(57)【要約】  本発明は、哺乳動物細胞において減少した程度のフコース改変を伴う異種ポリペプチドを産生するための方法であって、哺乳動物細胞を該異種ポリペプチドの発現に適当な条件下に培養しそして哺乳動物細胞または培養物から該異種ポリペプチドを回収し、その際哺乳動物細胞においてα１，６−フコシルトランスフェラーゼの酵素活性を、α１，６−フコシルトランスフェラーゼｍＲＮＡを指向するｓｈＲＮＡにより減少させる、ことを含む方法を含む。
2010512766.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞における減少した程度のフコース改変を伴う異種ポリペプチドをリコンビナントに産生するための方法であって、
−該異種ポリペプチドの発現のために適当な条件下に哺乳動物細胞を培養し、
−該哺乳動物細胞または培養物から該異種ポリペプチドを回収し、それにより該異種ポリペプチドを産生する、工程を含み、
該哺乳動物細胞は、
ｉ）α１，６−フコシルトランスフェラーゼｍＲＮＡを指向するｓｈＲＮＡに転写される配列番号５または配列番号６の第１核酸、および
ｉｉ）異種免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメントまたは免疫グロブリンコンジュゲートをコードする第２核酸、によりトランスフェクションされる、
方法。
【請求項２】
前記哺乳動物細胞の前記培養をＬＣＡの存在下に行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物細胞を、
ｉｉｉ）ネオマイシン選択マーカーまたはｌ−ＮＧＦＲをコードする第３核酸、
でトランスフェクションすることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物細胞を、
−α１，６−フコシルトランスフェラーゼｍＲＮＡを指向するｓｈＲＮＡに転写される配列番号５または配列番号６の第１核酸、
−ネオマイシン選択マーカーまたはｌ−ＮＧＦＲをコードする第２核酸、および
−前記異種ポリペプチドをコードする第３核酸、
を含む単一核酸でトランスフェクションすることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ0細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＨＥＫ ２９３ ＥＢＮＡ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞およびＣＯＳ細胞を含む哺乳動物細胞の群から選ばれることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
−配列番号５および配列番号６の核酸の群から選ばれる第１核酸、
−ネオマイシン選択マーカーまたはｌ−ＮＧＦＲをコードする第２核酸、および
−免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメントおよび免疫グロブリンコンジュゲートを含む異種ポリペプチドの群から選ばれる異種ポリペプチドをコードする第３核酸、
を含む核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含む哺乳動物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡｉの分野に関する。更に詳しくは、本発明は、診断抗体または治療抗体などのリコンビナントに産生されたタンパク質の改変を触媒する酵素の翻訳を減少させる分野に関する。
【０００２】
発明の背景
ＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングの現象は、長い二本鎖ＲＮＡ分子のマイクロインジェクションがそれぞれの遺伝子の不活性化をもたらすことが報告されたＣａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ系において最初に記載された（ＵＳ６，５０６，５５９）。その後に、ＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングは、脊椎動物（ＥＰ１１１４７８４）、哺乳動物、特にヒト細胞（ＥＰ１１４４６２３）において開示されている。これらの系において、もし１９〜２９ｂｐの短い二本鎖ＲＮＡ分子が関心のある特異的遺伝子を一時的にノックダウンするためにトランスフェクションされるならば、遺伝子不活性化は成功裡に達成される。
【０００３】
ＲＮＡ媒介遺伝子不活性化の機構は、これまで研究された種々の生物において僅かに異なると思われる。しかしながら、すべての系において、ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングは、いわゆるＲＩＳＣ複合体の一部であるエンドヌクレアーゼアルゴノート２により誘導されるターゲットｍＲＮＡの転写後分解に基づいている（ＷＯ０３／９３４３０）。分解の配列特異性は、RISC複合体にロードされた特異的アンチセンスＲＮＡ鎖のヌクレオチド配列により決定される。
【０００４】
導入の適切な可能性は、二本鎖ＲＮＡ分子自体をトランスフェクションすることまたは、ターゲットＲＮＡ分子の一部と同一である配列を有する短い二本鎖ＲＮＡ化合物を直接生じさせるＤＮＡベクター構築物のｉｎ  ｖｉｖｏ転写を含む。多くの場合に、いわゆるｓｈＲＮＡ構築物が、遺伝子サイレンシングのために成功裏に使用された。これらの構築物は、ステムーループＲＮＡをコードしており、それは、細胞への導入後に二本鎖ＲＮＡ化合物にプロセシングされ、その配列は元のＲＮＡ分子のステム（stem）に対応することを特徴とする。
【０００５】
ＩｇＧ１型免疫グロブリンは、位置Ａｓｎ２９７においてまたはある場合には位置Ａｓｎ２９８において、Ｆｃ領域に結合した２つのＮ−連結されたオリゴ糖鎖を有する。Ｎ−連結されたオリゴ糖は、一般にコア（core）フコースが存在するかまたは存在しないトリマンノシルコア構造からなる複合二分岐型(complex biantennary type)である(Rademacher, T.W., et al., Biochem.Soc.Symp.51(1986)131-148; Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180; Okazaki, A, et al., J. Mol. Biol. 336(2004)1239-1249; Shinkawa, T., et al., J. Biol. Chem. 278(2003)3466-3473)。
【０００６】
ＵＳ２００４／０１３２１４０およびＵＳ２００４／０１１０７０４は、リコンビナント抗体を発現する細胞系内でα１，６−フコシルトランスフェラーゼを阻害するためにリコンビナント法または遺伝的方法を報告している。
【０００７】
発明の要約
本発明は、哺乳動物細胞における減少した程度のフコース改変を伴う異種（heterologus）ポリペプチドを産生するための方法であって、
−異種ポリペプチドの発現のために適当な条件下に哺乳動物細胞を培養し、
−該哺乳動物細胞または培養物から異種ポリペプチドを回収する、
ことを含み、
該哺乳動物細胞は、α１，６−フコシルトランスフェラーゼｍＲＮＡを指向するｓｈＲＮＡに転写される配列番号５または配列番号６の核酸、および異種ポリペプチドをコードする核酸、好ましくは異種ポリペプチドとして免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメントまたは免疫グロブリンコンジュゲートをコードする核酸によりトランスフェクションされる、
方法を含む。
【０００８】
１つの態様においては、ｓｈＲＮＡの転写は、ＰｏｌＩＩＩプロモーター、好ましくはＵ６プロモーターのコントロール下にある。１つの態様においては、哺乳動物細胞は、ネオマイシン選択マーカーをコードする核酸で更にトランスフェクションされる。１つの態様においては、哺乳動物細胞はＣＨＯ由来の細胞である。１つの態様においては、哺乳動物細胞は、α１，６−フコシルトランスフェラーゼを指向するｓｈＲＮＡに転写される配列番号５または配列番号６の第１核酸およびネオマイシン選択マーカーをコードする第２核酸、および異種ポリペプチドをコードする第３核酸を含む単一核酸によりトランスフェクションされる。
