(57)【要約】【課題】  難溶性薬剤を含む安定したコロイドナノ粒子、ならびに例えば治療薬および診断薬として、そのようなナノ粒子の作製方法および使用法を開示する。【選択図】なし
2010533730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）化合物、
（ｂ）該化合物を取り巻く、第一ポリマーを含む第一所定固体ポリマー層、および
（ｃ）該第一層を取り巻く、第二ポリマーを含む第二所定固体ポリマー層
を含む安定したナノ粒子であって、該第一ポリマーと該第二ポリマーが反対電荷を有し、かつ直径が約１００nm〜約５００nmであるナノ粒子。
【請求項２】
該化合物が、約５重量％〜約９５重量％存在する、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
該第一ポリマー層と該第二ポリマー層とを併せた厚みが、約５nm〜約３０nmである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４】
該第一ポリマーが正電荷であり、かつ該第二ポリマーが負電荷である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項５】
該第一ポリマーが負電荷であり、かつ該第二ポリマーが正電荷である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項６】
３層以上の所定固体ポリマー層を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項７】
さらに、該第二ポリマー層を取り巻く第三ポリマー層であって、該第二ポリマーの反対電荷を有する第三ポリマーを含む第三ポリマー層を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項８】
該第一ポリマーと該第三ポリマーが同一である、請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項９】
さらに、該第三ポリマー層を取り巻く第四ポリマー層であって、該第三ポリマーの反対電荷を有するポリマーを含む第四ポリマー層を含む、請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
該第二ポリマー層が、標的薬によって改変されている、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
該第三ポリマー層が、標的薬によって改変されている、請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
該第四ポリマー層が、標的薬によって改変されている、請求項９に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
該標的薬が抗体である、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
洗浄剤または界面活性剤を含まない、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
該化合物が、約２時間以内に７％の速度で該ナノ粒子から放出される、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
該化合物が、約２時間以内に約３％の速度で該ナノ粒子から放出される、請求項１２に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
（ａ）化合物、および
（ｂ）逆帯電したポリマー（複数）の交互ポリマー層を含むポリマーコーティング
を含み、直径が約１００nm〜約５００nmであるナノ粒子。
【請求項１８】
２層以上の逆帯電したポリマー層を含む、請求項１７に記載のナノ粒子。
【請求項１９】
該化合物が、約５重量％〜約９５重量％存在する、請求項１７に記載のナノ粒子。
【請求項２０】
該ポリマー層（複数）を併せた厚みが、約５nm〜約３０nmである、請求項１７に記載のナノ粒子。
【請求項２１】
非水溶性化合物を超音波処理にかける工程、および超音波処理の存在下で該化合物に第一ポリマーを加える工程を含む安定したナノ粒子の作製方法であって、該化合物の周囲に安定した第一ポリマー層を形成するのに十分な濃度で該ポリマーを加える作製方法。
【請求項２２】
超音波処理後、該非水溶性化合物が、該ポリマーの非存在下では負電荷を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該化合物に加える該ポリマーが正電荷を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
該超音波処理を約２０℃〜約３０℃で実施する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
腫瘍を有する対象の治療方法であって、腫瘍の大きさまたは腫瘍細胞数を減少させるのに十分な量で、該対象にナノ粒子を投与する工程を含み、該ナノ粒子が、
（ａ）化合物、
（ｂ）該化合物を取り巻く、第一ポリマーを含む第一所定固体ポリマー層、および
（ｃ）該第一層を取り巻く、第二ポリマーを含む第二所定固体ポリマー層、
を含み、該第一ポリマーと該第二ポリマーが反対電荷を有し、かつ該ナノ粒子の直径が約１００nm〜約５００nmである治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学検診および治療のための治療用ナノ粒子の分野に関する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年７月１６日出願の米国仮出願第６０／９５９，７２８号に対して優先権の特典を主張し、その内容の全体は、参照により本明細書に援用したものとする。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、医学検診および治療のための治療用ナノ粒子の分野にある。
【０００４】
多くの強力な薬剤および薬剤候補、特に抗癌薬は水に難溶性である（例えばタモキシフェン、パクリタキセル、およびカンプトテシン）。それらは難溶性であるために、生物学的利用能が低く剤形の調製が困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この問題を解決するための現在の試みは、様々なナノサイズの医薬用担体、例えばリポソーム（リポソームの疎水性膜内に薬剤を装填する）、ミセル（ミセルの疎水性コア内に薬剤を装填する）に難溶性薬剤（通常、疎水性分子）を装填すること、および水中油滴型乳濁液に関連する。しかし、これら手法には多くの共通する問題が付随している。例えば、ナノ担体は、ナノ担体内への薬剤の装填効力が比較的低い（０．５％〜２５重量％、しばしば１０重量％未満）；各薬剤は、それ自体特定の可溶化条件を必要とするので、プロトコルを標準化することができない；技術を拡大することが困難である；そのようなナノ系の表面特性もしくは表面組成の制御が困難である、かつナノ担体の保存安定性は不十分であり、体内で不安定なことが実証されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、高濃度の水難溶性薬剤を含む安定したナノコロイドを作製するための普遍的プラットフォームの発見に少なくとも部分的に基づく。この発見を活用して、一態様では、化合物もしくは薬剤、該化合物を取り巻く、第一ポリマーを含む第一所定固体ポリマー層、および第一層を取り巻く、第二ポリマーを含む第二所定固体ポリマー層から構成された一組もしくは複数の二重層を含むナノ粒子であって、第一ポリマーと第二ポリマーが反対電荷を有し、直径が約１００nm〜約５００nmであるナノ粒子を特徴とする本発明を開発した。他の実施形態では、各層は、類似の等電点を有する二種以上のポリマーから構成することができる。
【０００７】
ある実施形態では、ナノ粒子の直径は、約１００nm〜約４５０nm、約１００nm〜約４００nm、約１００nm〜約３００nm、約１００nm〜約２５０nm、約１００nm〜約２００nm、約１００nm〜約１５０nm、または約１００nmである。
【０００８】
いくつかの実施形態では、化合物は、ナノ粒子内に約５重量％〜約９５重量％、約２０重量％〜約９０重量％、約４０重量％〜約８５重量％、約６０重量％〜約８５重量％、約７５重量％〜約９０重量％、および約８０重量％〜約９０重量％存在する。
【０００９】
他の実施形態では、第一ポリマー層と第二ポリマー層とを併せた厚みは、約５nm〜約３０nm、約５nm〜約２５nm、約５nm〜約２０nm、約５nm〜約１５nm、および約５nm〜約１０nmである。
【００１０】
ある実施形態では、第一ポリマーは正電荷であり、かつ第二ポリマーは負電荷である。他の実施形態では、第一ポリマーは負電荷であり、かつ第二ポリマーは正電荷である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、化合物は本明細書に記載した治療化合物である。一実施形態では、化合物は、本明細書に記載した癌治療薬である。特定の実施形態では、化合物はタモキシフェンまたはパクリタキセルである。他の実施形態では、化合物は、低可溶性抗癌薬、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、ＫＲＮ ５５００（ＫＲＮ）、メソ-テトラフェニルポルフィン、デキサメタゾン、ベンゾジアゼピン、アロプリノール、アセトヘキサミド、ベンズチアジド、クロルプロマジン、クロルジアゼポキシド、ハロペリドール、インドメタシン、ロラゼパム、メトキサレン、メチルプレドニゾン、ニフェジピン、オキサゼパム、オキシフェンブタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ピリメトアミン、フェニンジオン、スルフイソキサゾール、スルファジアジン、テマゼパム、スルファメラジン、エリプチシン、光線力学的治療用ポルフィン誘導体、および／またはトリオキサレンである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は二種以上の化合物を含む。
【００１２】
さらに他の実施形態では、第一ポリマーは、ポリ（ジメチルジアリルアミドアンモニウム塩化物）（ＰＤＤＡ）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）、またはプロタミン硫酸塩（ＰＳ）である。ある実施形態では、第一ポリマーは、ポリ（アリルアミン）、ポリ（ジメチルジアリアンモニム（dimethyldiallyammonim）塩化物）ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（アリルアミン）、デキストランアミン、ポリアルギニン、キトサン、ゼラチンＡ、またはプロタミン硫酸塩である。いくつかの実施形態では、第二ポリマーは、ナトリウムポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＳＳ）、またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。特定の実施形態では、第二ポリマーは、ポリグルタミン酸もしくはアルギン酸、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタル酸）、デキストラン硫酸塩、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチンＢ、コンドロイチン硫酸塩、および／またはヘパリンである。
【００１３】
ある実施形態では、第一ポリマーは、生体適合性および／または生分解性ポリマーである。他の実施形態では、第二ポリマーは、生体適合性および／または生分解性ポリマーである。他の実施形態では、両第一および第二ポリマーは、生体適合性および／または生分解性である。
【００１４】
さらに他の実施形態では、ナノ粒子は、さらに、第二ポリマー層を取り巻く第三ポリマー層を含む。特定の実施形態では、第三ポリマー層は、第二ポリマーの反対電荷を有する第三ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、第三ポリマー層はＰＤＤＡを含む。ある実施形態では、第一ポリマーと第三ポリマーは同一である。
