(57)【要約】  個体からの血小板含有生物試料を用意するステップと、少なくとも３種の血小板機能調節因子を用意するステップであって、各血小板機能調節因子を少なくとも３つの濃度で用意するステップと、前記血小板含有試料のアリコートを、別々の反応容器内で各濃度の各血小板機能調節因子と反応させるステップとを含む、個体の血小板反応性プロフィールを作成する方法。その後、血小板凝集を各反応容器内で測定し、それら血小板凝集測定値を用いて、各血小板機能調節因子の用量反応曲線を作成する。その際、得られた用量反応曲線、及び／又は前記得られた用量反応曲線の１つ又は複数の関数が前記個体の血小板反応性プロフィールを含む。本発明の方法の臨床適用、及びそれを行うためのキットも記述する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体からの血小板含有生物試料を用意するステップと、
少なくとも３種の血小板機能調節因子を用意するステップであって、各血小板機能調節因子を少なくとも３つの濃度で用意するステップと、
前記血小板含有試料のアリコートを、別々の反応容器内で各濃度の各血小板機能調節因子と反応させるステップと、
各反応容器内の血小板凝集を測定するステップと、
前記血小板凝集測定値を用いて、各血小板機能調節因子の用量反応曲線を作成するステップであって、得られた用量反応曲線（複数）、及び／又は前記得られた用量反応曲線（複数）の１つ又は複数の関数が前記個体の血小板反応性プロフィールを含むステップと
を含む、個体の血小板反応性プロフィールを決定する方法。
【請求項２】
少なくとも４種の血小板機能調節因子を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも５種の血小板機能調節因子を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記血小板機能調節因子が血小板アゴニストである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記血小板機能調節因子が、ＴＲＡＰ、コラーゲン、エピネフリン、ＡＤＰ、アラキドン酸、セロトニン及びトロンボキサンＡ２、リストセチン、ＮＯ供与体（ＳＮＡＰなど）、Ｕ４６６１９並びにコンブルキシンを含む群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも５種の血小板アゴニストが用いられ、前記アゴニストが、ＴＲＡＰ、コラーゲン、エピネフリン、ＡＤＰ及びアラキドン酸を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記用量反応曲線の前記関数（複数可）が、ヒル傾斜可変性、最大及び／若しくは最小凝集、並びにＥＣ値（すなわちＥＣ５０）の１つ又は複数から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記血小板機能調節因子を少なくとも６つの濃度で用意する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記血小板機能調節因子を少なくとも８つの濃度で用意する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記測定された血小板凝集パラメータが、少なくとも１７．５分間にわたる間に得られた最大凝集である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応容器が、マイクロタイタープレートのウェル、又は多数の反応ウェルを有する同等な装置のウェルである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
各反応容器内の血小板凝集パラメータが実質的に同時に測定されるハイスループット法である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
各血小板機能調節因子を、少なくとも２ログ単位にわたる範囲の濃度で用意する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
アラキドン酸が前記血小板機能調節因子の１つであり、用いられるアラキドン酸の濃度が、１．０〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
用いられるアラキドン酸の濃度が、０．５８ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
コラーゲンが前記血小板機能調節因子の１つであり、用いられるコラーゲンの濃度が、０．００１５〜０．２５ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
用いられるコラーゲンの濃度が、０．００２３〜１．９ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＡＤＰが前記血小板機能調節因子の１つであり、用いられるＡＤＰの濃度が、０．２〜３０μＭの範囲にわたる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＡＤＰの濃度が０．０１５〜２０μＭの範囲にわたる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記血小板機能調節因子が血小板アゴニストであり、かつ前記血小板アゴニストの少なくとも１種が、そのアゴニストの準最大濃度を含めた濃度範囲で用いられる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記血小板アゴニストの少なくとも２種が、そのアゴニストの準最大濃度を含めた濃度範囲で用いられる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記血小板アゴニストの少なくとも３種が、そのアゴニストの準最大濃度を含めた濃度範囲で用いられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
そのアゴニストの準最大濃度を含めた濃度範囲で用いられる前記少なくとも１種の血小板アゴニストが、コラーゲン、エピネフリン及びアラキドン酸のうちの１つ又は複数である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
血小板の凝集が光透過性凝集測定法によって決定される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
５７０〜５７５ｎｍの間の波長を用いて吸光度を測定する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記血小板含有試料が通常、洗浄血小板調製物、及び多血小板血漿（ＰＲＰ）から成る群から選択される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記血小板含有試料中の血小板の濃度が５×１０５／μｌ超である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＲＰが、血液をクエン酸溶液中に吸引することによって取得可能である、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
個体の血小板反応性状態を決定する方法であって、本発明の方法に従って、前記個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた前記血小板反応性プロフィールを、その個体のための基準血小板反応性プロフィールと比較するステップとを含む、方法。
