(57)【要約】  本発明は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）と２’−デオキシイノシン（ｄ−Ｉｎｏ）とを共カプセル化するリポソームを含んでなる医薬組成物を提供する。好適な実施形態では、リポソームは、好ましくは、２０〜８０／１０〜６０／１５〜６０のＰＣ／ＰＧ／ステロールモル比で、ホスファチジルコリン（ＰＣ）と、ホスファチジルグリコール（ＰＧ）と、ステロールとを含んでなる。本発明は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）と２’−デオキシイノシン（ｄ−Ｉｎｏ）とを共カプセル化するリポソームを調製する方法、および患者における癌を治療するための医薬品を製造するためのその使用をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）と２’−デオキシイノシン（ｄ−Ｉｎｏ）とを共カプセル化するリポソームを含んでなる医薬組成物。
【請求項２】
前記リポソームが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）と、ホスファチジルグリコール（ＰＧ）とステロールとを含んでなる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記リポソームが、２０〜８０／１０〜６０／１５〜６０のＰＣ／ＰＧ／ステロールモル比でホスファチジルコリン（ＰＣ）と、ホスファチジルグリコール（ＰＧ）と、ステロールとを含んでなる、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記リポソームが、３０〜５０／２０〜３０／２０〜４０のＰＣ／ＰＧ／ステロールモル比を含んでなる、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記リポソームが、３５〜４５／２４〜２８／２４〜３８のＰＣ／ＰＧ／ステロールモル比を含んでなる、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ステロールがコレステロールである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記リポソーム膜の外側にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含んでなる、請求項２〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記リポソームが、２０〜８０／１０〜６０／１５〜６０／０．３０〜１．５のＰＣ／ＰＧ／ステロール／ＰＥＧモル比でホスファチジルコリン（ＰＣ）と、ホスファチジルグリコール（ＰＧ）と、ステロールと、ＰＥＧとを含んでなる、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記リポソームが、４０／２６／３３／０．６８のＰＣ／ＰＧ／コレステロール／ＰＥＧモル比を含んでなる、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記リポソームが、５０〜２００ｎｍの間の平均粒径を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記リポソームが、フォリン酸をさらにカプセル化する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
（ａ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）と、ホスファチジルグリコール（ＰＧ）と、ステロールとを含んでなる脂質混合物をアルコール溶媒に溶解し、そして前記溶媒を取り出して、脂質膜を形成させること；
（ｂ）５−フルオロウラシルと２’−デオキシイノシンとを含有する溶液で前記脂質膜を水和させて、脂質分散体を形成させること；
（ｃ）前記脂質分散体を混合することによって、多層ベシクル（ＭＬＶ）を形成させること；
（ｄ）音波処理によって、そこから小さな単層ベシクル（ＳＵＶ）を得ること、
からなる工程を含んでなる、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）と２’−デオキシイノシン（ｄ−Ｉｎｏ）とを共カプセル化するリポソームを調製する方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）の前記溶液が、フォリン酸をさらに含んでなり、それによって、５−ＦＵと、ｄ−Ｉｎｏと、フォリン酸とを共カプセル化するリポソームが調製される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の方法によって得られるリポソーム。
【請求項１５】
患者における癌を治療するための医薬品を製造するための、請求項１〜１１、または１４のいずれか一項に記載のリポソームの使用。
【請求項１６】
前記患者が、５−ＦＵまたは別のフルオロピリミジン薬物に対して化学療法抵抗性を示している、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の化学療法において有用である５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を含んでなるリポソーム組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、５０年間使用されているという事実にもかかわらず、世界の癌の死亡原因の第３位である大腸癌の化学療法として、依然として最も信頼できる基準である。単剤療法として使用した場合の奏功率は２０％に過ぎず、基礎研究および臨床の両面から、その治療係数を改善するための多くの試みが行われている。５−ＦＵは、ＤＮＡ合成および細胞増殖に必須の酵素であるチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）を標的にするように合理的に設計された；しかし、その抗腫瘍特性を担う生化学的特性は複雑であり、そして実際には、癌細胞内でこのプロドラックから特定の５−ＦＵヌクレオチドへの同化を必要とする。その代謝活性化に関与するいくらかの酵素は、終局的に、活性な細胞障害性のヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドの形成をもたらす（非特許文献１）。しかし、５−ＦＵ細胞障害性の主な機構は、競合的５−フルオロ−２−デオキシウリジン−５−一リン酸（ＦｄＵＭＰ）の形成であり、それによって、ＴＳ活性を阻害し、続いて、細胞内チミジンの枯渇、ＤＮＡ合成の抑制、および究極的に、アポトーシスの誘導を伴う（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。ＴＳの過剰発現は、大腸癌患者における５−ＦＵ耐性に関連することが実証されている（非特許文献５；非特許文献６）。この点に関して、ＴＳ  ＦｄＵＭＰ合成の阻害に対して優先的に５−ＦＵ活性化のパターンを制御することが、その抗癌効力を最大にするための主な目標である。
【０００３】
腫瘍内ＦｄＵＭＰを生じるプロセスの主要な酵素は、ＤＮＡ経路を介する５−ＦＵの活性化の律速酵素であるチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）である（非特許文献７、非特許文献８）。腫瘍のＴＰレベルを上げるための試みが、「自殺遺伝子」ストラテジーを使用すること（非特許文献９および非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献７）、ＩＦＮのようなモジュレーター、タキソイド系の薬物、マイトマイシンＣ、または放射線療法によって腫瘍細胞を同時処置すること（非特許文献１２、非特許文献１３）のいずれかによって、５−ＦＵまたは経口５−ＦＵ（カペシタビン）に対する細胞感受性を改善する努力において、公開されている。推定モジュレーターとして試験された多数の化合物のうち、２’−デオキシイノシン（ｄ−Ｉｎｏ）は、ＴＰ補因子、デオキシリボース１−リン酸の非毒性前駆体であり、単独で使用する場合、またはＴＰを標的にする遺伝子治療ストラテジーと組み合わせた場合のいずれにおいても、いくらかのインビトロおよびインビボモデルで５−ＦＵの抗増殖活性を増強することが示されている（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献７、非特許文献１６）。これまで、赤血球で多量に代謝されること、およびその薬物動態プロファイルの改善がなされていないことから、ｄ−Ｉｎｏは、５−ＦＵの可能なモジュレーターとして臨床的に考慮されることはなかった。初めてｄ−Ｉｎｏ単独をカプセル化した製剤（ｄ−ＩｎｏＬ）は、ｄ−Ｉｎｏが赤血球クリアランスから免れるように設計された（非特許文献１７）。
【０００４】
本発明者らは、今回、５−ＦＵの治療係数を増強する５−ＦＵおよびそのモジュレーター、ｄ−Ｉｎｏの両方をカプセル化する二重リポソーム製剤を開発することに成功した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Boyer J, McLean EG, Aroori S, Wilson P, McCulla A, Carey PD, Longley DB, Johnston PG (2004) Characterization of p53 wild-type and null isogenic colorectal cancer cell lines resistant to 5-fluorouracil, oxaliplatin, and irinotecan. Clin Cancer Res 10: 2158-2167.
【非特許文献２】Pinedo HM, Peters GJ (1988) Fluorouracil: biochemistry and pharmacology. J Clin Oncol 6: 1653-1664.
【非特許文献３】Diasio RB, Harris BE (1989) Clinical pharmacology of 5-fluorouracil. Clin Pharmacokinet 16: 215-237.
【非特許文献４】Langley DB, Harkin DP, Johnston PG (2003), 5-fluorouracil mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer 3: 330-338.
【非特許文献５】Johnston PG, Lenz HJ, Leichman CG, Danenberg KD, Allegra CJ, Danenberg PV, Leichman L (1995) Thymidylate synthase gene and protein expression correlate and are associated with response to 5-fluorouracil in human colorectal and gastric tumors. Cancer Res 55: 1407-1412.
