(57)【要約】  対象者の生体試料中の一以上のバイオマーカーの量を判定することによって該対象者の上部消化器（ＧＩ）がんを診断する方法が提供される。また、ある期間にわたって提供された一連の生体試料の各々の中の少なくとも一つのバイオマーカーの量の測定可能な変化を判定することによって、対象者の上部ＧＩがんの予防処置または処置を開始するかあるいは継続するか否かを判定する方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者の上部消化器がんを診断するための方法において、
（ａ）対象者から生体試料を提供すること、
（ｂ）試料中の、ＨＥ４，ＬＧＡＬＳ３、ＩＬ１ＲＮ、ＴＲＩＰ１３、ＦＩＧＮＬ１、ＣＲＩＰ１、Ｓ１００Ａ４、ＥＸＯＳＣ８、ＥＸＰＩ、ＢＲＲＮ１、ＮＥＬＦ、ＥＲＥＧ、ＴＭＥＭ４０、およびＴＭＥＭ１０９からなるグループから選ばれる少なくとも一つのバイオマーカーの量を判定すること、および
（ｃ）試料中の少なくとも一つのバイオマーカーの量が存在する場合には、試料中の少なくとも一つのバイオマーカーの量を少なくとも一つのバイオマーカーの対照基準値と対比することを包含し、
対照基準値と比較して、試料中の少なくとも一つのバイオマーカーの量に測定可能な差異がある場合には、対象者が上部消化器がんを有するものと診断する、上部消化器がんの診断方法。
【請求項２】
上部消化器がんは、胃がん、すい臓がん、および食道がんからなるグループから選ばれるがんである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体試料は、血液、血清、血漿、胃分泌物、上部消化器生検試料、上部消化器生検試料からの顕微切開した細胞、上部消化器内腔内に落ち込んだ上部消化器細胞、および、便から回収された上部消化器細胞よりなる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも一つのバイオマーカーはＨＥ４である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに、試料中のＴＦＦ２バイオマーカーの量を判定することからなる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一つのバイオマーカーの量を判定することは、
（ａ）ＲＮＡ測定法を用いて、生体試料中の少なくとも一つのバイオマーカーのｍＲＮＡの量を判定すること、および、
（ｂ）タンパク質測定法を用いて、生体試料中の少なくとも一つのバイオマーカーのポリペプチドの量を判定すること、
から選んだ一つ又はそれ以上の技術よりなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＲＮＡ測定法は、ＲＮＡハイブリッド形成用プローブ・アレーまたは定量的ポリメラーゼ連鎖反応測定法よりなる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質測定法は、質量分析法（ＭＳ）または免疫検定分析法、あるいはその両方よりなる請求項６に記載の方法。
【請求項９】
免疫検定分析法は、少なくとも一つのバイオマーカーを選択的に結合する一以上の抗体よりなる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、少なくとも一つのバイオマーカーの判定された量にもとづいて、上部消化器がんのための処置を選択するかまたは処置を変更することからなる請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
対象者の上部消化器（ＧＩ）がんの予防処置または処置を開始または継続することを判定する方法において、
（ａ）対象者からある期間にわたって一連の生体試料を提供すること、
（ｂ）一連の生体試料を分析して、該試料の各々の中の、ＨＥ４，ＬＧＡＬＳ３、ＩＬ１ＲＮ、ＴＲＩＰ１３、ＦＩＧＮＬ１、ＣＲＩＰ１、Ｓ１００Ａ４、ＥＸＯＳＣ８、ＥＸＰＩ、ＢＲＲＮ１、ＮＥＬＦ、ＥＲＥＧ、ＴＭＥＭ４０、およびＴＭＥＭ１０９からなるグループから選ばれる少なくとも一つのバイオマーカーの量を判定すること、および
（ｃ）生体試料の各々の中の少なくとも一つバイオマーカーの量に何らかの測定可能な変化があるか否かを判定し、それによって、上部消化器（ＧＩ）がんの予防処置または処置を開始または継続すべきか否かを判定すること、
からなる、上部消化器がんの予防又は処置を開始又は続行するかの判定方法。
【請求項１２】
上部消化器がんは、胃がん、すい臓がん、および食道がんからなるグループから選ばれるがんである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
生体試料は、血液、血清、血漿、胃分泌物、上部消化器生検試料、上部消化器生検試料からの顕微切開した細胞、上部消化器内腔内に落ち込んだ上部消化器細胞、および、便から回収された上部消化器細胞からなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも一つのバイオマーカーはＨＥ４である請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、一連の生体試料を分析して試料の各々中のＴＦＦ２バイオマーカーの量を判定することからなる方法請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
一連の生体試料は、上部消化器がんのための予防処置または処置の開始に先立って回収された第一の生体試料及び該予防処置または処置の開始後に回収された第二の生体試料からなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
一連の生体試料を分析して該試料の各々の中の少なくとも一つのバイオマーカーの量を判定することは、
（ａ）ＲＮＡ測定法を用いて、生体試料の各々の中の少なくとも一つのバイオマーカーのｍＲＮＡの量を判定すること、および、
（ｂ）タンパク質測定法を用いて、生体試料の各々の中の少なくとも一つのバイオマーカーのポリペプチドの量を判定すること、
から選んだ一つ又はそれ以上の技術からなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
ＲＮＡ測定法は、ＲＮＡハイブリッド形成用プローブ・アレーまたは定量的ポリメラーゼ連鎖反応測定法からなる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質測定法は、質量分析法（ＭＳ）または免疫検定分析法、あるいはその両方からなる請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
免疫検定分析法は、少なくとも一つのバイオマーカーを選択的に結合する一以上の抗体からなる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
対象者の上部消化器（ＧＩ）がんを診断するためのキットであって、ＨＥ４，ＬＧＡＬＳ３、ＩＬ１ＲＮ、ＴＲＩＰ１３、ＦＩＧＮＬ１、ＣＲＩＰ１、Ｓ１００Ａ４、ＥＸＯＳＣ８、ＥＸＰＩ、ＢＲＲＮ１、ＮＥＬＦ、ＥＲＥＧ、ＴＭＥＭ４０、およびＴＭＥＭ１０９から選ばれた一以上のバイオマーカーの各々を選択的に結合するためのプローブを包含してなる診断用キット。
【請求項２２】
プローブは、基質に結合されている請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
プローブは標識化され、プローブと一以上のバイオマーカーとの結合を検出することができる請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
プローブは、ＲＮＡハイブリッド形成プローブである請求項２１に記載のキット。
【請求項２５】
プローブは、抗体である請求項２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先日及び関連出願の相互参照
本願は、２００６年９月６日に出願した米国仮特許出願第６０／８２４，６７８号の出願日について優先権を主張し、この米国仮特許出願の内容は全て本願明細書に参照文献として組込まれる。
【０００２】
政府の権利
本発明は、国立がん研究所の優れた研究のための特別プログラム（ＮＣＩ  ＳＰＯＲＥ）の一環として国立健康研究所（ＮＩＨ）から付与された助成金第Ｐ５０ＣＡ９５１０３号によって米国政府の支援を受けて行われたものである。したがって、米国政府は、ここに開示された発明に一定の権利を有するものである。
【０００３】
本発明は、対象者のがんの危険または存在を調べるスクリーニング法に関する。とくに、本発明は、対象者の上部消化器がんの危険または存在を調べるスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００４】
上部消化器（ＧＩ）がんは、胃がん、食道がん、すい臓がんを含めて、世界的にみても顕著な悪性疾病および死亡の原因となっている。実際、胃がんは、世界的にみてがん関連の死亡の主要な原因の一つであり、アジアでは、がん関連の死亡の最大の原因である。
【０００５】
胃の発がんに至る道筋は、胃系統に世界的な変化が生じており、その影響を受けている。過去１５年間の研究により、ヒトの胃がんの主要な原因は、バクテリアの特殊な亜綱に属するヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）の慢性感染によるものであることが示されている。Ｂｌａｓｅｒ，Ｍ、およびＰａｒｓｏｎｎｅｔ，Ｊによる、「胃のホメオスターシスおよび新生組織形成の変容につながるバクテリア、ヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｒｏｌｉ）の寄生」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：４−８、（１９９４）；及びＰａｒｓｏｎｎｅｔ，Ｊ、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，ＧＤ、Ｖａｎｄｅｒｓｔｅｅｎ，ＤＰ、Ｃｈａｎｇ，Ｙ、Ｖｏｇｅｌｍａｎ，ＪＨ、Ｏｒｅｎｔｒｅｉｃｈ，Ｎ および Ｓｉｂｌｅｙ，ＲＫによる「ヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）の感染と胃がんの危険性」、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２５：１１２７−３１（１９９１）を参照のこと。これらの所見によって、世界保健機構（ＷＨＯ）は、ヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）をクラス１のがん原性菌と指定するに至った。
【０００６】
ヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の慢性感染のもとで胃がんが拡がることに関与する二つの要因として、（１）感染が、胃の粘膜全体にわたって顕著な炎症反応を誘発すること、および、（２）慢性感染が、胃底腺系統、とくに酸分泌壁細胞およびペプシン分泌主細胞の欠損につながることが挙げられる。限局的であれ、大域的であれ、酸分泌領域の萎縮すなわち壁細胞の欠損が、胃がんの発生の前提条件であると思われる。Ｅｌ−Ｚｉｍａｉｔｙ，ＨＭＴ、Ｏｔａ，Ｈ、Ｇｒａｈａｍ，ＤＹ、Ａｋａｍａｔｓｕ，Ｔ および Ｋａｔｓｕｙａｍａ，Ｔ、「腸型の胃がんにおける胃萎縮のパターン（Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｙｐｅ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｉｎｏｍａ）」、Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１４２８−３６（２００２）参照。
【０００７】
壁細胞の欠損は、胃粘膜内部に腫瘍性形質転換を起こしやすい化生細胞系統の出現を招く。対象者は、酸分泌領域の萎縮に続いて、さまざまなレベルの胃腺窩上皮の過形成を示す場合がある。このような表面細胞の数の増加は、低酸症に続いて起こるガストリン放出の増加に対する反応応答と思われる。酸分泌領域の萎縮は、また、粘液細胞の化生を招く。過去十年の研究によって、粘液細胞の化生の前歴と、食道、すい臓、および胃における上部消化器がんの発生との関連がますます強調されるようになっている。
【０００８】
食道がんの発生は、バレット(Barrett)の上皮化生と密接に関連しており、すい臓腺がんは、離散的な粘液細胞の化生から生じる。Ｂｉａｎｋｉｎ，ＡＶ、Ｋｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．、Ｄｉｊｋｍａｎ，Ｆ．Ｐ．、Ｂｉａｋｉｎ，Ｓ．Ａ．および Ｈｅｎｓｈａｌｌ，Ｓ．Ｍ．による、「すい管腺がんの前駆的外傷の分子レベルでの病因（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｅｃｕｓｏｒ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ．）」、 Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３５：１４−２４（２００３）および Ｃａｍｅｒｏｎ，Ａ．Ｊ．、Ｌｏｍｂｏｙ，Ｃ．Ｔ． Ｐｅｒａ，Ｍ  Ｃａｒｐｅｎｔａｒ，Ｈ．Ａ．による、「食道-胃接合部の腺がんおよびバレットの食道（Ａｄｅｎｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｓｏｐｈａｇｏｇａｓｔｒｉｃ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ‘ｓ  ｅｓｏｐｈａｇａｕｓ）」、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０９：１５４１−１５４６（１９９５）。
【０００９】
細胞萎縮および炎症とがんの関連性は今日では受け容れられているが、萎縮から新生組織形成への進行を仲介する介在的な細胞内の諸現象は、まだ完全には明らかになっていない。また、上部消化器系がんとヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の慢性感染および酸分泌領域の萎縮との関連性は受け容れられているが、離散的化成とがんとの間の関連性はそれほど明らかではない。これらの詳細は、今後の研究によって明らかにされることとなろう。
【００１０】
上部消化器がんに関連する死亡率および罹病率についていえば、これらはいずれもスクリーニング（予検）による初期診断によって低下してきている。現在では、内視鏡による上部消化器系の厳密な監視が最も効果的なスクリーニング法であると考えられているが、これは、侵襲的であり、不快感を伴い、また時間と費用のかかる方法である。したがって、当該技術分野において、現在利用できるスクリーニング法に関連する諸欠点を克服できるような、対象者の上部消化器がんの危険性を識別する効果的なスクリーニング法の必要性は依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第 2003/0108965号
【特許文献２】米国特許第 4,683,195 号
【特許文献３】米国特許第 5,480,792 号
【特許文献４】米国特許第 5,525,524 号
【特許文献５】米国特許第 5,631,171 号
【特許文献６】米国特許第 5,679,526 号
【特許文献７】米国特許第 5,824,799 号
【特許文献８】米国特許第 5,851,776 号
【特許文献９】米国特許第 5,885,527 号
【特許文献１０】米国特許第 5,922,615 号
【特許文献１１】米国特許第 5,939,272 号
【特許文献１２】米国特許第 5,947,124 号
【特許文献１３】米国特許第 5,955,377 号
【特許文献１４】米国特許第 5,985,579 号
【特許文献１５】米国特許第 6,019,944 号
【特許文献１６】米国特許第 6,113,855 号
【特許文献１７】米国特許第 6,143,576 号
【特許文献１８】米国特許第 6,890,763 号
【特許文献１９】米国特許第 6,925,389 号
【特許文献２０】米国特許第 6,989,100 号
【００１２】
【非特許文献１】Aitola M, Sadek CM, Gustafsson JA, Pelto-Huikko M. Aint/Tacc3 is highly expressed in proliferating mouse tissues during development, spermatogenesis, and oogenesis. J Histochem Cytochem 2003;51:455-69.
【非特許文献２】Beauchamp RD, Barnard JA, McCutchen CM, Cherner JA, Coffey RJ, Jr. Localization of transforming growth factor alpha and its receptor in gastric mucosal cells. J.Clin.Invest. 1989;84:1017-1023.
【非特許文献３】Biankin, A.V., Kench, J.G., Dijkman, F.P., Biankin, S.A., and Henshall, S.M.  Molecular pathogenesis of precursor lesions of pancreatic ductal adenocarcinoma. Pathology 2003;35:14-24.
【非特許文献４】Bingle L, Singleton V, Bingle CD. The putative ovarian tumour marker gene HE4 (WFDC2), is expressed in normal tissues and undergoes complex alternative splicing to yield multiple protein isoforms. Oncogene 2002;21:2768-73.
【非特許文献５】Blaser, M., and Parsonnet, J. Parasitism by the bacterium Helicobacter pylori leads to altered gastric homeostasis and neoplasia. J.Clin.Invest. 1994;94:4-8.
【非特許文献６】Bouchard, D., Morisset, D., Bourbonnais, Y., and Tremblay, G.M. Proteins with whey-acidic-protein motifs and cancer. Lancet Oncol 2006;7:167-174.
【非特許文献７】Braun KA, Breeden LL. Nascent transcription of MCM2-7 is important for nuclear localization of the minichromosome maintenance complex in G1. Mol Biol Cell 2007;18:1447-56.
【非特許文献８】Cameron, A.J., Lomboy, C.T., Pera, M., and Carpenter, H.A. Adenocarcinoma of the esophagogastric junction and Barrett's esophagus. Gastroenterology 1995;109:1541-1546.
【非特許文献９】Correa, P. A human model of gastric carcinogenesis. Cancer Res. 1988;48:3554-3560.
【非特許文献１０】Dhar, D.K., Wang, T.C., Maruyama, R., Udagawa, J., Kubota, H., Fuji, T., Tachibana, M., Ono, T., Otani, H., and Nagasue, N. Expression of cytoplasmic TFF2 is a biomarker of tumor metastasis and negative prognostic factor in gastric cancer. Lab Invest 2003;83:1343-1352.
【非特許文献１１】Dinis-Ribeiro M, da Costa-Pereira A, Lopes C, Barbosa J, Guilherme M, Moreira-Dias L, Lomba-Viana H, Silva R, Abreu N, Lomba-Viana R. Validity of serum pepsinogen I/II ratio for the diagnosis of gastric epithelial dysplasia and intestinal metaplasia during the follow-up of patients at risk for intestinal-type gastric adenocarcinoma.  Neoplasia 2004; 6(5):449-56.
【非特許文献１２】El-Zimaity, HMT, Ota, H, Graham, DY, Akamatsu, T, and Katsuyama, T. Patterns of gastric atrophy in intestinal type gastric carcinoma, Cancer 2002;94: 1428-36.
【非特許文献１３】Filipe, M.I., Munoz, N., Matko, I., Kato, I., Pome-Kim, V., Juersek, A., Teuchmann, S., Benz, M., Prijon, T. Intestinal metaplasia types and the risk of gastric cancer: a cohort study in Slovenia, Int J Cancer. 1994;57: 324-329.
【非特許文献１４】Gait, M.J., ed., Oligonucleotide Synthesis, 1984.
【非特許文献１５】Galgano, M.T., Hampton, G.M., and Frierson, H.F. Comprehensive analysis of HE4 expression in normal and malignant human tissues. Mod Pathol 2006;19:847-853
【非特許文献１６】Glover, ed., DNA Cloning, Volumes I and II, 1985.
【非特許文献１７】Goldenring JR, Ray GS, Coffey RJ, Meunier PC, Haley PJ, Barnes TB, Car BD. Reversible drug-induced oxyntic atrophy in rats. Gastroenterology. 2000;118:1080-1093.
【非特許文献１８】Halldorsdottir, et al.  Spasmolytic polypeptide expressing metaplasia (SPEM) associated with gastric cancer in Iceland. Dig.Dis.Sci. 48:431-441.
【非特許文献１９】Hames & Higgins, eds., Nucleic Acid Hybridization, 1984.
【非特許文献２０】Hames & Higgins, eds., Transcription and Translation, 1984.
【非特許文献２１】Hattori, T. Development of adenocarcinomas in the stomach. Cancer 1986;57:1528-1534.
【非特許文献２２】Hellstrom, I., Raycraft, J., Hayden-Ledbetter, M., Ledbetter, J.A., Schummer, M., McIntosh, M., Drescher, C., Urban, N., and Hellstrom, K.E. The HE4 (WFDC2) protein is a biomarker for ovarian carcinoma. Cancer Res 2003;63:3695-3700.
【非特許文献２３】Houghton J, Stoicov C, Nomura S, Carlson J, Li H, Rogers AB, Fox JG, Goldenring JR, Wang TC. Gastric cancer originating from bone marrow derived cells. Science 2004;In Press.
【非特許文献２４】Karam SM, Leblond CP. Dynamics of epithelial cells in the corpus of the mouse stomach. III. Inward migration of neck cells followed by progressive transformation into zymogenic cells. Anat.Rec. 1993;236:297-313.
【非特許文献２５】Leys CM, Nomura S, Rudzinski E, Kaminishi M, Montgomery E, Washington MK, Goldenring JR. Expression of Pdx-1 in human gastric metaplasia and gastric adenocarcinoma. Hum Pathol 2006;37:1162-8.
