(57)【要約】アゼライン酸またはその誘導体もしくはアナログは、植物において病原体に対する強くかつより速い防御応答を誘導する。アゼライン酸処理だけでは公知の防御関連遺伝子の多くを誘導しないが、病原体に曝露されると植物の防御シグナル伝達を活性化する。植物において植物病原体に対する抵抗性を増加させる方法であって、該方法は、（ａ）有効な量のアゼライン酸またはアゼライン酸誘導体を含む組成物を得ること；および（ｂ）該植物の構成要素を該組成物と接触させて、該植物における該病原体に対する抵抗性を増加させることを包含する、方法。
2010536785.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物において植物病原体に対する抵抗性を増加させる方法であって、該方法は、
（ａ）有効な量のアゼライン酸またはアゼライン酸誘導体を含む組成物を得ること；および
（ｂ）該植物の構成要素を該組成物と接触させて、該植物における該病原体に対する抵抗性を増加させること
を包含する、方法。
【請求項２】
前記病原体が、細菌性、真菌性、卵菌性、およびウイルス性の植物病原体から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物が単子葉植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記植物は作物植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記植物は観賞植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アゼライン酸は、約０．０１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アゼライン酸の前記有効な量は、１ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記植物の前記構成要素は、葉、根、茎、果実、花、および種子からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、植物栄養素との組み合わせで投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、光の存在下で接触させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アゼライン酸誘導体が、水溶性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記アゼライン酸誘導体が、アゼライン酸ナトリウム、アゼライン酸カリウム、およびアゼライン酸エステルからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が湿潤剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、サリチル酸もしくはエチレンもしくはジャスモン酸またはそれらの組み合わせに依存する防御機構を誘導する薬剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤が、サリチル酸アゴニスト、反応性酸素種、ベンゾチアゾール、ジャスモン酸、およびエチレンまたはそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が植物出液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
植物を刺激して病原体に対する抵抗性応答を誘導する方法であって、該方法は：
（ａ）有効な量のアゼライン酸またはその誘導体を含む組成物を得ること；および
（ｂ）植物の構成要素を該組成物と接触させて該植物を刺激して、病原体の攻撃に対する該抵抗性応答を誘導すること
を包含する、組成物。
【請求項１８】
前記植物の構成要素が植物の葉である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抵抗性応答が、全身獲得抵抗性である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が、病原体攻撃の前に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
有効な量のアゼライン酸またはその誘導体と植物栄養素とを含む、植物防御誘導性組成物。
【請求項２２】
湿潤剤を含む、請求項２１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年８月１６日に出願した米国仮出願第６０／９５６，３０１号に対する優先権を主張する。この出願の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
合衆国政府は、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＥｎｅｒｇｙとＵＴ−Ｂａｔｔｅｌｌｅ，ＬＬＣとの間の契約番号第ＤＥ−ＡＣ０５−００ＯＲ２２７２５号によって、そしてまたＵ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって与えられた契約番号第ＩＯＢ−０４５０２０７号によっても、本発明における権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
アゼライン酸、その誘導体およびアナログは、植物病原体に対する抵抗性を増大させ、そして病原体感染に抵抗するよう植物を刺激する。
【０００４】
植物は、数百の遺伝子の誘導に関与する応答において、多くの病原体（病原性（ｖｉｒｕｌｅｎｔ）、非病原性（ａｖｉｒｕｌｅｎｔ）、および非宿主）に対して局所防御および全身防御の両方を活性化する。したがって、植物は病原体の増殖を制限することを助ける防御応答において、かなりの投資をする。多くの病原体に対する植物の応答はしばしば、病害の程度に基づいて、適合性または不適合性のいずれかに分類される。これらの両極端の中で、その病原体は典型的には増殖し、そして広範囲の病害症状を引き起こす（適合性の場合）か、またはその複製が比較的制限される（不適合性の場合）。不適合性応答（「抵抗性応答」とも呼ばれる）の場合、同種（ｃｏｇｎａｔｅ）の植物Ｒタンパク質と直接または間接的に相互作用する、病原体由来の非病原性（Ａｖｒ）タンパク質の知覚によってシグナル伝達が始まる。適合性の相互作用においてさえ、今や植物は多くの場合、病原体を制限するのに部分的に有効である防御応答を展開し得ることが明らかである。病原体感染後の全体的な発現プロファイリングは、適合性応答および不適合性応答は主に、同じセットの標的遺伝子に影響を与えるが、それらが誘導される速度および程度は、適合性の場合、より低いことを示唆する。これらの標的遺伝子のサブセットは、シグナル伝達カスケードに直接関与するかまたはシグナル伝達中間体を産生する、重要な調節性タンパク質をコードするので、これらの標的遺伝子のサブセットが誘導される可能性が高い。これらの調節性遺伝子が、異なる条件下でどのように活性化されるのか理解することは、調節性回路へのシグナルの流入に対する重要な洞察を与え得る。
