(57)【要約】  画像をセクターに分割し、多数のセクターを、無作為だが、セクター中の対象の可能性に比例する選択の確率で選択する。当該選択セクターについて、対象を測定又はカウントし、画像全体における対象の量の推定のために使用する。
2010512521.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成成分の不偏推定のための方法であって、以下のステップ
対象を示す識別可能な画像解析特性を画像に提供すること、
画像解析により、画像を複数のセクターに分割すること、及び当該複数のセクターの数よりも実質的に少ない数で、前記複数のセクターのサブセットを抽出すること、
各抽出セクターの対象の構成成分を決定すること、例えば対象の数ｘiをカウントすること又は量を測定すること、及び
抽出セクターにおける対象の構成成分の前記決定による結果に基づき、例えば対象の数又は量等の対象の総構成成分の不偏推定を計算すること、を含んでなり、
セクターのサブセット抽出は、セクターにおける対象存在の可能性に対して正の相関がある不均等な確率を用いる、無作為抽出基準に従って実施されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記方法が、
対象を示す、特定タイプの画像解析特性についての基準を規定すること、
コンピュータ化画像解析により、前記規定の基準に基づいてセクターを自動的に解析すること、及び各解析セクターに数的重み因子ｚiを割当てること、ここで該重み因子は、検出可能な特性の構成成分、例えば総数又は総量に対し、例えば比例する等の正の相関があり、
前記特定セクターの抽出確率は、その特定セクターのための重み因子ｚiに比例する、無作為抽出基準に従って多数のセクターを抽出すること、
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記無作為抽出基準が、系統的均等無作為抽出（Systematic Uniform Random Sampling）（ＳＵＲＳ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
全てのセクターについて累積重みＺを計算すること、標本の大きさｎを選択すること、及び抽出のためのＳＵＲＳ周期をＺ／ｎに設定すること、をさらに含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
任意により、累積重みＺを計算する前に、セクターの重みに基づくスムースフラクショネーター（Smooth Fractionator）に従う抽出のために、セクターを配置するステップをさらに含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
各セクターに、ＳＵＲＳ周期Ｚ／ｎで除した重み因子ｚiと等しい、不均等な抽出確率ｐiを与えることをさらに含んでなる、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記確率に従ってセクターを抽出するために、累積した重み因子ｚiでＳＵＲＳを用いることにより、セクターのサブセットを抽出することをさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
対象の構成成分、例えば総数又は総量等を推定するため、セクターのサブセットについてのｘi／ｐiの加算を伴う、ホルビッツ・トンプソン（Horvitz-Thompson）推定量を使用することをさらに含んでなる、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記特定タイプの画像解析特性のための基準が、色基準、形態基準及び状況基準（contextual criteria）からなる群の少なくとも１つである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記色基準が、３次元色空間における規定立体（defined volume）により表され、この色空間における３つの次元は、赤、緑及び青の飽和数値により各々与えられる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記規定立体が球である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
絶対的な精度が、所望の大きさの半分以下のセクターの標本に基づく２以上の独立した推定値から、これらの独立な推定値の平均で除したその平均の標準誤差を用いてコンピュータ計算される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
単純無作為抽出に対する精度が、既知の抽出確率ｚi及び既知の成分ｘiに基づいて、セクターの標本から自動的にコンピュータ計算される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
定量される対象に対して正の相関がある画像特性について自動的に解析されるセクターが、前記画像におけるセクター総数が大きい、既知の確率を持つ、統計的に均等な副標本である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記画像が、より大きな領域の多数の画像の集合である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記画像が、放射スペクトルの不可視部分における情報の２次元マップである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、解剖学的構造体である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、２つの薄い組織標本の連続切片又はその画像に頼る、物理的ディセクター（physical disector）の原理の使用を含む立体解析学を用いることにより、対象の構成成分を決定すること、例えば対象をカウント又は測定することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記画像が、顕微鏡画像である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、仮想顕微鏡又は走査型顕微鏡の使用によって顕微鏡画像を取得することを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、組織学的組織切片又は細胞学的細胞の伸展標本の顕微鏡画像を撮影することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記画像が、地理学領域の衛星画像又は天文領域の望遠画像である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は構成成分、例えば組織切片におけるガン細胞の数を推定するための方法に関する。特に本発明は、対象の構成成分、例えば数又は量の不偏推定のための方法であって、以下のステップ、
対象を示す識別可能な画像解析特性を画像に提供すること、
画像解析により、画像を複数のセクターに分割すること、及びかかる複数のセクターの数よりも実質的に少ない数で、複数のセクターのサブセットを抽出すること、
各抽出セクターの対象の構成成分を決定すること、例えば対象の数ｘiをカウントすること又は量を測定すること、及び
前記抽出セクターにおける対象の構成成分の決定による結果に基づき、対象の総構成成分の不偏推定を計算すること、
を含んでなる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物組織における構造体の定量は、現代医薬及びライフサイエンスの研究及び開発において重要な課題の１つである。組織学的検査は、しばしば多数の組織切片検体の顕微鏡による解析を必要とする。好ましくはその結果は、主観的かつ定性的なものよりも、客観的かつ定量的な性質を有するべきである。しかし、この処理は時間を消費し過ぎるべきではない。従って、組織切片の定量的顕微鏡解析を自動化する方法の要請がある。
【０００３】
いくつかの例において、定量的な組織学的解析は、組織切片の画像を多数のセクターにモザイク化すること基づいている。セクターのサブセットは抽出されて使用者に提示され、使用者によって全ての提示セクターにおける関連対象が定量される。これらの測定から、全体画像についての対象の総数又は総量が推定される。
【０００４】
一般的に、セクターは系統的均等無作為抽出（systematic, uniformly random sampling (ＳＵＲＳ)）操作で抽出される。ＳＵＲＳ法は、(Gundersen, 2002)によるスムースフラクショネーター（smooth fractionator）の導入により改善された。(Gardi 等 2006)により、この改善は、異なる対象分布において、コンピュータ支援立体解析学のためのシミュレーションを応用することにより、さらに検討されている。各セクターは、セクターにおける想定カウントに相関する重みが与えられる。重み付けは、セクターの潜在的カウントとその物理的大きさ又は色との間の任意の可能性ある相互関係に基づく。(Gardi 等 2006）においては、割当て重みを、平滑化プロトコルに従うセクターの再配列のためにのみ、実際のＳＵＲＳの前に使用する。平滑化プロトコルは全セクターが一定の（均等な）抽出確率を有するという事実を変えない。