【非特許文献２６】Mayer and Walker, eds. Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology, Academic Press, London, 1987
【非特許文献２７】Means AL, Meszoely IM, Suzuki K, Miyamoto Y, Rustgi AK, Coffey RJ, Jr., Wright CV, Stoffers DA, Leach SD. Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates. Development 2005;132:3767-76.
【非特許文献２８】Miller and Calos, eds., Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory, 1987.
【非特許文献２９】Nam KT, Varro A, Coffey RJ, Goldenring JR. Potentiation of oxyntic atrophy-induced gastric metaplasia in amphiregulin-deficient mice. Gastroenterology 2007;132:1804-19.
【非特許文献３０】Nomura S, Baxter S, Yamaguchi T, Leys C, Vartapetian AB, Fox JG, Lee JR, Wang TC, Goldenring JR. Relationship of spasmolytic polypeptide expressing metaplasia (SPEM) to pre-neoplasia in H. felis-infected mice. Gastroenterology 2004;127:582-594.
【非特許文献３１】Nomura, S., Settle, S.H., Leys, C., Means, A.L., Peek, R.M., Jr., Leach, S.D., Wright, C.V.E., Coffey, R.J., and Goldenring, J.R. Evidence for repatterning of the gastric fundic epithelium associated with Menetrier’s disease and TGFa overexpression. Gastroenterology 2005;128:1292-1305.
【非特許文献３２】Nomura, S., Yamaguchi, H., Wang, T.C., Lee, J.R., and Goldenring, J.R. Alterations in gastric mucosal lineages induced by acute oxyntic atrophy in wild type and gastrin deficient mice. Amer.J.Physiol. 2004;288:G362-G375.
【非特許文献３３】Ogawa, M., Nomura, S., Wang, T.C., and Goldenring, J.R. Altered metaplastic response of waved-2 EGF receptor mutant mice to acute oxyntic atrophy. Am J Physiol 2006;290:G793-G804.
【非特許文献３４】Oishi Y, Kiyohara Y, Kubo M, Tanaka K, Tanizaki Y, Ninomiya T, Doi Y, Shikata K, Yonemoto K, Shirota T, Matsumoto T, Iida M. The serum pepsinogen test as a predictor of gastric cancer: the Hisayama study. Am J Epidemiol. 2006;163(7):629-37.
【非特許文献３５】Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, Chang Y, Vogelman JH, Orentreich N, Sibley RK. Helicobacter pylori infection and the risk of gastric cancer. New Eng.J.Med. 1991;325:1127-1131.
【非特許文献３６】Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning; See Methods In Enzymology (1984, Academic Press, Inc., N.Y.).
【非特許文献３７】Pisani P, Bray F, Parkin DM. Estimates of the world-wide prevalence of cancer for 25 sites in the adult population. Int J Cancer 2002;97:72-81.
【非特許文献３８】R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., Culture Of Animal Cells, 1987.
【非特許文献３９】Ramsey VG, Doherty JM, Chen CC, Stappenbeck TS, Konieczny SF, Mills JC. The maturation of mucus-secreting gastric epithelial progenitors into digestive-enzyme secreting zymogenic cells requires Mist1. Development 2007;134:211-22.
【非特許文献４０】Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds. Molecular Cloning A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., ed. by Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chapters 16 and 17.
【非特許文献４１】Schmidt PH, Lee JR, Joshi V, Playford RJ, Poulsom R, Wright NA, Goldenring JR. Identification of a metaplastic cell lineage associated with human gastric adenocarcinoma. Lab.Invest. 1999;79:639-646.
【非特許文献４２】Smith, V.C., Genta, R.M. Role of Helicobacter pylori gastritis in gastric atrophy, intestinal metaplasia, and gastric neoplasia, Microsc Res Tech. 2000;48: 313-20.
【非特許文献４３】Stepan V, Ramamoorthy S, Nitsche H, Zavros Y, Merchant JL, Todisco A. Regulation and function of the sonic hedgehog signal transduction pathway in isolated gastric parietal cells. J Biol Chem 2005;280:15700-8.
【非特許文献４４】Wang TC, Dangler CA, Chen D, Goldenring JR, Koh T, Raychowdhury R, Coffey RJ, Ito S, Varro A, Dockray GJ, Fox JG. Synergistic interaction between hypergastrinemia and Helicobacter infection in a mouse model of gastric cancer. Gastroenterology 2000;118:36-47.
【非特許文献４５】Weir and Blackwell, eds. Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, 1986.
【非特許文献４６】Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155, Academic Press Inc., N.Y.
【非特許文献４７】Yamaguchi, H., Goldenring, J.R., Kaminishi, M., and Lee, J.R. Association of spasmolytic polypeptide expressing metaplasia (SPEM) with carcinogen administration and oxyntic atrophy in rats. Lab. Invest. 2002;82:1045-1052.
【非特許文献４８】Zhang B, Kirov S, Snoddy J. WebGestalt: an integrated system for exploring gene sets in various biological contexts. Nucleic Acids Res 2005;33:W741-8.
【非特許文献４９】Zhu L, Shi G, Schmidt CM, Hruban RH, Konieczny SF. Acinar cells contribute to the molecular heterogeneity of pancreatic intraepithelial neoplasia. Am J Pathol 2007;171:263-73.
【発明の概要】
【００１３】
ここでは、本発明のいくつかの実施形態を列挙すると同時に、多くの場合、それらの実施形態の変形例および置換例を列挙する。ただし、ここでは、多数で多様な実施形態の中の数例を挙げるにとどめる。ある実施形態について、一以上の代表的な特徴として述べられるものも、同じく例として挙げられるに過ぎない。その実施形態は、通常、ここに述べられる一以上の特徴を備えていてもあるいは備えていなくても存在し得るものである。同様に、それらの特徴は、ここに挙げられているいないにかかわらず、本発明の他の実施形態にも適用し得るものである。不要な重複を避けるため、ここでは、それら諸特徴のすべての可能な組み合わせを列挙することも暗示することもしない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、上に挙げた諸問題を解決するためのものである。いくつかの実施形態にあっては、対象者の生体試料の中の一以上のバイオマーカーの量を判定することによって対象者の上部消化器（ＧＩ）がんを診断する方法が提供される。本発明のいくつかの実施形態にあっては、さらに、ある期間にわたって提供された一連の生体試料の各々における少なくとも一つのバイオマーカーの量の測定可能な変化を判定することによって、対象者の上部消化器がんの予防処置または処置を開始あるいは継続するか否かを決定する方法が提供される。
【００１５】
上記の一以上のバイオマーカーは、以下のバイオマーカーを含むものとすることができるが、それらに限定されるものではない。ＨＥ４（ヒトの副精巣タンパク質４、ＷＦＤＣ２），ＬＧＡＬＳ３（レクチン、ガラクトース結合性、可溶性３）、ＩＬ１ＲＮ（インターロイキン１受容体アンタゴニスト）、ＴＲＩＰ１３（甲状腺ホルモン受容体相互作用因子１３）、ＦＩＧＮＬ１（フィドゲチン様：ｆｉｄｇｅｔｉｎ−ｌｉｋｅ１）、ＣＲＩＰ１（システインの豊富な腸のタンパク質１）、Ｓ１００Ａ４（Ｓ１００カルシウム結合性タンパク質Ａ４）、ＥＸＯＳＣ８（エキソソーム構成成分８）、ＥＸＰＩ（細胞外プロティナーゼ阻害物質、ＷＤＮＭ１）、ＢＲＲＮ１（不妊ホモローグ、ドロソフィラ属）、ＮＥＬＦ（鼻胚ＬＨＲＨ因子）、ＥＲＥＧ（エピレグリン）、ＴＭＥＭ４０（膜間タンパク質４０）、およびＴＭＥＭ１０９（膜間タンパク質１０９）。いくつかの実施形態にあっては、これらの方法は、さらに、試料中の一つのＴＦＦ２（トレフォイル因子２）バイオマーカーの量を判定することからなる。
【００１６】
いくつかの実施形態にあっては、生体試料は、血液、血清、血漿、胃分泌物、上部消化器生検試料、上部消化器生検試料から顕微切開した細胞、上部消化器内腔内に投棄された上部消化器細胞、および、便から回収された上部消化器細胞を含むものである。いくつかの実施形態にあっては、対象者は、ヒトである。
いくつかの実施形態にあっては、少なくとも一つのバイオマーカーの量を判定することは、ＲＮＡ測定法およびタンパク質測定法を含む当該技術分野で公知の一以上の手法を用いるものである。ＲＮＡ測定法の例としては、ＲＮＡハイブリッド形成用プローブ・マイクロアレーおよび定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）測定法（例、定量的リアルタイムＰＣＲ）がある。タンパク質測定法の例としては、質量分析法（ＭＳ）および免疫検定分析法がある。
【００１７】
これらの方法は、より侵襲的な処置に代わるものとして用いることができるし、あるいは、対象者にプレスクリーニングを行ってどの対象者に追加の処置を行わなければならないか、すなわち、追加の処置を行わなくともよい対象者と追加の処置を行いおよび／またはより頻繁に処置を行うほうがのぞましい対象者とを区分することに用いることができる。
【００１８】
本発明は、いくつかの実施形態にあっては、さらに、対象者の上部消化器がん診断用のキットを包含するものである。いくつかの実施形態にあっては、これらのキットは、本明細書に開示された一以上のバイオマーカーの各々を選択的に結合するためのプローブからなる。該プローブは基質に結合させ得る。いくつかの実施形態にあっては、これらのプローブは、ＲＮＡハイブリッド形成用プローブとすることができる。これらのＲＮＡハイブリッド形成用プローブは、一以上のバイオマーカーの各々に選択的に結合するポリヌクレオチドからなることができる。他の実施形態にあっては、プローブはバイオマーカーに選択的に結合する抗体である。いくつかの実施形態にあっては、これらのプローブは、標識化して、該プローブの一以上のバイオマーカーとの結合を検出することができるようにされる。例えば、いくつかの実施形態にあっては、あるプローブのあるバイオマーカーとの結合は、酵素結合抗体を用いて検出される。
【００１９】
したがって、本発明の一つの目的は、対象者の上部消化器がんのためのスクリーニング法を提供することである。この目的は、本発明によってそのすべてあるいは一部が達成される。
【００２０】
本発明の一つの目的は、上にすでに述べたとおりであるが、その目的は、本発明によってそのすべてあるいは一部が達成される。本発明の他の目的および効果は、当業者には、以下に示す本発明の説明、図面、および本発明を限定する意味を持たない実施例を検討することによって明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】上部消化器がんのスクリーニングのための典型的方法に含まれる工程を示すフローチャートである。
【００２２】
【図２】酸分泌領域の萎縮につづく鎮攣性ポリペプチド発現性化生（ＳＰＥＭ）の発生の仕組みを示す図である。
【００２３】
【図３】図３Ａ及び３Ｂは、一連の顕微鏡写真を示す図である。図３Ａは、ＤＭＰ−７７７で０、１、３、または７日間処置をしたガストリン・ノックアウト・マウスのＨＥ４の免疫染色を示す一連の顕微鏡写真であり、胃底腺の基部の細胞における成分の発現増加をあらわしている。図３Ｂは、正常な胃底ＳＰＥＭおよび胚細胞性腸上皮化生におけるＨＥ４の免疫染色を示す一連の顕微鏡写真であり、正常なヒトの胃は、ＨＥ４染色を示さないが、ＳＰＥＭおよび腸上皮化生は、ＨＥ４染色を示すことをあらわしている。
【００２４】
【図４】図４Ａ乃至４Ｉは、出現するＳＰＥＭの特徴を示す一連の顕微鏡写真である。図４Ａは、Ｍｉｓｔ１（緑、グレースケール写真で薄く染色）およびＴＦＦ２（赤、グレースケール写真で濃く染色）で二重に免疫染色した未処置のガストリン欠失マウス胃底粘膜を示す。Ｍｉｓｔ１抗体は、胃底腺の基部（写真の下の部分）の成熟主細胞の核を染色し、ＴＦＦ２は、胃底腺の頚部領域（写真の上の部分）の頚部粘液細胞に対して陽性である。識別し得る程度に二重に染色された細胞は、観察できなかった（スケールバー：５０μｍ）。図４Ｂおよび図４Ｃは、ＤＭＰ−７７７で３日間処置したガストリン欠失マウスにおけるＭｉｓｔ１およびＴＦＦ２の発現を示す。Ｍｉｓｔ１免疫反応細胞（緑、グレースケール写真で薄く染色）の数は、腺の底部で減少し、また、多数のＭｉｓｔ１陽性細胞は、ＴＦＦ２（赤、グレースケール写真で濃く染色）との二重免疫反応を示した（スケールバー：４Ｂ：５０μｍ、４Ｃ：１０μｍ）。強い電力を用いて撮影した図４Ｃは、Ｍｉｓｔ１およびＴＦＦ２で二重に標識化した細胞が存在することを示す（矢印）。図４Ｄは、Ｈ／Ｋ−ＡＴＰａｓｅ（青、グレースケール写真で中程度に染色）、ＴＦＦ２（赤、グレースケール写真で濃く染色）、および内因子（緑、グレースケール写真で薄く染色）の抗体で染色した未処置のマウスから得られた粘膜を示す。三つの系統の染色に重複の無いことに注意されたい（スケールバー：２０μｍ）。図４Ｅおよび４Ｆは、Ｈ／Ｋ−ＡＴＰａｓｅ（青、グレースケール写真で中程度に染色）、ＴＦＦ２（赤、グレースケール写真で濃く染色）、および内因子（緑、グレースケール写真で薄く染色）の抗体で染色したＤＭＰ−７７７で３日間処置したマウスから得られた粘膜を示す。壁細胞は、Ｈ／Ｋ−ＡＴＰａｓｅ抗体でのみ染色したのに対して、ＳＰＥＭ細胞は腺の基部で、内因子（緑、グレースケール写真で薄く染色）およびＴＦＦ２（赤、グレースケール写真で濃く染色）の双方で染色した。より強い電力を用いて撮影した図４Ｆは、ＳＰＥＭ細胞に小胞の二つの個別の個体群が存在することを示す（スケールバー：４Ｅ：１０μｍ、４Ｆ：４μｍ）。図４Ｇ、４Ｈ、および４Ｉは、未処置のマウスから得られた主細胞（図４Ｇ）およびＤＭＰ−７７７で３日間処置したマウスから発生したＳＰＥＭ細胞（図４Ｈおよび４Ｉ）を示す。図４Ｇに示す主細胞は、チモーゲンの細粒体を均等に染色することを示す。スケールバー：２μｍ）。図４Ｈおよび４Ｉに示すように、ＤＭＰ−７７７で３日間処置したマウスの胃底腺の基部にあるＳＰＥＭ細胞は、細粒状形態の異種の集合を含んでいる（スケールバー：４Ｇおよび４Ｈ：２μｍ、４Ｉ：１μｍ）。
【００２５】
【図５】ＳＰＥＭの発生中に転写物の定量的ＰＣＲ分析を行って得られた結果を示す一連のグラフである。顕微切開を行った系統中の発現が増加したまたは減少した選ばれた転写物の発現を定量的ＰＣＲで検査し、遺伝子マイクロアレーによる調査結果を確認した。結果は、未処置の主細胞のレベルと比較した発現の倍数変化としてあらわした（ｎ＝３、＋／−平均の標準誤差、ＳＥ）。マン−ホィットニーのＵ検定による＊ｐ＜０．０５。
【００２６】
【図６】図６Ａ乃至６Ｅは、顕微鏡写真であり、図６Ｆは、急性の酸分泌領域萎縮中のＭＣＭ３発現の結果を示すグラフである。未処置マウス（図６Ａ）またはＤＭＰ−７７７で１日（図６Ｂ），３日（図６Ｃ）、７日（図６Ｄ）または１４日（図６Ｅ）処置したマウスから得た切片をＭＣＭ３に対する抗体（緑、グレースケール写真で薄く染色）およびＫｉ−６７（赤、グレースケール写真で濃く染色）に対する抗体で二重に染色した。処置用ＤＭＰ−７７７の量が増加するにしたがって、腺の基部での細胞のＭＣＭ３の染色も増加することが観察された。図６Ｆに示すように、ＭＣＭ３およびＫｉ−６７の染色の定量化の結果、処置３−１４日でＭＣＭ３の染色が有意に増加したことが示された（緑の線、グレースケールの図には明るいグレーの線として示す、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。Ｋｉ−６７の染色（赤い線、グレースケールの図には黒線として示す）は、わずかな増加を示す。これは、７日の処置でのみ有意である（＊＜０．０５）。
【００２７】
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、未処置のマウスのＭＣＭ３陽性細胞が主細胞であることを示す顕微鏡写真である。未処置のマウスから得た切片は、ＭＣＭ３に対する抗体（赤、グレースケール写真で濃く染色、矢印で示す）、内因子に対する抗体（緑、グレースケール写真で薄く染色）、およびＤＡＰＩ（青、グレースケール写真で中程度に染色）で染色した。図７Ａの胃底腺の基部にある細胞の画像は、ＤＡＰＩとの二重のＭＣＭ３の染色を示す。図７Ｂは、三重に重ねた画像である。胃底腺の基部にあるＭＣＭ３陽性細胞は、内因子でも染色し（矢印）、主細胞として同定されることを示している（スケールバー：１０μｍ）。
【００２８】
【図８】図８Ａ乃至８Ｃは、未処置のおよびＤＭＰ−７７７で処置したガストリン欠失マウスのＴＡＣＣ３での免疫組織染色を示す顕微鏡写真である。未処置のガストリン欠失マウス（図８Ａ）およびＤＭＰ−７７７で１日（図８Ｂ）または３日（図８Ｃ）処置したマウスから得た胃底粘膜の切片をＴＦＦ２およびＴＡＣＣ３で二重に染色した。右側の端の部分に、色が二重の重なり合った画像を示す（合併の部分）。ＤＭＰ−７７７でのわずか１日の処置で、胃腺基部での細胞のＴＡＣＣ３の発現が明らになり、それに続くＤＭＰ−７７７での３日の処置で、これらの細胞のＴＡＣＣ３の発現が増加した。
【００２９】
