(57)【要約】  ウイルス関連癌を治療及びイメージングする方法及び組成物が提供されるが、当該方法は、被験者においてウイルス関連癌細胞が発現するウイルス抗原に結合する放射性標識結合分子を、被験者に投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス関連癌を有する被験者を治療する方法であって、該被験者に放射性標識結合分子を投与することを含み、該結合分子が、該被験者においてウイルス関連癌細胞が発現するウイルス抗原に結合する、方法。
【請求項２】
前記ウイルス抗原が前記ウイルス関連癌細胞の細胞表面にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルス抗原が前記ウイルス関連癌細胞の細胞内に位置する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記癌が固形腫瘍、半固形腫瘍、又は液性腫瘍である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記癌が子宮頸癌、肝細胞癌、リンパ腫、バーキットリンパ腫、上咽頭癌、ホジキン病、皮膚癌、原発性滲出液リンパ腫、多中心性キャッスルマン病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、脾リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病、有毛細胞白血病、カポジ肉腫、移植後リンパ腫、脳腫瘍、多中心性キャッスルマン病、骨肉腫、中皮腫、子宮頸部異形成、肛門癌、外陰癌、膣癌、陰茎癌、口腔咽頭癌、上咽頭癌、口腔癌、肝臓癌、又は皮膚癌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記癌が子宮頸癌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスがエンベロープウイルスである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルス抗原がＤＮＡウイルスの産物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルス抗原が、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、パピローマウイルス科、ポリオーマウイルス科、又はポックスウイルス科のウイルスの産物である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルス抗原がＲＮＡウイルスの産物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルス抗原がフラビウイルス科、パラミクソウイルス科、レトロウイルス科、又はラブドウイルス科のウイルスの産物である、請求項１〜７及び１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルス抗原が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）、パピローマウイルス１８（ＨＰＶ１８）、パピローマウイルス３１（ＨＰＶ３１）、パピローマウイルス３３（ＨＰＶ３３）、パピローマウイルス３５（ＨＰＶ３５）、パピローマウイルス３９（ＨＰＶ３９）、パピローマウイルス４５（ＨＰＶ４５）、パピローマウイルス５１（ＨＰＶ５１）、パピローマウイルス６６（ＨＰＶ６６）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ＪＣポリオーマウイルス（ＪＣＶ）、ＢＫポリオーマウイルス（ＢＫＶ）、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、マウス乳房白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒトアデノウイルスＡ〜Ｆ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス２（ＨＴＬＶ−２）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、カポジ肉腫ウイルス（ＫＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、トリ赤芽球症ウイルス、トリ骨髄芽球症ウイルス、トリ癌腫ウイルス、又はウォールアイ皮膚肉腫ウイルス（ＷＤＳＶ）の産物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルス抗原がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の産物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌が子宮頸癌であり、且つ前記ウイルス抗原がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の産物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合分子がパラトープ含有分子である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記パラトープ含有分子が無傷抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記パラトープ含有分子がＦａｂ抗体断片である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合分子が一本鎖ポリペプチドである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
放射線放出同位体が１１−Ｃ、１８−Ｆ、３２−Ｐ、３４ｍ−Ｃｌ、３８−Ｋ、４７−Ｓｃ、５１−Ｍｎ、５２−Ｍｎ、５２ｍ−Ｍｎ、５２−Ｆｅ、５５−Ｃｏ、６１−Ｃｕ、６２−Ｃｕ、６４−Ｃｕ、６７−Ｃｕ、６２−Ｇａ、６７−Ｇａ、６８−Ｇａ、７２−Ａｓ、７７−Ａｓ、７５−Ｂｒ、７６−Ｂｒ、８２ｍ−Ｒｂ、８３−Ｓｒ、８７−Ｓｒ、８６−Ｙ、８９−Ｓｒ、９０−Ｙ、８９−Ｚｒ、９４ｍ−Ｔｃ、９９ｍ−Ｔｃ、１０５−Ｒｈ、１０９−Ｐｄ、１１１−Ａｇ、１１０−Ｉｎ、１１１−Ｉｎ、１１８−Ｓｂ、１２０−Ｉ、１２２−Ｉ、１２３−Ｉ、１２４−Ｉ、１２５−Ｉ、１３１−Ｉ、１７７−Ｌｕ、１５３−Ｓｍ、１５９−Ｇｄ、１６６−Ｈｏ、１６６−Ｄｙ、１４０−Ｌａ、１９４−Ｉｒ、１９８−Ａｕ、１９９−Ａｕ、１８６−Ｒｅ、１８８−Ｒｅ、２１１−Ａｓ、２１２−Ｂｉ、２１３−Ｂｉ、２１２−Ｐｂ、２２２−Ｒａ、２２３−Ｒａ、２２４−Ｒａ、２２５−Ｒａ、２２５−Ａｃ、及び２５５−Ｆｍから成る群から選択される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験者がヒトである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
被験者においてウイルス関連腫瘍細胞をイメージングする方法であって、該被験者に放射性標識結合分子を投与することを含み、該結合分子が、該被験者においてウイルス関連腫瘍細胞が発現するウイルス抗原に結合する、方法。
【請求項２３】
前記ウイルス抗原が前記ウイルス関連腫瘍細胞の細胞表面にあり、及び／又は前記ウイルス抗原が前記ウイルス関連腫瘍細胞の細胞内に位置する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍細胞が固形腫瘍中に存在する、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験者が子宮頸癌、肝細胞癌、リンパ腫、バーキットリンパ腫、上咽頭癌、ホジキン病、皮膚癌、原発性滲出液リンパ腫、多中心性キャッスルマン病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、脾リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病、有毛細胞白血病、カポジ肉腫、移植後リンパ腫、脳腫瘍、多中心性キャッスルマン病、骨肉腫、中皮腫、子宮頸部異形成、肛門癌、外陰癌、膣癌、陰茎癌、口腔咽頭癌、上咽頭癌、口腔癌、肝臓癌、及び皮膚癌から成る群から選択される癌を有する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウイルスがエンベロープウイルスである、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルス抗原がＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスの産物である、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ウイルス抗原が、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、パピローマウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、レトロウイルス科、又はラブドウイルス科のウイルスの産物である、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ウイルス抗原が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）、ヒトパピローマウイルス１８（ＨＰＶ１８）、ヒトパピローマウイルス３１（ＨＰＶ３１）、パピローマウイルス３３（ＨＰＶ３３）、パピローマウイルス３５（ＨＰＶ３５）、パピローマウイルス３９（ＨＰＶ３９）、パピローマウイルス４５（ＨＰＶ４５）、パピローマウイルス５１（ＨＰＶ５１）、パピローマウイルス６６（ＨＰＶ６６）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ＪＣポリオーマウイルス（ＪＣＶ）、ＢＫポリオーマウイルス（ＢＫＶ）、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、マウス乳房白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒトアデノウイルスＡ〜Ｆ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス２（ＨＴＬＶ−２）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、カポジ肉腫ウイルス（ＫＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、トリ赤芽球症ウイルス、トリ骨髄芽球症ウイルス、トリ癌腫ウイルス、又はウォールアイ皮膚肉腫ウイルス（ＷＤＳＶ）の産物である、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記結合分子がパラトープ含有分子である、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記パラトープ含有分子が無傷抗体又はＦａｂ抗体断片である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記結合分子がモノクローナル抗体である、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記結合分子が一本鎖ポリペプチドである、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記被験者がヒトである、請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
投薬形態に製剤された医薬組成物であって、放射性標識結合分子及び薬学的に許容可能な担体を含み、該結合分子が、ウイルス関連癌細胞が発現するウイルス抗原に特異的であり、且つ投薬量が被験者において前記ウイルス抗原を発現する癌細胞を破壊するのに適切であるか、又は投薬量が被験者においてウイルス関連癌細胞をイメージングするのに適切である、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス抗原を発現する腫瘍細胞を、放射性同位体を担持する抗体等の抗ウイルス抗原結合分子により治療及びイメージングする放射免疫学的方法に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００６年１２月１９日付で出願された米国仮特許出願第６０／８７６，０５２号明細書（その内容は参照されて本明細書の一部とする）の利益を主張するものである。
【０００３】
［政府の支援に関する陳述］
本明細書中に開示される発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号ＡＩ６０５０７、ＡＩ３３７７４、ＡＩ３３１４２、ＡＩ５２７３３、ＨＬ５９８４２、Ｕ５４  ＡＩ１５７１５８、ＣＡ０７８５２７、及びＡＩ５１５１９の下、米国政府の支援により行われた。したがって、米国政府は本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
放射免疫療法（ＲＩＴ）は、３０年ほど前に癌の治療のために開発された。肝癌に対する米国で最初のＲＩＴの臨床試験は、１９８０年代半ばにOrder et al.により実施された（非特許文献１）。ＲＩＴは、致死量の細胞毒性放射線を放射する放射性核種を腫瘍細胞に送達するために抗原−抗体相互作用の特異性を利用し、化学療法及び外照射療法（ＥＢＲＴ）の有益な代替手段を提供する（非特許文献２、非特許文献３）。
【０００５】
ＲＩＴは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）療法に基づく薬物、例えば再発性又は難治性のＢ細胞性非ホジキンリンパ腫の治療のためのＺｅｖａｌｉｎ（登録商標）及びＢｅｘｘａｒ（登録商標）（それぞれ９０−Ｙ及び１３１−Ｉで標識した抗ＣＤ２０  ｍＡｂである）が最近承認されたことから明らかなように、或る特定の癌に対する成功した療法にまで発展してきた。濾胞性リンパ腫に対する初期治療としてのＲＩＴの使用に関する最近の報告は有望であり、したがって或る種の癌においてＲＩＴが一次療法となる可能性がある（非特許文献４）。また、ＲＩＴは近年、真菌性疾患及び細菌性疾患を治療することが実証されている（非特許文献５に掲載）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Order et al. (1985) J. Clin. Oncol. 3:1573-82
