(57)【要約】ＩｇＧは、病原体に対する保護の仲介、並びに組織、粘膜、及び皮膚表面への免疫系構成要素の漸増を促進するアレルギー性反応及び炎症性反応の仲介で重要な役割を果たす。本発明は、いくつかの実施形態で、ヒトＦｃＲｎに結合し、ＩｇＧのＦｃ部分がＦｃＲｎに結合するのを阻害し、それにより血清ＩｇＧ濃度を調節する、親水性ポリマーで誘導体化したペプチドに関する。開示された組成物及び方法は、いくつかの実施形態で、例えば、自己免疫疾患及び炎症障害を治療する際に使用され得る。本発明はまた、更なる実施形態で、本発明のペプチドを使用する方法及び作製する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列を有するペプチド。
【化４６】
2010535788.tif 000085
【化４７】
2010535788.tif 000086
【化４８】
2010535788.tif 000087
又は
【化４９】
2010535788.tif 000088
ここで式中、
−Ａは、存在する場合、親水性ポリマーを含む、又は水素、アシル若しくはアミノ保護基であり；
−Ｂは、存在する場合、親水性ポリマーを含む、又はアミノ基、ヒドロキシル基、若しくはカルボキシ保護基であり；
−Ｘ０は、存在する場合、所望により誘導体化されたアミノ酸若しくはその類似体であるか、又は、２〜１５個のアミノ酸の所望により誘導体化されたペプチド若しくはその類似体であり；
−Ｘ１は、存在する場合、所望により誘導体化されたアミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ２は、存在する場合、アミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ３は、Ｘ１０、Ｘ１２又はＸ１３と架橋を形成することができる、アミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ４は、所望により誘導体化されたアミノ酸若しくはその類似体であるか、又は、２〜４個のアミノ酸の所望により誘導体化されたペプチド若しくはその類似体であり；
−Ｘ６は、塩基性アミノ酸若しくはその類似体、芳香族アミノ酸若しくはその類似体、又は塩基性芳香族アミノ酸若しくはその類似体であり；
−Ｘ７は、フェニルアラニン又はその類似体であり；
−Ｘ８及びＸ９は、それぞれ独立して、グリシン若しくはその類似体、サルコシン若しくはその類似体、アスパラギン酸若しくはその類似体、Ｄ−アミノ酸若しくはその類似体、及びα−アミノイソ酪酸若しくはその類似体から選択されるか、又は、
−Ｘ８は、Ｘ９と共にジペプチド類似体を形成し；
−Ｘ１０は、アミノ酸若しくはその類似体であるか、又は
−Ｘ１０は、Ｘ９と共にジペプチド類似体を形成し；
−Ｘ１１は、チロシン又はその類似体であり；
−Ｘ１２は、所望により誘導体化されたアミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ１３は、存在する場合、アミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ１４は、存在する場合、所望により誘導体化されたアミノ酸若しくはその類似体であるか、又は、２〜１５個のアミノ酸の所望により誘導体化されたペプチド若しくはその類似体であり；
−Ｙは、親水性ポリマーを含み、
−Ｚは、
−Ａ；
−Ｂ；
−Ｘ０が存在する場合、Ｘ０のアミノ末端若しくは側鎖；Ｘ０が存在しない場合、Ｘ１のアミノ末端若しくは側鎖；Ｘ０及びＸ１が両方存在しない場合、Ｘ２のアミノ末端若しくは側鎖；又は、Ｘ０、Ｘ１及びＸ２が存在しない場合、Ｘ３のアミノ末端若しくは側鎖；
−Ｘ１４が存在する場合、Ｘ１４のカルボキシ末端若しくは側鎖；Ｘ１４が存在しない場合、Ｘ１３のカルボキシ末端若しくは側鎖；又はＸ１３及びＸ１４が両方存在しない場合、Ｘ１２のカルボキシ末端若しくは側鎖；
を通して、各ペプチドモノマーに結合するリンカーであり；
−ｍは、１、２及び３から選択される整数であり；
−ｎは、１、２及び３から選択される整数であり；
式中、
−各Ａ、Ｂ、Ｘ０、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３及びＸ１４は、独立して選択され；
−ペプチドの各モノマーの長さは、１０〜５０個のアミノ酸で変動する。
【請求項２】
以下の配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【化５０】
2010535788.tif 000089
ここで式中、
−Ｘ１は、誘導体化されていないアミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ４は、誘導体化されていないアミノ酸若しくはその類似体であるか、又は、２〜４個のアミノ酸の誘導体化されていないペプチド若しくはその類似体であり；
−Ｘ１２は、誘導体化されていないアミノ酸又はその類似体である。
【請求項３】
前記ペプチドが架橋されていない、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｘ３がＸ１３と架橋を形成する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記架橋が側鎖−側鎖架橋である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
Ｘ６がヒスチジン又はその類似体である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｘ８及びＸ９の少なくとも１つが、
−グリシン；
−Ｄ−アミノ酸；
−α−アミノイソ酪酸；及び
−サルコシン
から選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｘ１４が存在しない、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドが、式ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのいずれかのペプチドであり、ｎが１である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドが、式ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのいずれかのペプチドであり、ｎが２である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドが、以下の配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【化５１】
2010535788.tif 000090
【化５２】
2010535788.tif 000091
【化５３】
2010535788.tif 000092
又は
【化５４】
2010535788.tif 000093
【請求項１２】
前記ペプチドが、以下の配列を有する、請求項１１に記載のペプチド。
【化５５】
2010535788.tif 000094
【化５６】
2010535788.tif 000095
【化５７】
2010535788.tif 000096
又は
【化５８】
2010535788.tif 000097
ここで、横向きのかっこは架橋の存在を示す。
【請求項１３】
前記親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、デキストラン、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシアルキルデンプン、ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポロキサマー、及びポリエチレングリコールコポリマーから選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記親水性ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記ＰＥＧが直鎖ＰＥＧである、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記ＰＥＧが分岐ＰＥＧである、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１７】
前記ＰＥＧが、１０〜６０ｋＤａの範囲の平均分子量を有する、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１８】
前記ペプチドが、ヒトＦｃＲｎに特異的に結合する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１９】
前記ペプチドのヒトＦｃＲｎに対する親和性が５０ｆＭ〜１ｍＭの範囲である、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチドが、ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を阻害し、５０ｆＭ〜１ｍＭの範囲のＩＣ５０を有する、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチドが、配列
【化５９】
2010535788.tif 000098
を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２２】
前記ペプチドが、配列
【化６０】
2010535788.tif 000099
を有する、請求項２１に記載のペプチド。
ここで横向きのかっこは架橋の存在を示す。
【請求項２３】
前記ペプチドが、配列
【化６１】
2010535788.tif 000100
を有する、請求項２２に記載のペプチド。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載のペプチド及び第２分子を含む抱合体。
【請求項２５】
治療的に有効な量の、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のペプチド、又は治療的に有効な量の請求項４６に記載の抱合体を含む、製薬組成物。
【請求項２６】
請求項４７に記載の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、不適切に発現したＩｇＧ抗体又は過剰ＩｇＧを特徴とする疾患の治療方法。
【請求項２７】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項２４に記載の抱合体を、放射性同位体、検出可能な産物を有する酵素、蛍光団、化学発光化合物、磁性粒子、ミクロスフィア、ナノスフィア、ビオチン、ストレプトアビジン及びジゴキシンから選択される検出可能な標識で標識することを含む、ＦｃＲｎの検出方法。
【請求項２８】
（ａ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載のペプチド、又は請求項２４に記載の抱合体を、固体支持体に固定化することと、
（ｂ）ＦｃＲｎを含有する溶液を、固体支持体上の固定化されたペプチド又は抱合体と接触させることと、
（ｃ）前記固体支持体から溶液を分離することによりＦｃＲｎを精製することと、
を含む、ＦｃＲｎの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＩｇＧは、病原体に対する保護の仲介、並びに組織、粘膜、及び皮膚表面への免疫系構成要素の漸増を促進するアレルギー性反応及び炎症性反応の仲介で重要な役割を果たす。Ｊｕｎｇｈａｎｓ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．  １６（１）：２９  （１９９７）。しかし、ＩｇＧは種々の自己免疫疾患においても重要な役割を果たしている。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＧの血清半減期は、他の血漿タンパク質の血清半減期より長い。例えば、ＩｇＧの血清半減期は、マウスで５〜７日、ヒトで２２〜２３日である。非特許文献１；非特許文献２。血清半減期が長いのは、少なくとも部分的に、新生児Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎが原因であり、この受容体は（成体及び新生児において）飲作用されたＩｇＧのＦｃ部分に結合して、それをリソソーム分解から保護することによる。この飲作用を受けたＩｇＧは、その後、細胞外区画へ戻されて再利用される。例えば、非特許文献２、非特許文献１を参照のこと。実際に、β２ｍ及びＦｃＲｎ重鎖をコードしている遺伝子の少なくとも一部を発現しないノックアウトマウスモデルでは、ＩｇＧの血清半減期が短縮される。特許文献１、及び非特許文献２を参照のこと。
【０００３】
ＩｇＧの濃度が利用可能なＦｃＲｎを超える水準に達すると、非結合ＩｇＧは分解機構から保護されず、結果的に血清半減期がより短くなる。例えば、非特許文献３を参照のこと。類似して、ＦｃＲｎへのＩｇＧの結合が阻害されると、ＩｇＧ血清半減期は短縮され、それによって、ＩｇＧが再利用されなくなる。したがって、ＦｃＲｎへのＩｇＧの結合を阻害又は拮抗する薬剤を、不適切に発現したＩｇＧ抗体の存在を特徴とする障害（例えば、自己免疫性及び炎症性の疾患並びに障害等）の調節、治療、又は予防に使用することもできる。例えば、ＦｃＲｎのＩｇＧとの結合を阻害可能な抗体が、ＦｃＲｎ重鎖ノックアウトマウス系を使用して作製されている（国際公開第０２／４３６５８号）。別の例では、ＦｃＲｎ複合体に結合するペプチドが同定されている。非特許文献４、米国特許第６２１２０２２号。このようなペプチド、これらの合成、及びこれらの用途について更に記載している、２００７年２月１６日に出願された米国出願第１１／６７６１４８号、並びに２００６年２月１７日に出願された米国仮出願第６０／７７４８５３号、及び２００６年６月２３日に出願された米国仮出願第６０／８０５６３４号の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。しかし、現在、免疫反応を特徴とする病状、疾患、及び障害を調節、治療、又は予防するためにさらなる薬剤が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０２／４３６５８号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７０：３５２８  （２００３）
【非特許文献２】Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：５５１２  （１９９６）
【非特許文献３】Ｂｒａｍｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０３：１３５２  （１９６４）
【非特許文献４】Ｋｏｌｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９（２０）：  １３０５５−６０  （２００２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、ＦｃＲｎに特異的に結合して、ＩｇＧ  ＦｃがＦｃＲｎに結合するのを阻害し、それによりリソソームによる分解からＩｇＧを保護する役割におけるＦｃＲｎの機能を妨げることで、ＩｇＧが再利用されないようにするペプチドを開示する。代表的な実施形態では、ペプチドがＦｃＲｎに結合して、ＩｇＧのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のサブクラスがＦｃＲｎに結合するのを阻害する。
【０００７】
本発明のペプチドは、モノマー、あるいは例えばダイマー、トリマー、又はテトラマー等のマルチマーとして存在し得る。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、飲作用をより受けやすいペプチドであり得、それによりペプチドのより速い結合が可能になり、その結果、腎臓による排出がより少ない。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は、治療的に有効な量の、１つ又はそれ以上の本発明のペプチドを含有する製薬組成物を提供する。
【０００９】
他の実施形態では、本発明は、細胞を、治療的に有効な量の１つ又はそれ以上の本発明のペプチドと接触させることを含む、疾患の状態を調節する方法を提供する。更なる実施形態には、ＦｃＲｎに結合して、ＦｃＲｎがＩｇＧ分子のＦｃ部分に結合するのを阻害できる、１つ又はそれ以上の本発明のペプチドを含有する治療的に有効な量の組成物を対象に投与することを含む、対象の血清中のＩｇＧ濃度を調節する方法が含まれる。特定の実施形態では、対象の血清中の可溶性ＩｇＧの半減期を短縮するために、本発明の方法を用いることもできる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物を投与することによって、対象の血清中可溶性ＩｇＧの半減期が、ペプチド投与前の対象の血清中ＩｇＧの半減期と比較して短縮される結果となる。
【００１０】
他の実施形態では、本発明は、治療前のＩｇＧの血清濃度と比較してＩｇＧの血清濃度を低下させる、ヒトＩｇＧのＦｃ部分がＦｃＲｎに結合するのを阻害する方法を提供する。ＩｇＧの血清濃度を低下させる方法には、ＩｇＧ分子のＦｃ部分がＦｃＲｎに結合するのを阻害する１つ又はそれ以上の本発明のペプチドを含有する治療的に有効な量の組成物を対象に投与することが含まれる。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧの血清濃度の低下は、少なくとも１５％の低下のように少なくとも５％であるか、又はヒトＩｇＧの血清濃度の低下は少なくとも２５％である。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態は、例えば自己免疫疾患、炎症疾患、又は免疫系の癌等、ＩｇＧの発現増加又は不適切な発現を特徴とする疾患に罹患している対象を治療する方法を提供し、この方法には、ＦｃＲｎがＩｇＧ分子のＦｃ部分に結合しないようにすることができる１つ又はそれ以上の本発明のペプチドを含有する治療的に有効な量の組成物を対象に投与することが含まれる。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質又は遺伝子治療用ベクターに対する免疫反応を予防、治療、又は調節するために本発明の方法を用いることもできる。
【００１２】
他の実施形態では、例えば、放射性同位体、酵素（検出可能な、例えば有色、発光性、又は蛍光性等の、産物を生成する反応を触媒する酵素）、蛍光団、発色団、化学発光化合物、磁性粒子、ミクロスフィア、ナノスフィア、ビオチン、ストレプトアビジン、及びジゴキシン等から選択される少なくとも１つの検出可能な標識を用いて、本明細書に記載のペプチドを標識することを含む、ＦｃＲｎの検出方法を提供する。
【００１３】
本発明の他の実施形態には、本明細書に記載のペプチドを固体支持体に固定すること、ＦｃＲｎを含む溶液を固体支持体上に固定されたペプチドと接触させること、及び前記固体支持体からこの溶液を分離することによってＦｃＲｎを精製することを含む、ＦｃＲｎの精製方法が含まれる。
【００１４】
本発明の更なる実施形態、目的、及び利点を以下の説明で部分的に示し、また、部分的にこの記載から明らかであるか、又は本発明の実施により明らかにされ得る。本発明のこれらの実施形態、目的、及び利点は、添付の特許請求の範囲で具体的に指摘した要素及び組合せによって実現され、達成され得る。
【００１５】
上記の一般的な説明及び以下の詳細な説明は双方とも、例示及び説明のためだけのものであり、請求される本発明を制限するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１２に説明するような、例示的なＮ−末端アルデヒドペプチドモノマーの合成の概要を示した図である。
【図２】例示的な実施例としてペプチド２７０番を使用して実施例１２に説明する、還元的アルキル化によるペプチドダイマーの合成の概要を示した図である。
【図３】ビスチオールリンカーを含むペプチド及びブロモアセチル化されたペプチドを使用することによってペプチドダイマーを合成する例示的な実施例として、ペプチド１００番の合成を説明した図である。ペプチド配列の上にある横向きのかっこは架橋の存在を示す。
【図４】チオールリンカーを含むペプチド及びブロモアセチル化されたペプチドを使用してペプチドダイマーを合成する例示的な実施例として、ペプチド１２２番の合成を示した図である。ペプチド配列の上にある横向きのかっこは架橋の存在を示す。
【図５】二酸を含むリンカーを使用する、ペプチドダイマーの合成を示した図である。ペプチド２８３番の合成を例示的な実施例として示す。ペプチド配列の下にある横向きのかっこは架橋の存在を示す。
【図６】アミンを含むリンカーを使用する、ペプチドダイマーの合成を示した図である。ペプチド２８０番の合成を例示的な実施例として示す。ペプチド配列の下にある横向きのかっこは架橋の存在を示す。
【図７】精製したペプチド２８９番の４〜２０％トリス−グリシンゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によってペプチド２８９番の分子量を示した図である。レーン１は、分子量マーカーを含む。レーン２は、非抱合ＰＥＧ３ＯｋＤａ出発物質を含む。レーン３は、粗反応混合物を含む。レーン４は、精製したペプチド２８９番を含む。
【図８】ペプチド２８９番の静脈内注射後のＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧの異化動態を示した図である。
【図９】ペプチド２９０番、２９１番、２９２番、及び２９３番の化学構造を示した図である。
【図１０】４〜２０％トリス−グリシンゲルを使用した、還元的アルキル化によって合成したペグ化ペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示した図である。全てのレーンに１０ｍｇをロードした。レーン１は、分子量マーカーを含む。レーン２は、非抱合ＰＥＧ３ＯｋＤａ出発物質アルデヒドを含む。レーン３は、精製したペプチド２９０番を含む。レーン４は、非抱合ＰＥＧ２ＯｋＤａ出発物質アルデヒドを含む。レーン５は、精製したペプチド２９１番を含む。レーン６は、非抱合ＰＥＧ５ｋＤａ出発物質アルデヒドを含む。レーン７は、精製したペプチド２９２番を含む。
【図１１】４〜２０％トリス−グリシンゲルを使用した、還元的アルキル化によって合成したペグ化ペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示した図である。レーン１は、分子量マーカーを含む。レーン２は、精製したペプチド２９２番を含む。レーン３は、精製したペプチド２９１番を含む。レーン４は、精製したペプチド２９０番を含む。レーン５は、精製したペプチド２９３番を含む。レーン６は、精製したペプチド２９５番を含む。レーン７は、精製したペプチド２９６番を含む。レーン８は、分子量マーカーを含む。
【図１２】ｔ＝０時間で５００ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧを静脈内投与した後に、ｔ＝２４時間で５ｍｇ／ｋｇ又は２５ｍｇ／ｋｇのペプチド２９０番を静脈内注射した後の、ＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧの異化率を示した図である。実施例１８のようにｈＩｇＧの濃度をＥＬＩＳＡで測定して、ｔ＝２４時間の濃度に正規化し、ビヒクル対照群との比較を行った。
【図１３】ペプチド２９５番の化学構造を示した図である。
【図１４】ペプチド２９６番の化学構造を示した図である。
【図１５】ｔ＝０時間で５００ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧを静脈内投与した後に、ｔ＝２４時間で２５ｍｇ／ｋｇのペプチド２９０番、２９１番、２９３番、２９５番、及び２９６番を静脈内注射した後の、ＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧの異化率を示した図である。実施例１８のようにｈＩｇＧの濃度をＥＬＩＳＡで測定して、ｔ＝２４時間の濃度に正規化し、ビヒクル対照群との比較を行った。
【図１６】実施例４に説明するＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡ分析及び実施例１８のヒトＩｇＧの異化を用いて、インビトロ及びインビボにおける種々のペプチドの活性を比較した表である。
【図１７】分岐ＰＥＧ結合による抗ＦｃＲｎペプチドの合成を示した図である。
【図１８】ペプチド２９７番の化学構造を示した図である。
【図１９−１】ペプチド３０７番、３０８番、及び３０９番の化学構造を示した図である。
【図１９−２】ペプチド３０７番、３０８番、及び３０９番の化学構造を示した図である。
【図２０】２．５ｍｇ／ｋｇの皮下投与を用いる実施例１８に記載のＩｇＧ異化実験における、ペプチド２８３、２９８、２９９、３００、３０１の作用を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｉ．定義
本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸」は、コードされている及びコードされていないアミノ酸を包含する。本明細書では、コードされているアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）については、標準的な１文字及び３文字表記を用いる。
【００１８】
コードされていないアミノ酸としては、例えば、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸、及びω−アミノ酸が挙げられ、任意のキラル原子にＲ又はＳキラリティを有してもよい。コードされていないアミノ酸としては、例えば、コードされているアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸並びに、アロ−スレオニン及びアロ−イソロイシンのようなアロ−アミノ酸）及び構造異性体（例えば、β−アラニンが挙げられる）のような、コードされているアミノ酸の異性体が挙げられる。Ｄ−キラリティを有するコードされているアミノ酸の立体異性体を示すために、本明細書では小文字の１文字コードを用いる（例えば、ａ＝Ｄ−アラニン、ｙ＝Ｄ−チロシン）。コードされていないアミノ酸としてはまた、Ｎ−メチル化アミノ酸が挙げられる。特定の一般的なコードされていないアミノ酸については、本明細書では従来の３文字表記を用いる（例えば、Ａｉｂ＝アミノイソ酪酸、Ａｐａ＝５−アミノペンタン酸、Ｄａｂ＝１，３−ジアミノ酪酸、Ｄａｐ＝１，２−ジアミノプロピオン酸、Ｏｒｎ＝オルニチン、Ｐｅｎ＝ペニシラミン、Ｓａｒ＝サルコシン）。一般に、α−アミノ酸を示す特定の立体配置が存在しない場合、当業者は、アミノ酸がＬ−アミノ酸であることを理解するであろう。しかしながら、特定の実施形態では、コードされていないアミノ酸はまた、ラセミ体、非ラセミ体及びジアステレオマー混合物であってよい。
【００１９】
コードされていないアミノ酸は、ペプチド分野で周知であり、例えば、Ｎ−アセチルセリン、アロ−イソロイシン、アロ−スレオニン、β−アラニン（３−アミノプロピオン酸）、α−アミノアジピン酸、２−アミノブタン酸、４−アミノブタン酸、３−アミノ−１−カルボキシメチルバレロラクタム、１−アミノシクロペンタンカルボン酸、６−アミノヘキサン酸、２−アミノヘプタン二酸、７−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、アミノメチルピロールカルボン酸、８−アミノ−３，６−ジオキサ−オクタン酸、アミノピペリジンカルボン酸、アミノセリン、アミノテトラヒドロピラン−４−カルボン酸、アゼチジンカルボン酸、ベンゾチアゾリルアラニン、ブチルグリシン、カルニチン、４−クロロフェニルアラニン、シトルリン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルスタチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、ジヒドロキシフェニルアラニン、ジメチルチアゾリジンカルボン酸、４−グアニル−フェニルアラニン、ホモアルギニン、ホモシトルリン、ホモシステイン、ホモフェニルアラニン、ホモプロリン、ホモセリン、４−ヒドラジノ安息香酸、４−ヒドロキシプロリン、イソニペコ酸、メタノプロリン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、ｐ−アミノ安息香酸、ペニシラミン、フェニルグリシン、Ｏ−ホスホセリン、ピペリジニルアラニン、ピペリジニルグリシン、ピロリジニルアラニン、サルコシン、スタチン、テトラヒドロピラングリシン、チエニルアラニン、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジンが挙げられる。
【００２０】
アミノ酸の「類似体」は、アミノ酸ではないが、例えば、大きさ、電荷、親水性、疎水性、極性、水素結合能、又は剛性のような、少なくとも１つの特性に関してアミノ酸に類似する分子である。例えば、乳酸はアミノ酸類似体であり得る。同様に、ジペプチドの類似体は、ジペプチドではないが、例えば、大きさ、電荷、親水性、疎水性、極性、水素結合能、又は剛性のような、少なくとも１つの特性に関してジペプチドに類似する分子である。更に、ペプチド類似体は、ペプチドではないが、例えば、大きさ、電荷、親水性、疎水性、極性、水素結合能、又は剛性のような、少なくとも１つの特性に関してペプチドに類似する分子である。いくつかの実施形態では、ジペプチド類似体又はペプチド類似体は、１つ又はそれ以上のペプチド結合が、当業者に周知の方法により、例えば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−又は−ＣＨ２ＳＯ−から選択される結合により置換されるという点で、ジペプチド又はペプチドとは異なり得る。例えば、Ｆａｕｃｈｅｒｅ，  Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．  １５：２９  （１９８６）；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３０：１２２９  （１９８７）を参照のこと。ジペプチド類似体としてはまた、例えば、β−ターン類似体が挙げられる。例えば、Ｆｒｉｅｄｉｎｇｅｒ，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４６：５５５３−５５６６  （２００３）及び  Ｈａｎｅｓｓｉａｎ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５３：１２７８９−１２８５４  （１９９７）を参照のこと。
【００２１】
ジペプチド類似体の非限定的な例としては、例えば、β−アラニン、４−アミノブタン酸、５−アミノブタン酸、３−（アミノメチル）安息香酸、４−（アミノメチル安息香酸）、３−（アミノフェニル）酢酸、４−（アミノフェニル）酢酸、並びに
【化１】
2010535788.tif 000002
【化２】
2010535788.tif 000003
【化３】
2010535788.tif 000004
【化４】
2010535788.tif 000005
−３（Ｓ）−アミノ−２−オキソ−１−ピペリジン−酢酸及び３（Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピペリジン−酢酸；
−３（Ｓ）−アミノ−２−オキソ−１−アゼピン−酢酸及び３（Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−アゼピン−酢酸；
−３（Ｓ）−アミノ−２−オキソ−１−ピロリジン−酢酸及び３（Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピロリジン−酢酸；並びに
−３−アミノ−Ｎ−１−カルボキシメチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−［１］−ベンズアゼピン−２−オンが挙げられる。
【００２２】
所与の配列と「実質的に同一」であるアミノ酸配列は、例えば、所与の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一であり得る。実質的に同一である配列は、例えば、１つ又はそれ以上のアミノ酸を、１つ若しくはそれ以上のコードされていないアミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸又はＮ−メチル化アミノ酸のような）又はアミノ酸類似体で置換することを含む、１つ若しくはそれ以上のアミノ酸の切断、欠失、置換、付加又は修飾により、所与の配列と異なり得る。あるいは、実質的に同一である配列は、保存的アミノ酸置換によってのみ、所与の配列と異なり得る。
【００２３】
保存的置換は、第１アミノ酸が、例えば、大きさ、電荷、親水性、疎水性、極性、水素結合能、又は剛性のような、第１アミノ酸の少なくとも１つの特性に近い第２アミノ酸により置換される、置換である。保存的置換は、コードされているアミノ酸及びコードされていないアミノ酸の両方、並びにアミノ酸類似体を包含する。
【００２４】
