(57)【要約】  精製されたＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）を作製するための方法が提供される。この方法は、ｉ）細胞膜から得られるＰ−ｇｐおよび他のタンパク質の混合物を可溶化すること；ｉｉ）不溶物を遠心分離によって除くこと；ｉｉｉ）Ｐ−ｇｐおよび他のタンパク質の混合物を精製カラムに入れること；ならびにｉｖ）精製カラムに少なくとも１つの洗浄緩衝液を流して、望まれないタンパク質を除き、その後、少なくとも１つの溶出緩衝液を流して、Ｐ−ｇｐを回収することを含み、前記緩衝液の１つまたは複数が二糖類を含有する。【選択図】図１１
2010538053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製されたＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）を作製するための方法であって、この方法は、
ｉ）細胞膜から得られるＰ−ｇｐおよび他のタンパク質の混合物を可溶化すること；
ｉｉ）不溶物を遠心分離によって除くこと；
ｉｉｉ）Ｐ−ｇｐおよび他のタンパク質の混合物を精製カラムに入れること；ならびに
ｉｖ）精製カラムに少なくとも１つの洗浄緩衝液を流して、望まれないタンパク質を除き、その後、少なくとも１つの溶出緩衝液を流して、Ｐ−ｇｐを回収すること
を含み、前記緩衝液の１つまたは複数が二糖類を含有する、方法。
【請求項２】
一連の洗浄緩衝液および溶出緩衝液が方法中に使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
二糖類を含有する緩衝液が方法の最終溶出工程で使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
二糖類がトレハロースである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法によって作製される精製Ｐ−ｇｐ。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法によって作製される精製Ｐ−ｇｐから再構成されるＰ−ｇｐプロテオリポソーム。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法によって作製されるＰ−ｇｐまたはＰ−ｇｐプロテオリポソームの使用を含む、薬物についてのスクリーニングシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製されたＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）を、プロテオリポソームに再構成した後、生物学的活性の喪失を伴うことなく、凍結乾燥され、かつ、長期間にわたって貯蔵され得るような安定化された形態で作製するための方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
膜タンパク質のＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）は、ＡＢＣＢ１としても知られており、臨床的に関連性がある多剤輸送体または流出ポンプである。正常な生理学において、Ｐ−ｇｐは、非常に多数の異種トキシンにさらされる身体の領域（例えば、腸、腎臓などの管腔）における細胞の膜において発現されるか、または、そのような作用因に対して特に感受性である領域（例えば、血液脳関門、精巣など）における細胞の膜において発現される。Ｐ−ｇｐは、輸送体が典型的には１つまたは２つの基質分子または基質タイプに限定されることを考えたならば、非常に異例とも言える広範囲の基質を有する。「多剤輸送体」の呼び名は、ＡＴＰをエネルギー源として使用して、Ｐ−ｇｐが、非常に広い範囲の薬物を細胞から流出させることができるという事実に由来する。これらの薬物は、それらのすべてが疎水性であることは別として、多くの場合、構造的または機能的のいずれかであっても、類似性を互いにあまり有していない。
【０００３】
Ｐ−ｇｐは、細胞の原形質膜に広がり、薬物を、細胞膜を形成する脂質二重層から除き、また、薬物を細胞外空間に戻すことによって、薬物が細胞の内部に蓄積することを妨げる。すべての新しい薬物は、身体の感受性領域に入るかどうかを明らかにするために、Ｐ−ｇｐに対してスクリーニングされなければならない。細胞からのＰ−ｇｐ媒介による薬物排除はまた、一部のガンにおける多剤耐性（ＭＤＲ）表現型の大きな特徴である。ＭＤＲは著しい障害を一部の腫瘍の効果的な化学療法において引き起こす。したがって、Ｐ−ｇｐを組み込むスクリーニングシステムは、より広範囲の製薬業界および腫瘍学界の両方にとって価値がある。
【０００４】
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）は、大きな製薬企業および学術研究の両方にとってますます注目されている技術領域である。ＨＴＳのまさにその性質が、迅速かつ容易に、また、使用者にとって好都合な時間および場所において操作され得るために製薬企業および学術研究には必要である。したがって、スクリーニングおよびその構成部分の安定性が重要である。
【０００５】
膜タンパク質は、溶解状態で存在するタンパク質よりもその現下の環境に対して敏感であり得るという事実のために取り扱いが困難である。この感受性が多くの場合、生物学的活性の急速な喪失を引き起こす。機能するタンパク質がこの種のＨＴＳにとって重要である。そのようなものとして、膜タンパク質を要因（例えば、温度および長い貯蔵期間）に対して安定化させることは、大きな利点があると考えられる。そのうえ、一部の生物学的分子が、かなりの間、この様式で首尾良く保護されているが、機能するプロテオリポソームはこれまで首尾良く保護されていない。
【０００６】
凍結乾燥は、凍結された系から水を最初は昇華によって除き、その後、脱着によって除くことである。凍結乾燥は、これまでかなりの間にわたって、また、広範囲の適用に関して非常に大きな成功とともに使用されている技術である。しかしながら、ある種の分解的反応が起こることを排除しながら、水を生物学的系から除くことは、それ自体が有害であり得る。そのようなものとして、いくつかの場合には、分散保護剤の使用が、生物学的分子の構造および機能を保護することを助けるために要求される。種々の種類の分子が使用されるが、凍結乾燥された系を保護することにおいて特に良好である分子の１つの集団が二糖類である。これらが賦形剤として添加される。
【０００７】
Ｐ−ｇｐは金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製される。Ｐ−ｇｐは最初、細胞膜から可溶化され、その後、不溶物が遠心分離によって除かれ、混入しているタンパク質が、Ｐ−ｇｐが溶出される前に精製カラムから洗い流される。溶出緩衝液は脂質およびコレステロールを含有するが、界面活性剤もまた含有する。Ｐ−ｇｐがその要求する脂質環境に取り込まれるためには、界面活性剤が除かれなければならない。これが、界面活性剤をゆっくり除き、かつ、同時に、リポソームの形成を強制するバイオビーズとのインキュベーションによって達成される。界面活性剤が除かれるにつれ、疎水性脂質は、水性がますます増大する溶液からの熱力学的圧力のために、互いに、また、Ｐ−ｇｐの疎水性部分と会合する。これにより、Ｐ−ｇｐ発現細胞に存在する場合と酷似する脂質二重層の中にＰ−ｇｐが埋もれるプロテオリポソームが生じる。これが、Ｔａｙｌｏｒ他（２００１）、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３４、１６０９〜１６１８によって詳しく記載された方法である。
【０００８】
前記から明らかであるように、Ｐ−ｇｐは、一部のガンの効果的な化学療法に対する大きな課題を引き起こし、また、広範囲の薬物の生物学的利用能に影響を及ぼす。そのようなものとして、新しい薬物が様々な様式でＰ−ｇｐに対して試験される。ガン研究において、Ｐ−ｇｐおよびＰ−ｇｐプロテオリポソームが、新しい化学療法剤および／またはＰ−ｇｐ阻害剤を試験および開発するために使用される。残念ながら、その精製された形態において、Ｐ−ｇｐは、プロテオリポソームに再構成された場合、−８０℃で貯蔵されたときにＡＴＰａｓｅ活性を長期間保持するだけである。凍結乾燥が、様々な生物学的分子を首尾良く保存するために使用されている。しかしながら、今日まで、プロテオリポソーム系の凍結乾燥は何ら報告されていない。したがって、Ｐ−ｇｐプロテオリポソームの精製および安定化のための改善された方法が求められている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明によれば、精製されたＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）を作製するための方法が提供され、この方法は、
ｉ）細胞膜から得られるＰ−ｇｐおよび他のタンパク質の混合物を可溶化すること；
ｉｉ）不溶物を遠心分離によって除くこと；
ｉｉｉ）Ｐ−ｇｐおよび他のタンパク質の混合物を精製カラムに入れること；ならびに
ｉｖ）精製カラムに少なくとも１つの洗浄緩衝液を流して、望まれないタンパク質を除き、その後、少なくとも１つの溶出緩衝液を流して、Ｐ−ｇｐを回収すること
を含み、ここで、前記緩衝液の１つまたは複数が二糖類を含有する。トレハロースが、本発明における使用のための特に好ましい二糖類である。他の二糖類、例えば、マルトース、または、二糖類の混合物もまた使用することができる。
【００１０】
本発明はまた、上記の方法によって調製される精製されたＰ−ｇｐを提供する。なおさらに、本発明の方法に従って調製される精製されたＰ−ｇｐから再構成されるＰ−ｇｐプロテオリポソームが提供される。本発明の方法によって作製されるＰ−ｇｐまたはＰ−ｇｐプロテオリポソームの使用を含む、薬物についてのスクリーニングシステムもまた提供される。
【００１１】
本発明の方法は、凍結乾燥によるＰ−ｇｐプロテオリポソームの精製および安定化を可能にする。このようにして作製されるＰ−ｇｐは、８０％までのＡＴＰａｓｅ活性を、凍結乾燥、ならびに、４℃および２０℃での６０日までに及ぶ貯蔵の後で保持しており、これは、凍結乾燥されていないプロテオリポソームに対する著しい改善である。
