(57)【要約】  本発明は抗ヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）抗体及び抗体フラグメントを結晶化させるためのバッチ晶析方法として、前記抗体の工業的規模の生産を可能にする方法、抗体結晶（例えば抗ｈＴＮＦα抗体フラグメントの結晶）の寸法の制御方法、前記結晶を含有する組成物並びに前記結晶及び組成物の使用方法に関する。
2010535771.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の実質的に均一寸法の抗体結晶の製造方法であって、
ａ）抗体結晶の形成を可能にする条件下で抗体と少なくとも１種の結晶化剤を含有する水性結晶化混合物を準備する段階と；
ａ）前記結晶化混合物を制御条件下で撹拌し、所望の平均寸法範囲の抗体結晶を形成する段階を含む前記方法。
【請求項２】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約１〜約２００ｒｐｍの範囲の速度で撹拌することに対応する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記制御条件が前記結晶化混合物を直径約２〜約１００ｃｍの範囲のローラー容器に入れて撹拌することに対応する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することに対応し、前記ローラー容器の総容積の約１〜約１００％に結晶化混合物を充填する請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することに対応し、前記ローラー容器の総容積の約１〜約１００％に結晶化混合物を充填する請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約３０分間〜約２０日間撹拌することに対応する請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約−１５〜約＋５０℃の範囲の温度で撹拌することに対応する請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記撹拌が前記結晶化混合物のローリング、かき混ぜ、振盪及び／又はタンブリングを含む請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
結晶化剤がポリアルキレンポリオールである請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
結晶化剤がポリアルキレングリコールである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
結晶化剤がポリエチレングリコールである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
結晶が約１〜約１０００μｍの範囲内の均一な結晶粒径及び／又は粒長を含む請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
抗体が抗体フラグメントである請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
抗体フラグメントが抗ｈＴＮＦα抗体フラグメントである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗体フラグメントがＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２フラグメントである請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
抗体フラグメントが寄託番号ＥＣＡＣＣ８７０５０８０１のハイブリドーマ細胞株により産生されるＭＡＫ１９５のＦ（ａｂ’）２フラグメントであるＭＡＫ１９５Ｆである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＭＡＫ１９５Ｆが約０．５〜約２８０ｍｇ／ｍｌの範囲の初期蛋白質濃度で存在しており、ローラー容器に入れて約１５〜約２５℃の範囲の温度にて約５〜約１００ｒｐｍの範囲の速度で約１〜約６０日間撹拌する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記結晶が約１〜約２００μｍの範囲の制御された平均結晶粒長を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法により取得可能な抗体結晶。
【請求項２０】
抗ｈＴＮＦα抗体結合フラグメントを結晶化するためのバッチ晶析方法であって、
（ａ）抗体と、結晶化剤としての少なくとも１種のポリアルキレングリコールを含有する水性結晶化混合物を準備する段階と；
（ｂ）前記抗体の結晶が形成されるまで前記水性結晶化混合物をインキュベートする段階を含み、
前記少なくとも１種のポリアルキレングリコールを（ａ）１段階又は（ｂ）２段階以上で提供し、ある段階で形成された前記抗体結晶を次段階で取出さない前記方法。
【請求項２１】
抗体が抗体フラグメントである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記水性結晶化混合物のｐＨが約ｐＨ４〜約６．５の範囲である請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記水性結晶化混合物が緩衝液を含有している請求項２３に記載の方法。
【請求項２４】
前記緩衝液が酢酸緩衝液及び／又はクエン酸緩衝液を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記緩衝液が酢酸ナトリウム及び／又はクエン酸ナトリウムを含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記緩衝液が水性結晶化混合物中に約０．５Ｍまでの濃度で存在する請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ポリアルキレングリコールが約４００〜約１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量をもつ請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ポリアルキレングリコールが総容量の約５〜約３０％（ｗ／ｖ）の範囲の最終濃度で結晶化混合物中に存在する請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
以下の付加的な結晶化条件：
ａ）インキュベーションを約１時間〜約２５０日間実施する；
ｂ）インキュベーションを約−１５℃〜＋約５０℃の温度で実施する；
ｃ）抗体混合物が約０．５〜約２８０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で抗体フラグメントを含有する
のうちの少なくとも１つを満足する請求項１から５及び２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
更に前記結晶を乾燥する段階を含む請求項１から５及び２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
更に前記結晶を乾燥する段階を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
結晶化混合物が結晶と天然母液を含有しており、方法が更に天然母液を人工母液と交換する段階を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
結晶化混合物が約１ｍｌ〜約２０，０００リットルの範囲のバッチ容量を含む請求項１から５及び２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
結晶寸法制御条件下で結晶化を実施する請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約１〜約２００ｒｐｍの範囲の速度で撹拌することを含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記制御条件が前記結晶化混合物を直径約２〜約１００ｃｍの範囲のローラー容器に入れて撹拌することを含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することを含み、前記ローラー容器の総容積の約１〜約１００％に結晶化混合物を充填する請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することを含み、前記ローラー容器の総容積の約１〜約１００％に結晶化混合物を充填する請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約３０分間〜約２０日間撹拌することを含む請求項３６から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約−１５〜約＋５０℃の範囲の温度で撹拌することを含む請求項３６から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記撹拌が前記結晶化混合物のローリング、かき混ぜ、振盪及び／又はタンブリングを含む請求項３６から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
抗ｈＴＮＦα抗体フラグメントの結晶。
【請求項４５】
請求項１から５、２０から２２及び３６から４０のいずれか一項に記載の方法により取得可能な抗ｈＴＮＦα抗体フラグメントの結晶。
【請求項４６】
結晶が針状形態を含む請求項４４に記載の結晶。
【請求項４７】
結晶が針状形態を含む請求項４５に記載の結晶。
【請求項４８】
前記抗体フラグメントがポリクローナル抗体フラグメント又はモノクローナル抗体フラグメントである請求項３６に記載の方法により取得可能な結晶。
【請求項４９】
前記抗体フラグメントがキメラ抗体、ヒト化抗体、非糖鎖付加抗体、ヒト抗体及びマウス抗体のフラグメントから構成される群から選択される請求項３６に記載の方法により取得可能な結晶。
【請求項５０】
前記抗体フラグメントがＩｇＧ抗体のフラグメントである請求項３６に記載の方法により取得可能な結晶。
【請求項５１】
前記抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４抗体から構成される群から選択される請求項５０に記載の結晶。
【請求項５２】
前記抗体がＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２フラグメントである請求項４８から５１のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項５３】
抗体フラグメントが寄託番号ＥＣＡＣＣ８７０５０８０１のハイブリドーマ細胞株により産生される抗体ＭＡＫ１９５のＦ（ａｂ’）２フラグメントであるＭＡＫ１９５Ｆである請求項５２に記載の結晶。
【請求項５４】
（ａ）請求項１から５、２０から２２及び３６から４０のいずれか一項に記載の方法に従って製造された抗体の結晶と、（ｂ）少なくとも１種の医薬賦形剤を含有する医薬組成物であって、組成物が固体、半固体又は液体製剤として提供される前記組成物。
【請求項５５】
（ａ）請求項１から５、２０から２２及び３６から４０のいずれか一項に記載の方法に従って製造された抗体の結晶と、（ｂ）少なくとも１種の医薬賦形剤を含有する医薬組成物であって、賦形剤が前記結晶を包埋又は封入する前記組成物。
【請求項５６】
前記抗体が約１ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で存在する請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記抗体が約２００ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で存在する請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記抗体が約１ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で存在する請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
前記抗体が約２００ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で存在する請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
前記組成物が０．１〜９９．９％（ｗ／ｗ）の抗体結晶を含有する固体である請求項５４又は５５に記載の組成物。
【請求項６１】
前記賦形剤が少なくとも１種の生分解性もしくは非生分解性ポリマーキャリヤー及び／又は少なくとも１種の油性もしくは脂質キャリヤーを含む請求項５４又は５５に記載の組成物。
【請求項６２】
前記ポリマーキャリヤーがポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（酸無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、乳酸・グリコール酸コポリマーないしＰＬＧＡ、ポリ（β−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ（オルガノ）ホスファゼン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸・アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、そのブレンド及びコポリマーから構成される群から選択される少なくとも１種のポリマーを含む請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
請求項１から５、２０から２２及び３６から４０のいずれか一項に記載の方法により取得可能な抗体結晶を含有する注射用液体組成物であって、抗体が約１０〜約４００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する前記組成物。
【請求項６４】
請求項１から５、２０から２２及び３６から４０のいずれか一項に記載の方法により取得可能な抗体結晶を含有する結晶スラリー組成物であって、抗体が約１００ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で存在する前記組成物。
【請求項６５】
請求項１から５、２０から２２及び３６から４０のいずれか一項に記載の方法により取得可能な有効量の抗体結晶を哺乳動物に投与する段階を含む哺乳動物の治療方法。
【請求項６６】
有効量の請求項５４に記載の組成物を哺乳動物に投与する段階を含む哺乳動物の治療方法。
【請求項６７】
有効量の請求項５５に記載の組成物を哺乳動物に投与する段階を含む哺乳動物の治療方法。
【請求項６８】
非経口経路、経口経路又は注射により組成物を投与する請求項６６又は６７に記載の方法。
【請求項６９】
治療有効量の請求項１９及び４６から５１のいずれか一項に記載の抗体結晶を投与する段階を含む対象におけるｈＴＮＦα関連疾患の治療方法。
【請求項７０】
前記ｈＴＮＦα関連疾患が自己免疫疾患、特に関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症及び痛風性関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎及びネフローゼ症候群；感染症、移植拒絶反応ないし移植片対宿主病、悪性腫瘍、肺障害、腸障害、心臓障害、炎症性骨障害、骨吸収疾患、アルコール性肝炎、ウイルス性肝炎、劇症肝炎、凝固障害、熱傷、再潅流障害、ケロイド形成、瘢痕組織形成、発熱、歯周病、肥満症及び放射線傷害；脊椎関節症、肺障害、冠動脈障害、代謝障害、貧血、疼痛、肝障害、皮膚障害、爪障害、又は血管炎、ベーチェット病、強直性脊椎炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、再狭窄、糖尿病、貧血、疼痛、クローン病関連障害、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染、乾癬、乾癬性関節炎、及び慢性プラーク乾癬、加齢性悪液質、アルツハイマー病、脳浮腫、炎症性脳損傷、慢性疲労症候群、皮膚筋炎、薬物反応、脊髄内及び／又は周囲の浮腫、家族性周期性発熱、フェルティ症候群、線維症、糸球体腎炎（例えば連鎖球菌感染後糸球体腎炎やＩｇＡ腎症）、人工器官の緩み、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病、多発性骨髄腫、癌及び悪液質、多臓器障害、骨髄異形成症候群、睾丸炎、骨溶解、急性、慢性及び膵膿瘍を含む膵炎、歯周病、多発性筋炎、進行性腎不全、偽痛風、壊疽性膿皮症、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心臓病、サルコイドーシス、硬化性胆管炎、脳卒中、胸腹部大動脈瘤修復（ＴＡＡＡ）、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、黄熱病ワクチン接種関連症候群、耳関連炎症性疾患、慢性耳炎症、又は小児耳炎症、ぶどう膜炎、座骨神経痛、前立腺炎、子宮内膜症、脈絡膜血管新生、狼瘡、ショーグレン症候群、並びに滲出型黄斑変性症から構成される群から選択される請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ｈＴＮＦα関連疾患が後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全症関連疾患、後天性悪性貧血、急性冠症候群、急性及び慢性疼痛、急性特発性多発性神経炎、臓器移植に伴う急性免疫疾患、臓器移植に伴う急性又は慢性免疫疾患、急性炎症性脱髄性多発根神経炎、急性虚血、急性肝疾患、急性リウマチ熱、急性横断性脊髄炎、アジソン病、成人（急性）呼吸窮迫症候群、成人スティル病、アルコール性肝硬変、アルコール性肝障害、アレルギー性疾患、アレルギー、脱毛症、円形脱毛症、アルツハイマー病、過敏症、強直性脊椎炎、強直性脊椎炎関連肺疾患、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、動脈硬化症、関節症、喘息、アテローム性疾患／動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、アトピー性アレルギー、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、自己免疫性水疱症、自己免疫性皮膚炎、自己免疫性糖尿病、連鎖球菌感染に伴う自己免疫疾患、自己免疫性腸疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性聴力低下、自己免疫性リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性低血糖症、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性早発卵巣不全、自己免疫性血小板減少症（ＡＩＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性ぶどう膜炎、閉塞性細気管支炎、ベーチェット病、眼瞼炎、気管支拡張症、水疱性類天疱瘡、悪液質、心血管疾患、劇症型抗リン脂質抗体症候群、セリアック病、頸部脊椎症、クラミジア感染症、胆汁鬱滞、慢性活動性肝炎、慢性好酸球性肺炎、慢性疲労症候群、臓器移植に伴う慢性免疫疾患、慢性虚血、慢性肝疾患、慢性皮膚粘膜カンジダ症、瘢痕性類天疱瘡、多発性硬化症の危険を伴う最初のエピソードからなる症候群（ＣＩＳ）、分類不能型免疫不全症、分類不能型低ガンマグロブリン血症、結合組織病関連間質性肺疾患、結膜炎、クームス陽性溶血性貧血、小児期発症型精神障害、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、クローン病、特発性自己免疫性肝炎、特発性線維化性肺胞炎、涙嚢炎、鬱病、強皮症皮膚炎、皮膚筋炎、皮膚筋炎／多発性筋炎関連肺疾患、糖尿病網膜症、糖尿病、拡張型心筋症、円板状エリテマトーデス、椎間板ヘルニア、椎間板脱肛、播種性血管内凝固症、薬物性肝炎、薬物性間質性肺疾患、薬物性免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜炎、眼内炎、腸疾患性滑膜炎、上強膜炎、多形性紅斑、重症多形性紅斑、女性不妊症、線維症、線維性肺疾患、妊娠性類天疱瘡、巨細胞動脈炎（ＧＣＡ）、糸球体腎炎、甲状腺腫性自己免疫性甲状腺機能低下症（橋本病）、グッドパスチャー症候群、痛風性関節炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、グレーブス病、Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）感染症、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、ヘモジデリン沈着症関連肺疾患、花粉症、心不全、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒューズ症候群、ハンチントン舞踏病、甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、特発性白血球減少症、特発性血小板減少症、特発性パーキンソン病、特発性間質性肺炎、特異体質性肝疾患、ＩｇＥ介在型アレルギー、免疫性溶血性貧血、封入体筋炎、感染症、感染性眼炎症性疾患、炎症性腸疾患、炎症性脱髄疾患、炎症性心疾患、炎症性腎疾患、インスリン依存性糖尿病、間質���肺疾患、ＩＰＦ／ＵＩＰ、虹彩炎、若年性慢性関節炎、若年性悪性貧血、若年性関節リウマチ、川崎病、角膜炎、乾性角結膜炎、クスマウル病ないしクスマウル・マイヤー病、ランドリー麻痺、ランゲルハンス細胞組織球症、線状ＩｇＡ疾患、網状皮斑、ライム関節炎、リンパ球浸潤性肺疾患、黄斑変性症、特発性又はＮＯＳ男性不妊症、悪性腫瘍、顕微鏡的腎血管炎、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病関連肺疾患、強直性脊椎炎、運動ニューロン疾患、粘膜類天疱瘡、多発性硬化症（全サブタイプ：一次進行型、二次進行型、再発寛解型等）、多臓器不全、筋痛性脳炎／ロイヤルフリー病、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、心筋梗塞、心筋炎、ネフローゼ症候群、神経根障害、神経障害、非アルコール性脂肪肝炎、非Ａ非Ｂ肝炎、視神経炎、臓器移植拒絶反応、変形性関節症、骨溶解症、卵巣癌、卵巣不全、膵炎、寄生虫症、パーキンソン病、少関節型ＪＲＡ、類天疱瘡、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、水晶体起因性ぶどう膜炎、静脈炎、結節性多発動脈炎（ないし結節性動脈周囲炎）、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛症、白毛症、多関節型ＪＲＡ、多腺性内分泌不全症候群、多発性筋炎、多腺性内分泌不全症Ｉ型及び多腺性内分泌不全症ＩＩ型、リウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）、感染後間質性肺疾患、炎症後間質性肺疾患、ポストポンプ症候群、早発卵巣不全、原発性胆汁性肝硬変、原発性粘液水腫、原発性パーキンソン病、原発性硬化性胆管炎、原発性硬化性肝炎、原発性血管炎、前立腺癌及び直腸癌及び造血器悪性腫瘍（白血病及びリンパ腫）、前立腺炎、乾癬、１型乾癬、２型乾癬、乾癬性関節炎、乾癬性関節症、結合組織病続発性肺高血圧、結節性多発動脈炎の肺症状、純赤血球形成不全症、原発性副腎不全、放射線線維症、反応性関節炎、ライター病、再発性視神経脊髄炎、ＮＯＳ腎疾患、再狭窄、関節リウマチ、関節リウマチ関連間質性肺疾患、リウマチ性心臓病、ＳＡＰＨＯ（滑膜炎、座瘡、膿疱症、骨化症及び骨炎）、サルコイドーシス、統合失調症、シュミット症候群、強皮症、続発性アミロイドーシス、ショック肺、胸膜炎、座骨神経痛、続発性副腎不全、敗血症症候群、敗血症性関節炎、敗血症性ショック、血清反応陰性関節症、シリコン関連結合組織病、ショーグレン病関連肺疾患、ショーグレン症候群、スネッドン・ウィルキンソン皮膚病、精子自己免疫疾患、脊椎関節症、強直性脊椎炎、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、スティル病、脳卒中、交感性眼炎、全身免疫応答症候群、全身性エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス関連肺疾患、全身性硬化症、全身性硬化症関連間質性肺疾患、高安病／動脈炎、側頭動脈炎、Ｔｈ２型及びＴｈ１型介在性疾患、甲状腺炎、中毒性ショック症候群、トキソプラズマ性網膜炎、中毒性表皮壊死、横断性脊髄炎、ＴＲＡＰＳ（腫瘍壊死因子受容体）、黒色表皮症を伴うＢ型インスリン抵抗性、１型アレルギー反応、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫性ないしルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ抗体肝炎）、ＩＩ型糖尿病、潰瘍性大腸炎性関節症、潰瘍性大腸炎、蕁麻疹、通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）、ぶどう膜炎、血���炎性びまん性肺疾患、血管炎、春季カタル、ウイルス網膜炎、白斑、フォークト・小柳・原田症候群（ＶＫＨ症候群）、ウェゲナー肉芽腫症、滲出型黄斑変性症、創傷治癒、並びにエルシニア及びサルモネラ関連関節症から構成される群から選択される請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
ＴＮＦα関連疾患治療用医薬組成物の製造用としての請求項１９に記載の抗体結晶の使用。
【請求項７３】
ｈＴＮＦ阻害剤の結晶を含有する医薬組成物であって、結晶の生体利用性又は安全性がｈＴＮＦ阻害剤の液体組成物に比較して低下していない前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体フラグメントを含めて抗体を結晶化させるための組成物及び方法とその使用に関する。１態様において、本発明は抗ヒト腫瘍壊死因子α（ｈＴＮＦα）抗体フラグメント等の抗体フラグメントの工業的規模の晶析方法と、前記抗体及び抗体フラグメント結晶の寸法の制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在１００種類を超えるモノクローナル抗体が臨床試験フェーズ２又は３で検討中であり、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）市場は最も有望なバイオ医薬品市場の１つであるとみなされている。これらの薬剤は多くの場合には一度に１００ｍｇを上回る用量を患者に送達する必要があるため、安定性及び安全性要件と患者コンプライアンスを満足する適切な製剤を見出すことが急務である。
【０００３】
高濃度液体ｍＡｂ製剤は低濃度製剤よりも粘度が高いため、患者に優しい高ゲージの針で注射しにくい。更に、ｍＡｂ分子の凝集傾向は濃度の増加と共に指数的に増加し、安全性及び安定性要件を満たすことができなくなる。従って、高ｍＡｂ用量の送達は大容量に限定され、一般に輸液により送達しなければならない。しかし、この投与方法はコストがかかり、患者のコンプライアンスを著しく低下させる。
【０００４】
従って、結晶形態のｍＡｂが原薬用に望ましい。しかし、周知の通り、結晶化条件による予測不能性を伴うため、このストラテジーを検討する試みは殆ど行われていない。蛋白質インスリンは結晶化に成功しているが、大半の他の蛋白質は結晶よりも不規則沈殿を形成する傾向がある。従って、特定蛋白質の結晶化条件を決定するのは厄介な作業である。今日までに、選択蛋白質に好適な結晶化条件を確実に予測できる一般原理は存在しない。
【０００５】
特定蛋白質に潜在的に適切な結晶化条件をマイクロリットル規模でスクリーニングすることが可能な数種類のスクリーニングシステムが市販されている（例えばＨａｍｐｔｏｎ  １及び２や、Ｗｉｚａｒｄ  Ｉ及びＩＩ）。しかし、このようなスクリーニングシステムを使用して良い結果が得られたとしても、より大規模な工業的に適用可能なバッチ規模の結晶化を必ずしも成功できるとは限らない（Ｊｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１８（１１）：１４８３参照）。
【０００６】
Ｂａｌｄｏｃｋら（（１９９６）Ｊ．Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  １６８（１−４）：１７０−１７４）は結晶化条件の初期スクリーニング法としてマイクロバッチ法と蒸気拡散法の比較について報告している。１組の結晶化溶液を使用して６種類の市販蛋白質をスクリーニングしている。スクリーニングは一般的な蒸気拡散法と、３種類のマイクロバッチ晶析法を使用して実施された。同定された５８種類の結晶化条件のうち、４３種類（７４％）はマイクロバッチ法により同定され、４１種類（７１％）は蒸気拡散法により同定された。２６種類の条件が両方の方法により同定され、マイクロバッチ法を全く使用しなかった場合には１７種類（２９％）は同定されなかった。これらのデータから明らかなように、初期結晶化スクリーニングで最も一般的に使用されている蒸気拡散法で必ずしも良い結果が得られる訳ではない。
【０００７】
このように、規定方法又はアルゴリズムを使用して各種蛋白質の結晶化を首尾よく実施することはできない。確かに、過去２０〜３０年間の技術進歩は目覚ましい。例えば、Ａ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎは巨大分子の結晶化のための方策、ストラテジー、試薬及び装置について詳細に記載している。しかし、当業者がそれなりに成功を見込んで実際に所定の巨大分子を結晶化させることができるような方法については記載していない。ＭｃＰｈｅｒｓｏｎは例えば次のように述べている。「どのような手順であれ、分子間の特異的結合相互作用を助長及び促進し、一旦形成された相互作用を安定化させるために、溶媒と溶質の両者の系のパラメータを改良及び最適化する努力を惜しんではならない。問題のこの後者側面は一般に結晶化させる特定蛋白質又は核酸の特定の化学的及び物理的性質に依存する。」（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ａ．（１９９９）Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．１５９）。新規該当蛋白質を選択し、特定処理工程を適用し、それにより所望の結晶を取得するための確実なアルゴリズムが存在しないことは蛋白質結晶化分野の当業者に広く認められている。
【０００８】