【００１５】
他の実施形態では、化合物は水に難溶性である。特定の実施形態では、化合物は、水性媒体への溶解度が約１０mg/mL未満、約５mg/mL未満、約２．５mg/mL未満、約１mg/mL未満、または約０．５mg/mL未満である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、最外側のポリマー層は標的薬によって改変されている。ある実施形態では、標的薬は抗体である。特定の実施形態では、抗体は、ＩＬ２受容体ａ、補体系タンパク質Ｃ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＴＮＦ−α、Ｔ細胞ＣＤ３受容体、Ｔ細胞ＶＬＡ４受容体、ＲＳＶのＦタンパク質、上皮成長因子受容体、血管内皮増殖因子、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＣＤ５２、または上皮成長因子受容体に対する抗体である。他の実施形態では、抗体はモノクローナル２Ｃ５抗体である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、洗浄剤、界面活性剤、または油分を含まない。
【００１８】
他の実施形態では、化合物は、約２時間経つと、１、２、３、および４組のポリマー二重層コーティングを有する前記ナノ粒子から、それぞれ約９％、約７％、約６％〜４％、および約３％の速度で放出される。
【００１９】
別の態様では、本発明は、化合物、および逆帯電したポリマー（複数）の交互ポリマー層を含むポリマーコーティングを含み、直径が約１００nm〜約５００nmであるナノ粒子を特徴とする。ある実施形態では、ナノ粒子は、逆帯電したポリマー（複数）の２、３、４、５、または６種のポリマー層を含む。
【００２０】
ある実施形態では、ナノ粒子の直径は、約１００nm〜約４５０nm、約１００nm〜約４００nm、約１００nm〜約３００nm、約１００nm〜約２５０nm、約１００nm〜約２００nm、約１００nm〜約１５０nm、または約１００nmである。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ポリマーは、本明細書に記載したポリマーである。特定の実施形態では、ナノ粒子は、ポリ（ジメチルジアリルアミドアンモニウム塩化物）（ＰＤＤＡ）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）、またはプロタミン硫酸塩（ＰＳ）を含む第一ポリマー層を含む。他の実施形態では、ナノ粒子は、ナトリウムポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＳＳ）、またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む第二ポリマー層を含む。さらに他の実施形態では、ナノ粒子は、ポリ（ジメチルジアリルアミドアンモニウム塩化物）（ＰＤＤＡ）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）、またはプロタミン硫酸塩（ＰＳ）を含む第三ポリマー層を含む。さらに他の実施形態では、ナノ粒子は、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む第四ポリマー層を含む。そして、さらに他の実施形態では、ナノ粒子は、ポリ（ジメチルジアリルアミドアンモニウム塩化物）（ＰＤＤＡ）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）、またはプロタミン硫酸塩（ＰＳ）を含む第五ポリマー層を含む。さらに別の実施形態では、ナノ粒子は、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む第六ポリマー層を含む。
【００２２】
他の実施形態では、化合物は水に難溶性である。特定の実施形態では、化合物は、水性媒体への溶解度が約１０mg/mL未満、約５mg/mL未満、約２．５mg/mL未満、約１mg/mL未満、または約０．５mg/mL未満である。
【００２３】
ある実施形態では、化合物は本明細書に記載した治療化合物である。いくつかの実施形態では、化合物はタモキシフェンまたはパクリタキセルであり、化合物は、約５重量％〜約９５重量％、約２０重量％〜約９０重量％、約４０重量％〜約８５重量％、約６０重量％〜約８５重量％、約７５重量％〜約９０重量％、および約８０重量％〜約９０重量％存在する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、本明細書に記載したナノ粒子である。
【００２４】
別の態様では、本発明は、非水溶性化合物を超音波処理にかける工程、および超音波処理の存在下で化合物に第一ポリマーを加える工程を含む安定したナノ粒子の作製方法であって、該化合物の周囲に安定した第一ポリマー層を形成するのに十分な濃度で該ポリマーを加える作製方法を特徴とする。
【００２５】
いくつかの実施形態では、超音波処理後、前記非水溶性化合物は、前記ポリマーの非存在下では負電荷を有する。他の実施形態では、化合物に加えるポリマーは正電荷を有する。
【００２６】
特定の実施形態では、前記超音波処理を約２０℃〜約３０℃で実施する。ある実施形態では、前記超音波処理を約１０℃〜約４０℃、約１５℃〜約３５℃、または約１０℃〜約２５℃で実施する。
【００２７】
ある実施形態では、ナノ粒子の直径は、約１００nm〜約４５０nm、約１００nm〜約４００nm、約１００nm〜約３００nm、約１００nm〜約２５０nm、約１００nm〜約２００nm、約１００nm〜約１５０nm、または約１００nmである。
【００２８】
他の実施形態では、化合物は水に難溶性である。特定の実施形態では、化合物は、水性媒体への溶解度が約１０mg/mL未満、約５mg/mL未満、約２．５mg/mL未満、約１mg/mL未満、または約０．５mg/mL未満である。
【００２９】
ある実施形態では、化合物は本明細書に記載した治療化合物である。いくつかの実施形態では、化合物はタモキシフェンまたはパクリタキセルであり、化合物は約５重量％〜約９５重量％、約２０重量％〜約９０重量％、約４０重量％〜約８５重量％、約６０重量％〜約８５重量％、約７５重量％〜約９０重量％、および約８０重量％〜約９０重量％存在する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、本明細書に記載したナノ粒子である。
【００３０】
他の実施形態では、第一ポリマーは、ポリ（ジメチルジアリルアミドアンモニウム塩化物）（ＰＤＤＡ）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）、またはプロタミン硫酸塩（ＰＳ）である。特定の実施形態では、方法は、さらに、第一ポリマー層を形成した後、ナノ粒子に第二ポリマーを加える工程を含む。いくつかの実施形態では、第二ポリマーは、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）、またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。
【００３１】
さらに別の態様では、本発明は、腫瘍を有する対象の治療方法であって、腫瘍の大きさまたは腫瘍細胞数を減少させるのに十分な量で、該対象にナノ粒子を投与する工程を含み、該ナノ粒子が、化合物、該化合物を取り巻く、第一ポリマーを含む第一所定固体ポリマー層、および第一層を取り巻く、第二ポリマーを含む第二所定固体ポリマー層を含み、第一ポリマーと第二ポリマーが反対電荷を有し、かつ該ナノ粒子の直径が約１００nm〜約５００nmである治療方法を特徴とする。
【００３２】
ある実施形態では、ナノ粒子の直径は、約１００nm〜約４５０nm、約１００nm〜約４００nm、約１００nm〜約３００nm、約１００nm〜約２５０nm、約１００nm〜約２００nm、約１００nm〜約１５０nm、または約１００nmである。
【００３３】
ある実施形態では、化合物は本明細書に記載した治療化合物である。いくつかの実施形態では、化合物はタモキシフェンまたはパクリタキセルであり、化合物は約５重量％〜約９５重量％、約２０重量％〜約９０重量％、約４０重量％〜約８５重量％、約６０重量％〜約８５重量％、約７５重量％〜約９０重量％、および約８０重量％〜約９０重量％存在する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、本明細書に記載したナノ粒子である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、対象は脊椎動物である。ある実施形態では、対象は哺乳動物である。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００３５】
以下の図は、例証のみを目的として提供され、限定することを目的とするものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】本発明のナノ粒子の作製方法を示す図である。
【図１Ｂ】抗体と本発明のナノ粒子の抱合方法を示す図である。
【図２】様々な超音波処理時間後の、タモキシフェンまたはパクリタキセルを含むナノ粒子の粒径を表すグラフである。
【図３】通常のウォーターバス超音波処理またはパルス帯電式超音波処理後、タモキシフェン粒子（５mg/mL）から入手したゼータ電位を表すグラフである。
【図４】タモキシフェン（２mg/mL）ナノ粒子上に、ＰＤＤＡまたはＰＳＳを連続的に加えることによって入手したゼータ電位を表すグラフである。
【図５】パクリタキセル（２．５mg/mL）含有ナノ粒子上に、ＰＡＨおよびＰＤＤＡを加えることによって入手したゼータ電位を表すグラフである。
【図６】パクリタキセル（４mg/mL）含有ナノ粒子上に、ＰＡＨおよびＰＳＳを連続的に加えることによって入手したゼータ電位を表すグラフである。
【図７Ａ】２mg/mL ＰＡＨ付きタモキシフェン含有ナノ粒子の低倍率走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）イメージ画像である。
【図７Ｂ−７Ｃ】２個のタモキシフェン含有ナノ粒子のより高い倍率のＳＥＭイメージ画像である。
【図８】ポリアニオンＰＳＳでコーティングしたタモキシフェンのＳＥＭイメージ画像である。
【図９Ａ】いかなる高分子電解質もない氷上で、１８ワットで１０分間超音波処理したパクリタキセル（２mg/mL）のＳＥＭイメージ画像である。
【図９Ｂ】いかなる高分子電解質もない液体窒素環境で１８ワットで１０分間超音波処理したパクリタキセル（２mg/mL）のＳＥＭイメージ画像である。
【図９Ｃ】液体窒素環境で２組の二重層（ＰＡＨ−ＰＳＳ）２を沈着させた後に得られたパクリタキセル（２mg/mL）粒子のＳＥＭイメージ画像である。
【図９Ｄ】液体窒素環境で２組の二重層（ＰＡＨ−ＰＳＳ）２を沈着させた後に得られたパクリタキセル（２mg/mL）粒子のＳＥＭイメージ画像である。
【図１０】ＦＩＴＣ標識ＰＡＨでコーティングしたタモキシフェン含有ナノ粒子分散液の共焦点蛍光イメージ画像である。
【図１１】第三ＰＡＨ層をＦＩＴＣで標識した、ＰＡＨ−ＰＳＳ−ＰＡＨシェル組成物を含むタモキシフェン含有ナノ粒子の共焦点蛍光イメージ画像である。
【図１２】超音波処理なしのタモキシフェン単独、超音波処理付きタモキシフェン単独、単一ＰＤＤＡ層を有するタモキシフェン含有ナノ粒子、または（ＰＤＤＡ−ＰＳＳ）３二重層付きタモキシフェン含有ナノ粒子からのタモキシフェンの経時的放出を表すグラフである。
【図１３】超音波処理付き裸のパクリタキセル、ＰＤＤＡ一層を有するパクリタキセル含有ナノ粒子、または（ＰＤＤＡ−ＰＳＳ）３二重層を有するパクリタキセル含有ナノ粒子からのパクリタキセルの経時的放出を表すグラフである。
【図１４】様々な濃度の、パクリタキセル含有ナノ粒子、ｍＡｂ ２Ｃ５で修飾したパクリタキセル含有ナノ粒子、または上昇濃度の未変性ｍＡｂ ２Ｃ５について、ＥＬＩＳＡアッセイを表すグラフである。
