(57)【要約】流体試料中の2種類またはそれ以上の関心対象分析物の量を測定するための方法、および本方法に有用なキットを開示する。本方法は、個々の関心対象分析物の検出量と対照の検出量との合計に対する1種類の関心対象分析物の検出量の比率を決定する段階を含み、ここで個々の関心対象分析物の量は、個々の関心対象分析物に関する比率に正比例するか、または反比例する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個々の関心対象分析物の検出量と対照の検出量との合計に対する1種類の関心対象分析物の検出量の比率を決定する段階を含む、被験試料中の少なくとも2種類の関心対象分析物の量を固相アッセイ法を用いて測定する方法であって、個々の関心対象分析物の量が、個々の関心対象分析物に関する比率に正比例する、方法。
【請求項２】
バックグラウンドの検出量が、個々の関心対象分析物の全検出量と対照の検出量との合計に対する1種類の関心対象分析物の検出量の比率の決定に先だって、個々の関心対象分析物の検出量から、および対照から差し引かれる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
以下の段階を含む、被験試料中の少なくとも2種類の関心対象分析物の量を測定する方法：
a) 投入点と、少なくとも2つの試料捕捉ゾーンと、対照捕捉ゾーンとを含む固相装置を提供する段階であって、
第1の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された第1の試料捕捉用試薬を有し、第2の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された第2の試料捕捉用試薬を有し、かつ対照捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された対照捕捉用試薬を有し、
投入点、第1の試料ゾーン、第2の捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンが固相装置上に連続的に位置している、
段階；
b) 第1の分析物結合粒子の集団と第2の分析物結合粒子の集団とを含む試料収集装置を提供する段階であって、
第1の分析物結合粒子が第1の分析物結合剤で被覆されており、かつ第2の分析物結合粒子が第2の分析物結合剤で被覆されている、
段階；
c) i)流体試料を試料収集装置に導入し、混合流体試料を作製し、続いて緩衝液を混合流体試料中に導入すること；ii)緩衝液を試料収集装置に導入し、続いて流体試料を導入すること；またはiii)固体を緩衝液中に導入して流体試料を形成し、続いて流体試料を試料収集装置に導入することのいずれかを行い、それによって、接触済みの第1の分析物結合粒子(contacted first analyte binding particle)および接触済みの第2の分析物結合粒子(contacted second analyte binding particle)を含む、緩衝液で処理された混合流体試料を作製する段階；
d) 緩衝液で処理された混合流体試料を、固相装置の投入点に投入する段階；
e) 流体が、毛管作用により固相装置中を各試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの第1の分析物結合粒子および接触済みの第2の分析物結合粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの第1の分析物結合粒子と第1の試料捕捉ゾーン中の第1の試料捕捉用試薬との結合が可能となりかつ接触済みの第2の分析物結合粒子と第2の試料捕捉ゾーン中の第2の試料捕捉用試薬との結合が可能となる条件で；ならびに試料中の流体が、毛管作用により固相装置中を対照捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの第1の分析物結合粒子および接触済みの第2の分析物結合粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの第1の分析物結合粒子および接触済みの第2の分析物結合粒子と対照捕捉用試薬との結合が可能となる条件で、固相装置を維持する段階；
f) 第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物結合粒子の量、第2の捕捉ゾーンにおける接触済みの第2の分析物結合粒子の量、ならびに対照捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物結合粒子および接触済みの第2の分析物結合粒子の量を決定する段階；
g) 第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物結合粒子の量と、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第2の分析物結合粒子の量と、対照捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物結合粒子および接触済みの第2の分析物結合粒子の量との合計に対する、第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物結合粒子の量の比率として、第1の補正後の分析物結合粒子の量を決定し；かつ第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物結合粒子の量と、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第2の分析物結合粒子の量と、対照捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物結合粒子および接触済みの第2の分析物結合粒子の量との合計に対する、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第2の分析物結合粒子の量の比率として、第2の補正後の分析物結合粒子の量を決定する段階であって、
流体試料中の第1の関心対象分析物の量が、第1の補正後の分析物結合粒子の量に正比例し、かつ流体試料中の第2の関心対象分析物の量が、第2の補正後の分析物結合粒子の量に正比例する、
段階。
【請求項４】
固相装置が、個々の追加の関心対象分析物に対する追加の試料捕捉ゾーンを含み、個々の追加の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された試料捕捉用試薬を有し；試料収集装置が、個々の追加の関心対象分析物に対する追加の分析物結合粒子の集団をさらに含み；流体が、毛管作用により固相装置中を各試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの追加の分析物結合粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの追加の分析物結合粒子と個々の追加の試料捕捉ゾーン中の追加の試料捕捉用試薬との結合が可能となる条件で、前記固相装置が維持され；補正後の分析物結合粒子の量が、個々の関心対象分析物に関して、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンの全体における全分析物結合粒子の量に対する、個々の対応する追加の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの追加の分析物結合粒子の量の比率として決定され、かつ流体試料中の個々の関心対象分析物の量が、対応する補正後の分析物結合粒子の量に正比例する、
1種類または複数種類の追加の関心対象分析物の量を定量的に測定する段階をさらに含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
以下の段階を含む、被験試料中の少なくとも2種類の関心対象分析物の量を測定する方法：
a) 投入点と、少なくとも2つの試料捕捉ゾーンと、対照捕捉ゾーンとを含む固相装置を提供する段階であって、
第1の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された第1の試料捕捉用試薬を有し、第2の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された第2の試料捕捉用試薬を有し、かつ対照捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された対照捕捉用試薬を有し、
第1の試料ゾーン、第2の捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンが、固相装置上の投入点からほぼ等距離にある、
段階；
b) 第1の分析物結合粒子の集団と第2の分析物結合粒子の集団とを含む試料収集装置を提供する段階であって、
第1の分析物結合粒子が第1の分析物結合剤で被覆されており、かつ第2の分析物結合粒子が第2の分析物結合剤で被覆されている、
段階；
c) i)流体試料を試料収集装置に導入し、混合流体試料を作製し、続いて緩衝液を混合流体試料中に導入すること；ii)緩衝液を試料収集装置に導入し、続いて流体試料を導入すること；またはiii)固体を緩衝液中に導入して流体試料を形成し、続いて流体試料を試料収集装置に導入することのいずれかを行い、それによって、接触済みの第1の分析物結合粒子および接触済みの第2の分析物結合粒子を含む、緩衝液で処理された混合流体試料を作製する段階；
d) 緩衝液で処理された混合流体試料を、固相装置の投入点に投入する段階；
e) 流体が、毛管作用により固相装置中を各試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの第1の分析物結合粒子および接触済みの第2の分析物結合粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの第1の分析物結合粒子と第1の試料捕捉ゾーン中の第1の試料捕捉用試薬との結合が可能となりかつ接触済みの第2の分析物結合粒子と第2の試料捕捉ゾーン中の第2の試料捕捉用試薬との結合が可能となる条件で；ならびに試料中の流体が、毛管作用により固相装置中を対照捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの第1の分析物結合粒子および接触済みの第2の分析物結合粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの第1の分析物結合粒子および接触済みの第2の分析物結合粒子と対照捕捉用試薬との結合が可能となる条件で、固相装置を維持する段階；
f) 第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物結合粒子の量、第2の捕捉ゾーンにおける接触済みの第2の分析物結合粒子の量、ならびに対照捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物結合粒子および接触済みの第2の分析物結合粒子の量を決定する段階；
g) 第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物結合粒子の量と、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第2の分析物結合粒子の量と、対照捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物結合粒子および接触済みの第2の分析物結合粒子の量との合計に対する、第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物結合粒子の量の比率として、第1の補正後の分析物結合粒子の量を決定し；かつ第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物結合粒子の量と、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第2の分析物結合粒子の量と、対照捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物結合粒子および接触済みの第2の分析物結合粒子の量との合計に対する、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第2の分析物結合粒子の量の比率として、第2の補正後の分析物結合粒子の量を決定する段階であって、
流体試料中の第1の関心対象分析物の量が、第1の補正後の分析物結合粒子の量に正比例し、かつ流体試料中の第2の関心対象分析物の量が、第2の補正後の分析物結合粒子の量に正比例する、
段階。
【請求項６】
固相装置が、個々の追加の関心対象分析物に対する追加の試料捕捉ゾーンを含み、個々の追加の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された試料捕捉用試薬を有し；試料収集装置が、個々の追加の関心対象分析物に対する追加の分析物結合粒子の集団をさらに含み；流体が、毛管作用により固相装置中を各試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの追加の分析物結合粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの追加の分析物結合粒子と個々の追加の試料捕捉ゾーン中の追加の試料捕捉用試薬との結合が可能となる条件で、前記固相装置が維持され；補正後の分析物結合粒子の量が、個々の関心対象分析物に関して、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンの全体における全分析物結合粒子の量に対する、個々の対応する追加の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの追加の分析物結合粒子の量の比率として決定され、かつ流体試料中の個々の関心対象分析物の量が、対応する補正後の分析物結合粒子の量に正比例する、
1種類または複数種類の追加の関心対象分析物の量を定量的に測定する段階をさらに含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
以下の段階を含む、流体試料中の少なくとも2種類の関心対象分析物の量を定量的に測定するための方法：
a) 投入点と、少なくとも2つの試料捕捉ゾーンと、対照捕捉ゾーンとを含む固相装置を提供する段階であって、
第1の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された第1の試料捕捉用試薬を有し、第2の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された第2の試料捕捉用試薬を有し、かつ対照捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された対照捕捉用試薬を有し、
投入点、第1の試料ゾーン、第2の捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンが、固相装置上に連続的に位置している、
段階；
b) 分析物結合粒子の集団を含む試料収集装置を提供する段階であって、
分析物結合粒子が、第1の分析物結合剤および第2の分析物結合剤で被覆されている、
段階；
c) i)流体試料を試料収集装置に導入し、混合流体試料を作製し、続いて緩衝液を混合流体試料中に導入すること；ii)緩衝液を試料収集装置に導入し、続いて流体試料を導入すること；またはiii)固体を緩衝液中に導入して流体試料を形成し、続いて流体試料を試料収集装置に導入することのいずれかを行い、それによって、接触済みの分析物結合粒子を含む、緩衝液で処理された混合流体試料を作製する段階；
d) 緩衝液で処理された混合流体試料を、固相装置の投入点に投入する段階；
