(57)【要約】【課題】  バイオマスに由来するものなどの多糖体を、適切な単糖又はオリゴ糖に変換するための、及び適切な単糖又はオリゴ糖を生物燃料などのコモディティケミカルに変換するための方法、酵素、組換え微生物、並びに微生物系が提供される。また、本明細書に記述した方法によって産生されるコモディティケミカルが提供される。また、コモディティケミカルが豊富な精練所で生成された石油製品、並びに前述のものを産生するための方法が提供される。【選択図】      図2
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖体をコモディティケミカルに変換するための方法であって：
（a）任意にバイオマスに由来する多糖体を、多糖体分解又は脱重合代謝系と接触させることであって、該代謝系が、
（i）酵素的、又は化学的触媒作用、及び、
（ii）微生物系であって、該微生物系が、組換え微生物を含み、該組換え微生物は、それが唯一の炭素源として該多糖体上で成長することができる1つの又は複数の外来性遺伝子を含む、前記微生物系、
から選択され、
これにより該多糖体を適切な単糖、又はオリゴ糖に変換すること；並びに、
（b）該適切な単糖、又はオリゴ糖を、コモディティケミカル生合成経路と接触させることであって、該コモディティケミカル生合成経路が、アルデヒド、又はケトン生合成経路を含み、
これにより該多糖体を該コモディティケミカルに変換することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記バイオマスが海洋バイオマス、及び野菜／果実／植物バイオマスから選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記海洋バイオマスがケルプ、ジャイアントケルプ、ホンダワラ、海藻、藻類、海洋ミクロフローラ、微細藻類、及び海草から選択される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記野菜／果実／植物バイオマスが植物果皮、又は絞り滓を含む、請求項2記載の方法。
【請求項５】
前記野菜／果実／植物バイオマスが柑橘類、ジャガイモ、トマト、ブドウ、グズベリー、ニンジン、マンゴー、サトウダイコン、リンゴ、スイッチグラス、木、及び飼い葉から選択される、請求項2記載の方法。
【請求項６】
前記多糖体がアルギナート、寒天、カラゲナン、フコイダン、ペクチン、ポリガラクツロナート、セルロース、ヘミセルロース、キシラン、アラビナン、及びマンナンから選択される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記適切な単糖又はオリゴ糖が、2-ケト-3-デオキシD-グルコナート（KDG）、D-マンニトール、グルロナート、マンヌロナート、マンニトール、リキソース、グリセロール、キシリトール、グルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、グルクロナート、ガラクツロナート、及びラムノースから選択される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記コモディティケミカルが以下から選択される、請求項1記載の方法：メタン、メタノール、エタン、エテン、エタノール、n-プロパン、1-プロペン、1-プロパノール、プロパナール、アセトン、プロピオナート、n-ブタン、1-ブテン、1‐ブタノール、ブタナール、ブタノエート、イソブタナール、イソブタノール、2-メチルブタナール、2-メチルブタノール、3-メチルブタナール、3-メチルブタノール、2-ブテン、2-ブタノール、2-ブタノン、2,3-ブタンジオール、3-ヒドロキシ-2-ブタノン、2,3-ブタンジオン、エチルベンゼン、エテニルベンゼン、2-フェニルエタノール、フェニルアセトアルデヒド、1-フェニルブタン、4-フェニル-1-ブテン、4-フェニル-2-ブテン、1-フェニル-2-ブテン、1-フェニル-2-ブタノール、4-フェニル-2-ブタノール、1-フェニル-2-ブタノン、4-フェニル-2-ブタノン、1-フェニル-2,3-ブタンジオール、1-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、4-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、1-フェニル-2,3-ブタンジオン、n-ペンタン、エチルフェノール、エテニルフェノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、1-(4-ヒドロキシフェニル)ブタン、4-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ブテン、4-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ブテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノール、4-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノン、4-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、4-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタノンジオン、インドリルエタン、インドリルエテン、2-(インドール-3-）エタノール、n-ペンタン、1-ペンテン、1-ペンタノール、ペンタナール、ペンタノアート、2-ペンテン、2-ペンタノール、3-ペンタノール、2-ペンタノン、3-ペンタノン、4-メチルペンタナール、4-メチルペンタノール、2,3-ペンタンジオール、2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、2,3-ペンタンジオン、2-メチルペンタン、4-メチル-1-ペンテン、4-メチル-2-ペンテン、4-メチル-3-ペンテン、4-メチル-2-ペンタノール、2-メチル-3-ペンタノール、4-メチル-2-ペンタノン、2-メチル-3-ペンタノン、4-メチル-2,3-ペンタンジオール、4-メチル-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、4-メチル-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、4-メチル-2,3-ペンタンジオン、1-フェニルペンタン、1-フェニル-1-ペンテン、1-フェニル-2-ペンテン、1-フェニル-3-ペンテン、1-フェニル-2-ペンタノール、1-フェニル-3-ペンタノール、1-フェニル-2-ペンタノン、1-フェニル-3-ペンタノン、1-フェニル-2,3-ペンタンジオール、1-フェニル-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、1-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、1-フェニル-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-フェニルペンタン、4-メチル-1-フェニル-1-ペンテン、4-メチル-1-フェニル-2-ペンテン、4-メチル-1-フェニル-3-ペンテン、4-メチル-1-フェニル-3-ペンタノール、4-メチル-1-フェニル-2-ペンタノール、4-メチル-1-フェニル-3-ペンタノン、4-メチル-1-フェニル-2-ペンタノン、4-メチル-1-フェニル-2,3-ペンタンジオール、4-メチル-1-フェニル-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、4-メチル-1-フェニル-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)ペンタン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ペンテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンタノール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンタノール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ペンタンジオール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)ペンタン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンテン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンテン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ペンテン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンタノール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンタノール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンタノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンタノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ペンタンジオール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、1-インドール-3-ペンタン、1-(インドール-3)-1-ペンテン、1-(インドール-3)-2-ペンテン、1-(インドール-3)-3-ペンテン、1-(インドール-3)-2-ペンタノール、1-(インドール-3)-3-ペンタノール、1-(インドール-3)-2-ペンタノン、1-(インドール-3)-3-ペンタノン、1-(インドール-3)-2,3-ペンタンジオール、1-(インドール-3)-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、1-(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、1-(インドール-3)-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-(インドール-3-）ペンタン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ペンテン、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ペンテン、4-メチル-1-(インドール-3)-1-ペンテン、4-メチル-2-(インドール-3)-3-ペンタノール、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ペンタノール、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ペンタノン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ペンタノン、4-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ペンタンジオール、4-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、n-ヘキサン、1-ヘキセン、1‐ヘキサノール、ヘキサナール、ヘキサノアート、2-ヘキセン、3-ヘキセン、2-ヘキサノール、3-ヘキサノール、2-ヘキサノン、3-ヘキサノン、2,3-ヘキサンジオール、2,3-ヘキサンジオン、3,4-ヘキサンジオール、3,4-ヘキサンジオン、2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、3-ヒドロキシ-4-ヘキサノン、4-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、2-メチルヘキサン、3-メチルヘキサン、2-メチル-2-ヘキセン、2-メチル-3-ヘキセン、5-メチル-1-ヘキセン、5-メチル-2-ヘキセン、4-メチル-1-ヘキセン、4-メチル-2-ヘキセン、3-メチル-3-ヘキセン、3-メチル-2-ヘキセン、3-メチル-1-ヘキセン、2-メチル-3-ヘキサノール、5-メチル-2-ヘキサノール、5-メチル-3-ヘキサノール、2-メチル-3-ヘキサノン、5-メチル-2-ヘキサノン、5-メチル-3-ヘキサノン、2-メチル-3,4-ヘキサンジオール、2-メチル-3,4-ヘキサンジオン、5-メチル-2,3-ヘキサンジオール、5-メチル-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-2,3-ヘキサンジオール、4-メチル-2,3-ヘキサンジオン、2-メチル-3-ヒドロキシ-4-ヘキサノン、2-メチル-4-ヒドロキ���-3-ヘキサノン、5-メチル-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、5-メチル-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、4-メチル-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、4-メチル-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、2,5-ジメチルヘキサン、2,5-ジメチル-2-ヘキセン、2,5-ジメチル-3-ヘキセン、2,5-ジメチル-3-ヘキサノール、2,5-ジメチル-3-ヘキサノン、2,5-ジメチル-3,4-ヘキサンジオール、2,5-ジメチル-3,4-ヘキサンジオン、2,5-ジメチル-3-ヒドロキシ-4-ヘキサノン、5-メチル-1-フェニルヘキサン、4-メチル-1-フェニルヘキサン、5-メチル-1-フェニル-1-ヘキセン、5-メチル-1-フェニル-2-ヘキセン、5-メチル-1-フェニル-3-ヘキセン、4-メチル-1-フェニル-1-ヘキセン、4-メチル-1-フェニル-2-ヘキセン、4-メチル-1-フェニル-3-ヘキセン、5-メチル-1-フェニル-2-ヘキサノール、5-メチル-1-フェニル-3-ヘキサノール、4-メチル-1-フェニル-2-ヘキサノール、4-メチル-1-フェニル-3-ヘキサノール、5-メチル-1-フェニル-2-ヘキサノン、5-メチル-1-フェニル-3-ヘキサノン、4-メチル-1-フェニル-2-ヘキサノン、4-メチル-1-フェニル-3-ヘキサノン、5-メチル-1-フェニル-2,3-ヘキサンジオール、4-メチル-1-フェニル-2,3-ヘキサンジオール、5-メチル-1-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、5-メチル-1-フェニル-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、4-メチル-1-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、4-メチル-1-フェニル-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、5-メチル-1-フェニル-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-1-フェニル-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)ヘキサン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ヘキセン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキセン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキセン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ヘキセン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキセン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキセン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキサノール、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキサノール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキサノール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキサノール、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキサノン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキサノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキサノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキサノン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘキサンジオール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘキサンジオール、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-1-(インドール-3-)ヘキサン、5-メチル-1-(インドール-3)-1-ヘキセン、5-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキセン、5-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキセン、4-メチル-1-(インドール-3)-1-ヘキセン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキセン、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキセン、5-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキサノール、5-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキサノール、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキサノール、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキサノール、5-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキサノン、5-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキサノン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキサノン、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキサノン、5-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ヘキサンジオール、4-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ヘキサンジオール、5-メチル-1-(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、5-メチル-1-(インドール-3)-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、5-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ヘキサンジオン、n-ヘプタン、1-ヘプテン、1-ヘプタノール、ヘプタナール、ヘプタノエート、2-ヘプテン、3-ヘプテン、2-ヘプタノール、3-ヘプタノール、4-ヘプタノール、2-ヘプタノン、3-ヘプタノン、4-ヘプタノン、2,3-ヘプタンジオール、2,3-ヘプタンジオン、3,4-ヘプタンジオール、3,4-ヘプタンジオン、2-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、3-ヒドロキシ-2-ヘプタノン、3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、2-メチルヘプタン、3-メチルヘプタン、6-メチル-2-ヘプテン、6-メチル-3-ヘプテン、2-メチル-3-ヘプテン、2-メチル-2-ヘプテン、5-メチル-2-ヘプテン、5-メチル-3-ヘプテン、3-メチル-3-ヘプテン、2-メチル-3-ヘプタノール、2-メチル-4-ヘプタノール、6-メチル-3-ヘプタノール、5-メチル-3-ヘプタノール、3-メチル-4-ヘプタノール、2-メチル-3-ヘプタノン、2-メチル-4-ヘプタノン、6-メチル-3-ヘプタノン、5-メチル-3-ヘプタノン、3-メチル-4-ヘプタノン、
2-メチル-3,4-ヘプタンジオール、2-メチル-3,4-ヘプタンジオン、6-メチル-3,4-ヘプタンジオール、6-メチル-3,4-ヘプタンジオン、5-メチル-3,4-ヘプタンジオール、5-メチル-3,4-ヘプタンジオン、2-メチル-3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、2-メチル-4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、6-メチル-3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、6-メチル-4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、5-メチル-3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、5-メチル-4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、2,6-ジメチルヘプタン、2,5-ジメチルヘプタン、2,6-ジメチル-2-ヘプテン、2,6-ジメチル-3-ヘプテン、2,5-ジメチル-2-ヘプテン、2,5-ジメチル-3-ヘプテン、3,6-ジメチル-3-ヘプテン、2,6-ジメチル-3-ヘプタノール、2,6-ジメチル-4-ヘプタノール、2,5-ジメチル-3-ヘプタノール、2,5-ジメチル-4-ヘプタノール、2,6-ジメチル-3,4-ヘプタンジオール、2,6-ジメチル-3,4-ヘプタンジオン、2,5-ジメチル-3,4-ヘプタンジオール、2,5-ジメチル-3,4-ヘプタンジオン、2,6-ジメチル-3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、2,6-ジメチル-4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、2,5-ジメチル-3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、2,5-ジメチル-4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、n-オクタン、1-オクテン、2-オクテン、1-オクタノール、オクタナール、オクタノアート、3-オクテン、4-オクテン、4-オクタノール、4-オクタノン、4,5-オクタンジオール、4,5-オクタンジオン、4-ヒドロキシ-5-オクタノン、2-メチルオクタン、2-メチル-3-オクテン、2-メチル-4-オクテン、7-メチル-3-オクテン、3-メチル-3-オクテン、3-メチル-4-オクテン、6-メチル-3-オクテン、2-メチル-4-オクタノール、7-メチル-4-オクタノール、3-メチル-4-オクタノール、6-メチル-4-オクタノール、2-メチル-4-オクタノン、7-メチル-4-オクタノン、3-メチル-4-オクタノン、6-メチル-4-オクタノン、2-メチル-4,5-オクタンジオール、2-メチル-4,5-オクタンジオン、3-メチル-4,5-オクタンジオール、3-メチル-4,5-オクタンジオン、2-メチル-4-ヒドロキシ-5-オクタノン、2-メチル-5-ヒドロキシ-4-オクタノン、3-メチル-4-ヒドロキシ-5-オクタノン、3-メチル-5-ヒドロキシ-4-オクタノン、2,7-ジメチルオクタン、2,7-ジメチル-3-オクテン、2,7-ジメチル-4-オクテン、2,7-ジメチル-4-オクタノール、2,7-ジメチル-4-オクタノン、2,7-ジメチル-4,5-オクタンジオール、2,7-ジメチル-4,5-オクタンジオン、2,7-ジメチル-4-ヒドロキシ-5-オクタノン、2,6-ジメチルオクタン、2,6-ジメチル-3-オクテン、2,6-ジメチル-4-オクテン、3,7-ジメチル-3-オクテン、2,6-ジメチル-4-オクタノール、3,7-ジメチル-4-オクタノール、2,6-ジメチル-4-オクタノン、3,7-ジメチル-4-オクタノン、2,6-ジメチル-4,5-オクタンジオール、2,6-ジメチル-4,5-オクタンジオン、2,6-ジメチル-4-ヒドロキシ-5-オクタノン、2,6-ジメチル-5-ヒドロキシ-4-オクタノン、3,6-ジメチルオクタン、3,6-ジメチル-3-オクテン、3,6-ジメチル-4-オクテン、3,6-ジメチル-4-オクタノール、3,6-ジメチル-4-オクタノン、3,6-ジメチル-4,5-オクタンジオール、3,6-ジメチル-4,5-オクタンジオン、3,6-ジメチル-4-ヒドロキシ-5-オクタノン、n-ノナン、1-ノネン、1‐ノナノール、ノナナール、ノナノアート、2-メチルノナン、2-メチル-4-ノネン、2-メチル-5-ノネン、8-メチル-4-ノネン、2-メチル-5-ノナノール、8-メチル-4-ノナノール、2-メチル-5-ノナノン、8-メチル-4-ノナノン、8-メチル-4,5-ノナンジオール、8-メチル-4,5-ノナンジオン、8-メチル-4-ヒドロキシ-5-ノナノン、8-メチル-5-ヒドロキシ-4-ノナノン、2,8-ジメチルノナン、2,8-ジメチル-3-ノネン、2,8-ジメチル-4-ノネン、2,8-ジメチル-5-ノネン、2,8-ジメチル-4-ノナノール、2,8-ジメチル-5-ノナノール、2,8-ジメチル-4-ノナノン、2,8-ジメチル-5-ノナノン、2,8-ジメチル-4,5-ノナンジオール、2,8-ジメチル-4,5-ノナンジオン、2,8-ジメチル-4-ヒドロキシ-5-ノナノン、2,8-ジメチル-5-ヒドロキシ-4-ノナノン、2,7-ジメチルノナン、3,8-ジメチル-3-ノネン、3,8-ジメチル-4-ノネン、3,8-ジメチル-5-ノネン、3,8-ジメチル-4-ノナノール、3,8-ジメチル-5-ノナノール、3,8-ジメチル-4-ノナノン、3,8-ジメチル-5-ノナノン、3,8-ジメチル-4,5-ノナンジオール、3,8-ジメチル-4,5-ノナンジオン、3,8-ジメチル-4-ヒドロキシ-5-ノナノン、3,8-ジメチル-5-ヒドロキシ-4-ノナノン、n-デカン、1-デセン、1-デカノール、デカノアート、2,9-ジメチルデカン、2,9-ジメチル-3-デセン、2,9-ジメチル-4-デセン、2,9-ジメチル-5-デカノール、2,9-ジメチル-5-デカノン、2,9-ジメチル-5,6-デカンジオール、2,9-ジメチル-6-ヒドロキシ-5-デカノン、2,9-ジメチル-5,6-デカンジオネン-ウンデカン、1-ウンデセン、1-ウンデカノール、ウンデカナール、ウンデカノアート、n-ドデカン、1-ドデセン、1-ドデカノール、ドデカナール、ドデカノアート、n-ドデカン、1-デカデセン、1-ドデカノール、ドデカナール（ddodecanal）、ドデカノアート、n-トリデカン、1-トリデセン、1-トリデカノール、トリデカナール、トリデカノアート、n-テトラデカン、1-テトラデセン、1‐テトラデカノール、テトラデカナール、テトラデカノアート、n-ペンタデカン、1-ペンタデセン、1-ペンタデカノール、ペンタデカナール、ペンタデカノアート、n-ヘキサデカン、1-ヘキサデセン、1-ヘキサデカノール、ヘキサデカナール、ヘキサデカノアート、n-ヘプタデカン、1-ヘプタデセン、1-ヘプタデカノール、ヘプタデカナール、ヘプタデカノアート、n-オクタデカン、1-オクタデセン、1-オクタデカノール、オクタデカナール、オクタデカノアート、n-ノナデカン、1-ノナデセン、1-ノナデカノール、ノナデカナール、ノナデカノアート、エイコサン、1-エイコセン、1-エイコサノール、エイコサナール、エイコサノアート、3-ヒドロキシプロパナール、1,3-プロパンジオール、4-ヒドロキシブタナール、1,4-ブタンジオール、3-ヒドロキシ-2-ブタノン、2,3-ブタンジオール、1,5-ペンタンジオール、ホモシトラート、ホモイソシトラート、b-ヒドロキシアジパート、グルタラート、グルタルセミアルデヒド、グルタルアルデヒド、2-ヒドロキシ-1-シクロペンタノン、1,2-シクロペンタンジオール、シクロペンタノン、シクロペンタノール、(S)-2-アセトラクタート、(R)-2,3-ジヒドロキシ-イソバレレート、2-オキソイソバレレート、イソブチリル-CoA、イソブチレート、イソブチルアルデヒド、5-アミノペントアルデヒド、1,10-ジアミノデカン、1,10-ジアミノ-5-デセン、1,10-ジアミノ-5-ヒドロキシデカン、1,10-ジアミノ-5-デカノン、1,10-ジアミノ-5,6-デカンジオール、1,10-ジアミノ-6-ヒドロキシ-5-デカノン、フェニルアセトアルデヒド、1,4-ジフェニルブタン、1,4-ジフェニル-1-ブテン、1,4-ジフェニル-2-ブテン、1,4-ジフェニル-2-ブタノール、1,4-ジフェニル-2-ブタノン、1,4-ジフェニル-2,3-ブタンジオール、1,4-ジフェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニルブタン、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-1-ブテン、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-2-ブテン、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-2-ブタノール、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-2-ブタノン、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-2,3-ブタンジオール、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、1-(インドール-3)-4-フェニルブタン、1-(インドール-3)-4-フェニル-1-ブテン、1-(インドール-3)-4-フェニル-2-ブテン、1-(インドール-3)-4-フェニル-2-ブタノール、1-(インドール-3)-4-フェニル-2-ブタノン、1-(インドール-3)-4-フェニル-2,3-ブタンジオール、1-(インドール-3)-4-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)ブタン、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-1-ブテン、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブテン、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノール、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノン、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオール、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3-)ブタン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3)-1-ブテン、1-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3)-2-ブテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3)-2-ブタノール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3)-2-ブタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3)-2,3-ブタンジオール、1-(4-ヒドロキシフェニル-4-(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、インドール-3-アセトアルデヒド、1,4-ジ(インドール-3-)ブタン、1,4-ジ(インドール-3)-1-ブテン、1,4-ジ(インドール-3)-2-ブテン、1,4-ジ(インドール-3)-2-ブタノール、1,4-ジ(インドール-3)-2-ブタノン、1,4-ジ(インドール-3)-2,3-ブタンジオール、1,4-ジ(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、スクシナートセミアルデヒド、ヘキサン-1,8-ジカルボン酸、3-ヘキセン-1,8-ジカルボン酸、3-ヒドロキシ-ヘキサン-1,8-ジカルボン酸、3-ヘキサノン-1,8-ジカルボン酸、3,4-ヘキサンジオール-1,8-ジカルボン酸、4-ヒドロキシ-3-ヘキサノン-1,8-ジカルボン酸、フコイダン、ヨウ素、クロロフィル、カロテノイド、カルシウム、マグネシウム、鉄、ナトリウム、カリウム、及びホスフェート。
【請求項９】
多糖体を適切な単糖、又はオリゴ糖に変換するための方法であって：
（a）任意にバイオマスから得られる多糖体を、微生物系と、該多糖体を適切な単糖、又はオリゴ糖に変換するために十分な時間接触させることであって、該微生物系が、
（i）リアーゼ、及びヒドロラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子であって、該リアーゼ、及び／又はヒドロラーゼは、任意に少なくとも1つのシグナルペプチド、又は少なくとも1つの自己輸送体ドメインを含む、該少なくとも1つの遺伝子；
（ii）単糖輸送体、二糖輸送体、三糖輸送体、オリゴ糖輸送体、多糖体輸送体、及びスーパーチャンネルから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子；並びに、
（iii）単糖デヒドロゲナーゼ、イソメラーゼ、デヒドラターゼ、キナーゼ、及びアルドラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子、
を含み、
これにより該多糖体を適切な単糖、又はオリゴ糖に変換すること、
を含む、前記方法。
【請求項１０】
多糖体を、適切な単糖、又はオリゴ糖に変換するための方法であって：
（a）任意にバイオマスから得られる多糖体を、化学的、又は酵素的触媒作用経路と、該多糖体が第1の単糖、又はオリゴ糖に変換するために十分な時間接触させること；並びに、
（b）該第1の単糖、又はオリゴ糖を、微生物系と、該第1の単糖、又はオリゴ糖が該適切な単糖、又はオリゴ糖に変換するために十分な時間接触させることであって、該微生物系が、
（i）リアーゼ、及びヒドロラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子、
（ii）単糖輸送体、二糖輸送体、三糖輸送体、オリゴ糖輸送体、多糖体輸送体、及びスーパーチャンネルから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子；並びに、
（ii）単糖デヒドロゲナーゼ、イソメラーゼ、デヒドラターゼ、キナーゼ、及びアルドラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子、を含み、
これにより該多糖体を該適切な単糖、又はオリゴ糖に変換することを含む、前記方法。
【請求項１１】
前記リアーゼがアルギナートリアーゼ、ペクタートリアーゼ、ポリマンヌロナートリアーゼ、ポリグルロナートリアーゼ、ポリガラクツロナートリアーゼ、及びラムノガラクツロナートリアーゼから選択される、請求項9、又は請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒドロラーゼがアルギナートヒドロラーゼ、ラムノガラクツロナートヒドロラーゼ、ポリマンヌロナートヒドロラーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、及びポリガラクツロナートヒドロラーゼから選択される、請求項9、又は請求項10記載の方法。
【請求項１３】
前記輸送体がABC輸送体、共輸送体、及び外膜ポリンから選択される、請求項9、又は請求項10記載の方法。
【請求項１４】
前記ABC輸送体がAtu3021、Atu3022、Atu3023、Atu3024、algM1、algM2、AlgQ1、AlgQ2、AlgS、OG2516_05558、OG2516_05563、OG2516_05568、OG2516_05573、TogM、TogN、TogA、TogB、及びこれらの機能的な変異体から選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記共輸送体がV12B01_24239（配列番号：26）、V12B01_24194（配列番号：8）、及びTogT、並びにこれらの機能的な変異体から選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
前記外膜ポリンがV12B01_24269、KdgM、及びKdgN、並びにこれらの機能的な変異体から選択されるポリンを含む、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
唯一の炭素源として多糖体で成長することができる組換え微生物であって、該多糖体がアルギナート、ペクチン、トリ-ガラクツロナート、ジ-ガラクツロナート、セルロース、及びヘミセルロースから選択される、前記組換え微生物。
【請求項１８】
前記多糖体がアルギナートである、請求項17記載の組換え微生物。
【請求項１９】
多糖体がペクチンである、請求項17記載の組換え微生物。
【請求項２０】
前記多糖体がトリ-ガラクツロナートである、請求項17記載の組換え微生物。
【請求項２１】
組換え微生物であって、（i）リアーゼ、及びヒドロラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子であって、該リアーゼ、又はヒドロラーゼが、任意に少なくとも1つのシグナルペプチド、又は少なくとも1つの自己輸送体ドメインを含む、該少なくとも1つの遺伝子；（ii）単糖輸送体、二糖輸送体、三糖輸送体、オリゴ糖輸送体、多糖体輸送体、及びスーパーチャンネルから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子；並びに（iii）単糖デヒドロゲナーゼ、イソメラーゼ、デヒドラターゼ、キナーゼ、及びアルドラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子を含む、前記組換え微生物。
【請求項２２】
前記微生物が唯一の炭素源として多糖体で成長することができる、請求項17〜21のいずれか1項記載の組換え微生物。
【請求項２３】
前記多糖体がアルギナート、ペクチン、及びトリ-ガラクツロナートから選択される、請求項22記載の組換え微生物。
【請求項２４】
適切な単糖、又はオリゴ糖を第1のコモディティケミカルに変換するための方法であって、
（a）該適切な単糖、又はオリゴ糖を、微生物系と、適切な単糖、又はオリゴ糖が該コモディティケミカルに変換するために十分な時間接触させることであって、該微生物系が、組換え微生物を含み、該微生物が、コモディティケミカル生合成経路を含み、
これにより該適切な単糖、又はオリゴ糖を該第1のコモディティケミカルに変換することを含む、前記方法。
【請求項２５】
前記コモディティケミカル経路がアルデヒド又はケトン生合成経路をコードする1つ以上の遺伝子を含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
前記アルデヒド又はケトン生合成経路がアセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、2-メチル-ブチルアルデヒド、3-メチル-ブチルアルデヒド、2-フェニルアセトアルデヒド、2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド、2-インドール-3-アセトアルデヒド、グルタルアルデヒド、5-アミノ-ペントアルデヒド、スクシナートセミアルデヒド、及びスクシナート4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド生合成経路の1つ以上から選択される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
前記アルデヒド又はケトン生合成経路がアセトアルデヒド生合成経路、並びにプロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、2-メチル-ブチルアルデヒド、3-メチル-ブチルアルデヒド、2-フェニルアセトアルデヒド、2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド、及び2-インドール-3-アセトアルデヒド生合成経路から選択される生合成経路を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記アルデヒド又はケトン生合成経路がプロピオンアルデヒド生合成経路、並びにブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、2-メチル-ブチルアルデヒド、3-メチル-ブチルアルデヒド、及びフェニルアセトアルデヒド生合成経路から選択される生合成経路を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
前記アルデヒド又はケトン生合成経路がブチルアルデヒド生合成経路、並びにイソブチルアルデヒド、2-メチル-ブチルアルデヒド、3-メチル-ブチルアルデヒド、2-フェニルアセトアルデヒド、2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド、及び2-インドール-3-アセトアルデヒド生合成経路から選択される生合成経路を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３０】
前記アルデヒド又はケトン生合成経路がイソブチルアルデヒド生合成経路、並びに2-メチル-ブチルアルデヒド、3-メチル-ブチルアルデヒド、2-フェニルアセトアルデヒド、2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド、及び2-インドール-3-アセトアルデヒド生合成経路から選択される生合成経路を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３１】
前記アルデヒド又はケトン生合成経路が2-メチル-ブチルアルデヒド生合成経路、並びに3-メチル-ブチルアルデヒド、2-フェニルアセトアルデヒド、2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド、及び2-インドール-3-アセトアルデヒド生合成経路から選択される生合成経路を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３２】
前記アルデヒド又はケトン生合成経路が3-メチル-ブチルアルデヒド生合成経路、並びに2-フェニルアセトアルデヒド、2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド、及び2-インドール-3-アセトアルデヒド生合成経路から選択される生合成経路を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３３】
前記アルデヒド又はケトン生合成経路が2-フェニルアセトアルデヒド生合成経路、並びに2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド、及び2-インドール-3-アセトアルデヒド生合成経路から選択される生合成経路を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３４】
前記アルデヒド又はケトン生合成経路が2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド生合成経路、及び2-インドール-3-アセトアルデヒド生合成経路を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３５】
前記第1のコモディティケミカルが更に、酵素的に及び／又は化学的に第2のコモディティケミカルに還元され、及び脱水される、請求項24記載の方法。
【請求項３６】
適切な単糖、又はオリゴ糖をコモディティケミカルに変換するための方法であって、
（a）該適切な単糖、又はオリゴ糖を、微生物系と、該適切な単糖、又はオリゴ糖を該コモディティケミカルに変換するために十分な時間接触させることであって、該微生物系が；
（i）アルデヒド生合成経路をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子であって、該アルデヒド生合成経路が、デカルボキシラーゼ酵素をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子を含む、該1つ以上の遺伝子；並びに、
（ii）アルデヒドレダクターゼをコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子、
を含み、
これにより該適切な単糖、又はオリゴ糖を該コモディティケミカルに変換することを含む、前記方法。
【請求項３７】
前記デカルボキシラーゼ酵素がインドール-3-ピルベートデカルボキシラーゼ（IPDC）である、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
前記IPDCが配列番号：312に記載されたアミノ酸配列と少なくとも80%、90%、95%、98%、又は99%同じであるアミノ酸配列を含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
前記アルデヒドレダクターゼ酵素がフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（PAR）である、請求項36記載の方法。
【請求項４０】
前記PARが配列番号：313に記載されたアミノ酸配列と少なくとも80%、90%、95%、98%、又は99%同じであるアミノ酸配列を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
前記コモディティケミカルが2-フェニルエタノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、及びインドール-3-エタノールから選択される、請求項36記載の方法。
【請求項４２】
組換え微生物であって、（i）アルデヒド生合成経路をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子であって、該アルデヒド生合成経路が、デカルボキシラーゼ酵素をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子を含む、該1つ以上の遺伝子；並びに（ii）アルデヒドレダクターゼをコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子、を含む、前記組換え微生物。
【請求項４３】
前記アルデヒド生合成経路がCoA関連アルデヒド脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子を更に含む、請求項42記載の組換え微生物。
【請求項４４】
前記デカルボキシラーゼ酵素がインドール-3-ピルベートデカルボキシラーゼ（IPDC）である、請求項42記載の組換え微生物。
【請求項４５】
前記アルデヒドレダクターゼ酵素がフェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（PAR）である、請求項42記載の組換え微生物。
【請求項４６】
前記微生物が適切な単糖、又はオリゴ糖をコモディティケミカルに変換することができる、請求項42記載の組換え微生物。
【請求項４７】
前記コモディティケミカルが2-フェニルエタノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、及びインドール-3-エタノールから選択される、請求項46記載の組換え微生物。
【請求項４８】
前記微生物が、野生型微生物と比較して減少されたエタノール産生能力を含む、請求項17〜23、又は42〜47記載のいずれか1項記載の組換え微生物。
【請求項４９】
前記微生物が、アセチル-coAのエタノールへの変換の減少、又は阻害を含む、請求項48記載の組換え微生物。
【請求項５０】
前記組換え微生物がエタノールデヒドロゲナーゼの減少を含み、これによりエタノール産生能力の減少を提供する、請求項48記載の組換え微生物。
【請求項５１】
前記エタノールデヒドロゲナーゼがadhE、その相同体、又は変異体である、請求項50記載の組換え微生物。
【請求項５２】
前記微生物がadhE、その相同体、若しくは変異体の欠失、又はノックアウトを含む、請求項50記載の組換え微生物。
【請求項５３】
前記組換え微生物が、アセチル-coAのエタノールへの変換を触媒する酵素、ピルベートのラクタートへの変換を触媒する酵素、フマラートのスクシナートへの変換を触媒する酵素、アセチル-coA及びホスフェートのcoA及びアセチルホスフェートへの変換を触媒する酵素、アセチル-coA及びフォルマートのcoA及びピルベートへの変換を触媒する酵素、並びにα-ケト酸の分枝アミノ酸への変換を触媒する酵素から選択される酵素をコードする遺伝子における1つ以上の欠失、又はノックアウトを含む、請求項17〜23、又は42〜47のいずれか1項記載の組換え微生物。
【請求項５４】
前記組換え微生物、又は微生物系が以下を含む、請求項1-53のいずれか1項記載の微生物系、又は組換え微生物：アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）、アクロモバクター（Achromobacter）、アシジフィリウム属（Acidiphilium）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、アクチノマデュラ属（Actinomadura）、アクチノプラネス属（Actinoplanes）、超好熱性古細菌（Aeropyrum pernix）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、パインアップル（Ananas comosus ）（M）、アルトロバクター属（Arthrobacter）、クロコウジカビ（Aspargillus niger）、コウジカビ（Aspargillus oryze）、アスペルギルス・メレウス（Aspergillus melleus）、アスペルギルス・プルベルレンツス（Aspergillus pulverulentus）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、ショウユコウジカビ（Aspergillus sojea）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、ブレビス菌（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、リケニホルミス菌（Bacillus licheniformis）、バチルス・マセランス（Bacillus macerans）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ブレビバチルス・ブレービス（Brevibacillus brevis）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、カンジダ シリンドラセア（Candida cylindracea）、カンディダ・ルゴサ（Candida rugosa）、パパイヤ（Carica papaya）（L）、セルロシミクロビウム属（Cellulosimicrobium）、セファロスポリウム属（Cephalosporium）、ケトミウム・エラチカム（Chaetomium erraticum）、ケトミウム・グラシエ（Chaetomium gracile）、クロストリジウム属（Clostridium）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・アセトブチリクム (Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）（グルタミクム（glutamicum））、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、大腸菌（Escherichia coli）、エンテロコッカス（Enterococcus）、黒脚病菌（Erwina chrysanthemi）、グルコノバクター属（Gliconobacter）、グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）、ハロアーキュラ属（Haloarcula）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ンソレンス（Humicola nsolens）、キタサトスポラ・セタエ（Kitasatospora setae）、クレブシエラ属（Klebsiella）、クレブシェラオキシトーカ（Klebsiella oxytoca）、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）、クロイベロマイセス フラジリス（Kluyveromyces fragilis）、クルイベロミセスラクチス（Kluyveromyces lactis）、コクリア属（Kocuria）、ラクトラクティス（Lactlactis）、乳酸桿菌属（Lactobacillus）、発酵乳酸桿菌（Lactobacillus fermentum）、ラクトバシラス・サケ（Lactobacillus sake）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、メチロシスチス属（Methylocystis）、メタノロブス・シシリアエ（Methanolobus siciliae）、メタノゲニウム・オルガノフィラム（Methanogenium organophilum）、メタノバクテリウム・ブライアンティイ（Methanobacterium bryantii）、��クロバクテリウム・インペリアレ（Microbacterium imperiale）、ミクロコッカス・リソディクティカス（Micrococcus lysodeikticus）、ミクロルナタス属（Microlunatus）、ムコール・ジャバニカス（Mucor javanicus）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ミロセシウム属（Myrothecium）、硝酸菌属（Nitrobacter）、ニトロソモナス属（Nitrosomonas）、ノカルジア属（Nocardia）、パパイヤ（Papaya carica）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、醤油乳酸菌（Pediococcus halophilus）、ペニシリウム属（Penicillium）、ペニシリウム・カマンベルティ（Penicillium camemberti）、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）、ペニシリウム・エメルソニィ（Penicillium emersonii）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Penicillium roqueforti）、ペニシリウム・リラシナム（Penicillium lilactinum）、ペニシリウム・マルチカラー（Penicillium multicolor）、パラコッカス・パントトロファス（Paracoccus pantotrophus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、シュードモナス属（Pseudomonas）、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・デニトリフィカンス（Pseudomonas denitrificans）、パイロコッカス属（Pyrococcus）、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、パイロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshii）、根粒菌属（Rhizobium）、リゾムコール・マイハイ（Rhizomucor miehei）、リゾムコール・プシルス・リント（Rhizomucor pusillus Lindt）、リゾプス属（Rhizopus）、リゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）、リゾプス・ジャポニカス（Rhizopus japonicus）、リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、サッカロマイセス・セレビシエ（Sccharomyces cerevisiae）、スクレロチナ・リベルチナ（Sclerotina libertina）、スフィンゴバクテリウム・マルチボラム（Sphingobacterium multivorum）、スフィンゴビウム属（Sphingobium）、スフィンゴモナス属（Sphingomonas）、連鎖球菌属（Streptococcus）、サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）Y-1、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトミセス・ムリヌス（Streptomyces murinus）、ストレプトマイセス・ルビギノーサス（Streptomyces rubiginosus）、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Streptomyces violaceoruber）、ストレプトベルティシリウム・モバラエンス（Streptoverticillium mobaraense）、テトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）、サームス属（Thermus）、チオスファエラ パントトロファ（Thiosphaera pantotropha）、ホウロクタケ属（Trametes）、トリコデルマ属（Trichoderma）、トリコデルマ・ロンギブラキアータム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・レッセイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、トリコスポロン・ペニシラタム（Trichosporon penicillatum）、ビブリオ・アルギノリチカス（Vibrio alginolyticus）、ザントモナス属（Xanthomonas）、酵母（yeast）、ジゴサッカロミセス・ロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）、ザイモモナス属（Zymomonas）、及びザイモモナス・モビリス（Zymomonus mobilis）。
【請求項５５】
請求項1〜8、又は24〜41のいずれか1項記載の方法によって産生されるコモディティケミカル。
【請求項５６】
請求項55記載のコモディティケミカル、及び精練所で生成された石油製品を含む、混合されたコモディティケミカル。
【請求項５７】
前記コモディティケミカルがC10-C12炭化水素、2-フェニルエタノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、及びインドール-3-エタノールから選択される、請求項56記載の混合されたコモディティケミカル。
【請求項５８】
前記C10-C12炭化水素が2,7-ジメチルオクタン、及び2,9-ジメチルデカンから選択される、請求項57記載の混合されたコモディティケミカル。
【請求項５９】
前記精練所で生成された石油製品がジェット燃料、及びディーゼル燃料から選択される、請求項56記載の混合されたコモディティケミカル。
【請求項６０】
コモディティケミカルが豊富な精練所で生成された石油製品を生成する方法であって、
（a）該精練所で生成された石油製品を、請求項1〜8、又は24〜41のいずれか1項記載の方法によって生成されたコモディティケミカルと混合して、
これにより該コモディティケミカルが豊富な精練所で生成された石油製品を生成することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権情報）
本出願は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる2007年10月4日に出願した米国仮出願第60/977,628号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（配列表に関する記載）
本出願に付随する配列表は、紙の写しの代わりにテキスト形式で提供してあり、参照として本明細書に本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、150097_40101_SEQUENCE_LISTING.txt.である。テキストファイルは、519KBであり、2008年10月3日に作成され、EFS-Webを介して電子提出されている。
【０００３】
（技術分野）
本出願は、一般に、バイオマスを生物燃料／バイオガソリンなどのコモディティケミカルに変換するための微生物系、及び化学系の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
石油は、世界的備蓄が減少に向かっており、地球温暖化へと追いやる温室効果ガス放出の30%を超える要因となっている。毎年、800,000,000,000バレルの輸送燃料が世界的に消費される。ディーゼル燃料、及びジェット燃料は、世界的な輸送燃料の50%以上を占めている。
【０００５】
輸送燃料の生産、及び使用による炭素放出に上限を設け、又は減少させることを燃料生産者に要求する、有意な立法が通過した。燃料生産者は、既存の基盤（例えば、精練所、パイプライン、タンカー）を通じて混合すること、及び分配することができる、実質的に同様の低炭素燃料を探し求めている。
【０００６】
石油費用の増加、及び石油化学フィードストックに対する信頼性のため、化学物質産業は、また、マージン、及び価格安定性を改善し、その一方で、その環境への足跡を減少させる方法を探している。化学物質産業は、現在の製品よりも、よりエネルギー、水、及びCO2効果的な製品を開発するよう努めている。バイオマスなどの生物源から生成される燃料は、方法の一つの態様である。
【０００７】
バイオマスを生物燃料に変換するための本方法は、リグノセルロースのバイオマスの使用に焦点をあてており、この方法を使用することに関し、多くの問題がある。リグノセルロースのバイオマスの大規模栽培には、相当量の耕地が必要であり、これは、食用作物生産をエネルギー作物生産と置き換えること、森林伐採によって、及び現在未耕作の土地を再耕作することによって達成することができるだけである。その他の問題には、水の入手可能性、及び品質の低下、並びに殺虫薬、及び肥料の使用の増大を含む。
【０００８】
生物系を使用するリグノセルロースのバイオマスの分解は、その実質的な機械的強度、及び複雑な化学成分のために、非常に困難な挑戦である。リグノセルロースを完全に単糖に変換するためには、およそ30の異なる酵素が必要とされる。この複雑なアプローチに対して唯一利用できる代替物は、相当量の熱、圧力、及び強酸を必要とする。従って、当該技術分野において、生物燃料、又はバイオガソリンとして使用するために、バイオマスを炭化水素に変換するための経済的かつ技術的に単純な方法が必要とされる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例1に記述したフォスミドクローンのビブリオ・スプレンディダス（Vibrio splendidus）ゲノム領域を示す。遺伝子は、オレンジの矢印で示してある。表示は、数字で表わした遺伝子インデックス、及びタンパク質の予測される機能を示す。
【図２】大腸菌（E. coli）が唯一の炭素源としてアルギナートで成長するように操作され得る特定の実施態様に含まれる経路を図示する。
【図３】大腸菌が唯一の炭素源としてペクチンで成長するように操作され得る特定の実施態様に含まれる経路を図示する。
【図４】唯一の炭素源としてアルギナートで成長する操作された、又は組換えられた大腸菌の結果を示す（黒丸を参照されたい）。アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）細胞は、正の対照を提供する（ハッチングをかけた丸を参照されたい）。A. チュメファシエンス正の対照のすぐ左のウェルは、DH10B大腸菌細胞を含み、これは、負の対照を提供する。
【図５】ガラクツロナート、及びペクチンでの大腸菌の組換え株の成長を示す。図5Aは、24時間後の種々の長さのガラクツロナートでの大腸菌の成長を示す。図5Aの組換え株は、pTrlogl-kdgR + pBBRGal3Pを有する大腸菌BL21（DE3）株であり、及び対照株は、実施例2に記載されているように、pTrc99A + pBBR1MCS-2を有するBL21（DE3）株である。図5Bは、3〜4日後のペクチンでの組換え大腸菌の成長を示す。図5Bの組換え株は、実施例2に記載されているように、pPEL74（対照）、及びpPEL74、及びpROU2を含む大腸菌DH5a株である。
【００１０】
【図６】ピルベートを形成するためのアルギナートの分解を示す。図6Aは、アルギナートの分解、及び代謝に関する簡略代謝経路を図示する。図6Bは、酵素的分解経路によってピルベートを形成するためのアルギナートのインビトロでの分解の結果を示す。図6Cは、化学分解経路によってピルベートを形成するためのアルギナートのインビトロでの分解の結果を示す。
【図７】アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58から単離された種々のアルコールデヒドロゲナーゼの生物活性を示す。図7Aは、NADPH消費によってモニターしたDEHUヒドロゲナーゼ活性を示し、及び図7Bは、NADPH消費によってモニターしたマンヌロナートヒドロゲナーゼ活性を示す。
【図８】対照試料について（図8A）、並びにpBADalsS-ilvCD-leuABCD2、及びpTrcBALK（図8B）からのイソブチルアルデヒド、3-メチルペンタノール、及び2-メチルペンタナール産生についてのGC-MSクロマトグラム結果を示す。
【図９】対照試料について（図9A）、並びにpBADtyrA-aroLAC-aroG-tktA-aroBDE、及びpTrcBALK（図9B）からの4-ヒドロキシフェニルエタノール、及びインドール-3-エタノール産生についてのGC-MSクロマトグラム結果を示す。
【図１０】イソブタナール（図10A）、3-メチルペンタノール（図10B）、及び2-メチルペンタノール（図10C）についての質量分析結果を示す。
【００１１】
【図１１】フェニルエタノール（図11A）、4-ヒドロキシフェニルエタノール（図11B）、及びインドール-3-エタノール（図11C）についての質量分析結果を示す。
【図１２】ジオールデヒドラターゼの生物活性を示す。図12Aは、NADH消費によってモニターしたddh1、ddh2、及びddh3によるブチロインの還元を示す。図12Bは、NADH産生によって測定したddh3の1,2-シクロペンタンジオール、及び1,2-シクロヘキサンジオールへの酸化活性を示す。
【図１３】DDHポリペプチドによって触媒される酸化反応における種々の基質についての動力学的研究の結果を要約する。これらの反応は、NAD+依存的であった。
【図１４】ラクトバチルス・ブレビス（Lactobaccilus brevis）ATCC 367から単離されたジオールデヒドロゲナーゼDDH1のヌクレオチド配列（図14A）（配列番号：97）、及びポリペプチド配列（図14B）（配列番号：98）を示す。
【図１５】プチダ菌（Pseudomonas putida）KT2440から単離されたジオールデヒドロゲナーゼDDH2のヌクレオチド配列（図15A）（配列番号：99）、及びポリペプチド配列（図15B）（配列番号：100）を示す。
【００１２】
【図１６】肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）MGH78578から単離されたジオールデヒドロゲナーゼDDH3のヌクレオチド配列（図16A）（配列番号：101）、及びポリペプチド配列（図16B）（配列番号：102）を示す。
【図１７】蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）から単離されたベンズアルデヒドリアーゼ（bal）遺伝子（コドン選択性は、大腸菌タンパク質発現のために最適化させた）、及び肺炎桿菌亜種フェウモニエ（Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae）MGH 78578から単離されたddh遺伝子（DDH3）の連続的なインビボの生物活性を示す。この反応は、ブタナールの5-ヒドロキシ-4-オクタノン、及び次いで4,5-オクタノンジオールへの連続的な変換を図示する。図17Aは、5.36分におけるブチロイン（5-ヒドロキシ-4-オクタノン）の検出を示し、図17Bは、6.49、及び6.65分における4,5-オクタンジオールの検出を示す。
【図１８】蛍光菌から単離されたベンズアルデヒドリアーゼ（bal）遺伝子（コドン選択性は、大腸菌タンパク質発現のために最適化させた）、及び肺炎桿菌亜種フェウモニエMGH 78578から単離されたddh遺伝子（DDH3）の連続的なインビボの生物活性を示す。この図は、n-ペンタナールの6-ヒドロキシ-5-デカノン、及び次いで5,6-デカンジオールへの連続的な変換を図示する。図18Aは、8.22分におけるバレロイン（6-ヒドロキシ-5-デカノン）の検出を示し、図18Bは、9.22、及び9.35分における5,6-デカンジオールの検出を示す。
【図１９】蛍光菌から単離されたベンズアルデヒドリアーゼ（bal）遺伝子（コドン選択性は、大腸菌タンパク質発現のために最適化させた）、及び肺炎桿菌亜種フェウモニエMGH 78578から単離されたddh遺伝子（DDH3）の連続的なインビボの生物活性を示す。この図は3-メチルブタナールの、2,7-ジメチル-5-ヒドロキシ-4-オクタノン、及び次いで2,7-ジメチル-4,5-オクタンジオールへの連続的な変換を図示する。図19Aは、6.79分におけるイソベラロイン（2,7-ジメチル-5-ヒドロキシ-4-オクタノン）の検出を示し、図19Bは、7.95、及び8.15分における2,7-ジメチル-4,5-オクタンジオールの検出を示す。
【図２０】蛍光菌から単離されたベンズアルデヒドリアーゼ（bal）遺伝子（コドン選択性は、大腸菌タンパク質発現のために最適化させた）、及び肺炎桿菌亜種フェウモニエMGH 78578から単離されたddh遺伝子（DDH3）の連続的なインビボの生物活性を示す。この図は、n-ヘキサナールの7-ヒドロキシ-6-ドデカノン、及び次いで6,7-ドデカンジオールへの連続的な変換を図示する。図20Aは、10.42分におけるヘキサノイン（7-ヒドロキシ-6-デカノン）の検出を示し、図20Bは、10.89、及び10.95分における6,7 ドデカンジオールの検出を示す。
【００１３】
【図２１】蛍光菌から単離されたベンズアルデヒドリアーゼ（bal）遺伝子（コドン選択性は、大腸菌タンパク質発現のために最適化させた）、及び肺炎桿菌亜種フェウモニエMGH 78578から単離されたddh遺伝子（DDH3）の連続的なインビボの生物活性を示す。この図は、4-メチルペンタナールの2,9-ジメチル-6-ヒドロキシ-5-デカノン、及び次いで2,9-ジメチル-5,6-デカンジオールへの連続的な変換を図示する。図21Aは、9.45分におけるイソヘキサノイン（2,9-ジメチル-6-ヒドロキシ-5-デカノン）の検出を示し、図21Bは、10.38、及び10.44分における2,9-ジメチル-5,6-デカンジオールの検出を示す。
