(57)【要約】  破骨細胞の分化を介して骨質量を調節するCD200およびそのレセプターCD200Rに関連する方法および組成物が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD200タンパク質またはCD200タンパク質のレセプタータンパク質もしくはそのフラグメントを含む生物治療薬組成物であって、CD200経路を活性化または阻害する前記生物治療薬組成物。
【請求項２】
CD200タンパク質またはCD200タンパク質のレセプターもしくはそのフラグメントと効率的に結合する抗体または抗体の結合部位であって、CD200またはそのレセプターと結合する上記抗体または抗体の結合部位が破骨細胞の分化を阻害する、前記抗体または抗体の結合部位。
【請求項３】
CD200タンパク質またはCD200タンパク質のレセプタータンパク質もしくはそのフラグメントと効率的に結合する抗体または抗体の結合部位であって、CD200またはそのレセプターと結合する上記抗体または抗体の結合部位がCD200経路を活性化する、前記抗体または抗体の結合部位。
【請求項４】
骨粗しょう症、パジェット病、骨格がその好発部位である転移癌、多核化巨細胞が負の作用を有する疾患もしくは症状、および巨細胞腫瘍から選択される疾患または症状の治療方法であって、CD200およびそのレセプターの相互作用のアゴニストである請求項1に記載の生物治療薬組成物、または請求項3に記載の抗体の治療的に有効な量を患者に投与する工程を含む、前記疾患または症状の治療方法。
【請求項５】
疾患または症状が、骨粗しょう症、パジェット病、乳癌、前立腺癌、肺腫瘍、腎腫瘍、メラノーマ、多発性ミエローマおよび移植に対する慢性炎症性応答から選択される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
全身性骨低下を伴う疾患を治療する方法であって、前記方法が、CD200およびそのレセプターの相互作用を阻害する請求項1に記載の生物治療薬組成物、または請求項2に記載の抗体の治療的に有効な量を患者に投与する工程を含む、前記疾患治療方法。
【請求項７】
疾患が骨粗しょう症、慢性関節リウマチおよび歯周病から選択される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
CD200およびそのレセプターの相互作用を細胞内で阻害する化合物を同定する方法であって、（1）CD200およびそのレセプタータンパク質を含む細胞を推定的調節化合物と接触させる工程；および（2）CD200およびそのレセプターの相互作用を阻害する推定的調節化合物の能力を評価する工程を含む、前記化合物の同定方法。
【請求項９】
細胞内でのCD200とそのレセプターとの相互作用のアゴニストである化合物を同定する方法であって、（1）CD200およびそのレセプタータンパク質を含む細胞を推定的調節化合物と接触させる工程；および（2）CD200経路を活性化する推定的調節化合物の能力を評価する工程を含む、前記化合物の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願データ：本出願は米国仮特許出願60/880,094（2007年1月11日出願）に対する権利を主張する。本研究はNIH基金（A.V.へのグラント（No. DE12110））の支援を受けた。
【背景技術】
【０００２】
多核化破骨細胞は、単核食細胞の融合から生じ、骨吸収で主要な役割を果たす（Vignery, 2005a, b, c）。破骨細胞は骨の発育および再生の両方で必須であり、破骨細胞の数および／または活性の増加は、全身性骨低下を伴う疾患（例えば骨粗しょう症）、および局所性骨低下を伴う疾患（例えば慢性関節リウマチおよび歯周病）を生じる。融合は破骨細胞の分化の最重要工程であるので、マクロファージ融合の分子的メカニズムの細部の理解が、骨低下防止のための戦法の開発に役立つはずである。
融合に先行する細胞同士の接着には、ウイルスが宿主細胞との融合のために利用するタンパク質セットと類似するものが必要とされるようである（Hernandez et al. 1997）。さらにまた、ウイルスはその標的細胞の融合-タンパク質機構を強奪すると言われている（Vignery, 2000）。ウイルス-細胞融合には吸着メカニズムおよび融合ペプチドの両方が必要であることが今では一般的に受け入れられている。そのような融合の例は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）のgp120（Tリンパ球およびマクロファージ上のCD4と結合する（Dalgleish et al. 1984；Klatzmann et al. 1984））を必要とし、一方、融合分子gp40（gp120と同じ前駆体（gp160）に由来する）は実際の融合事象を始動すると考えられている。以前に我々は、マクロファージが利用する融合機構はウイルスが細胞に感染するために用いる融合機構と同様であると仮定した（Saginario et al. 1995）。MFR/SIRPαは融合の開始時にマクロファージで一過性に誘導されることを、我々は1998年に報告した（Saginario, 1995）。MFR/SIRPαおよびそのレセプター（CD47）は、CD4と同様に免疫グロブリンの上科（IgSF）に属し、それらの相互作用は自己認識およびマクロファージの融合で役割を有する（Han, 2000）。マクロファージの融合メカニズムについてさらに理解を深めるために、我々は、ラットの融合肺胞マクロファージを全ゲノムオリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析に付し、融合の開始時にCD200がde novoに発現されることを見出した。
【０００３】
CD200はIgSFに属し、短い細胞質尾部を有する。CD200は多様なタイプのマウスおよびヒトの細胞（概論についてはMinas & Liverside（2006）を参照されたい）ならびにマウス破骨細胞（Lee et al. 2006）で発現されるが、しかしながらマクロファージでは発現されない。対照的に、CD200のレセプター、CD200R（前記はCD200と同様に2つのIgSFドメインを含む）は、骨髄性細胞でもっぱら発現され、下流のシグナリングを媒介する細胞内ドメインを含む。したがって、CD200はCD47と同様に広く発現されるが、CD200RはMFR/SIRPαと同様にもっぱら骨髄系列に属する細胞で発現されるという点で、CD200-CD200Rは、MFR/SIRPα-CD47の発現パターンと類似の発現パターンを有する。したがって、我々は、CD200-CD200R軸はマクロファージの融合で役割を有し、さらにCD200を欠くマウスはマクロファージの融合に欠陥が有り、結果として破骨細胞の分化および骨再生の両方で欠陥を示すであろうと仮定した。
我々は、CD200の発現が融合の開始時にマクロファージで強力に誘導され、CD200を欠く破骨細胞は、分化およびRANKの下流のシグナリング（破骨細胞形成に必須である）に欠陥を示すことを見出した。我々はまた、CD200-欠損マウスは野生型マウスよりも高い骨密度および少ない数の破骨細胞を有することを見出した。総合すれば、我々の観察は、CD200-CD200R連係は、マクロファージ融合および破骨細胞形成に中心的な役割を有することを示している。
【発明の概要】
【０００４】
発明の詳細な説明
“患者”という用語にはヒトおよび非ヒト哺乳動物が含まれる。
“治療する”または“治療”という用語は患者の病的状態の処置を意味し以下が含まれる：
（i）ある患者が、遺伝的にあるいはまた別の要因で前記病的状態になりやすく、しかも前記病的状態であると未だ診断されていないときに、当該患者における前記病的状態の発生を予防すること；
（ii）患者の前記病的状態を抑制または緩和すること、すなわち病的状態の進行を停止または遅らせること：または
（iii）患者の前記病的状態を取り除くこと、すなわち病的状態を退行または治癒させること。
本明細書にいう推定的化合物には、例えば合理的な薬剤設計による生成物、天然の生成物、および部分的に明らかにされたシグナルトランスダクション調節特性を有する化合物であるものが含まれる。推定的化合物は、タンパク質系化合物でも、炭水化物系化合物でも、脂質系化合物でも、核酸系化合物でも、天然の有機化合物でも、合成により誘導された有機化合物でも、抗イディオタイプ抗体でもおよび／または触媒性抗体でも、または前記のフラグメントでもよい。推定的調節化合物は、例えば天然もしくは合成化合物のライブラリーから、特に化学物質ライブラリーまたはコンビナトリアルライブラリー（すなわち配列またはサイズが異なるが同じ構築ブロックを有する化合物ライブラリー；例えば以下を参照されたい：Rutter and Santiの米国特許5,010,175号および5,266,684号、前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）から入手されるか、または合理的な薬剤設計によって入手できる。
【０００５】
細胞内のCD200、CD200Rタンパク質の活性を調節するために十分な、培養液に懸濁させた推定的調節化合物の適切な量が、既知の検出方法を用いて前記活性の調節を検出できるように前記細胞に添加される。推定的調節化合物の好ましい量は、96ウェルプレートの各ウェル当たり約1nMから約10mMの推定的調節化合物を含む。細胞は適切な長さの時間インキュベートされ、推定的調節化合物が細胞内に侵入して標的タンパク質と相互作用することを可能にする。好ましいインキュベーション時間は約1分から約48時間である。
