(57)【要約】  本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質のレベルを決定することによりＢ型肝炎ウイルスを検出するための方法に関する。本発明はまた、突然変異Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質を検出するための方法、およびＢ型肝炎ウイルスを検出するためのキットに関する。
2010539488.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）試験サンプルを準備し、
（ｂ）中Ｂ型肝炎表面タンパク質（Ｍ−ＨＢｓＡｇ）／第１抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下、該試験サンプルを第１抗体と接触させることを含んでなり、該複合体の存在が、該サンプル中に存在するＢ型肝炎の検出を示す、試験サンプル中のＢ型肝炎を検出するための方法。
【請求項２】
Ｍ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１−５５が、第１抗体により認識されるエピトープを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１抗体が小Ｂ型肝炎表面タンパク質（Ｓ−ＨＢｓＡｇ）と交差反応しない、請求項２記載の方法。
【請求項４】
小Ｂ型肝炎表面タンパク質（Ｓ−ＨＢｓＡｇ）／第２抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下、該試験サンプルを第２抗体と接触させる工程を更に含み、該複合体の存在が、該試験サンプル中に存在するＢ型肝炎の検出を示す、請求項１記載の方法。
【請求項５】
Ｓ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１００−１６０が、第２抗体により認識されるエピトープを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
（ａ）試験サンプルを準備し、
（ｂ）中Ｂ型肝炎表面タンパク質（Ｍ−ＨＢｓＡｇ）／第１抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下、該試験サンプルを第１抗体と接触させ、
（ｃ）小Ｂ型肝炎表面タンパク質（Ｓ−ＨＢｓＡｇ）／第２抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下、該試験サンプルを第２抗体と接触させ、
（ｄ）Ｍ−ＨＢｓＡｇ／第１抗体複合体のレベルをＳ−ＨＢｓＡｇ／第２抗体複合体のレベルと比較することを含んでなり、Ｍ−ＨＢｓＡｇ／第１抗体複合体と比べて低い、Ｓ−ＨＢｓＡｇ／第２抗体複合体のレベルが、該試験サンプル中の突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇの検出を示す、試験サンプル中の突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇを検出するための方法。
【請求項７】
Ｍ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１−５５が、第１抗体により認識されるエピトープを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
第１抗体が小Ｂ型肝炎表面タンパク質（Ｓ−ＨＢｓＡｇ）と交差反応しない、請求項６記載の方法。
【請求項９】
Ｓ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１００−１６０が、第２抗体により認識されるエピトープを含む、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）試験サンプルを準備し、
（ｂ）小Ｂ型肝炎表面タンパク質（Ｓ−ＨＢｓＡｇ）／第１抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下、該試験サンプルを第１抗体と接触させることを含んでなり、対照と比べて低い、Ｓ−ＨＢｓＡｇ／抗体複合体のレベルが、該試験サンプル中の突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇの検出を示す、試験サンプル中の突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇを検出するための方法。
【請求項１１】
第１抗体が突然変異小Ｂ型肝炎表面タンパク質（Ｓ−ＨＢｓＡｇ）と交差反応しない、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）小Ｂ型肝炎表面タンパク質（Ｓ−ＨＢｓＡｇ）／第２抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下、該試験サンプルを第２抗体と接触させ、
（ｂ）Ｓ−ＨＢｓＡｇ／第１抗体複合体のレベルをＳ−ＨＢｓＡｇ／第２抗体複合体のレベルと比較する工程を更に含み、第２抗体により検出されたＳ−ＨＢｓＡｇのレベルに対する、第１抗体により検出されたＳ−ＨＢｓＡｇのレベルの比における、所定の比と比較した場合の相違が、該試験サンプル中の突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇの検出を示しうる、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）Ｍ−ＨＢｓＡｇに結合する少なくとも１つの抗体、および
（ｂ）Ｓ−ＨＢｓＡｇに結合する少なくとも１つの抗体を含んでなる、Ｂ型肝炎を検出するためのキット。
【請求項１４】
Ｍ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１−５５が、（ａ）の少なくとも１つの抗体により認識されるエピトープを含む、請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
前記の少なくとも１つの抗体がＳ−ＨＢｓＡｇと交差反応しない、請求項１３記載のキット。
【請求項１６】
Ｓ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１００−１６０が、（ｂ）の少なくとも１つの抗体により認識されるエピトープを含む、請求項１３記載のキット。
【請求項１７】
該Ｂ型肝炎の検出のための説明を更に含む、請求項１３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＢ型肝炎ウイルス抗原の検出方法およびそれに関連したキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は世界中で２０億人に感染していると推定されている。ＨＢＶは、軽度の無症状感染から慢性で活発な劇症肝炎まで、種々の病態を引き起こすことが公知である。４億人を超える人々、特に小児および高齢者が、ＨＢＶに慢性感染している。Ｂ型肝炎ウイルスはエイズウイルスより１００倍強い感染性を有するが、それはワクチン接種で予防可能である。ＨＢＶ感染を抑制するための中心的な方法は一般的ワクチン接種ならびに感染個体の初期検出および治療である。したがって、ＨＢＶの診断アッセイは、改良された及び正確なＨＢＶウイルス抗原検出に焦点が合わされている。
【０００３】
ＨＢＶゲノムは、少なくとも５つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする約３２００塩基対の環状部分的二本鎖ＤＮＡ配列である（Ｔｉｏｌｌａｉｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：４８９−４９５（１９８５））。４つの遺伝子（ポリメラーゼ（Ｐ）、表面（Ｓ）、コア（Ｃ）および（Ｘ））が存在し、ポリメラーゼ遺伝子は表面遺伝子と重複しており、Ｘおよびコア遺伝子とも部分的に重複している。これらの４つの遺伝子は７つのタンパク質を産生し、表面遺伝子の産物は、異なる開始部位を有するが同じ終結部位を有する３つのタンパク質よりなる。したがって、これらの３つのタンパク質（すなわち、小（Ｃ）、中（Ｍ）および大（Ｌ））表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は２２６アミノ酸のＳ−ＨＢｓＡｇ遺伝子配列を含有する（Ｇｅｒｌｉｃｈら．ｉｎ  Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら編，Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｗｉｌｋｅｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ｐ．１２１−１３４（１９９１））。Ｍ−ＨＢｓＡｇは５５アミノ酸のＰｒｅＳ２配列および全長２８１アミノ酸のＳ配列を含有する。Ｌ−ＨＢｓＡｇタンパク質は１０８アミノ酸のＰｒｅＳ１配列＋ＰｒｅＳ２および全長３８９アミノ酸のＳ配列を含有する。また、３つのエンベロープタンパク質のそれぞれは種々の度合のグリコシル化を示す。これらの３つのタンパク質は、Ｓ−ＨＢｓＡｇが全タンパク質の約９５％を構成する種々の比で発現され、ＨＢＶビリオンの外カプシドを形成するよう集合する（図１および図２を参照されたい）。Ｌ−ＨＢｓＡｇ、Ｍ−ＨＢｓＡｇおよびＳ−ＨＢｓＡｇは、不完全ウイルス粒子をも産生するよう同様の形態で集合する。ＨＢＶ表面抗原アッセイはビリオンおよび粒子の両方の形態学的形態を検出する。
