(57)【要約】  本発明は、グリーベックで処理することに耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療において、以下の一般式（１）［式中、Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはヘテロシクリルであり；Ｒは、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｈ、アルキル、アリール、またはヘテロシクリルである］により示される、全てのその立体異性と互変異性形態のコーヒー酸またはその誘導体、ならびに全ての割合でのその混合物、ならびにその医薬上許容される塩、その医薬上許容される溶媒和物、その医薬上許容される多形体またはそのプロドラッグの使用に関する。本発明はまた、グリーベックに耐性である細胞増殖を減少させる方法であって、一般式（１）の化合物と細胞を接触させることによる方法に関する。本発明はまた、一般式（１）で示されるコーヒー酸または誘導体またはそれらの塩を含む（医薬の製造のための）医薬組成物であって、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療のため、あるいはグリーベックに耐性である細胞の増殖を減少させるための医薬組成物に関する。さらに、本発明は、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療方法に関する。
2010502586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療方法であって、一般式（１）
【化１】
2010502586.tif 000012
（１）
［式中、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはヘテロシクリルであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、または存在しない］
で示される、全てのその立体異性体および互変異性体形態のコーヒー酸またはその誘導体、ならびに全ての割合におけるその混合物、その医薬上許容される塩、その医薬上許容される溶媒和物、その医薬上許容される多形体、またはそのプロドラッグの治療上有効な量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２】
グリーベックによる治療に耐性である細胞の増殖を減少させる方法であって、一般式（１）
【化２】
2010502586.tif 000013
（１）
［式中、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはヘテロシクリルであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、または存在しない］
で示される、全てのその立体異性体および互変異性体形態のコーヒー酸またはその誘導体、ならびに全ての割合におけるその混合物、その医薬上許容される塩、その医薬上許容される溶媒和物、その医薬上許容される多形体、またはそのプロドラッグの治療上有効な量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３】
コーヒー酸またはその誘導体が：
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸［コーヒー酸］；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸メチルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸エチルエステル；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−アクリル酸２−ニトロ−エチルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｎ−プロピルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｉ−プロピルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ブチルエステル；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−ピペリジン−１−イル−プロペノン；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−プロペノン；
１−（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン；
（Ｅ）−３−｛４−［３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリロイル］−ピペラジン−１−イル｝プロピオニトリル；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１−［４−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−プロペノン；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１−（４−フェニルピペラジン−１−イル）−プロペノン；
（Ｅ）−１−（４−アセチル−ピペラジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−（４−フェネチル−ピペラジン−１−イル）−プロペノン；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−モルホリン−４−イル−プロペノン；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−Ｎ−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−アクリルアミド；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ−イソプロピル−アクリルアミド；または
１−（４−ベンジル−ピペリジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン
である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
コーヒー酸誘導体が：
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸メチルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸エチルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｎ−プロピルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｉ−プロピルエステル；
１−（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ−イソプロピル−アクリルアミド；または
１−（４−ベンジル−ピペリジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン
である、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項５】
式（１）で示されるコーヒー酸またはその誘導体が、合成されるか、または天然物に由来する、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項６】
グリーベックに対する耐性が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異により引き起こされる、請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
細胞が、Ｋ−５６２−Ｒ、３２ＤｃｌＢｃｒ−Ａｂｌ Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｋ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｐ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ３５１Ｔ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３５９Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３１７Ｌ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｒ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ２４４Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｑ２５２Ｈ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｆ、またはＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｈ細胞株を含む、請求項２記載の方法。
【請求項８】
一般式（１）
【化３】
2010502586.tif 000014
（１）
［式中、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはヘテロシクリルであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、または存在しない］
で示される、全てのその立体異性体および互変異性体形態のコーヒー酸またはその誘導体、ならびに全ての割合におけるその混合物、その医薬上許容される塩、その医薬上許容される溶媒和物、その医薬上許容される多形体、またはそのプロドラッグの治療上有効な量を活性成分として、単独でまたは少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤を一緒に含む、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療のための医薬組成物。
【請求項９】
請求項８記載の医薬組成物の治療上有効な量をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含む、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を治療する方法。
【請求項１０】
一般式（１）
【化４】
2010502586.tif 000015
（１）
［式中、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはヘテロシクリルであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、または存在しない］
で示される、全てのその立体異性体および互変異性体形態のコーヒー酸またはその誘導体、ならびに全ての割合におけるその混合物、その医薬上許容される塩、その医薬上許容される溶媒和物、その医薬上許容される多形体、またはそのプロドラッグの使用であって、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療のための医薬の製造のための使用。
【請求項１１】
別の抗ガン剤をさらに含む、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１２】
コーヒー酸またはその誘導体が：
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸［コーヒー酸］；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸メチルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸エチルエステル；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−アクリル酸２−ニトロ−エチルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｎ−プロピルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｉ−プロピルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ブチルエステル；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−ピペリジン−１−イル−プロペノン；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−プロペノン；
１−（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン；
（Ｅ）−３−｛４−［３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリロイル］−ピペラジン−１−イル｝プロピオニトリル；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１−［４−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−プロペノン；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１−（４−フェニルピペラジン−１−イル）−プロペノン；
（Ｅ）−１−（４−アセチル−ピペラジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−（４−フェネチル−ピペラジン−１−イル）−プロペノン；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−モルホリン−４−イル−プロペノン；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−Ｎ−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−アクリルアミド；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ−イソプロピル−アクリルアミド；または
１−（４−ベンジル−ピペリジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン
である、請求項１０記載の使用。
【請求項１３】
コーヒー酸誘導体が：
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸メチルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸エチルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｎ−プロピルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｉ−プロピルエステル；
１−（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ−イソプロピル−アクリルアミド；または
１−（４−ベンジル−ピペリジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン
である、請求項１０記載の使用。
【請求項１４】
式（１）で示されるコーヒー酸またはその誘導体が、合成されるか、または天然物に由来する、請求項１０記載の使用。
【請求項１５】
グリーベックに対する耐性が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異により引き起こされる、請求項１０記載の使用。
【請求項１６】
耐性が、Ｋ−５６２−Ｒ、３２ＤｃｌＢｃｒ−Ａｂｌ Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｋ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｐ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ３５１Ｔ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３５９Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３１７Ｌ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｒ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ２４４Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｑ２５２Ｈ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｆ、またはＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｈ細胞株中で見出される変異から生じる、請求項１０記載の使用。