【図１５】ＦＩＴＣ−ＰＡＨでコーティングした、メソ-テトラフェニルポルフィリン含有ナノ粒子のゼータ電位を表すグラフである。
【図１６】ＰＡＨ、ＰＤＤＡ、ポリＬ−リジン、ＰＳＳでコーティングした、または未コートのカンプトテシン含有ナノ粒子の粒径を表すグラフである。
【図１７】ＰＳ、（ＰＳ−ＨＳＡ）１、（ＰＳ−ＨＳＡ）１ＰＳ、または（ＰＳ−ＨＳＡ）２でコーティングしたパクリタキセル含有ナノ粒子のゼータ電位を表すグラフである。
【図１８】超音波処理付き裸のパクリタキセル、ＰＤＤＡ１層付きパクリタキセル含有ナノ粒子、（ＰＳ−ＨＳＡ）２層を有するパクリタキセル含有ナノ粒子、または（ＰＤＤＡ−ＰＳＳ）３層を有するパクリタキセル含有ナノ粒子からパクリタキセルの経時的放出を表すグラフである。
【図１９】（ＰＳ−ＨＳＡ）３層でコーティングしたパクリタキセル含有ナノ粒子からのパクリタキセルの経時的放出を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
別段の明記がない限り、本明細書で使用する技術的および科学的用語は全て、本発明が属する当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本発明の実施もしくは試験には、本明細書に記載したものに類似し、またはそれらと等しい方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。GenBankデータベース配列を含め、本明細書に記載した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献の全体は参照により援用される。矛盾が場合によっては、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は、説明にすぎず限定するつもりはない。
【００３８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００３９】
[定義]
「タンパク質」という用語は、本明細書で「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語と互換的に使用される。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「対象」は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ブタ、または非ヒト霊長類、例えば、サル、チンパンジー、ヒヒ、もしくはアカゲザルである。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「生分解性」という用語は、（例えば、ヒトなどの脊椎動物において）自然の生物学的過程により、構成分子中で（例えば化学的もしくは酵素的に）崩壊しまたは分解する物質をさす。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「生体適合性」という用語は、標的生物の生物学的機能に予期しない有毒または有害な作用を与えない物質をさす。
【００４３】
「標的薬」という用語は、所望の標的分子と、相互作用するにせよ、そうでないにせよ、特異的にもしくは選択的に（すなわち非無作為に）結合しまたはハイブリダイズすることができるリガンドもしくは分子をさす。標的薬の例には、それだけには限定されないが、核酸分子（例えば、アプタマー、アンチセンス、またはリボザイムなど、リガンドが結合するＲＮＡ分子を含む、ＲＮＡおよびＤＮＡ）、ポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質、受容体リガンド、シグナルペプチド、および疎水性膜貫通ドメイン）、抗体（およびその一部）、有機分子（例えば、ビオチン、炭水化物、および糖タンパク）、および無機分子（例えばビタミン）が含まれる。本明細書に記載したナノ粒子は、様々のそのような標的薬の一種以上をそれに付加することができる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「ナノ粒子」という用語は、直径が約５０nm〜約１０００nmの範囲にある粒子をさす。ナノ粒子には、対象内で放出可能な治療薬または診断薬を含めることができる粒子が含まれる。本明細書では、「ナノ粒子」および「ナノコロイド」という用語を互換的に使用する。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「約（about）」は、引用した値から±１０％の範囲にある数値を意味する。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「治療する（treat）」、「治療（treating）」、または「治療（treatment）」は、疾病（例えば本明細書に記載した疾病）もしくはその症状を改善し、または疾病（例えば本明細書に記載した疾病）もしくはその症状の進行を防止しまたは遅らせるのに有効な量、方法（例えば投与計画）、および／または方式（例えば投与経路）で治療薬を投与することをさす。これは、例えば、統計上有意な程度に、または当業者が検出できる程度に、例えば、疾病もしくはその症状に関連するパラメーターを改善することによって実証できる。有効な量、方法、または方式は対象に応じて変えることができ、対象に合わせて調整してもよい。疾病もしくはその症状の進行を防止しまたは遅らせることによって、治療で、罹患した対象または診断対象の、疾病もしくはその症状から生じる悪化を防止または遅らせることができる。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「固体」層は、ナノ粒子内の化合物と、その化合物の外側環境と間の所定の堅い境界をさす。例えば、本明細書に記載したナノ粒子は、一層以上の固体ポリマー層を含むことができ、この層は、外部分子の化合物へのアクセスをナノ粒子コアで減少させ、または制限する。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「ポリマー」という用語は、繰り返しサブユニットから構成される分子をさす。そのような分子には、それだけに限定されないが、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、またはポリアルキレングリコールが含まれる。ポリマーも、生分解性および／または生体適合性でありうる。
【００４９】
本明細書では、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーをさす。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー、さらに一個以上のアミノ酸残基が天然のアミノ酸ではないアミノ酸ポリマーにも適用される。加えて、そのようなポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質には、任意の長さのアミノ酸鎖が含まれ、アミノ酸残基が共有結合性ペプチド結合によって結合する、完全長タンパク質が含まれる。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「安定した」は、ナノ粒子が作製されてから少なくとも６ヵ月という間、ナノ粒子の大半が、室温で、非懸濁形または乾燥ペレットとしてインタクトのまま残存することを意味する。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「難溶性」化合物とは、化合物のことをいう場合、水性媒体への溶解度が約１０mg/mL未満、例えば約１mg/mL未満の化合物を意味する。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「薬剤」という用語は、疾患もしくは状態の予防、診断、緩和、治療、または治癒で使用される任意の物質をさす。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「ゼータ電位」は、一荷電コロイドナノ粒子周囲の一イオン層、例えば荷電ポリマー層を超える電位を意味する。
【００５４】
「周囲（surrounding）」という用語は、本明細書では、薬剤または化合物または内部層の少なくとも一部を封入し、被覆し、包含し、またはその周囲に伸展することを意味するために使用される。
【００５５】
本明細書記載の方法は、部分的に、難溶性薬剤の安定したコロイドを作製するためのレイヤー−バイ−レイヤー（層ごとの）（ＬＢＬ）コーティング技術を使用する。この目的のために、粒径がおよそミクロンの難溶性薬剤の水性懸濁液を超音波処理またはボールミル処理（粉砕処理）などの物理的処理にかけ、個々の粒子のサイズをナノレベル（例えば約２５nm〜約１０００nm、約１００nm〜約５００nm、または約１００nm〜約２００nm）に減少させる。次いで、それらの表面に一層のポリマー薄層（または複数層）を形成することによって、それを溶液中で安定化させる。物理的処理の中止後、このポリマー層（または複数層）によって、粒子の集塊が防止され、それによって各コロイド粒子内に（例えば、約５０重量％を超え約９０重量％までの）高含有量で薬剤が含まれる、安定したコロイド分散液が形成される。例えば、超音波処理によって形成した薬剤ナノ懸濁液を水溶性ポリマー（ポリカチオンまたはポリアニオン）の存在下でインキュベートして、それらの表面にポリマーを沈着させた場合、ポリマーコーティングは、高分子電解質錯体化法に基づいて形成される。次いで、第一層と強固な静電的複合体（すなわち「二重層」）を形成する、別の逆帯電した高分子電解質を加えることによって、第一ポリマー層を安定化させることができる。これにより、各化合物ナノ粒子の周囲に、非常に薄いが安定したポリマー層もしくはシェルが出現する。このシェルによって、粒子の集塊を防止することができ、かつ任意の化合物粒子の表面に容易かつ再現可能にシェルは形成されうる。各ポリマー上の電荷密度またはコーティングサイクル数を変えることによって、ポリマーコートが異なる表面電荷および異なる厚みを有する、薬剤粒子を調製することができる。これにより、順次、そのような粒子からの薬剤放出を制御する方法が提供される。
【００５６】
吸着サイクル毎に、交互に反対電荷の最外層を形成することは手順の一部である。直鎖ポリアニオンおよびポリカチオンを交互に組み立てることによって、通常、１組の二重層に対して１〜２nmの成長工程がもたらされ、積み重ねられる二重層の数は１から数百の間で変化しうる。
【００５７】
[化合物]
本明細書に記載するナノ粒子には、多くのタイプの化合物、例えば治療用薬剤または薬剤を含めることができる。そのような治療薬は、それだけに限定されないが、ステロイド、鎮痛薬、局所麻酔薬、抗生剤、化学療法剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、増殖阻害剤、有糸分裂阻害剤、血管形成剤、抗精神病薬、中枢神経系（ＣＮＳ）薬；抗凝血剤、線維素溶解剤、増殖因子、抗体、眼薬、および代謝産物、類似体、誘導体、フラグメント、およびこれらの化学種の精製、単離、組換え、および化学合成バージョン、ならびにそれらの組合せであり得る。
【００５８】
代表的な有用治療薬には、それだけに限定されないが、タモキシフェン、パクリタキセル、低可溶性抗癌薬、カンプトテシンおよびその誘導体、例えば、トポテカンおよびイリノテカン、ＫＲＮ ５５００（ＫＲＮ）、メソ‐テトラフェニルポルフィン、デキサメタゾン、ベンゾジアゼピン、アロプリノール、アセトヘキサミド、ベンズチアジド、クロルプロマジン、クロルジアゼポキシド、ハロペリドール、インドメタシン、ロラゼパム、メトキサレン、メチルプレドニゾン、ニフェジピン、オキサゼパム、オキシフェンブタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ピリメトアミン、フェニンジオン、スルフイソキサゾール、スルファジアジン、テマゼパム、スルファメラジン、エリプチシン、光力学的治療用ポルフィン誘導体、および／またはトリオキサレン、ならびにペニシリン群、フルオロキノロン、および第一、第二、第三、および第四世代セファロスポリンを含む全ての主流抗生物質が含まれる。これらの薬剤は、特に、例えばMerck ＆ Co., Barr Laboratories, Avalon Pharma, and Sun Pharmaから市販されている。難溶性薬剤のナノサイズコロイド懸濁液は、薬剤の溶解度および生物学的利用能を増大させることができる。