【００１２】
本発明によれば、Ｐ−ｇｐが、Ｔａｙｌｏｒ他によって記載され、かつ、上記で要約された従来方法の改変された形態によって精製される。Ｐ−ｇｐプロテオリポソームの安定化を可能にする、この方法に対する新規かつ非自明な変更は下記の通りである。ｐＨを８から６．８に低下させる時点でのカラムの洗浄期間中の緩衝液の構成が変更された。洗浄および溶出の従来の緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．２５％（ｗ／ｖ）のＯＧ、０．１％（ｗ／ｖ）の脂質／コレステロールミックスおよび２０％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含有する。しかしながら、本発明の方法では、緩衝液の構成が、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．２５％（ｗ／ｖ）のＯＧ、０．１％（ｗ／ｖ）の脂質／コレステロールミックスおよび２０％（ｗ／ｖ）の二糖類に変更された。使用される二糖類の割合は変化してよいが、典型的には１０％〜３０％であり、好ましくは１５％〜２５％であり、最も好ましくは約２０％（ｗ／ｖ）であることが理解される。
【００１３】
したがって、Ｐ−ｇｐを精製カラムから溶出するために使用される最終緩衝液の組成を変更することによって、驚くべきことに、Ｐ−ｇｐ含有プロテオリポソームを凍結乾燥することができ、かつ、再水和したとき、タンパク質における生物学的活性を保持することが可能であることが見出されている。従来のタンパク質精製緩衝液は、優れた凍結保護剤である高い割合のグリセロールを含有する。しかしながら、これは凍結乾燥を妨げており、乾燥ストレスに対する真の保護を与えていない。二糖類（最も好ましくは、トレハロース）を含有する緩衝液を精製の最終段階の期間中に使用することによって、プロテオリポソームを凍結乾燥することが可能となっている。二糖類含有緩衝液を溶出のために使用するだけでなく、むしろ、精製の始めから終わりまで使用することが可能であり得る。
【００１４】
プロテオリポソームの作製、ならびに、リポソームおよびタンパク質の両方の凍結乾燥がかなり前から知られているが、凍結乾燥によるプロテオリポソームの成功した安定化が、本発明によって達成される新規かつかなり有利な発展である。その結果が、膜タンパク質がリポソームの一部として脂質二重層の中に組み込まれ、その場合には、凍結乾燥による生物学的活性の喪失から保護される系である。このことが、新しい薬物のためのハイスループットスクリーニングを開発するための基礎である。なぜならば、この系は、取り扱いおよび貯蔵の両方についてのより大きい範囲の条件に耐えることができるからである。
【００１５】
次に、本発明が、下記の実施例および添付されている図面を参照することによってより詳細に記載される（図１〜６は実施例１に関連し、図７〜１６は実施例２に関連し、図１７〜２３は実施例３に関連する）。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】スクロース密度勾配の組み立ておよびその後の回収を表すための図である。４００μｌの層を、異なるスクロース濃度の混合を避けるように超遠心分離チューブに注いだ。その後、これを１５００００ｇで一晩超遠心分離した。完了したとき、２００μｌの分画物をＡ分画物およびＢ分画物として集めた。
【００１７】
【図２】実施例１からのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。左から右へのレーン表示：ＭＷ＝分子量マーカー；１＝非結合タンパク質；２＝１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）；３＝１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）；４＝２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）；５＝３０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）；６＝２ｍＭイミダゾール（ｐＨ６．８）；７＝１２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ６．８）素通り；レーン８〜１１＝２分間のインキュベーションを伴う１２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ６．８）。矢印はＰ−ｇｐの位置を示す。
【００１８】
【図３】クーマシーブルーにより染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの一例である。精製された様々な体積のＰ−ｇｐが、標準曲線としての既知量のＢＳＡの隣で泳動された。Ｐ−ｇｐ濃度が、ゲル上に示されるバンドのデンシトメトリー分析を使用して計算された。
【００１９】
【図４】上段は、銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化されたときのＰ−ｇｐの位置を示す。［３Ｈ］−ホスファチジルコリンの存在位置が、液体シンチレーション計測によって求められたときのＤＰＭの棒グラフとして示される。タンパク質および脂質が、分画物１０Ａおよび１０Ｂに主に存在することが理解される。このことは良好な再構成を示している。
【００２０】
【図５】Ｐ−ｇｐの基礎状態の薬物刺激されていないＡＴＰａｓｅ活性および薬物刺激（３０μＭニカルジピン）されたＡＴＰａｓｅ活性を示すグラフである。基礎状態のＶｍａｘが０．６２μｍｏｌ／分／ｍｇであり、ニカルジピン刺激のＶｍａｘが２．５７μｍｏｌ／分／ｍｇであった（ｎ＝４の独立した精製物）。
【００２１】
【図６】ニカルジピンに対する薬物刺激ＡＴＰａｓｅ活性の用量応答曲線を示すグラフである。ＥＣ５０が、一般的な用量応答式を適合させることによって、２４．２μＭニカルジピンとして求められた。誤差棒は４つの独立した精製物からのＳＥＭを示す。
【００２２】
【図７】異なる温度で貯蔵されたときの経時的なＰ−ｇｐプロテオリポソームのＡＴＰａｓｅ活性の喪失を示すグラフである。
【００２３】
【図８】従来的に精製されたＰ−ｇｐプロテオリポソームを凍結乾燥したときのニカルジピン刺激ＡＴＰａｓｅ活性の喪失を示すグラフである。ＡＴＰａｓｅ活性が、Ｐ−ｇｐプロテオリポソームの再水和およびアッセイを行ったとき、回復しなかった。誤差棒はＳＥＭ（ｎ＝４）である。
【００２４】
【図９】実施例２からのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。左から右へのレーン表示：ＭＷ＝分子量マーカー；１＝非結合タンパク質（ｐＨ８）；２＝１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）；３＝１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）；４＝２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ）；５＝３０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）；６＝２ｍＭイミダゾール（ｐＨ）；７＝１２０ｍＭイミダゾール素通り（ｐＨ６．８）；レーン８〜１１＝２分間のインキュベーションを伴う１２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ６．８）。矢印はＰ−ｇｐの位置を示す。
【００２５】
【図１０】グリセロール精製されたＰ−ｇｐおよびトレハロース精製されたＰ−ｇｐの両方が比較として可視化されたＢＳＡゲルの一例である。０．２μｇ〜１．２μｇを泳動するＢＳＡ標準曲線が、精製されたＰ−ｇｐの量をデンシトメトリー分析により求めるために使用された。
【００２６】
【図１１】（Ａ）０ｍＭ（黒三角）、１０ｍＭ（白丸）、３０ｍＭ（白逆三角）、１００ｍＭ（白四角）および３００ｍＭ（黒菱形）のトレハロースにおけるニカルジピン（３０μＭ）刺激されたＡＴＰａｓｅ活性についてのＶｍａｘを示すグラフである。二元配置ＡＮＯＶＡは、有意差がトレハロースの存在下および非存在下でのＶｍａｘの間にないことを示す（ｐ＝０．６５５１）。（Ｂ）０ｍＭ（黒四角）、１０ｍＭ（黒三角）、３０ｍＭ（黒逆三角）、１００ｍＭ（黒菱形）および３００ｍＭ（黒丸）のトレハロースにおける基礎状態のＡＴＰａｓｅ活性を示すグラフである。誤差棒は、異なる濃度のトレハロースの存在下における４つの独立した精製物からの平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。二元配置ＡＮＯＶＡは、有意差がトレハロースの存在下および非存在下でのＶｍａｘの間にないことを示す（ｐ＝０．９４２２）。
【００２７】
【図１２】ニカルジピンに対する薬物刺激ＡＴＰａｓｅ活性の用量応答曲線を示すグラフである。点線および三角はトレハロースの非存在下でのＡＴＰａｓｅ活性を示し、実線および四角は、３００ｍＭのトレハロースを伴うＡＴＰａｓｅ活性である。ＥＣ５０が、一般的な用量応答式を適合させることによって、１９．２μＭニカルジピンとして求められた。誤差棒は４つの独立した精製物からのＳＥＭを示す。二元配置ＡＮＯＶＡは、有意差がこれら２つの曲線の間にないことを示す（ｐ＝０．７５４９）。
【００２８】
【図１３】凍結乾燥棚および生成物の温度変化を経時的に示すグラフである。温度が、棚に埋め込まれた熱電対、および、凍結乾燥前の生成物に入れて凍結された熱電対を使用して測定された。白三角は棚温度を表し、白四角は生成物を表す。誤差棒は、ｎ＝４のＳＥＭである。チャンバー圧力が期間中を通して０．０１１ｍＢａｒであった。
【００２９】
【図１４】凍結乾燥された生成物の残留水分が時間とともにどのように変化するかを示すグラフである。乾燥圧力が期間中を通して０．０１１ｍＢａｒであった。乾燥時間を７２時間から１４４時間にまで増大することは、残留水分のさらに０．５％の減少をもたらしただけであった。
【００３０】