【請求項１７】
耐性が、Ｋ−５６２−Ｒ、３２ＤｃｌＢｃｒ−Ａｂｌ Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｋ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｐ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ３５１Ｔ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３５９Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３１７Ｌ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｒ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ２４４Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｑ２５２Ｈ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｆ、またはＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｈ細胞株中で見出される変異から生じる、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
グリーベックによる治療に耐性である細胞の増殖を減少させる方法であって、一般式（１）
2010502586.tif 000016
（１）
［式中、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはヘテロシクリルであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、または存在しない］
により示される、全てのその立体異性体および互変異性体形態のコーヒー酸またはその誘導体、ならびに全ての割合におけるその混合物、その医薬上許容される塩、その医薬上許容される溶媒和物、その医薬上許容される多形体、またはそのプロドラッグの治療上有効な量と、細胞を接触させることを含む方法。
【請求項１９】
コーヒー酸またはその誘導体が：
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸［コーヒー酸］；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸メチルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸エチルエステル；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−アクリル酸２−ニトロ−エチルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｎ−プロピルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｉ−プロピルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ブチルエステル；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−ピペリジン−１−イル−プロペノン；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−プロペノン；
１−（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン；
（Ｅ）−３−｛４−［３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリロイル］−ピペラジン−１−イル｝プロピオニトリル；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１−［４−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−プロペノン；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１−（４−フェニルピペラジン−１−イル）−プロペノン；
（Ｅ）−１−（４−アセチル−ピペラジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−（４−フェネチル−ピペラジン−１−イル）−プロペノン；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−モルホリン−４−イル−プロペノン；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−Ｎ−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−アクリルアミド；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ−イソプロピル−アクリルアミド；または
１−（４−ベンジル−ピペリジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン
である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
コーヒー酸誘導体が：
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸メチルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸エチルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｎ−プロピルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｉ−プロピルエステル；
１−（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ−イソプロピル−アクリルアミド；または
１−（４−ベンジル−ピペリジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン
である、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
式（１）で示されるコーヒー酸またはその誘導体が、合成または天然物である、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
グリーベックに対する耐性が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異により引き起こされる、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
耐性が：Ｋ−５６２−Ｒ、３２ＤｃｌＢｃｒ−Ａｂｌ Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｋ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｐ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ３５１Ｔ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３５９Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３１７Ｌ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｒ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ２４４Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｑ２５２Ｈ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｆ、またはＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｈ細胞株で見出される変異から生じる、請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリーベック（Ｇｌｉｖｅｃ、イマチニブまたはＳＴＩ５７１）による治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療における、あるいはグリーベックに耐性である細胞の成長または増殖を減少させるための、コーヒー酸もしくは誘導体またはその塩の使用に関する。本発明はまた、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療のための、あるいはグリーベックに耐性である細胞の成長または増殖を減少させるための、一般式（１）により示されるコーヒー酸または誘導体またはその塩を含む（医薬の製造のための）医薬組成物に関する。本発明は、さらに、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、成熟の全ての段階において過剰な数の骨髄細胞を生じる悪性骨髄前駆細胞のクローン増殖により特徴付けされる。ＣＭＬの発生は、フィラデルフィア（Ｐｈ）染色体として知られる特異的な染色体転座に関連する。Ｐｈ染色体の体細胞変異は、染色体９と２２番の長腕の間の相互転座に由来する。この転座の分子的結果は、構成的な活性化チロシンキナーゼの融合タンパク質Ｂｃｒ−Ａｂｌを生じ、このタンパク質は疾病の過程を通して検出可能である。Ｐｈ染色体は、細胞増殖および分裂において中心的な役割を担う酵素を産生する。その酵素は、チロシンキナーゼ活性を高める融合タンパク質（Ｂｃｒ−Ａｂｌ）であり、細胞の正常な遺伝子の指令を変える。この異常な酵素は、細胞内の複数の経路を介してシグナルを送り出し、体内の白血球細胞の過剰産生を生じる。その結果、健常な血液１立方ミリメータ中には、４０００から１００００個の白血球が含まれるが、ＣＭＬにかかっている患者に由来する血液にはこの量の１０から２５倍が含まれる。白血球細胞数の大幅な増加がＣＭＬの特徴である。ＣＭＬに加えて、一部の急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）および急性骨髄性白血病ＡＭＬもまたＰｈ陽性白血病である。
【０００３】
グリーベック（Ｇｌｉｖｅｃ、イマチニブまたはＳＴＩ５７１）は、Ａｂｌキナーゼ抑制剤であり、現在、ＣＭＬ患者に対する最重要薬である。グリーベックは、フィラデルフィア染色体陽性のＣＭＬ患者の慢性期、加速期、または急性転化における治療に対して適用される。ある場合には、グリーベックは、インターフェロン−アルファ治療不全後に用いられる。さらにまた、ある場合には、インターフェロン−アルファ治療処置はグリーベック治療不全の後に施される。ＣＭＬにおけるグリーベックの有効性は、血液学および細胞遺伝学的反応速度全体に基づくものである。グリーベックは、これまで治療の選択肢が限定されていた疾患であるＣＭＬにかかっている患者に対して、新しい治療の選択肢を提供する新規な治療である。また、研究者にガンの生物学的メカニズムへの新しい概念を提供するものである。
【０００４】
グリーベックにより治療された患者の大半はいずれ有害事象を経験する。ほとんどの事象は、軽度から中程度であるが、ＣＭＬに対する第ＩＩ相臨床試験では、この薬は、慢性期では２％の患者、加速期では３％および急性転化では５％の有害事象のために中止となった。大半の共通な副作用として、吐き気、体液貯留、嘔吐、下痢、出血、筋痙攣、発疹、疲労、頭痛、消化不良および呼吸困難、ならびに好中球減少および血小板減少が含まれた。肝毒性（１％から４％）、体液貯留症候群（３％から１２％）、好中球減少（８％から４８％）および血小板減少（１％未満から３３％）のごとき深刻かつ重大な副作用もまた患者のいずれかで報告された。現在までに利用可能なグリーベック治療上の長期にわたる安全なデータは存在しない。グリーベックで治療されたＣＭＬ患者の大半は、著しい血液学および細胞遺伝学的反応を示すが、グリーベックによる治療に対する耐性はいまだ問題であり、主に疾患の加速期または急性転化期の患者で問題となる。
【０００５】
Ｎａｔｕｒｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎのＬｅｕｋｅｍｉａ（２００４、１−１１）の総論記事は、グリーベックによる治療に対する耐性の発生についての可能性のある理由を記載する。患者におけるグリーベックの治療に対する耐性は、非特異的な複数薬剤耐性からＢｃｒ−Ａｂｌ固有の遺伝子変化までに及ぶ異種混合（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｒｒａｙ）のメカニズムに関連している。獲得されたグリーベック耐性の最も高頻度で同定されたメカニズムは、グリーベック結合部位の妨害によるか、グリーベックへの結合の減少を伴うＢｃｒ−Ａｂｌ立体構造の安定化によるかのいずれかでグリーベック結合を障害するＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼドメイン点変異である。
【０００６】
ＵＳ２００６００５７１５７Ａ１はまた、グリーベックによる治療に対する耐性の発生についての可能性のある理由を記載する。この文献によると、アポトーシスの誘導が、化学治療剤の大半がその機能を発揮する基本的なメカニズムである。したがって、アポトーシスを受けないことが腫瘍における薬剤耐性を介在するメカニズムであろう。
【０００７】
ヒトＴ３１５Ｉは、最も一般的に観察されるＢｃｒ−Ａｂｌ変異型であり、グリーベック耐性である。Ｔ３１５Ｉは、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質のキナーゼドメインの位置３１５におけるスレオニン残基のイソロイシンへの点変異の結果である。
【０００８】
Ｂｌｏｏｄ，２００３，１０１，６９０−６９８は、Ｋ−５６２−Ｒ耐性細胞株を記載する。Ｋ−５６２は、野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質を含むヒト白血球細胞株の１つであり、一方で、Ｋ−５６２−Ｒは、数回の継代の間にグリーベック（２μｇ／ｍｌ）への継続的な露出によりグリーベックに対して耐性とされるＫ−５６２細胞株である。
【０００９】
Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００５，１８３−１８７は、治験中の２つの小分子ＡＢＬキナーゼ阻害剤ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）およびＡＭＮ１０７を記載し、イマチニブ（グリーベック）耐性ＣＭＬの治療に対して第Ｉ相臨床試験で有効性を示し、臨床的に評価されている。これらの新規な阻害剤の長期間の有効性については残された課題である。
【００１０】
Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００６，６６（２），１００７−１０１４およびＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰＮＡＳ），２００５，１０２（６），１９９２−１９９７は、グリーベック耐性ＣＭＬ（Ｔ３１５Ｉ）に対して活性な２つの化合物ＶＸ−６８０およびＯＮ−０１２３８０を記載する。
【００１１】
Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００５，６５（１１），４５００−４５０５は、臨床的に関連するイマチニブ耐性ＡｂＩキナーゼドメイン変異に対するＢｃｒ−ＡｂＩ阻害剤ＡＭＮ１０７およびＢＭＳ−３５４８２５のインビトロ活性を記載する。この論文は、様々なイマチニブ耐性細胞株−Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｋ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｐ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ３５１Ｔ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３５９Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３１７Ｌ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｒ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ２４４Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｑ２５２Ｈ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３ＦおよびＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｈを記載する。
