(57)【要約】  Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、Nesfatinおよび／またはNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体、ならびにその抗体を用いるNesfatin-1の免疫学的検出方法および検出キットを提供すること。また、Nesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体、ならびにその抗体を用いるNesfatinの免疫学的検出方法および検出キットを提供すること。  Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、Nesfatinおよび／またはNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体、ならびにNesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体。
2010536715.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、Nesfatinとは実質的に抗原抗体反応しない抗体。
【請求項２】
以下のアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として用いることにより得られる、請求項１記載の抗体。
NSF1-C18：-Gly-Cys-Ser-Lys-Glu-Leu-Asp-Leu-Val-Ser-His-His-Val-Arg-Thr-Lys-Leu -Asp-Glu-Leu
【請求項３】
Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体。
【請求項４】
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８１、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８２、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８３、またはＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８４として寄託されているハイブリドーマにより産生される、請求項３記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、NesfatinおよびNucB１とは実質的に抗原抗体反応しない抗体。
【請求項６】
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８２、またはＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８４として寄託されているハイブリドーマにより産生される、請求項５記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
Nesfatinと抗原抗体反応するが、Nesfatin-1およびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体。
【請求項８】
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８１、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８２、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８３、またはＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８４として寄託されているハイブリドーマ。
【請求項９】
検体を、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体に接触させる工程、
検体と抗原抗体反応した抗体を検出する工程を含む、Nesfatin-1の免疫学的検出方法。
【請求項１０】
検体を、請求項７記載の抗体に接触させる工程、
検体と抗原抗体反応した抗体を検出する工程を含む、Nesfatinの免疫学的検出方法。
【請求項１１】
検体中のNesfatin-1の免疫学的検出方法であって、
請求項１〜６記載の抗体のうちから選択された２種類の抗体を用いる、免疫学的検出方法。
【請求項１２】
検体を、固相に固定された一次抗体に接触させる工程、
一次抗体が結合した検体に、標識された二次抗体を接触させる工程、ついで
検体と抗原抗体反応した二次抗体を検出する工程を含み、
一次抗体または二次抗体のうち一方が、請求項１、２、５または６のいずれかに記載の抗体であって、
一次抗体または二次抗体のうち他方が、請求項３、４、５または６のいずれかに記載の抗体である、請求項１１記載の免疫学的検出方法。
【請求項１３】
一次抗体が、請求項１または２記載の抗体であって、
二次抗体が、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８１、またはＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８３として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体である、請求項１２記載の免疫学的検出方法。
【請求項１４】
一次抗体が、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８４、またはＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８２として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体であって、
二次抗体が、請求項１または２記載の抗体である、請求項１２記載の免疫学的検出方法。
【請求項１５】
Nesfatin-1の濃度が３０ｐＭ未満である検体と、Nesfatin-1の濃度が０ｐＭである対照検体とを弁別可能である感度を有する、請求項１１〜１４のいずれかに記載の記載の免疫学的検出方法。
【請求項１６】
検体中のNesfatinの免疫学的検出方法であって、
検体を、固相に固定された一次抗体に接触させる工程、
一次抗体が結合した検体に、標識された二次抗体を接触させる工程、ついで
検体と抗原抗体反応した二次抗体を検出する工程を含み、
一次抗体または二次抗体のうち一方が、請求項７記載の抗体であって、
一次抗体または二次抗体の他方が、Nesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体である、Nesfatinの免疫学的検出方法。
【請求項１７】
Nesfatinの濃度が３０ｐＭ未満である検体と、Nesfatinの濃度が０ｐＭである対照検体とを弁別可能である感度を有する、請求項１６記載の免疫学的検出方法。
【請求項１８】
一次抗体が、請求項７記載の抗体であり、
二次抗体が、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８１、またはＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８３として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体である請求項１６または１７記載の免疫学的検出方法。
【請求項１９】
請求項１２〜１５のいずれかに記載の検出方法に用いられるNesfatin-1の検出キットであって、
一次抗体が固定された固相、および標識された二次抗体を含み、
一次抗体または二次抗体のうち一方が、請求項１、２、５または６のいずれかに記載の抗体であって、
一次抗体または二次抗体の他方が、請求項３、４、５または６のいずれかに記載の抗体である、Nesfatin-1の検出キット。
【請求項２０】
請求項１６〜１８のいずれかに記載の検出方法に用いられるNesfatinの検出キットであって、
一次抗体が固定された固相、および標識された二次抗体を含み、
一次抗体または二次抗体のうち一方が、請求項７記載の抗体であって、
一次抗体または二次抗体の他方が、Nesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体である、Nesfatinの検出キット。
【請求項２１】
検体に、標識されたNesfatin-1標準物質を混和する工程、
標識化Nesfatin-1標準物質が混和された検体に、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体を接触させる工程、
抗体と抗原抗体反応した標識化Nesfatin-1標準物質を検出する工程を含む、Nesfatin-1の免疫学的検出方法。
【請求項２２】
抗体が、請求項５または６記載の抗体である、請求項２１記載の免疫学的検出方法。
【請求項２３】
検体に、標識されたNesfatin標準物質を混和する工程、
標識化Nesfatin標準物質が混和された検体に、Nesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体を接触させる工程、
抗体と抗原抗体反応した標識化Nesfatin標準物質を検出する工程を含む、Nesfatinの免疫学的検出方法。
【請求項２４】
抗体が、請求項７記載の抗体である、請求項２３記載の免疫学的検出方法。
【請求項２５】
請求項２１または２２記載の検出方法に用いられるNesfatin-1の検出キットであって、
標識化されたNesfatin-1標準物質、およびNesfatin-1と抗原抗体反応する抗体を含み、
該抗体が、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体である、Nesfatin-1の検出キット。
【請求項２６】
請求項２３または２４記載の検出方法に用いられるNesfatinの検出キットであって、
標識化されたNesfatin標準物質、およびNesfatinと抗原抗体反応する抗体を含み、
該抗体が、請求項７記載の抗体である、Nesfatinの検出キット。
【請求項２７】
請求項１〜７のいずれかに記載の抗体を含有する食欲亢進および／または体重増加亢進のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、本発明により初めて見出された新規Nesfatin-1特異的抗体およびその用途、ならびに新規Nesfatin特異的抗体およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
肥満とは、体重（特に白色脂肪組織）が過剰にある状態であり、一般的にBody Mass Index（ＢＭＩ）が≧２５kg／ｍ2であることによって分類され、また体脂肪率では成人男性で２５％以上・成人女性で３０％以上であることでも分類される。高脂肪食を中心とした食生活や運動不足は現代において、肥満に分類される人の割合は増加の傾向にある。2000年の厚生労働省による国民栄養調査の結果では、男性においてはこの10年および20年での比較で肥満に分類される人は確実に増えており、40歳から69歳においては約３０％の人が肥満に分類される。また女性においても60歳から69歳における約３０％が肥満に分類される。
【０００３】
現在、肥満そのものよりもそれに随伴する（随伴し得る）健康障害は、臨床上の大きな問題となっており、肥満の予防や治療の医学的根拠となっている。日本肥満学会では、肥満症を「肥満に起因ないし関連する健康障害を合併するか、臨床的にその合併が予測される場合で、医学的に減量を必要とする病態」と定義し、疾患として取り扱うことを提唱している。ここで言う健康障害には、2型糖尿病や耐糖能異常のほかに、高血圧、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心・脳血管疾患、睡眠時無呼吸症候群、変形性関節症などの整形外科的疾患、月経異常などが含まれる（松澤佑次  日本臨牀  株式会社日本臨牀社発行  2003年7月28日  61巻  増刊号６「肥満症」  ｐ５−８）。また肥満に起因する疾患としては悪性腫瘍が挙げられ、特に乳ガン、子宮ガン、結腸ガン、腎臓ガン、食道ガン、膵臓ガン、肝臓ガン、胆嚢ガンの発症に関して肥満がリスクファクターとなることが報告されている（松澤佑次  日本臨牀  株式会社日本臨牀社発行  2003年7月28日  61巻  増刊号６「肥満症」  ｐ５−８、アブーアビッド（Abu-Abid）等  ジャーナル・オブ・メディシン（Journal of medicine）（ΜSA）2002年1月1日  33巻１−４号  ｐ73−86、ナイアー（Nair）等  ヘパトロジー（Hepatology）（ΜSA）  2002年7月1日  36巻1号  ｐ150−155）。さらに近年、メタボリックシンドロームと呼ばれる動脈硬化性疾患（心筋梗塞・脳梗塞など）の危険性を高める複合型リスク症候群が提唱されており、日本における脳血管障害・心血管障害は全死亡率の３０％を占めることからも注目されている。そのため、日本肥満学会・日本動脈硬化学会・日本糖尿病学会・日本高血圧学会・日本循環器学会・日本腎臓学会・日本血栓止血学会・日本内科学会は合同でその診断基準をまとめ、２００５年４月８日の日本内科学会での記者会見でその基準を公表した。それによると、内臓肥満（内臓脂肪蓄積）をリスクの中心にすえ、ウエストの周囲径が男性では８５ｃｍ以上、女性では９０ｃｍ以上あることに加えて、血清脂質異常（トリグリセリド値が１５０ｍｇ／ｄＬ以上、ＨＤＬコレステロール値が４０ｍｇ／ｄＬ未満の何れかまたは両方）、血圧高値（収縮期血圧が１３０ｍｍＨｇ以上、拡張期血圧が８５ｍｍＨｇの何れかまたは両方）、高血糖（空腹時血糖値が１１０ｍｇ／ｄＬ以上）のうちの２つ以上のリスクを持つ場合をメタボリックシンドロームと診断することとなった（日本内科学会雑誌  メタボリックシンドローム診断基準検討委員会  ２００５年４月号  ９４巻  ｐ７９４−８０９）。この基準を用いた場合、人間ドックを受診した２９０名の成人男子のうち、肥満症と診断された人が６１名（２１％）であったのに対して、メタボリックシンドロームと診断された人は２７名（９％）であり、肥満症に含まれずにメタボリックシンドロームと診断された人も９名（３％）存在したという報告もある（医学の歩み  高橋和男、齋藤  康  ２００５年  ２１３巻６号  ｐ５４９−５５４）。
【０００４】
肥満に対して、過度の体重の低下（いわゆる「やせ」）や摂食の低下（いわゆる「食欲不振」）は、生体防御（免疫）反応の低下による易感染、造血系障害、無月経または月経不順、不妊症、精神的障害、末梢神経麻痺、低血圧、骨粗訴訟症などを引き起こす原因として問題になる。一般的にBMIが＜１８．５Ｋｇ／ｍ2の場合、もしくは体脂肪率が男性では１０％以下、女性では１５％以下の場合をやせに分類する。2000年の厚生労働省による国民栄養調査では、女性においてはBMI＜１８．５Ｋｇ／ｍ2の人の割合は20歳から39歳でこの10年および20年の間で確実に増えており、20〜29歳の人においては約２４％が「やせ」に分類される。これは若年の女性において体型を気にするための意図的な摂食量の調節による可能性もある。しかしながら、この年代層で多発する中枢性摂食異常症の中の神経性食欲不振症（拒食症）などにおいては食欲自体が極度に低下して、栄養状態が悪化して全身衰弱で死亡する場合もある。また、従来胃下垂・胃アトニー・神経性胃炎と言われていた概念を含む食欲が低下する疾患として、Functional dyspepsiaと呼ばれる疾患があり、この疾患は、食後早期の満腹感、食欲低下などの症状を示すと言われている（タリィ（Talley ）等 ガット（Gut）（England） １９９９年 ４５巻 Suppl 2: ｐ1137-1142）。さらに、食欲不振を起こす原因としては癌、炎症性疾患、下垂体・甲状腺・副腎などの機能低下、手術後、過度のストレスなどが挙げられ、このような状態で長期間食欲不振が持続することは身体の衰弱を引き起こす。
【０００５】
このような状況において、近年摂食を調節する生体内因子の研究が盛んに行われており、レプチン・アディポネクチン・グレリンなどの因子と摂食調節との関連についても研究がされている。近年では、摂食や肥満に関係する物質としてNesfatin-1が報告されており（Oh-I S. et al. Nature, 443(7112):709-12, 2006）、摂食調節および／または体重調節に関与する新規因子として期待されている。
【０００６】
Nesfatin-1は既知のNucleobindin 2（NucB2）と呼ばれる420個のアミノ酸からなるタンパク質から切り出される82個のアミノ酸からなるペプチドであり、検討の結果、摂食調節の作用を有しないNucB2からNesfatin-1が生成されることによって、摂食調節の作用を示すペプチドである（国際公開第WO2006/137597号パンフレット）。このように、Nesfatin-1はNucB2の一部分の配列であることから、NucB2と共通のアミノ酸組成および配列を持つため、NucB2には結合せず、Nesfatin-1にのみ結合する抗体を取得することは常識的には非常に困難と考えられていた。そのため、生体内での活性分子であるNesfatin-1を検出する方法としては、国際公開第WO2006/137597号パンフレットに記載のように、他の物理的な手段を用いてNucB2とNesfatin-1を分離してから抗体で検出する必要があった。この方法は、検出操作の煩雑さ、分離過程における抽出精製効率の制御の困難性などの点で、実際の臨床での診断などに実用的なNesfatin-1の測定系と言えるものはなかった。また、NucB2は、同じファミリーに属するNucB1との相同性が高いため、NucB1とも交差反応しないことが望ましい。
【０００７】
また、NucB2とNesfatin-1の両者に結合する抗体は、ラットの脳内に投与することで摂食を亢進する作用を持つことが示されているが、実際の治療薬として用いるには脳内に直接治療薬を投与することは実用的ではなく、血管などから投与する形態の薬剤が望ましい。その際に血液中などにNucB1が大量に存在する場合には、NucB1と交差反応を示す抗体を投与しても実際にNesfatin-1が存在している部位に到達する前にNucB1に横取りされて、その抗体の効果を十分に発揮できない可能性がある。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明が解決しようとする課題は、Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、Nesfatin（Nucleobindin 2（NucB2））もしくはNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体、または、Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、NesfatinおよびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体を提供することである。さらには、その抗体を用いる、Nesfatin-1の免疫学的検出方法および検出キットを提供することである。
【０００９】
また、本発明が解決しようとするもう１つの課題は、Nesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体を提供することである。さらには、その抗体を用いる、Nesfatinの免疫学的検出方法および検出キットを提供することである。
【００１０】
本発明者らは、Nesfatin-1内の各種ペプチドを免疫原として用いて得られた抗体を検討することにより、Nesfatin-1内の特定の配列からなるペプチドを免疫原とすることにより、Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、NesfatinもしくはNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体、Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、NesfatinおよびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体を取得できることを見出した。さらに、Nesfatinと高感度に抗原抗体反応を示す抗体を取得し、その抗体とNesfatin-1特異的抗体を組合すことによって、高感度にNesfatin-1を免疫学的に検出する方法を見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のものに関する。
（１）Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、Nesfatinとは実質的に抗原抗体反応しない抗体（抗体Ｎｏ．４９９８、ＮＡＰ４０−２、ＮＡＦ７）。
（２）以下のアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として用いることにより得られる、（１）記載の抗体（抗体Ｎｏ．４９９８）。