例えば、いくつかの実施形態では、アラニンは、例えば、メチオニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンのような別の疎水性アミノ酸により、又は上述のアミノ酸のいずれかの類似体により、保存的に置換され得る。他の実施形態では、アラニンは、例えば、β−アラニン、エチルグリシン、α−アミノイソ酪酸、若しくはＤ−アラニンのような、およそイソタクチックであるアミノ酸により、又は上述のアミノ酸のいずれかの類似体により、保存的に置換され得る。いくつかの実施形態では、システインは、例えば、ホモシステイン、Ｄ−システイン若しくはペニシラミンのような別のチオール含有アミノ酸により、又は上述のアミノ酸のいずれかの類似体により、保存的に置換され得る。他の実施形態では、システインは、例えば、セリン、スレオニン、若しくは２，３−ジアミノプロピオン酸のようなおよそイソタクチックであるアミノ酸により、又は上述のアミノ酸のいずれかの類似体により、保存的に置換され得る。他の実施形態では、フェニルアラニンは、例えば、３−フルオロフェニルアラニン、４−メチルフェニルアラニン、フェニルグリシン、１−ナフチルアラニン及び３，３−ジフェニルアラニン、４−アミノフェニルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、２−ピロリジニルアラニン、３−ピペリジルアラニン、若しくは４−ピペリジルアラニンにより、又は上述のアミノ酸のいずれかの類似体により、保存的に置換され得る。別の例として、ヒスチジンは、例えば、リジン、オルニチン、２，４−ジアミノ酪酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、アルギニン、若しくはグアニルアラニンのような塩基性アミノ酸により、又は上述のアミノ酸のいずれかの類似体により、保存的に置換され得る。他の実施形態では、ヒスチジンは、例えば、チエニルアラニン、チロシン、トリプトファン若しくはフェニルアラニンのような芳香族アミノ酸により、又は上述のアミノ酸のいずれかの類似体により、保存的に置換され得る。更に別の実施形態では、ヒスチジンは、例えば、１−メチルヒスチジン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、４−アミノフェニルアラニン、４−グアニルフェニルアラニン、チアゾリルアラニンのような、塩基性、芳香族アミノ酸、及びこれらの類似体により保存的に置換され得る。
【００２５】
特定の実施形態では、保存的置換は、第１アミノ酸を、例えば±０．５、±１、又は±２異なる値のような、類似の疎水性親水性指標を有する第２アミノ酸に置換する置換であり得る。他の実施形態では、保存的置換は、例えば±０．５、±１、又は±２異なる値のような、類似の親水性値を有する第２アミノ酸に置換する置換であり得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、非保存的置換を導入することができる。非保存的置換は、例えば、荷電アミノ酸を中性アミノ酸で置換する置換、塩基性アミノ酸を産生アミノ酸で置換する置換、極性アミノ酸を非極性アミノ酸で置換する置換、親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸で置換する置換、アミノ酸を立体的に異なるアミノ酸で置換する置換、又は異なる水素結合能を有するアミノ酸であり得る。非保存的置換は、適切な場合に行なうことができる。例えば、当業者は、生物学的活性（例えば、ＦｃＲｎ結合親和性又はインビボでのＩｇＧ濃度の低下のような）又はペプチドの構造を著しく変更することなく、非保存的に置換できる、ペプチドの１つ又はそれ以上のアミノ酸を同定することができる。例えば、実施例７を参照のこと。
【００２７】
ＩＩ．親水性ポリマーで誘導体化されたペプチド
一般に、本開示は、親水性ポリマーで誘導体化されたペプチドを提供する。例えば、実施例に開示されたいずれかのペプチドは、親水性ポリマーで誘導体化され得、親水性ポリマーで誘導体化され得るように改変することができる（例えば、下記のように）。用語「誘導体化された」は、本発明のペプチドに関連して用いるとき、親水性ポリマーを含む、アミノ酸若しくはペプチド、又はアミノ酸若しくはペプチドの類似体を指す。
【００２８】
親水性ポリマーは、例えば、モノアルキルポリエチレングリコールを含む、ポリエチレングリコール；ポリプロピレングリコール；例えば、デキストラン及びセルロースのような多糖類；メチルセルロース；ヒドロキシセルロース；ヒドロキシメチルセルロース；ヒドロキシプロピルセルロース；ヒドロキシプロピルメチルセルロース；例えば、ヒドロキシエチルデンプンを含むヒドロキシアルキルデンプン；ポリビニルアルコール；ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）；及びポロキサマーから選択してよい。他の実施形態では、親水性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコールコポリマー及びポリエチレングリコール−ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーのような、ポリエチレングリコールコポリマーから選択することができる。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーは、非ペプチドポリマーである。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーは容易に水和される。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーは、水和したとき、大きな流体力学半径を有する。例示的な実施形態では、親水性ポリマーはポリエチレングリコールである。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチド（モノマー又はマルチマー）は、ペプチドモノマーあたり１分子の親水性ポリマーを含有し得る。他の実施形態では、本発明のペプチドは、ペプチドモノマーあたり複数個の分子の親水性ポリマーを含有し得る。例えば、本明細書に開示する抗ＦｃＲｎペプチドは、ペプチドモノマーあたり１、２、３、４、５、６、７、８又は１〜４、１〜８、２〜３、２〜４、２〜６、３〜６又は２〜６分子の親水性ポリマーを有し得る。
【００３０】
いくつかの実施形態では、親水性ポリマーは直鎖であり得る。他の実施形態では、親水性ポリマーは分岐し得る。分岐親水性ポリマーは、例えば、２、３、４、５、６、７又は８個の枝を有し得る。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーは、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０ｋＤａの平均分子量を有してよく、又は、例えば約１０〜６０、１０〜４０、１０〜３０、２０〜３０、２０〜４０、２０〜５０、３０〜６０、１５〜２５、２５〜３５、３５〜４５又は４５〜５５ｋＤａの範囲の平均分子量を有して得る。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する誘導体化されたペプチドは、対応する誘導体化されていないペプチドに比べて、強化された薬剤学的性質を呈する。例えば、誘導体化されたペプチドは、動物での血清半減期が長い場合がある。いくつかの実施形態では、誘導体化されたペプチドは、ヒト、マウス、ラット及びカニクイザルのいずれかで、対応する誘導体化されていないペプチドより少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１５０、１７５、２００又は３００％長い血清半減期を有し得る。他の実施形態では、誘導体化されたペプチドは、ヒト、マウス、ラット及びカニクイザルのいずれかで、対応する誘導体化されていないペプチドの少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、５００、１，０００、５，０００又は１０，０００倍長い血清半減期を有し得る。血清半減期は、例えば、ＬＣ−ＭＳ又は適切な抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイにより決定できる。特定の実施形態では、誘導体化は、効力の著しい低下をもたらさない。例えば、いくつかの実施形態では、誘導体化は、例えば結合親和性の著しい低下をもたらさない。他の実施形態では、誘導体化は、ＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用に対する阻害活性の著しい低下をもたらさない。例えば、いくつかの実施形態では、誘導体化は、例えば、実施例４に説明するＩｇＧ−ペプチド競合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡ（動態排除アッセイ）により測定したとき、効力の著しい低下をもたらさず、誘導体化されたペプチドは、対応する誘導体化されていないペプチドの効力の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８又は９９％を有し得る。
【００３２】
いくつかの実施形態では、例えばペプチド番号２２７、２３５及び２３９のようなモノマー性ペプチドを誘導体化することができ、又は、誘導体化できるように改変することができる（例えば、保存的又は非保存的置換により）。他の実施形態では、例えば、ペプチド番号１１９、２４７、２７８、２８５、２８６、２８７のようなモノマー性ペプチドを誘導体化することができ、又は、誘導体化できるように改変することができる。
【００３３】
本発明の誘導体化されたペプチドは、例えばペプチド番号２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５及び２９６から選択することができる。例示的な実施形態では、誘導体化された抗ＦｃＲｎペプチドは、実施例２４、２７〜２９及び３１に説明されるように直鎖ＰＥＧ鎖で、又は実施例３３〜３４に記載のように分岐ＰＥＧ鎖でペグ化された、ペプチド番号２８５であり得る。いくつかの実施形態では、分岐ＰＥＧ鎖は、直鎖ＰＥＧ鎖よりも、インビトロ及びインビボでより有利な特徴を提供し得る。例示的な実施形態では、分岐ペグ化ペプチドは、２０ｋＤａの２分岐ＰＥＧ又は２分岐、４０ｋＤａのＰＥＧによるペプチド番号２８５の還元的アルキル化の産物であり得る。
【００３４】
誘導体化されたペプチドは、モノマー性又はマルチマー性（例えば、ダイマー性、トリマー性及びテトラマー性ペプチドを含む）であり得る。マルチマー性ペプチドの場合、それからマルチマーが構成される個々のペプチドモノマーのそれぞれが、同じであってもよく、又はマルチマー中の任意の他のペプチドモノマーと異なってもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドマルチマーは、個々のペプチドモノマーを多価リンカーと反応させることにより合成できる。例えば、Ｒｏｓｅ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１６：３０  （１９９４）を参照のこと。例えば、ペプチドマルチマーは、個々のペプチドモノマーを、樹脂中で、多価リンカーと反応させることにより合成できる。他の実施形態では、ペプチドマルチマーは、例えば、Ｐｏｓｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３：１７１９  （１９８８）のように、ペプチド配列の合成前に、分岐リンカー基を組み込むことにより合成できる。
【００３５】
当業者に既知である任意の好適なリンカーを用ることができる。一般に、ＦｃＲｎへの結合を干渉しないリンカーが選択される。例えば、リンカーは、例えば、実施例：米国特許第４，６７１，９５８号；同第４，８６７，９７３号；同第５，６９１，１５４号；同第５，８４６，７２８号；同第６，４７２，５０６号；同第６，５４１，６６９号；同第７，１４１，６７６号；同第７，１７６，１８５号；及び同第７，２３２，８０５号、並びに米国特許出願公開第２００６／０２２８３４８号に開示されているリンカーのうちの１つであり得る。
【００３６】
一般に、リンカーは、マルチマーのペプチドモノマー間の立体障害を避け、ＦｃＲｎへのペプチドモノマーの結合を干渉しないような、好適な長さとすることができる。いくつかの実施形態では、リンカーは共有結合であり得る。他の実施形態では、リンカーは、１〜１００、１〜６０、５〜６０、５〜４０、２〜５０、２〜２０、５〜１０又は５〜２０個の直鎖原子を含み得、この場合リンカーは、例えばエステル、アミド、ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、エーテル、チオエーテル、ホスホロチオエート、ホスホネート、チオエステル及び／又はジスルフィド結合を用いて、ペプチドモノマーに結合する。リンカー中の残りの直鎖原子は、好ましくは、炭素、酸素、窒素及び硫黄から成る群から選択され、これらの原子のいずれかは、所望により、炭素環、複素環、アリール又はヘテロアリール環に含まれ得る。リンカー中の直鎖炭素原子は、所望により、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アレーンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレーンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ及びウレイドから成る群から選択される置換基で置換することができる。リンカー中の直鎖窒素原子は、所望により、アシル、スルホニル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシカルボニルで置換することができる。リンカー中の直鎖硫黄原子は、所望により、酸化することができる。特定の実施形態では、リンカーは、例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８３４８号及び米国特許第４，８６７，９７３号；同第７，１７６，１８５号；同第７，２３２，８０５号に開示されているように、開裂可能であり得る。
【００３７】
いくつかの実施形態では、誘導体化されたペプチドは、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化又は脂質化のような、更なる修飾を含み得る。
【００３８】
誘導体化されたペプチドは、特定の実施形態では、ＦｃＲｎに対して多少の親和性を有する。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチド−ＦｃＲｎ相互作用のＫＤは、５０ｆＭ〜１ｍＭの範囲であり得る。他の実施形態では、ＫＤは５０ｆＭ〜１００μＭ、５０ｆＭ〜１ｎＭ、又は１ｐＭ〜１ｎＭの範囲であり得る。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＩｇＧのＦｃ部分がＦｃＲｎに結合するのを阻害する。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＩｇＧのＦｃ部分が、例えば５０ｆＭ〜１００μＭ、５０ｆＭ〜１μＭ、１ｐＭ〜１００ｎＭ、又は１０ｐＭ〜１０ｎＭのＩＣ５０で、ＦｃＲｎに結合するのを阻害することができる。
【００４０】
Ａ．代表的な誘導体化されたペプチド
いくつかの実施形態では、本開示は以下の代表的な誘導体化されたペプチドを提供する。
【００４１】
代表的な実施形態１：以下の配列を有する誘導体化されたペプチド。
【化５】
2010535788.tif 000006
【化６】
2010535788.tif 000007
【化７】
2010535788.tif 000008
又は
【化８】
2010535788.tif 000009
ここで式中、
−Ａは、存在する場合、親水性ポリマーを含む、又は水素、アシル若しくはアミノ保護基であり；
−Ｂは、存在する場合、親水性ポリマーを含む、又はＱ、アミノ基、ヒドロキシル基、若しくはカルボキシ保護基であり；
−Ｑは、存在する場合、アミン基（中性であっても、又は正電荷を有してもよい）であって、アルキレン基によりペプチドに結合し、ここでアルキレン基は、エチレン、ｎ−プロピレン、ｎ−ブチレン、ｎ−ペンチレン及びｎ−ヘキシレンを含むが、これらに限定されないか；又は、アルキレン基とアルキレンオキシドサブユニットとの組み合わせ（アルキレンオキシドサブユニットは−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｐ−（式中、ｐは１、２、３、４又は５である）を含むが、これらに限定されない）によりペプチドに結合するアミン基を含み；Ｑの非限定的な例としては、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、
−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２及び
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２
が挙げられ；
−Ｘ０は、存在する場合、所望により誘導体化されたアミノ酸若しくはその類似体であるか、又は、２〜１５個のアミノ酸の所望により誘導体化されたペプチド若しくはその類似体であり；
−Ｘ１は、存在する場合、所望により誘導体化されたアミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ２は、存在する場合、アミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ３は、Ｘ１０、Ｘ１２又はＸ１３と架橋を形成することができる、アミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ４は、所望により誘導体化されたアミノ酸若しくはその類似体であるか、又は、２〜４個のアミノ酸の所望により誘導体化されたペプチド若しくはその類似体であり；
−Ｘ６は、塩基性アミノ酸若しくはその類似体、芳香族アミノ酸若しくはその類似体、又は塩基性芳香族アミノ酸若しくはその類似体であり；
−Ｘ７は、フェニルアラニン又はその類似体であり；
−Ｘ８及びＸ９は、それぞれ独立して、グリシン若しくはその類似体、サルコシン若しくはその類似体、アスパラギン酸若しくはその類似体、Ｄ−アミノ酸若しくはその類似体、及びα−アミノイソ酪酸若しくはその類似体から選択されるか、又は、
−Ｘ８は、Ｘ９と共にジペプチド類似体を形成し；
−Ｘ１０は、アミノ酸若しくはその類似体であるか、又は
−Ｘ１０は、Ｘ９と共にジペプチド類似体を形成し；
−Ｘ１１は、チロシン又はその類似体であり；
−Ｘ１２は、所望により誘導体化されたアミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ１３は、存在する場合、アミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ１４は、存在する場合、所望により誘導体化されたアミノ酸又はその類似体であるか、又は、２〜１５個のアミノ酸の所望により誘導体化されたペプチド若しくはその類似体であり；
−Ｙは、親水性ポリマーを含み、
−Ｚは、
−Ａ；
−Ｂ；
−Ｘ０が存在する場合、Ｘ０のアミノ末端若しくは側鎖；Ｘ０が存在しない場合、Ｘ１のアミノ末端若しくは側鎖；Ｘ０及びＸ１が両方存在しない場合、Ｘ２のアミノ末端若しくは側鎖；又は、Ｘ０、Ｘ１及びＸ２が存在しない場合、Ｘ３のアミノ末端若しくは側鎖；
−Ｘ１４が存在する場合、Ｘ１４のカルボキシ末端若しくは側鎖；Ｘ１４が存在しない場合、Ｘ１３のカルボキシ末端若しくは側鎖；又はＸ１３及びＸ１４が両方存在しない場合、Ｘ１２のカルボキシ末端若しくは側鎖；
を通して、各ペプチドモノマーに結合するリンカーであり；
−ｍは、１、２及び３から選択される整数であり；
−ｎは、１、２及び３から選択される整数であり；
式中：
−各Ａ、Ｂ、Ｘ０、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３及びＸ１４は、独立して選択され；
−ペプチドの各モノマーの長さは、１０〜５０個のアミノ酸で変動する。
【００４２】
ＺがＸ０の側鎖を通してペプチドに結合する場合、Ａは必ず存在することが、当業者には明らかであろう。同様に、ＺがＸ１４の側鎖に結合する場合、Ｂは必ず存在する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、Ａは親水性ポリマーを含む。例えば、Ａは、親水性ポリマー及び、親水性ポリマーとＸ０（又は、Ｘ０が存在しない場合Ｘ１、Ｘ０及びＸ１が存在しない場合Ｘ２、若しくはＸ０、Ｘ１及びＸ２が存在しない場合Ｘ３）とを結合させるリンカー（例えば、本明細書に記載するリンカーのいずれかのような）を含み得る。他の実施形態では、Ａは水素、アシル又はアミノ保護基である。いくつかの実施形態では、Ｂは親水性ポリマーを含む。例えば、Ｂは親水性ポリマー及び、親水性ポリマーとＸ１４（又は、Ｘ１４が存在しない場合Ｘ１３、若しくはＸ１３及びＸ１４が存在しない場合Ｘ１２）とを結合させるリンカー（例えば、図１８中に見られるものを含む、本明細書に記載するリンカーのいずれかのような）を含み得る。他の実施形態では、Ｂはアミノ基、ヒドロキシル基、又はカルボキシ保護基である。
【００４４】
アミノ基又はカルボキシ基のようなイオン化可能な基の電荷は、環境に応じて、帯電してもよく、又は中性であってもよい。
【００４５】
代表的な実施形態２：以下の配列を有する、実施形態１に記載のペプチド。
【化９】
2010535788.tif 000010
ここで式中、
−Ｘ１は、誘導体化されていないアミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ４は、誘導体化されていないアミノ酸若しくはその類似体、又は誘導体化されていない２若しくは４個のアミノ酸若しくはその類似体のペプチドであり；
−Ｘ１２は、誘導体化されていないアミノ酸又はその類似体である。
【００４６】
代表的な実施形態３：Ｘ０が存在しない、実施形態１に記載のペプチド。
【００４７】
代表的な実施形態４：Ｘ１がアルギニン又はその類似体である、実施形態１に記載のペプチド。
【００４８】
代表的な実施形態５：Ｘ２が芳香族アミノ酸又はその類似体である、実施形態１に記載のペプチド。
【００４９】
代表的な実施形態６：Ｘ２がフェニルアラニン若しくはその類似体、チロシン又はその類似体、又はトリプトファン若しくはその類似体である、実施形態５に記載のペプチド。
【００５０】
代表的な実施形態７：Ｘ２がフェニルアラニン若しくはその類似体である、実施形態６に記載のペプチド。
【００５１】
代表的な実施形態８：ペプチドが架橋されていない、実施形態１に記載のペプチド。
【００５２】
代表的な実施形態９：Ｘ１０、Ｘ１２又はＸ１３の少なくとも１つが、Ｘ３と架橋を形成することができる、アミノ酸又はその類似体である、実施形態１に記載のペプチド。
【００５３】
代表的な実施形態１０：Ｘ３が、Ｘ１０、Ｘ１２又はＸ１３と架橋を形成する、実施形態９に記載のペプチド。Ｘ３と、Ｘ１０、Ｘ１２又はＸ１３との間の架橋は、側鎖−側鎖架橋か、又は側鎖−カルボキシ末端架橋であり得る（例えば、Ｘ１３がペプチドのカルボキシ末端である実施形態では）。架橋は、例えば、ジスルフィド（例えば、実施例７を参照のこと）、エーテル、チオエーテル、アルケン、又はアミド（例えば実施例１０を参照のこと）のような、１つ若しくはそれ以上の官能基を含むか、又はその官能基の形成に起因し得、この場合架橋は、例えばジスルフィド、エーテル、チオエーテル、アルケン又はアミド架橋と呼ぶことができる。
【００５４】
代表的な実施形態１１：Ｘ３がＸ１３と架橋を形成する、実施形態１０に記載のペプチド。
【００５５】
代表的な実施形態１２：架橋が、側鎖−側鎖架橋である、実施形態１１に記載のペプチド。
【００５６】
代表的な実施形態１３：側鎖−側鎖架橋が、ジスルフィド架橋、エーテル架橋、チオエーテル架橋、アルケン架橋、又はアミド架橋である、実施形態１２に記載のペプチド。
【００５７】
代表的な実施形態１４：側鎖−側鎖架橋が、
−システインとシステイン；
−システインとホモシステイン；
−システインとペニシラミン；
−ホモシステインとホモシステイン；
−ホモシステインとペニシラミン；又は
−ペニシラミンとペニシラミン
の間のジスルフィド架橋である、実施形態１３に記載のペプチド。
【００５８】
代表的な実施形態１５：側鎖−側鎖架橋が、
−アスパラギン酸とリジン；
−アスパラギン酸とオルニチン；
−アスパラギン酸と２，４−ジアミノ酪酸；
−アスパラギン酸と２，３−ジアミノプロピオン酸；
−グルタミン酸とリジン；
−グルタミン酸とオルニチン；
−グルタミン酸と２，４−ジアミノ酪酸；又は
−グルタミン酸と２，３−ジアミノプロピオン酸
の間のアミド架橋である、実施形態１３に記載のペプチド。
【００５９】
代表的な実施形態１６：ペプチドが少なくとも１つのシステインを含む、実施形態１に記載のペプチド。
【００６０】
代表的な実施形態１７：ペプチドが、
−ホモシステイン；
−Ｄ−システイン；及び
−ペニシラミン
から選択される、少なくとも１種のシステイン類似体を含む、実施形態１に記載のペプチド。
【００６１】
代表的な実施形態１８：Ｘ４がスレオニン又はその類似体である、実施形態１に記載のペプチド。
【００６２】
代表的な実施形態１９：Ｘ６が、
−リジン又はその類似体；
−オルニチン又はその類似体；
−２，４−ジアミノ酪酸又はその類似体；
−２，３−ジアミノプロピオン酸又はその類似体；
−アルギニン又はその類似体；及び
−グアニルアラニン又はその類似体
から選択される、塩基性アミノ酸又はその類似体である、実施形態１に記載のペプチド。
【００６３】
代表的な実施形態２０：Ｘ６が、
−チロシン又はその類似体；
−トリプトファン又はその類似体；及び
−フェニルアラニン又はその類似体
から選択される、芳香族アミノ酸又はその類似体である、実施形態１に記載のペプチド。
【００６４】
代表的な実施形態２１：Ｘ６が、
−ヒスチジン又はその類似体；
−１−メチルヒスチジン又はその類似体；
−２−ピルジルアラニン又はその類似体；
−３−ピルジルアラニン又はその類似体；
−４−ピルジルアラニン又はその類似体；
−４−アミノフェニルアラニン又はその類似体；
−４−グアニルフェニルアラニン又はその類似体；及び
−チアゾリルアラニン又はその類似体
から選択される、塩基性芳香族アミノ酸又はその類似体である、実施形態１に記載のペプチド。
【００６５】
代表的な実施形態２２：Ｘ６が、ヒスチジン若しくはその類似体、３−ピリジルアラニン若しくはその類似体、４−ピリジルアラニン若しくはその類似体、又は４−グアニルフェニルアラニン若しくはその類似体である、実施形態２１に記載のペプチド。
【００６６】
代表的な実施形態２３：Ｘ６が４−グアニルフェニルアラニン又はその類似体である、実施形態２２に記載のペプチド。
【００６７】
代表的な実施形態２４：Ｘ６がヒスチジン又はその類似体である、実施形態２２に記載のペプチド。
【００６８】
代表的な実施形態２５：Ｘ７がフェニルアラニンである、実施形態１に記載のペプチド。
【００６９】
代表的な実施形態２６：Ｘ８及びＸ９の少なくとも１つが、
−グリシン；
−Ｄ−アミノ酸；
−α−アミノイソ酪酸；及び
−サルコシン
から選択される、実施形態１に記載のペプチド。
【００７０】
代表的な実施形態２７：Ｘ８がＸ９と共に、
−β−アラニン；
−４−アミノブタン酸；
−５−アミノペンタン酸；
−３−（アミノメチル）安息香酸；
−４−（アミノメチル）安息香酸；
−３−（アミノフェニル）酢酸；
−４−（アミノフェニル）酢酸；
【化１０】
2010535788.tif 000011
【化１１】
2010535788.tif 000012
−３−アミノ−２−オキソ−１−ピペリジン−酢酸；
−３（Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピペリジン−酢酸；
−３（Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−アゼピン酢酸；
−３（Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸；及び
−３−アミノ−Ｎ−１−カルボキシメチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−［１］−ベンズアゼピン−２−オン、
から選択される、ジペプチド類似体を形成する、実施形態１に記載のペプチド。
【００７１】
代表的な実施形態２８：ペプチドが、
−トリプトファン；
−チロシン；
−２−アミノフェニルアラニン；
−３−アミノフェニルアラニン；
−４−アミノフェニルアラニン；
−ペンタフルオロフェニルアラニン；
−２−ピリジルアラニン；
−３−ピリジルアラニン；
−４−ニトロフェニルアラニン；
−１−ナフチルアラニン；
−ホモフェニルアラニン；
−フェニルグリシン；
−２−メチルフェニルアラニン；
−３−メチルフェニルアラニン；
−４−メチルフェニルアラニン；
−２−クロロフェニルアラニン；
−３−クロロフェニルアラニン；
−４−クロロフェニルアラニン；
−３，３−ジフェニルアラニン；
−４，４‘−ジフェニルアラニン；
−４−ｔ−ブチルフェニルアラニン；
−シクロヘキシルアラニン；
−（４−アミノアセチル）フェニルアラニン；
−Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸；
−Ｄ−β−メチルフェニルアラニン；及び
−Ｌ−β−メチルフェニルアラニン
から選択されるフェニルアラニン類似体を含む、実施形態１に記載のペプチド。
【００７２】
代表的な実施形態２９：ペプチドが、
−フェニルアラニン；
−４−アミノフェニルアラニン；
−４−メトキシフェニルアラニン；
−ペンタフルオロフェニルアラニン；
−２−ピリジルアラニン；
−３−ピリジルアラニン；
−４−ピリジルアラニン；
−４−ニトロフェニルアラニン；
−２−ニトロチロシン；及び
−４−フルオロフェニルアラニン
から選択される、少なくとも１種のチロシン類似体を含む、実施形態１に記載のペプチド。
【００７３】
代表的な実施形態３０：Ｘ９及びＸ１０は、共に、
−Ｄ，Ｌ−フリードリンガーラクタム
【化１２】
2010535788.tif 000013
及び、−Ｌ，Ｌ−フリードリンガーラクタム
【化１３】
2010535788.tif 000014
から選択される、ジペプチド類似体を形成する、実施形態１に記載のペプチド。
【００７４】
代表的な実施形態３１：ペプチドが、
−２，４−ジアミノ酪酸；
−チアゾリルアラニン；
−２，３−ジアミノプロピオン酸；
−グアニルアラニン；
−２−ピリジルアラニン；
−３−ピリジルアラニン；
−４−ピリジルアラニン；
−チエニルアラニン；
−オルニチン；
−リジン；
−アルギニン；
−４−グアニルフェニルアラニン；
−１−メチルヒスチジン；
−３−メチルヒスチジン；
−１，３−ジメチルヒスチジン；
−４−アミノフェニルアラニン；
−２−ピロリジルアラニン；
−３−ピペリジルアラニン；及び
−４−ピペリジルアラニン
から選択される、少なくとも１種のヒスチジン類似体を含む、実施形態１に記載のペプチド。
【００７５】
代表的な実施形態３２：Ｘ１０が、中性疎水性アミノ酸及びその類似体から選択される、実施形態１に記載のペプチド。他の実施形態では、Ｘ１０は中性アミノ酸又はその類似体である。更に他の実施形態では、Ｘ１０は疎水性アミノ酸又はその類似体である。更なる実施形態では、Ｘ１０はＮ−メチル化疎水性アミノ酸又はその類似体である。
【００７６】
代表的な実施形態３３：Ｘ１１が、チロシン又はその類似体である、実施形態１に記載のペプチド。
【００７７】
代表的な実施形態３４：Ｘ１２が、プロリン又はその類似体である、実施形態１に記載のペプチド。
【００７８】
代表的な実施形態３５：Ｘ１３が、チロシン又はその類似体である、実施形態１に記載のペプチド。
【００７９】
代表的な実施形態３６：Ｘ１４が存在しない、実施形態１に記載のペプチド。
【００８０】
代表的な実施形態３７：Ｘ１５がアミノ基である、実施形態１に記載のペプチド。
【００８１】
代表的な実施形態３８：ペプチドが、式ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのいずれかのペプチドであり、ｎが１である、実施形態１に記載のペプチド。
【００８２】
代表的な実施形態３９：ペプチドが、式ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのいずれかのペプチドであり、ｎが２である、実施形態１に記載のペプチド。
【００８３】
代表的な実施形態４０：ペプチドが、配列
【化１４】
2010535788.tif 000015
【化１５】
2010535788.tif 000016
【化１６】
2010535788.tif 000017
又は
【化１７】
2010535788.tif 000018
を有する、実施形態１に記載のペプチド。
【００８４】
代表的な実施形態４１：Ｘ０が存在しない、実施形態４０に記載のペプチド。
【００８５】
代表的な実施形態４２：Ｘ１、Ｘ４及び／又はＸ１２が、誘導体化されたアミノ酸又はその類似体である、実施形態４０に記載のペプチド。
【００８６】
代表的な実施形態４３：ペプチドが、以下の配列を有する、実施形態４０のペプチド。
【化１８】
2010535788.tif 000019
【化１９】
2010535788.tif 000020
【化２０】
2010535788.tif 000021
又は
【化２１】