抗体は分子の柔軟性により、特に結晶化が難しい。一方、異常Ｉｇ軽鎖二量体の結晶であるベンス・ジョーンズ蛋白質等の免疫グロブリン結晶の例は存在する（Ｊｏｎｅｓ，Ｈ．Ｂ．（１８４８）Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｌｏｎｄｏｎ  １３８：５５−６２）。更に、Ｉｇ重鎖オリゴマー（ｖｏｎ  Ｂｏｎｓｄｏｒｆ，Ｂ．，Ｈ．Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９３８）．Ｆｏｌｉａ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ  ５９：１８４−２０８）や、（２本の重鎖が２本の軽鎖に結合した）正常構造のヒト免疫グロブリンの結晶も記載されている（Ｐｕｔｎａｍ，Ｆ．Ｗ．（１９５５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２２：２７５−７；Ｔｅｒｒｙ，Ｗ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９６８）Ｎａｔｕｒｅ  ２２０（１６４）：２３９−４１；Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７６）．Ｎａｔｕｒｅ  ２６４（５５８５）：４１５−２０；Ｒａｊａｎ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０（７）：７８７−９９；Ｈａｒｒｉｓ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３６０（６４０２）：３６９−７２；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９６８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．３２：８９−９３；Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｇ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｃａｎａｄ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５１（８）：１１３７−４１；Ｍｉｌｌｓ，Ｌ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．９９（５）：６０１−４；及びＪｅｎｔｏｆｔ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１（２）：２８９−２９４）。例えば、Ｍａｒｇｏｌｉｎらは治療用モノクローナル抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））を結晶化することができ（Ｓｈｅｎｏｙ，Ｇｏｖａｒｄｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２）、結晶トラスツズマブ懸濁液がマウス腫瘍モデルで治療効果を示したと報告しており、結晶トラスツズマブが生物活性を維持することを実証している（Ｙａｎｇ，Ｍ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００（１２）：６９３４−６９３９）。しかし、均一な抗体結晶製剤を形成する予測可能な確実な方法については記載されていない。
【０００９】
ＷＯ−Ａ−０２／０７２６３６は完全無傷な抗体リツキシマブ、インフリキシマブ及びトラスツズマブの結晶化を開示している。結晶化実験の大半はイミダゾール、２−シクロヘキシルエタンスルホネート（ＣＨＥＳ）、メチルペンタンジオール、硫酸銅及び２−モルホリノエタンスルホネート（ＭＥＳ）等の毒性の不明な化学薬品を使用して実施されている。同出願の実施例の多くは結晶化を開始するために種晶を使用している。
【００１０】
ヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）は多数の疾患の原因物質であると考えられている。従って、ｈＴＮＦα関連疾患の適切な治療方法が大いに必要とされている。１つの有望な治療アプローチは医薬有効用量の抗ヒトＴＮＦα抗体を投与する方法である。最近、Ｄ２Ｅ７ないし属名アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ（登録商標））と呼ばれるこのような抗体の１種が商品名ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で上市されている。
【００１１】
ＷＯ−Ａ−２００４／００９７７６は等量の微量（１μｌ）の各種結晶化緩衝液とＤ２Ｅ７  Ｆ（ａｂ）’２又はＦａｂフラグメントを混合する段階を含むシッティングドロップ蒸気拡散法を使用するマイクロリットル規模の結晶化実験を開示している。Ｄ２Ｅ７抗体又はそのフラグメントの寸法制御結晶化方法は開示されていない。
【００１２】
ＥＰ−Ａ−０２６０６１０はＥＣＡＣＣ８７０５０８０１として寄託されたハイブリドーマ細胞株により産生される一連のマウス抗ｈＴＮＦαモノクローナル抗体、即ち中和抗体ＡＭ−１９５（別称ＭＡＫ１９５）を開示している。ＭＡＫ１９５のＦ（ａｂ’）２フラグメント（例えばＭＡＫ１９５Ｆ）もＡｆｅｌｉｍｏｍａｂ（登録商標）の名称で知られている。ＭＡＫ１９５及びＭＡＫ１９５Ｆの結晶は開示されていない。これらの抗体のバッチ晶析はこれまでに成功していない。
【００１３】
現在、抗ｈＴＮＦα抗体フラグメント結晶の生産を実現する技術的教示は得られていない。更に、抗体フラグメント（例えば抗ｈＴＮＦα抗体のフラグメント）を含む抗体分子の寸法制御結晶化を実現する教示も得られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第０２／０７２６３６号
【特許文献２】国際公開第２００４／００９７７６号
【特許文献３】欧州特許出願公開第０２６０６１０号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｊｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１８（１１）：１４８３
【非特許文献２】Ｂａｌｄｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  １６８（１−４）：１７０−１７４
【非特許文献３】ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ａ．（１９９９）Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．１５９
【非特許文献４】Ｊｏｎｅｓ，Ｈ．Ｂ．（１８４８）Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｌｏｎｄｏｎ  １３８：５５−６２
【非特許文献５】ｖｏｎ  Ｂｏｎｓｄｏｒｆ，Ｂ．，Ｈ．Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９３８）．Ｆｏｌｉａ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ  ５９：１８４−２０８
【非特許文献６】Ｐｕｔｎａｍ，Ｆ．Ｗ．（１９５５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２２：２７５−７
【非特許文献７】Ｔｅｒｒｙ，Ｗ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９６８）Ｎａｔｕｒｅ  ２２０（１６４）：２３９−４１
【非特許文献８】Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７６）．Ｎａｔｕｒｅ  ２６４（５５８５）：４１５−２０
【非特許文献９】Ｒａｊａｎ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０（７）：７８７−９９
【非特許文献１０】Ｈａｒｒｉｓ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３６０（６４０２）：３６９−７２
【非特許文献１１】Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９６８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．３２：８９−９３
【非特許文献１２】Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｇ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｃａｎａｄ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５１（８）：１１３７−４１
【非特許文献１３】Ｍｉｌｌｓ，Ｌ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．９９（５）：６０１−４
【非特許文献１４】Ｊｅｎｔｏｆｔ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１（２）：２８９−２９４
【非特許文献１５】Ｓｈｅｎｏｙ，Ｇｏｖａｒｄｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２
【非特許文献１６】Ｙａｎｇ，Ｍ．Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００（１２）：６９３４−６９３９。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従って、抗体及び抗体フラグメント（例えば抗ｈＴＮＦα抗体及び抗体フラグメント）に適した結晶化条件、特にバッチ晶析条件を開発し、工業的生産に適した結晶容量を生産するための晶析プロセス条件を確立することが必要である。また、このような抗体の医薬品としての利用可能性に悪影響を与える恐れのある毒性物質を使用しない晶析方法も必要である。更に、結晶寸法の選択と制御を可能にする抗体又は抗体フラグメント（例えばＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２フラグメント）の晶析方法も必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記問題は、晶析方法と前記方法により製造された結晶及びその使用を提供する本発明により意外にも解決される。
【００１８】
１側面において、本発明は抗体又は抗体フラグメント結晶の形成を可能にする条件下で抗体又は抗体フラグメントと少なくとも１種の結晶化剤を含有する水性結晶化混合物を準備し、結晶化混合物を制御条件下で撹拌し、好ましくは実質的に均一な所望の平均寸法範囲の抗体又は抗体フラグメント結晶を形成することにより、所望の平均寸法範囲の抗体又は抗体フラグメント結晶を寸法制御下に製造するための方法を提供する。
【００１９】
制御条件には数種の態様があり、これらを単独で使用してもよいし、任意組合せ又は順序で併用してもよい。１態様において、制御条件は結晶化混合物をローラー容器に入れて約１〜約２００ｒｐｍの範囲の速度で撹拌することを含むか、又はこれに対応する。別の態様において、制御条件は結晶化混合物を直径約２〜約１００ｃｍの範囲のローラー容器に入れて撹拌することを含むか、又はこれに対応する。別の態様において、制御条件は結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することに対応するか、又はこれを含み、ローラー容器の総容積の約１〜約１００％に結晶化混合物を充填する。更に別の態様において、制御条件は結晶化混合物をローラー容器に入れて約３０分間〜約２０日間撹拌することに対応するか、又はこれを含む。更に別の態様において、制御条件は結晶化混合物をローラー容器に入れて約−１５〜約＋５０℃の範囲の温度で撹拌することに対応するか、又はこれを含む。本発明の方法の撹拌段階はローリングに対応する条件下で結晶化混合物をローリング、かき混ぜ、振盪及び／又はタンブリングする段階を含むことができる。上記条件の任意数を任意順序で組合せることができる。
【００２０】
別の側面において、本発明の方法は約１〜約１０００μｍの範囲内の均一な結晶粒径及び／又は粒長を含む抗体又は抗体フラグメント結晶の小規模及び大規模生産を実現する。別の態様において、結晶は約１〜約２００μｍの範囲の制御された平均結晶粒長を含む。別の態様によると、段階ａ）で得られた結晶化混合物に結晶化を開始又は増進するために種晶として適切な量の既存抗体又は抗体フラグメント結晶を添加できるように本発明の上記晶析方法を実施してもよい。
【００２１】
１態様において、結晶化される抗体は任意型又はクラスの完全抗体又はその抗体フラグメントである。１態様において、抗体フラグメントはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体等のＩｇＧ抗体のフラグメントである。抗体フラグメントは例えばキメラ抗体又は非キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、二重可変領域免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標））、非糖鎖付加抗体、ヒト抗体及び非ヒト抗体（例えばマウス抗体）のポリクローナル抗体フラグメント又はモノクローナル抗体フラグメントとすることができる。１特定態様において、結晶化する抗体は場合により抗原結合性を改善するように更に処理された非キメラヒト抗体又はそのフラグメントである。
【００２２】
１態様において、抗体フラグメントは抗ｈＴＮＦα抗体結合フラグメントである。１特定態様において、抗体フラグメントは寄託番号ＥＣＡＣＣ８７０５０８０１のハイブリドーマ細胞株により産生される抗体ＭＡＫ１９５のＦ（ａｂ’）２フラグメントであるＭＡＫ１９５Ｆ等のＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２フラグメントである。
【００２３】
別の側面において、本発明は（例えば溶解形態の）抗体又は抗体フラグメントと、結晶化剤としての少なくとも１種のポリアルキレンポリオール（例えばポリアルキレングリコール）を含有する水性結晶化混合物を準備し、抗体又は抗体フラグメントの結晶が形成されるまで水性結晶化混合物をインキュベートすることにより、抗ｈＴＮＦα抗体又は抗体結合フラグメントを結晶化するためのバッチ晶析方法として、ポリアルキレングリコールを（ａ）１段階又は（２）２段階以上で提供し、ある段階で形成された前記抗体結晶を次段階の前に取出さない方法を提供する。
【００２４】
別の態様において、水性結晶化混合物のｐＨは約ｐＨ４〜約６．５の範囲であり、特に約４．５〜約６．０、又は約４．８〜約５．６、又は約５．０〜約５．４、例えば約５．１、約５．２又は約５．３である。上記に概説した結晶化混合物は一般に溶液又は固体としての結晶化剤を蛋白質溶液に加えることにより得られる。どちらの溶液も緩衝溶液とすることができるが、必ずしもそうでなくてもよい。元の結晶化溶液中の結晶化剤濃度と緩衝液モル濃度は一般に蛋白質溶液添加時に希釈される結晶化混合物中よりも高い。１態様において、水性結晶化混合物は少なくとも１種の緩衝液を含むことができる。緩衝液は例えば酢酸塩もしくはクエン酸成分又はそのアルカリ金属塩、例えばナトリウム又はカリウム塩（例えば酢酸ナトリウム及び／又はクエン酸ナトリウム）を含むことができる。酸（例えば酢酸又はクエン酸）を加えることにより塩を必要なｐＨに調整する。
【００２５】
晶析方法の１態様において、水性結晶化混合物中の緩衝液濃度（総酢酸塩又は総クエン酸塩）は約０〜約０．５Ｍ又は約０．０２〜約０．５Ｍ、例えば約０．０５〜約０．３Ｍ、約０．０７〜約０．２Ｍ又は約０．０９〜約０．１６Ｍである。
【００２６】
１態様において、ポリアルキレングリコールは約４００〜約１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量をもつ。例えば、ポリアルキレングリコールはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、総容量の約５〜約３０％（ｗ／ｖ）の範囲の最終濃度で結晶化混合物中に存在する。
【００２７】
別の態様では、以下の付加的な結晶化条件：ａ）インキュベーションを約１時間〜約２５０日間、又は約１日〜約２５０日間、又は約１３日〜約２５０日間、例えば約１日〜約３０日間、又は約２日〜約１０日間実施する；ｂ）インキュベーションを約−１５℃〜＋約５０℃、例えば約４℃〜約３７℃又は約１５℃〜約２５℃の温度で実施する；及びｃ）抗体混合物が約０．５〜約２８０ｍｇ／ｍｌ、又は約１〜２００ｍｇ／ｍｌ、又は約１〜約１００ｍｇ／ｍｌ、例えば約１．５〜約２０ｍｇ／ｍｌ、特に約２〜約１５ｍｇ／ｍｌ、又は約２〜約７ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で抗体フラグメントを含有する、のうちの少なくとも１つを満足する。蛋白質濃度は例えば適切な波長（例えば２８０ｎｍ）における光学密度の測定等の標準蛋白質測定法により測定することができる。
【００２８】
別の態様において、本発明の方法は生成された結晶を乾燥する段階を含む。適切な乾燥方法としては蒸発乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、流動層乾燥、噴霧凍結乾燥、準臨界乾燥、超臨界乾燥及び窒素ガス乾燥が挙げられる。
【００２９】
別の態様において、本発明の晶析方法は例えば遠心、透析濾過、限外濾過又は他の一般に使用されている緩衝液交換技術により結晶化母液を別の液体又は緩衝液（例えば約３００〜８，０００ダルトンの範囲の分子量であり、結晶化に使用するものとは異なる少なくとも１種のポリアルキレンポリオール、又はその混合物、又は本明細書に記載する他の（ポリマー）キャリヤー、脂質キャリヤーもしくは油性キャリヤーを含有する液体又は緩衝液）と交換する段階を更に含む。別の液体又は緩衝液は「人工母液」と言うこともでき、結晶の「天然」結晶化母液とは異なり、形成される結晶の溶解を妨げる。ｍＡｂ結晶製剤中の所定の賦形剤は結晶溶解を妨げる主機能をもつ。こうして、最終組成物中でポリエチレングリコールを置換することができる。
【００３０】
好ましい１態様において、例えばＰＥＧを結晶化剤とする晶析方法は、インキュベーションを約２０℃の温度と約３〜約１０ｍｇ／ｍｌの抗体濃度で約３〜約６０日間行うように実施される。
【００３１】
本発明の１特定態様では、ポリアルキレングリコールを２段階以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０段階で段階的に加える。驚くべきことに、このような段階的添加により、望ましくない非晶質蛋白質凝集物又は沈殿の同時形成を実質的に伴わずに抗体又は抗体フラグメント結晶の総収率を更に増加することができる。
【００３２】
別の態様によると、結晶化混合物の以下の条件下でバッチ晶析を実施する：（１）ポリアルキレングリコール：約８〜約１２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００；（２）緩衝液：約０〜約０．３Ｍ酢酸ナトリウム又はクエン酸ナトリウム（総酢酸塩又は総クエン酸塩）；（３）（最終）ｐＨ：約５．０〜約５．４；（４）抗ｈＴＮＦαフラグメント濃度：約３〜約１０ｍｇ／ｍｌ；（５）温度：約１８〜約２４℃；（６）バッチ容量：約１〜約１００リットル；（７）撹拌：なし；又は約１〜約１００ｒｐｍ；（８）期間：約１〜約６０日間。
【００３３】
１態様において、本発明は抗体又は抗体フラグメントと、結晶化剤としての少なくとも１種のポリアルキレングリコールを含有する水性結晶化混合物を準備し、抗体又は抗体フラグメントの結晶が形成されるまで水性結晶化混合物をインキュベートすることにより、抗ｈＴＮＦα抗体又は抗体結合フラグメントを結晶化するためのバッチ晶析方法として、少なくとも１種のポリアルキレングリコールを（ａ）１段階又は（ｂ）２段階以上で提供し、ある段階で形成された抗体結晶を次段階の前又は次段階中に取出さず、結晶寸法制御条件下で結晶化を実施する方法を提供する。
【００３４】
制御条件は１種以上の制御条件を任意組合せで含むことができる。１態様において、制御条件は結晶化混合物をローラー容器に入れて約１〜約２００ｒｐｍの範囲の速度で撹拌することに対応するか、又はこれを含む。別の態様において、制御条件は結晶化混合物を直径約２〜約１００ｃｍの範囲のローラー容器に入れて撹拌することに対応するか、又はこれを含む。更に別の態様において、制御条件は結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することに対応するか、又はこれを含み、ローラー容器の総容積の約１〜約１００％に結晶化混合物を充填する。更に別の態様において、制御条件は結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することに対応するか、又はこれを含み、ローラー容器の総容積の約１〜約１００％に結晶化混合物を充填する。更に別の態様において、制御条件は結晶化混合物をローラー容器に入れて約３０分間〜約２０日間、又はローラー容器に入れて約−１５〜約＋５０℃の範囲の温度で撹拌することに対応するか、又はこれを含む。撹拌段階は結晶化混合物のローリング、かき混ぜ、振盪及び／又はタンブリングに対応するか、又はこれを含むことができる。
【００３５】
別の側面において、本発明は例えば本明細書に定義する方法のいずれかにより製造された抗ｈＴＮＦα抗体又は抗体フラグメントの結晶を提供する。
【００３６】
１態様において、結晶は針状である。例えば、本発明の結晶は約２〜約５００μｍ又は約１００〜約３００μｍの最大長（ｌ）と約１〜約１００の長さ／直径（ｌ／ｄ）比をもつ針状形態により特徴付けることができる。このような針状結晶の高さはほぼ直径の寸法内である。
【００３７】
別の側面において、本発明は（ａ）本明細書に定義する方法により製造された抗体又は抗体フラグメントの結晶と、（ｂ）抗体結晶を安定に維持する少なくとも１種の医薬賦形剤を含有する医薬組成物を提供し、組成物は固体、半固体又は液体製剤として提供される。別の態様において、本発明は（ａ）本発明の方法により製造された抗体の結晶と、（ｂ）少なくとも１種の医薬賦形剤を含有する医薬組成物を提供し、賦形剤は結晶を包埋又は封入する。
【００３８】
別の態様において、抗体は約１ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で存在する。１特定態様において、抗体は約２００ｍｇ／ｍｌを上回る濃度、例えば約２００〜約６００ｍｇ／ｍｌ又は約３００〜約５００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。別の態様において、医薬組成物は約０．１〜約９．９％（ｗ／ｗ）の抗体結晶を含有する固体である。
【００３９】
１態様において、賦形剤は少なくとも１種の生分解性又は非生分解性ポリマーキャリヤー及び／又は少なくとも１種の油性もしくは脂質キャリヤー（その組合せもしくはブレンド又はそのコポリマーを含む）を含む。
【００４０】
典型的なポリマーキャリヤーはポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（酸無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、乳酸・グリコール酸コポリマーないしＰＬＧＡ、ポリ（β−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ（オルガノ）ホスファゼン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸・アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、多糖、ヒドロキシエチルデンプン、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、そのブレンド及びコポリマー、並びにＳＡＩＢから構成される群から選択される少なくとも１種のポリマーを含む。
【００４１】
脂質キャリヤーとしては脂肪酸及び脂肪酸塩、脂肪アルコール、脂肪アミン、脂肪酸のモノ、ジ及びトリグリセリド、リン脂質、糖脂質、ステロール及び蝋並びに関連類似物質が挙げられる。蝋は更に天然物と合成物に分類される。天然物としては蜜蝋、カルナウバ蝋又はモンタン蝋等の植物、動物又は鉱物資源から得られる蝋が挙げられる。合成蝋製品の例としては塩素化ナフタレンとエチレンポリマーが挙げられる。
【００４２】
油性（又は油性液体）キャリヤーとしては油性アーモンド油、コーン油、綿実油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱物油、軽鉱物油、オクチルドデカノール、オリーブ油、落花生油、杏仁油、胡麻油、大豆油、スクアレン、液体トリグリセリド、ポリエトキシル化ヒマシ油、液体蝋及び高級アルコール等の油類（又は油性液体）が挙げられる。賦形剤は更に主にキャリヤーに関連する（封入／包埋）。
【００４３】
脂質キャリヤーとしては脂肪酸及び脂肪酸塩、脂肪アルコール、脂肪アミン、脂肪酸のモノ、ジ及びトリグリセリド、リン脂質、糖脂質、ステロール及び蝋並びに関連類似物質が挙げられる。蝋は更に天然物と合成物に分類される。天然物としては蜜蝋、カルナウバ蝋又はモンタン蝋等の植物、動物又は鉱物資源から得られる蝋が挙げられる。合成蝋製品の例としては塩素化ナフタレンとエチレンポリマーが挙げられる。
【００４４】
油性（又は油性液体）キャリヤーとしては油性アーモンド油、コーン油、綿実油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱物油、軽鉱物油、オクチルドデカノール、オリーブ油、落花生油、杏仁油、胡麻油、大豆油、スクアレン、液体トリグリセリド、液体蝋及び高級アルコール等の油類（又は油性液体）が挙げられる。
【００４５】
別の側面において、本発明は本発明の方法により取得可能な抗体又は抗体フラグメント結晶を含有する注射用液体組成物を提供し、抗体又は抗体フラグメントは約１０〜約４００ｍｇ／ｍｌ又は約５０〜約３００ｍｇ／ｍｌの範囲、例えば約２００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００４６】
別の側面において、本発明は本発明の方法により取得可能な抗体又は抗体フラグメント結晶を含有する結晶スラリー組成物を提供し、抗体又は抗体フラグメントは約１００ｍｇ／ｍｌを上回る濃度、例えば約１５０〜約６００ｍｇ／ｍｌ又は約２００〜約４００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００４７】
別の側面において、本発明は本発明の方法により取得可能な有効量の抗体結晶又は組成物を哺乳動物に投与する段階を含む哺乳動物の治療方法を提供する。結晶及びその組成物の投与方法としては限定されないが、非経口経路、経口経路、吸入、注射又はその組合せによる投与が挙げられる。
【００４８】
１特定態様において、本発明は治療有効量の抗体結晶を対象に投与する段階を含む対象におけるｈＴＮＦα関連疾患の治療方法を提供する。
【００４９】
別の側面において、本発明はｈＴＮＦα関連疾患の治療用医薬組成物の製造用としての本発明の抗ｈＴＮＦα抗体結晶の使用を提供する。
【００５０】
本発明は更に医薬用としての上記に定義したｈＴＮＦα抗体フラグメント結晶を提供する。
【００５１】
本発明の上記及び他の目的、特徴及び利点と本発明自体は添付図面を参考に以下の好ましい態様の記載から更によく理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】種々のローラー速度におけるＭＡＫ１９５Ｆ結晶の収率を時間の関数として示す。
【図２】種々のローラー速度で得られたＭＡＫ１９５Ｆ結晶の顕微鏡画像を示す。
【図３】ＭＡＫ１９５Ｆ結晶の結晶長に及ぼすローラー速度の影響を示す。５種類の異なる速度の各々について種々のローラー速度の平均粒長を示す。
【図４】ＭＡＫ１９５Ｆサンプルの二次導関数ＩＲスペクトルを示す。Ａ結晶懸濁液；Ｂ再溶解結晶。実線は結晶ＭＡＫ１９５Ｆからのサンプルを表し、破線は液体標準を示す。夫々ＡはＢｉｏＡＴＲセルで記録し、ＢはＡｑｕａＳｐｅｃセルで記録した。分かりやすくするために夫々サンプルと標準間の補償を挿入した。
【図５】２５℃で６カ月間保存したＭＡＫ１９５Ｆサンプル（１８％  ＰＥＧ４，０００緩衝液中２００ｍｇ／ｍＬ結晶蛋白質）の二次導関数ＩＲスペクトルを示す。Ａ結晶懸濁液；Ｂ再溶解結晶。夫々ＡはＢｉｏＡＴＲセルで記録し、ＢはＡｑｕａＳｐｅｃセルで記録した。分かりやすくするために夫々サンプルと標準間の補償を挿入した。
【図６】ＭＡＫ１９５Ｆ結晶懸濁液、液体製剤（いずれも２００ｍｇ／ｍＬ）及びＰＥＧ４，０００を含有するプラセボ懸濁緩衝液のＤＳＣサーモグラムを示す。
【図７】ＳＥＭにより得られたＭＡＫ１９５Ｆ結晶の代表的な写真を示す。
【図８】結晶濃度と針直径に依存するＭＡＫ１９５Ｆ結晶懸濁液の注射適性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
Ａ．定義
「抗体結晶の形成を可能にする条件」とは非撹拌条件下で結晶形成を生じる溶液の任意条件を意味する。これは混合物のｐＨや温度等の所与条件下で時間の経過と共に結晶形成を開始するために十分な濃度の少なくとも１種の結晶化剤と抗体分子を含有する溶液を準備することを意味する。
【００５４】
「〜に対応する」とは本発明の趣旨では以下のことを意味する。
【００５５】
結晶化混合物を特定形状のローラー容器に入れて特定速度及び／又は特定充填容量で撹拌することを含む特定結晶化技術が寸法制御結晶化の「基準システム」を構成する。当業者は前記基準システムの記載に基づき、各種条件下で寸法制御抗体結晶化を実施できよう。「各種条件」としては、例えばローラー容器での晶析工程の大規模化もしくは小規模化、又は各種撹拌条件（例えば振盪、かき混ぜ又はタンブリングによる撹拌）の適用、又は撹拌速度の変動、又はその組合せが挙げられる。「バッチ晶析方法」とは結晶化させようとする抗体を含有する結晶化混合物に好ましくは溶解形態の少なくとも１種の結晶化剤を加える段階を含む晶析方法を意味する。
【００５６】
「マイクロスケール晶析方法」とは結晶化混合物の容量が０．１μＬ〜１０μＬである任意晶析方法、特に結晶化中に蒸気拡散を実施することが可能な任意方法を意味する。例えば、蒸気拡散法に基づく方法は、マイクロリットル範囲の小容量の抗体溶液に結晶化剤を含有するリザーバ緩衝液を添加する段階と；混合物の液滴を密閉容器に入れてリザーバ緩衝液のアリコートの隣に並べる段階と；蒸気拡散により液滴とリザーバの間で溶媒を交換させる段階を含み、前記段階の間に液滴の溶媒含量が変化し、適切な結晶化条件に達すると、結晶化が認められる。
【００５７】
「結晶化剤」とは結晶化させようとする抗体の結晶形成を助長、強化又は促進する物質である。
【００５８】
「結晶化溶液」は溶解形態の結晶化剤を含有する。好ましくは、前記溶液は水性系であり、即ちその液体成分は主に水から構成される。例えば、８０〜１００重量％又は９５〜１００重量％又は９８〜１００重量％を水から構成することができる。「リザーバ溶液」なる用語も蒸気拡散法によるマイクロスケール晶析に使用される「結晶化溶液」を意味する。
【００５９】
「結晶化混合物」は抗体又はそのフラグメントの水溶液と結晶化溶液を含有する。
【００６０】
「結晶」とは物質（例えば蛋白質）の固体状態の１形態であり、第２の固体形態即ち原則的に無秩序な不均質固体として存在する非晶質状態から区別される。結晶は格子と一般に呼ばれる規則的な三次元構造をもつ。抗体結晶は抗体分子の規則的な三次元配列を含む（Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．１−１６，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）参照）。
【００６１】
「完全」ないし「無傷」の抗体とはその抗原（例えばｈＴＮＦα）をインビトロ及び／又はインビボで認識してこれと結合することが可能な機能的抗体である。抗体は抗体とその抗原の結合に関連する患者のその後の免疫系反応、特に直接細胞傷害作用、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を開始することができる。抗体分子は一般に相互に共有結合した２本の同一の重鎖（各々ＭＷ約５０ｋＤａ）と、各々重鎖の一方と共有結合した２本の同一の軽鎖（各々ＭＷ約２５ｋＤａ）から構成される構造をもつ。４本鎖は古典的「Ｙ」字形モチーフとして配置されている。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲないしＶＨと略称する）と重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３領域から構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲないしＶＬと略称する）と軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１個の領域ＣＬから構成される。ＶＨ領域とＶＬ領域は更に相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域と、その間に配置された比較的保存度の高いフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域に分けることができる。各ＶＨ及びＶＬは一般にアミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３個のＣＤＲと４個のＦＲから構成される。完全な抗体分子は２個の抗原結合部位をもち、即ち「二価」である。これらの２個の抗原結合部位は単一のｈＴＮＦα抗原に特異的であり、即ち抗体は「単一特異性」である。上記構造は種の相違により異なる場合がある。