NSF1-C18：-Gly-Cys-Ser-Lys-Glu-Leu-Asp-Leu-Val-Ser-His-His-Val-Arg-Thr-Lys-Leu -Asp-Glu-Leu
（３）Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体（抗体Ｎｏ．４９９４、５２２３、６１５１、６１５２、ＮＡＰ４０−２、ＮＡＥ１、ＮＡＥ３、ＮＡＦ１１）。
（４）受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８１、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８２、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８３、またはＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８４として寄託されているハイブリドーマにより産生される、（３）記載のモノクローナル抗体（抗体Ｎｏ．ＮＡＥ１、ＮＡＦ７、ＮＡＦ１１、ＮＡＰ４０−２、）。
（５）Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、NesfatinおよびNucB１とは実質的に抗原抗体反応しない抗体。
（６）受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８２、またはＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８４として寄託されているハイブリドーマにより産生される、（５）記載のモノクローナル抗体（抗体Ｎｏ．ＮＡＦ７、ＮＡＰ４０−２）。
（７）Nesfatinと抗原抗体反応するが、Nesfatin-1およびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体（４９９４、ＮＡＤ１５）。
（８）受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８１、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８２、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８３、またはＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８４として寄託されているハイブリドーマ。
（９）検体を、（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体に接触させる工程、
検体と抗原抗体反応した抗体を検出する工程を含む、Nesfatin-1の免疫学的検出方法。
（１０）検体を、（７）記載の抗体に接触させる工程、
検体と抗原抗体反応した抗体を検出する工程を含む、Nesfatinの免疫学的検出方法。
（１１）検体中のNesfatin-1の免疫学的検出方法であって、
（１）〜（６）記載の抗体のうちから選択された２種類の抗体を用いる、免疫学的検出方法。
（１２）検体を、固相に固定された一次抗体に接触させる工程、
一次抗体が結合した検体に、標識された二次抗体を接触させる工程、ついで
検体と抗原抗体反応した二次抗体を検出する工程を含み、
一次抗体または二次抗体のうち一方が、（１）、（２）、（５）または（６）のいずれかに記載の抗体であって、
一次抗体または二次抗体のうち他方が、（３）、（４）、（５）または（６）のいずれかに記載の抗体である、（１１）記載の免疫学的検出方法。
（１３）一次抗体が、（１）または（２）記載の抗体（抗体Ｎｏ．４９９８）であって、
二次抗体が、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８１、またはＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８３として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体（抗体Ｎｏ．ＮＡＥ１、または抗体Ｎｏ．ＮＡＦ１１）である、（１２）記載の免疫学的検出方法。
（１４）一次抗体が、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８４、またはＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８２として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体（抗体Ｎｏ．ＮＡＰ４０−２、または抗体Ｎｏ．ＮＡＦ７）であって、
二次抗体が、（１）または（２）記載の抗体（抗体Ｎｏ．４９９８）である、（１２）記載の免疫学的検出方法。
（１５）Nesfatin-1の濃度が３０ｐＭ未満である検体と、Nesfatin-1の濃度が０ｐＭである対照検体とを弁別可能である感度を有する、（１１）〜（１４）のいずれかに記載の記載の免疫学的検出方法。
（１６）検体中のNesfatinの免疫学的検出方法であって、
検体を、固相に固定された一次抗体に接触させる工程、
一次抗体が結合した検体に、標識された二次抗体を接触させる工程、ついで
検体と抗原抗体反応した二次抗体を検出する工程を含み、
一次抗体または二次抗体のうち一方が、（７）記載の抗体であって、
一次抗体または二次抗体の他方が、Nesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体である、Nesfatinの免疫学的検出方法。
（１７）Nesfatinの濃度が３０ｐＭ未満である検体と、Nesfatinの濃度が０ｐＭである対照検体とを弁別可能である感度を有する、（１６）記載の免疫学的検出方法。
（１８）一次抗体が、（７）記載の抗体（抗体Ｎｏ．４９９４、ＮＡＤ１５）であり、
二次抗体が、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８１、またはＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８３として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体（抗体Ｎｏ．ＮＡＥ１、ＮＡＦ１１）である（１６）または（１７）記載の免疫学的検出方法。
（１９）（１２）〜（１５）のいずれかに記載の検出方法に用いられるNesfatin-1の検出キットであって、
一次抗体が固定された固相、および標識された二次抗体を含み、
一次抗体または二次抗体のうち一方が、（１）、（２）、（５）または（６）のいずれかに記載の抗体であって、
一次抗体または二次抗体の他方が、（３）、（４）、（５）または（６）のいずれかに記載の抗体である、Nesfatin-1の検出キット。
（２０）（１６）〜（１８）のいずれかに記載の検出方法に用いられるNesfatinの検出キットであって、
一次抗体が固定された固相、および標識された二次抗体を含み、
一次抗体または二次抗体のうち一方が、（７）記載の抗体であって、
一次抗体または二次抗体の他方が、Nesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体である、Nesfatinの検出キット。
（２１）検体に、標識されたNesfatin-1標準物質を混和する工程、
標識化Nesfatin-1標準物質が混和された検体に、（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体を接触させる工程、
抗体と抗原抗体反応した標識化Nesfatin-1標準物質を検出する工程を含む、Nesfatin-1の免疫学的検出方法。
（２２）抗体が、（５）または（６）記載の抗体である、（２１）記載の免疫学的検出方法。
（２３）検体に、標識されたNesfatin標準物質を混和する工程、
標識化Nesfatin標準物質が混和された検体に、Nesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体を接触させる工程、
抗体と抗原抗体反応した標識化Nesfatin標準物質を検出する工程を含む、Nesfatinの免疫学的検出方法。
（２４）抗体が、（７）記載の抗体である、（２３）記載の免疫学的検出方法。
（２５）（２１）または（２２）記載の検出方法に用いられるNesfatin-1の検出キットであって、
標識化されたNesfatin-1標準物質、およびNesfatin-1と抗原抗体反応する抗体を含み、
該抗体が、（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体である、Nesfatin-1の検出キット。
（２６）（２３）または（２４）記載の検出方法に用いられるNesfatinの検出キットであって、
標識化されたNesfatin標準物質、およびNesfatinと抗原抗体反応する抗体を含み、
該抗体が、（７）記載の抗体である、Nesfatinの検出キット。
（２７）（１）〜（７）のいずれかに記載の抗体を含有する食欲亢進および／または体重増加亢進のための医薬組成物。
【００１２】
本発明により、Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、NesfatinもしくはNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体、ならびにNesfatin-1と抗原抗体反応するが、NesfatinおよびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体、さらには、その抗体を用いる、Nesfatin-1の免疫学的検出方法および検出キットを提供することができる。
また、本発明により、Nesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体、さらには、その抗体を用いる、Nesfatinの免疫学的検出方法および検出キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、抗原として使用したペプチド（hNSF-N19、hNSF1-C18、hNSF-C18、hNSF1-M15）のNesfatinまたはNesfatin-1内の位置を示す模式図である。なお、図１に示されるポリペプチド全長が、Nesfatinに相当し、SPはシグナルペプチド、NAP1はNesfatin-1、NAP2はNesfatin-2、NAP3はNesfatin-3を表す。
【図２】図２は、抗NesfatinＩｇＧ（抗体Ｎｏ．４９９４）固定化プレートと、ビオチン化抗体（抗体Ｎｏ．４９９４、６１５１、６１５２、６１５３）を使用する測定系の、ヒトNesfatin（Ｆ−ＮＡＰ）との反応性を示すグラフである。
【図３】図３は、抗NesfatinＩｇＧ（抗体Ｎｏ．４９９４）固定化プレートと、ビオチン化抗体（抗体Ｎｏ．６１５１、６１５２）を使用する測定系の、ラットNesfatinとの交差反応性を示すグラフである。
【図４】図４は、抗NesfatinＩｇＧ（抗体Ｎｏ．４９９４）固定化プレートと、ビオチン化抗体（抗体Ｎｏ．６１５１、６１５２）を使用する測定系の、ラットまたはマウスNesfatinとの交差反応性を示すグラフである。
【図５】図５は、抗Nesfatin-1  ＩｇＧ（抗体Ｎｏ．６１５１）固定化プレートと、ビオチン化ＩｇＧ（抗体Ｎｏ．４９９８、抗体Ｎｏ．６１５１または抗体Ｎｏ．６１５２）を使用する測定系の、ヒトまたはラットのNesfatin-1との反応性を示すグラフである。
【図６】図６は、抗Nesfatin-1  ＩｇＧ（抗体Ｎｏ．６１５２）固定化プレートと、ビオチン化ＩｇＧ（抗体Ｎｏ．４９９８、抗体Ｎｏ．６１５１または抗体Ｎｏ．６１５２）を使用する測定系の、ヒトまたはラットのNesfatin-1との反応性を示すグラフである。
【図７】図７は、抗Nesfatin-1  ＩｇＧ（抗体Ｎｏ．６１５２）固定化プレートと、ビオチン化ＩｇＧ（抗体Ｎｏ．６１５１または抗体Ｎｏ．６１５２）を使用する測定系の、ヒトNesfatin、ヒトNucB1-N77との交差反応性を示すグラフである。
【図８】図８は、抗Nesfatin-1  ＩｇＧ（抗体Ｎｏ．４９９８）固定化プレートと、ビオチン化ＩｇＧ（抗体Ｎｏ．６１５１または抗体Ｎｏ．６１５２）を使用する測定系の、ヒトNesfatin、ヒトNesfatin-1、ヒトNucB1-N77との反応性を示すグラフである。
【図９】図９は、抗Nesfatin-１ＩｇＧ（抗体Ｎｏ．４９９８）固定化プレートと、ビオチン化抗体（抗体Ｎｏ．６１５２）を使用する測定系の、ラットまたはマウスNesfatin-1との交差反応性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、抗組換えヒトNesfatin-１マウスモノクローナル抗体（NAP40-2, NAP37, NAP39）固定化プレートと、ビオチン化ＩｇＧ（ビオチン化抗体Ｎｏ．６１５１）を使用する測定系の、ヒトNesfatin-1との反応性を示すグラフである。
【図１１】図１１は、抗組換えヒトNesfatin-１マウスモノクローナル抗体（NAP40-2, NAP37, NAP39）固定化プレートと、ビオチン化ＩｇＧ（ビオチン化抗体Ｎｏ．６１５２）を使用する測定系の、ヒトNesfatin-1との反応性を示すグラフである。
【図１２】図１２は、抗組換えヒトNesfatin-１マウスモノクローナル抗体（NAP40-2）固定化プレートと、ビオチン化ＩｇＧ（ビオチン化抗体Ｎｏ．４９９８、ビオチン化抗体Ｎｏ．６１５１、ビオチン化抗体Ｎｏ．６１５２）を使用する測定系の、ヒトNesfatin-１との反応性を示すグラフである。
【図１３】図１３は、抗組換えヒトNesfatin-１マウスモノクローナル抗体（NAP40-2）固定化プレートと、ビオチン化ＩｇＧ（ビオチン化抗体Ｎｏ．４９９８、ビオチン化抗体Ｎｏ．５０３６、ビオチン化抗体Ｎｏ．５０３７）を使用する測定系の、ヒトNesfatin-１との反応性を示すグラフである。
【図１４】図１４は、抗組換えヒトNesfatin-１マウスモノクローナル抗体（NAP40-2）固定化プレートと、ビオチン化抗体Ｎｏ．４９９８を使用する測定系の、ラットNesfatin-1との交差反応性を示すグラフである。
【図１５】図１５は、抗組換えヒトNesfatin-１マウスモノクローナル抗体（NAP40-2）固定化プレートと、ビオチン化抗体Ｎｏ．４９９８を使用する測定系の、Nesfatin（Ｆｕｌｌ分子）との交差反応性を示すグラフである。
【図１６】図１６は、抗Nesfatin-１C末端ペプチドＰＡｂ(抗体Ｎｏ．４９９８)固定化プレートと、ビオチン化ＩｇＧ（ビオチン化ＮＡＥ１）を使用する測定系の、ヒトNesfatin-１との反応性を示すグラフである。
【図１７】図１７は、抗Nesfatin-１C末端ペプチドＰＡｂ(抗体Ｎｏ．４９９８)固定化プレートと、ビオチン化ＩｇＧ（ビオチン化ＮＡＥ１、ビオチン化ＮＡＥ３）を使用する測定系の、ラットNesfatin-1との交差反応性を示すグラフである。
【図１８】図１８は、抗Nesfatin-１C末端ペプチドＰＡｂ(抗体Ｎｏ．４９９８)固定化プレートと、上記実施例１４（１）（Ａ）で作製したビオチン化ＩｇＧ（ビオチン化ＮＡＥ１）を使用する測定系の、NucB1-N77との交差反応性を示すグラフである。
【図１９】図１９は、抗Nesfatin-１C末端ペプチドＰＡｂ(抗体Ｎｏ．４９９８)固定化プレートと、上記実施例１４（１）（Ａ）で作製したビオチン化ＩｇＧ（ビオチン化ＮＡＥ１）を使用する測定系の、Nesfatinとの交差反応性を示すグラフである。
【図２０】図２０は、抗NesfatinＩｇＧ（抗体Ｎｏ．4994）固定プレートと、ビオチン化抗体（NAE1, NAE3, NAD15）を使用する測定系の、ヒトNesfatinに対する反応性を示すグラフである。
【図２１】図２１は、ヒトNesfatin C末端ペプチドに対するマウスモノクローナル抗体（抗体NAD15）固定プレートと、ビオチン化抗体（NAE1, NAE3）を使用する測定系の、ラットNesfatinとの交差反応性を示すグラフである。
【図２２】図２２は、抗NesfatinＩｇＧ（抗体Ｎｏ．4994）固定プレートと、ビオチン化抗体（NAE1）を使用する測定系の、ヒトNucB1との交差反応性を示すグラフである。
【図２３】図２３は、抗Nesfatin-１C末端ペプチドＰＡｂ(抗体Ｎｏ．４９９８)固定化プレートと、ビオチン化ＩｇＧ（ＮＡＦ１１）を使用する測定系の、ラットまたはマウスNesfatin-1との交差反応性を示すグラフである。
【図２４】図２４は、抗Nesfatin -１C末端ペプチドＰＡｂ(抗体Ｎｏ．４９９４)固定化プレートと、ビオチン化抗体（抗体ＮＡＦ１１）を使用する測定系の、マウスまたはラットNesfatinに対する交差反応性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、Nesfatinおよび／もしくはNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体＞
本発明は、Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、Nesfatin（Nucleobindin 2（NucB2））もしくはNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体、またはNesfatin-1と抗原抗体反応するが、NesfatinおよびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体に関する。
【００１５】
本発明において、「Nesfatin-1」とは、配列番号５〜７に示される、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドである。Nesfatin-1は、Nesfatinから、生体内のプロホルモン・コンバターゼ等の切断酵素で切り出されることにより、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を示すものである。また、本発明におけるNesfatn-1とは、配列番号５〜７のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換・欠損・挿入され、かつ摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドも含まれる。かかるポリペプチドとしては、具体的には、Nesfatinの消化に際して、切断酵素認識部位が末端に残存したポリペプチド、またはNesfatin-1の標識化の際に、１〜数個のアミノ酸が置換・欠損・挿入されたポリペプチドであって、かつ摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドなどがあげられる。
【００１６】
かかるNesfatin-1は、配列番号８〜１３のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するNESFATINポリペプチドをプロホルモン・コンバターゼで切断したのち、逆相クロマトグラフィー等で精製することにより、またはNesfatin-1ポリペプチドに対する抗体に対する結合と遊離の工程を行なうことにより取得することができる。また、実施例１のようにして組換えNesfatin-1を取得することもできる。
【００１７】
本発明における抗体の一つの様態は、Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、Nesfatinとは実質的に抗原抗体反応しない抗体である。ここでNesfatinとは、配列番号８〜１３に示されるポリペプチドをいう。「Nesfatinとは実質的に抗原抗体反応しない」とは、Nesfatin-1およびNesfatinをほぼ同じ分子数を固相に固定して、そこに各抗体を抗原抗体反応させたときの結合量が、Nesfatin-1を固定化した固相への結合量に対して、Nesfatinを固定化した固相への結合量が１/５未満の値であるものをいう。このようなNesfatin-1と抗原抗体反応するが、Nesfatinとは実質的に抗原抗体反応しない抗体は、以下のアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として用いることにより得ることができる。ここで、該ペプチドを免疫する動物としては、家兎が好ましい。
NSF1-C18：-Gly-Cys-Ser-Lys-Glu-Leu-Asp-Leu-Val-Ser-His-His-Val-Arg-Thr-Lys-Leu -Asp-Glu-Leu（配列番号１）
【００１８】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体については実施例５に、前述のNSF1-C18ペプチドをウサギに免疫することによって、Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、Nesfatinとは実質的に抗原抗体反応しない抗体が再現良く得られることが示されている。またモノクローナル抗体の例としては、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８２（寄託機関  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、受領日  ２００７年７月２７日）として寄託されているハイブリドーマ（ＮＡＦ７）により産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。また、本発明は、かかるハイブリドーマにも関する。
