(57)【要約】  本発明は、ヘプシジンに対して特異性を有する抗原結合タンパク質、ならびにヘプシジンと関連している疾患を治療および診断するためのそれらの使用に関する。
2010539969.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトヘプシジン−２５と結合できること、ならびにハイブリドーマＣＮＣＭ  Ｉ−３７９４によって産生された抗体ＡＮ−ＬＰ１の重鎖のＶＨ−ＣＤＲ３および軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ３を少なくとも含むことを特徴とする抗原結合タンパク質。
【請求項２】
抗体ＡＮ−ＬＰ１の重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１および軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３】
抗体ＡＮ−ＬＰ１の重鎖のＶＨ−ＣＤＲ２および軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ２をさらに含むことを特徴とする、請求項１または２のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４】
ａ）ハイブリドーマＣＮＣＭ  Ｉ−３７９４によって産生されたモノクローナル抗体ＡＮ−ＬＰ１、
ｂ）抗体ＡＮ−ＬＰ１の抗原結合断片、
ｃ）ＡＮ−ＬＰ１から得られたキメラまたはヒト化抗体、
ｄ）上記の抗体ｃ）の抗原結合断片
の間から選択されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５】
ヘプシジンとフェロポーチンの結合を阻害できる、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を発現する細胞。
【請求項９】
ハイブリドーマＣＮＣＭ  Ｉ−３７９４である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項７に記載の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項１から５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を調製する方法であって、請求項８から１０のいずれか一項に記載の少なくとも１種の細胞を培養するステップと、前記培養物から前記タンパク質を回収するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
生体サンプル中のヘプシジンを検出するための、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の使用。
【請求項１３】
異常なヘプシジンレベルと関連している疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断のための、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の使用。
【請求項１４】
医薬として使用するための、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトヘプシジンの成熟型を認識する抗体またはその断片、ならびにヘプシジンと関連している疾患を治療および診断するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
鉄は、ほとんどすべての生物の成長および生存に必要な必須元素である。したがって、鉄代謝の混乱は、それだけには限らないが、鉄欠乏性貧血、ヘモジデリン沈着症または鉄過剰疾患ヘモクロマトーシスをはじめとするいくつかの重大な哺乳類疾患の原因とされている（ＰＩＥＴＲＡＮＧＥＬＯ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２８２，Ｇ４０３−１４，２００２年；ＡＮＤＲＥＷＳ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，１，７５〜９８頁，２０００年；ＰＨＩＬＰＯＴＴ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３５，９９３〜１００１頁，２００２年；ＡＮＤＥＲＳＯＮ  ＆  ＰＯＷＥＬＬ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ，７６，２０３〜７頁，２００２年；ＢＥＵＴＬＥＲら，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ，２９，４９５〜９頁，２００１年）。
【０００３】
鉄欠乏症は、世界中で最もよく見られる栄養障害である。４０〜５０億人（すなわち、世界の人口の６５〜８０％）もが、鉄欠乏であり得、２０億人（世界の人口の３０％を超える、大部分は子供および出産年齢の女性）が、主に鉄欠乏症による貧血である。鉄欠乏症は、他のどんな状態よりも多くの人に影響を及ぼし、蔓延した公衆衛生状態を構成している。
【０００４】
哺乳類では、鉄バランスは、食事に含まれる鉄の、十二指腸による吸収のレベルで主に調節される。第二鉄は、吸収後、循環中に、アポ−トランスフェリンにのせられ、赤血球前駆体をはじめとする組織に輸送され、そこでトランスフェリン受容体媒介性エンドサイトーシスによって取り込まれる。細網内皮マクロファージは、老化した赤血球のヘモグロビンの分解からの鉄の再利用において主要な役割を果たすのに対し、肝細胞は、フェリチンポリマー中に生物の鉄貯蔵のほとんどを含有する。鉄欠乏である個体における鉄吸収を増強するが、鉄過剰の個体では鉄吸収が低減されるフィードバック機構が存在する。しかし、遺伝性ヘモクロマトーシス（ＨＨ）では、この調節機構は、損なわれているようであり、鉄過剰にもかかわらず、多量の鉄が食事から吸収され、内部臓器への過剰の鉄の蓄積につながり、この結果、臓器障害および臓器不全となる。腸が身体の鉄必要量の変化に応答する分子機構は、よく理解されていない。これに関連して、ヘプシジン、最近同定された哺乳類ペプチド（ＫＲＡＵＳＥら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４８０，１４７〜５０頁，２０００年；ＰＡＲＫら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７６，７８０６〜１０頁，２００１年）は、鉄ホメオスタシスを調節する重要なシグナル伝達成分であることがわかった（ＮＩＣＯＬＡＳら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９９，４５９６〜６０１頁，２００２年）。