【００６２】
「モノクローナル抗体」とはＢリンパ球（Ｂ細胞）の単一クローンに由来し、同一の抗原決定基を認識する抗体である。完全モノクローナル抗体は２本の完全な重鎖と２本の完全な軽鎖を含む上記古典的分子構造をもつ抗体である。モノクローナル抗体は抗体産生Ｂ細胞を不死化骨髄腫細胞と融合させ、細胞培養で持続的にモノクローナル抗体を産生するＢ細胞ハイブリドーマを作製することにより日常的に生産される。例えばファージディスプレイ技術を使用して細菌、酵母、昆虫、真核又は哺乳動物細胞培養でモノクローナル抗体を発現させる方法；遺伝子改変動物（ウシ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ニワトリ）又は完全ヒトＢ細胞ゲノムを含み、これを発現するように改変されたトランスジェニックマウスでインビボ生産する方法；あるいはタバコやトウモロコシ等の遺伝子改変植物で生産する方法等の他の生産方法も利用できる。このような全起源に由来する抗体又はフラグメントを本発明により結晶化させることができる。
【００６３】
本発明により結晶化させるモノクローナル抗体としては重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定種に由来又は特定抗体分類もしくは亜分類に属する抗体中の対応配列と同一又は相同であり、鎖のその他の部分が別の種に由来又は別の抗体分類もしくは亜分類に属する抗体中の対応配列と同一又は相同である「キメラ」抗体が挙げられる。１例として、マウス抗体の可変領域抗原結合部分とヒト抗体に由来する定常領域部分を含むマウス／ヒトキメラが挙げられる。
【００６４】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態も本発明に含まれる。ヒト化抗体は非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変ループ（ＨＶＬ）からの残基が所望機能をもつ非ヒト種（例えばマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類）のＣＤＲ又はＨＶＬからの残基で置換されたヒト免疫グロブリンである。抗原結合親和性を改善するためにヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基を対応する非ヒト残基で置換することができる。更に、ヒト化抗体は対応するヒト又は非ヒト抗体部分のどちらにも存在しない残基を含むことができる。抗体効力を更に改善するためにこれらの改変が必要となる場合がある。
【００６５】
「ヒト抗体」ないし「完全ヒト抗体」とはヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列をもつ抗体又は組換え生産された抗体である。本明細書で使用する「ヒト抗体」なる用語はヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域をもつ抗体を意味する。本発明のヒト抗体はヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えばランダムもしくは部位特異的インビトロ突然変異誘発又はインビボ体細胞突然変異により導入される突然変異）を例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３に含むことができる。他方、本明細書で使用する「ヒト抗体」なる用語はマウス等の別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列にグラフトした抗体を意味しない。
【００６６】
本明細書で使用する「組換えヒト抗体」なる用語は組換え手段により作製、発現、創製又は単離された全ヒト抗体を意味し、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックな動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えばＴａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５参照）又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列と他のＤＮＡ配列のスプライシングを伴う他の任意手段により作製、発現、創製もしくは単離された抗体が挙げられる。このような組換えヒト抗体はヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域をもつ。しかし、所定態様では、このような組換えヒト抗体にインビトロ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列にトランスジェニックな動物を使用する場合にはインビボ体細胞突然変異誘発）するため、組換え抗体のＶＨ領域とＶＬ領域のアミノ酸配列はヒト生殖細胞系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来するが、インビボヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然では存在しない場合もある配列である。
【００６７】
本明細書で使用する「中和抗体」（又は「ｈＴＮＦα活性を中和した抗体」）とはｈＴＮＦαと結合することによりｈＴＮＦαの生物活性を阻害する抗体を意味する。
【００６８】
「親和性成熟」抗体とは１個以上の超可変領域の１カ所以上の改変により、親抗体に比較して抗体の抗原親和性が改善された抗体である。親和性成熟抗体は標的抗原に対する親和性値がナノモル又はピコモルとなる。親和性成熟抗体は当分野で公知の方法により生産される。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３はＶＨ及びＶＬ領域シャフリングによる親和性成熟について記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発はＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３；Ｓｃｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９；及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６に記載されている。
【００６９】
本明細書で使用する「単離抗体」とは、異なる抗原特異性をもつ他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する（例えばｈＴＮＦαと特異的に結合する単離抗体はｈＴＮＦα以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。他方、ｈＴＮＦαと特異的に結合する単離抗体は他の種に由来するｈＴＮＦα分子等の他の抗原に対して交差反応性をもつ場合がある。更に、単離抗体は他の細胞材料及び／又は化学薬品を実質的に含まない場合がある。
【００７０】
本発明により結晶化された特定「親」抗体の「機能的等価物」とは同一の抗原特異性を示すが、アミノ酸レベル又は糖鎖付加レベルで「親」抗体の分子組成と相違する抗体である。但し、相違は単に結晶化条件が本明細書に開示するようなパラメータ範囲から外れないような程度でよい。
【００７１】
抗体結晶の「封入」とは、結晶がコーティング材料の少なくとも１層により個々に被覆された製剤を意味する。好ましい１態様において、このようなコーティング付き結晶は溶解速度を持続させることができる。
【００７２】
抗体結晶の「包埋」とは、封入の有無に拘わらず、結晶が分散状態で固体、液体又は半固体キャリヤーに組込まれた製剤を意味する。このような包埋結晶化抗体分子はキャリヤーから制御下で持続的に放出又は溶解させることができる。
【００７３】
「ポリアルキレンポリオール型の結晶化剤」を以下により詳細に定義する。
【００７４】
本発明により使用される「ポリアルキレンポリオール」とは直鎖又は分岐鎖、特に直鎖のポリＣ２−Ｃ６−アルキレンポリオールである。ポリエーテルは２〜６個、２〜４個、特に２又は３個の好ましくは隣接するヒドロキシル基と、好ましくは直鎖炭素主鎖を形成する２〜６個、特に２、３又は４個の炭素原子をもつ少なくとも１種の多官能性脂肪族アルコールから形成される。非限定的な例はエチレン−１，２−ジオール（グリコール）、プロピレン−１，２−ジオール、プロピレン−１，３−ジオール、ｎ−ブチレン−１，３−ジオール及びｎ−ブチレン−１，４−ジオールである。特に好ましいジオールはグリコールである。
【００７５】
「ポリアルキレンポリオール」なる用語は更に上記の誘導体も含む。非限定的な例はアルキルエステル及びエーテル、特にモノアルキルエーテル及びジアルキルエーテルである。「アルキル」とは特に直鎖又は分岐鎖Ｃ１−Ｃ６−アルキル残基として定義され、特にメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｉ−ペンチル及びｎ−ヘキシルが挙げられる。
【００７６】
本発明により使用されるポリアルキレンポリオール、特にポリアルキレングリコールは更に広範囲の分子量により特徴付けられる。数又は重量平均分子量として表した分子量範囲は一般に約４００〜約１０，０００ｇ／ｍｏｌ、例えば約１，０００〜約８，０００ｇ／ｍｏｌ、又は約２，０００〜約６，０００ｇ／ｍｏｌ、約３，０００〜約６，０００ｇ／ｍｏｌ又は約３，２００〜約６，０００ｇ／ｍｏｌ、例えば約３，３５０〜約６，０００ｇ／ｍｏｌ、約３，３５０〜約５０００ｇ／ｍｏｌ又は約３，８００〜約４，２００ｇ／ｍｏｌ、特に約４，０００ｇ／ｍｏｌである。
【００７７】
特に好ましいポリアルキレンポリオールはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）と対応するランダム又はブロックコポリマーである。適切なポリオールの特定例はＰＥＧ２，０００、ＰＥＧ３，０００、ＰＥＧ３，３５０、ＰＥＧ４，０００、ＰＥＧ５，０００及びＰＥＧ６，０００である。
【００７８】
結晶化混合物中のポリアルキレンポリオール濃度、特にＰＥＧ濃度は約５〜約３０％（ｗ／ｖ）、例えば約７〜約１５％（ｗ／ｖ）又は約９〜約１６％（ｗ／ｖ）又は約９〜約１４％（ｗ／ｖ）又は約９〜約１２％（ｗ／ｖ）である。平均分子量約４，０００のＰＥＧを結晶化混合物中に１段階法では約９〜約１２％（ｗ／ｖ）、多段階法では約１０〜約１６％（ｗ／ｖ）の濃度で使用することが好ましい。
【００７９】
本発明のポリアルキレンポリオールは単一種のポリオールから構成することもできるし、少なくとも２種類の異なるポリオールの混合物から構成することもでき、ポリオールはランダムに重合してもよいし、ブロックコポリマーとして存在するものでもよい。
【００８０】
本発明の好ましい１態様では、抗体蛋白質溶液と結晶化溶液を約１：１の比で混合する。従って、元の結晶化溶液中の緩衝剤／結晶化剤のモル濃度は結晶化混合物中のモル濃度の約２倍である。
【００８１】
１特定態様において、結晶化混合物は約１ｍｌ〜約２０，０００リットル、又は１ｍｌ〜約１５，０００リットル、又は１ｍｌ〜約１２，０００リットル、又は約１ｍｌ〜約１０，０００リットル、又は約１ｍｌ〜約６，０００リットル、又は約１ｍｌ〜約３，０００リットル、又は約１ｍｌ〜約１，０００リットル、又は約１ｍｌ〜約１００リットル、例えば約５０ｍｌ〜約８リットル、又は約１００ｍｌ〜約５リットル、又は約１リットル〜約３リットル、又は約１リットル〜約１，０００リットル、又は約１０リットル〜約５００リットルの範囲のバッチ容量を含む。１態様において、結晶化は本明細書に記載するような結晶寸法制御条件下で実施される。
【００８２】
Ｂ．晶析方法
特に指定しない限り、本発明の晶析方法は任意抗体又は抗体フラグメントに適用可能である。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。抗体は各々糖鎖付加又は非糖鎖付加型のキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、非ヒト抗体（例えばマウス抗体）とすることができる。抗体は例えば二重特異性抗体（ｄｓＡｂ）又は二重可変領域抗体（ＤＡＤＡｂ）でもよい。
【００８３】
特に指定しない限り、本発明の晶析方法は当分野で周知の技術的装置、化学薬品及び手法を利用する。しかし、上記に説明したように、本発明は特定結晶化条件、特に特定結晶化剤を選択し、場合により対応物質（緩衝液、抗体、結晶化剤）の特定ｐＨ条件及び／又は濃度範囲と組合せることにより、抗体又は抗体フラグメントの安定な結晶を再現可能に寸法制御条件下及び／又は大規模に製造することが初めて可能になり、これらの結晶を更に処理し、非常に有利な優れた医薬組成物の活性成分を形成できるという驚くべき発見に基づく。
【００８４】
晶析方法を実施するための出発材料は一般に結晶化させようとする抗体の濃厚溶液を含む。蛋白質濃度は例えば約５〜約７５ｍｇ／ｍｌの範囲とすることができる。溶液には溶解抗体を安定化させる添加剤を添加することができる。１態様では、添加剤を予め除去することが推奨される。これは本明細書に記載する緩衝液交換段階を実施することにより達成することができる。
【００８５】
好ましくは、本発明の晶析方法を実施するための出発材料はｐＨを約３．２〜約８．２又は約４．０〜約８．０、特に約４．５〜約．５、好ましくは約５．０〜約５．５の範囲に調整した水溶液中に抗体を含有する。ｐＨは適切な緩衝液を終濃度約１〜約５００ｍＭ、特に約１〜約１００ｍＭ又は約１〜約１０ｍＭで添加することにより調整することができる。溶液を更に安定化させるために、例えば溶液の総重量に対して約０．０１〜約１５又は約０．１〜約５又は約０．１〜約２重量％の割合で例えば塩類、糖類、糖アルコール類及び界面活性剤等の添加剤を溶液に添加することができる。賦形剤は医薬製剤に日常的に添加される生理的に許容可能な化合物から選択することが好ましい。非限定的な例として、塩類（例えばＮａＣｌ）；界面活性剤（例えばポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）やポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０））；糖類（例えばスクロースやトレハロース）；糖アルコール類（例えばマンニトールやソルビトール）；緩衝剤（例えば上記のようなリン酸水素ナトリウム緩衝液及びリン酸水素カリウム緩衝液等のリン酸緩衝系、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、マレイン酸緩衝液又は琥珀酸緩衝液、並びにヒスチジン緩衝液）；並びにアミノ酸（例えばヒスチジン、アルギニン及びグリシン）を挙げることができる。
【００８６】
緩衝液交換は例えば透析、透析濾過又は限外濾過等の常法により実施することができる。
【００８７】
出発材料として使用する水溶液の初期蛋白質濃度は約０．５〜約２８０ｍｇ／ｍｌ又は約１〜約５０ｍｇ／ｍｌの範囲とすべきである。
【００８８】
（１ｍｌ〜２０，０００リットルの範囲であり得る）目的最終バッチ寸法に応じて、初期容量の抗体水溶液を不活性材料（例えばガラス、ポリマー又は金属）製の適当な容器（例えば液体容器、ビン又はタンク）に入れる。水溶液の初期容量は最終バッチ寸法の約３０〜約８０％、通常は約５０％に対応する量とすることができる。
【００８９】
必要に応じて、容器に充填後の溶液を標準条件に設定する。特に、温度を約４℃〜約３７℃の範囲に調整する。必要な場合又は有利な場合には、温度を一定に維持する必要がなく、例えば温度を変化させてもよく、所望形状の結晶を生じる温度プロファイルを晶析工程中に適用してもよい。
【００９０】
次に、場合により抗体溶液と同様に予め条件設定した適当な濃度の結晶化剤を含有する結晶化溶液を抗体溶液に加え、結晶化混合物を形成する。
【００９１】
第１段階では、通常は初期抗体蛋白質濃度の比較的高い初期結晶化混合物中に凝集物／沈殿を実質的に形成せずに結晶化を開始するために十分な約９〜１１重量％の第１の終濃度まで大部分の結晶化剤を抗体溶液に加える。第１の結晶形成最大値に達するために十分な時間インキュベーション後、場合によりそれまでに形成された抗体結晶を除去した後に、結晶化剤の別のアリコートを加える。こうして結晶化剤の濃度を第２の終濃度まで約０．５〜約３重量％ずつ更に増加する。十分な時間、例えば約１時間〜約５日間更にインキュベーションする間に、実質的に凝集物／沈殿を形成せずに更に抗体結晶が形成され、上清又は「母液」から分離することができる。実質的に凝集物／沈殿を形成せずに更に抗体結晶形成が誘導される限り、同様に結晶化剤の補充を１回以上繰返すことができる。こうして結晶化剤の最終濃度は約１２〜約２０重量％の値に達することができる。
【００９２】
別の態様によると、段階ａ）で得られた結晶化混合物に結晶化を開始又は増進するために種晶として適切な量の既存抗体結晶、例えば抗ｈＴＮＦα抗体結合フラグメント結晶を添加できるように本発明の晶析方法を実施してもよい。
【００９３】
結晶化溶液の添加は２液の混合を助長するために場合により温和な撹拌下で連続的又は不連続的に実施する。蛋白質溶液を撹拌下に添加し、結晶化溶液（又はその固体形態の結晶化剤）を制御下に添加する条件下で添加を実施することが好ましい。
【００９４】
本発明の好ましい１態様では、少なくとも１種の主要パラメータ（例えばローラー速度）を選択すると、晶析工程中に形成される抗体結晶の平均粒度の制御が可能になる条件下で結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することに対応する制御条件下で結晶化を実施する。例えば、工程は結晶形成プラトーもしくは最大結晶収率に到達するまで、又は晶析工程中の所定時間持続し、例えば時間間隔当たり（例えば１日当たり）５％超又は１０％超又は１５％超の結晶化速度の増加を特徴とし得る主結晶形成相の間持続する。
【００９５】
本明細書で使用する「〜に対応する」とは、特定形状のローラー容器内で特定速度の撹拌を適用する特定結晶化技術を寸法制御結晶化の「基準システム」とみなすべきであることを意味する。当業者はこのような基準システムの記載に基づき、各種条件下で寸法制御抗体結晶化を実施することができ、このような条件としては、例えばローラー容器での晶析工程の大規模化もしくは小規模化、又は各種撹拌条件（例えば震盪、かき混ぜもしくはタンブリング又はその組合せによる撹拌）の適用が挙げられる。
【００９６】
少数の日常的実験を実施することにより、当業者は本発明の基準ローラー容器システムに関する本明細書の一般教示を小規模化又は大規模化したローラー容器晶析法に応用することができ、あるいは例えば適切な容器内での適切な震盪、かき混ぜ又はタンブリング速度を選択したり、適切な蛋白質及び結晶化剤濃度、温度、期間、液体結晶化混合物の容器充填レベル及び／又は混合物のｐＨを選択することにより、適切な条件下の結晶化混合物の震盪、かき混ぜ又はタンブリングに基づく寸法制御晶析法に応用することができよう。
【００９７】
本発明の基準システムによると、撹拌の１つの主要パラメータはローラー速度である。特に、ローラー速度は約１〜約２００ｒｐｍの範囲の値に設定される。ローラー速度は範囲内又は範囲内の一定区間内で変動させることができ、例えば範囲の約±１〜約±５、又は約±２〜約±４ｒｐｍとすることができる。しかし、１つの特定値に速度を設定し、晶析工程期間中、一定に維持することが好ましい。例えば、ローラー速度は約２〜約１５０ｒｐｍ、又は約５〜約１２０ｒｐｍ又は約８〜約１００ｒｐｍの範囲の値、例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０ｒｐｍに設定することができる。当業者はローラー容器での結晶化の大規模化もしくは小規模化又は震盪、かき混ぜもしくはタンブリングによる寸法制御結晶化に合わせて対応する適切な速度値を選択することができる。
【００９８】
基準システムの別の態様によると、結晶化混合物を直径約２〜約１００ｃｍ、例えば約５〜約８０又は約１０〜約５０ｃｍのローラー容器に入れて撹拌することに対応する制御条件下で結晶化を実施する。当然のことながら、基準ローラー容器システムで寸法制御結晶化に得られる実験設定を小規模化又は好ましくは大規模化により寸法又は容積の小さい容器又は好ましくは大きい容器（ローラー容器）に応用することができる。また、かき混ぜ、震盪又はタンブリングによる撹拌に適した小容量又は好ましくは大容量の他の型の容器に応用することもできる。適切な容器形状は当業者に周知である。
【００９９】
基準システムの別の態様によると、結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することに対応する制御条件下で寸法制御結晶化を実施し、ローラー容器の総容積の約１〜約１００容量％、例えば約４〜約９９、約１０〜約８０、約２０〜約７０、約３０〜約６０又は約４０〜約５０容量％に結晶化混合物を充填する。これらのパラメータ範囲は当然のことながら別の寸法の容器及びかき混ぜ、震盪又はタンブリングによる撹拌に使用する容器に応用することができる。
【０１００】
基準システムの別の態様によると、結晶化混合物をローラー容器に入れて３０分間〜約６０日間、例えば約１〜約４０日間、約２〜約２０日間又は約３〜約１０日間撹拌することに対応する制御条件下で寸法制御結晶化を実施する。これらのパラメータ範囲は当然のことながら、かき混ぜ、震盪又はタンブリング式撹拌による寸法制御結晶化に応用することができる。
【０１０１】
基準システムの別の態様によると、結晶化混合物をローラー容器に入れて約−１５〜約＋５０℃、例えば約０〜約４０、約５〜約３０、約１０〜約２５又は約１５〜約２０℃の範囲の温度で撹拌することに対応する制御条件下で寸法制御結晶化を実施する。これらのパラメータは当然のことながら、かき混ぜ、震盪又はタンブリング式撹拌による寸法制御結晶化に応用することができる。
【０１０２】
ローラー容器での寸法制御結晶化に好ましい基準システムは以下の主要パラメータの１つ以上、特にその組合せを適用する：
ローラー容器容積：約４５０〜約５５０ｍｌ、好ましくは約５００ｍｌ
ローラー容器直径：約６〜約１０ｃｍ、好ましくは約８ｃｍ
ローラー速度：約１〜約１００ｒｐｍの値に設定
充填：約５〜約１５、好ましくは約１０容量％
温度：約１５〜約２５、好ましくは約２０℃
期間：約２〜約２０、好ましくは約５〜約１０日間。
【０１０３】
本発明の教示に従うことにより、約１〜約１０００μｍ、例えば約５〜約４００、約１０〜約００、約１５〜約１５０、約１５〜約１００、約１５〜約５０又は約１８〜約４０μｍの範囲内に平均結晶粒度（即ち平均直径又は平均長）を調整することが可能である。１態様において、抗体フラグメントは抗ｈＴＮＦα抗体結合フラグメントである。１特定態様において、抗体フラグメントはＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２フラグメント、例えば寄託番号ＥＣＡＣＣ８７０５０８０１のハイブリドーマ細胞株により産生される抗体ＭＡＫ１９５のＦ（ａｂ’）２フラグメントであるＭＡＫ１９５Ｆである。
【０１０４】
１特定態様において、ＭＡＫ１９５Ｆは約０．５〜２８０ｍｇ／ｍｌの範囲の初期蛋白質濃度で存在しており、ローラー容器に入れて約１５〜約２５℃の範囲の温度にて約１〜約６０日間、約５〜約１００ｒｐｍの範囲の速度で撹拌する。
【０１０５】
ＭＡＫ１９５Ｆ結晶の寸法制御製造の好ましい１態様では、初期ＭＡＫ１９５Ｆ蛋白質濃度が約０．５〜約２８０ｍｇ／ｍｌ、特に約１〜約１５ｍｇ／ｍｌの範囲、好ましくは約５ｍｇ／ｍｌであるＭＡＫ１９５Ｆ含有結晶化混合物約５〜約８０容量％を容積約１００ｍｌ〜約１０００リットル及び直径約５〜約５０ｃｍの範囲のローラー容器に充填し、約１〜約１００ｒｐｍの範囲の速度で約１〜約６０日間、約１５〜約２５℃の範囲の温度で撹拌する。
【０１０６】
中規模結晶化の１態様において、ＭＡＫ１９５Ｆ蛋白質濃度は約１〜約１５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５ｍｇ／ｍｌであり、ローラー容器は容積約１００〜約１０００ｍｌ、直径約５〜約１０ｃｍの範囲であり、結晶化混合物約５〜約２０容量％を充填し、約１〜約１００ｒｐｍの範囲のローラー速度で約１〜約１０日間、約１５〜約２５℃の温度で撹拌する。
【０１０７】
大規模結晶化の１態様において、ＭＡＫ１９５Ｆ蛋白質濃度は約１〜約１５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５ｍｇ／ｍｌであり、容積約１０〜約２０，０００リットル、直径約１０ｃｍ〜約１００ｃｍの範囲のローラー容器に結晶化混合物約２０〜約９０容量％を充填し、約１〜約１０ｒｐｍの範囲のローラー速度で約１〜約１０日間、約１５〜約２５℃の温度で撹拌する。
【０１０８】
上記のようなポリアルキレンポリオール、特にポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は上記のような少なくとも２種類の異なるポリアルキレンポリオールの混合物を結晶化剤として添加することにより、抗体結晶の形成を開始する。結晶化溶液は結晶化混合物中に約５〜３０％（ｗ／ｖ）の範囲のポリアルキレンポリオールの終濃度を得るために十分な濃度の結晶化剤を含有する。
【０１０９】
好ましくは、結晶化溶液は更に結晶化混合物のｐＨを約４〜約６の範囲に調整できるようにするのに適した濃度の酸性緩衝液、即ち抗体溶液の緩衝液とは異なる緩衝液を含有する。
【０１１０】
結晶化溶液への結晶化剤の添加の完了後、抗体結晶の最大収率を得るために混合物を約１時間〜約２５０日間更に保温してもよい。必要に応じて、混合物を例えば撹拌、温和にかき混ぜ、ローリング又は当分野で公知の方法で運動させてもよい。結晶寸法を更に制御することが望ましい場合には、（上記に既に説明したような）制御条件下の撹拌に基づく寸法制御晶析方法を本発明のバッチ晶析方法に組込むことができる。
【０１１１】
得られた結晶を公知方法、例えば濾過又は遠心により分離することができ、例えば室温又は４℃にて約２００〜約２０，０００ｒｐｍ、好ましくは約５００〜約２，０００ｒｐｍで遠心する。残りの母液は捨ててもよいし、例えば更に結晶化剤を加えることにより更に処理してもよい。
【０１１２】
必要に応じて、単離した結晶を洗浄後、乾燥してもよいし、懸濁抗体の保存及び／又は最終利用に適した別の溶媒系に母液を交換してもよい。
【０１１３】
本発明により形成される抗体結晶は既に上述したように種々の形状をとることができる。治療投与では、結晶の寸法は投与経路により異なり、例えば皮下投与の場合の結晶寸法は静脈内投与よりも大きくすることができる。蛋白質結晶と低分子量有機及び無機分子の結晶の両者について従来記載されているように、結晶の形状は特定の付加的な添加剤を結晶化混合物に添加することにより変えることができる。
【０１１４】
必要に応じて、結晶が実際に抗体の結晶であることを検証してもよい。抗体の結晶を複屈折について顕微鏡分析することができる。一般に、内部立方対称以外の結晶では偏光の偏光面が回転する。更に別の方法では、結晶を単離し、洗浄し、再可溶化させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、場合により検出抗体で染色することができる。場合により、再可溶化させた抗体を更に標準アッセイによりその抗原との結合について試験することもできる。
【０１１５】
本発明により得られた結晶を更に相互に架橋させてもよい。このような架橋は結晶の安定性を増すことができる。結晶の架橋方法は例えば本明細書に援用する米国特許第５，８４９，２９６号に記載されている。グルタルアルデヒド等の二官能性試薬を使用して結晶を架橋させることができる。架橋後、結晶を凍結乾燥し、例えば診断又は治療用途に備えて保存することができる。
【０１１６】
場合により、結晶を乾燥することが望ましい場合がある。窒素ガス等の不活性ガス、真空オーブン乾燥、凍結乾燥、蒸発、トレー乾燥、流動層乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥又はローラー乾燥等により結晶を乾燥することができる。適切な方法は当分野で周知である。
【０１１７】
本発明により形成された結晶は元の結晶化溶液中に維持してもよいし、洗浄し、不活性キャリヤー又は成分等の他の物質を加え、本発明の結晶を含有する組成物又は製剤を形成してもよい。このような組成物又は製剤は例えば治療及び診断用途で使用することができる。
【０１１８】
好ましい１態様では、製剤の結晶を賦形剤により包埋又は封入するように適切なキャリヤー又は成分を本発明の結晶に添加する。適切なキャリヤー又は結晶化剤はポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（酸無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、乳酸・グリコール酸コポリマーないしＰＬＧＡ、ポリ（β−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、ジメチルシロキサン／メチルビニルシロキサンコポリマー、エチレン酢酸ビニルコポリマー、ポリ［ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン酸無水物］セバシン酸、、ポリグラクチン、ポリシロキサン、ポリ（ジオキサノン）；ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ（オルガノ）ホスファゼン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸・アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、ヒドロキシエチルデンプン、そのブレンド及びコポリマー、ＳＡＩＢ、脂肪酸及び脂肪酸塩、脂肪アルコール、脂肪アミン、脂肪酸のモノ、ジ及びトリグリセリド、リン脂質、糖脂質、ステロール及び蝋並びに関連類似物質から構成される非限定的な群から選択することができる。蝋は更に天然物と合成物に分類される。天然物としては蜜蝋、カルナウバ蝋又はモンタン蝋等の植物、動物又は鉱物資源から得られる蝋が挙げられる。合成蝋製品の例としては塩素化ナフタレンとエチレンポリマーが挙げられる。
【０１１９】
Ｃ．組成物
別の側面において、本発明は少なくとも１種のキャリヤー／賦形剤と共に抗体結晶を含有する組成物及び製剤を提供する。製剤は固体、半固体又は液体とすることができる。
【０１２０】
本発明の製剤は必要な純度の抗体をキャリヤー、賦形剤及び／又は安定剤等の生理的に許容可能な添加剤（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）参照）と混合することにより懸濁液として保存及び／又は使用に適した形態で製造され、あるいは凍結乾燥又は別の方法で乾燥される。場合により、別の抗体、生体分子、化学的又は酵素により合成された低分子量分子等の他の活性成分も加えてもよい。
【０１２１】
許容可能な添加剤は使用する用量及び濃度でレシピエントに非毒性である。その非限定的な例を以下に挙げる：
−酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、リンゴ酸、硝酸、リン酸、希リン酸、硫酸及び酒石酸等の酸性化剤；
−ブタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、イソブタン、プロパン及びトリクロロモノフルオロメタン等のエアゾール用噴射剤；
−二酸化炭素及び窒素等の空気置換剤；
−メチルイソブチルケトン及びオクタ酢酸スクロース等のアルコール変性剤；
−アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム及びトロラミン等のアルカリ化剤；
−ジメチコン及びシメチコン等の消泡剤；
−塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズアルコニウム溶液、塩化ベンズエトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチルパラベン、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、クロロクレゾール、クレゾール、デヒドロ酢酸、エチルパラベン、メチルパラベン、メチルパラベンナトリウム、フェノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、プロピルパラベン、プロピルパラベンナトリウム、安息香酸ナトリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸、チメロサール及びチモール等の抗菌防腐剤；
−アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、スルホキシル酸ナトリウムホルムアルデヒド、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、二酸化硫黄、トコフェロール及びトコフェロール賦形剤等の酸化防止剤；
−酢酸、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、クエン酸カリウム、メタリン酸カリウム、第一リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム溶液、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、ヒスチジン等の緩衝剤；
−エデト酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸及び塩並びにエデト酸等のキレート剤；
−カルボキシメチルセルロースナトリウム、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、ゼラチン、医薬品用艶出し剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタル酸エステメ、メタクリル酸コポリマー、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリ酢酸ビニルフタル酸塩、シェラック、スクロース、二酸化チタン、カルナウバ蝋、微結晶蝋、ゼイン、ポリアミノ酸、他のポリマー（例えばＰＬＧＡ等）、及びＳＡＩＢ等のコーティング剤；
−酸化第二鉄等の着色剤；
−エチレンジアミン四酸化及び塩（ＥＤＴＡ）、エデト酸、ゲンチシン酸エタノールアミド及び硫酸オキシキノリン等の錯化剤；
−塩化カルシウム、硫酸カルシウム及び二酸化ケイ素等の乾燥剤；
−アラビアガム、コレステロール、ジエタノールアミン（付加物）、モノステアリン酸グリセリル、ラノリンアルコール、レシチン、モノ及びジグリセリド、モノエタノールアミン（付加物）、オレイン酸（付加物）、オレイルアルコール（安定剤）、ポロキサマー、ステアリン酸ポリオキシエチレン５０、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル４０水素化ヒマシ油、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、プロピレングリコールジアセテート、モノステアリン酸プロピレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、ステアリン酸、トロラミン及び乳化蝋等の乳化剤及び／又は可溶化剤；
−粉末セルロース及び精製珪藻土等の濾過助剤；
−アネトール、ベンズアルデヒド、エチルバニリン、メントール、サリチル酸メチル、グルタミン酸一ナトリウム、オレンジ花油、ハッカ、ハッカ油、ハッカ精、バラ油、高濃度バラ水、チモール、トルーバルサムチンキ、バニラ、バニラチンキ及びバニリン等のフレーバー及び香料；
−ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素及びタルク等の流動促進剤及び／又は凝結防止剤；
−グリセリン、ヘキシレングリコール、プロピレングリコール及びソルビトール等の湿潤剤；
−ラノリン、無水ラノリン、親水性軟膏、白色軟膏、黄色軟膏、ポリエチレングリコール軟膏、ペトロラタム、親水性ペトロラタム、白色ペトロラタム、バラ水軟膏及びスクアレン等の軟膏基剤；
−ヒマシ油、ラノリン、鉱物油、ペトロラタム、ギ酸ベンジル、クロロブタノール、フタル酸ジエチル、ソルビトール、ジアセチル化モノグリセリド、フタル酸ジアセチル、グリセリン、グリセロール、モノ及びジアセチル化モノグリセリド、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トリアセチン、クエン酸トリエチル及びエタノール等の可塑剤；
−低分子量（約１０残基未満）等のポリペプチド；
−血清アルブミン、ゼラチン及び免疫グロブリン等の蛋白質；
−酢酸セルロース膜等のポリマー膜；
−アセトン、アルコール、希アルコール、アミレン水和物、安息香酸ベンジル、ブチルアルコール、四塩化炭素、クロロホルム、コーン油、綿実油、酢酸エチル、グリセリン、ヘキシレングリコール、イソプロピルアルコール、メチルアルコール、塩化メチレン、メチルイソブチルケトン、鉱物油、落花生油、ポリエチレングリコール、炭酸プロピレン、プロピレングリコール、胡麻油、注射用水、注射用滅菌水、洗浄用滅菌水、精製水、液体トリグリセリド、液体蝋及び高級アルコール等の溶剤；
−粉末セルロース、活性炭、精製珪藻土、二酸化炭素吸着剤、水酸化バリウム、石灰及びソーダ石灰等の吸着剤；
−水素化ヒマシ油、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、セチルエステル蝋、硬質脂肪、パラフィン、ポリエチレン賦形剤、ステアリルアルコール、乳化蝋、白蝋及び黄蝋等の硬化剤；
−カカオバター、硬質脂肪及びポリエチレングリコール等の坐剤基剤；
−アラビアガム、寒天、アルギン酸、モノステアリン酸アルミニウム、ベントナイト、精製ベントナイト、マグマベントナイト、カルボマー９３４ｐ、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム１２、カラギーナン、微結晶及びカルボキシメチルセルロースナトリウムセルロース、デキストリン、ゼラチン、グアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、アルギン酸プロピレングリコールエステル、二酸化ケイ素、コロイド状二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、トラガカントガム及びキサンタンガム等の懸濁剤及び／又は増粘剤；
−アスパルテーム、デキストレート、デキストロース、デキストロース賦形剤、フルクトース、マンニトール、サッカリン、サッカリンカルシウム、サッカリンナトリウム、ソルビトール、ソルビトール溶液、スクロース、圧縮糖、粉糖及びシロップ等の甘味剤；
−アラビアガム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース、デキストリン、エチルセルロース、ゼラチン、液体グルコース、グアーガム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ポビドン、糊化デンプン及びシロップ等の錠剤結合剤；
−炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶セルロース、粉末セルロース、デキストレート、デキストリン、デキストロース賦形剤、フルクトース、カオリン、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、デンプン、糊化デンプン、スクロース、圧縮糖及び粉糖等の錠剤及び／又はカプセル希釈剤；
−アルギン酸、微結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポラクリリンカリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプン及び糊化デンプン等の錠剤崩壊剤；
−ステアリン酸カルシウム、ベヘン酸グリセリル、ステアリン酸マグネシウム、軽鉱物油、ポリエチレングリコール、フマル酸ステアリルナトリウム、ステアリン酸、精製ステアリン酸、タルク、水素化植物油及びステアリン酸亜鉛等の錠剤及び／又はカプセル滑沢剤；
−デキストロース、グリセリン、マンニトール、塩化カリウム、塩化ナトリウム等の浸透圧調節剤；
−フレーバー入り及び／又は甘味剤入り芳香エリキシル、化合物ベンズアルデヒドエリキシル、イソアルコールエリキシル、ハッカ水、ソルビトール溶液、シロップ及びトルーバルサムシロップ等の溶媒；
−油性アーモンド油、コーン油、綿実油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱物油、軽鉱物油、ミリスチルアルコール、オクチルドデカノール、オリーブ油、落花生油、杏仁油、胡麻油、大豆油、スクアレン、固体キャリヤー粒状糖、注射用滅菌静菌水、静菌塩化ナトリウム注射液、液体トリグリセリド、液体蝋及び高級アルコール等の溶媒；
−シクロメチコン、ジメチコン及びシメチコン等の撥水剤；
−塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム、塩化セチルピリジニウム、ドクサートナトリウム、ノノキシノール９、ノノキシノール１０、オクトキシノール９、ポロキサマー、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル４０、水素化ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシル５０、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０、セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン及びチロキサポール等の湿潤剤及び／又は可溶化剤。
【０１２２】
安定性及び／又は持続放出を実現するために結晶にポリマーキャリヤーを添加してもよい。このようなポリマーとしては生体適合性で生分解性のポリマーが挙げられる。ポリマーキャリヤーは単一ポリマー種でもよいし、複数のポリマー種の混合物から構成してもよい。ポリマーキャリヤーの非限定的な例は上記に挙げた通りである。
【０１２３】
好ましい成分又は賦形剤の例を以下に挙げる：
−グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アスパラギン、グルタミン、プロリン及びヒスチジン等のアミノ酸の塩；
−グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース及びリボース等の単糖類；
−ラクトース、トレハロース、マルトース及びスクロース等の二糖類；
−マルトデキストリン、デキストラン、デンプン及びグリコーゲン等の多糖類；
−マンニトール、キシリトール、ラクチトール及びソルビトール等のアルジトール；
−グルクロン酸及びガラクツロン酸；
−メチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−（３−シクロデキストリン）等のシクロデキストリン類；
−塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ホウ酸、炭酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機塩類；
−酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩及び乳酸塩等の有機塩類；
−アラビアガム、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリル、レシチン、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマー、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸、モノラウリン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン及び他のソルビタン誘導体、ポリオキシル誘導体、蝋、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタン誘導体等の乳化剤又は可溶化剤；並びに
−寒天、アルギン酸とその塩、グアーガム、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、セルロースとその誘導体、炭酸プロピレン、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール及びチロキサポール等の増粘剤。
【０１２４】
本明細書に記載する製剤は更に有効量の結晶抗体を含有する。特に、本発明の製剤は「治療有効量」又は「予防有効量」の本発明の抗体結晶を含有することができる。「治療有効量」とは必要な用量と期間で所望治療結果を達成するために有効な量を意味する。抗体結晶の「治療有効量」は個体の疾患状態、年齢、性別及び体重や、個体に所望の応答を誘発する抗体の能力等の因子により変動し得る。治療有効量は抗体の有益な治療作用が毒性ないし有害作用を上回る量でもある。「予防有効量」とは必要な用量と期間で所望予防結果を達成するために有効な量を意味する。一般に、疾患以前又は疾患の初期段階の対象では予防用量を使用するので、予防有効量は治療有効量よりも少なくなる。
【０１２５】
適切な用量は標準方法を使用して容易に決定することができる。抗体を患者に一度に投与するか又は一連の治療で投与すると適切である。例えば１回もしくは２回以上に分けて投与するか、又は連続輸液により投与するかに関係なく、上記因子に応じて抗体約１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇが患者に投与する初期候補用量である。典型的な１日又は１週間用量は病態に応じて約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上とすることができ、疾患症状の所望の抑制が得られるまで投与を繰返す。しかし、他の投与レジメンが有用な場合もある。場合により、製剤は再可溶化時に少なくとも約１ｇ／Ｌ以上の濃度の抗体を含有する。他の態様では、抗体濃度は再可溶化時に少なくとも約１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌとする。
【０１２６】
抗体の結晶又はこのような結晶を含有する製剤は単独で投与してもよいし、医薬製剤の一部として投与してもよい。本発明の結晶は経口、非経口、肺、鼻、耳、肛門、皮膚、眼球、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、粘膜、舌下、皮下、経皮、局所又は頭蓋内経路で投与することができ、あるいは口腔内に投与してもよい。投与技術の特定例としては、肺吸入、病巣内投与、有針注射、乾燥粉末吸入、皮膚エレクトロポレーション、エアゾール送達及び無針注射技術（無針皮下投与を含む）が挙げられる。
【０１２７】
ｈＴＮＦα関連疾患は以下の疾患リストから選択することができる。
【０１２８】
【表１】
2010535771.tif 000003
2010535771.tif 000004
2010535771.tif 000005
2010535771.tif 000006
2010535771.tif 000007
2010535771.tif 000008
2010535771.tif 000009
2010535771.tif 000010
【０１２９】
ｈＴＮＦα関連疾患は以下の疾患リストから選択することもできる：リウマチ性脊椎炎、肺障害、腸障害、心臓障害、炎症性骨障害、骨吸収疾患、ウイルス性肝炎、劇症肝炎、凝固障害、熱傷、再潅流障害、ケロイド形成、瘢痕組織形成、発熱、歯周病、肥満症及び放射線傷害；脊椎関節症、代謝障害、貧血、疼痛、肝障害、皮膚障害、爪障害、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、貧血、疼痛、クローン病関連障害、慢性プラーク乾癬、加齢性悪液質、脳浮腫、炎症性脳損傷、薬物反応、脊髄内及び／又は周囲の浮腫、家族性周期性発熱、フェルティ症候群、連鎖球菌感染後糸球体腎炎又はＩｇＡ腎症、人工器官の緩み、多発性骨髄腫、癌、多臓器障害、睾丸炎、骨溶解、急性、慢性及び膵膿瘍を含む膵炎、歯周病、進行性腎不全、偽痛風、壊疽性膿皮症、再発性多発性軟骨炎、硬化性胆管炎、脳卒中、胸腹部大動脈瘤修復（ＴＡＡＡ）、黄熱病ワクチン接種関連症候群、耳関連炎症性疾患（例えば慢性耳炎症又は小児耳炎症）、並びに脈絡膜血管新生又は狼瘡。
【０１３０】
Ｄ．ＭＡＫ１９５Ｆ
ＭＡＫ１９５ＦはＡｆｅｌｉｍｏｍａｂ（登録商標）とも呼ばれ、概算分子量１００ｋＤａの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に特異的なマウスＩｇＧ３モノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントである。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントはＩｇＧ３モノクローナル抗体のペプチド消化物により産生され、２個のヘテロ二量体から構成される。ヘテロ二量体はＩｇＧ３抗体の軽鎖ポリペプチドと重鎖ポリペプチドのＦｄ’部分から構成される。抗体分子の４本の鎖は内部でジスルフィド結合により相互に結合されている。軽鎖と重鎖のＦｄ’部分の全システイン残基がジスルフィド結合に関与している。以下のシステイン残基対がジスルフィド結合により結合されると予想される。軽鎖内の結合：Ｌ２３−Ｌ８８とＬ１３４−Ｌ１９４、Ｆｄ’フラグメント内の結合：Ｈ２２−Ｈ９５とＨ１４４−Ｈ１９８、軽鎖とＦｄ’フラグメント間の結合：Ｌ２１４−Ｈ１３２、Ｆｄ’フラグメント間の結合：Ｈ２２９−Ｈ２２９。予想されるジスルフィドパターンはＡｆｅｌｉｍｏｍａｂ（登録商標）ポリペプチドのアミノ酸配列と、既知ジスルフィド構造をもつＩｇＧ抗体の高度に相同のアミノ酸配列との比較に基づく。ジスルフィド結合の形成は全ジスルフィド結合である程度まで不完全であり、Ｆ（ａｂ’）２分子１個当たり約０．３個のシステイン残基が遊離システインとして存在することが分かっている。
【０１３１】
軽鎖は各々２１４アミノ酸を含む。軽鎖のアミノ酸配列を以下に示す。アスパラギン残基１個（ＡｓｎＬ１５７）の脱アミノ化以外に、軽鎖の共有構造の変異は検出されなかった。完全ＩｇＧ３抗体の重鎖のアミノ酸配列は各々４４７アミノ酸を含む。アミノ酸配列を以下に示す。ｃＤＮＡ配列に由来する重鎖のＮ末端はアミノ酸グルタミンから開始する。このアミノ酸は完全にピログルタミン酸に変換される。
【０１３２】
【化１】
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【０１３３】
Ｎ末端Ｆｄ’フラグメントの形成に関与する蛋白分解開裂はヒンジ領域で行われ、Ｈ２３３位（得られるＦｄ’フラグメントのＣ末端  ．．．ＰＰＧＮ（配列番号３））、Ｈ２３５位（．．．ＰＰＧＮＩＬ（配列番号４））、Ｈ２３６位（．．．ＰＰＧＮＩＬＧ（配列番号５））、Ｈ２３９位（．．．ＮＩＬＧＧＰＳ（配列番号６））、Ｈ２４０位（．．．ＮＩＬＧＧＰＳＶ（配列番号７））及びＨ２４１位（．．．ＮＩＬＧＧＰＳＶＦ（配列番号８））でアミノ酸のＣ末端側に開裂を生じる。Ｈ２３６位の開裂を除き、開裂位置はＡｆｅｌｉｍｏｍａｂ（登録商標）ＡＰＩの製造に使用される蛋白分解剤であるペプシンに特異的である。Ｈ２３６位の開裂はカテプシンＤに起因することが分かった。カテプシンＤは無細胞上清中に存在しており、ペプシン等の酸性プロテアーゼである。この内在プロテアーゼの含量はクロマトグラフィー段階により低下させることができる。ペプシンの限られた特異性により、Ｆ（ａｂ’）２分子の重鎖ポリペプチドのＣ末端はある程度の不均一性を示す。
【０１３４】
ＳｅｒＨ２２２の部分Ｏ−結合型糖鎖付加もＡｆｅｌｉｍｏｍａｂ（登録商標）分子の不均一性の一因である。Ｆｄ’フラグメントの約７０％は糖鎖付加されていない。糖鎖付加フラグメントのうち、ＳｅｒＨ２２２に結合した主要なオリゴ糖構造はＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＮＧＮＡとして同定された（ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｇａｌ：ガラクトース、ＮＧＮＡ：Ｎ−グリコリルノイラミン酸）。更に、程度は低いが、２個のＮＧＮＡ部分をもつオリゴ糖ともたないオリゴ糖も認められた（下記参照）。
【０１３５】
【表２】
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【０１３６】
以下、実施例により本発明の実施について更に詳細に説明するが、以下の実施例は例証のみを目的とし、本発明を限定するものと解釈すべきではない。当業者は以下の記載の概説部分と自身の一般知識に基づき、過度の実験を要することなしに本発明の他の態様に想到できよう。
【０１３７】
実施例
Ａ．材料
ａ）蛋白質
全実験はＭＡＫ１９５ＦロットＧ００８．０１Ｅ／ＰＺ０１０５Ｐ０２５を初期ｍＡｂ濃度１２．３９ｍｇ／ｍＬで使用して実施した。
【０１３８】
ｂ）精製化学薬品
酢酸ナトリウムはＧｒｕｓｓｉｎｇ  ＧｍｂＨ，Ｆｉｌｓｕｍから入手した。ポリエチレングリコール４，０００はＣｌａｒｉａｎｔ  ＧｍｂＨ，Ｓｕｌｚｂａｃｈから入手した。更に、所定のマイクロスケール実験には市販結晶化スクリーニングキット及び試薬（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｍｅｒａｌｄ  ＢｉｏＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。全化学薬品はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ又はＭｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔから入手した。
【０１３９】
Ｂ．一般方法
ａ）Ａｆｅｌｉｍｏｍａｂ（登録商標）（ＭＡＫ１９５Ｆ）原薬の融解
ＭＡＫ１９５Ｆは撹拌下の水浴中で２５℃にて融解した。
【０１４０】
ｂ１）緩衝液交換−方法Ａ
ＭＡＫ１９５Ｆ溶液のアリコートをＳＬＩＤＥ−Ａ−ＬＹＺＥＲ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）に注入した。選択緩衝液を充填したビーカーに透析カセットを入れ、４℃で一晩撹拌下に緩衝液交換を行った。蛋白質濃度の調整後、０．２μｍシリンジ駆動式フィルターユニットで溶液を滅菌濾過した。
【０１４１】
ｂ２）緩衝液交換−方法Ｂ
ＭＡＫ１９５Ｆ溶液のアリコートを３０ＫＤａ  ＭＷＣＯ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ４コンセントレーター（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）にピペットで注入した。蛋白質サンプルを新しい緩衝液で４倍に希釈し、４℃にて１０，０００×ｇで遠心（Ｓｉｇｍａ  ４Ｋ  １５実験室用遠心機）することにより、サンプル容量を元のサンプル容量に戻した。希釈／遠心工程を２回繰返し、元のサンプル緩衝液の６４倍に希釈した。蛋白質濃度の調整後、０．２μｍシリンジ駆動式フィルターユニットで溶液を滅菌濾過した。
【０１４２】
ｂ３）緩衝液交換−方法Ｃ
ＭＡＫ１９５Ｆ溶液のアリコートを３０ＫＤａ  ＭＷＣＯ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０コンセントレーター（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）にピペットで注入した。蛋白質サンプルを新しい緩衝液で１０倍に希釈し、４℃にて５，０００×ｇで遠心（Ｓｉｇｍａ  ４Ｋ  １５実験室用遠心機）することにより、サンプル容量を元のサンプル容量に戻した。希釈／遠心工程を１回繰返し、元のサンプル緩衝液の１００倍に希釈した。蛋白質濃度の調整後、０．２μｍシリンジ駆動式フィルターユニットで溶液を滅菌濾過した。
【０１４３】
ｂ４）緩衝液交換−方法Ｄ
ＭＡＫ１９５Ｆ溶液のアリコートを３０ＫＤａ  ＭＷＣＯ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０コンセントレーター（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）にピペットで注入した。蛋白質サンプルを４℃にて５，０００×ｇで遠心（Ｓｉｇｍａ  ４Ｋ  １５実験室用遠心機）することにより元の容量の１０倍まで濃縮した。次に、濃縮したサンプルを新しい緩衝液で元のサンプル容量まで希釈した。遠心／希釈工程を１回繰返し、元のサンプル緩衝液の１００倍に希釈した。蛋白質濃度の調整後、０．２μｍシリンジ駆動式フィルターユニットで溶液を滅菌濾過した。
【０１４４】
ｂ５）緩衝液交換−方法Ｅ
ＭＡＫ１９５Ｆ溶液のアリコートをビーカーに加えた。３０ＫＤａ  ＭＷＣＯ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５０コンセントレーター（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を超純水でリンスし、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  ＥａｓｙＬｏａｄ  ＩＩポンプを使用して元のサンプル容量を４倍に濃縮した。次に蛋白質サンプルを元の容量まで希釈した。濃縮／希釈工程を３回繰返し、元の緩衝液の総希釈倍率２５６倍とした。蛋白質濃度の調整後、０．２μｍシリンジ駆動式フィルターユニットで溶液を滅菌濾過した。
【０１４５】
ｃ）ＯＤ２８０−蛋白質濃度測定
ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ＵＶ１装置を使用し、消光係数１．３７ｃｍ２ｍｇ−１を適用して波長２８０ｎｍで蛋白質濃度を推定した。このために、結晶化スラリーのアリコートを１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清中の残留蛋白質濃度を測定した。
【０１４６】
ｄ）ｐＨ測定
ｐＨ測定はＭｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＭＰ２２０  ｐＨ計を使用して実施した。  Ｉｎｌａｂ  ４１３電極とＩｎｌａｂ  ４２３微小電極を利用した。
【０１４７】
ｅ１）マイクロスケール晶析−シッティングドロップ蒸気拡散Ｈｙｄｒａ  ＩＩ
Ｈｙｄｒａ  ＩＩ結晶化ロボットとＧｒｅｉｎｅｒ  ９６ウェルプレート（３ドロップウェル，Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して初期結晶化スクリーニングを実施した。プレートをセットアップ後、ウェルをＣｌｅａｒｓｅａｌフィルム（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で密閉した。
【０１４８】
ｅ２）マイクロスケール晶析−ハンギングドロップ蒸気拡散法
ＶＤＸプレート（シーラント付き，Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と夫々ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド（正方形，Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）又はシリコンコートガラスカバースライド（円形，Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してハンギングドロップ蒸気拡散実験を実施した。リザーバ溶液の調製後、カバースライド上でリザーバ溶液１滴を蛋白質溶液１滴と混合し、液滴がリザーバの上に垂れ下がるようにカバースライドを裏返してウェルを密閉した。
【０１４９】
ｆ１）バッチ晶析−方法Ａ（９６／２４ウェルプレート）
ウェル内で蛋白質溶液を等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルを接着テープで密閉した。
【０１５０】
ｆ２）バッチ晶析−方法Ｂ（エッペンドルフ反応チューブ）
１．５ｍＬ又は２ｍＬエッペンドルフ反応チューブ内で蛋白質溶液を等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。
【０１５１】
ｆ３）バッチ晶析−方法Ｃ（ファルコンチューブ，撹拌なし）
５０ｍＬファルコンチューブ内で蛋白質溶液を等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。
【０１５２】
ｆ４）バッチ晶析−方法Ｄ（ファルコンチューブ，撹拌）
５０ｍＬファルコンチューブ内で蛋白質溶液を等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。蓋をした直後にチューブを実験室用振盪器（ＧＦＬ３０１３又はＧＦＬ３０１５）に載せるか、あるいはローリングにより撹拌した。これらの方法を適用することにより、サンプルに撹拌器を挿入するのを避けた。
【０１５３】
ｆ５）バッチ晶析−方法Ｅ（１リットルポリプロピレン容器，撹拌又は撹拌なし）
滅菌した１リットルポリプロピレンびん内で蛋白質溶液を等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。蓋をした直後に容器をローリングにより撹拌又は撹拌しなかった。これらの方法を適用することにより、サンプルに撹拌器を挿入するのを避けた。
【０１５４】
ｇ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
蛋白質濃度を８μｇ／２０μＬに調整することによりサンプルを作製した。ブロモフェノールブルーを添加したＳＤＳ／Ｔｒｉｓ／グリセリンでサンプルを希釈した。
【０１５５】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮｕＰａｇｅ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ、ＮｕＰａｇｅ  ＭＥＳ  ＳＤＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ及びＭａｒｋ１２  Ｗｉｄｅ  Ｒａｎｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓを使用して定性的ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を実施した。サンプル２０μＬをゲルポケットにピペットで注入した。ゲルを泳動させ、酢酸／メタノール試薬で固定後、Ｎｏｖｅｘ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔを使用して染色を実施した。Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ  Ｇｅｌ−Ｄｒｙ乾燥液を使用してゲルを乾燥した。
【０１５６】
ｈ）光学顕微鏡分析
Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２５又はＮｉｋｏｎ  Ｌａｂｏｐｈｏｔ顕微鏡を使用して結晶を観察した。後者には偏光フィルターセットとＪＶＣ  ＴＫ  Ｃ１３８０カラービデオカメラを接続した。
【０１５７】
ｉ）概算結晶寸法の推定
Ｎｉｋｏｎ  Ｌａｂｏｐｈｏｔ顕微鏡とＪＶＣ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｃｏｍｅｔソフトウェアバージョン３．５２ａを使用して概算結晶寸法を測定した。
【０１５８】
ｋ）ＳＥ−ＨＰＬＣ
ＭＡＫ１９５Ｆサンプルの凝集レベルをＳＥ−ＨＰＬＣにより推定した。Ｄｉｏｎｅｘ  Ｐ６８０ポンプと、ＡＳＩ−１００オートサンプラーと、ＵＶＤ１７０Ｕ検出器を使用した。批准Ａｂｂｏｔｔ標準プロトコール（Ａｆｅｌｉｍｏｍａｂ（登録商標）−原薬）を適用して２本の直列に接続したＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｇａｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬゲル濾過カラムにより凝集種を単量体から分離した。
【０１５９】
特に指定しない限り、上記一般手順の代わりに当業者に公知の他の任意等価手順を使用することができる。
【０１６０】
Ｃ．蒸気拡散結晶化実験
以下の実施例に記載する濃度値は抗体溶液とリザーバ溶液を混合する前の各溶液の初期値である。
【０１６１】
特に指定しない限り、全ｐＨ値は結晶化剤等の他の物質を加える前の緩衝液ストック（酢酸又はクエン酸緩衝液）のｐＨを表す。
【０１６２】
特に指定しない限り、全緩衝液モル濃度は一般に氷酢酸又はクエン酸を使用して実施したｐＨ調整前のストック溶液中の酢酸ナトリウム／クエン酸ナトリウム濃度を表す。
【０１６３】
（実施例１）