【００１２】
植物化学物質のコーヒー酸（３，４−ジヒドロキシ桂皮酸）は、コーヒー、果物、野菜、穀物およびミツバチプロポリスの構成要素である。コーヒー酸は、抗酸化および抗ウイルス効果のごとき様々な薬理学的活性を有することが知られている。コーヒー酸またはエステルのごとき誘導体は抗ガン活性を示すことが報告されている。
【００１３】
その後の報告は、コーヒー酸またはその誘導体の特異的な抗ガン特性を示す。
【００１４】
Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００４，６，Ｒ６３−Ｒ７４は、Ｔ４７Ｄヒト乳ガン細胞におけるコーヒー酸の抗増殖およびアポトーシス効果を記載する。
【００１５】
Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍ．，２００１，２２（１０），１１３１−１１３５は、Ｆｏｓ−Ｊｕｎ−ＤＮＡ複合体形成およびガン細胞増殖の抑制におけるコーヒー酸メチルエステルの阻害効果を記載する。この論文は、ヒトガン細胞株（Ａ５４９およびＫ−５６２）に対する細胞障害性効果を記載する。
【００１６】
Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２００５，２８（１２），２３３８−２３４１は、アポトーシスを介在するヒト組織球性リンパ腫Ｕ９３７細胞のオクチルカフェアート（ｏｃｔｙｌｃａｆｆｅａｔｅ）による増殖抑制を記載する。
【００１７】
Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９６，１０８，２１１−２１４は、ヒト白血病ＨＬ−６０細胞におけるコーヒー酸フェネチルエステルの阻害効果を記載する。
【００１８】
Ｊ．  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，１７（５），３５６−３６２は、ヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼ発現の下方調節により介在されるガン細胞転移のコーヒー酸フェネチルエステルの阻害効果を記載する。
【００１９】
以下の特許出願は、コーヒー酸またはその誘導体を含む組成物を開示する。
【００２０】
ＷＯ９１０５５４３は、活性成分としてコーヒー酸またはそのエステルもしくはアミドのうちの１つを含む医薬または化粧品組成物を記載する。
【００２１】
ＪＰ６００１３７１２は、５−リポキシゲナーゼ活性の抑制のための、活性成分としてのコーヒー酸メチルエステルを含む薬剤を記載する。
【００２２】
例えば、Ｂｃｒ−Ａｂｌ変異に対するグリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を治療するための医薬に緊急の必要性が存在する。
【００２３】
本発明は、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を治療するためのコーヒー酸またはその誘導体もしくは塩の使用に関する。本発明はまた、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を治療するための方法に関する。本発明の化合物は、Ｋ−５６２−および３２ＤｃｌＢｃｒ−Ａｂｌ Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｋ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｐ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ３５１Ｔ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３５９Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３１７Ｌ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｒ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ２４４Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｑ２５２Ｈ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｆ、およびＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｈを含むグリーベック耐性細胞株の増殖を抑制する方法において用いることができる。
【００２４】
本発明はまた、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を治療するための方法であって、治療上有効な量の式（１）のコーヒー酸もしくは誘導体、またはその塩を投与することを含む方法に関する。
【００２５】
本発明はまた、グリーベックに耐性である細胞の増殖を減少させる方法であって、式（１）のコーヒー酸もしくは誘導体、またはその塩と、細胞を接触させることを含む方法に関する。
【００２６】
さらに、本発明は、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を治療するための医薬組成物であって、治療上有効な量の式（１）のコーヒー酸もしくは誘導体、またはその塩を含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
なおさらに、本発明は、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を治療するための医薬の製造のための、コーヒー酸もしくは誘導体またはその塩の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、イマチニブ感受性（Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＷＴ）およびイマチニブ耐性（Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ）細胞株における本発明の化合物の抗増殖活性を示す。
【図２】図２は、本発明の化合物の抗増殖活性を示し、臨床中に観察されるごとく、イマチニブ耐性の低頻度変異を有する細胞（Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｋ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｐ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ２４４ＶおよびＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｑ２５２Ｈ）における、平均ＩＣ５０値としてμＭ単位で表す。
【図３】図３は、本発明の化合物の抗増殖活性を示し、臨床中に観察されるごとく、イマチニブ耐性の高頻度変異を有する細胞（Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ３５１Ｔ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３５９Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３１７Ｌ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｒ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３ＦおよびＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｈ）における、平均ＩＣ５０値としてμＭ単位で表す。
【図４】図４は、イマチニブ感受性および耐性細胞株における、（５μＭの）本発明の化合物による、４８時間後のアポトーシスの誘導を示す。
【図５】図５Ａは、イマチニブ耐性（Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ）異種移植モデルのＳＣＩＤにおける本発明の化合物のインビボ有効性を示す。図５Ｂは、イマチニブ感受性（Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＷＴ）異種移植モデルのＳＣＩＤにおける本発明の化合物のインビボ有効性を示す。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、以下の一般式（１）
【化１】
2010502586.tif 000003
（１）
［式中、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはヘテロシクリルであり；
Ｒは、存在するか、または存在せず、存在する場合、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロシクリル（すなわち、Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、または存在しない）である］
で示される、全てのその立体異性体および互変異性体形態のコーヒー酸またはその誘導体、ならびに全ての割合におけるその混合物、その医薬上許容される塩、その医薬上許容される溶媒和物、その医薬上許容される多形体、またはそのプロドラッグを提供する。
【００３０】
定義
定義を以下に記載し、それらを明細書および特許請求の範囲を通して用いられる用語に適用する。
【００３１】
本明細書で用いられるように、用語「アルキル」は、直鎖または分岐鎖アルキル基を含む脂肪族基を意味する。さらに、特に示されていない限り、用語「アルキル」は、置換されていないアルキル基ならびに１つまたはそれ以上の異なる置換基により置換されるアルキル基を含む。
【００３２】
１の具体例において、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格に２０個またはそれ以下の炭素原子（例えば、直鎖ではＣ１−Ｃ２０、分岐鎖ではＣ３−Ｃ２０）、例えば、１５個またはそれ以下の炭素原子を有する。１から２０個の炭素原子を含むアルキル残基の例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシルおよびエイコシル、これらの残基全てのｎ−異性体、イソプロピル、イソブチル、１−メチルブチル、イソペンチル、ネオペンチル、２，２−ジメチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、イソヘキシル、２，３，４−トリメチルヘキシル、イソデシル、ｓｅｃ−ブチル、またはｔｅｒｔ−ブチルである。適当なアルキル残基は、１から６個の炭素原子、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−プロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、またはイソ−ブチルのごとき、１から４個の炭素原子を含む。
【００３３】
アルキル基は、置換されていてもよく、または置換されていなくてもよい。特に示されていない限り、アルキル基は、置換され得ないか、または１個もしくはそれ以上（例えば、１、２、３、４または５個）の同一のもしくは異なる置換基により置換され得る。置換されたアルキル残基に存在するいかなる種類の置換基も、その置換が不安定な分子を誘導しない限り、いずれの所望の位置に存在することができる。置換されたアルキルは、１個またはそれ以上、例えば、１、２、３、４または５個の水素原子が、置換基、例えば、アルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル、カルボキシル、アルコキシル、シクロアルキル、エステル、エーテル、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ−アルキルアミノ、アミド、イミノ、ニトロ、アラルキル、アシルオキシ、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールに置換されるアルキル残基を意味する。
【００３４】
本明細書で用いられるように、用語「アリール」は、１４個までの環炭素原子、例えば、１０個までの環炭素原子を有し、抱合されたπ電子系を有する少なくとも１個の環状炭素環が存在する単環または多環式炭化水素基を意味する。（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール残基の適当な例は、フェニル、ナフチル、ビフェニル、フルオレニルまたはアントラセニル、特に、フェニルおよびナフチルを含む。特に示されない限り、アリール残基、例えば、フェニル、ナフチルまたはフルオレニルは、一般的に、１個またはそれ以上、例えば、ハロゲン、アルキル、フルオロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシ、アミノ、シアノ、ニトロ、チオール、イミン、アミド、カルボニル、アリール、およびヘテロシクリルからなる群から選択される５個までの同一または異なる置換基により置換され得るか、または置換され得ない。
【００３５】
用語「ヘテロシクリル」は、１４個までの環状原子を含み、そのうちの１、２または３個が窒素、炭素、または硫黄から選択される同一のまたは異なるヘテロ原子である、飽和、部分的に未飽和または芳香族の単環または多環式環系を意味する。ヘテロシクリル基は、例えば、環中に１もしくは２個の酸素原子および／または１もしくは２個の硫黄原子および／または１から４個の窒素原子を有してもよい。環状ヘテロ原子は、生じるヘテロ環系が当該技術分野で知られ、製剤原料中にサブグループとして安定で適切である限り、いかなる所望の数で、かついかなる位置に存在することができる。ヘテロシクリル基の適当な例は、ピペラジニル、ピペリジニル、イミダゾリル、ピロリジニル、モルホリニル、ベンゾオキサゾリル、キノリル、イソキノリル、カルバゾリル、インドリル、イソインドリル、フェノキサジニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、またはベンゾフラザニルを含む。
【００３６】
ヘテロシクリル基は、置換されていてもよく、または置換されていなくてもよい。特に示されていない限り、式１の化合物の定義でヘテロシクリル基に結合した置換基のいずれに関わらず、ヘテロシクリル基は、置換され得ないか、または環状炭素原子上で１個またはそれ以上の置換基、５個までの同一または異なる置換基を置換され得る。環状炭素および環状窒素原子の置換基に適当な例は、アルキル、アラルキル、アルコキシル、ハロゲン、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、フルオロアルキル、アリールオキシル、アミノ、シアノ、ニトロ、チオール、イミン、アミド、カルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アリール、またはヘテロシクリルを含む。置換基は、結果として安定な分子が生じる限り、１個またはそれ以上の位置に存在することができる。
【００３７】
本明細書で用いられるように、用語「アラルキル」は、アリールまたはヘテロアリール基で置換されたアルキル基を意味し、用語アルキル、アリール、およびヘテロアリールは上述の定義のごとくである。典型的なアラルキル基は、−（ＣＨ２）ｐ−フェニルまたは−（ＣＨ２）ｐ−ピリジルを含み、ここで、ｐは１から３の整数である。アラルキル基は、アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、アリール、ヘテロアリール、またはそれらの類似物質でさらに置換されていてもよい。
【００３８】
用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味する。
【００３９】
本明細書で用いられるように、用語「治療」「治療する」および「治療法」ならびにその類似用語は、患っている疾病（例えば、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））を軽減すること、進行を遅延させること、予防、低減または治癒を意味する。「予防する」は、本明細書で用いられるように、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の発症を遅らせ、遅延させ、抑制し、減少させ、または改善させることを意味する。
【００４０】
本明細書で用いられるように、用語「医薬上許容される」は、担体、希釈剤、賦形剤、および／または塩が製剤の他の活性成分に適合されなくてはならず、その受容者に有害であってはならないことを意味する。
【００４１】
用語「治療上有効な量」は、本明細書で用いられるように、適切な医学的判断の範囲内において、調節または治療される状態の陽性の改善を有意に導くのに十分であり、もしあれば（妥当な利益／リスクの比率で）副作用を回避するのに十分に低い化合物または組成物（例えば、式（１）のコーヒー酸または誘導体）の量を意味する。化合物または組成物の治療上有効な量は、治療される特定の条件、患者の年齢と身体的状態、治療／予防される状態の重症度、治療期間、併用される治療の形態、適用される特定の化合物または組成物、使用される特定の医薬上許容される担体、およびこれらの類似因子により変動する。
