(57)【要約】  式(I)の化合物又はその医薬として許容し得る塩、及びデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療方法を提供する：【化１】2010535828.tif 000021(式中、A1、A2、A3及びA4のうちの3つはCHを表し、A1、A2、A3及びA4のうちの1つはCR1を表し;R1はSO2R2又はNHCOR2を表し、R2は、1以上のハロゲン、ヒドロキシル又はアルコキシ基によって任意に置換されたC1-C6アルキルを表し;R9は、C6-C10アリールを表す。)。【選択図】なし
2010535828.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)の化合物又はその医薬として許容し得る塩：
【化１】
2010535828.tif 000019
(式中、A1、A2、A3及びA4のうちの3つはCHを表し、A1、A2、A3及びA4のうちの1つはCR1を表し;R1はSO2R2又はNHCOR2を表し、R2は1以上のハロゲン、ヒドロキシル又はアルコキシ基によって任意に置換されたC1-C6アルキルを表し;R9は1以上のハロゲン基によって任意に置換されたC6-C10アリールを表す。)。
【請求項２】
式Iaである、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
R9が2-ナフチル又は4-クロロフェニルを表す、請求項１又は請求項２記載の化合物。
【請求項４】
A1、A2及びA4がCHを表し、A3がCR1を表す、請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項５】
R2がエチル又はイソプロピルである、請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物。
【請求項６】
下記表から選択される化合物:
【表１】
2010535828.tif 000020
。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかの化合物及び医薬として許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかの化合物を投与することを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー筋ジストロフィー又は悪液質の治療又は予防方法。
【請求項９】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー筋ジストロフィー又は悪液質の治療又は予防のための医薬品の製造における、請求項１〜６のいずれかの化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願)
優先権は、2007年8月15日に出願された表題「デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療(TREATMENT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY)」のGB0715938.7に対して本明細書中において主張される。上記出願の開示は、その全体において引用により取り込まれている。
【０００２】
(分野)
本明細書中に提供されるものは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療方法である。
【背景技術】
【０００３】
(背景)
デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、筋肉機能の進行性悪化と関連している共通した、遺伝的神経筋疾患であり、フランスの神経科医Duchenne de Boulogneによって150年以上前に初めて記載され、その後に命名された疾患である。DMDは、男性3,500人のうちの1人に発症するX染色体連鎖劣性欠損症として特徴付けされ、ジストロフィン遺伝子の突然変異によって生じる。その遺伝子はヒトゲノムにおいて最も大きいものであり、DNAの2,600,000塩基対を包含し、かつ79のエキソンを含む。ジストロフィン突然変異の約60%は、下流のフレームシフトエラーを導く大きな挿入又は欠失であり、約40%は、点突然変異又は小さいフレームシフト再構成である。多くのDMD患者は、ジストロフィンタンパク質が欠乏している。ベッカー筋ジストロフィーは、より軽症型のDMDであり、ジストロフィンタンパク質の量の減少又はサイズの変化によって生じる。DMDの高い発生率(10,000個の精子又は卵子のうち1個)は、遺伝学的スクリーニングが当該疾患を排除することはないことを意味し、有効な療法が強く望まれている。
【０００４】
