囲内の全ての整数を含む）の配列を含みうる。
一実施態様では、核酸コンストラクトは選択マーカーを更に含む。かかる一実施態様では、第二転写ユニットが選択マーカーを更に含む。かかる一実施態様では、ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位 ）がＴｅｔＲをコードするコード配列と選択マーカーの間に配されている。
【００７５】
ｅ）対象ポリヌクレオチド
一実施態様では、対象ポリヌクレオチドは、翻訳されるＲＮＡ（つまり、ｍＲＮＡ）をコードする。他の実施態様では、対象ポリヌクレオチドは調節ＲＮＡ分子、例えば二本鎖ＲＮＡ分子の一又は双方の鎖をコードする。かかる一実施態様では、調節ＲＮＡ分子は、例えばｓｉＲＮＡ又はプレ-ｍｉＲＮＡのように、二本鎖領域を有するヘアピン構造を形成する。
他の実施態様では、調節ＲＮＡ分子は二本鎖領域を含み、該二本鎖領域の一方の鎖は標的核酸配列（例えばダウンレギュレートされる対象遺伝子から誘導されたｍＲＮＡの領域）と配列が実質的に同一（典型的には少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である）ものである。二本鎖領域の他方の鎖は標的核酸に完全に又は部分的に相補的である（典型的には標的核酸の領域の相補鎖に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である）。二本鎖領域は二つの別個のＲＮＡ鎖か、又はヘアピン構造を有する単一ＲＮＡの自己相補的部分により、形成されうると理解される。調節ＲＮＡ分子の二本鎖領域は、一般に約１０ヌクレオチド長、少なくとも約１５ヌクレオチド長、及びある実施態様では、約１５から約３０ヌクレオチド長である。しかしながら、有意に長い二本鎖領域は有効に使用することができる。一実施態様では、二本鎖領域は、約１９から２２ヌクレオチド長（その範囲内の任意の整数を含む）である。一実施態様では、二本鎖領域の一方の鎖はこの領域にわたる標的核酸配列と同一である。
【００７６】
他の実施態様では、対象ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子が「センス」領域、ループ領域及び「アンチセンス」領域を含むヘアピン構造を形成することができるように、自己相補的である調節ＲＮＡ分子をコードしている。かかる一実施態様では、センス及びアンチセンス領域はそれぞれ約１５から約３０ヌクレオチド長である。他のかかる実施態様では、ループ領域は約２から約１５ヌクレオチド長か又は約４から約９ヌクレオチド長である。かかる調節ＲＮＡ分子の発現後にセンス及びアンチセンス領域は二本鎖構造を形成する。
標的核酸配列が、高度に保存された遺伝子ファミリーである遺伝子から誘導されている場合、調節ＲＮＡ分子の二本鎖構造の配列は、所望される遺伝子のみがダウンレギュレートされるように配列比較ツールを用いて選択することができる。あるいは、調節ＲＮＡ分子の二本鎖領域の配列は、それが複数の関連した遺伝子を同時にダウンレギュレートするように設計されうる。
上記実施態様の何れかを単独で又は互いに組み合わせたものがここに明示的に提供される。
【００７７】
３．核酸コンストラクトを含む細胞及び動物
一実施態様では、上述の核酸コンストラクトの何れかを含む細胞が提供される。一実施態様では、細胞は一次細胞又はＨＥＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭＥＦ、及び２９３細胞のような細胞株からの培養細胞である。他の実施態様では、細胞は細菌宿主細胞である。他の実施態様では、細胞は哺乳動物細胞、例えばマウス又はヒト細胞である。かかる細胞は、例えば単離細胞(正常な又は罹患した(例えば癌の)細胞又は細胞株からの細胞を含む)；又は胚性細胞、例えば単離された胚性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、単細胞胚（つまり、受精卵）、又は単離胚内の細胞でありうる。
【００７８】
Ｂ．方法 
上記の核酸コンストラクトの何れかを細胞、例えば哺乳動物細胞に導入するための方法が提供される。核酸コンストラクトは、常套的な形質移入法又はマイクロインジェクションによって細胞に導入して、トランスジェニック細胞をつくることができる。一実施態様では、核酸コンストラクトは、胚性細胞、例えば単細胞胚(つまり、受精卵)、単離胚内の細胞、又は胚性幹(ES)細胞に導入（例えば形質移入又はマイクロインジェクション）される。トランスジェニック胚性肝細胞を胚(例えば、胚盤胞期胚)と組み合わせることができる。前記トランスジェニック細胞の何れかを含む胚を偽妊娠雌動物（例えばマウス）に移してトランスジェニック動物を生産することができる。あるいは、トランスジェニック胚性肝細胞を培養して分化細胞の集合体を含む胚様体を生成することができる。
ある実施態様では、別個のベクターに含まれるトランスポサーゼをコードするポリヌクレオチドはここに記載の核酸コンストラクトと同時形質移入又は同時注入される。ある実施態様では、トランスポサーゼをコードするポリヌクレオチドはここで提供される核酸コンストラクトに含まれる。
【００７９】
