(57)【要約】  本発明は、魚、好ましくはコイ、より好ましくはシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）において免疫原性がある、組み換えコイヘルペス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）及び、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はＣｙＨＶ−３により引き起こされる疾患の予防及び／又は治療処置のためのワクチンに関する。コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）により引き起こされる疾患に対して、魚において、好ましくはコイ、より好ましくはシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）において免疫を与えるために、５種類の組み換えヘルペスウイルスが使用される。
2010536394.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚において、好ましくはコイにおいて、より好ましくはシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）において免疫原性である、組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）。
【請求項２】
コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）により引き起こされる疾患に対して、魚において、好ましくはコイにおいて、より好ましくはシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）において免疫を与える能力を有する、請求項１に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項３】
複製に必須ではない１以上のウイルス遺伝子が欠損している、請求項１又は請求項２に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項４】
毒性に関与する少なくとも１つの遺伝子が欠損している、請求項１から請求項３の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項５】
チミジンキナーゼ遺伝子、ＯＲＦ１２：推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子、ＯＲＦ１６：推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子、ＯＲＦ１３４：推定インターロイキン１０ホモローグ遺伝子、ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子又はそれらの何らかの組み合わせからなる群から選択される毒性に関与する少なくとも１つの遺伝子が欠損している、請求項１から請求項４の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項６】
ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子及び、ＯＲＦ１２：推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子；ＯＲＦ１６：推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子；ＯＲＦ１３４：推定インターロイキン１０ホモローグ遺伝子；ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子又はそれらの何らかの組み合わせからなる群から選択される毒性に関与する少なくとも１つのさらなる遺伝子が欠損している、請求項１から請求項５の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項７】
チミジンキナーゼ遺伝子が欠損している、請求項１から請求項４の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項８】
ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子が欠損している、請求項１から請求項４の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項９】
チミジンキナーゼ遺伝子及びＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子が欠損している、請求項１から請求項４の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項１０】
ヘルペスウイルスが生きている形態である、請求項１から請求項９の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項１１】
許容状態の真核細胞又は魚個体に導入された際に、感染粒子を再構成する能力を有する、請求項１から請求項１０の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項１２】
弱毒化形態である、請求項１から請求項１１の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項１３】
前記ヘルペスウイルスに感染した、魚において、好ましくはコイにおいて、より好ましくはマゴイ（シプリヌス・カルピオ・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ））又はニシキゴイ（シプリヌス・カルピオ・コイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ））において、４０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは１％以下、またさらに好ましくは０．１％以下の致死率及び最も好ましくは０．０％の致死率をもたらす、請求項１から請求項１２の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項１４】
不活性であり、非複製形態であるか又は欠損弱毒化（ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）形態である、請求項１から請求項９の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項１５】
ＢＡＣ（細菌人工染色体）ベクター配列を含む、請求項１から請求項１４の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項１６】
ＢＡＣ（細菌人工染色体）ベクター配列がコイヘルペスウイルスゲノムに挿入される、請求項１から請求項１５の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項１７】
ＢＡＣベクター配列がヘルペスウイルスゲノムから切除され、それによりヘルペスウイルスゲノムのそれぞれ切除部位又は元の挿入部位において異種配列が残存する、請求項１５又は請求項１６の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項１８】
異種配列又は異種遺伝子、好ましくはコイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルスのＧ糖タンパク質をさらに含む、請求項１から請求項１７の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス。
【請求項１９】
コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）により引き起こされる疾患に対して、魚において、好ましくはコイにおいて、より好ましくはシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）において免疫を与える能力を有する、魚でのワクチン目的及び／又は予防的健康管理のために使用されるためのＤＮＡ配列。
【請求項２０】
異種配列又は異種遺伝子、好ましくはコイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルスのＧ糖タンパク質をさらに含む、請求項１９に記載のＤＮＡ配列。
【請求項２１】
コイヘルペスウイルスゲノム又はその一部を含む、ベクター。
【請求項２２】
コイヘルペスウイルスゲノムにおいて、チミジンキナーゼ遺伝子、ＯＲＦ１２：推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子、ＯＲＦ１６：推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子、ＯＲＦ１３４：推定インターロイキン１０相同遺伝子、ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子又はそれらの何らかの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が欠損しており、好ましくはチミジンキナーゼ遺伝子及び／又はＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子、さらに好ましくは両遺伝子が欠損している、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
異種配列又は異種遺伝子、好ましくはコイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルスのＧ糖タンパク質をさらに含む、請求項２１又は請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
ＢＡＣベクター配列をさらに含む、請求項２１又は請求項２３の何れか１項に記載のベクター。
【請求項２５】
請求項１から請求項１８に記載の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス又は請求項１９もしくは請求項２０に記載のＤＮＡ配列又は請求項２１から請求項２４の何れか１項に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２６】
寄託番号ＬＭＢＰ５６５８を有する、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
請求項２６に記載の細胞により生成されるウイルス。
【請求項２８】
次の組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）ゲノム又は組み換えコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）ゲノムの何れか１つ：（ａ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター配列を含む組み換えコイヘルペスウイルスゲノム（ＫＨＶ）又は組み換えコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）ゲノム；（ｂ）（ａ）の構築物から細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター配列が切除される、組み換えコイヘルペスウイルスゲノム（ＫＨＶ）又は組み換えコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）ゲノムを、許容状態の真核細胞に導入し；組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又は組み換えコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）を生成させるために宿主細胞を培養する段階を含む、組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はＣｙｐｒｉｎｉｄヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）の感染粒子の生成のための方法。
【請求項２９】
請求項２８の方法により生成される、感染粒子。
【請求項３０】
コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢ又はその派生物。
【請求項３１】
コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）により引き起こされる疾患の予防的及び／又は治療的処置のためのワクチン。
【請求項３２】
請求項１から請求項１８の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス又は請求項１９もしくは請求項２０に記載のＤＮＡ配列又は請求項２１から請求項２４の何れか１項に記載のベクター又は請求項２９に記載の感染粒子を含むか又はコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）もしくは（ＫＨＶ）もしくはコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢもしくはその派生物を含む、請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３３】
コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）により引き起こされる疾患の予防的及び／又は治療的処置のための医薬品／ワクチンの製造のための、請求項１から請求項１８の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス又は請求項１９もしくは請求項２０に記載のＤＮＡ配列又は請求項２１から請求項２４の何れか１項に記載のベクター又は請求項２９に記載の感染粒子又はコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はＣｙＨＶ−３寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢもしくはその派生物の使用。
【請求項３４】
請求項１から請求項１８の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス又は請求項１９もしくは請求項２０に記載のＤＮＡ配列又は請求項２１から請求項２４の何れか１項に記載のベクター又は請求項２９に記載の感染粒子又はコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はＣｙＨＶ−３寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢもしくはその派生物の治療的有効量の、魚、好ましくはコイ、より好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）又はニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）個体への導入を含む、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）により引き起こされる疾患の予防的及び／又は治療的処置のための方法。
【請求項３５】
請求項１８に記載の組み換えコイヘルペスウイルス又は請求項２０に記載のＤＮＡ配列又は請求項２３に記載のベクターを含んでいる、コイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルスにより引き起こされる疾患の予防的及び／又は治療的処置のためのワクチン。
【請求項３６】
チミジンキナーゼ遺伝子が欠損している、組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）。
【請求項３７】
ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子が欠損している、組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）。
【請求項３８】
チミジンキナーゼ遺伝子及びＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子が欠損している、組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）。
【請求項３９】
シプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）もしくはそれら由来の細胞へ又はシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）以外の魚もしくはそれら由来の細胞へ、関心のあるポリヌクレオチド又は遺伝子を運ぶためのベクターとしての、請求項１から請求項１８、請求項３６から請求項３８の何れか１項に記載の組み換えコイヘルペスウイルス又は請求項１９もしくは請求項２０に記載のＤＮＡ配列又は請求項２１から請求項２４の何れか１項に記載のベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）及び、マゴイ（シプリヌス・カルピオ・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ））又はニシキゴイ（シプリヌス・カルピオ・コイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ））においてコイヘルペスウイルス／コイ科ヘルペスウイルス３により引き起こされる疾患の予防のためのワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
マゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）は、主にアジア、欧州及び中東で食用のために最も広く養殖されている魚である。一方、ニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）亜種は、特に日本で、さらには世界中でも、個人の娯楽のために又は品評会のために、高価で美しく、色鮮やかなペット魚として養殖されている。マゴイ及びニシキゴイで致死的疾患を引き起こすウイルスは、最初はコイヘルペスウイルス疾患（ＫＨＶＤ）と呼ばれ、１９９６年に英国で検出された。このウイルスは、イスラエル、米国及びドイツにおいてニシキゴイ及びマゴイ間での大量死の原因としてすぐに同定された。マゴイの集約的養殖及びニシキゴイのショー及び国際貿易によって、残念なことに、この非常に感染力が高く非常に毒性の強い疾患が急速に世界に広がった。その出現から、ＫＨＶＤによって、ニシキゴイ及びマゴイ両方の養殖産業で世界的に深刻な経済的損失が引き起こされてきた。
【０００３】
ウイルスの初期の特性評価から、エンベロープ及びテグメント様構造により囲まれた１００−１１０ｎｍの２０面体の電子密度の高いコアを有するヘルペス様構造が示された。ウイルスのゲノムは、コイ科ヘルペスウイルス１（ＣｙＨＶ−１）と同様であるが、通常１２５から２４０ｋｂの大きさの範囲であるその他のヘルペスウイルス科のメンバーより大きい、−２９５ｋｂの直線状の２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む。ＫＨＶゲノムの配列がごく最近公開された（Ａｏｋｉら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８１、ｐ．５０５８−５０６５（２００７））。ＫＨＶゲノムは、何れのその他の既知のウイルス配列とも相同性がないかなりの数のＤＮＡ配列を含有する。さらに、これは、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、イリドウイルス及びその他の大きなＤＮＡウイルスのような、いくつかのｄｓＤＮＡウイルスのものと類似するポリペプチドをコードする高度に分岐したＤＮＡ配列を含有する。
【０００４】
