(57)【要約】本発明は、TGF-β1由来のアミノ酸配列及び細胞付着アミノ酸配列を含み、前記TGF-β1由来のアミノ酸配列は、配列番号1に記載のアミノ酸配列から構成されて、下記の一般式Iで表されるTGFP-CAPペプチドに関する：   一般式I  Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-THr-Gln-Tyr-細胞付着アミノ酸配列  本発明のTGFP-CAPペプチドは、優れた抗血管新生活性を示す。また、本発明のTGFP-CAPペプチドは、皮膚からメラニン形成を効果的に遮断することにより美白効能を示す。本発明のペプチドは、安定性が天然TGF-β1に比べて非常に優れており、皮膚透過度に非常に優れている。このような本発明のペプチドの優れた活性及び安定性は、医薬、医薬外品及び化粧品に非常に有利に適用できるようにする。【選択図】図３
2010524920.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
TGF-β1(transforming growth factor-β1)由来のアミノ酸配列及び細胞付着アミノ酸配列を含み、前記TGF-β1由来のアミノ酸配列は、配列番号1に記載のアミノ酸配列から構成されて、下記の一般式Iで表されるTGFP-CAPペプチド: 
一般式I 
Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-細胞付着アミノ酸配列
前記一般式Iにおいて、前記細胞付着アミノ酸配列は、RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), GPR(Gly-Pro-Arg), GHK(Gly-His-Lys), YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), CDPGYIGSR(Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), LCFR(Leu-Cys-Phe-Arg), EIL(Glu-Ile-Leu), EILDV(Glu-Ile-Leu-Asp-Val), EILDVPST(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr), EILEVPST(Glu-Ile-Leu-Glu-Val-Pro-Ser-Thr), LDV(Leu-Asp-Val)またはLDVPS(Leu-Asp-Val-Pro-Ser)である。
【請求項２】
前記TGF-β1由来のアミノ酸配列及び細胞付着アミノ酸配列間にリンカーが結合されており、前記TGFP-CAPペプチドは、下記の一般式IIで表されることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド: 
一般式II
Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-リンカー-細胞付着アミノ酸配列
前記一般式IIにおいて、前記細胞付着アミノ酸配列は、RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), GPR(Gly-Pro-Arg), GHK(Gly-His-Lys), YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), CDPGYIGSR(Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), LCFR(Leu-Cys-Phe-Arg), EIL(Glu-Ile-Leu), EILDV(Glu-Ile-Leu-Asp-Val), EILDVPST(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr), EILEVPST(Glu-Ile-Leu-Glu-Val-Pro-Ser-Thr), LDV(Leu-Asp-Val)またはLDVPS(Leu-Asp-Val-Pro-Ser)である。
【請求項３】
前記細胞付着アミノ酸配列は、RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val)またはGPR(Gly-Pro-Arg)であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記細胞付着アミノ酸配列は、RGD(Arg-Gly-Asp)であることを特徴とする、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記リンカーは、複数のアミノ酸残基からなるリンカーであることを特徴とする、請求項２に記載のペプチド。
【請求項６】
前記リンカーは、2〜10個のGly残基からなっていることを特徴とする、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドは、下記の一般式IIIで表されることを特徴とする、請求項６に記載のペプチド：
一般式III
Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-Gly(n)-Arg-Gly-Asp 
前記一般式III において、nは2〜8の整数を示す。 
【請求項８】
前記ペプチドのＮ−末端及びＣ−末端にあるアミノ酸残基の少なくとも一つは、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール(PEG)からなる群から選択される保護基が結合されていることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む抗血管新生用組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、虹彩炎、増殖網膜症、乾癬、血友病性関節、アテロム性動脈硬化プラーク内における毛細血管増殖、ケロイド、傷の顆粒化、血管接着、リウマチ様関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再発狭窄症、アテロム性動脈硬化、腸管接着、ネコひっかき病、潰瘍、肝硬変症、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、糸球体腎症、糖尿病、炎症または神経退行性疾患の治療または予防のための組成物であることを特徴とする、請求項８に記載の抗血管新生用組成物。
【請求項１１】
請求項１乃至８のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む皮膚美白用組成物。
【請求項１２】
(ａ)請求項１乃至８のいずれかに記載のペプチドの薬剤学的有効量、及び(ｂ)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を患者(subject)に投与する段階を含む血管新生関連疾患の予防または治療方法。
【請求項１３】
前記血管新生関連疾患は、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、虹彩炎、増殖網膜症、乾癬、血友病性関節、アテロム性動脈硬化プラーク内における毛細血管増殖、ケロイド、傷の顆粒化、血管接着、リウマチ様関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再発狭窄症、アテロム性動脈硬化、腸管接着、ネコひっかき病、潰瘍、肝硬変症、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、糸球体腎症、糖尿病、炎症または神経退行性疾患であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１乃至８のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む組成物をsubjectに投与する段階を含む皮膚美白方法。