【０００４】
コア遺伝子は、ヌクレオカプシドタンパク質であるＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）をコードしている。コア遺伝子の直上流にはプレコア領域が存在する。プレコア領域の最初の１９アミノ酸は、プレコア遺伝子産物であるＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）の膜トランスロケーションおよび最終的な分泌のためのシグナルとして働く。
【０００５】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と同様に、ＨＢＶは複製周期の必須段階として逆転写酵素（ＲＴ）を用いる。しかし、ＲＴは不十分なプルーフリーディング能しか有さないため、ヌクレオチドの過誤取り込みが高率で生じる。この誤りがちな複製は、コピーされる１０００〜１００，０００ヌクレオチド当たり１点の置換、欠失または挿入を招く、と計算は示唆している（Ｃａｒｍａｎら，Ｌａｎｃｅｔ  ３４１：３４９−３５３（１９９３））。ＨＢＶ表面抗原における可変性は古典的なサブタイプ決定研究により最初に記載された（Ｃｏｕｒｏｕｃｅら，Ｂｉｂｌｉｏｔｈｅｃａ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ４２：１（１９７６））。複製変異から生じたと考えられる、ＨＢＶの８つの公知遺伝子型が存在する（Ｎｏｒｄｅｒら，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４７：２８９−３０９（２００４））。
【０００６】
ＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２ならびにＳ「ａ」決定基を含むＨＢＶエンベロープ領域はウイルス粒子の表面に露出しており、したがって、免疫監視の標的であると予想される（Ｇｅｒｌｉｃｈら，前掲）。既に記載されている幾つかの表面抗原突然変異体は、共通および群特異的決定基の両方を含有する「ａ」決定基の抗原性に対して有意な影響を及ぼしている（Ｃａｒｍａｎら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０２：７１１−７１９（１９９２））。「ａ」決定基はＳ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１００〜１６０に位置し、複合的コンホメーションエピトープを与え、これは、高度に保存されたシステイン残基の間のジスルフィド結合により安定化される。「ａ」決定基の免疫反応性は、環状合成ペプチドを使用して部分的に模倣されうる。さらに、「ａ」決定基は、伝統的には、ポリクローナル抗血清に対する反応性により定められていたが、モノクローナル抗体の使用は、「ａ」決定基が、少なくとも５つの部分的に重複するエピトープよりなることを示している（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：９２０−９２７（１９８４））。文献に記載されている最も一般的な表面抗原突然変異体は、Ｓ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１４５位のグリシンをアルギニンで置換する単一ヌクレオチド置換（Ｇ−Ｒ  １４５）である。このＧ−Ｒ  １４５突然変異は、全てではないが幾つかの「ａ」決定基エピトープを破壊する。
【０００７】
また、「ａ」決定基における他の突然変異はサブタイプまたはタイプ特異的決定基ｙ／ｄおよびｗ／ｒの喪失を招く。また、ＰｒｅＳ１／ＰｒｅＳ２領域における全体的な欠失および点突然変異の出現は、該表面遺伝子の産物が慢性感染患者においては免疫選択下にあることを示唆している。さらに、Ｓ、ＣまたはＰ遺伝子内の欠失のために複製不可能なＨＢＶ突然変異体がＨＢＶ保有者からの血漿中で認められている。全ては、複製適格性であるＨＢＶ形態と共存している。
【０００８】
Ｏｋａｍｏｔｏらは、血漿または無症候保有者に由来するＰｒｅＳ／Ｓ、ＣおよびＰ遺伝子において全体的な欠失を有する突然変異ゲノムが肝細胞癌細胞での一過性発現系において相補されうることを示している（Ｏｋａｍｏｔｏら，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２：２６４−２６８（１９９２））。実際、欠陥干渉粒子として作用するＨＢＶ突然変異体は野生型ウイルスの複製を弱め、それにより、感染持続の維持を助けうることが示唆されている。
【０００９】
したがって、ＨＢＶは、Ｓ−ＨＢｓＡｇを含む表面タンパク質における突然変異により、免疫監視およびワクチン接種法を逃れうる。さらに、ＨＢＶ検出の幾つかの方法は、Ｓ−ＨＢｓＡｇ抗体を使用することによりエンベロープタンパク質内のエピトープをモニターすることに依存したものであるため、高度に突然変異したＨＢＶは検出をも逃れうる。したがって、ＨＢＶを検出するための方法および組成物が当技術分野において依然として必要とされている。
【００１０】
全ての米国特許および刊行物の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｔｉｏｌｌａｉｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：４８９−４９５（１９８５）
【非特許文献２】Ｇｅｒｌｉｃｈら．ｉｎ  Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ
【非特許文献３】Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら編，Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｗｉｌｋｅｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ｐ．１２１−１３４（１９９１）
【非特許文献４】Ｃａｒｍａｎら，Ｌａｎｃｅｔ  ３４１：３４９−３５３（１９９３）
【非特許文献５】Ｃｏｕｒｏｕｃｅら，Ｂｉｂｌｉｏｔｈｅｃａ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ４２：１（１９７６）
【非特許文献６】Ｎｏｒｄｅｒら，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４７：２８９−３０９（２００４）
【非特許文献７】Ｃａｒｍａｎら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０２：７１１−７１９（１９９２）
【非特許文献８】Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：９２０−９２７（１９８４）
【非特許文献９】Ｏｋａｍｏｔｏら，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２：２６４−２６８（１９９２）
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、サンプルを準備し、該サンプルを中Ｂ型肝炎表面タンパク質（「Ｍ−ＨＢｓＡｇ」）に対する第１抗体と、Ｍ−ＨＢｓＡｇ／第１抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で接触させることを含みうる、サンプル中のＢ型肝炎の野生型または突然変異形態を検出するための方法を提供する。Ｍ−ＨＢｓＡｇ／第１抗体複合体の特定は該サンプル中のＢ型肝炎の検出の指標となりうる。第１抗体はＳ−ＨＢｓＡｇとは交差反応し得ない。Ｍ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１−５５は、第１抗体により認識されるエピトープを含みうる。小Ｂ型肝炎表面タンパク質（「Ｓ−ＨＢｓＡｇ」）に結合しうる第２抗体も、サンプル中のＢ型肝炎の存在を判定するために、Ｓ−ＨＢｓＡｇ／第２抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で使用されうる。Ｓ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１００−１６０は、第２抗体により認識されるエピトープを含む。第２抗体は第１抗体と組合せて使用されうる。
【００１３】