このウイルスのユニークな特性から、３種類の異なる名称：第一に、その形態学的特徴によるコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）；第二に魚におけるその病原性の影響によるコイ間質性腎炎及び鰓壊死症ウイルス（ＣＮＧＶ）；及び最後にＣｙＨＶ−１及びＣｙＨＶ−２との遺伝子内容物類似性によるコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）がもたらされている。後者の名称は、最近、ウイルスゲノムの全長が配列決定されたことにより、さらに支持されるようになった。しかし、本明細書では以後、ＫＨＶという名称を使用する。
【０００５】
ＫＨＶは、ヘルペスウイルスメンバーの中で今まで同定されたものの中で最大ゲノムに相当するおよそ２９５ｋｂのゲノムを有する。１９９６年にＫＨＶが最初に同定されてから、ＫＨＶ病原性における及び天然宿主の感染の生物学における個々の遺伝子の役割に関する情報は得られていない。
【０００６】
弱毒化ワクチン候補は、国際公開ＷＯ２００４／０６１０９３Ａ１に記載されている。しかし、このワクチン候補には２つの大きな欠点がある。第一に、弱毒化は、インビトロでのウイルス複製中に生じた無作為突然変異の結果である。結果として、弱毒化の決定論は不明であり、完全に病原性である表現型への復帰を考慮しないわけにはいかない。第二に、ワクチン株は、小さな幼魚においては毒性が残存しており、ワクチン付与対象物の最大２０％が死に至る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００４／０６１０９３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｏｋｉ他、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、８１、２００７年、ｐ．５０５８−５０６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
１９９６年に最初に単離されてから、ＫＨＶに関する研究が増加している。これらから、ウイルス遺伝子内容物、ウイルス病原性、感染の病因、感染の診断及び制御法に関連するデータが報告された。しかし、現在まで、ＫＨＶ組み換え株は作製されておらず、結果としてＫＨＶ病原性及び天然宿主の感染の生物学における個々の遺伝子の役割は不明である。同様に、ＫＨＶ組み換え株がないことから、市場でその疾患を制御するための安全で有効な弱毒化組み換えワクチンがないことが明らかにされ得る。
【００１０】
ＫＨＶにおける応用及び基礎研究は、組み換えウイルス作製を必要とする。最近、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター（Ｍｅｓｓｅｒｌｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９４、１４７５９−１４７６３（１９９７）；Ｗａｇｎｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１０、３１８−３２４（２００２））の使用によって、大きなヘルペスウイルスゲノムの操作が容易になった。これらのベクターにより、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．コリ））でのウイルスゲノムの維持及び効率的な突然変異誘発と、それに続く、許容状態の真核細胞へのＢＡＣプラスミドの遺伝子移入による子孫ビリオンの再構成が可能になる。現在まで、ＢＡＣとしてクローニングされた最大のヘルペスウイルスゲノムに相当するヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）を含め、いくつかのヘルペスウイルスのゲノムを、感染性ＢＡＣクローンとして増殖させることに成功している（２３０Ｋｂ）（Ｂｏｒｓｔら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３、８３２０−８３２９（１９９９））。
【００１１】
従って、本発明の目的は、ＫＨＶ感染を制御するための安全で有効な弱毒化ワクチンの開発のために使用することができるワクチンとしての、ＫＨＶの株又はコンストラクトを提供することであった。さらなる目的は、魚全体又は魚類細胞へのポリヌクレオチド配列、即ち遺伝物質の輸送のための、ＫＨＶ由来のＤＮＡ配列及びベクターを提供することであった。
【００１２】
この目的は、魚において、好ましくはコイにおいて、より好ましくはシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）、またさらに好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）及び／又はニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）において免疫原性がある、組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）により解決された。
【００１３】
驚くことに、好ましくは毒性に関与する少なくとも１つの遺伝子が欠損している本発明の組み換えコイヘルペスウイルスは、このヘルペスウイルスに感染した場合、コイの致死率が顕著に低下するか又は致死とならず、野生型コイヘルペスウイルスに対する免疫を与える。
【００１４】
今までのところ、様々な研究者グループが、数年にわたり、ＢＡＣとしてＫＨＶゲノムをクローニングすることを試み、失敗してきた。彼らが得たのは、ゲノムが縮小したクローンのみであった。これらの問題は、今までのところクローニングされたあらゆるその他のヘルペスウイルスよりも大きい、ＫＨＶゲノムの大きさによるものであり得る（クローニングされた最新の最大ヘルペスウイルスの大きさは２３５ｋｂであり、一方、ＫＨＶヘルペスウイルスの大きさは２９０から３００ｋｂの範囲である。）。このウイルスのクローニングのためのさらなる問題は、ゲノム中に含まれる多くの反復配列によるものであり、この結果、クローンが不安定になり大きさが小さくなり得る。従って、本発明は、初めて、２９０から３００ｋｂの範囲の大きさである、ＫＨＶゲノムの全長感染性ＢＡＣクローンを提供する。本発明はまた、初めて、２９０から３００ｋｂの範囲の大きさを有するヘルペスウイルスゲノムに対する弱毒化組換え体を作製する。さらなる実施形態において、ＢＡＣベクター配列は、組み換えコイヘルペスウイルスのヘルペスウイルスゲノムから切除され得、それにより、ヘルペスウイルスゲノムの切除部位又は元の挿入部位に異種配列が残される。組み換えコイヘルペスウイルスのこのＢＡＣベクター配列切断コンストラクトはまた、下記で概説されるように、毒性に関与する少なくとも１つの遺伝子が欠損しており、所望の特性を示す。
【００１５】
ＫＨＶ  ＢＡＣクローン及びＢＡＣベクター配列がヘルペスウイルスゲノムから切除される、上述のＫＨＶコンストラクトの何れかの形態における本発明による組み換えコイヘルペスウイルスは、特異的遺伝子をゲノムから欠損させるために、例えば遺伝子操作技術を含むさらなる操作のために使用され得る。それによって、ウイルス遺伝子欠損が複数である場合、ゲノムの大きさが顕著に縮小され得る。従って、得られる派生物も本発明の範囲内である。
【００１６】
好ましい実施形態において、組み換えコイヘルペスウイルスは、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）により引き起こされる疾患に対して、魚において、好ましくはコイにおいて、より好ましくはシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）において、またさらに好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）及び／又はニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）において免疫を与える能力を有する。
【００１７】
好ましくは、組み換えコイヘルペスウイルスは、複製に必須ではない１以上のウイルス遺伝子が欠損している。より好ましくは、組み換えコイヘルペスウイルスは、毒性に関与する少なくとも１つの遺伝子が欠損している。本発明による組み換えコイヘルペスウイルスは、チミジンキナーゼ遺伝子；ＯＲＦ１２：推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子；ＯＲＦ１６：推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子；ＯＲＦ１３４：推定インターロイキン１０ホモローグ遺伝子；ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子又はそれらの何らかの組み合わせからなる群から選択される毒性に関与する少なくとも１つの遺伝子が欠損していることが特に好ましい。本発明による組み換えコイヘルペスウイルスは、ウイルス性チミジンキナーゼ遺伝子及び、ＯＲＦ１２：推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子；ＯＲＦ１６：推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子；ＯＲＦ１３４：推定インターロイキン１０ホモローグ遺伝子；ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子又はそれらの何らかの組み合わせからなる群から選択される毒性に関与する少なくとも１つのさらなる遺伝子が欠損していることがさらに好ましい。組み換えコイヘルペスウイルスは、上述の遺伝子の全てが欠損していることがさらに特に好ましい。さらに、組み換えコイヘルペスウイルスは、さらなるウイルス遺伝子が欠損し得る。
【００１８】
本発明の特に好ましい実施形態において、組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）はチミジンキナーゼ遺伝子が欠損している。
【００１９】
さらに、好ましくは、組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）は、ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子が欠損している。
【００２０】
またさらに好ましくは、組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）はチミジンキナーゼ遺伝子及びＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子が欠損している。
【００２１】
別の実施形態において、組み換えコイヘルペスウイルスは、コイヘルペスウイルスが複製特性を制限しているように、複製に必須である１以上のウイルス遺伝子が欠損している。
【００２２】
本発明のさらに好ましい実施形態において、組み換えコイヘルペスウイルスは生きている形態である。好ましくは、組み換えコイヘルペスウイルスは、許容状態の真核細胞又は魚個体、好ましくはコイにおいて、よりさらに好ましくはシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）、またさらに好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）及び／又はニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）に導入された際に、感染粒子を再構成する能力を有する。
【００２３】
さらに好ましくは、組み換えコイヘルペスウイルスは弱毒化形態である。
【００２４】
本発明のさらに好ましい実施形態において、組み換えコイヘルペスウイルスにより、前記のヘルペスウイルスに感染した、魚において、好ましくはコイにおいて、より好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）又はニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）において、結果として致死率が、４０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは１％以下、さらに好ましくは０．１％以下及び最も好ましくは結果として致死率が０．０％となる。
【００２５】
本発明の別の実施形態において、組み換えコイヘルペスウイルスは、不活性で非複製形態であるか又は欠損弱毒化形態である。非複製組み換え株は、複製に必須のＫＨＶ遺伝子の欠損により作製され得る。このような欠失ウイルスは、消失遺伝子を安定に発現する許容状態の細胞株において培養される（トランス−コンプリメンテーション（ｔｒａｎｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ））。このアプローチは、ｇＥ欠失Ｓｕｉｄヘルペスウイルス１（オーエスキーウイルス）及びウシヘルペスウイルス１などの様々なヘルペスウイルスに対して首尾よく使用されてきた。非複製組み換えコイヘルペスウイルスを受容するために、複製に関与する何らかの遺伝子を欠失させ得る。言い換えると、不活性化が非複製組み換えコイヘルペスウイルスを受容することに関与する、何らかの遺伝子を欠失させ得る。好ましくは、非複製形態をもたらすために欠失させ得る本発明による組み換えＫＨＶの遺伝子は：ＯＲＦ２５、ＯＲＦ３１、ＯＲＦ３２、ＯＲＦ３４、ＯＲＦ３５、ＯＲＦ４２、ＯＲＦ４３、ＯＲＦ４５、ＯＲＦ５１、ＯＲＦ５７、ＯＲＦ５９、ＯＲＦ６０、ＯＲＦ６２、ＯＲＦ６５、ＯＲＦ６６、ＯＲＦ６８、ＯＲＦ７０、ＯＲＦ７２、ＯＲＦ７８、ＯＲＦ８１、ＯＲＦ８４、ＯＲＦ８９、ＯＲＦ９０、ＯＲＦ９２、ＯＲＦ９５、ＯＲＦ９７、ＯＲＦ９９、ＯＲＦ１０８、ＯＲＦ１１５、ＯＲＦ１３１、ＯＲＦ１３２、ＯＲＦ１３６、ＯＲＦ１３７、ＯＲＦ１４８、ＯＲＦ１４９からなる群から選択される。
【００２６】
「欠損弱毒化形態」とは、組み換えコイヘルペスウイルスが細胞又は魚個体（例えばシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）、マゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）又はニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ））に感染する能力を有するが複製することができないことを意味する。
【００２７】
さらに好ましくは、本発明による組み換えコイヘルペスウイルスは、ＢＡＣ（細菌人工染色体）ベクター配列を含む。好ましくは、組み換えコイヘルペスウイルスは、コイヘルペスウイルスゲノムに挿入されるＢＡＣ（細菌人工染色体）ベクター配列を含む。
【００２８】
さらに好ましくは、組み換えコイヘルペスウイルスは、ウイルス性チミジンキナーゼ遺伝子又はあるいは毒性に関与する何らかのその他のウイルス遺伝子及び／又はウイルス複製に必須ではない何らかのその他のウイルス遺伝子及び／又は何らかの遺伝子間領域に挿入されるＢＡＣ（細菌人工染色体）ベクター配列を含む。ＢＡＣベクター配列が、相同組み換えを媒介する配列、好ましくはｌｏｘＰが両側にあることが特に好ましい。さらに好ましくは、ＢＡＣベクター配列は選択可能マーカーを含む。またさらに好ましくは、選択可能マーカーは、薬物選択可能マーカーである。さらにより好ましくは、選択可能マーカーは、緑色タンパク質をコードする遺伝子である。さらに好ましい実施形態において、前記組み換えヘルペスウイルスのゲノムは、プラスミドの形態で存在する。これは、ＢＡＣベクター配列を含む上述の組み換えコイヘルペスウイルスの環状形態を単離すること及び細菌細胞への導入により達成される。本発明にとっては、毒性に関与する上述の遺伝子の１以上が遺伝子操作技術により欠損させられる限り、毒性に関与するウイルス遺伝子の１以上にＢＡＣ（細菌人工染色体）ベクター配列が挿入されることは必須でないことに注意されたい。従って、ＢＡＣベクター配列は、毒性に関与するウイルス遺伝子の１以上が欠失される場合（好ましくはウイルスチミジンキナーゼ遺伝子及び／又はウイルス性ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子）、ウイルスの何らかの遺伝子間領域に挿入され得る。
【００２９】
本発明の別の実施形態において、ＢＡＣベクター配列はヘルペスウイルスゲノムから切除され、それにより、ヘルペスウイルスゲノムの切除部位又は元の挿入部位に異種配列が残される。好ましくは、異種配列は２００ヌクレオチド未満のサイズである。ｌｏｘＰ隣接ＢＡＣベクター配列を切除するＣｒｅレコンビナーゼを発現する許容状態の真核細胞への組み換えＫＨＶの導入によって、切除を行う。得られる組み換えＫＨＶは、好ましくは感染粒子を形成することが可能であり得る。
【００３０】
組み換えコイヘルペスウイルスのさらに好ましい実施形態において、さらなるウイルス遺伝子は、それらの活性が修飾されているか又はそれらの活性を欠損しているか又は欠失している。
【００３１】
さらに好ましい実施形態において、組み換えコイヘルペスウイルスは異種配列又は異種遺伝子をさらに含んでいる。これによって、個々の接種魚に何らかの遺伝子が導入され得る。好ましくは、さらなる異種遺伝子はコイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルスのＧ糖タンパク質である。このようなコンストラクトは、ＫＨＶだけでなくコイ春ウイルス血症からワクチン接種魚を守る。
【００３２】
本発明はまた、チミジンキナーゼ遺伝子が欠損している組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）も提供する。
【００３３】
さらに、本発明は、ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子が欠損している組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）を提供する。
【００３４】
またさらに、本発明は、チミジンキナーゼ遺伝子及びＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子が欠損している組み換えコイヘルペスウイルスを提供する。
【００３５】
驚くことに、チミジンキナーゼ遺伝子が欠損している組み換えコイヘルペスウイルスにより、このヘルペスウイルスに感染した場合にコイの致死率が顕著に低下し、野生型コイヘルペスウイルスに対する免疫がもたらされる。チミジンキナーゼ遺伝子及びＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子が欠損している組み換えコイヘルペスウイルスならびにＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子のみが欠損している組み換えコイヘルペスウイルスは、このヘルペスウイルスに感染した場合にコイが死に至らず、野生型コイヘルペスウイルスに対する免疫を与える。
【００３６】
本発明はまた、魚におけるワクチン目的及び／又は予防的健康管理で使用されるべきＤＮＡ配列も提供する（このＤＮＡ配列は、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）により引き起こされる疾患に対して、魚において、好ましくはコイにおいて、より好ましくはシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）において、より好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）又はニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）において、免疫を与える能力を有する。）。
【００３７】
ＤＮＡ配列はコイヘルペスウイルスゲノム又はその一部を含んでいる。ＤＮＡ配列の好ましい実施形態において、コイヘルペスウイルスゲノムは、チミジンキナーゼ遺伝子、ＯＲＦ１２：推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子、ＯＲＦ１６：推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子、ＯＲＦ１３４：推定インターロイキン１０ホモローグ遺伝子、ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子又はそれらの何らかの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子が欠損しており、好ましくは、チミジンキナーゼ遺伝子及び／又はＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子、さらに好ましくは両方の遺伝子が欠損している。