【０００５】
サリチル酸（ＳＡ）合成の誘導は、様々な適合性および不適合性の病原体に対する抵抗性を与えるために必要である。ＳＡの蓄積が減少しているかまたはＳＡのシグナル伝達が減少している多くの変異体はまた、グラム陰性細胞外病原体の１種であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅのような病原体に対する感受性の増加を示す。
【０００６】
局所防御応答に重要であることに加えて、ＳＡは、全身獲得抵抗性（ＳＡＲ）と呼ばれる、病原体に対する植物全体の適応応答に関係していた。非病原性病原体による感染後、ＳＡは全身の非感染組織に蓄積する。この全身組織は、そうでなければ高度に病原性である多くの病原体に対して増加した抵抗性を示す。全身組織においてＳＡを蓄積できないかまたはＳＡのレベルの増加を知覚できない植物は、ＳＡＲを発達させない。しかし、ＳＡはＳＡＲにおける重要な移動性防御シグナルではないと考えられ、そして防御応答の間に産生される、今までのところ同定されていないシグナルも、ＳＡＲの確立において役割を果たし得る。これらの同定されていないシグナル分子は、防御シグナルまたはシグナル中間体である可能性があるので、これらの同定されていないシグナル分子の正体および性質を発見することが重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（概要）
アゼライン酸およびその誘導体またはアナログは、植物を刺激して、病原体の攻撃に対するその抵抗性応答を活性化する。アゼライン酸およびその誘導体は、ほとんどの防御関連遺伝子の発現を活性化することなく、病原体の攻撃の前に、植物防御応答を誘導する。
【０００８】
植物において病原体に対する抵抗性を増加させる方法は、以下のものを含む：
（ａ）有効な量のアゼライン酸またはそのアナログもしくは誘導体を含む組成物を得ること；および
（ｂ）植物構成要素をその組成物と接触させて、植物における病原体に対する抵抗性を増加させこと。
【０００９】
適切な植物構成要素は、葉、根、茎、果実、花、および種子を含む群から選択される。
【００１０】
適切なアゼライン酸誘導体は、一般的に水溶性である。アゼライン酸誘導体の例としては、アゼライン酸ナトリウム、アゼライン酸カリウム、およびアゼライン酸エステルが挙げられる。
【００１１】
植物を刺激して病原体に対するその防御機構を誘導する方法は、以下のものを含む：
（ａ）アゼライン酸またはそのアナログもしくは誘導体を含む組成物を得ること；および
（ｂ）植物をその組成物と接触させて植物を刺激して、病原体の攻撃に応答したその防御機構を誘導すること。
【００１２】
病原体感染に対して植物を保護する方法は、以下のものを含む：
（ａ）アゼライン酸またはそのアナログもしくは誘導体を含む組成物を提供すること；および
（ｂ）植物をその組成物に曝露して、植物を病原体感染に対して保護する。
【００１３】
植物病原体のいくつかの例としては、細菌性、真菌性、卵菌性、およびウイルス性の植物病原体が挙げられる。本明細書中で記載されたような処理に適切な植物としては、単子葉植物および双子葉植物が挙げられる。例えば、単子葉植物は作物植物である。適切な植物はまた、観賞植物である。
【００１４】
組成物中のアゼライン酸濃度は、約０．０１ｍＭから１０ｍＭの範囲、および０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、および５ｍＭのような、間にあるあらゆる濃度を含み得る。アゼライン酸を１つまたはそれより多くの他の防御誘導成分と混合するなら、アゼライン酸の濃度はより低くてもよい。アゼライン酸またはアナログを含めてその誘導体は、植物の葉にスプレーされる。組成物は、植物の根からも取り込まれ得る。その組成物を、一般的に光の存在下で投与する。
【００１５】
本明細書中で開示される組成物をまた、植物栄養素との組み合わせとして投与し得る。その組成物を、病原体の攻撃の前、または病原体の攻撃中に投与し得る。
【００１６】
その組成物はまた、エチレンまたはジャスモン酸に依存する防御機構を誘導する成分を含み得る。
【００１７】
植物において病害抵抗性を誘導する方法は、以下を含む：
（ａ）植物を、有効な濃度のアゼライン酸およびアゼライン酸の機能に実質的に影響を与えない任意の他の成分から本質的になる組成物で前処理すること；
（ｂ）病原体に対する植物の防御応答を刺激することによって、植物において病害抵抗性を誘導すること。
【００１８】
植物において全身獲得抵抗性応答を誘導する方法は、以下を含む：
（ａ）アゼライン酸またはそのアナログもしくは誘導体を含む組成物を、植物の１つまたはそれより多くの部分に適用すること；および
（ｂ）病原体に対して植物全体における全身抵抗性応答を誘導すること。
【００１９】
病原体感染に対して植物を刺激する方法は、以下を含む：
（ａ）植物を、植物出液（ｐｌａｎｔ  ｅｘｕｄａｔｅ）の成分を含む組成物と接触させることであって、ここでその組成物は病原関連タンパク質１（ＰＲ−１）を有意に誘導しないこと；および
（ｂ）病原体感染に対して植物を刺激すること。
【００２０】
植物において病原体抵抗性を誘導する方法は、以下を含む：
（ａ）植物を、アゼライン酸またはその誘導体を含む組成物と接触させること；
（ｂ）植物を、１つまたはそれより多くの植物防御応答を活性化する薬剤と接触させること；および
（ｃ）植物において病原体抵抗性を誘導すること。
【００２１】
アゼライン酸またはその誘導体と共に使用し得る適切な薬剤としては、例えばサリチル酸アゴニスト、反応性酸素種、ベンゾチアゾール、ジャスモン酸、およびエチレンが挙げられる。
【００２２】
植物防御誘導組成物は、有効な量のアゼライン酸またはその誘導体および植物栄養素を含む。
【００２３】