【００１９】
本発明における抗体の別の様態としては、Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体である。ここでNucB1とは配列番号１４〜１６に示されるポリペプチドである。また、本件明細書において、特に一次構造的にNesfatin-1との相同性の高い部分はこの発明においてはNucB1-N77と呼び、配列番号１７〜１９にその構造が示されている。なお、リコンビナントNucB1-N77は、Ｎ末端にGly-Serが残存する構造となる。また、本発明において「NucB１」といった場合には「NucB1-N77」も含まれる場合がある。「NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない」とは、Nesfatin-1およびNucB１（NucB1-N77）をほぼ同じ分子数を固相に固定して、そこに各抗体を抗原抗体反応させたときの結合量が、Nesfatin-1を固定化した固相への結合量に対して、NucB1を固定化した固相への結合量が１/５未満の値であるものをいう。
【００２０】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体の例としては、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８１、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８２、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８３、またはＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８４（寄託機関  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、受領日  ２００７年７月２７日）として寄託されているハイブリドーマ（それぞれ、ＮＡＥ１、ＮＡＦ７、ＮＡＦ１１、またはＮＡＰ４０−２）により産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。また、本発明は、かかるハイブリドーマにも関する。
【００２１】
本発明における抗体のさらに好ましい様態としては、Nesfatin-1と抗原抗体反応するがNesfatinおよびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体が挙げられる。「NesfatinおよびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない」とは、前述の「Nesfatinとは実質的に抗原抗体反応しない」における要件と、「NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない」という要件を兼ね備えていることをいう。
【００２２】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。後述の実施例に示されるように、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８２、またはＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８４（寄託機関  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、受領日  ２００７年７月２７日）として寄託されているハイブリドーマ（それぞれ、ＮＡＦ７、またはＮＡＰ４０−２）により産生されるモノクローナル抗体は、Nesfatin-1との抗原抗体反応の感度、およびNesfatinおよびNucB1との交差反応性の低さの点で、特に優れている。また、本発明は、かかるハイブリドーマにも関する。
【００２３】
さらに、本発明の抗体は、NucB1-N77とも実質的に抗原抗体反応しないことが好ましい。このような抗体としては、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８２（寄託機関  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、受領日  ２００７年７月２７日）として寄託されているハイブリドーマ（ＮＡＦ７）により産生されるモノクローナル抗体があげられる。
【００２４】
また、前述のモノクローナル抗体を取得する方法としては、それぞれ取得したい抗体を産生するハイブリドーマを培養し、得られた培養上清から常法によって抗体を精製して取得することができる。また、別の方法としては、取得したい抗体を産生するハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子、より詳細には免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を取得して、該遺伝子を発現するためのベクターを作成し、宿主細胞（哺乳類細胞、昆虫細胞、微生物等）に導入して、該抗体を産生させることも可能である。このとき、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする遺伝子について、望む形質を導入するための遺伝子改変を行ったり、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域を用いて抗体キメラタンパク質、低分子抗体やスキャフォールド抗体を作成することは、公知の技術を用いることで、当業者であれば実施することができる。
【００２５】
＜Nesfatin-1の免疫学的検出方法＞
前述の「Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、NesfatinもしくはNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体、またはNesfatin-1と抗原抗体反応するが、NesfatinおよびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体」を用いることによって、Nesfatin-1を特異的に検出しうる免疫学的検出方法を構築できる。例えば、該Nesfatin-1の免疫学的検出方法は、（Ｉ）検体を、該Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、Nesfatinおよび／またはNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体に接触させる工程、（ＩＩ）検体と抗原抗体反応した抗体を検出する工程を含む。なお、抗原抗体反応を利用した免疫学的検出方法は、当技術分野において周知であり、本発明において、従来のいずれの方法をも採用することができる。
【００２６】
そのような免疫学的検出方法の一つの形態は、Nesfatin-1と抗原抗体反応する抗体の量を測定することである。またその形態の中での一つとしては、前述の抗体の内、２つの抗体を用いる方法である。この場合、用いる抗体の望ましい組合せは、Nesfatin-1と抗原抗体反応するがNesfatinとは実質的に抗原抗体反応しない抗体と、Nesfatin-1と抗原抗体反応するがNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体との組合せ、Nesfatin-1と抗原抗体反応するがNesfatiｎとは実質的に抗原抗体反応しない抗体と、Nesfatin-1と抗原抗体反応するがNesfatinおよびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体との組合せ、Nesfatin-1と抗原抗体反応するがNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体と、Nesfatin-1と抗原抗体反応するがNesfatinおよびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体との組合せ、Nesfatin-1と抗原抗体反応するがNesfatinおよびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体2種類の組合せである。ここで、Nesfatin-1と抗原抗体反応するがNesfatinとは実質的に抗原抗体反応しない抗体と、Nesfatin-1と抗原抗体反応するがNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体との組合せにおいては、前者はNucB1との抗原抗体反応を否定できず、後者はNesfatinとの抗原抗体反応を否定できない性状を持つが、その組合せによってNesfatin-1を特異的に検出し、NesfatinおよびNucB1を実質的に検出しないようにできる。
【００２７】
この２種類の抗体を用いた免疫学的測定法においては、少なくとも一種類の抗体を固相に固定する方法と、固定しない方法が挙げられる。
【００２８】
少なくとも１種類の抗体を固相に固定化する測定方法としては、（Ｉ）検体を、固相に固定された一次抗体に接触させる工程、（ＩＩ）一次抗体が結合した検体に、標識された二次抗体を接触させる工程、ついで（ＩＩＩ）検体と抗原抗体反応した二次抗体を検出する工程を含む、サンドイッチ法による測定方法が例示される。この測定方法での二次抗体の標識は、Nesfatin-1に抗原抗体反応した抗体の量が定量するために用いられ、一般的には酵素、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質が使用される。ここで、酵素で標識した二次抗体を用いる場合には、酵素による反応で発色、発光、蛍光を発するような物質を酵素の基質として反応させて、結果として生じた発色（吸光度として測定）、発光、蛍光を定量的に測定することで、Nesfatin-1と抗体抗原反応した二次抗体の量を測定する。また同時に、Nesfatin-1を含まない対照検体における測定値（バックグランド）、Nesfatin-1の標準ペプチドを用いていくつかの異なる濃度で該ペプチドを含む標準検体についても同時に測定を行って量依存的な結合状態を示す標準検量曲線を作成し、それによって得られた結果を用いて検体中に含まれるNesfatin-1を算定することが可能である。また、この測定方法によって検出できるNesfatn-1の最低濃度はその測定系の感度を規定する。つまりNesfatin-1を含まない対照検体における測定値に対して、有意に弁別できる測定値を示すNesfatin-1の標準ペプチドを含む標準検体におけるNesafatin-1濃度として、感度を表すことができる。本発明においては、３０ｐＭという低い濃度のNesfatin-1を含む標準検体においても、Nesfatin-1を含まない対照検体との弁別が可能であったことから、この測定系は３０ｐＭ未満まで測定可能な検出感度を有するといえる。また、本発明の好ましい態様によれば、５ｐＭ未満の濃度のNesfatin-1を含む標準検体においても、Nesfatin-1を含まない対照検体との弁別が可能である。
【００２９】
このような測定系の実例としては、実施例１４に示す、一次抗体が、NSF1-C18をウサギに免疫して作成したポリクローナル抗体（抗体Ｎｏ．４９９８）であり、二次抗体が、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８１として寄託されているハイブリドーマ（ＮＡＥ１）により産生される抗体である測定系が挙げられる。かかる系では、ヒトのNesfatin-1について数ｐＭであってもNesfatin-1を含まない対照検体との弁別が可能であり、３０ｐＭ以下の感度、さらに数ｐＭ程度の感度を有していることが示された。同様に、一次抗体として抗体Ｎｏ．４９９８を用い、二次抗体として受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８３として寄託されているハイブリドーマ（ＮＡＦ１１）により産生される抗体を用いる測定系も、検体中のNesfatin-1を高感度に検出することができる。
【００３０】
また、一次抗体として、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８４として寄託されているハイブリドーマ（ＮＡＰ４０−２）により産生される、Nesfatin-1と高感度に抗原抗体反応するが、NesfatinおよびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体を使用し、二次抗体として、Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、Nesfatinとは実質的に抗原抗体反応しない本発明の抗体（抗体Ｎｏ．４９９８）を使用することによっても、検体中のNesfatin-1を高感度に検出することができる。同様に、一次抗体として受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８２として寄託されているハイブリドーマ（ＮＡＦ７）により産生される抗体を用い、二次抗体として抗体Ｎｏ．４９９８、Ｎｏ．６１５１、またはＮｏ．６１５２を用いる測定系も、検体中のヒトNesfatin-1を高感度に検出することができる。
【００３１】
２種類の抗体とも固相に固定しない方法としては、FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）法やBRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)法が挙げられる。これらの方法は、Nesfatin-1と抗原抗体反応する２種類の抗体を用い、一方の抗体に蛍光物質または発光タンパク質を結合させておき、その蛍光や発光の特定波長での光のエネルギーを吸収する蛍光物質で他方の抗体を標識しておくことで実施できる。この光エネルギーの吸収（Energy Transfer）は光を発する蛍光物質または発光タンパク質とそのエネルギーを吸収する蛍光物質がごく近傍に存在する必要があるため、２種類の抗体が一つの抗原に抗原抗体反応をしたときのみ、第一の抗体の蛍光物質や発光タンパク質の光の消光や第二の抗体に結合している蛍光物質が発する波長の蛍光を検出することによって、抗原であるNesfatin-1に抗体が抗原抗体反応している状態を定量的に検出できる。
【００３２】
また、別の測定方法の様式としては、検体に、あらかじめ濃度を調整した標識化されたNesfatin-1の標準ペプチドを混和し、Nesfatin-1と抗原抗体反応する抗体に競合的に反応させることによって行う、競合的抗原抗体反応による測定方法も挙げられる。この場合、Nesfatin−1における標識は、抗体に結合した標準ペプチドを定量するために用いられ、一般的には放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素が使用される。ここで、酵素で標識した標準ペプチドを用いる場合には、酵素による反応で発色、発光、蛍光を発するような物質を酵素の基質として反応させて、結果として生じた発色（吸光度として測定）、発光、蛍光を定量的に測定することで、抗体と抗原抗体反応した標準ペプチドの量を測定する。ここで、用いる抗体は、標識化されたNesfatin-1の標準ペプチドと検体中に含まれるNesfatin-1との両方と抗原抗体反応するものであればよいが、好ましくはNesfatin-1と抗原抗体反応するが、NesfatinおよびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体が用いられ、さらに好ましくは、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８２、またはＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８４として寄託されているハイブリドーマ（ＮＡＦ７、ＮＡＰ４０−２）により産生されるモノクローナル抗体を用いることが望まれる。また同時に、Nesfatin-1を含まない対照検体における測定値（バックグランド）、標識化されていないNesfatin-1の標準ペプチドを用いていくつかの異なる濃度で該ペプチドを含む標準検体についても同時に測定を行って量依存的な結合状態を示す標準検量曲線を作成し、それによって得られた結果を用いて、検体中に含まれるNesfatin-1を算定することが可能である。
【００３３】
本発明の免疫学的検出方法に適用できる検体は、Nesfatin-1の検出が望まれるいずれのものであってもよく、例えば、患者の血液、血清、髄液、尿、腹水、胸水、唾液、涙液、喀痰、バイオプシーで取得した組織等を挙げることができる。
【００３４】
＜Nesfatin-1の免疫学的検出方法に用いられるキット＞
本発明は、前述のNesfatin-1の免疫学的検出方法に用いられるキットにも関する。例えば上記のサンドイッチ法による測定方法におけるキットには、前述の一次抗体が固定された固相、および前述の二次抗体が標識されたものが含まれる。二次抗体の標識に使用される試薬は、当技術分野において周知であり、例えば、ビオチン、蛍光物質、発光物質、酵素（パーオキシダーゼ、ホスファターゼ、グルコシターゼ、ルシフェラーゼ等）が挙げられる。ここで、酵素で標識した二次抗体を用いる場合には、酵素による反応で発色、発光、蛍光を発するような酵素の基質もキットに含まれることがある。
【００３５】
本発明のNesfatin-1のサンドイッチ法による免疫学的検出方法に用いられるキットは、さらに標準ペプチドを含んでいても良い。本発明のキットに含まれる標準ペプチドとは、前記抗体の、Nesfatin-1との量依存的な結合力を示す標準検量曲線を作成するために使用されるものである。このような標準ポリペプチドとして、Nesfatin-1を使用することができる。
【００３６】
これらを含む本発明のキットは、例えば、（１）固定化した一次抗体に標準ペプチドを添加して反応後、さらに標識された二次抗体を添加することにより標準検量曲線を作成し、（２）同様に固定化した一次抗体に検体を添加して反応後、標識された二次抗体を添加し、（３）検体での反応における二次抗体の結合量を標準検量曲線によって測定することによって、検体中に含まれるNesfatin-1の含有量を検出することができる。
その他のキットの様態としては、前述のFRET法やBRET法などの測定方法に用いられるキットが挙げられ、該キットには蛍光物質または発光タンパク質で標識化された第一の抗体と、該蛍光物質または発光物質の発する特定の波長の光エネルギーを吸収しうる蛍光物質で標識化された第二の抗体が含まれる。また、本発明のFRET法またはBRET法によるNesfatin-1の免疫学的検出方法に用いられるキットには、さらに、前記抗体の、Nesfatin-1との量依存的な結合力を示す標準検量曲線を作成するための標準ペプチドを含んでいても良い。このような標準ポリペプチドとして、Nesfatin-1を使用することができる。
【００３７】
さらに他のキットの様態としては、競合的抗原抗体反応による測定方法におけるキットが挙げられ、該キットには標識化されたNesfatin-1標準ペプチド、およびNesfatin-1と抗原抗体反応する抗体が含まれる。標準ペプチドの標識に使用される試薬は、当技術分野において周知であり、例えば、ビオチン、蛍光物質、発光物質、酵素（パーオキシダーゼ、ホスファターゼ、グルコシターゼ、ルシフェラーゼ等）が挙げられる。ここで、酵素で標識した標準ペプチドを用いる場合には、酵素による反応で発色、発光、蛍光を発するような酵素の基質もキットに含まれることがある。また、本発明の競合的抗原抗体反応法によるNesfatin-1の免疫学的検出方法に用いられるキットには、さらに、前記抗体の、Nesfatin-1との量依存的な結合力を示す標準検量曲線を作成するための標準ペプチドを含んでいても良い。このような標準ポリペプチドとして、Nesfatin-1を使用することができる。
【００３８】
そのほか、本発明のキットには、付加的な要素として、試薬や生体試料を希釈するための緩衝液、陽性対照、陰性対照、標識を測定するための基質、反応容器、アッセイプロトコルを記載した指示書などを含めることができる。これらの要素は必要に応じて予め混合しておくこともできる。また、必要に応じて、保存剤や防腐剤を各要素に加えることができる。
【００３９】
＜Nesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体＞
本発明は、Nesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体に関する。「NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない」とは、NesfatinおよびNucB１をほぼ同じ分子数を固相に固定して、そこに各抗体を抗原抗体反応させたときの結合量が、Nesfatinを固定化した固相への結合量に対して、NucB1を固定化した固相への結合量が１/５未満の値であるものをいう。
