(57)【要約】本発明は全体として、糖尿病を発症するリスクの増加に関連する生物学的マーカーの特定、ならびにこのような生物学的マーカーを糖尿病の診断および予後診断に使用する方法に関する。本発明の生物学的マーカーは、治療法のための新たな標的を指し示すこと、または糖尿病の処置もしくは予防のための新たな治療用物質を構成することができる。2010539513.tif 000059
2010539513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a. 被験体由来の試料中のセルピナ(Serpina)3Mまたはその代謝産物および任意で1種または複数種のさらなるT2DBマーカーの有効量を測定する段階; ならびに
b. 該量を基準値と比較する段階であって、基準値に対するセルピナ3Mおよび任意で1種または複数種のT2DBマーカーの量の増加または減少が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態に被験体が罹患していることを示す段階
を含む、被験体における2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を診断または特定する方法。
【請求項２】
基準値が、指数値、1つもしくは複数の糖尿病リスク予測アルゴリズムもしくは計算指数から導出した値、2型糖尿病もしくは前糖尿病状態に罹患していない被験体から導出した値、2型糖尿病もしくは前糖尿病状態と診断されたまたはそれらに罹患していると特定された被験体から導出した値、あるいは2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症と以前に診断されたまたはそれらに罹患していると以前に特定された被験体から導出した値を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
被験体が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を有すると以前に診断されているもの、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を有すると以前に診断されていないもの、あるいは2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態について無症候性であるものを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
a. 第1期間の被験体由来の第1試料中のセルピナ3Mおよび任意で1種または複数種のさらなるT2DBマーカーの有効量を検出する段階;
b. 第2期間の被験体由来の第2試料中のセルピナ3Mおよび任意で1種または複数種のさらなるT2DBマーカーの有効量を検出する段階; ならびに
c. 段階(a)で検出したセルピナ3Mおよび任意で1種または複数種のT2DBマーカーの量を、段階(b)で検出した量または基準値と比較する段階
を含む、被験体における2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の進行をモニタリングする方法。
【請求項５】
モニタリングが、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するリスクの変化の評価を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
被験体が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置を以前に受けたもの、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置を以前に受けていないもの、あるいは2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と以前に診断されていないまたはそれらに罹患していると以前に特定されていないものを含む、請求項4記載の方法。
【請求項７】
第1試料が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置を受ける前に、被験体から採取される、請求項4記載の方法。
【請求項８】
第2試料が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置を受けた後に、被験体から採取される、請求項4記載の方法。
【請求項９】
モニタリングが、被験体のための処置計画の選択、ならびに/あるいは2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態のための処置計画の有効性のモニタリングをさらに含む、請求項4記載の方法。
【請求項１０】
2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置が、運動計画、食事補充物、外科的介入、糖尿病調節剤、またはそれらの組み合わせを含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
基準値が、指数値、1つもしくは複数の糖尿病リスク予測アルゴリズムもしくは計算指数から導出した値、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態に罹患していない被験体から導出した値、あるいは2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と診断されたまたはそれらに罹患していると特定された被験体から導出した値を含む、請求項4記載の方法。
【請求項１２】
a. 第1期間の被験体由来の第1試料中に存在するセルピナ3Mまたはその代謝産物および任意で1種または複数種のさらなるT2DBマーカーの有効量を検出する段階; ならびに
b. セルピナ3Mおよび任意で1種もしくは複数種のT2DBマーカーまたはその代謝産物の量が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するリスクの低い1個体または複数個体の被験体で測定した基準値、あるいは1つまたは複数の糖尿病調節剤による処置の結果として糖尿病リスク因子の改善を示す1個体または複数個体の被験体で測定した基準値に戻るまで、被験体を1つまたは複数の糖尿病調節剤によって処置する段階
を含む、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と診断されたまたはそれらに罹患していると特定された被験体を処置する方法。
【請求項１３】
1つまたは複数の糖尿病調節剤が、スルホニル尿素、ビグアナイド、インスリン、インスリン類似体、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体-γ(PPAR-γ)アゴニスト、二重作用性PPARアゴニスト、インスリン分泌促進物質、グルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)の類似体、ジペプチジルペプチダーゼIVの阻害剤、膵臓リパーゼ阻害剤、α-グルコシダーゼ阻害剤、またはそれらの組み合せを含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
1つまたは複数の糖尿病調節剤による処置の結果としての糖尿病リスク因子の改善が、肥満度指数(BMI)の低下、血中グルコースレベルの低下、インスリンレベルの上昇、HDLレベルの上昇、収縮期および/または拡張期血圧の低下、あるいはそれらの組み合わせを含む、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
T2DBマーカー検出試薬が請求項17記載の単離抗体を含む、以下を含むキット：
セルピナ3Mおよび任意で1種または複数種のT2DBマーカーを検出するT2DBマーカー検出試薬、正常グルコースレベルを有する被験体から得た試料、ならびに任意で請求項1、4および12のいずれか一項記載の方法において該試薬を使用するための説明書。
【請求項１６】
検出試薬が、1つもしくは複数の抗体もしくはその断片、1つもしくは複数のアプタマー、1つもしくは複数のオリゴヌクレオチド、またはその組み合わせをさらに含む、請求項15記載のキット。
【請求項１７】
ヒト定常領域、および1種もしくは複数種のT2DBマーカーまたはその代謝産物に結合する抗原結合領域を含む、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
抗原結合領域が、配列番号:1の1つまたは複数のアミノ酸残基に結合する、請求項17記載の単離抗体。
【請求項１９】
組換え体である、請求項17記載の単離抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2007年3月28日付で出願された国際出願番号PCT/US2007/007875の一部継続出願であり、この国際出願は2006年9月1日付で出願された米国特許仮出願第60/841,717号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本明細書に引用されている各々の出願および特許は各々の出願および特許(各発行された特許の審査中のものを含む)に引用された各文献または参照文献(「出願引用文献」)とともに、ならびにこれらの出願および特許のいずれかに対応するおよび/またはそれらの優先権を主張する米国および外国出願または特許の各々、ならびに出願引用文献の各々に引用されたまたは参照された文献の各々は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。より一般的には、文献または参照文献は本明細書に、特許請求の範囲の前の参照文献一覧において、または本明細書それ自体において引用されており、これらの文献または参照文献(「本明細書引用資料」)の各々、および本明細書引用資料の各々に引用されている各文献または参照文献(製造元の仕様書、指示書などのいずれも含む)は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。本発明の実践において参照により本明細書に組み入れられる文献を用いることができる。
【０００３】
発明の分野
本発明は全体として、糖尿病を発症するリスクの増加に関連する生物学的マーカーの特定、ならびにこのような生物学的マーカーを糖尿病の診断および予後診断に使用する方法に関する。さらに、本発明の選択された生物学的マーカーは、治療法のための新たな標的を与え、糖尿病の処置または予防のための新たな治療用物質を構成する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
真性糖尿病は、代謝において重要な役割を果たす、膵臓でβ細胞によって産生されるホルモンであるインスリンを、人体が産生および/または使用できないことから生じる、慢性的高血糖によって区別される一群の疾患を含む。症状としては、喉の渇きおよび排尿の増加、空腹、体重減少、慢性感染症、創傷治癒遅延、疲労、ならびに不鮮明な視界が挙げられる。しかしながら、しばしば症状は、重篤でないか、認識されないか、または症状がない。糖尿病は、失明に至る網膜症、記憶喪失、腎不全に至りうる腎症、心血管疾患、神経障害、自律神経機能障害、および手足切断を含む、衰弱性のかつ生命を脅かす合併症に至ることがある。インスリン分泌β細胞を破壊して、結果として生じるインスリン欠乏を伴うプロセスと、インスリン取り込みに対して抵抗性をもたらす肝臓および平滑筋細胞における変化とを含むがこれらに限定されない、いくつかの病原性プロセスが、糖尿病の発症に関与している。糖尿病は、インスリン非感受性またはインスリン欠乏から生じる標的組織に対する不十分なインスリン作用に起因する炭水化物、脂質およびタンパク質代謝の異常も含みうる。
【０００５】
2型糖尿病は、糖尿病の最も一般的な形であり、通例は、体がインスリンを適切に使用できないこと(当技術分野においては「インスリン抵抗性」としても公知)に伴う、絶対的というよりは相対的なインスリン欠乏の結果として発症する。2型糖尿病は、小児を含めて過体重の人に現れることが多く; 他のリスク因子としては、高コレステロール、高血圧、民族性、および遺伝因子、例えば糖尿病の家族暦が挙げられる。2型糖尿病を有する患者の大多数が肥満であり、肥満自体が、インスリン抵抗性を引き起こしうるかまたは悪化させうる。成人は別として、ますます多くの小児も2型糖尿病と診断されている。疾患の進行性のために、糖尿病合併症は、これらの小児が成人になるときまでに発現することが多い。American Diabetes Association (ADA)による研究は、17歳以前に糖尿病と診断された小児51人を含んでいた。これらの小児がその30代初めに達するときまでに、3名が腎不全を有し、1名が盲目となり、2名が透析中に心臓発作で死亡した。本研究は、該疾患の重症度、糖尿病合併症によって与えられた深刻な損傷、および該疾患の早期診断の必要性を強調している。
【０００６】
糖尿病の発生率は、警戒すべき数値まで急激に上昇してきた。糖尿病は現在、世界中で約1億7000万人が罹患しており、世界保健機関(World Health Organization; WHO)は2025年までに3億人の糖尿病患者を予測している。米国だけで、糖尿病に罹患している人々が2080万人いる(人口の約6%で、6番目に最も多く見られる死亡原因)。20〜79歳の年齢層の人々に対する世界中の糖尿病の年間直接医療費は約1530〜2860億ドルと見積もられ、2025年には2130〜3960億ドルまで上昇すると予想されている。
【０００７】
糖尿病と診断された人口の増加とともに、主として2型糖尿病がその早期には無症候性であることが多いため、または高血糖が糖尿病の目立った症状を誘発するほど深刻でないことが多いため、診断未確定の糖尿病人口も引き続き増加している。米国における糖尿病患者2080万人の約33%が診断未確定のままであると考えられる。診断の遅れのために、糖尿病合併症は既に進行しており、それゆえさらなる合併症および脱線の将来のリスクが大幅に上昇する。複数の臓器への合併症および可逆的損傷を防ぐために、糖尿病管理指針は、疾患の予後の早期における治療的介入の開始を提唱している。
【０００８】
この現代の流行から、2型糖尿病が深刻で回復不能な損傷を引き起こす前に、この疾患を早期に検出するための新たなツールが必要である。加えて、患者の健康における重度の悪化を停止、遅延、または改善するための、理想的には疾患の経過を部分または完全治癒まで逆行させる新たな処置パラダイムが、疾患症状の慢性的管理に対処するに過ぎない現在の処置の代替または代用として必要とされている。糖尿病性高血糖は、体重減少、身体活動の向上、および/または治療的処置様式によって低下させられうる。いくつかの生物学的機構が、高血糖、例えばインスリン抵抗性、インスリン分泌、および糖新生に関連しており、これらの機構の1つまたは複数に作用するいくつかの利用可能な薬剤、例えば以下に限定されることはないが、メトホルミン、アカルボース、およびロシグリタゾンがある。
【０００９】
糖尿病のような血糖障害の検出前に、前糖尿病状態が10年またはそれ以上も存在する可能性が十分に立証されている。前糖尿病の治療剤による処置は糖尿病を遅延または予防することができるが; しかし特定および処置される前糖尿病はほとんどない。主な理由は上記のように、糖尿病を発症する個体の実際のリスクを判定する簡単な実験室試験が存在しないことである。それゆえ、当技術分野においては、まだ糖尿病ではないが、糖尿病を発症する重大なリスクに瀕している個体を特定および診断する方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、明白な疾患が明らかになるずっと前に、疾患関連バイオマーカーが血清または他の体液中で特定されうるという発見を前提としている。2型糖尿病に罹患している患者の血清フットプリントからのこれらのバイオマーカーの存在または非存在は、血中グルコース制御の混乱に先行して、早期診断ツールとして使用可能であり、このことのために非可逆性臓器損傷を予防、遅延、改善、または逆行させるための処置戦略が考案され施行されうる。本発明の疾患関連バイオマーカーの1つまたはいくつかが、2型糖尿病もしくは関連疾患に罹患している被験体を診断するために、または好都合には、2型糖尿病および関連疾患について無症候性である被験体を診断するために使用されうる。本発明のバイオマーカーは、新しい治療用物質の設計にも使用されうる。例えば、糖尿病患者には非存在であり、健常個体に見出されるバイオマーカーは、患者への投与時に症状を緩和する、または疾患を逆行することさえある新たな予防剤または治療剤を構成しうる。
【００１１】
したがって、一つの局面において、本発明は、被験体由来の試料中の1種または複数種のT2DBマーカーまたはその代謝産物の有効量を測定する段階、および該量を基準値と比較する段階であって、基準値に対する1種または複数種のT2DBマーカーの量の増加または減少が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態に被験体が罹患していることを示す段階を含む、被験体における2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を診断または特定する方法を提供する。
【００１２】
一つの態様において、基準値は、指数値、1つもしくは複数の糖尿病リスク予測アルゴリズムもしくは計算指数から導出した値、2型糖尿病もしくは前糖尿病状態に罹患していない被験体から導出した値、あるいは2型糖尿病もしくは前糖尿病状態と診断されたまたはそれらに罹患していると特定された被験体から導出した値、あるいは2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症と以前に診断されたまたはそれらに罹患していると以前に特定された被験体から導出した値を含む。
【００１３】
別の態様において、減少は、基準値よりも少なくとも10%大きい。他の態様において、増加は基準値よりも少なくとも10%大きい。
【００１４】
試料は、尿、血清、血漿、血球、内皮細胞、組織生検、膵液、腹水、骨髄、間質液、涙、痰、または唾液でありうる。
【００１５】
本発明のT2DBマーカーは、電気泳動によって、免疫化学的に、プロテオミクス技術によって、またはゲノム解析によって検出されうる。免疫化学検出は、ラジオイムノアッセイ法、免疫沈降、免疫ブロッティング、免疫蛍光アッセイ法、または酵素結合イムノソルベントアッセイ法でありうる。プロテオミクス技術は、SELDI、MALDI、LC/MS、タンデムLC/MS/MS、タンパク質/ペプチドアレイ、または抗体アレイを含みうる。ゲノム解析は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リアルタイムPCR、マイクロアレイ解析、ノザンブロッティング、またはサザンブロッティングを含みうる。好ましくは、本明細書において開示されるT2DBマーカーは、本開示の他の箇所に述べた、本発明の単離抗体を用いて免疫化学的に検出される。
【００１６】
別の態様において、被験体は2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を有すると以前に診断されていない。被験体は、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を有すると以前に診断されているものでもありうる。あるいは、被験体は、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態について無症候性でもありうる。
【００１７】
本発明の別の局面では、(a) 第1期間の被験体由来の第1試料中の1種または複数種のT2DBマーカーの有効量を検出する段階、(b) 第2期間の被験体由来の第2試料中の1種または複数種のT2DBマーカーの有効量を検出する段階、および(c) 段階(a)で検出した1種または複数種のT2DBマーカーの量を、段階(b)で検出した量または基準値と比較する段階を含む、被験体における2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の進行をモニタリングする方法を提供する。モニタリングには、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するリスクの変化の評価を含めることができる。
【００１８】
一つの態様において、被験体は、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置を以前に受けたものを含むことができる。あるいは、被験体は、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置を以前に受けていないものか、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と以前に診断されていないまたはそれらに罹患していると以前に特定されていないものであってもよい。
【００１９】
別の態様において、第1試料は、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置を受ける前に、被験体から採取される。第2試料は、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置を受けた後に、被験体から採取することができる。別の態様において、モニタリングは、被験体のための処置計画の選択ならびに/あるいは2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態のための処置計画の有効性のモニタリングをさらに含むことができる。
【００２０】
他の態様において、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置は、運動計画、食事補充物、外科的介入、糖尿病調節剤、またはそれらの組み合わせを含む。2型糖尿病、糖尿病合併症、または前糖尿病状態の進行は、肥満度指数(BMI)、インスリンレベル、血中グルコースレベル、HDLレベル、収縮期および/もしくは拡張期血圧、またはそれらの組み合わせの変化を検出することによってモニターされうる。
【００２１】
本発明の別の局面において、(a) 2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置前に被験体由来の第1試料中の1種または複数種のT2DBマーカーの有効量を検出する段階、(b) 2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置後に被験体由来の第2試料中の1種または複数種のT2DBマーカーの有効量を検出する段階、および(c) 段階(a)で検出した1種または複数種のT2DBマーカーの量を、段階(b)で検出した量または基準値と比較する段階を含む、被験体において2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態のための処置計画の有効性をモニタリングする方法が提供される。一つの態様において、血中グルコースレベルの変化は、経口グルコース負荷試験によって検出されうる。
【００２２】
本発明のなお別の局面では、第1期間の被験体由来の第1試料中に存在する1種もしくは複数種のT2DBマーカーまたはその代謝産物の有効量を検出する段階、および1種もしくは複数種のT2DBマーカーまたはその代謝産物の量が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するリスクの低い1個体または複数個体の被験体で測定した基準値、あるいは1つまたは複数の糖尿病調節剤による処置の結果として糖尿病リスク因子の改善を示す1個体または複数個体の被験体で測定した基準値に戻るまで、被験体を1つまたは複数の糖尿病調節剤によって処置する段階を含む、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と診断されたまたはそれらに罹患していると特定された被験体を処置する方法を提供する。
【００２３】
一つの態様において、1つまたは複数の糖尿病調節剤は、スルホニル尿素、ビグアナイド、インスリン、インスリン類似体、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体-γ(PPAR-γ)アゴニスト、二重作用性PPARアゴニスト、インスリン分泌促進物質、グルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)の類似体、ジペプチジルペプチダーゼIVの阻害剤、膵臓リパーゼ阻害剤、α-グルコシダーゼ阻害剤、またはそれらの組み合せを含む。別の態様において、1つまたは複数の糖尿病調節剤による処置の結果としての糖尿病リスク因子の改善は、肥満度指数(BMI)の低下、血中グルコースレベルの低下、インスリンレベルの上昇、HDLレベルの上昇、収縮期および/または拡張期血圧の低下、あるいはそれらの組み合わせを含む。
【００２４】
本発明の別の局面において、(a) 第1期間の被験体由来の第1試料中の1種または複数種のT2DBマーカーの有効量を検出する段階、(b) 第2期間の被験体由来の第2試料中の1種または複数種のT2DBマーカーの有効量を検出する段階、および段階(a)で検出した1種または複数種のT2DBマーカーの量を、段階(b)で検出した量または基準値と比較する段階を含む、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と診断されたまたはそれらに罹患していると特定された被験体のための処置計画を選択する方法が提供される。一つの態様において、基準値は、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の1つまたは複数の処置の結果として糖尿病リスク因子の改善を示す、1個体または複数個体の被験体から導出される。
【００２５】
本発明の別の局面では、(a) 第1期間の被験体由来の第1試料中の1種または複数種のT2DBマーカーの有効量を検出する段階、(b) 第2期間の被験体由来の第2試料中の1種または複数種のT2DBマーカーの有効量を検出する段階、および段階(a)で検出した1種または複数種のT2DBマーカーの量を、段階(b)で検出した量または基準値と比較する段階を含む、被験体において2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するリスクの変化を評価する方法を提供する。
【００２６】
別の局面において、被験体由来の試料中の1種もしくは複数種のT2DBマーカーまたはその代謝産物の有効量を測定する段階、および該量を基準値と比較する段階であって、基準値に対する1種または複数種のT2DBマーカーの量の増加または減少が、2型糖尿病に関連する合併症に被験体が罹患していることまたは2型糖尿病に関連する合併症を発症するリスクに被験体が瀕していることを示す、段階を含む、被験体における2型糖尿病に関連する1つまたは複数の合併症を特定する方法が提供される。
【００２７】
一つの態様において、合併症は、網膜症、失明、記憶喪失、腎症、腎不全、心血管疾患、神経障害、自律神経機能障害、高血糖性高浸透圧性昏睡、またはそれらの組み合わせを含む。別の態様において、基準値は、指数値、1つまたは複数の糖尿病リスク予測アルゴリズムまたは計算指数から導出した値、2型糖尿病と診断されたまたは2型糖尿病に罹患していると特定された被験体から導出した値、あるいは2型糖尿病に関連する1つまたは複数の合併症を有すると以前に特定された被験体から導出した値を含む。
【００２８】
本発明の別の局面では、2型糖尿病と診断されていないまたは2型糖尿病に罹患していると特定されていない1個体または複数個体の被験体で検出された1種または複数種のT2DBマーカーの発現レベルのパターンを含む、2型糖尿病基準発現プロファイルを提供する。別の局面において、本発明は、前糖尿病状態と診断されていないまたは前糖尿病状態に罹患していると特定されていない1個体または複数個体の被験体で検出された1種または複数種のT2DBマーカーの発現レベルのパターンを含む、前糖尿病状態基準発現プロファイルを提供する。本発明は、2型糖尿病と診断されたまたは2型糖尿病に罹患していると特定された、2型糖尿病を発症するリスクに瀕した、あるいは2型糖尿病の処置を受けている1個体または複数個体の被験体で検出された発現レベルのパターンを含む、2型糖尿病被験体発現プロファイルも提供する。別の局面において、本発明は、前糖尿病状態と診断されたまた前糖尿病状態に罹患していると特定された、前糖尿病状態を発症するリスクに瀕した、あるいは前糖尿病状態の処置を受けている1個体または複数個体の被験体で検出された発現レベルのパターンを含む、前糖尿病状態被験体発現プロファイルも提供する。
【００２９】
本発明は、1種または複数種のT2DBマーカーを検出するT2DBマーカー検出試薬、正常グルコースレベルを有する被験体から得た試料、および任意で本明細書において記述される本発明の方法のいずれかにおいて該試薬を使用するための説明書を含むキットも提供し、該T2DBマーカー検出試薬は、例えば本発明の単離抗体を含みうる。検出試薬は、例えば、1つもしくは複数の抗体もしくはその断片、1つもしくは複数のアプタマー、1つもしくは複数のオリゴヌクレオチド、またはその組み合わせをさらに含むこともできる。
【００３０】
本発明の別の局面において、1種もしくは複数種のT2DBマーカーまたはその代謝産物の治療的有効量、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、被験体における2型糖尿病または前糖尿病状態を処置するための薬学的組成物が、提供される。いくつかの態様において、T2DBマーカー代謝産物は、配列番号:1を含む。他の態様において、T2DBマーカー代謝産物は、配列番号:1の少なくとも5個の、少なくとも10個の、少なくとも15個の、または少なくとも20個の連続アミノ酸残基を含む。あるいは、T2DBマーカー代謝産物は、配列番号:1に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含みうる。
【００３１】
本発明は、配列番号:1および薬学的に許容される担体または希釈剤から本質的になる薬学的組成物も提供する。
【００３２】
また別の局面において、被験体に本発明の薬学的組成物の治療的有効量を投与する段階を含む、2型糖尿病または前糖尿病状態をその処置の必要な被験体において処置する方法が提供される。
【００３３】
本発明はさらに、ヒト定常領域、および1種もしくは複数種のT2DBマーカーまたはその代謝産物に結合する抗原結合領域を含む、単離抗体またはその抗原結合断片を提供する。好ましくは、本発明の単離抗体は、配列番号:1の1つまたは複数のアミノ酸残基に結合する抗原結合領域を含む。いくつかの態様において、単離抗体は組換え体でありうる。本発明の単離抗体または抗原結合断片は、本明細書において開示される方法のいずれかにおいて、表1に記載の1種または複数種のT2DBマーカーの検出のために使用することができる。
【００３４】
特別の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関連する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記述されるものと同様または同等の方法および材料が本発明の実践において使用されうるが、適当な方法および材料を以下に記述する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参照文献は、その全体が参照により明示的に本明細書に組み入れられる。矛盾がある場合には、定義を含めて本明細書が優先される。さらに、本明細書において記述される材料、方法、および実例は単に例証であるにすぎず、限定することを意図するものではない。
【００３５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるものと考えられ、それらにより包含される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
一例として与えられるが、記述した特定の態様に本発明を限定するものではない以下の詳細な説明は、参照により本明細書に組み入れられる添付図と併せて理解されうる。
【図１】通常飼料(RD)または銅欠乏高スクロース飼料(HSD)を与えられたCohen糖尿病抵抗性(CDr)および感受性(CDs)ラットからの膵臓抽出物のタンパク質発現プロファイルを示す。総タンパク質抽出物(5 μg)を還元条件下で調製して、4〜12%ポリアクリルアミドゲルに流した。
【図２Ａ】SELDI Q10アニオン交換表面チップでのCDr-RD、CDs-RD、CDr-HSD、およびCDs-HSDからの血清試料のグラフによる比較である。中央値ピークはCDr-RDおよびCDr-HSD(矢印によってマークする)に存在するが、CDs-RDおよびCDs-HSDには存在しない。この差次的に発現されたピークからのタンパク質断片は、セルピナ(Serpina)3MのC末端断片と特定された。
【図２Ｂ】SELDIによって特定された4.2キロダルトン断片のMS/MSスペクトルである。
【図３Ａ】38アミノ酸セルピナ3M(「D3」ともいわれる)ペプチドおよび同様の配列同一性を有すると特定されたタンパク質のBLAST配列比較を図示している。
【図３Ｂ】38アミノ酸セルピナ3Mペプチドおよび3Aで特定されたタンパク質をコードする核酸配列のBLAST配列比較を示す。
【図３Ｃ】図3Aおよび3BのBLAST配列比較で見出された保存アミノ酸モチーフを検出するように設計されている縮重プライマーを使ったRT-PCR実験の結果を示すアガロースゲルの写真である。
【図４Ａ】2D/LC分画システムによって解析されたCDr-RD、CDs-RD、CDr-HSDおよびCDs-HSD血清試料の2次元マップの写真である。青色バンドの強度は、UV吸収によって214 nmにて検出された相対タンパク質量を表す。
【図４Ｂ】選択した1次元等電点分画(画分31)のCDr-RD (赤色)対CDs-RD (緑色)の差次的2次元逆相HPLC溶離プロファイルを示す。CDs-RD試料で独自に特定されたタンパク質を本グラフの下に挙げる。
【図５Ａ】2次元ゲル電気泳動(2DE)を用いたCDラット血清試料の差次的タンパク質プロファイリングを表すタンパク質ゲルの写真である。1次元目のクロマトフォーカシングのpHはpH 5〜8であり、2次元目の分離では4〜20% トリス-HCl SDS-PAGEゲルを使用した。ゲルは視覚化のためにBioSafe Coomassie Staining (Bio-Rad)によって染色した。
【図５Ｂ】図5Aで特定したスポットの拡大図である。
【図６】2DEを用いてCohen糖尿病ラットモデルで見出された、差次的に発現されたタンパク質を示すグラフ表示を含む。
【図７】2DEによって特定された、差次的に発現されたCohen糖尿病ラット血清タンパク質を図示するヒストグラムである。
【図８】D3過免疫ウサギ血清の、CDr-RDおよびCDr-HSDラット血清に存在する約4 kDタンパク質断片との反応性を図示するウェスタンブロットの写真である。左の写真では、より高い分子量の二重鎖(49〜62 kDの範囲における)も過免疫血清と反応して、親タンパク質(およびタンパク質複合体)がRDおよびHSD治療様式の両方の下で全ての系統によって発現されることを示すが、これに対してより小さいサイズの誘導体はCDr系統においてのみ差次的に発現される。負の対照として、右の写真は、D3過免疫ウサギ血清の非存在下でインキュベートしたウェスタンブロット膜を示す。
