(57)【要約】  本発明は、対象物を混入物から選別するためのホログラフィック光トラッピングを使用すること、および対象物についてその識別を決定するために（単一細胞）ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を行うことを含む、法医学的サンプル中の対象物を選別し、該対象物を同定するための装置および方法に関する。加えて、対象物を選別するための支持体として用いられるチップは、単一細胞ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を行うためにも使用できる。別の実施形態によれば、単一細胞ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を行う前に、サンプルを流動させて対象物を選別するためにマイクロ流体チップが用いられる。マイクロ流体による流動および選別の非存在下または存在下において、ＨＯＴを利用する選別のために用いられるチップは、単一細胞ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析に用いられるものと同じであってもよい。
2010538644.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の対象物を選別および同定する方法であって、
ホログラフィック光トラッピング装置を提供すること；
分離されるべき対象物を含むサンプルを供給すること；
前記サンプル中の前記対象物を光学的に捕捉すること；
前記光トラッピングを用いて、前記対象物を所望の対象物と非所望の対象物とに選別すること；
前記サンプルから少なくとも１の所望の対象物を移動させること；および
前記所望の対象物についてＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を実施して、前記所望の対象物の識別を決定する、ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を実施することを含む方法。
【請求項２】
前記光トラッピングステップに先立って、前記方法が：
マイクロ流体チップ内の流体の流れの中に前記サンプルを供給すること；および
前記マイクロ流体チップを通して前記サンプルを流動させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記所望の対象物のそれぞれが個別チャンバー内へ選別される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記選別ステップおよび前記実施ステップが単一のマイクロ流体チップ上で行なわれる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記所望の対象物が細胞であり、前記非所望の対象物が混入物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記所望の対象物が癌細胞であり、前記非所望の対象物が健常細胞であるか、またはその逆である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記実施ステップが単一細胞ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記マイクロ流体チャンバーが前記サンプルを含む入力チャンバーを含み、前記サンプルが前記入力チャンバーから少なくとも１の出力チャンバーへ流れ込む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記入力チャンバーの出口にフィルターを供給することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
逆流を防ぐために前記マイクロ流体チャンバー内にバルブを供給することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記の選別ステップおよびＰＣＲ実施ステップが自動化ならびに多重化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
サンプル中の対象物を選別および同定する方法であって、
入力チャンバーおよび少なくとも１の出力チャンバーを有するマイクロ流体チップを提供すること；
選別されるべき対象物を含むサンプルを前記入力チャンバー内に供給すること；
前記対象物が所望の対象物と非所望の対象物とに選別されるように、前記対象物を前記入力チャンバー内で流体の流れを用いて選別すること；
前記所望の対象物を少なくとも１の前記出力チャンバー内へ移動させること；および
前記所望の対象物それぞれについてＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を実施して、前記所望の対象物の識別を決定することを含む方法。
【請求項１３】
前記選別ステップおよび前記実施ステップが単一のマイクロ流体チップ上で行なわれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記所望の対象物が細胞であり、前記非所望の対象物が混入物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記実施ステップが単一細胞ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記所望の対象物が正常細胞であり、前記非所望の対象物が癌性細胞であるか、またはその逆である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記入力チャンバーの出口にフィルターを供給することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
逆流を防ぐために前記マイクロ流体チャンバー内にバルブを供給することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記の選別ステップおよびＰＣＲ実施ステップが自動化ならびに多重化されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
対象物を選別するための装置であって、
サンプルが配置される支持体を有するホログラフィック光トラッピング装置であって、該光トラッピング装置が、前記サンプル中の非所望の対象物から所望の対象物を光学的に捕捉し選別するホログラフィック光トラッピング装置；および
前記所望の対象物についてＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を実施するための装置、を含む装置。
【請求項２１】
前記所望の対象物が細胞であり、前記非所望の対象物が混入物である、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
前記所望の対象物が正常細胞であり、前記非所望の対象物が癌性細胞であるか、またはその逆である、請求項２０に記載の装置。
【請求項２３】