DMDの自然及び設計された動物モデルが多く存在し、前臨床試験の主柱となっている(Allamand, V. & Campbell, K. P. 「筋ジストロフィーのための動物モデル：療法開発のための有用なツール(Animal models for muscular dystrophy: valuable tools for the development of therapies.)」 Hum. Mol. Genet. 9, 2459-2467 (2000))。マウス、ネコ及びイヌモデルはすべて、DMD遺伝子の突然変異を有し、ヒトにおいて見られるものと類似の生化学ジストロフィン異常症を示すが、その表現型に関して、それらは意外かつ相当な相違を示す。ヒトの様に、イヌ(ゴールデンレトリーバ筋ジストロフィー及びジャーマン・ショートヘアード・ポインター)モデルは重症な表現型を有する;これらのイヌは、典型的には心不全で死亡する。イヌは、ヒト疾患に対する最良の表現型模写を提供し、前臨床研究の高ベンチマークと考えられる。残念なことに、これらの動物を育てることは高価でありかつ難しく、臨床時間経過は同腹子の間で変動し得る。
【０００５】
mdxマウスは、利用可能性、短い妊娠時間、成熟する時間及び比較的低コストのため最も広く使われているモデルである(Bulfield, G., Siller, W. G., Wight, P. A. & Moore, K. J. 「マウスのX染色体連鎖筋ジストロフィー(mdx) (X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse.)」 Proc. Natl Acad. Sci. USA 81, 1189-1192 (1984))。
【０００６】
約20年前のDMD遺伝子の発見以来、様々な程度のDMD治療成功が、前臨床動物実験において達成された。その幾つかは、ヒトにおいて検証されている。現在の治療的戦略は、広く3つのグループに分けることができる:第一に、遺伝子療法アプローチ;第二に、細胞療法;最後に、薬理学的療法である。遺伝子及び細胞系療法は、特に疾患の経過初期に開始される場合、二次欠陥/病変(例えば痙縮)を個々に修正する必要性が除かれるという、基本的な利点を提供する。残念なことに、これらのアプローチは、多くの技術的な困難に直面する。毒性、安定な発現の欠如及び送達の困難性に加えて、ウィルスベクター、筋芽細胞及び新たに合成されたジストロフィンに対して、免疫学的反応が報告されている。
【０００７】
筋ジストロフィー治療のための薬理学的アプローチは、ミッシング遺伝子(missing gene)及び/又はタンパク質を送達するように設計されていないことにおいて、遺伝子及び細胞系アプローチと異なる。一般に、薬理学的戦略は、炎症の低下、カルシウムホメオスタシスの改善、及び筋前駆細胞増殖又は関与の増加などの手段によって表現型を改善する目的で、薬剤/分子を使用する。これらの戦略は、全身送達が容易であり、かつベクター及び細胞系療法に関連する多くの免疫学的及び/又は毒性の問題を回避できる利点を提供する。炎症の低下のためにコルチコステロイド及びクロモグリク酸ナトリウム、カルシウムホメオスタシスの維持のためにダントロレン、及び筋力の増加のためにクレンブテロールを用いた研究は、有望な結果をもたらしたが、これらの潜在的療法のいずれもが、DMDの治療に有効であることは今のところ示されていない。
【０００８】
別の薬理学的アプローチは、アップレギュレーション療法である。アップレギュレーション療法は、欠陥遺伝子を置き換えるために別の遺伝子の発現を増加させることに基づく。免疫応答が、前非存在のタンパク質に対してマウントされる場合に特に有益である。ユートロフィンのアップレギュレーション、ジストロフィンの常染色体パラログ(autosomal paralogue)が、DMDの潜在的療法として提唱された(Perkins & Davies, Neuromuscul Disord, Sl: S78-S89 (2002), Khurana & Davies, Nat Rev Drug Discov 2:379-390 (2003))。ユートロフィンがトランスジェニックmdxマウスにおいて過剰発現するとき、それは、筋細胞の筋細胞膜に局在し、ジストロフィン関連タンパク質複合体(DAPC)の成分を復元する。これにより、ジストロフィーの進行が抑制され、順に骨格筋の機能が改善される。イヌにおいて、ユートロフィンのアデノウイルス送達により、病変が抑制されることが示された。マウスモデルにおいて、出生直後にユートロフィン発現増加を開始することが有効であり、ユートロフィンが偏在的に発現されるときに毒性は観察されない。これは、この療法をヒトに転換するのに有望である。内因性ユートロフィンを病変の低下に十分なレベルにアップレギュレーションすることは、小さい拡散性化合物の送達によって達成されることができる。