【図９】SELDI解析から算出したCDrラット血清におけるD3ペプチドの濃度を図示している。
【図１０】一次抗D3血清抗体(1:200希釈)の存在(右パネル)または非存在(左パネル)下での、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合された二次ヤギ抗ウサギIgG (1:25000希釈)によってプローブされた、肝臓抽出物(10 μg)を含有するゲルの写真である。
【図１１】ウサギからのD3過免疫血清を使用した、ヒト血清を解析するウェスタンブロットの写真である。レーン1は、分子量マーカーに相当する。レーン2〜7は、健常個体(3045NGT)からの単一の血清試料の画分を表す。レーン10〜14は、2型糖尿病患者(291)からの単一の血清試料の画分を表す。
【図１２Ａ】CDr-HSDおよびCDs-HSD膵臓抽出物100 μgそれぞれを流した分取ゲルを示す。正の対照は抗アクチン抗体20 μgによって染色し、サブクローンレーンを馴化培養上清600 μlによって染色した。
【図１２Ｂ】CDr-HSDおよびCDs-HSD膵臓抽出物100 μgそれぞれを流した分取ゲルを示す。正の対照は抗アクチン抗体20 μgによって染色し、サブクローンレーンを馴化培養上清600 μlによって染色した。
【図１３】SELDIによってアニオン性Q10タンパク質チップ上でプロファリングした全ヒト血清の結果を図示している。
【図１４】13個のT2D試料および16個の正常ヒト血清試料で特定された、差次的に発現されたタンパク質ピークを示す擬ゲルの写真である。M/Z 15.2 kDマーカーでは、T2D試料の平均ピーク強度が2.6であったのに対し、正常試料では、平均ピーク強度が22.2であった。2つの試料の差は約9倍であった。M/Z 14.8 kDマーカーでは、T2D試料の平均強度が4.4であり、正常試料の平均強度が3.3であった。相対強度比は1.47であった。
【図１５】13個のT2D試料および16個の正常ヒト血清試料で特定された、差次的に発現されたタンパク質ピークを示す擬ゲルの写真である。T2D試料の平均ピーク強度が118であったのに対し、正常試料では、平均ピーク強度が182であった。相対強度の比は0.65であった。各ドットは個々の試料で測定したタンパク質ピークの強度を表す。
【図１６Ａ】肥満T2D被験体(Cheatham博士の試料)から得た試料対非肥満T2D被験体(Dankner博士の試料)から得た試料における差次的なアルブミンプロファイリングを図示するグラフである。
【図１６Ｂ】ポリクローナル抗D3抗体を用いて特定されたタンパク質のウェスタンブロットおよびバンド強度の定量化によるタンパク質の相対存在量を図示している。
【図１７Ａ】O.D. 450 nmの吸光度によって測定されたCDs-HSDおよびCDr-HSD特異的ハイブリドーマコロニーのELISA反応性のグラフ表示である。
【図１７Ｂ】O.D. 450 nmの吸光度によって測定されたCDs-HSDおよびCDr-HSD特異的ハイブリドーマコロニーのELISA反応性のグラフ表示である。
【図１８Ａ】CDs-HSDおよびCDr-HSD特異的ハイブリドーマクローンP2-10-B8-KA8、およびP1-14-A2-E-H8の反応性を図示するウェスタンブロットの写真である。
【図１８Ｂ】CDs-HSDおよびCDr-HSD特異的ハイブリドーマクローンP2-4-H5-K-B4、およびP1-20-B7-F-C1の反応性を図示するウェスタンブロットの写真である。
【図１８Ｃ】CDs-HSDおよびCDr-HSD特異的ハイブリドーマクローンP2-13-A9-P-A8、およびP1-5-F11-XF5の反応性を図示するウェスタンブロットの写真である。
【図１９】CDs-HSDおよびCDr-HSDに由来する特異的ハイブリドーマクローンによる免疫沈降後のクマシー染色SDSポリアクリルアミドゲルの写真である。
【図２０Ａ】図18のSDS-PAGEゲルから切り出した下方のバンドのMSスペクトル解析のスクリーンショットである。カルネキシンとしての下方のバンドの確実な確認を行った。
【図２０Ｂ】図18のSDS-PAGEゲルから切り出した下方のバンドのMSスペクトル解析のスクリーンショットである。カルネキシンとしての下方のバンドの確実な確認を行った。
【図２１】Cohen2型糖尿病ラット膵臓における137個の差次的に発現された遺伝子の散布図である。上方制御および下方制御された遺伝子の両方がプロットに示されている。
【図２２Ａ】Cohen2型糖尿病ラット膵臓に存在する12,729個の遺伝子の遺伝子系統樹マイクロアレイ解析を図示している。
【図２２Ｂ】Cohen2型糖尿病ラット膵臓において、発現が2倍の変化を有すると判明した820個の遺伝子、および発現が3倍の変化を有すると示された137個の遺伝子の、遺伝子系統樹マイクロアレイ解析を図示している。
【図２２Ｃ】K平均クラスタリングによって分類された、3倍の発現変化を示す137個の遺伝子のセット1〜5を図示している。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明は、糖尿病もしくは前糖尿病状態を有する、または糖尿病もしくは前糖尿病状態を発症する素因のある被験体に関連付けられたバイオマーカーの特定に関する。したがって、本発明は、本明細書において開示されるバイオマーカーの検出により、糖尿病または前糖尿病状態について無症候性である被験体を含め、糖尿病または前糖尿病状態を発症する素因のある被験体を特定するための診断および予後診断方法を特徴とする。本発明のバイオマーカーおよび方法によって、糖尿病または前糖尿病状態のいずれの症状も示していないが、それでもなお、糖尿病を発症するまたは前糖尿病状態に特徴的な症状を経験するリスクに瀕している可能性がある被験体を当業者は特定する、診断する、または別の方法で評価することが可能になる。バイオマーカーは、2型糖尿病に関する合併症を有する、または発症するリスクに瀕した被験体を特定するためにも好都合に使用されうる。これらのバイオマーカーは、糖尿病または前糖尿病状態の処置および治療を受けている被験体をモニタリングするのに、ならびに糖尿病または前糖尿病状態を有する被験体において有効でありうる治療および処置を選択するのにも有用であり、このような処置および治療の選択および使用は、糖尿病または前糖尿病状態の進行を遅くし、あるいはその発病を実質的に遅延または阻止する。本発明のバイオマーカーは、2型糖尿病または関連状態を有する被験体を処置するために使用される薬学的組成物の形態でありうる。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」とは、文脈上明らかに他の規定のない限り、単数形および複数形の指示対象を含む。したがって、例えば「1つの活性剤」または「1つの薬理学的活性剤」ということには、単数の活性剤はもちろん、2つまたはそれ以上の異なる活性剤の組み合わせも含まれ、「1つの担体」ということには、2つまたはそれ以上の担体の混合物はもちろん、単数の担体なども含まれる。
【００３９】
「分析物」という用語は、本明細書で使用する場合、測定されるいずれの物質も意味することができ、カルシウムなどの、電解質および元素を包含することができる。最後に、バイオマーカーは非限定的に、年齢、民族性、拡張期および収縮期血圧、肥満度指数、ならびに安定時心拍数などの、他の臨床的特徴を包含する健康状態の非分析物生理学的マーカーをいうこともできる。
【００４０】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、キメラ抗体、可溶性の形態でまたは結合した形態で標識できる抗体に対する抗イディオタイプ(抗Id)抗体、および非限定的に、酵素的切断、ペプチド合成または組換え技術などの任意の公知の技術によって供与される、それらの断片、領域または誘導体を含むよう意図される。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「抗原結合領域」という用語は、抗原に結合し抗原と相互作用する、かつ抗体に、抗原に対するその特異性および親和性を付与するアミノ酸残基を含んだ抗体分子のその部分をいう。抗体領域は、抗原結合残基の適切な高次構造を維持するのに必要な「フレームワーク」アミノ酸残基を含む。
【００４２】
「抗原」とは、抗体が結合できる分子または分子の部分であり、それはさらに、その抗原のエピトープに結合できる抗体を動物が産生するように誘導することもできる。抗原は、1つまたは複数のエピトープを持つことができる。前記の特異的反応は、抗原が高度に選択的な様式で、その対応する抗体と反応し、他の抗原によって誘発されうる多数の他の抗体とは反応しないことを示すよう意図される。本発明の抗体、抗体の断片および領域に結合する好ましい抗原は、配列番号:1の少なくとも1個、好ましくは2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上のアミノ酸残基を含むが、本明細書において表1に記載したものなどの、本発明のいずれか1種または複数種のT2DBマーカー、またはその代謝産物に結合することもできる。
【００４３】
本発明の文脈において「バイオマーカー」という用語は非限定的に、タンパク質、ペプチド、核酸、タンパク質および核酸の多型、スプライス変異体、タンパク質または核酸の断片、元素、代謝産物、ならびに他の分析物を包含する。バイオマーカーには変異タンパク質または変異核酸を含めることもできる。
【００４４】
「2型糖尿病に関連する合併症」または「前糖尿病状態に関連する合併症」は非限定的に、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、盲目、記憶喪失、腎不全、心血管疾患(冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳血管疾患、アテローム性動脈硬化、および高血圧を含む)、神経障害、自律神経機能障害、高血糖性高浸透圧性昏睡、またはそれらの組み合わせを含む。
【００４５】
「真性糖尿病」は本発明の文脈において、自己免疫性および特発性の両方の1型糖尿病ならびに2型糖尿病(合せて「糖尿病」)を含む。世界保健機関は、真性糖尿病について空腹時血漿グルコース濃度7.0 mmol/l (126 mg/dl)以上(全血6.1 mmol/lまたは110 mg/dl)、または2時間血中グルコースレベル≧11.1 mmol/L (≧200 mg/dL)の診断値を定義している。真性糖尿病に対する高いリスクを示す他の値には、高い動脈圧≧140/90 mmHg; 高い血漿トリグリセリド(≧1.7 mmol/L; 150 mg/dL)および/または低いHDLコレステロール(男性では＜0.9 mmol/L、35 mg/dl; 女性では＜1.0 mmol/L、39 mg/dL); 中心性肥満(男性:腹囲対臀囲比＞0.90; 女性: 腹囲対臀囲比＞0.85)および/または30 kg/m2を超える肥満度指数; ミクロアルブミン尿症、尿中アルブミン排泄率≧20 μg/分またはアルブミン:クレアチニン比≧30 mg/gの場合)が含まれる。
【００４６】
「エピトープ」という用語は、抗体の抗原結合領域の1つまたは複数の位置で抗体により認識され結合されうる任意の分子のその部分をいうように意図される。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面団(surface grouping)からなり、特異的な三次元構造的特徴および特異的な電荷的特徴を有する。エピトープは、本明細書で開示するT2DBマーカー、またはその代謝産物のいずれかの1つまたは複数の抗体結合領域を含むことができる。エピトープは、配列番号:1の少なくとも1個、好ましくは2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上のアミノ酸残基を含むこともできる。本発明の単離抗体によって認識されるエピトープのアミノ酸残基は、連続的である必要はない。
【００４７】
「耐糖能異常」(IGT)は、通常よりは高いが、真性糖尿病として分類されるほど高くない血中グルコースレベルを有すると定義される。IGTを有する被験体は、75 g経口グルコース負荷試験で140〜199 mg/dL (7.8〜11.0 mmol)の2時間血中グルコースレベルを有すると考えられる。これらの血中グルコースレベルは、正常より上であるが、糖尿病と診断されるレベルよりは低い。耐糖能異常または空腹時血糖異常を持つ被験体は、糖尿病を発症する重大なリスクを有し、それゆえ一次予防の重要な標的群である。
【００４８】
「インスリン抵抗性」は、体細胞がインスリンの効果に対して抵抗性となる、すなわち所与の量のインスリンに対する正常な応答が低下する状態をいう。結果として、インスリンがその効果を発揮するために、より高いレベルのインスリンが必要とされる。
【００４９】
「正常グルコースレベル」は、「血糖正常の」という用語と互換的に使用され、6.1 mmol/L (110 mg/dL)未満の空腹時静脈血漿グルコース濃度をいう。この量は任意であるが、このような値は正常耐糖能が証明された被験体にて観察されており、しかし一部は経口グルコース負荷試験(OGTT)によって測定されるようにIGTを有することがある。本発明の文脈におけるおよび本明細書において定義されるベースライン値、指数値、または基準値は、例えば「正常グルコースレベル」を含むことができる。
【００５０】
「前糖尿病状態」とは、正常グルコース恒常性および代謝と、明白な真性糖尿病で見られる状況との中間である代謝状況をいう。前糖尿病状態は非限定的に、メタボリックシンドローム(シンドロームX)、耐糖能異常(IGT)、および空腹時血糖異常(IFG)を含む。IGTは、グルコース調節の食後異常をいうが、IFGは空腹状態で測定される異常をいう。世界保健機関は、IFGの値を6.1 mmol/L (100 mg/dL)以上(全血5.6 mmol/L; 100 mg/dL)であるが、7.0 mmol/L (126 mg/dL)未満(全血6.1 mmol/L; 110 mg/dL)の空腹時血漿グルコース濃度と定義している。全米コレステロール教育プログラム(NCEP)基準によるメタボリックシンドロームは、次：血圧≧130/85 mmHg; 空腹時血漿グルコース≧6.1 mmol/L; 胴囲＞102 cm (男性)または＞88 cm (女性); トリグリセリド≧1.7 mmol/L; およびHDLコレステロール＜1.0 mmol/L (男性)または1.3 mmol/L (女性)の少なくとも3つを有すると定義される。
【００５１】
本発明の文脈において「試料」とは、被験体から単離された生物学的試料であり、例えば、血清、血漿、血球、内皮細胞、組織生検、リンパ液、膵液、腹水、間質液(「細胞外液」としても公知であり、特に歯肉溝滲出液を含む、細胞間の空間に見出される液を包含する)、骨髄、痰、唾液、涙または尿を含むことができる。
【００５２】
本発明の文脈において「被験体」とは、好ましくは、哺乳類である。哺乳類はヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシでありうるが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類は、2型真性糖尿病または前糖尿病状態の動物モデルとなる被験体として好都合に使用されうる。被験体は雄性または雌性であってもよい。被験体は、以前に2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と診断されたあるいはそれらに罹患しているとまたはそれらを有すると特定されたが、任意により、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置をこれまでに受ける必要がなかったものでありうる。被験体は、2型糖尿病または前糖尿病状態に罹患していないものでもありうる。被験体は、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と診断されたあるいはそれらに罹患していると特定されたが、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態のための1つまたは複数の処置を受けた結果として公知の糖尿病リスク因子の改善を示しているものでもありうる。あるいは、被験体は、糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を有すると以前に診断されていないものでもありうる。例えば、被験体は、糖尿病、糖尿病に関連する合併症または前糖尿病状態の1つまたは複数のリスク因子を示すもの、あるいは糖尿病リスク因子を示さない被験体、あるいは糖尿病、1つもしくは複数の糖尿病関連の合併症または前糖尿病状態について無症候性である被験体でありうる。被験体は、糖尿病または前糖尿病状態に罹患している、あるいはそれらを発症するリスクに瀕しているものでもありうる。被験体は、本明細書において定義するように2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と診断されたまたはそれらを有すると特定されたものでもありえ、あるいは、被験体は、以前に2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と診断されていないまたはそれらを有すると特定されていないものでありうる。
【００５３】
糖尿病または前糖尿病状態を有する、あるいは糖尿病または前糖尿病状態を発症する素因のある被験体においてレベルが変化するタンパク質、ペプチド、核酸、多型、および代謝産物は、表1にまとめられており、本明細書では集合的に、特に「糖尿病関連タンパク質」、「T2DBマーカーポリペプチド」、または「T2DBマーカータンパク質」といわれる。ポリペプチドをコードする対応する核酸は、「糖尿病関連核酸」、「糖尿病関連遺伝子」、「T2DBマーカー核酸」、または「T2DBマーカー遺伝子」といわれる。他に指定のない限り、「T2DBマーカー」、「糖尿病関連タンパク質」、「糖尿病関連核酸」は、本明細書で開示する配列のいずれもいうように意図される。本明細書では「T2DBマーカー代謝産物」といわれる、T2DBマーカータンパク質または核酸の対応する代謝産物も測定されうる。1種または複数種の、好ましくは2つまたはそれ以上の上述のクラスのT2DBマーカーの数学的組み合わせ測定から作成された計算指数は、「T2DBマーカー指数」といわれる。タンパク質、核酸、多型、変異タンパク質および変異核酸、代謝産物、ならびに他の分析物は、先の実体のいずれかから構築された一般的な生理学的測定値および指数と同様に、「T2DBマーカー」の広義の分類に含まれる。
【００５４】
548種のバイオマーカーが、糖尿病を有する、または前糖尿病状態に特徴的な症状を示す被験体、例えばインスリン抵抗性である、変化したβ細胞機能を有する、あるいは公知の臨床パラメータまたはリスク因子、例えば糖尿病の家族歴、低い活動レベル、質の悪い食事、過体重(特に胴囲付近)、45歳を超えた年齢、高血圧、高レベルのトリグリセリド、35未満のHDLコレステロール、以前に特定された耐糖能異常、以前の妊娠中の糖尿病(「妊娠真性糖尿病」)または体重が9ポンド超の新生児の出産、および民族性に基づいて糖尿病を発症するリスクに瀕している被験体において、変更または調節された存在または濃度レベルを有すると特定されている。
【００５５】
関心対象の1つのT2DBマーカーは、約4.2 kDの分子量を有し、セリンプロテアーゼ阻害剤である、セルピナ3MのC末端断片とさらに特定された。本マーカーはCDr-RDおよびCDr-HSDラットにおいて上方制御されることが示された。本断片のアミノ酸配列決定は、本断片がアミノ酸配列
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を含むことを明らかにした。
【００５６】
本発明の文脈においてT2DBマーカー「代謝産物」は、全長ポリペプチドの一部分を含む。「部分」という用語によって特定の長さは示されない。T2DBマーカー代謝産物は、長さがアミノ酸500個未満、例えば、長さがアミノ酸400、350、300、250、200、150、100、75、50、35、26、25、15、または10個またはそれ未満でありうる。例示的なT2DBマーカー代謝産物としては、配列番号:1の配列(全部または一部)を含みうるペプチドが挙げられる。好ましくは、T2DBマーカー代謝産物は、配列番号:1の少なくとも5、10、15、20、25個またはそれ以上の連続アミノ酸を含む。
【００５７】
本発明の実践において1種または複数種の、好ましくは2種またはそれ以上のT2DBマーカーを検出することができる。例えば、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、540種またはそれ以上のT2DBマーカーを検出することができる。いくつかの局面において、本明細書で開示される全548種のT2DBマーカーを検出することができる。T2DBマーカーの数を検出できる好ましい範囲には、1〜548から選択される任意の最小数、特に2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、540を、公知の全T2DBマーカー数までの任意の最大数、特に1、2、5、10、20、および25と組み合わせることによって境界される範囲が含まれる。特に好ましい範囲には、1〜2、1〜5、1〜10、1〜15、1〜20、1〜25、1〜30、1〜35、1〜40、1〜45、1〜50、1〜55、1〜60、1〜65、1〜70、1〜75、1〜80、1〜85、1〜90、1〜95、1〜100、1〜120、1〜125、1〜130、1〜140、1〜150、1〜160、1〜175、1〜200、1〜225、1〜250、1〜275、1〜300、1〜325、1〜350、1〜375、1〜400、1〜425、1〜450、1〜475、1〜500、1〜525、1〜540、1〜548、2〜5、2〜10、2〜15、2〜20、2〜25、2〜30、2〜35、2〜40、2〜45、2〜50、2〜55、2〜60、2〜65、2〜70、2〜75、2〜80、2〜85、2〜90、2〜95、2〜100、2〜120、2〜125、2〜130、2〜140、2〜150、2〜175、2〜200、2〜225、2〜250、2〜275、2〜300、2〜325、2〜350、2〜375、2〜400、2〜425、2〜450、2〜475、2〜500、2〜525、2〜540、2〜548、2〜5〜10（5〜10）、5〜15、5〜20、5〜25、5〜30、5〜35、5〜40、5〜45、5〜50、5〜55、5〜60、5〜65、5〜70、5〜75、5〜80、5〜85、5〜90、5〜95、5〜100、5〜120、5〜125、5〜130、5〜140、5〜150、5〜175、5〜200、5〜225、5〜250、5〜275、5〜300、5〜325、5〜350、5〜375、5〜400、5〜425、5〜450、5〜475、5〜500、5〜525、5〜540、5〜548、10〜15、10〜20、10〜25、10〜30、10〜35、10〜40、10〜45、10〜50、10〜55、10〜60、10〜65、10〜70、10〜75、10〜80、10〜85、10〜90、10〜95、10〜100、10〜120、10〜125、10〜130、10〜140、10〜150、10〜175、10〜200、10〜225、10〜250、10〜275、10〜300、10〜325、10〜350、10〜375、10〜400、10〜425、10〜450、10〜475、10〜500、10〜525、10〜540、10〜548、20〜50、20〜75、20〜100、20〜120、20〜125、20〜130、20〜140、20〜150、20〜175、20〜200、20〜225、20〜250、20〜275、20〜300、20〜325、20〜350、20〜375、20〜400、20〜425、20〜450、20〜475、20〜500、20〜525、20〜540、20〜548、50〜75、50〜100、50〜120、50〜125、50〜130、50〜140、50〜150、50〜175、50〜200、50〜225、50〜250、50〜275、50〜300、50〜325、50〜350、50〜375、50〜400、50〜425、50〜450、50〜475、50〜500、50〜525、50〜540、50〜548、100〜125、100〜150、100〜175、100〜200、100〜225、100〜250、100〜275、100〜300、100〜325、100〜350、100〜375、100〜400、100〜425（50〜425）、100〜450、100〜475、100〜500、100〜525、100〜540、100〜548、125〜150、125〜175、125〜200、125〜225、125〜250、125〜275、125〜300、125〜325、125〜350、125〜375、125〜400、125〜425、125〜450、125〜475、125〜500、125〜525、125〜540、125〜548、150〜175、150〜200、150〜225、150〜250、150〜275、150〜300、150〜325、150〜350、150〜375、150〜400、150〜425、150〜450、150〜475、150〜500、150〜525、150〜540および150〜548が含まれる。
【００５８】
診断および予後診断方法
糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するリスクは、試験試料(例えば、被験体由来の試料)中のT2DBマーカータンパク質、ペプチド、核酸、多型、代謝産物、および他の分析物の「有効量」を検査すること、ならびに該有効量を基準値または指数値と比較することによって検出することができる。「有効量」とは、試料中で検出されるT2DBマーカーの総量またはレベルでありうるか、あるいは「規準化された」量、例えば、試料中で検出されたT2DBマーカーとバックグラウンドノイズとの差でありうる。規準化方法および規準化値は、検出の方法に応じて異なると考えられる。好ましくは、数学的アルゴリズムを使用して、複数個体のT2DBマーカーの結果から得た情報を単一の測定値または指数に重ね合わせ処理することができる。糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態のリスク増加を有すると特定された被験体は任意により、本明細書において定義される「糖尿病調節剤」などの予防または治療化合物の投与のような、処置計画、あるいは糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の発病を予防または遅延するための運動計画または食事補充物の実施を受けるように選択されてもよい。被験体から単離された試料は、例えば、血液、血漿、血球、内皮細胞、組織生検、リンパ液、膵液、血清、骨髄、腹水、間質液(例えば、歯肉溝滲出液を含む)、尿、痰、唾液、涙または他の体液を含みうる。
【００５９】
T2DBマーカータンパク質、ペプチド、核酸、多型、代謝産物、または他の分析物の量を試験試料中で測定し、正常対照レベルと比較することができる。「正常対照レベル」という用語は、例えば高齢までモニターされ、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症していないことが見出された若年被験体の長期研究から収集された試料に対しての、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態に罹患しておらず、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を有する可能性が高くない被験体で通常見出される、1種もしくは複数種のT2DBマーカータンパク質、核酸、多型、代謝産物もしくは他の分析物のレベル、またはT2DBマーカー指数を意味する。「正常対照レベル」は、本明細書において定義される「正常グルコースレベル」または「血糖正常レベル」を有する被験体から導出された値を包含することができる。あるいは、正常対照レベルは、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態に罹患している被験体に通常見出される1種または複数種のT2DBマーカータンパク質、ペプチド、核酸、多型、代謝産物、または他の分析物のレベルを意味することもできる。正常対照レベルは範囲または指数でありうる。あるいは、正常対照レベルは、以前に試験された被験体から得たパターンのデータベースであってもよい。正常対照レベルと比べての1種または複数種のT2DBマーカータンパク質、核酸、多型、代謝産物、または他の分析物の被験体由来の試料中でのレベルの変化は、被験体が糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態に罹患している、またはそれらを発症するリスクに瀕していることを示しうる。対照的に、該方法が予防的に適用される場合、1種または複数種のT2DBマーカータンパク質、核酸、多型、代謝産物、または他の分析物の被験体由来の試料における正常対照レベルと比べての同様のレベルは、被験体が糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態に罹患していないか、それらを発症するリスクに瀕していない、または発症するリスクが低いことを示しうる。
【００６０】
基準値は、糖尿病状態が既知である(すなわち、2型糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と診断されたまたはそれらに罹患していると特定された、あるいは2型糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と診断されていない、またはそれらに罹患していると特定されていない)対照被験体または集団から導出した値をいうことができ、または指数値もしくはベースライン値であってもよい。基準試料または指数値もしくはベースライン値は、処置を受けた1個体または複数個体の被験体から取得または導出されうるか、あるいは糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するリスクが低い1個体または複数個体の被験体から取得または導出されうるか、あるいは処置を受けた結果として糖尿病リスク因子の改善を示している被験体から取得または導出されうる。あるいは、基準試料または指数値もしくはベースライン値は、処置を受けていない1個体または複数個体の被験体から取得または導出されうる。例えば、試料は、処置の進展をモニターするために、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の初期処置および糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態のその後の処置を受けた被験体から収集されうる。基準値は、リスク予測アルゴリズムまたは本明細書において開示されるものなどの集団研究より計算された指数から導出した値も含みうる。基準値は、2型糖尿病もしくは前糖尿病状態に関連する1つもしくは複数の合併症を有すると以前に特定された被験体から導出した値、あるいは合併症を発症していない、または以前に2型糖尿病もしくは前糖尿病状態に関連する合併症と診断されていないもしくはそれらを有すると特定されていない被験体から導出した値でもありうる。基準値は、正常対照レベルに対応する値、または本明細書において定義される「正常グルコースレベル」を有する1個体もしくは複数個体の被験体に由来する値も含みうる。
【００６１】
本発明の方法により測定したT2DBマーカーの(「有効量」でありうる)レベルまたは量の相違は、T2DBマーカーのレベルまたは量の増加または減少を含みうる。基準値に対してのT2DBマーカーの量の増加または減少は、2型糖尿病もしくは前糖尿病状態の進行、2型糖尿病もしくは前糖尿病状態に関連する合併症の遅延、進行、発症または軽減、2型糖尿病もしくは前糖尿病状態、またはそれに関連する合併症を発症するリスクの増加または減少を示しうる。増加または減少は、2型糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態のための1つまたは複数の処置計画の成功を示しうるか、あるいは糖尿病リスク因子の改善または逆行を示しうる。増加または減少は、例えば、基準値または正常対照レベルの少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、または少なくとも50%でありうる。
【００６２】
T2DBマーカーのレベル(または量)の相違は、好ましくは統計的に有意である。「統計的に有意である」とは、変化が偶然だけで起こると予想されるものよりも大きいことを意味する。統計的有意性は、当技術分野において公知のいずれの方法によっても決定されうる。例えば、統計的有意性は、p値によって決定されうる。p値は、実験中の群間の差が偶然によって起こった確率の指標である。(P(z>観察z(zobserved)))。例えば、0.01のp値は、結果が偶然起こった確率が100分の1であることを意味する。p値が小さくなればなるほど、群間の差が処置によって引き起こされた可能性がより高くなる。p値が少なくとも0.05である場合に、変化は統計的に有意である。好ましくは、p値は、0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.001またはそれ以下である。下記のように、本発明の制限なしに、統計的有意性を達成することは、必ずではないが一般に、いくつかのT2DBマーカーの組み合わせがパネルで共に使用されて、統計的に有意なT2DBマーカー指数を達成するために数学的アルゴリズムと併用されることが必要である。
【００６３】
試験、アッセイ法または方法の「診断精度」は、試験、アッセイ法または方法の、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を有する、または糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態のリスクに瀕した被験体を区別する能力が、1種または複数種のT2DBマーカーのレベルの「臨床的に有意な存在」または「臨床的に有意な変化」を被験体が有するかどうかに基づくことに関係する。「臨床的に有意な存在」または「臨床的に有意な変化」とは、被験体(通常は被験体由来の試料)におけるT2DBマーカーの存在(例えば、ミリグラム、ナノグラムなどの質量、もしくはデシリットル当たりのミリグラムなどの体積当たりの質量もしくは単位体積当たりの転写物のコピー数)またはT2DBマーカーの存在の変化が、そのT2DBマーカーの所定のカットオフ点(または閾値)よりも高く、それゆえ、そのタンパク質、ペプチド、核酸、多型、代謝産物または分析物の十分に高い存在がマーカーである糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を被験体が有すると示唆されることを意味する。
【００６４】
本発明を使用して2型糖尿病への転換のリスクの分類的または連続的測定を行い、したがって前糖尿病と定義された被験体の分類を診断することができる。
【００６５】
