(57)【要約】本発明は、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）のアゴニストであるペプチド化合物に関する。本発明は、そのようなペプチド化合物を使って赤血球産生の不足又は欠陥に関連する障害を処置する治療方法にも関係する。本発明のペプチド化合物を含む医薬組成物及び投薬量も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポエチンの不足又は低数の赤血球集団若しくは欠陥性赤血球集団を特徴とする障害を有する患者を処置するための方法であって、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）に結合してそれを活性化する式Ｉの化合物の治療有効量を前記患者に投与することを含み、前記治療有効量が前記患者の体重１キログラムにつき０．０２５〜０．５ミリグラムの化合物という投薬量である方法：
【化８９】
2010536858.tif 000107
［式中、ＰＥＧは、約２０，０００〜約５０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコール部分である］。
【請求項２】
前記化合物が式Ｉａ：
【化９０】
2010536858.tif 000108
である、請求項２に記載の方法。
【請求項３】
医薬的に許容できる担体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記障害が腎不全又は透析である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記治療有効量が前記患者の体重１キログラムにつき０．０２５〜０．２ミリグラムの化合物という投薬量である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記投薬量が前記患者の体重１キログラムにつき０．０５〜０．１ミリグラムの化合物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記障害が悪性疾患に関連する貧血である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記治療有効量が前記患者の体重１キログラムにつき０．０７５〜０．５ミリグラムの化合物という投薬量である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記投薬量が前記患者の体重１キログラムにつき０．２〜０．４ミリグラムの化合物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療有効量が３〜４週間ごとに１回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記障害が慢性腎臓疾患である、請求項１の方法。
【請求項１２】
前記治療有効量が前記患者の体重１キログラムにつき０．２５〜１．２５ミリグラムの化合物という投薬量である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記投薬量が前記患者の体重１キログラムにつき０．５〜０．７５ミリグラムの化合物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療有効量が３〜６週間ごとに１回投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療有効量が４週間ごとに１回投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療有効量が静脈内注射又は皮下注射のいずれかによって投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療有効量が皮下注射によって投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療有効量が前記患者の体重１キログラムにつき０．０５〜０．５ミリグラムの化合物という投薬量である、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
前記悪性疾患が固形腫瘍悪性疾患又はリンパ腫である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて、米国仮特許出願第６０／９８９，７５８号（２００７年１１月２１日出願）及び米国仮特許出願第６０／９５７，３９６号（２００７年８月２２日出願）への優先権を主張する。上記出願の内容は参照によりその全体が本開示に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、エリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）のアゴニストであるペプチド化合物に関する。本発明は、そのようなペプチド化合物を使って赤血球産生の不足又は欠陥に関連する障害を処置する治療方法にも関係する。本発明のペプチド化合物を含む医薬組成物も提供する。
【背景技術】
【０００３】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、約３４キロダルトン（ｋＤ）の分子量を有する１６５アミノ酸の糖タンパク質ホルモンであり、アミノ酸位置２４、３８、８３、及び１２６に優先的糖鎖付加部位を有する。これはまず、２３アミノ酸のシグナルペプチドを有する前駆体タンパク質として産生される。ＥＰＯはα、β、及びアシアロという３つの形態で見出されうる。α型及びβ型はその糖質構成要素がわずかに異なるものの、同じ力価、生物学的活性、及び分子量を有する。アシアロ型は末端糖質（シアル酸）が除去されたα型又はβ型である。ＥＰＯをコードするＤＮＡ配列は報告されている［米国特許第４，７０３，００８号（Ｌｉｎ）］。
【０００４】
ＥＰＯは赤血球前駆体細胞の有糸分裂及び分化を刺激し、よって赤血球の産生を保証する。これは、低酸素状態が優勢である時に腎臓で産生される。赤血球前駆体細胞のＥＰＯ誘発性分化中は、グロビン合成が誘導され、ヘム錯体合成が刺激され、フェリチン受容体の数が増加する。これらの変化により、細胞は、より多くの鉄を帯びて、成熟赤血球中で酸素を結合する機能的なヘモグロビンを合成することが可能になる。こうして、赤血球及びそのヘモグロビンは、身体に酸素を供給する上で極めて重要な役割を果たす。これらの変化は、ＥＰＯが赤血球前駆体細胞の細胞表面上で適当な受容体と相互作用することによって開始される［例えばGraber and Krantz (1978) Ann. Rev. Med. 29.51-66参照］。
【０００５】
ＥＰＯは、身体が健康な状態にあって組織が現存する数の赤血球から十分な酸素供給を受けている時は、血漿中に極めて低い濃度で存在する。加齢によって正常に失われる赤血球の補充を刺激するには、この正常低濃度で十分である。
【０００６】
循環中の血球による酸素輸送が減少する低酸素症の状態では、循環中のＥＰＯの量が増加する。低酸素症は、例えば出血によるかなりの失血、過剰な被曝による赤血球の破壊、高高度若しくは長時間にわたる失神による酸素摂取量の減少、又はさまざまな形態の貧血によって引き起こされうる。そのような低酸素ストレスに応答して、上昇したＥＰＯレベルが、赤血球前駆細胞の増殖を刺激することによって、赤血球産生を増加させる。循環中の赤血球数が正常組織酸素要求量に必要な数を上回れば、循環中のＥＰＯレベルが減少する。
【０００７】
ＥＰＯは赤血球形成のプロセスに不可欠であるので、このホルモンは、低い赤血球産生量又は赤血球産生の欠陥を特徴とする血液障害の診断及び処置の両方に、潜在的に有用な応用を有する。最近の研究により、例えば次に挙げるような、さまざまな疾患状態、障害、及び血液異常状態に対するＥＰＯの治療効力を推定するための根拠が得られている：ベータサラセミア［Vedovato, et al. (1984) Acta. Haematol. 71:211-213参照］；嚢胞性線維症［Vichinsky, et al. (1984) J. Pediatric 105:15-21参照］；妊娠及び月経障害［Cotes, et al. (193) Brit. J. Ostet. Gyneacol. 90:304-311参照］；未熟児早期貧血［Haga, et al. (1983) Acta Pediatr. Scand. 72;827-831参照］；脊髄損傷［Claus-Walker, et al. (1984) Arch. Phys. Med. Rehabil. 65:370-374参照］；宇宙飛行［Dunn, et al. (1984) Eur. J. Appl. Physiol. 52:178-182参照］；急性失血［Miller, et al. (1982) Brit. J. Haematol. 52:545-590参照］；加齢［Udupa, et al. (1984) J. Lab. Clin. Med. 103:574-580及び581-588並びにLipschitz, et al. (1983) Blood 63:502-509参照］；異常赤血球生成を伴う種々の新生物疾患状態［Dainiak, et al. (1983) Cancer 5:1101-1106及びSchwartz, et al. (1983) Otolaryngol. 109:269-272参照］；並びに腎不全［Eschbach. et al. (1987) N. Eng. J. Med. 316:73-78参照］。
【０００８】
精製された均一なＥＰＯが特徴づけられている［米国特許第４，６７７，１９５号（Ｈｅｗｉｃｋ）］。ＥＰＯをコードするＤＮＡ配列が精製され、クローニングされ、発現されて、天然ＥＰＯと同じ生化学的及び免疫学的性質を有する組換えポリペプチドが生産された。天然ＥＰＯ上のオリゴ糖と同じオリゴ糖を有する組換えＥＰＯ分子も生産されている［Sasaki, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:12059-12076参照］。
【０００９】
ＥＰＯの生物学的効果は、一部は、細胞膜結合型受容体との相互作用によって媒介されるようである。マウス脾臓から単離された未熟赤血球系細胞を使った初期の研究では、ＥＰＯ結合性細胞表面タンパク質が、それぞれ８５，０００ダルトン及び１００，０００ダルトンのおよその分子量を有する２つのポリペプチドを含むことが示唆された［Sawyer, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3690-3694］。ＥＰＯ結合部位の数は平均すると１細胞表面あたり８００〜１０００と計算された。これらの結合部位のうち、およそ３００がＥＰＯを約９０ｐＭ（ピコモル濃度）のＫｄで結合し、残りはそれより低い約５７０ｐＭのアフィニティーでＥＰＯを結合した［Sawyer, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:5554-5562］。独立した研究により、フレンド白血病ウイルスの貧血株（ＦＶＡ）を注射したマウスから調製されたＥＰＯ応答性脾臓赤芽球は、それぞれ約１００ｐＭ及び８００ｐＭのＫｄ値を有する合計約４００の高及び低アフィニティＥＰＯ結合部位を有することが示唆された［Landschulz, et al. (1989) Blood 73:1476-1486］。
【００１０】
その後の研究で、２つの形態のＥＰＯ受容体（ＥＰＯ−Ｒ）は単一の遺伝子によってコードされることが示された。この遺伝子はクローニングされている［例えばJones, et al. (1990) Blood 76, 31-35；Noguchi, et al. (1991) Blood 78:2548-2556；Maouche, et al. (1991) Blood 78:2557-2563参照］。例えば、マウス及びヒトＥＰＯ−Ｒタンパク質について、ＤＮＡ配列及びコードされるペプチド配列が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０８８２２（Ｄ’Ａｎｄｒｅａら）に記載されている。最新のモデルでは、ＥＰＯのＥＰＯ−Ｒへの結合が２つのＥＰＯ−Ｒ分子のダイマー化及び活性化をもたらし、それがその後のシグナル伝達ステップをもたらすことが示唆されている［例えばWatowich, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2140-2144参照］。
【００１１】
クローニングされたＥＰＯ−Ｒの遺伝子を利用できることで、この重要な受容体のアゴニスト及びアンタゴニストの探索が容易になる。組換え受容体タンパク質を利用できることで、さまざまなランダム及びセミランダムペプチド多様性生成系における受容体−リガンド相互作用の研究が可能になる。これらの系には「ペプチド・オン・プラスミド（peptides on plasmids）」系［米国特許第６，２７０，１７０号に記載］、「ペプチド・オン・ファージ（peptides on phage）」系［米国特許第５，４３２，０１８号及びCwirla, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382に記載］、「コード化合成ライブラリ（encoded synthetic library）」（ＥＳＬ）系［米国特許出願第９４６，２３９号（１９９２年９月１６日出願）に記載］、及び「超大規模固定化ポリマ合成（very large scale immobilized polymer synthesis）」系［米国特許第５，１４３，８５４号；ＰＣＴ公開第９０／１５０７０号；Fodor, et al. (1991) Science 251:767-773；Dower and Fodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem. 26:271-180；及び米国特許第５，４２４，１８６号に記載］が含まれる。
【００１２】
ＥＰＯ−Ｒと少なくともある程度は相互作用するペプチドが、例えば米国特許第５，７７３，５６９号、同第５，８３０，８５１号、及び同第５，９８６，０４７号（Ｗｒｉｇｈｔｏｎら）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０７４９（Ｗｒｉｇｈｔｏｎら）；米国特許第５，７６７，０７８号及びＰＣＴ公開第９６／４０７７２号（Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＺｉｖｉｎ）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／３８３４２（Ｂａｌｕ）；並びにＷＯ０１／９１７８０（Ｓｍｉｔｈ-Ｓｗｉｎｔｏｓｋｙら）に同定され、記載されている。特に、あるペプチドモチーフを含有する一群のペプチドであって、その構成要素がＥＰＯ−Ｒに結合してＥＰＯ依存的細胞増殖を刺激するものが同定されている。しかしながら、このモチーフを含有するペプチドであって現在までに同定されたものは、インビトロで、ＥＰＯ依存的細胞増殖を、約２０ナノモル濃度（ｎＭ）〜約２５０ｎＭのＥＣ５０値で刺激する。したがって、ＥＰＯによって刺激される最大細胞増殖の５０％を刺激するには、２０ｎＭ〜２５０ｎＭのペプチド濃度が要求される。ＥＰＯ受容体に結合するさらに別のペプチド及びそのコンストラクトが、米国仮特許出願第６０／４７０，２４４号、同第６０／４７０，２４５号、及び同第６０／４６９，９９３号（いずれも２００３年５月１２日出願）；米国仮特許出願第６０／６２７，４３２号及び同第６０／６２７，４３３号（どちらも２００４年１１月１１日出願）；米国非仮特許出願第１０／８４４，９６８号（２００４年５月１２日出願）；並びに国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１４８８６及びＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４８８９（どちらも２００４年５月１２日に出願され、それぞれＷＯ２００４／１０１６１１及びＷＯ２００４／１０１６０６として公開された）に記載されている。これらの出願のそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第４，７０３，００８号明細書
【特許文献２】米国特許第４，６７７，１９５号明細書
【特許文献３】国際公開第９０／０８８２２号パンフレット
【特許文献４】米国特許第６，２７０，１７０号明細書
【特許文献５】米国特許第５，４３２，０１８号明細書
【特許文献６】米国特許第５，１４３，８５４号明細書
【特許文献７】国際公開第第９０／１５０７０号パンフレット
【特許文献８】米国特許第５，４２４，１８６号明細書
【特許文献９】米国特許第５，７７３，５６９号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，８３０，８５１号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，９８６，０４７号明細書
【特許文献１２】国際公開第９６／４０７４９号パンフレット
【特許文献１３】米国特許第５，７６７，０７８号明細書
【特許文献１４】国際公開第９６／４０７７２号パンフレット
【特許文献１５】国際公開第０１／３８３４２号パンフレット
【特許文献１６】国際公開第０１／９１７８０号パンフレット
【特許文献１７】国際公開第２００４／１０１６１１号パンフレット
【特許文献１８】国際公開第２００４／１０１６０６号パンフレット
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Graber and Krantz (1978) Ann. Rev. Med. 29.51-66
【非特許文献２】Vedovato, et al. (1984) Acta. Haematol. 71:211-213
【非特許文献３】Vichinsky, et al. (1984) J. Pediatric 105:15-21
【非特許文献４】Cotes, et al. (193) Brit. J. Ostet. Gyneacol. 90:304-311
【非特許文献５】Haga, et al. (1983) Acta Pediatr. Scand. 72;827-831
【非特許文献６】Claus-Walker, et al. (1984) Arch. Phys. Med. Rehabil. 65:370-374
【非特許文献７】Dunn, et al. (1984) Eur. J. Appl. Physiol. 52:178-182
【非特許文献８】Miller, et al. (1982) Brit. J. Haematol. 52:545-590
【非特許文献９】Udupa, et al. (1984) J. Lab. Clin. Med. 103:574-580
【非特許文献１０】Udupa, et al. (1984) J. Lab. Clin. Med. 103:581-588
【非特許文献１１】Lipschitz, et al. (1983) Blood 63:502-509
【非特許文献１２】Dainiak, et al. (1983) Cancer 5:1101-1106
【非特許文献１３】Schwartz, et al. (1983) Otolaryngol. 109:269-272
【非特許文献１４】Eschbach. et al. (1987) N. Eng. J. Med. 316:73-78
【非特許文献１５】Sasaki, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:12059-12076
【非特許文献１６】Sawyer, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3690-3694
【非特許文献１７】Sawyer, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:5554-5562
【非特許文献１８】Landschulz, et al. (1989) Blood 73:1476-1486
【非特許文献１９】Jones, et al. (1990) Blood 76, 31-35
【非特許文献２０】Noguchi, et al. (1991) Blood 78:2548-2556
【非特許文献２１】Maouche, et al. (1991) Blood 78:2557-2563
【非特許文献２２】Watowich, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2140-2144
【非特許文献２３】Cwirla, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382
【非特許文献２４】Fodor, et al. (1991) Science 251:767-773
【非特許文献２５】Dower and Fodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem. 26:271-180
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
この受容体によって媒介される重要な生物学的活性の研究にとっても、疾患の処置にとっても、ＥＰＯ−Ｒアゴニストが計り知れない潜在性を有することを考えると、力価及び活性が強化されたペプチドＥＰＯ−Ｒアゴニストを同定する必要は、依然としてある。本発明はそのような化合物を提供する。
【００１６】
この項及び本明細書の全体における引用及び/又は引用文献の議論は、本発明の説明を理解しやすくするために記載されるに過ぎず、それらの参考文献のいずれかが本発明にとって「先行技術」であるとの承認ではない。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、劇的に強化された力価及び活性を有するＥＰＯ−Ｒアゴニストである新規ペプチド化合物を提供する。これらのペプチド化合物は、アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有するペプチドモノマーのホモダイマー、又はアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有するペプチドモノマーのホモダイマー、アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）（配列番号３）を有するペプチドモノマーのホモダイマーである（ここでは、各アミノ酸が標準の一文字表記で示されており、「（ＡｃＧ）」はＮ−アセチルグリシンであり、「（１−ｎａｌ）」は１−ナフチルアラニンであり、「（ＭｅＧ）」はＮ−メチルグリシン（サルコシンとも呼ばれている）である）。ペプチドダイマーの各ペプチドモノマーは、モノマーのシステイン残基間に分子内ジスルフィド結合を含有する。
【００１８】
ペプチドモノマーは分岐第三級アミドリンカーに共有結合で取付けることによってダイマー化することができる。第三級アミドリンカーは
−Ｃ１Ｏ−ＣＨ２−Ｘ−ＣＨ２−Ｃ２Ｏ−
［式中、ＸはＮＣＯ−（ＣＨ２）２−Ｎ１Ｈ−であり、リンカーのＣ１は第１ペプチドモノマーのＣ末端リジン残基のε−アミノ基とアミド結合を形成し、リンカーのＣ２は第２ペプチドモノマーのＣ末端リジン残基のε−アミノ基とアミド結合を形成し、ＸのＮ１はカルバメート結合又はアミド結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に取付けられ、ここにＰＥＧは約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する（用語「約」はＰＥＧの調製物において、一部の分子は明記した分子量より重く、一部の分子は明記した分子量より軽いことを示す）］
と表すことができる。
【００１９】
ホモダイマーの各モノマーがアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有し、リンカーのＮ１がカルバメート結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物は、次のように表すことができる。
【化１】
2010536858.tif 000002
【００２０】
ホモダイマーの各モノマーがアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有し、リンカーのＮ１がアミド結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物は、次のように表すことができる。
【化２】
2010536858.tif 000003
【００２１】
ホモダイマーの各モノマーがアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有し、リンカーのＮ１がカルバメート結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物は、次のように表すことができる。
【化３】
2010536858.tif 000004
【００２２】
ホモダイマーの各モノマーがアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有し、リンカーのＮ１がアミド結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物は、次のように表すことができる。
【化４】
2010536858.tif 000005
【００２３】
ペプチドモノマーは分岐第三級アミドリンカーに共有結合で取付けることによってダイマー化することもできる。第三級アミドリンカーは
−Ｃ１Ｏ−ＣＨ２−Ｘ−ＣＨ２−Ｃ２Ｏ−
［式中、ＸはＮＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ３Ｏ−であり、リンカーのＣ１は第１ペプチドモノマーのＣ末端リジン残基のε−アミノ基とアミド結合を形成し、リンカーのＣ２は第２ペプチドモノマーのＣ末端リジン残基のε−アミノ基とアミド結合を形成する］
と表すことができる。本発明のペプチドダイマーはさらに、次の構造のスペーサ部分を含む：
−Ｎ１Ｈ−（ＣＨ２）４−Ｃ４Ｈ−Ｎ２Ｈ−
［式中、スペーサのＣ４はＸのＣ３に共有結合で結合され、スペーサのＮ１は、カルバメート結合又はアミド結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に共有結合で取付けられ、スペーサのＮ２はカルバメート結合又はアミド結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合で取付けられ、ここにＰＥＧは約１０，０００〜約５０，０００ダルトンの分子量を有する（用語「約」はＰＥＧの調製物において、一部の分子は明記した分子量より重く、一部の分子は明記した分子量より軽いことを示す）］。各ＰＥＧ部分は、個別に、１０，０００ダルトン（１０ｋＤ）、２０ｋＤ、３０ｋＤ、４０ｋＤ、又は５０ｋＤであることができる。
【００２４】
ホモダイマーの各モノマーがアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有し、スペーサのＮ１及びＮ２がどちらもカルバメート結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合で取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物は、次のように表すことができる。
【化５】
2010536858.tif 000006
【００２５】
好ましい実施形態では、２つのペプチドモノマーのＣ末端リジンがＬ−リジンである。また、２つの線状ＰＥＧ部分がリジンによって（例えばｍＰＥＧ２−Ｌｙｓ−ＮＨＳとして、又はｍＰＥＧ２−リシノール−ＮＰＣとして）つながれ、そのリジンもまた好ましくはＬ−リジンであって、以下の立体化学を生じることは、上記の化学構造から、当業者には理解されるだろう。
【化６】
2010536858.tif 000007
【００２６】
或いは、リジン残基の１つ又はそれ以上がＤ−リジンであって、当業者には容易に理解されるであろう、もう一方の立体化学を生じてもよい。
【００２７】
ホモダイマーの各モノマーがアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）であり、スペーサのＮ１及びＮ２がどちらもアミド結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合で取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物は、次のように表すことができる。
【化７】
2010536858.tif 000008
【００２８】
ここでも、この化合物中のリジン分子は好ましくは全てＬ−リジンであって、次の立体化学を生じる。
【化８】
2010536858.tif 000009
【００２９】
或いは、リジン残基の１つ又はそれ以上がＤ−リジンであって、当業者には容易に理解されるであろう、もう一方の立体化学を生じてもよい。
【００３０】
ホモダイマーの各モノマーがアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有し、スペーサのＮ１及びＮ２がどちらもカルバメート結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合で取付けられ、Ｙがカルバメート基である場合、本発明の新規ペプチド化合物は、次のように表すことができる。
【化９】
2010536858.tif 000010
【００３１】
好ましくは、この分子においてペプチドモノマーと線状ＰＥＧ部分とをつなぐリジン残基は全てＬ−リジンであって、次の立体化学を生じる。
【化１０】
2010536858.tif 000011
【００３２】
或いは、リジン残基の１つ又はそれ以上がＤ−リジンであって、当業者には容易に理解されるであろう、もう一方の立体化学を生じてもよい。
【００３３】
ホモダイマーの各モノマーがアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有し、スペーサのＮ１及びＮ２がどちらもアミド結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合で取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物は、次のように表すことができる。
【化１１】
2010536858.tif 000012
【００３４】
好ましくは、この分子においてペプチドモノマーと線状ＰＥＧ部分とをつなぐリジン残基は全てＬ−リジンであって、次の立体化学を生じる。
【化１２】
2010536858.tif 000013
【００３５】
別の実施形態では、リジン残基の１つ又はそれ以上がＤ−リジンであって、当業者には容易に理解されるであろう、もう一方の立体化学を生じてもよい。
【００３６】
ペプチドモノマーはリジンリンカーへの取付けによってダイマー化することもでき、この場合は、一方のペプチドモノマーがそのＣ末端でリジンのε−アミノ基に取付けられ、第２のペプチドモノマーがそのＣ末端でリジンのα−アミノ基に取付けられる。
【００３７】
本発明のペプチドダイマーは、さらに、次の構造のスペーサ部分を含む。
−Ｎ１Ｈ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ２Ｈ−
一方の末端では、スペーサのＮ１が、アミド結合を介して、リジンリンカーのカルボニル炭素に取付けられる。反対の末端では、スペーサのＮ２が、カルバメート結合又はアミド結合を介して、活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に取付けられ、ここにＰＥＧは約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する（用語「約」はＰＥＧの調製物において、一部の分子は明記した分子量より重く、一部の分子は明記した分子量より軽いことを示す）。
【００３８】
スペーサがカルバメート結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物（配列番号３）は、次のように表すことができる。
【化１３】
2010536858.tif 000014
【００３９】
スペーサがアミド結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物（配列番号３）は、次のように表すことができる。
【化１４】
2010536858.tif 000015
【００４０】
本発明はさらに、上記のペプチド化合物を使ってさまざまな医学的状態を処置するための方法を提供する。本方法には、エリスロポエチンの不足又は低数の赤血球集団若しくは欠陥性赤血球集団を特徴とする障害を有する患者を、その患者に上記化合物の１つの治療有効量を投与することによって処置することが含まれる。一定の実施形態では、障害が、末期腎不全又は透析；慢性腎臓疾患、ＡＩＤＳ、自己免疫疾患又は悪性疾患に関連する貧血；ベータサラセミア；嚢胞性線維症；未熟児早期貧血；慢性炎症性疾患に関連する貧血；脊髄損傷；急性失血；加齢；又は異常赤血球生成を伴う新生物疾患状態である。さらにまた、一定の実施形態では、障害が腎不全又は透析であり、治療有効量が患者の体重１キログラムにつき０．０２５〜０．２ミリグラムの化合物という投薬量である。別の実施形態では、障害が腎不全又は透析であり、治療有効量が患者の体重１キログラムにつき０．０５〜０．１ミリグラムの化合物という投薬量である。一定の実施形態では、障害が悪性疾患に関連する貧血であり、治療有効量が患者の体重１キログラムにつき０．０５〜０．５ミリグラムの化合物という投薬量であるか、或いは患者の体重１キログラムにつき０．０７５〜０．５ミリグラムの化合物である。別の実施形態では、障害が悪性疾患に関連する貧血であり、治療有効量が患者の体重１キログラムにつき０．２〜０．４ミリグラムの化合物という投薬量である。治療有効量は３〜４週間ごとに１回投与することができる。
【００４１】
好ましい実施形態では、障害が慢性腎臓疾患であり、治療有効量が好ましくは患者の体重１キログラムにつき０．２５〜１．２５ミリグラムの化合物という投薬量であり、より好ましくは、投薬量は患者の体重１キログラムにつき０．５〜０．７５ミリグラムの化合物である。治療有効量は３〜６週間ごとに１回投与することができる。好ましい実施形態では、治療有効量が４週間ごとに１回投与される。治療有効量は静脈内注射又は皮下注射によって投与することができる。好ましい実施形態では、治療有効量が皮下注射によって投与される。特に好ましい実施形態では、慢性腎臓疾患患者が透析前である。
【００４２】
本発明はさらに、上記ペプチド化合物を含んでなる医薬組成物を提供する。一定の実施形態では、ＰＥＧが約２０，０００ダルトンの分子量を有する。別の実施形態では、医薬組成物が上記の化合物のいずれか１つ及び医薬的に許容できる担体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】０〜１２週間でのベースラインからの平均網状赤血球変化を示す。
【図２】０〜１２週間でのベースラインからの平均ヘモグロビン（Ｈｇｂ）変化を示す。
【図３】用量及び処置継続期間による貧血の補正（Ｈｇｂ＞１１ｇ／ｄＬ）を示す。
【図４】１２〜２２週間でのベースラインからの平均ヘモグロビン（Ｈｇｂ）変化を示す。
【図５】０〜１２週間での０．０５ｍｇ／ｋｇコホートにおける個々の患者に関するベースラインからのヘモグロビン（Ｈｇｂ）変化を示す。
【図６】３、６、９、及び１２週間で、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、及び０．２ｍｇ／ｋｇコホートにおいて、個々の患者のベースラインから≧１ｇ／ｄＬのヘモグロビン増加を示した患者のパーセントを示す。
【図７】０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、及び０．２ｍｇ／ｋｇ用量コホートにおいて、≧２ｇ／ｄＬのヘモグロビン増加、又は≧１ｇ／ｄＬの増加と少なくとも１１ｇ／ｄＬのヘモグロビン値との組合せを示す患者のパーセントを示す。
【図８】０〜１４週間での０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、及び０．２ｍｇ／ｋｇ用量コホートの患者に関するベースラインからのヘモグロビン増加を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
定義
ペプチド中のアミノ酸残基は次のように略記する：フェニルアラニンはＰｈｅ又はＦ；ロイシンはＬｅｕ又はＬ；イソロイシンはＩｌｅ又はＩ；メチオニンはＭｅｔ又はＭ；バリンはＶａｌ又はＶ；セリンはＳｅｒ又はＳ；プロリンはＰｒｏ又はＰ；スレオニンはＴｈｒ又はＴ；アラニンはＡｌａ又はＡ；チロシンはＴｙｒ又はＹ；ヒスチジンはＨｉｓ又はＨ；グルタミンはＧｌｎ又はＱ；アスパラギンはＡｓｎ又はＮ；リジンはＬｙｓ又はＫ；アスパラギン酸はＡｓｐ又はＤ；グルタミン酸はＧｌｕ又はＥ；システインはＣｙｓ又はＣ；トリプトファンはＴｒｐ又はＷ；アルギニンはＡｒｇ又はＲ；及びグリシンはＧＩｙ又はＧである。ペプチド中の異常アミノ酸は次のように略記する：１−ナフチルアラニンは１−ｎａｌ又はＮｐ；Ｎ−メチルグリシン（サルコシンとも呼ばれている）はＭｅＧ又はＳｃ；及びアセチル化グリシン（Ｎ−アセチルグリシン）はＡｃＧである。