【図２２】蛍光菌から単離されたベンズアルデヒドリアーゼ（bal）遺伝子（コドン選択性は、大腸菌タンパク質発現のために最適化させた）、及び肺炎桿菌亜種フェウモニエMGH 78578から単離されたddh遺伝子（DDH3）のインビボの生物活性を示す。この図は、12.35分におけるオクタノイン（9-ヒドロキシ-8-ヘキサデカノン）の検出の検出を示すことによって、n-オクタナールの9-ヒドロキシ-8-ヘキサデカノンへの変換を図示する。
【図２３】蛍光菌から単離されたベンズアルデヒドリアーゼ（bal）遺伝子（コドン選択性は、大腸菌タンパク質発現のために最適化させた）、及び肺炎桿菌亜種フェウモニエMGH 78578から単離されたddh遺伝子（DDH3）のインビボの生物活性を示す。この図は、rt=0.91分におけるアセトイン（3-ヒドロキシ-2-ブタノン）の検出を示すことによって、アセトアルデヒドの3-ヒドロキシ-2-ブタノンへの変換を図示する。
【図２４】蛍光菌から単離されたベンズアルデヒドリアーゼ（bal）遺伝子（コドン選択性は、大腸菌タンパク質発現のために最適化させた）、及び肺炎桿菌亜種フェウモニエMGH 78578から単離されたddh遺伝子（DDH3）の連続的なインビボの生物活性を示す。この図は、n-プロパナールの4-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、及び次いで3,4-ヘキサンジオールへの連続的な変換を図示する。図24Aは、rt=2.62分におけるプロピオイン（4-ヒドロキシ-3-ヘキサノン）の検出を示し、図24Bは、rt=3.79分における3,4-ヘキサンジオールの検出を示す。
【図２５】蛍光菌から単離されたベンズアルデヒドリアーゼ（bal）遺伝子（コドン選択性は、大腸菌タンパク質発現のために最適化させた）、及び肺炎桿菌亜種フェウモニエMGH 78578から単離されたddh遺伝子（DDH3）のインビボの生物活性。この図は、rt=13.66分における1,4-ジフェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノンの検出を示すことによって、フェニルアセトアルデヒドの1,4-ジフェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノンへの変換を図示する。
【００１４】
【図２６】肺炎桿菌MGH 78578からのジオールデヒドロゲナーゼddh（DDH3）、及び肺炎桿菌MGH 78578からのジオールデヒドラターゼpduCDEの連続的な生物学的活性を示す。図26Aは、試料抽出における、ddh3によるブチロインの還元により生じる予想産物である4,5-オクタンジオールの存在を確認するGC-MSデータを示す。図26Bは、試料抽出における、それぞれddh3、及びpduCDEによる、連続的なブチロインの脱水素、及び4,5-オクタンジオールの脱水により生じる予想産物である4-オクタノンの存在を確認するGC-MSデータを示す。
【図２７】肺炎桿菌MGH 78578からのジオールデヒドロゲナーゼddh（DDH3）、及び肺炎桿菌MGH 78578からのジオールデヒドラターゼpduCDEの連続的な生物学的活性を示す。図27A、及び27Bは、試料抽出ガスクロマトグラフ／質量スペクトル、及び4-オクタノン標準ガスクロマトグラフ／質量スペクトルとの間の比較を示し、4-オクタノンが酵素ジオールデヒドロゲナーゼ（ddh3）、及びジオールデヒドラターゼ（pduCDE）を使用してブチロインから産生されたことを確認する。
【図２８】肺炎桿菌MGH78578から単離されたジオールデヒドラターゼ大サブユニット（pduC）のヌクレオチド配列（図28A）（配列番号：103）、及びポリペプチド配列（図28B）（配列番号：104）を示す。
【図２９】肺炎桿菌MGH78578から単離されたジオールデヒドラターゼ中間サブユニット（pduD）のヌクレオチド配列（図29A）（配列番号：105）、及びポリペプチド配列（図29B）（配列番号：106）を、肺炎桿菌MGH78578から単離されたジオールデヒドラターゼ小サブユニット（pduE）のヌクレオチド配列（図29C）（配列番号：107）、及びポリペプチド配列（図29D）（配列番号：108）に加えて、示す。
【図３０】NADH産生（図30A）、及びNADPH産生（図30B）によってモニターした二級アルコールデヒドロゲナーゼによる4-オクタノールの酸化を示す。
【００１５】
【図３１】NADH産生（図31A）、及びNADPH産生（図31B）によってモニターした二級アルコールデヒドロゲナーゼによる4-オクタノールの酸化を示す。
【図３２】NADH産生（図32A）、及びNADPH産生（図32B）によってモニターした二級アルコールデヒドロゲナーゼによる2,7-ジメチルオクタノールの酸化を示す。
【図３３】2ADH11、及び2ADH16の酸化、並びに還元活性を示す。図33Aは、NADPH消費によって測定した2,7-ジメチル-4-オクタノンの還元を示す。図33Bは、2,7-ジメチル-4-オクタノン、4-オクタノン、及びシクロペンタノンの還元を示す。
【図３４】二級アルコールデヒドロゲナーゼによるシクロペンタノールの酸化、及び還元を示す。図34Aは、NADH、又はNADPH形成によってモニターしたシクロペンタノールの酸化を示す。図34Bは、NADPH消費によってモニターしたシクロペンタノールの還元を示す。
【図３５】二級アルコールデヒドロゲナーゼADH-16によって触媒されるそれぞれの基質（配列番号：138）について、図示された還元反応について算出された速度定数を示す。
【００１６】
【図３６】二級アルコールデヒドロゲナーゼADH-16によって触媒されるそれぞれの基質（配列番号：138）について、図示された酸化反応について算出された速度定数を示す。
【図３７】本明細書に記述した方法、及び組換え微生物に従って利用されるであろうアルギナートリアーゼ遺伝子／タンパク質の一覧を示す。
【図３８】本明細書に記述した方法、及び組換え微生物に従って利用されるであろうペクタートリアーゼ遺伝子／タンパク質の一覧を示す。
【図３９】図39Aは、本明細書に記述した方法、及び組換え微生物に従って利用されるであろうラムノガラクツロナンリアーゼ遺伝子／タンパク質の一覧を示す。図39Bは、本明細書に記した方法、及び組換え微生物に従って利用されるであろうラムノガラクツロナートヒドロラーゼ遺伝子／タンパク質の一覧を示す。
【図４０】本明細書に記述した方法、及び組換え微生物に従って利用されるであろうペクチンメチルエステラーゼ遺伝子／タンパク質の一覧を示す。
【００１７】
【図４１】本明細書に記述した方法、及び組換え微生物に従って利用されるであろうペクチンアセチルエステラーゼ遺伝子／タンパク質の一覧を示す。
【図４２】機能的2-フェニルエタノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、及び2-(インドール-3-）エタノール生合成経路を含む実施例4に記述した組換え微生物からの、24時間における2-フェニルエタノール（図42A）、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール（図42B）、及び2-(インドール-3-）エタノール（図42C）の産生を示す。
【図４３】実施例4に記述した組換え微生物（pBADpheA-aroLAC-aroG-tktA-aroBDE、及びpTrcBALK）からの1週における2-フェニルエタノール（図43B）の産生を確認するGC-MSクロマトグラム結果を示す。図43Aは、負の対照細胞（pBAD33、及びpTrc99A）を示す。
【図４４】実施例4に記述した組換え微生物（pBADtyrA-aroLAC-aroG-tktA-aroBDE、及びpTrcBALK）からの1週における2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール（9.36分）、及び2-(インドール-3）エタノール（10.32分）の産生を確認するGC-MSクロマトグラム結果を示す。
【図４５】1,2-プロパンジオールからの1-プロパナールの形成（図45A）、及びメソ2,3-ブタンジオールからの2-ブタノンの形成（図45B）の両方を確認し、これらは両方とも、実施例9に記載されているように単離されたB12非依存的ジオールデヒドラターゼによってインビトロで触媒された。
【００１８】
【図４６】図46Aは、1,2-プロパンジオールからの1-プロパノールのインビボでの産生を示す。図46Bは、メソ-2,3ブタンジオールからの2-ブタノールのインビボでの産生を示す。図46Cは、トランス-1,2-シクロペンタンジオールからのシクロペンタノンのインビボでの産生を示す。これらの実験は、実施例9に記載されているように行った。
【図４７】実施例10において行ったTBAアッセイの結果を示す。図47の左のチューブは、アルギナートリアーゼの分泌を示す、Vs24254を発現する細胞のオーバーナイト培養物から摂取した培地を表し、一方、右手のチューブは、Vs24259を発現する細胞から培地を使用するTBA反応を示す（負の対照）。負の対照におけるピンクの呈色の欠如は、アルギナート重合体の切断がほとんど、又は全く生じなかったことを示す。
【図４８】蛍光菌から単離され、大腸菌にクローン化したC-Cリガーゼのインビボでの生物活性を示す。GC-MSクロマトグラムの結果は、コドン最適化したベンズアルデヒドリアーゼ（BAL）がアセトアルデヒドとプロピオンアルデヒドとの間の結合反応による3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、及び2-ヒドロキシ-3-ペンタノンのインビボでの産生を触媒したこと（図48A）、並びにプロピオンアルデヒドとブチルアルデヒドとの間の結合反応により4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、及び3-ヒドロキシ-４‐ヘプタノンのインビボでの産生を触媒したこと（図48B）を示す。
【図４９】蛍光菌から単離され、大腸菌にクローン化したC-Cリガーゼのインビボでの生物活性を示す。GC-MSクロマトグラムの結果は、コドン最適化したBALがアセトアルデヒドとペンタナールとの間の結合反応により3-ヒドロキシ-2-ヘプタノンのインビボでの産生を触媒したこと（図49A）、並びにペンタナールとプロピオンアルデヒドとの間の結合反応により4-ヒドロキシ-3-オクタノン、及び3-ヒドロキシ-4-オクタノンのインビボでの産生を触媒したこと（図49B）を示す。
【図５０】蛍光菌から単離され、大腸菌にクローン化したC-Cリガーゼのインビボでの生物活性を示す。GC-MSクロマトグラムの結果は、コドン最適化したBALがブチルアルデヒドとペンタナールとの間と結合反応により5-ヒドロキシ-4-ノナノンのインビボでの産生を触媒したこと（図50A）、並びにヘキサナールと3-メチルブチルアルデヒドとの間の結合反応により2-メチル-5-ヒドロキシ-4-デカノン、及び2-メチル-4-ヒドロキシ-5-デカノンのインビボの産生を触媒したこと（図50B）を示す。
【００１９】
【図５１】蛍光菌から単離され、大腸菌にクローン化したC-Cリガーゼのインビボの生物活性を示す。GC-MSクロマトグラムの結果は、コドン最適化したBALがアセトアルデヒドと4-メチルヘキサナールとの間の結合反応により6-メチル-3-ヒドロキシ-2-ヘプタノンのインビボでの産生を触媒したこと（図51A）、並びに4-メチルヘキサナールとプロピオンアルデヒドとの間の結合反応により7-メチル-4-ヒドロキシ-3-オクタノンのインビボでの産生を触媒したこと（図51B）を示す。
【図５２】蛍光菌から単離され、大腸菌にクローン化したC-Cリガーゼのインビボの生物活性を示す。GC-MSクロマトグラムの結果は、コドン最適化したBALが4-メチルヘキサナールとブチルアルデヒドとの間の結合反応により8-メチル-5-ヒドロキシ-4-ノナノンのインビボでの産生を触媒したこと（図52A）、並びにアセトアルデヒドとオクタナールとの間の結合反応により3-ヒドロキシ-2-デカノンのインビボの産生を触媒したこと（図52B）を示す。
【図５３】蛍光菌から単離され、大腸菌にクローン化したC-Cリガーゼのインビボの生物活性を示す。GC-MSクロマトグラムの結果は、コドン最適化したBALがオクタナールとプロピオンアルデヒドとの間と結合反応により4-ヒドロキシ-3-ウンデカノンのインビボでの産生を触媒したこと（図53A）、並びにオクタナールとブチルアルデヒドとの間の結合反応により5-ヒドロキシ-4-ドデカノンのインビボでの産生を触媒したこと（図53B）を示す。
【図５４】蛍光菌から単離され、大腸菌にクローン化したC-Cリガーゼのインビボの生物活性を示す。GC-MSクロマトグラムの結果は、コドン最適化したBALがオクタナールとペンタナールとの間と結合反応により6-ヒドロキシ-5-トリデカンのインビボでの産生を触媒したこと（図54A）、並びにオクタナールと3-メチルブチルアルデヒドとの間の結合反応により2-メチル-5-ヒドロキシ-4-ドデカノン、及び2-メチル-4-ヒドロキシ-5-デカノンのインビボでの産生を触媒したこと（図54B）を示す。
【図５５】蛍光菌から単離され、大腸菌にクローン化したC-Cリガーゼのインビボの生物活性を示す。GC-MSクロマトグラムの結果は、コドン最適化したBALがオクタナールと4-メチルペンタナールとの間の結合反応により2-メチル-6-ヒドロキシ-5-トリデカンのインビボでの産生を触媒したことを示す。
【００２０】
【図５６】実施例10に記載されているように、唯一の炭素源としてのアルギナートでの組換えEK大腸菌の成長を示す（図56A）。グルコースでの成長（図56B）は、正の対照を提供する。細胞は、いずれのプラスミドもなし（BL21-負の対照）、一方のプラスミド（例えば、Da、又は3a）、又は2つのプラスミド（例えば、Dk3a、及びDa3k）で形質転換した。プラスミドは、小文字によって示してあり：「a」は、pET-DEST42プラスミドバックボーンを指し、「k」は、pENTR／D／TOPOバックボーンを指す。「D」は、プラスミドがゲノム領域Vs24214-24249を含むことを示し、一方、「3」は、プラスミドがゲノム領域Vs24189-24209を含むことを示す。従って、Daは、pET-DEST42-Vs24214-24249であろうし、Da3kは、pET-DEST42-Vs24214-24249、及びpENTR／D／TOPO-Vs24189-24209その他であろう。これらの結果は、ゲノム領域Vs24214-24249、及びVs24189-24209の組み合わせが、唯一の炭素源としてアルギナートで成長する能力を大腸菌に対して与えるのに十分であることを示す。
【図５７】実施例11において行ったとおり、アルギナートでの大腸菌成長によるエタノールの産生を示す。大腸菌は、pBBRPdc-AdhA/B、又はpBBRPdc-AdhA/B+1.5 FOSのいずれかで形質転換され、アルギナートを含むm9培地において成長させた。
【発明の概要】
【００２１】
（概要）
本発明の実施態様は、多糖体をコモディティケミカルに変換するための方法であって、（a）任意にバイオマスに由来する多糖体を多糖体分解又は脱重合代謝系と接触させることであって、該代謝系が（i）酵素的、又は、化学的触媒、及び（ii）微生物系であって、該微生物系が、組換え微生物を含み、該組換え微生物が、それが唯一の炭素源としての多糖体上で成長することができる1つの又は複数の外来性遺伝子を含む前記微生物系；から選択され、これにより多糖体を適切な単糖、又はオリゴ糖に変換すること；並びに（b）適切な単糖、又はオリゴ糖をコモディティケミカル生合成経路と接触させることであって、該コモディティケミカル生合成経路がアルデヒド、又はケトン生合成経路を含み、これにより多糖体をコモディティケミカルに変換することを含む、前記方法を含む。
【００２２】
特定の態様において、バイオマスは、海洋バイオマス、及び野菜／果実／植物バイオマスから選択される。特定の態様において、海洋バイオマスは、ケルプ、ジャイアントケルプ、ホンダワラ、海藻、藻類、海洋ミクロフローラ、微細藻類、及び海草から選択される。特定の態様において、野菜／果実／植物バイオマスは、植物果皮、又は絞り滓を含む。特定の態様において、野菜／果実／植物バイオマスは、柑橘類、ジャガイモ、トマト、ブドウ、グズベリー、ニンジン、マンゴー、サトウダイコン、リンゴ、スイッチグラス、木、及び飼い葉から選択される。
【００２３】
特定の態様において、多糖体は、アルギナート、寒天、カラゲナン、フコイダン、ペクチン、ポリガラクツロナート、セルロース、ヘミセルロース、キシラン、アラビナン、及びマンナンから選択される。特定の態様において、適切な単糖、又はオリゴ糖は、2-ケト-3-デオキシD-グルコナート（KDG）、D-マンニトール、グルロナート、マンヌロナート、マンニトール、リキソース、グリセロール、キシリトール、グルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、グルクロナート、ガラクツロナート、及びラムノースから選択される。
【００２４】
特定の態様において、コモディティケミカルは、以下から選択される：メタン、メタノール、エタン、エテン、エタノール、n-プロパン、1-プロペン、1-プロパノール、プロパナール、アセトン、プロピオナート、n-ブタン、1-ブテン、1‐ブタノール、ブタナール、ブタノエート、イソブタナール、イソブタノール、2-メチルブタナール、2-メチルブタノール、3-メチルブタナール、3-メチルブタノール、2-ブテン、2-ブタノール、2-ブタノン、2,3-ブタンジオール、3-ヒドロキシ-2-ブタノン、2,3-ブタンジオン、エチルベンゼン、エテニルベンゼン、2-フェニルエタノール、フェニルアセトアルデヒド、1-フェニルブタン、4-フェニル-1-ブテン、4-フェニル-2-ブテン、1-フェニル-2-ブテン、1-フェニル-2-ブタノール、4-フェニル-2-ブタノール、1-フェニル-2-ブタノン、4-フェニル-2-ブタノン、1-フェニル-2,3-ブタンジオール、1-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、4-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、1-フェニル-2,3-ブタンジオン、n-ペンタン、エチルフェノール、エテニルフェノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、1-(4-ヒドロキシフェニル)ブタン、4-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ブテン、4-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ブテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノール、4-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノン、4-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、4-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタノンジオン、インドリルエタン、インドリルエテン、2-(インドール-3-）エタノール、n-ペンタン、1-ペンテン、1-ペンタノール、ペンタナール、ペンタノアート、2-ペンテン、2-ペンタノール、3-ペンタノール、2-ペンタノン、3-ペンタノン、4-メチルペンタナール、4-メチルペンタノール、2,3-ペンタンジオール、2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、2,3-ペンタンジオン、2-メチルペンタン、4-メチル-1-ペンテン、4-メチル-2-ペンテン、4-メチル-3-ペンテン、4-メチル-2-ペンタノール、2-メチル-3-ペンタノール、4-メチル-2-ペンタノン、2-メチル-3-ペンタノン、4-メチル-2,3-ペンタンジオール、4-メチル-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、4-メチル-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、4-メチル-2,3-ペンタンジオン、1-フェニルペンタン、1-フェニル-1-ペンテン、1-フェニル-2-ペンテン、1-フェニル-3-ペンテン、1-フェニル-2-ペンタノール、1-フェニル-3-ペンタノール、1-フェニル-2-ペンタノン、1-フェニル-3-ペンタノン、1-フェニル-2,3-ペンタンジオール、1-フェニル-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、1-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、1-フェニル-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-フェニルペンタン、4-メチル-1-フェニル-1-ペンテン、4-メチル-1-フェニル-2-ペンテン、4-メチル-1-フェニル-3-ペンテン、4-メチル-1-フェニル-3-ペンタノール、4-メチル-1-フェニル-2-ペンタノール、4-メチル-1-フェニル-3-ペンタノン、4-メチル-1-フェニル-2-ペンタノン、4-メチル-1-フェニル-2,3-ペンタンジオール、4-メチル-1-フェニル-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、4-メチル-1-フェニル-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、1-(4-ヒドロキ���フェニル)ペンタン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ペンテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンタノール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンタノール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ペンタンジオール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)ペンタン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンテン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンテン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ペンテン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンタノール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンタノール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンタノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンタノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ペンタンジオール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、1-インドール-3-ペンタン、1-(インドール-3)-1-ペンテン、1-(インドール-3)-2-ペンテン、1-(インドール-3)-3-ペンテン、1-(インドール-3)-2-ペンタノール、1-(インドール-3)-3-ペンタノール、1-(インドール-3)-2-ペンタノン、1-(インドール-3)-3-ペンタノン、1-(インドール-3)-2,3-ペンタンジオール、1-(インドール-3)-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、1-(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、1-(インドール-3)-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-(インドール-3-）ペンタン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ペンテン、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ペンテン、4-メチル-1-(インドール-3)-1-ペンテン、4-メチル-2-(インドール-3)-3-ペンタノール、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ペンタノール、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ペンタノン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ペンタノン、4-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ペンタンジオール、4-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、n-ヘキサン、1-ヘキセン、1‐ヘキサノール、ヘキサナール、ヘキサノアート、2-ヘキセン、3-ヘキセン、2-ヘキサノール、3-ヘキサノール、2-ヘキサノン、3-ヘキサノン、2,3-ヘキサンジオール、2,3-ヘキサンジオン、3,4-ヘキサンジオール、3,4-ヘキサンジオン、2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、3-ヒドロキシ-4-ヘキサノン、4-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、2-メチルヘキサン、3-メチルヘキサン、2-メチル-2-ヘキセン、2-メチル-3-ヘキセン、5-メチル-1-ヘキセン、5-メチル-2-ヘキセン、4-メチル-1-ヘキセン、4-メチル-2-ヘキセン、3-メチル-3-ヘキセン、3-メチル-2-ヘキセン、3-メチル-1-ヘキセン、2-メチル-3-ヘキサノール、5-メチル-2-ヘキサノール、5-メチル-3-ヘキサノール、2-メチル-3-ヘキサノン、5-メチル-2-ヘキサノン、5-メチル-3-ヘキサノン、2-メチル-3,4-ヘキサンジオール、2-メチル-3,4-ヘキサンジオン、5-メチル-2,3-ヘキサンジオール、5-メチル-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-2,3-ヘキサンジオール、4-メチル-2,3-ヘキサンジオン、2-メチル-3-ヒドロキシ-4-ヘキサノン、2-メチル-4-ヒドロキ��-3-ヘキサノン、5-メチル-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、5-メチル-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、4-メチル-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、4-メチル-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、2,5-ジメチルヘキサン、2,5-ジメチル-2-ヘキセン、2,5-ジメチル-3-ヘキセン、2,5-ジメチル-3-ヘキサノール、2,5-ジメチル-3-ヘキサノン、2,5-ジメチル-3,4-ヘキサンジオール、2,5-ジメチル-3,4-ヘキサンジオン、2,5-ジメチル-3-ヒドロキシ-4-ヘキサノン、5-メチル-1-フェニルヘキサン、4-メチル-1-フェニルヘキサン、5-メチル-1-フェニル-1-ヘキセン、5-メチル-1-フェニル-2-ヘキセン、5-メチル-1-フェニル-3-ヘキセン、4-メチル-1-フェニル-1-ヘキセン、4-メチル-1-フェニル-2-ヘキセン、4-メチル-1-フェニル-3-ヘキセン、5-メチル-1-フェニル-2-ヘキサノール、5-メチル-1-フェニル-3-ヘキサノール、4-メチル-1-フェニル-2-ヘキサノール、4-メチル-1-フェニル-3-ヘキサノール、5-メチル-1-フェニル-2-ヘキサノン、5-メチル-1-フェニル-3-ヘキサノン、4-メチル-1-フェニル-2-ヘキサノン、4-メチル-1-フェニル-3-ヘキサノン、5-メチル-1-フェニル-2,3-ヘキサンジオール、4-メチル-1-フェニル-2,3-ヘキサンジオール、5-メチル-1-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、5-メチル-1-フェニル-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、4-メチル-1-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、4-メチル-1-フェニル-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、5-メチル-1-フェニル-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-1-フェニル-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)ヘキサン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ヘキセン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキセン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキセン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ヘキセン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキセン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキセン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキサノール、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキサノール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキサノール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキサノール、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキサノン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキサノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキサノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキサノン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘキサンジオール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘキサンジオール、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-1-(インドール-3-)ヘキサン、5-メチル-1-(インドール-3)-1-ヘキセン、5-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキセン、5-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキセン、4-メチル-1-(インドール-3)-1-ヘキセン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキセン、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキセン、5-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキサノール、5-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキサノール、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキサノール、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキサノール、5-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキサノン、5-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキサノン、4-メチル-1-(イン���ール-3)-2-ヘキサノン、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキサノン、5-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ヘキサンジオール、4-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ヘキサンジオール、5-メチル-1-(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、5-メチル-1-(インドール-3)-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、5-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ヘキサンジオン、n-ヘプタン、1-ヘプテン、1-ヘプタノール、ヘプタナール、ヘプタノエート、2-ヘプテン、3-ヘプテン、2-ヘプタノール、3-ヘプタノール、4-ヘプタノール、2-ヘプタノン、3-ヘプタノン、4-ヘプタノン、2,3-ヘプタンジオール、2,3-ヘプタンジオン、3,4-ヘプタンジオール、3,4-ヘプタンジオン、2-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、3-ヒドロキシ-2-ヘプタノン、3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、2-メチルヘプタン、3-メチルヘプタン、6-メチル-2-ヘプテン、6-メチル-3-ヘプテン、2-メチル-3-ヘプテン、2-メチル-2-ヘプテン、5-メチル-2-ヘプテン、5-メチル-3-ヘプテン、3-メチル-3-ヘプテン、
2-メチル-3-ヘプタノール、2-メチル-4-ヘプタノール、6-メチル-3-ヘプタノール、5-メチル-3-ヘプタノール、3-メチル-4-ヘプタノール、2-メチル-3-ヘプタノン、2-メチル-4-ヘプタノン、6-メチル-3-ヘプタノン、5-メチル-3-ヘプタノン、3-メチル-4-ヘプタノン、2-メチル-3,4-ヘプタンジオール、2-メチル-3,4-ヘプタンジオン、6-メチル-3,4-ヘプタンジオール、6-メチル-3,4-ヘプタンジオン、5-メチル-3,4-ヘプタンジオール、5-メチル-3,4-ヘプタンジオン、2-メチル-3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、2-メチル-4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、6-メチル-3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、6-メチル-4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、5-メチル-3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、5-メチル-4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、2,6-ジメチルヘプタン、2,5-ジメチルヘプタン、2,6-ジメチル-2-ヘプテン、2,6-ジメチル-3-ヘプテン、2,5-ジメチル-2-ヘプテン、2,5-ジメチル-3-ヘプテン、3,6-ジメチル-3-ヘプテン、2,6-ジメチル-3-ヘプタノール、2,6-ジメチル-4-ヘプタノール、2,5-ジメチル-3-ヘプタノール、2,5-ジメチル-4-ヘプタノール、2,6-ジメチル-3,4-ヘプタンジオール、2,6-ジメチル-3,4-ヘプタンジオン、2,5-ジメチル-3,4-ヘプタンジオール、2,5-ジメチル-3,4-ヘプタンジオン、2,6-ジメチル-3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、2,6-ジメチル-4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、2,5-ジメチル-3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、2,5-ジメチル-4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、n-オクタン、1-オクテン、2-オクテン、1-オクタノール、オクタナール、オクタノアート、3-オクテン、4-オクテン、4-オクタノール、4-オクタノン、4,5-オクタンジオール、4,5-オクタンジオン、4-ヒドロキシ-5-オクタノン、2-メチルオクタン、2-メチル-3-オクテン、2-メチル-4-オクテン、7-メチル-3-オクテン、3-メチル-3-オクテン、3-メチル-4-オクテン、6-メチル-3-オクテン、2-メチル-4-オクタノール、7-メチル-4-オクタノール、3-メチル-4-オクタノール、6-メチル-4-オクタノール、2-メチル-4-オクタノン、7-メチル-4-オクタノン、3-メチル-4-オクタノン、6-メチル-4-オクタノン、2-メチル-4,5-オクタンジオール、2-メチル-4,5-オクタンジオン、3-メチル-4,5-オクタンジオール、3-メチル-4,5-オクタンジオン、2-メチル-4-ヒドロキシ-5-オクタノン、2-メチル-5-ヒドロキシ-4-オクタノン、3-メチル-4-ヒドロキシ-5-オクタノン、3-メチル-5-ヒドロキシ-4-オクタノン、2,7-ジメチルオクタン、2,7-ジメチル-3-オクテン、2,7-ジメチル-4-オクテン、2,7-ジメチル-4-オクタノール、2,7-ジメチル-4-オクタノン、2,7-ジメチル-4,5-オクタンジオール、2,7-ジメチル-4,5-オクタンジオン、2,7-ジメチル-4-ヒドロキシ-5-オクタノン、2,6-ジメチルオクタン、2,6-ジメチル-3-オクテン、2,6-ジメチル-4-オクテン、3,7-ジメチル-3-オクテン、2,6-ジメチル-4-オクタノール、3,7-ジメチル-4-オクタノール、2,6-ジメチル-4-オクタノン、3,7-ジメチル-4-オクタノン、2,6-ジメチル-4,5-オクタンジオール、2,6-ジメチル-4,5-オクタンジオン、2,6-ジメチル-4-ヒドロキシ-5-オクタノン、2,6-ジメチル-5-ヒドロキシ-4-オクタノン、3,6-ジメチルオクタン、3,6-ジメチル-3-オクテン、3,6-ジメチル-4-オクテン、3,6-ジメチル-4-オクタノール、3,6-ジメチル-4-オクタノン、3,6-ジメチル-4,5-オクタンジオール、3,6-ジメチル-4,5-オクタンジオン、3,6-ジメチル-4-ヒドロキシ-5-オクタノン、n-ノナン、1-ノネン、1‐ノナノール、ノナナール、ノナノアート、2-メチルノナン、2-メチル-4-ノネン、2-メチ��-5-ノネン、8-メチル-4-ノネン、2-メチル-5-ノナノール、8-メチル-4-ノナノール、2-メチル-5-ノナノン、8-メチル-4-ノナノン、8-メチル-4,5-ノナンジオール、8-メチル-4,5-ノナンジオン、8-メチル-4-ヒドロキシ-5-ノナノン、8-メチル-5-ヒドロキシ-4-ノナノン、2,8-ジメチルノナン、2,8-ジメチル-3-ノネン、2,8-ジメチル-4-ノネン、2,8-ジメチル-5-ノネン、2,8-ジメチル-4-ノナノール、2,8-ジメチル-5-ノナノール、2,8-ジメチル-4-ノナノン、2,8-ジメチル-5-ノナノン、2,8-ジメチル-4,5-ノナンジオール、2,8-ジメチル-4,5-ノナンジオン、2,8-ジメチル-4-ヒドロキシ-5-ノナノン、2,8-ジメチル-5-ヒドロキシ-4-ノナノン、2,7-ジメチルノナン、3,8-ジメチル-3-ノネン、3,8-ジメチル-4-ノネン、3,8-ジメチル-5-ノネン、3,8-ジメチル-4-ノナノール、3,8-ジメチル-5-ノナノール、3,8-ジメチル-4-ノナノン、3,8-ジメチル-5-ノナノン、3,8-ジメチル-4,5-ノナンジオール、3,8-ジメチル-4,5-ノナンジオン、3,8-ジメチル-4-ヒドロキシ-5-ノナノン、3,8-ジメチル-5-ヒドロキシ-4-ノナノン、n-デカン、1-デセン、1-デカノール、デカノアート、2,9-ジメチルデカン、2,9-ジメチル-3-デセン、2,9-ジメチル-4-デセン、2,9-ジメチル-5-デカノール、2,9-ジメチル-5-デカノン、2,9-ジメチル-5,6-デカンジオール、2,9-ジメチル-6-ヒドロキシ-5-デカノン、2,9-ジメチル-5,6-デカンジオネン-ウンデカン、1-ウンデセン、1-ウンデカノール、ウンデカナール、ウンデカノアート、n-ドデカン、1-ドデセン、1-ドデカノール、ドデカナール、ドデカノアート、n-ドデカン、1-デカデセン、1-ドデカノール、ドデカナール（ddodecanal）、ドデカノアート、n-トリデカン、1-トリデセン、1-トリデカノール、トリデカナール、トリデカノアート、n-テトラデカン、1-テトラデセン、1‐テトラデカノール、テトラデカナール、テトラデカノアート、n-ペンタデカン、1-ペンタデセン、1-ペンタデカノール、ペンタデカナール、ペンタデカノアート、n-ヘキサデカン、1-ヘキサデセン、1-ヘキサデカノール、ヘキサデカナール、ヘキサデカノアート、n-ヘプタデカン、1-ヘプタデセン、1-ヘプタデカノール、ヘプタデカナール、ヘプタデカノアート、n-オクタデカン、1-オクタデセン、1-オクタデカノール、オクタデカナール、オクタデカノアート、n-ノナデカン、1-ノナデセン、1-ノナデカノール、ノナデカナール、ノナデカノアート、エイコサン、1-エイコセン、1-エイコサノール、エイコサナール、エイコサノアート、3-ヒドロキシプロパナール、1,3-プロパンジオール、4-ヒドロキシブタナール、1,4-ブタンジオール、3-ヒドロキシ-2-ブタノン、2,3-ブタンジオール、1,5-ペンタンジオール、ホモシトラート、ホモイソシトラート、b-ヒドロキシアジパート、グルタラート、グルタルセミアルデヒド、グルタルアルデヒド、2-ヒドロキシ-1-シクロペンタノン、1,2-シクロペンタンジオール、シクロペンタノン、シクロペンタノール、(S)-2-アセトラクタート、(R)-2,3-ジヒドロキシ-イソバレレート、2-オキソイソバレレート、イソブチリル-CoA、イソブチレート、イソブチルアルデヒド、5-アミノペントアルデヒド、1,10-ジアミノデカン、1,10-ジアミノ-5-デセン、1,10-ジアミノ-5-ヒドロキシデカン、1,10-ジアミノ-5-デカノン、1,10-ジアミノ-5,6-デカンジオール、1,10-ジアミノ-6-ヒドロキシ-5-デカノン、フェニルアセトアルデヒド、1,4-ジフェニルブタン、1,4-ジフェニル-1-ブテン、1,4-ジフェニル-2-ブテン、1,4-ジフェニル-2-ブタノール、1,4-ジフェニル-2-ブタノン、1,4-ジフェニル-2,3-ブタンジオール、1,4-ジフェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニルブタン、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-1-ブテン、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-2-ブテン、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-2-ブタノール、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-2-ブタノン、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-2,3-ブタンジオール、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、1-(インドール-3)-4-フェニルブタン、1-(インドール-3)-4-フェニル-1-ブテン、1-(インドール-3)-4-フェニル-2-ブテン、1-(インドール-3)-4-フェニル-2-ブタノール、1-(インドール-3)-4-フェニル-2-ブタノン、1-(インドール-3)-4-フェニル-2,3-ブタンジオール、1-(インドール-3)-4-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)ブタン、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-1-ブテン、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブテン、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノール、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノン、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオール、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3-)ブタン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3)-1-ブテン、1-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3)-2-ブテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3)-2-ブタノール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3)-2-ブタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3)-2,3-ブタンジオール、1-(4-ヒドロキシフェニル-4-(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、インドール-3-アセトアルデヒド、1,4-ジ(インドール-3-)ブタン、1,4-ジ(インドール-3)-1-ブテン、1,4-ジ(インドール-3)-2-ブテン、1,4-ジ(インドール-3)-2-ブタノール、1,4-ジ(インドール-3)-2-ブタノン、1,4-ジ(インドール-3)-2,3-ブタンジオール、1,4-ジ(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、スクシナートセミアルデヒド、ヘキサン-1,8-ジカルボン酸、3-ヘキセン-1,8-ジカルボン酸、3-ヒドロキシ-ヘキサン-1,8-ジカルボン酸、3-ヘキサノン-1,8-ジカルボン酸、3,4-ヘキサンジオール-1,8-ジカルボン酸、4-ヒドロキシ-3-ヘキサノン-1,8-ジカルボン酸、フコイダン、ヨウ素、クロロフィル、カロテノイド、カルシウム、マグネシウム、鉄、ナトリウム、カリウム、及びホスフェート。
【００２５】
本発明の特定の実施態様は、多糖体を適切な単糖、又はオリゴ糖に変換するための方法であって：（a）任意にバイオマスから得られる多糖体を、微生物系と該多糖体を適切な単糖、又はオリゴ糖に変換するために十分な時間接触させることであって、該微生物系が（i）リアーゼ及びヒドロラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子であって、該リアーゼ及び／又はヒドロラーゼは、任意に少なくとも1つのシグナルペプチド、又は少なくとも1つの自己輸送体ドメインを含む、前記少なくとも１つの遺伝子；（ii）単糖輸送体、二糖輸送体、三糖輸送体、オリゴ糖輸送体、多糖体輸送体、及びスーパーチャンネルから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子；並びに（iii）単糖デヒドロゲナーゼ、イソメラーゼ、デヒドラターゼ、キナーゼ、及びアルドラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子を含み、これにより該多糖体を適切な単糖、又はオリゴ糖に変換することを含む、前記方法を含む。
【００２６】
本発明の特定の実施態様は、多糖体を適切な単糖、又はオリゴ糖に変換するための方法であって：（a）任意にバイオマスから得られる多糖体を、化学的、又は酵素的触媒作用経路と、該多糖体を第1の単糖、又はオリゴ糖に変換するために十分な時間接触させること；並びに（b）該第1の単糖、又はオリゴ糖を、微生物系と、該第1の単糖、又はオリゴ糖を適切な単糖、又はオリゴ糖に変換するために十分な時間接触させることであって、該微生物系は、（i）リアーゼ、及びヒドロラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子、（ii）単糖輸送体、二糖輸送体、三糖輸送体、オリゴ糖輸送体、多糖体輸送体、及びスーパーチャンネルから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子；並びに（ii）単糖デヒドロゲナーゼ、イソメラーゼ、デヒドラターゼ、キナーゼ、及びアルドラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子を含み、これにより該多糖体を適切な単糖、又はオリゴ糖に変換することを含む、前記方法を含む。
【００２７】
特定の態様において、リアーゼは、アルギナートリアーゼ、ペクタートリアーゼ、ポリマンヌロナートリアーゼ、ポリグルロナートリアーゼ、ポリガラクツロナートリアーゼ、及びラムノガラクツロナートリアーゼから選択される。特定の態様において、ヒドロラーゼは、アルギナートヒドロラーゼ、ラムノガラクツロナートヒドロラーゼ、ポリマンヌロナートヒドロラーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、及びポリガラクツロナートヒドロラーゼから選択される。特定の態様において、輸送体は、ABC輸送体、共輸送体、及び外膜ポリンから選択される。特定の態様において、ABC輸送体は、Atu3021、Atu3022、Atu3023、Atu3024、algM1、algM2、AlgQ1、AlgQ2、AlgS、OG2516_05558、OG2516_05563、OG2516_05568、OG2516_05573、TogM、TogN、TogA、TogB、及びこれらの機能的変異体から選択される。特定の態様において、共輸送体は、V12B01_24239（配列番号：26）、V12B01_24194（配列番号：8）、及びTogT、並びにこれらの機能的変異体から選択される。特定の態様において、外膜ポリンは、V12B01_24269、KdgM、及びKdgN、並びにこれらの機能的変異体から選択されるポリンを含む。
【００２８】
特定の実施態様には、唯一の炭素源として多糖体で成長することができる組換え微生物であって、該多糖体は、アルギナート、ペクチン、トリ-ガラクツロナート、ジ-ガラクツロナート、セルロース、及びヘミセルロースから選択される、組換え微生物を含む。特定の態様において、多糖体は、アルギナートである。特定の態様において、多糖体は、ペクチンである。特定の態様において、多糖体は、トリ-ガラクツロナートである。
【００２９】
特定の実施態様には、（i）リアーゼ、及びヒドロラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子であって、該リアーゼ、又はヒドロラーゼは、任意に少なくとも1つのシグナルペプチド、又は少なくとも1つの自己輸送体ドメインを含む、前記少なくとも１つの遺伝子；（ii）単糖輸送体、二糖輸送体、三糖輸送体、オリゴ糖輸送体、多糖体輸送体、及びスーパーチャンネルから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子；並びに（iii）単糖デヒドロゲナーゼ、イソメラーゼ、デヒドラターゼ、キナーゼ、及びアルドラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子を含む、組換え微生物を含む。特定の態様において、微生物は、唯一の炭素源として多糖体で成長することができる。特定の態様において、多糖体は、アルギナート、ペクチン、及びトリガラクツロナートから選択される。
【００３０】
特定の実施態様には、適切な単糖、又はオリゴ糖を第1のコモディティケミカルに変換するための方法であって、（a）該適切な単糖、又はオリゴ糖を、微生物系と、適切な単糖、又はオリゴ糖をコモディティケミカルに変換するために十分な時間接触させることであって、該微生物系は、組換え微生物を含み、該微生物は、コモディティケミカル生合成経路を含み、これにより該適切な単糖、又はオリゴ糖を第1のコモディティケミカルに変換することを含む、前記方法を含む。特定の態様において、コモディティケミカル経路は、アルデヒド、又はケトン生合成経路をコードする1つ以上の遺伝子を含む。
【００３１】
特定の態様において、アルデヒド、又はケトン生合成経路は、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、2-メチル-ブチルアルデヒド、3-メチル-ブチルアルデヒド、2-フェニルアセトアルデヒド、2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド、2-インドール-3-アセトアルデヒド、グルタルアルデヒド、5-アミノ-ペントアルデヒド、スクシナートセミアルデヒド、及びスクシナート4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド生合成経路の1つ以上から選択される。特定の態様において、アルデヒド、又はケトン生合成経路は、アセトアルデヒド生合成経路、並びにプロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、2-メチル-ブチルアルデヒド、3-メチル-ブチルアルデヒド、2-フェニルアセトアルデヒド、2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド、及び2-インドール-3-アセトアルデヒド生合成経路から選択される生合成経路を含む。
【００３２】
特定の態様において、アルデヒド、又はケトン生合成経路は、プロピオンアルデヒド生合成経路、並びにブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、2-メチル-ブチルアルデヒド、3-メチル-ブチルアルデヒド、及びフェニルアセトアルデヒド生合成経路から選択される生合成経路を含む。特定の態様において、アルデヒド、又はケトン生合成経路は、ブチルアルデヒド生合成経路、並びにイソブチルアルデヒド、2-メチル-ブチルアルデヒド、3-メチル-ブチルアルデヒド、2-フェニルアセトアルデヒド、2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド、及び2-インドール-3-アセトアルデヒド生合成経路から選択される生合成経路を含む。特定の態様において、アルデヒド、又はケトン生合成経路は、イソブチルアルデヒド生合成経路、並びに2-メチル-ブチルアルデヒド、3-メチル-ブチルアルデヒド、2-フェニルアセトアルデヒド、2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド、及び2-インドール-3-アセトアルデヒド生合成経路から選択される生合成経路を含む。
【００３３】
特定の態様において、アルデヒド、又はケトン生合成経路は、2-メチル-ブチルアルデヒド生合成経路、並びに3-メチル-ブチルアルデヒド、2-フェニルアセトアルデヒド、2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド、及び2-インドール-3-アセトアルデヒド生合成経路から選択される生合成経路を含む。特定の態様において、アルデヒド、又はケトン生合成経路は、3-メチル-ブチルアルデヒド生合成経路、並びに2-フェニルアセトアルデヒド、2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド、及び2-インドール-3-アセトアルデヒド生合成経路から選択される生合成経路を含む。特定の態様において、アルデヒド、又はケトン生合成経路は、2-フェニルアセトアルデヒド生合成経路、並びに2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド、及び2-インドール-3-アセトアルデヒド生合成経路から選択される生合成経路を含む。
【００３４】
特定の態様において、アルデヒド、又はケトン生合成経路は、2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド生合成経路、及び2-インドール-3-アセトアルデヒド生合成経路を含む。特定の態様において、第1のコモディティケミカルは、更に酵素的に、及び／又は化学的に、第2のコモディティケミカルに還元され、及び脱水される。
【００３５】
特定の実施態様には、適切な単糖、又はオリゴ糖をコモディティケミカルに変換するための方法であって、（a）適切な単糖、又はオリゴ糖を、微生物系と、適切な単糖、又はオリゴ糖をコモディティケミカルに変換するために十分な時間接触させることであって、該微生物系は、（i）アルデヒド生合成経路をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子であって、該アルデヒド生合成経路は、デカルボキシラーゼ酵素をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子を含む、前記少なくとも１つの遺伝子；並びに（ii）アルデヒドレダクターゼをコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子を含み、これにより適切な単糖、又はオリゴ糖をコモディティケミカルに変換することを含む、前記方法を含む。特定の態様において、デカルボキシラーゼ酵素は、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ（IPDC）である。特定の態様において、IPDCは、配列番号：312に記載されたアミノ酸配列と少なくとも80%、90%、95%、98%、又は99%同じであるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、アルデヒドレダクターゼ酵素は、フェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（PAR）である。特定の態様において、PARは、配列番号：313に記載されたアミノ酸配列と少なくとも80%、90%、95%、98%、又は99%同じであるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、コモディティケミカルは、2-フェニルエタノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、及びインドール-3-エタノールから選択される。
【００３６】
特定の実施態様には、（i）アルデヒド生合成経路をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子であって、該アルデヒド生合成経路は、デカルボキシラーゼ酵素をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子を含む、前記遺伝子；並びに（ii）アルデヒドレダクターゼをコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子を含む、組換え微生物を含む。特定の態様において、アルデヒド生合成経路は、CoA関連アルデヒド脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子を更に含む。特定の態様において、デカルボキシラーゼ酵素は、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ（IPDC）である。特定の態様において、アルデヒドレダクターゼ酵素は、フェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（PAR）である。特定の態様において、微生物は、適切な単糖、又はオリゴ糖をコモディティケミカルに変換することができる。特定の態様において、コモディティケミカルは、2-フェニルエタノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、及びインドール-3-エタノールから選択される。
【００３７】
特定の実施態様には、組換え微生物を含み、該微生物は、野生型微生物と比較して減少されたエタノール産生能力を含む、組換え微生物を含む。特定の態様において、微生物は、アセチル-coAのエタノールへの変換の減少、又は阻害を含む。特定の態様において、組換え微生物は、エタノールデヒドロゲナーゼの減少を含み、これによりエタノール産生能力の減少を提供する。特定の態様において、エタノールデヒドロゲナーゼは、adhE、その相同体、又は変異体である。特定の態様において、微生物は、adhE、その相同体、若しくは変異体の欠失、又はノックアウトを含む。特定の態様において、組換え微生物は、アセチル-coAのエタノールへの変換を触媒する酵素、ピルベートのラクタートへの変換を触媒する酵素、フマラートのスクシナートへの変換を触媒する酵素、アセチル-coA及びホスフェートのcoA及びアセチルホスフェートへの変換を触媒する酵素、アセチル-coA及びフォルマートのcoA及びピルベートへの変換を触媒する酵素、並びにα-ケト酸の分枝アミノ酸への変換を触媒する酵素から選択される酵素をコードする遺伝子における1つ以上の欠失、又はノックアウトを含む。
【００３８】
特定の実施態様には、本明細書に記述した生物系、又は組換え微生物を含み、以下から選択される微生物を含む：アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）、アクロモバクター（Achromobacter）、アシジフィリウム属（Acidiphilium）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、アクチノマデュラ属（Actinomadura）、アクチノプラネス属（Actinoplanes）、超好熱性古細菌（Aeropyrum pernix）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、パインアップル（Ananas comosus ）（M）、アルトロバクター属（Arthrobacter）、クロコウジカビ（Aspargillus niger）、コウジカビ（Aspargillus oryze）、アスペルギルス・メレウス（Aspergillus melleus）、アスペルギルス・プルベルレンツス（Aspergillus pulverulentus）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、ショウユコウジカビ（Aspergillus sojea）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、ブレビス菌（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、リケニホルミス菌（Bacillus licheniformis）、バチルス・マセランス（Bacillus macerans）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ブレビバチルス・ブレービス（Brevibacillus brevis）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、カンジダ シリンドラセア（Candida cylindracea）、カンディダ・ルゴサ（Candida rugosa）、パパイヤ（Carica papaya）（L）、セルロシミクロビウム属（Cellulosimicrobium）、セファロスポリウム属（Cephalosporium）、ケトミウム・エラチカム（Chaetomium erraticum）、ケトミウム・グラシエ（Chaetomium gracile）、クロストリジウム属（Clostridium）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・アセトブチリクム (Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）（グルタミクム（glutamicum））、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、大腸菌（Escherichia coli）、エンテロコッカス（Enterococcus）、黒脚病菌（Erwina chrysanthemi）、グルコノバクター属（Gliconobacter）、グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）、ハロアーキュラ属（Haloarcula）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ンソレンス（Humicola nsolens）、キタサトスポラ・セタエ（Kitasatospora setae）、クレブシエラ属（Klebsiella）、クレブシェラオキシトーカ（Klebsiella oxytoca）、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）、クロイベロマイセス フラジリス（Kluyveromyces fragilis）、クルイベロミセスラクチス（Kluyveromyces lactis）、コクリア属（Kocuria）、ラクトラクティス（Lactlactis）、乳酸桿菌属（Lactobacillus）、発酵乳酸桿菌（Lactobacillus fermentum）、ラクトバシラス・サケ（Lactobacillus sake）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、メチロシスチス属（Methylocystis）、メタノロブス・シシリアエ（Methanolobus siciliae）、メタノゲニウム・オルガノフィラム（Methanogenium organophilum）、メタノバクテリウム・ブライアンティイ（Methanobacterium bryantii）���ミクロバクテリウム・インペリアレ（Microbacterium imperiale）、ミクロコッカス・リソディクティカス（Micrococcus lysodeikticus）、ミクロルナタス属（Microlunatus）、ムコール・ジャバニカス（Mucor javanicus）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ミロセシウム属（Myrothecium）、硝酸菌属（Nitrobacter）、ニトロソモナス属（Nitrosomonas）、ノカルジア属（Nocardia）、パパイヤ（Papaya carica）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、醤油乳酸菌（Pediococcus halophilus）、ペニシリウム属（Penicillium）、ペニシリウム・カマンベルティ（Penicillium camemberti）、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）、ペニシリウム・エメルソニィ（Penicillium emersonii）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Penicillium roqueforti）、ペニシリウム・リラシナム（Penicillium lilactinum）、ペニシリウム・マルチカラー（Penicillium multicolor）、パラコッカス・パントトロファス（Paracoccus pantotrophus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、シュードモナス属（Pseudomonas）、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・デニトリフィカンス（Pseudomonas denitrificans）、パイロコッカス属（Pyrococcus）、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、パイロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshii）、根粒菌属（Rhizobium）、リゾムコール・マイハイ（Rhizomucor miehei）、リゾムコール・プシルス・リント（Rhizomucor pusillus Lindt）、リゾプス属（Rhizopus）、リゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）、リゾプス・ジャポニカス（Rhizopus japonicus）、リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、サッカロマイセス・セレビシエ（Sccharomyces cerevisiae）、スクレロチナ・リベルチナ（Sclerotina libertina）、スフィンゴバクテリウム・マルチボラム（Sphingobacterium multivorum）、スフィンゴビウム属（Sphingobium）、スフィンゴモナス属（Sphingomonas）、連鎖球菌属（Streptococcus）、サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）Y-1、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトミセス・ムリヌス（Streptomyces murinus）、ストレプトマイセス・ルビギノーサス（Streptomyces rubiginosus）、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Streptomyces violaceoruber）、ストレプトベルティシリウム・モバラエンス（Streptoverticillium mobaraense）、テトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）、サームス属（Thermus）、チオスファエラ パントトロファ（Thiosphaera pantotropha）、ホウロクタケ属（Trametes）、トリコデルマ属（Trichoderma）、トリコデルマ・ロンギブラキアータム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・レッセイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、トリコスポロン・ペニシラタム（Trichosporon penicillatum）、ビブリオ・アルギノリチカス（Vibrio alginolyticus）、ザントモナス属（Xanthomonas）、酵母（yeast）、ジゴサッカロミセス・ロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）、ザイモモナス属（Zymomonas）、及びザイモモナス・モビリス（Zymomonus mobilis）。
【００３９】
特定の実施態様には、本明細書に記述した方法によって産生されるコモディティケミカルを含む。特定の態様には、本明細書に提供した方法によって産生されるコモディティケミカル、及び精練所で生成された石油製品を含む混合されたコモディティケミカルを含む。特定の態様において、コモディティケミカルは、C10-C12炭化水素、2-フェニルエタノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、及びインドール-3-エタノールから選択される。特定の態様において、C10-C12炭化水素は、2,7-ジメチルオクタン、及び2,9-ジメチルデカンから選択される。特定の態様において、精練所で生成された石油製品は、ジェット燃料、及びディーゼル燃料から選択される。