【００５９】
有用な他の薬剤は、ガドリウムなどの造影剤である。
【００６０】
化合物は、一層ナノ粒子から約９％、二層（または１組の二重層）ナノ粒子から約７％、三層ナノ粒子から約６％〜約４％、または四層（または２組の二重層）ナノ粒子から約３％の速度で、開示するナノ粒子から放出される。
【００６１】
[ポリマー]
本明細書に記載したナノ粒子は、一層以上のポリマー層内に、本明細書に記載の化合物をカプセル化することによって製造でき、所定のポリマー層が形成される。場合によっては、ポリカチオンポリマーを使用する。そのようなポリカチオンポリマーには、それだけに限定されないが、ポリ（アリルアミン）、ポリ（ジメチルジアリアンモニム（dimethyldiallyammonim）塩化物）ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（アリルアミン）、および天然ポリカチオン、例えば、デキストランアミン、ポリアルギニン、キトサン、ゼラチンＡ、および／またはプロタミン硫酸塩が含まれる。他の例では、ポリアニオンポリマーが使用され、それらのポリマーには、それだけに限定されないが、ポリ（スチレンスルホン酸塩）、ポリグルタミン酸もしくはアルギン酸、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタル酸）；およびデキストラン硫酸イオンなどの類似する電離基を有する天然高分子電解質；カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチンＢ、コンドロイチン硫酸塩、および／またはヘパリンが含まれる。これらのポリマーは、合成し、単離し、または購入することができる。
【００６２】
場合によっては、生分解性および／または生体適合性ポリマーを使用する。これらには、それだけに限定されないが、実質上純粋な炭素格子（例えば黒鉛）、デキストラン、多糖、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、アクリレートゲル、ポリ無水物、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリテトラフロウロエチレン（polytetraflouroethylene）、ポリヒドロキシアルコン酸塩、架橋アルギン酸塩、ゼラチン、コラーゲン、架橋コラーゲン、コラーゲン誘導体（スクシニル化コラーゲンまたはメチル化コラーゲンなど）、架橋ヒアルロン酸、キトサン、キトサン誘導体（メチルピロリドン−キトサンなど）、セルロースおよびセルロース誘導体（酢酸セルロースまたはカルボキシメチルセルロースなど）、デキストラン誘導体（カルボキシメチルデキストランなど）、澱粉および澱粉誘導体（ヒドロキシエチル澱粉など）、他のグリコサミノグリカンおよびそれらの誘導体、他のポリアニオン性多糖またはそれらの誘導体、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸とポリグリコール酸のコポリマー（ＰＬＧＡ）、ラクチド、グリコリド、および他のポリエステル、ポリグリコリドホモポリマー、ポリオキサノン（polyoxanones）およびポリシュウ酸塩、ポリ（ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン）無水物（ＰＣＰＰ）とセバシン酸のコポリマー、ポリ（１−グルタミン酸）、ポリ（ｄ−グルタミン酸）、ポリアクリル酸、ポリ（ｄｌ−グルタミン酸）、ポリ（ｌ−アスパラギン酸）、ポリ（ｄ−アスパラギン酸）、ポリ（ｄｌ−アスパラギン酸）、ポリエチレングリコール、上に挙げたポリアミノ酸とポリエチレングリコールとのコポリマー、ポリペプチド、例えば、コラーゲン様、シルク様、およびシルク−エラスチン様タンパク質、ポリカプロラクトン、ポリ（アルキレンコハク酸塩）、ポリ（ヒドロキシ酪酸塩）（ＰＨＢ）、ポリ（ブチレンジグリコール酸塩）、ナイロン−２／ナイロン−６−コポリアミド、ポリジヒドロピラン、ポリホスファゼン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリカゼイン、ケラチン、ミオシン、およびフィブリン、シリコーンゴム、またはポリウレタンなどが含まれる。使用できる他の生分解性材料には、天然由来ポリマー、例えば、アカシア、ゼラチン、デキストラン、アルブミン、アルギン酸塩／澱粉など、または親水性であろうと、または疎水性であろうと合成ポリマーが含まれる。それら材料は、合成し単離することができ、市販されている。
【００６３】
[標的薬]
場合によっては、本明細書に記載したナノ粒子は、ナノ粒子の最外層を介してナノ粒子に取り付け、固定し、または抱合させる標的薬を含む。ある状況では、標的薬は、特定の生物学的標的に特異的に結合する。生物学的標的の非制限的な例には、腫瘍細胞、細菌、ウイルス、細胞表面タンパク質、細胞表面受容体、細胞表面多糖、細胞外マトリックスタンパク質、細胞内タンパク質および細胞内核酸が含まれる。標的薬は、例えば、様々な特異的リガンド、例えば、抗体、モノクローナル抗体およびそれらのフラグメント、葉酸塩、マンノース、ガラクトースおよび他のモノ−、ジ−、およびオリゴ糖、およびＲＧＤペプチドであってよい。
【００６４】
本明細書に記載したナノ粒子および方法は、任意の特定の標的薬に限定されることがなく、様々な標的薬を使用することができる。そのような標的薬の例には、それだけに限定されないが、核酸（例えばＲＮＡおよびＤＮＡ）、ポリペプチド（例えば受容体リガンド、シグナルペプチド、アビジン、タンパク質Ａ、および抗原結合タンパク質）、多糖、ビオチン、疎水基、親水基、薬剤、および受容体に結合する任意の有機分子が含まれる。場合によっては、本明細書に記載したナノ粒子は、１、２、またはそれ以上の様々な標的薬に抱合させることができる。例えば、２種以上の標的薬を使用する場合、標的薬は類似していても、または異なっていてもよい。特定のナノ粒子に２種以上の標的薬を利用することによって、複数の生物学的標的の標的化が可能になり、または特定の標的への親和性を増大させることができる。
【００６５】
数種の方式で標的薬をナノ粒子と結合させることができる。例えば、短鎖連結（例えば直接カップリング）、中鎖連結（例えば、ＳＰＤＰ（Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL）などの小分子のニ官能基リンカーを使用）、または長鎖連結（例えばＰＥＧニ官能基リンカー（Nektar Therapeutics, Inc., San Carlos, CA））により、標的薬をナノ粒子の他の小成分／要素と結合させることができる（例えば共有結合または非共有結合させる）。あるいは、最外側のポリマー層にそのような薬剤を直接抱合させることができる。
【００６６】
さらに、本明細書に記載したナノ粒子を製造するために使用するポリマーには、反応基（例えばアミン基、例えば、ポリリジン、デキストラネミン（dextranemine）、プロファミン（profamine）硫酸塩、および／またはキトサン）を組み込むこともできる。反応基によって、さらに、様々な特異的リガンドまたはレポーター基（例えば１２５Ｉ、１３１Ｉ、Ｉ、Ｂｒ；１１１Ｉｎ、９９ｍ−Ｔｃ、ＧＤ、Ｍｎなどのレポーター重金属を搭載できるＤＴＰＡなどの様々なキレート基；ＦＩＴＣ、ローダミン、Ａｌｅｘａ、および量子ドットなどの蛍光基）、および／または他の部分（例えばリガンド、抗体、および／またはその一部）が結合できるようになる。これらの部分は、本明細書に記載したナノ粒子のその形成中に、ポリマーシェル中に組み込むこともできる。
【００６７】
[標的薬としての抗体]
場合によっては、標的薬は、抗原結合タンパク質もしくは抗体、またはその結合部分である。抗体を産生して、様々な生物学的標的（例えば病原体、腫瘍細胞、正常組織）上の抗原または免疫原（例えば腫瘍、組織、または病原体特異的抗原）の特異的標的化を行うことができる。そのような抗体には、それだけに限定されないが、ポリクローナル抗体；モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント；キメラ抗体など改変抗体、再形成抗体、ヒト化抗体、またはそのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）；または生合成抗体、例えば、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖｓ、または一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）が含まれる。
【００６８】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製し使用する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Harlowら, Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol I. Cold Spring Harbor Laboratory（１９９８年１２月１日）にある。改変抗体および抗体フラグメント（例えば、キメラ抗体、再形成抗体、ヒト化抗体、またはそのフラグメント、例えば、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント）；または生合成抗体（例えば、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（ＤＡＢｓ）、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）など）の作製方法が、当技術分野で公知であり、例えばZola, Monoclonal Antibodies: Preparation and use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Springer Verlag（２０００年１２月１５日、第１版）に見出すことができる。
【００６９】
場合によっては、抗体は、腫瘍特異的エピトープを認識する［例えば、タグ−７２（Kjeldsenら, Cancer Res., 48：2214-2220 （1988）、米国特許第５，８９２，０２０号；同第５，８９２，０１９号、および同第５，５１２，４４３号）、ヒト癌抗原（米国特許第５，６９３，７６３号、同第５，５４５，５３０号、および同第５，８０８，００５号）、骨癌細胞由来ＴＰ１およびＴＰ３抗原（米国特許第５，８５５，８６６号）、腺癌細胞由来Thomsen-Friedenreich（ＴＦ）抗原（米国特許第５，１１０，９１１号）、ヒト前立腺（prostrate）腺癌由来「ＫＣ−４抗原」（米国特許第４，７０８，９３０号および同第４，７４３，５４３号）、ヒト直腸結腸癌抗原（米国特許第４，９２１，７８９号）、嚢胞腺癌由来ＣＡ１２５抗原（米国特許第４，９２１，７９０号）、ヒト乳癌由来ＤＦ３抗原（米国特許第４，９６３，４８４号および同第５，０５３，４８９号）、ト胸部腫瘍抗原（米国特許第４，９３９，２４０号）、ヒト黒色腫のｐ９７抗原（米国特許第４，９１８，１６４号）、癌腫またはオロソムコイド関連抗原（ＣＯＲＡ）（米国特許第４，９１４，０２１号）、ヒト扁平細胞肺癌と反応するがヒト小細胞肺癌とは反応しないヒト肺癌抗原（米国特許第４，８９２，９３５号）、ヒト乳癌の糖タンパク中のＴおよびＴｎハプテン（Springerら, Carbohydr. Res., 178：271-292 （1988））、ＭＳＡ乳癌糖タンパク質（Tjandraら, Br. J. Surg., 75：811-817 （1988））、ＭＦＧＭ乳癌抗原（Ishidaら, Tumor Biol, 10: 12-22 （1989））、ＤＵ−ＰＡＮ−２膵臓癌抗原（Lanら, Cancer Res., 45：305-310 （1985））、ＣＡ１２５卵巣癌抗原（Hanischら, Carbohydr. Res., 178：29-47 （1988））、およびＹＨ２０６肺癌抗原（Hinodaら, Cancer J., 42：653-658 （1988））］。