植物生育促進組成物は、有効な量のアゼライン酸またはその誘導体および植物栄養素を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、病原体感染植物からの葉柄出液は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｃｏｌ植物において病害抵抗性および防御マーカーを誘導するシグナル伝達化合物を有することを示す。（Ａ）０．２５ｍＭのＥＤＴＡおよび偽処理Ｃｏｌからの葉柄出液（Ｃｏｌ−Ｍｅｘ）およびａｖｒＲｐｔ２を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ接種したＣｏｌからの葉柄出液（Ｃｏｌ−Ｐｅｘ）による処理の２日後における、野生型Ｃｏｌの葉におけるＰＲ１発現。ｍＲＮＡの量の内部コントロールとしてＡｔＥＦ１−αを用いた。（Ｂ）病原体誘導した葉柄出液を含むシリンジ接種によって前処理した（Ｃｏｌ−Ｐｅｘ）Ｃｏｌの葉における減少した細菌の増殖。異なる文字は、統計学的に有意な差異を示す（ｐ＜０．００１、ｔ検定、ｎ＝６）。（Ｃ）病原体接種後に様々な時間で採取した、異なる出液に浸潤した２日後における、Ｃｏｌの葉における相対的な遺伝子発現。アステリスクの数は、所定のレベルの統計学的有意性で互いに異なったサンプルを示す（＊＊ｐ＜０．０１）。０．２５ｍＭのＥＤＴＡをコントロールとして適用した（Ｍ）。
【図２】図２は、いくつかの防御変異体は、Ｃｏｌ−Ｐｅｘ出液によって誘導された、減弱した防御関連遺伝子の誘導および／または病原体抵抗性を示すことを示す。（Ａ）活性な出液の処理の２日後における、野生型（ＷＴ）（Ｃｏｌ）および変異体植物の葉における相対的防御関連遺伝子発現。（Ｂ）Ｃｏｌ−Ｍｅｘ（白いバー）およびＣｏｌ−Ｐｅｘ（黒いバー）によって処理した、野生型Ｃｏｌおよび変異体植物の葉における、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ  ＰｍａＤＧ３系統の増殖。ＰｍａＤＧ３（ＯＤ６００＝０．０００１）を、出液による前処理の２日後に、葉に浸潤させた。細菌の増殖を、接種後３日目に測定した。アステリスクの数は、所定のレベルの統計学的有意性で互いに異なったサンプルを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）。
【図３】図３は、葉柄出液成分アゼライン酸が、ＰｍａＤＧ３感染に対する植物の抵抗性を誘導することを示す。（Ａ）病原性ＰｍａＤＧ３感染に対する、アゼライン酸処理による局所および全身抵抗性応答。２１−２３日齢の植物の局所または全身性の葉を、病原性ＰｍａＤＧ３系統（ＯＤ６００＝０．０００１）によるチャレンジの２日前に、５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．６）（黒いバー）または５ｍＭのＭＥＳ中１ｍＭのアゼライン酸（ｐＨ５．６、白いバー）で処理した。ＭＥＳおよびアゼライン酸を、シリンジ浸潤によって葉に導入した。アゼライン酸は、局所および全身性の葉の病害症状の有意な減少および病原体の増殖の減少を誘導した。（Ｂ）５ｍＭのＭＥＳ（黒いバー）または５ｍＭのＭＥＳ中１ｍＭのアゼライン酸（ｐＨ５．６、白いバー）で前処理したＣｏｌの葉における、非病原性ＰｍａＤＧ６系統（ａｖｒＲｐｔ２を有するＰｍａＤＧ３）およびＰｍａＤＧ３４（ａｖｒＲｐｍ１を有するＰｍａＤＧ３）の増殖。（Ｃ）２３日齢の植物を、５ｍＭのＭＥＳ中１、１０、１００、および１０００μＭのアゼライン酸または５ｍＭのＭＥＳで２日間前処理し、そして次いでＯＤ６００＝０．０００１の病原性ＰｍａＤＧ３に感染させた。１００および１０００μＭのアゼライン酸処理は、試験した条件下で細菌の増殖の有意な阻害を引き起こした。（Ｄ）植物を、病原性ＰｍａＤＧ３による接種の前に、示した時間にわたって５ｍＭのＭＥＳまたは１ｍＭのアゼライン酸で処理した。ＰｍａＤＧ３による接種を、正午と午後１時との間に行った。５ｍＭのＭＥＳ中のアゼライン酸（Ａｚａ）を、手持ち式スプレー（ｓｐｒａｙｅｒ）を用いて植物に適用した。細菌の増殖を、接種後３日目に測定した。アステリスクの数は、所定のレベルで互いに有意に異なったサンプルを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。植物にスプレーしてから４８時間後に接種を行った場合に、有意な保護が起こった。（Ｅ）感染をｐｍ８時と９時との間に行った以外は、植物を（Ｄ）におけるように処理および感染させた。（＊ｐ＜０．０４）。これらの実験を２から４回繰り返して、再現性を確認した。
【図４】図４は、全身獲得抵抗性（ＳＡＲ）を欠損した植物およびサリチル酸（ＳＡ）欠乏変異体の葉における、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ（ＰｍａＤＧ３系統）の増殖を示す。５ｍＭのＭＥＳ中１ｍＭのアゼライン酸を、病原性ＰｍａＤＧ３（ＯＤ６００＝０．０００１）のチャレンジ接種の２日前に、野生型Ｃｏｌ、ＳＡＲ欠損変異体およびＳＡ欠乏変異体（Ａ）およびジャスモン酸／エチレン非感受性変異体（Ｂ）に適用した。アゼライン酸は、本明細書中で試験したＳＡＲ欠損変異体およびＳＡ欠乏変異体において植物抵抗性を誘導しなかった。これは、これらの細胞成分が、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるアゼライン酸によって誘導される抵抗性応答に必要であったことを示唆する。対照的に、ｊａｒ１およびｅｔｒ１変異は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるアゼライン酸誘導抵抗性に影響を与えなかった。その実験を最低３回繰り返した。アステリスクの数は、所定のレベルの統計学的有意性で互いに異なったサンプルを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図５】図５は、野生型Ｃｏｌ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて、アゼライン酸は内因性サリチル酸およびカマレキシンのレベルに影響を与えないが、脂質輸送タンパク質（ＬＴＰ）遺伝子の発現を誘導することを示す。（Ａ）５ｍＭのＭＥＳ（黒いバー）および５ｍＭのＭＥＳ中１ｍＭのアゼライン酸（白いバー）によるスプレー処理後の、Ｃｏｌの葉における遊離サリチル酸レベルおよび総サリチル酸レベルの時間経過。（Ｂ）スプレーによるアゼライン酸処理後のＣｏｌの葉におけるカマレキシンレベル。（Ａ）および（Ｂ）における各実験を、３つの異なるサンプルを用いて行い、そして実験を３回繰り返した。（Ｃ）ＬＴＰ遺伝子（Ａｔ２ｇ３８５３０）の発現は、（Ａ）におけるように行ったアゼライン酸処理後に上昇したが、ＰＲ１および多くの他の防御関連遺伝子の発現は影響を受けなかった。ＲＴ−ＰＣＲ（２３サイクル）を用いて、ＥＦ１ａをローディングコントロールとして、遺伝子発現を評価した。