【０００５】
ヘプシジンは、細胞鉄排出輸送体フェロポーチンと結合し、その内部移行および分解を引き起こすことによって鉄ホメオスタシスを調節する（ＮＥＭＥＴＨら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６，２０９０〜３頁，２００４年）。フェロポーチンの分解の結果は、細胞における鉄の貯留、ひいては、循環鉄の減少である。この機序によって、ヘプシジンは、鉄排出組織からの血漿への鉄流出を減少させ、ひいては、食事からの鉄の吸収、マクロファージからの再循環鉄の放出、肝細胞に貯蔵された鉄の放出および胎盤を通過する鉄の移動を減少させる。
【０００６】
ヘプシジンは、大部分は肝臓において産生される小さいシステインリッチペプチドである。この分子は、腸における鉄の吸収を調節し、マクロファージからの鉄の放出を阻害する。ヘプシジンは、最初、抗菌活性を示す２５アミノ酸（ａａ）のペプチドとしてヒト血漿および尿から単離された（ＫＲＡＵＳＥら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４８０，１４７〜５０頁，２０００年；ＰＡＲＫら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７６，７８０６〜１０頁，２００１年）。その後、鉄によって調節される肝臓特異的遺伝子を探索して、推定２４ａａのシグナルペプチドが含まれる、マウスでは８３ａａの前駆体、ラットおよびヒトでは８４ａａの前駆体をコードするヘプシジンｃＤＮＡが同定された（ＰＩＧＥＯＮら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７６，７８１１〜９，２００１年）。ヒトヘプシジンは、８４アミノ酸プレプロペプチドとして発現され、アミノ末端がプロセシングされて、約１０ｋＤａの６０アミノ酸残基前駆体（プロヘプシジン）となり、これがさらにプロセシングされて、約３ｋＤａの２５アミノ酸成熟ペプチド（ヘプシジン−２５）となる。２５−アミノ酸の形態に加えて、Ｎ末端で末端切断された２０−および２２−アミノ酸の形態もまた、尿において検出された（ＰＡＲＫら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７６，７８０６〜１０頁，２００１年）。しかし、これらのＮ−末端切断変異体は、鉄調節機能を全く有さないと思われる（ＲＩＶＥＲＡら，Ｂｌｏｏｄ，１０６，２１９６〜９頁，２００５年；ＮＥＭＥＴＨら，Ｂｌｏｏｄ，１０７，３２８〜３３頁，２００６年）。したがって、一般に、ヘプシジン−２５が、ヘプシジンの鉄濃度低下効果に主に関与している生物活性形態であると認められている。
【０００７】
ヘプシジンは、鉄ホメオスタシスの中心的な調節因子である。ヘプシジン欠乏は、ほとんどの鉄過剰障害において中心的な役割を果たしており、ヘプシジン過剰が、いくつかの形態の貧血に関与していることもわかっている。例えば、Ｎｉｃｏｌａｓ  Ｇ．ら（２００２年）は、トランスジェニックマウスにおいて、ヘプシジンの過剰発現が、重篤な貧血をもたらすことを示した（ＮＩＣＯＬＡＳら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９９，４５９６〜６０１，２００２年）。最近の研究によって、ヘプシジンは、炎症における貧血の重要なメディエーターであることが報告された（ＮＥＭＥＴＨら，Ｂｌｏｏｄ，１０１，２４６１〜３頁，２００３年）。さらに、異なる病因論を有する貧血、例えば、腎疾患と関連している貧血（ＴＯＭＯＳＵＧＩら，Ｂｌｏｏｄ，１０８，１３８１〜７，２００６年）、重篤な敗血症と関連している貧血（ＫＥＭＮＡら，Ｂｌｏｏｄ，１０６，３２６８〜７０頁，２００５年）、クローン病と関連している貧血（ＳＥＭＲＩＮら，Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ，１２，１１０１〜６頁，２００６年）および肝腺腫と関連している鉄不応性貧血（ＷＥＩＮＳＴＥＩＮら，Ｂｌｏｏｄ，１００，３７７６〜８１頁，２００２年）において異常な高濃度のヘプシジンが報告された。
【０００８】
鉄ホメオスタシスの障害におけるヘプシジンの関与により、これらの障害の診断およびモニタリングを目的として、血漿または尿におけるその検出および定量のための種々のアッセイが提案されてきた。
【０００９】
しかし、免疫化学的試薬の開発は、抗ヘプシジン抗体を利用できないことによって妨げられてきた。ポリクローナル抗ヘプシジンウサギ抗体を使用する免疫化学的アッセイが記載されている（ＮＥＭＥＴＨら，Ｂｌｏｏｄ，１０１，２４６１〜３頁，２００３年）が、尿中のヘプシジンを定量化するのを可能にするだけであり、血漿中では可能にしない。プロヘプシジンのａａ２８〜４７（ＥＧ（１）−ＨｅｐＮおよびＥＧ（２）−ＨｅｐＮ）およびａａ７０〜８４（ＥＧ（１）−ＨｅｐＣ）に対して産生されるウサギ抗血清も記載されている（ＰＣＴ出願ＷＯ２００４／０５８０４４；（ＫＵＬＡＫＳＩＺら，Ｇｕｔ，５３，７３５〜４３頁，２００４年）。これらの抗血清は、ヒト血清においてプロヘプシジンを検出したが、それらのうち生理活性ヘプシジン−２５を認識したものはなかった。
【００１０】