【００４０】
特定の実施態様には、コモディティケミカルが豊富な精練所で生成された石油製品を生成する方法であって、（a）精練所で生成された石油製品を本明細書に記述した方法によって生成されたコモディティケミカルと混合して、これによりコモディティケミカルが豊富な精練所で生成された石油製品を生成することを含む、前記方法を含む。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
（詳細な説明）
本発明の実施態様は、唯一の炭素源としてバイオマスに由来する特定の多糖体でそれ以外では成長することができない微生物を、唯一の炭素源としてこれらの多糖体で成長するように操作することができるという予想外の発見に関連する。このような微生物には、細菌、及び酵母などの、原核生物、及び真核生物の微生物の両方を含むことができる。いくつかの態様において、大腸菌の特定の研究室株、及び／又は野生型株は、唯一の炭素源としてアルギナート、又はペクチンのいずれかに由来するバイオマスで成長して適切な単糖、又はその他の分子を産生するように操作することができる。当業者に明らかなその他の用途のなかで、アルギナート、又はペクチンでの、これらの操作された、又は組換えられた微生物の成長によって産生される単糖、及びその他の分子は、生物燃料などの種々のコモディティケミカルの生成におけるフィードストックとして利用してもよい。
【００４２】
アルギナート、及びペクチンは、生物燃料フィードストックの生成において、その他のバイオマス供与源を上回る利点を提供する。例えば、海洋、川、及び湖を含む大部分の水圏は、利用されていないままであるので、大規模な水生農業（aquatic-farming）では、エネルギー作物生産と食用作物生産を置き換すること、森林伐採、及び現在未耕作の土地を再耕作することなく、相当量のバイオマスを生成することができる。一つの特定の例として、北アメリカ太平洋沿岸は、大規模な水生農業のために必要なミネラルが豊富である。その領域で生きているジャイアントケルプは、地球上で1m／日ほどの速さで成長し、これは植物の中で最も速く、50mまで成長する。加えて、水生農業は、赤潮大発生の予防、及び魚にフレンドリーな環境の創造を含む、その他の利益を有する。
【００４３】
さらなる利点として、及びリグノセルロースのバイオマスとは対照的に、水生、果実、植物、及び／又は野菜原料に由来するバイオマスは、分解するのが容易である。このようなバイオマスは、典型的にはリグニンを欠いており、かつリグノセルロースのバイオマスよりも著しく壊れやすく、従って、酵素、又は化学触媒（例えば、フォルマート）のいずれを使用しても容易に分解することができる。一例として、海藻は、リグノセルロース（グルコース：24.1-39%、マンノース：0.2-4.6%、ガラクトース：0.5-2.4%、キシロース：0.4-22.1%、アラビノース1.5-2.8 %、及びウロン酸：1.2-20.7%、並びに総糖含量は、乾燥重量の36.5-70%に相当する）と比較してかなり単純な主要な糖組成（アルギナート：30%、マンニトール：15%）を有するので、海藻などの水生バイオマスは、酵素、又は化学的触媒作用のいずれを使用しても単糖に容易に変換されるであろう。
【００４４】
さらなる例として、果実、及び／又は野菜などの植物からのバイオマスは、植物細胞壁に由来するヘテロ多糖である、ペクチンを含む。ペクチンの特徴的構造は、ペクチン-バックボーンであるホモガラクツロナンを形成するα-(1-4)-連結したD-ガラクツロン酸の直鎖である。ペクチンは、本明細書に記述した、酵素、化学的触媒作用、及び／又は炭素源としてペクチンを利用するように設計された微生物系を使用して、容易にオリゴ糖、又は適切な単糖に変換することができる。水生動物、果実、及び／又は植物のバイオマスを使用する糖化、及び発酵は、リグノセルロースを使用するよりも非常に容易である。
【００４５】
この点に関して、本発明の実施態様は、また、特定の微生物を生物燃料などの種々のコモディティケミカルを産生するように操作することができるという驚くべき発見に関する。特定の態様において、これらの生物燃料には、エタノールに基づいた生物燃料を上回る利点を提供する中鎖から長鎖アルカンなどのアルカンを含み得る。特定の態様において、種々の操作された、又は組換えられた微生物（例えば、炭素源としてペクチン、又はアルギナートで成長する組換え微生物）の成長によって産生される単糖（例えば2-ケト-3-デオキシD-グルコナート；KDG）、及びその他の分子は、生物燃料などのコモディティケミカルの生成に有用であろう。一例として、KDGなどの適切な単糖は、その他の化学物質の中で、中鎖から長鎖アルカンなどのアルカンを産生するために、組み換え微生物によって利用してもよい。特定の態様において、このような組換え微生物は、本明細書に提供され、及び当該技術分野において公知のその他の中で、2,7ジメチルオクタン、及び2,9ジメチルデカンなどのコモディティケミカルを生成するために利用してもよい。
【００４６】
このような方法は、その他の生物燃料を上回る有意な利点をもつ生物燃料を生成する。特に、中鎖から長鎖アルカンは、エタノール、及びブタノールなどの既存の共通の生物燃料を上回る多数の重要な利点を提供し、及び将来ガソリン、ディーゼル、灯油、及び重油などの石油系燃料の魅力的な長期の代替品である。一例として、中鎖から長鎖アルカン、及びアルコールは、特に全ての石油製品、及びジェット燃料の主成分であり、それ故、我々が生成するアルカンは、既存のエンジンによって直接利用することができる。さらなる例として、中鎖から長鎖アルコールは、エタノールよりもはるかに優れた燃料であり、ほとんどガソリンに相当するエネルギー密度を有する。
【００４７】
別の例として、n-アルカンは、ガソリン、ディーゼル、灯油、及び重油を含む全ての石油製品の主成分である。微生物系、又は組換え微生物は、例えば、C7〜C20以上の範囲：ガソリン（例えば、自動車）についてはC7、ディーゼル（例えば、自動車、列車、及び船）についてはC10-C15、並びに灯油（例えば、航空、及び船）については、及び全ての重油についてはC8-C16である異なる炭素長をもつn-アルカンを産生するために使用してもよい。
【００４８】
本発明の一つの態様として、本明細書に記述した方法、及び組換え微生物によって産生されるコモディティケミカルは、従来の精練所の方法によって生成される石油製品と混合するために、既存の石油精製所によって利用されてもよい。この目的で、上記の如く、燃料生産者は、既存の基盤（精練所、パイプライン、タンカー）を通じて混合すること、及び分配することができる、実質的に同様の低炭素燃料を探し求めている。炭化水素として、本明細書の方法に従って生成されるコモディティケミカルは、石油由来燃料と実質的に同様であり、80%を上回るまでの石油由来燃料からの温室ガス放出を減少させて、油、及びガス産業における既存の基盤に適合し得る。数ある中で、例えば、2,7ジメチルオクタン、2,7ジメチルデカノンなどの種々のC10-C12炭化水素を含む、本明細書において生成される特定のコモディティケミカルは、ジェット、及びディーゼル燃料などの精練所で生成された石油製品に直接混合することができる。ジェット、及びディーゼル燃料のためのブレンドストックとしてのこのような生物学的に産生されたコモディティケミカルを使用することにより、精練所は、80%を上回るまでの温室ガス放出を減少させるであろう。
【００４９】
従って、本発明の特定の実施態様は、一般に、バイオマスから多糖体を得ること；多糖体を分解し、又は脱重合する経路と多糖体を接触させ、これにより多糖体を適切な単糖に変換することを含む、バイオマスをコモディティケミカルに変換するための方法に関する。プロセスなどから得られた適切な単糖は、任意の所望の目的のために使用してもよい。例えば、特定の態様において、適切な単糖を、組換え微生物の一部としてであるかにかかわらず、生物燃料生合成経路、インビトロでの酵素的、若しくは化学的経路、又はこれらの組み合わせと接触させ、これにより単糖をコモディティケミカルに変換することにより、適切な単糖を、次いでコモディティケミカル（例えば、生物燃料）に変換してもよい。
【００５０】
その他の態様において、生物燃料などのコモディティケミカルを生成する際に、適切な単糖は、任意の入手可能な供与源から直接得て、本明細書に記述したように、適切な単糖を生物燃料生合成経路と接触させることによってコモディティケミカルに変換してもよい。当業者に明らかなその他の用途の中で、このような生物燃料は、次いでジェット、及びディーゼル燃料などの精練所で生成された石油製と直接混合して、コモディティケミカルが豊富な精練所で生成された石油製品を生成してもよい。
【００５１】
（定義）
他に定義されない限り、本明細書に使用される全ての専門的用語、及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記述したものと類似するか、又は同等の任意の方法、及び材料を本発明の実施、又は試験に使用することができるが、好ましい方法、及び材料を記述してある。本発明の目的のために、以下の用語を下記に定義してある。本明細書において言及した全ての参照文献は、これらの全体が参照により組み込まれる。
【００５２】
冠詞「一つの（a）」、及び「一つの（an）」は、本明細書において、1つの、又は1より多い（すなわち、少なくとも1つの）本冠詞の文法上の目的をいうために使用される。
例示として、「要素」は、1つの要素、又は複数の要素を意味する。
【００５３】
「約」は、参照する量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、又は長さに対して30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1%程度まで変化する量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを意味する。
【００５４】
参照ポリヌクレオチド、又はポリペプチド配列の断片に適用される、「生物学的に活性な断片」という用語は、参照配列の少なくとも約0.1、0.5、1、2、5、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100、110、120、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000%、又はそれ以上の活性を有する断片をいう。
【００５５】
「参照配列」という用語は、一般に、「野生型」配列などの、本明細書に記述した生物活性を有する任意の酵素（例えば、サッカライドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、デヒドラターゼ、リアーゼ、輸送体、デカルボキシラーゼ、ヒドロラーゼ、その他）の、核酸コード配列、又はアミノ酸配列をいい、配列番号：1〜144、及び308〜313によって例証される参照配列を含む。また、参照配列は、本明細書に記述した配列の天然に存在する、機能的変異体（すなわち、相同分子種、又は相同体）を含み得る。
【００５６】
参照ポリヌクレオチド、又はポリペプチドの酵素活性を有するポリペプチドを含むか、又はコードする、全ての間の整数を含む、少なくとも約18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、500、600、若しくはそれ以上の隣接するヌクレオチド、又はアミノ酸残基の長さの生物学的に活性な断片が本発明の範囲内にまれる。代表的な生物学的に活性な断片は、一般に、相互作用、例えば分子内、又は分子間の相互作用に関与する。分子間の相互作用は、特異的な結合相互作用、又は酵素的相互作用であることができる。酵素的相互作用、又は活性の例には、本明細書に記述した数ある中で、サッカライドデヒドロゲナーゼ活性、アルコールデヒドロゲナーゼ活性、デヒドラターゼ活性、リアーゼ活性、輸送体活性、イソメラーゼ活性、キナーゼ活性を含む。生物学的に活性な断片は、典型的には、本明細書に記述し、及び当該技術分野において公知の、1つ以上の活性部位、又は酵素的／結合モチーフを含む。
【００５７】
「コード配列」は、遺伝子のポリペプチド産物のためのコードに寄与する任意の核酸配列を意味する。対照的に、「非コード配列」という用語は、遺伝子のポリペプチド産物のためのコードに寄与しない任意の核酸配列をいう。
【００５８】
この明細書の全体にわたって、文脈が他に必要でない限り、「含む」、「含む」、及び「含んでいる」という語は、明示された工程、若しくは要素、又は工程、若しくは要素の群を包含するが、任意のその他の工程、若しくは要素、又は工程、若しくは要素の群を排除しないことを暗示することが理解されるであろう。
【００５９】
「からなる」は、「からなる」の句の前のものは何でも含むこと、及び限定されることを意味する。「からなる」の句は、列記された要素が必要とされ、又は必須であること、及びその他の要素が存在しなくてもよいことを示す。
【００６０】
「から本質的になる」は、該句の後に列記された任意の要素を含むこと、及び列記された要素についての開示において特定された活性若しくは作用を妨げない、又は寄与しないその他の要素に限定されることを意味する。従って、句「から本質的になる」は、列記された要素が必要とされ、又は必須であること、しかしその他の要素が随意であり、かつこれらが列記された要素の活性又は作用に影響を及ぼすか否かに応じて、存在しても、又は存在しなくてもよいことを示す。
【００６１】
「相補的」、及び「相補性」という用語は、塩基対合則に合致したポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）をいう。例えば、配列「A-G-T」は、配列「T-C-A」に対して相補的である。相補性は、核酸のいくつかの塩基のみが塩基対形成規則に従って適合されており、「部分的」であってもよい。又は、核酸の間に「完全な」、若しくは「全体の」相補性があってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率、及び強度に対して有意な効果を有する。
【００６２】
「に対応する」、又は「に対応している」は、（a）参照ポリヌクレオチド配列の全ての、若しくは一部に対して実質的に同一、若しくは相補的であるか、又はペプチド、若しくはタンパク質のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；又は（b）参照ペプチド、若しくはタンパク質のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチド、又はポリペプチドを意味する。
【００６３】
「誘導体」は、当該技術分野において理解されるであろうように、修飾によって、例えばその他の化学的部分との抱合（例えば、ペグ化）、若しくは錯体生成によって、又は翻訳後修飾技術によって、塩基配列に由来したポリペプチドを意味する。また、「誘導体」という用語には、その範囲内に、機能的に同等な分子を提供する付加、又は欠失を含む親配列に作製された変化を含む。
【００６４】
「酵素反応性条件」は、酵素を機能させることができるであろう環境（すなわち、温度、pH、阻害物質の欠如などの要因）において、任意の必要条件を利用できることを意味する。酵素反応性条件は、試験管におけるなどのインビトロで、又は細胞内などのインビボで、いずれであることもできる。
【００６５】
本明細書に使用される、「機能」、及び「機能的な」等という用語は、生物学的、又は酵素的な機能をいう。
【００６６】
「遺伝子」は、染色体上の特定座位を占め、かつ転写、及び／又は翻訳制御配列、及び／又はコード領域、及び／又は非翻訳配列（すなわち、イントロン、5'、及び3'非翻訳配列）からなる遺伝の単位を意味する。
【００６７】
「相同性」は、同一であるか、又は保存的置換を構成するアミノ酸のパーセント数をいう。相同性は、参照により本明細書に組み込まれるGAP（Deverauxらの文献、1984、Nucleic Acids Research 12、387-395）などの配列比較プログラムを使用して決定してもよい。このようにして、本明細書に引用したものと類似する、又は実質的に異なる長さの配列は、整列へのギャップの挿入によって比較することができ、このようなギャップは、例えばGAPによって使用される比較アルゴリズムによって決定される。
【００６８】
「宿主細胞」という用語には、任意の組換えベクター（群）、又は本発明の単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであることができる個々の細胞、若しくは細胞培養を含む。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫を含み、子孫は、天然の、偶発的な、若しくは計画的な突然変異、及び／又は変化のために、（形態において、又は全体のDNA相補性において）必ずしも元の親細胞と完全に同一でなくてもよい。宿主細胞には、インビボ、若しくはインビトロで本発明の組換えベクター、又はポリヌクレオチドがトランスフェクトされ、形質転換され、又は感染された細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞、組換え細胞、又は組換え微生物である。
【００６９】
「単離された」は、その天然の状態において通常それを伴う成分が実質的に、又は本質的にない材料を意味する。例えば、本明細書に使用される「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態においてそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば断片と通常隣接する配列から除去されたDNA断片をいう。或いは、本明細書に使用される「単離されたペプチド」、又は「単離されたポリペプチド」等は、その天然の細胞の環境から、及び細胞のその他の成分との会合からの、ペプチド、若しくはポリペプチド分子のインビトロでの単離、及び／又は精製、すなわち、それがインビボの物質と会合していないことをいう。
【００７０】
「増加した」、又は「増加している」は、修飾されていない微生物、又は異なる修飾がされた微生物などの対照微生物と比較して、1つ以上の組換え微生物が、より大量の所与の産物、又は分子（例えば、コモディティケミカル、生物燃料、又はその中間代謝物）を産生する能力を意味する。「増加される」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、修飾されていない微生物、又は異なる修飾がされた微生物によって産生される量の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍またはそれ以上（全ての間の整数、及び少数、例えば1.5、1.6、1.7、1.8、その他を含む）である増加を含み得る。
【００７１】
「から得られる」は、例えばポリヌクレオチド抽出物、又はポリペプチド抽出物などの試料が所望の生物体、典型的には微生物などの特定の供与源から単離され、又は由来することを意味する。また、「から得られる」は、ポリヌクレオチド、又はポリペプチド配列が特定の生物体、若しくは微生物から単離され、又は由来する状況をいうことができる。例えば、ベンズアルデヒドリアーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、シュードモナス属などの様々な原核生物、又は真核生物の微生物から単離され得る。
【００７２】
本明細書に使用される「作動可能に連結される」という用語は、プロモーターの調節制御下に遺伝子を置いて、次いで遺伝子の転写、及び任意に翻訳を制御することを意味する。異種プロモーター／構造遺伝子の組み合わせの構成では、一般に、遺伝子配列、又はプロモーターとそれがその天然の状況；すなわち、遺伝子配列、又はプロモーターが由来する遺伝子において制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じである遺伝子転写開始点から少し離して、遺伝子配列、又はプロモーターが位置することが好ましい。当技術分野において公知のとおり、この距離におけるいくつかの変異は、機能の喪失を伴わずに適応することができる。同様に、その制御下に置かれた異種遺伝子に関して調節配列エレメントの好ましい位置は、その天然の状況；すなわち、それが由来する遺伝子におけるエレメントの位置によって定義される。「構成的プロモーター」は、典型的には、大部分の条件下で活性である、すなわち転写を促進する。「誘導性プロモーター」は、典型的には、所与の分子因子（例えば、IPTG）、又は所与の環境条件（例えば、CO2濃度、栄養水準、光、熱）の存在下などの特定の状況下で活性なだけである。その条件の非存在下では、誘導性プロモーターは、典型的には、転写活性の有意な、又は測定可能なレベルにならない。
【００７３】
本明細書に使用される「ポリヌクレオチド」、又は「核酸」という記述は、mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA、又はDNAを示す。本用語は、典型的には、リボヌクレオチド、若しくはデオキシヌクレオチドのいずれか、又は修飾形態のいずれかのタイプのヌクレオチドの、長さが少なくとも10塩基のヌクレオチドの重合体形態をいう。本用語には、DNAの一本鎖、及び二本鎖形態を含む。
【００７４】
当業者によって理解されるであろうとおり、本発明のポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列、遺伝子外、及びプラスミドでコードされる配列、並びにタンパク質、ポリペプチド、ペプチド等を発現し、又は発現するように適応され得るより小さな操作された遺伝子セグメントを含むことができる。このようなセグメントは、天然において単離されていても、又はヒトの手によって合成的に修飾されていてもよい。
【００７５】
ポリヌクレオチドは、一本鎖（コーディング、又はアンチセンス）、又は二本鎖であってもよく、及びDNA（ゲノム、cDNA、又は合成）、又はRNA分子であってもよい。さらなるコード配列、又は非コード配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、必要ではなく、ポリヌクレオチドは、その他の分子、及び／又は補助物質に連結されていてもよいが、必要ではない。
【００７６】
ポリヌクレオチドは、天然の配列（すなわち、内因性配列）を含んでいてもよく、又はこのような配列の変異体、若しくは生物学的に機能的な同等物を含んでいてもよい。ポリヌクレオチド変異体は、更に下記に記述したように、好ましくはコードされたポリペプチドの酵素活性が修飾されていないポリペプチドと比較して、実質的に減弱しないように、及び好ましくはコードされたポリペプチドの酵素活性が修飾されていないポリペプチドと比較して、改善される（例えば、最適化される）ように、1つ以上の置換、付加、欠失、及び／又は挿入を含んでいてもよい。コードされたポリペプチドの酵素活性に対する効果は、一般に本明細書に記述したとおりに評価してもよい。
【００７７】
本発明のポリヌクレオチドは、コード配列それ自体の長さに関係なく、これらの全長がかなり変化し得るように、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニングサイト、その他のコードセグメント等のその他のDNA配列と組み合わせてもよい。従って、ほとんど任意の長さのポリヌクレオチド断片が使用されることが想定され、全長は、好ましくは意図される組換えDNAプロトコルにおける調製、及び使用の容易さにより限定される。
【００７８】
「ポリヌクレオチド変異体」、及び「変異体」等という用語は、本明細書に記述された任意の参照ポリヌクレオチド配列、又は遺伝子と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを、並びに本明細書に記述された任意の参照ポリヌクレオチド配列、又は本明細書で言及した任意の遺伝子、若しくはタンパク質の任意のポリヌクレオチドコード配列と、以下に定義し、及び当該技術分野において公知の低ストリンジェンシー、中間ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、又は非常に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをいう。また、これらの用語は、少なくとも1つのヌクレオチドの付加、欠失、又は置換によって参照ポリヌクレオチドから区別されるポリヌクレオチドを包含する。従って、「ポリヌクレオチド変異体」、及び「変異体」という用語は、1つ以上のヌクレオチドが付加され、若しくは欠失され、又は異なるヌクレオチドで置換されたポリヌクレオチドを含む。この点に関して、突然変異、付加、欠失、及び置換を含む特定の変化を参照ポリヌクレオチドに作製することができ、これにより、変化されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能、若しくは活性を保持するか、又は参照ポリヌクレオチドと比較して活性が増大される（すなわち、至適化される）ことが、当該技術分野において周知である。ポリヌクレオチド変異体は、例えば、本明細書に記述された参照ポリヌクレオチドと少なくとも50%（及び少なくとも51%〜少なくとも99%、及び全ての間の整数のパーセンテージ）の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
【００７９】
また、「ポリヌクレオチド変異体」、及び「変異体」という用語は、これらの酵素をコードする天然に存在する対立遺伝子変異体を含む。天然に存在する変異体の例は、対立遺伝子変異体（同じ座位）、相同体（異なる座位）、及び相同分子種（異なる生物体）を含む。これらなどの天然に存在する変異体は、例えば当技術分野において公知のとおりの種々のポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）、及びハイブリダイゼーションに基づいた技術を含む、周知の分子生物学技術を使用して同定すること、及び単離することができる。天然に存在する変異体は、本明細書に記述した適切な酵素活性を有する1つ以上の遺伝子（例えば、C-Cリガーゼ、ジオールデヒドロゲナーゼ、ペクタートリアーゼ、アルギナートリアーゼ、ジオールデヒドラターゼ、輸送体、その他）をコードする任意の生物体から単離することができる。
【００８０】
天然に存在しない変異体は、ポリヌクレオチド、細胞、又は生物体に適用されるたものを含む突然変異誘発技術によって作製することができる。変異体は、ヌクレオチド置換、欠失、反転、及び挿入を含むことができる。変異は、コード領域、及び非コード領域のいずれか、又は両方に存在することができる。特定の態様において、天然に存在しない変異体は、活性、安定性、又は他のいかなる望ましい特色の増大のために酵素を操作し、及びスクリーニングすることなどにより、所与の微生物（例えば、大腸菌）に使用するために最適化されていてもよい。変異により、（元のコードされる産物と比較して）保存的、及び非保存的アミノ酸置換を生じることができる。ヌクレオチド配列については、保存的変異体は、遺伝暗号の縮重のために、参照ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列を含む。また、変異体ヌクレオチド配列は、例えば部位特異的突然変異を使用して産生され、しかし、生物学的に活性なポリペプチドをなおもコードするものなどの合成に由来するヌクレオチド配列を含む。一般に、特定の参照ヌクレオチド配列の変異体は、デフォルトパラメーターを使用して本明細書に他に記述した配列整列プログラムによって決定すると、その特定のヌクレオチド配列に対して少なくとも約30%、40% 50% 、55%、60%、65%、70%、一般に少なくとも約75%、80%、85%、90%〜95%以上、更に約97%、又は98%以上の配列同一性を有するであろう。
【００８１】
本明細書に使用される、「低ストリンジェンシー、中間ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、又は非常に高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーション、及び洗浄のための条件を記述する。ハイブリダイゼーション反応を行うためのガイダンスは、Ausubelらの文献「分子生物学の現在のプロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」John Wiley & Sons Inc、1994-1998、6.3.1-6.3.6節において見つけることができる。水性、及び非水性の方法がその参照文献に記述されており、いずれを使用することもできる。
【００８２】
「低ストリンジェンシー」条件に対する本明細書における言及には、42℃におけるハイブリダイゼーションについて、少なくとも約1%v/v〜少なくとも約15%v/vのホルムアミド、及び少なくとも約1M〜少なくとも約2Mの塩、並びに42℃における洗浄について、少なくとも約1M〜少なくとも約2Mの塩を含み、かつ包含する。また、低ストリンジェンシー条件は、65℃におけるハイブリダイゼーションについて、1% ウシ血清アルブミン（BSA）、1mM EDTA、0.5M NaHPO4（pH 7.2）、7% SDS、及び室温での洗浄について、（i）2×SSC、0.1% SDS；又は（ii）0.5% BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4（pH 7.2）、5% SDSを含んでいてもよい。低ストリンジェンシー条件の一つの実施態様には、少なくとも約45℃における6×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）におけるハイブリダイゼーション、続く少なくとも50℃における0.2×SSC、0.1% SDSにおける2回の洗浄を含む（洗浄液の温度は、低ストリンジェンシー条件について、55℃に増加することができる）。
【００８３】
「中間ストリンジェンシー」条件は、42℃におけるハイブリダイゼーションについて、少なくとも約16%v/v〜少なくとも約30%v/vホルムアミド、及び少なくとも約0.5M〜少なくとも約0.9Mの塩、並びに55℃における洗浄について、少なくとも約0.1M〜少なくとも約0.2Mの塩を含み、かつ包含する。また、中間ストリンジェンシー条件は、65℃におけるハイブリダイゼーションについて1% ウシ血清アルブミン（BSA）、1mM EDTA、0.5のM NaHPO4（pH 7.2）、7% SDS、及び60〜65℃における洗浄について、（i）2×SSC、0.1% SDS；又は（ii）0.5% BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4（pH 7.2）、5% SDSを含んでいてもよい。中間ストリンジェンシー条件の一つの実施態様は、約45℃において6×SSC中でハイブリダイズすること、続いて60℃における1つ以上のが0.2×SSC、0.1% SDS中の洗浄を含む。
【００８４】
「高ストリンジェンシー」条件は、42℃におけるハイブリダイゼーションについて、少なくとも約31%v/v〜少なくとも約50%v/vホルムアミド、及び約0.01M〜約0.15Mの塩、並びに55℃における洗浄について、約0.01M〜約0.02Mの塩を含み、かつ包含する。また、高ストリンジェンシー条件は、65℃におけるハイブリダイゼーションについて、1% BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4（pH 7.2）、7% SDS、及び65℃上回る温度における洗浄について、（i）0.2×SSC、0.1% SDS；又は（ii）0.5% BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4（pH 7.2）、1% SDSを含んでいてもよい。高ストリンジェンシー条件の一つの実施態様は、約45℃において6×SSC中でハイブリダイズすること、続いて65℃における1会以上の0.2のSSC、0.1% SDS中の洗浄を含む。
【００８５】
「非常に高ストリンジェンシー」条件の一つの実施態様は、65℃において0.5Mのリン酸ナトリウム、7% SDS中でハイブリダイズすること、続く65℃における0.2×SSC、1% SDS中の1回以上の洗浄を含む。
【００８６】
その他のストリンジェンシー条件は、当該技術分野において周知であり、当業者であれば、種々の要因を、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化するために操作することができることを認識するであろう。最終洗浄のストリンジェンシーの最適化を行って高度なハイブリダイゼーションを保証することができる。詳細な例については、Ausubelらの文献、上記、2.10.1〜2.10.16ページ、及びSambrookらの文献、分子生物学の現在のプロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）（1989）、1.101〜1.104節を参照されたい。
【００８７】
ストリンジェントな洗浄は、典型的には約42℃〜68℃の温度にて実施されるが、当業者であれば、そのその他の温度もストリンジェント条件のために適し得ることを認識するであろう。最大ハイブリダイゼーション率は、典型的にはDNA-DNAハイブリッドの形成について、Tmの約20℃〜25℃下にて生じる。Tmは、融解温度、又は2つの相補ポリヌクレオチド配列が分離する温度であることは、当該技術分野において周知である。Tmを見積もるための方法は、当該技術分野において周知である（Ausubelらの文献、上記、2.10.8ページを参照されたい）。
【００８８】
一般に、完全にマッチしたDNAの二重鎖のTmは、式：Tm = 81.5 + 16.6（log10 M）+ 0.41（%G+C)-0.63（%ホルムアミド)-(600/長さ）（式中：Mは、Na+の濃度で、好ましくは0.01モル〜0.4モルの範囲であり；%G+Cは、塩基の総数の割合としてのグアノシン、及びシトシン塩基の合計で、30%〜75% G+C間の範囲であり；% ホルムアミドは、容積によるパーセントホルムアミド濃度であり；長さは、DNA二重螺旋における塩基対の数である）によって近似値として予測され得る。二重鎖DNAのTmは、ランダムにミスマッチの塩基対の数の1% 増大毎に、およそ1℃ずつ減少する。洗浄は、一般に 高ストリンジェンシーについてTm-15℃にて、又は適度なストリンジェンシーについてTm-30℃にて実施される。
【００８９】
ハイブリダイゼーション手順の一例では、固定されたDNAを含む膜（例えば、ニトロセルロース膜、又はナイロン膜）を、標識プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液（50% イオン除去ホルムアミド、5×SSC、5×Reinhardt溶液（0.1%糞便（fecal）、0.1% ポリビニルピロリドン、及び0.1% ウシ血清アルブミン）、0.1% SDS、及び200mg/mlの変性サケ精子DNA）中で42℃にて一晩ハイブリダイズさせる。次いで、膜を2回連続して中間ストリンジェンシー洗浄（すなわち、45℃において15分間の2×SSC、0.1% SDS、50℃において15分間の2×SSC、0.1% SDS）、続いて2回の連続するより高いストリンジェンシーの洗浄（すなわち、55℃において12分間の0.2×SSC、0.1% SDS、続いて65〜68℃において12分間の0.2×SSC、0.1% SDS溶液）に供する。
【００９０】
ポリヌクレオチド、及びその融合物は、任意の当該技術分野において公知の、及び利用可能な種々の十分に確立された技術を使用して調製しても、操作しても、並びに／又は発現してもよい。例えば、本発明のポリペプチド、又は融合タンパク質、若しくはその機能的な同等物をコードするポリヌクレオチド配列を組換えDNA分子に使用して、適切な宿主細胞における選択された酵素を直接発現してもよい。遺伝暗号の固有の縮重のために、同じか、又は機能的に等価なアミノ酸配列を実質的にコードするその他のDNA配列を産生してもよく、これらの配列は、所与のポリペプチドをクローン化し、及び発現するために使用してもよい。
【００９１】
当業者に理解されるであろうように、天然に存在しないコドンを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を産生することも、いくつかの例において有利であろう。例えば、特定の原核生物、又は真核生物宿主による好ましいコドンを選択して、タンパク質発現の割合を増加させ、又は天然に存在する配列から産生される転写物のものよりも長い半減期などの、望ましい特性を有する組換えRNA転写物を産生することができる。このようなヌクレオチドは、典型的には「コドン最適化させた」といわれる。本明細書に記述した任意のヌクレオチド配列を、このような「コドンを最適化させた」形態に利用してもよい。例えば、蛍光菌からのベンズアルデヒドリアーゼのヌクレオチドコード配列を大腸菌における発現のためにコドンを最適化させてもよい。
【００９２】
その上、本発明のポリヌクレオチド配列は、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、発現、及び／又は活性を修飾する変化を含むが限定されない、種々の理由のために、リペプチドをコードする配列を変化させるために、一般に当該技術分野において公知の方法を使用して操作することができる。
【００９３】
所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は機能的な同等物を、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコード配列の転写、及び翻訳のために必要なエレメントを含むベクターに挿入してもよい。当業者に周知である方法を、関心対象のポリペプチド、並びに適切な転写、及び翻訳調節エレメントをコードする配列を含む構築物発現ベクターに使用してもよい。これらの方法には、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えを含む。このような技術は、Sambrook らの文献、分子クローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL)、Molecular Biology（1989）、及びAusubelらの文献、分子生物学の現在のプロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）（1989）に記述されている。
【００９４】
「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体を、並びに前述のものの変異体、及び合成類似体をいうために、本明細書において同義的に使用される。従って、これらの用語は、1つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体などの合成の天然に存在しないアミノ酸であるアミノ酸重合体、並びに天然に存在するアミノ酸重合体に適用される。特定の態様において、ポリペプチドは、典型的には種々の化学反応を触媒する（すなわち、割合を増加させる）酵素的ポリペプチド、又は「酵素」を含んでいてもよい。
【００９５】
ポリペプチド「変異体」の記述は、少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって参照ポリペプチド配列から区別されるポリペプチドをいう。特定の実施態様において、ポリペプチド変異体は、保存的、又は非保存的でもよい1つ以上の置換によって参照ポリペプチドから区別される。特定の実施態様において、ポリペプチド変異体は、保存的置換を含み、この点に関しては、いくつかのアミノ酸が、ポリペプチドの活性の性質を変えることなく広く同様の特性をもつその他のものに変えられてもよいことは、当該技術分野において周知である。また、ポリペプチド変異体は、1つ以上のアミノ酸が付加され、若しくは欠失され、又は異なるアミノ酸残基で置換されたポリペプチドを包含する。
【００９６】
本発明は、任意の本明細書に記述した酵素活性有する全長ポリペプチドの変異体、これらの全長ポリペプチドの切断された断片、切断された断片の変異体、並びにこれらの関連した生物学的に活性な断片の、本明細書に記述した方法における使用を想定する。典型的には、ポリペプチドの生物学的に活性な断片は、相互作用、例えば分子内、又は分子間の相互作用に関与してもよい。分子間相互作用は、特異的な結合相互作用、又は酵素的相互作用であることができる（例えば、相互作用は、一過性であることができ、共有結合が形成され、又は壊される）。酵素活性が本明細書に記述されたポリペプチド／酵素的生物学的に活性な断片は、（推定上の）全長参照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して十分に類似するか、又は由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性な断片は、少なくとも1つの酵素活性でドメイン、又はモチーフを含み、種々の活性なドメインの1つ以上（及び、場合によっては全て）を含んでいてもよい。酵素の生物学的に活性な断片は、例えば、参照ポリペプチド配列の、全ての間の整数を含む10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、450、500、600、又はそれ以上の隣接するアミノ酸であるポリペプチド断片であることができる。特定の実施態様において、生物学的に活性な断片は、本明細書に他に記述され、及び当該技術分野において公知の、保存された酵素の配列、ドメイン、又はモチーフを含む。適切には、生物学的に活性な断片は、それが由来する野生型ポリペプチドの活性の約1%、10%、25%、50%以上を有する。
【００９７】
「外来性」という用語は、一般に、野生型の細胞、若しくは生物体に天然に存在しないが、典型的には分子生物学的技術、すなわち組換え微生物を産生するために操作することによって細胞に導入されるポリヌクレオチド配列、又はポリペプチドをいう。「外来性」ポリヌクレオチドの例は、所望のタンパク質、又は酵素をコードするベクター、プラスミド、及び／又は人工核酸構築物を含む。「内因性」という用語は、一般に、所与の野生型細胞、又は生物体において見いだされるであろう天然に存在するポリヌクレオチド配列、又はポリペプチドをいう。例えば、特定の天然に存在する細菌、又は酵母種は、典型的にはベンズアルデヒドリアーゼ遺伝子を含まず、従って、ベンズアルデヒドリアーゼをコードする「内因性」ポリヌクレオチド配列を含まない。この点に関して、生体が所与のポリヌクレオチド配列、又は遺伝子の内因性コピーを含み得る場合であっても、コードされるタンパク質を過剰発現するか、又はさもなければ発現を調節するためなど、その配列をコードするプラスミド、又はベクターの導入は、その遺伝子、又はポリヌクレオチド配列の「外来性」コピーを表すことにも留意されたい。本明細書に記述した任意の経路、遺伝子、又は酵素は、「内因性」配列を利用し、若しくは依拠してもよく、1つ以上の「外来性」ポリヌクレオチド配列として提供されてもよく、及び／又は所与の微生物内にすでに含まれる内因性配列に従って利用されてもよい。
【００９８】
「組み換え」微生物は、典型的には、プラスミド、又はベクターなどの1つ以上の外来性ヌクレオチドを含む。
【００９９】
本明細書に使用される、「配列同一性」、又は例えば「に対する50% 配列同一性」を含む記述は、配列が比較のウィンドウにわたるヌクレオチド間基準、又はアミノ酸間基準での同一性の程度をいう。従って、「配列同一性の割合」は、比較のウィンドウにわたって2つの至適に整列させた配列を比較すること、マッチした位置の数を得るために同一の核酸塩基（例えば、A、T、C、G、I）、又は同一のアミノ酸残基（例えばAla、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys、及びMet）が両方の配列に存在する位置の数を決定すること、マッチした位置の数を比較のウィンドウ（すなわち、ウィンドウサイズ）の位置の合計数によって割ること、及び配列同一性の割合を得るために結果に100を掛けることによって算出してもよい。
【０１００】
2つ以上のポリヌクレオチド、又はポリペプチドの配列関係を記述するために使用される用語は、「参照配列」、「比較ウィンドウ」「配列同一性」、「配列同一性の割合」、及び「実質的同一性」を含む。「参照配列」は、少なくとも12、しかし、しばしば15〜18、及びたいてい少なくとも25個の、ヌクレオチド、及びアミノ酸残基を含むモノマー単位の長さである。2つのポリヌクレオチドは、それぞれ（1）2つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、一部の完全なポリヌクレオチド配列のみ）、及び（2）2つのポリヌクレオチド間の多岐にわたる配列を含んでいてもよいので、2つの(又はそれ以上の）ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局部的な領域を同定し、及び比較して行われる。「比較ウィンドウ」とは、少なくとも6つ、通常約50〜約100、更に通常では約100〜約150の隣接する位置の概念上のセグメントであって、2つの配列を至適に整列させた後に、配列が隣接する位置の同数の参照配列と比較されるセグメントをいう。比較ウィンドウは、2つの配列の最適な整列のために、参照配列（これは、付加、又は欠失を含まない）と比較して約20%以下の付加、又は欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適な整列は、アルゴリズム（Wisconsin遺伝学ソフトウェアパッケージリリース7.0、Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USAのGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA）のコンピュータ化された実施によって、又は選択した任意の種々の方法によって生成される検査、及び最高の整列（すなわち、比較ウィンドウにわたって最高の割合の相同性を生じる）によって行われてもよい。また、例えば、Altschulらの文献、1997、Nucl. Acids Res. 25：3389によって開示されるような、BLASTファミリーのプログラムを参照してもよい。配列分析の詳細な考察は、Ausubelらの文献、「分子生物学の現在のプロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」John Wiley & Sons Inc、1994-1998、第15章の19.3単元において見つけることができる。
【０１０１】
「形質転換」は、一般に宿主細胞ゲノムへの外来性DNAの取り込み、及び組み込みにより生じる細胞の永久的な遺伝的変化；また、ある生物体から別の生物体のゲノムへの外来性遺伝子の移動をいう。
【０１０２】
「ベクター」は、例えば、その中にポリヌクレオチドを挿入すること、又はクローン化することができる、プラスミド、バクテリオファージ、酵母、又はウイルスに由来するポリヌクレオチド分子、好ましくはDNA分子を意味する。ベクターは、好ましくは1つ以上の独特の制限部位を含み、かつ標的細胞、若しくは組織、又はその前駆細胞、若しくは組織を含む宿主細胞における限定された自律増殖をすることができるか、又はクローン化した配列を再現できるように限定された宿主のゲノムに組み込むことができる。従って、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわちその複製が染色体の複製から独立している染色体外の実体として存在するベクター、例えば直鎖状、若しくは閉じた環状プラスミド、細胞質因子、ミニ染色体、又は人工染色体であることができる。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含むことができる。或いは、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに、ゲノム内に組み込まれて、それが組み込まれた染色体（群）と共に複製されるものであることができる。このようなベクターは、特定の宿主染色体の所望部位内に組換えできる特異的配列を含んでいてもよい。ベクター系は、宿主細胞のゲノム内に導入するための総DNAを共に含む、単一のベクター、若しくはプラスミド、2つ以上のベクター、若しくはプラスミド、又はトランスポゾンを含むことができる。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依存するであろう。今回の場合には、ベクターは、好ましくは、ラン藻細胞などの細菌細胞において作動可能に機能的であるものである。ベクターは、緑色蛍光タンパク質（GFP）などのリポーター遺伝子を含むことができ、これは、コードされるポリペプチドの1つ以上に対してインフレームで融合すること、又は別々に発現させることができる。また、ベクターは、適切な形質転換体の選択のために使用することができる抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含むことができる。
【０１０３】
「野生型」、及び「天然に存在する」という用語は、天然に存在する供与源から単離されたときに、その遺伝子、若しくは遺伝子産物の特徴を有する遺伝子、又は遺伝子産物をいうために、交換可能に使用される。野生型遺伝子、又は遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）は、集団において最も頻繁に観察されるものであり、従って、任意に遺伝子の「正常な」、又は「野生型」形態を設計する。
【０１０４】
「バイオマス」の例には、とりわけ、水性、又は海洋バイオマス、果実廃棄物などの果実に基づいたバイオマス、及び植物廃棄物などの野菜に基づいたバイオマスを含む。水性、又は海洋バイオマスの例は、ケルプ、ジャイアントケルプ、海藻、藻類、及び海洋ミクロフローラ、微細藻類、海草等を含むが、限定されない。特定の態様において、バイオマスは、典型的には地殻の表層内で見いだされる炭化水素などの化石化された炭素の供与源（例えば、天然ガス、ほぼ純粋な炭素で構成される不揮発性材料、無煙炭石炭のようなものなど）を含まない。
【０１０５】
果実、及び／又は植物のバイオマスの例は、とりわけ、柑橘類、オレンジ、グレープフルーツ、ジャガイモ、トマト、ブドウ、マンゴー、グズベリー、ニンジン、サトウダイコン、及びリンゴを含む植物果皮、並びに絞り滓などの任意のペクチンの供与源をを含むが、限定されない。
【０１０６】
多糖体、オリゴ糖、単糖、又はその他のバイオマスの糖組成の例には、アルギナート、寒天、カラゲナン、フコイダン、ペクチン、グルロナート、マンヌロナート、マンニトール、リキソース、セルロース、ヘミセルロース、グリセロール、キシリトール、グルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、キシラン、マンナン、アラビナン、アラビノース、グルクロナート、ガラクツロナート（ジ-、及びトリガラクツロナートを含む）、ラムノース等を含むが、限定されない。
【０１０７】
アルギナート由来多糖体の特定の例には、β-D-マンヌロナート、α-Lグルロナート、ジアルギナート、トリアルギナート、ペントアルギナート、ヘキサアルギナート、ヘプタアルギナート、オクタアルギナート、ノナアルギナート、デカアルギナート、ウンデカアルギナート、ドデカアルギナート、及びポリアルギナートなどの飽和多糖体、並びに4-デオキシ-L-エリスロ-5-ヘキソースウロースウロン酸、4-(4-デオキシ-β-D-マン-4-エヌロノシル)-D-マンヌロナート、又はL-グルロナート、4-(4-デオキシ-β-D-マン-4-エヌロノシル)-ジアルギナート、4-(4-デオキシ-β-D-マン-4-エヌロノシル)-トリアルギナート、4-(4-デオキシ-β-D-マン-4-エヌロノシル)-テトラアルギナート、4-(4-デオキシ-β-D-マン-4-エヌロノシル)-ペントアルギナート、4-(4-デオキシ-β-D-マン-4-エヌロノシル)-ヘキサアルギナート、4-(4-デオキシ-β-D-マン-4-エヌロノシル)-ヘプタアルギナート、4-(4-デオキシ-β-D-マン-4-エヌロノシル)-オクタアルギナート、4-(4-デオキシ-β-D-マン-4-エヌロノシル)-ノナアルギナート、4-(4-デオキシ-β-D-マン-4-エヌロノシル)-ウンデカアルギナート、及び4-(4-デオキシ-β-D-マン-4-エヌロノシル)-ドデカアルギナートなどの不飽和多糖体を含む。
【０１０８】
ペクチン由来多糖体の特定の例には、ガラクツロナート、ジガラクツロナート、トリガラクツロナート、テトラガラクツロナート、ペンタガラクツロナート、ヘキサガラクツロナート、ヘプタガラクツロナート、オクタガラクツロナート、ノナガラクツロナート、デカガラクツロナート、ドデカガラクツロナート、ポリガラクツロナート、及びラムノポリガラクツロナートなどの飽和多糖体、並びに4-デオキシ-L-スレオ-5-ヘキソースウロースウロナート、4-(4-デオキシ-α-D-グルコ-4-エヌロノシル)-D-ガラクツロナート、4-(4-デオキシ-α-D-グルコ-4-エヌロノシル)-D-ジガラクツロナート、4-(4-デオキシ-α-D-グルコ-4-エヌロノシル)-D-トリガラクツロナート、4-(4-デオキシ-α-D-グルコ-4-エヌロノシル)-D-テトラガラクツロナート、4-(4-デオキシ-α-D-グルコ-4-エヌロノシル)-D-ペンタガラクツロナート、4-(4-デオキシ-α-D-グルコ-4-エヌロノシル)-D-ヘキサガラクツロナート、4-(4-デオキシ-α-D-グルコ-4-エヌロノシル)-D-ヘプタガラクツロナート、4-(4-デオキシ-α-D-グルコ-4-エヌロノシル)-D-オクタガラクツロナート、4-(4-デオキシ-α-D-グルコ-4-エヌロノシル)-D-ノナガラクツロナート、4-(4-デオキシ-α-D-グルコ-4-エヌロノシル)-D-デカガラクツロナート、及び4-(4-デオキシ-α-D-グルコ-4-エヌロノシル)-D-ドデカガラクツロナートなどの飽和多糖体を含む。
【０１０９】
これらの多糖体、又はオリゴ糖成分は、炭素源（例えば、唯一の炭素源）として多糖体、又はその他の糖組成などで成長することができる本明細書に記述した微生物によって「適切な単糖」、又は「適切なオリゴ糖」などのその他の「適切なサッカライド」に変換してもよい。
【０１１０】
「適切な単糖」、又は「適切なサッカライド」は、一般に、供与源、又は唯一の炭素源としてペクチン、アルギナート、又はその他のサッカライド（例えば、ガラクツロナート、セルロース、ヘミセルロースその他）で成長する組換え微生物によって産生され得る任意のサッカライドをいい、更に一般に、生物燃料、又はバイオガソリンなどの炭化水素を産生するために本発明の生物燃料生合成経路に利用できる任意のサッカライドをいう。適切な単糖、又はオリゴ糖の例には、2-ケト-3-デオキシD-グルコナート（KDG）、D-マンニトール、グルロナート、マンヌロナート、マンニトール、リキソース、グリセロール、キシリトール、グルコース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、グルクロナート、ガラクツロナート、及びラムノース等を含むが、限定されない。本明細書に注目されるように、本明細書に使用される「適切な単糖」、又は「適切なサッカライド」は、本発明の操作された、若しくは組換えられた微生物によって産生してもよく、又は市販の供与源から得てもよい。
【０１１１】
本明細書に使用される「コモディティケミカル」の記述は、直接、又は生物燃料及び／若しくはバイオガソリンを含む本明細書に提供した方法の副産物として産生することができる任意の販売可能な、又は市場性のある化学物質を含む。「コモディティケミカル」の一般的な例には、生物燃料、ミネラル、重合体前駆体、脂肪アルコール、界面活性物質、可塑剤、及び溶媒を含むが、限定されない。本明細書に使用される「生物燃料」の記述には、少なくとも部分的に組換え微生物などの生物源に由来する固体、液体、又は気体燃料を含む。
【０１１２】
コモディティケミカルの例には、以下を含むが、限定されない：メタン、メタノール、エタン、エテン、エタノール、n-プロパン、1-プロペン、1-プロパノール、プロパナール、アセトン、プロピオナート、n-ブタン、1-ブテン、1‐ブタノール、ブタナール、ブタノエート、イソブタナール、イソブタノール、2-メチルブタナール、2-メチルブタノール、3-メチルブタナール、3-メチルブタノール、2-ブテン、2-ブタノール、2-ブタノン、2,3-ブタンジオール、3-ヒドロキシ-2-ブタノン、2,3-ブタンジオン、エチルベンゼン、エテニルベンゼン、2-フェニルエタノール、フェニルアセトアルデヒド、1-フェニルブタン、4-フェニル-1-ブテン、4-フェニル-2-ブテン、1-フェニル-2-ブテン、1-フェニル-2-ブタノール、4-フェニル-2-ブタノール、1-フェニル-2-ブタノン、4-フェニル-2-ブタノン、1-フェニル-2,3-ブタンジオール、1-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、4-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、1-フェニル-2,3-ブタンジオン、n-ペンタン、エチルフェノール、エテニルフェノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、1-(4-ヒドロキシフェニル)ブタン、4-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ブテン、4-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ブテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノール、4-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノン、4-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、4-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタノンジオン、インドリルエタン、インドリルエテン、2-(インドール-3-）エタノール、n-ペンタン、1-ペンテン、1-ペンタノール、ペンタナール、ペンタノアート、2-ペンテン、2-ペンタノール、3-ペンタノール、2-ペンタノン、3-ペンタノン、4-メチルペンタナール、4-メチルペンタノール、2,3-ペンタンジオール、2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、2,3-ペンタンジオン、2-メチルペンタン、4-メチル-1-ペンテン、4-メチル-2-ペンテン、4-メチル-3-ペンテン、4-メチル-2-ペンタノール、2-メチル-3-ペンタノール、4-メチル-2-ペンタノン、2-メチル-3-ペンタノン、4-メチル-2,3-ペンタンジオール、4-メチル-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、4-メチル-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、4-メチル-2,3-ペンタンジオン、1-フェニルペンタン、1-フェニル-1-ペンテン、1-フェニル-2-ペンテン、1-フェニル-3-ペンテン、1-フェニル-2-ペンタノール、1-フェニル-3-ペンタノール、1-フェニル-2-ペンタノン、1-フェニル-3-ペンタノン、1-フェニル-2,3-ペンタンジオール、1-フェニル-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、1-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、1-フェニル-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-フェニルペンタン、4-メチル-1-フェニル-1-ペンテン、4-メチル-1-フェニル-2-ペンテン、4-メチル-1-フェニル-3-ペンテン、4-メチル-1-フェニル-3-ペンタノール、4-メチル-1-フェニル-2-ペンタノール、4-メチル-1-フェニル-3-ペンタノン、4-メチル-1-フェニル-2-ペンタノン、4-メチル-1-フェニル-2,3-ペンタンジオール、4-メチル-1-フェニル-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、4-メチル-1-フェニル-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、1-(4-ヒドロキシフェ���ル)ペンタン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ペンテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンタノール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンタノール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ペンタンジオール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)ペンタン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンテン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンテン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ペンテン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンタノール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンタノール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ペンタノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ペンタノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ペンタンジオール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、1-インドール-3-ペンタン、1-(インドール-3)-1-ペンテン、1-(インドール-3)-2-ペンテン、1-(インドール-3)-3-ペンテン、1-(インドール-3)-2-ペンタノール、1-(インドール-3)-3-ペンタノール、1-(インドール-3)-2-ペンタノン、1-(インドール-3)-3-ペンタノン、1-(インドール-3)-2,3-ペンタンジオール、1-(インドール-3)-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、1-(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、1-(インドール-3)-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-(インドール-3-）ペンタン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ペンテン、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ペンテン、4-メチル-1-(インドール-3)-1-ペンテン、4-メチル-2-(インドール-3)-3-ペンタノール、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ペンタノール、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ペンタノン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ペンタノン、4-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ペンタンジオール、4-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ペンタンジオン、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ペンタノン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ヒドロキシ-3-ペンタノン、n-ヘキサン、1-ヘキセン、1‐ヘキサノール、ヘキサナール、ヘキサノアート、2-ヘキセン、3-ヘキセン、2-ヘキサノール、3-ヘキサノール、2-ヘキサノン、3-ヘキサノン、2,3-ヘキサンジオール、2,3-ヘキサンジオン、3,4-ヘキサンジオール、3,4-ヘキサンジオン、2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、3-ヒドロキシ-4-ヘキサノン、4-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、2-メチルヘキサン、3-メチルヘキサン、2-メチル-2-ヘキセン、2-メチル-3-ヘキセン、5-メチル-1-ヘキセン、5-メチル-2-ヘキセン、4-メチル-1-ヘキセン、4-メチル-2-ヘキセン、3-メチル-3-ヘキセン、3-メチル-2-ヘキセン、3-メチル-1-ヘキセン、2-メチル-3-ヘキサノール、5-メチル-2-ヘキサノール、5-メチル-3-ヘキサノール、2-メチル-3-ヘキサノン、5-メチル-2-ヘキサノン、5-メチル-3-ヘキサノン、2-メチル-3,4-ヘキサンジオール、2-メチル-3,4-ヘキサンジオン、5-メチル-2,3-ヘキサンジオール、5-メチル-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-2,3-ヘキサンジオール、4-メチル-2,3-ヘキサンジオン、2-メチル-3-ヒドロキシ-4-ヘキサノン、2-メチル-4-ヒドロキシ-3-ヘ��サノン、5-メチル-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、5-メチル-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、4-メチル-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、4-メチル-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、2,5-ジメチルヘキサン、2,5-ジメチル-2-ヘキセン、2,5-ジメチル-3-ヘキセン、2,5-ジメチル-3-ヘキサノール、2,5-ジメチル-3-ヘキサノン、2,5-ジメチル-3,4-ヘキサンジオール、2,5-ジメチル-3,4-ヘキサンジオン、2,5-ジメチル-3-ヒドロキシ-4-ヘキサノン、5-メチル-1-フェニルヘキサン、4-メチル-1-フェニルヘキサン、5-メチル-1-フェニル-1-ヘキセン、5-メチル-1-フェニル-2-ヘキセン、5-メチル-1-フェニル-3-ヘキセン、4-メチル-1-フェニル-1-ヘキセン、4-メチル-1-フェニル-2-ヘキセン、4-メチル-1-フェニル-3-ヘキセン、5-メチル-1-フェニル-2-ヘキサノール、5-メチル-1-フェニル-3-ヘキサノール、4-メチル-1-フェニル-2-ヘキサノール、4-メチル-1-フェニル-3-ヘキサノール、5-メチル-1-フェニル-2-ヘキサノン、5-メチル-1-フェニル-3-ヘキサノン、4-メチル-1-フェニル-2-ヘキサノン、4-メチル-1-フェニル-3-ヘキサノン、5-メチル-1-フェニル-2,3-ヘキサンジオール、4-メチル-1-フェニル-2,3-ヘキサンジオール、5-メチル-1-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、5-メチル-1-フェニル-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、4-メチル-1-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、4-メチル-1-フェニル-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、5-メチル-1-フェニル-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-1-フェニル-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)ヘキサン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ヘキセン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキセン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキセン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-1-ヘキセン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキセン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキセン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキサノール、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキサノール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキサノール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキサノール、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキサノン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキサノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヘキサノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヘキサノン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘキサンジオール、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘキサンジオール、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、5-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-1-(インドール-3-)ヘキサン、5-メチル-1-(インドール-3)-1-ヘキセン、5-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキセン、5-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキセン、4-メチル-1-(インドール-3)-1-ヘキセン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキセン、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキセン、5-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキサノール、5-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキサノール、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキサノール、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキサノール、5-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキサノン、5-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキサノン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ヘキサノン、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ヘキサノン、5-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ヘキサンジオール、4-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ヘキサンジオール、5-メチル-1-(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、5-メチル-1-(インドール-3)-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、4-メチル-1-(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ヘキサノン、4-メチル-1-(インドール-3)-2-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、5-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ヘキサンジオン、4-メチル-1-(インドール-3)-2,3-ヘキサンジオン、n-ヘプタン、1-ヘプテン、1-ヘプタノール、ヘプタナール、ヘプタノエート、2-ヘプテン、3-ヘプテン、2-ヘプタノール、3-ヘプタノール、4-ヘプタノール、2-ヘプタノン、3-ヘプタノン、4-ヘプタノン、2,3-ヘプタンジオール、2,3-ヘプタンジオン、3,4-ヘプタンジオール、3,4-ヘプタンジオン、2-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、3-ヒドロキシ-2-ヘプタノン、3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、2-メチルヘプタン、3-メチルヘプタン、6-メチル-2-ヘプテン、6-メチル-3-ヘプテン、2-メチル-3-ヘプテン、2-メチル-2-ヘプテン、5-メチル-2-ヘプテン、5-メチル-3-ヘプテン、3-メチル-3-ヘプテン、2-メチル-3-ヘプタノール、2-メチル-4-ヘプタノール、6-メチル-3-ヘプタノール、5-メチル-3-ヘプタノール、3-メチル-4-ヘプタノール、2-メチル-3-ヘプタノン、2-メチル-4-ヘプタノン、6-メチル-3-ヘプタノン、5-メチル-3-ヘプタノン、3-メチル-4-ヘプタノン、2-メチル-3,4-ヘプタンジオール、2-メチル-3,4-ヘプタンジオン、6-メチル-3,4-ヘプタンジオール、
