(57)【要約】  本発明は、配列番号３の新たに同定されたアスパラギナーゼポリペプチド変異体およびかかる新規のアスパラギナーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列に関する。さらに、本発明は、工業的プロセスにおけるこれらの新規のアスパラギナーゼ変異体の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスパラギナーゼ活性を有する親ポリペプチドの変異体であって、配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、アミノ酸４１、５３、６２、６３、６４、６６、７０、７１、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４２、１４３、１４５、１６１、１６２、１６３、１６４、１６８、１６９、１７０、１９５、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２８、２３２、２３３、２３４、２３５、２６２、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２９３、２９５、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３１８、３１９、３２１、３２３、３２４、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５または３７１のいずれかに対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されており、親ポリペプチドが配列番号３と少なくとも８０％の相同性を有する、変異体。
【請求項２】
前記親ポリペプチドが配列番号３に記された配列を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、アミノ酸４１、５３、６３、６４、６６、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０６、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４５、１６１、１７０、１９５、２１１、２１８、２２８、２３２、２３３、２６２、２６７、２９３、２９５、２９７、２９９、３００、３０１、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３２１、３２４、３３０、３３２、３３３または３７１のいずれかに対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されている、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項４】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、４１位のＩｌｅ、５３位のＴｙｒ、６３位のＧｌｙまたはＶａｌまたはＳｅｒ、６４位のＰｒｏ、６６位のＰｒｏ、７３位のＬｙｓ、７４位のＡｌａ、７６位のＴｈｒ、７７位のＩｌｅ、８８位のＴｙｒまたはＰｒｏ、９０位のＶａｌ、９１位のＧｌｕ、１０１位のＶａｌ、１０６位のＰｒｏ、１１１位のＧｌｙ、１１９位のＡｓｎ、１２２位のＨｉｓ、１２３位のＡｌａ、１３２位のＳｅｒ、１４０位のＡｓｎ、１４５位のＳｅｒ、１６１位のＬｅｕ、１７０位のＴｈｒ、１９５位のＡｓｐ、２１１位のＳｅｒ、２１８位のＶａｌ、２２８位のＨｉｓ、２３２位のＶａｌ、２３３位のＶａｌ、２６２位のＣｙｓまたはＨｉｓ、２６７位のＴｙｒ、２９３位のＳｅｒまたはＶａｌ、２９５位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位のＩｌｅ、３０１位のＰｒｏ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＴｈｒ、３１０位のＶａｌ、３１４位のＡｓｐ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＳｅｒ、３３２位のＡｌａ、３３３位のＧｌｕまたは３７１位のＭｅｔのうちの１つ以上を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項５】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、アミノ酸５３、６３、６４、６６、７３、７４、７６、７７、８８、１０１、１４０、１７０、２９３のいずれかに対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項６】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、５３位のＴｙｒ、６３位のＧｌｙまたはＶａｌ、６４位のＰｒｏ、６６位のＰｒｏ、７３位のＬｙｓ、７４位のＡｌａ、７６位のＴｈｒ、７７位のＩｌｅ、８８位のＴｈｒまたはＰｒｏ、１０１位のＶａｌ、１４０位のＡｓｎ、１７０位のＴｈｒ、２９３位のＳｅｒまたはＶａｌのうちの１つ以上を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項７】
前記親アスパラギナーゼポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項８】
同じｐＨで測定された前記親ポリペプチドのものよりも高い比活性を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項９】
前記親ポリペプチドのものよりも高い最適ｐＨを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１０】
請求項１に定義されているもの以外のアミノ酸残基の１つ以上の置換をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１１】
請求項１に定義されているもの以外の１〜５個の付加的な置換を含む、請求項１０に記載の変異体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の変異体をコードする核酸配列。
【請求項１３】
適切な発現宿主の中でアスパラギナーゼの発現を導くことができる１つ以上の制御配列に作動的に連結された、請求項１２に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクト。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸コンストラクトを含む組換え発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１６】
アスパラギナーゼの生産を導く条件下で請求項１５に記載の宿主細胞を培養するステップおよびアスパラギナーゼを回収するステップを含む、アスパラギナーゼ生産方法。
【請求項１７】
アスパラギナーゼポリペプチド変異体の生産方法であって、
ａ）  親アスパラギナーゼポリペプチドを選択するステップと；
ｂ）  ４１、５３、６２、６３、６４、６６、７０、７１、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４２、１４３、１４５、１６１、１６２、１６３、１６４、１６８、１６９、１７０、１９５、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２８、２３２、２３３、２３４、２３５、２６２、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２９３、２９５、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３１８、３１９、３２１、３２３、３２４、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５または３７１のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を置換するステップであって、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されており、前記親ポリペプチドが配列番号３と少なくとも８０％の相同性を有するステップと；
ｃ）  ｂ）で定義されている１つ以上のさらなるアミノ酸を任意に置換するステップと；
ｄ）  ステップａ）〜ｃ）の結果として得た変異体を調製するステップと；
ｅ）  前記変異体の少なくとも１つのｐＨにおける比活性および／または最適ｐＨを決定するステップと；
ｆ）  前記親アスパラギナーゼポリペプチドに比べて増大した少なくとも１つのｐＨにおける比活性および／または前記親アスパラギナーゼポリペプチドに比べて増大した最適ｐＨを有する変異体を選択し、これによりアスパラギナーゼポリペプチド変異体を生産するステップと、
を含む方法。
【請求項１８】
前記親アスパラギナーゼポリペプチドが配列番号３に記された配列を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップｂ）において、４１、５３、６３、６４、６６、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０６、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４５、１６１、１７０、１９５、２１１、２１８、２２８、２３２、２３３、２６２、２６７、２９３、２９５、２９７、２９９、３００、３０１、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３２１、３２４、３３０、３３２、３３３または３７１のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基が置換され、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、前記親ポリペプチドが配列番号３と少なくとも８０％の相同性を有する、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップｂ）において置換されたアミノ酸残基が、４１位のＩｌｅ、５３位のＴｙｒ、６３位のＧｌｙまたはＶａｌまたはＳｅｒ、６４位のＰｒｏ、６６位のＰｒｏ、７３位のＬｙｓ、７４位のＡｌａ、７６位のＴｈｒ、７７位のＩｌｅ、８８位のＴｙｒまたはＰｒｏ、９０位のＶａｌ、９１位のＧｌｕ、１０１位のＶａｌ、１０６位のＰｒｏ、１１１位のＧｌｙ、１１９位のＡｓｎ、１２２位のＨｉｓ、１２３位のＡｌａ、１３２位のＳｅｒ、１４０位のＡｓｎ、１４５位のＳｅｒ、１６１位のＬｅｕ、１７０位のＴｈｒ、１９５位のＡｓｐ、２１１位のＳｅｒ、２１８位のＶａｌ、２２８位のＨｉｓ、２３２位のＶａｌ、２３３位のＶａｌ、２６２位のＣｙｓまたはＨｉｓ、２６７位のＴｙｒ、２９３位のＳｅｒまたはＶａｌ、２９５位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位のＩｌｅ、３０１位のＰｒｏ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＴｈｒ、３１０位のＶａｌ、３１４位のＡｓｐ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＳｅｒ、３３２位のＡｌａ、３３３位のＧｌｕまたは３７１位のＭｅｔのうちの１つ以上に対応しており、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の変異体または請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法によって得られる変異体を含む組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼまたは請求項２１に記載の組成物の、食品生産における使用。
【請求項２３】
アスパラギン含有原料に基づく熱処理食品の中で形成されるアクリルアミドの量を削減することを目的とした、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼまたは請求項２１に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の１つ以上のアスパラギナーゼ酵素または請求項２１に記載の組成物を生産プロセス中の前記食品の中間形態に対し添加し、これによって前記食品の前記中間形態の中に存在するアスパラギナーゼレベルを低下させるのに有効な量で加熱ステップに先立ち酵素が添加されることになるステップを含む、少なくとも１つの加熱ステップが関与する食品の生産のためのプロセス。
【請求項２５】
請求項２４に記載のプロセスまたは請求項２２または２３に記載の使用によって得ることのできる食品。
【請求項２６】
腫瘍の治療のための薬剤としての、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼまたは請求項２１に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、アスパラギナーゼポリペプチド変異体およびこれらのアスパラギナーゼ変異体をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド配列に関する。本発明は同様に、工業的プロセスにおけるこれらの変異体タンパク質の使用方法にも関する。本発明の中に同様に含まれるのは、これらのタンパク質および細胞を生産するのに適した本発明にしたがったポリヌクレオチドで形質転換された細胞であり、ここで、本発明にしたがったタンパク質は、その活性および／または発現レベルを増強または削減するべく遺伝的に修飾されている。本発明は同様に、工業プロセスにおいてアスパラギナーゼ変異体を使用する方法にも関する。
【０００２】
［発明の背景］
近年、数多くの加熱食品中におけるアクリルアミドの発生が公開された（タレケ（Ｔａｒｅｋｅ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、第１３号、５１７〜５２２頁（２０００年））。アクリルアミドは動物およびヒトにとって発ガン性の恐れがあるものとみなされていることから、この発見事実は、結果として世界中の関心事となった。さらなる研究は、一般的なさまざまな焼き物、揚げ物およびオーブン調理食品の中で大量のアクリルアミドを検出可能であることを明らかにし、食品中のアクリルアミドの発生が加熱プロセスの結果であることが実証された。
【０００３】
モットラム（Ｍｏｔｔｒａｍ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第４１９号、４４８頁（２００２年）により、メイラード反応の結果としての還元糖およびアミノ酸からのアクリルアミドの形成経路が提案された。この仮説によると、アクリルアミドはメイラード反応中に形成され得る。焼いたり、ローストしたりする間に、メイラード反応は主として、色、においおよび風味に関与する。メイラードに付随する１つの反応は、アミノ酸のシュトレッカー分解であり、アクリルアミドへの経路が提案された。アクリルアミドの形成は、温度が１２０℃を超えた時点で検出可能となり、最高の形成速度は、１７０℃前後で観察された。アスパラギンおよびグルコースが存在した場合、最高レベルのアクリルアミドを検出でき、一方、グルタミンおよびアスパラギン酸は、微量という結果しかもたらさなかった。
【０００４】
食品と接触するプラスチックから食品内に移動するアクリルアミドについてのＥＵにおける公式の移動限界は、１０ｐｐｂ（１キログラムあたり１０マイクログラム）に設定されている。調理中に形成するアクリルアミドについてはいかなる公式限界もまだ設定されていないが、数多くの製品、特に穀物、パン製品およびジャガイモまたはトウモロコシベースの製品がこの値を超過しているという事実は、懸念を生じさせるものである。
【０００５】
複数の植物原料が実質的レベルのアスパラギンを含有するものとして公知である。ジャガイモ中では、アスパラギンが、主要な遊離アミノ酸であり（合計アミノ酸含有量の４０％に当たる９４０ｍｇ／ｋｇ）、小麦粉中では、アスパラギンが合計遊離アミノ酸プールの１４％に当たる約１６７ｍｇ／ｋｇのレベルで存在している（ベリッツ（Ｂｅｌｉｔｚ）およびグロッシュ（Ｇｒｏｓｃｈ）、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ中、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９年）。アクリルアミドが主として（還元糖と組合わされた）アスパラギンから形成されているという事実によって、揚げ物、オーブン調理またはローストされた植物製品中で高レベルのアクリルアミドの説明がつくかもしれない。したがって、公衆衛生の利益のため、実質的に低いレベルのアクリルアミドしかもたないか、好ましくはアクリルアミドを含まない食品に対する緊急のニーズが存在する。
【０００６】
アクリルアミド含有量を低減させるため、例えば加熱ステップの温度または持続時間といった加工変数を変えること、またはアクリルアミドの形成を化学的または酵素的に防止することまたは形成したアクリルアミドを除去することによるさまざまな解決法が提案されてきた。
【０００７】
複数の特許出願において、アスパラギンのレベルひいては形成されるアクリルアミドの量を減少させるためのアスパラギナーゼの使用が開示された。この目的のための適切なアスパラギナーゼ、例えば国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレット中のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）および国際公開第０４／０３２６４８号パンフレット中のアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）などが、複数の真菌供給源から生成された。
【０００８】
全てのＬ−アスパラギナーゼは同一の化学転化の触媒として作用するが、このことは、それらが同じ利用分野に適していることを意味するわけではない。さまざまな利用分野が、酵素が機能しなければならない条件に関して異なる要求を有する。酵素的転化の速度に影響を及ぼしうる物理的および化学的パラメータは、（化学反応速度にプラスの効果を有するものの酵素の安定性についてはマイナスの効果を有し得る）温度、含水量、ｐＨ、塩濃度、食品マトリクスの構造的完全性、酵素の活性化因子または阻害因子の存在、基質および生成物の濃度などである。