e) 流体が、毛管作用により固相装置中を各試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの分析物結合粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの分析物結合粒子と第1の試料捕捉ゾーン中の第1の試料捕捉用試薬との結合が可能となりかつ接触済みの分析物結合粒子と第2の試料捕捉ゾーン中の第2の試料捕捉用試薬との結合が可能となる条件で；ならびに試料中の流体が、毛管作用により固相装置中を対照捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの分析物結合粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの分析物結合粒子と対照捕捉用試薬との結合が可能となる条件で、固相装置を維持する段階；
f) 第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量、第2の捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量、および対照捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量を決定する段階；
g) 第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量と、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量と、対照捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量との合計に対する、第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量の比率として、第1の補正後の分析物結合粒子の量を決定し；かつ第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量と、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量と、対照捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量との合計に対する、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量の比率として、第2の補正後の分析物結合粒子の量を決定する段階であって、
流体試料中の第1の関心対象分析物の量が、第1の補正後の分析物結合粒子の量に正比例し、かつ流体試料中の第2の関心対象分析物の量が、第2の補正後の分析物結合粒子の量に正比例する、
段階。
【請求項８】
固相装置が、個々の追加の関心対象分析物に対する追加の試料捕捉ゾーンを含み、個々の追加の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された試料捕捉用試薬を有し；試料収集装置中の分析物結合粒子が、個々の追加の関心対象分析物に関して、分析物結合粒子上に被覆した追加の分析物結合剤をさらに含み；流体が、毛管作用により固相装置中を各試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの追加の分析物結合粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの追加の分析物結合粒子と個々の追加の試料捕捉ゾーン中の追加の試料捕捉用試薬との結合が可能となる条件で、前記固相装置が維持され；補正後の分析物結合粒子の量が、個々の関心対象分析物に関して、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンの全体における全分析物結合粒子の量に対する、個々の対応する追加の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの追加の分析物結合粒子の量の比率として決定され、かつ流体試料中の個々の関心対象分析物の量が、対応する補正後の分析物結合粒子の量に正比例する、
1種類または複数種類の追加の関心対象分析物の量を定量的に測定する段階をさらに含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
以下の段階を含む、流体試料中の少なくとも2種類の関心対象分析物の量を定量的に測定するための方法：
a) 投入点と、少なくとも2つの試料捕捉ゾーンと、対照捕捉ゾーンとを含む固相装置を提供する段階であって、
第1の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された第1の試料捕捉用試薬を有し、第2の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された第2の試料捕捉用試薬を有し、かつ対照捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された対照捕捉用試薬を有し、
各試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンが、投入点からほぼ等距離にある、
段階；
b) 分析物結合粒子の集団を含む試料収集装置を提供する段階であって、
分析物結合粒子が、第1の分析物結合剤および第2の分析物結合剤で被覆されている、
段階；
c) i)流体試料を試料収集装置に導入し、混合流体試料を作製し、続いて緩衝液を混合流体試料中に導入すること；ii)緩衝液を試料収集装置に導入し、続いて流体試料を導入すること；またはiii)固体を緩衝液中に導入して流体試料を形成し、続いて流体試料を試料収集装置に導入することのいずれかを行い、それによって、接触済みの分析物結合粒子を含む、緩衝液で処理された混合流体試料を作製する段階；
d) 緩衝液で処理された混合流体試料を、固相装置の投入点に投入する段階；
e) 流体が、毛管作用により固相装置中を各試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの分析物結合粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの分析物結合粒子と第1の試料捕捉ゾーン中の第1の試料捕捉用試薬との結合が可能となりかつ接触済みの分析物結合粒子と第2の試料捕捉ゾーン中の第2の試料捕捉用試薬との結合が可能となる条件で；ならびに試料中の流体が、毛管作用により固相装置中を対照捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの分析物結合粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの分析物結合粒子と対照捕捉用試薬との結合が可能となる条件で、固相装置を維持する段階；
f) 第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量、第2の捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量、および対照捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量を決定する段階；
g) 第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量と、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量と、対照捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量との合計に対する、第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量の比率として、第1の補正後の分析物結合粒子の量を決定し；かつ第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量と、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量と、対照捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量との合計に対する、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物結合粒子の量の比率として、第2の補正後の分析物結合粒子の量を決定する段階であって、
流体試料中の第1の関心対象分析物の量が、第1の補正後の分析物結合粒子の量に正比例し、かつ流体試料中の第2の関心対象分析物の量が、第2の補正後の分析物結合粒子の量に正比例する、
段階。
【請求項１０】
固相装置が、個々の追加の関心対象分析物に対する追加の試料捕捉ゾーンを含み、個々の追加の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された試料捕捉用試薬を有し；試料収集装置中の分析物結合粒子が、個々の追加の関心対象分析物に関して、分析物結合粒子上に被覆した追加の分析物結合剤をさらに含み；流体が、毛管作用により固相装置中を各試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの追加の分析物結合粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの追加の分析物結合粒子と個々の追加の試料捕捉ゾーン中の追加の試料捕捉用試薬との結合が可能となる条件で、前記固相装置が維持され；補正後の分析物結合粒子の量が、個々の関心対象分析物に関して、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンの全体における全分析物結合粒子の量に対する、個々の対応する追加の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの追加の分析物結合粒子の量の比率として決定され、かつ流体試料中の個々の関心対象分析物の量が、対応する補正後の分析物結合粒子の量に正比例する、
1種類または複数種類の追加の関心対象分析物の量を定量的に測定する段階をさらに含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
以下の段階を含む、被験試料中の少なくとも2種類の関心対象分析物の量を測定する方法：
a) 投入点と、少なくとも2つの試料捕捉ゾーンと、対照捕捉ゾーンとを含む固相装置を提供する段階であって、
第1の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された第1の試料捕捉用試薬を有し、第2の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された第2の試料捕捉用試薬を有し、かつ対照捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された対照捕捉用試薬を有し、
投入点、第1の試料ゾーン、第2の捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンが、固相装置上に連続的に位置している、
段階；
b) 第1の分析物被覆粒子(analyte coated particle)の集団と第2の分析物被覆粒子の集団とを含む試料収集装置を提供する段階であって、
第1の分析物被覆粒子が、第1の分析物または第1の分析物の類似体で被覆されており、かつ第2の分析物被覆粒子が、第2の分析物または第2の分析物の類似体で被覆されている、
段階；
c) i)流体試料を試料収集装置に導入し、混合流体試料を作製し、続いて緩衝液を混合流体試料中に導入すること；ii)緩衝液を試料収集装置に導入し、続いて流体試料を導入すること；またはiii)固体を緩衝液中に導入して流体試料を形成し、続いて流体試料を試料収集装置に導入することのいずれかを行い、それによって、接触済みの第1の分析物被覆粒子および接触済みの第2の分析物被覆粒子を含む、緩衝液で処理された混合流体試料を作製する段階；
d) 緩衝液で処理された混合流体試料を、固相装置の投入点に投入する段階；
e) 流体が、毛管作用により固相装置中を各試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの第1の分析物被覆粒子および接触済みの第2の分析物被覆粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの第1の分析物被覆粒子と第1の試料捕捉ゾーン中の第1の試料捕捉用試薬との結合が可能となりかつ接触済みの第2の分析物被覆粒子と第2の試料捕捉ゾーン中の第2の試料捕捉用試薬との結合が可能となる条件で；ならびに試料中の流体が、毛管作用により固相装置中を対照捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの第1の分析物被覆粒子および接触済みの第2の分析物被覆粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの第1の分析物被覆粒子および接触済みの第2の分析物被覆粒子と対照捕捉用試薬との結合が可能となる条件で、固相装置を維持する段階；
f) 第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物被覆粒子の量、第2の捕捉ゾーンにおける接触済みの第2の分析物被覆粒子の量、ならびに対照捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物被覆粒子および接触済みの第2の分析物被覆粒子の量を決定する段階；
g) 第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物被覆粒子の量と、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第2の分析物被覆粒子の量と、対照捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物被覆粒子および接触済みの第2の分析物被覆粒子の量との合計に対する、第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物被覆粒子の量の比率として、第1の補正後の分析物被覆粒子の量を決定し；かつ第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物被覆粒子の量と、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第2の分析物被覆粒子の量と、対照捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物被覆粒子および接触済みの第2の分析物被覆粒子の量との合計に対する、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第2の分析物被覆粒子の量の比率として、第2の補正後の分析物被覆粒子の量を決定する段階であって、
流体試料中の第1の関心対象分析物の量が、第1の補正後の分析物被覆粒子の量に反比例し、かつ流体試料中の第2の関心対象分析物の量が、第2の補正後の分析物被覆粒子の量に正比例する、
段階。
【請求項１２】
固相装置が、個々の追加の関心対象分析物に対する追加の試料捕捉ゾーンを含み、個々の追加の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された試料捕捉用試薬を有し；試料収集装置が、個々の追加の関心対象分析物に関して、追加の分析物被覆粒子の集団をさらに含み；流体が、毛管作用により固相装置中を各試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの追加の分析物被覆粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの追加の分析物被覆粒子と個々の追加の試料捕捉ゾーン中の追加の試料捕捉用試薬との結合が可能となる条件で、前記固相装置が維持され；補正後の分析物被覆粒子の量が、個々の関心対象分析物に関して、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンの全体における全分析物被覆粒子の量に対する、個々の対応する追加の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの追加の分析物被覆粒子の量の比率として決定され、かつ流体試料中の個々の関心対象分析物の量が、対応する補正後の分析物被覆粒子の量に反比例する、
1種類または複数種類の追加の関心対象分析物の量を定量的に測定する段階をさらに含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