【００７０】
例えば、乳癌細胞を標的とするために、葉酸、ＥＧＦ、ＦＧＦ、および抗体（または抗体フラグメント）によって、ナノ粒子を腫瘍関連抗原ＭＵＣ１、ｃＭｅｔ受容体およびＣＤ５６（ＮＣＡＭ）に改変することができる。
【００７１】
使用可能な他の抗体は、特異的病原体（例えばレジオネラペオモフィリア（Legionella peomophilia）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、破傷風菌（Clostridium tetani）、インフルエンザ菌（Hemophilus influenzae）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、コレラ菌（ Vibrio cholerae）、ライム病ボレリア（Borrelia burgdorferi）、ジフテリア菌（Cornebacterium diphtheria）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、風疹ウイルス、およびポリオウイルス）を認識する。
【００７２】
本明細書に記載したナノ粒子に結合することができる抗体またはリガンドは、それだけに限定されないが、抗体には、ＩＬ２受容体ａ、補体系タンパク質Ｃ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＴＮＦ−α、Ｔ細胞ＣＤ３受容体、Ｔ細胞ＶＬＡ４受容体、ＲＳＶのＦタンパク質、上皮成長因子受容体、血管内皮増殖因子、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＣＤ５２、および上皮成長因子受容体が含まれる。
【００７３】
ナノ粒子への抗体の結合は、ポリリジンまたはアミンデキストランの最外側ポリカチオン層の遊離アミン基への標準的な共有結合を通じて実施することができる（例えば、Torchilinら, （1987） Hybridoma, 6：229-240；Torchilinら, （2001） Biochim. Biophys. Acta, 1511：397-411；Masukoら, （2005）, Biomacromol., 6：800-884を参照）。
【００７４】
例えば、ポリカチオン／ポリアニオン多層シェルの形成中、組立てのあらゆる段階で、懸垂電離基の約５０％が前の層と反応し、他方の約５０％は最外側シェルで遊離しており、所与の表面電位によって示唆される表面電荷を提供する。従って、最外側シェルのアミンまたは酸性反応基の数は、ポリマー中の懸垂基の半分に相当しうる、例えば、直径１００nmのナノシェル最外層中のポリ（リジン）またはポリ（アリルアミン）には３，０００個の懸垂アミン基である。タンパク質の共有結合の標準的方法は、アミン基を介する共有結合などが知られている。この方法は例えば、Protein Architecture: Interfacing Molecular Assemblies and Immobilization, editors: Lvovら, （2000） Chapter 2, pp. 25-54に見出すことができる。
【００７５】
粒子のポリマーコートを活性化するためには、ポリマーは、遊離アミノ、カルボキシ、ＳＨ−、エポキシ−、および／もしくはリガンド分子と直接、または例えば、カルボジイミド、ＳＰＤＰ、ＳＭＣＣ、および／もしくは他の単官能性およびニ官能性試薬によって予備活性化後、反応させることができる他の基を有する粒子の最後の層に使用することができる。
【００７６】
[標的薬としてのシグナルペプチド]
場合によっては、標的薬はシグナルペプチドを含む。これらのペプチドは、公知の技術を使用し、化学合成し、またはクローン化し、発現させ、かつ精製することができる。シグナルペプチドは、細胞内の個々の（discreet）領域を本明細書に記載したナノ粒子の標的とするために使用できる。場合によっては、特異的アミノ酸配列は、細胞オルガネラおよび区画中にナノ粒子を標的化に関与している。例えば、シグナルペプチドは、ミトコンドリア中に本明細書に記載したナノ粒子を向かわせることができる。他の例では、核移行シグナルを使用する。
【００７７】
[標的薬としての核酸]
他の例では、標的薬は核酸（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）である。いくつかの例では、核酸標的薬は、塩基対形成によって特定の核酸（例えば染色体ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはリボソームのＲＮＡ）とハイブリダイズにするように設計されている。他の状況では、核酸は、リガンドまたは生物学的標的と結合する。例えば、核酸は、逆転写酵素であるＨＩＶのＲｅｖまたはＴａｔタンパク質（Tuerkら, Gene, 137（1）：33-9 （1993））、ヒト神経成長因子（Binkleyら, Nuc. Acids Res., 23（16）：3198-205 （1995））；または血管内皮増殖因子（Jellinekら, Biochem., 83（34）: 10450-6 （1994））と結合することができる。リガンドと結合する核酸は、ＳＥＬＥＸ手順などの公知の方法によって同定することができる（例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、同第５，２７０，１６３号、および同第５，４７５，０９６号、および国際公開公報第９７／３８１３４号、同第９８／３３９４１号、および同第９９／０７７２４号を参照）。標的薬は、特定の配列と結合するアプタマーであってもよい。
【００７８】
[他の標的薬]
標的薬は、予め選択した生物学的標的（例えば病原体、腫瘍細胞、または正常細胞）上の様々なエピトープを認識することができる。例えば、ある場合には標的薬は、ＨＩＶ（Wiesら, Nature, 333：426 （1988））、インフルエンザ（Whiteら, Cell, 56：725 （1989））、クラミジア（Infect. Immunol, 57：2378 （1989））、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、ブタ連鎖球菌（Streptococcus suis）、サルモネラ、流行性耳下腺炎、ニューカッスル、レオウイルス、センダイウイルス、およびミクソウイルスを標的とするシアル酸；およびコロナウイルス、脳脊髄炎ウイルス、およびロータウイルスを標的とする９−ＯＡＣシアル酸；サイトメガロウイルス（Virology, 176：337 （1990））および麻疹ウイルス（Virology, 172：386 （1989））を標的とする非シアル酸糖タンパク；ＣＤ４（Khatzmanら, Nature, 312：763 （1985））；血管作動性腸管ペプチド（Sacerdoteら, J. of Neuroscience Research, 18: 102 （1987））、およびＨＩＶを標的とするペプチドＴ（Ruffら, FEBS Letters, 211 : 17 （1987））；ワクシニア（Epsteinら, Nature, 318: 663 （1985））を標的とする上皮細胞増殖因子、狂犬病（Lentzら, Science 215: 182 （1982））を標的とするアセチルコリン受容体；エプスタイン−バーウイルス（Carelら, J. Biol. Chem., 265: 12293 （1990））を標的とするＣｄ３補体受容体；レオウイルス（Coら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 1494 （1985））を標的とするβ−アドレナリン作動性受容体；ＩＣＡＭ−１（Marlinら, Nature, 344：70 （1990））；Ｎ−ＣＡＭ；およびライノウイルスを標的とするミエリン関連糖タンパク質ＭＡｂ（Shepheyら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85：7743 （1988））；ポリオウイルス（Mendelsohnら, Cell, 56：855 （1989））を標的とするポリオウイルス受容体；ヘルペスウイルス（Kanerら, Science, 248: 1410 （1990））を標的とする線維芽細胞増殖因子受容体；大腸菌を標的とするオリゴマンノース；および髄膜炎菌を標的とするガングリオシドＧＭ１であってよい。
【００７９】
他の例では、標的薬は、本開示によるナノ粒子を発癌遺伝子によって発現した因子に向かわせる。これらには、それだけに限定されないが、Ｓｒｃファミリーの構成要素など、チロシンキナーゼ（膜結合体および細胞質体）；Ｍｏｓなどのセリン／トレオニンキナーゼ；血小板由来成長因子（ＰＤＤＧ）など増殖因子および受容体：ｒａｓファミリーを含む低分子量ＧＴＰ分解酵素（Ｇタンパク質）；サイクリン依存性タンパク質キナーゼ（ｃｄｋ）；ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、およびＬ−ｍｙｃを含むｍｙｃファミリーメンバーの構成要素；およびｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含めることができる。
【００８０】
さらに、受容体を有し、またはそうでないにせよ、ビタミンを摂取するための生物学的標的（例えば細胞）に向かわせる標的薬としてとして、ビタミン（脂溶性および非脂溶性ビタミン）を使用することができる。例えば、脂溶性ビタミン（ビタミンＤおよびその類似体、ビタミンＥ、ビタミンＡなど）、および水溶性ビタミン（ビタミンＣなど）を標的薬として使用することができる。
【００８１】
[治療投与]
本明細書に記載したナノ粒子を使用して、疾患細胞および組織を治療する（例えば、疾患細胞および組織への薬剤の移行を仲介する）ことができる。この点で、様々な疾患が、本明細書に記載したナノ粒子および方法を用いる治療に適している。対象ナノ粒子によって治療できる疾患の例示的で、非制限的リストには、乳癌、前立腺癌、肺癌、リンパ腫、皮膚癌、膵癌、大腸癌、黒色腫、卵巣癌、脳腫瘍、頭頚部癌、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌（non-small lung cancer）、子宮頚癌、白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性硬化症、神経芽細胞腫および神経膠芽腫、ＴおよびＢ細胞介在自己免疫疾患、炎症性疾患、感染、過剰増殖性疾患、ＡＩＤＳ、変性疾患、心血管疾患、移植拒絶などが含まれる。場合によっては、治療する癌細胞は転移性である。
【００８２】
本明細書に記載したナノ粒子の投与経路および／または方式は、所望の結果に応じて異なることもある。投与計画は、所望する応答、例えば治療応答が提供されるように調節することができる。
【００８３】
投与方法には、それだけに限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、脳内、腟内、経皮、直腸、吸入、または局所的、特に耳、鼻、眼、または皮膚へ局所的行うことが含まれる。投与方式は、医師の裁量に任される。
【００８４】
場合によっては、本明細書に記載したナノ粒子は局所的に投与される。これは、例えば、手術中の局所注入、局所使用（例えば、クリームまたはローションで）、注射、カテーテル、座薬または浣腸液、またはインプラントによって行われ、前記インプラントは、サイラスティック（sialastic）メンブレンなどのメンブレン、または繊維を含む多孔質性、非多孔質性、またはゼリー状材料のものでよい。場合によっては、脳室内、くも膜下腔内注射、傍脊柱（paraspinal）注射、硬膜外注射、浣腸液を含む任意の好適な経路、および末梢神経に隣接して注射することによって、本明細書に記載したナノ粒子を中枢神経系、循環系、または消化管に導入する。脳室内注射は、例えば、オンマヤ貯留槽などの貯蔵部取り付けた脳室内カテーテルによって容易に行うことができる。