上記核酸コンストラクトの何れかを使用する方法がここに提供される。例えば、一態様では、対象のポリヌクレオチドを発現する方法が提供され、該方法は、（ａ）上記核酸コンストラクトの何れかを哺乳動物細胞中に導入し、（ｂ）適切な誘導剤に細胞を曝露することを含む。他の実施態様では、内因性遺伝子の発現を阻害する方法が提供され、該方法は、（ａ）内因性遺伝子に特異的な調節ＲＮＡ分子(例えばshRNA)を誘導的に発現する上記核酸コンストラクトの何れかを細胞に導入し、（ｂ）該細胞を適切な誘導剤に曝露することを含む。上記方法の何れかでは、細胞はトランスジェニック動物中に存在しうる。上記方法の何れかにおいて、適切なトランスポサーゼ又はかかるトランスポサーゼをコードする核酸が細胞中に更に導入される。
【００８０】
他の態様では、トランスジェニック哺乳動物において対象のポリヌクレオチドを発現させる方法が提供され、該方法は、上記核酸コンストラクトの何れかを哺乳動物胚性細胞中に導入し、（ｂ）適切なトランスポサーゼ又はかかるトランスポサーゼをコードする核酸を哺乳動物胚性細胞中に導入し；（ｃ）（ａ）及び（ｂ）から得られる哺乳動物胚性細胞からトランスジェニック動物を生産し；（ｄ）トランスジェニック哺乳動物に適切な誘導剤を投与することを含む。該方法がトランスジェニック哺乳動物における内因性遺伝子の発現を阻害するために使用される一実施態様では、対象のポリヌクレオチドは内因性遺伝子に特異的な調節ＲＮＡ分子(例えばshRNA)をコードする。
【００８１】
他の態様では、細胞中にポリヌクレオチドを発現する方法が提供され、該方法は、（ａ）細胞中に、（ｉ）誘導プロモーターに作用可能に結合したポリヌクレオチドを含む第一転写ユニットであって、誘導プロモーターが一又は複数のＴｅｔＯ配列を含むものと；（ｉｉ）ＴｅｔＲをコードするコード配列を含む第二転写ユニットと；（ｉｉｉ）インバーテッドリピートの一方が（ｉ）及び（ｉｉ）の５’であり、インバーテッドリピートの他方が（ｉ）及び（ｉｉ）の３’である一対のインバーテッドリピートを含む核酸コンストラクトを導入し；（ｂ）該細胞を、誘導プロモーターからポリヌクレオチドの発現を誘導する誘導剤に暴露することを含む。
【００８２】
他の態様では、細胞における内因性遺伝子の発現を阻害する方法が提供され、該方法は、（ａ）細胞中に、（ｉ）誘導プロモーターに作用可能に結合したポリヌクレオチドを含む第一転写ユニットであって、誘導プロモーターが一又は複数のＴｅｔＯ配列を含み、ポリヌクレオチドが内因性遺伝子に特異的なｓｈＲＮＡをコードするものと；（ｉｉ）ＴｅｔＲをコードするコード配列を含む第二転写ユニットと；（ｉｉｉ）一対のｐｉｇｇｙＢａｃインバーテッドリピートであって、インバーテッドリピートの一方が（ｉ）及び（ｉｉ）の５’であり、インバーテッドリピートの他方が（ｉ）及び（ｉｉ）の３’であるものを含む核酸コンストラクトを導入し；（ｂ）該細胞を、誘導プロモーターからポリヌクレオチドの発現を誘導する誘導剤に暴露することを含む。
【００８３】
治療方法がまたここに提供される。一態様では、ここに提供される核酸コンストラクトは、例えば治療用核酸を標的細胞に送達する、インビボ治療用途に使用される。かかるインビボ遺伝子療法用途は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベース系を使用して証明されている。米国特許第６６１３７５２号を参照のこと。治療用核酸は標的細胞中における欠陥のある内因性遺伝子の機能を置換するか、又は癌又は免疫疾患のような疾患の治療において有用性を有しているコード配列でありうる。
遺伝的欠陥に基づく疾患症状の治療に使用される治療用核酸には、限定されるものではないが、次のものをコードするコード配列が含まれる：第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、β-グロビン、低密度タンパク質レセプター、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、 嚢胞性線維症膜制御因子、α-アンチトリプシン、ＣＤ-１８、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、分岐鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ、グルコース６-ホスファターゼ、α-Ｌ-フコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-Ｌ-イズロニダーゼ、ガラクトース１-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ等々が含まれる。
【００８４】