前記ＰＣＲ装置が単一細胞ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を行う、請求項２０に記載の装置。
【請求項２４】
前記所望の対象物の光トラッピングの前に前記サンプルを流動させるためのマイクロ流体チップをさらに含む、請求項２０に記載の装置。
【請求項２５】
前記支持体および前記のＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を実施するための前記装置が単一チップである、請求項２０に記載の装置。
【請求項２６】
逆流を防ぐための、前記マイクロ流体チャンバー内に配置される複数のバルブをさらに含む、請求項２０に記載の装置。
【請求項２７】
前記入口チャンバーの出口に配置されるフィルターをさらに含む、請求項２０に記載の装置。
【請求項２８】
前記の選別ステップおよびＰＣＲ実施ステップが自動化ならびに多重化されている、請求項２０に記載の装置。
【請求項２９】
対象物を選別するための装置であって、
サンプルを含む入力チャンバーおよび少なくとも１の出力チャンバーを含むマイクロ流体チップであって；
前記マイクロ流体チップが前記サンプルを流し、非所望の対象物から所望の対象物が、前記入力チャンバーから前記の少なくとも１の出力チャンバーへ選別されるマイクロ流体チップ；および
前記所望の対象物についてＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を実施するための装置、を含む装置。
【請求項３０】
前記非所望の対象物から前記所望の対象物を、前記入力チャンバーから前記の少なくとも１の出力チャンバーへ選別するためのホログラフィック光トラッピング装置をさらに含む、請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】
前記マイクロ流体チップおよび前記ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を実施するための前記装置が単一チップである、請求項２９に記載の装置。
【請求項３２】
前記所望の対象物が細胞であり、前記非所望の対象物が混入物である、請求項２９に記載の装置。
【請求項３３】
前記所望の対象物が正常細胞であり、前記非所望の対象物が癌性細胞である、請求項２９に記載の装置。
【請求項３４】
逆流を防ぐための、前記マイクロ流体チャンバー内に配置される複数のバルブをさらに含む、請求項２９に記載の装置。
【請求項３５】
前記入口チャンバーの出口に配置されるフィルターをさらに含む、請求項２９に記載の装置。
【請求項３６】
前記の選別ステップおよびＰＣＲ実施ステップが自動化ならびに多重化されている、請求項２９に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００７年９月１３日に出願した米国仮出願第６０／９６０，０５９号の優先権を主張するものである。この仮出願の内容全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、法医学的ＤＮＡ分析および医学的診断において対象物を選別するための方法および装置に関する。より詳細には、本発明は、性的暴行事件の犯人／加害者を同定するためのＳＴＲ分析等の法医学的ＤＮＡ分析において用いられる、単一細胞ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法のための精子の選別に関する。さらに本発明は、法医学的ＤＮＡ分析におけるオンチップＰＣＲの使用に関する。最後に、細胞選別および単一細胞ＰＣＲについての本発明は、健常細胞から癌細胞を区別するためにＳＴＲに基づく細胞同定が一般的となりつつある癌診断分野など、法医学分野以外にも適用される。
【背景技術】
【０００３】
従来の法医学的ＤＮＡ検体は、一般的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による高度に多型性のショートタンデムリピート（ＳＴＲ）の増幅を含むヒト同定システムを用いて、現代の法執行において申し立てられた犯罪容疑者と照合される。ＰＣＲは、微量のＤＮＡ断片を有意義な方法で分析できる量まで複製／増幅できる強力な手段である。この技術はＤＮＡ塩基配列決定、ＤＮＡ指紋鑑定などに適応され、サンプル中の特異的なＤＮＡ断片を検出することが可能である。
【０００４】
したがって、法医学的ＤＮＡ分析は、ヒトゲノム中のＳＴＲマーカーの高性能な識別能および迅速な分析速度により達成され、現在、法医学的ＤＮＡ分析において最も一般的に選択される方法となっている。
【０００５】
説明のために、ＳＴＲは、２〜６個のヌクレオチドのパターンが反復し、かつ該反復配列が互いに隣接している場合に生じる短いＤＮＡ配列である。ＳＴＲ配列は、反復単位の長さ、反復の数、および増分反復パターンと適合する厳密さにおいて異なる。ＳＴＲマーカーはゲノムの至る所に散乱しており、１０，０００ヌクレオチド毎に１の頻度で現れる。２００１年の国際ヒトゲノム配列決定コンソーシアム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）のデータに基づくと、ＳＴＲまたはマイクロサテライトは全ヒトゲノムの約３％を占める。現在、法医学的分析におけるヒト同定については、１３のＳＴＲが公知のＰＣＲ法を用いて分析されている。
【０００６】
ＳＴＲ分析は一般的に用いられているが、この分析には幾つか欠陥がある。このうち最も重要なものは、ＰＣＲ法を介したＳＴＲ分析が行なわれる前の照会ＤＮＡサンプルの汚染、およびＰＣＲ分析を行なうのに要する時間に起因する。
【０００７】
例えば、ＳＴＲについて分析される、性的暴行の証拠物由来のＤＮＡは、加害者の精子由来であることが理想的である。しかし、精子サンプルには一般に、（１）膣の内側の上皮細胞が混入しており、しばしば（２）口由来の上皮細胞（口腔細胞）、ならびに（３）皮膚由来の細胞、および尿サンプル中の細胞が混入している。性的暴行犯罪現場のサンプルにおいては、赤血球、好中球、泡沫細胞（特徴のない上皮細胞）なども見られることが予想される。
【０００８】
したがって、ＰＣＲを行う前に混入細胞のいずれかまたは全てから精子細胞を分離できれば、より良くより正確なＳＴＲ分析を実現することができることは明らかである。
【０００９】
一般的に使用される分別抽出（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）のような方法では、雄性（加害者）精子および雌性（被害者）上皮細胞のＤＮＡを完全に分離することはできない。例えば、還元剤を含まない溶液を用いた最初の溶解により、上皮細胞（性的暴行における法医学的サンプル中でも最も一般的な混入物）が溶解され、ＤＮＡ画分を効果的に分離するために精子細胞がそのままに残される。しかしながら、分別溶解（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｌｙｓｉｓ）によりしばしば精子細胞の溶解が不完全となり、ＰＣＲの間にしばしば不必要なＤＮＡが共増幅される。これにより、混合されたプロファイルおよび不完全なＳＴＲ分析が生じ、５０％を超えるＳＴＲ分析に基づくヒトの同定が失敗する原因となる。
