(57)【要約】  本発明は、ヒトサイトメガロウィルス（ｈＣＭＶ）と結合し、そしてｈＣＭＶ感染を中和する新規抗体配列を提供する。当該新規配列は、ｈＣＭＶ感染の内科的治療のために、特にｈＣＭＶ感染の予防または治療法において使用される医薬組成物を製造するために使用され得る。
2010512736.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むタンパク質。
【請求項２】
配列番号６および／または配列番号７をさらに含む、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項２記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３からなる群から選択される、一またはそれ以上の配列をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
配列番号１０と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
抗体、抗体断片、生理活性ペプチドまたは融合タンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記抗体がヒト組み換え抗体である、請求項６記載のタンパク質。
【請求項８】
前記抗体が、配列番号１５と少なくとも９０％の同一性があるタンパク質配列を有する重鎖、および配列番号１７と少なくとも９０％の同一性があるタンパク質配列を有する軽鎖を含む、請求項７記載のタンパク質。
【請求項９】
前記抗体断片が、可変性重鎖／軽鎖ヘテロ二量体または一本鎖可変断片である、請求項６記載のタンパク質。
【請求項１０】
ヒトサイトメガロウィルス（ｈＣＭＶ）と結合し、および中和する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１１】
２６Ａ１継代培養によって分泌される、ヒトＩｇＧ１抗体。
【請求項１２】
ｈＣＭＶの結合および中和において、請求項１１記載のＩｇＧ１抗体と競合するタンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質である、請求項１２記載のタンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１５】
配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項１４記載の核酸。
【請求項１６】
配列番号９と少なくとも９０％の同一性を有する配列をさらに含む、請求項１５記載の核酸。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の核酸を含む、原核または真核宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質を分泌する、請求項１８記載の宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質の産生のための、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の核酸、または請求項１８もしくは１９の宿主細胞の使用。
【請求項２１】
ｈＣＭＶ感染症またはｈＣＭＶ関連疾患の検出、治療、阻害、予防および／または寛解のための組成物の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の核酸を含むｈＣＭＶ感染症またはｈＣＭＶ関連疾患のための、治療用、予防用または診断用組成物。
【請求項２３】
眼球投与用または局所投与用である、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
異なるｈＣＭＶ中和抗体、静注用免疫グロブリン調製物および／または抗ウィルス化合物をさらに含む、請求項２２または２３記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の核酸の投与を含む、ｈＣＭＶ感染症またはｈＣＭＶ関連疾患の治療、予防または診断方法。
【請求項２６】
異なるｈＣＭＶ中和抗体、静注用免疫グロブリン調製物および／または抗ウィルス化合物の投与をさらに含む、請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ヒト細胞に感染するウィルスに特異的な生物学的活性を有する、ヒトＢ細胞から単離された新規抗体配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトサイトメガロウィルス（ｈＣＭＶ）は、広く蔓延し、高度に種特異的なヘルペスウィルスであり、免疫抑制された、または免疫的に未成熟な個人において著しい罹患および致死を引き起こす。
【０００３】
近年の幾つかの総説が、ｈＨＣＭＶの生物学および臨床症状を分析している（Ｌａｎｄｏｌｆｏ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，２００３；Ｇａｎｄｈｉ  Ｍ  ａｎｄ  Ｋｈａｎｎａ  Ｒ，２００４；Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ−Ｎａｕｃｌｅｒ  Ｃ，２００６ａ）。このウィルス性病原菌は、上部消化器系または呼吸器系の内皮細胞および上皮細胞を通じて、あるいは泌尿生殖器系を通じて入ってくるので、世界全体の人口の大部分で感染しており、そして体液接触の後に小児期で獲得される。ｈＣＭＶに対する血清反応陽性は、発展途上国または低所得地域において、より蔓延している。
【０００４】
初期感染の後、ｈＣＭＶは骨髄細胞系列の特定の宿主細胞で、潜伏状態で残存し、複製され、および多くの異なる細胞種（造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、または線維芽細胞）に転移し、ならびに宿主の免疫系から逃れている。完全にｈＣＭＶを除去することはほとんどできないが、ｈＣＭＶの感染および転移は、免疫系による調整下において防御されているので、ＣＭＶの感染は通常、健常人においては無症状である。実際ｈＣＭＶは、ウィルスゲノムが、選択された部位で潜伏状態のまま残存できるような有効な機構を発達させた。
【０００５】
ストレス条件または特定の治療のような、免疫機能を弱める幾つかの状況は、ｈＣＭＶの再活性化へと導き得る。ｈＣＭＶの臨床症状（網膜炎、腸炎、胃炎、または肝炎）は、ウィルスの一次感染、再感染または再活性化の後に起こり得る。胎盤を通じた母親から感染、分娩中、または授乳を通じて、約１０％の幼児は６ヶ月齢までに感染する。
【０００６】
ｈＣＭＶビリオンは、直線状の、鎖長２３０ｋｂである二本鎖ＤＮＡゲノムを含む２０面体のヌクレオカプシドからなる。ｈＣＭＶゲノムの発現は、ウィルスの感染、潜伏、および複製に関わる多くの生物学的活性に関与する２００以上のタンパク質の合成へと導く転写現象の複雑なカスケードによって制御される。（Ｂｒｉｔｔ  Ｗ  ａｎｄ  Ｍａｃｈ  Ｍ，１９９６）。
【０００７】
構造タンパク質は、非常に複雑で、いまだ完全に明らかにされていないビリオンエンベロープを形成する。それは、他のヘルペスウィルス科で確認された構造タンパク質の相同体であって、ビリオン中で、ジスルフィドで連結されたタンパク質複合体を形成し得る糖タンパク質：ｇＣＩ（ｇＢのみを含む）、ｇＣII（ｇＭおよびｇＮを含む）、ｇＣIII （ｇＨ、ｇＬおよびｇＯを含む）を含む。ｇＢ、ｇＨおよびｇＮ遺伝子はまた、ｈＣＭＶ株の遺伝子解析のために使用された（Ｃｏａｑｕｅｔｔｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｄａｒ  Ｌ，２００７）。
【０００８】
糖タンパク質ｇＮおよびｇＭは、最も豊富に存在し、そしてｇＨおよびｇＢと共に、ｈＣＭＶエンベロープと宿主細胞表面との間の初期相互作用に必須であり、そして結果的に感染性ｈＣＭＶの産生のために必須であることが示された。この理由のため、ｇＢ、ｇＨ、ｇＮおよび／またはｇＭを標的とする化合物は、ｈＣＭＶ感染、再感染または再活性化の後に起こる、細胞内への循環性ｈＣＭＶビリオンの進入を防ぐことによって、効果的にｈＣＭＶの完成を阻害することができる。
【０００９】
利用可能な治療法の選択肢がほとんどないため、ｈＣＭＶの治療は困難である。ウィルスの複製を阻害する、現在利用できる薬剤化合物（ガンシクロビル、シドフォビル、フォスカルネット、マリバビル、および開発中の他の薬剤）は、著しい臨床改善を実現するが、乏しい経口バイオアベイラビリティ、低い活性、（ウィルス標的の変異による）ｈＣＭＶ耐性の出現、および用量を制限する毒性に悩まされるかもしれない（Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑ  Ｅ，２００３；Ｂａｌｄａｎｔｉ  Ｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎａ  Ｇ，２００３；Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｃ  ａｎｄ  Ｂｏｉｖｉｎ  Ｇ，２００５）。
【００１０】
ｈＣＭＶ感染を予防および治療する新規手段が、特に免疫不全の患者のために、移植手術の準備において、および出産前の予防において必要とされている。実際、ｈＣＭＶは、ＨＩＶの患者において、および臓器移植者において臨床的に重大な日和見病原性菌であり、そしてそれは移植片拒絶とは独立して移植片喪失に寄与し、最終的に罹患および死亡へとつながる（Ｐｕｉｕｓ  Ｙ  ａｎｄ  Ｓｎｙｄｍａｎ  Ｄ，２００７）。骨髄および固体組織移植の増加は、ｈＨＣＭＶ性網膜炎のようなｈＣＭＶの臨床症状の可能性を上昇させる（Ｗｉｅｇａｎｄ  Ｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ  Ｌ，  ２００６）。さらに、ｈＣＭＶは、ｈＣＭＶに感染している母親によって先天的に、または周産期において感染させられることによる（難聴、発育遅延または知能発育不全のような）出生異常の主要な感染性の原因である（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ｐ  ａｎｄ  Ｗａｌｔｅｒ  Ｓ，２００５）。
【００１１】
したがって、万能であって、早期予防的ｈＣＭＶ特異的治療のための、例えば移植患者における（Ｈｅｂａｒｔ  Ｈ  ａｎｄ  Ｅｉｎｓｅｌｅ  Ｈ，２００４；ＫａＫｌ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｓｎｙｄｍａｎ  Ｄ，２００６）、ｈＣＭＶ関連性神経性病態を発症している患者における（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ｐ，２００４）、または垂直感染および胎児ならびに新生児の生命を危険にさらすｈＣＭＶ感染を予防するために、リスクのある妊娠における（Ｓｃｈｌｅｉｓｓ  Ｍ，２００３）ｈＣＭＶ疾患予防のための薬剤を提供することは重要である。
【００１２】
さらに、ｈＣＭＶに対する医薬組成物は、（心血管系疾患および自己免疫疾患または幾つかの種類の癌のような）他のより広範囲にわたる疾患の治療のために有用であるかもしれず、この場合、ｈＣＭＶは補助因子の可能性があり、そして／または免疫抑制治療中において再活性化され得る。例えば、ｈＣＭＶは、細胞のアポトーシス、分化および転移における腫瘍調節効果を有するかもしれないため、ｈＣＭＶは現在、腫瘍侵襲による、および免疫回避による長期合併症のような疾患において重要性の増しているヒト病原菌である。自己免疫疾患または血管疾患において、ｈＣＭＶ感染は免疫性および炎症性反応を変化させるしれない（Ｃｉｎａｔｌ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ−Ｎａｕｃｌｅｒ  Ｃ，２００６ｂ）。
【００１３】
多くの高リスクにある患者群に対して予防を提供する目的において、ｈＣＭＶ感染を予防する別の方法はワクチン接種である。しかし、ワクチン接種と、結果的に生ずる免疫応答との間の相関性が完全に理解されておらず、そして（特定の候補抗原または生弱毒化ワクチンを用いた）最適なワクチン接種法は、予防の標的とされている患者群に依存するようである。したがって、予防ワクチン接種法はいまだに評価段階にある（ＭｃＬｅａｎ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｓｃｈｌｅｉｓｓ  Ｍ，２００５）。
【００１４】
ｈＣＭＶ感染に対する薬理学的手法の現時点における制限という観点において、宿主−ｈＣＭＶの関係についての知識、および特にｈＣＭＶ−特異的な免疫応答の知識の増加によって、免疫を基盤とした治療法は、ｈＣＭＶ関連の合併症の良好な治療法として、既存の治療法と置き換わる、または補完する優れた代替手段となっている（Ｇａｎｄｈｉ  Ｍ  ａｎｄ  Ｋｈａｎｎａ  Ｒ，２００４）。近年、免疫不全のマウスにおいて、致死へと向かうＣＭＶ感染からの長期の予防が、ウィルス特異的メモリーＢ細胞を移植することで達成され、そしてこのことは、そのような細胞が治療的有用性を有するかもしれないことを示唆している（Ｋｌｅｎｏｖｓｅｋ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００１５】
細胞を基盤とした治療のより簡便な別の方法は、ヒトまたはウィルス性抗原（例えば、ｈＣＭＶ）に対して、明確な中和活性を有する治療抗体を含む医薬組成物を患者へ投与することからなる、受動免疫療法であり得る。
【００１６】
この治療方法は、抗原結合に基づいて、ならびにウィルスの治療標的に向かっていく抗体および抗体断片の生物学的特性に基づいて考案された（Ｄｕｎｍａｎ  Ｐ  ａｎｄ  Ｎｅｓｉｎ  Ｍ，２００３；Ｋｅｌｌｅｒ  Ｍ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｈｍ  Ｅ，２０００）。受動免疫療法は、臨床診療に導入され、速やかに（感染症、免疫介在疾患および癌を含む）広範囲にわたる疾患の治療機会を拡張した。この方法は、免疫系が標的分子を阻害および／または除去するために必要とされる量の、および／または特異性のある抗体を産生することのできない患者において特に有効であり得る（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ  Ｌ，２００５；Ｌａｆｆｌｙ  Ｅ  ａｎｄ  Ｓｏｄｏｙｅｒ  Ｒ，２００５）。
【００１７】
ｈＣＭＶ治療の分野において、この手法は、高力価の抗ｈＣＭＶ抗体を有するヒト血漿を貯留することで得られ、そして臨床用途のために（サイトテクト（Ｃｙｔｏｔｅｃｔ）またはサイトガムという名前で）市販されている、ヒト免疫グロブリン調製物を静脈内投与することによって行われる。しかし、これらの製品は、ｈＣＭＶ感染を阻害するための、部分的にのみ満足できる解決策である。実際に、この治療法は、免疫不全の患者に対して大部分が予防療法として、および抗ウィルス剤が通常同時投与される予防法として使用される（Ｍａｒａｓｃｏ  Ｗ  ａｎｄ  Ｓｕｉ  Ｊ，２００７；Ｎｉｇｒｏ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｂｏｎａｒｏｓ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｋｏｃｈｅｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋｒｕｇｅｒ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。さらに、文献で報告されている通り、安全上の問題およびそのような調製物の不足についての関心が高まっている（Ｂａｙｒｙ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，２００７；Ｈａｍｒｏｃｋ  Ｄ，２００６）。
【００１８】
ｈＣＭＶエンベロープ上に発現している抗原に対して高い親和性を有し、そして感染を中和することができるヒト組み換え抗体は、受動免疫法のためのより好適な薬剤となるだろう。エンベロープタンパク質の化学量論量は可変であり、そして宿主の免疫応答を避けるように変化するかもしれないが、実際、幾つかのｈＣＭＶ糖タンパク質は、ウィルスを中和する抗体の産生を含む強い宿主免疫応答を誘発する。この応答は、宿主免疫の重要な構成要素であると考えられ、そして抗体およびワクチンの両方の発展における目標を示している。
【００１９】
ヒトモノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体の本質的な制限のために、臨床適用のための最も好ましい抗体である。しかし、以前に同定されたｈＣＭＶ治療用ヒト抗体の発展は（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）、例えば造血幹細胞における（Ｂｏｅｃｋｈ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、または網膜炎における（Ｇｉｌｐｉｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）そのような抗体の有効性を評価した研究において、臨床的有益性が観察されなかったために中断されている。これらの失敗した試験により、最も広範囲のｈＣＭＶ株を、より効果的に中和できるヒトモノクローナル抗体を選択することを目指したさらなる研究が必要とされている。ＣＭＶ感染の治療は、培養中で培養されたヒトＢ細胞から精製されるヒトモノクローナル抗体か、または哺乳類細胞株中に導入されたヒト配列によって発現された、組み換えタンパク質として産生されるヒトモノクローナル抗体を含む、より活性のある医薬組成物を有することによって利益を受けるだろう。
