(57)【要約】  本開示は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）融合ポリペプチド、上述のポリペプチドをコードする核酸分子、ならびに上述のポリペプチドを使用する治療の方法に関する。
2010535489.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポエチンの活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドは、エリスロポエチン受容体のエリスロポエチン結合ドメインに直接または間接的に連結されるエリスロポエチンまたはその部分を含む核酸分子。
【請求項２】
エリスロポエチン受容体のエリスロポエチン結合ドメインに直接または間接的に連結されるエリスロポエチンまたはその活性結合部分のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項３】
エリスロポエチンは、ペプチドリンカーによってエリスロポエチン受容体の結合ドメインに連結される請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記ペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの少なくとも１コピーを含む、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記ペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの２、３、４、５または６コピーを含む、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの３コピーから成る、請求項５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記ペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの４コピーから成る、請求項５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
ペプチド連結分子を含まず、エリスロポエチンおよびエリスロポエチン受容体のエリスロポエチン結合ドメインの直接的な融合物である、請求項２から７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
ｉ）配列番号１で表される核酸配列、
ｉｉ）配列番号３で表される核酸配列、
ｉｉｉ）配列番号５で表される核酸配列、
ｉｖ）配列番号７で表される核酸配列、または
ｖ）配列番号１、３、５または７とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、エリスロポエチン受容体調節活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子
から選択される核酸配列を含む核酸分子。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは、アゴニストである、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは、アンタゴニストである、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１２】
配列番号１で表される核酸配列を含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
配列番号３で表される核酸配列を含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１４】
配列番号５で表される核酸配列を含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１５】
配列番号７で表される核酸配列を含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１６】
請求項１または９から１５のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるポリペプチド。
【請求項１７】
ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号４で表されるアミノ酸配列、
ｉｉｉ）配列番号６で表されるアミノ酸配列、
ｉｖ）配列番号８で表されるアミノ酸配列、
ｖ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列、
ｖｉ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、
エリスロポエチン受容体調節活性を有するポリペプチド。
【請求項１８】
アゴニストである、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
アンタゴニストである、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２６】
２つのポリペプチドから成るホモ二量体であって、前記ポリペプチドはそれぞれ、
ｉ）エリスロポエチンまたはその受容体結合ドメインを含む第１の部分と、ペプチド連結分子によってそれと任意選択で連結される
ｉｉ）エリスロポエチン受容体の少なくとも１つのエリスロポエチン結合ドメインを含む第２の部分と
を含むホモ二量体。
【請求項２７】
配列番号２を含む２つのポリペプチドを含む、請求項２６に記載のホモ二量体。
【請求項２８】
前記ホモ二量体は、配列番号４を含む２つのポリペプチドを含む、請求項２６に記載のホモ二量体。
【請求項２９】
前記ホモ二量体は、配列番号６を含む２つのポリペプチドを含む、請求項２６に記載のホモ二量体。
【請求項３０】
前記ホモ二量体は、配列番号８を含む２つのポリペプチドを含む、請求項２６に記載のホモ二量体。
【請求項３１】
前記ホモ二量体は、配列番号１７を含む２つのポリペプチドを含む、請求項２６に記載のホモ二量体。
【請求項３２】
前記ホモ二量体は、配列番号１８を含む２つのポリペプチドを含む、請求項２６に記載のホモ二量体。
【請求項３３】
請求項１または９から１５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３４】
請求項１もしくは９から１５のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項３３に記載のベクターを用いて形質移入または形質転換される細胞。
【請求項３５】
真核細胞である、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
原核細胞である、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３７】
賦形剤または担体を含む、請求項２から８または１６または１７から２５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項３８】
さらなる治療薬と組み合わせられる、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
エリスロポエチンアゴニストの投与が有効であろう状態に罹患しているヒト対象を治療するための方法であって、請求項２から８または１６または１７から２５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドの有効量を投与するステップを含む方法。
【請求項４０】