【発明の概要】
【０００９】
(説明)
予測的スクリーニングにおいて、内因性ユートロフィンをアップレギュレーションし、従ってDMDの治療に有用となり得る化合物を提供する。
【００１０】
式(I)の化合物又はその医薬として許容し得る塩を提供する。
【化１】
2010535828.tif 000003
(式中、A1、A2、A3及びA4のうちの3つがCHを表し、A1、A2、A3及びA4のうちの1つがCR1を表し;R1はSO2R2又はNHCOR2を表し、R2は、1以上のハロゲン、ヒドロキシル又はアルコキシ基(C1-C6アルコキシ基)によって任意に置換されたC1-C6アルキルを表し； R9は、1以上のハロゲン基によって任意に置換されたアリールを表す。)。
【００１１】
また、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー筋ジストロフィー又は悪液質の治療的及び/又は予防的治療のための医薬品の製造における式Iの化合物の使用を提供する。  
【００１２】
式Iの化合物は、互変異性体、鏡像異性体及びジアステレオマー形態で存在することができる。それらの全ては本開示の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本開示は、次に添付図面に関して記述される。
【図１】図1は、ルシフェラーゼレポーターアッセイ(マウスH2K細胞)を示す。
【図２】図2は、用量依存性ルシフェラーゼ誘導を示す。
【図３】図3は、マウスユートロフィンに特異的な抗体で染色されたTA筋断面の例を示す。
【図４】図4は、CPD-A(V2及びV3)に曝露されたマウスが、コントロールと比較して、ユートロフィン発現のレベルを増加したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
式Iの化合物の全ては、従来法によって製造されることができる。芳香族複素環構造を製造する方法は、周知技術である。特に、合成方法は、「総合複素環化学(Comprehensive Heterocyclic Chemistry)」, 第1巻 (編集者: AR Katritzky, CW Rees), Pergamon Press, Oxford, 1984、及び「総合複素環化学II：文献の総説(Comprehensive Heterocyclic Chemistry II: A Review of the Literature)」 1982-1995 「複素環化合物の構造、反応、合成、及び使用(The Structure, Reactions, Synthesis, and Uses of Heterocyclic Compounds)」, Alan R. Katritzky (編集者), Charles W. Rees (編集者), E.F.V. Scriven (編集者), Pergamon Pr, 1996年6月において論じられている。対象化合物の合成を補助する他の一般の供給源は、「マーチの高度有機化学：反応、機構、及び構造(March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure）」, Wiley-Interscience; 第5版(2001年1月15日)を含む。
【００１５】
式Iの化合物又はその医薬として許容し得る塩は、式IIの化合物
【化２】
2010535828.tif 000004
(式中、A1、A2、A3、及びA4は上記のように定義される。)
から、例えばEP 0 751 134に記載されているように、チオ尿素-S,S-二酸化物又は亜ジチオン酸塩(例えばアルカリ金属塩)との反応によって達成される還元的閉環で、調製されることができる。反応は、水溶液中、別の実施態様においてアルコール水溶液中、60〜80℃の温度で実施されることができる。環化は、特定の官能性の存在下、例えば、-NH2又は-OH官能基の存在下では生じないであろう。これらの基は、環化の前に保護されることを必要とする。例えば、-NH2基は、アミドとして保護されることができ、OH基はエーテルとして保護されることができる。適切な保護戦略は、例えばEP 0 751 134に開示されている。
【００１６】
式IIの化合物は、式IIIのジアゾニウム化合物
【化３】
2010535828.tif 000005
(式中、A1、A2、A3、及びA4は上記のように定義される。)
を、式IVのフェニル誘導体
【化４】
2010535828.tif 000006
(式中、R9は上記のように定義される。)
とジアゾニウムカップリング反応することによって調製されることができる。カップリング条件は、合成化学者にとって周知である。例えば、反応は、メタノール中、弱酸性条件下、最高24時間に渡って起こすことができる。
【００１７】
式IIIの化合物は、式Vの適切なアミン