蒸気拡散法による条件の初期スクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。Ｈｙｄｒａ  ＩＩ結晶化ロボットを使用し、数種類の市販結晶化スクリーニングキットを使用して９６ウェルＧｒｅｉｎｅｒプレートを周囲温度でセットアップした。蛋白質溶液と結晶化剤を１：１比で混合した。以下のスクリーニングキットを使用した。Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  １及び２（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｗｉｚａｒｄ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｉ及びＩＩ（Ｅｍｅｒａｌｄ  ＢｉｏＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｉｎｄｅｘ  Ｓｃｒｅｅｎ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｊｅｎａ  Ｓｃｒｅｅｎｓ  １−８（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。当分野で周知の結晶化剤に（条件毎に１滴ずつ）蛋白質を添加後、プレートをＣｌｅａｒｓｅａｌフィルムで密閉し、周囲温度で保存した。翌日から７日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１６４】
結果：試験した４８０種類の条件のうち、１１種類で結晶が認められた。これらの条件は製造業者により公表されているような以下の結晶化剤に相当した。
−０．１Ｍカコジル酸ナトリウムｐＨ６．５，０．２Ｍ酢酸カルシウム，１８％  ｗ／ｖ  ＰＥＧ８，０００
（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ，Ｄ１０）
−０．１Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５，１２％  ｗ／ｖ  ＰＥＧ２０，０００
（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ，Ｆ１０）
−０．１Ｍクエン酸塩，ｐＨ５．５，２０％  ｗ／ｖ  ＰＥＧ３，０００
（Ｗｉｚａｒｄ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｉ  ＆  ＩＩ，Ａ６）
−０．１Ｍ酢酸塩，ｐＨ４．５，２０％  ｗ／ｖ  ＰＥＧ３，０００
（Ｗｉｚａｒｄ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｉ  ＆  ＩＩ，Ｄ９）
−０．１Ｍ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．５，４５％  ｖ／ｖポリプロピレングリコールＰ４００
（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｉｎｄｅｘ，Ｅ１０）
−０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５，０．０２Ｍ塩化マグネシウム，２２％  ｗ／ｖポリアクリル酸５，１００ナトリウム塩
（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｉｎｄｅｘ，Ｅ１１）
−０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５，０．２ＭトリメチルアミンＮ−オキシド２水和物，２０％  ｗ／ｖ  ＰＥＧ  ＭＭＥ  ２０００
（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｉｎｄｅｘ，Ｆ２）
−０．２Ｍクエン酸ナトリウム２水和物，２０％  ｗ／ｖ  ＰＥＧ３，３５０
（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｉｎｄｅｘ，Ｈ１０）
−１０％  ＰＥＧ４，０００，０．１ＭナトリウムＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５，２０％イソプロパノール
（ＪＥＮＡ  １−４，Ｅ５）
−１５％  ＰＥＧ４，０００，０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ５．６，０．２Ｍ硫酸アンモニウム
（ＪＥＮＡ  １−４，Ｆ２）
−２０％  ＰＥＧ４，０００，０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ５．６，０．２Ｍ硫酸アンモニウム（ＪＥＮＡ  １−４，Ｇ６）。
結晶は長さ約１０〜１５０μｍの針状形態を示した。
【０１６５】
（実施例２）
Ｈａｍｐｔｏｎ  ＰＥＧ／イオンスクリーンを使用したハンギングドロップ蒸気拡散法
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。グリース付きＶＤＸプレートと円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。４８種類の緩衝液製剤各１ｍＬをウェルにピペットで注入した。蛋白質サンプル約１μＬをカバースライドにピペットで滴下した後、特定ウェルのリザーバ溶液約１μＬと混合した。カバースライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から７日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１６６】
結果：試験した４８種類の条件のうち、１種類で結晶が認められた。この条件は製造業者により公表されているように以下の結晶化剤に相当した。
−０．２Ｍクエン酸三カリウム１水和物，２０％  ｗ／ｖ  ＰＥＧ３，３５０  ｐＨ８．３。
結晶は寸法約１０〜５０μｍの針束状形態を示した。
【０１６７】
（実施例３）
Ｈａｍｐｔｏｎ低イオン強度スクリーンを使用したハンギングドロップ蒸気拡散法
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。グリース付きＶＤＸプレートと円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。２４％ｗ／ｖ  ＰＥＧ３，３５０脱水和溶液１ｍＬを１０８ウェルにピペットで注入した。蛋白質サンプル約２μＬをカバースライドにピペットで滴下した後、１８種類の特定緩衝液試薬の１種約１μＬと混合した。その後、６種類の異なる濃度のうちの１種のＰＥＧ３，３５０沈殿剤約２．５μＬを液滴に加えた。カバースライドを裏返してウェルを密閉し、１０８回の異なるハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から７日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１６８】
結果：試験した１０８種類の条件のうちで結晶は認められなかった。
【０１６９】
（実施例４）
ハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／クエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。グリース付きＶＤＸプレートと円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。クエン酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液と（完全に脱塩し、場合により予め蒸留した）ミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液１ｍＬを調製した。本実施例では、クエン酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００を約２０％ｗ／ｖで一定に維持した。ｐＨを約４．２から約６．５まで０．１刻みで変化させ、２４種類の異なる条件を設定した。円形シリコンコートガラスカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。一晩保存後、液滴の顕微鏡観察を実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１７０】
結果：一晩保存後に試験した２４種類の条件のうちで結晶は認められなかった。
【０１７１】
（実施例５）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／クエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。グリース付きＶＤＸプレートと円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。クエン酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液１ｍＬを調製した。本実施例では、クエン酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００を約１０％ｗ／ｖ、１５％ｗ／ｖ、２０％ｗ／ｖ及び２５％ｗ／ｖで添加した。ｐＨを約５．０から約６．５まで０．３刻みで変化させ、２４種類の異なる条件を設定した。円形シリコンコートガラスカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。一晩保存後、液滴の顕微鏡観察を実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１７２】
結果：一晩保存後に試験した２４種類の条件のうちで結晶は認められなかった。
【０１７３】
（実施例６）
ハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。グリース付きＶＤＸプレートと円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液１ｍＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００濃度を約２０％ｗ／ｖで一定に維持した。ｐＨを約３．６から約５．６まで０．１刻みで変化させ、２１種類の異なる条件を設定した。円形シリコンコートガラスカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から７日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１７４】
結果：試験した２１種類の条件のうち、夫々ｐＨ約４．９、５．０、５．３及び５．６で結晶が認められた。結晶は寸法約３０〜３００μｍの針状又は針束状形態を示した。
【０１７５】
（実施例７）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。グリース付きＶＤＸプレートと円形シリコンコートガラスカバースライドを使用した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液１ｍＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００を約１０％ｗ／ｖ、１５％ｗ／ｖ、２５％ｗ／ｖ、３０％ｗ／ｖ、３５％ｗ／ｖ及び４０％ｗ／ｖの濃度で添加した。ｐＨを約３．９、４．２、４．８及び５．１とし、２４種類の異なる条件を設定した。円形シリコンコートガラスカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から７日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１７６】
結果：試験した２４種類の条件のうち、ｐＨ約５．１とＰＥＧ４，０００濃度約１５％ｗ／ｖで結晶が認められた。結晶は長さ約５０〜１５０μｍの針状形態を示した。
【０１７７】
（実施例８）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。グリース付きＶＤＸプレートと正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００濃度を約２０％ｗ／ｖで一定に維持した。ｐＨを約４．２から約６．５まで０．１刻みで変化させ、２４種類の異なる条件を設定した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から２１日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１７８】
結果：試験した２４種類の条件のうち、ｐＨ約４．６、４．８、４．９、５．１、５．２、５．５及び５．７で結晶が認められた。結晶は針状又は針束状形態を示した。
【０１７９】
（実施例９）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。グリース付きＶＤＸプレートと正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００を約１６％ｗ／ｖ、１８％ｗ／ｖ、２２％ｗ／ｖ及び２４％ｗ／ｖの濃度で添加した。ｐＨを約４．２、４．７、５．２、５．７、６．２及び６．５とし、２４種類の異なる条件を設定した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から２１日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１８０】
結果：試験した２４種類の条件のうち、ｐＨ約６．２とＰＥＧ４，０００濃度約１８％、２２％及び２４％ｗ／ｖで結晶が認められた。結晶は針状又は針束状形態を示した。
【０１８１】
（実施例１０）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。グリース付きＶＤＸプレートと正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ｐＨを約５．７で一定に維持した。ＰＥＧ４，０００を約１０％ｗ／ｖ、１２％ｗ／ｖ、１４％ｗ／ｖ、１６％ｗ／ｖ、１８％ｗ／ｖ及び２０％ｗ／ｖの濃度で添加した。従って、６種類の異なる条件を４回ずつ評価した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から２１日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１８２】
結果：試験した６種類の条件のうち、全ＰＥＧ４，０００濃度で結晶が認められた。４回ずつ行った実験の１〜４個のウェルで結晶が認められた。
結晶は針状又は針束状形態を示した。
【０１８３】
（実施例１１）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。グリース付きＶＤＸプレートと正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００を約８％ｗ／ｖ、１０％ｗ／ｖ、１２％ｗ／ｖ及び１４％ｗ／ｖの濃度で添加した。ｐＨを約４．２、４．７、５．２、５．７、６．２及び６．５とし、２４種類の異なる条件を設定した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から２１日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１８４】
結果：試験した２４種類の条件のうち、ｐＨ約４．７とＰＥＧ４，０００濃度約８％ｗ／ｖ、１０％ｗ／ｖ及び１２％ｗ／ｖで結晶が認められた。更に、ｐＨ約５．２とＰＥＧ４，０００濃度約１２％ｗ／ｖ及び１４％ｗ／ｖで結晶が認められた。更に、ｐＨ約５．７とＰＥＧ４，０００濃度約１０％ｗ／ｖ、１２％ｗ／ｖ及び１４％ｗ／ｖで結晶が認められた。更に、ｐＨ約６．２とＰＥＧ４，０００濃度約１０％ｗ／ｖ及び１４％ｗ／ｖで結晶が認められた。更に、ｐＨ約６．５とＰＥＧ４，０００濃度約８％ｗ／ｖ及び１２％ｗ／ｖで結晶が認められた。結晶は針状又は針束状形態を示した。
【０１８５】
（実施例１２）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／クエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。グリース付きＶＤＸプレートと正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。クエン酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、クエン酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００濃度を約２０％ｗ／ｖで一定に維持した。ｐＨを約４．２から約６．５まで０．１ｐＨ刻みで変化させ、２４種類の異なる条件を設定した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から９日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１８６】
結果：試験した２４種類の条件のうち、ｐＨ約５．１〜６．５で結晶が認められた。結晶は針状又は針束状形態を示した。
【０１８７】
（実施例１３）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／クエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。グリース付きＶＤＸプレートと正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。クエン酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、クエン酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００を約１６％ｗ／ｖ、１８％ｗ／ｖ、２２％ｗ／ｖ及び２４％ｗ／ｖの濃度で添加した。ｐＨを約４．２から約６．５まで０．５ｐＨ刻みで変化させ、２４種類の異なる条件を設定した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から９日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１８８】
結果：試験した２４種類の条件のうち、ｐＨ約４．７とＰＥＧ４，０００濃度約１６％ｗ／ｖで結晶が認められた。更に、ｐＨ約５．２とＰＥＧ４，０００濃度約１６％ｗ／ｖ及び１８％ｗ／ｖで結晶が認められた。更に、ｐＨ約５．７とＰＥＧ４，０００濃度約１６％ｗ／ｖ、１８％ｗ／ｖ、２２％ｗ／ｖ及び２４％ｗ／ｖで結晶が認められた。更に、ｐＨ約６．２とＰＥＧ４，０００濃度約１０％ｗ／ｖ及び１４％ｗ／ｖで結晶が認められた。更に、ｐＨ約６．５とＰＥＧ４，０００濃度約１６％ｗ／ｖで結晶が認められた。結晶は針状又は針束状形態を示した。
【０１８９】
（実施例１４）
設定を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／クエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
ＭＡＫ１９５Ｆをその標準原薬緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８，ｐＨ７．２中１２．３９ｍｇ／ｍＬ  ＭＡＫ１９５Ｆ）中で使用した。Ａｂｂｏｔｔから公表されている緩衝液組成は１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８，ｐＨ７．２中１２．４ｍｇ／ｍＬ  ＭＡＫ１９５Ｆであった。グリース付きＶＤＸプレートと正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。クエン酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、クエン酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００を約２０％ｗ／ｖの濃度で一定に維持した。ｐＨを約４．２から約６．５まで０．１ｐＨ刻みで変化させ、２４種類の異なる条件を設定した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から６日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１９０】
結果：試験した２４種類の条件のうち、約５．３〜約５．９のｐＨ範囲で結晶が認められた。結晶は針状又は針束状形態を示した。
【０１９１】
（実施例１５）
蛋白質緩衝液を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／クエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
ＭＡＫ１９５Ｆをその標準原薬緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８，ｐＨ７．２中１２．３９ｍｇ／ｍＬ  ＭＡＫ１９５Ｆ）中で使用した。グリース付きＶＤＸプレートと正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。クエン酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、クエン酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００を約１６％ｗ／ｖ、１８％ｗ／ｖ、２２％ｗ／ｖ及び２４％ｗ／ｖの濃度で添加した。ｐＨを約４．２から約６．５まで０．５ｐＨ刻みで変化させ、２４種類の異なる条件を設定した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から６日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１９２】
結果：試験した２４種類の条件のうち、ｐＨ約５．７とＰＥＧ４，０００濃度約１６％ｗ／ｖ及び１８％ｗ／ｖで結晶が認められた。更に、ＰＥＧ４，０００濃度約１６％ｗ／ｖと夫々ｐＨ約６．２及び６．５で結晶が認められた。結晶は針状又は針束状形態を示した。
【０１９３】
（実施例１６）
ハンギングドロップ蒸気拡散法による酢酸亜鉛／クエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。グリース付きＶＤＸプレートと正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。クエン酸緩衝液と酢酸亜鉛とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、クエン酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、酢酸亜鉛を約０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．５Ｍ及び０．９Ｍの濃度で使用した。ｐＨを約４．２から約６．５まで０．５ｐＨ刻みで変化させ、２４種類の異なる条件を設定した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から２１日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１９４】
結果：試験した２４種類の条件のうちで結晶は認められなかった。
【０１９５】
（実施例１７）
ハンギングドロップ蒸気拡散法によるマンニトール／クエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。グリース付きＶＤＸプレートと正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。クエン酸緩衝液とマンニトールとミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、クエン酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、マンニトールを約０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．５Ｍ及び０．９Ｍの濃度で使用した。ｐＨを約４．２から約６．５まで０．５ｐＨ刻みで変化させ、２４種類の異なる条件を設定した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から６日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０１９６】
結果：試験した２４種類の条件のうちで結晶は認められなかった。
【０１９７】
（実施例１８）
温度を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。グリース付きＶＤＸプレートと正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００を約１０％ｗ／ｖ、１２％ｗ／ｖ、１８％ｗ／ｖ及び２０％ｗ／ｖの濃度で添加した。ｐＨは全工程で約５．６とした。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを４℃で保存した。一晩保存後、液滴の顕微鏡観察を実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。陽性対照として、同一条件で第２のプレートをセットアップし、周囲温度で保存した。
【０１９８】
結果：４℃で一晩保存後に試験した２４種類の条件で結晶は認められなかった。陽性対照は１０％ｗ／ｖ、１２％ｗ／ｖ及び１８％ｗ／ｖのＰＥＧ４，０００濃度で結晶を含有していた。
【０１９９】
（実施例１９）
蛋白質緩衝液を変更したハンギングドロップ蒸気拡散法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．５の緩衝液でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。グリース付きＶＤＸプレートと正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライドを使用した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定リザーバ溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、ＰＥＧ４，０００濃度を約１２％ｗ／ｖから約２６％ｗ／ｖまで２％刻みで変化させた。ｐＨは全工程で約５．５とした。各条件を３回ずつ評価した。正方形ＯｐｔｉＣｌｅａｒプラスチックカバースライド上で蛋白質溶液約１μＬを特定リザーバ溶液約１μＬと混合し、スライドを裏返してウェルを密閉し、ハンギングドロップ実験を行った。プレートを周囲温度で保存した。翌日から１４日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０２００】
結果：評価した２４個のウェルのうち、試験した全ＰＥＧ４，０００濃度で結晶が認められた。結晶は針状又は針束状形態を示した。
【０２０１】
Ｄ１．１ｍＬまでの容量のバッチ実験
以下の実施例に記載する濃度値は抗体溶液と結晶化溶液を混合する前の各溶液の初期値である。
特に指定しない限り、全ｐＨ値は結晶化剤等の他の物質を加える前の緩衝液ストック（酢酸又はクエン酸緩衝液）のｐＨを表す。
特に指定しない限り、全緩衝液モル濃度は一般に氷酢酸又はクエン酸を使用して実施したｐＨ調整前のストック溶液中の酢酸ナトリウム又はクエン酸ナトリウム濃度を表す。
【０２０２】
（実施例２０）
５０μＬ容量バッチ法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。ウェル内で蛋白質溶液約２５μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルプレートを接着テープで密閉した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定結晶化溶液２５μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．０５Ｍで一定に維持し、酢酸緩衝液ｐＨは全工程で約５．７とした。ＰＥＧ４，０００濃度を約１２％ｗ／ｖから約４％ｗ／ｖまで１％刻みで変化させた。各条件を２回ずつ評価した。プレートを周囲温度で保存した。３日後にウェルの顕微鏡観察を実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０２０３】
結果：３日後に試験した１８種類の条件で結晶は認められなかった。
【０２０４】
（実施例２１）
設定を変更した５０μＬ容量バッチ法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。ウェル内で蛋白質溶液約２５μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルプレートを接着テープで密閉した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定結晶化溶液２５μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、酢酸緩衝液ｐＨは全工程で約５．７とした。ＰＥＧ４，０００濃度を約１４％ｗ／ｖから約３６％ｗ／ｖまで２％刻みで変化させた。各条件を２回ずつ評価した。プレートを周囲温度で保存した。翌日から７日間、ウェルの顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０２０５】
結果：観察した１８個のウェルのうち、約２２％ｗ／ｖ〜１６％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００でセットアップした条件で結晶が認められた。
【０２０６】
（実施例２２）
３００μＬ容量バッチ法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。ウェル内で蛋白質溶液約１５０μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルプレートを接着テープで密閉した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定結晶化溶液１５０μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、酢酸緩衝液ｐＨは全工程で約５．７とした。ＰＥＧ４，０００濃度を約１８％ｗ／ｖから約２４％ｗ／ｖまで２％刻みで変化させた。各条件を２回ずつ評価した。プレートを周囲温度で保存した。翌日から１４日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０２０７】
結果：観察した８個のウェルのうち、試験した全条件で結晶が認められた。約２０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００バッチでは結晶種以外に沈殿は認めらなかった
【０２０８】
（実施例２３）
蛋白質緩衝液を変更した３００μＬ容量バッチ法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
ＭＡＫ１９５Ｆをその標準原薬緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８，ｐＨ７．２中１２．３９ｍｇ／ｍＬ  ＭＡＫ１９５Ｆ）中で使用した。ウェル内で蛋白質溶液約１５０μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルプレートを接着テープで密閉した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定結晶化溶液１５０μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、酢酸緩衝液ｐＨは全工程で約５．７とした。ＰＥＧ４，０００濃度を約１８％ｗ／ｖから約２４％ｗ／ｖまで２％刻みで変化させた。各条件を１回評価した。プレートを周囲温度で保存した。翌日から１４日間、液滴の顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０２０９】
結果：観察した４個のウェルのうち、試験した全条件で結晶が認められた。
【０２１０】
（実施例２４）
