(57)【要約】  本発明は、ポリヌクレオチドのようなバイオポリマーの自動合成のためのシステムおよび方法である。合成反応は、機械の遊休時間を最小限にするためにそして全運転の終了時でよりむしろ、より短いポリヌクレオチドが完了した場合に取り除かれることを可能にするために別個の反応容積において非同期的に行われる。【選択図】図１
2010502190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の反応容積における合成シーケンスが第二の反応容積における第二の合成シーケンスと非同期性である、
ａ）第一の反応容積において反復する複数の反応を含んでなり、各反応が注入装置で第一の反応容積に試薬を注入することにより引き起こされ、そして反応がポリヌクレオチドを生成する合成シーケンスを行う段階；および
ｂ）第二の反応容積において反復する複数の反応を含んでなり、各反応が注入装置で第二の反応容積に試薬を注入することにより引き起こされ、そして反応がポリヌクレオチドを生成する合成シーケンスを行う段階；
を含んでなるポリヌクレオチドの自動合成方法。
【請求項２】
反復する複数の反応の第一の反応が、第一の反応容積に試薬を加えることおよび第一の反応が起こる第一の期間待機することを含んでなり、第二の反応容積において第二の反応を行うために十分な時間が第一の期間に存在することを決定する段階；第二の反応容積を注入装置に隣接して配置する段階；および第二の反応容積に試薬を注入する段階をさらに含んでなる請求項１の方法。
【請求項３】
第一の反応容積が第一のプレート上に位置し、そして第二の反応容積が第二のプレート上に位置する請求項２の方法。
【請求項４】
第二のプレート上で所望のポリヌクレオチドを完了する段階；合成環境から第二のプレートを取り除く段階および第一のプレート上で別の所望のポリヌクレオチドの合成を継続する段階をさらに含んでなる請求項３の方法。
【請求項５】
合成環境から第二のプレートを取り除く段階が、合成環境を保ちながら第二のプレートをエアロックに通すことを含んでなる請求項４の方法。
【請求項６】
合成環境から第二のプレートを取り除く段階が、合成環境を保つ少なくとも１つのグローブをしたアクセス（ｇｌｏｖｅｄ  ａｃｃｅｓｓ）で第二のプレートを操作することを含んでなる請求項４の方法。
【請求項７】
第三の反応容積において合成シーケンスを行う段階をさらに含んでなり、ここで、複数の反応が注入装置で第三の反応容積に試薬を注入することにより引き起こされ、第一の反応容積における合成シーケンスが第三の反応容積における合成シーケンスと非同期性である請求項１の方法。
【請求項８】
第二の反応容積における合成シーケンスが第三の反応容積における合成シーケンスと非同期性である請求項１の方法。
【請求項９】
複数の反応が注入装置で第三の反応容積に試薬を注入することにより引き起こされる第三の反応容積において合成シーケンスを行う段階、第三の反応容積において第三の反応を行うために十分な時間が第一の期間に存在することを決定する段階；第三の反応容積を注入装置に隣接して配置する段階および試薬を第三の反応容積に注入する段階をさらに含んでなる請求項２の方法。
【請求項１０】
複数の反応が注入装置で第四の反応容積に試薬を注入することにより引き起こされる第四の反応容積において合成シーケンスを行う段階をさらに含んでなり、第一の反応容積における合成シーケンスが第四の反応容積における合成シーケンスと非同期性である請求項７の方法。
【請求項１１】
第一、第二、第三および第四の反応容積が別個のプレート上に位置する請求項１０の方法。
【請求項１２】
プレートが９６ウェルプレートを含んでなる請求項１１の方法。
【請求項１３】
第一および第二の反応容積が別個のプレート上に位置し、プレートが複数の縦列（ｃｏｌｕｍｎｓ）および複数の横列（ｒｏｗｓ）の反応ウェルを有し、同時に反応ウェルの全縦列に試薬を注入する段階をさらに含んでなる請求項１の方法。
【請求項１４】
複数の反応が非ブロック化、カップリング、キャッピングおよび酸化を含んでなる請求項１の方法。
【請求項１５】
統合乾燥チャンバー（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄｅｓｉｃｃａｎｔ  ｃｈａｍｂｅｒ）において１つもしくはそれ以上の試薬を貯蔵する段階をさらに含んでなる請求項１の方法。
【請求項１６】
複数の反応が注入装置で第五の反応容積に試薬を注入することにより引き起こされそして第一の反応容積において形成されるポリヌクレオチドが第五の反応容積において形成されるポリヌクレオチドと異なる配列を有する、第五のプレート上に位置する第五の反応容積をさらに含んでなる請求項３の方法。
【請求項１７】
第一の反応容積において形成されるポリヌクレオチドが第二の反応容積において形成されるポリヌクレオチドと異なる分子量を有する請求項１の方法。
【請求項１８】
第一の反応容積における合成シーケンスが第二の反応容積における合成シーケンスと非同期性である、第一の反応容積および第二の反応容積、第一の反応容積および第二の反応容積に試薬を送達するためのインジェクターを有する注入装置；第一の反応容積および第二の反応容積を注入装置に隣接して可動的に配置するように設定されるｘｙテーブル、ならびに第一の反応容積および第二の反応容積における合成シーケンスに対応する反復する複数の反応を行うように設定される制御装置を含んでなるポリヌクレオチドの自動合成のためのシステム。
【請求項１９】
反復する複数の反応の第一の反応が、第一の反応容積に試薬を加えることおよび第一の反応が起こる第一の期間待機することを含んでなり、そして制御装置が、第二の反応容積において第二の反応を行うために十分な時間が第一の期間に存在することを決定し、注入装置が第二の反応容積に隣接して配置されそして第二の反応容積に試薬を注入するようにｘｙテーブルを操作する請求項１８のシステム。
【請求項２０】
第一の反応容積が第一のプレート上に位置し、そして第二の反応容積が第二のプレート上に位置する請求項１９のシステム。
【請求項２１】
第一の反応容積、第二の反応容積、注入装置およびｘｙテーブルの周りの減少した水分の大気を保つためのドライボックスをさらに含んでなる請求項２０のシステム。
【請求項２２】
ドライボックスがエアロックをさらに含んでなる請求項２１のシステム。
【請求項２３】
ドライボックスが少なくとも１つのグローブをしたアクセスポイントをさらに含んでなる請求項２２のシステム。
【請求項２４】
１つもしくはそれ以上の試薬を貯蔵するように設定される統合デシケーターチャンバーをさらに含んでなる請求項２１のシステム。
【請求項２５】
１つもしくはそれ以上の試薬が、第一及び第二の反応容積への送達まで減少した水分の大気下で保たれるようにデシケーターチャンバーおよびドライボックスが設定される請求項２４のシステム。
【請求項２６】
第三の反応容積を注入装置に隣接して可動的に配置するようにｘｙテーブルが設定され、そして第一の反応容積における合成シーケンスが第三の反応容積における合成シーケンスと非同期性であるように第三の反応容積において反復する複数の反応を行うよう制御装置が設定される、第三の反応容積をさらに含んでなる請求項１８のシステム。
【請求項２７】
第四の反応容積を注入装置に隣接して可動的に配置するようにｘｙテーブルが設定され、そして第一の反応容積における合成シーケンスが第四の反応容積における合成シーケンスと非同期性であるように第四の反応容積において反復する複数の反応を行うよう制御装置が設定される、第四の反応容積をさらに含んでなる請求項２６のシステム。
【請求項２８】
第一、第二、第三および第四の反応容積が別個のプレート上に位置する請求項２７のシステム。
【請求項２９】
プレートが９６ウェルプレートを含んでなる請求項２８のシステム。
【請求項３０】
注入装置が複数の横列および複数の縦列の反応ウェルを含んでなるプレートに試薬を送達するように設定され、そして注入装置が同時に反応ウェルの全縦列に試薬を送達するように設定される請求項１８のシステム。
【請求項３１】
複数の反応が非ブロック化、カップリング、キャッピングおよび酸化を含んでなる請求項１８のシステム。
【請求項３２】
第一および第二の反応容積の状態を評価する段階、反応が完了するのを第一の反応容積が待機していることを決定する段階、第二の反応容積が次の反応の準備ができていることを決定する段階および次の反応を開始するために注入装置に第二の反応容積に送達させるコマンドを送る段階を含んでなるソフトウェア命令を制御装置が含む請求項１９のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一の機械がより多種多様なそして増加した数のポリヌクレオチドを短縮された合成時間で同時に製造することを可能にする、一般にバイオポリマー合成に、そしてさらに特に並行した高品質ポリヌクレオチドの自動合成のための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡシークエンシング、部位特異的突然変異誘発、全遺伝子アセンブリおよび一塩基多型(ＳＮＰ)分析を包含する、近代分子生物学における多くの技術は合成ポリヌクレオチドを用いる。分子生物学において使用される多数の他の試薬と異なり、ポリヌクレオチドは在庫品として一般に利用可能ではなく、各ユーザーの仕様に対して特注される。例えば、ポリヌクレオチドの配列、規模、純度および修飾は、ユーザーにより特定されることができる。
【０００３】
ポリヌクレオチド合成化学およびプロセシング技術における改善は、より低価格でより迅速な合成をもたらしている。しかしながら、ポリヌクレオチド合成は、一連の高効率化学反応を必要とする複雑な多段階プロセスのままである。
【０００４】
複雑なプロセスを考えると、合成機の１回の運転中に同時に多数の異なるポリヌクレオチドの製造を容易にすることが望ましい。実際に、自動ＤＮＡ合成の開始以来並行して行われる合成の数を増加することへの着実な流れがある。
【０００５】
例えば、Ｈｕｎｉｃｋｅ−Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．への特許文献１は、インジェクターノズルに９６ウェルプレートのウェルをさらすために可動合成ブロックを使用するオリゴヌクレオチドの製造に用いることができる合成機を開示する。ＭｅｒＭａｄｅ−１９２およびＭｅｒＭａｄｅ−３８４（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｐｌａｎｏ，ＴＸ）ＤＮＡ合成機は、それぞれ、２もしくは４枚の９６ウェルプレートにおけるポリヌクレオチドの並行合成を同様に可能にする。さらに、Ｐｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．への特許文献２はまた、１枚の３８４ウェルプレートにおける一度に何百もの異なる配列および長さの並行オリゴヌクレオチド合成のための装置および方法を開示する。この参考文献はまた、４枚の３８４ウェルプレートが用いられるシステムも記述する。しかしながら、４つの注入ヘッドが必要とされ、そして反応は全ての４枚のプレート上で重複される。
【０００６】
従って、記載の先行技術の方法およびシステムの全てにおいて、同じ反応シーケンスがウェルの各々において同時に行われる。異なるポリヌクレオチドを生成せしめるために異なる塩基を各ウェルに加えることができるが、ポリヌクレオチドは全て同じ速度でそして同時に伸長される。この方法は、著しい効率の悪さをもたらす。例えば、たとえ所望のポリヌクレオチド配列がウェルのいくつかにおいて完了され得るとしても、最も長いものが完了するまでより長いポリヌクレオチドに塩基が付加される間は自動運転は継続しなければならない。さらに、ある反応段階は反応が完了するのに様々な待機時間を伴う。これらの待機時間中、システムは働いていない。
【０００７】
自動合成における改善にもかかわらず、反応は時間がかかる。合成機の処理能力への重大な制約は、単に、既定の長さのポリヌクレオチドを製造するために必要とされる時間の長さである。例えば、２０ｍｅｒの並行合成は６時間以上かかり得る。上記の効率の悪さは、この時間のかなりの部分を含んでなる。
【０００８】
代替方法は、オリゴヌクレオチドを包含する化合物の多数の同時合成のための装置および方法を開示する、Ｈｏｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．への特許文献３に開示される。しかしながら、Ｈｏｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．は、様々な試薬の導入を可能にするために多数のポートを有するストッパーが各容器に取り付けられることを必要とする。比較的複雑な注入システムが各反応容器に重複されなければならないので、この方法は急速に非実用的になる。
【０００９】
従って、例えば、合成遺伝子製造のためのビルディングブロックとして適当な原料として、多数の高品質ポリヌクレオチドの迅速な並行合成を可能にする装置の必要性がある。ポリヌクレオチドの様々な長さの製造を可能にすることにより高度に柔軟性がありながら合成時間を最小限に抑える自動ポリヌクレオチド製造の必要性が同様にある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，８００，２５０号明細書
【特許文献２】米国特許第６，８６７，０５０号明細書
【特許文献３】米国特許第６，２５８，３２３号明細書
【発明の概要】
【００１１】
［発明の要約］
