(57)【要約】  本発明は、磁性の又は磁気標識された生体物質を分離又は浄化するための高勾配磁気分離装置であって、磁石（７）、分離カラム（１）、前記分離カラムの内的空間に配置可能な強磁性マトリクス（２）、ならびに、前記分離カラム（１）を平衡するための及び／又は前記生体物質を懸濁するための緩衝液を収容する貯蔵容器（１１）を有し、作動中、前記磁石（７）により発生する磁場が前記マトリクス（２）内に高勾配磁場を発生させることができ、かつ、緩衝液が前記液体貯蔵容器（１１）から前記分離カラム（１）を流通することができる、高勾配磁気分離装置に関する。この目的のため、前記緩衝液が、基礎液、及び前記マトリクス（２）の非特異結合部位を飽和可能な高分子を含む。
2010539446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性の又は磁気標識された生体物質を分離又は浄化するための高勾配磁気分離装置であって、
磁石（７）、分離カラム（１）、前記分離カラムの内的空間に配置可能な強磁性マトリクス（２）、ならびに、前記分離カラム（１）を平衡するための及び／又は前記生体物質を懸濁するための緩衝液を収容する貯蔵容器（１１）を有し、
作動中、前記磁石（７）により発生する磁場が前記マトリクス（２）内に高勾配磁場を発生させることができ、かつ、緩衝液が前記液体貯蔵容器（１１）から前記分離カラム（１）を流通することができる、高勾配磁気分離装置において、
前記緩衝液が、基礎液、及び前記マトリクス（２）の非特異結合部位を飽和可能な高分子を網羅することを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であって、
前記生体物質の粒子に作用する重力に起因する力が概ね補償される程度に、前記緩衝液が分離されるべき前記生体物質の前記粒子の濃さに合致する濃さを有し、従って前記粒子が前記緩衝液中にほとんど懸濁しており、及び／又は、前記緩衝液が分離工程に適した流速である前記分離カラム（１）を通る層流を促進する高い粘度を有する装置。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の装置であって、
前記磁石（７）が、前記分離カラム（１）を永久磁石又は電磁石により発生する前記特に均質な磁場内に配置できるように形状されている永久磁石又は電磁石であり、
前記分離カラム（１）を、選択的に、空間的分離及び／又はスイッチオフによって前記磁場の影響下に晒すことが可能な又は不可能な装置。
【請求項４】
先行する請求項のいずれか１項に記載の装置であって、
前記マトリクス（２）が、被覆されておらず、及び／又は、規則的又は不規則な、繊維状の、球状の、又は別様に形状された物質、特にステンレス鋼、磁性鋼、又は鋼綿を有する装置。
【請求項５】
先行する請求項のいずれか１項に記載の装置であって、
前記液体貯蔵容器（１１）が前記分離カラム（１）に接続し、前記分離カラム（１）に、流量制限素子（８、９）を介して調整可能な流速で緩衝液を導入することができ、又はできなくてもよく、及び／又は、前記分離カラム（１）が前記分離カラムからの流出及び前記分離カラム内部の前記流速に影響を与えることができる流量制限素子（４、５）を有する装置。
【請求項６】
先行する請求項のいずれか１項に記載の装置であって、
前記生体物質への前記高分子の凝集効果が補償されるように、前記基礎液のイオン強度が前記高分子に依存して適合され、前記基礎液が、等浸透圧濃度である陽イオンのナトリウム、カリウム、マグネシウム、又はカルシウム、及び、陰イオンの塩化物、リン酸塩、硫酸塩、又は炭酸塩を有し、特に、リン酸緩衝生理食塩水又はリン酸緩衝ショ糖液、又はリン酸緩衝生理食塩水とリン酸緩衝ショ糖液との混合液である装置。
【請求項７】
先行する請求項のいずれか１項に記載の装置であって、
前記高分子が、天然又は合成の高分子電解質又は両性高分子電解質、特に合成の高分子電解質、又は有機高分子電解質のｄ−グルクロン酸を含み、及び／又は、
前記高分子が、分離されるべき前記生体物質の前記粒子の電荷に対応する電荷を前記基礎液のｐＨ値にてもたらす等電点を有し、及び／又は、前記高分子が、約１０，０００〜約１００，０００ｋＤａ、特に約３０，０００〜約７０，０００ｋＤａの分子量を有する装置。
【請求項８】
先行する請求項のいずれか１項に記載の装置であって、
前記高分子が、球状蛋白質、特にアルブミン、ウシ又はヒト血清アルブミン、オボアルブミン、ラクトアルブミン又は植物アルブミン、β−ラクトグロブリン、κ−カゼイン、ヒストン、プロタミン、グロブリン、プロラミン、又はグルテリンを、前記緩衝液に対する濃度約３％〜約７％、特に約４％〜約５％で含む装置。
【請求項９】
先行する請求項のいずれか１項に記載の装置であって、
前記高分子が、繊維状蛋白質、特に加水分解コラーゲンを、濃度約０．３〜約２０重量％、特に約１〜約１０重量％で含み、又は、ゼラチン、ウシゼラチン、ブタゼラチン、又は硬骨類ゼラチンを、濃度約０．３％〜約１．５％、特に約０．４％〜約０．８％で含み、前記繊維状蛋白質が、約１５０ブルーム以下、特に約７５ブルーム以下の低いゲル強度を有する装置。
【請求項１０】
固有磁性の又は予備的に磁気標識された生体物質を高勾配磁気分離によって分離又は浄化するための方法であって、前記生体物質を有する前記懸濁液が、外部磁場内に配置された強磁性マトリクス（２）を流通し、前記物質が前記マトリクス（２）に凝着する、方法において、
前記マトリクス（２）が被覆されておらず、前記生体物質が、基礎液と前記マトリクスを流通する間に前記マトリクス（２）の非特異結合部位を飽和させる高分子とを有する緩衝液中に懸濁していることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
純緩衝液、即ち生体物質を含有しない緩衝液を用いた、実際に前記マトリクス（２）における非特異結合部位を飽和するための充分に長い期間にわたる、特に約３〜約２０分又は約５〜約１０分の持続時間にわたる事前孵置により、前記マトリクス（２）とマトリクス（２）を包囲する分離カラム（１）とが、前記懸濁液の貫流前に平衡しており、平衡の間、前記マトリクス（２）が、前記緩衝液により常に覆われ続ける方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の方法であって、
無用の生体物質を分離するために、前記溶出液、即ち前記マトリクス（２）を出る液体が前記貫流の後に捕捉され、前記マトリクス（２）に前記懸濁液が導入された後、前記磁場がまだ作動している状態で、前記懸濁液が前記マトリクス（２）を完全に確実に出てしまうまで、前記マトリクス（２）を追加の純緩衝液が流通し、前記貫流の間、前記緩衝液により前記マトリクス（２）が常に覆われ続ける方法。
【請求項１３】
請求項１０又は１１に記載の方法であって、
望ましい生体物質を分離するために、前記マトリクス（２）に前記懸濁液が導入された後、磁場がまだ作動している状態で、前記懸濁液が前記マトリクス（２）を完全に確実に出てしまうまで、前記マトリクス（２）を追加の純緩衝液が流通し、続いて前記マトリクス（２）が追加の純緩衝液で洗浄され、前記外部磁場が空間的分離又はスイッチオフにより作動停止され、前記溶出液が捕捉され、前記手順全体の間、前記マトリクス（２）が前記緩衝液により常に覆われ続ける方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、
捕捉された前記溶出液が遠心分離され、前記方法が一回又は数回反復され、前記終わりまで遠心分離された生体物質には前記溶出液の液相がない方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質を分離し浄化するための、高勾配磁気分離（ＨＧＭＳ）技術のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