前記状態は、貧血である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記状態は、慢性腎疾患の結果としての貧血である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記状態は、癌の治療における化学療法の結果としての貧血である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記状態は、慢性関節リウマチの治療における化学療法の結果としての貧血である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記状態は、ＡＩＤＳの治療における化学療法の結果としての貧血である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドは、静脈内に投与される、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリペプチドは、皮下に投与される、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリペプチドは、２日間隔で投与される、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリペプチドは、１週間隔で投与される、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ポリペプチドは、２週間隔で投与される、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリペプチドは、１か月間隔で投与される、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
貧血の治療のための医薬の製造のための、請求項２から８または１６または１７から２５のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項５２】
請求項２から８、１６、１７から２５、または２６から３２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは二量体に結合するモノクローナル抗体。
【請求項５３】
ポリペプチドまたは二量体に結合するが、エリスロポエチンまたはエリスロポエチン受容体にそれぞれ特異的に結合しない、請求項５２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５４】
本発明によるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製するための方法であって、
ｉ）本発明による少なくとも１つのポリペプチドまたはその断片を含む免疫原を用いて免疫応答性哺乳動物を免疫するステップ、
ｉｉ）免疫された免疫応答性哺乳動物のリンパ球を骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成するステップ、
ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体を、（ｉ）のポリペプチドに対する結合活性についてスクリーニングするステップ、
ｉｖ）ハイブリドーマ細胞を培養して、前記モノクローナル抗体を量産および／または分泌するステップ、ならびに
ｖ）培養上清からモノクローナル抗体を回収するステップを含む方法。
【請求項５５】
前記免疫応答性哺乳動物は、マウスまたはラットである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
請求項５４または５５に記載の方法によって得られるまたは入手可能なハイブリドーマ細胞株。
【請求項５７】
生体試料において、本発明によるポリペプチドを検出するための診断試験であって、
ｉ）試験対象となる単離試料を提供するステップ、
ｉｉ）前記試料を、請求項２から８、１６、および１７から２５のいずれか一項に記載のポリペプチドに結合するリガンドと接触させるステップ、ならびに
ｉｉｉ）前記試料において前記リガンドの結合を検出するステップを含む診断試験。
【請求項５８】
前記リガンドは、抗体である、請求項５７に記載の試験。
【請求項５９】
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項５８に記載の試験。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）融合ポリペプチドおよび二量体、上述のポリペプチドをコードする核酸分子、ならびに上述のポリペプチド／二量体を使用する治療の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカイン受容体は、２つの別個のクラスに分類することができる。クラス１（造血ホルモンファミリーまたは成長ホルモンファミリーと呼ばれる）受容体は、それらの細胞外ドメインのアミノ末端部分における４つの保存システイン残基およびＣ末端部分における保存Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒモチーフの存在によって特徴づけられる。受容体は、２つのポリペプチド鎖から成る。クラスＩ受容体は、ＧＭ−ＣＳＦサブファミリー（ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＣＳＦを含む）ならびにＩＬ−６サブファミリー（ＩＬ−６、ＩＬ−１１、およびＩＬ−１２を含む）に細分することができる。ＩＬ−６サブファミリーにおいて、１つまたは２つの異なるサイトカインサブユニットと結合する、共通の伝達サブユニット（ｇｐ１３０）がある。ＩＬ−２サブファミリー（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、およびＩＬ−１５を含む）と呼ばれる、さらなるサブファミリーがある。繰り返しＣｙｓモチーフはまた、リガンドが、α、β、およびγインターフェロンであるが、保存Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒモチーフを欠くクラス２（インターフェロン受容体ファミリー）においても存在する。
【０００３】
ヒトＥＰＯは、骨髄における赤血球産生の調節に関与する３５ｋＤ糖タンパク質ホルモンである。これは、腎臓によって産生され、１９７７年に精製され、１９８５年にクローニングされて以降、これは、慢性腎不全および他の疾患における貧血を治療するために使用されている。ＥＰＯに応答する細胞は、内皮細胞、神経細胞、および心臓細胞を含む。ＥＰＯの調製物は、特異なグリコシル化により不均一である。ＥＰＯのグリコシル化は、インビトロ活性に必要とされず、ＥＰＯの成熟形態が、グリコシル化の非存在下においてＥＰＯ受容体に結合することができることを示す。しかしながら、ＥＰＯのインビボ活性は、その分解を予防し、かつクリアランスを遅らせるための糖部分の追加に依存する。
ＥＰＯは、赤血球系細胞上で低度なレベルで発現され、成熟赤血球において不在である単一の高親和性受容体の活性化を通して赤血球発生を活性化する。ＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）は、クラス１サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する。ＥＰＯＲへのＥＰＯの結合は、多くの細胞質分子およびＥＰＯＲを含む膜結合分子のチロシンリン酸化を誘発する受容体二量体化をもたらす。ＥＰＯＲは筋細胞、ニューロン細胞、および内皮細胞において検出されており、ＥＰＯは、心臓および脳の発生をコントロールする際に作用すると考えられる。ＥＰＯはまた、炎症性および虚血性の損傷から心臓および脳を保護することが示された。ＥＰＯの血清レベルは、正常および病理学的条件に応じて変動的となり得る。ＥＰＯのレベルは、低酸素または失血に応じて１００〜１０００倍、増加し得る。
【０００４】
貧血は、多くの病理学的状態に起因し得る。たとえば、貧血状態は、失血、溶血、鉄欠乏、骨髄形成不全、または栄養障害に起因し得る。いくつかの病理学的条件において、ＥＰＯレベルは、非常に低度となり得、これは、ＥＰＯの産生の損失および結果的な貧血をもたらす慢性腎不全に起因する。さらに、ＥＰＯレベルは、慢性関節リウマチ、ＡＩＤＳ、および癌（化学療法の結果）などのような疾患に罹患している患者において低度となり得る。組換えＥＰＯが投与される場合（たとえばＥｐｏｇｅｎ、Ａｒａｎｓｅｓｐ、およびＥｐｏｇｉｎ）、貧血の治療は非常に有効である。典型的には、組換えＥＰＯは、皮下注射によってまたは静脈内に、１週間に２度または３度投与される。ＥＰＯの投与は、リスクがないわけではない。副作用のいくつかは、血圧の増加、悪心、嘔吐、頭痛、および息切れを含む。