上記の目的および以下に記載されそして明らかになるものに従って、本発明には、第一の反応容積における合成シーケンスが第二の反応容積における第二の合成シーケンスと非同期性である；第一の反応容積において反復する複数の反応を含んでなり、各反応が注入装置で第一の反応容積に試薬を注入することにより引き起こされ、そして反応がポリヌクレオチドを生成する合成シーケンスを行う段階；および第二の反応容積において反復する複数の反応を含んでなり、各反応が注入装置で第二の反応容積に試薬を注入することにより引き起こされ、そして反応がポリヌクレオチドを生成する合成シーケンスを行う段階を含んでなるポリヌクレオチドの自動合成の方法が包含される。
【００１２】
好ましくは、反復する複数の反応の第一の反応は、第一の反応容積に試薬を加えることおよび第一の反応が起こる第一の期間待機することを含んでなり、第二の反応容積において第二の反応を行うために十分な時間が第一の期間に存在することを決定する段階；第二の反応容積を注入装置に隣接して配置する段階および第二の反応容積に試薬を注入する段階をさらに含んでなる。記載の態様において、第一の反応容積は好ましくは第一のプレート上に位置し、そして第二の反応容積は第二のプレート上に位置する。
【００１３】
また好ましくは、該方法は第二のプレート上で所望のポリヌクレオチドを完了する段階、合成環境から第二のプレートを取り除く段階および第一のプレート上で別の所望のポリヌクレオチドの合成を継続する段階をさらに含む。本態様において、合成環境から第二のプレートを取り除く段階は、好ましくは、合成環境を保ちながらエアロックに第二のプレートを通すことを含んでなる。
【００１４】
本発明の別の態様において、合成環境から第二のプレートを取り除く段階は、合成環境を保つ少なくとも１つのグローブをしたアクセス（ｇｌｏｖｅｄ  ａｃｃｅｓｓ）で第二のプレートを操作することを含んでなる。
【００１５】
本発明によれば、該方法は、第三の反応容積において合成シーケンスを行う段階をさらに含んでなり、ここで、複数の反応は注入装置で第三の反応容積に試薬を注入することにより引き起こされ、第一の反応容積における合成シーケンスが第三の反応容積における合成シーケンスと非同期性であることができる。好ましくは、第二の反応容積における合成
シーケンスは第三の反応容積における合成シーケンスと非同期性である。記載の態様において、該方法は複数の反応が注入装置で第三の反応容積に試薬を注入することにより引き起こされる第三の反応容積において合成シーケンスを行うこと、第三の反応容積において第三の反応を行うために十分な時間が第一の期間に存在することを決定すること；第三の反応容積を注入装置に隣接して配置することおよび第三の注入容積に試薬を注入することをさらに含むことができる。
【００１６】
本発明のさらなる態様において、該方法は、複数の反応が注入装置で第四の反応容積に試薬を注入することにより引き起こされる第四の反応容積において合成シーケンスを行う段階をさらに含んでなり、第一の反応容積における合成シーケンスが第四の反応容積における合成シーケンスと非同期性である。好ましくは、第一、第二、第三および第四の反応容積は、９６ウェルプレートのような別個のプレート上に位置する。
【００１７】
本発明の１つの態様において、試薬を送達することには同時に反応ウェルの全縦列に試薬を注入することが包含される。
【００１８】
発明の好ましい態様において、複数の反応は非ブロック化、カップリング、キャッピングおよび酸化を含んでなる。
【００１９】
本発明によれば、異なる配列を有するポリヌクレオチドを非同期的に合成することができる。さらに、異なる長さを有するポリヌクレオチドを非同期的に合成することができる。
【００２０】
本発明には、また、第一の反応容積における合成シーケンスが第二の反応容積における合成シーケンスと非同期性である、第一の反応容積および第二の反応容積、第一の反応容積および第二の反応容積に試薬を送達するためのインジェクターを有する注入装置；第一の反応容積および第二の反応容積を注入装置に隣接して可動的に配置するように設定されるｘｙテーブル、ならびに第一の反応容積および第二の反応容積における合成シーケンスに対応する反復する複数の反応を行うように設定される制御装置を含んでなるポリヌクレオチドの自動合成のためのシステムも包含される。
【００２１】
好ましくは、反復する複数の反応の第一の反応は、第一の反応容積に試薬を加えることおよび第一の反応が起こる第一の期間待機することを含んでなり、そしてここで制御装置は、第二の反応容積において第二の反応を行うために十分な時間が第一の期間に存在することを決定するように設定され、注入装置が第二の反応容積に隣接して配置されそして第二の反応容積に試薬を注入するようにｘｙテーブルを操作する。
【００２２】
また好ましくは、第一の反応容積は第一のプレート上に位置し、そして第二の反応容積は第二のプレート上に位置する。
【００２３】
本発明によれば、システムは第一の反応容積、第二の反応容積、注入装置およびｘｙテーブルの周りの減少した水分の大気を保つためのドライボックスをさらに含んでなる。好ましくは、ドライボックスはエアロックをさらに含んでなる。また好ましくは、ドライボックスは少なくとも１つのグローブをしたアクセスポイントをさらに含んでなる。
【００２４】
本発明の別の態様において、システムは１つもしくはそれ以上の試薬を貯蔵するように設定される統合デシケーターチャンバーを含む。好ましくは、デシケーターチャンバーおよびドライボックスは、１つもしくはそれ以上の試薬が第一および第二の反応容積への送達まで減少した水分の大気下で保たれるように設定される。
【００２５】
本発明のさらなる態様において、システムは第三および／もしくは第四の反応容積を含み、ここでｘｙテーブルは、第三および／もしくは第四の反応容積を注入装置に隣接して可動的に配置するように設定され、そしてここで制御装置は、第一の反応容積における合成シーケンスが第三および／もしくは第四の反応容積における合成シーケンスと非同期性であるように第三および／もしくは第四の反応容積において反復する複数の反応を行うよう設定される。好ましくは、第一、第二、第三および第四の反応容積は、９６ウェルのような別個のプレート上に位置する。
【００２６】
本発明によれば、注入装置は同時に反応ウェルの全縦列に試薬を送達するように設定することができる。
【００２７】
本発明の１つの態様において、制御装置は、第一および第二の反応容積の状態を評価する段階、反応が完了するのを第一の反応容積が待機していることを決定する段階、第二の反応容積が次の反応の準備ができていることを決定する段階および次の反応を開始するために注入装置に第二の反応容積に送達させるコマンドを送る段階を含んでなるソフトウェア命令を含む。
【００２８】
さらなる特徴および利点は、添付の図面において説明されるように、本発明の好ましい態様の以下のそしてより特定の記述から明らかになり、そしてここで、同様の参照文字は図の全体を通して同じ部分もしくは要素を一般にさす。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明のポリヌクレオチドの自動合成のための装置を示す全体図である。
【図２】本発明の特徴を具体化する合成機の注入ヘッドおよびｘｙテーブルの概略図を示す。
【図３】本発明の特徴を具体化する９６ピン注入ヘッドの詳細図を示す。
【図４】本発明の自動ポリヌクレオチド合成機の試薬容器およびバルブの概略図を示す。
【図５】本発明の自動ポリヌクレオチド合成機の制御ハードウェアの概略図を示す。
【図６】本発明の自動ポリヌクレオチド合成機のガスサプライシステムの略図を示す。
【図７】本発明の自動ポリヌクレオチド合成機の試薬容器圧力システムの略図を示す。
【図８】本発明の自動ポリヌクレオチド合成機の洗浄システムの略図を示す。
【図９】本発明の自動ポリヌクレオチド合成機の真空廃棄物システムの略図を示す。
【図１０】本発明の複数の反応容積における反応段階のシーケンスを決定することにおいて行われる段階のフローチャートを示す。
【００３０】
［発明の詳細な記述］
本発明を詳細に記述する前に、本発明は特に例示される材料、方法もしくは構造に限定されず、そのようなものとしてもちろん異なり得ることが理解されるべきである。従って、本明細書に記述されるものと同様のもしくは同等の多数の材料および方法を本発明の実施において用いることができるが、好ましい材料および方法が本明細書に記述される。
【００３１】
また、本明細書において用いられる用語は、本発明の特定の態様を記述する目的のためだけであり、そして限定するものではないことも理解されるべきである。
【００３２】
他に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、本発明が関係する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３３】
さらに、本明細書において引用される全ての公開、特許および特許出願は、上記であろうと下記であろうと、それらの全部が引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００３４】
最後に、本明細書および添付の請求項において用いる場合、内容が明らかに他に指示しない限り「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その」という単数形には複数の指示対象が包含される。
【００３５】
本発明は、第一の反応容積における合成シーケンスが第二の反応容積における第二の反応シーケンスと非同期性である；第一の反応容積において反復する複数の反応を含んでなり、各反応が注入装置で第一の反応容積に試薬を注入することにより引き起こされ、そして反応がポリヌクレオチドを生成する合成シーケンスを行う段階；および第二の反応容積において反復する複数の反応を含んでなり、各反応が注入装置で第二の反応容積に試薬を注入することにより引き起こされ、そして反応がポリヌクレオチドを生成する合成シーケンスを行う段階を含んでなるポリヌクレオチドの自動合成の方法を提供する。
【００３６】
１つの態様において、反復する複数の反応の第一の反応は、第一の反応容積に試薬を加えることおよび第一の反応が起こるのを第一の期間待機することを含んでなる。好ましくは、該方法は、第二の反応容積において第二の反応を行うために十分な時間が第一の期間に存在することを決定する段階、注入装置を第二の反応容積まで移動させる段階および第二の反応容積に試薬を注入する段階をさらに含んでなる。
【００３７】
本発明の概念は、合成反応が反応容積の各々において非同期的に行われるように、３つもしくはそれ以上の反応容積に拡張することができる。好ましくは、３つもしくはそれ以上の反応容積の各々は別個のプレート上に位置する。追加の反応容積は各プレート上に位置することができ、ここで、各プレート上の合成反応は同期的に起こる。
【００３８】
本明細書において用いる場合、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、共有結合によって一緒に連結される２個もしくはそれ以上のヌクレオチドを意味するものとし、そして互換的に用いられる。例えば、ヌクレオチドはホスホジエステル結合によって一緒に連結されることができる。ポリヌクレオチドは４種のヌクレオチド、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンまたはイノシン、ジデオキシヌクレオチドもしくはヌクレオチドのチオール誘導体のようなヌクレオチドアナログおよび誘導体を含有することができる。ポリヌクレオチドを生成するためにヌクレオシドもしくはホスホルアミダイトのようなヌクレオチドの異なる化学形態を用いることができる。さらに、ヌクレオチドは放射性標識、蛍光色素、強磁性物質、発光性タグもしくはビオチンのような検出可能な部分のような検出可能な部分をさらに導入することができる。ポリヌクレオチドにはまた、例えばＲＮＡおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）も包含される。
【００３９】
本明細書において用いる場合、「試薬」は他の物質を検出するか、調べるか、測定するかもしくは生成するために化学反応において用いられる物質を意味するものとする。試薬がポリヌクレオチドのような所望の物質の製造において用いられる場合、試薬は所望の物質の製造における任意の段階で用いることができる。例えば、試薬はポリヌクレオチドの製造の開始時に用いられるヌクレオチド溶液のような前駆体であることができる。さらに、試薬は、結合していないヌクレオチドを洗い流すために用いられる洗浄溶液のようなポ
リヌクレオチドの製造において後で用いられる溶液であることができる。例えば、アセトニトリル洗浄溶液は、ポリヌクレオチドの製造において用いることができる試薬である。試薬には、例えば、アミダイト、非ブロック化、酸化剤、活性剤、キャッピング試薬およびアセトニトリル洗浄溶液が包含される。
【００４０】
本明細書において用いる場合、自動ポリヌクレオチド合成機の「合成プラットフォーム」という用語は、ポリヌクレオチド合成が起こる１つの反応容器もしくはチャンバー、または複数の容器もしくはチャンバーを含有するかもしくは保持することができる自動ポリヌクレオチド合成機の面を意味するものとする。例えば、合成プラットフォームは、ポリヌクレオチド合成反応が起こることができる１つもしくはそれ以上のウェルもしくは縦列もしくはプレートを含有することができる。いくつかの自動ポリヌクレオチド合成機は市販されている。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ  ３８１ＡおよびＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８９０５は、市販されている標準的なポリヌクレオチド合成機である。また、例えば、ポリヌクレオチド合成機はＭｅｒＭａｄｅポリヌクレオチド合成機（引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｒａｙｎｅｒ
ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８：７４１−７４７（１９９８）を参照）のような特注の合成機であることができる。無水条件下での自動ポリヌクレオチド合成に関する特定の詳細は、その全部が引用することにより本明細書に組み込まれる、２００４年１１月１１日に公開された米国特許出願公開第２００４０２２３８８５Ａ１に開示される。
【００４１】
ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドとしても知られている）を合成する方法は当該技術分野において既知であり、そして例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｔｅ，ｅｄ．，ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）；Ｗｅｉｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４３：２１８（１９９６）；Ｍａｓｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（７）：１６７９（１９９２）；Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｐｈｏｓｐｈｉｔｅｔｒｉｅｓｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ３５（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ａｎｄ  Ｇａｉｔ（ｅｄｓ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）に、そしてＡｎｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ．（１９９９）に記述されるのが見出されることができる。
【００４２】
ポリヌクレオチドおよび他のポリマー配列のアレイを生成するための固相合成方法は、例えば、Ｐｉｒｒｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１４３，８５４号（ＰＣＴ出願第ＷＯ９０／１５０７０号も参照）、Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ出願第ＷＯ９２／１００９２号；Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：７６７−７７７およびＷｉｎｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，１３６，２６９号；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／１０９７７号およびＢｌａｎｃｈａｒｄ  ＰＣＴ出願第ＷＯ９８／４１５３１号に記述されるのが見出されることができる。そのような方法には、マイクロピン、フォトリソグラフィーおよびオリゴヌクレオチドアレイのインクジェット合成を用いるアレイの合成およびプリンティングが包含される。
【００４３】
ポリヌクレオチドの逐次アニーリングにより大きい核酸ポリマーを合成する方法は、例えば、ＥｖａｎｓへのＰＣＴ出願第ＷＯ９９／１４３１８号およびＥｖａｎｓへの米国特
許第６，５２１，４２７号に記述されるのが見出されることができる。上記の参考文献は全て、それらの全部が引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００４４】
典型的なポリヌクレオチド合成シーケンスは、固定化ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護ヌクレオシドもしくはポリヌクレオチドの脱保護、固定化ヌクレオシドもしくはポリヌクレオチドに活性化されそして適切に保護されたヌクレオチドモノマー誘導体をカップリングすることによる鎖伸長、伸長反応中にヌクレオチドモノマーと反応することができなかった固定化ヌクレオシドもしくはヌクレオチド鎖を化学的に不活性化するためのキャッピング、および５価のリン酸トリエステルを含んでなるヌクレオチド鎖を生成せしめるための酸化のコア反応段階を含んでなる。これらのコア段階は、既定のポリヌクレオチドを合成するために必要な「反応サイクル」の一部として繰り返される。各反応サイクルは、固定化ヌクレオシドもしくはポリヌクレオチドに１個のヌクレオチドを付加し、そしてより大きい固定化ポリヌクレオチドを生じる。既定のポリヌクレオチド合成の終了時の最終段階は、新たに合成されたポリヌクレオチド鎖をそれが固定されている基質から遊離させる切断反応である。
【００４５】
本明細書において用いる場合、「同期の」という用語は、ポリヌクレオチド鎖伸長が必要である各反応容積において合成シーケンスにおける各個々の反応サイクルが同時に開始されるように別個の反応容積において少なくとも２つのポリヌクレオチド合成シーケンスを行うことを意味する。
【００４６】
少なくとも２つのポリヌクレオチドを伴う同期合成シーケンスにおいて、各々の必要な伸長反応は各別個の反応容積において同時に開始され、そして全ての他の合成サイクル反応もまた同時に行われる。結果は、同期合成シーケンスにおいて別個の反応容積において行われる各々の必要な合成サイクルは同時に始まりそして終わるということである。
【００４７】
ある例において合成されるポリヌクレオチドの少なくとも２つは、一方のポリヌクレオチドが異なる数のヌクレオチドを含んでなりそして合成されるもう一方のポリヌクレオチド分子より大きいように、サイズが相互に異なる。より大きいポリヌクレオチドを合成するためにはより多くの反応サイクルが必要であり、そしてより小さいポリヌクレオチドを合成するためにはより少ないものが必要とされる。従って、より大きいポリヌクレオチドを製造するためにはより長い期間が必要とされ、そしてより小さいポリヌクレオチドを製造するためにはより短い期間が必要とされる。
【００４８】
同期合成シーケンスにおいて新たな反応サイクルは、より遅い合成もしくはより遅い合成サイクル反応が全ての他の別個の反応容積において完了するまで開始することができない。同期合成シーケンスを完了するために必要とされる時間は、行われる最も遅い最も律速の個々のポリヌクレオチド合成もしくは合成サイクル反応と同じくらいの速さであることしかできないので、これはかなりの効率の悪さを生み出す。
【００４９】
本明細書において用いる場合、「非同期の」という用語は、ポリヌクレオチド鎖伸長が必要である各反応容積において合成シーケンスにおける各個々の反応サイクルが異なる時間で開始されるように別個の反応容積において行われる少なくとも２つのポリヌクレオチド合成シーケンスを意味する。
【００５０】
少なくとも２つのポリヌクレオチドを伴う非同期合成シーケンスにおいて、各々の必要な伸長反応は異なる時間で各別個の反応容積において開始されることができる。１つの結果は、各別個の反応容積における合成サイクル反応が非同期合成シーケンスにおいて異なる時間で行われ得ることである。これは、別個の反応容積における合成が、他の別個の反応容積において起こっている、より大きいポリヌクレオチドの合成もしくはより遅い合成
サイクル反応のような、より遅い合成プロセスとは独立に完了に向かって進行できることを意味する。非同期合成シーケンスにおける結果は、他の別個の反応容積において起こっている最も遅い最も律速の個々のポリヌクレオチド合成もしくはより遅い合成サイクル反応が完了するのを待って時間を浪費しないことである。
【００５１】
ポリヌクレオチドは、ホスホルアミダイト化学を用いて市販の核酸合成機上で生成することができる。Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈシリーズは、ホスホルアミダイトおよび代替合成戦略を概説している（Ｂｒｏｗｎ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｄｏｒｋａｓ，Ｊ．Ｓ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｄ．Ｆ．Ｅｃｋｓｉｅｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ  ＵＫ（１９９５））。
【００５２】
ポリヌクレオチドの化学合成は、４種のビルディングブロック（塩基ホスホルアミダイト）が線状ポリマーとして連結されるプロセスである。成分塩基に加えて、ヌクレオチド間結合の形成を助け、酸化し、キャッピングし、脱トリチル化し、そして脱保護するために多数の試薬が必要とされる。自動合成は、逐次化学反応の足場として働く固体担体マトリックス：マトリックスに試薬を送達するための一連のバルブおよびタイマー、ならびに最後に精製、定量、製品品質管理および凍結乾燥を包含することができる合成後処理の流れ上で行うことができる。
【００５３】
標準的なＤＮＡ塩基（グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ））のいくつかは反応性である第一級アミンを含有し；従って、第一級環外アミンは、合成中に望ましくない反応に関与しないように保護基で修飾することができる。さらに、４種のホスホルアミダイトは同様に保護される必要があるリン結合を含有する。これらの感受性部位を保護するために用いられる化学基は、ＤＮＡ合成サイクル中に損なわれないままであることができ、それにもかかわらず通常の非修飾ＤＮＡが生じるように合成後に容易に取り除かれることができる。多数の異なる保護戦略が開発されている。例えば、ｐ−シアノエチル保護されたリンを有するホスホルアミダイトを用いることができる。複素環式塩基について、第一級アミンの保護は、アデニンおよびシトシンにはベンゾイル基そしてグアニンにはジメチルホルムアミジンもしくはイソブチリル基のいずれかにより提供されることが多い。第一級アミンを欠くチミン（Ｔ）は、塩基保護を必要としない。これらの保護基は、合成中に用いられる条件下で安定であるが、アンモニアでの処理により迅速にそして効果的に取り除かれる。
【００５４】
活性化されたモノマーがそれら自体と反応せず固体担体につながれた成長するポリヌクレオチド鎖上の５’−ＯＨとのみ反応することができるように塩基−ホスホルアミダイトの５’−ＯＨをブロックすることもまた望ましい。現在の化学は、例えば、ジメトキシトリチル(ＤＭＴ）基を用いる。縮合後に、ＤＭＴ基は酸での処理により新たに付加されたＤＮＡ塩基から切断される。遊離されるＤＭＴ陽イオンは橙色であり、従って、ＤＮＡカップリング効率の進行は、４９０ｎｍでの分光光度読み取りを分析することによりモニターすることができる。
【００５５】
デオキシリボース糖の３’ヒドロキシル基は、極めて反応性のホスフィチル化剤で誘導体化される。この基上のリン酸酸素は、高温で水酸化アンモニア処理を用いてβ脱離により取り除くことができるβ−シアノエチル部分により通常はマスクされる。
【００５６】
従って、ホスホルアミダイトポリヌクレオチド合成サイクルは、反復段階：非ブロック化；活性化／カップリング；キャッピング；および酸化を含んでなる。
【００５７】
自動合成は固体担体、通常は制御多孔性ガラス（ＣＰＧ）もしくはポリスチレン上で行
うことができる。ＣＰＧは、反応チャンバーとして働く小さい縦列に充填される。充填した縦列はＤＮＡ合成機上の試薬送達ラインに取り付けられ、そして化学反応はコンピューター制御下で進む。塩基は、３’→５’方向（ＤＮＡポリメラーゼによる酵素合成とは反対）に成長鎖に付加される。「ユニバーサル」担体が存在するが、合成は、３’−ヒドロキシルでエステル結合によって結合される第一の塩基ですでに誘導体化されているＣＰＧを用いて開始されることがより多い。合成は、ＣＰＧ固体担体に結合される第一の塩基から始まり、そして３’→５’方向に伸長する。ＣＰＧ粒子は比較的大きく、そして多孔性であり、表面：体積比を非常に増加するチャンネルを含有し、反応が小容量の試薬を用いて小さな反応チャンバーにおいて行われることを可能にする。ＣＰＧは、一方の末端に試薬入口ポートそしてもう一方に出口ポートを有して；２つのフィルターフリット間の「縦列」に位置する。
【００５８】
合成中に、全長ポリヌクレオチドおよびトランケーション生成物もしくは部分ポリヌクレオチド生成物の両方がＣＰＧ担体に結合したままである。合成後に、これらの種は同様に切断されそして回収され、従って、最終反応生成物は所望のおよび望ましくない種の不均一混合物である。不純物は、ポリヌクレオチド長が増加するにつれてより大きい程度に蓄積する。さらに、切断された保護基もまた存在する。この時点で、ポリヌクレオチドは伝統的に、合成後処理を完了するために小分子不純物(保護基および短いトランケーション生成物)がゲル濾過もしくは有機固相抽出（ＳＰＥ）法を用いて除かれるプロセス、「脱塩」される。
【００５９】
さらなる精製のない脱塩されたポリヌクレオチドの使用は、日常的なＰＣＲもしくはＤＮＡシークエンシングのような、簡易用途において短いプライマーを用いる場合に適切であることができる。しかしながら、ｎ−１および他のトランケーションもしくは部分ポリヌクレオチド種は、クローニング、部位特異的突然変異誘発もしくは遺伝子アセンブリ用途において用いる場合には欠失突然変異体をもたらし得る。ＰＡＧＥもしくはＨＰＬＣによる精製は、トランケーションもしくは部分ポリヌクレオチド種を除くために用いることができる。