現在までに、血清中のヘプシジン−２５を認識できる抗体は、記載されておらず、血清中のヘプシジン−２５を測定するための利用可能な唯一のアッセイは、質量分析に基づくものである（ＴＯＭＯＳＵＧＩら，Ｂｌｏｏｄ，１０８，１３８１〜７頁，２００６年）（ＭＵＲＰＨＹら，Ｂｌｏｏｄ，１１０，１０４８〜５４頁，２００７年）。
【００１１】
さらに、ヘプシジンアンタゴニストとして作用する、すなわち、ヘプシジンとフェロポーチンの結合ならびにその後のフェロポーチンの内部移行および分解を阻害できる抗体は、過剰のヘプシジンに起因する状態の治療において有用であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、ヘプシジン−２５を認識し、血清におけるその測定を可能にし、さらに、ヘプシジンとフェロポーチンの結合を阻害できる抗体は、非常に望ましいと思われる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、このような抗体を得ることに、ここで成功した。
【００１４】
本明細書において以下、「ＡＮ−ＬＰ１」と表されるこのモノクローナル抗体は、寄託番号Ｉ−３７９４の下、２００７年８月１４日にブダペスト条約の条項に従って、ＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅ）に寄託されたハイブリドーマによって産生される。
【００１５】
本発明者らは、モノクローナル抗体ＡＮ−ＬＰ１の軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）および重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）をクローニングし、配列決定した。ソフトウェアプログラムＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ（ＧＩＵＤＩＣＥＬＬＩら．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２，Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅＷ４３５−４４０，２００４年）を使用して、従来のように、これらのＶＨおよびＶＬ配列を、ＩＭＧＴ参照データベースに対してアラインすることによって、前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする配列の端が得られた（ＬＥＦＲＡＮＣら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３３，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ  Ｄ５９３−５９７，２００５年）。これらの配列は以下の表１（重鎖について）および表２（軽鎖について）に記載されている。
【００１６】
【表１】
2010539969.tif 000003
【００１７】
【表２】
2010539969.tif 000004
【００１８】
本発明の目的は、ヒトヘプシジン−２５と結合できること、ならびに少なくとも抗体ＡＮ−ＬＰ１の重鎖のＶＨ−ＣＤＲ３および軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ３を含むことを特徴とする抗原結合タンパク質である。
【００１９】
好ましい実施形態によれば、前記抗原結合タンパク質は、抗体ＡＮ−ＬＰ１の重鎖のＶＨ−ＣＤＲ１および軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１をさらに含む。
【００２０】
別の好ましい実施形態によれば、前記抗原結合タンパク質は、抗体ＡＮ−ＬＰ１の重鎖のＶＨ−ＣＤＲ２および軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ２をさらに含む。
【００２１】
ＡＮ−ＬＰ１のＶＨ−ＣＤＲ３およびＶＬ−ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４および配列番号８によってコードされる。ＡＮ−ＬＰ１のＶＨ−ＣＤＲ１およびＶＬ−ＣＤＲ１は、それぞれ、配列番号２および配列番号６によってコードされる。ＡＮ−ＬＰ１のＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ２は、それぞれ、配列番号３および配列番号７によってコードされる。
【００２２】
本発明の抗原結合タンパク質は、特に、
ａ）ハイブリドーマＣＮＣＭ  Ｉ−３７９４によって産生されるモノクローナル抗体ＡＮ−ＬＰ１、
ｂ）抗体ＡＮ−ＬＰ１の抗原結合断片、
ｃ）ＡＮ−ＬＰ１から得られるキメラまたはヒト化抗体、
ｄ）上記の抗体ｃ）の抗原結合断片
を包含する。
【００２３】
特に断りのない限り、本明細書において用語「ヘプシジン−２５」とは、以下の配列：ＤＴＨＦＰＩＣＩＦＣＣＧＣＣＨＲＳＫＣＧＭＣＣＫＴ（配列番号９）を有するヒトヘプシジンポリペプチドを指す。
【００２４】
抗体のＣＤＲ（相補性決定領域）は、抗原認識特異性に関与している可変ドメインの一部である。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は各々、３つのＣＤＲを有し、それぞれＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、ＶＬ−ＣＤＲ３およびＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３と呼ばれる。
【００２５】
抗体の抗原結合断片は、前記抗体のＣＤＲを含む可変ドメインを含む。基本的な抗原結合断片として、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２が挙げられる。
【００２６】