癌の治療のための治療用核酸には、限定するものではないが、次のものが含まれる：腫瘍抑制因子、毒素、自殺タンパク質等をコードするコート配列；及び例えば癌促進遺伝子に特異的な調節ＲＮＡのような内因性遺伝子の発現を阻害するための調節ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。かかる癌促進遺伝子には、限定するものではないが、癌遺伝子、例えばＡＢＬＩ、ＢＣＬＩ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＲＢＢ２、ＥＴＳＩ、ＥＴＳ１、ＥＴＶ６、ＦＯＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬＩ、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬＩ、ＴＣＬ３、及びＹＥＳ；血管新生を促進する遺伝子、例えばＶＥＧＦ、ＶＥＧＦレセプター、及びエリスロポエチン；及び他の癌促進遺伝子、例えばＰＴＩ−１、ＰＴＩ−２、及びＰＴＩ−３が含まれる。免疫疾患の治療のための治療用核酸には、限定するものではないが、炎症に関与する遺伝子に特異的な調節ＲＮＡのような内因性遺伝子の発現を阻害するための調節ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、例えば限定しないがサイトカイン及びケモカインを含む。
【００８５】
細胞に核酸を導入するために様々な方法を使用することができる。その技術は、核酸がインビトロ、エキソビボ又はインビボで培養細胞中に移されるかどうかに依存して変わる。例えば、患者の細胞への核酸の導入方法はインビボ及びエキソビボ方法を含む。エキソビボ方法では、患者の細胞が除かれ、核酸がこれら単離細胞に導入され、改変された細胞が直接にあるいは例えば患者に移植されている多孔膜内に封入されて投与される（例えば米国特許第４８９２５３８号及び同第５２８３１８７号を参照）。インビボ核酸移送技術は脂質ベース系（核酸の脂質媒介移送に有用な脂質は例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ−Ｃｈｏｌである）を含む。トランスポゾン系ベクター内に含められた核酸は患者に直接（例えば静脈内）投与されうる。米国特許第６６１３７５２号を参照のこと。現在知られている遺伝子マーキング及び遺伝子療法プロトコルの概説については、Anderson等, 256:808-813(1992)を参照のこと。またＷＯ９３／２５６７３とそこに引用された文献を参照のこと。インビトロでの哺乳動物細胞中への核酸の移送に適した技術は、リポソームの使用、電気穿孔、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法等々を含む。
【００８６】
核酸分子を含むここで検討された治療剤はそのバイオアベイラビリティ、薬物動態及び薬力学的性質を改善するために改変され又は合成されうる。例えば、一又は複数のホスホロチオエート結合を持つ治療用核酸分子を、当該分野で知られている技術を使用して合成することができる。
【実施例】
【００８７】
ｓｈＲＮＡの誘導性発現のためのｐｉｇｇｙＢａｃ系ベクターの構築
ｐｉｇｇｙＢａｃ系ベクターを、ルシフェラーゼに特異的なｓｈＲＮＡの誘導性発現のために作製した。「ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）」と称されるベクターを図１に示す。ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）ｃはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(Stratagene, La Jolla, CA)骨格中に２つの内部転写ユニットに隣接するｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＲｓを含む。第一の転写ユニットは、ルシフェラーゼ遺伝子 (図１において「ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ」と称される)に特異的なｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作用可能に結合した、図１において「ｐ（Ｈ１）−ＴｅｔＯ」と称されるＨ１−ＴｅｔＯ２−２ｘプロモーター（配列番号１６）（５’から３’）を含む。ｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドにポリアデニル化シグナルが続く。第二転写ユニットは、ＴｅｔＲ−ＩＲＥＳ−ピューロマイシンカセットに作用可能に結合したヒト -アクチンプロモーター及びＨＴＬＶエンハンサー (図１において「Ｐ(アクチン)」と称される)を含む。ＴｅｔＲコード化配列(配列番号15)はコドン最適化されている。第一及び第二転写ユニットには、ｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＲｓ (図１において「ＰＢ」と称される)を含む配列が隣接している。当業者であれば、上述のベクターを、任意の標的核酸に特異的なｓｈＲＮＡの発現に適応化できることが分かるであろう。
【００８８】
ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）は次のようにして作製した。第二転写ユニットを含むプラスミドを常套的な組換え法を使用して構築した。ＰＣＲを使用して、第一転写ユニットを含む単位複製配列を生成し、単位複製配列をプラスミド中で第二転写ユニットの上流にサブクローニングした。ついで、ＰＣＲを用いて、第一及び第二転写ユニットを含む単位複製配列を生成した。ついで、その単位複製配列をｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＲｓを含む配列間にサブクローニングしたが、ｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＲｓはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  骨格(Stratagene, La Jolla, CA)内に含まれていた。ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）コンストラクトの全体の配列を図２及び配列番号１７に示す。コンストラクトの機能的エレメントについてまた図２に注釈を付ける。
ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）は次のように、また以下に更に詳細に実証するように機能する。「オフ」状態では、Ｔｅｔリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）が構成的に発現され、Ｈ１−ＴｅｔＯ２−２ｘプロモーター中のＴｅｔＯ配列に結合し、それによってｓｈＲＮＡの発現を阻害する。しかしながら、テトラサイクリンアナログのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の存在下では、ＴｅｔＲタンパク質がプロモーターから放出され、ｓｈＲＮＡの転写を許容する。よって、Ｄｏｘの存在下では、ルシフェラーゼの発現がノックダウンされ、従ってバイオルミネッセンスが減少する。
【００８９】
Ｂ．ドキシサイクリンはＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）を形質移入したＥＳ細胞中におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現のノックダウンを誘導する
ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）がルシフェラーゼに特異的なｓｈＲＮＡを誘導的に発現するかどうかを試験するために、ルシフェラーゼを発現するトランスジェニック動物及びＥＳ細胞を作製した。Ｒｏｓａ２６プロモーターからのルシフェラーゼの高レベルの発現のために、「Ｒｏｓａ２６−ルシフェラーゼ」と称される核酸コンストラクトを作製した。Ｒｏｓａ２６プロモーターはトランスジェニック動物において全ての組織にわたってルシフェラーゼを発現せしめ、それによって身体の画像化を可能にする。２００６年１０月１０日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３９０３５を参照のこと。Ｒｏｓａ２６−ルシフェラーゼコンストラクトは、簡便な制限部位を使用して１．７Ｋｂルシフェラーゼ遺伝子を含むベクター中にｐＢＲＯＡＤ３ (InvivoGen, San Diego, CA)から誘導した１．９ＫｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｘｂａ Ｉ断片としてマウスＲｏｓａ２６プロモーターをクローニングすることにより作製した。ルシフェラーゼのより良好な発現のために、ポリアデニル化部位をルシフェラーゼ遺伝子の３’末端に付加した。
【００９０】
Ｒｏｓａ２６−ルシフェラーゼコンストラクトを、Ｎｅｏ耐性プラスミド（１０：１）と共にＥＳ細胞中に同時形質移入し、Ｇ４１８で選択した。ルシフェラーゼ陽性細胞（「Ｒｏｓａ−ｌｕｃ ＥＳ細胞」と称す）を更なる研究のために選択した。その細胞をＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）での電気穿孔によって形質移入し、ピューロマイシンで選択した。選択した細胞を、０．８ｍｇ／ｍｌのルシフェリン（ルシフェラーゼ基質）の存在下で７日間、０．５μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌ何れかのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）で処理した。図３に示されるように、Ｄｏｘの濃度を増加させると、コントロール（「Ｄｏｘなし」）に対してバイオルミネッセンスが減少した（つまり、ルシフェラーゼ活性が減少）が、これはＤｏｘがルシフェラーゼに特異的なｓｈＲＮＡの発現を誘導したことを示している。各列は画像化細胞の徐々に長い曝露を示している。
ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）を形質移入したＲｏｓａ−ｌｕｃ ＥＳ細胞を個々にクローニングした。クローンをルシフェリンの存在下で３日間、１μｇ／ｍｌのＤｏｘで処理した。図４に示されるように、Ｄｏｘ処理細胞は、Ｄｏｘで処理しなかった細胞と比較して有意に低減したバイオルミネッセンスを示した。（図４において「コントロール」と標示された試料は、ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）を形質移入しなかったクローンを意味する。）バイオルミネッセンスの減少は、図５に示されるように、各個々のＲｏｓａ−ｌｕｃ ＥＳクローン細胞株に対して定量した。図５のｙ軸は図４の記録されたシグナルのカウントを表す。
