(57)【要約】本発明は、不連続エピトープの近位配置、及び／又は構造支持要素の使用によって、配座エピトープの本質的諸性質を再生することができるという認識、並びに類似の手法を拡張して、受容体のリガンド結合領域、酵素の基質結合領域などのタンパク質の他の３次元構造的又は機能的要素を再生することができるという認識に少なくとも部分的に基づく。本発明は、配座的に束縛されたポリペプチド配列のコンビナトリアルライブラリー、及びその使用に関する。特に、本発明は、配座エピトープのコンビナトリアルライブラリー、及びその使用に関する。
2010515463.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１個以上の未変性若しくは変種ポリペプチドの離散的若しくは無秩序な断片の、又は前記断片を模倣した配列の、直列型又は多量体集合体を含む物理的に選択可能なディスプレイであって、前記集合体の少なくとも一部が、配座的に束縛されたポリペプチド標的を形成し、前記断片の少なくとも一部が抗体断片以外である、物理的に選択可能なディスプレイ。
【請求項２】
配座エピトープライブラリーである、請求項１に記載のディスプレイ。
【請求項３】
１個を超えるポリペプチドの離散的若しくは無秩序な断片の、又は前記断片を模倣した配列の、直列型又は多量体集合体を含む、請求項１に記載のディスプレイ。
【請求項４】
前記直列型又は多量体集合体の少なくとも一部が、同じポリペプチドの異なる部分に由来する２個以上の断片、又は前記断片を模倣した配列を含む、請求項１に記載のディスプレイ。
【請求項５】
前記直列型又は多量体集合体の少なくとも一部が、異なるポリペプチドに由来する断片、又は前記断片を模倣した配列を含む、請求項１に記載のディスプレイ。
【請求項６】
前記直列型又は多量体集合体の少なくとも一部が、抗体又は抗体断片、及び前記抗体又は抗体断片のリガンドを含む、請求項１に記載のディスプレイ。
【請求項７】
前記直列型又は多量体集合体において、前記断片又は配列の少なくとも一部が互いに直接融合する、請求項１に記載のディスプレイ。
【請求項８】
前記直列型又は多量体集合体において、前記断片又は配列の少なくとも一部が外来性連結配列によって結合される、請求項１に記載のディスプレイ。
【請求項９】
前記直列型又は多量体集合体において、少なくとも幾つかの前記断片又は配列が、構造支持要素からなる、又は構造支持要素を含む、請求項１に記載のディスプレイ。
【請求項１０】
配座的に束縛されたポリペプチド標的の少なくとも一部が、前記直列型又は多量体集合体中に存在する断片又は模倣配列の近接の結果として形成される、請求項１に記載のディスプレイ。
【請求項１１】
配座的に束縛されたポリペプチド標的の少なくとも一部が、前記直列型又は多量体集合体中の構造支持要素の存在の結果として形成される、請求項１に記載のディスプレイ。
【請求項１２】
前記構造支持要素が、１個以上のタンパク質ファミリーに特有なモチーフである、請求項１１に記載のディスプレイ。
【請求項１３】
前記構造支持要素が、ヘリックスバンドル、βシート構造、三葉構造、膜貫通ヘリックス及び細胞外ループからなる群から選択される、請求項１１に記載のディスプレイ。
【請求項１４】
配座的に束縛されたポリペプチド標的が受容体配列を含む、請求項１に記載のディスプレイ。
【請求項１５】
前記受容体配列が受容体の構造モチーフを含む、請求項１４に記載のディスプレイ。
【請求項１６】
生体内及び生体外ディスプレイ系からなる群から選択される、請求項１に記載のディスプレイ。
【請求項１７】
ウイルス、真核生物、細菌、リボソーム、ｍＲＮＡ及びＤＮＡディスプレイ系からなる群から選択される、請求項１６に記載のディスプレイ系。
【請求項１８】
バクテリオファージディスプレイである、請求項１７に記載のディスプレイ。
【請求項１９】
前記真核生物ディスプレイ系がほ乳動物又は酵母ディスプレイである、請求項１７に記載のディスプレイ。
【請求項２０】
前記細菌ディスプレイ系が細菌細胞又は胞子ディスプレイである、請求項１７に記載のディスプレイ。
【請求項２１】
前記細菌ディスプレイ系がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子ディスプレイである、請求項２０に記載のディスプレイ。
【請求項２２】
前記細菌ディスプレイ系がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子ディスプレイである、請求項１１に記載のディスプレイ。
【請求項２３】
（ａ）１個以上の未変性若しくは変種ポリペプチドの離散的若しくは無秩序な断片の、又は前記断片を模倣した配列の、直列型又は多量体集合体を含む物理的に選択可能なディスプレイであって、前記集合体の少なくとも一部が、配座的に束縛されたポリペプチド標的を形成し、前記断片の少なくとも一部が抗体断片以外である、物理的に選択可能なディスプレイを用意すること、
（ｂ）互いに結合親和性を有する配座的に束縛されたポリペプチド標的と結合相手候補が標的−結合相手コンプレックスを形成する条件下で、前記ディスプレイを結合相手候補のライブラリーと接触させること、及び
（ｃ）形成された標的−結合相手コンプレックスの少なくとも一部を検出すること
を含む、スクリーニング方法。
【請求項２４】
（ｄ）検出された標的−結合相手コンプレックスの少なくとも一部の形成に関与する標的配列を特定するステップを更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
検出されたすべての標的−結合相手コンプレックスの形成に関与する標的配列が特定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ディスプレイが、１個を超えるポリペプチドの離散的若しくは無秩序な断片の、又は前記断片を模倣した配列の、直列型又は多量体集合体を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記直列型又は多量体集合体の少なくとも一部が、同じポリペプチドの異なる部分に由来する２個以上の配列、又は前記断片を模倣した配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記直列型又は多量体集合体の少なくとも一部が、異なるポリペプチドに由来する断片、又は前記断片を模倣した配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記直列型又は多量体集合体の少なくとも一部が、抗体又は抗体断片、及び前記抗体又は抗体断片のリガンドを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記直列型又は多量体集合体において、前記断片又は配列の少なくとも一部が互いに直接融合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記直列型又は多量体集合体において、前記断片又は配列の少なくとも一部が外来性連結配列によって結合される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記直列型又は多量体集合体において、２個以上の配列の少なくとも一部が、構造支持要素からなる、又は構造支持要素を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
配座的に束縛されたポリペプチド標的の少なくとも一部が、前記直列型又は多量体集合体中に存在する断片又は模倣配列の近接の結果として形成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
配座的に束縛されたポリペプチド標的の少なくとも一部が、前記直列型又は多量体集合体中の構造支持要素の存在の結果として形成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記構造支持要素が、１個以上のタンパク質ファミリーに特有なモチーフである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記構造支持要素が、ヘリックスバンドル、βシート構造、三葉構造、膜貫通ヘリックス及び細胞外ループからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
結合相手候補が抗体又は抗体断片である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ及び（ｓｃＦｖ）２断片、抗体断片から形成される線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、二重特異性抗体及び多重特異性抗体からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体断片がｓｃＦｖ断片である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体又は抗体断片が抗体ライブラリーの一部である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
結合タンパク質候補が抗体模倣物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項４２】
抗体模倣物がＡｆｆｉｂｏｄｙ又はアプタマーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記物理的に選択可能なディスプレイが生体内又は生体外ディスプレイ系である、請求項２３に記載の方法。
【請求項４４】
前記物理的に選択可能なディスプレイが、ウイルス、真核生物、細菌、リボソーム、ｍＲＮＡ及びＤＮＡディスプレイ系からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ディスプレイ系がバクテリオファージディスプレイである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記真核生物ディスプレイ系がほ乳動物又は酵母ディスプレイである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記細菌ディスプレイ系が細菌細胞又は胞子ディスプレイである、請求項４４に記載のライブラリー。
【請求項４８】
前記細菌ディスプレイ系がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子ディスプレイである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体ライブラリーが表示される、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
抗体ディスプレイが生体内又は生体外ディスプレイ系である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
抗体ディスプレイが、ウイルス、真核生物及び細菌ディスプレイ系からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記ディスプレイ系がバクテリオファージディスプレイである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記真核生物ディスプレイ系がほ乳動物又は酵母ディスプレイである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記細菌ディスプレイ系が細菌細胞又は胞子ディスプレイである、請求項５１に記載のライブラリー。
【請求項５５】
前記細菌ディスプレイ系がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子ディスプレイである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
抗体ライブラリーがファージライブラリーであり、物理的に選択可能なディスプレイが胞子ディスプレイ又はファージディスプレイである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記胞子ディスプレイがＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子ディスプレイである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記配座的に束縛されたポリペプチド標的が受容体配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項５９】
結合相手が受容体リガンド候補である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記受容体配列が受容体の構造モチーフを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
標的−結合相手コンプレックスの少なくとも一部の形成に関与する抗体配列又は抗体断片配列が更に特定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項６２】
標的−結合相手コンプレックスの少なくとも一部の形成に関与する標的配列及び抗体配列をステップ（ｄ）の前に濃縮及び分離するステップを更に含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
濃縮及び分離に続いて、ステップ（ｄ）の前に、標的−結合相手コンプレックスの少なくとも一部の形成に関与する標的配列及び抗体配列を個別に回収するステップを更に含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
標的−結合相手コンプレックスの少なくとも一部の形成に関与する標的配列が配座エピトープの一部である、請求項３８に記載の方法。
【請求項６５】
（ａ）１個以上の未変性若しくは変種ポリペプチドの離散的若しくは無秩序な断片の、又は前記断片を模倣した配列の、直列型又は多量体集合体を含む物理的に選択可能なディスプレイであって、前記集合体の少なくとも一部が配座エピトープを形成する、物理的に選択可能なディスプレイを用意すること、
（ｂ）互いに結合親和性を有する配座エピトープと抗体ライブラリーのメンバーとが配座エピトープ−抗体コンプレックスを形成する条件下で、前記ディスプレイを抗体ライブラリーと接触させること、及び
（ｃ）形成された配座エピトープ−抗体コンプレックスの少なくとも一部を検出すること
を含む、方法。
【請求項６６】
（ｄ）検出された配座エピトープ−抗体コンプレックスの少なくとも一部の形成に関与する配座エピトープ及び抗体配列を特定するステップを更に含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
形成されたすべての配座エピトープ−抗体コンプレックスが検出される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
検出されたすべての標的−結合相手コンプレックスの形成に関与する配座エピトープ配列が特定される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ディスプレイが、１個を超えるポリペプチドの離散的若しくは無秩序な断片の、又は前記断片を模倣した配列の、直列型又は多量体集合体を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記直列型又は多量体集合体の少なくとも一部が、同じポリペプチドの異なる部分に由来する断片、又は前記断片を模倣した配列を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
前記直列型又は多量体集合体の少なくとも一部が、異なるポリペプチドに由来する断片、又は前記断片を模倣した配列を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
前記直列型又は多量体集合体の少なくとも一部が、抗体又は抗体断片、及び前記抗体又は抗体断片のリガンドを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記直列型又は多量体集合体において、前記断片又は配列の少なくとも一部が互いに直接融合する、請求項６５に記載の方法。
【請求項７４】
前記直列型又は多量体集合体において、前記断片又は配列の少なくとも一部が外来性連結配列によって結合される、請求項６５に記載の方法。
【請求項７５】
前記直列型又は多量体集合体において、前記断片又は配列の少なくとも一部が、構造支持要素からなる、又は構造支持要素を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７６】
配座エピトープの少なくとも一部が、前記直列型又は多量体集合体中に存在する断片又は模倣配列の近接の結果として形成される、請求項６５に記載の方法。
【請求項７７】
配座エピトープの少なくとも一部が、前記直列型又は多量体集合体中の構造支持要素の存在の結果として形成される、請求項６５に記載の方法。