【００１０】
加えて、法医学的事件を解決する上での別の制限は、分析用細胞の入手可能性が限られていることに起因している。これは、標準的なＰＣＲに基づいて事件を解決するためには、証拠サンプルの存在が限られていること、一般に時間の経過とともにＤＮＡおよび細胞サンプルが分解すること、および／または性的暴行犯罪のサンプル中に精子細胞がほとんど無いことによる可能性がある。
【００１１】
したがって、上記の問題を阻止または軽減し得る、迅速で、効果的で、かつ法医学的サンプル中の単一細胞を正確に細胞選別する信頼できる方法を提供する方法が望まれる。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は概して、法医学的ＤＮＡ分析および医学的診断における使用のための、主として単一細胞レベルでの、対象物の選別に関する。さらに詳細には、本発明は、法医学的サンプルにおいて対象物を選別および同定する方法に関し、分離されるべき（所望のおよび非所望の）対象物を含む法医学的サンプル中の対象物を選別するためのホログラフィック光トラッピング装置を提供すること；対象物分離のためのチャンバーを含む（マイクロ流体に基づくか、またはその他の）サンプルチップを提供すること；法医学的サンプル中の対象物を光学的に捕捉し、光トラッピングを用いてそれらを所望の対象物と非所望の対象物とに選別すること；ＨＯＴもしくはマイクロ流体またはその両方を用いてサンプルから少なくとも１つの所望の対象物を移動させること；および所望の対象物について、その識別を決定するためにＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を実施すること、を含む。
【００１３】
本発明の一実施形態によれば、所望の対象物は細胞、特に精子であり、非所望の対象物は上皮細胞、精子ではない対象物などのような混入物である。
【００１４】
本発明の或る実施形態によれば、光トラッピングステップに先立ち、本方法はさらにマイクロ流体チャンバー内の流体の流れの中に法医学的サンプルを供給すること；およびマイクロ流体チャンバーを通ってサンプルを流動させることを含む。所望の対象物は、単一細胞ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を行なうことのできる個別チャンバー内へ選別されてよい。
【００１５】
本発明の或る実施形態によれば、マイクロ流体チャンバーは法医学的サンプルを含む入力チャンバーを有し、該サンプルは、単一細胞ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析をおこなうことのできる少なくとも１つの出力チャンバー内へ流れ込む。
【００１６】
本発明の或る実施形態によれば、法医学的サンプル中の対象物を同定してそれらを分離する方法は、入力チャンバーおよび少なくとも１つの出力チャンバーを有するマイクロ流体チャンバーを提供すること；分離されるべき対象物を含む法医学的サンプルを入力チャンバー内に供給すること；マイクロ流体チャンバー内のマイクロ流体の流れを用いて、対象物を所望の対象物と非所望の対象物とに分離すること；サンプルから少なくとも１つの所望の対象物を少なくとも１つの出力チャンバー内へ移動させること；および所望の対象物についてＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を実施して所望の対象物の識別を決定すること、を含む。
【００１７】
上記の各主要な実施形態の実施ステップは単一のチップ上で行われてよく、かつ／または単一細胞ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析は出力チャンバー内で行われる。
【００１８】
本発明の或る実施形態によれば、対象物を選別するための装置は、サンプルが配置される支持体を備え、サンプル中の非所望の対象物から所望の対象物を光学的に捕捉かつ選別する光トラッピング装置である、ホログラフィック光トラッピング装置；および所望の対象物についてＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を実施するための装置、を含む。
【００１９】
本発明の或る実施形態によれば、所望の対象物は細胞、特に精子であり、かつ／または単一細胞ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析が行われ、かつ／または単一チップ上で行われる。
【００２０】
本発明の或る実施形態によれば、該装置は、所望の対象物の光トラッピングに先立ちサンプルを流動させるためのマイクロ流体チップをさらに含む。
【００２１】
本発明の或る実施形態によれば、対象物を選別するための装置は、入力チャンバーおよび少なくとも１つの出力チャンバーを含むマイクロ流体チップを含み、該入力チャンバーはサンプルを含む；ここで、サンプル中の非所望の対象物から所望の対象物が選別され、かつ該所望の対象物が少なくとも１つの出力チャンバー内へ選別されるように、マイクロ流体チップはサンプルを流し；かつ所望の対象物についてＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を実施するための装置を含む。
【００２２】
本発明の別の実施形態によれば、該装置は、サンプル中の非所望の対象物から所望の対象物を、入力チャンバーから少なくとも１つの出力チャンバー内へ選別するためのホログラフィック光トラッピング装置をさらに含む。
【００２３】
本発明の別の実施形態によれば、所望の対象物は細胞、特に精子であり、非所望の対象物は混入物であり、対象物を選別し、ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を行うために単一チップが用いられ、かつ／またはＰＣＲに基づくＳＴＲ分析は単一細胞ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析である。
【００２４】
本発明によれば、単一細胞ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析により、複数の加害者が関与する性的犯罪事件が解決され、かつバルク（複数細胞ＰＣＲに基づく）法医学的分析を実行可能で信頼されるものにするために入手できる材料が限られている（すなわち、溶出された精子の数が限られている）場合にも事件解決の機会が与えられるであろう。さらに、単一細胞ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析により混入の問題も解決されるであろう（すなわち、被害者の上皮細胞が加害者の精子と混合しており、これが被害者のＤＮＡと加害者のＤＮＡとを共増幅させる原因となる場合）。したがって、単一細胞ＰＣＲは、共増幅を除外することにより、ヒト同定のためのＳＴＲ分析の失敗の主要な原因を解決するであろう。
【００２５】
数個の細胞により作業する能力（すなわち、単一細胞ＰＣＲを行なうこと）は、それ以外に解決できないような法医学的事件において加害者を同定するのに重要であり、かつ手に入るサンプルが限られている場合に（すなわち無精子症の男性の場合に）有罪者の関与を除外する機会も増やす。