分類的計画では、本発明の方法は正常被験体コホートと前糖尿病状態被験体コホートを区別するために使用されうる。本発明のこの分類的使用において、「高い診断精度」および「非常に高い診断精度」という用語は、前糖尿病状態の存在または非存在を正しく(精密に)示す所定のカットオフ点を持つそのT2DBマーカー(またはT2DBマーカー指数; T2DBマーカー値が、単一のT2DBマーカーからの、またはT2DBマーカーの指数から導出されたいずれかの個々の測定値を含む場合)についての試験またはアッセイ法をいう。完璧な試験は完璧な精度を有する。それゆえ前糖尿病状態を有する被験体では、該試験は陽性試験結果のみ示し、「陰性」とされる被験体のいずれも報告しない(「偽陰性」はない)。言い換えれば、試験の「感度」(真の陽性率)は100%であると考えられる。他方、それゆえ前糖尿病状態を有さなかった被験体では、該試験は陰性試験結果のみ示し、「陽性」とされる被験体のいずれも報告しない(「偽陽性」はない)。言い換えれば「特異性」(真の陰性率)は100%であると考えられる。試験、例えば臨床診断試験の特異性、感度、ならびに陽性および陰性予測値について議論している、例えばO'Marcaigh AS,Jacobson RM,「Estimating The Predictive Value Of A Diagnostic Test, How To Prevent Misleading Or Confusing Results」, Clin.Ped.1993,32(8):485-491を参照されたい。他の態様において、本発明は前糖尿病状態を糖尿病から、または糖尿病を正常から区別するために使用されうる。このような使用は、T2DBマーカーの異なるサブセット(表1に開示したような全T2DBマーカーからの)、数学的アルゴリズム、および/またはカットオフ点を必要とするが、所期の用途のために診断精度の同じ上述の測定を受ける。
【００６６】
疾患の分類的診断において、試験(またはアッセイ法)のカット点または閾値を変更することで、通常、感度および特異性が、ただし定性的に反比例関係で変化する。例えば、カット点を下げれば、試験集団内のさらに多くの被験体が、通常、カット点または閾値を超える試験結果を有すると考えられる。カット点を超える試験結果を有する被験体は、試験が行われる疾患、状態または症候群を有すると報告されるので、カット点を下げることにより、いっそう多くの被験体が陽性結果を有する(例えば、被験体が糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を有するもの)と報告されるようになると考えられる。このように、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を有するさらに高い割合の被験体が試験によって、それを有することが示されると考えられる。したがって、試験の感度(真の陽性率)は増大すると考えられる。しかしながら、同時に、疾患、状態または症候群を有していないさらに多くの人々(例えば、真に「陰性」である人々)が試験によって、カット点を超えたT2DBマーカー値を有するものと示され、それゆえ、試験によって陰性であると正しく示されるのではなく、むしろ陽性と(すなわち疾患、状態または症候群を有すると)報告されるので、さらに多くの偽陽性が存在すると考えられる。したがって、試験の特異性(真の陰性率)は低下すると考えられる。同様に、カット点を上昇させることは感度を低下させ、特異性を増大させる傾向があると考えられる。それゆえ、被験体の状態を評価するために提案された医学的試験、アッセイ法または方法の精度および有用性を評価する場合、感度と特異性の両方を常に考慮すべきであり、感度および特異性はカット点の範囲にわたり著しく変化しうるので、感度および特異性の報告時にカット点が何かということに注意すべきである。
【００６７】
しかしながら、試験(またはアッセイ法)のカット点の範囲全体にわたって、試験、アッセイ法、または方法の感度および特異性の表現を単一の値のみによって可能にする指標がある。その指標は、問題の試験、アッセイ法または方法の受信者動作特性(「ROC」)曲線から導出される。例えば、Shultz, 「Clinical Interpretation Of Laboratory Procedures」, chapter 14 in Teitz, Fundamentals of Clinical Chemistry, Burtis and Ashwood (eds.), 4th edition 1996, W.B. Saunders Company, pages 192-199; およびZweig et al., 「ROC Curve Analysis: An Example Showing The Relationships Among Serum Lipid And Apolipoprotein Concentrations In Identifying Subjects With Coronory Artery Disease」, Clin. Chem., 1992, 38(8): 1425-1428を参照されたい。
【００６８】
ROC曲線は、0から1のスケール(例えば100%)のx軸上の1マイナス特異性に等しい値に対する、0から1のスケール(例えば100%)のy軸上の感度のx-yプロットである。言い換えれば、それはその試験、アッセイ法、または方法での偽陽性率に対する真の陽性率のプロットである。問題の試験、アッセイ法、または方法のROC曲線を構築するには、被験体は、被験体が疾患、状態、または症候群について真に陽性または陰性であるかどうかを判定するために、例えば問題の試験、アッセイ法、または方法とは独立している完全に精密な、または「基準」方法を使用して評価されうる(例えば冠動脈造影は、冠状動脈アテローム性動脈硬化の存在についての基準試験である)。被験体はまた、問題の試験、アッセイ法または方法を使用して、各種のカット点について試験され、被験体は試験、アッセイ法、または方法にしたがって陽性または陰性として報告される。感度(真の陽性率)および1マイナス特異性に等しい値(偽陽性値と等しい値)が各カット点について決定され、x-y値の各対がx-y図に1つの点としてプロットされる。これらの点を連結する「曲線」がROC曲線である。
【００６９】
ROC曲線は、感度および特異性が最大化される最適な単一の臨床カットオフまたは処置閾値を決定するためにしばしば使用される。このような状況は、曲線の下に描かれうる1個の最大の長方形の左上角を描くROC曲線上の点を表す。
【００７０】
曲線下面積(「AUC」)全体は、試験のカット点の範囲全体にわたって、試験、アッセイ法、または方法の感度および特異性の表現を単一の値のみによって可能にする指標である。最大AUCは1であり(完全な試験)、最小面積は2分の1である(例えば正常対疾患の区別がない面積)。AUCが1に近づけば近づくほど、試験の精度はより良好である。全てのROCおよびAUCにおいて、問題の疾患および試験後時間水平の定義が暗黙であることに注目すべきである。
【００７１】
「高い診断精度」とは、AUC (試験またはアッセイ法のROC曲線下面積)が少なくとも0.70、望ましくは少なくとも0.75、さらに望ましくは少なくとも0.80、好ましくは少なくとも0.85、さらに好ましくは少なくとも0.90、最も好ましくは少なくとも0.95である試験またはアッセイ法を意味する。
【００７２】
「非常に高い診断精度」とは、AUC (試験またはアッセイ法のROC曲線下面積)が少なくとも0.80、望ましくは少なくとも0.85、さらに望ましくは少なくとも0.875、好ましくは少なくとも0.90、さらに好ましくは少なくとも0.925、最も好ましくは少なくとも0.95である試験またはアッセイ法を意味する。
【００７３】
あるいは、低罹患率の試験済み集団 (1年につき1%未満の発生率の集団と定義される)において、ROCおよびAUCは、試験の臨床有用性に関して誤解を招くおそれがあり、診断精度を判定するために本開示の別の箇所で定義される絶対および相対リスク比が利用されうる。試験される被験体の集団も四分位へ分類可能であり、上位四分の一(集団の25%)は、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するまたはそれらに罹患する最も高い相対リスクを有する被験体の群を含み、下位四分の一は、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症する最も低い相対リスクを持つ被験体の群を含む。一般に、低罹患率の集団における上位四分の一から下位四分の一の2.5倍を超える相対リスクを有する試験またはアッセイ法から導出された値は、「高い診断精度」を有すると見なされ、各四分位について5〜7倍の相対リスクを有するものは非常に高い診断精度を有すると見なされる。それでもなお、各四分位について1.2〜2.5倍の相対リスクしか持たない試験またはアッセイ法から導出された値も依然として臨床的に有用であり、疾患のリスク因子として広く使われている。これは将来の2型糖尿病のその予測に関するインスリンレベルまたは血中グルコースレベルの場合である。
【００７４】
いずれの試験の予測値も、試験の感度および特異性に、および試験される集団における該状態の罹患率に依存する。この概念は、ベイズ定理に基づいて、スクリーニングされる該状態が被験体または集団に存在する可能性(試験前確率)が大きければ大きいほど、陽性試験の妥当性はより大きく、結果が真の陽性である可能性がより大きいことを規定する。それゆえ該状態が存在する可能性が低いいずれかの集団において試験を使用することについての問題は、陽性結果が限定された値を有する(すなわち偽陽性となりやすい)ことである。同様に非常に高いリスクの集団では、陰性試験結果が偽陰性となりやすい。診断精度、すなわちROC曲線上のカット点を定義することによって、許容されるAUC値を定義することおよび本発明のT2DBマーカーの有効量を構成するものの相対濃度の許容される範囲を決定することは、当業者がT2DBマーカーを使用して所定の予測性レベルによって被験体を診断または特定できるようにする。
【００７５】
診断精度を決定する別法は、疾患分類またはリスク分類(前糖尿病状態などの)が関連する医学会および医学慣行によってなお明確に定義されていないときに一般に使用される、リスクの連続的測定とともに使用されねばならない。
【００７６】
「リスク」は、本発明の文脈において、特定の期間にわたって事象が発生する確率百分率をいう、「絶対」リスクを意味しうる。絶対リスクは、関連時間コホートの測定後実見に関連して、または関連する期間にわたって追跡された統計的に妥当な歴史的コホートから発生させた指数値に関連してのどちらかで測定されうる。「相対」リスクは、低リスクコホートまたは平均集団リスクのどちらかと比較した被験体のリスクの絶対リスクの比であり、臨床リスク因子が評価される方法によって変化しうる。オッズ比、所与の試験結果で陰性事象に対する陽性事象の比も、無転換に対して一般に使用される(オッズは式: p/(1-p)により、式中、pが事象の確率であり、(1-p)が事象なしの確率である)。本発明の文脈で評価されうる代わりの連続尺度には、糖尿病転換までの時間および治療的糖尿病転換リスク軽減比が含まれる。
【００７７】
このような連続尺度では、計算指数の診断精度の尺度は通常、予測された連続値と実際の観察値(または歴史的指数計算値)との間の線形回帰曲線当てはめに基づいており、R2乗、p値および信頼区間などの尺度を利用する。Genomic Health (Redwood City, California)によって商品化された将来の乳がん再発のリスクに関する試験におけるように、歴史的な観察されたコホートの予測に基づく信頼区間(通常、90%または95% CI)を含む、このようなアルゴリズムを使用する予測値が報告されることは珍しくはない。
【００７８】
糖尿病への真のリスク転換の最終的な決定因子および究極の判断基準は、十分に大きい集団内での実際の転換であり、特定の時間長にわたって観察される。しかしながら、これは問題がある。というのは、それが必然的に遡及的視点であり、予防的介入の機会の後にも起こるからである。結果として、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態に罹患している、またはそれらを発症するリスクに瀕した被験体は一般に、当技術分野において公知の方法によって診断または特定され、将来のリスクは歴史的経験および登録機関の研究に基づいて概算される。このような方法には、収縮期および拡張期血圧の測定、肥満度指数の測定、血液試料からの総コレステロール、LDL、HDL、インスリンおよびグルコースレベルのインビトロでの測定、経口グルコース負荷試験、ストレス試験、ヒト血清C反応性タンパク質(hsCRP)の測定、心電図(ECG)、c-ペプチドレベル、抗インスリン抗体、抗β細胞抗体、ならびにグリコシル化ヘモグロビン(HbA1c)が含まれるが、これらに限定されることはない。さらに、上記の方法のいずれも、被験体が「糖尿病リスク因子の改善」を示したかどうかを評価するために別個にまたは組み合わせて使用されうる。このような改善には非限定的に、肥満度指数(BMI)の低下、血中グルコースレベルの低下、HDLレベルの増大、収縮期および/もしくは拡張期血圧の低下、インスリンレベルの増大、またはその組み合わせが含まれる。
【００７９】
経口グルコース負荷試験(OGTT)は主に、妊娠中に、または疫学研究において血中グルコースレベルが疑わしい場合に、真性糖尿病または前糖尿病状態の診断に使用される(Definition, Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus and its Complications, Part 1, World Health Organization, 1999)。OGTTは、少なくとも3日間の制限されない食事(炭水化物1日当たり150 g超)および通常の身体活動後の朝に実施すべきである。試験前の晩には、合理的な(30〜50 g)炭水化物を含有する食事を摂取すべきである。試験の前に8〜14時間の一晩絶食を行うべきであり、その間に水は摂取してもよい。空腹時血液試料の採取後に、被験体は水250〜300 ml中の無水グルコース75 gまたはグルコース一水和物82.5 gを5分間のうちに飲むべきである。小児の場合、試験負荷は体重1 kg当たりグルコース1.75 gで、グルコース総量は75 gである。試験のタイミングは、飲用開始からである。血液試料は試験負荷の2時間後に採取する必要がある。先に記載したように、耐糖能異常(IGT)は、WHOのカットオフ点を使用した場合の7.5年間での糖尿病への転換について、わずか50%の感度で、＞10%の偽陽性であると記載されている。比較的高リスクの民族群でさえ、他のリスク因子によって高められない限り、このような期間にわたって糖尿病への10%の転換率を有するだけなので、このことは試験の臨床有用性にとって重大な問題である。選択されなかった一般集団では、このような期間にわたる転換率は通常、1年に付き5〜6%または1%未満として概算される。
【００８０】
血中のグルコースを測定する他の方法には、ソモギ・ネルソン法、ヘキソキナーゼおよびグルコースデヒドロゲナーゼを使用する方法、固定化グルコースオキシダーゼ電極、o-トルイジン法、フェリシアニド法ならびにネオクプロイン(neocuprine)自動分析器法などの、当技術分野において公知の還元測定法が含まれるが、これらに限定されることはない。全血グルコース値は通常、正常ヘマトクリット読取値を持つ患者の対応する血漿値よりも約15%低く、動脈値は一般に、対応する静脈値よりも約7%高い。インスリンを摂取する被験体は、1日のうち所定の時刻における血中グルコースの自己測定によって「血糖プロファイル」を構築することを要求されることが多い。各食事の前および90分後、ならびに就寝直前に試料を採取する「7点プロファイル」が有用である。
【００８１】
糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態に罹患している、またはそれらを発症するリスクに瀕している被験体は、心血管疾患、高血圧または肥満に罹患しているか、またはそれらを発症するリスクに瀕していることもある。特に2型糖尿病、および心血管疾患は共通のリスク因子を多く有し、これらのリスク因子の多くは相互に高度に相関している。これらのリスク因子間の関係は、少数の生理学的現象、おそらく単一の現象にさえ起因しうる。本発明の1種または複数種のT2DBマーカーのレベルを検出することに加えて、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症、心血管疾患、高血圧または肥満に罹患している、またはそれらを発症するリスクに瀕している被験体は当技術分野において公知の方法によって特定されうる。例えば、糖尿病は、空腹時血中グルコースレベルまたはインスリンを測定することによって診断されることが多い。正常な成人グルコースレベルは60〜126 mg/dlである。正常なインスリンレベルは7 mU/ml±3 mUである。高血圧は、常に140/90以上の血圧によって診断される。心血管疾患のリスクは、コレステロールレベルを測定することによっても診断されうる。例えば、137を超えるLDLコレステロールまたは200を超える総コレステロールは、心血管疾患のリスクの高まりを示す。肥満は、例えば、肥満度指数によって診断される。肥満度指数(BMI)が測定される(kg/m2 (またはlb/in2×704.5))。あるいは、胴囲(脂肪分布を推定)、腹囲対臀囲比(脂肪分布を推定)、皮下脂肪厚(複数部位で測定される場合、脂肪分布を推定)、または生体インピーダンス(除脂肪量は脂肪量よりも良好に電流を伝導する(すなわち、脂肪量は電流を妨害する)という原理に基づき、脂肪%を推定)が測定されうる。正常、過体重、または肥満個体のパラメータは次の通りである：体重不足: BMI<18.5; 正常: BMI 18.5〜24.9; 過体重: BMI＝25〜29.9。過体重個体は、胴囲が男性では＞94 cmまたは女性では＞80 cmならびに腹囲対臀囲比が男性では≧0.95および女性では≧0.80有ると特徴付けられる。肥満個体は、身長に対する「正常」体重よりも20%超であるBMI 30〜34.9を有し、体脂肪率が女性では＞30%および男性では＞25%有り、ならびに胴囲が男性では＞102 cm (40インチ)または女性では88 cm (35インチ)有ると特徴付けられる。重症または病的肥満の個体は、BMI≧35を有すると特徴付けられる。糖尿病と心血管疾患との相互関係のために、本発明の個々のT2DBマーカーおよびT2DBマーカー発現プロファイルの一部または全部が重複するか、または心血管疾患のバイオマーカーに包含されることがあり、実際に心血管疾患のリスクの診断において有用でありうる。
【００８２】
真性糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態のリスク予測は、被験体が歴史的コホートに関連して糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症する絶対リスクを評価および概算する、リスク予測アルゴリズムおよび計算指数も包含しうる。このような予測的数学的アルゴリズムおよび計算指数を用いるリスク評価は、診断試験および処置の指針のなかにますます組み入れられるようになっており、特に、代表的集団からの多段階層化試料から得られ、それにより検証された指数を包含する。複数の在来の糖尿病リスク因子が予測モデルに組み入れられる。このようなアルゴリズムの著名な例としてはフラミンガム心臓病研究(Framingham Heart Study) (Kannel, W.B., et al, (1976) Am. J. Cardiol. 38: 46-51)およびNCEP/ATP IIIとしても公知のNational Cholesterol Education Program Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III)などの、フラミンガム研究の改良されたものが挙げられ、NCEP/ATP IIIは、真性糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態に罹患している、またはそれらを発症するリスクに瀕している被験体で一般に見出される心血管疾患を発症するヒトの10年リスクを概算するために、患者の年齢、総コレステロール濃度、HDLコレステロール濃度、喫煙状況、および収縮期血圧を包含する。フラミンガムアルゴリズムは、真性糖尿病または前糖尿病状態を発症するリスクを適度に予測することが見出されている。
【００８３】
他の糖尿病リスク予測アルゴリズムには非限定的に、サンアントニオ心臓研究(San Antonio Heart Study) (Stern, M.P. et al, (1984) Am. J. Epidemiol. 120: 834-851; Stern, M.P. et al, (1993) Diabetes 42: 706-714; Burke, J.P. et al, (1999) Arch. Intern. Med. 159: 1450-1456)、アルキメデス(Archimedes) (Eddy, D.M. and Schlessinger, L. (2003) Diabetes Care 26(11): 3093-3101; Eddy, D.M. and Schlessinger, L. (2003) Diabetes Care 26(11): 3102-3110)、フィンランドを拠点とする糖尿病リスクスコア(the Finnish-based Diabetes Risk Score) (Lindstrom, J. and Tuomilehto, J. (2003) Diabetes Care 26(3): 725-731)、およびエリー研究(Ely Study) (Griffin, S.J. et al, (2000) Diabetes Metab. Res. Rev. 16: 164-171)が含まれ、これらの内容は参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
【００８４】
アルキメデスは、ヒトごとに、目的ごとに疾患状況を模擬する糖尿病の数学モデルであり、実際に連続している生物学的詳細事項、例えば関係する臓器系、50を超える連続的に相互作用する生物学的変数、ならびに糖尿病に一般に関連する主要な症状、試験、処置、および結果を含む。
【００８５】
アルキメデスは、単一の統合された生理学の中に多くの疾患を同時および相互作用的に含み、共存症、症候群、処置および他の複数の効果などの特徴に対処することを可能にしている。アルキメデスモデルは、糖尿病およびその合併症、例えば冠動脈疾患、うっ血性心不全、および喘息などを含む。該モデルは、オブジェクト指向プログラミングおよび「特徴」と呼ばれるコンストラクトを使用して各種の式で表される。該モデルは、被験体の構造(模擬された被験体は全て、臓器、例えば心臓、肝臓、膵臓、消化管、脂肪、筋肉、腎臓、目、肢、循環系、脳、皮膚、および末梢神経系を有する)、疾患の経過を決定して、実際の身体現象を示す「特徴」(例えば血漿1デシリットル中のグルコースのミリグラム数、行動的現象、または概念的現象(例えば疾患の「進行」)、疾患のリスク因子、発生率、および進行、グルコース代謝、徴候および試験、診断、症状、グルコース代謝の健康上の結果、処置、合併症、糖尿病およびその合併症による死、他の原因による死、治療プロセスおよび医療システム資源を含む。該モデルの代表的な利用では、数千名の模擬された被験体がおり、それぞれ模擬された構造および生理学を備え、模擬された疾患を得て、模擬された医療施設での治療を求めることが可能であり、模擬された施設で模擬された医療従事者に面会して、模擬された試験および処置を受けて、模擬された結果を得ると考えられる。実際と同様に、模擬された患者はそれぞれ異なっており、異なる特質、生理学、行動、および処置に対する応答を備え、全て実際に見られる個別の変化に適合するように設計されている。
【００８６】
該モデルは、現在の情報で最も良好に理解されるような、関連する生物学および病理学の非定量的または概念的記述−変数および関係−の開発により構築される。次に変数および関係に関する研究が識別され、通常、当技術分野の専門家が疾患についての独自の知識の基礎として認識する基礎研究、疫学、および臨床研究を含む。その情報は、変数を関連付ける各種の式を開発するために使用される。アルキメデスモデルのいずれかの特定の式の開発は、変数に関して入手可能な情報に最良に適合する形および係数を見出すことを含み、その後に式はオブジェクト指向言語へプログラミングされる。この後にモデルの部分が、最初は1回に1つずつ、次に適切な組み合わせで、公知の出力を有する入力を使用して試験およびデバッグされる、一連の演習が続く。次にモデル全体を使用して、モデルの個々の部分だけでなく、全ての部分間の連結も実証する複合試験を模擬することができる。アルキメデス計算は、分散コンピューティング技法を使用して実施される。アルキメデスは、糖尿病およびその合併症に関連する構造、病態生理学、処置および結果の実際的な表現として検証されてきた(Eddy, D.M.and Schlessinger, L.(2003)Diabetes Care 26(11)3102-3110)。
【００８７】
フィンランドを拠点とする糖尿病リスクスコアは、集団内の高リスク被験体を特定するための、ならびに改善可能なリスク因子および健康的なライフスタイルへの認識を向上させるためにスクリーニングツールとして設計されている。糖尿病リスクスコアは、ベースラインにて抗糖尿病薬治療を受けていない35〜64歳のフィンランドの男女のランダム集団試料から決定して、10年間追跡した。多変量ロジスティック回帰モデル係数を使用して各変数カテゴリにスコアを割り当てた。糖尿病リスクスコアは、これらの個々のスコアの合計を含み、5年間の前向き追跡調査を伴う1992年に実施された独立集団調査で検証された。年齢、BMI、胴囲、降圧薬治療および高血中グルコースの履歴、身体活動、果実、液果、または野菜の日常消費が分類変数として選択された。
【００８８】
フィンランドを拠点とする糖尿病リスクスコア値は、それらを5つの種類に分類することによってロジスティックモデルの係数から導出された。リスク因子のいずれかの組み合わせについての10年間の期間にわたる薬物処置糖尿病の概算確率(p)は、次の係数から算出できる。
2010539513.tif 000004
式中、β0は切片であり、β1、β2などは、リスク因子x1、x2などの各種の分類の回帰係数を表す。
【００８９】
感度は、試験が将来薬物処置糖尿病に罹患する被験体に対して陽性である確率に関連しており、特異性は、試験が薬物処置糖尿病でない被験体に対して陰性である確率を反映する。95%信頼区間(CI)の感度および特異性は、薬物処置糖尿病を発症した被験体を発症しなかった被験体から区別する場合に、各糖尿病リスクスコアレベルについて算出された。ROC曲線は糖尿病リスクスコアについてプロットされ、感度はy軸上にプロットされ、偽陽性率(1-特異性)はx軸上にプロットされた。試験がより精密に識別的であればあるほど、ROC曲線の上昇部分がより鋭くなり、AUCがより高くなり、最適カット点は曲線のピークである。
【００９０】
糖尿病リスクスコアにおける将来の薬物処置糖尿病の統計的に有意な独立した前兆は、年齢、BMI、胴囲、降圧薬治療、および高い血中グルコースレベルの履歴である。糖尿病リスクスコアモデルには、これらの統計的に有意な変数のみを含む簡易モデルと、身体活動ならびに果実および野菜消費を含むフルモデルがある。
【００９１】
サンアントニオ心臓研究は、メキシコ系アメリカ人および非ヒスパニック白人における糖尿病および心血管疾患の長期にわたるコミュニティーを拠点とする前向き観察研究である。試験は当初、メキシコ系アメリカ人3,301名および非ヒスパニック白人男性および非妊婦1,857名を1979〜1988年の2回の時期に登録した。参加者は登録時に25〜64歳であり、テキサス州サンアントニオで低所得、中所得、高所得地区からランダムに選択した。7〜8年間の追跡試験は、試験に当初登録した生存個体の約73%を追跡した。糖尿病の病歴、年齢、性別、民族性、BMI、収縮期および拡張期血圧、空腹時および2時間血漿血中グルコースレベル、空腹時血清総コレステロール、LDLおよびHDLコレステロールレベルはもちろんのこと、トリグリセリドレベルなどのベースライン特質を収集および評価した。従属変数としてのありがちな糖尿病を用いた多重ロジスティック回帰モデル、および上述ベースライン特質は、独立変数として利用した。このモデルを使用すると、単変量オッズ比を男性および女性について別個に、および両方の性別で合せて、潜在的各リスク因子について計算できる。連続的なリスク因子では、オッズ比は1-SD増分について示されうる。両方の性別を合せた多変量予測モデルは、個別に調査したときに統計的に有意なオッズ比を示した変数をモデルに入れることが許容される段階的ロジスティック回帰手順を使用して開発できる。多変量モデルは次に、ROC曲線およびDeLongによって記載されたような(DeLong E.R. et al, (1988) Biometrics 44: 837-45)ノンパラメトリックアルゴリズムによって概算されたROC曲線下面積の95%CIによって解析される。サンアントニオ心臓研究の結果は、前糖尿病被験体がリスク因子のアテローム発生パターン(おそらく肥満、高血糖、および特に高インスリン血症によって生じる)を有し、それが多年にわたって存在することがあり、臨床的糖尿病自体の期間と同じだけ大血管疾患のリスクの原因となりうることを示している。
【００９２】
糖尿病および前糖尿病状態のリスクを評価するために用いられている多数の研究およびアルゴリズムにもかかわらず、無症候性の個体またはそうでなければ健常な被験体において糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を顕在化させる短期および長期リスクの予測には、証拠に基づく多リスク因子評価法が中程度に正確なだけである。このようなリスク予測アルゴリズムは、関心対象の集団内の被験体を区別して糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するリスク層別化を決定するために、本発明のT2DBマーカーと組み合わせて好都合に使用されうる。本明細書において開示するT2DBマーカーおよび使用方法は、無症候性であり、在来のリスク因子を示さない被験体を評価、特定、または診断するために、このようなリスク予測アルゴリズムと組み合わせて使用されうるツールを提供する。
【００９３】
リスク予測アルゴリズムから、および本発明の方法から導出されたデータは、線形回帰によって比較されうる。線形回帰解析は、線形式を観察されたデータに当てはめることによって2つの変数間の関係をモデル化する。1つの変数は説明変数と見なされ、他方は従属変数と見なされる。例えばアルキメデスまたはサンアントニオ心臓解析から取得した値は、計算されたアルゴリズムスコアに潜在する基礎を成す生物学をさらに十分に定義する目的で、従属変数として使用され、説明変数としての1種または複数種のT2DBマーカーのレベルに対して解析されうる(実施例参照)。あるいは、このようなリスク予測アルゴリズム、または一般にT2DBマーカー自体であるその個々の入力は、本発明の実施に直接包含され、組み合わされたアルゴリズムは、歴史的コホートにおける実際の観察結果と比較される。
【００９４】
線形回帰直線は、Y = a + bXという形の式を有し、式中、Xは説明変数であり、Yは従属変数である。線の傾きはbであり、aは切片(x=0のときのyの値)である。2つの変数の間の関連の数値尺度は、「相関係数」、すなわちRであり、2つの変数について観察されたデータの関連の強度を示す-1〜1の値である。これはしばしば、「決定係数」、すなわちR2としての、相関係数の2乗としても報告される。この形では、それは直線を適合させることによって説明されるYの全変動の割合である。回帰直線を適合させる最も一般的な方法は、最小2乗法である。この方法は、各データ点から線までの垂直偏差(点が適合線上に正確に存在する場合、その垂直偏差は0である)の2乗の合計を最小化することによって、観察されたデータについて最良適合線を算出する。偏差が最初に2乗されて、次に合計されるので、正と負の値の間に相殺はない。
【００９５】
データ群について回帰直線が計算された後に、ラインから離れて位置する(それゆえ大きい残差値を有する)点は異常値として公知である。このような点は、誤データとなりうるか、または不適合回帰線を示しうる。点が水平方向で他のデータから離れている場合、それは影響を及ぼす観測値として公知である。この区別の理由は、これらの点が回帰直線の傾きに重大な影響を有しうることである。回帰モデルがデータ群にいったん適合されると、残差(適合直線から観測値までの偏差)の検定によって当業者は、線形関係が存在するという仮定の妥当性を調査できる。x軸上の説明変数に対して残差をy軸上にプロットすることは、変数間の考えられるいずれかの非線形関係を明らかにするか、または当業者に「潜在変数」を調査するように警告しうる。「潜在変数」は、2つの変数間の関係が、モデル化作業に含まれていなかった第3の変数の存在によって著しく影響されるときに存在する。
【００９６】
線形回帰解析は特に、被験体由来の試料中の1種または複数種のT2DBマーカーのレベルを、その被験体の、実際に観察された臨床結果と相関させることに基づき、あるいは例えば、算出されたアルキメデスリスクスコア、サンアントニオ心臓研究リスクスコア、または糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の罹患率を診断または予測する他の公知の方法と組み合わせて、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するリスクを予測するために使用することができる。しかしながら、特に有用なのは、糖尿病の公知の予測モデルと被験体試料中で検出されたT2DBマーカーのレベルとの間の関係を判定するための非線形式および解析である。特に関心があるのは、構造および共同分類アルゴリズム、ならびにKth 近傍法(Kth-Nearest Neighbor)、ブースティング(Boosting)、決定木(Decision Tree)、ニューラルネットワーク(Neural Network)、ベイジアンネットワーク(Bayesian Network)、サポートベクターマシン(Support Vector Machine)、および隠れマルコフモデル(Hidden Markov Model)などの確立された技法を含む、パターン認識機能の特徴を利用するリスク指数構築の方法である。最も一般的に使用されるのは、フラミンガム、フィンランド(Finnish)およびサンアントニオ心臓リスクスコアの基礎であるロジスティック回帰を使用する分類アルゴリズムである。さらに、このような技法の複数のT2DBマーカーのパネルへの応用は、複数のT2DBマーカーの入力からの情報を含む単一数値「リスク指数」または「リスクスコア」を作成するためのこのような組み合わせの使用と同様に、本発明の範囲によりまたは範囲内に包含される。
【００９７】
因子分析は、多数の相関変数(糖尿病リスク因子などの)が、元の変数の分散の大部分を説明する各種の属性を表すより少ない「因子」まで減少されうる数学的技法である(Hanson, R.L. et al, (2002) Diabetes 51: 3120-3127)。それゆえ、因子分析は、真性糖尿病および前糖尿病状態の成分、例えばIGT、IFG、およびメタボリックシンドロームを特定するのに大変適している。これらの解析による因子「スコア」の疫学研究は、メタボリックシンドロームの成分と糖尿病の発症との関係をさらに決定しうる。因子分析の基礎を成す前提は、1組の変数で観測された相関が少数の独自の未測定変数、すなわち「因子」によって説明されうるということである。因子分析は2つの手順を含む: 1) 因子の数を推定するための因子抽出、2) 元の変数に関する各因子の構成物を決定するための因子回転。
【００９８】