【請求項７８】
前記構造支持要素が、１個以上のタンパク質ファミリーに特有なモチーフである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記構造支持要素が、ヘリックスバンドル、βシート構造、三葉構造、膜貫通ヘリックス及び細胞外ループからなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記抗体ライブラリーが抗体断片を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項８１】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ及び（ｓｃＦｖ）２断片、抗体断片から形成される線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、二重特異性抗体及び多重特異性抗体からなる群から選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記抗体断片がｓｃＦｖ断片である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記物理的に選択可能なディスプレイが細菌細胞又は胞子ディスプレイである、請求項６５に記載の方法。
【請求項８４】
前記細菌ディスプレイ系がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子ディスプレイである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
抗体ライブラリーがファージライブラリーであり、物理的に選択可能なディスプレイが胞子ディスプレイ又はファージディスプレイである、請求項６５に記載の方法。
【請求項８６】
胞子ディスプレイがＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子ディスプレイである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
配座エピトープが、遺伝子断片の直列型又は多量体集合体の発現によって得られる、請求項６５に記載の方法。
【請求項８８】
遺伝子断片が、生物学的に関連する標的源から生じる、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記生物学的に関連する標的源が、細胞、組織、器官及び生物体からなる群から選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記生物学的に関連する標的源が、幹細胞、活性化された免疫細胞、患部組織、器官及び病的生物体からなる群から選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
遺伝子断片の少なくとも一部が、生物学的に関連する標的源における遺伝子発現データの分析によって特定される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列によって分離された、抗体又は抗体断片をコードするヌクレオチド配列と前記抗体又は抗体断片のリガンドをコードするヌクレオチド配列とを含む、核酸分子。
【請求項９３】
請求項９２に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項９４】
請求項９３に記載のベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項９５】
真核生物又は原核生物宿主細胞である、請求項９４に記載の宿主細胞。
【請求項９６】
細菌、ほ乳動物又は酵母細胞である、請求項９５に記載の宿主細胞。
【請求項９７】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項９５に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配座的に束縛されたポリペプチド配列のコンビナトリアルライブラリー、及びその使用に関する。特に、本発明は、配座エピトープのコンビナトリアルライブラリー、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体の結合部位を規定する必要性から、エピトープライブラリーが開発された。すなわち、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ（非特許文献１）は、バクテリオファージ発現ベクターを開発し、それを使用して、短鎖ペプチド配列をその表面に表示するバクテリオファージの大規模なコレクションを構築することができた。次いで、例えば、非特許文献１（上掲）、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５に記載のように、外来エピトープを表示するファージをバイオパニングによって精製することができた。続いて、この技術を拡張して、エピトープライブラリーのバイオパニングによって抗体に対するペプチドリガンドを特定した。エピトープライブラリーは、例えば、ワクチン開発やエピトープマッピングに使用することができた（非特許文献６）。
【０００３】
エピトープライブラリーのバイオパニングの公知手法によって、天然タンパク質配列内には存在しないが、天然線状エピトープを模倣する、短鎖（通常、最高約６個のアミノ酸）線状エピトープ配列、又はペプチド配列を特定した。しかし、線状エピトープは、不連続又は配座エピトープの断片であり、線状エピトープがその一部である配座エピトープよりも機能的能力が低い。したがって、配座エピトープを表示することが望ましく、又は構造支持要素の近接若しくは存在のために配座をとる、若しくは配座に近似する、不連続エピトープを近位に配置することによって、配座エピトープの本質的な諸性質を模倣することが望ましい。かかる配座エピトープライブラリーは、すべての配座エピトープの物理的に選択可能なディスプレイを含むことができ、すべての配座エピトープに対する抗体の選択に使用することができ、多数の更なる利点及び用途（ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ）を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｐａｒｍｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｇｅｎｅ  ７３：３０５  ３１８（１９８８）
【非特許文献２】Ｃｗｉｒｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：６３７８  ６３８２（１９９０）
【非特許文献３】Ｓｃｏｔｔ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６  ３９０（１９９０）
【非特許文献４】Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２７：７１１  ７１８（１９９２）
【非特許文献５】Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｓｃｏｔｔ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１７：２２８  ２５７（１９９３）
【非特許文献６】Ｓｃｏｔｔ，  Ｊ．Ｋ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  １７：２４１  ２４５（１９９２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、不連続エピトープの近位配置、及び／又は構造支持要素の使用によって、配座エピトープの本質的諸性質を再生することができるという認識、並びに類似の手法を拡張して、受容体のリガンド結合領域、酵素の基質結合領域などのタンパク質の他の３次元構造的又は機能的要素を再生することができるという認識に少なくとも部分的に基づく。
【０００６】
したがって、一態様においては、本発明は、１個以上の未変性若しくは変種ポリペプチドの離散的若しくは無秩序な断片の、又はかかる断片を模倣した配列の、直列型又は多量体集合体を含む物理的に選択可能なディスプレイであって、集合体の少なくとも一部が、配座的に束縛されたポリペプチド標的を形成し、断片の少なくとも一部が抗体断片以外である、物理的に選択可能なディスプレイに関する。
【０００７】
別の一態様においては、本発明は、
（ａ）１個以上の未変性若しくは変種ポリペプチドの離散的若しくは無秩序な断片の、又はかかる断片を模倣した配列の、直列型又は多量体集合体を含む物理的に選択可能なディスプレイであって、かかる集合体の少なくとも一部が、配座的に束縛されたポリペプチド標的を形成し、断片の少なくとも一部が抗体断片以外である、物理的に選択可能なディスプレイを用意すること、
（ｂ）互いに結合親和性を有する配座的に束縛されたポリペプチド標的と結合相手候補が標的−結合相手コンプレックスを形成する条件下で、ディスプレイを結合相手候補のライブラリーと接触させること、及び
（ｃ）形成された標的−結合相手コンプレックスの少なくとも一部を検出すること
を含む、スクリーニング方法に関する。
【０００８】
一実施形態においては、方法は、（ｄ）検出された標的−結合相手コンプレックスの少なくとも一部の形成に関与する標的配列を特定する追加のステップを含み得る。
【０００９】
別の一実施形態においては、検出されたすべての標的−結合相手コンプレックスの形成に関与する標的配列が特定される。
【００１０】
更に別の一実施形態においては、結合相手候補は、抗体、抗体断片又は抗体模倣物である。
【００１１】
更なる一実施形態においては、標的−結合相手コンプレックスの少なくとも一部の形成に関与する抗体、抗体断片又は抗体模倣配列が更に特定される。
【００１２】
更なる一実施形態においては、上記方法は、標的−結合相手コンプレックスの少なくとも一部の形成に関与する標的配列及び抗体、抗体断片又は抗体模倣配列をステップ（ｄ）の前に濃縮及び分離するステップを更に含む。
【００１３】
更なる一実施形態においては、方法は、濃縮及び分離に続いて、ステップ（ｄ）の前に、標的−結合相手コンプレックスの少なくとも一部の形成に関与する標的配列及び抗体、抗体断片又は抗体模倣配列を個別に回収するステップを更に含む。
【００１４】
異なる一実施形態においては、標的−結合相手コンプレックスの少なくとも一部の形成に関与する標的配列は、配座エピトープの一部である。
【００１５】
更に別の一態様においては、本発明は、
（ａ）１個以上の未変性若しくは変種ポリペプチドの離散的若しくは無秩序な断片の、又はかかる断片を模倣した配列の、直列型又は多量体集合体を含む物理的に選択可能なディスプレイであって、集合体の少なくとも一部が配座エピトープを形成する、物理的に選択可能なディスプレイを用意すること、
（ｂ）互いに結合親和性を有する配座エピトープと抗体ライブラリーのメンバーとが配座エピトープ−抗体コンプレックスを形成する条件下で、ディスプレイを抗体ライブラリーと接触させること、及び
（ｃ）形成された配座エピトープ−抗体コンプレックスの少なくとも一部を検出すること
を含む、方法に関する。
【００１６】
特定の一実施形態においては、配座エピトープは、遺伝子断片又はその模倣物の直列型又は多量体集合体の発現によって得られる。
【００１７】
別の一実施形態においては、遺伝子断片は、生物学的に関連する標的源から生じ、生物学的に関連する標的源は、例えば、細胞、組織、器官及び生物体からなる群から選択され得る。別の生物学的に関連する源としては、幹細胞、活性化された免疫細胞、患部組織、器官及び病的生物体が挙げられる。
【００１８】
更なる一実施形態においては、遺伝子断片の少なくとも一部は、生物学的に関連する標的源における遺伝子発現データの分析によって特定される。
【００１９】
以下の具体的実施形態は、本発明のすべての態様に適用される。
【００２０】
すべての態様においては、好ましい物理的に選択可能なディスプレイは配座エピトープライブラリーである。
【００２１】
種々の実施形態においては、ディスプレイは、１個を超える未変性若しくは変種ポリペプチドの離散的若しくは無秩序な断片の、又はかかる断片を模倣した配列の、直列型又は多量体集合体を含み得る。
【００２２】
別の実施形態においては、直列型又は多量体集合体の少なくとも一部は、同じポリペプチドの異なる部分に由来する２個以上の配列を含み、これらの配列は細胞内配列を含み得る。特定の一実施形態においては、直列型又は多量体集合体の各々は、同じポリペプチドの異なる部分に由来する２個以上の配列を含み、これらの配列は細胞内配列を含み得る。
【００２３】
更なる一実施形態においては、直列型又は多量体集合体は、抗体又は抗体断片、及び抗体又は抗体断片のリガンドを含む。
【００２４】
更なる実施形態においては、直列型又は多量体集合体において、断片又は模倣配列の少なくとも一部は互いに直接融合する。
【００２５】
異なる実施形態においては、直列型又は多量体集合体において、断片又は模倣配列の少なくとも一部は外来性連結配列によって結合される。
【００２６】
更なる実施形態においては、直列型又は多量体集合体において、断片又は模倣配列の少なくとも一部は、構造支持要素からなり、又は構造支持要素を含み、構造支持要素は、例えば、ヘリックスバンドル、βシート構造、三葉（ｔｒｉｆｏｉｌ）構造、膜貫通ヘリックス、細胞外ループなどの１個以上のタンパク質ファミリーに特有なモチーフであり得る。
【００２７】
別の一実施形態においては、配座的に束縛されたポリペプチド標的の少なくとも一部は、前記直列型又は多量体集合体中に存在する断片の近接の結果として形成される。
【００２８】
それとは別に、又はそれに加えて、配座的に束縛されたポリペプチド標的の少なくとも一部は、前記直列型又は多量体集合体中の構造支持要素の存在の結果として形成され得る。
【００２９】
すべての態様においては、配座的に束縛されたポリペプチド標的及び／又は結合相手候補は、例えば、バクテリオファージ、ほ乳動物、酵母、細菌細胞及び胞子ディスプレイ系、リボソーム、ｍＲＮＡ及びＤＮＡディスプレイなど、ウイルス、真核生物及び細菌及び生体外ディスプレイ系を含めて、ただしこれらだけに限定されない適切なディスプレイ系を用いて表示され得る。特定の一実施形態においては、胞子ディスプレイ系は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子ディスプレイである。
【００３０】
すべての態様においては、抗体断片は、これらだけに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２及びｄＡｂ断片、抗体断片から形成される線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、二重特異性抗体又は多重特異性抗体であり得、抗体模倣物は、例えば、Ａｆｆｉｂｏｄｙ又はアプタマーであり得る。
【００３１】
本発明は、さらに、適切なコード配列、ベクター及び組換え宿主細胞を含めて、ただしこれらだけに限定されない、本明細書における物理的に選択可能なディスプレイを作製する方法及び手段に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明のディスプレイにおいて配座エピトープを提示する２つの手法を示す図である。第１の手法（タイプＩ）においては、２個のポリペプチド断片は、柔軟なリンカーによって連結され、ディスプレイ媒体に繋留される。この場合、配座エピトープの形成は、柔軟な連結リンカーの結果として、２個の断片の近接、及び折りたたみ性（ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｆｏｌｄ）によって促進される。第２の手法（タイプＩＩ）においては、２個のポリペプチド断片は、構造足場によって連結され、ディスプレイ媒体に繋留され、配座エピトープの形成は、構造足場によって促進される。
【図２】配座エピトープと抗体ライブラリーの同時選択方法を示す図である。配座エピトープライブラリーは胞子ディスプレイを用いて提示され、抗体ライブラリーはファージミドライブラリーである。
【図３】エリスロポイエチン（ＥＰＯ）及び／又はトロンボポイエチン（ＴＰＯ）の配座エピトープの提示に使用することができる、ＥＰＯ交差ループ、ＴＰＯ交差ループ及びＥＰＯ／ＴＰＯ  Ｃ−Ｄ交差ループキメラ構築物を示す図である。
【図４】図３に示したＥＰＯ／ＴＰＯ  Ｃ−Ｄ交差ループキメラ構築物を用いた、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）に対する配座エピトープ特異的抗体の特定、続いてやはり図３に示した未変性ＴＰＯ交差ループ上の選択を示す図である。
【図５】繋留された抗原−抗体ディスプレイを用いた、配座エピトープのリガンド誘導性安定化を示す図である。