【０００９】
したがって、改善された特性をもつ複数の利用分野向けの改良型アスパラギナーゼに対する継続的なニーズが存在する。
【００１０】
［発明の目的］
本発明の目的は、新規のアスパラギナーゼ変異体ポリペプチドおよびかかる変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。さらなる目的は、かかるアスパラギナーゼ変異体を生産する組換え菌株を提供することにある。同様に、変異体の同定方法も、本発明にしたがったポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造および使用方法と合せて、本発明の一部を成す。
【００１１】
［発明の要約］
本発明は、アスパラギナーゼ活性を有する親ポリペプチドのポリペプチド変異体であって、配列番号３に記されている配列と整列させた場合にアミノ酸４１、５３、６２、６３、６４、６６、７０、７１、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４２、１４３、１４５、１６１、１６２、１６３、１６４、１６８、１６９、１７０、１９５、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２８、２３２、２３３、２３４、２３５、２６２、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２９３、２９５、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３１８、３１９、３２１、３２３、３２４、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５または３７１のいずれかに対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されているポリペプチド変異体を提供している。
【００１２】
本発明は同様に、次のものも提供する：
−  かかる変異体をコードする核酸配列；
−  適切な発現宿主内でのアスパラギナーゼの発現を誘導することのできる１つ以上の制御配列に対して作動的に連結された本発明の変異体をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクト；
−  かかる核酸コンストラクトを含む組換え発現ベクター；
−  かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞；
−  アスパラギナーゼの生産を誘導する条件下でかかる宿主細胞を培養するステップおよびアスパラギナーゼを回収するステップを含むアスパラギナーゼの生産方法；
−  アスパラギナーゼポリペプチド変異体の生産方法であって、
ａ）  親アスパラギナーゼポリペプチドを選択するステップと；
ｂ）  ４１、５３、６２、６３、６４、６６、７０、７１、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４２、１４３、１４５、１６１、１６２、１６３、１６４、１６８、１６９、１７０、１９５、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２８、２３２、２３３、２３４、２３５、２６２、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２９３、２９５、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３１８、３１９、３２１、３２３、３２４、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５または３７１のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を置換するステップであって、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されているステップと；
ｃ）  ｂ）で定義されている１つ以上のさらなるアミノ酸を任意に置換するステップと；
ｄ）  ステップａ）〜ｃ）の結果として得た変異体を調製するステップと；
ｅ）  変異体の比活性および／または最適ｐＨを決定するステップと；
ｆ）  親アスパラギナーゼポリペプチドに比べて増大した比活性および／または最適ｐＨを有する変異体を選択し、これによりアスパラギナーゼポリペプチド変異体を生産するステップと、を含む方法。
−  本発明の一変異体または本発明の方法により得られる変異体を含む組成物；
−  食品の生産における本発明の組成物の使用；
および
−  アスパラギン含有原料に基づく熱処理された食品の中で形成されるアクリルアミドの量を削減するための本発明の組成物の使用。
【００１３】
［発明の詳細な説明］
本明細書および随伴する特許請求の範囲全体を通して、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」という用語そして「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」といったような変形形態は、包括的に解釈されるものとする。すなわち、これらの用語は、文脈が許容する場合、具体的に列挙されていないその他の要素または整数の包含の可能性を伝達するように意図されている。
【００１４】
本発明は、アスパラギナーゼ活性を有する親ポリペプチドのポリペプチド変異体に関する。この変異体は、配列番号３に記されている配列と整列させた場合にアミノ酸４１、５３、６２、６３、６４、６６、７０、７１、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４２、１４３、１４５、１６１、１６２、１６３、１６４、１６８、１６９、１７０、１９５、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２８、２３２、２３３、２３４、２３５、２６２、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２９３、２９５、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３１８、３１９、３２１、３２３、３２４、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５または３７１のいずれかに対応するアミノ酸残基の１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されている。
【００１５】
すなわち、変異体アスパラギナーゼ配列を配列番号３のアスパラギナーゼ配列と整列させた場合、変異体は、配列番号３中の上述の位置のうちの１つに対応する（変異体内の）位置において少なくとも１つの置換を含むことになる。この文脈において「置換」とは、配列番号３中の上述の位置のうちの１つに対応する変異体中の１つの位置が、親ポリペプチド（この親ポリペプチドは配列番号３であってよい）中のその位置には見られないアミノ酸残基を含むことを表わす。
【００１６】
配列番号３中で上述された位置に対応する本発明の変異体アスパラギナーゼポリペプチド中のこれらの位置は、例えば、ＧＡＰプログラム（このプログラムの詳細については以下を参照のこと）により発現された最も相同な配列に対するＧＡＰアライメントなどを用いて変異体ポリペプチドの配列と配列番号３の配列とを整列させることによって同定され得る。こうして上述の配列番号３中の位置に対応する変異体中の位置を同定することができ、こられの位置は配列番号３を基準にして定義されたこれらの位置としてみなされる。
【００１７】
本発明の中で使用してよい親アスパラギナーゼポリペプチドは、あらゆるアスパラギナーゼであってよい（ＥＣ３．５．１．１）。適切なアスパラギナーゼポリペプチドを、例えば植物、動物または微生物といったようなさまざまな供給源から獲得してよい。例えば、アスパラギナーゼを、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種から獲得してもよい。適当なエスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）菌株の一例は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。適当なエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）菌株の一例は、エルウィニア・クリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）である。適当なストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株の一例は、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）およびストレプトマイセス・ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）である。適当なアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）菌株の一例は、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）である。適当なバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株の一例は、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウチュス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンチュス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・スュブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｇｉｅｎｓｉｓ）である。
【００１８】
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌株からアスパラギナーゼを獲得するのに適した方法の一例が、国際公開第０３／０８３０４３号パンフレットの中で記述されている。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からアスパラギナーゼを獲得するために適した方法の一例は、国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレットおよび国際公開第０４／０３２４６８号パンフレットの中で記述されている。
【００１９】
本発明の中で使用するのに適した好ましい親アスパラギナーゼポリペプチドは、配列番号３中に記されている配列を有するかまたは配列番号３と少なくとも８０％の相同性、例えば配列番号３と少なくとも８５％の相同性、例えば配列番号３と少なくとも８５％の相同性、例えば配列番号３と少なくとも９０％の相同性、例えば配列番号３と少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を有するポリペプチドである。
【００２０】
配列番号３中に記されている配列と比べて置換されている本発明の一変異体中のアミノ酸残基は、配列番号３の配列との関係において定義される通りの４１、５３、６２、６３、６４、６６、７０、７１、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４２、１４３、１４５、１６１、１６２、１６３、１６４、１６８、１６９、１７０、１９５、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２８、２３２、２３３、２３４、２３５、２６２、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２９３、２９５、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３１８、３１９、３２１、３２３、３２４、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５または３７１位に対応するものである。
【００２１】
変異体は、前記位置の１ヶ所以上において、例えば前記位置のうちの２、３、４ヶ所、少なくとも５ヶ所、少なくとも１０ヶ所、少なくとも１５ヶ所、少なくとも２０ヶ所、少なくとも２５ヶ所、少なくとも３０ヶ所、少なくとも３５ヶ所、少なくとも４０ヶ所、少なくとも４５ヶ所、少なくとも５０ヶ所、少なくとも５５ヶ所、少なくとも６０ヶ所、少なくとも６５ヶ所、少なくとも７０ヶ所または全てにおいて置換を含んでいてよい。
【００２２】
置換のための位置の好ましいサブセットは、配列番号３の配列との関係において定義づけされる通り、４１、５３、６２、６３、６４、６６、７０、７１、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４２、１４３、１４５、１６１、１６２、１６３、１６４、１６８、１６９、１７０、１９５、２１１、２１４、２１５、２１６、２１８、２２０、２２８、２３２、２３３、２６２、２６７、２９３、２９５、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３１９、３２１、３２４、３３０、３３２、３３３、３３４または３７１位にあるものによって定義される。
【００２３】
変異体は、前記位置の１ヶ所以上において、例えば前記位置のうちの２、３、４ヶ所、少なくとも５ヶ所、少なくとも１０ヶ所、少なくとも１５ヶ所、少なくとも２０ヶ所、少なくとも２５ヶ所、少なくとも３０ヶ所、少なくとも３５ヶ所、少なくとも４０ヶ所、少なくとも４５ヶ所または全てにおいて置換を含んでいてよい。
【００２４】
置換のための位置のより好ましいサブセットは、配列番号３の配列との関係において定義づけされる通り、４１、５３、６３、６４、６６、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０６、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４５、１６１、１７０、１９５、２１１、２１８、２２８、２３２、２３３、２６２、２６７、２９３、２９５、２９７、２９９、３００、３０１、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３２１、３２４、３３０、３３２、３３３または３７１位にあるものによって定義される。
【００２５】
置換のための位置のさらに一層好ましいサブセットは、配列番号３の配列との関係において定義づけされる通り、５３、６３、６４、６６、７３、７４、７６、７７、８８、１０１、１４０、１７０、２９３位にあるものによって定義される。
【００２６】
変異体は、前記位置の１ヶ所以上において、例えば前記位置のうちの２、３、４ヶ所、少なくとも５ヶ所、少なくとも１０ヶ所、少なくとも１５ヶ所、少なくとも２０ヶ所または全てにおいて置換を含んでいてよい。
【００２７】
本発明の一変異体は、上述の通り１つ以上の置換を含む。この文脈において「置換」とは、配列番号３中の上述の位置のうちの１つに対応する変異体中の１つの位置が、親ポリペプチド（この親ポリペプチドは配列番号３であってよい）中のその位置には見られないアミノ酸残基を含むということを表わす（親は配列番号３であってよい）。
【００２８】
好ましい置換は、以下の表に記されている（なお位置は配列番号３に記されている配列との関係において定義づけされている）。
【００２９】
【表１】
2010524447.tif 000002
【００３０】
【表２】
2010524447.tif 000003
【００３１】
【表３】
2010524447.tif 000004
【００３２】
【表４】
2010524447.tif 000005
【００３３】
本発明にしたがった変異体は、配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、４１位のＩｌｅ、５３位のＴｙｒ、６３位のＧｌｙまたはＶａｌまたはＳｅｒ、６４位のＰｒｏ、６６位のＰｒｏ、７３位のＬｙｓ、７４位のＡｌａ、７６位のＴｈｒ、７７位のＩｌｅ、８８位のＴｙｒまたはＰｒｏ、９０位のＶａｌ、９１位のＧｌｕ、１０１位のＶａｌ、１０６位のＰｒｏ、１１１位のＧｌｙ、１１９位のＡｓｎ、１２２位のＨｉｓ、１２３位のＡｌａ、１３２位のＳｅｒ、１４０位のＡｓｎ、１４５位のＳｅｒ、１６１位のＬｅｕ、１７０位のＴｈｒ、１９５位のＡｓｐ、２１１位のＳｅｒ、２１８位のＶａｌ、２２８位のＨｉｓ、２３２位のＶａｌ、２３３位のＶａｌ、２６２位のＣｙｓまたはＨｉｓ、２６７位のＴｙｒ、２９３位のＳｅｒまたはＶａｌ、２９５位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位のＩｌｅ、３０１位のＰｒｏ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＴｈｒ、３１０位のＶａｌ、３１４位のＡｓｐ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＳｅｒ、３３２位のＡｌａ、３３３位のＧｌｕまたは３７１位のＭｅｔのうちの１つ以上を含むアミノ酸配列を有していてよく、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されている。
【００３４】
好ましい実施形態においては、本発明にしたがった変異体は、配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、５３位のＴｙｒ、６３位のＧｌｙまたはＶａｌ、６４位のＰｒｏ、６６位のＰｒｏ、７３位のＬｙｓ、７４位のＡｌａ、７６位のＴｈｒ、７７位のＩｌｅ、８８位のＴｈｒまたはＰｒｏ、１０１位のＶａｌ、１４０位のＡｓｎ、１７０位のＴｈｒ、２９３位のＳｅｒまたはＶａｌのうちの１つ以上を含むアミノ酸配列を有していてよく、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されている。
【００３５】