因子抽出は、主成分の方法によって実施されうる。これらの成分は、構築される元の変数の線形組み合わせであるので、各成分は他の各成分それぞれとゼロの相関を有する。各主成分は、その成分によって説明される元の変数における分散を表す「固有値」と関連付けられる(各元の変数は分散1を有するように標準化される)。構築されうる主成分の数は、元の変数の数と等しい。因子分析では、因子の数は慣習的に、いずれの単一の元の変数よりも全分散のより多くを説明する成分(すなわち＞1の固有値を持つ成分)のみの保持によって決定される。
【００９９】
因子の数がいったん確定されると、次に元の変数に関して最も節減された解釈を有する因子の組成を決定するための因子回転が実施される。因子回転において、各因子と元の変数との相関を表す「因子負荷量」が変更されるので、これらの因子負荷量は、できるだけ0または1に近づけられる(因子によって説明される分散の総量が未変化のままであるという制約を伴う)。因子回転のための多数の方法が開発されており、それらが最後の因子の組に相互に非相関のままであることを要求するかどうか(「直交法」)によって、またはそれらが因子を相関させるかどうか(斜交法)によって区別されうる。因子解析の解釈では、元の変数のどれが各因子の主構成要素を表すかを決定するために、因子負荷量のパターンが調査される。慣習的には、＞0.4 (または-0.4未満)の因子負荷量を特定の因子と共に有する変数がその主構成要素と見なされる。因子分析は、T2DBマーカーパネルをその構成要素から構築するのに、およびマーカーの代用可能な群をグループ化するのに非常に有用でありうる。
【０１００】
比較は、同時にまたは時間的に別個の時点で測定した試験(「被験体」)試料および基準(「対照」)試料に対して実施されうる。後者の例は、収集された発現情報、例えばT2DBマーカーの発現レベルに関する情報を集める配列データベースの使用である。基準試料、例えば対照試料が糖尿病を有さない被験体からである場合、被験体試験試料および対照基準試料中のT2DBマーカーの量の類似は、処置が有効であることを示している。しかしながら、試験試料および基準試料中の1種または複数種のT2DBマーカーの量の変化は、あまり好ましくない臨床結果または予後を反映しうる。「効果的な」または「有効な」とは、処置が1種または複数種のT2DBマーカーの量の減少または増加、あるいは被験体における血清インスリンレベルまたは血中グルコースレベルの低下につながることを意味する。血清インスリンまたは血中グルコースレベルの評価は、標準臨床プロトコルを使用して解析されうる。有効性は、糖尿病を診断または処置するいずれかの公知の方法と併せて決定されうる。
【０１０１】
T2DBマーカータンパク質、ペプチド、核酸、多型、代謝産物、または他の分析物の有効量のレベルによっても、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置の経過をモニターすることが可能になる。本方法では、糖尿病のための、処置計画、例えば薬物処置を受けている被験体から生体試料が提供されうる。このような処置計画は運動計画、食事補給(非限定的に、αリポ酸、クロム、コエンザイムQ10、ニンニク、マグネシウム、およびω-3脂肪酸を含む)、外科的介入(以下に限定されることはないが、胃バイパス、血管形成術などのような)、ならびに例えば、本明細書において定義される糖尿病調節剤などの、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と診断または特定された被験体において使用される治療用物質または予防用物質による処置を含むことができるが、これらに限定されることはない。必要に応じて、生体試料は被験体から処置前、処置中、または処置後の各種の時点で採取される。次いで、T2DBマーカータンパク質、ペプチド、核酸、多型、代謝産物、または他の分析物の有効量のレベルを決定し、基準値、例えば、糖尿病状態が既知である対照の被験体もしくは集団または指数値もしくはベースライン値と比較することができる。基準試料または指数値もしくはベースライン値は、処置を受けた1個体または複数個体の被験体から取得または導出されうるか、あるいは糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するリスクが低い1個体または複数個体の被験体から取得または導出されうるか、あるいは処置を受けた結果として糖尿病リスク因子の改善を示している被験体から取得または導出されうる。あるいは、基準試料または指数値もしくはベースライン値は、処置を受けていない1個体または複数個体の被験体から取得または導出されうる。例えば、試料は、処置の進展をモニターするために、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の初期処置および糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態のその後の処置を受けた被験体から収集されうる。基準値は、リスク予測アルゴリズムまたは本明細書において開示されるものなどの集団研究による計算指数から導出された値も含みうる。
【０１０２】
したがって、本発明のT2DBマーカーは、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症、または耐糖能異常などの前糖尿病状態を持たない、および糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症することが予想されない被験体において検出されるT2DBマーカーの発現レベルのパターンを含む「基準発現プロファイル」を作製するために使用されうる。本明細書において開示されるT2DBマーカーは、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症、または耐糖能異常のような前糖尿病状態を有する被験体から取得したT2DBマーカーの発現レベルのパターンを含む「被験体発現プロファイル」を作製するためにも使用されうる。被験体発現プロファイルは、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するリスクに瀕した被験体を診断または特定するために、疾患の進行はもちろんのこと、2型糖尿病または前糖尿病状態に関連する合併症の発症または発症のリスクを含む、疾患の進行速度もモニターするために、および糖尿病または前糖尿病状態の処置様式の有効性をモニターするために、基準発現プロファイルと比較されうる。本発明の基準および被験体発現プロファイルは、以下に限定されることはないが、特にVCRによって読み取り可能なものなどのアナログテープまたはデジタルメディア、CD-ROM、DVD-ROM、USBフラッシュメディアのような、機械可読媒体に含有されうる。このような機械可読媒体は非限定的に、収縮期および拡張期血圧、血中グルコースレベル、インスリンレベル、BMI指数、ならびにコレステロール(LDLおよびHDL)レベルのような在来の糖尿病リスク因子の測定結果などの、さらなる試験結果も含有しうる。あるいはまたはさらに、機械可読媒体は、病歴およびいずれかの関連する家族暦などの被験体情報も含みうる。機械可読媒体は、本明細書において記述されるものなどの他の糖尿病リスクアルゴリズムおよび計算指数に関連する情報も含有しうる。
【０１０３】
被験体の遺伝子構造の相違は、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の症状またはそのリスク因子を調節しうる各種の薬剤を代謝するその相対的能力の相違を生じうる。糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を有する被験体、または糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するリスクに瀕した被験体は、年齢、民族性、肥満度指数(BMI)、総コレステロールレベル、血中グルコースレベル、血圧、LDLおよびHDLレベル、ならびに他のパラメータが異なりうる。したがって、本明細書において開示されるT2DBマーカーを使用することにより、選択した被験体において試験される推定上の治療用物質または予防用物質が被験体において糖尿病、前糖尿病状態、またはその合併症を処置または予防するのに適しているということの所定レベルの予測可能性が可能になる。
【０１０４】
特定の被験体に適した治療用物質または薬剤を特定するため、被験体由来の試験試料を治療剤または薬物に曝露し、T2DBマーカータンパク質、核酸、多型、代謝産物または他の分析物の1つまたは複数のレベルを判定することができる。1種または複数種のT2DBマーカーのレベルを処置または治療剤もしくは薬物への曝露前の第1期間のおよび処置または治療剤もしくは薬物への曝露後の第2期間の被験体に由来する試料と比較してもよく、あるいはこのような処置または曝露の結果として糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態のリスク因子の改善を示した1個体または複数個体の被験体に由来する試料と比較してもよい。糖尿病処置で使用されることが多く、糖尿病の症状またはリスク因子を調節できる、そのような治療用物質または薬剤の例としては、グリメピリド、グリブリド(当技術分野においてグリベンクラミドとしても公知)、グリピジド、グリクラジドのようなスルホニル尿素; メトホルミンなどのビグアナイド; インスリン(エクスベラなどの吸入製剤を含む)、ならびにインスリンリスプロ(ヒューマログ)、インスリングラルギン(ランタス)、インスリンデテミルおよびインスリングルリジンなどのインスリン類似体; トログリタゾン(リズリン)、ピオグリタゾン(アクトス)、ロシグリタゾン(アバンディア)およびイサグリタゾン(ネトグリタゾンとしても公知)を含むチアゾリジンジオンなどのペルオキシソーム増殖剤活性化受容体-γ(PPAR-γ)アゴニスト; BMS-298585およびテサグリタザルなどの二重作用性PPARアゴニスト; レパグリニドおよびナテグリニドなどのメトグリチニドを含むインスリン分泌促進物質; エクセナチド(AC-2993)およびリラグルチド(インスリノトロピン)などのグルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)の類似体; LAF-237のようなジペプチジルペプチダーゼIVの阻害剤; オルリスタットなどの膵臓リパーゼ阻害剤; アカルボース、ミグリトール、およびボグリボースなどのα-グルコシダーゼ阻害剤; ならびにそれらの組み合わせ、特にメトホルミンおよびグリブリド(グルコバンス)、メトホルミンおよびロシグリタゾン(アバンダメット(Avandamet))、ならびにメトホルミンおよびグリピジド(メタグリップ(Metaglip))が挙げられるが、これらに限定されることはない。このような治療用物質または薬剤(本明細書では「糖尿病調節剤」)は、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と診断された被験体に処方されており、糖尿病、糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の症状またはリスク因子を調節することができる。
【０１０５】
被験体試料を候補薬剤の存在下でインキュベートすることができ、試験試料中のT2DBマーカー発現のパターンを測定し、基準プロファイル、例えば、糖尿病基準発現プロファイルもしくは非糖尿病基準発現プロファイルまたは指数値もしくはベースライン値と比較する。試験薬剤は、任意の化合物もしくは組成物またはその組み合わせでありうる。例えば、試験薬剤は、糖尿病処置計画において用いられることが多い薬剤であり、本明細書において記述されている。
【０１０６】
表1は、本発明の548種のT2DBマーカーを含む。本明細書において提示されるT2DBマーカーは、多型、アイソフォーム、変異体、誘導体、核酸を含む前駆体、受容体(可溶性受容体および膜貫通受容体を含む)、リガンド、ならびに翻訳後修飾された変種はもちろんのこと、完全に組み立てられた構造の構成サブユニットとしてのT2DBマーカーのいずれかより構成される任意の多ユニット核酸、タンパク質および糖タンパク質構造も含むが、これらに限定されない、全ての形態および変種を包含することを、当業者は認識すると考えられる。
【０１０７】
（表１）T2DBマーカー
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【０１０８】
T2DBマーカーのレベルは、当技術分野において公知の任意の方法を用いて、タンパク質または核酸レベルで決定することができる。T2DBマーカーの量は特に、電気泳動によって(例えばアガロースゲル電気泳動、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、トリス-HClポリアクリルアミドゲル、非変性タンパク質ゲル、2次元ゲル電気泳動(2DE)などによって)、免疫化学的に(すなわち、ラジオイムノアッセイ法、免疫ブロッティング、免疫沈降、免疫蛍光、酵素結合イムノソルベントアッセイ法)、「プロテオミクス技術」によって、または「ゲノム解析」によって検出することができる。例えば、核酸レベルでは、ノザンおよびサザンハイブリダイゼーション分析はもちろんのこと、これらの配列の1つまたは複数を特異的に認識するプローブを用いるリボヌクレアーゼ保護アッセイ法も遺伝子発現を決定するために使用することができる。あるいは、発現は、例えば、遺伝子の差次的発現配列に特異的なプライマーを用いた逆転写に基づくPCRアッセイ(RT-PCR)法を用いて測定することもできる。発現は同様に、例えば、本明細書において記述される遺伝子産物によりコードされるペプチドのレベル、またはその活性を測定することによってタンパク質レベルで決定されうる。このような方法は、当技術分野において周知であり、例えば、遺伝子、アプタマーまたは分子インプリントによってコードされるタンパク質に対する抗体に基づくイムノアッセイ法を含む。いずれの生体材料もタンパク質またはその活性の検出/定量化に使用されうる。あるいは、分析された各タンパク質の活性にしたがって、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を決定するのに適した方法が選択されてもよい。
【０１０９】
「プロテオミクス技術」は、表面増強レーザ脱離イオン化(SELDI)、マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間(MALDI-TOF)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析法を用いるまたは用いない液体クロマトグラフィー(LC/MS)、タンデムLC/MS、タンパク質アレイ、ペプチドアレイ、および抗体アレイを含むが、これらに限定されることはない。
【０１１０】
「ゲノム解析」は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リアルタイムPCR(例えばRoche Applied Sciencesより入手できるLight Cycler (登録商標))、遺伝子発現の連続解析(SAGE)、ノザンブロット解析、およびサザンブロット解析を含みうる。
【０１１１】
マイクロアレイ技術は、小型の膜または固体支持体(以下に限定されることはないが、顕微鏡スライドガラス、プラスチック支持体、光ファイバ検出手段を用いたもしくは用いないシリコンチップもしくはウェファ、およびニトロセルロース、ナイロンもしくはポリフッ化ビニリデンを含む膜などの)を含め、遺伝子またはタンパク質発現を解析するツールとして使用されうる。固体支持体を化学的(例えばシラン、ストレプトアビジンおよび他の多くの例など)または物理的(例えば、フォトリソグラフィー)に誘導体化して、関心対象の分析物、通常は核酸、タンパク質、またはその代謝産物もしくは断片の結合を可能にすることができる。核酸またはタンパク質は、印刷(すなわち、インクジェット印刷)、スポット、またはインサイチュー合成されうる。関心対象の核酸またはタンパク質の被着は、アレイに正確で再現可能なスポットを与えるピン技術と併せて、x、y、およびz軸に対する非常に精密な移動制御手段を備えた自動スポット機器を利用する、xyzロボットマイクロアレイによって達成されうる。関心対象の分析物は、特に所望の分析物の容易な特定を促進するために、固体支持体上に規則的にまたは固定した配置で位置している。いくつかのマイクロアレイフォーマットが、特に、Affymetrix、ArrayIt、Agilent Technologies、Asper Biotech、BioMicro、CombiMatrix、GenePix、NanogenおよびRoche Diagnosticsより市販されている。
【０１１２】
関心対象の核酸またはタンパク質は、1つまたは複数の検出可能な標識でタグ付けされたヌクレオチドまたはアミノ酸の存在下で合成されうる。このような標識は、例えば、蛍光色素および化学発光標識を含む。特に、マイクロアレイ検出の場合、蛍光色素、例えば以下に限定されることはないが、ローダミン、フルオレセイン、フィコエリトリン、Cy3およびCy5のようなシアニン色素、ならびにストレプトアビジン-フィコエリトリンのような結合体(核酸またはタンパク質がビオチンでタグ付けされる場合)がよく使われる。蛍光シグナルの検出および画像収集は、典型的には、アレイ上に表された核酸またはタンパク質に対する相対シグナル強度および分析物存在比を与える、共焦点蛍光レーザ走査または光電子増倍管を用いて達成される。多種多様な種々の走査装置が利用可能であり、それらには、組み合わせた選択基準の数値評価を可能にして最適な走査条件、例えば中央値、四分位間範囲(IQR)、飽和スポットのカウントならびに対走査間の線形回帰(r2およびP)を定義する、いくつかの画像収集および定量化のパッケージが付随している。走査の再現性は、走査条件の最適化、バックグランド補正、および規準化と同様に、データ解析前に評価される。
【０１１３】
規準化とは、アレイ、サブアレイ(またはプリントチップグループ)および色素-標識チャネル間の系統的な非生物学的相違から生じる影響について、データ平均または変動を調整するために使用される一連のプロセスをいう。アレイは、チップまたは固体支持体上の標的プローブのセット全体として定義される。サブアレイまたはプリントチップグループとは、完全アレイ内でプローブの別個のより小規模なアレイとして特定されうる、同じプリントチップによって被着されたこれらの標的プローブのサブセットをいう。色素標識チャネルとは、チップにハイブリダイズされた標的試料の蛍光周波数をいう。2つの異なる色素標識試料が混合されて、同じチップにハイブリダイズされる実験は、当技術分野において「二重色素実験」といわれ、「赤色」チャネルと「緑色」チャネルとの間の比の対数として表されることが多い、アレイ上の各標的に対して、絶対的ではなく相対的な発現値を生じる。規準化は、レシオメトリック法または絶対値法にしたがって実施されうる。レシオメトリック解析は主に、1つのチャネルまたはアレイが共通基準に関連して考慮される二重色素実験で利用される。各標的プローブの発現の比を試験試料と基準試料との間で算出して、相対的な変化を対称的に表現するために、比のlog2(比)への変換を続ける。絶対値法は、チャネルまたはアレイの適当な基準がない単一色素実験または二重色素実験でよく使われる。関連する「ヒット」は、特定の実験条件を特徴付ける発現レベルまたは量として定義される。通常、発現レベルが、通常、各種の実験条件下での核酸またはタンパク質の発現レベルの比較によって、ならびに核酸またはタンパク質の相対発現(「倍数変化」)および試料1セットにおけるその発現レベルと、別のセットにおけるその発現との比を解析することによって、各種の実験条件間で著しく異なる核酸またはタンパク質がある。
【０１１４】
マイクロアレイ実験から取得したデータは、多数の統計解析、例えばクラスタリング法およびスコアリング法のいずれか1つによって解析されうる。クラスタリング法では、一連の条件または試料にわたって同様に挙動する標的(例えば、核酸および/またはタンパク質)を特定することを試みる。このような標的を見出そうとする動機付けは、同様の発現パターンを示す標的が共通の特徴、例えば共通の調節要素、共通の機能、または共通の細胞起源を共有しているという仮定によって動かされる。
【０１１５】
階層的クラスタリングは、単一メンバークラスタがますます大きなクラスタに融合する凝塊形成プロセスである。この手順は、全ての標的分子間の対の距離マトリクスを計算することによって始まり、距離マトリクスは最も近い遺伝子で探索され、それらはクラスタとして定義される。新しいクラスタが2つのクラスタの凝塊形成によって形成された後に、距離マトリクスは他の全てのクラスタからのその距離を反映するように更新される。次に、この手順は、凝塊形成する最も近いクラスタの対を検索する、などである。本手順は、複数のクラスタがその類似性にしたがってノードに融合して、単一の階層木を生じる、階層的樹状図を生じる。階層的クラスタリングソフトウェアアルゴリズムはクラスタ(Cluster)およびツリービュー(Treeview)を含む。
【０１１６】
K平均クラスタリングは、その「中心」点または平均によって定義されるクラスタを検索する反復手順である。クラスタ中心のセットがいったん定義されると、各標的分子はそれが最も近接しているクラスタに割り当てられる。クラスタリングアルゴリズムは次に、遺伝子の各クラスタの中心を調整して、各クラスタにおける標的分子の中心までの距離の和を最小化する。これはクラスタ中心の新たな選択をもたらし、標的分子はクラスタに再度割り当てられる。これらの繰り返しは、収束が観察されるまで適用される。自己組織化マップ(SOM)は、データが所定のクラスタのセットに割り当てられるという点で、一部はk平均手順に関連付けられる。しかしながらk平均とは異なり、次に続くのは、各クラスタにおける遺伝子発現ベクターが異なるクラスタ間で最良の差異を見出すように「訓練」されている反復プロセスである。言い換えれば、部分構造がデータに課されて、次に本構造がデータにしたがって繰り返し調節される。SOMは、例えばGeneClusterなどの多くのソフトウェアパッケージに含まれる。他のクラスタリング法は、グラフ理論的および統計的技法を利用して、同じ真のクラスタに属する可能性が高い高度に類似した要素(カーネル)の密着した群を特定するための、グラフ理論的クラスタリングを含む。いくつかの発見補助手順を次に使用して、カーネルをクラスタリング全体に拡張する。グラフ理論的クラスタリングを利用するソフトウェアの例としては、Expander描出ツールと組合されたCLICKが挙げられる。
【０１１７】
高処理発現解析から取得したデータは、パラメトリックおよび非パラメトリック法などの統計的方法を用いてスコア化されうる。パラメトリック手法は、パラメトリック表現内で発現プロファイルをモデル化して、実験群のパラメータがどのように異なっているかを問い合わせる。パラメトリック方法の例としては非限定的に、t検定、分離スコア、およびベイズt検定が挙げられる。非パラメトリック法は、データにおける発現プロファイルの分布に関する非アプリオリ仮定が行われ、発現測定の2つの群が識別される程度が直接検査される、データの解析を含む。別の方法では、発現値に対する単純閾値による、分離連続の試料2群を測定する、TNOM、すなわち誤分類の閾値数を使用する。
【０１１８】
遺伝子発現のレベルを系統的に決定するためにSAGE (遺伝子発現の連続解析)を使用することもできる。SAGEでは、規定の位置のなかに転写物を一意的に特定するのに十分な情報を含んだ短い配列タグを使用し、続けて連続的にタグが連接されている。例えば、Velculescu V.E. et al, (1995) Science 270: 484-487を参照されたい。オリゴ-dTプライミングによってポリアデニル化RNAを単離し、次にビオチン標識プライマーを用いてcDNAを合成する。次に固着している制限エンドヌクレアーゼによってcDNAを切断し、ストレプトアビジンコーティングビーズに3'末端cDNA断片が結合される。結合したcDNAに、タギング酵素の認識部位を含んだオリゴヌクレオチドリンカーが連結される。タギング酵素は、制限部位の3'側の一定数の塩基位置でDNAを切断するクラスII制限エンドヌクレアーゼであり、酵素による消化後にビーズから短いタグおよびリンカーを放出させることができる。次いで、放出されたタグとリンカーの3'末端を平滑末端化し、相互に連結させて、長さが約100塩基対である連結されたダイタグ(ditag)を形成させる。次いでダイタグをPCR増幅に供し、その後、固着している制限エンドヌクレアーゼでの消化によってリンカーおよびタグは放出される。その後、タグ(通常はサイズが25〜35 merの範囲に及ぶ)をゲル精製し、連結し、配列ベクターにクローニングする。コンカテマーの配列決定によって、個々のタグが特定されることが可能となり、所与の細胞または組織型の転写物の量が決定されうる。
【０１１９】
T2DBマーカータンパク質、ポリペプチド、変異、およびその多型は、当業者に公知のいずれの方法によっても検出されうる。特に有用なのは、タンパク質の混合物(血清などの生体試料に見出されるような)を等電点(例えば、5〜8のpH範囲のような)によって1次元に、および分子量によって2次元に分離する2次元ゲル電気泳動である。2次元液体クロマトグラフィーも本発明のT2DBマーカータンパク質、ポリペプチド、変異、および多型を特定または検出するのに好都合に使用され、1つの具体的な例である、ProteomeLab PF 2Dタンパク質分画システムを実施例で詳説する。PF 2Dシステムは、タンパク質を等電点によって1次元に、および疎水性によって2次元に分解する。タンパク質、ポリペプチド、変異、および多型を検出する別の好都合な方法には、SELDI (本明細書において開示されている)および他の高処理プロテオミックアレイが含まれる。
【０１２０】
T2DBマーカータンパク質、ポリペプチド、変異、および多型は、典型的には、被験体由来の試料と、T2DBマーカータンパク質、ポリペプチド、変異、または多型に結合する抗体とを接触させ、次に反応産物の存在または非存在を検出することによって検出されうる。抗体は、本明細書において詳細に論じられるように、モノクローナル、ポリクローナル、キメラまたは前記の断片であることができ、反応産物を検出する段階は任意の適当なイムノアッセイ法によって行うことができる。特に好ましい態様において、T2DBマーカータンパク質、ポリペプチド、変異、および多型は、本開示における他の箇所に開示されているように、本発明の単離抗体によって検出することができる。本発明によって提供される単離抗体は、例えば、ヒト定常領域(本明細書において定義される)および表1に記載の1種または複数種のT2DBマーカー、好ましくは配列番号:1の少なくとも1個、好ましくは2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上のアミノ酸残基に結合する抗原結合領域を含むことができる。被験体由来の試料は、典型的には、上記のように生体液であり、上記の方法を行うのに使用される同一の生体液試料でもよい。
【０１２１】
本発明によって行われるイムノアッセイ法は、同種アッセイ法または異種アッセイ法でありうる。同種アッセイ法では、免疫学的反応は、通常、特異抗体(例えば、抗T2DBマーカータンパク質抗体)、標識分析物、および関心対象の試料を含む。標識から生じるシグナルは抗体の標識分析物への結合時に、直接的または間接的に変化する。免疫反応もその程度の検出もともに均質溶液中で行うことができる。利用できる免疫化学標識には、遊離基、放射性同位体、蛍光色素、酵素、バクテリオファージ、または補酵素が含まれる。
【０１２２】
異種アッセイ手法では、試薬は、通常、試料、抗体、および検出可能なシグナルを生成させるための手段である。上記のような試料を使用することができる。抗体をビーズ(プロテインAアガロース、プロテインGアガロース、ラテックス、ポリスチレン、磁性もしくは常磁性ビーズなどの)、プレートまたはスライドなどの支持体に固定化し、抗原を含有することが疑われる試料と液相中で接触させることができる。次いで支持体を液相から分離し、支持相または液相のどちらかを、検出可能なシグナルがないか、このようなシグナルを生成させるための手段を利用して調べる。シグナルは、試料中の分析物の存在に関連付けられる。検出可能なシグナルを生成させるための手段には、放射性標識、蛍光標識、または酵素標識の使用が含まれる。例えば、検出される抗原が第2の結合部位を含む場合には、その部位に結合する抗体を検出可能な基に結合させ、分離段階の前に液相反応溶液に添加することができる。固体支持体上での検出可能な基の存在から、試験試料中に抗原の存在することが示される。適当なイムノアッセイ法の例は、オリゴヌクレオチド、免疫ブロッティング、免疫沈降、免疫蛍光法、化学発光法、電気化学発光または酵素結合イムノアッセイ法である。
【０１２３】
当業者は、本明細書において開示される方法を行うのに有用でありうる多数の特異的イムノアッセイ形式およびその変化形を熟知していると考えられる。おおむねは、E. Maggio, Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.)を参照されたく、同様に「Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application」と題したSkoldらの米国特許第4,727,022号、「Immunoassay of Antigens」と題したForrestらの米国特許第4,659,678号、「Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies」と題したDavidらの米国特許第4,376,110号、「Macromolecular Environment Control in Specific Receptor Assays」と題したLitmanらの米国特許第4,275,149号、「Reagents and Method Employing Channeling」と題したMaggioらの米国特許第4,233,402号、および「Heterogenous Specific Binding Assay Employing a Coenzyme as Label」と題したBoguslaskiらの米国特許第4,230,767号を参照されたい。
【０１２４】
本発明により提供されるものなどの、抗体は、受動的結合などの、公知の技術にしたがって診断アッセイ法に適した固体支持体(例えば、プロテインAもしくはプロテインGアガロースなどのビーズ、ミクロスフェア、プレート、スライドまたはラテックスもしくはポリスチレンなどの材料から形成されたウェル)に結合されうる。本明細書において記述される抗体は同様に、公知の技術にしたがって放射性標識(例えば、35S、125I、131I)、酵素標識(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ)および蛍光標識(例えば、フルオレセイン、Alexa、緑色蛍光タンパク質)などの検出可能な標識または基に結合されうる。
【０１２５】
抗体は同様に、チロシンリン酸化、トレオニンリン酸化、セリンリン酸化、グリコシル化(例えば、O-GlcNAc)などの、T2DBマーカータンパク質、ポリペプチド、変異、および多型の翻訳後修飾を検出するのに有用でありうる。このような抗体は、関心対象のタンパク質中のリン酸化アミノ酸を特異的に検出し、本明細書において記述される免疫ブロッティング、免疫蛍光法、およびELISAアッセイ法において使用されうる。これらの抗体は、当業者に周知であり、市販されている。翻訳後修飾は、リフレクタマトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間質量分析(MALDI-TOF)で準安定イオンを用いて決定することもできる(Wirth, U. et al. (2002) Proteomics 2(10): 1445-51)。
【０１２６】
酵素活性を有することが公知であるT2DBマーカータンパク質、ポリペプチド、変異、および多型の場合、その活性は、当技術分野において公知の酵素アッセイ法を用いてインビトロで決定されうる。このようなアッセイ法には非限定的に、数ある中でも、キナーゼアッセイ法、ホスファターゼアッセイ法、レダクターゼアッセイ法が含まれる。酵素活性の動態の調節は、Hillプロットなどの公知のアルゴリズム、ミカエリスメンテン(Michaelis-Menten)式、ラインウィーバーバークプロット(Lineweaver-Burk)解析などの線形回帰プロット、およびスキャッチャードプロット(Scatchard)プロットを用いて速度定数KMを測定することにより判定することができる。
【０１２７】
T2DBマーカー配列のデータベースエントリによって供与される配列情報を用いて、T2DBマーカー配列の発現が、当業者に周知の技術により検出(あるなら)および測定されることができる。例えば、T2DBマーカー配列に相当する配列データベースエントリ内の、または本明細書において開示される配列内の配列を用いて、例えば、ノザンブロットハイブリダイゼーション解析でまたは特異的に、および好ましくは、定量的に特異的核酸配列を増幅する方法でT2DBマーカーRNA配列を検出するためのプローブを構築することができる。別の例として、それらの配列を用いて、例えば、逆転写に基づくポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)などの増幅に基づく検出方法においてT2DBマーカー配列を特異的に増幅するためのプライマーを構築することができる。遺伝子発現の変化が遺伝子増幅、欠失、多型、および変異に関連付けられる場合、試験および基準細胞集団内の調査されたDNA配列の相対量を比較することによって、試験および基準集団における配列比較を行うことができる。
【０１２８】
本明細書において開示される遺伝子の発現は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてRNAレベルで測定することができる。例えば、これらの配列の1つまたは複数を特異的に認識するプローブによるノザンハイブリダイゼーション解析を用いて、遺伝子発現を判定することができる。あるいは、発現は、例えば、差次的発現配列に特異的なプライマーを使った逆転写に基づくPCRアッセイ(RT-PCR)法を用いて測定することもできる。
【０１２９】
あるいは、T2DBマーカータンパク質および核酸代謝産物または断片を測定することもできる。「代謝産物」という用語は、生体分子(例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、または脂質)のプロセッシング、切断、または消費によって作製された任意の化合物のような、代謝過程の任意の化学的または生化学的産物を含む。代謝産物は、屈折率分光法(RI)、紫外線分光法(UV)、蛍光分析、放射化学分析、近赤外分光法(近IR)、核磁気共鳴分光法(NMR)、光散乱分析(LS)、質量分析、熱分解質量分析、比濁法、分散ラマン分光法、質量分析と組み合わされたガスクロマトグラフィー、質量分析と組み合わされた液体クロマトグラフィー、質量分析と組み合わされた飛行時間型マトリクス支援レーザ脱離イオン化(MALDI-TOF)、表面増強レーザ脱離イオン化(SELDI)、質量分析と組み合わされたイオンスプレー分光法、キャピラリー電気泳動、NMRおよびIR検出を含め、当業者に公知の各種方法で検出することができる。(WO 04/056456およびWO 04/088309を参照されたく、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられる)。この関連で、他のT2DBマーカー分析物を、上記の検出方法、または当業者に公知の他の方法を用いて測定することができる。