Ｆｖ断片は、疎水性相互作用によって一緒に結合している抗体ＶＬドメインおよびＶＨドメインからなり、ｄｓＦｖ断片では、ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体は、ジスルフィド結合によって安定化されており、ｓｃＦｖ断片では、ＶＬドメインおよびＶＨドメインは、柔軟なペプチドリンカーによって互いに連結されており、従って、一本鎖タンパク質を形成する。Ｆａｂ断片は、抗体のパパイン消化によって得ることができ、それらは、ジスルフィド結合によって一緒に結合している、完全Ｌ鎖と、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分とを含む。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体のペプシン消化によって製造することができ、２つのＦａｂ断片、さらに免疫グロブリン分子のヒンジ領域の一部も含む。Ｆａｂ’断片は、ヒンジ領域においてジスルフィド結合を切断することによってＦ（ａｂ’）２断片から得ることができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、二価である、すなわち、それらは、天然の免疫グロブリン分子のように２つの抗原結合部位を含み、他方、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびＦａｂ’断片は、一価である、すなわち、それらは、１つの抗原結合部位を含む。
【００２７】
これらの基本的な抗原結合断片は、一緒に組み合わせて、多価抗原結合断片、例えば、ダイアボディー、トリアボディーまたはテトラボディーを得ることができる。これらの多価抗原結合断片もまた、本発明の一部である。
【００２８】
本明細書において、用語「キメラ抗体」とは、それが由来するモノクローナル抗体の可変ドメインを有し、かつ別の抗体に由来する定常ドメイン、好ましくは、ヒト抗体に由来する定常ドメインを有する改変抗体を指す。
【００２９】
本明細書において用語「ヒト化抗体」とは、マウス配列をそのヒト対応物とできる限り置換することによって、免疫原性を低減するが、抗原結合特異性は保持するよう操作されている抗体を指す。可変ドメイン内では、これらの配列置換は、通常、フレームワーク領域（ＦＲ）、すなわち、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列を標的とする。しかし、抗体をヒト化するいくつかの方法は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２内の配列置換を含む。
【００３０】
本発明のキメラおよびヒト化抗体は、任意のクラスの免疫グロブリンに属し得る。ＩｇＧクラスのサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４などに属することが好ましい。
【００３１】
本発明の抗原結合タンパク質の好ましい実施形態によれば、ヘプシジンとフェロポーチンの結合を阻害し、それによって、フェロポーチンの分解を阻害することができる。
【００３２】
ヘプシジンとフェロポーチンの結合を阻害する能力は、例えば、その表面にフェロポーチンを発現している細胞を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して容易に調べることができる。ヘプシジンの存在下では、フェロポーチンは、内部移行され、分解される。ヘプシジンとフェロポーチンの結合の阻害剤の存在下では、フェロポーチン内部移行および分解が低減または抑制される。フェロポーチンレベルの評価によって、阻害特性を決定することが可能となる。
【００３３】
本発明に従う抗原結合タンパク質は、従来技術によって得ることができる。例えば、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２のような抗原結合断片は、全抗体の酵素消化によって得てもよい。
【００３４】
これらの断片ならびにその他の一価および多価抗原結合断片、ならびにキメラまたはヒト化抗体もまた、従来の遺伝子工学技術、例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫら［ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．編，（１９８９年）］によって記載されるものによって調製できる。
【００３５】
抗体ＡＮ−ＬＰ１の可変領域またはそのＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリドーマＣＮＣＭ  Ｉ−３７９４のｃＤＮＡライブラリーから前記領域をクローニングすることによって得ることができる。それらはまた、本明細書に提供されるヌクレオチド配列に基づいて核酸合成によって、完全にまたは部分的に調製することができる。
【００３６】
抗体の可変領域を、適当なリンカーと、または別の抗体の定常領域と組み合わせることによって、組換え抗原結合断片またはキメラ抗体を調製する方法は、それ自体よく知られている。
【００３７】
抗体をヒト化する方法も、当技術分野で周知であり、例えば、ＲＯＵＴＬＥＤＧＥら［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｎ，１３〜４４頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｔｉｔｌｅｓ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９３年）中、「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」］によって、またはＲＯＧＵＳＫＡら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（１０），８９５〜９０４頁、（１９９６年）］によって記載されている。これらの方法もまた、ｓｃＦｖなどの抗原結合断片に適用することができる。
【００３８】