好ましい一実施形態においては、本発明にしたがった変異体は、配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、好ましくは６３位のＧｌｙまたはＶａｌを含むアミノ酸６３に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有していてよく、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、前記変異体の親ポリペプチドは配列番号３に対応する。
【００３６】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合にアミノ酸６３に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、親ポリペプチドが配列番号３に対応している、アスパラギナーゼ活性を有する親ポリペプチドの変異体の例としては、置換Ｄ６３ＧおよびＧ１３２Ｓを含むポリペプチド（ＡＳＮ０１と仮称）、置換Ｄ６３Ｇ、Ｄ１１１ＧおよびＲ１２２Ｈを含むポリペプチド（ＡＳＮ０２と仮称）、置換Ｄ６３ＶおよびＴ３００Ｉを含むポリペプチド（ＡＳＮ０３と仮称）がある。
【００３７】
別の好ましい実施形態においては、本発明にしたがった変異体は、配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、好ましくは６４位のＰｒｏを含むアミノ酸６４に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有していてよく、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、前記変異体の親ポリペプチドは配列番号３に対応する。
【００３８】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合にアミノ酸６４に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、親ポリペプチドが配列番号３に対応している、アスパラギナーゼ活性を有する親ポリペプチドの変異体の例としては、置換Ｓ６４ＰおよびＩ３１０Ｖを含むポリペプチド（ＡＳＮ０４と仮称）がある。
【００３９】
さらに別の好ましい実施形態においては、本発明にしたがった変異体は、配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、好ましくは６６位のＰｒｏを含むアミノ酸６６に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有していてよく、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、前記変異体の親ポリペプチドは配列番号３に対応する。
【００４０】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合にアミノ酸６６に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、親ポリペプチドが配列番号３に対応している、アスパラギナーゼ活性を有する親ポリペプチドの変異体の例としては、置換Ｔ４１ｌ、Ｓ６６ＰおよびＶ３７１Ｍを含むポリペプチド（ＡＳＮ０５と仮称）がある。
【００４１】
さらに別の好ましい実施形態においては、本発明にしたがった変異体は、配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、好ましくは７３位のＬｙｓ、７４位のＡｌａ、２９３位のＳｅｒまたはＶａｌのうちの１つ以上を含むアミノ酸７３、７４、２９３に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有していてよく、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、前記変異体の親ポリペプチドは配列番号３に対応する。
【００４２】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合にアミノ酸７３、７４または２９３に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、親ポリペプチドが配列番号３に対応している、アスパラギナーゼ活性を有する親ポリペプチドの変異体の例としては、置換Ｇ１９５ＤおよびＡ２９３Ｖを含むポリペプチド（ＡＳＮ１４と仮称）、置換Ｔ７３Ｋ；Ｓ７４Ａ；およびＡ２９３Ｓを含むポリペプチド（ＡＳＮ１５と仮称）および置換Ｔ７３Ｋ、Ｓ７４Ａ、Ｅ１０６Ｐ、Ａ２９３Ｓ、Ｇ２９７Ｓ、Ｔ２９９Ｓ、Ｑ３１９Ａ、Ｍ３２１ＴおよびＶ３２４Ｇを含むポリペプチド（ＡＳＮ１６と仮称）がある。
【００４３】
さらなる実施形態においては、本発明にしたがった変異体は、配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、好ましくは７６位のＴｈｒまたは１０１位のＶａｌのうちの１つ以上を含むアミノ酸７６または１０１に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有していてよく、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、前記変異体の親ポリペプチドは配列番号３に対応する。
【００４４】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合にアミノ酸７６または１０１に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、親ポリペプチドが配列番号３に対応している、アスパラギナーゼ活性を有する親ポリペプチドの変異体の例としては、置換Ａ７６ＴおよびＡ１０１Ｖを含むポリペプチド（ＡＳＮ０６と仮称）がある。
【００４５】
さらに１つのさらなる好ましい実施形態においては、本発明にしたがった変異体は、配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、好ましくは７７位のＩｌｅを含むアミノ酸７７に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有していてよく、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、前記変異体の親ポリペプチドは配列番号３に対応している。
【００４６】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合にアミノ酸７７に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、親ポリペプチドが配列番号３に対応している、アスパラギナーゼ活性を有する親ポリペプチドの変異体の例としては、置換Ｖ７７Ｉ、Ｖ１２３ＡおよびＥ３１４Ｄを含むポリペプチド（ＡＳＮ０７と仮称）がある。
【００４７】
一実施形態においては、本発明にしたがった変異体は、配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、好ましくは８８位のＴｙｒまたはＰｒｏを含むアミノ酸８８に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有していてよく、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、前記変異体の親ポリペプチドは配列番号３に対応する。
【００４８】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合にアミノ酸８８に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、親ポリペプチドが配列番号３に対応している、アスパラギナーゼ活性を有する親ポリペプチドの変異体の例としては、置換Ｓ８８Ｙを含むポリペプチド（ＡＳＮ０８と仮称）、置換Ｓ８８Ｐ、Ｉ１６１ＬおよびＲ２６２Ｃを含むポリペプチド（ＡＳＮ０９と仮称）がある。
【００４９】
別の実施形態においては、本発明にしたがった変異体は、配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、好ましくは１４０位のＡｓｎを含むアミノ酸１４０に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有していてよく、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、前記変異体の親ポリペプチドは配列番号３に対応する。
【００５０】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合にアミノ酸１４０に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、親ポリペプチドが配列番号３に対応している、アスパラギナーゼ活性を有する親ポリペプチドの変異体の例としては、置換Ｄ１４０Ｎを含むポリペプチド（ＡＳＮ１０と仮称）がある。
【００５１】
一実施形態においては、本発明にしたがった変異体は、配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、好ましくは１７０位のＴｈｒを含むアミノ酸１７０に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有していてよく、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、前記変異体の親ポリペプチドは配列番号３に対応する。
【００５２】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合にアミノ酸１７０に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、親ポリペプチドが配列番号３に対応している、アスパラギナーゼ活性を有する親ポリペプチドの変異体の例としては、置換Ｄ９１Ｅ、Ａ１７０ＴおよびＲ２６２Ｈを含むポリペプチド（ＡＳＮ１１と仮称）がある。
【００５３】
さらに１つの実施形態においては、本発明にしたがった変異体は、配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、好ましくは５３位のＴｙｒを含むアミノ酸５３に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有していてよく、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、前記変異体の親ポリペプチドは配列番号３に対応する。
【００５４】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合にアミノ酸５３に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、親ポリペプチドが配列番号３に対応している、アスパラギナーゼ活性を有する親ポリペプチドの変異体の例としては、置換Ｆ５３ＹおよびＫ１１９Ｎを含むポリペプチド（ＡＳＮ１３と仮称）がある。
【００５５】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合にアミノ酸４１、５３、６３、６４、６６、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０６、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４５、１６１、１７０、１９５、２１１、２１８、２２８、２３２、２３３、２６２、２６７、２９３、２９５、２９７、２９９、３００、３０１、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３２１、３２４、３３０、３３２、３３３または３７１に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、親ポリペプチドが配列番号３に対応している、アスパラギナーゼ活性を有する親ポリペプチドの変異体のさらなる例としては、置換Ｌ９０Ｖ、Ｋ１１９Ｎ、Ｙ２２８ＨおよびＲ２６２Ｃを含むポリペプチド（ＡＳＮ１２と仮称）がある。
【００５６】
本発明の変異体は、同様に、例えば１つ以上の付加的な置換、付加または欠失といった、上記で規定されているもの以外の位置における親に対比した付加的な修飾を含んでいてもよい。本発明の変異体は、この種の異なるタイプの修飾の組合せを含んでいてよい。変異体は、（全て同じタイプの修飾または異なるタイプの修飾であり得る）１個、２個、３個、４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個以上のこのような修飾を含んでいてよい。典型的には、付加的修飾は、置換であってよい。
【００５７】
本発明にしたがった変異体は、親ポリペプチドと少なくとも８０％の相同性、例えば親ポリペプチドと少なくとも８５％の相同性、例えば親ポリペプチドと９０％の相同性、親ポリペプチドと少なくとも９５％の相同性、親ポリペプチドと少なくとも９８％の相同性または親ポリペプチドと少なくとも９９％の相同性を有していてよい。
【００５８】
本発明の変異体は、典型的には、アスパラギナーゼ活性（ＥＣ．３．５．１．１）を保持する。すなわち、本発明の変異体は、典型的には、アスパラギンからアスパラギン酸への加水分解の触媒として作用することができる。したがって、本発明の変異体は、典型的に少なくとも１つの加熱ステップが関与する食品の生産中のアクリルアミド形成に関与するアスパラギナーゼの側鎖を修飾することができる変異体である。
【００５９】
好ましくは、本発明の変異体は、それを誘導する親アスパラギナーゼポリペプチドと比較して改善された特性を示す。このような改善された特性は、典型的には、例えば食料品の調製方法においてなど、以下で記されるように当該変異体が使用された場合に関連性を有する特性である。
【００６０】
かかる特性には、（必要とされる親アスパラギナーゼの量に比べて食料品の調製のための方法においてより少量の当該変異体しか使用しないことが可能となり得るような）増大した比活性、増加したまたは減少した最適ｐＨ、より詳細には（親アスパラギナーゼと比べて）食料品の調製方法における使用により適した最適ｐＨ、そして増大した熱安定性が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００６１】
一実施形態においては、本発明にしたがった変異体タンパク質は、親ポリペプチドのものよりも高いかまたは親ポリペプチドよりも低い最適ｐＨを有していてよい。好ましくは、変異体タンパク質の最適ｐＨは親ポリペプチドのものよりも高い。好ましくは、親ポリペプチドは配列番号３にしたがったものである。例えば、（配列番号３で開示されているような）Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来の野生型アスパラギナーゼは、ｐＨ４からｐＨ５の最適ｐＨを有する。本発明の変異体タンパク質はかかる野生型酵素よりもさらに好アルカリ性であってよい、すなわち例えばｐＨ５からｐＨ８、好ましくはｐＨ６からｐＨ７の最適ｐＨを有する。任意には、本発明の変異体タンパク質は、野生型アスパラギナーゼよりもさらに好酸性であってよい。
【００６２】
好ましくは、本発明にしたがった変異体アスパラギナーゼは、最適ｐＨよりも高く、５０％のアスパラギナーゼ活性がなおも存在し（以下アルカリ性ｐＨと呼ばれる）、親アスパラギナーゼのｐＨよりも高いｐＨを有し得る。親アスパラギナーゼが配列番号３にしたがったものである場合、変異体タンパク質は、少なくとも６．９、好ましくは少なくとも７．０、少なくとも７．５、好ましくは少なくとも８という、５０％活性の観察されるアルカリ性ｐＨを有していてよい。
【００６３】
親アスパラギナーゼとの関係において改善された特性を示す変異体というのは、典型的にはその変異体が例えば食料品の生産方法などにおける以下で記された通りの使用により適したものとなるような形で関連性ある特性の測定可能な低減または増加を示す変異体である。
【００６４】
好ましくは、本発明にしたがった変異体タンパク質は、同じｐＨで測定された親ポリペプチドの比活性よりも高い比活性を有していてよい。変異体タンパク質の比活性というのは、ここでは、純粋タンパク質のユニット／ｍｇ単位で測定される変異体タンパク質のアスパラギナーゼ活性が意図されている。好ましくは、本発明にしたがった変異体タンパク質の比活性は、同じｐＨで測定された親ポリペプチドのものに比べた場合、少なくとも１つのｐＨ、好ましくは４〜８の間のｐＨにおいて高いものである。
【００６５】
本発明の別の実施形態においては、変異体アスパラギナーゼは、親アスパラギナーゼポリペプチドよりも好熱性である。
【００６６】
したがって特性は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％だけ減少させられてよい。或は、特性は、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％だけ増大させられてよい。これに関して減少または増大百分率は、親アスパラギナーゼポリペプチドに比べた減少または増大百分率を表わす。かかる百分率変化をいかに測定できるかは当業者にとって周知である。それは、親アスパラギナーゼおよび変異体アスパラギナーゼの活性を比較することである。
【００６７】
本明細書で記述されている変異体は、「本発明にしたがったポリペプチド」または「本発明にしたがった変異体」という用語の中に集合的に含まれる。
【００６８】
「ペプチド」および「オリゴペプチド」という用語は、（一般に認知されている通りに）同義語とみなされ、ペプチジルリンケージによってカップリングされた少なくとも２つのアミノ酸の鎖を示すように、文脈により必要とされる通りに同義的に各々の用語を使用することができる。「ポリペプチド」という用語は、本明細書において７個超のアミノ酸残基を含む鎖について使用されている。本明細書中の全てのオリゴペプチドおよびポリペプチドの式は左から右へ、そしてアミノ末端からカルボキシ末端への方向で記されている。本明細書で用いられているアミノ酸の１文字コードは、当該技術分野において一般に公知であり、サンブルックら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９年）の中に見出すことができる。
【００６９】