【非特許文献６】Peters GJ, Backus HH, Freemantle S, van Triest B, Codacci-Pisanelli G, van der Wilt CL, Smid K, Lunec J, Calvert AH, Marsh H, McLeod HL, Bloemena E, Meijer s, Jansen G, van Groeningen CJ, Pinedo HM (2002) Induction of thymidylate synthase as a 5-fluorouracil resistance mechanism. Biochim Biophys Acta 1587: 194-205.
【非特許文献７】Ciccolini J, Cuq P, Evrard A, Giacometti S, Pelegrin A, Aubert C, Cano JP, Iliadis A (2001) Combination of thymidine phosphorylase gene transfer and deoxyinosine treatment greatly enhances 5-fluorouracil antitumor activity in vitro and in vivo. Mol Cancer Ther 1: 133-9.
【非特許文献８】De Bruin M, van Capel T, Smid K, van der Born K, Fukushima M, Hoekman K, Pinedo HM, Peters GJ (2004) Role of platelet derived endothelial cell growth factor/thymidine phosphorylase in fluoropyrimidine sensitivity and potential role of deoxyribose-1-phosphate. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 23: 1485-90.
【非特許文献９】Schwartz EL, Baptiste N, Megati S, Wadler S, Otter BA (1995a) 5-Ethoxy-2’-deoxyuridine, a novel substrate for thymidine phosphorylase, potentiates the antitumor activity of 5-fluorouracil when used in combination with interferon, an inducer of thymidine phosphorylase expression. Cancer Res 55: 3543-50.
【非特許文献１０】Schwartz EL, Baptiste N, Wadler S, Makower D (1995b) Thymidine phosphorylase mediates the sensitivity of human colon carcinoma cells to 5-fluorouracil. J Biol Chem 270: 19073-7.
【非特許文献１１】Evrard A, Cuq P, Ciccolini J, Vian L, Cano JP (1999) Increased cytotoxicity and bystander effect of 5-fluorouracil and 5-deoxy-5-fluorouridine in human colorectal cancer cells transfected with thymidine phosphorylase. Br J Cancer 80: 1726-33.
【非特許文献１２】Ciccolini J, Evrard A, Cuq P (2004) Thymidine phosphorylase and fluoropyrimidines efficacy: a Jekyll and Hyde story. Curr Med Chem Anticancer Agents 4: 71-81.
【非特許文献１３】Blanquicett C, Saif MW, Buchsbaum DJ, Eloubeidi M, Vickers SM, Chhieng DC, Carpenter MD, Sellers JC, Russo S, Diasio RB, Johnson MR (2005) Antitumor efficacy of capecitabine and celecoxib in irradiated and lead-shielded, contralateral human BxPC-3 pancreatic cancer xenografts: clinical implications of abscopal effects. Clin Cancer Res 11:8773-81.
【非特許文献１４】Ciccolini J, Peillard L, Aubert C, Formento P, Milano G, Catalin J (2000a) Monitoring of the intracellular activation of 5-fluorouracil to deoxyribonucleotides in HT29 human colon cell line: application to modulation of metabolism and cytotoxicity study. Fundam Clin Pharmacol 14: 147-54.
【非特許文献１５】Ciccolini J, Peillard L, Evrard A, Cuq P, Aubert C, Pelegrin A, Formento P, Milano G, Catalin J (2000b) Enhanced antitumor activity of 5-fluorouracil in combination with 2’-deoxyinosine in human colorectal cell lines and human colon tumor xenografts. Clin Cancer Res 6: 1529-35.
【非特許文献１６】Fanciullino R, Evrard A, Cuq P, Giacometti S, Peillard L, Mercier C, Aubert C, Milano G, Ciccolini J (2006) Genetic and biochemical modulation of 5-fluorouracil through the overexpression of thymidine kinase: an in-vitro study. Anticancer Drugs 17:463-70.
【非特許文献１７】Fanciullino R, Giacometti S, Aubert C, Fina F, Martin PM, Piccerelle P, Ciccolini J (2005) Development of stealth liposome formulation of 2’-deoxyinosine as 5-fluorouracil modulator: in vitro and in vivo study. Pharm Res 22: 2051-7.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）と２’−デオキシイノシン（ｄ−Ｉｎｏ）とを共カプセル化するリポソームを含んでなる医薬組成物を提供する。
【０００７】
好適な実施形態では、リポソームは、好ましくは、２０〜８０／１０〜６０／１５〜６０のＰＣ／ＰＧ／ステロールモル比で、より好ましくは、３０〜５０／２０〜３０／２０〜４０のＰＣ／ＰＧ／ステロールモル比で、なおより好ましくは、３５〜４５／２４〜２８／２４〜３８のＰＣ／ＰＧ／ステロールモル比で、ホスファチジルコリン（ＰＣ）と、ホスファチジルグリコール（ＰＧ）と、ステロールとを含んでなる。
【０００８】
有利には、ステロールは、コレステロールであってもよい。
【０００９】
組成物は、リポソーム膜の外側にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含んでなり得る。
【００１０】
好ましくは、リポソームは、２０〜８０／１０〜６０／１５〜６０／０．３０〜１．５のＰＣ／ＰＧ／ステロール／ＰＥＧモル比でホスファチジルコリン（ＰＣ）と、ホスファチジルグリコール（ＰＧ）と、ステロールと、ＰＥＧとを含んでなる。
【００１１】
最も好適な実施形態では、リポソームは、４０／２６／３３／０．６８のＰＣ／ＰＧ／コレステロール／ＰＥＧモル比を含んでなる。
【００１２】
本発明は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）と２’−デオキシイノシン（ｄ−Ｉｎｏ）とを共カプセル化するリポソームを調製する方法、および患者における癌を治療するための医薬品を製造するためのその使用をさらに提供する。
【００１３】
医薬品は、５−ＦＵまたは別のフルオロピリミジン薬物に対して化学療法抵抗性を示す患者において特に有用であり得る。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