モノクローナル抗体を作製する技術は周知である。一般的には、不死細胞株（典型的にはミエローマ細胞）が、与えられた抗原（例えばCD200、CD200R）を発現している全細胞で免疫された哺乳動物のリンパ球と融合され、生成されたハイブリドーマ細胞の培養上清が前記抗原に対する抗体についてスクリーニングされる。一般的には以下の文献を参照されたい：Kohler et al. 1975, Nature 265:295-497, “Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity”。
免疫は標準的方法を用いて達成することができる。単位用量および免疫方針は、免疫される哺乳動物種、その免疫状態、当該哺乳動物の体重などに左右される。典型的には、免疫した哺乳動物から採血し、適切なスクリーニングアッセイを用い具体的な抗体について各血液サンプルの血清をアッセイする。例えば、抗インテグリン抗体は、インテグリン発現細胞の125I標識細胞溶解物の免疫沈澱によって確認することができる。例えば抗CD200、CD200R抗体を含む抗体もまた、フローサイトメトリによって、例えばCD200、CD200R分子を認識すると思われる抗体とインキュベートした抗体-発現細胞の蛍光染色の測定によって確認することができる。ハイブリドーマ細胞の作製に用いられるリンパ球は典型的には免疫した哺乳動物から単離され、前記動物は、その血清が抗CD200、CD200R抗体の存在について陽性であることがそのようなスクリーニングアッセイを用いて既に試験された動物である。
【０００６】
典型的には、不死細胞株（例えばミエローマ細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液（“HAT培地”）に感受性を有するマウスミエローマ細胞株である。典型的には、HAT-感受性マウスミエローマ細胞は、分子量1500のポリエチレングリコール（“PEG1500”）を用いてマウスの脾細胞と融合される。融合で生じたハイブリドーマ細胞を続いてHAT培地を用いて選別する（HAT培地は未融合および非生産的融合ミエローマ細胞を殺す（未融合脾細胞は形質転換されないので数日後に死滅する））。所望の抗体を生成するハイブリドーマはハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出される。例えば、抗CD200、CD200R抗体を生成するように作製したハイブリドーマは、組換えCD200、CD200R-発現細胞株と結合する能力を有する分泌抗体についてハイブリドーマ培養上清を試験することによってスクリーニングすることができる。
完全な免疫グロブリンである、本発明の範囲内の抗体ホモローグ（例えば抗CD200、CD200R抗体ホモローグを含む）を製造するために、そのようなスクリーニングアッセイで試験結果が陽性であったハイブリドーマ細胞が、前記ハイブリドーマ細胞が培養液中にモノクローナル抗体を分泌することを可能にする培養条件下で、かつ十分な時間栄養培養液にて培養された。ハイブリドーマ細胞に適した組織培養技術および培養液は周知である。条件付けされたハイブリドーマ培養上清を採集し、場合によって、周知の方法によりCD200、CD200R抗体をさらに精製することができる。
【０００７】
また別には、所望の抗体は、ハイブリドーマ細胞を未免疫マウスの腹腔に注射することによって製造することができる。ハイブリドーマ細胞は腹腔内で増殖し腹水液として蓄積される抗体を分泌し続ける。抗体は、注射筒で腹水液を腹腔から抜き取ることによって採集することができる。
例えばCD200、CD200Rに対する完全にヒトのモノクローナル抗体ホモローグは、本発明の方法において抗原を阻止することができる、また別の好ましい結合物質である。それら無傷の形態として、それらは、Boernerら（Boerner et al. 1991, J Immunol 147:86-95, “Production of Antigen-specific Human Monoclonal Antibodies from In Vitro-Primed Human Splenocytes”）が記載したように、in vitroでプライミングされたヒト脾細胞を用いて製造することができる。
あるいは、それらは、以下の文献に記載されたようにレパートリークローニングによって製造することができる：Persson et al. 1991, Proc Natl Acad Sci USA 88:2432-2436, “Generation of diverse high-affinity human monoclonal antibodies by repertoire cloning”およびHuang and Stollar, 1991, J Immunol Methods 141:227-236, “Construction of representative immunoglobulin variable region cDNA libralies from human peripheral blood lymphocytes without in vitro stimulation”。米国特許5,798,230号（1998年8月25日、”Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use”）は、ヒトB細胞からのヒトモノクローナル抗体の作製を記載している。この方法では、エプスタイン-バーウイルスの核抗原2（EBNA2）を発現するエプスタイン-バーウイルスまたはその誘導体による感染によって、ヒト抗体産生B細胞が不死化される。続いてEBNA2機能（不死化のために要求される）は停止され、それによって抗体の産生が増加する。
【０００８】
完全にヒトの抗体を作製するさらに別の方法として、米国特許5,789,650号（1998年8月4日、”Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies”）は、異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物、および不活化された内因性免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物を記載している。内因性免疫グロブリン遺伝子は、アンチセンスポリヌクレオチドによって、および／または内因性免疫グロブリンに対して作製された抗血清によって抑制される。異種抗体は、非ヒト動物の当該種の遺伝子に通常は見出されない免疫グロブリン遺伝子によってコードされる。再編成されていないヒト免疫グロブリン重鎖の配列を含む1つ以上のトランスジーンを非ヒト動物に導入し、それによって、トランスジェニックな免疫グロブリン配列を機能的に再編成して、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされる多様なアイソタイプの抗体レパートリー産生することができるトランスジェニック動物を作製する。そのような異種ヒト抗体はB細胞で産生され、前記細胞はその後、例えば不死化細胞株（例えばミエローマ）と融合させることによって、またはそのようなB細胞を他の技術により操作して、モノクローナルで異種の完全にヒトの抗体ホモローグを産生することができる細胞株を永続化させることによって不死化する。
【０００９】
融合開始時のマクロファージにおけるCD200のde novo発現
マクロファージ融合機構の新規な成分を確認するために、我々は、ラットの融合肺胞マクロファージを全ゲノムマイクロアレイ分析に付した。そのようなマクロファージは、マクロファージ融合の研究のために使いやすく均質なモデル系を提供する（Saginario, 1995；Sterling, 1998；Han, 2000；概論のためにはVignery（2005）を参照されたい）。なぜならば、それらは“未感作”であり、コンフルエントにプレートしたとき、サイトカインを添加することなくin vitroで自発的に融合するからである。CD200（アクセッション番号＃X01785）をコードする任意の転写物が新しく単離したマクロファージではかろうじて検出されたが、プレート後1時間、24時間および120時間の転写物レベルは、新しく単離した細胞の転写物レベルのそれぞれ0.6±1.4、34.9±7.2、および61.6±23.4倍であった（平均±SD；n＝3）。CD200の細胞表面発現を確認するために、我々は、CD200の細胞外ドメインに対して作製したモノクローナル抗体と多核化肺胞マクロファージを反応させた。平行して、我々は融合肺胞マクロファージを種々の時間にウェスタンブロット分析に付した。MFR/SIRPαの発現はマクロファージ融合の開始時に誘導されるので（Saginario, 1995）、我々は、コントロールとしてこのタンパク質に対して作製した抗体を用いた。我々の実験結果は、プレート後早くも24時間でCD200の強いde novoの発現を確認した（図1A、B）。しかしながら、単核マクロファージで発現されるMFR/SIRPαと異なり、CD200は単核マクロファージでは発現されなかった（図1A）。
【００１０】