【図６】配座エピトープと抗体ライブラリーの同時選択方法を示す図である。両方のライブラリーは、ファージディスプレイを用いて提示される。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
Ａ．  定義
特に断らない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  １９９４）は、本願で使用する用語の多くに対する一般的指針を当業者に提供する。
【００３４】
当業者は、本発明の実施において使用することができる、本明細書に記載の方法及び材料と類似した、又は等価である、多数の方法及び材料を認識するはずである。実際、本発明は、記載の方法及び材料に決して限定されない。本発明では、下記の用語を以下で定義する。
【００３５】
本明細書では「エピトープ」という用語は、配列に応じて生成される抗体に単独で、又はより大きい配列の一部として、結合する配列を規定する、少なくとも約３から５、好ましくは少なくとも約５から１０、又は少なくとも約５から１５個のアミノ酸、典型的には約５００以下又は約１，０００個のアミノ酸の配列を指す。エピトープは、エピトープが由来する親タンパク質の部分と同一である配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、ウイルスゲノムは、常時変化した状態にあり、単離体間で比較的高度の多様性を示す。すなわち、「エピトープ」という用語は、未変性配列と同一である配列、並びに未変性配列における欠損、置換及び／又は挿入などの修飾を包含する。一般に、かかる修飾は、本質的に保存的であるが、非保存的修飾も企図される。この用語は、具体的には、「ミモトープ」、すなわち連続線状未変性配列を識別しないが、又は未変性タンパク質中に必ずしも存在しないが、未変性タンパク質上のエピトープを機能的に模倣する配列を含む。「エピトープ」という用語は、具体的には、線状及び配座エピトープを含む。
【００３６】
本明細書では「配座エピトープ」という用語は、適切に折りたたまれた完全長未変性タンパク質中の対応する配列の構造的特徴を有するタンパク質の不連続部分によって形成されるエピトープを指す。エピトープを規定する配列（配座エピトープを構成する不連続部分を含む配列）の長さは、これらのエピトープがタンパク質の３次元構造によって形成されるので、大きく変動し得る。したがって、エピトープを規定するアミノ酸は、比較的少なく、分子の長さ方向に広く分散し、折りたたみによって正しいエピトープ配座をとることができる。エピトープを規定する残基間のタンパク質部分は、エピトープの配座構造に重要でない場合もある。例えば、これらの介在配列の欠損又は置換は、エピトープ配座に重要である配列が維持されるのであれば、配座エピトープに影響を及ぼさないことがある。したがって、本明細書では「配座エピトープ」は、未変性配座エピトープと同一である必要はないが、未変性配座エピトープの（定性的な抗体結合性などの）本質的諸性質を再生する（示す）配座的に束縛された構造を含む。
【００３７】
「線状エピトープ」は、不連続又は配座エピトープの断片である。
【００３８】
エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術を用いて特定することができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ６６  （Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｅｄ．，  １９９６）  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．を参照されたい。
【００３９】
「配座的に束縛されたポリペプチド標的」という句は、適切に折りたたまれた完全長未変性タンパク質中の対応する配列の構造的特徴を有する、タンパク質の不連続部分、又は未変性タンパク質中に存在しない人工配列によって、形成される結合性配列を指す。この用語は、具体的には、配座エピトープを含み、受容体、酵素及び他のタンパク質の結合領域（ポケット）を模倣した配列を含めて、かかる結合領域も含む。すべての場合において、配座的に束縛されたポリペプチド標的を規定する配列は、これらの配座的に束縛された結合領域がタンパク質の３次元構造によって形成されるので、大きく変動し得る。したがって、配座的に束縛されたポリペプチド標的を規定するアミノ酸は、比較的少なく、分子の長さ方向に広く分散し、折りたたみによって正しい配座をとることができる。結合領域を規定する残基間のタンパク質部分は、配座構造に重要でない場合もある。例えば、これらの介在配列の欠損又は置換は、適切な配座に重要である配列が維持されるのであれば、配座的結合領域に影響を及ぼさないことがある。したがって、本明細書では「配座的に束縛されたポリペプチド標的」は、未変性タンパク質中に存在する構造要素と同一である必要はないが、かかる未変性構造の（結合性などの）本質的諸性質を再生する（示す）配座的に束縛された構造を含む。
【００４０】
「結合相手」又は「複数の結合相手」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、生体外及び／又は生体内条件下で、共有結合又は非共有結合性会合によって互いに結合することができる２個以上のポリペプチド配列を指す。かかる結合相手の例としては、抗体と抗原、リガンドと受容体、酵素と基質、リガンド結合抗体とかかるリガンド結合抗体を認識する抗免疫グロブリン抗体、抗イディオタイプ抗体とそれに結合する抗体が挙げられるが、これらだけに限定されない。これらの結合相手は、該結合相手が天然に存在する、又は導入された、細胞、組織、器官又は生物体から単離することができ、又はその一部であり得る。結合は、２個を超える結合相手の会合によって起こり得る。
【００４１】
「結合相手コンプレックス」又は「標的−結合相手コンプレックス」とは、特異的に検出可能な様式で互いに結合する、標的と標的に結合する分子など、（上で定義した）２個以上の結合相手の会合を意味し、したがって、例えば、リガンドと受容体、抗体と抗原、酵素と基質、抗体と抗イディオタイプ抗体、リガンド結合抗体とそれに結合する抗体の会合を意味する。
【００４２】
「固体支持体」という用語は、標的とその結合相手候補及び標的−結合相手コンプレックスが連結され得る不溶性マトリックスを指すのに本明細書では使用される。典型的には、固体支持体は、本質的に、細胞、胞子、ウイルス粒子、バクテリオファージ粒子など、ただしこれらだけに限定されない生物である。
【００４３】
「複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」、「複合型（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」及び「複合化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）」という用語は、共有又は非共有結合の任意及びすべての形態を指し、直接の遺伝子又は化学融合、リンカー又は架橋剤を介したカップリング、及び例えばロイシンジッパーを用いた、非共有結合性会合体（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）を含むが、これらだけに限定されない。
【００４４】
「直列型又は多量体集合体」、「直列型集合体」及び「多量体集合体」という用語は、最も広い意味で使用され、（上で定義した）複合化又はコンプレックス形成を含めて、任意の手段によって互いに会合した２個以上のポリペプチド断片を指す。ここで、「断片」は、未変性ポリペプチドの部分と同一であり得、及び／又は未変性ポリペプチド標的中に存在しない人工配列であり得る。「直列型集合体」とは２個の断片の会合を指し、「多量体集合体」とは２個を超える断片の会合を指す。
【００４５】
「融合」という用語は、１本のポリペプチド鎖中の異なる起源のアミノ酸配列の、それらのコードヌクレオチド配列のインフレームの組合せによる、組合せを指すのに本明細書では使用される。「融合」という用語は、その末端の１つとの融合に加えて、内部の融合、すなわち、ポリペプチド鎖内の異なる起源の配列の挿入を明示的に包含する。
【００４６】
本明細書では「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語はすべて、共有結合性「ペプチド結合」によって連結されたアミノ酸の一次配列を指す。一般に、ペプチドは、少数のアミノ酸、典型的には約２から約５０個のアミノ酸からなり、タンパク質よりも短い。本明細書では「ポリペプチド」という用語は、ペプチド及びタンパク質を包含する。
【００４７】
本発明の状況において「抗体」（Ａｂ）という用語は、最も広い意味で使用され、特異抗原、並びに免疫グロブリン、及び抗原特異性を欠く他の抗体様分子に対して結合特異性を示すポリペプチドを含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで産生され、骨髄腫によって高レベルで産生される。本願では「抗体」という用語は、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び抗体断片を含むが、これらだけに限定されない。
【００４８】
「未変性抗体」は、通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖と２本の同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、ジスルフィド結合数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。各重鎖及び軽鎖は、規則的に間隔をおいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続く幾つかの定常ドメインを一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと並び、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並ぶ。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの界面を形成すると考えられる（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８６：６５１（１９８５）、Ｎｏｖｏｔｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８２：４５９２（１９８５））。
【００４９】
抗体鎖に関連した「可変」という用語は、抗体間で配列が大きく異なり、その特定の抗原に対する特定の各抗体の結合及び特異性に関与する、抗体鎖の部分を指すのに使用される。かかる可変性は、いずれも軽鎖及び重鎖可変ドメイン中の超可変領域と称する３個のセグメントに集中する。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。未変性重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、４個のＦＲ（それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を各々含み、４個のＦＲは、主としてβシート形状をとり、３個の超可変領域によって連結される。３個の超可変領域は、βシート構造を連結するループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖の超可変領域は、他方の鎖の超可変領域と一緒に、ＦＲによって近位に共に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１），  ｐａｇｅｓ  ６４７−６６９参照）。定常ドメインは、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
【００５０】
本明細書では「超可変領域」という用語は、抗原結合性を担う、抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」、すなわち「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含む（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基３０−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）及び８６−９６（Ｌ３）、並びに重鎖可変ドメイン中の３０−３５（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）及び９３−１０１（Ｈ３）（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ，．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９６）。
【００５１】
「フレームワーク領域」という用語は、より異なる（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）ＣＤＲ領域間に存在する、当分野で認められた抗体可変領域の部分を指す。かかるフレームワーク領域は、典型的には、フレームワーク１から４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）と称され、ＣＤＲが抗原結合性表面を形成できるように、重鎖又は軽鎖抗体可変領域中に存在する３個のＣＤＲを３次元空間に保持する足場を提供する。
【００５２】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体は、異なるクラスに帰属させることができる。５つの主要な抗体クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、その幾つかはサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に更に分割することができる。
【００５３】
異なる免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
【００５４】
任意の脊椎動物種に由来する抗体の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプの１つに帰属させることができる。
【００５５】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般に抗原結合又はその可変ドメインを含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、抗体断片から形成される線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、二重特異性抗体、多重特異性抗体、並びに一般に、ポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００５６】
「モノクローナル抗体」という用語は、Ｂ細胞の単一クローンによって合成される抗体分子を指すのに使用される。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特性を示し、任意の特別な方法による抗体の生成を要すると解釈すべきではない。したがって、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：５１１（１９７６）によって最初に記述されたハイブリドーマ法によって作製することができ、組換えＤＮＡ技術によって作製することができ、又はファージ若しくは別の抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００５７】
「ポリクローナル抗体」という用語は、Ｂ細胞集団によって合成された抗体分子集団を指すのに使用される。
【００５８】
「単鎖Ｆｖ」、すなわち「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする、ＶＨドメインとＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｖｏｌ．  １１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。単鎖抗体は、例えば、国際公開第８８／０６６３０号及び同９２／０１０４７号に開示されている。
【００５９】
二重特異性抗体は、ＶＨドメインとＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、短かすぎて同じ鎖上でのこれら２個のドメインの対形成が不可能であるリンカーを用いることによって、これらのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２個の抗原結合部位を生成させた、二価の二重特異的な抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４  ６４４８（１９９３）、及びＰｏｌｊａｋ，  Ｒ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１  １１２３（１９９４）参照）。