【図６】図６は、アゼライン酸がＳＡ依存性防御シグナル伝達を刺激することを示す。（Ａ）アゼライン酸処理植物における内因性の遊離ＳＡおよび総ＳＡのレベルは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ感染の間、偽処理植物におけるものよりも有意に高かった。５ｍＭのＭＥＳまたは５ｍＭのＭＥＳ中１ｍＭのアゼライン酸を、１０ｍＭのＭｇＳＯ４（Ｍ）、病原性ＰｍａＤＧ３（Ｖ）およびＡｖｒＲｐｔ２を発現する非病原性ＰｍａＤＧ６（Ａｖ）の接種の２日前に、野生型Ｃｏｌ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉に適用した。接種後異なる時間に葉を収集し、そして内因性の遊離ＳＡレベルおよび総ＳＡレベルを測定した。（Ｂ）病原性ＰｍａＤＧ３感染後の、偽処理植物およびアゼライン酸処理植物の葉における相対的ＰＲ１発現。ＰＲ１の発現を、対数スケールでプロットした。アステリスクの数は、所定のレベルの統計学的有意性で互いに異なったサンプルを示す（＊ｐ＜０．０７５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０１）。
【図７】図７は、病原体感染植物からの出液は、偽処理植物からの出液よりも有意に多いアゼライン酸を含むことを示す。ＰｍａＤＧ６（Ｃｏｌ−Ｐｅｘ）または１０ｍＭのＭｇＳＯ４（Ｃｏｌ−Ｍｅｘ）で７２時間処理した葉からの出液サンプルを、ＧＣ−ＭＳを用いて分析した。活性な出液は、不活性な出液と比較して、平均６．２倍高いレベルのアゼライン酸を含んでいた（偽誘導出液において５．１μＭ、病原体によって誘導した出液において３１．６μＭ、ｐ＝０．０４２、ｔ検定）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（詳細な説明）
内因性防御機構を活性化することによって、植物において病害抵抗性を誘導する方法および組成物が本明細書中で開示される。植物出液成分であるアゼライン酸は、病原体の攻撃に対して植物を刺激することが示される。アゼライン酸はそれ自身、「防御遺伝子」（例えば病原体関連（ＰＲ）遺伝子）の実質的な誘導の非存在下で、植物の基礎にあるシグナル伝達機構を活性化することによって、植物における病原体の攻撃に対する保護を増強する。しかし、病原体によって攻撃されると、アゼライン酸処理植物は、未処理植物と比較して、病原体感染に対して増強された保護を示す。この保護は、防御応答のより強い活性化を伴い、アゼライン酸処理が、病原体の攻撃に対する植物の抵抗性応答を刺激することを示す。アゼライン酸処理は、病原体の攻撃がないときには植物に有意な代謝的負担をかけない。アゼライン酸の構造的および機能的なアナログおよび誘導体も、病原体に対する植物の抵抗性応答を活性化することにおいて適切である。
【００２６】
有効な量のアゼライン酸を含む組成物を、当業者に公知の適切な適用方法によって植物に適用する。例えばアゼライン酸またはその誘導体の安定な配合物を、根への施肥アプローチの一部として、植物栄養素ミックスに含める。地上部へのスプレー（ａｅｒｉａｌ  ｓｐｒａｙｉｎｇ）を用いて植物をアゼライン酸またはその誘導体と接触させる場合、例えば界面活性剤のような、葉の湿潤剤も使用し得る。その組成物を、例えば、スプレー（ｓｐｒａｙｉｎｇ）、アトマイジング（ａｔｏｍｉｚｉｎｇ）、ダスチング（ｄｕｓｔｉｎｇ）、スキャッタリング（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）、コーティングまたは注ぐ、土の中または上に導入する、灌水用水への導入によって、種子の処理によって、または植物病原体が現れ始めた時または保護処理として病原体の出現前にダスチングすることによって、適用し得る。アゼライン酸に基づく組成物を植物と接触させる任意の手段を、その実施態様の実施において使用し得る。その組成物を、許容可能な担体と共に、例えば懸濁液、溶液、エマルジョン、ダスチング粉末、分散性顆粒、湿潤性粉末、乳化性濃縮物、エアゾール、含浸された顆粒、アジュバント、コーティング性ペースト、または例えばポリマー物質中へのカプセル化封入でもある組成物に配合し得る。
【００２７】
本明細書中で開示された、アゼライン酸またはその誘導体を含む組成物を、界面活性剤、不活性な担体、保存剤、湿潤剤、施肥刺激物質、誘引物質、カプセル封入剤、結合剤、乳化剤、色素、ＵＶ保護剤、緩衝液、流動化剤または肥料、微量栄養素ドナーまたは植物の生育に影響を与える他の調製物の添加によって得ることができる。
【００２８】
農学的に許容可能な担体は公知であり、そして例えばカオリン粘土、アタパルジャイト粘土、ベントナイト、酸性粘土、パイロフィライト、タルク、珪藻土、方解石、コーンスターチ粉末、クルミの殻の粉末、尿素、硫酸アンモニウム、合成水和二酸化珪素等の微細な粉末または顆粒のような、固体担体を含む。許容可能な液体担体としては、例えばキシレン、メチルナフタレン等のような芳香族炭化水素、イソプロパノール、エチレングリコール、セロソルブ等のようなアルコール、アセトン、シクロヘキサノン、イソホロン等のようなケトン、大豆油、綿実油、コーン油等のような植物油、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等が挙げられる。
【００２９】
適切な湿潤剤としては、例えばアルキルベンゼンスルホネートおよびアルキルナフタレンスルホネート、アルキルスルホネートおよびアルキルアリールスルホネート、アルキルアミン酸化物、アルキルリン酸エステルおよびアルキルアリールリン酸エステル、有機シリコーン、フルオロ−有機湿潤剤、アルコールエトキシレート、アルコキシル化アミン、硫酸化脂肪アルコール、アミン、または酸アミド、イソチオン酸ナトリウムの長鎖酸エステル、スルホコハク酸ナトリウムのエステル、硫酸化脂肪酸エステルまたはスルホン酸化脂肪酸エステル、石油スルホネート、スルホン酸化植物油、ジ３級アセチレングリコール、ブロックコポリマー、アルキルフェノールのポリオキシアルキレン誘導体（特にイソオクチルフェノールおよびノニルフェノール）およびヘキシトール無水物（例えばソルビタン）のモノ高級脂肪酸エステルのポリオキシアルキレン誘導体が挙げられる。分散剤としては、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、リグニンスルホン酸ナトリウム、ポリマー性アルキルナフタレンスルホネート、ナフタレンスルホン酸ナトリウム、ポリメチレンビスナフタレンスルホネート、および中性化ポリオキシエチル化誘導体または環置換アルキルフェノールホスフェートが挙げられる。安定なエマルジョンを産生するために、珪酸アルミニウムマグネシウムおよびキサンタンガムのような安定剤も使用し得る。
【００３０】