【００４０】
本発明のNesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体は、特に高感度にNesfatinと抗原抗体反応をし、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない特定の抗体をいう。すなわち、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよいが、中でも、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８１、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８３として寄託されているハイブリドーマ（ＮＡＥ１、ＮＡＦ１１）により産生されるモノクローナル抗体が特に好ましい。また、本発明は、かかるハイブリドーマにも関する。
【００４１】
さらに別の態様としては、Nesfatinと抗原抗体反応するが、Nesfatin-1およびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体が挙げられる。「Nesfatin-1およびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない」とは、前述の「NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない」という要件に加え、NesfatinおよびNesfatin-1をほぼ同じ分子数を固相に固定して、そこに各抗体を抗原抗体反応させたときの結合量が、Nesfatinを固定化した固相への結合量に対して、Nesfatin-1を固定化した固相への結合量が１/５未満の値であるものをいう。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。
【００４２】
＜Nesfatinの免疫学的検出方法＞
前述の「Nesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体」、または「Nesfatinと抗原抗体反応するが、Nesfatin-1およびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体」を用いることによって、Nesfatinを特異的に検出しうる免疫学的検出方法を構築できる。例えば、該Nesfatinの免疫学的検出方法は、（Ｉ）検体を、Nesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない本発明の抗体に接触させる工程、（ＩＩ）検体と抗原抗体反応した抗体を検出する工程を含む。なお、抗原抗体反応を利用した免疫学的検出方法は、当技術分野において周知であり、本発明において、従来のいずれの方法をも採用することができる。
【００４３】
そのような免疫学的検出方法の一つの形態は、Nesfatinと抗原抗体反応する抗体の量を測定することである。またその形態の中での一つとしては、前述の抗体の内、２つの抗体を用いる方法である。この場合、望ましく用いる抗体の組合せは、２種類の抗体のうち、少なくとも１つは、Nesfatinと抗原抗体反応するがNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体を用いることである。
【００４４】
この２種類の抗体を用いた免疫学的測定法においては、少なくとも１種類の抗体を固相に固定する方法と、固定しない方法が挙げられる。
【００４５】
少なくとも1種類の抗体を固相に固定化する測定方法としては、（Ｉ）検体を、固相に固定された一次抗体に接触させる工程、（ＩＩ）一次抗体が結合した検体に、標識された二次抗体を接触させる工程、ついで（ＩＩＩ）検体と抗原抗体反応した二次抗体を検出する工程を含む、サンドイッチ法による測定方法が例示される。かかるサンドイッチ法による測定方法における二次抗体の標識、測定手法等は、前述の＜Nesfatin-1の免疫学的検出方法＞におけるサンドイッチ法による測定方法と同様にして行うことができる。また、この測定方法によって検出できるNesfatinの最低濃度はその測定系の感度を規定する。つまりNesfatinを含まない対照検体における測定値に対して、有意に弁別できる測定値を示すNesfatinの標準ペプチドを含む標準検体におけるNesafatin濃度として、感度を表すことができる。本発明においては、３０ｐＭという低い濃度のNesfatinを含む標準検体においても、Nesfatinを含まない対照検体との弁別が可能であったことから、この測定系は３０ｐＭ未満まで測定可能な検出感度を有するといえる。また、本発明の好ましい態様によれば、５ｐＭ未満の濃度のNesfatinを含む標準検体においても、Nesfatin-1を含まない対照検体との弁別が可能である。
【００４６】
中でも、一次抗体として、前述のNesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない本発明の抗体（抗体Ｎｏ．４９９４、ＮＡＤ１５）を使用し、二次抗体として、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８１、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８３として寄託されているハイブリドーマ（ＮＡＥ１、ＮＡＦ１１）により産生される、Nesfatinを高感度に検出する抗体を使用することにより、検体中のNesfatinを高感度に検出することができる。またこの際、一次抗体として、ハイブリドーマ（ＮＡＤ１５）により産生される、Nesfatinと抗原抗体反応するが、Nesfatin-1およびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体を使用することにより、より高感度に検出することができる。
【００４７】
２種類の抗体とも固相に固定しない方法としては、FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）法やBRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)法が挙げられる。
【００４８】
また、別の測定方法の様式としては、検体にあらかじめ濃度を調整した標識化されたNesfatinの標準ペプチドを混和し、Nesfatinと抗原抗体反応する抗体に対する結合を競争的に反応させることによって行う、競合的抗原抗体反応による測定方法も挙げられる。競合的抗原抗体反応による測定方法に関しても、前述の＜Nesfatin-1の免疫学的検出方法＞における競合的抗原抗体反応による測定方法と同様にして行うことができる。
【００４９】
本発明の免疫学的検出方法に適用できる検体は、Nesfatinの検出が望まれるいずれのものであってもよく、例えば、患者の血液、血清、髄液、尿、腹水、胸水、唾液、涙液、喀痰、バイオプシーで取得した組織等を挙げることができる。
【００５０】
＜Nesfatinの免疫学的検出方法に用いられるキット＞
本発明は、前述のNesfatinの免疫学的検出方法に用いられるキットにも関する。例えば上記のサンドイッチ法による測定方法におけるキットには、前述の一次抗体が固定された固相、および前述の二次抗体が標識されたものが含まれる。また、本発明のNesfatinの免疫学的検出方法に用いられるキットは、＜Nesfatin-1の免疫学的検出方法に用いられるキット＞と同様、さらに標準ペプチドや、酵素の基質等を含んでいても良く、同様にして使用することができる。
【００５１】
その他のキットの様態として、前述のFRET法やBRET法などの測定方法に用いられるキットには、蛍光物質または発光タンパク質で標識化された第一の抗体と、該蛍光物質または発光物質の発する特定の波長の光エネルギーを吸収しうる蛍光物質で標識化された第二の抗体が含まれる。また、本発明のFRET法またはBRET法によるNesfatinの免疫学的検出方法に用いられるキットも、＜Nesfatin-1の免疫学的検出方法に用いられるキット＞と同様、さらに標準ペプチド等を含んでいても良い。
【００５２】
さらに他のキットの様態としては、競合的抗原抗体反応による測定方法におけるキットが挙げられ、該キットには標識化されたNesfatin標準ペプチド、およびNesfatinと抗原抗体反応する抗体が含まれる。また、本発明の競合的抗原抗体反応法によるNesfatinの免疫学的検出方法に用いられるキットには、さらに標準ペプチドや酵素の基質等を含んでいても良い。
【００５３】
＜食欲亢進および／または体重増加亢進のための医薬組成物＞
前述の本発明の抗体は、製薬学的に許容される担体および／または希釈剤とともに、医薬組成物とすることができる。該医薬組成物は、摂食や体重増加が抑制されていることが問題となる疾患や症状に対して使用することができる。摂食や体重増加が抑制されていることが問題となる疾患や症状としては、たとえば拒食症、機能性胃腸症（Functional dyspepsia）、または癌、炎症性疾患、下垂体・甲状腺・副腎などの機能低下、手術後もしくは過度のストレスなどによる摂食抑制および／もしくは体重増加抑制状態などがあげられる。この医薬組成物は種々の剤形に成形して、経口的または非経口的に投与することができる。非経口投与としては、例えば、静脈、皮下、筋肉、経皮、または直腸内への投与が挙げられる。
【００５４】
本発明の抗体を有効成分として含有する製剤は、通常製剤化に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて調製される。製剤用の担体や賦形剤としては、固体又は液体いずれでも良く、例えば乳糖、ステアリン酸マグネシウム、スターチ、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコール等やその他常用のものが挙げられる。投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、あるいは静注、筋注等の注射剤、坐剤、経皮等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
【００５５】
本発明の抗体は、疾患の種類、投与経路、患者の症状、年齢、性別、体重等により異なるが、通常成人１人あたり、１回につき０．１〜５００ｍｇの範囲で、好ましくは０．５〜２０ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
【００５６】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００５７】
実施例１
＜組換え体によるリコンビナントNESFATIN-1の製造＞
NESFATIN-1をより大量に調製するため、組換え体を用いてリコンビナントNESFATIN-1を製造した。具体的には、ヒトNESFATIN-1をコードする遺伝子を取得し、そのN末端にGST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）とヒスチジンタグの遺伝子を結合し、翻訳後のタンパク質においてヒスチジンタグのアミノ酸配列とヒトNESFATIN-1のアミノ酸配列の間にトロンビンによる切断部位（-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-）が介在する形となるように、発現ベクターを構築した。詳細は以下のとおりである。
【００５８】
ヒトNesfatin-1の遺伝子の取得は、human Hypothalamus mRNA（Clontech社）からSuper Script III (Invitrogen社)を使用して合成したcDNAを鋳型として2回のPCR（Nested PCR）を行うことで実施した。
【００５９】
１回目のPCRは以下のForward（hNucB2-F0191：配列番号２０）およびReverse（hNucB2-R1549：配列番号２１）を各１００ｐMの濃度で、Pyrobest DNA polymerase（タカラバイオ（株）R005A）、添付の反応バッファーおよびｄNTPを使用し、添付のプロトコールに従って反応を行った。PCR反応は９０℃1分の反応の後、９８℃10秒・６８℃1分３０秒の温度サイクルを30サイクル、その後６８℃で2分間反応させる温度条件で行った。
Forward Primer (hNucB2-F0191)：
5’- GGAGATAAAAATTATTTACCTGCCTGAACA -3’（配列番号２０）
Reverse Primer (hNucB2-R1549)：
5’- AAATATTTATTGAGCAGAGAAAAGGGAAGG -3（配列番号２１）
【００６０】
得られたPCR産物0.5μＬを鋳型として用いて、２回目のPCRを実施した。以下のForward（hNucB2-F292[Sac2-Thr]）およびReverse（hNucB2-R514[NotI]）プライマー１００ｐMを用いて、１回目のＰＣＲと同様に、Pyrobest DNA polymeraseを用いてPCR反応を行った。PCR反応は９０℃1分の反応に続いて、９８℃10秒・６０℃30秒・６８℃１分の温度サイクルを２０サイクル行った後、６８℃で2分間反応させる温度条件で行った。
Forward Primer (hNucB2-F292[Sac2-Thr])：
5’-GGTTCCGCGGGTCTGGTTCCGCGTGGTTCTGTGCCTATTGATATAGACAAGACAAAAGT-3’
（配列番号２２）
Reverse Primer (hNucB2-R514[NotI])：
5’- GGTTGCGGCCGCTTACAGTTCATCAAGTTTTGTCCTCAC -3’（配列番号２３）
【００６１】
2回目のPCRを行ったPCR反応サンプルは、フェノール／クロロホルム抽出によって精製した後、制限酵素SacIIおよびNotIで切断し、アガロースゲル電気泳動を行って、約300ｂｐの長さに相当するバンドを切り出し、QIAEX-IIキット（QIAGEN社）によって精製した。精製された約300ｂｐのPCR産物は、制限酵素SacIIおよびNotIで切断されたｐET41a（＋）プラスミドベクター（Novagen社）に、Quick DNA ligase kit（New England Bio Lab社）を用いてライゲーションを行った。ライゲーションを行ったベクターを大腸菌JM109株に導入し、得られた形質転換体2個について小スケールでのプラスミド抽出を行い、得られたプラスミドを用いて組み込まれたNESFATIN-1遺伝子の配列をベックマンコールター社の自動シーケンサー装置ＣＥＱ８０００を用いて、CEQ DTCS Quick Start Kitを使用し、塩基配列の確認を行った。その結果、正しいNESFATIN-1の配列を持つ遺伝子が組み込まれている発現ベクターが得られたことを確認した。これをpET41a(+)GST-His-LVPRGS- hNSF1と命名した。
【００６２】
得られたpET41a(+)GST-His-LVPRGS-hNSF1を大腸菌BL21（DE3）Codon Plus RIPLに導入して発現させることで、GST・ヒスチジンタグ・トロンビン切断配列・NESFATIN-1の融合タンパク質（GST-His-LVPRGS- hNSF1）の発現を行った。pET41a(+)GST-His-LVPRGS- hNSF1を大腸菌BL21（DE3）Codon Plus RIPLに導入してカナマイシンを含むLB培地で選択して得たクローンを、１０mLのカナマイシンを含むLB倍地で３７℃において培養した。培養は、その培養液の600nmの波長による吸光度が約1.0になった時点で停止した。その培養液３mLを１００mLのカナマイシンを含むLB培地に植え継ぎ、さらに３７℃で培養してその培養液の600 nmの波長による吸光度が0.8になった時点で１００mMのIPTGを１mL加えてタンパク質の発現を誘導した。IPTG添加後、さらに３７℃で３時間振盪培養を行った。その培養液を8000rpmで20分間（4℃）で遠心分離して、大腸菌の菌体を回収した。
【００６３】
得られた大腸菌の菌体を超音波破砕し遠心分離することにより、GST-His-LVPRGS-hNSF1融合タンパク質を含む細胞ライセートを抽出して、ニッケルキレートカラム（Ni-NTA agarose）を用いて精製を行った。菌体を２０ｍｌの１倍濃度のComplete−EDTA free（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）および０．５倍濃度のBug Buster（メルク社Novagen Cat.No.70584）を含むSonication Buffer（50mM KH2PO4, 50mM NaCl, 2mM DTT, pH7.5）に懸濁し、氷水中で１０分間超音波による破砕を行った。超音波処理後のサンプルは１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、その上清を回収した。得られた上清１０mlを、Lysis Buffer（50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM imidazole, pH8.0）で平衡化した１ｍｌのNi-NTA agaroseカラムにアプライし、さらに１０ｍｌのWash Buffer（50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazole, pH8.0）で２回洗浄を行った。洗浄後のカラムを２．５mlのElution Buffer（50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM imidazole, pH8.0）で２回溶出を行い、溶出されたGST-His-LVPRGS- hNSF1融合タンパク質を含む画分を回収した。残りの菌体からの抽出上清も同様に処理して、GST-His-LVPRGS- hNSF1融合タンパク質を含む画分を回収した。
【００６４】
GST-His-LVPRGS- hNSF1融合タンパク質からGSTおよびヒスチジンタグの部分を除去してさらに精製すると共に、炎症性物質として作用する大腸菌由来のリポポリサッカライド（LPS）を除去するため、GST-His-LVPRGS-hNSF1融合タンパク質がGSTレジンに結合した状態でのトロンビン処理および逆相クロマトグラフィーによる精製を行った。なお、これ以降の処理におけるBufferは、LPSを含まないことを確認したものを使用した。Ni-NTA agaroseカラムでの精製で得られたGST-His-LVPRGS-hNSF1融合タンパク質を含む画分７．２ｍｌを１倍濃度のGST Bind/Wash Buffer（メルク社Novagen Cat.No.70571）で洗浄して、最終的に３ｍｌGST Bind/Wash Bufferで懸濁したGSTレジン（メルク社Novagen Cat.No.70541）（７．２ｍｌ相当）に添加して、２０℃で１時間弱く攪拌した。遠心分離によってレジンを回収した後、該レジンを３６ｍｌのGST Bind/Wash Bufferで２回洗浄した。洗浄後のレジンに20units／ｍｌのトロンビンをPBSに溶解したもの3.6mlを加えて懸濁し、２０℃で弱い攪拌状態において20時間反応を行った。反応後のレジンはポアサイズ0.22μmのフィルター付カップ（Millipore）に1.8mlずつ分注して、3,000rpmで2分間遠心して、ろ過されたトロンビン処理後サンプルを回収した。得られたトロンビン処理後サンプル450μlに対して50μlの酢酸を加え、C18逆相クロマトグラフィーのサンプルとした。逆相クロマトグラフィーは0.1％トリフルオロ酢酸存在下でアセトニトリルのグラジエントによる溶出法を用い、そのグラジエントは１０％アセトニトリル：１０分、１０〜２０％アセトニトリル勾配：６０分、３０〜５０％アセトニトリル勾配：８０分、５０〜６０％アセトニトリル勾配：５分に設定して行った。カラムから溶出されたタンパク質は、波長２３０nm、２８０nmの吸光度を測定することでモニタリングした。アセトニトリルのグラジエントで溶出を行った画分についてSDS-PAGE法およびウエスタンブロッティング法で調べたところ、NESFATIN-1はアセトニトリル濃度約４０％の所で溶出されることが判明した。そのため、この画分を回収し、凍結乾燥を行った後、注射用蒸留水に再度溶解したものを用いて、吸光度によるタンパク質濃度およびエンドスペーシー（生化学工業）によるLPSの含有量の測定を行った。
【００６５】
なお、マウスおよびラットのリコンビナントNESFATIN-1も同様にして調製した。使用した鋳型およびプライマーは以下の通りである。
【００６６】
【表１】
2010536715.tif 000003
【００６７】
実施例２
＜組換え体によるリコンビナントNESFATIN関連タンパクの製造＞