【００９１】
ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）を形質移入したＲｏｓａ−ｌｕｃ ＥＳ細胞を誘導して１１日間、胚様体（ＥＢｓ）に分化させた。ＥＢｓは、初期胚発達をインビトロで繰り返すので遺伝子機能を研究するための強力なツールである。分化は、分化培地（１０％の熱不活化仔ウシ血清、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補填した、１．０μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを伴うか伴わないＤＭＥＮ）の降り注ぐ液滴（〜６００細胞／３０μｌ／液滴）中で細胞を培養することにより誘導した。ついで、細菌学的ペトリ皿で７日間、ＥＢｓとして分化懸濁培地中で細胞を培養した。ついで、ＥＢｓを、全体で１１日の間、分化培地中での連続培養のために０．１％ゼラチンをコートした組織培養プレートに移した。図６に示されるように、ドキシサイクリンを含む培地で培養されたＥＢｓは、ドキシサイクリンを含まなかった培地で培養したＥＢｓと比較すると、バイオルミネッセンスの有意な減少を示した。（図５中の「コントロール」と標識したバーは、ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）を形質移入していないクローンを意味する。）
【００９２】
Ｃ．ドキシサイクリンはＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）トランスジェニック動物におけるルシフェラーゼ遺伝子発現のノックダウンを誘導する
Ｒｏｓａ２６−ルシフェラーゼコンストラクトを、２００６年１０月１０日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３９０３５に記載された常套的方法を使用して、ＦＶＢマウスからの卵母細胞中に注入し、トランスジェニック「Ｒｏｓａ−ｌｕｃ」マウスを作製した。トランスジェニックファウンダーを分析し、遍在性の強いルシフェラーゼ発現の一つの系統を次の実験に使用した。
トランスポサーゼをコードする核酸を、ヒトβ−アクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサーを含むプロモーター(InvivoGen, San Diego, CA)の制御下に配したベクターを構築した。得られたベクター（「ｐＣＡＧ−ＰＢａｓｅ」）の核酸配列を図１１及び配列番号１８に示す。１ｎｇ／μｌの濃度のｐＣＡＧ−ＰＢａｓｅと約１−３．２ｎｇ／μｌの濃度のＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）を、単細胞Ｒｏｓａ−ｌｕｃマウス胚（つまり受精卵）の前核中に同時注入した。注入した胚を代理雌マウスに移した。子孫の遺伝子型を、ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）の安定な生殖系列伝達を同定するためにＰＣＲによって同定した。そのマウスを飼育して、「ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）／Ｒｏｓａ−ｌｕｃ」マウス系統と称されるマウス系統を産生した。
【００９３】
ドキシサイクリンを、一週間まで０．２ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンと０．５％のスクロースを含む飲料水をマウスに与えることによってＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）／Ｒｏｓａ−ｌｕｃマウスに投与した。ついで、そのマウスに２５０μｌのルシフェリンを２０ｍｇ／ｍｌで腹腔内注射した。ついで、マウスを麻酔し、ＣＣＤカメラを使用して全身の画像化を行った。結果を図７に示す。ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）導入遺伝子を含んでいないＲｏｓａ−ｌｕｃコントロールマウス（マウス＃２１３）は、ドキシサイクリンでの処理後にバイオルミネッセンスの減少を示さなかった。ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）／Ｒｏｓａ−ｌｕｃマウス（マウス＃２１７）の一つは、３日の誘導後にバイオルミネッセンスの劇的な減少を示し、ドキシサイクリンがルシフェラーゼ特異的ｓｈＲＮＡの発現を誘導したことを示しており、これが続いてルシフェラーゼの発現をノックダウンした。他の２匹のＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）／Ｒｏｓａ−ｌｕｃマウス（マウス＃ｓ１９２及び２２３）はバイオルミネッセンスの約３３％の減少を示した。図７に示された結果を図８において定量化した。ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）／Ｒｏｓａ−ｌｕｃマウスに対するドキシサイクリンの効果を更に探求するために、我々は全体で７日間、Ｄｏｘでマウス＃１９２を処理し続けた。図９に示されるように、マウス＃１９２からのルシフェラーゼの発現レベルは７日目に劇的に低減した。これらの結果は、ルシフェラーゼに対して特異的なｓｈＲＮＡの誘導はドキシサイクリン送達の効率及び／又は期間に依存しうることを示唆している。