6-メチル-3,4-ヘプタンジオン、5-メチル-3,4-ヘプタンジオール、5-メチル-3,4-ヘプタンジオン、2-メチル-3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、2-メチル-4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、6-メチル-3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、6-メチル-4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、5-メチル-3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、5-メチル-4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、2,6-ジメチルヘプタン、2,5-ジメチルヘプタン、2,6-ジメチル-2-ヘプテン、2,6-ジメチル-3-ヘプテン、2,5-ジメチル-2-ヘプテン、2,5-ジメチル-3-ヘプテン、3,6-ジメチル-3-ヘプテン、2,6-ジメチル-3-ヘプタノール、2,6-ジメチル-4-ヘプタノール、2,5-ジメチル-3-ヘプタノール、2,5-ジメチル-4-ヘプタノール、2,6-ジメチル-3,4-ヘプタンジオール、2,6-ジメチル-3,4-ヘプタンジオン、2,5-ジメチル-3,4-ヘプタンジオール、2,5-ジメチル-3,4-ヘプタンジオン、2,6-ジメチル-3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、2,6-ジメチル-4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、2,5-ジメチル-3-ヒドロキシ-4-ヘプタノン、2,5-ジメチル-4-ヒドロキシ-3-ヘプタノン、n-オクタン、1-オクテン、2-オクテン、1-オクタノール、オクタナール、オクタノアート、3-オクテン、4-オクテン、4-オクタノール、4-オクタノン、4,5-オクタンジオール、4,5-オクタンジオン、4-ヒドロキシ-5-オクタノン、2-メチルオクタン、2-メチル-3-オクテン、2-メチル-4-オクテン、7-メチル-3-オクテン、3-メチル-3-オクテン、3-メチル-4-オクテン、6-メチル-3-オクテン、2-メチル-4-オクタノール、7-メチル-4-オクタノール、3-メチル-4-オクタノール、6-メチル-4-オクタノール、2-メチル-4-オクタノン、7-メチル-4-オクタノン、3-メチル-4-オクタノン、6-メチル-4-オクタノン、2-メチル-4,5-オクタンジオール、2-メチル-4,5-オクタンジオン、3-メチル-4,5-オクタンジオール、3-メチル-4,5-オクタンジオン、2-メチル-4-ヒドロキシ-5-オクタノン、2-メチル-5-ヒドロキシ-4-オクタノン、3-メチル-4-ヒドロキシ-5-オクタノン、3-メチル-5-ヒドロキシ-4-オクタノン、2,7-ジメチルオクタン、2,7-ジメチル-3-オクテン、2,7-ジメチル-4-オクテン、2,7-ジメチル-4-オクタノール、2,7-ジメチル-4-オクタノン、2,7-ジメチル-4,5-オクタンジオール、2,7-ジメチル-4,5-オクタンジオン、2,7-ジメチル-4-ヒドロキシ-5-オクタノン、2,6-ジメチルオクタン、2,6-ジメチル-3-オクテン、2,6-ジメチル-4-オクテン、3,7-ジメチル-3-オクテン、2,6-ジメチル-4-オクタノール、3,7-ジメチル-4-オクタノール、2,6-ジメチル-4-オクタノン、3,7-ジメチル-4-オクタノン、2,6-ジメチル-4,5-オクタンジオール、2,6-ジメチル-4,5-オクタンジオン、2,6-ジメチル-4-ヒドロキシ-5-オクタノン、2,6-ジメチル-5-ヒドロキシ-4-オクタノン、3,6-ジメチルオクタン、3,6-ジメチル-3-オクテン、3,6-ジメチル-4-オクテン、3,6-ジメチル-4-オクタノール、3,6-ジメチル-4-オクタノン、3,6-ジメチル-4,5-オクタンジオール、3,6-ジメチル-4,5-オクタンジオン、3,6-ジメチル-4-ヒドロキシ-5-オクタノン、n-ノナン、1-ノネン、1‐ノナノール、ノナナール、ノナノアート、2-メチルノナン、2-メチル-4-ノネン、2-メチル-5-ノネン、8-メチル-4-ノネン、2-メチル-5-ノナノール、8-メチル-4-ノナノール、2-メチル-5-ノナノン、8-メチル-4-ノナノン、8-メチル-4,5-ノナンジオール、8-メチル-4,5-ノナンジオン、8-メチル-4-ヒドロキシ-5-ノナノン、8-メチル-5-ヒドロキシ-4-ノナノン、2,8-ジメチルノナン、2,8-ジメチル-3-ノネン、2,8-ジメチル-4-ノネン、2,8-ジメチル-5-ノネン、2,8-���メチル-4-ノナノール、2,8-ジメチル-5-ノナノール、2,8-ジメチル-4-ノナノン、2,8-ジメチル-5-ノナノン、2,8-ジメチル-4,5-ノナンジオール、2,8-ジメチル-4,5-ノナンジオン、2,8-ジメチル-4-ヒドロキシ-5-ノナノン、2,8-ジメチル-5-ヒドロキシ-4-ノナノン、2,7-ジメチルノナン、3,8-ジメチル-3-ノネン、3,8-ジメチル-4-ノネン、3,8-ジメチル-5-ノネン、3,8-ジメチル-4-ノナノール、3,8-ジメチル-5-ノナノール、3,8-ジメチル-4-ノナノン、3,8-ジメチル-5-ノナノン、3,8-ジメチル-4,5-ノナンジオール、3,8-ジメチル-4,5-ノナンジオン、3,8-ジメチル-4-ヒドロキシ-5-ノナノン、3,8-ジメチル-5-ヒドロキシ-4-ノナノン、n-デカン、1-デセン、1-デカノール、デカノアート、2,9-ジメチルデカン、2,9-ジメチル-3-デセン、2,9-ジメチル-4-デセン、2,9-ジメチル-5-デカノール、2,9-ジメチル-5-デカノン、2,9-ジメチル-5,6-デカンジオール、2,9-ジメチル-6-ヒドロキシ-5-デカノン、2,9-ジメチル-5,6-デカンジオネン-ウンデカン、1-ウンデセン、1-ウンデカノール、ウンデカナール、ウンデカノアート、n-ドデカン、1-ドデセン、1-ドデカノール、ドデカナール、ドデカノアート、n-ドデカン、1-デカデセン、1-ドデカノール、ドデカナール（ddodecanal）、ドデカノアート、n-トリデカン、1-トリデセン、1-トリデカノール、トリデカナール、トリデカノアート、n-テトラデカン、1-テトラデセン、1‐テトラデカノール、テトラデカナール、テトラデカノアート、n-ペンタデカン、1-ペンタデセン、1-ペンタデカノール、ペンタデカナール、ペンタデカノアート、n-ヘキサデカン、1-ヘキサデセン、1-ヘキサデカノール、ヘキサデカナール、ヘキサデカノアート、n-ヘプタデカン、1-ヘプタデセン、1-ヘプタデカノール、ヘプタデカナール、ヘプタデカノアート、n-オクタデカン、1-オクタデセン、1-オクタデカノール、オクタデカナール、オクタデカノアート、n-ノナデカン、1-ノナデセン、1-ノナデカノール、ノナデカナール、ノナデカノアート、エイコサン、1-エイコセン、1-エイコサノール、エイコサナール、エイコサノアート、3-ヒドロキシプロパナール、1,3-プロパンジオール、4-ヒドロキシブタナール、1,4-ブタンジオール、3-ヒドロキシ-2-ブタノン、2,3-ブタンジオール、1,5-ペンタンジオール、ホモシトラート、ホモイソシトラート、b-ヒドロキシアジパート、グルタラート、グルタルセミアルデヒド、グルタルアルデヒド、2-ヒドロキシ-1-シクロペンタノン、1,2-シクロペンタンジオール、シクロペンタノン、シクロペンタノール、(S)-2-アセトラクタート、(R)-2,3-ジヒドロキシ-イソバレレート、2-オキソイソバレレート、イソブチリル-CoA、イソブチレート、イソブチルアルデヒド、5-アミノペントアルデヒド、1,10-ジアミノデカン、1,10-ジアミノ-5-デセン、1,10-ジアミノ-5-ヒドロキシデカン、1,10-ジアミノ-5-デカノン、1,10-ジアミノ-5,6-デカンジオール、1,10-ジアミノ-6-ヒドロキシ-5-デカノン、フェニルアセトアルデヒド、1,4-ジフェニルブタン、1,4-ジフェニル-1-ブテン、1,4-ジフェニル-2-ブテン、1,4-ジフェニル-2-ブタノール、1,4-ジフェニル-2-ブタノン、1,4-ジフェニル-2,3-ブタンジオール、1,4-ジフェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニルブタン、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-1-ブテン、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-2-ブテン、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-2-ブタノール、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-2-ブタノン、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-2,3-ブタンジオール、1-(4-ヒデオキシフェニル)-4-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、1-(インドール-3)-4-フェニルブタン、1-(インドール-3)-4-フェニル-1-ブテン、1-(インドール-3)-4-フェニル-2-ブテン、1-(インドール-3)-4-フェニル-2-ブタノール、1-(インドール-3)-4-フェニル-2-ブタノン、1-(インドール-3)-4-フェニル-2,3-ブタンジオール、1-(インドール-3)-4-フェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)ブタン、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-1-ブテン、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブテン、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノール、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノン、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオール、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3-)ブタン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3)-1-ブテン、1-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3)-2-ブテン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3)-2-ブタノール、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3)-2-ブタノン、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-(インドール-3)-2,3-ブタンジオール、1-(4-ヒドロキシフェニル-4-(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、インドール-3-アセトアルデヒド、1,4-ジ(インドール-3-)ブタン、1,4-ジ(インドール-3)-1-ブテン、1,4-ジ(インドール-3)-2-ブテン、1,4-ジ(インドール-3)-2-ブタノール、1,4-ジ(インドール-3)-2-ブタノン、1,4-ジ(インドール-3)-2,3-ブタンジオール、1,4-ジ(インドール-3)-3-ヒドロキシ-2-ブタノン、スクシナートセミアルデヒド、ヘキサン-1,8-ジカルボン酸、3-ヘキセン-1,8-ジカルボン酸、3-ヒドロキシ-ヘキサン-1,8-ジカルボン酸、3-ヘキサノン-1,8-ジカルボン酸、3,4-ヘキサンジオール-1,8-ジカルボン酸、4-ヒドロキシ-3-ヘキサノン-1,8-ジカルボン酸、フコイダン、ヨウ素、クロロフィル、カロテノイド、カルシウム、マグネシウム、鉄、ナトリウム、カリウム、ホスフェート等。
【０１１３】
本明細書に使用される「最適化された」という記述は、本来の分子、又は本来の細胞の環境（例えば、所与のポリペプチド、又は野生型微生物の野生型配列）に関してその機能的な特徴を改善するために、ポリペプチドのアミノ酸配列の遺伝的変化によって、又はポリペプチドの周囲の細胞環境の変化／修飾によってなど、変化された生物活性を有する経路、遺伝子、ポリペプチド、酵素、又はその他の分子をいう。本明細書に記述した任意のポリペプチド、又は酵素を任意に「最適化」してもよく、本明細書に記述した任意の遺伝子、又はヌクレオチド配列は、任意に、最適化されたポリペプチド、又は酵素をコードしてもよい。本明細書に記述した任意の経路には、任意に、1つ以上の「最適化された」酵素、又は最適化された酵素若しくはポリペプチドをコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【０１１４】
典型的には、ポリペプチド、酵素、又はその他の分子の改善された機能的特徴は、単糖、又はオリゴ糖を生物燃料に変換するための生物学的経路（例えば、生合成経路、C-C結合経路）に使用するための、ポリペプチド、又はその他の分子の適合性に関する。従って、特定の実施態様は、「最適化された」生物学的経路の使用を想定する。例示的な「最適化された」ポリペプチドは、所与の微生物系、若しくは微生物における改善された発現及び／又は安定性を促進し、所望の基質に関するポリペプチド活性（例えば、誘導性、又は抑圧可能な活性）の制御を可能にし、細胞内のポリペプチドの局在化（例えば、細胞内局在化、細胞外分泌）を調整し、及び／又は所望の基質に関するポリペプチド活性の全体のレベルに効果を及ぼす（例えば、酵素活性を減少させる、又は増加させる）そのアミノ酸コード配列における1つ以上の変化、又は突然変異（例えば、点突然変異、欠失、異種配列の付加）を含んでいてもよい。また、ポリペプチド、又はその他の分子は、その他の変化の中で、「最適化された」ポリペプチド、若しくはその他の分子の発現（例えば、アップレギュレーション）、局在化、及び／若しくは活性を調節する経路を変化させることによって、又は望ましくない副産物の産生を最小化する経路を変化させることによってなど、その系、又は生体内の1つ以上の経路を変化させることにより、所与の微生物系、又は微生物で使用するために「最適化されて」いてもよい。このように、ポリペプチド、又はその他の分子は、その野生型アミノ酸配列、又は本来の化学構造を変化するか否かにかかわらず「最適化されて」もよい。最適化されたポリペプチド、又は生物学的経路は、例えば、当該技術分野において公知の技術に従って、所望の表現型のために、直接突然変異誘発によって、又は自然選択によって、行われてもよい。
【０１１５】
特定の態様において、「最適化された」遺伝子、又はポリペプチドは、参照（例えば、野生型）遺伝子、又はポリペプチドのヌクレオチド配列、又はアミノ酸配列と50%〜99%同一（間の全ての整数を含む）であるヌクレオチドコード配列、又はアミノ酸配列を含み得る。特定の態様において、「最適化された」ポリペプチド、又は酵素は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100倍（間の全ての整数、及び小数点、例えば1.2、1.3、1.4、1.5、5.5、5.6、5.7、60、70、その他を含む）、又はそれ以上の参照ポリペプチドの生物活性を有してもよい。
【０１１６】
また、特定の本発明の態様は、本明細書に記述した方法、及び組換え微生物に従って産生される生物燃料などのコモディティケミカルを含む。このような生物燃料（例えば、中鎖から長鎖アルカン）は、放射性炭素年代測定法技術により、従来の精練所によって粗製炭素源から産生される燃料などのその他の燃料から区別され得る。例えば、炭素は、2つの安定な、非放射性同位元素：炭素12（12C）、及び炭素13（13C）を有する。加えて、微量の不安定同位体炭素14（14C）が地球上にある。炭素14は、5730年の半減期を有し、より多くのこの同位元素を生じる大気中の窒素に対する宇宙線の絶え間ない衝撃がないならば、地球からずっと以前に消えていただろう。宇宙線相互作用によって生じる中性子は、大気における窒素分子（N2）の原子に対する以下の核反応に関与する：
【０１１７】
【化１】
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【０１１８】
植物、及びその他の光合成生物は、光合成によって大気の二酸化炭素を吸収する。多くの植物が動物によって摂取されるため、地球上のあらゆる生きた生物は、その存在の間に、その環境で常に炭素14を交換する。しかし、一旦生物体が死ぬと、この交換が停止し、炭素14の量は、放射性β崩壊を介して時間とともに段階的に減少する。
【０１１９】
採掘操作に由来する粗製油、及び天然の気体などの大部分の炭化水素に基づいた燃料は、圧縮、及び地質時代にわたる古代有機材料（すなわち、ケロジェン）の加熱の結果である。石油の形成は、典型的には、大部分が高温、及び／又は圧力における様々な吸熱反応において、炭化水素熱分解から生じる。今日の油は、無酸素条件下で多量に海、又は湖底面に沈殿した有史以前の動物プランクトン、及び藻類の保存された残骸から形成された（一方で、有史以前の陸上植物の残りは、石炭を形成する傾向があった）。地質時代にわたり、有機物は、汚泥と混合して、沈降物の重い層の下に埋まって、高レベルの熱、及び圧力を生じる（続成作用として知られる）。この過程は、有機物を、最初に世界中の種々のオイルシェールにおいて見いだされるケロジェンとして知られているろう様の材料へと、次いで更に加熱により、カタゲネシスとして知られている過程で液体、及びガス状炭化水素へと、化学的に変化を生じさせる。大部分の粗製油に由来する炭化水素に基づいた燃料は、地質時代にわたって炭素14減衰の過程を受けており、従って、ほとんど検出可能な炭素14はないであろう。対照的に、本発明の生活微生物によって産生される特定の生物燃料は、全ての他の現在生きているものに匹敵するレベル（すなわち、平衡レベル）で炭素14を含むであろう。このように、本発明の炭化水素に基づいた生物燃料の炭素12対炭素14の比を測定し、その比を粗製油に由来する炭化水素に基づいた燃料に対して比較することにより、本明細書に提供される方法によって産生された生物燃料は、炭化水素に基づいた燃料の典型的な供与源から構造的に区別することができる。
【０１２０】
本発明の実施態様は、多糖体を適切な単糖に変換するための方法であって、（a）多糖体を得ること；及び（b）多糖体を、組換え微生物、又はこのような微生物を含む微生物系と、多糖体を適切な単糖に変換するために十分な時間接触させることを含み、該微生物系は、（i）リアーゼ、及びヒドロラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子であって、該リアーゼ、及び／又はヒドロラーゼは、任意に少なくとも1つのシグナルペプチド、又は少なくとも1つの自己輸送体ドメインを含む、前記遺伝子；（ii）単糖輸送体、二糖輸送体、三糖輸送体、オリゴ糖輸送体、及び多糖体輸送体から選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子；並びに（iii）単糖デヒドロゲナーゼ、イソメラーゼ、デヒドラターゼ、キナーゼ、及びアルドラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子を含み、これにより多糖体を適切な単糖に変換する、前記方法を含む。
【０１２１】
或いは、特定の態様は、多糖体を適切な単糖に変換するための方法であって、（a）多糖体を得ること；及び（b）多糖体を微生物系と、多糖体を適切な単糖に変換するために十分な時間接触させることを含み、該微生物系は、（i）リアーゼ、及びヒドロラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子；（ii）スーパーチャンネルをコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子；並びに（iii）単糖デヒドロゲナーゼ、イソメラーゼ、デヒドラターゼ、キナーゼ、及びアルドラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子を含み、これにより多糖体を適切な単糖に変換する、前記方法を含んでいてもよい。
【０１２２】
特定の実施態様において、微生物系、又は単離された微生物は、唯一の炭素源、及び／又はエネルギーとして多糖（例えば、アルギナート、ペクチン、その他）を使用して成長することができる。「唯一の炭素源」は、一般に所与の増殖培地における唯一の炭素源として所与の炭素源で成長する能力をいう。
【０１２３】
アルギナートに関して、およそ50パーセントの海藻乾燥重量は、種々の糖組成を含み、その中で、アルギナート、及びマンニトールは、それぞれ30、及び15パーセントの海藻乾燥重量に対応する主成分である。ペクチンに関しては、大腸菌などの微生物が、一般に、合成生物学において宿主生物体であると考えられるが、またこのような微生物は、マンニトールを代謝することができるが、これらは、アルギナートを分解し、及び代謝する能力を完全に欠いている。この点に関しては、大腸菌などの多くの研究室微生物、又は野生型微生物は、唯一の炭素源としてアルギナートで成長することができない。同様に、大腸菌などの多くの生物体は、多くの食物老廃物において見いだされる多糖体であるペクチンを分解し、及び代謝できず、従って、唯一の炭素源としてペクチンで成長することができない。従って、本出願の実施態様は、唯一の炭素源、及び／又はエネルギーとして、アルギナート、及びペクチンなどの多糖体を使用することができる、大腸菌などの操作された微生物、又はこのような操作された微生物を含む微生物系を含む。
【０１２４】
アルギナートは、β-D-マンヌロナート（M）、及びα-D-グルロナート（G）（M、及びGは、C5-カルボキシル基に関してエピマーである）のブロック共重合体である。それぞれのアルギナートの重合体は、全てM（ポリM）、全てG（ポリG）、及び／又はM及びG（ポリMG）の混合物の領域を含む。アルギナートを利用して1つ以上の適切な単糖を産生するために、特定の本発明の態様は、アルギナートを分解するか、若しくは脱重合すること、及び炭素源、及び／又はエネルギーとしてそれを使用することができる操作された、若しくは組換え微生物、又は微生物系を提供する。この目的を達成する1つの手段として、このような組換え微生物は、微生物系にアルギナートリアーゼ（ALs）などの多糖体を分解するか、又は脱重合する酵素のセットを組み込んでもよい。
【０１２５】
ALsは、これらの触媒作用に応じて、主に2つの特有のサブファミリー：エンド作用(EC 4.2.2.3）、及びエキソ作用（EC 4.2.2.-）ALsに分類されている。エンド作用ALsは、これらの触媒特異性に基づいて更に分類されている；M特異的、及びG特異的ALs。エンド作用ALsは、β-除去メカニズムを介してランダムにアルギナートを切断し、アルギナートを主に二糖、三糖、及び四糖に脱重合する。それぞれのオリゴ糖の非還元末端におけるウロナートは、不飽和糖ウロナートである4-デオキシ-α-L-エリスロ-ヘキシ-4-エンピラノシルウロナートに変換される。エキソ作用ALsは、これらのオリゴ糖のさらなる脱重合を触媒して、不飽和単糖を放出し、これが、非酵素的に、α-ケト酸、4-デオキシ-α-L-エリスロ-ヘキソセルロース（DEHU）を含む単糖に変換され得る。操作された微生物系、又は単離された、操作された微生物の特定の実施態様は、アルギナートなどの水性又は海洋バイオマス多糖体をDEHUなどの単糖に分解し、又は脱重合するために、endoM-、endoG-、及びエキソ作用ALsを含んでいてもよい。
【０１２６】
また、本発明の実施態様は、海産藻類、軟体動物、並びにシュードモナス属（Pseudomonas）、ビブリオ属（Vibrio）、及びスフィンゴモナス属（Sphingomonas）などの多様な微生物を含むが限定されない、種々の供与源から単離されたアルギナートリアーゼなどのリアーゼを含んでいてもよい。多くのアルギナートリアーゼは、エンド作用M特異的であり、いくつかは、G特異的であり、かつ少数しかエキソ作用ではない。例えば、スフィンゴモナス種株A1から単離されたALsは、5つのエンド作用ALsであるA1-I、A1-II、A1-II I'、A1-III、及びA1-IV I'、並びにエキソ作用ALであるA1-IVを含む。
【０１２７】
典型的には、A1-I、A1-II、及びA1-IIIは、それぞれ66kDa、25kDa、及び40kDaの分子量を有する。AI-II、及びAI-IIIは、A1-Iの自己スプライシング産物である。AI-IIは、Gに対してより特異的であろうし、A1-IIIは、Mに対して特異的であろう。A1-Iは、M、及びGに対して高活性を有するであろう。A1-IVは、約85kDaの分子量を有し、かつオリゴアルギナートの外溶解性（exo-lytic）の脱重合を触媒する。とはいえ、A1-II'、及びA1-IV I'は両方とも、A1-II、及びA1-IVの機能的相同体である。AI-II'は、外溶解性の活性を有し、かつM、又はGに対する選択性を有さないであろう。A1-IVは、主に内溶解性（endo-lytic）の活性を有する。これらのALsに加えて、アグロバクテリウム・チュメファシエンスに由来する外溶解性のALであるAtu3025は、オリゴアルギナートの脱重合に対して高活性を有し、本発明の特定の実施態様に使用してもよい。特定の実施態様は、A1-I、A1-II'、A1-IV、及びAtu3025をコードする遺伝子を微生物系、又は単離された微生物に組み込んでいてもよく、大腸菌などの適切な宿主生物のための最適なコドン使用を含んでいてもよい。
【０１２８】
本明細書に利用できるアルギナートリアーゼ、又はオリゴアルギナートリアーゼの特定の例は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスから単離されたオリゴアルギナートリアーゼAtu3025のヌクレオチド（配列番号：67）、及びポリペプチド（配列番号：68）配列を示す配列番号：67〜68に対して少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、98%、若しくはそれ以上（間の全ての整数を含む）の配列同一性を共有する酵素、又はポリペプチドを含む。本明細書に利用してもよいアルギナートリアーゼの特定の例は、図37に記述したアルギナートリアーゼ酵素、並びにビブリオ・スプレンディダス由来のVs24254によってコードされる分泌されるアルギナートリアーゼに対して少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、98%、又はそれ以上（間の全ての整数を含む）の配列同一性を共有する酵素、又はポリペプチドを含む。
【０１２９】
特定の実施態様において、微生物系、又は組換え微生物は、リアーゼにシグナルペプチド、又は自己輸送体ドメインを組み込むことなどによって、リアーゼ、又はアルギナートリアーゼ（ALs）を培地に分泌し、又は示すように操作してもよい。この点に関して、典型的には、細菌は、少なくとも4つの異なる型のタンパク質分泌機構（I型、II型、III型、及びIV型）を有することがよく理解されている。例えば、大腸菌では、II型分泌機構が組換えタンパク質の分泌のために使用される。II型分泌機構には、二段階の過程：シグナルペプチドでタグを付けた成熟前タンパク質の周辺質画分への転位置、及び成熟タンパク質へのプロセシング、続く培地への分泌を含み得る。
【０１３０】
第1の過程は、3つの異なる経路：secB依存的経路、シグナル識別粒子（SRP）経路、又は双-アルギニン転位置（TAT）経路のいずれかによって進行され得る。組換えタンパク質は、周辺質画分に分泌され得る。成熟タンパク質の運命は、タンパク質の型に依存して変化する。例えば、いくつかのタンパク質は、拡散によって自発的に、又は12-16タンパク質からなる分泌と命名された分泌装置によって受動的に分泌され、その他は、周辺質画分にとどまって最終的に分解される。
【０１３１】
また、いくつかのタンパク質は、自己輸送体ドメインを利用することなどにより、自己輸送体装置によって分泌され得る。自己輸送体ドメインによって分泌されるタンパク質は、典型的には、周辺質への転位置において役割を果たすN末端のシグナルペプチドを含み、これは、secB、若しくはSRP経路、パッセンジャードメイン、及び／又は特徴的なβ-バレル構造を有するC末端転位置ユニット（UT）によって媒介され得る。UTのβ-バレル部分は、外膜を越える水性のポアチャンネルを構築して、培地へのパッセンジャードメインの輸送を補助する。自己提示されたパッセンジャータンパク質は、たいてい自己輸送体によって切断されて、培地に遊離して置かれる。
【０１３２】
また、I型分泌機構は、大腸菌における組換えタンパク質の分泌のために使用され得る。I型分泌機構は、高分子量の毒素、及び細胞外酵素的分泌のために使用され得る。I型分泌機構は、ATP結合カセット（ABC）輸送体ファミリー、及び内因性外膜タンパク質（TolC）のメンバーである2つの内膜タンパク質（HlyB、及びHlyD）からなる。I型分泌機構に基づいた組換えタンパク質の分泌は、シグナル配列としてα-溶血素（HlyA）のC末端領域を利用し得る。組換えタンパク質は、I型分泌機構を介して内膜、周辺質、及び外膜を容易に通過し得る。
【０１３３】
本出願の種々の実施態様によって利用されるリンカー、及びシグナルペプチドの型に応じて、自己輸送体、及びI型分泌機構の両方を、細胞表面提示機構に変化させることができる。或いは、細胞表面提示に特異的な系を使用してもよい。例えば、この系において、標的タンパク質は、枯草菌（Bacillus subtilis）の表面に天然のまま提示されるPgsAタンパク質（ポリ-γ-グルタミン酸シンテターゼ複合体）に融合させてもよい。
【０１３４】
特定の実施態様は、I型、及びII型の両方の分泌機構によって分泌されるタンパク質において見いだされる種々のシグナルペプチド、並びに／又は自己輸送体ドメインと融合されたアルギナートリアーゼなどのリアーゼを含んでいてもよい。その他の実施態様は、本明細書に記述したか、又は当業者に公知のように、輸送機構で分泌されるタンパク質において見いだされるシグナルペプチド、及び、又は自己輸送体ドメインの任意の組み合わせと融合されたアルギナートリアーゼなどのリアーゼを含んでいてもよい。また、実施態様には、培地へのアルギナートリアーゼなどのリアーゼの分泌を最大にするために、実験的に再設計されたシグナルペプチド、又は自己輸送体ドメインを含んでいてもよく、更にまた、分泌の効率、又はリアーゼの細胞表面提示を改善するシグナルペプチド、リアーゼ、及び自己輸送体を融合する多くの異なるリンカー配列の使用を含んでいてもよい。
【０１３５】
特定の実施態様は、培地からサイトゾルに単糖（例えば、DEHU）、及びオリゴ糖を輸送して、炭素源、及び／又はエネルギーとしてこれらの単糖を効率的に利用することができるサッカライド輸送体を含む微生物系、又は単離された微生物を含んでいてもよい。例えば、DEHUパーミアーゼなどの単糖パーミアーゼ（すなわち、単糖輸送体）をコードする遺伝子は、炭素源、及び／又はエネルギーとしてアルギナートなどの多糖体で成長する細菌から単離してもよく、本微生物系、又は単離された微生物の実施態様に組み込まれてもよい。また、さらなる例として、実施態様には、単糖（例えば、DEHU）輸送のために特異的に変化された、再設計された天然のパーミアーゼ、又は輸送体を含んでいてもよい。
【０１３６】
この点に関しては、大腸菌は、単糖を輸送できるいくつかのパーミアーゼを含み、これには、2-ケト-3-デオキシ-D-グルコナート（KDG）輸送体のためのKdgT、D-ガラクツロナート及びD-グルクロナート輸送体などのアルドヘキシウロナートのためのExuT、グルコナート輸送体のためのGntT、GntU、GntP、及びGntT、並びにプロトン駆動されるα-ケトグルタラート輸送体のためのKgtPを含むが、限定されない。本明細書に記述した微生物系、又は組換え微生物は、当業者に公知であり、かつ本明細書において言及していないパーミアーゼに加えて、任意のこれらのパーミアーゼを含んでいてもよく、更にまた、DEHUなどのその他の単糖を輸送するように再設計されたパーミアーゼ酵素を含んでいてもよい。
【０１３７】
また、本発明に従った微生物系、又は組換え微生物は、培地から微生物の周辺質、又はサイトゾルへの単糖（例えば、D-マンヌロナート、及びD-リキソース）の輸送を触媒するパーミアーゼ／輸送体／スーパーチャンネル／ポリンを含んでいてもよい。例えば、土壌アエロモナス属のD-マンヌロナートのパーミアーゼをコードする遺伝子を、本明細書に記述したように微生物系に組み込んでもよい。
【０１３８】
一つの代わりの例として、微生物系、又は微生物は、D-マンヌロナート、及びD-リキソース輸送のためのなどの、効率的な単糖輸送機関のために、それらの特異性を変化させるように再設計された天然のパーミアーゼ／輸送体を含んでいてもよい。例えば、大腸菌は、D-マンノアート、及びD-リキソースなどの単糖、又は糖を輸送することができるいくつかのパーミアーゼを含み、2-ケト-3-デオキシ-D-グルコナート（KDG）輸送体のためのKdgT、D-ガラクツロナート、及びD-グルクロナート輸送体などのアルドヘキシウロナートのためのExuT、グルコナート／フルクツロナート輸送体のためのGntPTU、グルクロニド輸送体のためのuidB、L-フコース輸送体のためのfucP、ガラクトース輸送体のためのgalP、グリコラート輸送体のためのyghK、D-ガラクトナート輸送体のためのdgoT、ヘキソースリン酸輸送体のためのuhpT、オロタート／シトラート輸送体のためのdctA、グルコナート輸送体のためのgntUT、マルトース輸送体のためのmalEGF：D-アロース輸送体のためのalsABC、L-イドナート（idonate）／Dグルコナート輸送体のためのidnT、プロトンで駆動されるα-ケトグルタラート輸送体のためのKgtP、乳糖／ガラクトース輸送体のためのlacY、D-キシロース輸送体のためのxylEFGH、L-アラビノース輸送体のためのaraEFGH、及びD-リボース輸送体のためのrbsABCを含む。特定の実施態様において、微生物系、又は組換え微生物は、上記したようなパーミアーゼ、又は輸送体を含んでいてもよく、D-マンヌロナート、DEHU、及びD-リキソースなどの特定の単糖のインプロバイドされた（improvided）輸送のために再設計され、又は最適化されたものを含む。
【０１３９】
特定の態様には、「スーパーチャンネル」を含む組換え微生物を使用してもよく、これにより、アルギナートの重合体などの水性若しくは海洋バイオマス多糖体、又はペクチン重合体などの果実若しくは野菜バイオマスは、直接サイトゾルに組み込まれて、微生物系内部で分解されるであろう。例えば、スフィンゴモナド属（Sphingomonads）として特徴づけられる一群の細菌は、ポリ塩化多環芳香族（ジオキシン）などの環境的に危険な化合物を分解する広範な能力を有する。これらの細菌は、これらの細胞表面上に特徴的な大きなひだ状分子を含む。この点に関して、特定のスフィンゴモナド属は、細菌が直接巨大分子を吸収することを可能にする「スーパーチャンネル」として特徴づけられる構造を有する。
【０１４０】
スーパーチャンネルを含む微生物の一つの特定の例として、スフィンゴモナス種株A1は、スーパーチャンネルを介してアルギナートなどの多糖体を直接取り込む。このようなスーパーチャンネルは、外膜上のくぼみ（例えば、AlgR）、周辺質におけるアルギナートの結合タンパク質（例えば、AlgQ1、及びAlg Q2）、及びATP-結合カセット（ABC）輸送体（例えば、AlgM1、AlgM2、及びAlgS）から構成され得る。アルギナートなどの取り込まれた多糖類は、サイトゾルにおいて産生されるアルギナートリアーゼなどのリアーゼによって容易に脱重合され得る。従って、特定の実施態様は、この能力を微生物系、又は組換え微生物に導入するために、スーパーチャンネル（例えば、ccpA、algS、algM1、algM2、algQ1、algQ2）をコードする遺伝子を組み込んでいてもよい。その他の実施態様は、スーパーチャンネルをコードするプラスミド含む遺伝子を有し、かつ炭素源、及び／又はエネルギーとしてアルギナートなどの海洋、又は水性バイオマス多糖体を利用するための著しく改善された能力を有するスフィンゴモナス・サブアークチカ（Sphingomonas subarctica）IFO 16058Tなどの微生物を含んでいてもよい。特定の組換え微生物は、スフィンゴモナス・サブアークチカIFO 16058T内に含まれるこれらのスーパーチャンネルをコードするプラスミド配列を使用してもよい。
【０１４１】
本明細書に利用してもよいアルギナートのABC輸送体の特定の例は、ABC輸送体Atu3021、Atu3022、Atu3023、Atu3024、algM1、algM2、AlgQ1、AlgQ2、AlgS、OG2516_05558、OG2516_05563、OG2516_05568、及びOG2516_05573、並びにこれらの機能的変異体を含む。本明細書に利用してもよいアルギナートの共輸送体の特定の例は、とりわけ、共輸送体V12B01_24239、及びV12B01_24194を含み、これらの機能的な変異体を含む。アルギナートポリンのものさらなる例には、V12B01_24269、及びその変異体を含む。
【０１４２】
上記の如く、特定の実施態様は、1つ以上の単糖デヒドロゲナーゼ、イソメラーゼ、デヒドラターゼ、キナーゼ、及びアルドラーゼを含む組換え微生物を含んでいてもよい。単糖デヒドロゲナーゼに関して、特定の微生物系、又は組換え微生物は、種々の単糖（例えば、DEHU、マンヌロナート）を2-ケト-3-デオキシ-D-グルコナート（KDG）、又はD-マンニトールなどの生物燃料生合成のために適している単糖に還元させる酵素を組み込んでいてもよい。このような例示的な酵素には、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58から単離された新規のADH1〜ADH12酵素（例えば、配列番号：69〜92を参照されたい）などのDEHUヒドロゲナーゼ、及び／又はマンヌロナートデヒドロゲナーゼ活性を有する種々のアルコールデヒドロゲナーゼに加えて、例えばDEHUヒドロゲナーゼ、及びマンヌロナートヒドロゲナーゼを含む。
【０１４３】
ADH1〜ADH12酵素についての更なる詳細については、配列番号：69が、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58から単離されたADH1 Atu1557のヌクレオチドを示し、及び配列番号：70がポリペプチド配列を示す。配列番号：71は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58から単離されたADH2 Atu2022のヌクレオチドを示し、及び配列番号：72は、ポリペプチド配列を示す。配列番号：73は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58から単離されたADH3 Atu0626のヌクレオチドを示し、及び配列番号：74は、ポリペプチド配列を示す。
【０１４４】
配列番号：75は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58から単離されたADH4 Atu5240のヌクレオチドを示し、及び配列番号：76は、ポリペプチド配列を示す。配列番号：77は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58から単離されたADH5 Atu3163のヌクレオチドを示し、及び配列番号：78は、ポリペプチド配列を示す。配列番号：79は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58から単離されたADH6 Atu2151のヌクレオチドを示し、及び配列番号：80は、ポリペプチド配列を示す。
【０１４５】
配列番号：81は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58から単離されたADH7 Atu2814のヌクレオチドを示し、及び配列番号：82は、ポリペプチド配列を示す。配列番号：83は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58から単離されたADH8 Atu5447のヌクレオチドを示し、及び配列番号：84は、ポリペプチド配列を示す。配列番号：85は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58から単離されたADH9 Atu4087のヌクレオチドを示し、及び配列番号：86は、ポリペプチド配列を示す。
【０１４６】
配列番号：87は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58から単離されたADH10 Atu4289のヌクレオチドを示し、及び配列番号：88は、ポリペプチド配列を示す。配列番号：89は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58から単離されたADH11 Atu3027のヌクレオチドを示し、及び配列番号：90は、ポリペプチド配列を示す。配列番号：91は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58から単離されたADH12 Atu3026のヌクレオチドを示し、及び配列番号：92は、ポリペプチド配列を示す。
【０１４７】
デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素のさらなる例は、Atu3026、Atu3027、OG2516_05543、OG2516_05538、及びV12B01_24244を含む。また、本発明の微生物、及び方法は、その最適化された変異体を含むこれらのヒドロゲナーゼ酵素の生物学的に活性な断片、及び変異体を利用してもよい。
【０１４８】
さらなる例として、唯一の炭素源、及びエネルギーとしてアルギナートを使用して成長したシュードモナス属（Pseudomonas）は、コファクターとしてNADPHを使用するDEHUヒドロゲナーゼ酵素を含み、NADP+が溶液に存在するときにより安定であり、かつ周囲pHにて活性である。従って、本明細書に記述した微生物系、又は組換え微生物の特定の実施態様は、種々の微生物に由来し、若しくはから得られるDEHU、又はマンヌロナートヒドロゲナーゼなどのヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組み込んでいてもよく、これらの微生物は、炭素源、及び／又はエネルギーとしてアルギナート、又はペクチンなどの多糖体で成長ができるであろう。
【０１４９】
特定の実施態様は、炭素源、及びエネルギーとしてD-マンヌロナート、又はD-リキソースなどの単糖で効率的に成長することができる微生物系の構成要素、又は単離された微生物を組み込んでいてもよい。例えば、アエロモナス属、及びアエロゲネス菌PRL-R3は、両方ともD-マンヌロナートヒドロゲナーゼ、及びD-リキソースイソメラーゼなどの単糖デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む。従って、特定の微生物系、又は組換え微生物は、炭素源、及びエネルギーとしてD-マンヌロナート、若しくはD-リキソースで成長することができる微生物を含む、アエロモナス属、アエロゲネス菌PRL-R3、又は種々のその他の適切な微生物由来のD-マンヌロナートヒドロゲナーゼ、及びD-リキソースイソメラーゼなどの単糖デヒドロゲナーゼを含んでいてもよい。
【０１５０】
特定の実施態様は、D-マンノナート、及びD-キシルロースなどの単糖を、KDGなどの生物燃料生合成経路のために適した単糖へ変換するための効率が増強された微生物系、又は単離された微生物を含んでいてもよい。単なる説明として、D-マンノナート、及びD-キシルロースは、大腸菌などの微生物における代謝産物である。D-マンノナートは、D-マンノナートデヒドラターゼによってKDGに変換される。D-キシルロースは、ペントースリン酸経路に入る。従って、D-マンノナートのKDGへの変換を増大するために、外来性、又は内因性D-マンノナートデヒドラターゼ（例えば、uxuA）遺伝子を本発明の組換え微生物に過剰発現させてもよい。同様に、他の実施例では、これらの遺伝子の最適化された変異体などのその生物学的に活性な変異体、又は断片を含む、キナーゼ（例えば、kdgK）、nad、並びにKDGアルドラーゼ（例えば、kdgA、及びeda）などの適切な内因性、若しくは外来性遺伝子を所与の組換え微生物に組み込んでも、又は過剰発現してもよい（配列番号：93〜96を参照されたい）。配列番号：93は、大腸菌DH10Bからの2-ケト-デオキシグルコナートキナーゼ（KdgK）のヌクレオチド配列を示し、及び配列番号：94は、ポリペプチド配列を示す。配列番号：95は、大腸菌DH10Bからの2-ケト-デオキシグルコナート-6-ホスフェートアルドラーゼ（KdgA）のヌクレオチド配列を示し、及び配列番号：96は、ポリペプチド配列を示す。
【０１５１】
特定の態様において、上記の如く、唯一の炭素源としてアルギナート、又はペクチンで成長することができる組換え微生物は、デヒラドラターゼ（dehyradratase）、キナーゼ、及び／又はアルドラーゼの天然に存在する、又は内因性コピーを利用してもよい。例えば、大腸菌は、多糖体の適切な単糖への変換における適切な工程を触媒することができる内因性デヒドラターゼ、キナーゼ、及びアルドラーゼを含む。これら、及びその他の関連した態様において、また、天然に存在するデヒドラターゼ、又はキナーゼは、高度に構成的、又は誘導性のプロモーターに動作可能に連結された天然に存在するデヒドラターゼ、キナーゼ、又はアルドラーゼの外来性コピーを提供することなどにより、過剰発現してもよい。
【０１５２】
唯一の炭素源としてアルギナートで成長するように組換え微生物を操作するための酵素の1つの例示的な供与源として、ビブリオ・スプレンディダスは、アルギナートを代謝して成長を補助することができることが知られている。例えば、配列番号：1は、II型分泌装置をコードする特定のビブリオ・スプレンディダス遺伝子（V12B01_02425〜V12B01_02480）を有するセクレトーム（secretome）領域を示す。配列番号：2は、V12B01_24189〜V12B01_24249の間の全てのゲノム領域のヌクレオチド配列を示し、これは、ビブリオ・スプレンディダスに由来し、かつフォスミドクローンとして大腸菌に形質転換されたときに、唯一の炭素源としてアルギナートで成長する能力を与えるために十分であった。配列番号：3〜64は、配列番号：2内に含まれる個々の推定上の遺伝子を示す。従って、特定の態様において、唯一の炭素源、及び／又はエネルギーとしてアルギナートで成長することができる組換え微生物（例えば、大腸菌）は、最適化された変異体などのその生物学的に活性な断片、又は変異体を含む、配列番号：1〜64に記述した1つ以上のヌクレオチド、又はポリペプチド参照配列を含んでいてもよい。
【０１５３】
特定の態様において、唯一の炭素源としてアルギナートで成長することができる組換え微生物は、配列番号：3〜64の配列、又は最適化された変異体を含むその生物学的に活性な断片、若しくは変異体などの、配列番号：2内に含まれる特定のコードするヌクレオチド、又はポリペプチド配列を含んでいてもよい。これらの配列は、下記に詳述してある。
【０１５４】
配列番号：3は、推定上のタンパク質V12B01_24184のヌクレオチドコード配列を示す。この推定上のコード配列は、配列番号：2のポリヌクレオチド配列内に含まれ、かつ自己輸送体接着、又はI型分泌標的ggxgxdxxx（配列番号：145）リピートに類似するポリペプチドをコードする。配列番号：4は、配列番号：3のポリヌクレオチドによってコードされる推定上のタンパク質V12B01_24184のポリペプチド配列を示す。この推定上のポリペプチドは、自己輸送体接着、又はI型分泌標的ggxgxdxxx（配列番号：145）リピートに類似する。
【０１５５】
配列番号：5は、推定上のタンパク質V12B01_24189をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：6は、シクロヘキサジエニルデヒドラターゼに類似する推定上のタンパク質V12B01_24189のポリペプチド配列を示す。
【０１５６】
配列番号：7は、推定上のタンパク質V12B01_24194をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：8は、Na／プロリン輸送体に類似する推定上のタンパク質V12B01_24194のポリペプチド配列を示す。
【０１５７】
配列番号：9は、推定上のタンパク質V12B01_24199をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：10は、ケト-デオキシ-ホスホグルコン酸アルドラーゼに類似する推定上のタンパク質V12B01_24199のポリペプチド配列を示す。
【０１５８】
配列番号：11は、推定上のタンパク質V12B01_24204をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：12は、2-デヒドロ-3-デオキシグルコン酸キナーゼに類似する推定上のタンパク質V12B01_24204のポリペプチド配列を示す。
【０１５９】
配列番号：13は、推定上のタンパク質V12B01_241209をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：14は、推定上のタンパク質V12B01_241209のポリペプチド配列を示す。
【０１６０】
配列番号：15は、推定上のタンパク質V12B01_24214をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：16は、コンドロイチンAC／アルギナートリアーゼに類似する推定上のタンパク質V12B01_24214のポリペプチド配列を示す。
【０１６１】
配列番号：17は、推定上のタンパク質V12B01_24219をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：18は、コンドロイチンAC／アルギナートリアーゼに類似する推定上のタンパク質V12B01_24219のポリペプチド配列を示す。
【０１６２】
配列番号：19は、推定上のタンパク質V12B01_24224をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：20は、2-ケト-4-ペンテン酸エステルヒドラターゼ/2-オキソヘプタ-3-エン-1,7-二酸ヒドラターゼに類似する推定上のタンパク質V12B01_24224のポリペプチド配列を示す。
【０１６３】
配列番号：21は、推定上のタンパク質V12B01_24229をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：22は、GntR-ファミリー転写制御因子に類似する推定上のタンパク質V12B01_24229のポリペプチド配列を示す。
【０１６４】
配列番号：23は、推定上のタンパク質V12B01_24234をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：24は、Na+／プロリン共輸送体に類似する推定上のタンパク質V12B01_24234のポリペプチド配列を示す。
【０１６５】
配列番号：25は、推定上のタンパク質V12B01_24239をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：26は、オリゴアルギナートのリアーゼに類似する推定上のタンパク質V12B01_24239のポリペプチド配列を示す。
【０１６６】
配列番号：27は、推定上のタンパク質V12B01_24244をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：28は、3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼに類似する推定上のタンパク質V12B01_24244のポリペプチド配列を示す。
【０１６７】
配列番号：29は、推定上のタンパク質V12B01_24249をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：30は、メチル基受容走化性タンパク質に類似する推定上のタンパク質V12B01_24249のポリペプチド配列を示す。
【０１６８】
配列番号：31は、推定上のタンパク質V12B01_24254をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：32は、アルギナートリアーゼに類似する推定上のタンパク質V12B01_24254のポリペプチド配列を示す。
【０１６９】
配列番号：33は、推定上のタンパク質V12B01_24259をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：34は、アルギナートリアーゼに類似する推定上のタンパク質V12B01_24259のポリペプチド配列を示す。
【０１７０】
配列番号：35は、推定上のタンパク質V12B01_24264をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：36は、推定上のタンパク質V12B01_24264のポリペプチド配列を示す。
【０１７１】
配列番号：37は、推定上のタンパク質V12B01_24269をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：38は、推定上のオリゴガラクツロナート特異的ポリンに類似する推定上のタンパク質V12B01_24269のポリペプチド配列を示す。
【０１７２】
配列番号：39は、推定上のタンパク質V12B01_24274をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：40は、アルギナートリアーゼに類似する推定上のタンパク質V12B01_24274のポリペプチド配列を示す。
【０１７３】
図32は、推定上のタンパク質V12B01_02425のヌクレオチドコード配列、及びポリペプチド配列を示す。図32Aは、推定上のタンパク質V12B01_02425をコードするヌクレオチド配列を示す（配列番号：41）。図32Bは、II型分泌経路成分EpsCに類似する推定上のタンパク質V12B01_02425のポリペプチド配列を示す（配列番号：42）。
【０１７４】
配列番号：43は、推定上のタンパク質V12B01_02430をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：44は、II型分泌経路成分EpsDに類似する推定上のタンパク質V12B01_02430のポリペプチド配列を示す。
【０１７５】
配列番号：45は、推定上のタンパク質V12B01_02435をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：46は、II型分泌経路成分EpsEに類似する推定上のタンパク質V12B01_02435のポリペプチド配列を示す。
【０１７６】
配列番号：47は、推定上のタンパク質V12B01_02440をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：48は、II型分泌経路成分EpsFに類似する推定上のタンパク質V12B01_02440のポリペプチド配列を示す。
【０１７７】
配列番号：49は、推定上のタンパク質V12B01_02445をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：50は、II型分泌経路成分EpsGに類似する推定上のタンパク質V12B01_02445のポリペプチド配列を示す。
【０１７８】
配列番号：51は、推定上のタンパク質V12B01_02450をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：52は、II型分泌経路成分EpsHに類似する推定上のタンパク質V12B01_02450のポリペプチド配列を示す。
【０１７９】
配列番号：53は、推定上のタンパク質V12B01_02455をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：54は、II型分泌経路成分EpsIに類似する推定上のタンパク質V12B01_02455のポリペプチド配列を示す。
【０１８０】
配列番号：55は、推定上のタンパク質V12B01_02460をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：56は、II型分泌経路成分EpsJに類似する推定上のタンパク質V12B01_02460のポリペプチド配列を示す。
【０１８１】
配列番号：57は、推定上のタンパク質V12B01_02465をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：58は、II型分泌経路成分EpsKに類似する推定上のタンパク質V12B01_02465のポリペプチド配列を示す。
【０１８２】
配列番号：59は、推定上のタンパク質V12B01_02470をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：60は、II型分泌経路成分EpsLに類似する推定上のタンパク質V12B01_02470のポリペプチド配列を示す。
【０１８３】
配列番号：61は、推定上のタンパク質V12B01_02475をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：62は、II型分泌経路成分EpsMに類似する推定上のタンパク質V12B01_02475のポリペプチド配列を示す。
【０１８４】
配列番号：63は、推定上のタンパク質V12B01_02480をコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号：64は、II型分泌経路成分EpsCに類似する推定上のタンパク質V12B01_02480をコードするヌクレオチド配列を示す。
【０１８５】
アルギナートで成長するように微生物を操作するための酵素のさらなる例示的な供与源として、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58は、唯一の炭素源、及びエネルギーとして比較的小さなサイズのアルギナートの分子（〜1000 mers）を代謝することができる。A. チュメファシエンスC58は、植物バイオテクノロジーのために長く使用されてきたため、この生物体の遺伝学は、比較的よく研究されており、多くの遺伝的ツールを利用でき、かつ大腸菌などのその他のグラム陰性菌と適合し得る。従って、特定の態様は、適切な単糖の産生のためにこの微生物、又はその中の遺伝子を使用してもよい。例えば、上記の如く、本開示は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58から得られたDEHU、及びマンヌロナートヒドロゲナーゼ活性を有する一連の新規ADH遺伝子を提供する（配列番号：67〜92を参照されたい）。
【０１８６】
上記の如く、特定の態様は、唯一の炭素源、及び／又はエネルギーとしてペクチンで成長することができる組換え微生物、又は微生物系を含んでいてもよい。ペクチンは、ペクチン-バックボーン（ホモガラクツロナン）を形成するα-(1-4)-連結されたD-ガラクツロン酸の直鎖である。このバックボーン内に、ガラクツロン酸が（1-2)-連結されたL-ラムノースによって置換される領域がある。種々の中性糖の側鎖は、典型的にはラムノースから、分岐する。このタイプのペクチンは、ラムノガラクツロナンIと呼ばれている。全体的に見て、主鎖の全ての第25番までのガラクツロン酸は、ラムノースで交換される。いくつかは、交互のガラクツロン酸、及びラムノースの「毛髪状領域」からなって伸び、ラムノースのよりも低密度であるその他は、「平滑領域」からなって伸びる。中性の糖は、主にD-ガラクトース、L-アラビノース、及びD-キシロースを含み；中性の糖のタイプ、及び比率は、ペクチンの起源により変化する。事実上、ガラクツロン酸の約80% カルボキシル基は、メタノールでエステル化されている。サトウダイコン、ジャガイモ、及び西洋ナシのようないくつかの植物は、メチルエステルに加えてアセチル化されたガラクツロン酸を伴ったペクチンを含む。アセチル化は、ゲル形成力を妨げるが、ペクチンの安定化効果、及び乳化効果を増加させる。特定のペクチン分解、及び代謝経路を図3に例示してある。
【０１８７】
上記の遺伝子、酵素、及び生物学的経路に加えて、特定の組換え微生物には、唯一の炭素源としてペクチンでの成長のために有用である特徴を組み込んでいてもよい。例えば、唯一の炭素源としてペクチンを分解し、及び代謝するために、ペクチンメチル、及びアセチルエステラーゼは、最初にペクチンに対するメチル、及びアセチルエステルの加水分解を触媒する。ペクチンメチルエステラーゼの例は、pemA、及びpmeBを含むが、限定されない。ペクチンアセチルエステラーゼの例は、PaeX、及びPaeYをを含むが、限定されない。本明細書に利用してもよいペクチンメチルエステラーゼのさらなる例は、図40のペクタートメチルエステラーゼに対して少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、98%、若しくはそれ以上（間の全ての整数を含む）の配列同一性を共有する酵素、又はポリペプチドを含む。本明細書に利用してもよいペクタートアセチルエステラーゼのさらなる例は、図41に記述したペクタートアセチルエステラーゼに対して少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、98%、若しくはそれ以上（間の全ての整数を含む）の配列同一性を共有する酵素、又はポリペプチドを含む。
【０１８８】
この目的に関して、ペクタートリアーゼ、及びヒドロラーゼは、それぞれβ除去、及び加水分解を介したペクタートの内溶解性切断を触媒して、オリゴペクタートを生成する。ペクチンを代謝されるために利用してもよいその他の酵素は、ペクタートリアーゼの例を含み、PelA、PelB、PelC、PelD、PelE、Pelf、PelI、PelL、及びPelZを含むが、限定されない。ペクタートヒドロラーゼの例は、PehA、PehN、PehV、PehW、及びPehXを含むが、限定されない。ペクタートリアーゼのさらなる例は、図38に記述したペクタートリアーゼに対して少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、98%、若しくはそれ以上（間の全ての整数を含む）の配列同一性を共有するポリペプチド、又は酵素を含む。
【０１８９】
また、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナンリアーゼ、及びラムノガラクツロナンヒドロリアーゼは、ペクチンを分解し、及び代謝するために本明細書において利用してもよい。ラムノガラクツロナンリアーゼの例は、図39Aに記述したラムノガラクツロナンリアーゼ（すなわち、ラムノガラクツロナーゼ）に対して少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、98%、若しくはそれ以上（間の全ての整数を含む）の配列同一性を共有するポリペプチド、又は酵素を含む。ラムノガラクツロナートヒドロリアーゼの例は、図39Bに記述したラムノガラクツロナートヒドロラーゼに対して少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、98%、若しくはそれ以上（間の全ての整数を含む）の配列同一性を共有するポリペプチド、又は酵素を含む。
【０１９０】
従って、ペクチンを分解し、及び代謝させるために、本発明の特定の組換え微生物、及び方法は、とりわけ、当該技術分野において公知の、上記のメチル、及びアセチルエステラーゼ、リアーゼ、並びに／又はヒドロラーゼの1つ以上を組み込んでいてもよい。これらの酵素は、内因性、又は外来性遺伝子によってコードされても、及び発現されてもよく、更にまた、これらの酵素的相同体、相同分子種、及び／又は最適化された変異体などのその生物学的に活性な断片、又は変異体を含んでいてもよい。
【０１９１】
ペクチンの分解生成物を更に代謝させるために、オリゴペクタートを、外膜ポリンによってグラム陰性菌の周辺質画分に輸送してもよく、ここでこれらは、ジ-、及びトリガラクトヌラートなどの成分に更に分解される。外膜ポリンの例は、オリゴペクタートを周辺質に運搬することができるものを含み、kdgN、及びkdgMを含むが、限定されない。特定の組換え微生物には、これら、又は同様の遺伝子を組み込んでいてもよい。
【０１９２】
ジ-、及びトリ-ガラクトヌラートは、さらなる分解のために、次いでサイトゾルに輸送され得る。細菌は、共輸送体、及びABC輸送体（例えば、それぞれTogT、及びTogMNAB）を含む、ジ-、及びトリ-ガラクツロナートの輸送を担う少なくとも2つの異なる輸送体系を含む。従って、本明細書において提供される特定の組換え微生物は、TogT、及び／又はTogMNABなどの1つ以上のジ-、又はトリ-ガラクツロナートの輸送体系を含んでいてもよい。
【０１９３】
一旦ジ-、及びトリガラクツロナートがサイトゾルに取り込まれたら、短いペクタート、又はガラクツロナートリアーゼが、これらをD-ガラクツロナート、及び（4S)-4,6-ジヒドロキシ-2,5-ジオキソヘキシウロナートに分解する。短いペクタート、又はガラクツロナートリアーゼの例には、PelW、及びOglを含むが、限定されず、これらの遺伝子は、本明細書に提供される特定の組換え微生物に内因的、又は外因的に組み込まれてもよい。次いで、D-ガラクツロナート、及び（4S)-4,6-ジヒドロキシ-2,5-ジオキソヘキシウロナートは、5-デヒドロ-4-デオキシ-D-グルクロナートに、及び更にKDGに変換され、これらの工程は、それぞれKduI、及びKduDによって触媒され得る。KduI酵素は、イソメラーゼ活性を有し、KduD酵素は、2-デオキシ-D-グルコナート3-デヒドロゲナーゼ活性などのデヒドロゲナーゼ活性を有する。従って、本明細書に提供される特定の組換え微生物は、PelW、及び／又はOglなどの1つ以上の短いペクタート、又はガラクツロナートリアーゼを含んでいてもよく、そしてジ-、及びトリガラクツロナートをKDGなどの適切な単糖に変換するために、KduIなどの1つ以上のイソメラーゼ、並びにKduDなどの1つ以上のデヒドロゲナーゼを任意に含んでいてもよい。
【０１９４】
特定の態様において、唯一の炭素源、及び／又はエネルギーとしてペクチン、又はトリ-ガラクツロナートで成長することができる大腸菌などの組換え微生物は、最適化された変異体などのその生物学的に活性な断片、又は変異体を含む、配列番号：65、及び66内に含まれる遺伝子配列の1つ以上を含んでいてもよい。配列番号：65は、エルウィニア・カロトボラ（Erwinia carotovora）亜種アトロセプチカ（Atroseptica） SCRI1043由来のkdgF-PaeX領域のヌクレオチド配列を示す。配列番号：66は、エルウィニア・カロトボラ亜種アトロセプチカSCRI1043からogl-kdgRのヌクレオチド配列を示す。
【０１９５】
特定の態様において、唯一の炭素源、及び／又はエネルギーとしてペクチン、又はトリ-ガラクツロナートで成長することができる大腸菌などの組換え微生物は、ジ-、及びトリガラクツロナートの分解を担う酵素（kduI、kduD、ogl、pelW、及びpaeX）、輸送体（togM、togN、togA、togB、及びkdgM）、及び調節タンパク質（kdgR）をコードするいくつかの遺伝子（kdgF、kduI、kduD、pelW、togM、togN、togA、togB、kdgM、paeX、ogl、及びkdgR）、並びにペクタートリアーゼ（pelA、及びpelE）、ペクチンアセチルエステラーゼ（paeY）、及びペクチンメチルエステラーゼ（pem）をコードするいくつかの遺伝子（pelA、pelE、paeY、及びpem）（実施例2を参照されたい）を含む、エルウィニア・クリサンセミ（Erwinia Chrisanthemi）の1つ以上のゲノムの領域を含んでいてもよい。
【０１９６】
本明細書に利用してもよいイソメラーゼのさらなる例は、ファミリーuxaCのものなどのグルコトナートイソメラーゼ、並びにファミリーKduIのものなどの4-デオキシ-L-スレオ-5-ヘキシウロースウロン酸イソメラーゼを含む。本明細書に利用してもよいレダクターゼのさらなる例は、ファミリーuxaBのものなどのタガツロナート（tagaturonate）レダクターゼを含む。本明細書に利用してもよいデヒアドラターゼ（dehyadratases）のさらなる例は、ファミリーuxaAのものなどのアルトロナートデヒドラターゼを含む。本明細書に利用してもよいデヒドロゲナーゼのさらなる例は、ファミリーkduDのものなどの2-デオキシ-D-グルコナート3-デヒドロゲナーゼを含む。
【０１９７】
また、特定の態様は、KDG分解経路の効率を増強するように操作された組換えまた微生物を利用してもよい。例えば、細菌において、KDGは、D-グルクロナート、及びD-ガラクツロナートなどのヘキシウロナートの分解における共通の代謝中間体であり、Entner Doudoroff経路に入って、そこでこれが、ピルベート、及びグリセルアルデヒド-3-ホスフェート（G3P）に変換される。この経路において、KDGは、最初にKDGキナーゼ（KdgK）によってリン酸化され、続いてその2-ケト-3-デオキシ-D-6-ホスフェート-グルコナート（KDPG）アルドラーゼ（KdgA）を使用してピルベート、及びグリセルアルデヒド-3-ホスフェート（G3P）への切断がなされる。KDGパーミアーゼ（例えば、KdgT）と同時のこれらの酵素の発現は、KdgRによってネガティブに調節され、及び基底レベルにてほとんど何もない。発現は、ヘキシウロナートの添加により劇的に誘導され（3〜5倍）、同様の結果がアルギナートで成長するシュードモナス属（Pseudomonas）において報告されていた。それ故、KDGのピルベート、及びG3Pへの変換を増やすために、ネガティブ制御因子KdgRを除去してもよい。更に経路効率を改善するために、また、KdgK、及びKdgAの外来性コピーを、所与の組換え微生物に組み込んでよい。
【０１９８】