より低い投薬量の投与およびより少ない副作用をもたらす、少ない頻度で投与することができ、血清安定性が増加している、ＥＰＯのさらなる形態を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、薬物動態および活性が改善されたＥＰＯ組換え形態の同定に関する。新しいＥＰＯ分子は、生物学的に活性であり、二量体を形成し、安定性が改善されている。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１ａ】哺乳動物細胞における発現のための、ＥＰＯ−Ｌ１−ＥＰＯｒＥＣ（（Ｇ４Ｓ）４を介してＥＰＯｒＥＣに連結されたＥＰＯ）をコードする核酸配列を示す図である（ヌクレオチド配列：長さ＝１２９９ｂｐ、シグナル配列を含む）。配列は、太字および小文字のシグナル配列を含有する。＊は、終止コドンを指す。
【図１ｂ】アミノ酸配列（長さ＝４０６ａａ、シグナル配列なし）を示す図である。シグナル配列は太字で示す。
【図２ａ】細菌細胞における発現のための、ＥＰＯ−Ｌ１−ＥＰＯｒＥＣ（（Ｇ４Ｓ）４を介してＥＰＯｒＥＣに連結されたＥＰＯ）をコードする核酸配列を示す図である（ヌクレオチド配列：長さ＝１２４２ｂｐ）。太字は、Ｘｈｏ１および６×Ｈｉｓｔ残基を指す。＊は、終止コドンを指す。ＡＴＧ開始コドンは太字イタリック体で示す。
【図２ｂ】アミノ酸配列（長さ＝４１４ａａ）を示す図である。
【図３ａ】哺乳動物細胞における発現のための、ＥＰＯ−Ｌ２−ＥＰＯｒＥＣ（（Ｇ４Ｓ）３を介してＥＰＯｒＥＣに連結されたＥＰＯ）をコードする核酸配列を示す図である（ヌクレオチド配列：長さ＝１２８４ｂｐ、シグナル配列を含む）。ヌクレオチド配列およびタンパク質配列は、シグナル配列を有する、哺乳動物細胞株において発現される完全な配列を表す。配列は、太字および小文字のシグナル配列を含有する。＊は、終止コドンを指す。
【図３ｂ】アミノ酸配列（長さ＝４０１ａａ、シグナル配列なし）を示す図である。シグナル配列は太字で示す。
【図４ａ】細菌細胞における発現のための、ＥＰＯ−Ｌ２−ＥＰＯｒＥＣ（（Ｇ４Ｓ）３を介してＥＰＯｒＥＣに連結されたＥＰＯ）をコードする核酸配列を示す図である（ヌクレオチド配列：長さ＝１２２７ｂｐ）。ヌクレオチド配列およびタンパク質配列は、６×ヒスチジンタグを有し、シグナル配列を有していない大腸菌において発現される完全な配列を表す。太字は、Ｘｈｏ１および６×Ｈｉｓｔ残基を指す。＊は、終止コドンを指す。ＡＴＧ開始コドンは太字イタリック体で示す。
【図４ｂ】アミノ酸配列（長さ＝４０９ａａ）を示す図である。
【図５ａ】哺乳動物細胞において発現されるＥＰＯをコードする核酸配列を示す図である（ヌクレオチド配列：長さ＝５７９ｂｐ、シグナル配列を含む）。ヌクレオチド配列およびタンパク質配列は、シグナル配列を有する、哺乳動物細胞株において発現される完全な配列を表す。配列は、太字および小文字のシグナル配列を含有する。＊は、終止コドンを指す。
【図５ｂ】アミノ酸配列（長さ＝１６６ａａ、シグナル配列なし）を示す図である。シグナル配列は太字で示す。
【図６ａ】細菌細胞における発現のためのＥＰＯをコードする核酸配列を示す図である（ヌクレオチド配列：長さ＝５２２ｂｐ）。ヌクレオチド配列およびタンパク質配列は、６×ヒスチジンタグを有する、大腸菌において発現される完全な配列を表す。太字は、Ｘｈｏ１および６×Ｈｉｓｔ残基を指す。＊は、終止コドンを指す。ＡＴＧ開始コドンは太字イタリック体で示す。
【図６ｂ】アミノ酸配列（長さ＝１７４ａａ）を示す図である。
【図７ａ】哺乳動物細胞において発現されるＥＰＯｒＥＣをコードする核酸配列を示す図である（ヌクレオチド配列：長さ＝７３２ｂｐ、シグナル配列を含む）。ヌクレオチド配列およびタンパク質配列は、シグナル配列を有する、哺乳動物細胞において発現される完全な配列を表す。
【図７ｂ】アミノ酸配列（長さ＝２２０ａａ、シグナル配列なし）を示す図である。シグナル配列は太字で示す。
【図８ａ】細菌細胞において発現されるＥＰＯｒＥＣをコードする核酸配列を示す図である（ヌクレオチド配列：長さ＝６８４ｂｐ）。ヌクレオチド配列およびタンパク質配列は、６×ヒスチジンタグを有する、大腸菌において発現される完全な配列を表す。太字は、Ｘｈｏ１および６×Ｈｉｓｔ残基を指す。＊は、終止コドンを指す。ＡＴＧ開始コドンは太字イタリック体で示す。
【図８ｂ】アミノ酸配列：（長さ＝２２８ａａ）を示す図である。
【図９】ａ）ＰＣＲは、適した制限部位（プライマーＲ１〜４内に含有される）が側面に位置する、興味のある遺伝子から成るＤＮＡを生成するために使用した。ｂ）ＰＣＲ産物は、リンカー領域の両側に、適したベクターの中にライゲーションした。ｃ）構築物は、その後、適切なリンカーを導入するために修飾した。リンカーは、いかなる不要な配列（つまり非天然制限部位）も含有していなかった。
【図１０】ａ）オリゴヌクレオチドは、特有のオーバーラップを有する部分的に二本鎖の領域を形成するように設計し、アニールし、処理した場合、リガンドおよび受容体にアニールするであろう隣接領域を有するリンカーをコードするであろう。ｂ）ＰＣＲは、ＬＲ融合遺伝子を産生するために「メガプライマー」ならびに末端プライマー（Ｒ１およびＲ２）を使用して行った。Ｒ１およびＲ２プライマーは、標的ベクターの中へのライゲーションに有用な隣接制限部位を導入するように設計した。
【図１１】ＥＰＯ融合タンパク質のウェスタンブロット分析を示す図である。ＥＰＯおよびＥＰＯキメラ構築物を発現するＣＨＯ  ｆｌｐＩｎ安定細胞株のウェスタンブロット分析。レーン１＝３Ｂ２；レーン２＝３Ｂ２；レーン３＝ＥＰＯ；レーン４＝３Ａ１；レーン５＝偽培地。Ａ＝非還元条件；Ｂ＝還元条件。
【図１２】ヒトＥＰＯと比較したＥＰＯ融合タンパク質３Ａ１の活性を示す図である。図１２Ａは、ＴＦ−１細胞増殖アッセイにおけるＥＰＯ国際基準に対する用量応答を示し、ＴＦ−１細胞増殖アッセイにおけるＡＦＴ−ＥＰＯ  ３Ａ１の用量応答を示す。
【図１３】ＴＦ−１細胞増殖アッセイにおけるＥＰＯ国際基準に対する用量応答を示すグラフである。
【図１４】ＴＦ−１細胞増殖アッセイにおけるＡＦＴ−ＥＰＯ融合タンパク質（３Ａ１）に対する用量応答を示すグラフである。
【図１５】非治療ネガティブコントロールおよびＥＰＯポジティブコントロールと比較した網赤血球％に対する３Ａ１の効果を示すグラフである。
【図１６】非治療ネガティブコントロールおよびＥＰＯポジティブコントロールと比較したヘモグロビン計数（ｇ／ｄｌ）に対する３Ａ１の効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の一態様によれば、エリスロポエチンの活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子であって、上述のポリペプチドは、エリスロポエチン受容体のエリスロポエチン結合ドメインに直接または間接的に連結されるエリスロポエチンまたはその部分を含む核酸分子が提供される。
本発明の一態様によれば、エリスロポエチン受容体のエリスロポエチン結合ドメインに直接または間接的に連結されるエリスロポエチンのアミノ酸配列またはその活性結合部分を含む融合ポリペプチドが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、エリスロポエチンは、ペプチドリンカー、好ましくは柔軟なペプチドリンカーによって、エリスロポエチン受容体の結合ドメインに連結される。
本発明の好ましい実施形態において、上述のペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの少なくとも１コピーを含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述のペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの２、３、４、５または６コピーを含む。
好ましくは、上述のペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの３コピーから成る。
本発明の代替の好ましい実施形態において、上述のペプチド連結分子は、ペプチドＧｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒの４コピーから成る。