【化５】
2010535828.tif 000007
(式中、A1、A2、A3及びA4は上記のように定義される。）
のジアゾ化によって調製されることができる。ジアゾ化方法は、周知技術であり、例えば、水溶液中、0〜10℃でNaNO2/AcOHとの反応によって行われる。
【００１８】
式Vの化合物は、式VIの化合物
【化６】
2010535828.tif 000008
(式中、A1、A2、A3及びA4は上記のように定義され、Pはニトロ化条件に適切な保護基を表す。）
のニトロ化、続いて脱保護によって合成されることができる。ニトロ化は、例えば、その反応条件に適切な溶媒中、濃HNO3/濃H2SO4により達成され得る。
【００１９】
式IV及びVIの化合物は、それ自体公知の従来技術により製造されることができる。
上記の方法において、出発物質に存在する幾つかの官能基、例えばヒドロキシ又はアミノ基を保護する必要がある場合があり、従って、式Iの化合物を生成するために1以上の保護基を除去する必要があってもよい。
【００２０】
適切な保護基及びそれらの除去方法には、例えば、T. Greene及びP.G.M. Wutts, John Wiley and Sons Inc., 1991.による「有機化学における保護基(Protective Groups in Organic Synthesis)」に記載されている方法がある。ヒドロキシ基は、例えば、フェニルメチル、ジフェニルメチル又はトリフェニルメチルなどのアリールメチル基；アセチル、トリクロロアセチル又はトリフルオロアセチルなどのアシル基によって；又はテトラヒドロピラニル誘導体として、保護されることができる。適切なアミノ保護基は、ベンジル、(R,S)-α-フェニルエチル、ジフェニルメチル又はトリフェニルメチルなどのアリールメチル基、及びアセチル、トリクロロアセチル又はトリフルオロアセチルなどのアシル基を含む。従来の脱保護方法は、水素化分解、酸若しくは塩基加水分解、又は光分解などを用いることができる。アリールメチル基は、例えば、金属触媒(例えばパラジウム炭)の存在下、水素化分解により除去されることができる。テトラヒドロピラニル基は、酸性条件下で加水分解によって切断されることができる。アシル基は、水酸化ナトリウム又は炭酸カリウムなどの塩基を用いる加水分解によって除去されることができる。または、トリクロロアセチルなどの基は、例えば亜鉛及び酢酸を用いる還元により除去されることができる。
【００２１】
式Iの化合物及びその塩は、従来技術を用いて、それらの反応混合物から単離されることができる。
式Iの化合物の塩は、遊離酸若しくはその塩又は遊離塩基若しくはその塩、又はそれらの誘導体を、1当量又はそれ以上の適切な塩基又は酸と反応させることによって形成されることができる。当該反応は、塩が不溶である溶媒若しくは媒体中で又は塩が可溶である溶媒中で、例えばエタノール、テトラヒドロフラン又はジエチルエーテル中で、実施されることができる。これらは減圧下で又は凍結乾燥により除去されることができる。当該反応はまた、複分解法(metathetical process)であってもよく、又は当該反応は、イオン交換樹脂上で実施されてもよい。
【００２２】
式Iの化合物の医薬として許容し得る塩は、アルカリ金属塩、例えばナトリウム及びカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム及びマグネシウム塩；III族元素の塩、例えばアルミニウム塩；及びアンモニウム塩を含む。適切な有機塩基を有する塩、例えばヒドロキシルアミン；低級アルキルアミン、例えば、メチルアミン又はエチルアミンを有する塩；置換低級アルキルアミンを有する塩、例えば、ヒドロキシ置換アルキルアミンを有する塩；又は単環の窒素複素環化合物を有する塩、例えばピペリジン又はモルフォリンを有する塩；及びアミノ酸を有する塩、例えばアルギニン、リシンなど又はそのN-アルキル誘導体を有する塩；又はアミノ糖を有する塩、例えばN-メチル-D-グルカミン又はグルコサミンを有する塩を含む。一実施態様において、塩は、無毒性の生理学的に許容し得る塩であるが、例えば、生成物の単離又は精製においては他の塩も有用である。
【００２３】
ジアステレオ異性体は、従来技術、例えばクロマトグラフィー又は分別晶出を用いて分離されることができる。様々な光学異性体は、従来の、例えば分別晶出又はHPLC技術を用いて、化合物のラセミ体又は他の混合物の分離により単離されることができる。あるいは、所望の光学異性体は、ラセミ化を生じない条件下で、適当な光学活性出発物質の反応により製造されることができる。
【００２４】
アルキルが表すことができる置換基は、メチル、エチル、ブチル、及びsecブチルを含む。
アリールが表すことができる置換基は、1以上のハロゲンによって任意に置換された、C5-C10炭素環(単環又は二環式でもよい)、及び部分的若しくは完全芳香族化合物を含む。