【００４５】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、アミド結合によって一つにつながれたαアミノ酸であるアミノ酸モノマーのポリマーを指す。したがって、ポリペプチドは少なくとも２アミノ酸残基の長さを有し、通常はそれより長い。一般に、用語「ペプチド」は、長さが数アミノ酸残基しかないポリペプチドを指す。本発明の新規ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドは好ましくは長さが約５０アミノ酸残基を超えない。より好ましくは、約１７〜約４０アミノ酸残基の長さである。ポリペプチドは、ペプチドとは異なり、アミノ酸残基をいくつ含んでもよい。したがって、用語ポリペプチドは、ペプチドに加えて、より長いアミノ酸の配列を包含する。
【００４６】
本明細書で使用する表現「医薬的に許容できる」は、「一般に安全と認められる（generally regarded as safe）」、例えば生理的に忍容でき、ヒトに投与した場合に、通例、アレルギー反応又は類似の有害反応、例えば腹痛（gastric upset）、めまいなどを生じない、分子実体及び組成物を指す。好ましくは、本明細書に使用する用語「医薬的に許容できる」は、哺乳動物（より具体的にはヒト）における使用に関して、連邦政府若しくは州政府の規制当局によって承認されていること、又は米国薬局方若しくは他の広く認識されている薬局方に記載されていることを意味する。用語「担体」は、本化合物と一緒に投与される希釈剤、佐剤、賦形剤、又は溶剤を指す。そのような医薬担体は滅菌された液体、例えば水、及び油（石油、動物、植物又は合成由来のものを含み、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む）であることができる。水又は食塩水溶液及びデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液は、担体として、特に注射溶液剤用の担体として、好ましく使用される。適切な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎにより、「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【００４７】
本明細書で使用する用語「アゴニスト」は、その相補的生物活性受容体に結合してそれを活性化することにより、その受容体における生物学的応答を引き起こすか、又はその受容体の既存の生物学的活性を強化する、生物活性リガンドを指す。
【００４８】
ＥＰＯ−Ｒアゴニストである新規ペプチド
本発明は、劇的に強化された力価及び活性を有するＥＰＯ−Ｒアゴニストである新規ペプチド化合物を提供する。これらのペプチド化合物は、アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有するペプチドモノマーのホモダイマー、又はアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有するペプチドモノマーのホモダイマーである（ここでは、各アミノ酸が標準の一文字表記で示されており、「（ＡｃＧ）」はＮ−アセチルグリシンであり、「（１−ｎａｌ）」は１−ナフチルアラニンであり、「（ＭｅＧ）」はＮ−メチルグリシン（サルコシンとも呼ばれている）である）。ペプチドダイマーの各ペプチドモノマーは、モノマーのシステイン残基間に分子内ジスルフィド結合を含有する。そのようなモノマーは次のように図解することができる。
【化１５】
2010536858.tif 000016
【００４９】
これらのモノマーペプチドをダイマー化すると、強化されたＥＰＯ−Ｒアゴニスト活性を有するペプチドダイマーが得られる。リンカー（ＬＫ）部分は、各モノマーのＣ末端リジン残基に同時に結合することによって２つのペプチドモノマーのＣ末端を架橋する分岐第三級アミドである。第三級アミドリンカーは
−Ｃ１Ｏ−ＣＨ２−Ｘ−ＣＨ２−Ｃ２Ｏ−
［式中、ＸはＮＣＯ−（ＣＨ２）２−Ｎ１Ｈ−であり、リンカーのＣ１は第１ペプチドモノマーのＣ末端リジン残基のε−アミノ基とアミド結合を形成し、リンカーのＣ２は第２ペプチドモノマーのＣ末端リジン残基のε−アミノ基とアミド結合を形成し、ＸのＮ１はカルバメート結合又はアミド結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に取付けられ、ここにＰＥＧは約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する（用語「約」はＰＥＧの調製物において、一部の分子は明記した分子量より重く、一部の分子は明記した分子量より軽いことを示す）］
と表すことができる。
【００５０】
第三級アミドリンカーは
−Ｃ１Ｏ−ＣＨ２−Ｘ−ＣＨ２−Ｃ２Ｏ−
［式中、ＸはＮＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ３Ｏ−であり、リンカーのＣ１は第１ペプチドモノマーのＣ末端リジン残基のε−アミノ基とアミド結合を形成し、リンカーのＣ２は第２ペプチドモノマーのＣ末端リジン残基のε−アミノ基とアミド結合を形成する］
と表すこともできる。本発明のペプチドダイマーはさらに、次の構造のスペーサ部分を含む：
−Ｎ１Ｈ−（ＣＨ２）４−Ｃ４Ｈ−Ｎ２Ｈ−
［式中、スペーサのＣ４はＸのＣ３に共有結合で結合され、スペーサのＮ１は、カルバメート結合又はアミド結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合で取付けられ、スペーサのＮ２はカルバメート結合又はアミド結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合で取付けられ、ここにＰＥＧは約１０，０００〜約６０，０００ダルトンの分子量を有する（用語「約」はＰＥＧの調製物において、一部の分子は明記した分子量より重く、一部の分子は明記した分子量より軽いことを示す）］。
【００５１】
したがって本発明の新規ペプチドは、カルバメート結合又はアミド結合によってペプチドダイマーの第三級アミドリンカーに共有結合で取付けられたＰＥＧ部分も含有することができる。ＰＥＧは医薬的に許容できる水溶性ポリマーである。本発明で使用されるＰＥＧは、約２０キロダルトン（２０Ｋ）〜約６０Ｋの分子量を有する線状非分岐ＰＥＧであることができる（用語「約」はＰＥＧの調製物において、一部の分子は明記した分子量より重く、一部の分子は明記した分子量より軽いことを示す）。最も好ましくは、ＰＥＧは約３０Ｋ〜約４０Ｋの分子量を有する。当業者は、考慮すべき事項、例えば望ましい投薬量、循環時間、タンパク質分解に対する耐性、生物学的活性に対する効果があるとすれば、その効果、取扱いの容易さ、抗原性の程度又は欠如、及びＰＥＧが治療ペプチドに及ぼす他の公知の効果などに基づいて、望ましいポリマサイズを選択することができるだろう。
【００５２】
本発明のペプチド、ペプチドダイマー及びペプチドに基づく他の分子は、水溶性ポリマを分子（例えばペプチド＋スペーサ）の受容体結合部分に連結するためのさまざまなケミストリのいずれかを使って、水溶性ポリマー（例えばＰＥＧ）に取付けることができる。典型的な実施形態では、単一の取付け接合部を利用して、水溶性ポリマを受容体結合部位に共有結合で取付けるが、これに代わる実施形態では、スペーサ及び／又は一方若しくは両方のペプチド鎖への共有結合取付け接合部を含みうる複数の取付け接合部を使用してもよく、これには、異なる水溶性ポリマ種が異なる取付け接合部で受容体結合部位に取付けられるというさらなる変形が含まれる。いくつかの実施形態では、ダイマー又はさらに高次の多量体が、異なるペプチド鎖種を含むだろう（すなわちヘテロダイマー又は他のヘテロ多量体）。限定するわけではないが、一例として、ダイマーはＰＥＧ取付け接合部を有する第１ペプチド鎖を含み、第２ペプチド鎖は、ＰＥＧ取付け接合部を欠くか、第１ペプチド鎖とは異なる連結ケミストリを利用することができ、いくつかの変形では、スペーサがＰＥＧ取付け接合部位を含有するか、ＰＥＧ取付け接合部位を欠くことができ、前記スペーサは、もしＰＥＧ化されるのであれば、第１及び／又は第２ペプチド鎖とは異なる連結ケミストリを利用することができる。これに代わる実施形態では、受容体結合部分のスペーサ部分に取付けられたＰＥＧ、及びその分子のペプチド部分のアミノ酸の１つの側鎖にコンジュゲートされた異なる水溶性ポリマ（例えば糖質）を利用する。
【００５３】
多種多様なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）種を受容体結合部位（ペプチド＋スペーサ）のＰＥＧ化に使用することができる。適切な反応性ＰＥＧ試薬は実質上どれでも使用することができる。好ましい実施形態では、反応性ＰＥＧ試薬が、受容体結合部位へのコンジュゲーション時に、カルバメート結合又はアミド結合の形成をもたらすだろう。限定するわけではないが、適切な反応性ＰＥＧ種には、日油株式会社（１５０−６０１９東京都渋谷区恵比寿４丁目２０−３エビスガーデンプレイスタワー）のＤｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ（２００３）及びＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（３５８０６アラバマ州ハンツビル、ディスカバリドライブ４９０）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇカタログ（２００３）で販売されているものが含まれる。例えば、限定するわけではないが、次のＰＥＧ試薬はさまざまな実施形態においてしばしば好ましい：ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、ｍＰＥＧ２−ＡＬＤ、マルチアーム（multi-Arm）ＰＥＧ、ｍＰＥＧ（ＭＡＬ）２、ｍＰＥＧ２（ＭＡＬ）、ｍＰＥＧ−ＮＨ２、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ、ｍＰＥＧ−チオエステル、ｍＰＥＧ−ダブルエステル、ｍＰＥＧ−ＢＴＣ、ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ、ｍＰＥＧ−ＡＣＥＴ、ヘテロ官能性ＰＥＧ（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＶＳ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）、ＰＥＧアクリレート（ＡＣＲＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、ＰＥＧ−リン脂質（例えばｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＳＵＮＢＲＩＴＥシリーズのマルチアーム（multiarmed）ＰＥＧ、例えば当業者が選択したケミストリによって活性化されるグリセリンベースＰＥＧのＧＬシリーズ、ＳＵＮＢＲＩＴＥ活性化ＰＥＧのいずれか（例えば、限定するわけではないが、カルボキシル−ＰＥＧ、ｐ−ＮＰ−ＰＥＧ、トレシル−ＰＥＧ、アルデヒドＰＥＧ、アセタール−ＰＥＧ、アミノ−ＰＥＧ、チオール−ＰＥＧ、マレイミド−ＰＥＧ、ヒドロキシル−ＰＥＧ−アミン、アミノ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ヒドロキシル−ＰＥＧ−アルデヒド、カルボン酸無水物型−ＰＥＧ、官能化ＰＥＧ−リン脂質、並びに当業者によりその特定の用途及び使用法に合わせて選択される他の類似する且つ／又は適切な反応性ＰＥＧ）を含む。
【００５４】
本発明の新規ペプチドは、カルバメート結合又はアミド結合を介してスペーサ部分に共有結合で取付けられる２つのＰＥＧ部分を含有することもでき、この場合、スペーサ部分はペプチドダイマーの第三級アミドリンカーに共有結合で結合される。本発明のそのような実施形態で使用される２つのＰＥＧ部分のそれぞれは線状であることができ、単一の取付け点で一つに連結することができる。各ＰＥＧ部分は、好ましくは、約１０キロダルトン（１０Ｋ）〜約６０Ｋの分子量を有する（用語「約」はＰＥＧの調製物において、一部の分子は明記した分子量より重く、一部の分子は明記した分子量より軽いことを示す）。線状ＰＥＧ部分は特に好ましい。より好ましくは、２つのＰＥＧ部分のそれぞれが、約２０Ｋ〜約４０Ｋの分子量を有し、さらに好ましくは、約２０Ｋと約４０Ｋの間の分子量を有する。より一層好ましくは、２つのＰＥＧ部分のそれぞれが、約２０Ｋの分子量を有する。当業者は、考慮すべき事項、例えば望ましい投薬量、循環時間、タンパク質分解に対する耐性、生物学的活性に対する効果があるとすれば、その効果、取扱いの容易さ、抗原性の程度又は欠如、及びＰＥＧが治療ペプチドに及ぼす他の公知の効果などに基づいて、望ましいポリマサイズを選択することができるだろう。
【００５５】
本発明は、アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）（配列番号３）を有するペプチドモノマーのホモダイマーであるペプチドアゴニストも含む（ここでは、各アミノ酸が標準の一文字表記で示されており、「（ＡｃＧ）」はＮ−アセチルグリシンであり、「（１−ｎａｌ）」は１−ナフチルアラニンであり、「（ＭｅＧ）」はＮ−メチルグリシン（サルコシンとも呼ばれている）である）。ペプチドダイマーの各ペプチドモノマーは、モノマーのシステイン残基間に分子内ジスルフィド結合を含有する。そのようなモノマーは次のように図解することができる。
【化１６】
2010536858.tif 000017
【００５６】
これらのモノマーペプチドをダイマー化すると、強化されたＥＰＯ−Ｒアゴニスト活性を有するペプチドダイマーが得られる。リンカー（ＬＫ）部分は、各モノマーのＣ末端アミノ酸に同時に結合することによって２つのペプチドモノマーのＣ末端を架橋するリジン残基である。一方のペプチドモノマーはそのＣ末端でリジンのε−アミノ基に取付けられ、第２のペプチドモノマーはそのＣ末端でリジンのα−アミノ基に取付けられる。例えば、このダイマーは、式Ｉに示すように構造を図解することができ、式ＩＩに示すように要約することができる。
【化１７】
2010536858.tif 000018
式Ｉ及び式ＩＩにおいて、Ｎ２は、リジンのε-アミノ基の窒素原子を表し、Ｎ１はリジンのα−アミノ基の窒素原子を表す。
【００５７】
本発明のペプチドダイマーはさらに、次の構造のスペーサ部分を含む。
−Ｎ１Ｈ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ２Ｈ−
一方の末端では、スペーサのＮ１が、アミド結合を介して、リジンリンカーのカルボニル炭素に取付けられる。反対の末端では、スペーサのＮ２が、カルバメート結合又はアミド結合を介して、活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に取付けられ、ここにＰＥＧは約１０，０００〜約６０，０００ダルトンの分子量を有する（用語「約」はＰＥＧの調製物において、一部の分子は明記した分子量より重く、一部の分子は明記した分子量より軽いことを示す）。より好ましくは、ＰＥＧが約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
【００５８】
したがって本発明の新規ペプチドは、そのペプチドダイマーに共有結合で取付けられるＰＥＧ部分も含有する。ＰＥＧは医薬的に許容できる水溶性ポリマである。本発明で使用されるＰＥＧは、約２０キロダルトン（２０Ｋ）〜約６０Ｋの分子量を有する線状非分岐ＰＥＧであることができる（用語「約」はＰＥＧの調製物において、一部の分子は明記した分子量より重く、一部の分子は明記した分子量より軽いことを示す）。最も好ましくは、ＰＥＧは約２０Ｋ〜約４０Ｋの分子量を有し、さらにより好ましくは約３０Ｋ〜約４０Ｋの分子量を有する。当業者は、考慮すべき事項、例えば望ましい投薬量、循環時間、タンパク質分解に対する耐性、生物学的活性に対する効果があるとすれば、その効果、取扱いの容易さ、抗原性の程度又は欠如、及びＰＥＧが治療ペプチドに及ぼす他の公知の効果などに基づいて、望ましいポリマサイズを選択することができるだろう。
【００５９】
ホモダイマーの各モノマーがアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有し、リンカーのＮ１がカルバメート結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物は、次のように表すことができる。
【化１８】
2010536858.tif 000019
【００６０】
ホモダイマーの各モノマーがアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有し、リンカーのＮ１がアミド結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物は、次のように表すことができる。
【化１９】
2010536858.tif 000020
【００６１】
ホモダイマーの各モノマーがアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有し、リンカーのＮ１がカルバメート結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物は、次のように表すことができる。
【化２０】
2010536858.tif 000021
【００６２】
ホモダイマーの各モノマーがアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有し、リンカーのＮ１がアミド結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物は、次のように表すことができる。
【化２１】
2010536858.tif 000022
【００６３】
限定するわけではないが、本発明の好ましいペプチドダイマーには、次に挙げるものが含まれる：
【化２２】
2010536858.tif 000023
【化２３】
2010536858.tif 000024
【化２４】
2010536858.tif 000025
【化２５】
2010536858.tif 000026
【００６４】
ホモダイマーの各モノマーがアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有し、スペーサのＮ１及びＮ２がどちらもカルバメート結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合で取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物は、次のように表すことができる。
【化２６】
2010536858.tif 000027
【００６５】
ホモダイマーの各モノマーがアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有し、スペーサのＮ１及びＮ２がどちらもアミド結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合で取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物は、次のように表すことができる。
【化２７】
2010536858.tif 000028
【００６６】
ホモダイマーの各モノマーがアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有し、スペーサのＮ１及びＮ２がどちらもカルバメート結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合で取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物は、次のように表すことができる。
【化２８】
2010536858.tif 000029
【００６７】
ホモダイマーの各モノマーがアミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有し、スペーサのＮ１及びＮ２がどちらもアミド結合を介して活性化ＰＥＧ部分に共有結合で取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物は、次のように表すことができる。
【化２９】
2010536858.tif 000030
【００６８】
限定するわけではないが、本発明の好ましいペプチドダイマーには、次に挙げるものが含まれる：
【化３０】
2010536858.tif 000031
【化３１】
2010536858.tif 000032
【化３２】
2010536858.tif 000033
【化３３】
2010536858.tif 000034
【化３４】
2010536858.tif 000035
【化３５】
2010536858.tif 000036
【化３６】
2010536858.tif 000037
【００６９】
スペーサがカルバメート結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物（配列番号３）は、次のように表すことができる。
【化３７】
2010536858.tif 000038
【００７０】
スペーサがアミド結合を介して活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に取付けられる場合、本発明の新規ペプチド化合物（配列番号３）は、次のように表すことができる。
【化３８】
2010536858.tif 000039
【００７１】
このダイマー構造を［Ａｃ−ペプチド，ジスルフィド］２Ｌｙｓ−スペーサ−ＰＥＧ２０−４０Ｋと書いて、Ｎ−末端アセチル化ペプチドがリジンのαアミノ基とεアミノ基の両方に結合していて、各ペプチドは分子内ジスルフィドループを含有し、スペーサ分子がリジンのＣ末端とＰＥＧ部分の間に共有結合を形成し、ＰＥＧが約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有するものを表すことができる。
【００７２】
限定するわけではないが、本発明の好ましいペプチドダイマーには、次に挙げるものが含まれる：
【化３９】
2010536858.tif 000040
【化４０】
2010536858.tif 000041
【００７３】
２０の通常アミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばａ，ａ−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の異常アミノ酸も、本発明の化合物の適切な構成要素になりうる。限定するわけではないが、異常アミノ酸の例には、β−アラニン、３−ピリジルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ノルロイシン、並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸が含まれる。他の修飾、例えばアミノ末端の修飾、カルボキシ末端の修飾、遺伝子にコードされた天然アミノ酸の１つ又はそれ以上の、異常アミノ酸による置換、1つ又はそれ以上のアミノ酸残基の側鎖の修飾、ペプチドリン酸化なども考えられる。
【００７４】
本発明のペプチド配列は単独で存在するか、ペプチド鎖のＮ末端及び／又はＣ末端伸長部と繋がって存在することができる。そのような伸長部は自然にコードされたペプチド配列であり、場合により非天然配列を有しても非天然配列を実質的に有さなくてもよく、この伸長部は、当業者が望むとおりに、任意の付加、欠失、点突然変異、又は他の配列修飾若しくは組合せを含みうる。例えば、限定するわけではないが、天然配列は完全長又は部分長であることができ、側鎖のコンジュゲーションを介して糖質、ＰＥＧ、他のポリマなどを取付けるための部位が得られるようにアミノ酸置換を含みうる。ある変形では、アミノ酸置換が、配列のヒト化をもたらして、それをヒト免疫系に適合させる。本発明のＥＰＯ−Ｒ活性化配列に隣接した、又は本発明のＥＰＯ−Ｒ活性化配列に近接した、非免疫グロブリンスペーサ配列を有する、又は非免疫グロブリンスペーサ配列を有さない免疫グロブリン配列を含む、あらゆるタイプの融合タンパク質が提供される。実施形態の一タイプは、重鎖及び／又は軽鎖の可変（Ｖ）領域の代わりにＥＰＯ−Ｒ活性化配列を有する免疫グロブリン鎖である。
【００７５】
本発明のペプチド化合物の製造：
ペプチド合成
本発明のペプチドは当分野において公知の古典的方法によって製造することができる。これらの標準的方法には、完全固相合成、部分固相合成法、フラグメント縮合、古典的溶液合成、及び組換えＤＮＡ技術が挙げられる［例えばMerrifield J. Am. Chem. Soc. 1963 85:2149参照］。
【００７６】
ある実施形態では、ペプチドダイマーのペプチドモノマーが個別に合成され、合成後にダイマー化される。
【００７７】
もう一つの実施形態では、ダイマーのペプチドモノマーが、そのＣ末端を介して、ペプチド合成の開始部位として機能することができる２つの官能基及びもう一つの分子部分（例えば固形支持体の表面上に存在しうるもの）への結合を可能にする第３の官能基（例えばカルボキシル基又はアミノ基）を有する分岐第三級アミドリンカーＬＫ部分によって、連結される。この場合、２つのペプチドモノマーは、さまざまな固相合成技法で、リンカーＬＫ部分の２つの反応性窒素基上に直接合成することができる。そのような合成は逐次的であっても同時であってもよい。
【００７８】
もう一つの実施形態では、２つのペプチドモノマーを、さまざまな固相合成技法で、リンカーＬＫ部分の２つの反応性窒素基上に直接合成することができる。そのような合成は逐次的であっても同時であってもよい。この実施形態では、ペプチド合成の開始部位として機能することができる２つのアミノ基及びもう一つの分子部分（例えば固形支持体の表面上に存在しうるもの）への結合を可能にする第３の官能基（例えばリジンのカルボキシル基；又はリジンアミド（カルボキシル基がアミド部分−ＣＯＮＨ２に変換されているリジン残基）のアミノ基）を有するリジンリンカー（ＬＫ）部分が使用される。
【００７９】
リンカー上にダイマーのペプチド鎖を逐次的に合成しようとする場合は、リンカー分子上の２つのアミン官能基を、オルソゴナルに除去することができる２つの異なるアミン保護基で保護する。保護されたリンカーはリンカーの第３官能基を介して固形支持体にカップリングされる。第１アミン保護基を除去し、ダイマーの第１ペプチドを、脱保護された第１アミン部分上で合成する。次に第２アミン保護基を除去し、ダイマーの第２ペプチドを脱保護された第２アミン部分上で合成する。例えば、リンカーの第１アミノ部分をＡｌｌｏｃで保護し、第２アミノ部分をＦｍｏｃで保護することができる。この場合は、温和な塩基［例えば２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）］による処理でＦｍｏｃ基を除去して（Ａｌｌｏｃ基は除去されない）、第１ペプチド鎖を合成することができる。その後、Ａｌｌｏｃ基を適切な試薬［例えばＰｄ（ＰＰｈ３）／４−メチルモルホリン及びクロロホルム］で除去して、第２ペプチド鎖を合成することができる。システインに異なるチオール保護基を使ってジスルフィド結合形成を（後述のように）制御しようとする場合は、たとえダイマーのペプチド鎖の最終的なアミノ酸配列が同一であっても、この技法を使用しなければならないことに注意されたい。
【００８０】
リンカー上にダイマーのペプチド鎖を同時に合成しようとする場合は、リンカー分子の２つのアミン官能基を除去可能な同じアミン保護基で保護する。保護されたリンカーは、リンカーの第３官能基を介して固形支持体にカップリングされる。この場合は、リンカー分子の保護された２つの官能基を同時に脱保護し、脱保護されたアミン上で２つのペプチド鎖が同時に合成される。この技法を使うと、ダイマーのペプチド鎖の配列は同一になり、システイン残基のチオール保護基は全て同じになることに注意されたい。
【００８１】
好ましいペプチド合成法は固相合成である。固相ペプチド合成手法は当分野では周知である［例えばStewart Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman and Co.: San Francisco) 1969；Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ（米国サンディエゴ）の２００２／２００３ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃａｔａｌｏｇ；Goodman、Synthesis of Peptides and Peptidomimetics (Houben-Weyl, Stuttgart) 2002参照］。固相合成では、合成が、通例、α−アミノ保護樹脂を使ってペプチドのＣ末端から開始される。適切な出発物質は、例えば、必要なα−アミノ酸をクロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ポリスチレン樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂などに取付けることなどによって製造することができる。そのようなクロロメチル化樹脂の一つは、ＢＩＯ−ＢＥＡＤＳ ＳＸ−１という商品名でＢｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州リッチモンド）が販売している。ヒドロキシメチル樹脂の製造は記述されている［Bodonszky, et al. (1966) Chem. Ind. London 38:1597］。ベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂は記述されており［Pietta and Marshall (1970) Chem. Commun. 650］、その塩酸塩型はＢｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州パロアルト）から市販されている。例えば、α−アミノ保護アミノ酸は、Gisin (1973) Helv. Chim. Acta 56:1467に記載の方法に従い、炭酸水素セシウム触媒を利用してクロロメチル化樹脂にカップリングすることができる。
【００８２】
最初のカップリング後は、α−アミノ保護基を、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又は塩酸（ＨＣｌ）の有機溶媒溶液を使って、室温で除去する。その後は、支持体に結合された成長するペプチド鎖に、α−アミノ保護アミノ酸を連続的にカップリングする。α−アミノ保護基は、段階的ペプチド合成の分野で有用であることが公知であるもの、例えばアシルタイプの保護基（例えばホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル）、芳香族ウレタンタイプの保護基［例えばベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）及び置換Ｃｂｚ］、脂肪族ウレタン保護基［例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル］、及びアルキルタイプの保護基（例えばベンジル、トリフェニルメチル）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、及び１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）である。
【００８３】
側鎖保護基（典型的にはエーテル、エステル、トリチル、ＰＭＣなど）は、カップリング中は無傷のままであり、アミノ末端保護基の脱保護中及びカップリング中は切り離されない。側鎖保護基は、最終的なペプチドの合成が完了したら、ターゲットペプチドを変化させないような反応条件下で除去可能でなければならない。Ｔｙｒ用の側鎖保護基には、テトラヒドロピラニル、ｔｅｒｔ−ブチル、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、Ｚ−Ｂｒ−Ｃｂｚ、及び２，５−ジクロロベンジルが挙げられる。Ａｓｐ用の側鎖保護基には、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、メチル、エチル、及びシクロヘキシルが挙げられる。Ｔｈｒ及びＳｅｒ用の側鎖保護基には、アセチル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、及びＣｂｚが挙げられる。Ａｒｇ用の側鎖保護基には、ニトロ、トシル（Ｔｏｓ）、Ｃｂｚ、アダマンチルオキシカルボニルメシトイルスルホニル（Ｍｔｓ）、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、又はＢｏｃが挙げられる。Ｌｙｓ用の側鎖保護基には、Ｃｂｚ、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｃｂｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｃｂｚ）、Ｔｏｓ、又はＢｏｃが挙げられる。
【００８４】
α−アミノ保護基の除去後に、残った保護アミノ酸を所望の順序で段階的にカップリングする。各保護アミノ酸は一般に、適当なカルボキシル基活性化剤、例えば２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）又はジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を使って、溶液中で、例えば塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、又はその混合物中で、約３倍過剰に反応させる。
【００８５】
所望のアミノ酸配列が完成した後、所望のペプチドを、ペプチドを樹脂から切断するだけでなく、残っている側鎖保護基も全て切断する試薬、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又はフッ化水素（ＨＦ）による処理で、樹脂支持体から切り離す。クロロメチル化樹脂を使用する場合は、フッ化水素処理によって遊離ペプチド酸の形成が起こる。ベンズヒドリルアミン樹脂を使用する場合は、フッ化水素処理によって遊離ペプチドアミドが直接生成する。或いは、クロロメチル化樹脂を使用する場合は、アンモニアによるペプチド樹脂の処理で所望の側鎖保護アミドを得るか、アルキルアミンによるペプチド樹脂の処理で側鎖保護アルキルアミド又はジアルキルアミドを得ることにより、側鎖保護ペプチドを切り離すこともできる。次に、側鎖保護をフッ化水素による処理で通常どおり除去して、遊離のアミド、アルキルアミド、又はジアルキルアミドを得る。
【００８６】
本発明のエステルを製造する際は、ペプチド酸の製造に使用される樹脂を使用し、側鎖保護ペプチドを塩基及び適当なアルコール（例えばメタノール）で切断する。次に、側鎖保護基をフッ化水素による処理で通常どおりに除去して、所望のエステルを得る。
【００８７】
これらの手法を使って、本発明の化合物のいずれかの１、２、又はそれ以上の位置において、遺伝子にコードされた２０の天然アミノ酸以外のアミノ酸が代用されているペプチドを合成することもできる。限定するわけではないが、本発明のペプチド内に代用することができる合成アミノ酸には、Ｎ−メチル、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル、δアミノ酸、例えばＬ−δ−ヒドロキシリシル及びＤ−δ−メチルアラニル、Ｌ−α−メチルアラニル、βアミノ酸、並びにイソキノリルが挙げられる。Ｄ−アミノ酸及び非天然合成アミノ酸も、本発明のペプチド中に組み込むことができる。
【００８８】
ペプチド修飾
本発明のペプチド化合物のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端を修飾して、本発明の他の化合物を製造することもできる。例えばアミノ末端は、酢酸又はそのハロゲン化誘導体、例えばα−クロロ酢酸、α−ブロモ酢酸、又はα−ヨード酢酸でアセチル化することができる。
【００８９】
遺伝子にコードされた２０のアミノ酸（又は立体異性体Ｄアミノ酸）の天然側鎖を、他の側鎖、例えばアルキル、低級アルキル、４員、５員、６員、又は７員までの環状アルキル、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ（低級アルキル）、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ及びその低級エステル誘導体、並びに４員、５員、６員、又は７員までの複素環式基などといった基で置き換えることができる。特に、プロリン残基の環サイズを５員から４員、６員又は７員へと変化させたプロリン類似体を、使用することができる。環式基は飽和又は不飽和であることができ、不飽和である場合は、芳香族又は非芳香族であることができる。複素環式基は好ましくは１又はそれ以上の窒素、酸素、及び／又は硫黄ヘテロ原子を含有する。そのような基の例には、フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、モルホリニル（例えばモルホリノ）、オキサゾリル、ピペラジニル（例えば１−ピペラジニル）、ピペリジル（例えば１−ピペリジル、ピペリジノ）、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル（例えば１−ピロリジニル）、ピロリニル、ピロリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、チオモルホリニル（例えばチオモルホリノ）、及びトリアゾリルが挙げられる。これらの複素環式基は、置換されていても無置換でもよい。基が置換されている場合、置換基はアルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素、又は置換フェニル若しくは無置換フェニルであることができる。