【請求項３０】
アテローム血栓性イベントを有する危険性がある個体を同定する方法であって、本発明に従って、個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた血小板反応性プロフィールを、その個体のための基準血小板反応性プロフィールと比較するステップとを含み、前記個体の前記血小板反応性プロフィールが、あるアゴニストに対して、前記基準血小板反応性プロフィールにおけるそのアゴニストに対する反応と比較して、有意に増強された反応を示す場合、その個体はアテローム血栓性イベントを有する危険性がある、方法。
【請求項３１】
個体の異常な血小板反応性を同定する方法であって、本発明の方法に従って、個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた血小板反応性プロフィールを、その個体のための基準血小板反応性プロフィールと比較するステップとを含み、前記個体の血小板反応性プロフィールが前記基準血小板反応性プロフィールと有意に相違している場合、その個体は異常な血小板反応性を有する、方法。
【請求項３２】
それを必要とする個体に適した抗血小板剤又は用量を同定する方法であって、本発明の方法に従って、前記個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた血小板反応性プロフィールを、その個体のための基準血小板反応性プロフィールと比較するステップと、前記基準血小板反応性プロフィールにおけるそのアゴニストに対する反応と比較した際に、有意に増強された反応があるいかなるアゴニストも同定するステップと、そのアゴニストによって調節されている生物学的経路を標的とする抗血小板療法又は用量を選択するステップとを含む、方法。
【請求項３３】
個体で、不十分又は最適以下である抗血小板治療を同定及び修正する方法であって、本発明の方法に従って、前記個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた血小板反応性プロフィールを、前記抗血小板治療を受けている個体のための基準血小板反応性プロフィールと比較するステップと、前記基準プロフィールと比較して、不十分に阻害されているいかなるアゴニストも同定するステップと、前記アゴニストの適切な阻害を行うように前記抗血小板治療を改変するステップとを含む、方法。
【請求項３４】
前記治療の改変が、用いられる薬物の改変、又はその薬物の投与計画の改変を伴う、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
血小板活性調節剤を同定する方法であって、試験化合物の不存在下及び存在下で、本発明の方法に従って、前記個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた血小板反応性プロフィールを比較するステップと、前記得られた血小板反応性プロフィールの間に有意な相違がある場合、前記試験化合物が血小板アゴニストであるか、又は血小板アンタゴニストであるかを決定するステップとを含む、方法。
【請求項３６】
多くの異なった濃度の前記試験化合物に関して血小板反応性プロフィールを取得する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
血小板活性調節剤を得るために、試験化合物のライブラリーをスクリーニングする方法であって、請求項３５又は３６に記載の、血小板活性調節剤を同定する方法を用いる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体の血小板反応性プロフィールを作成する方法及びキットと、血小板反応性プロフィールの臨床及び研究適用とに関する。
【発明の背景】
【０００２】
心臓血管疾患は、依然として、欧州及び米国における主要死亡原因のままである。心臓発作又は卒中発作のいずれかを誰が患うであろうかという難問が残っている。集団内の高危険性患者の予測に成功しようとして、多数の危険性予測モデルが考案されており、ある程度の成功を収めている。心血管イベントは、血栓症の結果として起こる。血栓症は、血餅形成の作用であり、血小板活性化の結果として起こる。これは、アスピリンによって部分的に阻止されるが、イベントは依然として起こる。これは、個体間の「粘着性」又は活性化レベルが相違しており、治療に対する反応も異なることを示唆している。何が正常な血小板機能を構成するのかに関する確かな考えを、今日まで誰も持っていないことは驚くべきことである。これは、血小板を用いる研究における制限によるところが大きい。残念ながら、身体を離れた後、血小板は約４〜６時間の間しか生きていない。ｅｘ  ｖｉｖｏ血小板を調製するプロセスはこの時間を短縮し、それ故、一個人によって少ない数の試験しか行うことができず、したがって、血小板機能に関しては少量の情報しか得られない。
【０００３】
市販されている血小板機能分析器の数は少なく、それらはなんらかの制限を有している。ＰＦＡ（血小板機能分析器）−１００装置は、閉鎖時間として知られている、全血をコラーゲン及びエピネフリン、又はコラーゲン及びＡＤＰに暴露した後に凝固するまでの時間を測定する。測定されるパラメータは閉鎖時間である。血小板機能に関するゴールドスタンダード試験は、光透過性標準凝集測定法である。ＰＦＡ−１００（商標）をゴールドスタンダード血小板機能試験と比較した場合に結果が相違し、これはこの装置の重大な限界を浮き彫りにするものである。残念ながら、標準的凝集計は４チャネルのみを有する傾向にあるので、少数のチャネルを行うのにさえ手順にかなりの時間かかるという点で限定されている。Ａｃｃｕｍｅｔｒｉｃｓ  Ｖｅｒｉｆｙ  Ｎｏｗ（商標）装置は、ベッドサイドで使用し、全血を用いて血小板機能を評価する別の装置である。この装置はアスピリン及びクロピドグレルに対する反応を評価するのを可能にする。この試験は、ＰＦＡ−１００（商標）装置と同様に、血小板反応性に関して限られた量の情報しか提供しないという点で限定されている。さらに、これらの試験はすべて単一濃度でのアゴニストの影響を検査するのみである。
【０００４】
血小板反応性又は血小板が活性化する能力の評価は個体間で相違し、同一個体内でも異なった時点で相違している。現在利用可能な試験を用いてこの可変性を評価するのは困難であり、時間効率が悪く、かつ費用がかかる。
【０００５】
上述した問題の少なくとも１つを克服することが本発明の目的である。
【発明の記述】
【０００６】
本発明によれば、
−個体からの血小板含有生物試料を用意するステップと、
−少なくとも３種の血小板機能調節因子を用意するステップであって、各血小板機能調節因子を少なくとも３つの濃度で用意するステップと、
−前記血小板含有試料のアリコートを、別々の反応容器内で各濃度の各血小板機能調節因子と反応させるステップと、
−各反応容器内の血小板凝集を測定するステップと、
−前記血小板凝集測定値を用いて、各血小板機能調節因子の用量反曲線を作成するステップであって、得られた用量反応曲線（複数）、及び／又は前記得られた用量反応曲線（複数）の１つ又は複数の関数が前記個体の血小板反応性プロフィールを含むステップと
を含む、個体の血小板反応性プロフィールを作成する方法が提供される。
【０００７】
通常、少なくとも４種の血小板機能調節因子を用いる。好ましくは、少なくとも５種の血小板機能調節因子を用いる。理想的には、５種を超える血小板機能調節因子を用いる。
【０００８】
血小板機能調節因子は、血小板アゴニスト又はアンタゴニストのどちらかが適している。理想的には、血小板機能調節因子は血小板アゴニストである。
【０００９】