【発明の概要】
【００２０】
発明の開示
本発明は、ｈＣＭＶと結合し、および中和し、ならびにｈＣＭＶ感染またはｈＣＭＶ関連疾患を検出、治療、阻害、予防および／または改善するために使用され得る新規抗体配列を提供する。
【００２１】
ヒトＢ細胞は、ｈＣＭＶ血清反応陽性患者から得られ、そして不死化された。この不死化されたヒトＢ細胞のポリクローナル群は、インビトロにおいてｈＣＭＶの感染力を中和する、細胞培養上清中の抗体（免疫グロブリンＧ、ＩｇＧ）の存在について検査された継代培養を製造するために分けられた。特に、活性を中和する形態、アイソタイプおよびクローン性は、２６Ａ１と名づけられた継代培養によって分泌された抗体から決定された。当該抗体は、初代細胞培養上清および組み換えヒトモノクローナル抗体の両方からアフィニティ精製され、これは、ｈＣＭＶ感染のインビトロにおけるモデルを使用することによる、ｈＣＭＶ特異的中和活性を確認する。この抗体は、ｈＣＭＶエンベロープ上にある抗原に対する中和の性質決定に使用され得る。
【００２２】
２６Ａ１継代培養によって分泌される抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列は、増幅され、クローン化され、そして配列決定された。対応するタンパク質配列は、ｈＣＭＶ特異的生物活性の原因となる相補鎖決定領域（ＣＤＲ）を同定するために分析された。これらの配列は、組み換えタンパク質を産生するための好適な技術を使用して、ｈＣＭＶ特異的結合特性および中和特性を有する、完全抗体、抗体断片または他の形態にある構造タンパク質（例えば生理活性ペプチド、融合タンパク質）の形態となっているタンパク質を産生するために使用され得る。
【００２３】
ｈＣＭＶ感染症およびｈＣＭＶ関連疾患の取扱いにおける、治療的、予防的および／または診断的有用性を有する組成物は、本発明のタンパク質を使用して、組み換えタンパク質か、または２６Ａ１継代培養由来の細胞培養から精製される天然型抗体として産生され得る。そのような組成物は、抗ウィルス化合物および／または静脈注射用免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）調製物に基づく現在のｈＣＭＶ治療を補完する、または置き換えるために使用されるかもしれない。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態は、以下の詳細な説明において提供されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１（Ａ）は、文献（Ｒｏｔｈｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，２００１）に記載されている通りの、ｇＢ特異的ＥＬＩＳＡ中に取り付けられ、そして使用されたＣＧ３抗原の模式図である。組み換え株間融合ＣＧ３は、ｈＣＭＶ株ＡＤ１６９（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．Ｐ０６４７３；アミノ酸２７−８４）およびタウン（Ｔｏｗｎｅ）（スイスプロット  Ａｃｃ．  Ｎｏ．Ｐ１３２０１；アミノ酸２７−８４）由来のｇＢ抗原領域２（ＡＤ２、配列番号１および２）の組み合わせに相当する。ＡＤ領域は、異なるウィルス株中で保存されている、および中和抗体によって認識されることが示されている部位（アミノ酸７０〜８１、下線部）を含む（Ｑａｄｒｉ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｋｒｏｐｆｆ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。図１（Ｂ）は、ｇＨ特異的ＥＬＩＳＡアッセイに使用されるｇＨ（Ａｇ）−ＧＳＴ融合タンパク質を含む、ｇＨ抗原の模式図である。組み換え抗原ｇＨ（Ａｇ）−ＧＳＴは、ｈＣＭＶ株ＶＲ１８１４（Ｒｅｖｅｌｌｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）からのｇＨアミノ末端領域（アミノ酸１６〜１４４；配列番号３）と、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との間の読み枠内融合に相当する。ｇＨのアミノ末端は、中和抗体によって認識されるリニアー抗体結合部位（アミノ酸３４〜４３；下線部）を含む（Ｕｒｂａｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【図２】図２は、ｈＣＭＶと結合し、および中和するＩｇＧ抗体を含む継代培養（ウェル）を同定し、およびその特性を明らかにする選択過程の概要である。継代培養は、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５６８７１に開示されている、ＥＢＶ型の不死化方法を用いて、ｈＣＭＶ患者（ＣＭＶ７）由来のＢ細胞を不死化することによって得られた。著しい細胞増殖を示す継代培養（ウェル）からの上清は、マイクロ中和試験アッセイにおいて直接スクリーニングされた。中和活性を示す上清はその後、ｇＢおよびｇＨ特異的ＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングされた。それぞれのスクリーニングアッセイにおける陽性ウェルの数は、灰色の楕円で示される。
【図３】図３は、無血清培地中で培養された、２６Ａ１継代培養由来細胞培養の上清由来であるプロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製された、天然型２６Ａ１抗体のｈＣＭＶ中和活性を示す。用量反応曲線は、ｈＣＭＶ株ＡＤ１６９（１０００ＰＦＵ／反応；ＩＣ５０  ０．８２μｇ／ｍｌ）と共にヒト胚線維芽細胞（ＨＥＬＦ）を含む、またはｈＣＭＶ株ＶＲ１８１４（１０００ＰＦＵ／反応；ＩＣ５０  ０．６７μｇ／ｍｌ）と共にヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を含む、いずれかの場合におけるｈＣＭＶ中和アッセイについて描かれた。
【図４】図４は、不死化ヒトＢ細胞継代培養由来のＩｇＧを含む上清における、ｇＨ（Ａｇ）特異的（Ａ）、およびＣＧ３抗原特異的（Ｂ）結合活性を示す。ＥＬＩＳＡは、細胞培地のみ（培地、陰性対照）または２６Ａ１、１Ｆ７（欧州特許出願第０７１１１７４１号明細書に記載されている通り、ＣＭＶ５提供者から得られた不死化細胞において同定された）および８Ｃ１０（本特許出願および欧州特許出願第０７１１５４１０号において記載されている通り、ＣＭＶ７提供者から得られた不死化細胞において同定された）継代培養由来の上清を使用して行われた。点線は、継代培養が陽性であるとみなすための閾値（Ｏ．Ｄ．＝０．１）を表す。
【図５】図５（Ａ）は、２６Ａ１  ＩｇＧ（ＶＨ  ２６Ａ１；配列番号４および５）の重鎖可変領域における、ＤＮＡ（下側のもの、３９３個の塩基対）およびタンパク質（上側のもの、１３１個のアミノ酸）コンセンサス配列のアラインメントである。図５（Ｂ）は、予想されるＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、下線部、配列番号６、７および８）を示した、ＶＨ２６Ａ１のタンパク質コンセンサス配列である。単離されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体由来のプラスミド中においてクローン化されたＤＮＡ配列によってコードされた別のアミノ酸が、コンセンサスタンパク質配列の下側に示されている。
【図６】図６（Ａ）は、２６Ａ１  ＩｇＧ（ＶＬ  ２６Ａ１；配列番号９および１０）の軽鎖可変領域における、ＤＮＡ（下側のもの、３３０個の塩基対）およびタンパク質（上側のもの、１１０個のアミノ酸）コンセンサス配列のアラインメントである。図６（Ｂ）は、ＶＬ２６Ａ１の予想されるＣＤＲ（ＬＣＤＲｌ、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、下線部、配列番号１１、１２、１３）を示した、ＶＬ２６Ａ１のタンパク質コンセンサス配列である。
【図７】図７は、組み換えヒト２６Ａ１モノクローナル抗体（配列番号１５）の重鎖のＤＮＡ（下側のもの、１４４９個の塩基対、配列番号１４）およびタンパク質（上側のもの、４８２個のアミノ酸）コンセンサス配列のアラインメントである。ＳｉｇｎａｌＰ  ３．０オンライン予想プログラム（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，２００４）を使用して決定されるように、シグナルペプチドとして最も起こり得る切断部位は、１９番目と２０番目との間（ＶＬＳ−ＱＶ）である。２６Ａ１継代培養における細胞から作製されたｃＤＮＡにおいて最初に同定された配列は、下線が引かれている（図５を参照）。アミノ酸１５３〜４８２番目は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に相当する（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０１８５７）。
【図８】図８は、組み換えヒト２６Ａ１  ＩｇＧ（配列番号１７）の重鎖のＤＮＡ（下側のもの、７０５個の塩基対、配列番号１６）およびタンパク質（上側のもの、２３４個のアミノ酸）コンセンサス配列のアラインメントである。ＳｉｇｎａｌＰ  ３．０オンライン予想プログラム（Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，２００４）を使用して決定されるように、シグナルペプチドとして最も起こり得る切断部位は、１６番目と１７番目との間（ＣＴＧ−ＳＶ）である。２６Ａ１継代培養における細胞から作製されたｃＤＮＡにおいて最初に同定された配列は、下線が引かれている（図５を参照）。アミノ酸１〜１９番目および１３１〜２３４番目は、ヒトＩｇラムダ鎖に相当する（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ８Ｎ３５５）。
【図９】図９は、プロテインＡ精製された天然型２６Ａ１抗体と比較した、組み換えヒト２６Ａ１抗体のｈＣＭＶ中和活性を示す。活性は、マイクロ中和試験アッセイ（Ａ；１０００ＰＦＵ／反応、感染後７２時間）またはプラーク減少アッセイ（Ｂ）において、ＨＥＬＦ細胞およびＡＤ１６９ｈＣＭＶ株を用いて試験された。
【図１０】図１０は、プロテインＡから精製された天然型２６Ａ１抗体と比較した、組み換えヒト２６Ａ１モノクローナル抗体のｈＣＭＶ中和活性を示す。活性は、マイクロ中和試験アッセイ（Ａ；１０００ＰＦＵ／反応）においてＵＶＥＣヒト細胞およびＶＲ１８１４ｈＣＭＶ株を用いて、またはプラーク減少アッセイ（Ｂ；１０００ＰＦＵ／反応）においてＨＥＬＦヒト細胞およびＡＬ−１  ｈＣＭＶ株を用いて試験された。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５６８７１に記載された方法によって、生物学的活性（例えば、ヒトまたはウィルス標的との結合および／または中和）を有する抗体を血液中に含む患者から得られる、アイソタイプ特異的ヒトＢ細胞の効率的不死化を、そのような生理活性を有する抗体を分泌する細胞のポリクローナル群を得るという観点から行うことができる。低細胞密度（例えば１ウェルあたり５０、２０細胞またはそれよりも少ない量）での一段階のクローニングの後に、広範囲のスクリーニングアッセイが、これらの方法によって獲得された継代培養の上清を使用して行われ得る。この方法によって、多くのレパートリーのＩｇＧ分泌継代培養が特徴付けられ、そして結果的に、抗原に対する所望の結合特異性および／または生物学的活性を有する多くのヒトモノクローナルＩｇＧが同定され得る、不死化Ｂ細胞のポリクローナル群を得ることが可能である。
【００２７】
本発明において、ＩｇＧを分泌する、不死化ヒトＢ細胞のポリクローナル群は、その血清が生物学的活性として強いｈＣＭＶ中和活性を示す、ｈＣＭＶ患者の血液から得られた。当該ポリクローナル群は、１ウェルあたり２０細胞である一段階の継代培養において、そして所望の培養条件において、不死化ヒトＢ細胞を含む何千もの継代培養を作製するために使用された。より強い活性を示すものを選択する目的において、特定の生物学的活性が、何百もの効率的に増殖された細胞培養の上清を用いて試験され、そしてその後、分泌された抗体のアイソタイプ、および可能であればエピトープを決定した。
【００２８】
２６Ａ１と名付けられた、最も期待のできる継代培養の一つは、大規模培養から天然型ヒト抗体を精製すること、および不死化Ｂ細胞からそのような抗体をコードするＤＮＡを単離することの両方のために使用された。前記ＤＮＡ配列は、組み換えヒト抗体と同様、天然型ヒト抗体を産生するために使用された。天然型、および組み換えヒト２６Ａ１モノクローナル抗体は、より広範囲な生物学的アッセイを行うために、およびｈＣＭＶ関連の臨床適用における潜在的有益性を評価するために使用された。
【００２９】
実施例は、同様の生物学的活性を有する細胞培養上清、天然型ヒト抗体および組み換えヒト抗体が、どのようにして、最初の血清およびヒトＥＢＶ−不死化Ｂ細胞のポリクローナル群において決定されたのかを示している。これらの証拠は、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５６８７１に記載されている方法によって、生物学的に活性を有する、アイソタイプ特異的な、天然型および組み換えヒトモノクローナル抗体の同定、性質決定および産生をすることができることを裏付けている。実際、細胞の不死化および細胞培養条件における増殖の完全な方法は、ヒト抗体のレパートリーを速やかに、効率的におよび直接的に利用できるようにする。さらに、前記方法により得られた細胞は凍結され、そして異なる生物学的活性および／または抗原のために、異なる時期に、または同時にスクリーニングされ得る。
【００３０】
一の実施形態において、本発明は、２６Ａ１抗体（配列番号８）のＨＣＤＲ３（重鎖可変領域のＣＤＲ３）の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むタンパク質を提供する。ＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ２（配列番号６および７）と共に、このＨＣＤＲ３は、２６Ａ１抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ  ２６Ａ１；図５；配列番号５）中に含まれている。この配列は、２６Ａ１抗体を分泌する、最初の継代培養から得られた細胞を使用して増幅およびクローン化されたＤＮＡ配列（図５Ａ；配列番号４）によってコードされている。したがって、本発明のタンパク質は、２６Ａ１抗体のＨＣＤＲ３（配列番号８）と共に、２６Ａ１抗体のＨＣＤＲ１（配列番号６）および／またはＨＣＤＲ２（配列番号７）の配列を含んでもよい（図５Ｂ）。そのようなタンパク質は、２６Ａ１抗体の重鎖可変領域の全配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んでもよい。
【００３１】
２６Ａ１抗体はまた、前記と同様の方法を用いて、特定のＬＣＤＲ（配列番号１１、１２、および１３）と共に、ＤＮＡ（配列番号９）およびタンパク質（配列番号１０）の配列が決定された軽鎖可変領域を含んでもよい（図６）。したがって、本発明のタンパク質は、２６Ａ１抗体の単一のＬＣＤＲからなる群（配列番号１１、１２、および１３）から選択される、一またはそれ以上の配列をさらに含むことができ、そしてそれは、ＶＬ  ２６Ａ１と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むタンパク質として供給され得る（図６Ｂ；配列番号１０）。これは、天然型ＶＬ  ２６Ａ１およびＶＨ  ２６Ａ１配列の両方を、（二つの軽鎖および二つの重鎖を含む四量体複合体の天然高次構造において、または天然型抗体の組み換え変形体としての単一のタンパク質において）軽鎖および重鎖として含む、ヒト組み換え抗体が望ましいときに特に適用される。
【００３２】
同一性のレベルがどこで示されたとしても、この同一性のレベルは、本発明に関連のある配列の完全長に基づいて決定されるべきである。
【００３３】