2010535788.tif 000022
ここで、式中、横向きのかっこは架橋の存在を示す。式ＸＩでは、Ｚは、Ｃ−末端システイン残基（Ｘ１３）の側鎖がペニシラミン（Ｘ３）と架橋を形成するとき、カルボキシ末端を通して各ペプチドモノマーに結合することが、当業者には明らかであろう。同様に、式ＸＩＩでは、Ｚは、Ｃ−末端システイン残基（Ｘ１３）の側鎖がペニシラミン（Ｘ３）と架橋を形成するとき、カルボキシ末端を通して１つのペプチドモノマーに結合し、Ｚは、Ｘ１のアミノ末端又は側鎖を通して他のペプチドモノマーに結合することが、当業者には明らかであろう。
【００８７】
代表的な実施形態４４：親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、デキストラン；セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシアルキルデンプン、ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポロキサマー、及びポリエチレングリコールコポリマーから選択される、実施形態１に記載のペプチド。
【００８８】
代表的な実施形態４５：親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、実施形態４４に記載のペプチド。
【００８９】
代表的な実施形態４６：ＰＥＧが直鎖ＰＥＧである、実施形態４５に記載のペプチド。
【００９０】
代表的な実施形態４７：ＰＥＧが分岐ＰＥＧである、実施形態４５に記載のペプチド。
【００９１】
代表的な実施形態４８：ＰＥＧが１０〜６０ｋＤａの範囲の平均分子量を有する、実施形態４５に記載のペプチド。
【００９２】
代表的な実施形態４９：ＰＥＧが１０〜４０ｋＤａの範囲の平均分子量を有する、実施形態４５に記載のペプチド。
【００９３】
代表的な実施形態５０：ＰＥＧが約２０ｋＤａの分子量を有する、実施形態４５に記載のペプチド。
【００９４】
代表的な実施形態５１：ＰＥＧが約３０ｋＤａの分子量を有する、実施形態４５に記載のペプチド。
【００９５】
代表的な実施形態５２：ペプチドが、ヒトＦｃＲｎに特異的に結合する、実施形態１に記載のペプチド。
【００９６】
代表的な実施形態５３：ペプチドのヒトＦｃＲｎに対する親和性が、５０ｆＭ〜１ｍＭの範囲である、実施形態５２に記載のペプチド。
【００９７】
代表的な実施形態５４：ペプチドのヒトＦｃＲｎに対する親和性が、５００ｆＭ〜１００μＭの範囲である、実施形態５３に記載のペプチド。
【００９８】
代表的な実施形態５５：ペプチドのヒトＦｃＲｎに対する親和性が、５ｐＭ〜１μＭの範囲である、実施形態５４に記載のペプチド。
【００９９】
代表的な実施形態５６：ペプチドが、ヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合を阻害し、
５０ｆＭ〜１ｍＭの範囲のＩＣ５０を有する、実施形態５２に記載のペプチド。
【０１００】
代表的な実施形態５７：ペプチドが、１ｐＭ〜１００ｎＭの範囲のＩＣ５０を有する、実施形態５６に記載のペプチド。
【０１０１】
代表的な実施形態５８：ペプチドが、１０ｐＭ〜１０ｎＭの範囲のＩＣ５０を有する、実施形態５６に記載のペプチド。
【０１０２】
代表的な実施形態５９：ペプチドが、配列
【化２２】
2010535788.tif 000023
を有する、実施形態１に記載のペプチド。
【０１０３】
代表的な実施形態６０：ペプチドが、以下の配列を有する、実施形態５９に記載のペプチド。
【化２３】
2010535788.tif 000024
ここで、式中、横向きのかっこは架橋の存在を示す。
【０１０４】
代表的な実施形態６１：ペプチドが、配列
【化２４】
2010535788.tif 000025
を有する、実施形態６０に記載のペプチド。
【０１０５】
代表的な実施形態６２：ペプチドが、配列：
【化２５】
2010535788.tif 000026
を有する、実施形態５９に記載のペプチド。
【０１０６】
代表的な実施形態６３：ＢがＱである、実施形態１に記載のペプチド。
【０１０７】
代表的な実施形態６４：Ｂが、−（Ｗ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２であり、存在する場合、Ｗが−（ＣＨ２）ｐ、−（ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ−、−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−、又は
【化２６】
2010535788.tif 000027
であり、ｍが１、２、３、４又は５であり、ｎは１、２又は３であり、ｐは１、２、３、４、５である、実施形態６３に記載のペプチド。
【０１０８】
代表的な実施形態６５：Ｘ３がＸ１３と架橋を形成する、実施形態６４に記載のペプチド。
【０１０９】
代表的な実施形態６６：架橋が、側鎖−側鎖架橋である、実施形態６５に記載のペプチド。
【０１１０】
代表的な実施形態６７：Ｘ６がヒスチジン又はその類似体である、実施形態６４に記載のペプチド。
【０１１１】
代表的な実施形態６８：Ｘ８及びＸ９の少なくとも１つが、
−グリシン；
−Ｄ−アミノ酸；
−α−アミノイソ酪酸；及び
−サルコシン
から選択される、実施形態６４に記載のペプチド。
【０１１２】
代表的な実施形態６９：Ｘ１４が存在しない、実施形態６４に記載のペプチド。
【０１１３】
代表的な実施形態７０：ｎが１である、実施形態６４に記載のペプチド。
【０１１４】
代表的な実施形態７１：ペプチドが、配列
【化２７】
2010535788.tif 000028
を有する、実施形態６４に記載のペプチド。
【０１１５】
代表的な実施形態７２：ペプチドが、以下の配列を有する、実施形態７１に記載のペプチド。
【化２８】
2010535788.tif 000029
ここで、式中、横向きのかっこは架橋の存在を示す。
【０１１６】
代表的な実施形態７３：ペプチドが、配列
【化２９】
2010535788.tif 000030
を有する、実施形態６４に記載のペプチド。
【０１１７】
代表的な実施形態７４：ペプチドが、以下の配列を有する、実施形態７３に記載のペプチド。
【化３０】
2010535788.tif 000031
ここで式中、横向きのかっこは架橋の存在を示す。
【０１１８】
代表的な実施形態７５：ペプチドが、以下の配列を有する、実施形態７４に記載のペプチド。
【化３１】
2010535788.tif 000032
ここで式中、Ｂは、−（Ｗ）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２であり、存在する場合、Ｗは−（ＣＨ２）ｐ、−（ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ、−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−、又は
【化３２】
2010535788.tif 000033
であり、ｍが１、２、３、４又は５であり、ｎは１、２又は３であり、ｐは１、２、３、４、５である）
【０１１９】
Ｂ．誘導体化されたペプチドの合成
誘導体化されたペプチドは、当該技術分野において既知の任意の方法に従って調製できる。ポリエチレングリコールで誘導体化されたペプチド（「ペグ化された」ペプチド）を調製する代表的な方法を、以下に説明する。これらの方法は、本明細書に記載する任意のポリマーとともに用いることができる。したがって、本開示全体を通して用語「ペグ化する」、「ペグ化」又は「ペグ化された」を用いるときはいつでも、ポリエチレングリコールの代わりに、任意の親水性ポリマーで容易に代用できることが、当業者には明らかであろう。
【０１２０】
（１）誘導体化されていないペプチドのペグ化
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するペプチドは、対応するペグ化されていないペプチドとして合成し、次いでペグ化することができる。
【０１２１】
ａ．誘導体化されていないペプチドの合成
本発明のペプチドは、実施例に記載の手順に従って、又は、例えば固相ペプチド合成のような他の既知の合成方法によって合成することができる。例えば、Ａｂｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２８９：  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （１９９７）；Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，  ｅｄｓ．，  Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２０００）；  Ｂｅｎｏｉｔｏｎ，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ＣＲＣ  （２００５）；  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９３）；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌ．  （１９８４）を参照のこと。
【０１２２】
全体的にコードされているアミノ酸から構成される本発明のペプチドは、当該技術分野において周知の技術を用いて、細胞内で組み換えで合成してもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９）及び  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９）を参照のこと。
【０１２３】
あるいは、本発明のペプチドは、合成と組み換え方法を併用して合成してもよい。
【０１２４】
ｂ．ペグ化
ペグ化は、当該技術分野において既知のペグ化反応のいずれかによって実施することができる。ペグ化されたタンパク質産物を調製する方法は、一般に、（ａ）典型的に少なくとも１つの第２反応基を含む、本発明のペプチドが、１つ又はそれ以上のＰＥＧ基に結合する条件下で、ポリペプチドを、第１反応基（例えば、活性エステル、アルデヒド、アミン、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、オチオール、マレイミド及び、例えばヨードアセチルのようなα−ハロアシルのような）を含むＰＥＧと反応させることと、（ｂ）反応産物を得ることとを含む。反応条件は、ペグ化分野で既知であるもののいずれか、又は続いて開発されるものから選択することができる。一般に、本発明の抗ＦｃＲｎペプチドを分解しない反応条件（例えば、温度、溶媒及びｐＨを含む）が選択される。
【０１２５】
ペグ化されるべきペプチドが、ペグ化できる第２反応基を１個超含有する実施形態では、これらの基の一部又は全てを、ペグ化反応中適切なＰＥＧ化学量論を用いることにより、ペグ化することができる。２つのＣ−末端アミンを含むペプチドダイマーの例示的な例では、用いるＰＥＧ化学量論に応じて、両方のアミンをペグ化してもよく、又は１つのアミンのみをペグ化してもよい。
【０１２６】
アシル化  本明細書で使用するとき、アシル化は、制限なく、本発明のペプチドとＰＥＧとの間に以下の種類の結合：アミド、カルバメート、ウレタン等を含むことが想到される。例えば、Ｃｈａｍｏｗ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ５：１３３−１４０  （１９９４）を参照のこと。
【０１２７】
最初の例では、アミン含有ペプチド（アミン基が、例えば側鎖アミン基又はＮ−末端アミン基である場合）は、活性化エステル基（例えば、ＰＥＧスクシンイミジルエステル及びＰＥＧパラ−ニトロフェニルエステル、例えばＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．  （Ｊａｐａｎ）  Ｃａｔ．  Ｎｏｓ．  Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥＧＣ−３０ＴＳ  ａｎｄ  Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥＮＰ−３０Ｔ等）を有するＰＥＧ試薬と選択的に反応させて、アミド結合を生じさせることができる。あるいは、ペプチドは、アミノオキシ、ヒドラジン、又はヒドラジド基を含んでもよい。
【０１２８】
２番目の例では、ペプチドカルボン酸基（例えば、側鎖及びＣ−末端カルボン酸基を含む）は、種々の試薬（例えば、１−エチル−３−（３‘−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジド＋ＥＤＣを含む）で活性化することができる。活性化されたペプチドは、次いで、アミン含有ＰＥＧ試薬（例えば、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．  （Ｊａｐａｎ）  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥＰＡ−３０Ｔを含む）に結合させることができる。
【０１２９】
アルキル化及び還元的アルキル化  ペプチド−ＰＥＧ抱合体は、アミン（又はアミノオキシ、ヒドラジン、又はヒドラジド）とアルデヒドとの反応による、アルキル化により調製できる。例えば、アミノオキシ、ヒドラジン又はヒドラジドの反応を含む、いくつかの実施形態では、アルキル化産物は還元されない。他の実施形態では、ペプチド−ＰＥＧ抱合体は、好適な還元剤の存在下における、アミン（又はアミノオキシ、ヒドラジン、若しくはヒドラジド）とアルデヒドとの反応による還元的アルキル化により、又は、アミン（又はアミノオキシ、ヒドラジン、若しくはヒドラジド）とアルデヒドとを反応させ、次いで好適な還元剤で還元して、例えば実施例１２、１４、１６、２７〜２９及び３１〜３４に記載のような、安定な炭素−窒素単結合を生じさせることにより、調製できる。
【０１３０】
最初の例では、側鎖又は遊離Ｎ−末端アミン基を含むペプチドは、アルデヒド基を含むＰＥＧと結合することができる。ＰＥＧアルデヒドは市販されている（例えば、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．  （Ｊａｐａｎ）  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥ−３００Ａｌを含む）。別の代表的なＰＥＧアルデヒドは、水に対して安定性である、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、又はそのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシ若しくはアリールオキシ誘導体である。例えば、米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと。一般に、アルデヒド基を含有するＰＥＧは、単一の反応性アルデヒド基を有し得る。
【０１３１】
２番目の例では、ヒドロキシアミン、ヒドラジン又はヒドラジド基を含むペプチドは、ＰＥＧ−アルデヒドと容易に反応できる。（アミノオキシ、ヒドラジン又はヒドラジド基を含むペプチドは、実施例３９に記載のもののような、当業者に既知である標準的な方法により調製できる。）いくつかの実施形態では、得られる産物は還元される。他の実施形態では、得られる産物は還元されない。
【０１３２】
３番目の例では、ペプチドアルデヒドは、アミン含有ＰＥＧ試薬（例えば、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．  （Ｊａｐａｎ）  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＭＥＰＡ  ３０Ｔのような）と反応する。ペプチドアルデヒドは、例えば実施例１２に記載のように、又はアルデヒド含有アミノ酸を組み込むことにより、容易に反応する。
【０１３３】
トリアルキル化  遊離チオール官能基（例えば、システインアミノ酸残基由来の）を含むペプチドは、例えばマレイミド（例えば、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．  （Ｊａｐａｎ）  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＭＥ−３００ＭＡのような）又は、ヨードアセチルを含むハロアセチルを含むα−ハロアシルのような求電子剤で官能化されたＰＥＧと容易に反応して、チオエーテル結合を形成することができる。あるいは、求電子官能基（例えば、マレイミドを含み、これは当業者に既知である標準的な方法により調製できる）を含むペプチドは、チオール含有ＰＥＧ基（例えば、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．  （Ｊａｐａｎ）  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＭＥ−３００ＳＨのような）と反応することができる。好適な求電子官能基は、当業者に既知である。
【０１３４】
他の抱合化学  当業者が利用可能である多数のＰＥＧ結合方法が存在し、例えば、欧州特許第０４０１３８４号；Ｍａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．，  ２０：１０２８−１０３５  （１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓ，  Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，  ３（２）：４−１０  （１９９２）；欧州特許第０１５４３１６号；同第０４０１３８４号；国際公開第９２／１６２２１号及び同第９５／３４３２６号に記載されている。ＰＥＧ−ペプチド抱合のための他の可能な方法としては、例えば、アジド−アルキン化学（例えば、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２５：３１９２−３１９３  （２００３）に記載のような）の使用が挙げられる。特定の実施形態では、ＰＥＧチオエステルは、例えば、Ｄａｗｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｅｎｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６９：９２３  （２０００）に記載のように、Ｎ−末端システイン残基を有するペプチドと反応できる。
【０１３５】
（２）ペグ化部位
本明細書に記載の抗ＦｃＲｎペプチドは、下記のように、ペプチドの任意の好適な位置でペグ化することができる。いくつかの実施形態では、抗ＦｃＲｎペプチドは、複数の位置でペグ化することができる。
【０１３６】
Ｎ−末端  Ｎ−末端にアミン基を有するペプチドは、例えば、上記任意の好適な抱合方法により、Ｎ−末端をペグ化することができる。
【０１３７】
Ｎ−末端反応基の付加  いくつかの実施形態では、１つ又はそれ以上の反応基を、本発明の抗ＦｃＲｎペプチドのＮ−末端に付加することができる。いくつかの実施形態では、反応基は、アミノ酸側鎖である。例えば、アセチルでキャッピングされたリジン残基を、Ｎ−末端に付加し、ペグ化できる側鎖アミン基を得ることができる。他の実施形態では、アミン含有側鎖を有するアミノ酸をＮ−末端に付加することにより、複数のペグ化部位を導入することができる。例えば、リジン残基を、ペプチド番号２８５の遊離アミンに付加して、ペグ化のための２つの利用可能なアミン部位（リジンα−及びε−アミノ基）を生成することができる。リジン含有産物と好適に活性化されたＰＥＧ（例えば、下記アルデヒド含有ＰＥＧのような）との反応により、図１８に図示するように、ペプチド１つあたり２つのＰＥＧ部分を有するＰＥＧ−ペプチド抱合体を得ることができる。
【０１３８】
Ｎ−末端リンカー  モノマー性ペプチドは、例えば、実施例１２、１３及び１５に記載のような反応基を含むＮ−末端リンカーでマルチマー化することができる。例えば、ペプチド番号１００、１１９、１２０、１２１、１６０、１９９及び２００は、ペグ化できるカルボン酸基を含むＮ−末端リンカーを有し、ペプチド番号２８５及び２８６は、ペグ化できるアミン基を含むＮ−末端リンカーを有する。
【０１３９】
Ｃ−末端  Ｃ−末端にカルボン酸基を有するペプチドは、例えば、上記任意の好適な抱合方法により、Ｃ−末端をペグ化することができる。
【０１４０】
他の実施形態では、ペプチドは、Ｃ−末端アミン基を得るために、アミン含有樹脂（例えば、１，２−ジアミノエタントリチルＰＳ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ０１−６４−００８１）上で合成できる。
【０１４１】
Ｃ−末端反応基の付加  いくつかの実施形態では、ペグ化のための１つ又はそれ以上の反応基を、本発明の抗ＦｃＲｎペプチドのＣ−末端に付加することができる。いくつかの実施形態では、反応基は、アミノ酸側鎖である。例えば、Ｃ−末端アミド基を有するリジン残基をＣ−末端に付加して、ペグ化できる側鎖アミン基を得ることができる。他の実施形態では、アミン含有側鎖を有するアミノ酸Ｃ−末端に付加することにより、複数のペグ化部位を導入することができる。例えば、グルタミン酸残基を、Ｃ−末端に付加して、ペグ化のための２つの利用可能なカルボン酸部位（グルタミン酸α−及びγ−カルボキシル基）を生成することができる。反応基のＣ−末端への付加は、実施例７に記載のペプチド切断研究に基づいて、抗ＦｃＲｎの活性を実質的に妨げるとは予測されない。
【０１４２】
Ｃ−末端リンカー  モノマー性ペプチドは、例えば、実施例１２に記載のような反応基を含むＣ−末端リンカーでマルチマー化することができる。例えば、ペプチド番号２７８は、ペグ化できるアミン基を含むＣ−末端リンカーを有する。
【０１４３】
側鎖  いくつかの実施形態では、反応基は、例えばアミノ酸側鎖（例えば、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、オルニチン、及びリジンのような側鎖アミンを含むアミノ酸；例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸のような側鎖カルボン酸を含むアミノ酸；並びに、例えば、システイン及びペニシラミンのような側鎖チオール基を含むアミノ酸を含む）に位置し得る。
【０１４４】
特定の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、ペグ化できるアミノ酸側鎖を含む。
【０１４５】
他の実施形態では、好適なペグ化部位は、１つ又はそれ以上の所与の配列のアミノ酸を、所望の反応基を含むアミノ酸に置換することにより得ることができる。例えば、実施例７に記載のペプチドアラニン走査研究は、ペプチド番号５０１のアルギニン−２、スレオニン−５及びプロリン−１３残基が、インビトロでの効力を著しく低下させることなく、アラニンに置換できることを示したため、これらのアミノ酸の１つ、２つ又は全てもまた、インビトロでの効力を著しく低下させることなく、所望の反応基を含むアミノ酸に置換することが可能である。いくつかの実施形態では、ペプチド番号１のアルギニン−２、スレオニン−５及びプロリン−１３残基は、例えば、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、オルニチン、及びリジンのような側鎖アミンを含むアミノ酸；例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸のような側鎖カルボン酸を含むアミノ酸；並びに、例えば、システインのような側鎖チオール基を含むアミノ酸に置換し得る。いくつかの実施形態では、このような置換により、例えば、実施例４に記載のようなＩｇＧ−ペプチド競合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡ（動態排除アッセイ）により測定したとき、元のペプチドに比べて、インビトロでの効力が低下しない、又は元のペプチドのインビトロでの効力の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８若しくは９９％である、ペプチドを得ることができる。
【０１４６】
（３）ペグ化構成単位の組み込み
他の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、ＰＥＧ部分を含むアミノ酸構成単位を組み込むことにより合成できる。
【０１４７】
Ｃ．ペプチド抱合体
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、例えば、ペプチド及び第２分子を含む、共有及び非共有抱合体が挙げられる、抱合体として提供され、第２分子は、例えば、タンパク質、ペプチド、小分子、ポリマー又は核酸であり得る。いくつかの実施形態では、第２分子は、本明細書に記載のペプチドに、例えば、半減期の延長、安定性及び／又は輸送の促進のような所望の特性を付与することができる。いくつかの実施形態では、第２分子は、実施例４に示すように、例えばＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡにより測定される、本発明のペプチドの効果を高めることができる。いくつかの実施形態では、第２分子は、例えば、カニクイザルの血清ＩｇＧ濃度を全体的に低下させることにより、又は抱合されていないペプチドと比べた、特定の治療効果を得るために必要な、抱合化されたペプチドの投与頻度を比較することにより測定される、本発明のペプチドの効果を高めることができる。更なる実施形態では、例えば、第２分子は、特定の細胞、組織及び／又は器官に対するペプチドの標的化をもたらすことができる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、抱合体は、増大されたＩｇＧ−ＦｃＲｎを阻止する能力を有し得る。他の実施形態では、抱合体は、ペプチドが分解するのを防ぎ、それによりペプチドのインビボでの効果を高めることができる。いくつかの実施形態では、抱合体は、より長い循環半減期を有し得る。更なる実施形態では、このような抱合体は、本発明のペプチドよりも効率的に、他の分子を結合及び中和することができる。他の実施形態では、抱合体は精製を容易にすることができる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本発明の抱合化されているペプチドの第２分子は、ＩｇＧのＦｃドメイン又はその断片であり得る。ＩｇＧは、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４のようなヒトＩｇＧであり得る。いくつかの実施形態では、ＩｇＧは、例えば、Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ  Ｆｃγ２変異体、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ  Ｆｃγ４変異体、Ｌｅｕ２３４Ｖａｌ  Ｆｃγ１変異体、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ  Ｆｃγ１変異体、又はＰｒｏ３３１Ｓｅｒ  Ｆｃγ１のような、改変された又は突然変異したＩｇＧである。いくつかの実施形態では、第２分子は、例えば、ヒンジ、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ断片であり得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本発明の抱合化されているペプチドの第２分子は、アルブミン、アルブミン断片、又はアルブミン結合分子（例えば、ペプチド、タンパク質、及び、例えばアルブミンに非共有的に結合する長アルキル鎖が挙げられる分子のような）であり得る。このような抱合体は、インビボでの半減期がより長くなり得、したがって、所望の治療効果を得るために必要なペプチド用量はより少なくてよい。例えば、Ｃｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １９：５６９  （２００２）；米国特許第６，６８５，１７９を参照のこと。
【０１５１】
本発明のペプチドの、タンパク質、ペプチド、小分子、ポリマー又は核酸との抱合体は、当該技術分野において既知の、又は本明細書に記載の、任意の抱合化学に従って調製できる。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチドは、例えば、Ｚｏｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  １３：１５１３  （２００３）に記載のように、アルブミンに非共有的に結合するための疎水性芳香族キャッピング試薬により、キャッピングできる。他の実施形態では、チオール反応基で修飾されたペプチドを、例えばＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２：７５１  （２００３）に記載のように、遊離システイン残基への共有抱合のために用いることができる。更なる実施形態では、アルデヒドを含有する本発明のペプチドは、例えばＫｉｎｓｔｌｅｒ，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．  ５４：４７７  （２００２）に記載のように、還元的アルキル化反応により、第２分子と反応することができる。あるいは、第２分子がＮ−末端システインを有するタンパク質又はペプチドである場合、ペプチドチオエステルは、第２分子と反応して、例えばＤａｗｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｅｎｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６９：９２３  （２０００）に記載のように、共有抱合体を形成することができる。ペプチド−タンパク質及びペプチド−ペプチド抱合体はまた、特定の実施形態では、全てのアミノ酸がコードされているアミノ酸である場合、適切な宿主細胞で発現させることにより調製できる。
【０１５２】
Ｄ．代表的なペプチド抱合体
代表的な実施形態７６：実施形態１〜７５のいずれか１つに記載のペプチド及び第２分子を含む抱合体。
【０１５３】
代表的な実施形態７７：第２分子が、アルブミン、トランスフェリン及び免疫グロブリンのＦｃ部分から選択される、実施形態７６に記載の抱合体。
【０１５４】
代表的な実施形態７８：第２分子が免疫グロブリンのＦｃ部分である、実施形態７７に記載の抱合体。
【０１５５】
代表的な実施形態７９：免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択される、実施形態７８に記載の抱合体。
【０１５６】
ＩＩＩ．他のペプチド
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは誘導体化されない。このようなペプチドの代表的な実施形態を以下に記載する。
【０１５７】
代表的な実施形態Ａ：以下の配列を有するペプチド。
【化３３】
2010535788.tif 000034
【化３４】
2010535788.tif 000035
【化３５】
2010535788.tif 000036
又は
【化３６】
2010535788.tif 000037
ここで式中、
−Ａは、存在する場合、水素、アシル又はアミノ保護基であり；
−Ｂは、存在する場合、Ｑを含む、又はアミノ基、ヒドロキシル基、若しくはカルボキシ保護基であり；
−Ｑは、存在する場合、アミン基（中性であっても、又は正電荷を有してもよい）であって、アルキレン基によりペプチドに結合し、ここでアルキレン基は、エチレン、ｎ−プロピレン、ｎ−ブチレン、ｎ−ペンチレン及びｎ−ヘキシレンを含むが、これらに限定されないか；又は、アルキレン基とアルキレンオキシドサブユニットとの組み合わせ（アルキレンオキシドサブユニットは−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｐ−（式中、ｐは１、２、３、４又は５である）を含むが、これらに限定されない）によりペプチドに結合するアミン基を含み；Ｑの非限定的な例としては、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、
−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２及び
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２
が挙げられ；
−Ｘ０は、存在する場合、アミノ酸若しくはその類似体であるか、又は、２〜１５個のアミノ酸の所望により誘導体化されたペプチド若しくはその類似体であり；
−Ｘ１は、存在する場合、アミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ２は、存在する場合、アミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ３は、Ｘ１０、Ｘ１２又はＸ１３と架橋を形成することができる、アミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ４は、アミノ酸若しくはその類似体であるか、又は、２〜４個のアミノ酸の所望により誘導体化されたペプチド若しくはその類似体であり；
−Ｘ６は、塩基性アミノ酸若しくはその類似体、芳香族アミノ酸若しくはその類似体、又は塩基性芳香族アミノ酸若しくはその類似体であり；