一実施形態では、血小板機能調節因子は、ＴＲＡＰ、コラーゲン、エピネフリン、ＡＤＰ、アラキドン酸、セロトニン及びトロンボキサンＡ２、リストセチン、ＮＯ供与体（ＳＮＡＰなど）、Ｕ４６６１９並びにコンブルキシンを含む群から選択される。通常、血小板機能調節因子は、ＴＲＡＰ、コラーゲン、エピネフリン、ＡＤＰ及びアラキドン酸を含む群から選択される。
【００１０】
ＴＲＡＰを用いる場合、それ以外の血小板機能調節因子すべてを添加した後に、ＴＲＡＰを反応容器に添加するのが好ましい。理想的には、血小板含有試料を添加する直前にＴＲＡＰを容器に添加する。
【００１１】
適した血小板アンタゴニストは、血小板生物学分野の当業者にはよく知られているだろう。
【００１２】
理想的には、少なくとも５種の血小板アゴニストを用い、５種の血小板機能調節因子がＴＲＡＰ、コラーゲン、エピネフリン、ＡＤＰ及びアラキドン酸である。
【００１３】
一実施形態では、血小板機能プロフィールは、アッセイされた各血小板機能調節因子の用量反応曲線を、ヒル傾斜可変性、最大及び／又は最小凝集、並びにＥＣ値（すなわちＥＣ５０）などの、用量反応曲線の（１つ又は複数の）関数と併せて含む。一実施形態では、血小板機能プロフィールは、用量反応曲線のみ、又はＥＣ値のみから成る。
【００１４】
血小板凝集は、光学的凝集測定法を用いて決定するのが適切である。通常、光学的凝集計は、光学的凝集計によって提供された測定値の記録及び処理を行うプロセッサーに動作可能に接続されている。通常、プロセッサーは、各アゴニストの用量反応曲線と、任意選択で、ヒル傾斜可変性及びＥＣ値など、各用量反応曲線の特徴を得るために得られたデータとを処理するソフトウェアを含有しているであろう。好ましい実施形態では、ソフトウェアはＧＲＰＡＨＡＤ  ＰＲＩＳＭソフトウェアである。
【００１５】
通常、血小板機能調節因子を、少なくとも４、５、６、７、８、又は９つの濃度で用意する。通常、アラキドン酸は、１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる濃度、好ましくは３〜７０ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる濃度、より好ましくは０．５８ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる濃度で用意されるであろう。通常、コラーゲンは、０．００１〜０．３ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる濃度、好ましくは０．００１５〜０．２５ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる濃度、より好ましくは０．００２３〜０．１９ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる濃度で用意されるであろう。通常、ＡＤＰは、０．０１〜４０μＭ、好ましくは０．２〜３０μＭ、より好ましくは０．０１５〜２０μＭの範囲にわたる濃度で用意されるであろう。通常、エピネフリンは、０．０１〜４０μＭ、好ましくは０．１２５〜３０μＭ、より好ましくは０．０１２２〜２０μＭの範囲にわたる濃度で用意されるであろう。通常、ＴＲＡＰは、０．０１５〜２０μＭの範囲にわたる濃度で用意されるであろう。一般的に、血小板機能調節因子に用いる濃度の範囲は、４ログ単位にわたるべきであり、用いる血小板機能調節因子のそれぞれに関して、知られている有効用量範囲を包含するべきである。「範囲にわたる」という用語は、用いられた濃度が、上記に提示した範囲の最低値に等しいか又は近い最低値から、上記の範囲の最高値に等しいか又は近い最高値までの範囲にあり、それらの中間にある濃度がそれら両極端の間に広がっていることを意味するものとする。
【００１６】
好ましい実施形態では、測定された血小板凝集パラメータは、少なくとも１５分、１６分、１７分、適切には少なくとも１７．５分間にわたる間に得られた最大凝集である。理想的には、得られた最大凝集は、少なくとも１８分間の時間にわたって決定されたものである。
【００１７】
反応容器は、マイクロタイタープレートのウェル、又は多数の反応ウェルを有する同等な装置のウェルが適している。そのような多数の反応ウェルを有する同等な装置の他のタイプ、例えば小型化されたマイクロタイタープレート、及びカートリッジなどは、当業者には知られているであろう。
【００１８】
理想的には、本発明の方法は、各反応容器内の血小板凝集パラメータが実質的に同時に測定されるハイスループット法である。
【００１９】
各血小板機能調節因子は、少なくとも４、５、６又は７つの、好ましくは少なくとも２ログ単位にわたる濃度で用意するのが適切である。理想的には、血小板機能調節因子を８つの濃度で用意する。
【００２０】
一実施形態では、エピネフリンは血小板機能調節因子の１つであり、用いられるエピネフリンの濃度が、−８のＬｏｇ［濃度］から−５のＬｏｇ［濃度］までの範囲にある。理想的には、用いられるエピネフリンの濃度は、−９のＬｏｇ［濃度］から−５のＬｏｇ［濃度］までの範囲にある。
【００２１】
一実施形態では、コラーゲンは血小板機能調節因子の１つであり、用いられるコラーゲンの濃度は、−５．５のＬｏｇ［濃度］から−３．８のＬｏｇ［濃度］までの範囲にある。理想的には、用いられるコラーゲンの濃度は、−５．７のＬｏｇ［濃度］から−３．７のＬｏｇ［濃度］までの範囲にある。
【００２２】
一実施形態では、アラキドン酸は血小板機能調節因子の１つであり、用いられるアラキドン酸の濃度は、−５．０のＬｏｇ［濃度］から−３．４のＬｏｇ［濃度］までの範囲にある。理想的には、用いられるアラキドン酸の濃度は、−５．２のＬｏｇ［濃度］から−３．３のＬｏｇ［濃度］までの範囲にある。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、血小板機能調節因子は血小板アゴニストであり、血小板アゴニストの少なくとも１種は、そのアゴニストの準最大濃度を含めた濃度範囲で用いられる。血小板アゴニストの少なくとも２種は、そのアゴニストの準最大濃度を含めた濃度範囲で用いるのが適切である。血小板アゴニストの少なくとも３種は、そのアゴニストの準最大濃度を含めた濃度範囲で用いるのが好ましい。理想的には、そのアゴニストの準最大濃度を含めた濃度範囲で用いられる血小板アゴニストは、コラーゲン、エピネフリン及びアラキドン酸のうちの１つ又は複数である。本明細書では、「準最大濃度」という用語は、凝集によって定義された最大限又は最大の反応を誘導するアゴニストの濃度より低い程度の凝集を誘導する血小板アゴニストの濃度を意味する。
【００２４】
本明細書では、「血小板機能」という用語は、血小板試料の活性化状態、すなわち、血小板が他の血小板と凝集する能力を指す。血小板の凝集は、光透過性凝集測定法で決定するのが適切である。この方法では、反応混合物を含有するウェルを通過する光を、血小板機能調節因子の添加の前及び後に測定する。したがって、血小板アゴニストを添加された際に、ウェル内の活性化血小板の凝集により、反応混合物を通過した光の吸光度が概ね増大するであろう。通常、５５０〜５９０ｎｍの間、好ましくは５６０〜５８０ｎｍｍの間、より好ましくは５７０〜５７５ｎｍの間の波長を用いて吸光度を測定する。理想的には、５７２ｎｍの波長を用いて吸光度を測定する。マルチプレートからの光測定値の取得に適した光透過性リーダーは、当業者にはよく知られているだろう。さらに、例えば、４０５ｎｍ、４９０ｎｍ、及び他の波長など、異なった波長で吸光度を測定してもよい。
【００２５】