ハロゲンは、F、Cl、Br及びIを表すことができる。
【００２５】
また、デュシェンヌ筋ジストロフィー、ベッカー筋ジストロフィー又は悪液質の治療又は予防方法であって、その必要がある患者に、有効量の式(I)の化合物又はその医薬として許容し得る塩を投与することを含む、前記方法を提供する。
【００２６】
別の実施態様において、当該化合物は、式Iaを有する:式中、A1、A2、A3及びA4のうちの3つはCHを表し、A1、A2、A3及びA4のうちの1つはCR1を表し、R1はSO2R2又はNHCOR2を表し、R2は1以上のハロゲン、ヒドロキシル又はC1-6アルコキシ基によって任意に置換されたC1-C6アルキルを表し；R9は、C6-C10アリールを表す。
【００２７】
別の実施態様において、化合物の上記の定義された基で、R9は、2-ナフチル又は4-クロロフェニルを表す。
別の実施態様において、A1、A2及びA4はCHを表し、A3はCR1を表す。
別の実施態様において、R2は、エチル又はイソプロピルである。
【００２８】
DMDの治療に用いられる式Iの化合物は、通常、医薬組成物の形態で投与される。
したがって、この開示のさらなる態様によれば、医薬組成物であって、上記で定義された式Iの化合物又はその医薬として許容し得る塩を、一実施態様において80% w/w未満、別の実施態様において50% w/w未満、例えば0.1〜20%含み、医薬として許容し得る希釈剤又は担体と混合された、前記医薬組成物を提供する。
【００２９】
また、成分を混合することを含む、前記医薬組成物の製造方法も提供する。使用され得る医薬組成物、及び適切な希釈液又は担体の例は、以下の通りである：
静脈内注射又は注入用のために−精製水又は食塩溶液；
吸入組成物用のために−粗いラクトース；
錠剤、カプセル及び糖衣剤用のために−微結晶性セルロース、リン酸カルシウム、珪藻土、糖(ラクトース、ブドウ糖又はマンニトールなど)、タルク、ステアリン酸、デンプン、炭酸水素ナトリウム及び/又はゼラチン；
坐薬用のために−天然又は硬化した油又はワックス。
【００３０】
当該化合物が水溶液中で用いられる場合、例えば注入のために、他の賦形剤の組み込みが必要であってもよい。特に、キレート剤若しくは金属イオン封鎖剤、抗酸化剤、張度調整剤、pH-改質剤及び緩衝剤を言及することができる。
式Iの化合物を含む溶液は、必要に応じてエバポレート、例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥によって、固体組成物を与えることができ、これらは使用の前に再構成されることができる。
【００３１】
溶液中にない場合、式Iの化合物は、一実施態様において、0.01〜10μmの質量中央径を有する形態で存在する。また当該組成物は、適切な保存剤、安定剤及び湿潤剤、溶解剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの水溶性セルロースポリマー又はプロピレングリコールなどの水溶性グリコール、甘味料、及び着色剤、及び香料を含むこともできる。必要に応じて、当該組成物は、徐放性形態で製剤化されることができる。
【００３２】
医薬組成物中の式Iの化合物の含量は、通常、製剤全体に対して約0.01〜約99.9重量%であり、一実施態様において約0.1〜約50重量%である。
式Iの化合物の用量は、年齢、体重、一般健康状態、食事、投与時間、投与方法、クリアランス速度、薬剤の組合せ、患者がその時治療下にある疾患のレベル、及び他の要因を考慮して決定される。
【００３３】
用量は、標的疾患、状態、投与の対象、投与方法などに応じて変化し、デュシェンヌ筋ジストロフィーを罹患している患者における該疾患の治療のための経口投与用治療薬については、0.01 mg〜10 g、一実施態様において0.1〜100mgであり、一実施態様において、1日当たり一用量で又は2若しくは3分割量で投与される。
DMDの治療に用いられる式Iの化合物の潜在的活性は、以下の予測的アッセイ及びスクリーニングで立証できる。
【００３４】
(1. ルシフェラーゼレポータアッセイ(マウスH2K細胞))
スクリーニングのために使用される細胞株は、不死化mdxマウスH2K細胞株であり、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結された第1の非翻訳エキソンを含む、ユートロフィンAプロモーターの〜5kb断片を含有したプラスミドで安定にトランスフェクトされている(図1を参照)。
【００３５】
低温条件下及びインターフェロン含有培地下で、細胞は筋芽細胞として残存する。これらを96ウェルプレートにまき、化合物の存在下で3日間培養する。その後、ルシフェラーゼのレベルを、細胞溶解液、及びプレート照度計を利用する発現ルシフェラーゼ遺伝子から放出される光の読み込みにより測定する。