【００８５】
本開示はまた、本明細書に記載したナノ粒子を投与する器具を特徴とする。その器具は、例えば、医薬組成物を貯蔵する一個以上のハウジングを含むことができ、かつ本明細書に記載したナノ粒子の単位用量を送達するように構成することができる。
【００８６】
肺投与は、例えば、吸入器もしくは噴霧器とエアロゾル化薬剤を含む製剤との使用、またはフッ化炭素もしくは合成肺胞界面活性剤で灌流することによって行うこともできる。
【００８７】
場合によっては、本明細書に記載したナノ粒子を小胞、特にリポソームで送達することができる（Langer, Science 249：1527-1533 （1990）およびTreatら, Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer pp. 317-327 and pp. 353-365 （1989）を参照）。
【００８８】
さらに他の状況では、本明細書に記載したナノ粒子を制御放出系または持続放出系で送達することができる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 （1984）を参照）。Langer, Science 249: 1527-1533 （1990）による概説に記載された他の制御または持続放出系も使用することができる。一事例では、ポンプを使用することができる（Langer, Science 249: 1527-1533 （1990）；Sefton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14：201 （1987）；Buchwaldら, Surgery 88：507 （1980）、およびSaudekら, N. Engl. J. Med. 321 ：574 （1989））。
【００８９】
さらに他の状況では、制御または持続放出系は、本明細書に記載したナノ粒子の標的近傍に置くことができ、用量が全身性用量画分に減少される。本明細書に記載したナノ粒子は、好適な量の生理学的に許容される賦形剤（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences pp. 1447-1676 （Alfonso R. Gennaro編，第１９版，1995）を参照）を含む医薬組成物として製剤化する。そのような生理学的に許容される賦形剤は、例えば、石油、動物、植物、または合成を起源とする油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む水および油などの液体であってもよい。生理学的に許容される賦形剤は、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、澱粉ペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであってもよい。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤、滑沢剤、および着色剤を使用することができる。ある状況では、動物に投与する場合、生理学的に許容される賦形剤は無菌である。生理学的に許容される賦形剤は、製造および保管状態で安定しているべきであり、微生物の汚染作用から保護すべきである。本明細書に記載したナノ粒子を静脈内投与する場合、水は特に有用な賦形剤である。生理食塩水、および水性デキストロースやグリセロール溶液も、液体賦形剤として、特に注射液に使用することができる。好適な生理学的に許容される賦形剤には、澱粉、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなども含まれる。好適な生理学的に許容される賦形剤他の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences pp. 1447-1676 （Alfonso R. Gennaro編，第１９編，1995）に記載されている。必要に応じて、医薬組成物には、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含めてもよい。
【００９０】
液体担体は、溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ、およびエリキシルの調製に使用することができる。本明細書に記載したナノ粒子は、水、有機溶媒、両方の混合物、または製薬上許容される油または脂肪など、製薬上許容される液体担体に懸濁させることができる。液体担体には、溶解剤、乳化剤、緩衝液、防腐剤、甘味料、香味剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘度調節剤、安定剤、または浸透圧調節剤を含む他の好適な医薬添加物を含めることができる。経口および非経口投与用液体担体の好適な例には、水（特に、本明細書に記載した添加物、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を含むセルロース誘導体）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば分画ココナッツ油および落花生油）が含まれる。非経口投与には、担体は、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルであってもよい。液体担体は、投与には無菌液形であってよい。加圧組成物としての液体担体は、ハロゲン化炭化水素または他の製薬上許容される噴霧剤であってよい。
【００９１】
他の例では、本明細書に記載したナノ粒子を静脈内投与用に製剤化する。静脈内投与用組成物には、無菌等張緩衝水溶液を含めることができる。組成物には、可溶化剤を含めることもできる。静脈内投与用組成物は、注射部位で疼痛をやわらげるためにリグノカインなど局所麻酔薬を任意に含めてよい。成分は、別々で、または単位用量形に一緒に混合して、例えば、活性剤量を示すアンプルまたはサシェ（sachette）などの密封容器で、乾燥凍結乾燥粉または水不含濃縮物として供給することができる。本明細書に記載したナノ粒子を注入によって投与する場合、例えば、無菌医薬品等級水または生理食塩水を含む注入ボトルでナノ粒子を分注することができる。本明細書に記載したナノ粒子を注射により投与する場合、無菌注射用水または生理食塩水のアンプルを提供でき、それによって成分を投与前に混合することができる。
【００９２】
他の状況では、本明細書に記載したナノ粒子は、上皮組織および粘膜組織を含め、身体表面および身体通路の内層を超えて投与することができる。本明細書に記載したナノ粒子を用いることで、そのような投与は、ローション、クリーム、フォーム、パッチ、懸濁液、溶液、および座薬（例えば直腸用または膣用）で実施することができる。場合によっては、本明細書に記載したナノ粒子および本明細書に記載したナノ粒子に不活性な担体を含み、皮膚に無害であり、かつ皮膚を介して血流中に全身吸収させるためにその薬剤を送達することが可能な経皮パッチを使用することができる。担体は、任意の数の形態、例えば、クリームまたは軟膏、ペースト、ゲル、または閉塞性器具という形態をとることができる。クリームまたは軟膏は、水中油滴型または油中水滴型の粘稠性液体または半固体乳濁液であってよい。本明細書に記載したナノ粒子を含む石油または親水性石油に分散させた、吸収性粉末のペーストを使用することもできる。本明細書に記載したナノ粒子を血流中に放出するのに、担体があろうと、または担体がなかろうと、本明細書に記載したナノ粒子を含む貯蔵部を覆う半透膜、または本明細書に記載したナノ粒子を含むマトリックスなど、様々な閉塞性器具を使用することができる。
【００９３】
本明細書に記載したナノ粒子は、従来の座薬の形で経直腸的にまたは経膣的に投与することができる。座薬製剤は、当業者に公知の方法を使用し、座薬の融点を変えるためのワックスを添加した、または添加していないココアバター、およびグリセリンを含む従来の材料から作製することができる。様々な分子量のポリエチレングリコールなどの水溶性座薬の基材を使用することもできる。
【００９４】
疾病または疾患を治療するのに有効な本明細書に記載したナノ粒子の量は、当業者に公知の標準的臨床技術を使用し決定される。さらに、インビトロまたはインビボアッセイを任意で使用し、最適の投薬量の範囲を同定するのに役立てることができる。使用する正確な用量は、投与経路、状態、治療する状態の重症度、ならびに治療する個人に関連する様々な物理的要因にも依存し、かつ健康管理する医師の判断に従って決定されうる。例えば、本明細書に記載したナノ粒子の用量は、それぞれ、一日につき体重当たり約０．００１mg/kg〜約２５０mg/kg、一日につき体重当たり約１mg/kg〜約２５０mg/kg、一日につき体重当たり約１mg/kg〜約５０mg/kg、または一日につき体重当たり約１mg/kg〜約２０mg/kgの範囲であってよい。当量の投薬量を、それだけに限定されないが、約２時間毎、約６時間毎、約８時間毎、約１２時間毎、約２４時間毎、約３６時間毎、約４８時間毎、約７２時間毎、約毎週、約２週間毎、約３週間毎、約毎月、および約２ヵ月毎を含む様々な時間にわたって投与することができる。完了した治療コースに相当する投薬回数および頻度は、健康管理する医師の判断に従って決定することができる。
【００９５】
場合によっては、本明細書に記載した医薬組成物は、単位用量形、例えば、錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液、乳濁液、顆粒、または座薬などである。そのような形態では、医薬組成物は、本明細書に記載したナノ粒子を好適な量含む単位用量に小分けすることができる。単位用量形は、パッケージ化した医薬組成物、例えば、パケットの粉末、バイアル、アンプル、充填済み注射器、または液体を含むサシェであってよい。単位用量形は、例えば自体カプセルもしくは錠剤であってよく、または好適な数の任意のそのようなパッケージ形組成物であってよい。そのような単位用量形には、約１mg/kg〜約２５０mg/kg含めることができ、単一用量で、または２回以上の分割用量で投与することができる。
【００９６】
[キット]
本明細書に記載したナノ粒子は、キットで提供することができる。場合によっては、キットには、（ａ）ナノ粒子を含む容器、および任意により（ｂ）資料を含める。資料は、本明細書記載の方法および／またはナノ粒子の使用に関する説明書、指示書、販売書、または他の材料、例えば治療上の便益を目的したものであってよい。
【００９７】
キットの資料のその形態は限定されない。場合によっては、資料には、ナノ粒子の製造、ナノ粒子の分子量、濃度、有効期限についての情報、バッチまたは製造場所情報などを含めることができる。他の状況では、資料は、ナノ粒子の投与方法、例えば、好適な量、方法、または投与方式（例えば、本明細書に記載した用量、剤形、または投与方式）に関する。方法は、疾病を有する対象の治療方法でありうる。
【００９８】
場合によっては、資料は、例えば、使用説明書は、プリント物、例えば、プリントしたテキスト、図面、および／または写真、例えば、ラベルまたはプリントしたシートで提供される。資料は、他の様式、例えば点字、コンピューター読み取り物、ビデオ録画、またはオーディオ録音でも提供される。他の例では、キットの資料は、接触型情報、例えば、物理的アドレス、ｅメールアドレス、ウェブサイト、または電話番号であり、そこでキット使用者は、その中のナノ粒子および／または本明細書に記載の方法におけるそれら使用についてのかなりの情報を得ることができる。もちろん、資料は、様式を任意に組合せて提供することもできる。
【００９９】
ナノ粒子に加えて、キットには、他の成分、例えば、溶媒もしくは緩衝液、安定剤、または防腐剤を含めることができる。キットには、他の薬剤、例えば、第二もしくは第三の薬剤、例えば、他の治療薬を含めることもできる。成分は、任意の形態、例えば、液体形、乾燥形または凍結乾燥形で提供することができる。成分は、（それらを一緒に組み合わせることも、または互いに独立して送達することもできるが）実質上純粋かつ／または無菌でありうる。成分を溶液で提供する場合、溶液は、滅菌水溶液などの水溶液でありうる。成分を乾燥形態として提供する場合、一般的に、再構成は好適な溶媒を加えることによる。溶媒、例えば、滅菌水または緩衝液を、任意にキットに提供してもよい。