血小板含有試料は通常、洗浄血小板調製物及び多血小板血漿（ＰＲＰ）を含む群から選択される。血小板含有試料中の血小板の濃度は、適切には２×１０５／μｌ超であり、通常は３×１０５／μｌ超であり、好ましくは４×１０５／μｌ超であり、理想的には５×１０５／μｌ超である。理想的には、ＰＲＰは、クエン酸の溶液中、通常はクエン酸ナトリウムの溶液中に、通常は血液：クエン酸が１０：１の比率で血液を吸引することによって取得できる。クエン酸溶液は、通常は３％〜４％、理想的には３．２％（ｗ／ｖ）の濃度である。各ウェルに添加されるアゴニスト／血小板含有試料（緩衝剤を含有している）の容積は、通常は１５０〜２５０μｌの間、好ましくは１８０〜２２０μｌの間、最も好ましくは１９５〜２０５μｌの間、理想的には約２００μｌである。
【００２６】
通常、各反応容器内の凝集のレベルは、血小板を血小板機能調節因子に反応させた後の様々な時点で測定する。少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２又は１５の測定値が、適切には最初の３０分間、好ましくは最初の２５分間、最も好ましくは最初の２０分間の反応中にとられるであろう。測定値を２〜５分間毎にとるのが適切である。理想的には、０、３、９、１５、及び１８分目に測定値をとる。理想的には、測定と測定との間に、通常はオービタルシェーカーを用いて、プレートを撹拌する。理想的には、オービタルシェーカーは、０．５〜３ｍｍ、好ましくは約１ｍｍの軌道振動パターンで動作する。
【００２７】
本発明は、本発明の血小板反応性プロフィールを測定する方法を用いる、血小板反応性プロフィールへの試験化合物の影響を調査する方法であって、アゴニストと血小板含有試料との間の反応を化合物の存在下で行う方法にも関する。試験化合物の存在下及び不存在下で得られた、試験対象（複数可）の血小板反応性プロフィールを比較することによって、試験化合物が血小板凝集にアゴニスト作用又はアンタゴニスト作用を及ぼす能力を決定するのが適切である。したがって、本発明の方法は、化合物を試験して、それらが血小板凝集のアゴニストであるのか、アンタゴニストであるのか判定するため、化合物がどの生物学的経路を調節するのか試験するため、及び化合物の最適な濃度が何であるか決定するために用いることができる。さらに、本発明の方法は迅速なハイスループットアッセイを提供するので、迅速かつ好都合な方法で化合物のライブラリーをアッセイすることができる。
【００２８】
本発明は、個体の血小板反応性状態を決定する方法であって、本発明の方法に従って、個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた血小板反応性プロフィールを、その個体のための基準血小板反応性プロフィールと比較するステップとを含む方法にも関する。したがって、本発明の方法は、ある個体の血小板が、その個体のための基準活性化状態より高い活性化状態を有するか、又は低い活性化状態を有するか判定するのに用いることができる。個体の血小板反応性状態が、その個体のための基準より高い場合、個体は、アテローム血栓性イベントを患う危険性がありうる。そのように、血小板反応性状態は、個体の心臓血管健康の生物マーカーとして、又は個体が出血の危険性なしに手術を受けることができるかどうかに関する指標として、又は個体の血小板が移植に適しているかどうかの指標として機能しうる。
【００２９】
本発明は、アテローム血栓性イベントを有する危険性がある個体を同定する方法であって、本発明に従って、個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた血小板反応性プロフィールを、その個体のための基準血小板反応性プロフィールと比較するステップとを含み、個体の血小板反応性プロフィールが、あるアゴニストに対して、基準血小板反応性プロフィールにおけるそのアゴニストに対する反応と比較して、有意に増強された反応を示す場合、その個体はアテローム血栓性イベントを有する危険性がある方法にも関する。
【００３０】
本発明は、個体の異常な血小板反応性を同定する方法であって、本発明の方法に従って、個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた血小板反応性プロフィールを、その個体のための基準血小板反応性プロフィールと比較するステップとを含み、個体の血小板反応性プロフィールが基準血小板反応性プロフィールと有意に相違している場合、その個体は異常な血小板反応性を有する方法にも関する。
【００３１】
本発明は、それを必要とする個体に適した抗血小板剤又は用量を同定する方法であって、本発明の方法に従って、個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた血小板反応性プロフィールを、その個体のための基準血小板反応性プロフィールと比較するステップと、有意に増強された反応があるいかなるアゴニストも同定するステップと基準血小板反応性プロフィールにおけるそのアゴニストに対する反応と比較した際に、そのアゴニストによって改変された生物学的経路を標的とする抗血小板療法又は用量を選択するステップとを含む方法にも関する。
【００３２】
上記方法において、個体のための基準血小板反応性プロフィールは、個体の臨床状態に依存する。したがって、調査される個体が抗血小板治療を受けていない男性である場合、基準血小板反応性プロフィールは、正常な健康男性から得られた平均プロフィールであろう。しかし、調査される個体が治療介入を受けている場合、基準血小板反応性プロフィールは、同じ治療介入を受けている患者から得られた平均プロフィールであろう。通常、抗血小板治療の場合、治療はアスピリン／クロピドグレルの二重治療であろう。したがって、例えば、個体がアスピリン／クロピドグレルで治療されており、それらが依然としてＴＲＡＰに対して反応亢進性のままであることをそれらの血小板反応性プロフィールが示している場合、薬物の一方又は両方の用量を改変すると臨床医が決定するかもしれず、又は、実際、ＴＲＡＰによって調節されている生物学的経路を特異的に標的とする（すなわち、ＰＡＲ−１受容体を標的とする）ように、治療を改変すると決定するかもしれない。
【００３３】
一般的に、特異的アゴニストが十分に阻害されていないことを本発明の方法が示している場合、臨床医は、そのアゴニストによって調節されている経路を標的とする薬物を処方する可能性がある。したがって、ＴＲＡＰに対する阻害が不十分であることをプロフィールが示している場合、ＰＡＲ１受容体を標的とする薬物が処方されうる。同様に、コラーゲン又はエピネフリンに対する阻害が不十分であることをプロフィールが示している場合、ＩＩｂＩＩａ阻害剤が処方されうる。同様に、ＡＤＰに対する阻害が不十分であることをプロフィールが示している場合、クロピドグレル、チクロピジン又はプラスグレルが処方されうる。同様に、アラキドン酸に対する阻害が不十分であることをプロフィールが示している場合、アスピリン又はＩＩｂＩＩＩａ阻害剤が処方されうる。
【００３４】
したがって、本発明は、個体で、不十分又は最適以下である抗血小板治療を同定及び修正する方法であって、本発明の方法に従って、個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた血小板反応性プロフィールを、抗血小板治療を受けている個体のための基準血小板反応性プロフィールと比較するステップと、基準プロフィールと比較して、不十分に阻害されているいかなるアゴニストも同定するステップと、アゴニストの十分な阻害を行うように抗血小板治療を改変するステップとを含む方法にも関する。治療の改変は、用いられる薬物の改変、又はその薬物の投与計画の改変を伴うものでありうる。したがって、例えば、基準血小板反応性プロフィールと比較して、アラキドン酸誘発凝集が不十分に阻害されていることを血小板反応性プロフィールが示している場合、臨床医は、患者にアスピリン治療を施すと決定するかもしれず、或いは、患者が既にアスピリン治療を受けている場合、用量を増大させるように、又はアスピリンより効力の大きいものを処方するように治療を変えるかもしれない。