当該アッセイにおける化合物の薬理学的用量応答の例を図2に示す。
【００３６】
(2. mdxマウス)
ADMETデータから得られたデータを優先順位付けし、最善のインビトロルシフェラーゼ活性及び合理的なADMETデータを有する化合物を、mdx概念実証研究において試験するために優先順位付けした。その結果は、ビヒクルのみを投与したコントロール動物と比較した場合に、どの化合物が、ジストロフィン欠乏筋内のユートロフィンタンパク質レベルを増加させる能力があるかどうかを確認するためである。
【００３７】
28日間毎日腹腔内投与された10mg/kgの化合物で注射された2匹の動物及び年齢一致コントロールを存在させた。筋肉サンプルを採取し、切片化(ユートロフィンの筋細胞膜染色の増加を確認するため)、及びウェスタンブロット(ユートロフィンレベルの全体の増加を確認するため)のために処理した。
【００３８】
図3は、マウスユートロフィンに特異的な抗体で染色されたTA筋断面の例を示す。ビヒクルのみを注射したmdx筋との比較により、筋細胞膜結合ユートロフィン量の増加が示されている。
【００３９】
また、上記の処置マウスからの筋肉を切除し、ウエスタンブロットのために処理し、特異的抗体で染色した(図4を参照)。また、CPD-Aで投与された筋肉を再び使用することにより、TA脚筋及び隔膜の双方に存在するユートロフィンの全体のレベルの有意な増加が示される。CPD-A(V2及びV3)に曝露された両マウスは、コントロールと比較して、ユートロフィン発現レベルの増加を示した。
【００４０】
最初の28日の研究からのポジティブアップレギュレーションデータは、その後、さらなる2匹のマウスの28日の研究において再現された。計3つの異なる化合物が、二つ組(in duplicate)において、mdxマウスの28日間の腹腔内投与によって毎日送達された場合に、ユートロフィン発現レベルを増加させる能力を示した。このデータは、腹腔内投与で送達された場合に、mdx筋で見出されたユートロフィンレベルの有意な増加を生じる化合物の能力を示している。今までの全ての公表データは、ユートロフィンレベルの3倍以上の増加がジストロフィン欠乏筋に有意な作用効果を有することを示しているので、したがって、このアプローチが疾患を改善するという確信を我々に提供している。
【００４１】
(H2K/mdx/Utro Aレポータ細胞株保持)
H2K/mdx/Utro Aレポータ細胞株を、≦30%集密まで、週に2回継代した。該細胞を、10%CO2の存在下33℃で成長させた。
プラッティングのために筋芽細胞を取り除くため、単層が剥離し始めるまで、それらをトリプシン/EDTAでインキュベートした。
【００４２】
成長培地
DMEM Gibco 41966 
20% FCS 
1% Pen/Strep 
1% グルタミン 
10 mlsニワトリ胚抽出液
インターフェロン(1276 905 Roche) 新たな10μl/50mlsの培地を加える。
【００４３】
(96ウェルプレートに関するルシフェラーゼアッセイ)
H2K/mdx/Utro Aレポータ細胞株細胞を、190μlの通常の成長培地中、約5000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレート(Falcon 353296、白い不透明体)にまいた。その後、プレートを24時間、10%CO2存在下、33℃でインキュベートした。
【００４４】
化合物は、最終濃度が10μMになるように、各ウェルに10μlの希釈された化合物を加えることによって投与した。続いて、プレートをさらに48時間インキュベートした。
その後、細胞を、製造業者のプロトコル(Promega Steady-Gloルシフェラーゼアッセイシステム(E2520))に従ってその場(in situ)で溶解し、続いて、プレート照度計(Victor 1420)を用いて10秒間カウントした。
【００４５】
(化合物貯蔵)
スクリーニングのための化合物を、必要とされるまで、100%DMSO中、10 mMストックとして−20℃で貯蔵した。
【００４６】
(化合物を用いたmdxマウスの注射)
繁殖コロニーからMdxを試験のために選択した。マウスに、腹腔内経路(ip)を用いて、ビヒクル又は10mg/kgの化合物のいずれかを毎日注射した。マウスを計量し、化合物を、5%DMSO, 0.1% tweenを含むPBSで希釈した。
マウスを所望の時点で頚椎脱臼によって犠牲にし、分析のために筋肉を切除した。
【００４７】
(筋肉分析)
(免疫組織化学)
切片化のための組織を解剖し、OCT (Bright Cryo-M-Bed)に浸漬し、液体窒素冷却イソペンタンで凍結させた。未固定化8μM凍結切片をBrightクリオスタット上で切断し、−80℃で保存した。
【００４８】