本発明のさらなる代替の実施形態において、上述のポリペプチドは、ペプチド連結分子を含まず、エリスロポエチンおよびエリスロポエチン受容体のエリスロポエチン結合ドメインの直接的な融合物である。
本発明のさらなる態様によれば、
ｉ）配列番号１で表される核酸配列、
ｉｉ）配列番号３で表される核酸配列、
ｉｉｉ）配列番号５で表される核酸配列、
ｉｖ）配列番号７で表される核酸配列、または
ｖ）配列番号１、３、５または７とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、エリスロポエチン受容体調節活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子
から選択される核酸配列を含む核酸分子が提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述のポリペプチドは、アゴニストである。
本発明の代替の好ましい実施形態において、上述のポリペプチドは、アンタゴニストである。
核酸分子のハイブリダイゼーションは、２つの相補的な核酸分子が、互いに、かなりの量の水素結合を起こす場合に起こる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、核酸を取り囲む環境条件、ハイブリダイゼーション方法の性質、ならびに使用される核酸分子の組成および長さによって変動し得る。特定の程度のストリンジェンシーを達成するのに必要とされるハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２００１）およびＴｉｊｓｓｅｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  第Ｉ部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３）において説明される。Ｔｍは、核酸分子の所与の鎖の５０％が、その相補鎖にハイブリダイズする温度である。以下は、ハイブリダイゼーション条件の例示的なセットであり、限定的なものではない。
非常に高度なストリンジェンシー（少なくとも９０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：１６時間、６５℃で５×ＳＳＣ
２度洗浄：それぞれ１５分間、室温（ＲＴ）で２×ＳＳＣ
２度洗浄：それぞれ２０分間、６５℃で０．５×ＳＳＣ
高度なストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：１６〜２０時間、６５℃〜７０℃で５×〜６×ＳＳＣ
２度洗浄：それぞれ５〜２０分間、ＲＴで２×ＳＳＣ
２度洗浄：それぞれ３０分間、５５℃〜７０℃で１×ＳＳＣ
低度なストリンジェンシー（少なくとも５０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：１６〜２０時間、ＲＴ〜５５℃で６×ＳＳＣ
少なくとも２度洗浄：それぞれ２０〜３０分間、ＲＴ〜５５℃で２×〜３×ＳＳＣ。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号１で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号３で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号５で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述の核酸分子は、配列番号７で表される核酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の一態様によれば、本発明による核酸によってコードされるポリペプチドが提供される。
本発明のさらなる態様によれば、
ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号４で表されるアミノ酸配列、
ｉｉｉ）配列番号６で表されるアミノ酸配列、
ｉｖ）配列番号８で表されるアミノ酸配列、
ｖ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列、
ｖｉ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、エリスロポエチン受容体調節活性を有するポリペプチドが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述のポリペプチドは、アゴニストである。
本発明の代替の好ましい実施形態において、上述のポリペプチドは、アンタゴニストである。
本発明の好ましい実施形態において、上述のポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述のポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述のポリペプチドは、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述のポリペプチドは、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述のポリペプチドは、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の好ましい実施形態において、上述のポリペプチドは、配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むまたはそれから成る。
本発明の一態様によれば、２つのポリペプチドから成るホモ二量体であって、上述のポリペプチドはそれぞれ、
ｉ）エリスロポエチンまたはその受容体結合ドメインを含む第１の部分と、ペプチド連結分子によってそれと任意選択で連結される
ｉｉ）エリスロポエチン受容体のエリスロポエチン結合ドメインを含む第２の部分と
を含むホモ二量体が提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述のホモ二量体は、配列番号２を含むまたはそれから成る２つのポリペプチドを含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述のホモ二量体は、配列番号４を含むまたはそれから成る２つのポリペプチドを含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述のホモ二量体は、配列番号６を含むまたはそれから成る２つのポリペプチドを含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述のホモ二量体は、配列番号８を含むまたはそれから成る２つのポリペプチドを含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述のホモ二量体は、配列番号１７を含むまたはそれから成る２つのポリペプチドを含む。
本発明の好ましい実施形態において、上述のホモ二量体は、配列番号１８を含むまたはそれから成る２つのポリペプチドを含む。
本発明のさらなる態様によれば、本発明による核酸分子を含むベクターが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述のベクターは、本発明による核酸分子を発現するように適合された発現ベクターである。
本発明による（１つまたは複数の）核酸を含むベクターは、特に、ベクターが、安定した形質移入のための、ゲノムの中への組換えのために細胞の中に核酸を導入するために使用されることになっている場合、プロモーターまたは他の調節配列を含む必要はない。好ましくは、ベクターにおける核酸は、適切なプロモーターまたは宿主細胞における転写のための他の調節エレメントに作動可能に連結される。ベクターは、複数の宿主において機能する二機能性発現ベクターであってもよい。「プロモーター」によって、転写開始部位から上流の、転写に必要とされる調節領域をすべて含有するヌクレオチド配列が意味される。適したプロモーターは、真核細胞または原核細胞における発現のための構成的、組織特異的、誘発性、発生的、または他のプロモーターを含む。「作動可能に連結される」は、転写がプロモーターから開始されるように適切に位置し、配向する同じ核酸分子の一部としてつながれていることを意味する。プロモーターに作動可能に連結されるＤＮＡは、プロモーターの「転写開始調節下に」ある。