本発明においてはまた、サンプル中の突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇを検出するための第１方法を提供する。サンプル中のＭ−ＨＢｓＡｇ／第１抗体複合体およびＳ−ＨＢｓＡｇ／第２抗体複合体のレベルを決定し、比較することが可能である。Ｍ−ＨＢｓＡｇに結合しうる第１抗体は、Ｍ−ＨＢｓＡｇのレベルを決定するために用いられうる。Ｓ−ＨＢｓＡｇに結合しうる第２抗体は、Ｓ−ＨＢｓＡｇのレベルを決定するために用いられうる。Ｍ−ＨＢｓＡｇ／第１抗体複合体と比べて低い、Ｓ−ＨＢｓＡｇ／第２抗体複合体のレベルの特定は、サンプル中の突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇの指標となりうる。第１抗体はＳ−ＨＢｓＡｇとは交差反応し得ない。Ｍ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１−５５は、第１抗体により認識されるエピトープを含みうる。Ｓ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１００−１６０は、第２抗体により認識されるエピトープを含みうる。
【００１４】
本発明は、サンプルを準備し、該サンプルをＳ−ＨＢｓＡｇに対する抗体と接触させることを含みうる、サンプル中の突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇを検出するための第２方法を提供する。対照と比べて低い、抗体／Ｓ−ＨＢｓＡｇ複合体のレベルの特定は、サンプル中の突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇの指標となりうる。
【００１５】
該方法は更に、サンプル中のＨＢｓＡｇの野生型または突然変異形態のレベルを決定するためのもう１つの方法を含みうる。該方法は、サンプルを準備し、Ｓ−ＨＢｓＡｇ／第１抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で接触させることを含むことが可能であり、それは、ＨＢｓＡｇのレベルを決定するために用いられうる。第１抗体はＳ−ＨＢｓＡｇの突然変異形態を認識し得ず、対照と比べて低い、Ｓ／ＨＢｓ／第１抗体複合体のレベルは、サンプル中の突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇの検出を示す。該方法は更に、試験サンプルを準備し、Ｓ−ＨＢＡｇ／第２抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でＳ−ＨＢｓＡｇに結合しうる第２抗体を接触させることを含むことが可能であり、それは、Ｓ−ＨＢｓＡｇのレベルを決定するために用いられうる。第２抗体により検出されたＳ−ＨＢｓＡｇのレベルに対する、第１抗体により検出されたＳ−ＨＢｓＡｇのレベルの比における、所定の比レベルと比較した場合の相違は、試験サンプル中の突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇの検出を示しうる。
【００１６】
本発明は更に、Ｂ型肝炎を検出するためのキットを提供する。該キットは、Ｍ−ＨＢｓＡｇに結合しうる少なくとも１つの抗体と、Ｓ−ＨＢｓＡｇに結合しうる少なくとも１つの抗体とを含みうる。Ｍ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１−５５は、Ｍ−ＨＢｓＡｇに結合しうる少なくとも１つの抗体により認識されるエピトープを含みうる。Ｍ−ＨＢｓＡｇと交差反応する抗体はＳ−ＨＢｓＡｇとは交差反応し得ない。Ｓ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１００−１６０は、Ｍ−ＨＢｓＡｇに結合しうる少なくとも１つの抗体により認識されるエピトープを含みうる。Ｓ−ＨＢｓＡｇと交差反応する抗体はＭ−ＨＢｓＡｇとは交差反応し得ない。
【００１７】
詳細な説明
本発明者らは、Ｍ−ＨＢｓＡｇを検出する抗ＨＢｓのみ、またはＳ−ＨＢｓＡｇを検出抗ＨＢｓとの組合せが、ＨＢＶ感染を診断する、より高感度かつ正確な手段を提供するという驚くべき発見をなした。Ｍ−ＨＢｓＡｇはカプシド全タンパク質のごく一部を構成するに過ぎないため、これは特に重要である。ＨＢＶを検出するための現在利用可能な方法は、より多量のＳ−ＨＢｓＡｇのみに対する抗ＨＢｓを利用することにより達成される。しかし、これらの抗ＨＢｓ抗体試薬を使用する幾つかの商業的に入手可能なアッセイは、他の手段により検出可能なＨＢＶ感染が判明しているにもかかわらず、患者によってはＳ−ＨＢｓＡｇを検出し得ないことが見出されている。この偽陰性結果は、Ｓ−ＨＢｓＡｇ配列を改変する１つの突然変異または一連の突然変異をそのＨＢＶ株が含有するため、該キット試薬がＳ−ＨＢｓＡｇを検出し得ないことによるものであろう。これらの突然変異は、抗ＨＢｓモノクローナル抗体試薬が、もはや、ＨＢＶ感染を検出できなくなるよう、Ｓ−ＨＢｓＡｇエピトープに影響を及ぼしうる（Ｃｏｌｅｍａｎら，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．５９：１９−２４（１９９９））。エピトープの改変はＳ−ＨＢｓＡｇに局在化しており、Ｍ−ＨＢｓＡｇドメインに有意には伸長していない。
【００１８】
１．定義
本明細書中で用いる用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであるに過ぎず、限定的なものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる単数形表現は、文脈に明らかに矛盾しない限り、複数形の対象物を含む。
【００１９】
本明細書における数的範囲の記載に関しては、同程度の精度を伴うその間に介在する各数字が明示的に想定される。例えば、６〜９の範囲の場合には、６および９に加えて、７および８の数字が想定され、６．０〜７．０の範囲の場合には、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０の数字が明示的に想定される。
【００２０】
ａ．抗体
本明細書中で用いる「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＦの抗体またはそれらのフラグメントもしくは誘導体、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄおよび一本鎖抗体、ジアボディ、二重特異性抗体、二官能性抗体ならびにそれらの誘導体を意味しうる。抗体は、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対する十分な結合特異性を示すモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティ精製抗体またはそれらの混合物でありうる。ポリクローナル抗体は、哺乳動物、例えばヒト、ヤギ、ウサギまたはヒツジに由来するものでありうる。抗体はまた、キメラ抗体でありうる。抗体は、当技術分野で公知の１以上の化学的部分、ペプチド部分またはポリペプチド部分の結合により誘導体化されうる。抗体は化学的部分にコンジュゲート化されうる。抗体は特異的結合メンバーでありうる。
【００２１】
ｂ．結合
ポリペプチドおよび固体支持体に言及するために本明細書中で用いる「結合」または「固定化」は、該ポリペプチドおよび該固体支持体の間の結合が、結合、洗浄、分析および除去の条件下で安定であるために十分なものであることを意味しうる。該結合は共有結合または非共有結合でありうる。共有結合は該ポリペプチドと該固体支持体との間で直接的に形成されることが可能であり、あるいは架橋剤により、または固体支持体もしくはプローブもしくはその両方の分子上に特異的反応性基を含有させることにより形成されうる。非共有結合は静電性、親水性および疎水性相互作用の１以上でありうる。非共有結合に含まれるのは、該支持体への例えばストレプトアビジンのような分子の共有結合、および該ストレプトアビジンへのビオチン化ポリペプチドの非共有結合である。固定化は共有的相互作用と非共有的相互作用との組合せを含みうる。
【００２２】
ｃ．エピトープ
本明細書中で用いる「エピトープ」または「抗原」はポリペプチドの抗原決定基を意味しうる。エピトープは、該エピトープに特有の空間的コンホメーションにおける３アミノ酸を含みうる。エピトープは少なくとも５、６、７、８，９または１０アミノ酸を含みうる。空間的コンホメーションの検査方法は当技術分野で公知であり、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴を包含する。
【００２３】
ｄ．断片
本明細書中で用いる「断片」は、言及されているペプチドまたはポリペプチドの一部分を意味しうる。
【００２４】
ｅ．同一
２以上のポリペプチド配列の文脈において本明細書中で用いる「同一」または「同一性」は、それらの配列が、特定された領域にわたって同一である特定された割合（％）の残基を有することを意味しうる。該割合は、２つの配列を最適に整列させ、特定された領域にわたってそれらの２つの配列を比較し、同一残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得、一致した位置の数を、特定された領域における位置の総数で割り算し、その結果に１００を掛け算して、配列同一性の割合（％）を得ることにより計算されうる。それらの２つの配列が、異なる長さのものである場合、または該整列（アライメント）が１以上の食い違った末端を与え、特定された比較領域が単一の配列のみを含む場合には、単一配列の残基を該計算の分母には含め分子には含めない。