【００６０】
本発明は、複数の反応容積において非同期並行合成を行うための装置を提供する。次の合成反応は、既定の反応容積において起こっている反応の待機時間中に他の反応容積において行われる。
【００６１】
本発明の装置の例は図１に示され、装置の様々な図および拡大図は図２〜９に示される。
【００６２】
図１に示されるように、本発明の１つの態様には合成プレート、ｘｙテーブル、インジェクターヘッド、試薬、制御装置および配管（これらの全ては、以下に詳細に記述される）のような自動オリゴヌクレオチド合成機の様々なコンポーネントを収納するように設定されるキャビネット１０が包含される。単一のキャビネット内に合成機の全てのコンポーネントを入れることにより、合成反応の効率を改善するために閉鎖連続システムが提供される。一般に、キャビネット１０は合成プラットフォーム上の制御環境フードを含んでなるドライボックス１２を含む。グローブをしたアクセスポイント１４および１６は、オペレーターが大気を水分で汚染することなしにドライボックス１２内でプレートおよび機械を操作することを可能にする。ドライボックス１２はまた、制御された大気を保ちながらプレートおよび他の物質をドライボックス１２から導入するかもしくは取り除くことを可能するためにエアロック１８も含む。例えば、これは、たとえ合成が他のプレート上で継続していても、１枚のプレートを運転中にドライボックスから取り除くことを可能にする。１つもしくはそれ以上の観察ウィンドウ２０は、オペレーターが合成反応をモニターしそしてグローブをしたアクセスポイントおよびエアロックに関する任意の操作を容易にす
ることを可能にする。
【００６３】
当業者が理解するように、ドライボックス１２、グローブをしたアクセスポイント１４および１６ならびにエアロック１８は任意の適当な一群の天然および合成材料から構築することができ、例えば、パイレックスガラス、ステンレス鋼、ポリプロピレン、ゴム、ラテックスもしくはテフロンのような耐湿性および耐溶媒性材料を用いることができる。１つの態様において、ドライボックスは耐湿性材料で作られ、そしてオリゴヌクレオチド合成のための閉鎖連続無水システムを提供するように合成プラットフォーム上に密封される。本明細書において用いる場合、「耐湿性」という用語は、水蒸気および液体に不浸透性である物質を意味するものとする。
【００６４】
本明細書において用いる場合、「閉鎖連続無水システム」という用語は、恒常性を保つようにシステムにおける水分の量をモニターしそしてそれに反応することができるシステムを意味するものする。所望の恒常性状態は、システムにおける水分もしくは湿度のパーセントに関してユーザーにより設定されることができる。例えば、閉鎖連続無水システムは、水分の量が絶えずモニターされそしてシステムからできるだけ多くの水分を除くように調整される閉鎖領域であることができる。さらに、例えば、圧力レベルのような他の変数を閉鎖連続無水システムにおいて調節することができる。
【００６５】
「無水」という用語は、低い水分含有量を意味するものとする。水分含有量はいくつかの方法において、例えば湿度計を用いて湿度のパーセントとして測定することができる。無水システムは、低レベルの湿度もしくは水分を有することができる。例えば、無水システムは５％以下の相対湿度（ＲＨ）、４％以下の相対湿度、３％以下の相対湿度、２％以下の相対湿度、１％以下の相対湿度、０．５％以下の相対湿度を有するか、もしくは検出可能な相対湿度を有さないことができる。水分含有量はまた、１００万分の１（ｐｐｍ）単位で測定することもできる。例えば、有機溶媒における水分含有量は無水有機溶媒について１０ｐｐｍ以下であることができる。
【００６６】
キャビネット１０はまた、キャビネット１０内の統合デシケーターチャンバーへのアクセスを提供するためにドア２２および２４も含む。デシケーターチャンバーは、操作中に乾燥窒素の一定のフロー下で合成試薬を維持する。従って、試薬は、合成反応が無水条件において行われることを保証するためにシステムの操作中絶えず乾燥した環境で維持される。さらに、デシケーターチャンバーは、二次的な流出封じ込めおよび防火を提供する。
【００６７】
また図１に示されるように、キャビネット１０は、全て以下にさらに詳細に記述される、コンピューターを包含する制御ハードウェア、ならびにバルブ、チューブ、廃棄物容器および合成機の他の配管装置へのアクセスを提供するためにドア２６および２８を有する。
【００６８】
１つの態様において、本発明のポリヌクレオチド合成機は、４枚の標準的な９６ウェルプレートにおいて標準的なホスホルアミダイト化学を用いて１回の運転でポリヌクレオチドを合成するように設定される。機械は、各プレートにおいて標準的、変性もしくは修飾ポリヌクレオチドの組み合わせを製造することができる。運転時間は２０ｍｅｒの４枚のプレートおよび４０ｎＭの反応規模について約１７ｈｒ以下であることができる。反応容器は、各ウェルの底に開けられた穴を有する標準的なポリプロピレン９６ウェルプレートであることができる。
【００６９】
図２に図式的に示されるように、本態様の合成プラットフォームは４つの別個の真空チャック３０、３２、３４および３６を含んでなり、これらは９６ウェルプレート（明確にするために１枚のみが示される）のようなプレート３８を受けるように設定される。チャ
ック３０〜３６は、注入ヘッド４２の下の所望の位置に各プレートを配置するように設定されるｘｙテーブル４０上に取り付けられる。理解することができるように、各プレートの各ウェルは、試薬が所望のウェルに注入されることを可能にするために注入ヘッド４０の適切な試薬注入ライン下に正確に配置されなければならない。
【００７０】
ｘｙテーブル４０は一般に、真空チャック３０〜３６を一方向に移行することができるトラック４４およびチャックを垂直方向に移行することができるトラック４６を含んでなる。本発明の１つの態様において、トラック４４および４６は、Ｄａｅｄａｌリニアモーター（Ｐａｒｋｅｒ  Ｈａｎｎｉｆｉｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｒｗｉｎ，ＰＡ）のようなリニアモーターポジッショナーを含んでなる。この態様において、磁気エンコーダーはテーブル位置に対する精密な制御を提供し、そして較正に影響を及ぼすことなしにテーブルが手動で動かされることを可能にする。当該技術分野において既知であるようなｘｙテーブルの他の適当な機序もまた用いることができる。
【００７１】
図２に示されるように、注入ヘッド４２はｘｙテーブル４０上に取り付けられ、従って、プレートは適切な位置に化学物質注入ヘッドの下で動かされる。２つのチャンバーの組み合わせは、反応からの汚染物質を除くように設計される。
【００７２】
４枚の合成プレートは、各段階の後の試薬化学物質の排出を可能にするために真空チャック３０〜３６の内部に個々に取り付けることができる。真空チャックは、プレートの周りに一緒にボルトで固定される２つの部分からなる。チャックの下半分は、プレートとチャックとの間の密封を与えるためのガスケット、および真空に連結されるドレーンラインを含有する。プレートは、グローブをしたアクセスポイント１４および１６を用いてエアロック１８を通して真空チャックに取り付けることができる。
【００７３】
合成プレートを取り付けるために用いられるチャックは、標準的な合成機におけるよりも深い収集槽（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｂａｓｉｎ）を有するように改変することができる。例えば、チャックは８ｍｍ深い収集槽を有するように改変することができる。この改変は、試薬が反応段階中にフィルタープレートを通して漏出する場合に、試薬が槽を満たしそしてフィルター合成プレートにおける異なる合成マイクロウェルを交差汚染しないように有用である。
【００７４】
本発明の代わりの態様において、注入ヘッドをプレートに対して適切な位置にそれを配置するように動かす間プレートを固定することができる。
【００７５】
本発明のこの態様において、試薬は化学物質注入ヘッド４２を通してプレート３８のウェルに導入される。図３は、注入ヘッド４２のインジェクターピン配置を示す。示されるように、注入ヘッド４２は８列の１２インジェクターピンを含んでなる。列Ａにおいて、インジェクターピン４８、５０、５２および５４はホスホルアミダイトＡ、Ｔ、ＣおよびＧを送達するように設定される。インジェクターピン５６は、この配置において予備である。列Ｂにおいて、インジェクターピン群５８はインジェクターピン４８〜５４により送達されるホスホルアミダイトと連動して適切な活性剤試薬を送達するように設定される。各ホスホルアミダイトに別個の活性剤インジェクターピンを提供することにより、テーブル４０の動きは最小限に抑えられ、そして全プレートに塩基を送達するために必要な時間は短縮される。ピン群６０は予備であり、そして活性剤もしくは他の試薬と連動して修飾塩基を送達するために用いることができる。列Ｃにおいて、ピン群６２は同時にウェルの全縦列に非ブロック化試薬を送達するための完全なひとそろえのピンを提供する。同時に、列ＤおよびＥにおいて、ピン群６４および６６は１２のウェルの全縦列に同時にカップリング試薬ＡおよびＢを送達するように設定される。列Ｆはピン群６８を含んでなり、それはウェルの全縦列に酸化剤試薬を送達するように設定される。最後に、列ＧおよびＨは
ピン群７０を含んでなり、それらはウェルの全縦列に２倍容量の洗浄液を送達するように設定される。
【００７６】
上記のように、試薬はデシケーターチャンバー中のボトルに貯蔵され、そして注入ヘッド４２にテフロンチューブを通して送達されることができる。デシケーターチャンバーからドライボックス１２にチューブを持って行くためにリードスルー（ｌｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈｓ）を用いることができる。それを通してチューブがリードスルーに入るシールを製造するためにシリコーンシーラントを用いることができる。ＤＣソレノイドバルブを用いてウェルへの試薬のフローを調節することができ、それは今度は下記のソフトウェアにより切り替えられるソリッドステートリレーにより個々に制御することができる。バルブは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＮＢ−ＤＩＯ−９６カードにより制御することができる。シグナルはカードから３バンクのリレーカードに送られる（各カードは８リレーを含有する）。２つのカードは試薬注入のためのＤＣバルブを制御し；第三のカードはアルゴンおよび真空システムに使用されるＡＣバルブを制御する。モーターおよびバルブのためのＡＣおよびＤＣ電源は、電圧源ボックスにより提供される。これらのバルブで得られる最小注入容量は＜２０μｌである。しかしながら、ウェルにおける試薬の向上した混合は、少なくとも約５０μｌの範囲の注入容量で得られることができる。
【００７７】
図４は、キャビネット１０のデシケーターチャンバー内に含まれる試薬および関連する配管を図式的に示す。一般に、合成試薬は、ヌクレオチド塩基試薬アデニン、チミン、シトシンおよびグアニンを保持するために用いられる容器７２、７４、７６および７８のような容器の内部に貯蔵されることができる。容器８０は、最後のリン酸ホスホルアミダイト塩基を保持するために用いられる。追加の容器(示されない)は、修飾塩基のような追加のヌクレオチド塩基試薬用に用いることができる。さらに、容器８２は非ブロック化試薬を保持し、容器８４は酸化剤試薬を保持し、容器８６は活性剤試薬を保持し、容器８８および９０はキャッピング試薬を保持し、そして容器９２はアセトニトリルのような洗浄溶液を保持する。
【００７８】
チューブ（示されない）は、個々のソレノイドバルブを通してドライボックス１２中の注入ヘッド４２に試薬容器を連結する。１つの態様において、本発明の装置は、ガスサプライ（ｇａｓ  ｓｕｐｐｌｙ）に試薬容器７２〜９２を連結するチューブに連結されたフロースルーガスドライヤー９４および９６を含有する。また、本発明の装置は、合成プレート真空チャックと廃棄物容器との間にインラインソレノイドバルブ９８および１００を含有することができる。これらの通常は閉じたソレノイドは主真空システムによりアクティブ化され、そしてプレートを空にした後に合成フィルタープレートから廃棄物容器を分離するように働くことができる。
【００７９】
試薬容器は、液体試薬を保持することができる。１つの態様において、試薬容器は耐湿性である。耐湿性容器は、外部環境からの水分が容器の内部に浸透しないようにする。耐湿性容器はステンレス鋼、ガラスもしくはプラスチックのような耐湿性材料でできているかもしくは被覆される。試薬容器はまたそれらが保持する物質にも耐性であり、例えば、アセトニトリルのような溶媒を保持する試薬容器は耐溶媒性容器である。
【００８０】
使用されている試薬が水分を含まないことを保証するために、試薬容器、例えばガラスボトルは試薬を混合する前にきれいにしそしてオーブン乾燥させることができる。ボトルをドライボックス内に入れ、そして分子ふるいを加え、試薬を用いる前に２４時間沈降させる。さらに、試薬容器に挿入される吸入ラインにテフロンフィルターを加える。これは、吸入ラインに導入されそして合成プレートに導入されるふるいから微粒子もしくは他の小粒子の量を減らす。
【００８１】
キャビネット１０内に貯蔵されそしてドア２６および２８を通してアクセス可能にすることができる合成機の追加のコンポーネントを図５に示す。これらのコンポーネントにはコンピューター１０２、ソレノイドバルブを制御する制御装置ボックス１０４および制御装置（ｃｏｍｐｔｒｏｌｌｅｒ）を止めるための停止スイッチ１０６が包含される。他のコンポーネントには、下記のように有機廃棄物容器および他のガス調節機能に真空入口を制御するためのソレノイドバルブ１０８、１１０、１１２、１１４、１１６および１１８が包含される。