NESFATINおよびNESFATIN関連タンパク質（NESFATIN-N27K、NESFATIN-C21K）を大量に調製するため、組換え体を用いてリコンビナントNESFATIN、NESFATIN関連タンパク質を製造した。具体的には、ヒトNESFATINをコードする遺伝子を取得し、そのN末端にGST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）とヒスチジンタグの遺伝子を結合し、翻訳後のタンパク質においてヒスチジンタグのアミノ酸配列とヒトNESFATINのアミノ酸配列の間にトロンビンによる切断部位（-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-）が介在する形となるように、発現ベクターを構築した。詳細は以下のとおりである。
【００６８】
実施例１の１回目のPCRにより得られたPCR産物0.5μｌを鋳型として用い、以下のForward（hNucB2-F292[Sac2-Thr]）およびReverse（hNucB2-R1461[NotI]）プライマーを用いる以外は、実施例１の２回目のＰＣＲと同一の条件で、同一の試薬を用いることによって行った。
Forward Primer (hNucB2-F292[Sac2-Thr])：
5’-GGTTCCGCGGGTCTGGTTCCGCGTGGTTCTGTGCCTATTGATATAGACAAGACAAAAGT-3’（配列番号２２）
Reverse Primer (hNucB2-R1461[NotI])：
5’- GGTTGCGGCCGCGACTTTAAATGTGTGGCTCAAACTTC -3’（配列番号２４）
【００６９】
2回目のPCRを行ったPCR反応サンプルは、フェノール／クロロホルム抽出によって精製した後、制限酵素SacIIおよびNotIで切断し、アガロースゲル電気泳動を行って、約1.2Kｂｐの長さに相当するバンドを切り出し、QIAEX-IIキット（QIAGEN社）によって精製した。精製された約1.2KｂｐのPCR産物は、制限酵素SacIIおよびNotIで切断されたｐET41a（＋）プラスミドベクター（Novagen社）に、Quick DNA ligase kit（New England Bio Lab社）を用いてライゲーションを行った。ライゲーションを行ったベクターを大腸菌JM109株に導入し、得られた形質転換体2個について小スケールでのプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドを用いて、組み込まれたヒトNESFATIN遺伝子の配列を、実施例１と同様にして塩基配列の確認を行い、正しいヒトNESFATINの配列を持つ遺伝子が組み込まれている発現ベクターが得られたことを確認した。これをpET41a(+)GST-His-LVPRGS-hNSF fullと命名した。
【００７０】
得られたpET41a(+)GST-His-LVPRGS-hNSF fullを用いて、実施例１と同様にして、GST・ヒスチジンタグ・トロンビン切断配列・NESFATINの融合タンパク質（GST-His-LVPRGS-hNSF full）の発現、回収を行った。さらに実施例１と同様にして、GST-His-LVPRGS-hNSF full融合タンパク質から、GSTおよびヒスチジンタグの部分の除去、トロンビン処理ならびに逆相クロマトグラフィーによる精製により、NESFATINを得た。アセトニトリルのグラジエントは、実施例１と同じ設定とした。なお、NESFATIN中にも１箇所トロンビン切断配列が存在するため、トロンビン処理によりNESFATINは分断され得る。そこで、トロンビン処理により生じ得る、NESFATINのＮ末端側をNESFATIN-N27K、Ｃ末端側をNESFATIN-C21Kとした。また、アセトニトリルのグラジエントで溶出を行った画分についてSDS-PAGE法およびウエスタンブロッティング法で調べたところ、NESFATINは、アセトニトリル濃度約４０％の所で溶出されることが判明した。さらにNESFATIN-N27K、NESFATIN-C21KはそれぞれNESFATINの後と前にピークが現れることが判明した。そのため、これらの画分を回収し、NESFATIN、NESFATIN-N27K、NESFATIN-C21Kを得た。
【００７１】
なお、マウスおよびラットの、リコンビナントNESFATIN、およびNESFATIN関連タンパク質も同様にして調製した。ただし、マウスおよびラットにおいては、ＰＣＲは３回行った。３回目のＰＣＲの条件は、２回目のＰＣＲの条件と同じである。また、使用した鋳型およびプライマーは以下の通りである。
【００７２】
【表２】
2010536715.tif 000004
【００７３】
実施例３
＜組換え体によるリコンビナントNucB1-N77の製造＞
NucB2と高いホモロジーを有するNucB1のNesfatin-1に相当する部分(NucB1-N77)を大量に調製するため、組換え体を用いてリコンビナントヒトNucB1-N77を製造した。マウスおよびラットのリコンビナントNucB1-N77も同様にして調製した。具体的には、ヒトNucB1-N77をコードする遺伝子を取得し、そのN末端にGST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）とヒスチジンタグの遺伝子を結合し、翻訳後のタンパク質においてヒスチジンタグのアミノ酸配列とヒトNucB1-N77のアミノ酸配列の間にトロンビンによる切断部位（-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-）が介在する形となるように、発現ベクターを構築した。詳細は以下のとおりである。
【００７４】
ヒトNucB1-N77の遺伝子の取得は、human Hypothalamus mRNA（Clontech社）からSuper Script III (Invitrogen社)を使用して合成したcDNAを鋳型として2回のPCR（Nested PCR）を行うことで実施した。
【００７５】
１回目のPCRは、以下のForward（hNucB1-F061：配列番号２５）およびReverse（hNucB1-R1376[NotI]：配列番号２６）を用いる以外は、実施例１と同一の条件で、同一の試薬を用いることによって行った。
Forward Primer (hNucB1-F061)：
5’- TGCTGCTGCTGCTCCTGCTT-3’（配列番号２５）
Reverse Primer (hNucB1-R1376[NotI])：
5’- GGTTGCGGCCGCTCACAGATGCTGGGGCACCTCAACCTCA-3’（配列番号２６）
【００７６】
得られたPCR産物0.5μＬを鋳型として用いて、以下のForward（hNucB1-F096[Sac2Thr]）およびReverse（hNucB1-R303[NotI]）プライマーを用いる以外は、実施例１の２回目のＰＣＲと同一の条件で、同一の試薬を用いることによって、２回目のPCRを行った。
Forward Primer (hNucB1-F096[Sac2Thr])：
5’- GGTTCCGCGGGTCTGGTTCCGCGTGGTTCTGTCCCCCTGGAGCGAGGGGCGCCCAAC -3’
（配列番号２７）
Reverse Primer (hNucB1-R303[NotI])：
5’- GGTTGCGGCCGCTCAGAGCTCATCCAGCTTGGTGCGGAC-3’（配列番号２８）
【００７７】
2回目のPCRを行ったPCR反応サンプルは、フェノール／クロロホルム抽出によって精製した後、制限酵素SacIIおよびNotIで切断し、アガロースゲル電気泳動を行って、約300ｂｐの長さに相当するバンドを切り出し、QIAEX-IIキット（QIAGEN社）によって精製した。精製された約300ｂｐのPCR産物は、制限酵素SacIIおよびNotIで切断されたｐET41a（＋）プラスミドベクター（Novagen社）に、Quick DNA ligase kit（New England Bio Lab社）を用いてライゲーションを行った。ライゲーションを行ったベクターを大腸菌JM109株に導入し、得られた形質転換体2個について小スケールでのプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドを用いて、組み込まれたヒトNucB1-N77遺伝子の配列を、実施例１と同様にして塩基配列の確認を行い、正しいヒトNucB1-N77の配列を持つ遺伝子が組み込まれている発現ベクターが得られたことを確認した。これをpET41a(+)GST-His-LVPRGS-hNucB1-N77と命名した。
【００７８】
得られたpET41a(+)GST-His-LVPRGS-hNucB1-N77を用いて、実施例１と同様にして、GST・ヒスチジンタグ・トロンビン切断配列・ヒトNucB1-N77の融合タンパク質（GST-His-LVPRGS-hNucB1-N77）の発現、回収を行った。さらに実施例１と同様にして、GST-His-LVPRGS-hNucB1-N77融合タンパク質からGSTおよびヒスチジンタグの部分の除去、トロンビン処理、ならびに逆相クロマトグラフィーによる精製を行った。なお、逆相クロマトグラフィーは、実施例１と同様0.1％トリフルオロ酢酸存在下でアセトニトリルのグラジエントによる溶出法を用いた。なお、アセトニトリルのグラジエントを、１０％アセトニトリル：１０分／１０〜２０％アセトニトリル勾配：６０分／３０〜４０％アセトニトリル勾配：４０分／４０〜６０％アセトニトリル勾配：５分に設定して行い、カラムからの溶出タンパク質は、波長２８０nmの吸光度を測定することでモニタリングした。アセトニトリルのグラジエントで溶出を行った画分についてSDS-PAGE法およびウエスタンブロッティング法で調べたところ、NucB1-N77はアセトニトリル濃度37％の所で溶出されることが判明した。そのため、この画分を回収し、NucB1-N77を得た。
【００７９】
ヒト・マウス・ラット由来のNucB1-N77を、配列番号１７〜１９に示す。なお、リコンビナントNucB1-N77は、それぞれ、Ｎ末端にGly-Serが残存する構造となる。
【００８０】
なお、マウスおよびラットのリコンビナントNucB1-N77も同様にして調製した。使用した鋳型およびプライマーは以下の通りである。
【００８１】
【表３】
2010536715.tif 000005
【００８２】
実施例４
＜組換え体によるリコンビナントNucB1の製造＞
NucB2と高いホモロジーを有するNucB1を大量に調製するため、組換え体を用いてリコンビナントヒトNucB1を製造した。ラットおよびマウスのリコンビナントNucB1も同様にして調製した。具体的には、ヒトNucB1をコードする遺伝子を取得し、そのN末端にGST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）とヒスチジンタグの遺伝子を結合し、翻訳後のタンパク質においてヒスチジンタグのアミノ酸配列とヒトNucB1のアミノ酸配列の間にトロンビンによる切断部位（-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-）が介在する形となるように、発現ベクターを構築した。詳細は以下のとおりである。
【００８３】
ヒトNucB1の遺伝子の取得は、human Hypothalamus mRNA（Clontech社）からSuper Script III (Invitrogen社)を使用して合成したcDNAを鋳型として2回のPCR（Nested PCR）を行うことで実施した。
【００８４】
実施例３の１回目のＰＣＲにより得られたPCR産物0.5μＬを鋳型として用い、以下のForward（hNucB1-F096[Sac2Thr]）およびReverse（hNucB1-R1376[NotI]）プライマーを用いる以外は、実施例１の２回目のＰＣＲと同一の条件で、同一の試薬を用いることによって行った。
Forward Primer (hNucB1-F096[Sac2Thr])：
5’-GGTTCCGCGGGTCTGGTTCCGCGTGGTTCTGTCCCCCTGGAGCGAGGGGCGCCCAAC -3’
（配列番号２７）
Reverse Primer (hNucB1-R1376[NotI])：
5’- GGTTGCGGCCGCTCACAGATGCTGGGGCACCTCAACCTCA-3’（配列番号２６）
【００８５】
2回目のPCRを行ったPCR反応サンプルは、フェノール／クロロホルム抽出によって精製した後、制限酵素SacIIおよびNotIで切断し、アガロースゲル電気泳動を行って、約1.2Kｂｐの長さに相当するバンドを切り出し、QIAEX-IIキット（QIAGEN社）によって精製した。精製された約1.2KｂｐのPCR産物は、制限酵素SacIIおよびNotIで切断されたｐET41a（＋）プラスミドベクター（Novagen社）に、Quick DNA ligase kit（New England Bio Lab社）を用いてライゲーションを行った。ライゲーションを行ったベクターを大腸菌JM109株に導入し、得られた形質転換体2個について小スケールでのプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドを用いて、組み込まれたヒトNucB1遺伝子の配列を、実施例１と同様にして塩基配列の確認を行い、正しいヒトNucB1の配列を持つ遺伝子が組み込まれている発現ベクターが得られたことを確認した。これをpET41a(+)GST-His-LVPRGS-hNucB1 fullと命名した。
【００８６】
得られたpET41a(+)GST-His-LVPRGS-hNucB1 fullを用いて、実施例１と同様にして、GST・ヒスチジンタグ・トロンビン切断配列・ヒトNucB1の融合タンパク質（GST-His-LVPRGS-hNucB1 full）の発現、回収を行った。さらに実施例１と同様にして、GST-His-LVPRGS-hNucB1 full融合タンパク質からGSTおよびヒスチジンタグの部分の除去、トロンビン処理、ならびに逆相クロマトグラフィーによる精製により、hNucB1 fullを得た。アセトニトリルのグラジエントは、実施例１と同じ設定とした。なお、アセトニトリルのグラジエントで溶出を行った画分についてSDS-PAGE法およびウエスタンブロッティング法で調べたところ、hNucB1 fullはアセトニトリル濃度約４５％の所で溶出されることが判明した。そのため、この画分を回収し、hNucB1 fullを得た。
【００８７】
なお、マウスおよびラットのリコンビナントNucB1も同様にして調製した。使用した鋳型およびプライマーは以下の通りである。
【００８８】
【表４】
2010536715.tif 000006
【００８９】
実施例５
＜NESFATIN部分ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体の作製＞
（１）抗体の作製
NESFATINに対する抗体の作製のために、抗原として、ヒトNESFATINポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号９）のＮ末端およびＣ末端、ならびにヒトNESFATIN-1のＣ末端および内部アミノ酸配列部分の４種の合成ペプチド（配列番号１〜４：株式会社SIGMA genosysで合成）を用いた（以下、該ペプチドを総称してNAPペプチドとする）。
Nesfatin-1 Ｃ末端ペプチド（NSF1-C18）：N末-GCSKELDLVSHHVRTKLDEL-C末（配列番号１）
Nesfatin-1 Middleペプチド（NSF1-M15）：N末-PDTGLYYDEYLKQVIC-C末（配列番号２）
Nesfatin Ｃ末端ペプチド（NSF-C18）：N末-GCQGIPPSGPAGELKFEPHI-C末（配列番号３）
Nesfatin Ｎ末端ペプチド（NSF-N19）：N末-VPIDIDKTKVQNIHPVESAC-C末（配列番号４）
【００９０】
図１に抗原ペプチド部分を図示する。
【００９１】
該合成NAPペプチドはPIERCE社Imject（登録商標） Maleimide Activated Mariculture Keyhole Limpet Hemocyaninを用いて添付のプロトコールに従って、ペプチドをKLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）にコンジュゲートした。得られたコンジュゲートはウサギ１羽に対して0.2mgを1回分の免疫に用いた。免疫はコンジュゲート溶液0.25ml（コンジュゲート濃度１mg／ml）と等量のフロイントのコンプリートアジュバント H-37 Ra （和光純薬−Difco社 Cat. No.528-00031）を混合し、毛剃りしたニュージーランドホワイト系のウサギ（今井実験動物試験場より購入）の背部に、５０μlづつ８箇所に皮内注射することで行った。同様の免疫を２週間おきにさらに４回行った後、最後の免疫から１週間後に血液を一部採取して、その血清中の抗体価を免疫したペプチドコンジュゲートを用いたELISA法で確認し、その翌日に動物を屠殺して全血を採取した。得られた血液から血清を作製し、その血清からDEAESepharoseFF（Amersham Bioscience社  Cat. No.17-0709-10）を用いて定法によってウサギIgGを精製した。精製されたウサギIgGは、１mgのNAPペプチドを用いてSulfoLink kit（PIERCE社  Cat. No.44895）により作製したペプチド固定化カラムを用いて、該キット添付のプロトコールに従ってアフィニティー精製した。免疫原としてｈＮＳＦ−Ｃ１８、ｈＮＳＦ−Ｎ１９、ｈＮＳＦ１−Ｃ１８、ｈＮＳＦ１−Ｍ１５を使用することによって、それぞれ、抗体Ｎｏ．４９９３および４９９４、抗体Ｎｏ．４９９５および４９９６、抗体Ｎｏ．４９９７および４９９８、抗体Ｎｏ．５０３６および５０３７が作製された。
【００９２】
（２）抗原ELISAによる抗体の反応性評価
取得した抗血清あるいは抗原アフィニティー精製抗体を用いて、抗原ELISAにより、各抗体の、ヒトNesfatin-1 （human NSF1）、ヒトNesfatin (human NSF full)、ヒトNucB1-N77、ヒトNucB1、ラットNesfatin-1(rat NSF1)、ラットNesfatin (rat NSF full)、ラットNucB1-N77、ラットNucB1 (rat NucB1 full)に対する反応性評価を行った。
【００９３】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ：Ｎｕｎｃ社）に、ＰＢＳ（ｐＨ７）で１μｇ／ｍｌに希釈したＧＳＴ融合組換えヒトNesfatin-1、ヒトNesfatin、ヒトNucB1-N77、ヒトNucB1、ラットNesfatin-1、ラットNesfatin、ラットNucB1-N77、ラットNucB1を、それぞれ５０μｌ加え、4℃で一晩反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで37℃で1時間ブロッキングを行った。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、抗血清希釈液（抗血清濃度を400倍希釈から2倍ずつ段階希釈して作製した希釈系列）、または抗原アフィニティー精製抗体の希釈液（３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで、抗体濃度を１μg/mLから2倍ずつ段階希釈して作製した希釈系列）を５０μｌ加え、室温で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで２０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社）を５０μｌ加え、室温で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、0.1Mのジエタノールアミン（ｐH１０．０）に溶かした1mg/mlＰＮＰＰ（ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ、和光純薬  Ｃａｔ．Ｎｏ．１４９−０２３４２）溶液を１００μＬ加え、室温で１時間反応させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００９４】
各抗体の各ヒト組換えタンパク質に対する反応性評価結果を表５に示す。反応性は、4段階に分けて評価した。
◎（Excellent）：ＯＤ405nmが2.4以上
○（Good）     ：ＯＤ405nmが1.0以上2.4未満
△（Fair）     ：ＯＤ405nmが0.4以上1.0未満
×（Poor）     ：ＯＤ405nmが0.4未満
【００９５】
【表５】
2010536715.tif 000007
【００９６】
各抗体の各ラット組換えタンパク質に対する反応性評価結果を表６に示す。反応性は、4段階に分けて評価した。
◎（Excellent）：ＯＤ405nmが1.5以上
○（Good）     ：ＯＤ405nmが1.0以上1.5未満
△（Fair）     ：ＯＤ405nmが0.2以上1.0未満
×（Poor）     ：ＯＤ405nmが0.2未満
【００９７】
【表６】
2010536715.tif 000008
【００９８】
（３）ウエスタンブロティングによる抗体の反応性の確認