【００２６】
さらに単一細胞ＰＣＲは、単一細胞または数個の単一細胞（統計的な目的のため）を選別するので、（通常必要とされる）数百個の細胞を扱うよりも短い時間を要することから、サンプル処理の速度を改善する。
【００２７】
ＰＣＲに先立つ単一細胞選別のためのＨＯＴの使用により、本発明では、サンプルの取り扱いに完全な無菌環境を提供する使い捨てチップを使用する。これにより、単一または複数のプラットフォームにおける混入問題（すなわち使用者／技術者のサンプル処理による）が回避される。したがって、将来もし再分析が必要とされたときのために、証拠データを無菌環境において保存できる。
【００２８】
さらに、マイクロ流体チップの使用により、現在の選別および同定過程において処理されるべきサンプル量が著しく最小化されるであろう。また、サンプル量がより少ないと必要な試薬が全体としてより少ないことを意味するため、本発明の実行も安価にできるであろう。本発明は、細胞選別の様々な選択（すなわち、ＨＯＴの単独使用、またはマイクロ流体の単独使用、または両方の組み合わせ）、細胞溶解およびＤＮＡ抽出の様々な様式（オンチップ、または別々のチューブ内）、およびＰＣＲの様々な様式（フラットベッド型のサーモサイクラーを用いたオンチップ、または従来のＰＣＲ装置を用いた微量遠心チューブ内）を提供するのに十分に柔軟性がある。
【００２９】
さらに本発明によれば、ＨＯＴおよびマイクロ流体の両方に基づく細胞選別は穏やかな方法であり、細胞の不完全な溶解の原因とはならない。
【００３０】
本発明は、（単一細胞の抽出が可能なＬＣＭ（レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ｌａｓｅｒ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏ−ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）とは異なって）サンプル処理の前にサンプルの染色を必要とせず、これにより色素の費用およびさらなるサンプル処理工程が削減される。ただし、提案される発明は、もし必要であれば蛍光染色されたサンプルにも適合可能である。
【００３１】
本発明の実施形態は可視化に基づく技術（すなわち、顕微鏡による可視化、または完全に自動化された装置の場合は装置による画像も）を含むことから、本発明により、全ての中間工程を記録すること、および所定の事件において分析される細胞数を記録すること、もしくは分析された細胞の形態についての書類を作成することのような、法医学的サンプル処理のための優れた書類作成が可能となる。
【００３２】
分別抽出（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）などの従来の技術とは違い、本発明は完全な自動化に適している。さらに、本装置は小型化および携帯可能とすることができ、選別を行うためのサンプルチップおよびＰＣＲは使い捨て化することができる。
【００３３】
法医学的ＤＮＡ分析での使用について本明細書で述べられる本発明は、主として性的暴行事件に関わり、かつ精子の分離に焦点を合わせているが、単一細胞ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析の一般的な方法は、ヒト同定のために著しい数の特定の細胞型を分離することが困難であり得る他の法医学的サンプルの型式へ拡張することができる。分別抽出は顕微鏡による可視化を行わず、完全に化学的過程に頼っていることから、本発明の技術のような、ＳＴＲ分析の対象である細胞の可視化および抽出が可能な技術は法医学分野にとって大きな利益となるであろう。
【００３４】
本発明は、単一または数個の細胞に基づく法医学的ＤＮＡ分析の範囲を、性的暴行犯罪事件を越えて戦争被害者または兵士のヒト同定（例えば軍隊法医学の領域において）へ拡大する。本発明はまた、しばしば容疑者からの十分なサンプルの回収が困難となる場合の親子鑑定にも使用できる。
【００３５】
さらに本発明は、検体サンプル中の正常細胞から癌性細胞を区別するために、ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析がしばしば用いられる癌診断の領域で使用されてよく、単一細胞レベルのＳＴＲ分析は、正常対癌性に見える検体サンプル中の細胞のパーセンテージを明らかにすることにより、疾患の重症度および進行についてのさらなる情報を提供するであろう。
【００３６】
このように、以下の本発明の詳細な説明がより理解され、当該技術分野への本貢献がより評価され得るように、本発明のいくつかの特徴の概要を述べてきた。当然の事ながら、以下に述べられ、添付の請求項の主題を形成するような本発明の特徴が他にも存在する。
【００３７】
この点において、本発明の少なくとも１の実施形態の詳細を説明するにあたって、本発明の適用においては、以下の記載で説明され、または図面で説明される、構成の詳細および構成要素の配置に制限されるものではないことが理解されよう。本発明の方法および装置は、その他の実施形態であってもよく、様々な方法で実施し、実行することができる。また、本明細書で用いられる用語および専門用語、ならびに以下の要約は記述を目的とするものであり、限定するものとみなされるべきではないことを理解されたい。
【００３８】
そのようなものとして、当業者は本開示が基づく概念が、本発明の異なる目的を実行するための他の構造、方法およびシステムを設計するための基礎として容易に利用され得ることを理解するであろう。したがって、本発明の方法および装置の主旨ならびに範囲を逸脱しない限り、請求項がこのような均等の構造を含むものとみなされることが重要である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の一実施形態によるホログラフィック光トラッピング装置の模式図である。
【図２】マイクロ流体チップ、ホログラフィック光トラッピング装置、およびＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を行なう装置を含む、本発明の一実施形態による対象物選別装置の模式図である。
【図３】マイクロ流体チップ、および単一細胞ＰＣＲ／ＳＴＲ装置を含む、本発明の別の実施形態による対象物選別装置の模式図である。
【図４】マイクロ流体チップ、ホログラフィック光トラッピング装置、およびＰＣＲ／ＳＴＲ装置を含む、本発明の別の実施形態による対象物選別装置の模式図である。
【図５】マイクロ流体チップ、およびＰＣＲ／ＳＴＲ装置を含む、本発明の別の実施形態による対象物選別装置の模式図である。
【図６】マイクロ流体チップ、およびオンチップＰＣＲ／ＳＴＲ装置を含む、本発明の別の実施形態による対象物選別装置の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、法医学的ＤＮＡ分析において対象物を選別する方法および装置に関する。特に本発明は、法医学的ＤＮＡ分析において、混入物から精子を分離して加害者を同定するために、新規なアプローチ、すなわち、単独の単一細胞ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析もしくは該ＳＴＲ分析とホログラフィック光トラピング（ＨＯＴ）との組み合わせ、および／またはマイクロ流体チャンバーを使用する。対象物を選別する目的で用いられるチップはまた、下流のステップである細胞溶解、ＤＮＡ抽出およびＰＣＲ（オンチップＰＣＲ）を行なうためにも使用できる。
