(57)【要約】  本発明は（ａ）分析されるべき腫瘍細胞を含むサンプルを提供する、（ｂ）前記サンプルをＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子と接触させ、そして前記サンプル中でのそれの腫瘍細胞への結合を評価する、及び（ｃ）段階（ｂ）の評価に基づいて前記腫瘍細胞を分類する：段階を含む、腫瘍細胞の分類方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の実質的な結合が観察される場合上皮型腫瘍細胞又は組織として又はＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の実質的な結合が観察されない場合間葉型腫瘍細胞又は組織として腫瘍細胞又は腫瘍組織を分類する方法であって、
（ａ）ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子を腫瘍細胞又は腫瘍組織と接触させ、そして上記ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の上記腫瘍細胞又は上記腫瘍組織への結合を評価する、及び
（ｂ）段階（ａ）の評価に基づいて前記腫瘍細胞又は腫瘍組織を分類する
の段階を含む方法。
【請求項２】
前記ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の実質的な結合がＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストの投与を含む抗腫瘍治療への感受性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記腫瘍細胞又は組織が肺癌、詳細にはＮＳＣＬＣから又は前立腺癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、頭部及び首の癌、胃癌、卵巣癌、腎臓癌又は頸部の癌から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
上記腫瘍細胞又は腫瘍組織がヒト腫瘍患者に由来する又はヒト腫瘍患者中に存在している、請求項１〜３のいずれか１に記載の方法。
【請求項５】
前記患者の抗腫瘍治療の開始前に行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記患者の抗腫瘍治療中に行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記抗腫瘍治療がさらなる抗腫瘍剤及び／又は放射線治療の投与を任意に組み合せてＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストの投与を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストが小分子ＥＧＦＲ阻害剤、詳細にはエルロチニブ又はジェフィチニブから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストが抗ＥＧＦＲ抗体、詳細にはセツキシマブから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子がペプチド又は抗体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子が抗体Ｌ１９からのＣＤＲ配列を有する抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子が抗体ＡＰ３９である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子が検出可能な標識基と、詳細にはイメージング基と結合されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
上記標識基が放射活性標識基である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記標識基がＳＰＥＣＴ標識基、詳細には99mＴｃである、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記標識基がＰＥＴ標識基、詳細には18Ｆである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
細胞又は組織における、詳細には腫瘍細胞又は腫瘍組織における、上皮間葉移行（ＥＭＴ）の検出方法であって、
（ａ）ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子を細胞又は組織と接触させ、そして上記ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の上記細胞又は組織への結合を評価する、及び
（ｂ）段階（ａ）の評価に基づいて前記細胞又は組織を上皮型細胞又は組織として或いは間葉型細胞又は組織として同定する
の段階を含む方法。
【請求項２０】
段階（ａ）における評価がイメージング手順に基づいている、請求項１又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍細胞又は腫瘍組織をＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストでの治療に対して感受性である又は抵抗性であると分類する方法におけるＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の使用。
【請求項２２】