特定の態様において、唯一の炭素源として多糖体（例えば、アルギナート、ペクチンなど）で成長することができる組換え微生物は、所与のコモディティケミカル（例えば、エタノール）の増加した量を産生することができ、一方でその多糖体で成長することができるであろう。例えば、アルギナートで成長するように操作された大腸菌は、アルギナートで成長するように操作されていない大腸菌と比較して、アルギナートからエタノールの増加した量を産生するように操作してもよい（実施例11を参照されたい）。従って、特定の態様は、その機能的変異体を含む、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（pdc）、及び／又はアルコールデヒドロゲナーゼをコードし、並びに発現する1つ以上の遺伝子を含むことなどにより、唯一の炭素源としてアルギナート、又はペクチンで成長することができ、かつエタノールの増加した量を産生することができる組換え微生物を含む。特定の態様において、このような組換え微生物は、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）から得られるピルビン酸デカルボキシラーゼ（pdc）、及び2つのアルコールデヒドロゲナーゼ（adhA、及びadhB）を含んでもよい。
【０１９９】
また、本発明の実施態様は、多糖体を適切な単糖に変換するための方法であって、（a）多糖体を得ること；（b）該多糖体を化学的触媒作用、又は酵素的経路と接触させ、これにより該多糖体を第1の単糖、又はオリゴ糖に変換すること；及び（c）該第1の単糖を微生物系と、第1の単糖又はオリゴ糖を適切な単糖に変換するために十分な時間接触させる工程であって、該微生物系は、（i）単糖輸送体、二糖輸送体、三糖輸送体、オリゴ糖輸送体、及び多糖体輸送体から選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝子；並びに（ii）単糖デヒドロゲナーゼ、イソメラーゼ、デヒドラターゼ、キナーゼ、及びアルドラーゼから選択される酵素をコードし、及び発現する少なくとも1つの遺伝を含む、工程を含み、これにより適切な単糖に多糖体を変換する方法を含む。
【０２００】
特定の本発明の態様において、アルギナートなどの水性又は海洋バイオマス多糖体は、酸などの化学触媒を使用して化学的に分解してもよい。同様に、バイオマス由来ペクチンは、化学的に分解してもよい。例えば、化学触媒によって触媒される反応は、酵素触媒によって触媒されるβ除去反応型とは対照的に、典型的には加水分解を介する。従って、特定の実施態様は、強力な鉱酸とアルギナート、又はペクチンを沸騰して、D-マンヌロナートから二酸化炭素を遊離し、これにより多くの微生物によって利用される共通の糖代謝産物であるD-リキソース形成することを含んでいてもよい。このような実施態様には、例えば、化学触媒として当該技術分野において公知のその他の適切な酸に加えて、ギ酸、塩酸、硫酸を使用してもよい。
【０２０１】
酵素的経路には、アルギナート、又はペクチンなどの多糖体の分解を触媒することができる本明細書に記述した1つ以上の酵素を利用してもよい。
【０２０２】
その他の実施態様には、バイオマスに関連した多糖体と共に使用するために適した化学的触媒作用の改善され、又は再設計された方法を含む、本明細書に記述したか、又は当業者に公知のもよと同様の化学的触媒作用のバリエーションを使用してもよい。特定の実施態様には、生じる単糖ウロナートがD-マンヌロナートであるものを含む。
【０２０３】
上記の如く、本発明の組換え微生物、及び微生物系によって産生される適切な単糖、又は適切なオリゴ糖は、生物燃料などのコモディティケミカルの産生におけるフィードストック、並びにコモディティケミカル中間体として利用してもよい。従って、本発明の特定の実施態様は、一般に、適切な単糖、又はオリゴ糖を生物燃料などのコモディティケミカルに変換するための方法であって、（a）適切な単糖、又はオリゴ糖を得ること；（b）該適切な単糖、又はオリゴ糖を微生物系と、該適切な単糖を生物燃料に変換するために十分な時間接触させ、これにより適切な単糖を生物燃料に変換することを含む方法に関する。
【０２０４】
特定の態様は、適切な単糖を生物燃料などの第1のコモディティケミカルに変換するための方法であって、（a）適切な単糖を得ること；（b）該適切な単糖を微生物系と、該適切な単糖を第1のコモディティケミカルに変換するために十分な時間接触させる工程であって、該微生物系が、アルデヒド、又はケトン生合成経路をコードする1つ以上の遺伝子を含む、前記工程を含み、これにより、該適切な単糖を第1のコモディティケミカルに変換する、前記方法を含む。
【０２０５】
これら、及びその他の関連した態様において、使用される特定のケトン、又はアルデヒド生合成経路に応じて、第1のコモディティケミカルは、更に酵素的、及び／又は化学的に第2のコモディティケミカルに還元され、並びに脱水されてもよい。このような第2のコモディティケミカルの例は、以下を含むが、限定されない：ブテン、又はブタン；1-フェニルブテン、又は1-フェニルブタン；ペンテン、又はペンタン；2-メチルペンテン、又は2-メチルペンタン；1-フェニルペンテン、又は1-フェニルペンタン；1-フェニル-4-メチルペンテン、又は1-フェニル-4-メチルペンタン；ヘキセン、又はヘキサン；2-メチルヘキセン、又は2-メチルヘキサン；3-メチルヘキセン、又は3-メチルヘキサン；2,5-ジメチルヘキセン、又は2,5-ジメチルヘキサン；1-フェニルヘキセン、又は1-フェニルヘキサン；1-フェニル-4-メチルヘキセン、又は1-フェニル-4-メチルヘキサン；1-フェニル-5-メチルヘキセン、又は1-フェニル-5-メチルヘキサン；ヘプテン、又はヘプタン；2-メチルヘプテン、又は2-メチルヘプタン；3-メチルヘプテン、又は3-メチルヘプタン；2,6-ジメチルヘプテン、又は2,6-ジメチルヘプタン；3,6-ジメチルヘプテン、又は3,6-ジメチルヘプタン；3-メチルオクテン、又は3-メチルオクタン；2-メチルオクテン、又は2-メチルオクタン；2,6-ジメチルオクテン、又は2,6-ジメチルオクタン；2,7-ジメチルオクテン、又は2,7-ジメチルオクタン；3,6-ジメチルオクテン、又は3,6-ジメチルオクタン；及びシクロペンタン、又はシクロペンテン。
【０２０６】
また、本発明の特定の実施態様は、適切な単糖、又はオリゴ糖をコモディティケミカルに変換するための方法であって、（a）適切な単糖、又はオリゴ糖を得ること；（b）該適切な単糖、又はオリゴ糖を微生物系と、適切な単糖、又はオリゴ糖をコモディティケミカルに変換するために十分な時間接触させる工程であって、該微生物系は、（i）生合成経路をコードする1つ以上の遺伝子；（ii）C-C結合経路をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子；並びに（iii）ジオールデヒドロゲナーゼ、ジオールデヒドラターゼ、及び二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む還元、及び脱水経路をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子を含む、前記工程を含み、これにより適切な単糖、又はオリゴ糖をコモディティケミカルに変換する、前記方法を含んでいてもよい。
【０２０７】
また、特定の態様は、（i）生合成経路をコードする1つ以上の遺伝子；（ii）C-C結合経路をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子；並びに（iii）ジオールデヒドロゲナーゼ、ジオールデヒドラターゼ、及び二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む還元、及び脱水経路をコードし、並びに発現する1つ以上の遺伝子を含む組換え微生物を含む。また、特定の態様には、本明細書に記述したような生合成経路をコードする1つ以上の遺伝子を含む組換え微生物などの、上記の経路を個々に、又は特定の組み合わせで含む組換え微生物を含む。また、特定の態様には、本明細書に記述したようなC-C結合経路をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子を含む組換え微生物を含んでいてもよい。また、特定の態様には、本明細書に記述したような、ジオールデヒドロゲナーゼ、ジオールデヒドラターゼ、及び二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む還元、及び脱水経路をコードし、並びに発現する1つ以上の遺伝子を含む、組換え微生物を含む。
【０２０８】
上記の経路の組み合わせを含む組換え微生物に関して、特定の態様は、（i）生合成経路をコードする1つ以上の遺伝子；並びに（ii）C-C結合経路をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子を含む、組換え微生物を含んでいてもよい。また、特定の態様は、（i）C-C結合経路をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子；並びに（ii）ジオールデヒドロゲナーゼ、ジオールデヒドラターゼ、及び二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む還元及び脱水経路をコードし、並びに発現する1つ以上の遺伝子を含む、組換え微生物を含んでいてもよい。
【０２０９】
また、特定の態様は、ジオールデヒドロゲナーゼ、ジオールデヒドラターゼ、又は二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む組換え微生物などの、脱水及び還元経路の1つ以上の個々の成分を含む組換え微生物を含んでいてもよい。これらの、及びその他の微生物は、例えば、適切な多糖体を第1のコモディティケミカル、若しくはその中間体に変換するために、又は第1のコモディティケミカル、若しくはその中間体を第2のコモディティケミカルに変換するために利用してもよい。
【０２１０】
単なる例証として、C-C結合経路を含む組換え微生物は、ブタナールを、5-ヒドロキシ-4-オクタノンなどの第1のコモディティケミカル、又はその中間体に変換するために利用してもよく、次いでこれを任意の適切な経路によって第2のコモディティケミカル若しくはその中間体に変換することができる。さらなる例として、C-C結合経路、及びジオールヒドロゲナーゼを含む組換え微生物は、ブタナールを、5-ヒドロキシ-4-オクタノン、及び次いで4,5-オクタノンジオールへの連続的な変換のために利用してもよい。本明細書に記述した個々の経路のこれらの、及びその他の種々の組み合わせ、並びにこれらの経路の個々の成分の種々の組み合わせを含む組換え微生物の例は、当業者に明らかであろうし、また実施例においても見いだされるであろう。
【０２１１】
また、アルデヒド、又はケトン生合成経路を含む組換え微生物を利用することなどにより、多糖体を第1のコモディティケミカル、又はその中間体に変換する方法が含まれる。また、任意に生合成経路を含み、任意にC-C結合経路を含み、及び／又は任意に脱水、及び還元経路の個々成分の1つ以上を含む組換え微生物を利用することなどにより、第1のコモディティケミカル、又はその中間体を第2のコモディティケミカルに変換する方法が含まれる。単なる例証として、外来性C-Cリガーゼ（例えば、蛍光菌からのベンズアルデヒドリアーゼ）を含む組換え微生物は、3-メチルブタナールなどの第1のコモディティケミカルを2,7-ジメチル-5-ヒドロキシ-4-オクタノンなどの第2のコモディティケミカル変換するための方法において利用することができる。この例証の系統に沿って、ジオールデヒドロゲナーゼを含む同じか、又は異なる組換え微生物は、2,7-ジメチル-5-ヒドロキシ-4-オクタノンを2,7-ジメチル-4,5-オクタンジオールなどの別のコモディティケミカルに変換するための方法に利用することができる（その他の例については、表2を参照されたい）。さらなる図解の例として、外来性二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む組換え微生物は、2,7-ジメチル-4-オクタノンなどの第1のコモディティケミカルを2,7-ジメチルオクタノールなどの第2のコモディティケミカルに変換するための方法に利用することができる。
【０２１２】
本出願の微生物系、又は単離された微生物の実施態様には、天然に存在する生合成経路、及び／又は機能性の改善ために最適化され、操作され、再構築され、若しくは再設計された生合成経路を含んでいてもよい。
【０２１３】
本発明の微生物系、又は組換え微生物の実施態様は、クロストリジウム・アセトブチリクム、及びストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）などの微生物において見いだされるような、ブチルアルデヒド生合成経路などの天然、又は再構築された生合成経路を含んでいてもよい。説明において、ブチラート、及びブタノールは、クロストリジウム（Clostridia）などの特定の細菌種の共通の発酵産物であり、ブチラート、及びブタノールの産生は、特徴として脂肪酸分解経路に同様の合成チオラーゼ依存的経路によって媒介される。このような経路は、チオラーゼによって触媒されるアセチルCoAのアセトアセチルCoAへの2分子の縮合を伴って開始され得る。次いで、アセトアセチルCoAは、NAD（P）H依存的β-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼ（HBDH）によって触媒されて、β-ヒドロキシブチリル-CoAに還元される。クロトナーゼは、β-ヒドロキシブチリル-CoAからの脱水を触媒してクロトニル-CoAを形成する。NADH依存的ブチリルCoAデヒドロゲナーゼ（BCDH）によって触媒されるさらなる還元により、クロトニル-CoAのC2における二重結合を飽和させてブチリル-CoAを形成する。
【０２１４】
特定の実施態様において、この経路における第1の酵素であるチオラーゼを過剰発現させて、産生を最大にしてもよい。特定の実施態様において、チオラーゼを大腸菌において過剰発現させてもよい。この点に関して、以下の反応段階を触媒する全ての3つの酵素（例えば、HBDH、クロトナーゼ、及びBCDH）がクロストリジウム・アセトブチリクム ATCC824において見いだされる。特定の実施態様において、BDH、クロトナーゼ、及びBCDHは、大腸菌などの適切な微生物において発現しても、又は過剰発現してもよい。或いは、プチダ菌KT2440に由来する短鎖脂肪族アシル−CoAデヒドロゲナーゼを本出願の微生物系、又は単離された微生物のその他の実施態様に利用してもよい。
【０２１５】
さらにこの目的のために、クロストリジウムのブチリル-CoAは、少なくとも少数の異なる経路によって、ブタノール、及び／又はブチラートに容易に変換させてもよい。1つの経路において、ブチリル-CoAは、NADH依存的にCoAをアシル化するアルデヒド脱水素酵素（ALDH）によって触媒され、ブチルアルデヒドに直接還元される。ブチルアルデヒドは、NADH依存的ブタノールデヒドロゲナーゼによってブタノールに更に還元され得る。CoAをアシル化するALDHは、ブチリル-CoAのブチルアルデヒドへの一段階還元を触媒するが、微生物系へのCoAをアシル化するALDHの組み込みは、その乱交雑なアセチルCoA脱アシル化活性のため、アセトアルデヒド形成を生じ得る。特定の実施態様において、アセトアルデヒドの形成は、機能的に関連した酵素（類）を再設計することによって最小化してもよい。
【０２１６】
その他の生合成経路におけるブチリル-CoAは脱アシル化され、ホスホトランスブチリルアーゼによって触媒され、ブチリルホスフェートを形成する。次いで、ブチリルホスフェートは、可逆的にブチリルリン酸キナーゼによって加水分解されてブチラートを形成する。この反応は、ADPからのATP産生と対でなされる。これらの酵素を介したブチラート形成は、相当に特異的であることが知られている。特定の実施態様は、微生物系にホスホトランスブチリルアーゼ、及びブチリルリン酸キナーゼを含んでいてもよい。その他の実施態様において、ブチラートは、短鎖アシルCoAチオエステラーゼによって、ブチリル-CoAから直接形成され得る。
【０２１７】
また、クロストリジウムのブチラートは、単一のアルコール／アルデヒド脱水素酵素によって触媒されて、ブタノールに連続して還元され得る。特定の実施態様は、微生物系におけるブチルアルデヒドの産生を補完するために、プチダ菌などのその他の細菌由来の短鎖アルデヒド脱水素酵素を含んでいてもよい。短鎖アルデヒド脱水素酵素を使用する際の1つの潜在的な懸念は、アセテートからアセトアルデヒドを形成する可能性を含む。特定の実施態様は、例えば、アセテート産生に関与する酵素をコードするいくつかの遺伝子を欠失させることにより、微生物系におけるアセテート形成を最小化することに向けられてもよい。
【０２１８】
その上、アセテートを形成するための大腸菌における複数の経路があり、その一つは、ピルベートからピルベートオキシゲナーゼ（POXB）によって媒介されるが、もう一つは、アセチルCoAからリン酸トランスアセチラーゼ（PTA）、及びアセチルリン酸キナーゼ（ACKA）によって媒介される。poxB-、pta-、及びacka-である大腸菌突然変異株からのアセテート産生は、有意に減弱される。加えて、アセテートからのアセチルCoA形成を触媒するアセチルCoAシンターゼ（ACS）の組み込みにより、有意にアセテートの蓄積を減少させることも知られている。特定の実施態様は、POXB、PTA、及び／又はACKA遺伝子が欠失された微生物系、又は単離された微生物を含んでいてもよく、及びその他の実施態様では、また、欠失された遺伝子とは別々に、又は共に、ACSをコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子を含んでいてもよい。
【０２１９】
また、本明細書に提供される微生物系、又は組換え微生物は、グルタルアルデヒド生合成経路を含んでいてもよい。一例として、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）は、アセチルCoAが最初にクエン酸回路における共通の代謝産物であるα-ケトグルタラートに縮合されてホモシトラートを形成する、リジン生合成経路を有する。この反応は、酵母、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、又はディノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）に由来するホモシトラートシンターゼによって触媒される。酵母、サーマス・サーモフィラス、又はディノコッカス・ラディオデュランスに由来するホモアコニターゼは、ホモシトラート、及びホモイソクエン酸との間の変換を触媒する。次いで、ホモイソクエン酸は、2-ケトアジパートに酸化的に脱炭酸され、これは、酵母、サーマス・サーモフィラス、又はディノコッカス・ラディオデュランスに由来するホモイソシトラートデヒドロゲナーゼによって触媒される。また、ホモイソクエン酸は、グルタリル-CoAに酸化的に脱炭酸され、これは、ホモイソシトラートデヒドロゲナーゼによって触媒され得る。従って、特定の実施態様は、ホモシトラートシンターゼ、ホモアコニターゼ、及び／又はホモイソシトラートデヒドロゲナーゼを含んでいてもよい。
【０２２０】
さらにこの目的のために、2-ケト-アジピクセミアルデヒド（adipicsemialdehyde）を合成する際に、2-ケトアジパートは、2-ケト-アジピクセミアルデヒドに還元される。この反応は、ジアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒することができ、これは、例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58から単離してもよい。従って、特定の実施態様では、ジアルデヒドデヒドロゲナーゼを微生物系、又は組換え微生物に組み込んでいてもよい。
【０２２１】
グルタルアルデヒドを合成する際に、アシルCoAチオエステラーゼ（ACOT）は、また、グルタリル-CoAの加水分解を触媒し得る。ω-カルボン酸アシルCoA特異的ペルオキシソームACOTをコードする遺伝子は、多くの哺乳動物種において見いだされており；マウスに由来するACOT4、及びACOT8は両方とも、大腸菌において以前に発現され、両酵素は、グルタリル-CoAの加水分解に対して非常に活性でグルタラートを形成することが示された。特定の実施態様では、1つ以上のアシルCoAチオエステラーゼを含んでいてもよい。
【０２２２】
グルタラートは、グルタルアルデヒドに連続して還元される。この反応は、グルタルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（CpnE）によって触媒することができ、これは、例えば、コモナス属（Comomonas）種株NCIMB 9872から単離され得る。特定の実施態様では、CpnEなどのグルタルアルデヒドデヒドロゲナーゼを微生物系、又は単離された微生物に組み込んでもよい。その他の実施態様では、ACOT、及びCpnE酵素を含んでいてもよい。その他の実施態様では、1-ヒドロキシプロパノアート及びスクシナートの1-ヒドロキシプロパナール及びコハク酸アルデヒドへの還元を触媒するように再設計されたCpnE酵素を含んでいてもよい。
【０２２３】
特定の態様において、生合成経路には、アルデヒド生合成経路、ケトン生合成経路、又は両方を含んでいてもよい。特定の態様において、生合成経路は、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、2-メチル-ブチルアルデヒド、3-メチル-ブチルアルデヒド、4-メチルペントアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、2-フェニルアセトアルデヒド、2-(4-ヒドロキシフェニル)アセトアルデヒド、2-インドール-3-アセトアルデヒド、グルタルアルデヒド、5-アミノ-ペントアルデヒド、スクシナートセミアルデヒド、及び／又はスクシナート4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド生合成経路の1つ以上を含んでもよく、これらの種々の組み合わせを含む。
【０２２４】
生合成経路の組み合わせに関して、生合成経路は、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、2-メチル-ブチルアルデヒド、3-メチル-ブチルアルデヒド、又はフェニルアセトアルデヒド生合成経路の少なくとも1つと組み合わせて、アセトアルデヒド生合成経路を含んでいてもよい。
【０２２５】
特定の態様において、生合成経路は、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、2-メチル-ブチルアルデヒド、3-メチル-ブチルアルデヒド、又はフェニルアセトアルデヒド生合成経路の少なくとも1つと組み合わせて、プロピオンアルデヒド生合成経路を含んでいてもよい。特定の態様において、生合成経路は、イソブチルアルデヒド、2-メチル-ブチルアルデヒド、3-メチル-ブチルアルデヒド、又はフェニルアセトアルデヒド生合成経路の少なくとも1つと組み合わせて、ブチルアルデヒド生合成経路を含んでいてもよい。特定の態様において、生合成経路は、2-メチル-ブチルアルデヒド、3-メチル-ブチルアルデヒド、又はフェニルアセトアルデヒド生合成経路の少なくとも1つと組み合わせて、イソブチルアルデヒド生合成経路を含んでいてもよい。特定の態様において、生合成経路は、3-メチル-ブチルアルデヒド、又はフェニルアセトアルデヒド生合成経路の少なくとも1つと組み合わせて、2-メチル-ブチルアルデヒド生合成経路を含んでいてもよい。特定の態様において、生合成経路は、フェニルアセトアルデヒド生合成経路と組み合わせて、3-メチル-ブチルアルデヒド生合成経路を含んでいてもよい。
【０２２６】
特定の態様において、プロピオンアルデヒド生合成経路は、大腸菌などの生物体からのトレオニンデアミナーゼ（ilvA）遺伝子、及びラクトコッカス・ラクティスなどの生物体からのケトイソバレラートデカルボキシラーゼ（kivd）遺伝子、並びに／又はこれらの相同体、若しくは相同分子種、並びに最適化された変異体を含むこれらの酵素の機能的変異体を含んでいてもよい。これらの酵素は、一般に、プロピオンアルデヒドにL-トレオニンを変換するために利用してもよい。
【０２２７】
特定の態様において、ブチルアルデヒド生合成経路は、大腸菌などの生物体からのチオラーゼ（atoB）遺伝子、クロストリジウム・アセトブチリクム（例えば、ATCC 824）などの生物体からのβ-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼ（hbd）遺伝子、クロトナーゼ（crt）遺伝子、ブチリルCoAデヒドロゲナーゼ（bcd）遺伝子、電子伝達フラボタンパク質（etfA）遺伝子、及び／又は電子伝達フラボタンパク質B（etfB）、並びにクロストリジウム・ベイエリンキイ・アセトブチリクム ATCC 824などの生物体からのコエンザイムA連結ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ald）遺伝子の少なくとも1つを含んでいてもよい。特定の態様において、クロストリジウム・アセトブチリクム ATCC 824などの生物体からのコエンザイムA連結アルコールデヒドロゲナーゼ（adhE2）遺伝子は、ald遺伝子に代わるものとして使用してもよい。
【０２２８】
特定の態様において、イソブチルアルデヒド生合成経路は、枯草菌などの生物体からのアセトラクタートシンターゼ（alsS）、又は肺炎桿菌亜種フェウモニエMGH 78578などの生物体からのals遺伝子を含んでいてもよい（コドン選択性は、大腸菌タンパク質発現のために最適化してもよい）。このような経路は、また、大腸菌などの生物体からのアセトラクタートリダクトイソメラーゼ（ilvC）、及び／又は2,3-ジヒドロキシイソバレラートエステルデヒドラターゼ（ilvD）遺伝子、並びにラクトコッカス・ラクティスなどの生物体からのケトイソバレラートデカルボキシラーゼ（kivd）遺伝子を含んでいてもよい。
【０２２９】
特定の態様において、3-メチルブチルアルデヒド、及び2-メチルブチルアルデヒド生合成経路は、枯草菌などの生物体からのアセトラクタートシンターゼ（alsS）遺伝子、又は肺炎桿菌亜種フェウモニエMGH 78578などの生物体からの（als）遺伝子を含んでいてもよい（コドン選択性は、大腸菌タンパク質発現のために最適化してもよい）。このような経路の特定の態様は、また、大腸菌などの生物体からのアセトラクタートリダクトイソメラーゼ（ilvC）、2,3-ジヒドロキシイソバレラートデヒドラターゼ（ilvD）、イソプロピルマラートシンターゼ（LeuA）、イソプロピルマラートイソメラーゼ（LeuC、及びLeuD）、及び3-イソプロピルマラートデヒドロゲナーゼ（LeuB）遺伝子、並びにラクトコッカス・ラクティスなどの生物体からのケトイソバレラートデカルボキシラーゼ（kivd）を含んでいてもよい。
【０２３０】
特定の態様において、フェニルアセトアルデヒド、及び4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド生合成経路は、以下の1つ以上を含んでいてもよい：大腸菌などの生物体からの3-デオキシ-7-ホスホヘプトウロナートシンターゼ（aroF、aroG、及びaroH）、3-デヒドロキナートシンターゼ（aroB）、3-デヒドロキナートデヒドラターゼ（aroD）、デヒドロシキマートレダクターゼ（aroE）、シキマートキナーゼII（aroL）、シキマートキナーゼI（aroK）、5-エノールピルビルシキマート-3-ホスフェートシンセターゼ（aroA）、コリスマートシンターゼ（aroC）、融合されたコリスマートムターゼP／プレフェナートデヒドラターゼ（pheA）、及び／又は融合されたコリスマートムターゼT／プレフェナートデヒドロゲナーゼ（tyrA）、並びにラクトコッカス・ラクティスなどの生物体からのケトイソバレラートデカルボキシラーゼ（kivd）遺伝子。
【０２３１】
特定の態様において、1,10-ジアミノ-5-デカノール、及び1,10-ジカルボキシル-5-デカノールの最終産生のためなどの、生合成経路は、ディノコッカス・ラディオデュランス、及び／又はサーマス・サーモフィラスなどの生物体からのホモシトラートシンターゼ、ホモアコニテートヒドラターゼ、ホモイソシトラートデヒドロゲナーゼ、及び／又はホモイソシトラートデヒドロゲナーゼ遺伝子、並びにケトアジパートデカルボキシラーゼ遺伝子、2−アミノアジパートトランスアミナーゼ遺伝子、及びL-2-アミノアジパート-6-セミアルデヒド：NAD+6-オキシドレダクターゼ遺伝子を含んでいてもよい。このような生合成経路は、α-ケトグルタラートを5-アミノペントアルデヒドに変換することができるであろう。
【０２３２】
特定の態様において、シクロペンタノール産生の一工程のためなどの、α-ケトアジパートセミアルデヒド生合成経路は、ディノコッカス・ラディオデュランス、及び／又はサーマス・サーモフィラスなどの生物体からのホモシトラートシンターゼ（hcs）、ホモアコニテートヒドラターゼ、及びホモイソシトラートデヒドロゲナーゼ遺伝子、並びにα-ケトアジパートデカルボキシラーゼ遺伝子を含んでいてもよい。このような生合成経路は、アセチルCoA、及びα-ケトグルタラートをα-ケトアジパートセミアルデヒドに変換することができるだろう。
【０２３３】
その他の類似する化学物質の中で、2-フェニルエタノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、及びインドール-3-エタノールなどの特定のコモディティケミカルの産生については、生合成経路（例えば、アルデヒド生合成経路）には、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ（IPDC）などのカルボキシラーゼ酵素をコードする1つ以上の遺伝子を任意に、又は更に含んでいてもよい。IPDCは、例えば、アゾスピリルム・ブラシレンセ（Azospirillum brasilense）、及びパエニバチルス・ポリミクサ（Paenibacillus polymyxa）E681などの微生物から得てもよい。この点に関して、IPDCを利用して、より効率的に種々のカルボン酸のデキサルボキシレーション（dexarboxylation）を触媒して対応するアルデヒドを形成し、これを、本明細書に詳述したように、レダクターゼ、又はデヒドロゲナーゼによってコモディティケミカルに更に変換することができる。
【０２３４】
特定の態様において、2-フェニルエタノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、及び2-(インドール-3-）エタノール生合成経路には、以下を含み得る：トランスケトラーゼ（tktA）、3-デオキシ-7-ホスホヘプトウロナートシンターゼ（aroF、aroG、及びaroH）、3-デヒドロキナートシンターゼ（aroB）、3-デヒドロキナートデヒドラターゼ（aroD）、デヒドロシキマートレダクターゼ（aroE）、シキマートキナーゼII（aroL）、シキマートキナーゼI（aroK）、5-エノールピルビルシキマート-3-ホスフェートシンセターゼ（aroA）、コリスマートシンターゼ（aroC）、融合されたコリスマートムターゼP／プレフェナートデヒドラターゼ（pheA）、大腸菌からの融合されたコリスマートムターゼT／プレフェナートデヒドロゲナーゼ（tyrA）遺伝子、ラクトコッカス・ラクティスからのケトイソバレラートデカルボキシラーゼ（kivd）、サッカロマイセス・セレビジエからのアルコールデヒドロゲナーゼ（adh2）、アゾスピリルム・ブラシレンセ（Azospirillum brasilense）からのインドール-3-ピルベートデカルボキシラーゼ（ipdc）、ロドコッカス属種ST-10からのフェニルエタノールレダクターゼ（par）、及び蛍光菌からのベンズアルデヒドリアーゼ（bal）。
【０２３５】
本明細書に記述した他の全ての経路に関して、本明細書に記述した生合成経路のそれぞれについての成分は、内因的、又は外因的に、組換え微生物に存在してもよい。所与の生合成経路の効率を改善するためには、例えば、内因性遺伝子を、その内因性遺伝子のさらなる（すなわち外来性）コピーを組換え微生物に導入することなどにより、アップレギュレートさせても、又は過剰発現させてもよい。また、このような経路は、遺伝子の内因性バージョンを、突然変異誘発を介して変化させることによって最適化して機能性を改善し、続いて微生物への変化させた遺伝子を導入してもよい。内因性遺伝子の発現は、当該技術分野において公知、及び本明細書に記述した技術に従ってアップレギュレート、若しくはダウンレギュレートしても、又は更に除去させてもよい。同様に、外因的に提供される遺伝子の発現レベルは、種々の構成的、又は誘導性プロモーターを使用することなどにより、要望通りに調節してもよい。このような遺伝子は、また、本明細書に記述され、及び当該技術分野において公知のとおり、「コドン最適化」させてもよい。また、その相同体、又は相同分子種を含む本明細書に記述した遺伝子、及び酵素の機能的な天然に存在する変異体も含まれる。
【０２３６】
微生物系、又は単離された微生物の特定の実施態様には、CC結合経路を含んでいてもよい。特定の態様において、CC結合経路は、C-Cリガーゼ、又は最適化されたC-CリガーゼなどのThDP依存的酵素を含んでいてもよい。例えば、8炭素単位分子（ブチロイン）は、2つの4炭素単位分子（ブチルアルデヒド）を共に縮合することにより作製され得る。ThDP依存的酵素は、C-C結合の破壊、及び形成の両方を触媒することが知られる一群の酵素であり、化学酵素的合成における触媒として利用されてきた。これらの酵素が触媒する化学反応の範囲は、α-ケト酸の脱炭酸、酸化的脱炭酸反応、カルボライゲーション、及びCC結合の切断の範囲にまで至る。
【０２３７】
少数の例を提供すると、蛍光菌からのベンズアルデヒドリアーゼ（BAL）、プチダ菌からのベンゾイルホルマートデカルボキシラーゼ（BFD）、及びザイモモナス・モビリスからのピルベートデカルボキシラーゼ（PDC）は、2つのアルデヒド間のカルボライゲーション反応を触媒し得る。BALは、これらの3つの酵素の中で基質として最も幅広いアルデヒドの範囲を受け入れ、とりわけ、本明細書に示したように、置換されたベンズアルデヒドからアセトアルデヒドまでの範囲である。BALは、2つのアルデヒド間に立体特異的カルボライゲーション反応を触媒して、α-ヒドロキシケトンを形成し、R配置について99%eeを上回る。2つのベンズアルデヒド分子からのベンゾイン形成は、BALによって触媒される優勢な反応であり、320μmol（ベンゾイン）mg（タンパク質)-1分-1ほどの速度で進行する。α-ヒドロキシケトンの形成は、ブチルアルデヒドを含む多くの異なるアルデヒドを使用して実施してもよい。
【０２３８】
また、BFD、及びPCDは、2つのアルデヒド分子間のカルボライゲーション反応を触媒し得る。BFD、及びPCDは、それぞれ相対的により大きな、及びより小さなアルデヒド分子を受け入れる。ベンズアルデヒド、及びアセトアルデヒドが存在すると、BFDは、ベンゾイン、及び（S)-α-ヒドロキシフェニルプロパノン（2S-HPP）の形成を触媒するが、PCDは、（R)-α-ヒドロキシフェニルプロパノン（2R-HPP）、及び（R)-α-ヒドロキシ2-ブタノン（アセトイン）の形成を触媒する。下記に詳述したように、本出願の特定の微生物系、又は単離された微生物は、蛍光菌からのベンズアルデヒドリアーゼ（BAL）、プチダ菌からのベンゾイルホルマートデカルボキシラーゼ（BFD）、及びザイモモナス・モビリスからのピルベートデカルボキシラーゼ（PDC）から選択される天然、又は最適化させたC-Cリガーゼ（ThDP依存的酵素）を含んでいてもよい。その他の実施態様は、最適化された変異体などのその生物学的に活性な変異体を含む、蛍光菌からのベンズアルデヒドリアーゼ（BAL）（それぞれヌクレオチド、及びポリペプチド配列を示す配列番号：143〜144参照されたい）を含んでいてもよい。
【０２３９】
本発明のC-C結合経路は、典型的にはリアーゼ酵素などの1つ以上のC-Cリガーゼを含む。例示的なリアーゼには、アセトアルデヒドリアーゼ、プロピオンアルデヒドリアーゼ、ブチルアルデヒドリアーゼ、イソブチルアルデヒドリアーゼ、2-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼ、3-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼ（イソヴェルアルデヒド（isoveraldehyde））、フェニルアセトアルデヒドリアーゼ、α-ケトアジパートカルボキシリアーゼ、ペントアルデヒドリアーゼ、4-メチル-ペントアルデヒドリアーゼ、ヘキサアルデヒドリアーゼ、ヘプタアルデヒドリアーゼ、オクタアルデヒドリアーゼ、4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドリアーゼ、インドールアセトアルデヒドリアーゼ、インドールフェニルアセトアルデヒドリアーゼを含むが、限定されない。特定の態様において、選択されたCCリガーゼ、又はリアーゼ酵素は、とりわけ、アセトアルデヒドリアーゼ活性、プロピオンアルデヒドリアーゼ活性、ブチルアルデヒドリアーゼ活性、及び／又はイソブチルアルデヒドリアーゼ活性などの上記の例証されたリアーゼ活性の1つ以上を有してもよい。
【０２４０】
上記の如く、C-Cリガーゼは、蛍光菌から単離されたベンズアルデヒドリアーゼ（配列番号：143〜144）、並びにベンズアルデヒドリアーゼの最適化された変異体などのこの参照配列の生物学的に活性な断片、又は変異体などのベンズアルデヒドリアーゼを含んでいてもよい。この点に関しては、特定の態様は、配列番号：143〜144に対して80%、85%、90%、95%、97%、98%、99% 配列同一性を有し、かつ本明細書に記述したように、カルボライゲーション反応を触媒することができ、又はC-Cリアーゼ活性を有するヌクレオチド配列、又はポリペプチド配列を含んでいてもよい。特定の態様において、BAL酵素は、G27、E50、A57、G155、P162、P234、D271、G277、G422、G447、D448、及び／又はG512を含む1つ以上の保存されたアミノ酸残基を含むであろう。
【０２４１】
蛍光菌は、それが補因子としてチアミンジホスフェート（ThDP）を使用してアシロイン結合を切断する酵素ベンズアルデヒドリアーゼを有するため、唯一の炭素、及びエネルギー源としてR-ベンゾインで成長することができる。本明細書に利用されるような、逆反応において、ベンズアルデヒドリアーゼは、高い基質、及び立体特異性で2つのアルデヒドのカルボライゲーションを触媒する。その他のタンパク質で構造に基づいた比較では、ベンズアルデヒドリアーゼが一群の密接に関連したThDP依存的酵素に属することを示す。これらの酵素のThDP補因子は、別々のドメインでこれらの2つの末端にて固定され、これらの間に比較的可動性のチアゾリウム環を橋かけする。ThDPの2つの末端を結合する残基は、十分に保存されているが、チアゾリウム部分のまわりの活性中心ポケットの裏打ちは、基の中で非常に変化する。BALのための活性部位は、例えば、Kneenらの文献（Biochimica et Biophysica Acta 1753：263-271（2005））、及びBrandtらの文献（Biochemistry 47：7734-43（2008））に記述されている。蛍光菌に由来するベンズアルデヒドリアーゼは、少なくともアセトアルデヒドリアーゼ活性、プロピオンアルデヒドリアーゼ活性、ブチルアルデヒドリアーゼ活性、3-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼ活性、ペントアルデヒドリアーゼ活性、4-メチルペントアルデヒドリアーゼ活性、ヘキサアルデヒドリアーゼ活性、フェニルアセトアルデヒドリアーゼ活性、及びオクタアルデヒドリアーゼ活性（表2を参照されたい）、とりわけ、インビボのリアーゼ活性（図48〜55を参照されたい）を有することが本明細書において証明された。
【０２４２】
特定の態様において、蛍光菌に由来するBAL、プチダ菌に由来するBFD、又はザイモモナス・モビリスに由来するPDCなどのC-Cリガーゼには、本明細書に詳述したものの例示的な組み合わせなどの、その他の組み合わせ、及び活性の中で、プロピオンアルデヒドリアーゼ活性、及び3-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼ活性の両方を有するリアーゼなどのリアーゼ活性の組み合わせでリアーゼを含み得る。単なる例証として、リアーゼ活性の組み合わせを有するリアーゼは、本明細書において、プロピオンアルデヒド／3-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼと称してもよい。
【０２４３】
ジオールデヒドロゲナーゼ、ジオールデヒドラターゼ、及び二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む脱水、並びに還元経路は、アルデヒド、ケトン、又は対応するアルコールを更に生物燃料などのコモディティケミカルに変換するために利用してもよい。
【０２４４】
この目的のために、脱水、及び還元経路は、1つ以上のジオールデヒドロゲナーゼを含んでいてもよい。「ジオールデヒドロゲナーゼ」は、一般に、α-ヒドロキシケトン、及び／又はその対応するジオールの可逆的な還元、並びに酸化を触媒する酵素をいう。微生物系、又は単離された微生物の特定の実施態様は、例えば4,5,オクタンジオールデヒドロゲナーゼを含む、α-ヒドロキシ-ケトンの還元を特異的に触媒するジオールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含んでいてもよい。4,5,オクタンジオールデヒドロゲナーゼなどのジオールデヒドロゲナーゼは、種々の生物体から単離して、微生物系、又は単離された微生物に組み込んでもよい。アルコールデヒドロゲナーゼの特定の群は、種々のα-ヒドロキシアルコールを酸化し、かつ種々のα-ヒドロキシケトン、及びα-ケトケトンを還元させる特徴的能力を有する。従って、また、「ジオールデヒドロゲナーゼ」の記述は、このようなアルコールデヒドロゲナーゼを包含し得る。
【０２４５】
例示的な生物体からのジオールデヒドロゲナーゼに関する例として、ハンゼヌラ・オフナエンシス（Hansenula ofunaensis）から単離されたグリセロールデヒドロゲナーゼは、広い基質特異性を有し、かつ1,2-オクタンを含む種々のα-ヒドロキシアルコールの酸化、並びに3-ヒドロキシ-2-ブタノン及び3,4-ヘキサンジオンを含む種々のα-ヒドロキシケトン及びα-ケトケトンの還元を触媒することができ、それぞれ、その天然の基質であるグリセロール、及びジヒドロキシアセトンと同等の活性をもつ（40〜200%）。一つの更なる例として、ハンゼヌラ・ポルモルファ（Hansenula polumorpha）DI-1において発見されるグリセロールデヒドロゲナーゼも同様に働く。特定の実施態様において、微生物系、又は組換え微生物は、ハンゼヌラ・オフナエンシスから単離されたグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子、ハンゼヌラ・ポルモルファDI-1から単離されたグリセロールデヒドロゲナーゼ、及び／又は肺炎桿菌からのメソ-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼを含んでいてもよい。その他の実施態様において、微生物系、又は単離された微生物は、とりわけ本明細書に詳細を示した4,5,オクタンジオールデヒドロゲナーゼを含んでいてもよい。また、ジオールデヒドロゲナーゼは、本明細書に記述したように、ラクトバチルス・ブレビスATCC 367、プチダ菌KT2440、及び肺炎桿菌MGH78578から得てもよい（実施例5を参照されたい）。
【０２４６】
例示的なジオールデヒドロゲナーゼは、以下を含むが、限定されない：2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、3,4-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、4,5-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、5,6-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、6,7-ドデカンジオールデヒドロゲナーゼ、7,8-テトラデカンジオールデヒドロゲナーゼ、8,9-ヘキサデカンジオールデヒドロゲナーゼ、2,5-ジメチル-3,4-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、3,6-ジメチル-4,5-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,7-ジメチル-4,5-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,9-ジメチル-5,6-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、1,4-ジフェニル-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、ビス-1,4-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、1,4-ジインドール-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、1,2-シクロペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,3-ペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,3-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,3-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、4-メチル-2,3-ペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、4-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、5-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、6-メチル-2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、3,4-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、3,4-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、3,4-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、3,4-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、3,4-ウンデカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3,4-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、5-メチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、6-メチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、7-メチル-3,4-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2,3-ペンタンジオールデヒドロゲナーゼ,1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2,3-ペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、4,5-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、4,5-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、4,5-ウンデカンジオールデヒドロゲナーゼ、4,5-ドデカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、3-メチル-4,5-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-4,5-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、8-メチル-4,5-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、5,6-ウンデカンジオールデヒドロゲナーゼ、5,6-ウンデカンジオールデヒドロゲナーゼ、5,6-トリデカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3,4-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、3-メチル-4,5-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-4,5-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-5,6-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、6,7-トリデカンジオールデヒドロゲナーゼ、6,7-テトラデカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3,4-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、3-メチル-4,5-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-4,5-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-5,6-ウンデカンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2,3-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-2,3-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2,3-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、7,8-ペンタデカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3,4-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、3-メチル-4,5-ウンデカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-4,5-ウンデカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-5,6-ドデカンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2,3-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-2,3-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2,3-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3,4-ウンデカンジオールデヒドロゲナーゼ、3-メチル-4,5-ドデカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-4,5-ドデカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-5,6-トリデカンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2,3-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-2,3-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2,3-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、2,5-ジメチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,6-ジメチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,7-ジメチル-3,4-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-4-メチル-2,3-ペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-4-メチル-2,3-ペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-4-メチル-2,3-ペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,6-ジメチル-4,5-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、3,8-ジメチル-4,5-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-4-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-4-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-4-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、2,8-ジメチル-4,5-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-5-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-5-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-5-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-6-メチル-2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-6-メチル-2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-6-メチル-2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-4-フェニル-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-4-フェニル-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-4-（4-ヒドロキシフェニル）-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、1,10-ジアミノ-5,6-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、1,4-ジ（4-ヒドロキシフェニル）-2,3-ブタンジオール、2,3-ヘキサンジオール-1,6-ジカルボン酸デヒドロゲナーゼ、等。
【０２４７】
特定の態様において、選択されたジオールデヒドロゲナーゼ酵素は、とりわけ、2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性、3,4-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ活性、及び／又は4,5-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ活性などの上記の例証されたジオールデヒドロゲナーゼ活性の1つ以上を有してもよい。
【０２４８】
特定の態様において、組換え微生物は、最適化された変異体などのその生物学的に活性な断片、又は変異体を含む、配列番号：97、99、及び101から選択されるヌクレオチド参照配列によってコードされるジオールデヒドロゲナーゼ、又は配列番号：98、100、及び102から選択されるポリペプチド配列を有する酵素を含んでいてもよい。また、特定の態様は、配列番号：97〜102に対して80%、85%、90%、95%、97%、98%、99% 配列同一性を有するヌクレオチド配列、又はポリペプチド配列を含んでいてもよい。
【０２４９】
その他の実施態様は、とりわけ、1-ヒドロキシプロパナール、スクシニックアルデヒド、及びグルタルアルデヒドの、それぞれ1,3-プロパンジオール、1,4-ブタンジオール、及び1,5ペンタンジオールへの還元のために再設計されたジオールデヒドロゲナーゼを含んでいてもよい。
【０２５０】
脱水、及び還元経路は、本明細書に記述したように、1つ以上のジオールデヒドラターゼを含んでいてもよい。「ジオールデヒドラターゼ」は、一般に、不可逆的なジオールの脱水を触媒する酵素をいう。例えば、この酵素は、オクタンジオールを脱水して、4-オクタンを形成するのに役立ち得る。少なくとも2つの異なるタイプのジオールデヒドラターゼ：その触媒作用について補酵素B12に対して依存的、及び非依存的グループがあることが認識されている。補酵素B12依存的ジオールデヒドラターゼは、α-ヒドロキシアルコールからアルデヒド、又はケトンへのラジカルを媒介した脱水反応を触媒することが知られている。例えば、肺炎桿菌からのジオールデヒドラターゼは、グリセロールの脱水を触媒して、β-ヒドロキシプロピルアルデヒドを形成し、基質として2,3-ブタンジオールを受け入れて、脱水反応を触媒して2-ブタノンを形成する。
【０２５１】
さらなる例として、酪酸菌は、補酵素B12非依存的ジオールデヒドラターゼを含む。図46は、酪酸菌から単離した補酵素B12非依存的ジオールデヒドラターゼ（dhaB1）、及び活性化因子（dhaB2）のインビボの生物活性を示す（実施例9を参照されたい）。46Aは、1,2-プロパンジオールからの1-プロパノールのインビボの産生を示し、図46Bは、メソ-2,3ブタンジオールからの2-ブタノールのインビボ産生を示し、及び図46Cは、トランス-1,2-シクロペンタンジオールからのシクロペンタノンのインビボ産生を示す。
【０２５２】
従って、本発明の特定の実施態様は、基質として、4,5-オクタンジオールなどの種々の基質に適応する、最適化され、又は再設計されたジオールデヒドラターゼを含んでいてもよく、本明細書に記述した、及び当該技術分野において公知である生物体の中で、肺炎桿菌、及び酪酸菌から単離され、並びに／又は最適化されたジオールデヒドラターゼを含んでいてもよい。
【０２５３】
例示的なジオールデヒドラターゼは、以下を含むが、限定されない：2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、3,4-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、4,5-オクタンジオールデヒドラターゼ、5,6-デカンジオールデヒドラターゼ、6,7-ドデカンジオールデヒドラターゼ、7,8-テトラデカンジオールデヒドラターゼ、8,9-ヘキサデカンジオールデヒドラターゼ、2,5-ジメチル-3,4-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、3,6-ジメチル-4,5-オクタンジオールデヒドラターゼ、2,7-ジメチル-4,5-オクタンジオールデヒドラターゼ、2,9-ジメチル-5,6-デカンジオールデヒドラターゼ、1,4-ジフェニル-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、ビス-1,4-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、1,4-ジインドール-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、1,2-シクロペンタンジオールデヒドラターゼ、2,3-ペンタンジオールデヒドラターゼ、2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、2,3-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、2,3-オクタンジオールデヒドラターゼ、2,3-ノナンジオールデヒドラターゼ、4-メチル-2,3-ペンタンジオールデヒドラターゼ、4-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、5-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、6-メチル-2,3-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、1-フェニル-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、1-インドール-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、3,4-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、3,4-オクタンジオールデヒドラターゼ、3,4-ノナンジオールデヒドラターゼ、3,4-デカンジオールデヒドラターゼ、3,4-ウンデカンジオールデヒドラターゼ、2-メチル-3,4-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、5-メチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、6-メチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、7-メチル-3,4-オクタンジオールデヒドラターゼ、1-フェニル-2,3-ペンタンジオールデヒドラターゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル))-2,3-ペンタンジオールデヒドラターゼ、1-インドール-2,3-ペンタンジオールデヒドラターゼ、4,5-ノナンジオールデヒドラターゼ、4,5-デカンジオールデヒドラターゼ、4,5-ウンデカンジオールデヒドラターゼ、4,5-ドデカンジオールデヒドラターゼ、2-メチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、3-メチル-4,5-オクタンジオールデヒドラターゼ、2-メチル-4,5-オクタンジオールデヒドラターゼ、8-メチル-4,5-ノナンジオールデヒドラターゼ、1-フェニル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、1-インドール-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、5,6-ウンデカンジオールデヒドラターゼ、5,6-ウンデカンジオールデヒドラターゼ、5,6-トリデカンジオールデヒドラターゼ、2-メチル-3,4-オクタンジオールデヒドラターゼ、3-メチル-4,5-ノナンジオールデヒドラターゼ、2-メチル-4,5-ノナンジオールデヒドラターゼ、2-メチル-5,6-デカンジオールデヒドラターゼ、1-フェニル-2,3-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-2,3-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、1-インドール-2,3-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、6,7-トリデカンジオールデヒドラターゼ、6,7-テトラデカンジオールデヒドラターゼ、2-メチル-3,4-ノナンジオールデヒドラターゼ、3-メチル-4,5-デカンジオールデヒドラターゼ、2-メチル-4,5-デカンジオールデヒドラターゼ、2-メチル-5,6-ウンデカンジオールデヒドラターゼ、1-フェニル-2,3-オクタンジオールデヒドラターゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-2,3-オクタンジオールデヒドラターゼ、1-インドール-2,3-オクタンジオールデヒドラターゼ、7,8-ペンタデカンジオールデヒドラターゼ、2-メチル-3,4-デカンジオールデヒドラターゼ、3-メチル-4,5-ウンデカンジオールデヒドラターゼ、2-メチル-4,5-ウンデカンジオールデヒドラターゼ、2-メチル-5,6-ドデカンジオールデヒドラターゼ、1-フェニル-2,3-ノナンジオールデヒドラターゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-2,3-ノナンジオールデヒドラターゼ、1-インドール-2,3-ノナンジオールデヒドラターゼ、2-メチル-3,4-ウンデカンジオールデヒドラターゼ、3-メチル-4,5-ドデカンジオールデヒドラターゼ、2-メチル-4,5-ドデカンジオールデヒドラターゼ、2-メチル-5,6-トリデカンジオールデヒドラターゼ、1-フェニル-2,3-デカンジオールデヒドラターゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-2,3-デカンジオールデヒドラターゼ、1-インドール-2,3-デカンジオールデヒドラターゼ、2,5-ジメチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、2,6-ジメチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、2,7-ジメチル-3,4-オクタンジオールデヒドラターゼ、1-フェニル-4-メチル-2,3-ペンタンジオールデヒドラターゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-4-メチル-2,3-ペンタンジオールデヒドラターゼ、1-インドール-4-メチル-2,3-ペンタンジオールデヒドラターゼ、2,6-ジメチル-4,5-オクタンジオールデヒドラターゼ、3,8-ジメチル-4,5-ノナンジオールデヒドラターゼ、1-フェニル-4-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-4-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、1-インドール-4-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、2,8-ジメチル-4,5-ノナンジオールデヒドラターゼ、1-フェニル-5-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-5-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、1-インドール-5-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、1-フェニル-6-メチル-2,3-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-6-メチル-2,3-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、1-インドール-6-メチル-2,3-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、1-（4-ヒドロキシフェニル）-4-フェニル-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、1-インドール-4-フェニル-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、1-インドール-4-（4-ヒドロキシフェニル）-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、1,10-ジアミノ-5,6-デカンジオールデヒドラターゼ、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル）-2,3-ブタンジオール、2,3-ヘキサンジオール-1,6-ジカルボン酸デヒドラターゼ等。
【０２５４】
特定の態様において、選択されたジオールデヒドラターゼ酵素は、とりわけ、2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ活性、3,4-ヘキサンジオールデヒドラターゼ活性、及び／又は4,5-オクタンジオールデヒドラターゼ活性などの上記の例証されたジオールデヒドラターゼ活性の1つ以上を有してもよい。
【０２５５】
特定の態様において、ジオールデヒドラターゼは、肺炎桿菌MGH 78578から得てもよく、この微生物、及びその他の微生物のpduCDE遺伝子からを含む。特定の態様において、組換え微生物は、最適化された変異体などのその生物学的に活性な断片、又は変異体を含む、配列番号：103、105、及び107から選択されるヌクレオチド参照配列によってコードされる1つ以上のジオールデヒドラターゼ、又は配列番号：104、106、及び108から選択されるポリペプチド配列を有する酵素を含んでいてもよい。また、特定の態様は、配列番号：103〜108に対して80%、85%、90%、95%、97%、98%、99% 配列同一性を有するヌクレオチド配列、又はポリペプチド配列を含んでいてもよい。 特定の態様において、配列番号：104のポリペプチドは、以下から選択されるものを含む特定の保存されたアミノ酸残基を含み得る。
【化２】
2010539988.tif 000004
【０２５６】
特定の態様において、ジオールデヒドラターゼは、配列番号：308〜311に対して80%、85%、90%、95%、97%、98%、99% 配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含んでいてもよい。配列番号：308は、肺炎桿菌亜種フェウモニエMGH 78578に由来するジオールデヒドラターゼ再活性化大サブユニットである、PduGのポリペプチド配列を示す。配列番号：309は、肺炎桿菌亜種フェウモニエMGH 78578に由来するジオールデヒドラターゼ再活性化小サブユニットである、PduHのポリペプチド配列を示す。配列番号：310は、酪酸菌からのB12非依存的グリセロールデヒドラターゼのポリペプチド配列を示す。配列番号：311は、酪酸菌からのグリセロールデヒドラターゼ活性化因子のポリペプチド配列を示す。特定の態様において、B12非依存的グリセロールデヒドラターゼは、
【化３】
2010539988.tif 000005
などの保存されたアミノ酸残基を含んでいてもよい。特定の態様において、B12非依存的グリセロールデヒドラターゼ活性化因子は、
【化４】
2010539988.tif 000006
を含む特定の保存されたアミノ酸残基を含んでいてもよい。
【０２５７】
脱水、及び還元経路は、本明細書に記述したように、1つ以上のアルコールデヒドロゲナーゼ、又は二級アルコールデヒドロゲナーゼを含んでいてもよい。脱水、及び還元経路の一部である「アルコールデヒドロゲナーゼ」、又は「二級アルコールデヒドロゲナーゼ」は、一般に、アルコールにアルデヒド、又はケトン置換基の変換を触媒する酵素をいう。例えば、4-オクタノンは、ブチロインの生物燃料への変換のための、二級アルコールデヒドロゲナーゼ一酵素工程によって、4-オクタノールに還元させてもよい。シュードモナス菌は、NAD+をコファクターとして使用して、4-オクタノールを4-オクタノンに酸化する少なくとも1つの二級アルコールデヒドロゲナーゼを発現する。別の例として、ロドコッカス・エリスロポリスATCC4277は、コファクターとしてNADHを使用して、3-デカノール、及び4-デカノールの酸化も触媒する酵素も使用して、中鎖から長鎖二次脂肪アルコールの酸化を触媒する。加えて、ノカルディア・フスカ（Norcadia fusca）AKU2123は、（S)-特異的な二級アルコールデヒドロゲナーゼを含む。
【０２５８】
二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、本明細書に記述したように、当該技術分野において公知の技術に従って、これらの生物体、及びその他の生物体から単離して、組換え生物体を微生物系に組み込んでもよい。特定の実施態様において、微生物系、又は単離された微生物は、シュードモナス菌、ロドコッカス・エリスロポリスATCC4277、ノカルディア・フスカAKU2123、又はその他の適切な生物体からの天然、又は最適化させた二級アルコールデヒドロゲナーゼを含んでいてもよい。
【０２５９】