【００３８】
さらに好ましい実施形態において、ＤＮＡ配列は、異種配列又は異種遺伝子をさらに含んでいる。これにより、個々の接種魚に何らかの遺伝子が導入され得る。好ましくは、さらなる異種遺伝子はコイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルスのＧ糖タンパク質である。
【００３９】
本発明はまた、コイヘルペスウイルスゲノム又はその一部を含むベクターも提供する。ベクターの好ましい実施形態において、コイヘルペスウイルスゲノムは、チミジンキナーゼ遺伝子、ＯＲＦ１２：推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子、ＯＲＦ１６：推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子、ＯＲＦ１３４：推定インターロイキン１０ホモローグ遺伝子、ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子又はそれらの何らかの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を欠損しており、好ましくは、チミジンキナーゼ遺伝子及び／又はＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子、さらに好ましくは両方の遺伝子を欠損している。
【００４０】
本発明による組み換えコイヘルペスウイルス及びベクターは、シプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）以外のこのような魚類又はそれら由来の細胞に関心のある遺伝子を輸送するためのベクターとして、シプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）において及びまたコイ以外のその他の魚でも使用することができる。本発明による組み換えコイヘルペスウイルス及びベクターは、野生型コイヘルペスウイルスによるか又は本発明の組み換えコイヘルペスウイルスによるか又は本発明のベクターによる感染に感受性がある全ての魚においてインビボ発現ベクターとして使用することができる。好ましくは、このような魚は、コイと共生するものの何れかであり得る。さらに好ましくは、これらの魚は、テラピア群（オレオクロミス・ニロティカス（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ  ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ））、シルバーパーチ（ビディアヌス・ビディアヌス（Ｂｉｄｙａｎｕｓ  ｂｉｄｙａｎｕｓ））、シルバーカープ（ヒポフタルミクチス・モリトリクス（Ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｈｔｈｙｓ  ｍｏｌｉｔｒｉｘ））、キンギョ（カラシウス・オラートゥス（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ））、フナ（カラシウス・カラシウス（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ  ｃａｒａｓｓｉｕｓ））、ゴールデン・イデ（ローシスクス・イドゥス（Ｌｅｕｃｉｓｃｕｓ  ｉｄｕｓ））、ダニューブ・ナマズ（イクタルルス・ネロス（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ  ｎｅｌｏｓ））及びソウギョ（クテノファリンゴドン・イデラ（Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ  ｉｄｅｌｌａ））の魚からなる群から選択される。これは、シプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）もしくはそれら由来の細胞又はシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）以外の魚類もしくはそれら由来の細胞に、ポリヌクレオチド又は関心のある遺伝子を輸送するためのベクターとして、本発明による組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）又は本発明のコイヘルペスウイルスゲノム又はその一部を含むベクターを使用することができることを意味する。上記で概説されるように、本発明による前記組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）又は本発明によるコイヘルペスウイルスゲノム又はその一部を含むベクターは、好ましくは、チミジンキナーゼ遺伝子；ＯＲＦ１２：推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子；ＯＲＦ１６：推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子；ＯＲＦ１３４：推定インターロイキン１０ホモローグ遺伝子；ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子又はそれらの何らかの組み合わせからなる群から選択される毒性に関与する少なくとも１つの遺伝子が欠損しており、好ましくはチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）及び／又はＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子（ＴＭＰＫ）が欠損しており、好ましくは両方の遺伝子が欠損している。
【００４１】
またさらに好ましい実施形態において、本ベクターは異種配列又は異種遺伝子をさらに含んでいる。これにより、何らかの遺伝子が個々の魚に導入され得る。好ましくは、さらなる異種遺伝子は、コイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルスのＧ糖タンパク質である。このようなコンストラクトは、ＫＨＶからワクチン接種魚を守るだけでなく、コイ春ウイルス血症からも守る。
【００４２】
さらに好ましくは、本ベクターは、ＢＡＣベクター配列をさらに含んでいる。さらに好ましくは、本ベクターは、許容状態の真核細胞に導入された場合に、複製能を有し、さらに好ましくは感染粒子を再構成する能力も有する。
【００４３】
さらに好ましい実施形態において、本ベクターは、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）により引き起こされる疾患に対する防御免疫反応を誘導するために、許容状態の細胞又は魚個体に導入された場合に、ＫＨＶウイルス遺伝子を発現させることができる。さらに好ましくは、本ベクターは、魚において、好ましくはコイにおいて、より好ましくはシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）において、より好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）又はニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）において、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）により引き起こされる疾患に対する免疫を付与する能力を有する。
【００４４】
本発明はまた、上記で言及し特徴を述べた、本発明による組み換えコイヘルペスウイルス又はＤＮＡ配列又はベクターを含む細胞も提供する。好ましくは、本細胞は、細菌細胞である。別の実施形態において、本細胞は、許容状態の真核細胞、好ましくは魚由来の細胞、好ましくはコイ由来、より好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）又はニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）由来の細胞である。原核又は真核の何れかであり得る本細胞は、本発明による、上述の組み換えコイヘルペスウイルス又は上述のＤＮＡ配列又は上述のベクターの感染又は遺伝子移入により得ることができる。本細胞は、「形質転換体」と呼ばれ得る。ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子に組み込まれたＢＡＣベクター配列を有する組み換えコイヘルペスウイルスを含むＥ．コリ株は、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）（ＢＣＣＭ／ＬＭＰＢ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｈｅｎｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ  ９２７、９０５２  Ｇｅｎｔ−Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）に寄託した。本細胞は、２００７年７月１３日に寄託し、寄託番号ＬＭＢＰ５６５８を割り当てられた。この細胞は特に好ましい。
【００４５】
本発明はまた、本発明による細胞により生成されるウイルス又はウイルス粒子も提供する。
【００４６】
本発明は、許容状態の真核細胞への、次の組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）ゲノム又は組み換えコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）ゲノム：（ａ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター配列を含む組み換えｋｏｉヘルペスウイルスゲノム（ＫＨＶ）又は組み換えコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）ゲノム；（ｂ）組み換えコイヘルペスウイルスゲノム（ＫＨＶ）又は組み換えコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）ゲノム（細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター配列が（ａ）のコンストラクトから切除される。）の何れか１つの導入；及び組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又は組み換えコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）を生成させるための宿主細胞の培養の段階を含む、組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）の感染粒子の生成のための方法をさらに提供する。
【００４７】
さらに、本発明はまた、上述の方法により生成される感染粒子にも関する。さらに好ましくは、提供される感染粒子は、次の何れか１つを含んでいる：（ａ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター配列を含む、組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）ゲノム又は組み換えコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）ゲノム；（ｂ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター配列が（ａ）のコンストラクトから切除される、組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）ゲノム又は組み換えコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）ゲノム。
【００４８】
上述の組み換えコイヘルペスウイルス、上述のＤＮＡ配列、上述のベクター又は上述の感染粒子は、注射又は薬浴法又は経口による、魚、好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）又はニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）個体の免疫付与のために使用することができる。従って、本発明はまた、本発明による、上述の組み換えコイヘルペスウイルス又は上述のＤＮＡ配列又は上述のベクター又は上述の感染粒子を用いて免疫付与されたマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）又はニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）個体も提供する。
【００４９】
本発明は、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はＣｙＨＶ−３をさらに提供する。本明細書中でＦＬ株とも呼ばれるコイヘルペスウイルス分離株は、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）（ＢＣＣＭ／ＬＭＰＢ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｈｅｎｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ  ９２７、９０５２  Ｇｅｎｔ−Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）に寄託された。ＦＬ分離株は、２００７年７月１３日に寄託され、寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢが割り当てられた。この分離株（ＦＬ）は、３つの重要な特性を示す：（ｉ）細胞培養において非常に効率的な増殖特性を有する；（ｉｉ）同等の野生型株よりも病原性が低い；及び（ｉｉｉ）２ｇマゴイにおいて疾患の発症が２週間遅延する。このような分離株を得るために、様々なＫＨＶ野生分離株を、インビトロでのそれらの増殖特性（図１）及びニシキゴイ（７ｇ）及びマゴイ（２ｇ）でのそれらの毒性（図２）について比較した。これらの試験の結果に基づき、本明細書で以後ＦＬと呼ばれる株を選択した。ＫＨＶ／ＣｙＨＶ−３参照株（ＩＳ株）と比較して、ＦＬ株はインビトロでより効率的に複製し、インビボで病原性が低かった。７ｇニシキゴイでアッセイした場合、ＩＳ及びＦＬ株は、それぞれ９０％及び８０％の致死率となった（図２）。２ｇマゴイでアッセイした場合、ＦＬ株により誘導される疾患の発症はＩＳ株と比較して２週間遅かった。高毒性のＫＨＶ  ＩＳ株と比較して２週間の遅延が観察されることから及び、マゴイで高毒性のＫＨＶ  ＩＳ株により引き起こされる疾患の発症が約１週間後に起こることを考慮して、このようなＦＬ株は、生弱毒化組み換え株の開発のための適切な親株に相当すると考えられる。
【００５０】
本発明で提供されるＫＨＶ  ＦＬ株（寄託番号ＬＭＢＰ６５８１  ＣＢ）は、不活性化ワクチンの作製に非常に有用であり得、従って、産業面で重要な潜在力を有する。
【００５１】
上述の本発明による組み換えコイヘルペスウイルスを構築するためにＦＬ分離株を使用した。例えば、本発明による組み換えコイヘルペスウイルスを得るために、ＢＡＣベクター配列をウイルスチミジンキナーゼ遺伝子に導入した。しかし、本発明による組み換えコイヘルペスウイルスを構築するために、何らかのその他のＫＨＶ分離株を使用することができる。マゴイにおいて親ワクチン株となる可能性があるものとして、ＦＬ  ＢＡＣ切除株をアッセイした（図８参照）。７ｇマゴイにＦＬ株、ＦＬ  ＢＡＣ回収株及びＦＬ  ＢＡＣ切除株を接種し、それぞれ、８０％、４０％及び４０％の致死率となった。この実験から、ＴＫ遺伝子座の破壊は、ウイルスの劇的な減弱に関与することが分かった。一次接種のために使用された株とは独立して、一次接種に対して生き残った魚は全て、毒性ＦＬ株でのさらなる抗原曝露に対する防御免疫反応を発現した（図８の矢印５「抗原曝露」参照）。これらのデータを合わせると、複数回弱毒化組み換えワクチン開発のためのＦＬ  ＢＡＣクローンの親プラスミドとしての可能性が裏付けられる。
【００５２】
本発明のさらに好ましい実施形態において、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢは、魚において、好ましくはコイにおいて、より好ましくはシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）において、またさらに好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）及び／又はニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）において、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）により引き起こされる疾患に対して、免疫を与える能力を有する。
【００５３】
好ましくは、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢの派生物は、複製に必須ではない１以上のウイルス遺伝子が欠損している。より好ましくは、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢの派生物は、毒性に関与する少なくとも１つの遺伝子が欠損している。本発明によるコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢの派生物は、チミジンキナーゼ遺伝子；ＯＲＦ１２：推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子；ＯＲＦ  １６：推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子；ＯＲＦ１３４：推定インターロイキン１０ホモローグ遺伝子；ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子又はそれらの何らかの組み合わせからなる群から選択される毒性に関与する少なくとも１つの遺伝子が欠損していることが特に好ましい。本発明によるコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢの派生物は、ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子及び、ＯＲＦ１２：推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子；ＯＲＦ１６：推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子；ＯＲＦ１３４：推定インターロイキン１０ホモローグ遺伝子；ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子又はそれらの何らかの組み合わせからなる群から選択される毒性に関与する少なくとも１つのさらなる遺伝子が欠損していることがさらに好ましい。コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢの派生物は、上述の遺伝子の全てが欠損していることがさらに特に好ましい。さらに、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢの派生物は、さらなるウイルス遺伝子が欠損し得る。さらに好ましくは、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢの派生物は、チミジンキナーゼ遺伝子及び／又はＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子が欠損している。好ましくは、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢの派生物は、チミジンキナーゼ遺伝子及びＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子が欠損している。