染色準備において、切片を30分間、5%ウシ胎仔血清を含むPBS中でブロックした。一次抗体をブロッキング試薬で希釈し、湿潤チャンバー内で切片に接触させて1.5時間インキュベートし、その後、PBS中で5分間、3回洗浄した。また、二次抗体をブロッキング試薬で希釈し、湿潤チャンバー内で遮光下、1時間インキュベートした。最後に、切片をPBS中で5分間、3回洗浄し、カバーガラスを液封マウントで重ねた。スライドをライカ蛍光顕微鏡で分析した。
【００４９】
(結果)
生物学的活性を、マウスH2K細胞のルシフェラーゼレポータアッセイを用いて評価し、以下のように分類する：
＋        コントロールに対して最大200%
＋＋      コントロールに対して201%〜300％
＋＋＋    コントロールに対して301%〜400％
＋＋＋＋  コントロールに対して401%以上
【００５０】
【表１】
2010535828.tif 000009
【実施例】
【００５１】
HPLC-UV-MSは、Gilson 170 DAD及びエレクトロスプレーイオン化モードで操作するFinnigan AQA質量分析計により行われる検出を用いて、Gilson 321 HPLCで実行した。使用するHPLCカラムは、Phenomenex Gemini C18 150x4.6mmである。分取HPLCは、Gilson 170 DADにより行われる検出を用いて、Gilson 321で実行した。画分は、Gilson 215画分回収器を用いて回収した。使用する分取HPLCカラムは、Phenomenex Gemini C18 150x10mmであり、移動相はアセトニトリル/水である。
【００５２】
1H NMRスペクトルは、300MHzで操作するBruker計測器で記録した。NMRスペクトルは、基準としてクロロホルム(7.25ppm)又はDMSO-D6(2.50ppm)を用いるCDCl3溶液(ppmで記録される)として得た。ピーク多重度が記録される場合、以下の省略形を使用する。s(シングレット)、d(ダブレット)、t(トリプレット)、m(マルチプレット)、br(ブロード)、dd(ダブレットダブレット)、dt(ダブレットトリプレット)、td(トリプレットダブレット)である。結合定数は、与えられる場合にヘルツ(Hz)で記録される。
【００５３】
カラムクロマトグラフィーは、フラッシュクロマトグラフィ(40-65μmシリカゲル)により、又は自動化した精製系を用いて実行した(Biotage(登録商標)からのSP1(商標)精製系)。マイクロ波での反応は、Initiator 8(商標)(Biotage)で行った。
【００５４】
使用する省略形は、DMSO(ジメチルスルホキシド)、HCl(塩酸)、MgSO4(硫酸マグネシウム)、NaOH(水酸化ナトリウム)、Na2CO3(炭酸ナトリウム)、NaHCO3(炭酸水素ナトリウム)、THF(テトラヒドロフラン)である。
【００５５】
(実施例１)
N-(2-(ナフタレン-2-イル)-2H-インダゾール-6-イル)イソブチルアミド及びN-(1-(ナフタレン-2-イル)-1H-インダゾール-6-イル)イソブチルアミド
【化７】
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【００５６】
(工程1：アリール化)
【化８】
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オーブン中で乾燥させた封止チューブに、ヨウ化銅(29.2mg、0.05eq、0.153mmol)、6-ニトロインダゾール(500mg、1eq、3mmol)及びリン酸カリウム三塩基(1.37g、2.1eq、6.43mmol)を加えた。その後、2mlの乾燥トルエンを加えた。反応混合物を、窒素で二回フラッシュした。1.5mlの乾燥トルエンに溶解した2-ブロモナフタレン(762mg、1.2eq、3.68mmol)を、反応混合物に加え、続いて、1mLの乾燥トルエンに溶解したトランス、N,N'-ジメチル-1,2-シクロヘキサンジアミン(987.2mg, 0.20eq, 0.613mmol)を加えた。反応物を、窒素で二回フラッシュし、5分間脱気した。反応物を封止し、24時間110℃で加熱した。
【００５７】
反応物を、室温に冷却させる。粗反応混合物をEtOAcに溶解し、セライトを通してろ過した。セライトをEtOAcで3回洗浄し、減圧下で濃縮した。
10%EtOAc/90%石油を用いるカラムクロマトグラフィー(ジョーンズ25g)により精製し、282mgの異性体A及び53mgの異性体Bを得た。
【化９】
2010535828.tif 000012
【００５８】
(工程2:ニトロ還元)
(BからDへの変換のための説明)
【化１０】
2010535828.tif 000013