【０００５】
上記方法の弱点は、それらが実質的な作業を要すことである。これが、作業負荷を低下させつつも、正確な結果を与えるよう、当該方法を改善することが望まれる理由である。
【０００６】
一般的な画像解析技術は、そもそもは文字と単語の同定用のものとして欧州特許出願526197号に開示されている。この方法は、対象のカウントには不適であり、生物細胞カウントの目的にうまく適用できない。この方法を対象の大きさ推定に使用すると、生物細胞研究関連においては不所望の非常に偏った推定を得るという弱点を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、例えば組織標本等における対象の総量の不偏推定のためのより有効な方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、例えば適切な倍率で観察される顕微鏡の、衛星の及び望遠の画像等の全ての画像における対象の定量に、一般的に適する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的は、例えば対象の数もしくは量、又はその両方等の構成成分の不偏推定のための方法により達成される。ここで当該方法は、以下のステップ、
対象を示す識別可能な画像解析特性を画像に提供すること、
画像解析により、画像を複数のセクターに分割すること、
当該複数のセクターの数よりも実質的に少ない数で、前記複数のセクターのサブセットを抽出すること、
各抽出セクターの対象の構成成分を決定すること、例えば対象の数ｘiをカウントすること又は量を測定すること、及び
前記抽出セクターにおける対象の構成成分の決定による結果に基づき、例えば対象の数／量等の対象の総構成成分の正確な／不偏推定を計算すること、を含んでなる。
【０００９】
さらにこの方法は、セクターのサブセット抽出を、セクターに存在する対象の可能性に対して正の相関がある不均等な確率を用いる、無作為抽出基準に従って実施することが必要である。
【００１０】
本発明によると、画像はセクターに分割され、これらのセクターの少数（つまりサブセット）を、典型的にはコンピュータ画像解析プログラムを使用することにより、自動的に抽出する。より精密な検査のためのセクターの選択は、無作為抽出基準に依存する。異なる無作為抽出基準が、従来技術の文献で述べられているが、この新規な特性は、セクター選択の確率が、かかるセクターにおける対象の存在の可能性に依存することである。例えば、組織切片におけるガン細胞が青に染色される場合、組織切片の顕微鏡画像の青領域は、ガン細胞を含む可能性が高い組織を表す。すなわち、顕著な青色を伴う領域は大きな抽出確率が与えられ、一方ほとんど青くない領域はより小さな抽出確率が割当てられる。
【００１１】
これは、(Gardi 等 2006)に比べて改善である。なぜなら、(Gardi 等 2006)は平滑化のためだけに重みを使用しているものの、均等な（一定の）抽出確率を使用しているからである。
【００１２】
構成成分なる語は、対象の数又は量のことを言うだけでなく、他のパラメータ、例えば体積、長さ、周囲の長さ、及び／又は表面積にも及ぶ。画像における対象を示す画像解析特性は、例えば顕微鏡等の画像装置により識別可能であるとともに、顕微鏡を使用する場合に人の目で視覚的に識別可能であってもよい。
【００１３】
選択したセクターで対象の量が明らかになると、全体画像又は部分における対象の総構成成分、例えば総量等は、各セクターの抽出確率を考慮して推定される。すなわち、本発明による方法は、対象を有する可能性が高いセクターを使用者に提供するだけでなく、対象の総数の不偏推定値も提供するため、有効性を向上させるとともに労力を抑制する。
【００１４】
さらに、本方法はなんら追加の努力なしに、２つの独特な精度測定を可能にする。ここで「独特」とは、任意の有効な代替法（ＳＵＲＳ及びスムースフラクショネーター）には不可能なためである。
【００１５】
第一の精度測定は、直接ＣＥ推定である。所望のｎ個のセクターの標本は、大きさｎ／２の抽出課題に分けられる。この２つの抽出課題は完全に独立している。ここから得られた２つの推定値は、２つの独立な半分の大きさの推定値の平均で除したその平均の標準誤差（すなわちSEM／平均）を計算することにより、平均推定値の精度の不偏推定を提供する。あるいは２を超える抽出課題を実施することもできる。
【００１６】
第二の精度測定は、単純無作為抽出に対する有効性と呼ばれ、当該方法での抽出は各セクターに対して既知の確率を有するという事実に基づく。既知の確率で抽出された各セクターにおける構造体又は画像特性の既知量は、全てのセクターにおける平均量とそのばらつきの計算結果と認められる。これは同様に、従来の単純無作為抽出を使用する場合の精度の計算結果と認められる。最後に、これを上記の直接ＣＥ推定値と比較すると、単純無作為抽出のものに対する本方法の有効性の推定値がもたらされる。
【００１７】
上記の両方の精度測定は、より確実化するために複数の画像又は組織切片にわたって蓄積してもよい。
【００１８】
実際の実施態様によれば、本方法は、
対象を示す、特定タイプの画像解析特性についての基準を規定すること、
画像解析をコンピュータ化することにより、セクターを自動的に解析すること、及びコンピュータープログラムにおいて、各解析セクターに重み因子ｚiを割当てること、ここでその重み因子は、セクターにおける画像解析特性の構成成分（例えば総数もしくは総量、又は強度もしくは適合度）に対し、例えば比例する等の正の相関があり、
コンピュータープログラムにおいて、特定セクターの抽出確率は、その特定セクターのための重み因子ｚjに比例する、無作為抽出基準により複数のセクターを抽出すること、を含んでなる。
【００１９】
その後、この方法はさらに、解析の目的に非常によく合致する、各抽出セクターにおける特定タイプの構造又は画像の、要素又は特性の、数又は量ｘiの測定を必要とする。
【００２０】
組織特性の定量化は、本発明による一般的な方法（以下でプロポーショネーター（proportionator）抽出及び推定の手法と呼ぶ）、例えば自動画像解析及びサイズ比例確率（probability proportional to size、ＰＰＳ)での不均等な抽出を用いることにより改善する。注目の完全領域は視野に分割され、各視野は、例えばその中における要求の画像解析特性の数又は量等の総構成成分に比例する重みｚj（大きさ）を与えられる。セクター数は非常に多い（数千超）が、例えばＳＵＲＳを用いる既知の均等な確率で取られる、より小さい標本（数百超）は、全てのセクターに割当てる重みを有する必要がある。個々の重みに比例する既知の確率で抽出された視野は、正確なカウントを提供する検査者又は測定装置によってのみ見られるものである。画像解析及び自動特性検出が明らかに偏っていたとしても、推定量の厳格な不偏性はｘjの測定の正確さだけに依存する。
【００２１】
好ましい実施態様によれば、無作為抽出基準は系統的均等無作為抽出（ＳＵＲＳ）である。有利なことには、本方法は、全セクターの累積重みＺを計算し、標本の大きさｎを選択し、及び抽出のためのＳＵＲＳ周期をＺ／ｎに設定するステップを意味する。さらに、そのセクターの重みに基づいてスムースフラクショネーターに従って抽出のためにセクターを配列し、例えばその後に累積重みＺを計算してもよい。
【００２２】
好ましくは、ＳＵＲＳ周期Ｚ／ｎで除した重み因子ｚiと等しい、不均等な抽出確率ｐiを、各セクターに割当てる。その確率に従ってセクターを抽出するために、累積した重み因子ｚiでＳＵＲＳを用いることにより、セクターのサブセットを抽出してもよい。さらに、対象の構成成分、例えば総数又は総量等を推定するため、セクターのサブセットについてのｘi／ｐiの加算を伴う、ホルビッツ・トンプソン（Horvitz-Thompson）推定量を使用する。
【００２３】
任意に、特定タイプの画像解析特性のための基準は、色及びその飽和度を表すある数値範囲で表した色基準でもよい。この色を、任意に色空間における各次元が赤、緑及び青の飽和数値により与えられる３次元の色空間において、例えば球又は立方体等の規定立体より表してもよい。あるいは又はさらには、その基準が形態基準又は状況基準（contextual criteria）でもよい。例えば形態基準は、構造特徴、及び例えば円形又は伸長等の特定局所形状の形成に対する貢献度を表す数値範囲で表される。例えば、状況基準は、位置的特長、典型的には最も近い隣接構造体への距離を表す数値範囲により表される。
【００２４】