CD200が破骨細胞でも発現されたか否かを調べるために、我々は、マウスの骨髄マクロファージをM-CSF（30ng/mL）およびRANKL（50ng/mL）の存在下で5日間培養し、破骨細胞を発生させた（Li et al. 2005）。CD200をコードする転写物はマクロファージでは検出されなかったが、そのような転写物の強い発現がRANKLによって2日目には誘導された。さらにまた、CD200の発現誘導は、RANKLの用量に左右された（図1C）。対照的に、CD200Rの発現は明瞭に構成的であった（図1D）。さらにまた、MFR/SIRPα、CD47およびCD44は破骨細胞の分化の際にそれらの細胞で発現されたが、これらタンパク質のレベルはCD200発現の崩壊によって影響を受けなかった。なぜならばCD200欠損マウスの破骨細胞もこれらのタンパク質を同様なレベルで発現したからである。この観察は、これらの融合分子の発現は、CD200とは別個のメカニズムによって調節されることを提唱している。
CD200は破骨細胞表面で発現されたことを確認するために、我々は、先に記載したように骨マクロファージを培養し、それらをCD200の細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体と種々の時間反応させ、さらにそれらをフローサイトメトリ分析に付した。結果（図2に示す）は、破骨細胞の融合／多核化の開始時におけるCD200の強力でde novoな細胞表面発現を確認した。
総合すれば、我々の結果は、CD200は以前には認識されなかったマクロファージ融合機構の成分でありえることを示している。したがって、我々は、CD200の欠乏は破骨細胞の分化に影響を及ぼし、結果として骨の発育および／または再生に影響を与えるであろうと仮定した。
【００１１】
CD200欠損マウスは野生型マウスより高い骨密度および少ない破骨細胞を有していた
我々は、2ヶ月齢の雄および雌のCD200-/-マウスおよび野生型マウスをDEXA分析に付した（“材料と方法”を参照されたい）。予想したとおり、雄および雌のCD200-/-マウスはともに、対応する野生型マウスより高い脊椎骨密度を有していた（図3）。これらマウスの定量的抹消断層撮影法（pQCT）分析によって、CD200欠損は、月齢および性別が一致する野生型マウスと比較して雄および雌の両方の大腿骨骨幹、および雌の遠位大腿骨の総密度の増加を伴うことが明らかになった（図4）。対応する野生型マウスと比較したとき、CD200欠損雌マウスでは、大腿骨の骨幹および遠位部の小柱領域の増加があったが、CD200欠損雄マウスでは、遠位大腿骨の小柱領域のみ増加した。対応する野生型マウスと比較したとき、骨幹および遠位大腿骨の両方で骨膜環状面において、CD200欠損雄マウスでは増加が、さらにCD200欠損雌マウスでは減少が存在した。したがって、CD200欠損は骨の蓄積強化をもたらし、骨の形状およびサイズは性別特異的態様で変化するように思われた。
CD200の欠如が総骨密度を増加させる細胞メカニズムを分析するために、我々は、CD200欠損マウスおよび月齢性別一致野生型マウスの遠位大腿骨を組織体型測定分析に付した。我々の結果は、野生型と比較したときCD200欠損マウスは雄および雌ともに小柱の骨体積が増加することを確認した（図5）。我々はまた、CD200欠損マウスでは雄および雌ともに破骨細胞によって占有される相対的骨表面積が低下することを見出した。驚いたことに、我々は、CD200欠損雌マウスの骨密度の増加にもかかわらず、破骨細胞によって覆われた骨の相対的表面積低下を見出した（図5）。この結果は、CD200欠損マウスのより高い骨体積の原因となるのは実際のところ破骨細胞であることを示唆した。
骨体積は加齢とともに増加するのか否かを決定するために、我々は、6ヶ月齢のCD200欠損マウスおよび野生型マウスの遠位大腿骨をミクロCT分析に付した。CD200欠損マウスの雄および雌はともに対応する野生型よりも多くの小柱骨を有していた（図5）。この観察は同じ骨のpQCT分析によって支持された（pQCT分析は、小柱密度は対応する野生型よりもCD200欠損マウスで高いことを示した（データは示されていない））。
【００１２】
CD200の欠如は破骨細胞の分化を障害したが骨芽細胞の分化は妨げなかった
CD200の欠如が骨芽細胞の分化に影響を与えるか否かを決定するために、我々は、CD200欠損マウスおよび野生型マウスの骨髄細胞を、アスコルビン酸（50μg/mL）およびβ-グリセロホスフェート（10mM）の存在下で9日間培養し、それらの対応するアルカリホスファターゼ活性および骨様結節の形成能力を比較した。CD200の欠如は、骨芽細胞によるアルカリホスファターゼ活性および結節形成に対して影響を与えなかった（図6）。しかしながら、骨芽細胞のウェスタンブロット分析によって、相対的に低レベルのCD200発現（Lee et al. 2006）およびCD200Rの欠如が確認された。これらのデータは、骨体積の増加は骨芽細胞に起因しえないことを示唆した。
CD200欠損マウスにおけるin vitroで認められる破骨細胞数の低下は、破骨細胞の前駆細胞数の低下または破骨細胞形成の欠陥から生じる可能性がある。これらの可能性を調べるために、我々は、新しく単離した骨髄細胞を、前破骨細胞によって発現される表面マーカー（c-FMs+/c-Kit+/Macllow；Arai et al. 1999；Jimi et al. 2004）を用いるフローサイトメトリ分析に付した。骨髄細胞の総数に対する前駆細胞のパーセンテージは、CD200+/+マウスおよびCD200-/-マウスで類似していた（図6）。我々は、M-CSF（30ng/mL）の存在下で、さらにRANKLの濃度を増加させながら5日間マウス骨髄マクロファージを培養して破骨細胞を発生させた。CD200の欠如は、破骨細胞数および破骨細胞によって覆われる表面積の用量依存性低下をもたらした（図6）。これらのデータは、骨体積の増加は破骨細胞形成における欠陥から生じるという我々の仮説を強く支持した。
【００１３】
RANKL（RANKの下流で作動するNF-kBおよびMAPキナーゼシグナリング経路を活性化する）は破骨細胞生成に必須であるので、我々は、次にCD200の欠乏はRANKの下流のシグナリングに影響を与える可能性があるか否かを調べた。我々は、CD200欠損マウスおよび野生型マウスの骨髄細胞をM-CSF（30ng/mL）の存在下で2日間培養し、続いてそれらを2時間飢餓状態に置いた後、RANKL（50ng/mL）で2時間まで処理し、最後にIkBα、p38、ERK1/2およびJNKに対して作製したリン酸化型特異的抗体ならびにコントロール抗体を用いて、それらをウェスタンブロット分析に付した。IkBαの活性化の程度は時間とともにわずかに低下したが、JNKの活性化はCD200を欠く細胞内でほぼ完全に停止した。これらの結果は、CD200の欠如はRANK下流シグナルのトランスダクションを減弱させることを示し、CD200-CD200R相互作用は、このシグナリング経路および破骨細胞形成で役割を有する可能性を示唆した。
【００１４】
CD200-CD200R連係は融合機構の新規な構成要素である
マクロファージの融合におけるCD200-CD200R連係の推定的役割を説明するために、我々は、いくつかの補完的方法を用いた。第一に、我々は、CD200を欠く細胞におけるin vitro破骨細胞分化を外因性CD200が救済できるか否かを調べた。我々は、マウスCD200の細胞外ドメインを含む可溶性組換えタンパク質（rCD200e）を作製した。CD200欠損マウスおよび野生型マウスから単離した骨髄細胞をM-CSF（30ng/mL）、RANKL（50ng/mL）、およびrCD200e（0.5μg/mL）の存在下で培養した。rCD200e の添加によってCD200欠損破骨細胞の分化が救済された（図8）。我々は、次に、rCD200e 誘発融合はJNKおよびIkB活性化（前記はCD200の欠如下では抑制されている）の結果であるか否かを調べた。我々は、CD200欠損マウスおよび野生型マウスの骨髄細胞をM-CSF（5ng/mL）の存在下で2日間培養した。それらを2時間飢餓状態に置いた後、それらをRANKL（50ng/mL）で30分、rCD200e の存在下および非存在下にて処理し、最後に、上記に記載したようにそれらをウェスタンブロット分析に付した。rCD200e の添加はIkBαおよびJNKの活性化を回復させ、IkBαおよびJNKのCD200R媒介活性化を介する破骨細胞の分化におけるCD200の役割を支持した（図8）。
【００１５】
我々は、次に、CD200-CD200R相互作用が融合において役割を果たすならば、この相互作用に関する干渉は融合を阻止するはずであると仮定した。我々は、CD200Rの細胞外ドメインを含む可溶性マウス組換えタンパク質（rCD200Re）を作製した。我々は、野生型マウスの骨髄細胞をM-CSF（30ng/mL）およびRANKL（50ng/mL）の存在下で、rCD200Reの非存在下および存在下（10−1,000ng/mL）で培養した。予想したとおり、破骨細胞形成はrCD200Reの存在下で阻止された（図9）。CD200R（CD200R1としてもまた知られている）に加えて、マウスはCD200R2、CD200R3およびCD200R4を発現する（Wright et al. 2003）。我々は、マウス破骨細胞は、CD200R1およびCD200R4をコードする転写物のみを発現することを見出した（データは示されていない）。今日まで、これら追加のレセプター（CD200R2、R3およびR4）の機能は不明のままである。しかしながら、CD200はCD200R1とのみ結合しこれを活性化する（Hatherley et al. 2005）。