組換えNesfatin-1またはNesfatinを使用して取得した抗Nesfatinポリクローナル抗体の、ヒトおよびラットの組換えNesfatin-1またはNesfatinに対する反応性を確認した。各組換えタンパク質水溶液をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）用の５％のβ-mercaptoethanolを含むLaemmliサンプルバッファー（BIO-RAD社  Cat. No.161-0737）と等量混合してサンプル調製し、5pmole/laneでポリアクリルアミドゲル（BIO-RAD社  レディーゲル10〜20％  Cat. No.161-J390V）でTris-glycine/SDSバッファー（25ｍM Tris、192mM glycine、0.1％ SDS、ｐH8.3）を用いて１００Vで1時間電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写した。この膜を３％ゼラチン／ＴＢＳで室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＴＢＳで１回洗浄した。その後、抗Nesfatinポリクローナル抗体１μｇ／ｍｌを含む１％ゼラチン／ＴＢＳ溶液中、室温で終夜反応させた。翌日、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＴＢＳで１回洗浄し、約１μｇ／ｍｌの濃度で１％ゼラチン／ＴＢＳ溶液に希釈した抗ウサギＩｇＧヤギポリクローナル抗体パーオキシダーゼコンジュゲート（Cappel社  Cat. No.674371）を室温１時間反応させた。次にＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＴＢＳで２回洗浄し、HRP発色キット（BIO-RAD社  Cat. No.170-64631）で５分間、室温にて発色させてバンドを検出した。その結果、組換えNesfatinまたはNesfatin-1に対する反応性を確認した。
【００９９】
実施例６
＜組換えNESFATIN、またはNesfatin-1に対するウサギポリクローナル抗体の作製＞
（１）抗組換えNESFATIN抗体の取得
実施例１、２で調製した組換えNesfatin、Nesfatin-1、およびNesfatin-C21K（各４０μｇ／１回）をフロインドのコンプリートアジュバント（ＢＡＣＴＯ社製、１：１）とともに、２週間毎にそれぞれ２羽の家兎に皮内投与した（抗原組換えタンパク質領域を図１に図示する）。皮内投与を４回行った後、全採血をして抗血清を得た。この血清から常法に従い、プロテインＡセファロース４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にてＩｇＧを精製し、精製されたウサギIgGは、１mgの組換えNesfatinまたはNesfatin-1を用いてSulfoLink kit（PIERCE社  Cat. No.44895）により作製した組換えNesfatinあるいはNesfatin-1固定化カラムを用いて、該キット添付のプロトコールに従ってアフィニティー精製した。このようにして抗Nesfatinポリクローナル抗体（anti-Nesfatin PAb）、抗Nesfatin-1ポリクローナル抗体（anti-Nesfatin-1 PAb）を得た。具体的には免疫原としてｒＮＳＦ１、ｒＮＳＦ  ｆｕｌｌ、ｒＮＳＦ  Ｃ２１Ｋを使用することによって、それぞれ、抗体Ｎｏ．６１５１および６１５２、抗体Ｎｏ．６１５３および６１５４、抗体Ｎｏ．６１５５および６１５６が作製された。
【０１００】
（２）抗原ELISAによる抗体の反応性評価
取得した抗原アフィニティー精製抗体を用いて、抗原ELISAにより、各抗体の、ヒトNesfatin-1 （human NSF1）、ヒトNesfatin (human NSF full)、ヒトNucB1-N77、ヒトNucB1 (human NucB1-full)、ラットNesfatin-1(rat NSF1)、ラットNesfatin (rat NSF full)、ラットNucB1-N77、ラットNucB1 (rat NucB1-full)に対する反応性評価を、実施例５（２）と同様にして行った。抗原アフィニティー精製抗体は、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで、抗体濃度を１μg/mLから2倍ずつ段階希釈して希釈系列を作製して、反応性を評価した。
【０１０１】
各抗体の各組換えタンパク質に対する反応性評価結果を表７に示す。反応性は、4段階に分けて評価した。
◎（Excellent）：ＯＤ405nmが2.0以上
○（Good）     ：ＯＤ405nmが1.0以上2.0未満
△（Fair）     ：ＯＤ405nmが0.15以上1.0未満
×（Poor）     ：ＯＤ405nmが0.15未満
【０１０２】
【表７】
2010536715.tif 000009
【０１０３】
（３）ウエスタンブロティングによる反応性の確認
組換えNesfatin-1またはNesfatinを使用して取得した抗Nesfatinポリクローナル抗体の反応性を、実施例５（３）と同様にして確認した。使用する抗体を実施例６（１）で取得した抗体を使用する以外は、実施例５（３）と同様にして行った。その結果、組換えNesfatinまたはNesfatin-1に対する反応性を確認した。
【０１０４】
実施例７
＜Nesfatinに対するウサギポリクローナル抗体を使用したNesfatin測定系の作製＞
（１）Nesfatin測定系の構築
（Ａ）ビオチン化抗体の作製
実施例６で得られた抗原アフィニティー精製抗組換えヒトNesfatin-１ウサギポリクローナル抗体（抗体Ｎｏ．４９９４、６１５１、６１５２、６１５３）（ＩｇＧ）のビオチン化を、以下のように行った。１〜３ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液（ＰＢＳ溶液）に対し２００倍のモル当量のビオチン化試薬を加え、室温で１時間反応した。ビオチン化試薬はＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製＃２１３３５：分子量５５６）をジメチルホルムアミドで５０ｍＭに溶解して使用した。その後、終濃度１０ｍＭになるようにモノエタノールアミン、（ｐH8.0）を加え、さらに室温で１時間反応した。この反応液を、ＳｅｐｈａｄｘＧ−２５ゲル濾過カラムにアプライし、ＰＢＳ（−）で流出させてビオチン化ＩｇＧを回収した。さらに、終濃度１％のＢＳＡと終濃度０．１％のＮａＮ３を加えて保存した。
【０１０５】
（Ｂ）抗体固定化プレートの調製
９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ：Ｎｕｎｃ社）に、実施例５で作製した抗体（抗原アフィニティー精製抗Nesfatin C末端ペプチドウサギポリクローナル抗体（抗体Ｎｏ．４９９４））を２μｇ／ｍｌ含有するＰＢＳ溶液を５０μｌずつ各ウェルに加え、４℃の温度で一晩インキュベートした。これをＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、３％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液を２５０μｌ各ウェルに加え、37℃で1時間インキュベートして抗体Ｎｏ．４９９４が固定化された抗体固定化プレートを得た。
【０１０６】
（Ｃ）測定系の構築
実施例７（１）（Ｂ）で調製した抗NesfatinＩｇＧ（抗体Ｎｏ．４９９４）固定化プレートと、実施例７（１）（Ａ）で作製したビオチン化抗体を使用する測定系を検討した。
上記実施例７（１）（Ｂ）で調製した抗NESFATINＩｇＧ固定化プレートに、精製した組換えヒトNesfatin（Ｆ−ＮＡＰ）（標準物質）を０〜２ｎＭ（＝０〜１００ｐｇ／ｍL）の範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液（検体希釈液）５０μLを加え室温で1時間インキュベートし、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で3回洗浄後、上記実施例７（１）（Ａ）で作製したビオチン化ＩｇＧを２μｇ／ｍｌ含有する３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液を５０μｌ添加し、室温で１時間インキュベートした。次にＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、５０μｌ／ウェルでストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製、＃ＳＮＮ１００４）を１万倍希釈した３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液を加え、室温で１時間インキュベートした。その後ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩、０．０２％Ｈ２Ｏ２  ２．５ｍＭを含有する０．１Ｍ  リン酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ４．３）（Bio-Rad 社、TMB Peroxidase EIA Substrate Kit）５０μｌずつ各ウェルに加え、室温で５分間反応させた後、反応停止剤として１Ｍ  硫酸水溶液を５０μｌずつ加えて酵素反応を停止させた。次いで、分光光度計を用いて４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、これを標準物質濃度０〜２ｎＭ（＝０〜１００ｐｇ／ｍL）に対応してブロットした。結果を図２に示す。
【０１０７】
（２）Nesfatin測定系の種差に対する測定感度評価
実施例７（１）（Ｂ）で調製した抗NesfatinＩｇＧ（抗体Ｎｏ．４９９４）固定化プレートと、実施例７（１）（Ａ）で作製したビオチン化抗体（抗体Ｎｏ．６１５１、６１５２）を使用して、ラットまたはマウスNesfatinとの交差反応性を検討した。
検体として、精製した組換えヒトNesfatin（Ｆ−ＮＡＰ）（標準物質）、組換えラットNesfatin、またはマウスNesfatinは、０〜２ｎＭ（＝０〜１００ｐｇ／ｍL）の範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。ビオチン化抗体は、ビオチン化抗体を２μｇ／ｍｌ含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各種Nesfatin濃度０〜２ｎＭ（＝０〜１００ｐｇ／ｍL）の検体について、分光光度計を用いて４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、これをブロットした。結果を図３および図４に示す。
その結果、固定化に使用する抗体：抗体ＮＯ．４９９４；検出に使用するビオチン化抗体：抗体Ｎｏ．６１５２の組合せにおいて種差が少なく、感度良く各種Nesfatinを測定できることがわかった。一方、固定化に使用する抗体：抗体Ｎｏ．４９９４、検出に使用するビオチン化抗体：抗体Ｎｏ．６１５１の組合せはヒトに対する反応性が高く、ヒトNesfatin測定に適していることがわかった。
【０１０８】
実施例８
＜Nesfatin-1に対するウサギポリクローナル抗体を使用したNesfatin-1測定系の作製＞
（１）Nesfatin-1測定系の構築−１
（Ａ）ビオチン化抗体の作製
実施例５または６で得られた抗原アフィニティー精製抗Nesfatin-1ポリクローナル抗体（抗体Ｎｏ．４９９８、抗体Ｎｏ．６１５１、または抗体Ｎｏ．６１５２）（ＩｇＧ）ののビオチン化を、実施例７（１）（Ａ）と同様にして行った。
【０１０９】
（Ｂ）抗体固定化プレートの調製
実施例６で作製した抗体（抗原アフィニティー精製抗Nesfatin-1 C末端ペプチドウサギポリクローナル抗体（抗体Ｎｏ．６１５１または抗体Ｎｏ．６１５２））を使用して、実施例７（１）（Ｂ）と同様にして、抗体Ｎｏ．６１５１または抗体Ｎｏ．６１５２が固定化された抗体固定化プレートを作製した。
【０１１０】
（Ｃ）測定系の構築検討―１
上記実施例８（１）（Ｂ）で調製した抗Nesfatin-1  ＩｇＧ（抗体Ｎｏ．６１５１または抗体Ｎｏ．６１５２）固定化プレートと、上記実施例８（１）（Ａ）で作製したビオチン化ＩｇＧ（抗体Ｎｏ．６１５１または抗体Ｎｏ．６１５２）を使用する測定系を検討した。
【０１１１】
検体として、精製した組換えヒトNesfatin-1（標準物質）、または組換えラットNesfatin-1を０〜１０ｎＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。ビオチン化ＩｇＧは、ビオチン化ＩｇＧを２μｇ／ｍＬ含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各濃度０〜１０ｎＭの検体について、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、これをブロットした。結果を図５および６に示す。
この結果から、抗体Ｎｏ．６１５１はラットNesfatin-1に対する交差反応性が低く、抗体Ｎｏ．６１５２はラットNesfatin-1に対する交差反応性が高いことがわかった。また、これにより固相抗体としては抗体Ｎｏ．６１５２が適していることがわかった。
【０１１２】
（Ｄ）測定系構築検討―２
実施例８（１）（Ｃ）の結果から、上記実施例８（１）（Ｂ）で調製した抗Nesfatin-1  ＩｇＧ（抗体Ｎｏ．６１５２）固定化プレートと、上記実施例８（１）（Ａ）で作製したビオチン化ＩｇＧ（抗体Ｎｏ．６１５１または抗体Ｎｏ．６１５２）を使用して、ヒトNucB1-N77との交差反応性を検討した。
【０１１３】
検体として、精製した組換えヒトNesfatin-1(HuNAP1)（標準物質）、組換えヒトNesfatin（HuF-NAP）、または組換えヒトNucB1-N77(GST融合タンパク)を０−２０ｎＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。ビオチン化ＩｇＧは、ビオチン化ＩｇＧを２μｇ／ｍＬ含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各濃度０〜２０ｎＭの検体について、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、ブロットした。結果を図７に示す。
この結果から、固相抗体Ｎｏ．６１５２、検出抗体ビオチン化抗体Ｎｏ．６１５２または抗体Ｎｏ．６１５１を使用した系は、いずれもNucB1-N77に対しての交差反応性は観察されなかったが、Nesfatinに若干交差反応性を示し、Nesfatin-1特異的測定系としては使用できないことが判明した。
【０１１４】
（２）Nesfatin-1測定系の構築−２
（Ａ）ビオチン化抗体の作製
実施例７（１）（Ａ）と同様にして、抗原アフィニティー精製抗Nesfatin-1ポリクローナル抗体（抗体Ｎｏ．６１５１、または抗体Ｎｏ．６１５２）（ＩｇＧ）のビオチン化を行った。
【０１１５】
（Ｂ）抗体固定化プレートの調製
実施例５で作製した抗体（抗原アフィニティー精製抗Nesfatin-1 C末端ペプチドウサギポリクローナル抗体（抗体Ｎｏ．４９９８））を使用して、実施例７（１）（Ｂ）と同様にして、抗体Ｎｏ．４９９８が固定化された抗体固定化プレートを作製した。
【０１１６】
（Ｃ）測定系の構築
上記実施例８（２）（Ｂ）で調製した抗Nesfatin-1  ＩｇＧ（抗体Ｎｏ．４９９８）固定化プレートと、上記実施例８（２）（Ａ）で作製したビオチン化ＩｇＧ（抗体Ｎｏ．６１５１または抗体Ｎｏ．６１５２）を使用する測定系を検討した。
検体として、精製した組換えヒトNesfatin-1（標準物質）、または組換えヒトNucB1-N77を０〜１０ｎＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列、あるいは組換えヒトNesfatinを０〜１００ｎＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。ビオチン化抗体は、ビオチン化ＩｇＧを２μｇ／ｍｌ含有する３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液賭して使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各濃度０〜１００ｎＭの検体について、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、ブロットした。結果を図８に示す。
この結果から、固相抗体Ｎｏ．４９９８、検出抗体ビオチン化抗体Ｎｏ．６１５１または抗体Ｎｏ．６１５２を使用した系は、NucB1-N77やNesfatinに対する交差反応性はほとんど無く、Nesfatin-1特異的測定系となりうることが示された。
【０１１７】
（３）Nesfatin-1測定系（4998 &B-6152系）の種差に対する測定感度評価およびNesfatinに対する交差反応性評価
これまでの検討で、抗体Ｎｏ．６１５２はラットに対する交差反応性が高かったため、抗Nesfatin-１ＩｇＧ（抗体Ｎｏ．４９９８）固定化プレートと、ビオチン化抗体（抗体Ｎｏ．６１５２）を使用して、ラットNesfatin-1、およびマウスNesfatin-1に対する交差反応性を検討した。
【０１１８】
検体として、精製した組換えヒトNesfatin-１（標準物質）、組換えラットNesfatin-１、マウスNesfatin-１、組換えヒトNesfatin、組換えラットNesfatin、またはマウスNesfatinを０−２ｎＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。ビオチン化ＩｇＧ（Ｂ−６１５２）は、ビオチン化抗体を２μｇ／ｍｌ含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各種Nesfatin濃度０〜２ｎＭの検体について、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、ブロットした。結果を図９に示す。
【０１１９】
その結果、固定化に使用する抗体：抗体Ｎｏ．４９９８；検出に使用するビオチン化抗体：抗体Ｎｏ．６１５２の組合せを使用することで、ヒトNesfatin-１だけでなくマウス、ラットNesfatin-１に関しても感度良く測定できることがわかった。またヒト、マウス、ラットNesfatinに対する交差反応性もほとんど無いことがわかった。これらのことから、固定化抗体：抗体Ｎｏ．４９９８；検出用ビオチン化抗体：抗体Ｎｏ．６１５２の組合せの測定系がマウス、ラットNesfatin-1特異的測定系として使用できる可能性が示された。
【０１２０】
一方、固定化抗体：抗体Ｎｏ．４９９８；検出用ビオチン化抗体：抗体Ｎｏ．６１５１の組合せの測定系に関しては、実施例８(2)(C)の結果から、ヒトNesfatin-1特異的測定系として使用できると判断された。
【０１２１】
実施例９
＜NESFATIN-1に対するマウスモノクローナル抗体作製＞
（１）組換えNesfatinによるマウスの免疫
実施例１、２で調製した組換えhuman Nesfatin-1、組換えhuman Nesfatin、Nesfatin−Ｎ２７Ｋ、またはNesfatin−Ｃ２１Ｋを１０〜２０μｇ／回／ｈｅａｄでフロインドのコンプリートアジュバント（ＢＡＣＴＯ社製、１：１）とともに、２週間毎にＢａｌｂ／ｃマウス（７週齢、オス）に腹腔内投与した。これを４回行った後、５回目は細胞融合の３日前に組換えhuman Nesfatin-1、組換えhuman Nesfatin、Nesfatin−Ｎ２７Ｋ、またはNesfatin−Ｃ２１ＫのPBS溶液を５０μｇ／headで静脈内投与した。
【０１２２】
マウス血清中の抗Nesfatin-1抗体価測定に関しては、マウスの尾静脈より採血し、３７℃で３０分間インキュベートした後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心して血清を回収し、マウス血清中の抗Nesfatin-1抗体価を抗原ＥＬＩＳＡにより測定した。以下にその方法を述べる。
【０１２３】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ３９１２、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）にPBSで１μｇ／ｍｌに希釈した組換えhuman Nesfatin-1を５０μｌ加え、４℃で一晩反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで室温で１時間処理した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、検体を５０μｌ加え、室温で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄後、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで２０００倍に希釈したアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社、ＡＭＩ３７０５）を５０μＬ加え、室温で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、ＰＮＰＰ（ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ、和光純薬）の０．１Ｍ Diethanolamine Buffer,pH10.0溶液を室温で１時間反応させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１２４】