【０００９】
本発明は、更に、配列番号５または配列番号６の核酸から選ばれる第１核酸、ネオマイシン選択マーカーをコードする第２核酸、および免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメントまたは免疫グロブリンコンジュゲートを含む異種ポリペプチドの群から選ばれる異種ポリペプチドをコードする第３核酸を含む核酸を更に含む。
【００１０】
本発明は、本発明に従う核酸を含む細胞も報告する。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、ｓｈＲＮＡに転写される核酸および異種ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞において、減少した程度のフコース改変を伴う該異種ポリペプチドをリコンビナントに産生するための方法であって、哺乳動物細胞を前記核酸でトランスフェクションし、トランスフェクションされた哺乳動物細胞を該異種ポリペプチドの発現に適当な条件下に培養しそして哺乳動物細胞または培養物から該異種ポリペプチドを回収することを含み、その際哺乳動物細胞においてα１，６−フコシルトランスフェラーゼの酵素活性を、α１，６−フコシルトランスフェラーゼｍＲＮＡを指向する転写されたｓｈＲＮＡによって減少させることを含む。
【００１２】
驚くべきことに、ｓｈＲＮＡに転写される配列番号５または配列番号６の核酸によって、既知の方法に比較して減少した程度のフコース改変を伴う免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメントまたは免疫グロブリンコンジュゲートを、前記核酸を含む哺乳動物細胞の培養により得ることができることが見出された。
【００１３】
本発明は、更に、配列番号５および６から選ばれるα１，６−フコシルトランスフェラーゼに向けたｓｈＲＮＡを転写するための（第１）発現カセット、ネオマイシン選択マーカーを発現するための（第２）発現カセットおよび異種ポリペプチドを発現するための（第３）発現カセットを含む核酸を含む。
【００１４】
本発明は、更に本発明に従う核酸を含む哺乳動物細胞を含む。
【００１５】
本発明を実施するために有用な当業者により知られている方法および技術は、例えば、Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III(1997; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Glover, N.D., and Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II(1995), Oxford University Press; Freshney, R.I.(ed), Animal Cell Culture - a practical approach, IRL Press(1986);Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Second Edition, CHSL Press(1992); Winnacker, E. L.., From Genes to Clones, N.Y., VCH Publishers(1987); Celis, J., ed., Cell Biology, Second edition, Academic Press (1998); Freshney, R.L., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, Second Edition, Alan R. Liss, Inc., N. Y. (1987)。
【００１６】
リコンビナントＤＮＡ技術の使用は、核酸および／またはポリペプチドの多数の誘導体の産生を可能とする。このような誘導体は、例えば、１つの個々の位置またはいくつかの位置で置換、変化、交換、欠失または挿入により改変されうる。改変または誘導体化は、部位特異的突然変異誘発によって行われうる。このような改変は、当業者により容易に行われうる(例えば、Smbrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory manual(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization-a practical approach(1985) IRL Press, Oxford, England)参照)。
【００１７】
リコンビナント技術の使用は、種々のホスト細胞の１種以上の異種核酸によるトランスフォーメーションを可能とする。異なる細胞の転写および翻訳、即ち発現、装置は、同じエレメントを使用するけれども、異なる種に属する細胞は、とりわけ、異なるいわゆるコドン用法(codon usage)を有することができる。その際同じポリペプチド（アミノ酸配列に関して）が異なる核酸（１つまたは複数）によりコードされうる。遺伝コードの縮重により、異なる核酸が同じポリペプチドをコードすることができる。
【００１８】
本明細書で使用された「核酸」は、ポリヌクレオチド分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその改変を指す。このポリヌクレオチド分子は、天然に存在するポリヌクレオチド分子または合成ポリヌクレオチド分子あるいは１種以上の天然に存在するポリヌクレオチド分子の１種以上の合成ポリヌクレオチド分子との組み合わせであることができる。１つ以上のヌクレオチドが、例えば突然変異誘発により変えられているか、欠失しているかまたは付加されている天然に存在するポリヌクレオチド分子もこの定義により包含される。核酸は、単離されうるか、または他の核酸、例えば発現カセット、プラスミドまたはホスト細胞の染色体に組み込まれることができる。核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列により同様に特徴付けられる。
【００１９】
例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列を、該アミノ酸配列をコードする対応する核酸配列に転換するための手順および方法は、当業者に周知されている。したがって、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列により特徴付けられそしてそれによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列により同様に特徴付けられる。
【００２０】
用語「プラスミド」は、例えばシャトルおよび発現プラスミド／ベクターならびにトランスフェクションプラスミド／ベクターを含む。用語「プラスミド」および「ベクター」は、本願においては相互に交換可能に使用される。典型的には、「プラスミド」は、それぞれ、バクテリアにおけるベクター／プラスミドの複製および選択のための、複製の起点（例えばＣｏｌＥ１またはｏｒｉＰ複製起点）および選択マーカー（例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリンまたはクロラムフェニコール選択マーカー）も含むであろう。
【００２１】
「発現カセット」は、細胞における少なくとも含有された核酸、例えば構造遺伝子の発現のための、プロモーターおよびポリアデニル化部位などの必要な調節エレメントを含有する構築物を指す。例えば発現されたポリペプチドの分泌を可能とする場合により追加のエレメントが含有されうる。含有された核酸が転写後に更にポリペプチドに翻訳されないが、例えばｓｈＲＮＡを形成するならば、用語発現カセットを使用することも本発明の範囲内にある。
【００２２】
「構造遺伝子」は、シグナル配列なしの遺伝子のコード領域を示す。
【００２３】