例として、「リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」として知られる方法は、非ヒト抗体の可変領域のフレームワーク中の表面残基のセットを、表面残基のヒトセットと置換することからなり、ＣＤＲグラフティングとして知られる方法は、非ヒト抗体由来のＣＤＲを、ヒト抗体のフレームワーク領域に移植することからなる。ＣＤＲグラフティングは、通常、結合親和性を最適化するためのヒトフレームワークのいくつかの残基の置換からなるフレームワーク最適化によって完了される。
【００３９】
フレームワーク最適化の工程は、コンビナトリアルライブラリーの使用によって最近、単純化された（ＲＯＳＯＫ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、２２６１１〜２２６１８頁、１９９６年；ＢＡＣＡらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１０６７８〜１０６８４頁、１９９７年）。
【００４０】
抗体ヒト化のための別の最近の戦略は、軽鎖および重鎖の元の非ヒトＣＤＲ３配列のみを保存し、残りの配列は、天然ヒトＶ遺伝子ライブラリーから選択される（ＲＡＤＥＲら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９５、８９１０〜８９１５頁、１９９８年）。
【００４１】
本発明の主題はまた、抗体ＡＮ−ＬＰ１のＣＤＲを含む本発明の抗原結合タンパク質をコードする任意のポリヌクレオチド、ならびに前記ポリヌクレオチドを含む任意の組換えベクター、特に、任意の発現ベクターである。
【００４２】
本発明の主題はまた、抗体ＡＮ−ＬＰ１のＣＤＲを含む、本発明に従う抗原結合タンパク質を発現する任意の細胞である。これは、特に、ハイブリドーマＣＮＣＭ  Ｉ−３７９４、ならびにまた、本発明のポリヌクレオチドを用いて遺伝的に形質転換された任意の宿主細胞を包含する。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明に従う抗原結合タンパク質をコードする配列に加えて、前記タンパク質の分泌を可能にするシグナルペプチドをコードする配列を含むことが有利であり得る。それらはまた、前記タンパク質を検出するため、および／または精製を容易にするために、１種または複数のマーカーペプチド（単数または複数）をコードする１種または複数の配列（単数または複数）を含み得る。
【００４４】
本発明に従う発現ベクターは、選択される宿主細胞において活性である転写および翻訳調節エレメントと結合している、本発明に従う抗原結合タンパク質をコードする少なくとも１種の核酸配列を含む。本発明に従う発現ベクターを構築するために使用できる、それ自体公知である、さまざまな宿主ベクターがあり、適当なベクターの選択は、主に、使用されるよう意図される宿主細胞に応じて変わる。
【００４５】
本発明との関連で使用できる宿主細胞は、原核細胞であっても、真核細胞であってもよい。真核細胞の宿主細胞の例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌が挙げられる。使用してよい真核細胞の中でも、植物細胞（植物抗体の場合には）、酵母、例えば、サッカロミセス・クリベロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来の細胞、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエまたはスポドプテラ属細胞および哺乳類細胞、例えば、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、３Ｔ３、Ｃ１２７、ＢＨＫ、Ｈｅｃｋ２９３、ＣＯＳなどの細胞が特に言及される。
【００４６】
本発明に従う発現ベクターの構築および宿主細胞の形質転換は、分子生物学の従来技術によって実施できる。
【００４７】
本発明の主題はまた、本発明に従う抗原結合タンパク質を製造する方法であって、本発明に従う少なくとも１種の細胞を培養するステップと、前記培養から前記タンパク質を回収するステップとを含むことを特徴とする方法である。
【００４８】
タンパク質が分泌される場合には、培養培地から直接回収してもよく、そうでなければ、前もって細胞溶解を実施する。
【００４９】
次いで、それ自体当業者公知の従来手順によって、例えば、分画沈殿、特に、硫酸アンモニウムを用いた沈殿、電気泳動、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィーなどによって、タンパク質を、培養培地から、または細胞溶解物から精製してもよい。
【００５０】
必要に応じて、本発明の抗原結合タンパク質は、例えば、その検出を容易にするために、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるその投与を容易にするために、またはその治療特性を増強するために、さらに修飾してもよい。非制限的例として、それらを検出可能な分子または物質、例えば、蛍光分子、放射活性分子、核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージングのためのスピン標識または当技術分野で公知の任意のその他の標識で標識してもよく、それらはまた、その血漿半減期を延長するポリエチレングリコールなどの分子とカップリングしてもよい。
【００５１】
本発明の抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によって放射活性分子を用いて標識してもよい。例えば、放射活性分子として、それだけには限らないが、シンチグラフィー研究のための放射活性原子、例えば、Ｉ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８が挙げられる。本発明の抗体はまた、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄などを用いて標識してもよい（磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしても知られる）。