【非特許文献２】Sharkey et al. (2005) J. Nucl. Med. 46 Suppl 1:115S-127S
【非特許文献３】Milenic et al. (2004) Nat. Rev. Drug Discov. 3:488-99
【非特許文献４】Kaminski et al. (2005) N. Engl. J. Med. 352:441-9
【非特許文献５】Dadachova and Casadevall (2006) Q. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 50:193-204
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
腫瘍をイメージング及び治療する改善された方法が必要とされている。例えば、米国では２００４年には、口腔（oral cavity）癌及び咽頭癌の新たな症例がおよそ２８０００件、子宮頸癌の新たな症例が１０５００件、並びにカポジ肉腫の新たな症例が８０００件あった。口腔（Oral）癌及び子宮頸癌はヒトパピローマウイルスと関連し、カポジ肉腫はヘルペスウイルス８によって引き起こされる。
【０００８】
化学療法及び外科手術を含む従来の方法は近年、免疫療法により補完されている。既存の癌の放射免疫療法は、患者身体において「自己」抗原である腫瘍関連抗原を利用するが、これは正常器官において抗体の有意な取り込みを生じさせ、毒性をもたらし得る。免疫療法の一課題は、腫瘍特異的であり、正常組織の損傷を制限しながら効果を発揮することができる抗原の同定である。Ｂ細胞表面抗原であるＣＤ２０を対象とするモノクローナル抗体（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）は、Ｂ細胞リンパ腫に対する療法としてますます使用されてきている。しかしながら、ＣＤ２０は、全ての正常成熟Ｂ細胞上で発現されるため特異的な腫瘍標的ではない。
【０００９】
腫瘍を含む或る特定の動物癌細胞は、ウイルス抗原をその内部及び表面の両方で提示するか、又はかかるウイルス抗原を提示させることができる。結果として、ウイルス抗原は、腫瘍細胞に対して結合分子を特異的に標的化する有益な方法を示す。本明細書中に記載される発明は、この特異的標的化の使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ウイルス関連癌を有する被験者を治療する方法であって、被験者に放射性標識結合分子を投与することを含み、当該結合分子が、被験者においてウイルス関連癌細胞内及び／又は細胞上のウイルス抗原に結合する、方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、被験者においてウイルス関連腫瘍細胞をイメージング及び／又は治療する方法であって、被験者に放射性標識結合分子を投与することを含み、当該結合分子が、被験者においてウイルス関連腫瘍細胞内及び／又は細胞上のウイルス抗原に結合する、方法を提供する。
【００１２】
「伝統的な」放射免疫療法とは対照的に、ウイルスで形質転換した癌細胞は、宿主組織とは抗原的に非常に異なるため、癌細胞との非常に特異的な抗原−結合分子の相互作用がもたらされる。したがって、本発明では放射性標識結合分子の宿主組織との交差反応を限定することで、正常器官への毒性が従来のＲＩＴ又は化学療法よりも少なくなることが期待されている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】188Ｒｅ標識ＨＰＶ１６  Ｅ６特異ｍＡｂ  Ｃ１Ｐ５及びアイソタイプが一致する（isotype-matching）対照ｍＡｂ  １８Ｂ７（ＩｇＧｌ）の、全ＨＰＶ１６発現ヒト子宮頸癌ＣａｓＫｉ細胞への結合性を示す図である。菱形−ｍＡｂ  Ｃ１Ｐ５；三角形−ｍＡｂ  １８Ｂ７。
【図２】図２Ａ−２Ｂ  Ａ）188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂ；Ｂ）188Ｒｅ−１８Ｂ７  ｍＡｂ、の注射２４時間後のＣａｓＫｉ担癌マウスのシンチグラフィーによる画像である。
【図３】図３Ａ−３Ｆ  ウエスタンブロット法による、ヒト子宮頸癌細胞株におけるＥ６及びＥ７の発現、及び肝細胞癌細胞株におけるＨＢｘの発現、並びにＭＧ１３２プロテアソーム阻害剤処理のこれらの細胞株におけるＥ６、Ｅ７およびＨＢｘのレベルへの効果を示す図である；Ａ）ＭＧ１３２で３時間処理したＣａｓＫｉ細胞の抽出タンパク質に由来するＥ６；Ｂ）ＭＧ１３２で３時間処理したＣａｓＫｉ細胞の抽出タンパク質に由来するＥ７；Ｃ）ＭＧ１３２で６時間処理したＣａｓＫｉ細胞の抽出タンパク質に由来するＥ６；Ｄ）ＭＧ１３２で３時間処理したＳｉＨａ細胞の抽出タンパク質に由来するＥ７；Ｅ）ＭＧ１３２で３時間処理したＨｅＬａ  Ｓ３細胞の抽出タンパク質に由来するＥ７；Ｆ）ＭＧ１３２で３時間処理したＨｅｐ  ３Ｂ２．１−７細胞の抽出タンパク質に由来するＨＢｘ
【図４】図４Ａ−４Ｆ  腫瘍細胞及び腫瘍におけるウイルス抗原の検出を示す図である。：Ａ、Ｂ）固定腫瘍細胞及び透過性腫瘍細胞の免疫蛍光。左パネルは、細胞の光学顕微鏡検査の画像を示す。強い損傷を受けた細胞は矢印で示している。右パネルは、ウイルスタンパク質特異ｍＡｂ、続いてマウスＩｇＧに対するＦＴＩＣ標識ポリクローナル抗体で処理した同じスライドガラスの免疫蛍光法による画像を示す。Ａ−ＣａｓＫｉ細胞およびＥ６特異Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂ、Ｂ−Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７細胞及びＨＢｘ特異４Ｈ９  ｍＡｂ；Ｃ）ＣａｓＫｉ腫瘍の免疫組織化学。左パネルはＥ６特異ｍＡｂ  Ｃ１Ｐ５の結合を示す。右パネルは対照ｍＡｂ  １８Ｂ７の結合の欠如を示す。；ＨＢｘ特異ｍＡｂ  ４Ｈ９を用いたＨｅｐ３Ｂ２．１−７腫瘍のウエスタンブロット法。
【図５】図５Ａ−５Ｄ  注射後２４時間の担癌マウスのシンチグラフィーによる画像を示す図である。；Ａ）ＣａｓＫｉ腫瘍、Ｅ６−特異ｍＡｂ  188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂ；Ｂ）ＣａｓＫｉ腫瘍、対照188Ｒｅ−１８Ｂ７  ｍＡｂ；Ｃ）Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７及びＡ２０５８ヒト転移性黒色腫腫瘍、ＨＢｘ特異188Ｒｅ−４Ｈ９  ｍＡｂ。
【図６】図６Ａ−６Ｃ  ヌードマウスにおけるＣａｓＫｉ腫瘍の放射免疫療法。：Ａ）腫瘍容積の変化。；Ｂ）３５０μＣｉ188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂで処理したマウス；Ｃ）対照マウス（どちらも処理後２０日のマウスを示す。）
【図７】図７Ａ−７Ｃ  ヌードマウスにおけるＨｅｐ  ３Ｂ２．１−７腫瘍の放射免疫療法。：Ａ）腫瘍容積の変化。：Ｂ）対照未処理マウス；Ｃ）６００μＣｉ188Ｒｅ−４Ｈ９  ｍＡｂで処理したマウス。どちらも処理後１８日のマウスを示す。ＢおよびＣにおける下のパネルは実験の完了時のＨ＆Ｅ染色腫瘍を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ウイルス関連癌を有する被験者を治療する方法であって、被験者に放射性標識結合分子を投与することを含み、当該結合分子が、被験者においてウイルス関連癌細胞が発現するウイルス抗原に結合する、方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、被験者においてウイルス関連腫瘍細胞をイメージング又は治療する方法であって、被験者に放射性標識結合分子を投与することを含み、当該結合分子が、被験者においてウイルス関連腫瘍細胞が発現するウイルス抗原に結合する、方法を提供する。
【００１６】
癌細胞は、その内部（細胞内）及び／又は細胞表面にウイルス抗原を提示することができる。多くの癌細胞はその内部及び／又は表面にウイルス抗原を有しているか、又はその内部及び／又は表面にウイルス抗原を有するようにすることができる。結果として、ウイルス抗原に結合する結合分子は、ウイルス抗原を担持する細胞に（又は細胞内に）選択的に結合することになる。この結合により治療及び／又はイメージングのための、放射線放出同位体を担持する結合分子による癌細胞の特異的標的化が可能となる。したがって、ウイルス抗原は好ましくは、被験者の他の細胞に実質的に存在しない。しかしながら、当業者はウイルス抗原が癌細胞を有する被験者において前癌細胞にも存在する可能性があり、大抵はそうであることを理解するであろう。かかる前癌細胞の治療により、ウイルス感染細胞をそれが癌細胞へと形質転換する前に排除することができる。
【００１７】
ウイルス抗原は、腫瘍細胞表面又は細胞内に幾つかの経路によって存在するようになる。当業者は幾つかのヒト新生物、癌腫、及び異形成、並びにさらに多くの動物癌がウイルス感染によって引き起こされることを理解するであろう。例えば、ヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、カポジ肉腫ウイルス（ＫＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、マウス乳癌ウイルス、トリ赤芽球症ウイルス、トリ骨髄芽球症ウイルス、トリ癌腫ウイルス、ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス（ＷＤＳＶ）、及び他の発癌ウイルスの感染は、或る特定のヒト又は他の哺乳類の癌に直接寄与するか、又はその原因となると考えられる。このような場合、ウイルスにコードされた糖タンパク質及び外膜タンパク質を含むウイルスにコードされた遺伝子の発現は、感染の当然の結果である。好ましい実施形態では、ウイルス抗原はウイルスにコードされた膜タンパク質である。ウイルス抗原は好ましくは、ウイルスの構造タンパク質又はウイルスの非構造タンパク質である。ウイルス抗原は代替的には、発癌ウイルスの産物であるのが好ましい。
【００１８】
ウイルス抗原はまた、非発癌性の、任意に遺伝子組み換えしたウイルスの産物であり得る。したがって、ウイルス抗原は好ましくは、天然ウイルス遺伝子又は非天然ウイルス遺伝子の産物である。選択的にヒト癌細胞内で複製する非発癌ウイルスとしては、外膜を有する（−鎖）ＲＮＡウイルスである、ラブドウイルス科（rhabdoviridae）の水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）及びパラミクソウイルス科（paramyxoviridae）のニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）が挙げられる。ＮＤＶは通常は鳥類に感染するが、ＶＳＶは本来、家畜及び昆虫に感染する（Krishnamurthy et al. (2006) J. Virol. 80:5145-5155、Zarate and Novella (2004) J. Virol. 78:12236-12242）。現在、腫瘍崩壊剤として研究中であるが、これらのウイルスのヒト腫瘍細胞において選択的に複製する能力は、ウイルスを標的化遺伝子導入に適するようにするものでもある（Fernandez et al. (2002) J. Virol. 76(2):895-904）。
【００１９】
幾つかの好ましい実施形態では、ウイルス抗原は、例えば未修飾の、欠損の、又は改変したＶＳＶ、ＮＤＶ、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、偽型ウイルス、及び遺伝子を腫瘍細胞に導入するための当該技術分野で既知の他のウイルスを用いた、これらの又は他のウイルスベクターに基づく標的化遺伝子療法により、腫瘍細胞に関連付けられる（例えば、Spencer, et al.に対する米国特許第７，０９０，８３７号明細書及びその中に引用される参考文献を参照）。したがって、ある好ましい実施形態では、ウイルス抗原は、かかるウイルスベクターの天然遺伝子の産物である。或る特定の他の好ましい実施形態では、ウイルス抗原はウイルスベクターに挿入された遺伝子に由来し、ウイルスベクターに担持された天然又は非天然の遺伝子に由来し得る。
【００２０】
細胞のウイルス受容体に付着したウイルス抗原含有ウイルスは、細胞表面にも存在する。したがって、或る特定の好ましい実施形態では、ウイルス抗原はウイルス受容体により細胞表面に結合する。同様に、ウイルス抗原含有ウイルス様粒子、ビリオン断片、ビリオンサブユニット、又はウイルスタンパク質もウイルス受容体又は他の細胞表面結合部位との相互作用の結果、細胞表面に結合する。このような戦略は、放射線放出同位体を担持する結合分子を腫瘍細胞へと誘導するために、腫瘍細胞を非感染性ウイルス断片及び／又は精製ウイルス断片で特異的に標識化することを望む場合に有用であり得る。当業者は、ウイルス抗原を含有する非感染性製剤を調製し、被験者に投与する方法を熟知しているため、ウイルス抗原は代替的には、細胞の表面に結合するウイルス様粒子、ビリオン断片、ビリオンサブユニット、又はウイルスタンパク質の一部である。
【００２１】
また、二重特異性(bi-specific)抗体はウイルス抗原含有ウイルス、ウイルス様粒子、又はウイルス断片と、腫瘍細胞上のエピトープとの両方に結合し、ウイルスが腫瘍細胞に結合していない場合にウイルスを腫瘍細胞に結合させることができる。このような戦略は、腫瘍細胞が同族ウイルス受容体を欠いている場合に特に有用である。好ましくは、ウイルス抗原は、腫瘍細胞表面タンパク質又は表面オリゴ糖と自己相互作用する分子との相互作用の結果、腫瘍細胞の表面に存在する。
【００２２】
癌細胞は好ましくは、固形腫瘍、半固形腫瘍、又は液性腫瘍中に存在する。癌細胞は好ましくは腫瘍細胞である。癌は、例えば子宮頸癌、肝細胞癌、リンパ腫、バーキットリンパ腫、上咽頭癌（nasopharangeal carcinoma）、ホジキン病、皮膚癌、原発性滲出液リンパ腫、多中心性キャッスルマン病（multicentric Castleman's disease）、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、脾リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病、有毛細胞白血病、カポジ肉腫、移植後リンパ腫、脳腫瘍、多中心性キャッスルマン病（multicentric Castleman disease）、骨肉腫、中皮腫、子宮頸部異形成、肛門癌、子宮頸癌、外陰癌、膣癌、陰茎癌、口腔咽頭癌（oropharyneal cancer）、上咽頭癌（nasopharyneal cancer）、口腔癌、肝臓癌、又は皮膚癌であり得る。