上記腫瘍細胞又は腫瘍組織が肺癌、詳細にはＮＳＣＬＣから又は前立腺癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、頭部及び首の癌、胃癌、卵巣癌、腎臓癌又は頸部の癌から選択される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記抗腫瘍治療がさらなる抗腫瘍剤の投与及び／又は放射線治療を任意に組み合せてＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストの投与を含む、請求項２１又は２２に記載の使用。
【請求項２４】
上皮間葉移行の検出方法におけるＥＤ‐Ｂフィブロネクチン結合分子の使用。
【請求項２５】
検出可能な標識基と結合されたＡＰ３９及びＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストを含む腫瘍を治療するための組成物又はキット。
【請求項２６】
上記検出可能な標識基が放射活性標識基、詳細にはＳＰＥＣＴ標識基又はＰＥＴ標識基である、請求項２５に記載の組成物又はキット。
【請求項２７】
腫瘍の治療方法における、請求項２５又は２６に記載の組成物の使用。
【請求項２８】
Ｎ‐［６‐（４‐［18Ｆ］フルオロベンジリデン）アミノオキシヘキシル］マレイミドＡＰ３９（［18Ｆ］ＦＢＡＭ‐ＡＰ３９）
【請求項２９】
Ｎ‐スクシンイミヂル４‐［18Ｆ］フルオロ安息香酸塩ＡＰ３９（［18Ｆ］ＳＦＢ‐ＡＰ３９）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍薬に対する腫瘍の感受性について腫瘍を分類するための診断薬としての、及び詳細にはＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストのための分類マーカーとしての、例えばＥＤ‐Ｂドメインに対する標識化抗体又は抗体断片の、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ‐Ｂ）に対する分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害剤は腫瘍治療において、詳細には非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者の治療のために使用されている。ＥＧＦＲ阻害に対するＥＧＦＲを含むヒトＮＳＣＬＣ細胞系の感受性はそれらが上皮間葉移行（ＥＭＴ）を経験した程度に因る。上皮細胞連結タンパク質Ｅ‐カドヘリンを発現するＮＳＣＬＣ細胞系はＥＭＴを経験した細胞系に比較してＥＧＦＲ阻害に対してより大きな感受性を示す（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５（２００５），  ９４５５−９４６２）。
【０００３】
さらに、ＮＳＣＬＣ患者におけるＥＧＦＲアンタゴニストの臨床活性はヒト腫瘍細胞におけるＥＭＴ決定により予想されうることが分かっている（Ｙａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １１（２００５），  ８６８６−８６９８）。
【０００４】
ＥＭＴは上皮マーカー、例えばＥ‐カドヘリンの欠損、及び間葉マーカー、例えばヴィメンチンの獲得により特徴づけられる。ＥＭＴは脱分化、粘着性の拘束の欠損及び断節及び侵襲の高まりを引き起こす。これらの特性は悪化した悪性疾患の顕著な特徴である。したがって、ＥＭＴは癌細胞がこのより侵襲性の表現型を獲得する機構を提供する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １７２（２００６），  ９７３−９８１；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６６（２００６），  ８３１９−８３２６）。しかしながら、このプロセスはおそらく腫瘍内の別々の領域で一過的に起こるので、ルーチンの分析法によるＥＭＴの検出は困難である（Ｇｏｔｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．  ５６６（２００４）９−２０）。
【０００５】
したがって、ヒト腫瘍細胞若しくは組織又は関心のある他の細胞若しくは組織における上皮対間葉表現型の決定を可能にする信頼性のある及び感度の高い方法を提供することが本発明の目的であった。
【発明の概要】
【０００６】
第一の局面において、本発明は
（ａ）ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子を腫瘍細胞又は腫瘍組織と接触させ、そして上記ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の上記腫瘍細胞又は上記腫瘍組織への結合を評価する、及び
（ｂ）段階（ａ）の評価に基づいて前記腫瘍細胞又は腫瘍組織を分類する
の段階を含む、腫瘍細胞又は腫瘍組織の分類方法について言及する。
【０００７】
さらなる局面において、本発明は細胞又は組織における、詳細には腫瘍細胞又は腫瘍組織における上皮間葉移行（ＥＭＴ）の検出、詳細にはイメージング方法であって、
（ａ）ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子を細胞又は組織と接触させ、そしてＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の上記細胞又は組織への結合を評価する、及び
（ｂ）段階（ａ）の評価に基づいて上皮型細胞若しくは組織として又は間葉型細胞若しくは組織として前記細胞又は組織を同定する
の段階を含む方法について言及する。
【０００８】
さらなる局面において、本発明はＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の実質的な結合が観察されている場合上皮型腫瘍細胞又は組織として又はＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の実質的な結合が観察されない場合間葉型腫瘍細胞又は組織として腫瘍細胞又は腫瘍組織を分類する方法であって、