「遺伝子」は、ポリペプチドまたはタンパク質の発現のために必要な例えば染色体またはプラスミドにおける核酸セグメントを示す。コード領域の他に、遺伝子は、プロモーター、イントロン、ターミネーターおよび場合によりリーダーペプチドを含む他の機能的エレメントを含む。
【００２４】
「選択マーカー」は、選択マーカーを有する細胞が対応する選択剤の存在下に、そのためにまたはそれに対して特異的に選択されることを可能とする核酸である。有用な正の選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。この選択マーカーは、それでトランスフォーメーションされたホスト細胞が対応する選択剤、例えば抗生物質の存在下に正に選択されることを可能とする。トランスフォーメーションされていないホスト細胞は、培養物において選択的条件下に成長または生存することができない。選択マーカーは、正、負または二機能性であることができる。正の選択マーカーは、マーカーを有する細胞の選択を可能とするが、これに対して負の選択マーカーは、マーカーを有する細胞が選択的に除去されることを可能とする。典型的には、選択マーカーは、薬物に対する耐性を与えるかまたはホスト細胞における代謝または異化欠陥を相補するであろう。真核細胞で使用される選択マーカーは、例えば、ハイグロマイシン（ｈｙｇ）、ネオマイシン（ｎｅｏ）およびＧ４１８選択マーカーなどのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンターゼ、トリプトファンシンターゼ（選択剤インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（選択剤ヒスチジノールＤ）のための遺伝子、およびプロマイシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシンおよびマイコフェノール酸に対する耐性を与える核酸を含む。更なるマーカー遺伝子は、例えばＷＯ９２／０８７９６およびＷＯ９４／２８１４３に記載されている。
【００２５】
本明細書で使用された用語「発現」は、細胞内で起こる転写および／または翻訳プロセスを指す。ホスト細胞中の所望の産物の転写のレベルは、細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量に基づいて決定されうる。例えば、関心のある配列から転写されたｍＲＮＡは、ＰＣＲまたはノーザンハイブリダイゼーションにより定量されうる(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,  (1989)参照)。関心のある核酸によりコードされたポリペプチドは、種々の方法により、例えば、ＥＬＩＳＡにより、ポリペプチドの生物学的活性をアッセイすることにより、またはポリペプチドを認識しそしてポリペプチドに結合する免疫グロブリンを使用する、ウエスタンブロッティングまたはラジオイムノアッセイなどのこのような活性から独立したアッセイを使用することにより定量されうる(Sambrook et al., 1989, 上記参照)。
【００２６】
「異種ポリペプチドの発現に適当な条件下」という用語は、哺乳動物細胞にトランスフェクションされた核酸によりコードされている異種ポリペプチドを発現するために哺乳動物細胞の培養のために使用され、そして当業者に周知されているかまたは当業者により容易に決定されうる条件を指す。これらの条件は、培養される哺乳動物細胞のタイプおよび発現されるタンパク質のタイプに依存して変わることができる。一般に、哺乳動物細胞は、例えば２０℃〜４０℃の温度で、有効なタンパク質産生を可能とするのに十分な期間、例えば４〜２８日間培養される。
【００２７】
用語「細胞」または「ホスト細胞」は、例えば異種ポリペプチドをコードするかまたはｓｈＲＮＡを構成する核酸が導入／トランスフェクションされうるかまたはされる細胞を指す。ホスト細胞は、ベクター／プラスミドの増殖のために使用される原核細胞および核酸の発現のために使用される真核細胞の両方を含む。好ましくは、真核細胞は哺乳動物細胞である。好ましくは哺乳動物（ホスト）細胞は、ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１もしくはＣＨＯ  ＤＧ４４）、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、ＨＥＫ  ２９３ ＥＢＮＡ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはＣＯＳ細胞のような哺乳動物細胞から選ばれる。好ましくは、哺乳動物細胞は、ハイブリドーマ、ミエローマおよびげっ歯類細胞を含む群から選ばれる。ミエローマ細胞は、ラットミエローマ細胞（例えば、ＹＢ２）およびマウスミエローマ細胞（例えば、ＮＳ０、ＳＰ２／０）を含む。
【００２８】
「ポリペプチド」は、天然に産生されようが合成により産生されようが、ペプチド結合により連結されたアミノ酸からなるポリマーである。約２０未満のアミノ酸残基のポリペプチドは、「ペプチド」と言われうるが、２つ以上のポリペプチドからなるかまたは１００より多くのアミノ酸残基の１つのポリペプチドを含む分子は、「タンパク質」と呼ばれうる。ポリペプチドは、炭水化物基、金属イオンまたはカルボン酸エステルなどの非アミノ酸成分を含むこともできる。非アミノ酸成分は、ポリペプチドを産生する細胞により加えることができ、そして細胞のタイプとともに変わることができる。ポリペプチドは、それらのアミノ酸バックボーン構造によってここでは定義される。炭水化物基などの付加は、一般に特定されないが、それにもかかわらず存在することができる。
【００２９】
本願内で使用される用語「アミノ酸」は、直接または前駆体の形態で核酸によりコードされうるカルボキシα−アミノ酸の群を示し、該カルボキシα−アミノ酸は、アラニン（三文字コード：ａｌａ、一文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む。
【００３０】
本明細書で使用された用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされている１種以上のポリペプチドからなるタンパク質を示す。この定義は、突然変異した形態、即ち１個以上のアミノ酸の置換、欠失および挿入を伴う形態、トランケーションされた（truncated）形態、融合した形態、キメラ形態およびヒト化形態などの変異体を含む。認識された免疫グロブリン遺伝子は、異なる定常領域遺伝子および例えば霊長類およびげっ歯類からのミリアド免疫グロブリン可変領域遺伝子(myriad immunoglobulin variable region genes)を含む。免疫グロブリンは、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ）２、および一本鎖（ｓｃＦＶ）を含む種々の形態で存在することができる(例えば、Huston, J.S., et al., Proc. Natal. Acad. Sci. USA 85 (1988)5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242(1988)423-426; および一般に、Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition(1984) and Hunkapiller, T., and Hood, L., Nature 323(1986) 15-16)。モノクローナル免疫グロブリンは好ましい。
【００３１】
免疫グロブリンの重ポリペプチド鎖および軽ポリペプチド鎖の各々は、もし存在するならば、定常領域（一般にカルボキシル末端部分）を含むことができる。免疫グロブリンの重ポリペプチド鎖および軽ポリペプチド鎖の各々は、もし存在するならば、可変領域（一般にアミノ末端部分）を含むことができる。免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインは、異なる領域、即ち、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＣＤＲ）を含むことができる。