不均質な粒子懸濁液から特定の粒子を分離し浄化することは、特に生物医学研究の分野における様々な解析方法にとって非常に重要である。一般に、以下で「ターゲット粒子」と呼ばれる浄化されるべき粒子は、以下で「非ターゲット粒子」と呼ばれる、懸濁液に含有されている残りの粒子とほんの少しだけしか相違していないことが多い。ターゲット粒子及び非ターゲット粒子は、しばしば細胞又は細胞片であるが、その他の任意の生物学的物質であることもある。
【０００３】
確立された幾つかの分離方法は、ターゲット粒子が、自然発生的な「固有の」磁気特性を有する場合、又は、実際の分離手順の前の合成の磁性粒子が、目標とされているように付着して、ターゲット粒子が標識されている場合、ターゲット粒子の磁気特性を使用する。
【０００４】
赤血球に含有されているヘモグロビンが、酸素化状態ではなく脱酸素化又は酸化状態で存在する場合を仮定すると、固有磁性粒子というのは例えば赤血球である。ここで、脱酸素化とは酸素運搬しないことであり、酸素化とは酸素運搬することである。酸素化の場合、ヘモグロビン分子は、非共有結合している酸素分子、つまり可逆的に結合している酸素分子を運搬する。このことと、酸素原子又は酸化しているその他の原子がヘモグロビン分子の中心の鉄原子と共有結合している、つまり不可逆的に結合している、ヘモグロビンの酸化状態とは区別されねばならない。
【０００５】
次に、ヘモグロビン分子に含有される中心の鉄原子の軌道は、脱酸素化型ならびに酸化型の両方で（酸素化型ではなく）、不対電子を運搬する。これらの電子の不対スピンにより、磁場を印加すると鉄原子に磁極を誘導することが可能となる。
【０００６】
ところが従来の種類の磁場は、このような鉄原子を含有する粒子に、正味の指向性磁力を及ぼさない。というのも、原子の直径が極めて小さいために、極性のある鉄原子のＮ極及びＳ極での引力と反発力とがバランスを保っているからである。また、磁場を除去した後は、粒子はその極性を失うことになる。この種類の磁性は「常磁性」として知られている。特定の形態の常磁性が、「超常磁性」と呼ばれることもある。しかし、これらの形態の両方の間には、はっきりとした区別が物理的に存在しない。従って、以下で「常磁性」及び「常磁性の」という用語は、「超常磁性」及び「超常磁性の」という用語を網羅するものとする。
【０００７】
また、ターゲット粒子を磁気標識するのに使用される良好に確立された合成の二次粒子は、常磁性であり、普通、酸化したヘモグロビンに極めて類似した、最小量の酸化鉄又は磁化可能な別の物質を含有する。更に、これらの合成の二次粒子は理想的には非常に小さいので、懸濁状態で安定コロイドを形成する。換言すれば、これらの合成の二次粒子は長い期間（数ヶ月から数年）にわたって沈降することがない。従って、それらの直径は一般的には３０〜２００ｎｍである。この種類の商業的に利用可能な粒子が、例えばchemicell GmbH（Eresburgstrasse 22-23, D-12103 Berlin, Germany）、micromod Partikeltechnologie GmbH（Friedrich-Barnewitz-Str.4, D-18119 Rostock, Germany）、又はMiltenyi Biotech GmbH（Friedrich Ebert Strasse 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Germany）により、単独で、又は抗体と共役されて流通している。
【０００８】
常磁性粒子を浄化する、換言すれば常磁性粒子を粒子懸濁液から分離する確立された方法というのは、極度に高い磁場勾配を生成することである。磁気勾配が充分に高いということは、常磁性粒子のＮ極及びＳ極の引力と反発力、従って正味の指向性磁力が異なるということである。この技術は、高勾配磁気分離（ＨＧＭＳ）という用語で知られている。
【０００９】
ここで、いわゆる「内部」高勾配磁気分離器と「外部」高勾配磁気分離器とが区別されるべきである。ＨＧＭＳ技術の最初の記載は、内部分離器を参照したものである。これらの内部分離器は、Oberteuffer（IEEE Transactions on Magnetics, Mag-9, No. 3, September 1973:303-306）、及びUS 3.676.337に見ることができる。分離チャンバとして働く適切な非磁性容器内の強磁性物質が、電磁石又はＵ字形永久磁石（双極子磁石）により発生させることのできる強力で均質な磁場に導入される。この場合、強磁性物質は一般に「マトリクス」という名を使っている。マトリクスは、繊維状（針金状又は糸状）、球状（ボール状）、又はそれ以外の異なる形状とすることができ、例えば、穿孔鋼板から成ることができる。マトリクスの強磁性物質は、外部から印加された磁場により、その磁化率Ｘに対応して磁化される。センチメートル当たり１００テスラ以上に達することのある磁場勾配が、マトリクス物質の表面から開始して生成される。これによって、勾配の大きさは、活用される繊維状又は球状の要素の直径に逆比例する。「外部」高勾配磁気分離器は、例えばWO 98/055236、WO 99/019071、又はUS 6.241.894 B1に開示されているように、実際の分離チャンバの外にある磁石を、技術的により複雑かつ特別に配置することにより、同様に高い勾配を達成する。基本的な差異として、分離チャンバ内でのマトリクスの必要性はここでは生じない。
【００１０】
現在、生物医学研究では、内部高勾配磁気分離器が最も広範囲に使用されている。US 4.664.796及びUS 5.200.084は、このような分離器の特定の実施形態を記載している。
【００１１】
US 5.200.084は、特に、マイクロタイタープレートの穴において最小量の生体物質を浄化することを目的とした装置及び方法を開示している。とりわけ、常磁性の二次粒子で標識されたＣＤ４細胞が、末梢単核球（ＰＢＭＣ）から８３％まで浄化されたことが報告されている。
【００１２】
本発明者らの知識によれば、WO 96/26782及びEP 0.942.766 B1に開示されているように、高い浄化率を達成している内部高勾配磁気分離器の技術的設計は、現在のところ１つのみである。非ターゲット粒子とマトリクスとの非特異結合を回避するために、前記分離器の分離チャンバは、高分子で被覆されたマトリクスを収容する。このような非特異結合により、名を挙げた文献では浄化結果が損なわれている。WO 96/26782に詳細に記載されているように、高分子は、幾つかのステップにおいてマトリクス上に延伸される。著者らにより与えられている情報によれば、そのように組み立てられた分離チャンバは、高分子が、１％未満の水を含有する硬質で閉鎖された液体不透過性及びイオン不透過性の被覆をマトリクスの強磁性物質上に生成することにより、及び、高分子で被覆されたマトリクスが、既に述べた分離チャンバの総量の６０〜７０％を充填していることにより、注目されている。
【００１３】
名を挙げた刊行物によれば、非ターゲット粒子とマトリクスとの非特異結合を減少することとは別に、前記被覆は、強磁性マトリクス物質との直接的な接触による、分離されるべき生体物質の損傷（物理的な損傷）を回避すること、ならびに分離されるべき生体物質が自由イオンにより損傷すること（化学損傷）もあり得るので、強磁性マトリクス物質と、生体物質を懸濁するのに使用される緩衝液との化学反応を除外することも想定されている。一方で、この点について、科学的に保証された調査結果が利用可能でないことから、これらの種類の損傷は両方とも仮説と見なされるべきである。更に、Paul等のClinical and Laboratory Haematology, 7, 1985: 43-53での報告は、ＨＧＭＳカラムの無処置ステンレス鋼マトリクスを通過した血球及び血球片の形態及び生存能力に欠陥がないことを逆に報告している。
【００１４】
この点について言及されている特許及び刊行物は全て、参照によって本明細書に含まれる。
【００１５】