（ａ）ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子を腫瘍細胞又は腫瘍組織と接触させ、そして上記ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の上記腫瘍細胞又は上記腫瘍組織への結合を評価する、及び
（ｂ）段階（ａ）の評価に基づいて前記腫瘍細胞又は腫瘍組織を分類する
の段階を含む方法について言及する。
【０００９】
特に好ましい態様において、前記ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の実質的な結合はＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストの投与を含む抗腫瘍治療に対する感受性を示している。
【００１０】
さらに、本発明のさらなる局面は腫瘍細胞又は腫瘍組織を治療に対して感受性が高い又は抵抗性であると分類するための薬剤の製造のためのＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の使用について言及する。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は腫瘍細胞又は腫瘍組織をＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストでの治療に対して感受性が高い又は抵抗性であると分類する方法のためのＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の使用に関する。
【００１２】
さらに、本発明のさらなる局面は腫瘍細胞又は腫瘍組織をＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストでの治療に対して感受性が高い又は抵抗性であると分類するための薬剤の製造のためのＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の使用について言及する。好ましい態様において、上記腫瘍細胞又は腫瘍組織へのＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の実質的な結合は患者がＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストでの治療に対して感受性が高いことを表示している。
【００１３】
さらに、本発明のさらなる局面は上皮間葉移行を検出するための薬剤の製造のためのＥＤ‐Ｂフィブロネクチン結合分子の使用について言及する。さらに、本発明のさらなる局面は上皮間葉移行の検出方法におけるＥＤ‐Ｂフィブロネクチン結合分子の使用について言及する。好ましい態様において、ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の上記腫瘍細胞又は腫瘍組織への実質的な結合は上皮間葉移行を経験していない又はまだ経験していない組織を表示している。
【００１４】
さらに、本発明のさらなる局面は検出可能な標識基と結合されたＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的結合分子を含む腫瘍細胞又は腫瘍組織を分類するための組成物又はキットについて言及する。
【００１５】
さらに、本発明のさらなる局面は検出可能な標識基と結合されたＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的結合分子を含む上皮間葉移行を検出するための組成物又はキットについて言及する。
【００１６】
さらに、本発明のさらなる局面は検出可能な標識基と結合されたＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的結合分子及びＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストを含む腫瘍を治療するための組成物又はキットに関する。
【００１７】
好ましい態様において、本発明は腫瘍の治療方法における、検出可能な標識基と結合されたＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的結合分子及びＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストを含む組成物又はキットの使用に関する。
【００１８】
特に好ましい態様において、検出可能な標識基と結合された上記ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的結合分子は検出可能な標識基と結合されたＡＰ３９、詳細には99mＴｃ標識化ＡＰ３９である。
【００１９】
さらに、本発明のさらなる局面は腫瘍細胞又は腫瘍組織を分類し、そしてＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストでの治療に対して感受性が高いと同定された患者を治療することを含む腫瘍患者を治療するための組成物又はキットについて言及し、ここで上記キットは検出可能な標識基と結合されたＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的結合分子及びＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストを含む。
【００２０】
さらに、本発明のさらなる局面は上皮間葉移行を検出し、そして上皮間葉移行を経験していない患者を治療することを含む腫瘍患者を治療するための組成物又はキットについて言及し、ここで上記キットは検出可能な標識基と結合されたＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的結合分子及びＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストを含む。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は