【００３２】
本明細書で使用された用語「モノクローナル免疫グロブリン」は、実質的に均一な免疫グロブリンの集団から得られる免疫グロブリンを指す、即ち、集団を構成する個々の免疫グロブリンは少量で存在しうる可能な天然に存在する突然変異を除いては同一である。モノクローナル免疫グロブリンは、高度に特異的であり、単一抗原部位（エピトープ）を指向する。更に、異なる抗原部位（決定基またはエピトープ）を指向する異なる免疫グロブリンを含むポリクローナル免疫グロブリン調製物と対照的に、各モノクローナル免疫グロブリンは、抗原上の単一抗原部位を指向する。モノクローナル免疫グロブリンは、それらの特異性に加えて、それらが他の免疫グロブリンにより汚染されないで合成されうるという点で有利である。修飾句「モノクローナル」は、免疫グロブリンの実質的に均一な集団から得られるものとしての免疫グロブリンの性質を示しそして何らかの特定の方法により免疫グロブリンの産生を必要とするものとみなすべきではない。
【００３３】
非ヒト（例えばげっ歯類）免疫グロブリンの「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する部分配列およびヒト免疫グロブリンに由来する部分配列を含有するキメラ免疫グロブリンである。大抵の場合に、ヒト化免疫グロブリンは、超可変領域からの残基が、所望の特異性およびアフィニティーを有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー免疫グロブリン）の超可変領域からの残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント免疫グロブリン）に由来する(例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238; US 5,204,244参照)。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化免疫グロブリンは、更なる改変、例えば、レシピエント免疫グロブリンまたはドナー免疫グロブリンにおいて見出されないアミノ酸残基を含むことができる。このような改変は、対応する親配列と相同性であるが同一ではないこのようなレシピエント免疫グロブリンまたはドナー免疫グロブリンの変異体をもたらす。これらの改変は、免疫グロブリン性能をさらに精密にするためになされる。
【００３４】
一般に、ヒト化免疫グロブリンは、超可変ループのすべてまたは実質的すべてが非ヒトドナー免疫グロブリンの超可変ループに対応しそしてＦＲｓのすべてまたは実質的すべてがヒトレシピエント免疫グロブリンのそれである、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的すべてを含むであろう。ヒト化免疫グロブリンは、場合により、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含むであろう。
【００３５】
非ヒト免疫グロブリンをヒト化するための方法は当技術分野において記載されている。好ましくは、ヒト化免疫グロブリンは、非ヒトであるソースからそれに導入された１個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には「インポート」可変ドメインから取られる「インポート」残基としばしば呼ばれる。ヒト化は、Winterおよび共同研究者の方法に従って(Jones, P. T., et al., Nature 321(1986)522-525; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Verhoeyen, M., et al., Science 239 (1988) 1534-1536; Presta, L. G. Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992) 593-596)、ヒト免疫グロブリンの対応する配列を超可変領域配列で置き換えることにより本質的に行うことができる。したがって、このような「ヒト化」免疫グロブリンは、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ないものが、非ヒト種からの対応する配列により置き換えられているキメラ免疫グロブリン（例えば、ＵＳ４，８１６，５６７参照）である。実際に、ヒト化免疫グロブリンは、典型的には、いくらかの超可変領域残基および場合によりいくらかのフレームワーク領域残基が、げっ歯類または非ヒト霊長類免疫グロブリンにおける類似した部位からの残基により置き換えられているヒト免疫グロブリンである。
【００３６】
免疫グロブリンのリコンビナント産生は当技術分野の状態で周知でありそして、例えばMakrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.L., Mol. Biotechnol. 16(2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Reseach 48 (1988) 870-880の概説論文に報告されている。
好ましくは、異種ポリペプチドは、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、免疫グロブリンコンジュゲートを含む群より選ばれる。好ましくは上記免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、免疫グロブリンコンジュゲートは、モノクローナル免疫グロブリン、モノクローナル免疫グロブリンフラグメント、モノクローナル免疫グロブリンコンジュゲートである。
【００３７】
本明細書で使用された用語「免疫グロブリンフラグメント」は、免疫グロブリンの一部を示す。免疫グロブリンフラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、単一鎖（ｓｃＦｖ）、ならびに単一重鎖および単一軽鎖ならびに、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、フレームワーク領域４、超可変領域１、超可変領域２、超可変領域３、軽鎖および重鎖の各々、Ｆａｂ領域、ヒンジ領域、可変領域、重鎖定常ドメイン1、重鎖定常ドメイン２、重鎖定常ドメイン３および軽鎖定常ドメインを含む群より選ばれる少なくとも１つの領域および／またはドメインが欠失している免疫グロブリンを含む。
【００３８】
本明細書で使用される用語「免疫グロブリンコンジュゲート」は、免疫グロブリンとポリペプチドの融合を示す。用語免疫グロブリンコンジュゲートは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントと１〜８つ、好ましくは２つまたは４つのポリペプチドとの融合タンパク質であって、該ポリペプチドの各々は、介在するリンカーポリペプチドを伴いまたは伴わないで異なるＮ末端またはＣ末端アミノ酸に融合されている融合タンパク質を含む。免疫グロブリンコンジュゲートが１つより多くの非免疫グロブリンポリペプチドを含むならば、コンジュゲーションされた非免疫グロブリンポリペプチドの各々は、同じまたは異なるアミノ酸配列および／または長さを有することができる。
【００３９】
本明細書で使用された表現「細胞」は、被験細胞(subject cells)およびその子孫を含む。したがって、用語「トランスフォーマント」および「トランスフォーメーションされた細胞」は、初代被験細胞(primary subject cell)およびトランスファーの数に関係なくそれに由来する培養物を含む。すべての子孫は、意図的突然変異および意図しない突然変異により、ＤＮＡ含有率において正確に同じではないことがありうることも理解される。最初にトランスフォーメーションされた細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。
【００４０】