以下の段階を含む、被験試料中の少なくとも2種類の関心対象分析物の量を測定する方法：
a) 投入点と、少なくとも2つの試料捕捉ゾーンと、対照捕捉ゾーンとを含む固相装置を提供する段階であって
第1の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された第1の試料捕捉用試薬を有し、第2の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された第2の試料捕捉用試薬を有し、かつ対照捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された対照捕捉用試薬を有し、
第1の試料ゾーン、第2の捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンが、固相装置上の投入点からほぼ等距離にある、
段階；
b) 第1の分析物被覆粒子の集団と第2の分析物被覆粒子の集団とを含む試料収集装置を提供する段階であって、
第1の分析物被覆粒子が、第1の分析物または第1の分析物の類似体で被覆されており、かつ第2の分析物被覆粒子が、第2の分析物または第2の分析物の類似体で被覆されている、
段階；
c) i)流体試料を試料収集装置に導入し、混合流体試料を作製し、続いて緩衝液を混合流体試料中に導入すること；ii)緩衝液を試料収集装置に導入し、続いて流体試料を導入すること；またはiii)固体を緩衝液中に導入して流体試料を形成し、続いて流体試料を試料収集装置に導入することのいずれかを行い、それによって、接触済みの第1の分析物被覆粒子および接触済みの第2の分析物被覆粒子を含む、緩衝液で処理された混合流体試料を作製する段階；
d) 緩衝液で処理された混合流体試料を、固相装置の投入点に投入する段階；
e) 流体が、毛管作用により固相装置中を各試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの第1の分析物被覆粒子および接触済みの第2の分析物被覆粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの第1の分析物被覆粒子と第1の試料捕捉ゾーン中の第1の試料捕捉用試薬との結合が可能となりかつ接触済みの第2の分析物被覆粒子と第2の試料捕捉ゾーン中の第2の試料捕捉用試薬との結合が可能となる条件で；ならびに試料中の流体が、毛管作用により固相装置中を対照捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの第1の分析物被覆粒子および接触済みの第2の分析物被覆粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの第1の分析物被覆粒子および接触済みの第2の分析物被覆粒子と対照捕捉用試薬との結合が可能となる条件で、固相装置を維持する段階；
f) 第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物被覆粒子の量、第2の捕捉ゾーンにおける接触済みの第2の分析物被覆粒子の量、ならびに対照捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物被覆粒子および接触済みの第2の分析物被覆粒子の量を決定する段階；
g) 第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物被覆粒子の量と、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第2の分析物被覆粒子の量と、対照捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物被覆粒子および接触済みの第2の分析物被覆粒子の量との合計に対する、第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物被覆粒子の量の比率として、第1の補正後の分析物被覆粒子の量を決定し；かつ第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物被覆粒子の量と、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第2の分析物被覆粒子の量と、対照捕捉ゾーンにおける接触済みの第1の分析物被覆粒子および接触済みの第2の分析物被覆粒子の量との合計に対する、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの第2の分析物被覆粒子の量の比率として、第2の補正後の分析物被覆粒子の量を決定する段階であって、
流体試料中の第1の関心対象分析物の量が、第1の補正後の分析物被覆粒子の量に反比例し、かつ流体試料中の第2の関心対象分析物の量が、第2の補正後の分析物被覆粒子の量に正比例する、
段階。
【請求項１４】
固相装置が、個々の追加の関心対象分析物に対する追加の試料捕捉ゾーンを含み、個々の追加の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された試料捕捉用試薬を有し；試料収集装置が、個々の追加の関心対象分析物に関して、追加の分析物被覆粒子の集団をさらに含み；流体が、毛管作用により固相装置中を各試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの追加の分析物被覆粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの追加の分析物被覆粒子と個々の追加の試料捕捉ゾーン中の追加の試料捕捉用試薬との結合が可能となる条件で、前記固相装置が維持され；補正後の分析物被覆粒子の量が、個々の関心対象分析物に関して、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンの全体における全分析物被覆粒子の量に対する、個々の対応する追加の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの追加の分析物被覆粒子の量の比率として決定され、かつ流体試料中の個々の関心対象分析物の量が、対応する補正後の分析物被覆粒子の量に反比例する、
1種類または複数種類の追加の関心対象分析物の量を定量的に測定する段階をさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
以下の段階を含む、流体試料中の少なくとも2種類の関心対象分析物の量を定量的に測定するための方法：
a) 投入点と、少なくとも2つの試料捕捉ゾーンと、対照捕捉ゾーンとを含む固相装置を提供する段階であって、
第1の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された第1の試料捕捉用試薬を有し、第2の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された第2の試料捕捉用試薬を有し、かつ対照捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された対照捕捉用試薬を有し、
投入点、第1の試料ゾーン、第2の捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンが、固相装置上に連続的に位置している、
段階；
b) 分析物被覆粒子の集団を含む試料収集装置を提供する段階であって、
分析物被覆粒子が、第1の分析物または第1の分析物の類似体および第2の分析物または第2の分析物の類似体で被覆されている、
段階；
c) i)流体試料を試料収集装置に導入し、混合流体試料を作製し、続いて緩衝液を混合流体試料中に導入すること；ii)緩衝液を試料収集装置に導入し、続いて流体試料を導入すること；またはiii)固体を緩衝液中に導入して流体試料を形成し、続いて流体試料を試料収集装置に導入することのいずれかを行い、それによって、接触済みの分析物被覆粒子を含む、緩衝液で処理された混合流体試料を作製する段階；
d) 緩衝液で処理された混合流体試料を、固相装置の投入点に投入する段階；
e) 流体が、毛管作用により固相装置中を各試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの分析物被覆粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの分析物被覆粒子と第1の試料捕捉ゾーン中の第1の試料捕捉用試薬との結合が可能となりかつ接触済みの分析物被覆粒子と第2の試料捕捉ゾーン中の第2の試料捕捉用試薬との結合が可能となる条件で；ならびに試料中の流体が、毛管作用により固相装置中を対照捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの分析物被覆粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの分析物被覆粒子と対照捕捉用試薬との結合が可能となる条件で、固相装置を維持する段階；
f) 第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量、第2の捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量、および対照捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量を決定する段階；
g) 第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量と、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量と、対照捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量との合計に対する、第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量の比率として、第1の補正後の分析物被覆粒子の量を決定し；かつ第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量と、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量と、対照捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量との合計に対する、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量の比率として、第2の補正後の分析物被覆粒子の量を決定する段階であって、
流体試料中の第1の関心対象分析物の量が、第1の補正後の分析物被覆粒子の量に反比例し、かつ流体試料中の第2の関心対象分析物の量が、第2の補正後の分析物被覆粒子の量に反比例する、
段階。
【請求項１６】
固相装置が、個々の追加の関心対象分析物に対する追加の試料捕捉ゾーンを含み、個々の追加の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された試料捕捉用試薬を有し；試料収集装置中の分析物被覆粒子が、個々の追加の関心対象分析物に関して、分析物被覆粒子上に被覆した追加の分析物または分析物の類似体をさらに含み；流体が、毛管作用により固相装置中を各試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの追加の分析物被覆粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの追加の分析物被覆粒子と個々の追加の試料捕捉ゾーン中の追加の試料捕捉用試薬との結合が可能となる条件で、前記固相装置が維持され；補正後の分析物被覆粒子の量が、個々の関心対象分析物に関して、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンの全体における全分析物被覆粒子の量に対する、個々の対応する追加の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの追加の分析物被覆粒子の量の比率として決定され、かつ流体試料中の個々の関心対象分析物の量が、対応する補正後の分析物被覆粒子の量に反比例する、
1種類または複数種類の追加の関心対象分析物の量を定量的に測定する段階をさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
以下の段階を含む、流体試料中の少なくとも2種類の関心対象分析物の量を定量的に測定するための方法：
a) 投入点と、少なくとも2つの試料捕捉ゾーンと、対照捕捉ゾーンとを含む固相装置を提供する段階であって、
第1の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された第1の試料捕捉用試薬を有し、第2の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された第2の試料捕捉用試薬を有し、かつ対照捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された対照捕捉用試薬を有し、
各試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンが、投入点からほぼ等距離にある、
段階；
b) 分析物被覆粒子の集団を含む試料収集装置を提供する段階であって、
分析物被覆粒子が、第1の分析物または第1の分析物の類似体および第2の分析物または第2の分析物の類似体で被覆されている、
段階；
c) i)流体試料を試料収集装置に導入し、混合流体試料を作製し、続いて緩衝液を混合流体試料中に導入すること；ii)緩衝液を試料収集装置に導入し、続いて流体試料を導入すること；またはiii)固体を緩衝液中に導入して流体試料を形成し、続いて流体試料を試料収集装置に導入することのいずれかを行い、それによって、接触済みの分析物被覆粒子を含む、緩衝液で処理された混合流体試料を作製する段階；
d) 緩衝液で処理された混合流体試料を、固相装置の投入点に投入する段階；
e) 流体が、毛管作用により固相装置中を各試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの分析物被覆粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの分析物被覆粒子と第1の試料捕捉ゾーン中の第1の試料捕捉用試薬との結合が可能となりかつ接触済みの分析物被覆粒子と第2の試料捕捉ゾーン中の第2の試料捕捉用試薬との結合が可能となる条件で；ならびに試料中の流体が、毛管作用により固相装置中を対照捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの分析物被覆粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの分析物被覆粒子と対照捕捉用試薬との結合が可能となる条件で、固相装置を維持する段階；
f) 第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量、第2の捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量、および対照捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量を決定する段階；
g) 第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量と、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量と、対照捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量との合計に対する、第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量の比率として、第1の補正後の分析物被覆粒子の量を決定し；かつ第1の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量と、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量と、対照捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量との合計に対する、第2の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの分析物被覆粒子の量の比率として、第2の補正後の分析物被覆粒子の量を決定する段階であって、