【００２５】
ｆ．指示試薬
本明細書中で用いる「指示試薬」は、特定のポリペプチドに対する特異的結合メンバーにコンジュゲート化または結合されうる、外的手段により検出可能な測定可能なシグナルを生成しうる標識を含む組成物でありうる。該指示試薬は、特定のポリペプチドに対する特異的結合ペアの抗体メンバーでありうる。該指示試薬は、いずれかの特異的結合ペア（例えばハプテン−抗ハプテン系、例えばビオチンまたは抗ビオチン、アビジンまたはビオチン、炭水化物またはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターまたは受容体分子、酵素補因子および酵素、または酵素インヒビターおよび酵素）のメンバーであることも可能である。
【００２６】
ｇ．標識
本明細書中で用いる「標識」または「検出可能な標識」は、それが結合している分子の直接的または間接的な定量的または相対的測定を可能にするシグナルを生成しうる部分を意味しうる。該標識は固体、例えばマイクロタイタープレート、粒子、微粒子または顕微鏡スライド；酵素；酵素基質；酵素インヒビター；補酵素；酵素前駆体；アポ酵素；蛍光物質；色素；化学発光性化合物；発光性物質；着色物質；磁性物質；または金属粒子、例えば金コロイド；放射性物質、例えば１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓまたは１４Ｃ；リン酸化フェノール誘導体、例えばニトロフェニルホスファート、ルシフェリン誘導体またはジオキセタン誘導体などでありうる。該酵素は、デヒドロゲナーゼ；オキシドレダクターゼ、例えばレダクターゼまたはオキシダーゼ；官能基、例えばアミノ、カルボキシル、メチル、アシルまたはホスファート基の転移を触媒するトランスフェラーゼ；エステル、グリコシド、エーテルまたはペプチド結合のような結合を加水分解しうるヒドロラーゼ；リアーゼ；イソメラーゼ；またはリガーゼでありうる。該酵素は別の酵素にコンジュゲート化されることも可能である。
【００２７】
該酵素は酵素サイクリングにより検出されうる。例えば、検出可能な標識がアルカリホスファターゼである場合、測定は、ウンベリフェロン誘導体のような適当な基質から生じた蛍光または発光を観察することにより行われうる。該ウンベリフェロン誘導体は４−メチル−ウンベリフェリルホスファートを含みうる。
【００２８】
該蛍光標識および化学発光標識は、フルオレセインイソチオシアナート；ローダミン誘導体、例えばローダミンＢイソチオシアナートまたはテトラメチルローダミンイソチオシアナート；ダンシルクロリド（５−（ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニルクロリド）、ダンシルフルオリド、フルオレスカミン（４−フェニルスピロ［フラン−２（３Ｈ），１’−（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］−３，３’−ジオン）；フィコビリンタンパク質、例えばフィコシアニンおよびフィソエリトリン；アクリジニウム塩；ルミノール化合物、例えばルミフェリン、ルシフェラーゼまたはエクオリン；イミダゾール；シュウ酸エステル；ユウロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）またはサマリウム（Ｓｍ）のような希土類元素のキレート化合物；あるいはクマリン誘導体、例えば７−アミノ−４−メチルクマリンでありうる。
【００２９】
該標識は、ハプテン、例えばアダマンチン、フルオレセインイソチオシアナートまたはカルバゾールであることも可能である。該ハプテンは、多価抗体または（ストレプ）アビジン含有部分と接触した場合に、凝集物の形成を可能にしうる。該ハプテンは、それが固体基体に結合している分子の容易な結合をも可能にしうる。
【００３０】
該標識は、検出可能な標識に結合した分子のレベルを定量することにより、例えば、電極の使用；色、光もしくは吸光度の分光光度測定；または目視検査により検出されうる。
【００３１】
ｈ．ペプチド
本明細書中で用いる「ペプチド」または「ポリペプチド」はアミノ酸の連結配列を意味することが可能であり、天然物、合成物または天然物と合成物との組合せ若しくは修飾体でありうる。
【００３２】
ｉ．組換えポリペプチド
本明細書中で用いる「組換えポリペプチド」または「組換えタンパク質」は少なくとも、その起源または操作により、それに天然で又はライブラリーの形態において付随しているポリヌクレオチドの全部または一部を伴っていない、あるいはそれが天然で連結されているもの以外のポリヌクレオチドに連結されている、ゲノム、半合成または合成由来のポリペプチドを意味しうる。該組換えポリペプチドは、必ずしも、示されているＨＢＶ核酸配列から翻訳されなくてもよい。該組換えポリペプチドはまた、化学合成または組換え発現系の発現を含む任意の方法で製造されることが可能であり、あるいはＨＢＶから単離されることが可能である。
【００３３】
ｊ．固体支持体
本明細書中で用いる「固体支持体」または「固相」は、反応トレイのウェルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロース片、膜、微粒子、例えばラテックス粒子などでありうる。固体支持体は決定的なものではなく、当業者により選択されうる。したがって、ラテックス粒子、微粒子、磁性または非磁性ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェルの壁、ガラスまたはシリコンチップおよびヒツジ赤血球の全てが適例である。固体支持体上にペプチドを固定化するための適当な方法には、イオン性、疎水性、共有結合相互作用などが含まれる。固体支持体はまた、不溶性である任意の物質であることが可能であり、あるいは後続の反応により不溶性にされうる。固体支持体は、捕捉試薬を誘引し固定化するその固有の能力に関して選択されうる。あるいは、固体支持体は、捕捉試薬を誘引し固定化する能力を有する追加的受容体を保有しうる。該追加的受容体には、捕捉試薬自体とは逆に荷電した、または捕捉試薬にコンジュゲート化された荷電物質とは逆に荷電した荷電物質が含まれうる。さらにもう１つの代替手段として、該受容体分子は、特異的結合反応により捕捉試薬を固体化する能力を有する、固体支持体上に固定化（結合）された任意の特異的結合メンバーでありうる。該受容体分子は、アッセイの実施前またはアッセイの実施中に、固体支持体物質への捕捉試薬の間接的結合を可能にする。したがって、固体支持体は、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、試験管のガラスまたはケイ素表面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップおよび当業者に公知の他の形態でありうる。
【００３４】
固体支持体は、結合抗原に対する適当な表面アフィニティおよび検出抗体による接近を可能にするのに十分な多孔度を有する任意の適当な多孔性物質を含みうることも想定され、本発明の範囲内である。微孔性構造体が一般に好ましいが、水和状態のゲル構造を有する物質も使用されうる。そのような有用な固体支持体には以下のものが含まれる：天然重合体炭水化物およびその合成修飾、架橋または置換誘導体、例えば寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換および架橋グアーガム、セルロースエステル（特に硝酸およびカルボン酸とのもの）、混合セルロースエステルならびにセルロースエーテル；窒素を含有する天然重合体、例えばタンパク質および誘導体、例えば架橋または修飾ゼラチン；天然炭化水素重合体、例えばラテックスおよびゴム；適度に多孔性の構造を伴って製造されうる合成重合体、例えばビニル重合体、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリビニルクロリド、ポリビニルアセタートおよびその部分的に加水分解された誘導体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリラート、前記縮合重合体の共重合体および三元共重合体、例えばポリエステル、ポリアミドおよび他の重合体、例えばポリウレタンまたはポリエポキシド；多孔性無機物質、例えばアルカリ土類金属およびマグネシウムのスルファートまたはカルボナート、例えば硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルカリおよびアルカリ土類金属、アルミニウムおよびマグネシウムのシリカート；ならびにアルミニウムまたはケイ素オキシドまたはヒドラート、例えばクレー、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲルまたはガラス（これらの物質は前記重合体物質と共にフィルターとして使用されうる）；ならびに前記クラスの混合物または共重合体、例えば、既存天然重合体上で合成重合体の重合を開始させることにより得られるグラフト共重合体。これらの物質の全ては、例えばフィルム、シートまたはプレートのような適当な形状で使用されることが可能であり、あるいはそれらは例えば紙、ガラス、プラスチックフィルムまたは織物のような適当な不活性担体上にコーティングされ又はそれらに結合もしくは積層されうる。