【図１５】凍結乾燥前後のＰ−ｇｐプロテオリポソームのＡＴＰａｓｅ活性の比較である。サンプルを、凍結乾燥サイクルが完了した直後に室温の２回蒸留水により再水和した。１００％を、凍結乾燥前のニカルジピン刺激のＶｍａｘであると見なした。実線および四角は凍結乾燥前の活性を表し、破線および三角は凍結乾燥後の活性を表す。
【００３１】
【図１６】（Ａ）凍結乾燥されたトレハロース精製Ｐ−ｇｐプロテオリポソームの経時的なニカルジピン刺激ＡＴＰａｓｅ活性である。１００％を、凍結乾燥前のニカルジピン刺激のＶｍａｘであると見なした。実線および四角は４℃での貯蔵を表し、破線および三角は２０℃での貯蔵を表し、点線および逆三角は３７℃での貯蔵を表す。誤差棒は、ｎ＝４の独立した精製物のＳＥＭである。（Ｂ）凍結乾燥されたＰ−ｇｐプロテオリポソームにおける３０μＭニカルジピン刺激されたＡＴＰａｓｅ活性のＫｍを経時的に示すグラフである。実線は、４℃で貯蔵されたサンプルを表し、破線は２０℃でのサンプルを表し、点線は３７℃でのサンプルを表す。誤差棒は、ｎ＝４の独立した精製物のＳＥＭである。
【００３２】
【図１７】実施例３からのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。左から右へのレーン表示：ＭＷ＝分子量マーカー；１＝非結合タンパク質（ｐＨ８）；２＝１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）；３＝１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）；４＝２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）；５＝３０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）；６＝２ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）；７＝１２０ｍＭイミダゾール素通り（ｐＨ６．８）；レーン８〜１１＝２分間のインキュベーションを伴う１２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ６．８）。矢印はＰ−ｇｐの位置を示す。
【００３３】
【図１８】グリセロール精製されたＰ−ｇｐおよびマルトース精製されたＰ−ｇｐの両方が比較として可視化されたＢＳＡゲルの例である。０．２μｇ〜１．２μｇを泳動するＢＳＡ標準曲線が、精製されたＰ−ｇｐの量をデンシトメトリー分析により求めるために使用された。
【００３４】
【図１９】（Ａ）０ｍＭ（黒三角）、１０ｍＭ（白丸）、３０ｍＭ（白逆三角）、１００ｍＭ（白四角）および３００ｍＭ（黒菱形）のマルトースにおけるニカルジピン（３０μＭ）刺激されたＡＴＰａｓｅ活性についてのＶｍａｘを示すグラフである。二元配置ＡＮＯＶＡは、有意差がマルトースの存在下および非存在下でのＶｍａｘの間にないことを示す（ｐ＝０．４２１５）。（Ｂ）０ｍＭ（黒四角）、１０ｍＭ（黒三角）、３０ｍＭ（黒逆三角）、１００ｍＭ（黒菱形）および３００ｍＭ（黒丸）のマルトースにおける基礎状態のＡＴＰａｓｅ活性を示すグラフである。誤差棒は、異なる濃度のマルトースの存在下における４つの独立した精製物からの平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。二元配置ＡＮＯＶＡは、有意差がマルトースの存在下および非存在下でのＶｍａｘの間にないことを示す（ｐ＝０．２００２）。
【００３５】
【図２０】ニカルジピンに対する薬物刺激ＡＴＰａｓｅ活性の用量応答曲線を示すグラフである。点線および三角はマルトースの非存在下でのＡＴＰａｓｅ活性を示し、実線および四角は、３００ｍＭのマルトースを伴うＡＴＰａｓｅ活性である。ＥＣ５０が、一般的な用量応答式を適合させることによって、３０．０２μＭニカルジピンとして求められた。誤差棒は４つの独立した精製物からのＳＥＭを示す。二元配置ＡＮＯＶＡは、有意差がこれら２つの曲線の間にないことを示す（ｐ＝０．５２４９）。
【００３６】
【図２１】凍結乾燥後のＰ−ｇｐプロテオリポソームのＡＴＰａｓｅ活性の比較である。サンプルを、凍結乾燥サイクルが完了した直後に室温で２回蒸留水により再水和した。１００％を、凍結乾燥前のニカルジピン刺激のＶｍａｘであると見なした。実線および四角は凍結乾燥前の活性を表し、破線および三角は凍結乾燥後の活性を表す。
【００３７】
【図２２】（Ａ）マルトース精製されている凍結乾燥されたＰ−ｇｐプロテオリポソームの経時的なニカルジピン刺激ＡＴＰａｓｅ活性である。１００％を、凍結乾燥前のニカルジピン刺激のＶｍａｘであると見なした。実線および四角は４℃での貯蔵を表し、破線および三角は２０℃での貯蔵を表し、点線および逆三角は３７℃での貯蔵を表す。誤差棒は、ｎ＝４の独立した精製物のＳＥＭである。（Ｂ）トレハロース精製されている凍結乾燥されたＰ−ｇｐプロテオリポソームの経時的なニカルジピン刺激ＡＴＰａｓｅ活性である。１００％を、凍結乾燥前のニカルジピン刺激のＶｍａｘであると見なした。実線および白四角は４℃での貯蔵を表し、破線および白三角は２０℃での貯蔵を表し、点線および白逆三角は３７℃での貯蔵を表す。誤差棒は、ｎ＝４の独立した精製物のＳＥＭである。
【００３８】
【図２３】凍結乾燥されたマルトース精製Ｐ−ｇｐプロテオリポソームにおける３０μＭニカルジピン刺激されたＡＴＰａｓｅ活性のＫｍを経時的に示すグラフである。実線は、４℃で貯蔵されたサンプルを表し、破線は２０℃でのサンプルを表し、点線は３７℃でのサンプルを表す。誤差棒は、ｎ＝４の独立した精製物のＳＥＭである。
【実施例】
【００３９】
（実施例１）  Ｐ−ｇｐの精製
１．１  材料。
コレステロール、アデノシン三リン酸二ナトリウム（Ｎａ２ＡＴＰ）、ニカルジピンおよび緩衝剤塩をＳｉｇｍａ（Ｐｏｏｌｅ、英国）から得た。ＤＣ界面活性剤と適合し得るタンパク質アッセイキットおよびＳＭ−２  ＢｉｏｂｅａｄｓをＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｍｅｌ  Ｈｅｍｓｔｅａｄ、英国）から得た。オクチル−β−Ｄ−グルコシド（ＯＧ）、ロイペプチンヘミ硫酸塩、ペプスタチン、ベンズアミドＨＣｌおよびＮｉ−ＮＴＡ樹脂をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｎｏｔｔｉｇｈａｍ、英国）から得た。大腸菌総脂質抽出物をＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（アメリカ合衆国）から得た。［３Ｈ］−ホスファチジルコリン（８４Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（英国）から得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の銀染色キットをＩＣＮ（Ｔｈａｍｅ、英国）から得た。ＰａｇｅＢｌｕｅ（商標）ゲル染色システムをＦｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（アメリカ合衆国）から得た。
【００４０】
１．２  方法。
１．２．１  細胞培養およびバキュロウイルスの維持。
（Ｈｉｓ６）標識されたＰ−ｇｐをコードする組換えバキュロウイルスの作製を、Ｔａｙｌｏｒ他（２００１）によって記載されるように、ＮＤＣＬＳ（Ｏｘｆｏｒｄ）において行った。簡単に記載すると、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９００）を使用して、組換えウイルスを作製し、トリコプルシア・ニ（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）細胞を、（Ｈｉｓ６）標識されたＰ−ｇｐの発現のために使用した。全ての細胞の感染および培養が厚意によりＮＤＣＬＳの様々な職員によって行われた。
【００４１】
１．２．２  粗製膜の調製。
Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞を遠心分離（２０００ｇ、４℃、１０分）によってペレット化し、氷冷ＰＢＳで洗浄した。ペレットを膜緩衝液１（０．０１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．２５Ｍのスクロースおよび０．２ｍＭのＣａＣｌ２）に再懸濁して元のペレット体積の５倍にした。プロテアーゼ阻害剤を１００倍ストック液から加えて、２０μＭのロイペプチン、１ｍＭのベンズアミドおよび２μＭのペプスタチンにした。その後、細胞を窒素キャビテーション「ボンベ」に移し、４回のキャビテーション（約１５００ｐ．ｓ．ｉ．、１回あたり１５分、４℃）に供して、細胞を溶解した。
【００４２】
その後、非溶解細胞を遠心分離（２０００ｇ、４℃、１５分）によって除き、得られた上清を超遠心分離（１０００００ｇ、４℃、４５分）に供して、膜を単離した。その後、超遠心分離から得られたペレットを、元の細胞ペレットの体積に等しい体積の膜緩衝液２（膜緩衝液１と同様であるが、ＣａＣｌ２を含まない）に再懸濁した。プロテアーゼ阻害剤を加えて２倍の最終濃度にした。膜調製物のアリコートを−８０℃で貯蔵した。
【００４３】
１．２．３  Ｐ−ｇｐ発現の確認。
Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞から粗製膜を調製した後、Ｐ−ｇｐの発現を免疫ブロッティングによって確認した（Ｒｏｎｃｈｉ他、１９８９）。ＤＣ界面活性剤と適合し得るタンパク質アッセイキット（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｍｅｌ  Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ）を使用して、Ｐ−ｇｐを含有することが認められる膜調製物の総タンパク質濃度、および、Ｐ−ｇｐを含有すると考えられる調製物の総タンパク質濃度を求めた。５μｇ、１０μｇおよび２０μｇの総膜タンパク質を含有するサンプルを７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ウエスタンブロットした。Ｐ−ｇｐ特異的な一次抗体（Ｃ２１９）、次いで、抗マウスＩｇ西洋ワサビペルオキシダーゼ連結抗体を使用して、Ｐ−ｇｐを可視化した。