【００９０】
ペプチドをリン酸化又は他の方法で［例えばHruby, et al. (1990) Biochem J. 268:249-262に記載されているように］容易に修飾することもできる。
【００９１】
本発明のペプチド化合物は類似する生物学的活性を有する非ペプチド化合物のための構造モデルとしても役立つ。リードペプチド化合物と同じ又は類似する望ましい生物学的活性を有するが、溶解度、安定性、並びに加水分解及びタンパク質分解に対する感受性に関してリードよりもさらに好ましい活性を有する化合物を構築するために、さまざまな技法を利用できることは、当業者には理解されている［Morgan and Gainor (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252参照］。これらの技法には、ペプチド主鎖を、ホスホネート、アミデート、カルバメート、スルホンアミド、第二級アミン、及びＮ−メチルアミノ酸から構成される主鎖で置き換えることが含まれる。
【００９２】
ジスルフィド結合の形成
本発明の化合物は、２つの分子内ジスルフィド結合を含有する。そのようなジスルフィド結合は、各ペプチドモノマーのシステイン残基の酸化によって形成させることができる。
【００９３】
ある実施形態では、システイン結合形成の制御が、所望する異性体の形成を最適化するのに有効なタイプ及び濃度の酸化剤を選択することによって遂行される。例えば、酸化剤がＤＭＳＯ又はヨウ素（Ｉ２）である場合は、ペプチドダイマーの酸化による２つの分子内ジスルフィド結合（各ペプチド鎖上に１つ）の形成が（分子間ジスルフィド結合の形成と比較して）優先的に達成される。
【００９４】
別の実施形態では、ペプチド合成中のチオール保護基の選択的使用によって、システイン結合の形成が制御される。例えば、２つの分子内ジスルフィド結合を有するダイマーが望まれる場合、コア配列の２つのシステイン残基が第１チオール保護基［例えばトリチル（Ｔｒｔ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、及び１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）など］で保護された第１モノマーペプチド鎖を合成し、次に、コア配列の２つのシステイン残基が第１チオール保護基とは異なる第２チオール保護基［例えばアセトアミドメチル（Ａｃｍ）、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）など］で保護されている第２モノマーペプチドを合成する。その後、第１チオール保護基を除去して第１モノマーのビスルフィド環化を達成し、次に第２チオール保護基を除去して第２モノマーのビスルフィド環化を達成する。
【００９５】
本発明の他の実施形態は、硫黄の一つがＣＨ２基又は硫黄の他の等配電子体で置き換えられているこれらジスルフィド誘導体の類似体にも対応する。これらの類似体は本発明の化合物から製造することができ、この場合、各ペプチドモノマーは、当分野で公知の方法を使った分子内又は分子間置換により、少なくとも一つのＣ又はホモシステイン残基と、第２Ｃ残基の代わりにα−アミノ−γ−酪酸とを含有する［例えばBarker, et al. (1992) J. Med. Chem. 35:2040-2048及びOr, et al. (1991) J. Org. Chem. 56:3146-3149参照］。この置換をα−アミノ−γ−酪酸及びホモシステインの他のホモログを使って行なうこともできることは、当業者には容易に理解されるだろう。
【００９６】
上述の環化戦略に加えて、他の非ジスルフィドペプチド環化戦略も使用することができる。そのような代替環化戦略には、例えばアミド環化戦略並びにチオエーテル結合の形成を伴うものが含まれる。したがって本発明の化合物は、分子内アミド結合又は分子内チオエーテル結合を伴う環化型で存在することができる。例えば、コア配列の１つのシステインをリジンで置き換え、第２のシステインをグルタミン酸で置き換えたペプチドを合成することができる。その場合は、これら２つの残基の側鎖間のアミド結合によって環状モノマーを形成させることができる。或いは、コア配列の１つのシステインをリジン（又はセリン）で置き換えたペプチドを合成してもよい。その場合は、そのリジン（又はセリン）残基の側鎖とコア配列の第２システイン残基との間のチオエーテル結合によって、環状モノマーを形成させることができる。したがって、ジスルフィド環化戦略に加えて、アミド環化戦略及びチオエーテル環化戦略はどちらも、本発明の化合物を環化するために容易に使用することができる。或いは、ペプチドのアミノ末端を、α−置換基が脱離基であるα−置換酢酸、例えばα−ハロ酢酸、例えばα−クロロ酢酸、α−ブロモ酢酸、又はα−ヨード酢酸でキャッピングすることもできる。
【００９７】
分岐第三級アミドリンカーの付加
ペプチドモノマーは分岐第三級アミドリンカー部分によってダイマー化することができる。ある実施形態では、リンカーがペプチド合成の際にペプチド中に組み込まれる。例えばリンカーＬＫ部分がペプチドの合成の開始部位として機能することができる２つの官能基と、１つ又はそれ以上の他の分子部分への結合を可能にする１つ又はそれ以上の他の官能基（例えばカルボキシル基又はアミノ基）とを含有する場合は、リンカーを固形支持体にコンジュゲートすることができる。その後、２つのペプチドモノマーを、リンカーＬＫ部分の２つの反応性窒素基上に、固相合成技法の変形で、直接合成することができる。
【００９８】
これに代わる実施形態では、ペプチド合成後に、リンカーがペプチドダイマーの２つのペプチドモノマーにコンジュゲートされる。そのようなコンジュゲーションは、当分野で十分に確立された方法によって達成することができる。ある実施形態では、リンカーが、合成されたペプチドモノマーのターゲット官能基への取付けに適した２つの官能基を含有する。例えば、２つのカルボキシル基を含有するリンカーは、前もって活性化されることで、又は適切なカップリング試薬の存在下で、２つのペプチドモノマーのそれぞれのターゲットリジン側鎖アミン基と反応させることができる。
【００９９】
例えばペプチドモノマーは、第三級アミドリンカー
Ａ＊−Ｃ１Ｏ−ＣＨ２−Ｘ−ＣＨ２−Ｃ２Ｏ−Ｂ＊
［式中、ＸはＮＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｙであり、Ｙは適切な保護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基であり；Ａ＊は、リンカーのＣ１を第１ペプチドモノマーのＣ末端リジン残基のε−アミノ基にコンジュゲートするために用いられる適切な官能基、例えばＮ−オキシスクシンイミドであり；Ｂ＊は、リンカーのＣ２を第２ペプチドモノマーのＣ末端リジン残基のε−アミノ基にコンジュゲートするために用いられる適切な官能基、例えばＮ−オキシスクシンイミドである］
に、化学的にカップリングすることができる。
【０１００】
また、例えばペプチドモノマーは、第三級アミドリンカー
Ａ＊−Ｃ１Ｏ−ＣＨ２−Ｘ−ＣＨ２−Ｃ２Ｏ−Ｂ＊
［式中、ＸはＮＣＯ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ３Ｏ−であり；Ａ＊は、リンカーのＣ１を第１ペプチドモノマーのＣ末端リジン残基のε−アミノ基にコンジュゲートするために用いられる適切な官能基、例えばＮ−オキシスクシンイミドであり；Ｂ＊は、リンカーのＣ２を第２ペプチドモノマーのＣ末端リジン残基のε−アミノ基にコンジュゲートするために用いられる適切な官能基、例えばＮ−オキシスクシンイミドであり；第三級アミドリンカーはスペーサ部分
Ｙ−ＮＨ−（ＣＨ２）４−Ｃ４Ｈ−ＮＨ−Ｙ
（式中、ＸのＣ３はスペーサのＣ４に共有結合で結合され；Ｙは適切な保護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基である）
に化学的に結合される］
に、化学的にカップリングすることもできる。
【０１０１】
リジンリンカーの付加
ペプチドモノマーはリジンリンカーＬＫ部分によってダイマー化することができる。ある実施形態では、リジンリンカーがペプチド合成の際にペプチド中に組み込まれる。例えばリジンリンカーＬＫ部分がペプチド合成の開始部位として機能することができる２つの官能基と、もう一つの分子部分への結合を可能にする第３の官能基（例えばカルボキシル基又はアミノ基）とを含有する場合は、リンカーを固形支持体にコンジュゲートすることができる。その後、２つのペプチドモノマーを、リジンリンカーＬＫ部分の２つの反応性窒素基上に、固相合成技法の変形で、直接合成することができる。
【０１０２】
ペプチドダイマーがリジンリンカーＬＫ部分によってダイマー化されるもう一つの実施形態では、ペプチド合成後に、前記リンカーをペプチドダイマーの２つのペプチドモノマーにコンジュゲートすることができる。そのようなコンジュゲーションは、当分野で十分に確立された方法によって達成することができる。ある実施形態では、リンカーが、合成されたペプチドモノマーのターゲット官能基への取付けに適した少なくとも２つの官能基を含有する。例えばリジンの２つの遊離アミン基を、２つのペプチドモノマーのそれぞれのＣ末端カルボキシル基と反応させることができる。
【０１０３】
スペーサの付加
本発明のペプチド化合物はさらにスペーサ部分を含む。ある実施形態では、ペプチド合成の際にスペーサをペプチド中に組み込むことができる。例えばスペーサが遊離アミノ基と、もう一つの分子部分への結合を可能にする第２の官能基（例えばカルボキシル基又はアミノ基）とを含有する場合は、スペーサを固形支持体にコンジュゲートすることができる。
【０１０４】
ある実施形態では、２つの官能基を含有するスペーサをまず第１官能基を介して固形支持体にカップリングする。次に、ペプチド合成の開始部位として機能することができる２つの官能基と、もう一つの分子部分への結合を可能にする第３の官能基（例えばカルボキシル基又はアミノ基）とを有するリジンリンカーＬＫ部分を、スペーサの第２官能基及びリンカーの第３官能基を介してスペーサにコンジュゲートする。その後、２つのペプチドモノマーを、リンカーＬＫ部分の２つの反応性窒素基上に、固相合成技法の変形で、直接合成することができる。例えば、固形支持体にカップリングした、遊離アミン基を有するスペーサは、リンカーの遊離カルボキシル基を介してリジンリンカーと反応させることができる。
【０１０５】
これに代わる実施形態では、スペーサを、ペプチド合成後のペプチドダイマーにコンジュゲートすることができる。そのようなコンジュゲーションは、当分野で十分に確立された方法によって達成することができる。ある実施形態では、リンカーが、合成されたペプチドのターゲット官能基への取付けに適した少なくとも一つの官能基を含有する。例えば、遊離アミン基を有するスペーサは、ペプチドのＣ末端カルボキシル基と反応させることができる。もう一つの例では、遊離カルボキシル基を有するリンカーを、リジンアミドの遊離アミン基と反応させることができる。
【０１０６】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の取付け
近年、水溶性ポリマ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、治療上及び診断上重要なペプチドの共有結合修飾に使用されてきた。そのようなポリマの取付けは、生物学的活性を強化し、血液循環時間を引き延ばし、免疫原性を低減し、水溶性を増加させ、プロテアーゼ消化に対する耐性を強化すると考えられている。例えばＰＥＧを、治療ポリペプチド、例えばインターロイキン［Knauf, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263; 15064；Tsutsumi, et al. (1995) J. Controlled Release 33:447］、インターフェロン（Kita, et al. (1990) Drug Des. Delivery 6:157）、カタラーゼ（Abuchowski, et al. (1977) J. Biol. Chem. 252:582）、スーパーオキシドジスムターゼ（Beauchamp, et al. (1983) Anal. Biochem. 131:25）、及びアデノシンデアミナーゼ（Chen, et al. (1981) Biochim. Biophy. Acta 660:293）に共有結合で取付けると、それらの生体内半減期が延び、且つ／又はそれらの免疫原性及び抗原性が減少すると報告されている。
【０１０７】
本発明のペプチド化合物は、ペプチドダイマーの分岐第三級アミドリンカー又はスペーサに、カルバメート結合を介して、又はアミド結合を介して、共有結合で取付けられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含みうる。本発明で使用されるＰＥＧの一例は、約２０キロダルトン（２０Ｋ）〜約４０Ｋの分子量を有する線状非分岐ＰＥＧである（用語「約」はＰＥＧの調製物において、一部の分子は明記した分子量より重く、一部の分子は明記した分子量より軽いことを示す）。好ましくはＰＥＧは約３０Ｋ〜約４０Ｋの分子量を有する。
【０１０８】
本発明で使用されるＰＥＧのもう一つの例は、約１０Ｋ〜約６０Ｋの分子量を有する線状ＰＥＧである（用語「約」はＰＥＧの調製物において、一部の分子は明記した分子量より重く、一部の分子は明記した分子量より軽いことを示す）。好ましくはＰＥＧは約２０Ｋ〜約４０Ｋの分子量を有する。より好ましくは、ＰＥＧは約２０Ｋの分子量を有する。
【０１０９】
ＰＥＧを共有結合で取付ける方法（ＰＥＧ化）の例を以下に説明する。これらの例示的説明は限定を意図するものではない。多様なＰＥＧを共有結合で取付けるためのさまざまな方法が当分野において十分に確立されていることは、当業者には理解されるだろう。したがって、当分野でいくつか知られている取付け方法のいずれかによってＰＥＧが取付けられているペプチド化合物は、本発明によって包含されうる。
【０１１０】
例えばＰＥＧは、活性化ＰＥＧ分子を結合させうる反応性基（例えば遊離のアミノ基又はカルボキシル基）を介して、リンカーに共有結合で結合することができる。ＰＥＧ分子は、さまざまな反応性部分を有するメトキシル化ＰＥＧ（「ｍＰＥＧ」）を使って、アミノ基に取付けることができる。そのようなポリマには、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネート、ｍＰＥＧ−イミデート、ｍＰＥＧ−４−ニトロフェニルカーボネート、及びｍＰＥＧ−シアヌリッククロライドが挙げられる。同様に、遊離アミン基を有するメトキシル化ＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＮＨ２）を使ってＰＥＧ分子をカルボキシル基に取付けることもできる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、リンカー又はスペーサが末端アミノ基（すなわちスペーサの末端に位置するもの）を含有する。この末端アミノ基を、適切に活性化されたＰＥＧ分子、例えばｍＰＥＧ−パラ−ニトロフェニルカーボネート（ｍＰＥＧ−ＮＰＣ）と反応させて、安定な共有結合であるカルバメート結合を作らせることができる。或いは、この末端アミノ基を、適切に活性化されたＰＥＧ分子、例えば反応性Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）基を含有するｍＰＥＧ−スクシンイミジルブチレート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）又はｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）などと反応させて、安定な共有結合であるカルバメート結合を作らせることができる。別の実施形態では、リンカー反応性基が、適切な反応条件下でアミン含有ＰＥＧ分子との共有結合を形成するように活性化することができるカルボキシル基を含有する。適切なＰＥＧ分子にはｍＰＥＧ−ＮＨ２が挙げられ、適切な反応条件にはカルボジイミドが媒介するアミド形成などが挙げられる。
【０１１２】
ＥＰＯ−Ｒアゴニスト活性アッセイ：
インビトロ機能アッセイ
インビトロ競合結合アッセイでは、ＥＰＯ−Ｒへの結合に関してＥＰＯと競合する試験ペプチドの能力が定量される。例えば（例えば米国特許第５，７７３，５６９号に記述されているように）、ヒトＥＰＯ−Ｒの細胞外ドメイン（ＥＰＯ結合タンパク質、ＥＢＰ）は大腸菌内で組換え生産することができ、その組換えタンパク質を、固形支持体、例えばマイクロタイターディッシュ又は合成ビーズ［例えばＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（イリノイ州ロックフォード）のＳｕｌｆｏｌｉｎｋビーズ］にカップリングすることができる。次に、固定化されたＥＢＰを、標識された組換えＥＰＯと共に、又は標識された組換えＥＰＯ及び試験ペプチドと共にインキュベートする。そのような実験には試験ペプチドの希釈系列を使用する。試験ペプチドを加えないアッセイポイントによって、ＥＢＰに対する全ＥＰＯ結合量が定義される。試験ペプチドを含有する反応について、結合したＥＰＯの量を定量し、対照（全＝１００％）結合量の百分率として表す。これらの値をペプチド濃度に対してプロットする。ＩＣ５０値は、ＥＢＰへのＥＰＯの結合を５０％減少させる（すなわちＥＰＯ結合の５０％阻害）試験ペプチドの濃度と定義される。
【０１１３】
もう一つの異なるインビトロ競合結合アッセイでは、２つのビーズ、すなわちＥＰＯコンジュゲートビーズ及びＥＰＯ−Ｒコンジュゲートビーズの近接の関数として生成する光シグナルを測定する。ビーズの近接性はＥＰＯ−ＲへのＥＰＯの結合によって生じる。ＥＰＯ−Ｒへの結合に関してＥＰＯと競合する試験ペプチドはこの結合を妨げて、発光の減少を引き起こすだろう。発光を５０％減少させる試験ペプチドの濃度が、ＩＣ５０値と定義される。
【０１１４】
本発明のペプチドは、ＥＰＯ−Ｒへの結合に関して、極めて効率よくＥＰＯと競合する。この強化された機能は、ＥＰＯの結合をかなり低いペプチド濃度で阻害するその能力によって表される（すなわち、これらは極めて低いＩＣ５０値を有する）。
【０１１５】
ＥＰＯ受容体に特異的に結合する、本発明のモノマー型及びダイマー型ペプチドＥＰＯ−Ｒアゴニストの生物学的活性及び力価は、インビトロ細胞ベース機能アッセイを使って測定することができる。
【０１１６】
あるアッセイは、ヒトＥＰＯ−Ｒを発現させるマウスプレＢ細胞株であって、ｆｏｓプロモーター駆動のルシフェラーゼレポータ遺伝子コンストラクトをさらにトランスフェクトされたものに基づく。そのような細胞は、ＥＰＯ又は別のＥＰＯ−Ｒアゴニストにばく露されると、ルシフェラーゼを合成することによって応答する。ルシフェラーゼは、その基質ルシフェリンを添加すると、発光を引き起こす。したがって、そのような細胞におけるＥＰＯ−Ｒ活性化のレベルは、ルシフェラーゼ活性の測定によって定量することができる。試験ペプチドの活性は細胞に試験ペプチドの希釈系列を加え、それを４時間インキュベートすることによって測定される。インキュベーション後に、ルシフェリン基質を細胞に加え、発光を測定する。最大半量の（half-maximal）発光をもたらす試験ペプチドの濃度をＥＣ５０として記録する。
【０１１７】
本発明のペプチドは、このアッセイにおいて、劇的に強化された、ＥＰＯ−Ｒシグナリング依存的ルシフェラーゼ発現を促進する能力を示す。この強化された機能は、かなり低いペプチド濃度で最大ルシフェラーゼ活性の半分を与えるその能力によって表される（すなわち、これらは極めて低いＥＣ５０値を有する）。このアッセイは、本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの力価及び活性を見積るための好ましい方法である。
【０１１８】
もう一つのアッセイは、ＦＤＣ−Ｐ１／ＥＲ細胞［Dexter, et al. (1980) J. Exp. Med. 152:1036-1047］（詳しく特徴づけられた非形質転換マウス骨髄由来細胞株にＥＰＯ−Ｒが安定にトランスフェクトされているもの）を使って行なうことができる。これらの細胞はＥＰＯ依存的増殖を示す。
【０１１９】
そのようなアッセイの一つでは、細胞を必要な増殖因子の存在下で半定常期密度（half stationary density）まで成長させる（例えば米国特許５，７７３，５６９号に記載のとおり）。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、増殖因子を含まない全培地（whole media）中で１６〜２４時間飢餓状態に置く。細胞の生存率を（例えばトリパンブルー染色によって）決定した後、原液を（増殖因子を含まない全培地中に）作製して、５０μＬあたり約１０５細胞にする。試験しようとするペプチドＥＰＯ−Ｒアゴニスト化合物（典型的には、ファージ結合型若しくは他の結合型ペプチド又は固定化ペプチドではなく、遊離の溶液相ペプチド）の希釈系列を、最終体積が１ウェルあたり５０μＬになるように、９６穴組織培養プレート中に作製する。細胞（５０μＬ）を各ウェルに加え、細胞を２４〜４８時間インキュベートする。この時点で陰性対照は死ぬか、静止状態にあるはずである。次に、当分野で公知の技法、例えばＨ３−チミジン取り込みを細胞増殖の指標として測定するＭＴＴアッセイ［Mosmann (1983) J. Immunol. Methods 65:55-63参照］によって、細胞増殖を測定する。ペプチドをＥＰＯ−Ｒ発現細胞株と親非発現細胞株の両方で評価する。最大細胞増殖の半分を得るのに必要な試験ペプチドの濃度をＥＣ５０として記録する。
【０１２０】
本発明のペプチドは、このアッセイにおいて、劇的に強化された、ＥＰＯ依存的細胞成長を促進する能力を示す。この強化された機能は、かなり低いペプチド濃度で最大細胞増殖刺激活性の半分を与えるその能力によって表される（すなわち、これらは極めて低いＥＣ５０値を有する）。このアッセイは、本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの力価及び活性を見積るための好ましい方法である。
【０１２１】
もう一つのアッセイでは、細胞をＥＰＯ補足培地中で定常期まで成長させ、収集した後、ＥＰＯを含まない培地中でさらに１８時間培養する。細胞を細胞密度が等しい３つの群、すなわち因子を添加しない群（陰性対照）、ＥＰＯを添加する群（陽性対照）、及び試験ペプチドを加える実験群に分割する。次に、培養された細胞をさまざまな時点で集め、固定し、ＤＮＡ結合性蛍光色素（例えばヨウ化プロピジウム又はヘキスト色素、どちらもＳｉｇｍａから入手できる）で染色する。次に蛍光を、例えばＦＡＣＳ Ｓｃａｎフローサイトメータを使って測定する。次に、細胞周期の各期にある細胞の百分率を、例えばＣｅｌｌＦＩＴソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のＳＯＢＲモデルを使って決定することができる。ＥＰＯ又は活性ペプチドで処理した細胞では、陰性対照群と比較してＳ期にある細胞（増加したＤＮＡ含量の指標となる増加した蛍光によって決定されるもの）の比率が大きくなるだろう。
【０１２２】
同様のアッセイをＦＤＣＰ−１細胞株［例えばDexter et al. (1980) J. Exp. Med. 152:1036-1047参照］又はＴＦ−１細胞株［Kitamura, et al. (1989) Blood 73:375-380］を使って行なうことができる。ＦＤＣＰ−１は、ＷＥＨＩ−３馴化培地（ＩＬ−３を含有する培地、ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−６８）を補足すれば増殖できるが分化することはできない、増殖因子依存性マウス多能性原始造血前駆体細胞株である。そのような実験では、ＦＤＣＰ−１細胞株にヒト又はマウスＥＰＯ−Ｒをトランスフェクトして、ＥＰＯの存在下で増殖できるが分化することはできない、それぞれＦＤＣＰ−１−ｈＥＰＯ−Ｒ又はＦＤＣＰ−１−ｍＥＰＯ−Ｒ細胞株を作製する。ＥＰＯ依存性細胞株であるＴＦ−１も、細胞増殖に対するペプチドＥＰＯ−Ｒアゴニストの効果を測定するために使用することができる。
【０１２３】
さらにもう一つのアッセイでは、脾臓細胞へのＨ３−チミジン取り込みに基づく微量アッセイに関する、Krystal (1983) Exp. Hematol 11:649-660に記載の手法を使って、ＥＰＯアゴニストとして機能する本発明の化合物の能力を確認することができる。簡単に述べると、Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウスにフェニルヒドラジン（６０ｍｇ／ｋｇ）を２日間毎日注射する。３日目に脾臓細胞を取り出し、２４時間にわたるその増殖能力を、ＭＴＴアッセイを使って確認する。
【０１２４】
エリスロポエチン応答性細胞株におけるＥＰＯ−ＲへのＥＰＯの結合は、受容体のチロシンリン酸化と、数多くの細胞内タンパク質、例えばＳｈｃ、ｖａｖ及びＪＡＫ２キナーゼのチロシンリン酸化をどちらも誘発する。したがってもう一つのインビトロアッセイでは、ＥＰＯ−Ｒ及び下流の細胞内シグナル伝達タンパク質のチロシンリン酸化を誘発する本発明のペプチドの能力を測定する。上述の結合アッセイ及び増殖アッセイで同定される活性ペプチドは、エリスロポエチン応答性細胞において、ＥＰＯとほぼ同じリン酸化パターンを引き出す。このアッセイでは、ＦＤＣ−Ｐ１／ＥＲ細胞［Dexter, et al. (1980) J Exp Med 152:1036-47］をＥＰＯ補足培地中に維持し、定常期まで成長させる。次に、これらの細胞を、ＥＰＯを含まない培地で２４時間培養する。次に、所定の数のそのような細胞を、試験ペプチドと共に３７℃で約１０分間インキュベートする。ＥＰＯを使った細胞の対照試料も各アッセイと共に処理する。次に、処理された細胞を遠心分離によって集め、ＳＤＳ溶解緩衝液に再懸濁し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する。ゲル中の電気泳動されたタンパク質をニトロセルロースに転写し、ブロット上のホスホチロシン含有タンパク質を標準的な免疫学的技法によって視覚化する。例えばブロットを抗ホスホチロシン抗体（例えばＵｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．のマウス抗ホスホチロシンＩｇＧ）でプローブし、洗浄した後、二次抗体［例えばＫｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．(ワシントンＤＣ）のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ］でプローブすることができる。その後、ホスホチロシン含有タンパク質を、標準的な技法、例えば比色アッセイ、化学発光アッセイ、又は蛍光アッセイなどによって可視化することができる。例えば化学発光アッセイはＡｍｅｒｓｈａｍのＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使って行なうことができる。
【０１２５】
本発明のペプチドの活性を評価するために使用することができるもう一つの細胞ベースインビトロアッセイは、マウス骨髄細胞又はヒト末梢血細胞を用いるコロニーアッセイである。マウス骨髄はマウスの大腿骨から得ることができ、ヒト末梢血の試料は健常ドナーから得ることができる。末梢血の場合、例えばフィコール−ハイパック勾配による遠心分離によって、まず単核球が血液から単離される［Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カナダ・バンクーバ）］。このアッセイでは、有核細胞の計数を行なって、元の試料における有核細胞の数及び濃度を確定する。製造者の指示［Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カナダ・バンクーバ）］に従って、所定の数の細胞をメチルセルロース上に播種する。実験群を試験ペプチドで処理し、陽性対照群をＥＰＯで処理し、陰性対照群には処理を加えない。次に、所定のインキュベーション期間（一般的には１０日及び１８日）後に、成長するコロニーの数を、各群についてスコア化する。活性ペプチドはコロニー形成を促進するだろう。
【０１２６】
本発明の化合物の活性を証明するために使用することができる他のインビトロ生物学的アッセイが、Greenberger, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2931-2935（ＥＰＯ依存性造血前駆体細胞株）；Quelle and Wojchowski (1991) J. Biol. Chem. 266:609-614（Ｂ６ＳＵｔ．ＥＰ細胞におけるタンパク質チロシンリン酸化）；Dusanter-Fourt, et al. (1992) J. Biol. Chem. 287:10670-10678（ヒトＥＰＯ応答性細胞におけるＥＰＯ受容体のチロシンリン酸化）；Quelle, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:17055-17060（ＦＤＣ−ＥＲ細胞における細胞質タンパク質ｐｐ１００のチロシンリン酸化）；Worthington, et al. (1987) Exp. Hematol. 15:85-92（ヘモグロビンの比色アッセイ）；Kaiho and Miuno (1985) Anal. Biochem. 149:117-120（２，７−ジアミノフルオレンによるヘモグロビンの検出）；Patel, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:21300-21302（ｃ−ｍｙｂの発現）；Witthuhn, et al. (1993) Cell 74:227-236（ＪＡＫ２の会合及びチロシンリン酸化）；Leonard, et al. (1993) Blood 82:1071-1079（ＧＡＴＡ転写因子の発現）；及びAndo, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9571-9575（サイクリンＤ２及びＤ３によるＧ１移行の調節）に開示されている。
【０１２７】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．によって設計されたマイクロフィジオメータ（microphysiometer）と呼ばれる装置は、さまざまな受容体に対するアゴニスト及びアンタゴニストの効果の測定に、うまく使用することができると報告されている。この機器の原理は、受容体活性化に応答して起こる細胞外培地の酸性化速度の変化を測定することにある。
【０１２８】
インビボ機能アッセイ
試験ペプチドの力価を評価するために使用することができるインビボ機能アッセイの一つは、低酸素多血（polycythemic exhypoxic）マウスバイオアッセイである。このアッセイではマウスを数日にわたって交互の条件付けサイクルに供する。このサイクルではマウスが減圧状態の期間と周囲圧状態の期間とを交互に繰り返す。その後、マウスを２〜３日間周囲圧に維持してから、試験試料の投与を行なう。試験ペプチド試料、又は陽性対照マウスの場合のＥＰＯ標準は、条件付けされたマウスに皮下注射される。放射標識された鉄（例えば５９Ｆｅ）を２日後に投与し、放射標識された鉄を投与した２日後に、血液試料を採取する。次に、ヘマトクリット及び放射能測定値を、各血液試料について、標準的技法で決定する。活性試験ペプチドを注射したマウスから得られる血液試料は、試験ペプチドもＥＰＯも投与されなかったマウスより高い放射能（赤血球ヘモグロビンによるＦｅ５９の結合に起因するもの）を示すだろう。
【０１２９】
試験ペプチドの力価を評価するために使用することができるもう一つのインビボ機能アッセイは、網状赤血球アッセイである。このアッセイでは、正常無処置マウスに、３日連続して、ＥＰＯ又は試験ペプチドを皮下注射する。３日目にはマウスに鉄デキストランも腹腔内注射する。５日目に血液試料をマウスから集める。血中の網状赤血球のパーセント（％）をチアゾールオレンジ染色及びフローサイトメータ解析（網状赤血球数（retic-count）プログラム）で決定する。加えて、ヘマトクリットも手作業で決定する。補正された網状赤血球のパーセントは、次の式を使って決定される：
％ＲＥＴＩＣ補正＝％ＲＥＴＩＣ実測値×（ヘマトクリット個体／ヘマトクリット正常）。
活性試験化合物は、試験ペプチドもＥＰＯも投与しなかったマウスと比較して、増加した％ＲＥＴＩＣ補正レベルを示すだろう。
【０１３０】
本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの使用
本発明のペプチド化合物は、ＥＰＯの生物学的役割を理解するためのツールとして、例えばＥＰＯの産生及びＥＰＯ−ＲへのＥＰＯの結合に影響を及ぼし、またＥＰＯの産生及びＥＰＯ−ＲへのＥＰＯの結合によって影響されると思われる多くの因子（例えばＥＰＯ／ＥＰＯ−Ｒシグナル伝達／受容体活性化の機構）の評価に、インビトロで役立つ。本ペプチドはＥＰＯ−Ｒに結合する他の化合物の開発にも役立つ。なぜなら本化合物は、その開発を容易にする重要な構造−活性相関情報を与えるからである。
【０１３１】
さらにまた、本発明のペプチドは、ＥＰＯ−Ｒに結合するその能力に基づいて、生細胞上、固定された細胞上、生体液中、組織ホモジネート中、精製天然生物材料中などのＥＰＯ−Ｒを検出するための試薬として使用することもできる。例えば、そのようなペプチドを標識することにより、表面にＥＰＯ−Ｒを有する細胞を同定することができる。加えて、本発明のペプチドは、ＥＰＯ−Ｒに結合するその能力に基づいて、ｉｎ ｓｉｔｕ染色、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分別）解析、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）などに使用することができる。加えて、本発明のペプチドは、ＥＰＯ−Ｒに結合するその能力に基づいて、受容体の精製や、細胞表面（若しくは透過処理された細胞の内部）にＥＰＯ−Ｒを発現させる細胞の精製に、使用することができる。
【０１３２】
本発明のペプチドは、さまざまな医学研究及び診断目的に市販試薬として利用することもできる。限定するわけではないが、そのような使用には、（１）さまざまな機能アッセイにおいて候補ＥＰＯ−Ｒアゴニストの活性を定量するための較正標準としての使用；（２）ランダムペプチドスクリーニングにおけるブロッキング試薬としての使用、すなわち、ＥＰＯ−Ｒペプチドリガンドの新しいファミリーを捜す際に、本発明のＥＰＯペプチドの回収を阻止するために、本ペプチドを使用することができる；（３）ＥＰＯ−Ｒとの共結晶化における使用、すなわちＥＰＯ−Ｒに結合した本発明のペプチドの結晶を形成させることができ、それにより、Ｘ線結晶解析による受容体／ペプチド構造の決定が可能になる；（４）分化を開始することによって、グロビン合成及びヘム錯体合成を誘導し、フェリチン受容体の数を増加させる、赤血球前駆体細胞の能力を測定するための使用；（５）ＥＰＯ依存的細胞株、例えばＦＤＣＰ−１−ｍＥＰＯ−Ｒ細胞株及びＴＦ−１細胞株の増殖及び成長を維持するための使用；（６）放射性発色団による本発明のペプチドの標識に関係する使用；並びに（７）ＥＰＯ−Ｒが好ましく活性化され、又はそのような活性化が既知量のＥＰＯ−Ｒアゴニストなどに対して都合よく較正されるような、他の研究及び診断用途、を含めることができる。
【０１３３】
本発明のさらにもう一つの態様では、処置方法及び医薬の製造方法が提供される。本発明のペプチド化合物は、インビボでＥＰＯ−ＲへのＥＰＯの結合を刺激するために、温血動物（ヒトを含む）に投与することができる。したがって本発明は、ＥＰＯの不足に関連する障害の治療的処置方法であって、ＥＰＯ−Ｒを刺激するのに十分な量、したがってインビボでのＥＰＯの不足に関連する症状を軽減するのに十分な量で、本発明のペプチドを投与することを含む方法を包含する。例えば本発明のペプチドは、腎不全及び／又は末期腎不全／透析；慢性腎臓疾患、ＡＩＤＳに関連する貧血；慢性炎症性疾患（例えば関節リウマチ及び慢性腸炎）並びに自己免疫疾患に関連する貧血の処置や、手術前の患者の赤血球数の増強に役立つだろう。本発明のペプチドを投与することによって処置しうる他の疾患状態、障害、及び血液異常状態には、ベータサラセミア；嚢胞性線維症；妊娠及び月経障害；未熟児早期貧血；脊髄損傷；宇宙飛行；急性失血；加齢；脳卒中、虚血（ＣＮＳ虚血及び心虚血の両方）；並びに異常赤血球生成を伴う種々の新生物疾患状態が挙げられる。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明のペプチド化合物を、低赤血球数又は赤血球の不足を特徴としない障害の処置に、例えば輸液に先立つ前処置として、使用することができる。加えて、本発明の化合物の投与は出血時間の低下をもたらすことができ、したがって術前の患者への投与又は出血が起こると予想される適応症に役立つだろう。加えて、本発明の化合物は巨核球の活性化にも役立つだろう。