既に述べた分離チャンバの種類は、特にマトリクスの被覆のための製造工程が時間集中的であることに起因して費用がかかる。これらの分離チャンバは、Miltenyi Biotech GmbH（上記引用文中）から商業的に利用可能である。
【００１６】
これらの分離チャンバは、合成の常磁性粒子で標識された粒子に使用される場合の、特に粒子懸濁液からの高い浄化を達成している。
【００１７】
前記分離チャンバを、固有（自然）常磁性粒子用に被覆済みマトリクスと共に適用することが検討された。ここでは、マラリアに感染した赤血球が固有常磁性粒子として働いた。原生動物の群のマラリア原虫属の寄生虫であるマラリアの病原体は、赤血球を選択的に攻撃し、感染した赤血球内に生じる自由ヘム分子の中心の鉄原子を三価の鉄に酸化する特性を有する。上述のように、この赤血球は常磁性である。従って、高勾配磁気分離器の分離チャンバにおいて、マラリアに感染した赤血球が、非感染の酸素化された赤血球から分離可能であるべきである。このことは、最初に１９８１年に、Paul等（Lancet, July 11, 1981; 70-71）により１９８１年に示された。現在のところ、既に述べた商業的に利用可能な、被覆済みマトリクスを備えた分離チャンバは、８０％以上の浄化を達成すると考えられている（Uhlemann et al., MACS&more 2000; 4（2): 7-8、Trang et al., Malaria Journal 2004; 3: 1-7）。
【００１８】
一方、明記されている検討は、合計４つの病原性のマラリア病原体のうちのヒトについて知られている１つのみ、つまり熱帯性マラリアの病原物質である熱帯熱マラリア原虫、ならびに他の１つの、齧歯動物についてのマラリア病原体である齧歯類マラリア原虫を参照している。更に知られている、合計でほぼ１２０の原虫の種についての更なる科学研究は利用可能ではない。一方、商業的に利用可能な分離チャンバを、ヒトにも生じる三日熱マラリアの病原体である三日熱マラリア原虫に感染した赤血球の浄化に適用することが、常に満足な結果をもたらすわけでないということが本発明者らには既知である。
【００１９】
前述の説明から、ＨＧＭＳ技術の浄化の有効性の更なる改良が、生物医学研究の分野にとって大いに有用であろうことが明白である。一方、このことは費用効果に関しても当てはまる。というのも、特にマラリア病原体を検討する際に知られている高性能の分離チャンバが、異なる領域において、単に費用を考慮すれば常に利用できるわけではないからである。このことは特に、医療予算及び研究予算が少なめの国々に影響する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】US 3.676.337
【特許文献２】WO 98/055236
【特許文献３】WO 99/019071
【特許文献４】US 6.241.894 B1
【特許文献５】US 4.664.796
【特許文献６】US 5.200.084
【特許文献７】WO 96/26782
【特許文献８】EP 0.942.766 B1
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Oberteuffer（IEEE Transactions on Magnetics, Mag-9, No. 3, September 1973: 303-306）
【非特許文献２】Paul et al, Clinical and Laboratory Haematology, 7, 1985: 43-53
【非特許文献３】Paul et al, Lancet, July 11, 1981; 70-71
【非特許文献４】Uhlemann et al., MACS&more 2000; 4（2): 7-8
【非特許文献５】Trang et al., Malaria Journal 2004; 3: 1-7
【非特許文献６】Nakanishi et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, 91, 2001:233-244
【非特許文献７】Fukuzaki et al., Journal of Fermentation and Bioengineering, 80, 1995:6-11
【非特許文献８】Pradier et al., Surface and Interface Analysis, 34, 2002:50-54
【非特許文献９】Omanovic und Roscoe, Langmuir, 15, 1999:8315-8321
【非特許文献１０】Hansen et al., Corrosion Science, 37, 1995: 1423-1441
【非特許文献１１】Jan and Chien, Journal of General Physiology, 61, 1973:638-654, 655-668
【非特許文献１２】Armstrong et al., Biophysical Journal, 87, 2004:4259-4270
【非特許文献１３】Bhakdi et al., Cytometry A 2007:（71A) 662-667
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
従って、本発明の課題は、より良好な浄化結果を費用効果的なやり方で達成するＨＧＭＳ分離カラムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
この課題は、請求項１に記載のＨＧＭＳ分離カラム、及び請求項１０に記載の方法により満足され、ここでは内部ＨＧＭＳの利用されている。本発明による解決策は、前記請求項で言及されている特性を有する緩衝液により、前記分離カラムを平衡させ、分離されるべき前記生体物質を懸濁して、非ターゲット粒子とＨＧＭＳ分離カラムのマトリクスとの非特異結合の問題を解決するという原則を頼りとしている。その場合、前記分離カラムの前記非特異結合部位が前記緩衝液により飽和するため、前記複雑で費用推進的な被覆は、なしで済ますことができる。ここにおいて、非特異結合部位というのは、粒子が前記磁気特性とは無関係に付着する部位、従って、粒子が機械的に、電気的に、化学的に、物理的に、又はやはり異なるふうに結合するであろう部位と理解されるべきである。これによって、前記磁気勾配とは無関係に非ターゲット粒子が選択され、このことにより、浄化結果又は分離結果が不完全となるであろう。好ましくは、前記生体物質は、細胞、細胞集合体、又は細胞部分であり、これらの細胞、細胞集合体、又は細胞部分は固有常磁性を保有しているか、又はこれらの細胞、細胞集合体、又は細胞部分に、常磁性粒子又は超常磁性粒子によって直接的又は間接的に標識を付けることができる。
【００２４】
本発明による解決策は、前記緩衝液を比較的単純で費用効果的に実現できるという利点を有する。前記分離カラム及びこの分離カラムに収容されている前記マトリクスの、時間、物質及び費用を消費する予備処理は、なしで済ますことができる。これにより、このように簡素化することは、前記マトリクスの高性能の被覆を備えた従来の分離カラムと比較して浄化結果を改良するという利点さえも有する。
【００２５】
好ましくは、前記緩衝液は、前記粒子に作用する重力が基本的に補償され、従って前記粒子が前記緩衝液中でほとんど浮遊しているような、分離されるべき前記生体物質の前記粒子の濃さに合致する大きい程度の濃さを有し、及び／又は、前記緩衝液は高い粘度を有し、この高い粘度により、前記分離カラムを通る層流が、分離工程に適した流速をもつことが可能になる。このようにして、前記ターゲット粒子は、前記高勾配磁場の作用範囲において重力の影響を乱すことなく非常に長く保つことができるので、極めて高い度合いまで析出される。従って、分離及び浄化は特に高い度合いにすることができる。
【００２６】