【００５２】
本発明の抗原結合タンパク質は、ヘプシジン関連疾患の診断のために使用できる。
【００５３】
特に、生体サンプル、特に、血液、尿、羊水サンプルまたは臓器バイオプシーにおいて、ヘプシジンを検出するために、および／またはその量を評価するために使用してもよい。従って、それらは、ヘプシジン過剰と関連しているか、ヘプシジン欠乏と関連しているかにかかわらず、異常なヘプシジンレベルと関連しているすべての疾患を診断するために使用できる。
【００５４】
本発明の目的は、ヒト被験体から得た生体サンプル、特に、血清または血漿サンプル中のヘプシジンを検出するための方法および／またはその量を評価するための方法であり、前記方法は、前記サンプルを、ヘプシジンと前記抗原結合タンパク質間の免疫複合体の形成を可能にする条件下で本発明の抗原結合タンパク質と接触させるステップと、形成された免疫複合体を検出または測定するステップとを含む。
【００５５】
形成された免疫複合体は、非制限的例として、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはその他の固相イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、電気泳動、免疫蛍光またはウエスタンブロットを含めた、標準技術を使用する種々の方法によって検出または測定できる。
【００５６】
本発明のさらなる目的は、異常なヘプシジンレベルと関連している疾患を診断するための方法であり、前記方法は、試験されるべき被験体から得た生体サンプル中の、上記で示される、ヘプシジンの量を評価するステップと、決定された量を、正常被験体におけるヘプシジンの対照値と比較するステップとを含む。
【００５７】
本発明の方法は、過剰なヘプシジンレベルと関連している疾患、例えば、慢性疾患における貧血、癌における貧血および腎不全における貧血を診断するために、ならびに不十分なヘプシジンレベルと関連している疾患、例えば、先天性慢性貧血もしくは鉄欠乏性貧血（慢性出血、潰瘍性胃炎．．．）または相対的もしくは完全ヘプシジン欠乏と関連している疾患、例えば、遺伝性ヘモクロマトーシスを診断するために使用できる。
【００５８】
本発明はまた、イムノアッセイを実施するための１種または複数の装置および／または試薬と関連している本発明の抗原結合タンパク質を含むキットを提供する。例えば、本発明のキットは、固相支持体、例えば、組織培養プレートまたはビーズ（例えば、セファロースビーズ）とカップリングしている本発明の抗原結合タンパク質およびイムノアッセイを実施するための試薬を含み得る。
【００５９】
本発明の抗原結合タンパク質は、ヘプシジンとフェロポーチンの結合を阻害でき、医薬としても使用できる。それらは、過剰のヘプシジンと関連している疾患、特に、癌における貧血、腎不全における貧血および慢性疾患における貧血の治療にとって有用である。慢性疾患における貧血は、炎症における貧血としても知られ、同様に、入院患者において最も頻度の高い貧血である。この軽度から中程度の正球性から小球性の貧血は、慢性免疫活性化と関連している疾患、例えば、関節リウマチをはじめとする自己免疫障害、および悪性腫瘍およびＨＩＶをはじめとする慢性感染症を患う患者において８％から９５％の頻度で見られる。
【００６０】
したがって、本発明は、それを必要とする患者において貧血を治療する方法であって、前記患者に、ヘプシジンとフェロポーチンの結合を阻害できる、本発明の抗原結合タンパク質の治療上有効な量を投与するステップを含む方法を提供する。
【００６１】
本発明の抗原結合タンパク質によって治療可能な状態として、例えば、慢性疾患における貧血、腎臓機能の低下または喪失（慢性腎不全）と関連している貧血、骨髄抑制性治療、例えば、化学療法薬または抗ウイルス薬（例えば、ＡＺＴ）と関連している貧血、非骨髄性癌の進行と関連している貧血、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ）と関連している貧血、クローン病の患者における貧血、慢性免疫活性化を伴う貧血、老人性貧血および熱傷における貧血が挙げられる。
【００６２】
本発明はまた、本発明の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。本発明の抗原結合タンパク質は、それ自体で投与してもよく、医薬上許容される担体または賦形剤（単数または複数）と混合してもよい。それらは、全身に使用してもよく、局所的に使用してもよい。好ましい投与経路として、例えば、筋肉内、皮下、静脈内または腹膜内注射をはじめとする非経口経路がある。経口経路もまた、医薬が、有効成分を胃腸酵素から保護できる、経口投与に適した形態であるという条件で使用してよい。
【００６３】
本発明を、以下の、モノクローナル抗体ＡＮ−ＬＰ１を説明する実施例に言及するさらなる説明によってさらに示す。しかし、これらの実施例は、単に、本発明の例示として与えられるものであって、決して、その制限を成すものではないと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＡＮ−ＬＰ１のヘプシジン結合特性をＥＬＩＳＡによって試験した結果を示す。
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＡＮ−ＬＰ１の解析結果を示す。
【図３】ドットブロットによるＡＮ−ＬＰ１の解析結果を示す。
【図４】ウエスタンブロットによるＡＮ−ＬＰ１の解析結果を示す。
【図５】免疫組織化学によるＡＮ−ＬＰ１の解析結果を示す。
【図６】Ａは、ヘプシジンの活性について抗フェロポーチン抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す。Ｂは、無関係の抗体ＨＰＣ４と、Ｃは、抗体ＡＮ−ＬＰ１とともにそれぞれプレインキュベーションしたヘプシジンのフェロポーチン分解能の分析結果を示す。
【図６Ｄ】漸増濃度のＡＮ−ＬＰ１の効果を示す。