【００５４】
本発明のさらに好ましい実施形態において、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢの派生物は、生きている形態である。好ましくは、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢの派生物は、許容状態の真核細胞又は魚個体に、好ましくはコイにおいて、より好ましくはシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）において、またさらに好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）及び／又はニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）において導入された際に、感染粒子を再構成する能力を有する。
【００５５】
さらに好ましくは、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢの派生物は弱毒化形態である。
【００５６】
本発明のさらに好ましい実施形態において、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢの派生物は、前記ヘルペスウイルスに感染した、魚において、好ましくはコイにおいて、より好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）又はニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）において、４０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは１％以下、さらに好ましくは０．１％以下の致死率及び最も好ましくは結果として０．０％の致死率をもたらす。
【００５７】
本発明の別の実施形態において、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢの派生物は、不活性化及び非複製形態又は欠損弱毒化形態である。
【００５８】
本発明はまた、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はＣｙＨＶ−３により引き起こされる疾患の予防的及び／又は治療的処置のためのワクチンも提供する。
【００５９】
さらに好ましくは、本ワクチンは、本発明による、上述の組み換えコイヘルペスウイルス又は上述のＤＮＡ配列又は上述のベクター又は上述の感染粒子又はコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はＣｙＨＶ−３寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢ又はその誘導体を含んでいる。
【００６０】
さらに好ましい実施形態において、上述のワクチンは、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はＣｙＨＶ−３により引き起こされる疾患の予防的及び／又は治療的処置のために使用される。
【００６１】
本発明はまた、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）により引き起こされる疾患の予防的及び／又は治療的処置用の医薬品／ワクチンの製造のための、上述の組み換えコイヘルペスウイルス又は上述のＤＮＡ配列又は上述のベクター又は上述の感染粒子又は上述のコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はＣｙＨＶ−３寄託番号ＬＭＢＰ６５８１  ＣＢ又はその誘導体の使用も提供する。
【００６２】
本発明によるワクチンは、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はＣｙＨＶ−３により引き起こされる疾患の予防的及び／又は治療的処置に有用である。あらゆるタイプのワクチン、例えば不活性化ワクチン、不活性化及び非複製ワクチン、組み換え弱毒化ワクチン、外来トランス遺伝子を発現する組み換え弱毒化ワクチン、ＤＮＡワクチンなどを作製し得る。前記ワクチンの投与の好ましい経路は、経口、薬浴法及び注射であるが、その他の経路も除外されない。
【００６３】
本発明はまた、コイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルスにより引き起こされる疾患の予防的及び／又は治療的処置のためのワクチンも提供し、このワクチンは、組み換えコイヘルペスウイルス又はＤＮＡ配列又はベクターを含んでおり、これらのそれぞれは、ラブドウイルス由来の異種配列又は異種遺伝子、好ましくはコイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルスのＧ糖タンパク質をさらに含んでいる。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「ワクチン」という用語は、特定の疾患に対して宿主の免疫を確立するか又は向上させることができる物質を指す。疾患が病原体により引き起こされる場合、このようなワクチン物質は、一般に、生きている（ｌｉｆｅ）弱毒化もしくは不活性化病原体又はそれらの一部から構成される。このようなワクチンは、予防的又は治療的に免疫を生成させ得る。
【００６５】
一般に、ワクチンは、注射又は水中での送達のための、溶液、エマルジョン又は縣濁液として調製される。例えば、魚が保持される水タンク又は水槽に添加するために、エマルジョン又は乳剤を調製することができる。投与前の、液体ビヒクルでの溶解又は縣濁に又は固形餌との混合に適切な固体（例えば粉末）形態もまた調製され得る。本ワクチンは、滅菌希釈剤での再構成のための即時使用形態の凍結乾燥培養であり得る。例えば、凍結乾燥細胞は０．９％食塩水で再構成され得る（場合によっては包装ワクチン製品の一部として提供される。）。注射用ワクチンの好ましい製剤はエマルジョンである。ペン、タンク又は水槽に添加する前に、ワクチンの液体又は再構成形態を少量（例えば１から１００体積）の水で希釈し得る。
【００６６】
ある好ましい実施形態において、組み換えＫＨＶ又はＫＨＶ  ＦＬ株を含むワクチン製剤は、乾燥形態、例えば粉末形態、圧縮ペレット又は錠剤形態での凍結乾燥物などである。別の実施形態において、前記ウイルスは、組織培養液の形態であり得る。この液体は、周囲温度、好ましくは−７０℃で、最も好ましくはグリセロールを含有する溶液として保管され得る。ある具体例において、この組織培養液は２０％グリセロールを含有する。
【００６７】
本発明で開示される組み換えＫＨＶ又はＫＨＶ  ＦＬ株は、多くの方法により乾燥形態に変換され得る。乾燥の特に好ましい形態は凍結乾燥を通じたものである。乾燥、例えば凍結乾燥手順前に、保存料、抗酸化剤又は還元剤、様々な賦形剤など、様々な成分を媒体に添加し得る。このような賦形剤はまた、乾燥段階後にも、乾燥、例えば凍結乾燥された活性−弱毒化ウイルスに添加され得る。
【００６８】
従って、好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、凍結−乾燥形態である。凍結乾燥組成物を再構成するために、生理的に許容可能な希釈剤中でこれを縣濁する。このような希釈剤は、例えば、滅菌水のような単純なもの又は生理食塩水であり得る。より複雑な形態において、例えばＥＰ  １，１４０，１５２に記載のようにエマルジョン中で凍結乾燥ワクチンを縣濁し得る。
【００６９】
免疫付与は、通常、免疫付与しようとする魚を含有する水に、不活性化ウイルス、不活性化及び非複製ウイルス、欠損弱毒化ウイルス、組み換え弱毒化ウイルス、外来トランス遺伝子を発現する組み換え弱毒化ウイルス、生きている弱毒化ウイルスなどの非病原性ウイルス形態、ＤＮＡワクチンを添加することにより行われる。ワクチン製剤を魚に直接注射することもできる。免疫反応を促進するために、特に注射を意図する製剤の場合、この製剤は様々なアジュバント、サイトカイン又はその他の免疫刺激物質も含み得る。このワクチン製剤は、特に、魚を含有する水に導入される場合、様々な安定化剤、抗生物質なども含み得る。
【００７０】
本発明のある実施形態において、本ワクチンは、免疫調節アジュバント、安定化剤、抗生物質、免疫刺激物質又はその他の物質をさらに含む。アジュバントは、非特異的に宿主の免疫反応を促進する免疫刺激性物質である。これらのアジュバントは、ヒト及び獣医用医薬品で既に使用されるもので知られている。アジュバントは、親水性アジュバント、例えば水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウムなど、又は疎水性アジュバント、例えば鉱物油を基にしたアジュバントであり得る。ムラミールジペプチド、アブリジン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、油、油乳剤、サポニン、硫酸デキストラン、グルカン、サイトカイン、ブロックコポリマー、免疫刺激性オリゴヌクレオチド及び当技術分野で公知のその他のものなどのアジュバントを不活性化ウイルス上清と混合し得る。好ましいアジュバントは、フロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ）である。添加されるアジュバントの量は、アジュバントそのものの性質に依存する。ＦＩＡは、有利に、約１：１（体積）の比で、不活性化ウイルス上清とともに乳化され得る。
【００７１】
魚の養殖で頻繁に使用されるアジュバントの例は、ムラミルジペプチド、リポ多糖、いくつかのグルカン及びグリカン及びＣａｒｂｏｐｏｌ（Ｒ）（ホモポリマー）である。適切なアジュバントは、例えば油中水（ｗ／ｏ）エマルジョン、ｏ／ｗエマルジョン及びｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンである。ｗ／ｏエマルジョンでの使用に適切な油性アジュバントは、例えば鉱物油又は代謝可能な油である。鉱物油は、例えばＢａｙｒｏｌ（Ｒ）、Ｍａｒｃｏｌ（Ｒ）及びＤｒａｋｅｏｌ（Ｒ）であり；代謝可能な油は、例えば、ピーナツ油及び大豆油などの植物油、魚油スクアラン及びスクアレンなどの動物油である。あるいは、ＥＰ３８２，２７１に記載のようなビタミンＥ（トコフェロール）可溶化物（ｓｏｌｕｂｉｌｉｓａｔｅ）が有利に使用され得る。例えば５−５０％ｗ／ｗ水相及び９５−５０％ｗ／ｗ油性アジュバント、より好ましくは２０−５０％ｗ／ｗ水相及び８０−５０％ｗ／ｗ油性アジュバントから出発して得られる非常に適切なｏ／ｗエマルジョンが使用される。添加されるアジュバント量は、アジュバントそのものの性質及び製造者により提供されるこのような量に関する情報に依存する。
【００７２】
好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは安定化剤をさらに含む。安定化剤は、例えば、分解からワクチンを保護するために、貯蔵期間を延長させるために又は凍結乾燥効率を向上させるために、本発明によるワクチンに添加され得る。有用な安定化剤は、とりわけ、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら、１９５０、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．５９、ｐ．５０９）、スキムミルク、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、糖類、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストラン又はグルコース、ラクトース、タンパク質、例えば、アルブミンもしくはカゼインなど又はそれらの分解産物及び、アルカリ金属リン酸塩などの緩衝物質である。
【００７３】
細菌増殖の可能性を阻止するために、ネオマイシン及びストレプトマイシンなどの抗生物質を添加し得る。免疫刺激物質は、ワクチンにより与えられる防御を促進し得、多くの疾患に対する非特異的防御を与える。多くの化学物質及びその他の物質、即ち化学物質及びグルカン、藻−アルギン（アルギン酸シリリック（ｓｉｌｙｌｉｃ）エステル）からの抽出物及びサイトカインは、魚において免疫刺激特性を有することが報告されている。
【００７４】
さらに、本ワクチンは、１以上の適切な界面活性化合物又は乳化剤、例えばＳｐａｎ（Ｒ）又はＴｗｅｅｎ（Ｒ）を含み得る。本ワクチンはまた、いわゆる「ビヒクル」も含み得る。ビヒクルは、本発明によるＫＨＶウイルス（ウイルス粒子形態又はＤＮＡ形態の何れか）がそれに対する共有結合なしに接着する化合物である。このようなビヒクルは、とりわけ、バイオマイクロカプセル、マイクロアルギン酸、リポソーム及びマクロソールであり、全て当技術分野で公知である。このようなビヒクルの特定の形態は、上記のＩｓｃｏｍである。言うまでもなく、その他の安定化剤、担体、希釈剤、エマルジョンなどを本発明によるワクチンに混合することも本発明の範囲内である。
このような添加物は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ」（２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ、ＵＳＡ、ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）及び：「Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ」（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔら編、１９９７、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ＩＳＢＮ：０４４４８１９６８１）などの周知のハンドブックに記載されている。
【００７５】
ワクチンにおいてその乾燥形態で使用される場合の組み換えＫＨＶ又はＫＨＶ  ＦＬ株は、再構成液、好ましくは滅菌水、食塩水又は生理溶液をさらに含み得る。これはまた、細胞性タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、製造プロセスからの少量の残存物質を含有し得る。これらの物質が本質的に添加物ではない一方、これらは、それにもかかわらず、ワクチン製剤中に存在し得る。
【００７６】
本発明は、本明細書中で前に述べたＫＨＶにより引き起こされるウイルス感染に対して魚に免疫付与するための方法にさらに関し、この方法は、ＫＨＶによる続く感染に対する免疫を誘導するのに十分な量で投与される本発明による組み換えＫＨＶ又はＫＨＶ  ＦＬ株を含むワクチン製剤を、感染し易い魚へ投与することを含む。
【００７７】
本ワクチンは、水産養殖魚に個々に、経口で、例えばそれらの餌を通じて、又は強制経口投与によって、又は注射によって、投与され得る（筋肉内又は腹腔内経路）。あるいは、本ワクチンは、ワクチンを噴霧、溶解及び／又は浸漬することによって水域に含有される魚集団全体に同時に投与され得る。これらの方法は、例えば食用及び鑑賞用など、全ての種類の魚の、以下に限定されないが、池、水族館、自然の生息地及び淡水貯水池などの様々な環境での、ワクチン接種に有用である。
【００７８】
本発明のさらなる態様は、本発明による組み換えＫＨＶを含むＤＮＡワクチンに関する。核酸ワクチン（又はいわゆる遺伝子（ｇｅｎｅ又はｇｅｎｅｔｉｃ）−ワクチン）は、それを標的化するかもしくは保護するために、又は宿主（の細胞）によるその取り込みを促進するために、標的化又は送達ビヒクルを必要とし得る。このようなビヒクルは、生体又は合成であり得、例えば、バクテリオファージ、ウイルス様粒子、リポソーム又はミクロ粒子、粉末粒子又はナノ粒子である。
【００７９】
ＤＮＡワクチンは、皮内適用を通じて、例えばＧｅｎｅ  Ｇｕｎ（Ｒ）などの無針注射器を用いて、容易に投与され得る。この投与法により、ワクチン接種しようとする動物の細胞にＤＮＡが直接送達される。本発明による医薬組成物中に含まれる、本発明による、核酸、ＤＮＡ断片又は組み換えＤＮＡ分子の好ましい量（下記で概説）は、１０ｐｇから１０００μｇの間の範囲である。好ましくは、０．１から１００μｇの間の範囲の量が使用される。あるいは、例えば、投与しようとするＤＮＡの１０ｐｇから１０００μｇ／ｍＬの間を含む溶液に魚を浸漬することができる。これらは全て当技術分野で周知である。
【００８０】
同様に、本発明による、核酸、ＤＮＡ断片又は組み換えＤＮＡ分子を含む標的化−又は送達ビヒクルは、本発明による担体の範囲内である。これらを使用する結果、核酸が送達されるか又は標的生物もしくはその細胞内部でタンパク質が発現される。
【００８１】
さらなる態様において、本発明は、医薬的有効量で、及び医薬的に許容可能な担体中で、本発明によるワクチンを魚などの生物に投与することによる、魚のワクチン接種の方法に関する。「医薬的有効量」は下記で詳細に記載する。
【００８２】
本発明によるワクチンは、水産養殖に対する投与に適切であり、所望の適用経路及び所望の効果に適合する何らかの形態をとり得る。本発明によるワクチンの調製は、当業者にとって従来的である手段により行われる。
【００８３】
好ましくは、本発明によるワクチンは、縣濁液、溶液、分散、エマルジョンなど、注射に対して又は浸漬ワクチン接種に対して適切な形態で処方される。一般に、このようなワクチンは無菌的に調製される。
【００８４】
標的生物への本発明によるワクチンの適用の投与スキームは単回又は複数回投与であり得、これは、投与量及び処方に適合するように、免疫学的に有効となるような量で、同時に又は連続的に与えられ得る。例えば、ワクチン接種動物に対して実験的抗原曝露感染物を投与し、次に標的動物の疾患の臨床兆候、血清学的パラメーターを判定することによって、又は病原体の再単離を測定することによって、治療が「免疫学的に有効」であるか否かを決定することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００８５】
本発明による核酸に基づく本発明によるワクチンに対する「医薬的有効量」を構成するものは、所望の高価及び標的生物に依存する。有効量の決定は通常の実施者の技術範囲内である。本発明による医薬組成物中に含まれる、本発明による、核酸、ＤＮＡ断片又は組み換えＤＮＡ分子の好ましい量は上記で述べた。
【００８６】
本発明による組み換えＫＨＶウイルス又はＫＨＶ  ＦＬ株を含むワクチンの好ましい量は、例えば、プラーク形成単位（ｐｆｕ）、コロニー形成単位（ｃｆｕ）又は組織培養感染量５０％（ＴＣＩＤ５０）として表される。例えば、生ウイルスベクターに対して、動物投与あたり１から１０１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲の用量が有利に使用され得；好ましくは１０２から１０６ｐｆｕ／投与の範囲である。ウイルスの適切な投与量範囲は、単位用量あたり約１０２から１０９ＴＣＩＤ５０（接種される培養物の５０％に影響を与える組織培養感染量）、好ましくは単位用量あたり約１０４から１０８ＴＣＩＤ５０、より好ましくは単位用量あたり約１０６から１０７ＴＣＩＤ５０、最も好ましくは単位用量あたり約１０７ＴＣＩＤ５０である。好ましくは、処置しようとする魚に単回投与単位が投与される。多くの投与方法を適用することができる（全て当技術分野で公知）。本発明によるワクチンは、好ましくは、注射（筋肉内又は腹腔内経路）、浸漬、ディッピング又は経口を介して魚に投与される。投与のためのプロトコールは、標準的ワクチン接種実施に従い最適化され得る。
【００８７】
好ましくは、本ワクチンは、浸漬又は経口を介して投与される。これは、特に、商業的水産養殖の場合にこのようなワクチンを使用する場合、有効である。
【００８８】
上述の本発明によるワクチンは、能動ワクチン接種に寄与し、即ち、これらは宿主防御系を惹起する。
【００８９】