−Ｘ７は、フェニルアラニン又はその類似体であり；
−Ｘ８及びＸ９は、それぞれ独立して、グリシン若しくはその類似体、サルコシン若しくはその類似体、アスパラギン酸若しくはその類似体、Ｄ−アミノ酸若しくはその類似体、及びα−アミノイソ酪酸若しくはその類似体から選択されるか、又は、
−Ｘ８は、Ｘ９と共にジペプチド類似体を形成し；
−Ｘ１０は、アミノ酸若しくはその類似体であるか、又は
−Ｘ１０は、Ｘ９と共にジペプチド類似体を形成し；
−Ｘ１１は、チロシン又はその類似体であり；
−Ｘ１２は、アミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ１３は、存在する場合、アミノ酸又はその類似体であり；
−Ｘ１４は、存在する場合、アミノ酸又はその類似体であるか、又は、２〜１５個のアミノ酸のペプチド若しくはその類似体であり；
−Ｚは、
−Ａ；
−Ｂ；
−Ｘ０が存在する場合、Ｘ０のアミノ末端若しくは側鎖；Ｘ０が存在しない場合、Ｘ１のアミノ末端若しくは側鎖；Ｘ０及びＸ１が両方存在しない場合、Ｘ２のアミノ末端若しくは側鎖；又は、Ｘ０、Ｘ１及びＸ２が存在しない場合、Ｘ３のアミノ末端若しくは側鎖；
−Ｘ１４が存在する場合、Ｘ１４のカルボキシ末端若しくは側鎖；Ｘ１４が存在しない場合、Ｘ１３のカルボキシ末端若しくは側鎖；又はＸ１３及びＸ１４が両方存在しない場合、Ｘ１２のカルボキシ末端若しくは側鎖；
を通して、各ペプチドモノマーに結合するリンカーであり；
−ｍは、１、２及び３から選択される整数であり；
−ｎは、１、２及び３から選択される整数である。
式中：
−各Ａ、Ｂ、Ｘ０、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３及びＸ１４は、独立して選択され；
−ペプチドの各モノマーの長さは、１０〜５０個のアミノ酸で変動する。
【０１５８】
ＺがＸ０の側鎖を通してペプチドに結合する場合、Ａは必ず存在することが、当業者には明らかであろう。同様に、ＺがＸ１４の側鎖に結合する場合、Ｂは必ず存在する。
【０１５９】
代表的な実施形態Ｂ：ＢがＱである、実施形態Ａに記載のペプチド。
【０１６０】
代表的な実施形態Ｃ：Ｂが、−（Ｗ）ｍ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ２であり、Ｗが、存在する場合、−（ＣＨ２）ｐ、−（ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ、−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は
【化３７】
2010535788.tif 000038
であり、ｍが１、２、３、４又は５であり、ｐが１、２、３、４、５である、実施形態Ｂに記載のペプチド。
【０１６１】
代表的な実施形態Ｄ：Ｘ３がＸ１３と架橋を形成する、実施形態Ｃに記載のペプチド。
【０１６２】
代表的な実施形態Ｅ：架橋が側鎖−側鎖架橋である、実施形態Ｄに記載のペプチド。
【０１６３】
代表的な実施形態Ｆ：Ｘ６が、ヒスチジン又はその類似体である、実施形態Ｂに記載のペプチド。
【０１６４】
代表的な実施形態Ｇ：Ｘ８及びＸ９の少なくとも１つが、
−グリシン；
−Ｄ−アミノ酸；
−α−アミノイソ酪酸；及び
−サルコシン
から選択される、実施形態Ｂに記載のペプチド。
【０１６５】
代表的な実施形態Ｈ：Ｘ１４が存在しない、実施形態Ｂに記載のペプチド。
【０１６６】
代表的な実施形態Ｉ：ｎが１である、実施形態Ｂに記載のペプチド。
【０１６７】
代表的な実施形態Ｊ：ペプチドが、配列
【化３８】
2010535788.tif 000039
を有する、実施形態Ｂに記載のペプチド。
【０１６８】
代表的な実施形態Ｋ：ペプチドが、以下の配列を有する、実施形態Ｂに記載のペプチド。
【化３９】
2010535788.tif 000040
ここで式中、横向きのかっこは架橋の存在を示す。
【０１６９】
代表的な実施形態Ｌ：ペプチドが、配列
【化４０】
2010535788.tif 000041
を有する、実施形態Ｂに記載のペプチド。
【０１７０】
代表的な実施形態Ｍ：ペプチドが、以下の配列を有する、実施形態Ｌに記載のペプチド。
【化４１】
2010535788.tif 000042
ここで式中、横向きのかっこは架橋の存在を示す。
【０１７１】
代表的な実施形態Ｎ：ペプチドが、以下の配列を有する、実施形態Ｍに記載のペプチド。
【化４２】
2010535788.tif 000043
ここで式中、Ｂは、−Ｗ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２であり、Ｗは、存在する場合、−（ＣＨ２）ｐ、−（ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ、−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は
【化４３】
2010535788.tif 000044
であり、ｐは１、２、３、４、５である。
【０１７２】
代表的な実施形態Ｏ：Ｗが存在しない、実施形態Ｍに記載のペプチド。
【０１７３】
代表的な実施形態Ｐ：Ｗが、−（ＣＨ２−ＣＨ２）−である、実施形態Ｍに記載のペプチド。
【０１７４】
代表的な実施形態Ｑ：Ｗが、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｐ−であり、ｐが１である、実施形態Ｍに記載のペプチド。
【０１７５】
代表的な実施形態Ｒ：Ｗが、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｐ−であり、ｐが２である、実施形態Ｍに記載のペプチド。
【０１７６】
ＩＶ．ＦｃＲｎに結合し、ＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用を阻止するペプチドのスクリーニング及び発見方法
ＦｃＲｎに結合するペプチドは、ファージディスプレイライブラリを用いて同定できる。ファージディスプレイライブラリは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｅｎｋｏ，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ８７：３９１  （１９９７）に記載のように容易に作製できる。あるいは、ファージディスプレイライブラリは、例えばＤｙａｘ  Ｃｏｒｐ．  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）のような、商業的供給業者から入手することができる。スクリーニング条件に応じて、ファージは、種々の異なる特性により同定できる。ＦｃＲｎに結合する（それによりＩｇＧのＦｃＲｎへの結合と競合する）ペプチドを同定するために、ＦｃＲｎへの結合について、及びＩｇＧとの競合により、ファージライブラリをスクリーニングすることができる。所望により、ファージライブラリを１種又はそれ以上の代わりの受容体とともにインキュベートすることにより、ライブラリから、代わりの受容体に結合するペプチドを取り除くことができる。それにより、代わりの受容体に結合したファージは、所望のファージプールが枯渇する。ＦｃＲｎに結合できるファージクローンのＤＮＡの配列を決定することにより、ＦｃＲｎに結合し、ＩｇＧ−ＦｃＲｎ結合を阻害することができるペプチドを同定できる。
【０１７７】
ＦｃＲｎに結合するペプチドを同定する他の方法の例としては、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：１２２９７  （１９９７））、セルベースディスプレイ（Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５：５５３  （１９９７））、及び合成ペプチドライブラリ（Ｌａｍ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２  （１９９１）；  Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４  （１９９１））が挙げられる。
【０１７８】
Ｖ．ＦｃＲｎに結合し、ＩｇＧ：ＦｃＲｎ相互作用を阻止するペプチドの評価方法
多数の方法を用いて、ペプチド又はペプチドミメティックが、ＦｃＲｎに結合し、ＦｃＲｎ：ＩｇＧ相互作用を阻止する能力を評価できる。例えば、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）は、結合事象を判定するための、当業者に周知の方法である（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）。この方法を用いて、結合パートナーの一方（ＦｃＲｎ又はＩｇＧ）をＳＰＲセンサチップ上に固定し、もう一方の他の結合パートナーは、チップを通過させ、このチップが得られる信号をモニタする。同じ実験で、ＩｇＧとＦｃＲｎとの間の相互作用の競合者として判定されるペプチドも、チップを通過させる。任意の信号の低下は、ペプチドの、ＦｃＲｎとＩｇＧとの間の相互作用を阻止する能力の指標として解釈できる。
【０１７９】
他の可能性のある、ＩｇＧ：ＦｃＲｎ相互作用のペプチド阻害剤を評価するための方法も、当該技術分野において周知である。このような方法の１つは、９６ウェルプレート型におけるＩｇＧ競合アッセイである。この例のアッセイでは、９６ウェルプレート上の可溶性ヒトＦｃＲｎをＩｇＧ及び試験ペプチドに曝露する。抗ＩｇＧ抗体及び標準的なＥＬＩＳＡ可視化試薬により検出したとき、残りの結合したＩｇＧは、ペプチドの、ＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用を阻止する能力の指標を与える。
【０１８０】
ペプチドの、ＩｇＧ−ＦｃＲｎ結合を阻止する能力はまた、細胞表面上でヒトＦｃＲｎを発現させ得る細胞株を発生させるために、ヒトＦｃＲｎをコードするＤＮＡをトランスフェクトした細胞上で行ない得る。ＩｇＧ−ＦｃＲｎ結合のペプチド阻害剤が、蛍光標識されたＩｇＧ分子と競合する、結合競合アッセイを適用することができる。細胞に結合している残りのＩｇＧ濃度は、標準的な蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）を用いて測定できる。
【０１８１】
ＶＩ．免疫調節性ペプチドの製薬学的使用
本発明のペプチドは、ＦｃＲｎに結合し、ＩｇＧの定常領域のＦｃ部分がＦｃＲｎに結合するのを阻害し、本発明のペプチドの非存在下におけるＩｇＧの異化と比較して、ＩｇＧの異化を増加させる。代表的な実施形態では、ＩｇＧの定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブクラスに由来する。
【０１８２】
Ａ．製薬組成物の調製
本発明のペプチドは、ＩｇＧの異化が増加することが望ましい場合がある、任意の疾患又は病状の治療のための薬物（製薬組成物）の製造で用いることができる。したがって、本発明は、少なくとも１つの本発明のペプチドを含む製薬組成物を提供する。これらの組成物は、典型的には、製薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含む。好適な製薬担体は、Ｅ．Ｗ．  ＭａｒｔｉｎのＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。賦形剤の例としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を挙げることができる。組成物はまた、ｐＨ緩衝剤及び湿潤又は乳化剤を含有することができる。
【０１８３】
本発明の製薬組成物は、例えば、静脈内に、皮下に、筋肉内に、経口で、舌下に、口内に、舌下に、鼻に、直腸内に、膣内に、が挙げられる任意の合理的な投与経路により、又は吸入により、それを必要とする患者に投与するために処方することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ペプチドの持続放出を可能にするバイオポリマー固体支持体内に植え込んでもよく、又はそれに結合させてもよい。
【０１８４】
経口投与の場合、製薬組成物は、従来の手段により調製される錠剤又はカプセルの形態をとってよい。組成物はまた、例えば、シロップ剤又は懸濁液のような、液体として調製することもできる。液体は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、又は水添食用脂）、乳化剤（レシチン又はアカシア）、非水性媒体（例えば、扁桃油、油状エステル、エチルアルコール又は分留植物油）及び防腐剤（例えば、メチル若しくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸又はソルビン酸）を含むことができる。製剤はまた、着香剤、着色剤及び甘味剤を含んでもよい。あるいは、組成物は、水又は別の好適な媒体との構成のために、乾燥製品として提示してもよい。
【０１８５】
口内及び舌下投与の場合、組成物は、従来のプロトコルに従って、錠剤又は舐剤の形態をとり得る。
【０１８６】
吸入による投与の場合、本発明に従って使用するための化合物は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素又は他の好適な気体である、好適な噴射剤を用いて、加圧包装又は噴霧器（例えば、ＰＢＳ）から噴霧されるエアゾールスプレーの形態で、便利に送達される。加圧エアゾールの場合、用量単位は、計量された量を運ぶための弁を設けることにより決定できる。吸入器若しくは吹き入れ器で用いる、例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジを、化合物及び、ラクトース又はデンプンのような好適な粉末基剤の粉末ミックスを含有するように、処方することができる。
【０１８７】
製薬組成物は、大量瞬時投与による非経口投与（例えば、静脈内又は筋肉内投与を含む）のために処方することができる。注入のための処方は、防腐剤の添加された、例えば、アンプル又は複数回投与用容器内に、単位用量で提示することができる。組成物は、油性又は水性媒体中の懸濁液、溶液又はエマルションのような形態をとることができ、懸濁、安定化及び／又は分散剤のような処方剤を含有することができる。あるいは、活性成分は、例えば発熱物質を含まない水のような、好適な媒体との構成のために、粉末形態であり得る。
【０１８８】
製薬組成物はまた、例えば、カカオバター又は他のグリセリドのような従来の坐薬基剤を含有する、坐薬又は停留浣腸として直腸内投与するために処方することもできる。
【０１８９】
Ｂ．代表的な製薬組成物
代表的な実施形態８０：治療的に有効な量の、実施形態１〜７５又はＡ〜Ｒのいずれか１つに記載のペプチド、又は治療的に有効な量の、実施形態７６〜７９のいずれか１つに記載の抱合体を含む、製薬組成物。
【０１９０】
代表的な実施形態８１：治療的に有効な量のペプチドが、ペプチドで治療する前のヒトＩｇＧの血清濃度に比べて、ヒトＩｇＧの血清濃度を低下させることができる、実施形態８０に記載の組成物。
【０１９１】
代表的な実施形態８２：ヒトＩｇＧの血清濃度の低下が少なくとも５％である、実施形態８１に記載の組成物。
【０１９２】
代表的な実施形態８３：ヒトＩｇＧの血清濃度の低下が少なくとも１５％である、実施形態８２に記載の組成物。
【０１９３】
代表的な実施形態８４：ヒトＩｇＧの血清濃度の低下が少なくとも２５％である、実施形態８３に記載の組成物。
【０１９４】
Ｃ．治療方法
本発明の製薬組成物は、ＩｇＧの異化が増加することが望ましい任意の疾患又は病状を治療するのに有用である。したがって、本発明は、治療的に有効な量の本発明のペプチドを、それを必要とする患者に投与することを含む、不適切に発現したＩｇＧ抗体、又はＩｇＧの望ましくない量若しくは濃度を特徴とする疾患を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のペプチドでＩｇＧの血清濃度を調節することにより、疾患を治療する方法を提供する。用語「治療する」、「治療」及び「治療すること」は、（１）疾患若しくは病状の重篤度又は期間の低減、（２）必ずしも治癒するわけではないが、疾患若しくは病状に関連する１つ若しくはそれ以上の症状の寛解、又は（３）疾患若しくは病状の予防を指す。
【０１９５】
特定の実施形態では、本発明の方法を使用して、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫リンパ増殖症候群、自己免疫血小板減少性紫斑病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー−疱疹状皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、瘢痕性類天疱瘡、クレスト症候群、寒冷凝集素症、クローン病、ドゴー病、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状、本態性クリオグロブリン血症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｉｘｅｄ  ｃｒｙｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）、線維筋痛−線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性関節炎、扁平苔癬、狼瘡、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、移植片拒絶反応、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑並びにウェゲナー肉芽腫症が挙げられるが、これらに限定されない自己免疫疾患を治療、予防又は制御することができる。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、水疱性類天疱瘡、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、重症筋無力症（ＭＧ）、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡を含む）及び移植片拒絶反応から選択される。
【０１９７】
特定の実施形態では、本発明のペプチドを含む組成物は、免疫抑制のためにステロイドと併用してもよい。
【０１９８】
本発明のペプチドを用いて、限定されないが、ぜんそく、潰瘍性大腸炎及び炎症性腸症候群、アレルギー性鼻炎／副鼻腔炎皮膚アレルギー（例えば、発疹（すなわち、じんましん）、血管性浮腫、アトピー性皮膚炎を含む）、食物アレルギー、薬剤アレルギー、昆虫アレルギーを含むアレルギー、、肥満細胞症、変形性関節症を含む関節炎、関節リウマチ、並びに脊椎関節症を含む炎症性疾患を治療することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、炎症に基づく病因論を有する循環器疾患（例えば、動脈硬化）、移植片拒絶反応、及び／又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療する方法を提供する。
【０１９９】
本発明の他の実施形態は、本発明のペプチドを投与することにより、癌を治療する方法を含む。本発明の方法を使用して、多発性骨髄腫を含む形質細胞癌のような、ＩｇＧの過剰産生を伴う癌を治療する又は制御を補助することができる。
【０２００】
しばしば、治療用タンパク質の投与を必要とする疾患又は病状では、投与を受ける対象は治療用タンパク質に対する抗体を発現し、次いでこれは、治療用タンパク質を意図する治療目的に利用可能にすることを妨げる。したがって、本発明のペプチドは、治療用タンパク質と併用して、ＩｇＧ濃度を低下させることにより治療用タンパク質の利点を強化することができ、ここでＩｇＧ抗体は治療用タンパク質の生物学的利用能の低下に関与する。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、細胞を、治療的に有効な量の本明細書に開示する任意のペプチドと接触させることを含む、凝固因子に対する免疫反応に起因する病状、疾患若しくは障害を制御、治療又は予防する方法であって、前記凝固因子がフィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子又はフォン・ヴィレブランド因子から選択される方法を提供する。この方法を用いて、例えば血友病Ａ又は血友病Ｂに罹患している患者における、凝固因子に対する免疫反応を制御する、又は治療する、又は予防することができる。いくつかの実施形態では本発明のペプチドは、第ＶＩＩＩ因子阻害剤を阻止する。他の実施形態では、この方法を用いて、例えば赤芽球癆（ＰＲＣＡ）に罹患している患者における、例えば治療用エリトロポエチンに対する免疫反応を制御する、又は治療する、又は予防することができる。本発明は更に、リソソーム加水分解酵素に対する免疫反応を制御する、又は治療する、又は予防することができ、例えば、α−ガラクトシダーゼＡ、酸性セラミダーゼ、酸性α−Ｌ−フコシダーゼ、酸性β−グルコシダーゼ（グルコセレブロシダーゼ）、酸性βガラクトシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸性α−マンノシダーゼ、酸性β−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルフェートスルファターゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパランＮ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニド、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルフェートスルファターゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、シアリダーゼ、β−グルコロニダーゼ及びβ−ヘキソサミニダーゼＡのようなリソソーム加水分解酵素が存在しないと、リソソーム蓄積障害が生じる。
【０２０１】
他の実施形態では、本発明の方法を使用して、遺伝子治療用ベクターに対する免疫反応を治療、予防又は制御することができる。疾患又は病状を治療するための遺伝子治療をうまく実行する妨げとなるものとしてはまた、導入遺伝子によりコードされている治療用タンパク質に加えて、恐らく導入遺伝子を送達するのに用いられるベクターに特異的な抗体の発生が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載するペプチドは、遺伝子治療と併用して投与し、ＩｇＧの濃度を低下させることにより、コードされている治療用タンパク質の利点を強化することができる。これらの方法は、ＩｇＧ抗体が、遺伝子治療用ベクター又はコードされている治療用タンパク質の生物学的利用能の低下に関与する状況で特に有用である。遺伝子治療用ベクターは、例えば、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスのようなウイルスベクターであり得る。遺伝子治療を用いて治療できる疾患としては、嚢胞性線維症、血友病、ＰＲＣＡ、筋ジストロフィー又は、例えばゴーシェ病及びファブリー病のようなリソソーム蓄積症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０２】
本発明の方法では、本明細書に記載の組成物は、例えば、静脈内に、皮下に、筋肉内に、経口で、舌下に、口内に、舌下に、鼻に、直腸内に、膣内に、のような任意の好適な経路を介して、又は吸入により投与することができる。一般に、本明細書に記載する組成物の適切な用量は、治療される疾患又は病状、疾患又は病状の重篤度、対象の性別、年齢及び体重を含む対象、所望の成果、並びに用いられる具体的な投与経路に応じて変動する。例えば、用量は、０．１〜１００，０００μｇ／ｋｇ体重の範囲であってよい。いくつかの実施形態では、用量範囲は、１〜１０，０００μｇ／ｋｇであってよい。他の実施形態では、用量範囲は、１０〜１，０００μｇ／ｋｇであってよい。更に別の実施形態では、用量範囲は１００〜５００μｇ／ｋｇである。
【０２０３】
本発明の組成物は、連続的に又は特定の時間間隔で投与することができる。インビトロアッセイを使用して、最適な用量範囲及び／又は投与スケジュールを決定することができる。他の有効な用量は、用量反応曲線を定める日常的な治験を通して、当業者が容易に決定することができ、例えば、ＩｇＧ濃度を増加又は減少させるのに必要な本発明のペプチドの量は、インビボ実験から算出できる。当業者は、用量レベルが、特定の化合物、症状の重篤度、及び対象の副作用に対する感受性の関数として変化し得ることを容易に理解し、所与の化合物の好ましい用量は、種々の手段により当業者が容易に決定可能である。例えば、当業者は、用いられる具体的な薬剤に応じて、所望の効果を有することが必要な量に関する容易に利用可能な情報を用いて、適切な用量を算出できる。
【０２０４】
Ｄ．治療実施形態の代表的な方法
代表的な実施形態８５：実施形態８０〜８４のいずれか１つに記載の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、不適切に発現したＩｇＧ抗体又は過剰なＩｇＧを特徴とする疾患の治療方法。
【０２０５】
代表的な実施形態８６：疾患が、エリトロポエチン、リソソーム加水分解酵素（これが存在しないと、リソソーム蓄積症が生じる）及び凝固因子から選択される、治療用タンパク質に対する免疫反応である、実施形態８５に記載の方法。
【０２０６】
代表的な実施形態８７：リソソーム加水分解酵素が、α−ガラクトシダーゼＡ、酸性セラミダーゼ、酸性α−Ｌ−フコシダーゼ、酸性β−グルコシダーゼ（グルコセレブロシダーゼ）、酸性βガラクトシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸性α−マンノシダーゼ、酸性β−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルフェートスルファターゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパランＮ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニド、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルフェートスルファターゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、シアリダーゼ、β−グルコロニダーゼ及びβ−ヘキソサミニダーゼＡから成る群から選択される、実施形態８６に記載の方法。
【０２０７】
代表的な実施形態８８：凝固因子が、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子及びフォン・ヴィレブランド因子から選択される、実施形態８６に記載の方法。
【０２０８】
代表的な実施形態８９：ＩｇＧが遺伝子治療用ベクターに特異的である、実施形態８５に記載の方法。
【０２０９】
代表的な実施形態９０：疾患が、炎症疾患、自己免疫疾患及び癌から選択される、実施形態８９に記載の方法。
【０２１０】
代表的な実施形態９１：自己免疫疾患が、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫リンパ増殖症候群、自己免疫血小板減少性紫斑病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー−疱疹状皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、瘢痕性類天疱瘡、クレスト症候群、寒冷凝集素症、クローン病、ドゴー病、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状、本態性クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性関節炎、扁平苔癬、狼瘡、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、移植片拒絶反応、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑並びにウェゲナー肉芽腫症から選択される、実施形態９０に記載の方法。
【０２１１】
代表的な実施形態９２：自己免疫疾患が、水疱性類天疱瘡、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、天疱瘡及び移植片拒絶反応から選択される、実施形態９１に記載の方法。
【０２１２】
代表的な実施形態９３：天疱瘡が尋常性天疱瘡である、実施形態９２に記載の方法。
【０２１３】
代表的な実施形態９４：疾患が炎症疾患である、実施形態９１に記載の方法。
【０２１４】
代表的な実施形態９５：炎症疾患が、ぜんそく、潰瘍性大腸炎及び炎症性腸症候群、アレルギー性鼻炎／副鼻腔炎、皮膚アレルギー、食物アレルギー、薬剤アレルギー、昆虫アレルギーを含むアレルギー、肥満細胞症、変形性関節症を含む関節炎、関節リウマチ及び、脊椎関節症から選択される、実施形態９４に記載の方法。
【０２１５】
代表的な実施形態９６：皮膚アレルギーが、発疹、血管性浮腫、アトピー性皮膚炎から選択される、実施形態９５に記載の方法。
【０２１６】
ＶＩＩ．ＦｃＲｎのインビトロイメージング及び検出
本発明のペプチドを、ＦｃＲｎを検出するためのアッセイで用いることができる。いくつかの実施形態では、アッセイは、本発明のペプチドとＦｃＲｎとの結合を検出する結合アッセイである。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎを固定化して、本明細書に記載する１つ又はそれ以上のペプチドを、固定化したＦｃＲｎ上を通過させることができる。代替実施形態では、１つ又はそれ以上のペプチドを固定化して、ＦｃＲｎを、固定化したペプチド上を通過させることができる。ＦｃＲｎ又は本発明のペプチドのいずれかを検出可能に標識化させることができる。好適な標識としては、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３７Ｃｓ、１８６Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２４１Ａｍ、２４４Ｃｍ及び９９ｍＴｃ−ＭＤＰが挙げられるが、これらに限定されない放射性同位体；検出可能な産物（例えば、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等）を有する酵素；蛍光団（例えば、フルオレセイン（例えば、フルオレセインイソチオシアネートのように結合できる）、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタアルデヒド、及びフルオレサミン）；蛍光放射金属、例えば１５２Ｅ、又はＥＤＴＡのような金属キレート化基を通して本発明のペプチドに結合する、ランタン系列の他のもの；化学発光化合物、例えば、ルミノール、イソルミノール、セロマチックアクリジニウムエステル、アクリジニウム塩、イミダゾール、及びオキザラートエステル又は；並びに生物発光化合物、例えば、ルシフェリン、若しくはエクオリン（緑色蛍光タンパク質）、特異的結合分子、例えば金属粒子、ミクロスフィア、ナノスフィア、発光量子ドットナノ結晶等が挙げられる。
【０２１７】
あるいは、特異的結合対をアッセイで用いて、ＦｃＲｎを検出してもよく、このアッセイには、例えば、第２段階抗体又は検出可能に標識され、信号を増幅することができる試薬が関与する。例えば、本発明のペプチドは、ビオチン、及び第２段階試薬として添加される西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジンに抱合され得る。ジゴキシン及び抗ジゴキシンは、別の好適な結合対を提供する。他の実施形態では、第２段階抗体は、ペルオキシダーゼの存在下で色が変化する基質と組み合わせて、ペルオキシダーゼのような酵素に抱合され得る。本発明のペプチドとＦｃＲｎとの間の結合の存在又は非存在は、解離細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡検査、Ｘ線検査、蛍光定量、発色検出、ホスフォイメージング、フィルム上での化学発光の検出、及びシンチレーション計数が挙げられる、種々の方法により決定できる。このような試薬及びその使用法は、当該技術分野において周知である。
【０２１８】
インビボ診断適用では、少なくとも部分的に、ＦｃＲｎの発現を特徴とする場合がある、特定の組織又は更には特定の細胞性障害を、十分な量の本発明の標識化ペプチドの投与により画像化できる。
【０２１９】