【００３５】
本発明は、血小板活性調節剤を同定する方法であって、試験化合物の不存在下及び存在下で、本発明の方法に従って、個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた血小板反応性プロフィールを比較するステップと、得られた血小板反応性プロフィールの間に有意な相違がある場合、試験化合物が血小板アゴニストであるか、又は血小板アンタゴニストであるかを判定するステップとを含む方法にも関する。本発明の好ましい実施形態では、多くの異なった濃度の試験化合物に関して、血小板反応性プロフィールを取得する。本発明は、試験化合物のライブラリーをスクリーニングする方法であって、本発明による、血小板活性調節剤を同定する方法を用いる方法にも関する。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、個体の臨床状態の判定を補助する方法であって、本発明の方法に従って、個体の血小板機能プロフィールを決定するステップと、そのように得られた反応性プロフィールを、その個体のための基準血小板機能プロフィールと比較するステップとを含み、それによって、試験プロフィールと基準プロフィールとの間のいかなる相違が、個体の臨床状態の判定における補助を提供する方法に関する。個体の臨床状態には、薬物反応性、薬剤抵抗性、手術の危険性、心血管危険性状態及び血小板輸血の危険性が含まれうる。薬物反応性臨床状態には、アスピリン関連薬物、ＡＤＰ受容体阻害薬物及びＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト／遮断薬を含む群から選択されたものなど、抗血栓症薬剤に対する反応性が含まれうる。
【００３７】
したがって、本発明の方法は、個体に最も適した抗血栓症療法を、それらの血小板機能プロフィールを考慮して迅速に決定するために用いることができる。さらに、上記方法は、個体が手術中に出血する危険があるかどうか判定するのに用いることができる。一実施形態では、基準血小板機能プロフィールは、正常な健康男性ドナー又は女性ドナーのプロフィールでありえ、その場合、相関関係は、患者試料の血小板機能プロフィールが正常な健康な血小板機能を示すものであるかどうかを示すであろう。しかし、例えば、患者試料から得られたＥＣ５０値が正常な同性基準値と有意に相違している（すなわち低い）場合、これは、患者血小板が反応亢進性であり、それによって、患者の血栓性イベントの素因になっていることを示すものでありうるであろう。この点で、本発明の方法は、冠血管疾患の罹病率及び／又は死亡率の予後の方法を提供する。
【００３８】
本発明の方法は、通常、個体の血小板反応性プロフィールを作成するステップと、その反応性プロフィールを、その個体のための適した基準血小板反応性プロフィールと比較するステップとを伴う。血小板反応性プロフィールには、１つ又は複数の用量反応曲線、並びにＥＣ値、ヒル傾斜可変性、最大凝集値及び最小凝集値を含む群から選択されるパラメータが含まれる。基準プロフィールの選択は、患者によって決定され、例えば、患者が単独、二重又は三重抗血小板治療を受けている場合、基準プロフィールは通常、そのような治療を受けている患者のコホートの平均となるであろう（正常な健康な患者のための基準プロフィールの一例（用量反応曲線のみから成る）と、二重抗血小板治療を受けている、心臓血管疾患を有する患者のためのものとを下記に示す）。基準プロフィールのものとは異なっている血小板反応性プロフィールを有する個体を同定するためには、患者の血小板反応性プロフィールの一部を形成する１つ又は複数の血小板反応性パラメータを、基準プロフィールにおける同等なパラメータと比較する。理想的には、比較は、パラメータの相違が有意なものであるか、又は有意でないものであるかを確認するために、フィッシャーの正確検定を用いてパラメータ（複数可）を比較することによって行う。ｐ値を計算し、値が０．０５未満である場合、パラメータ間の相違が有意であると考えられる（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ａ．、１９２２年、「Ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  χ２  ｆｒｏｍ  ｃｏｎｔｉｎｇｅｎｃｙ  ｔａｂｌｅｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ８５（１）：８７−９４、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ａ．、「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｗｏｒｋｅｒｓ」、Ｏｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｙｄ、１９５４年）。例えば、患者が、アスピリン治療を受けている、既存の心臓血管疾患を有する患者であり、患者のエピネフリンＥＣ５０値が基準プロフィールの値より高い場合、これは、患者は十分に阻害されておらず、抗血小板療法の改変が必要であることを臨床医に示すであろう。
【００３９】
基準プロフィールのものとは有意に相違している（又は増大している）血小板反応性プロフィールを同定するさらに別の手段（その方法を、上述した方法に加えて、又はその代替手段として用いることができる）は、患者の用量反応曲線を、基準プロフィールから得た同等な複数の用量反応曲線の上に重ね合わせることであり、それらが明らかに重なり合わない場合、それらのプロフィールは異なっている。この比較方法を用いて、反応が上及び左に移動している場合、これは、基準と比較して、患者血小板がより反応性であること、及び患者がアテローム血栓性イベントを患う危険性がありうることを示すであろう。
【００４０】
本発明は、迅速かつハイスループットな方法で血小板機能プロフィールを作成するのに適したキットであって、
−多数の反応ウェルを有する装置と、
−少なくとも３種の血小板機能調節因子と、
−本発明の方法を行うための説明書と
を含むキットにも関する。
【００４１】
上記装置は、マイクロタイタープレートか、又は小型化されたマイクロタイタープレート若しくは多数の反応容器を有するカートリッジなどの同等な装置が適している。
【００４２】
一実施形態では、キットは、装置のウェル内にｉｎ  ｓｉｔｕに配置されている血小板機能調節因子と共に梱包されている。
【００４３】
装置のウェルは、ある範囲の濃度の少なくとも４種の血小板機能調節因子、理想的には少なくとも５種の血小板機能調節因子を保持していることが好ましい。通常、装置は、少なくとも５、６、７又は８つの濃度の血小板機能調節因子を保持している。理想的には、少なくとも１種、好ましくは２又は３種のアゴニストは、そのアゴニストの準最大濃度を含めた範囲の濃度で提供される。
【００４４】
理想的には、血小板機能調節因子は血小板アゴニストであり、それらは、ＡＤＰ、アラキドン酸、エピネフリン、ＴＲＡＰ及びコラーゲンを含むか、これらから成るか、又はこれらを含む群から選択されることが好ましい。通常、血小板機能調節因子は液体形態にある。しかし、代替の実施形態では、血小板機能調節因子は凍結乾燥形態にある（その場合、血小板機能調節因子は何週間か又は何カ月間か保存でき、任意選択で、プレートのウェル内に何週間か又は何カ月間か保存することもできる）。これは、例えば、様々な調節因子（すなわち血小板アゴニスト）の溶液をプレートのウェルに添加し、その後、プレートを凍結乾燥器内に入れてアゴニスト溶液を凍結乾燥させ、凍結乾燥されたばかりのアゴニストをプレートのウェル内に残すことによって実現される。その後、例えば、ピールオフ型のフタ、又はマイクロタイタープレートでの使用用に販売されているタイプのキャップ型のフタなどの適したカバーでプレートを覆ってもよい。