【００３５】
ニトロセルロースの多孔性構造体は、モノクローナル抗体を含む多種多様な試薬に対する優れた吸収および吸着特性を有する。ナイロンも類似特性を有し、同様に好適である。前記のそのような多孔性固体支持体は、好ましくは、約０．０１〜５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍの厚さのシートの形態である。その細孔径は広い範囲内の様々な値であることが可能であり、好ましくは約０．０２５〜１５ミクロン、特に約０．１５〜１５ミクロンである。そのような支持体の表面は、該支持体への該抗原または抗体の共有結合をもたらす化学的方法により活性化されうる。しかし、一般には、十分には理解されていない疎水性力による多孔性物質への吸着により、該抗原または抗体の不可逆的結合が得られる。適当な固体支持体はまた、米国特許出願第２２７，２７２号（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００３６】
ｋ．特異的結合メンバー
本明細書中で用いる「特異的結合メンバー」は特異的結合ペアのメンバーを意味しうる。該特異的結合ペアは、それを構成する一方の分子が化学的または物理的手段により他方の分子に特異的に結合する、２つの異なる分子でありうる。該特異的結合メンバーは免疫反応性であることが可能であり、特定のポリペプチドに結合しうる抗体、抗原または抗体／抗原複合体でありうる。
【００３７】
ｌ．実質的に同一
本明細書中で用いる「実質的に同一」は、第１配列と第２配列とが８〜１００個またはそれ以上の残基にわたって５０％〜９９％同一であることを意味しうる。
【００３８】
ｍ．変異体
ポリペプチドに関して本明細書中で用いる「変異体」は、（ｉ）８〜１００アミノ酸またはそれ以上でありうる、言及されているポリペプチドの一部分、あるいは（ｉｉ）言及されているポリペプチドと実質的に同一であるポリペプチドを意味しうる。変異体はまた、例えばタンパク質分解、リン酸化または他の翻訳後修飾により異なってプロセシングされたポリペプチドでありうる。
【００３９】
２．ＨＢＶタンパク質のレベルの決定
本発明は、サンプル中のＨＢＶタンパク質のレベルを決定するための方法を提供する。
【００４０】
ａ．Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質
ＨＢＶタンパク質はＨＢＶ表面抗原タンパク質でありうる。ＨＢＶ表面抗原タンパク質は、ＨＢＶ粒子の表面上に該ＨＢＶタンパク質を露出しうるＨＢＶエンベロープの一部を形成する能力を有しうる。ＨＢＶ表面抗原タンパク質は、抗原性でありうる又は免疫監視の標的でありうるエピトープを含みうる。エピトープは突然変異エピトープでありうる。ＨＢＶ表面抗原タンパク質はグリコシル化されていることも可能である。
【００４１】
（１）中Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質（Ｍ−ＨＢｓＡｇ）
ＨＢＶ表面抗原タンパク質はＭ−ＨＢｓＡｇでありうる。Ｍ−ＨＢｓＡｇは第１部分および第２部分を含むことが可能であり、約２８１アミノ酸の全長を有しうる。第１部分はプレＳ２領域を含むことが可能であり、Ｍ−ＨＢｓＡｇの最初の５５アミノ酸でありうる。第２部分は２２６アミノ酸長であることが可能であり、Ｓ−ＨＢｓＡｇの配列を含みうる。Ｍ−ＨＢｓＡｇは、表１に記載されている配列またはその変異体を含みうる。Ｍ−ＨＢｓＡｇの第１部分はエピトープをも含みうる。エピトープは抗体により結合されうる。該抗体は抗Ｍ−ＨＢｓＡｇ特異的抗体でありうる。
【００４２】
【表１】
2010539488.tif 000003
【００４３】
（２）小Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質（Ｓ−ＨＢｓＡｇ）
ＨＢＶ表面タンパク質はまた、Ｓ−ＨＢｓＡｇでありうる。Ｓ−ＨＢｓＡｇは約２２６アミノ酸長であることが可能であり、Ｓ領域を含みうる。Ｓ−ＨＢｓＡｇは野生型Ｓ−ＨＢｓＡｇでありうる。Ｓ−ＨＢｓＡｇは、表２に記載されている配列またはその変異体を含みうる。Ｓ−ＨＢｓＡｇは、米国特許第５，９２５，５１２号または第７，１４１，２４２号（それらの内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている「ａ」決定基の部分でありうるエピトープをも含みうる。Ｓ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１００−１６０もエピトープを含みうる。
【００４４】
【表２】
2010539488.tif 000004
【００４５】
（ａ）突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇ
Ｓ−ＨＢｓＡｇは突然変異体であることも可能であり、これは、野生型Ｓ−ＨＢｓＡｇとは少なくとも１アミノ酸異なる配列を含みうる。該突然変異はＳ−ＨＢｓＡｇの抗原性に影響を及ぼしうる。該抗原性は「ａ」決定基の破壊により影響を受けうる。突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇの抗原性は軽減されることが可能であり、これにより、該突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇエピトープは免疫監視を逃れうる。該突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇは、野生型Ｓ−ＨＢｓＡｇと比べて、抗ＨＢｓ抗体により検出される可能性が低いかもしれない。
【００４６】
該突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇはＳ−ＨＢｓＡｇの「ａ」決定基における突然変異を含むことが可能であり、それは、ＨＢＶ遺伝子型のいずれかのＳ−ＨＢｓＡｇ配列内のアミノ酸１００−１６０において見出されうる。挿入および点突然変異の重要な具体例（それらに限定されるものではない）を以下の表３に記載する。該突然変異体は欠失であることも可能である。推論により、これらの同じ突然変異がＭ−ＨＢｓＡｇおよびＬ−ＨＢｓＡｇにおいて生じるであろう。
【００４７】
【表３】
2010539488.tif 000005
【００４８】
突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇは、表３に記載されている突然変異の組合せを含むことが可能であり、あるいはそれは、米国特許第５，９２５，５１２号または第７，１４１，２４２号（それらの内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている突然変異を含みうる。
【００４９】
ｂ．抗体
本発明はまた、ＨＢＶタンパク質への結合能を有しうる抗体を提供する。該抗体は標識に結合していることが可能であり、固相に結合していることが可能である。該抗体はまた、第１抗体、第２抗体または第３抗ＨＢＶ抗体でありうる。第１抗体、第２抗体および第３抗ＨＢＶ抗体は全て、異なる位置またはエピトープにおいてＨＢＶタンパク質に結合する能力を有しうる。第１抗体、第２抗体および第３抗ＨＢＶ抗体はまた、お互いから識別されうる標識に結合することが可能である。本明細書中で用いる「第１抗体」、「第２抗体」および「第３抗体」は単に例示を目的としたものであるに過ぎない。本明細書に記載されている特性を有する他の抗体も、本明細書に記載されている方法のために使用されうる。
【００５０】
（１）第１抗体
第１抗体は、Ｍ−ＨＢｓＡｇに結合する能力を有しうる。第１抗体は、Ｍ−ＨＢｓＡｇのエピトープに結合する能力を有しうる。第１抗体はまた、Ｍ−ＨＢｓＡｇのプレＳ２領域内のエピトープに結合する能力を有しうる。第１抗体は更に、Ｍ−ＨＢｓＡｇとＳ−ＨＢｓＡｇとを識別する能力を有しうる。第１抗体はＳ−ＨＢｓＡｇと交差反応し得ない。第１抗体はまた、Ｓ−ＨＢｓＡｇに対するより高いアビディティでＭ−ＨＢｓＡｇに対して結合する能力を有しうる。第１抗体は５０−８０または１１６−３４モノクローナル抗ＨＢＶ表面タンパク質抗体または類似抗体でありうる。
【００５１】
（２）第２抗体
第２抗体は、Ｓ−ＨＢｓＡｇに結合する能力を有しうる。第２抗体はまた、Ｍ−ＨＢｓＡｇのＳ領域に結合する能力を有しうる。第２抗体はＨ１６６、Ｈ５７、Ｈ４０、Ｈ５３もしくはＨ３５モノクローナル抗ＨＢｓ抗体または類似抗体でありうる。
【００５２】
ｃ．ＨＢｓＡｇのレベルの決定
ＨＢｓＡｇのレベルは、サンプルを第１抗体と接触させることにより決定されうる。第１抗体を、タンパク質／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下、該サンプルと接触させることが可能である。