「単離」ポリペプチドまたはタンパク質という用語は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質を表す。例えば、宿主細胞内で発現される組換え生産されたポリペプチドおよびタンパク質は、スミスおよびジョンソン（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｇｅｎｅ  ６７：３１〜４０頁（１９８８年）中で開示されている一段階精製方法といったような任意の適切な技術によって実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様、本発明に関しては単離されたものとみなされる。
【００７０】
本発明にしたがったポリペプチド変異体は、当該技術分野において公知の方法により組換え細胞培養から回収され精製可能である。最も好ましくは高性能液体クロマトグラフィ（「ＨＰＬＣ」）が精製のために利用される。
【００７１】
本発明のポリペプチドには、化学合成手順の生成物および、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物の細胞を含めた原核生物または真核生物宿主から組換え技術により生産させる生成物が含まれる。組換え生産手順の中で用いられる宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもよく或いはまたグリコシル化されなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドは同様に、一部のケースでは宿主媒介プロセスの結果として初期修飾メチオニン残基をも含んでいてよい。
【００７２】
本発明は同様に、本発明にしたがったポリペプチド変異体の生物学的に活性なフラグメントをも特徴としている。かかるフラグメントは、「本発明の変異体」という用語の中に包含されるものとみなされる。
【００７３】
本発明のポリペプチド変異体の生物学的に活性なフラグメントには、全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含むものの対応する全長タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を示す本発明の変異体タンパク質のアミノ酸配列と充分な同一性を有するかまたはこれから誘導されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。典型的には、生物学的活性フラグメントは、本発明の変異体タンパク質の少なくとも１つの活性をもつドメインまたはモチーフを含む。本発明のタンパク質の生物学的に活性なフラグメントは、例えば長さがアミノ酸１０、２５、５０、１００個またはそれ以上であるポリペプチドであり得る。その上、タンパク質のその他の領域が欠失しているその他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製でき、本発明のポリペプチドの未変性形態の生物学的活性のうちの１つ以上について評価可能である。
【００７４】
典型的には、本発明のタンパク質フラグメントは、本明細書で定義されている置換の１つ以上を含む。
【００７５】
本発明は同様に、（それ自体本発明の変異体である）上述の生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸フラグメントをも特色としている。
【００７６】
上述のように、本発明は、本発明の変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明は同様に、本発明のポリペプチド変異体の少なくとも１つの機能的ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドにも関する。典型的には、かかるドメインは、本明細書で記述されている置換のうちの１つ以上を含む。
【００７７】
本発明の一実施形態においては、本発明にしたがった核酸配列はポリペプチドをコードし、ここでポリペプチドは、親アスパラギナーゼに比べてアミノ酸の１つ以上の切断、および／または少なくとも１つの置換、欠失および／または挿入を有するアミノ酸配列を含む変異体である。ただし、かかるポリペプチドは、典型的には本明細書で記述されている置換のうちの１つ以上を含む。
【００７８】
本明細書中で使用されている「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、本明細書で記述されている変異体をコードする読取り枠を含む核酸分子を意味する。遺伝子は、コード配列、非コード配列、イントロンおよび調節配列を含んでいてよい。すなわち、本明細書中で使用されている「遺伝子」とは、本明細書中で定義されている単離した核酸分子を意味してよい。したがって、「遺伝子」という用語は、本発明に関しては、天然に存在する配列のみを意味していない。
【００７９】
本発明の核酸分子は、本明細書で提供されている配列情報と組合せて考慮した場合に当業者にとって周知である標準的な分子生物学技術を用いて生成可能である。
【００８０】
例えば、標準的な合成技術を用いて、必要とされる核酸分子を新たに合成してもよい。かかる合成プロセスは典型的には自動化されたプロセスとなる。
【００８１】
代替的には、本発明の核酸分子は、例えば野生型核酸分子といった既存の核酸分子の部位特異的突然変異誘発を使用することによって生成されてよい。部位特異的突然変異誘発は、当業者にとって周知である多数の技術を用いて実施され得る。
【００８２】
単なる一例としてここで言及されるこのような方法の１つにおいては、所望の置換をコードするオリゴヌクレオチド「プライマ」を用いてプラスミド鋳型上でＰＣＲが実施される。プライマは新たに合成されたストランドの末端であることから、鋳型ＤＮＡストランドを結合させる上で第１サイクル中にミスマッチが存在した場合、その第１ラウンドの後、（突然変異を含む）プライマベースのストランドは、当初の鋳型と同等の濃度となる。連続的サイクルの後、それは指数関数的に成長し、２５回の後、８００万：１の領域内で当初の突然変異を受けていないストランドの数を上回り、その結果、突然変異を受けた増幅済みフラグメントのほぼ均質な溶液が得られると思われる。このとき鋳型ＤＮＡは、例えばＤｐｎ１といったような、メチル化されたＤＮＡのみを切断する制限酵素を用いて、酵素消化により除去され得る。アルカリ溶菌法プラスミド調製から誘導され、したがってメチル化されている鋳型は、このステップにおいて破壊されるが、突然変異を受けたプラスミドは、生体外で生成されておりかつその結果としてメチル化されていないことから、保存される。
【００８３】
かかる方法においては、２つ以上の突然変異（本明細書で記述されている変異体をコードする）を、例えば、各々１つ以上のミスマッチを含む１つ以上のオリゴヌクレオチドを用いることによって、単一のＰＣＲ反応の中で核酸分子内に導入してよい。或いは、改変された核酸が逐次的反復的に核酸内に導入されるような形で、各々が１つ以上の突然変異を導入する２つ以上のＰＣＲ反応を実施することによって、核酸分子内に２つ以上の突然変異を導入してもよい。
【００８４】
本発明の核酸は、上述の部位特異的突然変異誘発技術にしたがって適切なミスマッチオリゴヌクレオチドプライマおよび鋳型としてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ或いはまたゲノムＤＮＡを用いて生成可能である。このようにして誘導された核酸分子は、適切なベクターの中にクローニングさせ、ＤＮＡ配列分析により特徴付けすることができる。
【００８５】
本発明の核酸配列は、親アスパラギナーゼに比べて１つ以上の欠失すなわちギャップを含み得る。かかる欠失／ギャップは同様に、適切なオリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異誘発を用いても生成され得る。かかる欠失を生成するための技術は、当業者にとって周知である。
【００８６】
さらに、本発明にしたがったヌクレオチド配列に対応するかまたはこれに対してハイブリッド形成可能なオリゴヌクレオチドは、例えば自動化されたＤＮＡ合成装置を用いて、標準的合成技術により調製可能である。
【００８７】
同様に、相補的核酸分子も本発明に含まれる。別のヌクレオチド配列に相補的である核酸分子とは、もう一方のヌクレオチド配列にハイブリッド形成できかくして安定した２重鎖を形成できるようにもう一方のヌクレオチド配列に対する充分な相補性を有する核酸分子である。
【００８８】
本発明の一態様は、本発明の変異体をコードする単離核酸分子、またはその生物学的に活性なフラグメントまたはドメイン、ならびに、本発明の核酸分子の調製のためといったような核酸分子の増幅または突然変異のためのＰＣＲプライマとして使用するのに適した本発明のポリペプチドをコードする核酸分子およびかかる核酸分子のフラグメントを同定するためにハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに充分な核酸分子にも関する。
【００８９】
「単離ポリヌクレオチド」または「単離核酸」とは、それが由来する生体の天然に存在するゲノム内ではそれが直接隣接している（１つは５’末端上、１つは３’末端上）コード配列の両方と直接隣接していないＤＮＡまたはＤＮＡである。かくして、一実施形態においては、単離核酸は、コード配列に直接隣接する５’非コード（例えばプロモータ）配列の一部または全てを含む。したがってこの用語には、例えば、ベクター内、自己複製プラスミドまたはウイルス内、または原抗生物または真核生物のゲノムＤＮＡ内に取込まれるかまたは、その他の配列とは独立して別々の分子（例えばＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理により生産されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメント）として存在する組換えＤＮＡが含まれる。それにはまた、細胞材料、ウイルス材料または培地（組換えＤＮＡ技術により生産される場合）また化学的前駆体またはその他の化学物質（化学的に合成される場合）を実質的に含まない付加的なポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部分である組換えＤＮＡも含まれる。さらに、「単離核酸フラグメント」というのは、フラグメントとして天然に存在せず天然の状態では発見されないと思われる核酸フラグメントである。
【００９０】
本明細書中で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）およびヌクレオチド類似体を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むように意図されている。核酸分子は、１本鎖または２本鎖であり得るが、好ましくは、２本鎖ＤＮＡである。核酸は、オリゴヌクレオチド類似体または誘導体（例えばイノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド）を用いて合成され得る。かかるオリゴヌクレオチドは、例えば、改変した塩基対合能力または増大したヌクレアーゼ耐性をもつ核酸を調製するために用いることができる。
【００９１】
本発明の別の実施形態は、本発明の核酸分子に対しアンチセンスである単離核酸分子を提供する。
【００９２】
「相同性」または「同一性百分率」という用語は、本明細書において同義的に用いられる。本発明においては、ここで、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性百分率を決定するために、最適な比較を目的として配列を整列させることが規定されている（例えば、第２のアミノまたは核酸配列との最適なアラインメントのために第１のアミノ酸または核酸の配列の中にギャップを導入することができる）。このとき対応するアミノ酸またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸またはヌクレオチド残基が比較される。第１の配列内の１つの位置が第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸またはヌクレオチド残基によって占有されている場合には、分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性百分率は、配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／合計位置数（すなわち重複する位置）×１００）。好ましくは、２つの配列は同じ長さである。
【００９３】
配列比較は、比較中の２つの配列の全長にわたってかまたは２つの配列のフラグメント全体にわたって実施されてよい。典型的には、この比較は比較中の２つの配列の全長にわたって実施される。しかしながら、配列同一性は、例えば２０、５０、１００またはそれ以上の隣接アミノ酸残基の一領域にわたって実施することもできる。
【００９４】
当業者であれば、２つの配列の間の相同性を決定するために複数の異なるコンピュータプログラムを利用できるということに気づくであろう。例えば、２つの配列の間の配列の比較および同一性の百分率の決定を、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい実施形態においては、２つのアミノ酸または核酸配列の間の同一性百分率は、１６、１４、１２、１０、８、６または４というギャップ重み（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）および１、２、３、４、５または６という長さ重み（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）、およびＢｌｏｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかを用いて、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／で入手可能な）Ａｃｃｅｌｒｙｓ  ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラム内に取込まれたニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第４８号：４４４〜４５３頁（１９７０年））アルゴリズムを用いて決定される。当業者であれば、これらの異なるバラメータ全てがわずかに異なる結果を生み出すものの、２つの配列の全体的同一性百分率が、異なるアルゴリズムを使用した場合に著しく変わらない、ということを認識するだろう。
【００９５】
本発明のタンパク質配列または核酸配列は、さらに、例えばその他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定するべく、公開データベースに対する検索を実行するための「問合せ配列」として使用することができる。かかる検索は、アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５号：４０３〜１０頁のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラム（バージョン２．０）を用いて実行可能である。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を実行することができる。比較を目的としてギャップ付きアラインメントを得るためには、ギャップ付きＢＬＡＳＴをアルシュールら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２５号（１７）：３３８９〜３４０２頁に記述されている通りに利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴＰプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム（例えばＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメータを使用することができる。国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のホームページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照のこと。
【００９６】
本発明の別の態様は、本発明の変異体アスパラギナーゼをコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関係する。
【００９７】
本明細書中で使用する「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味する。１つのベクタータイプは、付加的なＤＮＡセグメントを中にライゲートできる環状２本鎖ＤＮＡループを意味する「プラスミド」である。別のベクタータイプは、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノム内にライゲートされ得る、ウイルスベクターである。一部のベクターは、それが中に導入される宿主細胞内で自己複製する能力をもつ（例えば、細菌複製起点をもつ細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入時点で宿主細胞のゲノム内に組込まれ、かくして宿主ゲノムと共に複製される。さらに、一部のベクターは、それが作動的に連結されている遺伝子の発現を誘導する能力をもつ。かかるベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは多くの場合プラスミドの形をしている。「プラスミド」および「ベクター」という用語は、プラスミドがベクターの最も一般的に用いられる形態であることから、本明細書において同義的に用いることができる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）といったようなその他の発現ベクター形態を含むように意図されている。