（ａ）腫瘍患者に検出可能な標識基と結合された診断として有効な量のＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的結合分子を投与する
（ｂ）ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的結合分子が組織に実質的に結合するかどうかを決定することにより、上記患者がＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストでの治療に対して感受性が高いかどうかを決定する、及び
（ｃ）上記患者がＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的結合分子の実質的な結合を示している場合、上記腫瘍患者に治療的に有効な量のＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストを投与する
の段階を含む、腫瘍患者の治療方法に関する。
【００２２】
本発明によると、ＥＤ‐Ｂフィブロネクチンの決定は腫瘍細胞又は腫瘍組織の選択又は分類のために及び／又はＥＭＴの検出のために使用されうることが驚くべきことに発見された。腫瘍細胞又は腫瘍組織のＥＤ‐Ｂ特異的分子への結合はＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストの如き抗腫瘍薬に対する感受性及び／又は上皮性表現型を表示している。腫瘍細胞又は腫瘍組織のＥＤ‐Ｂ特異的分子に対する結合の欠損又は結合の減少はＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストの如き抗腫瘍薬に対する抵抗性及び／又は間葉性表現型を表示している。したがって、本発明は腫瘍患者及びＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストでの治療の如き、抗腫瘍治療に対する患者の感受性の選択又は分類に特に好適である。
【００２３】
フィブロネクチンのＥＤ‐Ｂドメインについて特異的な分子、上記フィブロネクチン分子への代替のスプライシングにより挿入される（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４），  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５９，  ６１２−１８）９１アミノ酸の配列は本明細書中に引用されるＷＯ  ９７／４５５４４、ＷＯ  ０１／６２８００、ＷＯ  ０３／０５５９１７、ＷＯ  ０３／０７６４９及びＷＯ  ２００５／０２２３３１８中に既に示されている。好ましい結合分子は、例えば、ＥＤ‐Ｂドメインに対する抗体又は上記抗体の断片、例えば、タンパク質分解切断により得られうる抗体断片、例えば、Ｆａｂ‐、Ｆａｂ’‐Ｆ（ａｂ2）断片等又は組換え抗体断片、例えば、一重鎖Ｆｖ‐断片の如き、ＥＤ‐Ｂドメインに直接的に及び特異的に結合する分子である。上記ＥＤ‐Ｂ結合分子は診断適用に好適な標識基との結合体として好ましく使用される。
【００２４】
本発明の好ましい態様は標識基との結合体として存在している抗体Ｌ１９又はこの抗体の断片（Ｌ１９誘導体）の使用に関する。
【００２５】
Ｌ１９はフィブロネクチンのエキストラ‐ドメインＢ（ＥＤ‐Ｂ）に対するモノクローナル抗体のｓｃＦｖ断片（ｓｃＦｖ：一本鎖可変抗体断片）であり、そして以下のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号１）を有している：
【００２６】
【表１】
2010539112.tif 000002
【００２７】
（ａａ）表１中に示されている相補性決定領域ＨＣＤＲ３及び／又はＬＣＤＲ３を含むフィブロネクチンのエキストラ‐ドメインＢ（ＥＤ‐Ｂ）に対する少なくとも１の抗原結合部位又はその変形であって、ＨＣＤＲ３領域内に５アミノ酸までの及びＬＣＤＲ３領域内に６アミノ酸までの欠損、挿入及び／又は置換を示しており、ここで上記抗原結合部位は配列ＩＤ番号１中に示されている天然Ｌ１９と同じ機能を示している
（ａｂ）表１中に示されている相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むフィブロネクチンのエキストラ‐ドメインＢ（ＥＤ‐Ｂ）に対する少なくとも１の抗原結合部位又はその変形であって、ＨＣＤＲ１領域内に３アミノ酸までの、ＨＣＤＲ２領域内に８アミノ酸までの、ＨＣＤＲ３領域内に５アミノ酸までの、ＬＣＤＲ１領域内に６アミノ酸までの、ＬＣＤＲ２領域内に４アミノ酸までの及びＬＣＤＲ３領域内に６アミノ酸までの欠損、挿入及び／又は置換を示しており、ここで上記抗原結合部位は配列ＩＤ番号１中に示されている天然Ｌ１９と同じ機能を示している又は
（ａｃ）配列ＩＤ番号１中に示されている天然Ｌ１９の配列を含むフィブロネクチンのエキストラ‐ドメインＢ（ＥＤ‐Ｂ）に対する少なくとも１の抗原結合部位又はその変形であって、３０アミノ酸までの欠損、挿入及び／又は置換を示しており、ここで上記抗原結合部位は配列ＩＤ番号１中に示されている天然Ｌ１９と同じ機能を示している
及び場合により
（ｂａ）アミノ酸配列Ｘａａ1‐Ｘａａ2‐Ｘａａ3‐Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号２）、ここでＸａａ1、Ｘａａ2、及びＸａａ3は互いに独立にどの天然アミノ酸でも示している
（ｂｂ）アミノ酸配列Ｘａａ1‐Ｘａａ2‐Ｘａａ3‐Ｃｙｓ‐Ｘａａ4（配列ＩＤ番号３）、ここでＸａａ1、Ｘａａ2、Ｘａａ3、及びＸａａ4は互いに独立にどの天然アミノ酸でも示している
（ｂｃ）アミノ酸配列（Ｈｉｓ）n（配列ＩＤ番号４）、ここでｎは４〜６の整数である又は