【０１３０】
キット
本発明は同様に、キットの形態でともに包装されているT2DBマーカー検出試薬、例えば、T2DBマーカー核酸の一部分に相補的な、オリゴヌクレオチド配列などの相同核酸配列を有することによって1種もしくは複数種のT2DBマーカー核酸を特異的に特定する核酸、または、T2DBマーカー核酸によってコードされるタンパク質に対する抗体を含む。本発明のキットにより、当業者は、本明細書において開示される基準および被験体の発現プロファイルを作成することができる。本発明のキットは同様に、本開示において提供されるいずれの方法も有利に行うために使用することもできる。オリゴヌクレオチドは、T2DBマーカー遺伝子の断片でありうる。例えば、オリゴヌクレオチドは、長さが200、150、100、50、25、10個のまたはそれ以下のヌクレオチドでありうる。T2DBマーカー検出試薬は特に、抗体または抗体の断片、およびアプタマーを含むこともできる。キットは個別の容器内に核酸または抗体(固体マトリクスに既に結合されているか、もしくはそれらをマトリクスに結合するための試薬とともに個別に包装されているかのどちらかの)、対照配合物(陽性および/もしくは陰性)、ならびに/あるいは検出可能な標識を含むことができる。本発明の1種または複数種のT2DBマーカーを検出するアッセイ法を行うための説明書(例えば、書面、テープ、VCR、CD-ROMなど)を、キットに含めることができる。アッセイ法は、例えば、当技術分野において公知であるようにノザンブロットハイブリダイゼーションまたはサンドイッチELISAの形態でありうる。あるいは、キットは、当技術分野において公知であるようにマイクロアレイの形態でありうる。
【０１３１】
本明細書において記述される方法を行うための診断キットは、いくつかの方法で作製される。好ましくは、本発明のキットは、正常グルコースレベルを有する被験体から得た対照(または基準)試料を含む。あるいは、キットは、2型糖尿病もしくは前糖尿病状態と診断されたまたはそれらに罹患していると特定された被験体から得た対照試料を含むこともできる。一つの態様において、診断キットは、(a) 固体支持体に結合された抗体(例えば、フィブリノーゲンαCドメインペプチド)および(b) 検出可能な基に結合された本発明の第2抗体を含む。試薬には、緩衝剤などの補助剤およびタンパク質安定化剤、例えば、多糖類などを含めることもできる。診断キットは、必要な場合、検出可能な基がメンバー(例えば、酵素基質)であるシグナル生成系の他のメンバー、試験でのバックグラウンド干渉を低減する薬剤、対照試薬、試験を行うための装置などをさらに含むことができる。あるいは、試験キットは、(a) 本発明の抗体、および(b) 検出可能な基に結合された抗体の特異的結合パートナーを含むこともできる。試験キットは、任意の適当な方法で、典型的には単一の容器の中の全ての要素とともに、任意で試験を行うための印刷された説明書のシートとともに包装されうる。
【０１３２】
例えば、T2DBマーカー検出試薬は、少なくとも1種のT2DBマーカー検出部位を形成するように多孔性ストリップなどの固体マトリクスに固定化されうる。多孔性ストリップの測定または検出領域は、核酸を含有する複数の部位を含みうる。試験ストリップは、陰性および/または陽性対照の部位も含みうる。あるいは、対照部位は、試験ストリップとは別のストリップに位置しうる。任意で、各種の検出部位は、異なる量の、例えば第1検出部位に多い量の、および次の部位に少ない量の固定化核酸を含んでもよい。試験試料の添加時に、検出可能なシグナルを提示する部位の数が、試料中に存在するT2DBマーカーの量の定量的表示を与える。検出部位は、任意の適切に検出可能な形状で構成されることができ、典型的には試験ストリップの幅に及ぶ棒またはドットの形状の中にある。
【０１３３】
あるいは、キットは、1種または複数種の核酸配列を含む核酸基板アレイを含むこともできる。アレイ上の核酸は、T2DBマーカー1〜548で表される1種または複数種の核酸配列を特異的に特定する。各種の態様において、T2DBマーカー1〜548の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50種またはそれ以上の発現がアレイへの結合によって特定されうる。基板アレイは、例えば、固体基板上に、例えば、米国特許第5,744,305号に記述されているように「チップ」上にありうる。あるいは、基板アレイは溶液アレイ、例えば、xMAP (Luminex, Austin, TX)、Cyvera (Illumina, San Diego, CA)、CellCard (Vitra Bioscience, Mountain View, CA)およびQuantum Dots' Mosaic (Invitrogen, Carlsbad, CA)でありうる。
【０１３４】
当業者は、表1のT2DBマーカーのいずれに対しても、抗体、核酸プローブ、例えばオリオヌクレオチド、アプタマー、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドを日常的に作製することができる。本明細書において提示される実施例では、マウスにおけるモノクローナル抗体の作製はもちろんのこと、ウサギからのポリクローナル過免疫血清の産生についても記述する。このような技術は当業者に周知である。
【０１３５】
抗体
本発明は同様に、表1に提示される1種または複数種のT2DBマーカーに結合できる抗体、好ましくは、配列番号:1の1つまたは複数のアミノ酸に結合できる抗体を提供する。本発明の文脈において用いられる「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、キメラ抗体、可溶性の形態でまたは結合した形態で標識できる抗イディオタイプ(抗Id)抗体、および以下に限定されないが、酵素的切断、ペプチド合成または組換え技術などの任意の公知の技術によって供与される、それらの断片、領域または誘導体を含む。
【０１３６】
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫した動物の血清に由来する抗体分子の不均質な集団である。モノクローナル抗体は、抗原に特異的な抗体の実質的に均質な集団を含み、この集団は、実質的に類似のエピトープ結合部位を含む。mAbは、当業者に公知の方法によって得ることができる。例えば、Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975); 米国特許第4,376,110号; Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992); およびHarlow and Lane ANTIBODIES. A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)を参照されたく、これらの参照文献の内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３７】
このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、GILDおよびそれらの任意のサブクラスを含めて、どの免疫グロブリンクラスのものでもよい。本発明のmAbを産生するハイブリドーマは、インビトロ、インサイチューまたはインビボで培養することができる。インビボまたはインサイチューでの高力価のmAbの産生から、これは好ましい産生方法である。
【０１３８】
キメラ抗体は、その異なる部分が、マウスmAbに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどの、異なる動物種に由来する分子であり、これは適用時の免疫原性を低減させ、産生時の収量を増大させるために主に使用され、例えば、ハイブリドーマ由来のマウスmabは高い収量を有するが、ヒトでは免疫原性が高くなるような場合に、ヒト/マウスキメラmAbが使用される。キメラ抗体およびその産生方法は、当技術分野において公知である(Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646 (1984); Cabilly et al., 欧州特許出願第125023号(1984年11月14日付で公開); Neuberger et al., Nature 314:268-270 (1985); Taniguchi et al., 欧州特許出願第171496号(1985年2月19日付で公開); Morrison et al., 欧州特許出願第173494号(1986年3月5日付で公開); Neuberger et al., PCT出願WO 86/01533 (1986年3月13日付で公開); Kudo et al., 欧州特許出願第184187号(1986年6月11日付で公開); Morrison et al., 欧州特許出願第173494号(1986年3月5日付で公開); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson et al., 国際特許公報PCT/US86/02269(1987年5月7日付で公開); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Better et al., Science 240:1041-1043 (1988); およびHarlow and Lane Antibodies: a Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988))。これらの参照文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３９】
抗イディオタイプ(抗Id)抗体は、抗体の抗原結合部位に一般的に関連する特有の決定基を認識する抗体である。Id抗体は、抗Idを調製しようとしているmAbでmAbの供給源と同じ種および遺伝子型の動物(例えば、マウス系統)を免疫することにより調製することができる。免疫された動物は、免疫抗体のイディオタイプ決定基に対する抗体(抗Id抗体)を産生することにより、免疫抗体のイディオタイプ決定基を認識し、それに反応すると考えられる。例えば、米国特許第4,699,880号を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４０】
抗Id抗体はまた、別の動物において、免疫反応を誘導し、いわゆる抗-抗Id抗体を産生する「免疫原」としても使用できる。抗-抗Idは、抗Idを誘導した元のmAbとエピトープが同一でありうる。したがって、mAbのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することにより、特異性が同一の抗体を発現する他のクローンを特定することが可能である。
【０１４１】
本発明の抗体は、ポリクローナルAb、モノクローナルAb、その断片および/または領域が、配列番号:1の部分に結合する少なくとも1つの重鎖可変領域(Hv)または軽鎖可変領域(Lv)を含む、重鎖定常領域(Hc)、重鎖可変領域(Hv)、軽鎖可変領域(Lv)および軽鎖定常領域(Lc)の少なくとも1つを含むことができる。競合的阻害によりmAbの特異性および親和性を判定するのに好ましい方法は、Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)、およびMuller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)の中で見出すことができ、これらの参照文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４２】
遊離形態もしくは結合形態の小さなペプチド配列を認識してそれらに結合する、それらの配列に対する本発明の抗体を産生するための技術、または大きなタンパク質という状況で天然配列として提示される場合に、本発明の抗体を産生するための技術は、当技術分野において周知である。そのような抗体には、当技術分野において公知のハイブリドーマまたは組換え技術により作製されるマウス抗体、マウス-ヒト抗体およびヒト-ヒト抗体が含まれる。
【０１４３】
本明細書で使用する場合、「抗原結合領域」という用語は、抗原と相互作用し、かつ抗原に対するその特異性および親和性を抗体に付与するアミノ酸残基を含んだ抗体分子のその部分をいう。抗体領域は、抗原結合残基の適切な高次構造を維持するのに必要な「フレームワーク」アミノ酸残基を含む。
【０１４４】
本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」という用語は、一価、二価または多価免疫グロブリンを含む。一価キメラ抗体は、ジスルフィド架橋を通じてキメラL鎖と結合したキメラH鎖によって形成される二量体(HL)である。二価キメラ抗体は、少なくとも1つのジスルフィド架橋を通じて結合した2つのHL二量体によって形成される四量体(H2L2)である。例えば、凝集するCH領域(例えば、IgM H鎖、またはμ鎖由来)を利用することによって、多価キメラ抗体を産生させることもできる。
【０１４５】
本発明のマウス抗体およびキメラ抗体、断片ならびに領域は、個々の免疫グロブリン重(H)鎖および/または軽(L)鎖を含む。キメラH鎖は、CH1またはCH2などの、少なくとも一部のヒトH鎖C領域(CH)に連結されている、1種もしくは複数種のT2DBマーカーまたは好ましくは配列番号:1に特異的な非ヒト抗体のH鎖に由来する抗原結合領域を含む。
【０１４６】
本発明によるキメラL鎖は、少なくとも一部のヒトL鎖C領域(CL)に連結されている、1種もしくは複数種のT2DBマーカーまたは好ましくは配列番号:1に特異的な非ヒト抗体のL鎖に由来する抗原結合領域を含む。同じまたは異なる可変領域結合特異性のキメラH鎖およびL鎖を有する抗体、断片または誘導体は、公知の方法段階による、例えば、Ausubel、HarlowおよびColliganによる個々のポリペプチド鎖の適切な結合によって調製することもでき、これらの参照文献の内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。この手法を用いて、キメラH鎖(またはその誘導体)を発現する宿主を、キメラL鎖(またはその誘導体)を発現する宿主とは別に培養し、免疫グロブリン鎖を別々に回収し、次いで結合させる。あるいは、それらの宿主を共培養し、それらの鎖を培地中で自発的に結合させた後に、組み立てられた免疫グロブリン、断片または誘導体の回収を行ってもよい。
【０１４７】
ハイブリッド細胞は、非ヒト抗T2DBマーカーまたは抗配列番号:1 (例えば、実施例に開示の抗D3)抗体産生細胞、典型的には天然もしくは組換えT2DBマーカーもしくは配列番号:1、またはT2DBマーカーもしくは配列番号:1のいずれかの1種もしくは複数種のペプチド断片を免疫した動物の脾臓細胞の融合によって形成される。あるいは、非ヒト抗体産生細胞は、1種もしくは複数種のT2DBマーカーまたは配列番号:1の全部もしくは一部のアミノ酸配列を免疫した動物の、血液、脾臓、リンパ節または他の組織から得られたBリンパ球であってもよい。
【０１４８】
不死化機能を供与する第2の融合パートナーは、リンパ芽球様細胞、またはそれ自体が抗体産生細胞ではなく、悪性である形質細胞腫もしくは骨髄腫細胞でありうる。好ましい融合パートナー細胞には、SP2/0と略されるハイブリドーマSP2/0-Ag14 (ATCC CRL1581)および骨髄腫P3X63Ag8 (ATCC TIB9)、またはその派生細胞が含まれる。例えば、Ausubel、HarlowおよびColliganを参照されたく、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４９】
本発明のキメラ抗体の抗原結合領域をコードするヌクレオチド配列をもたらす抗体産生細胞を、ヒト以外の、霊長類などの、またはヒト細胞の形質転換によって作製することもできる。例えば、本発明の抗体を産生するBリンパ球にEpstein-Barrウイルスなどのウイルスを感染および形質転換させて、不死の抗体産生細胞を得ることができる(Kozbor et al., Immunol. Today 4:72-79 (1983))。あるいは、当技術分野において周知であるように、形質転換遺伝子または形質転換遺伝子産物を供与することによって、Bリンパ球を形質転換させることもできる。例えば、Ausubel下記、Harlow下記およびColligan下記を参照されたく、これらの参照文献の内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５０】
細胞融合およびハイブリドーマによって得られるモノクローナル抗体は、免疫学分野の当業者に周知の標準的な手順によって達成される。融合パートナー細胞株、ならびにハイブリドーマの融合かつ選択およびmAbのスクリーニングのための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ausubel、HarlowおよびColliganを参照されたく、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５１】
本発明のmAbは、該抗体を分泌するハイブリドーマまたはトランスフェクトーマの細胞をマウスの腹腔内に注射し、適当な時間の後、高力価のmAbを含有する腹水を採取し、その腹水からmAbを単離することにより大量に産生されうる。非マウス(例えば、ラットまたはヒト)ハイブリドーマによるmAbの、そのようなインビボ産生の場合、ハイブリドーマ細胞は放射線照射されたまたは無胸線のヌードマウス体内で増殖されることが好ましい。あるいは、該抗体は、ハイブリドーマまたはトランスフェクトーマ細胞をインビトロで培養し、分泌されたmAbを細胞培地からまたは組換えにより、真核細胞または原核細胞内で単離することによって産生されうる。
【０１５２】
本発明は同様に、マウスもしくはキメラ抗体の「誘導体」、それらの断片、領域または誘導体を提供し、その用語には、免疫グロブリン断片に機能的に似た分子種を得るよう切断遺伝子または修飾遺伝子によってコードされたタンパク質が含まれる。この修飾には、植物および細菌毒素などの細胞傷害性タンパク質をコードする遺伝子配列の付加が含まれるが、これらに限定されることはない。それらの断片および誘導体は、本発明の宿主のいずれかより産生されうる。あるいは、抗体、断片および領域をインビトロで細胞傷害性タンパク質または化合物に結合させて、1種または複数種のT2DBマーカーに対応する受容体を持った細胞を選択的に殺傷しうる細胞傷害性抗体を供与することもできる。
【０１５３】
断片には、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2およびFvが含まれる。これらの断片は、インタクト(intact)な抗体のFc断片を欠いており、インタクトな抗体よりも、血液循環から迅速に消失し、少ない非特異的組織結合を有しうる(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983))。これらの断片は、当技術分野において周知の方法を用いて、例えばパパイン(Fab断片を産生するため)またはペプシン(F(ab')2断片を産生するため)などの酵素でのタンパク質分解的切断によってインタクトな抗体から産生される。
【０１５４】
これらの抗原結合領域および/または本発明のmAbによって認識されるエピトープの特定により、本出願の態様に沿った、類似の結合特性および治療的または診断的有用性を有するさらなるモノクローナル抗体を作製するために必要な情報が提供される。
【０１５５】
配列番号:1のアミノ酸配列残基番号1-38に含まれるエピトープに結合する組換えマウス抗体またはキメラマウス-ヒト抗体もしくはキメラヒト-ヒト抗体は、本明細書において提供される教示に基づき、公知の技術を用いて本発明により提供されうる。例えば、Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N.Y. (1987, 1992, 1993); およびSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)を参照されたく、これらの全内容が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５６】
本発明の抗体をコードするDNAは、重鎖定常領域(Hc)、重鎖可変領域(Hv)、軽鎖可変領域(Lv)および軽鎖定常領域(Lc)の少なくとも1つをコードするゲノムDNAまたはcDNAでありうる。マウスV領域抗原結合セグメントをコードするDNAの供給源として染色体遺伝子断片を用いることに替わる簡便な方法は、例えばLiuら(Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84:3439 (1987) and J. Immunology 139:3521 (1987)によって報告されているように、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのcDNAの使用であり、これらの参照文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。cDNAの使用には、所望のタンパク質の合成を達成するために宿主細胞に適した遺伝子発現要素を遺伝子と組み合わせることが必要になる。cDNA配列の使用は、適切なRNAスプライシング系を欠いた細菌または他の宿主においてcDNA配列が発現されうるという点で、ゲノム配列(イントロンを含む)に比べて有利である。
【０１５７】
例えば、1種または複数種のT2DBマーカー、例えば、配列番号:1に結合できるマウスV領域抗原結合セグメントをコードするcDNAを、公知の方法を用いて提供することができる。本発明の抗体をコードするDNA配列の一部分に結合するプローブを使用し、公知の方法で、本発明により、本明細書において提示の、抗体、断片または領域を発現するハイブリドーマからDNAを単離することができる。
【０１５８】
可変領域の一部分に相当するオリゴヌクレオチドは、相同遺伝子の存在のスクリーニングに有用であり、本発明による抗体の可変領域または定常領域をコードするそのような遺伝子のクローニングに有用である。そのようなプローブは、1種または複数種のT2DBマーカーのエピトープ、特に配列番号:1の残基番号1-38の少なくとも5個のアミノ酸のエピトープに結合する軽鎖または重鎖可変領域をコードする配列の部分に結合することが好ましい。そのようなオリゴヌクレオチドを合成するためのそのような技術は、周知であり、例えば、Wu, et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21:101-141 (1978)、およびAusubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience (1987, 1993)によって開示されており、それらの全内容が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５９】
遺伝暗号は、縮重性であるため、2つ以上のコドンを使用して、特定のアミノ酸をコードすることができる(Watson, et al.)。遺伝暗号を用いて、各々がアミノ酸をコードしうる、1種または複数種の異なるオリゴヌクレオチドを特定することができる。特定のオリゴヌクレオチドが現に、実在のXXXコード配列を構成する可能性は、異常な塩基対合の関係および本発明の抗体またはその断片を発現する真核細胞または原核細胞において特定のコドンが(特定のアミノ酸をコードするために)実際に使用される頻度を考慮することによって推定することができる。このような「コドン使用則」がLathe, et al., J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985)により開示されている。Latheの「コドン使用則」を用いて、好ましい可変または定常領域配列をコードしうる理論的に「最も可能性の高い」スクレオチド配列を含んだ単一のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットが特定される。
【０１６０】
アミノ酸配列は、単一のオリゴヌクレオチドのみによりコードされうることもあるが、アミノ酸配列は、類似のオリゴヌクレオチドのセットのいずれかによりコードされうることが多い。重要なことに、セットのメンバーの全てが、ペプチド断片をコードしうるオリゴヌクレオチドを含み、したがって、ペプチド断片をコードする遺伝子と同じオリゴヌクレオチド配列を含む可能性があるとはいえ、セットの1つのメンバーしか遺伝子のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含まない。このメンバーは、セット内に存在するが、セットの他のメンバーの存在下でさえもDNAとハイブリダイズできるので、単一のオリゴヌクレオチドを用いて、タンパク質をコードする遺伝子をクローニングするのと同じように、未分画のオリゴヌクレオチドセットを用いすることが可能である。
【０１６１】
可変領域または定常領域を含む本発明の抗体または断片をコードしうる理論的に「最も可能性の高い」配列を含んだオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドのセットを使用して、「最も可能性の高い」配列または配列のセットとハイブリダイズしうる相補的なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセットの配列を特定する。このような相補的配列を含むオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、可変領域または定常領域遺伝子を特定および単離することができる(Sambrook et al., 下記)。
【０１６２】
可変領域もしくは定常領域の断片をコードしうる(またはこのようなオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドのセットに相補的である)適当なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットを、特定し(上記の手順を用いて)、合成し、抗体またはその可変領域もしくは定常領域を発現しうる細胞に由来するDNAまたはより好ましくはcDNA調製物に対して、当技術分野において周知の手段によりハイブリダイズさせる。「最も可能性の高い」可変または定常抗T2DBマーカー領域ペプチドをコードする配列に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド分子は、当業者に周知である手順を用いて合成することができる(Belagaje, et al., J. Biol. Chem. 254:5765-5780 (1979); Maniatis, et al., In: Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression, Nierlich, et al., Eds., Acad. Press, NY (1976); Wu, et al., Prog. Nucl. Acid Res. Molec. Biol. 21:101-141 (1978); Khorana, Science 203:614-625 (1979))。さらに、自動合成機の使用を通じてDNA合成を達成することもできる。核酸ハイブリダイゼーションの技術は、Sambrookら(下記)により、およびHayrnesら(In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985))により開示されており、これらの参照文献は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６３】
可変領域または定常領域をコードするポリヌクレオチドをクローニングする別の方法では、DNAまたはより好ましくはcDNA (抗体または可変領域もしくは定常領域を発現しうる細胞由来の)を発現ベクターにクローニングすることによって、発現ベクターのライブラリーを調製する。次いで、抗体の結合を競合的に阻害するタンパク質、および本発明の抗体またはその断片と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしうるヌクレオチド配列を有するタンパク質を発現しうるメンバーについてライブラリーをスクリーニングすることができる。この態様において、抗体または断片を発現しうる細胞から、DNAまたはより好ましくはcDNAを抽出し、精製する。精製されたcDNAを(剪断、エンドヌクレアーゼ消化などにより)断片化して、DNAまたはcDNA断片のプールを作製する。このプール由来のDNAまたはcDNA断片を次いで、メンバーがそれぞれ、λファージライブラリーにおけるような特有のクローニングされたDNAまたはcDNA断片の、原核細胞(例えば、細菌)または真核細胞(例えば、哺乳類、酵母、昆虫もしくは真菌)での発現を含む発現ベクターのゲノムライブラリーを作製するために、発現ベクターにクローニングする。例えば、Ausubel, Harlow, Colligan; Nyyssonen et al. Bio/Technology 11:591-595 (Can 1993); Marks et al., Bio/Technology 11:1145-1149 (October 1993)を参照されたい。そのような可変領域または定常領域をコードする核酸が単離されたら、阻害活性のある1種または複数種のT2DBマーカーに結合する組換えMAbを提供するために、その核酸を、他の定常または可変重鎖または軽鎖コード核酸とともに宿主細胞において適切に発現させることができる。そのような抗体は、好ましくは、抗原結合に関わる相補性決定残基を持つフレームワーク残基を含んだマウスまたはヒト可変領域を含む。好ましくは、上記の核酸によってコードされる可変軽鎖または重鎖は、配列番号:1の残基番号1-38のなかに含まれる少なくとも5個のアミノ酸のエピトープに結合する。
【０１６４】
本発明のマウスおよびキメラ抗体、断片および領域の定常(C)領域をコードするヒト遺伝子は、公知の方法によって、ヒト胎児肝臓ライブラリーより得ることができる。ヒトC領域遺伝子は、ヒト免疫グロブリンを発現および産生するものを含めて任意のヒト細胞より得ることができる。ヒトCH領域は、γ、μ、α、δまたはεを含むヒトH鎖の公知のクラスまたはアイソタイプ、ならびにG1、G2、G3およびG4などの、そのサブタイプのいずれかより得ることができる。H鎖アイソタイプは抗体のさまざまなエフェクター機能を担うので、CH領域の選択は、補体結合などの所望のエフェクター機能、または抗体依存性細胞毒性(ADCC)における活性によって導かれると考えられる。好ましくは、CH領域はγ1 (IgG1)、γ3 (IgG3)、γ4 (IgG4)またはμ(IgM)より得られる。ヒトCL領域はヒトL鎖アイソタイプκまたはλのいずれかより得ることができる。
【０１６５】
ヒト免疫グロブリンC領域をコードする遺伝子は標準的なクローニング技術によりヒト細胞から得られる(Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)およびAusubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology (1987-1993))。ヒトC領域遺伝子は、L鎖の2つのクラス、H鎖の5つのクラスおよびこれらのサブクラスに相当する遺伝子を含む公知のクローンから容易に入手可能である。F(ab')2およびFabなどのキメラ抗体断片は、適切に切り詰められたキメラH鎖遺伝子を設計することによって調製することができる。例えば、F(ab')2断片のH鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、CH1ドメインおよびH鎖の蝶番領域に続いて切断分子を生ずる翻訳終止コドンをコードしたDNA配列を含むと考えられる。
【０１６６】
一般に、本発明のマウス、ヒトまたはマウスおよびキメラ抗体、断片および領域は、抗体のH鎖およびL鎖抗原結合領域をコードするDNAセグメントをクローニングし、これらのDNAセグメントを、それぞれ、CHおよびCL領域をコードするDNAセグメントに連結して、マウス、ヒトまたはキメラ免疫グロブリンコード遺伝子を作製することによって産生される。
【０１６７】
少なくとも一部のヒトC領域をコードする第2のDNAセグメントに連結された、結合(J)セグメントを有する機能的に再構成されたV領域などの、非ヒト由来の少なくとも抗原結合領域をコードする第1のDNAセグメントを含んだ、融合キメラ遺伝子を作製することができる。それゆえ、抗体VおよびC領域をコードするcDNAで、本発明によるキメラ抗体を産生する方法は、本発明の抗体を産生する細胞株からの、ならびに重鎖および軽鎖定常領域を供給する任意のさらなる抗体からの伝令RNA (mRNA)の単離; クローニングおよびそれからのcDNA産生; L鎖およびH鎖遺伝子の適切なVおよび/またはC領域遺伝子セグメントが適切なプローブで特定され、配列決定され、キメラ抗体用の別の抗体由来のCまたはV遺伝子セグメントに適合されうる精製mRNA由来の完全長cDNAライブラリーの調製; クローニングされた特異的なV領域遺伝子セグメントの、クローニングされたC領域遺伝子への連結による完全なH鎖またはL鎖コード配列の構築; マウス-マウス、ヒト-マウス、ヒト-ヒトまたはヒトマウス抗体を提供するための原核および真核細胞を含む選択した宿主でのL鎖およびH鎖の発現および産生を含む、いくつかの段階を含む。
【０１６８】
全ての免疫グロブリンH鎖およびL鎖遺伝子ならびにこれらにコードされたmRNAの1つの共通の特徴は、J領域である。H鎖およびL鎖のJ領域は異なる配列を有するが、各グループ間で、特にC領域の近傍で高度の配列相同性(80%を超える)が存在する。この方法では、この相同性を利用し、後にV領域セグメントをヒトC領域セグメントに連結するためのJ領域への有用な制限部位の導入用のプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドを設計するために、H鎖およびL鎖のJ領域の共通配列を用いることができる。
【０１６９】
ヒト細胞から調製されたC領域cDNAベクターを部位特異的突然変異誘発により改変して、ヒト配列の類似の位置に制限部位を配置することがでる。例えば、完全なヒトκ鎖C (Ck)領域および完全なヒトγ-1 C領域(Cγ1)をクローニングすることができる。この場合、C領域ベクターの供給源としてのゲノムC領域クローンに基づく別の方法では、介在配列を除去するために必要な酵素を欠く細菌系においてこれらの遺伝子が発現されなくなると考えられる。クローニングされたV領域セグメントを切り出し、L鎖またはH鎖C領域ベクターに連結する。あるいは、終止コドンを導入し、それによってFab分子のH鎖部分をコードする遺伝子配列を作製することにより、ヒトCγ1領域を改変することもできる。次いで、原核生物または真核生物の適切な宿主での発現のために、連結されたVおよびC領域を有するコード配列を適切な発現ビヒクルに移入する。
【０１７０】
連結によってトリプレット読み枠の改変または中断なく、連続的に翻訳可能な配列が生ずる場合には、2つのコードDNA配列は「機能的に連結され」ているといわれる。DNAコード配列は、遺伝子発現要素に、連結によりその遺伝子発現要素の適切な機能をもたらして、コード配列の発現をもたらす場合には、機能的に連結されている。