２６Ａ１抗体のＨＣＤＲ３は、実施例で示されるように、ｈＣＭＶと結合し、および中和することができる特異的ヒト抗体の抗原結合部位を特徴づけるものだと考えられる。抗体の幾つかの、または全てのＣＤＲは通常、抗原結合表面に達するために必要とされているが、ＨＣＤＲ３は配列の観点のみならず、長さの観点からも抗体間で最も大きな違いを示すＣＤＲである。そのような多様性は、体液性免疫機構によって基本的にいかなる抗原をも認識することができる、結合領域の根本的な要素である（Ｘｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，２０００；Ｂａｒｒｉｏｓ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．２００４；Ｂｏｎｄ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。あるいは、ＣＤＲの組み合わせは、近年概説されたように（Ｌａｄｎｅｒ  Ｒ，２００７）、元来の結合特性を保持している非常に短いタンパク質で互いに接続され得る。
【００３４】
したがってｈＣＭＶ中和タンパク質は、ｈＣＭＶ結合部位である、２６Ａ１抗体のＨＣＤＲ３を使用して、２６Ａ１抗体由来の他のＣＤＲと組み合わせて、または組み合わせずに産生され、そしてそれは、抗体タンパク質フレームワーク中で（Ｋｎａｐｐｉｋ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、または抗体と関連のないタンパク質フレームワーク中で（Ｋｉｓｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）発現され得る。
【００３５】
２６Ａ１抗体（または単離されたＨＣＤＲおよびＬＣＤＲのような、選択された部位）を形成する重鎖および軽鎖の可変領域は、Ｓｃｆｖ（一本鎖可変断片）、Ｆａｂ（可変性重／軽鎖ヘテロ二量体）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、ペプタボディ（ｐｅｐｔａｂｏｄｙ）、ＶＨＨ（重鎖抗体の可変領域）単離された重鎖または軽鎖、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）および他の非臨床／臨床適用のための改変抗体変形体のような、異なる名前で文献に記載されている通りの、機能的抗体断片としての他の全てのタンパク質形態中に含まれ得る（Ｊａｉｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｌａｆｆｌｙ  Ｅ  ａｎｄ  Ｓｏｄｏｙｅｒ  Ｒ，２００５）。
【００３６】
別の抗体は、軽鎖可変領域（ＶＬ）シャッフリング法を通じて、２６Ａ１抗体の配列を用いて作製され得る。実際、親和性、安定性および／または組み換え体産生の観点において、改善された特性を有するＶＨ／ＶＬの組み合わせを決定する目的において、ＶＬ領域ライブラリーと結合された、（２６Ａ１の一つのような）一本鎖重鎖可変領域ＶＨを用いて、幾つかの異なる抗体が作製され、そしてｈＣＭＶ特異的活性を試験され得る（Ｏｈｌｉｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｒｏｊａｓ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｗａｔｋｉｎｓ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００３７】
新規生理活性ペプチドを開発するための新しい手法はまた、元の活性を維持し、そしてより好適な薬理学的プロファイルを有するかもしれない、Ｌ−アミノ酸および／またはＤ−アミノ酸を含む、ＣＤＲ由来ペプチドを合成する可能性を示す（Ｓｍｉｔｈ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；  Ｌｅｖｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｗｉｊｋｈｕｉｓｅｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００３８】
したがって、２６Ａ１抗体のＨＣＤＲ３のみならず、２６Ａ１抗体のＨＣＤＲ３と高い類似性を有する配列、それを含む融合タンパク質、および（例えば、正常な、またはレトロ−インバーソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）型の高次構造において、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸を含む）それら由来の合成ペプチドが試験され、そしてｈＣＭＶ結合タンパク質および中和タンパク質として使用され得る。
【００３９】
さらに、改善された特性のある抗体を有するために、特に、（より良い薬物動態特性、または抗原に対するより高い親和性のような）臨床適用のために、抗体は特定の位置において修飾されていてもよいことが知られている。これらの変更は、２６Ａ１抗体のＣＤＲおよび／またはフレームワーク中でなされ、そして当該配列は、親和性成熟法および他の方法を使用する、抗体の合理的設計のための任意の専用技術を適用することによって選択され得る（Ｋｉｍ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｊａｉｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。
【００４０】
本発明のタンパク質は、通常、特定のアイソタイプを有する完全ヒトモノクローナル抗体のような抗体として提供されてもよい。例えば、ＩｇＧアイソタイプは、ほとんど全ての承認された治療抗体の抗体形態である（Ｌａｆｆｌｙ  Ｅ  ａｎｄ  Ｓｏｄｏｙｅｒ  Ｒ，２００５）。しかし、ＨＩＶ中和ＩｇＧ１から単離された抗原結合部位がヒトＩｇＡ配列上に導入され、そして得られた抗体は、同様にＨＩＶ感染を阻害することができる（Ｍａｎｔｉｓ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００４１】
本発明のタンパク質はまた、抗体断片、生理活性ペプチドまたは融合タンパク質として提供されるかもしれない。これらの全て代替的な分子は、２６Ａ１抗体で決定された元のｈＣＭＶ結合および中和特性を、高めるとまではいかなくても、維持するはずである。融合タンパク質の場合において、異種タンパク質配列は、ｈＣＭＶ特異的部位（例えば抗体断片）の正確な発現および生物学的活性に影響を与えることなく、２６Ａ１由来の配列のＮ末端またはＣ末端に位置され得る。
【００４２】
用語「異種タンパク質配列」とは、ｈＣＭＶ特異的部位（例えば抗体断片）のＮ末端またはＣ末端の、天然に存在しないタンパク質配列を示す。このタンパク質配列をコードするＤＮＡ配列は通常、組み換えＤＮＡ技術によって融合され、そして少なくとも５アミノ酸をコードする配列を含む。
【００４３】
そのような異種タンパク質配列は通常、特定の診断的および／または治療的使用のために、ｈＣＭＶ特異的抗体断片に追加の特性を提供するために選択される。そのような追加の特性の例は：検出もしくは精製手段、追加の結合部位もしくは生物学的リガンド、または融合タンパク質の翻訳後修飾（例えばリン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化またはタンパク質内部分解性切断）を含む。
【００４４】
あるいは（または異種タンパク質配列との融合に加えて）、本発明のタンパク質の活性は、治療剤、安定化剤または診断剤のような、異なる化合物との結合によって改善されるかもしれない。これらの薬剤の例は、化学的リンカーまたは重合体を使用して結合され得る、検出可能な標識（例えば放射標識、蛍光化合物、毒素、金属原子、化学発光物質、生物発光物質または酵素）である。ｈＣＭＶ特異的な生物学的活性は、代謝および／または診断的もしくは治療的適用における安定性を変化させるタンパク質または重合体のような、別の治療用タンパク質との融合によって改善されるかもしれない。
【００４５】
タンパク質部位、リガンドおよび好適なリンカーを選択ならびに設計する方法だけでなく、融合タンパク質の構築、精製、検出および使用のための手法も、文献中で提供されており（Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，１９９７；「キメラ遺伝子およびハイブリッドタンパク質の適用」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．３２６〜３２８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２０００；国際公開第０１／７７１３７号）、そして臨床において、および研究室おいて一般に利用可能である。例えば、融合タンパク質は、融合タンパク質のインビボおよび／またはインビトロにおける同定またはその精製を容易にすることができる、（ポリヒスチジン、ＦＬＡＧ、ｃ−ＭｙｃまたはＨＡタグのようなタグを含む）市販の抗体によって認識される配列を含んでもよい。
【００４６】
他のタンパク質配列は、（緑色蛍光タンパク質の場合のような）直接的蛍光分析によって、または特定の基質もしくは酵素によって（例えばタンパク質分解部位を使用して）、同定され得る。ｈＣＭＶ特異的抗体、抗体断片、生理活性ペプチドおよび融合タンパク質の安定性は、ファージコートタンパク質（ｃｐ３またはｃｐ８）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のような担体タンパク質との融合によって改善されるかもしれない。
【００４７】
２６Ａ１抗体は、本発明の主要な目的であり、そしてそれは、特定の継代培養の上清中において、ｈＣＭＶを中和する能力によって選択された、ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体として特徴付けられた。この性質は、細胞培養上清（表１）、およびその後の、プロテインＡ精製（図３）、ならびに組み換えヒトモノクローナル抗体（図９および１０、配列番号１５および１７）を使用したインビトロ中和アッセイによって決定された。
【００４８】
２６Ａ１抗体によって認識される特定のｈＣＭＶ抗原は、ウィルス抗原中の既知のｈＣＭＶ中和エピトープの一群を使用して決定された（図１、２および４参照）。結果的に、このＩｇＧ抗体は、ｈＣＭＶ中和エピトープ、およびそのようなエピトープを認識することによってｈＣＭＶ感染を中和することができる、（例えば抗体、抗体断片、生理活性ペプチド、融合タンパク質または任意の天然型／組み換えタンパク質の形態である）抗原と結合するタンパク質を明らかにするために使用され得る。
【００４９】
従来、ｈＣＭＶ特異的短縮タンパク質または合成ペプチドを用いる、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットが同様に使用され（Ｇｒｅｉｊｅｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；  ｈｌｉｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、この方法において、ｈＣＭＶに向かう抗体は、それらの抗原である糖タンパク質Ｈ（国際公開第９４／１６７３０号、国際公開第９４／０９１３６号、国際公開第９２／１１０１８号）、糖タンパク質Ｂ（欧州特許第２４８９０９号明細書、国際公開第９３／２１９５２号）または糖タンパク質Ｍ／糖タンパク質Ｎ（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）に従って明らかにされた。さらに、ｈＣＭＶビリオンの他の構成要素は、ｐＵＬ１３０およびｐＵＬ１２８の場合のように、ウィルス親和性に影響を及ぼすのみならず、ｈＣＭＶ中和抗体の標的となり得る（Ｗａｎｇ  Ｄ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ  Ｔ，２００５）。したがって、２６Ａ１抗体によって認識されるＣＭＶ抗原／エピトープは、上記の文献に基づく異なるインビトロアッセイによって同定され得る。
【００５０】
本発明のさらなる実施形態は、２６Ａ１継代培養によって分泌されたヒトＩｇＧ１抗体であり、そしてそれは、ｈＣＭＶと結合しおよび中和する、プロテインＡ精製された天然型抗体として提供され得る。このＩｇＧ１抗体は、同様にｈＣＭＶと結合および中和し得る競合タンパク質を同定するために使用され得る。同様のタンパク質が、上記中においておよび実施例中において、特に組み換えヒト抗体および抗体断片として提供される。
【００５１】
ｈＣＭＶ中和の機構は、そしてそれは２６Ａ１抗体および上記の他のタンパク質によって認識されるウィルスエピトープと関わりがあるのだが、ヒト血清（Ｎａｖａｒｒｏ  Ｄｅｔ  ａｌ，１９９７；Ｋｌｅｉｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｗｅｂｅｒ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９１；Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）またはモノクローナル抗体（Ｓｃｈｏｐｐｅｌ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｇｉｃｋｌｈｏｒｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を使用した、文献に記載されているような、特定の構造ｈＣＭＶタンパク質および／または株のために利用可能なアッセイを使用して、性質決定され得る。
【００５２】
本発明のさらなる目的は、任意の抗体、抗体断片、融合タンパク質、生理活性ペプチド、または単離された上記のＨＣＤＲおよびＬＣＤＲをコードする核酸である。実施例は、特に、２６Ａ１の重鎖（配列番号４）および軽鎖（配列番号９）の完全な可変領域をコードする配列を提供する（図５Ａおよび６Ａ）。これらのＤＮＡ配列（または特定のＨＣＤＲおよびＬＣＤＲをコードするもののような、選択された部分；図５および６）は、抗体の別の形態の一つ（例えば、完全な、親和性の成熟した、またはＣＤＲが移植された抗体、もしくは抗体断片）または融合タンパク質にそれらを発現させるために、ベクター中に導入され得る。これらの核酸は、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有する配列であって、配列番号９と少なくとも９０％の同一性を有するものをさらに含む配列を有するかまたは有さない前記配列を含むことができ、そしてそれは、２６Ａ１の重鎖のみに由来する配列が必要とされるのか、または重鎖および軽鎖の両方が必要とされるのかに依存する。
【００５３】
完全ヒト抗体が望ましい時、抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥ定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域をさらに含むべきである。好ましくは、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＡ、（２６Ａ１継代培養から性質決定された、天然型２６Ａ１抗体に見られる）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４である。２６Ａ１重鎖および軽鎖の完全可変領域をコードする核酸配列は、クローン化され、そしてＰＣＲ反応、および得られたＰＣＲ産物を含む、Ｅコリ細胞を形質転換するために使用されたベクターを用いて、その性質が明らかとされた。そのような配列は、別のベクター中に、特に、ベクターの、または好適な制御配列（例えばプロモーター、転写ターミネーター）と作動可能に連結されている別個のベクターの発現カセット中に、（一部、または完全な形で）導入され得る。
【００５４】
ヒト２６Ａ１モノクローナル抗体、またはそのような抗体由来の他のタンパク質配列は、好適な宿主細胞を形質転換するためのベクターを使用して、組み換えタンパク質として発現され得る。本発明の核酸を含む宿主細胞は、原核または真核宿主細胞であることができ、そして所望の組み換えタンパク質を分泌することができるはずである。そのようなタンパク質を産生する方法は、タンパク質発現および宿主細胞培養からのタンパク質の回収に好適な条件下で、それらをコードした配列を含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養することを含む。当該ベクターは、プロモーター、（必要に応じて）リボソーム結合部位、開始／終始コドン、およびリーダー／分泌配列を含むべきであり、そしてそれは、所望のタンパク質のモノまたはバイシストロニック転写物の発現を促進し得る。当該ベクターによって、原核または真核宿主細胞中における組み換えタンパク質の発現ができる。そのような細胞を十分に含む細胞株は、その後単離され、安定な細胞株を提供する。
【００５５】
核酸および宿主細胞は、一般的な組み換えＤＮＡ技術を適用することによって、本発明のタンパク質を産生するために使用され得る。つまり、所望のＤＮＡ配列は、制限酵素を用いた初代クローニングベクターの消化によって抽出されるか、またはそのようなベクターをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として、ならびに重鎖および軽鎖の完全な可変領域またはそれらの一部のみ（例えばＨＣＤＲ３配列）を特異的に増幅するためのＰＣＲプライマーとして使用することで増幅され得る。これらのＤＮＡ断片はその後、オックスフォード大学出版より出版された「実用的手法」というシリーズ名のもの（「ＤＮＡクローニング  ２：発現系」，１９９５；「ＤＮＡクローニング  ４：哺乳類系」，１９９６；「タンパク質の発現」，１９９９；「タンパク質精製技術」，２００１）を含めて、クローン化および組み換えタンパク質を産生する方法についての本および総説中に記載されている通りの方法で、原核または真核宿主細胞中で発現させるための、より好適なベクターへ導入され得る。