【００６０】
「ミニボディ」という用語は、８０ｋＤａの二価の二量体（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２に自己組織化するｓｃＦｖ−ＣＨ３融合タンパク質を指すのに使用される。
【００６１】
「アプタマー」という用語は、タンパク質標的に高い特異性及び親和性で結合する合成核酸リガンドを指すのに本明細書では使用する。アプタマーは、タンパク質機能の強力な阻害剤として公知である。
【００６２】
「Ａｆｆｉｂｏｄｙ」という用語は、ブドウ球菌性プロテインＡに由来するＺドメインの３ヘリックス足場に典型的には基づく、操作された標的特異的非免疫グロブリン結合タンパク質を指すのに使用される。５８アミノ酸Ｚドメインは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロテインＡ（ＳＰＡ）中の５個の相同ドメイン中の１個（Ｂドメイン）に由来する。ＳＰＡは、免疫グロブリンのＦｃ領域に強く結合する。Ｚは、ＩｇＧ含有樹脂を用いることによって組換えタンパク質の親和性精製のための安定化遺伝子融合相手として最初は開発された。ＳＰＡのＢドメインとＦｃ断片のコンプレックスの構造によれば、結合性表面はヘリックス１及び２上に露出した残基からなるのに対して、ヘリックス３は結合に直接関与しない。Ａｆｆｉｂｏｄｙは、通常、ヘリックス１及び２のＦｃ結合性表面における典型的には１３個の残基が無作為化されたコンビナトリアルライブラリーから選択される。次いで、タンパク質を標的にした特異的結合剤は、所望の標的に対するファージディスプレイライブラリーのバイオパニングによって特定される。かかるＡｆｆｉｂｏｄｙは、種々の生化学アッセイ及び臨床応用において、免疫グロブリンの代替として使用することができる。
【００６３】
ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４  ５４６（１９８９））は、ＶＨドメインからなる。
【００６４】
１個以上のＣＤＲは、分子に共有結合的又は非共有結合的に組み込まれて、分子を「イムノアドヘシン」にすることができる。イムノアドヘシンは、より大きいポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲを取り込むことができ、ＣＤＲを別のポリペプチド鎖に共有結合的に連結することができ、又はＣＤＲを非共有結合的に取り込むことができる。ＣＤＲによって、イムノアドヘシンは特定の目的抗原に特異的に結合することができる。
【００６５】
本明細書では「抗体結合領域」という用語は、抗原に結合可能である、免疫グロブリン又は抗体可変領域の１個以上の部分を指す。典型的には、抗体結合領域は、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体軽鎖（ＶＬ）（又はその可変領域）、抗体重鎖（ＶＨ）（又はその可変領域）、重鎖Ｆｄ領域、組合せ抗体軽鎖及び重鎖（又はその可変領域）、又は完全長抗体、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ若しくはＩｇＭ抗体である。
【００６６】
「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」という用語は、典型的には、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択されるアミノ酸など、その分野で認められた定義を有するアミノ酸を指す。ただし、修飾、合成又は希少アミノ酸を所望のとおりに使用することができる。したがって、３７  ＣＦＲ  １．８２２（ｂ）（４）に記載の修飾及び異常アミノ酸は、この定義に具体的に含まれ、参照により本明細書に明確に援用される。アミノ酸は、種々の亜群に細分することができる。すなわち、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）、負に帯電した側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、正に帯電した側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）、又は無電荷の極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ及びＴｙｒ）を有するとして分類することができる。アミノ酸は、低分子アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ）、求核性アミノ酸（Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ）、疎水性アミノ酸（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、アミド（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）及び塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）として分類することもできる。
【００６７】
「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、その類似体（例えば、ヌクレオチド類似体又は核酸化学反応を用いて作製される、ＤＮＡ又はＲＮＡ）などの核酸を指す。所望のとおりに、ポリヌクレオチドは、例えば当分野で認められた核酸化学反応を用いて、合成的に作製することができ、又は例えばポリメラーゼを用いて、酵素的に作製することができ、必要に応じて修飾することができる。典型的な修飾としては、メチル化、ビオチン化、及び当分野で公知の他の修飾が挙げられる。また、核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよく、所望であれば、検出可能な成分と連結することができる。
【００６８】
「変異誘発」という用語は、別段の記載がない限り、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を変更する当分野で認められた任意の技術を指す。変異誘発の好ましいタイプとしては、誤りがちなＰＣＲ変異誘発、飽和変異誘発、又は他の部位特異的変異誘発が挙げられる。「ベクター」という用語は、細胞中で自己複製可能であり、ＤＮＡセグメント、例えば遺伝子又はポリヌクレオチドが、付着したセグメントが複製されるように作用可能に結合することができる、ｒＤＮＡ分子を指すのに使用される。１個以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を誘導可能なベクターを本明細書では「発現ベクター」と称する。「制御配列」という用語は、特定の宿主生物において作動可能に結合したコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物に適切な制御配列としては、プロモーターが挙げられ、場合によってはオペレーター配列及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００６９】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係にあるときに、「作動可能に結合」している。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に結合している。プロモーター又はエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に結合している。又は、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置する場合、コード配列に作動可能に結合している。一般に、「作動可能に結合した」とは、結合したＤＮＡ配列が隣接すること、また、分泌リーダーの場合、隣接し、読み相（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接されなくともよい。結合は、好都合な制限酵素切断部位における連結によってなされる。かかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを慣例的実務に従って使用する。
【００７０】
アミノ酸配列同一率は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用いて決定することができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードすることができ、又はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから入手することができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は、幾つかの検索パラメータを使用し、検索パラメータのすべては、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝ｙｅｓ、ｓｔｒａｎｄ＝ａｌｌ、ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓ＝１０、ｍｉｎｉｍｕｍ  ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｌｅｎｇｔｈ＝１５／５、ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ  ｅ−ｖａｌｕｅ＝０．０１、ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ＝２５、ｄｒｏｐｏｆｆ  ｆｏｒ  ｆｉｎａｌ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝２５、及びｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含めて、デフォルト値に設定される。
【００７１】
「ロイシンジッパー」という用語は、幾つかのタンパク質中に保存ドメインとして存在する４又は５個のロイシン残基を典型的には含む、７残基繰り返しモチーフを指すのに使用される。ロイシンジッパーは、短い平行らせんコイルとして折りたたまれ、ロイシンジッパーがドメインを形成するタンパク質のオリゴマー化の原因であると考えられる。
【００７２】
「マイクロアレイ」という用語は、基質上のポリヌクレオチドプローブなどのハイブリッド形成可能なアレイ要素の規則正しい配列を指す。
【００７３】
「遺伝子増幅」という句は、遺伝子又は遺伝子断片の複数の複製物が特定の細胞又は細胞系において形成されるプロセスを指す。複製領域（増幅されたＤＮＡの１配列）は、しばしば「アンプリコン」と称される。通常、生成するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）量、すなわち、遺伝子発現レベルは、発現される特定の遺伝子でできた複製物の数の比率も増加する。
【００７４】
Ｂ．  詳細な説明
本発明の方法を実施するための技術は当分野で周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９７）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ｅｄｓ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１、Ｏ’Ｂｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，  Ｈｉｃｋｌｅ  ａｎｄ  Ｆｉｔｃｈ，  ｅｄｓ．，  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９９０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：  ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ，  Ｔ．Ｒ．  Ｇｌａｒｅ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，  ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  ２０００、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１、及びＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｇ．  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，  ｅｄ．，  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ，  ２００４を含めて、標準の実験室の教科書に記載されている。変異誘発は、例えば、部位特異的変異誘発によって実施することができる（Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５））。ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４，６８３，１９２号、同４，６８３，２０２号、同４，８００，１５９号及び同４，９６５，１８８号、並びに”ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，  Ｈ．  Ｅｒｌｉｃｈ，  ｅｄ．，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、及びＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．（１９９０）を含めて、幾つかの教科書に記載されている。
【００７５】
本発明は、配座エピトープライブラリーなどの配座的に束縛されたポリペプチド標的の物理的に選択可能なディスプレイに関する。本発明によれば、未変性ポリペプチドの離散的若しくは無秩序な断片の、又はかかる断片を模倣した配列の、直列型又は多量体集合体は、選択可能な様式で表示され、結合相手候補のライブラリーを用いてスクリーニングされる。その断片若しくは配列の近接のために、及び／又は構造支持要素の存在のために、配座エピトープなど、３次元構造要素の一部である、直列型又は多量体集合体中に存在する断片は、配座的に束縛された適切な３次元構造をとり、配座エピトープなどの当該構造要素の本質的諸性質を再現する。次いで、配座的に束縛された構造は、結合相手候補を用いてスクリーニングされ、同定される。したがって、配座エピトープは、ポリペプチド断片の直列型又は多量体集合体の選択可能なディスプレイを抗体ライブラリーを用いてスクリーニングし、対応する標的−抗体コレクションを選択することによって、特定することができる。こうして、すべてのタンパク質のすべての可能な配座エピトープに対して抗体を作製することができる。より一般的な一態様においては、この手法は、配座的に束縛されたポリペプチド構造と抗体、足場、タンパク質、ペプチドなどの結合相手との同時選択に適切である。
【００７６】
したがって、本発明は、発現可能な遺伝子断片の直列型又は多量体集合体のクローニング、及び抗体ライブラリーなどの結合相手候補のライブラリーに対するクローン化された集合体のコレクションのスクリーニングを含む。次いで、対応する標的と結合相手（例えば、抗体）のコレクションを濃縮及び分離し、標的と結合（例えば、抗体）の各配列を個別に回収し、配列を決定する。
【００７７】
第一ステップでは、２個以上のｃＤＮＡ断片を、標準クローニングスキームによって、発現ベクターの２個以上のクローニング部位に逐次的にクローン化する。クローニング部位は、遊離アミノ又はカルボキシ末端及び束縛されたループを提示可能な足場上に存在する合成リンカーによって分離される場合もあれば、互いに直接融合する場合もある。配座断片提示の２つの代表例を図１に示し、実施例１に記載する。
【００７８】
特定の一実施形態においては、直列型又は多量体集合体に関与する断片は、互いに直接融合し、融合ポリペプチド配列をコードする核酸の発現によって生成される。或いは、コード配列は、直列型又は多量体断片が外来配列によって連結されたポリペプチドの発現をもたらす、外来性の発現可能な配列によって連結され得る。発現可能な配列としては、断片が所望の配座をとることができるように、柔軟性を与え、連結された断片の運動を許容する十分な長さであるが、断片を近位に連結し続けるのに十分な短さであり、その結果、配座の変化を誘発することができる、ペプチドリンカーが挙げられる。かかるリンカーは、通常、約３から約２５残基長、又は約５から約２０残基長、又は約８から約１５残基長、又は約１０から約１５残基長であるが、連結される断片の性質に応じて、より長いリンカーを使用することもできる。
【００７９】