二級アルコールデヒドロゲナーゼの例は、以下を含むが、限定されない：2-ブタノールデヒドロゲナーゼ、3-ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、4-オクタノールデヒドロゲナーゼ、5-デカノールデヒドロゲナーゼ、6-ドデカノールデヒドロゲナーゼ、7-テトラデカノールデヒドロゲナーゼ、8-ヘキサデカノールデヒドロゲナーゼ、2,5-ジメチル-3-ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、3,6-ジメチル-4-オクタノールデヒドロゲナーゼ、2,7-ジメチル-4-オクタノールデヒドロゲナーゼ、2,9-ジメチル-4-デカノールデヒドロゲナーゼ、1,4-ジフェニル-2-ブタノールデヒドロゲナーゼ、ビス-1,4-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノールデヒドロゲナーゼ、1,4-ジインドール-2-ブタノールデヒドロゲナーゼ、シクロペンタノールデヒドロゲナーゼ、2(又は3)-ペンタノールデヒドロゲナーゼ、2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、2(又は3)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼ、2(又は3)-オクタノールデヒドロゲナーゼ、2(又は3)-ノナノールデヒドロゲナーゼ、4-メチル-2(又は3)-ペンタノールデヒドロゲナーゼ、4-メチル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、5-メチル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、6-メチル-2(又は3)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2(又は3)-ブタノールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2(又は3)-ブタノールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2(又は3)-ブタノールデヒドロゲナーゼ、3(又は4)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼ、3(又は4)-オクタノールデヒドロゲナーゼ、3(又は4)-ノナノールデヒドロゲナーゼ、3(又は4)-デカノールデヒドロゲナーゼ、3(又は4)-ウンデカノールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3(又は4)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、5-メチル-3(又は4)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼ、6-メチル-3(又は4)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼ、7-メチル-3(又は4)-オクタノールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2(又は3)-ペンタノールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2(又は3)-ペンタノールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2(又は3)-ペンタノールデヒドロゲナーゼ、4(又は5)-ノナノールデヒドロゲナーゼ、4(又は5)-デカノールデヒドロゲナーゼ、4(又は5)-ウンデカノールデヒドロゲナーゼ、4(又は5)-ドデカノールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3(又は4)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼ、3-メチル-4(又は5)-オクタノールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-4(又は5)-オクタノールデヒドロゲナーゼ、8-メチル-4(又は5)-ノナノールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、4(又は5)-ウンデカノールデヒドロゲナーゼ、5(又は6)-ウンデカノールデヒドロゲナーゼ、5(又は6)-トリデカノールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3(又は4)-オクタノールデヒドロゲナーゼ、3-メチル-4(又は5)-ノナノールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-4(又は5)-ノナノールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-5(又は6)-デカノールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2(又は3)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2(又は3)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2(又は3)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼ、6(又は7)-トリデカノールデヒドロゲナーゼ、6(又は7)-テトラデカノールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3(又は4)-ノナノールデヒドロゲナーゼ、3-メチル-4(又は5)-デカノールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-4(又は5)-デカノールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-5(又は6)-ウンデカノールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2(又は3)-オクタノールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2(又は3)-オクタノールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2(又は3)-オクタノールデヒドロゲナーゼ、7(又は8)-ペンタデカノールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3(又は4)-デカノールデヒドロゲナーゼ、3-メチル-4(又は5)-ウンデカノールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-4(又は5)-ウンデカノールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-5(又は6)-ドデカノールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2(又は3)-ノナノールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2(又は3)-ノナノールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2(又は3)-ノナノールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3(又は4)-ウンデカノールデヒドロゲナーゼ、3-メチル-4(又は5)-ドデカノールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-4(又は5)-ドデカノールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-5(又は6)-トリデカノールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2(又は3)-デカノールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2(又は3)-デカノールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2(又は3)-デカノールデヒドロゲナーゼ、2,5-ジメチル-3(又は4)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼ、2,6-ジメチル-3(又は4)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼ、2,7-ジメチル-3(又は4)-オクタノールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-4-メチル-2(又は3)-ペンタノールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-メチル-2(又は3)-ペンタノールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-4-メチル-2(又は3)-ペンタノールデヒドロゲナーゼ、2,6-ジメチル-4(又は5)-オクタノールデヒドロゲナーゼ、3,8-ジメチル-4(又は5)-ノナノールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-4-メチル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-メチル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-4-メチル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、2,8-ジメチル-4(又は5)-ノナノールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-5-メチル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-5-メチル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-5-メチル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-6-メチル-2(又は3)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-6-メチル-2(又は3)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-6-メチル-2(又は3)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-フェニル-2(又は3)-ブタノールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-4-メチル-2(又は3)-ブタノールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-4-(4-ヒドロキシフェニル)-2(又は3)-ブタノールデヒドロゲナーゼ、1,10-ジアミノ-5-デカノールデヒドロゲナーゼ、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノールデヒドロゲナーゼ、2-ヘキサノール-1,6-ジカルボン酸デヒドロゲナーゼ、フェニルエタノールデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシフェニルエタノールデヒドロゲナーゼ、インドール-3-エタノールデヒドロゲナーゼ等。
【０２６０】
特定の態様において、選択されたアルコールデヒドロゲナーゼ、又は二級アルコールデヒドロゲナーゼは、とりわけ、2-ブタノールデヒドロゲナーゼ活性、3-ヘキサノールデヒドロゲナーゼ活性、及び／又は4-オクタノールデヒドロゲナーゼ活性などの上記の例証されたアルコールデヒドロゲナーゼ活性の1つ以上のを有してもよい。
【０２６１】
特定の態様において、組換え微生物は、最適化された変異体などのその生物学的に活性な断片、又は変異体を含む、配列番号：109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、及び141から選択されるヌクレオチド参照配列によってコードされる1つ以上の二級アルコールデヒドロゲナーゼ、又は配列番号：110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、及び142から選択されるポリペプチド配列を有する酵素を含んでいてもよい。特定の態様は、配列番号：109〜142に対して80%、85%、90%、95%、97%、98%、99% 配列同一性を有するヌクレオチド配列、又はポリペプチド配列をまた含んでいてもよい。
【０２６２】
上で言及した二級アルコールデヒドロゲナーゼ配列について、配列番号：109は、プチダ菌KT2440から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-1：PP_1946）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：110は、ポリペプチド配列である。配列番号：111は、プチダ菌KT2440から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-2：PP_1817）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：112は、ポリペプチド配列である。
【０２６３】
配列番号：113は、プチダ菌KT2440から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-3：PP_1953）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：114は、ポリペプチド配列である。配列番号：115は、プチダ菌KT2440から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-4：PP_3037）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：116は、ポリペプチド配列である。
【０２６４】
配列番号：117は、プチダ菌KT2440から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-5：PP_1852）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：118は、ポリペプチド配列である。配列番号：119は、プチダ菌KT2440から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-6：PP_2723）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：120は、ポリペプチド配列である。
【０２６５】
配列番号：121は、プチダ菌KT2440から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-7：PP_2002）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：122は、ポリペプチド配列である。配列番号：123は、プチダ菌KT2440から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-8：PP_1914）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：124は、ポリペプチド配列である。
【０２６６】
配列番号：125は、プチダ菌KT2440から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-9：PP_1914）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：126は、ポリペプチド配列である。配列番号：127は、プチダ菌KT2440から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-10：PP_3926）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：128は、ポリペプチド配列である。
【０２６７】
配列番号：129は、蛍光菌Pf-5から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-11：PFL_1756）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：130は、ポリペプチド配列である。配列番号：131は、肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-12：KPN_01694）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：132は、ポリペプチド配列である。
【０２６８】
配列番号：133は、肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-13：KPN_02061）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：134は、ポリペプチド配列である。配列番号：135は、肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-14：KPN_00827）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：136は、ポリペプチド配列である。
【０２６９】
配列番号：137は、肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-16：KPN_01350）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：138は、ポリペプチド配列である。配列番号：139は、肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-17：KPN_03369）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：140は、ポリペプチド配列である。配列番号：141は、肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578から単離した二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh-18：KPN_03363）のヌクレオチド配列であり、及び配列番号：142は、ポリペプチド配列である。
【０２７０】
特定の態様において、アルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、DEHUヒドロゲナーゼ）、二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2ADH）、これらの断片、変異体、若しくは誘導体、又はこのような活性部位を利用するその他の任意の酵素は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）、NADH、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP+）、又はNADPHの結合モチーフの少なくとも1つを含んでいてもよい。特定の実施態様において、NAD+、NADH、NADP+、又はNADPH結合モチーフは、
【化５】
2010539988.tif 000007
からなる群から選択してもよく；式中、Yは、アラニン、グリシン、及びセリンから独立して選択され、式中Gは、グリシンであり、及びXは、遺伝的にコードされるアミノ酸から独立して選択される。
【０２７１】
還元、及び脱水経路における工程の一例として、α-ヒドロキシシクロペンタノンは、1,2-シクロペンタンジオールに還元され得る。例えば、ハンゼヌラ・オフナエンシスから単離されたグリセロールデヒドロゲナーゼは、α-ヒドロキシケトン、及びα-ケトケトンの還元を選択し、及び非常に広い基質特異性を有する。ハンゼヌラ・ポルモルファに由来する同様のアルコールデヒドロゲナーゼ、及びメソ2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、同様の特性を有する。特定の実施態様は、1,2-シクロペンタンジオールデヒドロゲナーゼを微生物系、又は単離された微生物に組み込んでもよい。その他の実施態様は、ハンゼヌラ・オフナエンシス、ハンゼヌラ・ポルモルファ、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、又はその他の任意の適切な生物体からのグリセロールデヒドロゲナーゼを組み込んでいてもよい。
【０２７２】
例として、1,2-シクロペンタンジオールなどの化学物質、又は炭化水素は、還元、及び脱水経路の一酵素的工程として、脱水して、シクロペンタノンを形成してもよい。1,2-シクロペンタンジオールなどの化学物質の脱水を触媒し得る少なくとも2つの異なるタイプのジオールデヒドラターゼがある。還元、及び脱水経路を含む微生物系の特定の実施態様は、1,2-シクロペンタンジオールデヒドラターゼなどのジオールデヒドラターゼを含み得る。
【０２７３】
還元、及び脱水経路のための最後の酵素的工程において、α-ヒドロキシシクロペンタノン等の例示的な化学的のシクロペンタノールへの変換は、シクロペンタノンのシクロペンタノールへの還元を含み得る。この工程は、コモナス属種NCIMB 9872において見いだされ、かつその遺伝子（cpnA）が単離されているシクロペンタノールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る。微生物系、又は単離された微生物の特定の実施態様には、本明細書に記述したその他の中で、コモナス属種株NCIMB 9872のcpnAによって発現されるものなどのシクロペンタノールデヒドロゲナーゼを含んでいてもよい。
【０２７４】
下記の詳述したように、特定の実施態様において、選択されるC-C結合経路は、コモディティケミカル、又はその中間体を産生するために、還元、及び脱水経路の選択された成分、又は酵素と組み合わせて利用してもよい。
【０２７５】
例えば、特定の実施態様では、C -C結合経路がアセトアルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、及び2-ブタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がプロピオンアルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が3,4-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、3,4-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、及び3-ヘキサノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２７６】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がブチルアルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が4,5-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、4,5-オクタンジオールデヒドラターゼ、及び4-オクタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がブチルアルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が5,6-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、5,6-デカンジオールデヒドラターゼ、及び5-デカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２７７】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がブチルアルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が6,7-ドデカンジオールデヒドロゲナーゼ、6,7-ドデカンジオールデヒドラターゼ、及び6-ドデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がブチルアルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が7,8-テトラデカンジオールデヒドロゲナーゼ、7,8-テトラデカンジオールデヒドラターゼ、及び7-テトラデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２７８】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がブチルアルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が8,9-ヘキサデカンジオールデヒドロゲナーゼ、8,9-ヘキサデカンジオールデヒドラターゼ、及び8-ヘキサデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がイソブチルアルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2,5-ジメチル-3,4-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、2,5-ジメチル-3,4-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、及び2,5-ジメチル-3-ヘキサノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２７９】
さらなる実施態様は、C-C結合経路が2-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が3,6-ジメチル-4,5-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、3,6-ジメチル-4,5-オクタンジオールデヒドラターゼ、及び3,6-ジメチル-4-オクタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路が3-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2,7-ジメチル-4,5-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,7-ジメチル-4,5-オクタンジオールデヒドラターゼ、及び2,7-ジメチル-4-オクタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２８０】
さらなる実施態様は、C-C結合経路が3-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2,9-ジメチル-5,6-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、2,9-ジメチル-4,5-デカンジオールデヒドラターゼ、及び2,9-ジメチル-4-デカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がフェニルアセトアルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1,4-ジフェニル-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、1,4-ジフェニル-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、及び1,4-ジフェニル-2-ブタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２８１】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がフェニルアセトアルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路がビス-1,4-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、ビス-1,4-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、及びビス-1,4-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がフェニルアセトアルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1,4-ジインドール-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、1,4-ジインドール-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、及び1,4-ジインドール-2-ブタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２８２】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がα-ケトアジパートカルボキシリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1,2-シクロペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、1,2-シクロペンタンジオールデヒドラターゼ、及びシクロペンタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がアセトアルデヒド／プロピオンデヒド（propiondehyde）リアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2,3-ペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,3-ペンタンジオールデヒドラターゼ、及び2(又は3)-ペンタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２８３】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がアセトアルデヒド／ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、及び2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がアセトアルデヒド／ペントアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,3-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、及び2(又は3)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２８４】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がアセトアルデヒド／ヘキサアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2,3-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,3-オクタンジオールデヒドラターゼ、及び2(又は3)-オクタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がアセトアルデヒド／オクタアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2,3-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、2,3-ノナンジオールデヒドラターゼ、及び2(又は3)-ノナノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２８５】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がアセトアルデヒド／イソブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が4-メチル-2,3-ペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、4-メチル-2,3-ペンタンジオールデヒドラターゼ、及び4-メチル-2(又は3)-ペンタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がアセトアルデヒド／2-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が4-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、4-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、及び4-メチル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２８６】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がアセトアルデヒド／3-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が5-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、5-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、及び5-メチル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がアセトアルデヒド／4-メチル-ペントアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が6-メチル-2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、6-メチル-2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、及び6-メチル-2(又は3)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２８７】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がアセトアルデヒド／フェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-フェニル-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、及び1-フェニル-2(又は3)-ブタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がアセトアルデヒド／4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、及び1-(4-ヒドロキシフェニル)-2(又は3)-ブタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２８８】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がアセトアルデヒド／インドールアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-インドール-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、及び1-インドール-2(又は3)-ブタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がプロピオンアルデヒド／ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が3,4-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、3,4-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、及び3(又は4)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２８９】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がプロピオンアルデヒド／ペントアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が3,4-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、3,4-オクタンジオールデヒドラターゼ、及び3(又は4)-オクタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がプロピオンアルデヒド／ヘキサアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が3,4-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、3,4-ノナンジオールデヒドラターゼ、及び3(又は4)-ノナノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２９０】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がプロピオンアルデヒド／ヘプタアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が3,4-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、3,4-デカンジオールデヒドラターゼ、及び3(又は4)-デカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がプロピオンアルデヒド／オクタアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が3,4-ウンデカンジオールデヒドロゲナーゼ、3,4-ウンデカンジオールデヒドラターゼ、及び3(又は4)-ウンデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２９１】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がプロピオンアルデヒド／イソブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2-メチル-3,4-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3,4-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、及び2-メチル-3(又は4)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がプロピオンアルデヒド／2-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が5-メチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、5-メチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、及び5-メチル-3(又は4)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２９２】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がプロピオンアルデヒド／3-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が6-メチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、6-メチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、及び6-メチル-3(又は4)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がプロピオンアルデヒド／4-メチル-ペントアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が7-メチル-3,4-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、7-メチル-3,4-オクタンジオールデヒドラターゼ、及び7-メチル-3(又は4)-オクタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２９３】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がプロピオンアルデヒド、及びフェニルアセトアルデヒドの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-フェニル-2,3-ペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2,3-ペンタンジオールデヒドラターゼ、及び1-フェニル-2(又は3)-ペンタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がプロピオンアルデヒド／4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ペンタンジオールデヒドラターゼ、及び1-(4-ヒドロキシフェニル)-2(又は3)-ペンタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２９４】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がプロピオンアルデヒド／インドールアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-インドール-2,3-ペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2,3-ペンタンジオールデヒドラターゼ、及び1-インドール-2(又は3)-ペンタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がブチルアルデヒド／ペントアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が4,5-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、4,5-ノナンジオールデヒドラターゼ、及び4(又は5)-ノナノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２９５】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がブチルアルデヒド／ヘキサアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が4,5-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、4,5-デカンジオールデヒドラターゼ、及び4(又は5)-デカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がブチルアルデヒド／ヘプタアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が4,5-ウンデカンジオールデヒドロゲナーゼ、4,5-ウンデカンジオールデヒドラターゼ、及び4(又は5)-ウンデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２９６】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がブチルアルデヒド／オクタアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が4,5-ドデカンジオールデヒドロゲナーゼ、4,5-ドデカンジオールデヒドラターゼ、及び4(又は5)-ドデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がブチルアルデヒド／イソブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2-メチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、及び2-メチル-3(又は4)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２９７】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がブチルアルデヒド／2-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が3-メチル-4,5-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、3-メチル-4,5-オクタンジオールデヒドラターゼ、及び3-メチル-4(又は5)-オクタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がブチルアルデヒド／3-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2-メチル-4,5-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-4,5-オクタンジオールデヒドラターゼ、及び2-メチル-4(又は5)-オクタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２９８】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がブチルアルデヒド／4-メチル-ペントアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が8-メチル-4,5-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、8-メチル-4,5-ノナンジオールデヒドラターゼ、及び8-メチル-4(又は5)-ノナノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がブチルアルデヒド／フェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-フェニル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、及び1-フェニル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０２９９】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がブチルアルデヒド／4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、及び1-(4-ヒドロキシフェニル)-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がブチルアルデヒド／インドールアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-インドール-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、及び1-インドール-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３００】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がペントアルデヒド／ヘキサアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が5,6-ウンデカンジオールデヒドロゲナーゼ、4,5-ウンデカンジオールデヒドラターゼ、及び4(又は5)-ウンデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がペントアルデヒド／ヘプタアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が5,6-ウンデカンジオールデヒドロゲナーゼ、5,6-ウンデカンジオールデヒドラターゼ、及び5(又は6)-ウンデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３０１】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がペントアルデヒド／オクタアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が5,6-トリデカンジオールデヒドロゲナーゼ、5,6-トリデカンジオールデヒドラターゼ、及び5(又は6)-トリデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がペントアルデヒド／イソブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2-メチル-3,4-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3,4-オクタンジオールデヒドラターゼ、及び2-メチル-3(又は4)-オクタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３０２】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がペントアルデヒド／2-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が3-メチル-4,5-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、3-メチル-4,5-ノナンジオールデヒドラターゼ、及び3-メチル-4(又は5)-ノナノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がペントアルデヒド／3-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2-メチル-4,5-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-4,5-ノナンジオールデヒドラターゼ、及び2-メチル-4(又は5)-ノナノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３０３】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がペントアルデヒド／4-メチル-ペントアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2-メチル-5,6-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-5,6-デカンジオールデヒドラターゼ、及び2-メチル-5(又は6)-デカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がペントアルデヒド／フェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-フェニル-2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2,3-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、及び1-フェニル-2(又は3)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３０４】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がペントアルデヒド／4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、及び1-(4-ヒドロキシフェニル)-2(又は3)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がペントアルデヒド／インドールアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-インドール-2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2,3-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、及び1-インドール-2(又は3)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３０５】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がヘキサアルデヒド／ヘプタアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が6,7-トリデカンジオールデヒドロゲナーゼ、6,7-トリデカンジオールデヒドラターゼ、及び6(又は7)-トリデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がヘキサアルデヒド／オクタアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が6,7-テトラデカンジオールデヒドロゲナーゼ、6,7-テトラデカンジオールデヒドラターゼ、及び6(又は7)-テトラデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３０６】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がヘキサアルデヒド／イソブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2-メチル-3,4-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3,4-ノナンジオールデヒドラターゼ、及び2-メチル-3(又は4)-ノナノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がヘキサアルデヒド／2-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が3-メチル-4,5-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、3-メチル-4,5-デカンジオールデヒドラターゼ、及び3-メチル-4(又は5)-デカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３０７】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がヘキサアルデヒド／3-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2-メチル-4,5-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-4,5-デカンジオールデヒドラターゼ、及び2-メチル-4(又は5)-デカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がヘキサアルデヒド／4-メチル-ペントアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2-メチル-5,6-ウンデカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-5,6-ウンデカンジオールデヒドラターゼ、及び2-メチル-5(又は6)-ウンデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３０８】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がヘキサアルデヒド／フェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-フェニル-2,3-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2,3-オクタンジオールデヒドラターゼ、及び1-フェニル-2(又は3)-オクタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がヘキサアルデヒド／4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-オクタンジオールデヒドラターゼ、及び1-(4-ヒドロキシフェニル)-2(又は3)-オクタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３０９】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がヘキサアルデヒド／インドールアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-インドール-2,3-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2,3-オクタンジオールデヒドラターゼ、及び1-インドール-2(又は3)-オクタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がヘプタアルデヒド／オクタアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が7,8-ペンタデカンジオールデヒドロゲナーゼ、7,8-ペンタデカンジオールデヒドラターゼ、及び7(又は8)-ペンタデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３１０】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がヘプタアルデヒド／イソブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2-メチル-3,4-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3,4-デカンジオールデヒドラターゼ、及び2-メチル-3(又は4)-デカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がヘプタアルデヒド／2-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が3-メチル-4,5-ウンデカンジオールデヒドロゲナーゼ、3-メチル-4,5-ウンデカンジオールデヒドラターゼ、及び3-メチル-4(又は5)-ウンデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３１１】
さらなる実施態様は、C-C結合経路が少なくともヘプタアルデヒド／3-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2-メチル-4,5-ウンデカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-4,5-ウンデカンジオールデヒドラターゼ、及び2-メチル-4(又は5)-ウンデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がヘプタアルデヒド／4-メチル-ペントアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2-メチル-5,6-ドデカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-5,6-ドデカンジオールデヒドラターゼ、及び2-メチル-5(又は6)-ドデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３１２】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がヘプタアルデヒド／フェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-フェニル-2,3-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2,3-ノナンジオールデヒドラターゼ、及び1-フェニル-2(又は3)-ノナノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がヘプタアルデヒド／4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ノナンジオールデヒドラターゼ、及び1-(4-ヒドロキシフェニル)-2(又は3)-ノナノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３１３】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がヘプタアルデヒド／インドールアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-インドール-2,3-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2,3-ノナンジオールデヒドラターゼ、及び1-インドール-2(又は3)-ノナノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がオクタアルデヒド／イソブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2-メチル-3,4-ウンデカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-3,4-ウンデカンジオールデヒドラターゼ、及び2-メチル-3(又は4)-ウンデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３１４】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がオクタアルデヒド／2-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が3-メチル-4,5-ドデカンジオールデヒドロゲナーゼ、3-メチル-4,5-ドデカンジオールデヒドラターゼ、及び3-メチル-4(又は5)-ドデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がオクタアルデヒド／3-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2-メチル-4,5-ドデカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-4,5-ドデカンジオールデヒドラターゼ、及び2-メチル-4(又は5)-ドデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３１５】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がオクタアルデヒド／4-メチル-ペントアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2-メチル-5,6-トリデカンジオールデヒドロゲナーゼ、2-メチル-5,6-トリデカンジオールデヒドラターゼ、及び2-メチル-5(又は6)-トリデカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がオクタアルデヒド／フェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-フェニル-2,3-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-2,3-デカンジオールデヒドラターゼ、及び1-フェニル-2(又は3)-デカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３１６】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がオクタアルデヒド／4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-デカンジオールデヒドラターゼ、及び1-(4-ヒドロキシフェニル)-2(又は3)-デカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がオクタアルデヒド／インドールアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-インドール-2,3-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-2,3-デカンジオールデヒドラターゼ、及び1-インドール-2(又は3)-デカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３１７】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がイソブチルアルデヒド／2-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2,5-ジメチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,5-ジメチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、及び2,5-ジメチル-3(又は4)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がイソブチルアルデヒド／3-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2,6-ジメチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,6-ジメチル-3,4-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、及び2,6-ジメチル-3(又は4)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３１８】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がイソブチルアルデヒド／4-メチル-ペントアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2,7-ジメチル-3,4-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,7-ジメチル-3,4-オクタンジオールデヒドラターゼ、及び2,7-ジメチル-3(又は4)-オクタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がイソブチルアルデヒド／フェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-フェニル-4-メチル-2,3-ペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-4-メチル-2,3-ペンタンジオールデヒドラターゼ、及び1-フェニル-4-メチル-2(又は3)-ペンタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３１９】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がイソブチルアルデヒド／4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-メチル-2,3-ペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-メチル-2,3-ペンタンジオールデヒドラターゼ、及び1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-メチル-2(又は3)-ペンタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がイソブチルアルデヒド／インドールアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-インドール-4-メチル-2,3-ペンタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-4-メチル-2,3-ペンタンジオールデヒドラターゼ、及び1-インドール-4-メチル-2(又は3)-ペンタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３２０】
さらなる実施態様は、C-C結合経路が2-メチル-ブチルアルデヒド／3-メチル-ブチルアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2,6-ジメチル-4,5-オクタンジオールデヒドロゲナーゼ、2,6-ジメチル-4,5-オクタンジオールデヒドラターゼ、及び2,6-ジメチル-4(又は5)-オクタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路が2-メチル-ブチルアルデヒド／4-メチル-ペントアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が3,8-ジメチル-4,5-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、3,8-ジメチル-4,5-ノナンジオールデヒドラターゼ、及び3,8-ジメチル-4(又は5)-ノナノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３２１】
さらなる実施態様は、C-C結合経路が2-メチル-ブチルアルデヒド／フェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-フェニル-4-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-4-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、及び1-フェニル-4-メチル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路が2-メチル-ブチルアルデヒド／4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、及び1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-メチル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３２２】
さらなる実施態様は、C-C結合経路が2-メチル-ブチルアルデヒド／インドールアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-インドール-4-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-4-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、及び1-インドール-4-メチル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路が3-メチル-ブチルアルデヒド／4-メチル-ペントアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2,8-ジメチル-4,5-ノナンジオールデヒドロゲナーゼ、2,8-ジメチル-4,5-ノナンジオールデヒドラターゼ、及び2,8-ジメチル-4(又は5)-ノナノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３２３】