流体試料中の第1の関心対象分析物の量が、第1の補正後の分析物被覆粒子の量に反比例し、かつ流体試料中の第2の関心対象分析物の量が、第2の補正後の分析物被覆粒子の量に反比例する、
段階。
【請求項１８】
固相装置が、個々の追加の関心対象分析物に対する追加の試料捕捉ゾーンを含み、個々の追加の試料捕捉ゾーンが、該ゾーンに吸着された試料捕捉用試薬を有し；試料収集装置中の分析物被覆粒子が、個々の追加の関心対象分析物に関して、分析物被覆粒子上に被覆した追加の分析物または分析物の類似体をさらに含み；流体が、毛管作用により固相装置中を各試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、接触済みの追加の分析物被覆粒子を輸送できるようになり、それによって、接触済みの追加の分析物被覆粒子と個々の追加の試料捕捉ゾーン中の追加の試料捕捉用試薬との結合が可能となる条件で、前記固相装置が維持され；補正後の分析物被覆粒子の量が、個々の関心対象分析物に関して、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンの全体における全分析物被覆粒子の量に対する、個々の対応する追加の試料捕捉ゾーンにおける接触済みの追加の分析物被覆粒子の量の比率として決定され、かつ流体試料中の個々の関心対象分析物の量が、対応する補正後の分析物被覆粒子の量に反比例する、
1種類または複数種類の追加の関心対象分析物の量を定量的に測定する段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
バックグラウンドの検出量が、比率の決定に先だって、各ゾーンにおける粒子の決定された量から差し引かれる、請求項3〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
固相装置が側方流動固相装置である、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
固相装置が毛細管流動固相装置である、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2006年12月12日に出願された米国仮特許出願第60/874,315号の恩典を主張する。上記の出願の開示全体が、参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
流体試料、特に体液試料に含まれる細胞および分析物の定量分析を行うことで、医師および患者にとって、診断および治療に関する極めて重要な情報が得られることは少なくない。定量的免疫アッセイ法では、抗原(Ag)抗体(Ab)反応の特異性を利用して、試料中のAgまたはAbの検出および定量を行う。固相免疫アッセイ法では、1種類の試薬(例えばAgもしくはAb)を固体表面に結合させることで、結合状態の試薬または分析物と、遊離状態の試薬または分析物の分離が容易になる。固相は、分析物のAgまたはAbに結合する分析物を含む試料に曝露され；この結合の程度を定量することで、試料中の分析物濃度の尺度が得られる。しかし、測定可能なシグナルへと結合事象を変換することは、固相上での粒子の移動の制約を含む複数の制限の影響を受け、これは、定量的免疫アッセイ法の特異性および応用可能性に影響する。加えて、関連する関心対象分析物は、アッセイにおいて相互に競合する可能性があり、複数の関心対象分析物の存在の正確な評価を困難とする。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、関心対象分析物および捕捉用試薬が特異的な結合対の一部として使用される固相アッセイ法(例えばサンドイッチ免疫アッセイ法や阻害免疫アッセイ法)による、流体試料中の2種類またはそれ以上の関心対象分析物の量を測定する方法；ならびにこのような方法に使用されるキットに関する。本発明の方法では、1種類の関心対象分析物の検出量の比率は、個々の関心対象分析物に関する比率に正比例または反比例する。ある態様では、バックグラウンドの検出量が、比率の決定に先だって、個々の関心対象分析物の検出量から、および対照から差し引かれる。
【０００４】
本発明の方法は、側方流動固相装置や毛細管流動装置などの固相装置を利用する。本発明の代表的な方法では、固相装置は、投入点、2つまたはそれ以上の試料捕捉ゾーン(それぞれが個々の関心対象分析物に対応する)、および対照捕捉ゾーンを含み；試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンは、固相装置上に(毛管作用による液体の流れに関して)連続的に位置していてもよく；あるいは、試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンは投入点からほぼ等距離であってもよい。試料捕捉用試薬(例えば、関心対象分析物に対する抗体などの、関心対象分析物に結合する薬剤)は、それぞれが個々の関心対象分析物に対応する各試料捕捉ゾーンに吸着される。対照捕捉用試薬(例えば、抗免疫グロブリン抗体などの、分析物結合粒子に結合する薬剤)は、対照捕捉ゾーンに吸着される。
【０００５】
リポソーム、金コロイド、または有機ポリマーラテックス粒子などの、安定な状態で保存された粒子の集団を含む試料収集装置も提供される。本発明のサンドイッチ免疫アッセイ法では、粒子が、関心対象分析物に対する結合剤(例えば抗体)で被覆されているか、または多数の関心対象分析物に対する結合剤で被覆されている分析物結合粒子である；あるいは、それぞれが1種類の関心対象分析物に対する結合剤で被覆された、分析物結合粒子の異なる集団が利用される。競合アッセイ法または阻害アッセイ法では、粒子は、関心対象分析物で被覆されているか、または多数の関心対象分析物で被覆されている「分析物被覆」粒子(analyte coated particle)である；あるいは、それぞれが、1種類の関心対象分析物で被覆された、分析物被覆粒子の異なる集団が利用される。いずれのタイプのアッセイ法でも、粒子を、検出を容易にするために比色、蛍光、発光、化学発光、または他の適切な標識を用いて標識することができる。
【０００６】
この方法の1つの態様では、2種類またはそれ以上の関心対象分析物に関して評価される流体試料を試料収集装置に導入し、次に緩衝液を混合流体試料中に導入する。この方法の別の態様では、緩衝液を試料収集装置に導入し、次に関心対象分析物に関して評価される流体試料を導入する。この方法の第3の態様では、固体を緩衝液中に導入することで流体試料を形成させ、次に流体試料を試料収集装置に導入する。これらのどの態様でも、粒子を含む、緩衝液で処理された混合流体試料が作られる。
【０００７】
サンドイッチアッセイ法では、試料中に存在する関心対象分析物が分析物結合粒子と相互作用し、結果として、混合流体試料中に、接触済みの分析物結合粒子(contacted analyte binding particle)が生じる。緩衝液で処理された混合流体試料を、固相装置の投入点に投入する。次に、流体の毛管作用が、試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、および対照捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、粒子を輸送できるようになるのに十分な条件で、固相装置を維持する。試料捕捉用試薬は、接触済みの分析物結合粒子と相互作用し、これにより、粒子は試料捕捉ゾーンで停止する。流体の毛管作用は、接触済みの分析物結合粒子を試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って移動させるだけでなく、対照捕捉用試薬に結合する位置である対照捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って移動させる。次に各試料捕捉ゾーンで停止している、および対照捕捉ゾーンで停止している分析物結合粒子の量を決定する。
【０００８】
次に、流体試料中の関心対象分析物の量を決定する。例えば、流体試料中の関心対象分析物の量は、1)関心対象分析物に対応する、試料捕捉ゾーンで停止している分析物結合粒子の量と、2)試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンの全体における分析物結合粒子の量の合計との比率として決定可能である。別の態様では、必要に応じて、バックグラウンドの検出量が、比率の決定に先だって、各試料捕捉ゾーンにおける、および対照捕捉ゾーンにおける粒子の検出量から差し引かれる。
【０００９】
競合型または阻害型のアッセイ法では、緩衝液で処理された混合流体試料を、固相装置の投入点に投入する。次に、流体の毛管作用が、試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、ならびに対照捕捉用試薬に結合する位置である対照捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って分析物被覆粒子を輸送できるようになるのに十分な条件で、固相装置を維持する。試料捕捉用試薬は分析物被覆粒子と相互作用し；試料捕捉用試薬と分析物被覆粒子の相互作用は結果的に、分析物被覆粒子を試料捕捉ゾーンに停止させる。試料に含まれる分析物被覆粒子と分析物(存在する場合)との、試料捕捉ゾーンに含まれる試料捕捉用試薬上の結合部位をめぐる競合のために、試料捕捉ゾーンで停止している分析物被覆粒子の量は、試料に含まれる分析物の量に反比例する。試料捕捉ゾーンで、および対照捕捉ゾーンで停止している分析物被覆粒子の量を次に決定する。
【００１０】
次に、流体試料中の関心対象分析物の量を決定する。例えば、流体試料中の関心対象分析物の量は、1)関心対象分析物に対応する、試料捕捉ゾーンで停止している分析物被覆粒子の量と、2)試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンの全体における分析物被覆粒子の量の合計との比率に反比例する。別の態様では、必要に応じて、バックグラウンドの検出量が、比率の決定に先だって、各試料捕捉ゾーンにおける、および対照捕捉ゾーンにおける粒子の検出量から差し引かれる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
以下に本発明の例示的な態様を記述する。本明細書に引用された全ての特許、公開された出願、および参考文献の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００１２】
本発明は、固相アッセイ法による、2種類またはそれ以上の関心対象分析物の量を定量的に測定する方法、およびそのためのキットに関する。本発明の固相アッセイ法は、側方流動固相アッセイ法または毛細管流動固相アッセイ法である。
【００１３】
本明細書で用いるアッセイ法とは、分析物の有無または量を決定する目的で試料を分析するための、インビトロにおける手法を意味する。本発明のアッセイ法では、少なくとも2種類の関心対象分析物、および関心対象分析物に対応する分析物結合剤を使用する。個々の関心対象分析物、およびその分析物結合剤は、特異的な結合対の要素であり、結合対の第1の要素(例えば分析物)は、第2の要素(例えば結合剤)と特異的に反応する。結合対の一方または両方の要素は抗体であってもよい。例えば、結合対の第1の要素(例えば関心対象分析物)は抗体であり得、かつ結合対の第2の要素(例えば結合剤)は抗免疫グロブリン抗体であり得る；あるいは、結合対の第1の要素(例えば分析物)は抗原であり得、かつ結合対の第2の要素(例えば結合剤)は抗体であり得る。
【００１４】
1つの態様では、アッセイ法とは、手法の成分として抗体を用いる免疫アッセイ法である。好ましい態様では、免疫アッセイ法はサンドイッチアッセイ法であり、これは、分析物に対する抗体などの分析物結合剤で被覆された粒子と、分析物の有無または量について評価されるべき流体試料とを接触させ、得られた混合物を固相に投入し、その後、固相中を毛管作用により移動させるような、分析物についての試験である。正の結果は、固相の捕捉ゾーンにおける分析物と分析物結合剤被覆粒子との間の相互作用の検出により示され、捕捉ゾーンの分析物結合剤被覆粒子の量は、流体試料中の分析物の量に比例する。別の好ましい態様では、免疫アッセイ法は、阻害アッセイ法または競合アッセイ法であり、これは、分析物で被覆された粒子と、分析物の有無または量について評価されるべき流体被験試料とを接触させ、得られた混合物を固相に投入し、その後、固相中を毛管作用により移動させるような、分析物についての試験である。正の結果は、固相の捕捉ゾーンにおける分析物結合剤と分析物被覆粒子との間の相互作用の検出により示され、捕捉ゾーンの分析物被覆粒子の量は、流体試料中の分析物の量に反比例する。
【００１５】
本発明のアッセイ法の他の態様では、特異的な結合対における分析物と結合剤のいずれも抗体ではない：例えば結合対の第1の要素はリガンドであり得、かつ結合対の第2の要素は受容体であり得る；あるいは、結合対の第1の要素はレクチンであり得、かつ結合対の第2の要素は糖であり得る。さらに別の態様では、結合対の第1の要素は核酸(例えばDNA、RNA)であり得、かつ結合対の第2の要素は、結合対の第1の要素と特異的にハイブリダイズする核酸であり得る。本明細書で用いる、特異的なハイブリダイゼーションという表現は、第1の核酸が第2の核酸と(第1の核酸が、第2の核酸以外の任意の核酸とはハイブリダイズしないように)ハイブリダイズ可能なこと(例えば、第1の核酸が、ハイブリダイゼーションが行われる試料中の他の任意の核酸と比較して第2の核酸と高い類似性をもつこと)を意味する。ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー条件」とは、インキュベーション条件および洗浄条件(例えば、特定の核酸と第2の核酸とのハイブリダイゼーションを可能にする温度および緩衝液濃度の条件)を意味する当技術分野で用いられる表現であり；第1の核酸は、第2の核酸に対して完全に(すなわち100%)相補的であるか、または第1の核酸と第2の核酸は、完全未満(例えば70%、75%、80%、85%、90%、95%)の、ある程度の相補性を有し得る。例えば、ある高いストリンジェンシー条件は、完全に相補的な核酸を、相補性の低い核酸と区別する際に使用され得る。核酸のハイブリダイゼーションにおける「高ストリンジェンシー条件」、「中ストリンジェンシー条件」、および「低ストリンジェンシー条件」は、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M. et al.、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons (1998))、これらは、その内容全体が参照として本明細書に組み入れられる)の2.10.1〜2.10.16、および6.3.1〜6.3.6で説明されている。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する正確な条件は、イオン強度(例えば0.2×SSC、0.1×SSC)、温度(例えば室温、42℃、68℃)、およびホルムアミドなどの不安定化剤、またはSDSなどの変性剤の濃度に依存するだけでなく、核酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のミスマッチ率、および他の非同一配列内に含まれる配列のサブセットの出現頻度などの諸因子にも依存する。したがって、同等の条件を、2種類の核酸分子間における同程度の同一性または類似性を維持しながら、1種類または複数種類の上記パラメータを変化させることで決定することができる。
【００１６】
分析物およびその結合剤の組成にかかわらず、これらの2種類の成分は、第1の要素が第2の要素と特異的に反応する特異的な結合対を形成する。結合対の要素間の特異的な相互作用は、結合対の第1の要素が結合対の第2の要素と、好ましくは、アッセイ法に含まれる別の化合物との任意の結合を除外するようにして優先的に結合すること、または相互作用することを意味する。