本発明の応用は多数ある。本発明の好ましい応用は、その対象が細胞及び組織切片の顕微鏡画像である医薬及び生物の分野である。ただし、その発明はより一般的なタイプで、顕微鏡とは異なる分野で使用されることもあり、例えば画像／ピクチャが、地理学領域における１又は集合体の（１又は複数の）衛星画像又は（１又は複数の）航空写真でもよく、ここで選択された対象、例えば木、穀物、乗物又はある種の建物は、大きさ及び／又は数で推定される。
【００２５】
顕微鏡の応用において、最初の画像解析は染色組織切片の低倍率画像で実施されることが多い。低倍率にはある視野の深さが含まれているが、これは解析されるセクターが完全な２次元（２Ｄ）性ではなく、組織切片の厚みのために３次元（３Ｄ）構造のようであることを示す。いくつかの場合においては、抽出セクターにおける対象の数又は量の推定は、手動又はコンピュータ支援での画像解析（２−Ｄ）により行うことができ、他の場合においては、容積測定（３−Ｄ）、例えば光学的ディセクター（optical disector）等の立体解析学原理を用いて行うべきである。典型的には、後者はｚ軸でスクロールするための顕微鏡のオンライン使用及びコンピュータ支援立体解析学的手段の使用を要する。
【００２６】
さらに、以下の態様が考えられる。前記最初の画像解析は、必ずしも例えば染色した円形のガン細胞等の対象の存在を直接同定するためだけに設計されるとは限らない。多くの場合においては、対象自身が特徴的に染色され、又は識別可能な形態を有するが、最初の画像解析は、対象の存在と関連する特性、例えば新規に形成され、染色され及び伸長した血管等を見つけるために使用することもできる。従って、最初の画像解析の結果は、まさに対象の存在可能性の間接測定である。例えばガン細胞数の推定は、染色され伸長した脈管近傍の部分である可能性がより高い抽出に基づく。
【００２７】
本発明は、図の参照でより詳細に説明できる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、プロポーショネーター抽出を説明する。縦軸は累積重みを示す。縦軸上の抽出は、その重みに従って視野（セクター）をスムースフラクショネーター配列（smooth fractionator arrangement）した後の、系統的均等無作為抽出である。抽出視野は、より暗色でマークする。
【図２】図２は、重み付けを説明する。ボクセルは赤、緑及び青の３Ｄ色空間でマップされる。Ｘは要求の色を表す。●は画像ボクセルの２つの例を示し、球形の内部にある方はその重みに寄与し、他方は無視される。
【図３】図３は、第一の例で、ラット小脳における顆粒細胞の総数を推定する例を示している。
【図４】図４は、第二の例で、マウス脳におけるＧＦＰオレキシン神経細胞の総数を推定する例を示している。
【図５】図５は、第三の例で、イヌ膵臓におけるβ細胞の領域と総組織を推定する例を示している。
【図６】図６は、ラット小脳における顆粒細胞の総数を推定する場合の、個々の標本の分布及び二変数の抽出分布を示す。ａ）ディセクター（disector）当たりの正確なカウントの分布、ｂ）プロポーショネーターを用いて抽出された全領域での正確なカウントと重み、ｃ）推定値（縦軸は最大推定値に対する割合）、水平線は平均推定値である。
【図７】図７は、マウス脳におけるＧＦＰオレキシン神経細胞の総数を推定する場合の、個々の標本分布及び二変数の抽出分布を示す。ａ）ディセクター当たりの正確なカウントの分布、ｂ）プロポーショネーターを用いて抽出された全領域での正確なカウントと重み、ｃ）推定値（縦軸は最大推定値に対する割合）、水平線は平均推定値である。
【図８】図８は、イヌ膵臓におけるβ細胞の領域を推定する場合の、個々の標本の分布及び二変数の抽出分布を示す。ａ）ディセクター当たりの正確なカウントの分布、ｂ）プロポーショネーターを用いて抽出された全領域での正確なカウントと重み、ｃ）推定値（縦軸は最大推定値に対する割合）、水平線は平均推定値である。
【図９】図９は、イヌ膵臓における含有組織を推定する場合の、個々の標本の分布及び二変数の抽出分布を示す。ａ）ディセクター当たりの正確なカウントの分布、ｂ）プロポーショネーターを用いて抽出された全領域での正確なカウントと重み、ｃ）推定値（縦軸は最大推定値に対する割合）、水平線は平均推定値である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
上記の通り、組織特性の定量化は、本発明による一般的な方法（以下これをプロポーショネーター抽出及び推定の手法と呼ぶ)、例えば自動画像解析及びサイズ比例確率（ＰＰＳ)での不均等な抽出を用いることにより改善する。注目の完全領域は視野に分割され、各視野は、例えばその中における要求の画像解析特性の数又は量等の総構成成分に比例する重みｚj（大きさ）を与えられる。個々の重みに比例する既知の確率を用いて抽出された視野は、正確なカウントを提供する観察者によってのみ見られるものである。画像解析及び特性検出が明らかに偏っていたとしても、推定量は厳格に不偏である。以下において、３つの生物の例を用いて、プロポーショネーターを、一般に適用される抽出技術（２Ｄ空間における系統的均等無作為抽出、ＳＵＲＳ、又はいわゆる蛇行抽出（meander sampling））と比較する。３つの例は、ラット小脳における顆粒細胞の総数の推定、遺伝子組み換えマウスの脳におけるオレキシン陽性神経、及びイヌ膵臓におけるβ膵島細胞の絶対的面積及びその面比率の推定である。プロポーショネーターは、従来のコンピュータ制御抽出と比較して、少なくとも８倍以上有効（正確さ及び時間を併せて）であった。
【００３０】
不偏推定をもたらす、偏った画像解析と不均等な抽出の組み合わせであるプロポーショネーターは、シミュレーションを用いて研究されている。プロポーショネーターは、画像解析を用いる各視野への自動的な重み付けと、それに続く累積重みでの系統的均等無作為抽出（ＳＵＲＳ)に基づく。無条件不偏推定は、周知の一般的統計技術である（Hansen & Hurwitz 1943; Horvitz & Thompson 1952）。いわゆるホルビッツ・トンプソン推定量は、抽出視野における実カウントが（実カウントとは、熟練使用者又は正確な測定装置によりなされ、画像解析によらないもの）「正確」であり、その各視野の正確な抽出確率が既知である場合、不偏推定を提供する。
【００３１】
各視野の重みは、画像解析により自動的に割当てられる。画像解析は要求の画像解析特性の量に従って、視野に重み付けをする。緑色のＧＦＰ発現神経の数の推定では、例えば各視野の重みは蛍光照明の下で観察される緑色の量でもよい。
【００３２】
図１に示すように、視野は、その重みに基づくスムースフラクショネーターに従って最初に配列され、その後累積重みＺがこの順序でコンピュータ計算される。無作為な開始で、Ｚ／ｎのサンプリング周期を用い、特定のサイズｎの標本を累積重みの縦軸上に体系的に抽出する。その結果、既知の座標軸を伴うこれらの視野が、使用者に提供される。
【００３３】
熟練使用者は、明らかに正確な任意の測定原理、例えば立体解析的標識（光学的もしくは物理的な、点、線、フレーム、又はディセクター）等を用い、不偏カウントｘiを重みｚiで各抽出視野に割当てる。画像又は部分における不偏推定値Ｘの総カウントは、その後単純に、
【化１】
2010512521.tif 000003
となる。
【００３４】
視野の偏った重みとその領域の正確なカウントとの間の関係は、正でも負でもよい。それに関係なく、その推定値は常に不偏である。ただし、精度（ＣＥ）は、重みとカウントとの間の関係にかなり依存し、これが正であればあるほど精度がより良好になり、関係がない又は負の場合はむしろ悪くなり得る。また、重みとカウントの間の関係における全種類のノイズは、精度を低減させる。
【００３５】
本研究は、従来のＳＵＲＳ（Gundersen 等 1999）に対するプロポーショネーターの実機能を、３つの生物的な例に適用することにより比較する。３つの例は、ラット小脳における顆粒細胞の総数の推定、遺伝子組み換えマウスの脳におけるオレキシン神経、及びイヌ膵臓におけるβ膵島細胞の絶対的及び相対的面積である。
【００３６】
方法と原料
従来の文献（Gardi 等 2006）において、スムースフラクショネーター抽出が報告され、試験され、及びシミュレーションを用いてＳＵＲＳと比較された。シミュレーションの枠組みは、存在する立体解析のソフトウェアＣＡＳＴ上で構築した（VisioPharm、Horsholm、Denmark）。（Gardi 等 2006）においては、添付のＡに記載の通りに重み付けの手順を設計し、外部コンポーネントとしての開始から、dynamically loaded library（ｄｌｌ）としてのＣＡＳＴまでを実施した。現在この重み付けは、入力として画像及び要求の色ボクセルを得ると、出力としての重みを返す。
【００３７】
本研究におけるこの重み付けは、非常に基本的ではあるが確実である。入力画像はボクセルからなり、使用者が注目する要求の色もボクセルである。各ボクセルは赤、緑及び青の混合である色を有する。ボクセルは、３Ｄ色空間において座標軸としてのこれら３つの基礎的色で観察される。各画像における色ボクセルから要請色ボクセルまでの距離Ｄを、この３Ｄ色空間で測定する。基礎的色の値は０〜255の範囲であり、この３Ｄ空間の立方形における可能な最大距離は、√(2552+2552+2552)＝441.67である。各ボクセルについて、この最大距離に対する割合として要請ボクセルの近接性を計算する。