薬剤耐性は、広範に処方される代謝拮抗剤、５−ＦＵによるものも含む癌の化学療法において、処置不良の主な原因である。本発明者らは、５−ＦＵと生化学的モジュレーターとを組み合わせて、その腫瘍活性化を改善し、そして１つの同じステルスリポソームにこれらの両方の薬剤をカプセル化するダブルパンチストラテジーを使用することによって、５−ＦＵ耐性を反転することを提案する。
【００１５】
高度に耐性の標準的なＳＷ６２０ヒト大腸モデルに行われた実験では、これらの細胞を本発明のリポソーム製剤で処置した場合、５−ＦＵに対して８０％までの感受性が示された。この製剤による結果は、３０％高い腫瘍薬物の取り込み、極めて重要なＦｄＵＭＰを含む増加した活性代謝物によるより良好な活性化、腫瘍チミジル酸シンターゼのより優れた阻害（９８％）、および続いて、初期および後期アポトーシスの両方のより高い誘導を実証した。薬物モニタリングは、より高いかつ持続性の暴露が、リポソーム製剤で処置したラットにおいて達成されたことを示した。異種移植動物モデルにおいて試験した場合、標準的な５−ＦＵでは、有意な抗増殖活性を示すことも、また腫瘍を有するマウスの寿命を増加させることもできなかったが、本発明の二重薬剤リポソーム製剤では、腫瘍サイズが７４％減少し、生存期間が平均で２倍になった。
【００１６】
本発明に使用するために適切なリポソームとして、大きな単層ベシクル（ＬＵＶ）、多層ベシクル（ＭＬＶ）、小さな単層ベシクル（ＳＵＶ）および嵌合−融合リポソームが挙げられ、最も好ましくは、それらは、小さな単層ベシクル（ＳＵＶ）である。
【００１７】
好ましくは、本発明のリポソームは、コレステロールのようなステロールを含有する。コレステロールが３０ｍｏｌ％存在すると、脂質の相転移特徴を有意に改変し、そして組み入れられたコレステロールは、膜硬化を可能にする。
【００１８】
本発明のリポソームはまた、治療用脂質を含有してもよく、そのような脂質の例として、エーテル脂質、ホスファチジン酸、ホスホネート、セラミドおよびセラミド類似体、スフィンゴシンおよびスフィンゴシン類似体、ならびにセリン含有脂質が挙げられる。
【００１９】
また、リポソームを、ポリエチレングリコール−ＤＳＰＥのような表面安定化親水性ポリマー−脂質で調製して、循環寿命を増大させてもよい。ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のような負に荷電した脂質の組み入れもまた、リポソーム製剤に追加して、キャリアの循環寿命を増加させてもよい。
【００２０】
有効因子（即ち、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）および２’−デオキシイノシン（ｄ−Ｉｎｏ））をリポソームにカプセル化するために、様々な方法を利用することができる。
【００２１】
「カプセル化」には、薬剤と脂質基剤の送達媒体との共有結合または非共有結合が含まれる。例えば、これは、薬剤と、リポソームの外層もしくは複数の外層との相互作用、またはリポソーム内での薬剤の捕捉によるものとすることができ、そのときリポソームの異なる部分間で平衡状態に達する。それ故、薬剤のカプセル化は、脂質成分との共有結合もしくは非共有結合的相互作用を介するか、またはリポソームの水性内部への捕捉を介するか、あるいは内部水相と二分子膜との間の平衡状態において、薬剤が、リポソームの二分子膜との相互作用によって会合することによるものとすることができる。「充填」とは、１以上の薬剤を送達媒体にカプセル化する行為をいう。
【００２２】
治療用薬剤を、受動的および能動的充填方法の両方を使用して、リポソームに充填してもよい。有効因子をリポソームにカプセル化する受動的方法には、リポソームの調製中に薬剤をカプセル化することが含まれる。これには、Bangham, et al. (J. Mol. Biol. (1965) 12 : 238)に記載の受動的捕捉方法が含まれる。この技術により、押し出し成形時に大きな単層ベシクル（ＬＵＶ）または小さな単層ベシクル（ＳＵＶ）に変換することができる多層ベシクル（ＭＬＹ）の形成が生じる。受動的カプセル化のさらなる適切な方法として、Deamer and Bangham (1976)に記載のエーテル注入技術、およびSzoka and Paphadjopoulos (1978)に記載の逆相蒸発技術が挙げられる。
【００２３】
カプセル化の能動的方法として、U. S. patent No. 5,616,341、U. S. patent No. 5,736,155およびU. S. patent No. 5,785,987に記載のｐＨ勾配充填技術ならびに能動的金属充填が挙げられる。ｐＨ勾配充填の好適な方法は、４．０のｐＨで内部緩衝液としてクエン酸、および中性の外部緩衝液を利用するクエン酸に基づく充填方法である。
【００２４】
リポソームを横断するｐＨ勾配を確立および維持するために用いられる他の方法には、リポソーム膜に挿入することができ、そしてプロトンとの交換で膜を横断してイオンを輸送することができるイオノフォアの使用が含まれる（U. S. patent No. 5,837, 282を参照のこと）。また、イオノフォアの非存在下で、錯体化を介して薬剤のリポソームへの取り込みを推進するために遷移金属を利用する最近の技術を使用してもよい。この技術は、薬物の取り込みを推進するために、ｐＨ勾配の確立ではなく、薬物−金属錯体の形成に依存する。
【００２５】
金属に基づく能動的充填は、典型的に、（受動的に充填された治療用薬剤を伴うまたは伴わずに）受動的にカプセル化された金属イオンと共にリポソームを使用する。金属イオンの様々な塩が使用されるが、これらの塩は、薬学的に許容でき、かつ水溶液に可溶性であるであるという仮定に立っている。能動的に充填される薬剤は、金属イオンと錯体を形成することが可能であること、それ故、リポソーム内でそのような錯体形成がなされた場合、保持されること、さらに、金属イオンに錯体形成されない場合、リポソームに充填することが可能であることに基づいて選択される。金属に配位可能な薬剤は、典型的に、アミン、カルボニル基、エーテル、ケトン、アシル基、アセチレン、オレフィン、チオール、ヒドロキシルもしくはハライド基、または電子を金属イオンに供与することによって、金属イオンと錯体を形成することが可能な他の適切な基のような配位部位を含んでなる。
【００２６】
また、本発明のリポソーム製剤を調製するために、捕捉の受動的方法と能動的方法とを連結してもよい。
【００２７】
各リポソームにおける５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）対２’−デオキシイノシン（ｄ−Ｉｎｏ）の比は、一般的に、モルで約１：１、または１：１〜１．５である。
【００２８】
好適な実施形態では、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）と２’−デオキシイノシン（ｄ−Ｉｎｏ）とを共カプセル化するリポソームを調製する方法は、以下からなる工程を含んでなる。
（ａ）ホスファチジルコリン（ＰＣ）と、ホスファチジルグリコール（ＰＧ）と、ステロールとを含んでなる脂質混合物をアルコール溶媒に溶解し、そして溶媒を取り出して、脂質膜を形成させること；
（ｂ）５−フルオロウラシルと２’−デオキシイノシンとを含有する溶液で脂質膜を水和させて、脂質分散体を形成させること；
（ｃ）脂質分散体を混合することによって、多層ベシクル（ＭＬＶ）を形成させること；
（ｄ）音波処理によって、そこから小さな単層ベシクル（ＳＵＶ）を得ること。
【００２９】
上記の方法では、５−フルオロウラシルおよび２’−デオキシイノシンを含有する溶液は、好ましくは、炭酸緩衝液ｐＨ７．４を含有する。
【００３０】
特定の実施形態では、リポソームは、フォリン酸をさらにカプセル化する。
【００３１】
フォリン酸は、テトラヒドロ葉酸の５−ホルミル誘導体であり、そしてまた、ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎとしても公知である。
【００３２】
５−Ｆｕ、ｄ−Ｉｎｏ、およびフォリン酸を共カプセル化するリポソームは、上記の方法によって得ることができ、ここで、工程（ｂ）の溶液は、フォリン酸をさらに含んでなる。
【００３３】
５−Ｆｕ、ｄ−Ｉｎｏ、およびフォリン酸を共カプセル化するリポソームはまた、２０〜８０／１０〜６０／１５〜６０のＰＣ／ＰＧ／ステロールモル比でホスファチジルコリン（ＰＣ）と、ホスファチジルグリコール（ＰＧ）と、ステロールとを含んでなり得る。リポソームは、好ましくは、約２６／１６．７／２１／０．４４のＰＣ／ＰＧ／コレステロール／ＰＥＧモル比を含んでなる。
【００３４】
好ましくは、本発明のリポソームは、３００ｎｍ未満の平均粒径を有する。最も好ましくは、リポソームは、２００ｎｍ未満の平均粒径、好ましくは、５０ｎｍ〜２００ｎｍの間の平均粒径を有する。腫瘍脈管構造は、一般的に、内皮における開窓または間隙により正常な脈管構造よりも漏出性が大きい。このため、直径２００ｎｍ以下の送達媒体は、不連続な内皮細胞層、およびその下側にあって、血液を腫瘍に供給する血管周囲の基底膜にまで透過することが可能である。血管外遊走後に送達媒体が腫瘍部位へ選択的に蓄積することにより、抗癌薬の送達および治療有効性が増大する。