【００１７】
本明細書で用いる、分析物または関心対象分析物という表現は、上述の結合対の第1の要素を意味する。分析物とは、その量が測定される分子または化合物である。分析物は、乾燥物(例えば、粉末、粒子；胞子；もしくはその他の粒子)などの固体の形状であってもよく、または液体の状態であってもよい(例えば、液体中に溶解されたか懸濁された上述の固体；またはその他の液体試料)。分析物の例には、細菌；胞子；ホルモンや酵素などのタンパク質；糖タンパク質；ペプチド；小分子；多糖；抗体；核酸；薬剤；毒素(例えば環境毒素)；ウイルスまたはウイルス粒子；細胞壁の一部；および他の化合物などが含まれる。好ましい態様では、分析物は「免疫原性」である。この用語は、分析物に対して、または担体に結合した状態の分析物(例えば、ハプテンに対する抗体が生じる可能性がある、ハプテン-担体結合体)に対して抗体(後述)が生じる可能性があることを意味する。いくつかの代表的な態様では、第1の関心対象分析物が、A型インフルエンザであり得、かつ第2の関心対象分析物が、B型インフルエンザであり得る。関心対象分析物は液体試料中に存在していてもよい；あるいは、関心対象分析物は乾燥(非流体)試料(例えば粒子試料、粉末試料、または土壌試料などの固体)中に存在していてもよい。個々の関心対象分析物は、上述の結合対の第1の要素であり--すなわち個々の関心対象分析物は、結合対の第2の要素と特異的に反応する。
【００１８】
本発明の方法では、流体試料を、2種類またはそれ以上の関心対象分析物の有無または量に関して評価する。流体は、抗体/抗原反応などの、個々の関心対象分析物とその分析物結合剤との反応を支持し(すなわち抗体/抗原相互作用に干渉しない)；かつ毛管作用による流体の移動を可能とするのに十分な低い粘性をもつ、固相の材料を湿らせる流体であり得る。好ましい態様では、流体は(体液などの)水溶液である。流体試料は、比較的少ない成分を有する流体(例えば関心対象分析物を含む水溶液)であってもよい；あるいは流体試料は、複合環境試料(例えば汚水、廃水、地下水、もしくは他の水試料)、または複合生物学的流体(例えば全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液、精液、硝子体液、滑液、もしくは他の生物学的流体)などの多くの成分を有する流体であってもよい。流体が生物学的流体である好ましい態様では、流体は全血、血漿、または血清である。流体が生物学的流体である別の好ましい態様では、流体は粘液である。必要に応じて、流体試料を希釈することが可能であり；例えば、複合生物学的流体を流体試料として用いる場合、これを溶液(例えば水溶液)で希釈することができる。
【００１９】
関心対象分析物の1種類が溶液中に存在しない場合(例えば関心対象分析物が上述のように、乾燥試料もしくは固体試料中にある場合)、まず流体試料中に抽出するか、懸濁するか、または溶解することができる。例えば関心対象分析物が核酸であれば、これを対象細胞から、溶液(例えば、後述する緩衝液などの水溶液)中に抽出することが可能であり；別の例では、関心対象分析物が粉末材料または粒子材料(例えば粉末、粒子、土壌試料、もしくは胞子)の場合、乾燥材料の試料を(例えばスワブもしくは他の器具を用いて)得ることによって、および乾燥材料の試料を溶液中に配置することによって、溶液(例えば、後述する緩衝液などの水溶液)中に懸濁するか溶解することができる。したがって、流体試料とは、関心対象分析物に関して評価される液体試料を意味するだけでなく、固体材料(関心対象分析物に関して評価される)が抽出されるか、懸濁されるか、または溶解された流体試料を意味する場合もある。
【００２０】
本明細書で用いる、分析物結合剤とは、上述の結合対の第2の要素を意味する。個々の分析物結合剤は、抗体、ハプテン、または薬剤結合体、受容体、または別の結合パートナーなどの、関心対象分析物(結合対の第1の要素)に特異的に結合する化合物である。好ましい態様では、分析物結合剤は、関心対象分析物に対する抗体である。
【００２１】
サンドイッチアッセイ法
本発明のサンドイッチアッセイ法では、固相装置を使用することができる。1つの態様では、固相装置は側方流動固相装置である。他の態様では、固相装置は毛細管流動固相装置である。
【００２２】
側方流動固相装置は、RAMP(商標)装置(Response Biomedical, Burnaby, British Columbia, Canada；例えば、米国特許第6,509,196号；第7,175,992号に記載された装置を参照)などの、側方流動アッセイ用に設計された任意の固相装置であってよい。一般に、側方流動固相装置は、被験試料がその中を通って流れる膜を含む。膜は、以下の特徴を有する物質から作製することができる：膜の表面に沿った、および膜の内部を通過する、流体の毛管作用を可能にするのに十分な空隙率；被覆粒子(例えば後述するような分析物結合粒子)または粒子と関心対象分析物との複合体(例えば後述するような接触済みの分析物結合粒子)の毛管作用による移動を可能にする能力(すなわち粒子または粒子と関心対象分析物の複合体を妨害してはならない)；および分析物を含む流体によって湿った状態になる能力(例えば、水性流体の場合は親水性、有機溶媒の場合は疎水性)。膜の疎水性は、水性流体を使用するために、疎水性表面から親水性表面への変換について記載されている米国特許第4,340,482号、または米国特許第4,618,533号などに記載されている過程によって膜を親水性とするように変化させることができる。膜の物質の例には、セルロース、硝酸セルロース、酢酸セルロース、ガラスファイバー、ナイロン、高分子電解質イオン交換膜、アクリル共重合体/ナイロン、およびポリエーテルスルホンが含まれる。好ましい態様では、膜は硝酸セルロース(例えばマイラー裏材(Mylar backing)を有する硝酸セルロース膜)から作製される。側方流動固相装置は任意で、試料パッド、ウィッキングパッド、内部標準成分、対照成分、または他の特性を含む、他の特性を含む場合もある。
【００２３】
毛細管流動固相装置は、BioSite Triage(登録商標)免疫アッセイ製品(BioSite Inc., San Diego, CA)などの、毛細管流動アッセイ用に設計された任意の固相装置であってよい。一般に、毛細管流動固相装置は、被験試料がその中を通って流れる毛細管チャネルを含む。
【００２４】
側方流動固相装置または毛細管流動固相装置のいずれを使用するにせよ、固相装置は、投入点、2つまたはそれ以上の試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを有する。投入点(または投入領域)とは、流体が投入され得る膜上の位置、または毛細管チャネル中の位置である。投入パッドを任意で使用することも可能であり；投入パッドは固相上に、投入点のすぐ近傍に隣接するか、または投入点に覆いかかるように存在する。投入パッドは、流体試料をパッドに、膜上の投入点または毛細管チャネル上の投入点に投入した時に、流体試料を送達可能な吸収性物質から作製することができる。代表的な物質には、セルロース、硝酸セルロース、酢酸セルロース、ナイロン、高分子電解質イオン交換膜、アクリル共重合体/ナイロン、ポリエーテルスルホン、またはガラスファイバーが含まれる。1つの態様では、パッドはHemasep(登録商標)-Vパッド(Pall Corporation)である。別の態様では、パッドはガラスファイバーパッドである。ウィッキングパッドが存在する場合は、これを上記のような吸収性物質から同様に作製することができる。
【００２５】
試料捕捉ゾーンとは、試料捕捉用試薬が吸着されている(例えば、膜上に塗布されている、および/または膜中に浸透している、または毛細管チャネルの表面上に塗布されている)、膜上の点、または毛細管チャネル内の点を指す。本明細書で用いる、「吸着される」という表現は、2つの連結分子間の共有電子の不可逆的な化学結合をもたらすために化学的手段が使用される共有結合とは対照的に、薬剤が非共有結合性相互作用によって固定または付着されることを意味する。膜上に、または毛細管チャネル中に吸着された薬剤の漸増移動(例えば脱着)が生じる場合があるが、本発明のアッセイ法において無視できる影響であると考えられる。
【００２６】
試料捕捉用試薬は、特定の関心対象分析物に関して上述されたような分析物結合剤である。試料捕捉用試薬は、後述の粒子上の分析物結合剤に関して記載されたものと同じ分析物結合剤である必要はないが；しかし、個々の試料捕捉用試薬も、関心対象分析物と特異的および優先的に結合するという点で、関心対象分析物と結合対を形成する。好ましい態様では、試料捕捉用試薬は、その関心対象分析物に対する抗体であり；これは、粒子上に被覆する分析物結合剤として使用される抗体に結合するエピトープと同じ分析物エピトープに対するものであっても、または粒子上に被覆する分析物結合剤として使用される抗体に結合するエピトープとは異なる分析物エピトープに対するものであってもよい。複数の関心対象分析物が存在するために、複数の試料捕捉ゾーンが存在する(1つの試料捕捉ゾーンは1種類の関心対象分析物に対応する)。各試料捕捉ゾーンは、該ゾーンに吸着される少なくとも1種類の試料捕捉用試薬を有し、ここで試料捕捉用試薬は、その特定の(対応する)関心対象分析物に対する分析物結合剤である。必要に応じて、(必ずしも関心対象分析物と同じエピトープである必要はないものの)特定の試料捕捉ゾーンにおける全ての試料捕捉用試薬が同じ関心対象分析物を標的とするという前提で、複数の試料捕捉用試薬が、各試料捕捉ゾーンに存在していてもよい。必要に応じて、複数の試料捕捉用試薬を、各試料捕捉ゾーンに使用することができる。
【００２７】
本装置は、対照捕捉ゾーンに吸着された対照捕捉用試薬を付加的に含む。対照捕捉用試薬は、分析物結合粒子と反応するが、測定対象の分析物とは相互作用しない試薬である：例えば、対照捕捉用試薬は、分析物結合剤を被覆した粒子上の分析物結合剤と反応してもよく；粒子上の別の材料と反応してもよく；または粒子そのものと反応してもよい。例えば分析物結合剤が抗体の場合、対照捕捉用試薬は抗免疫グロブリン抗体であり得る。好ましい態様では、個々の分析物結合剤は抗体であり、かつ対照捕捉用試薬は抗免疫グロブリン抗体である。対照捕捉用試薬は、対照捕捉ゾーンの固相装置上に吸着されている(膜上に塗布されている、および/または膜内に浸透している、または毛細管チャネル内に塗布されている)。
【００２８】
ある態様では、試料捕捉ゾーンは、固相装置上における毛管作用による液体の流れに関して連続的に、および投入点の近位に位置している。他のある態様では、試料捕捉ゾーンは、投入点からほぼ等距離にある(例えば、相互に平行に、放射状に分散して、または試料捕捉ゾーンが液体の流れに関して投入点に近位となるように位置している)。必要に応じて、試料捕捉ゾーンは、投入点より固相装置の遠位端に比較的近くてもよい。さらなる態様では、試料捕捉ゾーンは重複するか、または同じ領域を占め；このような態様では、使用される粒子(後述)は異なって標識される(すなわち、異なる光学密度、異なる化学発光マーカー、および/または異なる蛍光マーカーなどによって)個別に同定可能なように標識される。
【００２９】
試料捕捉ゾーンが重複しないか、または同じ領域を占めない態様における試料捕捉ゾーンの連続的な配置では、各ゾーン間の距離は様々な場合があり；ゾーンが重複しないように距離が十分確保されることが必要である。好ましい態様では、連続的なゾーンは、以下に詳述するようにバックグラウンドレベルが、様々なゾーン間にも決定可能なように間隔が設けられる。各試料捕捉ゾーンは、隣接する試料捕捉ゾーンからほぼ等距離にある。特定の態様では、「ほぼ等距離にある」という表現は、標準的な製造装置の使用時に、距離が可能な限り近いことを意味する：例えば、製造装置の分解能(resolution)がミリメートル単位であれば、ほぼ等距離にあるとは、1 mm以内にあることを意味する。あるいは、別の特定の態様では、ほぼ等距離の分解能は、第1の試料捕捉ゾーンの中心から第2の捕捉ゾーンの中心までの距離に関連する場合がある：例えば、第1の試料捕捉ゾーンの中心から第2の試料捕捉ゾーンの中心までの距離の差、および第2の試料捕捉ゾーンの中心から第3の捕捉ゾーンの中心までの距離の差は、投入点の中心から試料捕捉ゾーンの中心までの距離(経路の長さ)の長さの10%以内、好ましくは7%以内、好ましくは5%以内、より好ましくは4%以内、より好ましくは3%以内、さらにより好ましくは2%以内、およびさらにより好ましくは1%以内である。
【００３０】
試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンは、毛管先端が第1の試料捕捉ゾーンに到達時に粒子の捕捉が可能となるに足るほど遅い速度まで毛管先端を減速させるのに十分な大きな空間によって、投入点から隔てられている。また、この距離は、総移動時間(毛管先端が固相装置の全体を移動する時間)が、流体試料中の遊離の分析物を分析物結合粒子と結合させるに足るほど長くなるように、十分大きくなければならない。固相装置上における成分間の最適距離は、常用の実験法で決定および調節することができる。
【００３１】
定量的アッセイ法では、試料収集装置を追加的に使用する。本明細書で用いる、試料収集装置とは、流体試料の収集に使用可能な装置を意味するか、または内部に、収集された流体試料を蓄積または保存することが可能な装置を意味する。試料収集装置は、後述する分析物結合粒子を含み得る、および測定済みの流体試料の容量を添加できる、任意の装置であり得る。代表的な試料収集装置には、試料チューブ、試験管、バイアル、ピペットもしくはピペットチップ、またはシリンジが含まれる。好ましい態様では、試料収集装置はピペットまたはピペットチップである。
【００３２】
1つの態様では、試料収集装置は、個々の関心対象分析物に対応する分析物結合剤が存在するように、個々の関心対象分析物に対する分析物結合剤、例えば、第1の関心対象分析物に対する第1の分析物結合剤、第2の関心対象分析物に対する第2の分析物結合剤などで被覆された、分析物結合粒子の集団を含む。あるいは試料収集装置は、個々の関心対象分析物に対応する分析物結合粒子の集団が存在するように、個々の分析物結合剤に対する分析物結合粒子の集団、すなわち、第1の関心対象分析物に対する分析物結合粒子の集団、第2の関心対象分析物に対する分析物結合粒子の集団などを含み得る。必要に応じて、分析物結合粒子の異なるタイプの集団の組み合わせを使用することもできる。
【００３３】
粒子の集団は、粒子の大きさおよび組成、固相装置の組成、ならびにアッセイ法の感度レベルに応じて変動する。集団は典型的には、約1×103〜1×109個の範囲であるが、必要に応じて、より少ない、またはより多いものを使用することができる。好ましい態様では、集団は約2×108個の粒子である。集団は、必要に応じて(例えば、3種類の関心対象分析物が評価される場合は、3倍多い粒子に)増やされる。
【００３４】
分析物結合粒子は、個々の関心対象分析物に対する分析物結合剤(結合対の第2の要素)で被覆可能な粒子である。好ましい態様では、分析物結合粒子は、リポソーム、金コロイド、有機高分子ラテックス粒子、無機蛍光粒子、またはリン光粒子である。特に好ましい態様では、粒子はポリスチレンラテックスビーズであり、具体的には、界面活性剤を含まないSuperactive Uniform Aldehyde/Sulfate Latexes (Interfacial Dynamics Corp., Portland, OR)などの、界面活性剤の不在下で調製されたポリスチレンラテックスビーズである。
【００３５】
粒子の大きさは、膜の空隙率、または毛細管チャネルのサイズに関連し、かつ(例えば微粒子分析物について)関心対象分析物の大きさにも関連する：粒子は、流体の毛管作用によって膜に沿って、または毛細管チャネルを通って輸送されるためには十分小さくなければならず、かつ同様に、(固体、例えば微粒子状分析物について)毛管作用によって膜に沿って、または毛細管チャネルを通って輸送されるためには、後述の接触済みの分析物結合粒子複合体に関しても十分小さくなければならない。粒子は、検出が容易になるよう標識してもよい。粒子は、粒子の物理的特性に大きく影響しない手段で標識可能であり；例えば粒子の内部を標識することができる(すなわち標識を、リポソームの内部、またはポリスチレンラテックスビーズの内部などの粒子内に含める)。代表的な標識には、発光標識；化学発光標識；リン光標識；酵素結合標識；電気活性剤(例えばフェロシアン化物)などの化学標識；および色素や蛍光標識などの比色性標識が含まれる。1つの態様では蛍光標識が使用される。別の態様では、リン光粒子、特に米国特許第5,043,265号に記載されているような「アップコンバート(up-converting)」リン光粒子が使用される。例えば、試料捕捉ゾーンが分けられている場合は、同じタイプの標識を、分析物結合粒子の各集団に対して使用することができる(例えば、第1の関心対象分析物に対する粒子の集団と、第2の関心対象分析物に対する粒子の集団との両者に対して)。あるいは、例えば試料捕捉ゾーンが重複するか、または同じ領域を占めるならば、異なるタイプの標識(個別の標識)を使用することができる。