【０１３５】
ＥＰＯは、血管内皮細胞に対する分裂促進効果及び化学走性効果並びに中枢コリン作動性ニューロンに対する効果を有することが示されているので［例えばAmagnostou, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5978-5982及びKonishi, et al. (1993) Brain Res. 609:29-35参照］、本発明の化合物は、さまざまな血管障害の処置、例えば創傷治癒の促進；側副冠血管の成長（例えば心筋梗塞後に起こりうるもの）の促進；外傷処置；及び血管移植後処置にも役立つだろう。本発明の化合物は、一般に、低いアセチルコリン絶対レベル、又は他の神経活性物質（例えば神経伝達物質）と比較して低いアセチルコリン相対レベルを特徴とする、さまざまな神経障害の処置にも役立つだろう。
【０１３６】
医薬組成物
本発明のさらにもう一つの態様では、上記ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド化合物の医薬組成物が提供される。そのような組成物の投与によって軽減又は調整されうる状態には上に示したものが含まれる。そのような医薬組成物は、経口、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）又は皮下注射）、経皮（受動的投与又はイオントフォレシス若しくはエレクトロポレーションを用いる投与）、経粘膜（鼻、膣、直腸、又は舌下）投与経路による投与用、又は生分解性インサートを使った投与用であることができ、各投与経路に適した剤形に製剤することができる。一般に、本発明に包含されるのは、本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド又は誘導品の有効量を、医薬的に許容できる希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、佐剤及び／又は担体と共に含む医薬組成物である。そのような組成物は、さまざまな緩衝剤含量（例えばトリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤；添加剤、例えば洗剤及び可溶化剤（例えばツイーン２０、ツイーン８０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えばチメルソール（Thimersol）、ベンジルアルコール）及び増量物質（例えばラクトース、マンニトール）；ポリマ化合物（例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸など）の粒状調製物又はリポソームへの材料の組み込みを含む。ヒアルロン酸も使用しうる。そのような組成物は、本タンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、及びインビボクリアランスの速度に影響を及ぼしうる。例えば、参照により本明細書に組み込まれるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042)の１４３５〜１７１２頁を参照されたい。本組成物は液状に製造してもよいし、乾燥粉末（例えば凍結乾燥）の形態であってもよい。
【０１３７】
経口送達
ここでの使用が考えられるのは、経口固形剤形であり、これは参照により本明細書に組み込まれるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042）の第89章に概説されている。固形剤形には、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤又は口中錠、カシェ剤、ペレット剤、粉末剤、又は顆粒剤が挙げられる。また、リポソーム又はプロテノイド封入も、（例えば米国特許第４，９２５，６７３号に報告されているプロテノイドミクロスフェアのような）本組成物の製剤に使用することができる。リポソーム封入を使用することができ、リポソームはさまざまなポリマで誘導体化することができる（例えば米国特許第５，０１３，５５６号）。治療薬のための考えうる固形剤形は、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．により、「Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ」（Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ及びＣ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ編）の第１０章（１９７９）に説明されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。一般に本製剤は、ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド（又はその化学修飾体）と、胃環境からの保護及び腸での生物活性物質の放出を見込んだ不活性成分とを含む。
【０１３８】
また、経口投与用の液状剤形、例えば医薬的に許容できる乳剤、溶液、懸濁剤、及びシロップ剤も、ここでの使用が考えられ、これは、他の構成要素、例えば不活性希釈剤；佐剤、例えば湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤；並びに甘味剤、着香剤、及び芳香剤を含有しうる。
【０１３９】
本ペプチドは誘導体の経口送達が有効であるように化学修飾することができる。一般に、考えられる化学修飾は構成要素分子そのものへの少なくとも一つの部分の取付けであり、前記部分は（ａ）タンパク質分解の阻害、及び（ｂ）胃又は腸からの血流への取り込みを可能にする。また、１又は複数の構成要素の総合的安定性の増加及び体内での循環時間の増加も望まれる。上述のようにＰＥＧ化は医薬的使用法にとって好ましい化学修飾である。使用しうる他の部分には、プロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマ、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロリン、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカン（tioxocane）が挙げられる［例えばAbuchowski and Davis (1981) 「Soluble Polymer-Enzyme Adducts」 Enzymes as Drugs. Hocenberg and Roberts, eds. (Wiley-Interscience: New York, NY) pp. 367-383；及びNewmark, et al. (1982) J. Appl. Biochem. 4:185-189参照］。
【０１４０】
経口製剤の場合、放出場所は胃、小腸（十二指腸、空腸、若しくは回腸）、又は大腸でありうる。当業者は、胃では溶解しないが、十二指腸又は腸のどこか他の場所で物質を放出する製剤を利用することができる。好ましくは、放出は、ペプチド（又は誘導体）を保護することによるか、或いは胃環境を越えてから、例えば腸内で、ペプチド（又は誘導体）を放出することによって、胃環境の有害な作用を回避する。
【０１４１】
完全な胃耐性を保証するには、少なくともｐＨ５．０までは不浸透性のコーティングが不可欠である。腸溶コーティングとして使用される、より一般的な不活性成分の例は、酢酸セルローストリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリ酢酸ビニルフタレート（ＰＶＡＰ）、オイドラギットＬ３０Ｄ、アクアテリック、酢酸セルロースフタレート（ＣＡＰ）、オイドラギットＬ、オイドラギットＳ、シェラックである。これらのコーティングは混合フィルムとして使用することができる。
【０１４２】
コーティング又はコーティングの混合物は、胃からの保護を意図しない錠剤にも使用することができる。これには、糖コーティング、又は錠剤を嚥下しやすくするコーティングを含めることができる。カプセル剤は、乾燥治療薬（すなわち粉末）を送達するためのハードシェル（例えばゼラチン）からなることができ、液状治療薬には軟ゼラチンシェルを使用することができる。カシェ剤のシェル材料は厚いデンプン又は他の可食ペーパーであることができる。丸薬、口中剤、成型錠剤又は擦り込み錠には、湿式塊化（moist massing）技法を使用することができる。
【０１４３】
本ペプチド（又は誘導体）は、粒径約１ｍｍの顆粒又はペレットの形をした微細マルチ粒子（fine multiparticulates）として製剤に組み込むことができる。カプセル投与用の物質の製剤は、粉末として、又は軽く圧縮したプラグ（plug）として行なうことができ、さらには錠剤として行なうこともできる。これらの治療薬は圧縮によって製造することができる。
【０１４４】
着色剤及び／又は着香剤も含めることができる。例えばペプチド（又は誘導体）を（例えばリポソーム又はミクロスフェア封入などによって）製剤した後、さらに可食製品、例えば着色剤及び着香剤を含有する冷蔵保存飲料などに含有させることができる。
【０１４５】
ペプチド（又は誘導体）の体積を不活性物質で希釈又は増加させることができる。これらの希釈剤には、糖質、特にマンニトール、α-ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストラン及びデンプンを挙げることができる。一定の無機塩、例えばカルシウム三リン酸、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムも、充填剤として使用することができる。市販希釈剤の例は、ファースト−フロ（Fast-Flo）、エムデックス（Emdex）、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、エムコンプレス（Emcompress）及びアビセルである。
【０１４６】
固形剤形への治療薬の製剤には崩壊剤を含めることができる。限定するわけではないが、崩壊剤として使用される材料には、デンプン、例えばデンプンに基づく市販の崩壊剤であるエキスプロタブが含まれる。グリコール酸デンプンナトリウム、アンバーライト、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン（ultramylopectin）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、海綿及びベントナイトは全て使用することができる。崩壊剤は不溶性カチオン交換樹脂であることもできる。粉末ゴムを崩壊剤及び結合剤として使用することができ、これには粉末ゴム、例えば寒天、カラヤゴム又はトラガカントゴムを挙げることができる。アルギン酸及びそのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。
【０１４７】
結合剤はペプチド（又は誘導体）剤を一つに保持して硬い錠剤を形成させるために使用することができ、これには天然物由来の材料、例えばアラビアゴム、トラガカント、デンプン及びゼラチンが挙げられる。その他、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）も挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）はどちらも、ペプチド（又は誘導体）を造粒するために、アルコール溶液中で使用することができる。
【０１４８】
製剤プロセス中の粘着を防ぐために、ペプチド（又は誘導体）の製剤には減摩剤を含めることができる。潤滑剤はペプチド（又は誘導体）とダイ壁の間の層として使用することができ、限定するわけではないが、これには、ステアリン酸（そのマグネシウム塩及びカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油及びワックスを挙げることができる。可溶性潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、さまざまな分子量のポリエチレングリコール、カーボワックス４０００及び６０００なども使用することができる。
【０１４９】
製剤時に薬物の流動性を改善しうる流動促進剤を、圧縮時の再配列を助けるために加えてもよい。流動促進剤には、デンプン、タルク、熱分解法シリカ及び水和シリコアルミネートを挙げることができる。
【０１５０】
水性環境へのペプチド(又は誘導体)の溶解を助けるために、界面活性剤を湿潤剤として加えてもよい。界面活性剤には、アニオンデタージェント、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルソジウムスルホサクシネート及びジオクチルソジウムスルホネートなどを挙げることができる。カチオンデタージェントを使用してもよく、これにはベンザルコニウムクロライド又はベンゼトニウムクロライドを挙げることができる。界面活性剤として製剤に含めることができる潜在的な非イオン性デタージェントのリストは、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート２０、４０、６０、６５及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース並びにカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、単独で、又はさまざまな比率の混合物として、タンパク質又は誘導体の製剤中に存在できる。
【０１５１】
ペプチド（又は誘導体）の取り込みを潜在的に強化する添加剤は、例えば、脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸及びリノレン酸である。
【０１５２】
放出制御経口用製剤が望ましい可能性がある。拡散機序又は浸出機序による放出を可能にする不活性マトリックス（例えばゴム）中にペプチド（又は誘導体）を組み込むことができる。ゆっくり変性するマトリックスも製剤中に組み込むことができる。いくつかの腸溶コーティングも、遅延放出効果を有する。放出制御のもう一つの形態は、Ｏｒｏｓ治療システム（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．）に基づく方法によるものである。すなわち、浸透圧効果によって単一の小さな開口部から水の進入を可能にし、かつ薬物を押し出すことを可能にする半透膜に、薬物を封入する。
【０１５３】
製剤には他のコーティングを使用することができる。これらには、コーティングパンで適用することができるさまざまな糖が挙げられる。ペプチド（又は誘導体）をフィルムコート錠に入れて与えることもでき、その場合に使用される材料は２つの群に分割される。１つ目は非腸溶性材料であり、これには、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシ−メチルセルロースナトリウム、プロビドン（providone）及びポリエチレングリコールが挙げられる。２つ目の群は、一般的にフタル酸のエステル類である腸溶性材料を含める。
【０１５４】
最適なフィルムコーティングを得るために、材料の混合物を使用してもよい。フィルムコーティングは、パンコーティング機又は流動床で行なってもよいし、圧縮コーティングによって行なってもよい。
【０１５５】
非経口送達
非経口投与のための本発明の調製物には、滅菌された水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳剤が挙げられる。非水性溶媒又は溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油及びトウモロコシ油、ゼラチン、並びに注射可能な有機エステル、例えばエチルオレートである。そのような剤形は、佐剤、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤も含有しうる。それらは、例えば細菌保持フィルタによる濾過、組成物への滅菌剤の組み込み、組成物の放射線照射、又は組成物の加熱によって滅菌することができる。滅菌水又は他の何らかの滅菌注射可能媒質を使って、それらを使用直前に作製することもできる。
【０１５６】
直腸送達又は膣送達
直腸又は膣投与用の組成物は、好ましくは坐剤であり、これは、活性物質に加えて、賦形剤、例えばカカオ脂又は坐剤用ワックスを含みうる。鼻又は舌下投与用の組成物も当分野で周知の標準的賦形剤を使って製造される。
【０１５７】
肺送達
ここではＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド（又はその誘導体）の肺送達も考えられる。ペプチド（又は誘導体）は、吸入時に哺乳動物の肺に送達され、肺の上皮層を横切って血流に至る［例えばAdjei, et al. (1990) Pharmaceutical Research 7:565-569；Adjei, et al. (1990) Int. J. Pharmaceutics 63:135-144（酢酸ロイプロリド）；Braquet, et al. (1989) J. Cardiovascular Pharmacology 13(sup5):143-146（エンドセリン−１）；Hubbard, et al. (1989) Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp. 206-212（α１−アンチトリプシン）；Smith, et al., (1989) J. Clin. Invest. 84:1145-1146（α−１−プロテイナーゼ）；Oswein,et al. (1990) 「Aerosolization of Proteins」, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone, Colorado（組換えヒト成長ホルモン）；Debs, et al. (1988) J. Immunol. 140:3482-3488（インターフェロン−γ及び腫瘍壊死因子α）；及び米国特許第５，２８４，６５６号（Ｐｌａｔｚら）（顆粒球コロニー刺激因子）参照］。全身作用を得るために薬物を肺送達するための方法及び組成物は米国特許第５，４５１，５６９号（Ｗｏｎｇら）に記載されている。
【０１５８】
治療薬製品の肺送達用に設計された種々の機械器具も、本発明の実施における使用が考えられる。限定するわけではないが、そのような機械器具には、ネブライザ、定量吸入器、及び粉末吸入器が含まれ、これらは全て当業者にはよく知られている。本発明の実施に適した市販器具の具体例には、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔネブライザ（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｉｎｃ．、ミズーリ州セントルイス）、Ａｃｏｒｎ ＩＩネブライザ（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、コロラド州エングルウッド）、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器（Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク）、及びＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ベッドフォード）がある。
【０１５９】
これらの器具はいずれもペプチド（又は誘導体）の投薬に適した製剤の使用を必要とする。通例、各製剤は、使用する器具のタイプに固有であり、治療に有用な通常の希釈剤、佐剤及び／又は担体に加えて、適当な噴射材の使用を伴いうる。また、リポソーム、マイクロカプセル若しくはミクロスフェア、包接錯体、又は他のタイプの担体の使用も考えられる。化学修飾ペプチドは、化学修飾のタイプ又は使用する器具のタイプに応じて、異なる製剤に調製することもできる。
【０１６０】
ネブライザ（ジェット又は超音波）と共に使用するのに適した製剤は、通例、溶液１ｍＬにつき生物活性タンパク質約０．１〜２５ｍｇの濃度で水に溶解させたペプチド（又は誘導体）を含む。製剤は緩衝剤及び単糖も含みうる（例えばタンパク質の安定化及び浸透圧の調節のため）。ネブライザ用製剤は、エアロゾルを形成する際に溶液の噴霧によって引き起こされるペプチド（又は誘導体）の表面誘発凝集を減少させ又は防止するために、界面活性剤も含有しうる。
【０１６１】
定量吸入器と共に使用される製剤は、一般に、界面活性剤を利用して噴射剤に懸濁させたペプチド（又は誘導体）を含有する微細粉末を含む。噴射剤は、この目的に使用される従来の任意の材料、例えばクロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、又は炭化水素、例えばトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び１，１，１，２−テトラフルオロエタン、又はそれらの組合せなどであることができる。適切な界面活性剤には、ソルビタントリオレート及び大豆レシチンが含まれる。オレイン酸も界面活性剤として役立ちうる。
【０１６２】
粉末吸入器具から投薬するための製剤は、ペプチド（又は誘導体）を含有する微細乾燥粉末を含み、増量剤、例えばラクトース、ソルビトール、スクロース、又はマンニトールも、その器具からの粉末の分散を容易にする量（例えば製剤の５０〜９０重量％）で含みうる。ペプチド（又は誘導体）は、肺末端に最も効果的に送達されるように、最も好都合には、１０ｍｍ（又はミクロン）未満、最も好ましくは０．５〜５ｍｍの平均粒径を有する粒子状に、調製されるべきである。
【０１６３】
鼻送達
ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチド（又は誘導体）の鼻送達も考えられる。鼻送達は、鼻への治療薬製品の投与後に、ペプチドが血流に直接移行することを可能にし、その製品を肺に沈着させる必要がない。鼻送達用の製剤には、デキストラン又はシクロデキストランを含むものが挙げられる。
【０１６４】
鼻送達を容易にするために使用される他の浸透強化剤も、本発明のペプチドと一緒に使用することが考えられる（例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第２００４０５６３１４号（２００３年１２月１７日出願）に記載されているもの）。
【０１６５】
投薬量
全ての本ペプチド化合物について、さらなる研究が行なわれるにつれて、さまざまな患者におけるさまざまな状態を治療するのに適当な投薬量レベルに関する情報が明らかになり、当業者は、治療状況、受容者の年齢及び全身の健康状態を考慮して、適正な投薬を確かめることができるだろう。選択される投薬量は、所望する治療効果、投与経路、及び所望する処置継続期間に依存する。一般に、毎日０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量レベルが、哺乳動物に投与される。一般に、静脈内注射又は静脈内注入の方が、投薬量は少ないだろう。
【０１６６】
一定の実施形態では、本発明のペプチドのいずれか一つを使って、透析前又は透析中の腎不全を有する個体（透析前患者又は透析患者）を処置することができる。この実施形態における治療用量範囲は、個体の体重１キログラム（ｋｇ）あたり０．０２５〜０．２ミリグラム（ｍｇ）の化合物（０．０２５〜０．２ｍｇ／ｋｇ）であり得る。より具体的には、０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇの用量範囲が好ましいだろう。さらにまた、医師は、まず０．０２５ｍｇ／ｋｇから開始して使用する投薬量を増加させ、処置を受ける各個体について、個々のヘモグロビン応答に基づいて、およそ０．０２５ｍｇ／ｋｇ刻みで投薬量を調整（titrate）することができる。したがって医師は、各個体について、十分なヘモグロビン応答が達成されるまで、投薬量を調整することができる。透析前患者又は透析患者である個体の場合、十分なヘモグロビン応答とは、正常ヘモグロビンレベル（１４〜１５ｇ／ｄＬ）又は医師によって決定される別のヘモグロビンレベルをほぼ達成することだろう。この実施形態では、個々の透析前患者又は透析患者に関する薬理学的活性用量（ＰＡＤ）は、０．０６７〜０．０７５ｍｇ／ｋｇであると予想される。この実施形態の利点は、他の現行赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）の場合のように毎週ではなく、個々の患者ごとに３〜４週間ごとに１回という低い投薬頻度であると予想される。多くの投与経路を使用することができる（上述のように経口、ＩＶなど）。透析患者にとって好ましい投与経路は静脈内である。透析前患者にとって好ましい投与経路は皮下である。他の一定の実施形態では、上述の化合物のうち１つを使って、悪性疾患に関連する貧血を有する個体（腫瘍患者）を処置することができる。この実施形態における治療用量範囲は、透析前患者又は透析患者に関する範囲の３〜５倍（すなわち０．０７５〜０．５ｍｇ／ｋｇ、或いは０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ）であると予想される。より具体的には、０．２〜０．４ｍｇ／ｋｇの用量範囲が好ましい。上記と同様に、腫瘍患者を処置する医師は、０．０７５ｍｇ／ｋｇから、或いは０．０５ｍｇ／ｋｇから出発して、０．０７５ｍｇ／ｋｇ刻み、或いは０．０５ｍｇ／ｋｇ刻みで、十分なヘモグロビン応答が達成されるまで、投薬量を調整することができる。個々の腫瘍患者に関するＰＡＤは、約０．２５ｍｇ／ｋｇであると予想される。ここでも、３〜４週間おきという低頻度の投薬という利点が、個々の患者について予想される。さらにまた、腫瘍患者にとっての別の利点は、網状赤血球刺激とヘモグロビン上昇の間の誘導期中のヘモグロビンの低下を防ぐために、この投薬量を化学療法前（例えば３〜５日前）に投与しうること、又は化学療法と同時投与しうることである。多くの投与経路を使用することができる（上述のように経口、ＩＶなど）。皮下投与は腫瘍患者にとって好ましい投与経路であるだろう。透析前患者、透析患者、又は腫瘍患者の処置に使用するための好ましい化合物には、以下に示すものが挙げられる。
【０１６７】
カルバメート結合、サルコシンなし、及びＰＥＧ重量の範囲（ここには配列番号１を示す）：
【化４１】
2010536858.tif 000042
【０１６８】
カルバメート結合、サルコシンなし、及び好ましいＰＥＧ重量（ここには配列番号１を示す）：
【化４２】
2010536858.tif 000043
【化４３】
2010536858.tif 000044
【０１６９】
カルバメート結合、サルコシンあり、及びＰＥＧ重量の範囲（ここには配列番号２を示す）：
【化４４】
2010536858.tif 000045
【０１７０】
カルバメート結合、サルコシンあり、及び好ましいＰＥＧ重量（ここには配列番号２を示す）：
【化４５】
2010536858.tif 000046
【化４６】
2010536858.tif 000047
【０１７１】
アミド結合、サルコシンなし、及びＰＥＧ重量の範囲（ここには配列番号１を示す）：
【化４７】
2010536858.tif 000048
【０１７２】
アミド結合、サルコシンなし、及び好ましいＰＥＧ重量 （ここには配列番号１を示す）： 
【化４８】
2010536858.tif 000049
【化４９】
2010536858.tif 000050
【０１７３】
アミド結合、サルコシンあり、及びＰＥＧ重量の範囲（ここには配列番号２を示す）：
【化５０】
2010536858.tif 000051
【０１７４】
アミド結合、サルコシン、及び好ましいＰＥＧ重量（ここには配列番号２を示す）：
【化５１】
2010536858.tif 000052
【化５２】
2010536858.tif 000053
【０１７５】
本発明のペプチド（又はその誘導体）は、１又はそれ以上の追加活性成分又は医薬組成物と一緒に投与することができる。
【実施例】
【０１７６】
次に本発明を以下の実施例によって説明する。しかし、これらの実施例及び本明細書のどこかに記載する他の例は、単なる例示であって、決して、本発明の及び例示した形態の範囲及び意味を限定するものではない。また本発明は本明細書に記載するどの特定の好ましい実施形態にも限定されない。実際、本明細書を読んだ当業者には本発明の数多くの変更及び変形が明白であるだろうし、それらを、その要旨及び範囲から逸脱することなく行なうことができる。したがって本発明は、請求項に認められるべき均等物の全範囲と共に、本願特許請求の範囲の語句によってのみ限定されるものとする。
【実施例１】
【０１７７】
固相合成によるＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドダイマーの合成
ステップ１−Ｃｂｚ−ＴＡＰの合成：市販のジアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．の「ＴＡＰ」）（１０ｇ、６７．４７ｍｍｏｌ）を含有する無水ＤＣＭ（１００ｍｌ）溶液を０℃まで冷却した。ベンジルクロロホルメート（４．８２ｍｌ、３３．７ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（５０ｍｌ）溶液を、滴下漏斗により、反応混合物の温度を０℃に維持しながら６〜７時間かけてゆっくり加えた後、室温（約２５℃）まで温めた。さらに１６時間の後、ＤＣＭを減圧下で除去し、残渣を３Ｎ ＨＣｌとエーテルとに分配した。水層を集め、５０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨ８〜９に中和し、エチルアセテートで抽出した。そのエチルアセテート層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した後、減圧下で濃縮することにより、粗モノ−Ｃｂｚ−ＴＡＰ（５ｇ、収率約５０％）を得た。この化合物をこれ以上精製せずに次の反応に使用した。
【化５３】
2010536858.tif 000054
【０１７８】
ステップ２−Ｃｂｚ−ＴＡＰ−Ｂｏｃの合成：Ｃｂｚ−ＴＡＰ（５ｇ、１７．７ｍｍｏｌ）をヘキサン（２５ｍｌ）中で激しく撹拌した懸濁液に、Ｂｏｃ２Ｏ（３．８６ｇ、１７．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で終夜撹拌を続けた。反応混合物をＤＣＭ（２５ｍｌ）で希釈し、１０％クエン酸水溶液（２回）、水（２回）及びブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物（収量５ｇ）をそのまま次の反応に使用した。
【化５４】
2010536858.tif 000055
【０１７９】
ステップ３−Ｂｏｃ−ＴＡＰの合成：先の反応で得た粗生成物をメタノール（２５ｍｌ）に溶解し、５％Ｐｄ炭素（５％ｗ／Ｗ）の存在下、バルーン圧力下で１６時間水素化した。混合物を濾過し、メタノールで洗浄し、濾液を減圧下で濃縮することにより、粗Ｈ−ＴＡＰ−Ｂｏｃ生成物（収量３．７ｇ）を得た。ステップ１〜３後のＢｏｃ−ＴＡＰのおおよその総収率は４４％だった（使用したＣｂｚ−Ｃｌの量に基づいて計算）。
【化５５】
2010536858.tif 000056
【０１８０】
ステップ４−ＴｅｎｔａＧｅｌ−リンカーの合成：ＴｅｎｔａＧｅｌブロミド（２．５ｇ、０．４８ｍｍｏｌ／ｇ、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、ドイツ）、フェノール系リンカー（５当量）及びＫ２ＣＯ３（５当量）を、２０ｍＬのＤＭＦ中で１４時間、７０℃に加熱した。室温まで冷却した後、樹脂を洗浄し（０．１Ｎ ＨＣｌ、水、ＡＣＮ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ）、乾燥することにより、琥珀色の樹脂を得た。
【化５６】
2010536858.tif 000057
【０１８１】
ステップ５−ＴｅｎｔａＧｅｌ−リンカー−ＴＡＰ（Ｂｏｃ）の合成：２．５ｇｍの上で得た樹脂及びＨ−ＴＡＰ−Ｂｏｃ（１．５ｇｍ、５当量）及び氷ＡｃＯＨ（３４μｌ、５当量）を、１：１のＭｅＯＨ−ＴＨＦ混合物にとり、終夜振とうした。これに、１Ｍ シアノ水素化ホウ素ナトリウム（５当量）／ＴＨＦ溶液を加え、さらに７時間振とうした。樹脂を濾過し、洗浄し（ＤＭＦ、ＴＨＦ、０．１Ｎ ＨＣｌ、水、ＭｅＯＨ）、乾燥した。少量の樹脂をＤＣＭ中、Ｂｚ−Ｃｌ及びＤＩＥＡでベンゾイル化し、７０％ＴＦＡ−ＤＣＭで切断し、ＬＣＭＳ及びＨＰＬＣでチェックした。
【化５７】
2010536858.tif 000058
【０１８２】
ステップ６−ＴｅｎｔａＧｅｌ−リンカー−ＴＡＰ−Ｌｙｓの合成：上で得た樹脂を活性化されたＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨの溶液（５当量のアミノ酸及び５当量のＨＡＴＵをＤＭＦに０．５Ｍの濃度で溶解した後、１０当量のＤＩＥＡを加えることによって調製）で処理し、１４時間穏やかに振とうした。樹脂を洗浄し（ＤＭＦ、ＴＨＦ、ＤＣＭ、ＭｅＯＨ）、乾燥することにより、保護樹脂を得た。樹脂をＤＣＭ中の１０％無水酢酸及び２０％ピリジン溶液で２０分間処理することによって残存アミン基をキャッピングした後、上述のように洗浄した。樹脂を３０％ピペリジン／ＤＭＦ中で２０分間穏やかに振とうすることによってＦｍｏｃ基を除去した後、洗浄し（ＤＭＦ、ＴＨＦ、ＤＣＭ、ＭｅＯＨ）、乾燥した。
【化５８】
2010536858.tif 000059
【０１８３】
ステップ７−ＴｅｎｔａＧｅｌ−リンカー−ＴＡＰ−Ｌｙｓ（ペプチド）２の合成：上で得た樹脂を、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ活性化によるＦｍｏｃ−アミノ酸カップリングとピペリジンによるＦｍｏｃ除去の繰返しサイクルに供することにより、両方のペプチド鎖を同時に構築した。これは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＡＢＩ４３３自動ペプチド合成装置で、都合よく行なわれた。最後のＦｍｏｃ除去後に、末端アミノ基をＤＭＦ中の無水酢酸（１０当量）及びＤＩＥＡ（２０当量）で２０分間アシル化してから、上述のように洗浄した。
【化５９】
2010536858.tif 000060
【０１８４】
ステップ８−樹脂からの切断：上で得た樹脂を、ＴＦＡ（８２．５％）、フェノール（５％）、エタンジチオール（２．５％）、水（５％）、及びチオアニソール（５％）の溶液に、室温で３時間、懸濁した。これに代わる切断用カクテル、例えばＴＦＡ（９５％）、水（２．５％）、及びトリイソプロピルシラン（２．５％）も使用することができる。ＴＦＡ溶液を５℃に冷却し、Ｅｔ２Ｏに注ぎ込んで、ペプチドを沈殿させた。減圧下で濾過及び乾燥することにより、所望のペプチドを得た。Ｃ１８カラムを用いる分取ＨＰＬＣで精製することにより、純粋なペプチドを得た。
【化６０】
2010536858.tif 000061
【０１８５】
ステップ９−ペプチドの酸化による分子内ジスルフィド結合の形成：ペプチドダイマーを２０％ＤＭＳＯ／水に溶解し（乾燥重量で１ｍｇのペプチド／ｍＬ）、室温で３６時間静置した。反応混合物をＣ１８ ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ Ｃ１８、粒径１５ミクロン、孔径３００オングストローム、４０ｍｍ×２００ｍｍ長）にロードした後、４０分にわたって５％ＡＣＮから９５％ＡＣＮまでの直線的ＡＣＮ／水／０．０１％ＴＦＡ勾配をかけることによって、ペプチドを精製した。所望のぺプチドを含有する画分を凍結乾燥すると、生成物が綿毛状の白色固体として得られる。
【化６１】
2010536858.tif 000062
【０１８６】
ステップ１０−末端−ＮＨ２基のＰＥＧ化：
カルバメート結合を介したＰＥＧ化：ペプチドダイマーを１．５当量（モルベース）の活性化ＰＥＧ種（日油株式会社（日本）のｍＰＥＧ−ＮＰＣ）と乾燥ＤＭＦ中で混合して、透明な溶液を得た。５分後に４当量のＤＩＥＡを上記の溶液に加えた。その混合物を周囲温度で１４時間撹拌した後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで精製した。ＰＥＧ化ペプチドの構造はＭＡＬＤＩ質量で確認した。精製ペプチドを、以下に概説する陽イオン交換クロマトグラフィによる精製にも供した。このｍＰＥＧ−ＮＰＣ ＰＥＧ化を、次のスキームに、配列番号３を使って示す。
【化６２】
2010536858.tif 000063
【０１８７】