好ましい実施形態において、プロモーターは、構成的、誘発性、または調節可能プロモーターである。
本発明のさらなる態様によれば、本発明による核酸分子またはベクターを用いて形質移入または形質転換される細胞が提供される。
好ましくは、上述の細胞は、真核細胞である。その代わりに、上述の細胞は、原核細胞である。
本発明の好ましい実施形態において、上述の細胞は、真菌細胞（たとえばピキア種、サッカロミセス種、アカパンカビ種）、昆虫細胞（たとえばスポドプテラ種）、哺乳動物細胞（たとえばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞）、植物細胞から成る群から選択される。
本発明のさらなる態様によれば、賦形剤または担体を含む、本発明によるポリペプチドを含む医薬組成物が提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述の医薬組成物は、さらなる治療薬と組み合わせられる。
投与される場合、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる調製物で投与される。そのような調製物は、薬学的に許容できる濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性の担体、および任意選択で他の治療薬を規定どおりに含有していてもよい。
本発明の医薬組成物は、注射を含む、任意の通常の経路によって投与することができる。投与および適用は、たとえば経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、関節内、皮下、局所（目）、皮膚（たとえば皮膚または粘膜へのクリーム状の脂質可溶性挿入物）、経皮、鼻腔内であってもよい。
本発明の医薬組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、単独でまたはさらなる薬もしくは共力性の薬剤と共に所望の応答をもたらす医薬品／組成物の量である。これは、一時的に疾患の進行を単に遅らせることを伴ってもよいが、より好ましくは、それは、持続的に疾患の進行を食い止めることを伴う。これは、ルーチン的な方法によってモニターすることができるまたは診断方法に従ってモニターすることができる。
対象に投与される医薬組成物の用量は、異なるパラメーターに従って、特に、使用される投与のモードおよび対象の状態（つまり年齢、性別）に従って選ぶことができる。投与される場合、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる量および薬学的に許容できる組成物で適用される。医薬で使用される場合、塩は、薬学的に許容できるはずであるが、薬学的に許容できない塩は、その薬学的に許容できる塩を調製するために好都合に使用されてもよく、本発明の範囲から除外されない。そのような薬理学的におよび薬学的に許容できる塩は、以下の酸から調製されるものを含むが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、およびその他同種のもの。さらに、薬学的に許容できる塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、またはカルシウム塩などのようなアルカリ金属塩またはアルカリ土類塩として調製することができる。
医薬組成物は、所望される場合、薬学的に許容できる担体と組み合わせられてもよい。本明細書において使用されるような用語「薬学的に許容できる担体」は、ヒトへの投与に適した１つまたは複数の適合性の固体または液体の増量剤、希釈剤、またはカプセル化する物質を意味する。用語「担体」は、適用を容易にするために有効成分が組み合わせられる天然または合成の有機または無機成分を示す。医薬組成物の構成成分はまた、所望の医薬品効力を実質的に損なうであろう相互作用がない方法で本発明の分子とおよび互いに混合することもできる。
医薬組成物は、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、および塩中のリン酸を含む適した緩衝剤を含有していてもよい。
医薬組成物はまた、任意選択で、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、およびチメロサールなどのような適した防腐剤を含有していてもよい。
医薬組成物は、単位剤形で好都合に与えられてもよく、薬学の技術分野においてよく知られている方法のいずれかによって調製されてもよい。方法はすべて、活性作用物質を、１つまたは複数の補助成分を構成する担体と結合させるステップを含む。一般に、組成物は、活性化合物を、液体の担体、微粉化した固体の担体、またはその両方と均一におよび完全に結合させることならびにその後、必要であれば、産物を成形することによって調製される。
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤、ロゼンジなどのように、別々の単位として与えられてもよく、それぞれが、所定の量の活性化合物を含有する。他の組成物は、シロップ剤、エリキシル剤、または乳剤などのような、水性の液体または非水系の液体中の懸濁剤を含む。
非経口投与に適した組成物は、好ましくは、レシピエントの血液と等張である滅菌した水性または非水系の調製物を好都合に含む。この調製物は、適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、知られている方法に従って製剤されてもよい。滅菌注射調製物はまた、たとえば１，３−ブタンジオール中の液剤のように、無毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶剤中の滅菌注射液剤または懸濁剤であってもよい。用いられてもよい許容できる溶剤の中には、水、リンガー溶液、および等張食塩水がある。さらに、滅菌した不揮発性油は、溶剤または懸濁化剤として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含む任意の無刺激の不揮発性油が用いられてもよい。さらに、オレイン酸などのような脂肪酸は、注射剤の調製物において使用されてもよい。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に適した担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて見つけることができる。
本発明のさらなる態様によれば、エリスロポエチンアゴニストの投与が有効であろう状態に罹患しているヒト対象を治療するための方法であって、本発明による少なくとも１つのポリペプチドの有効量を投与するステップを含む方法が提供される。
本発明の好ましい方法において、上述のポリペプチドは、静脈内に投与される。
本発明の代替の好ましい方法において、上述のポリペプチドは、皮下に投与される。
本発明のさらなる好ましい方法において、上述のポリペプチドは、２日間隔で投与され、好ましくは、上述のポリペプチドは、１週、２週、または１か月間隔で投与される。
本発明の好ましい方法において、上述の状態は、貧血である。
本発明の好ましい方法において、上述の状態は、慢性腎疾患の結果としての貧血である。
本発明の好ましい方法において、上述の状態は、癌の治療における化学療法の結果としての貧血である。
本発明の好ましい方法において、上述の状態は、慢性関節リウマチの治療における化学療法の結果としての貧血である。
本発明の好ましい方法において、上述の状態は、ＡＩＤＳの治療における化学療法の結果としての貧血である。
本発明の一態様によれば、貧血の治療のための医薬の製造のための、本発明によるポリペプチドの使用が提供される。
本発明のさらなる好ましい実施形態において、上述のポリペプチドは、２日間隔で投与され、好ましくは、上述のポリペプチドは、１週、２週、または１か月間隔で投与される。
本発明の好ましい方法において、上述の状態は、慢性腎疾患の結果としての貧血である。
本発明の代替の好ましい実施形態において、上述の状態は、癌の治療における化学療法の結果としての貧血である。