【００５３】
ＨＢｓＡｇのレベルを決定するための方法は、サンプルを固体支持体と接触させ、ＨＢｓＡｇを該固体支持体に結合させ、標識に結合した第１抗体にＨＢｓＡｇを接触させることを含みうる。ついでこの混合物を、タンパク質／抗体複合体を形成させるのに十分な時間及び条件下でインキュベートすることが可能である。ＨＢｓＡｇのレベルは、該標識により生成された測定可能なシグナルを検出することにより決定されうる。サンプル中のＨＢｓＡｇのレベルは、生成したシグナルに正比例しうる。
【００５４】
サンプルを、固体支持体に結合した第１抗体と接触させることが可能である。該混合物を、タンパク質／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートすることが可能である。ついで該混合物を、該固体支持体を捕捉しうるガラス繊維マトリックスに移すことが可能である。ついで該混合物を、標識に結合した第３抗ＨＢＶ抗体を含みうる指示試薬と接触させることが可能である。この抗体は実際に、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはそれらの混合物でありうる。ＨＢｓＡｇのレベルは、該標識により生成された測定可能なシグナルを検出することにより決定されうる。サンプル中のＨＢｓＡｇのレベルは、生成したシグナルに正比例しうる。
【００５５】
また、サンプルを、標識に結合しており固体支持体に結合している第１抗体と接触させることが可能である。該混合物を、タンパク質／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートすることが可能である。ついで該混合物を、標識に結合した第３抗ＨＢｓ抗体を含みうる指示試薬と接触させることが可能である。ＨＢｓＡｇのレベルは、該標識により生成された測定可能なシグナルを検出することにより決定されうる。ＨＢｓＡｇのレベルは、米国特許第５，７９５，７８４号または第５，８５６，１９４号（それらの内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている方法によっても決定されうる。サンプル中のＨＢｓＡｇのレベルは、生成したシグナルに正比例しうる。
【００５６】
サンプルを更に、固体支持体に結合した第１抗体、ならびに（ｉ）第３抗ＨＢＶ抗体および（ｉｉ）ビオチンを含みうる指示試薬と接触させることが可能である。該混合物を、タンパク質／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートすることが可能である。ついで該混合物を、該固体支持体を捕捉しうるガラス繊維マトリックスに移すことが可能である。ついで該混合物を、抗ビオチン抗体またはアビジンを含んでおり標識に結合した指示試薬と接触させることが可能である。ＨＢｓＡｇのレベルは、該標識により生成された測定可能なシグナルを検出することにより決定されうる。サンプル中のＨＢｓＡｇのレベルは、生成したシグナルに正比例しうる。
【００５７】
また、サンプルを、固体支持体に結合した第１抗体、および標識に結合した第３抗ＨＢＶ抗体を含みうる指示試薬と接触させることが可能である。該混合物を、タンパク質／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートすることが可能である。ＨＢｓＡｇのレベルは、該標識により生成された測定可能なシグナルを検出することにより決定されうる。サンプル中のＨＢｓＡｇのレベルは、生成したシグナルに正比例しうる。
【００５８】
サンプルを更に、固体支持体に結合した第１抗体と接触させることが可能である。該混合物を、タンパク質／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートすることが可能である。ついで該混合物を、標識に結合した第３抗ＨＢＶ抗体を含みうる指示試薬と接触させることが可能である。該混合物を、タンパク質／抗体複合体を形成するのに十分な第２の時間及び条件下でインキュベートすることが可能である。ＨＢｓＡｇのレベルは、該標識により生成された測定可能なシグナルを検出することにより決定されうる。サンプル中のＨＢｓＡｇのレベルは、生成したシグナルに正比例しうる。
【００５９】
該方法においては非固相診断アッセイが用いられうる。これらのアッセイは当業者によく知られており、本発明の範囲内であるとみなされる。そのようなアッセイの具体例には、米国特許第５，９２５，５１２号または第７，１４１，２４２号（それらの内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているものが含まれる。
【００６０】
該標識は、固相を含みうる検出系を用いて検出されうる。該固相は、半自動化または全自動化免疫分析装置により使用されるよう適合化されうる。該検出系は、該サンプルおよび試薬（これは抗体、標識、バッファーなどを含みうる）を反応容器へ運搬し、インキュベーションを行い、場合によっては、未結合標識ポリペプチドを結合標識ポリペプチドから洗い落としうる。該サンプルおよび試薬が該系内に挿入されたら、該検出系は、使用者の介入を伴わずに自動化されうる。該自動化検出系は、使用者の介入を伴うことなく４８時間以内に少なくとも８、１６，６４または１２８アッセイを該系が行いうることにより、手動の又はそれほど自動化されていない系から区別されうる。該系はまた、人間による計算または入力の必要性を伴うことなく、サンプル中のポリペプチドの濃度または量を自動的に計算することが可能でありうる。
【００６１】
該検出系はカートリッジ形態または試験片アッセイをも含みうる。該検出系は、使い捨て可能な装置内への単位用量で負荷（ローディング）可能なアッセイ試薬を提供し、該単位用量は、該ポリペプチドを検出するためにアッセイするのに必要な全ての試薬を含有しうる。そのような使い捨て可能な装置は、ナイロン、ニトロセルロースまたは他の適当な物質を含みうる使い捨て可能な膜様構造体を含みうるプラスチックハウジングを含みうる。該サンプルは予備加工され、または該使い捨て装置のローディング領域上に直接的にローディングされうる。ついで、場合によっては、該サンプルは、該膜様構造体を通って、該膜上に含有される複数の領域を経由して流動しうる。該膜様構造体は更に、界面活性剤または側方流動補助物質を含みうる。該膜様構造体はまた、過剰な流体を採集するための及び／又は該膜を通る側方流動を促進するための吸収剤を含有しうる。該検出系は、１、２、４、８、１０または１２アッセイを行うのに十分な試薬を各パックが含みうる多パック系を含みうる。
【００６２】
該検出系はまた、マイクロリットル範囲（例えば、４μＬ、１２μＬまたは５０μＬ未満）のサンプルを分析するよう設計されたマイクロフルイディック（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）装置を含みうる。該マイクロフルイディック装置は、場合によっては、該サンプルまたはアッセイ試薬またはそれらの両方がマイクロフルイディック装置内で輸送されるのを補助するための流動補助剤、推進装置（これは膨張性ゲル、ワックスおよび気体を含みうる）、ナノバルビング（ｎａｎｏｖａｌｖｉｎｇ）などを含みうる。
【００６３】
勿論、言うまでもなく、本明細書における典型的な形態の全て、および本発明のいずれのアッセイまたはキットも、例えば米国特許第５，０８９，４２４号および第５，００６，３０９号（それらの内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている、そして例えばＡｂｂｏｔｔのＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ、ＩＭＸ、ＰＲＩＳＭおよびＱｕａｎｔｕｍ  ＩＩ形態ならびに他の形態（これらに限定されるものではない）を含むＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）により市販されている自動化および半自動化系（微粒子を含む固相が存在するものを含む）における使用に適合化または最適化されうる。
【００６４】
また、本発明のアッセイおよびキットは、場合によっては、ＡｂｂｏｔｔのＰｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（商標））電気化学イムノアッセイ系を含むケア現場（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ）アッセイ系に適合化または最適化されうる。免疫センサーおよびその製造および操作方法（１回使用用試験装置におけるもの）が、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号ならびに公開されている米国特許出願公開第２００３０１７０８８１、２００４００１８５７７、２００５００５４０７８および２００６０１６０１６４号（それらの内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００６５】
ｄ．Ｓ−ＨＢｓＡｇのレベルの決定