本発明は、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はＣｙＨＶ−３により引き起こされる疾患の予防的及び／又は治療的処置のための、魚、好ましくはコイ、より好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）又はニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）個体への、上述の組み換えコイヘルペスウイルス又は上述のＤＮＡ配列又は上述のベクター又は上述の感染粒子又は上述のコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はＣｙＨＶ−３寄託番号ＬＭＢＰ６５８１ＣＢ又はその派生物の治療的有効量の導入を含む、コイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はＣｙＨＶ−３により引き起こされる疾患の予防的及び／又は治療的処置のための方法をさらに提供する。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
本発明は、組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）を提供し、これは、好ましくは、魚において、好ましくはコイにおいて、より好ましくはシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）において、より好ましくはマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｃａｒｐｉｏ）又はニシキゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  ｋｏｉ）において、免疫原性である。本発明のある実施形態において、組み換えコイヘルペスウイルスは、許容状態の真核細胞に導入された際に、感染粒子を再構成する能力を有する。発明者らは、安定かつ感染性のあるＢＡＣクローンとしてＫＨＶゲノムのクローニングを達成した。チミジンキナーゼ遺伝子座への修飾ｌｏｘＰ−隣接ＢＡＣカセットの挿入によってこの目的を達成した。この挿入により、ＫＨＶ  ＢＡＣクローンの生成を細菌中で安定して維持できるようになり、許容状態の細胞に遺伝子移入された際に、ビリオンを再生できるようになる。しかし、ＢＡＣ（細菌人工染色体）ベクター配列は、毒性に関与するウイルス遺伝子の１以上が欠損するようにされる限り、ＫＨＶヘルペスウイルスゲノムの何れかの部位に挿入され得る。好ましくは、毒性に関与する遺伝子は、チミジンキナーゼ遺伝子；ＯＲＦ１２：推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子；ＯＲＦ１６：推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子；ＯＲＦ１３４：推定インターロイキン１０ホモローグ遺伝子；ＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子又はそれらの何らかの組み合わせからなる群から選択される。さらに好ましくは、毒性に寄与し、組み換えＫＨＶで欠損している遺伝子は、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）及び／又はＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子（ＴＭＰＫ）である。またさらに好ましくは、組み換えＫＨＶでは、チミジンキナーゼ遺伝子及びＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子の両遺伝子が欠損している。
【００９１】
さらに、Ｃｒｅレコンビナーゼを発現する許容状態の細胞において再構成ビリオンを増殖させることによって、再構成ビリオンのゲノムから、ｌｏｘＰ−隣接ＢＡＣカセットを切除することができる。従って、本発明は、第一に、ＫＨＶゲノムのＢＡＣクローニングを提供することであり、第一に、ＫＨＶと同程度に大きいヘルペスウイルスゲノムのＢＡＣクローニングを提供することである。ＫＨＶ  ＢＡＣの有用性は重要な長所であり、これにより、ＫＨＶ病原性に関与するウイルス遺伝子の同定ならびに弱毒化組み換え候補ワクチンの作製が可能となる。
【００９２】
本発明は、ＫＨＶ複製に必須ではないと想定されたチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子座への修飾ｌｏｘＰ−隣接ＢＡＣカセットの挿入によって、ＫＨＶゲノムのクローニングにより達成された。この挿入により、細菌中でゲノムが安定に維持され、許容状態の細胞に遺伝子移入された際にビリオンを再生することができる、ＢＡＣ組み換えウイルスが得られた。
【００９３】
先行技術で使用されたコスミドベクターを超えるＢＡＣクローニング系の主要な長所は、Ｆ−プラスミドが細胞あたり唯一又は最大２つのコピーで存在し、それによりＤＮＡ断片間の組み換えの可能性が低下し、より重要なこととして、クローニングされた細菌遺伝子の致死性過剰発現が回避されることである。しかし、唯一のコピーとしてＢＡＣが存在するので、配列決定するのに十分なＤＮＡを得るためにはプラスミドＤＮＡを大量の培養物から抽出しなければならなず、これは、本明細書中で、これを達成するための簡易プロトコールとして実施例で述べる。
【００９４】
「ＢＡＣベクター」という用語は、Ｅ．コリのＦプラスミドを用いて産生されるプラスミド及びＥ．コリなどの細菌中で約３００ｋｂ以上の大きなＤＮＡ断片を安定して維持及び増殖させることができるベクターを指す。ＢＡＣベクターは、少なくとも、ＢＡＣベクターの複製に必須の領域を含有する。複製に必須であるこのような領域の例には、以下に限定されないが、Ｆプラスミドの複製起点及びその変異体が含まれる。
【００９５】
本明細書中で使用される場合、「ＢＡＣベクター配列」という用語は、ＢＡＣベクターの機能に必須の配列を含む配列を指す。場合によっては、ＢＡＣベクター配列は、「組み換えタンパク質依存性の組み換え配列」及び／又は「選択可能マーカー」をさらに含み得る。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、「相同組み換え」という用語は、２つの異なる相同核酸分子が互いに接触し、交差が起こり、核酸の新しい組み合わせが生成することを指す。本明細書中で使用される場合、「配列介在性相同組み換え」という用語は、相同組み換えを、触媒するか、実行するか又は促進している特異的組み換えタンパク質に依存する相同組み換えを引き起こす配列を指す。このような組み換えタンパク質は、好ましくは、「配列介在性相同組み換え」に特異的に作用し、その他の配列で作用しない。
【００９７】
このような配列及び、相同組み換えを触媒するか、実行するか又は促進する組み換えタンパク質の代表的ペアの例には、以下に限定されないが、バクテリオファージＰ１由来ｌｏｘＰ（Ｐ１のクロスオーバーの遺伝子座（ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｏｆ  Ｐ１））配列及びＣｒｅ（環化組み換え（ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ））タンパク質の組み合わせ、Ｆｌｐタンパク質及びＦＲＴ部位の組み合わせ、Ｃ３１及びａｔｔＢ又はａｔｔＰの組み合わせ、リゾルバーゼ及びｒｅｓ部位の組み合わせが含まれる。
【００９８】
本明細書中で使用される場合、「選択可能マーカー」という用語は、ＢＡＣベクターを含有する宿主細胞の選択のための指標として機能する遺伝子を指す。選択可能マーカーの例には、以下に限定されないが、蛍光マーカー、発光マーカー及び薬物選択可能マーカーが含まれる。「蛍光マーカー」の例には、以下に限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質をコードする遺伝子が含まれる。「発光マーカー」の例には、以下に限定されないが、ルシフェラーゼなどの発光タンパク質をコードする遺伝子が含まれる。「薬物選択可能マーカー」の例には、以下に限定されないが、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、グルタミンシンターゼ遺伝子、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、メタロチオネイン（ＭＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＭＰＤ１、２）、キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＵＭＰシンターゼ、Ｐ−糖タンパク質、アスパラギンシンターゼ及びオルニチンデカルボキシラーゼからなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。薬物選択可能マーカー及び薬物の組み合わせの例には、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）及びメトトレキセート（ＭＴＸ）の組み合わせ、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）遺伝子及びメチオニンスルホキシミン（Ｍｓｘ）の組み合わせ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）遺伝子及びＮ−ホスホンアセチル−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）の組み合わせ、ＭＴ遺伝子及びカドミウム（Ｃｄ２＋）の組み合わせ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）遺伝子及びアデノシン、アラノシン又は２’−デオキシコホルマイシンの組み合わせ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＭＰＤ１、２）遺伝子及びアデニン、アザセリン又はコホルマイシンの組み合わせ、キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子及びミコフェノール酸の組み合わせ、ＵＭＰシンターゼ遺伝子及び６−アザウリジン又はピラゾフランの組み合わせ、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ、ＭＤＲ）遺伝子及び複数の薬物の組み合わせ、アスパラギンシンターゼ（ＡＳ）遺伝子及び−アスパルチルヒドロキサミン酸又はアルビジインの組み合わせ及びオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子及びジフルオロメチル−オルニチン（ＤＦＭＯ）の組み合わせが含まれる。
【００９９】
好都合に、本明細書中で使用される場合のＢＡＣカセットは、原核細胞での選択マーカーであるクロラムフェニコール（ＣｍＲ）に対する耐性を与える遺伝子をさらに含有する。ＢＡＣカセットは、ＥＧＦＰと融合したＧ４１８（ＮｅｏＲ）に対する耐性遺伝子をさらに含む（ＥＧＦＰ−Ｎｅｏ）。結果として、ＥＧＦＰとＮｅｏとの間のこの融合タンパク質は、ＥＧＦＰ蛍光及びＧ４１８に対する耐性を与える。ＥＧＦＰ−Ｎｅｏ遺伝子は、ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターの制御下にあり、真核細胞における選択マーカーに相当する。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド配列又は関心のある遺伝子を標的細胞に輸送することができるポリヌクレオチドからなるか又はポリヌクレオチドを含有するビヒクルを指す。本ベクターは、「ウイルスベクター」又は「プラスミドベクター」であり得るか、又は１つのコンストラクト中で両方の特性を合わせ得る。ベクターの例には、自己複製可能であるか又は宿主細胞（例えば、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物全体及び植物全体）中の染色体に組み込まれ得るベクターが含まれ、ポリヌクレオチド又は遺伝子の転写に適切な部位にプロモーターを含有する。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、構造遺伝子及び、その発現を制御するためのプロモーター及び、さらに、宿主細胞内でそれらを操作させることができる状態で様々な制御エレメントを含む核酸配列を指す。制御エレメントには、好ましくは、終結因子、薬物耐性遺伝子などの選択可能マーカー（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子など）及びエンハンサーが含まれ得る。生物のタイプ、発現ベクター及び制御エレメントのタイプが宿主細胞に依存して変化し得ることは当業者にとって周知である。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写開始部位を決定するベース配列を指し、転写頻度を直接制御するＤＮＡ領域である。転写は、プロモーターに結合するＲＮＡポリメラーゼにより開始される。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、「形質転換」、「形質導入」及び「遺伝子移入」という用語は、別段の断りがない限り、同じ意味で使用され、宿主細胞への核酸の導入を指す。形質転換法として、例えば、エレクトロポレーション法、粒子銃法（遺伝子銃）、リン酸カルシウム沈殿法などの様々な周知の技術を含む、ＤＮＡを宿主細胞に導入するための何らかの技術が使用され得る。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、「形質転換体」という用語は、形質転換により生成する、生物全体又はその一部（細胞など）を指す。形質転換体の例には、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが含まれる。形質転換体は、対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などと呼ばれ得る。本明細書中で使用される場合、形態の全てが包含されるが、しかし、特定の内容において特定の形態が指定され得る。
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、「ＴＫ」という用語はチミジンキナーゼ遺伝子を指し、「ＴＭＰＫ」という用語はＯＲＦ１４０：推定チミジル酸キナーゼ遺伝子を指す。「ＴＫ−」という表示は、チミジンキナーゼ遺伝子が欠損している状況を指す。「ＴＫ＋」という表示は、チミジンキナーゼ遺伝子が機能的である状況を指す。「ＴＭＰＫ−」という表示は、推定チミジル酸キナーゼ遺伝子が欠損している状況を指す。「ＴＭＰＫ＋」という表示は、推定チミジル酸キナーゼ遺伝子が機能的である状況を指す。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ＫＨＶ野生分離株の３種類の増殖特性のインビトロでの比較を示す。ＣＣＢ細胞（シプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）脳細胞）に指示されたＫＨＶ野生分離株を感染させた（０．５ＰＦＵ／細胞の感染多重度）。２時間の温置時間後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、次いで材料及び方法に記載のように培地と重ね合わせた。感染から５日後、感染培養物の上清を回収し、ＣＣＢにおいてプラークアッセイにより感染性ウイルス量を調べた。
【図２】ＫＨＶ  ＦＬ株に対するＫＨＶ  ＩＳ株の病原性の比較を示す。第０日に、材料及び方法に記載のように、７ｇニシキゴイ（ｎ＝１０）及び２ｇマゴイ（ｎ＝１０）に、ＩＳ株（◆）又はＦＬ株（■）の何れかを感染させた（魚におけるＫＨＶ疾患の誘導）。生存％は感染後の日数により表す。
【図３】感染性ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドを作製するために使用されるストラテジーの略図である。（Ａ）２つの直接末端反復（ＬＴＲ及びＲＴＲ）が両側にあるＫＨＶ  ＦＬ株のゲノムを一番上に示す。ｐＧＥＭＴ−ＴＫベクターのＴＫ（チミジンキナーゼ）ＯＲＦのＲｓｒＩＩ部位にｌｏｘＰ−隣接ＢＡＣカセットを挿入し、その結果、ｐＧＥＭＴ−ＴＫＢＡＣが得られた。後者のベクターにおいて、ＢＡＣカセットは、５５８ｂｐ及び５７７ｂｐのＫＨＶ相同領域に挟まれている。（ＣｍＲ：クロラムフェニコールに対する耐性を与える。）。この遺伝子は原核プロモーターの制御下にある。ＲｅｄＦ：部位特異的レコンビナーゼ遺伝子（これは短縮型であり、この遺伝子生成が機能的であるか否かは不明である。）；ｒｅｐＥ：Ｏｒｉ２での複製複合体のアセンブリを媒介する；ｐａｒＡ、ｐａｒＢ、ｐａｒＣ：これらの３つのエレメントは、ＢＡＣが確実に細菌細胞あたり１コピーのままであるようにする；ＮｅｏＲ：Ｇ４１８に対する耐性遺伝子（ＥＧＦＰとの融合）；ＥＧＦＰ−Ｎｅｏ：このＯＲＦはＥＧＦＰとＮｅｏとの間で融合タンパク質をコードする。このＯＲＦの発現産物は、ＥＧＦＰ蛍光及びＧ４１８に対する耐性を与える。このＯＲＦは、ＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターの制御下にある。この遺伝子は真核細胞における選択マーカーである。（Ｂ）ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドを作製するために、その感染性を制御するために（ＦＬ  ＢＡＣ回収株）、再構成ウイルスのゲノムからのｌｏｘＰ−隣接ＢＡＣカセットを除去する可能性を示すために（ＦＬ  ＢＡＣ切除株）及び、ＦＬ  ＢＡＣプラスミド由来の野生型復帰突然変異株を作製するために行われる段階のフローチャート。
【図４Ａ】ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミド及び誘導株の構造分析を示す。（Ａ）ＳａｃＩ酵素制限により生成する断片のいくつかの略図。ＫＨＶ  ＦＬ及びＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ復帰突然変異株のゲノムは一番上に示す。ＴＫ、ＢＡＣ及びＴＲプローブは水平な太線により示す。ｋｂでの断片サイズを示す。このイラストは正しい縮尺で描かれていないことに注意。（Ｂ）ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミド及びＫＨＶ  ＦＬ、ＦＬ  ＢＡＣ、ＦＬ  ＢＡＣのゲノム回収株、ＦＬ  ＢＡＣ切除株、ＦＬ  ＢＡＣ復帰突然変異株をＳａｃＩ制限により分析し（左パネル）、ＴＫ  ＯＲＦ（第二のパネル）、ＢＡＣカセット（第三のパネル）又はＴＲ（第四のパネル）に対応するプローブを用いたサザンブロットによりさらに調べた。黒／白の矢印及び及び白抜き矢印は、それぞれＴＫ  ＯＲＦ及びＢＡＣカセットを含有する制限断片を指す。灰色矢印は、ＴＲプローブとのハイブリッド形成する制限断片を指す。ｋｂでのマーカーの大きさ（ＭＳ）を左に示す。
【図４Ｂ】ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミド及び誘導株の構造分析を示す。（Ａ）ＳａｃＩ酵素制限により生成する断片のいくつかの略図。ＫＨＶ  ＦＬ及びＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ復帰突然変異株のゲノムは一番上に示す。ＴＫ、ＢＡＣ及びＴＲプローブは水平な太線により示す。ｋｂでの断片サイズを示す。このイラストは正しい縮尺で描かれていないことに注意。（Ｂ）ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミド及びＫＨＶ  ＦＬ、ＦＬ  ＢＡＣ、ＦＬ  ＢＡＣのゲノム回収株、ＦＬ  ＢＡＣ切除株、ＦＬ  ＢＡＣ復帰突然変異株をＳａｃＩ制限により分析し（左パネル）、ＴＫ  ＯＲＦ（第二のパネル）、ＢＡＣカセット（第三のパネル）又はＴＲ（第四のパネル）に対応するプローブを用いたサザンブロットによりさらに調べた。黒／白の矢印及び及び白抜き矢印は、それぞれＴＫ  ＯＲＦ及びＢＡＣカセットを含有する制限断片を指す。灰色矢印は、ＴＲプローブとのハイブリッド形成する制限断片を指す。ｋｂでのマーカーの大きさ（ＭＳ）を左に示す。
【図５】ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミド間の不均一性を示す。２４種類の独立のＥ．コリクローンからＢＡＣプラスミドを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩにより分析した。ＫＨＶ親（ＦＬ株）及びＦＬ  ＢＡＣ株を対照として使用した。ｋｂでのマーカーの大きさ（ＭＳ）を左に示す。