【００５６】
真核宿主細胞（例えばイースト、虫または哺乳類の細胞）において、異なる転写および翻訳調節配列は、宿主の性質に依存して使用されてもよい。それらは、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス、シミアンウィルスなどのようなウィルス源由来であり、そしてそこで、調節シグナルは、高レベルに発現している特定の遺伝子と関わりがある。具体例は、ヘルペスウィルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、イーストｇａｌ４遺伝子プロモーターなどである。転写開始調節シグナルは、一過性の（または恒常的）抑制および活性化ならびに遺伝性発現を調節することができるように選択されるかもしれない。
【００５７】
組み換えタンパク質をコードしている配列は、例えば、コドンの利用および制限部位が、クローン化に、ならびに特定のベクターおよび宿主細胞中において組み換えタンパク質を発現させるために最も好適であるＤＮＡ配列を選択するためのソフトウェアを使用して決定され得る、ＤＮＡレベルのみでの修飾を行うために、順応され、そして再クローン化され得る（Ｇｒｏｔｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，２００５；Ｃａｒｔｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００５８】
さらなるクローニング化段階中において、タンパク質配列は、所望の抗体形態（Ｓｃｆｖ，Ｆａｂ、抗体フラグメント、完全ヒト抗体など）と関連して、または一またはそれ以上の内部アミノ酸の導入、置換または除去と関連して付加され得る。これらの技術はまた、構造上、および機能上のさらなる性質決定、ならびに一般的にはタンパク質の、および特に抗体の（Ｋｉｍ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）治療上の特性のさらなる最適化のために、あるいは安定なインビボ送達をすることができるベクターを製造するために（Ｆａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）使用され得る。例えば、組み換え抗体はまた、可変領域と融合している特定のＦｃ領域を選択することにより（Ｆｕｒｅｂｒｉｎｇ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ  Ｔ，２００７）、一本鎖抗体断片を作製することにより（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、および安定なペプチド配列（国際公開第０１／４９７１３号）、ポリマーまたは化学的に修飾された残基を有する放射化学物質（Ｃｈａｐｍａｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）を付加することにより、構造および／または活性のレベルで修飾され得る。
【００５９】
組み換えタンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、好適なエピソーム中へ、または非相同的もしくは相同的な組み込みベクター中へ挿入されると、形質転換するための幾つかの好適な手段（形質転換、接合、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、直接的マイクロインジェクションなど）によって適切な宿主細胞に導入され得る。特定のベクターを選択する時、考えられ得る重要な要素は：ベクターを含む宿主細胞が認識および選択される容易さ；所望のベクターのコピー数；および、ベクターが異なる種の宿主細胞間で「シャトル」できるかどうか、を含む。
【００６０】
導入されたＤＮＡによって安定に形質転換された細胞は、発現ベクターを含む宿主細胞の選択をすることができる、一またはそれ以上のマーカーを同様に導入することによって選択され得る。当該マーカーはまた、栄養要求性の宿主への光合成栄養、殺生物剤、例えば抗生剤、または銅のような重金属、に対する抵抗性などを提供してもよく、そして必要であれば、切断可能または抑制されてもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ遺伝子配列と直接に結合されているか、または同時形質移入によって同じ細胞中へ導入され得る。さらなる転写制御因子はまた、最適な発現のために必要とされてもよい。
【００６１】
宿主細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれかであってよい。原核宿主細胞の中で好ましいものは、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはＥ．コリである。真核宿主細胞の中で好ましいものは、イースト、昆虫または哺乳類細胞である。特に、ヒト、サル、マウス、（バキュロウィルスを基盤とした発現系を用いた）昆虫および（実施例中に示されるような）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、正確な折り畳み、または正確な部位への特定の形式のグリコシル化を含む、タンパク質分子への翻訳後修飾を提供する。同様に、イースト細胞は、グリコシル化を含む、翻訳後ペプチド修飾を行うことができる。強力なプロモーター配列、およびイースト中で所望のタンパク質の産生のために利用される高コピー数のプラスミドを利用する、多くの組み換えＤＮＡ手法が存在する。イーストは、クローン化哺乳類遺伝子産物中のリーダー配列を認識し、そしてリーダー配列を有するペプチド（すなわちプレペプチド）を分泌する。
【００６２】
発現のための宿主として利用可能な哺乳類培養細胞株は、当該分野において既知であり、そしてアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から利用可能な、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、サル腎臓（ＣＯＳ）、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ，ＨＥＫ２９３、Ｐｅｒ．Ｃ６、ボウズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマ、およびヒト肝細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）ならびにその他の培養細胞株を含むが、それらに限定されない、多くの不死化培養細胞株を含む。バキュロウィルス系において、バキュロウィルス／昆虫発現系のための原料は、キット形態で市販されている（例えば、インビトロジェンによって商品化されている）。
【００６３】
組み換えポリペプチドの長期間、高収率の産生において、安定な発現が好ましい。例えば、興味のあるポリペプチドを安定に発現する培養細胞株は、ウィルス性の複製および／または内因性発現要素、ならびに同じまたは別のベクター上に存在する選択可能なマーカー遺伝子を含んでもよい発現ベクターを使用して形質転換されてもよい。ベクターの導入の後に、細胞は、それらが選択培地に切り替えられる前に、強化培地中で一日またはそれ以上の日数の間培養されてもよい。選択可能なマーカーの目的は、選択に対する抵抗性を付与することであり、そしてその存在によって、導入された配列を首尾よく発現することができる細胞の増殖および回収をすることができる。安定に形質転換された細胞の抵抗性クローンは、細胞の種類に対して好適である組織培養技術を使用して増殖されてもよい。そのような細胞の十分に豊富な培養細胞株はその後、安定な培養細胞株を提供するために単離され得る。
【００６４】
完全組み換えヒト免疫グロブリンの場合において、重要な段階は、特定のアイソタイプおよび定常領域の選択である。所望のアイソタイプおよびサブタイプ（例えば、ヒトＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４）を有する抗体を発現するために特に設計されたベクターは、広く文献に記載されている。その結果、完全抗体または融合タンパク質は、原核細胞生命体（例えばエスケリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  Ｈ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ  Ｋ，２００５；Ｖｅｎｔｕｒｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，２００２）、植物（Ｍａ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，２００５）、または真核細胞中において組み換えタンパク質として発現されることができ、そしてそれは、一過性の、または安定な形質転換細胞として高レベルの発現をすることができる（Ｄｉｎｎｉｓ  Ｄ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｄ，２００５）。これは、抗体の性質決定が、インビボアッセイを含めて、より洗練されたアッセイを用いておこなわれなければならないときに、そしてそこで、抗体の半減期が決定され得るときに特に必要とされる。宿主細胞は、組み換えタンパク質の発現レベルに基づいて、さらに選択され得る。
【００６５】
さらに、タンパク質が、特に抗体として真核宿主細胞（特に哺乳類培養細胞株）中で発現されるとき、異なるベクターおよび発現系が、形質移入された培養細胞株の安定なプールを生じさせるために設計された（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂｉａｎｃｈｉ  Ａ  ａｎｄ  ＭｃＧｒｅｗ  Ｊ，２００３）。組み換え抗体の高レベルの、最適化された、安定な発現はまた、細胞培養条件の最適化によって（Ｇｒｕｎｂｅｒｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｙｏｏｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、およびより高レベルの抗体産生ならびに分泌を行うクローンを選択または設計することによって（Ｂｏｈｍ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｂｕｔｌｅｒ  Ｍ，２００５；）達成された（Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００６６】
抗体、抗体断片、生理活性ペプチド、融合タンパク質、およびｈＣＭＶと結合ならびに中和できる、上に定義した他のタンパク質は、細胞培養または合成精製品のいずれかからの非組み換え／組み換えタンパク質の単離をすることができる、確立した技術によって精製され得る。これらの技術は、ｈＣＭＶに関連のある予防的、診断的および治療的使用のための、より広範囲な性質決定および検証を行うために十分なタンパク質を（マイクログラムからミリグラムの範囲で）提供するはずである。この目的のために、組み換え、または天然型タンパク質の調製物は、インビトロまたはインビボアッセイ（生化学的、組織または細胞を基盤としたアッセイ、げっ歯類または霊長類で確立された疾患モデル、親和性を測定するための生物物理学的手法、エピトープマッピングなど）において、特に実施例またはｈＣＭＶ病理学および免疫生物学の研究に関する、開示されてある任意のものを使用して試験され得る。
【００６７】
ヒトＢ細胞上清由来の調製物から精製された、または組み換えタンパク質として発現された抗体は、文献既知の、組織または細胞を基盤としたインビトロアッセイを用いてさらに評価され得る（Ｅｇｇｅｒｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｌａｍ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ，２００６；Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｆｏｒｔｈａｌ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｇｏｏｄｒｕｍ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。さらに、関連のある前臨床試験が、ｈＣＭＶ感染動物において、特にヒト宿主細胞が移植されたモデルにおいてなされ得る（Ｂａｒｒｙ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｇｏｓｓｅｌｉｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｔｈｏｍｓｅｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００６８】
本発明の組み換えタンパク質の精製は、この目的のために知られた任意の従来法、すなわち、抽出、沈殿法、クロマトグラフィーなどに関する任意の方法によって行われ得る。特に、抗体精製の方法は、プロテインＡ、プロテインＧまたは合成基質に対する（Ｖｅｒｄｏｌｉｖａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｒｏｑｕｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、あるいは特定の抗原またはエピトープに対する（Ｍｕｒｒａｙ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｊｅｎｓｅｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、抗体の強い親和性を利用した、カラム中に含まれる固定化されたゲルマトリクスを使用して行われ得る（Ｎｉｓｎｅｖｉｔｃｈ  Ｍ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅｒ  Ｍ，２００１；Ｈｕｓｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｈｏｒｅｎｓｔｅｉｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。洗浄後、タンパク質はｐＨまたはイオン強度を変化させることによって、当該ゲルから溶出される。または、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）が使用され得る。溶出は通常、タンパク質の精製において用いられる水−アセトニトリルを基盤とした溶媒を使用して行われ得る。
【００６９】
抗体、抗体断片、生理活性ペプチド、融合タンパク質、および２６Ａ１抗体の配列を使用する、上に定義した他のタンパク質は、ｈＣＭＶ感染の検出、治療、阻害、予防および／または寛解のために使用され得る。この目的のために、そのような化合物は、ｈＣＭＶ感染に対応するための診断用、治療用または予防用の組成物を調製するために使用され得る。
【００７０】
特に、そのような化合物は、幾つかの薬学的に許容され得るビヒクルまたは担体とともに、医薬組成物を調製するために使用され得る。これらの組成物は、ワクチン、ｈＣＭＶ中和抗体、静注用免疫グロブリン調製物、免疫調整性化合物および／または抗ウィルス化合物のような、幾つかの追加の治療薬または予防薬をさらに含んでもよい。文献は、ｈＣＭＶ複製に作用する化合物（フォスカルネット、バンガンシクロビル（Ｖａｎｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ホミビルセンまたはガンシクロビル）、およびヒトにおいて単剤でまたは静注用免疫グロブリン調製物との併用で既に試験された化合物の幾つかの例を提供する（Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑ  Ｅ，２００３；Ｎｉｇｒａ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。
【００７１】
さらに、最近の文献は、ヒトモノクローナル抗体が、静注用免疫グロブリン調製物および／または抗ウィルス化合物のような現在の治療を補完する（および可能ならば置き換わる）ために使用されることができ、そしてそれが、医薬組成物の投薬回数および／または用量を減らす機会を与えることを示唆している（Ｂａｙｒｙ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００７２】