【化２】
2010512521.tif 000004
【００３８】
重み付けにおけるさらなる特徴は、使用者は、どのボクセルが無視されるかというだけでなく、その色の最低限の近接性を示してもよい点である。従って、その重みに寄与するボクセルは、要請ボクセル周囲の球で囲まれる。図２を参照。各視野に割当てられた重みは、その領域における全ボクセルからの近接割合の和である。
【００３９】
プロポーショネーターは、立体解析学のために修正された顕微鏡システムを用いて（詳細な装置は、以下の添付Ａに示す）、上記の３つの生物的な例を用いる従来のＳＵＲＳと比較する。全ての例において、各スライドで４つの独立した推定値を得る。４つとは、プロポーショネーターを用いる２つの推定値と従来のＳＵＲＳを用いる２つである。同じ方法における各反復における２つの推定値の間の相対的な相違は、その方法がいかに正確であるかの（粗い）指標を提供するために使用する。観察された視野の数、及びその領域を描くとともに重み付けすることに費やした時間を記録する。各標本について、およそ同じ総カウントを得るために必要な抽出比率を調整するために、プロポーショネーター及び従来のＳＵＲＳを用いて予備試験を行う。これらの比率は、各スライドにおける視野の総数にかかわらず、全部の例及びその中におけるスライドにわたって一定を維持する。各スライドにおいて、注目の領域は４回独立に描かれ、色の要請及び重み付けを２つのプロポーショネーターの推定値のために独立に実施する。色、染色、及び部分のアーチファクトにおける相違により、スライド間で重みの範囲が異なった。
【実施例１】
【００４０】
ラット小脳における顆粒細胞の総数
可変抽出率（varying sampling fraction）（Dorph-Petersen等、2001; Horvitz & Thompson 1952）を用いる光学的フラクショネーター（optical fractionator（West等、1991）を用いて、ラット小脳における顆粒細胞の総数の推定を、２匹の正常ラットから得た切片の系統的均等無作為抽出で行った。
【００４１】
画像を、図３に示す。青色の顆粒細胞層は1.25×ではっきりと見える（左上部のパネル）。注目の領域を粗く描き、視野に分割する。右上部のパネルは、グレースケールで重み付けされた視野を示す。左中央のパネルは、プロポーショネーターで抽出された領域（白の長方形）の分布を示し、この抽出された視野は顆粒細胞層におけるものであることはほぼ確実である。中央右（従来のＳＵＲＳでの抽出）に示される通り、このような視野はその青の領域に達してもよいし、そうでなくてもよい。下段の２つのパネルは、100×倍率（オイルレンズ）でのカウントの例である。
【００４２】
４％リン酸バッファ化ホルムアルデヒドにおける浸漬固定後、小脳を単離し等分した。一方の任意の半分を、イセクタ法(isector）（Nyengaard & Gundersen 1992）を用いて５％アガー中に等方的に埋め込み、メタクリル酸グリコール（Technovit 7100, Kulzer, Wehrheim, Germany）中に埋め込み、そして40μmずつの塊で完全に切り分けた。24の切片毎にＳＵＲＳで取り出すと共に修正ギムザ染色（Larsen & Braendgaard 1995）で染色し、それぞれに６と８の切片を提供した。最終的なスクリーン倍率は、100×の対物レンズを用いて2800×であった。球に含まれる色は20％であった。２Ｄ不偏カウントフレーム（Gundersen 1977）の及び視野の面積は、それぞれ418μm2及び14000μm2であった。ＳＵＲＳのｘ方向及びｙ方向におけるステップ長は、1864μm及び1332μm（視野抽出率5.64×10-3の場合）であり、総ディセクター領域の抽出率が1.68×10-4となった。プロポーショネーターについては1.09×10-3の抽出率で、ディセクター領域の抽出率は0.32×10-4（ＳＵＲＳの19％）であった。Ｑ￣重み付け切片の厚みは35μmで、光学的フラクショネーター高さ（the height of optical fractionator）は25μmであった。
【００４３】
小脳顆粒細胞の総数の推定量は、
【化３】
2010512521.tif 000005
ここで、因子２は半球抽出率の逆数、ＳＳＦは切片抽出率、ＡＳＦは領域の抽出率及びＨＳＦはＱ￣重み付け切片の厚みを用いた高さ抽出率である。
【化４】
2010512521.tif 000006
一般的に言えばこれは、非常に不規則な顆粒細胞層が器官のおおよそ１／４から１／３を構成する、準クラスター分布の例である。図３を参照。
【実施例２】
【００４４】
マウス脳におけるＧＦＰオレキシン神経の総数
成熟遺伝子組み換えマウス由来の２つの脳を研究に用い、この場合損傷視床下部及び近接した脳弓周囲領域におけるオレキシン神経を、強化緑色蛍光タンパク質（Burdakov等 2006）の発光によりインサイツ（in situ）で可視化した。
【００４５】
画像を図４に示す。上列は注目の同じ領域の10×対物倍率での、明視野及び蛍光ライト使用の色識別におけるものを示す。緑色がかった背景はノイズである。カウントは、パネル下に示す通り、光学ディセクターを用い、60×油浸対物レンズを用いて実施する。小さい挿入図は、抽出領域の位置を示す。
【００４６】
脳は、４％リン酸バッファ化ホルムアルデヒド中で数時間浸漬固定し、液体窒素で低温保護及び凍結した。脳を、低温ミクロトーム（cryomicrotome）を用いて80μmミクロトームずつ完全に切り分け、１個おきにＳＵＲＳで選択した。２つの脳由来の８及び６の切片を観察した。オレキシン神経の総数を、蛍光ライト及び光学フラクショネーターを用いて推定した。最終的なスクリーン倍率は、60×対物レンズを用いて1680×であった。球に含まれる色は５％であった。２Ｄ不偏カウントフレームの面積は18100μm2であり視野面積は43200μm2であった。ＳＵＲＳのｘ方向及びｙ方向におけるステップ長は、298μm及び223μm（視野抽出率0.65の場合）であり、総領域抽出フラクションが0.272となった。プロポーショネーターについては0.28の抽出率で、総領域抽出率は0.117（ＳＵＲＳの43％）であった。Ｑ￣重み付け切片の厚みは45μmで、光学フラクショネーター高さは35μmであった。総数は前の例で推定された。オレキシン神経は参照空間において、穏やかなクラスター分布を有する。本実施例は、背景の高く且つ非常に多様な非特異的「染色」での染色を伴う状況で、プロポーショネーターの機能を試験するために選択した。図４を参照。
【実施例３】
【００４７】
イヌ膵臓におけるβ細胞の領域
イヌ膵臓由来の任意に抽出した２つのパラフィンブロックを、β細胞を産生するインスリンの絶対的及び相対的面積推定の研究のために使用した。膵臓を、１％パラホルムアルデヒド及び１％グルタルアルデヒドでかん流固定しておき、３mmの濃厚な完全交差的切片を切り取り、パラフィンに埋め込んだ（Kroustrup & Gun- dersen 1983）。各ブロックから３μm厚みの切片を切り取り、Superfrost+ガラススライド上に載せた。自動染色装置（automatic stainer）（Benchmark XT, Ventana, Hlkirch Cedex, France）を用い、β細胞をインスリン抗体（1:50 ギネアブタ抗ブタインスリン、コード A0564, DAKO, Glostrup, Denmark）及びＸＴウルトラビューＤＡＢ（XT Ultra View DAB）で染色した。全細胞核をヘマトキシリンで染色した。図５を参照。
【００４８】
図５の上部パネルの左側で、この領域は1.25×対物レンズを用いて描く。まばらであるが非常に均一に分布したβ細胞の島がある。上部パネルの右側で、β細胞の茶色は、４×対物倍率で識別されるとともに重み付けがなされる。60×対物レンズでの抽出視野からの画像及び格子点標識を下のパネルで示す。
【００４９】
最終的なスクリーン倍率は、60×対物レンズを用いて1680×であった。球に含まれる色は15％であった。視野の総面積は36300μm2であった。ＳＵＲＳのｘ方向及びｙ方向におけるステップ長は、1580μm及び1180μm（視野抽出率0.0196の場合）であった。プロポーショネーターについては0.00383の領域抽出率であった（ＳＵＲＳの20％）。１点当たりの面積（ａ／ｐ）は、β細胞について386μm2であり含有組織について1540μm2であった。両カウントは同じ領域において実施し、プロポーショネーターについてはインスリン染色の量に基づいて選択された。各切片におけるβ細胞の総面積の推定量方程式は、
【化５】
2010512521.tif 000007
であり、ここで、総［Ｐ（β細胞）］は方程式１を用いて推定される。
これらの推定値は、並列な切片（の十分に大きな標本）が一定の分離度Ｔで均一に抽出される場合、必要なものの全てである。その結果、膵臓におけるβ細胞の総容量はカバリエリ推定量、