最後に、融合におけるCD200Rの役割をより直接的に調べるために、我々は、融合マクロファージでこのレセプターの発現を、短いヘアピンRNA（shRNA）によるRNA干渉（RNAi）によってサイレンシングすることを試みた。我々は、CD200R1に誘導される3つのレトロウイルス系shRNA構築物（shRNAi1、shRNAi2およびshRNAi3）とともに、ランダム配列をコードする構築物（MigR1rdm）を作製した。我々は、野生型マウスから単離した骨髄マクロファージにこれらの構築物とともに空ベクター（MigR1）を形質導入した。shRNA構築物の各々（shRNAi1、shRNAi2およびshRNAi3）は、CD200Rの発現に干渉し、破骨細胞の融合を妨げた（図9）。対照的に、MigR1もMigR1rdmもCD200Rの発現および破骨細胞の分化に影響を与えなかった。総合すれば、これらの結果は、マクロファージの融合および破骨細胞形成のCD200-CD200R連係に対して提唱された中心的役割を確認した。
【００１６】
CD200-CD200R連係は、マクロファージの融合および／または多核化における新規で中心的なプレーヤーであるように思われる（前記は破骨細胞の分化および骨質量の調節に必要である）。我々の結果は、単核マクロファージはCD200を発現しないことを確認したが、それら結果は、マクロファージの融合が強力でde novoなCD200の発現を伴うことを明らかにした。CD200の発現は融合破骨細胞で突然に誘導されるだけでなく、CD200の欠如は破骨細胞形成を障害し、続いて骨体積が増加し、したがって大理石骨病の軽症型を生じる。
骨髄細胞総数のパーセンテージとして骨髄マクロファージ／破骨細胞前駆細胞数の我々の分析（CD欠損マウスと野生型マウスで類似していた）は、CD200-CD200R連係は前駆単球の分化を制御しないことを提唱している（Fumio Arai et al. 1999；FACS分析についてはEijiro Jimi et al. 2004）。これは脾および腸間膜リンパ節のマクロファージ数と対照的である（前記は、CD200を欠くマウスで上昇する）（Hoek et al. 2000）。骨髄由来のものは類リンパ器官のものよりも分化の程度が低い可能性があり、低レベルのCD200を発現する可能性がある。それにもかかわらず、CD200欠損マウスにおける破骨細胞数の減少は、前駆細胞数の減少に帰することはできない。
【００１７】
CD4（HIVのレセプター）およびIzumo（Inoue et al. 2005）（精子融合タンパク質）と同様に、CD200およびCD200RはともにIgSFに属し、その類似性は細胞融合メカニズムにおけるいくつかの共有性を示唆している。さらにまた、CD200様タンパク質の遺伝子が、二本鎖DNAウイルス（例えばポックスウイルス、ヘルペスウイルス、およびアデノウイルス）ファミリーのいくつか（全てではないが）のメンバーのゲノムで確認されている（Chung et al. 2002；Foster-Cuevas et al. 2004）。さらにまた、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスのK14遺伝子の生成物はCD200Rのリガンドである（Chung, 2002；Foster-Cuevas, 2004）。同様に、M141Rは、粘液腫ウイルスによってコードされる、CD200とアミノ酸レベルにおいて顕著な相同性を有する細胞表面タンパク質であり、前記はヨーロッパウサギでの粘液腫ウイルスの完全な発症のために必要である（Cameron et al. 2005）。極めて重要なことには、CD200およびそのウイルスホモローグはともにCD200Rを活性化して、好塩基球（HHV-8；Shiratori, 2005）およびマクロファージ（HHV-8およびM141R；Foster-Cuevas, 2004；Cameron, 2005）機能をダウンレギュレートさせる。したがって、CD47の事例のように（CD47はワクシニアおよび粘液腫ウイルスによってコードされるタンパク質と相同である（Parkinson et al. 1995；Cameron et al. 2005））、ウイルスはCD200を“強奪”して、免疫応答を回避して細胞に融合し、これにウイルスを感染させるのかもしれない。
【００１８】
CD200-CD200Rの連係は免疫系において抑制性の役割を果たすが、マクロファージ融合においては、CD200の欠如は破骨細胞の分化を遅らせるので賦活性の役割を果たすように思われる。MFR/SIRPα-CD47の連係は破骨細胞の形成において賦活性の役割を果たすと提唱されているので、これら2種の連係は連続して作動し、破骨細胞の分化を確実にするという可能性がある。CD47およびCD200がともに欠如しているマウスはこの質問の答えに対するモデルを提供するかもしれない。さらにまた、我々は、CD200とそのレセプターがそれらのアミノ末端ドメインを介してcisおよびtransの両方で会合している可能性を排除することができない。なぜならばその融合パートナーはともにマクロファージだからである。実際、下流のシグナリングがcisまたはtransで弁別的に活性化されるか否かを将来の研究で決定することは重要であろう。
CD200欠損マウスにおける破骨細胞の形成の欠陥は、RANKの下流の活性化における欠陥から生じるという事実は、CD200RとRANKとの間の混線の可能性を示唆している。しかしながら、我々は、CD200の欠如は破骨細胞形成を遅らせるが、前記欠如はMFR/SIRPαおよびCD44（それらはマクロファージ融合機構の候補メンバーである）の発現を妨げないことに留意しなければならない。CD200の欠如がDC-STAMP（マクロファージ融合機構のもっとも新しく認定された成分である（Yagi, 2005；Vignery, 2005））の発現に影響を及ぼすか否かはこれから決定されなければならない。総合すれば、我々の結果は、マクロファージ融合機構は、多様な、おそらくは極めて豊富な分子を必要とすることを提唱している。
CD200の欠如は骨質量を増加させ、CD200Rの可溶性組換え細胞外ドメインはin vitroでマクロファージ融合を阻止した。したがって、CD200およびそのレセプターは、骨の低下を防ぐための新規な標的でありえよう。しかしながら、培養骨芽細胞は低レベルのCD200を発現し、CD200の欠如はそれらのin vitro分化に影響を与えないとしても、これら細胞のin vivoにおけるCD200の可能な役割を我々は排除することはできない。CD200Rの可溶性組換え細胞外ドメインによる動物モデルの治療を含む更なる研究がこの問題の解明に役立つであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ラット肺胞マクロファージおよびマウス骨髄由来マクロファージは多核化に際してCD200を発現する。新しく単離したラット肺胞マクロファージを各ウェルの表面の50%にわたってコンフルエントにプレートし、融合および多核化を促進させた。5日後に、それら細胞を免疫組織化学分析に付した。単核マクロファージはMFR/SIRPαおよびCD44について陽性であったが、CD200については陽性ではなかった点に留意されたい（棒線＝1mm）。さらに、多核化ラット肺胞マクロファージは、DAPIで染色された（青色）数百の核を含んでいた点にもまた留意されたい。新しく単離したラット肺胞マクロファージをAのようにプレートし、表示の時間にウェスタンブロット分析に付した。CD200は最初の24時間はマクロファージで検出されなかった点に留意されたい。マウス骨髄由来マクロファージをM-CSF（30ng/mL）およびRANKL（100ng/mL）の存在下で表示の時間培養し、多核化破骨細胞の分化を誘導した。細胞をRT-PCRによって分析した。マウス骨髄由来マクロファージはCD200レセプターI（CD200RI）の転写物を発現したが、CD200の転写物は発現しなかった点に留意されたい。GAPDHのmRNAに比して、M-CSF（30ng/mL）およびRANKLの用量増加に応答するCD200のmRNAの増量を測定した（棒線は標準偏差を示す；ｎ＝3）。マウス骨髄由来マクロファージをM-CSF（30ng/mL）およびRANKL（100ng/mL）の存在下で表示の時間培養し、多核化破骨細胞の分化を誘導した。表示の抗原に対して誘導した抗体を用いて細胞をウェスタンブロット分析に付した。
【図２】CD200の発現のフローサイトメトリ分析（蛍光活性化細胞分類装置（FACS）による）である。マウス骨髄由来マクロファージをCD200+/+およびCD200-/-マウスから単離し、M-CSF（30ng/mL）およびRANKL（100ng/mL）の存在下で培養し、表示の時間にCD200に対して誘導した抗体およびコントロールアイソタイプ抗体を用いてフローサイトメトリ分析に付した。骨髄由来マクロファージは、M-CSFおよびRANKL（前記は融合、多核化および破骨細胞形成を促進する）の存在下で時間とともに量を増加させながらCD200を発現させた。
【図３】CD200の欠如は骨密度を増加させる。2ヵ月齢の雄および雌のCD200欠損マウスは、野生型マウスよりも高い脊椎骨ミネラル密度を有していた（PIXImus/DEXA；n=8）。