【００２３】
ウイルス抗原は、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）、ヒトパピローマウイルス１８（ＨＰＶ１８）、ヒトパピローマウイルス３１（ＨＰＶ３１）、パピローマウイルス３３（ＨＰＶ３３）、パピローマウイルス３５（ＨＰＶ３５）、パピローマウイルス３９（ＨＰＶ３９）、パピローマウイルス４５（ＨＰＶ４５）、パピローマウイルス５１（ＨＰＶ５１）、パピローマウイルス６６（ＨＰＶ６６）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ＪＣポリオーマウイルス（ＪＣＶ）、ＢＫポリオーマウイルス（ＢＫＶ）、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、マウス乳房白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒトアデノウイルスＡ〜Ｆ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス２（ＨＴＬＶ−２）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、カポジ肉腫ウイルス（ＫＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、ヒト免疫不全（immunodeficieny）ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、トリ赤芽球症ウイルス、トリ骨髄芽球症ウイルス、トリ癌腫ウイルス、又はウォールアイ皮膚肉腫ウイルス（ＷＤＳＶ）の産物であり得る。
【００２４】
好ましい実施形態では、癌は子宮頸癌であり、且つウイルス抗原はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の産物である。
【００２５】
或る特定の他の好ましい実施形態では、ウイルスはエンベロープウイルスである。或る特定の好ましい実施形態では、ウイルス抗原はＤＮＡウイルスの産物であり、且つＤＮＡウイルスは好ましくは、ヘパドナウイルス科（hepadnaviridae）、ヘルペスウイルス科（herpesviridae）、パピローマウイルス科（papillomaviridae）、ポリオーマウイルス科（polyomaviridae）、又はポックスウイルス科（poxviridae）のウイルスである。ウイルス抗原は好ましくは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）、ＨＰＶ１６等のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（Vilchez and Butel (2004) Clin. Microb. Rev. 17:495-508、Butel (2000) Carcinogenesis 21:405-426）、ＪＣポリオーマウイルス（ＪＣＶ）、ＢＫポリオーマウイルス（ＢＫＶ）、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、マウス乳房白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒトアデノウイルスＡ〜Ｆ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、カポジ肉腫ウイルス（ＫＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス、及びマウス乳癌ウイルスから成る群から選択されるウイルスの産物である。
【００２６】
或る特定の他の実施形態では、ウイルス抗原はＲＮＡウイルスの産物であり、且つＲＮＡウイルスは好ましくは、ラブドウイルス科（rhabdoviridae）、フラビウイルス科（flaviviridae）、パラミクソウイルス科（paramyxoviridae）、又はレトロウイルス科（retroviridae）の成員である。ウイルス抗原は好ましくは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ＨＴＬＶ−１、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、カポジ肉腫ウイルス（ＫＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、マウス乳癌ウイルス、ＶＳＶ、及びＮＤＶから成る群から選択されるウイルスの産物である。
【００２７】
好ましい実施形態では、結合分子はパラトープ含有分子、好ましくは無傷抗体(intact antibody)、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はＦａｂ抗体断片である。或る特定の実施形態では、結合分子は一本鎖ポリペプチドである。或る特定の他の実施形態では、結合分子は、他の状況下でウイルス抗原と相互作用する非免疫グロブリン分子に由来する、パラトープの機能的等価物を含む。パラトープの機能的等価物は好ましくは、ウイルスのライフサイクル、最も好ましくはビリオンの集合及び形態形成においてウイルス抗原と相互作用する他のウイルス成分である。
【００２８】
異なる実施形態では、被験者は好ましくは、哺乳類、例えばマウス、ラット、ネコ、イヌ、ウマ、ヒツジ、雌ウシ、去勢ウシ、雄ウシ、家畜、霊長類、サル、好ましくはヒトであり、他の動物、例えばトリ又はシチメンチョウ等の鳥類、又はサケ又はコイ等の魚類でもあり得る。
【００２９】
好ましい実施形態では、結合分子により担持される放射線放出同位体は、１１−Ｃ、１８−Ｆ、３２−Ｐ、３４ｍ−Ｃｌ、３８−Ｋ、４７−Ｓｃ、５１−Ｍｎ、５２−Ｍｎ、５２ｍ−Ｍｎ、５２−Ｆｅ、５５−Ｃｏ、６１−Ｃｕ、６２−Ｃｕ、６４−Ｃｕ、６７−Ｃｕ、６２−Ｇａ、６７−Ｇａ、６８−Ｇａ、７２−Ａｓ、７７−Ａｓ、７５−Ｂｒ、７６−Ｂｒ、８２ｍ−Ｒｂ、８３−Ｓｒ、８７−Ｓｒ、８６−Ｙ、８９−Ｓｒ、９０−Ｙ、８９−Ｚｒ、９４ｍ−Ｔｃ、９９ｍ−Ｔｃ、１０５−Ｒｈ、１０９−Ｐｄ、１１１−Ａｇ、１１０−Ｉｎ、１１１−Ｉｎ、１１８−Ｓｂ、１２０−Ｉ、１２２−Ｉ、１２３−Ｉ、１２４−Ｉ、１２５−Ｉ、１３１−Ｉ、１７７−Ｌｕ、１５３−Ｓｍ、１５９−Ｇｄ、１６６−Ｈｏ、１６６−Ｄｙ、１４０−Ｌａ、１９４−Ｉｒ、１９８−Ａｕ、１９９−Ａｕ、１８６−Ｒｅ、１８８−Ｒｅ、２１１−Ａｓ、２１２−Ｂｉ、２１３−Ｂｉ、２１２−Ｐｂ、２２２−Ｒａ、２２３−Ｒａ、２２４−Ｒａ、２２５−Ｒａ、２２５−Ａｃ、及び２５５−Ｆｍから成る群から選択される。
【００３０】
結合分子を標識する特定の放射性同位体の選択は、治療される癌の大きさ及びその体内での局在性により決定することができる。放射性同位体の選択には、２つの特性、すなわち組織における放出範囲及び半減期が重要である。
【００３１】
β放射体と比較して短い放出範囲を有するα放射体は、体内で散在する小さい腫瘍の治療に好適であり得る。α放射体の例（括弧内は半減期）としては、２１３−Ｂｉ（半減期４６分）、２２３−ラジウム（半減期１１．３日）、２２４−ラジウム（半減期３．７日）、２２５−ラジウム（半減期１４．８日）、２２５−アクチニウム（半減期１０日）、２１２−鉛（半減期１０．６時間）、２１２−ビスマス（半減期６０分）、２１１−アスタチン（半減期７．２時間）、及び２５５−フェルミウム（半減期２０時間）が挙げられる。
【００３２】
好ましい実施形態では、α放出放射性同位体は２１３−ビスマスである。２１３−Ｂｉは、高い線エネルギー付与（ＬＥＴ）を持つα粒子をＥ＝５．９ＭｅＶで、５０μｍ〜８０μｍの組織内経路長で放出する。理論上は、細胞は１つ又は２つのα粒子が当たると破壊され得る。２１３−Ｂｉは、単一細胞性障害及び幾つかの固形癌に使用するために提案され（McDevitt et al. (2000) Cancer Res. 60:6095-6100、Kennel and Mirzadeh (1998) Nucl. Med. Biol. 25:241-246、Behr et al. (1999) Cancer Res. 59:2635-2643、Adams et al. (2000) Cancer Biother. Radiopharm. 15:402a）、第一相臨床試験で白血病患者を治療するために使用されてきた（Kolbert et al. (2001) J. Nucl. Med. 42:27-32、Sgouros et al. (1999) J. Nucl. Med. 40:1935-1946）。２１３−Ｂｉは、発生源（generator）形態で現在入手可能な唯一のα放射体であり、この同位体は供給源から米国及び外国の臨床施設へと輸送することが可能である。
【００３３】
β放射体は、そのより長い放出範囲のために、大きい腫瘍における癌細胞の治療に好適であり得る。β放射体の例としては、１８８−レニウム（半減期１６．７時間）、９０−イットリウム（半減期２．７日）、３２−リン（半減期１４．３日）、４７−スカンジウム（半減期３．４日）、６７−銅（半減期６２時間）、６４−銅（半減期１３時間）、７７−ヒ素（半減期３８．８時間）、８９−ストロンチウム（半減期５１日）、１０５−ロジウム（半減期３５時間）、１０９−パラジウム（半減期１３時間）、１１１−銀（半減期７．５日）、１３１−ヨウ素（半減期８日）、１７７−ルテチウム（半減期６．７日）、１５３−サマリウム（半減期４６．７時間）、１５９−カドリニウム（半減期１８．６時間）、１８６−レニウム（半減期３．７日）、１６６−ホルミウム（半減期２６．８時間）、１６６−ジスプロシウム（半減期８１．６時間）、１４０−ランタン（Lantanum）（半減期４０．３時間）、１９４−イリジウム（半減期１９時間）、１９８−金（半減期２．７日）、及び１９９−金（半減期３．１日）が挙げられる。好ましい実施形態では、β放出放射性同位体は１８８−レニウムである。１８８−Ｒｅは癌放射免疫療法、骨格の骨の苦痛緩和、及び血管形成術後の再狭窄を予防する血管内放射線療法を含む様々な治験において、魅力的な治療用放射性核種として近年現れた長範囲高エネルギーβ放射体（Ｅmax＝２．１２ＭｅＶ）である（Knapp (1988) Cancer Biother. Radiopharm. 13:337-349、Hoher et al. (2000) Circulation 101:2355-2360、Palmedo (2000) Eur. J. Nucl. Med. 27:123-130）。
【００３４】
１８８−Ｒｅは、イメージング研究に使用することができるγ線を放出するという付加的な利点を有する。大きい腫瘍又は体の深部の接近困難な部位にある癌細胞の治療に対しては、９０−イットリウム（半減期２．７日）、１７７−ルテチウム（半減期６．７日）、又は１３１−ヨウ素（半減期８日）等の長寿命同位体が好適であり得る。
【００３５】
複数の同位体で同じ方法で処理した同じ結合分子を使用することの利点は、本発明で実現される別の利点であり得る。１８８−Ｒｅの化学的類似体である９９ｍ−Ｔｃはイメージング用の光子放射体であり、１８８−Ｒｅと同じ結合分子で使用することができ、同じキレート剤を用いて同じ技法により付着されるという利点を有する。本発明の好ましい実施形態では、放射線放出同位体は９９ｍ−Ｔｃ、１８８−Ｒｅ、又はその両方である。
【００３６】
また、陽電子放射体、例えば５２ｍ−Ｍｎ（２１．１分）、６２−Ｃｕ（９．７４分）、６８−Ｇａ（６８．１分）、１１−Ｃ（２０分）、８２−Ｒｂ（１．２７分）、１１０−Ｉｎ（１．１５時間）、１１８−Ｓｂ（３．５分）、１２２−Ｉ（３．６３分）、１８−Ｆ（１．８３時間）、３４ｍ−Ｃｌ（３２．２分）、３８−Ｋ（７．６４分）、５１−Ｍｎ（４６．２分）、５２−Ｍｎ（５．５９日）、５２−Ｆe（８．２８時間）、５５−Ｃｏ（１７．５時間）、６１−Ｃｕ（３．４１時間）、６４−Ｃｕ（１２．７時間）、７２−Ａｓ（１．０８日）、７５−Ｂｒ（１．６２時間）、７６−Ｂｒ（１６．２時間）、８２ｍ−Ｒｂ（６．４７時間）、８３−Ｓｒ（１．３５日）、８６−Ｙ（１４．７時間）、８９−Ｚｒ（３．２７日）、９４ｍ−Ｔｃ（５２．０分）、１２０−Ｉ（１．３５時間）、１２４−Ｉ（４．１８日）を使用することができる。６４−Ｃｕは陽電子放射体、電子放射体、及びオージェ電子放射体の混合である。
【００３７】
α放射体以外の放射免疫療法に使用される放射性同位体、例えばβ放射体、陽電子放射体、又はβ放射体と陽電子放射体との混合物はいずれも、放射免疫イメージングにも低用量で使用することができる。放射免疫イメージングへの使用に好ましい放射性同位体としては、９９ｍ−テクネチウム、１１１−インジウム、６７−ガリウム、１２３−ヨウ素、１２４−ヨウ素、１３１−ヨウ素、及び１８−フッ素が挙げられる。２１３−Ｂｉの化学的類似体である１１１−インジウムは、イメージングに使用される光子放射体であり、同じ技法を用いて結合分子に連結させることができる。イメージングに関しては、患者への不必要な投与を避けるために、通常診断に使用される同位体（例えば９９ｍ−Ｔｃ）については約１ｍＣｉ〜約３０ｍＣｉ、通常治療に使用される同位体（例えば２１３−Ｂｉ）については約１ｍＣｉ〜約５ｍＣｉの、イメージングに有効な量の放射線放出同位体を使用することができる。
【００３８】
本発明はさらに、被験者において癌細胞を治療する方法であって、被験者に癌を治療するのに有効な量の、複数の異なる放射性同位体を担持する結合分子を投与する工程を含む、方法を提供する。ある実施形態では、放射性同位体は、複数の異なる元素の同位体である。好ましい実施形態では、複数の異なる放射性同位体のうち少なくとも１つの放射性同位体は、長距離放射体であり、少なくとも１つの放射性同位体は短距離放射体である。長距離放射体の例としては、γ放射体、ｘ線放射体、β放射体、及び陽電子放射体が挙げられる。短距離放射体の例としては、α放射体が挙げられる。陽電子放射体はまた、陽電子のエネルギーに応じて中距離放射体であり得る。好ましい実施形態では、長距離放射体はβ放射体であり、且つ短距離放射体はα放射体である。好ましくは、β放射体は１８８−レニウムである。好ましくは、α放射体は２１３−Ｂｉである。２分〜１００日の物理的半減期を有する、α放射体、β放射体、及び陽電子放射体のいずれかの混合物を含む異なる放射線放出同位体の組み合わせを使用することができる。好ましくは、複数の異なる放射性同位体は、単一の放射性同位体の放射線用量が複数の異なる放射性同位体の合わせた放射線用量と同じである場合、複数の異なる放射性同位体のうちの単一の放射性同位体よりも腫瘍細胞の治療に有効である。
【００３９】