【図６】Ｅ．コリにおけるＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドの安定性に対する実験を示す。連続２０日間にわたり、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドを含有するＤＨ１０Ｂ細胞を連続的に培養した。指示される日に、材料及び方法に記載のように、ＢＡＣ  ＤＮＡを調製し、次いでＳａｃＩにより消化した。ＫＨＶ親株（ＦＬ株）を対照として使用した。ｋｂでのマーカーの大きさ（ＭＳ）を左に示す。
【図７】ＫＨＶ  ＦＬ由来株の特徴を示す。（Ａ）ウイルス合胞体の落射蛍光分析。ＣＣＢ細胞にＫＨＶ  ＦＬ株（ｉ−ｉｉｉ）、ＦＬ  ＢＡＣ株（ｉｖ−ｉｖ）、ＦＬ  ＢＡＣ回収株（ｖｉｉ−ｉｘ）、ＦＬ  ＢＡＣ切除株（ｘ−ｘｉｉ）及びＦＬ  ＢＡＣ復帰突然変異株（ｘｉｉｉ−ｘｖ）を感染させ（０．１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩ）、１０％ＦＣＳ及び０．６％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＭＥＭに重ね合わせ、単離合胞体を得た。感染から７日後、一次及び二次抗体としてそれぞれＭａｂ８Ｇ１２及びＧＡＭ  Ａｌｅｘａ５６８を用いた間接的免疫蛍光染色によって合胞体が明らかになった。一連の３つの水平パネルは、同じ合胞体の分析に相当する。それぞれＥＧＦＰ及びＧＡＭ５６８蛍光発光について、パネル（ｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉｉ）、（ｘ）、（ｘｉｉｉ）及びパネル（ｉｉ）、（ｖ）、（ｖｉｉｉ）、（ｘｉ）、（ｘｉｖ）を分析した。組み合わせたＥＧＦＰ及びＡｌｅｘａ  ５６８シグナルをパネル（ｉｉｉ）、（ｖｉ）、（ｉｘ）、（ｘｉｉ）及び（ｘｖ）で示す。各パネルのサイドは２００μｍに相当する。（Ｂ）材料及び方法に記載のように、ＫＨＶ組み換え株の複製速度を親ＫＨＶ  ＦＬ株の複製速度と比較した。与えられるデータは３回測定の平均である。
【図８Ａ】ＦＬ  ＢＡＣプラスミド由来株に感染したコイの生存率の累積発現率を示す。第０日に、それぞれ１０匹のニシキゴイ（７ｇ）からなる（１３匹のコイからなる擬似感染群を除く。）５つの群に、材料及び方法に記載のように、擬似感染培地（Ａ）及びＦＬ（ＴＫ＋）３ｘ１０２ＰＦＵを含有する培地（Ａ）、ＦＬ  ＢＡＣ回収株（ＴＫ−）（Ｂ）、ＦＬ  ＢＡＣ切除株（ＴＫ−）（Ｂ）及びＦＬ  ＢＡＣ復帰突然変異株（ＴＫ＋）（Ｃ）をＩＰ注射により接種した。感染後第３２日に、ＩＰ注射により親ＦＬ株（３ｘ１０２ＰＦＵ／魚）を用いて、生存魚を抗原曝露処理した。  生存％を感染後の日数に従い表す。与えられる結果は、３回の独立した実験の代表である。
【図８Ｂ】ＦＬ  ＢＡＣプラスミド由来株に感染したコイの生存率の累積発現率を示す。第０日に、それぞれ１０匹のニシキゴイ（７ｇ）からなる（１３匹のコイからなる擬似感染群を除く。）５つの群に、材料及び方法に記載のように、擬似感染培地（Ａ）及びＦＬ（ＴＫ＋）３ｘ１０２ＰＦＵを含有する培地（Ａ）、ＦＬ  ＢＡＣ回収株（ＴＫ−）（Ｂ）、ＦＬ  ＢＡＣ切除株（ＴＫ−）（Ｂ）及びＦＬ  ＢＡＣ復帰突然変異株（ＴＫ＋）（Ｃ）をＩＰ注射により接種した。感染後第３２日に、ＩＰ注射により親ＦＬ株（３ｘ１０２ＰＦＵ／魚）を用いて、生存魚を抗原曝露処理した。  生存％を感染後の日数に従い表す。与えられる結果は、３回の独立した実験の代表である。
【図８Ｃ】ＦＬ  ＢＡＣプラスミド由来株に感染したコイの生存率の累積発現率を示す。第０日に、それぞれ１０匹のニシキゴイ（７ｇ）からなる（１３匹のコイからなる擬似感染群を除く。）５つの群に、材料及び方法に記載のように、擬似感染培地（Ａ）及びＦＬ（ＴＫ＋）３ｘ１０２ＰＦＵを含有する培地（Ａ）、ＦＬ  ＢＡＣ回収株（ＴＫ−）（Ｂ）、ＦＬ  ＢＡＣ切除株（ＴＫ−）（Ｂ）及びＦＬ  ＢＡＣ復帰突然変異株（ＴＫ＋）（Ｃ）をＩＰ注射により接種した。感染後第３２日に、ＩＰ注射により親ＦＬ株（３ｘ１０２ＰＦＵ／魚）を用いて、生存魚を抗原曝露処理した。  生存％を感染後の日数に従い表す。与えられる結果は、３回の独立した実験の代表である。
【図９】感染性ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ  ｇａｌＫ組み換えプラスミド及び派生ウイルス株を作製するために使用されるストラテジーの略図である。（Ａ）左部分。１個の末端反復を含有するＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドの略図。ＢＡＣカセット及び関心のある３つのＯＲＦ（１２、１６及び１４０）を示す。右部分。鋳型としてｐＧａｌＫベクターを用い、１４０ｇａｌＫプライマーを用いて、ＰＣＲにより１４０ｇａｌＫカセットを増幅した。このカセットにおいて、ｇａｌＫ  ＯＲＦは５０ｂｐＫＨＶ相同領域に挟まれている。同じ方法を用いて１２ｇａｌＫ及び１６ｇａｌＫカセットを作製した。（Ｂ）ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ  ｇａｌＫ組み換えプラスミドを作製するために、再構成ウイルスのゲノムからｌｏｘＰ−隣接ＢＡＣカセットを除去する可能性を示すために（ＦＬ  ＢＡＣ切除株）又はＦＬ  ＢＡＣプラスミド由来の野生型復帰突然変異株を作製するために（これはＯＲＦ１４０にのみ適用）、行われる段階のフローチャート。
【図１０Ａ】ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ  ｇａｌＫ組み換えプラスミド及び誘導ウイルス株の特徴を示す。（Ａ）ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ  ｇａｌＫ組み換えプラスミド及び派生ウイルス株の構造分析。ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミド、派生ｇａｌＫ組み換えプラスミド及び派生切除株又は復帰突然変異株のゲノムをＳａｃＩ制限により分析し（左パネル）、ＯＲＦ１２（推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子）、ＯＲＦ１６（推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子）、ＯＲＦ１４０（推定チミジル酸キナーゼ遺伝子）又はＴＫ  ＯＲＦに対応するプローブを用いてサザンブロット（右パネル）によりさらに調べた。ＫＨＶ  ＦＬ株を対照として使用した。白矢印及び白抜き矢印は、それぞれ対応するＯＲＦ及びｇａｌＫカセットを含有する制限断片を指す。灰色矢印はＴＫ  ＯＲＦを含有する制限断片を指す。ｋｂでのマーカーの大きさ（ＭＳ）を左に示す。（Ｂ）材料及び方法に記載のように、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ  ｇａｌＫ組み換え株の複製速度を親ＫＨＶ  ＦＬ株の複製速度と比較した。与えられるデータは３回測定の平均である。
【図１０Ｂ】ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ  ｇａｌＫ組み換えプラスミド及び誘導ウイルス株の特徴を示す。（Ａ）ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ  ｇａｌＫ組み換えプラスミド及び派生ウイルス株の構造分析。ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミド、派生ｇａｌＫ組み換えプラスミド及び派生切除株又は復帰突然変異株のゲノムをＳａｃＩ制限により分析し（左パネル）、ＯＲＦ１２（推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子）、ＯＲＦ１６（推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子）、ＯＲＦ１４０（推定チミジル酸キナーゼ遺伝子）又はＴＫ  ＯＲＦに対応するプローブを用いてサザンブロット（右パネル）によりさらに調べた。ＫＨＶ  ＦＬ株を対照として使用した。白矢印及び白抜き矢印は、それぞれ対応するＯＲＦ及びｇａｌＫカセットを含有する制限断片を指す。灰色矢印はＴＫ  ＯＲＦを含有する制限断片を指す。ｋｂでのマーカーの大きさ（ＭＳ）を左に示す。（Ｂ）材料及び方法に記載のように、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ  ｇａｌＫ組み換え株の複製速度を親ＫＨＶ  ＦＬ株の複製速度と比較した。与えられるデータは３回測定の平均である。
【図１１Ａ】ＢＡＣ由来複数欠損組み換え株を感染させたコイの生存率の累積発現率を示す。第０日に、それぞれ１０匹のニシキゴイ（７ｇ）からなる７つの群に、材料及び方法に記載のように、擬似感染培地（Ａ）及びＦＬ株（ＴＫ＋、ＴＭＰＫ＋）（Ａ）、ＦＬ  ＢＡＣ切除株（ＴＫ−、ＴＭＰＫ＋）（Ｂ）、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１２切除株（ＴＫ−、ＴＭＰＫ＋）（Ｂ）、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１６切除株（ＴＫ−、ＴＭＰＫ＋）（Ｃ）、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株（ＴＫ−、ＴＭＰＫ−）（Ｃ）及びＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０ＴＫ復帰突然変異株（ＴＫ＋、ＴＭＰＫ−）（Ｄ）をＩＰにより接種した。感染後第２７日に、ＩＰによりＦＬ株（３ｘ１０２ＰＦＵ／魚）を用いて、生存魚を抗原曝露処理した。生存魚％を感染後の日数に従い表す。与えられる結果は、３つの独立した実験の代表である。
【図１１Ｂ】ＢＡＣ由来複数欠損組み換え株を感染させたコイの生存率の累積発現率を示す。第０日に、それぞれ１０匹のニシキゴイ（７ｇ）からなる７つの群に、材料及び方法に記載のように、擬似感染培地（Ａ）及びＦＬ株（ＴＫ＋、ＴＭＰＫ＋）（Ａ）、ＦＬ  ＢＡＣ切除株（ＴＫ−、ＴＭＰＫ＋）（Ｂ）、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１２切除株（ＴＫ−、ＴＭＰＫ＋）（Ｂ）、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１６切除株（ＴＫ−、ＴＭＰＫ＋）（Ｃ）、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株（ＴＫ−、ＴＭＰＫ−）（Ｃ）及びＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０ＴＫ復帰突然変異株（ＴＫ＋、ＴＭＰＫ−）（Ｄ）をＩＰにより接種した。感染後第２７日に、ＩＰによりＦＬ株（３ｘ１０２ＰＦＵ／魚）を用いて、生存魚を抗原曝露処理した。生存魚％を感染後の日数に従い表す。与えられる結果は、３つの独立した実験の代表である。
【図１１Ｃ】ＢＡＣ由来複数欠損組み換え株を感染させたコイの生存率の累積発現率を示す。第０日に、それぞれ１０匹のニシキゴイ（７ｇ）からなる７つの群に、材料及び方法に記載のように、擬似感染培地（Ａ）及びＦＬ株（ＴＫ＋、ＴＭＰＫ＋）（Ａ）、ＦＬ  ＢＡＣ切除株（ＴＫ−、ＴＭＰＫ＋）（Ｂ）、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１２切除株（ＴＫ−、ＴＭＰＫ＋）（Ｂ）、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１６切除株（ＴＫ−、ＴＭＰＫ＋）（Ｃ）、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株（ＴＫ−、ＴＭＰＫ−）（Ｃ）及びＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０ＴＫ復帰突然変異株（ＴＫ＋、ＴＭＰＫ−）（Ｄ）をＩＰにより接種した。感染後第２７日に、ＩＰによりＦＬ株（３ｘ１０２ＰＦＵ／魚）を用いて、生存魚を抗原曝露処理した。生存魚％を感染後の日数に従い表す。与えられる結果は、３つの独立した実験の代表である。
【図１１Ｄ】ＢＡＣ由来複数欠損組み換え株を感染させたコイの生存率の累積発現率を示す。第０日に、それぞれ１０匹のニシキゴイ（７ｇ）からなる７つの群に、材料及び方法に記載のように、擬似感染培地（Ａ）及びＦＬ株（ＴＫ＋、ＴＭＰＫ＋）（Ａ）、ＦＬ  ＢＡＣ切除株（ＴＫ−、ＴＭＰＫ＋）（Ｂ）、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１２切除株（ＴＫ−、ＴＭＰＫ＋）（Ｂ）、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１６切除株（ＴＫ−、ＴＭＰＫ＋）（Ｃ）、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株（ＴＫ−、ＴＭＰＫ−）（Ｃ）及びＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０ＴＫ復帰突然変異株（ＴＫ＋、ＴＭＰＫ−）（Ｄ）をＩＰにより接種した。感染後第２７日に、ＩＰによりＦＬ株（３ｘ１０２ＰＦＵ／魚）を用いて、生存魚を抗原曝露処理した。生存魚％を感染後の日数に従い表す。与えられる結果は、３つの独立した実験の代表である。
【図１２Ａ】マゴイでの生物発光イメージングを用いて、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株により与えられる臨床的防御及びウイルス防御を示す。（Ａ）実験の略図。第０日に、それぞれ８匹のマゴイ（８ｇ）からなる２つの群に、擬似感染培地又は、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株を薬浴法（４０ＰＦＵ／ｍＬ）により感染させた。感染から３０日後、ヒトＩＥプロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現する毒性ＫＨＶ  ＦＬ  ＬＵＣ株を用いて、薬浴法（４０ＰＦＵ／ｍＬ）により、全ての魚を抗原曝露処理した。抗原曝露処理から３及び６日後（３３及び３６ｄｐｉ）、コイを麻酔し、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を用いて分析した。（Ｂ及びＣ）生物発光イメージング。光子束の最大を赤、最低レベルを紫として、擬似カラースケールでルシフェラーゼ活性を示す。光子束に対する一定の最小及び最大閾値とともに代表的画像を与える。擬似カラーで生物発光シグナルを表示し、グレースケール画像に重ね合わせる。
【図１２Ｂ】マゴイでの生物発光イメージングを用いて、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株により与えられる臨床的防御及びウイルス防御を示す。（Ａ）実験の略図。第０日に、それぞれ８匹のマゴイ（８ｇ）からなる２つの群に、擬似感染培地又は、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株を薬浴法（４０ＰＦＵ／ｍＬ）により感染させた。感染から３０日後、ヒトＩＥプロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現する毒性ＫＨＶ  ＦＬ  ＬＵＣ株を用いて、薬浴法（４０ＰＦＵ／ｍＬ）により、全ての魚を抗原曝露処理した。抗原曝露処理から３及び６日後（３３及び３６ｄｐｉ）、コイを麻酔し、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を用いて分析した。（Ｂ及びＣ）生物発光イメージング。光子束の最大を赤、最低レベルを紫として、擬似カラースケールでルシフェラーゼ活性を示す。光子束に対する一定の最小及び最大閾値とともに代表的画像を与える。擬似カラーで生物発光シグナルを表示し、グレースケール画像に重ね合わせる。
【図１２Ｃ】マゴイでの生物発光イメージングを用いて、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株により与えられる臨床的防御及びウイルス防御を示す。（Ａ）実験の略図。第０日に、それぞれ８匹のマゴイ（８ｇ）からなる２つの群に、擬似感染培地又は、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株を薬浴法（４０ＰＦＵ／ｍＬ）により感染させた。感染から３０日後、ヒトＩＥプロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現する毒性ＫＨＶ  ＦＬ  ＬＵＣ株を用いて、薬浴法（４０ＰＦＵ／ｍＬ）により、全ての魚を抗原曝露処理した。抗原曝露処理から３及び６日後（３３及び３６ｄｐｉ）、コイを麻酔し、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を用いて分析した。（Ｂ及びＣ）生物発光イメージング。光子束の最大を赤、最低レベルを紫として、擬似カラースケールでルシフェラーゼ活性を示す。光子束に対する一定の最小及び最大閾値とともに代表的画像を与える。擬似カラーで生物発光シグナルを表示し、グレースケール画像に重ね合わせる。
【図１３】ＫＨＶ潜在部位としての脳の同定を示す。それぞれ１０匹のニシキゴイからなる２つの群（平均重量２７ｇ）に、擬似感染させるか又は薬浴法により感染させる。感染のために、ＫＨＶ  ＦＬ  ＬＵＣ株を水に添加し、４０ＰＦＵ／ｍＬの最終濃度にした。感染５０日後、急性感染から生き残ったコイ（ｎ＝３）を殺し、解剖し、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を用いて単離臓器を分析した。光子束の最大を赤、最低レベルを紫として、擬似カラースケールでルシフェラーゼ活性を示す。ある代表的なコイを各群に対して示す。光子束に対する一定の最小及び最大閾値とともに代表的画像を与える。擬似カラーで生物発光シグナルを表示し、グレースケール画像に重ね合わせる。検出可能なシグナルを発光した臓器は脳のみであった（白丸）。
【実施例】
【０１０７】
材料及び方法
ａ）細胞及びウイルス。４．５ｇ／Ｌグルコース（Ｄ−グルコース１水和物、Ｍｅｒｃｋ）及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有する最小必須培地（ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でシプリヌス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）脳細胞（ＣＣＢ）（Ｎｅｕｋｒｉｃｈら、Ｂｕｌｌ．Ｅｕｒ．Ａｓｓ．Ｆｉｓｈ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９（５）、２２１−２２４（１９９９））を培養した。５％ＣＯ２を含有する湿気のある環境にて２５℃で細胞を培養した。ＫＨＶで死亡した魚の腎臓からＫＨＶ  ＦＬ株を単離した（ＣＥＲ  Ｍａｒｌｏｉｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）。ＦＬは株を単離したＦｒａｎｇｏｉｓ  Ｌｉｅｆｆｒｉｇを表す。ＫＨＶ  ＩＳ及びＫＨＶ−Ｕ株は、それぞれＭ．Ｋｏｔｌｅｒ（Ｈｅｂｒｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）及びＲ．Ｈｅｄｒｉｃｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＵＳＡ）の好意により提供された（Ｒｏｎｅｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２１（３２）、４６７７−４６８４（２００３）；Ｈｅｄｒｉｃｋら、Ｂｕｌｌ．Ｒｅｓ．Ａｇｅｎ．、Ｓ２、１−７（２００５））。
【０１０８】