【００８２】
図６は、ドライボックス１２におけるガスフローの詳細な図を示す。液体窒素デュワーからのボイルオフは、ドライボックスガスパージに用いられる。図において見られるように、チューブ１２６は液体窒素デュワー１２８およびガス調節装置１３０を下側ガスドライヤー入口ポート１３４を通してガスドライヤー１３２に連結する。チューブ１３６は、上側ガスドライヤー出口ポート１３８をメインガス制御ソレノイドバルブ１１２に連結する。示されるように、チューブ１４０はメインガス制御１１２を高流量制御ソレノイドバルブ１１６に連結し、そしてチューブ１４２は高流量制御ソレノイドバルブ１１６を高流量計１４４に連結する。さらに、チューブ１４６は高流量計１４４を３方向コネクター１４８に連結する。チューブ１５０はメインガス制御ソレノイドバルブ１１２を低流量制御ソレノイドバルブ１１８に連結し、そしてチューブ１５２は低流量制御ソレノイドバルブ１１８を低流量計１５４に連結し、そしてチューブ１５６は低流量計１５４を３方向コネクター１４８に連結する。チューブ１５８は３方向コネクター１４８を３方向コネクター１６０に連結する。チューブ１６２は３方向コネクター１６０をガス入口ポート１６４に連結し、そしてチューブ１６６は３方向コネクター１６０をガス入口ポート１６８に連結する。チューブ１７０はガス出口ポート１７２を３方向コネクター１７４に連結し、そしてチューブ１７６はガス出口ポート１７８を３方向コネクター１７４に連結する。ガス入口および出口ポート１６４、１６８、１７２および１７８はドライボックス１２に連結される。チューブ１８０は３方向コネクター１７４をガスドライヤー１８４上のガス入口ポート１８２に連結し、そしてチューブ１８６は排出するために大気にガスドライヤー１８４上のガス出口ポート１８８を連結する。
【００８３】
図７は、試薬ボトル圧力計の詳細な図を示す。図は、調節されたヘリウムガスサプライ１９０およびガス調節装置１９２、調節されたヘリウムガスサプライ１９０およびガス調節装置１９２とガスドライヤー９６上のガス入口ポート１９６をを連結するチューブ１９４を示す。チューブ１９８は、ガスドライヤー９６上のガス出口ポート２００をデジタルガス調節装置２０４上の入口ポート２０２と連結する。チューブ２０６は、デジタルガス調節装置２０４を３方向コネクター２０８と連結する。チューブ２１０は、３方向コネクター２０８をガスサプライマニホールド２１２と連結し、そしてチューブ２１４は３方向コネクター２０８をガスサプライマニホールド２１６と連結する。ガスサプライマニホールドは、各試薬容器７２〜９２（図５上に示されない）に供給する。
【００８４】
図８は、アセトニトリル（ＡＣＮ）洗浄システムの詳細な図を示す。図は、調節されたヘリウムガスサプライ２１８およびガス調節装置２２０、調節されたヘリウムガスサプライ２１８およびガス調節装置２２０とガスドライヤー９４上のガス入口ポート２２４を連結するチューブ２２２を示す。チューブ２２６はガスドライヤー９４上のガス出口ポート２２８をデジタルガス調節装置２３２上の入口ポート２３０と連結する。チューブ２３４はデジタルガス調節装置２３２をアセトニトリルデュワー２３６と連結する。チューブ２３８はアセトニトリルデュワー２３６を３方向コネクター２４０と連結する。チューブ２４２は、３方向コネクター２４０をソレノイドバルブ洗浄ラインマニホールド２４４と連結し、そしてチューブ２４６は３方向コネクター２４０をソレノイドバルブ洗浄ラインマニホールド２４８と連結する。本発明の１つの態様において、合計２４の洗浄ラインに供給されるように２個のさらなるソレノイドバルブ洗浄ラインマニフォールドが提供される
。
【００８５】
図９は、真空システムの詳細な図を示す。図は、廃棄物容器２５２をソレノイドバルブ１００と連結するチューブ２５０およびソレノイドバルブ１００を合成プレート(プレート１)３８と連結するチューブ２５４を示す。図はまた、廃棄物容器２５８をソレノイドバルブ９８と連結するチューブ２５６およびソレノイドバルブ９８を合成プレート(プレート２)２６２と連結するチューブ２６０も示す。チューブ２６４は廃棄物容器２５２を３方向真空入口ソレノイドバルブ１０８と連結し、そしてチューブ２６６は３方向真空入口ソレノイドバルブ１０８をドライテフロン真空ポンプ２６８およびトラップ２７０と連結する。同様に、チューブ２７２は廃棄物容器２５８を３方向真空入口ソレノイドバルブ１１０と連結し、そしてチューブ２７４は３方向真空入口ソレノイドバルブ１１０をドライテフロン真空ポンプ２６８およびトラップ２７０と連結する。ドレーン２７６はチューブ２８０でドレーン廃棄物容器２７８に連結され、そしてチューブ２８２はドレーン廃棄物容器２７８を真空入口ソレノイドバルブ１１４と連結する。チューブ２８４は真空入口ソレノイドバルブ１１４をドライテフロン真空ポンプ２６８およびトラップ２７０と連結する。好ましい態様において、２枚の追加のプレートに対応するために同様の連結、チューブおよびバルブが使用され、従って、システムは合計４枚のプレート用に設定される。
【００８６】
上記に説明されるように、従来の自動ポリヌクレオチド合成機は様々なポリヌクレオチドを並行して製造する能力を有する。しかしながら、先行技術のシステムは全て、合成反応が反応ウェルの各々において同期的に起こることを必要とする。例えば、塩基は異なり得るが、２０番目の塩基は各ポリヌクレオチドに同時に付加される。従って、たとえより短いポリヌクレオチドが前に完了している可能性があっても最も長いポリヌクレオチドが合成されるまで自動運転は継続しなければならない。同様に、各反応ウェルはキャッピング、脱酸素、脱保護および洗浄を同様に同時に受ける。従って、かなりの待機時間を有する反応中、全システムは働いていない。
【００８７】
本発明は、少なくとも２つの異なる反応容積において非同期的に反応を行うことにより自動合成の柔軟性および性能を高める。特に、１つのウェルにおける反応の待機時間中に、注入ヘッドは別のウェルに試薬を送達するために用いられ、従って、そのウェルにおける合成サイクルは反応が第一のウェルにおいて完了するのを待機することなく継続することができる。例えば、第一のプレートにおけるカップリング段階の待機時間中に、非ブロック化、キャッピングもしくは酸化段階を第二のプレートにおいて行うことができる。さらに、反応を非同期的に行うことにはまた、ポリヌクレオチド鎖上の異なる位置における塩基のカップリングに対応する反応待機時間中に第二のプレート上でカップリング段階を行うことも包含される。例えば、第二のプレートにおけるポリヌクレオチドへの１０番目の塩基のカップリングは、第一のプレートにおけるポリヌクレオチドに９番目の塩基をカップリングする反応が起こっている間に開始することができる。
【００８８】
代わりのプレートにおいてさらなる反応段階を行うために全ての利用可能な待機時間を使用することにより、システムの遊休時間の量を劇的に晴らすことができる。
【００８９】
本発明のさらなる態様において、１つより多くのさらなる反応段階は、第一のプレートの反応待機時間中に１つもしくはそれ以上のさらなるプレート上で行われる。
【００９０】
上記の本発明の態様において、４枚の別個の９６ウェルプレートが用いられる。同じプレート上で合成されるように同様の長さのポリヌクレオチドをグループ化することにより、各プレートはプレート上の最も長いポリヌクレオチドが合成されるやいなや取り除くことができる。この利点は、１枚より多くのプレートを用いる任意の態様において実現される。エアロック１８とグローブをしたアクセスポイント１４および１６の組み合わせは、
大気を汚染することなしに合成プラットフォームからの１枚のプレートの除去を容易にし、合成が残りのプレート上で継続することを可能にする。従って、好ましい態様において、２枚の別個のプレートが用いられる。より好ましくは、３枚の別個のプレートが用いられる。さらにより好ましくは、４枚の別個のプレートが用いられる。当業者が理解するように、本発明の概念はまた５枚以上の別個のプレートを有する態様に拡張することもできる。
【００９１】
上記に説明されるように、ホスホルアミダイトポリヌクレオチド合成サイクルは、以下に詳細に記述される４つの段階：（１）非ブロック化；（２）活性化／カップリング；（３）キャッピング；および(４)酸化を一般に含んでなる。
【００９２】
非ブロック化：合成サイクルは、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）もしくはトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）に短時間さらされることによる５’末端塩基の５’ヒドロキシルからのＤＭＴ基の除去から始まる。合成反応の効率をモニターするのに役立つように生成するトリチル陽イオンの収率を測定することができる。ヌクレオシドビルディングブロック上で、反応性種（第一級アミンおよび遊離ヒドロキシル）の保護は、さらされた５’−ヒドロキシルがカップリング反応(次の段階)に関与することができる唯一の反応性求核剤であることを保証する。
【００９３】
活性化／カップリング：ＤＮＡホスホルアミダイトは、カップリングの時点でテトラゾールもしくはテトラゾール誘導体における処理によってより反応性の形態に転化される。これらのプロセスはホスホルアミダイトの迅速な脱保護、続いてホスホロテトラゾリド中間体の可逆的なそして比較的遅い形成によって起こる。活性化されたデオキシリボヌクレオシド−ホスホルアミダイト試薬とのカップリング反応は、速くそして効率がよい。完全な活性化およびＣＰＧにカップリングされる反応性ポリヌクレオチドに対して過剰のホスホルアミダイトを保証するためにホスホルアミダイトに対して過剰のテトラゾールを用いることができる。これらのタイプの条件下で＞９９％のカップリング効率を得ることができる。
【００９４】
カップリング：塩基−カップリング反応は１００％効率的ではないので、ＣＰＧ担体上のわずかな割合の成長ポリヌクレオチドはカップリングすることができず、そして望ましくないトランケーション種をもたらす。ブロックされない場合、これらのトランケーションもしくは部分ポリヌクレオチド生成物は、後のサイクルにおいて基質として働き続け、伸長し、そして内部欠失を有するほぼ全長のポリヌクレオチドをもたらすことができる。これらのトランケーションもしくは部分ポリヌクレオチド生成物は（ｎ−１）ｍｅｒ種と呼ばれる。これらの「反応の失敗」は、無水酢酸での遊離５’−ＯＨのアセチル化を伴う「キャッピング」により次の合成サイクルに関与するのを大抵は防ぐことができる。好ましい態様において、ＣａｐＡ試薬はテトラヒドロフラン無水酢酸を含んでなり、そしてＣａｐＢ試薬はテトラヒドロフランピリジン−Ｎ−メチルイミダゾールを含んでなる。
【００９５】
酸化：この時点で、ＤＮＡ塩基は潜在的に不安定な３価の亜リン酸トリエステルにより連結される。この種は、酸化により安定な５価のホスホトリエステル結合に転化される。水／ピリジン／テトラヒドロフランにおける希ヨウ素での反応生成物の処理はヨウ素−リン付加物を形成し、それは加水分解されて５価のリンを生成せしめる。酸化段階はポリヌクレオチド合成の１サイクルを完了し；次のサイクルは新たに付加された５’−塩基からの５’−ＤＭＴの除去から始まる。あるいはまた、次のキャッピング段階が酸化段階に続くことができる。
【００９６】
合成が完了した後に、切断および脱保護反応はポリヌクレオチドの製造を終わらせる。ポリヌクレオチドは、室温で濃水酸化アンモニウムで固体担体から切断される。高温でア
ンモニアにおける継続インキュベーションは、シアノエチル基のＳ−脱離によってリンを脱保護し、そしてまた複素環式塩基から保護基も取り除く。
【００９７】
本発明の現在好ましい態様において、合成機１０のような自動ポリヌクレオチド合成機は、複数の９６ウェルプレートに試薬を送達するために用いられる。第一に、アセトニトリルでの予洗は群７０から１対のインジェクターピンで行われ、５００μＬの総容量を送達する。この段階はプレート当たり行うのに６秒かかる。次に、プレキャッピング段階が群６４および６６におけるインジェクターピンからのＣａｐＡおよびＢ試薬で行われる。２２０μＬの最終容量を送達するために２回の注入が行われる。この段階はプレート当たり行うのに１６秒かかり、そして７５秒の待機時間を必要とする。反復サイクルが始まる前に、群７０からの１対のインジェクターピンでさらなるアセトニトリル洗浄があり、５００μＬの総容量を送達する。この段階はプレート当たり行うのに６秒かかる。
【００９８】