【化６】
2010512521.tif 000008
により得られる。
【００５０】
切片が、未知の又は多様な距離で均等に抽出されるという、（起こりそうもない）状況においては、従来の容積率推定量、
【化７】
2010512521.tif 000009
を使用したであろう。これは膵臓におけるβ細胞の総容積を得るため、参照空間に到達している点のさらなるカウントと、総膵臓容積の独立の推定値、Ｖ（組織）を必要とする。
【化８】
2010512521.tif 000010
【００５１】
両推定量は、不偏にするため、β細胞の総量を縮小させる種々の次元の観点での決定が必要である。膵臓のβ細胞は、小さくかつ希少な事象の、おおまかな一様分布の例であり、その容積率は0.027未満でしかない。
【００５２】
上記３つの例の結果
研究対象の最初の標本は、ラット小脳における顆粒細胞の総数の推定量である。顆粒細胞層の区別できる青色染色は、1.25×対物レンズ明視野ではっきりと見え、その色識別及び重み付けを、速く且つ確実にさせる（図３）。100×対物レンズでカウントするフレームの小面積抽出率（３％）により、空領域の識別が迅速プロセスになった。図６は、カウント分布、並びに重みとカウント及び推定値との間の関係を示す。
【００５３】
図６ａは、ディセクター当たりの正確なカウントの分布を示す。グレーのヒストグラムは、従来のＳＵＲＳ標本における細胞カウントであり、一方全面に描かれたヒストグラムはプロポーショネーターである（その分布は同じモードに標準化されている）。図６ｂは、プロポーショネーターで抽出された全領域の正確なカウント及び重みを示す。各領域からの総推定値に対する寄与は、原点からデータ点までの線の傾きに比例する。推定値は図６ｃに示され（縦軸は最大推定値の比率を示す）、水平線は平均推定値である。平均推定値に対応する傾きは、図６ｂにおいて示される線の傾きである。プロポーショネーターのＣＥは、この傾き周辺の傾きのＣＥである。従ってプロポーショネーターについて、カウントのばらつきそれ自身は無関係である（領域から領域への変動に対して感度が低い）。
【００５４】
図６ａで説明した通り、プロポーショネーターは従来のＳＵＲＳと比較して非常に高い平均カウントで領域を抽出し（9.8対2.2）、従って研究のためにはＳＵＲＳに必要な領域数のおよそ１／４しか必要ない。さらに各領域からのプロポーショネーター推定値のＣＶ（図６ｃ）は、ＳＵＲＳ領域におけるそれより非常に低く（図６ｃにおけるグレーの分布）、0.24対0.63である。したがって研究対象の領域の数がより少ないにもかかわらず、プロポーショネーターの統計有効性（大雑把に１／ＣＥ2）は従来のＳＵＲＳのそれと比較してより大きくなり、17以下対2.5である。推定値及び精度に関する結果の総括を示す、表１も参照せよ。
【００５５】
大きさｎの１つの標本の代わりに、大きさｎ／２の２つの独立な標本を取ることにより、各部分のためのプロポーショネーター推定値のＣＥを直接推定することが可能である。通常、ｉ番目の部分における構造体の総量Ｘiの推定値の分散Ｖari（Ｘ）の直接推定量を考慮することは、より有益である。全ｍ個の部分における総量ΣＸの推定値のために、直接ＣＥ全体：
【化９】
2010512521.tif 000011
をコンピュータ計算してもよい。
ＳＵＲＳ抽出した視野（ＦＯＶ)は依存性であるため、従来のＳＵＲＳに対して同じ戦略は機能しない。
【００５６】
【表１】
2010512521.tif 000012
表１．３つの生物的な例の推定値及び精度の総括
値は、動物当たり（又は膵臓のスライド当たり）の平均値。括弧の中の値は、ＳＵＲＳのプロポーショネーター割合である。「推定値ＣＥ」は反復のＣＶである。直接ＣＥを伴うプロポーショネーターは、そのプロポーショネーター標本を２つの独立した標本に混ぜることにより実施した。本文参照。
【００５７】
推定値の統計的精度は、方程式８及び９を用い、半分の大きさの統計的に独立な２つの標本での推定を実施することにより決定してもよい。
【００５８】
顆粒細胞及びＧＦＰオレキシン神経の双方の総数についての、従来のＳＵＲＳ推定量の不良な精度は、切片の不均一性又は領域から領域への変動を示す。ただし、推定ＣＥを提供するための２つの反復の総合しかなく、また直接的ＣＥ推定値は２つの独立な標本であって（つまり半分の大きさの）２つの比較の結果である。結果的に、表１における全ＣＥ推定値はかなり不正確である。通常、各群における全ｍ匹の動物にわたる直接ＣＥ推定値を平均するものであり、
【化１０】
2010512521.tif 000013
これにより、より有用な推定値を得る。
【００５９】
各３つの例の抽出設計は、従来のＳＵＲＳとプロポーショネーター抽出及び推定の結果が可能な限り同程度であることを確認するために作られることを強調する必要がある。カウントノイズは、ΣＱ−におおよそ比例するので、研究対象の領域数はおおよそ同じ総カウントを与えるよう（予備研究において）調節される。フレームの大きさ及びディセクターの高さは、いずれの抽出戦略においても同じである。当然ながら、抽出設計はその対応する戦略のために最適化されることはない。
【００６０】
ある例に従えば、約３倍多い領域の抽出により、ＳＵＲＳの統計有効性を改善してもよい。その結果、カウントするフレームは、本フレームの１／６の複合面積である領域当たり、最大に分離されたフレームの２つにまで低減できる。調べられた６倍高いフレーム数は、ＳＵＲＳ精度に対する組織不均一性の影響をかなり減少させるだろう（プロポーショネーターを最適化する種々の手法は以下に開示する）。
【００６１】
抽出戦略の現実的な比較を試みる場合に、より多くの領域を研究することの負担について、戦略を最適化する例は、動物当たりにかかる時間を考慮する重要性を明確に示す。Ｔが動物当たりにかかる時間である場合、従来のＳＵＲＳと比較してプロポーショネーターの相対的有効性（時間及び精度）は、
【化１１】
2010512521.tif 000014
である。
【００６２】
表２は、各例に費やす総時間を示す。不良なＳＵＲＳ推定量は既にプロポーショネーターの２倍以上であるため、小脳の顆粒細胞カウントにおいて、従来のＳＵＲＳがプロポーショネーターと同程度有効になることは明らかに無理である。
【００６３】
【表２】
2010512521.tif 000015
表２．１匹の動物（又は膵臓標本における１つのスライド）をカウントするために費やす平均時間。
括弧の中の値は、ＳＵＲＳの割合におけるプロポーショネーターである。最後のカラムは、以下の方程式10を用いてコンピュータ計算する。使われるＣＥ2は、直接ＣＥ推定値のより低い観察数を考慮に入れた、ＥstＣＥ2及びＤirＣＥ2の重み付け平均であり、ＣＥ2＝（２*ＥstＣＥ2＋ＤirＣＥ2）／３。
【００６４】
プロポーショネーターと従来のＳＵＲＳの上記比較は、画像がＳＵＲＳで別々に抽出される必要があるので、通常使うことができない。ただし、さらなる努力を全く行わずに、単純無作為抽出に対してプロポーショネーターの効率を計算することができる。
【００６５】
定義
Ｎ＝視野の総数（常に既知）
ｎ＝プロポーショネーター標本の大きさ（使用者に観察される抽出視野の数）
Ｐi＝ｉ番目の視野のプロポーショネーター抽出の既知の確率
ｘi＝ｉ番目の視野における使用者によって提供された正確なカウント
直接的ＣＥを用いて推定したＣＥProp
この方法は、
・母集団における複数のｘiの推定量
【化１２】
2010512521.tif 000016
・母集団の中心積率の推定量
【化１３】
2010512521.tif 000017
・母集団のＶar（ｘ）の推定量
【化１４】
2010512521.tif 000018
・母集団のＣＶ2（ｘ）の推定量
【化１５】
2010512521.tif 000019
・及び、最後に、単純無作為抽出のものに対するプロポーショネーターの有効性の推定量
【化１６】
2010512521.tif 000020
、を含む。
【００６６】
確実性のため、個体当たりのいくつかの切片は方程式８に従い、及びいくつかの個体は方程式９に従い、上記を計算する。
【００６７】
図７ａにおいて、この例は、見せかけの非常に大きな重み（非常に低カウントで）を伴う領域、及び低い重みの領域における大きなカウントの両方により明確に特徴づけされる。
【００６８】
第二の例は、遺伝子改変マウス脳におけるオレキシン神経の総数の推定である。ＧＦＰ発現オレキシン神経の重み付けは、蛍光ライトの下、10×対物レンズでのみ可能である（図４）。このノイズのある緑色がかった画像は、非自明の色識別及び重み付けに寄与する。要求の色は精密に調整されるべきで、３Ｄ空間における最大距離（図２）は背景ノイズを拾わないよう慎重に調節されるべきである。注目の領域は小さく、総視野の数はスライド当たり40以下であった。プロポーショネーター及び従来のＳＵＲＳ両方についての大きな標本大きさ（それぞれ28％と65％）により、プロポーショネーターにおいては（各スライドに対する）色識別と重み付けが、最も時間のかかる操作になり（表２）、従来のＳＵＲＳと比較して時間の点でプロポーショネーターが不利になっていた。表２を参照。個々の標本及び重みは図７に示す。