【００４１】
さらに、単一細胞に基づくＰＣＲ分析を実施する前に、サンプルを流し、非所望の混入物から興味ある対象物（細胞）を選別するためにマイクロ流体チップが用いられる。選別のためにＨＯＴを単独で使用するよりも、この方法では、様々な多数の混入物が存在するサンプルの場合、ＨＯＴを使用する前にマイクロ流体に基づく選別が用いられる。選別のためのこのようなＨＯＴとマイクロ流体との組み合わせにより、選別のためにＨＯＴを単独使用したときと比較して、処理能力が改善され（ＰＣＲの前の選別時間の短縮）、純度も改善され得る。対象物の同定および選別に用いられるチップは、ＳＴＲ分析のための単一細胞ＰＣＲ用のチップと同じであってよい。
【００４２】
法医学的科学捜査のための単一細胞ＰＣＲは、非所望の対象物の混入を避けられること、限られた証拠サンプルの処理が可能であること、複数の加害者を検出可能であること、速度および自動化の改善、ならびに費用の削減の可能性を含む、複数の利点を有する。法医学的分析のためのオンチップＰＣＲもまた、携帯性、小型化、および処理のための無菌環境の維持などの複数の利点を有する。
【００４３】
本発明は、法医学的分析のためのオンチップＰＣＲの新規な使用を提案し、それにより中間処理を最小限とし得る新種の使い捨てチップが得られる。提案された発明は可視化に基づく方法を含み、サンプル分析における全ての中間処理工程についての書類作成能力を提供する。
【００４４】
本発明は法医学を踏まえて詳細を記述するが、その範囲が法医学を越えて、例えば、まれな細胞（すなわち癌性細胞）を同定し、それらをＳＴＲに基づいて正常なものから区別する癌診断の分野へ進出することには大きな価値がある。
【００４５】
本発明の第一の実施形態によれば、精子細胞を同定および捕獲し、それらを性的暴行犯罪サンプル中の他の混入細胞から分離するために、ホログラフィック光トラッピング（ＨＯＴ）が用いられる。
【００４６】
ＨＯＴ装置１００（例えば、参照により本明細書に援用されるＧｒｉｅｒ他の米国特許第６，０５５，１０６を参照）は、支持体１０３上のサンプル１０２中の対象物を光学的に捕捉し、操作するための光源として用いられるレーザー１０１を含む（図１を参照）。具体的には、レーザー１０１は平行レーザービーム（ｃｏｌｌｉｍａｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｂｅａｍ）１０４を放射し、該ビームは、空間光変調器（ＳＬＭ）１０５のような回折光学素子（ＤＯＥ）１０５により成形され、かつ、例えばテレスコープレンズ１０７、１０８およびダイクロイックミラー１０９を通して対物レンズ１０６の後口径へ移動する。ビーム１０４はＤＯＥ１０５により回折されて複数のビームレットとなり、顕微鏡装置（対物レンズ１０６はその一部である）の支持体１０３上に、複数の独立した可動性の光トラップ１１０を形成する。支持体１０３およびサンプル１０２は、光源１１２から放射されるビーム１１１によって照射される。図１において点Ｂ’はＢと共役する。しかし、所望により、テレスコープレンズ１０７、１０８は装置１００から除かれてよく、単一の転送レンズ（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｌｅｎｓ）に置き換えられてよいことに留意されたい。
【００４７】
サンプル１０２中の光学的にトラップされた対象物を視察するため、ＣＣＤカメラなどのような結像光学系１１３が用いられる。光トラッピングを制御し、操作中のデータを記録できるコンピュータ（不図示）に、装置１００が接続されてよい。
【００４８】
本実施形態によれば、法医学的サンプル１０２中の対象物を選別するためにホログラフィック光トラッピング装置が用いられる。精子およびその他の細胞のサンプル１０２は犯罪現場から得られ、該サンプル１０２中の細胞は溶出され、例えばピペッティング、重力、またはその他の能動的もしくは受動的機構によりマイクロ流体チップ２００上に配置される（図２を参照）。マイクロ流体チップ２００は、手動またはコンピュータ制御を用いて自動化された視覚的検査のため、顕微鏡プラットフォーム１０３に配置される。
【００４９】
したがってＨＯＴ１００は、例えば光学的にトラップされた精子をマイクロ流体チップ２００の或る領域から同チップ２００上の個別チャンバー２０１〜２０３へ移動させることによって、視覚的（顕微鏡またはモニター）検査により、法医学的サンプル１０２中の精子を他の混入細胞から分離するために使用される。
【００５０】
その後、ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析２０４を行ない、そのＤＮＡの特徴が精子（検体サンプル）のＳＴＲ分析に一致する人物（ＣＯＤＩＳデータベース内に保存されたＳＴＲの特徴に通常一致する）を同定する。ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析自体は当該技術分野において公知であり、広く商品化されている。
【００５１】
具体的には、フラットベッド型のサーモサイクラーにチップ２００を配置し、ここで法医学的事件のための市販のＳＴＲプライマーを用いたＰＣＲにより、抽出されたＤＮＡを増幅する。あるいは、法医学的事件には関連しない注文設計の適切なプライマーが使用できる。ＰＣＲサイクルの終わりに個々の細胞から十分なＤＮＡが残されるように、熱サイクルの回数を増やす。
【００５２】
ＤＮＡ抽出は（細胞溶解後に）遠心分離により、または磁性ビーズへの付着により行なわれてよく、ｐＨを変化させることによって（ＤＮＡ上の電荷を変化させる、すなわちＤＮＡのビーズへの結合に影響することにより）、または溶出緩衝液の塩濃度を変化させることによって、ＤＮＡがビーズ（磁性ビーズまたはその他のビーズ）から溶出される。
【００５３】
ＰＣＲが完了した次点で、ＰＣＲが行なわれ増幅されたＤＮＡについてのＳＴＲ分析を行なうことができ、これは、増幅されたＤＮＡをゲル上に流すことを含み（通常は）、各ＰＣＲ反応は単一精子由来の増幅されたＤＮＡに相当する。この目的のために、市販の装置を用いてもよい。
【００５４】
従来は、信頼できるＳＴＲの読み出しシグナルを得るためには著しい数の細胞が必要とされていた。しかし、ＨＯＴに基づく精子の分離という穏やかな方法および感度の改善により、混入している精子以外の細胞から精子をより確実に分離することができ、ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析に必要とされる精子細胞の数において、約２００（従来の方法に必要とされる数として）から数個の細胞、または単一細胞ＰＣＲのレベルにまでサンプル採取を減量することができ、その効率を大きく増大することができる（チャンバー２０１〜２０３を参照）。
【００５５】