【００３５】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、非経口的、即ち、動脈内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内に投与される。より好ましくは、医薬組成物は、大量瞬時投与によって、静脈内または腹腔内に投与される。例えば、Rahman, et al., U. S. patent No. 3,993, 754；Sears, U. S. patent No. 4,145, 410；Papahadjopoulos, et al., U. S. patent No. 4,235, 871；Schneider, U. S. patent No. 4,224, 179；Lenk, et al., U. S. patent No. 4,522, 803；およびFountain, et aL, U. S. patent No. 4, 588, 578を参照のこと。
【００３６】
他の方法では、本発明の医薬組成物は、組織に組成物を直接適用することによって、標的組織と接触させることができる。
【００３７】
医薬組成物は、水、緩衝水、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン、５％デキストロースなどを含む薬学的に許容できる賦形剤をさらに含んでなり得、安定性を増強するための糖タンパク質、例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどを含む。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって、滅菌してもよい。得られる水溶液は、使用のために包装してもよく、または無菌条件下でろ過し、そして凍結乾燥してもよく、凍結乾燥した調製物は、投与の前に滅菌水溶液と組み合わされる。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｄｊｕｓｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）などのような適切な生理学的条件に必要な薬学的に許容できる補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどを含有してもよい。
【００３８】
さらに、送達媒体懸濁液は、貯蔵時のフリーラジカルおよび脂質過酸化損傷に対して脂質を保護する脂質保護剤を含んでもよい。α−トコフェロールのような脂質親和性のフリーラジカル消去剤およびフェリオキサミンのような水溶性鉄特異的キレーターが適切である。
【００３９】
医薬組成物のリポソームの濃度は、例えば、約０．０５重量％未満から、通常、約２〜５重量％または少なくとも約２〜５重量％、多い時で１０〜３０重量％まで幅広く変動させることができ、そして主として、選択される特定の投与形態に応じて、液量、粘度などによって選択されるであろう。例えば、治療に伴う液体充填量を低減させるために、濃度を増加させてもよい。
【００４０】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、静脈内に投与される。送達媒体製剤の用量は、薬物対脂質の比、および患者の年齢、重量、および状態に基づく医師の見解に依存するであろう。同じリポソームにおいて５−ＦＵとｄ−ＩＮＯとを組み合わせると、５−ＦＵを単独で使用した場合に必要な用量と比較して、５−ＦＵを減少させることが可能になる。例えば、静脈内輸注では、５日間以下の期間中、１時間３０分間における２５０ｍｌの５％グルコース血清（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｅｒｕｍ）中３００ｍｇ未満／ｍ２／日、好ましくは、１５０ｍｇ未満／ｍ２／日のレジメンが提案される。
【００４１】
本発明の組成物は、いずれの哺乳動物、特にヒトに投与することができる。
【００４２】
本発明のリポソーム組成物は、好ましくは、癌、好ましくは、大腸癌、乳癌または頭頚部癌を含む固形癌を処置するために使用される。有利なことに、標的にされる癌は、チミジル酸シンターゼを過剰発現する５−ＦＵ耐性の大腸癌、乳癌または頭頚部癌のような薬物耐性固形癌である。本発明のリポソーム組成物はまた、カペシタビン、ＵＦＴ、ｆｔｏｒａｆｕｒ、またはＳ１のような別のフルオロピリミジンに対して化学療法抵抗性を示す癌患者においても有用であり得る。
【００４３】
以下の図面および実施例は、例示のために付与されるものであって、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】リポソーム［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌ型からのｄ−Ｉｎｏ（◆）および５−ＦＵ（□）放出のモニタリング。ｄ−Ｉｎｏおよび５−ＦＵ濃度を２４８ｎｍで測定した。棒線：標準偏差。
【図２】遊離のｄ−Ｉｎｏ（■）によるかまたは共カプセル化［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌ型（▲）としての５−ＦＵ（◇）細胞障害性のモジュレーション。細胞を２４時間処置し、そして薬物を含まない培地における４８時間の別の増殖後、生存能をＭＴＴ試験によって測定した。棒線：標準偏差。
【図３】単独形態、遊離のｄ−Ｉｎｏに随伴させた形態、またはリポソーム［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌの組み合わせとしての形態のトリチウム化５−ＦＵの腫瘍内活性化のモニタリング。データは、１つの代表的な実験由来のものである。ＦＵＨ２：ジヒドロフルオロウラシル、ＦＵＲｄ：フルオロウリジン、ＦＵＭＰ：フルオロウリジン一リン酸、ＦＵＤＰ：フルオロウリジン二リン酸、ＦＵＴＰ：フルオロウリジン三リン酸、ＦｄＵＲｄ：フルオロデオキシウリジン、ＦｄＵＭＰ：フルオロデオキシウリジン一リン酸、ＦｄＵＤＰ：フルオロデオキシウリジン二リン酸、ＦｄＵＴＰ：フルオロデオキシウリジン三リン酸。
【図４】単独形態、遊離のｄ−Ｉｎｏと組み合わせた形態、またはリポソーム｜５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌ会合を伴う形態の５−ＦＵによるＴＳ阻害の強化。細胞を、単独形態、２５０μＭのｄ−Ｉｎｏとの組み合わせの形態、またはカプセル化会合形態で１００μＭの５−ＦＵに２４時間暴露した。
【図５】単独形態、遊離のｄ−Ｉｎｏと組み合わせた形態、またはリポソーム｜５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌ会合を伴う形態の５−ＦＵによる細胞死阻害。細胞を、単独形態、または２５０μＭのｄ−Ｉｎｏに随伴させた形態の１００μＭの５−ＦＵに２４時間暴露した。ＰＩ染色およびフローサイトメトリー分析の４８および７２時間後、細胞死を測定した。
【図６】５−ＦＵ−誘導性アポトーシスの増強。ＳＷ６２０を、単独形態または２５０μＭのｄ−Ｉｎｏ（遊離もしくはリポソームによる組み合わせとしてのいずれか）と組み合わせた形態の１００μＭの５−ＦＵに暴露した。初期および後期アポトーシスを、ＰＩ／アネキシンＶ二重染色、それに続く、フローサイトメトリー分析によって、識別した。
【図７】ヌードマウスにおけるＳＷ６２０腫瘍増殖に対するリポソーム会合［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌの効果。動物（ｎ＝５／グループ）に対し、ＳＷ６２０腫瘍細胞を皮下に移植し、そして次のもののそれぞれを、連続３日間、連続３週間、投与した：炭酸塩（毎日ＩＰ）；単独形態（５０ｍｇ／ｋｇ、毎日ＩＰ）もしくはｄ−Ｉｎｏと組み合わされた形態（１２０ｍｇ／ｋｇ、毎日ＩＰ）、または［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌ製剤としての形態（それぞれ５０ｍｇ／ｋｇ＋１２０ｍｇ／ｋｇ）の５−ＦＵ。棒線：標準偏差。
【図８】５−ＦＵ単独、５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏで、または［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌの組み合わせとしてのいずれかで処置した腫瘍を有するマウスの生存率を、非処置動物と比較して表したＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ曲線。
【実施例】
【００４５】
実施例１：大腸癌細胞における５−ＦＵに対する耐性のインビトロおよびインビボでの反転
材料および方法
細胞系統
すべての実験は、ＴＳを過剰発現する５−ＦＵ−耐性のヒト結腸癌腫細胞系統ＳＷ６２０（ＣＣＬ２２７としても知られる）において行った。細胞を、１０％ウシ胎児血清、５％グルタミン、１０％ペニシリン、１０％ストレプトマイシンおよび１％カナマイシンを補充したＲＰＭＩ中、湿式ＣＯ２インキュベータにおいて３７℃で維持した。すべての実験を、指数増殖期の細胞において実施した。
【００４６】
薬物および化学物質