【０１７１】
発現ビヒクルの中にはプラスミドまたは他のベクターがあり、これらは、適切な付着末端を有する任意のVHまたはVL鎖配列を容易に挿入できるように遺伝子操作された適切な制限部位を持つ機能的に完全なヒトCHまたはCL鎖配列を保有するように使用される。したがって、ヒトCHまたはCL鎖配列を含むビヒクルは、任意の適切な宿主における任意の所望の完全なH鎖またはL鎖発現のための中間体として役立つ。
【０１７２】
マウス-ヒトまたはヒト-ヒトなどのキメラ抗体は、典型的には、構築体に用いられるマウスH鎖およびL鎖V領域に固有の染色体遺伝子プロモーターによって駆動される遺伝子から合成され;スプライシングは、通常、マウスJ領域中のスプライスドナー部位とヒトC領域に先行するスプライス受容部位との間で行われ、同様にヒトC領域内に存在するスプライス領域の位置で行われ; ポリアデニル化および転写終結はヒトコード領域下流の固有の染色体上の部位で行われる。
【０１７３】
本発明の少なくとも1つの抗体またはAb断片をコードする核酸配列は、核酸連結用の平滑末端または接着末端、適切な末端を供与するための制限酵素消化、必要に応じて付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および適切なリガーゼによる核酸連結を含め、従来の技術にしたがってベクターDNAと組換えることができる。このような操作のための技術は、例えば、全体が参照により本明細書に組み入れられるAusubel、下記、Sambrook、下記によって開示されており、当技術分野において周知である。
【０１７４】
DNAなどの核酸分子は、転写および翻訳の調節情報を含むヌクレオチド配列を含む場合にポリペプチドを「発現することができる」といわれ、このような配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「機能的に連結」されている。機能的な連結とは、調節DNA配列および発現しようとするDNA配列が、回収可能な量で抗体またはAb断片の遺伝子発現を可能とするようにつながれている連結である。遺伝子発現に必要な調節領域の的確な性質は、類似の技術分野において周知であるように、生物によって異なりうる。例えば、Sambrook、前記およびAusubel、前記を参照されたい。
【０１７５】
本発明はしたがって、原核細胞または真核細胞のいずれかでの、抗体またはAb断片の発現を包含するが、真核生物発現が好ましい。好ましい宿主は、インビボもしくはインサイチューのいずれかの細菌、酵母、昆虫、真菌、鳥および哺乳類細胞を含む細菌宿主もしくは真核生物宿主、または哺乳類、昆虫、鳥もしくは酵母由来の宿主細胞である。哺乳類細胞または組織は、ヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、げっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌまたはネコ由来のものであることが好ましいが、その他任意の哺乳類細胞を用いることもできる。
【０１７６】
さらに、例えば、酵母ユビキチンヒドロラーゼ系の使用により、ユビキチン-膜貫通ポリペプチド融合タンパク質のインビボでの合成を達成することができる。こうして産生された融合タンパク質は、インビボでプロセッシングされ、またはインビトロで精製されプロセッシングされ、指定のアミノ末端配列を有する本発明の抗体またはAb断片の合成を可能にすることができる。さらに、酵母(または細菌)での直接的な発現における開始コドン由来のメチオニン残基の残存に関連する問題を回避することもできる。Sabin et al., Bio/Technol. 7(7): 705-709 (1989); Miller et al., Bio/Technol. 7(7):698-704 (1989)。
【０１７７】
酵母がグルコースに富んだ培地中で増殖される場合に多量に産生される糖分解酵素をコードする、活発に発現している遺伝子由来のプロモーターおよび終結要素を組み入れた任意の一連の酵母遺伝子発現系を利用して、本発明の抗体またはAb断片を得ることができる。公知の解糖系遺伝子も、非常に効率的な転写制御シグナルを供与することができる。例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターおよびターミネーターシグナルを利用することができる。
【０１７８】
昆虫における抗体もしくはAb断片またはそれらの機能的誘導体の産生は、例えば、当業者に公知の方法によって膜貫通ポリペプチドを発現するように遺伝子操作されたバキュロウイルスを昆虫宿主に感染させることにより達成することができる。Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology Wiley Interscience, 16.8-16.11 (1987, 1993)を参照されたい。
【０１７９】
好ましい態様において、導入ヌクレオチド配列は、レシピエント宿主での自己複製が可能なプラスミドまたはウイルスベクターに組み込まれる。多種多様のベクターのいずれもこの目的に用いることができる。例えば、Ausubelら、1.5節、1.10節、7.1節、7.3節、8.1節、9.6節、9.7節、13.4節、16.2節、16.6節および16.8〜16.11節を参照されたい。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する上で重要な因子には、ベクターを含むレシピエント細胞を認識でき、ベクターを含まないレシピエント細胞から選択できる容易さ; 特定の宿主において望まれるベクターのコピーの数; および異なる種の宿主細胞間でベクターを「往復させ」られることが望ましいかどうかが含まれる。
【０１８０】
当技術分野において公知の好ましい原核生物ベクターには、大腸菌(E. coli)において増殖できるものなどのプラスミド(例えば、pBR322、ColE1、pSC101、pACYC 184、πVXなどの)が含まれる。そのようなプラスミドは、例えば、Maniatis, T.ら(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel、下記によって開示されている。バチルス(Bacillus)プラスミドには、pC194、pC221、pT127などが含まれる。そのようなプラスミドは、Gryczan, T. (In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), pp. 307-329)によって開示されている。適当なストレプトマイセス(Streptomyces)プラスミドにはpIJ101 (Kendall, K. J., et al., J. Bacteriol. 169:4177-4183 (1987))、およびφC31などのストレプトマイセスバクテリオファージ(Chater, K. F., et al., In: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54)が含まれる。シュードモナス(Pseudomonas)プラスミドは、John, J. F.ら(Rev. Infect. Dis. 8:693-704 (1986))、ならびにIzaki, K. (Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742 (1978); およびAusubelら、前記)によって概説されている。
【０１８１】
あるいは、抗体、抗体断片またはペプチドをコードするcDNAの発現に有用な遺伝子発現要素には、(a) SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスLTR (Gorman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 79:6777 (1982))およびモロニーマウス白血病ウイルスLTR (Grosschedl, et al., Cell 41:885 (1985))などの、ウイルス転写プロモーターおよびそれらのエンハンサー要素(Okayama, et al., Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)); (b) SV40後期領域に由来するものなどのスプライス領域およびポリアデニル化部位(Okayareaら、下記); ならびに(c) SV40におけるようなポリアデニル化部位(Okayamaら、下記)が含まれるが、これらに限定されることはない。
【０１８２】
免疫グロブリンcDNA遺伝子を、Liuら、下記およびWeidle et al., Gene 51:21 (1987)によって記述されているように、発現要素としてSV40初期プロモーターおよびそのエンハンサー、マウス免疫グロブリンH鎖プロモーターエンハンサー、SV40後期領域mRNAスプライシング、ウサギS-グロビン介在配列、免疫グロブリンおよびウサギS-グロビンポリアデニル化部位、ならびにSV40ポリアデニル化要素を用いて発現させることができる。
【０１８３】
一部cDNA、一部ゲノムDNAから構成される免疫グロブリン遺伝子(Whittle et al., Protein Engineering 1:499 (1987))の場合、転写プロモーターはヒトサイトメガロウイルスであることができ、プロモーターエンハンサーはサイトメガロウイルスであることができ、マウス/ヒト免疫グロブリン、ならびにmRNAスプライシングおよびポリアデニル化領域は、天然の染色体の免疫グロブリン配列であることができる。例えば、げっ歯類細胞におけるcDNA遺伝子の発現の場合、転写プロモーターはウイルスLTR配列であり、転写プロモーターエンハンサーは、マウス免疫グロブリン重鎖エンハンサーおよびウイルスLTRエンハンサーのいずれかまたは両方であり、スプライス領域は31 bpを超えるイントロンを含み、ポリアデニル化領域および転写終結領域は、合成される免疫グロブリン鎖に対応する天然の染色体配列に由来する。他のタンパク質をコードするcDNA配列を上記の発現要素と組み合わせて、哺乳類細胞におけるタンパク質の発現を達成することもできる。
【０１８４】
各融合遺伝子は、発現ベクター内で組み立てられ、または発現ベクターへ挿入されうる。次いでキメラ免疫グロブリン鎖遺伝子産物を発現できるレシピエント細胞に、抗体をコードする配列を、またはキメラH鎖もしくはキメラL鎖コード遺伝子を単独でトランスフェクトし、あるいはキメラH鎖およびキメラL鎖遺伝子を同時にトランスフェクトする。トランスフェクトされたレシピエント細胞を、組み込まれた遺伝子の発現を可能にする条件の下で培養し、発現された免疫グロブリン鎖またはインタクトな抗体または断片を培養液から回収する。抗体もしくはキメラH鎖およびL鎖、またはそれらの部分をコードする融合遺伝子を、別個の発現ベクター内で組み立ててもよく、これを用いてレシピエント細胞に同時にトランスフェクトする。
【０１８５】
各ベクターは、2つの選択可能な遺伝子、つまり細菌系での選択用に設計された第1の選択可能な遺伝子、および真核生物系での選択用に設計された第2の選択可能な遺伝子を含むことができ、その際に各ベクターは、異なる一対の遺伝子を有する。この戦略では、細菌系での融合遺伝子の産生をまず初めに指令し、かつその増幅を可能にするベクターが得られる。細菌宿主においてこのように産生され増幅された遺伝子を引き続き、真核細胞に同時にトランスフェクトするのに使用し、所望のトランスフェクト遺伝子を保有する同時トランスフェクト細胞の選択を可能にする。
【０１８６】
細菌系で用いるための選択可能な遺伝子の例は、アンピシリンに対する耐性を付与する遺伝子およびクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子である。真核生物のトランスフェクタントで用いるのに好ましい選択可能な遺伝子には、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(gptと呼ばれる)およびTn5由来のホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neoと呼ばれる)が含まれる。gptを発現する細胞の選択は、この遺伝子によってコードされる酵素がプリンヌクレオチド合成の基質としてキサンチンを利用するのに対し、類似の内因性酵素は利用できないという事実に基づいている。イノシン一リン酸のキサンチン一リン酸への変換を遮断するミコフェノール酸、およびキサンチンを含有する培地では、gpt遺伝子を発現する細胞しか生存することができない。neoの産物は、抗生物質G418およびネオマイシンクラスの他の抗生物質によるタンパク質合成の阻害を遮断する。
【０１８７】
この2つの選択手順を同時にまたは連続的に用いて、2つの異なるDNAベクター上で真核細胞に導入された免疫グロブリン鎖遺伝子の発現を選択することができる。真核細胞に関して異なる選択可能なマーカーを含む必要はなく、それぞれが同じ選択可能なマーカーを含んだH鎖およびL鎖ベクターを、同時にトランスフェクトすることができる。適切な耐性細胞の選択後、クローンの大部分は、H鎖とL鎖ベクターの両方および/または抗体断片が組み込まれたコピーを含むと考えられる。あるいは、キメラH鎖およびL鎖をコードする融合遺伝子を、同じ発現ベクター上で組み立てることもできる。
【０１８８】
発現ベクターのトランスフェクションおよびキメラ抗体の産生の場合、好ましいレシピエント細胞株は骨髄腫細胞である。骨髄腫細胞は、トランスフェクトされた免疫グロブリン遺伝子によってコードされた免疫グロブリンを合成し、組み立てて、分泌することができ、免疫グロブリンのグリコシル化のための機構を備えている。特に好ましいレシピエント細胞は、組換えIg産生骨髄腫細胞SP2/0 (ATCC #CRL 8287)である。SP2/0細胞は、トランスフェクトされた遺伝子によってコードされた免疫グロブリンのみを産生する。骨髄腫細胞は培養液中で、または分泌された免疫グロブリンを腹水から得ることができるマウス腹腔内で増殖されうる。他の適当なレシピエント細胞には、ヒトもしくは非ヒト由来のBリンパ球、ヒトもしくは非ヒト由来のハイブリドーマ細胞、または異種間のヘテロハイブリドーマ細胞などのリンパ球様細胞が含まれる。
【０１８９】
本発明のキメラ抗体構築体、抗体または抗体断片を保有する発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、結合、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿およびジエチルアミノエチル(DEAE)デキストランなどのポリカチオンの適用のような生化学的手段、ならびにエレクトロポレーション、直接的マイクロインジェクションおよび微粒子銃のような機械的手段を含め、種々の適当な手段のいずれかにより適切な宿主細胞に導入することができる(Johnston et al., Science 240:1538 (1988))。リンパ球様細胞にDNAを導入する好ましい方法は、エレクトロポレーションによるものである(Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7161 (1984); Yoshikawa, et al., Jpn. J. Cancer Res. 77:1122-1133)。この手順では、組み込まれるDNAの存在下でレシピエント細胞に電気パルスをかける。典型的には、トランスフェクションの後、細胞を完全培地中で約24時間回復させ、次に選択培地の存在下で96ウェル培養プレートに播種する。約0.4〜0.8 mg/mlのG418を用いてG418による選択を行う。ミコフェノール酸による選択では、約6 μg/mlを約0.25 mg/mlのキサンチンに加えて用いる。エレクトロポレーション技術では、Sp2/0細胞の場合、約10-5〜約10-4のトランスフェクション頻度が得られるものと期待される。プロトプラスト融合法では、キメラ抗体遺伝子を含んだカタル性の内部に持つ組換えプラスミドから細胞壁を取り除くためにリゾチームが用いられる。得られたスフェロプラストを次いで、ポリエチレングリコールを用いて骨髄腫細胞と融合することができる。
【０１９０】
本発明の免疫グロブリン遺伝子は、非リンパ系の哺乳類細胞中でもしくは酵母などの他の真核細胞中で、または原核細胞、特に細菌中で発現させることもできる。免疫グロブリンH鎖およびL鎖の産生に関して、酵母は細菌に比べてかなりの利点を提供する。酵母はグリコシル化を含む翻訳後のペプチド修飾を行う。現在では、酵母での所望のタンパク質の産生に使用できる強力なプロモーター配列および高コピー数プラスミドを用いる、いくつかの組換えDNA戦略が存在する。酵母は、クローニングされた哺乳類遺伝子産物のリーダー配列を認識し、リーダー配列を保持するペプチド(すなわち、プレペプチド)を分泌する(Hitzman, et al., 11th International Conference on Yeast, Genetics and Molecular Biology, Montpelier, France, Sep. 13-17, 1982)。
【０１９１】
酵母遺伝子発現系は、抗体ならびに組み立てられたマウスおよびキメラ抗体、これらの断片および領域の産生、分泌のレベルおよび安定性を日常的に評価することができる。酵母がグルコースに富んだ培地中で増殖される場合に多量に産生される糖分解酵素をコードする、活発に発現している遺伝子由来のプロモーターおよび終結要素を組み入れた任意の一連の酵母遺伝子発現系を用いることができる。公知の解糖系遺伝子も、非常に効率的な転写制御シグナルを供与することができる。例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)遺伝子のプロモーターおよびターミネーターシグナルを用いることができる。酵母におけるクローニングされた免疫グロブリンcDNAの発現に最適な発現プラスミドを評価するのにいくつかの手法をとることができる(Glover, ed., DNA Cloning, Vol. II, pp 45-66, IRL Press, 1985を参照のこと)。
【０１９２】
細菌株を本発明によって記述される抗体分子またはペプチドの産生用の宿主として用いることもでき、大腸菌W3110 (ATCC 27325)などの大腸菌K12株、およびネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)または霊菌(Serratia marcescens)などの他の腸内細菌、ならびに種々のシュードモナス種を用いることができる。宿主細胞と適合性のある種に由来するレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの細菌宿主とともに用いられる。ベクターは、複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型選択を供与できる特異的な遺伝子を保有する。クローニングされた免疫グロブリンcDNAによりコードされるマウスおよびキメラ抗体、断片および領域または抗体鎖の、細菌での産生用の発現プラスミドを評価するのにいくつかの手法をとることができる(Glover, ed., DNA Cloning, Vol. I, IRL Press, 1985, Ausubel、下記、Sambrook, infra, Colligan、下記を参照のこと)。
【０１９３】
好ましい宿主は、インビトロまたはインビボで増殖される哺乳類細胞である。哺乳類細胞は、免疫グロブリンタンパク質分子に、リーダーペプチドの除去、H鎖およびL鎖の折り畳みおよび組み立て、抗体分子のグリコシル化、ならびに機能的な抗体タンパク質の分泌を含む翻訳後修飾をもたらす。上記のリンパ系由来の細胞に加えて、抗体タンパク質の産生用の宿主として有用でありうる哺乳類細胞には、Vero (ATCC CRL 81)またはCHO-K1 (ATCC CRL 61)などの、線維芽由来細胞が含まれる。
【０１９４】
クローニングされた抗体、H鎖およびL鎖遺伝子、または抗体断片の、哺乳類細胞での発現のために、多くのベクター系が利用可能である(Glover, ed., DNA Cloning, Vol. II, pp 143-238, IRL Press, 1985を参照のこと)。完全なH2L2抗体を得るために、異なる手法にしたがうことができる。上記のように、同じ細胞中でH鎖およびL鎖を同時に発現させて、本発明の完全な四量体H2L2抗体および/または抗体および/または抗体断片へのH鎖およびL鎖の細胞内結合および連結を達成することが可能である。同一宿主中で同じまたは異なるプラスミドのいずれかを用いることにより、同時発現を行うことができる。H鎖およびL鎖の両方および/または抗体および/または抗体断片に対する遺伝子を、同じプラスミドに配置することができ、これを細胞にトランスフェクトし、これによって両方の鎖を発現する細胞を直接的に選択することができる。あるいは、細胞に一つの鎖、例えばL鎖をコードするプラスミドを最初にトランスフェクトした後に、得られた細胞株の、第二の選択可能なマーカーを含むH鎖プラスミドによるトランスフェクションを行うこともできる。抗体および/またはH2L2分子および/または抗体断片をどちらかの経路を介して産生する細胞株に、さらなる選択可能なマーカーとともにさらなるコピーのペプチド、H鎖、L鎖またはH鎖に加えてL鎖をコードするプラスミドをトランスフェクトして、組み立てられたH2L2抗体分子のいっそう高い産生またはトランスフェクトされた細胞株の安定性の増強などの、特性の増強を有する細胞株を作製することができる。
【０１９５】
モノクローナル抗体またはキメラ抗体に加えて、本発明は同様に、本発明の抗体に特異的な抗イディオタイプ(抗Id)抗体に関する。抗Id抗体は、別の抗体の抗原結合領域に一般に関連する固有の決定基を認識する抗体である。1種もしくは複数種のT2DBマーカーまたは配列番号:1に特異的な抗体は、イディオタイプ抗体またはId抗体と呼ばれる。Id抗体またはその抗原結合領域でId抗体の供給源と同じ種および遺伝子型の動物(例えばマウス系統)を免疫することにより、抗Idを調製することができる。免疫された動物は、免疫抗体のイディオタイプ決定基を認識し、それに反応して、抗Id抗体を産生すると考えられる。抗Id抗体をさらに別の動物において免疫反応を誘導するための「免疫原」として使用し、いわゆる抗抗Id抗体を産生することもできる。抗抗Idは、抗Idを誘導した元の抗体に対してエピトープ的に同一でありうる。したがって、mAbのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることにより、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを特定することが可能である。
【０１９６】
したがって、本発明による1種または複数種のT2DBマーカーに対して作製されたmAbを使用してBALB/cマウスなどの、適当な動物において抗Id抗体を誘導することができる。このような免疫マウス由来の脾臓細胞を使用して、抗Id mAbを分泌する抗Idハイブリドーマを作製することができる。さらに、抗Id InAbをキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)などの担体に結合させ、これを用いて、さらなるBALB/cマウスを免疫することもできる。これらのマウス由来の血清は、T2DBマーカーのエピトープ、または好ましくは、配列番号:1のアミノ酸残基番号1-38のなかに含まれるエピトープに特異的な元のmAbの結合特性を有する抗抗Id抗体を含むと考えられる。
【０１９７】
薬学的組成物および処置方法
「処置する」という用語は、本発明に関連したその各種の文法形において、疾患状態、疾患進行、疾患原因因子(例えば、細菌もしくはウイルス)または他の異常状態の悪影響の予防(すなわち化学的予防)、治癒、逆行、減弱、緩和、最小化、抑制または停止をいう。例えば、処置は、疾患の1つの症状(すなわち、必ずしも全ての症状ではない)の緩和または疾患の進行の減弱を含みうる。
【０１９８】
本明細書で使用する場合、「治療的有効量」とは、T2DBマーカーまたは所望の生物学的応答をもたらしうる他の糖尿病調節剤の量を限定するよう意図される。本発明の文脈において、所望の生物応答は、被験体、例えばヒトにおける、2型糖尿病、前糖尿病状態、および2型糖尿病または前糖尿病状態に関連する合併症の進行の部分または完全抑制、遅延または予防; 2型糖尿病、前糖尿病状態または2型糖尿病もしくは前糖尿病状態に関連する合併症の再発の抑制、遅延または予防; あるいは2型糖尿病、前糖尿病状態または2型糖尿病もしくは前糖尿病状態に関連する合併症の発病または進行の予防(化学的予防)でありうる。
【０１９９】
薬学的組成物の一部として好ましく含まれるT2DBマーカーは、当業者に知られた任意の公知の投与方法によっても投与されうる。投与経路の例としては経口、非経口、腹腔内、静脈内、動脈内、経皮、局所、舌下、筋肉内、経直腸、経頬側、経鼻、リポソーム、吸入、経膣、眼内、カテーテルもしくはステントによる局所送達、皮下、脂肪内、関節内、髄腔内、または徐放投薬形態が挙げられるが、これらに限定されることはない。T2DBマーカーまたはT2DBマーカーを含む薬学的組成物は、疾患を処置するのに有効な用量を達成する任意の用量および投薬スケジュールにしたがって投与されうる。
【０２００】
例として、本発明のT2DBマーカーまたはT2DBマーカーを含む薬学的組成物は、錠剤、カプセル(その各々が持続放出または徐放製剤を含む)、丸剤、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ、懸濁液、シロップおよび乳濁液のような経口形態で投与されうる。同様に、T2DBマーカーまたはT2DBマーカーを含む薬学的組成物は、静脈内(例えば、ボーラスもしくは輸液)、腹腔内、皮下、筋肉内、または薬学的分野の当業者に周知の形態を用いる他の経路によって投与されうる。
【０２０１】
T2DBマーカーおよびT2DBマーカーを含む薬学的組成物は、活性成分の持続放出を可能にするような方法で製剤化されうるデポー注射またはインプラント調製物の形態でも投与されうる。活性成分は、ペレットまたは小型円筒形に圧縮され、デポー注射またはインプラントとして皮下または筋肉内に埋め込まれうる。インプラントには生分解性ポリマーまたは合成シリコーン、例えば、Dow-Corning Corporationが製造するSilastic、シリコーンゴムまたは他のポリマーなどの不活性材料を用いることができる。
【０２０２】
T2DBマーカーまたはT2DBマーカーを含む薬学的組成物は、小型単層小胞、大型単層小胞および多層小胞などの、リポソーム送達系の形態でも投与されうる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンなどの、各種のリン脂質から形成されうる。糖尿病調節剤のリポソーム調製物を本発明の方法において使用することもできる。
【０２０３】
T2DBマーカーまたはT2DBマーカーを含む薬学的組成物は、化合物分子が結合される個別の担体としてのモノクローナル抗体の使用によっても送達されうる。
【０２０４】
T2DBマーカーまたはT2DBマーカーを含む薬学的組成物は、標的化可能な薬物担体として可溶性ポリマーを用いて調製されうる。このようなポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシ-プロピル-メタクリルアミド-フェノール、ポリヒドロキシエチル-アスパルトアミド-フェノール、またはパルミトイル残基によって置換されたポリエチレンオキシド−ポリリジンを含むことができる。さらに、T2DBマーカーまたはT2DBマーカーを含む薬学的組成物は、薬物の制御放出を達成するのに有用な生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびハイドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーを用いて調製されうる。
【０２０５】
T2DBマーカーまたはT2DBマーカーを含む薬学的組成物は同様に、適当な鼻腔内ビヒクルの局所使用により、または当業者に周知の経皮皮膚パッチの形態を用いた経皮経路により、鼻腔内形態で投与されうる。経皮送達系の形態で投与されるために、投薬量の投与は、当然ながら、投薬計画を通じて間欠的というよりも連続的となると考えられる。
【０２０６】
本明細書において記述され、本発明の方法において用いるのに適した薬剤の、適当な薬学的に許容される塩は、従来の無毒性の塩であり、塩基との塩または無機塩基との塩などの酸付加塩、例えば、アルカリ金属塩(例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩など)、アルカリ土類金属塩(例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩など)、アンモニウム塩; 有機塩基との塩、例えば、有機アミン塩(例えば、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン塩など)など; 無機酸付加塩(例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など); 有機カルボン酸またはスルホン酸付加塩(例えば、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩など); 塩基性または酸性アミノ酸(例えば、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸など)との塩などを含むことができる。
【０２０７】
さらに、本発明は同様に、本発明の1種または複数種のT2DBマーカーのいずれかの固体または液体の物理的形状を含む薬学的組成物も包含する。例えば、T2DBマーカーは結晶形でも、非晶形でもよく、任意の粒径も有してもよい。T2DBマーカー粒子は微粉化されてもよく、あるいは凝集化されてもよく、微粒子の顆粒、粉末、油、油性懸濁液または固体もしくは液体の物理的形状のその他任意の形態であってもよい。
【０２０８】
経口投与の場合、薬学的組成物は液体または固体でありうる。適当な固体経口製剤には錠剤、カプセル、丸剤、顆粒、ペレットなどが含まれる。適当な液体経口製剤には溶液、懸濁液、分散液、乳濁液、油などが含まれる。
【０２０９】
例えば、ガム、デンプン、糖、セルロース系材料、アクリレートまたはそれらの混合物などの、担体または希釈剤として一般に使用される任意の不活性賦形剤を本発明の製剤に使用することができる。組成物は、崩壊剤および滑沢剤をさらに含むことができ、加えて、結合剤、緩衝剤、プロテアーゼ阻害剤、表面活性剤、可溶化剤、可塑剤、乳化剤、安定化剤、増粘剤、甘味料、膜形成剤、またはそれらのいずれかの組み合わせより選択される1種または複数種の添加剤を含むこともできる。さらに、本発明の組成物は、制御放出または即時放出製剤の形態であってもよい。
【０２１０】
T2DBマーカーは、意図した投与形態に関して適当に選択された適当な薬学的希釈剤、賦形剤または担体(本明細書では集合的に「担体」材料または「薬学的に許容される担体」といわれる)と混合された活性成分として投与されうる。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体または希釈剤」とは、薬学的投与に適合する、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むよう意図される。適当な担体は、参照により本明細書に組み入れられる、当分野の標準的な参照テキストRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記述されている。
【０２１１】
液体製剤の場合、薬学的に許容される担体は水性もしくは非水性溶液、懸濁液、乳濁液または油でありうる。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝化媒質を含む、水、アルコール性/水性溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。油の例は、石油、動物、植物または合成由来のもの、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、オリーブ油、ヒマワリ油、および魚肝油である。溶液または懸濁液は、次の成分: 滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒; 抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン; 抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム; キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA); 緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および等張度の調整剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含むこともできる。pHは酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムによって調整されうる。
【０２１２】
リポソームおよび非水性ビヒクル、例えば固定油も使用されうる。薬学的に活性な物質のためにこのような媒質および薬剤を使用することは、当技術分野において周知である。任意の従来の媒質または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物でのその使用が企図される。補助活性化合物を組成物に組み入れることもできる。
【０２１３】
固体担体/希釈剤には、ガム、デンプン(例えば、トウモロコシデンプン、アルファ化デンプン)、糖(例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース、デキストロース)、セルロース系材料(例えば、微結晶性セルロース)、アクリレート(例えば、ポリメチルアクリレート)、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されることはない。
【０２１４】