【請求項１５】
血管新生関連疾患の予防または治療用薬物(medicament)を製造するための、請求項１乃至８のいずれかに記載のペプチドの用途(use)。
【請求項１６】
前記血管新生関連疾患は、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、虹彩炎、増殖網膜症、乾癬、血友病性関節、アテロム性動脈硬化プラーク内における毛細血管増殖、ケロイド、傷の顆粒化、血管接着、リウマチ様関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再発狭窄症、アテロム性動脈硬化、腸管接着、ネコひっかき病、潰瘍、肝硬変症、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、糸球体腎症、糖尿病、炎症または神経退行性疾患であることを特徴とする、請求項１５に記載の用途。
【請求項１７】
皮膚美白用組成物を製造するための、請求項１乃至８のいずれかに記載のペプチドの用途(use)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、TGF-β1由来のペプチドを含む新規なペプチド及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
形質転換成長因子−β(Transforming growth factor-beta, TGF-β)は、細胞分化及び増殖を調節するポリペプチド集団である。この集団における他の構成員としては、Mulleria抑制物質(Cate et al., 1986, Cell, 45:685-698)、インヒビン類(inhibins；Mason et al., 1985, Nature, 318:659-663)及びDrosophillaのDecapentaplegic遺伝子複合体の転写物から予見される蛋白質(Padgett et al., 1987, Nature, 325:81-84)が挙げられる。形質転換成長因子-β(TGF-β)は、分子量が13,000である二つの類似したジスルフィド連結サブユニットからなっている(Assoian et al., 1983, J.Biol.Chem. 258:7155-7160; Frolik et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3676-3680; Frolik et al., 1984, J Biol. Chem. 260:10995-11000)。TGF-βは、幾つかの組織、例えば胎盤(Frolik et al., 1983, Nature 325:81-84)、血小板(Childs et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5312-5316, Assioan et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:7155-7160)、腎臓(Roberts et al., 1983, Biochemistry 22:5692-5698)及び無機分が減少された骨(Seyedin et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 119-123)から精製してきた。
【０００３】
10%血清及び表皮成長因子の存在下で、TGF-βは、正常的なラットの腎臓線維芽細胞の足場非依存性(anchorage independent)生育を増進させて(Roberts et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5339-5343; Roberts et al., 1982, Nature 295:417-419; Twardzik et al., 1985, J. Cell Biochem. 28:289-297)、10%血清のみが存在する時は、AKR-2B線維芽細胞の集落形成を誘導することができる(Tucker et al., 1983, Cancer Res. 43:1518-1586)。またTGF-βは、胎児ラットの筋肉間葉細胞の分化及び軟骨特異巨大分子の生成を引き起こすと判明された(Seyedin et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:5693-5695)。細胞増殖に及ぼすその効果とは対照的に、アフリカ産みどり猿細胞(BSC-1)から分離された機能的連関蛋白質だけではなく、人体血小板から精製されたTGF-βは、培養中、ある細胞の生育を阻害すると判明された(Tucker et al., 1984, Science 226:705-707)。また、TGF-βは、幾つかの人体癌細胞株の生長も阻害することが明かされた(Roberts et., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 82:119-123)。TGF-βのこのような抑制/刺激効果は、例えば細胞形態及び細胞の生理状態のような幾つかの因子に依存すると報告されている(Spon et al., 1986, Science 232:534)。
【０００４】
人体TGF-β(Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705)、マウスTGF-β(Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379)及びシミアンTGF-β(Sharples et. al., 1987, DNA 6:239-244)の遺伝子をコーディングするcDNAクローンが分離された。これらのようなクローンのDNA配列分析結果、TGF-βモノマーを生成させる大きい前駆体ポリペプチドとして合成されることが分かった。上述のあらゆるTGF-β原からのTGF-β前駆体蛋白質は、全体的に非常に高い配列相同性が発見された。
【０００５】
最近、無機分の減少された牛の骨から分離し出したある蛋白質がTGF-βに関連するとして同定された(Seyedin et al., 1987, J. Biol. Chem, 262: 1946-1949)。またこの蛋白質は、豚の血小板(Cheifetz et al., 1987, Cell 48:409-415)、人体前立腺腺癌種細胞株PC-3(Ikeda et al.,1987, Biochemistry 26:2406-2410)及び人体膠芽細胞株(Wrann et al., 1987, EMBO 6:1633-1636)からも分離された。この蛋白質の一部アミノ酸配列は、これがTGF-βと相同であることが明かされたため、TGF-β2と命名された。上述の人体TGF-β(Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705)、マウスTGF-β(Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379)及びシミアンTGF-β(Sharples et al.,1987, DNA 6:239-244)は、TGF-β1と命名された。
【０００６】
TGF-β1は、活性が高い蛋白質であるが、発現が非常に難しく、高価で、且つ半減期が短いため、円滑な使用に制約がある。
【０００７】