アゼライン酸またはその誘導体の適切な濃度は、１ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭおよび５００ｍＭのような、間にある濃度のいずれも含む、約０．１ｍＭから約１０００ｍＭの範囲である。植物の性質、植物の齢、投与の方式、および環境条件に依存して、より低いまたはより高い濃度のアゼライン酸も適用し得る。それに加えて、アゼライン酸アナログまたはアゼライン酸誘導体の安定性、毒性、および有効性に依存して、適切な濃度は約０．０１ｍＭから約１０ｍＭの範囲であり得る。アゼライン酸およびその誘導体またはアナログの最適な濃度を、例えば感染後の病原体の増殖または遺伝子発現を測定することによって、または任意の適切な抵抗性応答マーカーを決定することによって、本明細書中で開示された１つまたはそれより多くの方法を用いることによって決定する。アゼライン酸またはその誘導体から本質的になる組成物は、ストック懸濁液の形式または乾燥状態であり得る。
【００３１】
アゼライン酸のアナログおよび誘導体の望ましい考慮すべき問題のいくつかは、インビボおよびエキソビボの安定性の延長、有効性の増加、植物毒性の抑制、葉および／または根から吸収される能力、およびもしあるなら、植物製品を通しての任意の残留誘導体またはアナログをヒトが摂取したときの副作用の低減を含む。そのアナログおよび誘導体は、アゼライン酸の構造アナログ、およびアゼライン酸の安定性もしくは有効性または両方を延長する配合物を含む。
【００３２】
アゼライン酸またはその誘導体をまた、病原体に対する植物抵抗性応答を増強する他の組成物と組み合わせて使用し得る。例えば、適切な量のアゼライン酸またはその誘導体を、植物においてサリチル酸応答を活性化する適切な量の化合物（例えばサリチル酸（ＳＡ）または２，６−ジクロロイソニコチン酸（ＩＮＡ）、３−ヒドロキシピコリン酸およびベンゾ（１，２，３）チアジアゾール−７−カルボチオ酸Ｓ−メチルエステル（ＢＴＨまたはベンゾチアジアゾール）のようなＳＡアゴニスト）と混合し得る。同様に、適切な量のアゼライン酸またはその誘導体を、ジャスモン酸およびエチレンシグナル伝達経路を活性化する適切な量の化合物と混合し得る。さらに、適切な量のアゼライン酸またはその誘導体を、適切な量の反応性酸素種、例えば過酢酸または過酸化物化合物、またはレドックスサイクリング薬剤のような、反応性酸素中間体を産生する化合物と混合し得る。同様に、適切な量のアゼライン酸またはその誘導体を、植物への病原体の攻撃を模倣する、適切な量のハーピンのようなエリシターと混合し得る。ＳＡ、ＢＴＨのようなＳＡアゴニスト、反応性酸素種、エリシターまたは任意の他の防御誘導化合物を、アゼライン酸と共に、またはアゼライン酸を適用した後に適用し得る。これらのさらなる防御誘導化合物をまた、アゼライン酸適用の前に適用し得る。これらのさらなる防御誘導化合物の濃度は、約０．１μＭから約１００μＭまで、または１ｍＭまで変動し得る。もしこれらのさらなる化合物をアゼライン酸の適用後に適用するなら、連続した適用の間に約４〜２４時間の期間を与える。アゼライン酸またはこれらのさらなる化合物の追加適用も同様に行い得る。
【００３３】
「アゼライン酸誘導体」という用語は、アゼライン酸から誘導される任意の化学物質、例えばアゼライン酸の特定の塩を含む。アゼライン酸誘導体はまた、構造アナログを含む。アゼライン酸誘導体は、アゼライン酸のエステルを含み、それは例えばジメチルアゼレート、ジエチルアゼレート、ジプロピルアゼレート、ジヘキシルアゼレート、ジ−（ｔ−ブチル）アゼレート等を含む。さらなる誘導体は、例えばアゼロイル（ａｚｅｌｏｙｌ）グリシン、アゼライン酸のモノナトリウム塩またはジナトリウム塩、モノカリウム塩またはジカリウム塩カリウム塩を含む。一般的に、アゼライン酸誘導体は、もし必要なら水溶性、および／または安定性を増加させる。
【００３４】
アゼライン酸またはその誘導体を含む組成物は、約９５％の純度のアゼライン酸、または９０％の純度または８５％の純度または８５％の純度または約７５％より高い純度のアゼライン酸を含み得る。有効な量のアゼライン酸またはその誘導体を含む、粗製または部分的に精製した植物出液も、組成物として使用するために適切である。
【００３５】
「から本質的になる」という用語は、アゼライン酸またはその誘導体もしくはアナログを活性成分として含み、そして必要に応じて、例えば植物における抵抗性応答の誘導において、アゼライン酸の機能的特質に実質的に影響を与えない任意の他の成分を含み得る組成物を指す。例えば、アゼライン酸から本質的になる組成物は、湿潤剤または担体を含み得る。
【００３６】
「曝露する」および「接触させる」という用語は、例えばスプレーまたは浸潤または根への施肥のような、任意の適切な方法によって、植物をアゼライン酸またはその誘導体で処理する１つまたはそれより多くの方法を指す。
【００３７】
「刺激する」という用語は、病原体に対する有効な抵抗性応答を開始するために植物を準備するプロセスを指す。
【００３８】
「防御関連遺伝子」という用語は、病原体の攻撃の数時間以内に、少なくとも２倍または３倍または５倍より高く誘導される、１つまたはそれより多くの遺伝子を指す。これらの防御関連遺伝子は、病原関連（ＰＲ）遺伝子を含む。例えば、ＰＲ−１は、適切な防御関連遺伝子である。防御関連遺伝子はまた、防御関連マーカーとも考えられ得る。
【００３９】
「全身獲得抵抗性」（ＳＡＲ）という用語は、植物の一部分における病原体の攻撃（または任意の他の抵抗性誘導処理）の際の植物全体の抵抗性応答を指す。
【００４０】
「抗微生物」または「抗微生物活性」という用語は、植物病原体に対する抗細菌、抗ウイルス、抗線虫、および抗真菌の活性を指す。よって、アゼライン酸およびその誘導体は、植物に寄生する昆虫および線虫に対する抵抗性を増強し得る。
【００４１】
「植物病原体」または「植物病害（ｐｌａｎｔ  ｐｅｓｔ）」という用語は、植物に感染し、そして害を引き起こし得る任意の生物を指す。植物の生育を阻害または遅延させることによって、植物の組織に対する損傷によって、植物の防御機構を弱くすることによって、非生物的ストレスに対する植物の抵抗性の低下によって、成熟前の植物死等によって、植物は害を受け得る。植物病原体および植物害虫は、線虫、および真菌、卵菌、ウイルス、および細菌のような生物を含むがこれに限らない。
【００４２】
「病害抵抗性」または「病原体抵抗性」という用語は、その生物が、生物−病原体相互作用の結果である病害の症状を回避することを意味するよう意図される。すなわち、病原体が病害および関連する病害症状を引き起こすことを防ぐ、またはあるいは病原体によって引き起こされる病害症状を最小限にする、または減少させる。
【００４３】