【図４】2ヵ月齢のCD200欠損マウスおよび野生型マウスの遠位大腿骨および大腿骨骨幹のpQCT分析である。雄および雌CD200欠損マウスの大腿骨骨幹は総骨密度を増加させたが、一方、雌のCD200欠損マウスのみが小柱領域を減少させた点に留意されたい。雄および雌の両CD200欠損マウスの遠位大腿骨は総骨密度を増加させた。対照的に、小柱領域および骨膜環状面は、野生型と比較して、CD200欠損の雄で増加し、CD200欠損の雌で減少した。
【図５】2ヵ月齢のCD200欠損の雄および雌マウスならびに野生型マウスの基部脛骨のトルイジンブルー染色切片（棒線＝1mm）である。2ヵ月齢のCD200欠損雄および雌マウスの基部脛骨の組織体型測定分析。雄および雌の両CD200欠損マウスは、骨体積（BV/TV）増加、および骨表面に対する破骨細胞表面（Oc.S/BS）の減少を示した。雌のCD200欠損マウスはまた、骨芽細胞表面（Ob.S/BS）の減少を示した。6ヶ月齢雄および雌のCD200欠損マウス由来の遠位大腿骨のMicroCT分析である。野生型と比較して雄および雌のCD200欠損マウスの遠位大腿骨内部の小柱密度の増加に留意されたい。骨断面の最大直径はおおざっぱに約3mmに相当する。
【図６】骨芽細胞はCD200Rを発現せず、骨芽細胞も前骨芽細胞もCD200の欠如によって影響を受けない。6ヶ月齢から8ヶ月齢のCD200欠損マウスおよび野生型マウスの骨髄細胞を24ウェルプレートにプレートし（5ｘ106細胞/ウェル）、骨芽細胞表現型を得るためにアスコルビン酸（50μg/mL）およびβ-グリセロホスフェート（10mM）を補充したα-MEMで9から11日培養した。細胞の溶解物をアルカリホスファターゼ活性およびタンパク質濃度について調べた（SD；n＝6）。骨芽細胞をアルカリホスファターゼ活性について調べ、さらにアリザリンレッドSでカルシウムについて染色してウェル当たりの小結節数の定量を可能にした（SD；n＝6）。細胞をマウスCD200、CD200RおよびGAPDHに対して誘導した抗体を用いてウェスタンブロット分析に付した。6週齢のCD欠損マウスおよび野生型マウスの骨髄由来マクロファージをM-CSF（30ng/mL）の存在下で、フローサイトメトリ分析に付す前に2日間、細胞表面マーカーとしてc-fms、Mac-1およびC-kitに対して誘導した抗体を用いて培養した。CD200の欠如は破骨細胞の前駆細胞数に影響を及ぼさなかった点に留意されたい（左図版、棒線＝SD；n＝5）。6週齢のCD200欠損マウスの骨髄由来マクロファージをM-CSF（30ng/mL）の存在下およびRANKLの濃度を増加させながら5日間培養して、破骨細胞の分化を誘導した。CD200を欠く骨髄マクロファージは、野生型細胞よりも少ない破骨細胞を形成した（右図版；棒線＝SD；n＝5）。
【図７】CD200を欠く破骨細胞では、RANKの下流のシグナリング分子の活性化が抑制される。CD200欠損マウスおよび野生型マウスから単離した骨髄マクロファージをM-CSF（5ng/mL）の存在下で12−18時間培養した。非接着性細胞をさらに2日間24ウェル皿で培養し、2時間飢餓状態に置き、続いて50ng/mLのRANKLにより表示時間刺激した。SDS-PAGE分析のためにレムリ（Laemmli）サンプル緩衝液（プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害物質を補充）で細胞を溶解し、表示の抗原に対して誘導した抗体によるウェスタンブロット分析に付した。IkBおよびJNKのリン酸化による活性化は、野生型細胞よりもCD200欠損細胞で程度が弱かった。この実験を3回繰り返し同様な結果が得られた。
【図８】CD200-CD200R連係が破骨細胞の融合／多核化に要求される。6週齢の野生型マウスの骨髄由来マクロファージを、M-CSF（30ng/mL）およびRANKL（50ng/mL）の存在下で、組換え細胞外CD200ドメイン（rCD200e；100ng/mL）を添加しまたは添加しないで培養した。rCD200eは、CD200を欠くマクロファージ内で破骨細胞の分化を可能にした（SD；n＝3）。CD200欠損マウスおよび野生型マウスから単離した骨髄マクロファージをM-CSF（5ng/mL）の存在下で12−18時間培養した。非接着性細胞をさらに2日間M-CSF（30ng/mL）の存在下で培養し、2時間飢餓状態に置き、続いてRANKL（50ng/mL）でrCD200eとともにまたはrCD200e無しに30分処理した。続いて細胞をIkBαおよびJNKならびにそれらのリン酸化型に対する表示の抗体によるウェスタンブロット分析に付した。rCD200eの添加はJNKおよびIkBαの活性化を回復させた。
【図９】6週齢の野生型マウスの骨髄由来マクロファージを、M-CSF（30ng/mL）およびRANKL（100ng/mL）の存在下で、CD200レセプターの組換え細胞外ドメイン（rCD200Re）を添加しまたは添加しないで培養した。rCD200Reは、マクロファージの融合を阻止した（SD；n＝5）。6週齢の野生型マウスの骨髄由来マクロファージをM-CSF（5ng/mL）の存在下で、レトロウイルスベクターMigR1（前記はCD200R1 cDNAの後ろに設計された短いヘアピンRNAをコードするか、またはコードしない）による形質導入の前に2日間培養した。ランダム（rdm）オリゴヌクレオチドをコードする構築物を陰性コントロールとして用いた。3つの標的誘導レトロウイルス構築物の各々（すなわちshRNAi1、shRNAi2およびshRNAi3）はCD200R1の発現を停止させ、多核化破骨細胞の形成を妨げた。
【図１０】骨密度はCD200の欠如下で増加した。A：6ヶ月齢の雄および雌のCD200欠損マウスは小柱密度の増加を示した。CD200欠損の雄はまた、野生型の雄よりもはるかに高い皮質下含有量を示した（pQCT；n＝8）。B：CD200の欠如は卵巣摘出に応答する骨低下を防止しなかった。2ヵ月齢の雌のCD200欠損マウスおよび野生型マウスをコントロールとして用いるか、またはそれらを擬似手術もしくは卵巣摘出術に付した（n＝8；SD）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
実験の説明
動物：CD200-/-マウスは以前に記載されたように相同組換えによって作製した（Hoek et al. 2000）。マウスは、CD200+/+フォワードプライマー5'-gtagaagatccctgcatccatcag-3'およびリバースプライマー5'-gcccagaaaacatggtcacctac-3'（前記は、野生型マウスについて1000塩基のPCR生成物およびCD200欠損マウスについて1250塩基のPCR生成物を生じる）を用いてPCRによってスクリーニングした。動物はエール動物飼育（Yale Animal Care）施設で、免疫欠損マウスのために用意した無菌的条件下（オートクレーブ処理ケージおよび飼料とともに、清浄空気キャビネット内でのケージの交換／無菌技術を使用する交換ステーションを含む）で飼育および交配した。骨を組織体型測定分析に付すマウスには、殺処分の1および6日前に2回のカルセイン（3μg/g体重；Merck, Darmstadt, Germany）のi.p.注射を与えた。エール動物飼育利用委員会（Yale Animal Care and Use Committee）は全実験を承認した。
骨ラジオグラフィー： MX-20（Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL）を3秒間30kVで用いて、摘出大腿骨をX線照射に付した。X線はEpson Perfection 4870でスキャンした。
ミクロスケールでのコンピュータ連動断層撮影法（ミクロCT）：6ヶ月齢雄のCD200-/-およびCD200+/+マウスの近位脛骨を、ミクロCTスキャナー（microCT40；Scanco, Bassersdorf, Switzerland）で2,048ｘ2,048マトリックスおよび12μmボクセルサイズによる9μm3の等方性解析を用いてスキャンし、二次海綿体の三次元小柱測定は以前に記載されたように直接実施した（Li et al. 2005）。
【００２１】
骨密度測定法：骨密度は、以前に記載されたように（Ballica et al. 1998）、ストラテック(Stratec)スキャナーモデルXCT960M（Norland Medical Systems, Fort Atkinson, WI）を用い抹消定量性コンピュータ連動断層撮影法によって決定した。日常的な目盛修正は、ルーサイトに包埋されたヒドロキシアパタイト結晶を含む規定の標準物（Norland Medical Systems提供）を用いて毎日実施した。我々は、遠位大腿骨骨端線の遠位端から近位側に3mmの距離に置いた1mmの厚さのスライスをスキャンした。ボクセルサイズは0.15mmに設定した。スキャンは、製造業者から供給されたソフトプログラム（XMICE, ヴァージョン5.1）を用いて分析した。骨密度および幾何学パラメーターはループ分析によって概算した。低密度および高密度閾値はそれぞれ1,300および2,000に設定した。骨外側端からの軟組織の分離は輪郭（contour）モード1を用いて実施した。皮質骨（高い骨密度）および小柱骨（低骨密度）を分離し、剥離（peel）モード3を用いて小柱データを得た。皮質骨および小柱骨を分離し、皮質モード1を用いて皮質データを得た。