本発明に従う異種ポリペプチドは、リコンビナント手段により産生される。このような方法は、当該分野の技術水準において広く知られており、そして異種ポリペプチドのその後の回収および単離ならびに通常薬学的に許容されうる純度への精製を伴う、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質発現を含む。免疫グロブリンである異種ポリペプチドの場合には、軽鎖および重鎖またはそのフラグメントまたはそのコンジュゲートをコードする核酸は、標準方法により発現カセットに挿入される。免疫グロブリンをコードする核酸は、慣用の方法を使用して容易に単離されそして配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このような核酸のソースとして役立つことができる。発現カセットは、１つ以上の発現ベクターに挿入されることができ、この発現ベクターは、次いでそうしなければ免疫グロブリンを産生しない（ホスト）細胞にトランスフェクションされる。発現は、適切な真核（ホスト）細胞において行われそして免疫グロブリンは、溶解後の細胞からまたは上清から回収される。
【００４１】
抗体のリコンビナント産生は、当該分野の技術水準において周知でありそして、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17(1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16(2000) 151-160; Werner, R. G. Drug Research 48 (1998) 870-880の概説論文に記載されている。
【００４２】
微生物タンパク質によるアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオン交換（カルボキシメチル樹脂）、アニオン交換（アミノエチル樹脂）および混合方式交換）、チオフィリック吸着（例えば、β−メルカプトエタノールおよび他のＳＨリガンドによる）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニルセファロース、アザ−アレノフィリック樹脂(aza-arenophilic resins)またはｍ−アミノフェニルボロン酸による）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えばＮｉ（ＩＩ）アフィニティー物質およびＣｕ（ＩＩ）アフィニティー物質による）、サイズ排除クロマトグラフィーおよび電気泳動法（ゲル電気泳動、キャピタリー電気泳動などの）（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75(1998)93-102）などのタンパク質回収および精製のための種々の方法が十分に確立されそして広く使用されている。
【００４３】
本発明は、一般にいわゆる二本鎖ＲＮＡヌクリアーゼダイサーおよびＲＩＳＣ複合体を発現するすべての生きている細胞、換言すれば、ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングが観察されうるすべての細胞において一般に適用可能である。したがって、本発明は、哺乳動物細胞系に主として適用されうるが、すべてのタイプの真核細胞にも適用されうる。しかしながら、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、例えばＣＨＯ  Ｋ１(Jones, C., et al., Cytogenet. Cell Genet. 16(1976) 387-390)またはＣＨＯ  ＤＧ４４（Urlaub, G, et al, Cell 33 (1983) 405-412; Urlaub, G., et al., Somat. Cell. Mol. Genet. 12(1986) 555-566）,ヒト胚腎臓細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞(Graham, F.L., et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59-74)またはＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞、ＮＳ0細胞(Barnes L. M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes L. M., et al., Biotech. Bioeng. 73(2001) 269-270)、および／またはＳＰ２／０細胞（Schulman, M., et al., Nature 276 (1978) 269-270）などのリコンビナントポリペプチドを産生するために普通に使用される細胞系が好ましい。
【００４４】
本発明の文脈において、用語「α１，６−フコシルトランスフェラーゼおよびその文字通りの均等物の酵素活性の減少」は、異種ポリペプチドの発現のために使用される細胞におけるｓｈＲＮＡ化合物により媒介される該α１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする特異的ターゲットｍＲＮＡの分解を示す。ｓｈＲＮＡ化合物自体は、該ｓｈＲＮＡ化合物を構成する適切な発現カセットによる（ホスト）細胞のトランスフェクション後に合成される。または、後にＲＮＡｉ化合物にプロセシングされるＲＮＡｉ化合物の前駆体によるトランスフェクションが可能である。
【００４５】
本発明に従うＲＮＡｉ化合物は、α１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ターゲティングされたｍＲＮＡ）を指向するｓｈＲＮＡである。これまで、２つの主要な遺伝子サイレンシングストラテジーがｉｎ−ｖｉｔｒｏ研究のために出現した：小さな干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）および小さなヘアピンＲＮＡｓ（ｓｈＲＮＡｓ）(Tuschl, T., Nature Biotechnol. 20 (2002) 446-448)。本発明に従うプラスミド由来のｓｈＲＮＡｓは、レポーター遺伝子または選択マーカーとの組み合わせおよびウイルスベクターを介するデリバリーに対する選択の自由を与える(Brummelkamp, T.R, and Bernards, R., Ｎat. Ｒev. Ｃancer 3 (2003) 781-789)。ＲＮＡｉ化合物による細胞のトランスフェクションは、ターゲットｍＲＮＡおよびしたがって対応するポリペプチドおよび同時に対応する酵素活性の減少したレベルを有する細胞をもたらす。ｍＲＮＡレベルは、対応する野生型細胞のｍＲＮＡレベルの５％〜２０％、好ましくは５％〜１５％、更に好ましくは５％〜１０％である。野生型細胞は、ターゲティングされたｍＲＮＡがＲＮＡｉ化合物により分解されていない、ＲＮＡｉ化合物をコードする核酸の導入の前の細胞である。
【００４６】
安定な細胞クローンの発生は、しばしば冗長で長いプロセスである。したがつて、１つの態様においては、リコンビナントに発現された細胞表面マーカーによる選択が、トランスフェクタントの単離のために使用される。任意の種類の遺伝子であって、その発現産物が高レベルのｓｈＲＮＡ化合物を発現するトランスフェクタントの濃縮および選択のためのマーカーとして細胞表面上に位置している任意の種類の遺伝子を使用することは本発明の範囲内にある。Ｉ−ＮＧＦＲ、トランケーションされた形態の低アフィニティー神経増殖因子レセプター（したがって、シグナル伝達のためには不活性である）は、細胞表面に発現されそして細胞生物学的解析のための高度に有用なマーカーであることが証明された(Phillips, K., et al., Nat. Med. 2 (1996) 1154-1156 and Machl, A.W., et al., Cytometry 29 (1997) 371-374)。
【００４７】