【００３６】
粒子は、個々の関心対象分析物に対する結合対の第2の要素である分析物結合剤で被覆される(例えば、複数のタイプの分析物結合剤で被覆されている粒子；または各集団がその分析物に対する1つのタイプの分析物結合剤で被覆されている、異なる粒子集団)。上述したように、分析物結合剤(結合対の第2の要素)は、関心対象分析物(結合対の第1の要素)に特異的および優先的に結合する。代表的な分析物結合剤には、抗体(もしくは抗体断片)；ハプテン；薬剤結合体；受容体；または他の結合パートナーが含まれる。1つの好ましい態様では、分析物結合剤は、関心対象分析物に対する抗体である。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。本明細書で用いる、「抗体」という用語は、関心対象分析物に結合するのに十分な抗体断片を意味する。あるいは別の態様では、分析物結合部位を有する操作されたタンパク質などの、関心対象分析物に特異的に結合する分子を使用することもできる(Holliger, P.およびH.R. Hoogenbloom, Trends in Biotechnology 13:7 9(1995)；Chamow, S.M.およびA. Ashkenazi, Trends in Biotechnology 14:52 60:1996))。さらに別の態様では、関心対象分析物が薬剤の場合、ハプテンまたは他の薬剤結合体を分析物結合剤として使用することができる。あるいはさらなる態様では、分析物に結合する受容体を使用することができる(例えば関心対象分析物がリガンドの場合)。分析物が既知の特異性をもつ抗体の場合、粒子は、分析物抗体が指向する抗原で被覆されていてもよく、または分析物抗体に対する抗体で被覆されていてもよい。さらに、分析物および分析物結合剤は結合対を形成するので、代表的な分析物として記載されている化合物または分子は、分析物結合剤として作用する場合もあり、および代表的な分析物結合剤として記載されているものは、本明細書に記載されたように同様に分析物として作用する場合もある。
【００３７】
試料収集装置に含まれる分析物結合粒子は、試料収集装置に安定な状態で保存される。本明細書で用いる、「安定な状態」という表現は、粒子が、保存中に化学的組成や物理的状態を大きく変化しない状態を意味する。安定な状態は、液体状態、ゲル状態、または固体状態であり得る。好ましい態様では、試料収集装置に含まれる分析物結合粒子は、蒸発乾燥された状態；凍結乾燥された状態；および/または真空乾燥された状態である。
【００３８】
特に好ましい態様では、試料収集装置は、真空乾燥された分析物結合粒子が内部に存在するピペットチップである。
【００３９】
アッセイ法を実施するためには、上述のような、関心対象分析物の存在に関して評価される流体試料を用いる。1つの態様では、流体試料を試料収集装置に導入する(引き込む、注入する、または配置する)。例えば1つの態様では、ピペットチップを含む試料収集装置に流体試料を引き込む。試料収集装置に流体試料を導入することで、流体試料と分析物結合粒子とが混合され、「混合流体試料」が形成される。分析物結合粒子を蒸発乾燥、凍結乾燥、または真空乾燥する場合、試料収集装置に流体試料を導入することで、流体試料中における分析物結合粒子の再水和および懸濁が可能となる。緩衝液(例えば希釈用)も混合流体試料に導入すると、「緩衝液で処理された混合流体試料」が形成される。緩衝液で処理された混合流体試料は、混合流体試料を、緩衝液を含む「緩衝液容器」(例えば試験管)内に分注することによるか、または緩衝液を、流体試料を導入する前に試料収集装置に導入することによって形成することができる。あるいは、関心対象分析物が固体(例えば、上記の粉末、粒子；胞子；または他の粒子)の場合、上記の流体試料は、緩衝液容器内に固体を導入することで調製することが可能であり；この態様では、緩衝液で処理された混合流体試料は、流体試料(緩衝液を含む)を試料収集装置に導入することによって形成される。別の態様では、緩衝液を試料収集装置に導入した後に、流体試料を試料収集装置に導入する。
【００４０】
緩衝液は、関心対象分析物と分析物結合剤との間の反応を支持する(例えば抗体/抗原相互作用に干渉しない)水性流体であり得；かつ毛管作用による流体の移動を可能とするのに十分な低い粘性を有する水性流体であり得る。1つの態様では、緩衝液は1つまたは複数の以下の成分を含む：緩衝剤(例えばリン酸塩)；塩類(例えばNaCl)；タンパク質安定剤(例えばBSA、カゼイン、血清)；および/または非イオン性の界面活性剤もしくは表面活性物質などの界面活性剤(例えば、表面活性物質ツールキットで通常利用されている1種類または複数種類の以下の薬剤：NINATE 411、Zonyl FSN 100、Aerosol OT 100%、GEROPON T 77、BIO TERGE AS 40、STANDAPOL ES 1、Tetronic 1307、Surfnyol 465、Surfynol 485、Surfynol 104PG 50、IGEPAL CA210、TRITON X 45、TRITON X 100、TRITON X305、SILWET L7600、RHODASURF ON 870、Cremophor EL、TWEEN 20、TWEEN 80、BRIJ 35、CHEMAL LA 9、Pluronic L64、SURFACTANT 1OG、SPAN 60、CREL)。任意で、必要に応じて、緩衝液は濃化剤を含んでよい。緩衝液のこのような成分は市販されている。代表的な緩衝液には例えば、生理食塩水、または50 mM Tris HCl、pH 7.2が含まれる。あるいは、緩衝液の代わりに水を用いることが可能であり；本明細書で用いる、「緩衝液」という用語は、緩衝作用をもつ溶液または水のいずれかを意味する。別の態様では、緩衝液の成分は凍結乾燥されており、かつ試料収集装置に含められており；この態様では、本発明の方法では、緩衝液の代わりに水が使用される。
【００４１】
分析物結合粒子を、流体試料中にさらに分散させるためには、必要に応じて、内部に流体試料および緩衝液が導入されている試料収集装置を、または内部に混合流体試料が導入されている緩衝液容器を(例えばボルテックス、振盪、ピペット操作などで)攪拌してもよい。
【００４２】
好ましい態様では、試料収集装置は、チップ中に真空乾燥された分析物結合粒子を有するピペットチップを含み；流体試料をピペット内に引き込むことで、乾燥状態の分析物結合粒子が再水和され、混合流体試料が形成される。特に好ましい態様では、混合流体試料を緩衝液容器に導入し、結果として、緩衝液で処理された混合流体試料が得られ；緩衝液容器中の、緩衝液で処理された混合流体試料を、試料収集装置を用いてピペット操作することで、分析物結合粒子をさらに分散させる。
【００４３】
関心対象分析物が、緩衝液で処理された混合流体試料中に存在する場合、結合が、分析物と分析物結合粒子との間で起こる。分析物と分析物結合粒子が「結合する」ということは、粒子上へ被覆した分析物結合剤が、関心対象分析物と相互作用(例えば結合)することを意味する。流体中の分析物(存在する場合)と、接触領域中に吸着された分析物結合粒子との結合を可能とする条件で維持されている(インキュベートされている)分析物結合粒子を、本明細書では「接触済みの分析物結合粒子」と呼ぶ。接触済みの分析物結合粒子は、個々の関心対象分析物が流体試料中に存在するか否か、および分析物が分析物結合粒子上の分析物結合剤に結合した状態にあるか否かに応じて、分析物結合剤に結合した状態の分析物を有する場合もあれば有しない場合もある。分析物結合粒子上には、分析物に対する多数の結合部位があるので、分析物結合粒子に結合した状態の分析物の有無および濃度は変動し；分析物結合粒子に結合した状態の分析物の濃度は、流体試料に含まれる分析物の量に比例して増し、かつ分析物結合粒子が、対応する試料捕捉ゾーン(後述)で停止する確率は同様に、分析物結合粒子に結合した状態の分析物の量の増加に伴い上昇する。したがって、接触済みの分析物結合粒子の集団は、分析物結合剤に結合した状態の、様々な量の分析物を有する粒子、ならびに分析物結合剤に結合した状態の分析物を有しない粒子(最初に分析物結合粒子に結合した状態の分析物を有しない分析物結合剤と同様)を含むことができる。また結合の程度は、条件の時間因子の延長に伴い強くなり；つまり、結合の大半は、1分以内(例えば60秒、好ましくは60秒未満(例えば45秒、30秒、またはこれ未満)に起こり、追加インキュベーション(例えば1分以上(2分、5分、10分、15分)によって追加的な結合が生じる。複数の分析物結合粒子の集団(例えば、異なる関心対象分析物に関する別の集団)が存在する場合、流体中の分析物(存在する場合)と、分析物結合粒子との結合を可能とする条件で維持された(インキュベートされた)分析物結合粒子は、個々の関心対象分析物に関して「接触済みの第1の分析物結合粒子」、「接触済みの第2の分析物結合粒子」などと表現され、および集合的に、接触済みの分析物結合粒子として知られる。
【００４４】
緩衝液で処理された混合流体試料を、固相装置の投入点、または投入パッド(存在する場合)に投入する。緩衝液で処理された混合流体試料と固相装置とを接触させた後に、流体が毛管作用によって前記装置に向けてかつ前記装置を通って移動することが可能となる条件で、前記固相装置を維持する。接触済みの分析物結合粒子は、緩衝液で処理された混合流体試料から、流体の毛管作用の結果として移動する。接触済みの分析物結合粒子が毛管作用によって試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って移動し、続いて対照捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って移動し、ならびに続いて任意で捕捉ゾーンを超えて(例えばウィッキングパッド中に)移動することが可能となる条件(例えば十分な時間および流体容量)で、固相装置を維持することにより、任意の非結合粒子を捕捉ゾーンから除去する。
【００４５】
一部の接触済みの分析物結合粒子の移動は、接触済みの分析物結合粒子と個々の関心対象分析物に対する試料捕捉ゾーンの試料捕捉用試薬との結合によって、および接触済みの分析物結合粒子の一部と対照捕捉ゾーンの対照捕捉用試薬との結合によって停止する。1つの好ましい態様では、分析物結合剤は、関心対象抗原に対する抗体であり、および対照捕捉用試薬は、分析物結合剤が由来する種の免疫グロブリンに対する抗体であり得る。この態様では、免疫グロブリンに対する抗体は、試料の他の成分と交差反応しないようにすべきである：例えばヒト試料を検討する場合、ヒト免疫グロブリンと反応しない抗体を、対照捕捉用試薬として使用することができる。
【００４６】
試料捕捉用試薬は、接触済みの分析物結合粒子上の分析物結合剤と結合した状態の関心対象分析物との結合によって、接触済みの分析物結合粒子と結合する。本明細書で用いる、試料-試薬-粒子複合体という表現は、試料捕捉用試薬と、接触済みの分析物結合粒子との複合体を意味する。接触済みの分析物結合粒子は、試料捕捉ゾーンにおける分析物と試料捕捉用試薬との相互作用によって接触済みの分析物結合粒子が捕捉されるために、試料捕捉ゾーンで停止し、試料-試薬-粒子複合体を形成する。各試料捕捉ゾーンは、個々の特定の関心対象分析物が、試料中に存在するか否か、および接触済みの分析物結合粒子上においてその分析物結合剤と結合した状態にあるか否かに応じて、同ゾーンで停止している試料-試薬-粒子複合体を有し得る。
【００４７】
対照捕捉用試薬は、接触済みの分析物結合粒子上の分析物結合剤との結合によって、接触済みの分析物結合粒子と結合する。本明細書で用いる、対照-試薬-粒子複合体という表現は、対照捕捉用試薬と、接触済みの分析物結合粒子との複合体を意味する。接触済みの分析物結合粒子は、対照捕捉ゾーンにおける分析物結合粒子と対照捕捉用試薬との相互作用によって接触済みの分析物結合粒子が捕捉されるために、対照捕捉ゾーンで停止し、対照-試薬-粒子複合体を形成する。上述したように、対照捕捉用試薬は分析物結合粒子と相互作用する(例えば、分析物結合剤被覆粒子上の分析物結合剤と、もしくは粒子上の別の材料と、または粒子そのものと相互作用する)が、試験(その試験のために試料捕捉ゾーンが存在している)に使用される任意の分析物そのものとは相互作用しない。
【００４８】
典型的には、次に毛管作用が、試料捕捉ゾーンまたは対照捕捉ゾーンのいずれでも停止していない、任意の接触済みの分析物結合粒子を、これらのゾーンを超えるように前方へ移動させることによって、停止していない任意の粒子を除去する。好ましい態様では、流体は、停止していない任意の接触済みの分析物結合粒子を、捕捉ゾーンに続くウィッキングパッド中に移動させる。
【００４９】
必要に応じて、第2の洗浄段階を用いることができる。緩衝液(例えば上述の緩衝液)は、緩衝液で処理された混合流体試料が膜に染み込んで、毛細管チューブを通して引き込まれた後に、または投入パッド(存在する場合)中に染み込んだ後に、投入点に投入することができる。緩衝液で処理された混合流体試料を希釈しない場合は、第2の洗浄段階を、その後の任意の時間に用いることができる。第2の洗浄過程は、後述するように分析物結合粒子が検出される場合に、バックグラウンドシグナルの減少に寄与し得る。
【００５０】
次に、各試料捕捉ゾーンで停止している分析物結合粒子(試料-試薬-粒子複合体)の量を、分析物結合粒子に用いられる標識の種類に適切な手段で検出する。好ましい態様では、この量を、分析物結合粒子の標識の蛍光量を測定する方法のような光学的な方法で検出する。
【００５１】
特に好ましい態様では、液体の流れの方向に沿って数百の測定値が得られるように、第1の試料捕捉ゾーンの上流から、対照捕捉ゾーンを超えるまでの領域全体がスキャンされる。このようにして、各ゾーンにおける、ならびにゾーン間における、ならびに初期ゾーン前および対照ゾーン後における結合の量を、これらの各領域における標識の量を定量するのに十分な分解能で決定することができる。ゾーン間における結合の量を、後述するように、バックグラウンドシグナルを補正するために使用することができる。
【００５２】
あるいは、電気伝導度または誘電率(電気容量)を元に、試料-試薬-粒子複合体の量を検出することができる。あるいはHayesら(Analytical Chem. 66: 1860-1865 (1994))に記載されているインジウム、ビスマス、ガリウム、またはテルルのイオンなどの電気活性剤(electroactive agent)、またはRobertsおよびDurst (Analytical Chem. 67:482-491 (1995))で示唆されているフェロシアン化物の放出を電気化学的に検出することができる。例えばリポソームを使用する場合、リポソームで包んだフェロシアン化物を、1滴の界面活性剤を捕捉ゾーンに添加することで放出することができ、放出されたフェロシアン化物を電気化学的に検出することができる(RobertsおよびDurst、上記)。キレート剤-タンパク質結合体を金属イオンのキレートに用いる場合は、1滴の酸を捕捉ゾーンに添加することでイオンが放出されるので、陽極ストリッピングボルタメトリー(anodic stripping voltametry)(Hayesら、上記)による定量が可能となる。同様に、対照捕捉ゾーンで停止している分析物結合粒子(本明細書では「対照」とも呼ばれる)の量を、試料捕捉ゾーンの分析物結合粒子の量と同じ手順で検出する。
【００５３】