別の一実施形態においては、直列型又は多量体集合体に関与する少なくとも１個の断片は、構造的に束縛され、したがって、例えば、ヘリックス状若しくはβシート構造、又はのモチーフ特性、又はヘリックスバンドル、三葉構造、膜貫通ヘリックス、細胞外ループなどの、よりタンパク質ファミリーであり得る。したがって、導入された配列が最初のタンパク質の一部又は全部の配座要素を採用するように、標的タンパク質の単一の線状又は不連続配列を代替足場上に提示することができる。この手法の例を実施例３に記載する。
【００８０】
実施例３で説明し、図３及び４に示した、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）及びエリスロポイエチン（ＥＰＯ）に加えて、４個の逆平行ヘリックスバンドルを含む４ヘリックス構造は、多数のサイトカイン、かかるインターロイキン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３及びそれぞれのファミリーメンバー、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、並びに幾つかの成長因子の共通の構造足場である。１種類のサイトカインに由来する基準４ヘリックスバンドルは、別のサイトカインなどの別のヘリックスバンドルタンパク質由来のエピトープを提示するための構造足場として使用することができる。同様に、７回膜貫通受容体などの受容体由来の細胞外ループは、同じ又は異なるタンパク質由来のエピトープを表示する足場として使用することができる。この手法は、すべての公知の４ヘリックスバンドルタンパク質、又は別の明確に定義された構造モチーフの存在を特徴とするタンパク質に対する抗体の、容易な定方向の抗体選択を可能にする。或いは、これらの足場は、任意の数の標的タンパク質由来の複数のループ、単一若しくは複数のヘリックス置換、又はさらにはループとヘリックスの組合せまでも含むように、操作することができる。ひいては、可溶性単一スパンタンパク質の別の保存された構造要素を利用して、同族のスーパーファミリータンパク質内のそれらの重要な要素に対する抗体認識を与え、誘導することができる。したがって、マルチスパンＧタンパク質共役受容体の細胞外ドメインの部分は、実施例４に示すように、無関係なタンパク質足場にグラフトすることができる。
【００８１】
本発明の方法に使用することができる他の足場は、その内容全体を参照により本明細書に明確に援用する、Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（１０）：１２５７−１２６８（２００５）に記載されている。かかる足場としては、ＣＴＬＡ−４、テンダミスタット（ｔａｎｄａｍｉｓｔａｔ）、フィブロネクチン、ネオカルチノスタチン、ＣＭＢ４−２、リポカリン、Ｔ細胞受容体、プロテインＡドメインプロテインＺ）、ｌｍ９、設計されたＡＲタンパク質、ジンクフィンガー、ｐＶＩＩＩ、トリすい臓ポリペプチド、ＧＣＮ４、ＷＷドメイン、Ｓｒｃ相同領域３（ＳＨ３）、Ｓｒｃ相同領域２（ＳＨ２）、ＰＤＺドメイン、ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼ、ＧＦＰ、チオレドキシン、ブドウ球菌性ヌクレアーゼ、ＰＨＤフィンガー、Ｃｌ−２、ＢＰＴＩ、ＡＰＰＩ、ＨＰＳＴＩ、エコチン、ＬＡＣＩ−Ｄ１、ＬＤＴ−Ｉ、ＭＴＩ−ＩＩ、サソリ毒、昆虫デフェンシンＡペプチド、ＥＥＴＩ−ＩＩ、Ｍｉｎ−２３、ＣＢＤ、ＰＢＰ、チトクロムＢ５６２、Ｌｄ１受容体ドメインＡ、γクリスタリン、ユビキチン、トランスフェリン、Ｃ型レクチン様ドメイン、Ａｖｉｍｅｒｓ（Ａｖｉｄｉａ／Ａｍｇｅｎ）及びミクロプロテイン（ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）（Ａｍｕｎｉｘ）が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００８２】
直列型又は多量体断片は、単一遺伝子、分化細胞、組織、器官又は生物体を含めて、任意の公知のポリヌクレオチド源に由来し得る。したがって、例えば、特定の遺伝子に由来する無秩序な断片又は所望の断片と、同じ遺伝子の別の断片との同時発現、及びそれに続く抗体ライブラリーを用いたスクリーニングによって、所望のエピトープに対する抗体、及び単一標的のすべてのエピトープに対する抗体が得られる。この手法は、発現された遺伝子を、抗体選択のための物理的に表現されたクローンコレクションに変換し、完全長遺伝子のクローニングを不要にする戦略も提供する。
【００８３】
別の一実施形態においては、マイクロアレイ又は遺伝子増幅試験の結果を、遺伝子の発現差異（過剰又は低発現）、及び遺伝子の構造上の決定要因について分析することができる。マイクロアレイ技術の特定の一実施形態においては、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅された挿入断片を高密度アレイ中の基質に塗布する。好ましくは、少なくとも１０，０００個のヌクレオチド配列を基質に塗布する。マイクロチップ上に各１０，０００要素で固定された、マイクロアレイ化された遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適している。蛍光標識されたｃＤＮＡプローブは、対象組織から抽出されたＲＮＡの逆転写によって蛍光性ヌクレオチドを組み入れることによって、作製することができる。チップに塗布された標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットと特異的にハイブリッド形成する。非特異的に結合したプローブを厳密な洗浄によって除去した後、チップを共焦点レーザー顕微鏡法、又はＣＣＤカメラなどの別の検出方法によって、走査する。各アレイ化要素のハイブリダイゼーションの定量化によって、対応するｍＲＮＡ存在量を評価することができる。二色蛍光を用いて、２つのＲＮＡ源から作製された別々に標識されたｃＤＮＡプローブをアレイと対でハイブリッド形成させる。したがって、各指定遺伝子に対応する２つのＲＮＡ源由来の転写物の相対存在量を同時に測定する。小規模のハイブリダイゼーションによって、多数の遺伝子に対する発現パターンを簡便かつ迅速に評価することができる。かかる方法は、細胞１個当たり数個の複製物が発現される希少転写物を検出し、発現レベルの少なくとも約２倍の差を再現性良く検出するのに必要な感度を有することが示された（Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３（２）：１０６−１４９（１９９６））。マイクロアレイ分析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎＣｈｉｐ技術、Ｉｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術などの市販装置によって製造者の手順に従って実施することができる。
【００８４】
遺伝子発現の大規模分析のためのマイクロアレイ法の開発によって、癌分類の分子マーカーを系統的に探索し、種々の腫ようタイプにおいて結果を予測することが可能になる。
【００８５】
（患部組織、例えば癌組織において、同じ細胞型の正常組織よりも過剰又は低発現される決定要因などの）異なって発現される決定要因を特定した後、決定要因を、例えばペプチド合成の公知の化学的方法によって、再合成することができる。この再合成プロセスは、これらの決定要因を標準化し、膨大なコンビナトリアルクローン化可能成分を含む定方向物理ライブラリー（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ）を与えると予想される。
【００８６】
ＲＮＡ又は全ＤＮＡを標的細胞から取り出し、続いて本発明に従ってかかるＲＮＡ又はＤＮＡに由来する発現配列の直列型又は多量体集合体をスクリーニングすることによって、標的組織、器官又は生物体由来のすべてのエピトープを特定することができる。したがって、例えば、この実施形態によって、幹細胞、患部組織、活性化された免疫細胞などに由来する抗原決定基に対する抗体を特定することができる。ＲＮＡ及びＤＮＡ抽出の一般的方法は当分野で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）を含めて、分子生物学の標準的教科書に開示されている。癌生検試料などのパラフィン包埋組織からＲＮＡを抽出する方法は、例えば、Ｒｕｐｐ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋｅｒ，  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ５６：Ａ６７（１９８７）、及びＤｅ  Ａｎｄｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４（１９９５）に開示されている。特に、ＲＮＡの単離は、Ｑｉａｇｅｎなどの商業製造者から得られる精製キット、緩衝剤セット及びプロテアーゼを用いて、製造者の指示に従って実施することができる。例えば、培養細胞由来の全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラムを用いて単離することができる。他の市販ＲＮＡ単離キットとしては、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，  Ｉｎｃ．）などが挙げられる。組織試料から得られる全ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を用いて単離することができる。腫ようから調製されるＲＮＡは、例えば塩化セシウム密度勾配遠心法によって、単離することができる。
【００８７】
クローニング及び発現ベクターは、当分野で周知であり、市販されている。ベクター成分としては、一般に、シグナル配列、複製開始点、１個以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列のうちの１個以上が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００８８】
本明細書においてベクター中でＤＮＡをクローン化又は発現するのに適切な宿主細胞は、原核生物、酵母又は高等真核生物（ほ乳動物）細胞である。適切な原核生物としては、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｆｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ、並びにＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日に公表されたＤＤ２６６，７１０に開示されたＢ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ）などのＢａｃｉｌｌｉ、Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ  １７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、Ｅ  ｃｏｉｌ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）などの他の系統も適切である。これらの例は、説明のためのものであって、限定的なものではない。
【００８９】
適切な酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、又は一般的なパン酵母が挙げられる。また、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；例えば、Ｋ．  ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．  ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．  ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｋ．  ｍａｒｘｉａｎｕｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ  ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ  １８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ  ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；並びに糸状菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、及びＡ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．  ｎｉｇｅｒなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主など、幾つかの他の属、種及び系統も本明細書において一般に利用可能であり、有用である。
【００９０】
無脊椎多細胞生物の例としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉなどの宿主から得られる昆虫宿主細胞を含めて、植物及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞の移入用ウイルス株としては、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１変種、及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５系統が挙げられる。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト及びタバコの植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。
【００９１】
適切なほ乳動物宿主細胞系の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；懸濁培養増殖用にサブクローニングされたヒト胚性腎臓系２９３（２９３細胞）、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；スイギュウラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫よう（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞癌系（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００９２】
宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。市販培地としては、ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、ダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などが挙げられる。また、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．  ５８：４４（１９７９）、及びＢａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０２：２５５（１９８０）に記載の培地のいずれかを宿主細胞用培地として使用することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で以前に使用された条件であり、製造者の指示に含まれ、又は当業者に明らかである。
【００９３】
一実施形態においては、直列型又は多量体集合体を構成する両方／全部の断片が無作為に選択される。例えば、この手法を使用して、標的集団に由来するすべての発現可能なエピトープを発現させることができる。
【００９４】