【００４４】
１．２．４  クロマトグラフィーのための膜タンパク質の安定化。
大腸菌脂質（ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールおよびカルジオリピン）ならびにコレステロールを、大腸菌：コレステロール（４：１）を得るために１００ｍｇ／ｍｌでクロロホルム：メタノール（２：１）に溶解し、混合した。それらを窒素流のもとで乾燥し、その後、真空下で少なくとも１時間乾燥した。オクチル−β−Ｄ−グルコシド（ＯＧ）を伴う精製緩衝液１（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２０％（ｖ／ｖ）グリセロール）を加え、そして、繰り返される超音波処理およびボルテックス撹拌を透明になるまで行うことによって、脂質およびコレステロールを緩衝液に再懸濁し、取り込んだ。５０ｍｇの総タンパク質を与えるために十分な体積の粗製膜を精製緩衝液１（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２０％（ｖ／ｖ）グリセロール）で希釈し、遠心分離した（１０００００ｇ、４℃、２０分）。その後、ペレットを、２％（ｗ／ｖ）のＯＧが補充された精製緩衝液１に再懸濁して、膜タンパク質と、０．４％（ｗ／ｖ）の、大腸菌脂質およびコレステロールの混合物とを可溶化した。
【００４５】
その後、再懸濁された膜ペレットを４℃で４０分間インキュベーションして、界面活性剤により、膜タンパク質を可溶化させた。何らかの残留する不溶物をさらなる遠心分離（１０００００ｇ、４℃、２０分）により除き、これにより、上清は可溶物を含有した。
【００４６】
１．２．５  Ｐ−ｇｐの精製。
可溶化されたＰ−ｇｐを精製するためのＮｉ−ＮＴＡの使用が以前に詳しく報告されており（Ｔａｙｌｏｒ他、２００１）、また、以下に記載される。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を、穏やかな遠心分離によって、２０倍のカラム床体積（ｂｖ）の水、次いで、２０ｂｖの可溶化緩衝液で洗浄した。その後、可溶化されたタンパク質を樹脂に加え、混合物を穏やかな揺動とともに４℃で少なくとも１時間インキュベーションした。その後、混合物を空のＥｃｏｎｏカラムに加え、流出させ、これにより、何らかの非結合のタンパク質を除いた。その後、カラムを、順次、２０ｂｖの一連の洗浄および溶出緩衝液によって洗浄した（表１を参照のこと）。
【００４７】
すべての緩衝液が、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．２５％（ｗ／ｖ）のＯＧおよび０．１％（ｗ／ｖ）の脂質／コレステロールミックス、２０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、ならびに、非特異的に結合したタンパク質を除くための様々な量のイミダゾールを含有した。ｐＨはまた、Ｐ−ｇｐが洗浄期間中はそのヒスチジンタグにより結合したままであるが、精製の最終段階では溶出されるように調節された。
2010538053.tif 000003
【００４８】
Ｐ−ｇｐが、カラム上での２分間のインキュベーションの後、溶出緩衝液の２ｂｖの分画物において溶出された。すべての洗浄液および溶出液の３％をＴＣＡ沈殿し（Ｂｅｎｓａｄｏｕｎ他、１９７６）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。ゲルは、精製をモニターし、また、Ｐ−ｇｐ含有分画物を特定するために、銀染色（ＩＣＮ）、または、ＰａｇｅＢｌｕｅ（商標）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する染色のどちらかに供された。
【００４９】
１．２．６  リポソームの脂質二重層へのＰ−ｇｐの再構成。
Ｐ−ｇｐを含有する溶出分画物をプールし、ＳＭ−２  ＢｉｏＢｅａｄｓを１ｍｌのＰ−ｇｐ溶出あたり２２５ｍｇのＢｉｏＢｅａｄｓで加えて、界面活性剤を除き、それにより、Ｐ−ｇｐをプロテオリポソームに再構成した（Ｒｉｇａｕｄ他、１９８８）。ＢｉｏＢｅａｄｓを、水、次いで５０：５０の水：メタノール、メタノール、最後に水で３回、振とう機において５分間洗浄することによって調製した。再構成効率を評価するために、スクロース密度勾配を用いた。１μＣｉの［３Ｈ］ホスファチジルコリンを脂質トレーサーとして加えた。その後、これを室温での２時間の回転によって混合した。
【００５０】
再構成効率は精製後に常に評価されるわけではなかった。しかしながら、ＡＴＰａｓｅ活性の実証は、再構成を確認するために十分であると見なされた。なぜならば、Ｐ−ｇｐは、脂質二重層の中に入っていないときにはＡＴＰａｓｅ活性を事実上全く示さないからである（Ｃａｌｌａｇｈａｎ他、１９９７）。
【００５１】
１．２．７  スクロース密度遠心分離による再構成効率の評価。
再構成されたＰ−ｇｐの一部（２００μｌ）を等体積の６０％（ｗ／ｖ）スクロース／０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と混合した。４００μｌの２０％、１０％、５％および０％スクロース溶液がサンプルに重層された。その後、これを遠心分離し（１５００００ｇ、４℃、１２時間）、各層の２００μｌを集めた。各層の上側２００μｌの分画物には「Ａ」の印を付け、下側には「Ｂ」の印を付けた（例えば、３０％Ａおよび３０％Ｂ）（図１を参照のこと）。その後、それぞれの分画物から、５０μｌを使用して、［３Ｈ］−ホスファチジルコリンの分布を液体シンチレーション計数（Ｒｅａｄｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎシンチラント、ＬＳ６５００シンチレーションカウンター、Ｂｅｃｋｍａｎ）によって求めた。残る１５０μｌをＴＣＡ沈殿し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、銀染色またはＰａｇｅＢｌｕｅ（商標）のどちらかにより可視化して、脂質に対するタンパク質の位置をモニターした。再構成は、タンパク質および脂質が密度勾配の同じ分画物に共移動するとき、成功したと見なされた。その後、精製されている再構成されたＰ−ｇｐを−８０℃で貯蔵した。
【００５２】
１．２．８  タンパク質濃度の決定。
精製されたＰ−ｇｐのタンパク質濃度を決定するために、様々な量のＰ−ｇｐを既知量のＢＳＡの隣にＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。これは、０．２μｇ〜１．２μｇを泳動するＢＳＡの標準曲線をもたらした。その後、ゲルをクーマシーブルーにより染色し（少なくとも３０分間）、１０％（ｖ／ｖ）酢酸、５％メタノール（ｖ／ｖ）により一晩、脱染色し、これにより、デンシトメトリー分析に備えた。デンシトメトリー分析を、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅソフトウエア（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、合衆国）を使用して行い、Ｐ−ｇｐの濃度をこのＢＳＡ標準曲線から計算した。
【００５３】
１．２．９  様々なＡＴＰ濃度でのミカエリス・メンテン速度論。
Ｐ−ｇｐは、ＡＤＰおよび無機リン酸（Ｐｉ）へのＡＴＰの加水分解をもたらすＡＴＰａｓｅ活性を示す。比色測定アッセイ（Ｃｈｉｆｆｌｅｔ他、１９８８）を使用して、ＡＴＰの加水分解を無機リン酸の遊離により求めた。Ｐ−ｇｐ活性をμｍｏｌ（Ｐｉ）／分／ｍｇタンパク質として表した。
【００５４】
再構成されたＰ−ｇｐ（０．３μｇ）を、９６ウエルプレートにおいて３０μＭのニカルジピンの存在下（薬物刺激された活性）または非存在下（基礎状態の活性）、様々な濃度のＡＴＰ（０〜２ｍＭ）に加えた。ニカルジピンをＤＭＳＯでの５０ｍＭストック液から加え、かつ、ＤＭＳＯの量を、タンパク質の能力を保証するために１％（ｖ／ｖ）未満で維持した。
【００５５】
０〜２０ｎｍｏｌの標準曲線を、ＫＨ２ＰＯ４をＰｉ源として使用して組み立てた。バックグラウンドＰｉを、タンパク質または薬物を含まず、ＡＴＰおよびＡＴＰａｓｅ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）のみを含有するウエルを使用して測定した。
【００５６】
プレートを３７℃で２０分間インキュベーションし、反応を、４０μｌの１２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳをすべてのウエルに素早く加えることによって停止させた。１Ｍ  ＨＣｌにおける６％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸塩：１％（ｗ／ｖ）モリブデン酸アンモニウムの１：１混合物の１００μｌ（その光感受性のために、反応が停止された後で調製された）をすべてのウエルに加え、プレートを室温で５分間インキュベーションした。最後に、１００μｌの２％（ｗ／ｖ）クエン酸ナトリウム／メタ亜ヒ酸ナトリウム／２％（ｖ／ｖ）酢酸を加え、プレートを３７℃で１５分間インキュベーションした。その後、プレートを冷却し、吸光度を７５０ｎｍの波長においてプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ２５０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ／Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ）で測定した。遊離したＰｉの量をＰｉ標準曲線から計算し、Ｐ−ｇｐのＡＴＰａｓｅ活性を計算した。
【００５７】
２０μｌにおけるタンパク質の量（ｍｇ）を、ＡＴＰａｓｅ活性をμｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質として決定することを可能にするＢＳＡ標準曲線（１．２．８を参照のこと）によって求められたタンパク質濃度から計算した。ミカエリス・メンテン式（式１）を、非線形最小二乗フィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０）を使用してＡＴＰａｓｅ活性のグラフに適合させた。