【００４２】
コーヒー酸化合物およびそれらを適用する方法
一般式（１）のコーヒー酸または誘導体は、文献中で知られており、下記で示されるスキームＩにより合成され、任意選択的に、それらの医薬上許容される塩に変換されうる。
【００４３】
３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（Ａ）は、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００３，５９，４３８３−４３８７に記載の方法により乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の炭酸セシウムの存在下でジブロモメタンによる処理によりピペロナール（Ｂ）に変換されうる。これにより得られたピペロナール（Ｂ）は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，３７，９７９−９８４に記載の方法によりマロン酸とのクネーフェナーゲル縮合にかけられて３，４−（メチレンジオキシ）桂皮酸（Ｃ）が得られうる。この酸（Ｃ）は、塩化チオニルとメタノールとの反応によりそのメチルエステル（Ｄ）に変換されうる。三臭化ホウ素を用いるメチルエステル（Ｄ）のメチレンジオキシ基の脱保護は、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７４，３９，１４２７−１４２９に記載の手順により行われうる。反応混合物の仕上げ工程（ｗｏｒｋ  ｕｐ）はエステルの加水分解を生じ、コーヒー酸（Ｅ）が得られうる。コーヒー酸（Ｅ）は、０℃で適当なアルコールの存在下で塩化チオニルまたは塩化オキサリルとの処理、続いて反応の要件に応じてこの混合物を室温まで温めるか、または還流で加熱させることにより、エステル（Ｆ）（Ｘ＝ＯおよびＲ＝アルキル、アリール、またはヘテロシクリル）に変換されうる。コーヒー酸（Ｅ）は、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００４，１４，４６７７−４６８１に記載の手順により室温で塩化メチレン中の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、および
【化２】
2010502586.tif 000004
トリエチルアミンを用いて適当なアミンとのカップリングにより、アミド（Ｆ）（Ｘ＝ＮおよびＲ＝Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロシクリル）に変換されうる。代替的な方法において、コーヒー酸は、塩化チオニルまたは塩化オキサリルとの処理によりその酸塩化物に変換され、後に、選択されたアミンとの処理によりアミド（Ｆ）（Ｘ＝ＮおよびＲ＝Ｈ、アルキル、アリールまたはヘテロシクリル）に変換されうる。
【００４４】
一般式（１）のコーヒー酸または誘導体はまた、植物抽出物のごとき天然物から得られうる。
【００４５】
本発明の式（１）のコーヒー酸または誘導体は、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に有用である。
【００４６】
式（１）の化合物の抗増殖活性は、Ｋ−５６２−Ｒおよび３２ＤｃｌＢｃｒ−Ａｂｌ Ｔ３１５Ｉのごときグリーベック耐性変異細胞株に対して評価されうる。数種類の他の造血性細胞株はまた、抗増殖活性に関する化合物を研究するために用いることができる。前記細胞株は、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｋ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｐ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ３５１Ｔ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３５９Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３１７Ｌ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｒ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ２４４Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｑ２５２Ｈ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｆ、またはＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｈを含む。
【００４７】
本発明の態様は、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）にかかっている哺乳動物（例えば、ヒト）を治療するための方法であって、一般式（１）で示される化合物またはその化合物の医薬上許容される塩の治療上有効な量を前記哺乳動物に投与することによる方法である。
【００４８】
本発明の別の態様は、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）から生じる傷害を予防し、減少させ、または最小にするための方法であって、一般式（１）の化合物またはこの化合物の医薬上許容される塩の治療上有効な量を患っている哺乳動物（例、女または男のヒト）に投与することによる方法を対象とする。
【００４９】
本発明はまた、グリーベックによる治療に耐性である細胞の増殖を減少させるための方法を提供する。この方法は、コーヒー酸またはその誘導体もしくはその塩と細胞を接触させることを含む。本発明の１の態様では、コーヒー酸、誘導体、または塩は一般式（１）で示される化合物である。化合物は、グリーベック耐性細胞の増殖を減少させるのに治療上有効な量で投与されうる。
【００５０】
本発明において、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療に有用である代表的な化合物は：
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸［コーヒー酸］；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸メチルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸エチルエステル；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−アクリル酸２−ニトロ−エチルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｎ−プロピルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｉ−プロピルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ブチルエステル；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−ピペリジン−１−イル−プロペノン；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−プロペノン；
１−（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン；
（Ｅ）−３−｛４−［３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリロイル］−ピペラジン−１−イル｝プロピオニトリル；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１−［４−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−プロペノン；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１−（４−フェニルピペラジン−１−イル）−プロペノン；
（Ｅ）−１−（４−アセチル−ピペラジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−（４−フェネチル−ピペラジン−１−イル）−プロペノン；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−モルホリン−４−イル−プロペノン；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−Ｎ−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−アクリルアミド；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ−イソプロピル−アクリルアミド；または
１−（４−ベンジル−ピペリジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノンを含む。
【００５１】
本発明において、グリーベックによる治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療に適当な化合物は：
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸メチルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸エチルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｎ−プロピルエステル；
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｉ−プロピルエステル；
１−（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン；
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｎ−イソプロピル−アクリルアミド；または
１−（４−ベンジル−ピペリジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノンを含む。
【００５２】
本発明は、さらに、通常の医薬上許容される担体を加えた一般式（１）のうちの少なくとも１つの化合物またはその生理学的に許容される塩の有効な量を含む医薬組成物、ならびに式（１）の化合物の少なくとも１つを、医薬上適切かつ生理学的に耐えられる賦形剤および適当な場合にはさらに適切な活性化合物、添加剤または補助剤を用いて適切な投与形態中に導入することを含む、医薬品の製造方法に関する。
【００５３】
本発明の化合物は、ガン、特に、グリーベック治療に反応しない慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を治療するのに有用である。したがって、本発明は、グリーベック治療に反応しない慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）のごときガンの予防または治療のための、医薬の製造のための一般式（１）の化合物の使用に関する。
【００５４】
１の具体例において、本発明は、グリーベック活性による治療に耐性である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療または予防のための医薬の製造のための方法であって、一般式（１）のうちの少なくとも１つの化合物が医薬上活性な物質として用いられることを特徴とする方法に関する。
【００５５】
本発明は、さらに、グリーベックによる治療に耐性である細胞の増殖を減少させるための、一般式（１）のうちの少なくとも１つの化合物を含む医薬の製造のための方法に関する。
【００５６】
本発明はまた、一般式（１）の化合物またはこの化合物の医薬上許容される塩の他の医薬上活性な化合物との組み合わせた使用を想定する。例えば、一般式（１）の化合物または医薬上許容される塩を含む医薬組成物は、グリーベック耐性細胞または腫瘍に対して活性であるいずれか他の化合物、または上記疾病のうちの１つを治療するのに有用であることが知られるいずれか他の医薬上活性な化合物と一緒に、相互に混合するかまたは医薬調製物の形態において、哺乳動物、特にヒトに投与されうる。
【００５７】
本発明の化合物は、インビボでグリーベック感受性（例えば、Ｋ−５６２またはＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＷＴ）およびグリーベック耐性（Ｋ−５６２−Ｒおよび３２ＤｃｌＢｃｒ−Ａｂｌ Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｋ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｐ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ３５１Ｔ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３５９Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３１７Ｌ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｒ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ２４４Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｑ２５２Ｈ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｆ、またはＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｈ）の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞の集団を減少させる方法において用いることができる。
【００５８】
グリーベック感受性およびグリーベック耐性の腫瘍モデルにおける本発明の化合物のインビボ有効性は、ＳＣＩＤ（Ｓｅｖｅｒｅｌｙ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）マウスの異種移植モデルにおいて、全長野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌ（Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＷＴ）または変異型Ｂｃｒ−Ａｂｌ（Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ）を発現するＢａ／Ｆ３トランスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）のごとき細胞株を用いることにより評価することができる。
【００５９】
したがって、本発明は、ガン、特に、グリーベック治療に反応しない慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の予防または治療のための医薬の製造のための一般式（１）の化合物の使用に関する。
【００６０】
本発明の１の態様において、本明細書に記載される治療方法および細胞増殖を減少させる方法は、下記の投与経路、様式等により投与することができる上述の医薬組成物を使用する。
【００６１】
医薬組成物および方法
医薬品は、経口、例えば、ピル、錠剤、被膜錠剤、カプセル、顆粒またはエリキシル剤の形態で投与することができる。しかし、投与はまた、例えば、坐剤の形態で、直腸内に、あるいは、注射可能な滅菌溶液または懸濁液の形態で、非経口的に、例えば、静脈内、筋肉内または皮下に、あるいは、溶液または経皮貼布の形態、あるいは、他の方法で、例えば、エアロゾルまたは鼻腔用スプレーの形態で、局所的に行うことができる。
【００６２】
本発明による医薬調製物は、当業者に公知および慣用な手段で調製される。医薬上許容される不活性な無機および／または有機担体および／または添加剤は、一般式（１）の化合物、および／またはその（それらの）生理学的に許容される塩に添加して用いることができる。ピル、錠剤、被膜錠剤および硬ゼラチンカプセルの生成には、例えば、ラクトース、コーンスターチまたはその誘導体、アラビアゴム、マグネシアまたはグルコース等を使用することができる。軟ゼラチンカプセルおよび坐剤用の担体は、例えば、脂肪、ワックス、天然油または硬化油等である。溶液、例えば、注射溶液、または乳剤もしくはシロップの生成に適当な担体は、例えば、水、生理食塩溶液またはアルコール、例えば、エタノール、プロパノールまたはグリセロール、グルコース溶液またはマンニトール溶液のごとき糖液、あるいは公知である様々な溶媒混合物である。
【００６３】