【００９４】
Ｄ．リピン又は他の遺伝子に特異的なｓｈＲＮＡの誘導性発現のためのｐｉｇｇｙＢａｃ系ベクターの構築
リピンに特異的なｓｈＲＮＡの誘導性発現のためのｐｉｇｇｙＢａｃ系ベクターを以下に記載のようにして構築した。
ｓｈＲＮＡシャトルベクターを、ｐＳｕｐｅｒｉｏｒ Ｈ１プロモーター(OligoEngine, Seattle, WA)をＰＣＲによって増幅させ、ついで増幅産物をｐＥＮＴＲ／Ｄ (Invitrogen, Carlsbad, CA)中にＴＯＰＯ-クローニングすることによって、構築した。ついで、次のオリゴをベクターのＭｓｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結してｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｈ１を得た：
センスオリゴ
5’ACGTGAAATCCCTATCAGTGATAGAGACTTATAAGTTCCCTATCAGTGATAGAGATCTAAAGGGAAAA 3’(配列番号19)
アンチセンスオリゴ
5’AGCTTTTTCCCTTTAGATCTCTATCACTGATAGGGAACTTATAAGTCTCTATCACTGATAGGGATTTCACGT 3" (配列番号20)(下線部tetO)
【００９５】
ｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｈ１中の得られたプロモーター（「Ｈ１−ＴｅｔＯ２−２ｘ」）は、Ｈ１プロモーターと二つのＴｅｔＯ配列を含んでおり、その一つはＴＡＴＡボックスと転写開始部位の間に位置し、その他方はＴＡＴＡボックスの上流に位置していた。ｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｈ１中のＨ１−ＴｅｔＯ２−２ｘプロモーターのポリヌクレオチド配列は次の配列を含んでいる：
CGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATCCCTATCAGTGATAGAGACTTATAAGTTCCCTATCAGTGATAGAGATCCCC(配列番号16)。
【００９６】
ｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｈ１において、Ｈ１−ＴｅｔＯ２−２ｘ  プロモーターにはＧａｔｅｗａｙ組換え部位ａｔｔＬ１及びａｔｔＬ２が隣接しているので、プロモーター（及びプロモーターの下流であるがａｔｔＬ２の上流にサブクローニングされた任意のポリヌクレオチド）がＧａｔｅｗａｙ組換えによって容易に移動されうる。
【００９７】
リピン遺伝子に特異的なｓｈＲＮＡｓをコードする３つの異なったＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をそれぞれＴｅｔＯ配列の下流のｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｈ１中に連結させた。３つの断片は、次の３セットのオリゴヌクレオチドを使用して作製した（下線は自己相補性の領域を示している）：
セット１
リピン-shRNA OL3A
GATCCCCCGACAACCCTGCTATCATCTTCAAGAGAGATGATAGCAGGGTTGTCGTTTTTTGGAAA (配列番号23)
リピン-shRNA OL3B
AGCTTTTCCAAAAAACGACAACCCTGCTATCATCTCTCTTGAAGATGATAGCAGGGTTGTCGGGG (配列番号24)
セット２
リピン-shRNA OL5A
GATCCCCGGTTGACGCCAAAGAATAATTCAAGAGATTATTCTTTGGCGTCAACCTTTTTTGGAAA (配列番号25)
リピン-shRNA OL5B
AGCTTTTCCAAAAAAGGTTGACGCCAAAGAATAATCTCTTGAATTATTCTTTGGCGTCAACCGGG (配列番号26)
セット３
リピン-shRNA OL8A GATCCCCCCGGAAGACTCCTGATAAATTCAAGAGATTTATCAGGAGTCTTCCGGTTTTTTGGAAA (配列番号27)
リピン-shRNA OL8B AGCTTTTCCAAAAAACCGGAAGACTCCTGATAAATCTCTTGAATTTATCAGGAGTCTTCCGGGGG (配列番号28)
【００９８】