アミド結合を介したＰＥＧ化：ペプチドダイマーを１．５当量（モルベース）の１当量活性化ＰＥＧ種（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ（米国）のＰＥＧ−ＳＰＡ−ＮＨＳ）と乾燥ＤＭＦ中で混合して、透明な溶液を得る。５分後に１０当量のＤＩＥＡを上記の溶液に加える。その混合物を周囲温度で２時間撹拌した後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで精製する。ＰＥＧ化ペプチドの構造はＭＡＬＤＩ質量で確認した。精製ペプチドを以下に概説する陽イオン交換クロマトグラフィによる精製にも供した。このＰＥＧ−ＳＰＡ−ＮＨＳ ＰＥＧ化を、次のスキームに、配列番号３を使って示す。
【化６３】
2010536858.tif 000064
【０１８８】
ステップ１１−イオン交換精製：いくつかの交換支持体を、出発ダイマーペプチドを保持するその能力に加えて、上記ペプチド−ＰＥＧコンジュゲートを未反応の（又は加水分解された）ＰＥＧから分離するその能力について調査した。イオン交換樹脂（２〜３ｇ）を１ｃｍカラムに充填した後、ナトリウム型に変換し（溶出液がｐＨ１４になるまで０．２Ｎ ＮａＯＨをカラムにロード、約５カラム体積）、次に水素型に変換し（溶出液がロードのｐＨと一致するまで０．１Ｎ ＨＣｌ又は０．１Ｍ ＨＯＡｃのいずれかで溶出、約５カラム体積）、次にｐＨ６になるまで、２５％ＡＣＮ／水で洗浄した。コンジュゲーション前のペプチド又はペプチド−ＰＥＧコンジュゲートを２５％ＡＣＮ／水に溶解し（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＴＦＡでｐＨを＜３に調節してから、カラムにロードした。２〜３カラム体積の２５％ＡＣＮ／水で洗浄して、５ｍＬ画分を集めた後、２５％ＡＣＮ／水中の０．１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃによる溶離で、ペプチドをカラムから放出させ、再び５ｍL画分を集めた。ＨＰＬＣで解析したところ、どの画分が所望のペプチドを含有しているかが明らかになった。エバポレイティブ光散乱検出器（ＥＬＳＤ）で解析したところ、ペプチドがカラム上に保持されてＮＨ４ＯＡｃ溶液で溶出させた場合（一般に画分４と画分１０の間）は、非コンジュゲートＰＥＧが夾雑物として観察されないことが示された。ペプチドが最初の洗浄緩衝液（一般に最初の２画分）中に溶出した場合、所望のＰＥＧコンジュゲートと過剰のＰＥＧとの分離は観察されなかった。
【０１８９】
次に挙げるカラムは、ペプチドとペプチド−ＰＥＧコンジュゲートをどちらもうまく保持し、ペプチド−ＰＥＧコンジュゲートを非コンジュゲートペプチドからうまく精製した。
【表１】
2010536858.tif 000065
【実施例２】
【０１９０】
フラグメント縮合によるＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドダイマーの合成
ステップ１−（Ｃｂｚ）２−Ｌｙｓの合成：リジンを標準的条件でベンジルクロロホルメートの溶液と反応させて、その２つのアミノ基がＣｂｚ基で保護されたリジンを得る。
【化６４】
2010536858.tif 000066
【０１９１】
ステップ２−Ｂｏｃ−ＴＡＰの合成：Ｂｏｃ−ＴＡＰを実施例１のステップ１〜３で説明したように合成する。
【０１９２】
ステップ３−（Ｃｂｚ）２−ＬｙｓとＢｏｃ−ＴＡＰのカップリング：（Ｃｂｚ）２−ＬｙｓとＢｏｃ−ＴＡＰを標準的カップリング条件でカップリングして、（Ｃｂｚ）２−Ｌｙｓ−ＴＡＰ−Ｂｏｃを得る。
【化６５】
2010536858.tif 000067
【０１９３】
ステップ４−Ｌｙｓ−ＴＡＰ−Ｂｏｃ：先の反応で得た粗生成物をメタノール（２５ｍｌ）に溶解し、５％Ｐｄ炭素（５％ｗ／Ｗ）の存在下、バルーン圧力下で、１６時間水素化する。混合物を濾過し、メタノールで洗浄し、濾液を減圧下で濃縮することにより、粗Ｌｙｓ−ＴＡＰ−Ｂｏｃ生成物を得る。
【化６６】
2010536858.tif 000068
【０１９４】
ステップ５−フラグメント縮合によるペプチドモノマーの合成：ペプチドモノマー配列の４つのペプチドフラグメントを標準的技術によって合成する。次に、これらの部分的に保護されたフラグメントを、２ラウンドの独立したカップリングに供する。第１ラウンドでは、モノマーのＮ末端側の半分を、２つのペプチドフラグメントをカップリングすることによって形成させると共に、モノマーのＣ末端側の半分を、他の２つのペプチドフラグメントのカップリングによって形成させる。第２ラウンドのカップリングでは、そのＮ末端及びＣ末端側の各半分をカップリングして、完全に保護されたモノマーを形成させる。次にモノマーを標準的技法でＯＢｎ脱保護する。
【化６７】
2010536858.tif 000069
【０１９５】
ステップ６−ペプチドモノマーの酸化による分子内ジスルフィド結合の形成：次に、ＯＢｎ脱保護された縮合ペプチドモノマー（配列番号１２）をヨウ化物で酸化して、モノマーのＡｃｍ保護システイン残基間に分子内ジスルフィド結合を形成させる。
【化６８】
2010536858.tif 000070
【０１９６】
ステップ７−酸化型ＯＢｎ脱保護モノマーへのＬｙｓ−ＴＡＰ−Ｂｏｃのカップリングによるペプチドダイマーの形成：Ｌｙｓ−ＴＡＰ−Ｂｏｃを２倍モル過剰の酸化型ＯＢｎ脱保護モノマーに標準的条件でカップリングして、ペプチドダイマーを形成させる。次に、そのペプチドダイマーを標準的条件で脱保護する。
【化６９】
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【０１９７】
ステップ８−脱保護されたダイマーのＰＥＧ化：次に、脱保護されたペプチドダイマーを、実施例１のステップ１０で説明したようにＰＥＧ化する。
【０１９８】
ステップ９−イオン交換精製：次に、ＰＥＧ化ペプチドダイマーを、実施例１のステップ１１で説明したように精製する。
【実施例３】
【０１９９】
インビトロ活性アッセイ
この実施例では、本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの活性及び力価の評価に役立つ種々のインビトロアッセイを説明する。これらのアッセイの結果によって、本発明の新規ペプチドがＥＰＯ−Ｒに結合してＥＰＯ−Ｒシグナリングを活性化することが証明される。さらにまた、これらのアッセイの結果から、新規ペプチド組成物は、今までに記載されたＥＰＯミメティックペプチドと比較して、ＥＰＯ−Ｒ結合アフィニティ及び生物学的活性に驚くべき増加を示すことがわかる。
【０２００】
実施例１又は実施例２に記載の方法に従ってＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドダイマーを製造する。これらのペプチドダイマーの力価は、レポータアッセイ、増殖アッセイ、競合結合アッセイ、及びＣ／ＢＦＵ−ｅアッセイを含む一連のインビトロ活性アッセイを使って評価される。これら４つのアッセイを以下にさらに詳しく説明する。
【０２０１】
これらインビトロ活性アッセイの結果を表２に要約する。
【０２０２】
１．レポータアッセイ
このアッセイは、マウスプレＢ細胞株由来のレポータ細胞Ｂａｆ３／ＥｐｏＲ／ＧＣＳＦＲ ｆｏｓ／ｌｕｘに基づく。このレポータ細胞株は、ヒトＧＣＳＦ受容体の細胞内部分に融合したヒトＥＰＯ受容体の細胞外部分を含むキメラ受容体を発現させる。この細胞株には、さらに、ｆｏｓプロモーター駆動のルシフェラーゼレポータ遺伝子コンストラクトがトランスフェクトされる。赤血球生成剤の添加によるこのキメラ受容体の活性化は、ルシフェラーゼレポータ遺伝子の発現をもたらし、したがってルシフェラーゼ基質ルシフェリンを添加した時には、光の生成をもたらす。こうして、そのような細胞におけるＥＰＯ−Ｒ活性化のレベルは、ルシフェラーゼ活性の測定によって定量することができる。
【０２０３】
Ｂａｆ３／ＥｐｏＲ／ＧＣＳＦＲ ｆｏｓ／ｌｕｘ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％ＷＥＨＩ−３上清（ＷＥＨＩ−３細胞、ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−６８の培養物から得た上清）、及びペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養される。アッセイの約１８時間前に、１０％ＦＢＳ及び０．１％ＷＥＨＩ−３上清を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に細胞を移すことによって、細胞を飢餓状態にする。アッセイの日に、１０％ＦＢＳを補足した（ＷＥＨＩ−３上清なしの）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で細胞を１回洗浄し、次に１０％ＦＢＳを補足した（ＷＥＨＩ−３上清なしの）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、既知濃度の試験ペプチドの存在下で、又は陽性対照としてのＥＰＯ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）と共に、１×１０6細胞／ｍＬを培養する。このアッセイでは、試験ペプチドの希釈系列が同時に試験される。アッセイプレートを５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で４時間インキュベートした後、ルシフェリン（Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ；Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を各ウェルに加える。５分間のインキュベーション後に、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．、イリノイ州ダウナーズグローブ）で、発光を測定する。光カウントを試験ペプチド濃度に対してプロットし、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄソフトウェアを使って解析する。最大半量の発光をもたらす試験ペプチドの濃度をＥＣ５０として記録する［表２：レポータＥＣ５０参照］。
【０２０４】
２．増殖アッセイ
このアッセイは、ヒトＥＰＯ−Ｒを発現するようにトランスフェクトされたマウスプレＢ細胞株Ｂａｆ３に基づく。その結果生じる細胞株ＢａＦ３／Ｇａｌ４／Ｅｌｋ／ＥＰＯＲの増殖はＥＰＯ−Ｒ活性化に依存する。細胞増殖の程度をＭＴＴを使って定量する。この場合、ＭＴＴアッセイにおけるシグナルは生細胞の数に比例する。
【０２０５】
ＢａＦ３／Ｇａｌ４／Ｅｌｋ／ＥＰＯＲ細胞を、スピナーフラスコ中、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及び２％ＷＥＨＩ−３上清（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−６８）を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養する。培養細胞を、スピナーフラスコ中、１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度において、１０％ＦＢＳ及び０．１％ＷＥＨＩ−３上清を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で、終夜、飢餓状態に置く。次に、飢餓細胞をダルベッコＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄し、１０％ＦＢＳを補足した（ＷＥＨＩ−３上清なしの）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に再懸濁して、密度を１×１０６細胞／ｍｌにする。次に、５０μＬ（約５０，０００細胞）ずつの細胞懸濁液を、９６穴アッセイプレートに、３つ一組にして播種する。１０％ＦＢＳを補足した（ＷＥＨＩ−３上清Ｉなしの）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、５０μＬずつの試験ＥＰＯミメティックペプチドの希釈系列、又は５０μＬのＥＰＯ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）若しくはＡｒａｎｅｓｐ（商標）（ダルベポエチンα、Ａｍｇｅｎから市販されているＥＰＯ−Ｒアゴニスト）を、９６穴アッセイプレートに加える（最終ウェル液量１００μＬ）。例えば、試験ペプチド（又は対照ＥＰＯペプチド）の最終濃度が８１０ｐＭ〜０．００４５ｐＭの範囲にわたる１２個の異なる希釈液を試験することができる。次に、播種した細胞を、３７℃で４８時間インキュベートする。次に、１０μＬのＭＴＴ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を各培養皿ウェルに加えてから、４時間インキュベートしておく。次に、１０％ＳＤＳ＋０．０１Ｎ ＨＣｌを加えることによって、反応を停止させる。次に、プレートを３７℃で終夜、インキュベートする。次に、５９５ｎｍの波長における各ウェルの吸光度を分光測光法で測定する。吸光度の読み 対 試験ペプチド濃度のプロットを構築し、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄソフトウェアを使ってＥＣ５０を計算する。最大半量の吸光度をもたらす試験ペプチドの濃度をＥＣ５０として記録する［表２：増殖ＥＣ５０参照］。
【０２０６】
３．競合結合アッセイ
競合結合計算は、光シグナルが２つのビーズ（すなわち、ビオチン化ＥＰＯ−Ｒ結合ペプチドトレーサを保持するストレプトアビジンドナービーズと、ＥＰＯ−Ｒが結合しているアクセプタビーズ）の近接の関数として生成するアッセイを使って行なわれる。光は、光の照射時に一重項酸素が第１ビーズから放出され、放出された一重項酸素との接触が第２ビーズの発光を引き起こすという、無放射性エネルギー移動によって生成する。これらのビーズセットは市販されている（Ｐａｃｋａｒｄ）。ビーズの近接は、ＥＰＯ−ＲへのＥＰＯ−Ｒ結合ペプチドトレーサの結合によって生じる。ＥＰＯ−Ｒへの結合に関してＥＰＯ−Ｒ結合ペプチドトレーサと競合する試験ペプチドはこの結合を妨げることになり、発光の減少を引き起こす。
【０２０７】
さらに詳しく述べると、この方法は次のとおりである。４μＬの試験ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの希釈系列、又は陽性若しくは陰性対照を、３８４穴プレートのウェルに加える。次に２μＬ／ウェルの受容体／ビーズカクテルを加える。受容体ビーズカクテルは、１５μＬの５ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンドナービーズ（Ｐａｃｋａｒｄ）、１５μＬの５ｍｇ／ｍｌモノクローナル抗体ａｂ１７９（この抗体は組換えＥＰＯ−Ｒに含まれるヒト胎盤アルカリホスファターゼタンパク質の一部を認識する）、プロテインＡ被覆アクセプタビーズ（プロテインＡはａｂ１７９抗体に結合することになる；Ｐａｃｋａｒｄ）、１１２．５μLの、組換えＥＰＯ−Ｒ（チャイニーズハムスター卵巣細胞中で、ａｂ１７９ターゲットエピトープを含有するヒト胎盤アルカリホスファターゼタンパク質の一部との融合タンパク質として生産されるもの）の１：６．６希釈液、及び６０７．５μＬのＡｌｐｈａｑｕｅｓｔ緩衝液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．１％ＢＳＡ、０．０５％ツィーン２０）からなる。タッピングして混合する。２μＬ／ウェルのビオチン化ＥＰＯ−Ｒ結合ペプチドトレーサを加える（３０ｎＭの最終濃度）。ビオチン−ＧＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴＷＶＣＱＰＬＲＧ（配列番号４）という配列を有するペプチドトレーサＥＰＯ−Ｒ結合ペプチド（表の「レポータＥＣ５０（ｐＭ）」を参照）を、実施例１に記載の方法に従って作製する。
【化７０】
2010536858.tif 000072
【０２０８】
混合するために１分間遠心分離する。プレートをＰａｃｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｓｅａｌで封止し、ホイルで包む。室温で終夜インキュベートする。１８時間後にＡｌｐｈａＱｕｅｓｔリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ）を使って発光を読む。発光対ペプチド濃度をプロットし、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ又はＥｘｃｅｌで解析する。
【０２０９】
試験ペプチドなしで観察される発光と比較して発光を５０％減少させる試験ペプチドの濃度を、ＩＣ５０として記録する［表２：ＡＱ ＩＣ５０参照］。
【０２１０】
４．Ｃ／ＢＦＵ−ｅアッセイ
ＥＰＯ−Ｒシグナリングは、骨髄幹細胞から増殖する赤血球前駆体への分化を刺激する。このアッセイは初代ヒト骨髄多能性幹細胞からの赤血球前駆体の増殖及び分化を刺激する試験ぺプチドの能力を測定する。
【０２１１】
このアッセイのために、試験ペプチドの希釈系列を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補足したＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中に調製する。次に、これらの希釈系列、又は陽性対照ＥＰＯペプチドを、メチルセルロースに加えて最終体積を１．５ｍＬにする。次に、そのメチルセルロース及びペプチド混合物を十分にボルテックスする。ヒト骨髄由来ＣＤ３４＋細胞（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ／Ｃａｍｂｒｅｘ）のアリコート（１００，０００細胞／ｍＬ）を解凍する。解凍した細胞を５０ｍＬチューブ中の０．１ｍＬの１ｍｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）に静かに加える。次に、４０〜５０ｍＬのＩＭＤＭ培地を細胞に静かに加える。すなわち培地は、最初の１０ｍＬを５０ｍＬチューブの側面に沿って１滴ずつ加えた後、残りの培地をチューブの側面に沿ってゆっくりと分注する。次に細胞を９００ｒｐｍで２０分間遠心し、培地を静かに吸引することにより、注意深く除去する。細胞を１ｍｌのＩＭＤＭ培地に再懸濁し、１ｍＬあたりの細胞密度を血球計盤スライドでカウントする（スライド上に１０μＬの細胞懸濁液、細胞密度は平均数×１０，０００細胞／ｍｌである）。次に、細胞をＩＭＤＭ培地に希釈して、細胞密度を１５，０００細胞／ｍＬにする。次に、１００μＬの希釈細胞を各１．５ｍＬのメチルセルロース＋ペプチド試料に加え（アッセイ培地中の最終細胞濃度は１，０００細胞／ｍＬである）、その混合物をボルテックスする。混合物中の気泡を消失させた後、鈍針を使って１ｍＬ吸引する。各試料から得た０．２５ｍＬの吸引混合物を、２４穴プレート（Ｆａｌｃｏｎブランド）の４つのウェルのそれぞれに加える。播種した混合物を、湿潤培養器中、５％ＣＯ２下、３７℃で、１４日間インキュベートする。位相差顕微鏡（対物５×〜１０×、最終倍率１００×）を使って、赤血球系コロニーの存在についてスコア化する。形成されるコロニーの数が、ＥＰＯ陽性対照を使って観察される値との比較で、最大の９０％になる試験ペプチドの濃度を、ＥＣ９０として記録する［表２：Ｃ／ＢＦＵ−ｅ ＥＣ９０参照］。
【０２１２】
５．放射性リガンド競合結合アッセイ
代替の放射性リガンド競合結合アッセイを使って、本発明におけるペプチドのＩＣ５０値を測定することもできる。このアッセイでは、ＥＰＯｒへの１２５Ｉ−ＥＰＯの結合を測定する。アッセイは、好ましくは、以下の例示的プロトコルに従って実施される。
【化７１】
2010536858.tif 000073
【０２１３】
Ｂ．適当な受容体濃度の決定
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合された組換えＥＰＯｒ細胞外ドメインの凍結乾燥品の、１本の５０μｇバイアルを、１ｍＬのアッセイ緩衝液で再構成する。アッセイで使用すべき正しい受容体量を決定するために、この受容体調製物の１００μＬ希釈系列を、２００μＬのヨウ素化組換えヒトエリスロポエチン（１２５Ｉ−ＥＰＯ）中の約２０，０００ｃｐｍと、１２×７５ｍｍポリプロピレン試験管で混合する。チューブに蓋をして、ＬａｂＱｕａｋｅ回転式振とう機上、４℃で終夜、穏やかに混合する。
【０２１４】
翌日、５０μＬの、プロテインＧセファロースの５０％スラリーを、各チューブに加える。次にチューブを、穏やかに混合しながら、４℃で２時間インキュベートする。次にチューブを４０００ＲＰＭ（３２９７×Ｇ）で１５分間遠心分離して、プロテインＧセファロースをペレット化する。上清を注意深く取り出して捨てる。１ｍＬの４℃アッセイ緩衝液で３回洗浄した後、ペレットをＷａｌｌａｃ Ｗｉｚａｒｄガンマカウンタでカウントする。次に結果を解析し、最大結合値の５０％に達するのに要求される希釈を計算する。
【０２１５】
Ｃ．ペプチドのＩＣ５０決定
ペプチドＩのＩＣ５０を決定するために、ペプチドの１００μＬ希釈系列を、１００μＬの組換えエリスロポエチン受容体（１００ｐｇ／チューブ）と、１２×７５ｍｍポリプロピレン試験管中で混合する。次に、１００μＬのヨウ素化組換えヒトエリスロポエチン（１２５Ｉ−ＥＰＯ）を各チューブに加え、チューブに蓋をして、４℃で終夜、穏やかに混合する。
【０２１６】
翌日、結合している１２５Ｉ−ＥＰＯを上述のように定量する。結果を解析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）のＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン４．０を使ってＩＣ５０値を算出する。合計３回又はそれ以上反復してＩＣ５０を決定するために、各被験ペプチドごとに、アッセイを２回又はそれ以上繰り返す。
【表２】
2010536858.tif 000074
【実施例４】
【０２１７】
インビボ活性アッセイ
この実施例では、本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの活性及び力価を評価するのに役立つ種々のインビボアッセイを説明する。ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドダイマーは実施例１又は実施例２に記載の方法に従って製造される。これらのペプチドモノマー及びダイマーのインビボ活性は、低酸素多血マウスバイオアッセイ及び網状赤血球アッセイを含む一連のアッセイを使って評価される。これら２つのアッセイを以下にさらに詳しく説明する。
【０２１８】
１．低酸素多血マウスバイオアッセイ
試験ペプチドのインビボ活性を、Cotes and Bangham (1961), Nature 191:1065-1067に記載の方法を改変した低酸素多血マウスバイオアッセイでアッセイする。このアッセイでは、ＥＰＯミメティックとして機能する（すなわちＥＰＯ−Ｒを活性化して新しい赤血球合成を誘導する）試験ペプチドの能力を調べる。赤血球合成は、合成された赤血球のヘモグロビンへの放射標識鉄の取り込みに基づいて定量される。
【０２１９】
ＢＤＦ１マウスを、７〜１０日間、周囲条件に順応させる。体重を全ての動物について決定し、低体重の動物（＜１５グラム）は使用しない。マウスを、計１４日間にわたって、低圧室での逐次的条件付けサイクルに供する。各２４時間サイクルは、０．４０±０．０２％大気圧での１８時間と、周囲圧での６時間とからなる。条件付けの後、投薬に先だってさらに７２時間は、マウスを周囲圧に維持する。
【０２２０】
試験ペプチド又は組換えヒトＥＰＯ標準をＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ溶剤（ＰＢＳ／ＢＳＡ）で希釈する。ペプチドモノマー原液を、まずジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈する。陰性対照群には、ＰＢＳ／ＢＳＡのみを注射した１マウス群と、１％ＤＭＳＯを注射した１マウス群を含める。各用量群は１０匹のマウスを含む。マウスに、０．５ｍＬの適する試料を皮下（首筋）注射する。
【０２２１】
試料注射の４８時間後に、マウスに、用量が約０．７５マイクロキュリー／マウスになるように、０．２ｍｌのＦｅ５９（Ｄｕｐｏｎｔ，ＮＥＮ）の腹腔内注射を施す。マウスの体重をＦｅ５９投与の２４時間後に決定し、Ｆｅ５９投与の４８時間後にマウスを屠殺する。血液を各動物から心臓穿刺によって収集し、ヘマトクリットを決定する（ヘパリンを抗凝固剤として使用した）。Ｐａｃｋａｒｄガンマカウンターを使って、各血液試料（０．２ｍｌ）をＦｅ５９の取り込みについて解析する。非応答マウス（すなわち放射能取り込み量が陰性対照群よりも少ないマウス）は適正データセットから除外する。陰性対照群の５３％未満のヘマトクリット値を有するマウスも除外する。
【０２２２】
結果は、各実験用量ごとに１０匹のセットから導かれる。各群から得た血液試料に取り込まれた放射能の平均量［カウント毎分（ＣＰＭ）］を計算する。
【０２２３】
２．網状赤血球アッセイ
正常ＢＤＦ１マウスに、３日間連続して、ＥＰＯ対照又は試験ペプチドのいずれかを投薬する（０．５ｍＬ、皮下注射）。３日目にはマウスに鉄デキストラン（１００ｍｇ／ｍｌ）も投薬する（０．１ｍＬ、腹腔内注射）。５日目にマウスをＣＯ２で麻酔し、心臓穿刺によって採血する。各血液試料について、網状赤血球のパーセント（％）を、チアゾールオレンジ染色及びフローサイトメータ解析（網状赤血球数プログラム）によって決定する。ヘマトクリットを手作業で決定する。補正された網状赤血球のパーセントは、次の式を使って決定される：
％ＲＥＴＩＣ補正＝％ＲＥＴＩＣ実測値×（ヘマトクリット個体／ヘマトクリット正常）。
【０２２４】
３．血液学的アッセイ
正常ＣＤ１マウスに、ＥＰＯ陽性対照、試験ペプチド、又は溶剤のいずれかを、４回の週１回静脈内ボーラス注射で投薬する。製剤中の活性化合物濃度を変化させることによって、ある範囲の陽性対照用量及び試験ペプチド用量（ｍｇ／ｋｇで表したもの）を試験する。注射体積は５ｍｌ／ｋｇである。溶剤対照群は１２匹からなり、残りの用量群はそれぞれ８匹である。毎日の生存率と、週ごとの体重とを記録する。
【０２２５】
１日目（溶剤対照マウスの場合）並びに１５日目及び２９日目（４匹／群／日）に、投薬したマウスを絶食させてから、イソフルランを吸入させて麻酔し、心臓穿刺又は腹部大動脈穿刺によって最終血液試料を収集する。血液をＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ブランドのチューブに移す。好ましい抗凝固剤はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【０２２６】
当分野で周知の自動臨床分析機器（例えばＣｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．製のもの）を使って、赤血球の合成及び生理機能を測定するエンドポイント、例えばヘマトクリット（Ｈｃｔ）、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）及び総赤血球数（ＲＢＣ）について、血液試料を評価する。
【実施例５】
【０２２７】
アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有するペプチドモノマーのＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドホモダイマーの合成
ステップ１−ペプチドモノマーの合成：ペプチドモノマーは、標準的なＦｍｏｃケミストリを使用し、ＡＢＩ４３１Ａペプチド合成装置で、ＴＧ−ＲＡＭ樹脂（０．１８ｍｍｏｌ／ｇ、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、ドイツ）を使って合成される。アミド化されたカルボキシ末端を有するペプチドモノマーを合成するために、完全に組み立てられたペプチドを、樹脂から、８２．５％ＴＦＡ、５％水、６．２５％アニソール、６．２５％エタンジチオールを使って切断する。脱保護された生成物を樹脂から濾過し、ジエチルエーテルで沈殿させる。十分に乾燥した後、生成物を、Ｃ１８逆相高速液体クロマトグラフィにより、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル／水の勾配で精製する。ペプチドの構造をエレクトロスプレイ質量分析法で確認する。ペプチドを、ＤＭＳＯ：水の１：１溶液に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解することにより、ジスルフィド形成を達成する。生成物を、Ｃ１８逆相高速液体クロマトグラフィにより、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル／水の勾配で精製する。このペプチドモノマーは次のように図解することができる：
【化７２】
2010536858.tif 000075
【０２２８】
ステップ２−三官能性リンカーの合成：１００ｍＬのＤＣＭに溶解したジエチルイミノアセテート（１０．０ｇ、５２．８ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ−ベータ−アラニン（１０．０ｇ、５２．８ｍｍｏｌ）に、ジイソプロピルカルボジイミド（８．０ｍＬ、５１．１ｍｍｏｌ）を、室温で、１０分かけて加えた。反応混合物は添加中に最大約１０度温まった後、２０分かけて室温まで冷めた。反応混合物を終夜撹拌しておき、沈殿したジイソプロピルウレアを濾去した。溶媒を減圧下で除去してゴム質とし、残渣をエチルアセテートに溶解して、再び濾過することにより、沈殿したウレアをさらに除去した。有機相を分液漏斗に入れ、洗浄し（飽和ＮａＨＣＯ３、ブライン、０．５Ｎ ＨＣｌ、ブライン）、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮することにより、ジエステル生成物を無色の油状物として得た。そのジエステルを、ＭｅＯＨ：ＴＨＦの１：１混合物（１００ｍＬ）にとり、これに水（２５ｍＬ）を加えてから、ＮａＯＨ（５ｇ、１２５ｍｍｏｌ）を加えた。ｐＨは＞１０と測定された。反応混合物を室温で２時間撹拌した後、６Ｎ ＨＣｌでｐＨ１に酸性化した。水相をＮａＣｌで飽和させ、エチルアセテートで４回抽出した。合わせた有機相を洗浄し（ブライン）、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して、白色半固体を得た。その固体を５０ｍＬのＤＣＭに溶解し、これに３００ｍＬのヘキサンを加えたところ、白色スラリーが生成した。溶媒を減圧下で除去することにより、二酸を白色固体として得た（１４．７ｇ、２ステップで収率９１．５％）。２０ｍＬのＤＭＦに溶解した二酸（１ｇ、３．２９ｍｍｏｌ）に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（７７０ｍｇ、６．６９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルカルボジイミド（１．００ｍＬ、６．３８ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（３ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を終夜撹拌し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をエチルアセテートにとり、沈殿したウレアを除去するために濾過した。有機相を分液漏斗に入れ、洗浄し（飽和ＮａＨＣＯ３、ブライン、０．５Ｎ ＨＣｌ、ブライン）、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮することにより、ジ-ＮＨＳエステル生成物を白色固体として得た（１．１２ｇ、収率６８％）。
【化７３】
2010536858.tif 000076
【０２２９】
ステップ３−ペプチドモノマーへの三官能性リンカーのカップリング：リンカーへのカップリングのために、２当量のペプチドを乾燥ＤＭＦ中で１当量の三官能性リンカーと混合して透明な溶液を得て、２分後に５当量のＤＩＥＡを加える。その混合物を周囲温度で１４時間撹拌する。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を８０％ＴＦＡ／ＤＣＭに３０分間溶解することによってＢｏｃ基を除去した後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで精製する。ダイマーの構造をエレクトロスプレイ質量分析法によって確認する。このカップリング反応により、リンカーは、各モノマーのリジン残基のε−アミノ基の窒素原子に取付けられる。このプロセスを配列番号１を使って次に示す。
【化７４】
2010536858.tif 000077
【０２３０】
ステップ４−ペプチドダイマーのＰＥＧ化：
カルバメート結合を介したＰＥＧ化：ペプチドダイマーを等量（モルベース）の活性化ＰＥＧ種（日油株式会社（日本）のｍＰＥＧ−ＮＰＣ）と乾燥ＤＭＦ中で混合して、透明な溶液を得る。５分後に４当量のＤＩＥＡを上記の溶液に加える。その混合物を周囲温度で１４時間撹拌した後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで精製する。ＰＥＧ化ペプチドの構造をＭＡＬＤＩ質量で確認する。精製ペプチドを、以下に概説する陽イオン交換クロマトグラフィによる精製にも供した。このｍＰＥＧ−ＮＰＣ ＰＥＧ化を、次のスキームに、配列番号１を使って示す。
【化７５】
2010536858.tif 000078
【０２３１】
アミド結合を介したＰＥＧ化：ペプチドダイマーを等量（モルベース）の活性化ＰＥＧ種（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ（米国）のＰＥＧ−ＳＰＡ−ＮＨＳ）と乾燥ＤＭＦ中で混合して、透明な溶液を得る。５分後に１０当量のＤＩＥＡを上記の溶液に加える。その混合物を周囲温度で２時間撹拌した後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで精製する。ＰＥＧ化ペプチドの構造はＭＡＬＤＩ質量で確認した。精製ペプチドを以下に概説する陽イオン交換クロマトグラフィによる精製にも供した。このＰＥＧ−ＳＰＡ−ＮＨＳ ＰＥＧ化を、次のスキームに、配列番号１を使って示す。
【化７６】
2010536858.tif 000079
【０２３２】
ステップ５：ペプチドのイオン交換精製：いくつかの交換支持体を、出発ダイマーペプチドを保持するその能力に加えて、上記ペプチド−ＰＥＧコンジュゲートを未反応の（又は加水分解された）ＰＥＧから分離するその能力について調査した。イオン交換樹脂（２〜３ｇ）を１ｃｍカラムに充填した後、ナトリウム型に変換し（溶出液がｐＨ１４になるまで０．２Ｎ ＮａＯＨをカラムにロード、約５カラム体積）、次に水素型に変換し（溶出液がロードのｐＨと一致するまで０．１Ｎ ＨＣｌ又は０．１Ｍ ＨＯＡｃのいずれかで溶出、約５カラム体積）、次にｐＨ６になるまで、２５％ＡＣＮ／水で洗浄した。コンジュゲーション前のペプチド又はペプチド−ＰＥＧコンジュゲートを２５％ＡＣＮ／水に溶解し（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＴＦＡでｐＨを＜３に調節してから、カラムにロードした。２〜３カラム体積の２５％ＡＣＮ／水で洗浄して、５ｍＬ画分を集めた後、２５％ＡＣＮ／水中の０．１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃによる溶離で、再び５ｍL画分を集めながら、ペプチドをカラムから放出させた。ＨＰＬＣで解析したところ、どの画分が所望のペプチドを含有しているかが明らかになった。エバポレイティブ光散乱検出器（ＥＬＳＤ）で解析したところ、ペプチドがカラム上に保持されてＮＨ４ＯＡｃ溶液で溶出（一般に画分４と画分１０の間）させた場合は、夾雑物として非コンジュゲートＰＥＧが観察されないことが示された。ペプチドが最初の洗浄緩衝液（一般に最初の２画分）中に溶出した場合、所望のＰＥＧコンジュゲートと過剰のＰＥＧとの分離は観察されなかった。
【０２３３】
次に挙げるカラムは、ペプチドとペプチド−ＰＥＧコンジュゲートをどちらもうまく保持し、ペプチド−ＰＥＧコンジュゲートを非コンジュゲートペプチドからうまく精製した。
【表３】
2010536858.tif 000080
【実施例６】
【０２３４】
アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有するペプチドモノマーのＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドホモダイマーの合成
アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有するペプチドモノマーのＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドホモダイマーを、ステップ１において、合成されるペプチドモノマーが、（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）である点以外は、実施例１で述べたとおりに合成する。