本発明の代替の好ましい実施形態において、上述の状態は、慢性関節リウマチの治療における化学療法の結果としての貧血である。
本発明の代替の好ましい実施形態において、上述の状態は、ＡＩＤＳの治療における化学療法の結果としての貧血である。
本発明のさらなる態様によれば、本発明によるポリペプチドまたは二量体に結合するモノクローナル抗体が提供される。
好ましくは、上述のモノクローナル抗体は、ポリペプチドまたは二量体に結合するが、エリスロポエチンまたはエリスロポエチン受容体にそれぞれ特異的に結合しない抗体である。
モノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドを含む二量体のいずれかによって提示される立体構造抗原（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）に結合する。
本発明のさらなる態様において、本発明によるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製するための方法であって、
ｉ）本発明による少なくとも１つのポリペプチドを含む免疫原を用いて免疫応答性哺乳動物を免疫するステップ、ｉｉ）免疫された免疫応答性哺乳動物のリンパ球を骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成するステップ、
ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体を、（ｉ）のポリペプチドに対する結合活性についてスクリーニングするステップ、
ｉｖ）ハイブリドーマ細胞を培養して、上述のモノクローナル抗体を量産および／または分泌するステップ、ならびに
ｖ）培養上清からモノクローナル抗体を回収するステップを含む方法が提供される。
好ましくは、上述の免疫応答性哺乳動物は、マウスである。その代わりに、上述の免疫応答性哺乳動物は、ラットである。
ハイブリドーマ細胞を使用するモノクローナル抗体の産生は、当技術分野においてよく知られている。モノクローナル抗体を産生するために使用される方法は、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６、４９５〜４９７ページ（１９７５）におけるＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎならびにＤｏｎｉｌｌａｒｄおよびＨｏｆｆｍａｎ、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖ．ＩＩ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ編、１９８１における「Ｂａｓｉｃ  Ｆａｃｔｓ  ａｂｏｕｔ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」によって開示され、これらは、参照によって組み込まれる。
本発明のさらなる態様によれば、本発明による方法によって得られるまたは入手可能なハイブリドーマ細胞株が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、生体試料において、本発明によるポリペプチドを検出するための診断試験であって、
ｉ）試験対象となる単離試料を提供するステップ、
ｉｉ）上述の試料を、本発明によるポリペプチドに結合するリガンドと接触させるステップ、および
ｉｉｉ）上述の試料において上述のリガンドの結合を検出するステップを含む診断試験が提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上述のリガンドは、抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
本明細書の説明および請求項の全体にわたって、その用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」および用語の変化形、たとえば「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「〜を含むが、これらに限定されない」を意味し、他の部分、添加剤、構成成分、整数、またはステップを除外することを意図しない（および除外しない）。
本明細書の説明および請求項の全体にわたって、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、明細書は、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、複数および単数を企図するものとして理解されたい。
本発明の特定の態様、実施形態、または実施例に関連して記載される特色、整数、特徴、化合物、化学的部分、または化学基は、矛盾しない限り、本明細書において記載される他の態様、実施形態、または実施例に適用可能であることが理解されたい。
本発明の実施形態は、ここで、ほんの一例として、以下の図に関連して記載することとする。
材料および方法
インビトロ試験
ＥＰＯのインビトロバイオアッセイは、当技術分野においてよく知られている。これらは、ＥＰＯＲを発現する細胞の増殖および／または分化のＥＰＯ誘発性の刺激を測定する。いくつかのアッセイは、ＥＰＯ応答細胞の源としての骨髄を使用して赤血球系コロニー形成を測定する。他のバイオアッセイは、３Ｈ−チミジンを使用する増殖または懸濁培養物におけるヘモグロビンへの放射性の鉄の組み込みの測定による分化を測定する。ＥＰＯ応答腫瘍細胞株（ＴＦ１細胞）またはＥＰＯＲを用いて形質転換した細胞の使用は、ＥＰＯアゴニスト活性を試験するために使用された。
インビボ試験
エリスロポエチンのためのインビボバイオアッセイは、当技術分野においてよく知られており、動物モデル、たとえばラットにおける赤血球形成の外来性ＥＰＯによる刺激に基づき、赤血球前駆体プールは、低酸素、出血、または細胞毒性薬によって増えている。応答は、典型的には、脾臓または赤血球への放射性の鉄の組み込みによって測定される。
そのような１つの試験は、超低酸素症赤血球増加症マウス・アッセイ（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ  ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ  ｍｏｕｓｅ  ａｓｓａｙ）と呼ばれ、組換えＥＰＯの試験の産業基準である（Ｃｏｌｅｓら  Ｎａｔｕｒｅ１９１：１０６５ページ、１９６１を参照されたい）。
免疫試験
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体へのＥＰＯの結合を測定するイムノアッセイは、当技術分野において知られている。市販で入手可能なＥＰＯ抗体は、試料におけるＥＰＯを検出するためにおよびまた競合的阻害研究における使用のためにも入手可能である。たとえば、モノクローナル抗体は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂ−ｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ  ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃで購入することができる。
融合タンパク質の組換え産生
融合タンパク質の構成成分は、リガンドまたは受容体にアニールし、標的ベクターの中にクローニングするための適した制限部位を導入するように設計したプライマーを使用して、ＰＣＲによって生成した（図８ａ）。ＰＣＲのための鋳型は、標的遺伝子を含み、ＩＭＡＧＥクローン、ｃＤＮＡライブラリー、または特注合成遺伝子から得た。適切な隣接制限部位を有するリガンドおよび受容体の遺伝子を合成したら、これらは、その後、標的ベクターにおけるリンカー領域の両側にライゲーションした（図８ｂ）。構築物は、その後、リンカー領域の両側の２つの特有の制限部位の間への特注合成長のＤＮＡの挿入によって、ｓｓＤＮＡ修飾技術によるリンカー領域の変更によって、適した制限部位の間へのプライマーデュプレックス／マルチプレックスの挿入によって、またはＰＣＲ修飾によって、隣接制限部位を有していない適切なリンカーを含有するように修飾した（図８ｃ）。