2010538053.tif 000004
式１：ミカエリス・メンテン式、式において、
Ｖ＝μｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質として表される加水分解速度、
Ｖｍａｘ＝最大加水分解速度、
［Ｓ］＝ＡＴＰの濃度（Ｍ）、および
Ｋｍ＝ミカエリス定数（Ｍ）。
【００５８】
１．２．１０  一定のＡＴＰ濃度における様々な薬物濃度。
再構成されたＰ−ｇｐのＡＴＰａｓｅ活性を、２ｍＭのＡＴＰの存在下において、０〜１００ｍＭのニカルジピンの範囲にわたって測定した。この目的は、Ｐ−ｇｐと、ニカルジピンとの間の相互作用を評価することであった。アッセイを、上記された条件と同一の条件で組み立て、行い、読み取った。ＡＴＰａｓｅ活性をニカルジピン濃度に対してプロットし、一般的な用量応答曲線を、非線形フィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０）を使用して適合させた。一般的な用量応答曲線についての式が下記に示される（式２）。
2010538053.tif 000005
式２：一般的な用量応答曲線の式、式において、
Ｖ＝μｍｏｌ／分／ｍｇのＰｉとして表される加水分解速度、
Ｖｍａｘ＝最大加水分解速度、
Ｖｍｉｎ＝最小加水分解速度、
［Ｄ］＝薬物の濃度、および
ＥＣ５０＝加水分解の最大速度の１／２をもたらすために要求される薬物の濃度。
【００５９】
１．３  精製の結果および分析。
１．３．１  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製のモニタリング。
洗浄液および溶出物のうちの３％（または約２μｇ）の分画物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化した（図２を参照のこと）。レーン２〜７において認められ得るように、非特異的に結合したタンパク質が除かれた。しかしながら、Ｐ−ｇｐは、Ｎｉ−ＮＴＡに対するヒスチジンタグの結合親和性がｐＨの低下によって減少し、かつ、タンパク質が、増大するイミダゾール濃度から生じる競合的結合によって置き換えられるときに溶出されるだけである（レーン８〜１１）。
【００６０】
１．３．１  Ｐ−ｇｐの収量の決定。
５０ｍｇの総膜タンパク質を含有する粗製膜から、ＢＳＡゲル（例えば、図３）から決定されるように６０μｇ（ｎ＝４、ＳＥＭ２．３）のＰ−ｇｐを、グリセロール緩衝液を使用して精製することができた。ＯＧにより、存在するＰ−ｇｐの５０％を可溶化されたという以前の研究（未発表）からの証拠に基づいて、出発した膜タンパク質の０．６％がＰ−ｇｐであると結論することができる。
【００６１】
１．３．２  再構成効率の評価。
図４から理解され得るように、分画物１０ＡおよびＢにおいてＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化された大多数のタンパク質が、棒グラフによって示される［３Ｈ］−ホスファチジルコリンの位置に対応することを理解することができる。このことは、Ｐ−ｇｐが、プロテオリポソームを形成するリポソームの二重層の中に入っていること、および、Ｐ−ｇｐはＡＴＰａｓｅ活性を示すことができることを示している。
【００６２】
１．３．３  精製されたＰ−ｇｐのＡＴＰａｓｅ活性。
精製されたＰ−ｇｐが機能的であったことを保証するために、ＡＴＰａｓｅ活性を薬物刺激の存在下および非存在下の両方で測定した。図５は、ＡＴＰａｓｅ活性を示す、グリセロール緩衝液において溶出されたＰ−ｇｐの例である。３０μＭのニカルジピンの存在下では、Ｖｍａｘが２．６μｍｏｌ（Ｐｉ）／分／ｍｇ・Ｐ−ｇｐ（ｎ＝４、ＳＥＭ０．１５）であり、Ｋｍが０．６ｍＭ（ＡＴＰ）（ｎ＝４、ＳＥＭ０．０４）であることが見出された。基礎状態のＶｍａｘが０．５μｍｏｌ（Ｐｉ）／分／ｍｇ・Ｐ−ｇｐ（ｎ＝４、ＳＥＭ０．０６）であり、Ｋｍが０．４ｍＭ（ＡＴＰ）（ｎ＝４、ＳＥＭ０．０７）であった。
【００６３】
Ｐ−ｇｐのＡＴＰａｓｅ活性がまた、ニカルジピン濃度のある範囲にわたって測定された。Ｐ−ｇｐに対するニカルジピンのＥＣ５０が２４．２μＭであることが見出された（図６を参照のこと）。
【００６４】
１．４  結果の要約。
上記で示される結果が示すように、Ｐ−ｇｐを昆虫細胞の膜から単離および精製することができ、その後、基礎状態のＡＴＰａｓｅ活性およびニカルジピン刺激されたＡＴＰａｓｅ活性の両方を示したプロテオリポソームに首尾良く再構成することができた。
【００６５】
Ｐ−ｇｐを発現するＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞が数回の窒素キャビテーションにより破壊され、何らかの残留する溶解されていない細胞がさらなる遠心分離によって除かれた。膜の単離が超遠心分離によって達成され、ペレットが緩衝液に再懸濁された。これらの膜は、必要ならば、−８０℃で長期間にわたって貯蔵することができた。この時点で、Ｐ−ｇｐの発現を、Ｐ−ｇｐを可視化するための、特異的な一次抗体（Ｃ２１９）、次いで、抗マウスＩｇ西洋ワサビペルオキシダーゼ連結抗体による免疫ブロッティングによって確認することができた。膜タンパク質として、その後、Ｐ−ｇｐの精製では、Ｐ−ｇｐを膜から取り出すために、２％（ｗ／ｖ）のＯＧによるその可溶化が要求された。その後、Ｐ−ｇｐが、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、大腸菌脂質およびコレステロールの存在下で精製された。界面活性剤が、プロテオリポソームへのＰ−ｇｐの再構成を強制するＢｉｏＢｅａｄｓを使用して除かれた。この再構成の効率を、スクロース密度勾配を使用してモニターすることができた。成功した再構成では、タンパク質および脂質の両方がスクロース勾配の同じ層において示された。ＡＴＰａｓｅ活性が、ＡＤＰ＋ＰｉへのＡＴＰの加水分解の期間中に遊離した無機リン酸の量に基づく比色測定アッセイ（Ｃｈｉｆｆｌｅｔ他、１９８８）によって測定された。ＶｍａｘおよびＫｍが、ミカエリス・メンテン式を使用して、３０μＭのニカルジピンの存在下では２．６μｍｏｌ（Ｐｉ）／分／ｍｇ・Ｐ−ｇｐ（ｎ＝４、ＳＥＭ０．１５）および０．６ｍＭ（ＡＴＰ）（ｎ＝４、ＳＥＭ０．０４）として計算され、また、０．５μｍｏｌ（Ｐｉ）／分／ｍｇ・Ｐ−ｇｐ（ｎ＝４、ＳＥＭ０．０６）および０．４ｍＭ（ＡＴＰ）（ｎ＝４、ＳＥＭ０．０７）の基礎状態の値として計算された。加えて、ニカルジピンのＥＣ５０が２４．２μＭであることが求められた。これらの方法は、本研究におけるそれらの使用の前に、Ｔａｙｌｏｒ他によって十分に確立されていた。
【００６６】
（実施例２）  トレハロースを伴うＰ−ｇｐプロテオリポソームの凍結乾燥
２．１  序論。
２．１．１  乾燥状態での生存およびトレハロース。
生物における無水生活には、高レベルの二糖類（特に、トレハロース）が一般に関連する（Ｃｒｏｗｅ，Ｌ．Ｍ．、２００２）。トレハロース、すなわち、α−Ｄ−グルコピラノシル（１−１）α−Ｄ−グルコピラノースは、無水形態または二水和物形態のどちらかを取る非還元性二糖類である。無水トレハロースの化学構造は下記の通りである：
2010538053.tif 000006
【００６７】
２．１．２  凍結乾燥における分散保護剤としてのトレハロース。
膜および不安定なタンパク質の脱水、乾燥および凍結乾燥における分散保護剤としてのトレハロースの使用は十分に確立されている（Ｃｒｏｗｅ  Ｊ．Ｈ．他（１９９２）によって総説される）。水置換仮説およびガラス化仮説の両方におけるトレハロースの役割についての証拠が存在しており、両方の説が互いに排他的であるとは考えられない。トレハロースは、非晶質状態での高いガラス転移温度、および、水素結合を無水環境で形成する能力の両方を示す（Ｃｒｏｗｅ  Ｊ．Ｈ．他、１９８４；Ｌｉａｏ  Ｙ．、２００２；Ｄｅａｎ  Ａｌｌｉｓｏｎ  Ｓ．他、１９９９）。少量の水の取り込みは、トレハロース二水和物の形成のためにトレハロースのガラス転移温度に影響を及ぼさず、これにより、生成物の残り部分が水分から保護されるようである（Ｃｒｏｗｅ  Ｊ．Ｈ．他、１９９８）。
【００６８】
２．２  方法。
２．２．１  トレハロースによるグリセロールの置換。
最初の実験では、Ｐ−ｇｐの精製において使用される緩衝液のグリセロール濃度がこの緩衝液を凍結乾燥のために不適にしたことが示された。上記のように、トレハロースは多くの無水生活生物において一般的であり、また、多くの凍結乾燥された系における分散保護剤賦形剤として広く使用されている。Ｐ−ｇｐプロテオリポソームの成功した凍結乾燥では、緩衝液の凍結保護特性を依然として保持しながら、緩衝液からグリセロールを除くことが要求された。したがって、トレハロースが、凍結乾燥のためにＰ−ｇｐプロテオリポソームの調製においてグリセロールに取って代わるための理想的な候補として理解された。なぜならば、トレハロースは凍結および分散保護特性の両方を有するからである（Ｘｉｅ，Ｇ．およびＴｉｍａｓｈｅｆｆ，Ｓ．、１９９７）。
【００６９】
精製を、洗浄５および溶出までは記載されたような緩衝液を用いて、改変することなく行った。これらの緩衝液の組成を、Ｐ−ｇｐの溶出およびプロテオリポソームへの再構成を、トレハロースの存在下で、かつ、グリセロールの非存在下で可能にするために変更した（例えば、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．２５％（ｗ／ｖ）のＯＧおよび０．１％（ｗ／ｖ）の脂質／コレステロールミックス、２０％（ｗ／ｖ）のトレハロース）。
【００７０】
２．２．２  トレハロースはＰ−ｇｐのＡＴＰａｓｅ活性またはニカルジピンの効力に影響を及ぼすか？
トレハロースが実行可能な分散保護剤であるためには、ＡＴＰａｓｅ活性に対する薬理学的変化がなかったことを明らかにすることが必要であった。ＡＴＰａｓｅ活性を、ある範囲のトレハロース濃度にわたって、グリセロール精製されたＰ−ｇｐにおいてアッセイした。最大濃度は、２０％（ｗ／ｖ）の緩衝液が使用されたときのＡＴＰａｓｅアッセイの反応体積において見出される最大濃度と類似した（１０ｍＭ〜３００ｍＭ）。トレハロースを、５０μｌのウエル体積におけるトレハロースの正確な濃度を作製するためにＡＴＰａｓｅ緩衝液に溶解し、加えた。様々なＡＴＰアッセイおよび様々な薬物アッセイの両方を行った。