インビボでの組織イメージングに好適な広範な金属イオンが試験され、臨床的に利用されている。放射性同位体によるイメージングでは、以下の特徴が一般に望ましい。（ａ）患者への放射線量が少ない。（ｂ）光子収量が高く、そのため核医学手順を短期間で実施することが可能になる。（ｃ）十分な量を生成する能力。（ｄ）コストが許容可能である。（ｅ）投与するための製剤が単純である。及び（ｆ）後で患者を隔離する必要がない。これらの特徴は、一般に以下のように言い換えられる。（ａ）最も重要な器官への放射線被曝が５ラド未満である。（ｂ）注入後数時間以内に単一像を得ることができる。（ｃ）放射性同位体が粒子を放射して崩壊しない。（ｄ）同位体を容易に検出できる。及び（ｅ）半減期が４日未満である（Ｌａｍｂ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ，  “Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，”  Ｉｎ  Ｒａｄｉｏｔｒａｃｅｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｖｏｌ．  １，  Ｒａｙｕｄｕ  （Ｅｄ．），  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ｐｐ．  １７−６２）。いくつかの実施形態では、金属はテクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）である。
【０２２０】
したがって、本発明は、対象に、放射性である金属を含有する少なくとも１つの本発明のペプチドを含む組成物を有効量投与し、放射性金属の崩壊から得られるシンチグラフィー像を記録することを含む、対象の内部領域の画像を得る方法を提供する。同様に、本発明は、対象に、常磁性である金属を含有する少なくとも１つの本発明のペプチドを含む組成物を有効量投与し、対象のＭＲ画像を記録することを含む、対象の内部領域の磁気共鳴（ＭＲ）画像を向上させる方法を提供する。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供する他の方法としては、対象に、金属を含有する少なくとも１つの本発明のペプチドを含む組成物を有効量投与し、対象の内部領域の超音波画像を記録することを含む、対象の内部領域の超音波画像を向上させる方法を提供する。一般に、金属は、任意の非毒性重金属イオンであり得る。特定の実施形態では、対象に、金属を含有する少なくとも１つの本発明のペプチドを含む組成物を有効量投与し、対象の内部領域のＸ線画像を記録することを含む、対象の内部領域のＸ線画像を向上させる方法もまた提供される。一般に、放射性、非毒性重金属イオンを用いてよい。
【０２２２】
本発明のペプチドは、例えば米国特許第５，３２６，８５６号に記載されているもののようなキレート剤に結合することができる。ペプチド−キレート剤複合体は、次いで、放射性標識されて、ＩｇＧ濃度の調節に関与する疾患若しくは病状の診断又は治療用の造影剤を提供する。本発明のペプチドはまた、イメージング及び放射線治療で用いるための、放射性標識されたペプチドを作製するための、米国特許第５，４４９，７６１号で開示されている方法で用いることもできる。
【０２２３】
Ａ．代表的なＦｃＲｎの検出方法
代表的な実施形態９７：実施形態１〜７５のいずれか１つに記載のペプチド、又は実施形態７６〜７９のいずれか１つに記載の抱合体を、放射性同位体、検出可能な産物を有する酵素、蛍光団、化学発光化合物、磁性粒子、ミクロスフィア、ナノスフィア、ビオチン、ストレプトアビジン及びジゴキシンから選択される検出可能な標識で標識することを含む、ＦｃＲｎの検出方法。
【０２２４】
代表的な実施形態９８：検出可能な標識で標識されたペプチド又は抱合体が、診断用キットに含まれる、実施形態９７に記載の方法。
【０２２５】
ＶＩＩＩ．ＦｃＲｎの精製
本発明のペプチドを用いてＦｃＲｎを精製することもできる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、適切なクロマトグラフィーマトリックスに共有結合して、有効なＦｃＲｎ分離媒質を形成する。ＦｃＲｎを含有する溶液を、次いで、クロマトグラフィーマトリックス上を通過させると、ＦｃＲｎは固定化された結合パートナーと非共有結合する。ＦｃＲｎを含有する溶液は、体液、組織又は細胞試料、細胞培養上清のような生体試料由来であり得る。ＦｃＲｎは、固定化されたペプチド：ＦｃＲｎ複合体を好適な溶液で洗浄して、不純物を取り除き、次いで好適な溶出溶液でクロマトグラフィーマトリックスからＦｃＲｎを放出することにより精製される。
【０２２６】
本発明のペプチドは、当業者に周知である多数の化学的アプローチを用いて、好適なクロマトグラフィーマトリックスに結合することができる。例えば、本発明のペプチドは、チオール、アミン、カルボン酸、アルコール、アルデヒド、アルキルハロゲン化物、Ｎ−アルキルマレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、エポキシド、アミノオキシ、及びヒドラジドのような、好適な反応基を含むマトリックスに結合できる。
【０２２７】
他の実施形態では、本発明のペプチドは、適切なクロマトグラフィーマトリックスに非共有的に結合する化学部分又はペプチド配列を含むよう改変することができる。例えば、ペプチドは、ビオチン部分で改変して、アビジンタンパク質を含有するクロマトグラフィーマトリックスに非共有的に結合させることができる。あるいは、改変されたペプチドは、ＦｃＲｎ溶液とともにインキュベートして、得られる混合物を適切なクロマトグラフィーマトリックス上に通過させて、ＦｃＲｎ：ペプチド複合体を分離することができる。
【０２２８】
親和性精製用のペプチドの類似用途の例は、Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，  “Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｔｅｐ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｃＧＭＰ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ，”  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｖｏｌ．  ８７，  Ｎｏ．  ３，  Ｗｉｌｅｙ  ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ，  ２００４，  ｐｐ．  ４００−４１２及び米国特許第６，１９７，５２６号中に見出すことができる。
【０２２９】
Ａ．代表的なＦｃＲｎの精製方法
代表的な実施形態９９：
（ａ）実施形態１〜７５若しくはＡ〜Ｒのいずれか１つに記載のペプチド、又は実施形態７６〜７９のいずれか１つに記載の抱合体を、固体支持体に固定化することと、
（ｂ）ＦｃＲｎを含有する溶液を、固体支持体上の固定化されたペプチド又は抱合体と接触させることと、
（ｃ）前記固体支持体から溶液を分離することによりＦｃＲｎを精製することと、
を含む、ＦｃＲｎの精製方法。
【実施例】
【０２３０】
上述した発明の態様及び実施形態を実施例によっても説明し詳述するが、これは単に本発明を例示するためのものであって、いかなる形であれ本発明を限定するものではない。実施例は、下記の実験が、行った実験の全てであること、又は行った実験がこれだけであることを表すものではない。使用する数値（例えば、量、温度等）に関して精度を確実にするために努力したが、ある程度の実験の誤差及び偏差は考慮されたい。特に明記しない限り、割合は重量により、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、かつ圧力は大気圧又は大気圧付近である。
（実施例１）
【０２３１】
可溶性ヒトＦｃＲｎ（ｓｈＦｃＲｎ）の発現
文献に記載のように、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるグルタミン合成酵素発現系を用いて、可溶性ヒトＦｃＲｎのｃＤＮＡをクローニングして発現させ、精製を行った。例えば、米国特許第５６２３０５３号を参照のこと。膜貫通領域を除くために、ヒトＦｃＲｎのタンパク質配列のアミノ酸２７４位の後に停止コドンを入れた。
（実施例２）
【０２３２】
ヒトＦｃＲｎによるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞（ＡＴＣＣ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）のトランスフェクションは、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を使用して製造業者の推奨プロトコルに従って行った。ＦｃＲｎ発現ベクター、ＦｃＲｎ：ｐＣＤＮＡ６を作製するために、全長ＦｃＲｎのｃＤＮＡ構築物（Ｓｔｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８０：２３７７−２３８１  （１９９４）、Ｓｉｍｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２６：１５２７−１５３１  （１９９６））を、最初にプラスミドベクターとしてのｐｃＤＮＡ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）にクローニングした。ヒトβ２ｍのｃＤＮＡ構築物を、最初にプラスミドベクターとしてのｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、ヒトβ２ｍ発現ベクター、β２ｍ：ｐｃＤＮＡ３を作製した（Ｇｕｓｓｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３９：３１３２−３１３８  （１９８７））。
【０２３３】
トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ２９３細胞を１００ｍｍシャーレあたり０．５〜２．５×１０６細胞で播種して、ｃＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２で１６時間インキュベートした。ｃＤＭＥＭの組成には、１ＬのＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１９９５−０６５）；１０ｍＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５５；１０ｍＬのＭＥＭアミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１１３０−０５１）；１０ｍＬのＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１１４０−０５０）；１０ｍＬの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１３６０−０７０）；１０ｍＬのペニシリンストレプトマイシン液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１５１４０−１４８）；１０ｍＬのＬ−グルタミン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃２５０３０−０８１）；１ｍＬの２‐メルカプトエタノールの５５ｍＭダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃２１９８５−０２３）；１００ｍＬの熱失活させたウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。トランスフェクション当日に、５μｇのＦｃＲｎ：ｐＣＤＮＡ６構築物及び５μｇのβ２ｍ：ｐＣＤＮＡ３のＤＮＡを２９０μＬのＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に加えた。この溶液を数秒間混合した後に遠心した。次いで、６０μＬのＳｕｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）をこのＤＮＡ溶液に加えて、１０秒間ボルテックス処理を行った。このＤＮＡ／ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ溶液を室温で５〜１０分間インキュベートし、その間に、細胞が入っているシャーレから培地を吸引して、細胞を４ｍＬのＰＢＳで１回洗浄した。ＤＮＡ／ＳｕｐｅｒＦｅｃｔを５〜１０分間インキュベートした後に、３ｍＬの完全増殖培地（ｃＤＭＥＭ）をこのＤＮＡ／ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ溶液に加え、溶液を混合して直ちに１００ｍｍシャーレ中の細胞に添加した。
【０２３４】
この細胞をＤＮＡ／ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ溶液と共に、３７℃、５％ＣＯ２で２〜３時間インキュベートした。ＤＮＡ／ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ溶液を含む培地を細胞から除去して、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、この細胞に新しいｃＤＭＥＭを加えた。４８時間インキュベートした後に、この培地をイムノブロット分析によって評価して、ＦｃＲｎ／β２ｍ複合体の一過性発現が生じたかどうかを判定した。さらに、この細胞を、抗生物質として２５０μｇ／Ｌのジェネテシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、ブラストサイジン抵抗性の安定したトランスフェクタントを選択するために５μｇ／Ｌのブラストサイジンとを含むｃＤＭＥＭ中に１：４の比率で継代した。抗生物質選択の４週後、生存細胞を９６ウェル組織培養プレート中にウェルあたり１細胞の密度で播種した。最終的に１２クローンを選択して、それぞれを増殖させ、イムノブロット分析によってＦｃＲｎ及びβ２ｍの発現を確認した。最も高い発現水準を有すると同定された、ＦｃＲｎ及びβ２ｍを発現している２９３をその後のアッセイに用いた。
（実施例３）
【０２３５】
ＦｃＲｎ−ＩｇＧ阻害剤のためのファージライブラリのスクリーニング
Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）から使用認可された繊維状ファージディスプレイライブラリのスクリーニングによって、ＩｇＧのＦｃ部分がＦｃＲｎに結合するのを阻害できるペプチドを同定した。より詳細には、ＴＮ−９−ＩＶ、ＴＮ１０−Ｘ、ＴＮ−１１−Ｉ、及びＴＮ−１２−Ｉのライブラリを組み合わせてスクリーニングに使用した。Ｄｙａｘのプロトコルに記載のように、各ライブラリ中に含まれる生存能力のあるそれぞれのファージの総数を、ライブラリを大腸菌中で発現させて限界希釈で播いたときに各ライブラリに確立される形質転換体の数で表した。ＴＮ−９−ＩＶ、ＴＮ１０−Ｘ、ＴＮ−１１−Ｉ、及びＴＮ−１２−Ｉの形質転換体の数はそれぞれ、３．２×１０９、２×１０９、２．７×１０９、及び１．４×１０９であった。所与の体積中の生存能力のあるファージの絶対数は、単位体積あたりのプラーク形成単位（ｐｆｕ）で報告することができる。
【０２３６】
Ａ．ファージスクリーニングに使用する緩衝液
以下の緩衝液をＦｃＲｎ結合ペプチドのスクリーニングに使用した。
１．ＮＺＣＹＭ培養液：ＮＺアミン−Ａ１０ｇ；塩化ナトリウム５ｇ；バクト酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）５ｇ；カザミノ酸１ｇ；無水硫酸マグネシウム粉末１ｇ：材料を８００ｍＬの水に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７．５に調整した後に、水で全量を１Ｌにして２０分間加圧滅菌した。
２．結合緩衝液（ＢＢ）：ＰＢＳ、ｐＨ６に１０ｍＭのＥＤＴＡを添加。Ｃ．ＮＺＣＹＭ−Ｔ：ＮＺＣＹＭ培養液に１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを添加。
３．ＨＢＳＳ−Ｅ：ハンクス平衡塩類溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１０ｍＭのＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加。
４．最小塩類Ａ：Ｋ２ＨＰＯ４（リン酸二カリウム）１０．５ｇ；ＫＨ２ＰＯ４（リン酸一カリウム）４．５ｇ；（ＮＨ４）２ＳＯ４（硫酸アンモニウム）１．０ｇ及びクエン酸ナトリウム０．５ｇを１Ｌの水に溶解した。
５．ＬＢ培養液：バクトトリプトン１０ｇ；バクト酵母エキス５ｇ；塩化ナトリウム１０ｇを１Ｌの水に溶解して、２０分間加圧滅菌した。
６．ＣＢＳ  ｐＨ２：５０ｍＭクエン酸ナトリウム；１５０ｍＭ塩化ナトリウム：緩衝液をＨＣｌでｐＨ２に調製してフィルター滅菌した。
７．ＬＢ寒天培地：バクトトリプトン３０ｇ；バクト酵母エキス１５ｇ；塩化ナトリウム３０ｇを３Ｌの水に溶解して、２０分間加圧滅菌した。
８．ＬＢ軟寒天培地：バクトトリプトン２０ｇ；バクト酵母エキス１０ｇ；塩化ナトリウム２０ｇ；バクト寒天１４ｇを２Ｌの水に入れて沸騰させずに軽く加熱して溶解した。
９．ＴＥ緩衝液：１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７。
【０２３７】
Ｂ．スクリーニングプロトコル：１回目
各ライブラリーの約１００ランダムライブラリー相当をそれらの力価に応じてプールした。すなわち、２４μＬのＴＮ９−ＩＶ（１．３×１０１０−ｐｆｕ／μＬ）、１２．５μＬのＴＮ１０−Ｘ（１．６×１０１０ｐｆｕ／μＬ）、２２５μＬのＴＮ１１−Ｉ（１．２×１０９ｐｆｕ／μＬ）、及び４８．７μＬのＴＮ１２−Ｉ（２．９×１０９ｐｆｕ／μＬ）を１８９μＬのＰＢＳ、７５μＬの氷冷した１７％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（平均分子量：８０００Ｄａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）及び７５μＬの３Ｍ塩化ナトリウムと混合して、氷上で３０分間インキュベートした。２９３クローン１１細胞（実施例２）のＴ７５フラスコ１本をＨＢＳＳ−Ｅで１：３の比率に分けた。この細胞を１ｍＬの微量遠心管に移して、冷却した結合緩衝液で１回洗浄し、その上清を除去した。この細胞をファージと共に４℃で１．５時間、ローテーター上でインキュベートした。インキュベート後、細胞を１ｍＬの氷冷ＢＢで５回洗浄し、各回の洗浄後に１４００ｒｐｍで２分間の遠心を行った。強く結合したファージは、ＢＢ中に透析しておいた６６μＭのヒトＩｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を加えることによって溶出した。このファージ−ＩｇＧ混合物を細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。遠心処理（１４００ｒｐｍの回転を２分間）の後に、細胞の沈殿物を最初に２００μＬの６６μＭ  ＩｇＧで洗浄して遠心（１４００ｒｐｍの回転を２分間）し、最後に１００μＬのＩｇＧで洗浄した。このＩｇＧ洗浄と併せて、最終量５００μＬのＩｇＧ溶出を行った。下記のように、溶出液中のファージを力価測定して増幅した。
【０２３８】
Ｃ．ファージ力価
ファージ溶液を１００倍で段階希釈した。通常は、２μＬのファージ溶液を１９８μＬのＮＺＣＹＭ培養液に加え、これを連続して１０−１０まで希釈した。ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’大腸菌細胞が対数増殖期にあってＡ６００（ＵＶ吸光度６００ｎｍ）で光学密度０．５に達したときに、希釈したファージをＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’大腸菌細胞の培養物に加えた。この培養物を室温で１０分間インキュベートした。その後、０．５ｍＬの感染細胞を３．５ｍＬの溶解した約５５℃の上層寒天培地（ＬＢ培養液及びＬＢ寒天培地の５０／５０混合物）に加えて、標準寒天平板上に広げて、３７℃で一晩インキュベートした。３０〜３００個のプラークを含むプレートから力価を算出した。１０−８のファージ希釈から播いた、５０個プラークを含むプレートの場合、算出は以下のように行う。５０個のプラーク／５００μＬ感染細胞×感染期間中の１０倍希釈×１０８ファージ希釈＝μＬあたりの１０８プラーク形成単位。
【０２３９】
後のファージＥＬＩＳＡ及びシークエンシング解析に必要な場合には、ファージプラークを含むそれぞれの寒天培地の断片を加圧滅菌したパスツールピペットで採取した。９６ウェル滅菌丸底組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中に断片を沈殿させ、それにウェルあたり１００μＬのＴＥを加えた。３７℃で２時間又は４℃で一晩、ファージをプラークから溶出させた。
【０２４０】
Ｄ．ファージ増幅
ＸＬ１  ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’大腸菌細胞の培養物を、飽和した一晩培養物の１／１００希釈から、培養物がＡ６００で光学密度０．５に達するまで、ＮＺＣＹＭ−Ｔ培養液中で増殖させた。この細胞を３５００ｒｐｍで１５分間遠心することによって濃縮した後に、原体積の１／２０となるように最小塩類Ａ中に再懸濁した。一連の選択の後に細胞から溶出したファージを、最終体積１ｍＬとなるように最小塩類Ａ中に希釈して、１ｍＬの濃縮した細菌培養物に加えた。３７℃の水浴中で１５分間インキュベートした後、ファージ−細胞混合物を２×ＮＺＣＹＭ培養液２ｍＬに加え、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＮＺＣＹＭの入った大きなＮＵＮＣプレート上に乾燥するまで塗布した。プレートを３７℃で１４〜１８時間インキュベートした。一晩で形成されたコロニーを、２０ｍＬのＰＢＳ存在下、コンラージ棒で穏やかにかき集めた。ＰＢＳを含む細菌及びファージを遠心管中に回収した。プレート上に残った細菌を１０ｍＬのＰＢＳ存在下で再びかき集めて回収した。最後に１０ｍＬのＰＢＳでプレートを１回すすぎ、かき集めた全ての材料と共にプールした。この細菌細胞を遠心（３５００ｒｐｍで１５分間）によって沈殿させて、透明な上清を別の遠心管に注ぎ移して、再び浄化し、最後にまた注ぎ移した。次いで、０．１５ｍＬの１７％ＰＥＧ＋３Ｍ  ＮａＣｌをこの上清に加え、これを混合して４℃で一晩保存した。遠心（８５００×ｇを３０分間）して、その後上清を捨てることにより、沈殿したファージを回収した。このファージの沈殿物を少量のＰＢＳ中に再懸濁して、短時間の回転で浄化し、０．１５体積の１７％ＰＥＧ＋３Ｍ  ＮａＣｌで再沈殿させた。最終的なファージの沈殿物をＰＢＳ中に再懸濁して、次の回の選択に備えて力価測定した。
【０２４１】
Ｅ．２回目
１ｍＬの結合緩衝液中に１０ランダムライブラリー相当のみが希釈されるように、増幅したファージライブラリーを希釈した。トランスフェクトしていない２９３細胞のＴ７５フラスコ１本の３分の１を、冷却した結合緩衝液で１回洗浄した。ＦｃＲｎを発現していない細胞に結合可能なペプチドを発現するファージをライブラリーから除去するためにあるサブトラクションの工程を、ファージをトランスフェクトしていない細胞と共に１５分間インキュベートすることによって２回行った。この上清を回収した。次いで、２９３クローン１１細胞のＴ７５フラスコ１本の３分の１を、冷却した結合緩衝液で１回洗浄して、ファージと共に４℃で１．５時間、ローテーター中でインキュベートした。この細胞を１ｍＬの冷却した結合緩衝液で５回洗浄及び遠心（１４００ｒｐｍの回転を２分間）して、（結合緩衝液中で透析した）２００μＬの６６μＭヒトＩｇＧを用いてファージ−細胞−ＩｇＧ混合物を４℃で１時間インキュベートすることによって強く結合したファージを溶出した。遠心（１４００ｒｐｍの回転を２分間）した後に、上清を回収して、沈殿物を２００μＬの６６μＭ  ＩｇＧで洗浄し、次いで１００μＬの６６μＭ  ＩｇＧで洗浄した。標識したファージの力価というセクション及びファージ増幅というセクションで後述するように、この溶出液中のファージを力価測定して増幅した。
【０２４２】
Ｆ．３回目
この回は、２回目で前述したように行った。３回目の完了後、溶出液中のファージの力価を測定し、ファージＥＬＩＳＡを用いてＩｇＧ−ＦｃＲｎ阻害剤のためのアッセイを行った。
【０２４３】
Ｇ．ファージＥＬＩＳＡ
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって、ＦｃＲｎに結合可能なペプチドをコードするファージを同定するために以下の工程を行った。まず、以下の溶液を調製した。
緩衝液Ａ：ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ＋０．５％ＢＳＡ
緩衝液Ｂ：１００ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ
緩衝液Ｃ：５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ
【０２４４】
ＦｃＲｎに結合できることが示されたファージを増殖させるためのＸＬ１  ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’大腸菌培養物を、一晩培養物の１：１００希釈からＡ６００で光学密度０．５になるまで増殖させた。次いで、上記のように調製した１０μＬの各ファージプラーク溶出液を、９６ウェルプレートのウェル中の３０μＬのＸＬ１  ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’大腸菌細胞に加えて、室温で１５分間インキュベートした。次いで、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１３０μＬのＮＺＣＹＭ培養液を各ウェルに加えて、このプレートを３７℃で一晩インキュベートした。
【０２４５】
ストレプトアビジンコーティング、ＢＳＡブロッキング済みのマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を、ウェルあたり２００μＬの緩衝液Ａですすいで調製して、これを緩衝液Ａ中、１ｍｇ／ｍＬのビオチン化した可溶性ヒトＦｃＲｎ（実施例４、セクションＡ）を用いて４℃で一晩コーティングした。このＦｃＲｎを含んだ緩衝液を捨て、プレートを緩衝液Ｃで２回すすいだ。次いで、７０μＬの緩衝液Ｂをプレートの各ウェルに加えた後に、ファージを含んだ３０μＬの細菌培養物を加えた。室温で１時間後、プレートを２００μＬの緩衝液Ｃで５回洗浄した。次いで、１：１００００希釈のＨＲＰ抱合抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む１００μＬの緩衝液Ｃを各ウェルに加えた。このプレートを室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを緩衝液Ｃで９回洗浄して、１ステップＴＭＢ（ＫＰＬ）で発色させ、５〜１５分後に２Ｍ硫酸で反応停止させて、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎｍで読み取った。
【０２４６】
Ｈ．ファージＤＮＡのＰＣＲ増幅
製造業者の使用説明書によってＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  ＳｙｓｔｅｍＩＩキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＴＥ中のプラークから溶出したファージを配列決定用に増幅した。次いで、５ｍＬの溶出したファージを、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５００ｎＭの３ＰＣＲＵＰプライマー（５’−ＣＧＧＣＧＣＡＡＣＴＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＡＧＣＴＧ−３’）、５００ｎＭの３ＰＣＲＤＮプライマー（５’−ＣＡＴＧＴＡＣＣＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＧＴＴＴＣＧＴＣ−３’）、１×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（１０×：５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ  ２５℃でｐＨ９．０、１％トリトンＸ−１００、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、及び１．２５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素を含む反応混合液に加えた。反応は、ＭＪリサーチＰＣＴ−２００サーマルサイクラーで以下のプログラムにかけた：９４℃で５分間；９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で６０秒間を３０サイクル、その後７２℃で７分間。得られた産物を、製造業者の使用説明書に従ってＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、Ａ２６０の吸光度で定量して、３ＳＥＱ−８０プライマー（５’−ＧＡＴＡＡＡＣＣＧＡＴＡＣＡＡＴＴＡＡＡＧＧＣＴＣＣ−３’）を用いて配列決定した。
【０２４７】
３回のスクリーニング後に増幅したファージの配列を決定することによって、全長のヒトＦｃＲｎ及びヒトβ−２ミクログロブリン１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が明らかにされた。これらの「ファージヒット」をまとめて、以下のアミノ酸配列で定義されるコンセンサスペプチド配列を同定した：Ｇ−Ｈ−Ｆ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｙ。
（実施例４）
【０２４８】
ペプチド−ＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡ
繊維状ファージディスプレイライブラリのスクリーニングから得られた本発明のペプチドが、ＩｇＧのＦｃＲｎへの結合も阻止できるかどうかを決定するために、以下のＥＬＩＳＡアッセイを考案して行った。
【０２４９】
Ａ．ｓｈＦｃＲｎのビオチン化
トリス緩衝液中の可溶性ヒトＦｃＲｎ（ｓｈＦｃＲｎ）の溶液を、２リットルのＰＢＳ、ｐＨ８．０中で３時間ずつ２回透析した。回収したｓｈＦｃＲｎの量は、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。ｓｈＦｃＲｎの濃度は、読み取った吸光度をｓｈＦｃＲｎの吸光係数、すなわち、ε＝８５８８０Ｍ−１ｃｍ−１で乗算することによって得られた。透析したｓｈＦｃＲｎを、２倍モル過剰のＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）で４℃で２時間処理することによって、ｓｈＦｃＲｎがビオチン化された。その後、ｓｈＦｃＲｎ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン反応混合物を、２Ｌの冷却したＰＢＳ中で２回透析し、もう一度吸光度を読み取って、残存しているタンパク質の濃度を決定した。このビオチン化したｓｈＦｃＲｎを、必要なときまで４℃で０．１％アジ化ナトリウムと共に保存した。
【０２５０】
Ｂ．ペプチド−ＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡアッセイ
ＢＳＡでブロッキングされた９６ウェルＲｅａｃｔｉＢｉｎｄニュートラアビジンコーティング済みプレート（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）を、２００μＬ／ウェルの緩衝液Ａ（緩衝液Ａ：ＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ，  １４０４０）、ＩｇＧを含まない０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄した。このウェルを、１００μＬ／ウェルの緩衝液Ａ中１μｇ／ｍＬのビオチン化したｓｈＦｃＲｎでコーティングした。このプレートを密閉して３７℃で２時間インキュベートした。その後、このプレートを２００μＬ／ウェルの緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ：１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ＩｇＧを含まない０．５％ＢＳＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  ＰＡ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄した。次いで、緩衝液Ｂ中の６ｎＭヒトＩｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）５０μＬ／ウェル並びに（さまざまな濃度の）種々の競合ペプチド５０μＬ／ウェルを加え、これによりウェル中のＩｇＧの最終濃度が３ｎＭとなった。混合させるために、プレートを２分間振動させて、密閉して３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後に、液体をプレートから吸引して、緩衝液Ｂ中に１：１００００希釈したペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）断片特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  ＰＡ）１００μＬ／ウェルを加えた。プレートを覆い、室温で３０分間インキュベートして、２００μＬ／ウェルの氷冷した緩衝液Ｂで４回洗浄した。ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ基質溶液（１００μＬ／ウェル、ＫＰＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）を加え、発色するまで５〜１０分間、プレートを室温でインキュベートした。発色後、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ停止液（ＫＰＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）を加えて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。データをペプチド濃度に対する吸光度でプロットして、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値を導いた。