（２）細胞融合によるハイブリドーマの作製
細胞融合の直前にマウスを殺し、脾細胞をＰＢＳ中でホモジナイズし、残渣をナイロンメッシュで濾過後、ＰＢＳで遠心洗浄を１回行った。この脾細胞とマウスミエローマ（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１）とを常法（Kohler, Milstein; Nature, 256, 495−497 (1975)）に従って細胞融合した。
【０１２５】
すなわち、脾細胞５×１０７個とマウスミエローマ細胞Ｐ３×６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１）５×１０６個をＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄後、１５００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞ペレットにした。３５％ポリエチレングリコール液（ＲＰＭＩ  １６４０培地５．７５ｍｌ＋ポリエチレングリコール３．５ｍｌ＋ジメチルスルホキシド０．７５ｍｌ）を２分間で１ｍｌ加え、細胞をゆるやかに浮遊させた。ＲＰＭＩ １６４０培地を２分間で１ｍｌ加えた後、さらに２分間で２ｍｌ加えた。次にＧＩＴ−ＨＡＴ培地（９５μＭ  ヒポキサンチン、０．４μＭ  アミノプテリン、１．６μＭ  チミジン、および５％ＦＣＳを含むＧＩＴ培地）を２分間で４ｍｌ加えた後、さらに２分間で８ｍｌ加えた。３７℃で３０分間インキュベート後、各ウェルあたり約１０4 個のマウス腹腔浸出細胞を播きこんだ９６ウェル平底プレート１枚に分注し、５％ＣＯ２存在下で３７℃で培養した。
【０１２６】
１週間後にＧＩＴ−ＨＴ培地（ＧＩＴ−ＨＡＴ培地よりアミノプテリンを除いた培地）で培地を半量交換し、さらに５％ＣＯ２存在下、３７℃で約１週間培養することにより、各ウェルあたり数個のハイブリドーマのコロニーが得られた。
【０１２７】
（３）ハイブリドーマのスクリーニング
２週間後に組換えhuman Nesfatin-1または組換えhuman Nesfatinをコートしたプレートによるスクリーニングを行った。組換えhuman Nesfatin-1または組換えhuman NesfatinのPBS溶液（１μｇ／ｍｌ）を、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社、ＰＶＣ製）に各ウェル当り５０μｌづつ分注し、４℃で一晩放置した。洗浄後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳを各ウェル当り２００μｌ加えて３７℃で１時間ブロッキングした。再度洗浄後、各ウェル当り５０μｌの培養上清を加え、室温で１時間放置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄した。
【０１２８】
次に、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで２０００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼコンジュゲートをウェル当り５０μｌ加え、室温で１時間放置した。再度洗浄し、０．２５ｍＭの塩化マグネシウムを含む１Ｍ  ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）に溶解したｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム塩（和光純薬）の１ｍｇ／ｍｌ溶液をウェル当り１００μｌ加え、室温で３０分間反応させた。この４０５ｎｍにおける吸光度を、９６ウェルプレート用のＥＬＩＳＡリーダー測定器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄａｖｉｃｅ社  Ｖｍａｘ）を用いて調べ、組換えhuman Nesfatin-1あるいは組換えhuman Nesfatinと結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを選択した。
【０１２９】
（４）ハイブリドーマのクローニング
このように選択したハイブリドーマについて、限界希釈法によるクローニングを２回行い、株化した。具体的にはマウス腹腔浸出細胞をＨＴ培地中１０６個／ｍｌの割合に調製したものを各ウェルに分注し、これにウェル当り０．５個の割合でＨＴ培地に懸濁したハイブリドーマ細胞を播き込んだ。５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で２週間培養し、その培養上清について上記ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングし、単一コロニーをピックアップすることで株化を行った。
【０１３０】
最終的に、human Nesfatin-1を免疫して得られたハイブリドーマからのみ、組換えhuman Nesfatin-1または組換えhuman Nesfatinに反応性を有するIgGを産生するハイブリドーマをクローニングすることができた。
【０１３１】
実施例１０
＜NESFATIN-1に対するマウスモノクローナル抗体の反応性評価＞
ハイブリドーマ産生抗体の各種抗原（ヒトNesfatin-1、ヒトNesfatin、ヒトNucB1-N77、ラットNesfatin-1、またはラットNesfatin）に対する反応性を評価するため、実施例１、２、３または４で作製された組換えGST融合タンパク質をプレートに固定して反応性を抗原ＥＬＩＳＡ法にて評価した。
【０１３２】
ヒトNesfatin-1、ヒトNesfatin、ヒトNucB1-N77、ラットNesfatin-1、またはラットNesfatinのGST融合タンパクのPBS溶液（１μｇ／ｍＬ）を９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社、ＰＶＣ製）に各ウェル当り５０μＬづつ分注し、４℃で一晩放置した。洗浄後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳを各ウェル当り２００μＬ加えて３７℃で１時間ブロッキングした。再度洗浄後、各ウェル当り５０μＬのハイブリドーマ培養上清を加え、室温で１時間放置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄した。
【０１３３】
次に、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼをウェル当り５０μＬ加え、室温で１時間放置した。再度洗浄し、０．２５ｍＭの塩化マグネシウムを含む１Ｍ  ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）に溶解したｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム塩（和光純薬）の１ｍｇ／ｍＬ溶液をウェル当り１００μＬ加え、室温で３０分間反応させた。この４０５ｎｍにおける吸光度を、９６ウェルプレート用のＥＬＩＳＡリーダー測定器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄａｖｉｃｅ社  Ｖｍａｘ）を用いて調べ、組換えNesfatin-1と特異的に結合するモノクローナルＩｇＧ抗体を分泌するハイブリドーマ２１クローンを選択した。Ｉｇタイピングは、ＰＩＡＲＣＥ社のIsotyping Kitを使用して実施した。ハイブリドーマ２１クローンのうち９クローンについて、各モノクローナル抗体の各組換えタンパク質に対する反応性評価結果を表８に示す。反応性は、３段階に分けて評価した。
◎（Excellent）：ＯＤ405nmが０．３以上
○（Good）     ：ＯＤ405nmが０．０６以上〜０．３未満
×（Poor）     ：ＯＤ405nmが０．０６未満
【０１３４】
【表８】
2010536715.tif 000010
【０１３５】
これらの結果から、抗Nesfatin-1抗体を産生するハイブリドーマ２１クローンのうち、ＮＡＰ３７、ＮＡＰ３９、ＮＡＰ４０−２の３クローンを選択して、大量培養し、培養上清を回収した。培養上清中の抗体をプロテインＧカラムで常法により精製した。
【０１３６】
実施例１１
＜Nesfatin-1に対するマウスモノクローナル抗体を使用したNesfatin-1測定系の作製＞
（１）Nesfatin-1測定系の構成
（Ａ）ビオチン化抗体の作製
実施例５または６で得られた抗Nesfatin、Nesfatin-1ウサギポリクローナル抗体（抗体Ｎｏ．４９９８、抗体Ｎｏ．５０３６、抗体Ｎｏ．５０３７、抗体Ｎｏ．６１５１、抗体Ｎｏ．６１５２）のＩｇＧのビオチン化を、実施例７（１）（Ａ）と同様にして行った。
【０１３７】
（Ｂ）抗体固定化プレートの調製
実施例１０で得られた抗体（抗組換えヒトNesfatin-１マウスモノクローナル抗体（NAP40-2, NAP37, NAP39））を使用して、実施例７（１）（Ｂ）と同様にして、NAP40-2、NAP37、またはNAP39が固定化された抗体固定化プレートを得た。
【０１３８】
（Ｃ）測定系の構築−（１）
上記実施例１１（１）（Ｂ）で調製した抗組換えヒトNesfatin-１マウスモノクローナル抗体（NAP40-2, NAP37, NAP39）固定化プレートと、上記実施例１１（１）（Ａ）で作製したビオチン化ＩｇＧ（ビオチン化抗体Ｎｏ．６１５１、ビオチン化抗体Ｎｏ．６１５２）を使用する測定系を検討した。
検体として、精製した組換えヒトNesfatin-１（標準物質）を０−１０ｎＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。ビオチン化ＩｇＧを２μｇ／ｍＬ含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各濃度０−１０ｎＭの検体について、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、ブロットした。結果を図１０および１１に示す。
その結果、NAP40-2固定プレートが最も感度良くヒトNesfatin-1を測定できることがわかった。NAP40-2については、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託した（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８４  受領日  ２００７年７月２７日）。
【０１３９】
（Ｃ）測定系の構築−（２）
上記実施例１１（１）（Ｂ）で調製した抗組換えヒトNesfatin-１マウスモノクローナル抗体（NAP40-2）固定化プレートと、実施例１１（１）（Ａ）で作製したビオチン化ＩｇＧ（ビオチン化抗体Ｎｏ．６１５１、ビオチン化抗体Ｎｏ．６１５２、ビオチン化抗体Ｎｏ．４９９８、ビオチン化抗体Ｎｏ．５０３６、またはビオチン化抗体Ｎｏ．５０３７）を使用する測定系を検討した。
検体として、精製した組換えヒトNesfatin-１（標準物質）を０〜１０ｎＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。ビオチン化ＩｇＧは、ビオチン化ＩｇＧを２μｇ／ｍＬ含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各濃度０〜１０ｎＭの検体について、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、ブロットした。結果を図１２および図１３に示す。
その結果、ビオチン化抗体Ｎｏ．４９９８が最も感度良くヒトNesfatin-1を測定できることがわかった。
【０１４０】
（２）測定系の種差に対する測定感度評価
上記実施例１１（１）で検出感度の最も良かった測定系（抗組換えヒトNesfatin-１マウスモノクローナル抗体（NAP40-2）固定化プレートと、ビオチン化抗体Ｎｏ．４９９８を使用する系）を使用して、ラットNesfatin-1との交差反応性を検討した。
検体として、精製した組換えヒトNesfatin-１（標準物質）、組換えラットNesfatin-１（標準物質）を０〜１００ｎＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。ビオチン化ＩｇＧは、ビオチン化ＩｇＧを２μｇ／ｍＬ含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各濃度０〜１００ｎＭの検体について、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、ブロットした。結果を図１４に示す。
【０１４１】
（３）測定系のNesfatinに対する交差反応性評価
上記実施例１１（１）でNesfatin-1の検出感度の最も良かった測定系（抗組換えヒトNesfatin-１マウスモノクローナル抗体（NAP40-2）固定化プレートと、ビオチン化抗体Ｎｏ．４９９８を使用する系）を使用して、Nesfatin（Ｆｕｌｌ分子）との交差反応性を検討した。
【０１４２】
検体として、精製した組換えヒトNesfatin-１（標準物質）、組換えラットNesfatin-１（標準物質）、または組換えマウスNesfatin-１（標準物質）を０〜５０ｎＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。また、交差反応性を検証するための検体として、精製した組換えヒトNesfatin（標準物質）、組換えラットNesfatin（標準物質）、または組換えマウスNesfatin（標準物質）を０〜２５ｎＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈液を作製使用した。ビオチン化ＩｇＧは、ビオチン化ＩｇＧを２μｇ／ｍＬ含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各濃度０〜５０ｎＭの検体ついて、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、ブロットした。結果を図１５に示す。
結果から、ＮＡＰ４０−２抗体固定およびビオチン化抗体Ｎｏ．４９９８を用いる系では、ラット、マウスのNesfatinに対する反応性は検出されず、ラット、マウスNesfatin-1特異的に測定できることがわかった。また、ヒトNesfatinに対しては、25nMで若干反応性が観察されるものの１０００倍近い感度でヒトNesfatin-1を検出できるので、それ以下の比でNesfatin-1とNesfatinが存在するなら問題にならないと判断された。
【０１４３】
実施例１２
＜NESFATIN部分ペプチドに対するマウスモノクローナル抗体作製＞
（１）Nesfatin部分ペプチドによるマウスの免疫
実施例５で作製したNesfatin部分ペプチド（配列番号１〜４）を１０〜２０μｇ／回／ｈｅａｄをフロインドのコンプリートアジュバント（ＢＡＣＴＯ社製、１：１）とともに、２週間毎にＢａｌｂ／ｃマウス（７週齢、オス）に腹腔内投与した。これを４回行った後、５回目は細胞融合の３日前に組換えhuman Nesfatin-1あるいは組換えhuman Nesfatin溶液５０μｇを静脈内投与した。
【０１４４】
マウスの尾静脈より採血し、３７℃で３０分間インキュベートした後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心して血清を回収し、マウス血清中の抗Nesfatin抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。得られた血清を用い、およびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体として、ＺＹＭＥＤ社製のものに変える以外は、実施例９（１）と同様にして行った。
【０１４５】
（２）細胞融合によるハイブリドーマの作製
実施例１１（１）で免疫されたマウスの脾細胞を用いて、実施例９（２）と同様にしてハイブリドーマを作製した。
【０１４６】
（３）ハイブリドーマのスクリーニング
得られたハイブリドーマに対して、実施例９（２）と同様のスクリーニングを行った。なお、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで２０００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼコンジュゲートの代わりに、３％ＢＳＡおよび０．２％スキムミルクを含むＰＢＳで２０００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｔａｇｏ社）を使用した。結果を表９に示す。表中、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧは、それぞれ、Ｄ：NesfatinのＣ末端ペプチド（NSF-C18）、Ｅ：NesfatinのＮ末端ペプチド（NSF-N19）、Ｆ：Nesfatin-1のＣ末端ペプチド（NSF1-C18）、またはＧ：Nesfatin-1の中央部分のペプチド（NSF1-M15）による免疫マウスより得られたハイブリドーマのクローンを表す。また、表中の数値は、４０５ｎｍにおける吸光度を表す。
【０１４７】
【表９】
2010536715.tif 000011
【０１４８】
（４）ハイブリドーマのクローニング
実施例９（４）と同様にして、選択したハイブリドーマについてクローニングを行った。
【０１４９】
（５）ハイブリドーマの培養および抗体精製
以上の操作で得られた抗Nesfatin-1抗体を産生するハイブリドーマ２０クローンのうち、１１クローンを大量培養し、培養上清を回収した。培養上清中の抗体をプロテインＧカラムで常法により精製した。
【０１５０】
実施例１３
＜NESFATIN部分ペプチドに対するマウスモノクローナル抗体の反応性評価＞
（１）抗原ELISAによる抗体の反応性評価
実施例１２により取得した精製ＩｇＧを用いて、抗原ELISAによる各抗体の反応性評価を実施例５（２）と同様にして行った。そのほか、反応性評価対象として、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ：Ｎｕｎｃ社）にＰＢＳ（ｐＨ７）で１μｇ／ｍｌに希釈したＧＳＴ融合組換えヒトNesfatin-1、ヒトNesfatin、ヒトNucB1-N77、ラットNesfatin、またはラットNesfatin-1が固定されたものを使用する以外は、実施例５（２）と同様にして行った。結果を表１０および表１１に示す。表中の数値は、４０５ｎｍにおける吸光度を表す。なお、表中表されるクローンは、例えば、ＮＡＥ−３を例にあげると、ＮＡＥ−３は、表９におけるＥ：NesfatinのＮ末端ペプチド（NSF-N19）による免疫マウスより得られたハイブリドーマのクローン番号３と同一のものを表す。
【０１５１】
【表１０】
2010536715.tif 000012
【０１５２】
【表１１】
2010536715.tif 000013
【０１５３】
表１０の結果から、ＮＡＥ１がヒトNesfatin、ヒトNesfatin-1、ラットNesfatinのいずれにも高い反応性を示し、一方、ＮＡＥ３はヒトNesfatin、ヒトNesfatin-1に高い反応性を示したがラットとの交差反応性は無いことがわかった。またＮＡＤ１５はヒトNesfatin、ラットNesfatinのいずれにも高い反応性をしめし、ヒトNesfatin-1には反応しないことがわかった。いずれの抗体もNucB1-N77には反応性を全く示さなかった。
【０１５４】
表１１の結果から、ＮＡＦ１１がヒトNesfatin、ヒトNesfatin-1、ラットNesfatin-1のいずれにも高い反応性を有し、ヒトNucB1-N77に対する交差反応性は無いことがわかった。
【０１５５】
NAE-1、NAF-7、NAF-11およびについては、それぞれ、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託した（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８１、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８２、およびＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０８８３  受領日  ２００７年７月２７日）。
【０１５６】