【００４５】
したがって、一実施形態では、血小板アゴニストは、マイクロタイタープレートのウェル内でｉｎ  ｓｉｔｕで凍結乾燥される。
【００４６】
一実施形態では、血小板機能修飾因子は、ＴＲＡＰ、コラーゲン、エピネフリン、ＡＤＰ、アラキドン酸、セロトニン、トロンボキサンＡ２、コンブルキシン、ＮＯ供与体（すなわちＳＮＡＰ）及びＵ４６６１９を含む群から選択される。血小板機能修飾因子は、ＴＲＡＰ、コラーゲン、エピネフリン、ＡＤＰ及びアラキドン酸を含む群から選択されることが好ましい。
【００４７】
理想的には、マイクロタイタープレートは９６ウェルマイクロタイタープレートである。別法として、小型化又は改変バージョンのマイクロタイタープレートを用いてもよい。
【００４８】
通常、説明書は、血小板機能修飾因子を少なくとも３、４、５、６、７、８又は９つの濃度でプレートに添加することを示す。通常、アラキドン酸は、１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる濃度、好ましくは３〜７０ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる濃度、より好ましくは０．５８ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる濃度で提供されるであろう。通常、コラーゲンは、０．００１〜０．３ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる濃度、好ましくは０．００１５〜０．２５ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる濃度、より好ましくは０．００２３〜０．１９ｍｇ／ｍｌの範囲にわたる濃度で提供されるであろう。通常、ＡＤＰは、０．０１〜４０μＭ、好ましくは０．２〜３０μＭ、より好ましくは０．０１５〜２０μＭの範囲にわたる濃度で提供されるであろう。通常、エピネフリンは、０．０１〜４０μＭ、好ましくは０．１２５〜３０μＭ、より好ましくは０．０１２２〜２０μＭの範囲にわたる濃度で提供されるであろう。通常、ＴＲＡＰは、０．０１５〜２０μＭの範囲にわたる濃度で提供されるであろう。一般的に、血小板機能調節因子に用いられる濃度の範囲は、４ログ単位にわたるべきであり、かつ用いられる血小板機能調節因子のそれぞれについて知られている有効用量範囲を包含するべきである。
【００４９】
本発明は、例としてのみ示す、その一部の実施形態に関する下記の説明から、より明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】正常（健康）個体の平均血小板反応性プロフィールを示す図である。
【図２】正常（健康）な男女の平均血小板反応性プロフィールを示す図である。
【図３】炎症性関節リウマチ患者の血小板反応性プロフィールを示す図である。
【図４】アスピリン、クロピドグレル及びアブシキシマブの抗血小板療法を受けている、冠動脈血栓を有する３７歳の男性に関して得られた血小板反応性プロフィールを示す図である。
【図５】エピネフリンの用量反応曲線を示す図である。図５ａは、従来の系列希釈濃度のエピネフリンを用いて作成された、アゴニストであるエピネフリンの用量反応曲線を示す図である。図５ｂは、準最大濃度を含めた範囲の濃度のエピネフリンを用いて作成された、エピネフリンの用量反応性治療を示す図である。
【図６】（図６ａ〜６ｅ）５０人の正常（健康）ボランティア（黒三角）の平均血小板反応性プロフィールに対する、アスピリン７５ｍｇ及びクロピドグレル７５ｍｇから成る二重抗血小板治療を受けている、既知の心臓血管疾患を有する７５人の患者の平均プロフィール（白丸）を示す図である。
【図７】（図７ａ〜７ｅ）アスピリン７５ｍｇ及びクロピドグレル７５ｍｇから成る二重抗血小板治療を受けている、既知の心臓血管疾患を有する７５人の患者の平均血小板反応性プロフィール（白丸）に対する、以前に２回の心筋梗塞と、さらに血栓性脳卒中とを有した個体男性のもの（黒三角＝来院１、白四角＝来院２）を示す図である。
【発明の詳細な説明】
【００５１】
材料及び方法
調査前１４日以内にいかなる抗血小板薬物も投与されていなかった健康な対象を募集した。早朝の静脈切開前４時間の間、対象は激しい運動及びたばこの喫煙を控えた。血液は肘窩から採取した。最初に採取した５ｍｌは、好ましくない血小板活性化を回避するために廃棄し、次の２７ｍｌの血液を３ｍｌの３．２％クエン酸ナトリウム抗凝血物質中に収集した。その後、この血液クエン酸混合物を１５０ｇで１０分間遠心分離して、上清の多血小板血漿（ＰＲＰ）を回収した。Ｓｙｓｍｅｘ社ＫＸ  ２１Ｎを用いて血小板濃度を測定した。
【００５２】
９６ウェルプレートの調製：
透明な底部を有する９６ウェルのＢｌａｃｋ  ＩｓｏＰｌａｔｅを用いた。横列１−アラキドン酸（ＡＡ）、横列２−コラーゲン、横列３−ＡＤＰ、横列４−エピネフリン、横列５−トロンビン関連活性化ペプチド（ＴＲＡＰ）、及び、横列６を、対照４ウェルのＰＲＰと４ウェルの低濃度血小板血漿（ＰＰＰ）とを含有している対照の列として、列ごとにアゴニストを配置した。残り６列の横列は、必要に応じて、追加のアゴニスト又は特異的ペプチドに使用できる。１２チャネルピペットを用いて、各列のウェル２〜８に緩衝液Ａ（６ｍＭ  ブドウ糖、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、９ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、３ｍＭ  ＫＣｌ、０．８１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、及び０．９ｍＭ  ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ［ｐＨ７．４］）を添加した。横列１−  １０μｌの緩衝液Ａをウェル２に入れた。次に、２０μｌの緩衝液Ａを、包括的にウェル３〜８のそれぞれに添加した。次に、５０μｌのＡＡ（５００ｍｇ／ｍｌ保存液）をウェル１に入れた。ウェル１から３０μｌのＡＡを取り、ウェル２内の緩衝液Ａと混合した。２０μｌのＡＡ／緩衝液Ａをウェル２から取り、ウェル３内で混合した。次に、ウェル３から２０μｌを取り、ウェル４内で混合した。これを、ウェル８を含めて、ウェル８までこの横列全体にわたって繰り返し、２０μｌが残されて、それを廃棄する。横列２−  コラーゲン（１．９ｍｇ／ｍｌ保存液）、横列１と同じプロセス。横列３及び５、ＡＤＰ（横列３）及びＴＲＡＰ（横列５）、ウェル２〜８には、それぞれの中に２０μｌの緩衝液Ａを入れた。４０μｌの量のＡＤＰ（２００μＭ保存液）をウェル１に入れた。２０μｌのアゴニストをウェル１から取り、ウェル２に入れ、次にその中で緩衝液Ａと完全に混合した。次に、この同じプロセスをプレート全体にわたって繰り返し、ウェル８の後には、２０μｌが残った。これを、その後廃棄した。同じプロセスを、横列５−ＴＲＡＰ（２００μＭ保存液）についても繰り返す。横列４エピネフリン−  別々の９６ウェル混合プレートを用いて、ウェル２〜８と、２番目の横列のウェル１〜８とに、２０μｌの緩衝液Ａを添加して、緩衝剤Ａを含有する１５ウェルを得る。アゴニストＡＤＰ及びＴＲＡＰで行ったのと同じ系列希釈のプロセスを繰り返して８つの濃度の代わりに１６つの濃度を用意する。最初のウェルは、ウェル１に添加された４０μｌのエピネフリン（２００μＭ保存液）を有する。このアゴニスト／緩衝液混合物を混合プレートのウェル１、３、５、７、９、１１、１３、１５から取り出し、その後、マスタプレートに移す。この方法は、一度に最大８枚のプレートを作るように適応させてある。