先に考察したように、抗体及び他のポリペプチドを含めて、異種タンパク質を表示する系は、当分野で周知である。抗体断片は、抗体遺伝子をコードする繊維状ファージの表面で表示される（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：３８１  ３８８（１９９２）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８（６３０１）：５５２  ５５４（１９９０）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １３（１４）：３２４５−３２６０（１９９４））。抗体ライブラリーを選択及びスクリーニングする技術の総説については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３（９）：１１０５−１１１６（２００５）を参照されたい。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ａｇｔｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ８８：３７−４５（１９９０）、Ｃｈａｒｂｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ７０：１８１−１８９（１９８８）、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：２７１３−２７１７（１９９２））、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母（Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５：５５３−５５７（１９９７）、Ｋｉｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １０：１３０３−１３１０（１９９７））の表面での異種タンパク質及びその断片のディスプレイのための当分野で公知の系がある。他の公知のディスプレイ技術としては、リボソーム又はｍＲＮＡディスプレイ（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：９０２２−９０２６（１９９４）、Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：４９３７−４９４２  （１９９７））、ＤＮＡディスプレイ（Ｙｏｎｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ３１（１９）：ｅ１１８（２００３））、細菌ディスプレイなどの微生物細胞ディスプレイ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：２９−３４（１９９７））、ほ乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ（Ｉｓｔｉｃａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８３：６２９４−６３０１（２００１）、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７１：３３３７−３３４１（２００５）、及び２００６年１１月１３日に出願された同時係属中の仮特許出願第６０／８６５，５７４号）、レトロウイルスディスプレイなどのウイルスディスプレイ（Ｕｒｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３３：ｅ３５（２００５）、タンパク質−ＤＮＡ結合に基づくディスプレイ（Ｏｄｅｇｒｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ａｃａｄ．  Ｎａｔｌ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１：２８０６−２８１０（２００４）、Ｒｅｉｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３３：ｅ１０（２００５））、ミクロビーズディスプレイ（Ｓｅｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５３２：４���５−４５８（２００２））などが挙げられる。
【００９５】
本発明では、ポリペプチド断片の直列型又は多量体集合体（例えば、直列型及び／又は多量体抗原断片）は、その開示全体を参照により本明細書に明確に援用する、Ｉｓｔｉｃａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８３：６２９４−６３０１（２００１）、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７１：３３３７−３３４１（２００５）、及び２００６年１１月１３日に出願された同時係属中の仮特許出願第６０／８６５，５７４号に記載のように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子殻の成分（ＣｏｒＢ）を用いた表面ディスプレイ系、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）胞子ディスプレイを含めて、胞子ディスプレイを用いて有利に表示することができる。
【００９６】
胞子ディスプレイ系は、表示すべき配列を（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子コートタンパク質などの）コートタンパク質、又は（Ｂｔプロトキシン配列などの）毒素プロトキシンに付着させることに基づく。胞子ディスプレイ系の利点は、理想的な非反応性バックグラウンドを提供すると予想される非真核の性質の均質な粒子表面及び粒径である。また、胞子の粒径は、相互作用に基づいて、選択可能なクローン単離を可能にするフローサイトメトリーによる選択を可能にするのに十分である。
【００９７】
胞子の安定性を活用して、胞子形成後に種々の化学的、酵素的及び／又は環境的処理及び改変を実施することができる。すなわち、かかる構造が表示されるときに、構造上のヘリックス構造を、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を用いた化学処理によって安定化することができる。また、活性酸素種（例えば、ペルオキシド）又は活性窒素種（例えば、亜硝酸）を用いた処理などの酸化的ストレス処理が可能である。胞子表示ポリペプチドの明確な集団又は粗製集団を、タンパク質分解性曝露などの酵素処理、別の酵素プロセス、リン酸化に曝露することもできる。他の可能な処理としては、過酸化亜硝酸処理によるニトロシル化、組換え、精製又は血清プロテアーゼ処理によるタンパク質分解、照射、（細菌とほ乳動物の両方の）熱ショックタンパク質などの公知シャペロンとの共インキュベーション、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、プロリルイソメラーゼなどの折りたたみタンパク質による処理、凍結乾燥、及びチメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓｏｌ）処理などの防腐剤様処理が挙げられるが、これらだけに限定されない。これらの処理は、当分野で周知の方法によって実施することができる。
【００９８】
最後に、ファージ表示抗体クローンは、同族抗原を有する個々の胞子と一緒にウェルに同時捕捉することができる。これによって、多重の同時分離（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）、及び抗原−抗体対の救済が可能になる。同様に、これを拡張して、別の結合相手を選択し、救済することもできる。
【００９９】
手短に述べると、Ｂｔ胞子ディスプレイ系において、Ｂｔプロトキシン配列は、化学合成若しくは組換えＤＮＡ技術方法、又は当分野で公知の任意の他の技術によって生成された、未変性Ｂｔプロトキシンタンパク質から得ることができる。未変性Ｂｔプロトキシンタンパク質又はそのコード配列は、例えば、亜種ｋｕｒｓｔａｋｉ、ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ、ｇａｌｌｅｒｉａｅ、ｅｎｔｏｍｏｃｉｄｕｓ、ａｉｚａｗａｉ、ｍｏｒｒｉｓｏｎｉ、ｔｏｌｗｏｒｔｈｉ、ａｌｅｓｔｉ、ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓなどの種々のＢｔ亜種から単離することができる。
【０１００】
したがって、Ｂｔプロトキシン断片をコードするＤＮＡは、適切なオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを用いて、当分野で公知の方法によって、適切なＢｔ亜種の染色体からＰＣＲ増幅することができる。次いで、ＰＣＲ産物は、例えば、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）などの公知技術によって、製造者の指示に従って精製することができる。
【０１０１】
プロトキシン断片のクローニングに適切な組換え宿主細胞としては、原核生物、酵母、高等真核生物細胞などが挙げられる。クローニング及び定常的なプラスミド操作に好ましい宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【０１０２】
次いで、Ｂｔプロトキシン配列を用いて、本発明の直列型又は多量体集合体をＢｔ胞子の表面に表示する。したがって、本発明は、Ｂｔプロトキシン配列とポリペプチド配列のかかる直列型又は多量体集合体との複合体にも関する。
【０１０３】
本発明の直列型又は多量体集合体とＢｔプロトキシン配列との複合化は、好ましくはＢｔプロトキシン配列のＮ又はＣ末端などの末端における、融合によって実施することができる。或いは、適切なペプチドリンカー配列を使用して、複合体を調製することができる。
【０１０４】
配列中に存在する断片が、配座的に束縛された構造を形成することが可能である場合、リンカー配列は、表示された集合体とＢｔプロトキシン配列を、各配列が適切な配座（配座的に束縛された構造）を確実にとることができるのに十分な距離だけ分離する。リンカー配列の長さは、変動し得、一般に１から約５０アミノ酸長、より一般的には最高約１５アミノ酸長、又は最高約１０アミノ酸長、又は最高約８アミノ酸長、又は最高約７アミノ酸長、又は最高約５アミノ酸長、又は最高約３アミノ酸長である。リンカー配列は、当分野で周知の方法によって複合体に組み入れられる。
【０１０５】
表示された分子の除去を容易にするために、リンカーは、プロテアーゼなどの酵素の基質である配列を含むことができる。したがって、特定の一実施形態においては、所与のプロテアーゼの天然基質をリンカーペプチドとして使用することができ、又はリンカーペプチドに含めることができる。例えば、リンカーは、ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈウイルス（ＴＥＶ）（ＥＮＬＹＦＯＧ）の基質部位とすることができ、又は該基質部位を含むことができる。或いは、リンカーペプチドは、プロテアーゼの天然基質と異なり得るが、プロテアーゼによって切断し得る配列を含むことができる。すなわち、トリプシン様プロテアーゼはリシン及びアルギニン残基のカルボキシル側で特異的に開裂するが、キモトリプシン様プロテアーゼはチロシン、フェニルアラニン及びトリプトファン残基などにおける切断に特異的であることが知られている。
【０１０６】
プロトキシン配列と表示される直列型又は多量体集合体との結合は、ヘテロ二量体モチーフを用いて得ることができる。二量体を形成する２成分は、互いに共有結合的に会合する結合相手とすることができ、又は非共有結合性相互作用によって会合し得る結合相手とすることができる。
【０１０７】
共有結合性会合は、例えば、結合相手のシステイン間のジスルフィド結合の形成によって起こり得る。例えば、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、βメルカプトエタノール、ホスフィン、水素化ホウ素ナトリウムなど、ジスルフィド結合を分裂させる還元剤で処理することによって、ジスルフィド結合を切断し、表示された集合体を遊離させることができる。好ましくは、チオール基含有還元剤を使用する。
【０１０８】
非共有結合性会合は、例えば１対のロイシンジッパーペプチドを用いて、得ることができる。ロイシンジッパーは、幾つかのＤＮＡ結合タンパク質において最初に同定された（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：  １７５９，  １９８８）。すなわち、ロイシンジッパードメインは、タンパク質の二量体化の原因である、これら及びタンパク質中に存在する保存されたペプチドドメインを指すのに使用される用語である。ロイシンジッパードメインは、典型的には別のアミノ酸が点在する４又は５個のロイシン残基を含む、７残基繰り返しを含む。
【０１０９】
ロイシンジッパーペプチドとしては、例えば、周知のｃ−Ｊｕｎ「ロイシンジッパーペプチド」ＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＶＭＮＹ（配列番号１）及びｖ−Ｆｏｓ「ロイシンジッパーペプチド」ＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＬＥＤＫＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＦＩＬＡＡＹ（配列番号２）が挙げられる。
【０１１０】
核内癌遺伝子ｆｏｓ及びｊｕｎの産物は、ヘテロ二量体を優先的に形成するロイシンジッパードメインを含む（Ｏ’Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：６４６，  １９８９、Ｔｕｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｔｊｉａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８９，  １９８９）。
【０１１１】
ロイシンジッパーペプチドの別の例としては、酵母転写因子ＧＣＮ４、及びラット肝臓中に存在する耐熱性ＤＮＡ結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ、Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８１，  １９８９）；ネズミ癌原遺伝子の遺伝子産物ｃ−ｍｙｃ（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９，  １９８８）中に存在するドメインが挙げられるが、これらだけに限定されない。パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス及び多数のレトロウイルスを含めて、幾つかの異なるウイルスの膜融合タンパク質も、ロイシンジッパードメインを有する（Ｂｕｃｋｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗｉｌｄ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：５４７，  １９８９、Ｂｒｉｔｔｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：３９４，  １９９１、Ｄｅｌｗａｔ  ａｎｄ  Ｍｏｓｉａｌｏｓ，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ６：７０３，  １９９０）。合成配列は、安定性などの改善された性質を示すように設計することができるので、天然ロイシンジッパーペプチドに対して、合成ロイシンジッパーペプチドの使用が好ましいことが多い。
【０１１２】
本発明の融合物を作製するために、増幅されたＢｔプロトキシンＤＮＡ断片を、適切な胞子形成特異的プロモーターの制御下で、表示すべき直列型又は多量体集合体の集合体のコード配列と一緒にインフレームで適切なプラスミドにクローン化することができる。胞子形成特異的プロモーターは、Ｂｔプロトキシン断片が生ずる同じＢｔ亜種から得ることができるが、同じＢｔ亜種から得なくてもよい。
【０１１３】
プロトキシン断片に非相同なポリペプチド融合物のコード配列を含むプラスミドは、基本的にＤｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７１（６）：３３３７−３３４１（２００５）に記載されたように、Ｍａｃａｌｕｓｏ  ａｎｄ  Ｍｅｔｔｕｓ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７３：１３５３−１３５６（１９９１）の方法に従って、電気穿孔法によってＢｔに導入することができる。
【０１１４】
標的Ｂｔ系統のプラスミド形質転換後、細胞を適切な培地中で増殖させて、胞子形成を促進する。その結果、Ｂｔ胞子は、融合物中に存在する異種ペプチド又はポリペプチドの表面に表示される。
【０１１５】
毒素表示された分子複合体は胞子表面に付着するとされるが、本明細書において複合体に関与するプロトキシンは胞子殻の一部であるが、コートタンパク質ではないので、実際には、毒素成分は胞子殻内部に達する。
【０１１６】
類似の技術は、例えば、米国特許出願公開第２００２０１５０５９４号、同２００３０１６５５３８号、同２００４０１８０３４８号、同２００４０１７１０６５号及び同２００４０２５４３６４号に開示された胞子ディスプレイ系を含めて、付着が胞子コートタンパク質に対するものであるディスプレイを含めて、すべての胞子ディスプレイ系に使用することができる。
【０１１７】