その後、個々の関心対象分析物に対する補正後の分析物結合粒子の量を決定する。補正後の分析物結合粒子の量は、関心対象分析物に対応する試料捕捉ゾーン、および他の試料捕捉ゾーンで停止している分析物結合粒子の量、ならびに対照捕捉ゾーンで停止している分析物結合粒子の量に基づく。例えば1つの態様では、第1の関心対象分析物に対する補正後の分析物結合粒子の量は、第1の試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量と他の各試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンに存在するその量との合計に対する、第1の試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子量の比率(R)として決定される。1つの態様では、例えば2種類の関心対象分析物が存在する場合は、第1の関心対象分析物に対する補正後の分析物結合粒子量は、以下の比率から決定される：(第1の試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量＋第2の試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量＋対照捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量)の合計に対する、第1の試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量。同様に、2種類の関心対象分析物に関しては、第2の関心対象分析物に対する補正後の分析物結合粒子の量は、以下の比率から決定される：(第1の試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量＋第2の試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量＋対照捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量)の合計に対する、第2の試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量。
【００５４】
個々の関心対象分析物に対する補正後の分析物結合粒子の量が決定されたら、次に関心対象分析物の有無を、分析物に対する補正後の分析物結合粒子の量から、適切な比較によって決定することができる。1つの態様では、個々の関心対象分析物に対する補正後の分析物結合粒子の量は、補正後の結合粒子の量と分析物の既知濃度との間の関係が確立している標準曲線から予め決定された閾値と比較され；閾値と等しいか、または閾値より大きい補正後の分析物結合粒子の量は、正の結果を意味し(すなわち被験試料中における関心対象分析物の存在を意味し)、かつ閾値に満たない補正後の分析物結合粒子の量は、負の結果を意味する(すなわち被験試料中における関心対象分析物の不在を意味する)。
【００５５】
あるいは、個々の関心対象分析物に対する補正後の分析物結合粒子の量が決定されたら、次に関心対象分析物の量を、分析物に対する補正後の分析物結合粒子の量から、適切な計算によって決定することができる。例えば、存在する分析物の量は、標準曲線を利用すると、補正後の分析物結合粒子の量(比率)と正比例し得る。標準曲線は、検出される分析物を含む流体に既知濃度の関心対象分析物を含む一連の対照試料(例えば、分析物が枯渇した血清など)を調製することで作成する。次に、一連の対照試料を対象にアッセイし；R値を各対照試料について測定し；R値を、対照試料中の分析物の濃度の関数としてプロットする。未知量の分析物を含む試料(「被験試料」)を、被験試料のR値を測定することでアッセイし、被験試料中の分析物の濃度を、標準曲線を参照して決定する。上述したように、1つの標準曲線を、1つのロットの全被験試料に対して(例えば、被験試薬用の特殊な調製物を用いる全被験試料に対して)作成して使用することが可能であり；標準曲線を、各被験試料用に作成することは必ずしも必要ではない。あるいは、他の比率、および/または標準曲線を使用して、試料中に含まれる分析物の量を決定することもできる。
【００５６】
また必要に応じて、バックグラウンドの標識量を、各試料捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量および対照捕捉ゾーンに存在する分析物結合粒子の量から、補正後の分析物結合粒子の量の計算時に、および比率(R)の計算を行う前に差し引くことができる。例えば、アッセイ法の実施後に(液体が捕捉ゾーンを通りかつ超えて移動した後に)、固相装置の全体または一部をスキャンして、各捕捉ゾーンの前、ゾーン中、ゾーン後の領域中における標識粒子の量を評価することができる。スキャンは、捕捉ゾーンを含む領域周囲において主に実施可能であるが、これらのゾーン外に及ぶ領域、および/またはこれらのゾーン間の領域を対象に実施することもできる。捕捉ゾーン外の領域に存在する粒子は、「バックグラウンド」、すなわち試料の存在下で固相装置に非特異的に結合する粒子、および捕捉ゾーンにも存在する試料マトリックスの他の構成成分である。捕捉ゾーンに存在する粒子の量は、捕捉用試薬によって捕捉された特定の粒子に加えて、この非特異的なバックグラウンドを含む。粒子のバックグラウンドの検出量(すなわち、捕捉ゾーンの前方および/または後方などの捕捉ゾーン以外の位置において検出される粒子の量)を、個々の捕捉ゾーンについて決定された粒子の総量から差し引くことができる。これによって、バックグラウンドの量が補正され、および試料中に存在する分析物の量が、より正確に決定され得る。例えば、バックグラウンドの検出量は、捕捉ゾーンのすぐ近傍および上流の位置に；または捕捉ゾーンのすぐ近傍および下流の位置に；または投入点と第1の試料捕捉ゾーンとの間に；または捕捉ゾーン以外の別の位置において同定され得る。あるいは、バックグラウンドの検出量は、複数の位置において同定されてもよい：例えば、バックグラウンドの検出量は、捕捉ゾーンの上流の位置に、および同捕捉ゾーンの下流の位置においても同定されてよく；これらの2つのバックグラウンドの検出量の平均は、「バックグラウンド補正後の分析物結合粒子の量」を得るために分析物結合粒子の量から差し引かれる、粒子のバックグラウンドの検出量として使用することができる。本明細書で用いる、「バックグラウンド補正後の分析物結合粒子の量」という表現は、粒子のバックグラウンドの量が差し引かれた分析物結合粒子の量を意味する。
【００５７】
好ましい態様では、粒子のバックグラウンドの検出量は、個々の捕捉ゾーンのすぐ近傍および上流において決定される：例えば、2種類の関心対象分析物が存在し、したがって2つの試料捕捉ゾーンが存在する態様では、バックグラウンドの量は、第1の試料捕捉ゾーンの上流(第1の試料捕捉ゾーンに対する)；第1の試料捕捉ゾーンの下流かつ第2の試料捕捉ゾーンの上流(第2の試料捕捉ゾーンに対する)；ならびに第2の試料捕捉ゾーンの下流かつ対照捕捉ゾーンの上流(対照捕捉ゾーンに対する)で検出される。あるいは、同じバックグラウンドの検出量を、各試料捕捉ゾーンに対して、および対照捕捉ゾーンに対して使用することができる。
【００５８】
別の好ましい態様では、粒子のバックグラウンドの検出量は、個々の捕捉ゾーンのすぐ近傍および上流、ならびに個々の捕捉ゾーンのすぐ近傍および下流の両方において決定され、ならびに2つの量の平均が、バックグラウンド補正後の分析物結合粒子の量の決定に使用される。例えば、2種類の関心対象分析物が存在し、したがって2つの試料捕捉ゾーンが存在する態様では、バックグラウンドの量は、第1の試料捕捉ゾーンの上流かつ第1の試料捕捉ゾーンの下流で検出され、およびこれらの2つの量が平均されて、第1の試料捕捉ゾーンに対するバックグラウンドの量として使用され；第1の試料捕捉ゾーンの下流におけるバックグラウンドの量はまた、第2の試料捕捉ゾーンの上流におけるバックグラウンドの量としても使用され、およびこれは、第2の試料捕捉ゾーンの下流におけるバックグラウンドの量とともに、第2の試料捕捉ゾーンに対するバックグラウンドの量としてこの平均を使用できるように平均される。必要に応じて、読み値の他の組み合わせを使用しかつ平均することで、バックグラウンドの量として提供することができる。
【００５９】
本発明の1つの好ましい態様では、2種類の関心対象分析物は、A型インフルエンザとB型インフルエンザである。この態様では、A型インフルエンザに対する抗体が第1の分析物結合剤として使用され、およびB型インフルエンザに対する抗体が第2の分析物結合剤として使用される。
【００６０】
「競合」または「阻害」アッセイ法
本発明の競合アッセイ法または阻害アッセイ法は、サンドイッチアッセイ法と同様に、投入点、2つまたはそれ以上の試料捕捉ゾーン、および対照捕捉ゾーンを含む、上述の固相装置を用いる。この態様は、上述の試料収集装置も用いる。競合(阻害)アッセイ用の試料収集装置は、(サンドイッチアッセイ法に関して述べたように、分析物結合剤で被覆される代わりに)全ての関心対象分析物で、または全ての関心対象分析物の類似体で被覆される分析物被覆粒子の集団を含むか；あるいは、試料収集装置は、分析物被覆粒子の複数の集団(個々の関心対象分析物に対して1つの集団)を含み；各集団は、関心対象分析物によって、または関心対象分析物の類似体によって、またはこれらの組み合わせによって被覆されている。本明細書で用いる、分析物の類似体は、上述した、分析物結合剤と結合対を形成するという点で、分析物と類似の結合特性を有する化合物である。分析物および/または分析物の類似体は、粒子上に直接被覆してもよく、粒子に間接的に結合させてもよい。後述するように、分析物被覆粒子という表現は、関心対象分析物、および/または関心対象分析物の類似体のいずれかで被覆された粒子を意味し得る。サンドイッチアッセイ法に関して既に記載したように、粒子の集団は、粒子の大きさおよび組成、固相装置の組成、ならびにアッセイ法の感度のレベルに応じて変動する。
【００６１】
上述したように、試料捕捉ゾーンとは、試料捕捉用試薬が吸着される固相装置上の位置である。試料捕捉用試薬は、上述したような分析物結合剤である。試料捕捉用試薬は、上記と同じ分析物結合剤である必要はないが；試料捕捉用試薬は、関心対象分析物と特異的また優先的に結合する点に関して、関心対象分析物と結合対も形成する。複数の関心対象分析物が存在するので、上述したように、複数の試料捕捉ゾーンが存在することになる。上述したように、好ましい態様では試料捕捉用試薬は、分析物に対する抗体であり；これは、粒子上に被覆する分析物結合剤として使用される抗体に結合するエピトープと同じ分析物エピトープに対するものであっても、または異なる分析物エピトープに対するものであってもよい。必要に応じて、複数の試料捕捉用試薬を、各試料捕捉ゾーンに使用することができる。
【００６２】
上述のように、装置は、対照捕捉用試薬を追加的に含み、これは、分析物被覆粒子と反応するが、測定対象の分析物とは相互作用しない：例えば対照捕捉用試薬は、粒子上の別の材料(例えば、粒子と結合している分析物に対する担体；抗体)と；または粒子そのものと反応し得る。好ましい態様では、試料捕捉用試薬および対照捕捉剤はいずれも抗体である。対照捕捉用試薬は、対照捕捉ゾーンに吸着される。競合アッセイ法の成分は、サンドイッチアッセイ法に関して既に述べた方法と類似の方法で位置付けられる。
【００６３】
競合アッセイ法を実施するためには、関心対象分析物の存在に関して評価される流体試料を上述のように用いる。1つの態様では、流体試料を試料収集装置に導入する(引き込む、注入する、またはそれ以外の方法で配置する)。例えば1つの態様では、ピペットチップを含む試料収集装置に流体試料を引き込む。試料収集装置に流体試料を導入することで、流体試料と分析物被覆粒子とが混合され、混合流体試料が形成される。分析物被覆粒子を蒸発乾燥、凍結乾燥、または真空乾燥する場合、試料収集装置に流体試料を導入することで、流体試料中における分析物結合粒子の再水和および懸濁が可能となる。緩衝液(例えば上述の緩衝液)も混合流体試料中に導入すると、緩衝液で処理された混合流体試料が形成される。緩衝液で処理された混合流体試料は、混合流体試料を、緩衝液を含む緩衝液容器(例えば試験管)に分注することによるか、または緩衝液を、流体試料を導入する前に試料収集装置に導入することによって形成することができる。別の態様では、緩衝液を試料収集装置に導入してから、流体試料を試料収集装置に導入する。あるいは、関心対象分析物が固体(例えば、上記の粉末、粒子；胞子；または他の粒子)の場合、上述の流体試料は、緩衝液容器に固体を導入することで調製することが可能であり；この態様では、緩衝液で処理された混合流体試料は、流体試料(緩衝液を含む)を試料収集装置に導入することによって形成される。
【００６４】
分析物被覆粒子を、流体試料中にさらに分散させるためには、必要に応じて、内部に流体試料および緩衝液が導入されている試料収集装置を、または混合流体試料が導入されている緩衝液容器を(例えばボルテックス、振盪、ピペット操作などで)攪拌してもよい。
【００６５】
好ましい態様では、試料収集装置は、真空乾燥された分析物被覆粒子をチップ中に有するピペットチップを含み；流体試料をピペットに引き込むことによって、乾燥状態の分析物被覆粒子を再水和し、混合流体試料を形成する。特に好ましい態様では、混合流体試料を緩衝液容器に導入し、緩衝液で処理された混合流体試料を得て；緩衝液容器中の、緩衝液で処理された混合流体試料を、試料収集装置を用いてピペット操作することにより、分析物被覆粒子をさらに分散させる。
【００６６】
緩衝液で処理された混合流体試料を、固相装置の投入点に、または投入パッド(存在する場合)に投入する。緩衝液で処理された混合流体試料と固相装置とを接触させた後に、流体が毛管作用により前記固相装置に向けてかつ前記固相装置を通って移動することが可能となる条件で、前記装置を維持する。分析物被覆粒子(および試料中に存在する場合は分析物)は、装置中を、流体の毛管作用の結果として、緩衝液で処理された混合流体試料から、試料捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って、続いて対照捕捉ゾーンに向けてかつ該ゾーンを通って移動する。
【００６７】
一部の分析物被覆粒子の移動は、試料捕捉ゾーンにおける分析物被覆粒子と試料捕捉用試薬との結合、および対照捕捉ゾーンにおける一部の分析物被覆粒子と対照捕捉用試薬との結合によっても停止する。分析物被覆粒子は、試料捕捉用試薬との結合をめぐって、試料中の分析物(存在する場合)と競合する。試料捕捉用試薬は、分析物被覆粒子上の分析物との結合により、分析物被覆粒子と結合する。本明細書で用いる、試料-試薬-分析物被覆粒子複合体という表現は、試料捕捉用試薬と分析物被覆粒子との複合体を意味する。分析物被覆粒子は、粒子上の関心対象分析物と試料捕捉ゾーンの試料捕捉用試薬との相互作用によって分析物被覆粒子が捕捉されるために、試料捕捉ゾーンで停止し、試料-試薬-分析物被覆粒子の複合体を形成する。
【００６８】
対照捕捉用試薬は、分析物そのものを除く、分析物被覆粒子の任意の成分に結合することで、分析物被覆粒子に結合する。上記のように使用される、対照-試薬-分析物被覆粒子の複合体という表現は、対照捕捉用試薬と分析物被覆粒子との複合体を意味する。上述したように、分析物被覆粒子は、分析物結合粒子と対照捕捉ゾーンの対照捕捉用試薬との相互作用によって分析物被覆粒子が捕捉されるために、対照捕捉ゾーンで停止し、対照-試薬-分析物被覆粒子の複合体を形成する。
【００６９】
次に毛管作用は、試料捕捉ゾーンまたは対照捕捉ゾーンのいずれにおいても停止していない任意の分析物被覆粒子を、捕捉ゾーンを超える方向に向けて移動させることができる。
【００７０】
次に、各捕捉ゾーンで停止している分析物被覆粒子を検出する。分析物被覆粒子は、サンドイッチアッセイ法による分析物結合粒子の量の検出に関連して上述したように、分析物被覆粒子に使用する標識の型に適した手段で検出する。同様に、対照捕捉ゾーンで停止している分析物被覆粒子(本明細書では「対照」とも呼ばれる)の量は、試料捕捉ゾーンの分析物被覆粒子の量と同様にして検出する。
【００７１】