（実施例５）
【０２５１】
ペプチド−ＩｇＧ競合ＦＡＣＳアッセイ
実施例４に記載のＥＬＩＳＡのアプローチを用いることに加えて、繊維状ファージディスプレイライブラリのスクリーニングから得られた本発明のペプチドが、細胞上のＦｃＲｎへのＩｇＧの結合も阻止できるかどうかを決定するために、以下の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイを考案して行った。
【０２５２】
Ａ．Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−４８８によるＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）の標識
製造業者の提唱するプロトコルに従ってＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８タンパク質標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いて、ヒト化ＩｇＧ１（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）を標識した。簡単に説明すると、５０μＬの１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ９．０を、２ｍｇ／ｍＬのＩｇＧのＰＢＳ溶液５００μＬに加えた。このタンパク質溶液を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８スクシニミジルエステル（乾燥粉末）に加えて、室温で１時間インキュベートした。キットコンポーネントカラム（Ｂｉｏ−ＲａｄバイオゲルＰ−３０細サイズ排除精製樹脂）を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによって、このタンパク質を精製した。この試料をカラム上にロードして、ＰＢＳで溶出した。第１の有色バンドに標識したタンパク質が含まれていた。２８０ｎｍ及び４９４ｎｍにおける溶出したＩｇＧの吸光度を測定することによって、標識の程度を決定した。以下の式を使用してタンパク質モル濃度を決定した。タンパク質濃度（Ｍ）＝［Ａ２８０−（Ａ４９４×０．１１）×希釈係数］／２０３，０００。さらに、タンパク質１モルあたりの色素のモル数を導くために以下の式を使用した。＝Ａ４９４×希釈係数／７１，０００×タンパク質濃度（Ｍ）。典型的には、ＩｇＧ１モルあたり４〜７モルのＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８が組み込まれた。
【０２５３】
Ｂ．２９３クローン１１細胞を用いたＩｇＧ−ペプチド競合ＦＡＣＳアッセイ
アッセイのための準備では、５μｇ／ｍＬのブラストサイジン及び２５０μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｇｉｂｃｏ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中のＨＥＫ２９３クローン１１細胞（実施例２）をスピンダウンして、３×１０６細胞／ｍＬの濃度で緩衝液Ｃ（緩衝液Ｃ：１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を含むダルベッコＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ））に再懸濁した。細胞（０．１ｍＬ）をピペットで９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに入れて、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴ７ベンチトップ遠心機を使用して、このプレートを２６００ＲＰＭで５分間遠心した。上清を静かに注ぎ移して、プレートをペーパータオル上で吸い取らせた。様々な濃度で緩衝液Ｃ中に可溶化した競合ペプチド（９０μＬ）をこのプレートに加えて、マルチチャンネルピペットで混合した。Ａｌｅｘａ  ４８８で標識したＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）１０μＬをこのプレートの各ウェルに加え、これにより、Ａｌｅｘａ  ４８８で標識したＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）の最終濃度は１００ｎＭとなった。このプレートをホイルに包み、氷上に１時間置いた後に、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴ７ベンチトップ遠心機中２６００ｒｐｍで５分間遠心し、次いで、１００μＬの緩衝液Ｃで１回洗浄して再び遠心した。この細胞を２００μＬの緩衝液Ｃに再懸濁して、ベックマンコールターＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメーターで解析した。
（実施例６）
【０２５４】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いてペプチドの平衡結合定数（ＫＤ）を決定する方法
Ｂｉａｃｏｒｅ（ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＢ，  ｓｅｃｔｉｏｎ  ４．２，  Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）により推奨されるように以下の工程を行い、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）が関与するアミンカップリング反応によって、ヒト又はカニクイザルの可溶性ＦｃＲｎをセンサーチップＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）のデキストラン表面に架橋した。ＦｃＲｎタンパク質を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）中、１０〜３０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、これを用いてセンサーチップ上の１つのフローセルをコーティングした。このＦｃＲｎフローセル上の残存部位を、１Ｍエタノールアミン塩酸塩  ｐＨ８．５（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）で阻止した。対照フローセルをリファレンスサブトラクション用にエタノールアミン塩酸塩で阻止した。モノマー性ペプチドを解析する場合には、最終密度４０００〜５０００レスポンスユニット（ＲＵ）となるようにＦｃＲｎをコーティングした。ダイマー性ペプチドを解析する場合には、最終密度２０００〜２５００ＲＵとなるようにＦｃＲｎをコーティングした。ＳＰＲ測定は全て、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００測定器（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して行った。ｐＨ６又はｐＨ７．４で測定する場合は、５０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％界面活性剤Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）中で実験を行った。
【０２５５】
Ａ．モノマー性ペプチドの結合定数を決定する代表的な方法
１０段階２倍希釈したペプチドを、ＦｃＲｎ−ＣＭ５チップに流速２０μＬ／分で２分間注入した。ペプチドを緩衝液で２．５分間チップから解離させた。ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を３０μＬ／分の速度で３０秒間注入して、残ったペプチドを全てチップから除去した。ＢｉａＥｖａｌソフトウェア  バージョン３．１（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、センサーグラムを作製し解析した。注入毎に観察される平衡ＲＵを濃度に対してプロットした。ＢｉａＥｖａｌソフトウェアにある定常状態親和性モデルを用いてプロットを解析することによって、平衡ＫＤ値を導いた。
【０２５６】
Ｂ．ダイマー性ペプチドの結合定数を決定する代表的な方法
１０段階２倍希釈したペプチドを、ＦｃＲｎ−ＣＭ５チップに流速３０μＬ／分で１０分間注入した。ペプチドを緩衝液で１０分間チップから解離させた。５０ｍＭトリス−塩酸塩、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％界面活性剤Ｐ２０  ｐＨ９．０を含む溶液を、１００μＬ／分で６０秒間、２回注入して、残ったペプチドを全てチップから除去した。
【０２５７】
ＢｉａＥｖａｌソフトウェア  バージョン３．１（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、センサーグラムを作製し解析した。注入毎に観察される平衡ＲＵを濃度に対してプロットした。ＢｉａＥｖａｌソフトウェアにある定常状態親和性モデルを用いてプロットを解析することによって、平衡ＫＤ値を導いた。
（実施例７）
【０２５８】
ジスルフィド結合を含むモノマーペプチドの合成
モノマーペプチドの合成を、焼結した丸底フラスコを用いて手作業で又はＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ  ３９６−ｏｍｅｇａ合成器（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）を用いてのいずれかで、固相ペプチド合成を用いて行なった。Ｒｉｎｋアミド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）又はＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と組み合わせた、標準的なＦｍｏｃ／ｔＢｕプルトコルを用いて（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ  ｅｄｓ．，Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００））、切断時にＣ末端アミドを生じた。カップリング試薬は、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）及びＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾル（ＨＯＢｔ）（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）であった。基剤は、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）であり、溶媒は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）であった。典型的な合成サイクルは、２０％ピペリジン／ＤＭＦを用いる２×１０分の脱保護工程、ＨＯＢｔ／ＨＢＴＵを用いる２×３０分のアミノ酸カップリング、及び無水酢酸／ＨＯＢｔを用いる１０分のキャッピング工程を含んだ。９５％トリフルオロ酢酸；２．５％エタンジチオール；１．５％トリイソプロピルシラン、及び１％水で２時間処理することによって、ペプチドを樹脂から切断し、氷冷エーテルで沈殿させ、遠心分離し、エーテルで３回粉末化（ｔｒｉｔｕｒａｔｅ）した。
【０２５９】
システインを含む粗ペプチドを、１ｍｇ／ｍＬの濃度まで酢酸と水の４：１混合物（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）に溶解することによって対応するジスルフィドに酸化した。１０モル当量のヨウ素（１Ｍ水溶液、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をこの溶液に加え、反応混合物を室温で１時間混合した。透明な溶液が得られるまで、１Ｍチオ硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を徐々に添加することによって、反応を停止させた。この反応混合物を真空中で濃縮し、その後２５０ｍｍ×２１．２ｍｍ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ  ＣＡ）Ｃ１８カラムを装備したＷａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ６００逆相ＨＰＬＣシステム（Ｍｉｌｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて精製した。ＨＰＬＣ精製工程用に選ばれた溶出液は、０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡを含むアセトニトリル／水の濃度勾配であった。適当な画分を回収し、プールし、凍結乾燥した。エレクトロスプレー質量分析（Ｍａｒｉｎｅｒ  ＥＳ−ＭＳ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と連結した、２５０ｍｍ×２ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）を組み合わせた逆相分析ＨＰＬＣにより、ペプチドの同一性及び純度を確認した。
【０２６０】
表２は、ヒトＦｃＲｎに対する高い親和性及びＩｇＧ−ＦｃＲｎ相互作用を阻止する能力を有するペプチドを同定するのに使用されたペプチド発現ライブラリのスクリーニングから得られた、元のファージペプチド配列のリストを提供する。表２及びその後の表において、列１はペプチド識別子を含む。列２は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。列３は、実施例４で概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡで決定したときの各ペプチドのＩＣ５０を含む。列４及び５は、実施例６で概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によって、それぞれ、ｐＨ６及びｐＨ７．４で決定したときの各ペプチドのＫＤを含む。
【表１】
2010535788.tif 000045
【０２６１】
表３は、ペプチド番号５０６の切断物のリストを提供し、これらのペプチドのヒトＦｃＲｎとの結合パラメーターに対する切断の効果を示している。列１は、ペプチド識別子を含む。列２は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。列３は、実施例４で概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡで決定したときの各ペプチドのＩＣ５０を含む。列４及び５は、実施例６で概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によって、それぞれ、ｐＨ６及びｐＨ７．４で決定したときの各ペプチドのＫＤを含む。
【表２】
2010535788.tif 000046
【０２６２】
表４は、ペプチド番号５０１に由来するペプチド及びペプチド類似体のリストを提供する。このペプチドでは、１つのアミノ酸がアラニンで置換されている（アラニン走査）。表４は、これらのペプチドのヒトＦｃＲｎとの結合パラメーターに対する置換の効果を示している。
【表３】
2010535788.tif 000047
【０２６３】
表５は、ペプチド番号５０１に由来するペプチド及びペプチド類似体のリストを提供する。このペプチドでは、システイン類似体によるシステインの置換が行なわれている。表５は、これらのペプチドのヒトＦｃＲｎとの結合パラメーターに対する置換の効果を示している。
【表４】
2010535788.tif 000048
【０２６４】
表６は、ペプチド番号５０１ペプチド及びペプチド番号３２に由来するペプチドのリストを提供する。これらのペプチドでは、１つのアミノ酸がＮ−メチルアミノ酸に置換されている。表６は、これらのペプチドのヒトＦｃＲｎとの結合パラメーターに対する置換の効果を示している。
【表５】
2010535788.tif 000049
【０２６５】
表７は、ペプチド番号３２由来ペプチド類似体の切断のリストを提供する。表７は、これらのペプチドのヒトＦｃＲｎとの結合パラメーターに対する切断の効果を示している。
【表６】
2010535788.tif 000050
【０２６６】
表８は、ペプチド番号３２に由来するペプチド及びペプチド類似体のリストを提供する。これらのペプチドでは、通常Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕという配列がある場所に様々なアミノ酸及びアミノ酸類似体による置換が生じている。
【表７−１】
2010535788.tif 000051
【表７−２】
2010535788.tif 000052
【０２６７】
表９は、ペプチド番号３２に由来するペプチド及びペプチド類似体のリストを提供する。これらのペプチドでは、通常Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ペニシルアミンという配列がある場所に様々なアミノ酸及びアミノ酸類似体による置換が生じている。
【表８】
2010535788.tif 000053
【０２６８】
表１０は、ペプチド番号３２に由来するペプチド及びペプチド類似体のリストを提供する。これらのペプチドでは、通常ペニシルアミン−Ｔｈｒ−Ｇｌｙという配列がある場所に様々なアミノ酸及びアミノ酸類似体による置換が生じている。
【表９】
2010535788.tif 000054
【０２６９】
表１１は、ペプチド番号１８７に由来するペプチド及びペプチド類似体のリストを提供する。これらのペプチドでは、通常Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−サルコシンという配列がある場所に様々なアミノ酸及びアミノ酸類似体による置換が生じている。
【表１０】
2010535788.tif 000055
【０２７０】
表１２は、ペプチド番号３２に由来するペプチド及びペプチド類似体のリストを提供する。これらのペプチドでは、通常Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙという配列がある場所に様々なアミノ酸及びアミノ酸類似体による置換が生じている。
【表１１−１】
2010535788.tif 000056
【表１１−２】
2010535788.tif 000057
【０２７１】
表１３は、ペプチド番号３２に由来するペプチド及びペプチド類似体のリストを提供する。これらのペプチドでは、様々なアミノ酸及びアミノ酸類似体によるチロシンの置換が生じている。
【表１２−１】
2010535788.tif 000058
【表１２−２】
2010535788.tif 000059
【０２７２】
表１４は、ペプチド番号３２に由来するペプチド及びペプチド類似体のリストを提供する。これらのペプチドでは、通常Ｇｌｙ−Ｌｅｕという配列がある場所に様々なアミノ酸及びアミノ酸類似体による置換が生じている。
【表１３】
2010535788.tif 000060
【０２７３】
表１５は、通常Ｇｌｙ−Ｌｅｕという配列がある場所でグリシン及びロイシンが共にジペプチドミメティックに置換されている、ペプチド番号３２に由来するペプチド及びペプチド類似体のリストを提供する。
【表１４】
2010535788.tif 000061
（実施例８）
【０２７４】
ヒスチジン類似体を含むペプチドの合成
以下の改変ヒスチジン類似体を除いては、モノマーペプチドジスルフィドの合成について実施例７で記載したように、改変ヒスチジン類似体（表１６）を合成した。ペプチド番号９９に類似した完全保護ペプチドを含む樹脂を未希釈のヨウ化メチルに１５時間懸濁することによって、ペプチド番号２５９を合成した。この樹脂をジクロロメタンで洗浄し、上記のようにペプチドを樹脂から切断し、酸化し、ＨＰＬＣで精製して、モノメチル化ヒスチジンペプチド（ペプチド番号２５９）を得た。
【０２７５】
ペプチド番号９９に類似した完全保護ペプチドを含む樹脂を未希釈のヨウ化メチルに７２時間懸濁することによって、ペプチド番号２６０を合成した。この樹脂をジクロロメタンで洗浄し、上記のようにペプチドを樹脂から切断し、酸化し、ＨＰＬＣで精製して、ジメチル化ヒスチジンペプチド（ペプチド番号２６０）を得た。
【０２７６】
ペプチド番号２４８に類似した完全保護ペプチドを含む樹脂を窒素下でジクロロメタンに懸濁することによって、ペプチド番号２６９を合成した。この懸濁液に１０モル当量の２，４，６−トリ−ｔｅｒｔ−ブチルピリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、その後５モル当量のメチル−トリフルオロメタン−スルホネート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えた。揺動させながら、この反応を４時間進行させ、まずジクロロメタンですすぎ、次にジメチルホルムアミドですすぎ、最後にジクロロメタンでもう一度すすいだ。上記のようにペプチドを樹脂から切断し、酸化し、ＨＰＬＣで精製して、Ｎ−メチル−チアゾリウムペプチド（ペプチド番号２６９）を得た。
【０２７７】
１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に３３％エタノール、１０％アセトニトリル、１０％  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを含む溶液中で、ペプチド（ペプチド番号２６１）を３０当量の硫酸銅、３０当量のアスコルビン酸、及び１０当量のアジ化ナトリウムで処理することにより、ペプチド番号２７１を合成した。この反応を２時間進行させ、混合物を上記のようなＨＰＬＣで精製して、１，２，３−トリアゾル側鎖を含むペプチド（ペプチド番号２７１）を得た。
【０２７８】
表１６は、同一のペプチド又はペプチド類似体と比較した様々なペプチド及びペプチド類似体のリストを提供する。これらのペプチドでは、ヒスチジンが１つのアミノ酸又はアミノ酸類似体と置換されている。これらのペプチドのヒトＦｃＲｎとの結合パラメーターに対する置換の効果も提供する。
【表１５−１】
2010535788.tif 000062
【表１５−２】
2010535788.tif 000063
（実施例９）
【０２７９】
Ｇｌｙ−Ｇｌｙのペプチドミメティック類似体を含むペプチドの合成
Ｇｌｙ−Ｇｌｙアミノ酸ミメティック（表１７）は全て、Ｆｍｏｃ−アミノ酸保護アミノ酸として組み込まれており、特に断らない限り市販されていた（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ，Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ）。Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：１０４−１０９（１９８２）によって記載されたプロトコルに従って、３（Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピペリジン酢酸のＮ−Ｆｍｏｃ誘導体をペプチド番号２２７に組み込むことにより、３（Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピペリジン酢酸を含むペプチドを合成した。Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：１０４−１０９（１９８２）によって記載されたプロトコルに従って、３（Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸のＮ−Ｆｍｏｃ誘導体をペプチド番号２１４に組み込むことにより、３（Ｒ）−３−アミノ−２−オキソ−１−ピロリジン酢酸を含むペプチドを合成した。全てＤ−アミノ酸を使用することを除いては、Ｓｕｂａｓｉｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：２３５６−２３６１（１９９３）によって記載されたプロトコルに従って、５，５−二環式ジペプチド模倣物をペプチド番号１９７又はペプチド番号１９８に組み込むことにより、５，５−二環式ジペプチド模倣物を含むペプチドを合成した。全てＤ−アミノ酸を使用することを除いては、Ｅｔｚｋｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：１０４１２（１９９４）によって記載されたプロトコルに従って、６，５−二環式ジペプチド模倣物をペプチド番号２０４に組み込むことにより、６，５−二環式ジペプチド模倣物を含むペプチドを合成した。Ｄ−メチオニンの代わりにＬ−メチオニンを使用することを除いては、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：１０４−１０９（１９８２）によって記載されたプロトコルに従って、（Ｄ，Ｌ）−フリードリンガーラクタムをペプチド番号２１６に組み込むことにより、（Ｄ，Ｌ）−フリードリンガーラクタムを含むペプチドを合成した。
【０２８０】
表１７は、ペプチド番号５０１に由来するペプチド及びペプチド類似体のリストを提供する。これらのペプチド及びペプチド類似体では、通常２つの隣接するグリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）がある所に様々なアミノ酸及びアミノ酸類似体による置換がなされている。
【表１６】
2010535788.tif 000064
【０２８１】
表１８は、通常Ｇｌｙ−Ｇｌｙという配列がある場所で２つのグリシンが共にペプチドミメティック類似体に置換されている、ペプチド番号９９に由来するペプチド及びペプチド類似体のリストを提供する。
【表１７−１】
2010535788.tif 000065
【表１７−２】
2010535788.tif 000066
（実施例１０）
【０２８２】
ラクタム架橋を介して環状化されたペプチドの合成
様々なシステインの代わりとして以下のアミノ酸：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌｙｌ）−ＯＨ、並びにＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＡｌｌｙｌ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を使用することを除いては、上記に実施例７で概説したように、固相ペプチド合成によってラクタム環状化ペプチド（表１９）を合成した。完全保護ペプチドを樹脂上で生成する過程が終了した後、この樹脂をジクロロメタン中で膨潤させ、窒素でパージし、０．１モル当量のテトラキス−（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び３０モル当量のフェニルシラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理し、反応を３時間進行させた。この樹脂を、まずジクロロメタンで洗浄し、ＤＭＦで洗浄し、最後に１％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン及び１％（ｗ／ｖ）ジエチルジチオカルバミン酸のＤＭＦ溶液で更に５回洗浄した。ＤＭＦを用いた追加の洗浄工程の後、ベンゾトリアゾル−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）及びＤＩＥＡで１６時間、樹脂を処理した。実施例７で上記したように、この樹脂からペプチドを切断し、精製した。
【０２８３】
表１９は、ラクタム架橋を介してそれぞれのペプチドの環状化を可能にするであろう、システイン残基からアミノ酸及びアミノ酸類似体へのアミノ酸置換を有する本発明の様々なペプチドのリストを提供する。これらのペプチドのヒトＦｃＲｎとの結合パラメーターに対するこれらの置換の効果も提供する。
【表１８−１】
2010535788.tif 000067
【表１８−２】
2010535788.tif 000068
（実施例１１）
【０２８４】
直鎖ペプチド類似体の合成
ジスルフィド形成アミノ酸を表２０及び２１で示すように置換することを除いては、実施例７で上記したように、非架橋（「直鎖」）ペプチド類似体を合成した。
【０２８５】
表２０は、本発明のペプチド番号５０１由来の直鎖ペプチド及びペプチド類似体のリストを提供する。表２０は、これらのペプチドのヒトＦｃＲｎとの結合パラメーターも提供する。
【表１９−１】
2010535788.tif 000069
【表１９−２】
2010535788.tif 000070
【表１９−３】
2010535788.tif 000071
【０２８６】
表２１は、通常グリシン−サルコシンという配列（Ｇｌｙ−Ｓａｒ）がある場所で様々なペプチドミメティックに置換されている、ペプチド番号２３６由来ペプチド及びペプチド類似体のリストを提供する。
【表２０】
2010535788.tif 000072
（実施例１２）
【０２８７】
還元的アルキル化を介したペプチドダイマーの合成
ペプチドアルデヒド及びペプチドのアミノ（Ｎ）又はカルボキシ（Ｃ）末端アミンの還元的アルキル化によって、ペプチドダイマー（表２２）を作製した。
【０２８８】
モノマーペプチドジスルフィドの合成について実施例７で上記したように、ペプチドＮ−末端アミンを合成した。
【０２８９】
１，２−ジアミノエタン樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を合成工程で使用することを除いては、モノマーペプチドジスルフィドの合成について実施例７で上記したように、ペプチドＣ−末端アミンも合成した。その結果、樹脂からの切断によって、Ｃ末端エチルアミンが生じた。
【０２９０】
Ｎ末端アミノ酸の非保護アミンを、ＤＩＥＡ／ＤＭＦの存在下で２時間、５当量の無水コハク酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と反応させることによって、ペプチドＮ末端アルデヒド（図１）を合成した。その後、ＰｙＢＯＰ及びＤＩＥＡの存在下で２時間、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソランメタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）と反応させることによって、保護ジオール樹脂を得た。次に、この樹脂から粗ペプチドを切断し、その後、モノマーペプチドジスルフィドの合成について実施例７で上記したように、システインを酸化し、精製することによって、ペプチドジオールを得た。このジオールを３３％酢酸に溶解し、その後２当量の過ヨウ素酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、反応を５分間進行させた。この反応混合物を（ジオールに対して）２０当量のエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でクエンチし、１０分後、粗反応混合物を水で３倍希釈し、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル／水の増加する濃度勾配を用いて、Ｃ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）で精製した。ペプチドアルデヒドを凍結乾燥し、実施例７で記載した液体クロマトグラフィー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の後、質量分析（Ｍａｒｉｎｅｒ  ＥＳ−ＭＳ）による分析に供した。
【０２９１】
Ｒｉｎｋアミド樹脂の代わりにＦｍｏｃ−１−アミノ−２，３−プロパンジオール−２’−クロロトリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用することを除いては、モノマーペプチドジスルフィドの合成について実施例７で上記したように、ペプチドＣ末端アルデヒドを合成した。それ故に、結果として得られるペプチド樹脂は、マスクされたＣ末端ジオールを含んだ。この樹脂からの切断によって、Ｎ末端アルデヒドについて上記したように、ジオールをアルデヒドに酸化した。
【０２９２】