異性体A又はB(120mg、1eq、0.415mmol)及び塩化アンモニウム(45mg、2eq、0.830mmol)を、THF(4mL)/H2O(ImL)の混合液に溶解し、その混合物を80℃で加熱した。続いて、鉄粉(116mg、5eq、2.07mmol)を該混合物に加えた。反応物を80℃で12時間加熱した。TLCにより出発物質は残っていなかった。反応混合物を室温に冷却し、セライトを通してろ過した。セライトをTHFで3回洗浄し、減圧下で濃縮した。残渣をEtOAcに溶解し、H2Oで2回及びブラインで1回洗浄した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。精製は試みなかった。
【００５９】
(工程3：アミド形成)
(DからFへの変換のための説明)
【化１１】
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粗アニリンC又はD(130mg、1eq、0.5mmol)を、ピリジン(8mL)に溶解し、イソブチリルクロリドを室温で滴下添加した。反応混合物を、室温で18時間、撹拌を維持した。
【００６０】
18時間後、TLCによって出発物質は観察されなかった。反応混合物をCuSO4水溶液で希釈し、EtOAcで3回抽出した。合わせた有機相をブライン及びH2Oで1回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。
【００６１】
20%EtOAc/80%石油を用いるカラムクロマトグラフィー(ジョーンズ2g)により精製し、エーテル中で粉砕し、わずかな溶媒を除去した。
異性体A: 赤い固体 LCMS RT=6.88 M+1 =330.2
異性体B: 白色固体LCMS RT=6.42 M+1=330.2
【化１２】
2010535828.tif 000015
【００６２】
(実施例２)
【化１３】
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【００６３】
(2-(4-クロロフェニル)-6-(エチルスルホニル)-2H-インダゾール)
窒素下、乾燥シュレンクに、2-(4-クロロフェニル)-6-(メチルスルホニル)-2H-インダゾール(200mg, 0.65mmol)及び乾燥テトラヒドロフラン(14mL)を加えた。続いて、その溶液を-78℃に冷却し、リチウムビス(トリメチルシリル)アミド(0.65mL、0.65mmol)を加えた。反応物を、-78℃で2時間撹拌し、その後、ヨウ化メチル(81μL、1.31mmol)を加えた。溶液を、16時間、室温に暖めた。その溶液に、飽和塩化アンモニウム水溶液(10mL)を加え、有機相を分離し、水相を酢酸エチルで3回抽出した。合わせた有機相を、無水MgSO4で乾燥し、エバポレートした。得られた固体をカラムクロマトグラフィーにより、酢酸エチル/ヘキサン1:2v/vを用いて溶出して精製し、先のバッチと合わせ、108mgを逆相HPLCで精製し、85mgの表題化合物(LCMS RT= 6.39分、MH+ 322.2)を得た。
【化１４】
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【００６４】
(実施例３)
(5-(エチルスルホニル)-2-(ナフタレン-2'-イル)-2H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール)
窒素下、乾燥シュレンクに、5-(メチルスルホニル)-2-(ナフタレン-2-イル)-2H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール(83mg, 0.26mmol)及び乾燥テトラヒドロフラン(8mL) を加えた。その後、溶液を-78℃に冷却し、リチウムビス(トリメチルシリル)アミド(0.28mL、0.28mmol)を加えた。反応物を、-78℃で1時間撹拌し、続いて、ヨウ化メチル(33μL、0.52mmol)を加えた。溶液を、16時間、室温に暖めた。その溶液に、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、有機相を分離し、水相を酢酸エチルで2回抽出した。合わせた有機相を、無水MgSO4で乾燥し、エバポレートした。得られた固体を、カラムクロマトグラフィーにより酢酸エチル/ヘキサン1:2v/vで溶出し、続いて別のカラムクロマトグラフィーにより酢酸エチル/ヘキサン1:3v/vで溶出して精製し、その後、逆相HPLCにより精製して、19mg (22%)の表題化合物(LCMS RT= 7.25分、(2M+NH4)+ 692.0)を得た。
【化１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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