有利には、前記磁石は、前記分離カラムをこの永久磁石又は電磁石により発生する前記特に均質な磁場内に配置できるように形状されている永久磁石又は電磁石であり、前記分離カラムは、任意で、空間的分離及び／又はスイッチオフによって前記磁場の影響下に晒すことができ、又はできなくてもよい。前記形状を調整することにより、前記磁場は、前記マトリクスの付近にもたらすことができ、従って、充分な外部磁場強度を与える。更に、前記磁石は、前記マトリクスを介して前記磁場強度を集中することにより強力な高勾配磁場を発生できるように充分に強力でなければならない。特定の作業ステップにおいて、前記分離カラムから流れ出る前記液体が前記ターゲット粒子を含有すると想定されているかどうかに応じて、前記ターゲット粒子は、空間的分離又はスイッチオフを介して選択的に保持したり解放したりすることができる。
【００２７】
好ましくは、前記マトリクスは、被覆されておらず、及び／又は、規則的又は不規則な、繊維状の、球状の、又は別様に形状された物質、特に錆びない磁性ステンレス鋼又は鋼綿を有する。被覆されていないマトリクスというのは特に費用効果的であり、本発明によれば被覆は不要である。一方、別法として、被覆が設けられ、その場合、この被覆は、通例の被覆よりも不完全な、又はさほど高くない等級のものにできることが想像できよう。前記マトリクスが、比較的広範に網状に配置されていることにより、分離されるべき前記生体物質の物理的損傷又は化学損傷が防止される。例えば、以下に記載される実験では、感受性細胞の損傷を効率的に回避することができた。
【００２８】
好ましくは、前記貯蔵容器が前記分離カラムに接続し、前記分離カラムに、調整可能な流速で流入制限素子を介して緩衝液を導入することができ、又はできなくてもよく、及び／又は、前記分離カラムが貫流制限素子を有し、この貫流制限素子が、前記分離カラムからの流出及びこの分離カラム内部の前記流速を制御することができる。ここで、貯蔵容器と分離カラムとの間の前記接続は、場合によっては管を介して、ただし自由滴下によってでもよいが、技術的構造物として実現することができる。従って、前記流速は、前記生体物質、前記緩衝液、及び前記特定の作業ステップに適合させることができ、例えば前記分離カラムの残りの相が平衡できるようにするためには、又は緩衝液を要しない作業ステップでは、緩衝液の流入を完全に封鎖することも可能である。
【００２９】
前記緩衝液は、基礎液と少なくとも１つの高分子とを含む。例えば、前記緩衝液は、８０〜９９．８重量％の基礎液と、０．２〜２０重量％の高分子とを含有する。
【００３０】
好ましくは、前記緩衝液は基礎液を有し、この基礎液のイオン強度は、前記生体物質への前記高分子の凝集効果が補償されるように、前記高分子に依存して適合される。前記基礎液は、等浸透圧濃度である陽イオンのナトリウム、カリウム、マグネシウム、又はカルシウム、及び、陰イオンの塩化物、リン酸塩、硫酸塩、又は炭酸塩を有し、特に、リン酸緩衝生理食塩水又はショ糖液、又はそれらの混合液である。以下に記載する機構により一層良好な結果を達成するために、前記非特異結合部位の飽和について、前記基礎液は、ｐＨ値及びその他のような特性が前記生体物質と前記高分子の両方に合致すべきでもある。ここで、前記等浸透圧（生理的）リン酸緩衝生理食塩水溶液が、等浸透圧リン酸緩衝ショ糖液に完全に又は部分的に取り替えられた場合、前記生体物質の無用の凝集は特に良好に防止される。ショ糖液以外のその他の糖液も考えられる。
【００３１】
例えば、前記緩衝液は、０．２〜１０重量％のゼラチン、９．５〜１０重量％のショ糖、８０〜９５重量％の蒸留水及び緩衝用リン酸ナトリウム、及び／又は、３〜１０重量％のウシ血清アルブミン、０．８５〜０．９５重量％の生理食塩水、ならびに８９〜９８重量％の蒸留水及び緩衝用リン酸ナトリウム、及び／又は、０．５〜２０重量％の加水分解コラーゲン、５〜１０重量％のショ糖、０．１〜０．９重量％の生理食塩水及び緩衝用リン酸ナトリウムを含有する。
【００３２】
有利には、前記高分子は、強でも弱でもよい天然又は合成の高分子電解質又は両性高分子電解質、特に前記合成の高分子電解質のオロタン１８５０、又は有機高分子電解質のＤ−グルクロン酸を網羅することができ、及び／又は、前記高分子は、分離されるべき前記生体物質の前記粒子の電荷に対応する電荷を前記基礎液のｐＨ値にてもたらす等電点を有し、及び／又は、前記高分子は、１０，０００〜１００，０００ｋＤａ、特に３０，０００〜７０，０００ｋＤａの分子量を有する。このような緩衝液は特に良好な結果をもたらすことがわかった。
【００３３】
更に、前記高分子は、好ましくは、球状蛋白質、特にアルブミン、ウシ又はヒト血清アルブミン、オボアルブミン、ラクトアルブミン又は植物アルブミン、β−ラクトグロブリン、κ−カゼイン、ヒストン、プロタミン、グロブリン、プロラミン、又はグルテリンを、濃度３〜７重量％、特に４〜５重量％で網羅することができる。別法として、又は付加的に、前記高分子は、より好ましくは、１５０ブルーム以下、特に７５ブルーム以下の低いゲル強度を有する、繊維状蛋白質、特にゼラチン、ウシゼラチン、ブタゼラチン、又は硬骨類ゼラチンを、濃度０．３〜１．５重量％、特に０．４〜０．８重量％で更に網羅する。また、別法として、又は付加的に、酵素加水分解コラーゲン（コラーゲン加水分解物）を、好ましくは、濃度０．３〜２０重量％、特に１〜１０重量％で利用することができる。
【００３４】
特に、明記された濃度であり、このことから得られる粘度と、適切な流速及び濃さとを有するこれらの種類の高分子は、前記非特異結合部位を飽和するのに並外れて良く適しており、これによって、前記ターゲット粒子が前記マトリクスに特に良好に粘着する状況が作られる。
【００３５】
本発明による前記方法では、前記緩衝液として、本明細書において適切なものとして言及されている各緩衝液、特に、前記装置に対する従属請求項において既に述べた各緩衝液を使用することができる。
【００３６】
好ましくは、清浄な緩衝液、即ち生体物質を含有しない緩衝液を用いた、実際に前記マトリクスにおける非特異結合部位を飽和するための充分に長い期間にわたる、特に３〜２０分又は５〜１０分の持続時間にわたる事前孵置により、前記マトリクスと、このマトリクスを包囲する分離カラムとは、この配置において、前記懸濁液の貫流前に平衡している。平衡の間、前記マトリクスは、緩衝液により連続的に覆われ続ける。より一層好適なやり方では、前記懸濁液は、前記分離工程のために前記生体物質の臨界濃度を有する。この臨界濃度も、利用される前記緩衝液に依存している。言及した前記期間は、本発明者らの前記調査結果によれば、前記非特異結合部位を前もって適切に飽和するのに十分である。前記予備平衡は、前記マトリクスに前記懸濁液を導入する際、緩衝液によりまだ完全に飽和していない前記懸濁液の前記非特異結合部位に、望ましくない粒子が最初に付着することを防止する。前記完全な手順の間、前記マトリクスは、前記非特異結合部位が解放されず、前記流れ状態が一定に保たれるように覆われ続けるべきである。というのも、この非特異結合部位が解放されると前記分離結果が損われるであろうからである。
【００３７】
望ましくない生体物質を分離するために、前記溶出液、即ち前記マトリクスを出る液体は、好ましくは前記貫流の後に捕捉され、前記マトリクスに前記懸濁液を導入した後、磁場がまだ作動している状態で、前記懸濁液が前記マトリクスを完全に出てしまうまで、前記マトリクスを追加の清浄な緩衝液により流通させ、前記貫流の間、前記緩衝液により前記マトリクスをすっかり覆い続ける。この場合、ターゲット粒子は、除去されるべき妨害物であり、前記生体物質の前記実際に所望する成分が前記マトリクスから完全に洗い流されるまで前記マトリクス内に付着している。前記捕捉された溶出液は、磁力により前記マトリクスに付着した前記ターゲット粒子をもはや含有せず、ターゲット粒子は分離しているので、ターゲット粒子の濃度は前記溶出液中で相当低減する。理想的な場合、前記溶出液はこのようなターゲット粒子をもはや含有しない。続いて、前記マトリクス内に残留している前記ターゲット粒子を、独自の作業ステップで迸出することにより、別途廃棄し又はその他の目的で使用することができる。
【００３８】