ｂ）増殖アッセイ。ＣＣＢ細胞の３回の培養物に、ＫＨＶ  ＦＬ、ＫＨＶ  ＩＳ及びＫＨＶ−Ｕ株を感染させた（０．５ＰＦＵ／細胞の感染多重度）。２時間の温置時間後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、次いで、４．５ｇ／Ｌグルコース及び１０％ＦＣＳを含有するダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に重ねた。感染から５日後、感染培養物の上清を回収し、既に述べられたように、ＣＣＢ細胞でのプラークアッセイにより感染性ウイルスの量を調べた（Ｇｉｌｌｅｔら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、８６、９０７−９１７（２００５））。
【０１０９】
ｃ）ＫＨＶのＢＡＣクローニング。第一に、鋳型としてＫＨＶ  ＦＬ  ＤＮＡを用いて、ＰＣＲにより、ＫＨＶゲノムのＴＫ  ＯＲＦ（ＯＲＦ５５）及びＯＲＦ５６に対応する１１３７ｂｐＤＮＡ断片を増幅した。増幅のために次のプライマーを使用した：それぞれＫＨＶ  ＴＫ  ＯＲＦのヌクレオチド１−２１及びＯＲＦ５６のヌクレオチド２７９−２９７に対応する、フォワードプライマー５’−ＡＴＧＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＴＧ−３’及びリバースプライマー５’−ＣＴＣＡＡＣＡＧＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＣＧ−３’（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＤＱ１７７３４６）。増幅産物をｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター（ｐｒｏｍｅｇａ）へとＴＡクローニングし、その結果、ｐＧＥＭＴ−ＴＫを得た（図３Ａ）。３種類の独立したクローンの配列を決定した。ｐＢｅｌｏＢＡＣ修飾−ＥＧＦＰＮｅｏベクターのＰｍｅＩ消化により、ＢＡＣカセットを放出させ（Ｄｅｗａｌｓら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、８７、５０９−５１７（２００６））、次いでｐＧＥＭＴ−ＴＫベクターのＲｓｒＩＩ部位に連結し、その結果、ＢＡＣカセットがＫＨＶゲノムに相同である配列に挟まれているｐＧＥＭＴ−ＴＫＢＡＣベクターを得た（図３Ａ）。真核細胞での相同組み換えにより、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ組み換え株を作製するために、５５８ｂｐ及び５７７ｂｐのこれらの相同領域を使用した（図３Ｂ）。簡潔に述べると、０．５ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで新鮮播種ＣＣＢ細胞にＫＨＶを感染させた。２時間の温置後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｉｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて環状ｐＧＥＭＴ−ＴＫＢＡＣベクターを細胞に遺伝子移入した。感染から４日後に、感染細胞の細胞上清を回収し、Ｇ４１８（最終濃度５００μｇ／ｍＬ）存在下で、コンフルエントＣＣＢ細胞単層（１０６細胞／９．５ｃｍ２）に接種した。純粋なＢＡＣ−組み換え集団が得られるまでこの段階を３回繰り返した。このウイルス調製物を１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで新鮮播種ＣＣＢ細胞に接種した。環化形態のウイルスＢＡＣ−組み換えゲノムを既に述べたように接種から２０時間後に抽出し（Ｍｏｒｇａｎら、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ、３４、３４５−３５１（１９９０））、他所で述べたように、２μｇＤＮＡをエレクトロポレーション（２２５０ｖ、１３２Ω、４０μＦ）によりＥ．コリＤＨ１０Ｂ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。クロラムフェニコール（１７μｇ／ｍＬ）を添加した固形ＬＢプレートにエレクトロポレーション処理した細胞を播種した。この段階において、不完全なＫＨＶ  ＢＡＣプラスミドを含有する細菌の優先的増殖を避けるために液体前培養を回避することはこの段階において重要であることに注意すること。
【０１１０】
ｄ）ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドからの感染性ウイルスの再構成。ＦＬ  ＢＡＣ回収株を作製するために、許容状態のＣＣＢ細胞にＦＬ  ＢＡＣプラスミドを遺伝子移入した（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｉｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＢＡＣ由来の野生型復帰突然変異株を作製するために、ｐＧＥＭＴ−ＴＫベクターとともにＦＬ  ＢＡＣプラスミドをＣＣＢ細胞において同時遺伝子移入した（分子比１：７５）。遺伝子移入から７日後、ＥＧＦＰ発現に関して陰性であるウイルスプラークを拾い、３回の連続のプラーク精製により濃縮した。同様に、ウイルスゲノムからＢＡＣカセットが切除されたビリオンを再構成するために、核局在シグナルに融合したＣｒｅレコンビナーゼをコードするｐＥＦＩＮ３−ＮＬＳ−ＣｒｅベクターとともにＦＬ  ＢＡＣプラスミドをＣＣＢ細胞に同時遺伝子移入した（Ｇｉｌｌｅｔら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、８６、９０７−９１７（２００５））（分子比：１：７０）。
【０１１１】
ｅ）サザンブロッティング。既に述べたようにサザンブロット分析を行った（Ｍａｒｋｉｎｅ−Ｇｏｒｉａｙｎｏｆｆら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、８５、３５５−３６７（２００４））。いくつかのプローブを使用した。ＫＨＶＴＫ  ＯＲＦのヌクレオチド１−２１及びＯＲＦ５６のヌクレオチド２７９−２９７にそれぞれ対応するＴＫｆｗ５’−ＡＴＧＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＴＧ−３’及びリバースプライマー（ＴＫｒｅｖ）５’−ＣＴＣＡＡＣＡＧＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＣＧ−３’（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＤＱ１７７３４６）を用い、鋳型としてＫＨＶ  ＦＬゲノムを用いて、ＰＣＲによりＴＫプローブを作製した。ＴＲプローブは、ＫＨＶゲノムの、ＬＴＲのヌクレオチド３８１７−４２２８及びＲＴＲのヌクレオチド２７６４９４−２７６９０５に対応した（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＤＱ１７７３４６）。ＰｍｅＩ消化により、ｐＢｅｌｏＢＡＣ修飾−ＥＧＦＰ  ＮｅｏベクターからＢＡＣプローブを放出させた。ＯＲＦ１２、ＯＲＦ１６及びＯＲＦ１４０プローブはこれらの遺伝子座のＯＲＦに対応した。
【０１１２】
ｆ）間接的免疫蛍光染色。ＣＣＢ細胞を固定し、−２０℃で１０分間、アセトン−エタノール（５０：５０）で透過処理した。１０％ＦＣＳを含有するＰＢＳ中で免疫蛍光染色（温置及び洗浄）を行った。感染細胞の核で発現される非同定ＫＨＶ抗原に対して生成させたマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）８Ｇ１２とともに２５℃で４５分間、試料を温置した。３回の洗浄後、二次結合物としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＧＡＭ５６８、２μｇ／μＬ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とともに、２５℃で３０分間、試料を温置した。
【０１１３】
ｇ）顕微鏡分析。既に述べられるように、ＤＣ３００Ｆ  ＣＣＤカメラ（Ｌｅｉｃａ）を備えたＤＭＩＲＢＥ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて落射蛍光顕微鏡分析を行った。
【０１１４】
ｈ）多段階増殖曲線。ＣＣＢ細胞のの培養物に、０．５ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで感染させた。２時間の温置時間後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、次いで４．５ｇ／Ｌグルコース及び１０％ＦＣＳを含有するダルベッコの改変必須培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に重ね合わせた。感染後間を置いて連続的に感染培養物の上清を回収し、既に述べたように、ＣＣＢ細胞でのプラークアッセイにより感染性ウイルスの量を調べた（Ｇｉｌｌｅｔら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、８６、９０７−９１７（２００５））。
【０１１５】
ｉ）細菌でのｇａｌＫ陽性選択を用いたＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ組み換えプラスミドの作製。既に述べたように、細菌でのｇａｌＫ陽性選択を用いて、ＯＲＦ１２（推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子）、ＯＲＦ１６（推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子）又はＯＲＦ１４０（推定チミジル酸キナーゼ遺伝子）の何れかが欠失したＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ組み換えプラスミドを作製した（Ｗａｒｍｉｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３３（４）（２００５））（図９）。組み換え断片は、欠失されるべきＯＲＦの始まり及び終わりに対応する５０ｂｐ配列が両側にあるガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）遺伝子（１３３１ｂｐ）から構成された。鋳型としてｐｇａｌＫベクターを用いて、ＰＣＲによりこれらの断片を作製した。増幅のために次のプライマーを使用した：ＯＲＦ１２：フォワード５’−ＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴＴＧＧＡＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＡ−３’及びリバース５’−ＴＣＡＡＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＴＧＣＡＣＡＴＡＴＴＣＧＴＣＣＣＣＣＣＣＡＣＧＧＴＴＴＴＣＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＴ−３’プライマー；ＯＲＦ１６：フォワード５’−ＡＴＧＡＡＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＧＧＧＣＴＧＣＴＴＧＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＡ−３’及びリバース５’−ＴＣＡＴＡＧＧＡＣＧＣＣＡＴＣＧＧＴＴＧＡＧＴＴＣＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＣＧＡＣＴＣＣＣＡＧＴＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＴ−３’プライマー；ＯＲＦ１４０：フォワード５’−ＡＴＧＧＡＡＣＣＣＧＡＧＣＣＴＣＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＧＣＧＡＧＣＴＣＣＣＴＴＴＣＡＴＧＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＡ−３’及びリバース５’−ＴＣＡＡＧＡＣＣＡＴＡＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＧＴＴＣＡＧＣＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＴ−３’プライマー（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＤＱ１７７３４６）。増幅産物を精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）、使用するまで−２０℃で保存した。平行して、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミド１μｇをエレクトロポレーション（２５００Ｖ、１００Ω、２５μＦ）でＥ．コリＳＷ１０２細胞に導入した。エレクトロポレーション処理した細胞を、クロラムフェニコール（１７μｇ／ｍＬ）入りの液体ＬＢ培地中で３２℃にて増殖させた。次に、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドを含有するエレクトロコンピテントＳＷ１０２細胞に上述のＰＣＲ産物２．５ｎｇをエレクトロポレーションで導入した。相同組み換えが起こった細菌を選択するために、他所に記載のように２０％ガラクトース及びクロラムフェニコール（１７μｇ／ｍＬ）を添加した固形Ｍ６３最小培地にエレクトロポレーション処理細胞を播種した。最後に、ｇａｌＫ陽性クローンの生成を確認するために、他所に記載のように、ＭａｃＣｏｎｋｅｙインジケータープレート上に得られたコロニーで筋状に画線した。
【０１１６】
ｊ）魚におけるＫＨＶ疾患の誘導。特異的病原体不含のニシキゴイ及びマゴイを６０Ｌのタンクで２４℃の水温にて維持した。１／インビボでＫＨＶ野外株の病原性を試験するために、１０匹のニシキゴイ及び１０匹のマゴイをそれぞれ含む２群の魚を使用した。ニシキゴイ（７ｇ）にＫＨＶ  ＩＳ又はＫＨＶ  ＦＬ株の３ｘ１０２ＰＦＵを含有する０．１ｍＬをＩＰ注射により感染させた。３０ＰＦＵ／ｍＬの最終濃度とするためにＫＨＶ  ＩＳ株又はＫＨＶ  ＦＬ株の何れかが添加された３００ｍＬタンクに魚を入れることによって、マゴイ（２ｇ）に感染させた。これらの条件下で２時間後、マゴイを大型のタンクに移した。２／ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ由来株の病原性を比較するために、１０匹のニシキゴイ（７ｇ）をそれぞれ含む５群の魚を使用した（１３匹のコイからなる擬似感染群を除く。）。ＫＨＶ  ＦＬ株、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ回収株、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ切除株及びＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ復帰突然変異株の３ｘ１０２ＰＦＵを含有する０．１ｍＬを用いてＩＰ注射によってニシキゴイに感染させた。接種前にウイルス接種材料の滴定を行い、接種後に逆滴定して群間で用量が同等であったことを確認した。対照群（擬似感染）に同じ条件下で培地を注射した。ＫＨＶ疾患の臨床兆候について魚を毎日調べ、死亡した魚を除去した。３／上述のように、ニシキゴイにおいて、多重欠損ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１２、ΔＯＲＦ１６、ΔＯＲＦ１４０切除株及びＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０ＴＫ復帰突然変異株の病原性を調べた（ポイント２参照）。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｅｇｅ（ベルギー）のローカルの倫理委員会により動物実験の認可を得た。
【０１１７】
ｋ）細菌におけるｇａｌＫ陽性及び陰性選択を用いたＫＨＶ  ＦＬ  ＬＵＣ組み換え株の作製。ホタルルシフェラーゼを発現するＫＨＶ  ＦＬ  ＬＵＣ組み換え体を次のように作製した。最初に、上述のように、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミド及び細菌のｇａｌＫ陽性選択を用いて、遺伝子間のＯＲＦ１３６及びＯＲＦ１３７領域にｇａｌＫカセットを有するＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミド（Ｇｅｎｂａｎｋ  寄託番号ＤＱ１７７３４６）を作製した。第二に、細菌のｇａｌＫ陰性選択を用いて、ヒトサイトメガロウイルス超初期プロモーターの制御下で、ホタルルシフェラーゼ遺伝子に対応するＬＵＣカセットによりｇａｌＫカセットを置換し（Ｗａｒｍｉｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３３（４）（２００５））、これにより、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ  ＬＵＣプラスミドを得た。第三に、ＬＵＣ発現カセット及び野生型ＴＫ配列をコードする感染粒子を再構成するために、既に述べたｐＧＥＭＴ−ＴＫベクターとともにＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ  ＬＵＣプラスミドをＣＣＢ細胞に同時遺伝子移入し、これによりＫＨＶ  ＦＬ  ＬＵＣ株を得た。ＫＨＶ  ＦＬ  ＬＵＣ株がインビトロで親ＦＬ株と同程度に複製することが証明された。インビボで、８ｇマゴイを水槽に入れることによって接種した場合、ＫＨＶ  ＦＬ  ＬＵＣ及び親ＦＬ株は同程度の毒性を示した。両株により、８０％前後の死亡率（データは示さない。）となった。
【０１１８】
ｌ）生物発光イメージング。冷却ＣＣＤカメラ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）からなるＸｅｎｏｇｅｎインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）で魚におけるホタルルシフェラーゼのイメージングを行った。簡潔に述べると、ＩＰ注射によってＤ−ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ）１５０ｍｇ／ｋｇを魚に投与した。次に、ベンゾカイン（５０ｍｇ／Ｌ水）で魚を麻酔し、Ｄ−ルシフェリン投与から１０分後にイメージングを開始した。１分間の曝露時間、４のビニング係数及び１のｆ／ｓｔｏｐを用いて、画像を得た。各魚の左右に対して画像を得た。紫（最低強度）から赤（最高強度）の範囲の擬似カラー画像として、インビボ生物発光からの透過光の相対強度を表した。光子束に対する均一な最小及び最大閾値で画像が与えられた。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ分析ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて、対応するグレースケール写真及びカラールシフェラーゼ画像を重ね合わせた。
【０１１９】
実施例１
ＫＨＶ  ＦＬ株は、派生弱毒化組み換えワクチンの作製に対する親株としての固有の特性を有する。
【０１２０】
野外株をインビトロでのそれらの増殖特性及びインビボでのそれらの毒性について試験した。派生弱毒化組み換え株の作製のための親株として、このスクリーニングプロセスの終わりにＫＨＶ  ＦＬ株を選択した。図１は、２種類のＫＨＶ参照株（ＩＳ及びＫＨＶ−Ｕ株）と比較した場合のＫＨＶ  ＦＬ株の増殖特性を示し、このＦＬ株はインビトロでより効率的に複製した。図２は、インビボでのＫＨＶ  ＦＬ株がＫＨＶ  ＩＳ株よりも病原性が低かったことを示す。実際に、７ｇニシキゴイでアッセイした場合、ＩＳ株及びＦＬ株により致死性がそれぞれ９０％及び８０％となった（図２）。興味深いことに、２ｇマゴイでアッセイした場合、ＩＳ株と比較して、ＦＬ株により誘導される疾患発症が２週間遅延した。より毒性が高いＫＨＶ株と比較して２週間の遅延が観察された観点で、及びより毒性が高いＫＨＶ株により引き起こされる疾患発症がマゴイにおいて約１週間後に起こることを考慮して、さらなる実験に対して親株としてＦＬ株を選択した（ＦＬは、株を単離したＦｒａｎｇｏｉｓ  Ｌｉｅｆｆｒｉｇを表す。）［寄託番号ＬＭＰＢ６５８１ＣＢ］。