１ｍＬ超までの大規模化の主要条件を見出す１５０μＬ容量バッチ法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。ウェル内で蛋白質溶液約７５μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルプレートを接着テープで密閉した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定結晶化溶液７５μＬを調製した。本実施例では、緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、緩衝液ｐＨを約４．２、４．７、５．２、５．７及び６．２とした。ＰＥＧ４，０００濃度を約６％ｗ／ｖから約２８％ｗ／ｖまで２％刻みで変化させた。各条件を３回ずつ評価した。プレートを周囲温度で保存した。夫々１、２、３及び７日後に液滴の顕微鏡観察を実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。また、１条件３個のウェルのうちの２個から粒状物質の収率をＯＤ２８０により測定した。１００μＬアリコートを１４，０００×ｇで遠心し、上清の蛋白質濃度を評価した。
【０２１１】
結果：ＰＥＧ４，０００濃度を約６％ｗ／ｖから約２８％ｗ／ｖまで変化させることにより、結晶混合物の外観は透明（低ＰＥＧ濃度）から針状又は針束状結晶（中ＰＥＧ濃度）を経て沈殿（高ＰＥＧ濃度）まで変化した。結晶化窓の外観は緩衝液組成（ｐＨ、イオン強度、塩）にも依存した。酢酸緩衝液とｐＨ６．２、クエン酸緩衝液とｐＨ４．２及び６．２で結晶は認められなかった。他の全緩衝系は特徴的ＰＥＧ４，０００濃度で結晶化窓を示した。これらの結果から、添加した化学薬品を使用することにより形成されたマトリックスに可能な結晶化条件が広がっており、沈殿を伴わずに結晶を生じる緩衝液組成を選択できることが判明した。
【０２１２】
（実施例２５）
１ｍＬ容量バッチ法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。１．５ｍＬエッペンドルフ反応チューブ内で蛋白質溶液約５００μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水をチューブ内で混合することにより特定結晶化溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、酢酸緩衝液ｐＨを約４．７又は５．２とした。ＰＥＧ４，０００を約１６％ｗ／ｖと約１８％ｗ／ｖの２種類の濃度で添加した。各条件を２回ずつ評価した。チューブを周囲温度で保存した。翌日から１カ月間、各チューブの１μＬアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０２１３】
結果：１４日後に、試験した全条件で針状物が認められた。
【０２１４】
（実施例２６）
蛋白質緩衝液を変更した１５０μＬ容量バッチ法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．５の緩衝液でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。ウェル内で蛋白質溶液約７５μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルプレートを接着テープで密閉した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を各ウェル内で混合することにより特定結晶化溶液７５μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、酢酸緩衝液ｐＨは全工程で約５．５とした。ＰＥＧ４，０００を１８％ｗ／ｖと２０％ｗ／ｖの濃度で使用した。各条件を２回ずつ評価した。プレートを周囲温度で保存した。翌日から１２日間、ウェルの顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０２１５】
結果：どちらの条件でも針状又は針束状形態の結晶が認められた。
（実施例２７）
蛋白質緩衝液を変更した１ｍＬ容量バッチ法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．０又は５．５の緩衝液でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。ウェル内で蛋白質溶液約５００μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルプレートを接着テープで密閉した。各ウェル内で酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水を混合することにより特定結晶化溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍで一定に維持し、酢酸緩衝液ｐＨは全工程で約５．０又は５．５とした。ｐＨ５．５に緩衝した蛋白質をｐＨ５．５の結晶化溶液と混合し、ｐＨ５．０に緩衝した蛋白質緩衝液でも同様とした。ＰＥＧ４，０００濃度を約１６％ｗ／ｖから約２４％ｗ／ｖまで２％刻みで変化させて使用した。各条件を３回ずつ評価した。プレートを周囲温度で保存した。翌日から１カ月間、ウェルの顕微鏡観察を実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０２１６】
結果：試験した全条件で針状又は針束状結晶が認められた。
【０２１７】
（実施例２８）
設定を変更した１ｍＬ容量バッチ法によるＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウムグリッドスクリーニング
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．０又は５．５の緩衝液でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。ウェル内で蛋白質溶液約５００μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。次いで、水分蒸発を防ぐためにウェルプレートを接着テープで密閉した。各ウェル内で蒸留水と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液を混合することにより特定結晶化溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を０Ｍとし、即ち実験における唯一の酢酸緩衝液は元のＭＡＫ１９５Ｆ溶液中に存在するものとした。ＰＥＧ４，０００は約２２％ｗ／ｖから約２６％ｗ／ｖまで２％刻みで濃度を変化させて使用した。プレートを周囲温度で保存した。翌日から１カ月間、ウェルの顕微鏡観察を複数回実施した。透明液滴、ランダム沈殿を含む液滴、結晶を含む液滴、及び沈殿種と結晶の混合物を含む液滴に条件を分類した。
【０２１８】
結果：ｐＨ５．５緩衝液中に２２％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００と蛋白質を含有するウェルで針状又は針束状結晶が認められた。
【０２１９】
（実施例２９）
ポリソルベート８０添加の影響下における１ｍＬバッチ容量でのＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウム結晶化条件
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．５の緩衝液でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。ポリソルベート８０を蛋白質溶液に約１％、０．１％、０．０１％及び０．００１％の濃度で加えた。ポリソルベート８０を含有しない溶液を対照として準備した。結晶化実験を開始する前に溶液を一晩インキュベートした。１．５ｍＬエッペンドルフ反応チューブ内で蛋白質溶液約５００μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液５００μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約５．５とした。ＰＥＧ４，０００を２０％ｗ／ｖの濃度で使用した。各ポリソルベート８０濃度を２回ずつ評価した。チューブを周囲温度で保存した。翌日から１カ月間、溶液の１μＬアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。
【０２２０】
結果：全容器で５日後に針状結晶が出現した。結晶形態にも結晶収率にも相違を認めることはできなかった。
【０２２１】
（実施例３０）
結晶化核生成剤としての各種鉱物の影響下における１００μＬバッチ容量でのＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウム結晶化条件
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。４９種類の異なる鉱物１組（ミュンヘン州立鉱物学博物館（Ｍｉｎｅｒａｌｏｇｉｓｃｈｅ  Ｓｔａａｔｓｓａｍｍｌｕｎｇ  Ｍｕｎｃｈｅｎ）所有）を結晶化核生成剤として評価した。この実験の背景の思想は標準針状又は針束状形態とは異なる多形結晶形態の成長用表面としてのこのような鉱物の使用可能性を検討することであった。各鉱物を新たに分割し、５０〜２５０μｍの寸法の粒子をウェルに入れた。各鉱物を２回ずつ試験し、鉱物を添加しない多数のウェルを対照として準備した。ウェル内で蛋白質溶液約５０μＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水をウェル内で混合することにより結晶化溶液５０μＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約５．２とした。ＰＥＧ４，０００を約１６％ｗ／ｖの濃度で使用した。翌日から２週間、ウェルプレートの顕微鏡観察を実施した。
【０２２２】
結果：マラカイトは蛋白質の油状沈殿を生じることが判明した。
【０２２３】
Ｄ２．１ｍＬ超の容量のバッチ実験
以下の実施例に記載する濃度値は抗体溶液と結晶化溶液を混合する前の各溶液の初期値である。
特に指定しない限り、全ｐＨ値は結晶化剤等の他の物質を加える前の緩衝液ストック（酢酸又はクエン酸緩衝液）のｐＨを表す。
特に指定しない限り、全緩衝液モル濃度は一般に氷酢酸又はクエン酸を使用して実施したｐＨ調整前のストック溶液中の酢酸ナトリウム又はクエン酸ナトリウム濃度を表す。
【０２２４】
（実施例３１）
１０ｍＬバッチ容量でのＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウム結晶化条件
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。５０ｍＬファルコンチューブ内で蛋白質溶液約５ｍＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液５ｍＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約５．２とした。ＰＥＧ４，０００を１８％ｗ／ｖの濃度で使用した。チューブを周囲温度で保存した。翌日から数カ月間、溶液の１μＬアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、ＯＤ２８０により結晶収率を測定した。懸濁液のアリコートを１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清中の蛋白質濃度を推定した。
【０２２５】
結果：一晩保存後に長さ約１００〜３００μｍの針状結晶が出現した。翌日から１カ月間保存中に沈殿種は認められなかった。上清中の残留蛋白質濃度からＯＤ２８０により結晶収率を測定した処、１０日後に６０〜８０％であった。
【０２２６】
（実施例３２）
撹拌導入下の１０ｍｌバッチ容量でのＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウム結晶化条件
２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。５０ｍＬファルコンチューブ内で蛋白質溶液約５ｍＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液５ｍＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約５．２とした。ＰＥＧ４，０００を１８％ｗ／ｖの濃度で使用した。バッチを実験室用振盪器で撹拌しながらチューブを周囲温度で保存した。翌日から数カ月間、溶液の１μＬアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、ＯＤ２８０により結晶収率を測定した。懸濁液のアリコートを１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清中の蛋白質濃度を推定した。
【０２２７】
結果：１日後に長さ約１０〜３０μｍの針状結晶が出現した。実験中に沈殿種は認められなかった。上清中の残留蛋白質濃度からＯＤ２８０により結晶収率を測定した処、１０日後に６０〜８０％であった。
【０２２８】
（実施例３３）
蛋白質緩衝液を変更した１０ｍＬバッチ容量でのＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウム結晶化条件
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．５の緩衝液でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。５０ｍＬファルコンチューブ内で蛋白質溶液約５ｍＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液５ｍＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約５．５とした。ＰＥＧ４，０００を約２０％ｗ／ｖ及び２２％ｗ／ｖの濃度で使用した。チューブを周囲温度で保存した。翌日から１カ月間、溶液の１μＬアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、バッチの結晶収率をＯＤ２８０により測定した。懸濁液のアリコートを１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清中の蛋白質濃度を推定した。
【０２２９】
結果：どちらのＰＥＧ濃度レベルでも２日後に長さ１００〜３００μｍの針状結晶が出現した。翌日から１カ月間の保存中に沈殿種は認められなかった。上清中の残留蛋白質濃度からＯＤ２８０により結晶収率を測定した処、１０日後に６０〜８０％であった。
【０２３０】
（実施例３４）
蛋白質緩衝液を変更し、非撹拌下と撹拌下のバッチを比較した１０ｍｌバッチ容量でのＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウム結晶化条件
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。５０ｍＬファルコンチューブ内で蛋白質溶液約５ｍＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液５ｍＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約５．２とした。ＰＥＧ４，０００を約２０％ｗ／ｖの濃度で使用した。非撹拌下と実験室用振盪器で撹拌下にチューブを周囲温度で保存した。翌日から２１日間、溶液の１μＬアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、結晶収率をＯＤ２８０により測定した。懸濁液のアリコートを１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清中の蛋白質濃度を推定した。
【０２３１】
結果：どちらの容器でも７日後に針状結晶が出現した。撹拌下のバッチからの針状物は非撹拌下のバッチからの針状物の長さの約１０分の１であった。非撹拌下のバッチでは、針の長さは１００〜３００μｍであり、撹拌下のバッチでは針の長さは約１０〜３０μｍであった。上清中の残留蛋白質濃度からＯＤ２８０により結晶収率を測定した処、どちらの容器でも１０日後に５０〜８０％であった。
【０２３２】
（実施例３５）
蛋白質緩衝液を変更し、非撹拌下と撹拌下のバッチを比較した１０ｍＬバッチ容量でのＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウム結晶化条件
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．５の緩衝液でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。５０ｍＬファルコンチューブ内で蛋白質溶液約５ｍＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液５ｍＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約５．５とした。ＰＥＧ４，０００を約２０％ｗ／ｖの濃度で使用した。非撹拌下と実験室用振盪器で撹拌下にチューブを周囲温度で保存した。翌日から２１日間、溶液の１μＬアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、結晶収率をＯＤ２８０により測定した。懸濁液のアリコートを１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清中の蛋白質濃度を推定した。
【０２３３】
結果：どちらの容器でも７日後に針状結晶が出現した。撹拌下のバッチからの針状物は非撹拌下のバッチからの針状物の長さの約１０分の１であった。非撹拌下のバッチでは、針の長さは１００〜３００μｍであり、撹拌下のバッチでは針の長さは約１０〜３０μｍであった。上清中の残留蛋白質濃度からＯＤ２８０により結晶収率を測定した処、どちらの容器でも１０日後に５０〜８０％であった。
【０２３４】
（実施例３６）
２５０ｍＬバッチ容量でのＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウム結晶化条件
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。１リットルポリプロピレン容器内で蛋白質溶液約１２５ｍＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液１２５ｍＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約５．２とした。ＰＥＧ４，０００を約２０％ｗ／ｖの濃度で使用した。容器を周囲温度で保存した。容器を約６０ｒｐｍでローリングすることにより撹拌を実施した。翌日から数カ月間、溶液の１μＬアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、結晶収率をＯＤ２８０により測定した。懸濁液のアリコートを１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清中の蛋白質濃度を推定した。
【０２３５】
結果：３日後に長さ１０〜３０μｍの針状結晶が出現した。翌日から１カ月間保存中に沈殿種は認められなかった。上清中の残留蛋白質濃度からＯＤ２８０により結晶収率を測定した処、７日後に６０〜７０％であった。
【０２３６】
（実施例３７）
容器材料を変更した１０ｍＬバッチ容量でのＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウム結晶化条件
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。５０ｍＬガラス（クラスＩ）バイアル内で蛋白質溶液約５ｍＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液５ｍＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約５．２とした。ＰＥＧ４，０００を約２０％ｗ／ｖの濃度で使用した。バイアルをテフロン（登録商標）ストッパーで密閉し、実験室用振盪器で撹拌下に周囲温度で保存した。翌日から２１日間、溶液の１μＬアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。
【０２３７】
結果：３日後に針状結晶が出現した。
【０２３８】
（実施例３８）
温度を変更した１０ｍＬバッチ容量でのＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウム結晶化条件
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。５０ｍＬファルコンチューブ内で蛋白質溶液約５ｍＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液５ｍＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約５．２とした。ＰＥＧ４，０００を約２０％ｗ／ｖの濃度で使用した。チューブを実験室用振盪器で撹拌下に周囲温度で保存した。翌日から１０日間、溶液の１μＬアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。４℃で１０日間保存後、バッチを周囲温度に戻した。
【０２３９】
結果：４℃で保存中に結晶は出現しなかった。バッチを周囲温度に戻すと、一晩で結晶が出現した。
【０２４０】
（実施例３９）
１Ｌバッチ容量でのＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウム結晶化条件
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。１リットルポリプロピレン容器内で蛋白質溶液約５００ｍＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液５００ｍＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約５．２とした。ＰＥＧ４，０００を約２０％ｗ／ｖの濃度で使用した。容器を周囲温度で保存した。容器を約６０ｒｐｍでローリングすることにより撹拌を実施した。翌日から数週間、溶液の１μＬアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、結晶収率をＯＤ２８０により測定した。懸濁液のアリコートを１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清中の蛋白質濃度を推定した。
【０２４１】
結果：２日後に針状結晶が出現した。翌日から１カ月間保存中に沈殿種は認められなかった。上清中の残留蛋白質濃度からＯＤ２８０により結晶収率を測定した処、７日後に６０〜７０％であった。
【０２４２】
（実施例４０）
非撹拌下の４００ｍＬバッチ容量でのＰＥＧ４，０００／酢酸ナトリウム結晶化条件
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液でＭＡＫ１９５Ｆを希釈した。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。１リットルポリプロピレン容器内で蛋白質溶液約２００ｍＬを等量の結晶化溶液と混合することによりバッチ晶析を実施した。酢酸緩衝液と５０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００溶液とミリＱ水をチューブ内で混合することにより結晶化溶液２００ｍＬを調製した。本実施例では、酢酸緩衝液モル濃度を約０．１Ｍとし、酢酸緩衝液ｐＨを約５．２とした。ＰＥＧ４，０００を約２０％ｗ／ｖの濃度で使用した。容器を周囲温度で保存した。翌日から数週間、溶液の１μＬアリコートの顕微鏡観察を複数回実施した。更に、ＯＤ２８０により結晶収率を測定した。懸濁液のアリコートを１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清中の蛋白質濃度を推定した。
【０２４３】
結果：１４日後に針束状結晶が認められた。結晶は長さ約１００〜３００μｍであった。上清中の残留蛋白質濃度からＯＤ２８０により結晶収率を測定した処、３１日後に４０〜５０％であった。
【０２４４】
Ｅ．結晶処理及び分析方法
（実施例４１）
結晶の洗浄
結晶の形成後は、結晶を再溶解させない洗浄工程が有利である。従って、実施例３６に記載したような結晶化工程の終了後、結晶スラリーを遠心管に移し、５００〜１０００×ｇで２０分間遠心した。遠心は４℃又は周囲温度で実施した。遠心後、上清を捨て、約０．１Ｍ酢酸ナトリウム中に約２４％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００を含有するｐＨ約５．２の緩衝液に結晶ペレットを容易に再懸濁した。ＯＤ２８０により分析した処、このような洗浄用緩衝液中に測定可能なＭＡＫ１９５Ｆ結晶は溶解していなかった。次いで遠心／再懸濁工程を１〜３回繰返し、この洗浄工程後に、ペレットを再懸濁し、保存した。
【０２４５】
（実施例４２）
晶析工程の収率増加
晶析工程の終点は結晶化スラリーの上清のアリコートのＯＤ２８０測定値が例えばその後３日間一定となる時点として定義することができる。結晶化スラリーの上清に所定量のＰＥＧ４，０００（ｐＨ約５．２の約０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中５０％ｗ／ｖ溶液）を補充することにより収率増加が可能であることが判明した。最初に晶出した結晶と同一形状の結晶がその後の数日間に形成された。この手順を適用すると、沈殿を導入せずに総収率は容易に９０％を超えた。
【０２４６】
例えば、実施例３９の上清のアリコート中でＰＥＧ４，０００濃度を約１０％ｗ／ｖから約２０％ｗ／ｖ、１８％ｗ／ｖ、１６％ｗ／ｖ、１４％ｗ／ｖ及び１２％ｗ／ｖまで増加させた。周囲温度で一晩保存後、約２０％ｗ／ｖ、１８％ｗ／ｖ及び１６％ｗ／ｖ  ＰＥＧ４，０００で沈殿種が認められた。約１４％ｗ／ｖ及び約１２％ｗ／ｖＰＥＧ４，０００では、沈殿を伴わずに結晶が認められた。結晶化スラリーの残留上清にＰＥＧ４，０００を約１４％ｗ／ｖの総濃度まで加えることにより、総結晶収率は２日間で約６０％〜約７０％から９０％超まで増加した。
【０２４７】
（実施例４３）
ＳＤＳ  ＰＡＧＥによる結晶の分析
結晶の蛋白性を確認するために、実施例４１のプロトコルに従って実施例３６からの結晶を洗浄した。数回の洗浄段階後、洗浄用緩衝液上清中に測定可能な量の溶解蛋白質が存在していないことをＯＤ２８０により確認した。上清を捨てた後、結晶を蒸留水に溶解した。この溶液のＯＤ２８０測定によると、ＵＶ吸光度が有意に高いことから、溶解蛋白質が存在するようになったことが判明した。この溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＭＡＫ１９５Ｆ標準に比較して同一パターンを示した。
【０２４８】
（実施例４４）
ＳＥ−ＨＰＬＣによる結晶の分析
ＭＡＫ１９５Ｆ結晶の凝集種の含量を調べるために、実施例３６からの洗浄した結晶のアリコートを遠心し、標準方法に従ってＳＥ−ＨＰＬＣランニング緩衝液に再溶解した。晶析工程の完了後（本実施例では周囲温度で７日）に、凝集物含量は約０．９％から約１．３〜１．４％まで僅かに増加した。このような凝集物がＭＡＫ１９５Ｆ結晶の固有特徴であるのか、又は例えば非結晶化可溶性ＭＡＫ１９５Ｆ単量体が結晶表面に凝集したのかはまだ不明である。
【０２４９】
ＭＡＫ１９５Ｆ結晶を生じた上記バッチ実験の実験条件を下表２にまとめる。
【０２５０】
【表３】
2010535771.tif 000013
2010535771.tif 000014
【０２５１】
Ｆ．結晶化結果に及ぼす撹拌の影響を検討する実験
これらの実験の目的は抗体（例えばＭＡＤ１９５Ｆ）の実施容易なバッチ晶析法に及ぼす撹拌速度の影響を検討することであった。他の全結晶化パラメータを一定に維持することにより、５個の連続バッチ（１０、２０、４０、６０及び８０ｒｐｍ）で撹拌の程度を変えた。結晶化速度、総収率、粒子形状及び粒度分布に及ぼす影響を検討した。
【０２５２】
（実施例４５）
制御条件下のＭＡＫ１９５Ｆの結晶化
材料
−ＭＡＫ１９５Ｆ，ロットＧ００８．０１Ｅ／ＰＺ０１０５Ｐ０２５（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
−無水酢酸ナトリウム（Ｇｒｕｅｓｓｉｎｇ）
−氷酢酸（Ｍｅｒｃｋ）
−ポリエチレングリコール４，０００（Ｃｌａｒｉａｎｔ）
−ポリプロピレンびん，直径８ｃｍ，高さ１０ｃｍ。
【０２５３】
方法
（５００ｍｌポリプロピレンびんに入れて−８０℃で保存した）凍結ＭＡＫ１９５Ｆを周囲温度で２時間以内に融解させた。融解後、原薬溶液は透明であり、肉眼で汚染性粒子は認められなかった。蛋白質緩衝液を以下のように調製した。酢酸ナトリウム４１．０２ｇを精製水に溶解することにより酢酸緩衝液５００ｍＬを調製した。容量を５００．０ｍＬに調整し、氷酢酸でｐＨを５．２に調整した。この緩衝液４００ｍＬを精製水で総容量４．０Ｌまで希釈した。この緩衝液を５回の各バッチ晶析前に新たに調製した。
【０２５４】
バッチ晶析毎に、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（充填容量１２〜３０ｍＬ，１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用することにより２５ｍＬのＭＡＫ１９５Ｆを蛋白質緩衝液で希釈した。次に蛋白質緩衝液で蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整し、０．２２μｍフィルターディスク（ＰＶＤＦ）を使用して溶液を滅菌濾過した。
【０２５５】
結晶化溶液は次のように調製した。酢酸ナトリウム４１．０２ｇを精製水に溶解することにより酢酸緩衝液５００ｍＬを調製した。容量を５００．０ｍＬに調整し、氷酢酸でｐＨを５．２に調整した。２００ｇのＰＥＧ４，０００を酢酸緩衝液と精製水１００ｍＬに溶解した後、容量を１，０００ｍＬに調整した。この結晶化溶液を全バッチ晶析に使用し、２〜８℃で保存した。
【０２５６】
ポリプロピレンびんで蛋白質溶液２５ｍＬを結晶化溶液２５ｍＬと混合することにより結晶化を開始した。次にびんを２０℃で９日間ローリングすることにより撹拌した。５個の結晶化バッチを準備し、夫々１０ｒｐｍ、２０ｒｐｍ、４０ｒｐｍ、６０ｒｐｍ及び８０ｒｐｍ（毎分回転数）で撹拌した。毎日、任意サンプルから２００μＬのアリコートを取出し、結晶の遠心後にＯＤ２８０蛋白質濃度測定により結晶収率を求めた：
結晶収率［％］＝Ｃ（総蛋白質）−Ｃ（蛋白質上清）／Ｃ（総蛋白質）×１００％
結晶の光学顕微鏡写真を次のように撮影した。８日間撹拌後、１０μＬアリコートを対物レンズホルダーにピペットで滴下した後、ガラスカバースライドをかぶせた。Ｅ−ＰＩ  １０倍接眼レンズと４０倍対物レンズを装着したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２５倒立型光学顕微鏡を使用して調製物を分析した。デジタルカメラ（Ｓｏｎｙ  Ｃｙｂｅｒｓｈｏｔ  ＤＳＣ  Ｓ７５）を使用して写真撮影した。
【０２５７】
結晶の粒度測定を以下のように実施した。
Ｉ）手動評価
８日間撹拌後、１０μＬアリコートを対物レンズホルダーにピペットで滴下した後、ガラスカバースライドをかぶせた。ＣＦＷ  １０倍接眼レンズと２０倍対物レンズを装着したＮｉｋｏｎ  Ｌａｂｏｐｈｏｔ顕微鏡を使用した。ＪＶＣ  ＴＫ  Ｃ１３８０カラービデオカメラを介して顕微鏡写真をコンピュータスクリーンに転送し、ＪＶＣ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｃｏｍｅｔソフトウェアバージョン３．５２ａにより１００個の結晶の長さを測定することにより、結晶寸法（最大長）を推定した。これらの１００回の測定から粒度分布と最大長の平均値を特定した。
【０２５８】
ＩＩ）自動評価
統計的有意に基づいてサンプルの粒度分布を検討するために、ＰＳ  Ｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ  ＸＰＴ−Ｃ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＳ  Ｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で更に懸濁液を分析した。Ｆｅｒｅｔｍａｘ（全粒子方向の最長距離）値を記録した。サンプル当たりの粒子数は夫々５，０００超であった。