腫瘍の放射免疫療法研究から、最大の標的化を達成するために全抗体は循環して通常１日〜３日の期間を要することが知られている。遅い標的化は、比較的長い半減期を有する放射性同位体、例えば１８８−Ｒｅ（ｔ1/2＝１６．７時間）には問題を引き起こさないが、短寿命放射性同位体、例えば２１３−Ｂｉ（ｔ1/2＝４６分）にはより速い送達ビヒクルが必要である。Ｆ（ａｂ’）2及びＦａｂ’断片を含む小さい結合分子は、短寿命放射性核種の半減期に匹敵するさらに速い標的化をもたらす（Milenic (2000) Semin. Radiat. Oncol. 10:139-155、Buchsbaum (2000) Semin. Radiat. Oncol. 10:156-167）。短寿命結合分子及び放射線放出同位体の使用により、被験者を抗原となる可能性のある結合分子及び放射性毒となる可能性のある同位体に曝す期間を低減することで、方法の安全性をさらに増大することができる。
【００４０】
放射線放出同位体の治療に有効な量（用量）は、腫瘍の局在性及び大きさ、放射線放出同位体を担持する結合分子を（局所又は全身に）投与する方法、及び同位体の崩壊図式に応じて変化し得る。重要な器官に放射毒性を与えることなく癌を治療することができる用量を算出するために、核医学では一般的であるように、診断用放射性同位体又は低活性治療用放射性同位体で放射性標識された結合分子による患者の診断走査を、療法の前に実施することができる。線量測定計算は、診断走査のデータを用いて実施することができる（Early and Sodee (1995) Principles and Practice of Nuclear Medicine, 2nd ed. Mosby）。ウイルス関連癌を有する被験者の治療については、癌を治療するのに有効な量で放射標識（radiolabled）結合分子を投与するのが好ましい。異なる実施形態では、ＲＩＴ用の放射性同位体の放射線放出同位体の治療に有効な量は、約１ｍＣｉ〜約１０００ｍＣｉである。
【００４１】
腫瘍細胞等の癌細胞のＲＩＴは、結合分子がリシン又はジフテリア毒素等の毒素分子を担持する類似の免疫毒素アプローチに優る幾つかの利点を有する。ＲＩＴでは、放射線照射に使用される結合分子は、毒素がそうであるように、細胞を破壊するために内在化する必要はない。同様に、ＲＩＴでは、体内の全てのウイルス感染細胞が結合分子により標的化される必要はない。iｎ  ｖｉｖｏでは、小さな三次元の空間内に多くの腫瘍細胞が存在し得るため、「十字火」放射線が有効である。一方で、毒素はそれが入った細胞しか破壊しない。この機構と一致して、188Ｒｅ標識ｍＡｂはｉｎ  ｖｉｔｒｏよりもｉｎ  ｖｉｖｏで有効であることが観察された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、「十字火」放射線の大部分は、組織培養ウェルの底部で細胞層に代表される二次元表面に堆積する。
【００４２】
この点で、「十字火」により細胞を選択的に破壊するβ放出放射性核種（Milenic et al. (2004) Nature Rev. Drug Discovery 3:488-498）は、単一細胞の疾患である白血病の療法のために（Burke et al. (2002) Cancer Control 9:106-113）、全身性真菌感染症の前臨床ＲＩＴにおいて（Dadachova et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10942-10947、Dadachova et al. (2004) Antimicrob. Agents. Chemother. 48:1004-1006、Dadachova et al. (2006) J. Infect. Dis. 193:427-1436）首尾よく使用されている。
【００４３】
毒素分子に対して、放射性同位体自体は、その後の使用を限定し得る有意な免疫応答を引き出す可能性は低い。ＲＩＴはまた、188Ｒｅ及び213Ｂｉを含む抗体に連結する異なる放射性同位体の化学的性質が十分に明らかにされており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの放射性標識抗体の特別な安定性が確認されているため、毒性を有する可能性は低い。
【００４４】
当業者に既知のように、半減期及び放射線タイプが異なる多くの同位体が利用可能であることにより、特異的な標的及び結合分子に応じたＲＩＴの設計に多大な多用性が与えられる（Milenic et al. (2004) Nature Rev. Drug Discovery 3:488-498、Milenic et al. (2004) Cancer. Biother. Radiopharm. 19:135-147、Dadachova et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:14865-14870）。それにもかかわらず、ＲＩＴ及び別のモダリティ、例えば化学療法、免疫毒素、又は放射線ビーム療法を含む併用療法は、ＲＩＴモダリティ単独よりもさらなる利点をもたらし得る。
【００４５】
癌の臨床ＲＩＴにおいて累積されたデータに基づくと、ＲＩＴの一次毒性は骨髄抑制であり得る。骨髄抑制の程度及び持続時間の重要な決定因子としては、骨髄予備能（一次細胞毒性療法及び疾患の関与の程度に基づく）、総感染負荷、及び脾臓の大きさ（Knox and Meredith (2000) Semin. Radiat. Oncol. 10:73-93、Hernandez and Knox (2003) Semin. Oncol. 30(6 Suppl l7):6-100）が挙げられる。
【００４６】
また、患者に放射性療法を用いる場合は常に、放射線誘発突然変異によりその後に起こり得る新生物の発生等の長期的影響の懸念がある。しかしながら、この危険性は短期間曝露の後では極めて低く、腫瘍の治療の利益が危険性を上回るはずである。
【００４７】
また、ＲＩＴに利用される微粒子放射線が、ゲノム情報が治療される腫瘍細胞内にある任意のウイルスの突然変異を引き起こす可能性は極めて低い。ウイルス複製は既に本質的に高い突然変異率を有し、ＲＮＡウイルスについては、突然変異率は、継続的な実行可能性（continued viability）と適合する最大の率に近づいている（Drake (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4171-4175）。したがって、突然変異率の増大は、特にＲＮＡウイルスのウイルス適応性を低減し得る。ウイルスゲノムはまた、腫瘍細胞核と比較して物理的に小さく、放出される放射線により直接損害を受けにくい。さらに、電離放射線は環境中に豊富な化学的変異原と比べて弱い変異原である（Hall (2000) Radiobiology for the Radiologist, 5th ed, Lippincott Williams & Wilkins）。
【００４８】
臨床データは、放射性標識抗体及びペプチドの分割(fractionaized)用量が、腫瘍に対して単一用量よりも有効であり、正常器官への放射性毒性が低いことを示している（Dadachova et al. (2004) Antimicrob. Agents Chemother. 48:1004-1006、Lehrman (2005) Lancet 366:549-555）。患者の状態及びＲＩＴによる一次治療の有効性に応じて、治療は一つの用量又はその後の幾つかの分割用量から成り得る。
【００４９】
放射性標識結合分子は、局所投与及び全身投与を含む、医学診療又は獣医学診療において使用される多様な手段で被験者に導入することができる。好ましくは、放射性標識結合分子は非経口的に投与される。放射性標識結合分子は、例えば血流に、筋肉内に、又は器官若しくは体腔内に注射することができる。
【００５０】
本発明はまた、癌の被験者を治療するのに有効な組成物を製造する方法であって、放射性標識結合分子と担体とを混合することを含み、ウイルス感染癌細胞上及び／又は細胞内において結合分子がウイルス抗原に特異的に結合する、方法を提供する。かかる組成物は、被験者の癌をイメージングするのにも使用することができる。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「担体」は標準的な医薬担体、例えば無菌等張食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、水、及び油中水乳剤又は水中油乳剤等の乳剤のいずれかを包含する。
【００５２】
本発明はさらに、癌の被験者を治療又はイメージングするための組成物の調製のための放射性標識結合分子の使用であって、結合分子がウイルス感染癌細胞上及び／又は細胞内のウイルス抗原に特異的であり、且つ放射性標識結合分子がウイルス抗原に特異的に結合する、使用を提供する。
【００５３】
本発明はまた、ウイルス感染癌細胞をイメージング及び／又は治療するために放射性標識結合分子を使用する方法であって：
（ａ）ウイルス感染癌細胞が発現するウイルス抗原に対する結合分子を生成すること、
（ｂ）結合分子に放射標識を付着させること、及び
（ｃ）被験者に、ウイルス感染癌細胞をイメージング及び／又は治療するのに有効な量の放射性標識結合分子を投与することを含む、方法を提供する。
【００５４】
本発明はまた、投薬形態に製剤された医薬組成物であって、放射性標識結合分子及び薬学的に許容可能な担体を含み、当該結合分子が、ウイルス感染癌細胞が発現するウイルス抗原に特異的であり、且つ投薬量が被験者においてウイルス抗原を発現する癌細胞を破壊するのに適切であるか、又は投薬量が被験者においてウイルス感染癌細胞をイメージングするのに適切である、医薬組成物を提供する。
【００５５】
定義
「ウイルス関連癌」とは、ウイルス感染が癌における補因子である癌を指す。ヒトの癌に関係するウイルスとしては、リンパ腫及び鼻咽頭癌に関連するエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、共に肝臓癌に関連するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、頸癌に関連するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、それぞれ成人Ｔ細胞白血病及び有毛細胞白血病に関連するヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）及びヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス２型（ＨＴＬＶ−２）、並びにカポジ肉腫に関連するヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８）が挙げられる。
【００５６】
「腫瘍細胞」とは、動物において任意の形態で（すなわち、固形腫瘍、良性腫瘍、上皮内癌腫、分散癌腫、転移性腫瘍細胞、前癌病変、疣贅、又は異形成の形態で）異常な細胞増殖、異形成、新生物、及び癌腫を示す細胞を指す。本発明の文脈内では、腫瘍細胞は誤制御複製又は発生を有する他の細胞を含み、具体的には疣贅及び前癌病変を含む細胞を含む。
【００５７】
「抗原」は、エピトープを含む分子又は分子の一部である。エピトープは結合分子の結合部位であり、立体構造エピトープ及び直線状エピトープとして当該技術分野で既知のものを含む。「ウイルス抗原」はウイルスによりコードされる抗原である。
【００５８】
抗原はそれが細胞外環境、又は細胞外空間と位相的に等価な細胞内空間の環境（小胞体、ゴルジ体、及びエンドサイトーシス小胞の内腔等）に曝される場合、細胞表面に存在する。抗原はまた、本発明に関して、それが細胞の外にある場合、及び他の分子により細胞表面に結合する場合、細胞表面に存在する。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、癌の被験者を「治療する」という用語は、被験者において癌が転移するのを防ぐため、被験者において癌のさらなる転移を低減するため、被験者において腫瘍の増殖を低減するため、腫瘍の増殖を予防するため、腫瘍の大きさを低減するため、及び／又は被験者において腫瘍若しくは癌を排除するために、ウイルス抗原を発現する被験者の癌細胞を破壊することを意味する。腫瘍を「治療する」という用語は、腫瘍を根絶すること、腫瘍の大きさを低減すること、腫瘍をその大きさが増大しないように安定化すること、又は腫瘍のさらなる増殖を低減することを意味する。
【００６０】
「結合分子」は、抗原に特異的に結合可能な分子である。本発明による結合分子は、結合分子の抗原結合部位であるパラトープ、又はその機能的等価物を含む。例示的且つ好適な結合分子としては、抗体及びＴ細胞受容体が挙げられる。被験者に適用して使用される場合、用語「抗体」は全抗体及び全抗体の断片を包含する。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）2及びＦａｂ’断片、又は概して、Ｆａｂ断片が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆ（ａｂ’）2は、欠失結晶化可能断片（Ｆｃ）領域及び保存結合領域を有する抗体分子の抗原結合断片である。Ｆａｂ’は結合領域の１／２のみを有するＦ（ａｂ’）2分子の１／２である。さらに、用語「結合分子」は、任意の種からのポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、並びに非天然抗体及び改変した抗体、例えば「ヒト化」マウス抗体、一本鎖抗体、及びHansen, et alに対する米国特許第７，０７４，４０５号明細書に教示されるような二重特異性抗体を包含することを意味する。
【００６１】
「Ｍａｂ」又は「ｍＡｂ」とは、この定義によると一種類の抗体、ほとんどの場合はモノクローナル抗体を意味するが、標準ハイブリドーマ技法では作成されない抗体を含み得る。ポリクローナル抗体とは、一種類より多い抗体を含む混合物を意味する。好ましい結合分子は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、並びにＦａｂ断片及び改変した抗体、例えば一本鎖抗体、及びヒト化マウス抗体を含む。好ましくは、結合分子は特異的にウイルス抗原に結合する。二重特異性抗体を同様に使用することができる。しかしながら、一実施形態では、結合分子は二重特異性抗体ではない。しかし、結合分子は、免疫グロブリンであるか、又は免疫グロブリンに由来する必要はない。当業者は、免疫グロブリンのパラトープの機能的等価物が存在することを理解するであろう。かかる等価物は、例えば、抗原と結合することができる他のウイルス分子に由来する、腫瘍細胞の表面のウイルス抗原と結合可能な分子又は分子の一領域である。
【００６２】