【００６９】
ただし、顕著な不均一性により、従来のＳＵＲＳが、非常に非効率的で極めて時間を費やすものとなったので、この実際には困難な例での比較において、単に統計有効性がかなり良好であるというだけの理由で、プロポーショネーターは約８倍有効との結果になった。重みに比例する抽出及びこれに逆比例する推定の組み合わせの真の有効性が、この例において強調される。従って、これを成し遂げる時間が２倍かかるとしても、実際に多数の領域を力ずくでカウントするより、数的密度についての不均一性を回避することがかなり有効である。
【００７０】
第三かつ最後の例は、点カウントを用いるイヌ膵臓におけるβ細胞の面積の推定である。β細胞は、1.25×対物レンズで暗い茶色として明らかに見えた。茶の影としても見える組織の端でのカメラのアーチファクトのために、領域は1.25×対物レンズで描いたが、色識別及び重み付けは４×対物レンズで行った（図５）。視野の数はおよそ3000であり（60×で図全体を満たすように計算された）、これは４×での重み付け操作を、正確だが時間のかかるものにしてしまう。色の識別は迅速だが、視野の総数を観察するための実際のステージ動作が、およそ３分となってしまった（表２）。
【００７１】
図８ｂは、プロポーショネーターでの小さくかつ希少な事象の抽出における特別な問題を明らかに示している。非ゼロのカウントが低い重み領域に発生し、それらが精度を低減させる非常に高い推定値を与える（右側の上部２つのデータ点）可能性がある。
【００７２】
総組織の抽出（図９）は、インスリン−染色の重みを用いて実施するので、カウント−重みの関係が非常に悪化する。
【００７３】
図８は、カウント、重み及び推定値の統計的特長を示す。β細胞は、比較的希少な事象の検出における、プロポーショネーター機能の典型的事例であり、低カウントの領域を非常によく回避すし、高カウントの領域へ集中する。極端な推定値を示すとともに精度を低減させる、非常に低い重みの領域における臨時の正のカウントは、同等により良好な精度及びより迅速な機能のため、非常に希少であり、従来のＳＵＲＳのものと比較しておおよそ25倍良好である有効性を実際に消失させることはない。
【００７４】
β細胞染色の抽出に基づく、図９における総組織面積の推定は、大胆な試みである（及び上記に概説した通り、総β細胞容積の推定のためには不要である）。むしろ切片における膵島の一様分布のために、総量が非常に大きいすなわち大きな重みのβ細胞染色は、図９ａにおいて示したように、大きな組織面積を有するプロポーショネーター抽出領域を提供する。カウント−重みの関連は非常に弱く、推定値はそれほど正確でない。手順は速いが、組み合わせた有効性は従来のＳＵＲＳのものより明らかに良好である。
【００７５】
これは、現実の例でのプロポーショネーターの機能の初の研究であり、予備的な研究としては明らかに初のものである。主な目的は、新規な抽出メカニズムの実施でのいくつかの経験を得ることで、有効性の不正確な推定値は第二目的である(それ故、研究対象動物の数は少ない）。しかしながら有効性の推定値は、この根本的に異なる抽出及び推定のパラダイムを持つ、定量的顕微鏡法のために継続された研究を後押しした。
【００７６】
推定された有効性については、全ての例が、プロポーショネーターは従来のＳＵＲＳよりかなり有効であることを示している。ただし、有効性の推定値はそれほど正確ではなく、推定値は種々のスケールで完全に不均一であるため、上記結論が一般的に注目される多くの事例において通用しないかもしれない。それでも多少驚くべきことに、組み合わせた有効性は、ＧＦＰ及び膵臓組織標本によって証明されたように、不良なカウント−重みの関連に対して非常に確実であることが判明した。
【００７７】
プロポーショネーターは、それが現実の精度、つまり表１における直接ＣＥが、不偏に推定されるようにする点で、つまり使用者の余分なコスト又は努力がない点で、有効な抽出戦略において独特である。これが非常に大きな利点になるいくつかの理由が存在する。
・領域から領域への変動（組織の不均一性）に起因する推定量の不正確性は、現在のＣＥの統計的予測法（predictor）（Kieu 等 1999）を用いては予測できない（領域が体系的に抽出され、２Ｄ切片におけるその精度予測は数学的に困難であるから）。不均一組織における現実のＣＥは、（不完全に）予測されたものより数倍大きくなるであろう。
・非常に均一な組織における数の推定のため、プロポーショネーターのＣＥは、一般的にＣＥノイズ＝１／√カウントであり、カウントノイズより低く、ＣＥのこの部分が0.1以下となるために100細胞をカウントする必要があることを意味する。プロポーショネーターのより高い精度をうまく活用するために、24のＳＵＲＳ領域における100細胞の代わりに、16の領域における70細胞（両者とも、均一組織の大きな切片において0.1のＣＥである）をカウントする前に、熱心な研究者であれば、その切片における精度とは何かを正確に知りたいはずである。
・正確に実施されるプロポーショネーターは、カウント−重みの関係にかかわらず、不偏となることが保証される。ただし、この関係は予期せず弱く又は負ですらある可能性がある（又は自動的な重み付けに何か悪い事態が発生する可能性がある）。その結果このことが、最後の領域におけるカウント後にモニターの右に見られる、（予期せぬ）高いＣＥに反映されるので、これが安心できる安全装置となる。
・従来のＳＵＲＳと比較されるプロポーショネーターの相対的有効性は、通常の研究において実施できない（ＳＵＲＳの二重推定値を要する）。ただし、プロポーショネーターの標本単独であれば、単純無作為抽出に対するその有効性を推定するには十分である。方程式10〜13を参照。これは、その手順が、単純無作為抽出に対する約１以下の有効性により、自身の故障（使用者の誤った理解、誤った重み付け、又は非常に高いカウント／重み比率であるセクターの発生等の任意の他の理由が原因である）を報告できるという大きな利点を有する。
【００７８】
この研究のために選択された広範な例において直面した多くの現実的問題は、プロポーショネーター抽出及び推定の効率を改善し得る多くの特性を我々に確認させる。これらの多くは予想通りであったが、我々は、開始点が初歩的なシミュレーション研究のために開発されたソフトウェアであったことを考慮し、この段階で可能な限り単純な技術装置及びソフトウェアを維持したかった。
【００７９】
通常の領域から領域への変動に対しては感度が低く、研究中の特性に関して部分の不均一性がノイズよりもシグナルとなることはプロポーショネーターの特徴である。一方で、図６〜８に示される、カウント−重みの関係における任意のノイズは、精度を低減させる。組織及び染色の特定の特徴、例えば抗体などは多くの種類の「ノイズ」を与える。ただし、ノイズの源の多くが、技術的特長であり、潜在的に予防可能又は克服し得る。
【００８０】
プロポーショネーターの方法においては、顕微鏡法及び光学が、通常の顕微鏡法よりも深く組み入れられる。最適な機能のため、多くの特徴が重要である。
低倍率においては、切片での照明が非常に不規則である。図３を参照。これは、その方法に組み込まれている単純な画像解析アルゴリズム（Bischof 等 2004、 Osadchy & Keren 2004）により、比較的簡単に除去される。
非常に低倍率では、様々な回折現象が切片の端で発生し得る。この問題を最小化するため、低倍率の対物レンズを幅広く選択する必要がある。顕微鏡の製造業者により、１×、1.25×、1.6×、２×、４×、６×、10×、及び15×をしばしば利用できる。
ほとんど全ての不均一な器官は、切片から切片の変動も示す。このノイズをシグナルに混ぜ込む明らかな手法は、１のランにおける切片のセット全体で、重み付け及び抽出を行わせることである。そのため顕微鏡が、マルチスライドステージを装備することを要し、通常これらはほとんどの場合１の動物に対して十分な（もしそうでない場合、ある者はある組において１つおきに、他の者は別の組で解析すべきであり、それは必然的にその変動を除去する（Gundersen, 2002））８つの切片を供給する。適用可能な場合は、この戦略だけで多様なプロポーショネーターの有効性を向上し得る。最適な有効性のために、染色強度及び切片厚みを、切片においておおよそ一定にする必要がある。
総組織面積が、最終的な倍率のスケールで大きくなる場合、重み付け及びプロポーショネーター抽出の前に視野（ＦＯＶ)のＳＵＲＳサブ抽出を使用してもよい。視野（ＦＯＶ)の数が数千を超えると、多数の視野（ＦＯＶ)が抽出される場合に、有効性が改善する可能性は低く、その明らかな例外は希少事象の解析である。
【００８１】
全視野（ＦＯＶ)の低倍率スキャンは、プロポーショネーター有効性のために重要であり、いくつかの手法で最適化され得る。
スライド上の切片の位置の最初の指示は、長方形を素早くドラッグすることにより行ってよい。
多くの場合、注目の面積は切片全体であり、切片と上記の長方形外部との間の全ての空の視野（ＦＯＶ)が、要求の特定のシグナルを作らず（０の重みを得る）、従ってそれらは重みに比例する抽出において自動的に推定されるので、さらなる描写は必要ない。