次の５つの段階はコア合成サイクルを含んでなり、ここで、ヌクレオチド塩基が各反復ごとに成長する分子鎖にアニーリングされる。各段階の後に洗浄が続く。第一に、ＤＣＡでの非ブロック化反応は、１００μＬの最終容量を送達するために群６２からのインジェクターピンで２容量を注入することにより開始される。この段階はプレート当たり行うのに６秒を必要とし、そして５０秒の待機時間を必要とする。アセトニトリル洗浄は群７０からの１対のインジェクターピンで行われ、５００μＬの総容量を送達する。この段階はプレート当たり行うのに６秒かかる。第二に、カップリング反応は、２００μＬの総注入容量について、１００μＬの活性剤試薬と一緒にインジェクターピン４８〜５６の１つから１００μＬのアミダイトを注入することにより開始される。この段階はプレート当たり４０秒を必要とし、そして２５０秒の待機時間を必要とする。アセトニトリル洗浄は群７０からの１つのインジェクターピンで行われ、２５０μＬの総容量を送達する。この段階はプレート当たり行うのに６秒かかる。第三に、キャッピング反応は群６４および６６におけるインジェクターピンからのＣａｐＡおよびＢ試薬で行われる。１１０μＬの最終容量を送達するために１回の注入が行われる。この段階はプレート当たり行うのに１６秒かかり、そして７５秒の待機時間を必要とする。アセトニトリル洗浄は群７０からの１つのインジェクターピンで行われ、２５０μＬの総容量を送達する。この段階はプレート当たり行うのに６秒かかる。第四に、酸化反応は群６８からのインジェクターピンでヨウ素を注入することにより行われる。５０μＬの最終容量を送達するために１回の注入が行われる。この段階はプレート当たり行うのに６秒かかり、そして７０秒の待機時間を必要とする。第五に、別のキャッピング反応は群６４および６６におけるインジェクターピンからのＣａｐＡおよびＢ試薬で行われる。１１０μＬの最終容量を送達するために１回の注入が行われる。この段階はプレート当たり行うのに１６秒かかり、そして７５秒の待機時間を必要とする。アセトニトリル洗浄は群７０からの１つのインジェクターピンで行われ、２５０μＬの総容量を送達する。この段階はプレート当たり行うのに６秒かかる。
【００９９】
最後のヌクレオチド塩基がポリヌクレオチド鎖に付加された後、最終非ブロック化段階が３００μＬの最終容量を送達するために群６２におけるピンからの３回のＤＣＡ注入で行われる。最終アセトニトリル洗浄は群７０におけるピンからの３回の注入で行われ、７５０μＬの総容量を送達する。
【０１００】
示されるように、非ブロック化、カップリング、キャッピングおよび酸化段階の後にかなりの待機時間が必要とされる。特に、非ブロック化は５０秒を必要とし、カップリングは２５０秒を必要とし、キャッピングは７５秒を必要とし、そして酸化は７０秒を必要とする。さらに、プレートにおける各ウェルに試薬を送達するために必要とされる全ての時間は、最も短い待機時間より少ない。特に、洗浄段階は６秒のみを必要とし、非ブロック化段階は６秒を必要とし、カップリング段階は４０秒を必要とし、キャッピング段階は１６秒を必要とし、そして酸化段階は６秒を必要とする。従って、どの反応が最初のプレー
トにおいて起こっているかにかかわらず、待機時間中に少なくとも１つのさらなるプレートにおいて少なくとも１つの反応段階を行うために十分な時間がある。好ましくは、複数のさらなる反応段階が待機時間中に１つもしくはそれ以上のさらなるプレート上で行われる。
【０１０１】
本発明の別の態様において、注入容量は以下の結果を与えるように増加することができる。１２００μＬの総容量で予洗し、４４０μＬの総容量でプレキャッピングし、１２００μＬの総容量で洗浄し、２００μＬの総容量で非ブロック化し、１２００μＬの総容量で洗浄し、４００μＬの総容量でカップリングし、６００μＬの総容量で洗浄し、２２０μＬの総容量でキャッピングし、６００μＬの総容量で洗浄し、８０μＬの総容量で酸化し、６００μＬの総容量で洗浄し、２２０μＬの総容量でキャッピングし、６００μＬの総容量で洗浄し、３００μＬの総容量で最終非ブロック化し、そして１８００μＬの総容量で最終洗浄する。
【０１０２】
本発明のさらに別の態様において、典型的な注入容量は下記のとおりであり、ヌクレオチド塩基、活性剤、ｃａｐＢおよび非ブロック化については、各々１００μＬ、洗浄は６５０μＬであり、酸化剤は８０μＬであり、そしてｃａｐＡは１２０μＬである。この態様において、以下の典型的な待機時間を用いることができ、非ブロック化段階には５０秒、カップリング段階には２７０秒、キャッピング段階には１００秒そして酸化段階には７０秒。１８秒のパージ時間および２秒の排出時間もまた排出には１５秒そして等化には２秒の真空時間と一緒に用いることができる。
【０１０３】
コンピューター１０２は、好ましくは別の反応ウェルにおいて起こっている反応の待機時間中に合成反応が少なくとも１つの反応ウェルにおいて進むことを可能にするために送達時間と一緒に反応待機時間を利用するように制御装置１０４に命令するようプログラムされる。従って、本発明の特徴を具体化する合成機は、ウィンドウズ(R)ＸＰもしくはウィンドウズ(R)２０００コンピューターにより制御されることができる。１つの態様において、ソフトウェアはＶｉｓｕａｌＢａｓｉｃ  ６．０で書かれる。また好ましくは、コンピュータはソレノイドバルブおよびｘｙテーブルを制御しそして合成の能力をモニターするためにそれぞれＣｏｍｐｕｍｏｔｏｒ  Ｃｏｍ制御およびＳｉｇｍａ  Ｓｃａｎ画像解析ソフトウェアを実行する。一般に、ソフトウェアは機械操作を制御する。
【０１０４】
１つの態様において、起動手続きは、必要な段階を通してオペレーターに指示する一連のダイアログボックスに従うことにより行われる。いったん機械が運転のためにセットアップされ、そして合成手続きが開始されると、さらなるユーザー介入は必要とされない。ソフトウェアはテーブルの動きおよびバルブ操作に対処し、合成プロセスの状態の絶え間ない更新を与え、そしていったん合成が完了すると必要とされるシャットダウン段階を行う。さらに、好ましくは、ユーザーが様々なサービスおよびメインテナンス手続きを行うことを可能にするための一連のオプションがある（注入容量の較正ならびにプレートオフセットおよびウェル位置をリセットすることのような）。
【０１０５】
図１０は、別個のプレート上で行われる合成反応段階のシーケンスを管理するための一連の段階のフローチャートを示す。本発明の１つの態様において、コンピューター１０２は４枚のプレートに関して図１０に示される段階を行うようにプログラムされる。一般に、段階３００は各プレートの状態をチェックするためにシステムクロックで動かされる。段階３０２は、いずれかのプレートの待機時間が終了しているかどうかを決定し、従って、少なくとも１枚のプレートがさらなる反応段階の準備ができていることを示す。いずれのプレートも準備ができていない場合、別のクロック周期が経ちそして各プレートの状態を再チェックすることを可能にするために段階３００に戻る。少なくとも１枚のプレートが準備ができている場合、段階３０４はプレートの状態を１８の可能なケースの１つを示
すコードに変換する。段階３０６〜３１８は段階３０４において決定されるケースに対応し、そしてプロセスは下記のとおりそれぞれの段階を行う。
【０１０６】
段階３０６は、全てのプレートが準備ができている場合に適用され、そしてこれは段階３２０の実行につながり、それはプレート１キューへの次のコマンドを実行する。
【０１０７】
段階３０８は、プレートが待機することなしに、１枚もしくはそれ以上のプレートが準備ができておりそして残りが完了している場合に適用される。この段階は段階３２２の実行につながり、それはアクティブプレートキューへの次のコマンドを実行する。
【０１０８】
段階３１０は、１枚のプレートが準備ができておりそして残りが完了しているかもしくは待機しているが、全てが完了しているわけではない場合に適用される。この段階は段階３２４につながり、それはカレントプレートキューへの次のコマンドの実行をもたらす。アクティブプレートキューは、現在使用可能にされている（ｂｅｉｎｇ  ｓｕｒｖｉｃｅｄ）プレートのコマンドの一覧である。一度に１枚のみのアクティブなプレートがある。カレントプレートキューは、使用可能にされる準備ができている次のプレートのコマンドの一覧である。システムがそのプレートキューにアクセスする場合、それはアクティブプレートキューもしくはカレントプレートキューになる。
【０１０９】
段階３１２は、２枚のプレートが準備ができており、１枚のプレートが完了しておりそして１枚のプレートが待機している場合に適用される。この段階もまた、上記に説明される段階３２４につながる。
【０１１０】
段階３１４は、３枚のプレートが準備ができておりそして１枚のプレートが待機している場合に適用される。この段階もまた、上記に説明される段階３２４につながる。
【０１１１】
段階３１６は、全てのプレートが待機している場合に、もしくはあるプレートが待機しておりそしてあるプレートが完了している場合に適用される。これは、段階３００およびタイマーループにプロセスを戻す。
【０１１２】
最後に、段階３１８は全てのプレートが完了している場合に適用される。その場合、段階３２６はシステムのタイマーを止め、そして段階３２８はプロセスを終わらせる。
【０１１３】
段階３２０、３２２もしくは３２４の実行後に、段階３３０において次のコマンドが待機であるかどうかが決定される。そうでない場合、プロセスは段階３２０、３２２および３２４のプロセスキューに戻る。コマンドが待機である場合、プレートの状態は更新され、そしてプロセスは段階３００およびタイマーループに戻される。
【０１１４】
本発明の１つの態様において、プレートの状態を決定するプロセスは４桁のコードを指定することを含んでなる。千の位置がプレート１に対応し、百の位置がプレート２に対応し、１０の位置がプレート３に対応し、そして１の位置がプレート４に対応する。各位置において、数字１はプレートが準備できていることを示し、数字２はプレートが待機していることを示し、そして数字３はプレートが完了していることを示す。
【０１１５】
このコードを実行することにより、プレートの状態を示すために以下の１８の可能な状態が用いられる。ケース１において、コードは全てのプレートが準備ができていることを示す１１１１の値を有する。
【０１１６】
ケース２において、コードは、少なくとも１枚のプレートが準備ができておりそして残りが待機していることを示す値１１１３、１１３１、１３１１、３１１１、１１３３、１
３１３、１３３１、３３１１、３１１３、３１３１、１３３３、３１３３、３３１３および３３３１を有することができる。ケース３において、コードは、プレート１が準備ができており、少なくとも１枚のプレートが待機しておりそして残りが完了していることを示す値１２２３、１２３２、１３２２、１３２３，１３３２、１２３３および１２２２を有することができる。ケース４において、コードは、プレート２が準備ができており、少なくとも１枚のプレートが待機しておりそして残りが完了していることを示す値２１２３、２１３２、３１２２、３１２３、３１３２、２１３３および２１２２を有することができる。ケース５において、コードは、プレート３が準備ができており、少なくとも１枚のプレートが待機しておりそして残りが完了していることを示す値２２１３、２３１２、３２１２、３２１３、３３１２、２３１３および２２１２を有することができる。ケース６において、コードは、プレート４が準備ができており、少なくとも１枚のプレートが待機しておりそして残りが完了していることを示す値２２３１、２３２１、３２２１、３２３１、３３２１、２３３１および２２２１を有することができる。
【０１１７】
ケース７において、コードは、プレート１および２が準備ができており、少なくとも１枚のプレートが待機しておりそして残りが完了していることを示す値１１２３、１１３２および１１２２を有することができる。ケース８において、コードは、プレート１および３が準備ができており、少なくとも１枚のプレートが待機しておりそして残りが完了していることを示す値１２１３、１３１２および１２１２を有することができる。ケース９において、コードは、プレート１および４が準備ができており、少なくとも１枚のプレートが待機しておりそして残りが完了していることを示す値１２３１、１３２１および１２２１を有することができる。ケース１０において、コードは、プレート２および３が準備ができており、少なくとも１枚のプレートが待機しておりそして残りが完了していることを示す値２１１３、３１１２および２１１２を有することができる。ケース１１において、コードは、プレート２および４が準備ができており、少なくとも１枚のプレートが待機しておりそして残りが完了していることを示す値２１３１、３１２１および２１２１を有することができる。ケース１２において、コードは、プレート３および４が準備ができており、少なくとも１枚のプレートが待機しておりそして残りが完了していることを示す値２３１１、３２１１および２２１１を有することができる。
【０１１８】
ケース１３において、コードは、プレート２、３および４が準備ができておりそしてプレート１が待機していることを示す値２１１１を有することができる。ケース１４において、コードは、プレート１、３および４が準備ができておりそしてプレート２が待機していることを示す値１２１１を有することができる。ケース１５において、コードは、プレート１、２および４が準備ができておりそしてプレート３が待機していることを示す値１１２１を有することができる。ケース１６において、コードは、プレート１、２および３が準備ができておりそしてプレート４が待機していることを示す値１１１２を有することができる。
【０１１９】
ケース１７において、コードは、少なくとも１枚のプレートが待機しておりそして残りのプレートが完了していることを示す値２２２３、２２３２、２３２２、３２２２、２２３３、２３３２、３３２２、２３２３、３２３２、２３３３、３２３３、３３２３および３３３２を有することができる。
【０１２０】
最後に、ケース１８において、コードは、全てのプレートが完了していることを示す値３３３３を有する。上記に示されるように、各ケースは段階３０６〜３１８の１つに対応する。
【０１２１】
本発明の装置はまた、非常に効率のよい合成のための条件を最適化するために合成環境も調節する。ポリヌクレオチド化学は、水蒸気および空気の存在に特に感受性であること
が知られている（Ｇａｉｔ“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ
ｐｒａｃｔｉｃａｌ−ａｐｐｒｏａｃｈ”Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８４）。カップリング反応の効率は、水分により著しく下げられる。この感受性に対処するために、本発明の装置は好ましくは自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖連続無水システムを維持する。そのような装置の利点は、ポリヌクレオチド合成反応中に湿度が減少されることである。自動ポリヌクレオチド合成システム内の湿度もしくは水分の減少は、増加したカップリング効率をもたらす。増加したカップリング効率は各段階でのより大きい収率およびより長いポリヌクレオチドを合成する能力をもたらす。増加したカップリング効率はまた、部分ポリヌクレオチド生成物の量も減らし、最終ポリヌクレオチド生成物の品質を高める。
【０１２２】
本発明の装置の別の利点は、装置が圧力安定性を調節できることである。安定な圧力は、合成反応における化学物質の送達の変動を減らすことができる。例えば、合成反応が継続するにつれて、試薬容器容量および高純度ガスの高圧ガスシリンダーにおけるガス圧力の減少があり、それは付随する圧力の減少をもたらす。この圧力の減少は合成反応において送達される試薬の量の変化をもたらす可能性があり、それはカップリング効率を下げ得る。デジタルガス調節装置のような本発明の装置のコンポーネントは、リアルタイムでガス圧力をモニターすることができそして反応することができ、より一定のレベルへの圧力の等化をもたらす。一定圧力を維持することは合成反応における試薬の正確な量のより一貫した送達をもたらし、それはより良いカップリング効率をもたらす。システムにおいて一定圧力を維持することはまた、システムにおける相対湿度を減らすことにも役立つ。
【０１２３】
本発明の装置は、例えば、低い水分含有量および化学試薬の一貫した送達のための一定の圧力レベルで、恒常性状態を調節するかもしくは制御することができる。湿度の減少および化学物質送達の変動の減少は両方とも、より長い長さおよびより高い品質のポリヌクレオチドの製造を可能にするより高いカップリング効率をもたらすことができる。高品質のポリヌクレオチドは、精製段階なしに用いることができる。精製段階は時間がかかり、労力を要し、そして最終生成物のより低い収率をもたらす。長い長さもしくは高い品質のポリヌクレオチドは、例えば遺伝子アセンブリおよび部位特異的突然変異誘発を包含するいくつかの用途において有用である。
【０１２４】
ポリヌクレオチド合成効率は、各サイクルの化学について典型的に約９８〜９９％であり、従って、各サイクルについて反応生成物の約１〜２％は予想されるよりも１塩基短い。あるトランケーション種は「キャッピング」できず、そしてＤＮＡ合成のさらなるサイクルに関与し続ける。６０ｍｅｒのポリヌクレオチドについて、最終生成物の５０％未満が所望の全長分子である。最終合成生成物には配列の不均一収集物、事実上あらゆる可能な位置での欠失突然変異体のプールに相当する（ｎ−１）ｍｅｒおよび（ｎ−２）ｍｅｒなどの分子の混合集団が含まれる。
【０１２５】
合成規模は出発物質の量をさし、一方、合成収率は合成および精製段階が完了した後に回収される最終生成物の量をさす。ポリヌクレオチド合成において、３’末端の塩基は顧客により注文された規模で固体担体に付けられる。塩基は、３’→５’方向に１度に１個付加される。理想的には、各々の付加される塩基は１００％の効率でカップリングし、１００％の収率をもたらす。実際には、カップリング効率はいくらか１００％を下回り、そしてこのわずかな減少は最終オリゴヌクレオチドの収率の実質的な減少をもたらし得る（カップリング効率の影響は相加的であるので）。さらに、カップリング効率は付加される各塩基について異なる可能性があり、従って、配列自体が収率の幅広い変動に寄与し得る。２５０ｎｍｏｌｅ規模の反応について、脱保護および精製後の最終収量は１０〜１００ｎｍｏｌｅの間であることができる。ある配列は他のものより高い収量をもたらす傾向があり、そしてこの傾向は通常は再現可能である。たとえ２つの配列が同じ試薬を用いて同
じ機械上で同じ日に実行されるとしても、ある２０塩基配列の合成の収率は、異なる２０塩基配列について得られるものの２倍であることができる。収率のある変動性はまた、使用する個々の機械にも由来し得る。
【０１２６】
既定合成の理論的収率は（Ｅｆｆ）ｎ−１であり、「Ｅｆｆ」はカップリング効率を表し、そして「ｎ」はポリヌクレオチドにおける塩基の数を表す。カップリング効率が９９％（Ｅｆｆ＝０．９９）である場合、合成後に存在する全長生成物の割合は２０ｍｅｒについて約（０．９９）１９すなわち８３％；５０ｍｅｒについて（０．９９）４９すなわち６１％；そして７５ｍｅｒについて（０．９９）７４すなわち４８％である。カップリング効率のわずかな減少は、予想される収率の実質的な減少をもたらす。例えば、カップリング効率が９９％である場合、１００ｍｅｒの収率は（０．９９）９９すなわち３７％であるが、カップリング効率が９８％に落ちる場合、収率は（０．９８）９９すなわち１３％まで落ちる。
【０１２７】
しかしながら、カップリング効率は付加される各塩基によって異なる。カップリング効率は、おそらく固体担体の表面近くの立体障害のために、最初の５〜６塩基について低くなる。次に、２０番目の塩基の付加に特徴的であるように、カップリング効率は約９９％の最適条件まで増加し、そして次に再度、長さが増加するにつれて次善レベルに落ちる。ポリヌクレオチドが非常に長くなるにつれてカップリング効率は実際には減少するので、１００ｍｅｒでの収率は１０％未満であり得ることが多い。生成物はまた、行われる場合には任意の精製プロセス中に失われ、それは収率をさらに下げる。
【０１２８】
上記のように、ポリヌクレオチド合成の効率は、無水反応環境を提供することにより最大化される。従って、本発明の好ましい態様において、１つもしくはそれ以上の特徴がシステムへの水分の流入を制限するように設計された。従って、本発明の装置は、例えば、耐湿性試薬容器、合成プラットフォームを囲む密封ドライボックス、グローブをしたアクセスポイント、エアロック、試薬を貯蔵するための統合乾燥チャンバー、耐湿性チューブ連結およびインラインガスドライヤーを包含する、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖連続無水システムを含んでなることができる。
【０１２９】
本発明の装置はいくつかのシール、例えばドライボックスと合成プラットフォームとの間のシールおよびコネクターと試薬の容器との間のシールを含有する。シールは、気密連結を生じる閉鎖を意味するものとする。シールは気密連結をもたらすことができる任意の材料で、例えばガラス、プラスチックもしくは金属でできていることができる。従って、シールは耐溶媒性材料でできていることができる。密封材料には、例えばゴム、ＴＹＧＯＮもしくはシリコーンが包含される。１つの態様において、本発明の装置における連結は水分流入を除くために密封される。別の態様において、連結はシリコーンコークで密封される。さらなる態様において、連結は二重密封される。
【０１３０】
装置において使用されるシールは、気密連結を維持するために十分な強度のものでなければならない。シールの強度は、例えば、真空もしくはある強度の圧力を維持するその能力により測定することができる。本発明の装置の密封連結は１００ｐｓｉより大きい、７５ｐｓｉより大きい、５０ｐｓｉより大きいもしくは２５ｐｓｉより大きい圧力を維持することができる。１つの態様において、本発明の装置の密封連結は２５ｐｓｉより大きい圧力を維持することができる。
【０１３１】
ドライボックス１２および関連コンポーネントの継ぎ目は内側および外側で二重密封されることができ、そしてアクセスドア上のガスケットはシリコーンシーラーで補強される。さらに、ケーブルカップリングは密封され、そして注入ラインに供給するために用いられる開管カップリングはシリコーンゴムシーラントを用いて密封される。
【０１３２】
本発明の装置は好ましくは、ドライボックス内に湿度計を含有する。例えば、湿度計はデジタル湿度計であることができる。該計器は、内部ドライボックス湿度がリアルタイムでシステムにより絶えずモニターされることを可能にすることができる。次に、このデータは手動でもしくは自動的にコンピューターに入力され、そして合成を開始する前に既定の期間待機するのとは対照的にいつ合成が始まるべきかを決定するために用いることができる。例えば、合成は、ドライボックス内の湿度が１％の湿度以下である場合に始まるようにプログラムすることができる。さらに、システムは、湿度が特定の量を上回る場合にオペレーターに警告しそして必要に応じて合成反応を一時停止することができる。
【０１３３】
合成ドライボックスの湿度含有量が高すぎる場合に反応は始まることができないかもしくは進むことができないので、合成反応の効率は湿度計を加えることにより改善することができる。さらに、設定期間の代わりに湿度レベルに基づいて合成反応を開始することは、許容しうるレベルまで湿度を減らすために必要とされる時間が設定期間未満である場合に合成反応をスピードアップすることができる。湿度計は、例えばＤｉｃｋｉｎｓｏｎモデルＴＰ１２０  ＳＮ  ０２２２１３４７のようなＤｉｃｋｉｎｓｏｎから市販されている。
【０１３４】
図７に関する上記の本発明の態様において、例えば、フロースルーガスドライヤー９４および９６は、試薬ガスフィード（ｇａｓ  ｆｅｅｄｓ）としても知られているガスサプライに試薬容器７２〜９２を連結するチューブにつながれる。試薬ガスフィードは、所望の圧力レベルに耐えることができる材料でできている。例えば、試薬ガスフィードは、洗浄溶液容器とガスシリンダーを連結するプラスチック、ステンレス鋼もしくはテフロンチューブであることができる。様々なタイプのチューブを試薬ガスフィードに用いることができ、例えば、チューブがガス源から試薬容器にガスを運ぶことができる限りチューブは異なるレベルの柔軟性もしくは異なる直径を有することができる。また上記のように、フロースルーガスドライヤー１３２は、ガスサプライとドライボックス１２との間に連結されることができる。さらなる態様において、本発明の装置は、ドライボックスガス出口ポートに連結されるフロースルーガスドライヤー、ヌクレオチド溶液容器を加圧するために用いられる試薬ガスフィードに連結されるフロースルーガスドライヤーおよびアセトニトリル洗浄溶液容器（デュワーとしても知られている）を加圧するために用いられる試薬ガスフィードに連結されるフロースルーガスドライヤーを含有する。
【０１３５】
１つの態様において、試薬ガスフィードは耐湿性および耐溶媒性チューブでできている。ガスフィードは加圧されたガスを運ぶので、適切な強度および組成のチューブおよびシールが用いられる。例えば、ガスフィードはＳｗａｇｅｌｏｋ(R)圧力パイプ継手を用いてガスシリンダーに一方の末端でそしてＳｗａｇｅｌｏｋ(R)圧力パイプ継手を用いて１つの試薬容器もしくは複数の容器にもう一方の末端で連結されるテフロンチューブであることができる。試薬ガスフィードは、ヌクレオチド溶液のような試薬をガスシリンダー、例えばヘリウムガスシリンダーに連結することができる。ヘリウムは試薬ボトルを加圧するために用いることができ、それは送達ラインにおける気泡を防ぐことができる。さらに、試薬ガスフィードは、図８に図示されるようにガスシリンダーに洗浄溶液、例えばアセトニトリルのような試薬を連結することができる。
【０１３６】
本発明の装置は、合成プレート真空チャックと廃棄物容器との間に少なくとも１つのインラインソレノイドバルブ９８および１００を含有することができる。これらの通常は閉じたソレノイドは、図９に示されるように主真空システムによりアクティブ化されそしてプレートを空にした後に合成フィルタープレートから廃棄物容器を分離するように働くことができる。これは廃棄物容器が等化するのを防ぎ、そして容器が持続陰圧（真空）下で保たれることを可能にすることができる。得られる効果は、最初に廃棄物容器をポンプダ
ウンする必要があることよりむしろ、システムが合成プレートをすぐに真空にできることである。別の態様において、本発明の装置は等化を防ぐために別の経路に切り替えられそして短絡される３方向真空入口ソレノイドバルブ１０８および１１０を有することができる（図９参照）。Ｗｅｌｃｈ自浄式テフロンドライ真空システムモデル２０２５(Ｇａｒｄｎｅｒ  Ｄｅｎｖｅｒ  Ｔｈｏｍａｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬ)のような高強度真空システムを本発明の装置において用いることができる。
【０１３７】
いくつかのタイプのガスを本発明の装置において用いることができる。本発明の装置において用いられるガスは、それら単独で反応性をほとんど含有しない安定なもしくは不活性のガスであることができる。例えば、ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノンおよびラドンのような希ガスは、装置において用いることができる不活性ガスである。さらに、窒素のようなガスを不活性ガスとして本発明の装置において用いることができる。１つの態様において、本発明の装置において使用されるガスは窒素、アルゴンもしくはヘリウムである。別の態様において、ヘリウムは試薬容器を加圧するために用いられ、そして窒素はドライボックスにおいて用いられる。窒素ガスは、例えば、液体窒素（Ｎ２）ボイルオフデュワーから得ることができる。窒素を用いることの利点は、それが安価なガスであることである。
【０１３８】
チューブは、例えば、耐湿性および耐溶媒性チューブであることができる。プラスチックおよびＴＹＧＯＮ(R)、テフロン(R)およびポリプロピレンチューブのような、いくつかのタイプの耐湿性および耐溶媒性チューブが当該技術分野において既知であり、そして市販されている。好ましくは、装置において使用されるチューブはテフロン(R)チューブである。