これらの組成物は、抗体、抗体断片、生理活性ペプチド、融合タンパク質およびヒト２６Ａ１モノクローナル抗体の配列および活性に基づく、上に定義した他のタンパク質を含んでもよい。当該組成物は、異なるｈＣＭＶ中和抗体、静注用免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）調製物および／または抗ウィルス化合物をさらに含んでもよい。異なるｈＣＭＶ中和抗体は、既に文献に記載されている、または欧州特許出願第０７１１４７８２号明細書、第０７１１５４１０号明細書、および第０７１１１７４１号明細書（それぞれ１０Ｂ７、８Ｃ１０、１Ｆ７）に記載されているものであって、ｇＨ、ｇＢ，または他のｈＣＭＶ抗原と関わりのあるもののような、異なるエピトープによって性質決定されるべきである。実際、文献は、ウィルスまたはヒト標的に向かう二またはそれ以上の抗体が医薬組成物と結合している時、得られる組成物が単なる相加効果ではなく、特定の相乗効果による、改善された治療有効性を有するかもしれない多くの例を示している（Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ  Ｔ，２００７）。
【００７３】
任意のタンパク質（例えば抗体、抗体断片、融合タンパク質、生理活性ペプチド）および上に定義した核酸を含む組成物は、ｈＣＭＶ関連の診断、治療または予防目的で、患者に使用および投与され得る。これらの組成物は、ｈＣＭＶビリオンを標的とすることによって、治療患者におけるウィルスの増殖を阻害し、そして集団におけるウィルス感染の発生を潜在的に阻害することができる治療用化合物（特に治療用抗体または治療用抗体断片）を提供する、ｈＣＭＶ特異的受動免疫のための手段として投与され得る。
【００７４】
特定の使用に応じて、当該組成物は、より長い期間またはより短い期間における、被験者（特に妊婦、またはｈＣＭＶもしくはｈＣＭＶ感染者と接触をしたためにｈＣＭＶに対するリスクがあると考えられるその他の患者）に対する化合物を提供するはずである。この目的のために、当該組成物は、単回投与でまたは複数回投与で、および／または好適な装置を用いて、異なる経路：すなわち筋肉内、静脈内、皮下、局所、粘膜を通じて、噴霧器もしくは吸入器により、点眼剤として、生物分解性のないマトリクス物質中において、または微粒子の薬物送達系を使用して、投与され得る。特に、当該組成物を局所的投与または眼球投与してもよく、そしてそれは、粘膜および眼にｈＣＭＶが存在する場合において有用な方法を示している。さらに、抗体および抗体断片は、創傷（Ｓｔｒｅｉｔ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，２００６）、角膜（Ｂｒｅｒｅｔｏｎ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）または膣（Ｃａｓｔｌｅ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）に、局所的に投与されたとき、有効であり得る。
【００７５】
本発明の医薬組成物は、十分な期間、その活性を発現するために化合物を投与できる被験者に対して、治療用にまたは予防用に有効な量の化合物を提供するはずである。所望の効果は、ｈＣＭＶの感染、再活性化、および／または再感染を調節することによって、ならびに網膜炎または肺炎のような、ｈＣＭＶ感染の少なくとも幾つかの臨床症状を減らすことによって、ｈＣＭＶ患者の状態を改善することである（Ｌａｎｄｏｌｆｏ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。例えば、当該組成物は、投与経路、投与回数、および患者の状態に依存するが、約０．００５から約５０ｍｇ／ｋｇ／体重の有効量で投与されるべきである。
【００７６】
診断的用途を有する組成物の場合において、当該化合物は、生体サンプル中のウィルスを検出するための、臨床および研究室において一般的に確立された技術（例えばＥＬＩＳＡまたは他の血清学的アッセイ）を使用して、あるいはインビボで、被験者において投与後少なくとも１、２、５、１０、２４時間またはそれ以上経過したときに検出されるべきである。ｈＣＭＶの検出は、本発明のタンパク質を使用して、インビトロで得られたデータと臨床状態との間に相関がある場合において、免疫応答性の、および免疫不全の宿主の両方のリスクのある集団において、慢性のまたは急性のｈＣＭＶ感染を観察するための確立された既知の手法および手順と置き換えて、または組み合わせて行なわれ得る（Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｇ，２００２；Ｇｅｒｎａ  Ｇ  ａｎｄ  Ｌｉｌｌｅｒｉ  Ｄ，２００６；Ｌａｚｚａｒｏｔｔｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。
【００７７】
ｈＣＭＶもしくはｈＣＭＶ関連疾患の治療、予防または診断法は、上で定義したタンパク質または核酸の投与を含み得る。当該方法は、異なるｈＣＭＶ中和抗体、静注用免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）調製物および／または抗ウィルス化合物の投与をさらに含んでもよい。
【００７８】
臨床開発および臨床的使用は、抗体の薬物動態および薬物力学に（Ｌｏｂｏ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；Ａｒｉｚｏｎｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、前臨床および臨床の安全性試験のデータに（Ｔａｂｒｉｚｉ  Ｍ  ａｎｄ  Ｒｉｓｋｏｓ  Ｌ，２００７）、ならびにヒトに対する治療およびインビボ診断のために使用されるべきモノクローナル抗体の産生および品質調整のための国際的基準の遵守（Ｈａｒｒｉｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．２００４）に基づいて行なわれるべきである。
【００７９】
本発明のタンパク質はまた、ｈＣＭＶ関連性またはｈＣＭＶ付随性疾患として定義され得る、他のより蔓延している（心血管系および自己免疫疾患または幾つかの種類の癌のような）疾患を検出、治療、阻害、予防および／または寛解するための組成物の調製のために使用され得る。このウィルスは、（Ｆｃ受容体、細胞接着分子、ケモカインおよびサイトカインの発現を刺激することによる）細胞性／免疫性炎症疾患過程、（例えばアテローム性動脈硬化、再狭窄における）自己免疫活性、および（ＭＨＣクラスＩおよびIIの発現を阻害することによる）例えば血管中および活発に増殖している細胞中における、細胞のアポトーシス、分化、および遊走につながる抗原提示経路の変化、と関わりがあることがよく知られているため、これらの条件において、ｈＣＭＶは、可能性のある補助因子と考えられる（Ｃｉｎａｔｌ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，２００４；Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ−Ｎａｕｃｌｅｒ  Ｃ，２００６ｂ）。
【００８０】
さらに、ｈＣＭＶ感染はまた、細胞代謝の変化（Ｍｕｎｇｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、抑制（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）または血栓事象に対する危険因子（Ｆｒｉｄｌｅｎｄｅｒ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）と関わりがあることが判明した。ｈＣＭＶの再活性化および関連のある合併症はまた、癌患者において（Ｓａｎｄｈｅｒｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｈａｎ  Ｘ，２００７）、または炎症性結合組織疾患を患っている患者において（Ｙｏｄａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）、および通常、副腎皮質ステロイドのような免疫抑制治療（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）下にある、または化学療法および他の抗体を基盤とした免疫抑制療法（Ｏ‘Ｂｒｉｅｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）下にある患者において見られた。
【００８１】
本発明は、以下の実施例によってこれから記載されるが、それはいかなる場合においても本発明を制限するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００８２】
実施例１：ｈＣＭＶの感染力を中和するヒトモノクローナル抗体を分泌する細胞培養の製造
材料および方法
血清中にｈＣＭＶを中和するＩｇＧ抗体を有する、ヒト提供者の選択
これらのｈＣＭＶ特異的アッセイを、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５６８７１に記載されている通りに、または下記に要約された、文献記載の通りに行なった。
【００８３】
ｈＣＭＶ中和抗体を、ヒト胎児肺線維芽細胞（ＨＥＬＦ細胞）およびｈＣＭＶ  ＡＤ１６９株（ＡＴＣＣ，ｃｏｄ．ＶＲ−５３８由来のｈＣＭＶ実験室株）を基盤にしたｈＣＭＶマイクロ中和アッセイに従って検出した。
【００８４】
ｈＣＭＶマイクロ中和アッセイを、同様に、内皮親和性ｈＣＭＶ  ＶＲ１８１４株、妊婦の頸部スワブから回収された臨床分離株の誘導体（Ｒｅｖｅｌｌｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、およびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて行なった。これらの細胞を、臍帯血の酵素処理によって、および２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト組み換え血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ヒト上皮細胞増殖因子（ｈＥＧＦ）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−１）、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、ヘパリン、ゲンタマイシンおよびアムホテリシンＢ（それぞれ１μｇ／ｍｌ）を加えた内皮細胞増殖培地（ＥＧＭ−２、ケンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）バイオサイエンス）中で培養した。実験を、第２〜６継代の細胞を用いて行なった。
【００８５】
臨床および実験室株を使用した、ｈＣＭＶ感染および複製を研究するためのＨＥＬＦおよびＨＵＶＥＣ細胞の利用は、多くの論文に記載されている（Ｇｅｒｎａ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。本発明の場合において、当該細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＮａＰ）、およびＧＰＳ（２ｍＭ  グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を有するミニマムエッセンシャル培地（ＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含む、１００μｌの増殖培地入りの、９６ウェルプレートの平底のウェル上に蒔いた（２．０〜２．５ｘ１０4／ウェル）。細胞を、３７℃で２４時間培養した。
【００８６】
５０μｌの抗体を含む（ヒト血清、細胞培養上清、またはプロテインＡで精製された、指示濃度の天然型もしくは組み換えＩｇＧの）サンプルを、実験室株ｈＣＭＶ  ＡＤ１６９（５％ＦＣＳを有する５０μｌのＭＥＭ中、５００プラーク形成単位（ｐｆｕ）；混合物の合計量は１００μｌ）で、３７℃で１時間、インキュベートした。抗体調製物およびウィルスの混合物にその後、ＨＥＬＦ細胞単層（ｈＣＭＶ  ＡＤ１６９およびＡＬ−１株に対して）またはＨＵＶＥＣ細胞単層（ｈＣＭＶ  ＶＲ１８１４に対して）を添加し、そして１時間インキュベートした。増殖培地を細胞単層から除去し、そして抗体−ウィルス混合物と交換した。プレートをその後、２，０００ｇで３０分間遠心分離し、そして５％ＣＯ2存在中、３７℃で９０分間インキュベートした。増殖培地（１００μｌ）を添加し、そして当該培養を恒温器中でさらに７２時間保存した。
【００８７】
ｈＣＭＶの感染力におけるＢ細胞上清の効果を、間接的免疫ペルオキシダーゼ染色によって、ｈＣＭＶ中間体早期抗原（ＩＥ１＋ＩＥ２）を染色することによって測定した。細胞単層を、（−２０℃で保管された）アセトン／メタノール溶液で１分間固定化し、その後、ＰＢＳで洗浄した。当該細胞を、１％Ｈ2Ｏ2を含んだ０．１％トリトンＸ−１００のＰＢＳ溶液中で、氷上で５分間透過処理し、その後ＰＢＳを用いて洗浄した。内因性ペルオキダーゼを、５０％メタノールおよび０．６％Ｈ2Ｏ2入りのＰＢＳを用いて、暗所中において室温で３０分間阻害し、その後ＰＢＳで洗浄した。５０μｌのタンパク質遮断薬（ウルトラ  テック（Ｕｌｔｒａ  Ｔｅｃｈ）ＨＲＰ５００〜６００テスト；ストレプトアビジン−ビオチン万能検出系；ＰＮ  ＩＭ２３９１）を室温で１０分間付加し、それからＰＢＳを用いて洗い流した。マウス抗ＨＣＭＶ  ＩＥＡ（クローンＥ１３；アルジーン  バイオソフト（Ａｒｇｅｎｅ  Ｂｉｏｓｏｆｔ）；１１−００３参照）をウェルへ室温で６０分間付加した。洗浄後、細胞を５０μｌのビオチン結合性二次抗ヒトＩｇＧ（ウルトラ  テックＨＲＰ５００〜６００テスト；ストレプトアビジン−ビオチン万能検出系；ＰＮ  ＩＭ２３９１）、またはペルオキシダーゼ結合性ヤギ抗マウスＩｇＧ（ウルトラテックＨＲＰ）と共に１０分間インキュベートした。ＤＡＢ基質（Ｍｅｒｃｋ；ｎｏ．１．０２９２４．０００１）の０．１％Ｈ2Ｏ2溶液を、暗所にて２０℃で３０〜４５分間添加し、そして反応を、ＰＢＳを用いて希釈することにより停止した。ＩＥＡ−陽性の核を顕微鏡で数えた。
【００８８】
培地のみ、または無関係のＩｇＧ抗体を含む細胞上清を、陰性対照として使用した。ｈＣＭＶ血清陽性の患者の血清から精製された、ヒトＩｇＧの市販の調製物（サイトテクト；バイオテスト（Ｂｉｏｔｅｓｔ））を、１２５μｇ／ｍｌから始めて希釈させながら、陽性対照として使用した。陽性を、陰性対照ウェルと比較して、ＩＥＡ陽性細胞を≧４０％阻害するものとして定義した。
【００８９】
Ｒｅｅｄ−Ｍｕｎｃｈ法を使用して計算された５０％阻害の終点は、中和力価（ＮＴ）と考えられるだろう：
ＮＴ＝抗体希釈の逆数［＞５０％阻害］ｘ［（５０％超の％阻害−５０％）／（５０％超の％阻害−５０％未満の％阻害）］
【００９０】
ｈＣＭＶエンベロープ糖タンパク質ｇＢまたはｇＨの領域と結合するＩｇＧ血清の存在に基づいたヒト提供者の選択
ｈＣＭＶ特異的結合アッセイを、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５６８７１に記載されている通りか、または製造業者によって指示された通りに行い、そしてＣＭＶ特異的ＩｇＧ抗体の市販混合物（サイトテクト、バイオテスト）を用いて検証した。血清を、市販である、ｈＣＭＶビリオンタンパク質と結合するヒトＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡ（ＢＥＩＡ−ＣＭＶ  ＩｇＧ  Ｑｕａｎｔ；Ｂｏｕｔｙ，ｃｏｄ．２１４６５）、および同様に市販である、ｇＢ（ＡＤ２）ｈＣＭＶ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ（ＣＧ３抗原バイオテストＡＧ，ｃｏｄ．８０７０３５；図１Ａ）を用いて試験した。
【００９１】
すなわち、失活した（実験室株ＡＤ１６９由来の）ｈＣＭＶタンパク質混合物で覆われた壊れやすい条片を、マイクロプレート中に置き、そして（８００μｌのＢＥＩＡ系のサンプル希釈液に１０μｌの上清を加えて）１：８１に希釈されたＢ細胞上清とインキュベートし、そして当該プレートを３０分間、室温でインキュベートした。洗浄サイクルの後、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した、希釈前のモノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（１００μｌ）を加え、そしてプレートをさらに３０分間、室温でインキュベートした。第二の洗浄サイクルの後、希釈前の基質−ＴＭＢ溶液（１００μｌ）を加え、そしてプレートを１５分間室温でインキュベートした。反応を、停止溶液（１００μｌ／ウェル）を用いて停止し、そして吸光度を４５０／６２０ｎｍにおける２つの色収差（ｂｉ−ｃｈｒｏｍａｔｉｓｍ）を用いて測定した。
【００９２】
不死化Ｂ細胞培養の製造