組織体型測定法：以前に記載されたように（Baron et al. 1982）、CD200+/+およびCD200-/-マウスの脛骨を連続勾配エタノールで脱水し、脱灰せずにメチルメタクリレートに包埋した。炭化カーバイド刃付きオートカット（AutocutTM）ミクロトーム（Jung, Reichert, Germany）により縦方向切片を切り出した。4μmの厚さの切片をトルイジンブルー（pH3.7）で染色し、静的組織体型分析に付し（一方、動的組織体型分析のためには無染色の8μm切片をマウントした）、分析は、画像分析システム（OsteomeasureTM；Osteometrics, Atlanta, GA）を用い、成長線（小柱骨を含む）から一定の距離で実施した。測定したパラメーターには以下が含まれていた：総体積に対する骨体積（BV/TV）；ミネラル付加速度を考慮した骨形成速度（BFR/BV）；活動性吸収周線当たりの破骨細胞数（N.Oc/B.Pm）；活動性形成周線当たりの骨芽細胞数（N.Ob/B.Pm）および骨体積に対する類骨体積(OV/BV)。
【００２２】
試薬：組換えマウスRANKLおよびM-CSFをR&Dシステム（Minneapolis, MN）から入手した。ラットCD200に対して作製されたマウスモノクローナル抗体およびマウスCD200およびCD200Rに対して作製されたラットモノクローナル抗体はセロテック（Serotec, Raleigh, NC）から購入した。MFRの細胞内ドメインに対して作製されたポリクローナル抗体は以前に報告した（Han, 2000）。p38、リン酸化p38（P-p38）、ERK1/2、P-ERK1/2、JNKに対して作製されたウサギポリクローナル抗体、およびIkB、P-IkBおよびP-JNKに対して作製されたマウスモノクローナル抗体は、セルシグナリング（Cell Signaling, Beverly, MA）から入手した。マウスCD44に対して作製されたモノクローナル抗体は、BDバイオサイエンス（BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ）から入手した。GAPDHに対して作製されたマウスモノクローナル抗体は、ノヴァスバイオロジカルズ社（Novus Biologicals, Inc. Littleton, CO）から購入した。ウサギおよびマウスIgGに対して作製されたセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合F(ab')2は、ジャクソンイムノリサーチ（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）から購入した。フローサイトメトリに使用したラット抗マウスモノクローナル抗体には以下が含まれていた：フルオレセイン結合抗Mac-1（CD-11ｂ）（Mac1-FITC；M1/70；PharMingen, San Diego, CA）、フィコレイトリン結合抗c-fmsおよびアロフィコシアニン結合抗c-Kit（c-kit-APC；eBioscience, San Diego, CA）。二次抗体のFITC結合抗ラットIgG2aはファーミンゲン（PharMingen）から購入した。組織培養用の全ての供給物および試薬はエンドトキシンを含まなかった。いくらかの骨髄細胞は硫酸ポリミキシンBで24時間処理し、処理前のエンドトキシンの作用を回避した。
【００２３】
骨髄マクロファージおよび破骨細胞：6週齢から12週齢のCD200-/-およびCD200+/+マウスの骨髄細胞を10cmの培養皿に入れ、10%FBS補充α-MEM（Life Technologies, Grand Island, NY）中でM-CSF（5ng/mL）（1ｘ107細胞/10cm培養皿）の存在下で12−18時間培養した。非接着細胞を採集し、M-CSF（30ng/mL）とともに上記と同じ密度でさらに48時間10cm培養皿で培養した。浮遊細胞を除去し、接着細胞（酒石酸塩耐性酸性ホファターゼ陽性（TRAP+）マクロファージ）を破骨細胞の前駆細胞として用いた（Li et al. 2005）。破骨細胞を生じさせるために、我々は、骨髄マクロファージをRANKL（50ng/mL）およびM-CSF（30ng/mL）の存在下で、またはL929細胞の培養上清の30%（v/v）希釈の存在下で、0.5ｘ106細胞/mLの密度で96ウェル、24ウェルまたは60mm培養皿で培養した。
【００２４】
ウェスタンブロット分析：プロテアーゼ阻害物質カクテル（コンプリートタブレット、Roche Molecular Biochemicals）およびホスファターゼ阻害剤カクテル2（Sigma, St Louis, MI）を補充した非変性RIPA緩衝液（150mMのNaCl、20mMのトリス（pH7.5）、1%のNP40、5mMのEDTA）中で、培養細胞を直接溶解させた。溶解物を超音波処理し、2ｘ105細胞の等価物を、10%変性または非変性アクリルアミドゲルに添加し、1−2時間泳動させた。前記タンパク質をニトロセルロース膜に移し、さらにT-PBS中の5%ドライミルクでブロックした。一次抗体および二次抗体と連続してインキュベートした。最後に膜をスーパーシグナル（ECL kit, Pierce Chemical Co., New York）とともにインキュベートし、ｘ線フィルムを感光させた。
【００２５】
非接着骨髄細胞を用いた破骨細胞の発生：6週齢から8週齢のCD200+/+およびCD200-/-マウスの骨髄細胞を10cmの培養皿にプレートし、10%FBS補充α-MEM中でM-CSF（10ng/mL、107細胞/10cm培養皿）の存在下で12−18時間培養した。非接着細胞を採集し、M-CSF（30ng/mL）とともに上記と同じ密度でさらに48時間10cm培養皿で培養した。浮遊細胞を除去し、接着細胞を破骨細胞の前駆細胞として用いた。破骨細胞を生じさせるために、骨髄マクロファージをRANKL（25−100ng/mL）およびM-CSF（30ng/mL）の存在下、またはL929細胞の培養上清の30%（v/v）希釈の存在下で、4ｘ105細胞/cm2の密度で96ウェル、24ウェルまたは60mm培養皿で培養した。TRAP陽性破骨細胞様多核細胞（3つ以上の核を有する）を組織体型測定に付した。
【００２６】
骨芽細胞アルカリホスファターゼ（ALP）アッセイ（Mikihiko Morinobu et al. 2005）：6週齢から8週齢のCD200-/-およびCD200+/+マウスの骨髄細胞を24ウェルプレートにプレートし（5ｘ106細胞/ウェル）、10%FBS、50μg/mLアスコルビン酸、10mMβ-グリセロホスフェート補充α-MEM中で培養した。培養液を3日毎に交換し、細胞を9日間培養した。この細胞を2回氷冷PBSですすぎ、2mMのMgCl2および0.05%のトリトンX-100を含む10mMトリス-HCl（pH8.2）中に掻きとった。2回の凍結融解の後で細胞溶解物を短時間氷上で超音波処理した。上清のアリコットを、製造業者の指示にしたがいALP活性測定（Sigma, St Louis, MI）に付し、タンパク質濃度はBradfordにしたがって決定した。
【００２７】
石化結節形成アッセイ（Mikihiko Morinobu et al. 2005）：6週齢から8週齢のCD200-/-およびCD200+/+マウスの骨髄細胞を24ウェルプレートにプレートし（5ｘ106細胞/ウェル）、10%FBS、50μg/mLアスコルビン酸、10mMβ-グリセロホスフェートおよび抗生物質（100U/mLペニシリン、100μg/mL硫酸ストレプトマイシン）補充α-MEM中で培養した。培養液を3日毎に交換し、細胞を11日間培養した。培養の終わりに、細胞を10%ホルマリン/食塩水で固定し、石化骨結節を識別するためにアリザリンレッドS（Sigma, St Louis, MI）でカルシウムを染色した。ウェル当たりの結節数を記録した。
【００２８】
フローサイトメトリー
細胞を第一の抗体で染色し、氷上で30分インキュベートし、さらに洗浄緩衝液（5%FCS/PBS）で2回洗浄した。二次抗体を添加し、細胞を30分氷上でインキュベートした。インキュベーションの後で細胞を洗浄緩衝液で2回洗浄し、さらにFACS分析のために洗浄緩衝液に懸濁した。FACS分析はFACSカリブール（FACS Calibur, BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ）を用いて実施した。
【００２９】
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）
全RNAを製造業者の指示にしたがいトリゾール（Trizol, Invitrogen, Carlsbad, CA）に抽出した。第一鎖cDNAは、1μgの全RNAおよびモロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素を用いて合成した。PCR反応のプライマー対は以下のとおりであった：GAPDHフォワード、5'-AAACCCATCACCATCTTCCA-3'；リバース、5'-GTGGTTCACACCCATCACAA-3'、（前記によって198塩基サイズの生成物が生じた）；TRAPフォワード、5'-CAGCTGTCCTGGCTCAAAA-3'、リバース、5'-ACATAGCCCACACCGTTCTC-3'（前記によって218塩基サイズの生成物が生じた）；CD200、フォワード5'-AGTGGTGACCCAGGATGAA-3'、リバース、5'-TACTATGGGCTGTACATAG-3'、（前記によって337塩基サイズの生成物が生じた）；CD200R1フォワード、5'-AGGAGGATGAAATGCAGCCTTA-3'、リバース、5'-TGCCTCCACCTTAGTCACAGTATC-3' （前記によって103塩基サイズの生成物が生じた）。CD200R2、CD200R3およびCD200R4については、我々は、Voehringerら（2004）が記載したプライマーを用いた。