結合分子として使用される抗体は、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、又はＩｇＭ抗体のいずれかであり得る。ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２抗体であり得る。ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体であり得る。これらの抗体のどの組み合わせも同様に使用することができる。使用される抗体のタイプを選択する上で考慮すべき一事項は、抗体の所望の血中半減期である。ＩｇＧは２３日、ＩｇＡは６日、ＩｇＭは５日、ＩｇＤは３日、及びＩｇＥは２日の血中半減期を有する（Abbas et al. Cellular and Molecular Immunology, 4th edition, W. B. Saunders Co., Philadelphia, 2000）。考慮すべき別の事項は抗体の大きさである。例えば、ＩｇＧの大きさがＩｇＭの大きさよりも小さいと、より多くのＩｇＧが腫瘍に侵入することとなる。ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが好ましい抗体である。
【００６３】
本方法に有用な多くの結合分子が記載されてきた。好ましい抗体としては、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８  Ｅ６に対する抗体ｍＡｂ  Ｃ１Ｐ５（Abcam, Cambridge, MA, USA）、ＨＴＬＶ−１  ｇｐ４６に対するｍＡｂ  ＰＲＨ−７Ａ、ｍＡｂ  ＰＲＨ−３、ｍＡｂ  ＰＲＨ−４、ＥＢＶエンベロープｇｐ３５０に対するｍＡｂ  ７２Ａｌ、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８）潜伏性核抗原１（ＬＮＡ−１）に対するｍＡｂ  １３Ｂ１０、及びＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対するＭＡｂ  Ｄ４．１２．９が挙げられる。他の好ましい抗体は、Advanced Biotechnologies Inc.（Columbia、MD）からのＥＢＶ  Ｅａ−Ｒタンパク質ｐ１７に特異的な、ＨＨＶ−８  Ｋ８．１遺伝子産物（Ｋ８．１Ａ外膜タンパク質及びＫ８．１Ｂ外膜タンパク質）に特異的なマウスＩｇＧ1、及びＯＲＦ  Ｋ８．１Ａ（外膜）に特異的なマウスＩｇＧ2aである。またさらに好ましい結合分子は、下記の実施例において提供される。
【００６４】
本明細書中で有用な結合分子は、いわゆる「中和」抗体又はその結合部分である必要がなく、好ましくはそうではないことが理解されよう。したがって、結合分子自体は、ウイルス抗原を提示する癌細胞を破壊するか、又はその破壊に関与するものではないことが好ましい。この抗原への特異結合だけで、ここで意図される目的に十分である。
【００６５】
結合分子は、例えば、「直接」放射標識法又は二官能性キレート剤を介した放射標識法の２つの技法の１つを用いて、放射線放出同位体により放射性標識することができる。以前記載されたように（Dadachova et al.、米国特許出願公開第２００４／０１１５２０３号明細書及び同第２００６／００３９８５８号明細書）、２２５−Ａｃ／２１３−Ｂｉ発生器を構成する２２５−アクチニウム（２２５−Ａｃ）は、Oak Ridge National Laboratory（Oak Ridge、TN）から入手することができる。２２５−Ａｃ／２１３−Ｂｉ発生器は、ＭＰ−５０陽イオン交換樹脂を用いて構成され、２１３−Ｂｉは、Boll et al.（Radiochim. Acta 79:145-149, 1997）に記載されるように、０．１５Ｍ  ＨＩ（ヨウ化水素酸）により２１３−ＢｉＩ3の形態で溶出される。111ＩｎＣｌ3はIso-Tex Diagnostics（Friendswood、TX）から購入することができる。結合分子は、二官能性キレート剤ＣＨＸＡ’’（Ｎ−［２−アミノ−３−（ｐ−イソチオシアナト−フェニル）プロピル］−ｔｒａｎｓ−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’’−ペンタ酢酸）により、例えば２１３−Ｂｉ（療法用）又は１１１−Ｉｎ（イメージング用）で放射性標識することができる（Saha, Fundamentals of Nuclear Pharmacy, (1997) Springer, New York, pp.139-143）。抗体当たりの平均キレート数は、イットリウム−アルセナゾＩＩＩ分光光度法で求めることができる（Dadachova et al. (1997) Appl. Rad. Isotop. 48:477-481、Pippin et al. (1992) Bioconjug. Chem. 3:342-345）。必要に応じて、放射性標識抗体をサイズ排除ＨＰＬＣ（ＴＳＫ−Ｇｅｌ．ＲＴＭ．Ｇ３０００ＳＷ、TosoHaas、Japan）により精製することができる。また、結合分子を、例えば抗体のジチオスレイトールとのジスルフィド結合の還元による「直接標識化」を介して、１８８−Ｒｅ及び９９ｍ−Ｔｃで標識することができる（Dadachova and Mirzadeh, Nucl. Med. Biol. (1997) 24:605-608）。過レニウム酸ナトリウム（Ｎａ  １８８−ＲｅＯ4）の形態の１８８−Ｒｅを、１８８−Ｗ／１８８−Ｒｅ発生器（Oak Ridge National Laboratory、Oak Ridge、TN）から溶出させることができる。ｍＡｂは、抗体を７５倍モル過剰のジチオスレイトールと３７℃で４０分間インキュベートし、続いてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０又は−５０ミクロ濃縮器で０．１５Ｍ  ＮＨ4ＯＡｃ（ｐＨ  ６．５）で遠心精製することによる、抗体のジスルフィド結合の還元を介して１８８−Ｒｅで標識することができる。同時に生理食塩水中３ｍＣｉ〜１０ｍＣｉ（１１０ＭＢｑ〜３７０ＭＢｑ）の１８８−ＲｅＯ4をＳｎＣｌ2でグルコン酸ナトリウムの存在下でインキュベートすることにより低減することができ、精製低減抗体と合わせて、３７℃で６０分間維持する。抗体と結合していない放射能は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎミクロ濃縮器（Millipore Corp. Billerica、MA）で遠心精製により除去することができる。Ｎａ99mＴｃＯ4はGE Healthcare（Bronx、NY）から購入して、１８８−Ｒｅに関して記載したように結合分子に付着させることができる。
【００６６】
本発明は、好ましい実施形態に重点を置いて記載されるが、好ましい化合物及び方法の変形形態を使用することができ、本発明を本明細書中で具体的に記載されるものとは別の方法で実施することができると意図されることは当業者に明らかである。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲で規定される本発明の精神及び範囲内に包含される全ての変更形態を含む。
【００６７】
「１つの（A）」、「１つの（an）」及び他の単数形は、特に除外されない限りその複数形を含むと意図され、また、特に除外されない限り複数形は単数形を含むと意図される。
【実施例】
【００６８】
実験の詳細
世界的に見てヒト癌の２０％近くが感染性の病因を有すると予想されている（Parkin DM (2006) Int J Cancer 118:3030-3044.）。これらの腫瘍の大部分がウイルス性であり、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と肝細胞癌との、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）と頸癌、肛門癌、外隠癌、膣癌との関連性、並びに口腔咽頭エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）とリンパ腫及び上咽頭癌腫との、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）と成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫との、及びヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８）とカポジ肉腫との関連性が確立している（Cesarman E and Mesri EA (2007) Curr Top Microbiol Immunol 312:263-287、Jones EE and Wells SI (2006) Curr Mol Med 6:795-808、El-Aneed A and Banoub J (2006) Anticancer Res 26:3293-3300、Arbach H et al. (2006) J Virol 80:845-853、Young LS and Murray PG (2003) Oncogene 22:5108-5121、Mortreux F et al. (2003) Leukemia 17:26-38）。これらのウイルス関連腫瘍は、合わせて毎年およそ１３０万件の癌（その内５２３０００件がＨＢＶ／ＨＣＶ関連肝臓癌であり、５６１０００件がＨＰＶ関連腫瘍である）の負担となる（Parkin et al. (2005) CA Cancer J Clin 55:74-108）。ウイルス関連癌の治療及び予防に新たなアプローチを見出す必要性は明らかであり、急を要する。
【００６９】
ウイルス関連子宮頸癌及び肝細胞癌の放射免疫療法
本発明は、ウイルスタンパク質へのｍＡｂ等の結合分子を使用して、殺腫瘍放射線を送達する、ウイルスによって引き起こされる腫瘍に対する新規の戦略を提供する。この戦略は、「自己」タンパク質である標的化腫瘍関連抗原を有する放射免疫療法（ＲＩＴ）の従来の使用とは根本的に異なる。
【００７０】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は子宮頸癌を引き起こすが、子宮頸癌は、世界保健機関（ＷＨＯ）によると（２００６年）、世界的に見て女性の癌死亡率の第２の原因とされている。ＷＨＯは、子宮頸癌の死亡数を年間およそ２５００００であると推定している。ＨＰＶの遺伝子型は、各々の遺伝子型への感染後に癌が発生する危険度に応じて、「高リスク」型及び「低リスク」型に分類することができる。ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８等の高リスクＨＰＶの女性の一部では、子宮頸部上皮新生物の新生物発生前病変が発生する。高度異形成へと進行する病変の少数は持続し、及び／又は浸潤癌になる前にｉｎ  ｓｉｔｕで癌腫へと進行する傾向がある。ＷＨＯによると、子宮頸部腺癌及び外陰、膣、陰茎、及び肛門の扁平上皮癌（ＳＣＣ）の大多数は、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８によって引き起こされ（世界規模では合わせて件数の約７０％）、残りの３０％は他の高リスク型ＨＰＶ（ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ６６）によるものである。異なる高リスク型の相対的重要性は国及び地域間で異なるが、１６型が全ての地域において子宮頸癌の最大の原因となっている。ＨＰＶはまた、肛門、頭部、及び頚部の他の癌に関連し、まれに小児における再発性呼吸器乳頭腫症にも関連する（ＷＨＯ、２００６年）。
【００７１】
米国では、子宮頸癌は女性の健康に大きな影響を与え、２００４年には米国において１０５００件の新たな症例が診断されている（米国癌協会の統計）。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８は、子宮頸癌のおよそ９０％に関連する。突然変異分析により、高リスク型ＨＰＶのＥ６及びＥ７遺伝子が、ＨＰＶの形質転換機能に必要且つ十分であることが示される。したがって、形質転換細胞のＥ６及びＥ７タンパク質の殺細胞剤による標的化は、子宮頸癌の治療及び／又は予防の戦略となる。
【００７２】
標的化ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の適合性を決定するために、１８８−レニウム（188Ｒｅ）で放射性標識したＥ６に対する市販のＣ１Ｐ５  ｍＡｂ（ＩｇＧ１アイソタイプ、Abcam、Cambridge MA）及びＨＰＶ１６を発現するＣａｓＫｉヒト子宮頸癌細胞株で、ＲＩＴを用いて実験を実施した。全ＣａｓＫｉ細胞に対する188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂの結合性を、188Ｒｅ標識したアイソタイプが一致する対照ｍＡｂ  １８Ｂ７の結合性と比較した。188Ｒｅ−１８Ｂ７の６％と比較して、１６％の全ＣａｓＫｉ細胞に対する188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５の結合性が見られた（図１）。標的化細胞に隣接する細胞、又はさらには離れた細胞（放射性核種の放出範囲に応じる）がいわゆる「十字火」効果により破壊されるため、有効な療法のために腫瘍中の全ての細胞を結合に関して標的化する必要はない。
【００７３】
188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏでの取り込みを評価するために、ＣａｓＫｉ腫瘍をヌードマウスにおいて、１０7個の細胞を皮下注射することで誘導した。腫瘍の直径が４ｍｍ〜５ｍｍに達すると、マウスに188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂ又は188Ｒｅ−１８Ｂ７対照  ｍＡｂを腹腔内注射した。動物のシンチグラフィーによるイメージングを注射の２４時間後に実行し、生体内分布研究を４８時間後に実施した。188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５では腫瘍においてシンチグラフィーによる画像上に取り込みが認められたが、対照  ｍＡｂの188Ｒｅ−１８Ｂ７では取り込みは認められなかった（図２Ａ及び図２Ｂ）。生体内分布結果から算出した腫瘍と正常筋肉との比により、188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５と188Ｒｅ−１８Ｂ７との差が際立っていること（それぞれ１０：１に対して３：１）が示された。188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂの腫瘍における総取り込みは、注射の４８時間後では体重（ｇｒ）当たりに注射した用量の２．０（±０．３）％であった。188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５のこの取り込みレベルは、Ｅ６抗原が188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂに接触可能となっている腫瘍において、生育不能の細胞及び／又はアポトーシスを起こした細胞の数が低いことによるものであり得る。接触可能抗原のレベルの低さに対抗する方法としては、アポトーシスを起こした細胞及び壊死細胞の数を増加させる外部電離放射線、及び／又はＥ６及びＥ７タンパク質レベルの増大を引き起こすプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２のいずれかによる腫瘍細胞の前処理が挙げられる（Oh, KJ et al. J Virol. 78, 5338 (2004)、Kehmeier, E et al. Virology 299, 72 (2002)）。代替的には、Ｃ１Ｐ５よりも高い特異性を有するｍＡｂを使用してもよい。