【０２５９】
ＳＥ−ＨＰＬＣデータを次のように評価した。任意結晶化バッチの３００μＬアリコート２画分を１２日後に採取した。アリコートを遠心後、上清を捨てた。蛋白質濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように結晶ペレットをＭＡＫ１９５Ｆ原薬緩衝液で再溶解した。ＳＥ−ＨＰＬＣ分析時までアリコートを−８０℃で保存した。標準方法に従ってＳＥ−ＨＰＬＣ分析を実施した。
【０２６０】
結晶化速度と総収率に及ぼす撹拌速度（直径８ｃｍ，高さ１０ｃｍポリプロピレンびん，毎分回転数＝ｒｐｍ）の影響を図１に示す。
【０２６１】
その結果、種々の回転速度を適用することにより、結晶化速度（曲線の形状）にも総収率（ｙｍａｘ）にも影響がないことが判明した。８日間結晶化後に総収率は常に約５５％であったが、結晶化曲線の形状から全実験を３つの類似部分に分けることができる。
−誘導期（１日及び２日），収率ゼロ；
−主結晶化期（３〜５日），結晶化率＞１０％（収率に比較）に達する。
−低結晶化期及び停滞期（６〜８日），結晶化率＜１０％，ＳＥ−ＨＰＬＣ分析による最大ＭＡＫ１９５Ｆ純度。
【０２６２】
回転速度が分解物及び／又は凝集物の形成に影響を与えるか否かを調べるために各結晶化バッチにＳＥ−ＨＰＬＣ分析を実施した。表３に示す結果から明らかなように、ＭＡＫ１９５Ｆ純度は変化しない。
【０２６３】
【表４】
2010535771.tif 000015
【０２６４】
粒子形状と粒度分布
粒子形状に及ぼす撹拌速度の影響を図２に示す。全バッチ晶析は針状の結晶物を生じた。
−写真Ａ：ＭＡＫ１９５Ｆ結晶，１０ｒｐｍ
−写真Ｂ：ＭＡＫ１９５Ｆ結晶，２０ｒｐｍ
−写真Ｃ：ＭＡＫ１９５Ｆ結晶，４０ｒｐｍ
−写真Ｄ：ＭＡＫ１９５Ｆ結晶，６０ｒｐｍ
−写真Ｆ：ＭＡＫ１９５Ｆ結晶，８０ｒｐｍ。
【０２６５】
粒度分布に及ぼす撹拌速度の影響を図３に示す（手動評価）。平均粒度は１０ｒｐｍバッチの３９．６μｍから８０ｒｐｍバッチの１９．９μｍまでであった。
【０２６６】
ＸＰＴ−Ｃ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを適用する自動法により、以下の値が得られた。１０ｒｐｍ，ｘ（１，２）２６．４μｍ；２０ｒｐｍ，ｘ（１，２）２５．９μｍ；４０ｒｐｍ，ｘ（１，２）２０．４μｍ；６０ｒｐｍ，ｘ（１，２）２３．６μｍ；８０ｒｐｍ，ｘ（１，２）１８．７μｍ。
【０２６７】
このデータによると、統計的有意により、撹拌レベルが高いほど針長が短いことが判明した。自動測定と手動測定から得られた絶対値のずれは粒子がＣＣＤカメラを装着した測定セル内で必ずしも完全に整列（即ち最大のＦｅｒｅｔｍａｘ検出）していないという事実により説明することができる。
【０２６８】
本試験はバッチ回転速度と数種のバッチパラメータの間に関係があるか否かを試験するために開始した。ｍＡｂ純度、結晶化速度、収率及び基本結晶形態等の因子は変化しないが、結晶寸法は撹拌度の増加により減少することが上記データから立証された。
【０２６９】
Ｇ．その他の実施例
（実施例４６）
固体結晶化剤
約０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含有するｐＨ約５．２の緩衝液でＭＡＫ１９５Ｆを希釈する。蛋白質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【０２７０】
２ｍＬエッペンドルフ反応チューブ内で蛋白質溶液約５００μＬを酢酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ５．２）約４００μＬと混合することによりバッチ晶析を実施する。次に、固体ポリエチレングリコールを終濃度１０％ｍ／ｖ（１００ｍｇ／ｍＬ）まで加える。次いでチューブを密閉し、結晶化剤の完全な溶解が得られるまで撹拌する。チューブを非撹拌下に周囲温度で保存する。翌日から数週間、結晶化の進行に伴って結晶化混合物のアリコートの顕微鏡観察を複数回実施する。
【０２７１】
（実施例４７）
別の緩衝液調製プロトコール及び結晶の作製
本実施例では、次のように酢酸緩衝液を調製する。氷酢酸６０ｇを精製水約８４０ｍＬで希釈する。水酸化ナトリウム溶液でｐＨを調整し、容量を１，０００ｍＬに調整する。この場合には、総酢酸塩量を１Ｍ（蛋白質溶液、結晶化溶液及び結晶化混合物中１００ｍＭ）に固定する。
【０２７２】
実施例３６に従って結晶化を実施する。
【０２７３】
（実施例４８）
封入結晶の作製
実施例３６で得られた結晶はＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ｎａｎｏを使用するゼータ電位測定によると正に荷電している。
【０２７４】
結晶性を維持し、結晶を荷電状態に保つｐＨをもつ賦形剤を含有する緩衝液で結晶を洗浄懸濁する。次に、適切な封入剤を結晶懸濁液に加える。この点で、適切な封入剤は低毒性で生分解性と対イオン特徴をもつ（ポリマー）物質である。この対イオン特徴により、前記物質は結晶に吸引され、コーティングを可能にする。この技術により、結晶性を維持する他の賦形剤を含有しない溶媒への結晶の溶解を持続することが好ましい。
【０２７５】
（実施例４９）
封入／包埋結晶の作製
実施例３６に記載したように結晶を得る。
結晶性を維持する賦形剤を含有する緩衝液で結晶を洗浄懸濁する。
その後、当分野で公知の方法を使用し、
−結晶を乾燥し、これらの乾燥した結晶を例えば圧縮、溶融分散等によりキャリヤーと混合することにより結晶を包埋することができる。
−結晶懸濁液を水不混和性キャリヤー溶液と混合することにより結晶を封入／包埋することができる。キャリヤーから溶媒の除去後にキャリヤーは沈殿する。その後、材料を乾燥する。
−結晶懸濁液を水混和性キャリヤー溶液と混合することにより結晶を封入／包埋することができる。キャリヤーは混合物中でその溶解度限界を越えると沈殿する。
−乾燥した結晶又は結晶懸濁液を水混和性キャリヤー溶液と混合することにより結晶を包埋することができる。
−乾燥した結晶を水不混和性キャリヤー溶液と混合することにより結晶を包埋することができる。
【０２７６】
Ｈ．結晶特性決定
Ｈ１．生物活性試験
【０２７７】
（実施例５０）
結晶ＭＡＫ１９５Ｆの生物活性の維持
ａ）一般方法
指標としてマウスＬ−９２９細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートで規定量のｒＨｕＴＮＦと共に３７℃で各種濃度のＡｆｅｌｉｍｏｍａｂ（登録商標）の存在下に４８時間インキュベートすることによりｒＨｕＴＮＦの細胞傷害作用に対するＡｆｅｌｉｍｏｍａｂ（登録商標）溶液の中和作用を測定する。生存細胞はクリスタルバイオレットで染色される。マイクロタイタープレートの個々のウェルで分光法により色強度を測定し、評価する。ＩＣ５０、即ち細胞の５０％が生存するようにＬ−９２９細胞に及ぼすｒＨｕＴＮＦの細胞傷害作用を低減するＡｆｅｌｉｍｏｍａｂ（登録商標）の濃度を測定する。
【０２７８】
別の希釈箱で１μｇ蛋白質／ｍＬ希釈液から開始し、９個の滴定曲線測定点（曲線希釈液）をサンプルと参照標準について希釈チューブで個々に調製した。
【０２７９】
Ｌ−９２９細胞懸濁液を培地で希釈し、細胞６０，０００個／ｍＬの濃度とした。次に、各細胞濃度の１００μＬ／ウェルを試験プレートの１〜１１列にピペットで注入した。１２列目のウェルには各々培地１００μＬのみを加えた。試験プレートで３７℃及び５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２にて２４時間インキュベーションした。
【０２８０】
２４時間インキュベーション後、９個の滴定曲線希釈液各５０μＬを希釈箱から参照標準又はサンプル用の試験プレートに移し、即ち参照標準用では１〜９列のＡ〜Ｄ行のウェルに移し、サンプル用では１〜９列のＥ〜Ｈ行に移した。
【０２８１】
培地５０μＬを１０列目にピペットで注入し、各々１００μＬを１１列と１２列にピペットで注入した。ＴＮＦ参照標準（蛋白質１２．５ｎｇ／ｍＬ培地）５０μＬを１〜１０列、Ａ〜Ｈ行のウェルにピペットで注入し、１０列目が１００％溶解値に対応するようにした（ＴＮＦ対照）。１１列は１００％増殖対照であり、１２列には細胞材料を加えず、従って、ブランクとした。ウェル当たりの最終容量は２００μＬとした。試験プレートのインキュベーションを３７℃、５％ＣＯ２下に４８時間実施した。
【０２８２】
２日間インキュベーション後、素早く逆さにして１回激しく下向きに震盪することにより試験プレートウェルからの液体を捨てた。次に、クリスタルバイオレット溶液５０μＬを各ウェルにピペットで注入した。溶液をウェルに１５分間残した後、上記のように捨てた。プレートを洗浄し、室温で約３０分間乾燥した。次に、試薬溶液１００μＬを各ウェルにピペットで注入した。プレートを（約３００ｒｐｍで１５分間）撹拌すると、ウェルの各々に均一に着色した溶液が得られた。試験プレートウェル内の色素の吸光度をプレート光度計で６２０ｎｍにて測定した。個々の値をグラフにプロットし、抗体の夫々の希釈度又は濃度（ｎｇ／ｍＬ）（ｘ軸）に対して吸光度（ｙ軸）をプロットした。
【０２８３】
１）阻害効果に対する用量を示す曲線の最低プラトー；２）阻害効果に対する用量を示す曲線の最高プラトー；３）ＩＣ５０値；及び４）曲線変曲点の傾きの４個のパラメータを生物活性測定に使用した。４パラメータプロットから、細胞の半数が生存し、半数が死滅する濃度（ＩＣ５０値）を読取った。この濃度は曲線データの４パラメータ関数のパラメータ３により計算した。参照標準濃度の平均値を計算した。参照標準の平均ＩＣ５０値をサンプルの個々のＩＣ５０値で割り、１００％を掛けることによりサンプルの相対生物活性を計算した。次に相対活性の平均を求めた。
【０２８４】
ｂ）結果
参照標準に対するサンプル（洗浄済み結晶；実施例４１に記載の洗浄プロトコル，実施例３９に記載のバッチに由来する結晶）の生物活性の比較として試験を実施した。吸光度値をＡｆｅｌｉｍｏｍａｂ（登録商標）の濃度に対してプロットし、４パラメータ非線形回帰により評価した処、抗体によるＴＮＦ効果の阻害のＩＣ５０値が判明した。両方のサンプルをマイクロプレート１枚で４回ずつ繰返して試験したので、夫々Ａｆｅｌｉｍｏｍａｂ（登録商標）参照標準とサンプルに４個のＩＣ５０値を得た。次に、参照標準のＩＣ５０値の平均を計算し、参照標準の平均ＩＣ５０値をサンプルの該当ＩＣ５０値で割り、１００％を掛けることによりサンプルの各反復の相対活性を評価した。
【０２８５】
サンプル（１．８７ｍｇ／ｍＬ結晶懸濁液）の試験の結果、相対生物活性は１０２％であり、従って完全に生物学的に活性であることが判明した。
【０２８６】
Ｈ２．顕微鏡による特性決定
（実施例５１）
ＭＡＫ１９５Ｆの結晶の顕微鏡による特性決定
ａ）ｍＡｂ結晶バッチサンプルの光学分析
均質化後、１〜１０μＬサンプル容量のアリコートを対物レンズホルダープレートにピペットで滴下し、ガラスカバースライドをかぶせた。Ｅ−ＰＩ  １０倍接眼レンズと夫々１０倍、２０倍及び４０倍対物レンズを装着したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２５倒立型光学顕微鏡を使用して結晶調製物を評価した。デジタルカメラ（Ｓｏｎｙ  Ｃｙｂｅｒｓｈｏｔ  ＤＳＣ  Ｓ７５）を使用して写真撮影した。
【０２８７】
Ｈ３．複屈折
複屈折挙動を検出するために、ＣＦＷ  １０倍接眼レンズと４倍、１０倍、２０倍及び４０倍対物レンズを装着したＮｉｋｏｎ  Ｌａｂｏｐｈｏｔ顕微鏡を使用した。更に、顕微鏡にフィルターセット（検光子及び偏光子ユニット）を装着した。
【０２８８】
全バッチ実験から生じた結晶は複屈折を示した。
【０２８９】
Ｈ４．注射適性
結晶中に取込まれた蛋白質１５０ｍｇ／ｍＬを実施例４１からの洗浄用緩衝液に配合したＭＡＫ１９５Ｆ結晶懸濁液は２７Ｇ針で注射可能である。
【０２９０】
以下のセクションでは、各種ゲージ針を使用してモノクローナル抗体フラグメントＭＡＫ１９５Ｆ（１０〜２００ｍｇ／ｍｌ）の（ＰＥＧ中）結晶懸濁液の注射適性を判定するために実施した実験を要約する。
【０２９１】
ＰＥＧ緩衝液：
１８％  ＰＥＧ４，０００ｍ／ｖ
０．０１％ポロキサマー１８８
１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
ｐＨを水酸化ナトリウム溶液で７．２に調整した。
【０２９２】
投与中に患者が手動で実施するようにシリンジ排出（充填容量１ｍＬ）を実施した。２０〜２７．５Ｇ針サイズを評価した。
【０２９３】
シリンジ：２０／２３／２６Ｇ：
Ｈｅｎｋｅ  Ｓａｓｓ  Ｗｏｌｆ  ＧｍｂＨ  １ｍＬ  Ｎｏｒｍ−Ｊｅｃｔシリンジに、
−Ｈｅｎｋｅ  Ｓａｓｓ  Ｗｏｌｆ  ＧｍｂＨ  Ｆｉｎｅ−Ｊｅｃｔ（登録商標）２０Ｇ針
−Ｔｅｒｕｍｏ（登録商標）２３Ｇ針
−Ｎｅｏｐｏｉｎｔ（登録商標）２６Ｇ針
を装着した。
【０２９４】
２７．５Ｇ：
ＢＤ  ＨｙＰａｋ  ＳＣＦ（登録商標）１ｍＬの長いシリンジに２７．５Ｇ  ＲＮＳ針３８８００  Ｌｅ  Ｐｏｎｔ  ｄｕ  Ｃｌａｉｘを装着した。
【０２９５】
その結果（図８）、２７．５Ｇ針は高濃度の結晶のより低速の送達を可能にすると思われる。
【０２９６】
Ｉ．二次構造
（実施例５２）
結晶化／結晶の再溶解後の天然二次構造の維持
Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｔｅｎｓｏｒ  ２７でＣｏｎｆｏｃｈｅｃｋシステムを使用してＩＲスペクトルを記録した。ＭｉｃｒｏＢｉｏｌｙｔｉｃｓ  ＡｑｕａＳｐｅｃセルを使用して液体サンプルを分析した。Ｈａｒｒｉｃｋ  ＢｉｏＡＴＲＩＩセル（登録商標）を使用して蛋白質懸濁液の測定を実施した。２５℃で１２０〜５００個のスキャンの測定を少なくとも２回実施して各サンプルを評価した。ブランク緩衝液スペクトルを蛋白質スペクトルから夫々差し引いた。フーリエ変換により蛋白質二次導関数スペクトルを作成し、相対比較のために１５８０〜１７２０ｃｍ−１からベクトルを正規化した。
【０２９７】
結晶の再溶解を次のように実施した。結晶懸濁液を遠心し、上清を捨て、ペレットをｐＨ５．２の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に蛋白質濃度１０ｍｇ／ｍＬまで溶解した。図４は（実施例３９に記載の方法に従って結晶化させ、実施例４１に紹介した手順に従って洗浄した）結晶ＭＡＫ１９５Ｆ懸濁液とこのような前処理した結晶の再溶解後のＦＴ−ＩＲ二次導関数スペクトルを示す。スペクトルから明らかなように、結晶固体状態でも再溶解後でも二次構造の顕著な変化は認められなかった。
【０２９８】
Ｊ．安定性データ
（実施例５３）
Ｐｅｇ／リン酸緩衝液中の１２カ月安定性データ（Ｓｅ  Ｈｐｌｃ，Ｆｔ−Ｉｒ，形態）
実施例３９に記載した結晶化手順を使用してＭＡＫ１９５Ｆを結晶化させた。この場合には１８％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４，０００と、０．０１％ポロキサマー１８８と、１０ｍＭリン酸ナトリウムを含有する緩衝液（ｐＨ７．２）を使用し、実施例４１に記載したように結晶を洗浄した。次に、結晶を遠心により夫々５ｍｇ／ｍＬ及び２００ｍｇ／ｍＬ蛋白質含量まで濃縮し、２〜８℃で保存した。５／２００ｍｇ／ｍＬ結晶ＭＡＫ１９５Ｆを２〜８℃で１２カ月間保存後の安定性データは９０％を上回る単量体の維持を明白に示す。
【０２９９】
材料:
分散緩衝液:
１８％  ＰＥＧ４，０００ｍ／ｖ
０．０１％ポロキサマー１８８
１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
ｐＨを水酸化ナトリウム溶液で７．２に調整した。
【０３００】
ＳＥ−ＨＰＬＣ
【０３０１】
【表５】
2010535771.tif 000016
【０３０２】
【表６】
2010535771.tif 000017
【０３０３】
Ｄｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣシステム（Ｐ６８０ポンプ，ＡＳＩ  １００オートサンプラー，ＵＶＤ１７０Ｕ）を使用した。流速０．５ｍＬ／分を適用し、２本の直列に接続したＧＥ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）１２カラムでＭＡＫ１９５Ｆサンプルを分離した。波長２８０ｎｍで検出を実施した。ランニング緩衝液は０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．９）中０．５Ｍ塩化ナトリウムから構成した。
【０３０４】
ＦＴ−ＩＲ
Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｔｅｎｓｏｒ  ２７でＣｏｎｆｏｃｈｅｃｋを使用してＩＲスペクトルを記録した。ＭｉｃｒｏＢｉｏｌｙｔｉｃｓ  ＡｑｕａＳｐｅｃセルを使用して液体サンプルを分析した。Ｈａｒｒｉｃｋ  ＢｉｏＡＴＲＩＩセル（登録商標）を使用して蛋白質懸濁液の測定を実施した。２５℃で１２０〜５００個のスキャンの測定を少なくとも２回実施して各サンプルを評価した。ブランク緩衝液スペクトルを蛋白質スペクトルから夫々差し引いた。フーリエ変換により蛋白質二次導関数スペクトルを作成し、相対比較のために１５８０〜１７２０ｃｍ−１からベクトルを正規化した。
【０３０５】
結晶の再溶解を次のように実施した。結晶懸濁液を遠心し、上清を捨て、ペレットをｐＨ５．２の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に蛋白質濃度１０ｍｇ／ｍＬまで溶解した。
【０３０６】
図５は結晶ＭＡＫ１９５Ｆ懸濁液（上記のように調製し、２５℃で６カ月間保存した２００ｍｇ／ｍＬ保存安定性サンプル）とこのような前処理した結晶の再溶解後のＦＴ−ＩＲ二次導関数スペクトルを示す。スペクトルから明らかなように、結晶固体状態でも再溶解後でも２５℃で６カ月間保存後に二次構造の顕著な変化は認められなかった。
【０３０７】
形態
１〜１０μＬサンプル容量のアリコートを対物レンズホルダープレートにピペットで滴下し、製剤化用緩衝液（２０％ＰＥＧ）で希釈し、ガラスカバースライドをかぶせた。Ｅ−ＰＩ  １０倍接眼レンズと夫々１０倍、２０倍及び４０倍対物レンズを装着したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２５倒立型光学顕微鏡を使用して調製物を評価した。２〜８℃で１２カ月間保存後に結晶の光学顕微鏡分析で顕著な形態変化は認められなかった。
【０３０８】
Ｋ．ＤＳＣ分析
（実施例５４）
ＤＳＣ分析
２００ｍｇ／ｍＬのストレスなしのサンプルで示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を実施した。パラグラフ３）に記載したように調製した結晶懸濁液と、液体製剤（０．０１％ポロキサマー１８８、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７．２を含有する緩衝液中のＭＡＫ１９５Ｆ）と、プラセボ１８％  ＰＥＧ４，０００結晶懸濁緩衝液を比較した。
【０３０９】
ＣＣ  ２００Ｌコントローラ、ＣＣ  ２００供給システム及びＴＡＳＣ  ４１４／３Ａコントローラに接続したＮｅｔｚｓｃｈ  ＤＳＣ  ２０４セルを使用した。液体サンプル又は懸濁液２０μＬをＡｌるつぼに移し、るつぼを密閉後、５Ｋ／分の加熱速度で０〜１００℃に加熱することによりサンプル分析を実施した。図６はサンプルに得られた典型的なサーモグラムを示す。
【０３１０】
溶液は６６〜７８℃のかなり広い吸熱反応を示したが、結晶懸濁液は約７７℃の著しく先鋭な吸熱ピークを特徴とした。プラセボ懸濁緩衝液の加熱に熱イベントは結び付けられなかった（図６）。
【０３１１】
以上の結果から、ＭＡＫ１９５Ｆは液体製剤に比較して吸熱ピーク温度が高いため、結晶状態の配座安定性が高く、ＭＡＫ１９５Ｆは溶液よりも結晶状態のほうが吸熱ピークが鋭いため、純度と配座均一性が高いと考えられる（Ｅｌｋｏｒｄｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２４７：７９−９０）。
【０３１２】
Ｌ．ＭＡＫ１９５Ｆ結晶の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による特性決定
（実施例５５）
ＭＡＫ１９５Ｆ結晶の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による特性決定
実施例３９に記載したように調製したＭＡＫ１９５Ｆ結晶懸濁液のアリコートを遠心した。上清のデカント後、ペレットを無水エタノールに再懸濁した。遠心／エタノール再懸濁工程を数回連続して実施した後、懸濁液１滴をＳＥＭサンプルホルダーに移し、室温で乾燥した。サンプルに炭素スパッタリングし、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ７４１８検出器に接続したＪＥＯＬ  ＪＳＭ  ６５００Ｆ走査型電子顕微鏡でデータを集めた。図７はＭＡＫ１９５Ｆ結晶の典型例を示す。
【０３１３】
Ｌ．連続法の適用による収率増加（既存実施例４２における設定変更）
（実施例５６）
設定を変更して連続法とした晶析工程の収率増加
晶析工程の終点は結晶化スラリーの上清のアリコートのＯＤ２８０測定値が例えばその後３日間一定となる時点として定義することができる。結晶化スラリーの上清に所定量のＰＥＧ４，０００（ｐＨ約５．２の約０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中５０％ｗ／ｖ溶液）を補充することにより収率増加が可能である。最初に晶出した結晶と同一晶癖の結晶がその後の数日間形成される。この手順を適用すると、沈殿を導入せずに総収率は容易に９０％を超える。
【０３１４】
本実施例では、（場合により基本レベルとして所定量の結晶化剤を加えた）結晶化バッチに付加的な沈殿剤及び／又は蛋白質を所定速度で「滴定」する。こうして経時的連続結晶化を誘導し、最終的に９０％を上回る結晶収率が得られる。
【０３１５】
Ｍ．結晶化バッチの種晶添加
（実施例５７）
ＭＡＫ１９５Ｆ結晶化バッチの種晶添加
実施例３９に記載したようにＭＡＫ１９５Ｆ結晶化バッチを調製する。蛋白質溶液を結晶化用緩衝液と混合後、混合物に既存ＭＡＫ１９５Ｆ結晶を均質種晶添加する。例えば、約６０〜７０％の結晶収率を示す実施例３９に記載したように調製した結晶懸濁液のアリコートを例えば１／２０比（ｖ／ｖ）で結晶化バッチに加える（本実施例では、５０ｍＬを１  ，０００ｍＬに加える）。このストラテジーを適用し、より短時間の処理時間で収率を高めるように総結晶収率と処理時間を更に最適化する。
【０３１６】
Ｐ．ＰＫ／ＴＯＸ試験
（実施例５８）
ラットにおけるＰＫ／ｔｏｘ試験（下記参照）用サンプルの調製
４種類の異なる製剤を調製した：
−ＭＡＫ１９５Ｆ液体製剤，５０ｍｇ／ｍＬ
−ＭＡＫ１９５Ｆ結晶懸濁液，５０ｍｇ／ｍＬ，撹拌下の工程（より短い針状物を生じる）
−ＭＡＫ１９５Ｆ結晶懸濁液，２００ｍｇ／ｍＬ，撹拌下の工程
−ＭＡＫ１９５Ｆ結晶懸濁液，２００ｍｇ／ｍＬ，非撹拌下の工程（より長い針状物を生じる）。
【０３１７】
ａ）ＭＡＫ１９５Ｆ液体製剤
ＭＡＫ１９５Ｆ溶液の融解
ＭＡＫ１９５Ｆ（ＬＯＴ  Ｇ００８．０１Ｅ／ＰＺ０１０５Ｐ０２５，ｃ＝１２．４ｍｇ／ｍＬ）の溶液２０ｍＬを撹拌下の２５℃の水浴中で２時間以内に融解した。
【０３１８】
５０ｍｇ／ｍＬバッチの調製
準備の容易なＶｉｖａｓｐｉｎ  ２０チューブ（３０ｋＤａ  ＰＥＳ  ＭＷＣＯ）を使用してＭＡＫ１９５Ｆ溶液２０ｍＬを５ｍＬまで濃縮し、容量が５ｍＬに減少するまで５，０００×ｇで４℃にて遠心した。溶液を滅菌濾過した。
【０３１９】
濃度測定（ＯＤ２８０）
得られたＭＡＫ１９５Ｆ溶液の濃度をＯＤ２８０により測定し、蒸留水１９９０ｍＬで希釈した蛋白質溶液１０μＬを蒸留水に対して測定した。
Ａ＝０．３５３／０．３５９／０．３５４，ｃ＝５１．９ｍｇ／ｍＬ。
【０３２０】
溶液を２ｍＬエッペンドルフ反応チューブに充填した。
【０３２１】
組成
ＭＡＫ１９５Ｆ                    ５１．９ｍｇ／ｍＬ
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ  ６８        ０．１ｍｇ／ｍＬ
リン酸２水素ナトリウム２水和物    １．５６ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム                    ８．７７ｍｇ／ｍＬ
水酸化ナトリウム                  ｐＨ調整７．２。
【０３２２】
ｂ）ＭＡＫ１９５Ｆ結晶懸濁液
１．バッチ晶析：
ＭＡＫ１９５Ｆ溶液の融解
ＭＡＫ１９５Ｆ（ＬＯＴ  Ｇ００８．０１  Ｅ／ＰＺ０１０５Ｐ０２５，ｃ＝１２．４ｍｇ／ｍＬ）の溶液４００ｍＬを撹拌下の２５℃の水浴中で２時間以内に融解した。溶液を１０００ｍＬビーカーに移した。
【０３２３】
緩衝液交換装置の作製
水４００ｍＬが濾液容器に流入するまでＶｉｖａｆｌｏｗ  ５０（３００００  ＭＷＣＯ，ＰＥＳ）カートリッジを蒸留水５００ｍＬでリンスした。
【０３２４】
緩衝液の調製
緩衝液Ａ（１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ５．２）
５００ｍＬメスフラスコ内で酢酸ナトリウム４１．０２ｇを蒸留水約４５０ｍＬに溶解した。更に蒸留水を加えることにより容量を５００ｍＬに調整した。濃酢酸を加えることにより緩衝液のｐＨを５．２に調整した。
【０３２５】
緩衝液Ｂ（０．１Ｍ酢酸ナトリウム  ｐＨ５．２）
５０００ｍＬビーカー内で緩衝液Ａ２５０ｍＬを蒸留水で総容量２５００ｍＬまで希釈した。
【０３２６】
緩衝液Ｃ（０．１Ｍ酢酸ナトリウム中２０％  ＰＥＧ４０００  ｐＨ５．２）
緩衝液Ａ１５０ｍＬと３００ｇのＰＥＧ４０００を１５００ｍＬメスフラスコに移し、蒸留水を総容量１５００ｍＬまで充填した。次に緩衝液を層流ベンチ下におき、滅菌濾過した（細孔寸法０．２２μｍフィルターディスク２枚）。
【０３２７】
ＭＡＫ１９５Ｆの緩衝液交換
準備の容易なＶｉｖａｆｌｏｗ  ５０カートリッジを使用することによりＭＡＫ１９５Ｆ溶液４００ｍＬを５０ｍＬまで濃縮した。この濃縮溶液（ｃ＝約１００ｍｇ／ｍＬ）を１０００ｍＬビーカー内で緩衝液Ｂ４５０ｍＬで希釈した。準備の容易なＶｉｖａｆｌｏｗ  ５０カートリッジを使用し、容量を５０ｍＬに戻した。この手順を１回繰返した。最終段階で５０ｍＬを緩衝液Ｂ４５０ｍＬで希釈したが、容量は減らさず、蛋白質濃度を約１０ｍｇ／ｍＬとなるようにした。元のＭＡＫ１９５Ｆ緩衝液の総希釈倍率は１０００倍である。
【０３２８】
ｍＡｂ濃度の測定と１０ｍｇ／ｍＬに調整（ＯＤ２８０）
得られたＭＡＫ１９５Ｆ溶液の緩衝液Ｂ中の濃度をＯＤ２８０により測定し、蒸留水１９６０μＬで希釈した蛋白質溶液４０μＬを蒸留水に対して測定した。
Ａ＝０．２５８  ｃ＝９．４ｍｇ／ｍＬ
【０３２９】
バッチ作製
ｍＡｂ溶液４７０ｍＬを層流ベンチ下におき、滅菌濾過した（細孔寸法０．２２μｍフィルターディスク２枚）。溶液２６０ｍＬを１０００ｍＬメスシリンダーに移し、緩衝液Ｃ２６０ｍＬと混合した。混液を１０００ｍＬポリプロピレン容器びんに移した。びんをパラフィルムで密閉し、２０℃で保存した。びんを約６０ｒｐｍで撹拌した（「撹拌下の工程」）。溶液２１０ｍＬを１０００ｍＬメスシリンダーに移し、緩衝液Ｃ２１０ｍＬと混合した。混液を１０００ｍＬポリプロピレン容器びんに移した。びんをパラフィルムで密閉し、２０℃で保存した。びんを撹拌しなかった（「非撹拌下の工程」）。
【０３３０】
２．「撹拌下の工程」サンプルの作製、バッチ晶析開始後１６日：
製剤緩衝液調製
まず、０．５Ｍリン酸ストック溶液５０ｍＬを調製した。リン酸２水素ナトリウム２水和物３．９ｇを精製水約４０ｍＬに溶解した後、水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調整した。容量を５０ｍＬに調整した。３６０ｇのＰＥＧ４，０００とストック溶液４０ｍＬと０．２ｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を精製水２０００ｍＬに溶解した。
【０３３１】
結晶収率の測定
得られたＭＡＫ１９５Ｆ結晶化バッチの濃度をＯＤ２８０により測定した。１５０μＬアリコートを１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心した。上清１００μＬを蒸留水１９００μＬで希釈し、蒸留水に対して測定した。
上清Ｉ：Ａ＝０．１５８
上清ＩＩ：Ａ＝０．１５４  ｃ＝２．３ｍｇ／ｍＬ  結晶収率５４％。
【０３３２】
濃縮及び緩衝液交換／充填
全遠心工程は容易に再懸濁可能なペレットが形成され、上清中に残留固体が残らないように５００〜２，０００ｒｐｍの速度で実施した。結晶スラリーを滅菌５０ｍＬポリプロピレンチューブ１０本に分注し、遠心した。上清を捨て、ペレットを夫々１８％  ＰＥＧ４，０００緩衝液２０ｍＬに再懸濁し、全チューブを５０ｍｌポリプロピレンチューブ４本にプールした。チューブを再び遠心し、上清を捨て、ペレットを夫々１８％  ＰＥＧ４，０００緩衝液２０ｍＬに再懸濁後、結晶スラリーをチューブ２本にプールし、遠心した。洗浄と遠心を更に１回実施し、緩衝液を捨てた後、新鮮な緩衝液で濃度を５０ｍｇ／ｍＬに調整した。アリコートの濃度をＯＤ２８０により測定した（水１９９０μＬ中１０μＬ）。
Ａ＝０．３４５／０．３５８／０．３５６，ｃ＝５１．５ｍｇ／ｍＬ。
このスラリーを１５ｍＬ滅菌ポリプロピレンチューブ２本に容量２及び３ｍＬで充填した。残りのスラリーを遠心により２００ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。アリコートの濃度をＯＤ２８０により測定した（水１９９５μＬ中５μＬ）。
Ａ＝０．６５６／０．６５９／０．６５２，ｃ＝１９１．４ｍｇ／ｍＬ。
このスラリーを２ｍＬ滅菌エッペンドルフ反応チューブに充填した。
【０３３３】
組成
ＭＡＫ１９５Ｆ                    ５１．５／１９１．４ｍｇ／ｍＬ
ＰＥＧ４，０００                  １８％  ｍ／ｖ
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ  ６８        ０．１ｍｇ／ｍＬ
リン酸２水素ナトリウム２水和物    １．５６ｍｇ／ｍＬ
水酸化ナトリウム                  ｐＨ調整７．２。
【０３３４】
３．「非撹拌下の工程」サンプルの作製，、バッチ晶析開始後３１日：
緩衝液調製（緩衝液ＭＡＫ１９５Ｆ＋ＰＥＧ）
まず、０．５Ｍリン酸ストック溶液５０ｍＬを調製した。リン酸２水素ナトリウム２水和物３．９ｇを精製水約４０ｍＬに溶解した後、水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調整した。容量を５０ｍＬに調整した。３６０ｇのＰＥＧ４，０００とストック溶液４０ｍＬと０．２ｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を精製水２０００ｍＬに溶解した。
【０３３５】
結晶収率の測定
得られたＭＡＫ１９５Ｆ結晶化バッチの濃度をＯＤ２８０により測定した。１５０μＬアリコートを１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心した。上清１００μＬを蒸留水１９００μＬで希釈し、蒸留水に対して測定した。
上清Ｉ：Ａ＝０．１９２
上清ＩＩ：Ａ＝０．１９３  ｃ＝２．８ｍｇ／ｍＬ  結晶収率４４％。
【０３３６】
濃縮及び緩衝液交換／充填
全遠心工程は容易に再懸濁可能なペレットが形成され、上清中に残留固体が残らないように５００〜２，０００ｒｐｍの速度で実施した。結晶スラリーを滅菌５０ｍＬポリプロピレンチューブ９本に分注し、遠心した。上清を捨て、ペレットを夫々１８％  ＰＥＧ４，０００緩衝液２０ｍＬに再懸濁し、全チューブを５０ｍｌポリプロピレンチューブ４本にプールした。チューブを再び遠心し、上清を捨て、ペレットを夫々１８％  ＰＥＧ４，０００緩衝液２０ｍＬに再懸濁後、結晶スラリーをチューブ２本にプールし、遠心した。洗浄と遠心を更に１回実施し、緩衝液を捨てた後、新鮮な緩衝液で濃度を２００ｍｇ／ｍＬに調整した。アリコートの濃度をＯＤ２８０により測定した（水１９９５μＬ中５μＬ）。Ａ＝０．６８５／０．６５２／０．６５１，ｃ＝１９３．５ｍｇ／ｍＬ。
【０３３７】
このスラリーを２ｍＬ滅菌エッペンドルフ反応チューブに充填した。
【０３３８】
組成