【図９】図９Ａ乃至９Ｉは、ＳＰＥＭおよび胚(goblet)細胞性腸上皮化生におけるＨＥ４の発現増加(up-regulation)を示す顕微鏡写真である。マウス（図９Ａ−図９Ｃ）およびヒト（図９Ｄ−図９Ｉ）の胃の上皮化生におけるＨＥ４の発現を検査した。図９Ａに示すように、未処置のガストリン欠失マウスの正常な胃粘膜では、ＨＥ４の免疫反応性は、ほとんど検出できない。図９Ｂに示すように、ＤＭＰ−７７７で処置したガストリン欠失マウスのＳＰＥＭではＨＥ４での顕著な染色が認められる。図９Ｃに示すように、ヘリコバクター・フェリス菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｌｉｓ）に９ヶ月感染したＣ５７ＢＬ／６のマウスの粘膜のＳＰＥＭでは、ＨＥ４での強い染色が観察された。図９Ｄに示すように、正常なヒトの胃底粘膜ではＨＥ４での染色は、認められない。図９ＡＥに示すように、ヒトのＳＰＥＭはＨＥ４で強く染色された。図９Ｆに示すように、ＳＰＥＭおよび腺細胞性腸上皮化生では、ともに化生への遷移領域においてＨＥ４で染色する。図９Ｇおよび９Ｈに示すように、ＳＰＥＭおよび腸上皮化生をともに含む切片では、両化生においてＨＥ４の免疫反応性が存在した。図９Ｉに示すように、腸上皮化生は、ＨＥ４に対して強い陽性を示した。
【００３０】
【図１０】図１０Ａ乃至１０Ｌは、ヒトの胃腺がんにおけるＨＥ４に対する免疫染色を示す顕微鏡写真である。ＨＥ４抗体は、アルカリ性フォスファターゼ共役二次抗体およびベクター・レッド色素原による免疫組織検出で胃腺がんの切片を染色するために用いられた。図１０Ａ乃至１０Ｄは、高分化ないしは中分化胃がんの顕微鏡写真である。腸型胃腺がんにおけるＨＥ４の顕著な発現に注目されたい。図１０Ｅ乃至１０Ｇは、低分化胃がんの顕微鏡写真である。低分化あるいはびまん性がんの大部分は、免疫反応性を示さなかったが、腫瘍の中のわずかなものは、陽性を示した。図１０Ｈ乃至１０Ｉは、印環細胞型胃腺がんの顕微鏡写真である。印環腺がんにおいて、ＨＥ４陽性が最も強く認められた。
【００３１】
【図１１】病変したヒトのすい臓および正常なヒトのすい臓におけるＨＥ４に対する免疫染色を示す一連の顕微鏡写真である。正常なヒトのすい臓の切片（左上）、発がん前のＰＡＮＩＮ病変のあるヒトのすい臓切片（右上）、高分化すい臓腺がんのあるヒトのすい臓切片（左下）または低分化すい臓腺がんのあるヒトのすい臓切片（右下）をＨＥ４に対する抗体で染色した。
【配列表の簡単な説明】
【００３２】
配列番号：  １および２は、それぞれ、ＧＡＰＤＨに固有のＰＣＲセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーである。
配列番号：  ３および４は、それぞれ、ＭＣＭ３に固有のＰＣＲセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーである。
配列番号：  ５および６は、それぞれ、ＭＣＭ５に固有のＰＣＲセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーである。
配列番号：  ７および８は、それぞれ、ＭＣＭ７に固有のＰＣＲセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーである。
配列番号：  ９および１０は、それぞれ、ＳＴ３ＧＡＬ６に固有のＰＣＲセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーである。
配列番号：  １１および１２、それぞれ、ＡＴＦ３に固有のＰＣＲセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーである。
配列番号：  １３および１４は、それぞれ、ＨＥ４に固有のＰＣＲセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーである。
配列番号：  １５および１６は、それぞれ、ＩＬ１ＲＮに固有のＰＣＲセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーである。
配列番号：  １７および１８、それぞれ、ＴＦＦ２に固有のＰＣＲセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明の一以上の実施形態を詳細に説明する。本発明の他の特徴、目的、および効果は、明細書、図面、および請求の範囲から明らかとなろう。本明細書で述べられたすべての出版物、特許出願、および他の参考文献は、それらに言及することによってその全部が本明細書に組み込まれたものとなる。ここに開示されるポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の中のあるものは、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）または他の公共のデータベースの登録番号と相互参照されたものである。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）または他の公共のデータベースと相互参照された配列は、それらに言及することによってＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）または他の公共のデータベースに存在する同等の関連ある配列として明白に本明細書に組み込まれたものとなる。また、ここに開示される配列に関連するＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）に存在するすべての注釈は、それらに言及することによって明白に本明細書に組み込まれたものとなる。さらに、Goldenring等による米国特許第６，７７３，８９０号、第６，３７２，４３９号、および第６，１０７，０４８号も、ここにそれらに言及することによって本明細書に組み込まれたものとなる。紛争が生じた場合には、本明細書が、諸定義を含めて、支配力をもつ。
【００３４】
他にとくに定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野で当業者が普通に理解しているものと同じ意味をもつ。本発明の実施または試験には、本明細書に述べられているものと類似のあるいは同等のあらゆる方法、装置、および材料を用いることができるが、以下、代表的な方法、装置、および材料について説明する。
【００３５】
特許法の長年の慣行にしたがって、「一つの（ａ）、（ａｎ）」、および「該（ｔｈｅ）」は、請求の範囲を含めて本出願に用いられる場合、「一以上の」を指す。したがって、例えば、「一つの細胞」と述べた場合、それは、複数の同様な細胞を包含する。
【００３６】
他にとくに示されない限り、本明細書および請求の範囲で用いられる成分の量、反応条件、その他をあらわすすべての数字は、すべての場合、「約」という用語で修飾されていると理解されるべきである。したがって、それに反するように示されていない限り、本明細書および添付の請求の範囲に述べられている数字は、近似的な数字であり、本発明によって得ることが求められているのぞましい性質に応じて変わり得るものである。
【００３７】
本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、ある値、あるいは質量、重量、時間、容積、濃度、あるいはパーセントを指す場合、開示された方法を実行するために適当であれば、実施形態に応じて、ある場合には±２０％、ある場合には±１０％、ある場合には±５％、ある場合には±１％、ある場合には±０．５％、またある場合には±０．１％の指定された量からの変動を含むことを意味する。
【００３８】
上部消化器(Upper gastrointestimal)（ＧＩ）がんは、いぜんとして世界中でがんが関係する死亡の主要な原因の一つである。発がんの原因の個別のメカニズムは、いぜんはっきりしないが、これらのがんの病因として不変に存在するメカニズムの一つは、関係する細胞の連続する系統変化である。例えば、胃がんは、一部は、胃底粘膜からの酸分泌壁細胞の欠損、すなわち酸分泌領域の萎縮によって発生する。壁細胞の欠損は胃粘膜の細胞の変容と化生(metaplastic)粘液細胞系統の出現を招く。ヒトにおける酸分泌領域の萎縮および胃がんの発生は、正常から化生への連続する系統変化を介して新生物質と強く関連している（Ｐａｒｓｏｎｎｅｔ  Ｊ、Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＧＤ、Ｖａｎｄｅｒｓｔｅｅｎ  ＤＰ、Ｃｈａｎｇ  Ｙ、Ｖｏｇｅｌｍａｎ  ＪＨ、Ｏｒｅｎｔｒｅｉｃｈ  Ｎ、Ｓｉｂｌｅｙ  ＲＫヘリコバクターピロリ菌の感染および胃がんの危険性（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｇａｓｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９１；３２５：１１２７−１１３１）。細胞系統の変容とともに、細胞タンパク質のバイオマーカーの発現にも変化が起こる。
【００３９】
本明細書で用いられる用語としての「上部消化器がん」は、動物対象者の上部消化管に認められる新生細胞あるいは悪性腫瘍を指し、上部消化管は、動物の口、咽頭、食道、および胃（一または複数）ならびに、すい臓および胆嚢を含めて関連する器官を含む。上部消化器がんの例としては、胃がん、すい臓がん、および食道がんがあるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
本発明は、上部消化器がんの診断のために対象者で測定することのできる上部消化器がん用バイオマーカーの同定を行うものである。例えば、実施例に詳細が開示されているように、マウスにおいては、ＷＡＰドメインのタンパク質ＨＥ４は、正常な胃では発現しないが、マウスから得られた鎮攣性ポリペプチ／ＴＦＦ２−発現化生（ＳＰＥＭ）ならびにヒトのＳＰＥＭおよび腸の化生では強く発現する。本明細書で開示されように、ＨＥ４は、調査した腸型および印環細胞型胃腺がんの大多数で発現した（実施例を参照のこと）。本明細書に開示される結果は、ＳＰＥＭが、主細胞の分化転換から発生することを示している。さらに、この化生への遷移は、前がんの発生過程に関連する他の重要な分泌型バイオマーカーの発現に関連しており、これは、本明細書に開示され、本発明の診断方法の一部として利用することができる。
【００４１】
したがって、本発明は、いくつかの実施形態にあっては、対象者から提供された生体試料中のがんに関連する一以上のバイオマーカーの量を判定することによって対象者の上部消化器がんを診断するための方法を提供するものである。本明細書に開示される診断方法で用いることのできる上部消化器がんに関連するバイオマーカーの典型例としては、ＨＥ４（ヒトの副精巣タンパク質４、ＷＦＤＣ２とも呼ばれる），ＬＧＡＬＳ３（レクチン、ガラクトース結合性、可溶性３）、ＩＬ１ＲＮ（インターロイキン１受容体アンタゴニスト）、ＴＲＩＰ１３（甲状腺ホルモン受容体相互作用因子１３）、ＦＩＧＮＬ１（フィドゲチン様１）、ＣＲＩＰ１（システインの豊富な腸のタンパク質１）、Ｓ１００Ａ４（Ｓ１００カルシウム結合性タンパク質Ａ４）、ＥＸＯＳＣ８（エキソソーム構成成分８）、ＥＸＰＩ（細胞外プロティナーゼ阻害物質、ＷＤＮＭ１とも呼ばれる）、ＢＲＲＮ１（不妊ホモローグ１、ＮＣＡＰＨとも呼ばれる）、ＮＥＬＦ（鼻胚ＬＨＲＨ因子）、ＥＲＥＧ（エピレグリン）、ＴＭＥＭ４０（膜間タンパク質４０）、およびＴＭＥＭ１０９（膜間タンパク質１０９）があるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態にあっては、上に開示された一以上のバイオマーカーに加えて、消化管およびそれに関連する器官のがんに関連するバイオマーカーのトレフォイル因子２（ＴＦＦ２）を生体試料中でスクリーニングしてＴＦＦ２の量を測定することができる。
【００４２】
表１は、上部消化器がんに関連するヒトのバイオマーカーの典型例（ただし、マウスのバイオマーカーの開示であるＥＸＰＩを除く）をさらに挙げたものであり、また、遺伝子座およびバイオマーカー・ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの登録ＩＤ番号を示している。ただし、これらのヒトのバイオマーカーの典型例は、ヒトのバイオマーカーあるいは単にｍＲＮＡバイオマーカーに対して本発明を限定することを意図するものではない。本発明は、むしろ、上部消化器がんに関連するさまざまな動物の種にまたがるバイオマーカーを包含するものである。また、標準の遺伝子／タンパク質命名法の各種ガイドラインは、通常、ヒトの遺伝子名の省略形を大文字でまたイタリックで記し、またタンパク質名の省略形は、大文字で記すがイタリックでは記さないと規定している。さらに、標準の遺伝子／タンパク質命名法の各種ガイドラインは、通常、マウス、ラット、およびチキンの遺伝子名の省略形は、イタリックで記しまた最初の文字のみを大文字で記し、またタンパク質名の省略形は、大文字で記すがイタリックでは記さないと規定している。これに対して、本明細書で用いられる遺伝子／タンパク質命名法は、特定のバイオマーカーを引用する場合、バイオマーカーの省略形にはすべて大文字を用い、さまざまな動物の種にまたがる遺伝子（ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡを含む）およびタンパク質を含むことを意図している。
【００４３】
「バイオマーカー」とは、対象者の生物的な状態の指標として有用な分子である。本発明に関しては、本明細書に開示されているバイオマーカーは、対象者の上部消化器がんの発生、存在、または進行の危険と相関性のあり得る発現の変化または状態を示すポリペプチドの場合もあり得る。さらに、本明細書に開示されているバイオマーカーは、バイオマーカー・ポリペプチドをコード化するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。これは、あるｍＲＮＡの発現の変化を測定することが、そのｍＲＮＡによってコード化されたポリペプチドの発現の変化と相関している場合があり得るためである。したがって、ある生体試料中のあるバイオマーカーの量を測定することは、あるポリペプチド・バイオマーカーの量を測定するかおよび／またはあるｍＲＮＡの量を直接または間接に測定する（例、そのｍＲＮＡから合成された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を測定する）ことによってそのポリペプチド・バイオマーカーをコード化するｍＲＮＡの量を測定することを包含するものとなる。
【表１】
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【００４４】
「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」という用語は、本明細書では、互換性のある用語として用いられており、大きさあるいは機能にかかわらず、修飾アミノ酸（例、リン酸化、グリコシル化、など）を含めて２０のタンパク質アミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」は、比較的大きなポリペプチドを指して用いられることが多く、また「ペプチド」は、小さなポリペプチドを指して用いられることが多いが、当該技術分野におけるこれらの用語の使われ方は、重なり合いまた多様である。「ペプチド」という用語は、本明細書では、他にとくに注記のない限り、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、およびタンパク質断片を指す。本明細書では、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、遺伝子産物およびその断片を指す場合、互換性のある用語として用いられる。したがって、ポリペプチドの典型例としては、遺伝子産物、自然に発生するタンパク質、ホモローグ、オルトローグ、パラローグ、それらの他の同等物、変異型、および断片がある。
【００４５】
本明細書で、「ポリペプチド断片」あるいは「断片」という用語がポリペプチドに関連して用いられる場合、完全長ポリペプチド自身と比較してアミノ酸残基が存在しないが、残るアミノ酸の配列が、通常、基準となるポリペプチド内での対応する位置と同じであるようなポリペプチドを指す。このような欠失は、基準ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端あるいはその両方で起こり得る。
【００４６】
一つの断片は、基準ポリペプチドの一以上の生物活性を保持することができる。いくつかの実施形態にあっては、一つの断片は、一つのドメインすなわち特長を有するものとすることができ、またオプションとして、特長であるドメインの片側または両側に追加的なアミノ酸を有するものとすることができる。これらの追加的なアミノ酸の残基は、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０あるいは１００までさらにはそれ以上の残基に達するものとすることができる。さらに、断片は、特定の領域の細断片(sub-fragment)を含むものとすることができ、この細断片は、それが生じた領域の機能を保持するものである。本明細書で「ペプチド」という用語が用いられる場合、それは、完全長ペプチドならびにペプチドの断片を包含すると意図される。したがって、あるペプチドの同定された断片（例えば、質量分析法または免疫検定法によって）は、断片ならびに完全長ペプチドを含むものとする。したがって、ある試料の中のバイオマーカーの量を測定することは、完全長バイオマーカーポリペプチド、修飾された変異型、および／またはそれらの断片の量を判定することを含むものである。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態にあっては、対象者の上部消化器がんを診断する方法が提供される。本明細書で用いられる「診断する」および「診断」という用語は、熟練した技術者がそれによってある対象者が疾病または状態に罹患しているか否かを評価しさらには判定することのできる方法を意味する。熟練した技術者は、（例えば存在または不存在を含めて）その量が状態の存在、その重度、あるいは不存在を示すバイオマーカーなどの一以上の診断指標にもとづいて診断を行うことが多い。
【００４８】
診断とともに、臨床がんの予後（治療後の経過の予測）は、大きな関心領域である。最も効果的な治療法を立案するためには、がん細胞の活動性や腫瘍の再発の可能性を知ることが重要である。より正確な予後さらにはがん発生の潜在的危険性のアセスメントを行うことができれば、対象者のために適当な治療法さらにある場合にはより穏やかな治療法を選択することができる。すぐれた予後をあたえられた対象者および／または治療を必要としないあるいは限られた治療のみが必要ながん発生の危険性の低い対象者を、より集中的な処置を行うことが好ましくよりがんの発生する可能性の高いあるいはがんの再発のおそれのある対象者から区分けするためには、がんのバイオマーカーの測定が有用である。
【００４９】
したがって、本明細書で用いられる「診断を行う」あるいは「診断する」という表現は、さらに、がんの発生の危険性を判定するあるいは予後を決定することを含むものであり、それによって、本明細書で開示される診断バイオマーカーの測定にもつづいて、（医療処置を行うあるいは行わない）臨床の結果を予測し、適当な処置（あるいは処置が有効であるか否か）を選択し、あるいは現行の処置をモニターして処置を変更する可能性を予測することが可能となる。さらに、本発明のいくつかの実施形態にあっては、長期間にわたってバイオマーカーを多重に判定することによって、診断および／または予後を容易にすることができる。バイオマーカーの経時的変化を用いて、臨床の結果を予測し、上部消化器がんの進行および／またはそのがんに対して行われる適当な治療法の効果をモニターすることができる。例えば、そのような一実施形態にあっては、有効な治療法の過程で、長期間にわたって、生体試料中の本明細書に開示された一以上のバイオマーカーの量（さらに、モニターされる場合には、ＴＦＦ２を含めてまたそれに限定されることなく一以上の付加的なバイオマーカーの量もあり得る）の減少が予想される場合も起こり得る。
【００５０】
本発明は、さらに、いくつかの実施形態にあっては、対象者の体内のがんの予防処置または処置を開始あるいは継続すべきか否かを決定するための方法を提供するものである。いくつかの実施形態にあっては、この方法は、対象者から長期間にわたって一連の生体試料を提供し、該生体試料を分析して該生体試料の各々の中の本明細書に開示された少なくとも一つのバイオマーカーの量を測定し、該生体試料の各々の中の一以上のバイオマーカーの量の測定可能な変化を比較することからなる。長期間にわたるバイオマーカーの量の何らかの変化を用いて、がんの発生の危険性を予測し、臨床の結果を予測し、がんの予防処置または治療法を開始あるいは継続すべきか否かまた現在の治療法はがんを効果的に処置しているか否かを判定することができる。例えば、ある処置の開始に先立つ第一の時点とその処置の開始後のあるときの第二の時点を選択することができる。異なる時点で採取された各試料のバイオマーカーのレベル（濃度）を測定し、定性的および／または定量的な差を記録することができる。異なる試料のバイオマーカーレベルの量の変化を、上部消化器がんの危険性、予後、処置の有効性の判定、および／または対象者のがんの進行と相関させることができる。
【００５１】
本明細書で開示されたバイオマーカーを診断および予後に使用することに関連して本明細書で用いられる「相関した」および「相関する」という用語は、ある対象者の中のバイオマーカーの存在またはその量が、ある所与の状態（例えば、上部消化器がん）に罹患しているあるいは罹患する危険性があることが知られている対象者またはある所与の状態のないことが知られている対象者すなわち「正常な対象者」または「対照対象者」の中でのバイオマーカーの存在または量に匹敵することを意味する。例えば、ある生体試料の中の本明細書で開示された一以上のバイオマーカーのレベルが、ある特定の種類のがんとの関連性が決定されているバイオマーカーのレベルに匹敵する場合には、その試料のバイオマーカーのレベルは、ある診断と相関するということができる。すなわち、熟練した技術者は、そのバイオマーカーのレベルを用いて、対象者が特定の種類のがんに罹患しているか否かを判定することができ、それに応じて対応することができる。あるいは別法として、その試料のバイオマーカーのレベルは、よい結果（例えば、がんの不在）との関連性が知られている対照バイオマーカーのレベル（対照バイオマーカー基準値：control biomarker level）例えば正常な対象者の母集団で認められる平均レベルに匹敵するということができる。