【００７４】
Ｅ６及びＥ７の発現を、３つのヒト子宮頸癌細胞株（ＨＰＶ１６陽性のＣａｓＫｉ細胞株及びＳｉＨａ細胞株、並びにＨＰＶ１８陽性ＨｅＬａ  Ｓ３細胞株）においてウエスタンブロット法により評価した。ＣａｓＫｉ細胞ではＥ６抗原及びＥ７抗原の両方が発現し（図３Ａ、図３Ｂ）、一方でＳｉＨａ細胞株及びＨｅＬａ  Ｓ３細胞株は、Ｅ７タンパク質を（ＳｉＨａ細胞ではＥ７発現のレベルは低いものではあるが（図３Ｄ））発現したが（図３Ｄ、図３Ｅ）、測定可能なＥ６抗原の発現を示さなかった（結果は図示しない）。
【００７５】
プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２は、哺乳類細胞においてユビキチン共役タンパク質の分解を、ＡＴＰアーゼ又はイソペプチダーゼの活性に影響を与えることなく低減する。ＭＧ１３２が子宮頸癌細胞においてＥ６及びＥ７タンパク質のレベルを増大させることが報告されている（Kehmeier et al. (2002) Virology 299:72-87、Oh et al. (2004) J Virol 78:5338-5346）。標的抗原量を高くすることでＲＩＴの結果を改善することができる可能性があり、Ｅ６及びＥ７の発現レベルについて、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２による子宮頸癌（ＣＣ）細胞の前処理の効果の研究が行われている。図３Ａ及び図３Ｂは、ＣａｓＫｉ細胞においてＭＧ１３２による前処理によりＥ６及びＥ７の両方の発現が増大したが、ＭＧ１３２を２μｇ／ｍＬ及び５μｇ／ｍＬ使用することにより最大の発現レベルが達成され、これはより高い用量を使用することで低下したことを示している。ＣａｓＫｉ細胞とＭＧ１３２とのインキュベート期間を延長しても、Ｅ６発現は増大しなかった。実際には、ＣａｓＫｉ細胞のＭＧ１３２への曝露を延長することで、Ｅ６発現の低下が観察され（図３Ｃ）、これは３時間を越えるインキュベート後のタンパク質分解の増大を反映し得る。同様の実験をＳｉＨａ細胞株及びＨｅＬａ  Ｓ３細胞株において、Ｅ７タンパク質に対して実施した（図３Ｄ、図３Ｅ）。ＳｉＨａ細胞はＥ７レベルの明らかな増大を示さなかったが（図４Ｄ）、１μｇ／ｍＬ及び２μｇ／ｍＬのＭＧ１３２で処理したＨｅＬａ  Ｓ３細胞については、Ｅ７レベルはわずかに増大した（図３Ｅ）。ＣａｓＫｉ細胞におけるＥ６の確かな高い発現、及びヌードマウスにおいて腫瘍を産生するその能力を鑑みて、ＣａｓＫｉ細胞及びＥ６タンパク質をさらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験及びｉｎ  ｖｉｖｏ実験のために選択した。
【００７６】
細胞株の選択−実験的Ｂ型肝炎関連肝細胞癌（ＨＣＣ）モデルとして働く抗原の組み合わせ。２つのＢ型肝炎関連ウイルスタンパク質（ＨＢｘ及びＰｒｅＳ２）を、ＲＩＴの潜在的標的として評価した。ＨＢｘは肝細胞癌の発症に関与すると疑われており、他の潜在的選択肢とは違って、ＨＢｘは宿主タンパク質と相同性を有しない。さらに、ＨＢｘをコードする遺伝子はＨＢＶゲノムが肝細胞癌（ＨＣＣ）に組み込まれ始めても保持されているが、他のＨＢＶ遺伝子は失われ得る（Hwang et al. (2003) J Clinical Microbiol 41:5598-5603、Lupberger J and Hildt E (2007) World J Gastroenterol 13:74-81）。ＰｒｅＳ２も肝細胞癌の発症に関与すると疑われている（すなわち、増殖制御に重要な細胞遺伝子のトランス活性化による）（Lupberger J and Hildt E (2007) World J Gastroenterol 13:74-81）。ＨＢｘタンパク質は、ＨＣＣ細胞株Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７の４Ｈ９  ｍＡｂを用いたウエスタンブロット法により一貫して検出され、その発現はＭＧ１３２プロテアソーム阻害剤での前処理とは独立していたが（図３Ｆ）、ｐｒｅＳ２は検出されなかった（結果は示さない）。したがって、Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７細胞株とＨＢｘタンパク質との組み合わせがさらなる実験のために選択された。
【００７７】
生育不能細胞における抗体のウイルス抗原への結合。ＲＩＴのための標的として同定したウイルスタンパク質に対する抗体が、生育不能腫瘍細胞においてウイルスタンパク質に結合可能かどうか明らかにするために、固定及び透過性ＣａｓＫｉ細胞及びＨｅｐ  ３Ｂ２．１−７細胞の免疫蛍光を、それぞれＥ６タンパク質に対してはｍＡｂ  Ｃ１Ｐ５及びＨＢｘタンパク質に対してはｍＡｂ  ４Ｈ９、続いてマウスＩｇＧに対してＦＩＴＣ標識ポリクローナル抗体を用いて実施した。Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂのほぼ無傷な細胞への結合は弱かったが、透過可能な膜を有する強い損傷を受けた細胞は、Ｃ１Ｐ５のＥ６への結合に対して明るい蛍光の指向性（pointing）を示した（図４Ａ)。固定化及び透過化により、ｍＡｂ  ４Ｈ９がＨＢｘタンパク質に結合することも可能となった（図４Ｂ）。対照ＩｇＧ１  ｍＡｂの固定及び透過性ＣａｓＫｉ細胞又はＨｅｐ  ３Ｂ２．１−７細胞への結合は全く観察されなかった（結果は示さない）。
【００７８】
腫瘍におけるウイルスタンパク質の発現。ヌードマウスにおいて誘導される腫瘍において、ＣａｓＫｉ細胞及びＨｅｐ  ３Ｂ２．１−７細胞がそれぞれＥ６ウイルス抗原及びＨＢｘウイルス抗原を継続して発現することを確認するために、免疫組織化学及び免疫ブロット法をそれぞれＥ６及びＨＢｘについて実施した。免疫組織化学により器官においてＨＢｘタンパク質を正確に検出することの難しさを報告している文献に基づいて（Reifenberg K et al. (1999) J. Virol. 73:10399-10405）、Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７誘導腫瘍についてはウエスタンブロット法を選択した。ＣａｓＫｉ腫瘍において特異ｍＡｂ  Ｃ１Ｐ５によるＥ６の強い染色が見られたが（図４Ｃ、左パネル）、対照ＩｇＧｌ  ｍＡｂでは染色は観察されなかった（図４Ｃ、右パネル）。Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７誘導腫瘍のウエスタンブロット法によってＨＢｘタンパク質の存在が明らかになった（図４Ｄ）。したがって、ＣＣ及びＨＣＣ実験的腫瘍における標的ウイルスタンパク質の存在により、シンチグラフィーによるイメージング及び療法のための放射性標識ｍＡｂによるこれらの抗原のｉｎ  ｖｉｖｏでの標的化の可能性がもたらされた。
【００７９】
ＣａｓＫｉ及びＨｅｐ  ３Ｂ２．１−７腫瘍担持ヌードマウスにおけるウイルスタンパク質に対する放射性標識ｍＡｂの生体内分布。イメージング及び生体内分布実験を188Ｒｅ放射性標識Ｃ１Ｐ５及び４Ｈ９  ｍＡｂにより、それぞれＣａｓＫｉ及びＨｅｐ  ３Ｂ２．１−７腫瘍を担持するヌードマウスにおいて実施して、腫瘍に対するｍＡｂの局在性を確認した。注射の２４時間後、ＣａｓＫｉ腫瘍は、無関連188Ｒｅ−１８Ｂ７  ｍＡｂを注射したマウスの画像（図５Ｂ）とは対照的に、188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂを注射したマウスのシンチグラフィー画像（図５Ａ）において観察できる。腫瘍と筋肉との比は、４８時間の生体内分布の結果から算出したが、188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５では１０：１であったのに対し、188Ｒｅ−１８Ｂ７では３：１であった。188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂの腫瘍における総取り込みは、注射の４８時間後で腫瘍１ｇ当たり注射した用量の２．０（±０．３）％であった。肝臓、脾臓、及び血液のような他の器官は、ＩｇＧ１  ｍＡｂに特徴的な取り込みレベルを示した。Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７については、マウスが２つの異なる腫瘍（一方は対象の腫瘍であり、他方は無関連対照腫瘍である）を担持する場合、モデルを用いてｍＡｂの腫瘍への取り込みの特異性を証明するために別のアプローチを利用した。ヌードマウスはＡ２０５８ヒト転移性黒色腫腫瘍を右脇腹に、Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７を左脇腹に担持していた（図５Ｃ）。マウスに188Ｒｅ−４Ｈ９  ｍＡｂを注射し、注射の２４時間後シンチグラフィーによりイメージングした。抗体は無関連対照黒色腫腫瘍（図５Ｄ）とは対照的に、Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７腫瘍に局在した。ウイルス抗原に対する放射性標識ｍＡｂのマウスにおいてこれらの腫瘍に局在する能力によって、これらのｉｎ  ｖｉｖｏ癌モデルにおけるＲＩＴ評価が正当化された。
【００８０】
ＣａｓＫｉ及びＨｅｐ  ３Ｂ２．１−７腫瘍担持ヌードマウスのＲＩＴ。ＣａｓＫｉ担癌マウスにおける188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂの治療効果を評価するために、動物に３５０μＣｉの188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂ、若しくは一致する量（マウス１体当たり３０μｇ）の非標識（「コールド(cold)」）Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂのいずれかを注射するか、又は未処理のままにした。図６Ａに処理グループ及び対照グループにおける腫瘍容積の変化を示す。３５０μＣｉの188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂを用いたＲＩＴにより腫瘍増殖が完全に停止し、その容積が低減したが（図６Ａ及び図６Ｂ）、未処理の腫瘍は激しく増殖し（図６Ａ及び図６Ｃ）、未処理の対照マウスは処理の２０日後には屠殺しなければならなかった（Ｐ＜＜０．０１）。興味深いことに、「コールド」Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂの投与により、腫瘍増殖の有意な遅延ももたらされたが、これはｍＡｂによる炎症の誘発及び補体カスケードによるものであり得る。
【００８１】
ヌードマウスにおけるＨｅｐ  ３Ｂ２．１−７腫瘍のＲＩＴについては、３５０μＣｉの188Ｒｅ−４Ｈ９  ｍＡｂ、「コールド」ｍＡｂ処理対照、及び未処理グループを用いて、ＣａｓＫｉ腫瘍に関するものと同じ実験的設計を初めに採用した。３５０μＣｉの188Ｒｅ−４Ｈ９  ｍＡｂの投与により、腫瘍増殖の減速がもたらされたが、ＣａｓＫｉ腫瘍の場合のようには腫瘍増殖は停止されなかった。「コールド」４Ｈ９  ｍＡｂは腫瘍増殖に対して効果を有しなかった。非常に侵攻性の強いＨｅｐ  ３Ｂ２．１−７の増殖を遅延させる、放射性標識ｍＡｂの最も有効な用量を見出すために、用量応答実験を行なった。188Ｒｅ−４Ｈ９  ｍＡｂの治療効果は、２８０μＣｉの用量で現れ始め、用量を続いて増加する度に増大した（図７Ａ）（Ｐ＜０．０２）。実験の完了時に、対照の未処理マウス及び最高の６００μＣｉを投与したグループのマウスを組織学的に解析した。対照腫瘍は、壊死、フィブリン血栓、及び出血性の小さな病巣が散在した中分化肝様細胞から成っていた。新生物性細胞は、十分に好酸性の細胞質から細かく空胞化した細胞質まで、及び中間の大きさの核から、複数の大きい好酸性の核小体を含有する非常に大きく且つ未分化の核までを有し、時に多核細胞も認められた。分裂指数は高く、アポトーシスを起こした細胞が散在していた（図７Ｂ）。対照的に、ＲＩＴ処理腫瘍は対照において見られるよりも有意に多い壊死及び出血性の細胞を有していた。腫瘍細胞の形態的外観は多くの場合、より空胞化した（変性を示唆する）原形質を有していた（図７Ｃ）。
【００８２】
考察
本明細書中に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験及びｉｎ  ｖｉｖｏ実験の原理証明により、ウイルスが病因とされている腫瘍における、療法用の放射性標識抗体によるウイルス抗原の標的化の実現可能性が確立された。実験的子宮頸癌（ＣＣ）モデル及び肝細胞癌（ＨＣＣ）モデルを、これらの癌がそれぞれＨＰＶ及びＨＢＶ／ＨＣＶに病因学的に関連し、世界的に見て公衆衛生に重大な意義を有するため使用した。
【００８３】
第一の課題はＣＣ及びＨＣＣにおける標的ウイルス抗原の選択であった。ＨＰＶ関連ＣＣであるＥ６及びＥ７腫瘍性タンパク質を、ＲＩＴに対する潜在的標的として同定した。これは、これらは全ての子宮頸癌細胞において発現されると考えられるが、他のウイルス遺伝子は腫瘍形成の多段階プロセス中に失われ得るためである。同様に、ＨＣＣにおいて、ＨＢｘ発現は維持されると考えられる。しかしながら、これら３つのタンパク質の放射性標識ｍＡｂによる標的化にはその細胞内での位置という重要な問題がある。Ｅ６及びＥ７の両方は核内に位置し、ＨＢｘは核及び時には原形質に見られる。結果として、これらのタンパク質に対する放射性標識ｍＡｂは、これらが死細胞から放出されるか、又は腫瘍細胞が透過性である場合にそれぞれの抗原のみに結合する。ＣａｓＫｉ細胞株は、Ｅ６及びＥ７をｉｎ  ｖｉｔｒｏで高レベルで発現し、腫瘍が潜伏期の後ヌードマウスにおいて激しく増殖するためＣＣモデルとして選択した。Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７細胞株は、ＨＢｘを高レベルで発現し、マウスにおいて速い腫瘍増殖を示すためＨＣＣモデルとして選択した。