【００７１】
加えて、ＡＴＰａｓｅ活性を、使用された新規な緩衝液がＰ−ｇｐに影響を及ぼさなかったことを確認するために、トレハロースで精製されたＰ−ｇｐにおいて測定した。
【００７２】
２．２．３  凍結乾燥サイクルの確立。
凍結乾燥のすべてを、凝縮器温度が−８０℃に設定されたＣＨＲＩＳＴ  Ａｌｐｈａ２−４（ＭａｒｔｉｎＣｈｒｉｓｔ、ドイツ）を使用して行った。最初の実験を、生成物を微量遠心分離チューブに入れて行った。その後の実験を、２ｍｌのガラス製の凍結乾燥用バイアルおよび凍結乾燥用注入ストッパーをストッパーシステムとの併用で使用して行った。これは、バイアルが真空下で密封され、したがって、チャンバー圧力が大気にまで上げられたとき、大気からの水分の取り込みを避けることを可能にした。すべての実験において、棚を−８０℃に予冷して、チャンバーが要求圧力にまで排気されている間に生成物が融解することを避けた。
【００７３】
生成物が凍結乾燥により乾燥される速度および程度はいくつかの要因に依存する。これらの要因のいくつかを制御することは、装置の性質、および、サンプルを貯蔵し、また、輸送することの実務のために不可能であったが、しかしながら、異なる乾燥条件を特徴づけることが重要であった。直接的な制御を受けていたのが、チャンバー圧力および乾燥時間の長さであった。様々な圧力および乾燥時間を、Ｐ−ｇｐプロテオリポソームを凍結乾燥する最初の研究において使用した。
2010538053.tif 000007
【００７４】
しかしながら、最適化の後、下記の時間および圧力が、凍結乾燥されたＰ−ｇｐプロテオリポソームに対する残留水分含量の影響を調べるために使用された。
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【００７５】
２．２．４  カール・フィッシャー滴定による残留水分含量の決定。
凍結乾燥されたＰ−ｇｐプロテオリポソームの残留水分含量を、ＡＦ７  Ｃｏｕｌｏｍｅｔｒｉｃ  Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ（ＱＣＬ  Ｌｔｄ．、英国）を使用して求めた。残留水分を、乾燥された生成物の質量の百分率として表した。カール・フィッシャー滴定では、水分含量が、下記の式３において詳述されるように、ヨウ素と水との間の１：１の反応により求められた。
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式３：カール・フィッシャー滴定を記述する化学式。
この反応は、メタノールを溶媒として行われた。ヨウ素が電量分析的に生じ、このヨウ素から、ｍｇ単位での水の量が求められる。残留水分を乾燥生成物の総重量の百分率として計算した。
【００７６】
２．２．５  凍結乾燥後のＡＴＰａｓｅ活性の評価。
凍結乾燥が成功したと見なされるためには、Ｐ−ｇｐが、凍結乾燥直後に再水和されたとき、ＡＴＰａｓｅ活性を少なくとも保持していなければならない。凍結乾燥サイクルが完了したとき、固体の生成物ケークを蒸留水により再水和した。生成物のバイアルをボルテックス撹拌して、乾燥された生成物が完全に溶解し、再水和されたことを保証した。その後、ＡＴＰａｓｅ活性を、以前に記載されたようにアッセイした。
【００７７】
しかしながら、Ｐ−ｇｐプロテオリポソームの成功した安定化では、ＡＴＰａｓｅ活性が、所与の温度で現在可能であるよりも長く保持されることが要求された。例えば、Ｐ−ｇｐプロテオリポソームは、ＡＴＰａｓｅ活性を長期間にわたって保存するためには−８０℃での貯蔵を必要とする（図７、未発表データ、Ｒｏｔｈｎｉｅ  Ａ．）。
【００７８】
Ｐ−ｇｐプロテオリポソームを凍結乾燥し、密封し、様々な温度（４℃、２０℃および３７℃）で貯蔵し、ＡＴＰａｓｅ活性を１５０日までの間隔で評価した。
【００７９】
２．３  結果および考察。
２．３．１  グリセロールはＰ−ｇｐプロテオリポソームの凍結乾燥には適していない。
Ｐ−ｇｐの従来的精製が、２０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを伴う緩衝液において行われる。Ｐ−ｇｐの安定化を調べるために、この系の何らかの改変が必要とされたか否かを明らかにすることが必要であった。Ｐ−ｇｐプロテオリポソームを、上記されるサイクル４に従って凍結乾燥した。
【００８０】
凍結乾燥後、液体のグリセロールがバイアルに残っており、凍結乾燥された生成物に一般に付随するケーク構造が何ら見られなかった。ＡＴＰａｓｅ活性の完全な喪失の結果、グリセロールは、Ｐ−ｇｐプロテオリポソームを凍結乾燥するのに適していなかったことが理解され得る。図８を参照のこと。
【００８１】
２．３．２  トレハロースは精製時にグリセロールに代わって使用することができる。
上記されたように、精製されたＰ−ｇｐがグリセロール非含有緩衝液において溶出され、プロテオリポソームに組み込まれることが必要であった。緩衝液の保護特性を維持するために、２０％（ｖ／ｖ）のグリセロールが洗浄５の緩衝液および溶出緩衝液（表１）において２０％（ｗ／ｖ）のトレハロースに代わって使用された。図９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化される、グリセロールがトレハロースに代わって使用された精製の期間中に採取された分画物を示す。図２と同様に、不純物が洗浄期間中に除かれ、Ｐ−ｇｐに対応する単一バンドが溶出物において認められることを理解することができる。
【００８２】
レーン１〜６において使用された緩衝液は２０％（ｖ／ｖ）のグリセロール（ｐＨ８）を含有し、レーン７〜１１は２０％（ｗ／ｖ）のトレハロース（ｐＨ６．８）を含有した。
【００８３】
トレハロースが最後の精製および溶出のときに使用されたとき、Ｐ−ｇｐの良好な収量を得ることができたことを確認することもまた必要であった。前記のように、タンパク質収量を、クーマシーブルーにより染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリー分析によって測定した。グリセロールおよびトレハロースにおいて溶出されるＰ−ｇｐについてのバンドのサイズが同じであることを下記（図１０を参照のこと）において理解することができ、このことは、純粋なタンパク質の収量が溶出緩衝液の改変によって影響されなかったことを示す。グリセリール緩衝液において精製されたＰ−ｇｐは５０ｍｇの総膜タンパク質から１１５μｇ（ＳＥＭ４１．７、ｎ＝４）を与え、トレハロース精製されたＰ−ｇｐの収量は１０８μｇ（ＳＥＭ２８．５、ｎ＝４）であった。
【００８４】
２．３．３  トレハロースは、グリセロール緩衝液において溶出されるＰ−ｇｐのＡＴＰａｓｅ活性に影響を及ぼさない。
トレハロースが、Ｐ−ｇｐに関して使用されることについて検討され得る前には、賦形剤としてのトレハロースがＡＴＰａｓｅ活性または薬物結合を妨害しなかったことを明らかにしなければならなかった。ＡＴＰａｓｅ活性を、様々なＡＴＰ濃度およびニカルジピン濃度に対して、ある範囲のトレハロース濃度にわたって測定した。使用されたトレハロースの最大濃度が３００ｍＭであった。なぜならば、これは、２０％（ｗ／ｖ）のトレハロースが溶出緩衝液において使用されたときのＡＴＰａｓｅアッセイ期間中の５０μｌの反応体積におけるトレハロースの最終濃度に近づけるために計算されたからである。グリセロール精製されたＰ−ｇｐへのトレハロースの添加は、ＡＴＰａｓｅ活性（図１１ＡおよびＢ）、または、刺激されたＡＴＰａｓｅ活性に対するニカルジピンの効力（図１２）に影響を及ぼさなかったことを理解することができる。トレハロース存在下および非存在下で得られた結果の比較により、ｐ＝０．６５５１およびｐ＝０．７５４９（二元配置ＡＮＯＶＡ）がニカルジピン刺激ＡＴＰａｓｅ活性およびニカルジピン結合についてそれぞれ示された。
【００８５】
下記の表４は、使用されたトレハロースのそれぞれの濃度についてのＶｍａｘ（μｍｏｌ／分／ｍｇ）およびＫｍ（ｍＭ）のデータ、同様にまた、トレハロースの非存在下でのデータを示す。ニカルジピン刺激の平均データおよび基礎状態の平均データの両方が、４つの独立した精製物からのそれぞれの値についてのＳＥＭとともに示される。トレハロースの添加は、Ｐ−ｇｐによるＡＴＰの加水分解に影響を及ぼしていない。トレハロース媒介の阻害または刺激がないことは、トレハロースを、Ｐ−ｇｐプロテオリポソームの分散保護に対する継続した調査のための実行可能な候補にした。
2010538053.tif 000010
【００８６】
２．３．４  グリセロールの非存在下で、かつ、トレハロースの存在下で溶出されるＰ−ｇｐ。
トレハロースがＡＴＰａｓｅ活性または薬物結合の直接的な変化を生じさせなかったことが明らかにされると、ＡＴＰａｓｅ活性が、グリセロールおよびトレハロースにおいて溶出されるＰ−ｇｐにおいて類似していることを示すことが必要であった。グリセロールおよびトレハロースの両方において精製されたＰ−ｇｐのニカルジピン刺激されたＶｍａｘおよびＫｍが表５において比較される。
2010538053.tif 000011
【００８７】
グリセロールがトレハロースにより置き換えられたとき、Ｐ−ｇｐが依然として、良好なＡＴＰａｓｅ活性を伴って精製できたことが見出された。ＡＴＰａｓｅ活性が、プロテオリポソームを−８０℃で凍結する前および凍結した後の両方で維持された。このことは、２０％（ｗ／ｖ）のトレハロースが、２０％（ｖ／ｖ）のグリセロールと類似する凍結保護特性を有したことを示している。
【００８８】
２．３．５  凍結乾燥サイクルの確立。
凍結乾燥されるサンプルの体積が小さいこと（４００μｌ）のために、凍結乾燥時に使用される棚を、サンプルの凍結乾燥の前に−８０℃での少なくとも１時間のインキュベーションによって予冷することが必要であった。このことは、真空が引かれている間、サンプルを凍結状態で保ち、かつ、サンプルの温度を、一次乾燥の期間中、融解点よりも低い温度で安全に維持するという二重の目的に役立った。
【００８９】