本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、天然TGF-β1アミノ酸配列で美白作用ができながらも、天然TGF-β1より安定性に優れて皮膚透過率に優れているペプチドを製造するために、多様な種類のヒトTGF-β1由来ペプチドを製造及びスクリーニングした。その結果、数多いペプチド候補物質の中から、生理活性だけではなく安定性にも優れているペプチドを選別することにより、本発明を完成した。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、TGF-β1由来ペプチドを含む新規なペプチドを提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、抗血管新生用組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明のまた他の目的は、皮膚美白用組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、血管新生関連疾患の予防または治療方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、皮膚美白方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一様態によると、本発明は、TGF-β1(transforming growth factor-β1)由来のアミノ酸配列及び細胞付着アミノ酸配列を含み、前記TGF-β1由来のアミノ酸配列は、配列番号1に記載のアミノ酸配列から構成されて、下記の一般式Iで表されるTGFP-CAPペプチドを提供する: 
一般式I 
Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-細胞付着アミノ酸配列
前記一般式Iにおいて、前記細胞付着アミノ酸配列は、RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP (Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP (Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES (Gly-Arg-Gly-Glu-Ser), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP (Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS (Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), GPR (Gly-Pro-Arg), GHK(Gly-His-Lys), YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), CDPGYIGSR(Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), LCFR(Leu-Cys-Phe-Arg), EIL(Glu-Ile-Leu), EILDV(Glu-Ile-Leu-Asp-Val), EILDVPST(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr), EILEVPST(Glu-Ile-Leu-Glu-Val-Pro-Ser-Thr), LDV(Leu-Asp-Val)またはLDVPS(Leu-Asp-Val-Pro-Ser)である。
【００１６】
本発明者らは、天然TGF-β1アミノ酸配列で美白作用ができながらも、天然TGF-β1より安定性に優れて皮膚透過率に優れているペプチドを製造するために、多様な種類のヒトTGF-β1由来ペプチドを製造及びスクリーニングした。その結果、数多いペプチド候補物質の中から、生理活性だけではなく安定性にも優れているペプチドを選択した。
【００１７】
本発明において、本発明者らが採択した戦略は以下のようである。まず、本発明のペプチドをTGF-β1由来配列(即ち、TGF-β1活性部位)及び細胞付着部位の二つの部分で形成させる。前記TGF-β1活性部位は、天然TGF-β1アミノ酸配列から選択する。そして、本発明のペプチドのTGF-β1活性を向上させるための前記細胞付着部位を選択する。このようにして選択されたTGF-β1活性部位は‘Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr’ペプチド配列(配列番号1)であり、細胞付着部位は、上述のアミノ酸配列である。このような戦略によって構築された本発明のペプチドは、TGF-β1由来ペプチドと細胞付着ペプチドの融合ペプチドであるため、‘TGFP(transforming growth factor peptide)-CAP(cell adhesion peptide)ペプチド’と命名する。
【００１８】
前記一般式Iに記載された細胞付着アミノ酸配列は、細胞付着モチーフに該当するものである。したがって、前記細胞付着アミノ酸配列を必須配列として含む、より長いアミノ酸配列も本発明の範囲に含まれる。
【００１９】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のペプチドに含まれる細胞付着アミノ酸配列は、RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val)またはGPR(Gly-Pro-Arg)であり、最も好ましくは、RGD(Arg-Gly-Asp)である。RGD配列は、細胞間質タンパク質であるフィブロネクチン(fibronectin)から選択されたものである。
【００２０】
本発明の好ましい具現例によると、前記二つの機能部位を直接連結するより、リンカーを介して間接的に連結する。この場合、本発明のTGFP-CAPペプチドは、下記の一般式IIで表される：
一般式II
Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-リンカー-細胞付着アミノ酸配列
前記一般式IIにおいて、前記細胞付着アミノ酸配列は、前記一般式Iと同一である。
【００２１】
前記TGF-β1活性部位及び細胞付着部位を連結するリンカーとしては、当業界に公知の多様なリンカーが利用できる。好ましくは、前記リンカーは、複数のアミノ酸残基からなるリンカーである。アミノ酸配列からなるリンカーは、Huston, et al., Methods in Enzymology, 203:46-88(1991)、及びWhitlow, et al., Protein Eng., 6:989(1993))に開示されており、前記文献は、本明細書に参照として取り込まれる。本発明に適したリンカーは、主にグリシンまたはグリシンとセリンアミノ酸から構成されて、その長さは、2〜18アミノ酸である。本発明のより好ましい具現例によると、前記リンカーは、2〜10個のGly残基からなっている。本発明のペプチドにおいて、アミノ酸からなるリンカー、特にGly残基からなるリンカーは、本発明のペプチドの安定性にも寄与する。
【００２２】
本発明のペプチドは、それ自体が天然TGF-β1より非常に優れた安定性を示すが、追加的なアミノ酸の変形によって安定性が向上され得る。本発明の好ましい具現例によると、 前記一般式1のペプチドのN−末端及びC−末端に存在するアミノ酸残基の少なくとも一つは、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール(PEG)から構成された群から選択される保護基が結合されている。このような保護基は、本発明のペプチドの安定性を増加させる役割をする。
【００２３】
本発明の他の変形例によると、前記一般式1のペプチドのC−末端は、アミノ基で変形されており、これは、ペプチドの安定性を増加させる作用をする。
【００２４】
本明細書において用語‘安定性’は、インビボ安定性だけではなく、貯蔵安定性(例えば、常温貯蔵安定性)も意味する。上述の保護基は、生体内の蛋白質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。
【００２５】
本発明の最も好ましい具現例によると、本発明のペプチドは、下記の一般式IIIで表される。
一般式III
Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-Gly(n)-Arg-Gly-Asp 
前記一般式IIIにおいて、nは2〜8の整数を示す。