【００８４】
腫瘍細胞の免疫蛍光並びに腫瘍の免疫組織化学及びウエスタンブロット法により、多量のＥ６抗原性標的及びＨＢｘ抗原性標的が、それぞれＣａｓＫｉ誘導腫瘍及びＨｅｐ  ３Ｂ２．１−７誘導腫瘍に存在することが明らかにされた（図４）。放射性標識ｍＡｂに対して接近可能な抗原が存在するのは、速い代謝回転を受ける腫瘍細胞からのタンパク質放出の結果であると思われる。したがって、放射性標識抗体は腫瘍組織に蓄積し、シンチグラフィーによりイメージングすることができた（図５）。腫瘍における標的化ウイルス抗原の利点の１つは、悪性細胞のみにしか見られないという点である。対照的に、Chen and colleagues（Cancer Res 49:4578-4585, 1980）により、特異放射性標識抗体及び非特異放射性標識抗体の生体内分布実験では、それらが核内のヒストンを標的化する場合に腫瘍の取り込みに差異がないことが観察された。
【００８５】
ウイルスタンパク質に対する放射性標識ｍＡｂの細胞毒性放射性核種を送達する能力。腫瘍細胞に対する１８８−レニウムは、担癌マウスにおけるこれらのｍＡｂによるＲＩＴの結果の成功を容易にする。ＣａｓＫｉ担癌マウスに３５０μＣｉ量のＥ６結合188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂを投与することにより、腫瘍増殖が完全に停止し、さらにはその退行をもたらした（図６）。また、抗体自体が非標識抗体として炎症反応を媒介し、補体を活性化することから、幾つかのさらなる治療上の利点があると思われる。Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７  ＨＣＣ腫瘍を担持するマウスにおける用量応答実験により、治療効果の用量依存性が明確に実証された（図７）。ＨＣＣにおいて治療効果をもたらすために子宮頸腫瘍よりも高い用量の放射性標識ｍＡｂが必要とされた事実は、Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７の悪性度、及び比較的放射線への感受性が高い子宮頸癌と比較した肝臓腫瘍の既知の放射線耐性を反映し得る（Yang et al. (2005) World J Gastroenterol 11:4098-4101）。また、マウスにおける188Ｒｅ標識ＩｇＧ１に対するおよそ８００μＣｉの最大耐量をはるかに下回る放射線用量で、両方の実験的腫瘍における治療効果（gains）が達成され（Sharkey et al. (1997) Int J Cancer 72:477-485）、そのように使用される用量は、いかなる短期毒性又は慢性毒性も生じないことが予想されているのは注目に値する。
【００８６】
ウイルス関連癌をウイルス抗原の標的化により治療する場合、腫瘍中の全ての細胞が治療効果を得るためにウイルス抗原を発現する必要はないことを重視するのは重要である。188Ｒｅ（組織における放出範囲が１０ｍｍ）等の長距離放射体は、放射線を３６０°の範囲に放出するため、抗原位置の近傍の細胞を破壊することができる。さらに、高濃度の標的化ウイルス抗原は、黒色腫に対するＲＩＴの最新モデル（細胞内抗原でもあるメラニンに対して標的化される）によると、腫瘍への治療用量の送達には恐らく必要とされない。このモデルにより、腫瘍に送達される放射線用量は概して、メラニン（抗原）濃度に依存しないことが示される（Schweitzer et al. (2007) Melanoma Res 17:291-303）。
【００８７】
このアプローチはまた、慢性的に感染した個体（例えば、ＨＩＶ感染個体におけるＨＰＶ感染の持続は、個体がＨＰＶ関連癌を発症する危険性を有意に高める）においてウイルス関連癌を予防する見込みがある。ＨＢＶ及びＨＣＶに対する免疫療法があるが、多くの患者はウイルス排除を達成せず、治療はかなりの罹患率を伴う。また、ＨＣＶに対するワクチンはなく、世界的に見て何百万という人々が、有効なワクチンを入手可能であるにも関わらずＨＢＶに感染している。ＨＰＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、又は他のウイルスの持続感染を受けた細胞は、ウイルス抗原を標的とするＲＩＴにより悪性の表現型に形質転換する前に排除される可能性がある。
【００８８】
結論として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの実験により、ウイルスタンパク質に対する放射性標識ｍＡｂ標的化を用いて、ウイルス関連腫瘍を治療する新規の戦略が実証された。この戦略は、腫瘍学におけるＲＩＴの従来の使用（腫瘍関連ヒト抗原を標的とするため、正常組織において放射性抗体の有意な取り込みを生じ、毒性をもたらす）とは根本的に異なる。本研究の結果により、自己タンパク質の代わりにウイルスタンパク質を標的とすることで、放射性標識ｍＡｂがより特異的に腫瘍組織内に集中し、より大きな有効性及びより小さい毒性をもたらし得ることが示される。この戦略はまた、発癌ウイルスに感染した細胞を癌に形質転換する前に排除することで、慢性感染患者においてウイルス関連癌を予防する可能性をさらに高める。
【００８９】
材料及び方法
抗体。AbcamからのマウスｍＡｂである、ＨＰＶ１６  Ｅ６＋ＨＰＶ１８  Ｅ６に対するＣ１Ｐ５及びＨＰＶ１６  Ｅ７に対するＴＶＧ  ７０１ＹをＣＣ実験に使用した。ＨＢＶ  ＨＢｘに対するマウスｍＡｂ  ４Ｈ９（Aviva、カタログ番号ＡＶＡＭＭ２００５）及びＨＢｓＡｇ  ｐｒｅＳ２抗原と交差反応するＨＢＶタンパク質Ｈｂｓに対するマウスｍＡｂ  Ｓ２６（Gene Tex Inc.、カタログ番号ＧＴＸ１８７９７）をＨＣＣ実験に使用した。クリプトコックス・ネオフォルマンス（C. neoformans）に対するマウス１８Ｂ７  ｍＡｂ（ＩｇＧ１）（Casadevall A et al. (1992) J Infec Dis 165:1086-1093）を全ての特異抗体の無関連対照として使用した。アルカリホスファターゼで標識した、マウスＩｇＧ  Ｈ＆Ｌに対するウサギポリクローナル抗体をAbcamから購入し、ウエスタンブロット法において二次抗体として使用した。
【００９０】
細胞株及び細胞培養法。３種のヒト子宮頸癌細胞株：ＨｅＩａ  Ｓ３、ＳｉＨａ、及びＣａｓＫｉをATCC（Manassas、VA）から購入した。細胞を１０％ＦＢＳ（Sigma）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Sigma、ペニシリン１００００Ｕ及びストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ−１２Ｋ（Sigma、１：１）中、３７℃で５％ＣＯ2培養器において通常どおり培養した。細胞株Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７（ヒト肝細胞癌）をATCCから購入した。当該細胞株は統合Ｂ型肝炎ウイルスゲノムを含有し、８歳の黒人少年の肝細胞癌組織に由来する。細胞を１０％ＦＢＳ（Sigma）を含有するイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）（ATCC）中、３７℃で５％ＣＯ2培養器において通常どおり培養した。細胞層を７５ｍｌ容フラスコ中で、２ｍｌの１×トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Sigma、０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン−０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ）添加することにより室温で１５分間分散させた。悪性黒色腫の患者のリンパ節転移に由来するＡ２０５８細胞株はATCCから得た。細胞を１０％ウシ胎仔血清及び５％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液を補充した、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、４．５ｇ／Ｌグルコース、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含むダルベッコ変法イーグル培地中、３７℃及び５％ＣＯ2で単層に維持し、０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて採取した。全ての細胞株の通常の維持をATCCのプロトコルに従って実施した。
【００９１】
ウエスタンブロット法。細胞ペレットを溶解バッファー（４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．５Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ  ６．８）、０．００２％ブロモフェノールブルー、及び１０％β−メルカプトエタノール）中で懸濁した。タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行する前に１５分間水中で煮沸した。２５μｌ〜３０μｌのタンパク質溶液を、１２％プレキャストＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Bio-Rad）の各々のウェルに充填した。試料中の相対タンパク質量をモニタリングするためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをタンパク質の分離に使用し、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ（登録商標）３  Ｃｅｌｌ装置（Bio-Rad）を用いて電気泳動を実施した。電気泳動後、ゲルをＰＶＤＦ転写バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９０ｍＭグリシン、及び２．５％（ｖ／ｖ）メタノール）に５分間移した。次に、タンパク質をゲルからＩｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ（商標）ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad）に、Ｓｅｍｉ−ｄｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌ（Bio-Rad）上で、１５Ｖで１７分間転写した。膜をブロッキングバッファー（２５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ  ７．６）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に５分間浸した後、ブロッキング溶液（ブロッキングバッファー中５％脱脂粉乳）に移し、１時間穏やかに振とうした。膜を、１：３０００に希釈した一次抗体を含有するＴＢＳＴ溶液（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、２５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ  ７．６）、及び５００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。次に、膜をＴＢＳＴで３回洗浄した（１回の洗浄に１０分）。膜を、ＴＢＳＴで１：１０００００に希釈した、アルカリホスファターゼで標識した二次抗体（マウスＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（アルカリホスファターゼ）に対するウサギポリクローナル）とハイブリダイズさせた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、膜をＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標）化学発光基質溶液（Sigma）中で５分間インキュベートし、その後、ＣＬ−ＸＰｏｓｕｒｅ（商標）フィルム（Pierce）に曝露した。メーカーの使用説明書に従ってフィルムを現像した。
【００９２】
細胞のＭＧ１３２処理。CALBIOCHEMから購入したＭＧ１３２（Ｚ−ＬＬＬ−ＣＨＯ、ＭＷ＝４５７．６）は、強力な細胞透過性の可逆的プロテアソーム阻害剤（Ｋｉ＝４ｎＭ）である。ＭＧ１３２をまず、１滴の１００％エタノール、続いてＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ−１２Ｋ培地中にＦＢＳを添加せずに溶解し、原液を４℃で保管した。細胞培養物を採取し、６本の滅菌試験管に移した。各々の管には０．５ｍｌ〜１ｍｌの細胞培養物が含まれており（細胞濃度は約１０6細胞数／ｍｌ）、細胞を５％ＣＯ2培養器内、３７℃で一晩増殖させた。次に、ＭＧ１３２溶液を０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、又は２５μｇ／ｍｌ（それぞれ０μＭ、２．１μＭ、４．２μＭ、１０．５μＭ、２１μＭ、又は５２μＭ）の最終濃度で管に添加した。細胞を同じ条件下でさらに３時間又は６時間インキュベートした。最後に、細胞を遠心分離で採取し、ＰＢＳで洗浄することにより清澄化した。
【００９３】
放射性同位体及び抗体の放射標識化。１６．９時間の半減期を有するβ放射体188Ｒｅを、過レニウム酸ナトリウムＮａ188ＲｅＯ4の形で188Ｗ／188Ｒｅ発生器（Oak Ridge National Laboratory、Oak Ridge、TN）から溶出させた。以前に記載されているように（Kaminski MS et al. (2005) N Engl J Med 352:441-449.）、抗体を還元188Ｒｅの抗体上に生じた−ＳＨ基への結合を介して188Ｒｅで直接標識した。
【００９４】