一次乾燥が、生成物の温度が劇的に上昇して棚の温度に一致した３〜４時間後において終了していると確認された（図１３）。このことは、すべての氷が昇華し、結合水のみが残っていることを示すものであった。
【００９０】
棚の温度を直接に制御するための設備がないために、最終的な棚温度が周囲の室温によって決定された。あらゆる努力が、室温ができる限り変動しなかったことを保証するためになされたが、条件がそれぞれの凍結乾燥について同一でなかったことは避けられないことであった。この結果として、二次乾燥が生じるために許された時間が、種々の環境条件を最小限にしようとして大きかった。文献におけるチャンバー圧力は０．０１１ｍｂａｒよりも著しく高く、典型的には０．１〜０．２ｍＢａｒであったことが注目された（Ｌｉａｏ  Ｙ．他（２００２）、Ｄｅａｎ  Ａｌｌｉｓｏｎ  Ｓ．他（１９９９）、および、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  Ｊ．他（１９９３））。しかしながら、二次乾燥の期間中におけるチャンバー圧力は、結合水の脱着を促進させるために低くされる（例えば、０．０１ｍＢａｒ）（ｖａｎ  Ｗｉｎｄｅｎ  Ｅ．他、１９９９）。したがって、サイクル４において特定される短い一次乾燥時間を考えると、０．０１１ｍＢａｒが１工程サイクルでは始めから終わりまで使用されることが決定された。
【００９１】
２．３．６  残留水分含量の決定。
水が凍結乾燥サイクルの期間中に除かれた程度を正確に決定し、これにより、環境の影響を最小限に抑えるために、サンプルを、チャンバー圧力が大気に戻される前に密封した。残留水分が生成物の乾燥質量の百分率として計算され、０．０１１ｍＢａｒにおいて７２時間の後、カール・フィッシャー滴定によって４．２％（ＳＥＭ０．３５、ｎ＝４の独立した実験）として決定された；図１４を参照のこと。
【００９２】
２．３．７  ＡＴＰａｓｅ活性が、凍結乾燥されたＰ−ｇｐプロテオリポソームを再水和したときに保持される。
凍結乾燥されたＰ−ｇｐプロテオリポソームをサイクル終了直後に再水和し、ＡＴＰａｓｅアッセイを以前に記載されたように測定した。再水和を３３０μｌの室温の蒸留水によって行った。平均乾燥ケーク重量が６６．７ｍｇ（ＳＥＭ１．２５、ｎ＝４）であったので、この体積が使用され、また、ＡＴＰａｓｅ活性を正確に測定し、比較するために、凍結乾燥前後のアッセイで使用されるＰ−ｇｐの濃度はできる限り近づけなければならなかった。Ｐ−ｇｐは、その凍結乾燥前のニカルジピン刺激された最大ＡＴＰａｓｅ活性の８３．０％（ＳＥＭ１９．７％、ｎ＝４）を保持する。凍結乾燥前後のサンプルについてのＫｍがそれぞれ、０．６６ｍＭ（ＡＴＰ）および０．７３ｍＭ（ＡＴＰ）であり（ＳＥＭ０．４１、ｎ＝４）、このことは、ＡＴＰに対する親和性が影響されなかったことを示した（図１５）。
【００９３】
２．３．８  ＡＴＰａｓｅ活性が、凍結乾燥されたＰ−ｇｐプロテオリポソームの長期に及ぶ貯蔵の後で保持される。
方法（２．２．５）で述べられたように、長期間にわたるＡＴＰａｓｅ活性の保存はＰ−ｇｐプロテオリポソームの成功した安定化を構成する。貯蔵試験の結果は、Ｐ−ｇｐが実際にＡＴＰａｓｅ活性を数ヶ月間にわたって保持したことを明らかにした。異なる貯蔵温度は、４℃＞２０℃＞３７℃の順で、活性が保存された程度に対する影響を有していたが、４℃と２０℃との間の差は最小であった。Ｖｍａｘが保存されたことに加えて、Ｋｍは、１２日での２つの異常な結果は別として、長期間にわたって変化しないままであった。このことは、ＡＴＰの加水分解の特徴が凍結乾燥および貯蔵によって影響されなかったことを示している。
【００９４】
したがって、図１６ＡおよびＢにおけるデータは、トレハロースが長期間にわたってプロテオリポソームのための分散保護剤として作用することができることを示す。
【００９５】
２．４  結果の要約。
上記で示された結果は、トレハロースが分散保護剤としての実行可能な候補であったことを示す。トレハロースは、タンパク質の立体配座変化およびＡＴＰの拡散を妨げる溶液の粘度のために、２０℃では高濃度（０．６Ｍ〜０．８Ｍ）において、原形質膜のＨ＋−ＡＴＰａｓｅのＡＴＰａｓｅ活性を阻害することが認められた。しかしながら、４０℃では、Ｖｍａｘにおける低下は無視できるほどであった（Ｓａｍｐｅｄｒｏ  Ｊ．他、２００２）。３００ｍＭまでの濃度におけるトレハロースはニカルジピン刺激のまたは基礎状態のＡＴＰ加水分解に影響を及ぼさない（ｐ＝０．６５５１およびｐ＝０．９４２２）。ＡＴＰａｓｅ活性を刺激するニカルジピンの効力は同様に影響を受けず、ＥＣ５０が、トレハロースの非存在下での２４．２μＭと比較して、トレハロースの存在下では１９．２μＭであり、有意差がこれらの曲線の間にはない（ｐ＝０．７５４９）。トレハロースが精製プロセスの最終部分においてグリセロールに代わって使用できることもまた明らかにされた。２０％（ｗ／ｖ）のトレハロースが、Ｐ−ｇｐをカラムから溶出するために使用される緩衝液において２０％のグリセロール（ｖ／ｖ）の代わりに使用されたとき、ＡＴＰａｓｅ活性の喪失が何ら測定されなかった。タンパク質の収量もまた、ＢＳＡ標準曲線を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリー測定によって測定されたように同程度であった（図１０）。
【００９６】
グリセロールを含有する緩衝液が凍結乾燥のために全く適していないことが証明されたが、トレハロースは、棚が周囲温度よりも高く熱くならない場合でさえ、サンプルを７２時間にわたって約４％の残留水分にまで乾燥することを可能にした。重要なことに、凍結乾燥されたＰ−ｇｐプロテオリポソームが再水和されたとき、８０％を越えるＡＴＰａｓｅ活性が直後に回復し、活性が、４℃および２０℃では１５０日間、６０％までにおいて持続し、一方、３７℃では、４０％前後の活性が同じ期間にわたって保持された。
【００９７】
（実施例３）  マルトースを伴うＰ−ｇｐプロテオリポソームの凍結乾燥
３．１  序論。
３．１．１  自然界におけるマルトース。
マルトース、すなわち、α−Ｄ−グルコピラノシル（１−４）α−Ｄ−グルコピラノースは、デンプンの加水分解によって形成される天然に存在する二糖類である。２つのグルコースモノマーの間における（１−４）グリコシド連結のために、マルトースは、トレハロースとは異なり、還元糖である。マルトースは一水和物を形成するが、無水形態でもまた存在する。無水マルトースの化学構造は下記の通りである：
2010538053.tif 000012
【００９８】
３．１．２  分散保護剤としてのマルトース。
凍結乾燥の研究では広く使用されていないが、マルトースは、酵母の原形質膜タンパク質を保護することにおいてトレハロースに次いで２番目であることが示されている（Ｓａｍｐｅｄｒｏ  Ｊ．Ｇ．他、２００２）。マルトオリゴ糖を形成するマルトースの能力が、タンパク質の二次構造の保護に対する、増大する分子量の影響を調べるために使用されている。マルトースはグルコース（マルトースの成分分子）よりも効果的であったが、構造の安定化が、二糖類を越えるユニットの付加とともに低下したことが示された（Ｉｚｕｔｓｕ  Ｋ．他、２００４）。同じ傾向が、凍結乾燥されたリポソームの安定化に対する、増大するマルトオリゴ糖サイズの影響が調べられたときに観測された（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ．他、１９９６；Ｏｚａｋｉ  Ｋ．およびＨａｙａｓｈｉ  Ｍ．、１９９７）。すなわち、二糖類形態が、より大きな糖よりも優れている。
【００９９】
３．２  方法。
３．２．１  マルトースによるグリセロールの置換。
グリセロールが凍結乾燥に適していないことにより、Ｐ−ｇｐプロテオリポソームの精製および凍結乾燥を可能にするその代用物が必要とされた。トレハロースは凍結保護性および分散保護性の両方を示し、また、Ｐ−ｇｐの成功した精製を可能にしたことが示されている。トレハロースおよびマルトースの相対的な能力を調べるためには、Ｐ−ｇｐが、マルトースを含有する緩衝液により首尾良く精製され得ることが必要であった。したがって、最終の洗浄および溶出が、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．２５％（ｗ／ｖ）のＯＧおよび０．１％（ｗ／ｖ）の脂質／コレステロールミックス、２０％（ｗ／ｖ）のマルトースに変更された。
【０１００】
３．２．２  マルトースはＰ−ｇｐのＡＴＰａｓｅ活性またはニカルジピンの効力に影響を及ぼすか？
マルトースおよびトレハロースの化学的類似性にもかかわらず、構造的違いにより、マルトースが、ＡＴＰの加水分解およびニカルジピンの結合に関してトレハロースによって示されない何らかの性質を有し得る可能性がある。観測される何らかの違いが、二糖類それ自体の存在ではなく、異なる二糖類の存在下における凍結乾燥の結果であったことを明らかにするために、同じ改変されたＡＴＰａｓｅアッセイを、ある範囲のマルトース濃度にわたって、グリセロール精製されたタンパク質に対して行った。
【０１０１】
比較がまた、グリセロール精製されたタンパク質と、マルトース緩衝液において精製されたタンパク質との間で行われた。
【０１０２】
３．２．３  凍結乾燥。
最適化プロセスを繰り返さず、サイクル４を生成物の類似性のために使用した。真空下での密封および棚の冷却を可能にした凍結乾燥用バイアルの使用は、トレハロースに基づく生成物に対して行われた実験と同一であった。
【０１０３】
３．２．４  残留水分含量の決定。
凍結乾燥された生成物の残留水分含量を、前記されたように電量測定によるカール・フィッシャー分析によって行い、乾燥生成物重量の百分率として表した。
【０１０４】
３．２．５  凍結乾燥後のＡＴＰａｓｅ活性の評価。
Ｐ−ｇｐプロテオリポソームの再構成の後、ＡＴＰａｓｅ活性を前記されたように測定した。活性を、３０日までの間隔で、４℃、２０℃および３７℃での貯蔵の後で評価した。
【０１０５】
３．３  結果および考察。
３．３．１  マルトースは精製時にグリセロールに代わって使用することができる。