増幅は直線範囲内の21−25サイクルで実施した。各サイクルは、0.5μLのそれぞれのcDNA、200mMのそれぞれのプライマー、0.2mMのdNPTおよび1UのTaq DNAポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含む50μLの反応混合物中で、94℃にて30秒；55℃にて30秒；および72℃にて40秒で実施した。増幅後、各反応混合物の30μLを電気泳動に付し、1.2%アガロースゲルで分析した。バンドを臭化エチジウム染色で可視化し、デジタルカメラでスキャンした。半定量PCR実験のためには、CD200バンド対GAPDH内部コントロールの発光値をコダックID5ソフトウェアで測定した。
【００３０】
CD200およびCD200Rの可溶性細胞外ドメイン（それぞれsCD200eおよびsCD200Re）の作製
CD200およびCD200Rの細胞外ドメインを、以下のプライマーを用いて脾細胞cDNAからRT-PCRによって増幅した：CD200フォワード、5'-CCCAAGCTTGGGCAAGTGGAAGTGGTGACCC-3'；リバース、5'-CGGGATCCCGTGGAACTGAAAACCAAAATCCT-3'；CD200Rフォワード、5'-CCCAAGCTTGGGACTGATAAGAATCAAACAACACAGAAC-3'；リバース、5'-CGGGATCCCG GTATGGAATATATGGTCGTAATGATTG-3'。PCR生成物をpSectag/Hygroベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）のHindIIIおよびBamHI部位でサブクローニングした。組換えDNAの配列は配列決定によって立証した。可溶性CD200（sCD200e）およびsCD200Re構築物を293T細胞にトランスフェクトし、上清をトランスフェクション後4日に採集した。sCD200eおよびsCD200Reタンパク質はNi-NTAアガロースビーズによって精製した（Qiagen, Valencia, CA）。sCD200eおよびsCD200Reタンパク質の最終溶出物は、スライド-A-ライサー（Slide-A-Lyser, Pierce）を用いて1xPBSに対して透析し、0.22μmのシリンジフィルターを用いて滅菌した。
【００３１】
短鎖ヘアピンRNA干渉（shRNAi）
我々は、以下のプライマーを用いてU6-Zeocin-shRNAiベクターをPCR増幅することによって、短小ヘアピンRNA（shRNA）を生成し、CD200R発現をサイレントにした：
ユニバーサルフォワードプライマー、5'-gaAGATCTtcGATTTAGGTGACACTATAG（下線付き文字はBglII制限部位を示す）；SH1のためのリバースプライマー、5'-gGAATTCcAAAAAAACCAATCATTACGACCATATATTCCATACCAATATGGAATATATGGTCGTAATGATTGGTTGTCGACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3'；SH2のためのリバースプライマー、5'-gGAATTCcAAAAATGGGCCTCCACACCTGACCACAGTCCTGACCAATCAGGACTGTGGTCAGGTGTGGAGGCCCAGTCGACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3'；SH3のためのリバースプライマー、5'-gGAATTCcAAAAAAAGCAGTATTAATCACATGGATAATAAAGCCAACTTTATTATCCATGTGATTAATACTGCTTGTCGACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3'；スクランブルコントロールのためのリバースプライマー、5'-gGAATTCcAAAAAGACAAGGATGTGACGCCTATACTCTCACTCCAAAGTGAGAGTATAGGCGTCACATCCTTGTCGTCGACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3'（下線付き文字はSH1、SH2、SH3およびスクランブルのためのEcoRI制限部位を示す）。PCR生成物は、以前に記載したように（Pear et al. 1998）、MigRI-IRES-GFPレトロウイルスベクターでサブクローニングした。レトロウイルスは、GPG293パーッケージング細胞株にshRNA構築物をトランスフェクトすることによって生成した。マウス骨髄由来マクロファージに、非接着細胞の再プレートから2時間後にshRNAを8時間形質導入した。続いて感染細胞を30ng/mLのM-CSFを補充した増殖培養液で一晩培養した。感染効率は約45−50%であり、UV光下でGFP発現によってモニターした。感染細胞を100ng/mLのRANKLで3日間処理し、TRAP陽性破骨細胞を記録した。
【００３２】
統計分析
実験群間の統計的に有意な相違は変数分析によって判定した（Zar, 1984）。平均変化の有意性は、アンペアード・スチューデント2テールｔ検定（unpaired Student's two-tailed t-test）によって決定し、有意性はｐ＜0.05のときに認定した。
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【００３３】
破骨細胞および巨細胞は長い間認識されていたが、それらの単核前駆細胞が相互に接着して融合する分子メカニズム（それら細胞の分化において最重要工程）はほとんど理解されていない。実際のところ、細胞-細胞融合自体は（精子-卵母細胞融合または筋原細胞-筋原細胞融合（それぞれ受精および筋肉の発生をもたらす）に関するものであっても）、完全には究明されていない。融合をもたらす細胞-細胞接着は、ウイルスが宿主細胞と融合しそれらのDNAまたはRNAを注入するために利用するタンパク質セットと類似のものが必要とされると考えられる（Hernandez et al. 1997）。ウイルスは、それらの標的細胞から融合タンパク質機構を盗み取ると仮定されている。ウイルス-細胞融合には接着メカニズムおよび融合ペプチドの両方が必要であることが今や明確に受け入れられている。そのような例の1つはヒト免疫不全ウイルスのHIV gp120であり、前記はTリンパ球およびマクロファージのCD4と結合し（Dalgleish et al. 1984；Klatzmann et al. 1984）、一方、同じ前駆体分子（gp160）から生じる融合分子gp40は実際の融合事象を始動させると考えられる。精子-卵母細胞および筋原細胞融合を媒介する推定的融合分子が報告されたが（Blobel et al. 1992；Wakelam, 1989）、これら細胞の接着および融合を支配する実際のタンパク質機構は不明のままである。
マクロファージの融合に関連して、CD44の100kD型（造血細胞によって発現されるもっとも一般的ないわゆる“標準型”）は、ポリオウイルスのHeLa細胞との接着だけでなく（Shepley and Racaniello, 1994）、HIVによる単核性食細胞の感染においても必要である（Rivandeneira et al. 1995）。しかしながら、CD44は、これら2つの事例のいずれにおいてもウイルスレセプターとして機能するわけではない。
【００３４】
MFRは、免疫グロブリン（Ig）の上科に属するI型トランスメンブレン糖タンパク質である（Saginario et al. 1998）。MFRは、その細胞外部分に3つのIgドメインを含みCD4に近似する
CD47（MFR/SIRPαタンパク質のためのリガンド）は、ワクシニアウイルスおよびバリオラウイルスによって発現される。A38Lは、CD47のように実際の融合タンパク質として知られているわけではないが、A38Lは、おそらくポアを形成することによってCa++の細胞内進入を促進する（Sanderson et al. 1996）。実際、ポアの形成は、寄生虫が宿主細胞に侵入するために用いる古典的戦法である（Kirby et al. 1998）。重要なことには、ATPのためのポア形成P2Z/P2X7レセプターの過剰発現は細胞-細胞融合をもたらすが、その後細胞死を生じる。同様に、CD47またはA38Lの過剰発現は細胞死を生じる（Nishiyama et al. 1997）。このことは、向き合う細胞の膜がいったん接近して並置され安定すると、CD47分子は細胞-細胞融合を始動させるポアを形成しえるという可能性を提供する。この最後の可能性は極めて思弁的であるが、興味深い研究手段を提供するであろう。