さらなる実施態様は、C-C結合経路が3-メチル-ブチルアルデヒド／フェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-フェニル-5-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-5-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、及び1-フェニル-5-メチル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路が3-メチル-ブチルアルデヒド／4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-(4-ヒドロキシフェニル)-5-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-5-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、及び1-(4-ヒドロキシフェニル)-5-メチル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３２４】
さらなる実施態様は、C-C結合経路が3-メチル-ブチルアルデヒド／インドールアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-インドール-5-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-5-メチル-2,3-ヘキサンジオールデヒドラターゼ、及び1-インドール-5-メチル-2(又は3)-ヘキサノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路が4-メチル-ペントアルデヒド／フェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-フェニル-6-メチル-2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-フェニル-6-メチル-2,3-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、及び1-インドール-6-メチル-2(又は3)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３２５】
さらなる実施態様は、C-C結合経路が4-メチル-ペントアルデヒド／4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-(4-ヒドロキシフェニル)-6-メチル-2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-6-メチル-2,3-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、及び1-(4-ヒドロキシフェニル)-6-メチル-2(又は3)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路が4-メチル-ペントアルデヒド／インドールアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-インドール-6-メチル-2,3-ヘプタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-6-メチル-2,3-ヘプタンジオールデヒドラターゼ、及び1-インドール-6-メチル-2(又は3)-ヘプタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３２６】
さらなる実施態様は、C-C結合経路がフェニルアセトアルデヒド／4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-フェニル-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-フェニル-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、及び1-(4-ヒドロキシフェニル)-4-フェニル-2(又は3)-ブタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がフェニルアセトアルデヒド／インドールフェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-インドール-4-フェニル-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-4-フェニル-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、及び1-インドール-4-フェニル-2(又は3)-ブタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３２７】
さらなる実施態様は、C-C結合経路が4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド／インドールフェニルアセトアルデヒドリアーゼの少なくとも1つを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1-インドール-4-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、1-インドール-4-(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、及び1-インドール-4-(4-ヒドロキシフェニル)-2(又は3)-ブタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路が5-アミノ-ペント(pant)アルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1,10-ジアミノ-5,6-デカンジオールデヒドロゲナーゼ、1,10-ジアミノ-5,6-デカンジオールデヒドラターゼ、及び1,10-ジアミノ-5-デカノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３２８】
さらなる実施態様は、C-C結合経路が4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオール、1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-2,3-ブタンジオールデヒドラターゼ、及び1,4-ジ(4-ヒドロキシフェニル)-2-ブタノールデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。さらなる実施態様は、C-C結合経路がスクシナートセミアルデヒドリアーゼを含んでいてもよく、かつ還元、及び脱水経路が2,3-ヘキサンジオール-1,6-ジカルボン酸デヒドロゲナーゼ、2,3-ヘキサンジオール-1,6-ジカルボン酸デヒドラターゼ、及び2-ヘキサノール-1,6-ジカルボキシルデヒドロゲナーゼの少なくとも1つを含んでいてもよい方法を含む。
【０３２９】
微生物系、又は組換え微生物の特定の実施態様は、4-オクタノールのオクテン、又はオクタンへの変換を触媒すること（例えば、還元、及び脱水）ができる酵素をコードする遺伝子を含んでいてもよい。その他の実施態様は、この還元、及び脱水経路のために再設計され、又は新規に設計された酵素を含んでいてもよい。例えば、3つの再設計された酵素は、4-オクタノンを3-、及び4-オクテンのいずれにも変換することができる。第1の工程は、再設計されたイソシトラート脱水素酵素によって触媒することができる。この酵素は、4-ヒドロキシ-3イオキシニル(又は5)-カルボキシルオクタンの形成を触媒することができる。4-ヒドロキシ基は、再設計されたキナーゼによってリン酸化することができる。最後に、再設計されたメバロナートジホスフェートデカルボキシラーゼは、3(又は4)-オクテンの形成を触媒する。
【０３３０】
その他の実施態様において、いくつかの再設計された酵素は、4-オクタノンをオクタンに変換することができる。例えば、4-ヒドロキシ-3(又は5)-カルボキシルオクタンは、連続して還元され、及び脱水されて、3(又は5)-カルボキシルオクタンを形成する。脂肪酸代謝に関与する再設計された酵素は、これらの反応を触媒することができる。3(又は5)-カルボキシルオクタンは、アルデヒド脱水素酵素によって対応するアルデヒドに還元させることができ、生成物は、再設計されたデカルボニラーゼによって触媒されて脱カルボニル化されてオクタンを形成し得る。
【０３３１】
上記の如く、その他の同様の化学物質の中で、2-フェニルエタノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、及びインドール-3-エタノールなどの特定のコモディティケミカルの産生については、生合成経路（例えば、アルデヒド生合成経路）には、アルデヒドを産生するための、インドール-3-ピルベートデカルボキシラーゼ（IPDC）などのデカルボキシラーゼ酵素をコードする1つ以上の遺伝子を任意に、又は更に含み得る。特定の態様において、IPDCには、配列番号：312に記載したアミノ酸配列と少なくとも80%、90%、95%、98%、又は99%同じであるアミノ酸配列を含み得る。IDPC酵素は、G24、D25、E48、A55、R60、G75、E89、H113、G252、G405、G413、G428、G430、及び／又はN456などの特定の保存されたアミノ酸残基を含んでいてもよい。
【０３３２】
これら、及びその他の実施態様において、組換え微生物は、コモディティケミカルにアルデヒドを変換するために、フェニルアセトアルデヒドレダクターゼ（PAR）などのアルデヒドレダクターゼを含んでいてもよい。特定の態様において、PARは、ロドコッカス属種ST-10に由来するPAR酵素の配列を示す配列番号：313に記載したアミノ酸配列と少なくとも80%、90%、95%、98%、又は99%同じであるアミノ酸配列を含み得る。特定の態様において、PAR酵素は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）、NADH、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP+）、又はNADPHの少なくとも1つ結合モチーフを含んでもよい。特定の実施態様において、NAD+、NADH、NADP+、又はNADPH結合モチーフは、
【化６】
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からなる群から選択されてもよく、式中、Yは、アラニン、グリシン、及びセリンから独立して選択され、式中、Gは、グリシンであり、かつXは、遺伝的にコードされたアミノ酸から独立して選択される。
【０３３３】
特定の実施態様において、このような組換え微生物は、また、又は代わりに、アルデヒドをその対応するアルコール（例えば、2-フェニルエタノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、及びインドール-3-エタノール）に還元するために、フェニルエタノールデヒドロゲナーゼ活性、4-ヒドロキシフェニルエタノールデヒドロゲナーゼ活性、及びインドール-3-エタノールデヒドロゲナーゼ活性の少なくとも1つから選択される活性を有する二級アルコールデヒドロゲナーゼを含んでいてもよい。
【０３３４】
また、本発明の実施態様は、コモディティケミカルに適した単糖を変換するための方法であって、（a）適切な単糖を得ること；（b）適切な単糖を微生物系と、生物燃料に適した単糖を変換するために十分な時間接触させる工程であって、該微生物系は、（i）脂肪酸生合成経路、アミノ酸生合成経路、及び／又は短鎖アルコール生合成経路をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子；（ii）ケト-酸デカルボキシラーゼ、アルデヒド脱水素酵素、及び／又はアルコールデヒドロゲナーゼをコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子；並びに（iii）（1）酵素的長鎖アルコール還元経路、（2）酵素的脱カルボニル経路、（3）酵素的脱炭酸経路、及び（4）（1）、（2）、及び／又は（3）を含む酵素還元経路から選択される酵素還元経路を含む、前記工程を含み、これにより適切な単糖をコモディティケミカルに変換する、前記方法を含む。
【０３３５】
本発明の実施態様は、一つの例として、中鎖から長鎖アルカンなどのアルカンの形態で生物燃料を産生するために使用してもよい、脂肪酸合成経路における酵素をコードし、及び発現する1つ以上の遺伝子を含んでいてもよい。特定の実施態様において、微生物系における脂肪酸生合成経路の特異性は、再調整しても、又は再設計してもよい。単なる例として、微生物は、一般に長鎖脂肪酸の混合物を産生する（例えば、大腸菌は、大量の長鎖脂肪酸（C16-C19：細胞全体において＜95%）、及び少量の中間鎖脂肪酸（細胞全体においてC12：2%、及びC14：5%）を天然に産生する）。
【０３３６】
特定の実施態様において、再調整、又は再構成は、これらの脂肪酸から産生されるアルカンが、ガソリン、ディーゼル、及び灯油の主成分であるので、カプリラート（C8）、カプラート（C10）、ラウレート（C12）、ミリスタート（C14）、及びパルミタート（C16）を含むが、限定されない、中鎖アルカンの産生の増加に向けられてもよい。これらの脂肪酸に加えて、これらの脂肪酸から産生されるn-アルカンは、重油における主成分の1つであるので、その他の実施態様は、ステアラート（C18）、アラキドナート（C20）、ベヘナート（C22）、及びより長い脂肪酸を含むが、限定されない、長鎖脂肪酸の産生の増加に向けられてもよい。
【０３３７】
例えば、クフェア属（Cuphea）は、これらの種子油における主成分として主に中間鎖脂肪酸を蓄積し、これらの組成物は、種に依存して変化する。特に、クフェア・プルチェリマ（Cuphea pulcherrima）は、96%のカプリラート（C8：0）を蓄積し、クフェア・コエネアナ（Cuphea koehneana）は95.3%のカプラート（C10：0）を蓄積し、及びクフェア・ポリモルファ（Cuphea polymorpha）は、80.1%のラウレート（C12：0）を蓄積する。本出願に従った微生物系、又は単離された微生物の実施態様は、脂肪酸生合成経路に関与する酵素をコードする種々のクフェア種由来の遺伝子を組み込んでいてもよく、これらの微生物は、部分的には中鎖脂肪酸の産生に向けられてもよい。
【０３３８】
その他の実施態様において、クフェア・フーケリアナ（Cuphea hookeriana）、クフェア・パルストリス（Cuphea palustris）、カリフォルニアゲッケイジュ（Umbellularia californica）、及びクスノキ（Cinnamomum camphorum）を含む種々の種に由来するアシル-ACP（ACP）チオエステラーゼ（TE）を大腸菌などの微生物において過剰発現してもよく、この場合、それぞれの中間鎖脂肪酸、カプリラート（C8）、カプラート（C10）、ラウレート（C12）、ミリスタート（C14）、及びパルミタート（C16）の形成についての比活性は、野生型を上回って改善される。特定の実施態様は、ACP、及びβ-ケトアシルACPシンターゼ（KAS）IVを含むが、限定されない、当業者に公知の脂肪酸生合成その他の酵素成分を含んでいてもよい、。
【０３３９】
また、本出願の微生物系、及び単離された微生物には、脂肪酸を脂肪アルデヒドに還元させるために、脂肪アルデヒド脱水素酵素を組み込んでいてもよい。単なる説明として、脂肪酸の脂肪アルデヒドへの変換は、種々の適切な生物体から単離された中鎖、及び／又は長鎖脂肪アルデヒド脱水素酵素によって触媒され得る。特定の実施態様は、例えば、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）に由来する脂肪アルデヒド脱水素酵素を組み込んでいてもよい。
【０３４０】
また、本出願の微生物系、及び単離された微生物には、例えば、酵素的長鎖アルコール還元経路を含む酵素を含む、脂肪アルデヒドの、n-アルカンなどの生物燃料への変換を触媒する1つ以上の酵素を組み込んでいてもよい。特定の実施態様は、脂肪酸の、アルカンなどの生物燃料への還元、及び脱水を触媒することができる酵素をコードする種々のその他の供与源からの遺伝子を組み込んでもよい。例えば、菌株HD-1は、種々の鎖長をもつn-アルカンなどの生物燃料を産生することができ、更に奇数の、及び偶数のアルカンの両方を産生する。本明細書に提供される微生物系、及び組換え微生物の特定の実施態様には、この経路に含まれる酵素をコードするHD-1遺伝子を組み込んでもよい。
【０３４１】
その他の実施態様は、この還元経路のために再設計され、又は新規にデザインされた酵素を組み込んでいてもよい。例えば、本発明の実施態様は、2-カルボキシ-1-アルコールの形成を触媒し得る再設計されたイソクエン酸脱水素酵素を含んでいてもよい。特定の実施態様において、2-カルボキシ-1-アルコールは、連続して還元され、及び脱水されて2-カルボキシ-アルカンを形成してもよく、これは脂肪酸代謝に関与する再設計された酵素によって触媒され得る。2-カルボキシ-アルカンは、アルデヒド脱水素酵素によって対応するアルデヒドに還元させることができ、次いで後述するように再設計されたデカルボニラーゼによって触媒されて、n-アルカンに脱カルボニル化することができる。これらの微生物系の特定の実施態様は、偶数のたn-アルカンも、奇数のn-アルカン、又は両方を産生し得る。
【０３４２】
本出願の特定の実施態様は、脱カルボニル、又は酵素的脱カルボニル経路を触媒する酵素をコードする遺伝子を組み込んでいてもよい。単なる例として、緑のコロニーの藻類であるボトリオコックス・ブラウニイ（Botyrococcus braunii）品種Aは、直鎖状の奇数のC27、C29、及びC31炭化水素を産生し、これは、合計で該藻類の乾燥重量の32%までになる。この生物体のミクロソーム標品は、脱カルボニル活性を有する。B. ブラウニイ（B. braunii）培養からのこのデカルボニラーゼは、酵素を含むコバルトプロトポルフィリンIXである。単離された微生物の特定の微生物系には、ボトリオコックス・ブラウニイからの脂肪アルデヒドデカルボニラーゼをコードする遺伝子を組み込んでいてもよい。
【０３４３】
その他の実施態様は、例えば、N末端の膜配列が置換されている、再設計されたデカルボニラーゼ酵素を含んでいてもよい。説明として、同様の酵素である、Fe-プロトポルフィリン IX（ヘム）を含むチトクロームP450の機能的活性は、N末端の膜結合配列を置換することによって改善され、本微生物系のデカルボニラーゼの機能的活性には、同様の置換、又は改善を含んでいてもよい。
【０３４４】
その他の実施態様は、Co-ポルフィリンシンターゼをコードする遺伝子を組み込んでいてもよい。説明において、デカルボニラーゼ酵素は、コファクターとしてCo-プロトポルフィリンIXを使用し得るし、クロストリジウム・テトラノモルフム（Clostridium tetranomorphum）は、インキュベートされたCo-ポルフィリンIX内にコバルトを取り込むむことができる。特定の実施態様は、クロストリジウム・テトラノモルフムからの、又はその他の適切な微生物からのCo-ポルフィリンシンターゼを組み込んでいてもよい。その他の実施態様は、触媒としてCo2+、Fe2+、及びNi2+などの無機金属を使用して、新規に設計された脱カルボニル酵素を組み込んでいてもよい。
【０３４５】
特定の実施態様は、アルケンの形成、又は酵素的脱炭酸経路を担う酵素をコードする遺伝子を含んでいてもよい。これらの遺伝子は、高等植物、及び昆虫などの種々の供与源に由来しても、又はから単離してもよい。例えば、出芽ベニバナ（ベニバナL.（Carthamus tinctorius L.））などの高等植物は、1-ペンタデセン、1-ヘプタデセン、1,8-ヘプタデカジエン、及び1,8,11-ヘプタデカトリエンを含む多数の奇数の1-アルケンを、加えてこれらの対応する脂肪酸からの脱炭酸によって約80〜90% の1,8,11,14-ヘプタデカテトラエンを産生する。特定の実施態様は、ベニバナ（Carthamus tinctorius）などの高等植物からの遺伝子を組み込んでいてもよい。
【０３４６】
その他の実施態様は、菌株DH-1などを含むが、限定されない微生物からのアルケンの形成を担う酵素（例えば、酵素的脱炭酸経路）をコードする遺伝子を組み込んでいてもよい。説明として、菌株DH-1は、n-アルカンに加えてn-アルケンを産生する。
【０３４７】
その他の実施態様は、酵素的脱炭酸経路のために新規に設計された酵素から遺の伝子を組み込んでいてもよい。例えば、これらの再設計された酵素は、β-ヒドロキシ脂肪酸をn-アルケンに変換する。第1の工程は、β-ヒドロキシ基のリン酸化を触媒する再設計されたキナーゼによって触媒される。次いで、再設計されたメバロナートジホスフェートデカルボキシラーゼが、n-1-アルケンなどのn-アルケンの形成を触媒する。
【０３４８】
本発明に従った任意の微生物を利用してもよい。特定の態様において、微生物は、真核又は原核の微生物である。特定の態様において、微生物は、S.セレビジエ（S. cerevisiae）などの酵母である。特定の態様において、微生物は、グラム陽性菌、又はグラム陰性菌などの細菌である。その迅速な増殖速度、十分に理解された遺伝学、利用できる遺伝的なツールの多様性、及び異種タンパク質を産生する際のその能力を考慮すると、遺伝子改変された大腸菌を、本明細書に記述したように、アルギナート若しくはペクチンなどの多糖体の分解及び代謝のため、又は生物燃料などのコモディティケミカルの形成、又は生合成のためであるかにかかわらず、微生物系の特定の実施態様に使用してもよい。
【０３４９】
その他の微生物を、部分的には宿主生物に対する酵素、及び代謝産物の適合性に基づいて、本発明に従って使用してもよい。例えば、以下などのその他の生物体を、本明細書に提供される組換え微生物として利用してもよく、及び従って、本発明の種々の方法に従って利用してもよい：アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）、アクロモバクター（Achromobacter）、アシジフィリウム属（Acidiphilium）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、アクチノマデュラ属（Actinomadura）、アクチノプラネス属（Actinoplanes）、超好熱性古細菌（Aeropyrum pernix）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、パインアップル（Ananas comosus ）（M）、アルトロバクター属（Arthrobacter）、クロコウジカビ（Aspargillus niger）、コウジカビ（Aspargillus oryze）、アスペルギルス・メレウス（Aspergillus melleus）、アスペルギルス・プルベルレンツス（Aspergillus pulverulentus）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、ショウユコウジカビ（Aspergillus sojea）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、ブレビス菌（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウシイ（Bacillus clausii）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、リケニホルミス菌（Bacillus licheniformis）、バチルス・マセランス、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ブレビバチルス・ブレービス（Brevibacillus brevis）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、カンジダ シリンドラセア（Candida cylindracea）、カンディダ・ルゴサ（Candida rugosa）、パパイヤ（L）、セルロシミクロビウム属（Cellulosimicrobium）、セファロスポリウム属（Cephalosporium）、ケトミウム・エラチカム（Chaetomium erraticum）、ケトミウム・グラシエ（Chaetomium gracile）、クロストリジウム属（Clostridium）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・アセトブチリクム (Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）（グルタミクム（glutamicum））、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、大腸菌（Escherichia coli）、エンテロコッカス（Enterococcus）、黒脚病菌（Erwina chrysanthemi）、グルコノバクター属（Gliconobacter）、グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）、ハロアーキュラ属（Haloarcula）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ンソレンス（Humicola nsolens）、キタサトスポラ・セタエ（Kitasatospora setae）、クレブシエラ属（Klebsiella）、クレブシェラオキシトーカ（Klebsiella oxytoca）、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）、クロイベロマイセス フラジリス（Kluyveromyces fragilis）、クルイベロミセスラクチス（Kluyveromyces lactis）、コクリア属（Kocuria）、ラクトラクティス（Lactlactis）、乳酸桿菌属（Lactobacillus）、発酵乳酸桿菌（Lactobacillus fermentum）、ラクトバシラス・サケ（Lactobacillus sake）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、メチロシスチス属（Methylocystis）、メタノロブス・シシリアエ（Methanolobus siciliae）、メタノゲニウム・オルガノフィラム（Methanogenium organophilum）、メタノバクテリウム・ブライアンティイ（Methanobacterium bryantii）、ミクロバクテリウム・インペリアレ（Microbacterium imperiale）、ミクロコッカス・リソディクティカス（Micrococcus lysodeikticus）、ミクロルナタス属（Microlunatus）、ムコール・ジャバニカス（Mucor javanicus）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ミロセシウム属（Myrothecium）、硝酸菌属（Nitrobacter）、ニトロソモナス属（Nitrosomonas）、ノカルジア属（Nocardia）、パパイヤ（Papaya carica）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、醤油乳酸菌（Pediococcus halophilus）、ペニシリウム属（Penicillium）、ペニシリウム・カマンベルティ（Penicillium camemberti）、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）、ペニシリウム・エメルソニィ（Penicillium emersonii）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Penicillium roqueforti）、ペニシリウム・リラシナム（Penicillium lilactinum）、ペニシリウム・マルチカラー（Penicillium multicolor）、パラコッカス・パントトロファス（Paracoccus pantotrophus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、シュードモナス属（Pseudomonas）、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・デニトリフィカンス（Pseudomonas denitrificans）、パイロコッカス属（Pyrococcus）、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、パイロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshii）、根粒菌属（Rhizobium）、リゾムコール・マイハイ（Rhizomucor miehei）、リゾムコール・プシルス・リント（Rhizomucor pusillus Lindt）、リゾプス属（Rhizopus）、リゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）、リゾプス・ジャポニカス（Rhizopus japonicus）、リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、サッカロマイセス・セレビシエ（Sccharomyces cerevisiae）、スクレロチナ・リベルチナ（Sclerotina libertina）、スフィンゴバクテリウム・マルチボラム（Sphingobacterium multivorum）、スフィンゴビウム属（Sphingobium）、スフィンゴモナス属（Sphingomonas）、連鎖球菌属（Streptococcus）、サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）Y-1、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトミセス・ムリヌス（Streptomyces murinus）、ストレプトマイセス・ルビギノーサス（Streptomyces rubiginosus）、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Streptomyces violaceoruber）、ストレプトベルティシリウム・モバラエンス（Streptoverticillium mobaraense）、テトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）、サームス属（Thermus）、チオスファエラ パントトロファ（Thiosphaera pantotropha）、ホウロクタケ属（Trametes）、トリコデルマ属（Trichoderma）、トリコデルマ・ロンギブラキアータム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・レッセイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、トリコスポロン・ペニシラタム（Trichosporon penicillatum）、ビブリオ・アルギノリチカス（Vibrio alginolyticus）、ザントモナス属（Xanthomonas）、酵母（yeast）、ジゴサッカロミセス・ロキシー（Zygosaccharomyces rouxii）、ザイモモナス属（Zymomonas）、及びザイモモナス・モビリス（Zymomonus mobilis）。
【０３５０】
以下の実施例は、例証として提供され、限定ではない。
【実施例】
【０３５１】
実施例1
唯一の炭素源としてアルギナートで成長するような大腸菌の操作
野生型大腸菌は、アルギナート重合体を使用すること、又はその唯一の炭素源として、アルギナートを分解することができない（図4を参照されたい）。しかし、ビブリオ・スプレンディダスは、成長を補助するためにアルギナートを代謝することができることが知られている。その唯一の炭素源として分解されたアルギナートを使用する組換え大腸菌を産生するために、ビブリオ・スプレンディダスフォスミドライブラリーを構築して、大腸菌にクローン化した。
【０３５２】
ビブリオ・スプレンディダスフォスミドライブラリーを調製するために、ゲノムDNAは、DNeasy血液、及び組織キット（Qiagen、Valencia Ca）を使用してビブリオ・スプレンディダス B01（Dr. Martin Polz（MIT）からの贈呈）から単離した。次いで、コピー制御フォスミドライブラリー産生キット（Epicentre、Madison、WI）を使用して、フォスミドライブラリーを構築した。このライブラリーは、ベクターpCC1FOS（Epicentre、Madison、WI）に挿入されたおよそ40kbのランダムなゲノムの断片からなった。
【０３５３】
フォスミドライブラリーをファージにパックして、特定のビブリオ・スプレンディダス遺伝子（V12B01_02425〜V12B01_02480；II型分泌装置をコードする；配列番号：1を参照されたい）を有するpDONR221プラスミド（Invitrogen、Carlsbad, CA）を有する大腸菌DH10B細胞を、ファージライブラリーでトランスフェクトした。このセクレトーム領域は、ビブリオ・スプレンディダスに由来するII型分泌装置をコードし、これをpDONR221プラスミドにクローン化して、大腸菌株DH10Bに導入した（実施例1を参照されたい）。
【０３５４】
形質転換体をクロロアムフェニコール（chloroamphenicol）耐性について選択して、次いで、これらが分解されたアルギナートで成長する能力についてスクリーニングした。生じる形質転換体を、分解されたアルギナート培地での成長についてスクリーニングした。分解されたアルギナート培地は、フラボバクテリウム属種（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）からのアルギナートリアーゼと共に2% アルギナート（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）、10mM Na-リン酸緩衝液、50mM KCl、400mM NaClを少なくとも1週間室温にてインキュベートすることによって調製した。この分解されたアルギナートを0.8% 濃度に希釈して、1×M9塩、2mM MgSO4、100μM CaCl2、0.007% ロイシン、0.01% カザミノ酸、1.5% NaClの終濃度を有した成長培地を作製した（これは、ナトリウムの全ての供与源：M9、希釈されたアルギナート、及び添加されたNaClを含む）。
【０３５５】
この培地上でよく成長した1つのフォスミド含む大腸菌クローンを単離した。このクローンからのフォスミド DNAを、フォスミドMAX DNA精製キット（Epicentre、Madison,WI）を使用して単離して、調製した。この単離されたフォスミドをDH10B細胞内にトランスフェクトして戻して、これらの細胞をアルギナートで成長する能力について試験した。
【０３５６】
結果は、図4に図示してあり、これは、特定のフォスミド含有大腸菌クローンが唯一の炭素源としてアルギナートで成長することができることを示す。アグロバクテリウム・チュメファシエンスは、正の対照を提供する（ハッチングをかけた丸を参照されたい）。負の対照として、大腸菌DH10B細胞は、アルギナートで成長することができない（正の対照のすぐ左を参照されたい）。
【０３５７】
また、これらの結果は、このビブリオ・スプレンディダス由来フォスミドクローン内に含まれる配列が、大腸菌に対して唯一の炭素源として分解されたアルギナート成長する能力を与えるのに十分であることを証明する。従って、元のDH10B細胞によって保有される、pDONR221ベクター内に含まれるII型分泌機構配列（すなわち配列番号：1）は、分解されたアルギナートでの成長のために必要ではなかった。
【０３５８】
唯一の炭素源として成長するアルギナートを与えるために十分な単離されたフォスミドは、以下のプライマーを使用してElim BIopharmaceuticals（Hayward、Ca）によってシーケンスした。
【化７】
2010539988.tif 000009
及び
【化８】
2010539988.tif 000010
シーケンシングは、ベクターが全長遺伝子V12B01_24189〜V12B01_24249を含んだゲノムDNA切片を含んだことを示した（配列番号：2〜64を参照されたい）。配列番号：2は、V12B01_24189〜V12B01_24249の間の全ての領域のヌクレオチド配列を示す。配列番号：3〜64は、配列番号：2内に含まれる個々の推定上の遺伝子を示す。この配列において、V12B01_24189の前に大きな遺伝子があり、これは、フォスミドクローンでは切断されている。大きな遺伝子V12B01_24184は、自己輸送体に対して類似性をもち、かつヘム利用、又は接着に関与する大きなエキソタンパク質を含むオルソロガスタンパク質のクラスターであるCOG3210に属する推定上のタンパク質である。フォスミドクローンにおいて、V12B01_24184は、N末端で切断され、その結果、最初の5893bpが予測されるオープンリーディングフレームから失われる（これは、全体で22889bpを含むことが予測される）。
【０３５９】
実施例2
唯一の炭素源としてペクチンで成長するように大腸菌を操作
野生型大腸菌は、唯一の炭素源としてペクチン、ジ-、又はトリガラクツロナートで成長することができない。大腸菌に唯一の炭素源としてのペクチン、ジ-、及び／又はトリガラクツロナートで成長することができる能力を与える最小成分を同定するために、pBBRGal3Pプラスミド、及びpTrcogl-kdgRプラスミドの両方を保有する大腸菌株BL21（DE3）を操作して、これらの多糖体で成長する能力について試験した。
【０３６０】
pBBRGal3Pプラスミドを、ジ-、及びトリガラクツロナートの分解を担う、特定の酵素（kduI、kduD、ogl、pelW、及びpaeX）、輸送体（togM、togN、togA、togB、及びkdgM）、及び調節タンパク質（kdgR）をコードするいくつかの遺伝子（kdgF、kduI、kduD、pelW、togM、togN、togA、togB、kdgM、及びpaeX）を含むエルウィニア・カロトボラ亜種アトロセプチカ（Atroseptica）SCRI 1043の特定のゲノム領域を含むように操作した。配列番号：65は、エルウィニア・カロトボラ亜種アトロセプチカ SCRI1043からのkdgF-PaeX領域のヌクレオチド配列を示す。
【０３６１】
このプラスミドを構築するために、エルウィニア・カロトボラ亜種アトロセプチカSCRI 1043のkdgF、kduI、kduD、pelW、togM、togN、togA、togB、kdgM、paeX、ogl、及びkdgRをコードするDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃6分間、30回、繰り返す。反応混合物には、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μMフォワード
【化９】
2010539988.tif 000011
及びリバース
【化１０】
2010539988.tif 000012
プライマー、1U Phusion高忠実度DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ng エルウィニア・カロトボラ亜種アトロセプチカ SCRI 1043ゲノム（ATCC）を50μlで含んだ。
【０３６２】
次いで、pBBR1MCS-2ベクターをポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：10秒間98℃、60℃15秒間、及び72℃2.5分、30回、繰り返した。反応混合物には、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μMフォワード
【化１１】
2010539988.tif 000013
及びリバース
【化１２】
2010539988.tif 000014
プライマーを、1U Phusion高忠実度DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ng pBBR1MCS-2を50μlで含んだ。両方の増幅されたDNA断片をBamHI、及びXbaIで消化して、連結した。
【０３６３】
pTrcogl-kdgRプラスミドを、それぞれジ-、及びトリガラクツロナートの分解を担う酵素（ogl）、及び調節タンパク質（kdgR）をコードする2つの遺伝子（ogl、及びkdgR）を含むエルウィニア・カロトボラ亜種アトロセプチカ SCRI 1043の特定のゲノム領域を含むように操作した。配列番号：66は、エルウィニア・カロトボラ亜種アトロセプチカ SCRI1043からのogl-kdgRのヌクレオチド配列を示す。
【０３６４】
この構築物を調製するために、エルウィニア・カロトボラ亜種アトロセプチカSCRI 1043のogl及びkdgRをコードするDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃4分30回、繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μMフォワードプライマー
【化１３】
2010539988.tif 000015
及びリバースプライマー
【化１４】
2010539988.tif 000016
、1U Phusion高忠実度DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ng エルウィニア・カロトボラ亜種アトロセプチカ SCRI 1043ゲノム（ATCC）を50μlで含んだ。増幅されたDNA断片をXbaI、及びHindIIIで消化して、同じ制限酵素で事前に消化したpTrc99Aに連結した。
【０３６５】
プラスミドpBBRGal3P、及びpTrcogl-kdgRを大腸菌株BL21（DE3）に同時形質転換した。単一コロニーを、50μg／mlのカナマイシン、及び100μg／mlのアンピシリンを含むLB培地に播種して、培養をインキュベーションシェーカーにおいて37℃にて200rpmで培養した。培養が0.6のOD600nmに達したときに、500μlの培養をエッペンドルフチューブへ移して、遠心分離して、細胞をペレットにした。細胞を2mM MgSO4、100μM CaCl2、0.4% ジ-、又はトリガラクツロナートを含む50μlのM9培地に再懸濁し、5μlのこの溶液を2mM MgSO4、100μM CaCl2、0.4% ジ-、又はトリガラクツロナートを含む500μlの新鮮なM9培地に播種した。培養は、インキュベーションシェーカーにおいて200rpmで37℃にて培養した。
【０３６６】
図5Aの結果は、これらの2つのプラスミドが唯一の炭素源としてジ-、及びトリガラクツロナートで成長する能力を大腸菌に提供するために十分であったが、ペクチンでは十分ではなかったことを示す。特に、これらの結果は、領域kdgF-paeX、及びogl-kdgRが大腸菌に対してこの能力を与えるのに十分だったことを示す。
【０３６７】
上記の実験から得られる情報に基づいて、ペクタートリアーゼ、ペクタートアセチルエステラーゼ、及びメチルエステラーゼの導入が大腸菌にペクチンで成長能力を与えるかもしれないことが考えられた。この仮説を試験するために、大腸菌株DH5α細菌細胞を、pROU2プラスミド、及びpPEL74プラスミドを含むように操作した。
【０３６８】
pROU2プラスミドは、ジ-、及びトリガラクツロナートの分解を担う酵素（kduI、kduD、ogl、pelW、及びpaeX）、輸送体（togM、togN、togA、togB、及びkdgM）、及び調節タンパク質（kdgR）をコードするいくつかの遺伝子（kdgF、kduI、kduD,pelW、togM、togN、togA、togB、kdgM、paeX、ogl、及びkdgR）を含む、エルウィニア・クリサンセミの特定のゲノム領域を含む。
【０３６９】
pPEL74プラスミドは、ペクタートリアーゼ（pelA、及びpelE）、ペクチンアセチルエステラーゼ（paeY）、及びペクチンメチルエステラーゼ（pem）をコードするいくつかの遺伝子（pelA、pelE、paeY、及びpem）を含むエルウィニア・クリサンセミの特定のゲノム領域を含む。
【０３７０】
図5Bに示したように、pROU2、及びpPEL74で操作した大腸菌DH5αは、唯一の炭素源としてペクチンで成長することができ、これらのプラスミド内に含まれる遺伝子は、さもないと唯一の炭素源としてペクチンで成長することがができない生物体に対してこの特性を与えるために十分であることを示した。
【０３７１】
実施例3
アルギナートのピルベート及びグリセルアルデヒド-3-ホスフェートへのインビトロでの変換
アルギナートの分解、及び代謝のために必要とされる全ての酵素を含む酵素混合物の能力を、アルギナートからピルベートを産生する能力について研究した。加えて、アグロバクテリウム・チュメファシエンスから単離したADH1-12（配列番号：69〜92を参照されたい）などの種々の新規アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）を、DEHU、又はマンヌロナート水素付加を触媒する能力について試験した。
【０３７２】
アルギナートの分解、及び代謝のための簡略化した代謝経路は、図2に示してある。アルギナートは、少なくとも2つの異なる方法論：酵素的、及び化学的方法によって分解することができる。
【０３７３】
酵素的分解において、アルギナートの分解は、アルギナートリアーゼと呼ばれる酵素のファミリーによって触媒される。この実験のためには、Atu3025を使用した。Atu3025は、外から溶解性に（exolytically）作用する酵素であり、アルギナート重合体からDEHUを産する。DEHUは、一般的なヘキサウロン酸代謝産物KDGに変換される。この反応は、アルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、DEHUヒドロゲナーゼ）によって触媒される。
【０３７４】
フォルマートなどの酸性溶液によって触媒される化学分解は、単糖マンヌロナートを産する。マンヌロナートは、マンノン酸デヒドロゲナーゼ（マンヌロナートレダクターゼ）活性を有する酵素によって触媒され、次いでマンノナートに変換される。細菌において、マンノナートデヒドラターゼ（UxuA）は、マンヌロナートからの脱水を触媒しKDGを形成する。
【０３７５】
KDGは、ピルベート、及びグリセルアルデヒド-3-ホスフェート（G3P）の形態に容易に代謝される。KDGは、最初にKDG-6-ホスフェート（KDGP）にリン酸化され、これがKDGキナーゼによって触媒され、次いでKDGPアルドラーゼによって触媒され、ピルベート、及びG3Pに破壊される。
【０３７６】
アグロバクテリウム・チュメファシエンス C58由来のオリゴアルギナートリアーゼAtu3025の調製。pETAtu3025は、pET29プラスミドバックボーン（Novagen）に基づいて構築した。オリゴアルギナートリアーゼAtu3025は、PCRによって増幅した：98℃10秒間、55℃15秒間、及び72℃60秒間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化１５】
2010539988.tif 000017
及びリバースプライマー
【化１６】
2010539988.tif 000018
、2.5 U Phusion DNAポリメラーゼ（Finezyme）、及び鋳型として一定分量のアグロバクテリウム・チュメファシエンスC58（Eugene Nester教授、University of Washingtonからの贈呈）細胞を100μlの総容積で含んだ。増幅した断片をNdeI、及びBamHIで消化して、同じ酵素であらかじめ消化したpET29にT4DNAリガーゼを使用して連結し、pETAtu3025を形成した。構築したプラスミドをシーケンスして（Elim Biopharmaceuticals）、挿入断片のDNA配列を確認した。Atu3025挿入断片のヌクレオチド配列は、配列番号：67に提供してある。Atu3025挿入断片によってコードされるポリペプチド配列は、配列番号：68に提供してある。
【０３７７】
pETAtu3025を大腸菌株BL21（DE3）に形質転換した。pETAtu3025を含むBL21（DE3）のコロニーを、50μg/mlのカナマイシン（Km50）を含む50mlのLB培地に播種した。この株を37℃にて200rpmで軌道シェーカーにおいて培養した。OD600nmが0.6に達したときに、0.2mMのIPTGを培養に添加し、誘導した培養を20℃にて200rpmで軌道シェーカーにおいて培養した。誘導の24時間後に, 4,000rpm×gにて10分間の遠心分離によって細胞を収集し、沈殿を、10μlのLysonase（商標） Bioprocessing Reagent（Novagen）を含む2mlのBugbuster（Novagen）に再懸濁した。溶液を10分間、4,000rpm×gにて再び遠心分離し、上清を得た。
【０３７８】
pETADH12を介したpETADH1の構築。アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58のADH1-12のDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワード（表1）、及びリバース（表1）プライマー、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngのアグロバクテリウム・チュメファシエンスC58ゲノムを50μlに含んだ。増幅したDNA断片をNdeI、及びBamHIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpET28に連結した。内部にNdeI、又はBamHI部位を有するDNA配列については、それぞれのADHの前半、及び後半の配列を、最初に、記述した方法使用して増幅した。生じる2つのDNA断片をゲル精製し、オーバーラッピングPCRによってスプライスした。
【０３７９】
【表１】
2010539988.tif 000019
【０３８０】
（ADH1-10の発現、及び精製。）全てのプラスミドを大腸菌株BL21（DE3）に形質転換した。それぞれのアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）遺伝子を含むBL21（DE3）の単一のコロニーを、50μg/mlのカナマイシン（Km50）を含む50mlのLB培地に播種した。これらの株は、37℃にて200rpmで軌道シェーカーにおいて培養した。OD600nmが0.6に達したときに、0.2mMのIPTGをそれぞれの培養に添加し、誘導した培養を20℃にて200rpmで軌道シェーカーにおいて培養した。誘導の24時間後に、4,000rpm×gにて10分間の遠心分離によって細胞を収集し、沈殿を10μlのLysonas（商標） Bioprocessing Reagent（Novagen）を含む2mlのBugbuster（Novagen）に再懸濁した。溶液を10分間、4,000rpm×gにて再び遠心分離し、上清を得た。
【０３８１】
（酵素的分解による〜2%DEHU溶液の調製。）DEHU溶液は、酵素的に調製した。2%アルギナート溶液は、500mlの20mM Tris-HCl（pH7.5）溶液に10gの低粘性アルギナートを添加することによって調製した。およそ10mgのフラボバクテリウム種（Flavobacterium）由来のアルギナートリアーゼ（Sigma-aldrichから購入した）をアルギナート溶液に添加した。次いで、250mlのこの溶液を別の瓶へ移し、上の節で調製したAtu3025を含む大腸菌細胞可溶化物を添加した。アルギナート分解は、室温で一晩実施した。生じた産物は、薄層クロマトグラフィーによって解析し、DEHUの形成を確認した。
【０３８２】
（化学分解によるD-マンヌロナート溶液の調製。）D-マンヌロナート溶液は、Spoehrの文献（Archive of Biochemistry, 14：pp153-155）によって以前に記述されたプロトコルに基づいて、化学的に調製した。50mgアルギナートを800μlの90% フォルマートに溶解した。この溶液を100℃にて一晩インキュベートした。次いでフォルマートを蒸発させ、残留する物質を2回無水エタノールで洗浄した。残留する物質を再び無水エタノールに溶解して、濾過した。エタノールを蒸発させ、残留する物質を20mL の20mM Tris-HCl（pH 8.0）に再懸濁し、溶液を濾過してD-マンヌロナート溶液を作製した。このD-マンヌロナート溶液を5倍に希釈し、アッセイのために使用した。
【０３８３】
（DEHUヒドロゲナーゼのためのアッセイ法。）DEHUヒドロゲナーゼを同定するために、NADPH依存的DEHU水素付加アッセイを行った。それぞれのADHを含む20μlの調製した細胞可溶化物を、上の節で調製した160μlの20倍希釈したDEHU溶液に添加した。A.チュメファシエンス（A.tumefaciens）C58の細胞可溶化物を使用する予備研究では、DEHUの水素付加は補因子としてNADPHを必要とすることが示されたので、20μlの2.5mg/ml NADPH溶液（20mM Tris-HCl, pH 8.0）を添加して、水素付加反応を開始した。NADPHの消費は、ThermoMAX 96ウェルプレートリーダー（Molecular Devises）の動力学的モードを使用して、340nmでの吸光度を30分間モニターした。N末端ドメインの一部を欠いているアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）10を含む大腸菌細胞可溶化物を、対照反応混合物において使用した。
【０３８４】
（D-マンヌロナートヒドロゲナーゼのアッセイ。）D-マンヌロナートヒドロゲナーゼを同定するために、NADPH依存的D-マンヌロナート水素付加アッセイを行った。それぞれのADHを含む20μlの調製した細胞可溶化物を、上の節で調製した160μlのD-マンヌロナート溶液に添加した。20μlの2.5mg/ml NADPH溶液（20mM Tris-HCl, pH 8.0）を添加して、水素付加反応を開始した。NADPHの消費は、ThermoMAX 96ウェルプレートリーダー（Molecular Devises）の動力学的モードを使用して、340nmでの吸光度を30分間モニターした。N末端ドメインの一部を欠いているアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）10を含む大腸菌細胞可溶化物を、対照反応混合物に使用した。
【０３８５】
（pETkdgKの構築。）2-ケト-デオキシグルコナートキナーゼをコードする大腸菌のkdgKのDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化１７】
2010539988.tif 000020
及びリバースプライマー
【化１８】
2010539988.tif 000021
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngの大腸菌DH10Bゲノムを50μlに含んだ。増幅した断片をNdeI、及びBamHIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpET29に連結した。
【０３８６】
（pETkdgAの構築。）2-ケト-デオキシグルコナート-6-ホスフェートアルドラーゼをコードするkdgA大腸菌のDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化１９】
2010539988.tif 000022
及びリバースプライマー
【化２０】
2010539988.tif 000023
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngの大腸菌DH10Bゲノムを50μlに含んだ。増幅した断片をNdeI、及びBamHIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpET29に連結した。
【０３８７】
（タンパク質発現、及び精製。）全てのプラスミド（pETAtu3025、pETADH11、pETADH12、pETkdgA、pETkdgK、及びpETuxuA）は、大腸菌株BL21（DE3）に形質転換した。それぞれのプラスミドを含むBL21（DE3）の単一のコロニーを、50μg/mlのカナマイシン（Km50）を含む50mlのLB培地に播種した。これらの株を、37℃にて200rpmで軌道シェーカーにおいて培養した。OD600nmが0.6に達したときに、0.2mMのIPTGをそれぞれの培養に添加し、誘導した培養は、20℃にて200rpmで軌道シェーカーにおいて培養した。誘導の24時間後に, 4,000rpm×gにて10分間の遠心分離によって細胞を収集し、沈殿を10μlのLysonase（商標） Bioprocessing Reagent（Novagen）、及び示唆された量のプロテアーゼ阻害剤カクテル（SIGMA）を含む2mlのBugbuster（Novagen）に再懸濁した。溶液を10分間、4,000rpm×gにて再び遠心分離し、上清を得た。上清をニッケル-NTAスピンカラム（Qiagen）に適用し、Hisタグの付いたタンパク質を精製した。
【０３８８】
ADH1-10のDEHUヒドロゲナーゼ活性、及びD-マンヌロナートヒドロゲナーゼ活性についてのアッセイの結果は、図7A、及び7Bに示してある。これらの結果は、新規酵素ADH1、及びADH2が有意なDEHUヒドロゲナーゼ活性を示したこと（図7A）、及び新規酵素ADH3、ADH4、及びADH9が、有意なマンヌロナートヒドロゲナーゼ活性を示したこと（図7B）を証明する。
【０３８９】
（インビトロでのピルベートの形成。）反応混合物は、1%アルギナート、又は〜0.5%マンヌロナート、〜5μgの精製したAtu3026（ADH12）、若しくはAtu3027（ADH11）、及び〜5μgの精製したオリゴアルギナートリアーゼ（Atu3025）、UxuA、KdgK、及びKdgA、2mMのATP、及び0.6mM NADPを20mM Tris-HCl pH7.0中に含んだ。反応を一晩実施し、ピルベート形成は、ピルベートアッセイキット（BioVision, Inc）によってモニターした。
【０３９０】
酵素的、及び化学分解によって媒介されるインビトロでのアルギナートからのピルベートの形成の結果は、それぞれ図6B、及び図6Cに示してある。これらの図で分かるように、アルギナートは、単離された酵素によってピルベートに変換された。また、これらの結果は、それぞれのAtu3026（ADH12）、及びAtu3027（ADH11）がDEHUヒドロゲナーゼ、及びマンヌロナートヒドロゲナーゼ反応の両方を触媒することができることを示す。
【０３９１】
実施例4
生合成経路の構築、及び生物活性
（経路の構築）：
大腸菌からのスレオニンデアミナーゼ（ilvA）遺伝子、及びラクトコッカス・ラクティスからのケトイソバレラートデカルボキシラーゼ（kivd）を含むプロピオンアルデヒド生合成経路を構築して、L-トレオニンをプロピオンアルデヒドに変換する能力について試験する。
【０３９２】
大腸菌からのチオラーゼ（atoB）遺伝子、クロストリジウム・アセトブチリクムATCC 824からのβ-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼ（hbd）、クロトナーゼ（crt）、ブチリルCoAデヒドロゲナーゼ（bcd）、電子伝達フラボタンパク質（etfA）、及び電子伝達フラボタンパク質B（etfB）遺伝子、並びにクロストリジウム・ベイエリンキイ・アセトブチリクム（Clostridium beijerinckii acetobutyricum）ATCC 824からのコエンザイムA関連ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ald）遺伝子を含むブチルアルデヒド生合成経路を大腸菌において構築し、ブチルアルデヒドを産生する能力について試験した。また、クロストリジウム・アセトブチリクムATCC 824からのコエンザイムA関連アルコールデヒドロゲナーゼ（adhE2）遺伝子をaldに代わるものとして使用し、ブタノールを産生する能力について試験した。
【０３９３】
枯草菌、又は肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578（コドン選択性は、大腸菌のタンパク質発現に最適化させた）からのアセトラクタートシンターゼ（alsS）、及び大腸菌からのアセトラクタートレダクトイソメラーゼ（ilvC）、及び2,3-ジヒドロキシイソバレラートエステルデヒドラターゼ（ilvD）遺伝子、及びラクトコッカス・ラクティスからのケトイソバレラートデカルボキシラーゼ（kivd）を含むイソブチルアルデヒド生合成経路を構築して、イソブタナール産生によって測定されるイソブチルアルデヒドを産生する能力について試験した。
【０３９４】
枯草菌、又は肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578（コドン選択性は、大腸菌のタンパク質発現に最適化させた）からのアセトラクタートシンターゼ（alsS）、大腸菌からのアセトラクタートレダクトイソメラーゼ（ilvC）、2,3-ジヒドロキシイソバレラートエステルデヒドラターゼ（ilvD）、イソプロピルマラートシンターゼ（LeuA）、イソプロピルマラートイソメラーゼ（LeuC、及びLeuD）、及び3-イソプロピルマラートデヒドロゲナーゼ（LeuB）遺伝子、及びラクトコッカス・ラクティスからのケトイソバレラートデカルボキシラーゼ（kivd）を含む3-メチルブチルアルデヒド、及び2-メチルブチルアルデヒド生合成経路を構築して、3-イソバレルアルデヒド、及び2-イソバレルアルデヒドを産生する能力について試験した。
【０３９５】
大腸菌からのトランスケトラーゼ（tktA）、3-デオキシ-7-ホスホヘプツロナートシンターゼ（aroF、aroG、及びaroH）、3-デヒドロキナートシンターゼ（aroB）、3-デヒドロキナートデヒドラターゼ（aroD）、デヒドロシキマートレダクターゼ（aroE）、シキマートキナーゼII（aroL）、シキマートキナーゼI（aroK）、5-エノールピルビルシキマート-3-ホスフェートシンセターゼ（aroA）、コリスマートシンターゼ（aroC）、融合したコリスマートムターゼP/プレフェン酸デヒドラターゼ（pheA）、及び融合したコリスマートムターゼT/プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（tyrA）遺伝子、ラクトコッカス・ラクティスからのケトイソバレラートデカルボキシラーゼ（kivd）を含むフェニルアセトアルデヒド、及び4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドの生合成経路を構築して、フェニルアセトアルデヒド、及び/又は4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドを産生する能力について試験した。
【０３９６】
大腸菌からのトランスケトラーゼ（tktA）、3-デオキシ-7-ホスホヘプツロン酸シンターゼ（aroF、aroG、及びaroH）、3-デヒドロキナートシンターゼ（aroB）、3-デヒドロキナートデヒドラターゼ（aroD）、デヒドロシキマートレダクターゼ（aroE）、シキマートキナーゼII（aroL）、シキマートキナーゼI（aroK）、5-エノールピルビルシキマート-3-ホスフェートシンセターゼ（aroA）、コリスマートシンターゼ（aroC）、融合したコリスマートムターゼP／プレフェナートデヒドラターゼ（pheA）、及び融合したコリスマートムターゼT／プレフェナートデヒドロゲナーゼ（tyrA）遺伝子、ラクトコッカス・ラクティスからのケトイソバレラートデカルボキシラーゼ（kivd）、サッカロマイセス セレビジエからのアルコールデヒドロゲナーゼ（adh2）、アゾスピリルム・ブラシレンセからのインドール-3-ピルベートデカルボキシラーゼ（ipdc）、ロドコッカス属ST-10からのフェニルエタノールレダクターゼ（par）、蛍光菌からのベンズアルデヒドリアーゼ（bal）を含む2-フェニルエタノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、及び2-(インドール-3-）エタノールの生合成経路を構築して、2-フェニルエタノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、及び/又は2-(インドール-3-）エタノールを産生する能力について試験した。
【０３９７】
（pBADButPの構築。）クロストリジウム・アセトブチリクムATCC 824のhbd、crt、bcd、etfA、及びetfBをコードするDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃3分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化２１】
2010539988.tif 000024
及びリバースプライマー
【化２２】
2010539988.tif 000025
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngのクロストリジウム・アセトブチリクムATCC 824ゲノム（ATCC）を50μlに含んだ。増幅した断片をBamHI、及びXbaIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpBAD33に連結した。
【０３９８】
（pBADButP-atoBの構築。）大腸菌DH10BのatoBをコードするDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化２３】
2010539988.tif 000026
及びリバースプライマー
【化２４】
2010539988.tif 000027
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngの大腸菌DH10Bゲノムを50μlに含んだ。増幅した断片をXbaI、及びPstIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpBADButPに連結した。
【０３９９】
（pBADatoB-aldの構築。）大腸菌DH10BのatoB、及びクロストリジウム・ベイエリンキイからのaldをコードするDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって別々に増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μMのatoBのためのフォワード
【化２５】
2010539988.tif 000028
及びaldのためのフォワード
【化２６】
2010539988.tif 000029
並びにatoBのためのリバース
【化２７】
2010539988.tif 000030
及びaldのためのリバース
【化２８】
2010539988.tif 000031
プライマー、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngの大腸菌DH10B、及びクロストリジウム・ベイエリンキゲノム（ATCC）を50μlにそれぞれ含んだ。増幅したDNA断片をゲル精製し、30μlのEB緩衝液（Qiagen）に溶出した。それぞれのDNA溶液からの5μlを合わせて、それぞれのDNA断片をもう一回PCRによってスプライスした：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃2分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化２９】
2010539988.tif 000032
及びリバースプライマー
【化３０】
2010539988.tif 000033
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）を含んだ。スプライスした断片をSacI、及びHindIIIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpBADButPに連結した。
【０４００】
（pBADButP-atoB-ALDの構築。）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、P15複製開始点、araBADプロモーター、大腸菌DH10BのatoB、及びクロストリジウム・ベイエリンキイのaldをコードするDNA断片1、並びにaraBADプロモータークロストリジウム アセトブチリクムATCC 824の、hbd、crt、bcd、etfA、及びetfBをコードするDNA断片2をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって別々に増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃4分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μMの断片1のためのフォワード
【化３１】
2010539988.tif 000034
及び断片2のためのフォワード
【化３２】
2010539988.tif 000035
並びに断片1のためのリバース
【化３３】
2010539988.tif 000036
及び断片2のためのリバース
【化３４】
2010539988.tif 000037
プライマー、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngのpBADatoB-ald、及びpBADButPを50μlにそれぞれ含んだ。増幅したDNA断片を、NotI、及びKpnIで消化して、互いを連結した。
【０４０１】
（pBADilvCDの構築。）大腸菌DH10BのilvC、及びilvDをコードするDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって別々に増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μMのilvCのためのフォワード
【化３５】
2010539988.tif 000038
及びilvDのためのフォワード
【化３６】
2010539988.tif 000039
並びにilvCのためのリバース
【化３７】
2010539988.tif 000040
及びilvDのためのリバース
【化３８】
2010539988.tif 000041
プライマー、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngの大腸菌DH10Bゲノム（ATCC）を50μlに含んだ。増幅したDNA断片をゲル精製し、30μlのEB緩衝液（Qiagen）に溶出した。それぞれのDNA溶液からの5μlを合わせて、それぞれのDNA断片をもう一回PCRによってスプライスした：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃2分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化３９】
2010539988.tif 000042
及びリバースプライマー
【化４０】
2010539988.tif 000043
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）を含んだ。スプライスした断片をXbaI、及びSphIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpBAD33に連結した。
【０４０２】
（pBADals-ilvCDの構築。）大腸菌での過剰発現のために最適化させたそのコドン選択性の肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578のalsをコードするDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化４１】
2010539988.tif 000044
及びリバースプライマー
【化４２】
2010539988.tif 000045
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngのpETalsを50μlに含んだ。増幅した断片をSacI、及びXbaIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpBADilvCDに連結した。