したがって、標準的なＰＣＲ法（精子を同時に溶解し、ＤＮＡを抽出する）を用い、チャンバー２０１〜２０３内の個々の精子について単一細胞ＰＣＲを行なうことができる。
【００５６】
別の実施形態によれば、単一細胞から抽出した後のＤＮＡは、ＳＴＲ分析に先立ちＰＣＲ反応を行なうためにエッペンドルフチューブに移すことができる。１つの装置において、任意の所与の時間で複数のＰＣＲ反応を実行することができる。しかし、選別チップからチューブへの移動の間のＤＮＡの損失を避けるため、上記のように、フラットベッド型のサーモサイクラーを用いて、チップ上でＰＣＲを実行してよい。
【００５７】
チューブ内またはプレート上での標準的なＰＣＲ／ＳＴＲ分析に加え、一実施形態によれば、単一チップ２０６上（オンチップＰＣＲ）で分析を行なってもよい（図３を参照）。図３に示すように、本実施形態によれば、サンプル１０２中の精子はｉｎ  ｓｉｔｕ  ２００で溶解できるか、または各ウェルもしくはチャンバー２０１〜２０３内で精子を溶解でき、フィルター２０７を通してＤＮＡから細胞細片を分離し、ＤＮＡのみを（バルク）ＰＣＲが実行される（すなわち数種の精子由来のＤＮＡについて）次のチャンバー２０８へ進行させることができる。チャンバー２０８は、ＳＴＲの読み出しが可能なオンチップＰＣＲ装置２０６に接続されている。
【００５８】
分析された個々の精子に対する最終的なＳＴＲレポートが作成され、個々の精子からのＳＴＲ読み出しについての統計が作成される。例えば、法医学的な使用の場合、得られたデータはヒト同定のためのＣＯＤＩＳデータベースと照合される。
【００５９】
個々の精子（単一細胞）のＰＣＲに基づくＳＴＲ読み出しの長所は：
（１）非所望のＤＮＡの共増幅により起こり、現在のところＰＣＲに基づくＳＴＲ分析の主要な問題である、複数細胞が存在する状況における混入問題を解決すること；
（２）ＳＴＲ読み出しの（標準化により、確立している）統計的有意性に基づいて、複数の加害者の検出可能性が増大すること（性的暴行事件に関連する場合）；
（３）例えば、サンプル精子細胞の入手可能性が限られるために２００精子細胞を得ることが難しく、それ故に性的暴行事件において有罪者を除外する機会を増大するような犯罪事件を分析することが可能になること；および
（４）標準的なＰＣＲに基づく分析で用いられる多数の細胞の分離よりも、１〜数個の細胞の分離がより迅速であることにより、全処理時間を迅速化すること、である。
【００６０】
したがって、ＳＴＲに基づく科学捜査の性質および範囲を根本的に変え、以前には十分なサンプル収集に問題があった多くの事件の解決法が提案されることが想定されるであろう。１個または数個の細胞の分析により、サンプル採取の時間も同様に短縮されるであろう。
【００６１】
対立遺伝子の脱落が問題となり、（標準的なバルクＰＣＲ分析に基づく）ＳＴＲプロファイルがＣＯＤＩＳデータベースと適合しない（優性な対立遺伝子がもう一方をマスクする）稀な場合において、単一細胞ＰＣＲにより得られたＳＴＲの特徴を関連する統計的算出によるデータベースと照合して、必要な確率に達することができる可能性が大きい。
【００６２】
個々の精子細胞についてのＳＴＲの分析、および所与のサンプル由来の多数の精子細胞の一つずつについて分析を反復することにより、輪姦犯罪のような複数の加害者が関与する性的犯罪事件を確実に解決することができる。したがって、細胞混合物のセット由来の個人についてのＳＴＲプロファイルの解決にはデコンボリューションは必要とされない。
【００６３】
さらに、単一細胞ＰＣＲに基づく科学捜査により、所定の検体由来の複数の単一細胞について反復測定を行なうことが可能となり、犯罪事件の解決において統計学的にさらに信頼できるデータが得られる。
【００６４】
本発明はまた、試薬のコストの削減により、マイクロ流体チップにおける実施がより安価でもある。さらに、使い捨て器具の使用およびＨＯＴ装置の小型化の余地により、携帯性が増すであろう。
【００６５】
したがって、ＨＯＴに基づく精子選別は、単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）ＤＮＡを損なうことなく、既存の技術よりも信頼性があることが分かる。さらに、法医学的サンプル１０２から興味ある実体を捕捉かつ選別するために光を用いるＨＯＴ１００は、細胞サンプル１０２から得られたＤＮＡを損傷しないので、この方法によりデータ収集が迅速化され（２００個の細胞を補足するよりも、１個または数個の細胞を捕捉するほうがより短い時間を要するであろう）、その結果、（単一細胞ＰＣＲに基づく法医学的科学捜査のためのサンプルサイズの縮小による）速度の向上および純度の向上（示差的光選別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）は、化学的抽出に基づく分別溶解（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｌｙｓｉｓ）よりも良いため）がなされ、自動化の余地（基本的に、法医学的ＤＮＡ分析のためのいずれの既存の技術も、現在のところ可能ではない）がもたらされる。
【００６６】
ＨＯＴ  １００を用いて選別された精子細胞の改善された純度および品質管理により、改善されたＰＣＲおよびＳＴＲ分析２０４が促進され、それにより、上皮細胞またはその他の細胞の混入により、精子由来の所望の単位複製配列（加害者由来）と組み合わさって、混入細胞（しばしば被害者由来）からの非所望の単位複製配列の増幅による問題が提起されるような多くの未解決事件を解決する助けとなるであろう。ＰＣＲおよびＳＴＲ分析は、刑事告訴の妥当性を照合するために、混入物または非所望の対象物（すなわち上皮細胞）についても同様に行なうことが可能であることに留意されたい。
【００６７】
代替の精子選別技術、例えば分別抽出などの化学的分離アプローチ、または真空濾過もしくはトラックエッチ濾過（機械的に駆動される）などの機械的分離では、精子の選別におけるＨＯＴ１００のような視覚的（顕微鏡に基づく）検査が提供されず、効率的ではない。これらの方法ではしばしば、精子の溶解が不完全であり、かつＳＴＲ読み出しのために分析されるＤＮＡに対して有害である。
【００６８】
加えて、ＳＴＲ分析の前の、上述の既存の細胞処理法のいずれも、本発明の利点である単一細胞分析を行なうことはできない。光トラッピング（ＨＯＴ）１００は、可視化に基づく選別が可能ではない化学的分離アプローチに頼るよりもむしろ、精子細胞を可視化して捕捉する独特の能力を提供する。
【００６９】
したがって本発明は、標準的なＰＣＲ法によっては通常、未解決であった性的暴行事件の解決に役立ち得る、法医学的科学捜査のための単一または少数細胞ＰＣＲを用いる。さらに本発明は、例えば犯人が精子過少の男性である場合の事件を解決するであろう。このような男性はその射精された精液中の精子数が非常に少なく、そのため、増幅されるべき源のＤＮＡが分別溶解に由来する場合、標準的なＰＣＲに基づくＳＴＲ法では失敗する。したがって、ＨＯＴ１００および単一細胞ＰＣＲ２０４の使用により、法医学的分析において求められる同定が提供される。
【００７０】