医薬調製物は、通常、約１から９９重量％、例えば、約５から７０重量％、または約１０から約３０重量％の式（１）で示される化合物またはその生理学的に許容される塩を含む。医薬調製物中の式（１）またはその生理学的に許容される塩の活性成分の量は、通常、約５から５００ｍｇである。投与されるべき本発明の化合物の用量は、広範囲で包含できる。１日に投与されるべき用量は、所望の効果に適するように選択されるべきである。適当な用量は、約０．００１から１００ｍｇ／ｋｇ／日の式（１）で示される化合物またはそれらの生理学的に許容される塩、例えば、約０．０１から５０ｍｇ／ｋｇ／日の式（１）で示される化合物またはこの化合物の医薬上許容される塩である。必要に応じて、より高いか、またはより低い１日の用量もまた投与されうる。本発明の医薬組成物における活性成分の実際の用量レベルは、患者に毒性を示すことなく、特定の患者、組成物、および投与形態によって所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変動されてもよい。
【００６４】
選択される用量レベルは、用いられる本発明の特定の化合物、またはエステル、その塩もしくはアミドの活性、用いられる特定の化合物の投与経路、投与時間、排出速度、治療期間、用いられる特定の化合物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物および／または物質、治療される患者の年齢、性別、重量、状態、総体的な健康および以前の病歴、ならびに医学分野で周知な類似因子を含む多くの因子に依存する。
【００６５】
医薬調製物は、一般式（１）の活性成分またはその生理学的に許容される塩および担体物質に加えて、例えば、充填剤、抗酸化剤、分散剤、乳剤、消泡剤、香味料、保存剤、安定化剤または着色剤のごとき添加剤を含むことができる。それらはまた、２つまたはそれ以上の一般式（１）の化合物またはそれらの生理学的に許容される塩を含む。さらに、医薬調製物はまた、一般式（１）で示される少なくとも１つの化合物またはその生理学的に許容される塩に加えて、１つまたはそれ以上の他の治療上または予防上活性な成分を含むことができる。
【００６６】
本発明の様々な実施態様の活性に実質的に影響を与えない改変も、本明細書中で開示される本発明内に含まれるものと理解される。したがって、下記の実施例は例示を意図するものであるが、本発明を限定するものではない。
【００６７】
（実施例１）
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸［コーヒー酸］（化合物１）
実施例１ｃの化合物（６．０ｇ、０．０２９ｍｏｌ）をクロロホルム（２０ｍＬ）中に溶解し、クロロホルム（９０ｍＬ）中の２５％ｗ／ｖの三臭化ホウ素溶液を添加し、２５℃で１６時間撹拌した。反応混合物を２５℃で撹拌しながら、１０％重炭酸ナトリウム水溶液を滴下して反応を停止させ、最終的にｐＨ７とした。有機相を分離し、水（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して表題化合物を得た。
収率：２．０ｇ（３８．３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３＋ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ６．８３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ）、６．４１（ｄ，１Ｈ）、６．２５（ｄｄ，１Ｈ）、６．１８（ｄ，１Ｈ）、６．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ）。
【００６８】
（実施例１ａ）
ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−カルバルデヒド［ピペロナール］
３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（２５ｇ、０．１８１ｍｏｌ）、炭酸セシウム（８８．２９ｇ、０．２７１ｍｏｌ）およびジブロモメタン（１９．０ｍＬ、０．２７１ｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４００ｍＬ）中に溶解し、反応混合物を１１０℃で１．５時間加熱した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを減圧下で蒸発させ、反応混合物を酢酸エチル（５００ｍＬ）を用いて希釈し、水（２ｘ２５０ｍＬ）およびブライン（２ｘ２５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して表題化合物を得た。
収率：２３．０ｇ（８４．６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ９．８（ｓ，１Ｈ）、７．４２（ｄ，１Ｈ）、７．３４（ｄ，１Ｈ）、６．９４（ｄ，１Ｈ）、６．０９（ｓ，２Ｈ）。
【００６９】
（実施例１ｂ）
３−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−アクリル酸
実施例１ａの化合物（２３ｇ、０．１５３ｍｏｌ）およびマロン酸（３１．７７ｇ、０．３０５ｍｏｌ）の混合物をピリミジン（６９ｍＬ）中に撹拌しながら溶解し、ピペリジン（０．９２ｍＬ）を添加した。反応混合物を８５℃で１時間加熱し、その後、温度を１０５℃までさらに上昇させ、この温度を３時間維持した。反応混合物を冷まし、水（５０ｍＬ）で希釈し、１０％  水酸化ナトリウム水溶液を用いて（ｐＨ９まで）塩基性にした。混合物を酢酸エチルで抽出した（２ｘ２５０ｍＬ）。水相を５０％塩酸水溶液を用いて（ｐＨ２まで）酸性にし、生じた固体をろ過し、水で洗浄し、乾燥させて表題化合物を得た。
収率：２０．０ｇ（６８％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．４２（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、７．３１（ｓ，１Ｈ）、７．１０（ｄ，１Ｈ）、６．９２（ｄ，１Ｈ）、６．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、６．０４（ｓ，２Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ−）：１９１（Ｍ−１）。
【００７０】
（実施例１ｃ）
３−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−アクリル酸メチルエステル
実施例１ｂの化合物（２５ｇ、０．１３ｍｏｌ）をメタノール（２００ｍＬ）中に溶解し、０−５℃まで冷却した。塩化チオニル（１４．２ｍＬ、０．１９５ｍｏｌ）を滴下し、混合物を０℃で３０分間撹拌した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、１６時間撹拌した。反応終了時、混合物を減圧下で濃縮した。残渣を１０％重炭酸ナトリウムで希釈してｐＨ７とし、酢酸エチルで抽出した（２ｘ２５０ｍＬ）。有機相を水（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して白色固体として表題化合物を得た。
収率：２０．０ｇ（７４．６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、７．３８（ｄ，１Ｈ）、７．１７（ｄｄ，１Ｈ）、６．９３（ｄ，１Ｈ）、６．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、６．０５（ｓ，２Ｈ）、３．６８（ｓ，３Ｈ）。
【００７１】
（実施例２）
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸メチルエステル（化合物２）
化合物１（８．０ｇ、０．０４４ｍｏｌ）をメタノール（７０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化チオニル（４．８４ｍＬ、０．０６６ｍｏｌ）を０℃に温度を３０分間維持しながら滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、１６時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を１０％重炭酸ナトリウムで希釈してｐＨ７にし、酢酸エチルで抽出した（２ｘ１００ｍＬ）。有機相を水（５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して白色固体として表題化合物を得た。
収率：７．５ｇ（８７．８％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、７．０２（ｓ，１Ｈ）、６．９８（ｄ，１Ｈ）、６．７３（ｄ，１Ｈ）、６．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、３．７（ｓ，３Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ−）：１９３（Ｍ−１）。
【００７２】
（実施例３）
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸エチルエステル（化合物３）
化合物１（０．２ｇ、１．１１ｍｍｏｌ）をエタノール（１５ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化チオニル（０．１ｍＬ、１．４１ｍｍｏｌ）を０℃に温度を維持して３０分かけて滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、５０℃まで加熱し、その温度で一晩（１６時間）維持した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を１０％重炭酸ナトリウムで希釈してｐＨ７とし、酢酸エチルで抽出した（２ｘ１０ｍＬ）。有機相を水（５ｍＬ）およびブライン（５ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、石油エーテル中の５％酢酸エチル）により精製して表題化合物を得た。
収率：０．１１ｇ（４７．５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ９．３１（ｂｓ，２Ｈ）、７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、７．００（ｓ，１Ｈ）、６．９７（ｄ，１Ｈ）、６．７３（ｄ，１Ｈ）、６．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、４．１２（ｑ，２Ｈ）、１．２４（ｔ，３Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ−）：２０７（Ｍ−１）。
【００７３】
（実施例４）
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸２−ニトロ−エチルエステル（化合物４）
化合物１（０．４００ｇ、２．２２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化チオニル（０．４９ｍＬ、６．８８ｍｍｏｌ）を０℃に温度を維持して３０分かけて滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で乾燥するまで濃縮した。残渣をテトラヒドロフラン（５ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。２−ニトロエタノール（１．５９ｍＬ、２２．２０ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を室温（２５℃）まで温め、一晩撹拌した（１６時間）。反応終了時に、混合物を減圧下で濃縮した。残渣を１０％重炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ７まで希釈し、酢酸エチルで抽出した（２ｘ１５ｍＬ）。有機相を水（１０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム中の１％メタノール）により精製して表題化合物を得た。
収率：０．１７０ｇ（３０．３５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、７．０３（ｄ，１Ｈ）、６．９４（ｄｄ，１Ｈ）、６．７６（ｄ，１Ｈ）、６．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、４．７９（ｍ，２Ｈ）、４．６６（ｍ，２Ｈ）。
【００７４】
（実施例５）
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｎ−プロピルエステル（化合物５）
化合物１（０．２５ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）をプロパン−１−オール（２０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化チオニル（０．１２ｍＬ、１．６５ｍｍｏｌ）を０℃に温度を３０分間維持しながら滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、５０℃まで加熱し、その温度で一晩（１６時間）維持した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を１０％重炭酸ナトリウムでｐＨ７まで希釈し、酢酸エチルで抽出した（２ｘ１０ｍＬ）。有機相を水（５ｍＬ）およびブライン（５ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、石油エーテル中の５％酢酸エチル）により精製して表題化合物を得た。
収率：０．２ｇ（６５．２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ９．５（ｂｓ，２Ｈ）、７．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、７．０２（ｓ，１Ｈ）、６．９８（ｄ，１Ｈ）、６．７３（ｄ，１Ｈ）、６．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、４．０４（ｔ，２Ｈ）、１．６１（ｍ，２Ｈ）、０．８９（ｔ，３Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ−）：２２１（Ｍ−１）。
【００７５】
（実施例６）
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ｉ−プロピルエステル（化合物６）
実施例１の化合物（０．３ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）をプロパン−２−オール（２０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化チオニル（０．１８ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）を０℃に温度を３０分間維持しながら滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、次いで７０℃まで加熱し、室温で一晩（１６時間）維持した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を１０％重炭酸ナトリウムでｐＨ７まで希釈し、酢酸エチルで抽出した（２ｘ１０ｍＬ）。有機相を水（５ｍＬ）およびブライン（５ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム中の３％プロパン−２−オール）により精製して表題化合物を得た。
収率：０．２ｇ（５４．２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ９．３３（ｂｓ，２Ｈ）、７．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、７．００（ｓ，１Ｈ）、６．９７（ｄ，１Ｈ）、６．７３（ｄ，１Ｈ）、６．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、４．９６（ｍ，１Ｈ）、１．２１（ｄ，６Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ−）：２２１（Ｍ−１）。
【００７６】
（実施例７）
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリル酸ブチルエステル（化合物７）
化合物１（０．１ｇ、５．５ｍｍｏｌ）をｎ−ブタノール（１０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化チオニル（０．０４ｍＬ、８．３ｍｍｏｌ）を０℃に温度を３０分間維持しながら滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、１６時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を１０％重炭酸ナトリウム水溶液で希釈してｐＨ７にし、酢酸エチルで抽出した（２ｘ２５ｍＬ）。有機相を水（１０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、石油エーテル中の５％酢酸エチル）により精製して表題化合物を得た。