本発明の範囲内で、細胞トランスフォーマントは、当技術分野で知られている実質的に任意の種類のトランスフェクション方法により得ることができる。例えば、ベクターＤＮＡは、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションにより細胞に導入されうる。または、ＦｕＧＥＮＥ  ６(Roch Diagnostics GmbH)、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ(Roch Diagnostics GmbH)、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ(Invitrogen Corp.)またはヌクレオフェクション(AMAXA AG, cologne, Germany)などのリポフェクション試薬を使用することができる。更に別法として、細胞表面タンパク質およびｓｈＲＮＡ化合物のための発現カセットを含むベクターＤＮＡを、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに基づく適切なウイルスベクターにより細胞に導入することができる(Singer,O., Proc. Natl. Acad.USA 101 (2004) 5513-5314)。
【００４８】
１つの態様においては、哺乳動物細胞を選択マーカーをコードする核酸でトランスフェクションする。好ましくは、選択マーカーは、ハイグロマイシン、プロマイシンおよび／またはネオマイシン選択マーカーから選ばれる。この態様においては、選択圧力、即ち選択剤の存在下の培養は、安定にトランスフェクションされた細胞系の選択／増殖をもたらす。１つの態様においては、選択圧力は、Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＬＣＡ）の添加による。
【００４９】
１つの態様においては、本発明は、哺乳動物細胞における減少した程度のフコース改変を有する異種ポリペプチドをリコンビナントに産生するための方法であって、
異種ポリペプチドの発現に適当な条件下に哺乳動物細胞を培養し、
哺乳動物細胞または培養物から異種ポリペプチドを回収する、
ことを含み、その際、哺乳動物細胞は、α１，６−フコシルトランスフェラーゼｍＲＮＡを指向するｓｈＲＮＡに転写される配列番号５または配列番号６の第１核酸、ネオマイシン選択マーカーをコードする第３核酸および異種ポリペプチドをコードする第２核酸を含む核酸でトランスフェクションされる、方法を含む。１つの態様においては、哺乳動物細胞は、単一核酸でトランスフェクションされる。用語「単一核酸」は、本願においては、核酸の発生および産生から現れる１つのヌクレオチド変化（これらの変化はコードされたｍＲＮＡに対する効果を持たない）にもかかわらず同一の核酸配列を有する核酸の混合物を示す。用語「同一の核酸配列」は、前記哺乳動物細胞をトランスフェクションするために使用される核酸が少なくとも９０％、または少なくとも９５％または少なくとも９８％または９８％以上のヌクレオチド同一性を有することを示す。
【００５０】
ｓｈＲＮＡ化合物を構成している核酸に由来する転写物は、ＣＭＶプロモーターなどのＰｏｌＩＩプロモーターまたはＨ１、Ｕ６もしくは７ＳＫプロモーターなどのＰｏｌ ＩＩＩプロモーターから転写されうる(Zhou, H., et al., Nucleic Acids Res. 33(2005) e62; Brummelkamp, T.R. and Bernards, R., Nat. Rev. Cancer 3(2003) 781-789; Czauderma, F., et al., Nucleic Acids res. 31 (2003) e127)。
【００５１】
Ｐｏｌ  ＩＩＩ媒介転写の場合には、前駆体ＲＮＡ産物の適切な３’プロセシングのために転写されたＲＮＡの３’端部にＴＴＴＴ、好ましくはＴＴＴＴＴＴのＰＯｌ  ＩＩＩターミネーター配列を有することが必須である(Dykxhoorn, D. M.., et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4(2003) 457-467)。
【００５２】
ＲＮＡｉ化合物は、ヘアピンコンホメーションを有するＲＮＡ、即ち、ｓｈＲＮＡである。活性なＲＮＡｉ化合物として、このような分子は、Ｈ１およびＵ６プロモーターからの転写が通常Ｇで出発するという事実により、その５’端部でＧヌクレオチドで出発することができる。分子のステムは、逆方向反復配列によるものでありそして長さが１９〜２９、好ましくは１９〜２３塩基対である。好ましくは、これらの逆方向反復配列は互いに完全に相補性であり、そして何らの内部ミスマッチなしに二本鎖ハイブリッドを形成することができる。
【００５３】
分子の内部ループは、４〜４０、好ましくは４〜９ヌクレオチドの単一ストランド鎖である。このループでは、分子をｓｈＲＮＡ分子として作用することができない別の二次構造にそれ自体を折りたたむのを阻止するために、任意の逆方向反復配列を回避することは重要である。
【００５４】
ｓｈＲＮＡの３’端部にはオーバーハングがありうる。ＰＯｌ  ＩＩＩプロモーターの使用の場合に、オーバーハングは、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターのターミネーターシグナルにより２〜４Ｕ残基であることができる。細胞内で発現されるとき、これらのヘアピン構築物は、遺伝子サイレンシングを媒介することができる活性な二本鎖分子に急速にプロセシングされる(Dykxhoorn, D. M. et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4(2003)457-467)。
【００５５】
核酸（ＤＮＡ）は、４つのヌクレオ塩基またはヌクレオチド塩基、Ａ、Ｃ、ＴおよびＧからなる。Ａはアデノシンを表し、Ｃはシチジンを表し、Ｔはチミジンを表しそしてはＧはグアノシンを表す。ＲＮＡにおいては、チミジンは、ウリジン（Ｕ）により置き換えられる。
【００５６】
α１，６−フコシルトランスフェラーゼｍＲＮＡを指向するｓｈＲＮＡ化合物は、適切な発現カセットから転写される。それは、長さが１９〜２９ヌクレオチド、好ましくは１９〜２３ヌクレオチドのステムを含み、その配列は、不活性化されなければならないターゲットｍＲＮＡと同一／相補性である。
【００５７】
１つの態様においては、α１，６−フコシルトランスフェラーゼｍＲＮＡを指向するｓｈＲＮＡのステムの核酸は、
【００５８】
【表１】
2010512766.tif 000003
【００５９】
を含む核酸の群から選ばれる。
【００６０】
１つの態様においては、α１，６−フコシルトランスフェラーゼｍＲＮＡを指向するｓｈＲＮＡのループの核酸は、核酸ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号４）である。
【００６１】
１つの態様においては、ｓｈＲＮＡに転写される核酸は、配列番号５および６を含む核酸の群から選ばれる、即ち、ｓｈＲＮＡに転写される核酸は、配列番号５の核酸配列または配列番号６の核酸配列を有する。
【００６２】
本発明に従う方法により、約５０倍のターゲットｍＲＮＡの減少が達成されうる。このような程度の減少は、合理的に高い収率で減少した程度のフコシル化を有する異種ポリペプチドを産生するのに十分である。
【００６３】
用語「減少した程度のフコース改変を有する異種ポリペプチド」及びその文法的均等物は、α１，６−フコシルトランスフェラーゼｍＲＮＡを指向するｓｈＲＮＡに転写される核酸および異種ポリペプチドをコードする核酸でトランスフェクションされている哺乳動物細胞において発現される異種ポリペプチドであって、アスパラギン連結Ｎ−アセチルグルコサミンの６−位置におけるそのフコシル化は、異種ポリペプチドをコードする核酸でトランスフェクションされているがα１，６−フコシルトランスフェラーゼを指向するｓｈＲＮＡに転写される核酸でトランスフェクションされていない同じタイプの哺乳動物細胞において発現される異種ポリペプチドと比較して減少している、異種ポリペプチドを示す。１つの態様においては、α１，６−フコシルトランスフェラーゼｍＲＮＡを指向するｓｈＲＮＡに転写される核酸および異種ポリペプチドをコードする核酸でトランスフェクションされている哺乳動物細胞において発現される異種ポリペプチドのフコシル化の、異種ポリペプチドをコードする核酸でトランスフェクションされているがα１，６−フコシルトランスフェラーゼｍＲＮＡを指向するｓｈＲＮＡに転写される核酸でトランスフェクションされていない同じタイプの哺乳動物細胞において発現される異種ポリペプチドのフコシル化に対する割合は、１５％以下である。これは、異種ポリペプチドが１５％以下までフコシル化されることを示す。好ましくは、フコシル化されていない異種ポリペプチドのフコシル化されている異種ポリペプチドに対する割合は、０．１５以下、即ち、例えば０．１２である。