【００２６】
本発明のペプチドの具体的な例は、配列番号2に記載されている。
【００２７】
本明細書において、用語‘ペプチド’は、ペプチド結合によりアミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。
【００２８】
本発明のペプチドは、当業界に公知の化学的合成方法、特に、固相合成技術(soliD-phase synthesis techniques)によって製造できる(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nD. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984))。
【００２９】
一方、本発明のペプチドの基本的な構造は、TGF-β1由来配列及び細胞付着配列が結合されている構造である。したがって、前記一般式I及びIIは、本発明のペプチドの構造を便宜的に表現するために記載されたもので、これの変形も本発明に属するということは当業者に明らかである。例えば、前記一般式I及びIIにおいて、TGF-β1由来配列及び細胞付着配列が反対に位置したペプチド‘細胞付着アミノ酸配列-Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr’及び‘細胞付着アミノ酸配列-リンカー-Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr’も本発明の範囲に属するということは、当業者に自明である。また、本発明で採択したTGF-β1由来配列及び/または細胞付着配列に、幾つか(例えば、1〜2個)のアミノ酸が追加的に結合されたものも本発明の範囲に属する。例えば、細胞付着配列Arg-Gly-AspのC-末端にSerが追加的に結合されたものも本発明の範囲に属する。
【００３０】
本発明のペプチドは、優れた美白作用及び抗血管新生活性を発揮するだけではなく、熱安定性及び酸とアルカリなどの物理化学的因子に対する安定性に優れている。したがって、優れた長期保存性を有する本発明のペプチドは、医薬品、医薬外品、化粧品及び口腔用品のような長期間貯蔵が要求される製品に有利に適用できる。
【００３１】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述の本発明のTGFP-CAPペプチドを有効成分として含む抗血管新生用組成物を提供する。
【００３２】
本発明の他の様態によると、本発明は、(ａ)上述の本発明のTGFP-CAPペプチドの薬剤学的有効量、及び(B)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を患者(subject)に投与する段階を含む血管新生関連疾患の予防または治療方法を提供する。
【００３３】
本発明の他の様態によると、本発明は、血管新生関連疾患の予防または治療用薬物(medicament)を製造するための、上述の本発明のTGFP-CAPペプチドの用途(use)を提供する。
【００３４】
本発明の組成物は、上述の本発明のTGFP-CAPペプチドを有効成分として含むため、その重複する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
【００３５】
本発明で有効成分として利用されるペプチドは、下記の実施例で立証したように非常に優れた抗血管新生活性を発揮する。本発明の組成物は、過多な血管新生により誘発される疾患または状態(conditions)に適用されて、優れた治療、抑制または緩和効能を示す。
【００３６】
本発明で使用される用語‘血管新生関連疾患’は、血管の非調節的(unregulated)成長により招来される疾患、疾病または状態を意味する。
【００３７】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物は、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、虹彩炎、増殖網膜症、乾癬、血友病性関節、アテロム性動脈硬化プラーク内における毛細血管増殖、ケロイド、傷の顆粒化、血管接着、リウマチ様関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再発狭窄症、アテロム性動脈硬化、腸管接着、ネコひっかき病、潰瘍、肝硬変症、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、糸球体腎症、糖尿病、炎症または神経退行性疾患の治療、予防、抑制または緩和のために適用される。最も好ましくは、本発明の組成物は、癌の治療、予防、抑制または緩和に利用される。特に、本発明の組成物は、皮膚癌に有利に適用できる。
【００３８】
本発明のまた他の形態によると、本発明は、上述の本発明のTGFP-CAPペプチドを有効成分として含む美白用組成物を提供する。
【００３９】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述の本発明のTGFP-CAPペプチドを有効成分として含む組成物をsubjectに投与する段階を含む皮膚美白方法を提供する。
【００４０】
本発明の他の様態によると、本発明は、皮膚美白用組成物を製造するための、上述の本発明のTGFP-CAPペプチドの用途(use)を提供する。
【００４１】
本発明のTGFP-CAPペプチドは、皮膚からメラニン形成を効果的に遮断することにより美白効能を奏する。本発明の美白組成物は、皮膚色相を明るくして、皮膚トーンを一定にするか、皮膚色素の除去及びシミの除去などの効果を示す。
【００４２】
本発明の組成物は、薬剤学的組成物と化粧品組成物として製造できる。
【００４３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物は、(ａ)上述の本発明のペプチドの薬剤学的有効量、及び(ｂ)薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物である。
【００４４】
本明細書において用語‘薬剤学的有効量’は、上述のペプチドの効能または活性を達成するに十分な量を意味する。
【００４５】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。薬剤学的に許容される適した担体及び製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)に詳細に記載されている。
【００４６】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口、好ましくは、非経口で投与でき、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などにより投与できる。
【００４７】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって様々である。一方、本発明の薬剤学的組成物の好ましい投与量は、1日当たり、0.0001〜100μgである。
【００４８】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び/または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、または多用量容器内に入れて製造できる。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００４９】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物は、(ａ)上述の本発明のペプチドの化粧品学的有効量(cosmetically effective amount)、及び(ｂ)化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物である。
【００５０】