【０１００】
キットには、ナノ粒子または他の薬剤用に一個以上の容器を含めることができる。場合によっては、キットには、ナノ粒子および資料用に別個の容器、分割物、または区画が含まれる。例えば、ナノ粒子は、ボトル、バイアル、または注射器に含めてよく、資料は、ビニール袋（plastic sleeve）または小包に含めてよい。他の状況では、キットの別々の要素は、単一の分割されていない容器内に含まれている。例えば、ナノ粒子は、そこに資料をラベルの形で取り付けたボトル、バイアルまたは注射器に含めてよい。場合によっては、キットは、各容器がナノ粒子の一個以上の単位用量形（例えば、本明細書に記載した剤形）を含む個々の容器を複数（例えばパック）含んでよい。容器には、単位用量、例えばナノ粒子を含む単位を含めてよい。例えば、キットには、例えば、それぞれが単位用量を含む、複数の注射器、アンプル、ホイル包、ブリスタ包装、または医療器具を含めることができる。キット容器は、気密で耐水性（例えば湿気もしくは蒸発変化に不透過性）があり、かつ／または耐光性でありうる。
【０１０１】
キットには、任意に、ナノ粒子投与に適した器具、例えば、注射器または他の好適な送達器具を含めてよい。器具は、例えば単位用量のナノ粒子を事前に装填して提供することも、または空であるが装填に好適であってよい。
【０１０２】
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。例示のみを目的として実施例を提供する。実施例は、決して本発明の範囲または本発明の内容を制限するものとは解釈されない。
【実施例１】
【０１０３】
[安定した難溶性薬剤ナノコロイド調製]
難溶性薬剤の可溶化および生物学的利用能を増大するために、安定した難溶性薬剤コロイドを調製した。このハイパワー超音波処理を行うために、難溶性薬剤の水性分散剤を同時ＬｂＬ−ナノコーティングと共に使用する。そのようなコーティングによって粒子表面電荷は逆転し増強され、それによって薬剤の再凝集は防止され、薬剤コロイドは（超音波処理時間に比例して）ますます小さくなる。
【０１０４】
以下の方法（図１Ａに概略図を示す）で、強力な超音波処理と反対電荷の高分子電解質の吸着を同時に適用して、不溶性薬剤粒子のサイズをナノスケールに系統的に減少させた。超音波処理エネルギーでまずバルク薬剤を切断し亀裂を入れると、高分子電解質が直ちにこの下位分割物に取り付き、破片の再凝集が防止される。超音波処理時間を長くすれば、粒子は小さくなり（直径約１００nm）、その小さい粒子は吸着した高分子電解質の単層により水中で安定する。レイヤー−バイ−レイヤー（ＬｂＬ）構造（ポリカチオンとポリアニオンの交互吸着）によって組織化された多層シェルをさらに積層すると、約５nm〜約３０nmのより厚いシェルが形成され、それによって薬剤の放出速度が制御された。
Ａ．方法
【０１０５】
[材料および機器]
この実験では、難溶性かつ強力な抗癌薬タモキシフェン（ＴＭＦ）およびパクリタキセル（ＰＣＴ）を使用した（溶解度１μg/mL未満）。ＬｂＬ組立法に使用した高分子電解質は全て、濃度２mg/mLで使用した。正電荷高分子電解質として、ポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）、ＦＩＴＣ標識ＰＡＨ、およびポリ（塩化ジメチルジアリルアミドアンモニウム）（ＰＤＤＡ）を使用した。負電荷高分子電解質として、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）を使用した。溶媒として、脱イオン水およびｐＨ７．４のＰＢＳを使用した。ウルトラソニケーター（超音波破砕装置）３０００（Misonix Inc, Farmingdale, NY）を３〜１８Wtで１０〜３０分使用し、薬剤結晶の崩壊を行った。超音波処理中の試料の過熱を防止し、２０〜３０℃の範囲に温度を保つために、液体窒素を使用しサンプルチューブを冷却した。高分子電解質多層の厚みは、Quartz Crystal Microbalance（9 MHz QCM, USI-System, 日本）を使用し測定した。ZetaPlus Microelectrophoresis（Brookhaven Instruments）を使用し、表面電位（ゼータ電位）および粒径測定を実施した。粒子イメージングには、電界放射型走査型電子顕微鏡（日立製作所，２００６年）を使用した。シェル形成を制御しコロイドの安定性を追跡するために、レーザー走査型共焦点顕微鏡（Leica Microsystems社製Leica TCS SP2）も使用した。
【０１０６】
[ＬｂＬ組立法およびナノ粒子の特性]
まず、いかなる高分子電解質を加える前に、薬剤試料は全て、冷却しながら、１mL容量中、１８Ｗで最長３０分間の超音波処理を使用し崩壊させた。形成された薬剤粒子径を定期的に測定した。高分子電解質の第一層を加える前に、ゼータ電位読取り値も読み取った。両薬剤の薬剤ナノ粒子は、固有の負電荷を有することが判明したので、ポリカチオンを使用して第一表面層を形成した。次いで、薬剤試料を１４，０００rpmで７分間遠心分離し、洗浄し、水またはＰＢＳに再懸濁して、余分な高分子電解質を除去した。次いで、ゼータ電位の読み取りを行った。ポリアニオンポリマーを使用して、コーティング過程を繰り返したが、超音波処理はしなかった。ゼータ電位の測定は、各層を加えた後に行った。
【０１０７】
ＬｂＬ組立法の直後および４８時間後に、形成されたコロイド粒子の撮影を行い、形成されたコロイドの安定性を分析した。得られたコロイド懸濁液の５μL〜１０μLを使用し、ＳＥＭイメージング用に乾燥試料を調製した。むき出しのシリコンウェーハ上の試料滴を、５０℃で１時間それらを加熱することによって、または終夜室温でそれらを貯蔵することによって乾燥した。薬剤の放出を防ぐために、低容量の飽和溶液に薬剤コロイドを保存した。
【０１０８】
[浸漬条件でコロイド粒子から薬剤放出]
ＬｂＬ組立法を使用し調製したコロイド粒子からの様々な薬剤の放出速度を測定するために、１mLの酢酸セルロース膜製水平拡散チャンバー内に、異なる数のコーティングサイクルを使用し調製した試料を置いた。次いで、大容量のＰＢＳ（ｐＨ７．２）に試料を攪拌して、インビボで予想される浸漬条件を模倣した。放出される薬剤の濃度をＨＰＬＣにより測定した。
【０１０９】
[難溶性薬剤ＬｂＬナノコロイドにリガンド部分を結合]
様々なリガンドの共有結合に好適な「反応性」表面を有するナノコロイドを調製するために、遊離アミノ基を含むＰＡＨを使用して薬剤粒子に外層を形成した。この一連の実験でパクリタキセルを薬剤として使用した。モノクローナルヌクレオソーム特異的２Ｃ５抗体（ｍＡｂ ２Ｃ５）をＬｂＬパクリタキセルナノ粒子に抱合させた。癌細胞表面結合ヌクレオソームを介して、この抗体は多様な癌細胞を認識する（Iakoubovら, Oncol. Res. 9 (1997) 439-446、およびIakoubovら, Cancer Detect. Prev. 22 (1998) 470-475を参照）。この抗体を２段階で抱合させた（図１Ｂ）。第１段階では、１−エチル−３−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）とを用いて、ｍＡｂ ２Ｃ５のカルボキシル基を活性化し、抗体をアミン反応性にした。第２段階では、ポリアミノ含有ＰＡＨポリマーでコーティングしたＬｂＬパクリタキセルナノ粒子に、活性化した抗体を加えた。全ての反応は、アルゴンガスの存在下、４℃、ｐＨ７．４のＨＢＳ中で攪拌を継続しながら実施した。改変された粒子を１２rpmで１０分間遠心分離し、ＰＢＳを使用し２度再懸濁させて、抱合していない抗体を除去した。
【０１１０】
逆相ＨＰＬＣによって、ナノ粒子調製物中のパクリタキセルの量を測定した。ダイオードアレイ（日立製作所、日本）とSpherisorb ODS2カラム、４．６mm×２５０mm（Waters, Milford, MA, USA）を備えたＤ−７０００ＨＰＬＣ系を使用した。ＨＰＬＣカラムにロードする前に、粒子を移動相で溶解した。カラムをアセトニトリル／水（６５：３５％、v/v）で１．０mL/minにて溶出させた。パクリタキセルのピークは、２２７nmで検出された。注射量は５０μLであった。全試料は三つ組で分析した。
【０１１１】
[ＬｂＬ薬剤ナノ粒子表面での抗体活性保存]
ＬｂＬ−パクリタキセルナノ粒子と抱合後のｍＡｂ ２Ｃ５比活性の保存を検証するために、標準的ＥＬＩＳＡを実施した。要するに、４０μg/mlポリリジン溶液を含むＴＢＳ（ｐＨ７．４）で予め処理したＥＬＩＳＡプレートを４０μg/mLヌクレオソーム（仔ウシ胸腺核ヒストンの水溶性画分、Worthington Biochemical, Lakewood, NJ）５０μLでコーティングし、室温で１時間インキュベートした。次いで、０．２％カゼイン、０．０５％Tween 20を含むＴＢＳ（カゼイン／ＴＢＳ）（ｐＨ７．４）でプレートを水洗いした。これらのプレートに、ｍＡｂ ２Ｃ５含有試料の段階希釈液を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをカゼイン／ＴＢＳで徹底的に洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼヤギ抗マウスＩｇＧ抱合体（ICN Biomedical, Aurora, OH）でコーティングし、製造業者の指示に従って希釈した。室温で１時間インキュベーション後、プレートをカゼイン／ＴＢＳで洗浄した。結合したペルオキシダーゼをその基質であるジアミノベンジジン分解によって数量化したが、この基質は、増感型K-Blue TMB基質（Neogen, Lexington, KY）という使用可能な溶液として提供された。現像した色彩強度は、Labsystems Multiscan MCC/340 ELISAリーダーを使用し４９２nmで分析した（Labsystems and Life Sciences International, UK）。
【０１１２】
[標的化したパクリタキセルＬｂＬナノ粒子の細胞毒性]
ＭＣＦ−７およびＢＴ−２０細胞に対する様々な濃度のＬｂＬ−パクリタキセルナノ粒子の細胞毒性を、ＭＴＴテストを用いて研究した。製造業者のプロトコルに従って、ＭＴＴ（Promega, Madison, WI）の使用可能なCellTiter 96（登録商標）Aqueous One solutionを使用した。Ｈａｎｋ緩衝液に分散させたパクリタキセルの濃度が最高２００ng/mLまでの製剤を９６ウェルプレートで約４０％集密に増殖させた細胞に加えた。３７℃、５％ＣＯ２で４８時間または７２時間インキュベーション後、プレートをＨａｎｋ緩衝液で３回洗浄した。次に、培養液１００μlおよびCellTiter 96（登録商標）Aqueous One solution２０μlをプレートに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。次いで、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用し、４９２nmでのＭＴＴ分解生成物の色彩強度を測定することによって細胞生存率を推定した。未処理細胞を１００％増殖と考慮した。
Ｂ．結果
【０１１３】
[ＬｂＬにより安定化した薬剤ナノ粒子および表面ゼータ電位]
最適の超音波処理条件を見つけるために、初期実験は、懸濁液中のタモキシフェン結晶の濃度２mg/mLで実施した。図２に示すように、粒径は、超音波処理時間により制御でき、超音波処理時間を長くして減少させることができた。１８Wtで３０分の超音波処理後、約１００nmの粒子を得た（粒子の再凝集を防ぐため、サイズ測定前にポリカチオンのＰＤＤＡを加えた）。類似の超音波処理条件をパクリタキセルの結晶にかけた場合、約１００nmの粒径も得られた。超音波処理時間をさらに延ばしても、薬剤粒径で著しい減少は見られなかった。
【０１１４】
図３に示すように、通常の槽内超音波処理後、タモキシフェンで表面電荷は観察されなかったが、丁度２．５秒のパルス帯電式超音波処理後、強力な負電荷が得られた。ＰＡＨ層およびＰＳＳ層の連続添加の結果、それぞれ正および負電荷を有するナノ粒子が得られた。