（ｂｄ）配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６又は配列ＩＤ番号７中に示されている配列を含むアミノ酸配列
を含むＬ１９誘導体は特に好ましく、ここで（ａａ）、（ａｂ）又は（ａｃ）のＣ末端は（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）又は（ｂｄ）のＮ末端へのペプチド結合を介して任意に結合されている。
【００２８】
本発明の範囲内で、上記標識化Ｌ１９誘導体は抗原結合部位（ａａ）、（ａｂ）又は（ａｃ）から選択されるフィブロネクチンのエキストラ‐ドメインＢ（ＥＤ‐Ｂ）に対するＮ末端抗原結合部位及び場合によりアミノ酸配列（ｂａ）、（ｂｂ）、（ｂｃ）又は（ｂｄ）から選択されるＣ末端アミノ酸配列を含み、ここで上記抗原結合部位は配列ＩＤ番号１中に示されている天然Ｌ１９と同じ機能を示している。
【００２９】
本発明によると、上記標識化Ｌ１９誘導体（ａａ）又は（ａｂ）のフィブロネクチンのエキストラ‐ドメインＢ（ＥＤ‐Ｂ）に対する抗原結合部位は表１中に示されている相補性決定領域ＨＣＤＲ３及び／又はＬＣＤＲ３又はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。本発明の範囲内で、上記相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は以下のように定義されている：
【００３０】
【表２】
2010539112.tif 000003
【００３１】
表１中に定義されている相補性決定領域に加えて、上記標識化Ｌ１９誘導体（ａａ）又は（ａｂ）のフィブロネクチンのエキストラ‐ドメインＢ（ＥＤ‐Ｂ）に対する抗原結合部位はこれらの領域の変形をもまた含みうる。本発明によると、上記ＨＣＤＲ１領域の変形は上記ＨＣＤＲ１領域内に３アミノ酸までの欠損、挿入及び／又は置換、すなわち、表１中に示されている配列（配列ＩＤ番号８）と比較して１、２又は３アミノ酸の欠損、挿入及び／又は置換を含む。上記ＨＣＤＲ２領域の変形は上記ＨＣＤＲ２領域内に８アミノ酸までの欠損、挿入及び／又は置換、すなわち、表１中に示されている配列（配列ＩＤ番号９）と比較して１、２、３、４、５、６、７又は８アミノ酸の欠損、挿入及び／又は置換を含む。さらに、上記ＨＣＤＲ３領域の変形は上記ＨＣＤＲ３領域内に５アミノ酸までの欠損、挿入及び／又は置換、すなわち、表１中に示されている配列（配列ＩＤ番号１０）と比較して１、２、３、４又は５アミノ酸の欠損、挿入及び／又は置換を含む。しかしながら、上記ＬＣＤＲ１領域の変形は上記ＬＣＤＲ１領域内に６アミノ酸までの欠損、挿入及び／又は置換、すなわち、表１中に示されている配列（配列ＩＤ番号１１）と比較して１、２、３、４、５又は６アミノ酸の欠損、挿入及び／又は置換を含む。さらに、上記ＬＣＤＲ２領域の変形は上記ＬＣＤＲ２領域内に４アミノ酸までの欠損、挿入及び／又は置換、すなわち、表１中に示されている配列（配列ＩＤ番号１２）と比較して１、２、３又は４アミノ酸の欠損、挿入及び／又は置換を含む。上記ＬＣＤＲ３領域の変形は上記ＬＣＤＲ３領域内に６アミノ酸までの欠損、挿入及び／又は置換、すなわち、表１中に示されている配列（配列ＩＤ番号１３）と比較して１、２、３、４、５又は６アミノ酸の欠損、挿入及び／又は置換を含む。
【００３２】
本発明によると、上記標識化Ｌ１９誘導体（ａｃ）のフィブロネクチンのエキストラ‐ドメインＢ（ＥＤ‐Ｂ）に対する抗原結合部位は配列ＩＤ番号１中に示されている天然Ｌ１９の配列又はその変形を含み、それは３０アミノ酸までの欠損、挿入及び／又は置換、すなわち、配列ＩＤ番号１中に示されている配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０アミノ酸の欠損、挿入及び／又は置換を示している。
【００３３】
上記標識化Ｌ１９誘導体のアミノ酸配列（ｂａ）、（ｂｂ）又は（ｂｃ）は配列Ｘａａ1‐Ｘａａ2‐Ｘａａ3‐Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号２）、Ｘａａ1‐Ｘａａ2‐Ｘａａ3‐Ｃｙｓ‐Ｘａａ4（配列ＩＤ番号３）又は（ＨＩＳ）n（配列ＩＤ番号４）を含む。
【００３４】
本発明の好ましい態様において、上記アミノ酸配列（ｂａ）Ｘａａ1‐Ｘａａ2‐Ｘａａ3‐Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号２）は配列Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号１４）又はＧｌｙ‐Ｃｙｓ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号１５）である。配列Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ（配列ＩＤ番号１４）は特に好ましい。
【００３５】
本発明の他の好ましい態様において、上記アミノ酸配列（ｂｂ）Ｘａａ1‐Ｘａａ2‐Ｘａａ3‐Ｃｙｓ‐Ｘａａ4（配列ＩＤ番号３）は配列Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ‐Ａｌａ（配列ＩＤ番号１６）又はＧｌｙ‐Ｃｙｓ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ‐Ａｌａ（配列ＩＤ番号１７）である。配列Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ‐Ａｌａ（配列ＩＤ番号１６）は特に好ましい。
【００３６】
本発明の他の好ましい態様において、上記アミノ酸配列（ｂｃ）（Ｈｉｓ）n（配列ＩＤ番号４）はｎが６に等しい配列（Ｈｉｓ）6（配列ＩＤ番号１８）である。
【００３７】