腫瘍細胞におけるウイルス抗原の免疫蛍光検出。腫瘍細胞をスライドチャンバー内で、３７℃で１２時間培養した。培地を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。手順全体を通して、細胞は各々の処理後にＰＢＳで３回洗浄した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定し、続いてＰＢＳ中０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で室温で１０分間透過化した。固定及び透過化した細胞をＰＢＳ中５％ＢＳＡ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で室温で３０分間ブロッキングした。ウイルス抗原特異ｍＡｂを、上記のＢＳＡ＋Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液で１：２００に希釈し、細胞と共に室温で６０分間インキュベートした。１：３００に希釈した、マウスＩｇＧに対するＦＴＩＣ標識ウサギポリクローナル抗体を細胞に添加し、室温で６０分間暗所でインキュベートした。スライドを、ＦＩＴＣフィルタを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＡＸ７０顕微鏡（Melville、NY）を用いて観察した。
【００９５】
腫瘍モデル。全ての動物研究は、アルバートアインシュタイン医科大学の動物研究研究所のガイドラインに従って実施された。ヒト子宮頸癌ＣａｓＫｉ細胞株及びヒト肝細胞癌Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７細胞株を、それぞれがＥ６及びＨＢｘを発現すること、及びヌードマウスにおけるその腫瘍原性に基づいて腫瘍モデルとして選択した。Charles Riverから購入した６週齢のメスＮｕ／Ｎｕ  ＣＤｌヌードマウスの右の脇腹に、１０％牛胎仔血清を含有する０．１ｍｌのＤＭＥＭ培地中１０7個のＣａＳｋｉ細胞又はＨｅｐ  ３Ｂ２．１−７細胞を注射した。ＣａｓＫｉ腫瘍は注射後およそ６０日で現れ始め、Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７腫瘍は細胞注射後１０日で現れ始めた。ＨＢｘ特異ｍＡｂの生体内分布については、１０7個のＡ２０５８ヒト転移性黒色腫細胞及び１０7個のＨｅｐ  ３Ｂ２．１−７細胞を、それぞれヌードマウスの右及び左の脇腹に接種した。生体内分布及び療法の実験は、腫瘍の直径が０．３ｃｍ〜０．７ｃｍに達した時点で開始した。
【００９６】
ＣａｓＫｉ腫瘍におけるＨＰＶ  Ｅ６タンパク質の免疫組織化学的検出。ＣａｓＫｉ担癌マウスから採取した腫瘍を、１０％緩衝ホルマリン中で一晩固定し、続いて７０％エタノール中に入れた。パラフィン包埋腫瘍組織を５μｍの切片（slides）にした。切片をキシレン中で脱パラフィンし、エタノール中で連続して脱水し、クエン酸緩衝液（ｐＨ  ６．０）で１００℃で２０分間前処理して抗原を回収した。内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害するために、切片をメタノール中３％過酸化水素で処理した。次に、Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ（登録商標）−Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔｓ  Ｚｙｍｅｄ（登録商標）２nd  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＬＡＢ−ＳＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）を用いて、メーカーの使用説明書に従って腫瘍組織切片のＩＨＣ染色を実施した。マウスｍＡｂ  Ｃ１Ｐ５を一次抗体として使用して、腫瘍組織中のＥ６タンパク質を検出し、陰性対照を一次抗体の代わりに１８Ｂ７  ｍＡｂと共に、同じ条件下でインキュベートした。ＩＨＣに使用される他の試薬はキットに同梱されている。
【００９７】
Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７腫瘍におけるＨＢｘ抗原のウエスタンブロット検出。Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７腫瘍を氷上で均質化し、ウエスタンブロット法を上記のように実施した。
【００９８】
生体内分布及び188Ｒｅ標識ｍＡｂによるシンチグラフィーによるイメージング。ＣａｓＫｉ担癌マウス又はＨｅｐ  ３Ｂ２．１−７担癌マウスにおける生体内分布及びシンチグラフィーによるイメージングについては、マウスを３つのグループに分け、１００μＣｉの特異ｍＡｂ188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５若しくは188Ｒｅ−４Ｈ９、又は対照ｍＡｂ188Ｒｅ−１８Ｂ７のいずれかを腹腔内注射した。注射の２４時間後、マウスにイソフルランで麻酔をかけ、Iconの画像処理ソフトウェアを備えたSiemensのガンマカメラで、シンチグラフィーにより２分間イメージングした。注射の４８時間後、マウスを屠殺して、腫瘍及び筋肉を除去し、血液を拭き取り、秤量し、ガンマカウンターで測定して、組織１ｇ当たりの注入量（％）及び腫瘍と筋肉との比を算出した。
【００９９】
ヌードマウスのＣａＳｋｉ腫瘍及びＨｅｐ  ３Ｂ２．１−７腫瘍の188Ｒｅ標識ｍＡｂによる治療法。治療法研究のために、直径０．３ｃｍ〜０．７ｃｍの腫瘍を有するマウスを、無作為に６つのグループに分けた。ＣａｓＫｉ担癌マウスについては、グループ＃１は３５０μＣｉの188Ｒｅ−Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂで、グループ＃２は適合する量（３０μｇ）の「コールド」Ｃ１Ｐ５  ｍＡｂで腹腔内処理し、グループ＃３は未処理のままにした。Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７担癌マウスのＲＩＴについては、グループ＃１には２４０μＣｉの188Ｒｅ−４Ｈ９  ｍＡｂ、グループ＃２には２８０μＣｉの、グループ＃３には３５０μＣｉの、グループ＃４には５００μＣｉの、グループ＃５には６００μＣｉの188Ｒｅ−４Ｈ９  ｍＡｂ、グループ＃６には３０μｇの「コールド」４Ｈ９  ｍＡｂを腹腔内投与し、グループ＃７は未処理のままにした。マウスをその健康状態及び腫瘍増殖について観察した。腫瘍の大きさを３日毎に、キャリパーを用いて三次元で測定し、腫瘍容積を三次元を２で除算した値として算出した。組織学的分析のために、腫瘍を実験の完了時にマウスから除去して、緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンで処理し、５μｍの切片にして、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０１００】
統計分析。ノンパラメトリック検定であるウィルコクソンの順位和検定を、生体内分布研究における器官の取り込み、及び治療法研究における腫瘍の大きさを比較するために使用した。Ｐ値が０．０５未満であった場合に、差異は統計的に有意であると見なした。
【０１０１】
理論実験例
理論実験例１。抗ウイルス抗原ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）2断片及びＦａｂ’断片の発生：エプスタイン・バーウイルスｇｐ  ３５０に対するモノクローナルＩｇＧ抗体７２Ａ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ並びにマウス及びヒトのｉｎ  ｖｉｖｏの両方でＥＢＶによる感染を予防することが示されている（Haque et al. (2006) J Infect. Dis. 194:584-587）。Ｆ（ａｂ’）2断片は、Lendvai et al.（J Infect. Dis. 177:1647-59, 1998）のように市販キット（ImmunoPure、Pierce）を使用して得ることができる。簡潔に述べると、ｐＨ  ４．２でのＩｇＧのペプシン消化を実行した後、ペプシンビーズを遠心分離し、５Ｍ酢酸ナトリウムでｐＨを７に調整することによりタンパク質分解を停止することができる。Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）2断片を１０ｍＭジチオスレイトール、続いて２２ｍＭヨードアセトアミドとインキュベートし、チオール基を阻害することにより生成することができる。得られた断片の分子量は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、及びサイズ排除ＨＰＬＣにより解析することができる。タンパク質濃度は、Lowry et al.（J. Biol. Chem. 193:265-275, 1951）による方法、又は当該技術分野で既知の他の手段により求めることができる。
【０１０２】
理論実験例２。スクシンイミジル−ＨＹＮＩＣ（ヒドラジノニコチンアミド）を用いた抗体及びＦ（ａｂ’）2断片の間接標識化：例えば１８８−Ｒｅ及び１１１−Ｉｎによる「間接」放射標識化のために、抗体及びＦ（ａｂ’）2断片を、例えばスクシンイミジル−ＨＹＮＩＣ（ヒドラジノニコチンアミド）を用いて誘導体化し、Blankenberg et al.（J. Nucl. Med. 40:184-191, 1999）のように精製することができる。ＨＹＮＩＣ等の二官能性キレート剤による「間接」標識化を採用することの「直接」標識化に優る利点は、長期間にわたって冷凍保管することができる一定分量のＨＹＮＩＣ結合分子を用いることで、放射標識化プロセスが大いに単純化及び短縮される点である。タンパク質にＨＹＮＩＣを組み込むことで、３８５ｎｍで分光測定でモニタリングすることができる（King et al. (1986) Biochem. 25:5774-5779）。最初のＨＹＮＩＣとタンパク質との比は、好ましくは最終のＨＹＮＩＣとタンパク質との比が約１．５を超えないように選択されるが、これはこの数字を超えると免疫反応性が部分的に失われる可能性があるためである。
【０１０３】
理論実験例３。ＨＥＨＡの付着による結合分子の放射標識化：ＨＥＨＡ（１，４，７，１０，１３，１６−ヘキサアザシクロ−ヘキサデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ヘキサ酢酸）は、タンパク性結合分子に共有結合可能な一価のキレート剤である。ＨＥＨＡは放射免疫療法に対する放射線放出同位体として優れた担体であると記載され、α放射体２２５−Ａｃに特に有用である（Brechbiel et al.に対する米国特許第６，９９５，２４７号明細書）。２２５−Ａｃは、以前記載されたように、２２５−Ｒａ（ｔ1/2＝１５日）からイオン交換及び抽出カラムクロマトグラフィにより分離することができる（Boll et al. (1997) Radiochim. Acta 79:145-149）。０．１Ｍ  ＨＮＯ3中の精製２２５−Ａｃの原液は、必要に応じて新たに調製することができる。２２５−Ａｃは、およそ１００μｌの２２５−Ａｃ溶液（およそ１０ＭＢｑ、０．１Ｍ  ＨＮＯ3）と２０μｌのリガンド（水中約０．０１Ｍ）を混合し、５μｌ〜１０μｌの１．０Ｍ酢酸アンモニウムを添加してｐＨを５．０近くに調整することで、ＨＥＨＡと複合させることができる。混合物を４０℃に３０分間維持し、次に０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ＝５．０）で予め平衡化したＣｈｅｌｅｘカラム（Bio-Rad Laboratories、Richmond、Calif．）で、約３００μｌのベッドボリュームで、２ｍｌの酢酸アンモニウム溶液を溶離液として用いて精製する。
【０１０４】
抗体溶液は、初めに透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ＣＥ  ＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｓｅｒｓ、ＭＷＣＯ  １０Ｋ、５ｍｌ）に移し、コンジュゲートバッファー（１ｌ、０．０５Ｍ  ＣＯ3-2／ＨＣＯ3-1、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．６）に対して、４℃で６時間透析することができる。透析後、タンパク質濃度は、ローリー法（Lowry et al, (1951) J. Biol. Chem. 193:265-275）を用いてウシ血清アルブミン標準溶液により分光測定で求めることができる。ＨＥＨＡ−ＮＣＳ水溶液を、リガンドの抗体に対する最初のモル比が５０倍となるように抗体溶液に添加する。反応混合物を室温で一晩（約１８時間）放置する。反応混合物をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（ＭＷＣＯ  ３０Ｋ又は５０Ｋ）（Amicon）濾過ユニットに移す。酢酸アンモニウム緩衝液（０．１５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ  ７．０）を濾過ユニットに全容積が１．５ｍｌとなるまで添加し、濾過ユニットを残存容積がおよそ０．５ｍｌとなるまで遠心分離する。さらなるバッファーを添加して、このプロセスを合計で６回繰り返す。最終抗体濃度は分光測定で測定することができ、リガンドのタンパク質に対する比（Ｌ／Ｐ）は、以前記載されたように求めることができる（Dadachova et al, (1999) Nucl. Med. Biol. 26:977 982）。
【０１０５】
簡潔に述べると、放射標識化は、Mirzadeh et al.（Bioconjugate Chem. 1:59 65, 1990）に詳細に記載されるものを若干修正した手順を用いて実施することができる。標識化はｐＨ＝４〜４．２で実施する。放射性金属溶液のｐＨ値を、数μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃを添加して３．８〜４．０に調整する。非標識ＨＥＨＡ複合体のｐＨを、必要な量の０．１５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝４．０）を添加することで、４〜４．２に低下させる。この溶液に放射性金属を添加し、反応混合物を室温で３０分間放置する。３Ｍ  ＮａＯＡｃでｐＨを約６に上げることで反応を停止させ、任意の遊離放射性金属を５ｍｌの０．５Ｍ  Ｎａ2ＥＤＴＡ溶液を用いて取り除くことができる。生成物は、１ｍｌ／分でＰＢＳを溶出してＴＳＫ−３０００  ＨＰＬＣカラム（Thompson Instruments）を通過させることにより精製することができる。
【０１０６】
本明細書に引用される各々の特許、出願、及び論文は、参照により援用される。上述の発明を実施するための形態及び実施例は例示として意図され、限定するものとは解釈されない。本発明の精神及び範囲の内にある他の変形形態も可能であり、当業者は容易に理解することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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