本発明の第２の実施形態によれば、チャンバーを有するマイクロ流体チップ３００をＨＯＴ１００と共に、または単独で使用して、ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析３０１に先立ち精子を選別することができる（図４を参照）。
【００７１】
特に提案される精子選別法は、光学的に透明なマイクロ流体チップ３００上で行なうことができるので、非常に少ないサンプル量についての操作が可能である。チャンバーを有するマイクロ流体チップ３００を用いたサンプル分離は当該技術分野において周知であり、広く商品化されている。本明細書では、発想を変え、マイクロ流体チップの（深さ、またはｚ方向において）異なる層にチャネルを組み込むことにより、単一細胞分離が提供される。
【００７２】
例えば、入力チャンバー３０４および複数の出力チャンバー３０５（チャネル３０６を介して結合しているが、精子の選別に従って互いに分離可能である）を備えた特別注文のマイクロ流体チップ３００（図４を参照）を使用して、単一精子細胞を、サンプル３０２中の他の混入物（非精子）から、ならびにお互いから分離してもよい。マイクロ流体チャンバー３００は、チャンバー３０４を通し、フローインジェクター、およびフロー緩衝液（未提示）を含み得る。
【００７３】
一例によれば、入力チャンバー３０４の寸法はサンプル３０２そのものの必要に基づいて選択されるが、精子の選別については、長さとしては５００μｍ、幅としては１００μｍ、および深さとしては使用するサンプル量に基づくものの約１〜５μｌ（または、オンチップＰＣＲがナノリットル量でもうまく実行できることから、ナノリットル範囲のように、より少ない量でもよい）と推定され得る。出力チャンバー３０５は入力チャンバー３０４よりも小型で、かつ該チャンバー３０５が単一チャネル３０６または複数チャネル３０６を介して入力チャンバー３０４と結合され、１以上のチャンバー３０４が入力チャンバー３０４に結合して無菌使い捨てチップを形成するのに適切なサイズであってよい。
【００７４】
マイクロ流体チップ３００の単独使用、またはＨＯＴ１００と組み合わせたマイクロ流体チップ３００の使用は、試薬コストの削減、および出発材料の入手が限られている場合における、ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を行なう前の最適な精子数密度の維持に重要であろう。
【００７５】
例えば、本実施形態では、犯罪現場からスワブを得て、サンプル細胞（精子および混入物）３０２を溶出して、能動的機構またはピペッティングを介してマイクロ流体チップ３００上に配置する。該マイクロ流体チップ３００を、（手動のまたはコンピュータ制御を用いて自動化された）視覚的検査のために顕微鏡プラットフォーム３０３上に配置する（図４を参照）。
【００７６】
その後、マイクロ流体チャンバーを上皮細胞からの精子の分離に用い、続いて入力チャンバー３０４に配置されたサンプル３０２を個別チャンバー３０５へ選別するために（所望であれば）、別の実施形態においてはＨＯＴ１００を使用できる。特に、精子はチャンバーまたはウェル３０４の縁に固着する傾向があることから、処理能力（すなわち、所与の時間内に何個の精子細胞を選別できるか）を容易に増大し得、かつ、入力チャンバー／ウェル３０４から発出する複数の結合チャネル３０６を有する１を超える出力チャンバー／ウェル３０５が存在する場合には、混入非精子細胞からの干渉も回避される。この配置により、精子の選別における信頼性および効率が改善されるであろう。
【００７７】
マイクロ流体の流れまたはＨＯＴ１００を用いた選別が行なわれた後、バルブ／ストッパーなどの従来の手段を用いて、チャンバー３０５を入力チャンバー３０４から封鎖することができる。あるいは、所定のマイクロ流体チップにわたってチャネルの寸法（通常は幅）を均一に保つよりも、それを縮小する（調節する）ことにより、選別された対象物の逆流を阻止できる。
【００７８】
その後マイクロ流体チップ３００上において精子の溶解を個別チャンバー３０４内で行い、その後、ＤＮＡを抽出するために溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を手動またはロボット工学を用いて抽出することができる。その後、個々の精子由来のＤＮＡを、第１の実施形態に記載されるように、同じチップ３００上かまたは別の実施形態の第２のチップ上のいずれかの、別々のチャンバー３０５内に配置する。
【００７９】
上記の第１の実施形態で述べたように、抽出されたＤＮＡを有するチップ３００を、ＳＴＲプライマーを用いた増幅のため、ＰＣＲ（サーモサイクラー）装置３０６に配置する。その後、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡについてＳＴＲ分析を行う（すなわち、標準ＳＴＲマーカーに対するバンドを同定するためゲルを流す）。
【００８０】
したがって、本実施形態においても同様に、単一細胞ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を行なうことができる。
【００８１】
最後に、上記のように、個々の精子分析に対する最終的なＳＴＲレポートが作成され、標準的なデータベース（例えばヒト同定のためのＣＯＤＩＳ）に対する適切な照合のための統計が作成される。
【００８２】
したがって上記のように、ＨＯＴ１００をＰＣＲに基づくＳＴＲ分析と共に用いることにより、単一細胞分析および標準的なバルク（複数細胞）分析が可能となる。さらに上記のように、ＨＯＴ１００は、個々の細胞を三次元的に移動、回転、操作することを可能にする。可視光または赤外光の照明を、精子細胞を同定および移動する光トラッピングに使用することにより、精子細胞をサンプル中の混入上皮細胞から分離することができる。可視のまたは赤外の励起光の使用により、ＵＶ光の使用時に起こり得る主要な懸念である細胞損傷が避けられる。選別された精子細胞をそれぞれ別々のチャンバー内（すなわち、１または数個の同じ種類の細胞を所定の１チャンバー内に）へ導くことができ、ｉｎ  ｓｉｔｕまたは別の、望ましいＰＣＲに基づくＳＴＲ分析を行なうことができる。
【００８３】
したがって次に、標準的なバルク分析と比較して、単一細胞分析の全ての利点が得られる、単一または複数の精子細胞についてのＰＣＲおよびＳＴＲ分析の実行を選択することが可能である。
【００８４】
上記のように、最初から最後までたった１つのチップのみが用いられるように、ＰＣＲに基づくＳＴＲ分析をオンチップで行なうこともできる。
【００８５】
本発明の第３の実施形態によれば、第２の実施形態によるマイクロ流体チップ４００は、入力チャンバー４０１（図５を参照）からの液体の流速、チャネル４０２の寸法（すなわち長さ、幅、深さ）、およびチップ４００自体の材料が調整されるように改変されており、かつ、サンプル４０２からの２個の細胞がチャネル４０３の内側、特には接合部４０４付近の同一位置を占めないように流れが調節されているため、単一細胞を、チャネル４０５を通してチャンバー４０６〜４０９などへ選別できる。１つのチャンバー（例えば４０６）は１個の細胞を含むことが理想的である。
【００８６】
加えて、精子細胞のみをチャネル４０３へ進入させるように、フィルター４１０を組み込んでもより。
【００８７】