【００９８】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内での核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含んでおり、これはすなわち、組換え発現ベクターが、発現させるべき核酸配列に作動的に連結された、発現に用いるべく宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味している。組換え発現ベクターの内部で、「作動的に連結された」という表現は、関心対象のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする要領で（例えば生体外転写／翻訳系内またはベクターが宿主細胞内に導入される場合には宿主細胞内で）、１つまたは複数の調節配列に連結されている、ということを意味するように意図されている。「調節配列」という用語は、プロモータ、エンハンサおよびその他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むように意図されている。かかる調節配列は、例えばゴーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０年）の中で記述されている。調節配列としては、数多くのタイプの宿主細胞内でヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するものおよび一部の宿主細胞内でのみヌクレオチド配列の発現を誘導するもの（例えば組織特異的調節配列）が含まれる。当業者であれば、発現ベクターの設計が形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルといったような要因によって左右され得るということがわかるだろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入されて、本明細書中で記述されているような核酸によりコードされるタンパク質またはペプチドを生産することができる（例えば、配列番号３のアスパラギナーゼ変異体またはその変異体、例えば機能的等価物またはフラグメント、またはかかる変異体のうちの１つ以上を含む融合タンパク質）。
【００９９】
本発明の組換え発現ベクターは、原核または真核細胞内での本発明の変異体タンパク質の発現用として設計され得る。例えば、本発明の変異体タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）といった細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞または哺乳動物細胞の中で発現可能である。適切な宿主細胞はさらに、ゴーデル、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０年）の中で論述されている。或いは、組換え発現ベクターを、例えばＴ７プロモータ調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、生体外で転写および翻訳することもできる。
【０１００】
本発明において有用である発現ベクターとしては、染色体、エピソームおよびウイルスに由来するベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスに由来するベクター、そしてこれらの組合せに由来するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素に由来するベクター、例えばコスミドおよびファージミドが含まれる。
【０１０１】
ＤＮＡインサートは、いくつかの例を挙げると、ファージラムダＰＬプロモータ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモータ、ＳＶ４０早期および後期プロモータそしてレトロウイルスＬＴＲのプロモータといったような適切なプロモータに対して作動的に連結されなくてはならない。その他の適切なプロモータは、当業者にとって周知であろう。具体的な実施形態においては、糸状菌内でアスパラギナーゼの高い発現レベルを誘導することのできるプロモータが好ましい。このようなプロモータは当該技術分野において公知である。発現コンストラクトは、転写開始、終結のための部位そして転写された領域内では、翻訳のためのリボソーム結合部位を含んでいてよい。コンストラクトにより発現される成熟した転写産物のコード部分は、最初に翻訳開始ＡＵＧそして翻訳すべきポリペプチドの末端に適切に位置づけされた終端コドンを含む。
【０１０２】
従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して、原核または真核細胞内にベクターＤＮＡを導入することができる。本明細書で使用される「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、形質導入、感染、リポフェクション、カチオン脂質仲介型トランスフェクションまたは電気穿孔を含めた、宿主細胞内に外来性核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための当該技術分野で認知されたさまざまな技術を意味するように意図されている。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、サンブルックら、（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９年）、デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、「Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８６年）およびその他の実験室マニュアルの中に見出すことができる。
【０１０３】
哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションのためには、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、わずかな細胞画分だけが外来性ＤＮＡをそのゲノム内に組込み得る。これらの組込み体を同定し選択するために、選択的マーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が一般に、関心対象の遺伝子と共に宿主細胞内に導入される。好ましい選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメタトレキセートといったような薬物に対する耐性を付与するマーカーが含まれる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、本発明の変異体タンパク質をコードするものと同じベクター上で宿主細胞内に導入することができ、そうでなければ別々のベクター上で導入することができる。導入された核酸での安定したトランスフェクションを受けた細胞は、薬物選択によって同定可能である（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を取込んだ細胞は、その他の細胞が死枯する一方で生存し続ける）。
【０１０４】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質の発現を誘導する構成的プロモータまたは誘導可能なプロモータを含むベクターと共に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で実施されることが多い。融合ベクターは、その中でコードされるタンパク質、例えば組換えタンパク質のアミノ末端に対し数多くのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的に次の３つの目的に使用される。すなわち１）組換えタンパク質の発現を増大させるため；２）組換えタンパク質の溶解度を増大させるため；そして３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助するため。多くの場合、融合発現ベクター内では、融合タンパク質の精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離することができるように、融合部分と組換えタンパク質の接合部にタンパク質分解切断部位が導入されている。
【０１０５】
上述の通り、発現ベクターは好ましくは、選択可能なマーカーを含む。かかるマーカーとしては、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびその他の細菌内での培養のためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性が含まれる。適切な宿主の代表例としては、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセスサルモネラチフリウム（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）および一部のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種；真菌細胞、例えばアスペルギルス種、例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇａｒ）、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）およびＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、例えば酵母、例えばクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、例えばＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）および／またはプッチア（Ｐｕｃｈｉａ）例えばＰ．パストリス（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ）；昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳおよびバウス（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫；および植物細胞が含まれる。上述の宿主細胞のための適切な培地および条件は、当該技術分野において公知である。
【０１０６】
細菌中で使用するために好ましいベクターは、例えば、本明細書に参考により援用されている国際公開第Ａ１−２００４／０７４４６８号パンフレット中で開示されている。その他の適切なベクターは、当業者にとって容易に明らかになる。
【０１０７】
本発明において使用するのに適した公知の細菌プロモータには、本明細書に参考により援用されている国際公開第Ａ１−２００４／０７４４６８号パンフレット中で開示されているプロモータが含まれる。
【０１０８】
高等真核動物による本発明の変異体をコードするＤＮＡの転写は、ベクター内にエンハンサ配列を挿入することによって増大させることができる。エンハンサは、所与の宿主細胞タイプの中でプロモータの転写活性を増大させるように作用する通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性要素である。エンハンサの例としては、ｂｐ１００〜２７０で複製起点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルス早期プロモータエンハンサ、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサ、およびアデノウイルスエンハンサが含まれる。
【０１０９】
小胞体内腔内、ペリプラズム空間内または細胞外環境内へ翻訳済みタンパク質を分泌するために、発現されたポリペプチド内に適切な分泌シグナルを取込んでよい。シグナルは、ポリペプチドに対し内因性であり得、そうでなければ、非相同シグナルであってよい。
【０１１０】
本発明の変異体は、それが例えば分泌シグナルなどの付加的な非相同機能領域を含み得るような形態で発現されてよい。本発明の変異体は、例えば、精製中または後続する取扱いおよび貯蔵中の宿主細胞内での安定性および持続性を改善するなどの目的でポリペプチドのＮ末端に付加される追加のアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を含んでいてもよい。同様に、例えばヒスチジン残基またはＴ７タグを付加することによって、精製を容易にするために本発明の変異体に対しペプチド部分を添加してもよい。
【０１１１】
本発明の変異体、例えば本発明のタンパク質またはその機能的等価物、例えばその生物学的に活性な部分およびフラグメントは、非変異体ポリペプチド（例えば非相同性アミノ酸配列）に対して作動的に連結されて、融合タンパク質を形成できる。この文脈において「非変異体ポリペプチド」というのは、本発明の変異体アスパラギナーゼに対して実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。
【０１１２】
融合タンパク質中で、本発明の変異体は、本発明のポリペプチドの全長配列または生物学的に活性なフラグメントに対応し得る。好ましい実施形態においては、本発明の融合タンパク質は、少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質の中で、「作動的に連結された」という用語は、変異体ポリペプチドおよび非変異体ポリペプチドが互いに枠内で融合されていることを表わすように意図されている。非変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０１１３】
例えば、一実施形態においては、融合タンパク質は、ＧＳＴ配列のＣ末端に１つまたは複数の変異体配列が融合されている融合タンパク質である。かかる融合タンパク質は本発明にしたがった組換え変異体の精製を容易にすることができる。別の実施形態では、融合タンパク質はそのＮ末端に非相同性シグナル配列を含む本発明の変異体である。一部の宿主細胞（例えば哺乳動物および酵母宿主細胞）においては、本発明の変異体の発現および／または分泌は、非相同性シグナル配列の使用を通して増大させることが可能である。
【０１１４】
別の実施例においては、バキュロウイルス外皮タンパク質のｇｐ６７分泌配列を、非相同シグナル配列として使用することができる（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、アウスベルら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２年）。真核生物非相同性シグナル配列のその他の例としては、メリチンおよびヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼの分泌配列が含まれる（カリフォルニア州ラホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））。さらに別の例においては、有用な原核生物非相同性シグナル配列には、ｐｈｏＡ分泌シグナル（サンブルックら、上掲書）およびプロテインＡ分泌シグナル（ニュージャージー州ピスカタウェイのファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）；）が含まれる。
【０１１５】
シグナル配列は、本発明の一変異体の分泌および単離を容易にするために使用することができる。シグナル配列の典型的な特徴は、一般に１つ以上の切断事象において分泌中に成熟タンパク質から切断される疎水性アミノ酸のコアにある。かかるシグナルペプチドは、分泌経路を通過するにつれて成熟タンパク質からシグナル配列を切断させることができるようにするプロセッシング部位を含んでいる。シグナル配列は、中に発現ベクターが形質転換される原核細胞宿主からといったような変異体の分泌を導くことができ、このときシグナル配列はその後にまたは同時に切断されてよい。本発明の変異体はこのとき、公知の方法によって細胞外培地から容易に精製されてよい。或いは、シグナル配列は、ＧＳＴドメインといったような精製を容易にする配列を用いて、関心対象の変異体に連結され得る。かくして、例えば、本発明の変異体をコードする配列は、本発明の融合された変異体の精製を容易にする、ペプチドをコードする配列といったようなマーカー配列に融合されてよい。本発明のこの態様の一部の好ましい実施形態においては、マーカー配列は、なかでもその多くが市販されているｐＱＥベクター（キアゲン株式会社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．））の中で提供されているｔａｇといったようなヘキサ−ヒスチジンペプチドである。例えばゲンツ（Ｇｅｎｔｚ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８６号、８２１〜８２４頁（１９８９年）で記述されているように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製を提供する。ＨＡタグは、例えばウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら、Ｃｅｌｌ、第３７号：７６７頁（１９８４年）によって記述されたインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドである。
【０１１６】
本発明の融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により生産されてよい。例えば、異なるポリペプチド配列についてコードするＤＮＡフラグメントは、例えばライゲーションのための平滑末端または付着末端の利用、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な粘着末端の充填、望ましくない接合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理および酵素ライゲーションなどの従来の技術にしたがって枠内で合わせてライゲートされる。別の実施形態においては、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成することができる。或いは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、後にアニールされ再増幅されてキメラ遺伝子配列を生成することのできる２つの連続する遺伝子フラグメントの間の相補的オーバーハングを発生させるアンカープライマーを用いて、実施可能である（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、編、アウスベルら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２年）。その上、すでに融合部分をコードしている数多くの発現ベクターが市販されている（例えばＧＳＴポリペプチド）。融合部分が前記変異体に対し枠内で連結されるような形でこのような発現ベクター内に変異体をコードする核酸をクローニングすることができる。