【００５２】
いくつかの実施形態にあっては、ある診断または予後バイオマーカーは、単にそれが存在するまたは存在しないことによってある状態または疾病と相関する。他の実施形態にあっては、診断または予後の閾値レベルを設定し、対象者の試料の中のレベルまたは指標をその閾値レベルと比較することができる。
【００５３】
すでに記したように、いくつかの実施形態にあっては、一以上の診断または予後バイオマーカーの多重判定を行うことができ、またマーカーの中の経時的変化を用いて診断を行いまたは予後を決定することができる。例えば、ある診断マーカーを最初の時点で判定し、またその後の第二の時点で再度判定することができる。そのような実施形態にあっては、最初の時点から第二の時点までのマーカーの増加によって、特定の種類のがんあるいはがんの重症度を診断することができ、あるいは所与の予後を選定することができる。同様に、最初の時点から第二の時点までのマーカーの減少によって、特定種類のがんあるいはがんの重症度を診断できあるいは所与の予後を選定できる。さらに、一以上のマーカーの変化の程度を、がんの重症度および将来の好ましくない事象と関連付けることもできる。
【００５４】
熟練した技術者は、いくつかの実施形態にあっては、複数の時点で同一のバイオマーカーの測定比較を行うことができるとともに、また、ある時点で所与のバイオマーカーを測定し、第二の時点で第二のバイオマーカーを測定し、それらのバイオマーカーを比較することによって診断情報を得ることもできることを理解されよう。
【００５５】
本明細書で用いられる「予後を決定する」という表現は、熟練した技術者が、ある対象者の状態の経過または結果を予測できる方法を意味する。「予後」という用語は、１００％の正確さである状態の経過または結果を予測する能力を意味するものではなく、バイオマーカーの存在、不存在、またはレベルにもとづいてある所与の経過または結果が多少とも予測可能に起こり易いことを意味するものでさえない。そうではなく、熟練した技術者は、「予後」という用語が、ある経過または結果が起こる高い確率、すなわち、ある状態を示す対象者とその状態を示さない個体を比較した場合、ある経過または結果が前者においてより起こりそうなことを意味するものであると理解されよう。例えば、その状態を示さない（例えば、バイオマーカーを発現しないあるいは低いレベルで発現している）個体にあっては、所与の結果を得る（例えば、上部消化器がんを罹患する）可能性は、きわめて低く（例えば、＜１％）、あるいは存在しないかもしれない。それに対して、その状態を示す（例えば、バイオマーカーを発現しているあるいは対照基準値（コントロール・レベル）より大きく高まったレベルで発現している）個体にあっては、所与の結果を得る（例えば、上部消化器がんを罹患する）可能性は高いかもしれない。いくつかの実施形態にあっては、ある予後は、所与の予想される結果が生じる可能性は、約５％、約７％、約１０％，約１２％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７５％、約９０％、あるいは約９５％である。
【００５６】
熟練した技術者は、統計的分析では、予後の指標が好ましくない結果を生じる素因と関連付けられることを理解されよう。例えば、いくつかの実施形態にあっては、コントロール・レベル(control level)より高いバイオマーカーのレベルは、それが統計的有意性のあるレベルと判定された場合、その対象者が、コントロール・レベルより低いあるいはそれと等しいレベルの対象者と比較して、よりがんに罹患する可能性が高いことを示す場合があり得る。さらに、マーカーの濃度が基底線のレベルから変化した場合、それが対象者の予後を反映している場合があり得るし、またマーカーのレベルの変化の程度が好ましくない事象の重度に関係付けられる場合があり得る。統計的有意性は、二つ以上の個体群を比較することによって、および信頼区間およびｐ値を判定することによって決定されることが多い。例えば、Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８３）を参照のこと。同書は、ここに言及したことによってその全体が本明細書に組み込まれたものとなる。本発明の典型的な信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、および９９．９９％であり、典型的なｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、および０．０００１である。
【００５７】
他の実施形態にあっては、本明細書に開示された予後バイオマーカーあるいは診断バイオマーカーのレベルの変化の閾値の程度を確立することができ、また生体試料の中の指標のレベルの変化の程度を単にレベルの変化の閾値の程度と比較することができる。ここに開示された本発明のマーカーに関するレベルの変化の好ましい閾値は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、約１００％、および約１５０％である。さらに他の実施形態にあっては、「ノモグラム」を確立し、それによって、予後または診断の指標のレベルを所与の結果へと向かう関連する素因と直接関係付けることができる。熟練した技術者は、ノモグラムを用いて二つの数値を関係付けることを知っており、また個々の試料の測定は、参照値を得るためのものであり、母集団の平均ではないので、その測定の不確かさは、マーカー濃度の不確かさと同じであることを理解している。
【００５８】
ある試料から求められたあるバイオマーカーの「量」とは、そのバイオマーカーの定性的測定（例、測定された試料に存在するまたはしない）、定量的測定（例、どれくらい存在する）、またはその両者であることを意味する。「コントロール・レベル」（対照基準値）とは、上部消化器がんのないあるいは少なくとも試験の対象である上部消化器がんのない対象者の匹敵しうる生体試料で見出されたバイオマーカーの量（定性的存在または不存在を含めて）またはバイオマーカーの量の範囲を意味する。コントロール・レベルを計算する例では、正常な生体試料に存在するバイオマーカーの量を計算で求めることができ、またそれを全対象者に外挿することができるが、本発明は、それに限定されるものではない。
【００５９】
以下、図１を参照して、本発明にもとづく対象者の上部消化器がんの診断のための典型的方法を開示するが、本発明は、それに限定されるものではない。典型的方法１００は、対象者から生体試料を提供すること１０２、該生体試料の中の少なくとも一つのバイオマーカーであって、ＨＥ４，ＬＧＡＬＳ３、ＩＬ１ＲＮ、ＴＲＩＰ１３、ＦＩＧＮＬ１、ＣＲＩＰ１、Ｓ１００Ａ４、ＥＸＯＳＣ８、ＥＸＰＩ、ＢＲＲＮ１、ＮＥＬＦ、ＥＲＥＧ、ＴＭＥＭ４０、およびＴＭＥＭ１０９から選ばれた少なくとも一つのバイオマーカーの量を判定すること１０４、および少なくとも一つのバイオマーカーが存在する場合には、そのバイオマーカーの試料中の量を少なくとも一つのバイオマーカーのコントロール・レベルと比較すること１０６を含む。次に、試料中の少なくとも一つのバイオマーカーの量をコントロール・レベルと比較して測定可能な差がある場合には、
対象者は、上部消化器がんを有すると診断される。
【００６０】
対象者から生体試料を提供する工程１０２に関して、この典型的方法１００にあっては、異なる種類の生体試料を提供して使用することができる。例えば、血清、血漿、または血液の試料を提供することができる。他の例として、胃の分泌物を提供することもできる。さらに他の例として、以下の生体試料を提供することもできる、すなわち、上部消化器生検試料（例えば、胃から）、上部消化器生検から顕微切開した細胞、上部消化器内腔内に落ち込んだ上部消化器細胞、および、便から回収された上部消化器細胞である。対象者から上記の試料を得る方法は、当該技術分野では一般に公知である。
【００６１】
次に、生体試料中の少なくとも一つのバイオマーカーの量を判定する工程１０４に移って、提供された生体試料中の一以上のバイオマーカーを同定するためには、当業者に公知の各種の方法を使用することができる。いくつかの実施形態にあっては、少なくとも一つのバイオマーカーの量を判定することは、試料中のバイオマーカー・ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡを測定するＲＮＡ測定法および／または試料中のバイオマーカー・ポリペプチドの量を測定するタンパク質測定法を用いることからなる。
【００６２】
この方法のいくつかの実施形態にあっては、バイオマーカーの量は、当該技術分野で熟練したものには公知のＲＮＡ同定検定法を用いて試料中のバイオマーカーのｍＲＮＡを精査することによって判定することができる。要するに、ＲＮＡは、試料から抽出し、増幅し、ｃＤＮＡに変換し、標識化し、既知の配列のプローブとハイブッド化することができ、例えば基質（例えばアレー又はマイクロアレー）に固定化したあるいはリアルタイムＰＣＲ（例、米国、カリフォルニア州ハーキュラスのＢｉｏ−Ｒｅｄラボラトリースから入手可能な定量的リアルタイムＰＣＲ）によって定量化した公知のＲＮＡハイブリッド形成プローブ（バイオマーカーポリペプチドをコード化するｍＲＮＡに選択的な）とハイブリッド化することができる。試料の核酸分子が結合するプローブは公知であるので、該試料中の分子は、同定することができる。この点に関して、ＨＥ４，ＬＧＡＬＳ３、ＩＬ１ＲＮ、ＴＲＩＰ１３、ＦＩＧＮＬ１、ＣＲＩＰ１、Ｓ１００Ａ４、ＥＸＯＳＣ８、ＥＸＰＩ、ＢＲＲＮ１、ＮＥＬＦ、ＥＲＥＧ、ＴＭＥＭ４０、およびＴＭＥＭ１０９の一以上のものに対するＤＮＡプローブは、基質上に固定化でき、本発明にもとづく方法を実施するための使用に供することができる。
【００６３】
試料中のバイオマーカー・ポリペプチドの量を測定することに関して、質量分析および／または免疫検定装置および方法を使用することができる。ただし、当業者には、他の方法も公知である。例えば、米国特許第６，１４３，５７６号、第６，１１３，８５５号、第６，０１９，９４４号、第５，９８５、５７９号、第５，９４７，１２４号、第５，９３９，２７２号、第５，９２２，６１５号、第５，８８５，５２７号、第５，８５１，７７６号、第５，８２４，７９９号、第５，６７９，５２６号、第５，５２５，５２４号、および第５，４８０，７９２号を参照されたい。これらの各特許は、ここに言及したことによってその全体が本明細書に組み込まれたものとなる。免疫検定装置および方法は、対象となる分析物の存在またはその量に関係する信号を生成するために各種サンドイッチ型、競合型、または非競合型検定フォーマットで標識化した分子を利用することができる。さらに、標識化した分子を必要とせずに分析物の存在またはその量を判定するために、バイオセンサーや光学的免疫検定法などいくつかの方法および装置を使用することができる。例えば、米国特許第５，６３１，１７１号および第５，９５５，３７７号を参照されたい。これらの各特許は、ここに言及したことによってその全体が本明細書に組み込まれたものとなる。
【００６４】
したがって、ここに開示される本発明のいくつかの実施形態にあっては、バイオマーカー・ペプチドは、免疫検定法を用いて分析される。本明細書に開示されるバイオマーカー・ペプチドの存在または量は、各バイオマーカー・ポリペプチドまたはその断片に固有の抗体またはその断片を用い、また固有の結合を検出して測定することができる。例えば、いくつかの実施形態にあっては、この抗体は、ＨＥ４，ＬＧＡＬＳ３、ＩＬ１ＲＮ、ＴＲＩＰ１３、ＦＩＧＮＬ１、ＣＲＩＰ１、Ｓ１００Ａ４、ＥＸＯＳＣ８、ＥＸＰＩ、ＢＲＲＮ１、ＮＥＬＦ、ＥＲＥＧ、ＴＭＥＭ４０、およびＴＭＥＭ１０９を特異的に結合する。この抗体は、完全長ペプチドまたはその断片を結合する抗体を包含する。
【００６５】
例えば、酵素結合免疫検定法（ＥＬＩＳＡ），放射免疫検定法（ＲＩＡ）、競合結合検定法等のいずれか適当な免疫検定法も利用することができる。抗体のマーカーに対する特異的な免疫学的結合は、直接的または間接的に検出することができる。直接標識には、抗体に取り付けられた蛍光または発光タグ、金属、染料、放射性核種等がある。間接標識には、アルカリ性フォスファターゼ、西洋ワサビぺロキシダーゼ等々の当該技術分野で公知の各種酵素がある。
【００６６】
マーカーに固有の固定化抗体またはその断片の使用も、本発明が意図するものである。これらの抗体は、磁気またはクロマトグラフ・マトリックス粒子、（例えば、マイクロプレート・ウェルなどの）アッセイプレートの表面、（例えば、プラスチック、ナイロン、紙などの）固体基質材料の小片等の各種の固体支持体の上で固定化することができる。アッセイストリップは、アレーとした抗体または複数の抗体を個体支持体上に被覆することにより作成することができる。このストリップは、次に、供試生体試料の中に浸し、さらに洗浄および検出工程を介して迅速に処理すれば、例えば着色したスポットなどの形で測定可能な信号を生成することができる。
【００６７】
いくつかの実施形態にあっては、質量分析法（ＭＳ）のみを用いて、あるいは他の方法（例えば、免疫検定法またはＲＮＡ測定法）と組み合わせて用いて、生体試料中における本明細書に開示される一以上のバイオマーカーの存在および／またはその量を判定することができる。いくつかの実施形態にあっては、質量分析法（ＭＳ）は、例えば直接−スポットＭＡＬＤＩ−ＴＯＦまたは液体クロマトグラフィーＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法などのマトリックス支援レーザー脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間（ＴＯＦ）ＭＳ分析法からなる。いくつかの実施形態にあっては、ＭＳ分析法は、例えば液体クロマトグラフィー（ＬＣ）ＥＳＩ−ＭＳなどのエレクトロスプレー・イオン化（ＥＳＩ）ＭＳからなる。質量分析は、市販のスペクトロメーターを用いて行うことができる。生体試料中のバイオマーカーの存在またはその量を検出するためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳを含めてＭＳ分析を利用する方法は、当該技術分野では公知である。さらなる手引きとしては、例えば、米国特許第６，９２５，３８９号、第６，９８９，１００号、および第６，８９０，７６３号を参照されたい。これらの各特許は、ここに言及したことによってその全体が本明細書に組み込まれたものとなる。
【００６８】
本法のいくつかの実施形態は、生体試料中の一以上のバイオマーカーの存在または不存在の定性的評価のみを必要とするが、本法の他の実施形態は、生体試料中の一以上のバイオマーカーの各々の量の定量的評価を必要とする。そのような定量的評価は、例えば、当該技術分野で熟練したものには理解できるように、上述した方法のいずれか一つを用いて行うことができる。
【００６９】
表１に示した特定のバイオマーカーに加えて、上部消化器がんの診断に有用な他のバイオマーカーの量の測定も提供される。例えば、トレフォイル因子２（ＴＦＦ２）免疫反応性細胞の存在は、胃がんと関連している。Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｐ．Ｈ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｊｏｓｈｉ，Ｖ．，Ｐｌａｙｆｏｒｄ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｏｕｌｓｏｍ，Ｒ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｎ．Ａ．，およびＧｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．(１９９９)によるＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｅｔａｐｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（ヒトの胃腺がんに関連する化生細胞系統の同定）．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：６３９：６４６（“Ｓｃｈｍｉｄｔ，等”）を参照されたい。他の例として、ペプシノゲンＩ／ＩＩの或る比率は、ある種の上部消化器がんと関連している。例えば、Ｏｉｓｈｉ  Ｙ，Ｋｉｙｏｈａｒａ  Ｙ，Ｋｕｂｏ  Ｍ，Ｔａｎａｋａ  Ｋ，Ｔａｎｉｚａｋｉ  Ｙ，Ｎｉｎｏｍｉｙａ  Ｔ，Ｄｏｉ  Ｙ，Ｓｈｉｋａｔａ  Ｋ，Ｙｏｎｅｍｏｔｏ  Ｋ，Ｓｈｉｒｏｔａ  Ｔ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｔ，Ｉｉｄａ  Ｍ．(２００６)によるＴｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｐｅｐｓｉｎｏｇｅｎ  ｔｅｓｔ  ａｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｇａｓｔｏｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ（胃がんの予測因子としての血清ペプシノゲン試験）：ｔｈｅ  Ｈｉｒａｙａｍａ  ｓｔｕｄｙ．Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１６７（３）：６２９−３７；およびＤｅｎｉｓ−Ｒｉｂｅｉｒｏ  Ｍ．ｄａＣｏｓｔａ−Ｐｅｒｅｉｒａ  Ａ，Ｌｏｐｅｓ  Ｃ，Ｂａｒｂｏｓａ  Ｊ，Ｇｕｉｌｈｅｒｍｅ  Ｍ，Ｍｏｒｅｉｒａ−Ｄｉａｓ  Ｌ，Ｌｏｍｂａ−Ｖｉａｎａ  Ｈ，Ｓｉｌｖａ  Ｒ，Ａｂｒｅｕ  Ｎ，  Ｌｏｍｂａ−Ｖｉａｎａ  Ｒ．(２００４)によるＶａｌｉｄｉｔｙ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ｐｅｐｓｉｎｏｇｅｎＩ／ＩＩｒａｔｉｏ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｏｆ  ｓｕｊｅｃｔｓ  ａｔ  ｒｉｋ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ−ｔｙｐｅ  ｇａｓｔｉｒｃ  ａｄｅｎｏｃａｃｉｎｏｍａ（腸型胃腺がんの危険のある対象者の追跡中における胃上皮異形成および腸の化生の診断に関する血清ペプシノゲンのＩ／ＩＩ比の妥当性）．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．６（５）：４４９−５６を参照されたい。したがって、ＴＦＦ２および／または（ペプシノゲンＩ／ＩＩ比を求めるために）ペプシノゲンＩとペプシノゲンＩＩをさらに測定して、上部消化器がんの危険性のあるものまたは現在罹患しているものの同定のために診断マトリックスを生成することができる。
【００７０】
本法のいくつかの実施形態にあっては、生体試料と同時に分析される対照試料を含めるようにして、生体試料から得られる結果を対照試料から得られる結果と比較することものぞましいかもしれない。さらに、標準曲線を提供し、生体試料に関する検定結果をそれと比較することも考慮されている。このような標準曲線は、バイオマーカーのレベルを、検定単位の関数として示す。すなわち蛍光標識が使用される場合には蛍光信号の強度の関数として示す。標準曲線は、多数の提供者から採取した試料を用いて、正常な組織における一以上のバイオマーカーの対照基準値を規定し、また、化成のある提供者あるいは上部消化器がんのある提供者から採取した組織中の一以上のバイオマーカーの「危険な」レベルを規定することが可能となる。
【００７１】
本法のいくつかの実施形態にあっては、対象者は、該対象者から得られた生体試料中で、ＨＥ４，ＬＧＡＬＳ３、ＩＬ１ＲＮ、ＴＲＩＰ１３、ＦＩＧＮＬ１、ＣＲＩＰ１、Ｓ１００Ａ４、ＥＸＯＳＣ８、ＥＸＰＩ、ＢＲＲＮ１、ＮＥＬＦ、ＥＲＥＧ、ＴＭＥＭ４０、およびＴＭＥＭ１０９から選ばれた一以上のバイオマーカーを同定することによって化生(metaplasia)を有するものとして同定される。本法の他の実施形態にあっては、対象者から得られた生体試料中で一以上のこれらのバイオマーカーを同定することは、該対象者ががんを有するものとして同定されることになる。
【００７２】
バイオマーカーの遺伝子発現、例えばｍＲＮＡ、を測定することによって、あるいはタンパク質バイオマーカーを直接測定することによって、生体試料中で一以上のバイオマーカーが同定されるか否かにかかわらず、生体試料中で多数のバイオマーカーを精査することによって、診断方法の効率、正確性、感度、および特異性を高めうることが想定される。例えば、本法のいくつかの実施形態にあっては、生体試料は、ＴＦＴ２およびＨＥ４，ＬＧＡＬＳ３、ＩＬ１ＲＮ、ＴＲＩＰ１３、ＦＩＧＮＬ１、ＣＲＩＰ１、Ｓ１００Ａ４、ＥＸＯＳＣ８、ＥＸＰＩ、ＢＲＲＮ１、ＮＥＬＦ、ＥＲＥＧ、ＴＭＥＭ４０、およびＴＭＥＭ１０９から選ばれた一つのバイオマーカーに関して精査することができる。他の例として、生体試料は、ＨＥ４，ＬＧＡＬＳ３、ＩＬ１ＲＮ、ＴＲＩＰ１３、ＦＩＧＮＬ１、ＣＲＩＰ１、Ｓ１００Ａ４、ＥＸＯＳＣ８、ＥＸＰＩ、ＢＲＲＮ１、ＮＥＬＦ、ＥＲＥＧ、ＴＭＥＭ４０、およびＴＭＥＭ１０９から選ばれた２−５個のバイオマーカーに関して精査することができる。さらに他の例として、生体試料は、ＨＥ４，ＬＧＡＬＳ３、ＩＬ１ＲＮ、ＴＲＩＰ１３、ＦＩＧＮＬ１、ＣＲＩＰ１、Ｓ１００Ａ４、ＥＸＯＳＣ８、ＥＸＰＩ、ＢＲＲＮ１、ＮＥＬＦ、ＥＲＥＧ、ＴＭＥＭ４０、およびＴＭＥＭ１０９から選ばれた６−１０個のバイオマーカーに関して精査することができる。
【００７３】
マーカーの分析は、一つの試験試料の中で個別にまたは追加のマーカーと同時に行うことができる。例えば、いくつかのマーカーを組み合わせて一つの試験を行えば、多数の試料の処理の効率を高め、また診断および／または予後の正確性を高める可能性を得ることができる。さらに、当該技術分野で熟練したものは、同じ対象者から（例えば、時間的に順次）多数の試料を試験することの価値を認識しているであろう。このように順次試料を試験することによって、マーカーのレベルの経時的変化を同定することが可能となる。マーカーのレベルの上昇または下降、ならびにマーカーのレベルに変化のないことは、疾病の状態についての有用な情報を提供し得るものであり、そのような情報は、事象の発生からのおおよその時間を同定するのに限定されないが、救済可能な組織の存在およびその量、薬物療法の適当性、各種治療法の有効性、および将来の事象の発生の危険性を含めて対象者に生じる結果の同定を包含するものである。