加えて、組成物は、結合剤(例えば、アラビアゴム、トウモロコシデンプン、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン)、崩壊剤(例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グアーガム、デンプングリコール酸ナトリウム、プリモゲル)、各種のpHおよびイオン強度の緩衝剤(例えば、トリス-HCl、酢酸塩、リン酸塩)、表面への吸収を防止するアルブミンまたはゼラチンなどの添加剤、界面活性剤(例えば、Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸塩)、プロテアーゼ阻害剤、表面活性剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)、浸透促進剤、可溶化剤(例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール)、流動促進剤(例えば、コロイド状二酸化ケイ素)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール)、安定剤(例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、増粘剤(例えば、カルボマー、コロイド状二酸化ケイ素、エチルセルロース、グアーガム)、甘味料(例えば、スクロース、アスパルテーム、クエン酸)、香味剤(例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香味料)、保存料(例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン)、滑沢剤(例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム)、流動助剤(例えば、コロイド状二酸化ケイ素)、可塑剤(例えば、ジエチルフタレート、クエン酸トリエチル)、乳化剤(例えば、カルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム)、ポリマーコーティング(例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン)、コーティングおよび膜形成剤(例えば、エチルセルロース、アクリレート、ポリメタクリレート)ならびに/あるいはアジュバントをさらに含むこともできる。
【０２１５】
一つの態様において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤のような、身体からの迅速な排除から化合物を保護する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性ポリマーが使用されうる。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかであると考えられる。それらの材料は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals,Inc.から購入することもできる。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されたリポソームを含む)を薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記述されているように、当業者に公知の方法にしたがって調製されうる。
【０２１６】
投与の容易さおよび投薬の一様性のため、経口組成物を投薬単位剤形で製剤化することが、特に好都合である。投薬単位剤形は本明細書で使用する場合、処置される被験体に対する単位投薬量として適した物理的に別個の単位をいい、各単位は、所望の治療効果をもたらすように算出された活性化合物の所定の量を必要な薬学的担体とともに含有する。本発明の投薬単位剤形の仕様は、活性化合物に固有の特徴および達成される特定の治療効果、ならびにこのような活性化合物を個体の処置のために配合するという技術分野に付いて回る制限によって決定づけられ、それらに直接依存する。薬学的組成物は、投与のための説明書とともに容器、パック、またはディスペンサに含まれうる。
【０２１７】
活性成分を含有する薬学的組成物の調製、例えば混合、造粒、または錠剤形成プロセスは、当技術分野において十分に理解されている。活性治療成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合性である賦形剤と混合されることが多い。経口投与の場合、活性剤は、このために慣習的な添加剤、例えばビヒクル、安定剤、または不活性希釈剤と混合され、慣習的な方法によって投与に適した形態、例えば、上で詳説したような錠剤、コーティング錠、硬質または軟質ゼラチンカプセル、水性、アルコール性または油性溶液などに変換される。
【０２１８】
IV投与の場合、グルクロン酸、L-乳酸、酢酸、クエン酸または静脈内投与に許容されるpH範囲において合理的な緩衝能力を備えた任意の薬学的に許容される酸/共役塩基が緩衝剤として使用されうる。pHが酸または塩基のどちらか、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムによって所望の範囲に調整された塩化ナトリウム溶液も利用されうる。典型的には、静脈内製剤のpH範囲は、約5〜約12の範囲内にありうる。ヒドロキサム酸部分を有するHDAC阻害剤を含む静脈内製剤の詳細なpH範囲は、約9〜約12でありうる。
【０２１９】
皮下製剤は、約5〜約12の範囲のpHで当技術分野において周知の手順にしたがって調製可能であり、適当な緩衝剤および等張剤を含む。それらは、1回または複数回の1日皮下投与にて活性剤の1日用量を送達するように製剤化されうる。製剤の適切な緩衝剤およびpHの選択は、投与される1種または複数種のT2DBマーカーの溶解性に応じ、当業者によって容易に行われる。pHが酸または塩基のどちらか、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムによって所望の範囲に調整された塩化ナトリウム溶液も皮下製剤で利用されうる。典型的には、皮下製剤のpH範囲は、約5〜約12の範囲内にありうる。
【０２２０】
本発明の組成物は同様に、適当な鼻腔内ビヒクルの局所使用により、または当業者に周知の経皮皮膚パッチの形態を用いた経皮経路により、鼻腔内形態で投与されうる。経皮送達系の形態で投与されるために、投薬量の投与は、当然ながら、投薬計画を通じて間欠的というよりも連続的となると考えられる。
【０２２１】
実施例
実施例1：2型糖尿病のCohenラットモデルにおけるバイオマーカー同定
Cohen糖尿病（CD）ラットは、周知で用途の多い2型糖尿病動物モデルであり、ヒトにおける2型糖尿病（T2D）の一般的な特徴の多くを発する二つの齧歯類系統で構成されている。感受性系統（CDs）は、高ショ糖／銅欠乏食（HSD）に維持されると30日以内に糖尿病を発症するが、耐性系統（CDr）は正常な血糖値を保持する。通常の齧歯類食（RD）で無期限的に維持される場合、いずれも系統もT2Dの症候を発することはない。
【０２２２】
試料調製
RDまたはHSDを30日間与えたCDrラットおよびCDsラットから血清、尿および組織試料（脾臓組織、膵臓組織および肝臓組織を含む）を得た。試料を瞬間冷凍し、−80℃で貯蔵した。
【０２２３】
四つの実験条件それぞれに関して、1グループあたり10個の臓器を使用して全タンパク質抽出物を調製した。機械的せん断装置（Polytron）を使用して膵臓組織を処理した。処理された試料におけるタンパク質完全性を保存するために、処理が開始し、すべての緩衝液および器具が予冷されるまで組織をドライアイス上で維持した。また、均質化プロセス中、試料を氷上で維持した。
【０２２４】
T-Per緩衝液（Pierce）を氷上で予冷し、使用前に緩衝剤50mlあたりCompleteプロテアーゼ阻害剤（Roche Applied Sciences）2錠を加えた。ひとたびプロテアーゼ阻害剤を加えると、未使用の緩衝液を捨てた。組織1グラムあたり20mlのT-Per緩衝液を使用した。グループごとに、膵臓試料を計量し、必要な細胞溶解緩衝液の量を算出し、50ml管の中で各組織試料に加えた。各試料を氷上で10秒間均質化したのち、30秒の静止期間をとって試料を放冷した。粗い組織片がまだ見える場合には、ホモジネートが平滑になるまでサイクルを繰り返した。発泡を最小限にするため、均質化プローブを試料中に管の底から約1cmのところまで挿入した。均質化が完了すると、抽出物を4℃で10,000×gで15分間遠心分離した。
【０２２５】
遠心分離後、上澄みを回収し、ビシンコニン酸（BCA）アッセイを実施して全タンパク質含量を測定した。表2は、RDまたはHSDを与えられたCDrラットおよびRDまたはHSDを与えられたCDsラットに対応する試料の平均タンパク質含量を提供する。
【０２２６】
（表２）Cohen糖尿病ラットからの膵臓抽出物の全タンパク質含量
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【０２２７】
上澄みをアリコートに分注し、−80℃で貯蔵した。また、ペレット化材料を−80℃で維持、貯蔵した。
【０２２８】
膵臓抽出物に対し、一次元SDS-PAGEを使用して、CDrおよびCDs表現型のタンパク質発現プロファイリングを実施した。全タンパク質6μgを含有する各抽出物の試料を試料緩衝液中に調製し、4〜12％アクリルアミドゲルに添加した。電気泳動実験が完了したのち、ゲルをクマシー染料で1時間浸漬し、蒸留水中で一晩脱染した。得られたタンパク質発現プロファイルは、各抽出物の経験的な目視比較を可能にした（図1）。その後、これらの膵臓抽出物を、本明細書に開示される双方向免疫学的対比に使用した。
【０２２９】
アルブミン、免疫グロブリンおよび他の高存在度タンパク質が血清中の全タンパク質の約95〜97％を構成するため、全血清を直接分析したとしても、より少ない高存在度のタンパク質およびペプチドマーカーの検出は隠蔽される。したがって、低存在度タンパク質の隠蔽を減らし、分析に使用可能なピークの数を増すために、血清試料の分画が必要であった。
【０２３０】
多数のピークの検出を増大し、アルブミン、免疫グロブリンなどの多量の高存在度タンパク質からの少量のタンパク質に対するシグナル抑制効果を軽減するために、RDまたはHSDを与えられたCDrおよびCDsラットからの粗血清試料を六画分に分画した。分画は、Ciphergen（Fremont, CA）から購入したアニオン交換ビーズベースの血清分画キットを使用して実施した。簡潔に言うと、血清試料を9M尿素変性溶液で希釈し；希釈した試料を、アニオン交換吸着剤を事前に充填した96穴フィルターマイクロプレートに添加した。このプロセスを使用して、試料をビーズの活性表面に結合させ、4℃で30分間インキュベーションしたのち、段階pH勾配緩衝液を使用して試料を溶離させた。このプロセスにより、pH9、pH7、pH5、pH4、pH3および有機溶離物を含む六つの画分を収集することができた。分画後、血清試料を、SELDIチップ上、以下のフォーマットで分析した。
【０２３１】
SELDI（表面増強レーザ脱離イオン化法）
SELDI Proteinchip（登録商標）技術（Ciphergen）は、クロマトグラフィーチップ表面に保持されたタンパク質混合物の質量分析を実施するように設計されている。SELDI質量分析計は、混合物中のタンパク質の質量／電荷比およびチップ表面へのそれらの結合親和性に基づいて複雑なタンパク質混合物のスペクトルを生成する。ピーク強度を比較することにより、示差的に発現するタンパク質がこれらのタンパク質プロファイルから決定される。この技術は、化学的修飾表面（親水性、疎水性、予備活性化、順相、固定化金属親和性、カチオン性またはアニオン性）または生物学的（抗体、抗原結合フラグメント（たとえばscFv）、DNA、酵素または受容体）ベイト表面を有するように作製されたアルミニウムベースの支持体、すなわちチップを使用する。これら様々な化学的および生化学的表面は、タンパク質そのものの固有の性質に基づくタンパク質の示差的捕獲を可能にする。わずか1μlの量の組織抽出物または体液がこれらの表面に直接塗布されると、そこで、ベイト表面に対して親和性を有するタンパク質が結合する。非特異的にまたは弱く結合したタンパク質を除去するための一連の洗浄ののち、結合したタンパク質を、レーザ脱離させ、イオン化してMS分析に備える。小さなペプチドからタンパク質にまで及ぶタンパク質の分子量（1000ダルトン〜200kD）が計測される。その後、これらの質量スペクトルパターンを使用して一つの試料を別の試料から差別し、さらなる分析のためのリード候補マーカーを同定する。候補マーカーは、順化対順化幹細胞培地のタンパク質プロファイルを比較することによって同定されてきた。ひとたび候補マーカーが同定されると、それらを精製し、配列決定する。
【０２３２】
分画された血清試料を異なる化学的に修飾された表面チップ（カチオン交換、アニオン交換、金属親和性結合、疎水性および順相）に塗布し、SELDI、二次元PAGE（2DE）および二次元液クロマトグラフィー（2D/LC）によってプロファイリングした。
【０２３３】
二次元液クロマトグラフィー（2D/LC）
ProteomeLab PF 2Dタンパク質分画システムは、第一の次元では等電点（pI）によって、第二の次元では疎水性によってタンパク質を分解し、収集する全自動二次元分画システム（液相中）である。システムは、異なる試料の間でのタンパク質プロファイリングの直接比較を可能にする二次元タンパク質マップによって複雑なパターンを視覚化する。すべての成分は、液相中で単離され、収集されるため、質量分析法を使用する下流側タンパク質同定および／または抗体産生のためのタンパク質抽出にとって理想的である。
【０２３４】
PF 2Dシステムは、従来のプロテオミクス研究に伴う問題の多く、たとえば低存在度タンパク質の検出、実験間再現精度、定量化、膜または疎水性タンパク質の検出、塩基性タンパク質の検出ならびに超低分子量および超高分子量タンパク質の検出に対応する。血清中のタンパク質のダイナミックレンジは10桁を上回る範囲に及び、比較的僅かな高存在度タンパク質が全タンパク質含量の95％超を構成するため、これは、候補マーカーである低存在度タンパク質を検出することを非常に困難にする。より少ない高存在度のタンパク質を富化し、同定するために、IgY-R7齧歯類最適化分配カラムを使用して血清試料を分配して、七つの高存在度タンパク質（アルブミン、IgG、トランスフェリン、フィブリノーゲン、IgM、α1アンチトリプシン、ハプトグロビン）をより少ない高存在度のタンパク質から分離した。
【０２３５】
分配した血清をPF-2Dに適用した。HPCFカラム上、出発緩衝液（pH8.5）および溶離緩衝液（pH4.0）を使用して生成した線形pH勾配を用いて第一次元クロマトフォーカシングを実施した。pIに基づいてタンパク質を分離した。画分を収集し、逆相HPRPカラムに適用して第二次元分離を実施した。次に、各試料から生成された2Dマップを比較し、示差的なピークパターンを同定した。その後、画分を選択し、トリプシン消化に供した。LC/MSを使用して、消化された試料を配列決定してタンパク質を同定した。
【０２３６】
2Dゲル電気泳動
二次元電気泳動は、何千ものタンパク質の複雑な混合物を単一ゲル中で同時に分解する能力を有する。第一の次元において、タンパク質はpIによって分離され、第二の次元において、タンパク質はMWによって分離される。2Dゲル電気泳動の用途としては、プロテオーム分析、細胞分化、疾病マーカーの検出、治療に対する応答のモニタリングなどがある。
【０２３７】
IgY分配血清試料を固定化pH勾配（IPG）ストリップに異なるpH勾配（pH3〜10、pH3〜6およびpH5〜8）で適用した。第一次元実験ののち、IPGストリップを8〜16％または4〜20％ SDS-PAGE勾配ゲルの上に配置して第二次元分離を実施した。
【０２３８】
結果
図2Aに示すように、CDr-RDおよびCDr-HSDの血清中に約4200ダルトンのピークタンパク質が存在したが、CDs-RDまたはCDs-HSDの血清中には存在しなかった。図2Bは、4200ダルトンフラグメントのMS/MSスペクトルである。このタンパク質を配列決定し、広範なデータベース検索ののち、それが新規タンパク質であることを見いだした。このペプチドを「D3」と指定し、その配列が、
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であることを見いだした。D3ペプチドは、Cohen糖尿病ラットで発見された第一のバイオマーカーに対応する38量体ペプチド配列である。National Center for Biotechnology Information（NCBI）から利用可能なBLASTアルゴリズムを使用する配列アラインメントを実施し、この38アミノ酸フラグメントが少なくとも10の異なるアミノ酸配列とで配列同一性を有するということを見いだした。注目すべきことに、BLASTアラインメントは、38アミノ酸D3ペプチドが、「FNRPFL」および「FMS/GKVT/VNP」に対応する保存モチーフを含有することを明らかにした。図3Aは、D3ペプチドフラグメントに関するアミノ酸配列のBLASTアラインメントの結果を示し、図3Bは、D3ペプチドおよびタンパク質BLASTによって同定されたペプチドをコードする核酸配列のBLASTアラインメントの結果を示す。保存モチーフを標的化し、以下の配列を含むように縮重プライマーを設計した。フォワードプライマー（アミノ酸配列「FNRPFL」：
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を含有する領域を標的化）およびリバースプライマー（配列「FMS/GKVT/VNP」：
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を含有する領域を標的化）（ここで、M＝AまたはC；R＝AまたはG；Y＝CまたはT；S＝CまたはG；K＝GまたはT；およびV＝A、CまたはG）。これらの縮重プライマーを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）で使用して、肝臓および膵臓におけるヒトセルピナ3を増幅した。図3Cに示すように、ヒト肝臓および膵臓中に1.3Kbフラグメントが同定された。
【０２３９】
以下の表3は、SELDI分析によって同定されたさらなる候補マーカーを表す。
【０２４０】
（表３）
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【０２４１】
Cohen糖尿病ラットの間の差を図4Aおよび4Bに示す。これらの図は、LC/MS技術によって同定されたバイオマーカーを示すゲルおよび示差二次元逆相HPLCまたは選択された第一次元pI画分（画分31）のCDr-RD（赤）対CDs-RD（緑）によって得られた溶離プロファイルを示すグラフを表す。図5Aは、四つのCohen糖尿病ラットモデルそれぞれに由来する試料の2DEゲルを表し、図5Bは、図4Aでアポリポタンパク質E、肝臓再生関連タンパク質および未同定タンパク質として同定されたスポットの拡大図である。図6は、2DE技術を使用して四つのCohen糖尿病ラットモデルで見いだされた示差的に発現したタンパク質を示すグラフ図である。図7は、2DEによって同定された示差的に発現したCohen糖尿病ラット血清タンパク質を示すヒストグラムである。
【０２４２】
D3ペプチドをウサギにおける高度免疫血清の産生に使用した。図8は、CDr-RDおよびCDr-HSDラット血清画分6から単離された約4kDタンパク質とのD3高度免疫血清の反応性を示すウェスタンブロットを示す。分画CDラット血清試料を10％ SDS-PAGEゲル上で移動させたのち、PVDF膜に移した。同じく高度免疫血清と反応したより高分子量のダブレット(doublet)（49〜62kDの範囲）は、親タンパク質が治療様式RDまたはHSDの下のすべての系統によって発現されるが、D3フラグメントに対応するより小さなサイズ（約4kD）の誘導体は、CDr系統のみで示差的に発現されるということを示した。これらの結果は、SELDIプロファイリングによって得られた結果と合致している。続いて、CDrラット血清中のD3フラグメントの濃度をSELDIによって分析した。一連の合成D3ペプチド標準（0.1、0.033、0.011、0.0037、0.0012および0mg/ml）および10×希釈CDr血清をQ10タンパク質チップアレイ上に二重反復でスポッティングした。D3ペプチド標準の濃度に対してピーク強度をプロットした。プロット（図9）に基づくと、濃度測定の線形範囲は0〜0.01mg/mlである。したがって、CDr-RD血清中のD3の濃度は、CDr-RD血清試料のピーク強度に基づいて約0.04mg/mlである。
【０２４３】
Cohenラット肝臓抽出物中、抗D3ウサギ血清（1：200）およびHRP結合二次ヤギ抗ウサギIgG（1：25,000希釈）を使用して、ウェスタンブロット分析によるセルピナ発現の分析を実施した。また、肝臓抽出物（10μg）およびHRP結合二次ヤギ抗ウサギIgG抗体（1：25,000希釈）を含有するが、一次抗体を含有しない対照をも分析した（図10）。肝臓抽出物とD3高度免疫血清との反応ののち、タンパク質（41、45および47kD）のクラスタを視覚化した。41および45kDタンパク質はほぼ同じレベルで発現したが、47kDタンパク質は、糖尿病ラット、すなわちCDs-HSD（糖尿病）においては検出されない。
【０２４４】
表4は、CDラット血清試料から得られたバイオマーカーデータの概要を含む。
【０２４５】
（表４）T2DBマーカーデータ概要
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【０２４６】
実施例2：ヒト血清におけるバイオマーカー同定
D3高度免疫血清（ウサギ、図11）を使用してヒト血清の分析を実施した。使用した一次抗体は、D3ペプチドによる免疫化ののち産生されたウサギポリクロナール抗体であった。分子量20kDのタンパク質（14kD〜28kDマーカー）が、ヒト血清中、2型糖尿病患者と比較して、正常な個人においてより高い強度で発現する。MW60〜80kDの一対のタンパク質が両試料（正常および糖尿病）中に存在すると思われる。興味深いことに、ダブレット中のタンパク質の強度が逆転しているように思われた。これは、CDr-HSDおよびCDs-HSD膵臓による免疫サブトラクション法に由来するモノクローナル抗体を使用して実施された観察である。図12Aおよび12Bは、CDr-HSDまたはCDs-HSD膵臓抽出物100μgを含有する分離用ゲルを示す。正の対照を抗アクチン抗体20μgで染色し、かつサブクローンレーンを順化培養上澄み（本開示の他の場所で説明済み）600μlで染色した。
【０２４７】
正常な対象、糖尿病対象およびインスリン耐性対象から採取された試料に対応するヒト血清試料を三人の異なる提供者：Itamar Raz博士、Wendell Cheatham博士およびRachel Dankner博士からいただき、SELDI分析に供した。Raz博士の試料（以下「Raz試料」）は、11のT2Dヒト血清および血漿試料ならびに九つの正常なヒト血清および血漿試料を含むものであった。Cheatham試料は、全部で51の血清および尿試料を含むものであり、そのうち12が1型糖尿病個人に由来し、13がT2D個人に由来し、10がインスリン耐性対象に由来し、16が正常な対象に由来するものであった。Dankner試料は、23のT2Dヒト血清試料および25の正常なヒト血清試料を含むものであった。SELDI分析は、以下表5および6に示される、RazおよびDankner試料からの有意なピークを明らかにした。図13は、SELDIによってアニオン性Q10チップ上でプロファイリングされた全ヒト血清の例である。
【０２４８】
（表５）Raz試料中に存在する選択された有意なピーク
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【０２４９】
（表６）Dankner試料中に存在する選択された有意なピーク
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【０２５０】
SELDI分析は、13のT2Dヒト試料および16の正常なヒト試料で同定された示差的に発現したタンパク質ピークを明らかにした。図14は、試料の画分1のSELDI分析の擬似ゲル図を示す。各レーンは、M/Z 14.0kD〜16.0kDの個々の試料のスペクトルを表す。タンパク質バンドのM/Zは、それぞれ約15.2、14.8および14.5kDである。図15は、Q10タンパク質チップ上でプロファイリングされた、13のT2Dおよび16の正常な分画血清試料（画分3）に対して実施されたSELDI分析の別の擬似ゲル図である。各レーンは、M/Z 8.0kD〜10.0kDの個々の試料のスペクトルを表す。タンパク質マーカーのM/Zは約9.3kDである。図15中の下のグラフは、T2D試料中で下方制御されるマーカー（M/Z約6430）のクラスタ図である。図16Aに示すように、Cheatham試料に対してSELDIを使用してアルブミンのレベルをプロファイリングし、それをDankner試料に比較した。
【０２５１】
正常な患者、糖尿病前症患者および糖尿病患者からのヒト血清試料を同じくCheatham博士からいただいた。これらの試料を収集し、分画し、SDS-PAGEによって分解した。本明細書に開示されるウサギ抗D3ポリクローナル抗体を使用して、分離したタンパク質に対して免疫ブロッティングを実施した。図16Bは、免疫ブロットの結果ならびに糖尿病前、T2D（糖尿病）および正常な対象の対応するバンドを示す。免疫ブロットのタンパク質バンドの強度を定量化すると、図11で得られた結果と同様に、60〜80kD範囲の分子量を有するダブレットバンドが、ヒト血清中、2型糖尿病と診断された患者と比較して、正常な個人でより高い強度で発現することが実証された。
【０２５２】
実施例3：モノクローナル抗体の双方向免疫学的対比および生成
SDS-PAGEによって得られた膵臓抽出物タンパク質プロファイルから、CDr-HSD試料とCDs-HSD試料との間でバンド形成パターンにおける明白な差が認められた（図1）。これら二つの試料の間で双方向免疫学的対比を実施した。この技術は、別々に対比されるCohen糖尿病ラットからの二つの膵臓抽出物を実験動物（たとえばBalb/cマウス）の足裏に注入することを含む。抗原提示細胞（APC）による注入部位における抗原の吸収および処理ののち、活性化されたAPCは局所リンパ節（膝窩）に移動して免疫応答を開始する。これらのリンパ節は、各脚に位置するため、解剖学的に互いに離れており、それが、この地点における抗原特異的リンパ球の混合を防ぐ。のちに、免疫応答において、これらの活性化されたリンパ球は、局所リンパ節から脾臓に移動し、そこで混合し、そこから全身に循環することができる。
【０２５３】
足裏注入から2週後、以前と同じ抗原を各足裏に注入することによって実験動物を追加免疫した。この追加免疫は、抗原特異的リンパ球を注入部位に呼び戻して、その後、再び膝窩リンパ節に流す。この技術は、自然な増殖および細胞移動プロセスをろ過機構として使用して特異的リンパ球を各リンパ節中で分離し、富化し、そこで、リンパ球は、解剖学的に隔離されて、抽出物の一方のみで発現した抗原に特異的である細胞の混合を最小限にする。追加免疫から3日後、膝窩リンパ節を取り出し、実験動物の各側に由来するプールに分離した。追加免疫時、抗原材料を交換しないことが決まりである。理由は、交換すると、特異的リンパ球が両側の膝窩リンパ節に移動し、特異的細胞の解剖学的隔離、ひいてはこの技術の利点が失われるからである。
【０２５４】
6〜8週齢のメスBalb/cマウス15匹をHarlanから得た。各マウスの左後足裏にCDr-HSD膵臓抽出物25μgを注入し、右後足裏にCDs-HSD膵臓抽出物25μgを注入した。抗原を、以下のように、20％ Ribiアジュバント中、50μlの最終量に調製した。
【０２５５】
（表７）
2010539513.tif 000032
【０２５６】
Ribiアジュバントを37℃に加温し、無菌PBS 1mlで再構成した。ボトルを少なくとも1分間ボルテックスし材料を完全に再構成した。次に、正しい量のRibiアジュバントを抗原試料に加え、混合物を再び1分間ボルテックスした。未使用の調合材料を捨て、未使用のRibiアジュバントを4℃で貯蔵し、追加免疫注射を調合するために使用した。マウスを1日目に初回抗原刺激し、14日目に追加免疫した。17日目にマウスを安楽死させ、死後、膝窩リンパ節を切除し、研究室に戻して処理した。
【０２５７】
ハイブリドーマの生成
本質的には、KohlerおよびMilstein（1975）によって記載されているよう、ハイブリドーマ細胞系を作製した。免疫化された動物に由来するリンパ球を、ポリエチレングリコール（PEG）を用いるインキュベーションにより、ネズミ骨髄腫細胞系（Sp2/0）と融合させた。融合ののち、細胞を、キメラ融合細胞の増殖のみを促進するヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する選択培地（HAT培地）中に維持した。
【０２５８】
融合の前日、融合の24時間前に、融合パートナー（分裂段階にある、生存率95％超のSp2/0x Ag14細胞）を1mlあたり1×105個の生存可能細胞に分割した。融合当日、マウスを殺処分し、リンパ節を切除し、10％ウシ胎児血清（FBS）で補足した、予熱された室温のDMEMを含有するペトリ皿に入れた。無菌顕微鏡スライドを使用して、リンパ節をスライドの二つのフロスト面の間に配置し、押し潰して単細胞懸濁液にした。次に、細胞懸濁液を15ml管に移し、1000rpmで1分間遠心分離した。上澄みを吸引によって除去し、細胞ペレットを無血清DMEM 12ml中にやさしく再懸濁させたのち、1000rpmで10分間もう一回の遠心分離に供した。血清が完全に除去されたことを保証するため、このプロセスをもう2回繰り返した。洗浄後、細胞を無血清DMEM5ml中に再懸濁させ、顕微鏡下で計数した。
【０２５９】
遠心分離器中1000rpmで10分間スピンさせることによって融合パートナーを収集した。細胞を無血清DMEM中で3回洗浄し、最後に、無血清DMEM中に再懸濁させ、計数した。リンパ節細胞の数に基づいて融合パートナー細胞の数を算出した。骨髄腫細胞（融合パートナー）1個あたり二つのリンパ節細胞が必要である（骨髄腫細胞対リンパ節細胞の比1：2、たとえば、10×106個のリンパ節細胞の場合、5×106個の融合パートナー細胞が必要である）。LN細胞に対して適切な数の骨髄腫細胞を加え、無血清DMEMを使用して細胞の全量を25mlに調節したのち、3％デキストラン25mlを細胞に加えた。この混合物を1000rpmで10分間スピンし、細胞ペレットから上澄みを可能な限り吸引した。細胞を含有する管にふたを配した場合には、管の底を軽くたたいて細胞を再懸濁させ、予熱された50％（v/v）PEG 1mlを管に加えた。凝集した細胞を1分間放置したのち、無血清DMEM 20ml、次いで20％ FBS 25ml、25mM Hepesを含むDMEMを加えた。管を一度逆さまにして混合させたのち、1000rpmで10分間遠心分離した。培地を吸引し、軽くたたくことによって細胞をやさしく再懸濁させた。細胞懸濁液が1mlあたり細胞0.125×106個または1mlあたり細胞0.0625×106個になるようにHAT選択培地を加えた。96穴平底プレートに穴1個あたり細胞100μlを加え、37℃、CO2 8.5％でインキュベートした。2日後、細胞に新鮮なHAT選択培地100μlを加えた。7日後、コロニー成長に関して細胞をチェックした。
【０２６０】
ハイブリドーマスクリーニング
目に見えるコロニーが96穴プレート中に観察されると、ELISAによるスクリーニングのために順化上澄み100μlを各コロニーから回収した。CDr-HSD抽出物およびCDs-HSD抽出物の両方に対して検出可能なレベルの抗原特異的IgGの存在に関して上澄みをスクリーニングした。二つの抽出物の一方に対して少なくとも2倍の差で陽性のELISA反応を示すコロニーのみを増大およびさらなる特性決定のために選択した。
【０２６１】
試験される25μg/ml濃度の膵臓抽出物を炭酸水素塩緩衝液に希釈した（炭酸水素塩1カプセルを脱イオン水100mlに溶解した）。96穴プレートのうち、正の対照のための二つの余分な穴および負の対照のための二つの余分な穴を残しておいた。次に、接着フィルムを使用してプレートをカバーし、4℃で一晩インキュベートした。
【０２６２】
プレートをPBS/Tween 200μlで一度洗浄した。プレートをシンクに振り下ろすことによって穴の中身を除去したのち、プレートを吸収紙に軽く押し当てて残りの液体を除去した。洗浄緩衝液（PBS/Tween）約200μlを加え、その後、前記のように捨てた。次に、プレート全体を、5％粉末ミルク/PBS/Tween200μl中、37℃で1時間ブロッキングした。その後、前記のようにPBS/Tweenを使用してプレートを3回洗浄した。
【０２６３】
融合培養上澄みを0.5％ミルク/PBS/Tween中で1：1に希釈し、各試料を穴に加え（50μl、最終量は穴1個あたり100μl）、抗アクチンAb（Sigma）50μlを、緩衝液50μlを含有する穴に20μg/mlで加えた。緩衝液50μlを負の対照の穴にも加えた。プレートをカバーし、4℃で一晩インキュベートした。前記のようにPBS/Tweenを使用してプレートを3回洗浄し、0.5％ミルク/PBS/Tween中1：20000の抗HRP抗マウスIgG（100μl）を各穴に加えた。プレートをカバーし、37℃で2時間インキュベートした。
【０２６４】
二次抗体とのインキュベーションののち、前記のようにプレートを4、5回洗浄した。最後の洗浄の際、洗浄緩衝液をプレート上に数分間残したのち、捨てた。予熱した室温のTMB（VWR、暗所保存）100μlを、気泡の導入を最小限にしながら、発色するまで各穴に加えた（20〜30分）。2M硫酸50μlを加えることによって反応を停止させた。分光光度計を使用して450nmでプレートを計測した。
【０２６５】
13クローンが、上記で概説した実験基準を満たすモノクローナル抗体（mAb）を産生した（9がCDs-HSDに対し、4がCDr-HSDに対して）。これらのコロニーのELISAデータを表5にまとめ、図17Aおよび17Bにグラフで示す。表8は、単一特異性CDr-HSDおよびCDs-HSDハイブリドーマのELISAスクリーニングデータを示す。コロニーごとに絶対吸光度値およびOD 450nmにおける倍率差が示されている。一次スクリーニングデータを立証するために、いくつかのクローンを増大中に再試験して、初期スクリーンからの実験観察を確証した。
【０２６６】
（表８）
2010539513.tif 000033
【０２６７】
モノクロナールハイブリドーマ系統を得るために、希釈を制限することによって各コロニーをサブクローニングした。各親コロニーに由来する得られたクローン系統を再びスクリーニングし、O.D. 450nmによってランク付けして最良クローンを決定した。上位10の抗体分泌クローンを増大させ、液体窒素貯蔵所に保管した。細胞を計数し、生存率が少なくとも80％であることを保証した。細胞を、DMEM中10％ FBSおよび10％ハイブリドーマクローニング因子（bioVeris）を含有するサブクローニング培地中、1mlあたり細胞5個で調製した（3プレートの場合、約60ml）。同じ細胞の別のセットを1mlあたり細胞約1.6個の濃度で調製した（3プレートの場合、約60ml）。96穴丸底プレート中、1穴あたり細胞200μlをプレーティングした。3枚一組のプレートが1穴あたり細胞1個を含有し、別の組が平均で3穴あたり細胞1個を含有した。10日後、細胞は目視可能であり、特異性に関してサブクローンを試験した。対象の細胞を、24穴プレート中、ハイブリドーマクローニング因子を5％含有する10％ FBS DMEM中で増大させた。
【０２６８】
各成分の重鎖および軽鎖のクラスならびに分子量を決定することによって各mAbの組成を画定した。Immunopureモノクローナル抗体アイソタイピングキットI（Pierce）を製造者の取扱説明にしたがって使用してアイソタイプ決定を実施した。重鎖および軽鎖の分子量は、Bio-RadのExperion自動化電気泳動システムを使用して決定した。Experionシステムは、ゲルベース電気泳動の多数のステップ、すなわち分離、染色、脱染、バンド検出、画像化およびデータ分析を自動的に実行する。これらの分析の結果を、CDr-HSDおよびCDs-HSD特異的モノクローナル抗体の物理的特性を示す表9に示す。重鎖および軽鎖の同定は、Immunopureモノクローナル抗体アイソタイプピングキットI（Pierce）を使用して実施し、分子量（kD単位）は、Experion自動化電気泳動システム（Bio-Rad）を使用して決定した。