本明細書において用語‘化粧品学的有効量’は、上述の本発明の組成物の皮膚改善効能を達成するに十分な量を意味する。
【００５１】
本発明の化粧品組成物は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤形にも製造でき、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤形化することができるが、これに限定されるものではない。より詳しくは、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤形に製造することができる。
【００５２】
本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合は、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、または酸化亜鉛などが利用できる。
【００５３】
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーである場合は、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、またはポリアミドパウダーが利用でき、特にスプレーの場合は、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン/ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体をさらに含むことができる。
【００５４】
本発明の剤形が溶液または乳濁液である場合は、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が利用されて、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、1，3−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、またはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００５５】
本発明の剤形が懸濁液である場合は、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガーまたはトラガカントなどが利用できる。
【００５６】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合は、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イソチオネート、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用できる。
【００５７】
本発明の化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分としてのペプチドと担体成分の他に、化粧品組成物に通常的に利用される成分を含むが、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常的な補助剤を含むことができる。
【発明の効果】
【００５８】
本発明の特徴及び利点(advantages)を要約すると、以下のようである。
(i)本発明のTGFP-CAPペプチドは、優れた抗血管新生活性を示す。
(ii)本発明のTGFP-CAPペプチドは、皮膚からメラニン形成を効果的に遮断することにより美白効能を示す。
(iii)本発明のペプチドは、安定性が天然TGF-β1と比較して非常に優れており、皮膚透過度に非常に優れている。
(iv)上述の本発明のペプチドの優れた活性及び安定性は、医薬、医薬外品及び化粧品に非常に有利に適用できるようにする
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明の実施例により製造されたトリデカペプチドに対するHPLC(High performance liquid chromatography)分析結果を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例により製造されたトリデカペプチドの安定性を測定した結果を示すグラフである。‘Peptide’は、実施例1で製造されたリンカーが二つのGly残基から構成された本発明のペプチドを示す。‘TGFB-1’は、TGF-β1を示す。
【図３】B16F10黒色腫細胞のα-MSHによるメラニン色素の誘発が、本発明の実施例により製造されたトリデカペプチドの濃度別処理により減少される程度を示す図である。
【図４】本発明の実施例により製造されたトリデカペプチドのB16F10黒色腫細胞におけるチロシナーゼの活性に及ぼす影響を示す。比較群としてTGF-β1を利用した。
【図５】本発明の実施例により製造されたトリデカペプチドのB16F10黒色腫細胞におけるERK 1/2の活性化に及ぼす影響を示す顕微鏡写真であって、メラノソームの減少を測定した写真である。比較群としてTGF-β1を利用した。‘TGP2’は、実施例1で製造されたリンカーが二つのGly残基から構成された本発明のペプチドを示す。‘TGFB1’は、TGF-β1を示す。
【図６】B16F10黒色腫細胞におけるERK 1/2抑制因子のPD98059によるERK 1/2のリン酸化抑制を、本発明のトリデカペプチドが回復することを確認するウェスタンブロッティング実験結果である。
【図７】本発明の実施例により製造されたトリデカペプチドが、マウスに移植された(xenotransplantation)黒色腫瘍の大きさを縮小することを示す写真である。
【図８】本発明の実施例により製造されたトリデカペプチドが、マウスに移植された黒色腫の転移を抑制することを示す写真である。
【図９】本発明の実施例により製造されたトリデカペプチドを利用した細胞毒性実験の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【００６１】
実施例1: 
NH2-Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-Gly(n)-Arg-Gly-Asp-OH の合成
クロロトリチルクロライドレジン(Chloro trityl chloride resin: CTL resin, Nova Biochem Cat No. 01-64-0021)700mgを反応容器に入れて、メチレンクロライド(MC)10mlを加えて3分間攪拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド(DMF)を10ml入れて3分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に10mlのメチレンクロライド溶液を入れて、Fmoc-Asp(otbu)-OH 200mmole及びDIEA  400mmoleを入れた後、攪拌してよく溶かして、1時間攪拌しながら反応させた。反応後、洗浄して、メタノールとDIEA(2:1)をMCに溶解してレジンと10分間反応した後、過量のMC/DMF(1:1)で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド(DMF)を10ml入れて3分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液(20%のピペリジン/DMF)10mlを反応容器に入れて、10分間常温で攪拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて、再び10分間反応を維持した後、溶液を除去し、DMFで2回、MCで1回、再びDMFで3分間1回洗浄して、Gly-CTLレジンを製造した。新しい反応器に10mlのDMF溶液を入れて、Fmoc-Gly-OH(Novabiochem, 米国)200mmole、HoBt  200mmole及びBop  200mmoleを入れた後、攪拌してよく溶解させた。