【００７４】
バイオマーカーの分析は、さまざまな物理的フォーマットを用いて行うことができる。例えば、マイクロプレートまたはオートメーションを使用すれば、多数の試験用試料の処置を容易にすることができる。あるいは、単一試料フォーマットを開発して、例えば救急車による搬送あるいは救急処置室などの環境での応急処置および診断を時機的要領で容易にすることもできる。
【００７５】
再び図１を参照して、対象者は、コントロール・レベルと比較して試料中の少なくとも一つのバイオマーカーの量に測定可能な差がある場合には、上部消化器がんを有すると診断される１０６。逆に、生体試料の精査の結果、その中でバイオマーカーが同定されない場合には、対象者は、上部消化器がんを有しない、がんの危険性はない、あるいはがんの危険性が低いと同定することができる。この点に関して、がんまたはその危険性を有する対象者は、がんまたはその危険性が低いか実質的にない対象者と区別することができる。上部消化器がん発生の危険性を有する対象者は、上部消化器の内視鏡検査を含めてより集中的および／または規則的スクリーニングのスケジュールに載せることができる。他方、危険性が低いか実質的にない対象者は、将来のスクリーニング、例えば本発明にもとづいて行われるスクリーニングによって対象者に上部消化器がんの危険性が示されたときまでは、そのような内視鏡検査を行わなくともよいかもしれない。
【００７６】
上に述べたように、本発明にもとづく方法の実施形態によっては、一以上のバイオマーカーの同定は、バイオマーカーの存在または不存在の定性的判定であり得るし、あるいはバイオマーカーの濃度の定量的判定であり得る。この点に関して、典型的方法では、上部消化器がんを有するまたは発生する危険のある対象者の診断の工程は、いくつかの閾値の測定が行われたこと、すなわち生体試料中の一以上のバイオマーカーのレベルが規定のコントロール・レベルを超えたことを示すものである１０６。本法のいくつかの実施形態にあっては、コントロール・レベルは、バイオマーカーの任意の検出可能なレベルである。本法の対照試料が生体試料と同時に試験される他の実施形態にあっては、既定のレベルは、対照試料中での検出のレベルである。本法の他の実施形態にあっては、既定のレベルは、標準曲線にもとづくおよび／または標準曲線によって同定されるレベルである。本法の他の実施形態にあっては、既定のレベルは、特異的に同定された濃度または濃度の範囲である。したがって、既定のレベルは、一部は、実際に用いられる本法の実施形態およびのぞましい特異性等にもとづいて、当業者には明らかな許容し得る限度内で選択できるものである。
【００７７】
さらに、本発明の診断方法に関して、好ましい対象者は、脊椎動物である。好ましい脊椎動物は、温血動物であり、好ましい温血脊椎動物は、哺乳動物である。好ましい哺乳動物の最も好ましいのはヒトである。本明細書で用いられる場合、「対象者」という用語は、ヒトおよび動物の対象者の両方を含む。したがって、本発明にもとづけば、獣医学的な治療用途が提供される。
【００７８】
したがって、本発明は、ヒトならびにシベリアタイガーなどの絶滅の危機に瀕していることから重要性のある哺乳動物やヒトが消費するために牧場で飼育されている動物などの経済的に重要な哺乳動物、および／またはペットとしてまたは動物園で維持されている動物などのヒトにとって社会的に重要な動物の診断方法を提供するものである。このような動物の例としては、猫および犬などの食肉動物、ピッグ、ホッグ、およびイノシシを含めて豚類動物、キャトル（畜牛）、オックス（食用および荷役牛）、羊、キリン、鹿、山羊、バイソン、およびラクダなどの反芻動物および／または有蹄動物、および馬を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。したがって、豚、反芻動物、有蹄動物、馬（競走馬を含めて）等を含む家畜類の診断方法および処置方法が提供されるが、家畜類は、上に挙げたものに限定されるものではない。
【００７９】
本発明は、さらに、対象者における上部消化器がんの診断のためのシステムを含むものである。このシステムは、例えば、生体試料使用を回収した対象者の中の上部消化器がんの危険性または上部消化器がんの診断のためのスクリーニングに用いる市販用キットとして提供することができる。本発明にもとづいて提供される典型的システムとしては、ＨＥ４，ＬＧＡＬＳ３、ＩＬ１ＲＮ、ＴＲＩＰ１３、ＦＩＧＮＬ１、ＣＲＩＰ１、Ｓ１００Ａ４、ＥＸＯＳＣ８、ＥＸＰＩ、ＢＲＲＮ１、ＮＥＬＦ、ＥＲＥＧ、ＴＭＥＭ４０、およびＴＭＥＭ１０９から選ばれた一以上のバイオマーカーの各々に選択的に結合するプローブ、および一以上のバイオマーカーに対するプローブの結合を検出するための構成部品がある。
【００８０】
このシステムのいくつかの実施形態にあっては、該プローブは、ＲＮＡハイブリッド形成用プローブとすることができる。この場合には、生体試料のＲＮＡは単離され、増幅され、ｃＤＮＡに変換され、標識化され、ハイブリッド形成を可能とするためにプローブとともにインキュベートされる。プローブがバイオマーカーのｃＤＮＡへ結合することは、該プローブの標識を用いて検出することができる。該標識は、例えば、蛍光標識とすることができる。
【００８１】
該システムの他の実施形態にあっては、プローブは、タンパク質のバイオマーカーと選択的に結合する抗体とすることができる。抗体がバイオマーカーと結合することは、例えば、酵素結合抗体を用いて検出することができる。
【００８２】
このシステムは、また、対照として使用するために或る試料を含むものとすることができる。このシステムは、さらに、バイオマーカーｍＲＮＡのレベルまたはバイオマーカータンパク質のレベルを検定単位の関数として規定する一以上の標識曲線を含むものとすることができる。このシステムは、加えて、ＴＦＦ２用プローブおよび／または（ペプシノゲンＩ／ＩＩの比を求めるための）ペプシノゲンＩおよびペプシノゲンＩＩ用プローブを含むものとすることができる。
【００８３】
したがって、本発明のいくつかの実施形態にあっては、バイオマーカーの分析用キットであって、例えば、バイオマーカーのポリペプチドに対して選択的な抗体を含めてのプローブ、または本明細書で開示される一以上のバイオマーカーに対して特異性を有し、ｍＲＮＡバイオマーカー（またはそれから増幅されたｃＤＮＡ）と選択的に結合することのできるＲＮＡハイブリッド形成用プローブからなるキットが提供される。いくつかの実施形態にあっては、プローブは、基質に結合させることができる。そのようなキットは、少なくとも一つの試験用試料を分析するための装置および試薬を含むものとすることができる。該キットは、さらに、該キットを使用する際および分析を行う際の説明書を含むものとすることができる。場合によっては、キットは、マーカーのレベルを対象者の診断または予後に変換するための一以上の試薬または装置を含むものとすることができる。
【００８４】
本発明の実施にあたっては、他にとくに示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック（遺伝子組み換え）生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の慣用の手法を用いることができる。これらは、当該技術分野の技能の範囲に含まれるものである。これらの手法は、文献に充分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローン化の研究マニュアル）（１９８９），２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １６  ａｎｄ  １７；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，１９５；  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＤＮＡのクローン化），  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，  Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．，１９８５；  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（オリゴヌクレオチドの合成），Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（核酸のハイブリッド化），Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４；  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（転写と翻訳），Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４；  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（動物細胞の培養），Ｒ．Ｉ．Ｒｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７；  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（固定化細胞と酵素），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６；  Ｐｅｒｂａｌ（１９８４），Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子のクローン化の実用案内書）；  Ｓｅｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（哺乳動物の細胞のための遺伝子導入ベクター），Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８７；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（酵素学の方法），Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５，Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（細胞および分子生物学における免疫化学的方法）（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７；  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（実験免疫学ハンドブック），Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６を参照されたい。
【００８５】
実施例
以下の実施例は、本発明の態様を示すためのものである。本開示および当該技術分野の一般的な技能に照らして、当業者には、以下の実施例は単に例示されたものにすぎず、本発明の範囲から逸脱することなく多数の変化、修正、および変更が可能なことが理解されよう。
【００８６】
実施例１
ヒトにおける胃がんの病因論
図２を参照して、西欧の大多数の研究者は、伝統的に、胚細胞性腸上皮化生(goblet cell intestimal metaplasia)を胃がんの始まりを示す主要な症状であると考えてきた。Ｃｏｒｒｅａ，Ｐ．１９８８．Ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（胃発がんのヒトのモデル）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：３５５４−３５６０；Ｓｍｉｔｈ，Ｖ．Ｃ．，Ｇｅｎｔａ，Ｒ．Ｍ．２０００．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｈｅｌｉｃｏｂｃｔｅｒ  ｐｙｒｏｌｉ  ｇａｓｔｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ，ｉｎｔｅｎｓｔｉｎａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ，  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ（胃の萎縮、腸上皮化生、および胃の新生組織形成におけるヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）による胃炎の役割）、Ｍｉｃｒｏｓｃ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈ．４８；３１３−２０：およびＦｉｌｉｐｅ，Ｍ．Ｉ．，Ｍｕｎｏｚ，Ｎ．，Ｎａｔｋｏ，Ｉ．，Ｋａｔｏ，Ｉ．，Ｐｏｍｅ−Ｋｉｍ，Ｖ．，Ｊｕｅｒｓｅｋ，Ａ．，Ｔｅｕｃｈｍａｎｎ，Ｓ．，Ｂｅｎｚ，Ｍ．，Ｐｒｉｊｏｎ，Ｔ．１９９４．  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ  ｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ；  ａ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  Ｓｌｏｖｅｎｉａ（腸上皮化生の型および胃がんの危険性：スロベニアにおけるコホート（集団）調査），Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｃｅｒ．５７：３２４−３２９を参照されたい。胚細胞は、正常な胃では見出せない。したがって、胚細胞の形態をとる細胞の存在は、腸発現型の細胞をともなう明白な化生の進行をあらわしている。
【００８７】
しかしながら、腸上皮化生を異形成形質転換と直接結びつける証拠は、ほとんど存在しない。Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｔ．１９８６．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｏｍａｃｈ（胃における腺がんの発生）．Ｃａｎｃｅｒ  ５７：１５２８−１５３４を参照されたい。実際、腸上皮化生は、がんの唯一可能な化成前駆体ではない。とくにアジアにおいて、多数の研究者が、幽門洞腺表現型と同様な一般的な表現型をもつ胃底部の化生腺の存在に注意を集中してきている。Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｔ．１９８６．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｏｍａｃｈ（胃における腺がんの発生）．Ｃａｎｃｅｒ  ５７：１５２８−１５３４を参照されたい。この胃底部表現型の幽門化あるいは擬似幽門化生は、腸型の腺がんと普通関連付けられている。再度図２を参照して、同様な化生の進行が、鎮攣性ポリペプチド発現性化生（ＳＰＥＭ）として記述されている。これは、深部幽門腺細胞あるいはブルナーの腺細胞と同様な形態特性を有する胃底部のトレフォイル因子２（ＴＦＦ２または鎮攣性ポリペプチド）免疫反応性細胞の存在によって特徴付けられる。Ｓｃｈｍｉｄｔ，ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。
【００８８】
ＳＰＥＭは、米国、日本、およびアイスランドでの三つの研究で、切除した胃がんの９０％以上と関連付けられている。Ｓｃｈｍｉｄｔ，ｅｔ  ａｌ．；  Ｈａｌｌｄｏｒｓｄｏｔｔｉｒ，ｅｔ  ａｌ。鎮攣性ポリペプチド発現性化生（ＳＰＥＭ）は、アイスランドでは胃がんと関連付けられている。Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．４８：４３１−４４１．を参照されたい。さらに、韓国の対象者および化生と相関するＴＦＦ２の発現に関しても同様の所見が報告されている。Ｄｈａｒ，Ｄ．Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｃ．Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｒ．，Ｕｄａｇａｗａ，Ｊ．Ｋｕｂｏｔａ，Ｈ．，Ｆｕｊｉ，Ｔ．，Ｔａｃｈｉｂａｎａ，Ｍ．，Ｏｎｏ，Ｔ．，Ｏｔａｎｉ，Ｈ．，ａｎｄＮａｇａｓｕｅ，Ｎ．(２００３)。細胞質ＴＦＦ２の発現は、腫瘍の転移および胃がんの陰性予後因子のバイオマーカーである。Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８３：１３４３−１３５２を参照されたい。これらの研究のすべてで、ＳＰＥＭは、頻繁にまたはより頻繁に胚細胞性腸上皮化生よりはがんと関連して存在する。アイスランドの研究では、ＴＦＦ２の免疫反応性は、進行した胃がんではあまり顕著ではないが、初期の胃がんでは５０％以上でＴＦＦ２の免疫反応性が観察された。Ｈａｌｌｄｏｒｓｄｏｔｔｉｒ，ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。これらのヒトにおける研究は、すべて、推定されるヒトの前がん性化生として、ＳＰＥＭおよび腸上皮化生の重要性を示している。
【００８９】
実施例２
急性酸分泌領域萎縮につづくＳＰＥＭの誘発
経口活性のある細胞浸透性好中球エラスターゼ阻害剤であるＤＭＰ−７７７によって、有意の炎症性浸潤物のない急性酸分泌領域萎縮につづくＳＰＥＭの誘発の検査が可能になった。経口ＤＭＰ−７７７の多量の投与で処置した（＞２００ｍｇ／ｋｇ／ｄ）マウスあるいはラットは、３日の投薬で壁細胞の急速な欠損を示した。Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．，Ｒａｙ，Ｇ.Ｓ．，Ｃｏｆｆｅｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｅｕｎｉｅｒ，Ｐ．Ｃ．，Ｈａｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｔ．Ｂ.，および Ｃａｒ．Ｂ．Ｄ．(２０００)．Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｘｙｎｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ（ラットにおける可逆的薬物誘発酸分泌領域の萎縮）．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１１８：１０８０−１０９３（“Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．”）；および Ｎｏｍｕｒａ，Ｓ．，Ｓｅｔｔｌｅ，Ｓ．Ｈ．，Ｌｅｙｓ，Ｃ．，Ｍｅａｎｓ，Ａ．Ｌ．，Ｐｅｅｋ，Ｒ．Ｍ．，Ｊｒ．，Ｌｅａｃｈ，Ｓ．Ｄ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｃ．Ｖ．Ｅ．，Ｃｏｆｆｅｙ，Ｒ．Ｊ．，および Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．(２００５)．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｒｅｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｆｕｎｄｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｎｅｔｒｉｅｒ‘ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ＧＦ１  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（メネトリエ病及びＴＧＦａ過剰発現に関連する胃底上皮の再パターン化の証拠）．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２８；１２９２−１３０５（“Ｎｏｍｕｒａ，ｅｔ．ａｌ．（２００５）”）。急性酸分泌領域萎縮につづいてすぐ、顕著な胃小窩過形成が起こり、次に、酸分泌領域萎縮の７ないし１０日後に、胃底部にＳＰＥＭが発生した。これらの研究は、胃の化生の誘発が、壁細胞の欠損の直接の結果であることを示している。これらの結果は、壁細胞から分泌される分化に役立つ成長因子の欠損と両立性がある。これらの成長因子は、ＥＧＦ受容体リガンドＴＧＦ−α、アンフィレグリン、およびＨＢ−ＥＧＦならびにソニックヘッジホッグ遺伝子を含みうる。この急性酸分泌領域の萎縮のモデルでは、ガストリン・ノックアウト・マウスはＤＭＰ−７７７の処置に反応して表面細胞の過形成を発生しないことから、ガストリンが胃小窩過形成の主要な推進力であると思われる。Ｎｏｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）を参照されたい。しかし、ガストリンの不存在は、ＳＰＥＭの発生を促進し、わずか１日のＤＭＰ−７７７処置の後に急速に化生を誘発している。
【００９０】