場合によっては、切片境界の自動検出（Sahoo 等 1988; Skarbek W. & Koschan A. 1994; Wang 等 2006）が上記の代替法である。
ニューキャスト（NewCast（登録商標））（VisioPharm Horsholm, Denmark）のような現代の立体学ソフトウェアシステムには、既にモニター上で低倍率での高速スキャンをさせ、切片全体の合成画像を提示するものもある。注目の面積が単に切片の（小）部分である場合、熟練使用者による必須の手作業の描写は、近年ではこのいわゆる「スーパーレンズ（SuperLens）」画像で行われることが多い。最初のスキャンが十分な解像度で実施されると、重み付けのための情報は既に利用可能であり、これにより各切片を組み立てるのに費やす時間をさらに低減させる。
【００８２】
切片を視野（ＦＯＶ)へ分割することも考慮すべきである。多くの場合、重み情報を収集する「管理領域（catchment area）」は、高倍率での正確な視野（ＦＯＶ)とは異なっていてもよい。それは立体解析学の試験系と同程度の大きさであるべきで、しばしばその周囲の保護領域も含有し、両方とも予備試験において使用者により規定される。さらに、（問題の、いわゆるレンズのパーセンタリング（parcenterin）に対し感度の高い）非常に異なる倍率の間の切片座標の変形における不正確さを考慮するために、この領域の増大を必要としてもよい。図３で説明した通り、この特性はラット小脳の解析において推定量をかなり改善させるだろう。フレーム面積は、視野（ＦＯＶ)のたった３％であり、図６の真ん中の線より下のデータ点のほとんどが、比較的低いカウントであるのは、総視野（ＦＯＶ)のための重みは視野（ＦＯＶ)の非常に小さい面積におけるカウントとほとんど一致しないという事実による。
【００８３】
要求の色の指示は、我々がちょうど特徴的なピクセルで初歩的なポインティングを使用したため、いくつかの手法で容易に最適化できる。
研究中の構造体の多数の例により、切片において実際に表わされた色の範囲は、考慮されるべきである。
色空間においてこれらの色を囲むボックスは、十分に感度が高くさらに特異的な重み付けをさせるため、ある設定量で自動的に拡大してもよい。
最初の切片で指示された色を、しばしばその後の全切片で、特に上記ボックスが十分に大きい場合に、使用してもよい。
ボックス中で発生する全ての画像ピクセルが重み１を与えられ、その他の全ては無視される（暗に重み０を与えられる）場合、重み付けはより速くなる。その結果視野（ＦＯＶ)の重みは単に、その中の全ピクセルの重みの総和である。
色選択の精密な調節は、重み１の全ピクセルの指示を有する保存画像を相互に使用しているべきである。
膵臓組織の例は、単一の特徴的色を有さない点で特有である。図５における高倍率画像の検査は、対比染色のため膵臓組織が、インスリン抗体染色と類似する茶の影を含む広範な色を有することを明確に示す。このような場合、要求の「色」は、組織全体にわたって長方形をドラッグすることにより指示されるべきで、全要求の色を囲むかなり大きなボックスであることが判明する。その結果、特定の相への特異的な染色である、実施例におけるインスリン染色は、別々に指示される（それは単に再利用されるファイルに既に保存されている可能性がある）。現在膵臓組織のための重み付けは、ブーリアン（Boolean)の迅速法でもよい。これは、大きなボックス中である色を有する全ピクセルに、１の重みを割当てるが、それらが「インスリンボックス」中には無いために無視される場合は除く。
色が、ここで使用された基本的な赤−緑−青の表示の代わりに、色相、飽和度、及び強度の空間で表される場合（Pydipati 等 2006）、ピクセルの色に基づく重み付けは、より感度が高くかつ特異的である可能性が高い。
【００８４】
色以外の他の自動的に検出された特性の使用は、非常に有望な研究対象領域である。プロポーショネーターの原理は以下の３つだけを要請する。
・重み付けは「自動的」であるべき、
・各視野（ＦＯＶ)に最大限に適する、幅０で「数」を作成すべき、及び
・重みは、抽出視野（ＦＯＶ)において提供される正確なシグナルに対して「正の相関」を有すべき、である。
【００８５】
我々は、単に個々のピクセルの色を使用したが、それは非常に単純に実施できる（及び、染色が研究中の構造体を正に増強するために使用されるという、一般的な戦略に適合させる）ためである。今なお、自動的に抽出されかつ定量され得る画像特性が大量にあるが（Gonzalez & Woods 2002）、それらは全てプロポーショネーター抽出及び推定のために使用できる。例によると、小脳における顆粒細胞層の明確な「端」が検出され、かつ各視野（ＦＯＶ)においてそれらの量に従って重みを与える場合、プルキンエ細胞の抽出は大いに促進され得る。ただし、全ての視野（ＦＯＶ)が顆粒細胞層の端である場合、１つおきにはプルキンエ細胞を含まないであろう。プルキンエ細胞は、青ではなく青方向の勾配が小脳表面に隣接しているその端だけが、天然の切片端であり、その隣接関係も明らかに自動的に検出可能な特性である。抽出領域からの正確なシグナルは、それが視野（ＦＯＶ)からの任意の正確なシグナルの可能性もあり、修正された測光法又は超音波顕微鏡法により提供される構造体質量等の、顕微鏡法からの少数例を述べるだけの、単なる立体解析学的カウントに制限されないことを強調する。
【００８６】
重みの編集は実際に利点があることが多い。図３の上部の右に示した重みのマップは、問題の検出をかなり容易にする。編集には多数の形態があり得る。
・使用者は、例えば折れ曲がり又はアーチファクト染色の局在のような技術的問題が原因で、特定の領域を無視すべきことを単純に示してもよい（ただし、これは不偏推定に適合しない）
・重みは公正な（just）数字であるが、研究中の構造体に関してほとんど確実に偏ったものである。カウントに対する正の相関を保つ（及び構造体を持つ任意の領域を排除しない）全ての種類の変換が許容される。
・・非常に小さい重みを持つ視野（ＦＯＶ)が正のカウントを提供することを回避するため、全重みに定数を付加してもよい。これが頻繁に発生しすぎる場合、その推定値は非常に高いので、明らかに精度を低減させる可能性がある（各領域からの全体への寄与は、重みで除されるカウントに比例する）。
・・図６〜８で説明したカウント−重みの関係が、直線でない単調な曲線で最も良く表されている場合、全重みを√重みに変換してもよく、あるいはその関係を修正する任意の他の類似する数学的変換を使用してもよい。
・・本明細書中と同様に、色が重み付けのために使用される場合、検出された顆粒細胞層である青の端におけるプルキンエ細胞のカウント−重みの関係は二相性であってもよく、適度な重みＷmでの最大化の後、より高い重みに向かうに従って下がる。これは、重み’＝重み−Ｗmとして最終的に重み付けをすることによる、Ｗm超の全ての重みを不利にすることにより修正してもよい。
・かなり特異的な抗体でも、切片の物理的端の非特異染色に遭遇することがある。上記で議論した切片の端の自動的検出の後に、端近傍のへりにおける全ピクセルの重み（不偏性を保つために０より大きい必要があり、当然ながら該へりも研究中の特定の構造体を含み得る）を、多少小さい重みまで低減してもよい。
【００８７】
上記の全てを総括すると、これはプロポーショネーターの現実の機能の初の報告であるが、我々はこれが最後だとは考えていない。数十年にわたって生物調査は、タンパク質又はペプチド又は遺伝子配列又は特定の発現産物等のための非常に特異的なマーカーの有効性から、（同様に一世紀にわたって特異性の低い化学染色から）多大な利益を得てきた。プロポーショネーターによって、我々はこの定量化がさらにより効率的となり、従ってそれ自身における立体解析学的手法の広範な使用を促進すると強く信じている。
【００８８】
添付Ａ−ハードウェアセットアップ
使用されたシステムは、オリンパスBX50F-3顕微鏡（日本）であり、コンピュータのシリアルポートを介して接続するPrior controller box H128V3 (Cambridge, England)に接続されるPrior Scientific InstrumentsのHlOlBX型及びJoystick PriorのH152EF型により製造されるモータ化ステージを備えるものであった。Heidenhaim microcatorのND 281型 (Traunreut, Germany)は、同様にシリアルポートを介して接続された。USH-102DのU- ULSlOOHG型ランプを備えたオリンパス100Ｗ高圧水銀バーナーUSIHIO BH2-RFL-T3は、蛍光を伝送するものであった。（適用できる場合は）使用した蛍光フィルタは「pe U-N51006 F/TR C59531」であった。通常の明視野光が必要な場合は、オリンパスハロゲンランプJC12V 100W HAL-L U-LH100を適用した。解像度4080×3072ピクセルの画像をもたらすピクセル移動技術と組み合わせた、1.45百万ピクセルＣＣＤを備えたオリンパスDP70デジタルカメラを、専用のＰＣＩバスカードを介してコンピュータに接続した。以下のオリンパスレンズを使用した。UPlanApo 1.25×/NA 0.04, UPlanFl 4×/NA 0.13, UPlanApo 10×/NA 0.40, UPlanFL 40×/NA 0.75, UPlanApo 60×/NA 1.4 オイル, UPlanApo 100×/NA 1.35 オイル。使用したコンピュータは、インテル（Intel）を基礎とした混合ブランドで、特別にアップグレードしたComputer Aided Stereology Tool (CAST software - Visiopharm, Horsholm, Denmark)を実行した。これは、オリジナルのオリンパスCASTコード2.3.0.2版から2003年11月10日に作製されたブランチコードに基づく。