２０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを２０％（ｗ／ｖ）のマルトースにより置き換えることは、Ｐ−ｇｐの精製に影響を及ぼさなかった。図１７において理解され得るように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化されたとき、Ｐ−ｇｐが、不純物の除去と、Ｐ−ｇｐの位置に対応するバンドのみとを伴って首尾良く精製された。
【０１０６】
レーン１〜６において使用された緩衝液は２０％（ｖ／ｖ）のグリセロール（ｐＨ８）を含有し、レーン７〜１１は２０％（ｗ／ｖ）のマルトース（ｐＨ６．８）を含有した。
【０１０７】
マルトース緩衝液において精製されたタンパク質の収量は、グリセロール緩衝液およびトレハロース緩衝液の両方における収量と類似していた（図１８）。
【０１０８】
３．３．２  マルトースは、グリセロール緩衝液において溶出されるＰ−ｇｐのＡＴＰａｓｅ活性に影響を及ぼさない。
トレハロース緩衝液の場合と同様に、Ｐ−ｇｐのＡＴＰａｓｅ活性、または、ＡＴＰａｓｅ活性を刺激するニカルジピンの効力に対するマルトースの直接的な影響がなかったことを明らかにすることは重要であった。同じ改変されたＡＴＰａｓｅアッセイを、トレハロースがマルトースにより置き換えられたことを除いて、２．２．２で記載されるように使用した。ニカルジピン刺激のＶｍａｘに対する著しい影響が、ｐ＝０．４２１５により、試験された濃度の範囲にわたって認められなかった（図１９ＡおよびＢ）。表６から理解され得るように、Ｋｍ、ならびに、基礎状態のＶｍａｘおよびＫｍもまた、マルトースの存在下では変化しないままであった。したがって、マルトースは、Ｐ−ｇｐによるＡＴＰの加水分解が影響されなかったという認識とともに、分散保護剤として詳しく調べることができた。トレハロースおよびマルトースが非常に類似する分子であり、また、影響がトレハロース濃度の増大とともに何ら観測されなかったことを考えれば、マルトースが何らかの影響を発揮していたと考えられる可能性はないようである。
2010538053.tif 000013
【０１０９】
やはり、マルトースは、ｐ＝０．５２４９により、Ｐ−ｇｐとニカルジピンとの間の相互作用に対する影響を有していなかった（図２０）。したがって、マルトース自体は、トレハロースのように、グリセロールにおいて精製されたＰ−ｇｐのＡＴＰａｓｅ活性を変化させなかった。
【０１１０】
３．３．３  グリセロールの非存在下で、かつ、マルトースの存在下で溶出されるＰ−ｇｐ。
マルトースを可能な分散保護剤として進めるためには、ｐ−ｇｐが、ＡＴＰａｓｅ活性の喪失を伴うことなくマルトースにおいて溶出できたかを明らかにすることが必要であった。２０％（ｗ／ｖ）マルトース緩衝液において溶出されたＰ−ｇｐでは、３０μＭのニカルジピンの存在下におけるＡＴＰａｓｅ活性の実際の喪失が認められなかった。表６における活性は、以前に報告された活性よりも低いが、これは、従来的にグリセロール精製されたＰ−ｇｐについての値もまた低いので、マルトースが精製における使用に適していないことを示すものでないことに留意することが重要である。これは、細胞培養条件、ならびに、それに続くタンパク質発現レベルおよびタンパク質局在化における変動の結果である。
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【０１１１】
したがって、マルトースを、凍結乾燥時における可能な保護剤として調べることができた。なぜならば、マルトースは、Ｐ−ｇｐの精製および凍結を、ＡＴＰａｓｅ活性を保持しながら可能にしたからであった。
【０１１２】
３．３．４  凍結乾燥および残留水分の決定。
同一のサイクルを、トレハロース溶出のＰ−ｇｐに関して使用されたように、マルトースにおいて溶出されたＰ−ｇｐを凍結乾燥するために使用した（例えば、棚を−８０℃に冷却し、その後、チャンバーを０．０１１ｍＢａｒに７２時間にわたって排気し、その後で、凍結乾燥用バイアルを真空下で密封すること）。
【０１１３】
残留水分含量を再び、電量測定法によるカール・フィッシャー滴定によって求めた。マルトース溶出のサンプルは、トレハロースによるサンプルと極めて類似するレベルの残留水分を凍結乾燥後にもたらした。このことは驚くことではない。なぜならば、マルトースおよびトレハロースは化学的に同一であるが、二水和物を形成するトレハロースと比較して、マルトースは一水和物を形成するからである。凍結乾燥されたマルトース溶出Ｐ−ｇｐにおける残留水分は、４．８％（ＳＥＭ０．２５、ｎ＝４）であることが見出された。このことはまた、乾燥された生成物の質量において反映された。トレハロース溶出されている凍結乾燥されたＰ−ｇｐにおける乾燥生成物は６６．７ｍｇ（ＳＥＭ１．２５、ｎ＝４）であり、これに対して、マルトースの場合には、質量が６６．９ｍｇ（ＳＥＭ１．３５、ｎ＝４）に増大した。
【０１１４】
３．３．５  ＡＴＰａｓｅ活性が、凍結乾燥されたＰ−ｇｐプロテオリポソームを再水和したときに保持される。
凍結乾燥後に再水和したとき、Ｐ−ｇｐプロテオリポソームは、ニカルジピン刺激されたＡＴＰａｓｅ活性を示した。しかしながら、トレハロースにおいて精製されたＰ−ｇｐプロテオリポソームは高いレベルの回復したＡＴＰａｓｅ活性（２．３．７を参照のこと）を示したが、マルトースにおいて溶出されたＰ−ｇｐプロテオリポソームは、６９．９％（ＳＥＭ２１．６％、ｎ＝４）とわずかにより低いレベルの回復活性を示した。回復活性は、凍結乾燥前のニカルジピン刺激のＶｍａｘによって除された凍結乾燥後のニカルジピン刺激のＶｍａｘとして定義された。Ｖｍａｘが凍結乾燥後に低下することが示されたが、ＡＴＰに対する親和性には影響しないままであった。凍結乾燥前のＫｍが０．９１ｍＭ（ＡＴＰ）であり、凍結乾燥後は１．２ｍＭ（ＡＴＰ）であった（ＳＥＭ０．８３、ｎ＝４）。図２１を参照のこと。
【０１１５】
３．３．６  ＡＴＰａｓｅ活性が、凍結乾燥されたＰ−ｇｐプロテオリポソームの長期貯蔵の後で急速に低下する。
マルトースは、凍結乾燥後、ＡＴＰａｓｅ活性を保存することができるかを、前記されたように、ある範囲の温度および期間にわたって試験した。マルトース精製されたＰ−ｇｐにおけるＡＴＰａｓｅ活性が、トレハロースにおいて溶出されたＰ−ｇｐと比較して、比較的急速に低下したことが観測された。図２２Ａは、活性が、４℃を超えて貯蔵されたサンプルでは直ちに低下したことを示す。しかしながら、影響は２０℃では３７℃よりも少なかった。ほんの１２日後に、４℃で貯蔵されたサンプルはまた低下し始め、３０日では、すべての温度で貯蔵されたサンプルがそれらの凍結乾燥前のニカルジピン刺激のＶｍａｘの５０％未満を有した。
【０１１６】
トレハロース精製されたＰ−ｇｐプロテオリポソームから得られる類似する期間にわたる貯蔵データ（図２２Ｂ）との直接の比較によって、マルトースは、ＡＴＰａｓｅ活性を乾燥状態で保存することにおいてはるかに効果的でないことが理解され得る。マルトースにおいて精製されたＰ−ｇｐは、凍結乾燥後において最初、トレハロース同等物よりも小さいＡＴＰａｓｅ活性を保持するだけでなく（３．３．５）、活性はまた、試験されたすべての温度において、トレハロース同等物よりも急速に低下する。
【０１１７】
Ｖｍａｘが、測定された期間にわたって急速に低下した一方で、Ｋｍが変化した。このことは、時間とともに加水分解されたＡＴＰの量が低下したが、ＡＴＰに対するＰ−ｇｐの親和性は変化しなかったことを示唆する（図２３）。
【０１１８】
これらのデータは、まとめると、マルトースはＰ−ｇｐプロテオリポソームを即時的な凍結乾燥損傷から保護することができるが、試験された温度のいずれにおいても、どのような長さの時間にわたっても使用に適していないことを示す。
【０１１９】
３．４  結果の要約。
マルトースは、本質的にはＰ−ｇｐのＡＴＰａｓｅ活性またはニカルジピンの効力に影響を及ぼさないこと（それぞれ、ｐ＝０．４２１５およびｐ＝０．５２４９の値）が上記で示されている。このことは、有意差が、ある範囲の濃度のマルトースの存在下および非存在下での活性の間にないことを示す。これに加えて、マルトースに基づく緩衝液を、純度、収量またはＡＴＰａｓｅ活性の喪失を伴うことなく、グリセロールに基づく緩衝液の代わりにｐ−ｇｐを溶出させるために使用することができる。
【０１２０】
興味深いことに、凍結乾燥されたマルトース配合物は、トレハロースよりもわずかに大きい残留水分測定値を示した；４．２％（ＳＥＭ０．３５、ｎ＝４）とは対照的に４．８％（ＳＥＭ０．２５、ｎ＝４）。差は大きくないが、それは、残留する水が結晶性の二糖類水和物に保持されているならば、予想されることとは逆である。先に述べたように、マルトースは一水和物を形成する（すなわち、１分子のマルトースあたり１分子の水）。しかしながら、トレハロースは二水和物を形成する。このことは、約４％は、典型的には約１％の残留水分を有するいくつかの凍結乾燥された配合物については高いようであるが、プロテオリポソーム系における残留する水は「自由」水ではなく、むしろ、サイクルの脱着段階の期間中に除かれない結合水であることを示唆する。
【０１２１】
配合におけるマルトースの使用はまた、ある程度の分散保護をもたらし、トレハロースにおける８３．０％と比較して、凍結乾燥前のＡＴＰａｓｅ活性の６９．９％が凍結乾燥後の再水和のときに回復する。しかしながら、ＡＴＰａｓｅ活性が時間およびある範囲の温度にわたって評価されたとき、大きな違いが、トレハロースとマルトースとの間で観測された。マルトースは、１２日を越える期間について、４℃のみでのその場合でさえ、Ｐ−ｇｐのＡＴＰａｓｅ活性を保存することができなかった。より高い温度では、回復活性の喪失が急速であった。保護のこの喪失の原因、および、トレハロースによってもたらされる保護との著しい相違は、詳しく調べる必要がある。分散保護におけるこの大きな違いは、これらの二糖類が構造的に非常に類似するという事実のために注目される。
【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図９】
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【図１０】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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