【０１３９】
チューブは、様々な方法で試薬容器に連結することができる。例えば、チューブは試薬容器のような装置の他のコンポーネントに取り外し可能に連結することができる。これは、チューブの迅速なそして都合のよい調整もしくは置換および容器の交換を可能にする。１つの態様において、取り外し可能な連結は、容器の入口もしくは出口ポートのような開口部の外面上にチューブを伸ばすことにより得ることができる。入口もしくは出口ポートの外面上に伸びたチューブは、弾性リングもしくは金属留め金のような留め金により適所に保持することができる。また、例えば、チューブは気密閉鎖を形成するために一方の末端上で入口もしくは出口ポートのような開口部の外面をそしてもう一方の末端上で入口もしくは出口ポートの外面を包み込む外被により適所に保持することもできる。都合のよい外被は、例えば、ＴＹＧＯＮ(R)チューブを包含するチューブの短い部分であることができる。また、様々な容器にチューブを連結するために例えばＳｗａｇｅｌｏｋ(R)  Ｐａｒｋｅｒ圧力パイプ継手、ポリプロピレンおよびステンレス鋼継手を用いることもできる。
【０１４０】
図７および８に示されるように、本発明の装置はデジタルガス調節装置２０４および２３２を含有し、ここで、ガス調節装置は試薬容器における一定圧力を保つ。１つの態様において、ガス調節装置はデジタルガス調節装置である。ガス調節装置はリアルタイムで正確にガス圧力のレベルをモニターすることができ、そしてガス圧力を一定に保つためにガスのレベルに調整を行うことができる。ガス圧力の一定レベルは、所望の値の前後にわずかに変動し得る圧力のレベルである。例えば、試薬の容量が減少するにつれて、試薬容器における圧力は変化する。この変化はガス調節装置により迅速に検出され、そしてシグナルが送られ、それは元の所望のレベルへのガス圧力の調節をもたらす。ガス圧力のわずかな変化は短期間経験され得るが、ガス調節装置は、ガス圧力のレベルが本質的に一定であるようにガス圧力のわずかな変化に迅速に反応することができる。何らかの理由でシステムにおける圧力が特定の量未満に減少する場合、システムはオペレーターに警告し、そして必要に応じて合成反応を一時停止することができる。このようにして持続的な恒常性の
システムが維持される。デジタルシグナルは、アナログシグナルの使用より正確なガス圧力調整を可能にする。従って、デジタルシグナルはガス圧力の同時調整を可能にする。デジタルガス調節装置は、例えば０．１ｐｓｉの圧力、０．０５ｐｓｉの圧力もしくは０．０１ｐｓｉの圧力の増加量で、ガス圧力を維持するために用いることができる。ガス調節装置が正確になるほどシステム内の圧力の制御はますます正確になる。デジタルガス調節装置は、例えばＡｌｉｃａｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  （Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）から市販されている。
【０１４１】
本明細書において用いる場合、「デジタルガス調節装置」という用語は、経時的に正確にガス圧力をモニターしそして所望のレベルにガス圧力を調整するように働く装置に出力シグナルを送ることができる装置を意味するものとする。デジタルガス調節装置は、ガス圧力をモニターしそしてシステムにおけるガス圧力の一定レベルを維持するように設定することができる。例えば、デジタルガス調節装置は、容器における試薬のレベルが変化するかもしくはガスシリンダーにおける圧力が変化する場合に、容器における圧力の生じる変化がデジタルガス調節装置によって正確にモニターされそしてデジタル表示上に示されるように加圧試薬容器、高圧ガスシリンダーもしくは閉鎖システムにおけるガス圧力のレベルをモニターすることができる。次に、デジタルガス調節装置は試薬容器に入るガスの量を制御するバルブにシグナルを送り、容器におけるガス圧力を等化するために容器に入るガスの量を調整することができる。
【０１４２】
ドライボックスガス入口および出口ポートに連結されるフロースルーガスドライヤーは、液体窒素デュワーからドライボックスに導入されているガスが予備乾燥されることそしてドライボックス排気からの逆流によってほとんどもしくは全く水分が導入されないことを保証するのを助けるために用いることができる。試薬ガスフィードに連結されるフロースルーガスドライヤーは、水分が試薬もしくは洗浄化学物質に導入されないことを保証するのを助ける。
【０１４３】
フロースルーガスドライヤーは、コネクター中の物質が乾燥装置を通って流れることができるように、チューブのような、コネクターとインラインで位置する任意の乾燥装置である。従って、乾燥装置はコネクター中の物質から水分を除く任意の装置であることができる。例えば、乾燥装置はコネクター中の物質から水分を吸収する乾燥剤物質を含有することができる。さらに、乾燥剤物質はドライボックスの内部にもしくは水分含有量を減らすのに役立つ任意の場所に置くことができる。多数の乾燥剤が当該技術分野において既知であり、そして市販されている、例えば、粘土ベースの物質およびゼオライト。市販されている乾燥剤には、例えば、ＤＲＩＥＲＩＴＥ(R)およびＳｉｌｉｐｏｒｉｔｅ  ＮＫ１０Ｆが包含される。１つの態様において、本発明の装置において用いられる乾燥剤物質は五酸化リンおよび水酸化ナトリウムである。別の態様において、本発明の装置において用いられる乾燥剤物質はＤＲＩＥＲＩＴＥ(R)および５Ａ分子ふるいである。ＤＲＩＥＲＩＴＥ(R)のような乾燥剤物質は、０．００５ｍｇ／ｌ空気の乾燥度までガスを乾燥させることができる。
【０１４４】
フロースルーガスドライヤーは、例えば、ガスラインからの水分、不純物および微粒子の除去のために表示するＤＲＩＥＲＩＴＥ(R)および５Ａ分子ふるいを詰めたＤＲＩＥＲＩＴＥ(R)ガス清浄器であることができる。そのようなガス清浄器は、圧縮型チューブ継手を用いて取り付けることができる。ＤＲＩＥＲＩＴＥ(R)は、乾燥能力の低下を示すために青色から桃色に変色する。ＤＲＩＥＲＩＴＥ(R)は、既知の方法により置換するかもしくは再生することができる。５Ａ分子ふるいは、５オングストローム未満の有効分子直径を有する不純物を取り除く。ＤＲＩＥＲＩＴＥ(R)ガス清浄器は市販されている。それは成形ポリカーボネートおよびｏ−リングガスケットを装着したポリカーボネートキャップでできている縦列を有する。ＤＲＩＥＲＩＴＥ(R)および分子ふるいは、フェルトフィ
ルター間で適所に保持される。ベッド担体およびコイルばねはステンレス鋼であり、そして出口フリットは４０ミクロンである。縦列の寸法は２  ５／８インチｘ１１  ３／８インチである。連結は１／８インチステンレス鋼オスチューブ継手である。推奨される最大作動圧力は１００ｐｓｉｇであり、そして水容量は２５グラムである。推奨される流速は、最大効率のためには時間当たり３００リットルまでである。
【０１４５】
上にさらに記述されるように、上記の装置における連結は、例えばシリコーンコークを用いて、水分流入を除くために密封することができる。また密封連結は、１００ｐｓｉより大きい強度の圧力を維持することができる。また上記のように、試薬容器はヌクレオチド溶液容器もしくは廃棄物溶液容器であることができ、そして１つの態様において、試薬容器は洗浄溶液容器および１つもしくはそれ以上のヌクレオチド溶液容器である。装置は、ドライボックスに乾燥試薬を送達する試薬容器を加圧するチューブに連結されるか、もしくは試薬ガスフィードに連結される少なくとも１つのフロースルーガスドライヤーをさらに含有することができる。さらに、装置は湿度計を含有することができる。
【０１４６】
本発明は、自動ポリヌクレオチド合成のための閉鎖連続システムを維持するための装置を提供する。本発明の装置は、いくつかの試薬容器：自動ポリヌクレオチド合成機の合成プラットフォーム上にシールを形成することができるドライボックス；試薬容器をドライボックスに連結する耐湿性チューブ；試薬容器をガスに連結する試薬ガスフィード、および試薬ガスフィードに連結されるデジタルガス調節装置を有することができる。チューブが溶媒と接触している装置内の場所にある場合、選択される耐湿性チューブはまた耐溶媒性でもある。異なる溶媒に耐性であるいくつかの物質は、当該技術分野において既知である。
【０１４７】
さらに、アルゴンもしくは別の不活性ガスは、ドライボックス１２および統合デシケーターキャビネットに絶えず送り込まれる。ガスの一定のフローは、非ブロック化および酸化ラインからの蒸気によるホスホルアミダイトおよびテトラゾールラインの汚染を最小限に抑える。反応物から水蒸気および空気を減らすために２つのチャンバーの組み合わせを使用する先行技術のオリゴヌクレオチド合成機とは対照的に、請求される装置は１つの連続無水ドライボックス反応チャンバーを含有する。
【０１４８】
特注のおよび市販されている両方の、当該技術分野において既知であるいくつかのポリヌクレオチド合成機装置は、本発明の装置に導入することができる。１つの態様において、本発明の装置は、本発明の装置に取り付けるかもしくはそのコンポーネントであることができる、Ｒａｙｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８：７４１−７４７（１９９８））に記述されるようなポリヌクレオチド合成機を含有する。
【０１４９】
上記のＲａｙｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．により記述されるポリヌクレオチド合成機に加えて、多数のポリヌクレオチドの迅速な合成に利用可能な他のハイスループットポリヌクレオチド合成機がある。例えば、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂにより考案されそして構築されたポリヌクレオチド合成機は、マルチチャンネルフォーマットを使用する（Ｓｉｎｄｅｌａｒ  ａｎｄ  Ｊａｋｌｅｖｉｃ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：９８２−９８７（１９９５））。このシステムもまたホスホルアミダイト化学を使用するが、各運転１２ポリヌクレオチドに限定される。Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで考案されそして構築されたポリヌクレオチド合成機、ＡＭＯＳは同じ化学を使用し、そしてＭｅｒＭａｄｅ合成機と同様の反応規模で９６ウェルフォーマットに直接合成する（Ｌａｓｈｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７９１２−７９１５（１９９５））。
【０１５０】
ポリヌクレオチド合成機は約５５インチの幅、約２６インチの奥行きおよび約７２インチの高さを有することができる。合成試薬は上記のように乾燥チャンバーにおいて、標準的な加圧メディウムボトルにおいて貯蔵することができ、そしてキャビネット１０の上部に位置するドライボックス１２にテフロンラインによって移される。記述されるようなキャビネット１０内の機械を制御する電子機器およびコンピューターは、便宜上（ａｓ  ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  ｄｉｃｔａｔｅｓ）本体の内側もしくは外側のいずれかに設置することができる別個のカートに位置することができる。２個のアルゴンタンク（ボトル圧力および不活性合成環境を提供するための）は、本体の側面に固定することができる。
【０１５１】
合成運転に必要なパラメーターは、制御ソフトウェアによりアクセスされる一群の簡単なテキストファイルに保存することができる。これらのファイルは、各ポリヌクレオチドの配列ならびに注入容量、合成サイクルにおける各段階の待機時間、各段階の後の洗浄サイクルの数、ならびにプレートおよびウェルオフセットおよびｘｙテーブルのモーター速度／加速についての情報を含有する。これらは、プレートに異なる濃度および収率を可能にするために各プレートについて変更することができる。さらに、上記に説明されるように、単一のプレート上に同様の長さのポリヌクレオチドをグループ化することにより、より長いポリヌクレオチドの合成が残りのプレート上で途切れずに継続しながら、プレートがその最も長いポリヌクレオチドの合成が完了するやいなや取り除かれることを可能にする。また、異なるポリヌクレオチド配列は、他のプレート上で非同期合成を行うために既定プレートの待機時間を利用することにより表される効率を最大にするために異なるプレートに割り当てることもできる。
【０１５２】
反応パラメーターは、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と質量分析との組み合わせを用いてポリヌクレオチド品質を評価することにより満足できる操作条件に調整することができる。ＣＥおよびＨＰＬＣトレースは、Ｎの％純度についての情報を提供し、一方、ＨＰＬＣトレースは、合成プロセスが完了した後に残される残留化学物質の量を定量するために用いることができる。
【０１５３】
本明細書に記述されるのは現在好ましい態様であり、しかしながら、本発明に関係する当業者は、同等な代替態様があることを理解する。そのようなものとして、変更および改変は、適切に公平に以下の請求項の同等の全範囲内であり、そしてあるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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