【０２３５】
ＰＥＧをカルバメート結合でリンカーに取付ける場合、配列番号２を使ったこの合成の最終生成物は、その構造を次のように図解することができる。
【化７７】
2010536858.tif 000081
【０２３６】
ＰＥＧをアミド結合でリンカーに取付ける場合、配列番号２を使ったこの合成の最終生成物は、その構造を次のように図解することができる。
【化７８】
2010536858.tif 000082
【実施例７】
【０２３７】
インビトロ活性アッセイ
この実施例では、本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの活性及び力価の評価に役立つ種々のインビトロアッセイを説明する。これらのアッセイの結果によって、本発明の新規ペプチドがＥＰＯ−Ｒに結合してＥＰＯ−Ｒシグナリングを活性化することが証明される。さらにまた、これらのアッセイの結果から、新規ペプチド組成物は、今までに記載されたＥＰＯミメティックペプチドと比較して、ＥＰＯ−Ｒ結合アフィニティ及び生物学的活性に驚くべき増加を示すことがわかる。
【０２３８】
実施例１又は実施例２に記載の方法に従ってＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドモノマー及びダイマーを製造する。これらのペプチドダイマーの力価は、レポータアッセイ、増殖アッセイ、競合結合アッセイ、及びＣ／ＢＦＵ−ｅアッセイを含む一連のインビトロ活性アッセイを使って評価される。これら４つのアッセイを以下にさらに詳しく説明する。
【０２３９】
これらインビトロ活性アッセイの結果を表２に要約する。
【０２４０】
１．レポータアッセイ
このアッセイは、マウスプレＢ細胞株由来のレポータ細胞Ｂａｆ３／ＥｐｏＲ／ＧＣＳＦＲ ｆｏｓ／ｌｕｘに基づく。このレポータ細胞株は、ヒトＧＣＳＦ受容体の細胞内部分に融合したヒトＥＰＯ受容体の細胞外部分を含むキメラ受容体を発現させる。この細胞株には、さらに、ｆｏｓプロモーター駆動のルシフェラーゼレポータ遺伝子コンストラクトがトランスフェクトされる。赤血球生成剤の添加によるこのキメラ受容体の活性化は、ルシフェラーゼレポータ遺伝子の発現をもたらし、したがってルシフェラーゼ基質ルシフェリンを添加した時には、光の生成をもたらす。こうして、そのような細胞におけるＥＰＯ−Ｒ活性化のレベルは、ルシフェラーゼ活性の測定によって定量することができる。
【０２４１】
Ｂａｆ３／ＥｐｏＲ／ＧＣＳＦＲ ｆｏｓ／ｌｕｘ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％ＷＥＨＩ−３上清（ＷＥＨＩ−３細胞、ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−６８の培養物から得た上清）、及びペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養される。アッセイの約１８時間前に、１０％ＦＢＳ及び０．１％ＷＥＨＩ−３上清を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に細胞を移すことによって、細胞を飢餓状態にする。アッセイの日に、１０％ＦＢＳを補足した（ＷＥＨＩ−３上清なしの）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で細胞を１回洗浄し、次に１０％ＦＢＳを補足した（ＷＥＨＩ−３上清なしの）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、既知濃度の試験ペプチドの存在下で、又は陽性対照としてのＥＰＯ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）と共に、１×１０6細胞／ｍＬを培養する。このアッセイでは、試験ペプチドの希釈系列が同時に試験される。アッセイプレートを５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で４時間インキュベートした後、ルシフェリン（Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ；Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を各ウェルに加える。５分間のインキュベーション後に、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．、イリノイ州ダウナーズグローブ）で、発光を測定する。光カウントを試験ペプチド濃度に対してプロットし、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄソフトウェアを使って解析する。最大半量の発光をもたらす試験ペプチドの濃度をＥＣ５０として記録する。
【０２４２】
２．増殖アッセイ
このアッセイは、ヒトＥＰＯ−Ｒを発現するようにトランスフェクトされたマウスプレＢ細胞株Ｂａｆ３に基づく。その結果生じる細胞株ＢａＦ３／Ｇａｌ４／Ｅｌｋ／ＥＰＯＲの増殖はＥＰＯ−Ｒ活性化に依存する。細胞増殖の程度をＭＴＴを使って定量する。この場合、ＭＴＴアッセイにおけるシグナルは生細胞の数に比例する。
【０２４３】
ＢａＦ３／Ｇａｌ４／Ｅｌｋ／ＥＰＯＲ細胞を、スピナーフラスコ中、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及び２％ＷＥＨＩ−３上清（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−６８）を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養する。培養細胞を、スピナーフラスコ中、１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度において、１０％ＦＢＳ及び０．１％ＷＥＨＩ−３上清を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で、終夜、飢餓状態に置く。次に、飢餓細胞をダルベッコＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄し、１０％ＦＢＳを補足した（ＷＥＨＩ−３上清なしの）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に再懸濁して、密度を１×１０６細胞／ｍｌにする。次に、５０μＬ（約５０，０００細胞）ずつの細胞懸濁液を、９６穴アッセイプレートに、３つ一組にして播種する。１０％ＦＢＳを補足した（ＷＥＨＩ−３上清Ｉなしの）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、５０μＬずつの試験ＥＰＯミメティックペプチドの希釈系列、又は５０μＬのＥＰＯ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）若しくはＡｒａｎｅｓｐ（商標）（ダルベポエチンα、Ａｍｇｅｎから市販されているＥＰＯ−Ｒアゴニスト）を、９６穴アッセイプレートに加える（最終ウェル液量１００μＬ）。例えば、試験ペプチド（又は対照ＥＰＯペプチド）の最終濃度が８１０ｐＭ〜０．００４５ｐＭの範囲にわたる１２個の異なる希釈液を試験することができる。次に、播種した細胞を、３７℃で４８時間インキュベートする。次に、１０μＬのＭＴＴ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を各培養皿ウェルに加えてから、４時間インキュベートしておく。次に、１０％ＳＤＳ＋０．０１Ｎ ＨＣｌを加えることによって、反応を停止させる。次に、プレートを３７℃で終夜、インキュベートする。次に、５９５ｎｍの波長における各ウェルの吸光度を分光測光法で測定する。吸光度の読み 対 試験ペプチド濃度のプロットを構築し、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄソフトウェアを使ってＥＣ５０を計算する。最大半量の吸光度をもたらす試験ペプチドの濃度をＥＣ５０として記録する。
【０２４４】
３．競合結合アッセイ
競合結合計算は、光シグナルが２つのビーズ（すなわち、ビオチン化ＥＰＯ−Ｒ結合ペプチドトレーサを保持するストレプトアビジンドナービーズと、ＥＰＯ−Ｒが結合しているアクセプタビーズ）の近接の関数として生成するアッセイを使って行なわれる。光は、光の照射時に一重項酸素が第１ビーズから放出され、放出された一重項酸素との接触が第２ビーズの発光を引き起こすという、無放射エネルギー移動によって生成する。これらのビーズセットは市販されている（Ｐａｃｋａｒｄ）。ビーズの近接は、ＥＰＯ−ＲへのＥＰＯ−Ｒ結合ペプチドトレーサの結合によって生じる。ＥＰＯ−Ｒへの結合に関してＥＰＯ−Ｒ結合ペプチドトレーサと競合する試験ペプチドはこの結合を妨げることになり、発光の減少を引き起こす。
【０２４５】
さらに詳しく述べると、この方法は次のとおりである。４μＬの試験ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの希釈系列、又は陽性若しくは陰性対照を、３８４穴プレートのウェルに加える。次に２μＬ／ウェルの受容体／ビーズカクテルを加える。受容体ビーズカクテルは、１５μＬの５ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンドナービーズ（Ｐａｃｋａｒｄ）、１５μＬの５ｍｇ／ｍｌモノクローナル抗体ａｂ１７９（この抗体は組換えＥＰＯ−Ｒに含まれるヒト胎盤アルカリホスファターゼタンパク質の一部を認識する）、プロテインＡ被覆アクセプタビーズ（プロテインＡはａｂ１７９抗体に結合することになる；Ｐａｃｋａｒｄ）、１１２．５μLの、組換えＥＰＯ−Ｒ（チャイニーズハムスター卵巣細胞中で、ａｂ１７９ターゲットエピトープを含有するヒト胎盤アルカリホスファターゼタンパク質の一部に融合された融合タンパク質として生産されるもの）の１：６．６希釈液、及び６０７．５μＬのＡｌｐｈａｑｕｅｓｔ緩衝液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．１％ＢＳＡ、０．０５％ツィーン２０）からなる。タッピングして混合する。２μＬ／ウェルのビオチン化ＥＰＯ−Ｒ結合ペプチドトレーサを加える（３０ｎＭの最終濃度）。ペプチドトレーサＥＰＯ−Ｒ結合ペプチド（表の「レポータＥＣ５０（ｐＭ）」を参照）は、実施例１に記載の方法に従って、配列番号４を使って作製される。
【化７９】
2010536858.tif 000083
【０２４６】
混合するために１分間遠心分離する。プレートをＰａｃｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｓｅａｌで封止し、ホイルで包む。室温で終夜インキュベートする。１８時間後にＡｌｐｈａＱｕｅｓｔリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ）を使って発光を読む。発光対ペプチド濃度をプロットし、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ又はＥｘｃｅｌで解析する。
【０２４７】
試験ペプチドなしで観察される発光と比較して発光を５０％減少させる試験ペプチドの濃度を、ＩＣ５０として記録する。
【０２４８】
４．Ｃ／ＢＦＵ−ｅアッセイ
ＥＰＯ−Ｒシグナリングは、増殖する赤血球前駆体への骨髄幹細胞の分化を刺激する。このアッセイは初代ヒト骨髄多能性幹細胞からの赤血球前駆体の増殖及び分化を刺激する試験ぺプチドの能力を測定する。
【０２４９】
このアッセイのために、試験ペプチドの希釈系列を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補足したＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中に調製する。次に、これらの希釈系列、又は陽性対照ＥＰＯペプチドを、メチルセルロースに加えて最終体積を１．５ｍＬにする。次に、そのメチルセルロース及びペプチド混合物を十分にボルテックスする。ヒト骨髄由来ＣＤ３４＋細胞（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ／Ｃａｍｂｒｅｘ）のアリコート（１００，０００細胞／ｍＬ）を解凍する。解凍した細胞を５０ｍＬチューブ中の０．１ｍＬの１ｍｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）に静かに加える。次に、４０〜５０ｍＬのＩＭＤＭ培地を細胞に静かに加える。すなわち培地は、最初の１０ｍＬを５０ｍＬチューブの側面に沿って１滴ずつ加えた後、残りの培地をチューブの側面に沿ってゆっくりと分注する。次に細胞を９００ｒｐｍで２０分間遠心し、培地を静かに吸引することにより、注意深く除去する。細胞を１ｍｌのＩＭＤＭ培地に再懸濁し、１ｍＬあたりの細胞密度を血球計盤スライドでカウントする（スライド上に１０μＬの細胞懸濁液、細胞密度は平均数×１０，０００細胞／ｍｌである）。次に、細胞をＩＭＤＭ培地に希釈して、細胞密度を１５，０００細胞／ｍＬにする。次に、１００μＬの希釈細胞を各１．５ｍＬのメチルセルロース＋ペプチド試料に加え（アッセイ培地中の最終細胞濃度は１，０００細胞／ｍＬである）、その混合物をボルテックスする。混合物中の気泡を消失させた後、鈍針を使って１ｍＬ吸引する。各試料から得た０．２５ｍＬの吸引混合物を、２４穴プレート（Ｆａｌｃｏｎブランド）の４つのウェルのそれぞれに加える。播種した混合物を、湿潤培養器中、５％ＣＯ２下、３７℃で、１４日間インキュベートする。位相差顕微鏡（対物５×〜１０×、最終倍率１００×）を使って、赤血球系コロニーの存在についてスコア化する。形成されるコロニーの数が、ＥＰＯ陽性対照を使って観察される値との比較で、最大の９０％になる試験ペプチドの濃度を、ＥＣ９０として記録する［表２：Ｃ／ＢＦＵ−ｅ ＥＣ９０参照］。
【表４】
2010536858.tif 000084
【実施例８】
【０２５０】
インビボ活性アッセイ
この実施例では、本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの活性及び力価を評価するのに役立つ種々のインビボアッセイを説明する。ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドモノマー及びダイマーは実施例１に記載の方法に従って製造される。これらペプチドモノマー及びダイマーのインビボ活性は、低酸素多血マウスバイオアッセイ及び網状赤血球アッセイを含む一連のアッセイを使って評価される。これら２つのアッセイを以下にさらに詳しく説明する。
【０２５１】
１．低酸素多血マウスバイオアッセイ
試験ペプチドのインビボ活性を、Cotes and Bangham (1961), Nature 191:1065-1067に記載の方法を改変した低酸素多血マウスバイオアッセイでアッセイする。このアッセイでは、ＥＰＯミメティックとして機能する（すなわちＥＰＯ−Ｒを活性化して新しい赤血球合成を誘導する）試験ペプチドの能力を調べる。赤血球合成は、合成された赤血球のヘモグロビンへの放射標識鉄の取り込みに基づいて定量される。
【０２５２】
ＢＤＦ１マウスを、７〜１０日間、周囲条件に順応させる。体重を全ての動物について決定し、低体重の動物（＜１５グラム）は使用しない。マウスを、計１４日間にわたって、低圧室での逐次的条件付けサイクルに供する。各２４時間サイクルは、０．４０±０．０２％大気圧での１８時間と、周囲圧での６時間とからなる。条件付けの後、投薬に先だってさらに７２時間は、マウスを周囲圧に維持する。
【０２５３】
試験ペプチド又は組み換えヒトＥＰＯ標準をＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ溶剤（ＰＢＳ／ＢＳＡ）で希釈する。ペプチドモノマー原液を、まずジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で可溶化する。陰性対照群には、ＰＢＳ／ＢＳＡのみを注射した１マウス群と、１％ＤＭＳＯを注射した１マウス群を含める。各用量群は１０匹のマウスを含む。マウスに、０．５ｍＬの適当な試料を皮下（首筋）注射する。
【０２５４】
試料注射の４８時間後に、マウスに、用量が約０．７５マイクロキュリー／マウスになるように、０．２ｍｌのＦｅ５９（Ｄｕｐｏｎｔ，ＮＥＮ）の腹腔内注射を施す。マウスの体重をＦｅ５９投与の２４時間後に決定し、Ｆｅ５９投与の４８時間後にマウスを屠殺する。血液を各動物から心臓穿刺によって収集し、ヘマトクリットを決定する（ヘパリンを抗凝固剤として使用した）。Ｐａｃｋａｒｄガンマカウンターを使って、各血液試料（０．２ｍｌ）をＦｅ５９の取り込みについて解析する。非応答マウス（すなわち放射能取り込み量が陰性対照群よりも少ないマウス）は適正データセットから除外する。陰性対照群の５３％未満のヘマトクリット値を有するマウスも除外する。
【０２５５】
結果は、各実験用量ごとに１０匹のセットから導かれる。各群から得た血液試料に取り込まれた放射能の平均量［カウント毎分（ＣＰＭ）］を計算する。
【０２５６】
２．網状赤血球アッセイ
正常ＢＤＦ１マウスに、３日間連続して、ＥＰＯ対照又は試験ペプチドのいずれかを投薬する（０．５ｍＬ、皮下注射）。３日目にはマウスに鉄デキストラン（１００ｍｇ／ｍｌ）も投薬する（０．１ｍＬ、腹腔内注射）。５日目にマウスをＣＯ２で麻酔し、心臓穿刺によって採血する。各血液試料について、網状赤血球のパーセント（％）を、チアゾールオレンジ染色及びフローサイトメータ解析（網状赤血球数プログラム）によって決定する。ヘマトクリットを手作業で決定する。補正された網状赤血球のパーセントは、次の式を使って決定される：
％ＲＥＴＩＣ補正＝％ＲＥＴＩＣ実測値×（ヘマトクリット個体／ヘマトクリット正常）。
【０２５７】
３．血液学的アッセイ
正常ＣＤ１マウスに、ＥＰＯ陽性対照、試験ペプチド、又は溶剤のいずれかを、４回の週１回静脈内ボーラス注射で投薬する。製剤中の活性化合物濃度を変化させることによって、ある範囲の陽性対照用量及び試験ペプチド用量（ｍｇ／ｋｇで表したもの）を試験する。注射体積は５ｍｌ／ｋｇである。溶剤対照群は１２匹からなり、残りの用量群はそれぞれ８匹である。毎日の生存率と、週ごとの体重とを記録する。
【０２５８】
１日目（溶剤対照マウスの場合）並びに１５日目及び２９日目（４匹／群／日）に、投薬したマウスを絶食させてから、イソフルランを吸入させて麻酔し、心臓穿刺又は腹部大動脈穿刺によって最終血液試料を収集する。血液をＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ブランドのチューブに移す。好ましい抗凝固剤はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【０２５９】
当分野で周知の自動臨床分析機器（例えばＣｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．製のもの）を使って、赤血球の合成及び生理機能を測定するエンドポイント、例えばヘマトクリット（Ｈｃｔ）、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）及び総赤血球数（ＲＢＣ）について、血液試料を評価する。
【実施例９】
【０２６０】
アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ（配列番号１）を有するペプチドモノマーのＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドホモダイマーの合成
ステップ１−ペプチドモノマーの合成：ペプチドモノマーは、標準的なＦｍｏｃケミストリを使用し、ＡＢＩ４３１Ａペプチド合成装置で、ＴＧ−ＲＡＭ樹脂（０．１８ｍｍｏｌ／ｇ、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、ドイツ）を使って合成される。アミド化されたカルボキシ末端を有するペプチドモノマーを合成するために、完全に組み立てられたペプチドを、樹脂から、８２．５％ＴＦＡ、５％水、６．２５％アニソール、６．２５％エタンジチオールを使って切断する。脱保護された生成物を樹脂から濾過し、ジエチルエーテルで沈殿させる。十分に乾燥した後、生成物を、Ｃ１８逆相高速液体クロマトグラフィにより、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル／水の勾配で精製する。ペプチドの構造をエレクトロスプレイ質量分析法で確認する。このペプチドモノマーは次のように図解することができる：
（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲＫ−ＮＨ２（配列番号１）。
【０２６１】
ステップ２−三官能性リンカーの合成：１００ｍＬのＤＣＭに溶解したジエチルイミノアセテート（１０．０ｇ、５２．８ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ−ベータ−アラニン（１０．０ｇ、５２．８ｍｍｏｌ）に、ジイソプロピルカルボジイミド（８．０ｍＬ、５１．１ｍｍｏｌ）を、室温で、１０分かけて加えた。反応混合物は添加中に最大約１０度温まった後、２０分かけて室温まで冷めた。反応混合物を終夜撹拌しておき、沈殿したジイソプロピルウレアを濾去した。溶媒を減圧下で除去してゴム質とし、残渣をエチルアセテートに溶解して、再び濾過することにより、沈殿したウレアをさらに除去した。有機相を分液漏斗に入れ、洗浄し（飽和ＮａＨＣＯ３、ブライン、０．５Ｎ ＨＣｌ、ブライン）、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮することにより、ジエステル生成物を無色の油状物として得た。そのジエステルを、ＭｅＯＨ：ＴＨＦの１：１混合物（１００ｍＬ）にとり、これに水（２５ｍＬ）を加えてから、ＮａＯＨ（５ｇ、１２５ｍｍｏｌ）を加えた。ｐＨは＞１０と測定された。反応混合物を室温で２時間撹拌した後、６Ｎ ＨＣｌでｐＨ１に酸性化した。水相をＮａＣｌで飽和させ、エチルアセテートで４回抽出した。合わせた有機相を洗浄し（ブライン）、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮して、白色半固体を得た。その固体を５０ｍＬのＤＣＭに溶解し、これに３００ｍＬのヘキサンを加えたところ、白色スラリーが生成した。溶媒を減圧下で除去することにより、二酸を白色固体として得た（１４．７ｇ、２ステップで収率９１．５％）。２０ｍＬのＤＭＦに溶解した二酸（１ｇ、３．２９ｍｍｏｌ）に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（７７０ｍｇ、６．６９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルカルボジイミド（１．００ｍＬ、６．３８ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（３ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を終夜撹拌し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をエチルアセテートにとり、沈殿したウレアを除去するために濾過した。有機相を分液漏斗に入れ、洗浄し（飽和ＮａＨＣＯ３、ブライン、０．５Ｎ ＨＣｌ、ブライン）、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、減圧下で濃縮することにより、ジ-ＮＨＳエステル生成物を白色固体として得た（１．１２ｇ、収率６８％）。
【化８０】
2010536858.tif 000085
【０２６２】
ステップ３−ペプチドモノマーへの三官能性リンカーのカップリング：リンカーへのカップリングのために、２当量のペプチドを乾燥ＤＭＦ中で１当量の三官能性リンカーと混合して透明な溶液を得て、２分後に５当量のＤＩＥＡを加える。その混合物を周囲温度で１４時間撹拌する。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を８０％ＴＦＡ／ＤＣＭに３０分間溶解することによってＢｏｃ基を除去した後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで精製する。ダイマーの構造をエレクトロスプレイ質量分析法によって確認する。このカップリング反応により、リンカーは、各モノマーのリジン残基のε−アミノ基の窒素原子に取付けられる。配列番号１を使ったカップリングを次に示す。
【化８１】
2010536858.tif 000086
【０２６３】
ステップ４−リジンによって連結された２つの線状ＰＥＧ鎖を含むＰＥＧ部分の合成
ｍＰＥＧ２−リシノール−ＮＰＣ
リシノール（市販品を入手することができる）を過剰のｍＰＥＧ２−ＮＰＣで処理することで、ＭＰＥＧ２−リシノールとし、次にそれをＮＰＣと反応させることで、ｍＰＥＧ２−リシノール−ＮＰＣを形成させる。
【０２６４】
ｍＰＥＧ２−Ｌｙｓ−ＮＨＳ
この生成物は、例えばＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（アラバマ州３５８０６ハンツビル、ディスカバリドライブ４９０）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇカタログ（２００３）から（品番アイテム番号２Ｚ３Ｘ０Ｔ０１）、市販品を入手することができる。
【０２６５】
ステップ５−ペプチドダイマーのＰＥＧ化：
カルバメート結合を介したＰＥＧ化：
ペプチドダイマー及びＰＥＧ種（ｍＰＥＧ２−リシノール−ＮＰＣ）を、乾燥ＤＭＦ中、１：２のモル比で混合して、透明な溶液を得る。５分後に４当量のＤＩＥＡを上記の溶液に加える。その混合物を周囲温度で１４時間撹拌した後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで精製する。ＰＥＧ化ペプチドの構造をＭＡＬＤＩ質量で確認する。精製ペプチドを、以下に概説する陽イオン交換クロマトグラフィによる精製にも供した。ｍＰＥＧ−リシノール−ＮＰＣを使ったＰＥＧ化を、次のスキームに、配列番号１を使って示す。
【化８２】
2010536858.tif 000087
【０２６６】
アミド結合を介したＰＥＧ化：
ペプチドダイマー及びＰＥＧ種（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ（米国）のｍＰＥＧ２−Ｌｙｓ−ＮＨＳ）を、乾燥ＤＭＦ中、１：２のモル比で混合して、透明な溶液を得る。５分後に１０当量のＤＩＥＡを上記の溶液に加える。その混合物を周囲温度で２時間撹拌した後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで精製する。ＰＥＧ化ペプチドの構造はＭＡＬＤＩ質量で確認した。精製ペプチドを以下に概説する陽イオン交換クロマトグラフィによる精製にも供した。配列番号１を使用しｍＰＥＧ２−Ｌｙｓ−ＮＨＳを用いるＰＥＧ化を、次のスキームに示す。
【化８３】
2010536858.tif 000088
【０２６７】
ステップ６−ペプチドのイオン交換精製：いくつかの交換支持体を、出発ダイマーペプチドを保持するその能力に加えて、上記ペプチド−ＰＥＧコンジュゲートを未反応の（又は加水分解された）ＰＥＧから分離するその能力について調査した。イオン交換樹脂（２〜３ｇ）を１ｃｍカラムに充填した後、ナトリウム型に変換し（溶出液がｐＨ１４になるまで０．２Ｎ ＮａＯＨをカラムにロード、約５カラム体積）、次に水素型に変換し（溶出液がロードのｐＨと一致するまで０．１Ｎ ＨＣｌ又は０．１Ｍ ＨＯＡｃのいずれかで溶出、約５カラム体積）、次にｐＨ６になるまで、２５％ＡＣＮ／水で洗浄した。コンジュゲーション前のペプチド又はペプチド−ＰＥＧコンジュゲートを２５％ＡＣＮ／水に溶解し（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＴＦＡでｐＨを＜３に調節してから、カラムにロードした。２〜３カラム体積の２５％ＡＣＮ／水で洗浄して、５ｍＬ画分を集めた後、２５％ＡＣＮ／水中の０．１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃによる溶離で、再び５ｍL画分を集めながら、ペプチドをカラムから放出させた。ＨＰＬＣで解析したところ、どの画分が所望のペプチドを含有しているかが明らかになった。エバポレイティブ光散乱検出器（ＥＬＳＤ）で解析したところ、ペプチドがカラム上に保持されてＮＨ４ＯＡｃ溶液で溶出（一般に画分４と画分１０の間）させた場合は、夾雑物として非コンジュゲートＰＥＧが観察されないことが示された。ペプチドが最初の洗浄緩衝液（一般に最初の２画分）中に溶出した場合、所望のＰＥＧコンジュゲートと過剰のＰＥＧとの分離は観察されなかった。
【０２６８】
次に挙げるカラムは、ペプチドとペプチド−ＰＥＧコンジュゲートをどちらもうまく保持し、ペプチド−ＰＥＧコンジュゲートを非コンジュゲートペプチドからうまく精製した。
【表５】
2010536858.tif 000089
【実施例１０】
【０２６９】
アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有するペプチドモノマーのＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドホモダイマーの合成
アミノ酸配列（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）を有するペプチドモノマーのＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドホモダイマーを、ステップ１において、合成されるペプチドモノマーが（ＡｃＧ）ＧＬＹＡＣＨＭＧＰＩＴ（１−ｎａｌ）ＶＣＱＰＬＲ（ＭｅＧ）Ｋ（配列番号２）である点以外は、実施例１で述べたとおりに合成する。
【０２７０】
ＰＥＧをカルバメート結合でスペーサに取付ける場合、配列番号２を使ったこの合成の最終生成物は、その構造を次のように図解することができる。
【化８４】
2010536858.tif 000090
【０２７１】
ＰＥＧをアミド結合でスペーサに取付ける場合、配列番号２を使ったこの合成の最終生成物は、その構造を次のように図解することができる。
【化８５】
2010536858.tif 000091
【実施例１１】
【０２７２】
インビトロ活性アッセイ
この実施例では、本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの活性及び力価の評価に役立つ種々のインビトロアッセイを説明する。これらのアッセイの結果によって、本発明の新規ペプチドがＥＰＯ−Ｒに結合してＥＰＯ−Ｒシグナリングを活性化することが証明される。さらにまた、これらのアッセイの結果から、新規ペプチド組成物は、今までに記載されたＥＰＯミメティックペプチドと比較して、ＥＰＯ−Ｒ結合アフィニティ及び生物学的活性に驚くべき増加を示すことがわかる。
【０２７３】
実施例１又は実施例２に記載の方法に従ってＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドモノマー及びダイマーを製造する。これらのペプチドダイマーの力価は、レポータアッセイ、増殖アッセイ、競合結合アッセイ、及びＣ／ＢＦＵ−ｅアッセイを含む一連のインビトロ活性アッセイを使って評価される。これら４つのアッセイを以下にさらに詳しく説明する。
【０２７４】
これらインビトロ活性アッセイの結果を表２に要約する。
【０２７５】
１．レポータアッセイ
このアッセイは、マウスプレＢ細胞株由来のレポータ細胞Ｂａｆ３／ＥｐｏＲ／ＧＣＳＦＲ ｆｏｓ／ｌｕｘに基づく。このレポータ細胞株は、ヒトＧＣＳＦ受容体の細胞内部分に融合したヒトＥＰＯ受容体の細胞外部分を含むキメラ受容体を発現させる。この細胞株には、さらに、ｆｏｓプロモーター駆動のルシフェラーゼレポータ遺伝子コンストラクトがトランスフェクトされる。赤血球生成剤の添加によるこのキメラ受容体の活性化は、ルシフェラーゼレポータ遺伝子の発現をもたらし、したがってルシフェラーゼ基質ルシフェリンを添加した時には、光の生成をもたらす。こうして、そのような細胞におけるＥＰＯ−Ｒ活性化のレベルは、ルシフェラーゼ活性の測定によって定量することができる。
【０２７６】
Ｂａｆ３／ＥｐｏＲ／ＧＣＳＦＲ ｆｏｓ／ｌｕｘ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％ＷＥＨＩ−３上清（ＷＥＨＩ−３細胞、ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−６８の培養物から得た上清）、及びペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養される。アッセイの約１８時間前に、１０％ＦＢＳ及び０．１％ＷＥＨＩ−３上清を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に細胞を移すことによって、細胞を飢餓状態にする。アッセイの日に、１０％ＦＢＳを補足した（ＷＥＨＩ−３上清なしの）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で細胞を１回洗浄し、次に１０％ＦＢＳを補足した（ＷＥＨＩ−３上清なしの）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、既知濃度の試験ペプチドの存在下で、又は陽性対照としてのＥＰＯ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）と共に、１×１０6細胞／ｍＬを培養する。このアッセイでは、試験ペプチドの希釈系列が同時に試験される。アッセイプレートを５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で４時間インキュベートした後、ルシフェリン（Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ；Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を各ウェルに加える。５分間のインキュベーション後に、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．、イリノイ州ダウナーズグローブ）で、発光を測定する。光カウントを試験ペプチド濃度に対してプロットし、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄソフトウェアを使って解析する。最大半量の発光をもたらす試験ペプチドの濃度をＥＣ５０として記録する。
【０２７７】
２．増殖アッセイ
このアッセイは、ヒトＥＰＯ−Ｒを発現するようにトランスフェクトされたマウスプレＢ細胞株Ｂａｆ３に基づく。その結果生じる細胞株ＢａＦ３／Ｇａｌ４／Ｅｌｋ／ＥＰＯＲの増殖はＥＰＯ−Ｒ活性化に依存する。細胞増殖の程度をＭＴＴを使って定量する。この場合、ＭＴＴアッセイにおけるシグナルは生細胞の数に比例する。
【０２７８】
ＢａＦ３／Ｇａｌ４／Ｅｌｋ／ＥＰＯＲ細胞を、スピナーフラスコ中、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及び２％ＷＥＨＩ−３上清（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−６８）を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養する。培養細胞を、スピナーフラスコ中、１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度において、１０％ＦＢＳ及び０．１％ＷＥＨＩ−３上清を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で、終夜、飢餓状態に置く。次に、飢餓細胞をダルベッコＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄し、１０％ＦＢＳを補足した（ＷＥＨＩ−３上清なしの）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に再懸濁して、密度を１×１０６細胞／ｍｌにする。次に、５０μＬ（約５０，０００細胞）ずつの細胞懸濁液を、９６穴アッセイプレートに、３つ一組にして播種する。１０％ＦＢＳを補足した（ＷＥＨＩ−３上清Ｉなしの）ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、５０μＬずつの試験ＥＰＯミメティックペプチドの希釈系列、又は５０μＬのＥＰＯ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、ミネソタ州ミネアポリス）若しくはＡｒａｎｅｓｐ（商標）（ダルベポエチンα、Ａｍｇｅｎから市販されているＥＰＯ−Ｒアゴニスト）を、９６穴アッセイプレートに加える（最終ウェル液量１００μＬ）。例えば、試験ペプチド（又は対照ＥＰＯペプチド）の最終濃度が８１０ｐＭ〜０．００４５ｐＭの範囲にわたる１２個の異なる希釈液を試験することができる。次に、播種した細胞を、３７℃で４８時間インキュベートする。次に、１０μＬのＭＴＴ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を各培養皿ウェルに加えてから、４時間インキュベートしておく。次に、１０％ＳＤＳ＋０．０１Ｎ ＨＣｌを加えることによって、反応を停止させる。次に、プレートを３７℃で終夜、インキュベートする。次に、５９５ｎｍの波長における各ウェルの吸光度を分光測光法で測定する。吸光度の読み 対 試験ペプチド濃度のプロットを構築し、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄソフトウェアを使ってＥＣ５０を計算する。最大半量の吸光度をもたらす試験ペプチドの濃度をＥＣ５０として記録する。