反応器に400mmoleのDIEAを分画で2回にかけて入れて、全ての固体が溶けるまで少なくとも5分間攪拌した。溶解されたアミノ酸混合溶液を、脱保護されたレジンが入っている反応容器に入れて、1時間常温で攪拌しながら反応させた。反応液を除去し、DMF溶液で5分間ずつ3回攪拌した後、未反応溶媒を除去した。反応レジンを少量取って、カイザーテスト(Ninhydrine test)を利用して反応程度を点検した。脱保護溶液で上記と同様に2回脱保護反応し、Gly-Asp(tBu)-CTL resinを製造した。DMFとMCで十分洗浄し、再びカイザーテストを行った後、上記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。即ち、本発明で選定されたアミノ酸配列に基づき、Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Gly(n回), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Gln(trt), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Asp(otbu), Fmoc-Leu, Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Trp(boc), Fmoc-Ileの順に連鎖反応を行った。但し、中間のGlyは、ペプチド別にそれぞれ2回反復から6回反復まで多様な残基数で合成を行い、合計5種のペプチジルレジンを製造した。製造されたペプチジルレジンは、同様な方法により脱保護してFmocを除去した後、DMF、MC及びメタノールでそれぞれ3回洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、P2O5下で真空に減圧して完全に乾燥し、ペプチジルレジンを準備した。製造されたレジンに脱漏溶液[トリフルオロ化酢酸(TFA)81.5%、蒸留水5%、チオアニソール5%、フェノール5%、EDT 2.5%及びTIS 1%]30mlを入れて、常温で時々振りながら2時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のTFA溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、50mlの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに2回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のNH2-Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-Gly(n)-Arg-Gly-Asp-OH  5種のペプチドを獲得した。即ち、前記アミノ酸配列において、リンカー役割をするGly残基の数が1〜5個の5種のペプチドを収得した。この中、NH2-Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-OHの場合は、約0.87gを収得し、分子量測定器(Perseptive Pioneer DE-STR ABI, 米国)を利用して、分子量1467.9(理論値1467.5)が得られた。下記の実施例は、リンカーとしてGly残基が2個であるペプチドを利用して���った。図1は、合成して精製したペプチドを、HPLCを通じて分析した結果である。
【００６２】
実施例２：トリデカペプチドの安定性評価
実施例１で製造及び精製されたトリデカペプチド、即ち、NH2-Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-OHの安定性を確認するために、10μg/mlとなるように、トリデカペプチドを50mM Tris-HCl(pH 8.0)緩衝溶液に溶解した。対照群として、１μg/mlの濃度で大腸菌から生産された組換えTGF-β1(Sigma)を類似緩衝溶液に用意した。用意した溶液をガラスバイアルに入れて、37℃で静置した。37℃で静置された溶液を、0、1、10、25、50、75、そして100日目にサンプリングして、NIH-3T3 cell (Korean Cell Line Bank)に対するMTT分析(Scudiero, D. A., et al. Cancer Res. 48:4827-4833(1988))を行って、ペプチドとTGF-β1の活性を測定した(図2)。この時、0日のサンプル活性を100％として基準した。
【００６３】
図2から分かるように、組換えTGF-β1の場合、時間が経過するにつれて、活性度が急激に減少するが、本発明によるトリデカペプチドの場合は、活性度が長く持続されることを確認することができた。
【００６４】
実施例３：ナノ化ペプチドの製造
前記実施例から得られたトリデカペプチド50mgを正確に秤量した後、蒸留水500mlで十分に攪拌して溶解した。ペプチド溶液を、レシチン5g、オレイン酸ナトリウム(sodium oleate)0.3ml、エタノール50ml及び少量の油相と共に混合した後、総量が1Lとなるように蒸留水で調節した後、マイクロ流動化装置(microfluidizer)を利用して高圧で乳化し、大きさ100nm程度のナノソームを製造した。製造されたナノソームは、最終濃度が約50ppmであって、化粧品製造用に使用した。
【００６５】
剤形例１：柔軟化粧水
前記実施例3で製造されたトリデカペプチド含有ナノソームを含み、下記組成からなる柔軟化粧水を、一般的な化粧水製造方法により製造した。
【００６６】
【表１】
2010524920.tif 000003
【００６７】
剤形例２：栄養クリーム
前記実施例3で製造されたトリデカペプチド含有ナノソームを含み、下記組成からなる栄養クリームを、一般的な栄養クリームの製造方法により製造した。
【００６８】
【表２】
2010524920.tif 000004
【００６９】
剤形例３：栄養化粧水
前記実施例3で製造されたトリデカペプチド含有ナノソームを含み、下記組成からなる栄養化粧水を、一般的な化粧水製造方法により製造した。
【００７０】
【表３】
2010524920.tif 000005
【００７１】
剤形例４：エッセンス
前記実施例3で製造されたトリデカペプチド含有ナノソームを含み、下記組成からなるエッセンスを、一般的なエッセンス製造方法により製造した。
【００７２】
【表４】
2010524920.tif 000006
【００７３】
実施例4：トリデカペプチドによるメラニン色素の減少
実施例1で製造したペプチドのメラニン色素の減少効果を測定するために、マウスの色素細胞(melanocyte)を培養した後、α-MSH(melanocyte stimulating hormone /Sigma、米国)を添加した後、ペプチドを濃度別に処理して、メラニン生成抑制効果を測定した。マウスの色素細胞は、C57BL/6マウス由来のもので、DMEM(Dulbecco's modified Eagle's media)に10%牛胎児血清(fetal bovine serum)を添加した培地で37℃, 5% CO2条件で培養した。24-ウェルプレートに1 x 105 細胞/ウェル(cells/well)の濃度で細胞を培養し、細胞の付着を確認した後、細胞培養液に一定な濃度の試験物質を加えて、3日間培養した。ここで試験物質は、下記表5の組成物のそれぞれの成分を培地溶媒に溶解した後、プロピレングリコール:エタノール:精製水の比率が5:3:2である混合溶媒に溶解させて試験濃度に希釈して、同一な比率で混合したものである。培養液を除去し、PBSで洗浄した後、1N水酸化ナトリウムで細胞を溶かし、400nmで吸光度を測定した後、メラニン生成抑制率を計算し、その結果を図3に示した(Dooley方法)。 
【００７４】
【表５】
2010524920.tif 000007