３つの得られたコンストラクトは、図１０Ａに示されるように、上位概念的にｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ（リピン）と称される。（Ｈ１−ＴｅｔＯ２−２ｘプロモーターは図１０Ａにおいて「Ｈ１プロモーター」と称される。）ｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ（リピン）からのＨ１プロモーター−ｓｈＲＮＡカセットを、ついでＧａｔｅｗａｙ組換えを使用してｐＨＵＳＨ−ＧＷプラスミド（２００６年７月２７日出願の米国出願第１１／４６０６０６号）中にサブクローニングした。図１０Ａに示されるように、ｐＨＵＳＨ−ＧＷプラスミドは、ＴｅｔＲ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−ｐｏｌｙＡカセットの上流にａｔｔＲ１−ｃｍＲ−ｃｃｄＢ−ａｔｔＲ２カセットを含んでいる。（）ＴｅｔＲ−ＩＲＥＳ−ピューロマイシン−ｐｏｌｙＡカセットは図１０Ａ及び１０Ｂにおいて「ＴｅｔＲ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ」と称される。）得られたコンストラクトは、ＴｅｔＲ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏカセットの上流にＨ１プロモーター−ｓｈＲＮＡカセットを含むが、図１０Ａに示されるように、「ｐＨＵＳＨ−ｓｈＲＮＡ（リピン）」と称される。ついで、図１０Ｂに示されるように、Ｈ１プロモーター−ｓｈＲＮＡ−ＴｅｔＲ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ断片を、ＨｐａＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を有するプライマーを使用してｐＨＵＳＨ−ｓｈＲＮＡ（リピン）からＰＣＲによって増幅させた。ついで、単位複製配列を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ骨格（図１０Ｂにおいて「ＰＢ−ｐＳＫ ＩＩ」と称する）中のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンのＨｐａＩ及びＢｇｌＩＩ部位中にサブクローニングして、ＰＢ（リピン−ｓｈＲＮＡ）を作製した。配列番号３及び５（セクションＩＩ．Ａ．１．ｂの「配置２」を参照）に相当するｐｉｇｇｙＢａｃ ＩＲｓは標示された領域内にある。ＰＢ（ｌｕｃ−ｓｈＲＮＡ）に対して上述したものと同じ方法でＰＢ（ｌｉｐｉｎ−ｓｈＲＮＡ）を使用して、トランスジェニックマウスを作製した。
当業者であれば、上述のベクターを、任意の標的核酸に特異的なｓｈＲＮＡを発現できるように適応化させることができることが分かるであろう。
【００９９】
前記発明は理解の明確さのために例証と実施例によってある程度詳細に記載したが、記載と実施例が発明の範囲を限定すると考えてはならない。ここで引用された全ての特許及び科学的文献の開示は出典明示によってその全体がここに援用される。ここで使用される項目名は構成上の簡便性のためのもので、限定するものと解してはならない。
【図１】
2010512794.tif 000004
【図２ａ】
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【図２ｂ】
2010512794.tif 000006
【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
2010512794.tif 000009
【図２ｆ】
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【図２ｇ】
2010512794.tif 000011
【図２ｈ】
2010512794.tif 000012
【図２ｉ】
2010512794.tif 000013
【図２ｊ】
2010512794.tif 000014
【図３】
2010512794.tif 000015
【図４】
2010512794.tif 000016
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2010512794.tif 000021
【図１０ａ】
2010512794.tif 000022
【図１０ｂ】
2010512794.tif 000023
【図１１ａ】
2010512794.tif 000024
【図１１ｂ】
2010512794.tif 000025
【図１１ｃ】
2010512794.tif 000026
【図１１ｄ】
2010512794.tif 000027
【図１１ｅ】
2010512794.tif 000028
【配列表】
2010512794000001.app
【国際調査報告】
2010512794.tif 000029
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2010512794.tif 000031
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