【０２７９】
３．競合結合アッセイ
競合結合計算は、光シグナルが２つのビーズ（すなわち、ビオチン化ＥＰＯ−Ｒ結合ペプチドトレーサを保持するストレプトアビジンドナービーズと、ＥＰＯ−Ｒが結合しているアクセプタビーズ）の近接の関数として生成するアッセイを使って行なわれる。光は、光の照射時に一重項酸素が第１ビーズから放出され、放出された一重項酸素との接触が第２ビーズの発光を引き起こすという、非放射性エネルギー移動によって生成する。これらのビーズセットは市販されている（Ｐａｃｋａｒｄ）。ビーズの近接は、ＥＰＯ−ＲへのＥＰＯ−Ｒ結合ペプチドトレーサの結合によって生じる。ＥＰＯ−Ｒへの結合に関してＥＰＯ−Ｒ結合ペプチドトレーサと競合する試験ペプチドはこの結合を妨げることになり、発光の減少を引き起こす。
【０２８０】
さらに詳しく述べると、この方法は次のとおりである。４μＬの試験ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの希釈系列、又は陽性若しくは陰性対照を、３８４穴プレートのウェルに加える。次に２μＬ／ウェルの受容体／ビーズカクテルを加える。受容体ビーズカクテルは、１５μＬの５ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンドナービーズ（Ｐａｃｋａｒｄ）、１５μＬの５ｍｇ／ｍｌモノクローナル抗体ａｂ１７９（この抗体は組換えＥＰＯ−Ｒに含まれるヒト胎盤アルカリホスファターゼタンパク質の一部を認識する）、プロテインＡ被覆アクセプタビーズ（プロテインＡはａｂ１７９抗体に結合することになる；Ｐａｃｋａｒｄ）、１１２．５μLの、組換えＥＰＯ−Ｒ（チャイニーズハムスター卵巣細胞中で、ａｂ１７９ターゲットエピトープを含有するヒト胎盤アルカリホスファターゼタンパク質の一部に融合された融合タンパク質として生産されるもの）の１：６．６希釈液、及び６０７．５μＬのＡｌｐｈａｑｕｅｓｔ緩衝液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．１％ＢＳＡ、０．０５％ツィーン２０）からなる。タッピングして混合する。２μＬ／ウェルのビオチン化ＥＰＯ−Ｒ結合ペプチドトレーサを加える（３０ｎＭの最終濃度）。ペプチドトレーサＥＰＯ−Ｒ結合ペプチド（表の「レポータＥＣ５０（ｐＭ）」を参照）は、実施例１に記載の方法に従って、配列番号４を使って作製される。
【化８６】
2010536858.tif 000092
【０２８１】
混合するために１分間遠心分離する。プレートをＰａｃｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｓｅａｌで封止し、ホイルで包む。室温で終夜インキュベートする。１８時間後にＡｌｐｈａＱｕｅｓｔリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ）を使って発光を読む。発光 対 ペプチド濃度をプロットし、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ又はＥｘｃｅｌで解析する。
【０２８２】
試験ペプチドなしで観察される発光と比較して発光を５０％減少させる試験ペプチドの濃度を、ＩＣ５０として記録する。
【０２８３】
４．Ｃ／ＢＦＵ−ｅアッセイ
ＥＰＯ−Ｒシグナリングは、骨髄幹細胞から増殖する赤血球前駆体への分化を刺激する。このアッセイは初代ヒト骨髄多能性幹細胞からの赤血球前駆体の増殖及び分化を刺激する試験ぺプチドの能力を測定する。
【０２８４】
このアッセイのために、試験ペプチドの希釈系列を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補足したＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中に調製する。次に、これらの希釈系列、又は陽性対照ＥＰＯペプチドを、メチルセルロースに加えて最終体積を１．５ｍＬにする。次に、そのメチルセルロース及びペプチド混合物を十分にボルテックスする。ヒト骨髄由来ＣＤ３４＋細胞（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ／Ｃａｍｂｒｅｘ）のアリコート（１００，０００細胞／ｍＬ）を解凍する。解凍した細胞を５０ｍＬチューブ中の０．１ｍＬの１ｍｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）に静かに加える。次に、４０〜５０ｍＬのＩＭＤＭ培地を細胞に静かに加える。すなわち培地は、最初の１０ｍＬを５０ｍＬチューブの側面に沿って１滴ずつ加えた後、残りの培地をチューブの側面に沿ってゆっくりと分注する。次に細胞を９００ｒｐｍで２０分間遠心し、培地を静かに吸引することにより、注意深く除去する。細胞を１ｍｌのＩＭＤＭ培地に再懸濁し、１ｍＬあたりの細胞密度を血球計盤スライドでカウントする（スライド上に１０μＬの細胞懸濁液、細胞密度は平均数×１０，０００細胞／ｍｌである）。次に、細胞をＩＭＤＭ培地に希釈して、細胞密度を１５，０００細胞／ｍＬにする。次に、１００μＬの希釈細胞を各１．５ｍＬのメチルセルロース＋ペプチド試料に加え（アッセイ培地中の最終細胞濃度は１，０００細胞／ｍＬである）、その混合物をボルテックスする。混合物中の気泡を消失させた後、鈍針を使って１ｍＬ吸引する。各試料から得た０．２５ｍＬの吸引混合物を、２４穴プレート（Ｆａｌｃｏｎブランド）の４つのウェルのそれぞれに加える。播種した混合物を、湿潤培養器中、５％ＣＯ２下、３７℃で、１４日間インキュベートする。位相差顕微鏡（対物５×〜１０×、最終倍率１００×）を使って、赤血球系コロニーの存在についてスコア化する。形成されるコロニーの数が、ＥＰＯ陽性対照を使って観察される値との比較で、最大の９０％になる試験ペプチドの濃度を、ＥＣ９０として記録する［表２：Ｃ／ＢＦＵ−ｅ ＥＣ９０参照］。
【表６】
2010536858.tif 000093
【実施例１２】
【０２８５】
インビボ活性アッセイ
この実施例では、本発明のＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドの活性及び力価を評価するのに役立つ種々のインビボアッセイを説明する。ＥＰＯ−Ｒアゴニストペプチドモノマー及びダイマーは実施例１に記載の方法に従って製造される。これらペプチドモノマー及びダイマーのインビボ活性は、低酸素多血マウスバイオアッセイ及び網状赤血球アッセイを含む一連のアッセイを使って評価される。これら２つのアッセイを以下にさらに詳しく説明する。
【０２８６】
１．低酸素多血マウスバイオアッセイ
試験ペプチドのインビボ活性を、Cotes and Bangham (1961), Nature 191:1065-1067に記載の方法を改変した低酸素多血マウスバイオアッセイでアッセイする。このアッセイでは、ＥＰＯミメティックとして機能する（すなわちＥＰＯ−Ｒを活性化して新しい赤血球合成を誘導する）試験ペプチドの能力を調べる。赤血球合成は、合成された赤血球のヘモグロビンへの放射標識鉄の取り込みに基づいて定量される。
【０２８７】
ＢＤＦ１マウスを、７〜１０日間、周囲条件に順応させる。体重を全ての動物について決定し、低体重の動物（＜１５グラム）は使用しない。マウスを、計１４日間にわたって、低圧室での逐次的条件付けサイクルに供する。各２４時間サイクルは、０．４０±０．０２％大気圧での１８時間と、周囲圧での６時間とからなる。条件付けの後、投薬に先だってさらに７２時間は、マウスを周囲圧に維持する。
【０２８８】
試験ペプチド又は組み換えヒトＥＰＯ標準をＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ溶剤（ＰＢＳ／ＢＳＡ）で希釈する。ペプチドモノマー原液を、まずジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で可溶化する。陰性対照群には、ＰＢＳ／ＢＳＡのみを注射した１マウス群と、１％ＤＭＳＯを注射した１マウス群を含める。各用量群は１０匹のマウスを含む。マウスに、０．５ｍＬの適した試料を皮下（首筋）注射する。
【０２８９】
試料注射の４８時間後に、マウスに、用量が約０．７５マイクロキュリー／マウスになるように、０．２ｍｌのＦｅ５９（Ｄｕｐｏｎｔ，ＮＥＮ）の腹腔内注射を施す。マウスの体重をＦｅ５９投与の２４時間後に決定し、Ｆｅ５９投与の４８時間後にマウスを屠殺する。血液を各動物から心臓穿刺によって収集し、ヘマトクリットを決定する（ヘパリンを抗凝固剤として使用した）。Ｐａｃｋａｒｄガンマカウンターを使って、各血液試料（０．２ｍｌ）をＦｅ５９の取り込みについて解析する。非応答マウス（すなわち放射能取り込み量が陰性対照群よりも少ないマウス）は適正データセットから除外する。陰性対照群の５３％未満のヘマトクリット値を有するマウスも除外する。
【０２９０】
結果は、各実験用量ごとに１０匹のセットから導かれる。各群から得た血液試料に取り込まれた放射能の平均量［カウント毎分（ＣＰＭ）］を計算する。
【０２９１】
２．網状赤血球アッセイ
正常ＢＤＦ１マウスに、３日間連続して、ＥＰＯ対照又は試験ペプチドのいずれかを投薬する（０．５ｍＬ、皮下注射）。３日目にはマウスに鉄デキストラン（１００ｍｇ／ｍｌ）も投薬する（０．１ｍＬ、腹腔内注射）。５日目にマウスをＣＯ２で麻酔し、心臓穿刺によって採血する。各血液試料について、網状赤血球のパーセント（％）を、チアゾールオレンジ染色及びフローサイトメータ解析（網状赤血球数プログラム）によって決定する。ヘマトクリットを手作業で決定する。補正された網状赤血球のパーセントは、次の式を使って決定される：
％ＲＥＴＩＣ補正＝％ＲＥＴＩＣ実測値×（ヘマトクリット個体／ヘマトクリット正常）。
【０２９２】
３．血液学的アッセイ
正常ＣＤ１マウスに、ＥＰＯ陽性対照、試験ペプチド、又は溶剤のいずれかを、４回の週１回静脈内ボーラス注射で投薬する。製剤中の活性化合物濃度を変化させることによって、ある範囲の陽性対照用量及び試験ペプチド用量（ｍｇ／ｋｇで表したもの）を試験する。注射体積は５ｍｌ／ｋｇである。溶剤対照群は１２匹からなり、残りの用量群はそれぞれ８匹である。毎日の生存率と、週ごとの体重とを記録する。
【０２９３】
１日目（溶剤対照マウスの場合）並びに１５日目及び２９日目（４匹／群／日）に、投薬したマウスを絶食させてから、イソフルランを吸入させて麻酔し、心臓穿刺又は腹部大動脈穿刺によって最終血液試料を収集する。血液をＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ブランドのチューブに移す。好ましい抗凝固剤はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【０２９４】
当分野で周知の自動臨床分析機器（例えばＣｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．製のもの）を使って、赤血球の合成及び生理機能を測定するエンドポイント、例えばヘマトクリット（Ｈｃｔ）、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）及び総赤血球数（ＲＢＣ）について、血液試料を評価する。
【実施例１３】
【０２９５】
動物及びヒト正常健常ボランティア（ＮＨＶ）におけるヘモグロビンレベルの増加
１．概論
非臨床データ及び臨床データによれば、完全合成ＥＰＯ受容体アゴニストであるペプチドＩは、不十分なＥＰＯ産生に続発する貧血を安全且つ効果的に軽減する潜在能力を有する。ペプチドＩは、現在利用できるＥＰＯ製品と比較して、次に挙げるものを含むいくつかの潜在的利点を有しうると予想される：投薬間隔が３〜４週間ごとになると予想される持続的な半減期及び薬力学活性（これは利便性及び服薬遵守の改善につながりうる）；内在性ＥＰＯと共通するアミノ酸配列がないので、抗体による赤芽球癆（ＰＲＣＡ）の可能性が減少すること；内在性ＥＰＯと交差反応する市販ＥＰＯに対する抗体が引き起こすＰＲＣＡを有する患者を処置できる可能性；及び室温でタンパク質治療薬よりも長い貯蔵寿命を有する強化された安定性。
【０２９６】
ペプチドＩの一次アミノ酸配列は組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）のものとは異なるので、内在性ＥＰＯに対する交差反応性免疫応答を誘発する可能性は低い。極めて稀ではあるが、交差反応性免疫応答は、組換えヒトＥＳＡと内在性ＥＰＯの両方の力価の喪失を伴う重篤な副作用を引き起こす場合がある。加えて、ペプチドＩは合成ペプチドなので、その製造において、組換えタンパク質製品では起こりうる宿主細胞物質による薬物の汚染という潜在的リスクが回避される。
【０２９７】
２．動物におけるペプチドＩの薬物動態
ペプチドＩは、赤血球生成の強力な刺激因子であり、マウス、ラット（正常赤血球数ラット及び腎摘ラット）、イヌ、ウサギ及びサルにおける単回又は反復投薬後には、用量依存的活性が観察される。ラット及びサルにおける薬理学的研究は、ヘモグロビンレベルによって測定される網状赤血球（未熟ＲＢＣ）およびＲＢＣの上昇が用量比例的であることを示す。
【０２９８】
ラット、イヌ及びサルにおける薬物動態研究では、現在販売されているｒＨｕＥＰＯ製品と比較して持続的なペプチドＩの血漿残留が証明された。消失半減期（ｔ１／２）は、ラットにおける２１．５〜３０．７時間から、イヌにおける７３．７時間までの範囲にわたる。ペプチドＩの体内分布は、主として血漿画分への分布である。６分の５腎摘ラットへの９．８７ｍｇ／ｋｇのペプチドＩのＩＶ投与後は、ｔ１／２が約４８時間、クリアランスは０．７６３ｍＬ／時／ｋｇと（正常赤血球数ラットにおける１．４４ｍＬ／時／ｋｇと比較して）低く、１．８の増加したＡＵＣ強度をもたらした。
【０２９９】
２．ヒトにおけるペプチドＩの薬力学及び薬物動態
２．１．概略及び方法
あるフェーズ１試験においてペプチドＩを２０人のＮＨＶで試験した。ペプチドＩによるこの初めてのヒト試験（first-in-human study）は、ランダム化、二重盲検、プラセボ対照、単回投与、ＩＶ、漸増用量、安全性及び認容性治験だった。この試験の主目標は、ペプチドＩの安全性及び薬物動態を評価すること、並びに薬理学的活性用量（ＰＡＤ）を確立することだった。各７人の男性ボランティアからなるコホートがペプチドＩ又はプラセボの単回投与を５：２の比率で受けるようにスケジュールを設定した。ベースライン値からのヘモグロビンの増加によって決定されるＰＡＤが観察されるまで、用量レベルを増加させながらコホートを加えることとし、ＰＡＤが観察された時点で、ＰＡＤと同定された用量レベルを、もう一つのボランティアのコホートで繰り返す。
【０３００】
試験は、それぞれ０．０２５、０．０５、０．１ｍｇ／ｋｇ、及び０．１ｍｇ／ｋｇのペプチドＩ用量（１コホートあたり単回投与）で、逐次的に登録される４つのコホートで開始した。試験の結果は、３番目のコホートが０．１ｍｇ／ｋｇのペプチドＩを投与された後に、網状赤血球数及びヘモグロビンレベルの増加が達成されることを示した。この用量を４番目のコホートで繰り返して、３番目のコホートで観察された結果を確認した。こうして試験を終了した。非盲検結果を以下に要約する。
【０３０１】
２．２．薬力学結果
網状赤血球数（絶対値及びパーセント）は、ペプチドＩ用量の増加に伴って、用量依存的な増加を示した。網状赤血球数は、全ての用量コホートで、投与の約７日後に最大に達した。最大網状赤血球応答及び網状赤血球 対 時間曲線（ＡＵＣ０−１４日及びＡＵＣ０−２８日）の比較は、用量群間に有意差を示した（ｐ＜０．０５）。
【０３０２】
投薬後２８日間にわたるヘモグロビンの応答及びベースラインからの変化（平均及び最大の両方）は、ペプチドＩの用量の増加に伴って用量依存的な増加を示したのに対し、対照群は、試験に関する採血後の経時的なヘモグロビンのわずかな減少が赤血球生成の外因性刺激に付随するものではないこと示した［０．０００１の一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）ｐ値]。混合モデルを用いる一元配置共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）を使って、４つの群全ての間で、経時的なベースラインからの個々の変化を比較した。この分析の結果は、４つの用量群の全ての間で有意な用量応答を示し（ｐ＝０．０００１）、０．０２５ｍｇ／ｋｇ群と０．１ｍｇ／ｋｇ群の間（ｐ＝０．００２７）、並びに０．０５ｍｇ／ｋｇ群と０．１ｍｇ／ｋｇ群の間（ｐ＝０．０１１３）に有意差があった。少なくとも１．０ｇ／ｄＬというヘモグロビンの増加を伴うペプチドＩのＰＡＤは０．１ｍｇ／ｋｇだった。
【０３０３】
また、コホート３及びコホート４の被験者（０．１ｍｇ／ｋｇのペプチドＩ又はプラセボ）を、投与後４２日間にわたって追跡した。４２日目の時点で、平均ヘモグロビンレベルは、０．１ｍｇ／ｋｇのペプチドＩで処置した被験者では、ベースラインに戻っていたが、プラセボ被験者では、依然としてベースライン値を下回っていた。このように、４２日目の時点で、試験全体を通してそうであるように、０．１ｍｇ／ｋｇのペプチドＩの投与を受けた被験者とプラセボの投与を受けた被験者との間で、ベースラインヘモグロビンからの変化の差は、≧０．５ｇ／ｄＬだった。
【０３０４】
血清ＥＰＯレベルは、ペプチドＩ用量の増加に伴って、一過性に低下した。他の薬力学パラメータの変化（赤血球数及びヘマトクリットの増加、フェリチン及び網状赤血球ヘモグロビン含量の一過性の減少、可溶性トランスフェリン受容体タンパク質の一過性の増加、並びにＥＰＯの一過性の減少）は、赤血球生成の刺激と合致していた。
【０３０５】
２．３．薬物動態結果
０．０２５、０．０５及び０．１ｍｇ／ｋｇのペプチドＩを５分間かけてＩＶ投与した後、薬物濃度は一般に注入開始の５分後から１時間後までの間でピークに達した。０．０２５ｍｇ／ｋｇ用量群では、ペプチドＩ濃度が５分と１５分の間でピークに達したが、０．１ｍｇ／ｋｇ用量の場合、ｔｍａｘは１時間近くになった。Ｃｍａｘに到達した後、血漿濃度は低下し、一般に、０．０２５ｍｇ／ｋｇの投薬後は９６時間まで、０．０５ｍｇ／ｋｇ用量の場合は５日目まで、そして０．１ｍｇ／ｋｇ用量の場合は７日目まで、定量可能だった（＞２５ｎｇ／ｍＬ）。算出される半減期は０．１ｍｇ／ｋｇ用量で小さな増加を示し、０．０２５ｍｇ／ｋｇの投薬後は１６．７〜２１．９時間（平均１９．２時間）、０．０５ｍｇ／ｋｇの投薬後は１５．３〜２５．１時間（平均１８．７時間）、そして０．１ｍｇ／ｋｇの投薬後は１７．７〜３３．１時間（平均２３．５時間）の範囲だった。
【０３０６】
薬物の分布及び排出は、標準的な１又は２コンパートメント動態には従わないようだった。一次速度が、より低い薬物濃度でしか観察されなかったことから、約４００ｎｇ／ｍＬを超える血漿濃度では、代謝／排出プロセスの飽和が示唆される。分布容積は用量による変化をほとんど示さなかった（０．０２５、０．０５及び０．１ｍｇ／ｋｇの用量で平均はそれぞれ２１６５、１９０３、及び２０１０ｍＬ）。血漿クリアランスは、用量と共に小さな低下を示し、０．０２５、０．０５及び０．１ｍｇ／ｋｇの用量で幾何平均はそれぞれ７８．０、７０．７、及び５９．２ｍＬ／時間だった。用量標準化Ｃｍａｘ及びＡＵＣ（０−無限）データのＡＮＯＶＡは、Ｃｍａｘが用量と線形関係にあるらしいことを示した。しかしＡＵＣ（０−無限）は、最高用量の０．１ｍｇ／ｋｇにおいて、高用量で観察された薬物クリアランスの小さな減少に関連すると思われる非線形性の証拠を示した。
【０３０７】
２．４．安全性結果
１５人の被験者（プラセボの投与を受けた８人のうちの４人及びペプチドＩの投与を受けた２０人のうちの１１人）が合計２８件の有害事象（ＡＥ）を経験した（プラセボ群で６件、ペプチドＩ群で２２件）。ペプチドＩの投与を受けた被験者では、頭痛（４／２０、２０．０％）及び腹痛（２／２０、１０．０％）、悪心（２／２０、１０．０％）及び鼻咽頭炎（２／２０、１０．０％）が、報告頻度の高い事象だった。１件を除く全てのＡＥが軽度（グレード１）に類別された。ペプチドＩ受容者に観察された大半のＡＥ（１５／２２）は、試験薬ペプチドＩには恐らく関係がないと考えられた。ＡＥの頻度、重篤度又はパターンの相違は４つの群間にはなかった。重篤有害事象（ＳＡＥ）もＡＥを原因とする試験からの離脱もなかったが、０．０２５ｍｇ／ｋｇのペプチドＩ用量に割り当てられた１人の被験者については、軽度の薬物反応により、試験薬を中止した。注入の２分後に始まったこの反応は、胸に始まって顔まで拡がった紅潮であり、熱っぽい感覚、不快感及び喉のいがらっぽさを伴った。安全策としてこの被験者については注入を中止した。症状は自発的且つ迅速に消散した。治療的介入は必要なかった。バイタルサインに変化はなかった。実験パラメータは追加の免疫学的検査を含めて正常であったので、この反応の具体的性質を解明することはできない。類似する（又はさらに重篤な）薬物反応が他のＥＳＡを含む多くの薬物で観察されている。加えて、ペプチドＩのＩＶ投与中は患者を観察すべきである。患者が類似する症状を発現したら、注射を中止すべきである。
【０３０８】
１人のプラセボ受容者及び１人のペプチドＩ受容者には、それぞれ軽度の頭痛及び軽度の腹部疝痛に対する投薬が併用された。バイタルサイン、心電図（ＥＣＧ）又は検査値に臨床的に有意な変化はなかった。この治験においてペプチドＩに特異的な抗体を産生した被験者はいなかった。
【０３０９】
２．５．要約
要約すると、ペプチドＩは０．０２５、０．０５、又は０．１ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ投薬後に、安全であり、且つ認容性が高く、プラセボに似た安全性プロファイルを有するようだった。薬物動態結果は約１５〜３３時間の範囲の半減期を示し、０．１ｍｇ／ｋｇ用量では平均が２３．５時間だった。中央値は全ての用量について同程度であり、注入開始の１５分後に見られた。Ｃｍａｘは用量と線形関係にあるようであり、ＡＵＣ（０−∞）は０．１ｍｇ／ｋｇ用量において非線形であるようであった。一次速度が、より低い薬物濃度でしか観察されなかったことから、＞４００ｎｇ／ｍＬの血漿濃度では、代謝／排出プロセスの飽和が示唆される。ペプチドＩは、評価した全ての用量で網状赤血球に対する薬理学的活性を示し、一般に、その応答は用量依存的で、用量の増加と共に、応答も大きく且つ長くなった。０．１ｍｇ／ｋｇ用量群は、臨床的にも統計的にも有意な、ベースラインからのヘモグロビンの増加を伴い、１０人のペプチドＩ受容者の間で、１．３６±０．３９ｇ／ｄＬというベースラインからの平均最大増加が見られたので、この用量をＮＨＶにおけるＰＡＤと定めた。他の薬力学パラメータの変化（赤血球数及びヘマトクリットの増加、フェリチン及び網状赤血球ヘモグロビン含量の一過性の減少、可溶性トランスフェリン受容体タンパク質の一過性の増加、並びにＥＰＯの一過性の減少）は、赤血球生成の刺激と合致していた。
【０３１０】
欧州血液学会第１０回年会（２００５年６月４日、於ストックホルム）で発表されたポスター及び要旨番号０４７０は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例１４】
【０３１１】
透析前患者、透析中患者、及び腫瘍患者におけるヘモグロビンレベルの増加
１．透析前患者
透析を受けておらず、以前に赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）処置を受けたことがない慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）患者を対象として、ペプチドＩ注射の単回静脈内投薬の安全性、薬力学及び薬物動態の、ランダム化、二重盲検、プラセボ対照、逐次的用量増量試験が行なわれる。この試験では透析を受けていないＣＫＤ患者（透析前患者）におけるペプチドＩの単回静脈内（ＩＶ）用量レベルの安全性プロファイルが評価される。また、この試験では、薬力学パラメータ、例えばヘモグロビン、網状赤血球、及び鉄貯蔵に対するペプチドＩの単回投薬の用量応答関係が評価され、透析前患者における静脈内でのペプチドＩの単回用量レベルの薬物動態プロファイルが評価され、透析前患者における静脈内での薬理学的活性用量（ＰＡＤ）（例えば患者の＞７０％がベースラインから≧１ｇ／ｄＬのヘモグロビン増加を達成することになる用量）が決定される。
【０３１２】
試験のエンドポイントには次の項目が含まれる：有害事象（ＡＥ）；重篤有害事象（ＳＡＥ）；薬物動態パラメータ（Ｃｍａｘ、ＡＵＣ０−ｔ、ＡＵＣ０−無限、ｔ１／２β、Ｖｄ、及びＣＬを含む）；薬理学パラメータ（網状赤血球、ヘモグロビン、網状赤血球ヘモグロビン含量、及び鉄貯蔵の血清測定値（例えば血清フェリチン、トランスフェリン飽和度、及びトランスフェリン受容体タンパク質）を含む）；ベースラインからの平均ヘモグロビン変化；ベースラインからの最大ヘモグロビン変化；ベースラインから≧１ｇ／ｄＬのヘモグロビン増加を達成する処置患者の割合；及び赤血球輸血の頻度。
【０３１３】
この試験に組み入れるために選択される患者は、１８〜７５歳の透析前患者であって、慢性腎臓疾患に続発してヘモグロビンが≧９ｇ／ｄＬ且つ≦１１ｇ／ｄＬであり、ＥＳＡによる処置を以前に受けたことがなく、適格性基準を満たす患者である。９人の患者からなる各コホートにおいて、ペプチドＩ（ｎ＝７）又はプラセボ（ｎ＝２）の単回投与を受けるように、患者をランダムに割り当てる。１コホートあたり５人のペプチドＩ処置患者で最低２２日分のデータを確実に入手することができるように、あるコホート内で３人目以降について２２日目より前に試験を終了する場合、これを補充する。各補充患者は、休薬した患者と同じ処置群に割り当てられる。２２日目以降に試験から離脱した患者は補充しない。
【０３１４】
最大６つの用量レベルコホート（最大４つの計画的用量レベル及び最大２つまで追加される、より低い用量、中間用量、及び／又は反復［確認］用量レベルに対するＬＩＰ）が、独立安全性監視者（Independent Safety Monitor）、治験責任医師（Investigator）、及び治験依頼者（Sponsor）による決定に応じて、逐次的に組み入れられるように計画する。最大で５４人の評価可能な患者をこの治験に組み入れることができる。
【０３１５】
この試験において、各患者は、投薬後少なくとも２８日間は参加することが期待される。
【０３１６】
各患者はペプチドＩ又はプラセボの単回投与を受ける。計画される逐次的ペプチドＩ用量レベルは、次のとおりである。
【化８７】
2010536858.tif 000094
【０３１７】
これは、１コホートあたり９人の透析前患者からなる最大Ｇ個の用量コホートによる、ランダム化、二重盲検、プラセボ対照、逐次的用量増量試験である。各コホートにおいて、患者は２９日目又は有害事象の安定化のどちらか遅い方まで追跡される、ヘモグロビンレベルは、全ての患者において、上昇したレベルがベースラインレベルから０．５ｇ／ｄＬ以内に戻るまで追跡される。
【０３１８】
ベースラインヘモグロビン濃度を、試験薬投薬前の直近の３つのヘモグロビン値の平均と定める。試験中、コホートの開始又は中止決定のためのヘモグロビンの変化は、次に続くヘモグロビン値による確認を必要とする。
【０３１９】
患者のヘモグロビンレベルが１４ｇ／ｄＬに達した場合は、臨床的に必要であれば、患者を瀉血すべきである。患者のヘモグロビンのレベルが１６ｇ／ｄＬ（確認値）に達した場合は、患者を瀉血すべきである。
【０３２０】
第１コホートの投薬後、続いて行なわれる、次の用量レベルの次のコホートの組み入れは、プロトコルに指定された用量増量基準に基づいて行なわれる。次の用量レベルコホートへの用量増量はプロトコルに指定された中止基準に基づいて停止される。非盲検の独立安全性監視者が、非盲検臨床及び検査データを常時審査して、いつ用量増量基準又は中止基準が満たされたかを決定する。
【０３２１】
治験責任医師である臨床要員及び治験依頼者である臨床要員は、個々の患者の処置割り当てや、患者の特定されたＰＫパラメータ、血液学的パラメータ、並びに鉄パラメータ結果（例えばヘマトクリット、ヘモグロビン、ＭＣＨＣ（平均赤血球ヘモグロビン濃度）、ＭＣＨ（平均赤血球ヘモグロビン量）、ＭＣＶ（平均赤血球容積）、網状赤血球数、及び網状赤血球ヘモグロビン含量）、又は鉄貯蔵結果（例えばフェリチン、トランスフェリン飽和度、及びトランスフェリン受容体タンパク質）については、知らされない。しかしこれらの要員は、試験の過程で、患者の特定を不可能にした結果を審査することはできる。結果が患者によって特定されると、その結果から、処置割り当てが明らかになる可能性があるので、これらの要員には、これらのパラメータについて、患者の特定された結果を入手する権限が与えられないようにする。
【０３２２】
安全上の懸念が認められず、コホート中のどの患者も≧１．０ｇ／ｄＬのヘモグロビン増加を達成していないか、又はペプチドＩの投与を受けてベースラインから＞１．０ｇ／ｄＬのヘモグロビン増加を達成した全ての患者が、最低２つの時点にわたって安定性（ピークヘモグロビン値から０．５ｇ／ｄＬ以内）又は可逆性（ピークヘモグロビン値からの減少）を示す場合には、コホート中の全ての評価可能な患者（７人以上）が２２日目に達した時から、次のコホートへの用量増量が許される。
【０３２３】
次に挙げる基準のいずれかが満たされる場合は、目下のコホートへの新しい患者の組み入れ及び新しい用量への増量が中止される：あるコホート内で２人又はそれ以上の患者がグレード３又はグレード４のペプチドＩ関連有害事象を有すること；あるコホート内で、ペプチドＩの投与を受けた２人以上の患者が、任意の４週間にわたって、≧２．０ｇ／ｄＬのヘモグロビン増加（ベースラインレベルの上から始まる増加）を有すること；又は、あるコホート内で、ペプチドＩの投与を受けた２人又はそれ以上の患者が、ヘモグロビンの標的範囲の上限を超えること（＞１３ｇ／ｄＬ）。
【０３２４】
安全上の懸念が認められない場合は、あるコホート内の全ての評価可能な患者（７人以上）が２２日目に達した後に、確認（反復）用量、より低い用量、又は中間用量を調べるために、９人の患者からなる追加のコホートを開始することができる。
【０３２５】
透析前患者の場合、ＰＡＤは０．０２５〜０．２ｍｇ／ｋｇ、或いは０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇ、或いは０．０６７〜０．０７５ｍｇ／ｋｇであると決定されると予想される。
【０３２６】
２．透析患者
慢性血液透析患者における貧血の維持治療のために静脈内投与されるペプチドＩ注射の安全性、薬力学、及び薬物動態の、オープンラベル多施設逐次的用量探索試験を行なって、ヘモグロビン値がエポエチンアルファで安定している血液透析患者におけるベースライン値の上下１．０ｇ／ｄＬ以内にヘモグロビン値を維持するような、月１回の静脈内投与ペプチドＩ用量の範囲を決定する。また、この試験では、血液透析患者に静脈内投与される３回までのペプチドＩの投薬の安全性プロファイルが評価され、血液透析患者に静脈内投与される３回までのペプチドＩの投薬の薬物動態プロファイルも評価される（試験患者のサブセットにおける評価）。
【０３２７】
試験のエンドポイントには次の項目が含まれる：ベースラインからの平均週ヘモグロビン変化；１３週目までヘモグロビンがベースラインの上下１．０ｇ／ｄＬ以内にある患者の数（％）；１３週目までヘモグロビンが９．５〜１３．０ｇ／ｄＬ以内に維持される患者の数（％）；試験中に用量調節がなかった患者の数（％）及び試験中に用量の増減があった患者の数（％）；赤血球輸血の頻度；追加の薬理学パラメータ、例えば網状赤血球数（絶対値及びＡＵＣ）、網状赤血球ヘモグロビン含量、及び鉄貯蔵の血清測定値（例えば血清フェリチン、トランスフェリン飽和度、及び可溶性トランスフェリン受容体タンパク質）；有害事象；重篤有害事象；並びに薬物動態パラメータ、例えばＣｍａｘ、ＡＵＣ０−ｔ、ＡＵＣ０−∞、ｔ１／２β、Ｖｄ、Ｖｓｓ及びＣＬ（試験患者のサブセットにおける評価）。その薬物動態解析及び薬力学解析の結果を使って、エポエチンアルファの週１回用量に基づいてペプチドＩの月１回用量を最適に予測する予備的換算係数が決定される。
【０３２８】
この試験に組み入れるために選択される患者は、安定用量の市販エポエチンアルファで安定したヘモグロビンに維持されている１８歳又はそれ以上の血液透析患者であって、適格性基準を満たす患者である。１コホートあたり１５人の患者からなる、最大４つの逐次的用量レベルコホートが、３〜１０ヶ所の臨床施設で組み入れられるように計画する。
【０３２９】
３回のペプチドＩ投薬を受けた１コホートあたり最低１０人の患者でデータを確実に入手することができるように、あるコホート内で６人目及びそれ以降の患者が３回目の投薬を受ける前に試験を終了する場合、最大４人まで補充する。３回の投薬を受けた後に試験から離脱した患者は補充しない。
【０３３０】
２つの用量レベルコホートが、まず最初に、逐次的に組み入れられるように計画する。観察された安全性プロフィール及び薬理学的応答に応じて、それぞれ１５人の患者からなる最大２つの追加コホートを加えて、より低い用量レベル、中間用量レベル、及び／若しくは反復（確認）用量レベル、並びに／又は投与頻度を試験することができる。
【０３３１】
この治験には最低３０人且つ最大６０人の評価可能な患者を組み入れることができる。この試験において、各患者は、４週間のスクリーニング期間後、約１５週間にわたって参加することが期待される。
【０３３２】
裏づけとなるデータが入手できるまで、投薬期間をさらに１２週間延長するための補正を計画する。
【０３３３】
ペプチドＩの用量は、透析の最後の１５分間中に３０秒間での急速静脈内ボーラス注射として、４週間ごとに合計３回、投与される。あるコホート内の各患者には、前もって指定されたエポエチンアルファ／ペプチドＩ換算レベルから開始されるオープンラベル用量のペプチドＩが投与される。用量は、先のコホートで観察された用量反応関係に基づいて、次のコホートでは、増量又は減量される。計画される開始ペプチドＩ用量レベル換算は次のとおりである。
【化８８】
2010536858.tif 000095
【０３３４】
ペプチドＩ用量は、個々の患者において、次のように調節することができる。ペプチドＩ試験薬の３番目の用量から出発して、患者の確認されたヘモグロビンがベースライン値ら＞１．０ｇ／ｄＬの減少を示すか、又は患者の確認されたヘモグロビンがベースラインに対して≧０．５ｇ／ｄＬの減少から１１ｇ／ｄＬ下のレベルまでの減少を示した場合は、用量を２５％増加させる。試験薬の３番目の用量から出発して、患者の確認されたヘモグロビンがベースラインから＞１．５ｇ／ｄＬの増加を示すか、又は患者の確認されたヘモグロビンがベースラインに対して≧０．５ｇ／ｄＬの増加から１２ｇ／ｄＬ上のレベルまでの増加を示した場合は、用量を２５％減少させる。試験中の任意の時点において、患者の確認されたヘモグロビンが、任意の２週間以内で、＞１．０ｇ／ｄＬの増加（ベースラインの上から始まる増加）を示した場合は、次の用量を２５％減少させる。試験中の任意の時点において、患者の確認されたヘモグロビンが１２．５ｇ／ｄＬを超えた場合は、ヘモグロビンが１２．０ｇ／ｄＬに減少するまで次の投薬を遅らせ、用量を２５％減少させる。
【０３３５】
ベースラインヘモグロビン濃度を、試験薬投与前の３週間に収集される、直近の３つの週半ば透析前ヘモグロビン値の平均と定める。試験中、個々の用量調節又はコホートの開始若しくは中止基準決定のためのヘモグロビンレベルの変化は、７日以内の任意の時点における反復ヘモグロビン値による確認を必要とする。
【０３３６】
これは、１コホートあたり１５人の血液透析患者からなる２〜４つの処置コホートによるオープンラベル逐次的用量探索治験である。各患者は、ペプチドＩの静脈内投薬を、４週間ごとに合計３回受ける。ペプチドＩの最初の投薬を受けた後、患者は試験全体を通して少なくとも週１回は診察される。試験中、鉄状態はＫｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（Ｋ／ＤＯＱＩ）治療ガイドラインに従って維持される。
【０３３７】
患者は、ペプチドＩの最後の投与後、最低４２日間、又は有害事象の安定化のどちらか遅い方まで追跡される。処置の中止後は、ヘモグロビンレベルを、全ての患者で、標的範囲に戻るまで追跡する。
【０３３８】
患者のヘモグロビンレベルが１４ｇ／ｄＬ（確認値）に達した場合は、治験責任医師の判断に従って患者を瀉血することができる。患者のヘモグロビンレベルが１６ｇ／ｄＬ（確認値）に達した場合は、患者を瀉血する。瀉血の方法は、その施設の標準的臨床実務に従って行なわれる。瀉血された血液の体積を記録しておく。瀉血された患者はペプチドＩの受容を中断し、瀉血後の薬力学データは解析から除外する。
【０３３９】
第１コホートの投薬後、続いて行なわれる次のコホートの組み入れは、プロトコルに指定された用量増量又は用量減量基準に基づく。適当な用量レベル換算係数が同定されたら、その換算係数用量レベルを確認コホートで繰り返すことができる。独立安全性監視者及び治験依頼者は、臨床データ及び検査データを常時審査して、いつ用量増量、用量減量、追加コホート、又は中止基準が満たされたかを決定する。