卵黄ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、コレステロール（Ｃ）、ホスファチジルエタノールアミンに共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、２’−デオキシイノシン（ｄ−Ｉｎｏ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）および５’ｄＦＵＲは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ、仏国）から購入した。リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）緩衝液、硝酸テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＮ）、アセトニトリル、エーテルおよびメタノールは、ＣａｒｂｏＥｒｂａ（Ｍｉｌａｎ、伊国）由来であった。ジメチルスルホキシド、アポトーシスキット、および培養培地は、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ（Ｓｏｕｆｆｅｌｗｅｙｅｒｓｈｅｉｍ、仏国）から購入した。トリチウム化５−ＦＵ（１２Ｃｉ／ｍＭｏｌ）は、Ｍｏｒａｖｅｃｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｂｒｅａ，ＣＡ、米国）から入手した。すべての試薬は、分析級であった。
【００４７】
リポソームの調製
リポソーム（［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌ）は、古典的な薄膜法（Olson et al, 1979）によって調製した。簡単に説明すると、メタノール中卵ＰＣ／ＰＧ／ＣＨＯＬ／ＰＥＧ（４０：２６：３３：０．６８のモル比）からなる脂質混合物を、窒素下、丸底フラスコにおいてエバポレートして、乾燥薄膜を形成させた。次いで、この膜を等張性の炭酸溶液（Ｐｈ４．２〜７．４）で水和した。比：中性リン脂質対コレステロールは３０％であり、そして存在する場合、負に荷電した脂質は、中性脂質の１０％であった。脂質分散体を室温においてボルテックスで混合することによって、多層ベシクルを形成させた。５−ＦＵ（０．２ｍＭ）およびｄ−Ｉｎｏ（０．２４ｍＭ）を、脂質膜と共に、３０分間、３７〜４０℃でインキュベートすることによって、カプセル化した。次いで、得られる充填されたＰＥＧ−リポソームを振盪した。ＳＵＶとしての均質なサイズ分布を、プローブによる５分間の２０ＫＨｚ音波処理によって達成した。カプセル化されていない薬物を取り出すため、リポソーム懸濁液を、７０，０００×ｇ、４℃で１６時間、超遠心分離し、そして得られたペレットを、その用途（例えば、インビトロであるか、またはインビボであるか）に依存して、１０ｍｌの培養培地または１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ７．４）のいずれかに再懸濁した。最後に、ＰＶＤＦフィルター（Ｄｕｒａｐｏｒｅ０．２２μｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、仏国）を介して押し出した後、滅菌リポソームを得た。
【００４８】
多分散性研究
直径および粒度分布を、Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｕｒ  ＲＴＧサブミクロン粒子分析装置（Ｓｅｍａｔｅｃｈ，Ｎｉｃｅ、仏国）を使用する動的レーザー光散乱によって決定した。測定は、９０°の角度、室温で実施した。リポソームの平均粒径は、粒子分析装置によって求められる容積分布曲線から見積もった。
【００４９】
カプセル化率および放出研究
５−ＦＵおよびｄ−Ｉｎｏの両方のカプセル化率を、先に公開された方法（Fanciullino et al, 2005）を使用して、ＨＰＬＣによって求めた。５−ＦＵおよびｄ−Ｉｎｏのリポソーム放出を、他に記載（Fanciullino et al, 2005）のような透析によってモニターした。３０分間ごとに４時間まで、サンプリングを実施した。５−ＦＵおよびｄ−Ｉｎｏの全放出量を、ＵＶ−分光光度法により、２４８ｎｍで決定した（Ｂｅｃｋｍａｎ、仏国）。
【００５０】
抗増殖アッセイ
細胞を、８×１０４個の細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレートに播種した。１晩付着させた後、指数増殖期の細胞を、漸増濃度の５−ＦＵ単独、遊離のｄ−Ｉｎｏと組み合わせた５−ＦＵ、またはリポソーム製剤［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌに２４時間暴露した。次に、薬物を取り出し、そして細胞を、新鮮培地において、さらに４８時間、増殖させた。７２時間の断続的な暴露後、古典的な比色ＭＴＴアッセイ（Alley et al, 1988）を使用して、細胞生存率を評価した。ＩＣ５０を、細胞増殖の５０％を阻害する５−ＦＵ濃度として定義した。
【００５１】
５−ＦＵ腫瘍代謝研究
指数増初期の細胞を、単独形態、遊離のｄ−Ｉｎｏと組み合わせた形態、またはリポソーム調製物［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌとしての形態の１μＭのトリチウム化５−ＦＵに暴露した。３、４および６時間の暴露後、細胞を回収し、７０％メタノールに溶解し、そしてサイトゾルを遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０分間）によって単離し、そして分析まで、−８０℃で貯蔵した。５−ＦＵおよびその主要代謝物の分離は、Ｆｌｏ−Ｏｎｅ放射線検出器（Ｐａｃｋａｒｄ、仏国）に連結し、そしてＲＰ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、仏国）を具備するＨＰ１０９０  ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ、仏国）を使用し、続いて、先に記載（Ciccolini et al, 2000b）のようにＫ２ＨＰＯ４−ＴＢＡＮ：メタノール勾配で溶出させることによって達成した。
【００５２】
ＴＳ阻害
ＴＳ活性を、先に記載（Chazal et al, 1997）のように評価した。簡単に説明すると、指数増殖期の細胞を、様々な濃度の１００μＭの５−ＦＵ単独、２５０μＭのｄ−Ｉｎｏと組み合わせた５−ＦＵ、またはリポソーム製剤［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌに１２時間暴露した。ＴＳ活性の阻害を、８、２４、４８および７２時間に評価した。次いで、細胞を回収し、そしてさらなる分析まで、ペレットを−８０℃で貯蔵した。過剰のメチレンテトラヒドロ葉酸の存在下で［３Ｈ］−デオキシウリジン一リン酸からのトリチウム化Ｈ２Ｏ放出に基づく標準的なRobertsの方法（Roberts et al, 1966）に従って、ＴＳ活性をアッセイした。
【００５３】
細胞死の誘導
１００μＭの５−ＦＵ、２５０μＭの遊離のｄ−Ｉｎｏと組み合わせた５−ＦＵ、または同じ濃度での［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌの組み合わせに、細胞を４８および７２時間暴露した後、細胞周期の分布をモニターした。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、そして７０％メタノールに１時間、４℃で懸濁した。次に、それらを遠心分離し、そして製造者の推奨に従って、直ちに、３００μＬのＰＢＳおよび８０μＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）に回収した。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して、サンプルをＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、仏国）で分析した。ＰＩ染色においてサブ−Ｇ０／Ｇ１ピークを検出することによって、細胞死の百分率を測定した（Derzynkiewicz et al, 1992）。
【００５４】
アポトーシス研究
指数期の細胞を、１００μＭの５−ＦＵ単独、２５０μＭのｄ−Ｉｎｏを伴う５−ＦＵ、またはリポソームによる組み合わせ［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌに、２４、４８および７２時間暴露した。細胞を回収し、そして初期ならびに後期アポトーシスの変化を、アネキシンＶ  ＦＩＴＣ染色キット（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕａｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、仏国）を使用して、アネキシンおよびヨウ化プロピジウムによる同時染色によって検出した。細胞を、製造者のガイドラインに従って処置した。Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用するＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｐｏｉｓａｔ、仏国）においてＦＡＣＳ解析を行い、そして非処置細胞において測定したアポトーシスを１００％と定義した。
【００５５】
薬物モニタリング研究