所望する生体物質を浄化する別法として、前記懸濁液を前記マトリクスに導入した後、前記外部磁場がまだ作動している状態で、前記懸濁液が前記マトリクスを完全に出てしまうまで、前記マトリクスを追加の清浄な緩衝液により流通させ、続いて、前記マトリクスを追加の清浄な緩衝液で洗い流し、前記外部磁場は、空間的分離又はこの外部磁場をスイッチオフすることにより作動停止し、これによって、前記溶出液を捕捉し、前記完全な手順の間、前記マトリクスを緩衝液により覆い続ける。この場合、前記磁場が作動している段階で前記マトリクスを出る前記液体は一次対象の生体物質を含有せず、この液体は廃棄し又は他の方法で使用することができる。引き続き磁場なしで洗い流される間にのみ、前記マトリクスは前記ターゲット粒子を再度解放する。従ってこれらのターゲット粒子は、その後に続けて前記マトリクスが洗い流される間に、捕捉される前記溶出液中に極めて著しく高い浄化の度合いで含有されている。このように洗い流す間の前記緩衝液は、磁場が作動している状態での前記実際のＨＧＭＳ段階中のものと同じ緩衝液とすることができるが、異なる緩衝液であってもよい。この場合、前記ターゲット粒子は、前記溶出液のもう一方の緩衝液中、又は両方の緩衝液の混合液中に含有される。
【００３９】
好ましくは、捕捉された前記溶出液は遠心分離され、前記手順は、好ましくは一回又は数回反復される。終わりまで遠心分離された生体物質には、前記溶出液の液相がない。従って、前記分離手順では、前記生体物質は、分離されるべきターゲット粒子を乱すことがないままである。全く反対に、前記浄化手順の間、前記ターゲット粒子は、前記懸濁液の前記緩衝液のない純粋な形で留まる。一度流通させた後に既に達成された前記普通高い度合いの分離又は浄化が充分でない限りにおいて、前記手順は再度実施することができる。このことは、特に、前記マトリクスが分離工程中に過負荷となった場合、さもなければ、前記最初の流通と比較して改良がはっきりと減退していることしか予測され得ない場合に当てはまる。
【００４０】
本発明による前記方法は、前記独立請求項に続く前記従属請求項に詳述されているのと類似の特徴により、網羅的ではなく例示によって更に展開することができ、同時に類似の利点を有する。
【００４１】
本発明は、以下で更なる特徴及び利点に関して、例示による実施形態及び図面を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明によるＨＧＭＳ装置の実施形態の組立体及び分離カラムの略正面図。
【図２】緩衝液として０．７５％のゼラチンを有する等浸透圧リン酸緩衝ショ糖液を利用する、本発明による浄化の第１実施例のフローサイトメトリー解析（図２Ａ：ＨＧＭＳカラムを通過する前の熱帯熱マラリア原虫培養液、図２Ｂ：分離カラムを通過させ洗い流し磁場から除去した後の溶出液）。
【図３】緩衝液としての、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）を用いた第２実施例の図２による図。
【図４】第３実施例の、ドットプロットとしてのフローサイトメトリー解析（図４Ａ：浄化前の、末梢単核球（ＰＢＭＣ）の懸濁液中のＣＤ８陽性白血球の割合、図４Ｂ：分離カラムを、ＰＢＭＣにより通過させ洗浄し磁場から除去した後の、分離カラムからの溶出液）、第１実施例におけるような、緩衝液として０.７５％のゼラチンを有する等浸透圧リン酸緩衝ショ糖液の使用。
【図５】図４による第４実施例の、ただし第２実施例におけるように、緩衝液として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）を使用している図。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
図１は、本発明による浄化装置の実施形態の略正面図を示す。浄化素子は、分離カラム１と、分離カラム１に緩衝液をそこから供給することのできる液体貯蔵容器１１と、強力な磁場を発生させるための永久磁石又は電磁石７と、特定の緩衝液とを含む。この緩衝液は、更に以下で詳細に説明されている。
【００４４】
分離カラム１は、ケーシングと、ケーシング内に配置されたマトリクス２とを有する。ケーシングは、非磁性物質から成り、少なくとも１つの液体入口６と、少なくとも１つの液体出口３とを保有する。液体出口３には、分離カラム１内の緩衝液の流速を左右するための素子４が装備されており、素子４は、多方向タップ４と貫流制限素子５とを有する。別法として、分離カラム内の流速を調節するための、知られているその他の素子を利用することができる。
【００４５】
マトリクス２は、外部に配置された磁場により分離カラム１の内部で高い磁気勾配が発生するように設計されている。というのは、この磁気勾配がＨＧＭ分離に必要であるためである。このため、マトリクス２は、強磁性物質、例えばステンレス鋼、磁性ステンレス鋼、又はその他のものを有し、この強磁性物質は、規則的又は不規則な、繊維状の、球状の、又は異なるふうに形状されたものである。マトリクス２の設計の例としては、実験による浄化に関連して、以下で更に名が挙げられている。
【００４６】
中にマトリクス２が収容されている分離カラム１は、強力で、好ましくは均質な磁場内に設置されており、この磁場は、永久磁石又は電磁石７により生成することができる。磁場は、例えば永久磁石の磁場から分離カラムを除去することにより、又は電磁石７をスイッチオフすることにより、スイッチオフ又はオンすることができる。
【００４７】
液体貯蔵容器１１は、液体入口領域１２とレザバー領域と液体出口１０とを有し、緩衝液は液体出口１０から分離カラム１の液体入口６にもたらすことができる。液体貯蔵容器１１の液体出口１０には、この液体貯蔵容器内に収容されている液体の流出速度を左右するための素子が装備されており、この素子は、一方向タップ８及び流量制限素子９を有する。分離カラム１の液体出口３の場合のように、液体貯蔵容器１１からの出口流速を調節するためのその他の知られている素子を、ここでも考慮することができる。また、要件に応じて、一方向又は多方向タップを使用及び／又は交換することができる。
【００４８】
本発明により利用される上述の緩衝液は、分離カラム１と、分離されるべき生体物質の懸濁液とを平衡するように働く。この緩衝液は、純水と１つ以上の異なる種類の高分子とを含有することができ、これらの高分子は、充分な濃度になると、分離カラム１内の非特異結合部位と、分離カラム内に収容されているマトリクス２とを飽和できる特性を有する。更に、緩衝液は好ましくは、分離されるべき粒子の濃さに充分に類似した濃さを有し、粒子に対する重力の効果を激しく、場合によっては一層完全に低減し、従ってこれらの粒子を懸濁状態に保つ。このようにして、分離カラム内に緩慢な流速がある間は、分離されるべき粒子の沈澱が回避される。更に、緩衝液は粘度を保有し、この粘度により層流特性をもつ分離カラム１内の流速が、分離工程に適したものとなる。最後に、緩衝液中には、除外するものではなく例として、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、及びカルシウム等の陽イオン、又は塩化物、リン酸塩、硫酸塩、及び炭酸塩等の陰イオンの異なるイオンが含有されていてもよい。ここで、言及されている列挙は、更なる他の陽イオン又は陰イオンを除外することを意図するものでは決してない。
【００４９】
緩衝液中で利用される高分子は、非特異結合部位を効率的に飽和できるほど充分に大きいものとすべきであるが、利用されるべき濃度において緩衝液の粘度を臨界まで増加するほど大きくすべきではない。従って、分子量が１０，０００〜１００，０００ｋＤａ、より一層好適には分子量が３０，０００〜７０，０００ｋＤａである高分子が好適である。有利には、付加される高分子は、分離されるべき粒子の電荷に対応する電荷を帯びる。というのも、このことが、好ましくは分離されるべき粒子及び高分子とマトリクス２の物質との非特異結合の競合的阻害に関連するからである。例えば、分離されるべき粒子がその細胞壁が主に負電荷を帯びている細胞である場合に、好ましくは負電荷をもつ高分子が選ばれる。