抗体などの結合相手は、ファージディスプレイによって有利に表示することができる。ファージディスプレイにおいては、単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）などの異種タンパク質はファージ粒子のコートタンパク質に結合するが、異種タンパク質が発現されたＤＮＡ配列はファージ外被内に収められる。ファージディスプレイ法の詳細は、例えば、非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからのヒト抗体及び抗体断片の生体外での生成を記述したＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８，  ５５２−５５３（１９９０））に見いだすことができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３、ｆｄなどの糸状バクテリオファージの主要な又は少数のコートタンパク質遺伝子中にインフレームでクローン化され、ファージ粒子表面で機能的抗体断片として表示される。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡ複製物を含むので、抗体を機能的性質に基づいて選択すると、その性質を示す抗体をコードする遺伝子も選択される。したがって、ファージは、Ｂ細胞の諸性質の一部を模倣する。ファージディスプレイは、種々の形式で実施することができる。その総説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３，  ５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。幾つかのＶ遺伝子セグメント源をファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，  ６２４−６２８（１９９１）は、免疫マウスのひ臓に由来するＶ遺伝子の小規模無作為コンビナトリアルライブラリーから多様な抗オキサゾロン抗体を単離した。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２，  ５８１−５９７（１９９１）、又はＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２，  ７２５−７３４（１９９３）に記載の技術に基本的に従って、非免疫ヒトドナー由来のＶ遺伝子レパートリーを構築することができ、（自己抗原を含めて）多様な抗原に対する抗体を単離することができる。自然な免疫応答においては、抗体遺伝子は、変異を高速で蓄積する（体細胞超変異）。導入された変化の一部はより高い親和性を与え、それに続く抗原曝露中に、高親和性表面免疫グロブリンを示すＢ細胞が優先的に複製され、分化する。この自然プロセスは、「鎖シャフリング」として知られる技術を使用することによって模倣することができる（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．  １０，  ７７９−７８３（１９９２））。この方法では、ファージディスプレイによって得られる「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖及び軽鎖Ｖ領域遺伝子を、非免疫ドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然変種（レパートリー）のレパートリーで順次置換することによって改善することができる。この技術によって、ｎＭ範囲の親和性を有する抗体及び抗体断片を作製することができる。極めて大きなファージ抗体レパートリーを作製する戦略は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１，  ２２６５−２２６６（１９９３）によって記述された。
【０１１８】
胞子上に表示されたエピトープライブラリーと抗体ライブラリーのファージディスプレイとの同時選択を図２に示す。手短に述べると、ステップ１において、胞子表示配座エピトープライブラリーをファージミド抗体ライブラリーと結合させる。胞子を遠心分離によって収集し、結合していない抗体ファージを洗い流す。次に、マウス抗ファージ抗体及び常磁性抗マウスビーズを添加することによって、結合していない胞子を除去する。ファージ−胞子コンプレックスは磁性カラムに結合する。次いで磁性カラムを洗浄して、結合していない胞子を除去する。これらのステップに従って、ファージ−胞子コンプレックスを回収することができ、ファージを胞子から解離させることができ、ファージと胞子を選択的に増幅することができる。上記ステップを必要に応じて通常更に２から４回繰り返すことができる。ステップ３において、例えば、マウス抗ファージ抗体、及び検出可能な程度に標識された（例えば、蛍光（ｇｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ））抗マウス抗体を添加することによって、胞子を個々のマイクロプレートウェルに選別することができる。次いで、ファージを増幅し、胞子表示配列を有するｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を増殖させることができる。
【０１１９】
各々が同じ担体を用いて表示される場合、配座エピトープと抗体ライブラリーの同時選択も可能である。ファージディスプレイとして各々提示される配座エピトープと抗体ライブラリーの同時選択の例示的方法を図６に示す。ステップ１において、結合していない抗体ファージを除去する。まず、適切なタグ（例えば、ＨＡ）で標識されたファージミド配座エピトープライブラリーを、異なるタグ（例えば、ＦＬＡＧ）で標識されたファージミド抗体ライブラリーと結合させる。ＨＡエピトープファージとコンプレックス型抗体ファージを親和性精製によって分離し、結合していない抗体ファージを洗い流す。次に、コンプレックス型ファージを解離させ、エピトープ及びライブラリーファージミドプールを、例えばＥ．ｃｏｌｉを宿主として用いて、増幅する。ステップ２において、結合していないエピトープファージを除去する。まず、ＨＡタグ付きファージミド配座エピトープライブラリーをＦＬＡＧタグ付きファージミド抗体ライブラリーと再結合させ、ＦＬＡＧ抗体ファージとコンプレックス型エピトープファージを親和性精製によって分離する。結合していないエピトープファージを洗い流し、コンプレックス型ファージを解離させ、エピトープ及びライブラリーファージミドプールを、例えばＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を用いて、増幅する。
【０１２０】
本発明をある種のファージ及び胞子ディスプレイ系に関連して説明したが、本発明はそのように限定されない。ファージ及び胞子ディスプレイ系は単なる説明のためのものであって、本明細書に具体的に言及されているかどうかにかかわらず、別のディスプレイも本発明の実施に適切である。
【実施例】
【０１２１】
本発明の更なる詳細を以下の非限定的実施例に記載する。
（実施例１）
直列に組み立てられた配座ｃＤＮＡ断片（図１及び２）
すべての発現可能なエピトープを標的集団から組み立てるために、まず、標的集団由来の発現された遺伝子のコレクションを用意する。本実施例では、目標は、活性化リンパ球由来のすべての可能な配座エピトープを捕捉することであるが、本明細書に記載の方法は、あらゆる源由来の配座エピトープを捕捉するのにも同様に適切である。
【０１２２】
まず、全血をＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（商標）細胞調製管に収集することによって、末梢血単核球を３個体から単離する。次に、３個のコレクションの各々からの１ｅ７細胞を混合し、続いて６時間インキュベートして、リンパ球を活性化する。インキュベーション後、新しい組織、又はＲＮＡｌａｔｅｒで安定化された組織からＴｒｉ試薬（Ｓｉｇｍａ）によって全ＲＮＡを抽出する。続いて、単離されたドナー全ＲＮＡを、ｏｌｉｇｏｔｅｘ精製（Ｑｉａｇｅｎ）によってｍＲＮＡに更に精製する。次に、第１の鎖ｃＤＮＡ合成は、ランダム九量体オリゴヌクレオチド及び／又はオリゴ（ｄＴ）１８プライマーを用いて、ＡｃｃｕＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の手順に従って、なされる。手短に述べると、Ａｃｃｕｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ緩衝剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中のｍＲＮＡ  １００ｎｇ、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ及びランダム九量体３００ｎｇ及び又はオリゴ（ｄＴ）１８プライマー５００ｎｇを６５℃で５分間インキュベートし、続いて４℃に急冷する。次いで、１０×逆転写酵素反応緩衝剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、１００ｍＭ  ＤＴＴ、Ａｃｃｕｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ及びＲＮＡｓｅ  Ｂｌｏｃｋを添加し、４２℃で１時間インキュベートする。７０℃で１５分間加熱して、逆転写酵素を不活性化する。次いで、これらのｃＤＮＡ断片を、標準クローニングスキームによって、発現ベクターの２個の直列クローニング部位に順次クローン化することができる。直列部位は、合成リンカーによって分離され、又は遊離アミノ若しくはカルボキシ末端及び束縛されたループを提示可能な足場上に存在する。（図１、タイプＩ及びタイプＩＩ）。本実施例では、これらの発現された直列型断片は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓプロトキシンとの組換え融合の形で、胞子表面に繋留される。
【０１２３】
生成した胞子表示コレクションをコンビナトリアル抗体ライブラリーに対してスクリーニングして、活性化リンパ球配座エピトープに対して反応性であるクローンを濃縮する。スクリーニングのために、１０００万から１億個のＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子を含む１ミリリットルを１００億から１０００億個のファージと混合し、コレクションを室温で２時間インキュベートする。このインキュベーション後、胞子コレクション及び結合した抗体を遠心分離によって収集する。遠心分離によって、結合していないすべてのファージを除去し、結合していない胞子と胞子−ファージコンプレックスの両方のコレクションを得る。次に、マウスモノクローナル抗ファージ抗体、及び磁性選択の場合は抗マウス常磁性ナノ粒子（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、又はＦＡＣＳによる濃縮若しくは単離の場合は蛍光複合型抗マウス抗体と一緒に混合物をインキュベートして、胞子−ファージコンプレックスをポジティブ選択する（図２）。次いで、コンプレックスをｐＨ２．２グリシンで１０分間処理し、次いで２Ｍ  Ｔｒｉｓで中和する。この酸溶出後、抗体−抗原相互作用を不可逆的に破壊し、ファージを胞子から離れて増幅し、Ｅ．ｃｏｌｉ．及びｂａｃｉｌｌｕｓを再増殖し、選択することができる。或いは、ファージ及び胞子をコードするＤＮＡを救済し、ＰＣＲなどの別の分子生物学的技術を用いて増幅することができる。
【０１２４】
３から５回の選択後、抗体プールは、活性化リンパ球について更に試験又は選択するのに十分に濃縮されたと予想される。特異的濃縮を実証するために、個体、又は抗体クローンのプールを、可溶性抗体断片として調製し、活性化リンパ球集団を染色する能力についてフローサイトメトリーによって試験する。
【０１２５】
具体的には、抗体クローン培養物２００ｍｌをＥ．ｃｏｌｉ系統ＨＢ２１５１中で、５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１００μＭ  ＩＰＴＧを補充した２−ＹＴ中で３０℃で終夜増殖させる。この終夜増殖後、細胞を遠心分離によって収集する。周辺質に蓄積した抗体タンパク質を単離するために、細胞をまずＢＢＳ−１０Ｅ（２００ｍＭホウ酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）１０ｍｌに再懸濁させる。次に、ＢＢＳ−１０ＥＬ（２００ｍＭホウ酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム）５ｍｌを添加し、混合物をオービタルシェーカーに３７℃で６０から９０分間置く。このインキュベーション後、抗体を含む溶解物から細胞破片を遠心分離によって除去する。次に、この溶解物を親胞子と一緒にインキュベートして、同族のエピトープとの結合を検出する。具体的には、３％ＢＳＡを含むＰＢＳによって最終体積０．１ｍｌで室温で１５分間胞子をブロックする。これらのブロックされた胞子に溶解物０．１ｍｌを添加し、混合物を４℃で１時間インキュベートする。次に、ＰＢＳ  ０．８ｍｌを添加して洗浄し、次いで胞子を遠心分離によって再単離する。次いで、マウスモノクローナル抗Ｈｉｓ６抗体を使用し、４℃で３０から６０分間インキュベートして、胞子と結合した抗体を検出する。更に１回洗浄後、適切な抗マウスフィコエリトリン蛍光団複合体を用いて結合を検出する。
【０１２６】
任意の特異抗体に対する同族の抗原を伝統的プロテオミクス及び分子生物学的方法によって特定することができる。或いは、明確に特定された抗体を使用して、配座エピトープを含むその同族の胞子クローンを回収することができる。エピトープは、胞子によって運ばれるプラスミド上にコードされるので、エピトープの配列を決定し、エピトープを使用して、公的に利用可能な配列データベースから親遺伝子又は複数の親遺伝子を特定することができる。
【０１２７】
本実施例に記載のプロセスは、対象となる任意の特別な細胞集団又は組織に対してすべての可能な抗原を生成すると予想される。これらの断片は無秩序であるので、配座エピトープを評価することができるだけでなく、単一タンパク質由来、さらには複数のタンパク質由来の不連続エピトープも評価することができる。
（実施例２）
単一遺伝子配座断片
指定の抗原に対する抗体の生成においては、典型的には、免疫優性エピトープ又は複数の免疫優性エピトープに対する液性応答が見られる。多くの場合、望ましい機能的抗体は、免疫優性のより低いエピトープを認識する必要があり得る。この場合、免疫優性エピトープを抗体でブロックし、次いで再免疫又は選択しようとすることが多い。次いで、液性応答は、所望の抗体をまだ生成し得る、又は生成し得ない、次に最も接触可能なエピトープに向けられる。新しい抗体発見の目標は、機能的配座エピトープに対する抗体を生成することであるので、選択のためにかかるエピトープ（又は複数のエピトープ）を発現させることになる。単一エピトープは、線状決定要因に対する応答しか生じない場合があり、生成した抗体は未変性タンパク質を認識しない可能性がある。かかる未変性タンパク質に対する配座抗体を生成する見込みを増加させるために、このエピトープは、未変性タンパク質に近似させるために、ある重要な構造要素に関連して発現される必要がある。
【０１２８】
したがって、所望のエピトープを直列型構築物の単一部位中に合成的に組み立て、次いで、第２の部位に親タンパク質由来の断片を補充する。この第２の断片は、構造的配座触媒として役立つ。特定の一実施形態においては、第１の断片は単一配列を用いて固定され、次いで親タンパク質由来の無秩序な断片が第２の部位に挿入され、次いで第２の部位は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子コートタンパク質などのＢａｃｉｌｌｕｓ担体に組換えによって繋留される。次に、実施例１に記載のように、このコレクションをコンビナトリアル抗体ライブラリーに対してスクリーニングする。３から５回の二重選択後、この濃縮抗体コレクションを未変性タンパク質に対して対抗選択する。未変性構造を認識する結合抗体を保持し、増幅し、同定する。配座触媒作用は、関連した構造上の代替物によっても提供され得る一般的構造支持を与えると予想される。したがって、第２の部位の別の選択肢として、単一モチーフ、又は代替構造モチーフのコレクションを組み入れて、配座エピトープ形成を補完し、「触媒する」。
【０１２９】
本実施例においては、単一エピトープの強制認識を記述する。しかし、すべての可能なエピトープの発現が分離されるように、断片を無作為化することもできる。この場合、単一タンパク質に対するすべての可能なエピトープを同時にスクリーニングすることができ、それによって特定のタンパク質に対してすべての可能な抗体溶液を生成することができる。
（実施例３）
可溶性スーパーファミリー配座抗原（図３及び４）
導入された配列が最初のタンパク質の一部又は全部の配座要素を採用するように、標的タンパク質の単一の線状又は不連続配列を代替足場上に提示することができる。本実施例においては、公知の標的抗体相互作用をトロンボポイエチン（Ｔｐｏ）、４ヘリックスバンドルサイトカイン及び中和抗体の間で再現する。抗Ｔｐｏ抗体ＴＮ１は、Ｔｐｏ由来の交差ループを認識する。このループが、エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）などの密接に関連した代替４ヘリックスバンドルタンパク質に重なるときには、ＴＮ１抗体がキメラタンパク質と結合するように十分な構造上の配座を有すると予想される。