その代わりに、最適なリガンドまたは受容体のドメインにアニールするように設計した隣接配列を有するリンカーを、オリゴヌクレオチドデュプレックスを作製することによって、最初に合成し、これを、二本鎖のＤＮＡを生成するように処理した（図９ａ）。その後、「メガプライマー」としてのリンカー配列、「メガプライマー」がアニールするリガンドおよび受容体の反対側の末端に対して設計したプライマーを使用し、鋳型としてのリガンドおよび受容体を用いてＰＣＲを行った。末端プライマーは、最適な発現ベクターへのライゲーションに適した制限部位を用いて設計した（図９ｂ）。
融合タンパク質の発現および精製
発現は、適した系（たとえば哺乳動物ＣＨＯ細胞および大腸菌）において実行し、これは、ＥＰＯ融合遺伝子を生成したベクターに依存した。発現は、その後、１つまたは複数の、当技術分野においてよく知られているＳＤＳ−ＰＡＧＥ、未変性ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡを含むことができる多種多様の方法を使用して分析した。
安定形質移入ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞株を約３〜４日間、７５ｃｍ２フラスコにおいて成長させ、この時点で試料を分析のために採取した。試料を、２５ｍＭ  ＤＴＴの存在下および非存在下において等容量のｌａｅｍｍｌｉローディングバッファーと混合し、５分間、沸騰させた。試料を、１５％（ｗ／ｖ）ビスアクリルアミドゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＢＳ−０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０中の５％（ｗ／ｖ）牛乳タンパク質中でブロックした後に、試料検出は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合二次抗体と共に特異的抗ＥＰＯ抗体を使用して実行した。視覚化は、ＨＲＰ検出キットを使用する、写真用フィルム上での化学発光によるものとした。図１１を参照されたい。
適したレベルの発現が達成されたら、ＲＬ融合物は、精製および後の分析のための十分なタンパク質を産生するためにより大規模で発現させた。精製は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、サイズ排除、および／またはアフィニティークロマトグラフィーなどのような１つまたは複数のクロマトグラフィー手順の適した組合せを使用して実行した（ニッケル／コバルト樹脂、抗体固定化樹脂、および／またはリガンド／受容体固定化樹脂を使用）。精製タンパク質は、１つまたは複数のブラッドフォードアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、未変性ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡを含むことができる、多種多様の方法を使用して分析した。
ＬＲ融合物の特徴づけ
変性ＰＡＧＥ、未変性ＰＡＧＥゲル、およびウェスタンブロッティングは、融合ポリペプチドを分析するために使用し、ウェスタンブロッティングは、ＬＲ融合物に対して非立体構造感受性の抗体を用いて行った。未変性溶液状態の分子量情報は、ＳｕｐｅｒｏｓｅＧ２００分析カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーおよび分析超遠心法などのような技術から得ることができる。
統計
２つのグループは、それらの分散が正常に分布した場合、スチューデント検定を用いてまたは正常に分布しなかった場合、スチューデント−サタースウェイト検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔｅ’ｓ  ｔｅｓｔ）によって比較した。分布は、Ｆ検定を用いて試験した。一元配置ＡＮＯＶＡは、３つ以上のグループの平均値を比較するために使用し、有意水準がｐ＜０．０５であった場合、個々の比較はダネット検定を用いて行った。統計的検定はすべて、５％の有意水準で両側とし、欠測値に対するインピュテーションは行わなかった。
インビトロバイオアッセイ
細胞調製物
３Ａ１の生物活性は、インビトロＴＦ−１細胞増殖モデルにおいて決定した。ＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ、バッチ番号５００３３１０）を、液体窒素貯蔵庫から取り出し、２分間、３７℃ウォーターバスの中に置いた。その後、バイアルの内容物を、９ｍｌの培養培地を含有する１５ｍｌチューブに移した。（ＲＰＭＩ中、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ）。細胞を１２３ｘｇで５分間、遠心分離し、細胞ペレットを培養培地中に再懸濁し、細胞密度を４×１０４細胞／ｍｌに調節した。
細胞培養
細胞を、２×１０４〜５×１０４細胞／ｍｌの密度で、培養培地中で、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）において培養した。細胞密度が７×１０５細胞／ｍｌを超過しないことを確実にしながら、継代接種を１週間に２度行った。細胞生存率をトリパンブルー排除法によって評価した。アッセイに先立って、細胞を、約１２５ｘｇで５分間、回転させることによってＰＢＳを用いて３回洗浄した。その後、ペレットをアッセイ培地において元に戻し（ＲＰＭＩ中、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン）、細胞密度を２×１０５細胞／ｍｌに調節した。
標準／試料調製物
ＥＰＯ（国際基準、ＮＩＢＳＣ、バッチ番号８８／５７４）を、アッセイ培地において元に戻し、１μｇ／ｍｌ（１２０ＩＵ／ｍｌ）の濃度にし、１００μｌ一定分量に分け、−８０℃で保存した。毎日のアッセイで、１本のバイアルを冷凍庫から取り出し、使用濃度を調製した。
ＴＦ−１バイオアッセイ
５０μｌの試験するそれぞれのタンパク質を９６ウェルマイクロプレート中の適切なウェルに加えた。その後、５０μｌの細胞懸濁液を追加し、プレートを静かに振盪し、細胞および標準物／試料を混合した。コントロールウェルは、アッセイ培地および細胞懸濁液（５０μｌ＋５０μｌ）のみを含有し、ブランクウェルは、アッセイ培地（１００μｌ）のみを含有していた。細胞は、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）において７２時間、異なる濃度の試験タンパク質にさらし、その後、１０μｌのＭＴＴをそれぞれのウェルに追加した。インキュベーション（５％ＣＯ２、３７℃）の４時間後に、可溶化バッファーを追加し（１００μｌ／ウェル）、プレートは、ＣＯ２インキュベーターに一晩置いた。その後、吸光度を５７０ｎｍおよび６５０ｎｍ（参照）で読んだ。
結果の計算
生データはすべて、以下のように変えて、Ｇｅｎ５ソフトウェアを使用して分析した。
１．参照（６５０ｎｍ）からの結果を５７０ｎｍで得た結果から引いた。
２．その後、コントロールからの結果を、異なる濃度の試験タンパク質にさらした細胞について得た結果から引いた。
３．ステップ２から得た結果を、ＯＤ／ＯＤｍａｘの比率（％）としてプロットした。
それぞれの用量応答曲線（対数、４パラメーター）に基づいて、それぞれのタンパク質に対するＥＣ５０（最大の応答のうちの５０％を引き起こす濃度）の値を計算した。
インビボバイオアッセイ
ＥＰＯ−ＬＲ融合物タンパク質（３Ａ１）は、下記に詳述されるように、正球性（ｎｏｒｍｏｃｙｔｈａｅｍｉｃ）マウスモデルにおいて試験した。正球性マウスモデルは、マウスにおける網赤血球産生の刺激の測定に基づく。さらに、モデルは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはそのＥＰＯ模倣タンパク質の生物学的活性を検出するために使用することができる。動物タイプ：３２  Ｂ６Ｄ２Ｆ１／ＯｌａＨｓｄマウス、メス、研究の開始時６〜９週齢。４匹のマウスをそれぞれの治療に使用した。動物は、Ｈａｒｌａｎ  Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ  ＧｍｂＨから調達した、コントロールされた完全な壁で維持された飼育系（ＳＰＦ）に由来した。アッセイ手順の初めに、マウスは、ケージ当たり４匹のマウスに無作為に分けた。これらの動物は、尾を彩色することによって同定のためにマークした（ケージ当たり１つの標識）。動物に、０．５ｍＬの適切な治療薬（ケージ当たり１つの溶液）を皮下注射し、新しいケージに入れた。治療マウスを収容するそれぞれのケージが、それぞれの異なる治療からの１匹のマウスを含有するようにマウスを組み合わせた。注射の４日後に、血液を尾静脈から収集し、網赤血球の数をフローサイトメトリーによって決定した。