【０２６９】
（表９）
2010539513.tif 000034
【０２７０】
クローンごとの特異的抗原を決定するために、各mAbをウェスタンブロッティングによって試験して、対応する抗原の分子量を確認した。反応性クローンから得られたデータを図18A〜18Cに示す。
【０２７１】
P2-10-B8-KA8に特異的な抗原を精製するために、免疫沈降を実施した。特異的抗体をGタンパク質ビーズに結合させ、それを使用して、全タンパク質6mgを含有するCDR-HSD膵臓抽出物から抗原をパニングした。エッペンドルフ管中、CDr-HSD膵臓抽出物を13,000rpmで5分間遠心分離し、抽出物の上の沈積物を除去した。ペレットのいずれをも除去することなく、抽出物6mgを三つの清浄な遠心分離管に移し、T-per緩衝液の添加によって量を1mlに調節した。管1に対し、精製P2-10-B8-KA8 100μgを希釈試料に加え、精製P2-10-B8-KA8 200μgを管2に加え、精製P2-10-B8-KA8 300μgを管3に加えた。管を4℃で一晩回転させた。
【０２７２】
Gタンパク質ビーズスラリー（1ml）をエッペンドルフ遠心器中500×gで3分間遠心分離し、予冷T-per緩衝液でビーズを1：1に希釈することによって2回洗浄した。スラリー（200μl）を、抗体・抗原混合物を含有する各管に移した。T-Per緩衝液1mlおよび抗体300μg中のスラリー200μlで管を準備することにより、対照管をセットアップした。管を4℃で2時間回転させた。その後、予冷T-per緩衝液を使用してビーズを2回洗浄し（500×gで3分間遠心分離）、上澄みを保持した。冷温PBS中で最後に一度洗浄したのち、上澄みをできるだけ除去し、2×試料緩衝液（Pierce 5×添加緩衝液：添加緩衝液200μl、還元剤100μl、水200μlで完成）100μlを加えた。試料を95℃で5分間煮沸したのち、氷上で5分間冷却した。試料を3分間スピンさせたのち、各試料を1レーンあたり20μlの量で4〜12％SDS-PAGEミニゲルに添加して電気泳動させた。
【０２７３】
沈殿後、全タンパク質に関してクマシーで染色したのち、ゲル上にいくつかのバンドが見られた。ほのかなダブレットバンドが分子量範囲70〜80kDで観察された（図19を参照）。同じmAbを用いて同様なゲルから調製されたウェスタンブロットをプローブすることにより、このダブレットが対象のバンドであることを確認した（データは示さず）。ダブレットバンドをSDS-PAGEゲルから個々に切除し、質量分析法による同定に提出した。低い方のバンドのカルネキンとしての肯定的同定が下された。カルネキンは、小胞体に関連する分子シャペロンである。
【０２７４】
カルネキンは、小胞体（ER）の90kD細胞膜内タンパク質である。大きな（50kD）N末端カルシウム結合内腔領域、一つの膜貫通らせんおよび短い（90残基）酸性細胞質テールからなる。カルネキンは、タンパク質フォールディングおよび品質管理を支援して、正しくフォールディングされ、アセンブルされたタンパク質だけが分泌経路に沿ってさらに進むことを保証する主な機能を特徴とする「シャペロン」として知られるタンパク質のファミリーに属する。カルネキンの機能は、フォールディングされていない、またはアセンブルされていないN結合糖タンパク質を小胞体中に保持することである。カルネキンは、GlcNAc2Man9Glclオリゴ糖を有するN糖タンパク質のみに結合する。三つの連続するグルコース残基を有するオリゴ糖がER中の新生タンパク質のアスパラギン残基に加えられる。カルネキンによって認識されるモノグルコシル化オリゴ糖は、二つのグルコシダーゼIおよびIIの連続作用によって二つのグルコース残基をトリミングすることから生じる。グルコシダーゼIIはまた、第三かつ最後のグルコース残基を除去することができる。糖タンパク質が正しくフォールディングされていない場合には、UGGTと呼ばれる酵素がグルコース残基をオリゴ糖に戻し、それにより、カルネキンに結合する糖タンパク質の能力を再生する。したがって、何らかの理由で正しくフォールディングすることが困難な糖タンパク質鎖はER中でぶらぶらし、MNS1（α-マンノシダーゼ）と遭遇する危険を冒し、それが最終的に、性能不十分な糖タンパク質を、そのマンノース残基を除去することによって分解に追いやる。ATPおよびCa2+が、カルネキンの基質結合に関与する補因子の二つである。図20Aおよび20Bは、対象のタンパク質をカルネキンと同定するMS分光写真の読み取りを示すスクリーンショットである。
【０２７５】
実施例4：Cohen2型糖尿病ラットからの組織中の遺伝子発現のマイクロアレイ分析
マイクロアレイデータをフェーズIおよびフェーズII分析によって分析した。フェーズIは、Gene Logicから処理済みデータに基づく。フェーズIIは、GeneSpring GXを使用するデータ分析に対応する。統計、シグナル伝達経路およびクラスタリングを含むさらなる基準を分析に使用した。
【０２７６】
Affymetrix, Inc.のMAS5.0ソフトウェアを使用して、Cohen2型糖尿病ラット（CDs-HSD、CDr-HSD）の膵臓全RNAの比較から導出されたGene Logic（フェーズI）からのマイクロアレイ結果を分析した。全体的な遺伝子発現分析は、CDr-HSD中には上方制御された1178の遺伝子があり、CDs-HSDに比較して803の遺伝子が下方制御されていることを示した。これらの転写物の多くは、2型糖尿病に関連するいくつかのシグナル伝達経路、たとえばインスリンシグナル伝達、β細胞機能不全ならびに脂質およびグルコース代謝に関与する。また、いくつかのセルピンファミリーメンバー（セリンプロテイナーゼ阻害剤）が二つのモデルで異なって発現する。表10は、3倍を超える変化が認められた、Gene Logicから導出されたデータの概要を提供する。
【０２７７】
（表１０）
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【０２７８】
チップ間比較を改善するために正規化データ（比＝転写物シグナル／対照シグナル）を使用するGeneSpring GXを使用してフェーズIIデータ分析を実施した。GeneSpring GXは、発現レベルにおける2倍または3倍の変化を示す遺伝子にしたがって遺伝子リストをフィルタリングすることを可能にする。GeneSpring GXはまた、統計学的アルゴリズム、たとえばANOVA、Post-HocテストおよびCross-Gene Error Modelingならびにクラスタリングアルゴリズム、たとえばGene Tree、K-Meansクラスタリングおよび自己組織化マップ（Self-Organizing Map）（SOM）クラスタリングを含む。GeneSpring GXはまた、当技術分野、たとえばKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（「KEGG経路」）およびGen Map Annotator and Pathway Profiler（GenMAPP）で公表されている経路と統合する能力を有する。
【０２７９】
GeneSpring GXによって分析されたマイクロアレイ結果は、二つのグループ中で3倍を超える変化を有する転写物のうち、137の転写物が0.05未満のp値を有するということを示す。これらの遺伝子は、いくつかのシグナル伝達経路、たとえばインスリンシグナル伝達経路、セルピンタンパク質ファミリー、基本代謝、膵臓機能および炎症に関与している。図21は、示差的に発現した遺伝子の散布図を示す。レベルが3倍またはそれ以上の変化を示す137の転写物が図22Bに示され、また、表11および12でグループ分けされている。
【０２８０】
（表１１）上方制御された遺伝子（合計＝101転写物）
2010539513.tif 000036
2010539513.tif 000037
2010539513.tif 000038
【０２８１】
（表１２）下方制御された遺伝子（合計＝36転写物）
2010539513.tif 000039
【０２８２】
図22Aに示されるGene Tree遺伝子クラスタリング分析は、六つの試料すべてに存在する12,729の遺伝子を示す。先に説明したように、820の遺伝子は発現における2倍の変化を示すと同時に、137の遺伝子は発現における3倍の変化を示し、かつGene Tree図が図22Bに示されている。3倍の変化を示した137の遺伝子のうち、K-Meanクラスタリング分析がこれら137の遺伝子を遺伝子間の最大類似度に基づいて五つのセットにさらに分割した（図21C）。これらの五つのセットを「アップ-1」、「アップ-2」、「アップ-3」、「アップ-4」および「アップ-5」と指定し、以下の表13〜17にまとめる。
【０２８３】
（表１３）アップ-1
2010539513.tif 000040
【０２８４】
（表１４）アップ-2
2010539513.tif 000041
【０２８５】
（表１５）アップ-3
2010539513.tif 000042
【０２８６】
（表１６）アップ-4
2010539513.tif 000043
【０２８７】
（表１７）アップ-5
2010539513.tif 000044
【０２８８】
「ダウン-1」および「ダウン-2」と呼ばれる二つのさらなるセットが、Cohen糖尿病ラット試料中で下方制御されることが、GeneSpring GX分析によって見いだされた遺伝子を表す。以下の表18および19は、「ダウン-1」および「ダウン-2」セットで得られた結果をまとめたものである。
【０２８９】
（表１８）ダウン-1
2010539513.tif 000045
【０２９０】
（表１９）ダウン-2
2010539513.tif 000046
【０２９１】
最後に、定量的RT-PCRを標準的方法にしたがって使用して、マイクロアレイによって得られた遺伝子発現分析を確証した。以下の表は、マイクロアレイ分析によって同定され、その発現における倍率変化がQ-RT-PCRによって立証された対象遺伝子の概要を提供する。
【０２９２】
（表２０）選択された遺伝子に対する定量的RT-PCR
2010539513.tif 000047
【０２９３】
CD53遺伝子によってコードされるタンパク質は、テトラスパニンファミリーとも知られる膜4回貫通スーパーファミリーのメンバーである。これらのメンバーの大部分は、四つの疎水性ドメインの存在を特徴とする細胞表面タンパク質である。これらのタンパク質は、細胞発生、活性化、成長および運動性の調節で役割を果たすシグナル変換イベントを媒介する。このコードされたタンパク質は、インテグリンと複合することが知られている細胞表面糖タンパク質である。T細胞およびナチュラルキラー細胞中のCD2生成シグナルの変換に貢献し、成長調節において役割を果たすことが示唆されている。この遺伝子の家族性欠失は、バクテリア、真菌およびウイルスによって引き起こされる再発性感染症に伴う免疫不全に関連している。選択的スプライシングが、同じタンパク質をコードする多数の転写変異体を生じさせる。CD38は、細胞および組織、特に白血球の中に広く発現する新規の多機能エクト酵素である。CD38はまた、細胞接着、シグナル変換およびカルシウムシグナル伝達において機能する。
【０２９４】
マイクロアレイおよび定量的PCR分析を適用して、通常の食事（RD）または糖尿病誘発／高ショ糖食（HSD）に暴露された二つの系統の膵臓および精巣上体脂肪組織におけるトランスクリプトーム変化を同定した。膵臓組織および内臓脂肪組織・精巣上体脂肪組織の両方が、疾病の予測、進行およびおそらくは予防において決定的な役割を果たす可能性がある遺伝子転写物を研究するのに重要な主要組織とみなされている。
【０２９５】
通常の食事（RD）および糖尿病誘発食（HSD）下の系統（CDs、CDr）それぞれからの膵臓および精巣上体脂肪組織から全RNAを抽出した。次に、30,000を超える転写物に対するオリゴヌクレオチドプローブを含むRat Expression Arrays（Affymetrix）セット230を使用してトランスクリプトームを分析した。各グループ（CDs-RD、CDs-HSD、CDr-RDおよびCDr-HSD）から3〜5匹のラットをデータ分析に使用した。GeneSpring GX（Agilent, CA）を使用して結果を分析した。また、いくつかの選択された転写物の発現をリアルタイムPCRによって確証した。
【０２９６】
まず、膵臓組織のトランスクリプトーム変化をマイクロアレイによって分析した。この実験の場合、以下のグループ：CDr-HSDおよびCDs-HSDのそれぞれからの3匹のラットを分析した。CDr-HSDおよびCDs-HSDラットにおいては、二つのグループを比較した場合、82の転写物が3倍またはそれ以上の変化を示し（表２1および22を参照）、19の転写物が下方制御され（CDr-HSDにおける発現が1/3倍またはそれ以下に低下している。表22）、かつ63の転写物が上方制御されている（CDr-HSDにおける発現が3倍またはそれ以上増大している。表21）。これらの転写物の14を選択し、発現レベルにおけるそれらの変化を定量的PCRによって確証した。定量的PCR分析は、マイクロアレイ分析によって観察された発現の変化を立証した。
【０２９７】
（表２１）CDr-HSDラットにおいて3倍増で発現した上方制御された転写物
2010539513.tif 000048
2010539513.tif 000049
【０２９８】
（表２２）CDr-HSDラットにおいて1/3倍減の発現を示す下方制御された転写物
2010539513.tif 000050
【０２９９】
また、膵臓組織で観察された変化ならびに両方法、すなわちマイクロアレイ分析および定量的PCRによるそれらの一貫性を考慮して、Cohen糖尿病ラットの四つのグループすべてに関して精巣上体脂肪組織におけるトランスクリプトームレベルの変化を分析した。グループ間の比較が、2型糖尿病の素因、進行および耐性に使用されるバイオマーカーの発見につながることができる。たとえば、CDr-RD対CDs-RDの比較は、2型糖尿病の素因を示すことができ、CDs-RD対CDs-HSDの比較は、疾病の進行のモデルとして働くことができ、CDr-HSD対CDs-HSDの比較は、2型糖尿病の発症に対する耐性のためのモデルとして使用することができる。
【０３００】
上述のグループそれぞれからの5匹の動物からの組織試料を分析し、結果を本明細書にまとめる。200の転写物（80の既知の転写物および120の未知の転写物）が、2型糖尿病を発症するグループであるCDs-HSDグループだけで発現した。バックグラウンドノイズよりも有意に大きいシグナル強さ（任意の蛍光単位）を有する25の転写物を表23にリストする。
【０３０１】
（表２３）CDs-HSDラットのみで発現した転写物
2010539513.tif 000051
【０３０２】
三つのグループの間での比較の結果を以下の表24に示す。モデルごとに示差的に発現した遺伝子の中にいくつか共通の転写物がある。
【０３０３】
（表２４）精巣上体脂肪組織におけるマイクロアレイ分析の結果
2010539513.tif 000052
【０３０４】
表25は、耐性および進行モデル中で示差的に発現した共通および固有の転写物の結果をまとめたものである。
【０３０５】
（表２５）モデルごとに示差的に発現した共通および固有の転写物
2010539513.tif 000053
【０３０６】
これら二つのモデルに関して共通の48の転写物を表26にリストする。
【０３０７】
（表２６）進行モデルおよび耐性モデル中で示差的に発現した共通の転写物
2010539513.tif 000054
2010539513.tif 000055
2010539513.tif 000056
【０３０８】
発現における3倍またはそれ以上の変化を示す固有の転写物を表27にリストする。これらの転写物は、発現レベルの変化が前記モデルの一つの中でのみ認められるという意味で固有であり、そのようなものとして、2型糖尿病に対する耐性またはその病気の進行および素因をさらに研究するためのマーカーとして働くことができる。
【０３０９】
（表２７）3倍を超える変化を有する精巣上体脂肪組織中に見いだされた固有の転写物（付表IV）
2010539513.tif 000057
2010539513.tif 000058
【０３１０】
要するに、Cohenラットモデルに関して膵臓および精巣上体脂肪組織に対してトランスクリプトーム／遺伝子発現分析を実施した。両組織で示差的に発現した転写物が上記のように特性決定された。選択された転写物（膵臓組織の場合の14の転写物および精巣上体脂肪組織の場合の48の転写物）に関して、マイクロアレイ結果は定量的PCRによって確証された。
【０３１１】
本発明をその詳細な説明に関連して説明したが、前記説明は、本発明を例示するためのものであり、請求の範囲によって画定される本発明の範囲を限定するものではないことが理解されると考えられる。他の局面、利点および改変が以下の請求の範囲に入る。
【図１】
2010539513.tif 000060
【図２Ａ】
2010539513.tif 000061
【図２Ｂ】
2010539513.tif 000062
【図３Ａ】
2010539513.tif 000063
【図３Ｂ】
2010539513.tif 000064
【図３Ｃ】
2010539513.tif 000065
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2010539513.tif 000067
【図５Ａ】
2010539513.tif 000068
【図５Ｂ】
2010539513.tif 000069
【図６】
2010539513.tif 000070
【図７】
2010539513.tif 000071
【図８】
2010539513.tif 000072
【図９】
2010539513.tif 000073
【図１０】
2010539513.tif 000074
【図１１】
2010539513.tif 000075
【図１２Ａ】
2010539513.tif 000076
【図１２Ｂ】
2010539513.tif 000077
【図１３】
2010539513.tif 000078
【図１４】
2010539513.tif 000079
【図１５】
2010539513.tif 000080
【図１６Ａ】
2010539513.tif 000081
【図１６Ｂ】
2010539513.tif 000082
【図１７Ａ】
2010539513.tif 000083
【図１７Ｂ】
2010539513.tif 000084
【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
2010539513.tif 000087
【図１９】
2010539513.tif 000088
【図２０Ａ】
2010539513.tif 000089
【図２０Ｂ】
2010539513.tif 000090
【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【配列表】
2010539513000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月10日(2010.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a. 被験体から得られた試料中の表23における転写物から選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定する段階; ならびに
b. 段階(a)における少なくとも1つのバイオマーカーの量を基準値と比較する段階であって、基準値と比較した少なくとも1つのバイオマーカーの量の増加が、2型糖尿病を被験体が有していることを示す段階
を含む、被験体における2型糖尿病を診断するための方法。
【請求項２】
a. 被験体から得られた試料中の表21または表22における転写物から選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定する段階; ならびに
b. 段階(a)における少なくとも1つのバイオマーカーの量を基準値と比較する段階であって、基準値と比較した表21における転写物から選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量の増加または表22における転写物から選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量の減少が、2型糖尿病の発症に被験体が抵抗性であることを示す段階
を含む、2型糖尿病の発症に対する被験体の抵抗性を決定するための方法。
【請求項３】
基準値が、指数値、1つもしくは複数の糖尿病リスク予測アルゴリズムもしくは計算指数から導出した値、2型糖尿病もしくは前糖尿病状態に罹患していない被験体から導出した値、2型糖尿病もしくは前糖尿病状態と診断されたまたはそれらに罹患していると特定された被験体から導出した値、あるいは2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症と以前に診断されたまたはそれらに罹患していると以前に特定された被験体から導出した値を含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
被験体が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を有すると以前に診断されているもの、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を有すると以前に診断されていないもの、あるいは2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態について無症候性であるものを含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項５】
a. 第1期間の被験体由来の第1試料中の表26における転写物から選択されるバイオマーカーの有効量を検出する段階;ならびに
b. 第2期間の被験体由来の第2試料中の段階(a)からのバイオマーカーの有効量を検出する段階; ならびに
c. 段階(a)で検出したバイオマーカーの量を、段階(b)で検出した量または基準値と比較する段階
を含む、被験体における2型糖尿病の進行をモニタリングする方法。
【請求項６】
モニタリングが、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するリスクの変化の評価を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
被験体が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置を以前に受けたもの、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置を以前に受けていないもの、あるいは2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と以前に診断されていないまたはそれらに罹患していると以前に特定されていないものを含む、請求項5記載の方法。
【請求項８】
第1試料が、2型糖尿病の処置を受ける前に、被験体から採取される、請求項5記載の方法。
【請求項９】
第2試料が、2型糖尿病の処置を受けた後に、被験体から採取される、請求項5記載の方法。
【請求項１０】
第1試料が、前糖尿病状態を有する被験体から採取される、請求項5記載の方法。
【請求項１１】
モニタリングが、被験体のための処置計画の選択、ならびに/あるいは2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態のための処置計画の有効性のモニタリングをさらに含む、請求項5記載の方法。
【請求項１２】
2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置が、運動計画、食事補充物、外科的介入、糖尿病調節剤、またはそれらの組み合わせを含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
基準値が、指数値、1つもしくは複数の糖尿病リスク予測アルゴリズムもしくは計算指数から導出した値、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態に罹患していない被験体から導出した値、あるいは2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と診断されたまたはそれらに罹患していると特定された被験体から導出した値を含む、請求項5記載の方法。
【請求項１４】
a. 第1期間の被験体由来の第1試料中に表23における転写物から選択される少なくとも1つのバイオマーカーの有効量を検出する段階; ならびに
b. 段階(a)で検出した少なくとも1つのバイオマーカーの量が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するリスクの低い1個体または複数個体の被験体で測定した基準値、あるいは1つまたは複数の糖尿病調節剤による処置の結果として糖尿病リスク因子の改善を示す1個体または複数個体の被験体で測定した基準値に戻るまで、被験体を1つまたは複数の糖尿病調節剤によって処置する段階
を含む、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と診断されたまたはそれらに罹患していると特定された被験体を処置する方法。
【請求項１５】
1つまたは複数の糖尿病調節剤が、スルホニル尿素、ビグアナイド、インスリン、インスリン類似体、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体-γ(PPAR-γ)アゴニスト、二重作用性PPARアゴニスト、インスリン分泌促進物質、グルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)の類似体、ジペプチジルペプチダーゼIVの阻害剤、膵臓リパーゼ阻害剤、α-グルコシダーゼ阻害剤、またはそれらの組み合せを含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
1つまたは複数の糖尿病調節剤による処置の結果としての糖尿病リスク因子の改善が、肥満度指数(BMI)の低下、血中グルコースレベルの低下、インスリンレベルの上昇、HDLレベルの上昇、収縮期および/または拡張期血圧の低下、あるいはそれらの組み合わせを含む、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
ヒト定常領域、および表21、22、23または26における転写物から選択される1種もしくは複数種のバイオマーカーに結合する抗原結合領域を含む、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
組換え体である、請求項17記載の単離抗体。
【請求項１９】
T2DBマーカー検出試薬が請求項17記載の単離抗体を含む、以下を含むキット：
表21、22、23または26における転写物から選択される少なくとも1つのバイオマーカーを検出するT2DBマーカー検出試薬、正常グルコースレベルを有する被験体から得た試料、ならびに任意で請求項1、5および14のいずれか一項記載の方法において該試薬を使用するための説明書。
【請求項２０】
検出試薬が、1つもしくは複数の抗体もしくはその断片、1つもしくは複数のアプタマー、1つもしくは複数のオリゴヌクレオチド、またはその組み合わせをさらに含む、請求項19記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるものと考えられ、それらにより包含される。
[請求項101]
a. 被験体由来の試料中のセルピナ(Serpina)3Mまたはその代謝産物および任意で1種または複数種のさらなるT2DBマーカーの有効量を測定する段階; ならびに
b. 該量を基準値と比較する段階であって、基準値に対するセルピナ3Mおよび任意で1種または複数種のT2DBマーカーの量の増加または減少が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態に被験体が罹患していることを示す段階
を含む、被験体における2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を診断または特定する方法。
[請求項102]
基準値が、指数値、1つもしくは複数の糖尿病リスク予測アルゴリズムもしくは計算指数から導出した値、2型糖尿病もしくは前糖尿病状態に罹患していない被験体から導出した値、2型糖尿病もしくは前糖尿病状態と診断されたまたはそれらに罹患していると特定された被験体から導出した値、あるいは2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症と以前に診断されたまたはそれらに罹患していると以前に特定された被験体から導出した値を含む、請求項101記載の方法。
[請求項103]
被験体が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を有すると以前に診断されているもの、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を有すると以前に診断されていないもの、あるいは2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態について無症候性であるものを含む、請求項101記載の方法。
[請求項104]
a. 第1期間の被験体由来の第1試料中のセルピナ3Mおよび任意で1種または複数種のさらなるT2DBマーカーの有効量を検出する段階;
b. 第2期間の被験体由来の第2試料中のセルピナ3Mおよび任意で1種または複数種のさらなるT2DBマーカーの有効量を検出する段階; ならびに
c. 段階(a)で検出したセルピナ3Mおよび任意で1種または複数種のT2DBマーカーの量を、段階(b)で検出した量または基準値と比較する段階
を含む、被験体における2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の進行をモニタリングする方法。
[請求項105]
モニタリングが、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するリスクの変化の評価を含む、請求項104記載の方法。
[請求項106]
被験体が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置を以前に受けたもの、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置を以前に受けていないもの、あるいは2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と以前に診断されていないまたはそれらに罹患していると以前に特定されていないものを含む、請求項104記載の方法。
[請求項107]
第1試料が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置を受ける前に、被験体から採取される、請求項104記載の方法。
[請求項108]
第2試料が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置を受けた後に、被験体から採取される、請求項104記載の方法。
[請求項109]
モニタリングが、被験体のための処置計画の選択、ならびに/あるいは2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態のための処置計画の有効性のモニタリングをさらに含む、請求項104記載の方法。
[請求項110]
2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態の処置が、運動計画、食事補充物、外科的介入、糖尿病調節剤、またはそれらの組み合わせを含む、請求項109記載の方法。
[請求項111]
基準値が、指数値、1つもしくは複数の糖尿病リスク予測アルゴリズムもしくは計算指数から導出した値、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態に罹患していない被験体から導出した値、あるいは2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と診断されたまたはそれらに罹患していると特定された被験体から導出した値を含む、請求項104記載の方法。
[請求項112]
a. 第1期間の被験体由来の第1試料中に存在するセルピナ3Mまたはその代謝産物および任意で1種または複数種のさらなるT2DBマーカーの有効量を検出する段階; ならびに
b. セルピナ3Mおよび任意で1種もしくは複数種のT2DBマーカーまたはその代謝産物の量が、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態を発症するリスクの低い1個体または複数個体の被験体で測定した基準値、あるいは1つまたは複数の糖尿病調節剤による処置の結果として糖尿病リスク因子の改善を示す1個体または複数個体の被験体で測定した基準値に戻るまで、被験体を1つまたは複数の糖尿病調節剤によって処置する段階
を含む、2型糖尿病、2型糖尿病に関連する1つもしくは複数の合併症または前糖尿病状態と診断されたまたはそれらに罹患していると特定された被験体を処置する方法。
[請求項113]
1つまたは複数の糖尿病調節剤が、スルホニル尿素、ビグアナイド、インスリン、インスリン類似体、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体-γ(PPAR-γ)アゴニスト、二重作用性PPARアゴニスト、インスリン分泌促進物質、グルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)の類似体、ジペプチジルペプチダーゼIVの阻害剤、膵臓リパーゼ阻害剤、α-グルコシダーゼ阻害剤、またはそれらの組み合せを含む、請求項112記載の方法。
[請求項114]
1つまたは複数の糖尿病調節剤による処置の結果としての糖尿病リスク因子の改善が、肥満度指数(BMI)の低下、血中グルコースレベルの低下、インスリンレベルの上昇、HDLレベルの上昇、収縮期および/または拡張期血圧の低下、あるいはそれらの組み合わせを含む、請求項112記載の方法。
[請求項115]
ヒト定常領域、および1種もしくは複数種のT2DBマーカーまたはその代謝産物に結合する抗原結合領域を含む、単離抗体またはその抗原結合断片。
[請求項116]
抗原結合領域が、配列番号:1の1つまたは複数のアミノ酸残基に結合する、請求項115記載の単離抗体。
[請求項117]
組換え体である、請求項115記載の単離抗体。
[請求項118]
T2DBマーカー検出試薬が請求項115記載の単離抗体を含む、以下を含むキット:
セルピナ3Mおよび任意で1種または複数種のT2DBマーカーを検出するT2DBマーカー検出試薬、正常グルコースレベルを有する被験体から得た試料、ならびに任意で請求項101、104および112のいずれか一項記載の方法において該試薬を使用するための説明書。
[請求項119]
検出試薬が、1つもしくは複数の抗体もしくはその断片、1つもしくは複数のアプタマー、1つもしくは複数のオリゴヌクレオチド、またはその組み合わせをさらに含む、請求項118記載のキット。
【国際調査報告】
2010539513.tif 000095
2010539513.tif 000096
2010539513.tif 000097