次に、個々の関心対象分析物に対する補正後の分析物被覆粒子の量を決定する。補正後の分析物被覆粒子の量は、関心対象分析物に対応する、試料捕捉ゾーンで停止している分析物被覆粒子の量、および他の試料捕捉ゾーンならびに対照捕捉ゾーンで停止している分析物被覆粒子の量に基づく。例えば1つの態様では、第1の関心対象分析物に対する補正後の分析物被覆粒子の量は、第1の試料捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子の量と他の各試料捕捉ゾーンおよび対照捕捉ゾーンに存在するその量との合計に対する、第1の試料捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子の量の比率(R)に反比例する。1つの態様では、例えば、2種類の関心対象分析物が存在する場合は、第1の関心対象分析物に対する補正後の分析物被覆粒子の量は、以下の比率に反比例する：(第1の試料捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子の量＋第2の試料捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子の量＋対照捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子の量)の合計に対する、第1の試料捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子の量。同様に、2種類の関心対象分析物に関しては、第2の関心対象分析物に対する補正後の分析物被覆粒子の量は、以下の比率に反比例する：(第1の試料捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子の量＋第2の試料捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子の量＋対照捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子の量)の合計に対する、第2の試料捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子の量。
【００７２】
個々の関心対象分析物に対する補正後の分析物被覆粒子の量が決定されたら、次に関心対象分析物の有無を、分析物に対する補正後の分析物被覆粒子の量から、適切な比較を使用することで決定することができる。1つの態様では、個々の関心対象分析物に対する補正後の分析物被覆粒子の量は、サンドイッチアッセイ法に関連して上述されたように、予め決定された閾値と比較され；閾値と等しいか、または閾値より大きい補正後の分析物結合粒子の量は、負の結果を意味し(すなわち、被験試料中における関心対象分析物の不在を意味し)、および閾値を上回る補正後の分析物被覆粒子の量は、正の結果を意味する(すなわち、被験試料中における関心対象分析物の存在を意味する)。
【００７３】
あるいは、個々の関心対象分析物に対する補正後の分析物被覆粒子の量が決定されたら、次に関心対象分析物の量を、分析物に対する補正後の分析物被覆粒子の量から、適切な計算によって決定することができる。例えば、存在する分析物の量を次に、補正後の分析物被覆粒子の量(比率)から、標準曲線を利用して決定することができる。標準曲線は、検出される分析物を含む流体に既知濃度の関心対象分析物を含む一連の対照試料(例えば、分析物が枯渇した血清など)を調製することで作成する。次に、一連の対照試料を対象にアッセイし；R値を各対照試料について測定し；同値を、対照試料中の分析物の濃度の関数としてプロットする。未知量の分析物を含む試料(「被験試料」)を、被験試料のR値を測定することでアッセイし、被験試料中の分析物の濃度を、標準曲線を参照して決定する。上述したように、1つの標準曲線を作成して、1つのロットの全被験試料(例えば、試験用試薬の特定の調製物を用いる全被験試料)に対して使用することが可能であり；標準曲線を各被験試料について再び作成する必要はない。
【００７４】
あるいは、上述したように、他の比率、および/または標準曲線を使用して、試料中の分析物の量を決定することもできる。
【００７５】
また必要に応じて、サンドイッチアッセイ法に関して上述したように、バックグラウンドの標識量を、各試料捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子の量、および対照捕捉ゾーンに存在する分析物被覆粒子の量から、補正後の分析物被覆粒子の量の計算時に、および比率(R)の計算に先だって差し引くことができる。例えば、バックグラウンドの検出量は、捕捉ゾーンのすぐ近傍および上流の位置に；または捕捉ゾーンのすぐ近傍および下流の位置に；または投入点と第1の試料捕捉ゾーンとの間に；または捕捉ゾーン以外の別の位置において同定され得る。あるいは、バックグラウンドの検出量は、複数の位置において同定されてもよい：例えば、バックグラウンドの検出量は、捕捉ゾーンの上流の位置に、および同捕捉ゾーンの下流の位置においても同定されてよく；これらの2つのバックグラウンドの検出量の平均は、「バックグラウンド補正後の分析物被覆粒子の量」を得るために分析物被覆粒子の量から差し引かれる、粒子のバックグラウンドの検出量として使用することができる。本明細書で用いる、「バックグラウンド補正後の被覆結合粒子の量」という表現は、粒子のバックグラウンドの量が差し引かれた分析物被覆粒子の量を意味する。
【００７６】
好ましい態様では、粒子のバックグラウンドの検出量は、個々の捕捉ゾーンのすぐ近傍および上流において決定される：例えば、2種類の関心対象分析物が存在し、したがって2つの試料捕捉ゾーンが存在する態様では、バックグラウンドの量は、第1の試料捕捉ゾーンの上流(第1の試料捕捉ゾーンに対する)；第1の試料捕捉ゾーンの下流かつ第2の試料捕捉ゾーンの上流(第2の試料捕捉ゾーンに対する)；および第2の試料捕捉ゾーンの下流かつ対照捕捉ゾーンの上流(対照捕捉ゾーンに対する)で検出される。あるいは、同じバックグラウンドの検出量を、各試料捕捉ゾーンに対して、および対照捕捉ゾーンに対して使用することができる。別の好ましい態様では、粒子のバックグラウンドの検出量は、個々の捕捉ゾーンのすぐ近傍および上流、ならびに個々の捕捉ゾーンのすぐ近傍および下流の両方において決定され、ならびに2つの量の平均が、バックグラウンド補正後の分析物被覆粒子の量の決定に使用される。例えば、2種類の関心対象分析物が存在し、したがって2つの試料捕捉ゾーンが存在する態様では、バックグラウンドの量は、第1の試料捕捉ゾーンの上流かつ第1の試料捕捉ゾーンの下流で検出され、およびこれら2つの量が平均されて、第1の試料捕捉ゾーンに対するバックグラウンドの量として使用され；第1の試料捕捉ゾーンの下流におけるバックグラウンドの量はまた、第2の試料捕捉ゾーンの上流におけるバックグラウンドの量としても使用され、およびこれは、第2の試料捕捉ゾーンの下流におけるバックグラウンドの量とともに、第2の試料捕捉ゾーンに対するバックグラウンドの量としてこの平均を使用できるように平均される。必要に応じて、読み値の他の組み合わせを使用しかつ平均することで、バックグラウンドの量として提供することができる。
【００７７】
本発明の利点
本発明の方法は、分析物結合粒子が、固相装置の膜内に埋め込まれているか、または固相装置の膜に接するように配置されているか、または毛細管流動固相装置上に同様に配置された結合パッド(conjugate pad)内に含まれるアッセイ法と比較して、感度が増強されたアッセイ法を提供する。例えばサンドイッチアッセイ法では、関心対象分析物に関してアッセイされる流体試料を、固相装置への投入前に分析物結合粒子と混合するので、関心対象分析物が、固相上で生じる捕捉反応の前に分析物結合粒子と結合する時間がより長くなる。また、関心対象分析物と分析物結合粒子との相互作用は液相中で起こるので、粒子の移動度が大きいために、固相装置のマトリックスにおける関心対象分析物と分析物結合粒子との間の同じ相互作用と比較して、より効率的な結合が可能となる。またサンドイッチアッセイ法と競合アッセイ法の両方に関して、より多くの粒子が、固相装置に埋め込まれる可能性よりも流体収集装置に含まれ得る；つまり数が多くなると、反応の感度がさらに高まる。また、分析物結合粒子(または分析物被覆粒子)は、緩衝液で処理された混合流体試料の固相への投入前に、緩衝液で処理された混合流体試料中に分散しているので、粒子は、流体先端の頂点に急に押し寄せる(quick wave)というより、連続的に流体の毛管作用で捕捉ゾーンを通過する。結果として、低濃度の粒子が捕捉ゾーンを長い時間をかけて流れる：したがって、捕捉ゾーンを通過する粒子の量は効率的に減少し、粒子が流体先端の頂点を通過する場合に生じる、他のものによる一部の粒子の捕捉の非特異的な物理的なブロッキングが避けられる一方で、粒子が「捕捉」され得る時間は効率的に増加し、これにより、捕捉ゾーンにおける、より高い特異性の結合が可能となる。
【００７８】
また、評価は、1つの内部対照を使用して多数の分析物に関して実施することが可能であり、こうすることで、複数の化合物を同時に解析することができるようになる。加えて、比率の使用は、内部較正物質(internal calibrator)に基づく補正を提供し、アッセイ法における粒子の総量の変動を補正することにより、様々な量の標識、ならびにアッセイ法の感度の差が相殺される。
【００７９】
本発明のアッセイ法は、特に免疫アッセイ法に関して説明されているが、本発明のアッセイ法は、分析物および分析物結合剤として所望の成分を伴う上記と同じ方法を用いて、上述の他の結合対(例えば核酸、受容体-リガンド、レクチン-糖)とともに同様に使用することができる。
【００８０】
本発明のキット
本発明は、本明細書に記載された方法に使用するためのキットも含む。キットの成分は以下を含み得る：特異的な結合対の第1および/または第2の要素、緩衝液および/または緩衝液容器、流体収集手段、1つまたは複数の固相装置(任意で投入パッドおよび/またはウィッキングパッドを含む)、少なくとも1つの試料収集装置、1つまたは複数の緩衝液容器、標準曲線作製用の対照試料および/または他の標準曲線情報、分析物結合粒子、分析物被覆粒子、および/または対照粒子、捕捉用試薬、抗体、関心対象分析物に関して評価される試料の収集を補助するツール(例えばスワブ)、廃棄処理装置(例えばバイオハザード用の廃棄用バッグ)、および/または試料収集装置に関する他の情報もしくは指示書(例えばロット情報や有効期限など)。例えば1つの態様では、キットは、分析物結合粒子を内部に有する少なくとも1つの試料収集装置を含み；好ましい態様では、キットは、蒸発乾燥された、真空乾燥された、または凍結乾燥された分析物結合粒子を内部に有する少なくとも1つのピペットチップを含む。別の態様では、キットは、本明細書に記載された、少なくとも1つの固相装置、および少なくとも1つの試料収集装置を含む。別の好ましい態様では、キットは少なくとも1つのピペット；蒸発乾燥された、真空乾燥された、または凍結乾燥された分析物結合粒子を内部に有する少なくとも1つまたは複数のピペットチップ；および少なくとも1つの固相装置を含む。この好ましい態様は任意で、ピペットチップ中の分析物結合粒子に関する標準曲線、ロット情報、および/または有効期限に関する情報を含んでもよい。さらに別の好ましい態様では、キットは少なくとも1つの試料収集装置；乾燥状態の分析物結合粒子を内部に有する少なくとも1つのピペットチップ；少なくとも1つの固相装置；および少なくとも1つの緩衝液容器を含む。この好ましい態様は任意で、緩衝液容器内に緩衝液を含む場合があり；かつ固体試料の収集用のツール(例えばスワブ)を含む場合もある。
【００８１】
本発明を、以下の実施例で説明するが、これらは何ら限定を意図するものではない。
【００８２】
実施例：A型インフルエンザおよびB型インフルエンザに関する試料の解析
A．材料
免疫クロマトグラフィーアッセイ用の膜細片(strip)を作製するために、以下の手順を用いる。
TL-位置(第1の試料捕捉ゾーン)で剥離(strip)された、1.5 mg/ml、1 μl/cmのFluA抗体。
UL-位置(第2の試料捕捉ゾーン)で剥離された、1.5 mg/ml、1 μl/cmのFluB抗体。
ISL-位置(対照捕捉ゾーン)で剥離された、1 mg/ml、1 μl/cmのヤギ抗マウス抗体。
【００８３】
上記の抗体は、抗体溶液をニトロセルロース膜上に1 μl/cmの速度で加え、これを1% PVAでブロック処理し、10 mM PB溶液で洗浄後に乾燥させて剥離する。膜を、5 mm幅の細片に切断する。
【００８４】
試験カートリッジ(固相装置)は、本明細書に記載の通り、細片、試料パッド、およびウィッキングパッドを使用して組み立てる。
【００８５】
分析物結合粒子を調製するために、以下の2つのフォーマットのうち1つを使用する。
【００８６】
フォーマット1：共結合体(co-conjugate)
0.25 mgのFluA抗体および0.125 mgのFluB抗体を、4 mlの蛍光色素ラテックスビーズに共有結合的に結合させる。
ピペットチップ(試料収集装置)中にラテックス-抗体結合体をスポットし、真空ポンプを使用して乾燥させてアッセイ用のチップを調製するか、またはラテックス抗体結合体を試料緩衝液とともに凍結乾燥緩衝液中に含める。
【００８７】
フォーマット2：コンジュゲーションの分離
0.25 mgのFluA抗体を、4 mlの蛍光色素化ラテックスビーズに共有結合的に結合させる。
0.125 mgのFluB抗体を、4 mlの蛍光色素化ラテックスビーズに共有結合的に結合させる。
FluA抗体-ラテックス結合体とFluB抗体-ラテックス結合体とを混合し、混合した結合体をピペットチップ(試料収集装置)中にスポットし、真空ポンプを使用して乾燥させてアッセイ用のチップを調製するか、またはラテックス抗体結合体を試料緩衝液とともに、凍結乾燥緩衝液中に含める。
【００８８】
緩衝液を調製するために、以下の2つのフォーマットのうち1つを使用する。
【００８９】
フォーマット1：液体緩衝液フォーマット
138 mM PB、138 mM NaCl、3.6% BSA、0.84% Surfactant 1OG、0.6%カゼイン、0.05% Polyox、0.05% v/v ProClin 300、pH 7.2の試料緩衝液組成。このフォーマットは、上述のアッセイ用チップを使用する。
【００９０】
フォーマット2：凍結乾燥緩衝液フォーマット
上記の液体緩衝液を、凍結乾燥試料緩衝液中のラテックス抗体結合体を伴って、または伴わずに、凍結乾燥する。ラテックスが、凍結乾燥緩衝液中に含まれている場合は、ラテックスは、ピペットチップ中で乾燥させる必要はない。
【００９１】
B．方法
インフルエンザ(flu)を含むことが疑われる被験試料を、上記の試料緩衝液を溶媒として調製する(例えば被験試料を液体試料緩衝液に直接添加することで希釈するか、または試料を凍結乾燥試料緩衝液を再構成するために使用する)。ラテックス-抗体結合体を、凍結乾燥試料緩衝液中に含めるか、またはラテックス-抗体結合体を、試料をアッセイ用チップで混合することで調製済みの試料に添加する。次に試料を試験カートリッジ(RAMPカートリッジ、Response Biomedical, Burnaby, Canada)中に添加し、カートリッジをRAMP Fluorescence Reader (Response Biomedical)中に挿入する。
【００９２】
14分後に、RAMP蛍光リーダーを使用して、カートリッジをスキャンする。蛍光測定値は、UL(第1の試料捕捉ゾーン)、TL(第2の試料捕捉ゾーン)、ISL(対照捕捉ゾーン)、およびこれらの各ゾーンに対するバックグラウンドの位置において測定する。UL、TL、およびISLのシグナルを、対応するバックグラウンドシグナルを差し引くことで補正する。FluAおよびFluBのアッセイに関する比率の計算をリーダーによって以下のように実施する。
FluAの比率=dR10=TL/(TL+UL+ISL)
FluBの比率=dUR10=UL/(TL+UL+ISL)
【００９３】
dR10比率およびdUR10比率を、各値に関して事前に決定された閾値レベルと比較する。比率の値が閾値レベルと等しいか、または閾値レベルより大きければ、結果は正である。比率の値が閾値レベルに満たなければ、結果は負である。
【００９４】
あるいは、計算された比率を、事前に作成された標準曲線と比較することが可能であり、かつ値を、試料の濃度を測定するために量的結果に変換することができる。
【００９５】
本発明は、本発明の好ましい態様に関して特に説明および記述したが、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく形状および内容に様々な変更が加えられることは、当業者により理解される。
【国際調査報告】
2010512539.tif 000002
2010512539.tif 000003
2010512539.tif 000004