ペプチド番号２７５のようなラクタム環状化ペプチドを合成するために、ラクタム架橋で環状化されたペプチドの合成を示す、実施例１０で上記した方法に従って、ペプチドモノマーを合成した。そこでは、樹脂からの切断の前に、Ａｓｐ−Ｌｙｓ環状化を樹脂上で行なった。
【０２９３】
２％酢酸を含むＤＭＦ中、４０ｍｇ／ｍｌの濃度で、１当量のペプチドアルデヒドを１当量のアミン含有ペプチドと反応させることによって、ペプチドダイマーを合成した（図２）。６０分後、２当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、反応物を１時間、振盪させた。反応混合物を水で１０倍希釈し、実施例７で記載したように、ＨＰＬＣで精製し、液体クロマトグラフィー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の後、質量分析（Ｍａｒｉｎｅｒ  ＥＳ−ＭＳ）で分析した。
【０２９４】
表２２は、還元的アルキル化によって合成された本発明のダイマーペプチドのリストを提供する。表２２及びその後の表において、列１は、ペプチド識別子を含む。列２は、ペプチドのアミノ酸配列を含む。列３は、実施例４で概説したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡで決定したときの各ペプチドのＩＣ５０を含む。列４及び５は、実施例６で概説したＢｉａｃｏｒｅ分析によって、それぞれ、ｐＨ６及びｐＨ７．４で決定したときの各ペプチドのＫＤを含む。列６は、実施例５で概説したような競合的ＩｇＧ結合ＦＡＣＳで決定したときの各ペプチドのＩＣ５０を含む。
【表２１−１】
2010535788.tif 000073
【表２１−２】
2010535788.tif 000074
（実施例１３）
【０２９５】
チオールリンカー及びブロモアセチル化ペプチドによるペプチドダイマーの合成
ブロモアセチル化ペプチドをチオールリンカーと反応させることによって、ペプチドダイマー（表２３）も合成した。保護ペプチド樹脂の遊離のα−アミノ基を４当量の臭化ブロモアセチル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び８当量のＤＩＥＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とＤＭＦ中で反応させることによって、ブロモアセチル化ペプチドを合成した（図３）。１時間後、樹脂をＤＭＦで洗浄し、その後ＤＣＭで洗浄し、実施例７で上記したように樹脂から切断した。ラクタム環状化ペプチドを、ビス−チオールを用いてダイマー化する場合には、ブロモアセチル化工程の前に、樹脂上での（ｏｎ−ｒｅｓｉｎ）環状化工程を実施した。ジスルフィド含有ペプチドを、ビス−チオールリンカーを用いてダイマー化する場合には、実施例７で上記したような切断の後に、ヨウ素酸化工程を実施した。
【０２９６】
ＮＨ２−Ｇｌｙ−２−クロロトリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、２当量のＰｙＢＯＰ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びＤＩＥＡ／ＤＭＦの存在下で１８時間、２当量のＮ，Ｎ−ビス（Ｎ’−Ｆｍｏｃ−３−アミノプロピル）グリシンカリウムヘミ硫酸塩（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ，Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ）と反応させることによって、ビス−チオールリンカーを合成した（図３）。２０％ピペリジン／ＤＭＦで１０分間、２回処理することによって、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。リンカー化合物のいくつかについては、β−アラニンもスペーサー単位として組み込んだ。ＰｙＢＯＰ及びＤＩＥを用いて、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を上記のような樹脂に結合させた。２０％ピペリジン／ＤＭＦを用いてＦｍｏｃ保護基を除去した後、遊離のＮ末端アミン樹脂を２当量のＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロプリオネート（ＳＡＴＰ；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）及び４当量のＤＩＥＡと１８時間反応させることによって、別のβ−アラニンスペーサー単位を組み込むか、又はビス−チオールリンカーを組み込むかのいずれかにした。
【０２９７】
その後、０．０５ｍｍｏｌのペプチド樹脂を、１ｍｌのＤＭＦ及び０．４ｍｌの緩衝剤Ａ（緩衝剤Ａ：１Ｍ塩酸ヒドロキシアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、４０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を含む脱気溶液と１８時間反応させることによって、Ｓ−アセチル保護基の除去を遂行した。この樹脂をＤＭＦ、次いでＤＣＭで洗浄し、２％トリイソプロピルシランを含む５０％ＴＦＡのＤＣＭ溶液で１５分間、樹脂から切断した。粗リンカーを処理し、実施例７で上記したように精製した。
【０２９８】
水（１０％）及び１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５（５０％）を含むＤＭＦ中で、１当量の精製ビス−チオールリンカーを２当量のブロモアセチル化Ｎ末端ペプチドと反応させることにより、ビス−チオールリンカーを用いてペプチドダイマーを作製した（図３）。１８時間後、この粗反応混合物を、実施例７で上記したように逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。
【０２９９】
ブロモアセチル化ペプチドをＳＡＴＰで誘導体化したペプチドと反応させることによって、ペプチド番号１２２を合成した（図４）。簡潔には、遊離Ｎ末端アミンを有する粗ペプチド樹脂を、２当量のＳＡＴＰとＤＭＦ中で２時間反応させた。Ｓ−アセチル保護基を上記のように除去し、次いで上記のように樹脂から切断し、その後精製した。
【０３００】
表２３は、チオールリンカーによって合成された本発明のダイマーペプチドのリストを提供する。
【表２２−１】
2010535788.tif 000075
【表２２−２】
2010535788.tif 000076
【表２２−３】
2010535788.tif 000077
（実施例１４）
【０３０１】
還元的アルキル化を介したペプチドトリマーの合成：ペプチド番号２４７
ペプチドアルデヒド及びペプチドアミノＮ−末端アミンの還元的アルキル化によって、ペプチドトリマー（表２２）を作製した。
【０３０２】
Ｎ末端をビス−アミニプロピルグリシン（ＢＡＰＧ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｌ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから購入したＢｉｓ−Ｆｍｏｃ−ＢＡＰＧとして使用）等の二官能性アミンリンカーでキャッピングし、その後、サルコシンを結合させることを除いては、モノマーペプチドジスルフィドの合成について実施例７で上記したように、ペプチドＮ末端アミンを合成した。ペプチドＮ末端アルデヒド（図１）を実施例１２で記載したように合成した。２％酢酸を含むＤＭＦ中、４０ｍｇ／ｍｌの濃度で２当量のペプチドアルデヒドを１当量のアミン含有ペプチドと反応させることによって、ペプチドトリマーを（図２のように）合成した。６０分後、４当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、反応物を１時間振盪した。この反応混合物を水で１０倍希釈し、実施例７で記載したように、ＨＰＬＣで精製し、液体クロマトグラフィー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の後、質量分析（Ｍａｒｉｎｅｒ  ＥＳ−ＭＳ）で分析した。
（実施例１５）
【０３０３】
二酸リンカー及びアミンリンカーを用いたペプチドダイマーの合成
２つの樹脂上のペプチドモノマーのＮ末端を二官能性酸リンカーと反応させることによるか、又は二官能性アミンリンカーを含む樹脂上でペプチドの合成を行ない、それにより２つの樹脂上のペプチドモノマーのＣ末端を連結することによるかのいずれかで、アミドが結合したペプチドダイマー（表２４）を作製した。
【０３０４】
以下を除いては、モノマーペプチドジスルフィドの合成について実施例７で上記したように、Ｎ末端で結合したペプチドダイマーを合成した。すなわち、ペプチドを樹脂から切断する前に、２つのペプチドモノマーのＮ末端を二官能性酸リンカーと連結させる。例えば、１当量のＰｙＢＯＰ及び２当量のＤＩＥＡの存在下で、０．５当量のコハク酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、ペプチド番号２３５と類似したペプチド配列を含むペプチド樹脂を非保護Ｎ末端と反応させることによって、ペプチド番号２８３を合成する。これにより、Ｎ末端を介したアミド結合で共有結合的に結合している、樹脂上の隣接するペプチドが結果として生じる。
【０３０５】
ＨＰＬＣ精製の前にペプチドジスルフィドを酸化しないことを除いては、実施例７で記載したように、結果として得られるペプチドダイマーを樹脂から切断し、精製する。精製された還元ペプチドを、２０％ＤＭＳＯを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）に約０．１ｍｇ／ｍＬまで溶解し、室温で３日間混合する。この酸化工程は、ダイマーの２つのモノマー間とは対照的に、ダイマーの１つのペプチドモノマーの内部でのジスルフィド結合の形成を可能にする。この反応混合物をペプチド濃度０．０５ｍｇ／ｍＬまで水で希釈し、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル／水の増加する濃度勾配を用いてＣ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）で精製する。ペプチドダイマーを凍結乾燥し、実施例７で記載したように、液体クロマトグラフィー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の後、質量分析（Ｍａｒｉｎｅｒ  ＥＳ−ＭＳ）による分析に供した（図５参照）。ペプチド番号２８３の場合、ペプチドをトリプシンで３０分間消化し、その後、結果として得られるペプチドをＬＣＭＳで分析することによって、ジスルフィド結合様式を確認した。トリプシンは、アルギニン残基及びリジン残基の後ろで切断することが知られており、アルギニン−フェニルアラニン結合の位置でペプチド番号２８３を切断する。ペプチド番号２８３の主なＬＣＭＳの産物は、ＮＨ２−［Ｐｈｅ  Ｐｈｅ−Ｐｅｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓａｒ−ＮＭｅＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ］−ＣＯＮＨ２（ジスルフィド）（ＬＣＭＳ：Ｍ＋Ｈ＝１３５５．６Ｄａ）であり、これは、ペプチド番号２８３のジスルフィド結合が、各々の１３アミノ酸ペプチドモノマーの分子内で形成されていることを示す。
【０３０６】
ペプチド配列がペプチド番号３２と類似していたこと、使用された二酸リンカーがエチレングリコール−ビス（コハク酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）であったこと、及びＰｙＢＯＰをカップリング反応に使用しなかったことを除いては、ペプチド番号２８３と同様に、ペプチド番号２０１を合成した。
【０３０７】
使用された二酸リンカーがビス−ｄＰＥＧ６−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎｓ  Ｌｔｄ．）であったこと、及びＰｙＢＯＰをカップリング反応に使用しなかったことを除いては、ペプチド番号２８３と同様に、ペプチド番号２７９を合成した。
【０３０８】
大過剰の無水コハク酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でペプチド樹脂を処理したことを除いては、ペプチド番号２８３と同様に、ペプチド番号２８１を合成した。それにより、樹脂上の全てのペプチドが、コハク酸でキャッピングされたＮ末端を含む結果となる。この樹脂を、１当量のＰｙＢＯＰ及び２当量のＤＩＥＡの存在下で、０．５当量のＮ，Ｎ’−ジメチルエチル−エンジアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理した。その後の切断、精製、及び酸化工程を、ペプチド番号２８３についてと同様に実施した。
【０３０９】
使用された二酸リンカーがＮ−メチル−イミノジ酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）であったことを除いては、ペプチド番号２８３と同様に、ペプチド番号２８２を合成した。
【０３１０】
使用された二酸リンカーが３，３−ジメチルグルタル酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）であったことを除いては、ペプチド番号２８３と同様に、ペプチド番号２８４を合成した。
【０３１１】
使用された二酸リンカーがＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＨ）−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）であったことを除いては、ペプチド番号２８３と同様に、ペプチド番号２８５を合成した。
【０３１２】
使用された二酸リンカーがＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＨ）−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）であったことを除いては、ペプチド番号２８３と同様に、ペプチド番号２８６を合成した。
【０３１３】
ペプチド合成の前に二官能性アミンリンカーを樹脂に結合させることを除いては、モノマーペプチドジスルフィドの合成について実施例７で上記したように、Ｃ末端で結合したペプチドダイマーを合成した。これにより、Ｃ末端がアミド結合で共有結合的に結合したペプチドダイマーが結果として生じる。例えば、まずＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を樹脂に結合させ、その後アミノ酸に結合させてペプチド番号２３５と類似した配列を生み出すことにより、ペプチド番号２８０を合成した。これにより、樹脂上で合成されている間に、２つのペプチド鎖の共有結合的結合が結果として生じる。結果として得られるペプチドダイマーを、Ｎ末端が結合したダイマーについて上記したように、樹脂から切断し、精製し、酸化する（図６参照）。
【０３１４】
グリシン残基（Ｇｌｙ）がペプチド番号２３５配列と分岐リジンリンカーとの間に挿入されることを除いては、ペプチド番号２８０と同様に、ペプチド番号２８７を合成した。
【０３１５】
２つのグリシン残基（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）がペプチド番号２３５配列と分岐リジンリンカーとの間に挿入されることを除いては、ペプチド番号２８０と同様に、ペプチド番号２８８を合成した。
【０３１６】
表２４は、アミド結合を含む本発明のダイマーペプチドのリストを提供する。
【表２３−１】
2010535788.tif 000078
【表２３−２】
2010535788.tif 000079
（実施例１６）
【０３１７】
還元的アルキル化を介したペプチド−Ｆｃ融合体の合成
ペプチドＮ末端アルデヒド、ペプチド番号２５２、ペプチド番号２２９、及びペプチド番号２３２（表２５）を実施例１２で記載したように合成した。３つのペプチド−Ｆｃ融合体は全て、同じプロトコルを用いて作製した。ＣｙｓＦｃ（Ｎ末端システインを持つＦｃドメイン）及び４．５当量のペプチドアルデヒドを、氷上、８０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中で、１時間インキュベートした。シアノ水素化ホウ素ナトリウムを最終濃度２０ｍＭまで加え、反応物を４℃で１６時間インキュベートした。この反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、主に１個のペプチドがＦｃタンパク質に付加されていることを確認した。このタンパク質混合物をＰＢＳで２回透析し、インビトロの阻止活性について試験した（表２５）。ペプチド番号２５２−Ｆｃの場合、タンパク質をＴＧ３２ＢマウスＩｇＧ異化モデルでも評価した。ＣｙｓＦｃの産生は、米国特許出願公開第２００５／００２７１０９号に記載されたように実施することができる。ここで、ＣｙｓＦｃの産生の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０３１８】
表２５は、ＣｙｓＦｃ及びアルデヒドペプチドを用いて合成された本発明のペプチド−Ｆｃ融合タンパク質のリストを提供する。
【表２４】
2010535788.tif 000080
（実施例１７）
【０３１９】
トランスジェニックマウス
トランスジェニックマウスは、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥのＪａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＲｏｏｐｅｎｉａｎ博士から入手した。内在性のマウスＦｃＲｎ及びβ２ｍ遺伝子は、相同組み換えによる外来ポリヌクレオチド配列の挿入によって不活化され、遺伝子導入によってヒトＦｃＲｎ及びヒトβ２ｍ遺伝子と置換された（ｍｕＦｃＲｎ（−／−）、ｍｕβ２ｍ（−／−）、＋ｈｕＦｃＲｎ、＋ｈｕβ２ｍ）。これらのマウスを系統名ＴＧ３２Ｂと呼ぶ。
（実施例１８）
【０３２０】
５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇを用いたＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧ異化に対するペプチド番号２７０の効果
成体ＴＧ３２Ｂマウスに、ｔ＝０時間（Ｔ０）で、５００ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を静脈内注射した。２４、４８、７２、９６、及び１２０時間で、５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのいずれかのペプチド番号２７０をマウスに静脈内注射した。各時点で１５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を含むビヒクルＰＢＳを用いて、対照注射を行なった。注射前に全ての時点で、及び１６８時間で、血液試料を採取した。血清を調製し、ＥＬＩＳＡを実施するまで−２０℃で保存した。
【０３２１】
ＩｇＧ  Ｆｃドメイン特異的ＥＬＩＳＡを用いて、各時点での血清中ヒトＩｇＧのレベルを検出した。簡潔には、３０μｌの１０μｇ／ｍｌ原液のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を、６ｍｌの０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で希釈した。９６ウェルプレートを５０μｌ／ウェルのこの溶液でコーティングし、３７℃で１時間インキュベートした。コーティング溶液を除去し、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）で１回洗浄した。その後、２００μｌ／ウェルの２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）原液／ＰＢＳを加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、５０ｎｇ／ｍｌのｈＩｇＧ１から始めて２．５倍希釈を行なうことによって標準曲線を３通りで作成した。その後、１００μｌの標準溶液又は試料溶液のいずれかをウェルに加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。更に３回ＰＢＳＴ洗浄を行なった後、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のヤギ抗ヒトＩｇＧ［Ｆｃ］−ＨＲＰ抱合体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の１：１０，０００希釈液１００μｌを加えた。このプレートを３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄し、各ウェルに１００μｌのＴＭＢ  Ｏｎｅ−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ基質（ＢｉｏＦＸ，Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ）を加えた。各ウェルに１００μｌの０．２５Ｍ硫酸を加えることによって、５分後に発色を停止させた。各ウェルについてのＵＶ吸光度を４５０ｎｍで測定し、キャリブレーション曲線を用いて、これらの実験についての血清ＩｇＧ濃度対時間のプロットを導いた。
（実施例１９）
【０３２２】
ＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧ異化に対するペプチド番号２３１、ペプチド番号２７４、及びペプチド番号２５２−Ｆｃの効果
成体ＴＧ３２Ｂマウスに、ｔ＝０時間（Ｔ０）で、５００ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を静脈内注射した。２４、４８、及び７２時間で、１ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２３１、１ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２７４、又は２０ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２５２−Ｆｃのいずれかをマウスに静脈内注射した。対照注射は、１５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５を用いて各時点で行ない、全ての注射用のビヒクルとしての役割を果たした。注射前に全ての時点で、並びに３０、９６、及び１４４時間で、血液試料を採取した。血清を調製し、ＥＬＩＳＡを実施するまで−２０℃で保存した。
【０３２３】
各時点での血清中ヒトＩｇＧの濃度を、実施例１８で上記したように決定した。
（実施例２０）
【０３２４】
カニクイザルにおけるヒトＩｇＧ異化並びに内在性ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びアルブミンに対するペプチド番号２７０の効果
平均体重４．８ｋｇの３匹の成体カニクイザルに、０時間で、静脈内用量の５ｍｇ／ｋｇのビオチン化ヒトＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を静脈内注射した。４、４８、７２、及び９６時間で、１０ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２７０又は同体積のビヒクル（３０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５）のいずれかを、１ｍｌ／分の速度で動物に静脈内注射した。１２０時間で、動物ＣＯ６２１５を、第５用量の１０ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２７０で処理した。全ての注射の前、並びに１２０、１６８、１９２、及び２４４時間で、並びに３０日で、血液試料を採取した。血清を調製し、ＥＬＩＳＡを実施するまで−２０℃で保存した。
【０３２５】
ストレプトアビジン−Ｆｃ−特異的ＥＬＩＳＡを用いてビオチン−ｈＩｇＧトレーサーを検出した。ストレプトアビジンをコーティングしたプレート（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，Ｃａｔ  ＃１５１２１）をＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。血清試料及び標準をＰＢＳＢ（ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ）で希釈した。標準曲線を１．５６ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲で定めた。希釈した試料（１００μｌ）又は標準をウェル毎に加え、室温で２時間インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳＴ（３００μｌ／ウェル）で３回洗浄した。ヤギ抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，Ｃａｔ  ＃３１４１６）をＰＢＳＢで１：２５，０００に希釈し、１００μｌ／ウェルを加え、プレートを室温で３０分間インキュベートした。このプレートをＰＢＳＴ（３００μｌ／ウェル）で３回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＢｉｏＦｘ高感度ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ，Ｏｗｉｎｇ  Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ）を用いて室温で約５分間発色させた。１００μｌ／ウェルの０．２５Ｍ硫酸を加えることによって、反応物の発色を停止させ、各ウェルの吸光度を４５０ｎｍの波長で測定した。
【０３２６】
以下のＥＬＩＳＡプロトコルを用いて、内在性のカニクイザルＩｇＧを検出した。まず、ウサギ抗サルＩｇＧをコーティング緩衝液（コーティング緩衝液＝１錠の炭酸塩−重炭酸塩カプセル，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  Ｃａｔ＃Ｃ−３０４１を１００ｍＬの水に溶かしたもの）で２μｇ／ｍｌまで希釈した。次に、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ／Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、１００μｌ／ウェルの２μｇ／ｍｌウサギ抗サルＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコーティングし、３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で４回洗浄し、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＢ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ；１０％ＢＳＡ／ＰＢＳストック（ＫＰＬ）から希釈）を用いて３７℃で１時間ブロッキングした。このプレートをＰＢＳＴで再び４回洗浄した。血清試料及び標準をＰＢＳＢで希釈した。標準曲線を２０００ｎｇ／ｍｌ〜１．９ｎｇ／ｍｌのサルＩｇＧ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｄａｖｉｓ，ＣＡ）の範囲で定めた。その後、１００μｌ／ウェルの各試料を３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μｌ／ウェルの１：３０，０００希釈のウサギ抗サルＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）／ＰＢＳＢを加え、３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ基質（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて室温で約５分間発色させた。発色反応を１００μｌ／ウェルのＴＭＰ停止溶液（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で停止させ、各ウェルの吸光度を４５０ｎｍの波長で測定した。
【０３２７】
以下のＥＬＩＳＡプロトコルを用いて内在性のカニクイザル血清アルブミンを検出した。まず、ウサギ抗サル血清アルブミンをコーティング緩衝液（コーティング緩衝液＝１錠の炭酸塩−重炭酸塩カプセル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  ｃａｔ＃Ｃ−３０４１を１００ｍＬの水に溶かしたもの）で５μｇ／ｍｌまで希釈した。次に、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ／Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、１００μｌ／ウェルの５μｇ／ｍｌウサギ抗サル血清アルブミン（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，ｃａｔ＃ＲＡＭｏｎ／Ａｌｂ）でコーティングし、３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で４回洗浄し、３００μｌ／ウェルの５％魚ゼラチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  ｃａｔ＃Ｇ−７７６５）原液／ＰＢＳを用いて３７℃で１時間ブロッキングした。このプレートをＰＢＳＴで再び４回洗浄した。血清試料及び標準をＰＢＳＢで希釈した。標準曲線を２００ｎｇ／ｍｌ〜０．３９ｎｇ／ｍｌのサル血清アルブミン（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，ｃａｔ＃ＭｏｎＡｌｂ  Ｂａｔｃｈ＃６０８２）の範囲で定めた。その後、１００μｌ／ウェルの各試料を３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳＴで６回洗浄した。１００μｌ／ウェルの１：３０，０００希釈のヤギ抗ヒトアルブミン−ＨＲＰ抱合体（Ａｃａｄｅｍｙ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ｃａｔ＃ＡＬ１０Ｈ−Ｇ１ａ）／ＰＢＳＢを加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ基質（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて室温で約５分間発色させた。発色反応を１００μｌ／ウェルのＴＭＰ停止溶液（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で停止させ、各ウェルの吸光度を４５０ｎｍの波長で測定した。
【０３２８】
以下のＥＬＩＳＡプロトコルを用いて、内在性のカニクイザルＩｇＭを検出した。まず、ヤギ抗サルＩｇＭ抗体をコーティング緩衝液（コーティング緩衝液＝１錠の炭酸塩−重炭酸塩カプセル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  ｃａｔ＃Ｃ−３０４１を１００ｍＬの水に溶かしたもの）で５μｇ／ｍｌまで希釈した。次に、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ／Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、１００μｌ／ウェルの５μｇ／ｍｌヤギ抗サルＩｇＭ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ｃａｔ＃０７１−１１−０３１）でコーティングし、３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で４回洗浄し、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＢ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ；１０％ＢＳＡ／ＰＢＳストック（ＫＰＬ）から希釈）を用いて３７℃で１時間ブロッキングした。このプレートをＰＢＳＴで再び４回洗浄した。血清試料及び標準をＰＢＳＢで希釈した。標準曲線を２０００ｎｇ／ｍｌ〜１５．６ｎｇ／ｍｌのサルＩｇＭ（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ，ｃａｔ  ＃２００１３０１）の範囲で定めた。その後、１００μｌ／ウェルの各試料を３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μｌ／ウェルの１：１０，０００希釈のヤギ抗サルＩｇＭ−ＨＲＰ抱合体（ＲＤＩ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ，ｃａｔ  ＃６１７１０３００７）／ＰＢＳを加え、３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ基質（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて室温で約５分間発色させた。発色反応を１００μｌ／ウェルのＴＭＰ停止溶液（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で停止させ、各ウェルの吸光度を４５０ｎｍの波長で測定した。