ＭＡＫ１９５Ｆ                    １９３．５ｍｇ／ｍＬ
ＰＥＧ４，０００                  １８％  ｍ／ｖ
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ  ６８        ０．１ｍｇ／ｍＬ
リン酸２水素ナトリウム２水和物    １．５６ｍｇ／ｍＬ
水酸化ナトリウム                  ｐＨ調整７．２。
【０３３９】
ＳＥ−ＨＰＬＣデータ
サンプルのＳＥ−ＨＰＬＣ分析の結果、全４個のサンプルは９７．５％超の単量体種を含有することが判明した。
【０３４０】
（実施例５９）
単回皮下投与後の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにおけるＭＡＫ１９５Ｆ（Ａｆｅｌｉｍｏｍａｂ）結晶の局所耐性及び毒性に関する適性試験
【０３４１】
１．実験データ
本試験の目的は新規型の製剤におけるＴＮＦαに対する抗体であるＭＡＫ１９５Ｆ（ａｆｅｌｉｍｏｍａｂ）の局所耐性を試験することであった。更に、本試験では製剤の全身毒性及び毒物動態データに関する他の情報について検討した。雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，６９５９２  Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）にＭＡＫ１９５Ｆ（ａｆｅｌｉｍｏｍａｂ）の各種製剤の単回皮下注射後に種々の観察期間後にＭＡＫ１９５Ｆ（ａｆｅｌｉｍｏｍａｂ）の局所耐性と毒物動態及び病理作用を試験した（表６及び７参照）。投与容量は１ｍＬ／ｋｇ体重とした。
【０３４２】
【表７】
2010535771.tif 000018
【０３４３】
【表８】
2010535771.tif 000019
【０３４４】
１日目に投与後１５分、１時間、３時間、５時間及び２４時間とその後、少なくとも１日１回ずつ動物の臨床徴候と死亡率を観察した。投与日（１日）及び検視日（夫々３日、１５日又は２１日）と、適用可能な場合には週２回ずつ体重を測定した。１日（投与後４時間）と、適用可能な場合には２日、３日、５日、８日及び１５日に薬物分析用血液サンプルを採取した。検視前に採血し、血液及び臨床化学パラメータを評価した。検視前の各動物の血液塗抹を作製した。検視時に体腔の顕微鏡観察を実施した。肝臓、腎臓、胸腺、脾臓及びリンパ節で臓器重量測定を実施した。注射部位と肝臓、腎臓、胸腺、脾臓及びリンパ節で予備組織病理試験を実施した。全動物は予定した検視まで試験に耐えて生存した。体重に及ぼす試験品目関連作用は認められなかった。血液及び臨床化学値は非常にばらつきが大きかった。血液又は臨床化学値に明白な試験品目関連変化は認められなかった。検尿に試験品目関連変化は認められなかった。臓器重量測定の結果、ばらつきが大きく、臓器重量に明白な試験品目関連変化は認められなかった。他の全変化はこの系統及び年齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに広く認められる自然所見の範囲であった。
【０３４５】
顕微鏡所見：
−群０１、０２所見なし。
−群０３及び０５では軽度〜中度の汎発性皮下炎症。
−群０３（８日及び１５日）と０５群（３日）では最軽度〜軽度の皮下浮腫。
−０６群では最軽度の混合細胞浸潤（１５日）以外に所見なし。
【０３４６】
局所反応での汎Ｔサプレッサー／細胞傷害性Ｔ細胞／ナチュラルキラー細胞、汎Ｂ細胞及び汎マクロファージマーカーの予備免疫組織化学試験結果によると、主にマクロファージとナチュラルキラー細胞が皮下炎症／浸潤に関与しているらしい。このため、使用した製剤に対する局所免疫応答の徴候は認められなかった。他の全変化はこの系統及び年齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに広く認められる自然所見の範囲であった。
【０３４７】
試験した全サンプルにおけるＡｆｅｌｉｍｏｍａｂの絶対レベルは低かった。サンプル間に大きなばらつきが認められたが、これはサンプリング頻度が低く、使用した動物数が少ないためであると思われる。殆どのサンプルでは、５〜８日後に血清中にＡｆｅｌｉｍｏｍａｂを検出することはできなかった。液体及び結晶製剤でも同様のＰＫプロファイルが観察され、ＰＫプロファイルに及ぼす（撹拌下又は非撹拌下の）結晶法の影響はなかった。大半のサンプルで観察されたＴ１／２は１〜２日であった。詳細を表８に示す。
【０３４８】
【表９】
2010535771.tif 000020
【０３４９】
各種製剤でＭＡＫ１９５Ｆ（Ａｆｅｌｉｍｏｍａｂ）の皮下投与後に、死亡又は試験品目関連臨床徴候は認められなかった。試験品目製剤に対する肉眼的局所反応は認められなかった。血液、臨床化学及び臓器重量試験の結果、数値のばらつきが大きく、試験品目との明白な関係はなかった。肉眼試験により確認された投与部位における局所炎症反応の重篤度はどちらの濃度でも撹拌下に作製した結晶製剤（短い針状）のほうが非撹拌下に作製した結晶製剤（長い針状）及び標準製剤よりも高かった。
【０３５０】
（文献の援用）
本明細書の随所に引用する全引用文献（文献資料、特許、特許出願及びウェブサイトを含む）の内容を特に本明細書に援用する。特に指定しない限り、本発明の実施には当分野で周知の従来の小規模及び大規模蛋白質結晶化及び製剤化技術を利用する。
【０３５１】
（等価物）
本発明はその精神又は本質的特徴から逸脱せずに他の特定形態で実施することができる。従って、上記態様は本明細書に記載する発明を制限するものではなく、あらゆる点において例証とみなすべきである。即ち、本発明の範囲は以上の記載により指定されるのではなく、特許請求の範囲により指定され、従って、特許請求の範囲と等価の意味及び範囲内に該当するあらゆる変更も本発明に含むものとする。
【図３】
2010535771.tif 000021
【図６】
2010535771.tif 000022
【図１】
2010535771.tif 000023
【図２】
2010535771.tif 000024
【図４】
2010535771.tif 000025
【図５】
2010535771.tif 000026
【図７】
2010535771.tif 000027
【図８】
2010535771.tif 000028
【配列表】
2010535771000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月8日(2009.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の実質的に均一寸法の抗体結晶の製造方法であって、
ａ）抗体結晶の形成を可能にする条件下で抗体と少なくとも１種の結晶化剤を含有する水性結晶化混合物を準備する段階と；
ｂ）前記結晶化混合物を制御条件下で撹拌し、実質的に均一な所望の平均寸法範囲の抗体結晶を形成する段階を含む前記方法。
【請求項２】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約１〜約２００ｒｐｍの範囲の速度で撹拌することに対応する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記制御条件が前記結晶化混合物を直径約２〜約１００ｃｍの範囲のローラー容器に入れて撹拌することに対応する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することに対応し、前記ローラー容器の総容積の約１〜約１００％に結晶化混合物を充填する請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することに対応し、前記ローラー容器の総容積の約１〜約１００％に結晶化混合物を充填する請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約３０分間〜約２０日間撹拌することに対応する請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約−１５〜約＋５０℃の範囲の温度で撹拌することに対応する請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記撹拌が前記結晶化混合物のローリング、かき混ぜ、振盪及び／又はタンブリングを含む請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
結晶化剤がポリアルキレンポリオールである請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
結晶化剤がポリアルキレングリコールである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
結晶化剤がポリエチレングリコールである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
結晶が約１〜約１０００μｍの範囲内の均一な結晶粒径及び／又は粒長を含む請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
抗体が抗体フラグメントである請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
抗体フラグメントが抗ｈＴＮＦα抗体フラグメントである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗体フラグメントがＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２フラグメントである請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
抗体フラグメントが寄託番号ＥＣＡＣＣ８７０５０８０１のハイブリドーマ細胞株により産生されるＭＡＫ１９５のＦ（ａｂ’）２フラグメントであるＭＡＫ１９５Ｆである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＭＡＫ１９５Ｆが約０．５〜約２８０ｍｇ／ｍｌの範囲の初期蛋白質濃度で存在しており、ローラー容器に入れて約１５〜約２５℃の範囲の温度にて約５〜約１００ｒｐｍの範囲の速度で約１〜約６０日間撹拌する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記結晶が約１〜約２００μｍの範囲の制御された平均結晶粒長を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法により取得可能な抗体結晶。
【請求項２０】
抗ｈＴＮＦα抗体結合フラグメントを結晶化するためのバッチ晶析方法であって、
（ａ）抗体と、結晶化剤としての少なくとも１種のポリアルキレングリコールを含有する水性結晶化混合物を準備する段階と；
（ｂ）前記抗体の結晶が形成されるまで前記水性結晶化混合物をインキュベートする段階を含み、
前記少なくとも１種のポリアルキレングリコールを（ａ）１段階又は（ｂ）２段階以上で提供し；
ある段階で形成された前記抗体結晶を次段階で取出さず；
結晶化を結晶寸法制御条件下で実施する前記方法。
【請求項２１】
抗体が抗体フラグメントである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記水性結晶化混合物のｐＨが約ｐＨ４〜約６．５の範囲である請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記水性結晶化混合物が緩衝液を含有している請求項２３に記載の方法。
【請求項２４】
前記緩衝液が酢酸緩衝液及び／又はクエン酸緩衝液を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記緩衝液が酢酸ナトリウム及び／又はクエン酸ナトリウムを含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記緩衝液が水性結晶化混合物中に約０．５Ｍまでの濃度で存在する請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ポリアルキレングリコールが約４００〜約１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量をもつ請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ポリアルキレングリコールが総容量の約５〜約３０％（ｗ／ｖ）の範囲の最終濃度で結晶化混合物中に存在する請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
以下の付加的な結晶化条件：
ａ）インキュベーションを約１時間〜約２５０日間実施する；
ｂ）インキュベーションを約−１５℃〜＋約５０℃の温度で実施する；
ｃ）抗体混合物が約０．５〜約２８０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で抗体フラグメントを含有する
のうちの少なくとも１つを満足する請求項１から５及び２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
更に前記結晶を乾燥する段階を含む請求項１から５及び２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
更に前記結晶を乾燥する段階を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
結晶化混合物が結晶と天然母液を含有しており、方法が更に天然母液を人工母液と交換する段階を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
結晶化混合物が約１ｍｌ〜約２０，０００リットルの範囲のバッチ容量を含む請求項１から５及び２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
結晶寸法制御条件下で結晶化を実施する請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約１〜約２００ｒｐｍの範囲の速度で撹拌することを含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記制御条件が前記結晶化混合物を直径約２〜約１００ｃｍの範囲のローラー容器に入れて撹拌することを含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することを含み、前記ローラー容器の総容積の約１〜約１００％に結晶化混合物を充填する請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて撹拌することを含み、前記ローラー容器の総容積の約１〜約１００％に結晶化混合物を充填する請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約３０分間〜約２０日間撹拌することを含む請求項３６から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記制御条件が前記結晶化混合物をローラー容器に入れて約−１５〜約＋５０℃の範囲の温度で撹拌することを含む請求項３６から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記撹拌が前記結晶化混合物のローリング、かき混ぜ、振盪及び／又はタンブリングを含む請求項３６から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
抗ｈＴＮＦα抗体フラグメントの結晶であって、前記抗体フラグメントが寄託番号ＥＣＡＣＣ８７０５０８０１のハイブリドーマ細胞株により産生される抗体ＭＡＫ１９５のＦ（ａｂ’）２フラグメントであるＭＡＫ１９５Ｆである前記結晶。
【請求項４５】
請求項１から５、２０から２２及び３６から４０のいずれか一項に記載の方法により取得可能な抗ｈＴＮＦα抗体フラグメントの結晶。
【請求項４６】
結晶が針状形態を含む請求項４４に記載の結晶。
【請求項４７】
結晶が針状形態を含む請求項４５に記載の結晶。
【請求項４８】
前記抗体フラグメントがポリクローナル抗体フラグメント又はモノクローナル抗体フラグメントである請求項３６に記載の方法により取得可能な結晶。
【請求項４９】
前記抗体フラグメントがキメラ抗体、ヒト化抗体、非糖鎖付加抗体、ヒト抗体及びマウス抗体のフラグメントから構成される群から選択される請求項３６に記載の方法により取得可能な結晶。
【請求項５０】
前記抗体フラグメントがＩｇＧ抗体のフラグメントである請求項３６に記載の方法により取得可能な結晶。
【請求項５１】
前記抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４抗体から構成される群から選択される請求項５０に記載の結晶。
【請求項５２】
前記抗体がＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２フラグメントである請求項４８から５１のいずれか一項に記載の結晶。
【請求項５３】
抗体フラグメントが寄託番号ＥＣＡＣＣ８７０５０８０１のハイブリドーマ細胞株により産生される抗体ＭＡＫ１９５のＦ（ａｂ’）２フラグメントであるＭＡＫ１９５Ｆである請求項５２に記載の結晶。
【請求項５４】
（ａ）請求項１から５、２０から２２及び３６から４０のいずれか一項に記載の方法に従って製造された抗体の結晶と、（ｂ）少なくとも１種の医薬賦形剤を含有する医薬組成物であって、組成物が固体、半固体又は液体製剤として提供される前記組成物。
【請求項５５】
（ａ）請求項１から５、２０から２２及び３６から４０のいずれか一項に記載の方法に従って製造された抗体の結晶と、（ｂ）少なくとも１種の医薬賦形剤を含有する医薬組成物であって、賦形剤が前記結晶を包埋又は封入する前記組成物。
【請求項５６】
前記抗体が約１ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で存在する請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記抗体が約２００ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で存在する請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記抗体が約１ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で存在する請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
前記抗体が約２００ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で存在する請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
前記組成物が０．１〜９９．９％（ｗ／ｗ）の抗体結晶を含有する固体である請求項５４又は５５に記載の組成物。
【請求項６１】
前記賦形剤が少なくとも１種の生分解性もしくは非生分解性ポリマーキャリヤー及び／又は少なくとも１種の油性もしくは脂質キャリヤーを含む請求項５４又は５５に記載の組成物。
【請求項６２】
前記ポリマーキャリヤーがポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（酸無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、乳酸・グリコール酸コポリマーないしＰＬＧＡ、ポリ（β−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ（オルガノ）ホスファゼン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸・アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、そのブレンド及びコポリマーから構成される群から選択される少なくとも１種のポリマーを含む請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
請求項１から５、２０から２２及び３６から４０のいずれか一項に記載の方法により取得可能な抗体結晶を含有する注射用液体組成物であって、抗体が約１０〜約４００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する前記組成物。
【請求項６４】
請求項１から５、２０から２２及び３６から４０のいずれか一項に記載の方法により取得可能な抗体結晶を含有する結晶スラリー組成物であって、抗体が約１００ｍｇ／ｍｌを上回る濃度で存在する前記組成物。
【請求項６５】
請求項１から５、２０から２２及び３６から４０のいずれか一項に記載の方法により取得可能な有効量の抗体結晶を哺乳動物に投与する段階を含む哺乳動物の治療方法。
【請求項６６】
有効量の請求項５４に記載の組成物を哺乳動物に投与する段階を含む哺乳動物の治療方法。
【請求項６７】
有効量の請求項５５に記載の組成物を哺乳動物に投与する段階を含む哺乳動物の治療方法。
【請求項６８】
非経口経路、経口経路又は注射により組成物を投与する請求項６６又は６７に記載の方法。
【請求項６９】
治療有効量の請求項１９及び４６から５１のいずれか一項に記載の抗体結晶を投与する段階を含む対象におけるｈＴＮＦα関連疾患の治療方法。
【請求項７０】
前記ｈＴＮＦα関連疾患が自己免疫疾患、特に関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症及び痛風性関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎及びネフローゼ症候群；感染症、移植拒絶反応ないし移植片対宿主病、悪性腫瘍、肺障害、腸障害、心臓障害、炎症性骨障害、骨吸収疾患、アルコール性肝炎、ウイルス性肝炎、劇症肝炎、凝固障害、熱傷、再潅流障害、ケロイド形成、瘢痕組織形成、発熱、歯周病、肥満症及び放射線傷害；脊椎関節症、肺障害、冠動脈障害、代謝障害、貧血、疼痛、肝障害、皮膚障害、爪障害、又は血管炎、ベーチェット病、強直性脊椎炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、再狭窄、糖尿病、貧血、疼痛、クローン病関連障害、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染、乾癬、乾癬性関節炎、及び慢性プラーク乾癬、加齢性悪液質、アルツハイマー病、脳浮腫、炎症性脳損傷、慢性疲労症候群、皮膚筋炎、薬物反応、脊髄内及び／又は周囲の浮腫、家族性周期性発熱、フェルティ症候群、線維症、糸球体腎炎（例えば連鎖球菌感染後糸球体腎炎やＩｇＡ腎症）、人工器官の緩み、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病、多発性骨髄腫、癌及び悪液質、多臓器障害、骨髄異形成症候群、睾丸炎、骨溶解、急性、慢性及び膵膿瘍を含む膵炎、歯周病、多発性筋炎、進行性腎不全、偽痛風、壊疽性膿皮症、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心臓病、サルコイドーシス、硬化性胆管炎、脳卒中、胸腹部大動脈瘤修復（ＴＡＡＡ）、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、黄熱病ワクチン接種関連症候群、耳関連炎症性疾患、慢性耳炎症、又は小児耳炎症、ぶどう膜炎、座骨神経痛、前立腺炎、子宮内膜症、脈絡膜血管新生、狼瘡、ショーグレン症候群、並びに滲出型黄斑変性症から構成される群から選択される請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ｈＴＮＦα関連疾患が後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全症関連疾患、後天性悪性貧血、急性冠症候群、急性及び慢性疼痛、急性特発性多発性神経炎、臓器移植に伴う急性免疫疾患、臓器移植に伴う急性又は慢性免疫疾患、急性炎症性脱髄性多発根神経炎、急性虚血、急性肝疾患、急性リウマチ熱、急性横断性脊髄炎、アジソン病、成人（急性）呼吸窮迫症候群、成人スティル病、アルコール性肝硬変、アルコール性肝障害、アレルギー性疾患、アレルギー、脱毛症、円形脱毛症、アルツハイマー病、過敏症、強直性脊椎炎、強直性脊椎炎関連肺疾患、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、動脈硬化症、関節症、喘息、アテローム性疾患／動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、アトピー性アレルギー、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、自己免疫性水疱症、自己免疫性皮膚炎、自己免疫性糖尿病、連鎖球菌感染に伴う自己免疫疾患、自己免疫性腸疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性聴力低下、自己免疫性リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性低血糖症、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性早発卵巣不全、自己免疫性血小板減少症（ＡＩＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性ぶどう膜炎、閉塞性細気管支炎、ベーチェット病、眼瞼炎、気管支拡張症、水疱性類天疱瘡、悪液質、心血管疾患、劇症型抗リン脂質抗体症候群、セリアック病、頸部脊椎症、クラミジア感染症、胆汁鬱滞、慢性活動性肝炎、慢性好酸球性肺炎、慢性疲労症候群、臓器移植に伴う慢性免疫疾患、慢性虚血、慢性肝疾患、慢性皮膚粘膜カンジダ症、瘢痕性類天疱瘡、多発性硬化症の危険を伴う最初のエピソードからなる症候群（ＣＩＳ）、分類不能型免疫不全症、分類不能型低ガンマグロブリン血症、結合組織病関連間質性肺疾患、結膜炎、クームス陽性溶血性貧血、小児期発症型精神障害、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、クローン病、特発性自己免疫性肝炎、特発性線維化性肺胞炎、涙嚢炎、鬱病、強皮症皮膚炎、皮膚筋炎、皮膚筋炎／多発性筋炎関連肺疾患、糖尿病網膜症、糖尿病、拡張型心筋症、円板状エリテマトーデス、椎間板ヘルニア、椎間板脱肛、播種性血管内凝固症、薬物性肝炎、薬物性間質性肺疾患、薬物性免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜炎、眼内炎、腸疾患性滑膜炎、上強膜炎、多形性紅斑、重症多形性紅斑、女性不妊症、線維症、線維性肺疾患、妊娠性類天疱瘡、巨細胞動脈炎（ＧＣＡ）、糸球体腎炎、甲状腺腫性自己免疫性甲状腺機能低下症（橋本病）、グッドパスチャー症候群、痛風性関節炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、グレーブス病、Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）感染症、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、ヘモジデリン沈着症関連肺疾患、花粉症、心不全、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒューズ症候群、ハンチントン舞踏病、甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、特発性白血球減少症、特発性血小板減少症、特発性パーキンソン病、特発性間質性肺炎、特異体質性肝疾患、ＩｇＥ介在型アレルギー、免疫性溶血性貧血、封入体筋炎、感染症、感染性眼炎症性疾患、炎症性腸疾患、炎症性脱髄疾患、炎症性心疾患、炎症性腎疾患、インスリン依存性糖尿病、間質���肺疾患、ＩＰＦ／ＵＩＰ、虹彩炎、若年性慢性関節炎、若年性悪性貧血、若年性関節リウマチ、川崎病、角膜炎、乾性角結膜炎、クスマウル病ないしクスマウル・マイヤー病、ランドリー麻痺、ランゲルハンス細胞組織球症、線状ＩｇＡ疾患、網状皮斑、ライム関節炎、リンパ球浸潤性肺疾患、黄斑変性症、特発性又はＮＯＳ男性不妊症、悪性腫瘍、顕微鏡的腎血管炎、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病関連肺疾患、強直性脊椎炎、運動ニューロン疾患、粘膜類天疱瘡、多発性硬化症（全サブタイプ：一次進行型、二次進行型、再発寛解型等）、多臓器不全、筋痛性脳炎／ロイヤルフリー病、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、心筋梗塞、心筋炎、ネフローゼ症候群、神経根障害、神経障害、非アルコール性脂肪肝炎、非Ａ非Ｂ肝炎、視神経炎、臓器移植拒絶反応、変形性関節症、骨溶解症、卵巣癌、卵巣不全、膵炎、寄生虫症、パーキンソン病、少関節型ＪＲＡ、類天疱瘡、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、水晶体起因性ぶどう膜炎、静脈炎、結節性多発動脈炎（ないし結節性動脈周囲炎）、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛症、白毛症、多関節型ＪＲＡ、多腺性内分泌不全症候群、多発性筋炎、多腺性内分泌不全症Ｉ型及び多腺性内分泌不全症ＩＩ型、リウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）、感染後間質性肺疾患、炎症後間質性肺疾患、ポストポンプ症候群、早発卵巣不全、原発性胆汁性肝硬変、原発性粘液水腫、原発性パーキンソン病、原発性硬化性胆管炎、原発性硬化性肝炎、原発性血管炎、前立腺癌及び直腸癌及び造血器悪性腫瘍（白血病及びリンパ腫）、前立腺炎、乾癬、１型乾癬、２型乾癬、乾癬性関節炎、乾癬性関節症、結合組織病続発性肺高血圧、結節性多発動脈炎の肺症状、純赤血球形成不全症、原発性副腎不全、放射線線維症、反応性関節炎、ライター病、再発性視神経脊髄炎、ＮＯＳ腎疾患、再狭窄、関節リウマチ、関節リウマチ関連間質性肺疾患、リウマチ性心臓病、ＳＡＰＨＯ（滑膜炎、座瘡、膿疱症、骨化症及び骨炎）、サルコイドーシス、統合失調症、シュミット症候群、強皮症、続発性アミロイドーシス、ショック肺、胸膜炎、座骨神経痛、続発性副腎不全、敗血症症候群、敗血症性関節炎、敗血症性ショック、血清反応陰性関節症、シリコン関連結合組織病、ショーグレン病関連肺疾患、ショーグレン症候群、スネッドン・ウィルキンソン皮膚病、精子自己免疫疾患、脊椎関節症、強直性脊椎炎、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、スティル病、脳卒中、交感性眼炎、全身免疫応答症候群、全身性エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス関連肺疾患、全身性硬化症、全身性硬化症関連間質性肺疾患、高安病／動脈炎、側頭動脈炎、Ｔｈ２型及びＴｈ１型介在性疾患、甲状腺炎、中毒性ショック症候群、トキソプラズマ性網膜炎、中毒性表皮壊死、横断性脊髄炎、ＴＲＡＰＳ（腫瘍壊死因子受容体）、黒色表皮症を伴うＢ型インスリン抵抗性、１型アレルギー反応、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫性ないしルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ抗体肝炎）、ＩＩ型糖尿病、潰瘍性大腸炎性関節症、潰瘍性大腸炎、蕁麻疹、通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）、ぶどう膜炎、血���炎性びまん性肺疾患、血管炎、春季カタル、ウイルス網膜炎、白斑、フォークト・小柳・原田症候群（ＶＫＨ症候群）、ウェゲナー肉芽腫症、滲出型黄斑変性症、創傷治癒、並びにエルシニア及びサルモネラ関連関節症から構成される群から選択される請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
ＴＮＦα関連疾患治療用医薬組成物の製造用としての請求項１９に記載の抗体結晶の使用。
【請求項７３】
ｈＴＮＦ阻害剤の結晶を含有する医薬組成物であって、結晶の生体利用性又は安全性がｈＴＮＦ阻害剤の液体組成物に比較して低下していない、前記結晶が実質的に均一で所望の平均寸法の範囲である前記組成物。
【国際調査報告】
2010535771.tif 000029
2010535771.tif 000030