【００６４】
「異種ＤＮＡ」または「異種ポリペプチド」は、所与のホスト細胞内に天然には存在しないＤＮＡ分子もしくはポリペプチド、またはＤＮＡ分子の集団もしくはポリペプチドの集団を指す。特定のホスト細胞に対して異種のＤＮＡ分子は、ホストＤＮＡが非ホストＤＮＡ（即ち外来性ＤＮＡ）と組み合わされているかぎり、ホスト細胞種に由来するＤＮＡ（即ち内在性ＤＮＡ）を含有することができる。例えば、プロモーターを含むホストＤＮＡセグメントに作用可能に連結された(operably linked)ポリペプチドをコードする非ホストＤＮＡセグメントを含有するＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子であると考えられる。反対に、異種ＤＮＡ分子は、外来性プロモーターと作用可能に連結された内在性構造遺伝子を含むことができる。非ホストＤＮＡ分子によりコードされたポリペプチドは、「異種」ポリペプチドである。
【００６５】
「作用可能に連結された」は、２つ以上の成分の並置(juxtaposition)であって、そのように記載された成分が、それらの意図する方式でそれらを機能させる関係にある、２つ以上の成分の並置である。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、もしそれがシスで作用して連結された配列の転写をコントロールまたはモデュレーションするならば、コード配列に作用可能に連結されている。一般に、しかし必ずしもそうではないが、「作用可能に連結されている」ＤＮＡ配列は、連続しておりそして分泌リーダー／シグナル配列とポリペプチドなどの２つのタンパク質コード領域を接続することが必要ならば、連続しておりそしてフレームワーク内にある。ポリアデニル化部位は、転写がコード配列を通してポリアデニル化配列に進行するように、それがコード配列の下流端部に位置しているならば、コード配列に作用可能に連結されている。連結は、当技術分野で知られているリコンビナント方法により、例えばＰＣＲ方法を使用しておよび／または都合のよい制限部位におけるライゲーションにより達成される。都合のよい制限部位が存在しなければ、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが慣用の実施に従って使用される。
下記の実施例、配列リストおよび図は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく記載された方法において改変がなされるうることは理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ｓｈＲＮＡＦｕＴ８の転写のための本発明に従うベクターである。
【図２】ｓｈＲＮＡＦｕＴ８でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞から単離された高い（上部パネル）および低い（下部パネル）量の異なってフコシル化された抗体を示す質量スペクトルおよびネオマイシン、ｌ−ＮＧＦＲ濃縮およびＬＣＡ選択（上部パネル）によるその後の選択または実施例４に開示されたネオマイシン選択のみによるその後の選択を示す。
【図３】抗体のアスパラギンに結合した炭水化物構造の略図（ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｍａｎ＝マンノース、Ｇａｌ＝ガラクトース、Ｆｕｃ＝フコース、ＮｅｕＡｃ＝Ｎ−アセチルノイラミン酸）である。
【００６７】
実施例
実施例１
ベクタークローニング
ベクターｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１＿Ｕ６ｎｅｏ(Ambion Inc., ca. no. 5764)の位置１８４に、ＸｈｏＩ部位を部位特異的突然変異誘発により導入した。次いでｌ−ＮＧＦＲ（低アフィニティー神経成長因子；例えば、Phllips, K., et al., Nat. Med. 2 (1996) 1154-1156およびMachl, A. W., et al., Cytometry 29 (19987) 371-374参照）発現カセットをＸｈｏｌ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位にクローニングした。ＦｕＴ８ｓｈＲＮＡを発生させるために、下記のオリゴヌクレオチドを使用した。
【００６８】
【表２】
2010512766.tif 000004
【００６９】
アニーリングされたＦｕＴ８ｓｈＲＮＡを対応するベクターフラグメント（ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化された）にライゲーションした。完成したベクターは、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１＿Ｕ６ｎｅｏ＿ｌ−ＮＧＦＲ＿ｓｈＲＮＡＦｕＴ８（ｐサイレンサー）と呼ばれた。
【００７０】
実施例２
単一クローンの選択および単離
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を抗体発現プラスミドでトランスフェクションした。例示的抗体として、ヒトインスリン様成長因子レセプター１に結合する抗体を使用した（配列について、例えばＷＯ２００５／００５６３５参照）。
抗体を産生するＣＨＯ−ＤＧ４４クローン（野生型、ｐサイレンサーなしの）を、製造者のマニュアルに従ってＦｕＧＥＮＥ試薬（Roche Diagnostics GmbH）を使用してｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１＿Ｕ６ｎｅｏ＿ｌ−ＮＧＦＲ＿ｓｈＲＮＡＦｕＴ８でトランスフェクションした。安定にトランスフェクションされた細胞を、１％２００mM  Ｌ−グルタミン（Gibco）および１０％の透析されγ照射されたウシ胎仔血清(cat. No. 1060-017; Gibco（登録商標), Invitrogen GmbH, Germany)を補充されたＭＥＭα培地(cat. No. 2561-021; Gibco（登録商標）, Invitrogen GmbH, Germany）中で培養した。トランスフェクションされた細胞を４００μg／mlネオマイシンで１週間選択した。生残している細胞を、製造者のマニュアルに従ってＭＡＣＳｅｌｅｃｔ−ｌ−ＮＧＦＲシステム(Miltenyi Biotec; cat. 130-091-879)を使用してｌ−ＮＧＦＲ濃縮した。ｌ−ＮＧＦＲ濃縮した細胞を０．５mg/mlＬＣＡ（Lens culinaris agglutinin)で選択した。ＬＣＡ選択されたプールを１個の細胞／９６ウエルに希釈することによりＬＣＡ選択された細胞のクローンを回収した。
【００７１】
実施例３
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成および定量的ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡをＤＮＡｓｅ消化を含むＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ(Qiagen GmbH, Germany)を使用して単離した。等量の全ＲＮＡ（４００ng）を、アンカーされたオリゴ（ｄＴ）１８プライマーによりＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ(Roche Diagnostic  GmbH, Germany)を使用して逆転写した。サンプルを、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ｋｉｔ(Roche Diagnostic  GmbH, Germany)を使用してｃＤＮＡ合成後にリアルタイムＰＣＲにより解析した。ＦｕＴ８(Fucosyltransferase 8)およびＡＬＡＳ（５−アミノレブリン酸シンターゼ）ｃＤＮＡの増幅および検出のために、配列特異的プライマーを下記のとおり使用した：