【図７】ヘプシジンとＡＮ−ＬＰ１の相互作用についての分析結果を示す。
【実施例】
【００６５】
＜実施例１＞
抗ヘプシジン抗体ＡＮ−ＬＰ１製造および特徴決定：
ハイブリドーマＣＮＣＭ  Ｉ−３７９４によって産生されたＡＮ−ＬＰ１のヘプシジン結合特性をＥＬＩＳＡによって試験した。合成ヒトヘプシジン−２５を、１００ｍＭ炭酸バッファー、ｐＨ９．５中、１〜１０マイクログラム／ｍｌの濃度で９６ウェルボックスにコーティングした。ウェルの一部は、無関係のペプチド（ＰＥＬＡＰＶＳＳＮＬＫＹＴＬＤＣ、配列番号１０）でコーティングし、特異的成分の測定されるシグナルが調べられるようにする。一晩接触させた後、ＰＢＳ／０．０５％ｔｗｅｅｎ２０の溶液でウェルを３回洗浄し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ２０％、スクロースｐＨ７．８の溶液で満たす。マウス血清を、１０倍連続希釈物を用いて２連で加える。６時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳ０．０５％、ｔｗｅｅｎ２０の溶液で３回洗浄し、ＰＢＳ、０．１％  ＢＳＡ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０で１／５，０００に希釈した、ペルオキシダーゼとカップリングしている抗マウス抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を、さらに１時間３０分から２時間加えた。抗体の結合は、基質としてＡＢＴＳ［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を使用して示し、読み取りは４０５ｎｍで実施した。
【００６６】
結果は、図１によって示されている。それらは、ＡＮ−ＬＰ１は、ウェルにコーティングされたヒトヘプシジン−２５と特異的に結合し、対照ペプチドとは結合しないことを示す。
【００６７】
抗体を産生するハイブリドーマＣＮＣＭ  Ｉ−３７９４の細胞を、ＡＮ−ＬＰ１抗体の腹水製造のために使用した。マウスをプリスタン０．５ｍｌのＩＰ注射で処置し、８日後、１０７個ハイブリドーマ細胞を注射した。２週間後、腹水を取り出し、カプリル酸を用いた連続沈殿の技術によって抗体を精製した。カプリル酸は、分子量１００〜１２０ｋＤａ未満のタンパク質を沈殿させる。沈殿を沈降させ、次いで、上清中に存在する免疫グロブリンを、硫酸アンモニウムを４５％（ｗ／ｖ）最終濃度で使用して沈殿させた。これらの２種の連続沈殿によって、２匹のマウスから出発して、３０ミリグラムの精製抗体を得ることが可能となる。
【００６８】
分泌されるＡＮ−ＬＰ１免疫グロブリンは、ＩｇＧ１κである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果は、図２に示されている。これらの結果は、ＡＮ−ＬＰ１が、ＩｇＧの従来の特徴（重鎖５０ｋＤａ、軽鎖２５ｋＤａ）を呈することを示す。
【００６９】
抗体をより特性決定するために、さらなる実験を実施した。
【００７０】
１−ドットブロット解析：
合成ヒトヘプシジン（１００〜５００ｎｇ）または合成マウスヘプシジン（５００ｎｇ）のサンプル（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ，ＵＳＡ）または炎症性疾患の患者から得た、もしくは健常ボランティアから得た１０もしくは４０μｌの血清のサンプルを使用した。一実験では、合成ヒトヘプシジンの１サンプル（５００ｎｇ）を、Ｌａｅｍｍｌｉバッファーで処理した。このサンプルを、ニトロセルロースメンブレンに直接スポットし、一晩乾燥させた。メンブレンをＴＢＳ−Ｔ中５％スキムミルクに浸漬すること（室温で、１時間）によって非特異的部位をブロッキングした。
【００７１】
一次抗体（ＡＮ−ＬＰ１抗体、またはヒトタンパク質ＣのエピトープＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ（配列番号１１）に対して作製された無関係抗体ＨＰＣ４）を、６ｍｇ／ｍｌの溶液からの１：２００の希釈で加えた。インキュベーションを室温で２時間または＋４℃で一晩実施した。
【００７２】
ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、メンブレンを、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしている二次抗体（１：５０００）とともに室温で１時間インキュベートした。
【００７３】
シグナルを、ＥＣＬ試薬を使用した化学発光と、それに続くオートラジオグラフィーによって可視化した。
【００７４】
結果は、図３に示されている。これらの結果は、以下を示す：
−抗体ＡＮ−ＬＰ１を用いたヘプシジンの顕色は、特異的である（無関係抗体ＨＰＣ４を用いてシグナルはない）ということ
−抗体ＡＮ−ＬＰ１を用いたヘプシジンの顕色には、ペプチドの天然構造が必要である（サンプルをＬａｅｍｍｌｉで処理した場合にシグナルはない）ということ
−抗体ＡＮ−ＬＰ１は、マウスヘプシジン−２５と交差反応しないということ、
−ヒトサンプル由来の血清ヘプシジンは、抗体ＡＮ−ＬＰ１によって十分に認識されるということ。
【００７５】
２−ウエスタンブロット解析：
合成ヒトまたはマウスヘプシジン（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のサンプルを、非還元状態で１６％  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｔｒｉｃｉｎｅゲルで分離し、ＰＶＤＦメンブレンで室温で１時間ブロッティングを実施した。メンブレンをＴＢＳ−Ｔ中５％スキムミルクに浸漬することによって非特異的部位をブロッキングした（室温で、２時間）。
【００７６】
一次抗体（１：１００に希釈したＡＮ−ＬＰ１抗体、６ｍｇ／ｍｌ）とともにインキュベーションを＋４℃で一晩実施した。
【００７７】
ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、メンブレンを、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしている二次抗体（１：５０００）とともに室温で１時間インキュベートした。
【００７８】
シグナルを、ＥＣＬ試薬を使用した化学発光と、それに続くオートラジオグラフィーによって可視化した。
【００７９】
結果は、図４に示されている。これらの結果は、ＡＮ−ＬＰ１抗体は、ウエスタンブロット解析においてヒトヘプシジンを検出するために効率的であるということを示し、これは産物の正しい大きさ（２５ＡＡのペプチドについて約３ｋＤａ）およびヘプシジンの二量体に対応する可能性が最も高いさらなるバンドを明らかにしている。対照的に、マウスヘプシジンのシグナルは観察されず、このことから、ドットブロット解析の結果が確認される。
【００８０】
３−免疫組織化学：
免疫化学を、パラフィン包埋ヒト肝臓で実施した。ＡＮ−ＬＰ１抗体は、１：５０希釈で、＋４℃で一晩使用した。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしている二次抗体とともにインキュベーションした後、ジアミノベンジジンを用いて切片を明らかにした。
【００８１】
結果は、図５に示されている。これらの結果は、ＡＮ−ＬＰ１抗体は、ヒト肝臓バイオプシーにおいてヘプシジンを明らかにするのに効率的であることを示す。
【００８２】
＜実施例２＞
抗体ＡＮ−ＬＰ１の機能特性：
ヘプシジン生物活性についてのスクリーニング試験を開発した。この試験は、ヘプシジンの、鉄排出輸送体、フェロポーチンを分解する能力に基づいている。ヘプシジンの存在下で、フェロポーチンを発現するマクロファージ（Ｊ７７４マウス細胞株）を数時間の間インキュベーションすることからなる。ヘプシジンが生物学的に活性である場合は、フェロポーチンと結合し、その分解を誘導する。
【００８３】
より詳しくは：
Ｊ７７４細胞を、２００μＭの鉄−ＮＴＡで一晩処理して、フェロポーチン産生を誘導した。合成ヘプシジン−２５（１００ｎＭ）を単独で、もしくはＫＬＨ（２００ｎＭ）と連結させて、またはＫＬＨ（１００ｎＭ）と連結させた無関係ペプチドを、細胞培養物に加えた。ペプチドを加えていない培養物を対照として使用した。
【００８４】
３７℃で５時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、次いで、溶解させた。膜抽出物を調製し、抗フェロポーチン抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した。結果は、図６Ａに示されている（レーン１：対照）。
【００８５】
これらの結果は、単独またはＫＬＨと連結しているヘプシジンは、フェロポーチン分解を誘導するが、無関係ペプチドは効果がないことを示す。
【００８６】
細胞培養物に添加する前に、３または３０μｇのＡＮ−ＬＰ１または無関係の抗体ＨＰＣ４とともに、３７℃で１時間プレインキュベートした合成ヘプシジン−２５（１００ｎＭ）を用いて、同じ実験を反復した。
【００８７】
結果は、図６Ｂ（無関係の抗体ＨＰＣ４とともにプレインキュベートしたヘプシジン）および６Ｃ（抗体ＡＮ−ＬＰ１とともにプレインキュベートしたヘプシジン）および６Ｄ（漸増濃度のＡＮ−ＬＰ１の効果）によって示されている。
【００８８】
これらの結果は、ヘプシジンは、通常、無関係の抗体の存在下でフェロポーチンの分解を誘導し、ＡＮ−ＬＰ１抗体とヘプシジンの結合は、その作用を中和し、そのようにして、フェロポーチンの内部移行および分解を妨げることを示す。
【００８９】
＜実施例３＞
ヘプシジン／ＡＮ−ＬＰ１相互作用の親和性
センサー表面へのリガンドの固定化
ＡＮ−ＬＰ１親和性定数および抗体−抗原相互作用を推定するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を、カルボキシメチル化デキストランＣＭ５チップを使用するＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて実施した。５ｍＭのマレイン酸バッファー（ｐＨ５．７５）で２μｇ／ｍｌに希釈したＡＮ−ＬＰ１を、アミンカップリングによってＣＭ５チップに上に固定化した。
【００９０】
結合アッセイおよびデータ解析
ヘプシジンは、ランニングバッファーＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．００５％ポリソルベート２０）で希釈した。３分、６０μＬ／分で、分析物を注入し、１０分間解離をモニターした。グリシン−ＨＣＬ１０ｍＭ  ｐＨ２の３０秒〜１分間の注入によって表面Ａｂが生じた。精製抗体を用いて動態速度定数を決定した。濃縮したヘプシジン（０．３９ｎＭ対１２．５ｎＭ）を、６０μＬ／分の速度でチップ表面上に注入し、結合データを集めた。データ分析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０ソフトウェアを用いて実施した。
【００９１】
結果は図７に示されている。ヘプシジンの濃度は各曲線に示されている（Ｂｌｋ＝ブランク）。
【００９２】
ＡＮ−ＬＰ１の親和性定数（Ｋｄ）は、９．９×Ｅ−１１Ｍである。
【図１】
2010539969.tif 000005
【図２】
2010539969.tif 000006
【図３】
2010539969.tif 000007
【図４】
2010539969.tif 000008
【図５】
2010539969.tif 000009
【図６】
2010539969.tif 000010
【図６Ｄ】
2010539969.tif 000011
【図７】
2010539969.tif 000012
【配列表】
2010539969000001.app
【国際調査報告】
2010539969.tif 000013
2010539969.tif 000014
2010539969.tif 000015
2010539969.tif 000016