【０１１７】
「機能的等価物」および「機能的変異体」という用語は、本明細書において同義的に使用される。本発明にしたがった機能的等価物は、本明細書で定義されているような変異体の特定の機能を示すポリペプチドをコードする単離ＤＮＡフラグメントである。したがって機能的等価物は同様に、生物学的に活性なフラグメントを包含し、それ自体本発明の「変異体」という用語の範囲内に包含される。
【０１１８】
好ましくは、本発明の機能的等価物は、本明細書で記述されている置換のうちの１つ以上を含む。ただし、機能的等価物は上述の置換に加えて１つ以上の修飾を含んでいてよい。
【０１１９】
機能的核酸等価物は典型的には、サイレント突然変異またはコードされたポリペプチドの生物学的機能を改変しない突然変異を含んでいてよい。したがって、本発明は、特定の生物学的活性にとって不可欠でないアミノ酸残基の変更を含む変異体アスパラギナーゼタンパク質をコードする核酸分子を提供する。かかる変異体タンパク質は、アミノ酸配列に関して、それらを誘導する親アスパラギナーゼ配列と異なっており、しかもその少なくとも１つの生物学的活性を保持し、好ましくは、少なくともアスパラギナーゼ活性を保持している。一実施形態においては、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでこのタンパク質は親アミノ酸配列（例えば配列番号３に示されているもの）に対する少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の相同性をもつ実質的に相同性のアミノ酸配列を含んでいる。
【０１２０】
本明細書で定義されているように、「実質的に相同な」という用語は、第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列が共通のドメインを有するような形で第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列と同一または等価の（例えば類似の側鎖を伴う）アミノ酸またはヌクレオチドを充分な数または最少限の数だけ含む第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列を意味する。例えば、約６０％、好ましくは６５％、より好ましくは７０％、さらに一層好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の同一性を有する共通のドメインを含むアミノ酸またはヌクレオチド配列が、本明細書において、充分に同一であると定義される。
【０１２１】
当業者であれば、本発明にしたがったヌクレオチド配列への突然変異によって変化を取り込みこうして結果として得られたタンパク質の機能を実質的に改変することなくこのタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことができる、ということを認識することだろう。
【０１２２】
したがって、本発明のアスパラギナーゼ変異体は、好ましくは、親アミノ酸配列、例えば配列番号３に示されているものに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の相同性をもち、典型的には同様に親ポリペプチドの少なくとも１つの機能的活性を保持するタンパク質である。
【０１２３】
本発明の変異体、例えば本発明にしたがったタンパク質の機能的等価物は、同様に、例えばアスパラギナーゼ活性について本発明の突然変異体例えば切断型突然変異体の組合せライブラリをスクリーニングすることによっても同定可能である。一実施形態においては、変異体の変化に富んだライブラリが、核酸レベルでの組合せ突然変異誘発によって生成される。変異体の変化に富んだライブラリは、例えば、縮退した１組の潜在的なタンパク質配列が個々のポリペプチドとしてか或いは１組のより大きな融合タンパク質として（例えばファージディスプレイ向け）発現可能となるような形で遺伝子配列内に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素によりライゲートすることによって生成可能である。縮退したオリゴヌクレオチド配列から本発明のポリペプチドの潜在的変異体のライブラリを生産するために使用できるさまざまな方法が存在する。縮退したオリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該技術分野において公知である（例えばナラング（Ｎａｒａｎｇ）（１９８３年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、第３９号：３頁；イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）ら、（１９８４年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第５３号：３２３頁；イタクラら、（１９８４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１９８号：１０５６頁；アイク（Ｉｋｅ）ら、（１９８３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．第１１号：４７７頁）を参照のこと）。
【０１２４】
さらに、本発明のポリペプチドをコードする配列のフラグメントライブラリは、後続する変異体の選択をスクリーニングするために変化に富んだポリペプチド集団を生成する目的で使用可能である。例えば、ニッキングが１分子あたりおよそ一回しか発生しない条件下でヌクレアーゼと関心対象のコード配列の２本鎖ＰＣＲフラグメントを処理すること、２本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニッキング産物からのセンス／アンチセンス対を含むことのできる２本鎖ＤＮＡを形成するようにＤＮＡを復元すること、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理により再形成された２重鎖から１本鎖部分を除去することそして、結果として得られたフラグメントライブラリを発現ベクター内にライゲートすることによって、コード配列フラグメントのライブラリを生成することができる。この方法によって関心対象のタンパク質のさまざまなサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリを誘導することができる。
【０１２５】
当該技術分野においては、切断の点突然変異によって作られる組合せライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするため、そして選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするための複数の技術が公知である。大きな遺伝子ライブラリをスクリーニングするために最も広く用いられている高スループット解析に適した技術には、典型的に、複製可能な発現ベクター内に遺伝子ライブラリをクローニングすること、結果として得られるベクターライブラリで適切な細胞を形質転換すること、そして、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が所望の活性の検出によって容易になる条件下で、組合せ遺伝子を発現すること、が含まれる。ライブラリ内の機能的突然変異体の頻度を増強する技術である循環アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）をスクリーニング検定と組合せて使用して、本発明のタンパク質の変異体を同定することができる（アルキン（Ａｒｋｉｎ）およびユアバン（Ｙｏｕｒｖａｎ）（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９号：７８１１〜７８１５頁；デルグレーブ（Ｄｅｌｇｒａｖｅ）ら、（１９９３年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第６号（３）：３２７〜３３１頁）。
【０１２６】
本発明にしたがったポリヌクレオチドのフラグメントは同様に、機能的ポリペプチドをコードしないポリヌクレオチドをも含んでいてよい。かかるポリヌクレオチドは、ＰＣＲ反応のためのプローブまたはプライマとして機能し得る。
【０１２７】
本発明にしたがった核酸はそれらが機能的または非機能的ポリペプチドのいずれをコードするかとは無関係に、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマとして使用可能である。アスパラギナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の用途としてはとりわけ、（１）ベルマ（Ｖｅｒｍａ）ら、Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８８年）の中で記述されているようなアスパラギナーゼコーティング遺伝子の精確な染色体位置を提供するための中期染色体スプレッドに対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えばＦＩＳＨ）；（２）特定の組織および／または細胞内でのアスパラギナーゼｍＲＮＡの発現を検出するためのノーザンブロット分析；および（３）所与の生物学的（例えば組織）試料中でプローブまたはプライマに対しハイブリッド形成可能な核酸の存在を分析するための診断ツールとして使用可能なかかるプローブおよびプライマ。
【０１２８】
所与の親アスパラギナーゼ酵素の変異体は、以下の標準的手順によって得ることができる：
−  突然変異誘発（変異性、ドープされたオリゴ、スパイクされたオリゴ）
−  一次スクリーニング
−  （例えば比活性に関して）改善された変異体の同定
−  維持（例えばグリセロール培養、ＬＢ−Ａｍｐ平板、ミニープレップ内）
−  別の検定平板上でのストリーキング−二次スクリーニング
−  ＤＮＡ配列決定
−  例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）内での形質転換
−  例えば１００ｍｌスケール中での培養、精製、ＤＳＣ
【０１２９】
一実施形態においては本発明は、本発明にしたがったアスパラギナーゼポリペプチド変異体の生産方法において、
ａ）  親アスパラギナーゼポリペプチドを選択するステップ；
ｂ）  ４１、５３、６２、６３、６４、６６、７０、７１、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４２、１４３、１４５、１６１、１６２、１６３、１６４、１６８、１６９、１７０、１９５、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２８、２３２、２３３、２３４、２３５、２６２、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２９３、２９５、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３１８、３１９、３２１、３２３、３２４、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５または３７１のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を置換するステップであって、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されているステップと；
ｃ）  ｂ）で定義されている１つ以上のさらなるアミノ酸を任意に置換するステップと；
ｄ）  ステップａ）〜ｃ）の結果として得た変異体を調製するステップと；
ｅ）  変異体の少なくとも１つのｐＨにおける比活性および／または最適ｐＨを決定するステップと；
ｆ）  親アスパラギナーゼポリペプチドに比べて増大した少なくとも１つのｐＨにおける比活性および／または親アスパラギナーゼポリペプチドに比べて増大した最適ｐＨを有する変異体を選択し、これによりアスパラギナーゼポリペプチド変異体を生産するステップと、を含む方法に関する。
【０１３０】
好ましい実施形態においては、本発明にしたがったアスパラギナーゼポリペプチド変異体の生産方法の中で、親アスパラギナーゼポリペプチドは配列番号３に記された配列を有する。
【０１３１】
より好ましくは、本発明にしたがった方法のステップｂ）において、４１、５３、６３、６４、６６、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０６、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４５、１６１、１７０、１９５、２１１、２１８、２２８、２３２、２３３、２６２、２６７、２９３、２９５、２９７、２９９、３００、３０１、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３２１、３２４、３３０、３３２、３３３または３７１のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基が置換され、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、親ポリペプチドは配列番号３と少なくとも８０％の相同性を有する。
【０１３２】
さらに一層好ましくは、ステップｂ）において置換されたアミノ酸残基は、配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、４１位のＩｌｅ、５３位のＴｙｒ、６３位のＧｌｙまたはＶａｌまたはＳｅｒ、６４位のＰｒｏ、６６位のＰｒｏ、７３位のＬｙｓ、７４位のＡｌａ、７６位のＴｈｒ、７７位のＩｌｅ、８８位のＴｙｒまたはＰｒｏ、９０位のＶａｌ、９１位のＧｌｕ、１０１位のＶａｌ、１０６位のＰｒｏ、１１１位のＧｌｙ、１１９位のＡｓｎ、１２２位のＨｉｓ、１２３位のＡｌａ、１３２位のＳｅｒ、１４０位のＡｓｎ、１４５位のＳｅｒ、１６１位のＬｅｕ、１７０位のＴｈｒ、１９５位のＡｓｐ、２１１位のＳｅｒ、２１８位のＶａｌ、２２８位のＨｉｓ、２３２位のＶａｌ、２３３位のＶａｌ、２６２位のＣｙｓまたはＨｉｓ、２６７位のＴｙｒ、２９３位のＳｅｒまたはＶａｌ、２９５位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位のＩｌｅ、３０１位のＰｒｏ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＴｈｒ、３１０位のＶａｌ、３１４位のＡｓｐ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＳｅｒ、３３２位のＡｌａ、３３３位のＧｌｕまたは３７１位のＭｅｔのうちの１つ以上に対応しており、前記位置は配列番号３を基準にして定義されている。
【０１３３】
本発明のプロセスの一実施形態においては、ステップｅ）で、比活性は、４〜８の間のｐＨで決定される。ステップｅ）の別の実施形態においては、変異体の少なくとも１つのｐＨおよび／または最適ｐＨにおける比活性を決定する前に、変異体のｐＨ７におけるアスパラギナーゼ活性とｐＨ５におけるアスパラギナーゼ活性の間の特定の温度での比率が測定されてよく、前記比率が親アスパラギナーゼポリペプチドのものよりも高い変異体を選択してよい。
【０１３４】
本発明のプロセスの別の実施形態においては、ステップｆ）で、親ポリペプチドに比べて増大した少なくとも１つのｐＨ、好ましくは４〜８の間のｐＨでの比活性を有しかつ／または親ポリペプチドと比べて増大した最適ｐＨを有する変異体が選択される。好ましくは、変異体は、親ポリペプチドに比べて増大した少なくとも１つのｐＨ、好ましくは４〜８の間のｐＨでの比活性および親ポリペプチドに比べて増大した最適ｐＨを有する。本発明のプロセスの別の実施形態においては、ステップｆ）で、親ポリペプチドに比べて増大した少なくとも１つのｐＨ、好ましくは４〜８の間のｐＨでの比活性を有する変異体が選択される。
【０１３５】
別の実施形態においては、本発明は、本発明に包含される核酸を含む細胞例えば形質転換された宿主細胞または組換え宿主細胞を特徴とする。「形質転換された細胞」または「組換え細胞」というのは、その中に（またはその先祖の中に）組換えＤＮＡ技術を用いて本発明にしたがった核酸が導入された細胞である。原核細胞および真核細胞の両方、例えば細菌、真菌、酵母などが含まれ、最も好ましいのは、糸状菌、特にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の細胞である。
【０１３６】
挿入された配列の発現を調節するかまたは取込まれた核酸配列によってコードされた産物を特異的な所望の要領で修飾しプロセッシングする宿主細胞を選択することができる。タンパク質産物のかかる修飾（例えばグリコシル化）およびプロセッシング（例えば分割）は、コードされたタンパク質の最適な機能を促進し得る。
【０１３７】
さまざまな宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾について特徴的かつ特異的機序を有する。分子生物学および／または微生物学の当業者にとってなじみのある適切な細胞系統または宿主系を選択して、発現された外来性タンパク質の所望のかつ適正な修飾およびプロセッシングを確保することができる。この目的で、一次転写産物の適切なプロセッシング、グリコシル化および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することが可能である。かかる宿主細胞は、当該技術分野において周知である。
【０１３８】
宿主細胞には同様に、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８および脈絡叢細胞系統といったような哺乳動物細胞系統も含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１３９】
望ましい場合、安定した形でトランスフェクトされた細胞系統が、本発明に従った変異体を生産できる。哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションに適した多数のベクターが、一般に入手可能であり、かかる細胞系統を構築するための方法も同様に、例えばアウスベルら、（上掲書）中に記されているように公知である。
【０１４０】