【０１３０】
具体的には、２タイプのＥｐｏ−Ｔｐｏループタンパク質を構築する。第１のＥｐｏ−Ｔｐｏループタンパク質は、Ｔｐｏ由来のアミノ酸５７から６１をＥｐｏ中のアミノ酸５７から６１の代わりに用いる。これは、交差ループに相当する。ループの前後関係の提示（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）が重要であり得るので、Ｔｐｏ由来の隣接ヘリックス配列を更に含む別のＥｐｏ−Ｔｐｏループタンパク質も作製する。この場合、Ｔｐｏ由来のアミノ酸５３から６８で、Ｅｐｏ中のアミノ酸５３から６８を置換する。交差ループに更なる配座安定性を付与することを意図して、境界は、ＴｐｏとＥｐｏの両方に存在する保存配列によって画定される。ＴＮ１抗体の結晶構造はＢヘリックスｗｅと幾つかの軽微な近接接触（ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｃｏｎｔａｃｔ）を示したので、前述のＴｐｏループ構築物の両方を、Ｅｐｏ中のアミノ酸１１４から１３９の代わりにＴｐｏ由来のアミノ酸１１０から１２５による対応するＴｐｏ置換、及びＥｐｏ中のアミノ酸１０２から１４８の代わりにＴｐｏ由来のアミノ酸９７から１３４による対応するＴｐｏ置換を含む、Ｅｐｏ−Ｔｐｏ変異体のバックグラウンドにおいても作製する。
【０１３１】
上記Ｅｐｏ−Ｔｐｏループタンパク質を、Ｂａｃｉｌｌｕｓプロトキシン胞子ディスプレイ系と組換え融合させ、胞子をＴＮ１抗体に対してスクリーニングする。これらの構築物は、１回のパニングにおいて、無関係な負の対照抗体よりもＴＮ１抗体に選択的に結合し、ＴＮ１抗体を濃縮すると予想される。次に、本発明者らは、３から５回の胞子パニングによって、コンビナトリアル抗体ライブラリーに対して、濃縮性の最も高いＥＴＬタンパク質をスクリーニングする。これが終了した後、濃縮された抗体を未変性Ｔｐｏタンパク質との結合について対抗選択する。その結果、特定された任意の抗Ｔｐｏ抗体は、ＴＰＯ交差ループの事実上の結合剤になる。
【０１３２】
多数の公知サイトカイン及び成長因子は、極めて変わりやすいループ構造を有する４ヘリックスバンドルタンパク質であるので、Ｅｐｏなどの代替４ヘリックスバンドル足場を利用して、公知４ヘリックスバンドルタンパク質由来のループのライブラリーを表示することができる。この手法によって、すべての公知４ヘリックスバンドルタンパク質に対する抗体の容易かつ定方向の抗体選択が可能になる。或いは、これらの足場は、任意の数の標的タンパク質由来の複数のループ、単一若しくは複数のヘリックス置換、又はさらにはループとヘリックスの組合せまでも含むように、操作することができる。ひいては、可溶性単一スパンタンパク質の別の保存された構造要素を利用して、同族のスーパーファミリータンパク質内のそれらの重要な要素に対する抗体認識を与え、誘導することができる。
（実施例４）
マルチスパンスーパーファミリー配座抗原−ＧＰＣＲ  図１
実施例３と同様に、導入された配列が、未変性標的タンパク質中に存在する配座要素を部分的又は完全に採用するように、標的タンパク質の単一の線状又は不連続配列を代替足場上に提示することができる。例として、マルチスパンＧタンパク質共役受容体の細胞外ドメインの部分を無関係なタンパク質足場にグラフトする。Ｇタンパク質のＢ１断片は、それぞれＣＣＲ３由来の成熟アミノ末端及びＣＣＲ３由来の第３の細胞外ループで置換することができる遊離アミノ末端及び近位ループ構造を有する。以前の研究では、融合物は、親和性が全体として１／１０００に低下しても、完全長ＣＣＲ３受容体に対して同様に位置付けられる親和性で、ＣＣＲ３同族リガンド、エオタキシン及び変異体に結合した（Ｄａｔｔａ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｖｏｌ．  １２，  ｐｇ．２４８２，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００３）。これらの結果によれば、可溶性構築物は、受容体を模倣するのに十分な配座要素を部分的に提供し得る。ＣＣＲ３との品質管理結合（ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）のために、Ｂ１キメラを可溶性又はファージ表示されたエオタキシンを用いて試験した。具体的には、アミノ末端（アミノ酸１から３４）及びＣＣＲ３の第３の細胞外ループ（アミノ酸２６５から２８１）を、アミノ末端の２個のアミノ酸の代わりに用い、Ｇタンパク質のＢ１ドメイン断片のループアミノ酸１８と１９の間に挿入する。次に、胞子表面に表示されたこの構築物を、３から５回の濃縮によってコンビナトリアル抗体ライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、濃縮プールを、ＣＣＲ３を過剰発現する操作されたほ乳動物細胞系に対してポジティブ選択する。次いで、生成した抗体クローンを組換え発現させ、精製し、次いでＣＣＲ３との結合について、又はエオタキシン中和アッセイにおいて、試験する。
【０１３３】
第２の例として、ＣＣＲ２のアミノ末端、及び第３の細胞外ループを、Ｂ１ディスプレイ足場上に同様に表示し、中和抗ＣＣＲ２抗体１Ｄ９に対する反応性を試験する。具体的には、アミノ末端（アミノ酸１から４２）及びＣＣＲ２の第３の細胞外ループ（アミノ酸２６９から２８５）を、アミノ末端の２個のアミノ酸の代わりに用い、Ｇタンパク質のＢ１ドメイン断片のループアミノ酸１８と１９の間で置換される。次に、胞子表面に表示されたこの構築物を、３から５回の濃縮によってコンビナトリアル抗体ライブラリーに対してスクリーニングする。濃縮プールを、ＣＣＲ２を過剰発現する操作されたほ乳動物細胞系に対してポジティブ選択する。生成したクローンを精製し、ＣＣＲ２との結合について、又はＭＣＰ−１中和アッセイにおいて、試験する。実施例１に記載のように、胞子期（ｓｐｏｒｅ−ｐｈａｓｅ）スクリーニングを実施する。
【０１３４】
重要なことには、これら２つの例では第３の細胞外ループを選択したが、第１の細胞外ループを代わりに使用することができ、又は第２の細胞外ループでも代わりに使用することができる。１個を超える細胞外ループを組み入れ、又はこれらのループ由来の膜近傍領域の部分でさえも組み入れて、より多くの配座構成（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｅｘｔ）を提供することが必要又は有利であり得る。類似の手法は、すべてのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャネル、並びに他のマルチスパン及び他の可溶性又は統合マルチループタンパク質などの構造モチーフを有する別のタンパク質に適用することができる。
（実施例５）
配座抗原を特定し、生成する生物情報学手法
上記実施例は、個々のタンパク質又はスーパーファミリー、及び無秩序なコレクションを使用する方法を記載する。重要なことには、無秩序なコレクションは、発現されたｃＤＮＡに由来する可能性があり、ｃＤＮＡの表示は、相対発現レベルによって極めて偏り、タンパク質のタイプ、又は未変性タンパク質上の断片の接触性に限定されない。また、無秩序な断片のクローニングにおいては、せいぜい、方向性を制御できるのみに過ぎず、枠の適切な読みを制御することはできない。したがって、そのアミノ又はカルボキシ末端において適切な融合を形成しない多数の非生産的クローンが存在すると予想される。これらの態様の一部は、生物情報学手法によって扱うことができる。
【０１３５】
例えば、実施例１に記載の活性化リンパ球由来の発現遺伝子断片を直接クローン化する代わりに、活性化リンパ球における遺伝子発現を検討して、発現特性（ｔｒａｉｔ）の変化した目的遺伝子を見つける。一次フィルターとして、本発明者らは、細胞外である目的遺伝子に焦点を合わせることができる。次に、対応するｃＤＮＡを合成又は救済し、上記実施例に記載の手順と同様に、その断片をクローン化する。その結果、生産性融合をもたらす適切な配向及び枠にある断片のみが生成する。最終結果として、このコレクションのスクリーニングによって、細胞外タンパク質に対する抗体のみが生成する。
【０１３６】
追加の生物情報学段階として、上記目的遺伝子を更に検討し、これらのタンパク質の外面に存在する予測溶媒和領域を特定する。次いで、これらの溶媒和領域を合成し、配座足場にクローン化し、コンビナトリアル抗体ライブラリーに対してスクリーニングすることができる。この追加の段階によって、タンパク質の予測曝露領域のみからなる断片を作製し、接触可能なエピトープに対してコレクションを更に生産的にする。
【０１３７】
どちらの合成手法でも主要な利点は、遺伝子を標準化する能力であり、又は遺伝子誘導レベル、時間的発現などの他の関連する判定基準に基づく指定の偏り（ｃｕｓｔｏｍ  ｂｉａｓ）までも生じる能力である。この手法は、予測される細胞内タンパク質をコードする遺伝子に対して使用することもでき、細胞内抗体として使用するための抗体を単離することもできる。
（実施例６）
抗体抗原コンプレックスのスクリーニング（図５）
抗体は、その可変領域における特異的相互作用によって抗原に結合する。安定な結合がしばしば形成され、一方又は両方の成分において誘導適合のために維持される。抗体の場合には、リガンド結合抗体とリガンド非結合抗体は構造的に異なることが判明した。この構造上の差は、配座エピトープ提示を利用して、特定の抗体−抗原コンプレックスを認識する抗体をスクリーニングすることによって、活用される。
【０１３８】
一例においては、抗体を直列型発現プラスミドの第１の部位にクローン化し、同族のエピトープを第２の部位にクローン化する。抗原を抗体の近位に配置することによって、抗原は抗体に対する配座触媒として作用することができる。その結果は、コンプレックススクリーニングに適切な安定な繋留された抗原−抗体コンプレックスである。さらに、抗原結合は、抗体における独特の配座変化を誘発するので、この安定な提示によって、リガンド結合した特定の抗イディオタイプ抗体を効率的に特定することができる。
【０１３９】
例えば、抗ｃ−ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）は、柔軟なリンカー［（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３］のアミノ末端において発現され、Ｂａｃｉｌｌｕｓプロトキシンに組換え繋留されたｃ−ｍｙｃペプチドエピトープに結合することができる。生成した胞子表示コンプレックスをコンビナトリアルファージ抗体ライブラリーに対してスクリーニングして、抗コンプレックス抗体及び抗リガンド結合抗イディオタイプ抗体を見つける。これらの生成した抗体のどちらかを９Ｅ１０抗体と一緒に二重特異性抗体の１本のアームとして使用することができる。この二重特異性抗体を細胞外装飾されたｃ−ｍｙｃ細胞と組み合わせると、２つの結果が得られる。１つは、ｃ−ｍｙｃと９Ｅ１０アームの「定方向」反応である。第２の予想される結果は、抗イディオタイプアームが、別の二重特異性抗体分子の９Ｅ１０＋ｃ−ｍｙｃタンパク質コンプレックス又はリガンド結合９Ｅ１０アームに結合する、「トランス」反応である。この「トランス」反応は、すべての標的が化学量論的に消費されるまで続く、進行性の反応である。実際には、この「抗体連鎖反応」は、抗体と標的の結合を装飾し、強化して、最大量のＦｃを標的に送達し、安定化する。
（実施例７）
ファージ−ファージ標的−抗体選択（図６）
上記実施例においては、胞子を使用してエピトープコレクションを表示し、ファージを使用して抗体選択を表示した。コレクションが、選択に対して物理的に識別可能であり、かつ増幅に対して遺伝子的に識別可能である場合、同じディスプレイ系を用いて両方のコレクションを表示することもできる。
【０１４０】
本実施例においては、第一ステップは、異なる抗生物質耐性、すなわち、エピトープライブラリーの場合のテトラサイクリン耐性と抗体コレクションの場合のアンピシリン耐性を有するプラスミドにおいてコレクションを発現させることである。第二に、ファージコートタンパク質にエピトープタグを付けて、別個のコレクションを物理的に識別する。そうするために、独特の親和性タグをｐＶＩＩコートタンパク質のアミノ末端に組換え融合させる。具体的には、まず、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）又はＨＡ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）ペプチドｐＶＩＩタグ付きヘルパーファージを作製する。例えば、ＨＡヘルパーファージを使用して、エピトープライブラリーファージミドコレクションを作製することができ、ＦＬＡＧヘルパーファージを使用して、抗体ファージミドライブラリーコレクションを作製することができる。１ｅ６−７エピトープライブラリーファージミドをＰＢＳ＋１％ＢＳＡ  １ｍｌ中で１ｅ９−１０抗体ライブラリーファージミドと混合し、室温で２時間インキュベートする。次に、抗ＨＡ被覆プロテインＡビーズを混合物と一緒に４℃で１時間インキュベートする。次いで、ビーズをＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３から５回洗浄する。最後に、ビーズをｐＨ２．２  グリシンで１０分間処理し、次いで２Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基で中和する。このステップは、抗体−抗原コンプレックスを不可逆的に解離させ、それらにＥ．ｃｏｌｉを感染させ、アンピシリン又はテトラサイクリン選択下で増幅させることができる。増幅されたコレクションは、エピトープライブラリー全体、及び生産性抗体のみの結合剤を含む。次の選択ステップは、前のステップに類似しているが、ＨＡ沈殿の代わりに抗ＦＬＡＧ沈殿を実施する。したがって、このステップは、結合していないすべてのエピトープライブラリーメンバーを除去し、生産性エピトープ−抗体コレクションのみを強化する。
【０１４１】
この例は、抗体−抗原相互作用を挙げたが、同じ手法は、任意の数又は種類の相互作用的ファージ表示コレクションにも有効であると予想される。これらは、別の抗体に対する抗体であり得、又は受容体若しくは酵素に対するペプチドでさえあり得る。タグが適切なエピトープ又は抗体集団に各回で適切に再生される場合、単一の免疫学的に異なるヘルパーファージを用いて類似の結果を達成することもできる。この免疫学的に異なる差は、ヘルパーファージコートタンパク質中に設計することができ、又は２種類のファージコートタンパク質間に天然に存在し得る。
（実施例８）
配座エピトープと抗体ライブラリーの同時選択
上記例では、配座エピトープライブラリーコレクションを使用して、未変性タンパク質を認識する抗体、又は天然に提示される標的を濃縮した。しかし、今記述する系を用いて、同時配座標的−抗体選択を実施することができる。この例の目標は、特定の標的−抗体対形成を維持することである。これは、例えば、標的が不溶性胞子粒子に結合し、抗体が可溶性糸状バクテリオファージに融合するときなど、標的コレクションディスプレイが抗体ディスプレイコレクションと実質的に物理的に異なるときにのみ可能である。対形成を維持するために、まず、標的コレクションを抗体コレクションと混合する。適切なインキュベーション時間後、胞子標的コレクションを遠心分離によって収集し、結合していないファージを適切な洗液を用いて除去する。結合していないファージを除去する洗浄ステップ後、コンプレックス型コレクションをモノクローナル抗ファージ抗体と一緒にインキュベートし、次いでファージ結合胞子のポジティブ磁性選択のために常磁性抗マウスビーズと結合させる。或いは、ファージ−胞子及び抗ファージコンプレックスを蛍光団複合型抗マウス抗体を用いて検出することができ、個々の胞子をＦＡＣＳによってクローン的に選別することができる。対の組合せを適切な条件下で個々に救済して、バクテリオファージを処理可能に（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｙ）独立に救済し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ胞子を増殖させることができる。
【０１４２】
上記記述においては、本発明を特定の実施形態に関連して説明したが、本発明はそのようには限定されない。実際、本明細書に示し、記載するものに加えて、本発明の種々の改変が、上記記述から当業者に明らかになるはずであり、添付の特許請求の範囲に包含される。
【０１４３】
本明細書を通して引用するすべての参考文献、及びその中で引用される参考文献を、参照によりその全体を本明細書に明確に援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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