本発明の他の好ましい態様において、（ａａ）、（ａｂ）又は（ａｃ）のＮ末端はリンカーアミノ酸配列のＣ末端へのペプチド結合を介して任意につなげられている。上記リンカーアミノ酸配列は好ましくは３０アミノ酸まで、好ましくは２５アミノ酸まで、及び特に好ましくは２２アミノ酸までの長さを有する。配列ＩＤ番号１９中に示されている配列であるリンカーアミノ酸配列は特に好ましい。
【００３８】
本発明によると、特に好ましい標識化Ｌ１９誘導体は配列ＩＤ番号１（天然Ｌ１９）、配列ＩＤ番号２０（ＡＰ３８）、配列ＩＤ番号２１（ＡＰ３９）、配列ＩＤ番号２２（Ｌ１９‐ＧｌｙＣｙｓＧｌｙＣｙｓ）、配列ＩＤ番号２３（Ｌ１９‐ＧｌｙＣｙｓＧｌｙＣｙｓＡｌａ）、配列ＩＤ番号２４（ＺＫ２２５２９３）、配列ＩＤ番号２５（ＺＫ２１７６９１／２１７６９５）、配列ＩＤ番号２６（ＺＫ２１０９１７）及び配列ＩＤ番号２７（ＺＫ２４８２１９／２４８２２０）中に示されている配列を含む。ＡＰ３９は特に好ましい。
【００３９】
99mＴｃ‐標識化ＡＰ３９は好ましくは非経口又は静脈内投与により、より好ましくは静脈内注射により患者に適用される。上記ヒト投与量は典型的に一人の患者当たり約０．０１〜１０ｍｇの範囲内、好ましくは約０．１〜１ｍｇの範囲内である。
【００４０】
上記ＥＤ‐Ｂドメインに対する結合分子は好ましくは標識基との結合体の形態で存在している。標識基として、診断適用、詳細にはｉｎ  ｖｉｖｏでの診断適用に好適な全ての標識物質、例えば、放射活性検出、例えば、放射活性イメージング法のための放射性標識物質又は非放射活性検出、例えば、光学イメージング又は磁気共鳴イメージングに好適な標識物質の如き非放射活性イメージング法のための標識物質が使用されうる。特に好ましい態様において、上記標識基はＳＰＥＣＴ（単光子放出コンピューター化トモグラフィー）に好適な標識基、詳細には放射性同位体99mＴｃである。さらに特に好ましい態様において、上記標識基はＰＥＴ（陽電子放出トモグラフィー）に好適な標識基、詳細には放射性同位体18Ｆである。ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴにおける本発明に係る方法及び使用の適用は好ましい。
【００４１】
生検はしばしば取ることが困難であり、そして外科的介入を必要とするので、本使用及び方法は生検を取ることなく診断をまた許容するため、ｉｎ  ｖｉｖｏでの診断適用は特に好ましい。また、ＥＤ‐Ｂフィブロネクチンは間質細胞外マトリックスタンパク質であり、そしてｉｎ  ｖｉｖｏイメージング手順のためにアクセス可能である。それは腫瘍の新生血管形成の外側に及び細胞外に位置している。
【００４２】
ポリペプチド、ペプチド及び詳細にはｓｃＦｖ断片中に標識物質を導入するプロセスは先行技術で周知である。上記結合分子は好ましくは放射性同位体、例えば、ヨウ素（Ｉ）、インジウム（Ｉｎ）、イットリウム（Ｙ）、テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、ガリウム（Ｇａ）、臭素（Ｂｒ）又はフッ素（Ｆ）の放射性同位体で標識化される。放射性同位体125Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、86Ｙ、94mＴｃ、99mＴｃ、67Ｇａ、68Ｇａ、76Ｂｒ又は18Ｆは特に好ましい。好ましい放射性同位体は99mＴｃ、18Ｆ及び123Ｉである。
【００４３】
18Ｆ‐標識化ＡＰ３９分子の合成は実施例４及び５中に示されている。これらの18Ｆ‐標識化分子は詳細には本発明に係るＰＥＴにおける使用に好適である。ＡＰ３９はＷＯ  ０３／０５５９１７中に示されているＬ１９抗体の誘導体である。
【００４４】
したがって、他の好ましい態様において、詳細には［18Ｆ］ＦＢＡＭ‐ＡＰ３９及び［18Ｆ］ＳＦＢ‐ＡＰ３９から選択される18Ｆ‐標識化ＡＰ３９は詳細にはＰＥＴでの本発明に係る方法及び使用に特に有用である。
【００４５】
本発明の好ましい態様において、抗体断片、例えば、還元型Ｌ１９誘導体が使用される。本発明の範囲内で、用語「還元型」は、上記断片がモノマー型で存在しており、そして例えば、分子間ジスルフィド架橋により仲介されるダイマー型又は多重結合型では存在していないことを意味する。上記抗体断片の還元型は好ましくは好適な還元剤を添加することにより得られる。好適な還元剤は先行技術で周知であり、そしてＴＣＥＰ（トリス（２‐カルボキシエチル）フォスフィン）及び１，４‐ジメルカプト‐２，３‐ブタンジオールを含む。
【００４６】
さらに、本発明は、上記医薬組成物又はキットが上記結合分子に加えて、生理学的に適合性の補助剤、賦形剤及び／又は希釈剤を任意に含むことを提供する。好適な補助剤、賦形剤及び／又は希釈剤は医薬品化学の分野における当業者に周知である。
【００４７】
本発明の好ましい態様において、腫瘍は、ＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の実質的な結合が観察される場合、上皮型腫瘍として又はＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子の実質的な結合が観察されない場合、間葉型腫瘍として分類される。この文脈において、用語「実質的な結合」はコントロール細胞又はコントロール組織への非特異的結合又は間葉型細胞への結合を超えて区別されうる標的抗原との免疫学的反応を含む。この文脈において、用語「実質的な結合」は細胞の取り込みもまた含むことに留意すべきである。実質的な結合はＳＰＥＣＴカメラ及びＰＥＴ分析の、視覚による観察により又は組織学的染色の分析のための定量的な又は半定量的なプログラムを介して直接的に及び定性的に決定されうる。
【００４８】
本発明にしたがって分析されるべき細胞又は組織は好ましくはＥＭＴを経験することが可能な細胞又はＥＭＴを経験することが可能な細胞を含む組織である。より好ましくは、上記細胞又は組織は腫瘍細胞又は腫瘍組織、例えば、ＮＳＣＬＣ細胞又は組織の如き肺癌細胞又は組織又は前立腺癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、頭部及び首の癌、卵巣癌、腎臓癌、胃又は頸部の癌からの細胞又は組織及び例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ及びＲａｊａｓｅｋａｒａｎ（上記）により示されている他の腫瘍細胞又は組織である。