血清中にｈＣＭＶ中和抗体が存在しているため、急性ｈＣＭＶ感染（ＣＭＶ７）から回復した患者から、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得た。ＣＭＶ７患者由来のＰＢＭＣがその後にさらされるＥＢＶ不死化過程を、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５６８７１の技術に従って行なった。短時間で、従来法のフィコール／ハイパックを用いた密度勾配遠心法によって、ＰＢＭＣを末梢血から精製した。ＣＤ２２陽性細胞を、製造業者によって記載された通りのバリオマックス（ＶａｒｉｏＭＡＣＳ）技術（ミルテニー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）バイオテック社）を使用することによる、抗ヒトＣＤ２２被覆ビーズを用いて、新鮮なＰＢＭＣ（＞９０％中純度）から単離した。精製された細胞を、ＣｐＧ２００６（コーリー（Ｃｏｌｅｙ）、１μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（ロシュ、２００Ｕ／ｍｌ）の併用で刺激した。４日間の刺激の後、細胞を新鮮な細胞培地（ＲＰＭＩ−１６４０）で洗浄し、そしてＢ細胞を、製造業者の指示に従って、バリオマックス（ＶａｒｉｏＭＡＣＳ）技術（ミルテニー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）バイオテック社）を使用することによる、抗ヒトＩｇＧ被覆ビーズを用いてＩｇＧ陽性細胞中で高度に濃縮した。
【００９３】
選択され、および刺激された細胞を、５％ＣＯ2下、３７℃で、２４ウェルプレート中で、１０％（ｖ／ｖ）の熱失活したＦＣＳ（ウシ胎児血清）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリンを追加したＲＰＭＩ−１６４０細胞培養培地中で懸濁し、そして保存した。Ｂ９５．８細胞上清を使用して（１：１  ｖ／ｖ、１６時間）、ＥＢＶ不死化を行なった。
【００９４】
当該過程の最後に、不死化細胞を新鮮な培養培地（１０％ウシ胎児血清を付加したＲＰＭＩ１６４０）で洗浄し、そして支持細胞層（５ｘ１０5細胞／ウェルで蒔かれた、放射線を照射した同種ＰＢＭＣ）を用いて、ＣｐＧ２００６無しで（そしてＣＭＶ５ドナーから得られたＰＢＭＣから開始した過程において、ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６９７８０に記載されているＣＰＧ２００６を用いること無く）、２４ウェルプレート中で１．５ｘ１０6細胞／ｍｌの濃度で３週間培養した。
【００９５】
ｈＣＭＶ中和抗体を分泌する不死化ヒトＢ細胞の継代培養の選択
ＥＢＶにさらされてから１５日後、ｈＣＭＶ中和活性を、上記のＡＤ１６９／ＨＥＬＦを基盤としたマイクロ中和アッセイを用いて、増殖したポリクローナル細胞培養中で確認した。その後細胞を、ＣｐＧ２００６およびＩＬ−２の非存在下、１０％ＦＣＳおよび非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、１００Ｘの原液から１Ｘに希釈された；ユーロクローン（ＥｕｒｏＣｌｏｎｅ））を添加した１００μｌＩＭＤＬ中の、放射線を照射した（３０Ｇｙ）同種ＰＢＭＣ（５０，０００／ウェル）上に、２０細胞／ウェルで蒔いた。全体で４２２４個の継代培養を製造し、そして２週間後、５０μｌの同じ培地を加えた。さらに１〜２週間の培養の後、増殖および凝集した細胞を有する細胞培養上清を、ＨＥＬＦ細胞およびｈＣＭＶ株ＡＤ１６９型ｈＣＭＶ中和アッセイを使用して同時に試験した。
【００９６】
ｈＣＭＶ中和活性を示す細胞培養上清を、ｇＢ  ｈＣＭＶエンベロープ糖タンパク質または上記の全体ｈＣＭＶタンパク質領域への、ヒトＩｇＧの結合を検出するＥＬＩＳＡを使用して試験した。
【００９７】
あるいは、ｇＢまたはｇＨ型の抗原をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として製造した。ｇＢ（Ａｇ）−ＧＳＴ抗原の場合においては、ｈＣＭＶ株Ｃ１９４由来のｇＢ免疫優性領域をＧＳＴ（バイオデザイン（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ）、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ１８１０２；ＧＳ−４Ｂセファロース親和性精製、１ｍｇ／ｍｌ）と融合した。ｇＨ（Ａｇ）−ＧＳＴ抗原の場合においては、ＨＣＭＶ株ＶＲ１８１４のｇＨ糖タンパク質断片を、ＰＣＲでクローン化し、ＧＳＴ遺伝子と融合し、Ｅ．コリ中で産生し、そしてＧＳＴ親和性に基づいて、細菌細胞溶解物から精製した。組み換えｇＨ（Ａｇ）−ＧＳＴ抗原は、ｈＣＭＶ株ＶＲ１８１４由来のｇＨアミノ末端領域（アミノ酸１６〜１４４；図１Ｂ）とＧＳＴとの間におけるインフレーム融合に相当する。ＧＳＴ単体を陰性対照として使用した。
【００９８】
これらのＥＬＩＳＡを、９６ウェル形式で、一般的なＥＬＩＳＡの手順に軽微な変更を加えて適用することによって行なった。簡潔に言えば、抗原をＰＢＳ中２μｇ／ｍｌで希釈し、そして５０μｌの（細菌を使用して発現された融合タンパク質を１００ｎｇ含む）このタンパク質溶液を、ＥＩＡポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ；Ｃａｔ  Ｎｏ．４６９９４９）を被覆するために使用した。ＥＬＩＳＡプレートの被覆を４℃で一晩行い、そしてタンパク質溶液を除去した後、当該プレートを１５０μｌの洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）を用いて４度洗浄した。非特異的結合を阻害する処置を、１％のミルクを含む１００μｌのＰＢＳをそれぞれのウェルへ、３７℃で一時間分注することによって行なった。１５０μｌの洗浄緩衝液を用いた４度の洗浄サイクルの後、細胞培養由来の５０μｌの上清をそれぞれのウェル中で、３７℃で２時間インキュベートし、そして５０μｌ／ウェルの細胞培養培地を陰性対照として使用した。４度の洗浄サイクルの後、５０μｌの二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体；洗浄緩衝液中１：３０，０００希釈；Ｓｉｇｍａ，Ｎｏ．Ａ０１７０）をそれぞれのウェル中に分注し、そしてプレートを室温で１時間インキュベートした。さらに４度の洗浄サイクルの後、酵素反応を、５０μｌの基質−ＴＭＢ（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン；シグマ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｔ０４４０）をそれぞれのウェルに加えることによって、室温でさらに３０分間行なった。発色反応を、１００μｌの停止溶液（１Ｎ  硫酸）をそれぞれのウェル中に分注することによって停止し、そして吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
【００９９】
結果
血清中和抗体を誘導するものとして最もよく性質決定された（Ｑａｄｒｉ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９２；Ｋｒｏｐｆｆ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、およびＣＧ３抗原（図１Ａ）中でクローン化された、ｈＣＭＶ抗原の一つである糖タンパク質ＢのＡＤ２領域への結合に基づいて、ＥＬＩＳＡに対する強い反応性（１：６４希釈で陽性；サンプルは、ＩｇＧ  抗ｇＢが１／４またはそれ以上の希釈で存在する場合に陽性であると考えられる）と共に、ヒトＰＢＭＣを、血清中で著しいｈＣＭＶ中和力価（１：１０５希釈で５０％中和）を示すｈＣＭＶ患者（ＣＭＶ７）から得た。さらに、ＣＭＶ７の血清は、ｈＣＭＶビリオンタンパク質全体を使用した別のＥＬＩＳＡにおいて陽性であって、７４ＡＵ／ｍｌの活性を示した（サンプルは、結果が少なくとも１０ＡＵ／ｍｌであるとき、抗ｈＣＭＶ  ＩｇＧがある場合に陽性であると考えられる）。
【０１００】
ＣＭＶ７患者由来のＢ細胞を、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５６８７１およびＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６９７８０に開示されているＥＢＶ型不死化方法を用いて、ＩｇＧを分泌するＢ細胞が高度に濃縮された不死化ポリクローナル細胞培養を製造するために使用した。別の提供者（ＣＭＶ５）由来の抗ｈＣＭＶ抗体の選択について開示している後者の文献と比較して、当該継代培養を最初のバルク、すなわちＣｐＧ２００６および上清の非存在下にある不死化細胞のポリクローナル群から調製し、そして当該上清を、マイクロ中和アッセイによってｈＣＭＶ感染力を中和する抗体の存在についてまず選択し、次いで選択されたｈＣＭＶ抗原に結合する抗体についてのみ選択した。
【０１０１】
ｈＣＭＶマイクロ中和アッセイを、培養３週目において、活発に増殖している細胞群であると判明した継代培養にのみ適用した。３２４ウェル由来の上清を、はじめにｈＣＭＶ中和アッセイでスクリーニングし、これらのうちの２０上清が、少なくとも４０％までｈＣＭＶ  ＡＤ１６９株の感染力を減らすことが分かった。これらのウェル中のｈＣＭＶ結合活性について性質決定したとき、２つのみが、（ＣＧ３抗原またはｇＢ（Ａｇ）−ＧＳＴ融合タンパク質としてのいずれかである）ｇＢに対して陽性であり、（ｇＨ（Ａｇ）−ＧＳＴ融合タンパク質としての；図１Ｂ）ｇＨに対して陰性であり、そして１８ウェルは、いずれに対しても陰性であった（図２）。
【０１０２】
それぞれのウェル中に最初に蒔かれる細胞の数が少ない（２０細胞／ウェル）ために、特に、増殖し、そしてｈＣＭＶ中和ＩｇＧを分泌すると期待される不死化ポリクローナル細胞群中の細胞の発生頻度が低い場合には、ｈＣＭＶ中和活性を示すそれぞれの継代培養は、モノクローナル抗体（すなわち、単一の、特定の不死化細胞によって、クローン的に得られる細胞によって分泌される抗体）を産生するであろう。これらの仮定を確認するために、さらなる実験を計画した。
【０１０３】
実施例２：２６Ａ１抗体の性質決定
材料および方法
２６Ａ１継代培養の増殖および性質決定
２６Ａ１の最初の継代培養由来の細胞を、（１０％ＦＣＳおよびＮＥＡＡを添加した）放射線を照射したＩＭＤＭ培地中の同種ＰＢＭＣ上に増殖させ、そしてｈＣＭＶ中和活性を、実施例１に記載の通りのｈＣＭＶマイクロ中和アッセイを使用して、この増殖段階の間に少なくとも２回確認した（表１参照）。
【０１０４】
２６Ａ１継代培養によって分泌される抗体量を、製造業者の指示に従って、市販の定量的ヒトＩｇＧＥＬＩＳＡキット（イムノテック（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｋ）；ｃｏｄ．０８０１１８２；ゼプトメトリクス（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ）社）を使用して、２４、４８、および７２時間で決定した。２６Ａ１抗体のサブクラスを、市販のアッセイ（ＰｅｌｉＣｌａｓｓ  ヒトＩｇＧサブクラスＥＬＩＳＡ  コンビ−キット；ｃｏｄ．＃ＲＤＩ−Ｍ１５５１ｃｉｂ，フィッツジェラルド  インダストリーズ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｌ．）のＲＤＩ部門）を使用して決定した。
【０１０５】
細胞培養は、４８ウェルプレートの一のウェル中に、９６ウェルプレートの一のウェル中に含まれる細胞（約１ｘ１０5）を、５％ＦＣＳを加えたＩＭＤＭ中にある、放射線を照射した同種のＰＢＭＣ上に蒔くことによって、徐々に増殖した。５〜７日後に、支持細胞層の非存在下、５％ＦＣＳを加えたＩＭＤＭを含む２４ウェルプレートの一のウェルに細胞が増殖した。その後、細胞（５ｘ１０5／ｍｌ）を、支持細胞層の非存在下、２．５％ＦＣＳを加えた５０％ＩＭＤＭおよび５０％ハイブリドーマ−ＳＦＭ（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）、ｃｏｄ．１２０４５−０８４）を入れた６ウェルプレートに蒔いた。細胞をこれらの条件で少なくとも１週間培養した。対数増殖期細胞を、その後洗浄し、Ｔ７５フラスコ中で、５ｘ１０5〜１０6／ｍｌの濃度のハイブリドーマ−ＳＦＭ中で培養した。細胞培養上清を回収し、ＩｇＧを定量し、そしてプロテインＡカラムで精製し、ＰＢＳ緩衝液で透析し、そしてろ過した（０．２μＭ）。
【０１０６】
２６Ａ１継代培養によって分泌された抗体の性質決定
ＢＥＩＡ−ＣＭＶ、ｇＢ型、およびｇＨ型ＥＬＩＳＡアッセイを、実施例１で記載した（図１および２）。ＨＳＶアッセイを、文献に従って行なった（Ｌａｑｕｅｒｒｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）。
【０１０７】
ｈＣＭＶプラーク減少アッセイを、ｈＣＭＶ  ＡＤ１６９株を使用して行なった。すなわち、ウィルスを１０００ＰＦＵ／反応、に希釈した。等量のウィルス（０．１ｍｌ）およびそれぞれの抗体または細胞培養上清を混合し、そして３７℃で１時間インキュベートした。当該混合物を、（２４ウェルプレート中の）ＨＥＬＦ細胞単層に添加し、そして３７℃で１時間吸着させた。その後、抗体−ウィルス混合物を除去し、そして１％メチルセルロース重層−ＭＥＭ−２％ＦＣＳを感染細胞に加えた。感染後１０または１２日目で感染力の基準として、プラーク数を数えた。
【０１０８】
２６Ａ１細胞培養上清を、非感染のＨＥＬＦまたはＨＵＶＥＣ細胞上で免疫蛍光法を用いて試験した。すなわち、細胞（７ｘ１０4／ｍｌ）を、２４ウェルプレート中に、１０％ＦＣＳを添加したＭＥＭ中で、ゼラチンで被覆したカバーグラス上に蒔き、それから半集密に増殖させた。細胞をその後、暖めたＰＢＳを用いて２度洗浄し、あらかじめ冷却した（−２０℃）５０％アセトン／５０％メタノールの混合液で、室温（ＲＴ）で１分間固定化し、それからＰＢＳで洗浄した。固定化された細胞を、０．２％トリトン  Ｘ−１００のＰＢＳ溶液を用いて、２０分間氷上で透過処理し、ＰＢＳで洗浄し、そして停止溶液（２％ＦＣＳを添加したＰＢＳ）を用いて、ＲＴで１５分間インキュベートした。あるいは、固定化された細胞を、抗体が細胞表面の構成要素を認識する能力を決定するために、透過処理しなかった。この場合において、固定化された細胞をＰＢＳで洗浄し、停止溶液（２％ＦＣＳを添加したＰＢＳ）を用いてＲＴで１５分間インキュベートし、そして２６Ａ１細胞培養上清（８０μｌ）とともに３７℃で２時間インキュベートした。細胞をその後、暖めたＰＢＳを用いて洗浄し（３度）、そして８０μｌのＦＩＴＣ結合性ウサギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）2（ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ））とともにインキュベートし、緑色のヒトＩｇＧ着色を検知した。二次抗体を０．０５％のＴｗｅｅｎ８０を添加したＰＢＳで１：５０に希釈し、そして細胞へ暗所下、３７℃で１時間添加した。その後細胞を、暖められたＰＢＳで洗浄し（３度）、そしてヨウ化プロピジウム（０．２５μｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液；シグマ）を用いて対比染色した。カバーグラスを、マウンティング培地（ベクター・ラボラトリーズ）を使用したスライドグラス上にのせた。画像をオリンパス  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ−ＩＸ７０倒立型共焦点レーザー顕微鏡を用いて記録した。
【０１０９】
２６Ａ１  ＩｇＧ  ＤＮＡ／タンパク質配列および組み換え発現の特徴付け
初期２６Ａ１細胞培養の発現から得られた細胞培養の一定分量を、フュージョン・アンチボディーズ（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）社によって確立された技術に従って、２６Ａ１抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）可変領域の配列決定のために使用した。（少なくとも５０，０００個の細胞を含む）凍結細胞のペレットを、全てのＲＮＡを抽出するために使用した。対応するｃＤＮＡを、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた逆転写によって製造した。ＩｇＧ特異的プライマー混合物を使用してＶＨ領域を、およびＩｇｋ／λプライマーの混合物を使用してＶＬ領域を増幅するために、ＰＣＲ反応を行なった。２つの増幅反応のＰＣＲ産物を、シーケンシング・ベクター（ｐＣＲ２．１；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中のＥｃｏ  ＲＩ制限部位を使用してクローン化し、そしてＴＯＰ１０  Ｅ．コリ細胞を形質転換するために使用した。
【０１１０】
二つの形質転換体から得られた、少なくとも１０個の選択されたコロニーを取り出し、そして配列決定により分析した。得られたＤＮＡ配列を整列化し、そしてＶＨ  ２６Ａ１のコンセンサスＤＮＡおよびタンパク質配列（それぞれ配列番号４、および配列番号５）ならびにＶＬ  ２６Ａ１のコンセンサスＤＮＡおよびタンパク質配列（それぞれ配列番号９および１０）を生じるタンパク質配列へと翻訳した。ＶＨ  ２６Ａ１およびＶＬ  ２６Ａ１タンパク質配列を、公有のデータベースに存在する配列と（ＧｅｎｏｍｅＱｕｅｓｔ、ＧｅｎｅＳｅｑ、およびＥＢＩデータベースを使用して）比較し、そして配列化した。ＶＨ  ２６Ａ１（配列番号５，７および８）およびＶＬ  ２６Ａ１（配列番号１１、１２、および１３）のタンパク質配列の性質を決定するＣＤＲを、ＩＭＧＴデータベース（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ，２００４）によって予想した。