【００５０】
このような正又は負に帯電した高分子が、先立つ高分子電解質で知られている。高分子電解質の下位群が、名を挙げた両性高分子電解質で更に知られている。この両性高分子電解質は、陽と陰の両方の官能基を担持する高分子電解質と称される。両性高分子電解質の正味電荷は、これらの両性高分子電解質の等電点、及び分子を包囲する緩衝液のｐＨが既知であるとき、容易に減じることができる。緩衝液のｐＨが両性高分子電解質の等電点未満である場合、その正味電荷は陽性域にある。緩衝液のｐＨ値が等電点を超えると逆であるので、正味電荷は陰性域にある。緩衝液のｐＨ値が両性高分子電解質の等電点であるか又はこれに極めて近い場合、中性であるので正味電荷を帯びない。
【００５１】
本発明の状況において細胞物質を分離するのに特に有利であることがわかった高分子電解質は例えば、蛋白質の群の高分子である。蛋白質の群は、球形蛋白質（球状）及び繊維状蛋白質（ファイバ状）という２つの下位群に分けられる。一方、名を挙げた２つの下位群の間での概念的な区切りは、厳密に言えば、拡散と見なされるべきである。というのも、球状蛋白質と繊維状蛋白質との間に中間の形態が存在するからである。従って、以下では、「球状」及び「繊維状」という用語は、両方の下位群の蛋白質及び移行形態を網羅するものとする。
【００５２】
次に、液体中に溶解している球状蛋白質及び繊維状蛋白質は、固体表面に可逆的及び不可逆的に結合する特性を保有しており、この現象は主に、吸着又は凝着と呼ばれる。ステンレス鋼表面への結合に関連して、液体中に溶解している蛋白質がステンレス鋼表面と接触すると、蛋白質分子の単分子層（分子の単一の層）がステンレス鋼表面に被着することを、科学的刊行物が指摘している（Nakanishi et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, 91, 2001:233-244、Fukuzaki et al., Journal of Fermentation and Bioengineering, 80, 1995:6-11）。この単分子層の厚さは、それぞれの蛋白質分子の流体力学直径（ストークス半径）の範囲内にあり、つまり数ナノメートルの範囲内であるが、単分子層の正確な領域対称性は、これまでのところ知られていない。一方、単分子層は全体的に規則正しく形状されていないと想定することができる。場合によっては被着した蛋白質分子間に間隙さえも存在すること、即ち蛋白質分子でステンレス鋼表面をすっかり覆うことができないであろうことをPradier等は指摘している（Surface and Interface Analysis, 34, 2002 :50-54）。このような単分子層の形成が、ステンレス鋼表面の腐食に好影響を与えるのか又は悪影響を与えるのかを、更なる調査は曖昧にしている（Omanovic und Roscoe, Langmuir, 15, 1999:8315-8321、Hansen et al., Corrosion Science, 37, 1995: 1423-1441）。全体的にみて、単分子層は、水分子及び溶解したイオンを決して完全には排除しないと想定されねばならない。それでもやはり、本発明の状況において、このような単分子層の形成は、非ターゲット粒子とＨＧＭＳ分離器のマトリクスとの非特異結合を極度に効率的に防止できることがわかった。更に、分離されるべき生体物質の物理的損傷も化学的損傷も観察されなかった。
【００５３】
以下では、特に本発明の状況において価値があることがわかった幾つかの蛋白質を、本発明をこれらの特に妥当な蛋白質に制限することなく更に取り上げるものとする。
【００５４】
この点で、特に好ましくは、球状蛋白質の下位群を代表するものとして、例えばウシ又はヒト血清アルブミン等のアルブミンの名を挙げるべきである。アルブミンの群からは、例えばその他の任意の種の血清アルブミンや、除外するものではなく例として、オボアルブミン、ラクトアルブミン、又は植物アルブミン等のその他のアルブミンも使用することができるが、これらはさほど好適ではない。
【００５５】
等浸透圧（生理的）リン酸緩衝生理食塩水溶液中のウシ又はヒト血清アルブミンでは、細胞物質の分離工程用に、本発明の状況において３％〜７％の濃度、より一層好適には４％〜５％の濃度が最適であることがわかった。
【００５６】
本発明の状況では、例えば細胞研究において生理的緩衝に普通付加されるような、際立って低めの濃度（０．１％〜１％）は、所望する結果をもたらさなかった。一方で、このことは、このような比較的低いアルブミン濃度が、本発明で利用される被覆されていないマトリクス２を用いた分離カラム１の非特異結合部位を効果的に飽和できないという点で説明される。他方で、これらの低アルブミン濃度は、必要な濃さを緩衝液に与えない。このことにより、分離されるべき粒子を懸濁状態に保つことができ、重力に誘起される沈澱を、緩慢な流速によって防止することもできる。
【００５７】
本発明の状況において特に好適なものとして、繊維状蛋白質の下位群のゼラチンの名を挙げるべきである。それらの好都合な等電点が約ｐＨ４．５〜ｐＨ５．６であり、従ってそれらの負電荷が中性のｐＨ範囲にあることに起因して、生理的ｐＨ範囲内で細胞物質を分離するためのゼラチンの中で、クラスＢのゼラチン（ウシゼラチン）は特に好適であることがわかっている。細胞物質の分離工程にとって特に好都合であるウシゼラチンの濃度範囲は、０．３％〜１．５％、より一層好適には０．４％〜０．８％であることがわかった。クラスＡのゼラチン（ブタゼラチン）又は硬骨類ゼラチン（魚ゼラチン）等のその他のゼラチン、又はその他の任意のゼラチン、ならびに、ゼラチンの別の下位群としての酵素加水分解コラーゲン（コラーゲン加水分解物）は、同じ程度に使用可能であるが、少なくとも生理的ｐＨ範囲における分離にとって等電点がさほど好都合でないため、さほど好適ではない。一般に、異なるゼラチンＢ及び名を挙げたその他の群のゼラチンのうちでは、好ましくは１５０ブルーム未満、より一層好適には７５ブルーム未満の低ゲル強度（ブルーム強度）を有するものが好適とされるはずである。
【００５８】
蛋白質の群の更なる高分子として、ただしこれらの高分子は本発明の状況において利用できるものであるが、非排他的に列挙すると、とりわけ、更なる球状蛋白質、例として、β−ラクトグロブリン又はκ−カゼイン、又は、ヒストン又はプロタミン、グロブリン、プロラミン、及びグルテリンの下位群のその他の球状蛋白質、ならびに更なる繊維状蛋白質がある。
【００５９】
本発明の更なる実施形態では、有機又は合成の高分子電解質、例えば合成の高分子電解質のオロタン１８５０（商標）（Rohm and Haas, Philadelphia, PA, USA）、又は有機高分子電解質のＤ−グルクロン酸の群のその他の高分子の利用が考えられる。
【００６０】
緩衝液に付加して、分離されるべき生体物質とマトリクス物質との非特異結合を減少できる言及された高分子には、特定の緩衝液と合わせて、分離されるべき生体物質を懸濁状態で凝集させるものがある。懸濁状態での赤血球の凝集親和性は、付加された高分子の分子量及び濃度、ならびに緩衝液のイオン強度と肯定的に相関する。イオン強度は、緩衝液中の溶解したイオンの総電荷濃度と理解される。イオン強度が低ければ、凝集に抗して作用することができ、凝集を完全に防止することさえもできる。この凝集というのは、付加された高分子により引き起こされるものである。流体力学直径（ストークス半径）を考慮することにより、この場合、流体力学直径とは分子量及び固有の粘度の測定から推論できるものであるが、特定の高分子の分子量だけを考慮するよりも一層正確に、赤血球の懸濁液に対するその高分子の凝集促進作用を予測することが可能である（Jan及びChienの研究（Journal of General Physiology, 61, 1973:638-654, 655-668）と、Armstrong等の研究（Biophysical Journal, 87, 2004:4259-4270）とを比較のこと）。以下では、高分子の「分子量」という用語は、分子量から推論することのできるこの高分子の流体力学直径（ストークス半径）を常に代表するものとする。