実施例１４
＜NESFATIN部分ペプチドに対するマウスモノクローナル抗体(NAE1)を使用したNesfatin-1測定系の作製＞
（１）測定系の構築
（Ａ）ビオチン化抗体の作製
実施例１２で得られた抗Nesfatin-１C末端ペプチドマウスモノクローナル抗体（NAE1、NAE3）（ＩｇＧ）のビオチン化を、実施例７（１）（Ａ）と同様にして行った。
【０１５７】
（Ｂ）抗体固定化プレートの調製
実施例５で作製した抗体（抗原アフィニティー精製抗Nesfatin-1 C末端ペプチドウサギポリクローナル抗体（抗体Ｎｏ．４９９８））を使用して、実施例７（１）（Ｂ）と同様にして、抗体Ｎｏ．４９９８が固定化された抗体固定化プレートを作製した。
【０１５８】
（Ｃ）測定系の構築
上記実施例１４（１）（Ｂ）で調製した抗Nesfatin-１C末端ペプチドＰＡｂ(抗体Ｎｏ．４９９８)固定化プレートと、上記実施例１４（１）（Ａ）で作製したビオチン化ＩｇＧ（ビオチン化ＮＡＥ１）を使用する測定系を検討した。
検体として、精製した組換えヒトNesfatin-１（標準物質）を０−２００ｐＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。ビオチン化抗体は、ビオチン化抗体を２μｇ／ｍｌ含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各濃度０〜２００ｐＭの検体について、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、ブロットした。結果を図１６に示す。
【０１５９】
（２）測定系の種差に対する測定評価
上記実施例１４（１）（Ｂ）で調製した抗Nesfatin-１C末端ペプチドＰＡｂ(抗体Ｎｏ．４９９８)固定化プレートと、上記実施例１４（１）（Ａ）で作製したビオチン化ＩｇＧ（ビオチン化ＮＡＥ１、ビオチン化ＮＡＥ３）を使用して、ラットNesfatin-1との交差反応性を検討した。
【０１６０】
検体として、精製した組換えヒトNesfatin-１（標準物質）、または組換えラットNesfatin-１（標準物質）を０−２ｎＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。ビオチン化ＩｇＧは、ビオチン化ＩｇＧを２μｇ／ｍｌ含有する３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各濃度０〜２ｎＭの検体について、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、ブロットした。結果を図１７に示す。
その結果、ビオチン化ＮＡＥ１、およびビオチン化ＮＡＥ３は共に、ヒトNesfatin-1のみを検出し、ラットNesfatin-1には交差反応性を示さないことがわかった。
【０１６１】
（３）NucB1-N77交差反応性評価
上記実施例１４（１）（Ｂ）で調製した抗Nesfatin-１C末端ペプチドＰＡｂ(抗体Ｎｏ．４９９８)固定化プレートと、上記実施例１４（１）（Ａ）で作製したビオチン化ＩｇＧ（ビオチン化ＮＡＥ１）を使用して、NucB1-N77との交差反応性を検討した。
【０１６２】
検体として、精製した組換えヒトNesfatin-１（標準物質）、または精製組換えヒトNucB1-N77を０〜２００ｐＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。ビオチン化ＩｇＧは、ビオチン化ＩｇＧを２μｇ／ｍＬ含有する３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各濃度０〜２ｎＭの検体について、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、ブロットした。結果を図１８に示す。
その結果、本測定系はヒトNesfatin-1のみを検出し、ヒトNucB1-N77には交差反応性を示さないことがわかった。
【０１６３】
（４）Nesfatin交差反応性評価
上記実施例１４（１）（Ｂ）で調製した抗Nesfatin-１C末端ペプチドＰＡｂ(抗体Ｎｏ．４９９８)固定化プレートと、上記実施例１４（１）（Ａ）で作製したビオチン化ＩｇＧ（ビオチン化ＮＡＥ１）を使用して、精製した組換えヒトNesfatinとの交差反応性を検討した。
【０１６４】
検体として、精製した組換えヒトNesfatin-１（標準物質）、または組換えヒトNesfatinを０〜２００ｐＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。ビオチン化ＩｇＧは、ビオチン化ＩｇＧを２μｇ／ｍＬ含有する３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各濃度０〜２００ｐＭの検体について、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、ブロットした。結果を図１９に示す。
その結果、本測定系はヒトNesfatin-1のみを検出し、ヒトNesfatinには交差反応性を示さないことがわかった。
【０１６５】
実施例１５
＜NESFATIN部分ペプチドに対するマウスモノクローナル抗体(NAE1)を使用したNesfatin測定系の作製＞
（１）測定系の構築
（Ａ）ビオチン化抗体の作製
実施例１２で得られた抗Nesfatin-１C末ペプチドマウスモノクローナル抗体（NAE1, NAE3, NAD15）（ＩｇＧ）のビオチン化を、実施例７（１）（Ａ）と同様にして行った。
【０１６６】
（Ｂ）抗体固定化プレートの調製
抗体（抗原ペプチドアフィニティー精製 抗Nesfatin C末端ペプチドＰＡｂ；抗体Ｎｏ．４９９４、または抗Nesfatin-１C末ペプチドマウスモノクローナル抗体（NAD15））を使用して、実施例７（１）（Ｂ）と同様にして、抗体Ｎｏ．４９９４またはＮＡＤ１５が固定化された抗体固定化プレートを作製した。
【０１６７】
（Ｃ）測定系の構築
抗体Ｎｏ．4994固定プレートと、ビオチン化NAE1, NAE3, NAD15を使用して、ヒトNesfatinに対する反応性を検討した。
検体として、精製した組換えNesfatin（標準物質）を０〜１ｎＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。ビオチン化ＩｇＧは、ビオチン化ＩｇＧを２μｇ／ｍｌ含有する３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各濃度０−１ｎＭの検体について、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、ブロットした。結果を図２０に示す。
【０１６８】
（２）ビオチン化抗体の種差に対する反応性評価
抗体NAD15(ヒトNesfatin C末端ペプチドに対するマウスモノクローナル抗体)固定プレートと、ビオチン化NAE1, NAE3を使用して、組換えヒトNesfatinまたは組換えラットNesfatinとの交差反応性を検討した。
【０１６９】
検体として、精製した組換えヒトNesfatin（標準物質）、またはラットNesfatinを０〜１０ｎＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。ビオチン化ＩｇＧは、ビオチン化ＩｇＧを２μｇ／ｍｌ含有する３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各濃度０〜１０ｎＭの検体について、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、ブロットした。結果を図２１に示す。
この結果から、NAE1, NAE3共にラットNesfatinに対する反応性が無いことが示された。
【０１７０】
（３）NucB1に対する交差反応性評価
実施例１５（１）より、抗体Ｎｏ．4994固定プレートと、ビオチン化NAE1（検出抗体）を使用する測定系がヒトNesfatinを最も高感度に検出しうることが示されたため、この測定系に関して、ヒトNucB1との交差反応性を検討した。
【０１７１】
検体として、精製した組換えヒトＮｕｃＢ１（ＧＳＴ融合タンパク）を０〜８００ｐＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列、および精製した組換えヒトNesfatinを０−２００ｐＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。ビオチン化ＩｇＧは、ビオチン化ＩｇＧを２μｇ／ｍｌ含有する３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各濃度０〜１ｎＭの検体について、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、ブロットした。結果を図２２に示す。
この結果からＮｕｃＢ１に対する交差反応性は全く認められなかった。このことから本測定系はNesfatin特異的な測定系であると考えられる。
【０１７２】
実施例１６
＜NESFATIN部分ペプチドに対するマウスモノクローナル抗体(NAF11)を使用したNesfatin-1測定系の作製＞
（１）測定系の構築
（Ａ）ビオチン化抗体の作製
実施例１２で得られたマウスモノクローナル抗体のうち、ヒトとラットのNesfatin-１に反応し、ヒトNucB1との交差反応性が認められなかった抗Nesfatin-１C末ペプチドマウスモノクローナル抗体（NAF11）を用いて、そのＩｇＧのビオチン化を実施例７（１）（Ａ）と同様にして行った。
【０１７３】
（Ｂ）抗体固定化プレートの調製
抗体（抗原ペプチドアフィニティー精製 抗Nesfatin-１C末端ペプチドＰＡｂ(抗体Ｎｏ．４９９８)）を使用して、実施例７（１）（Ｂ）と同様にして、抗体Ｎｏ．４９９８が固定化された抗体固定化プレートを作製した。
【０１７４】
（Ｃ）測定系の構築
上記実施例１６（１）（Ｂ）で調製した抗Nesfatin-１C末端ペプチドＰＡｂ(抗体Ｎｏ．４９９８)固定化プレートと、上記実施例１６（１）（Ａ）で作製したビオチン化ＩｇＧ（ＮＡＦ１１）を使用する測定系を検討した。
検体として、精製した組換えNesfatin-１（標準物質）を０〜1ｎＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈系列を作製し使用した。ビオチン化ＩｇＧは、ビオチン化ＩｇＧを２μｇ／ｍｌ含有する３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各濃度０〜1ｎＭの検体について、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、これをブロットした。結果を図２３に示す。
【０１７５】
実施例１７
＜NESFATIN部分ペプチドに対するマウスモノクローナル抗体(NAF11)を使用したNesfatin測定系の作製＞
（１）測定系の構築
（Ａ）ビオチン化抗体の作製
実施例１２で得られたマウスモノクローナル抗体のうち、ヒトとラットのNesfatin-１に反応し、ヒトNucB1との交差反応性が認められなかった抗Nesfatin-１C末ペプチドマウスモノクローナル抗体（NAF11）を用いて、ＩｇＧのビオチン化を、実施例７（１）（Ａ）と同様にして行った。
【０１７６】
（Ｂ）抗体固定化プレートの調製
抗体（抗原ペプチドアフィニティー精製 抗Nesfatin C末端ペプチドＰＡｂ；抗体Ｎｏ．４９９４）を使用して、実施例７（１）（Ｂ）と同様にして、抗体Ｎｏ．４９９４が固定化された抗体固定化プレートを作製した。
【０１７７】
（Ｃ）測定系の構築
上記実施例１７（Ｂ）で調製した抗Nesfatin -１C末端ペプチドＰＡｂ(抗体Ｎｏ．４９９４)固定化プレートと、ビオチン化抗体（抗体ＮＡＦ１１）を使用して、ヒト、マウス、ラットに対する交差反応性を検討した。
【０１７８】
検体として、精製した組換えヒト、ラット、マウスNesfatin（標準物質）を０〜１ｎＭの範囲で含有する３％ＢＳＡ含有１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液の検体希釈液を作製し使用した。ビオチン化ＩｇＧは、ビオチン化ＩｇＧを２μｇ／ｍｌ含有する３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．２）溶液として使用した。それ以外は、実施例７（１）（Ｃ）と同様にして行った。各濃度０〜１ｎＭの検体について、４５０ｎｍの波長におけるこの溶液の吸収強度を測定し、ブロットした。結果を図２４に示す。
【産業上の利用可能性】
【０１７９】
本発明により、Nesfatin-1と抗原抗体反応するが、NesfatinもしくはNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体、ならびにNesfatin-1と抗原抗体反応するが、NesfatinおよびNucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体、さらには、その抗体を用いる、Nesfatin-1の免疫学的検出方法および検出キットを提供することができる。
また、本発明により、Nesfatinと抗原抗体反応するが、NucB1とは実質的に抗原抗体反応しない抗体、さらには、その抗体を用いる、Nesfatinの免疫学的検出方法および検出キットを提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１８０】
配列表の説明
（１）配列番号１  ＮＳＦ１−Ｃ１８のアミノ酸配列
（２）配列番号２  ＮＳＦ１−Ｍ１５のアミノ酸配列
（３）配列番号３  ＮＳＦ−Ｃ１８のアミノ酸配列
（４）配列番号４  ＮＳＦ−Ｎ１９のアミノ酸配列
（５）配列番号５  ヒト由来Nesfatin-1のアミノ酸配列
（６）配列番号６  マウス由来Nesfatin-1のアミノ酸配列
（７）配列番号７  ラット由来Nesfatin-1のアミノ酸配列
（８）配列番号８  ヒト由来ＮＥＳＦＡＴＩＮのアミノ酸配列
（９）配列番号９  ヒト由来ＮＥＳＦＡＴＩＮ（Ｍａｔｕｒｅ）のアミノ酸配列
（１０）配列番号１０  マウス由来ＮＥＳＦＡＴＩＮのアミノ酸配列
（１１）配列番号１１  マウス由来ＮＥＳＦＡＴＩＮ（Ｍａｔｕｒｅ）のアミノ酸配列
（１２）配列番号１２  ラット由来ＮＥＳＦＡＴＩＮのアミノ酸配列
（１３）配列番号１３  ラット由来ＮＥＳＦＡＴＩＮ（Ｍａｔｕｒｅ）のアミノ酸配列
（１４）配列番号１４  ヒト由来ＮｕｃＢ１（Ｍａｔｕｒｅ）のアミノ酸配列
（１５）配列番号１５  マウス由来ＮｕｃＢ１（Ｍａｔｕｒｅ）のアミノ酸配列
（１６）配列番号１６  ラット由来ＮｕｃＢ１（Ｍａｔｕｒｅ）のアミノ酸配列
（１７）配列番号１７  ヒト由来ＮｕｃＢ１−Ｎ７７のアミノ酸配列
（１８）配列番号１８  マウス由来ＮｕｃＢ１−Ｎ７７のアミノ酸配列
（１９）配列番号１９  ラット由来ＮｕｃＢ１−Ｎ７７のアミノ酸配列
（２０）配列番号２０  Human NESFATIN & Human NESFATIN-1 1st PCR Primer hNucB2-F0191
（２１）配列番号２１  Human NESFATIN & Human NESFATIN-1 1st PCR Primer hNucB2-R1549
（２２）配列番号２２  Human NESFATIN & Human NESFATIN-1 2nd PCR Primer hNucB2-F292
（２３）配列番号２３  Human NESFATIN-1 2nd PCR Primer hNucB2-R514
（２４）配列番号２４  Human NESFATIN 2nd PCR Primer hNucB2 R1461
（２５）配列番号２５  Human NucB1 & Human NucB1-N77 1st PCR Primer hNucB1-F061
（２６）配列番号２６  Human NucB1 & Human NucB1-N77 1st PCR Primer hNucB1-R1376
（２７）配列番号２７  Human NucB1 & Human NucB1-N77 2nd PCR Primer hNucB1-F096
（２８）配列番号２８  Human NucB1-N77 2nd PCR Primer hNucB1-R303
（２９）配列番号２９  トロンビン認識部位
（３０）配列番号３０  mouse NESFATIN & mouse NESFATIN-1 1st PCR Primer mNucB2-F337
（３１）配列番号３１  mouse NESFATIN & mouse NESFATIN-1 1st PCR Primer mNucB2-R1613
（３２）配列番号３２  mouse NESFATIN & mouse NESFATIN-1 2nd PCR Primer mNucB2-F360
（３３）配列番号３３  mouse NESFATIN-1 2nd PCR Primer mNucB2-R582
（３４）配列番号３４  mouse NESFATIN 2nd & 3rd PCR Primer mNucB2-R1527
（３５）配列番号３５  mouse NESFATIN 3rd PCR Primer His-Thr-For
（３６）配列番号３６  mouse NucB1 & mouse NucB1-N77 1st PCR Primer mNucB1-F009
（３７）配列番号３７  mouse NucB1 & mouse NucB1-N77 1st PCR Primer mNucB1-R1406
（３８）配列番号３８  mouse NucB1 & mouse NucB1-N77 2nd PCR Primer mNucB1-F094
（３９）配列番号３９  mouse NucB1-N77 2nd PCR Primer mNucB1-R301
（４０）配列番号４０  mouse NucB1 2nd PCR Primer mNucB1-R1360
（４１）配列番号４１  rat NESFATIN & rat NESFATIN-1 1st PCR Primer rNucB2-F204
（４２）配列番号４２  rat NESFATIN & rat NESFATIN-1 1st PCR Primer rNucB2-R1540
（４３）配列番号４３  rat NESFATIN & rat NESFATIN-1 2nd PCR Primer ratNucB2-F286
（４４）配列番号４４  rat NESFATIN-1 2nd PCR Primer ratNucB2-R507
（４５）配列番号４５  rat NESFATIN 2nd & 3rd PCR Primer ratNucB2-R1531
（４６）配列番号４６  rat NucB1 & rat NucB1-N77 1st PCR Primer ratNucB1-F001
（４７）配列番号４７  rat NucB1 & rat NucB1-N77 1st PCR Primer ratNucB1-R1402
（４８）配列番号４８  rat NucB1 & rat NucB1-N77 2nd PCR Primer rNucB1-F078
（４９）配列番号４９  rat NucB1-N77 2nd PCR Primer rNucB1-R285
（５０）配列番号５０  rat NucB1 2nd PCR Primer rNucB1-R1357
【図１】
2010536715.tif 000014
【図２】
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【図３】
2010536715.tif 000016
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010536715.tif 000020
【図８】
2010536715.tif 000021
【図９】
2010536715.tif 000022
【図１０】
2010536715.tif 000023
【図１１】
2010536715.tif 000024
【図１２】
2010536715.tif 000025
【図１３】
2010536715.tif 000026
【図１４】
2010536715.tif 000027
【図１５】
2010536715.tif 000028
【図１６】
2010536715.tif 000029
【図１７】
2010536715.tif 000030
【図１８】
2010536715.tif 000031
【図１９】
2010536715.tif 000032
【図２０】
2010536715.tif 000033
【図２１】
2010536715.tif 000034
【図２２】
2010536715.tif 000035
【図２３】
2010536715.tif 000036
【図２４】
2010536715.tif 000037
【配列表】
2010536715000001.app
【国際調査報告】
2010536715.tif 000038
2010536715.tif 000039
2010536715.tif 000040
2010536715.tif 000041
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