遊離のまたはカプセル化された５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏの組み合わせで処置した動物において、達成された薬物暴露レベルを比較した。６週齢の雄性ｗｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｌｙｏｎ、仏国）は、全研究期間中、Ｏ２／ＮＯ２  ｇａｚ＋ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ（ＴＥＭ，Ｂｏｒｄｅａｕｘ、仏国）を使用して、麻酔した。加温ブランケットを使用して、体温を３７℃に維持した。動物（ｎ＝３／グループ）に、５−ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）＋ｄ−Ｉｎｏ（１２０ｍｇ／ｋｇ）（遊離であるか、またはリポソーム製剤中に組み合わされたかのいずれか）を、腹腔内注入によって投与した。サンプリング時間は次のとおりである：Ｔ０、Ｔ６０、Ｔ９０およびＴ１２０分。１ｍｌの血液を、頸静脈からヘパリン化チューブ上に採取し、そして血漿を、５０００ｇで１０分間の遠心分離によって単離した。サンプルを、分析するまで−２０℃で貯蔵した。５−ＦＵおよびｄ−Ｉｎｏ血漿濃度を、内部標準として２−デオキシアデノシンを使用して、先に記載（Ｆａｎｃｉｕｌｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２００５）のように、逆相ＵＶ−ＨＰＬＣによって決定した。動物研究は、動物福祉ガイドラインに従って実施し、そして実験の開始前に、地域の動物倫理委員会の承認を得た。
【００５６】
インビボでの効力研究
単独形態、または遊離のｄ−Ｉｎｏとの随伴形態、またはリポソーム［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌの組み合わせとしての形態の５−ＦＵの抗腫瘍効力を、ＳＷ６２０マウス異種移植モデルにおいて調べた。マウスの管理は、本発明者らの施設の動物福祉ガイドラインに一致し、そして実験の開始前に、地域の動物倫理委員会の承認を得た。４週齢の雌性Ｓｗｉｓｓヌードマウス（１グループあたりｎ＝５、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｌｙｏｎ、仏国）の右側腹部の皮下に、１×１０６個のＳＷ６２０細胞を播種した。インプラントの１０日後、および一旦、腫瘍が正確に測定可能なサイズに到達したら、マウスを、５−ＦＵ自体、遊離のｄ−Ｉｎｏと組み合わせた５−ＦＵ、または次のような［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌ型：５−ＦＵ：５０ｍｇ／ｋｇ、ｄ−Ｉｎｏ、および１２０ｍｇ／ｋｇで処置した。薬物を、３×／各週の連続３週間（例えば、Ｄ１／Ｄ２／Ｄ３、Ｄ８／Ｄ９／Ｄ１０およびＤ１６／Ｄ１７／Ｄ１８）で腹腔内投与した。腫瘍サイズを、週３回、ノギスを使用して、３次元で測定し、そして腫瘍重量（ｍｇ）を、次の標準式：質量＝ｐｉ／６×長さ×幅×高さ（Waterhouse et al, 2005）を使用して計算した。空のリポソームによる予備実験を行って、任意のインビボ抗増殖活性が認められないことを確認した。動物の重量を、毒性のマーカーとしてモニターした。最初の重量から２５％の消失が観察された場合はいつでも、または腫瘍が２５００ｍｇに到達した場合、動物を屠殺した。
【００５７】
結果
カプセル化率および放出研究
均質な１００ｎｍ直径のリポソーム集団を得た。５−ＦＵおよびｄ−Ｉｎｏのカプセル化率は、それぞれ、１０．６±１．６％および２６．２±５．３％であった。５−ＦＵおよびｄ−Ｉｎｏの放出曲線は類似のプロファイルを有した（ｎ＝５）。両方を多項式によって記述した（図１）。１８０〜２４０分間の間の濃度には、有意差が観察されなかった（ｐ＞０．０５、ｔ検定）。両方の薬物について、４時間のインキュベーション後、リポソームから最大で１００％の放出が達成された。
【００５８】
抗増殖活性のモジュレーション
空のリポソームは、インビトロでの細胞障害性を示さなかった（データ示さず）。細胞障害性研究の結果を、図２にまとめる。５−ＦＵを、遊離のｄ−Ｉｎｏとを組み合わせても、またはリポソーム［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌ製剤として使用しても、細胞感受性において有意な増加がもたらされた。単独形態、ｄ−Ｉｎｏに遊離な形で随伴させた形態、または単一のリポソームにｄ−Ｉｎｏと共にカプセル化した形態の５−ＦＵの各ＩＣ５０は、それぞれ、７７±６、５７±１３および４８±６．４μＭ（ｎ＝３）であった。ＩＣ５０レベルでは、遊離のｄ−Ｉｎｏを使用すると、５−ＦＵの効力において２６％の改善を生じたが、二重薬剤リポソーム製剤は、ＳＷ６２０感受性において３７％の増加を示した。同様に、細胞応答は、ＩＣ２０レベルで５２および７７％（それぞれ遊離のｄ−Ｉｎｏおよびリポソーム製剤）、ならびにＩＣ８０レベルで１８および８０％（遊離のｄ−Ｉｎｏ／リポソーム）さらに改善された。
【００５９】
５−ＦＵ細胞内活性化のモジュレーション
単独で使用した形態、ｄ−Ｉｎｏと組み合わせた形態、またはリポソーム製剤として使用した形態の５−ＦＵの腫瘍内代謝プロファイルを、図３に示す。単独で使用した場合、ＲＮＡ経路を介して５−ＦＵの同化が生じ、そして３〜６時間の観察期間の間、ＦｄＵＭＰは、ほとんどまたはまったく形成されなかった。ｄ−Ｉｎｏと５−ＦＵとを組み合わせることにより、５−ＦＵの活性化パターンが顕著に変化して、ＤＮＡ経路を介する活性化が優勢になり、続いてその結果、フルオロ−デオキシヌクレオチドが細胞内に蓄積した。全体的に、抗ＴＳ  ＦｄＵＭＰ合成は、８３ｄｐｍ／ｍｇタンパク質（５−ＦＵ単独）から３１９９ｄｐｍ／ｍｇ（５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ、＋３８０１％）および１１２７６ｄｐｍ／ｍｇ（リポソームによる組み合わせ、＋１３５６１％）に増加した。変化しなかった５−ＦＵおよび形成された代謝物の全サイトゾル内量を考慮すると、データは、ＳＷ６２０細胞を［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌの組み合わせに暴露すると、遊離型の組み合わせと比較して、３６％の薬物取り込みの増加が生じたことが示された。
【００６０】
ＴＳ阻害研究
遊離なｄ−Ｉｎｏおよびカプセル化された製剤の両方において、ＴＳ阻害の有意な改善が観察された（図４）。５−ＦＵ単独と比較して、５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏに暴露された細胞では、８時間後、ＴＳ活性が９６％低減した。リポソーム製剤は、この阻害レベルをさらに６１％改善し、終局的にＴＳ活性が９８％減少した（ｎ＝３）。
【００６１】
細胞周期分析
ＰＩ染色の４８時間後のサブ−Ｇ０／Ｇ１集団のモニタリングを図５に示す。結果は、５−ＦＵ単独と比較して、遊離のｄ−Ｉｎｏに随伴させた場合では５−ＦＵによる細胞死が３２４％高く誘導され、そしてリポソーム型では細胞死が４０８％増加したことを示した。７２時間では、ｄ−Ｉｎｏまたはリポソーム製剤（ｎ＝３）では、それぞれ１５０％および１６９％の細胞死の増加が観察された。
【００６２】
アポトーシス研究
遊離のｄ−ＩｎｏでモジュレートされたＦＵ、または共カプセル化型に暴露されたＳＷ６２０では、初期および後期アポトーシスの両方において、より大きな誘導が観察された（図６）。初期アポトーシスの誘導は、５−ＦＵ単独と比較して、２４、４８および７２時間に、それぞれ２３５、１０３および１３６％増加し（遊離のｄ−Ｉｎｏ）、そしてリポソーム形態では、３２６、２６８および２１９％増加した。同様に、後期アポトーシスは、標準的な５−ＦＵの使用（ｎ＝４）と比較して、２４、４８および７２時間後、９２、１１９および１３８％増加し（遊離のｄ−Ｉｎｏ）、そしてカプセル化型では、１５９、２０６および２１９％増加した。
【００６３】
薬物モニタリング研究
血漿中５−ＦＵおよびｄ−Ｉｎｏのモニタリングを、遊離またはリポソームによる組み合わせとしてのいずれかで注入されるこれらの薬物の投与後に、実施した。内因性のピークが合併することによる分析干渉のため、使用した製剤にかかわらず、５−ＦＵ濃度は、本発明者らの検出限界未満を維持していた。対照的に、ｄ−Ｉｎｏは、６０〜１２０分間の期間の間、十分に測定可能であり、そしてリポソームとして投与した場合、遊離型と比較して、１３９％まで高い循環濃度を示した。１２０分では、リポソームグループのラットにおいて４７０ｎｇ／ｍｌのｄ−Ｉｎｏがなお測定されたが、遊離の５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ随伴で処置した動物では、もはやモジュレーターは検出されなかった。
【００６４】
インビボでの効力研究
空のリポソームによる処置では、非処置動物と比較して、腫瘍増殖に対する影響が認められなかった（データ示さず）。研究の終了時には、５−ＦＵ単独、遊離のｄ−Ｉｎｏを伴う５−ＦＵ、または［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌ製剤で処置したマウスにおいて、腫瘍サイズが、それぞれ、２８％（ｎ．ｓ）、２３％（ｎ．ｓ）および７４％（ｐ＜０．０５）減少した（図７）。治療モダリティにかかわらず、これらの動物において毒性の徴候は観察されず、そして異なるグループ間で、動物の重量に統計的差異が認められなかった（データ示さず）。コントロールと比較した場合、生存期間は、５−ＦＵ−処置グループにおいて２５％（２０日対１６日）、５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏの組み合わせで処置したグループにおいて５６％、そしてリポソーム製剤で処置した動物において９４％増加した（ｐ＜０．０５、図８）。