（実施例２１）
【０３２９】
様々な投薬スケジュールを用いたＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧ異化に対するペプチド番号２７０の効果
成体ＴＧ３２Ｂマウスに、ｔ＝０時間（Ｔ０）で、５００ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を静脈内注射した。４匹のマウスの群に、ｔ＝２４時間で、５ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２７０（第１群）；ｔ＝２４及び７２時間で、５ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２７０（第２群）；並びにｔ＝２４、４８時間、７２、及び９６時間で、２．５ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２７０（第３群）を静脈内注射した。各時点で１５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を含むビヒクルＰＢＳを用いて、追加のマウスの群を用いて、対照注射を行なった。注射前に全ての時点で、及び１６８時間で、血液試料を採取した。実施例１８と同様に、血清を調製し、ＥＬＩＳＡを実施するまで−２０℃で保存した。
（実施例２２）
【０３３０】
追加のＴＧ３２Ｂマウス実験
ペプチド番号２７０を用いてＴＧ３２Ｂマウスで追加の実験を実施した。実施例１８で記載したのと同じ実験設計を用いて、ペプチド番号２７０がＩｇＧ異化の速度を加速するのに有効であることが、皮下（ＳＣ）及び腹腔内（ＩＰ）経路の投与を用いて分かった。２４時間から開始した５日用量の５ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２７０は、ペプチド番号２７０の皮下（ＳＣ）及び腹腔内（ＩＰ）注射の後、ＩｇＧの半減期を５６時間まで低下させることが分かった。これらの半減期は、８０〜１００時間のＩｇＧ半減期を示す典型的な対照群よりも顕著に短かった。更に、対照群と比較したとき、ｈＩｇＧの濃度は、ペプチド番号２７０を用いた１６８時間後に５６％（ＳＣ）及び６６％（ＩＰ）低下した。
【０３３１】
実施例１８で記載した実験プロトコルを用いて、ペプチド番号２３０もＴＧ３２Ｂマウスで試験した。ヒトＩｇＧを静脈内注射した２４時間後、５ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２３０の静脈内（ＩＶ）注射を、毎日、合計５日間投与した。対照群の半減期９２時間と比較したとき、ｈＩｇＧの半減期は、３９時間まで低下した。更に、対照群と比較したとき、ｈＩｇＧの濃度は、１６８時間後に７６％低下した。
【０３３２】
また、３回の１日ペプチド用量と比較したときの１回のペプチド用量の効果を評価するために設計された２つの実験で、ペプチド番号２３０を試験した。実施例１８で記載した実験プロトコルを用いて、ヒトＩｇＧを静脈内注射した２４時間後、１つの動物群を、１回の静脈内用量である５ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２３０で処理する一方、２番目の動物群は、３回連続で１日静脈内用量である５ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２３０を受けた。１２０時間後、単一用量のペプチド番号２３０は、マウスにおけるｈＩｇＧの濃度を４１％低下させた。３回の１日用量のペプチド番号２３０を受けたマウスの群では、ｈＩｇＧの濃度は、１２０時間後に６１％減少した。
（実施例２３）
【０３３３】
ＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧ異化に対するペプチド番号２８３の効果
成体ＴＧ３２Ｂマウスに、ｔ＝０時間（Ｔ０）で、５００ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を静脈内注射した。２４、４８、７２、及び９６時間で、０．５、１、２．５、５、又は１０ｍｇ／ｋｇのいずれかのペプチド番号２８３をマウスに静脈内注射した。対照注射は、１５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５を用いて各時点で行ない、全ての注射用のビヒクルとしての役割を果たした。注射前に全ての時点で、１２０時間、及び１６８時間で、並びに３０日で、血液試料を採取した。血清を調製し、ＥＬＩＳＡを実施するまで−２０℃で保存した。
【０３３４】
各時点での血清中ヒトＩｇＧの濃度を実施例１８で上記したように決定した。
（実施例２４）
【０３３５】
ペグ化されたペプチド番号２８９の合成
ペプチド番号２８５を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、１当量のＰＥＧ３０ｋＤａ−スクシニミジルエステル（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．（Ｊａｐａｎ）Ｃａｔ．Ｎｏ．  Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥＧＣ−３０ＴＳ）で１８時間処理した。この粗反応混合物を、実施例７で説明されるＣ４カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ，  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で精製し、凍結乾燥し、ペプチドが１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中で樹脂と結合する陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｆｒａｃｔｏｐｒｅｐ  ＳＯ３−、カタログ番号１．１７９７２、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）で再び精製し、樹脂を１０ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）で洗浄し、ペプチドを１００ｍＭ塩化ナトリウムで１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中に溶出した。このペプチド溶液を１％酢酸に対して透析し、凍結乾燥した。この精製ペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析して、約５０ｋＤａのペプチド染色バンドを示し、ＨＰＬＣで解析して、残存する遊離ペプチドがないことを示した（図７）。
【表２５】
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（実施例２５）
【０３３６】
ＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧ異化に対するペプチド番号２８９の効果
成体ＴＧ３２Ｂマウスに、ｔ＝０時間（Ｔ０）で、５００ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を静脈内注射した。２４時間で、２５ｍｇ／ｋｇのペプチド番号２８９をマウスに静脈内注射した。２４、４８、７２、９６、１２０、及び１６８時間で、血液試料を採取した。血清を調製し、ＥＬＩＳＡを実施するまで−２０℃で保存した。各時点での血清中ヒトＩｇＧの濃度を、実施例１８で上記したように決定した。結果を図８に示す。
（実施例２６）
【０３３７】
カニクイザルにおけるｈＩｇＧ異化並びに内在性ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びアルブミン濃度に対するペプチド番号２８３の効果
１８匹のカニクイザルを３匹の動物ずつの６群に分け、全ての動物を、ｔ＝３日で、５ｍｇ／ｋｇのビオチン化されたヒトＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）で処理した。ｔ＝０から始めて、動物を以下の投与レジメンに従ってペプチド番号２８３で４週間処理した。１）１ｍｇ／ｋｇ、３回／週、静脈内；２）１ｍｇ／ｋｇ、１回／週、皮下；３）１ｍｇ／ｋｇ、３回／週、皮下；４）５ｍｇ／ｋｇ、３回／週、静脈内；５）５ｍｇ／ｋｇ、１回／週、皮下；６）５ｍｇ／ｋｇ、３回／週、皮下。第４群についての最後のペプチド投与は１６日目であったことに留意されたい。血清試料を３日前、１５分前、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、１４日目、１６日目、１８日目、２１日目、２３日目、２５日目、２８日目、３０日目、３２日目、３５日目、４２日目、４９日目、７７日目に採取した。ビオチン化ヒトＩｇＧ、内在性ＩｇＧ、及びアルブミンの濃度を、実施例２０で記載したように決定した。
（実施例２７）
【０３３８】
還元的アルキル化を用いた３０ｋＤａのペグ化されたペプチド番号２９０の合成
ペプチド番号２８５及び１．２５当量の直鎖３０ｋＤａ  ＰＥＧ−アルデヒド（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．（Ｊａｐａｎ）  Ｃａｔ．Ｎｏ．  Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥ−３００−ＡＬ）を１０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ濃度で１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に溶解し、４℃で３０分間インキュベートした。その最終濃度が２０ｍＭになるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えた。この反応物を４℃で１８時間揺動し、その後実施例７で記載したように、逆相Ｃ４カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で精製して、遊離ペプチドを除去し、凍結乾燥した。その後、実施例２４で記載したように、この材料を陽イオン交換クロマトグラフィーで精製し、遊離ＰＥＧを除去した。実施例２４と同様に透析した後、ペプチド溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析して、約５０ｋＤａのバンドを示し、逆相ＨＰＬＣで解析して、残存する遊離ペプチドがないことを示した。図９、１０、及び１１を参照のこと。
（実施例２８）
【０３３９】
還元的アルキル化を用いた２０ｋＤａのペグ化されたペプチド番号２９１の合成
ペプチド番号２８５及び１．２５当量の直鎖２０ｋＤａ  ＰＥＧ−アルデヒド（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．（Ｊａｐａｎ）  Ｃａｔ．Ｎｏ．  Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥ−３００−ＡＬ）を１０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ濃度で１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に溶解し、４℃で３０分間インキュベートした。その最終濃度が２０ｍＭになるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えた。この反応物を４℃で１８時間揺動し、その後、実施例７で記載したように、逆相Ｃ４カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で精製して、遊離ペプチドを除去し、凍結乾燥した。その後、実施例２４で記載したように、この材料を陽イオン交換クロマトグラフィーで精製し、遊離ＰＥＧを除去した。１００〜３００ｍＭの酢酸ナトリウムを含む溶出画分を合わせ、Ｃ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）に通して、酢酸塩を除去し、その後１％酢酸から凍結乾燥した。ペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析して、約３５ｋＤａのバンドを示し、逆相ＨＰＬＣで解析して、残存する遊離ペプチドがないことを示した。図９、１０、及び１１を参照のこと。
（実施例２９）
【０３４０】
還元的アルキル化を用いた５ｋＤａのペグ化されたペプチド番号２９２の合成
ペプチド番号２８５及び１．２５当量の直鎖５ｋＤａ  ＰＥＧ−アルデヒド（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．（Ｊａｐａｎ）  Ｃａｔ．Ｎｏ．  Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥ−３００−ＡＬ）を１０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ濃度で１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に溶解し、４℃で３０分間インキュベートした。その最終濃度が２０ｍＭになるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えた。この反応物を４℃で１８時間揺動し、その後、実施例７で記載したように、逆相Ｃ４カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で精製して、遊離ペプチドを除去し、凍結乾燥した。その後、実施例２４で記載したように、この材料を陽イオン交換クロマトグラフィーで精製し、遊離ＰＥＧを除去した。１００〜３００ｍＭの酢酸ナトリウムを含む溶出画分を合わせ、Ｃ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）に通して、酢酸塩を除去し、その後１％酢酸から凍結乾燥した。ペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析して、約８ｋＤａのバンドを示し、逆相ＨＰＬＣで解析して、残存する遊離ペプチドがないことを示した。図９、１０、及び１１を参照のこと。
（実施例３０）
【０３４１】
ＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧ異化に対するペプチド番号２９０の効果
成体ＴＧ３２Ｂマウスに、ｔ＝０時間（Ｔ０）で、５００ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を静脈内注射した。２４時間で、５ｍｇ／ｋｇ又は２５ｍｇ／ｋｇのいずれかのペプチド番号２９０をマウスに静脈内注射した。２４、４８、７２、９６、１２０、及び１６８時間で、血液試料を採取した。血清を調製し、ＥＬＩＳＡを実施するまで−２０℃で保存した。各時点での血清中ヒトＩｇＧの濃度を、実施例１８で上記のように決定した（図１２）。
（実施例３１）
【０３４２】
還元的アルキル化を用いた４０ｋＤａのペグ化されたペプチド番号２９３の合成
ペプチド番号２８５及び１．２５当量の直鎖４０ｋＤａ  ＰＥＧ−アルデヒド（Ｄｏｗ  Ｐｈａｒｍａ，Ｃａｔ  ＃００８−００５）を１０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ濃度で１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に溶解し、４℃で３０分間インキュベートした。その最終濃度が２０ｍＭになるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えた。この反応物を４℃で１８時間揺動し、その後１０ｋＤａ膜カットオフを通して、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中に透析した。その後、実施例２４で記載したように、この材料を陽イオン交換クロマトグラフィーで精製し、遊離ＰＥＧを除去した。１％酢酸中に透析した後、ペプチド溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析して、約６５ｋＤａのバンド（図１１）を示し、逆相ＨＰＬＣ（ＴＳＫフェニル１０００  Ａカラム）で解析して、残存する遊離ペプチドがないことを示した。
（実施例３２）
【０３４３】
還元的アルキル化を用いた１０ｋＤａのペグ化されたペプチド番号２９４の合成
ペプチド番号２８５及び１．２５当量の直鎖１０ｋＤａ  ＰＥＧ−アルデヒド（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ，Ｊａｐａｎ，Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥ−１００−ＡＬ）を１０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ濃度で１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に溶解し、４℃で３０分間インキュベートする。その最終濃度が２０ｍＭになるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを加える。この反応物を４℃で１８時間揺動し、その後、実施例７で記載したように、逆相Ｃ４カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で精製して、遊離ペプチドを除去し、その後、液体を凍結乾燥する。実施例２４で記載したように、この材料を陽イオン交換クロマトグラフィーで精製し、遊離ＰＥＧを除去する。１００〜３００ｍＭ酢酸ナトリウムを含む溶出画分を合わせ、Ｃ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）に通して、酢酸塩を除去し、その後１％酢酸から凍結乾燥する。ペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析して、抱合反応がうまく行ったことを確認し、及び逆相ＨＰＬＣで解析して、最終産物中に残存する遊離ペプチドがないことを示す。
（実施例３３）
【０３４４】
２０ｋＤａの２アーム型ペグ化ペプチド番号２９５の合成
ペプチド番号２８５及び１．２５当量の２０ｋＤａ分岐ＰＥＧ−アルデヒド（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．（Ｊａｐａｎ）Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＧＬ３−２００ＡＬ０２０Ｕ）を１０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ濃度で１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に溶解し、４℃で３０分間インキュベートした。その最終濃度が２０ｍＭになるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えた。この反応物を４℃で１８時間揺動し、その後１０ｋＤａメンブレンカットオフを通して、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中に透析した。その後、実施例２４で記載したように、この材料を陽イオン交換クロマトグラフィーで精製して、遊離ＰＥＧを除去した。１％酢酸中に透析した後、ペプチド溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析して、約４４ｋＤａのバンド（図１２）を示し、逆相ＨＰＬＣ（ＴＳＫフェニル１０００  Ａカラム）で解析して、残存する遊離ペプチドがないことを示した。ペプチド番号２９５の構造を図１３に示す。
（実施例３４）
【０３４５】
４０ｋＤａの２アーム型ペグ化ペプチド番号２９６の合成
ペプチド番号２８５及び１．２５当量の４０ｋＤａ分岐状ＰＥＧ−アルデヒド（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．（Ｊａｐａｎ）Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＧＬ３−４００ＡＬ２）を１０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ濃度で１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に溶解し、４℃で３０分間インキュベートした。その最終濃度が２０ｍＭになるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えた。この反応物を４℃で１８時間揺動し、その後１０ｋＤａ膜カットオフを通して、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中に透析した。その後、実施例２４で記載したように、この材料を陽イオン交換クロマトグラフィーで精製して、遊離ＰＥＧを除去した。１％酢酸中に透析した後、ペプチド溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析して、約７５ｋＤａのバンド（図１２）を示し、逆相ＨＰＬＣ（ＴＳＫフェニル１０００  Ａカラム）で解析して、残存する遊離ペプチドがないことを示した。ペプチド番号２９６の構造を図１４に示す。
（実施例３５）
【０３４６】
ＴＧ３２ＢマウスにおけるヒトＩｇＧ異化に対するペプチド番号２９０、２９２、２９１、２９６、２９５、及び２９３の効果
成体ＴＧ３２Ｂマウスに、ｔ＝０時間（Ｔ０）で、５００ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を静脈内注射した。２４時間で、２５ｍｇ／ｋｇのペグ化されたペプチドをマウスに静脈内注射した。２４、４８、７２、９６、１２０、及び１６８時間で、血液試料を採取した。血清を調製し、ＥＬＩＳＡを実施するまで−２０℃で保存した。各時点での血清中ヒトＩｇＧの濃度を、実施例１８で上記したように決定した（図１２）。結果を図１５に示す。
（実施例３６）
【０３４７】
ペグ化されたペプチドのインビトロ活性
様々なペグ化されたペプチドのインビトロ活性を、実施例４で説明したＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて試験した。結果を図１６に示す。
（実施例３７）
【０３４８】
分岐ＰＥＧ結合を有する抗ＦｃＲｎペプチドの合成
リジン等のビス−アミンリンカーをペプチド番号２８５の遊離アミンに結合させ、ペグ化のための２つの利用可能なアミン部位を生み出すことができる。（アルデヒド−ＰＥＧのような）直鎖ＰＥＧとそのような化合物の反応は、図１７で示した抱合体のような、分岐ＰＥＧ−ペプチド抱合体を提供することができる。
（実施例３８）
【０３４９】
還元的アルキル化を用いた３０ｋＤａのペグ化されたペプチド番号２９７の合成
ペプチドを１，２−ジアミノエタントリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａｔ＃０１−６４−００８１）上で合成することを除いては、実施例１５で記載したように、Ｃ末端のエチルアミンリンカーを有するペプチド番号２９７（図１８参照）を合成した。ペプチド番号２９７及び０．７５当量の直鎖３０ｋＤａ  ＰＥＧ−アルデヒド（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．（Ｊａｐａｎ）Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥ−３００−ＡＬ）を１０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ濃度で１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に溶解し、４℃で３０分間インキュベートした。その最終濃度が２０ｍＭになるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えた。この反応物を４℃で１８時間揺動し、その後１０ｋＤａ膜カットオフを通して、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中に透析した。その後、実施例２４で記載したように、この材料を陽イオン交換クロマトグラフィーで精製して、遊離ＰＥＧを除去した。１％酢酸中に透析した後、逆相ＨＰＬＣ（ＴＳＫフェニル１０００  Ａカラム）でペプチド溶液を解析して、残存する遊離ペプチドがないことを示した。１００〜３００ｍＭ酢酸ナトリウムを含む溶出画分を合わせ、１％酢酸中に透析し、凍結乾燥した。実施例４で説明されるＩｇＧ競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いてペプチド番号２９７の活性を試験した。このアッセイの結果を図１９に示す。
（実施例３９）
【０３５０】
二酸リンカー及びアミンリンカーを用いた追加のペプチドダイマーの合成
追加のアミド結合ペプチドダイマー（表２７）を、以下のことを除いては、実施例１５で記載したように合成した。すなわち、ペプチド番号２９８は、１，２−ジアミノエタントリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａｔ  ＃０１−６４−００８１）上で合成し；ペプチド番号２９９は、１，４−ジアミノブタントリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａｔ  ＃０１−６４−００８２）上で合成し；ペプチド番号３００は、Ｏ−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコールトリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａｔ  ＃０１−６４−０２３５）上で合成し；ペプチド番号３０１は、ビス−（２−アミノエチル）−エーテルトリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ＃０１−６４−０１４１）上で合成した。
【表２６】
2010535788.tif 000082
【０３５１】
実施例１８で説明される、ｔ＝０時間での５００ｍｇ／ｋｇの静脈内用量のヒトＩｇＧ、その後のｔ＝２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、及び９６ｈでの、２．５ｍｇ／ｋｇのペプチド２９９、３００、及び３０１の皮下注射の後のＴＧ３２ＢにおけるヒトＩｇＧ異化の速度を図２０に示す。ｈＩｇＧの濃度を実施例１８と同様にＥＬＩＳＡで決定し、ｔ＝２４水準に対して標準化し、ビヒクル対照群と比較した。
（実施例４０）
【０３５２】
還元的アルキル化を用いた３０ｋＤａのペグ化されたペプチド番号３０７、３０８、及び３０９の合成
ペグ化されたペプチド３０７、３０８、及び３０９のペプチド構成要素は、それぞれ、ペプチド番号３０４、３０５、及び３０６である。３０４では、Ａｒｇ２をＬｙｓと置換し、３０５では、Ｔｈｒ４をＬｙｓと置換し、３０６では、Ｐｒｏ１２をＬｙｓと置換することを除いては、実施例１５のペプチド２８３のように、ペプチド３０４、３０５、及び３０６を合成した。これにより、ダイマーペプチド当たり２つのＬｙｓが与えられる。ＰＥＧ化を行なって、ダイマーペプチド当たり１つのＰＥＧ部分を生じさせる。
【０３５３】
ペプチド３０４、３０５、又は３０６及び２当量の直鎖３０ｋＤａ  ＰＥＧ−アルデヒド（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．（Ｊａｐａｎ）Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥ−３００−ＡＬ）を１０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ濃度で１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に溶解し、４℃で３０分間インキュベートした。その最終濃度が２０ｍＭになるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えた。この反応物を４℃で１８時間揺動し、その後１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）に対して透析して、遊離ペプチドを除去した。その後、実施例２４で記載したように、透析した反応物を陽イオン交換クロマトグラフィーで精製して、遊離ＰＥＧを除去した。精製材料を１％酢酸に対して透析し、凍結乾燥した。これらのペプチドの構造を図１９に示す。その後、これらのペプチドを、実施例４及び１８で記載したようにインビトロ及びインビボでの活性について試験した（図１６）。
（実施例４１）
【０３５４】
３０ｋＤａのペグ化されたペプチド３０３の合成
ダイマー化反応でＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＨ）−ＯＨを使用する代わりにＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＨ）−ＯＨを使用することを除いては、上記のように、ペプチド番号３０２を樹脂上で合成した。樹脂上のペプチドをＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＨ）−ＯＨと反応させて樹脂上のダイマーを作製した後、この樹脂を２０％ピペリジン／ＤＭＦ（２×１０分）で処理し、ＤＭＦで洗浄し、４当量のビス−Ｂｏｃ−アミノオキシ酢酸、４当量のＰｙＢＯＰ、及び８当量のＤＩＥＡ／ＤＭＦで処理し、１時間混合した。実施例１５で記載したように、このペプチドを樹脂から切断し、酸化し、ペプチド番号３０２を得た。
【化４４】
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【０３５５】
ペプチド番号３０２を、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを含む水の中で、１．１当量の３０ｋＤａ  ＰＥＧ−アルデヒド（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．，Ｊａｐａｎ，Ｃａｔ  ＃Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥ−３００−ＡＬ）で処理した。この反応混合物を３０分間インキュベートし、実施例２４と同様に精製し、ペプチド番号３０３を生じた。このペプチドのインビトロ及びインビボでの活性を、実施例４及び１８で記載したように試験し、その結果を図１６に示す。
【化４５】
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【０３５６】
本明細書は、本明細書中で引用された参照の教示に照らせば、完全に理解される。本明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の例証を提供するものであり、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。当業者は、他の多くの実施形態が本発明によって包含されるということを容易に認識する。本開示で引用された全ての刊行物及び特許は、それらの全文が参照することにより組み込まれる。参照することにより組み入れられる内容が本明細書と矛盾するか又は一致しない場合、本明細書は、いかなるそのような内容にも優先する。本明細書におけるいかなる参照の引用も、そのような参照が本発明の先行技術であるという承認ではない。
【０３５７】
特に指示がない限り、特許請求の範囲を含む、本明細書で使用される成分、反応条件等の量を表す全ての数字は、全ての場合に、用語「約」により修正されるものであると理解すべきである。したがって、特に反対の指示がない限り、数値パラメーターは近似であり、本発明によって得ようとしている所望の特性に応じて様々に変わり得る。最低限、特許請求の範囲に対する等価物の原理の応用を制限しようとするのではなく、各数値パラメーターは、有効数字の桁数及び普通の丸め手法（ｒｏｕｎｄｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈ）に照らして、解釈されるべきである。
【０３５８】
特に指示がない限り、一連の要素の前に置く用語「少なくとも」は、先行するあらゆる要素を指すものと理解されるべきである。当業者は、本明細書で記載された本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又はいつもと同じ程度の実験を用いて、それを確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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