収率：５０．０ｍｇ（３８．４％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５６（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、７．０８（ｓ，１Ｈ）、７．０１（ｄ，１Ｈ）、６．８７（ｄ，１Ｈ）、６．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、５．８６（ｂｓ，１Ｈ）、５．８０（ｂｓ，１Ｈ）、４．１９（ｔ，２Ｈ）、１．７０（ｍ，２Ｈ）、１．４４（ｍ，２Ｈ）、０．９５（ｔ，３Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ−）２３５（Ｍ−１）。
【００７７】
（実施例８）
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−ピペリジン−１−イル−プロペノン（化合物８）
化合物１（０．５００ｇ、２．７７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化チオニル（１ｍＬ、１３．８５ｍｍｏｌ）を、０℃に温度を維持して３０分かけて滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で乾燥するまで濃縮した。残渣をテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。ピペラジン（１．１ｍＬ、１１．０８ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を室温（２５℃）まで温め、一晩（１６時間）撹拌した。反応終了時に、混合物を減圧下で濃縮した。残渣を１０％重炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ７まで希釈し、酢酸エチルで抽出した（２ｘ２５ｍＬ）。有機相を水（１０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム中の２％メタノール）により精製して表題化合物を得た。
収率：０．３５０ｇ（５１．０２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、７．０４（ｄ，１Ｈ）、６．９５（ｄｄ，１Ｈ，），６．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、６．７１（ｄ，１Ｈ，）、３．５３（ｍ，４Ｈ）、１．５７（ｍ，６Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ−）：２４６．１１。
【００７８】
（実施例９）
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−プロペノン（化合物９）
化合物１（０．３ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（５ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化チオニル（０．３６ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）を、０℃に温度を３０分間維持しながら滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で乾燥するまで濃縮した。残渣をテトラヒドロフラン（５ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。１−エチル−ピペラジン（１．１ｍＬ、８．６２ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を室温（２５℃）まで温め、一晩（１６時間）撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を１０％重炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ７まで希釈し、酢酸エチルで抽出した（２ｘ２５ｍＬ）。有機相を水（１０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム中の５％メタノール）により精製して表題化合物を得た。
収率：１８０ｍｇ（３９．２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ９．４３（ｓ，１Ｈ）、８．９７（ｓ，１Ｈ）、７．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、７．０５（ｄ，１Ｈ）、６．９６（ｄｄ，１Ｈ）、６．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ）、６．７１（ｄ，１Ｈ）、３．５６（ｍ，４Ｈ）、２．３２（ｍ，６Ｈ）、０．９９（ｔ，３Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ＋）：２７７（Ｍ＋１）。
塩酸塩の調製：
４−［３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリロイル］−１−エチル−ピペラジン−１−イウム塩化物
化合物９（２．０ｇ、７．２９ｍｍｏｌ）を１０ｍＬ  メタノール中に溶解した。溶液を０−５℃まで冷却し、５％エーテル塩酸溶液（２５ｍＬ）を添加し、１０分間撹拌した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、生じた固体を完全に乾燥させて所望の生成物を得た。
収率：２．１ｇ（９３．３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．８８（ｓ，１Ｈ）、７．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、７．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ）、６．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ）、６．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、６．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、４．４８（ｍ，２Ｈ）、３．４６（ｍ，２Ｈ）、３．１１（ｍ，４Ｈ）、２．９１（ｍ，２Ｈ）、１．２３（ｔ，３Ｈ）。
【００７９】
（実施例１０）
１−（４−ベンジル−ピペラジン−１−イル）３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン（化合物１０）
化合物１（０．３ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（５ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化チオニル（０．６ｍＬ、８．５ｍｍｏｌ）を０℃に温度を３０分間維持しながら滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で乾燥するまで濃縮した。残渣をテトラヒドロフラン（５ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。１−ベンジル−ピペラジン（０．９ｍＬ、５．２ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を室温（２５℃）まで温め、一晩（１６時間）撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を１０％重炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ７まで希釈し、酢酸エチルで抽出した（２ｘ２５ｍＬ）。有機相を水（１０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム中の５％メタノール）により精製して表題化合物を得た。
収率：１６０ｍｇ（２８．４％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ  ７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、７．３２（ｍ，５Ｈ）、７．０３（ｄ，１Ｈ）、６．９６（ｄｄ，１Ｈ）、６．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、６．７５（ｄ，１Ｈ）、３．７１（ｂｓ，４Ｈ）、３．５６（ｓ，２Ｈ）、２．４９（ｂｓ，４Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ＋）：３３９（Ｍ＋１）。
塩酸塩の調製：
４−［３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリロイル］−１−ベンジル−ピペラジン−１−イウム塩化物
化合物１０（０．５ｇ、１．４９ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのメタノールに溶解した。溶液を０−５℃まで冷却し、５％エーテル塩酸溶液（２５ｍＬ）を添加し、１０分間撹拌した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、生じた固体を完全に乾燥させて所望の生成物を得た。
収率：０．５２ｇ（９４．５４％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ９．５６（ｓ，１Ｈ）、７．５６（ｍ，２Ｈ）、７．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、９．０６（ｄ，１Ｈ）、６．９５（ｍ，１Ｈ）、６．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、６．７２（ｄ，１Ｈ）、４．４３（ｍ，２Ｈ）、４．２７（ｍ，２Ｈ）、３．２６（ｍ，３Ｈ）、２．８９（ｍ，３Ｈ）。
【００８０】
（実施例１１）
（Ｅ）−３−｛４−［３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−アクリロイル］−ピペラジン−１−イル｝プロピオニトリル（化合物１１）
化合物１（０．４００ｇ、２．２２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化オキサリル（０．５７ｍＬ、６．６６ｍｍｏｌ）を、温度を０℃に維持して３０分かけて滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で乾燥するまで濃縮した。残渣をテトラヒドラン（１５ｍＬ）に溶解し、窒素雰囲気下で０℃まで冷却した。これを、０℃に保持したテトラヒドロフラン中の３−ピペラジン−１−イル−プロピオニトリル（０．３７ｇ、２．６６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．６７ｍｌ、４８．８ｍｍｏｌ）の溶液に滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、一晩（１６時間）撹拌した。反応終了時に、混合物を減圧下で濃縮し、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム中の１％メタノール）により精製して表題化合物を得た。
収率：０．１３０ｇ（１９．４３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ  ７．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５Ｈｚ）、７．０４（ｄ，１Ｈ）、６．９７（ｄｄ，１Ｈ）、６．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、６．７６（ｄ，１Ｈ）、３．７５（ｍ，４Ｈ）、２．７１（ｍ，４Ｈ）、２．６６（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ＋）：３０２．１４。
【００８１】
（実施例１２）
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−［４−（１−メチル−ピペリジン−４−イル）ピペラジン−１−イル］−プロペノン（化合物１２）
化合物１（０．５００ｇ、２．７７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化オキサリル（０．５２ｍＬ、６．０９ｍｍｏｌ）を、温度を０℃に保持して３０分かけて滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、３時間撹拌した。反応混合物を減圧下で乾燥するまで濃縮した。残渣をテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中に溶解し、窒素雰囲気下で０℃まで冷却した。これを、テトラヒドロフラン中の１−（１−メチルピペリジン−４−イル）ピペラジン（０．４５ｇ、２．４９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．８４ｍＬ、６．０９ｍｍｏｌ）の溶液に０℃に維持しながら滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、撹拌した（１６時間）。反応終了時に、混合物を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム中の１％メタノール）により精製して表題化合物を得た。
収率：０．１７０ｇ、（１７．７４  ％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ  ７．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、７．０６（ｄ，１Ｈ）、６．９８（ｄｄ，１Ｈ）、６．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、６．７９（ｄ，１Ｈ）、３．７６（ｂｓ，４Ｈ）、３．１８（ｍ，２Ｈ）、２．６３（ｂｓ，４Ｈ）、２．５１（ｓ，３Ｈ）、２．４５（ｍ，３Ｈ）、１．９６（ｍ，２Ｈ）、１．６９（ｍ，２Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ＋）：３４６．２１。
【００８２】
（実施例１３）
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−（４−フェニルピペラジン−１−イル）−プロペノン（化合物１３）
化合物１（０．５００ｇ、２．７７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化オキサリル（０．７１ｍＬ、８．３１ｍｍｏｌ）を、温度を０℃に維持して３０分かけて滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、３時間撹拌した。反応混合物を減圧下で乾燥するまで濃縮した。残渣をテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中に溶解し、窒素雰囲気下で０℃まで冷却した。これを、テトラヒドロフラン中のＮ−フェニル−ピペラジン（０．５４ｍＬ、３．６０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．８４ｍＬ、６．０９ｍｍｏｌ）の溶液に０℃に維持しながら滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、一晩（１６時間）撹拌した。反応終了時に、混合物を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム中の１％メタノール）により精製して表題化合物を得た。
収率：０．１００ｍｇ（１１．１１％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ  ７．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、７．２３（ｔ，２Ｈ）、７．０５（ｄ，１Ｈ）、６．９８（ｄ，２Ｈ）、６．９１（１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、６．８４（ｍ，１Ｈ）、６．７７（ｄ，１Ｈ）、３．８５（ｂｓ，４Ｈ）、３．１９（ｂｓ，４Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ−）：３２３．１２。
【００８３】
（実施例１４）
（Ｅ）−１−（４−アセチル−ピペラジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン（化合物１４）