【００６５】
これらの結果は、これらの化合物の薬力学に匹敵するカプセル化率および放出プロファイルで５−ＦＵおよびそのモジュレーターを再現可能に共カプセル化することが可能であることを示したが、これは、３〜６時間の時間窓で活性なＦｄＵＭＰが腫瘍内に形成されることが、消化器癌モデルにおける最大の効力と関連があることを示す（Ciccolini et al, 2000bおよび2001）。しかし、５−ＦＵおよびそのモジュレーターの両方の共カプセル化率は、比較的不良である（それぞれ１１および２６％）。５−ＦＵのそのような中等度のカプセル化率は、ここで使用されるような標準的なペグ化リポソームを調製する場合、その取り扱いをかなり困難にするこの薬物の極性および両性特性を考慮する場合、驚くべきことではない（Nii et al, 2005）。実際、本ストラテジーは、できるだけ基本的かつ簡単にステルス型送達システムを開発すること、標準的な装置および試薬を具備するほとんどの研究室において実施することができる組み立てプロセスを容易に標準化することであった。
【００６６】
この研究では、カプセル化率が、時間全体を通じて、高い再現性があることが判明した（例えば、５−ＦＵでは＜２％）ことから、以後の実験に偏りを生じる可能性のあるバッチごとのばらつきがほとんどないことが示唆される。インビトロでは、本発明者らのモデルの耐性プロファイルが反転し、細胞死およびアポトーシス誘導の両方が増加し、ならびに５−ＦＵに対するＳＷ６２０細胞の感受性亢進が顕著に増加した（例えば、ＩＣ２０において＋８０％）。さらなる実験により、このような効力の増加は、ＲＮＡ活性化経路からＤＮＡ活性化経路への著しい切り換えによるものであり、５−ＦＵをｄ−Ｉｎｏでモジュレートした場合、活性なＦｄＵＭＰの形成が増加したことが確認された。薬理学的目的として、その後のＴＳ活性の調査により、リポソームによる組み合わせに暴露された細胞において、この標的の強力かつ持続的な阻害が示された。さらに、本発明者らは、ＦｄＵＭＰに対する優先的な活性化の他に、リポソーム製剤で処置した細胞において、全体的な５−ＦＵサイトゾルレベルがほぼ４０％増加したことを観察したが、おそらく、そのことによって、より高い細胞障害性効果がもたらされたことが後に測定された。興味深いことに、５−ＦＵに対する耐性の同様な反転が、マウスにおいても達成された。単剤療法として使用した場合、５−ＦＵは、非処置動物と比較して、腫瘍増殖を減少することができなかった。５−ＦＵと遊離なｄ−Ｉｎｏとを組み合わせると、この動物研究においてほとんど効力が改善されなかったことは注目すべきことであるが、これはおそらく、使用したモジュレーターの用量が比較的低かった（１２０ｍｇ／ｋｇ）ことによるものであり、ｄ−Ｉｎｏの劇的な異化、およびインビボでモジュレート効果を達成するために通常必要とされる用量（３．２ｇ／ｋｇ）も考慮される（Ciccolini et al, 2000bおよび2001）。対照的に、［ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌは、非処置動物と比較した場合、腫瘍サイズが６９％減少し、そして５−ＦＵ単独と比較した場合、有意に５７％減少した。留意すべきことに、このような効力の増加に伴って、毒性が付加されることはなく、そしてすべての動物は、優れた忍容性を示し、それ故、５−ＦＵの治療係数の明らかな改善が示された。抗腫瘍効力の増加および良好な忍容性と調和して、生存期間中央値は、標準的な５−ＦＵと比較して、本発明者らのリポソーム製剤で処置した動物においてほぼ２倍になり、それ故、５−ＦＵに対する化学療法抵抗性を克服することができることが実証された。
【００６７】
実施例２：別の組成物
薬物および化学物質
卵黄ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、コレステロール（Ｃ）、ホスファチジルエタノールアミンに共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｄ−Ｉｎｏ、および５−ＦＵは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ、仏国）から購入した。
【００６８】
小さな単層リポソームの調製方法
二重−リポソーム（［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ］−Ｌ）は、古典的な薄膜法（Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９７９）によって調製した。ＤＳＰＣ／Ｃ／ＰＧ／ＰＥＧ４０：３３：０．６８：２６相対モル比からなる脂質混合物を調製した。
【００６９】
脂質をメタノール溶液に溶解し、続いて、丸底フラスコにおいて乾燥して、乾燥薄膜を形成させ、そして３時間の間、真空ポンプ中に置いて、溶媒を取り出した。得られた脂質膜を、高減圧下、少なくとも２時間、置いた。脂質膜を、５−フルオロウラシル（０．２ｍＭ）および２’−デオキシイノシン（０．２４ｍＭ）の溶液を含有する炭酸緩衝液、ｐｈ７．４で、３０分間の間、３７〜４０℃で水和した。脂質分散体を室温においてボルテックスで混合することによって、多層ベシクル（ＭＬＶ）を形成させた。水和後、小さな単層ベシクル（ＳＵＶ）を、５分間、氷上４℃での音波プローブによる音波処理（２０ｋＨｚ）によって得た。
【００７０】
得られたリポソームのサイズ分布は均質であり、そして約１００ｎｍの直径であった。３００００ｋＤａカラム（例えば、ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用する約２時間の遠心分離（１００００ｇ）によって、カプセル化されなかった薬物を取り出した。次に、調製物のその後の用途（インビトロ、インビボ）に依存して、リポソーム薬物を含有する画分を、１０ｍｌの炭酸緩衝液または培養培地のいずれかに再懸濁した。ＰＶＤＦフィルター（０．２２μｍポアサイズ）を介して押し出した後、滅菌リポソームを得た。
【００７１】
多分散性研究
リポソームサイズの分布を、サブミクロン粒子分析装置（Ｓｅｍａｔｅｃｈ，Ｎｉｃｅ、仏国）による動的光散乱によって決定した。測定は、９０°の角度から室温で実施した。均質な１００ｎｍ直径のリポソーム集団を得た。５−ＦＵおよびｄ−Ｉｎｏのカプセル化率は、それぞれ、１０．６±１．６％および２６．２±５．３％であった。
【００７２】
実施例３：５−ＦＵ、ｄ−Ｉｎｏ、およびフォリン酸のカプセル化
薬物および化学物質
卵黄ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、コレステロール（Ｃ）、ホスファチジルエタノールアミンに共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｄ−Ｉｎｏ、および５−ＦＵは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ、仏国）から購入した。フォリン酸は、Ｄａｋｏｔａ  Ｐｈａｒｍ（Ｐａｒｉｓ、仏国）から購入した。
【００７３】
小さな単層リポソームの調製方法
三重−リポソーム（［５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ＋フォリン酸］−Ｌ）は、古典的な薄膜法（Olson et al, 1979）によって調製した。ＤＳＰＣ／ＰＧ／Ｃ／ＰＥＧ  ２６／１６．７／２１／０．４４相対モル比からなる脂質混合物を調製した。
【００７４】
脂質をメタノール溶液に溶解し、続いて、窒素フロー下で乾燥させて、乾燥薄膜を形成させた。得られた脂質膜を、炭酸緩衝液で水和し、そしてカプセル化のために、３０分間、３７℃で５−フルオロウラシル（０．２ｍＭ）および２’−デオキシイノシン（０．２４ｍＭ）およびフォリン酸（０．２ｍＭ）の溶液に接触させた。小さな単層ベシクル（ＳＵＶ）を、音波プローブによる音波処理（２０ｋＨｚ）によって均質化し、そして遠心分離（９，０００ｇ）した。ペレットを等張液に回収すれば、使用可能である。
【００７５】
カプセル化率および放出研究
均質な１００ｎｍ直径のリポソーム集団を得た。５−ＦＵ、ｄ−Ｉｎｏおよびフォリン酸のカプセル化率は、それぞれ１０％、２１％、および１０％であった。
【００７６】
３つの薬物について、４時間のインキュベーション後、リポソームから最大で１００％の放出が達成された。
【００７７】
抗増殖活性のモジュレーション
５−ＦＵ−耐性ＳＷ６２０ヒト大腸細胞系統に対する三重リポソーム製剤（５−ＦＵ＋ｄ−Ｉｎｏ＋フォリン酸）の抗腫瘍効力を、インビトロで評価した。細胞感受性を、異なるレジメンのそれぞれのＩＣ５０を計算することによって、評価した（ＭＴＴ試験、７２連続暴露）。測定されたＩＣ５０は、６２μＭ（５−ＦＵ単独）、２１μＭ（５−ＦＵ＋フォリン酸、Ｆｕｆｏｌプロトコルとしても知られる）および５μＭ（リポソーム製剤）であった。リポソーム製剤により、標準的な５−ＦＵおよび標準的なＦｕｆｏｌに対して１２倍および４倍の効力の最大の増加がもたらされた。
【００７８】
参考文献
Alley MC, Scudiero DA, Monks A, Hursey ML, Czerwinski MJ, Fine DL, Abbott BJ, Mayo JG, Shoemaker RH, Boyd MR (1988) Feasability of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Res 48 : 589-601.