本発明はさらに、本発明にしたがったアスパラギナーゼ変異体を含む組成物を開示している。この組成物は、任意には、例えばその他の酵素といったようなその他の成分を含んでいてよい。本発明にしたがったアスパラギナーゼ変異体または前記アスパラギナーゼを含む組成物は、食品の生産において使用可能である。本発明の一実施形態においては、本発明にしたがったアスパラギナーゼ変異体または組成物は、アスパラギン含有原料をベースとする熱処理食品中で形成されるアクリルアミドの量を削減するために使用可能である。これらは例えば、少なくとも１つの加熱ステップが関与し、この加熱ステップに先立ち前記食品の中間形態で存在するアスパラギナーゼのレベルを削減する上で有効である量で酵素を添加する前記生産プロセス内での前記食品の中間形態への１つ以上のアスパラギナーゼ酵素の添加ステップを含む、食品の生産用プロセスにおいて使用可能である。かかるプロセスは国際公開第０４／０３０４６８号パンフレット内で開示されており、このプロセスおよびその全ての選好性は本明細書に参考により援用されている。同様に、国際公開第０４／０２６０４３号パンフレットには、本発明にしたがったアスパラギナーゼを使用することができると思われる適切なプロセスが記述されている。国際公開第０４／０２６０４３号パンフレット中に開示されているプロセスおよび開示されている全ての選好性は、本明細書に参考により援用されている。
【０１４１】
食品の中間体は、本明細書では、食品の最終的形態が得られまでの生産プロセス中に発生するあらゆる形態として定義づけされている。中間形態は、使用された個々の原料および／またはその混合物および／または添加剤および／またはプロセス助剤との混合物、またはその後プロセッシングされたその形態を含んでいてよい。例えば、食品パンの場合、中間形態は、例えば小麦、小麦粉、例えば水、塩、酵母およびパン改良組成物といったその他のパン成分とのその初期混合物、混合パン生地、練上げパン生地、発酵生地および部分焼上げ生地を含む。例えば、いくつかのジャガイモベースの製品については乾燥ポテトフレークまたは顆粒が中間製品であり、トルティーヤチップスについては、コーン・マサが中間製品である。
【０１４２】
食品は、例えばジャガイモ、タバコ、コーヒー、ココア、米、穀物、例えば小麦、ライ麦モロコシ（ｒｙｅ  ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、大麦、ひき割り穀物、ソバおよびオート麦といった植物由来のものである少なくとも１つの原料から作られていてよい。以降、小麦という用語は、例えば、パン小麦、デュラム小麦および／またはスペルト小麦といったコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）属の公知の全ての種を包含するように意図されている。２つ以上の原料または中間体から作られた食品、例えば小麦（小麦粉および／またはデンプン）およびジャガイモの両方を含む食品も、本発明の範囲内に含み入れられる。本発明にしたがったプロセスが適している食品の例としては、あらゆる小麦粉ベースの製品（例えばパン、ペストリー、ケーキ、プレッツェル、ベーグル、ダッチハニーケーキ、クッキー、ジンジャーブレッド、ジンジャーケーキおよびクリスプブレッド）そしてあらゆるジャガイモベースの製品（例えばフレンチフライ、フライドポテト、ポテトチップス、コロッケ）がある。
【０１４３】
以上で列挙した通りの原料は、生産プロセスの加熱ステップ中のアクリルアミド形成に関与している実質的な量のアスパラギンを含有するものとして公知である。或いは、アスパラギンは、例えば食品生産プロセスにおいて添加剤として用いられる酵母エキス、大豆加水分解物、カゼイン加水分解物などといったようなタンパク質加水分解物といったように、原料以外の供給源に由来している可能性もある。好ましい生産プロセスは、小麦粉および／またはその他の穀物由来の粉からのパンおよびその他の焼上げ製品の焼上げである。別の好ましい生産プロセスは、ジャガイモのスライスからのポテトチップスのディープフライである。
【０１４４】
好ましい加熱ステップは、中間食品の少なくとも一部分例えば食品の表面を、アクリルアミド形成が促進される温度、例えば１１０℃以上、１２０℃以上の温度に曝露するステップである。本発明にしたがったプロセス内の加熱ステップは例えば、パンおよびその他のベーカリー製品を焼上げる場合のようにオーブン内において例えば１８０〜２２０℃の温度で実施されるか、またはポテトチップスの揚げ作業のように油中において例えば１６０〜１９０℃の温度で実施されてよい。
【０１４５】
別の態様においては、本発明は、以上で記述されているような本発明のプロセスによってかまたは食品を生産するべく以上で記述した新規のアスパラギナーゼを使用することによって得ることのできる食品を提供している。これらの食品は、前記加熱ステップ中のアクリルアミドの形成に関与するアミノ酸のレベルを削減するのに有効な量で１つ以上の酵素を添加するステップを含まない生産プロセスによって得ることのできる食品と比べて著しく削減されたアクリルアミドレベルを特徴とする。本発明にしたがったプロセスは、従来のプロセスで得られた食品と比較して、生産された食品のアクリルアミド含有量の好ましくは５０％超、より好ましくは２０％超、さらに一層好ましくは１０％超そして最も好ましくは５％超という減少を得るために使用可能である。
【０１４６】
本発明にしたがったアスパラギナーゼ変異体のための付加的な利用分野は、動物およびヒトにおける腫瘍の治療において利用することである。腫瘍細胞の代謝にはＬ−アスパラギンが必要であり、これはアスパラギナーゼによって迅速に分解され得る。本発明にしたがったアスパラギナーゼは同様に、一部のヒト白血病の治療における補助治療薬としても使用可能である。実験動物およびヒトにおけるアスパラギナーゼの投与は、一部のリンパ腫および白血病の退行を導く。したがって、一実施形態において、本発明は、例えば動物またはヒトの腫瘍の治療例えばリンパ腫または白血病の治療における薬剤として使用するための本発明にしたがったアスパラギナーゼまたは組成物に関する。
【０１４７】
本発明にしたがったアスパラギナーゼ変異体は、都合のよいことに微生物中で生産され得る。上述のプロセスにおいては、組換えＤＮＡ技術によって得られるアスパラギナーゼを使用することが有利である。かかる組換え酵素は、細菌またはウイルスといったような汚染性作用物質を含まないだけでなく細菌毒素またはその他の汚染性酵素活性も含まず、高収量で低コストで生産できるといった数多くの利点を有する。
【０１４８】
本発明について以下で、次の限定的な意味のない実施例によって例示する。
【０１４９】
［実施例］
［材料と方法］
［ｐＨ＝４からｐＨ＝９までの範囲内のｐＨ依存性を測定するためのアスパラギナーゼ検定］
アスパラギナーゼ活性を、基質としてＬ−アスパラギンを用いて測定した。酵素の作用によって遊離されたアンモニア量を、ベルトロー反応にしたがって測定した。既製の試薬フェノールニトロプルシドおよびアルカリ性次亜塩素酸塩をシグマ（Ｓｉｇｍａ）から得た。所望のｐＨの５０ｍＭのピロリン酸ナトリウム緩衝液と５０ｍＭのクエン酸の混合物中の１００ｍＭのＬ−アスパラギン２０００μｌと１００μｌの酵素試料を混合した。３０分間３７℃でインキュベートした後、４００μｌの２５％のトリクロロ酢酸を添加することによって反応を停止させ、その後２５００μｌの水を加えた。インキュベーションの間、他に指示のない限り温度は３７℃に定めた。
【０１５０】
当業者であれば、上述の条件下でのインキュベーションの後、背景よりも著しく高く、それでもなお得られたシグナルが加えられた酵素の量に正比例している範囲内にあるシグナルが得られるような形で、酵素の用量が選択されたということを理解するはずである。好ましくは反応は、ゼロ次反応であった。
【０１５１】
反応を停止した後、１５６μｌの水に４μｌのインキュベーション混合物を添加した。その後、３４μｌのフェノール／ニトロプルシド溶液（シグマＰ６９９４）および３４μｌのアルカリ性次亜塩素酸塩溶液（シグマＡ１７２７）を添加した。３７℃で６７６秒のインキュベーションの後、６００ｎｍで消光を測定した。適切なブランクを含み入れることによって、背景シグナルについて読取り値を補正した。ブランクとして、（ＴＣＡ）不活性化酵素を伴う試料を使用した。例えば、Ｋｏｎｅｌａｂ  Ａｒｅｎａ  ３０（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））といった自動分析装置上で、検定を実施した。標準系列の既知の硫酸アンモニウム濃度との関係において６００ｎｍでの測定された吸光度をプロットすることによって作成された較正線を用いて、活性を決定した。活性は、規定の検定条件下で一分あたり１ミクロモルのアンモニアをＬ−アスパラギンから遊離させるのに必要とされる酵素の量として１ユニットを定義して、ユニット単位で表現された。
【０１５２】
［ｐＨ＝４からｐＨ＝８までの範囲内のｐＨ依存性を測定するためのアスパラギナーゼ検定］
この方法は、所望のｐＨの５０ｍＭのリン酸／クエン酸緩衝液中の１００ｍＭのＬ−アスパラギン２０００μｌと１００μｌの酵素試料を混合したという違いはあるものの、ｐＨ＝４からｐＨ＝９までの範囲についての活性のｐＨ依存性の測定に関する上述の方法と同じ要領で、実施された。
【０１５３】
［ｐＨ＝５およびｐＨ＝７での活性を測定するためのアスパラギナーゼ手作業検定］
この検定は、例えばマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）または試験管内で実施した。シフトされたｐＨ活性プロファイルをもつアスパラギナーゼを同定するために、ｐＨ＝５およびｐＨ＝７で活性を測定した。１０μｌの酵素試料を、ｐＨ５．０の１００ｍＭのクエン酸緩衝液またはｐＨ７．０の１００ｍＭのリン酸緩衝液中の１００ｍＭのＬ−アスパラギンと混合した。室温で１時間のインキュベーションの後、１２．５％のトリクロロ酢酸１００μｌを添加することによって反応を停止した。室温で１時間のインキュベーション後に、背景よりも著しく高いところでシグナルが得られるような形で、酵素用量を選択した。反応停止後、８μｌのインキュベーション混合物に対して９５μｌの水を添加した。その後、７０μｌのフェノール／ニトロプルシド溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ）ｐ６９９４）と７０μｌのアルカリ性次亜塩素酸素溶液（シグマＡ１７２７）を加えた。室温で６０分間のインキュベーションの後、６２０ｎｍで消光を測定した。適切なブランク例えば空の宿主菌株の発酵試料由来の上清および／または不活性化試料を含み入れることによって、背景シグナルについて読取り値を補正した。空菌株（ｅｍｐｔｙ  ｓｔｒａｉｎ）は、アスパラギナーゼ遺伝子を含有するように形質転換されなかった宿主菌株を表わす。標準系列の公知の硫酸アンモニウム濃度との関係において６２０ｎｍでの測定された吸光度をプロットすることによって作製された較正線を用いて、活性を決定した。活性はユニット単位で表現され、ここで１ユニットは、定義された検定条件下で１分あたり１ミクロモルのアンモニウムをＬ−アスパラギンから遊離させるのに必要な酵素の量として定義される。
【０１５４】
全ての検定において、アスパラギナーゼ試料の活性をユニット／ｍｌ単位で表わした。
【０１５５】
［実施例１］
［本発明にしたがったアスパラギナーゼの発酵、単離および精製］
本発明のアスパラギナーゼは、国際公開第２００４／０３０４６８号パンフレットに記述されているように本発明のアスパラギナーゼをコードするＤＮＡ配列を含有する発現プラスミドを構築し、プラスミドでアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）菌株を形質転換させアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）菌株を成長させることによって得られた。
【０１５６】
適正な発現プラスミドを含有するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を成長させた後、４℃で３０分間５０００×ｇで発酵ブロスを遠心分離して無細胞上清を調製した。必要な場合は、上清をそれぞれにＭｉｒａｃｌｏｔｈフィルタ（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）カタログ番号４７５８５５）およびＧＦ／Ａ  Ｗｈａｔｍａｎｎ  Ｇｌａｓｓマイクロファイバフィルタ（１５０ｍｍφ）上でろ過して、あらゆる固体を除去した。あらゆる真菌材料を除去するために、上清を４ＮのＫＯＨでｐＨ＝５に調整し、吸引しながら２μｍの（ボトルトップ）フィルタ上で無菌ろ過することができた。上清を使用まで４℃に貯蔵し、必要な場合は−２０℃で凍結させた。
【０１５７】
不純物が６０％ｗ／ｗを上回った場合には、無細胞上清から始めてアニオンイオン交換クロマトグラフィによりアスパラギナーゼを精製するかまたは、ＰＤ−１０カラム（アマーシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を介してｃｃＵＦ脱塩した。脱塩した材料を、２０ｍＭのヒスチジン緩衝液ｐＨ５．９６中で平衡化されたＭｏｎｏ−ＱまたはＱ−セファロースカラムに適用した。大規模な洗浄の後、アスパラギナーゼを、０〜１ＭのＮａＣｌ勾配を用いてカラムから溶出させた。
【０１５８】
アスパラギナーゼ活性を含有する上清画分または精製されたアスパラギナーゼ画分（ｍｇタンパク質／ｍｌ単位で決定されたもの）の純度を、分析サイズ排除クロマトグラフィ（ＨＰ−ＳＥＣ：高性能サイズ排除クロマトグラフィ、ＴＳＫｇｅｌ  ３０００ＳＷ−ＸＬ、カラム３００＊７．８ｍｍ；ＭＷ範囲１０〜３００ｋＤａ、１００ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７およびｐＨ５．９６）によって確認した。全ての流量は１ｍｌ／分であった（５ｍｌ／分であったＱ−セファロースカラム上の試料注入は除く）。溶出されたタンパク質の検出を２８０ｎｍで行なった。溶出されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）アスパラギナーゼの濃度を、１０２４０Ｍ−１・ｃｍ−１のモル消光係数を用いて２８０ｎｍ（Ａ２８０）での消光から計算した（Ａ２８０１ｃｍ，１ｍｇ／ｍｌ＝０．２８、なお式中Ａ２８０１ｃｍ，１ｍｇ／ｍｌは、１ｍｇ／ｍｌという純粋タンパク質濃度でかつ１ｃｍという経路長で測定した２８０ｎｍでの消光である）。Ａ２８０の測定は、Ｕｖｉｋｏｎ  ＸＬ  Ｓｅｃｏｍａｍ分光光度計（オランダ、アップカウデのＢｅｕｎ  ｄｅ  Ｒｏｎｄｅ）の中で実施した。ＡＳＮ１５およびＡＳＮ１６に対応するアスパラギナーゼにつては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のものと同じ消光係数を使用した。２８０ｎｍで吸収する不純物の場合には、アスパラギナーゼ濃度は、アスパラギナーゼピークの下の面積と２８０ｎｍで吸収するピークの合計面積の比を測定されたアスパラギナーゼ試料のＡ２８０に乗ずることにより、ＨＰ−ＳＥＣクロマトグラムに基づいて補正された。アスパラギナーゼピークがその他のピークから明らかに離れていない場合には、ピーク面積に代ってピーク高さを取上げた。
【０１５９】
ＡＳＮ０１〜ＡＳＮ１４に対応するアスパラギナーゼについては、（１ｍｌあたりのタンパク質ｍｇ数単位で決定される）アスパラギナーゼ含有量を、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ１２ウェルゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＮＰ０３２２ＢＯＸ）を用いてＰＡＡ−ＳＤＳゲル電気泳動によって決定可能である。１μｌの培養上清を１μｌの１０×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試料還元剤（インビトロジェン、ＮＰ０００４）、２．５μｌの４×ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液（インビトロジェン、ＮＰ０００７）および５．５μｌのｍｉｌｌｉＱ水と共に７０℃で１０分間インキュベートした。結果として得た還元済み試料をゲル上に装填した。サイズマーカーとして、ＳｅｃＢｌｕｅ（登録商標）ｐｌｕｓ２予備染色済み標準（インビトロジェン、ＬＣ５９２５）を用いた。さらに、タンパク質の量についての較正物質として０．５ｇのＢＳＡ（シグマＡ９４１８）を装填した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤（インビトロジェン、ＮＰ０００５）を含有するＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ  ＳＤＳランニングバッファ（インビトロジェン、ＮＰ０００２）中で２００Ｖで３５分間、ゲルを走らせた。電気泳動の後、Ｆｉｘ溶液（７％のＨＡｃ（ｖ／ｖ）および１０％のエタノール（ｖ／ｖ））の中で２×３０分間ゲルを定着させ、ＳＹＰＲＯルビー（Ｒｕｂｙ）タンパク質ゲル染色液（インビトロジェンＳ１２０００）で一晩染色し、２×３０分間Ｆｉｘ溶液中で脱染した。その後、ゲルを脱塩水で洗浄し、タイフーン（Ｔｙｐｈｏｏｎ）９２００スキャナー（ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でスキャンした。Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＴＬｖ２００３．０２ソフトウェアを用いてピーク体積を計算し、タンパク質濃度を、ＢＳＡタンパク質バンドに基づいて計算した。
【０１６０】
［実施例２］
［発明にしたがった変異体アスパラギナーゼの性能］
変化したｐＨ活性プロファイルを有する突然変異体について、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスパラギナーゼ突然変異体（ここで親ポリペプチドは配列番号３にしたがったものであった）の無作為ライブラリをスクリーニングした。よりアルカリ性のｐＨで改善された活性をもつ突然変異体を発見するために、アスパラギナーゼ突然変異体の活性をｐＨ＝５およびｐＨ＝７で決定した。その後、ｐＨ＝７での活性とｐＨ＝５での活性の間の比率を決定した。この比率は表１に示されている。より高い比率は、ｐＨ＝７に向かうｐＨ活性プロファイルのシフトを示す。
【０１６１】
【表５】
2010524447.tif 000006
【０１６２】