「植物構成要素（ｐｌａｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」という用語は、病原体によって攻撃されるのに適切な任意の植物材料を指す。適切な植物構成要素は、例えば葉、茎、根、花、果実、種子、実生、カルス、塊茎、および植物細胞培養物を含む。
【００４４】
アゼライン酸に基づく組成物は、病原体チャレンジから生じる病害症状を、少なくとも約５％から約５０％、少なくとも約１０％から約６０％、少なくとも約３０％から約７０％、少なくとも約４０％から約８０％、または少なくとも約５０％から約９０％またはそれより多く低減し得る。
【００４５】
目的の植物の例としては、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、アブラナ属の種（例えばＢ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、特に種子油の原料として有用なアブラナ属の種、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ミレット（例えばトウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｎｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、柑橘類の木（シトラス属の種）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、カラスムギ、オオムギ、野菜、観賞植物、および針葉樹が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４６】
野菜としては、例えばトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（例えばＬａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウ類（Ｌａｔｈｙｒｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｉｓｕｍ  ｓｐｐ．）が挙げられる。観賞植物としては、例えばアザレア（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｓｐｐ．）、アジサイ（Ｈｙｄｒａｎｇｅａ  ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ（Ｒｏｓａ  ｓｐｐ．）、チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）、スイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｓｐｐ．）、およびクリサンセマムが挙げられる。
【００４７】
この実施態様の病原体としては、ウイルスまたはウイロイド、細菌、線虫、真菌等が挙げられるがこれに限らない。ウイルスとしては、あらゆる植物ウイルス、例えばタバコモザイクウイルスまたはキュウリモザイクウイルス、輪斑病ウイルス、ネクローシスウイルス、トウモロコシ矮化モザイクウイルス等が挙げられる。主な穀物の特定の真菌、卵菌、およびウイルス病原体としては、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、フザリウム属菌種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、ピチウム属菌種（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ダイズモザイクウイルス、タバコリングスポットウイルス、タバコ条斑ウイルス、トマト黄化えそウイルス（Ｔｏｍａｔｏ  ｓｐｏｔｔｅｄ  ｗｉｌｔ  ｖｉｒｕｓ）、スクレロティニア属（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）、ツユカビ属（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）、クラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ウドンコカビ属（Ｅｒｙｓｏｐｈｅ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、さび病菌属種（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｐｐ．）、およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）。特定の細菌性植物病原体としては、植物に感染するあらゆる細菌種が挙げられ、そしてキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）（例えばＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ  ｐｖ．ａｕｒａｎｔｉｆｏｌｉｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）（例えばＥｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｓｕｂｓｐ．ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）（例えばＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ、およびＸｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａが挙げられるがこれらに限定されない。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例は、説明目的のみのためであり、そしてその開示の範囲を制限することを意図しない。
【００４９】
（実施例１：葉柄出液は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ感染に対する防御応答を誘導する）