【００７２】
【表３】
2010512766.tif 000005
【００７３】
増幅を下記の条件下に行った：９５℃で１０分間のプレインキュベーション工程、続いて９５℃で１０秒、５２℃で１０秒および７２℃で８秒（温度勾配２０℃／秒）の４５サイクル。ＦｕＴ８ｃＤＮＡレベルをLightCycler Relative Quantification Softwareを使用してハウスキーピング遺伝子ＡＬＡＳのレベルに対して正規化した。結果を下記の表１に示す。
【００７４】
表１：  ＦｕＴ８ｍＲＮＡ発現のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＲＴ−ＰＣＲ解析
【表４】
2010512766.tif 000006
ＬＣＡ、クローン１およびＬＣＡ、クローン９は、約５０〜４０倍減少しているα１，６−フコシルトランスフェラーゼｍＲＮＡの残留量を表す。
【００７５】
実施例４
抗体糖構造の質量分光分析
抗体のそれぞれＡｓｎ２９７およびＡｓｎ２９８における糖鎖アイソフォームの相対的含有率を、グリコシル化されたインタクトな抗体重鎖（ＨＣ）において下記に述べた質量分析法により決定した：
Ａ）抗体およびＦｕＴ８ｓｈＲＮＡを発現する細胞の培養上清からの抗体の精製
ＦｕＴ８に対するｓｈＲＮＡも発現する細胞により産生される抗体（濃度〜５〜２０μg／ml）を含有する培養上清約５〜１０mlをプロテインＡ−セファロース（商標）ＣＬ−４Ｂ（３０mg／１００μl；Amersham Pharmacia Biotech AB）懸濁液約１００μlと４℃で一夜バイアルを逆さにしながらインキュベーションした。その後、サンプルをエッペンドルフ遠心分離機５８１０Ｒ中で約４００×gで１５分間遠心して、抗体が結合しているプロテインＡ−セファロースを沈降させた。培養上清を完全に除去し、ペレットを二重蒸留した水約５０μlで３回洗浄した。第３洗浄後に、溶液を完全に除去し、１００mMクエン酸バッファー、ｐＨ２．８約３０〜５０μlをペレットに加えそして室温で１５分間振とうしながらインキュベーションして、プロテインAに結合した抗体を放出させた。インキュベーション後に、懸濁液をエッペンドルフ遠心分離機で１４，０００rpmにて５分間遠心し、そして得られる上清を注意深く除去した。１００mMクエン酸バッファー、ｐＨ２．８約３０〜５０μlを加え、室温で約１５分間振とうさせそしてエッペンドルフ遠心分離機で１４，０００rpmにて５分間遠心によりプロテインＡ−セファロースを沈殿させる(spinning down)ことにより、プロテインＡペレットを1回洗浄した。上清を注意深く除去しそして第１放出工程のそれぞれの溶液と一緒にした。プロテインＡペレットを捨てた。
【００７６】
Ｂ）ＥＳＩ質量分析法によるオリゴ糖構造アイソフォームの分析
工程Ａ）で得られた抗体サンプル（〜６０μl、各々２０〜５０μgを含有する）を、６Mグアニジン塩酸塩１００μlおよびＴＣＥＰ−グアニジン溶液（６Mグアニジン塩酸塩中の１Mトリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン塩酸塩）６０μlを加えて抗体溶液を３〜４Mグアニジン塩酸塩および２５０mMＴＣＥＰに調節することにより、軽鎖（ＬＣ）およびグリコシル化された重鎖（ＨＣ）に変性、還元した。サンプルを３７℃で１．５時間インキュベーションした。還元されそして変性されたサンプルをランニングバッファーとして２％ギ酸（容積／容積）および４０％アセトニトリル（容積／容積）によるＧ２５ゲルろ過により脱塩し、次いで約１００００の解像力でＷａｔｅｒｓからのＱ−Ｔｏｆ２またはＬＣＴ質量分析計機器においてナノスプレー針(Proxeon Cat # ES 387)によるオフライン静的ＥＳＩ−ＭＳ分析に供した。この機器を、製造者のインストラクションに従って調整しそして一次多項式フィットを使用して５００〜２０００の質量範囲においてヨウ化ナトリウムにより較正した。結果を図２に示す。
【００７７】
サンプルの測定期間中、７００〜２０００の質量範囲における３０〜４０回のシングルスキャンをルーチンに記録しそして１０〜３０回のシングルスキャンを加えて評価のために使用される最終のｍ／ｚスペクトルを得た。
【００７８】
ＨＣに結合した炭水化物構造の同定および個々の糖構造アイソフォームの相対的含有率の計算を、得られたｍ／ｚスペクトルから行った。Ｗａｔｅｒｓのマスリンクスソフトウエア(mass lynx software)のデコンボルーションツールを使用して、検出された個々のグリコシル化されたＨＣ種の質量を計算した。
【００７９】
ＨＣに結合したそれぞれの炭水化物構造は、個々のグリコシル化されたＨＣ種について得られた質量とＤＮＡ配列から推定されたグリコシル化されていないＨＣの質量との質量差を計算しそしてこれらの質量差を抗体の既知のＮ−連結されたグリコール構造の理論的質量と比較することにより適宜に帰属された。
【００８０】
オリゴ糖アイソフォームの割合の決定のために、個々の異なってグリコシル化されたＨＣ種のピーク高さを、ＬＣ等のような他の分子の他のシグナルと重なり合わない、いくつかの選ばれた単一電荷（ｍ／ｚ）状態から決定した。オリゴ糖アイソフォームの割合の決定のために、Ｇ０＋ＦｕｃおよびＧ０のピーク高さ（図３参照）を選ばれた単一電荷（ｍ／ｚ）状態から決定した（図２における例参照）。異なるフコシル化を有する糖構造の相対的含有率を、Ｇ０構造＋フコースを含有するＨＣ種（Ｇ０＋Ｆｕｃ；末端ガラクトース残基を欠きそしてコアフコシル化を有する複合二分岐構造(complex,bi-antennary structure)）のピーク高さとＧ０構造−フコース（Ｇ０−Ｆｕｃ；図３ａ参照）を含有するＨＣ種のピーク高さの比からのみ推定した。この決定のために、同じ電荷（ｍ／ｚ）状態内の対応するピークを使用した（例えば、Ｇ０＋フコースおよびｍ／ｚ４５のフコースなしのＧ０のピーク）。定量的結果を表２に示す。
【００８１】
表２：質量分析法により決定されたフコシル化の百分率
【表５】
2010512766.tif 000007
【００８２】
実施例５
ＡＤＣＣアッセイ（抗体依存性細胞傷害性）
ＬＣＡクローン１および９およびコントロールとしての野生型細胞により産生された抗体の添加により誘導される腫瘍細胞溶解の検出のためのＡＤＣＣアッセイを、製造者のマニュアル（PerkinElmer, USA）に従って行った。エフェクター細胞として、単離されたばかりの末梢血細胞を使用し、ターゲット細胞として、ＤＵ１４５細胞を使用した。結果を表３に示す。
【００８３】
表３：０．５％トリトン処理細胞（１００％放出）に対する放出された細胞の百分率を示すＡＤＣＣアッセイ
【表６】
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【００８４】
実施例６
サイレンシング効果の安定性
ＣＨＯ−ＤＧ４４／野生型およびＣＨＯ−ＤＧ４４／ＬＣＡクローン９を選択圧力なしで４週間培養した。週毎に１×１０６細胞を６cｍ培養皿でプレートした。２４時間後に、細胞を回収した。ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびデータ解析を、実施例３におけると同じに行った。結果を表４に示す。
【００８５】
表４：サイレンシング効果の安定性
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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