【０１１５】
図４は、タモキシフェンコアへ連続的にＰＤＤＡ／ＰＳＳを吸着させる過程中に測定されたゼータ電位値を示す。ＰＤＤＡの添加後、当初負電荷ナノ粒子を約＋４５mVの正電位まで再充電した。超音波処理を停止させたとき、ＰＤＤＡの添加によって安定したコロイド溶液が形成された。次いで、ＬｂＬ組立法を実施するために、超音波処理の存在下で、ＰＤＤＡでコーティングしたタモキシフェンナノ粒子にポリアニオンのＰＳＳを加えた。ＰＳＳポリアニオンの吸着によってシェルにさらに一単層が加えられ、表面電位が負の値（−１７mV）に再度逆転した。次に、ＰＤＤＡポリカチオンを再度加えたが、それにより正電荷（およそ＋８０mV）のタモキシフェン粒子が得られた。ポリアニオンＰＳＳの第四ポリマー層を加えると、再度負のタモキシフェン粒子が得られた。組成（ＰＤＤＡ／ＰＳＳ）３を有する、組織化された多層シェルでコーティングしたタモキシフェンナノ粒子が形成されるまで、ＰＤＤＡとＰＳＳの交互層をタモキシフェン粒子に加えた（図４）。
【０１１６】
超音波処理したパクリタキセル粒子もまた、当初負電荷であった（図５）。パクリタキセルをＰＡＨまたはＰＤＤＡでコーティングしたとき、表面電荷は超音波処理後に逆転した（図５）。パクリタキセル／ＰＡＨナノ粒子にポリアニオンＰＳＳを続いて加えたとき、得られたナノ粒子は負のゼータ電位を有した（図６）。超音波処理下、ＰＡＨとＰＳＳの交互添加を使用するさらなる組立法によって、ゼータ電位値で対応して変化するナノ粒子が得られ、初めて（ＰＡＨ／ＰＳＳ）２の組成を有するパクリタキセルナノ粒子が形成された（図６）。
【０１１７】
石英共鳴器でのＰＤＤＡ／ＰＳＳまたはＰＡＨ／ＰＳＳ組立法の水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）モニタリングを使用する別個の実験では、1組のポリカチオン／ポリアニオン二重層は、乾燥状態で１．５nmの厚みを有することが定量された。高分子電解質多層の厚みは水中で２倍になるので（Decher, Science 227 (1997) 1232-1237、およびDecher and Schlenoff (Eds.), Multilayer Thin Films: Sequential Assembly of Nanocomposite Materials. Wiley -VCH, Weinheim, Germany, 2003を参照）、（ＰＤＤＡ／ＰＳＳ）３シェルの厚みは、乾燥状態でおよそ４．５nm、そして水溶液中でおよそ９nmであると推定された。（ＰＡＨ／ＰＳＳ）２シェル厚は、乾燥状態でおよそ３nm、水溶液中で６nmであると推定された。
【０１１８】
[ナノ粒子イメージングと数種の特性]
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）および共焦点蛍光顕微鏡を使用して、本明細書に記載したＬｂＬ技術により形成したナノ粒子のサイズを確認した。タモキシフェンを２mg/mLのＰＡＨの存在下で２０分間超音波処理した後、主として球形であり、直径が１２０±３０nmであるナノ粒子が得られた（図７Ｂおよび７Ｃ）。４８時間後に撮影したＳＥＭイメージでは、個々に集塊していないナノサイズ粒子が依然として見られた。従ってナノコロイドは水中で安定していた（図７Ｂおよび７Ｃ）。図８は、ポリアニオンＰＳＳの第一層を加えても、超音波処理の２０分後でさえタモキシフェンのサイズが減少しないことを示している。
【０１１９】
パクリタキセルについては、（ＰＡＨ−ＰＳＳ）２シェル組成を有するナノ粒子が生成され、粒径は約８７nm〜約１５７nmであった（図９Ｃおよび９Ｄ）。しかし、数個のパクリタキセルナノ粒子が凝集して約１．５μm直径の粒子となったことが観察された。初期パクリタキセル濃度を１mg/mLに低減すると、寸法が約５０nm×約１２０nmの細長い棒状形のナノ粒子が得られ、それらは凝集しなかった。
【０１２０】
試料を乾燥した後にＳＥＭイメージを取得した。乾燥工程中、ナノ粒子は図７Ａに示すように部分的に凝集するようになる。この凝集がＳＥＭ試料の調製の結果であり、かつナノ粒子が水性懸濁液中で凝集しないことを実証するために、共焦点蛍光顕微鏡を使用して試料イメージを取得した。
【０１２１】
タモキシフェンをＦＩＴＣ標識ＰＡＨ層でコーティングすることによって、タモキシフェンナノ粒子を調製した。これらのＬｂＬでコーティングしたタモキシフェン粒子を含む懸濁液の蛍光イメージングでは、いかなる凝集も見られなかった（図１０）。ＦＩＴＣ標識ＰＡＨでコーティングしたパクリタキセルナノ粒子も凝集しなかった。多層を構築するために、ＰＡＨとＰＳＳを交互に連続して吸着させることにより、ＰＡＨでコーティングしたタモキシフェンナノ粒子のさらなる組立てを実施したが、その際、最後のＰＡＨ層をＦＩＴＣで標識した。図１１は、タモキシフェンナノ粒子の共焦点イメージを示すが、３層シェル内に効果的なＬｂＬカプセル化が示されている。
【０１２２】
他の実験では、試料形成から２〜７日後にＳＥＭおよび共焦点イメージを取得し、水性薬剤ナノコロイドの安定性が実証された。
【０１２３】
単一ポリマー層の厚みが乾燥状態で約１．５nmであると仮定して、安定したナノコロイド粒子中の薬剤の量を算出すると、約８５重量％（３組のＰＤＤＡ／ＰＳＳ二重層コーティングのタモキシフェン粒子）〜約９０重量％（２組のＰＡＨ／ＰＳＳ層コーティングのパクリタキセル粒子）であった。さらに、両薬剤のコロイド懸濁液は、２週間の観察期間中、完全に安定していた。
【０１２４】
[ＬｂＬナノ粒子からの薬剤放出]
ＬｂＬ技術は、ナノ粒子の厚みまたは組成を変えることによって、ポリマーにより安定化したコロイドナノ粒子からの薬剤放出速度を制御するために使用することができる。従って、２mg/mLタモキシフェンを含み、単一ＰＤＤＡコーティングまたは（ＰＤＤＡ／ＰＳＳ）３コーティング組成を有するＬｂＬナノコロイド粒子からのタモキシフェンの放出を標準的浸漬条件（ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液）で測定した。指数関数近似のPeppasモデルを使用し、実験データから曲線を生成した（Peppas, Pharm. Acta Helv. (1985) 60: 110-112を参照）。図１２に示すように、シェルの高分子電解質層数が増加するにつれ、放出速度が遅くなることが観察された。浸漬条件（ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液）で、未コートタモキシフェン結晶（超音波処理有りおよび無し）を約２時間以内に可溶化した。ＰＤＤＡでコーティングしたナノ粒子および（ＰＤＤＡ／ＰＳＳ）３でコーティングしたナノ粒子は、およそ１０時間で可溶化すると推測された。パクリタキセルでも同様の結果が得られた。異なるポリカチオンとポリアニオンを含むＬｂＬコーティングを使用し、シェル数を変えると、遅い放出速度が得られた。パクリタキセルナノ粒子でも同様の結果が見られた（図１３）。
【０１２５】
[ＬｂＬでコーティングした薬剤ナノ粒子の表面改変および細胞毒性の分析]
ＬｂＬでコーティングした薬剤ナノ粒子を誘導体化する能力を実証するために、上記のように、ＰＡＨ一層を有するパクリタキセル含有ナノ粒子を作製した。次いで、ＰＡＨ表面層の遊離アミノ基を介して、腫瘍特異的ｍＡｂ ２Ｃ５を、ＰＡＨでコーティングしたパクリタキセルナノ粒子に結合させた。図１４に示すように、２Ｃ５で改変したＬｂＬコートパクリタキセルナノ粒子は、標的抗原（すなわちヌクレオソーム）を特異的に認識した。
【０１２６】
上記のように、ＭＣＦ−７細胞およびＢＴ−２０細胞を使用し、ｍＡｂ ２Ｃ５で改変したパクリタキセル含有ナノ粒子の細胞毒性を定量した。単一ＰＡＨ層を有するが、２Ｃ５改変を行っていないパクリタキセルナノ粒子を対照として使用した。１００ng/mLの未改変パクリタキセルナノ粒子の存在下で、ＭＣＦ−７細胞を４８時間または７２時間をインキュベートした後も、細胞の約９５％は生存していた。しかし、１００ng/mlの２Ｃ５で改変したパクリタキセル含有ナノ粒子の存在下で、ＭＣＦ−７細胞をインキュベートしたときは、およそ３０％の細胞が死滅した。３０ng/mlのパクリタキセルナノ粒子の存在下でＢＴ−２０細胞をインキュベートしたときも、同様の結果が見られた。
【実施例２】
【０１２７】
[メソ-テトラフェニルポルフィリンおよびカンプトテシンの安定したナノ粒子の調製]
実施例１に記載したように、メソ-テトラフェニルポルフィリンおよびカンプトテシンのＬｂＬナノ粒子を調製した。図１５に示すように、メソ-テトラフェニルポルフィリンナノ粒子は、表面電荷を負から正に逆転させるＦＩＴＣ標識ＰＡＨコーティングを使用し生成した。ＳＥＭにより、粒径は約８３nm〜約１９４nmであることが示された（図１５Ｂ）。
【０１２８】
カンプトテシンのＬｂＬナノ粒子も調製した。第一ポリカチオンコーティングの最適化を実施した。３種のポリカチオン（ＰＡＨ、ＰＥＩ、およびＰＤＤＡ）ならびに１種のポリアニオン（ＰＳＳ）を使用した。薬剤コアと同じ電荷を有するＰＳＳの存在下、粒径の減少は見られなかった（図１６）。全てのポリカチオンが粒径を減少させることができ、最小粒子はポリリジン処理により得られた。カチオン性ポリＬ−リジンで３０分間超音波処理した後のカンプトテシンのＳＥＭイメージから約３９０nmの粒子が検出されたが、ＰＳＳでの超音波処理ではそれより大きい粒子が生じた。
【０１２９】
いくつかの代表的な結果を下表１に要約する。タモキシフェンの放出時間は約６時間であった。
【０１３０】
【表１】
2010533730.tif 000003
【実施例３】
【０１３１】
[生体適合性コーティングを使用する安定したパクリタキセルナノ粒子の調製]
実施例１に記載したように、パクリタキセルのＬｂＬ薬剤ナノ粒子を調製したが、コーティングに生体適合性材料を使用した。第一層をプロタミン硫酸塩（ＰＳ）に、続いて次のコーティングをヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）にして、パクリタキセル含有ナノ粒子を調製した。３０分間の超音波処理＋プロタミン硫酸塩でのＬｂＬコーティングにより、より小さいナノ粒子が得られた。
【０１３２】
図１７に、生体適合性ＰＳおよびＨＳＡによるパクリタキセルＬｂＬのゼータ電位読み取り値を示す。実証されているように、電荷は、続くＰＳとＨＳＡの各添加によって、それぞれ、正と負の値の間で交互に変化する。
【０１３３】
実施例１に記載したように、これらのナノ粒子からのパクリタキセルの放出を定量するために、２００nm膜を通しての放出速度を２時間にわたって測定した。図１８に示すように、超音波処理によって、２時間で裸のパクリタキセルから１２．０６％のパクリタキセルが放出された。ＰＤＤＡ一層を有する粒子から９．７％のパクリタキセルが放出され、２組の（ＰＳ−ＨＳＡ）二重層を有する粒子から７．４１％のパクリタキセルが放出され、３組の（ＰＤＤＡ−ＰＳＳ）二重層を有する粒子から３．４４％のパクリタキセルが放出された。
【０１３４】
図１９に、生体適合性ＰＳとＨＳＡの３組の二重層によりｐＨ７．３の浸漬条件で８時間コーティングしたパクリタキセルの持続放出曲線を示す。実証されているように、これらのナノ粒子は、５００分間にわたって放出が持続した。
【０１３５】
[同等物]
本発明は、その詳細な説明に関連して記載されているが、当然ことながら、先の記載は、添付の請求項の範囲によって定義される本発明を説明することを目的とするもので、本発明の範囲を制限するものではない。他の態様、利点、および変更形態も添付の請求項の範囲内にある。
【図１Ａ】
2010533730.tif 000004
【図１Ｂ】
2010533730.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2010533730.tif 000010
【図７Ａ】
2010533730.tif 000011
【図７Ｂ】
2010533730.tif 000012
【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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