該方法はまた、サンプル中のＳ−ＨＢｓＡｇのレベルを決定することを含みうる。これは、サンプルをモノクローナル抗体と接触させることによるものでありうる。Ｓ−ＨＢｓＡｇのレベルは、該標識により生成された測定可能なシグナルを検出することにより決定されうる。サンプル中のＳ−ＨＢｓＡｇの量は、生成したシグナルに正比例しうる。該方法は、ＨＢｓＡｇのレベルを決定するための前記のものに類似した工程を含みうる。
【００６６】
ｅ．Ｍ−ＨＢｓＡｇのレベルの決定
該方法はまた、サンプル中のＭ−ＨＢｓＡｇのレベルを決定することを含みうる。これは、サンプルをモノクローナル抗体と接触させることによるものでありうる。Ｓ−ＨＢｓＡｇのレベルは、該標識により生成された測定可能なシグナルを検出することにより決定されうる。サンプル中のＭ−ＨＢｓＡｇの量は、生成したシグナルに正比例しうる。該方法は、ＨＢｓＡｇのレベルを決定するための前記のものに類似した工程を含みうる。
【００６７】
ｆ．Ｌ−ＨＢｓＡｇのレベルの決定
該方法はまた、サンプル中のＬ−ＨＢｓＡｇのレベルを決定することを含みうる。これは、サンプルをモノクローナル抗体と接触させることによるものでありうる。Ｌ−ＨＢｓＡｇのレベルは、該標識により生成された測定可能なシグナルを検出することにより決定されうる。サンプル中のＬ−ＨＢｓＡｇの量は、生成したシグナルに正比例しうる。該方法は、ＨＢｓＡｇのレベルを決定するための前記のものに類似した工程を含みうる。
【００６８】
ｇ．サンプル
本発明においては、ＨＢＶタンパク質を含みうるサンプルが提供される。該サンプルはＨＢｓＡｇを含むことが可能であり、Ｓ−ＨＢｓＡｇ、Ｍ−ＨＢｓＡｇまたはＬ−ＨＢｓＡｇを含むことも可能である。該サンプルは更に、Ｍ−ＨＢｓＡｇおよびＳ−ＨＢｓＡｇを、１０００：１および１：１０００の範囲内でありうる既知比率で含みうる。
【００６９】
該サンプルは患者から単離されうる。該サンプルは、動物、例えばヒトから単離された生物学的組織または流体でありうる。該サンプルはまた、組織の切片、例えば生検または剖検サンプル、組織学的目的で採取された凍結切片、血液、血漿、血清、喀痰、糞便、涙、粘液、毛または皮膚でありうる。該サンプルはまた、動物または患者の組織から誘導された外植片または初代もしくは形質転換細胞培養でありうる。該サンプルは、動物から細胞のサンプルを取り出すことにより提供されうるが、予め単離された細胞（例えば、別人から、別の時点で、および／または別の目的で単離されたもの）を使用することによっても得られうる。アーカイブ組織、例えば、治療または結果の履歴を示すものも使用されうる。該サンプルはまた、血液、血液画分、浸出液、腹水、唾液、脳脊髄液、子宮頸部分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、胃腸分泌物、気管支分泌物、喀痰、細胞系、組織サンプルまたは乳房からの分泌物でありうる。
【００７０】
３．ＨＢＶの検出
本発明は、ＨＢＶタンパク質、例えばＳ−ＨＢｓＡｇ、Ｍ−ＨＢｓＡｇまたはＬ−ＨＢｓＡｇのレベルを決定することによるものでありうる、ＨＢＶの検出方法を提供する。Ｓ−ＨＢｓＡｇ、Ｍ−ＨＢｓＡｇまたはＬ−ＨＢｓＡｇのレベルを所定のＳ−ＨＢｓＡｇ、Ｍ−ＨＢｓＡｇまたはＬ−ＨＢｓＡｇ値と比較することが可能であり、これはサンプル中のＨＢＶの指標となりうる。２つの異なるＨＢＶタンパク質のレベルの比を計算することが可能である。所定の比の値と比較した該比における相違はサンプル中のＨＢＶタンパク質の指標となりうる。
【００７１】
ａ．所定のＭ−ＨＢｓＡｇ値
所定のＭ−ＨＢｓＡｇ値は陽性Ｍ−ＨＢｓＡｇ対照サンプル中のＭ−ＨＢｓＡｇのレベルでありうる。該Ｍ−ＨＢｓＡｇ対照サンプルは既知量のＭ−ＨＢｓＡｇを含みうる。該Ｍ−ＨＢｓＡｇ対照サンプルはＨＢＶをも含みうる。所定のＭ−ＨＢｓＡｇ値はまた、陰性Ｍ−ＨＢｓＡｇ対照サンプル中のＭ−ＨＢｓＡｇのレベルでありうる。
【００７２】
所定のＭ−ＨＢｓＡｇ値は、その値以上のサンプル中のＭ−ＨＢｓＡｇのレベルがＨＢＶの存在の指標となりうるような値でありうる。所定のＭ−ＨＢｓＡｇ値はまた、その値より小さいＭ−ＨＢｓＡｇのレベルがＨＢＶの非存在の指標となりうるような値でありうる。所定のＭ−ＨＢｓＡｇ値は１×１０−１２〜１×１０−２ｇｍｓの範囲内でありうる。
【００７３】
ｂ．突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇの検出方法
本発明はまた、ＨＢＶを検出することによるものでありうる、突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇを検出するための方法を提供する。所定の値の又は所定の値を超えるＭ−ＨＢｓＡｇのレベル、ならびに所定のＳ−ＨＢｓＡｇ値より小さいＳ−ＨＢｓＡｇのレベルは、突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇの存在の指標となりうる。
【００７４】
（１）所定のＳ−ＨＢｓＡｇ値
所定のＳ−ＨＢｓＡｇ値は、Ｓ−ＨＢｓＡｇを含むことが判明している又は既知量のＳ−ＨＢｓＡｇを含む陽性Ｓ−ＨＢｓＡｇ対照サンプルにおけるＳ−ＨＢｓＡｇのレベルでありうる。そのような所定のＳ−ＨＢｓＡｇ値はまた、その値より小さいＳ−ＨＢｓＡｇのレベルが突然変異Ｓ−ＨＢｓＡｇの存在を示すような値でありうる。所定のＳ−ＨＢｓＡｇ値は１×１０−１２〜１×１０−２ｇｍｓの範囲内でありうる。
【００７５】
ｃ．所定のＬ−ＨＢｓＡｇ値
所定のＬ−ＨＢｓＡｇ値は、Ｌ−ＨＢｓＡｇを含むことが判明している又は既知量のＬ−ＨＢｓＡｇを含む、陽性Ｌ−ＨＢｓＡｇ対照サンプルにおけるＬ−ＨＢｓＡｇのレベルでありうる。
【００７６】
４．キット
本発明は、ＨＢＶを検出するために使用されうるキットを提供する。該キットは第１抗体を含むことが可能であり、第２抗体をも含みうる。該キットは、サンプルからのタンパク質に結合するのに適した固体支持体をも含みうる。該キットは更に、陽性対照として使用するための既知濃度のＨＢＶタンパク質を含むＨＢＶ組成物を含みうる。該陽性対照は、所定の値を測定するために使用されうる。
【００７７】
該キットは、タンパク質−タンパク質相互作用を促進させ若しくは妨げるために又は未結合タンパク質を固体支持体から除去するために要求されうる例えばバッファーまたは塩のような追加的試薬をも含みうる。該キットは更に、検出可能なシグナルを生成するよう抗体上の標識を誘導しうる物質を含みうる。該キットは、標識がシグナルを生成するのを停止させうる物質をも含みうる。
【００７８】
該キットは、別々の試薬を各容器が含有する１以上の容器、例えばバイアルまたはボトルをも含みうる。該キットは更に、書面の説明を含むことが可能であり、これは、本明細書に記載されているアッセイの実施または解釈方法を説明したものでありうる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ＨＢＶエンベロープタンパク質構成成分Ｌ−ＨＢｓＡｇ、Ｍ−ＨＢｓＡｇおよびＳ−ＨＢｓＡｇを含むＨＢＶビリオンの概要図である。
【図２】プレＳ１、プレＳ２およびＳ領域の開始部位およびＨＢＶ表面遺伝子オープンリーディングフレームの概要図を示す。図２は、それぞれプレＳ２、プレＳ２およびＳ開始部位から転写されるＨＢＶ表面タンパク質Ｌ−ＨＢｓＡｇ、Ｍ−ＨＢｓＡｇおよびＳ−ＨＢｓＡｇの概要図をも示す。
【図３】Ｓ−ＨＢｓＡｇのアミノ酸１２１−１２４における公知の天然に存在する突然変異の概要図を示す。該突然変異は、Ａｂｂｏｔｔ抗ＨＢｓモノクローナル抗体Ｈ１６６により結合されうるエピトープに影響を及ぼしうる。
【図４】抗ＨＢｓモノクローナル抗体１１６−３４、Ｈ１６６、Ｈ５７、Ｈ５３、Ｈ４０およびＨ３５の相対捕捉アビディティを示す。
【図５】カナダ人集団から集めた臨床試料におけるＨＢＶの検出におけるＨ１６６、１１６−３４およびＨ５３の間の比較を示す。
【図６】公知ＨＢＶ突然変異体を含有する血清試料におけるＨＢＶを検出する１１６−３４、Ｈ１６６、Ｈ５７、Ｈ３５およびＨ５３の能力の比較を示す。
【図７】野生型および突然変異ＨＢＶサンプルを検出するＨ１６６、Ｈ４０、Ｈ５７、Ｈ３５、Ｈ５３、１１６−３４ならびにＨ４０、Ｈ５７およびＨ１１６の組合せの能力の比較を示す。
【００８０】
本発明は、以下の非限定的な実施例により例示される複数の態様を有する。
【実施例１】
【００８１】
Ｂ型肝炎の検出
材料および方法：
以下の方法を用いて、モノクローナル抗ＨＢｓ抗体（Ｈ５３または１１６−３４）をポリスチレン微粒子に結合させた。抗体を１５ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ４．７）中で約４００μｇ／ｍｌに希釈した。ポリスチレン微粒子を、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１５ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ４．７）中で懸濁させ、洗浄した。１％  固体の微粒子を１５ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ４．７）中の０．０４ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＡＣで活性化し、抗ＨＢｓ抗体を２００μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。該混合物を３０分間インキュベートし、ついでリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄した。該粒子をイムノアッセイのために０．１％  固体の最終濃度に調節した。