化合物１（０．５００ｇ、２．７７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化オキサリル（０．５２ｍＬ、６．０９ｍｍｏｌ）を、温度を０℃に維持して３０分かけて滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、３時間撹拌した。反応混合物を減圧下で乾燥するまで濃縮した。残渣をテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中に溶解し、窒素雰囲気下で０℃まで冷却した。これを、テトラヒドロフラン中のＮ−アセチル−ピペラジン（０．３５ｇ、２．７７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．８４ｍＬ、６．０９ｍｍｏｌ）の溶液に０℃に維持しながら滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、一晩（１６時間）撹拌した。反応終了時に、混合物を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム中の１％メタノール）により精製して表題化合物を得た。
収率：０．３ｇ（３７．２６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．９３（ｂｓ，１Ｈ）、７．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、６．９９（ｄｄ，１Ｈ）、７．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５Ｈｚ）、６．７５（ｄ，１Ｈ）、３．８５（ｍ，８Ｈ）、２．０３（ｓ，３Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ＋）：２９１．１５（Ｍ＋１）。
【００８４】
（実施例１５）
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−（４−フェネチル−ピペラジン−１−イル）−プロペノン（化合物１５）
化合物１（０．５００ｇ、２．７７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化オキサリル（０．３５ｍＬ、４．１５ｍｍｏｌ）を、温度を０℃に維持して３０分かけて滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、３時間撹拌した。反応混合物を減圧下で乾燥するまで濃縮した。残渣をテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中に溶解し、窒素雰囲気下で０℃まで冷却した。これを、テトラヒドロフラン中の１−フェニルエチル−ピペラジン（０．５２ｇ、２．７７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．８４ｍＬ、６．０９ｍｍｏｌ）の溶液に０℃に維持しながら滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、一晩（１６時間）撹拌した。反応終了時に、混合物を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム中の１％メタノール）を精製して表題化合物を得た。
収率：０．１５０ｇ（１５．３３％）。ＭＳ（ＥＳ＋）：３５３．２４。
【００８５】
（実施例１６）
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−１−モルホリン−４−イル−プロペノン（化合物１６）
実施例１の化合物（０．４ｇ、２．２２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化チオニル（０．５１ｍＬ、７．１０ｍｍｏｌ）を、温度を０℃に維持して３０分かけて滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で乾燥するまで濃縮した。残渣をテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。モルホリン（０．７７ｍＬ、８．８８ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を室温（２５℃）まで温め、一晩（１６時間）撹拌した。反応終了時に、混合物を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム中の１％メタノール）により精製して表題化合物を得た。
収率：０．２００ｇ（２８．９４％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５Ｈｚ）、７．０６（ｂｓ，１Ｈ）、６．９６（ｄ，１Ｈ）、６．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、６．７１（ｄ，１Ｈ）、３．６０（ｍ，８Ｈ）。
【００８６】
（実施例１７）
３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−Ｎ−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−アクリルアミド（化合物１７）
化合物１（０．２ｇ、１．１１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパン−１，３−ジアミン（０．１３ｍＬ、１．１１ｍｍｏｌ）およびＨＯＢＴ（０．２ｇ、１．３２ｍｍｏｌ）の混合物をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中に溶解した。トリエチルアミン（０．４ｍＬ、３．３ｍｍｏｌ）をこの溶液に０℃で添加した。１０分後、ＥＤＣ（０．２５ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮し、残渣を酢酸エチル（２５ｍＬ）で希釈した。有機相を水（１０ｍＬ）、ブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム中の０．３％メタノール）により精製して表題化合物を得た。
収率：１９０ｍｇ（６４．７％）。ＭＳ（ＥＳ−）：２６３（Ｍ−１）。
【００８７】
（実施例１８）
（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−Ｎ−イソプロピル−アクリルアミド（化合物１８）
化合物１（０．５００ｇ、２．７７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化オキサリル（０．７１ｍＬ、８．３１ｍｍｏｌ）を、温度を０℃に維持して３０分かけて滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、３時間撹拌した。反応混合物を減圧下で乾燥するまで濃縮した。残渣をテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中に溶解し、窒素雰囲気下で０℃まで冷却した。これを、イソプロピルアミン（０．３０ｍＬ、３．６０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．８４ｍＬ、６．０９ｍｍｏｌ）の溶液に０℃に維持しながら滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、一晩（１６時間）撹拌した。反応終了時に、混合物を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム中の１％メタノール）により精製して表題化合物を得た。
収率：０．１５０ｇ（２４．４２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ  ７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ）、６．９８（ｄ，１Ｈ）、６．８８（ｄｄ，１Ｈ）、６．７４（ｄ，１Ｈ）、６．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ）、４．０６（ｍ，１Ｈ）、１．１７（ｄ，６Ｈ）。
【００８８】
（実施例１９）
１−（４−ベンジル−ピペリジン−１−イル）−３−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−プロペノン
化合物１（５ｇ、２７．７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（６０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。これに、塩化オキサリル（５．２６ｍＬ、６１．０ｍｍｏｌ）を、温度を０℃に維持しながら３０分かけて滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、３時間撹拌した。反応混合物を減圧下で乾燥するまで濃縮した。残渣をテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中に溶解し、窒素雰囲気下で０℃まで冷却した。これを、４−ベンジルピペリジン（５．３５ｇ、３０．５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（５．５２ｍＬ、４１．６ｍｍｏｌ）の溶液に０℃に維持しながら滴下した。反応混合物を室温（２５℃）まで温め、一晩（１６時間）撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム中の１％メタノール）により精製して表題化合物を得た。
収率：２．２ｇ（２３．５０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ  ７．４１（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、７．２５（ｍ，２Ｈ）７．１５（ｍ，３Ｈ）、７．０２（ｄ，１Ｈ）、６．９５（ｄｄ，１Ｈ）、６．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ）、６．７６（ｄ，１Ｈ）、４．５７（ｍ，１Ｈ）、４．２０（ｍ，１Ｈ）、３．０８（ｍ，１Ｈ）、２．６７（ｍ，１Ｈ）、２．５６（ｄ，２Ｈ）、１．８５（ｍ，１Ｈ）、１．７３（ｍ，２Ｈ）、１．１８（ｍ，２Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ−）：３３６．１（Ｍ−１）。
【００８９】
グリーベック感受性細胞株Ｋ−５６２、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＷＴならびにグリーベック耐性細胞株Ｋ−５６２−Ｒおよび３２ＤｃｌＢｃｒ−Ａｂｌ Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｋ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｐ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ３５１Ｔ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３５９Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３１７Ｌ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｒ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ２４４Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｑ２５２Ｈ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３ＦおよびＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｈを抑制する時の本発明の化合物の有効性は、以下に記載の多くの薬理学的アッセイにより決定することができる。
【００９０】
以下の略記を本明細書中で用いる。
ＡＴＣＣ        ：アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関
ＯＨＳＵ        ：アメリカ合衆国、オレゴン州のオレゴン保健科学大学
ＮＰＲＣ        ：インド、ムンバイのニコラスピラマル研究センター
ＦＢＳ          ：ウシ胎児血清
ＩＭＤＭ        ：イスコフ改変ダルベッコ培地
ＲＰＭＩ        ：ロズウェルパーク記念研究所
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＳ          ：リン酸緩衝食塩水
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＮＰ−４０      ：ノニデットＰ−４０
ＨＥＰＥＳ      ：（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンス                    ルホン酸］）
ＤＴＴ          ：ジチオトレイトール
ＥＧＴＡ        ：エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ                    ’Ｎ’−四酢酸
ＩＬ３          ：インターロイキン３
【００９１】
（実施例２０）
細胞増殖アッセイ
３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ：３Ｈ−チミジン取り込みは、培養中の分裂する細胞数に対して直接的に比例する。
【００９２】
プロトコル：
細胞株を異なる供給源から入手し（表１）、供給者により推奨されるごとく増殖の最適条件で維持した。指数増殖している培養物を、以下に記載のごとく異なる濃度の試験化合物および標準物質にかけた。
表１：様々な造血細胞株の記載
【００９３】
【表１】
2010502586.tif 000005
【００９４】
方法：
細胞を、透明な９６ウェル組織培養プレート（アメリカ合衆国のＮＵＮＣ）に（０．１８０ｍＬ中の）１ウェルあたり３ｘ１０３から５ｘ１０３個の密度で撒種し、５％二酸化炭素インキュベーターにおいて３７℃で２−６時間培養した。試験化合物を様々な濃度で培地（１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）中に希釈し、０．０２ｍＬの１０ｘストックを３系にて各ウェルに添加した。プレートを５％二酸化炭素インキュベーターにおいて３７℃で７２時間培養し、途中、２４時間ごとに顕微鏡で観察した。
【００９５】
７２時間の培養後、プレートをプレート遠心分離器において１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。上澄み液を慎重に吸引し、３Ｈ−チミジンを、０．１ｍＬの完全培地に０．５μＣｉ／ウェルの濃度で全ウェルに添加した。さらに、プレートを５％二酸化炭素インキュベーターにおいて３７℃で６−１４時間培養した。
【００９６】
培養期間の終了時に、９６ウェルガラスフィルタープレート（カタログ番号６００５１７７、Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ−９６、ＧＦ／Ｂ、アメリカ合衆国のＰａｃｋａｒｄ）上でｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（アメリカ合衆国のＰａｃｋａｒｄ）を用いて、９６ウェルプレートから細胞を収集した。フィルタープレートを、６０℃で１時間か、または室温（２５℃）で一晩（１６時間）で完全に乾燥させた。乾燥後、プレートの底面をシールで塞ぎ、０．０５ｍＬ／ウェルのシンチラント液（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ  ｆｌｕｉｄ）（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−Ｏ、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加した。プレートを上部から密封し、シンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ、Ｐａｃｋａｒｄ）で読み取り、抑制のパーセント値およびＩＣ５０をコントロール値と比較して算出した。
表２：様々な細胞株による化合物２の抗増殖活性
【００９７】
【表２】
2010502586.tif 000006
【００９８】
結論：本発明の化合物２は、グリーベック耐性細胞Ｋ−５６２、Ｋ−５６２−Ｒおよび３２ＤｃｌＢｃｒ−Ａｂｌ Ｔ３１５Ｉの増殖を抑制した。
【００９９】
（実施例２１）
インビトロ抗増殖活性を用いたイマチニブ耐性細胞株に対する試験化合物の特異性の決定。
数種類のイマチニブ耐性細胞株を、Ｂｒｉａｎ  Ｄｒｕｋｅｒ博士の研究室、ハワードヒューズ医療研究所、アメリカ合衆国、オレゴン州、ポートランドのオレゴン保健科学大学（ＯＨＳＵ）ガン研究所から入手した。その詳細を表３に示す。これらの細胞株を供給者により推奨される増殖の最適条件下で維持した。