細胞はチャンバー４０６〜４０９内で溶解され、これらに対応するチャンバー４１１〜４１４は個々の細胞由来の抽出されたＤＮＡを含み得る。一実施形態では（上記のように）、チャンバー４１１〜４１４内のＤＮＡは、オンチップでＰＣＲ４１５を行なうことができるか、または、ピペッティングもしくは能動的（ポンピング）機構により、またはロボットアームを用いて、別のチップへ移動させることによりＤＮＡの移動を行なうことができる。
【００８８】
代替の実施形態によれば、スワブから溶出されたサンプル４０２（細胞混合物）を含む入力チャンバー４０１は、精子細胞がチャンバー４０１の底面に沈殿することができ、かつ該層から発出できるように層形式（ｌａｙｅｒｅｄ  ｆｏｒｍａｔ）に構築でき、チャネル４０３を通して個々の細胞が取り出される。該層は分離されたチャネルのセットを含み、細胞を混合させない。選別された材料の逆流を防ぐために、マイクロ流体チップ４００内にバルブを組み込んでもよい。
【００８９】
本発明の第４の実施形態によれば、サンプル５００から溶出された細胞は（図６を参照）、サンプル５００が蓄積されたマイクロ流体チップ５０２上の入口チャンバー５０１内へ溶出される。
【００９０】
サンプル５００からの混入物（すなわち上皮細胞）は入口チャンバー／リザーバー５０１の底面に沈殿し、精子細胞は、チャネル５０３を通した流量により移動させられて、出口チャンバーリザーバー５０４内に回収される。第２段階において、前述の方法に従い、チャネル５０８を介して選別された精子は個別回収リザーバー５０４〜５０７に回収される。
【００９１】
第３段階において、チャンバー５０９〜５１２内で個々の精子の溶解が行なわれ、前述の方法に従って、単一細胞ＰＣＲ（オンチップＰＣＲ）によりＤＮＡの抽出が達成される。
【００９２】
別の実施形態によれば、ＰＣＲおよびＳＴＲ分析の過程は自動化でき、高速が達成でき、現在のＳＴＲ分析において使用されているアプローチでしばしば起こる別の障害（ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋ）が排除されるであろう。現在、分別抽出は、ほぼ全てが手動で操作されている。様々なポアサイズのメッシュフィルターを用いる機械的選別（トラックエッチ濾過）などの他の技術もまた、フィルターを詰まらせる傾向があることから自動化が可能ではない。しかしながら、ＨＯＴに基づく上皮細胞からの精子の選別は容易に自動化できる。自動化により操作コストおよび時間を削減することができ、それにり、所定時間内により多くの性的暴行事件が解決されるであろう。
【００９３】
本発明のさらなる別の実施形態によれば、提案される方法は自動化および多重化に適している。すなわち、複数の法医学的サンプルの分析を行なうことにより処理能力が向上する。
【００９４】
本発明のさらなる別の実施形態によれば、複数の犯罪サンプルを同時に溶出、分離、および試験することにより処理能力を向上できるようなロボット工学と組み合わせにより、プラットフォーム非依存性であること、すなわち、スライドガラス（ガラスカバースリップ）上、または試験管内もしくはエッペンドルフ内、または９６ウェルフォーマット（現在、ＰＣＲを９６ウェルまたはさらに多数のウェル形式内で行なえる機器があることを考えれば、このような分離を用いたｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲが可能である）内においても実行できることから、さらなる利点をある。ロボット操作により、細胞サンプルを行なう者の取り扱いに起因し得るその他の混入物源が回避される。
【００９５】
上記のように、この方法論は、法医学的サンプルについてのｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲにも適している。したがって、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲの様々な利点には：
（ｉ）ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲは、含まれるステップがより少なく、或る容器から他の容器へのサンプル移動が回避されるので、混入の機会が減少すること；および
（ｉｉ）より多くのステップおよびサンプル移動が関与すると思われる供給コストを制限することにより、このような法医学的分析のコストを削減すること、
などに有効であろう。
【００９６】
したがって、単一細胞からのＤＮＡ量が限られているため、既存の複数細胞（バルク）ＰＣＲに基づく方法と比較して、ＳＴＲ分析の前のＰＣＲサイクル数は増加するであろう。
【００９７】
単一精子由来の鋳型単位複製配列としてのゲノムＤＮＡを用いた１３ＳＴＲ断片の等しい増幅の問題にアプローチするため、時間または効率を損なうことなく、さらなる品質管理の制御としてリアルタイムＰＣＲを実行できる。また、複数細胞について行なわれるのと同じ様に、多重ＰＣＲを単一細胞についても行なうことができる。
【００９８】
したがって、単一細胞ＰＣＲに基づく法医学的科学捜査は、既存のバルク（複数細胞）ＰＣＲに基づく法医学的科学捜査が提供するものを損なうことなく、犯罪サンプルの分析のためのさらなる利点を提供する。
【００９９】
最後に上記のように、単一細胞ＰＣＲは自動化でき、小型化および携帯性のための機会を促進するチップ上（オンチップＰＣＲ）においても行なうことができる。
【０１００】
小型化および携帯性のための機会により、単一細胞ＰＣＲに基づく法医学的ＤＮＡ分析の範囲が、性的暴行犯罪事件を越えて、戦争被害者または兵士のヒト同定（例えば軍隊法医学の領域において）、およびしばしば被験者から十分なサンプルを回収することが困難となる場合の親子鑑定までにも開放される。
【０１０１】
個々の精子のＳＴＲ読み出しの長所は、それがＳＴＲ読み出しの統計的有意性（標準化により、確立している）に基づき、複数の加害者の検出可能性が増大する（性的暴行事件に関連する場合）ということである。また、分析のために入手できるサンプルが限られている（＜２００精子が得られるか否かという）性的暴行事件において、有罪者を除外する機会も増大する。対立遺伝子の脱落が問題となり、（標準的なバルクＰＣＲ分析に基づく）ＳＴＲプロファイルがＣＯＤＩＳデータベースと適合しない（優性な対立遺伝子がもう一方をマスクする）稀な場合において、単一細胞ＰＣＲにより得られたＳＴＲの特徴を関連する統計的算出によるデータベースと照合して、必要な確率に達することができる可能性が高いア。したがって本発明は、法医学的ＤＮＡ分析に現存する多数の問題を解決するために有利である。
【０１０２】
本発明の上記の実施形態は、本発明の原理を明確に理解するために説明される、実施の可能な例にすぎないことが強調されなければならない。本発明の上記の実施形態は、本発明の主旨および原理を逸脱しない限り、変更および改変されてよい。このような改変および変更の全ては本明細書において、本発明の範囲内に含まれ、以下の請求項により保護されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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