（実施例１）
ＥＰＯ遺伝子は、ＩＭＡＧＥクローンとして得て、発現ベクターｐＥＴ２１ａ＋（大腸菌発現用）およびｐＳｅｃＴａｇ（哺乳動物発現用）の中にサブクローニングした。ＰＣＲは、ベクターへの挿入に適した制限部位が側面に位置するＥＰＯ遺伝子を含有するＤＮＡを産生するために使用した。
細菌発現については、使用したプライマーは、ヒスチジンタグつきタンパク質についてＮｄｅＥＰＯＦ（５’−ａａｔｔａａｔｔｃａｔａｔｇｇｃｃｃｃａｃｃａｃｇｃｃｔｃａｔｃｔｇ−３’）およびＥＰＯＸｈｏＲ（５’−ａａｔｔｃｔｃｇａｇｔｃｔｇｔｃｃｃｃｔｇｔｃｃｔｇｃａｇ−３’）ならびにタグなしタンパク質についてＮｄｅＥＰＯＦおよびＥＰＯ＊ＸｈｏＲ（５’−ａａｔｔｃｔｃｇａｇｃｔａｔｃｔｇｔｃｃｃｃｔｇｔｃｃｔｇｃａｇ−３’）とした。その後、ＰＣＲ産物は、ｐＥＴ２１ａ＋においてＮｄｅＩおよびＸｈｏＩの部位の間にライゲーションした。結果として生じるクローンは、配列決定によって確認した。
大腸菌からのＥＰＯの発現は、ｐＥＴ２１ａ＋ＥＰＯ＋／−Ｈｉｓプラスミドを用いて形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＰＬ細胞において実行した。発現は、ＩＰＴＧを用いて誘発し、ＥＰＯに対する抗体を使用して、ウェスタンブロットによって確認した（図２Ｘ）。
哺乳動物発現については、使用したプライマーは、ＮｈｅＥＰＯＦ（５’−ａａａｔｔｔｇｃｔａｇｃｃａｃｃａｔｇｇｇｇｇｔｇｃａｃｇａａｔｇｔｃｃｔｇ−３’）およびＥＰＯ＊Ｈ３Ｒ（５’−ａａｔｔａａｇｃｔｔｃｔａｔｃｔｇｔｃｃｃｃｔｇｔｃｃｔｇｃａｇ−３’）とした。その後、ＰＣＲ産物は、ｐＳｅｃＴａｇにおいてＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの部位の間にライゲーションした。
（実施例２）
ＥＰＯＲ遺伝子は、特注で遺伝子合成し／胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーから得、発現ベクターｐＥＴ２１ａ＋（大腸菌発現用）およびｐＳｅｃＴａｇ（哺乳動物発現用）の中にサブクローニングした。ＰＣＲは、ベクターへの挿入に適した制限部位が側面に位置するＥＰＯ遺伝子を含有するＤＮＡを産生するために使用した。
細菌発現については、使用したプライマーは、ヒスチジンタグつきタンパク質についてＮｄｅＥＰＯＲＦｏｒ（５’−ｇｃｇｃａｔａＣＡＴＡＴＧｇｃｇｃｃｃｃｃｇｃｃｔａａｃｃｔｃｃｃ−３’）およびＥＰＯＲＸｈｏＲｅｖ２（５’−ｇｃｇｃＣＴＣＧＡＧＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＣＡＧＧＣＴ−３’）ならびにタグなしタンパク質についてＮｄｅＥＰＯＦおよびＥＰＯＲ＊ＸｈｏＲｅｖ２（５’−ｇｃｇｃＣＴＣＧＡＧｔｃａＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＣＡＧＧＣＴ−３’）とした。その後、ＰＣＲ産物は、ｐＥＴ２１ａ＋においてＮｄｅＩおよびＸｈｏＩの部位の間にライゲーションした。結果として生じるクローンは、配列決定によって確認した。
哺乳動物発現については、使用したプライマーは、ＮｈｅＥＰＯＲＦｏｒ（５’−ｇｃｇｃＧＣＴＡＧＣｃａｃｃａｔｇｇａｃｃａｃｃｔｃｇｇｇｇｃｇｔｃ−３’）およびＥＰＯＲＨｉｎｄＲｅｖ２（５’−ｇｃｇｃＡＡＧＣＴＴｔｃａＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＣＡＧＧＣＴ−３’）とした。その後、ＰＣＲ産物は、ｐＳｅｃＴａｇにおいてＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの部位の間にライゲーションした。
（実施例３）
一方の末端でＥＰＯおよび他方でＥＰＯＲに相補的な隣接配列を有する（Ｇ４Ｓ）３リンカーは、オリゴヌクレオチドのマルチプレックスを形成するために、３つのオリゴヌクレオチド；ＥＰＯｌｉｎｋ３Ｆ（５’−ａｇｇｔａｇｔｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｔａｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇ−３’）、ＥＰＯｌｉｎｋ３Ｒ１（５’−ｇｇｇａｇｇｔｔａｇｇｃｇｇｇｇｇｃｇｃａｇａａｃｃｔｃｃｇｃｃａｃｃｇｃｔａｃｃ−３’）、およびＥＰＯｌｉｎｋ３Ｒ２（５’−ｔｃｃｇｃｃａｃｃａｃｔａｃｃｔｃｃｇｃｃａｃｃｔｃｔｇｔｃｃｃｃｔｇｔｃｃｔｇｃａｇ−３’）を相互にアニールすることによって合成した。その後、このマルチプレックスは、ＰＣＲにおいてプライマーとして使用することができる二本鎖ＤＮＡを作製するために処理した。
その後、ＰＣＲは、プライマーＢａｍＮｈｅＥＰＯＦｏｒ（５’−ａａａｔｔｔｇｇａｔｃｃｇｃｔａｇｃｃａｃｃａｔｇｇｇｇｇｔｇｃａｃｇａａｔｇｔｃｃｔｇ−３’）、ＥＰＯＲＨｉｎｄＲｅｖ２（５’−ｇｃｇｃＡＡＧＣＴＴｔｃａＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＣＡＧＧＣＴ−３’）、および鋳型としてのＥＰＯおよびＥＰＯＲとの、先に産生したリンカー「メガプライマー」を使用して行った。これにより、哺乳動物発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ（ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）ならびにファージベクターＭ１３ｍｐ１８（ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）へのライゲーションに適した制限部位が側面に位置するＥＰＯ−（Ｇ４Ｓ）３−ＥＰＯｒＥＣ遺伝子を産生した。
細菌発現については、ＥＰＯ−（Ｇ４Ｓ）３−ＥＰＯｒＥＣ遺伝子は、プライマーＮｄｅＥＰＯＦ（５’−ａａｔｔａａｔｔｃａｔａｔｇｇｃｃｃｃａｃｃａｃｇｃｃｔｃａｔｃｔｇ−３’）およびＥＰＯＲ＊ＸｈｏＲｅｖ２（５’−ｇｃｇｃＣＴＣＧＡＧｔｃａＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＣＡＧＧＣＴ−３’）を使用して、ＰＣＲによってＮｄｅＩおよび＊ＸｈｏＩ隣接領域を用いて生成した。その後、これを、ｐＥＴ２１ａ＋の中にライゲーションした。
（実施例４）
図１１は、ＥＰＯ受容体融合タンパク質の２つの例；３Ａ１および３Ｂ２の発現および検出を示す。３Ａ１および３Ｂ２の両方は７５および１００ｋＤａの間まで流れる。ＥＰＯは、グリコシル化タンパク質について予想されるように３７および４５ｋＤａの間まで流れる。
３Ａ１の生物学的活性を、ヒトＥＰＯと比較してアッセイし、図１２、１３、および１４に示す。
（実施例５）
３Ａ１について検査した用量範囲は、動物体重１ｋｇ当たり２．５〜１５０ｕｇ（標準ＥＰＯと等価な質量）であった。図１５および１６は、投薬の４日後の、網赤血球およびヘモグロビンに対する３Ａ１のインビボ活性を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ）】
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【図１０Ｂ）】
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【図１１ａ）】
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【図１１ｂ）】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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