図3から分かるように、α-MSHを入れた群では、メラニン生成が急激に増加したが、ペプチドを処理した群では、投与量によって活性が低下し、α-MSHを処理しない時とほぼ等しいメラニン生成を示した。これは、皮膚にメラニンの生成を誘発する要因が適用された時、ペプチドがその活性を抑制して皮膚のトーンを明るくすることができるということを示す結果である。
【００７５】
実施例５：トリデカペプチドによるチロシナーゼ活性の減少
実施例1で合成したトリデカペプチドと形質転換成長因子の美白活性を検証するために、メラニン生成因子であるα-MSHを処理した後のメラニン生成抑制能を調べた。B16F10細胞(韓国細胞株銀行)を1x105個程度培養ディッシュに接種して、三日間37℃, 5% CO2条件でDMEM(Sigma 米国)培地で培養した。細胞が定着された後、2%血清が含有された培地に入れ替えた。細胞培養液に一定な濃度の試験物質を加えて、四日間37℃, 5% CO2条件で培養した。ここで試験物質は、下記表6の組成物のそれぞれの成分を培地溶媒に溶解した後、プロピレングリコール:エタノール:精製水の比率が5:3:2である混合溶媒に溶解させて試験濃度に希釈して、同一な比率で混合したものである。
【００７６】
【表６】
2010524920.tif 000008
【００７７】
次いで、細胞を集めた後、細胞に、ナトリウムドデシルサルフェート(Sigma,米国)とTriton X-100(Sigma,米国)が含まれた細胞膜除去緩衝液を処理し、細胞から蛋白質を抽出した。抽出した蛋白質をBCA方法で定量した後、各群別に90μlの蛋白質溶液に10μlのL-DOPA(Sigma,米国)を入れて、37℃で30分間反応した後、405nm分光光度計で吸光度を測定して、チロシナーゼの活性を測定した。
【００７８】
実験結果、図4から分かるように、α-MSHを入れた群では、チロシナーゼの活性が急激に増加したが、TGF-β1またはトリデカペプチドを処理した群では、相対的に活性が低下して、α-MSHを処理しない時とほぼ等しいチロシナーゼの活性を示して、特に、ペプチドの処理濃度によって漸次的に減少されることが分かった。これは、皮膚などにチロシナーゼの活性を高める要因が適用された時、トリデカペプチドなどがその活性を抑制して皮膚のトーンを明るくすることができるということを示す結果であって、本発明のトリデカペプチドは、TGF-β1と同様な活性メカニズムを示すと判断される。
【００７９】
実施例６：トリデカペプチドによるERKのリン酸化
実施例1で合成したトリデカペプチドと形質転換成長因子の美白活性を検証するために、ERK抑制活性を有する標識物質であるPD98059(Sigma, USA)を通じてERKの活性を抑制した後、これを克服する活性を観察した。まず6-ウェルの細胞培養ディッシュにB16F10細胞を1 x 105 個程度接種して、三日間37℃, 5% CO2 条件でDMEM培地で培養した。細胞が定着された後、2%血清が含有された培地に入れ替えた。陰性対照群には何の処理もせず、他の二つの培養ディッシュには、それぞれ形質転換成長因子1ng/mlと実施例1で製造したトリデカペプチドを30μg/mlの濃度でそれぞれ処理した。一方、他の三つのディッシュには、陽性対照群として、10μMのERK抑制因子のPD98059(ERK蛋白質がリン酸化されることを妨害する物質)を処理した。この中、二つのディッシュには、一時間後、形質転換成長因子1ng/mlと実施例1で製造したトリデカペプチドを30μg/mlの濃度でそれぞれ処理した後、四日間培養して、顕微鏡を通じて細胞の形態を観察した。
【００８０】
図5から分かるように、正常の細胞群に比べ、PD98059を処理した細胞群では、メラノソームが誘導されて黒色色素がたくさん沈着されることが分かる。その反面、TGF-β1またはトリデカペプチドをPD98059と共に処理した細胞群では、著しく低いメラノソームを観察することができて、これは、トリデカペプチドがTGF-β1のようにERKのPhospo-ERK化を誘導して、メラノソームの形成を抑制することを示す結果である。 
【００８１】
またTGF-β1とトリデカペプチドの信号伝達体系に及ぼす影響を客観的に検証するために、上述の方法と同様に黒色腫を培養した後、10μM PD98059と30μg/mlトリデカペプチドを同時に処理した。細胞抽出液を得た後、同一蛋白質量SDS-PAGEゲル電気泳動を通じて展開した後、PVDF(polyvinylidene difluoride)膜(GE Health care,米国)に電気移動した。次いで、PVDF膜を4時間常温でPhospho ERK 1/2抗体(セルシグナリング,米国, 1/3000希釈)と反応した。次いで、洗浄緩衝液でPVDF膜を洗浄した後、HRPが付着された抗マウスIgG抗体(SantaCruz, 米国, 1/5000希釈)と反応させた。その後、洗浄緩衝液で2回洗浄した後、ECL(enhanced chemilumineseance)溶液(GE Health care, 米国)で反応させて感光した(図6)。図6において、PD98059処理群ラインにおいて‘Con’は、10μM PD98059のみを処理したもので、‘TGFb1’は、10μM PD98059と10ng/ml TGF-β1を同時に処理したものである。
【００８２】
図6から分かるように、無処理黒色腫群に比べ、PD98059を処理した群では、Phoshpo ERK 1及びERK 2のレベルが著しく減少したが、トリデカペプチド及びTGF-β1を処理した群では、Phoshpo ERK 1及びERK 2のレベルが増加した。これとは反対に、TRP-1(tyrosinase related protein-1)及びTRP-2は、PD98059を処理した群でそのレベルが増加して、トリデカペプチド及びTGF-β1を処理した群では減少した。したがって、本発明のペプチドは、TGF-β1と同一な方式で信号伝達に関与するということが分かる。
【００８３】
実施例７：トリデカペプチドによるマウス黒色腫の成長の抑制実験
健康な5週齢の雄性Balb/Cマウス(中央実験動物, 韓国)の背中部位の毛を除毛した後、培養したB16F10黒色腫(韓国細胞株銀行)をそれぞれ200万細胞ずつ、背中の2ヶ所に注入した。正常食餌をしてマウスを三日間飼育した後から、黒色腫部位が黒く腫れてくることを観察することができた。同じ程度に腫れている二つの部位に、1ヶ所には対照群としてPBSを、他の1ヶ所には約100μgのトリデカペプチドを、一日一回ずつ投与した。
【００８４】
図7は、本発明のトリデカペプチドを投与した後、一週間が経過した後に腫瘍部位を撮影した写真であって、ペプチドを処理した部位で腫瘍が退化することを観察することができた。また、マウスを犠牲させて腫瘍部位を観察した結果、腫瘍の転移が抑制されて、血管新生が抑制されたことが観察されて、図8のように、同じ部位をパラフィンブロックで製作して薄片した後、ヘマトキシリンとエオシンで染色してみた結果、組織内に黒色腫の発生が著しく減少されたことを発見することができた。
【００８５】
実施例８：トリデカペプチドを利用した細胞毒性実験