より最近の研究では、ＤＭＰ−７７７での処置の後、矮小体型の突然変異を有するｗａｖｅ−２マウスのＥＧＦ受容体シグナルが減少し、これがＥＧＦ受容体チロシン・キナーゼ活性を低下させ、またＳＰＥＭの発生を加速させたことが示されている。Ｏｇａｗａ，Ｍ．Ｎｏｍｕｒａ，Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．(２００６)．Ａｌｔｅｒｅｄ  ｍｅｔａｐｌａｓｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｗａｖｅｄ−２  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｕｔａｎｔ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ａｃｕｔｅ  ｏｘｙｎｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ（ＥＧＦ受容体突然変異のｗａｖｅ−２マウスの急性酸分泌領域萎縮に対する化生反応の変容）．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９０：Ｇ７９３−Ｇ８０４を参照されたい。これらの研究は、壁細胞の欠損後、固有のパラクリンおよびエンドクリン調節因子が、化生の出現を変調することを示している。ＤＭＰ−７７７処置のモデルでは、化生の急速な誘発が可能であるが、この薬物の一年もの長期にわたる投与の後でも、深刻な酸分泌領域萎縮およびＳＰＥＭにもかかわらず、マウスあるいはラットで異形成病変は観察されなかったことに留意しなければならない。これらの結果は、ＤＭＰ−７７７で処置した動物に有意な炎症性浸潤物がないことから生じるものと思われる。理論に束縛されたくないが、浸潤物がないと思われることは、この薬物の細胞浸透性好中球エラスターゼ阻害剤としての主要な作用の結果である。これらの研究は、炎症性浸潤物のない場合でも、壁細胞の欠損に反応してＳＰＥＭが発生することを示している。さらに、これらの研究は、化生から異形成の発生のためには、慢性炎症の存在が一つの要件であることを指摘している。
【００９１】
これらの研究での重要な所見は、ガストリン・ノックアウト・マウスにおけるＤＮＰ−７７７処置に反応してＳＰＥＭの急速な誘発に関する。ガストリン欠乏マウスは、ＤＭＰ−７７７のわずか一回の投与後にＳＰＥＭを発生する。これに対して、野生型Ｃ５７ＢＬ／６のマウスでは７−１０日が必要である。古典的には、すべての胃底系統は、腺の上部頚部領域に位置する前駆細胞帯域から派生すると考えられている。しかし、マウスを用いた最近の研究では、主細胞は、中間的な増殖前駆細胞を介することなく頚部粘液細胞の再分化から発生することが示されている。
【００９２】
これが再分化であるか分化転換であるかにかかわらず、これらの所見は、各種の胃細胞が、腺軸に沿った正常な分化の一部としてそのトランスクリプトーム(transcriptome)の中で変容し得るものであることを示している。ＳＰＥＭが胃底腺基部にあるクリプティック前駆細胞から発生することは暗示されていたが、これらの結果は、ＳＰＥＭが主細胞の分化転換を介して発生することを暗示している。実際、個別の顆粒状の固有の因子（マウスにおける主細胞バイオマーカー）およびＴＦＴ２をともに発現する腺の基部に細胞が存在することは、ＳＰＥＭの誘発をよく反映したものであることが見出されている。ＤＭＰ−７７７で処置したガストリン欠乏マウスでは、処置のわずか１日後にこれらの二重発現細胞が急速に増加した。二重発現細胞に加えて、胃底腺の基部にあるＢｒｄＵ−標識化されたＳ期細胞が、内腔近傍にある正常な前駆細胞帯域とは別に観察されている。Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，およびＮｏｍｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ．，を参照されたい。
【００９３】
ＤＭＰ−７７７で処置したマウスで観察された増殖速度は、Ｈ．ｆｅｌｉｓ−感染マウスで、ＳＰＥＭで観察されたものよりかなり低いが、基部にある増殖細胞の急速な誘発は、いくつかの分化転換細胞が細胞サイクルに再参入し得ることを暗示している。したがって、ＳＰＥＭ細胞は、最終的には自己再生細胞となるかあるいは炎症調節因子によって化生膨張または異形成形質転換に向かうように影響されるかもしれない。
【００９４】
実施例３
主細胞の分化転換の遺伝子マイクロアレー分析
急性酸分泌領域萎縮のマウス・モデルを用いて、壁細胞の欠損につづく最初期の事象の研究が行われた。ゲッ歯類を壁細胞プロトノフォア（protonophore)プロトンを膜透過させる物質）ＤＭＰ−７７７で処置すると、１ないし３日以内に酸分泌壁細胞の急速な欠損が生じる。野性型Ｃ５７ＢＬ／６のマウスでは、壁細胞の欠損につづいて、薬物処置の１０−１４日後に深い胃底腺にＳＰＥＭが出現し、それと同時に同じく胃底腺の基部にＢｒｄＵ−標識化された増殖細胞が出現する。Ｎｏｍｕｒａ，Ｓ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｃ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｒ．，および Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．(２００４) Ａｌａｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｃｕｔｅ  ｏｘｙｎｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ（野生型でガストリン欠乏マウスにおける急性酸分泌領域の萎縮によって誘発した胃粘膜系統の変容）．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８８：Ｇ３６２−Ｇ３７５を参照されたい。これらの化生腺のきわめて基部で、ＴＦＦ２および内因子（ゲッ歯類における主細胞に特異的なバイオマーカー）の両方に対して二重に免疫反応性を示す細胞の存在が観察された。Ｏｇａｗａ，Ｍ．Ｎｏｍｕｒａ，Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｃ．，および Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．(２００６) Ａｌｔｅｒｅｄ  ｍｅｔａｐｌａｓｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｗａｖｅｄ−２  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｕｔａｎｔ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ａｃｕｔｅ  ｏｘｙｎｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ（ＥＧＦ受容体突然変異のｗａｖｅ−２マウスの急性酸分泌領域の萎縮への化生反応の変容）．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９０：Ｇ７９３−Ｇ８０４；  Ｎｏｍｕｒａ，Ｓ．，Ｂａｘｔｅｒ，  Ｓ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｌｅｙｓ，Ｃ．，Ｖａｒｔａｐｅｔｉａｎ，Ａ．Ｂ．，Ｆｏｘ，Ｊ．Ｇ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｃ．，および Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ.(２００４) Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｓｐａｓｍｏｌｙｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ  （ＳＰＥＭ）ｔｏ  ｐｒｅ−ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ｉｎ  Ｈ．ｆｅｌｉｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｍｉｃｅ（Ｈ−ｆｅｌｉｓ感染マウスの前がんに対する鎮攣性ポリペプチド発現性化生（ＳＰＥＭ）の関係）．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２７：５８２−５９４；および Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．，Ｋａｍｉｎｉｓｈｉ，Ｍ．，および Ｌｅｅ，Ｊ．Ｒ．(２００２) Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐａｓｍｏｌｙｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ  （ＳＰＥＭ）  ｗｉｔｈ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｘｙｎｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ（ラットにおける鎮攣性ポリペプチド発現性化生（ＳＰＥＭ）とがん源投与および酸分泌領域の萎縮との関連）．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２：１０４５−１０５４を参照されたい。
【００９５】
より最近、ガストリン・ノックアウト・マウスでは、やはり胃腺の底部におけるＢｒｄＵ陽性のＳ期細胞の存在に関連して、ＤＭＰ−７７７を一回だけ投与した後にＳＰＥＭを発生したことが見出されている。Ｎｏｍｕｒａ，Ｓ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｃ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｒ．，および Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．(２００４) Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｃｕｔｅ  ｏｘｙｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ（野生型でガストリン欠乏マウスにおける急性酸分泌領域の萎縮によって誘発した胃粘膜系統の変容）．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８８：Ｇ３６２−Ｇ３７５を参照されたい。これらの結果ならびに二重に免疫反応性を有する細胞の同定から、ＳＰＥＭが、最初は主細胞の分化転換からは生じるという仮説が導かれている。この仮説をより直接検討するために、主細胞を未処置のガストリン・ノックアウト・マウスのきわめて基部から顕微切開によって切除し、またＤＭＰ−７７７での１〜３日の処置後に胃底腺の基部にあるＳＰＥＭ細胞から切除した。各グループの４匹の異なるマウスから単離した１００００個の細胞から全ＲＮＡを用意した。１２の試料の各々に線形増幅を行い、アフィメトリックス(Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ) マウス２．０遺伝子のマイクロアレーを精査した。次に、データを分析して、発現が少なくとも二倍に増加または減少した遺伝子を判別した。これらの結果から以下の所見が得られた。第一に、発現が増加した転写物のグループで検出されたアポプトーシス促進(pro-apoptotic)遺伝子はない。第二に、ＢＲＣＡ１、ＲＩＳ２、ＲＡＤ５１、ＴＡＣＣ３およびリガーゼ１の５つのＭＣＭタンパク質を含めて３０の遺伝子が、Ｇ１−Ｓ界面遷移に関与していると同定された。ＤＭＰ−７７７で１日または３日処置をしたマウスの胃底腺の基部にあるＳＰＥＭ細胞でＭＣＭ３ならびにＴＡＣＣ３の発現増加(upregulation)を免疫細胞化学によって確認した。これらの変化は、すべて、増殖性表現型に向かう変容と合致する。ガストリン・ノックアウト・マウスのＤＭＰ−７７７での処置が、胃底腺基部でのＢｒｄＵ標識化細胞の増加を生じることは既にのべたが、標識化の増加がＳＰＥＭ表現型の出現を説明できるようには思われない。Ｎｏｍｕｒａ，Ｓ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｃ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｒ．，および Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．(２００４) Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｃｕｔｅ  ｏｘｙｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ（野生型でガストリン欠乏マウスにおける急性酸分泌領域の萎縮によって誘発した胃粘膜系統の変容）．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８８：Ｇ３６２−Ｇ３７５を参照されたい。したがって、Ｇ１／Ｓ界面に関与するタンパク質の発現増加は、ＳＰＥＭ内への主細胞の分化転換と合致する。これは、そのような変化には、大域的なトランススクリプトーム、ＤＮＡをほどくことを必要とする変容、およ���ＤＮＡメチル化における変容を含めて遺伝子の活性化における変化を必要とするであろうという理由からである。
【００９６】
分化転換が起こっていることを示すバイオマーカーに加えて、発現増加のリストは、表２に示すように、分泌性タンパク質あるいは細胞表面タンパク質であるいくつかの重要と推定されるバイオマーカーを含んでいる（倍増数は、２の指数として示してある）。
【００９７】
【表２】
2010502229.tif 000003
【００９８】
これらのタンパク質は、酸分泌領域の萎縮の後、主細胞のＳＰＥＭへの分化転換中に発現が有意に増加するタンパク質のグループを表す。したがって、これらのタンパク質は、胃の前がん性化生に対するバイオマーカーとなり得るものである。
【００９９】
表２に示したバイオマーカーに加えて、発現増加した遺伝子の中にはヒトの副精巣タンパク質４（ＨＥ４）がある。Ｂｉｎｇｌｅ，Ｌ．，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｖ．，および Ｂｉｎｇｌｅ，Ｃ．Ｄ．(２００２) Ｔｈｅ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｏｖａｒｉａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｂｉｏｍａｋｅｒ  ｇｅｎｅ  ＨＥ４（ＷＦＤＣ２），ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｕｎｄｅｒｇｏｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｔｏ  ｙｉｅｌｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ（推定的卵巣腫瘍のバイオマーカー遺伝子ＨＥ４（ＷＦＤＣ２）は、正常な組織で発現し、複雑な交互スプライシングを経て、多数のタンパク質のイソフォームを生じる）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２１；２７６８−２７３３；  Ｂｏｕｃｈａｒｄ，Ｄ．，Ｍｏｒｉｓｓｅｔ，Ｄ．，Ｂｏｕｒｂｏｎｎａｉｓ，Ｙ．，および Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ｇ．Ｍ．(２００６) Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｗｈｅｙ−ａｃｉｄｉｃ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｔｉｆｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ（乳清酸性タンパク質モチーフを有するタンパク質とがん）．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ７：１６７−１７４；  Ｇａｌｇａｎｏ，Ｍ．Ｔ．，Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｇ．Ｍ．，および Ｆｒｉｅｒｓｏｎ，Ｈ．Ｆ．(２００６) Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＨＥ４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ（正常なおよび悪性のヒト組織中のＨＥ４発現の包括的分析）．Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ１９：８４７−８５３；  Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．，Ｒａｙｃｒａｆｔ，Ｊ．，Ｈａｙｄｅｎ−Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．，Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｓｃｈｕｍｍｅｒ，Ｍ．，ＭｃＩｎｔｏｓｈ，Ｍ．，Ｄｒｅｓｃｈｅｒ，Ｃ．，Ｕｒｂａｎ，Ｎ．，および Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｋ．Ｅ．(２００３) Ｔｈｅ  ＨＥ４（ＷＦＤＣ２）  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ａ  ｂｉｏｒｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＨＥ４タンパク質は、卵巣がん腫に対するバイオマーカーである）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ６３：３６９５−３７００を参照されたい。実際、ＨＥ４遺伝子の発現には１６倍以上の増加が観察された。ＨＥ４は、卵巣がんなどいくつかのがんに対する有用なバイオマーカーであると同定されている。例えば米国特許出願公開第２００３／０１０８９６５号を参照されたい。しかし、ＨＥ４は、胃では発現しないと考えられていたため、胃がんに対する有用なバイオマーカーであると同定することは予想されていなかった。Ｇａｌｇａｎｏ，Ｍ．Ｔ．，Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｇ．Ｍ．；および Ｆｒｉｅｒｓｏｎ  Ｊｒ．，Ｈ．Ｆ．(２００６) Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＨＥ４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ（正常なおよび悪性のヒトの組織中のＨＥ４発現の包括的分析）．  Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．１９：８４７−８５３を参照されたい。
【０１００】
図３を参照して、未処置マウスの胃底粘膜ではＨＥ４免疫反応性はほとんどないしまったく観察されなかった。しかし。わずか１日の処置の後、ＨＥ４免疫反応性は、ＳＰＥＭ内で顕著に増加した。さらに、正常なヒトの胃底部はＨＥ４を発現しないが、ＳＰＥＭおよび腸上皮化生はともにＨＥ４を強く発現することが見出された。
【０１０１】
実施例４−８のための材料および方法
遺伝子マイクロアレー分析
ガストリン遺伝子を標的にして崩壊させてガストリン欠乏マウスをつくり、Ｃ５７ＢＬ／６のバックグラウンド上で維持した（Ｎｏｍｕｒａ  Ｓ，Ｙａｓｍａｇｕｃｈｉ  Ｈ，  Ｗａｎｇ  ＴＣ，Ｌｅｅ  ＪＲ，Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ  ＪＲ．Ａｌａｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｃｕｔｅ  ｏｘｙｎｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ（野生型でガストリン欠乏マウスにおける急性酸分泌領域の萎縮によって誘発した胃粘膜系統の変容）．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００４；Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ）。マウスは、０．５％メチルセルロースの中で処方したＤＭＰ−７７７（デュポン製薬からの寄贈）の経口摂食投与で１日または３日処置した（摂食として１日に１回３５０ｍｇ／ｋｇ／日経口投与した）。未処置のマウスは、対照（コントロール）として利用した。マウスを屠殺して、その胃を大湾曲部に沿って切開し、レーザーキャプチャー法による顕微切開を行うために処理して冷凍切片とした。未処置のガストリン欠乏マウスから、胃腺の基部から主細胞を顕微切開した。１日または３日の薬物経口投与後にＤＭＰ−７７７で処置したガストリン欠乏マウスの胃底腺の基部から、出現してきたＳＰＥＭ細胞を顕微切開した。すでに述べたようにして細胞収集（１００００個の細胞）および全ＲＮＡの抽出を行った（Ｎｏｍｕｒａ，Ｓ．，Ｂａｘｔｅｒ，  Ｓ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｌｅｙｓ，Ｃ．，Ｖａｒｔａｐｅｔｉａｎ，Ａ．Ｂ．，Ｆｏｘ，Ｊ．Ｇ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｃ．，および Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ.(２００４) Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｓｐａｓｍｏｌｙｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ  （ＳＰＥＭ）ｔｏ  ｐｒｅ−ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ｉｎ  Ｈ．ｆｅｌｉｓ−ｆｅｃｔｅｄ  ｍｉｃｅ（Ｈ−ｆｅｌｉｓ感染マウスの前がんに対する鎮攣性ポリペプチド発現性化生（ＳＰＥＭ）の関係）．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２７：５８２−５９４）。
【０１０２】