表３：様々なイマチニブ感受性およびイマチニブ耐性細胞株の記載
【０１００】
【表３】
2010502586.tif 000007
＊ベクターのみを含むＢａ／Ｆ３−細胞（Ｂａ／Ｆ３−ｐＳＲα）
＊＊増殖因子としてのＩＬ３
【０１０１】
表３に記載される細胞株を試験化合物の抗増殖活性をテストするのに用いた。抗増殖薬としての試験化合物の活性を、ＣＣＫ−８アッセイを用いてイマチニブ耐性細胞株においてイマチニブメシラートと比較した。
【０１０２】
細胞増殖および細胞障害性ＣＣＫ−８アッセイ：
Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８）は、同仁化学研究所の高水溶性テトラゾリウム塩を利用することにより非常に簡便なアッセイを可能にする。ＣＣＫ−８は、非放射性であり、細胞増殖時における生存細胞数の測定のための高感度の比色定量アッセイおよび細胞障害性アッセイを可能にする。細胞中のデヒドロゲナーゼにより生じるホルマザン色素の量は、直接的に生存細胞の数に比例する。それゆえ、ＣＣＫ−８アッセイをＨ３−チミジン取り込みアッセイに置き換えることもできる。
【０１０３】
化合物の調製
イマチニブメシラートをインドのＮａｔｃｏ  Ｐｈａｒｍａから購入した。試験化合物および標準イマチニブメシラートについて、ＤＭＳＯで１０ｍＭストックを調製した。
【０１０４】
方法
細胞を、透明な９６ウェル組織培養プレート（アメリカ合衆国のＮＵＮＣ）に１ウェル（０．０９ｍＬ）あたり〜５ｘ１０３個の密度で撒種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２−６時間培養した。異なる濃度の試験化合物および標準イマチニブを各ウェルに３系にて添加した。さらに、プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで７２時間培養した。１０μｌのＣＣＫ−８溶液を各ウェルに添加し、プレートをインキュベーター内で１−４時間培養した。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０５】
Ａ．抑制のパーセント値およびＩＣ５０をコントロール値と比較して算出した。結果を以下の表４および５に示す。
【０１０６】
Ｂ．試験化合物の抗増殖活性を、臨床で見られるイマチニブ感受性（Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＷＴ）および耐性（Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ）において、ＩＣ５０値としてμＭで表し、図１で示されるグラフにより表す。
【０１０７】
化合物の抗増殖活性を、臨床で見られるイマチニブ耐性の低頻度変異における５つの細胞株（Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｋ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｐ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｅ２５５Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ２４４ＶおよびＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｑ２５２Ｈ）において、平均ＩＣ５０値としてμＭで表し、図２に示されるグラフにより表す。
【０１０８】
化合物の抗増殖活性を、臨床で見られるイマチニブ耐性の高頻度変異における７つの細胞株（Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−ＡｂＩ／Ｔ３１５Ｉ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｍ３５１Ｔ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３５９Ｖ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｆ３１７Ｌ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｈ３９６Ｒ、Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３ＦおよびＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｙ２５３Ｈ）において、平均ＩＣ５０値としてμＭで表し、図３で示されるグラフにより表す。
表４：イマチニブ感受性および耐性細胞株における本発明の化合物についての抑制濃度（ＩＣ５０）。
【０１０９】
【表４】
2010502586.tif 000008
表５：イマチニブ耐性細胞株における本発明の化合物の細胞障害性抑制活性
【０１１０】
【表５】
2010502586.tif 000009
Ｉ−化合物１、ＩＩ−化合物２、ＩＩＩ−化合物３、ＩＶ−化合物５、Ｖ−化合物６、ＶＩ−化合物１０、ＶＩＩ−化合物１９、ＶＩＩＩ−イマチニブメシラート
【０１１１】
結論：本発明の化合物がＢｃｒ−Ａｂｌ変異イマチニブ耐性細胞に対して有意な抑制活性を示したという結果から明らかである。
【０１１２】
（実施例２２）
Ｂｃｒ−ａｂｌキナーゼアッセイ
目的：
Ｂｃｒ−ａｂｌの自己リン酸化の抑制を研究するためである。Ｋ−５６２細胞溶解物に由来するｐ２１０ｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼの免疫沈殿、次いでキナーゼ酵素アッセイにより研究を行った。反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次にオートラジオグラフィーにかけた。
【０１１３】
イントロダクション：
免疫沈殿は、粗細胞溶解物から特定の抗体を用いて特定のタンパク質の精製を可能にする技術である。この一次抗体は、残ったサンプルから抗体−抗原複合体を物理的に分離するために、その方法において、すでにアガロースに結合しているか、またはプロテイン−Ａ−セファロースビーズに結合しうるかのどちらかである。
【０１１４】
方法：
本発明の化合物によるｐ２１０ｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼの自己リン酸化抑制について調べるため、野生型Ｂｃｒ−ａｂｌを発現するＫ−５６２細胞を用いた。２ｘ１０６個のＫ−５６２細胞を、（実施例２０に記載されるごとく、Ｋ−５６２を用いた抗増殖活性データに基づいた）ＩＣ５０および３ｘＩＣ５０濃度で処理し、加湿５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。細胞をＰＢＳ溶液で洗浄し、溶解緩衝液（ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  ｒｅａｇｅｎｔ、アメリカ合衆国のＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて低温条件で２−３時間溶解した。タンパク質をブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｒｅａｇｅｎｔ、アメリカ合衆国のＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）により測定した。免疫沈殿では、等量のタンパク質を全てのサンプルから取得する。ｐ２１０ｂｃｒ−ａｂｌタンパク質をポリクローナル抗ｃ−ａｂｌ抗体（アメリカ合衆国のＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて免疫沈殿し、次いでプロテインＡ−セファロースと４℃で一晩インキュベートした。免疫複合体を単離し、ＮＥＴ−Ｎ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５％  ＮＰ４０）で３回洗浄し、次いで、キナーゼ緩衝（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、２．５  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸、１ｍＭ  ＮａＦおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）水溶液で再懸濁した。
【０１１５】
１反応あたり０．５μＣｉの（γ３２Ｐ）−アデノシン三リン酸を用いてキナーゼ反応を行い、室温（２５℃）で３０分間インキュベートした。ＳＤＳサンプル緩衝液を添加し、９５℃で５分間加熱することよりキナーゼ反応を停止した。自己リン酸化反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離させ、オートラジオグラフィーにより検出する。
【０１１６】
結果：免疫沈殿、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーは、バンド密度の減少により観察されるように、Ｂｃｒ−Ａｂｌ自己リン酸化の減少を示した。化合物２が強力なＢｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤であることがわかった。
【０１１７】
（実施例２３）
フローサイトメトリーを用いるＢｃｒ−Ａｂｌ変異型イマチニブ耐性細胞株における細胞周期およびアポトーシスについての本発明の化合物の効果。
フローサイトメトリー用の細胞を１０ｘ１０４細胞／ｍＬの密度で撒種し、試験化合物／イマチニブ（５μＭ）と３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターにおいて２４時間培養した。培養終了時に、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより細胞を収集し、次いでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。最終洗浄からの細胞沈殿物を７０％氷冷エタノール中に除々に再懸濁して染色の透過性を促進させた。細胞懸濁液をヨウ化プロピジウムで染色する前に最低４時間保存した。固定した細胞をＲＮａｓｅ  Ａ（５０μｇ／ｍＬ）の存在下においてＰＩ（８０μｇ／ｍＬ）で染色し、細胞周期分析用のＢＤ  ＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｅｒで読み取った。この実験の結果を図４に示す。
【０１１８】
結論：イマチニブ耐性細胞株における本発明の化合物により誘導されるアポトーシス誘導は顕著である。
【０１１９】
（実施例２４）
イマチニブ耐性およびイマチニブ感受性腫瘍モデルにおける本発明の化合物のインビボ有効性試験を、全長野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌ（Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＷＴ）または変異型Ｂｃｒ−Ａｂｌ（Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ）を発現するＢａ／Ｆ３トランスフェクタントのごとき細胞株を用いることにより行った。
【０１２０】
目的
イマチニブ耐性およびイマチニブ感受性腫瘍モデルにおけるコーヒー酸誘導体のインビボ有効性試験。
【０１２１】
細胞株
全長野生型イマチニブ感受性（Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＷＴ）または変異型イマチニブ耐性（Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ）を発現する細胞株Ｂａ／Ｆ３トランスフェクタントをこの実験で用いた。これらの組み換え細胞株は、Ｂｒｉａｎ  Ｄｒｕｋｅｒ博士の研究室、ハワードヒューズ医療研究所、アメリカ合衆国、オレゴン州、ポートランドのオレゴン保健科学大学（ＯＨＳＵ）から使用を許諾された（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，６２，７１４９−７１５３）。
【０１２２】
化合物保存
標準物質を含む全ての化合物を、琥珀色の瓶中で４−８℃において保存した。溶液中の化合物もまた冷蔵庫で４−８℃において保管した。動物注入用のサンプルを、毎日作りたてを調製し、残存量を貯めておき、化学物質廃棄用の標準実施要領に従って廃棄した。
【０１２３】
用量調製
必要な化合物の量を測り、０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）と混合し、除々に水を添加しながらＴｗｅｅｎ−２０（ｓｅｃｕｎｄｕｍ  ａｒｔｕｍ）で粉砕して最終濃度に調合した。
【０１２４】
ＳＣＩＤマウスにおける有効性実験
６−９週齢、〜２０ｇの重量である１１０匹のＳｅｖｅｒｌｙ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ（ＳＣＩＤ系統−ＣＢｙＳｍｎ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ、ジャクソン研究室、ストック番号００１８０３）雄マウスの群を用いた。
【０１２５】
Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＷＴ細胞およびＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地において５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で増殖させた。細胞を１０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により沈殿させた。細胞を生理食塩水中に再懸濁させて１ｍＬあたり８０−１００ｘ１０６細胞数とし、この細胞懸濁液の０．２ｍＬをＳＣＩＤマウスに皮下（ｓ．ｃ．）経路により注入した。マウスを、目に見える腫瘍塊について１日おきに観察した。腫瘍の大きさが直径５−７ｍｍの大きさに達したら、動物を無作為に各処理群に分けた。コントロールまたは試験化合物を毎日投与した。腫瘍の大きさを２−５日の間隔で記録した。腫瘍の重さ（ｍｇ）を、比重を１、πを３と仮定して長楕円に関する式：｛長さ（ｍｍ）ｘ［幅（ｍｍ）２］ｘ０．５｝に従って算出した。化合物で処理した動物における腫瘍の増殖を、Ｔ／Ｃ（処理／コントロール）ｘ１００％として算出し、増殖抑制パーセント（ＧＩ％）を［１００−Ｔ／Ｃ％］とした。
各処理群を表６に示す。
結果を図５Ａおよび図５Ｂに図示する。
表６：異種移植モデルにおける処理群（セットＩおよびセットＩＩ）
（セットＩ）命名：Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉ
【０１２６】
【表６】
2010502586.tif 000010
ｐ．ｏ．＝経口；ｎ＝動物数
ｑ１ｄｘ１２＝１２日間単回投与
（セットＩＩ）命名：Ｂａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＷＴ
【０１２７】
【表７】
2010502586.tif 000011
ｐ．ｏ．＝経口；ｎ＝動物数
ｑ１ｄｘ１４＝１４日間単回投与
【０１２８】
結論：図５Ａおよび図５Ｂに表されるデータは、異種移植モデルを発現する野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌ、すなわちＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／ＷＴの濃度と同じ濃度でテストする場合、Ｂｃｒ−Ａｂｌの最も優勢な変異型、すなわちＢａ／Ｆ３  Ｂｃｒ−Ａｂｌ／Ｔ３１５Ｉを抑制する時に、本発明の化合物がイマチニブメシラートより有意に高いインビボ有効性を示したことを示す。
【０１２９】
この明細書および特許請求の範囲で用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明確に別のことを示していない限り、複数の対象を含むことに注意すべきである。それゆえ、例えば、「化合物」を含む組成物は、２またはそれ以上の化合物の混合を含むものとする。用語「または」は、内容が明確に別のことを示していない限り、一般的に、「および／または」を含む意味で用いられることにも注意すべきである。
【０１３０】
本明細書における全ての刊行物および特許出願は、本明細書が関連する技術分野のレベルを示している。
【０１３１】
本発明は、様々な特定のおよび好ましい具体例と技術について記載されている。しかしながら、多くのバリエーションと修飾がなされうるが、それらもまた本発明の精神と範囲内であると理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
2010502586.tif 000018
【図３】
2010502586.tif 000019
【図４】
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【図５】
2010502586.tif 000021
【国際調査報告】
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