可能性のある防御誘導シグナル分子の産生を誘導するために、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉に、全身獲得抵抗性（ＳＡＲ）を誘導するａｖｒＲｐｔ２を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ  ＥＳ４３２６の非病原性誘導体（ＰｍａＤＧ６系統）を浸潤させた。１０ｍＭのＭｇＳＯ４による浸潤を、偽接種コントロールとした。１２〜１５時間後、葉を切り出し、そして葉柄から運び出される、篩部成分であると推定される物質を収集するために、１ｍＭのＥＤＴＡ中に置いた。ＥＤＴＡは創傷部位におけるカロースの産生を阻害し、そして切断末端が詰まることを防ぎ、それによって可能性のある防御誘導シグナル分子の収集を可能にする。４分の１の濃度の細菌非含有葉柄出液を葉に浸潤させて、その防御応答を活性化する能力を試験した。図１Ａは、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ、偽誘導出液（Ｃｏｌ−Ｍｅｘ）、または病原体で誘導した出液（Ｃｏｌ−Ｐｅｘ）による処理の２日後の葉における、サリチル酸（ＳＡ）シグナル伝達マーカーの１つであるＰＲ１の発現レベルを示す。Ｃｏｌ−Ｐｅｘは、Ｃｏｌ−Ｍｅｘによる処理後に見出されるものと比較して、高レベルのＰＲ１発現を引き起こした。これらのデータは、Ｃｏｌ−Ｐｅｘにおいて、ＰＲ１発現を誘導し得る、１つまたはそれより多くの生物学的に活性なシグナル分子が存在することを示す。
【００５０】
Ｃｏｌ−Ｐｅｘが病原体感染に対する抵抗性も与え得るかどうかを試験するために、空のベクターを有するＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ  ＥＳ４３２６の病原性誘導体（ＰｍａＤＧ３系統）を、出液による前処理の２日後、２５日齢の植物の葉に接種した。３日後の細菌増殖は、偽処理植物およびＣｏｌ−Ｍｅｘ処理植物のものと比較して、Ｃｏｌ−Ｐｅｘで前処理した葉において有意に抑制された（図１Ｂ）。これらのデータは、非病原性細菌を接種した葉からの葉柄出液の生物学的活性を示す。
【００５１】
活性な出液において見出されるシグナル分子は、ＳＡＲ誘導性細菌による感染後の全く異なった時間に誘発され得る。従って、葉柄出液を、非病原性ＰｍａＤＧ６による感染後様々な時間において収集し、そして４分の１の濃度の出液を葉に浸潤させ、それを処理の２日後にＰＲ１発現に関して分析した（図１Ｃ）。発現レベルを、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ処理植物において見出される発現レベルに対して正規化した。病原体接種の４８時間後および７２時間後に収集された葉柄出液が、ＰＲ１発現を誘導した。ＰＲ１発現のレベルは、病原体接種の４８時間後に収集されたＣｏｌ−Ｐｅｘに浸潤させた葉において有意に高かった。
【００５２】
活性な出液は、一連のＳＡＲ欠損変異体（ＳＡＲ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）およびＳＡ欠乏（ＳＡ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）変異体において、ＡＬＤ１およびＰＲ１発現を誘導し得るかどうかも試験した。活性なＣｏｌ−Ｐｅｘ出液を、総ＲＮＡの単離のために組織を収集する２日前に、野生型植物および変異体植物の葉に浸潤させた。図２Ａは、野生型の葉における発現に対して正規化した、異なる変異体における相対的ＰＲ１発現レベルを示す。Ｃｏｌ−Ｐｅｘは、ｎｄｒ１、ｐａｄ４、ｎｐｒ１、ｓｉｄ１およびｓｉｄ２の葉において、ＰＲ１発現を弱く誘導したのみであった。これらのデータは、ＳＡＲに必須のこれらの細胞成分は、葉柄出液中のシグナル分子に対する応答にも必要であったことを示す。さらに、Ｃｏｌ−Ｐｅｘによって誘導された植物抵抗性は、試験したＳＡＲ欠損変異体およびＳＡ欠乏変異体において、完全に消滅した（図２Ｂ）。Ｃｏｌ−Ｐｅｘは、ｄｔｈ９変異体植物（これは、ＳＡＲの維持が損なわれていることが公知であり、そしてＳＡ処理に応答して抵抗性を誘導することができない）において、依然として活性であった（ｐ＜０．０５、ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定）。
【００５３】
（実施例２：高レベルのアゼライン酸が、活性な葉柄出液に蓄積する）
活性な出液中の代謝産物を、偽誘導出液の代謝産物と比較して、植物防御の誘導を担う分子を発見した。出液中の約１６０個の代謝産物のレベルを、質量分析法と組み合わせたガスクロマトグラフィー（９５％ジメチル／５％ジフェニルポリシロキサンカラムを用いる）（ＧＣ−ＭＳ）を用いて分析した。Ｃｏｌ−Ｍｅｘのものと比較して高レベルのアゼライン酸（Ｃ９Ｈ１６Ｏ４）が、活性なＣｏｌ−Ｐｅｘ調製物において検出された（表１）。各実験による応答率の差は、異なる時間で生育した植物におけるアゼライン酸の基底レベルにおける変動に主に由来した。
【００５４】
図７に示すように、活性出液は、不活性出液より平均６．２倍高いレベルのアゼライン酸を含んでいた。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
（実施例３：アゼライン酸は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ感染に対する抵抗性応答を与える）
病害抵抗性の誘導におけるアゼライン酸の生物学的活性。１ｍＭのアゼライン酸を、３週齢の植物の葉３および葉４に浸潤させた。２日後、植物の葉３および葉４上で、またはアゼライン酸で前処理しなかった上部の葉（全身性の葉）に病原性ＰｍａＤＧ３を接種した。５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．６）に溶解したアゼライン酸（１ｍＭ）は、植物細胞に毒性ではなかった。アゼライン酸処理植物の局所および全身性の両方の葉において、ＰｍａＤＧ３の増殖は、偽処理植物でのものと比較して有意に低減した（図３Ａ）。偽処理植物と異なり、アゼライン酸処理植物は、非常にわずかな病害症状の発達しか見せなかった。偽処理植物およびアゼライン酸処理植物をまた、ａｖｒＲｐｔ２を有するＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｍａｃｕｌｉｃｏｌａの非病原性誘導体（ＰｍａＤＧ６）またはａｖｒＲｐｍ１を有するＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｍａｃｕｌｉｃｏｌａの非病原性誘導体（ＰｍａＤＧ３４）に浸潤させた。アゼライン酸は、ＰｍａＤＧ６（ａｖｒＲｐｔ２を有する）の増殖の低減を引き起こしたが、ＰｍａＤＧ３４（ａｖｒＲｐｍ１を有する；図３Ｂ）では引き起こさなかった。
【００５７】