【００８９】
参考文献
【表３】
2010512521.tif 000021
【表４】
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【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年10月17日(2008.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
第一の精度測定は、直接ＣＥ推定（ＣＥ＝誤差係数（Cofficient of Errors））である。所望のｎ個のセクターの標本は、大きさｎ／２の抽出課題に分けられる。この２つの抽出課題は完全に独立している。ここから得られた２つの推定値は、２つの独立な半分の大きさの推定値の平均で除したその平均の標準誤差（すなわちSEM／平均）を計算することにより、平均推定値の精度の不偏推定を提供する。あるいは２を超える抽出課題を実施することもできる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
視野の偏った重みとその領域の正確なカウントとの間の関係は、正でも負でもよい。それに関係なく、その推定値は常に不偏である。ただし、精度（ＣＥ＝誤差係数）は、重みとカウントとの間の関係にかなり依存し、これが正であればあるほど精度がより良好になり、関係がない又は負の場合はむしろ悪くなり得る。また、重みとカウントの間の関係における全種類のノイズは、精度を低減させる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成成分の不偏推定のための方法であって、以下のステップ
対象を示す識別可能な画像解析特性を画像に提供すること、
画像解析により、画像を複数のセクターに分割すること、及び当該複数のセクターの数よりも実質的に少ない数で、前記複数のセクターのサブセットを抽出すること、
各抽出セクターの対象の構成成分を決定すること、及び
抽出セクターにおける対象の構成成分の前記決定による結果に基づき、画像における対象の総構成成分の不偏推定を計算すること、を含んでなり、
セクターのサブセット抽出は、無作為抽出基準に従って実施されるとともに、
前記抽出が、セクターにおける対象存在の可能性に対して正の相関がある不均等な確率を用いる、無作為抽出基準に従って実施されること、を特徴とする、方法。
【請求項２】
前記方法が、
対象を示す、特定タイプの画像解析特性についての基準を規定すること、
コンピュータ化画像解析により、前記規定の基準に基づいてセクターを自動的に解析すること、及び各解析セクターに数的重み因子ｚiを割当てること、ここで該重み因子は、検出可能な特性の構成成分、例えば総数又は総量に対し、例えば比例する等の正の相関があり、
前記特定セクターの抽出確率は、その特定セクターのための重み因子ｚiに比例する、無作為抽出基準に従って多数のセクターを抽出すること、
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記無作為抽出基準が、系統的均等無作為抽出（Systematic Uniform Random Sampling）（ＳＵＲＳ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
全てのセクターについて累積重みＺを計算すること、標本の大きさｎを選択すること、及び抽出のためのＳＵＲＳ周期をＺ／ｎに設定すること、をさらに含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
任意により、累積重みＺを計算する前に、セクターの重みに基づくスムースフラクショネーター（Smooth Fractionator）に従う抽出のために、セクターを配置するステップをさらに含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
各セクターに、ＳＵＲＳ周期Ｚ／ｎで除した重み因子ｚiと等しい、不均等な抽出確率ｐiを与えることをさらに含んでなる、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記確率に従ってセクターを抽出するために、累積した重み因子ｚiでＳＵＲＳを用いることにより、セクターのサブセットを抽出することをさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
対象の構成成分、例えば総数又は総量等を推定するため、セクターのサブセットについてのｘi／ｐiの加算を伴う、ホルビッツ・トンプソン（Horvitz-Thompson）推定量を使用することをさらに含んでなる、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記特定タイプの画像解析特性のための基準が、色基準、形態基準及び状況基準（contextual criteria）からなる群の少なくとも１つである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記色基準が、３次元色空間における規定立体（defined volume）により表され、この色空間における３つの次元は、赤、緑及び青の飽和数値により各々与えられる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記規定立体が球である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
誤差係数（Cofficient of Errors）の形態での絶対的な精度が、所望の大きさの半分以下のセクターの標本に基づく２以上の独立した推定値から、これらの独立な推定値の平均で除したその平均の標準誤差を用いてコンピュータ計算される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
単純無作為抽出に対する本方法の有効性が、既知の抽出確率ｚi及び既知の成分ｘiに基づいて、セクターの標本から自動的にコンピュータ計算される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
定量される対象に対して正の相関がある画像特性について自動的に解析されるセクターが、前記画像におけるセクター総数が大きい、既知の確率を持つ、統計的に均等な副標本である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記画像が、より大きな領域の多数の画像の集合である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記画像が、放射スペクトルの不可視部分における情報の２次元マップである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、解剖学的構造体である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、２つの薄い組織標本の連続切片又はその画像に頼る、物理的ディセクター（physical disector）の原理の使用を含む立体解析学を用いることにより、対象の構成成分を決定すること、例えば対象をカウント又は測定することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記画像が、顕微鏡画像である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、仮想顕微鏡又は走査型顕微鏡の使用によって顕微鏡画像を取得することを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、組織学的組織切片又は細胞学的細胞の伸展標本の顕微鏡画像を撮影することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記画像が、地理学領域の衛星画像又は天文領域の望遠画像である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2010512521.tif 000033
2010512521.tif 000034
2010512521.tif 000035