【００８２】
種々のアッセイ試薬形態を使用して、ＨＢｓＡｇ試験を行った。Ａｂｂｏｔｔ  ＩＭｘ  ＨＢｓＡｇアッセイを該製造業者の説明に従い用いた。該参照Ｉｍｘ  ＨＢｓＡｇアッセイ（これは抗ＨＢｓ  Ｈ１６６を捕捉試薬として利用する）を、プレＳ２抗ＨＢｓモノクローナル１１６−３４またはＳ−ＨＢｓＡｇモノクローナルＨ５３を捕捉試薬として含有する２つの試験アッセイ形態と比較した。ＩＭｘ  ＨＢｓＡｇのビオチン：抗ビオチンコンジュゲート検出系を使用して、両方の試験アッセイ反応性を測定した。シグナル対カットオフ（陰性対照値の２倍）比、すなわち、ｓ／ｃｏを、参照および該試験アッセイに関して計算した。試験変動を最小にするために、同じＩＭｘ装置上で、同じ日にサンプルを試験した。
【００８３】
結果：
参照ＩＭｘ  ＨＢｓＡｇ、微粒子捕捉相上に１１６−３４またはＨ５３を含有する２つの試験アッセイ条件で、臨床サンプルを試験した。臨床サンプルを、より低い抗原濃度に、正常ヒト血清中で１：１０希釈した。アッセイ結果を図５に示す。１１６−３４試験形態に関するｓ／ｃｏ値は、ＨＢｓＡｇの免疫捕捉のためにＨ１６６を使用する参照アッセイまたはＨＢｓＡｇの免疫捕捉のためにＨ５３を使用する試験アッセイに関する値より有意に高かった。このデータからの結論は、プレＳ２モノクローナル捕捉形態がＨＢｓＡｇの野生型形態に対する微粒子アッセイ感度を増加させうることである。
【実施例２】
【００８４】
突然変異Ｂ型肝炎の検出
材料および方法：
以下の方法を用いて、モノクローナル抗ＨＢｓ抗体（Ｈ１６６、Ｈ５７、Ｈ３５、Ｈ５３および１１６−３４）をポリスチレン微粒子に結合させた。抗体を１５ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ４．７）中で約４００μｇ／ｍｌに希釈した。ポリスチレン微粒子を、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１５ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ４．７）中で懸濁させ、洗浄した。１％  固体の微粒子を１５ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ４．７）中の０．０４ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＡＣで活性化し、抗ＨＢｓ抗体を２００μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。該混合物を３０分間インキュベートし、ついでリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄した。該粒子をイムノアッセイのために０．１％  固体の最終濃度に調節した。
【００８５】
種々のアッセイ試薬形態を使用して、ＨＢｓＡｇ試験を行った。該アッセイ形態は、プレＳ２抗ＨＢｓモノクローナル１１６−３４またはＳ−ＨＢｓＡｇモノクローナル（Ｈ１６６、Ｈ５７、Ｈ３５、Ｈ５３）を捕捉試薬として使用した。ＩＭｘ  ＨＢｓＡｇのビオチン：抗ビオチンコンジュゲート検出系を使用して、アッセイ反応性を測定した。シグナル対カットオフ（陰性対照値の２倍）比、すなわち、ｓ／ｃｏを、参照および該試験アッセイに関して計算した。
【００８６】
既知ｎｇ／ｍｌ濃度のＨＢｓＡｇ標準よりなるＨＢＶパネルを種々の抗ＨＢｓモノクローナル結合微粒子で試験した。また、既知ＨＢｓＡｇ突然変異体を含有する臨床サンプルをも試験した。試験変動を最小にするために、同じＩＭｘ装置上で、同じ日にサンプルを試験した。
【００８７】
結果：
プレＳ２抗ＨＢｓモノクローナル１１６−３４またはＳ−ＨＢｓＡｇモノクローナル（Ｈ１６６、Ｈ５７、Ｈ３５、Ｈ５３）を捕捉試薬として使用するＩＭｘ  ＨＢｓＡｇアッセイ形態において、サンプルを試験した。アッセイ結果を図６に示す。全体的に、１１６−３４試験形態に関するｓ／ｃｏ値は、ＨＢｓＡｇの突然変異形態の免疫捕捉のためのＳ−ＨＢｓＡｇモノクローナルに関する値より高かった。このデータからの結論は、プレＳ２モノクローナル捕捉形態がＨＢｓＡｇの突然変異形態に対する微粒子アッセイ感度を増加させうることである。
【実施例３】
【００８８】
突然変異Ｂ型肝炎の検出
材料および方法：
既に記載されているとおりに（Ｃｏｌｅｍａｎら，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．５９：１９−２４（１９９９））、ＨＢｓＡｇ突然変異体を製造した。簡潔に説明すると、同じ出発野生型配列内に導入された種々の一定の突然変異を含有する表面抗原遺伝子配列を、所有権を有する発現ベクターのＸｈｏＩおよびＨｐａＩ制限部位内にクローニングした。挿入された遺伝子を配列決定により確認し、確認された発現ベクターを使用して、リポフェクタミンの存在下、８５％のコンフルエンシーでマウスＬ細胞を一過性にトランスフェクトした。組換え抗原の発現に関して、細胞培養上清を第３日にモニターした。Ａｂｂｏｔｔ  Ａｕｓｒｉａアッセイを用いて、初期定量を行った。なぜなら、このアッセイのポリクローナル捕捉およびポリクローナル検出試薬形態は全ての突然変異体を検出することが可能だったからである。細胞培養上清を正常ヒト血漿中に希釈し、ＨＢｓＡｇの存在に関して試験した。
【００８９】
以下の方法を用いて、モノクローナル抗ＨＢｓ（Ｈ１６６、Ｈ４０、Ｈ５７、Ｈ３５、Ｈ５３および１１６−３４）をポリスチレンビーズ上にコーティングした。４分の１インチのポリスチレンビーズを蒸留水で３回洗浄した。抗ＨＢｓモノクローナル抗体を０．２５Ｍ  クエン酸バッファー（ｐＨ７．２）中で１０マイクログラム／ｍｌに希釈した。該洗浄ビーズを蓋付きボトル内の該抗ＨＢｓ溶液に加え、２時間２０分にわたり４６℃で回転させた。ついで該抗ＨＢｓ溶液を該ビーズから除去した。該ビーズを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する０．２５Ｍ  クエン酸バッファー（ｐＨ７．２）で洗浄し、ついで０．２５Ｍ  クエン酸バッファー（ｐＨ７．２）のみで洗浄し、ついで０．４Ｍ  クエン酸二水和物１％リン酸ガラス２％スクロースバッファー（ｐＨ７．２）で洗浄し、ついで風乾させた。
【００９０】
種々のアッセイ試薬形態を使用して、ＨＢｓＡｇ試験を行った。Ａｂｂｏｔｔ  Ａｕｓｚｙｍｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌアッセイを該製造業者の説明に従い用いた。この参照条件を、ポリクローナル抗ＨＢｓ：ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートと共にインキュベートしたＳ−ＨＢｓＡｇ（Ｈ１６６、Ｈ４０、Ｈ５７、Ｈ３５およびＨ５３）の「ａ」決定基またはプレＳ２（１１６−３４）を認識するモノクローナル抗ＨＢｓでコーティングされた試験固相捕捉ビーズと比較した。４９２ｎｍにおける吸光度（Ａ）を測定した。サンプルを３回重複実験に付し、平均化した。組換えＨＢｓＡｇ突然変異体を種々の抗ＨＢｓモノクローナル試薬が検出する能力を評価した。
【００９１】
結果：
２つ組換えＨＢｓＡｇ突然変異体（アミノ酸１２２位にＡｓｎ  Ｔｈｒの挿入を含有するＨＢｓＡｇ突然変異体１２０８およびアミノ酸１２３位にＴｈｒからＡｌａへの置換を含有するＨＢｓＡｇ突然変異体Ｔ１２３Ａ）を、この研究において評価した。また、野生型ＨＢｓＡｇを含有するＡｕｓｚｙｍｅ陽性対照を２つの濃度で試験した。そのＡｕｓｚｙｍｅの結果および抗ＨＢｓモノクローナル反応性の結果を図７に示す。該抗ＨＢｓコート化ビーズの全てが該野生型陽性対照を認識したが、それらは２つのＨＢｓＡｇ突然変異体に対しては異なる反応性を示した。両方の突然変異体に関して最高のＡ（４９２ｎｍ）読取値を有する抗ＨＢｓモノクローナル抗体はＭ−ＨＢｓＡｇのプレＳ２領域に対する１１６−３４であった。該１１６−３４シグナルは、その他の抗ＨＢｓモノクローナルまたはＡｕｓｚｙｍｅキットシグナルより、有意に、より高感度であった。Ｈ５３と１１６−３４とのモノクローナル組合せはＨＢｓＡｇ突然変異体１２０８を最も良く検出し、一方、Ｈ５７と１１６−３４とのモノクローナル組合せはＨＢｓＡｇ突然変異体Ｔ１２３Ａを最も良く検出するであろう。このデータからの結論は、プレＳ２モノクローナル捕捉形態がＨＢｓＡｇの突然変異形態に対するアッセイ感度を増加させることである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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