ＰｍａＤＧ３の増殖を、様々な濃度のアゼライン酸による、植物のスプレー処理後に測定した。図３Ｃは、１００μＭおよび１０００μＭのアゼライン酸で前処理した植物は、ＰｍａＤＧ３に抵抗性であったことを示す。この誘導された抵抗性は、細菌増殖の１０倍の抑制を引き起こした。対照的に、試験した条件において、５ｍＭのＭＥＳおよび１または１０μＭのアゼライン酸による処理後には、細菌増殖に差は無かった。アゼライン酸が、誘導抵抗性応答のために一定の誘導期間を必要とするかどうかも試験した。明所で生育させて感染の６時間前に手持ち式スプレヤーを用いてアゼライン酸で前処理した植物は、依然として病原性Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅに感受性であり（図３Ｄ）、一方病原体チャレンジの１２時間前の前処理は、低レベルの抵抗性を与えた（図３Ｄ）。しかし、植物を処理後１２時間暗所で生育させた場合、アゼライン酸は病害抵抗性の付与において無効であった（図３Ｅ）。誘導された抵抗性は、より長い時間のアゼライン酸に対する接触ではより安定でかつより強力であった。従って、アゼライン酸はＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅによる感染に対する、光依存性の病害抵抗性応答を誘導し、それはまた濃度および時間依存性である。
【００５８】
（実施例４：アゼライン酸によって誘導される抵抗性は、ＳＡＲ欠損変異体、ＳＡ非感受性変異体およびＳＡ欠乏変異体において減弱するが、ＪＡ／エチレン非感受性変異体においては減弱しない）
植物がアゼライン酸によって誘導される抵抗性をどのように調節するのかをさらに特徴付けるために、１ｍＭのアゼライン酸を、病原性ＰｍａＤＧ３による感染の２日前に、野生型およびいくつかの変異体植物にスプレーし、そして細菌の増殖を測定した。野生型植物と異なり、試験したＳＡ経路変異体は、アゼライン酸での処理にかかわらず、病原性ＰｍａＤＧ３感染に感受性であった（図４Ａ）。これらのデータは、ＳＡの調節、合成、および応答に重要であることが公知である、複数の防御成分（ＮＤＲ１、ＰＡＤ４、ＮＰＲ１、ＳＩＤ１、ＳＩＤ２、およびＦＭＯ１）が、この実施例において試験した植物においてアゼライン酸によって誘導される植物抵抗性に役割を果たし得ることを示す。病原体抵抗性はまた、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいてＳＡ誘導病害抵抗性およびＳＡＲの維持に重要であるＤＴＨ９に依存性であった。１ｍＭのアゼライン酸による処理後に、ＪＡ非感受性変異体ｊａｒ１およびエチレン非感受性変異体ｅｔｒ１の葉においても、細菌の増殖をモニターした。図４Ｂは、アゼライン酸の処理は、ｊａｒ１変異体およびｅｔｒ１変異体における細菌増殖の制限に有効であったことを示し、ジャスモン酸依存性シグナル伝達およびエチレン依存性シグナル伝達は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるアゼライン酸によって誘導される抵抗性に必要でないことを示唆する。
【００５９】
（実施例５：アゼライン酸の外来性処理は、サリチル酸またはカマレキシンのレベルを増加させない）
Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅに対する抵抗性は、内因性ＳＡレベルの上昇を伴うＳＡ依存性防御の活性化を必要とするので、アゼライン酸が直接ＳＡの蓄積を誘導するどうかを調査した。植物を１ｍＭのアゼライン酸でスプレー処理した後、偽処理植物とアゼライン酸処理植物との間に、遊離ＳＡレベルおよび総ＳＡレベルの有意な差はなかった（図５Ａ）。さらに、フィトアレキシンであり防御代謝産物の１つであるカマレキシンのレベルは、アゼライン酸処理植物と偽処理植物とで同様であった（図５Ｂ）。これらのデータは、アゼライン酸がＳＡまたはカマレキシンのいずれのレベルにも直接影響しないことを示す。アゼライン酸がさらなる防御マーカーに影響を与え得るかどうかを調査するために、防御関連遺伝子の発現を、ミニアレイを用いてモニターした。驚くべきことに、試験したほとんどの防御関連遺伝子は、偽処理植物とアゼライン酸処理植物との間で、発現に差を示さなかった。可能性のある脂質輸送（ＬＴＰ）タンパク質をコードする１つの遺伝子Ａｔ２ｇ３８５３０が、アゼライン酸によって有意に誘導された（３倍）。ＲＴ−ＰＣＲは、Ａｔ２ｇ３８５３０が、アゼライン酸によって誘導されたことを確認した。しかし、ＳＡシグナル伝達マーカーであるＰＲ１は、アゼライン酸によって誘導されなかった。従って、アゼライン酸は、Ｐ．ｓｙｒｉｎａｇａｅによって活性化される公知のシグナル伝達経路に大きな変化は誘導しないようであるが、少なくとも１つの防御関連遺伝子を誘導する。
【００６０】
（実施例６：アゼライン酸は防御応答を刺激する）
ＳＡシグナル伝達変異体は、アゼライン酸に対する応答が損なわれているので、アゼライン酸が植物におけるＳＡ合成またはＳＡ依存性防御応答を刺激し得るかどうかを調査した。これを試験するために、植物に１ｍＭのアゼライン酸（または５ｍＭのＭＥＳ）をスプレーし、そして２日後に病原性ＰｍａＤＧ３および非病原性ＰｍａＤＧ６（ａｖｒＲｐｔ２を有する）（ＯＤ６００＝０．０１）で感染させた。図６Ａは、アゼライン酸処理植物における遊離ＳＡのレベルが、病原性ＰｍａＤＧ３感染の６および１８時間後に、偽処理植物におけるものよりも有意に高かったことを示す（ｐ＜０．０５、ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定）。ＰｍａＤＧ６（ａｖｒＲｐｔ２を有する）による感染後に同様の傾向が見られたが、その結果は統計学的に有意ではなかった。さらに、アゼライン酸の前処理は、ＰｍａＤＧ３およびＰｍａＤＧ６両方による接種の１８時間後において、偽処理植物のものと比較してより高いレベルの全ＳＡ蓄積を引き起こした（ｐ＜０．０１、ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定）。アゼライン酸による刺激効果をまた、ＰＲ１発現、ＳＡシグナル伝達の分子マーカーを分析することによって調査した（図６Ｂ）。偽処理植物およびアゼライン酸処理植物に、スプレー処理の２日後に病原性ＰｍａＤＧ３（ＯＤ６００＝０．０１）を感染させた。ＰＲ１発現は、病原性系統による感染後に、アゼライン酸処理植物および未処理植物の両方において増加した。しかし、アゼライン酸によって前処理した葉における病原体感染後のその発現は、病原体感染後の偽処理植物における発現と比較してより高かった（図６Ｂにおける対数スケールに注意）。これらのデータは、アゼライン酸の作用様式は、植物を刺激して、未処理植物より強くかつより速く防御を誘導することであることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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