【０４０３】
（pBADalsS-ilvCDの構築。）枯草菌B26のalsSの前半、及び後半をコードするDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃0.5分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μMの前半のためのフォワードプライマー
【化４３】
2010539988.tif 000046
及び後半のためのフォワードプライマー
【化４４】
2010539988.tif 000047
並びに前半のためのリバースプライマー
【化４５】
2010539988.tif 000048
及び後半のためのリバースプライマー
【化４６】
2010539988.tif 000049
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngの枯草菌B26ゲノム（ATCC）を50μlに含んだ。増幅したDNA断片をゲル精製し、30μlのEB緩衝液（Qiagen）に溶出した。それぞれのDNA溶液からの5μlを合わせて、それぞれのDNA断片をもう一回PCRによってスプライスした：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化４７】
2010539988.tif 000050
及びリバースプライマー
【化４８】
2010539988.tif 000051
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）を含んだ。スプライスした断片には内部のXbaI部位がないので、従ってSacI、及びXbaIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpBADilvCDに連結した。
【０４０４】
（pBADLeuABCDの構築。）大腸菌BL21（DE3）のleuA、leuB、leuC、及びleuDをコードするDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃3分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化４９】
2010539988.tif 000052
及びリバースプライマー
【化５０】
2010539988.tif 000053
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngの大腸菌BL21（DE3）ゲノムを50μlに含んだ。増幅した断片をSacI、及びXbaIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpBAD33に連結した。
【０４０５】
（pBADLeuABCD2の構築。）大腸菌BL21（DE3）のleuA、及びleuBをコードするDNA断片1、並びにleuC、及びleuDをコードするDNA断片2をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μMの断片1のためのフォワードプライマー
【化５１】
2010539988.tif 000054
及び断片2のためのフォワードプライマー
【化５２】
2010539988.tif 000055
並びに断片1のためのリバースプライマー
【化５３】
2010539988.tif 000056
及び断片2のためのリバースプライマー
【化５４】
2010539988.tif 000057
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngの大腸菌BL21（DE3）ゲノムを50μlに含んだ。増幅したDNA断片をゲル精製し、30μlのEB緩衝液（Qiagen）に溶出した。それぞれのDNA溶液からの5μlを合わせて、それぞれのDNA断片をもう一回PCRによってスプライスした：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃3分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化５５】
2010539988.tif 000058
及びリバースプライマー
【化５６】
2010539988.tif 000059
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）を含んだ。スプライスした断片はSacI、及びXbaIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpBAD33に連結した。
【０４０６】
（pBADLeuABCD4の構築。）大腸菌BL21（DE3）のleuA、leuB、leuC、及びleuDをコードするDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM のleuAのためのフォワードプライマー
【化５７】
2010539988.tif 000060
leuBのためのフォワードプライマー
【化５８】
2010539988.tif 000061
leuCのためのフォワードプライマー
【化５９】
2010539988.tif 000062
及びleuDのためのフォワードプライマー
【化６０】
2010539988.tif 000063
並びにleuAのためのリバースプライマー
【化６１】
2010539988.tif 000064
leuBのためのリバースプライマー
【化６２】
2010539988.tif 000065
leuCのためのリバースプライマー
【化６３】
2010539988.tif 000066
及びleuDのためのリバースプライマー
【化６４】
2010539988.tif 000067
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngの大腸菌BL21（DE3）ゲノムを50μlにそれぞれ含んだ。増幅したDNA断片をゲル精製し、30μlのEB緩衝液（Qiagen）に溶出した。それぞれのDNA溶液からの5μlを合わせて、それぞれのDNA断片をもう一回PCRによってスプライスした：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃3分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化６５】
2010539988.tif 000068
及びリバースプライマー
【化６６】
2010539988.tif 000069
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）を含んだ。スプライスした断片をSacI、及びXbaIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpBAD33に連結した。
【０４０７】
（pBADals-ilvCD-leuABCD、pBADals-ilvCD-leuABCD2、pBADals-ilvCD-leuABCD4、pBADalsS-ilvCD-leuABCD、pBADalsS-ilvCD-leuABCD2、pBADalsS-ilvCD-leuABCD4の構築。）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、P15複製開始点、araBADプロモーター、大腸菌での過剰発現のために最適化させたそのコドン選択性の肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578のals、又は枯草菌B26のalsS、並びに大腸菌DH10BのilvC、及びilvDをコードするDNA断片1（alsのため）、及び2（alsSのため）をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって、別々に増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃4分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μMのフォワードプライマー
【化６７】
2010539988.tif 000070
及びリバースプライマー
【化６８】
2010539988.tif 000071
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、並びに50ngのpBADals-ilvCD、及びpBADalsS-ilvCDを50μlにそれぞれ含んだ。
【０４０８】
leuCからの内部のSphI制限酵素部位を除去するために、オーバーラップPCRを実施した。araBADプロモーター、大腸菌BL21（DE3）のleuA、leuB、leuC、及びleuDをコードするDNA断片3（leuABCDのため）、断片4（leuABCD2のため）、並びに断片5（leuABCD4のための）の前半、及び後半をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって、別々に増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃4分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM の前半のためのフォワードプライマー
【化６９】
2010539988.tif 000072
及び後半のためのフォワードプライマー
【化７０】
2010539988.tif 000073
並びに前半のためのリバースプライマー
【化７１】
2010539988.tif 000074
及び後半のためのリバースプライマー
【化７２】
2010539988.tif 000075
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、並びに50ngのpBADleuABCD、pBADleuABCD2、及びpBADleuABCD4を50μlにそれぞれ含んだ。増幅したDNA断片をゲル精製し、30μlのEB緩衝液（Qiagen）に溶出した。それぞれのDNA溶液からの5μlを合わせて、それぞれのDNA断片をもう一回PCRによってスプライスした：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃4分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化７３】
2010539988.tif 000076
及びリバースプライマー
【化７４】
2010539988.tif 000077
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）を含んだ。生じる断片3、4、及び5をSphI、及びNotIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化した断片1、及び2の両方に連結した。
【０４０９】
（pBADaroG-tktA-aroBDEの構築。）大腸菌BL21（DE3）のaroG、tktA、aroB、aroD、及びaroEをコードするDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM のaroGのためのフォワードプライマー
【化７５】
2010539988.tif 000078
tktAのためのフォワードプライマー
【化７６】
2010539988.tif 000079
aroBのためのフォワードプライマー
【化７７】
2010539988.tif 000080
aroDのためのフォワードプライマー
【化７８】
2010539988.tif 000081
及びaroEのためのフォワードプライマー
【化７９】
2010539988.tif 000082
並びにaroGのためのリバースプライマー
【化８０】
2010539988.tif 000083
tktAのためのリバースプライマー
【化８１】
2010539988.tif 000084
aroBのためのリバースプライマー
【化８２】
2010539988.tif 000085
aroDのためのリバースプライマー
【化８３】
2010539988.tif 000086
及びaroEのためのリバースプライマー
【化８４】
2010539988.tif 000087
プライマー、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngの大腸菌BL21（DE3）ゲノムを50μlにそれぞれ含んだ。増幅したDNA断片をゲル精製し、30μlのEB緩衝液（Qiagen）に溶出した。それぞれのDNA溶液からの5μlを合わせて、それぞれのDNA断片をもう一回PCRによってスプライスした：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃3分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化８５】
2010539988.tif 000088
及びリバースプライマー
【化８６】
2010539988.tif 000089
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）を含んだ。スプライスした断片をSacI、及びSphIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpBAD33に連結した。
【０４１０】
（pBADpheA-aroLACの構築。）大腸菌DH10のpheA、aroL、aroA、及びaroCをコードするDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM のpheAのためのフォワードプライマー
【化８７】
2010539988.tif 000090
aroLのためのフォワードプライマー
【化８８】
2010539988.tif 000091
aroAのためのフォワードプライマー
【化８９】
2010539988.tif 000092
及びaroCのためのフォワードプライマー
【化９０】
2010539988.tif 000093
並びにpheAのためのリバースプライマー
【化９１】
2010539988.tif 000094
aroLのためのリバースプライマー
【化９２】
2010539988.tif 000095
aroAのためのリバースプライマー
【化９３】
2010539988.tif 000096
及びaroCのためのリバースプライマー
【化９４】
2010539988.tif 000097
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngの大腸菌BL21（DE3）ゲノムを50μlにそれぞれ含んだ。増幅したDNA断片をゲル精製し、30μlのEB緩衝液（Qiagen）に溶出した。それぞれのDNA溶液からの5μlを合わせて、それぞれのDNA断片をもう一回PCRによってスプライスした：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃4分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化９５】
2010539988.tif 000098
及びリバースプライマー
【化９６】
2010539988.tif 000099
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）を含んだ。スプライスした断片をSacI、及びSphIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpBAD33に連結した。
【０４１１】
（pBADtyrA-aroLACの構築。）大腸菌DH10のpheA、aroL、aroA、及びaroCをコードするDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM のtyrAのためのフォワードプライマー
【化９７】
2010539988.tif 000100
aroLのためのフォワードプライマー
【化９８】
2010539988.tif 000101
aroAのためのフォワードプライマー
【化９９】
2010539988.tif 000102
及びaroCのためのフォワードプライマー
【化１００】
2010539988.tif 000103
並びにtyrAのためのリバースプライマー
【化１０１】
2010539988.tif 000104
aroLのためのリバースプライマー
【化１０２】
2010539988.tif 000105
aroAのためのリバースプライマー
【化１０３】
2010539988.tif 000106
及びaroCのためのリバースプライマー
【化１０４】
2010539988.tif 000107
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngの大腸菌BL21（DE3）を50μlにそれぞれ含んだ。増幅したDNA断片をゲル精製し、30μlのEB緩衝液（Qiagen）に溶出した。それぞれのDNA溶液からの5μlを合わせて、それぞれのDNA断片をもう一回PCRによってスプライスした：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃4分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化１０５】
2010539988.tif 000108
及びリバースプライマー
【化１０６】
2010539988.tif 000109
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）を含んだ。スプライスした断片をSacI、及びSphIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpBAD33に連結した。
【０４１２】
（pBADpheA-aroLAC-aroG-tktA-aroBDE、及びpBADtyrA-aroLAC-aroG-tktA-aroBDEの構築。）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、P15複製開始点、araBADプロモーター、大腸菌DH10BのpheA、又はtyrA、aroL、aroA、aroCをコードするDNA断片1（pheAのため）、及び2（tyrAのため）、並びにaraBADプロモーター、大腸菌DH10BのaroG、tktA、aroB、aroD、及びaroEをコードするDNA断片3をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって、別々に増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃4分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM の断片1、及び2のためのフォワードプライマー
【化１０７】
2010539988.tif 000110
及び断片3のためのフォワードプライマー
【化１０８】
2010539988.tif 000111
並びに断片1、及び2のためのリバースプライマー
【化１０９】
2010539988.tif 000112
及び断片3のためのリバースプライマー
【化１１０】
2010539988.tif 000113
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、並びに50ngのpBADpheA-aroLAC、pBADtyrA-aroLAC、及びpBADaroG-tktA-aroBDEを50μlにそれぞれ含んだ。増幅したDNA断片1、及び2をNotI、及びXbaIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化した断片3に連結した。
【０４１３】
（pTrcBALの構築。）大腸菌での過剰発現のために最適化させたそのコドン選択性の蛍光菌のベンズアルデヒドリアーゼ（bal）をコードするDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化１１１】
2010539988.tif 000114
及びリバースプライマー
【化１１２】
2010539988.tif 000115
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngのpETBALを50μlに含んだ。増幅したDNA断片をNcoI、及びSacIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpTrc99Aに連結した。
【０４１４】
（pTrcAdhE2の構築。）クロストリジウム・アセトブチリクムATCC824のCoAが連結したアルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼ（adhE2）をコードするDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化１１３】
2010539988.tif 000116
及びリバースプライマー
【化１１４】
2010539988.tif 000117
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngのクロストリジウム・アセトブチリクムATCC824ゲノムを50μlに含んだ。増幅したDNA断片をNcoI、及びSacIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpTrc99Aに連結した。
【０４１５】
（pTrcAdh2の構築。）サッカロマイセス セレビジエのアルコールデヒドロゲナーゼ（adh2）をコードするDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化１１５】
2010539988.tif 000118
及びリバースプライマー
【化１１６】
2010539988.tif 000119
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngのサッカロマイセス セレビジエゲノムを50μlに含んだ。増幅したDNA断片をNcoI、及びSacIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpTrc99Aに連結した。
【０４１６】
（pTrcBALDの構築。）クロストリジウム・ベイエリンキイのCoAが連結したアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ald）をコードするDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化１１７】
2010539988.tif 000120
及びリバースプライマー
【化１１８】
2010539988.tif 000121
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngのpETBALを50μlに含んだ。増幅したDNA断片をSacI、及びHindIIIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpTrcBALに連結した。
【０４１７】
（pTrcBALKの構築。）ラクトコッカス ラブティス（Lactococcus lavtis）のケトイソバレラートデカルボキシラーゼ（kivd）をコードするDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化１１９】
2010539988.tif 000122
及びリバースプライマー
【化１２０】
2010539988.tif 000123
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngのpETBALを50μlに含んだ。増幅したDNA断片をSacI、及びXbaIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpTrcBALに連結した。
【０４１８】
pTrcAdh-Kivdの構築。ラクトコッカス ラブティス（Lactococcus lavtis）のケトイソバレラートデカルボキシラーゼ（kivd）をコードするDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化１２１】
2010539988.tif 000124
及びリバースプライマー
【化１２２】
2010539988.tif 000125
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngのpETBALを50μlに含んだ。増幅したDNA断片をSacI、及びXbaIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpTrcAdh2に連結した。
【０４１９】
（pTrcBAL-DDH-2ADHの構築。）内部のNcoI部位を除去するために、オーバーラップPCRを実施した。肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578のメソ-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ddh）、並びに蛍光菌の二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2adh）の前半、及び後半をコードするDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって、別々に増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM のddhの前半のためのフォワードプライマー
【化１２３】
2010539988.tif 000126
ddhの後半のためのフォワードプライマー
【化１２４】
2010539988.tif 000127
2adhの前半のためのフォワードプライマー
【化１２５】
2010539988.tif 000128
及び2adhの後半のためのフォワードプライマー
【化１２６】
2010539988.tif 000129
並びにddhの前半のためのリバースプライマー
【化１２７】
2010539988.tif 000130
ddhの後半のためのリバースプライマー
【化１２８】
2010539988.tif 000131
2adhの前半のためのリバースプライマー
【化１２９】
2010539988.tif 000132
及び2adhの後半のためのリバースプライマー
【化１３０】
2010539988.tif 000133
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及びddhについては50ngの肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578ゲノム、及び2adhについては50ngの蛍光菌ゲノムを50μlにそれぞれ含んだ。増幅したDNA断片をゲル精製し、30μlのEB緩衝液（Qiagen）に溶出した。それぞれのDNA溶液からの5μlを合わせて、それぞれのDNA断片をもう一回PCRによってスプライスした：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃2分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化１３１】
2010539988.tif 000134
及びリバースプライマー
【化１３２】
2010539988.tif 000135
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）を含んだ。スプライスした断片をSacI、及びHindIIIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpTrcBALに連結した。
【０４２０】
（pBBRPduCDEGHの構築。）肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578のプロパンジオールデヒドラターゼの中（pduD）及び小（pduE）サブユニット、並びにプロパンジオールデヒドラターゼ再活性化大（pduG）及び小（pduH）サブユニットをコードするDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃2分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化１３３】
2010539988.tif 000136
及びリバースプライマー
【化１３４】
2010539988.tif 000137
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngの肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578を50μlに含んだ。増幅したDNA断片をSacII、及びXbaIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpTrc99Aに連結してpBBRPduDEGHを形成した。
【０４２１】
肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578のプロパンジオールデヒドラターゼ大サブユニット（pduC）をコードするDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化１３５】
2010539988.tif 000138
及びリバースプライマー
【化１３６】
2010539988.tif 000139
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngの肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578を50μlに含んだ。増幅したDNA断片をXhoI、及びXbaIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpBBRPduDEGHに連結した。
【０４２２】
（pTrcIpdc-Parの構築。）アゾスピリルム・ブラシレンセのインドール-3-ピルベート（ipdc）、及びロドコッカス属種ST-10のフェニルエタノールレダクターゼ（Par）をコードするDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM のipdcのためのフォワードプライマー
【化１３７】
2010539988.tif 000140
及びparのためのフォワードプライマー
【化１３８】
2010539988.tif 000141
並びにipdcのためのリバースプライマー
【化１３９】
2010539988.tif 000142
及びparのためのリバースプライマー
【化１４０】
2010539988.tif 000143
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、並びに50ngのpTrcIpdc、及びpTrcParを50μlにそれぞれ含んだ。Ipdc、及びParの増幅したDNA断片を、それぞれNcoI/SacI、及びSacI/XbaIで消化して、NcoI、及びXbaIであらかじめ消化したpTrc99Aに連結した。
【０４２３】
（試験、及び結果）：
ブチルアルデヒド生合成経路を試験するために、pBADButP-atoB/pTrcBALD、及びpBADButP-atoB-ALD/pTrcB2DH/pBBRpduCDEGHを有するDH10Bを37℃、200rpmにて、50μg/mlのクロラムフェニコール（Cm50）、及び100μg/mlのアンピシリン（Amp100）を含むLB培地において一晩培養した。それぞれの種培養の一定分量を、Cm50、及びAmp100を含む新鮮なTB培地に播種して、37℃、200rpmにて、インキュベーションシェーカーにおいて培養した。播種の3時間後に、培養を13.3mMアラビノース、及び1mM IPTGで誘導して、一晩の間培養した。この培養の700μlを同容積の酢酸エチルで抽出して、GC-MSによって解析した。
【０４２４】
イソブチルアルデヒド生合成経路を試験するために、pBADals-ilvCD/pTrcBALK、又はpBADalsS-ilvCD/pTrcBALKを有するDH10B細胞を、37℃、200rpmにて、50μg/mlのクロラムフェニコール（Cm50）、及び100μg/mlのアンピシリン（Amp100）を含むLB培地において一晩培養した。それぞれの種培養の一定分量を、Cm50、及びAmp100を含む新鮮なTB培地に播種して、37℃、200rpmにて、インキュベーションシェーカーにおいて培養した。播種の3時間後に、培養を13.3mMアラビノース、及び1mM IPTGで誘導して、一晩の間培養した。この培養の700μlを同容積の酢酸エチルで抽出して、イソブチルアルデヒドの産生についてGC-MSによって解析した。図8bは、これらの培養からのイソブタナールの産生を示す。
【０４２５】
3-メチルブチルアルデヒド、及び2-メチルブチルアルデヒド生合成経路を試験するために、pBADals-ilvCD-LeuABCD/pTrcBALK、pBADals-ilvCD-LeuABCD2/pTrcBALK、pBADals-ilvCD-LeuABCD/pTrcBALK4、pBADalsS-LeuABCD/pTrcBALK、pBADalsS-LeuABCD2/pTrcBALK、又はpBADalsS-LeuABCD4/pTrcBALKを有するDH10B細胞を、37℃、200rpmにて、50μg/mlのクロラムフェニコール（Cm50）、及び100μg/mlのアンピシリン（Amp100）を含むLB培地において一晩培養した。それぞれの種培養の一定分量を、Cm50、及びAmp100を含む新鮮なTB培地に播種して、37℃、200rpmにて、インキュベーションシェーカーにおいて培養した。播種の3時間後に、培養を13.3mMアラビノース、及び1mM IPTGで誘導して、一晩の間培養した。この培養の700μlを同容積の酢酸エチルで抽出して、GC-MSによって解析した。3-イソバレルアルデヒド、及び2-イソバレルアルデヒドは、これらの対応するアルコールに自発的に変換されるので、2-イソバレルアルコール（2-メチルペンタール）、及び3-イソバレルアルコール（3-メチルペンタール）の産生をモニターした。図8Bは、これらの培養からの2-メチルペンタール、及び3-メチルペンタールの産生を示す。
【０４２６】
フェニルアセトアルデヒド、及び4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド生合成経路を試験するために、pBADpheA-aroLAC/pTrcBALK、pBADtyrA-aroLAC/pTrcBALK、pBADaroG-tktA-aroBDE/pTrcBALK、pBADpheA-aroLAC-aroG-tktA-aroBDE/pTrcBALK、及びpBADpheA-aroLAC-aroG-tktA-aroBDE/pTrcBALKを有するDH10B細胞を、37℃、200rpmにて、50μg/mlのクロラムフェニコール（Cm50）、及び100μg/mlのアンピシリン（Amp100）を含むLB培地において一晩培養した。それぞれの種培養の一定分量を、Cm50、及びAmp100を含む新鮮なTB培地に播種して、37℃、200rpmにて、インキュベーションシェーカーにおいて培養した。播種の3時間後に、培養を13.3mMアラビノース、及び1mM IPTGで誘導して、一晩の間培養した。この培養の700μlを同容積の酢酸エチルで抽出して、GC-MSによって解析した。フェニルアセトアルデヒド、4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、及びこれらの対応するアルコールの産生は、GC-MSを使用してモニターした。図9Bは、これらの培養からの4-ヒドロキシフェニルエタノールの産生を示す。
【０４２７】
2-フェニルエタノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、及び2-(インドール-3-）エタノール生合成経路を試験するために、pBADpheA-aroLAC-aroG-tktA-aroBDE/pTrcBALK、pBADpheA-aroLAC-aroG-tktA-aroBDE/pTrcBALK、pBADpheA-aroLAC-aroG-tktA-aroBDE/pTrcAdh2-Kivd、pBADpheA-aroLAC-aroG-tktA-aroBDE/pTrcAdh2-Kivd、pBADpheA-aroLAC-aroG-tktA-aroBDE/pTrcIpdc-Par、及びpBADpheA-aroLAC-aroG-tktA-aroBDE/pTrcIpdc-Parを有するDH10Bを、37℃、200rpmにて、50μg/mlのクロラムフェニコール（Cm50）、及び100μg/mlのアンピシリン（Amp100）を含むLB培地において一晩培養した。それぞれの種培養の一定分量を、Cm50、及びAmp100を含む新鮮なTB培地に播種して、37℃、200rpmにて、インキュベーションシェーカーにおいて培養した。播種の3時間後に、培養を13.3mMアラビノース、及び1mM IPTGで誘導して、一晩の間培養した。この培養の700μlを同等の容積の酢酸エチルで抽出して、GC-MSによって解析した。結果は、下記に詳述してある。
【０４２８】
2-フェニルエタノール、2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール、及び／又は2-(インドール-3-）エタノールの産生は、GC-MSを使用してモニターした。図42Aは、24時間でのこれらの培養からの2-フェニルエタノールの産生を示す。図42Bは、24時間でのこれらの培養からの2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノールの産生を示す。図42Cは、24時間でのこれらの培養からの2-(インドール-3-）エタノールの産生を示す。
【０４２９】
図43Aは、1週での対照（pBAD33、及びpTrc99A）のGC-MSクロマトグラムを示す。図43Bは、1週でのpBADpheA-aroLAC-aroG-tktA-aroBDE、及びpTrcBALKからの2-フェニルエタノール（5.97分）産生のGC-MSクロマトグラムを示す。図44は、1週でのpBADtyrA-aroLAC-aroG-tktA-aroBDE、及びpTrcBALKから2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノール（9.36分）、及び2-(インドール-3）エタノール（10.32分）産生のGC-MSクロマトグラムを示す。
【０４３０】
実施例5
ジオールデヒドロゲナーゼの単離、及び生物活性
3-ヒドロキシ-2-ブタノン（アセトイン）、4-ヒドロキシ-3-ヘキサノン（プロピオイン）、5-ヒドロキシ-4-オクタノン（ブチロイン）、6-ヒドロキシ-5-デカノン（バレロイン）、及び1,2-シクロペンタンジオールなどの入手できる基質を使用して、ジオールデヒドロゲナーゼ（ddh）が大型の飽和α-ヒドロキシケトンの還元を触媒してジオールを産生する能力を測定した。特に明記しない限り、全ての試薬は、Sigma-Aldrich社、及びTCI Americaから購入した。
【０４３１】
DDHポリペプチドのクローン化、及び単離のために、いくつかの種の細菌からのゲノムDNAをATCC（ラクトバチルス・ブレビスATCC 367、プチダ菌KT2440、及び肺炎桿菌MGH78578）から得て、以下のプロトコルを利用してPCR増幅した（50μLの反応において、1×Phusion緩衝液、0.2mM dNTP、0.5μL Phusion酵素、1.5μMプライマー、及び20pg鋳型DNAと共にポリメラーゼを含むPhusioinを使用して）：30サイクル、98℃／10秒（変性）、60℃／15秒（アニーリング）、72℃/30秒（伸長）。次いで、ポリメラーゼ連鎖反応産物を制限酵素NdeI、及びBamHIを使用して消化し、次いでNdeI／BamHI消化したpET28ベクターに連結した。ddhクローンを含むベクターを、タンパク質発現のためにBL21（DE3）コンピテント細胞に形質転換した。単一のコロニーをLB培地に播種し、関心対象の6×Hisのタグを付けたタンパク質の発現は、OD600 = 0.6にて0.1mM IPTGで誘導した。発現は、22℃にて15時間まで進行させた。6×Hisタグが付いた酵素は、QIAGENにより示唆されたプロトコルに従って、Ni-NTAスピンカラムを使用することにより精製し、1.1〜6.5mg/mlの範囲の精製したタンパク質濃度（Bradfordアッセイによって決定される）を得た。
【０４３２】
ジオールデヒドロゲナーゼddh1をラクトバチルス・ブレビスATCC 367から単離し、ジオールデヒドロゲナーゼddh2をプチダ菌KT2440から単離し、ジオールデヒドロゲナーゼddh3を肺炎桿菌MGH78578から単離した。ddh1をコードするヌクレオチド配列、及びポリペプチド配列は、配列番号：97、及び98において、それぞれ示され；ddh2をコードするヌクレオチド配列、及びポリペプチド配列は、配列番号：99、及び100において、それぞれ示され；並びにddh3をコードするヌクレオチド配列、及びポリペプチド配列は、配列番号：101、及び102において、それぞれ示される。
【０４３３】
DDHポリペプチドの生物活性を測定する反応は、以下の通りに200μlの最終容積で行った：25mM基質、0.04mg/ml DDHポリペプチド、0.25mg/mlニコチンアミド補因子、200mMイミダゾール、14mM Tris-HCl、及び1.5容量％ DMSO。生物活性は、Mokecular Devices Thermomax 96ウェルプレートリーダーを使用してアッセイし、NADH、又はNADPH濃度に対応する340nmの吸光度をモニターした。動力学的研究のためには、0.04mg/ml DDHポリペプチド、0.25mg/ml NADH、20mM Tris HCl緩衝液pH 6.5（還元）、又は9.0（酸化）、T=25 C、100μlの総容積を使用した。
【０４３４】
図12Aは、基質としてブチロインを使用したddh1、ddh2、及びddh3の生物活性を示す（三角は、ddh3活性を表す）。図12Bは、NADH産生によって測定される、1,2-シクロペンタンジオール、及び1,2-シクロヘキサンジオールに対するddh3の酸化活性を示す。図13は、DDHポリペプチドによって触媒される酸化反応における種々の基質についての動力学的研究の結果を要約する。これらの反応は、NAD+依存的であった。
【０４３５】
実施例6
CC-リガーゼ（リアーゼ）、及びジオールデヒドロゲナーゼの連続的なインビボ生物活性
C-Cリアーゼ、及びジオールヒドロゲナーゼが以下の連続的な反応を行う能力を大腸菌において試験した：
【化１４１】
2010539988.tif 000144
【０４３６】
α-ヒドロキシケトン、及びジオール産生については、蛍光菌（コドン選択性は、大腸菌タンパク質発現に最適化させた）から単離したベンズアルデヒドリアーゼ（bal）遺伝子、及び肺炎桿菌亜種肺炎MGH 78578から単離されたメソ-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ddh）遺伝子を含む経路を大腸菌において構築して、インビボにおいて、表2において下記に詳述した基質（例えば、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、2-メチル-ブチルアルデヒド、3-メチル-ブチルアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、及び4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、又はこれらに対応するアルコール）を縮合し、α-ヒドロキシケトン、及び対応するジオールを形成する能力について試験した。種々のα-ヒドロキシケトン、及びジオールの産生をガスクロマトグラフィー／質量分析法（GC-MS）によってモニターした。
【０４３７】
【表２】
2010539988.tif 000145
【０４３８】
（C10以下の解析について。）pTrcBAL-DDH-2ADHを有する大腸菌を、50μg/ml カナマイシン（km）を含むLB培地において一晩培養した。この種培養を、3%（v/v）グリセロール、0.5%（g/v）、及び50μg/ml Kmを含むM9培地に播種した。10mlの培養をO.D.600 = 0.7まで培養し、次いで、培養を0.5mM IPTGで誘導した。関心対象の酵素を細胞に発現させた3時間後に、種々のアルデヒドを5〜10mMの濃度に添加した。アルデヒドの添加の後、培養にキャップをし、振とうしながら37℃にて72時間インキュベートした。培養を2mL酢酸エチルで抽出して、以下のプロトコルを使用してGC-MSで解析した：
1μl注入、w/50：1分割
入口温度‐150℃
最初のオーブン温度‐50℃
温度ランプ1‐10℃/分を150℃まで
温度ランプ2‐50℃/分を300℃まで
GCからMSへの移動温度‐250℃
MSの検出‐フルスキャン、MW 35〜200。
【０４３９】
（C12以上の解析について。）pTrc99A（対照ベクター）、又はpTrcBALを有する大腸菌DH10B株を、0.1mM CaCl2、2mM MgSO4、1mM KCl、1% ガラクツロナート、5μg/mLチアミン、Ampを含む0.75×M9/0.5% LBに播種した。培養を0.8の光学濃度（600nm）まで培養し、0.25mM IPTGで誘導した。細胞は、37℃にてタンパク質を2.5時間発現させ、次いで、アルデヒド基質を5mMの濃度に添加し、培養バイアルをきつく密閉し、200rpmで振とうしながら37℃にて72時間インキュベートした。1mlの最終培養を0.75mlの酢酸エチルで抽出し、遠心して相分離を促し、次いで以下の方法を使用してGCMSによって解析した。
1μl注入、w/50：1分割
入口温度‐250℃
最初のオーブン温度‐50℃
温度ランプ1‐10℃/分を125℃まで
温度ランプ2‐30℃/分を300℃まで
最終温度300℃‐1分
GCからMSへの移動温度‐250℃
MSの検出‐フルスキャン、MW 40〜260
【０４４０】
結果を図17〜25に示してある。図17は、5-ヒドロキシ-4-オクタノン、及び次いで4,5-オクタノンジオールへの、ブタナールの連続的な変換を示す。図18は、6-ヒドロキシ-5-デカノン、及び次いで5,6-デカンジオールへの、n-ペンタナールの連続的な変換を示す。図19は、2,7-ジメチル-5-ヒドロキシ-4-オクタノン、及び次いで2,7-ジメチル-4,5-オクタンジオールへの、3-メチルブタナールの変換を示す。図20は、7-ヒドロキシ-6-ドデカノン、次いで6,7-ドデカンジオールへの、n-ヘキサナールの連続的な変換を示す。図21は、2,9-ジメチル-6-ヒドロキシ-5-デカノン、次いで2,9-ジメチル-5,6-デカンジオールへの、4-メチルペンタナールの変換を示す。図22は、9-ヒドロキシ-8-ヘキサデカノンへの、n-オクタナールの変換を示す。図23は、3-ヒドロキシ-2-ブタノンへの、アセトアルデヒドの変換を示す。図24は、4-ヒドロキシ-3-ヘキサノン、次いで3,4-ヘキサンジオールへの、n-プロパナールの連続的な変換を示す。図25は、1,4-ジフェニル-3-ヒドロキシ-2-ブタノンへの、フェニルアセトアルデヒドの変換を示す。
【０４４１】
上と同様に、蛍光菌（コドン選択性は、大腸菌タンパク質発現のために最適化させた）から単離されたベンズアルデヒドリアーゼ（bal）遺伝子を含む経路を大腸菌において構築して、種々のα-ヒドロキシケトンの産生を触媒する能力について試験した。試験したbal遺伝子のC-Cリガーゼ活性の広域スペクトルを示す結果は、図48〜図55に記載される。
【０４４２】
実施例7
ジオールデヒドロゲナーゼ、及びジオールデヒドラターゼの連続的な生物活性
脱水、及び還元経路におけるジオールデヒドロゲナーゼ、及びジオールデヒドラターゼの連続的な生物活性を試験するために、連続的な反応における基質としてブチロインを使用し、4-オクタノンを産生した。酵素ジオールデヒドロゲナーゼ（例えば、ddh）は、α-ヒドロキシケトン、及びその対応するジオール、例えば5-ヒドロキシ-4-オクタノン、及び4,5-オクタンジオールの可逆的な還元、及び酸化を触媒し、酵素ジオールデヒドラターゼ（例えば、pduCDE）は、ジオール、例えば4,5-オクタンジオールの不可逆的脱水を触媒する。
【０４４３】
肺炎桿菌MGH 78578からのジオールデヒドロゲナーゼddh、及び肺炎桿菌MGH 78578からのジオールデヒドラターゼpduCDEは、ジオールデヒドラターゼの発現、及び精製の間中ずっと1mM 1,2-プロパンジオールを添加したことを除き、実施例Xに記載されているように、細菌発現ベクターにクローン化して、発現し、Ni-NTAカラムで精製した。pduCDEポリペプチドの大、中、及び小サブユニットは、それぞれ配列番号：103、105，及び107のヌクレオチド配列によってコードされ、ポリペプチド配列は、それぞれ配列番号：104、106，及び108に記載されている。
【０４４４】
ddh3、及びpduCDEのポリペプチドをブチロイン、及びこれらの適切な補因子と共にインキュベートして、次いで、これらが産物4-オクタノンを生じる連続反応を行う能力について、ガスクロマトグラフィー／質量分析法（GC-MS）を使用してアッセイした。反応条件は、下記の表3に示してある。反応混合物は、最小限の上部空間で0.6mL エッペンドルフチューブにおいて、37℃で40時間インキュベートした。反応生成物を等量の酢酸エチルで抽出して、ガラスバイアルに貯蔵し、GC-MSによる組成解析のために、サーモフィッシャー科学機器部門（Thermo Fischer Scientific Instruments Division）に送った。
【０４４５】
【表３】
2010539988.tif 000146
【０４４６】
図26Aは、試料抽出における4,5-オクタンジオールの存在を確認するGC-MSデータを示す。保持時間5.36における質量スペクトルのピークは、ブチロイン（基質）として同定され、6.01、6.09、及び6.12分におけるピークは、4,5-オクタンジオールの異なる異性体として同定された。この化合物は、ddh3によるブチロインの還元により生じる予想産物である。
【０４４７】
図26Bは、試料抽出における4-オクタノンの存在を確認するGC-MSデータを示す。保持時間4.55における質量スペクトルのピークは、4-オクタノンとして同定された。この化合物は、それぞれddh3、及びpduCDEによるブチロインの連続的な脱水素、及び4,5-オクタンジオールの脱水により生じる予想産物である。
【０４４８】
図27A、及び27Bは、試料抽出のガスクロマトグラフ／質量スペクトル、及び4-オクタノン標準ガスクロマトグラフ/質量スペクトルの間の比較を示す。これらの結果は、4-オクタノンが、酵素ジオールデヒドロゲナーゼ（ddh3）、及びジオールデヒドラターゼ（pduCDE）を使用してブチロインから産生されたことを証明する。インキュベートした反応混合物のGC-MS解析により、出発材料、中間体、及び産物を確認し、これらの酵素がこれらの特異的基質に再び適用することができることを証明した。
【０４４９】
実施例8
二級アルコールデヒドロゲナーゼの単離、及び生物活性
4-オクタノン、2,7-ジメチル-4-オクタノン、シクロペンタノン、及び対応するアルコールなどの基質を利用して、二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2ADHs）が大型の飽和ケトンの二級アルコールへの還元を触媒する能力を測定した。二級アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される反応の例は、下記に図示される（4-オクタノンの4-オクタノールへの還元を示してある）：
【化１４２】
2010539988.tif 000147
【０４５０】
特に明記しない限り、全ての酵素、及び試薬は、それぞれNew England Biolabs、及びSigmaから購入した。
【０４５１】
種々の二級アルコールデヒドロゲナーゼ（2ADH）は、プチダ菌KT2440、蛍光菌Pf-5、及び肺炎桿菌MGH 78578から単離した。全てのベクターをBL21（DE3）コンピテント細胞に形質転換し、関心対象のタンパク質をコードする遺伝子の発現をIPTGで誘導した（T7プロモーターを介して）。細胞を溶解し、タンパク質を抽出して、次いでNi-NTAカラムで精製した。Ni-NTA溶出液における最終的なタンパク質濃度は、アッセイ前に、0.15mg/mlに希釈した。
【０４５２】
NADPH/NADPH消費、及び産生アッセイは、動力学的モードでTHERMOmaxマイクロプレートリーダーを使用して行い、反応が平衡に到達するまで、340nmでのNADPHの吸光度ピークをモニターした。表2に記述したアッセイにおいて、2ADH-2、2ADH-5、2ADH-8、及び2ADH-10を、これらが4-オクタノールの酸化を触媒するか、又は4-オクタノンの還元を触媒する能力について試験した。これらの反応条件は、下記の表4に見いだされる。
【０４５３】
【表４】
2010539988.tif 000148
【０４５４】
下記の表5に記載したように、さらなる試験を行い、2ADH-2、2ADH-11、2ADH-12、2ADH-13、2ADH-14、2ADH-15、2ADH-16、2ADH-17、及び2ADH-18を、これらが4-オクタノール、2,7-ジメチル-4-オクタノール、若しくはシクロペンタノールの酸化を触媒するか、又は4-オクタノン、2,7-ジメチル-4-オクタノン、若しくはシクロペンタノンの還元を触媒する能力について試験した。
【０４５５】
【表５】
2010539988.tif 000149
【０４５６】
図30Aは、表3のNADH産生アッセイからの結果を示し、2ADH-2は、NADH産生によって測定されるように、NAD+の存在下において4-オクタノールの酸化を触媒する。図30Bは、表3のNADPH産生アッセイの結果を示し、2ADH-5、2ADH-8、及び2ADH-10は、NADPH産生によって測定される、NADP+の存在下において4-オクタノールの酸化を触媒する。
【０４５７】
図31は、それぞれ、NADH、及びNADPH産生によって測定される、2ADH-11（図31A）、及び2ADH-16（図31B）による4-オクタノールの酸化を示す。図32は、それぞれ、NADH、及びNADPH産生によって測定される、2ADH-11、及びその他（図32A）、並びに2ADH-16（図32B）による2,7-ジメチルオクタノールの酸化を示す。
【０４５８】
図33Aは、NADPH消費によってモニターされる、2ADH-11、及び2ADH-16による2,7-ジメチルオクタノールの還元を示す。図33Bは、種々の基質に対する2ADH-11、及び2ADH-16の両者の還元活性を示す。図34は、2ADH-16によるシクロペンタノールの酸化（図34A）、及び還元（図34B）を示す。
【０４５９】
上と同様に、酸化、及び還元反応の両者についての動力学的試験を、2ADH-16を使用して種々の基質に対して行った。これらの研究のための条件は、以下の通りであった：0.04 mg/ml酵素、0.25mg/ml補因子、20mM Tris HCl緩衝液pH 6.5（還元）、又は9.0（酸化）、T=25 C、100μlの総容積を使用した。還元反応について算出した速度定数を基質の構造とともに、図35に要約してある。酸化反応についての算出した速度定数を基質の構造とともに、図36に要約してある。これらの結果は、2ADH-16が多種多様な基質の酸化、及び還元の両方を触媒することができることを示す。
【０４６０】
実施例9
補酵素B12非依存的ジオールデヒドラターゼの単離、及びインビトロならびにインビボでの活性
1,2-プロパンジオール、メソ-2,3-ブタンジオール、及びトランス-1,2-シクロペンタンジオールなどの基質を利用して、脱水、及び還元経路におけるB12非依存的ジオールデヒドラターゼのインビトロ、及びインビボでの生物活性を試験した。ジオールデヒドラターゼは、1,2-プロパンジオールなどのジオールの不可逆的脱水を触媒する。
【０４６１】
インビトロでの活性については、pETPduCDE（ジオールデヒドラターゼサブユニット）を有する大腸菌BL21（DE3）を100mL LB培地に播種して、OD600= 0.7まで培養し、0.15mM IPTGで誘導し、22℃にて22時間インキュベートした。細胞を溶解し、関心対象のタンパク質をNi-NTAスピンカラムで精製した。全ての3つのデヒドラターゼサブユニットの精製は、5mM 1,2-プロパンジオールを溶解及び洗浄緩衝液に添加することによって達成した。Ni-NTA精製により、2.2mg/mlの濃度にて、およそ660μlのタンパク質混合物を得た。タンパク質濃度のアッセイは、Bradford試薬プロトコルを使用して行った。
【０４６２】
精製したPduCDEは、インビトロでのジオールデヒドラターゼ反応を準備するために使用した。3回のアッセイを1,2-プロパンジオール、及びメソ-2,3-ブタンジオールで行った。また、対照反応は、精製PduCDEの代わりに溶出緩衝液を添加して準備した。インビトロでの反応は、2mLのねじ口ガラスバイアルにおける準嫌気的な条件下で行った。反応組成、及び濃度を表6に示してある。
【０４６３】
【表６】
2010539988.tif 000150
【０４６４】
48時間後に、1mLの反応混合物を0.5mLの酢酸エチル、又はヘキサノールで抽出して、GCMSによって解析した。
【０４６５】
以下のGCMSプロトコルを全ての実験のために使用した：
1μl注入、w/50：1分割
入口温度‐250℃
最初のオーブン温度‐50℃
温度ランプ1‐10℃/分を125℃まで
温度ランプ2‐30℃/分を300℃まで
最終温度300℃‐1分
GCからMSへの移動温度‐250℃
MSの検出‐フルスキャン、MW 40〜260
【０４６６】
これらの結果を図45に示してある。図45Aでは、1,2-プロパンジオールからの1-プロパナールの形成を確認し、図45Bでは、メソ-2,3-ブタンジオールからの2-ブタノンの形成を確認し、その両方がB12非依存的ジオールデヒドラターゼによって触媒された。
【０４６７】
インビボの活性については、pBBRDhaB1/2プラスミドを以下の通りに構築した：酪酸菌のB12非依存的グリセロールデヒドラターゼ（dhaB1）、及び活性化因子（dhaB2）をコードするDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した：98℃10秒間、60℃15秒間、並びに72℃でdhaB1については2分間、及びdhaB2については1分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM のdhaB1のためのフォワードプライマー
【化１４３】
2010539988.tif 000151
及びdhaB2のためのフォワードプライマー
【化１４４】
2010539988.tif 000152
並びにdhaB1のためのリバースプライマー
【化１４５】
2010539988.tif 000153
及びdhaB2のためのリバースプライマー
【化１４６】
2010539988.tif 000154
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngのpETdhaB1、及びpET dhaB2を50μlにそれぞれ含んだ。増幅したDNA断片をゲル精製し、もう一回PCRによってスプライスした：98℃10秒間、60℃15秒間、及び72℃2.5分間、30回繰り返した。反応混合物は、1×Phusion緩衝液（NEB）、2mM dNTP、0.5μM フォワードプライマー
【化１４７】
2010539988.tif 000155
及びリバースプライマー
【化１４８】
2010539988.tif 000156
、1U Phusion High Fidelity DNAポリメラーゼ（NEB）、及び50ngのそれぞれの断片を50μlに含んだ。増幅した断片をXhoI、及びSacIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpBBR1MCS-2に連結した。
【０４６８】
pBBR1MCS-2、又はpBBRDhaB1/2を有する大腸菌DH10Bの2つの株を、グリセロールを含まないTB培地に播種した。培養をOD600= 0.5まで培養し、基質1,2-プロパンジオール、メソ-2,3-ブタンジオール、及びトランス-1,2-シクロペンタンジオールを10mMの濃度になるように別々の培養に添加した。培養を嫌気的環境へ移す前に、5μg/mlの補酵素S‐アデノシルメチオニンを添加した。培養を37℃で48時間インキュベートした。
【０４６９】
48時間後に、1mLの培養を0.5mLの酢酸エチル、又はヘキサノールで抽出して、上記のようにGCMSによって解析した。結果を図46に示してある。図46Aは、1,2-プロパンジオールからの1-プロパノールのインビボの産生を示す。図46Bは、メソ-2,3-ブタンジオールからの2-ブタノールのインビボの産生を示す。図46Cは、トランス-1,2-シクロペンタンジオールからのシクロペンタノンのインビボの産生を示す。
【０４７０】
実施例10
分泌されたアルギナートリアーゼ、及び唯一の炭素源としてアルギナートで成長するために十分なゲノムの領域の同定
分泌された、又は外部アルギナートリアーゼを同定するため、及び唯一の炭素源としてのアルギナートでの成長を可能にするために十分な、ビブリオ・スプレンディダス由来のゲノムの領域を同定するために、以下のクローンを、Invitrogen（Carlsbad, CA）のゲートウェイ系を使用して作製した。最初に、エントリーベクターを、PCR断片をpENTR/D/TOPOにTOPOクローニングするよって作製した。PCR断片は、鋳型としてビブリオ・スプレンディダスB01ゲノムDNAを使用して産生し、以下のプライマーペアで増幅した：
Vs24214-24249：V12B01_24214とV12B01_24249との間の遺伝子idに対応するゲノムの領域（実施例1を参照されたい）。
【表７】
2010539988.tif 000157
【０４７１】
Vs24189-24209：V12B01_24189とV12B01_24209との間の遺伝子idに対応するゲノムの領域（実施例1を参照されたい）。
【表８】
2010539988.tif 000158
【０４７２】
Vs24214-24239：V12B01_24214とV12B01_24239との間の遺伝子idに対応するゲノムの領域（実施例1を参照されたい）。
【表９】
2010539988.tif 000159
【０４７３】
エントリーベクターを、LRリコンビナーゼ酵素（Invitrogen）を使用して目的ベクターpET-DEST42（Invitrogen）と再結合させた。次いで、これらの目的ベクターをエレクトロコンピテントなDH10B、又はBL21細胞に入れた。
【０４７４】
次いで、アルギナートリアーゼのクローンを、ビブリオ・スプレンディダスB01ゲノムDNAを使用して産生したPCR産物を消化する（酵素NdeI、及びBamHIを使用する）ことによって作製し、以下のプライマーペアで増幅した：
【表１０】
2010539988.tif 000160
【０４７５】
次いで、消化されたPCR産物を切断したpET28ベクターに連結した。特定のビブリオ・スプレンディダスB01のクローン化したゲノム領域を、分泌されたアルギナートリアーゼの存在について試験して、上記の構築物を、唯一の炭素源としてのアルギナートでの成長を可能にする能力について、種々の組み合わせで試験した。
【０４７６】
ビブリオ・スプレンディダスのVs24254（配列番号：32）領域は、機能的な外部アルギナートリアーゼをコードする。pET28ベクターからのVs24254を発現するBL21細胞は、増殖培地において、アルギナートを破棄することができた。LB + 2%アルギナート+ 0.1 mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）で培養したときに、Vs24254遺伝子を発現する細胞のみが、ピンクの色の陽性のTBAアッセイの結果を示す。このアッセイは、上述した培地で培養した一晩の培養物をスピンダウンすることによって行った。次いで、培地を0.8%チオバルビツール酸（TBA）と1：1の比で混合し、摂氏99度にて10分間加熱して、ピンクの呈色についてアッセイした。図47は、このアッセイの結果を示す。図47における左のチューブは、Vs24254を発現する細胞の一晩培養物から採取した培地を表し、一方、右側のチューブは、Vs24259を発現する細胞からの培地を使用したTBA反応を示す（負の対照）。負の対照におけるピンクの呈色の欠如は、アルギナート重合体の切断がほとんど、又は全く生じなかったことを示す。いずれの組換えタンパク質も発現していない野生型の大腸菌細胞は、負の対照Vs24259と同じ呈色を示す（データ示さず）。
【０４７７】
組み換え大腸菌が唯一の炭素源としてアルギナートで成長する能力を試験するために、形質転換細胞を96ウェルプレートにおいて穏やかに振盪しながら摂氏30度にて19時間培養した。それぞれのウェルには、分解されたアルギナート、又はグルコース（成長の正の対照）のいずれかの形態の0.66%炭素源を有する222μlの最少培地（最少培地を説明については、培養条件を参照されたい）を保った。すべての細胞は、プラスミド無し（BL21-負の対照）、1つのプラスミド（Da、又は3a）、若しくは2つのプラスミド（Dk3a、及びDa3k）を有するBL21のいずれかであった。プラスミドは、小文字で示してあり：「a」は、プラスミドバックボーンのpET-DEST42を指し、「k」は、pENTR/D/TOPOバックボーンを指す。「D」は、ゲノム領域Vs24214-24249を含むプラスミドを示し、「3」は、ゲノム領域Vs24189-24209を含むプラスミドを示す。従って、Daは、pET-DEST42-Vs24214-24249であろうし、Da3kは、pET-DEST42-Vs24214-24249、及びpENTR/D/TOPO-Vs24189-24209、などであろう。
【０４７８】
図56Aに示したように、2つのベクター構築物pET-DEST42-Vs24214-24249、及びpENTR/D/TOPO-Vs24189-24209は、大腸菌において組み合わさったときに、唯一の炭素源として分解されたアルギナートでの成長が可能となる。この同じ結果は、これらのゲノム挿入断片が反対のベクターに切り替わったときにも観察される（pET-DEST42-Vs24189-24209、及びpENTR/D/TOPO-Vs24214-24249）。図56Bは、正の対照としてグルコースでの成長を示す。従って、ビブリオ・スプレンディダスのVs24214-24249、及びVs24189-24209の組み合わさったゲノム領域は、唯一の炭素源としてのアルギナートで成長する能力を大腸菌に対して付与するのに十分であった。
【０４７９】
実施例11
アルギナートからのエタノールの生産
組み換え大腸菌が唯一の炭素源のアルギナートでの成長によりエタノールを産生する能力を試験した。組み換え大腸菌を産生するために、ザイモモナス・モビリスのピルベートデカルボキシラーゼ（pdc）、及び2つのアルコールデヒドロゲナーゼ（adhA、及びadhB）をコードするDNA配列を、ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅した。増幅したDNA断片をゲル精製し、もう一回PCRによってスプライスした。最終的に増幅した断片をBamHI、及びXbaIで消化して、同じ制限酵素であらかじめ消化したpBBR1MCS-2に連結した。その結果得られたプラスミドをpBBRPdc-AdhA/Bとする。
【０４８０】
大腸菌を、pBBRPdc-AdhA/B、又はpBBRPdc-AdhA/B + 1.5 fos（V12B01_24189とV12B01_24249との間のゲノム領域を含むフォスミドクローン；これらの配列は、唯一の炭素源としてアルギナートを使用する能力を大腸菌に与える、実施例1、及び10を参照されたい）のいずれかで形質転換し、アルギナートを含むm9培地で培養し、エタノールの産生について試験した。結果を図57に示してあり、pBBRPdc-AdhA/B + 1.5 FOSを有する株は、アルギナートで成長するときに、有意に高いエタノール産生を示したことを証明する。これらの結果は、pBBRPdc-AdhA/B + 1.5 FOSが、エタノール産生において、唯一の炭素源としてアルギナートを利用できたことを示している。
【０４８１】
以下の刊行物は、これらの全体が本明細書に参照により組み込まれる。
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【図１】
2010539988.tif 000161
【図２】
2010539988.tif 000162
【図３】
2010539988.tif 000163
【図４】
2010539988.tif 000164
【図５Ａ】
2010539988.tif 000165
【図５Ｂ】
2010539988.tif 000166
【図６Ａ】
2010539988.tif 000167
【図６Ｂ】
2010539988.tif 000168
【図６Ｃ】
2010539988.tif 000169
【図７Ａ】
2010539988.tif 000170
【図７Ｂ】
2010539988.tif 000171
【図８Ａ】
2010539988.tif 000172
【図８Ｂ】
2010539988.tif 000173
【図９Ａ】
2010539988.tif 000174
【図９Ｂ】
2010539988.tif 000175
【図１０Ａ】
2010539988.tif 000176
【図１０Ｂ】
2010539988.tif 000177
【図１０Ｃ】
2010539988.tif 000178
【図１１Ａ】
2010539988.tif 000179
【図１１Ｂ】
2010539988.tif 000180
【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ−Ｂ】
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【図２９Ａ−Ｄ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３８Ｅ】
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【図３８Ｆ】
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【図３８Ｇ】
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【図３８Ｈ】
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【図３９Ａ−Ｂ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４７】
2010539988.tif 000247
【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
2010539988.tif 000249
【図４９Ａ】
2010539988.tif 000250
【図４９Ｂ】
2010539988.tif 000251
【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５３Ａ】
2010539988.tif 000258
【図５３Ｂ】
2010539988.tif 000259
【図５４Ａ】
2010539988.tif 000260
【図５４Ｂ】
2010539988.tif 000261
【図５５】
2010539988.tif 000262
【図５６Ａ−Ｂ】
2010539988.tif 000263
【図５７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年6月30日(2010.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2010539988000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月30日(2010.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2010539988.tif 000265
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４７】
2010539988.tif 000266
【国際調査報告】
2010539988.tif 000267
2010539988.tif 000268
2010539988.tif 000269
2010539988.tif 000270
2010539988.tif 000271