【００５３】
ひとたびプレートが調製されたならば、ＰＲＰを添加する。マルチチャンネルピペットを用いて、１８０μｌのＰＲＰを各横列に添加し、リバースピペット技法を用いて、ウェル内のいかなる気泡生成も回避する。これによって、２００μｌの最終容積を得る。
【００５４】
このプレートを次にＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ３プレートリーダーに入れる。時間ゼロ（Ｔ０）に、５７２ｎｍの吸光度に関して、このプレートを測定する。その後、このプレートを０．１ｍｍの軌道で１０００ｒｐｍ、３分間振盪するように設定する。Ｔ３（３分）の測定値を取り、その後、Ｔ９（９分）の測定まで振盪を再開する。さらなる測定値を、各時点の間に振盪させながら、Ｔ１５（１５分）及びＴ１８（１８分）にとる。このプロトコール全体を３７℃で行う。
【００５５】
その後、最小凝集及び最大凝集を表す、ＰＰＰ及びＰＲＰの吸光度の値からデータを正規化する。次に、データをＰＲＩＳＭソフトウェアに入れ、最大凝集、ＥＣ５０及びヒル傾斜可変性を計算するために分析を行う。
【００５６】
実施例１
５０人の健康男性及び女性の血小板反応性プロフィールを作成するために、上記の材料及び方法を用いる。図１（図１ａ〜１ｅ）は、健康男性の平均血小板反応性プロフィールを示し、図２（図２ａ〜２ｅ）は、健康女性の平均血小板反応性プロフィールを示す。これが明確に実証することは、複数の濃度の複数のアゴニストを用いる値である。伝統的な単一濃度の特定のアゴニストを用いる場合（各グラフの最も右側における、最大凝集が起こる濃度によって代表される）、生物学的変異を拾い上げることがないと見て取ることができる。これは、準最大濃度で、これらの特別に計画された濃度における男女間の血小板反応性の有意な相違によって、明確に見られる。
【００５７】
実施例２
炎症性関節リウマチ患者の血小板反応性プロフィールを作成した−図３（図３ａ〜３ｅ）参照。関節リウマチ集団は、血栓の危険性が増大している炎症性患者群である。本発明者らのアッセイは、この炎症性関節リウマチ患者で、アゴニストであるアラキドン酸（図３ａ）、ＡＤＰ（図３ｄ）及びエピネフリン（図３ｅ）からの過度の血小板反応性を明確に実証した。Ｇｅｒｂｅｒによって記述された方法を用いていたら、ＡＤＰ５及びＡＤＰ２０の使用によって、この重要な臨床障害は見落とされていたであろう。これは、図３ｄにおいて、正常集団（ｎ＝５０）で見られると予測された反応と比較されている、ＡＤＰ５μＭ及び２０μＭを特定する２つの円で目立つようにしてある。この反応性が、このアッセイで標準物質として使用されているアゴニストのすべてではなく、一部で起こるという事実は、この重大な反応亢進の特定の機構を示唆する。この実施例も、準最大濃度の複数のアゴニストを用いることの絶対的価値を際立たせている。
【００５８】
実施例３
アスピリン、クロピドグレル及びアブシキシマブの抗血小板療法を受けている、冠動脈血栓を有する３７歳の男性の血小板反応性プロフィールを得た。これを図４（図４ａ〜４ｅ）に示す。この実施例は、実際に、この抗血小板療法がこの個体で許容できる阻害を与えていないこと、及び将来、アテローム血栓性イベントが起きる彼らの危険性が依然として重大であることをＴＲＡＰ用量反応曲線（図４ｅ）が明確に示しているときに、もしも血小板反応性プロフィールを作成する従来技術の方法に従って、１又は２つの濃度のアラキドン酸及びＡＤＰ凝集（図４ａ及び４ｃ）に血小板反応性プロフィールが限定されていたならば、患者は、彼らの抗血小板療法が良好に作用しており、彼らの血栓危険性が低いと知らされるであろうことに脚光を当てるものである。
【００５９】
実施例４
図５ａは、従来の系列希釈濃度のエピネフリンを用いて作成された、アゴニストであるエピネフリンの用量反応曲線を示す。図５ｂは、準最大濃度を含めた範囲の濃度のエピネフリンを用いて作成された、エピネフリンの用量反応性治療を示す。明らかに、図５ａは濃度反応曲線に反応しておらず、一方、図５ｂは濃度反応性の作動モデルに従っている。
【００６０】
実施例５
図６（図６ａ〜６ｅ）は、５０人の正常（健康）ボランティア（黒三角）の平均血小板反応性プロフィールに対する、アスピリン７５ｍｇ及びクロピドグレル７５ｍｇから成る二重抗血小板治療を受けている、既知の心臓血管疾患を有する７５人の患者の平均プロフィール（白丸）を示す。
【００６１】
実施例６
図７（図７ａ〜７ｅ）は、アスピリン７５ｍｇ及びクロピドグレル７５ｍｇから成る二重抗血小板治療を受けている、既知の心臓血管疾患を有する７５人の患者の平均血小板反応性プロフィール（白丸）に対する、以前に２回の心筋梗塞と、さらに血栓性脳卒中とを有した個体男性のもの（黒三角＝来院１、白四角＝来院２）を示す。
【００６２】
上記セットの図は、以前に２回の心筋梗塞と、さらに血栓性脳卒中とを有していることによって、心血管性の危険性が増大していると実証されている男性を明確に実証している。彼は、来院１の時点で、腸コーティングされたアスピリン１日７５ｍｇ及びクロピドグレル１日７５ｍｇを摂取しており、彼の血小板反応性が試験されている。これは、彼の現在の抗血小板療法による血小板阻害がないか、あってもほとんどなく、試験された５種のアゴニスト全体にわたって反応亢進性の表現型を実証している。患者は４週間後に再来院し、その間に、彼の薬物投与はアスピリン（可溶性）１５０ｍｇに変わっており、クロピドグレルは以前の通り毎日１回７５ｍｇのままである。本発明者らがアラキドン酸グラフを検査し、今回は、来院２に注目する場合、アスピリンがアンタゴニスト作用の原因となる、この患者のＣＯＸ経路が明確に阻害されており、それが、二重抗血小板治療を受けている７５人の他の個体で見られた結果に匹敵するものであることを、本発明者らは見て取る。彼の血小板反応性は一貫して低下している。しかし、患者の血栓の危険性が治療にもかかわらず依然として有意に高いままであることを他のアゴニストが示しているという点で、このアッセイは、この療法にもかかわらず、その価値を実証している。
【００６３】
これは、
１．このアッセイが血栓性イベントの危険性がある人を明確に同定すること、
２．臨床管理の変化が血栓症の原因となる１つの経路の阻害をもたらしたこと、
３．しかし、血小板反応性の低減にもかかわらず、彼は、アスピリン及びクロピドグレルの二重治療を受けている心臓血管集団のその他の人より高用量にもかかわらず、より有意に高い血小板反応性を有するままであること
を際立たせている。
【００６４】
実施例７
本発明者は、次の論文、すなわち、Ｅｄｗａｒｄｓ、Ｒ．Ｊ．ら、「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．」、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ、２００７年、３（２）巻、１０８〜１２頁に記載されている、合成ペプチドの血小板活性調節能の調査において、本発明の方法を用いている。
【００６５】
本発明は、以上に記載された実施形態に限定されず、本発明の趣旨から逸脱せずに、構成及び詳細の両方で改変されうる。
【図１】
2010506165.tif 000003
【図２】
2010506165.tif 000004
【図３】
2010506165.tif 000005
【図４】
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【図５】
2010506165.tif 000007