【０１１１】
既に対応する（ヒトＩｇＧ１重鎖およびヒトＩｇラムダ鎖に対する）定常領域を含んでいる同じ発現ベクター中、および両方の抗体鎖の発現をすることができる二重プロモーターベクター中にある、コンセンサス２６Ａ１重鎖および軽鎖可変領域配列をクローン化することにより、組み換えヒト２６Ａ１モノクローナル抗体を真核細胞中で発現した。ベクター中の組み換えヒト２６Ａ１モノクローナル抗体の完全な配列を、ＤＮＡ配列決定法により確認し、そして無血清懸濁培養中で増殖するように適応し、１２５ｍｌスピナーフラスコ中に１ｘ１０6細胞／ｍｌで蒔かれたＣＨＯ  ＤＧ４４細胞（Ｄｅｒｏｕａｚｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，２００６）を一時的に形質移入するために使用した。形質移入を、３００μｇの発現ベクターと９００μｇの直鎖状２５ｋＤａポリ（エチレンイミン）との混合物を用いて行なった。培地を回収する前に、細胞をスピナーフラスコ中で６日間、５％ＣＯ2下、３７℃でインキュベートした。組み換え抗体を、製造業者による標準的なプログラムに従って、アクタ・プライム（Ａｋｔａ  Ｐｒｉｍｅ）クロマトグラフィーユニットに充填したプロテインＧカラムを使用して精製した。
【０１１２】
結果
増殖し、およびＩｇＧを分泌する細胞を含む継代培養の中で、それらの幾つかの細胞培養上清は、ｈＣＭＶ感染を中和する抗体を含んでいたが、ＥＬＩＳＡによって試験された特定の組み換え抗原ｇＢおよびｇＨに対して、著しい結合を示さなかった（図１および２）。特に、ＩｇＧ１を分泌する２６Ａ１継代培養は、より強くそしてより再現可能なｈＣＭＶ中和活性を示し、そしてそれは、より詳細な分子的および生物学的性質決定のために選択された。
【０１１３】
２６Ａ１継代培養由来の上清に含まれるＩｇＧのｈＣＭＶへの結合を、ｈＣＭＶタンパク質の混合物を含むＥＬＩＳＡ（ＢＥＩＡ−ＣＭＶ）を使用して確認した。同時に、この上清は、２つのヒト宿主細胞系における異なるｈＣＭＶ株に対して、（表１に示す通り）著しいｈＣＭＶ中和活性を示した。この活性は、上清がＨＳＶ特異的中和アッセイにおいて使用された時には観察されなかった。
【０１１４】
さらに、２６Ａ１継代培養を増殖させ、そしてｈＣＭＶ中和ヒトＩｇＧ１の発現の観点から、そのモノクローナル性を確認するために、１０細胞／ウェルでさらにサブクローニングした。実際、細胞増殖を示すウェルの中で、初代のＡＤ１６９型アッセイにおいて、５０〜９８％の範囲で、全てが中和活性を示し、そして初代の２６Ａ１継代培養を用いて得られた結果を確認した。
【０１１５】
初代の２６Ａ１継代培養における細胞を、ＩｇＧ産生のスケールアップのために使用し、そしてそれは徐々に、ＩｇＧが精製され、そしてｈＣＭＶアッセイにおいて試験される、より大きな培養を生じた。しだいに２６Ａ１培養を増殖させることにより、そして細胞培養における増殖に対する幾つかの要件（例えば支持細胞層、牛胎児血清）を排除することによって、より大きい培養を生じた。この方法を使用することにより、初代の２６Ａ１継代培養から生じたより大きな細胞培養が、約１６μｇ／ｍｌ／１０6細胞の濃度でＩｇＧ１を分泌することが実証された。より大きなこれらの培養は、支持細胞層の非存在下においても４日間の倍増時間を示し、そしてｈＣＭＶ中和活性を２ヶ月以上、培養中で維持した。
【０１１６】
ｈＣＭＶ中和アッセイを、大きな細胞培養からアフィニティクロマトグラフィーによって精製された、ヒトＩｇＧの形態である２６Ａ１抗体を用いて繰り返した。ｈＣＭＶ感染力の５０％阻害に必要な濃度（阻害濃度５０またはＩＣ５０）を評価するために、２６Ａ１  ＩｇＧを、用量−反応実験で試験した。当該結果は、プロテインＡ精製された天然型２６Ａ１  ＩｇＧの強い中和活性は、細胞種またはウィルス種のいずれにも特異的ではなく、そして、約１μｇ／ｍｌのＩＣ５０値およびいずれのアッセイにおいても１００％に達する中和効果を提供するものとして定量的に評価され得ることを示した（図３）。
【０１１７】
ＨＵＶＥＣ細胞における臨床分離株に対する、プロテインＡ精製した天然型２６Ａ１  ＩｇＧの中和活性と、市販の、ｈＣＭＶに対する高力価ＩｇＧ（ＩＶＩｇ）調製物（サイトテクト、バイオテスト）のそれとを比較した時、２６Ａ１のＩＣ５０は、この市販調製物について必要とされたものよりも２５倍低く、そしてそれは、２６Ａ１抗体の強い中和活性を実証している。
【０１１８】
２６Ａ１継代培養由来の上清中に存在する中和活性が、細胞表面分子との結合に起因することを除外するために、未感染のＨＥＬＦまたはＨＵＶＥＣ細胞を用いて、当該上清を免疫蛍光法にて試験した。このアッセイは、２６Ａ１培養によって産生されるＩｇＧ１が未感染のヒト細胞に結合しないことを示した。同じ細胞上清を関連のあるｈＣＭＶ抗原に対するＥＬＩＳＡで試験した時、当該抗体はそのようなタンパク質とは結合せず（図４）、そしてそのことは、２６Ａ１抗体が中和抗体の産生を誘導する、ｈＣＭＶエンベロープ上にある、別の未だ決定されていない抗原を認識している可能性があることを示している。
【０１１９】
２６Ａ１由来細胞培養中で分泌されたｈＣＭＶ中和抗体のモノクローナル性は、この細胞培養から得られたＩｇＧ特異的ＰＣＲ産物の配列決定によって、さらに確認された。細胞ペレットを、２６Ａ１継代培養由来の細胞を使用したＲＮＡ抽出および逆転写のために調製した。得られたｃＤＮＡをその後、ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域のための特定のプライマーを使用して、ＶＨおよびＶＬ配列を増幅するために使用した。ＰＣＲ産物をその後、細菌性細胞を形質転換するために使用されるプラスミド中にクローン化した。細菌性形質転換体を無作為に取り出し、そしてクローン化されたＰＣＲ産物の配列決定のために使用した。全てのクローンは、おそらくＰＣＲによって誘導されたエラーに起因する微小の違いを別として、ヒト２６Ａ１モノクローナル抗体の重鎖（図５）および軽鎖（図６）可変領域のコンセンサス配列およびＣＤＲを決定させる、同じＤＮＡ配列を示した。
【０１２０】
２６Ａ１抗体のＶＨおよびＶＬ領域をコードする配列は、抗体断片（ＦａｂまたはＳｃＦｖ）としての、または特定のアイソタイプおよびサブクラス（例えばＩｇＡ，ＩｇＧ１またはＩｇＧ４）を有する完全なヒト組み換え抗体内の、２６Ａ１可変領域の好適な発現のための、発現ベクター中で再クローン化され得る。これらの組み換え抗体を、好適なアッセイによって、特定のｈＣＭＶ中和活性を確認するために試験した。
【０１２１】
重鎖（図７）および軽鎖（図８）をコードするＤＮＡを、一時的発現実験においてＣＨＯ細胞を形質移入するために使用されている好適な発現ベクター中でクローン化することによって、組み換えヒト２６Ａ１モノクローナル抗体を、組み換えヒトＩｇＧ１として真核細胞中で産生した。組み換えヒト２６Ａ１モノクローナル抗体を、細胞培養上清によってアフィニティ精製し、そしてｈＣＭＶ中和のための異なる試験において試験した。マイクロ中和試験およびプラーク減少アッセイのいずれも、ＡＤ１６９／ＨＥＬＦ細胞系を用いて、試験を行なった。組み換えヒト２６Ａ１モノクローナル抗体は、約１μｇ／ｍｌの計算されたＩＣ５０を有するプロテインＡ精製された天然型２６Ａ１抗体と同程度に、効率的にｈＣＭＶ感染力を中和した（図９）。ｈＣＭＶ株と標的細胞との異なる組み合わせに基づいた中和およびプラーク減少アッセイにおいて、同様に試験が行なわれ、そして全てについて、天然型および組み換えヒト２６Ａ１モノクローナル抗体の両方において同程度の有効性が確認された（図１０）。
【０１２２】
したがって、天然型または組み換えヒトモノクローナル抗体のいずれかの形態にある、２６Ａ１抗体は、ｈＣＭＶ感染症およびｈＣＭＶ関連疾患の臨床管理のために使用され得る抗体である
【０１２３】
【表１】
2010512736.tif 000003
【０１２４】
参考文献
Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，（２００３）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．１９：１４３３〜８．
Ａｒｉｚｏｎｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）．Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．４４：９０９〜１３．
Ｂａｌｄａｎｔｉ  Ｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎａ  Ｇ，（２００３）．Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５２：３２４〜３０．
Ｂａｒｒｉｏｓ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：３３２〜８．
Ｂａｒｒｙ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．ＩＬＡＲ  Ｊ．４７：４９〜６４．
Ｂａｙｒｙ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．３：１２０〜１．
Ｂｅｎｄｔｓｅｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３４０：７８３〜９５．
Ｂｉａｎｃｈｉ  Ａ  ａｎｄ  ＭｃＧｒｅｗ  Ｊ（２００３）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８４：４３９〜４４．
Ｂｏｅｃｋｈ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）．Ｂｉｏｌ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．７：３４３〜３５１．
Ｂｏｈｍ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８８：  ６９９〜７０６．
Ｂｏｎａｒｏｓ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．７７：８９０〜７．
Ｂｏｎｄ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３３２：６４３〜５５．
Ｂｒｅｒｅｔｏｎ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）．Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．８９：１２０５−９．
Ｂｒｉｔｔ  Ｗ  ａｎｄ  Ｍａｃｈ  Ｍ，（１９９６）．Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ．３９：４０１〜１２．
Ｂｕｔｌｅｒ  Ｍ，（２００５）．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６８：２８３〜９１．
Ｃａｒｔｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．５５：２７９〜８６．
Ｃａｓｔｌｅ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）．Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５６：６１〜７６．
Ｃｈａｐｍａｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：７８０〜３．
Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ  Ｌ，（２００５）．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１０９：２９７〜３２８．
Ｃｉｎａｔｌ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．２８：５９〜７７．
Ｃｏａｑｕｅｔｔｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．３９：１５５〜６１．
Ｄａｒ  Ｌ，（２００７）．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ．１２６：９９〜１００．
Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑ  Ｅ，（２００３）．Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５１：１０７９〜８３．
Ｄｅｒｏｕａｚｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，（２００６）．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３４０：１０６９〜７７．
Ｄｉｎｎｉｓ  Ｄ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｄ，（２００５）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．９１：１８０〜９．
Ｄｕｎｍａｎ  Ｐ  ａｎｄ  Ｎｅｓｉｎ  Ｍ，（２００３）．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：４８６〜９６．
Ｅｇｇｅｒｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．５６：３５１〜８．
Ｆａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５８４〜９０．
Ｆｏｒｔｈａｌ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）．  Ｔｒａｎｓｐｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．３（Ｓｕｐｐｌ  ２）：３１〜４．
Ｆｒｉｄｌｅｎｄｅｒ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．Ａｍｅｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．３３４：１１１〜４．
Ｆｕｒｅｂｒｉｎｇ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：８３３〜４０．
Ｇａｎｄｈｉ  Ｍ  ａｎｄ  Ｋｈａｎｎａ  Ｒ，（２００４）．Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．４：７２５〜３８．
Ｇｅｒｎａ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：２３３〜８．
Ｇｅｒｎａ  Ｇ  ａｎｄ  Ｌｉｌｌｅｒｉ  Ｄ，（２００６）．Ｈｅｒｐｅｓ．１３：４〜１１．
Ｇｉｃｋｌｈｏｒｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８４：１８５９〜６２．
Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｇ，（２００２）．Ｍｅｄ  Ｊ  Ａｕｓｔ．１７６：２２９〜３６．
Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｃ  ａｎｄ  Ｂｏｉｖｉｎ  Ｇ，（２００５）．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４９：８７３〜８３．
Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．４７：１〜２０．
Ｇｉｌｐｉｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｔｒｉａｌｓ．２４：９２〜８．
Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：Ｄ７８１〜４．
Ｇｏｏｄｒｕｍ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）．ＰＮＡＳ．９９：１６２５５〜６０．
Ｇｏｓｓｅｌｉｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：  １５８７〜９３．
Ｇｒｅｉｊｅｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：１７９〜８８．
Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ｐ，（２００４）．Ｈｅｒｐｅｓ．１１（Ｓｕｐｐｌ  ２）：９５Ａ〜１０４Ａ．
Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ｐ  ａｎｄ  Ｗａｌｔｅｒ  Ｓ，（２００５）．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１８：２４１〜５．
Ｇｒｏｔｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｗ５２６〜３１．
Ｇｒｕｎｂｅｒｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．３４：９６８〜７２．
Ｈａｍｒｏｃｋ  Ｄ，（２００６）．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍｃｏｌｏｇｙ．６：５３５〜４２．
Ｈａｎ  Ｘ，（２００７）．Ｊ  Ｃｌｉｎ  ＭＩｃｒｏｂ．４５：１１２６〜３２．
Ｈａｒｒｉｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．６１：１３７〜１５４．
Ｈｅｂａｒｔ  Ｈ  ａｎｄ  Ｅｉｎｓｅｌｅ  Ｈ，（２００４）．Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：４３２〜６．
Ｈｏｒｅｎｓｔｅｉｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２７５：９９〜１１２．
Ｈｕｓｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．５１：２１７〜３１．
Ｊａｉｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：３０７〜１６．
Ｊｅｎｓｅｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２８４：４５〜５４．
ＫａＫｌ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）．Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１４３：８７０〜８０．
Ｋｅｌｌｅｒ  Ｍ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｈｍ  Ｅ，（２０００）．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．１３：６０２〜１４．
Ｋｉｍ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ．２０：１７〜２９．
Ｋｉｓｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：ｅｌ３２．
Ｋｌｅｉｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７３：８７８〜８６．
Ｋｌｅｎｏｖｓｅｋ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．Ｂｌｏｏｄ．１１０：３４７２〜９．
Ｋｎａｐｐｉｋ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２９６：５７〜８６．
Ｋｏｃｈｅｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌ．２２：２５０〜７．
Ｒｒｏｐｆｆ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．３９：１８７〜９５．
Ｋｒｕｇｅｒ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌ．２２：７５４〜６３．
Ｌａｄｎｅｒ  Ｒ，（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：８７５〜７７．
Ｌａｆｆｌｙ  Ｅ  ａｎｄ  Ｓｏｄｏｙｅｒ  Ｒ，（２００５）．Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．１４：３３〜５５．
Ｌａｍ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．９３：１０２９〜３９．
Ｌａｎｄｏｌｆｏ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．９８：２６９〜９７．
Ｌａｑｕｅｒｒｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２：６１１９〜６１３０．
Ｌａｚｚａｒｏｔｔｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｖｉｒ．Ｄｏｉ  ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｖ．２００７．１０．０１５．
Ｌｅｖｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，（２０００）．ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．１６：５９〜６５．
Ｌｏｂｏ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．９３：２６４５〜６８．
Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ  Ｔ，（２００７）．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：３９０〜４．
Ｍａ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）．Ｖａｃｃｉｎｅ．２３：１８１４〜８．
Ｍａｎｔｉｓ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：３１４４〜５２．
ＭｃＬｅａｎ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２０１２〜２２．
Ｍａｒａｓｃｏ  Ｗ  ａｎｄ  Ｓｕｉ  Ｊ，（２００７）．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：１４２１〜３４．
Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）．Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：３２９〜４１．
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）．Ｂｉｏｃｈ  Ｂｉｏｐｈｙ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１３７：２７３〜２８０．
Ｍｕｎｇｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．２：１１６５〜１１７５．
Ｍｕｒｒａｙ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｓｃｉ．４０：３４３〜９．
Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．１１：１〜１６．
Ｎａｖａｒｒｏ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．５２：４５１〜９．
Ｎｉｇｒａ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３５３：１３５０〜６２．
Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．１１：１〜１６．
Ｎｉｓｎｅｖｉｔｃｈ  Ｍ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅｒ  Ｍ，（２００１）．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．４９：４６７〜８０．
Ｏ‘Ｂｒｉｅｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．Ｃｌｉｎ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｍｙｅｌｏｍａ．７：１２５〜３０．
Ｏｈｌｉｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６７：７０３〜１０．
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）．Ｂｒａｉｎ  Ｂｅｈａｖ  Ｉｍｍｕｎ．  Ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｉ．２００７．０６．０１２．
Ｐｕｉｕｓ  Ｙ  ａｎｄ  Ｓｎｙｄｍａｎ  Ｄ，（２００７）．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２０：４１９〜２４．
Ｑａｄｒｉ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．７３：２９１３〜２１．
Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１６４：８３５〜４２．
Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０９：１〜９．
Ｒｅｖｅｌｌｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１８４：１０７８〜８１．
Ｒｏｊａｓ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２９３：７１〜８３．
Ｒｏｑｕｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２０：６３９〜５．
Ｒｏｔｈｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．６５：７１９〜２９．
Ｓａｎｄｈｅｒｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ．１７：１０５１〜９．
Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００７）Ｂｌｏｏｄ．  １０９：３２１９〜２４．
Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２１：１２２〜３３．
Ｓｃｈｌｅｉｓｓ  Ｍ，（２００３）．Ｈｅｒｐｅｓ．１０：４〜１１．
Ｓｃｈｌｅｉｓｓ  Ｍ，（２００５）．Ｈｅｒｐｅｓ．１２：６６〜７５．
Ｓｃｈｏｐｐｅｌ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２１６：１３３〜４５．
Ｓｃｈｒａｄｅｒ  Ｊ  ａｎｄ  ＭｃＬｅａｎ  Ｇ，（２００７）．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．１１２：５８〜６０．
Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８０：４５９１〜６００．
Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６７：４８９〜９６．
Ｓｍｉｔｈ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７０：３０４８６〜３０４９０．
Ｓｎｙｄｍａｎ  Ｄ，（２００６）．Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．１６：２８９〜９５．
Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ−Ｎａｕｃｌｅｒ  Ｃ，（２００６ａ）．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：２３１〜６４．
Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ−Ｎａｕｃｌｅｒ  Ｃ，（２００６ｂ）．Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．２５９：２１９〜４６．
Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  Ｈ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ  Ｋ，（２００５）．Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．４：１．
Ｓｔｒｅｉｔ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．Ｉｎｔ  Ｗｏｕｎｄ  Ｊ．３：１７１〜９．
Ｔａｂｒｉｚｉ  Ｍ  ａｎｄ  Ｒｉｓｋｏｓ  Ｌ，（２００７）．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  Ｔｏｄａｙ．１２：５４０〜７．
Ｔｈｏｍｓｅｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．６６：７３〜８２．
Ｕｒｂａｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ６６：１３０３〜１１．
Ｖｅｎｔｕｒｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３１５：１〜８．
Ｖｅｒｄｏｌｉｖａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２７１：７７〜８．
Ｘｕ  Ｊ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ  Ｍ，（２０００）．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１３：３７〜４５．
Ｗａｎｇ  Ｄ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ  Ｔ，（２００５）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０２：１８１５３〜８．
Ｗａｎｇ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ，（２００５）．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１１：５１５〜５２１．
Ｗａｔｋｉｎｓ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．６３：３４５〜５４．
Ｗｅｂｅｒ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．７１：２７０〜６．
Ｗｉｅｇａｎｄ  Ｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ  Ｌ，（２００６）．Ｉｎｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｃｌｉｎ．４６：９１〜１１０．
Ｗｉｊｋｈｕｉｓｅｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６８：１７５〜８２．
Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２４：６４９〜５５．
Ｙｏｄａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．Ｍｏｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１６：１３７〜４２．
Ｙｏｏｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２０：１６８３〜８．
【図１】
2010512736.tif 000004
【図２】
2010512736.tif 000005
【図３】
2010512736.tif 000006
【図４】
2010512736.tif 000007
【図５Ａ）】
2010512736.tif 000008
【図５Ｂ）】
2010512736.tif 000009
【図６Ａ）】
2010512736.tif 000010
【図６Ｂ）】
2010512736.tif 000011
【図７】
2010512736.tif 000012
【図８】
2010512736.tif 000013
【図９】
2010512736.tif 000014
【図１０】
2010512736.tif 000015
【配列表】
2010512736000001.app
【国際調査報告】
2010512736.tif 000016
2010512736.tif 000017
2010512736.tif 000018