【０１２１】
実施例２
Ｅ．コリでのＫＨＶゲノムのクローニング
ＫＨＶ組み換え株を作製するために、ＢＡＣとしてＫＨＶ  ＦＬ株のゲノムをクローニングした。ＢＡＣクローンＫＨＶに対して、図３で示されるアプローチを使用した。このアプローチは、第一段階として、真核細胞での相同組み換えによる、ＫＨＶゲノムへのＢＡＣカセットの挿入を必要とした。発明者らが研究を開始したとき、部分的にしか配列決定されていなかったので、ＴＫ遺伝子の末端でＢＡＣカセットの挿入部位を選択した（図３Ａ）。ＫＨＶ−感染ＣＣＢ細胞へのｐＧＥＭＴ−ＴＫＢＡＣの遺伝子移入により、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ株が得られた（図３Ｂ）。後者のウイルスがＧ４１８の存在下で増殖する能力によって、親株からのその単離が可能となった。さらに、選択プロセスの進行を監視するために、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ株により誘導されるＥＧＦＰの発現を使用した。Ｇ４１８の存在下でのウイルスの３継代後、純粋なＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ集団を得た。ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ及びサザンブロットアプローチの組み合わせにより、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ株の分子構造を確認した（図４）。親ＦＬ株において、およそ５．２ｋｂのＤＮＡ断片にＴＫ  ＯＲＦが含有された。ＦＬ  ＢＡＣ株において、ＴＫ遺伝子座へのＢＡＣカセット挿入の結果として、ＴＫ配列が、およそ５．３ｋｂ及び９．１ｋｂの２つの断片に分配された（図４）。次に、発明者らは、ＦＬ  ＢＡＣゲノムの環状中間体の細菌へのクローニングを試みた。驚くことに、５００を超える個別クローンのスクリーニングにもかかわらず、発明者らは、ＦＬ  ＢＡＣゲノムをコードする単クローンを選択することができなかった。得られたＢＡＣプラスミドから、予想される制限プロファイルに対応するバンドが数本しかない不均一な制限プロファイルが得られた（図５）。ＫＨＶゲノムのサイズが大きいために、不完全なＫＨＶ  ＢＡＣプラスミドをコードする細菌が、全長ＫＨＶ  ＢＡＣクローンをコードする細菌において選択的優位性を有し得；結果として、形質転換細菌の液体培地（固形培地に播種する前に行われた。）から、ＫＨＶゲノムの一部のみをコードするＢＡＣプラスミドを有する細菌が選択され得ると仮定できよう。この仮説を評価するために、エレクトロポレーション後、固形ＬＢ培地にＥ．コリをすぐに播種した。このアプローチにより、ＦＬ  ＢＡＣ株ゲノムで見出される制限断片の殆どをコードするＢＡＣプラスミドが得られた。しかし、ＦＬ  ＢＡＣ株ゲノムと同等の制限プロファイルを示したのはクローンの１−２％のみであった。これらの正しいクローンの１つの特徴を、ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ及びサザンブロットアプローチの組み合わせにより調べた（図４）。細菌でのゲノムの環状化により、ＦＬ及びＦＬ  ＢＡＣ株に存在する左右末端反復（ＬＴＲ及びＲＴＲ）の先端を含む２本のバンド（７．１ｋｂ及び１４．１ｋＢ）は、ＦＬ  ＢＡＣプラスミドでは欠落していた（図４）。しかし、ＦＬ  ＢＡＣプラスミドの制限プロファイルでは、２１．２ｋｂの予想される融合断片が見られなかった（図４）。この観察から、ＢＡＣが末端反復１コピーを含有することが示唆された。この仮説を調べるために、ＴＲプローブを用いて、サザンブロッティングにより、ＳａｃＩプロファイルを分析し��。この分析から、ＦＬ及びＦＬ  ＢＡＣ株プロファイルにおいては２本のバンド（７．１ｋｂ及び１１．３ｋＢ）が存在し、ＦＬ  ＢＡＣプラスミドでは１本のバンド（１１．３ｋＢ）のみが存在することが分かった（図４）。これらの結果から、ＦＬ  ＢＡＣプラスミドが、末端反復１コピーのみを含有することが分かった。この観察はまた、ＢＡＣの配列決定によっても確認された。要するに、上記で与えられる結果から、Ｅ．コリでのＢＡＣとしてＫＨＶゲノム全体がクローニングされたことが分かった［寄託番号ＬＭＢＰ５６５８］。
【０１２２】
実施例３
Ｅ．コリにおけるＫＨＶゲノムの安定性
ＢＡＣプラスミドは通常、組み換えを最小限に抑えるｒｅｃｋ突然変異を有する細菌中で増殖させる。しかし、ＫＨＶゲノムは大型で複雑な構造であることから、ＢＡＣプラスミドは比較的不安定になり得た（Ｉｌｏｕｚｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、７０（１）、１４７−１５６（２００６））。ＢＡＣプラスミドとしてのＫＨＶゲノムの安定性を評価するために、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドを含有する細菌を連続２０日間にわたり連続的に培養した（各日およそ３６世代に相当）。様々な培養時間後、ＢＡＣプラスミドを単離し、ＳａｃＩエンドヌクレアーゼ消化により特徴を調べた（図６）。様々な時間にわたり増殖させたプラスミド間で違いは観察されず、これにより、Ｅ．コリでＫＨＶゲノムの安定性が高いことが明らかになった。
【０１２３】
実施例４
ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドからの感染性ウイルスの再構成
ヘルペスウイルスＢＡＣクローンの有用性には、ＢＡＣプラスミドから感染粒子を再構成する能力が必要とされる。従って、発明者らは、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドのＣＣＢ細胞への遺伝子移入により感染粒子が生成され得るか否かを試験した（図３Ｂ）。遺伝子移入から６日後、ＥＧＦＰを発現するウイルス合胞体を検出した。再構成ウイルス（ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ回収株）のＤＮＡのＳａｃＩ制限分析から、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ株に対して観察されたパターンと同一の制限プロファイルが明らかになった（図４）。これらのデータから、感染性ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣビリオンが、許容状態の細胞へのＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドの遺伝子移入により効率的に再構成され得たことが分かった。促進薬物で処理せずに再構成ビリオンの生成が得られたことに注意することは重要である。これらのデータから、ＢＡＣは、１個しか末端反復をコードしないとしても、ゲノム全体及び感染粒子を再生することができることが示される。
【０１２４】
再構成ビリオンのゲノムからＢＡＣカセットを切除するために、Ｃｒｅレコンビナーゼ発現ベクターとともにＦＬ  ＢＡＣプラスミドをＣＣＢ細胞に同時遺伝子移入した（図３Ｂ）。ＥＧＦＰ蛍光の消失（図７）により及び制限エンドヌクレアーゼ及びサザンブロットアプローチの組み合わせにより（図４Ｂ）、ＢＡＣカセットの欠失を監視した。ＢＡＣカセットのｃｒｅ−ｌｏｘＰ−介在性の欠失により、ＴＫ  ＯＲＦの末端に１７２ｂｐの配列が残り、これにより、野生型対応断片よりもＳａｃＩ制限断片がわずかに大きくなった。１７２ｐｂは、１つのｌｏｘＰ部位（３４ｂｐ）及びｌｏｘＰ部位のＢＡＣカセット上流（１２６ｂｐ）及び下流（１２ｂｐ）の配列からなる。ＴＫ  ＯＲＦへの外来配列のこの１７２ｐｂ挿入により、ＦＬ  ＢＡＣ切除株は、野生型タンパク質（２１７残基）の１８５の最初のアミノ酸（ａａ）に対応する短縮型を発現した。
【０１２５】
最後に、復帰突然変異株を作製するために、ｐＧＥＭＴ−ＴＫベクターとともにＦＬ  ＢＡＣプラスミドをＣＣＢ細胞に同時遺伝子移入した（図３Ｂ）。ＥＧＦＰ非発現においてＦＬ  ＢＡＣ復帰突然変異株を選択した。制限分析から、親野生型ＦＬ株に対して観察されたパターンと同一のプロファイルが明らかになった（図４）。
【０１２６】
実施例５
ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ由来株の特性分析
細胞培養においてＦＬ  ＢＡＣ由来株のさらなる特性分析を行った。第一に、免疫染色されたウイルス合胞体を顕微鏡で調べることでは組み換え体間の違いは明らかにならなかった（図７Ａ）。第二に、インビトロでのウイルス増殖における組み換えプロセスの推定的効果を調べるために、複数段階の増殖アッセイを用いて、全ての組み換え株を比較した（図７Ｂ）。試験されたウイルスは全て、同様の増殖曲線を示し（Ｐ≦０．０５）、このことから、ＴＫの破壊はインビトロでのＫＨＶ複製に影響せず、ＫＨＶゲノムは、その大きなサイズにもかかわらず、大きな挿入を担持することができるという結論が導かれる。
【０１２７】
実施例６
ワクチンとしてのＢＡＣ由来ウイルス
チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子座を破壊するために、ＫＨＶ  ＦＬゲノムのＢＡＣクローニング法を設計した。このＯＲＦの欠失がＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ由来のウイルスの弱毒化に関与するか否かを調べるために、インビボで、ＦＬ親及びＦＬ  ＢＡＣ復帰突然変異株（ＴＫ＋である。）とＦＬ  ＢＡＣ回収株及びＦＬ  ＢＡＣ切除株（ＴＫ−である。）を比較した。７ｇニシキゴイにおいてこの実験を行った（図８）。親ＦＬ株は、無気力、背鰭の折れ、粘液分泌増加、窒息、泳ぎの異常及び平衡感覚の喪失を含むＫＨＶに付随する臨床兆候全てを誘導した。ＦＬ株は８０％の致死率を誘導した。剖検において、殆どの魚で、鰓弁の変色、ヘルペス性皮膚病変及び壊死腎炎が観察された。ＦＬ親株との比較において、ＦＬ  ＢＡＣ回収及び切除株は、同様の臨床兆候及び病変を特徴とする（しかし強度は低い。）部分的弱毒化表現型を示した。観察される弱毒化と一致して、これらの株の致死率は４０％に低下した。重要なこととして、ＦＬ  ＢＡＣ復帰突然変異株の毒性は親ＦＬ株の毒性と同様であった。興味深いことに、初感染で生存した魚は全て、毒性ＦＬ株でのさらなる抗原曝露（感染後第３２日）に対して防御免疫反応を発現した。これらのデータをまとめると、多重−弱毒化組み換えワクチンの開発のための親プラスミドとしてのＦＬ  ＢＡＣクローンの潜在力が支持される。
【０１２８】
実施例７
ｇａｌＫ陽性選択を用いた細菌での突然変異誘発による、ＫＨＶ  ＢＡＣ組み換えプラスミドの作製のための、親プラスミドとしてのＫＨＶ  ＢＡＣプラスミド
上記の結果は、ニシキゴイでアッセイした場合にＫＨＶ疾患の弱毒化を誘導するＴＫ欠失ＫＨＶ株（ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ切除株）の作製を述べる（図８）。これらのデータは、多重弱毒化組み換えワクチンの開発のための親プラスミドとしてのＦＬ  ＢＡＣクローンの潜在力を支持する。この概念の実現可能性を示すために、ｇａｌＫ陽性選択を用いて、細菌における相同組み換えにより、毒性遺伝子候補に対して欠失がある３種類のＫＨＶ  ＢＡＣ組み換えプラスミドを作製した：推定腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体遺伝子をコードするＯＲＦ１２に対して欠失があるＫＨＶ  ＢＡＣ（ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１２プラスミド）；推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）遺伝子をコードするＯＲＦ１６に対して欠失があるＫＨＶ  ＢＡＣ（ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１６プラスミド）及び推定チミジル酸キナーゼ遺伝子をコードするＯＲＦ１４０に対して欠失があるＫＨＶＢＡＣ（ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０プラスミド）（図９）。ＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ及びサザンブロットアプローチの組み合わせにより、作製された組み換えプラスミドの分子構造を確認した（図１０Ａ）。親ＫＨＶ  ＦＬ株及びＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミドにおいて、ＯＲＦ１２及びＯＲＦ１６は、およそ４．８ｋｂのＤＮＡ断片に含有され、およそ１．８ｋｂ及び１ｋｂの２つのＤＮＡ断片にＯＲＦ１４０が含有された。予想されるように、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ組み換えプラスミドにおいて、１．３ｋｂのｇａｌＫカセットを包含するＯＲＦ１２、ＯＲＦ１６及びＯＲＦ１４０ＤＮＡ断片は、それぞれおよそ５．７ｋｂ、５ｋｂ及び３．５ｋｂの断片に制限切断された（図１０Ａ）。ＯＲＦ１６に対して５ｋｂのバンドがサザンブロットで薄く見えたことに注意すること。次に、組み換えプラスミドのゲノムからＢＡＣカセットを切除するために、Ｃｒｅレコンビナーゼ−発現プラスミドともに、ＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣ組み換えプラスミドのＤＮＡをＣＣＢ細胞に同時遺伝子移入した（図９Ｂ）。ＥＧＦＰ蛍光の消失によって、及び組み合わせられた制限エンドヌクレアーゼ及びサザンブロットアプローチによって、ＢＡＣカセットの欠失を監視した。ＢＡＣカセットのｃｒｅ−ｌｏｘＰ−介在性欠失により、上述のように、ＴＫ  ＯＲＦの末端に１７２ｂｐの配列が残された。最終的に、ＯＲＦ１４０について欠失があるが野生型転写ＴＫ配列を含有するΔＯＲＦ１４０ＴＫ復帰突然変異株を作製した（図９Ｂ）。ＥＧＦＰ非発現においてこの復帰突然変異株を選択した。制限分析から、親ＦＬ株に対して観察されるように、ＴＫ  ＯＲＦの存在が明らかになった（図１０Ａ）。要するに、これらの結果から、原核組み換え技術を用いて、組み換え株を作製するために、本発明のＫＨＶ  ＦＬ  ＢＡＣプラスミド対象を使用することができることが示された。ＫＨＶゲノムの大きさ及び反復領域が高含量であることにより、レコンビナーゼの発現をオンにした場合に起こるはずであるゲノム内組み換えゆえに、このプロセスが不可能になるはずであると仮説が立てられていたので、この結果は予想外であった。
【０１２９】
多段階増殖アッセイを用いて、細胞培養において、ＫＨＶＢＡＣ組み換え株のさらなる特性分析を行った（図１０Ｂ）。試験したウイルスは全て、同様の増殖曲線を示し（Ｐ≦０．０５）、このことから、ＯＲＦ１２、ＯＲＦ１６又はＯＲＦ１４０の破壊と組み合わせたＴＫの破壊がインビトロでのＫＨＶ複製に影響を与えないという結論が導かれる。
【０１３０】
実施例８
ワクチンとしてのＢＡＣ由来多重欠失組み換え体
上記で与えられる結果は、３種類の多重欠失組み換え株の作製を述べる。弱毒化ワクチンとしてのこれらの多重欠失組み換え株の潜在力を試験するために、発明者らは、ニシキゴイにおけるそれらの病原性及びＫＨＶに対する防御免疫反応を誘導するためのそれらの特性を比較した。これらの実験の結果を図１１で与える。ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１２切除株（ＴＫ及びＯＲＦ１２が欠失）及びＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１６切除株（ＴＫ及びＯＲＦ１６が欠失）は、野生型と比較してそれぞれ６０％及び４０％という低い致死率を示した。注目に値することとして、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株（ＴＫ及びＯＲＦ１４０が欠失）は致死とはならず、ＫＨＶ疾患の臨床兆候が誘導されなかった（図１１）。同様に、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０ＴＫ復帰突然変異株（ＯＲＦ１４０が欠失しているが復帰野生型ＴＫ配列をコード）で致死とならなかった。感染魚は、感染後第４日に、軽度（無気力及び背鰭の折れ）で一時的な臨床兆候しか示さなかった。接種から２７日後に、毒性ＦＬ株を用いて、一次接種で生き残った魚を抗原曝露処理した。一次接種に対して使用された株とは独立して、抗原曝露処理された魚は全て、この疾患の臨床兆候を何ら示すことなく生存した。要するに、これらのデータから、多重欠失組み換え株、特に組み換え弱毒化生ワクチンとしてのＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株の潜在力が支持される。
【０１３１】
実施例９
ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株での魚のワクチン接種により、ＫＨＶに対する臨床的防御及びウイルス防御が与えられる。
【０１３２】
上記で与えられる結果から、弱毒化生ワクチンとしてのＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株の潜在力が示される。本ウイルスは、ワクチン接種対象において致死とならないか又は臨床兆候すら誘発せずに、ＫＨＶに対して防御免疫反応を誘導することができる。次に、発明者らは、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株でのワクチン接種が、ＫＨＶ疾患に対する免疫防御を誘導し得るだけでなく（臨床防御）、ワクチン接種対象がＫＨＶにより再接種される場合、さらなる感染を予防する免疫反応も与え得る（ウイルス防御）可能性に取り組んだ。
【０１３３】
この疑問を評価するために、薬浴法によってマゴイ（８ｇ）に最初にＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株を感染させた（図１２）。陰性対照として、培地で感染させた魚の群を使用した。感染後第３０日に、ホタルルシフェラーゼを発現する毒性ＫＨＶＬＵＣ株を用いて、全ての魚を抗原曝露処理した。次に、このワクチン株により与えられる防御を調べるために、抗原曝露から３及び６日後にＩＶＩＳにより全ての魚を分析した。この実験の結果を図１２で与える。未処理の魚（第０日に擬似感染させた魚）は、抗原曝露後第３及び６日に強い生物発光シグナルを示した（左パネル）。一方、ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株でワクチン接種した魚は、抗原接種後常に生物発光の検出可能なシグナルを全く示さなかった（右パネル）。さらに、これらのワクチン接種した魚は、ＫＨＶ疾患の臨床兆候を何ら示さなかった。要するに、これらの結果から、ＫＨＶに対する臨床的防御及びウイルス防御を与える弱毒化生ワクチンとしてのＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株の潜在力が支持される。
【０１３４】
実施例１０
ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株は、潜伏時間から再活性化することができないワクチン株である。
【０１３５】
ＫＨＶの潜伏部位が魚の脳であることが同定された（図１３）。脳細胞は分裂せず、結果として細胞性ＴＫ及びＴＭＰＫ核活性を発現しないことが知られているので、産生されるＴＫ／ＴＭＰＫ二重欠失ウイルス（ＦＬ  ＢＡＣΔＯＲＦ１４０切除株）が潜伏期間から再活性化し得ないはずであると仮定し得た。結果として、ワクチン接種動物は、それらが潜在保因者になった際に、ワクチン株の播種に関与しないはずである。
【０１３６】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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