【００６１】
本発明の状況では、これらの調査結果を活用し、緩衝液のイオン強度を適合して、分離されるべき生体物質の凝集を効率的に防止することが有利であることがわかっている。例えば、本発明者らは、特にゼラチンを含有する生理的リン酸緩衝生理食塩水溶液に懸濁する際の血球の凝集を観察した。ゼラチンの使用中にこの凝集を防止して血球を分離するには、生理的リン酸緩衝生理食塩水溶液を生理的リン酸緩衝ショ糖液に部分的に又は完全に取り替えることが特に有利であることがわかった。
【００６２】
緩衝液の粒子凝集と特定の特性（特に高分子の濃度及び分子量、ならびに緩衝液のイオン強度）との間の記載された相互関係から、分離されるべき特異的生体物質を分離するには、高分子と緩衝液のどの組み合わせが特に適切であるかについて予測することができ、特異的粒子にとって必要な分離条件にその高分子の物理化学特性が合致されている高分子を含有する緩衝液を選ぶことができる。ここで、本発明の状況における緩衝液の物理化学特性という用語は、液体の粘度、濃さ、イオン強度、容量オスモル濃度、及びｐＨ値、更に、その液体中に溶解している高分子の種類、分子量、電荷、及び濃度、ならびに、高分子及びこれらの高分子を包囲する液体の両方の、操作可能なその他の物理化学パラメータを網羅するものとする。
【００６３】
以下では、本発明による浄化方法が、より詳細に段階的に説明される。
【００６４】
第１ステップにおいて、分離カラム１を緩衝液と平衡させ、非特異結合部位を飽和させる。ここで平衡は、分離カラム１と、検討されるべき特異的粒子懸濁液の分離工程に適した、以下で緩衝液Ａと呼ばれる上述のような緩衝液とを、充分に長い期間にわたって事前孵置することにより行われる。この期間は、緩衝液中で利用される高分子に基づく。概して、この期間は、３〜２０分、より正式には５〜１０分であるが、稀にそれより短い期間又は長い期間を要することもある。
【００６５】
平衡後、分離されるべき生体物質を、緩衝液Ａ中に懸濁させ、分離カラム１の入口領域６に送り込む。分離カラム１は、Ｕ字形磁石又は電磁石７の均質な磁場内に設置されている。同時に、多方向タップ４の助けにより分離カラム１の液体出口３を開放する。ここで、マトリクス２を緩衝液で常に覆い続けることに注意しなければならない。生体物質は分離カラム１を流通し、合成の常磁性粒子で予め標識されている固有磁性粒子又はターゲット粒子がマトリクス２に粘着する。一方、全ての非磁性粒子は、妨げられずに分離カラム１を通過し、液体出口３から退出する。
【００６６】
分離されるべき生体物質の完全な付加後に、分離カラム１の洗浄を続ける。この洗浄は、分離カラム１内に残留している非磁性の非ターゲット粒子を洗い流すように働く。緩衝液Ａを収容する液体貯蔵容器１１の液体出口１０が一方向タップ８の助けにより開放され、次に純緩衝液Ａが洗浄溶液として分離カラム１を流通する。ここで再度、マトリクス２を常に緩衝液で覆い続けることに注意を払わなければならない。容量３ｍｌの分離カラム１を適切に洗浄するのに必要な緩衝液Ａの量は凡そ３０〜６０ｍｌであるが、その他の寸法の分離カラムでは、それに応じて適合されねばならない。
【００６７】
分離カラム１の洗浄完了後、分離カラム１及び液体貯蔵容器１１の液体出口３は閉鎖される。分離カラム１はＵ字形磁石７の磁場から除去され、又は、電磁石７を利用している場合は、磁場はスイッチオフされる。磁場の影響がなくなれば、次に、マトリクス２からターゲット粒子が解放されるので、緩衝液Ａにより、又は、今や分離が実行されてしまっているので所望するその他の任意の緩衝液により、分離カラム１を順行性又は逆行性で洗浄することによってターゲット粒子を洗い流すことができる。
【００６８】
ターゲット粒子が溶出液中に含有されており、この溶出液というのがカラムを洗い流すことにより得られたものであるため、この方法はこれらの粒子の浄化にとって、ならびに分離されるべき生体物質からターゲット粒子を除去することの両方にとって適切である。第２の場合、ターゲット粒子により還元された生体物質を含有する、分離カラム１を退出する洗浄溶液が対象である。その場合、洗浄溶液は、緩衝液Ａ中に懸濁している生体物質を分離カラム１に導入する間に、及び、続いて分離カラム１を純緩衝液Ａで洗浄する間に捕捉される。ここで、過度に多い多数のターゲット粒子でマトリクス２が過負荷にならないよう気を付けることが重要である。というのも、マトリクス２の能力が消耗すると、結合していないターゲット粒子が、分離されるべき残りの生体物質と共に分離カラム１の液体出口３を出ることがあるからである。
【００６９】
本方法は、一層高い浄化が達成されるべき場合、得られた浄化済みターゲット粒子を用いて反復することができる。ターゲット粒子の分離されるべき生体物質からの一層純粋な除去を目的としている場合、同じことが分離カラム１の流通後に捕捉された洗浄溶液にも当てはまる。しかし、本発明による浄化が高い度合いであるため、このことはもはやほとんど必要でない。
【００７０】
以下のテスト例は、本発明を更に示すことが意図されている。ただし、このことによりテスト例に対する適用性を制限するものではない。
【００７１】
実施例１
等浸透圧ゼラチン含有リン酸緩衝ショ糖液による、マラリア病原体（マラリア原虫）に感染した赤血球の、熱帯熱マラリア原虫培養液からの浄化。
【００７２】
物質：
緩衝液Ａ１：０．７５％のゼラチンを有する等浸透圧リン酸緩衝ショ糖液
ステンレス鋼綿１ｇ
一方向タップ
三方向タップ
２０Ｇ注射針
３ｍｌ使い捨て注射器
１０ｍｌ使い捨て注射器
５０ｍｌ使い捨て注射器
ネオジムＵ字形磁石１個
【００７３】
ａ）浄化キットの準備
分離カラムの作製
マトリクス２としての１グラムのステンレス鋼綿を、分離カラム１としての３ｍｌ使い捨て注射器にその総量の３分の２まで充填した。ここで、ステンレス鋼綿ファイバの大部分が注射器体の長手方向にくることに注意した。三方向タップ４及び流量制限素子５としての２０Ｇ注射針を注射器体の液体出口３に接続した。ステンレス鋼綿が充填されていない使い捨て注射器の上部３分の１は、分離カラム１の入口域６として働いた。
【００７４】
分離カラムの平衡
そのように作製した分離カラムに緩衝液を、三方向タップ４を通る垂直位置で逆行的に充填した。指で叩いて気泡を極力完全に抜いたが、残留している気泡が小さめであれば分離工程に悪影響を与えないことがわかった。次に、マトリクス２全部が磁場に露出されるように分離カラム１をＵ字形磁石７の両極間に位置決めし、１０分間平衡させた。
【００７５】
液体貯蔵容器の組立て及び位置決め
流量制限素子９としての１８Ｇ針を装備させた一方向タップ８を、液体貯蔵容器１１として働く５０ｍｌ使い捨て注射器の液体出口１０に嵌合した。その際、この一方向タップは、分離カラム１の上方に位置決めして、針から退出する液体が分離カラム１の入口領域へ落下できるようにした。
【００７６】
ｂ）分離工程の準備及び実行
マラリア病原体に感染した赤血球を浄化するための熱帯熱マラリア原虫培養液の準備
熱帯熱マラリア原虫培養液の赤血球５０μｌと１３．５１％の寄生虫とを４５０μｌのＲＰＭＩ媒体中で再懸濁させ、室内空気の影響下に１０分間酸素化させた。その後、培養液を遠心分離して５ｍｌ緩衝液Ａ１中に再懸濁させた。
【００７７】
分離工程の実行
分離カラム１の１０分間の平衡が完了した後、その液体出口３を開放し、同時に、再懸濁させた細胞を、マトリクス２が永続的に液体で覆われているように分離カラム１の入口領域にゆっくりと導入した。再懸濁させた培養液の完全な付加後、４５ｍｌの緩衝液Ａ１を収容している液体貯蔵容器１１の液体出口１０を開放した。ここで、分離カラム１の液体出口３を操作することによって、分離カラム１内での流速が変化することは回避するべきであり、分離カラム１のマトリクス２を緩衝液Ａ１で常に覆い続けるように注意を払うべきであった。液体貯蔵容器１１からの緩衝液Ａ１の付加が完了した後、液体出口３を閉鎖することにより分離カラム１内の流れを停止させ、分離カラム１を磁場から除去した。緩衝液Ａ１を充填した１０ｍｌ使い捨て注射器を三方向タップ４に取り付け、分離カラム１を逆行的に洗い流した。ここで、溶出液を適切な容器に捕捉し、懸濁液を１５００ｇにて５分間遠心分離した。上清は廃棄し、ペレットは３００μｌのリン酸緩衝生理食塩水溶液中に再懸濁させた。