顕微切開で採取した細胞からの全ＲＮＡを逆転写し、Ｎｕｇｅｎ  Ｏｖａｔｉｏｎキットを用いて線形増幅を２ラウンド行って増幅し、ＲＮＡ１０−２０ｎｇを増幅し標識化した。得られた一本鎖のｃＤＮＡ生成物をキアゲン社のＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）カラムへの結合および該かラムからの溶出によって精製した。該ｃＤＮＡ生成物を定量化し、断片化し標識化した生成物２．２μｇを、一晩でアフィメトリックスマウス(Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ)４３０２．０マイクロアレーにハイブリッド形成し、翌日染色と走査を行った。未処置ガストリン欠乏マウス４匹、ＤＭＰ−７７７で１日処置したマウス４匹、およびＤＭＰ−７７７で３日処置したマウス４匹から顕微切開で採取した細胞のうちから遺伝子発現を分析した。Ａｆｆｙ関数をＲで使用して生の遺伝子発現データ（．ｃｅｌ  ｆｉｌｅｓ）を発現値に変換した（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒウエッブサイト参照）。最初に、グループ（対照、１日処置、３日処置）間の差について、分散分析を用いた全体の順列Ｆ−テストを用いてグループ間の発現レベルを比較した。統計的に有意な全体の差が認められる場合には、対照と１日処置および対照と３日処置の対の差について順列ｔ−テストを用いて比較した。次に、統計的に有意な対の差を示すデータにおいて処置グループ（１日および３日）と対照の間で少なくとも４倍の差を要件として候補のプローブのリストをさらに減らした。ＳＡＦＥパッケージをＲで使用してすべての発現データの分析を行った。ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔソフトウエアを用いて注釈およびパスウエイを問い合わせた（Ｚｈａｎｇ  Ｂ，Ｋｉｒｏｖ  Ｓ，Ｓｎｏｄｄｙ  Ｊ．ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｓｅｔｓ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔｅｘｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ２００５；３３：Ｗ７４１−８）。
【０１０３】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応
レーザー捕捉顕微切開を行った正常、ＤＭＰ−７７７での１日処置、およびＤＭＰ−７７７での３日処置のガストリン欠損マウスの胃から得られた細胞の収集物から単離した全ＲＮＡは、定量的ＰＣＲ検定法で分析した。ランダム・プライマーおよびＱｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  トランスクリプターゼ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、４２℃で３０分、各全ＲＮＡ試料からの逆転写を行った。Ｂｉｏ−ＲａｄｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いた３段階法で定量的リアルタイムＰＣＲを行った。各反応は、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）、および１μＬのテンプレートｃＤＮＡからなる５０μＬの混合液の中で行った。使用したプライマーの配列を表３に示す。定量的リアルタイムＰＣＲのためのＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間、９４℃で１５秒間を４５サイクル、６０℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間とした。各試料中のｃＤＮＡテンプレーの定量化は、すでに述べたようにＧＡＰＤＨを対照として使用して比較閾サイクル（ＣＴ）法を用いて判定した（Ｎｏｍｕｒａ，Ｓ．，Ｂａｘｔｅｒ，  Ｓ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｌｅｙｓ，Ｃ．，Ｖａｒｔａｐｅｔｉａｎ，Ａ．Ｂ．，Ｆｏｘ，ＪＧ．，Ｌｅｅ，ＪＲ．，Ｗａｎｇ，ＴＣ．，および Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，ＪＲ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｓｐａｓｍｏｌｙｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ  （ＳＰＥＭ）ｔｏ  ｐｒｅ−ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ｉｎ  Ｈ．ｆｅｌｉｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｍｉｃｅ（Ｈ−ｆｅｌｉｓ感染マウスの前がんに対する鎮攣性ポリペプチド発現性化生（ＳＰＥＭ）の関係）．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ(２００４) １２７：５８２−５９４）。グループ間の平均ΔΔＣＴの統計的比較は、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵテストを用いて判定した。
【０１０４】
表３
定量的ＰＣＲに用いたプライマー・セット
ＧＡＰＤＨに対して特異的な人工生成ＰＣＲセンス・プライマー配列
ＧＡＰＤＨに対して特異的な人工生成ＰＣＲアンチセンス・プライマー配列
GAPDH    センス 5’-TGA CGT GCC GCC TGG AGA AA-3’ (SEQ ID NO:1)
アンチセンス 5’-CCG GCA TCG AAG GTG GAA GAG-3’ (SEQ ID NO:2)
生成物サイズ: 160bp
MCM3     センス5’-GCG CAG AGA GAC TAC TTG GAC-3’ (SEQ ID NO:3)
アンチセンス5’-TGC TTG GCG TAG GTG G-3’ (SEQ ID NO:4)
生成物サイズ: 239bp
MCM5     センス5’-GCG GCA TTA CAA CCT GGG TGA-3’ (SEQ ID NO:5)
アンチセンス5’-ACG GGC TGG CAT CTG ACT TGA-3’ (SEQ ID NO:6)
生成物サイズ: 224bp
MCM7     センス5’-CAC GCT CAA TGC CCG ATG CT-3’ (SEQ ID NO:7)
アンチセンス5’-TTG TCT CTG TCG GGC CGG TCT-3’ (SEQ ID NO:8)
生成物サイズ: 159bp
ST3GAL6  センス 5’-CAT ATA TCA CCA GCG AAG CAG-3’ (SEQ ID NO:9)
アンチセンス 5’-TGG CAT TCC CGT AGT AGT GT-3’ (SEQ ID NO:10)
生成物サイズ: 198bp
ATF3     センス5’-GAT GCA ACG CGC TCC CAG-3’ (SEQ ID NO:11)
アンチセンス 5’-GGC GGC CAG GGT CCA GAG AAC-3’(SEQ ID NO:12)
生成物サイズ: 163bp
HE4      センス5’-TGC CTG CCT GTC GCC TCT G-3’ (SEQ ID NO:13)
アンチセンス5’-TGT CCG CAC AGT CCT TGT CCA-3’ (SEQ ID NO:14)
生成物サイズ: 171bp
IL1RN    センス5’-TTG GCC TAG GTG TCT TCT GCT-3’ (SEQ ID NO:15)
アンチセンス5’-TAT GTG ATG CCC TGG TGG TT-3’ (SEQ ID NO:16)
生成物サイズ: 243bp
TFF2     センス 5’-TGC TTT GAT CTT GGA TGC TG-3’ (SEQ ID NO:17)
アンチセンス5’-GGA AAA GCA GCA GTT TCG AC-3’ (SEQ ID NO:18)
生成物サイズ: 191bp
【０１０５】
免疫組織化学
ＤＭＰ−７７７で処置したガストリン欠乏マウスまたは未処置の対照から切除した胃をパラフィンに埋め込んだものを免疫組織化学分析に使用した。Ｃ５７ＢＬ／６野生型のマウスからとった胃およびＨ．ｆｅｌｉｓ−感染Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６ヶ月感染）からの切片も比較のために染色して検査した。免疫組織化学分析のために、Ｍｉｓｔ１染色を除いて、パラフィンを除去した切片をＴａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ（標的回収）溶液（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）を用い、１２０℃で１５分間、抗原回収で事前処理し、その後ただちに氷水で冷却した。Ｍｉｓｔ１の免疫組織化学分析では、抗原回収作業中にＴｒｉｌｏｇｙ抗原回収溶液（Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いた。断片は、２％の遮断血清で処理し、次に一次抗体を用いて４℃で一晩インキュベートした。以下の一次抗体を用いて免疫染色を行った：ネズミのモノクローナル・イムノグロブリンＭ（ｌｇＭ）抗トレフォイル因子ファミリー２（ＴＦＦ２，英国Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，サー・ニコラス・ライトからの寄贈１：１０００）、ウサギのａｎｔｉ−Ｍｉｓｔ１（１：２０００）、ネズミのモノクローナル・ａｎｔｉ−Ｈ／Ｋ−ＡＴＰａｓｅ（サウスカロライナ州医科大学アダム・Ｊ・スモルカ博士からの寄贈、１：１００，０００）、ウサギのａｎｔｉ−ＨＥ４（１：２０００）、ウサギのａｎｔｉ−内因子（セントルイス、ワシントン大学デヴィッド・アルパーズ博士からの寄贈、１：２０００）、ヤギのａｎｔｉ−内因子（１：２０００）、ウサギのａｎｔｉ−ＭＣＭ３（１：２０００），ラットのモノクロナール・ａｎｔｉ−Ｋｉ６７（ＴＥＣ−３、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ；１：２００）。
【０１０６】
免疫蛍光法分析のためには、Ｃｙ３−ヤギアンチ−マウス  ＩｇＭ抗体、Ｃｙ５−ヤギアンチ−マウス  ＩｇＧ抗体（ペンシルベニア州ウエストグラブ、ジャクソン・イムノリサーチ）、およびＡｌｅｘａ４８８ヤギアンチ−ラビット  ＩｇＧ（カリフォルニア州カールスバッド、インビトロゲン）を使用した。核の対比染色およびマウント用媒質のためには、ＰＲＯＬＯＮＧ（登録商標）  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  ＲｅａｇｅｎｔをＤＡＰＩ（インビトロゲン）とともに用いた。
【０１０７】
ジアミノベンジジンで検出する免疫組織化学分析では、切片をビオチン標識二次抗体と共に、次に西洋ワサビぺロキシダーゼ共役ストレプタビジンと共にインキュベートした。ジアミノベンジジン（カリフォルニア州サンラモン、バイオジェネックス社）でクロモゲンを発現させた。アルカリ性フォスファターゼで検出する免疫組織化学分析では、切片をビオチン標識二次抗体と共に、次にアルカリ性フォスファターゼ共役アビジン−ビオチン錯体と共にインキュベートした。ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）  Ｒｅｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  （カリフォルニア州バーリンゲーム、ベクター・ラボラトリーズ社）でクロモゲンを発現させた。切片は、すべてジルのヘマトキシリンで対比染色した。
【０１０８】
切片を目視し、さらにツァイスのＡＸＩＯＶＩＳＩＯＮ（登録商標）デジタル撮像システム（ツァイス）またはＦＬＵＯＶＩＥＷ（登録商標）ＦＶ１０００共焦顕微鏡システム（オリンパス）を備えたＡＸＩＯＰＨＯＴ（登録商標）顕微鏡で写真撮影した。
【０１０９】
ヒトの胃試料の染色には、すでに述べたように二つの組織のアレーを利用した（Ｌｅｙｓ  ＣＭ，Ｎｏｍｕｒａ  Ｓ，Ｒｕｄｚｉｎｓｋｉ  Ｅ，Ｋａｍｉｎｉｓｈｉ  Ｍ，ｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  Ｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＭＫ，Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ  ＪＲ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｄｘ−１  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｉｎｏｍａ（ヒトの胃の化成および胃の腺がんにおけるＰｄｘ−１の発現）．Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００６；３７：１１６２−８）。一つの組織アレーは、日本国東京大学で切除した３３の胃から得られた正常な胃粘膜およびＳＰＥＭならびに胃上皮化生の例となる試料を含むものであった。第二のアレーは、テネシー州ナッシュビルのヴァンダービルト大学で切除した４４人の対象者からえられた正常な粘膜および胃腺がんを含むものであった。
【０１１０】
電子顕微鏡分析
未処置の対照およびＰＢＳ中の０．１ＭのＣａｃｏｄｙｌａｔｅ緩衝剤、２．５％のグルタールアルデヒドの中で氷の上で２．５時間固定した、３日ＤＭＰ−７７７で処置したガストリン欠損マウスの胃底領域から得られた新鮮な試料を用いた。試料は、１％の四酸化オスミウム（ＯｓＯ４）および０．１ＭのＣａｃｏｄｙｌａｔｅ緩衝剤の中で４℃で一晩固定した。その後、試料にエタノール脱水シリーズを行い、Ｓｐｕｒｒｓ樹脂のなかに埋め込んだ。５０−１００ｎｍの薄い切片を切り取って２００メッシュのｆｏｒｍｖａｒ被覆した銅格子の上に回収した。一晩乾燥した後、格子を２％劣化ウラニルアセテート（ＵＡ）で対比染色し、さらに飽和クエン酸鉛で染色した。試料を、フィリップＣＭ１２電子顕微鏡で検査した。
【０１１１】
実施例４
分化転換に関する形態学的証拠
ガストリン欠乏マウスでＳＰＥＭが急速に広がることを暗示する結果が得られていることから（Ｎｏｍｕｒａ，Ｓ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，ＴＣ．，Ｌｅｅ，ＪＲ．，および Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，ＪＲ．Ａｌａｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｃｕｔｅ  ｏｘｙｎｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００４（野生型でガストリン欠乏マウスにおける急性酸分泌領域の萎縮によって誘発した胃粘膜系統の変容）），ｂＨＬＨ転写因子Ｍｉｓｔ１を発現する成熟主細胞がＤＭＰ−７７７で処置したマウスでＳＰＥＭを生じ得るものか否かの評価を行った（Ｒａｍｓｅｙ  ＶＧ，Ｄｏｈｅｒｔｙ  ＪＭ，Ｃｈｅｎ  ＣＣ，Ｓｔａｐｐｅｎｂｅｃｋ  ＴＳ，Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ  ＳＦ，Ｍｉｌｌｓ  ＪＣ．Ｔｈｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｃｕｓ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎｔｏ  ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ−ｅｎｚｙｍｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｚｙｍｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｍｉｓｔ１（粘液分泌胃上皮前駆細胞の消化酵素分泌酵素源細胞への成熟はＭｉｓｔ１を必要とする）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ (２００７)；１３４：２１１−２２）。  未処置のガストリン欠乏マウスでは、成熟した主細胞の核がＭｉｓｔ１に対する抗体で染色し、頚部粘液細胞は、ＴＦＦ２抗体で染色した（図４Ａ）。これに対して、ＤＭＰ−７７７で３日処置したマウスでは、Ｍｉｓｔ１免疫反応細胞の数は腺の基部で減少し、多くのＭｉｓｔ１陽性細胞はＴＦＦ２に対して二重に免疫反応性があった（図４、Ｂ−Ｃ参照）。正常な胃では、ＴＦＦ２および内因子は、それぞれ頚部粘液細胞または主細胞の分泌顆粒で発現した（図４Ｄ）。しかし、ＤＭＰ−７７７で３日処置したガストリン欠乏マウスでは、胃底腺の基部に、ＴＦＴ２および内因子染色顆粒の二つの個別の個体群を発現するＳＰＥＭ細胞が存在した（図４、Ｅ−Ｆ）。これらの結果は、ＤＭＰ−７７７で処置したマウスの壁細胞の欠損は、主細胞の細胞表現型の顕著な変容を誘発することを暗示している。
【０１１２】
細胞系統(cell lineages)をより正確に検査するため、未処置のガストリン欠乏マウスからの主細胞およびＤＭＰ−７７７で３日処置したガストリン欠乏マウスから出現してきたＳＰＥＭ細胞を電子顕微鏡で検査した（図４、Ｇ−Ｉ）．未処置のマウスでは、均質に染色したチモーゲン顆粒とともに正常な主細胞が観察された（図４Ｇ）。しかし、ＤＭＰ−７７７で処置した細胞では、胃底腺基部でＳＰＥＭ細胞に異質な顆粒形態の集合が観察された（図４、Ｈ−Ｉ）。ＳＰＥＭ細胞は、ほぼ核周辺部でいくつかの正常に見えるチモーゲン顆粒を含んでいたが、粘液分泌顆粒とより整合性のある形態で比較的電子濃度の高い物質および電子密度の低い単一の輝く円形外周内包部を有する大きい顆粒も存在した。さらに、内腔下部で多数の比較的小さい電子密度の低い顆粒が観察された。主細胞顆粒形態のこれらの変化は、アポトーシスの形態的証拠なしに観察された。これらの結果は、粘膜分泌細胞により類似した形態を採用するためにそれらの顆粒の内容物を変容させていることを示す（Ｒａｍｓｅｙ  ＶＧ，Ｄｏｈｅｒｔｙ  ＪＭ，Ｃｈｅｎ  ＣＣ，Ｓｔａｐｐｅｎｂｅｃｋ  ＴＳ，Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ  ＳＦ，Ｍｉｌｌｓ  ＪＣ．Ｔｈｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｃｕｓ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎｔｏ  ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ−ｅｎｚｙｍｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｚｙｍｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｑｕｉｒｅ  Ｍｉｓｔ１（粘液分泌胃上皮前駆細胞の消化酵素分泌酵素源細胞への成熟はＭｉｓｔ１を必要とする）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００７；１３４：２１１−２２）。
【０１１３】
実施例５
ＳＰＥＭの出現の遺伝子マイクロアレー分析
ＳＰＥＭの出現にともなう遺伝子発現の変容を分析するため、レーザーキャプチャー法による顕微切開を利用して、未処置のガストリン欠乏マウスから主細胞をまたＤＭＰ−７７７で１日または３日処置したガストリン欠乏マウスから出現してきたＳＰＥＭ細胞を単離した。アフィメトリックス遺伝子マイクロアレーを、顕微切開で得た細胞から作成したｍＲＮＡで精査した。表４は、わずか１回ＤＭＰ−７７７で処置した後、この薬物の処置によって多数の転写物の発現が急速に増加したことを示している。経路分析は、転写物の最も顕著な集合が細胞周期調節とヌクレオチドの代謝に関与していることを示している（表４Ａ）。とくに、発現増加した転写物に対するトップ５０のプローブの中の３４個は、ＡＴＦ３、ＲＩＳ２、ＲＡＤ５１、ＴＡＣＣ３およびリガーゼ１の５つのＭＣＭタンパク質を含めてＧ１／Ｓ遷移の調節に関係するタンパク質に対するメッセージを検出した。ＤＭＰ−７７７で１日および３日処置したマウスの発現増加した遺伝子の転写物のコホートでは、ともにプロ−アポトーシス（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）遺伝子が検出されなかった。遺伝子転写物の発現減少の明確なパターンは観察されなかったが、主細胞の生成物であるリパーゼに対する転写物の有意な減少があったことは注意に値する。Ｇ１／Ｓ調節因子の発現増加に加えて、ＷＦＤＣ２（ＨＥ４）およびＷＤＮＭ１（Ｅｘｐｉ）の二つのＷＡＰドメインのタンパク質、インターロイキン−１受容体阻害アンタゴニスト（ＩＬ１ＲＮ），およびエピレグリンを含めて多数の分泌された調節因子の顕著な発現増加を観察した（表４Ｂ）。
【表４】
2010502229.tif 000004
【０１１４】
実施例６
ＳＰＥＭの出現の定量的ＰＣＲ分析