【０３４０】
あるコホートに組み入れられた６人又はそれ以上の患者の７週目データの審査を起点として、安全上の懸念が独立安全性監視者によって認められず、かつ組み合わされた６人又はそれ以上の患者が、７週目以降、ベースラインからの１．０ｇ／ｄＬを上回る確認されたヘモグロビンの減少を示す場合には、目下のコホートへの組み入れを中止することができ、次のコホートへの用量増量が許される。
【０３４１】
あるコホートに組み入れられた６人又はそれ以上の患者の７週目データの審査を起点として、安全上の懸念が独立安全性監視者によって認められず、かつ組み合わされた６人又はそれ以上の患者が、７週目以降に、、ベースラインに対して＞１．０ｇ／ｄＬの増加から＞１３．０ｇ／ｄＬのヘモグロビン値までの確認されたヘモグロビンの増加を示す場合、又は確認されたヘモグロビンが、試験エントリ後、任意の２週間以内に、＞１．０ｇ／ｄＬの増加（ベースラインから上への増加）を示す場合は、目下のコホートへの組み入れを中止することができ、次のコホートへの用量減量が許される。
【０３４２】
あるコホートに組み入れられた１０人又はそれ以上の患者の７週目データの審査を起点として、安全上の懸念が安全性監視者によって認められない場合は、より低い又は中間（現在試験しているものと先に試験したものとの間）の換算係数、及び／又は投与頻度を試験するために、追加コホートを開始することができる。最大２つの追加コホートを組み入れることができる。
【０３４３】
あるコホートに組み入れられた１０人又はそれ以上の患者の７週目データの審査後に、安全上の懸念が独立安全性監視者によって認められず、用量増量規則も用量減量規則も満たされない場合には、同じ換算係数を利用する確認コホートを開始して、同じ換算係数及び／又は投与頻度を繰り返すことができる。
【０３４４】
次に挙げる基準が満たされる場合は、目下のコホートへの新しい患者の組み入れ及び新しい用量への増量が中止される：あるコホート内の３人の患者がグレード３又はグレード４のペプチドＩ関連有害事象を有すること。
【０３４５】
透析患者の場合、ＰＡＤは０．０２５〜０．２ｍｇ／ｋｇ、或いは０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇ、或いは０．０６７〜０．０７５ｍｇ／ｋｇであると決定されると予想される。
【０３４６】
３．腫瘍患者
化学療法誘発貧血（ＣＩＡ）を有する患者におけるヘモグロビン応答に関連する、皮下（ＳＣ）注射によって３週間ごとに投与されるべきペプチドＩ用量を決定するために、化学療法誘発貧血を有する癌患者における皮下投与されたペプチドＩの安全性、薬力学及び薬物動態のオープンラベル多施設用量増量試験を行なう。他の目標には、骨髄抑制化学療法を同時に受ける癌患者において３週間ごとに皮下投与されるペプチドＩの４回までの投薬の安全性プロファイルを評価すること；用量レベルが異なるペプチドＩで、ＣＩＡ患者におけるＨｇｂのベースラインからの変化を決定すること；ペプチドＩに対してＨｇｂ応答を示す患者（エンドポイントで定義するもの）の割合を決定すること；ＣＩＡ患者において、１１〜１３ｇ／ｄＬの標的範囲内にヘモグロビンを増加させて維持するような、皮下投与されるペプチドＩの用量を決定すること；ＣＩＡ患者において、皮下投与されるペプチドＩの４回までの投薬の薬物動態プロファイルを評価すること（試験患者のサブセットにおける評価）；及びペプチドＩの活性用量における投与頻度及び非経口鉄補充の効果を調査することが含まれる。
【０３４７】
試験のエンドポイントには次の項目が含まれる：４週間、９週間及び１２週間の時点で、過去２８日以内にＲＢＣ輸血を受けずに、ヘモグロビンが＞２ｇ／ｄＬの増加を示す患者、又はＨｇｂが＞１ｇ／ｄＬから少なくとも１２ｇ／ｄＬまでの増加を示す患者の、処置群あたりの割合；４週間、９週間及び１２週間の時点で、過去２８日以内にＲＢＣ輸血を受けずに、ベースラインから＞１ｇ／ｄＬのＨｇｂ増加を示す患者の割合；４週目、９週目、及び１２週目に、１１〜１３ｇ／ｄＬの標的範囲内のＨｇｂを有する患者の割合；４週目後に、１１〜１３ｇ／ｄＬの標的範囲内にあるＨｇｂ値の割合；ベースラインからの平均ヘモグロビン変化；赤血球輸血の頻度；追加の薬理学パラメータ、例えば網状赤血球数（絶対値及びＡＵＣ）、網状赤血球ヘモグロビン含量、鉄貯蔵の測定値（例えばトランスフェリン飽和度及び血清フェリチン）の変化；有害事象（ＡＥ）；重篤有害事象（ＳＡＥ）；並びに試験患者のサブセットにおける薬物動態パラメータ、例えばＣｍａｘ、ＡＵＣ０−ｔ、ＡＵＣ０−∞、ｔ１／２β（消失半減期）、Ｖｄ（見かけの分布容積）、Ｖｓｓ（定常状態での分布容積）及びＣＬ（クリアランス）。
【０３４８】
この試験のために選択される患者は、化学療法に続発する≧９ｇ／ｄＬ且つ≦１１ｇ／ｄＬのヘモグロビンを有し、過去９０日以内にＥＳＡによる事前の処置を受けておらず、適格性基準を満たす、１８〜８０歳の固形腫瘍又はリンパ腫を有する患者であり、これらの患者は、メディカルモニタ（Medical Monitor）（ＭＭ）によって承認された開始用量又はその後の逐次的用量レベルのペプチドＩに割り当てられる。１処置群あたり最低１０人の処置患者で１２週間のデータを確実に入手することができるように、ある郡内で６人目及びそれ以降の患者について８週間以前に試験を終了した場合、最大５人まで補充する。各補充患者は、離脱した患者と同じ処置群に割り当てられる。１５人の患者からなる最大４つのオープンラベル処置群を、引き続いて加えて、より低い用量レベル、中間用量レベル、及び／若しくは反復用量レベル、並びに／又はペプチドＩの投与頻度、及び／又はトランスフェリン飽和レベルを２５〜５０％に維持するための非経口鉄補充を試験することができる。考えうる全ての投薬レジメンを調査する場合は、この治験に最低３０人且つ最大９０人の患者（補充分を含まない）を組み入れることができる。
【０３４９】
この試験において、各患者は、４週間までのスクリーニング期間後、最大１２週間にわたって参加することが期待される。
【０３５０】
１５人の患者からなる逐次的コホートに、漸増する用量のペプチドＩを投与する。オープンラベル用量を、３週間ごとに合計４回、ＳＣ注射によって投与する（試験１、４、７、１０週目）。ペプチドＩは、典型的には、化学療法サイクルの１日目に投与される。ペプチドＩの開始用量及び投薬頻度は、健常ボランティアを対象とするフェーズ１データと、ペプチドＩ及び他の赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）に対する赤血球生成応答のＰＫ／ＰＤデータからモデル化された予想応答とに基づく。計画されるペプチドＩ用量レベル及び各群の患者数を表７に示す。
【表７】
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患者を、最後の注射後２８日間、又は有害事象の安定化まで、又はヘモグロビン値が１１〜１３ｇ／ｄＬの間になるまでの、いずれか一番遅い時点まで、追跡する。用量増加は許さない。４週目後、Ｈｇｂを標的範囲内に維持するためにＲＢＣ輸血が必要な場合は、その患者を試験から外して、標準的な医療に戻し、安全のためにさらに２８日間は追跡する。試験中の任意の時点において、患者のヘモグロビンが任意の２週間以内に＞１．０ｇ／ｄＬ増加した場合は、ヘモグロビンが安定する（１週間で＜０．５ｇ／ｄＬの増加）まで次の投薬を遅らせ、用量を５０％減少させる。ベースラインヘモグロビン濃度を、試験薬投与の前の週に収集される、直近の２つの週ヘモグロビン値の平均と定める（例えばスクリーニング値及びベースライン値）。試験中、コホートの開始又は中止基準決定のためのヘモグロビンレベルの変化は、７日以内の次に続くヘモグロビン値による確認を必要とする。
【０３５１】
この試験は、１群あたり１５人のＣＩＡ患者からなる最大６つの処置群によるオープンラベル多施設治験である。最初の処置群では、オープンラベルのペプチドＩが、３週間ごとに合計４回まで、皮下注射によって投与される。最初の投薬後、患者は試験全体を通して少なくとも週１回は診察される。患者を、試験薬の最後の投与後、最低２８日間、又は有害事象の安定化まで、又はヘモグロビン値が１１〜１３ｇ／ｄＬの間になるまでの、いずれか一番遅い時点まで、追跡する。患者のヘモグロビンレベルが１４ｇ／ｄＬ（確認値）に達した場合は、臨床的に必要であれば、患者を瀉血することができ、瀉血体積を記録しておく。瀉血された患者は試験薬の受容を中断し、瀉血後の薬力学データは解析から除外する。メディカルモニタ（ＭＭ）及び治験依頼者は、安全性データ及び薬力学データを常時審査して、中止基準が満たされたかどうか、そしていつ中止基準が満たされたかを決定する。
【０３５２】
あるコホートに組み入れられた６人又はそれ以上の患者が、少なくとも６週間（すなわち２回目の投薬後、少なくとも３週間）の経過観察を完了した後は、安全上の懸念がＭＭによって認められず、６人又はそれ以上の患者が４週目後に輸血を受けるか、又は６週目時点で＜１ｇ／ｄＬの確認されたヘモグロビン増加を示す場合に、目下のコホートへの組み入れを停止することができ、次のコホートへの用量増量が許される。
【０３５３】
あるコホートに組み入れられた６人又はそれ以上の患者が、少なくとも６週間（すなわち２回目の投薬後、少なくとも３週間）の経過観察を完了した後は、ペプチドＩとの関係が疑われる少なくとも３つのグレード３又はグレード４ＡＥの発生があった場合、又はＭＭがペプチドＩに対して何らかの具体的懸念を認めた場合、又は合計６人又はそれ以上の患者が、＞１３．０ｇ／ｄＬの確認されたヘモグロビンレベル（輸血に関係しないもの）若しくは任意の２週間以内に＞１．０ｇ／ｄＬの確認されたヘモグロビン増加（輸血に関係しないもの）を示す場合に、目下のコホートへの組み入れを停止することができ、次のコホートにおいて、より低いレベルへの用量減量を許すことができる。
【０３５４】
安全上の懸念がＭＭ及び治験依頼者によって認められない場合は、１５人の患者からなる最大２つの追加オープンラベル処置群を開始して、より低い用量レベル、中間（現在試験しているものと先に試験したものとの間）用量レベル、又は反復用量レベルを試験することができる。加えて、３週間ごとに投与される活性用量が決定されたら、最大２つの追加コホートを組み入れて、異なる頻度で分割して投与される全部で同じ総用量（例えば、４週間ごとに投与される、３週間ごとの用量の４／３）の相対的効果を決定することができる。２５〜５０％のトランスフェリン飽和度を達成するための非経口的鉄投与の効果も、別のコホートで調査することができる。
【０３５５】
腫瘍患者の場合、ＰＡＤは０．０７５〜０．５ｍｇ／ｋｇ、或いは０．２〜０．４ｍｇ／ｋｇ、或いは０．２５ｍｇ／ｋｇであると決定されると予想される。
【実施例１５】
【０３５６】
慢性腎臓疾患を有する患者を対象とするフェーズＩＩ複数回投与試験におけるペプチドＩの長期安全性、認容性、及び薬力学
１．試験方法
ペプチドＩ（配列番号２）の月１回（Ｑ４Ｗ）の皮下（ＳＣ）送達の複数回投薬の安全性及び薬力学を評価するために、慢性腎臓疾患を有する患者に対して多施設オープンラベル逐次的用量探索フェーズＩＩ臨床治験を行なった。合計６０人の赤血球生成刺激剤未経験の透析前の慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）患者［ヘモグロビン（Ｈｇｂ）レベル９．０〜１０．９ｇ／ｄＬ、フェリチン＞１００μｇ／Ｌ及びトランスフェリン飽和度（ＴＳＡＴ）＞２０％］を、３つの用量コホートに組み入れた。患者は最大６回の月１回ＳＣ薬物投与を受けた。開始用量は０．０２５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１５）、０．０５０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３０）及び０．０７５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１５）とした。１回目の投薬後に、患者のＨｇｂレベルに基づいて、用量調整（dose titration）を許した。
【０３５７】
２．平均ベースライン特徴及び個別患者用量調節
ベースライン特徴は、表８に示すように、用量群間でよく釣り合わせた。
【表８】
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【０３５８】
患者の最初の投薬後に用量調整を許した。用量調節は、測定された患者のヘモグロビン（Ｈｇｂ）レベルに依存して、先の用量の±２５％とした。１２週目までに用量調整が行なわれた患者（パーセントで表す）を表９に示す。
【表９】
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【０３５９】
試験の薬力学結果を図１〜４に示す。０〜１２週間でのベースラインからの平均網状赤血球変化を図１に示す。試験０〜１２週目についてベースラインからの平均ヘモグロビン（Ｈｇｂ）変化を図２に示す。用量及び処置継続期間による貧血の補正（Ｈｇｂ＞１１ｇ／ｄＬ）を図３に示す。試験１２〜２２週目についてベースラインからの平均ヘモグロビン（Ｈｇｂ）変化を図４に示す。試験０〜１２週目について０．０５ｍｇ／ｋｇコホートにおける個々の患者に関するベースラインからのヘモグロビン（Ｈｇｂ）変化を図５に示す。
【０３６０】
３．安全性結果
試験中は有害事象及び重篤有害事象を監視した。１１人（１８％）の患者が３６件の有害事象を報告した。全ての事象が試験薬とは無関係と評価された。試験離脱につながる有害事象はなく、注射部位反応は報告されなかった。全ての重篤有害事象が試験薬とは無関係と評価された。
【０３６１】
４．結論
透析前慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）患者は、ペプチドＩにより、皮下注射による月１回の投薬で、効果的に処置することができる。複数回の月１回皮下ペプチドＩ注射は良好な認容性である。月１回の薬物投与により、８週目までに患者における貧血の補正が達成される。この薬物は、慢性腎臓疾患を有する患者に月１回投薬した場合、２２週目までヘモグロビン（Ｈｇｂ）の持続的な増加をもたらす。
【実施例１６】
【０３６２】
固形腫瘍悪性疾患又はリンパ腫に関連する貧血を患っている患者を対象とするフェーズＩＩ複数回投与試験におけるペプチドＩの安全性、認容性、及び薬力学
１．試験方法
３週間ごと（Ｑ３Ｗ）に皮下（ＳＣ）送達で投与される、ペプチドＩ（配列番号２）の複数回投薬の安全性及び薬力学を評価するために、癌を有する患者に対して多施設オープンラベル逐次的用量探索フェーズＩＩ臨床治験を行なった。合計６０人の固形腫瘍悪性疾患又はリンパ腫を有する患者［患者は９週間を越える化学療法を受けており、ベースラインヘモグロビンレベルは８ｇ／ｄＬよりは高いが１１ｇ／ｄＬよりは低く、鉄、葉酸及びＢ１２貯蔵量は十分だった］を、４つの用量コホートに組み入れた。患者は、３週間ごとに１回与えられる最大２回のＳＣ薬物投与を受けた。開始用量は０．０５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１５）、０．１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１５）、０．１５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１５）、及び０．２０ｋｇ／ｍｇ（ｎ＝１５）とした。
【０３６３】
２．平均ベースライン特徴及び薬力学結果
４つの用量コホートにわたって、平均ベースラインヘモグロビン値と、試験を完了した患者のパーセントを、次の表に示す。下記の表１０には、４つの用量コホートにわたる４２人の患者を含む薬力学データセットにおいて、試験の７週目にベースラインヘモグロビンからの≧１ｇ／ｄＬの平均増加を示す患者のパーセントも示す。
【表１０】
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【０３６４】
３．安全性結果
試験中は有害事象及び重篤有害事象を監視した。試験薬とは無関係と評価された有害事象により、３人の患者が試験から離脱した。重篤有害事象により、６人の患者が試験から離脱した。１件の重篤有害事象、すなわち血栓性静脈炎は、おそらく試験薬と関係があるが、重篤有害事象の他の５件の報告は試験薬に原因があるとは考えられなかった。薬物試験の過程で３人の患者が死亡した（２人は疾患の進行による死亡、１人は腎不全による死亡）。どの死亡例も試験薬に原因があるとは考えられなかった。
【０３６５】
４．結論
固形腫瘍悪性疾患又はリンパ腫に関連する貧血を患っていて、化学療法も受けている患者は、ペプチドＩにより、３週間ごとの皮下注射で、効果的に処置することができる。３週間ごとのペプチドＩの皮下注射は良好な認容性であった。ペプチドＩは、試験の７週目までに、試験の患者において、ベースラインヘモグロビンからの≧１ｇ／ｄＬの平均増加をもたらした。
【実施例１７】
【０３６６】
固形腫瘍悪性疾患又はリンパ腫に関連する貧血を患っている患者を対象とするフェーズＩＩ複数回投与試験におけるペプチドＩの安全性、認容性、及び薬力学
１．試験方法
Ｑ３Ｗ ＳＣ送達で投与される、ペプチドＩ（配列番号２）の複数回投薬の安全性及び薬力学を評価するために、癌を有する患者に対して多施設オープンラベル逐次的用量探索フェーズＩＩ臨床治験を行なった。合計６０人の固形腫瘍悪性疾患又はリンパ腫を有する患者［患者は９週間を越える化学療法を受けており、ベースラインヘモグロビンレベルは８ｇ／ｄＬよりは高いが１１ｇ／ｄＬよりは低く、鉄、葉酸及びＢ１２貯蔵量は十分であり、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスは０〜２だった］を、４つの用量コホートに組み入れた。患者は、３週間ごとに１回与えられる少なくとも２回のＳＣ薬物投与を受けた。開始用量は０．０５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１５）、０．１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１５）、０．１５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１５）、及び０．２０ｋｇ／ｍｇ（ｎ＝１５）とした。
【０３６７】
２．平均ベースライン特徴及び薬力学結果
薬力学データセット（ｎ＝４９）には、少なくとも２回のペプチドＩの投薬を受けた患者であって、１回目の投薬時又は１回目の投薬の６週間後の少なくとも２つのヘモグロビン値がわかる患者を含めた。過去２８日間に赤血球輸血を受けていない患者で、ヘモグロビン応答を決定した。４つの用量コホートにわたって試験を完了した患者に関するデモグラフィ特徴及びベースライン特徴を表１１に示す。
【表１１】
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【０３６８】
図６は、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、及び０．２ｍｇ／ｋｇのペプチドＩ（配列番号２）の１回目の投薬後６週間の時点でベースラインから≧１ｇ／ｄＬのヘモグロビンの増加が、それぞれ１７％、７３％、５５％、及び４７％の患者で観察されたことを表している。図７は、試験の１回目の投薬後、６週間目において、≧２ｇ／ｄＬのヘモグロビン増加を示すか、又は≧１ｇ／ｄＬの増加と少なくとも１１ｇ／ｄＬのヘモグロビン値との組合せを示す患者のパーセントが、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、及び０．２ｍｇ／ｋｇ用量コホートにおいて、それぞれ８％、７３％、５５％、及び４０％の患者に見られたことを表している。表１２に示すように、用量の減少及び投薬の遅延は、０．２ｍｇ／ｋｇコホートでは、より頻繁に起こった。
【表１２】
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図８は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、及び０．２ｍｇ／ｋｇ用量コホートの患者が、ベースラインからのヘモグロビンの増加を示したことを表している。
【０３６９】
３．安全性結果
試験中は有害事象及び重篤有害事象を監視した。６０人の患者のうち４５人が有害事象を報告した。最も高頻度に報告された有害事象は、悪心（２２％）、発熱（１２％）、嘔吐（１２％）、貧血（１０％）、呼吸困難（１０％）、便秘（８％）、発熱性好中球減少症（８％）だった。８人の患者（１３％に相当）には、試験薬と関係があると考えられる１つ又はそれ以上の有害事象があった。２人の患者では、以下の５つの事象が起こった：便秘、悪心、嘔吐、血液学的検査異常、及び網状赤血球数の増加。１人の患者は１１の他の関連事象に苦しんだ。
【０３７０】
３７件の重篤有害事象が１８人の患者に報告された。１件の重篤有害事象、すなわち血栓性静脈炎は、おそらく試験薬と関係があるが、他の重篤有害事象の報告は試験薬に原因があるとは考えられなかった。最も高頻度に報告された重篤有害事象には、発熱性好中球減少症（８％）、好中球減少症（５％）、好中球減少性敗血症（５％）、汎血球減少症（５％）、貧血（３％）、及び感染症（３％）が含まれた。薬物試験の過程で起こった重篤有害事象により、３人の患者が死亡した（１人は肺水腫による死亡、1人は疾患の進行による死亡、そして１人は腎不全による死亡）。試験完了後、＞1ヶ月経ってから、胸水及びパフォーマンスステータスの低下とうい重篤有害事象により、４例目の死亡が起こった。どの死亡例も試験薬に原因があるとは考えられなかった。
【０３７１】
４．結論
固形腫瘍悪性疾患又はリンパ腫に関連する貧血を患っていて、化学療法も受けている患者は、ペプチドＩにより、３週間ごとの皮下注射で、効果的に処置することができる。３週間ごとのペプチドＩの皮下注射は良好な認容性であった。ペプチドＩは、骨髄抑制化学療法も受けている腫瘍患者において、３週間ごとに皮下注射によって投与される０．１ｍｇ／ｋｇ及び０．１５ｍｇ／ｋｇの用量で、試験の６週目までに、試験の患者の５０％に、≧１ｇ／ｄＬのヘモグロビンの増加をもたらした。０．１ｍｇ／ｋｇ及び０．１５ｍｇ／ｋｇ用量コホートにおけるヘモグロビンの増加は、９週間及び１２週間にわたって持続的であるようだった。０．０５ｍｇ／ｋｇ用量は、意味のあるヘモグロビンの増加を生じなかったが、ヘモグロビン値はベースライン近くに維持された。０．２ｍｇ／ｋｇ用量コホートの患者の４７パーセント（％）は、６週目までに≧１ｇ／ｄＬのヘモグロビン増加を示したが、これは持続しなかった。０．２ｍｇ／ｋｇ用量コホートでは、０．１ｍｇ／ｋｇ又は０．１５ｍｇ／ｋｇ用量コホートと比較して、経時的に応答率が低くなり平均ヘモグロビンも低くなるという傾向は、いくつかの要因、例えば投薬遅延の数の多さ及び初期の大きなヘモグロビン増加に引き続いて起こる減少などによるものである。
【０３７２】
癌患者におけるペプチドＩ処置のＨｇｂ及び用量解析
化学療法を受けている貧血癌患者における、皮下投与されたペプチドＩの安全性、薬力学、及び薬物動態のオープンラベル多施設用量増量試験を行なった。この試験の目標は、化学療法を受けている貧血癌患者の≧５０％における９週目での≧１ｇ／ｄＬのヘモグロビン増加に関連する、皮下（ＳＣ）注射によって３週間ごとに投与されるペプチドＩの用量を決定することだった。この試験の時間枠は約１３週間だった。試験の結果は、試験した３つの癌タイプ、すなわち乳癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、及び前立腺癌で結果をグループ分けした表１３に示すように、要約することができる。さらなる詳細を以下に考察し、表１４〜１６に提示する。
【表１３】
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【０３７３】
試験の他の測定には次の項目を含めた：（１）同時に骨髄抑制化学療法を受けている癌患者に３週間ごとに皮下投与されるペプチドＩの４回までの投薬の安全性プロファイルの評価、（２）化学療法を受けている貧血癌患者における、ペプチドＩの異なる用量レベルでの、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）のベースラインからの変化の決定、（３）ペプチドＩに対してＨｇｂ応答を示す患者の比率の決定、（４）化学療法を受けている貧血癌患者においてヘモグロビンを１１〜１３ｇ／ｄＬの標的範囲に増加させてその範囲に維持する、皮下投与されるペプチドＩの決定、（５）化学療法を受けている貧血癌患者において皮下投与されるペプチドＩの４回までの投薬の薬物動態プロファイルの評価（試験患者のサブセットにおける評価）、（６）活性用量のペプチドＩにおける投薬頻度の効果の調査、及び（７）活性用量のペプチドＩにおける非経口鉄補充の効果の調査。
【０３７４】
この試験に関する患者選択基準は次のとおりとした：（１）患者には、この試験の研究的性質が告げられ、施設、現地、及び国家のガイドラインに従って、文書による、証人の署名がなされたインフォームド・コンセントが患者から得られていること；（２）年齢が≧１８歳且つ≦８０歳の男性又は女性；閉経前の女性（手術によって不妊となった人は除く）はスクリーニング時に妊娠検査陰でなければならない；性的に活発な人は試験開始前の少なくとも２週間は有効性の高い産児制限方法を実行しなければならず、試験薬の最後の投薬後少なくとも４週間は産児制限を実行し続ける意志がなければならない。有効性の高い産児制限方法とは、一貫して正しく使用した場合に低い失敗率（すなわち年間１％未満）をもたらすものと定義され、例えばインプラント、注射剤、混合経口避妊薬、いくつかのＩＵＤ、禁欲（ライフスタイルとして実行される場合にのみ許容することができ、性的に活発な人が試験の継続期間のみ禁欲を実行する場合には許容することができない）、又は精管切除術を受けたパートナーなどである；（３）組織学的に確認された固形腫瘍悪性疾患又はリンパ腫を有し、試験中に少なくとも９週間の周期的骨髄抑制化学療法を受ける予定になっている患者；（４）試験薬の投与前１週間以内に≧８且つ≦１１ｇ／ｄＬのヘモグロビン値；（５）０〜２のＥＣＯＧパフォーマンスステータス；（６）試験薬投与前４週間以内に１回の網状赤血球ヘモグロビン含量（ＣＨｒ）＞２９ｐｇ；（７）試験薬投与前４週間以内に１回のトランスフェリン飽和度≧１５％；（８）試験薬投与前４週間以内に１回の、正常値の下限を上回る血清又は赤血球葉酸レベル；（９）試験薬投与前４週間以内に１回の、正常値の下限を上回るビタミンＢ１２レベル；（１０）試験薬投与前１週間以内に１回の絶対好中球数＞１．０×１０９／Ｌ；（１１）試験薬投与前１週間以内に１回の血小板数＞７５×１０９／Ｌ；及び（１２）平均余命＞６ヶ月。
【０３７５】
患者が治験責任医師によって鉄不足とみなされ、ＩＶ鉄補充が必要な場合は、ヘモグロビンが前週から０．５ｇ／ｄＬを上回る増加を示さなくなるまで、その患者を、毎週、再スクリーニングした（鉄投与の７日後以降）。
【０３７６】
患者除外基準には次の項目を含めた：（１）過去９０日に何らかの赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）による処置；（２）ＥＳＡ処置に応答できなかった病歴；（３）他のＥＳＡに対する既知の抗体又は赤芽球癆（ＰＲＣＡ）の病歴；（４）急性若しくは慢性白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、又は多発性骨髄腫；（５）骨盤又は脊椎のいずれか一方の５０％以上に対する過去の放射線治療又はそのような放射線治療の予定；（６）非経口鉄補充に対する既知の不耐性；（７）試験薬投与前４週間以内の赤血球（ＲＢＣ）輸血；（８）既知の異常ヘモグロビン症（例えばホモ接合鎌状赤血球症、あらゆるタイプのサラセミアなど）；（９）既知の溶血；（１０）過去２年間に肺塞栓症若しくはＤＶＴの病歴、又は現時点における抗凝固薬の治療的投薬；（１１）貧血の原因としての既知の失血；（１２）制御されない又は症候性の炎症性疾患（例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）；（１３）ＡＳＴ又はＡＬＴ＞（正常値の上限の２．５倍）；肝転移が存在する場合はＡＳＴ又はＡＬＴ＞（正常値の上限の５倍）；（１４）クレアチニン＞１７５μｍｏｌ／Ｌ；（１５）骨髄又は末梢血細胞移植の病歴；（１６）試験薬投与前４８時間以内の発熱／高熱≧３９℃；（１７）試験薬投与前４週間以内にコントロール不良の高血圧（治験責任医師の判断による）（例えば反復測定で収縮期圧≧１７０ｍｍＨｇ又は拡張期圧≧１００ｍｍＨｇ）；（１８）試験薬投与前６ヶ月にてんかん発作；進行慢性うっ血性心不全−ニューヨーク心臓学会クラスＩＶ；（１９）試験の早期離脱又は中断の高い可能性（例えば過去３ヶ月以内の心筋梗塞；重症又は不安定冠状動脈疾患；脳卒中；呼吸異常、自己免疫異常、精神神経異常又は神経異常；肝疾患、活動性Ｂ型又はＣ型肝炎を含む；活動性ＨＩＶ疾患；又は過去６ヶ月以内の他の任意の臨床的に有意な医学的疾患又は状態であって、治験責任医師の見解によれば、その患者の評価又は経過観察を妨害しうるもの）；（２０）試験期間中に予期される待機手術；（２１）多剤アレルギーの病歴；（２２）試験薬の投与前１ヶ月以内の何らかの治験薬へのばく露、又は試験期間中の受容の予定。
【０３７７】
表１４〜１６に癌の群別に臨床結果を記載する。データには、ヘモグロビン濃度（各表の上部分）と、ペプチドＩに関する投薬情報（各表の下部分）が含まれる。これらの表で使用する略号は次のとおりである：「Ｈｇｂ」はＨｇｂ濃度（単位ｇ／ｄＬ）を指す；
「ｎ」は観察数を示す；「ｓｔｄ」は標準偏差を指す。「タキサン」は、その患者がタキサン系化学療法剤で処置されていたことを示す。「非タキサン」は、その患者が非タキサン系化学療法剤で処置されていたことを示す。空欄は、データが得られなかったこと、又は投薬が行なわれなかったことを示す。
【表１４−１】
2010536858.tif 000103
【表１４−２】
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【表１５】
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【表１６】
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【０３７８】
［配列表］
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Pro Leu Arg Lys 
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Xaa Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Ile Thr Xaa Val Cys Gln 
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Pro Leu Arg Xaa Lys 
20      
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<223>  synthetic protein
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<223>  Xaa is N-methylglycine
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Xaa Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Ile Thr Xaa Val Cys Gln 
1               5                   10                  15      
Pro Leu Arg Xaa 
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Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Gln 
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Pro Leu Arg Gly 
20  
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Xaa Gly Leu Tyr Ala 
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Leu Arg Xaa 
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1               5                   
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Xaa Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Ile Thr Xaa Val Cys Gln 
1               5                   10                  15      
Pro Leu Arg Xaa 
20  
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<213>  artificial
<220>
<223>  synthetic peptide
<220>
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<220>
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Pro Leu Arg Xaa 
20  
<210>  13
<211>  20
<212>  PRT
<213>  artificial
<220>
<223>  synthetic peptide
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<222>  (1)..(1)
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<220>
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<222>  (4)..(4)
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<220>
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<220>
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<221>  MISC_FEATURE
<222>  (19)..(19)
<223>  side chain Pbf protected
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (20)..(20)
<223>  Xaa is N-methylglycine
<400>  13
Xaa Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Ile Thr Xaa Val Cys Gln 
1               5                   10                  15      
Pro Leu Arg Xaa 
20  
*                *               *
【０３７９】
本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態によって、その範囲を限定されないものとする。実際、本明細書に記載された実施形態の他にも、本発明のさまざまな変更実施形態が、上述の説明及び添付の図面から、当業者には明白になるだろう。そのような変更実施形態は、添付の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【０３８０】
また、全ての値は近似値であり、説明のために記載されていると理解すべきである。
【０３８１】
数多くの参考文献、例えば特許、特許出願、及び種々の刊行物が、本発明の説明では引用され、考察される。そのような参考文献の引用及び／又は考察は、単に本発明の説明を明解にするためになされたものであり、そのような参考文献のいずれかが本発明の「先行技術」であるという承認ではない。本明細書において引用し考察する参考文献は全て、各参考文献が個別に参照により本明細書に組み込まれた場合と同じ程度に、参照によりその全体が、本明細書に組み込まれる。
【図１】
2010536858.tif 000109
【図２】
2010536858.tif 000110
【図３】
2010536858.tif 000111
【図４】
2010536858.tif 000112
【図５】
2010536858.tif 000113
【図６】
2010536858.tif 000114
【図７】
2010536858.tif 000115
【図８】
2010536858.tif 000116
【配列表】
2010536858000001.xml
【国際調査報告】
2010536858.tif 000134