【００７８】
ｃ）解析及び結果
その後、他の場所（Bhakdi et al., Cytometry A 2007:（71A) 662-667）に記載されているような、アクリジンオレンジによる細胞の染色及びフローサイトメトリー解析を続けた。図２は、浄化の結果をフローサイトメトリー解析の柱状図によって示す。Ａ）高勾配磁気分離カラムを通過させる前の熱帯熱マラリア原虫培養液。Ｍ１：正常な赤血球、Ｍ２：熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球（１３．５１％）。Ｂ）分離カラム１を、培養液により通過させ４５ｍｌの緩衝液Ａ１で洗浄し磁場から除去した後の、分離カラム１からの溶出液。Ｍ１：正常な赤血球、Ｍ２：熱帯熱マラリア原虫に感染し、９９．５４％まで浄化された赤血球。これに応じて、ギムザで染色された血液塗沫標本は、マラリア病原体に感染した赤血球だけを示した。浄化された赤血球からのマラリア病原体は、数日にわたり問題なく培養された。
【００７９】
実施例２
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）による、マラリア病原体に感染した赤血球の、熱帯熱マラリア原虫培養液からの浄化。
【００８０】
物質：
実施例１に列挙されているようなもの、ただし緩衝液Ａ１は緩衝液Ａ２（ＢＳＡが５％であるＰＢＳ）に取り替えられた。
【００８１】
ａ）浄化キットの準備
実施例１に記載されているようなもの。
【００８２】
ｂ）分離工程の準備及び実行
マラリア病原体に感染した赤血球を浄化するための熱帯熱マラリア原虫培養液の準備
実施例１に記載されているようなもの。本実験において、熱帯熱マラリア原虫培養液の寄生虫は１４．４７％であった。緩衝液Ａ１は緩衝液Ａ２に取り替えた。
【００８３】
分離工程の実行
実施例１に記載されているような、ただし以下の差異のあるもの：
緩衝液Ａ１は、緩衝液Ａ２に取り替えた。その後、溶出液の遠心分離を８００ｇにて５分間実行した。
【００８４】
ｃ）解析及び結果
解析を実施例１と同じように実行した。図３は、浄化の結果をフローサイトメトリー解析の柱状図によって示す。Ａ）高勾配磁気分離カラムを通過させる前の熱帯熱マラリア原虫培養液。Ｍ１：正常な赤血球、Ｍ２：熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球（１４．４７％）。Ｂ）分離カラム１を、培養液により通過させ４５ｍｌの緩衝液Ａ２で洗浄し磁場から除去した後の、分離カラム１からの溶出液。Ｍ１：正常な赤血球、Ｍ２：熱帯熱マラリア原虫に感染し、９７．０３％まで浄化された赤血球。これに応じて、ギムザで染色された血液塗沫標本は、ほぼマラリア病原体に感染した赤血球だけを示した。浄化された赤血球中のマラリア病原体は、更に数日にわたり問題なく培養された。
【００８５】
実施例３
表面抗原ＣＤ８（ＣＤ８陽性細胞）を担持する白血球の、白血球（末梢単核球（ＰＢＭＣ））の懸濁液からの浄化
【００８６】
物質：
実施例１に列挙されているようなもの
【００８７】
ａ）浄化キットの準備
実施例１に記載されているようなもの
【００８８】
ｂ）分離工程の準備及び実行
ＣＤ８陽性細胞の、抗体で共役された合成の常磁性粒子（微粒子）による標識
１．５×１０７のヒト末梢単核球（ＰＢＭＣ）を、ラットモノクローナル抗ヒトＣＤ８ＩｇＧ抗体により３０分間、ＰＢＳ／ＢＳＡ１％中で氷上にて孵置した。細胞は同じ緩衝液で２度洗浄し、続いて抗ラットＩｇＧで共役された微粒子（Miltenyi Biotech GmbH、（上記引用文中））により更に１０分間、氷上にて孵置した。細胞は、同じ緩衝液中で再び２度洗浄し、続いて更に３０分間、蛍光で標識された抗体（ＰＥ−抗ＣＤ８及びＦＩＴＣ−抗ＣＤ３、Simultest（商標） BD Biosciences, 2350 Qume Drive, San Jose, CA USA 95131）により氷上にて孵置した。その後、ＰＢＳ／ＢＳＡ１％による細胞の二重洗浄を再度続けた。その後、細胞は終わりまで再度遠心分離し、１１．５ｍｌの緩衝液Ａ中で再懸濁させた。
【００８９】
分離工程の実行
実施例１に記載されているようなもの
【００９０】
ｃ）解析及び結果
図４は、ＣＤ８陽性細胞のＰＢＭＣの懸濁液からの浄化の結果を示す。Ａ）試料の細胞個体群。上方の２つの象限はＣＤ８陽性細胞（２３．２１％）を示す。Ｂ）分離カラム１を、ＰＢＭＣにより通過させ４５ｍｌの緩衝液Ａ１で洗浄し磁場から除去した後の、分離カラム１からの溶出液。上方の２つの象限は、ＣＤ８陽性細胞が９９．１７％まで浄化されたことを示す。
【００９１】
実施例４
ＣＤ８陽性細胞の、ＰＢＭＣの懸濁液からの除去（減損）
【００９２】
物質
実施例２に列挙されているようなもの、ただし流量制限素子として２０Ｇ注射針ではなく２５Ｇ注射針を利用した。
【００９３】
Ａ）浄化キットの準備
実施例１に記載されているようなもの
【００９４】
Ｂ）分離工程の準備及び実行
ＣＤ８陽性細胞の、抗体で共役された合成の常磁性粒子（微粒子）による標識
実施例３に記載されているようなもの
【００９５】
分離工程の実行
実施例２に列挙されているようなもの、ただし１５ｍｌ緩衝液Ａ２を使用した。このテストでは、分離カラム１を通過する液体を対象とした。この液体を適切な容器内に捕捉し、細胞を８００ｇにて５分間終わりまで遠心分離し、３００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。
【００９６】
ｃ）解析及び結果
図５は、ＣＤ８陽性細胞のＰＢＭＣの懸濁液からの除去の結果を示す。Ａ）試料の細胞個体群。上方の２つの象限はＣＤ８陽性細胞（３５．４１％）を示す。Ｂ）分離カラム１を、ＰＢＭＣにより通過させ１５ｍｌの緩衝液Ａ２で洗浄し磁場から除去した後の、分離カラムからの溶出液。上方の２つの象限は、ＣＤ８陽性細胞が０．５７％まで減損されたことを示す。
【００９７】
上述の刊行物が全て、参照により本特許明細書に援用される。
【００９８】
要約すると、本発明は、生体物質に高勾配磁気分離を実行するための、「キット」とも表される消耗物質を備えた技術的装置であって、
１．１．強力で均質な外部磁場内で高勾配磁場を発生させるのに適した強磁性物質から成るマトリクスを収容する分離カラムと、
１．２．分離カラムの入口領域に緩衝液Ａをそこからもたらすことのできる液体貯蔵容器と、
１．３．強力で一様な磁場を発生させるための永久磁石又は電磁石と、
１．４．分離カラムを平衡させ、分離されるべき生体物質を懸濁するための緩衝液Ａであって、以下の３つの有利な特性のうちの少なくとも１つを示す緩衝液Ａと
を網羅するか又はこれらから成り、これらの特性とは、
１．５．緩衝液Ａが、分離されるべき生体物質を平衡し懸濁するための高分子を含有し、この場合、この高分子が分離カラム内の非特異結合部位を飽和できるという特性を保有する、及び／又は、
１．６．緩衝液Ａが濃さを有し、この場合、この濃さは分離されるべき粒子の濃さに充分に類似して、粒子に対する重力の効果を極力低減し、従ってこれらの粒子を緩衝液Ａ中で懸濁し続けるものである、及び／又は、
１．７．前記緩衝液Ａが粘度を保有し、この場合、この粘度は分離カラム内の層流特性により、分離工程に適した流速に寄与するものである、
以上の技術的装置を使用するという考えに基づいている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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