【００４９】
好ましくは、上記細胞又は組織はヒト腫瘍患者からの細胞又は組織である。本発明に係る方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで行われうることに留意すべきである。ｉｎ  ｖｉｖｏ診断法は好ましくはヒト患者に由来する細胞又は組織サンプル、例えば、腫瘍細胞又は腫瘍組織サンプルの体外試験を含む。ｉｎ  ｖｉｖｏ法はＥＤ‐Ｂフィブロネクチン特異的分子を患者、例えば、ヒト患者又は実験動物に投与し、そして上記患者において決定、好ましくはイメージング手順を行うことを含む。
【００５０】
本発明に係るｉｎ  ｖｉｖｏ法は好ましくはＥＤ‐Ｂ結合分子を含む医薬組成物を試験されるべき患者の静脈及び／又は動脈内に注入し、そして存在している場合、細胞又は組織、例えば、腫瘍細胞又は腫瘍組織に結合した標識化ＥＤ‐Ｂ結合分子を検出することにより行われる。放射性同位体標識化結合分子が使用される場合、上記検出はシンチグラフィー、ＳＰＥＣＴ又はＰＥＴにより行われうる。
【００５１】
本発明に係る方法は治療に対する、好ましくは抗腫瘍治療に対する感受性についての患者、好ましくは腫瘍患者の分類に特に好適である。上記方法はある治療プロトコールに対する感受性を決定するために、上記患者の抗腫瘍治療の開始前に行われうる。あるいは又はさらに、上記方法は上記患者の抗腫瘍治療中にもまた行われうる。上記抗腫瘍治療は好ましくは、任意にさらなる抗腫瘍剤の投与及び／又は放射線治療を伴う、ＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストの投与を含む。上記ＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストは小分子ＥＧＦＲ阻害剤、例えば、エルロチニブ又はジェフィチニブの如きＥＧＦＲキナーゼ阻害剤から選択されうる。あるいは、上記ＥＧＦ／ＥＧＦＲアンタゴニストはセツキシマブの如き抗ＥＧＦＲ抗体から選択されうる。
【００５２】
単一治療として又はイリノテカンとの組み合わせで推奨されるセツキシマブのヒトへの用量は静脈内投与される開始ロード用量として４００ｍｇ／ｍ2である。推奨される毎週の維持用量はこれもまた静脈内投与される２５０ｍｇ／ｍ2である。上記のような用量管理が典型的に本発明にしたがって患者に適用されうるが、より低い又はより高い用量もまた可能である。
【００５３】
特に好ましい態様において、本発明に係る方法はエルロチニブの如きＥＧＦＲアンタゴニストを用いる抗腫瘍治療の開始前に行われる。それにより治療抵抗性患者は治療感受性患者から区別され、それにより有効でない腫瘍治療を高い率で減少させうる。
【００５４】
さらに、本発明は以下の実施例によりさらに詳細に説明されうる。
【実施例】
【００５５】
実施例１：Ｌ１９誘導体の生成
Ｌ１９誘導体ＡＰ３９の生成は、その内容が本明細書中に援用されるＷＯ  ０３／０５５９１７中に示されているように行われる。
実施例２：Ｌ１９誘導体の放射性同位体での標識化
標識化Ｌ１９誘導体ＡＰ３９‐Ｔｃ９９ｍの生成は、その内容が本明細書中に援用されるＷＯ  ０３／０５５９１７中に示されているように行われる。
実施例３：標識化Ｌ１９誘導体のＮＳＣＬＣ細胞系への結合研究
結合研究をマウスにおける２のヒトＮＳＣＬＣ腫瘍モデル：エルロチニブ感受性上皮型モデルであるＮＣＩ‐Ｈ２９２、及びエルロチニブ抵抗性間葉型モデルであるＣａｌｕ‐６において行った。
【００５６】
ＴＣＥＰ還元ＡＰ３９を３‐（Ｎ‐マレイミドプロピオニル）ビオシチン（Ｓｉｇｍａ）を用いてビオチン付加した。ビオチン付加ＡＰ３９のＮＣＩ‐Ｈ２９２及びＣａｌｕ‐６腫瘍組織の凍結切片（５‐１０μｍ）へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合をＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｓｉｇｍａ）及び液体ＤＡＢ基質パック（Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｐａｃｋ）（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）を利用することにより製造業者のプロトコールにしたがって決定した。ビオチン付加ＡＰ３９のより広範囲な結合はＣａｌｕ‐６腫瘍組織（図１Ｂ）に比較してＮＣＩ‐Ｈ２９２腫瘍組織（図１Ａ）中で観察された。
【００５７】
Ｔｃ‐９９ｍ放射性標識ＡＰ３９を約１１１ｋＢｑの用量でＮＣＩ‐Ｈ２９２及びＣａｌｕ‐６腫瘍保持ヌードマウス（体重約３０ｇ）に静脈内注入した。上記腫瘍内の放射活性密度を上記物質の投与１時間後にガンマ‐カウンターを用いてｅｘ  ｖｉｖｏで計測した。Ｔｃ‐９９ｍ‐ＡＰ３９の濃度はＮＣＩ‐Ｈ２９２腫瘍組織において実質的により高いことが推測されうる（図２）。
【００５８】
Ｔｃ‐９９ｍ放射性標識ＡＰ３９を約１５０ＭＢｑの用量でＮＣＩ‐Ｈ２９２及びＣａｌｕ‐６腫瘍保持ヌードマウス（体重約３０ｇ）に静脈内注入した。ＳＰＥＣＴイメージングを上記物質の投与４時間後に行った。この調査の結果は、ＮＣＩ‐Ｈ２９２（図３Ａ）腫瘍はＣａｌｕ‐６（図３Ｂ）腫瘍よりＳＰＥＣＴイメージングによりかなりよく描写されうることを示している。
実施例４：Ｎ‐［６‐（４‐［18Ｆ］フルオロベンジリデン）アミノオキシヘキシル］マレイミドＡＰ３９（［18Ｆ］ＦＢＡＭ‐ＡＰ３９）の合成