ｐＨ活性プロファイルがどの程度までアルカリ性ｐＨへとシフトしたかを立証するため、野生型Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アスパラギナーゼよりも高い比率をもつ突然変異体をさらにテストした。これらの突然変異体について、完全ｐＨ活性プロファイルを測定し、特にｐＨ活性プロファイルのアルカリ性縁がより高いｐＨへとシフトしたということが示された。ｐＨ活性プロファイルのアルカリ性縁がその最適ｐＨでの突然変異体の最大活性の５０％を示すｐＨを、野生型に比較したｐＨ活性プロファイルのアルカリ性縁のシフトのインジケータとして取上げる（表１）。より高いｐＨへのシフトが、よりアルカリ性である条件下でのより高い活性を表わす。かかる突然変異体は、特に、よりアルカリ性である条件を必要とする利用分野において有益である。
【０１６３】
ｐＨ＝７での活性とｐＨ＝５での活性の間の比率がより低いものである突然変異体について選択を行なう場合、ｐＨ活性プロファイルのアルカリ性縁がより低いｐＨへとシフトすることが観察される（表２）。
【０１６４】
【表６】
2010524447.tif 000007
【０１６５】
［ｐＨ活性依存性および最適ｐＨ］
無細胞上清を用いてｐＨ＝４からｐＨ＝８までのｐＨ範囲について５０ｍＭのリン酸／クエン酸緩衝液中で、突然変異体についてのアスパラギナーゼ活性のｐＨ依存性を決定した。１つの突然変異体について最高の活性が観察されたｐＨは、前記突然変異体についての最適ｐＨと呼ばれる。表３および４では、１つの突然変異体について観察された最大活性は１００％に設定されており、その他のｐＨ値での前記突然変異体の活性は、前記突然変異体について観察された最大活性の百分率として示されている。表３では、リン酸／クエン酸緩衝液系を用いてｐＨ＝４からｐＨ＝８までのｐＨ範囲についてｐＨ活性プロファイルを決定した。表４では、ピロリン酸／クエン酸緩衝液系を用いてｐＨ＝４からｐＨ＝９までのｐＨ範囲についてｐＨ活性プロファイルを決定した。
【０１６６】
【表７】
2010524447.tif 000008
【０１６７】
【表８】
2010524447.tif 000009
【０１６８】
ｐＨ活性プロファイルのアルカリ性縁のシフトの他に、より高いｐＨに向かっての最適ｐＨのシフトも存在する。突然変異Ｄ６３Ｇを含む突然変異体は両方共、ｐＨ＝７までの最適ｐＨのシフトを示す。Ｄ６３Ｇ突然変異体は付加的な突然変異を含んでいる。しかしながらこれらの付加的な突然変異は各Ｄ６３Ｇ突然変異体において異なり、一方ｐＨ活性プロファイルはほぼ同一である。したがってＤ６３Ｇが観察されたｐＨ活性プロファイルのシフトの原因であると思われる。突然変異体Ｄ１４０Ｎ、Ａ１７０Ｔを含む突然変異体そして突然変異Ｓ６６Ｐを含む突然変異体の最適ｐＨはｐＨ＝６までシフトされる。
【０１６９】
残りの突然変異体は、野生型に比べてｐＨ＝５でより明示的な最適ｐＨを示す。表３および４は、同時に実質的活性がｐＨ＝４からｐＨ＝６までの酸性領域内でも維持されている一方で、ｐＨ＝６からｐＨ＝８までの範囲について特に増大した相対活性を伴うより広いｐＨ活性プロファイルを結果としてもたらすより高いｐＨに向かってのｐＨ活性プロファイルのアルカリ性縁のシフトを明確に示している。
【０１７０】
［ｐＨの一関数としての比活性］
アスパラギナーゼ変異体の比活性を、無細胞上清を用いて５０ｍＭのリン酸／クエン酸緩衝液中でｐＨ＝４、ｐＨ＝５、Ｐｈ＝６、ｐＨ＝７、ｐＨ＝８で決定した。
【０１７１】
【表９】
2010524447.tif 000010
【０１７２】
表５は、ｐＨ＝６、ｐＨ＝７およびｐＨ＝８での突然変異体の比活性が野生型アスパラギナーゼと比べて実質的に改善されたということを示している。特に突然変異体Ｔ７３Ｋ＋Ｓ７４Ａ＋Ａ２９３Ｓ、Ｔ４１ｌ＋Ｓ６６Ｐ＋Ｖ３７１Ｍ、Ｓ８８Ｐ＋ｌ１６１Ｌ＋Ｒ２６２ＣおよびＦ５３Ｙ＋Ｋ１１９Ｎは、ｐＨ＝４〜ｐＨ＝８の全ｐＨ範囲にわたりより高い活性を示すことから非常に有用である。突然変異体Ｔ７３Ｋ＋Ｓ７４Ａ＋Ａ２９３Ｓ＋Ｅ１０６Ｐ＋Ｇ２９７Ｓ＋Ｔ２９９Ｓ＋Ｑ３１９Ａ＋Ｍ３２１Ｔ＋Ｖ３２４Ｇは、ｐＨ＝４からｐＨ＝６までの酸性ｐＨ領域においてさらに活性である。
【０１７３】
［最適温度］
温度に対する活性の依存性を確認するため、異なる温度で活性を測定した。１つの検定においては、酵素反応を１０分後に停止させ、第２の検定においては、３０分後に反応を停止させた。３０分検定における酵素用量は、１０分検定における用量の３分の１であった。適用された条件下で酵素が安定している場合、観察される活性は類似しているはずである。不活性化が起こった場合、より長い検定時間の後に活性が減少することが予想される。結果は表６に示されている。
【０１７４】
【表１０】
2010524447.tif 000011
【０１７５】
表６は、変異体の安定性が野生型アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ．ｎｉｇｅｒ）アスパラギナーゼに非常に類似していることを示している。突然変異体は、７０℃においてさえ、３０分のインキュベーション後に１０分の場合に比べていかなる活性低下も示さず、このことは、突然変異体が７０℃で少なくとも３０分間は安定していることを表している。意外にも、突然変異体の最適温度はより高温へとシフトされていることがわかる。野生型については、最適温度は、テストされている温度を考慮して５０℃である。突然変異体Ｓ１６Ａ＋Ｄ６３Ｇ＋Ｇ１３２Ｓ、Ｄ６３Ｇ＋Ｄ１１１Ｇ＋Ｒ１２２ＨおよびＴ４１ｌ＋Ｓ６６Ｐ＋Ｖ３７１Ｍについては、それは７０℃までシフトした。かかる特性は、高温で働くアスパラギナーゼを必要とする利用分野において特に有用である。
【配列表】
2010524447000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年11月19日(2009.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスパラギナーゼ活性を有する親ポリペプチドの変異体であって、配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、アミノ酸４１、５３、６２、６３、６４、６６、７０、７１、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４２、１４３、１４５、１６１、１６２、１６３、１６４、１６８、１６９、１７０、１９５、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２８、２３２、２３３、２３４、２３５、２６２、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２９３、２９５、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３１８、３１９、３２１、３２３、３２４、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５または３７１のいずれかに対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されており、親ポリペプチドが配列番号３と少なくとも８０％の相同性を有する、変異体。
【請求項２】
前記親ポリペプチドが配列番号３に記された配列を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、アミノ酸４１、５３、６３、６４、６６、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０６、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４５、１６１、１７０、１９５、２１１、２１８、２２８、２３２、２３３、２６２、２６７、２９３、２９５、２９７、２９９、３００、３０１、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３２１、３２４、３３０、３３２、３３３または３７１のいずれかに対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されている、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項４】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、４１位のＩｌｅ、５３位のＴｙｒ、６３位のＧｌｙまたはＶａｌまたはＳｅｒ、６４位のＰｒｏ、６６位のＰｒｏ、７３位のＬｙｓ、７４位のＡｌａ、７６位のＴｈｒ、７７位のＩｌｅ、８８位のＴｙｒまたはＰｒｏ、９０位のＶａｌ、９１位のＧｌｕ、１０１位のＶａｌ、１０６位のＰｒｏ、１１１位のＧｌｙ、１１９位のＡｓｎ、１２２位のＨｉｓ、１２３位のＡｌａ、１３２位のＳｅｒ、１４０位のＡｓｎ、１４５位のＳｅｒ、１６１位のＬｅｕ、１７０位のＴｈｒ、１９５位のＡｓｐ、２１１位のＳｅｒ、２１８位のＶａｌ、２２８位のＨｉｓ、２３２位のＶａｌ、２３３位のＶａｌ、２６２位のＣｙｓまたはＨｉｓ、２６７位のＴｙｒ、２９３位のＳｅｒまたはＶａｌ、２９５位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位のＩｌｅ、３０１位のＰｒｏ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＴｈｒ、３１０位のＶａｌ、３１４位のＡｓｐ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＳｅｒ、３３２位のＡｌａ、３３３位のＧｌｕまたは３７１位のＭｅｔのうちの１つ以上を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項５】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、アミノ酸５３、６３、６４、６６、７３、７４、７６、７７、８８、１０１、１４０、１７０、２９３のいずれかに対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項６】
配列番号３に記されている配列と整列させた場合に、５３位のＴｙｒ、６３位のＧｌｙまたはＶａｌ、６４位のＰｒｏ、６６位のＰｒｏ、７３位のＬｙｓ、７４位のＡｌａ、７６位のＴｈｒ、７７位のＩｌｅ、８８位のＴｈｒまたはＰｒｏ、１０１位のＶａｌ、１４０位のＡｓｎ、１７０位のＴｈｒ、２９３位のＳｅｒまたはＶａｌのうちの１つ以上を含むアミノ酸配列を有し、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項７】
前記変異体が配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項８】
前記親アスパラギナーゼポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項９】
同じｐＨで測定された前記親ポリペプチドのものよりも高い比活性を有し、好ましくは前記変異体タンパク質の比活性が、少なくとも１つのｐＨ、より好ましくは４〜８の間のｐＨにおいて、同じｐＨで測定された前記親ポリペプチドのものよりも高いものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１０】
前記親ポリペプチドのものよりも高い最適ｐＨを有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１１】
請求項１に定義されているもの以外のアミノ酸残基の１つ以上の置換をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項１２】
請求項１に定義されているもの以外の１〜５個の付加的な置換を含む、請求項１１に記載の変異体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の変異体をコードする核酸配列。
【請求項１４】
適切な発現宿主の中でアスパラギナーゼの発現を導くことができる１つ以上の制御配列に作動的に連結された、請求項１３に記載の核酸配列を含む核酸コンストラクト。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸コンストラクトを含む組換え発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の発現ベクターを含む組換え型宿主細胞。
【請求項１７】
アスパラギナーゼの生産を導く条件下で請求項１６に記載の宿主細胞を培養するステップおよびアスパラギナーゼを回収するステップを含む、アスパラギナーゼ生産方法。
【請求項１８】
アスパラギナーゼポリペプチド変異体の生産方法であって、
ａ）  親アスパラギナーゼポリペプチドを選択するステップと；
ｂ）  ４１、５３、６２、６３、６４、６６、７０、７１、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４２、１４３、１４５、１６１、１６２、１６３、１６４、１６８、１６９、１７０、１９５、２１１、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２８、２３２、２３３、２３４、２３５、２６２、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２９３、２９５、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３１８、３１９、３２１、３２３、３２４、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５または３７１のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を置換するステップであって、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されており、前記親ポリペプチドが配列番号３と少なくとも８０％の相同性を有するステップと；
ｃ）  ｂ）で定義されている１つ以上のさらなるアミノ酸を任意に置換するステップと；
ｄ）  ステップａ）〜ｃ）の結果として得た変異体を調製するステップと；
ｅ）  前記変異体の少なくとも１つのｐＨにおける比活性および／または最適ｐＨを決定するステップと；
ｆ）  前記親アスパラギナーゼポリペプチドに比べて増大した少なくとも１つのｐＨにおける比活性および／または前記親アスパラギナーゼポリペプチドに比べて増大した最適ｐＨを有する変異体を選択し、これによりアスパラギナーゼポリペプチド変異体を生産するステップと、
を含む方法。
【請求項１９】
前記親アスパラギナーゼポリペプチドが配列番号３に記された配列を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップｂ）において、４１、５３、６３、６４、６６、７３、７４、７６、７７、８８、９０、９１、１０１、１０６、１１１、１１９、１２２、１２３、１３２、１４０、１４５、１６１、１７０、１９５、２１１、２１８、２２８、２３２、２３３、２６２、２６７、２９３、２９５、２９７、２９９、３００、３０１、３０３、３０４、３１０、３１４、３１７、３２１、３２４、３３０、３３２、３３３または３７１のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基が置換され、ここで前記位置は配列番号３を基準にして定義されており、前記親ポリペプチドが配列番号３と少なくとも８０％の相同性を有する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップｂ）において置換されたアミノ酸残基が、４１位のＩｌｅ、５３位のＴｙｒ、６３位のＧｌｙまたはＶａｌまたはＳｅｒ、６４位のＰｒｏ、６６位のＰｒｏ、７３位のＬｙｓ、７４位のＡｌａ、７６位のＴｈｒ、７７位のＩｌｅ、８８位のＴｙｒまたはＰｒｏ、９０位のＶａｌ、９１位のＧｌｕ、１０１位のＶａｌ、１０６位のＰｒｏ、１１１位のＧｌｙ、１１９位のＡｓｎ、１２２位のＨｉｓ、１２３位のＡｌａ、１３２位のＳｅｒ、１４０位のＡｓｎ、１４５位のＳｅｒ、１６１位のＬｅｕ、１７０位のＴｈｒ、１９５位のＡｓｐ、２１１位のＳｅｒ、２１８位のＶａｌ、２２８位のＨｉｓ、２３２位のＶａｌ、２３３位のＶａｌ、２６２位のＣｙｓまたはＨｉｓ、２６７位のＴｙｒ、２９３位のＳｅｒまたはＶａｌ、２９５位のＳｅｒ、２９７位のＳｅｒ、２９９位のＳｅｒ、３００位のＩｌｅ、３０１位のＰｒｏ、３０３位のＳｅｒ、３０４位のＴｈｒ、３１０位のＶａｌ、３１４位のＡｓｐ、３１７位のＩｌｅ、３２１位のＴｈｒ、３２４位のＧｌｙ、３３０位のＳｅｒ、３３２位のＡｌａ、３３３位のＧｌｕまたは３７１位のＭｅｔのうちの１つ以上に対応しており、ここで前記位置が配列番号３を基準にして定義されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の変異体または請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法によって得られる変異体を含む組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼまたは請求項２２に記載の組成物の、食品生産における使用。
【請求項２４】
アスパラギン含有原料に基づく熱処理食品の中で形成されるアクリルアミドの量を削減することを目的とした、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼまたは請求項２２に記載の組成物の使用。
【請求項２５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の１つ以上のアスパラギナーゼ酵素または請求項２２に記載の組成物を生産プロセス中の前記食品の中間形態に対し添加し、これによって前記食品の前記中間形態の中に存在するアスパラギナーゼレベルを低下させるのに有効な量で加熱ステップに先立ち酵素が添加されることになるステップを含む、少なくとも１つの加熱ステップが関与する食品の生産のためのプロセス。
【請求項２６】
請求項２５に記載のプロセスまたは請求項２３または２４に記載の使用によって得ることのできる食品。
【請求項２７】
腫瘍の治療のための薬剤としての、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアスパラギナーゼまたは請求項２２に記載の組成物の使用。
【国際調査報告】
2010524447.tif 000012
2010524447.tif 000013