遺伝子マイクロアレーによる研究の結果の妥当性を確認するため、定量的ＰＣＲを用いて、顕微切開した系統の中から選んだ発現増加した転写物または発現減少した転写物の発現を評価した。ＭＣＭ３，ＭＣＭ５，ＭＣＭ７，およびＡＴＦ３を含めてＧ１／Ｓ関連転写物の発現増加(up-regulation)が確認された（図５）。ＨＥ４およびＩＬ１ＲＮを含めて推定される可溶性メジエーターに関する転写物の発現増加も確認され、また、ＳＴ３ＧａＩ６の発現減少(down-regulation)も確認された。すでに述べたように、アフィメトリックス遺伝子アレーは、ＴＦＦ２の発現の変化を正確に検出しない（Ｎｏｍｕｒａ，Ｓ．，Ｂａｘｔｅｒ，  Ｓ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｌｅｙｓ，Ｃ．，Ｖａｒｔａｐｅｔｉａｎ，ＡＢ．，Ｆｏｘ，ＪＧ．，Ｌｅｅ，ＪＲ．，Ｗａｎｇ，ＴＣ．，Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，ＪＲ.２００４．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｓｐａｓｍｏｌｙｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ  （ＳＰＥＭ）ｔｏ  ｐｒｅ−ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ｉｎ  Ｈ．ｆｅｌｉｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｍｉｃｅ（Ｈ−ｆｅｌｉｓ感染マウスの前がんに対する鎮攣性ポリペプチド発現性化生（ＳＰＥＭ）の関係）．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ２００４；１２７：５８２−５９４）。しかし、定量的PＣＲ測定法では、ＤＭＰ−７７７処置した動物から出現するＳＰＥＭで、ＴＦＦ２のレベルは７倍以上に上昇した（図５）。
【０１１５】
実施例７
急性酸分泌領域の萎縮につづいてＭＣＭ３およびＴＡＣＣ３の発現は増加する
Ｇ１／３遷移に関与する転写物の発現増加を調べるために、ＤＭＰ−７７７処置したまたは未処置のガストリン欠損マウスの胃を、増殖性細胞の一般的なバイオマーカーであるＭＣＭ３およびＫｉ６７に対する抗体で二重染色して検査した（図６）。未処置のマウスでは、ＭＣＭ３は、腺の頚部にある正常な前駆細胞(progenitor)帯内部の細胞に主として局在した（図６Ａ）。しかし、ときどき、胃底腺の基部の細胞内の核ＭＣＭ３染色が観察された（図６Ａ）。ＤＭＰ−７７７処置したマウスでは、増殖性頚部領域でのＭＣＭ３染色に加えて、胃底腺基部のＳＰＥＭ細胞内で顕著な核染色が観察された（図６、Ｂ−Ｅ）。ＭＣＭ３発現細胞は、Ｋｉ６７標識化細胞と比較して、ＳＰＥＭ細胞内部でより広範に分布していた。Ｋｉ６７陽性細胞の数は、ＤＭＰ−７７７処置後にわずかな増加を示したが、ＭＣＭ陽性細胞の数は、１日のＤＭＰ−７７７処置後（図６Ｂ）に増加し、処置から１４日間高いレベルにとどまっていた（図６、Ｃ−Ｅ）。これらの結果は、出現したＳＰＥＭの中でのＭＣＭ３の活性化は、細胞周期の中に活性参入する場合より顕著であることを暗示している（図６Ｆ）。
【０１１６】
これらの結果は、胃腺基部から出現するＳＰＥＭ細胞はMＣＭ３を発現することを示しているが、未処置マウスの腺基部でのＭＣＭ３染色の同一性を理解することも求められる。上の観察結果は、同様なＭＣＭ３発現細胞が野性型のＣ５７ＢＬ６マウスの腺基部でも観察されることから（データは示していない）、ガストリン欠損マウスに特有のものではない。このため、ＭＣＭ３および成熟した主細胞のバイオマーカーである内因子双方の切片の二重染色を行った（図７）。すべての場合、腺基部のＭＣＭ染色核をもつ細胞は、内因子に対しても主細胞であることを示す免疫反応性を示した（図７Ｂ）。
【０１１７】
細胞周期の開始に関連するタンパク質であるＴＡＣＣ３（Ａｉｔｏｌａ  Ｍ，Ｓａｄｅｋ  ＣＭ，Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ＪＡ，Ｐｅｌｔｏ−Ｈｕｉｋｋｏ  Ｍ．Ａｎｔｉ／Ｔａｃｃ３  ｉｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ａｎｔｉ／Ｔａｃｃ３は、発生、精子形成、および卵形成中に増殖するマウスの組織で高度に発現する）．Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ(２００３)；５１：４５５−６９）の発現も、ＤＭＰ−７７７処置したマウスの胃で検査した。未処置のマウスの胃では、ＴＡＣＣ３の発現はほとんど認められなかったが（図５）、３日ＤＭＰ−７７７で処置した後のマウスの胃底腺の基部のＳＰＥＭ細胞ではＴＡＣＣ３の発現が大きく増加した（図８）。
【０１１８】
実施例８
胃の化生およびがんでのＨＥ４の発現増加
すでに述べたように、ＳＰＥＭの出現はいくつかの分泌因子の発現増加と合致する。したがって、ガストリン欠損マウスのＷＡＰドメインのタンパク質ＨＥ４に対する免疫染色を行った。免疫染色は、ガストリン欠損マウス（図９Ａ）あるいは野生型Ｃ５７ＢＬ６マウスの正常な胃粘膜でほとんど検出できなかった。しかし、ＤＭＰ−７７７で処置したマウスでは、胃底腺の基部のＳＰＥＭ細胞でＨＥ４の発現の顕著な増加が観察された（図９Ｂ）。免疫蛍光染色調査では、ＨＥ４の顆粒は、ＳＰＥＭ細胞中のＴＦＦ２染色性顆粒から明白に染色された。ＨＥ４の発現増加がＳＰＥＭに共通の特性であるかどうかを評価するために、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｌｉｓ（ヘリコバクター・フェリス菌）９ヶ月間に感染したＣ５７ＢＬ／６マウスの粘膜でのＨＥ４の染色を同様に評価した。Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｌｉｓ（ヘリコバクター・フェリス菌）に感染したマウスの胃底部の粘膜全体で、ＳＰＥＭ細胞に顕著なＨＥ４染色が観察された（図９Ｃ）。
【０１１９】
マウスの研究で、ＨＥ４の発現と胃化生(gastric metaplasia)との強い関連が暗示されたため、ヒトの胃におけるＨＥ４の発現を評価した。すでに述べたように（Ｂｉｎｇｌｅ  Ｌ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  Ｖ、Ｂｉｎｇｌｅ  ＣＤ．Ｔｈｅ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｏｖａｒｉａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｂｉｏｍａｋｅｒ  ｇｅｎｅ  ＨＥ４（ＷＦＤＣ２），ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｕｎｄｅｒｇｏｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｔｏ  ｙｉｅｌｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ（推定的卵巣腫瘍のバイオマーカー遺伝子ＨＥ４（ＷＦＤＣ２）は、正常な組織で発現し、複雑な選択的スプライシングを受けて、多数のタンパク質のアイソフォームを生じる）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ(２００２)；２１；２７６８−７３）、ＨＥ４は、正常なヒトの胃基部粘膜では検出されなかった（図９Ｄ）．おどろくべきことに、ＳＰＥＭおよび胚細胞胃上皮化生の両方および遷移性化生の変化においてもＨＥ４は強く発現したことが見出される。（図９、Ｅ−Ｉ）。さらに、組織アレー分析によって、ＳＰＥＭ（図９Ｅ），ＳＰＥＭおよび腸上皮化生遷移性病変（図９Ｆ），ＳＰＥＭと腸上皮化生の共存病変（図９、Ｇ−Ｈ）、および腸上皮化生（図９Ｉ）を含めてすべての化生病変で陽性であることが示された。ヒトの胃の化生におけるＨＥ４の強い発現が与えられるならば、ヒトの胃腺がんにおけるＨＥ４の発現も同じく検査した。胃がんの一般的な欠損を示すＴＦＦ２と異なって、よくないしは中程度に分化した腸型の胃腺がんの７０％でＨＥ４の持久的な発現が観察された（図１０、Ａ−Ｄ）、びまん性腫瘍または低分化腫瘍の２０％も、ＨＥ４染色を示した（図１０、Ｅ−Ｆ）。ＨＥ４染色は、印環細胞型腺がんの８０％でとくに強かった（図１０、Ｇ−Ｉ）。免疫蛍光染色でも同様な結果が観察され、ＨＥ４について組織化学的染色の結果が支持された（図１０、Ｊ−Ｌ）。これらの結果は、ＨＥ４が、胃の前がんおよび新生組織形成の過程に対する耐久性のあるバイオマーカーであることを示している。
【０１２０】
実施例の検討
壁細胞の欠損すなわち酸分泌領域の萎縮は、ヒトの胃がんと確実に相関している。上の実施例で示された結果は、ガストリン欠乏マウスの壁細胞の欠損が、胃底部の主細胞の粘液分泌ＳＰＥＭ系統への分化転換を招くことを暗示している。この分化転換の過程にともなって、Ｇ１／Ｓ期の遷移に関係する遺伝子の発現が増加し、それが細胞の個体群の細胞周期への再参入を招くことが観察された。この分化転換の過程は、正常な胃の粘膜には通常存在しない多数の推定される可溶性調節因子の発現増加にも関連していた。とくに、ＨＥ４は、マウスとヒト双方の胃の化生で発現が増加し、その発現は、胃腺がんでも維持された。したがって、マウスにおける分化転換の過程を検査したことによって、ヒトにおける腫瘍形成の過程に関連する多数のきわめて重要な調節因子が明らかにされた。
【０１２１】
胃の粘膜の観察は、もっぱら胃底腺の頚部における正常な前駆細胞帯からの系統生成に集中しておこなわれていたが、本発明における調査は、壁細胞の欠損につづいて誘発された胃底腺の基部で増殖性の潜在的区室に注意を集中した（Ｎｏｍｕｒａ  Ｓ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｈ，Ｗａｎｇ  ＴＣ，Ｌｅｅ  ＪＲ，Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ  ＪＲ．Ａｌａｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｃｕｔｅ  ｏｘｙｎｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ（野生型でガストリン欠乏マウスにおける急性酸分泌領域の萎縮によって誘発した胃粘膜系統の変容）．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．(２００４)）。特定の理論に束縛されたくないが、この観察には二つの説明がある。第一に、頚部における正常な前駆細胞領域とは別に、胃底腺の基部に隠れた前駆細胞の個体群が存在するかもしれず、これは、壁細胞が放出する粘膜分化因子によって抑制されるものと思われる。あるいは別法として、主細胞の分化転換からＳＰＥＭが発生するのかもしれない。これまでの研究は、急性酸分泌領域萎縮からマウスの分化主細胞のバイオマーカーであるＭｉｓｔ１および内因子を発現する増殖性細胞が観察されるようになることを示している（Ｎｏｍｕｒａ  Ｓ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｈ，Ｗａｎｇ  ＴＣ，Ｌｅｅ  ＪＲ，Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ  ＪＲ．Ａｌａｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｃｕｔｅ  ｏｘｙｎｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ（野生型でガストリン欠乏マウスにおける急性酸分泌領域の萎縮によって誘発した胃粘膜系統の変容）．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００４）（Ｎａｍ  ＫＴ，Ｖａｒｒｏ  Ａ，Ｃｏｆｆｅｙ  ＲＦ，Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ  ＪＲ．Ｐｏｎｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｘｙｎｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ  ｉｎ  ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ（アンフィレグリン欠乏マウスの酸分泌領域の萎縮によって誘発された胃化生の増強）．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ(２００７)；１３２：１８０４−１９）．内因子は珍しい前チモゲン細胞で発現されるが、Ｍｉｓｔ１は成熟主細胞でのみ発現される(Ramsey VG, Doherty JM, Chen CC, Stappenbeck TS, Konieczny SF, Mills JC. 粘液分泌胃上皮前駆細胞の消化酵素分泌チモゲン細胞への成熟にはＭｉｓｔ１を必要とする。Development (2007); 134:211〜22)。本発明におけるＴＦＦ２を発現するＭｉｓｔ１免疫反応性細胞の観察は、主細胞の分化転換がＳＰＥＭ発生の起源であることを支持するものである。しかし、これらの所見は、また、両仮説と両立するモデルを支持するものかもしれない。Ｇ１／Ｓ遷移中のＤＮＡをほどくのに必要であるＭＣＭ３は、胃腺頚部の正常な前駆細胞のみならず、胃底腺の基部の内因子―免疫反応性主細胞の小さい個体群の中でも発現した。したがって、主細胞の亜個体群、実際には隠れた(cryptic)前駆細胞の個体群が、分化転換の可能性をもっているのかもしれない。さらに、ＤＭＰ−７���７の処置後のガストリン欠乏マウスにおける胃腺基部でのＳＰＥＭの急速な出現は、わずか１日または３日の処置後に観察されたＳＰＥＭの量を説明するためにはより幅広い分化転換の過程が必要とされることを暗示している。
【０１２２】
顕微切開で得られたＳＰＥＭ細胞の遺伝子マイクロアレーの研究も、主細胞の分化転換に関する一つの分子表現型を支持するものである。Ｇ１／Ｓ細胞周期の遷移の開始に関係する遺伝子転写物のコホートのＤＭＰ−７７７の一回のみの投与後に急速な発現増加が観察されている。ＭＣＭタンパク質（ＭＣＭ２−７）は、Ｍ／Ｇ１で転写され、集まって、ＤＮＡ合成に先立ってクロマチンをほどく機能をもつＤＮＡへリカーゼとなる（Ｂｒａｕｎ  ＫＡ，Ｂｒｅｅｄｅｎ  ＬＬ．Ｎａｓｃｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＣＭ２−７  ｉｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  Ｇ１．（ＭＣＭ２−７の転写初期は、Ｇ１におけるミニ染色体維持複合体の核局在化にとって重要である）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ (２００７)；１８：１４４７−５６）。ＭＣＭ３は、Ｇ２／Ｍにおいて特異的に偏在化され、細胞が有糸分裂を終了すると劣化する。さらに、ＭＣＭタンパク質は、ＤＭＰ−７７７処置したマウスの胃底腺の基部におけるＳＰＥＭ内で幅広く発現増加したが、増殖周期に参入する細胞の亜集合もただ一つではあるが観察された。したがって、いくつかの細胞は、細胞周期に再参入するが、Ｇ１／Ｓ遷移に関与する多数のタンパク質の発現増加の観察も、もう一つの仮説と合致している。分化転換には、必ずしも増殖周期に進むことなく、細胞で発現した一連の転写物の大きな変更を必要とするであろう。そのような転写物の変化には、Ｇ１／Ｓ細胞周期の界面における場合のようにＤＮＡをほどくことが必要となろう。したがって、ＤＮＡリモデリングに関与するタンパク質の発現増加は、分化転換の過程を増殖の活性化より大きく反映しているかもしれない。ＤＭＰ−７７７で処置したマウスにおけるＭＣＭ３の持久的な発現は、細胞周期の限られた進行と共に分化転換中に一連の転写物の変更のコンセプトを支持するものである。
【０１２３】
本明細書で示された所見は、さらに、分化転換が、粘液細胞化生に対して特異的な遺伝子転写物の発現増加を招くことを暗示している。チモゲン細胞の粘液化生への分化転換は、上部消化管における前がん遷移の基礎となる一般的なメカニズムかもしれない。Ｍｅａｎｓ等は、ＴＧＦαの過発現が、すい臓チモゲン細胞の粘液分泌化生細胞への分化転換を招くことを証明した（Ｍｅａｎｓ  ＡＬ，Ｍｅｓｚｏｅｌｙ  ＩＭ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｙ，Ｒｕｓｔｇｉ  ＡＫ，Ｃｏｆｆｅｙ  ＲＪ，Ｊｒ．，Ｗｒｉｇｈｔ  ＣＶ，Ｓｔｏｆｆｅｒｓ  ＤＡ，Ｌｅａｄ  ＳＤ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｃｉｎａｒ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｓｔｉｎ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｍｄｉａｔｅｓ（腺房細胞の分化転換およびネスチン陽性介在物の生成によって仲介されるすい臓上皮の塑性）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ (２００５)；１３２：３７６７−７６）。腺房細胞の分化転換は、すい臓における前がんＰＡＮＩＮ病変に寄与する（Ｚｈｕ  Ｌ，Ｓｈｉ  Ｇ，  Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＣＭ，Ｈｒｕｂａｎ  ＲＨ，Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ  ＳＦ．Ａｃｉｎａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｎｔｒａｅｐｈｉｔｈｅｌｉｃａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ（腺房細胞は、すい臓上皮内腫瘍の分子異種接合性に寄与する）．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ (２００７)；１７１：２６３−７３）。同様に、壁細胞の欠損は、胃のチモゲン分泌主細胞の分化転換を誘発するかもしれない。しかし、本発明における所見は、分化転換の過程にともなって、粘液細胞化生が、ＨＥ４，ＷＤＮＭ１，ＩＬ１ＲＮ，およびエピレグリンを含めて特異的分泌粘膜因子の発現を増加させることを暗示している。ＩＬ１ＲＮは、多数の腫瘍過程に関係してきている（Ｍａｃｈａｄｏ  ＪＣ，Ｐｈａｒｏａ  Ｐ，Ｓｏｕｓａ  Ｓ，Ｃａｒｖａｌｈｏ  Ｒ，Ｏｌｉｖｅｉｒａ  Ｃ，Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  Ｃ，Ａｍｏｒｉｍ  Ａ，ＳｅｒｕｃａＲ，Ｃａｌｄａｓ  Ｃ，Ｃａｒｎｅｉｒｏ  Ｆ，Ｓｏｂｒｉｎｈｏ−Ｓｉｍｏｅｓ  Ｍ．Ｉｎｔｅｒｌｅｉｋｉｎ  １Ｂ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １ＲＮ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｇａｓｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（インターロイキン１Ｂおよびインターロイキン１ＲＮの多型性は、胃がんの危険性の増大と関連している）．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ (２００１)；１２１：８２３−９）。ＨＥ４は、卵巣がんの発生から早期に発現が増加し、卵巣腫瘍のバイオマーカーとして役立つかもしれない（Ｄｒａｐｋｉｎ  Ｒ，ｖｏｎ  Ｈｏｒｓｔｅｎ  ＨＨ，Ｌｉｎ  Ｙ，Ｍｏｋ  ＳＣ，Ｃｒｕｍ  ＣＰ，Ｗｅｌｃｈ  ＷＲ，Ｈｅｃｈｔ  ＪＬ．Ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＨＥ４）ｉｓ  ａ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｓｅｒｏｕｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｉｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｉｎｏ��ａｓ，  ｂｕｔ  ｈａｓ  ｎｏｔ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｂｅｅｎ  ｒｅｐｏｒｔｅｄ  ｉｎ  ｕｐｐｅｒ  ＧＩ  ｃａｎｃｅｒｓ（ヒトの精巣上体タンパク質４（ＨＥ４）は、漿液および卵巣類内膜がんによって過発現する分泌性糖タンパク質であるが、これまで上部消化器がんでは報告されていない。）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ (２００５)；６５：２１６２−９）。ＨＥ４は、正常なヒトの胃粘膜では発現しない。おどろくべきことに、本発明のデータは、腸上皮化生およびＳＰＥＭの両方でＨＥ４発現の顕著な発現増加を証明している。重要なことは、ＨＥ４の発現が、大多数の分化した胃腺がんで維持されることである。したがって、本発明の実施例は、ＳＰＥＭを生成するための分化転換の過程で発現が増加した因子が、胃の前がんおよび腫瘍の代理バイオマーカーとして役立つかもしれないことを示している。
【０１２４】
本発明のデータは、また、ＰＡＮＩＮ病変および腎臓腺がんにおけるＨＥ４の発現増加を証明している（図１１）。ＨＥ４は、正常なすい臓外分泌部では検出されなかった。しかし、ＰＡＮＩＮ病変およびすい臓腺がんの双方においてＨＥ４の強い染色が観察された（図１１）。
【０１２５】
要するに、従来の見解は胃の上皮化生が正常な粘膜前駆細胞から生じることを暗示しているが、本発明の実施例は、胃底部粘膜から壁細胞の欠損が生じることが、主細胞の転写分布の変容を誘発し、それが、細胞分泌表現型および分化転換の変化を招いて粘液細胞の化生にいたることを示している。これらの変化にともなって、ＨＥ４などの特定の可溶性調節因子および本明細書で開示されている他のバイオマーカー（表１）が、化生の中で発現増加するものであり、これらのバイオマーカーは、化生および前がんの過程に対して特徴的な推定的バイオマーカーを代表するものである。
【０１２６】
本発明のさまざまな詳細部分は、本発明の範囲から逸脱することなく変更し得るものであることは理解されよう。さらに、上の記述は、本発明を例示するためのみのものであり、本発明を限定するためのものではない。
【図１】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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