Bangham, et al. J. Mol. Biol. (1965) 12 : 238
Blanquicett C, Saif MW, Buchsbaum DJ, Eloubeidi M, Vickers SM, Chhieng DC, Carpenter MD, Sellers JC, Russo S, Diasio RB, Johnson MR (2005) Antitumor efficacy of capecitabine and celecoxib in irradiated and lead-shielded, contralateral human BxPC-3 pancreatic cancer xenografts: clinical implications of abscopal effects. Clin Cancer Res 11:8773-81.
Boyer J, McLean EG, Aroori S, Wilson P, McCulla A, Carey PD, Longley DB, Johnston PG (2004) Characterization of p53 wild-type and null isogenic colorectal cancer cell lines resistant to 5-fluorouracil, oxaliplatin, and irinotecan. Clin Cancer Res 10: 2158-2167.
Chazal M, Cheradame S, Formento JL, Francoual M, Formento P, Etienne MC, Francois E, Richelme H, Mousseau M, Letoublon C, Pezet D, Cure H, Seitz JF, Milano G (1997) Decreased folylpolyglutamate synthetase activity in tumors resistant to fluorouracil-folinic acid treatment:clinical data. Clin Cancer Res 3: 553-557.
Ciccolini J, Peillard L, Aubert C, Formento P, Milano G, Catalin J (2000a) Monitoring of the intracellular activation of 5-fluorouracil to deoxyribonucleotides in HT29 human colon cell line: application to modulation of metabolism and cytotoxicity study. Fundam Clin Pharmacol 14: 147-54.
Ciccolini J, Peillard L, Evrard A, Cuq P, Aubert C, Pelegrin A, Formento P, Milano G, Catalin J (2000b) Enhanced antitumor activity of 5-fluorouracil in combination with 2’-deoxyinosine in human colorectal cell lines and human colon tumor xenografts. Clin Cancer Res 6: 1529-35.
Ciccolini J, Cuq P, Evrard A, Giacometti S, Pelegrin A, Aubert C, Cano JP, Iliadis A (2001) Combination of thymidine phosphorylase gene transfer and deoxyinosine treatment greatly enhances 5-fluorouracil antitumor activity in vitro and in vivo. Mol Cancer Ther 1: 133-9.
Ciccolini J, Evrard A, Cuq P (2004) Thymidine phosphorylase and fluoropyrimidines efficacy: a Jekyll and Hyde story. Curr Med Chem Anticancer Agents 4: 71-81. 
Deamer and Bangham, Biochiln. Biopl vs. Acta (1976) 443 : 629
De Bruin M, van Capel T, Smid K, van der Born K, Fukushima M, Hoekman K, Pinedo HM, Peters GJ (2004) Role of platelet derived endothelial cell growth factor/thymidine phosphorylase in fluoropyrimidine sensitivity and potential role of deoxyribose-1-phosphate. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 23: 1485-90.
Derzynkiewicz Z, Bruno S, Del Bino G, Gorczyca W, Hotz MA, Lassota P, Traganos F (1992) Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry 13: 95-808.
Diasio RB, Harris BE (1989) Clinical pharmacology of 5-fluorouracil. Clin Pharmacokinet 16: 215-237.
Evrard A, Cuq P, Ciccolini J, Vian L, Cano JP (1999) Increased cytotoxicity and bystander effect of 5-fluorouracil and 5-deoxy-5-fluorouridine in human colorectal cancer cells transfected with thymidine phosphorylase. Br J Cancer 80: 1726-33.
Fanciullino R, Giacometti S, Aubert C, Fina F, Martin PM, Piccerelle P, Ciccolini J (2005) Development of stealth liposome formulation of 2’-deoxyinosine as 5-fluorouracil modulator: in vitro and in vivo study. Pharm Res 22: 2051-7.
Fanciullino R, Evrard A, Cuq P, Giacometti S, Peillard L, Mercier C, Aubert C, Milano G, Ciccolini J (2006) Genetic and biochemical modulation of 5-fluorouracil through the overexpression of thymidine kinase: an in-vitro study. Anticancer Drugs 17:463-70.
Johnston PG, Lenz HJ, Leichman CG, Danenberg KD, Allegra CJ, Danenberg PV, Leichman L (1995) Thymidylate synthase gene and protein expression correlate and are associated with response to 5-fluorouracil in human colorectal and gastric tumors. Cancer Res 55: 1407-1412.
Langley DB, Harkin DP, Johnston PG (2003), 5-fluorouracil mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer 3: 330-338.
Nii T, Ishii F (2005) Encapsulation efficiency of water-soluble and insoluble drugs in liposomes prepared by the microencapsulation vesicle method. Int J Pharm 298: 198-205.
Olson F, Hunt CA, Szoka FC, Vail WJ, Papahadjopoulos D (1979) Biochim Biophys Acta 557: 9-23.
Peters GJ, Backus HH, Freemantle S, van Triest B, Codacci-Pisanelli G, van der Wilt CL, Smid K, Lunec J, Calvert AH, Marsh H, McLeod HL, Bloemena E, Meijer s, Jansen G, van Groeningen CJ, Pinedo HM (2002) Induction of thymidylate synthase as a 5-fluorouracil resistance mechanism. Biochim Biophys Acta 1587: 194-205.
Pinedo HM, Peters GJ (1988) Fluorouracil: biochemistry and pharmacology. J Clin Oncol 6: 1653-1664.
Roberts D (1966) An isotopic assay for thymidylate synthetase. Biochemistry 5: 3546-3548.
Schwartz EL, Baptiste N, Megati S, Wadler S, Otter BA (1995a) 5-Ethoxy-2’-deoxyuridine, a novel substrate for thymidine phosphorylase, potentiates the antitumor activity of 5-fluorouracil when used in combination with interferon, an inducer of thymidine phosphorylase expression. Cancer Res 55: 3543-50.
Schwartz EL, Baptiste N, Wadler S, Makower D (1995b) Thymidine phosphorylase mediates the sensitivity of human colon carcinoma cells to 5-fluorouracil. J Biol Chem 270: 19073-7.
Szoka and Paphadjopoulos, P. N. A. S. (1978) 75: 4194. 
Waterhouse DN, Madden TD, Cullis PR, Bally MB, Mayer LD, Webb MS (2005) Preparation, characterization, and biological analysis of liposomal formulations of vincristine. Methods Enzymol 391:40-57.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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