CD200様遺伝子が、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノウイルスの二本鎖DNAウイルスファミリーのいくつか（全てではないが）のメンバーについて確認されている（Chung et al. 2002；Foster-Cuevas et al. 2004）。カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV/HHV-8）−K14遺伝子生成物はCD200Rのリガンドである（Chung et al. 2002；Foster-Cuevas et al. 2004）。同様に、M141Rは、CD200に対して顕著なアミノ酸類似性を有する細胞表面タンパク質をコードするミクソーマウイルス遺伝子であり、ヨーロッパウサギでの粘液腫ウイルスの完全な発症のために要求される（Camron et al. 2005）。
【００３５】
使用の方法
背景技術の章で述べたように、破骨細胞は骨の発育と再生の両方に不可欠であり、破骨細胞の数および／または活性の増加は、全身性骨低下を伴う疾患を生じる。したがって、本発明は、全身性骨低下を伴う疾患（例えば骨粗しょう症）および局所的骨低下を伴う他の疾患（例えば慢性関節リウマチおよび歯周病）を有する患者を治療する方法を提供する。
本発明はしたがって、骨転移を有する癌の患者を治療する方法を提供する。乳癌および前立腺癌は、女性の癌死の主要原因であり男性では肺癌に続いて二番目の原因である。これらの癌の早期発見および治療は、もっとも早期に発見されたときは、5年生存率を乳癌については98%および前立腺癌については100%へ増加させた。しかしながら、乳癌の生存率は遠隔転移を有すると最初に診断された患者については26%、一方、前立腺癌の生存率は遠隔転移を有する場合33%に下落する。骨格は乳癌および前立腺癌転移の好発部位である。多くの他の一般的な癌（肺および腎腫瘍、メラノーマならびに多発性ミエローマを含む）もまた骨格を攻撃する。
骨転移に対する治療的介在には4つの主要な標的が存在する：（A）腫瘍細胞、しかし腫瘍細胞そのものだけでなく、（B）破骨細胞による骨吸収；（C）骨芽細胞の活性；および（D）腫瘍細胞そのものを取り巻く個々の骨の顕微鏡的環境。破骨細胞ターゲッティングは、骨格を攻撃する全ての腫瘍タイプの承認された臨床処置の基礎を形成する。骨転移形成に対する従来の臨床処置は一時しのぎである。それらは効果的に転移を低下させ、患者の生活の質を改善するが、それらは生存率を高めない。我々は今や、ほとんどのタイプの癌治療が骨低下を引き起こすこと、および骨転移を有する患者の主要な病状が難治性疼痛であることを理解している。癌付随骨転移の形成を防止するためにマクロファージ融合を調節することはきわめて重要である。
参考文献：
John M. Chigwin and Theresa A. Guise. Skeletal Metastases: Decreasing Tumor Burdon by Targeting the Bone Microenvironment. Journal of Cellular Biochemistry 102:1333-1342 (2007)
【００３６】
異物巨細胞：
多核化巨細胞は、長い間、外来微生物、物質、病原体あるいは未確認病因物質の持続的存在により生じる慢性炎症の象徴的な組織学的特徴とみなされてきた。それら細胞は、未だ解明されていないメカニズムにより、さらにまた不確実な生理学的原因のために生じた慢性炎症における血液単球由来マクロファージ-マクロファージ融合により形成される。しかしながら、移植された生物材料上での外来小体巨細胞形成は物質の分解および生物医療装置の機能不良と密接に関係し、したがって生物医療ポリマーに対する慢性炎症応答の望ましくない結果である。
移植生物材料および装置（センサー用分子であれ、デリバー用分子であれ）に対する巨細胞の有害な作用を防止するために、マクロファージ融合を調節することはきわめて重要である。
参考文献：
Amy K. McNally, James M. Anderson. Multinucleated giant cell formation exhibits features of phagocytosis withparticipation of the endoplasmic reticulum. Experimental and Molecular Pathology 79:126 - 135 (2005)
【００３７】
本発明はしたがって、巨細胞腫瘍を有する患者を治療する方法を提供する。骨の巨細胞腫瘍（GCT）（前記はまた破骨細胞腫としても知られている）は、原発性骨溶解性骨新形成であり、前記新形成では、単球性マクロファージ／破骨細胞前駆細胞および多核化破骨細胞様巨細胞が腫瘍内に浸潤する。GCTはまた非骨性組織（例えば子宮）にも生じる。GCTの起源は不明であるが、GCTの腫瘍細胞は、破骨細胞およびそれらの前駆細胞を引きつけることができるケモアトラクタントを産生すると報告されている。GCTは、単球／マクロファージ系列に属する細胞とそれら自身との融合または腫瘍細胞との融合から生じると考えられている。
GCTは通常は良性であるが局所的には攻撃性であり、極めて一般的に長骨の骨端に生じる。稀に、GCTは骨性部位外に発生しえる。骨のGCTからの転移は珍しく、しばしば不活性な状態を示し、外科手術によって対応しえる。さらに稀なことであるが、GCTはきわめて攻撃性の表現型を示すことがある。
巨細胞腫瘍の形成を防止するためにマクロファージの融合を調節することは極めて重要である。
参考文献：
Skubitz KM, Manivel JC.  Giant cell tumor of the uterus: case report and response to chemotherapy.  BMC Cancer 7:46. Review. (2007)
【００３８】
本発明の組成物は、CD200/CD200R、アゴニスト、アンタゴニスト、CD200をベースにするバイオ治療薬、当該経路の活性化を促進する賦活性抗体またはフラグメントを含むことができる。治療薬として使用するためには、本組成物は、任意の一般的な投薬形で任意の一般的な態様で投与することができる。投与ルートには、静脈内、筋肉内、皮下、関節滑液嚢内、輸液、舌下、経皮、経口、局所的または吸入による投与が含まれるが、ただしこれらに限定されない。好ましい投与態様は経口および静脈内投与である。本組成物は単独で投与してもよいが、また前記阻害物質の安定性を強化するか、ある種の実施態様では前記を含む医薬組成物の投与を容易にするか、分解または分散の向上を提供するか、阻害活性を高めるか、補助治療を提供するなどのための補助薬（他の活性成分を含む）と併用して投与してもよい。有利には、そのような併用療法では、通常の治療薬よりも少ない投与量が利用され、したがってそれら薬剤が単一治療として用いられるときに生じる毒性および副作用を回避することが可能である。上記に記載の組成物は、通常の治療薬または他の補助薬と物理的に混合され単一の医薬組成物が形成される。有利には、本組成物はしたがって単一投薬形として一緒に投与することができる。いくつかの実施態様では、そのような組成物の組合せを含む医薬組成物は、少なくとも約5%、より好ましくは少なくとも約20%の組成物（w/w）またはその組合せを含む。本発明の組成物の最適なパーセンテージ（w/w）は変動可能であり、当業者の関与範囲内である。また別には、組成物は別々に（連続的にまたは平行して）投与してもよい。別個に投与することによって投与計画についてより大きな融通性が許容される。
【００３９】
上記で述べたように、ここに記載した組成物の投薬形は、医薬的に許容できる担体および当業者に公知の補助薬を含む。これらの担体および補助薬には、例えばイオン交換物質、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、緩衝物質、水、塩または電解質、およびセルロース系物質が含まれる。好ましい投薬形には、錠剤、カプセル、カプレット、リキッド、溶液、懸濁物、エマルジョン、ロゼンジ、シロップ、再構成可能粉末、顆粒、座薬および経皮パッチが含まれる。そのような投薬形の製造方法は公知である（例えば以下を参照されたい：H.C. Ansel and N.G. Popovish, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th ed., Lea and Febiger 1990）。投薬レベルおよび要件は当分野では周知であり、当業者は、個々の患者に適した利用可能な方法および技術から選択することができる。いくつかの実施態様では、投薬レベルは、70kgの患者に対して約1−1000mg/用量の範囲である。1日当たり1用量が十分であるが、1日当たり5用量まで投与することができる。経口用量については、2000mg/日まで要求することができる。当業者には理解されるところであるが、個々の要件に応じてより低いまたは高い用量を要求することができる。例えば、具体的な投薬および治療計画は、例えば患者の一般的健康状態、患者の疾患の重篤度および経過またはそれに対する処置、ならびに主治医の判断のような要件に左右されるであろう。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【国際調査報告】
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