【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年6月9日(2009.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体からの血小板含有生物試料を用意するステップと、
少なくとも３種の血小板機能調節因子を用意するステップであって、各血小板機能調節因子を少なくとも３つの濃度で用意するステップと、
前記血小板含有試料のアリコートを、別々の反応容器内で各濃度の各血小板機能調節因子と反応させるステップと、
各反応容器内の血小板凝集を測定するステップと、
前記血小板凝集測定値を用いて、各血小板機能調節因子の用量反応曲線を作成するステップであって、得られた用量反応曲線（複数）、及び／又は前記得られた用量反応曲線（複数）の１つ又は複数の関数が前記個体の血小板反応性プロフィールを含むステップと
を含む、個体の血小板反応性プロフィールを決定する方法。
【請求項２】
少なくとも４種の血小板機能調節因子を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも５種の血小板機能調節因子を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記血小板機能調節因子が血小板アゴニストである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも５種の血小板アゴニストが用いられ、前記アゴニストが、ＴＲＡＰ、コラーゲン、エピネフリン、ＡＤＰ及びアラキドン酸を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記用量反応曲線の前記関数（複数可）が、ヒル傾斜可変性、最大及び／若しくは最小凝集、並びにＥＣ値（すなわちＥＣ５０）の１つ又は複数から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記反応容器が、マイクロタイタープレートのウェル、又は多数の反応ウェルを有する同等な装置のウェルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
各反応容器内の血小板凝集パラメータが実質的に同時に測定されるハイスループット法である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
各血小板機能調節因子を、少なくとも２ログ単位にわたる範囲の濃度で用意する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記血小板機能調節因子が血小板アゴニストであり、かつ前記血小板アゴニストの少なくとも１種が、そのアゴニストの準最大濃度を含めた濃度範囲で用いられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
そのアゴニストの準最大濃度を含めた濃度範囲で用いられる前記少なくとも１種の血小板アゴニストが、コラーゲン、エピネフリン及びアラキドン酸のうちの１つ又は複数である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
個体の血小板反応性状態を決定する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法に従って、前記個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた前記血小板反応性プロフィールを、その個体のための基準血小板反応性プロフィールと比較するステップとを含む、方法。
【請求項１３】
アテローム血栓性イベントを有する危険性がある個体を同定する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法に従って、個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた血小板反応性プロフィールを、その個体のための基準血小板反応性プロフィールと比較するステップとを含み、前記個体の前記血小板反応性プロフィールが、あるアゴニストに対して、前記基準血小板反応性プロフィールにおけるそのアゴニストに対する反応と比較して、有意に増強された反応を示す場合、その個体はアテローム血栓性イベントを有する危険性がある、方法。
【請求項１４】
個体の異常な血小板反応性を同定する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法に従って、個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた血小板反応性プロフィールを、その個体のための基準血小板反応性プロフィールと比較するステップとを含み、前記個体の血小板反応性プロフィールが前記基準血小板反応性プロフィールと有意に相違している場合、その個体は異常な血小板反応性を有する、方法。
【請求項１５】
それを必要とする個体に適した抗血小板剤又は用量を同定する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法に従って、前記個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた血小板反応性プロフィールを、その個体のための基準血小板反応性プロフィールと比較するステップと、前記基準血小板反応性プロフィールにおけるそのアゴニストに対する反応と比較した際に、有意に増強された反応があるいかなるアゴニストも同定するステップと、そのアゴニストによって調節されている生物学的経路を標的とする抗血小板療法又は用量を選択するステップとを含む、方法。
【請求項１６】
個体で、不十分又は最適以下である抗血小板治療を同定及び修正する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法に従って、前記個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた血小板反応性プロフィールを、前記抗血小板治療を受けている個体のための基準血小板反応性プロフィールと比較するステップと、前記基準プロフィールと比較して、不十分に阻害されているいかなるアゴニストも同定するステップと、前記アゴニストの適切な阻害を行うように前記抗血小板治療を改変するステップとを含む、方法。
【請求項１７】
前記治療の改変が、用いられる薬物の改変、又はその薬物の投与計画の改変を伴う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
血小板活性調節剤を同定する方法であって、試験化合物の不存在下及び存在下で、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法に従って、個体の血小板反応性プロフィールを決定するステップと、得られた血小板反応性プロフィールを比較するステップと、前記得られた血小板反応性プロフィールの間に有意な相違がある場合、前記試験化合物が血小板アゴニストであるか、又は血小板アンタゴニストであるかを決定するステップとを含む、方法。
【請求項１９】
多くの異なった濃度の前記試験化合物に関して血小板反応性プロフィールを取得する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
血小板活性調節剤を得るために、試験化合物のライブラリーをスクリーニングする方法であって、請求項１８又は１９に記載の、血小板活性調節剤を同定する方法を用いる、方法。
【国際調査報告】
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