［18Ｆ］ＦＢＡＭを文献（Ｂｅｒｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．  ２００７，  ３４（１），  ５‐１５）にしたがってＧＥ  ｔｒａｃｅｒｌａｂ上で１ポット合成で合成し、そしてイソクラティック（無勾配）半調製済みＨＰＬＣ（ｔR＝１５分；６５／３５  水／ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ；ＡＣＥ  ５  Ｃ１８‐ＨＬ  ２５０*１０ｍｍ；５μｍ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＡＣＥ３２１‐２５１０）により精製した。典型的な実験で、［18Ｆ］ＦＢＡＭを崩壊について修正される３０〜４０％放射性化学収率で７５分後に５００〜１，０００ＭＢｑの量で単離した。ＨＰＬＣ後、総容量をＣ‐１８  ＳＰＥにより減少させ、そして［18Ｆ］ＦＢＡＭを２ｍＬ  ＭｅＣＮ中に調合し、そして乾燥するまで５５℃で窒素流中で乾燥させた。［18Ｆ］ＦＢＡＭをＤＭＳＯ／０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．４）（１／９（ｖ／ｖ））中に溶解し、そしてＡＰ３９（９０μＬ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の１００μｇ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。結合率を分析ＨＰＬＣ（ｔR＝１３．２分；ＴＳＫｇｅｌ  ｓｕｐｅｒＳＷ２０００；３００*４．６ｍｍ；４μ；Ｔｏｓｏ  Ｂｉｏｓｅｐ；ＴＳＫ緩衝液（０．１Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4／０．１Ｍ  Ｎａ2ＳＯ4／０．０５％  ＮａＮ3；ｐＨ６．７，イソクラティック  ０．３ｍｌ／分））により確認した。Ｆ‐１８標識化ＡＰ３９をＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）ＮＡＰ５カートリッヂを用いたゲルろ過により精製し、そしてＨＰＬＣ及び電気泳動により分析した。免疫反応性の評価をＢｉｒｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９，  ２３１，  ２３９‐２４８）にしたがってＥＤ‐Ｂフィブロネクチン結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを含むカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより行った。非修正結合率は［18Ｆ］ＦＢＡＭについて１０〜１５％であった。
【００５９】
18Ｆ‐標識化ＡＰ３９、詳細には［18Ｆ］ＦＢＡＭ‐ＡＰ３９は詳細にはＰＥＴでの本発明に係る方法及び使用のために特に有用である。
実施例５：Ｎ‐スクシンイミジル４‐［18Ｆ］フルオロ安息香酸塩ＡＰ３９（［18Ｆ］ＳＦＢ‐ＡＰ３９）の合成
［18Ｆ］ＳＦＢを文献（Ｋａｂａｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  ２００８，  ５１，  ６８‐７１）にしたがってＧＥ  ｔｒａｃｅｒｌａｂ上で１ポット合成で合成し、そしてイソクラティック半調製済みＨＰＬＣ（ｔR＝１６．５分；６５／３５  水／ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ；ＡＣＥ  ５  Ｃ１８‐ＨＬ  ２５０*１０ｍｍ；５μｍ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．：ＡＣＥ３２１‐２５１０）により精製した。典型的な実験で、［18Ｆ］ＳＦＢを崩壊について修正される３０〜３５％放射性化学収率で６５分後に４００〜８００ＭＢｑの量で単離した。ＨＰＬＣ後、［18Ｆ］ＳＦＢの容量をＣ‐１８  ＳＰＥにより減少させ、そして［18Ｆ］ＳＦＢを２ｍＬ  ＭｅＣＮ中に調合し、そして乾燥するまで５５℃で窒素流中で乾燥させた。［18Ｆ］ＳＦＢをＤＭＳＯ／０．１Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ＝８．６）（１／９（ｖ／ｖ））中に再溶解し、そしてＡＰ３９（９０μＬ  ＰＢＳ，ｐＨ７．４中の１００μｇ）を添加した。インキュベーションを３７℃で３０分間行った。結合率を分析ＨＰＬＣ（ｔR＝１３．２分；ＴＳＫｇｅｌ  ｓｕｐｅｒＳＷ２０００；３００*４．６ｍｍ；４μ；Ｔｏｓｏ  Ｂｉｏｓｅｐ；ＴＳＫ緩衝液（０．１Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4／０．１Ｍ  Ｎａ2ＳＯ4／０．０５％  ＮａＮ3；ｐＨ６．７，イソクラティック  ０．３ｍｌ／分）により確認した。Ｆ‐１８標識化ＡＰ３９をＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）ＮＡＰ５カートリッジを用いたゲルろ過により精製し、そしてＨＰＬＣ及び電気泳動により分析した。免疫反応性の評価をＢｉｒｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．にしたがってＥＤ‐Ｂフィブロネクチン結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを含むカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより行った。非修正結合率は［18Ｆ］ＦＢＡＭについて１０〜１２％であった。
【００６０】
18Ｆ‐標識化ＡＰ３９、詳細には［18Ｆ］ＳＦＢ‐ＡＰ３９は詳細にはＰＥＴでの本発明に係る方法及び使用に特に有用である。
【配列表】
2010539112000001.app
【国際調査報告】
2010539112.tif 000004
2010539112.tif 000005
2010539112.tif 000006
2010539112.tif 000007
2010539112.tif 000008