本発明のペプチドに対し、角質細胞、線維芽細胞及び黒色腫細胞に対する毒性があるかどうかを確認するために、Rizzinoらの方法(Cancer Res., 48:4266(1988))を参照して、HacaT, NIH3T3及びB16F10細胞株を利用したSRB(Sulforhodamine B)のひ比色法を利用して測定した。HacaT, NIH3T3及びB16F10細胞株(韓国細胞株銀行)を、それぞれ100% FBS(fetal bovine serum)が含有されたEMEM(Eagle's minimal essential media, Gibco, U.S.A.)が入っている250ml容量の組織培養用フラスコを利用して培養した。培養されたHacaT, NIH3T3及びB16F10細胞株を、0.25%トリプシン溶液で培養容器の底から離した後、遠心分離して、細胞沈殿物のみを集めた。これを、FBSが含有されていないEMEM培養液に再び懸濁した後、96-ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり1 x 105 細胞になるように入れて、24時間37℃, 7%CO2 条件下で培養した。24時間後、血清を完全に除去した同一な培養液に培地を入れ替えた後、標準を取るための空試料とトリデカペプチドを水と10% DMSOに滅菌状態で溶解した後、500pg/ml, 10ng/ml, 1μg/ml, 100μg/ml及び200μg/mlの濃度で、上記と同一条件で72時間培養した。培養が完了した後、培養上澄み液を除去して、PBSで1回洗浄した。洗浄溶液を除去した後、比色SRB溶液(Sigma, USA)で処理し、PBSで十分洗浄した後、顕微鏡で細胞を観察し、生存細胞の状態を観察して、590nmで吸光度を測定し、細胞の生存状態を測定した。図9から分かるように、低濃度から高濃度まで投与したペプチドによる細胞数の減少は全く観察されず、細胞の顕微鏡的な観察においても、特別な変化が観察されなかった。このことから、本ペプチドは、皮膚関連細胞の毒性が全くないことが分かり、本ペプチドを皮膚に処理しても、皮膚細胞に大きい影響を及ぼさないことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明のTGFP-CAPペプチドは、優れた抗血管新生活性を示す。また、本発明のTGFP-CAPペプチドは、皮膚からメラニン形成を効果的に遮断することにより美白効能を示す。本発明のペプチドは、安定性が天然TGF-β1に比べて非常に優れており、皮膚透過度に非常に優れている。このような本発明のペプチドの優れた活性及び安定性は、医薬、医薬外品及び化粧品に非常に有利に適用できるようにする。
【００８７】
以上、本発明の特定な部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図３】
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【図４】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年11月2日(2009.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
TGF-β1(transforming growth factor-β1)由来のアミノ酸配列及び細胞付着アミノ酸配列を含み、前記TGF-β1由来のアミノ酸配列は、配列番号1に記載のアミノ酸配列から構成されて、下記の一般式Iで表されるTGFP-CAPペプチド: 
一般式I 
Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-細胞付着アミノ酸配列
前記一般式Iにおいて、前記細胞付着アミノ酸配列は、RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), GPR(Gly-Pro-Arg), GHK(Gly-His-Lys), YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), CDPGYIGSR(Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), LCFR(Leu-Cys-Phe-Arg), EIL(Glu-Ile-Leu), EILDV(Glu-Ile-Leu-Asp-Val), EILDVPST(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr), EILEVPST(Glu-Ile-Leu-Glu-Val-Pro-Ser-Thr), LDV(Leu-Asp-Val)またはLDVPS(Leu-Asp-Val-Pro-Ser)である。
【請求項２】
前記TGF-β1由来のアミノ酸配列及び細胞付着アミノ酸配列間にリンカーが結合されており、前記TGFP-CAPペプチドは、下記の一般式IIで表されることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド: 
一般式II
Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-リンカー-細胞付着アミノ酸配列
前記一般式IIにおいて、前記細胞付着アミノ酸配列は、RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), GPR(Gly-Pro-Arg), GHK(Gly-His-Lys), YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), CDPGYIGSR(Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), LCFR(Leu-Cys-Phe-Arg), EIL(Glu-Ile-Leu), EILDV(Glu-Ile-Leu-Asp-Val), EILDVPST(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr), EILEVPST(Glu-Ile-Leu-Glu-Val-Pro-Ser-Thr), LDV(Leu-Asp-Val)またはLDVPS(Leu-Asp-Val-Pro-Ser)である。
【請求項３】
前記細胞付着アミノ酸配列は、RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val)またはGPR(Gly-Pro-Arg)であることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記細胞付着アミノ酸配列は、RGD(Arg-Gly-Asp)であることを特徴とする、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記リンカーは、複数のアミノ酸残基からなるリンカーであることを特徴とする、請求項２に記載のペプチド。
【請求項６】
前記リンカーは、2〜10個のGly残基からなっていることを特徴とする、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドは、下記の一般式IIIで表されることを特徴とする、請求項６に記載のペプチド：
一般式III
Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-Gly(n)-Arg-Gly-Asp 
前記一般式III において、nは2〜8の整数を示す。 
【請求項８】
前記ペプチドのＮ−末端及びＣ−末端にあるアミノ酸残基の少なくとも一つは、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール(PEG)からなる群から選択される保護基が結合されていることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む抗血管新生用組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、虹彩炎、増殖網膜症、乾癬、血友病性関節、アテロム性動脈硬化プラーク内における毛細血管増殖、ケロイド、傷の顆粒化、血管接着、リウマチ様関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再発狭窄症、アテロム性動脈硬化、腸管接着、ネコひっかき病、潰瘍、肝硬変症、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、糸球体腎症、糖尿病、炎症または神経退行性疾患の治療または予防のための組成物であることを特徴とする、請求項８に記載の抗血管新生用組成物。
【請求項１１】
請求項１乃至８のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む皮膚美白用組成物。
【国際調査報告】
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